(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なホスフォリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）および該新規ＰＬＡ１由来のペプチドまたはポリペプチドを提供すること、新規ＰＬＡ１由来のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供すること、新規ＰＬＡ１由来のペプチドまたはポリペプチドの製造法を提供すること、並びに新規ＰＬＡ１由来のペプチドまたはポリペプチドに対する抗体を提供すること、さらにこれらを利用して新規ＰＬＡ１の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤の同定を行なうこと、同定された化合物を提供することであり、またこれらを利用した医薬組成物・診断方法を提供することである。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該アミノ酸配列と少なくとも約４０％以上の相同性を有しかつホスファチジン酸を分解する活性を有するポリぺプチドを提供し、並びに該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群より選ばれるポリペプチド；
▲１▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、
▲２▼前記▲１▼のポリペプチドを含有するポリペプチド、
▲３▼前記▲１▼のポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有しかつホスファチジン酸を分解する活性を有するポリペプチド、
および
▲４▼前記アミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有し、かつホスファチジン酸を分解する活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも約８個の連続するアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列またはその相補的配列の少なくとも約１５個の連続するヌクレオチド配列で示されるポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３ないし５に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項７の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または２に記載のポリペプチドまたはペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載のポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項１０】
ホスファチジン酸を分解する活性を抑制する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと相互作用してその活性を阻害もしくは活性化する化合物、および／または請求項３もしくは４に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化合物の同定方法であって、請求項１または２に記載のポリペプチドもしくはペプチド、請求項３ないし５に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載のベクター、請求項７に記載の形質転換体、請求項９もしくは１０に記載の抗体の内の少なくとも何れか一つを用いることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドと相互作用してその活性を阻害もしくは活性化する化合物、または請求項３もしくは４に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化合物の同定方法であって、化合物とポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチドとスクリーニングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作用はポリペプチドと化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを提供しうる第２の成分に関連したものである）、次いで、化合物とポリペプチドとの相互作用により生じるシグナルの存在または不存在を検出することにより、化合物がポリペプチドと相互作用して、その活性を活性化または阻害するかどうかを決定することを含む方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の方法で同定される化合物。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドと相互作用してその活性を阻害もしくは活性化する化合物、または請求項３もしくは４に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化合物。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のポリペプチドもしくはペプチド、請求項３ないし５に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載のベクター、請求項７に記載の形質転換体、請求項９もしくは１０に記載の抗体、または請求項１３もしくは１４に記載の化合物の内の少なくとも何れか一つを含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
個体における請求項１のポリペプチドの発現または活性に関連した疾病の診断方法であって、（ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列、および／または（ｂ）個体由来の試料中の該ポリペプチドをマーカーとして分析することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なリパーゼ、特にホスフォリパーゼＡ１（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ１；以下ＰＬＡ１と呼ぶこともある）に関するものである。さらに詳しくは、新規ＰＬＡ１のアミノ酸配列の全部または一部を有するペプチドまたはポリペプチド、該ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を使ったペプチドまたはポリペプチドの製造方法、該ペプチドまたはポリペプチドに対する抗体、これらを利用した化合物の同定方法、該同定された化合物、該ポリペプチド若しくは該ポリヌクレオチドに作用する活性阻害化合物または活性賦活化合物、これらに関係する医薬組成物、およびこれらに関係する疾病診断方法に関係する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＬＡ１は、グリセロリン脂質のグリセロール１位のエステル結合を加水分解する酵素である。