(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ヒト成人全脳及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーからタンパク質をコードしている領域を含む新規なＤＮＡを直接クローニングし、それらの塩基配列を決定し、更にそれらの機能を同定すること。【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ：（ａ）特定のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）特定のアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、上記ＤＮＡにコードされる組換えポリペプチド、および該ポリペプチドを含むタンパク質。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、
をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、請求項１（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡを含む遺伝子構築物。
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子構築物にコードされる組換えポリペプチド。
【請求項６】
請求項４または５に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項７】
請求項１または２に記載のＤＮＡを配列させた、ＤＮＡチップ。
【請求項８】
請求項４または５に記載のポリペプチドを配列させたポリペプチドチップ。
【請求項９】
請求項６に記載の抗体を配列させた抗体チップ。
【請求項１０】
請求本項１又は２記載のＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡおよび該ＤＮＡを含む遺伝子、並びに該ＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドおよび該ポリペプチドを含む新規組換えタンパク質に関し、より詳細には、Ｑｕｉｅｓｃｉｎ　Ｑ６　ファミリーに属すると考えられる新規なタンパク質の遺伝子及びそれにコードされるタンパク質に関する。
【０００２】
【従来技術】
ヒトゲノム計画における大規模シークエンシングによって、ヒトゲノムの塩基配列に関する膨大な情報が得られ、日々解析が進められている。
ヒトゲノム計画の最終目的は単にゲノム全塩基配列を決定することではなく、その構造情報、即ち、ＤＮＡの塩基配列情報からヒトのさまざまな生命現象を読み解くことにあろう。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｄｏｎａｌｄ　Ｌ．　Ｃｏｐｐｏｃｋ他　著、Ｇｅｎｏｍｉｃｉｓ　５４，　“Ｔｈｅ　Ｑｕｉｅｓｃｉｎ　Ｑ６　Ｇｅｎｅ　（ＱＳＣＮ　６）　ｉｓ　ａ　Ｆｕｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｗｏ　Ａｎｃｉｅｎｔ　Ｇｅｎｅ　Ｆａｍｉｌｉｅｓ：　Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ａｎｄ　ＥＲＶ１”，　１９９８，　ｐ．４６０−４６８
【非特許文献２】
Ｂｅａｔｒｉｃｅ　Ｂｅｎａｙｏｕｎ他　著、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７６，　Ｎｏ．１７，　“Ｒａｔ　Ｓｅｍｉｎａｌ　Ｖｅｓｉｃｌｅ　ＦＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ”，２００１，　ｐ．１３８３０−１３８３７
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトゲノム配列中でタンパク質をコードしている領域はそのごく一部であり、現在は、ニューラルネットワークや隠れマルコフモデルと呼ばれる情報科学の手法を用いて、そのコード領域の予測が行われている。しかしながら、それらの予測精度はまだ充分なものではない。
【０００５】
今回、本発明者は新規な遺伝子を見出すべく、ヒト成人全脳、及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、タンパク質をコードしている領域を含む新規なＤＮＡを直接クローニングすることに成功し、それらの塩基配列を決定して本発明を完成させた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は第一の態様において、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、
をコードする塩基配列を含むＤＮＡに係る。このようなＤＮＡの例として、限定するものではないが、配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡが挙げられる。
また本発明は第二の態様において、本発明の第一の態様であるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに係る。
以上の本発明の第一および第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下「本発明ＤＮＡ」ともいう。さらに本発明は、本発明ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡにも係る。
【０００７】
さらに本発明は第三の態様において、本発明ＤＮＡを含む遺伝子構築物に係る。
本明細書において「遺伝子構築物」とは、人為的に操作されたあらゆる遺伝子を意味する。遺伝子構築物の例としては、限定するものではないが、本発明ＤＮＡまたは本発明ＤＮＡのアンチセンスＤＮＡを含むベクター、および本発明ＤＮＡの発現ベクターが挙げられる。
【０００８】
本発明は第四の態様において、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、
に係る。
また本発明は第五の態様において、本発明の第三の態様である遺伝子構築物にコードされる組換えポリペプチドにも係る。
