(57)【要約】【課題】内皮化が早期に行われるよう改善された生体由来組織片からなる移植医療用材料を提供すること。【解決手段】コラーゲン結合性を持つよう人工的に設計された成長因子融合蛋白と、コラーゲンを成分として含む生体由来組織片とからなり、該生体由来組織片のコラーゲンに前記成長因子融合蛋白が結合されてなる移植医療用材料。好ましくは、前記成長因子融合蛋白が、ファイブロネクチンのコラーゲン結合性ドメイン配列から選ばれるアミノ酸配列と、ＨＧＦあるいはＶＥＧＦのいずれかから選ばれる血管新生因子とが連結された融合蛋白である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン結合性を持つよう人工的に設計された成長因子融合蛋白と、コラーゲンを成分として含む生体由来組織片とからなり、該生体由来組織片のコラーゲンに前記成長因子融合蛋白が結合されてなる移植医療用材料。
【請求項２】
前記成長因子融合蛋白が、ファイブロネクチンのコラーゲン結合性ドメイン配列から選ばれるアミノ酸配列と、ＨＧＦあるいはＶＥＧＦのいずれかから選ばれる血管新生因子とが連結された融合蛋白であることを特徴とする前記１の移植医療用材料。
【請求項３】
前記成長因子融合蛋白質が配列表配列番号２で表される配列からなる蛋白である前記１または２の移植医療用材料。
【請求項４】
前記生体由来組織片が、脱細胞化された心臓弁あるいは血管を含む組織片のいずれかである前記１〜３のいずれかの移植医療用材料。
【請求項５】
コラーゲン結合性を持つよう人工的に設計された成長因子融合蛋白を生理的塩類溶液に溶解し、その溶液に生体由来組織片を浸漬する移植医療用材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、生体に移植した際に、早期に自己組織化の誘導が可能な移植用材料、とくに心臓弁と血管のための移植医療用材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
心臓、血管系組織の病変・損傷や先天的な機能異常に対しては、有効確実な治療法が求められており、一つの手段として損傷・欠陥組織の置換移植手術がある。たとえば心臓弁膜症に対する治療法として、人工弁による置換術が行われている。しかし確立された外科手術とはいえ、機械弁の場合には、長期にわたって抗凝固療法が必要なため、新たな人工弁または生体材料の開発が望まれている。
機械弁に代わるものとして、ヒトやブタなどから採取された生体弁も考えられているが、他家移植、異種移植となるため、免疫拒絶の問題は重要な解決課題である。特に生細胞が残存している生体弁の場合には、移植片が生着出来ないか長期の維持が困難である。また感染性の問題も残されている。さらに、ヒト由来の弁の場合は当然ながら死体からの採取となるため、供給の問題が指摘される。
これらの問題を解決するために例えば、動物から採取した心臓弁や血管を脱細胞化し細胞間物質（細胞外マトリックス，ＥＣＭ）だけを残し、細胞の足場として利用し細胞成分は患者本人の細胞で置換する（自己組織化）という方法が考えられている。脱細胞化とは、移植される個体に取って抗原性をもつ細胞成分（蛋白質、核酸、複合糖質、リン脂質、リン脂質複合体など）を除去することを意味し、これによって免疫拒絶を回避する考え方である。生体免疫反応因子を取り除き、かつ構造組織の生化学的および生体工学的特性を維持するような処理方法として、蛋白分解酵素、変性剤、溶剤、界面活性剤、核酸分解酵素など、およびそれらを用いる上での処理時間、温度、圧力、ｐＨ、イオン強度などの条件が検討されている。脱細胞化によって残される血管や心臓弁のＥＣＭの主成分はコラーゲンとエラスチンである。コラーゲンは動物種間で殆ど差異がなく免疫原性の非常に低い蛋白質であるため、免疫拒絶の問題はほとんど無いと考えられる。
【０００３】
脱細胞化の処理によっては、グルタールアルデヒドによる架橋が施すこともあるが、この処理は逆に移植片が生体内で石灰化を引き起こすとされている。従って、石灰化を引き起こさずかつ理想的には、細胞成分を全く含まないＥＣＭだけであることが望ましい。