これまでに様々な臓器で、この酵素活性の存在が検出されており、また基質特異性により区別されるいくつかのＰＬＡ１が報告されている。ｃＤＮＡクロ−ニングされているものとしては、蜂毒のＰＬＡ１（Ｄｏｌｍ１）、ＰＳ−ＰＬＡ１〔ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびリゾホスファチジルセリン（ｌｙｓｏＰＳ）のグリセロールの１位のエステル結合を特異的に加水分解する（特開平１０−２０１４７９号）（蛋白質  核酸  酵素，４４，１０３８−１０４２，１９９９）〕、ヒト精巣のＰＡ−ＰＬＡ１〔ホスファチジン酸（ＰＡ）のグリセロールの１位のエステル結合を特異的に加水分解する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，５４６８−５４７７，１９９８）〕等がある。また、リパーゼファミリーの分子は、しばしばトリアシルグリセロールを分解する活性以外に、ＰＬＡ１活性を併せ持つことが知られている（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３２０，１４５−１４９，１９９３）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，４７０２−４７０７，１９９３）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２１９２−２１９８，１９９７）。さらに、これまでに見つかっている、リパーゼファミリーに属するＰＬＡ１は、全て、短いリッド（Ｌｉｄ）（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１３７６，４１７−４３２，１９９８）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，４７０２−４７０７，１９９３）を有するが、その生理的意義は必ずしも明らかになっていない。また、リパーゼ分子上の糖鎖がリパーゼ活性に関与する可能性が示唆されている（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３５，１５１１−１５２３，１９９４）（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３６，９３９−９５１，１９９５）。
【０００３】
ＰＬＡ１の機能の一つに、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）を分解する作用があるが、生成物のひとつであるリゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ；以下ＬＰＡと略称することもある）（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１１９８，１８５−１９６，１９９４）には多くの生理活性が知られており、生物学的有用性において着目されている〔細胞工学，１７，（５），７３９−７４５，１９９８〕。ＬＰＡの主要な作用としては、血圧の上昇作用（Ｌｉｐｉｄｓ，１３，５７２−５７４，１９７８）、血小板凝集作用（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，９６，４２３−４３８，１９７９）、細胞増殖促進作用（Ｃｅｌｌ，５９，４５−５４，１９８９）があり、またこれら以外にも、ガン細胞の浸潤促進、細胞接着、ストレスファイバーの形成、化学走性誘発、神経突起の退縮、アポトーシスの抑制、創傷治癒への関連等多様な作用が報告されている（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１１９８，１８５−１９６，１９９４）。
【０００４】
ホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ；以下、ＰＡと略称することもある）に対して特異性を持つＰＬＡ１としては、ヒト精巣ＰＡ−ＰＬＡ１が知られており、ｃＤＮＡもクローニングされているが、本酵素は細胞内の酵素であり、リン脂質代謝の中心であるホスファチジン酸のｓｎ−１位の脂肪酸の代謝回転を決定する因子として捉えられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，５４６８−５４７７，１９９８）。また、ヒト精巣ＰＡ−ＰＬＡ１は反応条件によっては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）も加水分解することが報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題のひとつは、上記のように多様な、ある局面においてはむしろ悪益な作用の原因物質となりうるＬＰＡの産生触媒たるＰＬＡ１に関する新規な物質を見いだし、生体内におけるＬＰＡの制御を可能にすることである。より具体的には、本発明の課題は新規な特性をもつ新規ＰＬＡ１を提供することであり、それに伴い有用性ある新規ＰＬＡ１由来のペプチドまたはポリペプチドを提供することである。また本発明の別の課題は、新規ＰＬＡ１由来のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、遺伝子工学手法による、新規ＰＬＡ１由来のペプチドまたはポリペプチドの製造法を提供することである。さらに本発明の別の課題は、新規ＰＬＡ１由来のペプチドまたはポリペプチドに対する抗体を提供することである。その他の本発明の課題は、上記のものを利用して新規ＰＬＡ１の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤の同定をおこなうことであり、同定された化合物を提供することであり、またこれらを利用した医薬組成物・診断方法を提供することである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
（新規ＰＬＡ１）
本発明において提供される新規ＰＬＡ１は、ｃＤＮＡライブラリーから、新規なアミノ酸配列を有する物質としてそのｃＤＮＡが取得されたものである。そして、本発明から成る新規ＰＬＡ１は、ヒトの肺、腎臓、膵臓、前立腺、睾丸、卵巣、結腸において、その存在がノザンブロッティング法によって確認された。本発明からなる新規ＰＬＡ１の性質は以下である。リン脂質、特にホスファチジン酸に作用してＬＰＡを生成する。基質特異性として、ＰＡに対して高い特異的活性をもつ。リパーゼファミリーに保存されるコンセンサス配列および触媒トライアドならびにリッドと考えられるアミノ酸を有する。また、既知ＰＬＡ１類との相同性は約４０％未満である。
【０００７】
（ポリペプチドまたはペプチド）