以上のポリペプチドは、まとめて、以下「本発明ポリペプチド」ともいう。尚、本明細書では、ポリペプチドとは、「あらゆる分子量を有するアミノ酸の重合体」を意味する。本発明はまた、本発明ポリペプチドを含んでなる組換えタンパク質にも係る。前述の定義の通り、本明細書において用語「ポリペプチド」は分子量による制限を課していないため、用語「本発明ポリペプチド」には本発明ポリペプチドを含む組換えタンパク質もまた含まれる。
【０００９】
本発明は第六の態様において、本発明ポリペプチドに対する抗体に係る。
本発明は第七の態様において、本発明ＤＮＡを配列させたＤＮＡチップに係る。
本発明は第八の態様において、本発明ポリペプチドを配列させたポリペプチドチップに係る。
本発明は第九の態様において、本発明の第六の態様である抗体を配列させた抗体チップに係る。
本発明は第十の態様において、本発明ＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに係る。
本発明ＤＮＡを有するクローンの名称、本発明ポリペプチドの長さ、予測される機能および推定の根拠を表１に示す。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明ＤＮＡは、市販されている（クロンテック社製）ヒト成人全脳及びヒト胎児全脳のｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。
即ち、具体的には、小原他の方法（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　４：５３−５９（１９９７））に従って調製したヒト成人全脳及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーからクローンをランダムに単離する。
これらの末端塩基配列を解析後、クエリーとして既知遺伝子のデータベースにて相同性検索を行い、その結果、新規であることが判明したクローンについて、ｃＤＮＡの５’および３’の末端配列をヒトのゲノム配列に対応させ、それらが挟む領域に未知の長鎖遺伝子が確認された場合には、そのｃＤＮＡの全長解析をおこなう。
また、短い断片や得られた配列に人工的な間違いが起こらないように十分な注意を払いながら、ＲＡＣＥなどのＰＣＲ法を使用することによっても、本発明ＤＮＡを含むヒト由来遺伝子の全領域を調製することも可能である。
【００１１】
更に、本発明は、本発明ＤＮＡまたは本発明ＤＮＡを含む遺伝子構築物を含有する組換えベクター、該組換えベクターを保持する形質転換体、該形質転換体を培養し、本発明ポリペプチドもしくは該ポリペプチドを含む組換えタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、本発明ポリペプチドもしくは該ポリペプチドを含む組換えタンパク質、またはその塩の製造方法、および、こうして得られる本発明ポリペプチドもしくは該ポリペプチドを含む組換えタンパク質またはその塩を提供する。
【００１２】
また本発明は、本発明ＤＮＡまたは遺伝子構築物を含有してなる医薬、本発明ポリペプチドもしくはその部分ポリペプチドまたは該ポリペプチドを含む組換えタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（ＤＮＡ）、本発明ＤＮＡに対するアンチセンスヌクレオチド、該ポリヌクレオチドまたはアンチセンスヌクレオチドを含有してなる医薬、本発明ポリペプチドもしくはその部分ポリペプチド、および、該ポリペプチドまたはそれらを含む組換えタンパク質を含有してなる医薬に係る。
【００１３】
また本発明は、本発明ＤＮＡ、本発明ポリペプチド、および本発明ポリペプチドに対する抗体を配列して作製される、ＤＮＡチップ、ペプチドチップ、および抗体チップにも係る。
【００１４】
更に、本発明は、本発明ポリペプチド、その部分ポリペプチドもしくは該ポリペプチドを含む組換えタンパク質またはそれらの塩、またはそれらに対する抗体を用いることを特徴とする、それら物質と特異的に相互作用する物質のスクリーニング方法、スクリーニング用キット、並びに、該スクリーニング方法によって同定される物質（化合物）自体などにも係る。
【００１５】
本発明ＤＮＡとしては、前述した本発明ポリペプチドをコードする塩基配列からなるものであればいかなるものであってもよい。また、ヒトの脳、または、それ以外の組織、例えば、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣などの細胞・組織に由来するｃＤＮＡライブラリーなどから同定・単離されたｃＤＮＡ、または、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりトータルＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
【００１６】
本発明ＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、本発明ポリペプチドまたはその部分ポリペプチドをコードするＤＮＡと実質的に相補的な塩基配列を有し、本発明ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有する任意のアンチセンスＤＮＡが含まれる。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。また、これらアンチセンスＤＮＡと同様の作用を有する核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾体）も本発明でいうアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００１７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号１で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上であるアミノ酸配列を意味する。
従って、本発明の配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドを挙げることができる。ここで、実質的に同質とは、それらの活性（機能）が性質的に同質であることを示す。
また、本発明ポリペプチドには、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列中の一部（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列からなり、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドも含まれる。