Ｖｅｓｅｌｅｙら（Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ６０，  Ｓ５３９−６４（１９９５））は石灰化を引き起こさない脱細胞化処理の方法を開示しているが、それによると、蛋白分解酵素阻害剤の存在下に高塩濃度で長期間洗浄し、蛋白を８Ｍの尿素で溶出させ、界面活性剤で処理し、さらに核酸分解酵素で処理することで、脱細胞化組織が得られるという。このように処理しても、石灰化は抑制されるが、抗原性は残存したと述べている。ただし移植拒絶につながる反応であるかどうかは明らかにしていない。Ｍａｌｏｎｅら（Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １，  １８１  （１９８４））およびＬａｌｋａら（Ａｎｎ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ３：１０８  （１９８９））も同種間で、脱細胞化した動脈組織片の移植を行った所、免疫応答を刺激したと報告している。しかし、その一方で血管内皮細胞の生着、増殖も認められたとも述べている。脱細胞化した組織片には、非特異的な異物反応を引き起こす残存物がまだある可能性も考えられるが、移植の上では問題にならない程度であるとも考えられる。たとえばＯ’Ｂｒｉｅｎら（Ｓｅｍｉｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．  １１  （４，  Ｓｕｐｐｌ．１，  １９４−２００  （１９９９））は脱細胞化したブタ弁組織を、ヒツジに移植したところ、超急性拒絶反応を示さなかったと報告している。
【０００４】
これらの研究をもとに、組織工学的生体弁（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｖａｌｖｅ）として、たとえば、脱細胞化したブタの弁（ＳｙｎｅｒＧｒａｆｔ、クライオライフ社）が開発され、既に臨床治験を行っていると報告されている。同様な方向での検討はこのほかにも学会発表などで報告されている（たとえば、ＷｏｌｆｇａｎｇらやＤｏｈｍｅｎら、Ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｂｉｅｎｎｉａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  Ｌｏｎｄｏｎ  （２００１））。
心臓弁は血管と同様その表面は血管内皮細胞で覆われている。内皮は、血管組織全体の恒常性を保つ上で重要である。たとえば、内皮が損傷剥離した場合、過剰な修復反応によって血管内膜の肥厚がおこり、細い血管では狭窄や閉塞につながる。また外部からの障壁としての機能ももっており、血栓形成や、血液の漏洩や、不適切な細胞の付着・移入や有害物質、病原体の侵入などを防いでいる。これに対して生体由来の脱細胞化弁においては、ＥＣＭの繊維構造が露出しており、炎症性反応、血液成分の付着、血栓の形成などのおそれがあり、その表面が自己組織（内皮組織）で被覆される必要がある。また機能的な組織として再生するためには、さらに移植片内部へ周囲の繊維芽細胞、平滑筋細胞などの移入による再組織化が行われなければならない。自己組織化が不完全な移植片はやがて石灰化や組織の崩壊あるいは肥厚が起き、長期の使用に耐えないため、再度の置換手術が必要となる。
従って心臓弁や血管の移植においても、早期の自己組織化、特に内皮による被覆化は、移植片の確実な生着と早期の機能回復、機能持続の上で重要である。しかしながら、これまでのところ脱細胞化した弁が移植後に自己組織化されるには長い時間を要することが知られている。Ｗｉｌｓｏｎらによれば（１９９５）、内部への細胞移入は１ヶ月程度で完了するが、内皮化は不完全であると報告している。Ｏ’Ｂｒｉｅｎらも自己組織化がおこることを報告しているが（Ｏ’Ｂｒｅｉｎら、Ｓｅｍｉｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．  １１  （４  Ｓｕｐｐｌ．１），  １９４  （１９９９）；  Ｅｌｋｉｎｓら  ｉｂｉｄ  １３  （４  Ｓｕｐｐｌ  １），  ８７  （２００１））、移植後１５０日を経過した組織片において細胞はほとんどが平滑筋細胞および繊維芽細胞であり、内皮化に乏しいことを認めている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ７０，１９６２  （２０００））。