本発明の新規ＰＬＡ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示すポリペプチドである。さらに本発明のポリペプチドまたはペプチドは、該配列表の配列番号１に示すポリペプチドの少なくとも一部分を含有するポリペプチドまたはペプチドから選択される。その選択されるポリペプチドまたはペプチドは、配列表の配列番号１に示すポリペプチドと、アミノ酸配列上で約４０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する。この相同性をもつポリペプチドまたはペプチドの選択は、リン脂質、特にホスファチジン酸を分解しうる活性および／またはホスファチジン酸に対する基質特異性の存在を指標にして可能である（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０３，４４２−４４７，１９８８）（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，１２８０−１２８７，１９９５）（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，５３−６１，１９８７）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３５，２５９５−２５９９，１９６０）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２１９２−２１９８，１９９７）。なお、配列表の配列番号１において、Ｍ（Ｍｅｔ）１−Ｅ（Ｇｌｕ）１９はシグナル配列であると推定される。シグナル配列は本発明のペプチド等を分泌する限りにおいては該配列に限定されず、例えば、別の蛋白質由来のシグナルペプチドでもよい。また、シグナルペプチドの有無に拘わらず本発明の範囲に包含される。
【０００８】
アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。
【０００９】
本発明のポリペプチドまたはペプチドは、配列表の配列番号１に示すポリペプチドの部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドを包含し、これらは例えば試薬・標準物質・免疫原として利用できる。その最小単位としては８個以上のアミノ酸、好ましくは１０個以上のアミノ酸、より好ましくは１２個以上、さらに好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、好ましくは免疫学的に同定しうるポリペプチドまたはペプチドを本発明の対象とする。これらのペプチドは、試薬もしくは標準物質、または後述するように新規ＰＬＡ１に特異的な抗体を作製するための抗原として単独またはキャリア（例えば、キーホールリンペイトヘモシアニンまたは卵白アルブミン）と結合して使用できるが、これらのように別種の蛋白質または物質を結合したものも本発明の範囲に包含される。
【００１０】
さらに、このように特定されたポリペプチドまたはペプチドを元にして、リン脂質、特にホスファチジン酸を分解しうる活性および／またはホスファチジン酸に対する基質特異性の存在を指標とすることにより、１以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個で特に好ましくは１ないし数個のアミノ酸の欠失・置換・付加あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはペプチドも提供される。欠失・置換・付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社，１９８８、エールリッヒ，ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス，１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，６６６，１９８３）を利用することが出来る。
【００１１】
上記のような変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、活性、または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。後述するように、リパーゼファミリーのコンセンサス配列およびリッド領域は活性の発現または調節に重要と考えられ、これらを含有する領域、特に触媒トライアドを含むコンセンサス配列は一次配列上および／または立体構造上保持されていることがＰＬＡ１活性、特にＰＡ−ＰＬＡ１活性を維持するためには好ましい。また糖鎖の有無に拘わらず本発明の範囲に包含されるが、糖鎖が活性に影響する可能性もあるため、少なくとも１つのグリコシレーションサイトは保持されていることが好ましい。
【００１２】
本発明においては、配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドと同様のＰＬＡ１活性を有するポリペプチドまたはその最小活性単位（領域もしくはドメイン）も提供されるが、それら以外にも、活性の強度または基質特異性の変更したポリペプチドが提供される。これらは、例えばＰＬＡ１活性様物質もしくはＰＬＡ１拮抗物質として、またはＰＬＡ１活性を調節する物質のスクリーニング等において有用である。なお、ヒト以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包含される。
【００１３】
さらに、本発明のポリペプチド等の検出もしくは精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片またはＦＬＡＧ−ｔａｇ等のペプチドを直接またはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することは当業者には容易であり、これらの別の物質を結合したポリペプチド等も本発明の範囲に包含される。
【００１４】
（ポリヌクレオチド）
一つの態様において、本発明のポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、本発明のポリペプチド等、例えば配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対する相補鎖を意味する。これらは例えば上記新規ＰＬＡ１の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸に関する試薬・標準品としても利用できる。好ましいポリヌクレオチドを示す配列表の配列番号２において、塩基番号８９のＡ（ａｄｅｎｉｎｅ）から塩基番号１４４１のＧ（ｇｕａｎｉｎｅ）までがコーディング領域と推定される。また、アミノ酸配列Ｍ（Ｍｅｔ）１−Ｅ（Ｇｌｕ）１９をコードしているａｔｇ〜ｇａａはシグナル配列をコードしているものと推定され、産生される蛋白質は分泌型として産生され、プロセッシングを経ることで、成熟型の蛋白質となることが推定される。なお、ヒト個体による塩基配列の多型の存在が認められた。その内の一例では、配列表の配列番号２のヌクレオチド配列の塩基番号１０８８のＧ（ｇｕａｎｉｎｅ）がＴ（ｔｈｙｍｉｎｅ）に置換され、結果としてアミノ酸番号３３４のＤ（Ａｓｐ）がＹ（Ｔｙｒ）に置換されており、別の例では、配列表の配列番号２のヌクレオチド配列の塩基番号１２０４のＡ（ａｄｅｎｉｎｅ）がＧ（ｇｕａｎｉｎｅ）に置換され、この例においてはアミノ酸置換は無いと考えられた。