【００１８】
上記の配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその一部のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、およびＰＣＲ法などの当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、その際に、実質的に同質の生物学的活性を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。また、実質的に同質の生物学的活性の維持のためには、本発明のポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
【００１９】
本発明ＤＮＡは、本発明ポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及び、本発明の第一の態様であるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能と同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。
このようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡの例としては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡなどを挙げることができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションは、「分子生物学の最新プロトコール」（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７））に記載の方法など、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６５℃の１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ナトリウム、０．５Ｍ　リン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ　水溶液中でハイブリダイズさせ、６５℃の１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ナトリウム、４０ｍＭ　リン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ　水溶液中でメンブレンを洗浄する条件でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。上記以外の条件によっても、同じストリンジェンシーとすることができる。
【００２１】
本発明ＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明ポリペプチドの部分などの適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明ポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、上記の「分子生物学の最新プロトコール」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２２】
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、（１）本発明ＤＮＡまたは本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどを利用することができる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点などを付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされたタンパク質を他のタンパク質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼおよびプロテインＡ）との融合タンパク質として発現させることも可能である。このような融合タンパク質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれのタンパク質に分離することができる。
【００２３】
宿主細胞としては、例えば、エシェリキア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリキア属菌の具体例としては、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　６０：１６０（１９６８））、ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　９：３０９（１９８１））、ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１２０：５１７（１９７８））、およびＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　４１：４５９（１９６９））などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，　２４：２５５（１９８３））、２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　９５：８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２などのサッカロマイセス、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００２４】
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、６９：２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ，　１７：１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１６８：１１１（１９７９）、「酵素学における方法」（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１９４巻、１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　７５：１９２９（１９７８）、細胞工学別冊８　新　細胞工学実験プロトコール、２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；およびＶｉｒｏｌｏｇｙ，　５２：４５６（１９７３）を参照できる。