内皮化させる方法として、生体外で、人工あるいは生体由来の移植用血管の表面に内皮細胞を播種することが考えられている。このような試みは、血管についてばかりでなく、弁組織においても試みられている（Ｅｂｅｒｌら、Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ５３，  ４８７  （１９９２））。たとえば生体より切り出した弁組織の表面の内皮細胞を剥離・除去後、まず繊維芽細胞を播種し細胞層を形成させ、さらに内皮細胞を播種する。このようにして内皮化した弁組織が得られるが、その培養には約１ヶ月を要する。播種するための細胞は患者の自己細胞であることが望ましいが、細胞の採取と、弁組織の移植という２重の侵襲手術が必要である。
生体由来の弁とは別のアプローチとして、人工物で移植用弁を製造する試みも報告されている。生体親和性が高いとされているポリ乳酸やポリグリコール酸あるいはそれらの共重合体を弁葉の形状に成形することは比較的簡単である。生体由来材料のような抗原性を有する異物残存の問題も解消される。人工物であるため形状が自由に作れ、一定の品質のものが製造できる利点がある。さらにこれらの材料は生分解性であるため、やがて自己組織に置換されていくことが期待されている。ただしこのような人工弁も、組織への親和性を持たせるため、内皮細胞などをその上に播種して疑似組織化した上で移植する必要がある（Ｓｈｉｎｎｏｋａら、Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ６０；  Ｓ５１３−６  （１９９５））。この場合にも１ヶ月程度の培養期間を要し、また２重の侵襲手術が必要であるという点は上記の生体弁に細胞を播種する例と同様である。
【０００５】
【発明が解決しようとしている課題】
上述のごとく、脱細胞化された生体由来組織片について、新たな生体適合性の医療用材料の可能性が示されているが、長期に機能維持するうえで必要な自己組織化に時間を要するという問題点があった。特に移植材料の表面を早期に内皮化させることが重要であるが、これまで内皮化を積極的に誘導する機能を生体由来の移植材料に付与する方法として開示されたものはない。
移植された脱細胞化血管や弁の内皮化が不十分である原因として、隣接する血管内皮層が移植部位へ進展するのに長期の時間を要すること考えられる。つまり既存の血管内皮細胞の増殖活性が低いことが予想される。内皮細胞を増殖刺激する因子（血管新生因子）を移植と同時にあるいは前後に投与することにより、このような内皮細胞の増殖を活性化して、内皮形成を促進する方法を想像することは出来るが、一般的にこのような蛋白性因子は活性持続性がわるく、また拡散性であるため、目的とする効果（早期の内皮化）を得るにはさらなる工夫が必要である。
内皮の再形成については、既存の血管からの進展の他に、血流中を循環している血管系の細胞によって内皮層の再形成が起こる可能性が指摘されている。末梢血流中には血管内皮細胞の前駆細胞（Ａｓａｈａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７５，９６４  （１９９７））が循環しており、このような細胞が移植片に付着、さらに増殖して内皮構造を再形成（内皮化）する可能性も考えられる。前駆細胞あるいは内皮細胞が移植部位に付着後、直ちに増殖刺激を受けられるよう移植用材料上に刺激因子を配置することも有効であろうと考えられるが、因子を化学的に移植片に固定化する方法では因子の活性が損なわれる。
従って本発明の課題は、内皮細胞あるいはその前駆細胞の増殖を刺激する活性をもつ血管新生因子を安定な状態で移植用材料に固定化する方法を考案し、自己組織化を誘導する機能を有する移植用材料、特に心臓弁および血管用の移植材料を作製する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上に述べた様に、早期の自己組織化を誘導する能力をもつ移植用材料が求められている。この問題点を鋭意検討した結果、遺伝子工学的にコラーゲン結合性を付与した血管新生因子を、脱細胞化された生体由来組織片に固定化する方法を考案するに至り、血管新生因子と組み合わせてなる新たな移植医療用材料を提供することが可能となった。すなわち本発明の課題は以下によって解決される。
【０００７】
１）コラーゲン結合性を持つよう人工的に設計された成長因子融合蛋白と、コラーゲンを成分として含む生体由来組織片とからなり、該生体由来組織片のコラーゲンに前記成長因子融合蛋白が結合されてなる移植医療用材料。