【００１５】
別の態様において本発明は、本発明のポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列、例えば配列表の配列番号１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号２のヌクレオチド配列で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，（１９８９）等に従うことができる。これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチド、特に配列表の配列番号２のヌクレオチド配列で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイズするものであれば必ずしも相補的配列でなくとも良い。例えば、配列表の配列番号２のヌクレオチド配列またはその相補配列に対する相同性において、少なくとも約４０％、例えば、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上である。また本発明のポリヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する連続する１０個以上のヌクレオチド、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上の配列からなるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび該相補鎖を包含する。
【００１６】
これらのポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド等の製造において、新規ＰＬＡ１をコードする核酸、例えば、その遺伝子、もしくはｍＲＮＡの検出のためのプローブもしくはプライマーとして、または遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として有用である。その意味で、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。例えば、アンチセンスによって新規ＰＬＡ１の発現を特異的に阻害するためには、リパーゼファミリーで保存されているコンセンサス配列領域以外の新規ＰＬＡ１に固有な領域のヌクレオチド配列を用いることが想定される。一方、保存配列を用いることにより新規ＰＬＡ１を含む複数のリパーゼの発現を同時に抑制することも可能と考えられる。ここで、新規ＰＬＡ１または同様の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の決定は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現蛋白質の確認を行い、その生理活性特にホスファチジン酸を分解する活性を指標にして選別することにより行うことができる。無細胞蛋白質発現系を利用する場合は、例えば胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる（Ｎａｔｕｒｅ、１７９、１６０〜１６１、１９５７）。
【００１７】
（形質転換体）
上記のような無細胞系以外にも、本発明は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によっても、本発明からなる新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドは提供可能である。本発明の具体例においては、昆虫細胞を利用したが、無論これに限定されるものではない（日本国特許第２１２９４８７号および第２６４４４４７号：組み替えバキュウロウィルス発現ベクターの製法とポリペプチドの合成）。なお、本発明の新規およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドは、分泌型の蛋白質であるため、酵母、動物細胞等の分泌系の機能を保持する宿主が好ましい。
【００１８】
形質転換は、自体公知の手段が応用され、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法であるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系の利用である。ベクターは、選択した宿主の種類により選別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。組合せは原核細胞、真核細胞によって分別され、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等を自体公知の方法によって組合せ利用できる。本発明の具体例においては、バキュロウイルス系を利用したが、無論これに限定されるものではない。
【００１９】
形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、発現産生される新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドの酵素活性特にホスファチジン酸を分解する酵素活性をマーカーにしておこなってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチによって、生産してもよい。
【００２０】
（新規ＰＬＡ１およびその由来物回収）
培地からの新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドの回収は、ホスファチジン酸を分解する酵素活性を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を組合せるか、溶解度差にもとづく硫安、アルコール等の分画手段によっても精製回収できる。好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列に対する抗体を作成し、ポリクローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。簡便には、へパリンを利用したアフィニティクロマトグラフィーが利用できる。
【００２１】
（抗体）