【００２５】
このようにして得られた、本発明ＤＮＡまたは本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。
例えば、宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００２６】
上記培養物から本発明ポリペプチドまたはタンパク質を分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗製抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００（商標）などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。
【００２７】
こうして得られた本発明ポリペプチドは、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に、トリプシンおよびキモトリプシンのような適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
【００２８】
本発明ポリペプチドまたはその塩の存在は、様々な結合アッセイおよび特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
本発明ポリペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。
本発明ポリペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のポリペプチドには、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００２９】
本発明のポリペプチドの部分ポリペプチドとしては、前記した本発明ポリペプチドの部分ペプチドであって、実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明ポリペプチドの構成アミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するペプチドなどが用いられる。本発明の部分ポリペプチドとしては、例えば、各機能ドメインを含むものが好ましい。また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明のポリペプチドのごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２　）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のポリペプチドと同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。本発明の部分ペプチドは、例えば、試薬、実験の際の標準物質、または免疫原もしくはその一部として使用することができる。
本発明ポリペプチドまたはその部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００３０】
本発明ポリペプチド、その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体は、当該技術分野で公知の化学合成方法を用いて調製することもできる。例えば、通常市販されているタンパク質合成用樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、当業界において知られた各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、例えば、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドのようなカルボジイミド類に代表されるポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，　ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または対照とする酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、酸アミド類、ハロゲン化炭化水素類、アルコール類、スルホキシド類、およびエーテル類など、当業界においてポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料の各アミノ基、カルボキシル基、およびセリン水酸基などの保護基としても、当該技術分野において、通常使用される基を使用することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００３１】
本発明の部分ペプチドまたはそれらの塩は、当該技術分野において知られたペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、（１９７５年）、矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）、矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店に記載された方法が挙げられる。
反応後の精製も公知の方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００３２】
本発明ポリペプチド、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、それらを認識し得るものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明ポリペプチド、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明ポリペプチドまたはその部分ペプチドを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明ポリペプチドなどを検出するために使用することができる。また、これらを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明ポリペプチドの検出、被検細胞内における本発明ポリペプチドの挙動の分析などのために使用することができる。