２）前記成長因子融合蛋白が、ファイブロネクチンのコラーゲン結合性ドメイン配列から選ばれるアミノ酸配列と、ＨＧＦあるいはＶＥＧＦのいずれかから選ばれる血管新生因子とが連結された融合蛋白であることを特徴とする前記１の移植医療用材料。
３）前記成長因子融合蛋白質が配列表配列番号２で表される配列からなる蛋白である前記１または２の移植医療用材料。
４）前記生体由来組織片が、脱細胞化された心臓弁あるいは血管を含む組織片のいずれかである前記１〜３のいずれかの移植医療用材料。
５）コラーゲン結合性を持つよう人工的に設計された成長因子融合蛋白を生理的塩類溶液に溶解し、その溶液に生体由来組織片を浸漬する移植医療用材料の製造方法。
６）溶解された前記成長因子融合蛋白の溶液濃度は１〜１００μｇ／ｍｌである前記５の移植医療用材料の製造方法。
７）浸漬は４℃から３７℃で３０分以上２４時間以内の浸漬を行う前記５または６の移植医療用材料の製造方法。
８）浸漬を大気圧以上の加圧下で行う前記５〜７のいずれかの移植医療用材料の製造方法。
９）前記１〜４のいずれかの移植医療用材料上に細胞が培養されてなる細胞組込型移植用材料。
【０００８】
【発明の実施形態】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明を実施する上でもっとも望ましい形態は、内皮細胞の増殖を刺激する活性をもつ成長因子（血管新生因子）が活性を持つ状態で固定化された移植用材料である。この移植用材料には、生体弁を脱細胞化したものを用いることができる。脱細胞化された組織片は主に繊維性成分からなる細胞間物質（ＥＣＭ）であるが、主成分としてはコラーゲン、エラスチンなどである。特にコラーゲンは組織再生の過程での細胞の足場として機能するものである。このような脱細胞化された組織が移植用心臓弁として利用可能であることが近年報告されているが、それ自体に内皮細胞が生着して内皮化するには移植後一ヶ月以上を要する。本発明では、このような脱細胞化した組織片にさらにコラーゲン結合性を持つよう遺伝子工学的に改良された血管新生因子を固定化することで自己組織化を誘導する移植用材料の作製が可能となる。なお本発明で言うコラーゲン結合性とは、コラーゲンの様々な状態、すなわちプロトコラーゲン、プロコラーゲン、成熟型の３本鎖コラーゲン、変性コラーゲン（ゼラチン）のいずれかあるいはそのすべてに対する結合性を意味する。コラーゲン結合性血管新生因子は、脱細胞化後の組織片のコラーゲンと強固に結合するため、組織片上に安定に固定化・維持され、血管新生因子としての活性も長期間持続することになる。このように作製される移植用材料は、内皮細胞を持続的に増殖刺激するため、内皮化が早期に進行し、移植部位の組織との一体化（自己組織化）が図られる。
従来多くの蛋白性の因子類が血管新生活性をもつと報告されているが、そのなかでも肝増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）などがよく知られている。この中でも本発明においては、ＨＧＦが望ましい。ＨＧＦはもともとその名のとおり肝細胞の増殖因子として発見されたものであるが（Ｎａｋａｍｕｒａら、  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，  ４４０  （１９８９）；  Ｍｉｙａｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １６３，  ９６７  （１９８９））、血管内皮細胞に対する増殖活性が強いことが知られるようになってきた（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１９，  ６２９  （１９９２）；  Ｇｒａｎｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０，  １９３７  （１９９３）；  特開平６−９６９１号）。その活性は、ＶＥＧＦ（Ｌｅｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６，  １３０６（１９８９））よりも強いとされ、血管組織においては内皮細胞に特異的で、平滑筋細胞への増殖活性が無いことがＶＥＧＦとは際だった差異である  （Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２８，  ４０９  （１９９０））。平滑筋細胞の過増殖は血管壁の肥厚につながるため望ましくない。ただし、用途により平滑筋細胞も内皮細胞も同様に増殖させる必要がある場合にはＶＥＧＦのある程度の利用も望ましいであろう。