抗体は、本発明の新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドの抗原決定基を選別し、作製する。抗原は新規ＰＬＡ１またはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。新規ＰＬＡ１に特異的な抗体を作製するためには、リパーゼファミリーのコンセンサス配列領域以外の新規ＰＬＡ１に固有な配列からなる領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号１と相同である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位が不連続部位であれば、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であることも有効である。抗体は、免疫学的に新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定される。
【００２２】
抗体を産生するためには、本発明の新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に結合して、動物に対して体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導をおこなうことによって行われる。担体は、自身が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、兎、やぎ、馬等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法である。
【００２３】
モノクロ−ナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、ハイブリドーマをクローン化し、本発明のＰＬＡ１を特異的に認識する抗体を選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
【００２４】
ＰＬＡ１活性を抑制し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、直接本発明からなる新規ＰＬＡ１を結合し、活性を制御可能であり、リン脂質特にＰＡからのＬＰＡ産生系の制御を容易に行うことができる。そのため、ＬＰＡが関連する各種悪益的疾患の治療・予防のために有用である。
【００２５】
（同定・スクリーニング）
かくして調製された新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、またはこれらを用いる蛋白質合成系並びに新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数手段を組合せることによって、新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドに対する活性阻害剤または活性賦活剤の同定・スクリーニングに有効な手段を提供する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品スクリーニングシステムにおいて、利用可能である。
【００２６】
また、本発明の新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドは、スクリーニング候補の化合物とこれらペプチドまたはポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選別し、この相互作用の有無を検出することのできるシグナル（マーカー）を使用する系を導入し、このシグナル（マーカー）の存在・不存在を検出することにより、本発明の新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドの活性を賦活または阻害する化合物を同定可能である。
【００２７】
（化合物、医薬組成物）
このようにして同定された化合物は、新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドの系に関する活性阻害剤、活性拮抗剤、活性賦活剤の候補化合物として、利用可能である。また、遺伝子レベルでの新規ＰＬＡ１およびその由来物の系に対する発現阻害剤、発現拮抗剤、発現賦活剤の候補化合物としても利用可能である。その効果は、ＬＰＡに由来する各種悪益的症状の予防・治療を期待できる。
【００２８】
かくして選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、医薬組成物として調製可能である。また本発明からなる新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター並びに、新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体が、診断マーカー、試薬等の疾病診断手段、または新規ＰＬＡ１の活性阻害・拮抗・賦活等の機能を利用して治療薬等の医薬手段として使用しうる可能性がある。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたはポリペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、抗体等各対象に応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００２９】
診断手段としては、本発明の新規ＰＬＡ１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドの発現または活性に関連して疾患の診断手段として有用であり、例えば当該ペプチドをコードしている核酸配列との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸配列の存在量を決定すること、および／または当該ペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、および／または当該ペプチドの存在、個体由来の試料中の存在量を決定することによって行われる。詳しくは、新規ＰＬＡ１を診断マーカーとして検定するのである。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、ＰＣＲ反応系等を利用すればよい。さらに、前述したように、個体による多型の存在が認められるので、公知の方法により単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出することも有用な診断手段である。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
（遺伝子の単離）