【００３３】
以下に本発明ＤＮＡ、本発明ポリペプチド、本発明の抗体などの使用についてさらに詳述する。
本発明ＤＮＡ、本発明ＤＮＡのアンチセンスＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡを含む遺伝子構築物をプローブとして使用することにより、本発明ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができる。
例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　５：８７４−８７９（１９８９）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　８６：２７６６−２７７０（１９８９））などにより実施することができる。更に、本発明ＤＮＡまたは遺伝子に異常がある場合、欠損している場合あるいは発現量が減少している場合、生体内において正常な機能を発揮できない患者に対しては、公知手段に従ってレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療によって、本発明ＤＮＡまたは遺伝子構築物を該患者体内に導入し発現させると効果的であると考えられる。また、発現量が増加しているために正常な機能が発揮できない場合には、アンチセンスの導入が効果的であろう。
本発明ＤＮＡ、本発明のアンチセンスＤＮＡ、または遺伝子構築物を、それらのＤＮＡや構築物を単独、または摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。
または上記の疾患の患者に対して本発明のポリペプチドなどを該患者に注入することなどによって、該患者において本発明のポリペプチドなどの機能を発揮させることができるものと考えられる。
【００３４】
更に、本発明の抗体は、公知の方法による被検液中の本発明ポリペプチドなどの定量、特に、モノクローナル抗体を使用したサンドイッチ免疫測定法による定量、および組織染色などによる検出などに使用することができる。それによって、例えば、本発明ポリペプチドなどが関与する疾病の診断を行うことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２　、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドなどの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、当該技術分野で公知の、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などを用いることができる。
【００３５】
これらの測定・検出方法に関する一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江　寛編、続ラジオイムノアッセイ（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編、酵素免疫測定法（第３版；医学書院、昭和６２年発行）、「酵素学における方法」第７０巻「免疫化学的技術（パートＡ）」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、同書第７３巻「免疫化学的技術（パートＢ）」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、同書第７４巻「免疫化学的技術（パートＣ）」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、同書第８４巻「免疫化学的技術（パートＤ：選択された免疫アッセイ）」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ：　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書第９２巻「免疫化学的技術（パートＥ：モノクローナル抗体および一般的な免疫アッセイ法）」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書第１２１巻「免疫化学的技術（パートＩ：ハイブリドーマ技術およびモノクローナル抗体）」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００３６】
また本発明ＤＮＡを配列させて作製したＤＮＡチップは、本発明ＤＮＡの変異・多型性の検出、発現量のモニタリングにおいて有用である。ＤＮＡチップの一種であるＤＮＡアレイなどに関しては、「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（細胞工学別冊　ゲノムサイエンスシリーズ１、村松正明、那波宏之監修、２０００年３月１６日第１版第１刷発行）などを参照されたい。
さらに本発明ポリペプチドを配列させて作製したポリペプチドチップは、本発明ポリペプチドの発現、相互作用、翻訳後修飾などの機能解析や、タンパク質の同定、精製のための強力なツールとなり得る。
本発明ポリペプチドに対する抗体を配列させて作製した抗体チップは、疾患、障害、その他の生理的現象と本発明ポリペプチドとの相関を解析するために非常に有用である。
これらのチップの作製方法および材料は当業者には公知である。
【００３７】
更に、本発明ポリペプチドなどは、これらと特異的に相互作用する化合物をスクリーニングするための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明ポリペプチド、その部分ペプチドもしくはそれらの塩、又はそれらに対する抗体（以下、「本発明ポリペプチドなど」ともいう）を用いることを特徴とする、該物質またはそれらの塩と特異的に相互作用する化合物のスクリーニング方法、およびそのためのスクリーニング用キットを提供する。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて同定される化合物またはその塩は、本発明ポリペプチドなどと相互作用し、その生物学的活性を調節、阻害、促進、または拮抗などする化合物である。該化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドなどの活性に直接作用するものであってもよいし、本発明ポリペプチドなどの発現に作用することによって間接的に本発明ポリペプチドなどの活性に作用するものであってもよい。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容しうる塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。本発明ポリペプチドなどの生物学的活性を阻害する化合物も上記各種疾病に対する治療・予防剤などの医薬として使用できる可能性がある。
【００３８】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名に関する委員会による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００３９】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、上記の「分子生物学の最新プロトコール」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９８７））に記載されている方法に従った。
（１）ヒト成人全脳及びヒト胎児全脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
ＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌクレオチド（ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）１５）（インビトロジェン社製）をプライマーとして、ヒト成人全脳およびヒト胎児全脳由来ｍＲＮＡ（クロンテック社製）を鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳａｌＩ部位を有するアダプター（インビトロジェン社製）をｃＤＮＡとライゲーションした。その後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融解アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。
精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ＋プラスミドとライゲーションした。大腸菌　ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ　ＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社製）にエレクトロポレーション法によりこの組換えプラスミドを導入した。
【００４０】
（２）スクリーニング
ランダムに単離したクローンの末端塩基配列を決定し、得られた配列をクエリーとして相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ　２．２．１　（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｆ．、Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．　Ｍａｄｄｅｎ、Ａｌｅｊａｎｄｒｏ　Ａ．　Ｓｃｈａｆｆｅｒ、Ｊｉｎｇｈｕｉ　Ｚｈａｎｇ、Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ、Ｗｅｂｂ　Ｍｉｌｌｅｒ、およびＤａｖｉｄ　Ｊ．　Ｌｉｐｍａｎ　（１９９７）、「ギャップＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新規作成」（Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：　ａ　ｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ），　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９−３４０２）を用いて、ｎｒ（ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ配列（但しＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳまたはフェーズ０、１または２のＨＴＧＳ配列は含まず））データベースに対して相同検索を行った。その結果、相同遺伝子が存在しなかったもの、即ち、新規遺伝子であるものについて、その５’および３’の末端配列を、相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ２．２．１を用いて、ヒトのゲノム配列（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／）に対応させた。
【００４１】
次に、それらが挟むゲノム領域から、Ｇｅｎｓｃａｎプログラム（Ｂｕｒｇｅ，　Ｃ．　ａｎｄ　Ｋａｒｌｉｎ，　Ｓ．　１９９７，　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ，　Ｊ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２６８，　７８−９４　、ゲノムから遺伝子を予測するコンピューターソフト）を用いて、コードされる遺伝子を抜き出した。これをクエリーとして、相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ２．２．１を用いて、ｍｅｒｇｅｄｂ（かずさＤＮＡ研究所で決定したヒトのｃＤＮＡの配列とＧｅｎＢａｎｋのｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓデータベースからＥＳＴとゲノムを除いたものを重複なく混ぜ合わせた、かずさＤＮＡ研究所で独自に作成したＤＮＡ配列データベース）に対応させ、新規の長鎖（Ｇｅｎｓｃａｎ予想ｃｄｓが１２００　ｂｐ以上）遺伝子が確認された場合には、ｃＤＮＡの全長解析をおこなった。
配列決定には、ＰＥアプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７７）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
このようにして新規ＤＮＡまたは遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、配列表の配列番号１に示された新規ＤＮＡまたは遺伝子を有するクローン「ｆｊ０３２０４」が検出された。