ホスファチジルセリンを特異的に加水分解するラットホスフォリパーゼＡ１（ＰＳ−ＰＬＡ１）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，（４），２１９２−２１９８，１９９７）のアミノ酸配列をプローブとして、ｄｂＥＳＴ（ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｓ）に対して、ホモロジーサーチ（ｔｂｌａｓｔｎ  ｓｅａｒｃｈ）を実施した。その結果、未知の核酸配列で相同性スコアの比較的高かった、受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．）ＡＡ１４９７９１、ＡＡ１０２３２２の２種類のＥＳＴ配列を得た。次に、受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．）ＡＡ１０２３２２の核酸配列をプローブとして、ｄｂＥＳＴに対してホモロジーサーチ（ｂｌａｓｔｎ  ｓｅａｒｃｈ）を実施した。
【００３１】
その結果、受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．）ＡＡ３６７３６８の配列と、ＡＡ１４９７９１の配列とが重なる塩基配列領域を有することが明らかとなった（図１）。これらの配列を、重複する領域で並べたところ、ＡＡ１４９７９１（翻訳開始コドンと予想されるメチオニン残基を含む配列）、ＡＡ１０２３２２（ＡＡ１４９７９１と重なりを有する配列）、ＡＡ３６７３６８（ＡＡ１０２３２２と大幅に重なり、触媒トライアド等を含む配列）の順番で配置することが可能であることが判明した。次に、これらの配列を並べ、その特色を解析した。ＰＳ−ＰＬＡ１や、リパーゼに特色的な、活性トライアドのアミノ酸残基や立体構造的に活性ポケット近傍にあるリッドと呼ばれるループ構造領域（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１３７６，４１７−４３２，１９９８）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，４７０２−４７０７，１９９３）（蛋白質  核酸  酵素，４４，１０３８−１０４２，１９９９）が存在することが予測され、その配列上の特色から新規なホスフォリパーゼＡ１である可能性が推測された。
【００３２】
（新規配列のクローニング）
実際に、上記解析で予測された新規ＰＬＡ１遺伝子配列を有するｃＤＮＡをクローニングする目的で、開始メチオニンコドンを有すると考えられたヒト大腸由来の部分的なｃＤＮＡ配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＡ１４９７９１）を含むクローンを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。
【００３３】
該クローンの核酸配列を確認したところ、全長ｃＤＮＡを含む可能性が示唆された。これがアーティファクトでないことを確認するため、該配列をもとに、ＰＣＲプライマーとして、配列表の配列番号３の５’−ＴＧＣＧＡＡＧＴＡＡＡＴＣＡＴＴＣＴＴＧＴＧＡＡ−３’（フォワードプライマー配列）および配列表の配列番号４の５’−ＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＡＧＧＡＣＧＣＴＡＣＴＧ−３’（リバースプライマー配列）の塩基配列のオリゴヌクレオチドを作製し、ヒトの大腸、肺、腎臓由来のＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲした。増幅された遺伝子断片（約１．５ｋｂｐ）を、プラスミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をクローニング用のベクターとし、これのマルチクローニングサイトＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩにクローン化後、塩基配列を決定した。配列は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫのマルチクローニングサイトのプライマーを使用し、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩの４個所の制限サイトを活用しながら、シークエンスを行った。次に、この配列をもとに、プライマーオリゴマーを設計し、プライマーウオーキングの手法を用いて新規ＰＬＡ１と考えられた配列表の配列番号２の塩基配列を最終的に確認した（図２）。また、ＲＴ−ＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスによっても配列を確認した。これらにより、塩基配列の２カ所に個体による多型を認めた。なお、該塩基配列を含有するプラスミドを含む大腸菌は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４２８として工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９９年６月２２付で寄託されている。
【００３４】
この配列表の配列番号２に示すｃＤＮＡは、配列表の配列番号１に示す４５１アミノ酸残基からなる蛋白質を暗号化可能な、１３５３塩基からなるオープンリーディングフレームを含み、Ｎ末端領域に、シグナル配列と予想される領域を有していた。配列的な特色としては、アスパラギングリコシレーションサイトのモチーフであるＮ−｛Ｐ｝−［ＳＴ］−｛Ｐ｝．を４個所（Ｎ（Ａｓｎ）５０−Ｃ（Ｃｙｓ）５３、Ｎ（Ａｓｎ）５８−Ａ（Ａｌａ）６１、Ｎ（Ａｓｎ）６６−Ｋ（Ｌｙｓ）６９、Ｎ（Ａｓｎ）３５７−Ｅ（Ｇｌｕ）３６０））持ち、細胞結合領域のモチーフとして知られるＲＧＤ配列を１個所（Ｒ（Ａｒｇ）３４４−Ｄ（Ａｓｐ）３４６）含み、システイン残基を１３個有していた。
【００３５】
また、下記に記載するバキュロウイルスの発現系を用い細胞外に分泌されることが確認されたので、本発明の酵素は、シグナルペプチドを有し、おそらく分泌蛋白質であると考えられる。シグナルペプチドの部位は、組換え型蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を決定していないので確定していないが、Ｍ（Ｍｅｔ）１−Ｅ（Ｇｌｕ）１９までと予測される。
【００３６】
（既存蛋白質との相同性）
塩基配列の翻訳によって予想されるアミノ酸配列を用いて、既存のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）に対してｔｂｌａｓｔｎを用いたホモロジーサーチを実施した。その結果、図３に示すように、本発明の新規リパーゼ（ｃｏｌｏｎ  ｌｉｐａｓｅ）はヒトＰＳ−ＰＬＡ１（ｈＰＳ−ＰＬＡ１）、膵臓型リパーゼ（ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｌｉｐａｓｅ）、肝臓型リパーゼ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｉｐａｓｅ）、リポプロテインリパーゼ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｐａｓｅ）、膵臓リパーゼ関連蛋白質１（ｐｌｒｐ１；ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｌｉｐａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）および２（ｐｌｒｐ２；ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｌｉｐａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）と有意な相同性をしめした。その他、立体構造的にリパーゼと相同性が高い領域があるとされるビテロジェニンとの相同性も高かった。これらの相同性が高かった既知蛋白質配列のうちビテロジェニンを除く上記各蛋白質において、酵素活性トライアドと予測されるアミノ酸残基（Ｓ（Ｓｅｒ）１５４、Ｄ（Ａｓｐ）１７８、Ｈ（Ｈｉｓ）２４８）がすべて保存されているのが確認されたので、これらの配列をＧＥＮＥＴＹＸ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔモジュール（ソフトウエア開発株式会社）を用いて、マルチプルアライメント表を作成した。