【００４２】
（３）本発明ＤＮＡの相同性検索
次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、クローンのアミノ酸配列を既知配列ライブラリーｎｒ　に対して解析プログラムＢＬＡＳＴＰ　２．２．１　（「ギャップＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新規作成」、前掲）を用いて検索したところ表２に示した各相同遺伝子と相同性を示すことが明らかになった。尚、表１には、これら相同遺伝子に関する情報、即ち、その名称、データベースＩＤ、生物種およびその学名、タンパク質長、および記載文献を示す。
【００４３】
【表１】
2004135617.tif 000002
【００４４】
更に、各クローンに含まれる本発明ＤＮＡまたは遺伝子と表１に示した各相同遺伝子との相同性に関する各種データを表２にまとめた。これら表中の各項目の意味は以下の通りである。
「Ｓｃｏｒｅ」この値が高いほど信頼度が高い
「Ｅ−ｖａｌｕｅ」この値が０に近いほど信頼度が高い
「相同性」相同領域のアミノ酸残基の一致の割合
「相同範囲率」相同遺伝子中の相同領域の割合
【００４５】
【表２】
2004135617.tif 000003
【００４６】
（４）各種ドメインの検索
次に、クローンに含まれるＤＮＡがコードするアミノ酸配列中から、Ｐｆａｍ　７．６に含まれる検索ツールＰｆａｍ　ＨＭＭ　ｖｅｒ　２．１　Ｓｅａｒｃｈ　（ＨＭＭＰＦＡＭ）　（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ　ＥＬＬ、Ｅｄｄｙ　ＳＲ、Ｂｉｒｎｅｙ　Ｅ、Ｂａｔｅｍａｎ　Ａ、およびＤｕｒｂｉｎ　Ｒ　（１９９８）「Ｐｆａｍ：　マルチプル配列アライメントおよびタンパク質ドメインのＨＭＭ特性」（Ｐｆａｍ：　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　ＨＭＭ−ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｏｍａｉｎｓ），　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２６：３２０−３２２）を用いて機能ドメインを検索した。
更に、膜タンパク質予測プログラムであるＳＯＳＵＩ　ｓｙｓｔｅｍ　（ｖｅｒ．　１．０　／　１０，　Ｍａｒ．，　１９９６）　（Ｔａｋａｔｓｕｇｕ　Ｈｉｒｏｋａｗａ，　Ｓｅａｈ　Ｂｏｏｎ−ＣｈｉｅｎｇおよびＳｈｉｇｅｋｉ　Ｍｉｔａｋｕ、「ＳＯＳＵＩ：膜タンパク質に関する分類と２次構造予測システム」（ＳＯＳＵＩ：　Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　（以前のＣＡＢＩＯＳ）　１９９８　Ｍａｙ；１４（４）：３７８−３７９）を用いて膜貫通ドメインを検索した。
これらの検出された機能ドメインおよび膜貫通ドメインをそれぞれのクローンについて表３に示した。
これら表中の各項目の意味は以下の通りである。
「機能ドメイン」ＰｆａｍまたはＳＯＳＵＩにより検出されたドメイン
「起点　（Ｆｒｏｍ）」機能ドメインの起点となるアミノ酸位置
「終点　（Ｔｏ）」機能ドメインの終点となるアミノ酸位置
「Ｓｃｏｒｅ（Ｐｆａｍのみ）」この値が高いほど信頼度が高い
「Ｅｘｐ（Ｐｆａｍのみ）」この値が０に近いほど信頼度が高い
【００４７】
【表３】
2004135617.tif 000004
【００４８】
（５）発現部位
ＲＴ−ＰＣＲ　ＥＬＩＳＡを用いて、組織と脳の部位での発現を調べた結果を表４に示した　（Ｎａｇａｓｅ　Ｔ，　Ｉｓｈｉｋａｗａ　Ｋ，　Ｓｕｙａｍａ　Ｍ，　Ｋｉｋｕｎｏ　Ｒ，　Ｍｉｙａｊｉｍａ　Ｎ，　Ｔａｎａｋａ　Ａ，　Ｋｏｔａｎｉ　Ｈ，　Ｎｏｍｕｒａ　Ｎ，　Ｏｈａｒａ　Ｏ．　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｅｓ．　ＸＩ．　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　１００　ｎｅｗ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｂｒａｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｄｅ　ｆｏｒ　ｌａｒｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．　ＤＮＡ　Ｒｅｓ．　１９９８　Ｏｃｔ　３０；５（５）：２７７−８６．）。
発現量（単位（ｆｇ）　ｐｅｒ　ｎｇ　ｏｆ　ｐｏｌｙ（Ａ）＋　ＲＮＡ）が０．１未満を　＋　、０．１以上１００未満を　＋＋　、１００以上を　＋＋＋　で示した。
尚、各組織及び脳の部位の完全標記を表５に示した。
【００４９】
【表４】
2004135617.tif 000005
【００５０】
【表５】
2004135617.tif 000006
【００５１】
（６）染色体位置
クローンのＤＮＡ塩基配列に対応する既知配列ライブラリーＧｅｎｂａｎｋ　ｒｅｌｅａｓｅ１２２　及び　１２３　中のヒトゲノム配列に対して解析プログラムＢＬＡＳＴＮ　２．．２．１　（「ギャップＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新規作成」、前掲）を用いて検索した。又、クローンのＤＮＡ配列を、相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ　２．２．１を用いてヒトゲノムをコードするクローンのライブラリー（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／）に対応させた。その結果、本発明の遺伝子は２番目の染色体（２ｑ２１）に位置することが確認された。
【００５２】
（７）　インビトロでの転写翻訳
インビトロでの転写翻訳系（プロメガ社，ＴＮＴ　Ｔ７　Ｑｕｉｃｋ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｔｒａｎｓｃｉｏｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ１１０７）を用いて、ｃＤＮＡクローンｆｊ０３２０４からの遺伝子産物を発現させた。