【００３７】
その結果、配列表の配列番号１のアミノ酸配列においては、図２に示すように、リパーゼファミリーに保存されているコンセンサス配列ＧＸＳＸＧ（Ｇ（Ｇｌｙ）１５２−Ｇ（Ｇｌｙ）１５６）、ＩＴＧＬＤ（Ｉ（Ｉｌｅ）１７４−Ｄ（Ａｓｐ）１７８）およびＣＸＨ（Ｃ（Ｃｙｓ）２４６−Ｈ（Ｈｉｓ）２４８）（Ｘは任意のアミノ酸を示す）が存在し、これらには触媒活性トライアドと考えられるアミノ酸残基が全て含まれていることが判明した。また、立体構造的に活性トライアドが存在するポケットの近傍に存在し、リパーゼの活性発現を調節しているリッドと呼ばれるループ構造（Ｐ（Ｐｒｏ）２３４−Ｋ（Ｌｙｓ）２４５）が、ＰＳ−ＰＬＡ１のそれと同じ残基数すなわち１２個存在することが判明した。通常、ＰＳ−ＰＬＡ１以外のリパーゼ群は、リッド構造のアミノ酸残基数が長く、コリパーゼと呼ばれる蛋白性の因子が結合することによって活性が発現されることが知られている（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１３７６，４１７−４３２，１９９８）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，４７０２−４７０７，１９９３）（蛋白質  核酸  酵素，４４，１０３８−１０４２，１９９９）が、比較的リッドが短いＰＳ−ＰＬＡ１は、コリパーゼの必要性は、現在まで明らかにされていない。従って、今回得た塩基配列から翻訳される蛋白質も、ＰＳ−ＰＬＡ１に似た機構で活性発現する可能性も予測される。
【００３８】
次に、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ  ｔｒｅｅ（ＵＰＧＭＡ  ｍｅｔｈｏｄ）モジュール（ソフトウエア開発株式会社）によって、配列の進化的な系統樹を予測した。その結果、新規配列は、ＰＳ−ＰＬＡ１と最も進化的に近い配列であることが推測された。以上のことから、新規配列が翻訳された蛋白質は、リパーゼ群に近く、特にホスフォリパーゼに近縁な新規リパーゼであることが推測された。
【００３９】
（発現組織の確認）
新規リパーゼの発現組織を調べる目的で、ヒト正常組織に対してノザンブロッティングを行った。オープンリーディングフレーム内のｃＤＮＡ断片である約０．７ｋｂｐのＰＣＲ断片をプローブとして用いた。すなわち、ＰＣＲプライマーとして、配列表の配列番号５のＣＴＧＣＧＣＡＣＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＴＣ（フォワードプライマー配列）および配列表の配列番号６のＡＧＧＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＡＣ（リバースプライマー配列）の塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲをおこなうことにより３２Ｐ標識プローブを調製した。ノザンブロッティングは、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてユーザーマニュアル（ＰＴ１２００−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従って実施した。その結果、正常組織においては、肺、腎臓、膵臓、前立腺、睾丸、卵巣、結腸において発現が認められた（図４）。
【００４０】
（新規リパーゼの発現）
完全長ｃＤＮＡを上述のｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）から、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで切り出し作製した。プラスミドｐＦＡＳＴＢＡＣ１（ライフテックオリエンタル社）中のマルチクローニングサイトにＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩの制限酵素サイトでｃＤＮＡを組み込んだ。  Ｃ末端側にＦＬＡＧ−ｔａｇ（Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１２０５−１２１０，１９８８）をつけたものに関しては、終止コドンを取り除き代わりに、  配列表の配列番号８に示すＦＬＡＧ−ｔａｇをコードする核酸配列末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を持った合成オリゴクレオチド  （プライマー２）を作製し、また、配列表の配列番号７に示す開始メチオニンの最初にＢａｍＨＩを導入したオリゴヌクレオチド（プライマー１）を作製し、上述のｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）をテンプレートに用いＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを増幅した。
【００４１】
プライマー１：５’−ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＡＴＣ−３’  （配列表の配列番号７）
プライマー２  ：５’−ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＡＡＴ−３’（配列表の配列番号８）
【００４２】
プラスミドｐＦＡＳＴＢＡＣ１中のマルチクローニングサイトの、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩの制限酵素サイトにｃＤＮＡを組み込んだ後、大腸菌ＪＭ１０９に、構築したｐＦＡＳＴＢＡＣ１をトランスフェクションし、ポジティブクローンを選択後、該ポジティブクローンの培養を行いプラスミドを回収した。このプラスミドを、ＤＨ１０ＢＡＣＴＭコンピーテントセル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）にトランスフェクションし、組み換えＢａｃｍｉｄを回収した。得られたＢａｃｍｉｄは、ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮＴＭ（ｐＦＡＳＴＢＡＣ１）とともにＳｆ９細胞（夜盗蛾Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａさなぎ卵巣組織由来）にトランスフェクションした。