３５Ｓ標識メチオニンを取り込ませた産物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ゲルを乾燥させ、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）のシステムでオートラジオグラフィーをおこない、クローンｆｊ０３２０４の遺伝子産物を検出した。
その結果、７７ｋＤａのサイズマーカーに対応する位置に、クローンｆｊ０３２０４の転写翻訳産物と思われるバンドを確認した。
ｆｊ０３２０４がコードするタンパク質は、最初のメチオニンから数えると６９８アミノ酸残基からなり、分子量は７７，３５０ｋＤａと予想され、実験結果はこれによく一致するものであった。
【００５３】
（８）　本発明遺伝子の機能
以上の、相同性、相同性遺伝子に関する情報、各種ドメイン、発現部位、及び染色体位置等に関するデータから以下のことが明らかとなった。
【００５４】
即ち、相同性検索及び機能ドメインの検索から、本発明のＤＮＡまたは遺伝子はＱｕｉｅｓｃｉｎ　Ｑ６　Ｇｅｎｅ　（ＱＳＣＮ　６）のファミリーと４０％程度の相同性を有し、そのＮ末端領域にチオレドキシン（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）ドメインを有していることが明らかとなった。更に、非特許文献１及び非特許文献２に開示されたＱｕｉｅｓｃｉｎ　Ｑ６　Ｇｅｎｅ　（ＱＳＣＮ　６）アミノ酸配列とのアライメントからも明らかなように、本発明のＤＮＡまたは遺伝子のＣ末端領域（配列番号１におけるアミノ酸４０５〜５３９番目）には酵母のＥＲＶ１を有していることが判明した。　これらのことから、本発明のＤＮＡまたは遺伝子は非特許文献１及び非特許文献２等に記載されたＱｕｉｅｓｃｉｎ　Ｑ６　Ｇｅｎｅ　（ＱＳＣＮ　６）のファミリーに属すると推測することが出来る。
【００５５】
非特許文献１及び非特許文献２に記載されているように、ＥＲＶ１遺伝子は酵母の酸化的リン酸化及び無性増殖に必須の遺伝子であり（Ｌｉｓｏｗｓｋｙ，　Ｔ．　（１９９２），Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２３２：５８−６４）、酵母ミトコンドリアゲノムの維持及び細胞分裂周期に重要な役割を担っていると考えられている（Ｌｉｓｏｗｓｋｙ，　Ｔ．　（１９９４），　Ｃｕｒｒ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２６：１５−２０）。
又、ＱＳＣＮ６　は活発に増殖している繊維芽細胞における発現は低く、静止期にある繊維芽細胞では高発現されている。ＱＳＣＮ６のｍＲＮＡは繊維芽細胞が増殖期から静止期に移行し始めるときに、強く発現が誘導され、一方で、形質転換された繊維芽細胞においては抑制されていることが知られている（Ｃｏｐｐｏｃｋ　Ｄ．　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９３）　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．，　４：４８３−４９３）。更に、このグループに属する幾つかの遺伝子は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分である。ＥＣＭは細胞において構造的な役割を果たしているだけではなく、例えば、腫瘍抑制及び増殖調節のような機能的な役割も担っている。
【００５６】
以上のことから、ＱＳＣＮ６　は細胞接着における役割を担っている可能性がある。更に、正常細胞が可逆的静止期に入る過程において機能している可能性があり、この遺伝子の活性が阻害されることが癌化において或る役割を担っていることも考えられる。又、　ＱＳＣＮ６　は細胞増殖の制御及び酸化還元状態に関わる役割を有するものと考えられる。
従って、当業者であれば、本発明のＤＮＡまたは遺伝子が加齢に伴う疾患又は癌に深く関わる機能を有するものと推測することができる。
【００５７】
又、配列番号１に示されたクローンｆｊ０３２０４の塩基配列から明らかなように、翻訳開始コドン周辺の塩基配列（ＡＡＣＡＴＧＧ）が、Ｋｏｚａｋの共通配列（ＡＣＣＡＴＧＧ）に良く一致している。更に、非特許文献２に記載されているように、ＱＳＣＮ６は酵母ミトコンドリアのマトリックスに存在する蛋白質であるが、機能ドメインの検索から、クローンｆｊ０３２０４のＮ末端にも分泌に必要なシグナル配列（Ｓｏｓｕｉ　プログラム検出領域）が確認された。
以上の事実から、クローンｆｊ０３２０４は完全長の遺伝子をコードしているものと考えられる。
【００５８】
【発明の効果】
細胞或いは組織の成長は、増殖期にある細胞の分画、静止期にある細胞の分画、及び細胞死の割合によって決定される動的プロセスである。細胞の増殖期から静止期への移行の調整は、成長の調整全体において重大なステップであり、適切な静止期への移行の阻害が癌や他の増殖性疾患の特徴である。
従って、本発明により加齢に伴う疾患又は癌の診断及び治療に大きな進歩が期待される。
【００５９】
更に、本発明のＤＮＡもしくは遺伝子またはそれらの一部の塩基配列に基づき作成した合成ＤＮＡプライマーを使用し、ヒトの血液または組織から抽出した染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、その産物の塩基配列を決定することにより、本発明のＤＮＡまたは遺伝子中にある個体によって異なる一塩基の変異、即ちＳＮＰを見出すことができる。これにより、個体の体質などが予測され、各個体に適した医薬の開発などが可能となる。
また、クロスハイブリダイゼーションにより、マウスなどのモデル生物における本発明のＤＮＡまたは遺伝子に対するオルソログ（ホモログ、カウンターパート）遺伝子を単離し、例えば、これら遺伝子をノックアウトすることによってヒトの疾患モデル動物を作成し、ヒトの病因となる遺伝子を探索・同定することもできる。
【００６０】
本発明で得られた新規なＤＮＡまたは遺伝子を所謂ＤＮＡチップなどに集積させ、このチップに、例えば、癌患者などの患者と対照としての正常人由来の血液または組織などから作製したプローブをハイブリダイゼーションさせることによって、これらの疾患の診断、治療などに役立てることができる。
また本発明ポリペプチドに対する抗体を網羅的に作製して配列させた抗体チップは、患者と正常人のタンパク質発現量の差異を検出するなどのプロテオーム解析から、病気の診断、治療などに役立てることができる。
更に、本発明のＤＮＡ又は遺伝子構築物はワクチンの活性成分として利用することができる。
【００６１】
【配列表】
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