【００４３】
その結果、組み換え型バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）が培養上清中に回収された。次に、蛋白質の発現を確認する目的で、回収したバキュロウイルスをＳｆ９昆虫細胞に感染させ２７℃９６時間培養した。感染細胞の上清から抽出した発現蛋白質をサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウエスタンブロッティングをＦＬＡＧ−ｔａｇに対する抗体を用いて実施したところ予想される新規リパーゼの分子量約５２ｋＤａにバンドが認められた（図５）。従って、新規リパーゼを、昆虫細胞などを用いることによって培養上清中に上記手法により発現させ得ることを確認した。
【００４４】
（新規リパーゼの精製）
組み換え型バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）（日本国特許第２１２９４８７号および第２６４４４４７号：組み替えバキュウロウィルス発現ベクターの製法とポリペプチドの合成）感染培養上清５００ｍｌを回収し、１００００×  ｇ、２０分、４℃の遠心にて細胞断片を除き、更に、フィルターをかけることにより（Ｆａｌｃｏｎ  ポアサイズ０．４５μｍ）さらに培養上清中のゴミを除去した。ＦＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、上述した培養上清を、ヘパリンカラム（Ｈｉ−ｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，５ｍｌ）  に付し最終的に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）  存在下、１００ｍＭから  １５００ｍＭ  のＮａＣｌで濃度勾配溶出を行った。溶出の分画は、２．５ｍｌづつ行い、全部で２０フラクション分画した。次に分画した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体によってウエスタンブロッティングしたところ、特定の画分に、バンドが検出されることを確認した。
【００４５】
同様に対照として、野生型バキュロウイルス（ｗｉｌｄｔｙｐｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）を感染させた培養上清を、上述のようにヘパリンカラムに付し、ＮａＣｌ  の濃度勾配溶出画分を調製した。この画分を、ウエスタンブロッティングしたが、該画分中には  ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体が反応する分子は確認されなかった。
【００４６】
（基質特異性の検討）
ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体でバンドが検出された画分を用いて、脂肪酸が［１４Ｃ］で放射標識されたホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリアシルグリセロール（ＴＧ）を基質として、ホスホリパーゼ活性、リパーゼ活性を測定した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２１９２−２１９８，１９９７）。ホスホリパーゼ活性（ＰＡ、ＰＳ、ＰＣ）は、４０  μＭのそれぞれの基質を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下、酵素とともに３７℃  １時間インキュベートし、遊離した放射標識脂肪酸をドール法により抽出し、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００４７】
リパーゼ活性（ＴＧ）は、４０μＭ  の基質を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下、酵素とともに３７℃  １時間インキュベートし、遊離した放射標識脂肪酸をドール法により抽出し、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００４８】
その結果、Ｆｌａｇ−ｔａｇ抗体で新規リパーゼ組み換え型タンパク質が検出された画分には、ＰＡを切断するホスフォリパーゼ活性が検出された。ＴＧを切断するリパーゼ活性、ＰＣ、ＰＳに対するホスフォリパーゼ活性に関しては有意な活性は検出されなかった。  ＰＡを切断するホスフォリパーゼ活性は、野生型バキュロウイルス（ｗｉｌｄｔｙｐｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）を感染させたＳｆ９細胞培養上清からのヘパリンカラム溶出画分には検出されなかった。以上の検討により、新規ホスフォリパーゼＡ１は、ＰＡを加水分解し、細胞の分化・増殖を促進する成長因子であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の生成過程に関与する可能性があることが示唆された。
【００４９】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の新規リパーゼは、新規ＰＬＡ１であり、その基質特異性としてホスファチジン酸を分解する活性が特徴的である。この特性を利用した新規医薬組成物、診療手段の提供は、リパーゼ関連の臨床・基礎の医用領域において大きな有用性を提供する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】新規リパーゼの塩基配列とＥＳＴの塩基配列の関係を説明する図である。図中、ＡＴＧは開始コドン、Ｓ、Ｄ、Ｈは活性トライアド、Ｃ−Ｃはリッド領域、ＥＳＴ配列中の破線はＥＳＴ配列の欠失がある領域である。
【図２】新規リパーゼの配列およびその配列の特徴を説明する図である。図中、二重下線はシグナル配列、下線は糖鎖付加予測部位、両矢印の下線はリパーゼコンセンサス配列およびリッド領域、四角（斜線入り）で囲んだＳ、Ｄ、Ｈは活性トライアド、四角（白抜き）はＲＧＤ配列を示す。
【図３】新規リパーゼ（ｃｏｌｏｎ  ｌｉｐａｓｅ）と、該新規リパーゼに相同性を有するリパーゼのアミノ酸配列を比較するマルチプルアラインメント図である。
【図４】ヒト組織における新規リパーゼの発現をノザンブロットで確認した図である。
【図５】新規リパーゼの組換え型蛋白質の昆虫細胞における発現をウェスタンブロットで確認した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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