【０００９】
本発明で組織片に結合させるコラーゲン結合性血管新生因子、とくに、コラーゲン結合性ＨＧＦは以下のような構造を持つものである。すなわちファイブロネクチン（ＦＮ）のコラーゲン結合性ドメイン（ＣＢＤ）より選択された配列と血管新生因子ＨＧＦの成熟蛋白質配列を遺伝子工学的に連結して作られる融合蛋白質である。ウシＦＮのＣＢＤ（ＦＮＣＢＤ）配列について、Ｓｋｏｒｓｔｅｎｇａａｒｄら（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １４０，  ２３５  （１９８４）  ）が報告している。ただし単純にその配列を他の配列と融合させて組み換え蛋白を製造しても目的の立体構造が保たれる確証は無い。この点を考慮にいれ、本発明ではヒトＦＮＣＢＤの配列として機能的な融合蛋白を作れる可能性のある配列を選択したうえで設計された血管新生因子との融合蛋白を用いている。すなわちＦＮの成熟蛋白配列のアミノ末端から２６０番目のアミノ酸から５９９番目のアミノ酸配列（Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １２９，  ６２７  （２００１）；特開２００１−１９０２８０号）、あるいは、２６０番目から４８４番目までのアミノ酸配列（ＷＯ０２／１４５０５）を選択しこれをコードする遺伝子配列と、ＨＧＦ成熟蛋白配列をコードする遺伝子配列を連結した。この融合遺伝子配列を適切な発現ベクターに組み込んで、融合蛋白質、コラーゲン結合性ＨＧＦを生産することができる。この融合蛋白の模式的な構造を図１に示す。
融合蛋白を生産するための宿主としては真核細胞が望ましい。特に昆虫細胞を宿主とするバキュロウィルス発現系が適切である。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）などの動物細胞や酵母を宿主とする発現系での生産も可能であろう。融合蛋白は適切なシグナル配列を付加しておくことにより宿主細胞の培養液中に分泌される。分泌された蛋白は、ヘパリンカラムによって精製することが可能である。
無血清培地で培養することが精製上は望ましい。血清非存在下で培養された宿主細胞から分泌される融合蛋白質は１本鎖構造である。天然型ＨＧＦと同様にα鎖β鎖に切断されたヘテロダイマーとするためには、融合蛋白を２％程度に希釈した血清中に短時間おけば良い。
【００１０】
これまでに、コラーゲンがＨＧＦに結合性をもつことは報告されているが、その結合性は実質的なものではないと考えられる。例えば生理的塩濃度では一旦結合したＨＧＦもその半分程度が解離する。また低濃度の状態（たとえば４０ｎｇ／ｍｌ）でその結合性が飽和するため、実質的にコラーゲンに結合する量はごく微量である（Ｓｃｈｕｐｐａｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１４，１３９−１５２  （１９９８））。これに対して本発明のコラーゲン結合性ＨＧＦは生理的塩濃度で強固な結合性を示すばかりでなく、天然型ＨＧＦに比べ遙かに高い濃度においてもその結合が飽和しない。このような特性は例えば、コラーゲンコートしたウェルにＨＧＦあるいは、コラーゲン結合性ＨＧＦを添加してその結合量をＨＧＦ抗体で測定する（ＥＬＩＳＡ方式）ことで明らかにできる。この測定法では、ＨＧＦそのものの結合性は検出できないのに対し、コラーゲン結合性ＨＧＦは添加濃度依存的に結合量が増加し、既に報告されているＨＧＦの結合が飽和する濃度の２０倍以上の濃度（１μｇ／ｍｌ）で添加してもなお結合量の飽和は認められなかった。また融合型ＨＧＦの結合安定性は、結合させる際あるいはその後の洗浄液の塩濃度を生理的条件よりも高くした場合に結合を維持しているかで検討することもできる。
【００１１】
コラーゲン結合性ＨＧＦはコラーゲン結合後においても、内皮細胞増殖活性を示すものである。このことは、例えばコラーゲンコートした培養ウェルに添加し、生理的塩濃度の液で洗浄後内皮細胞を播種して見ることができる。適当な期間培養した後、ＭＴＴ法、ＸＴＴ法、ＷＳＴ１法（Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  １，  ２６７−７１（１９９５））など、細胞が持つミトコンドリア酵素の活性が細胞数に対応することを応用した方法で増殖活性を測ることができる。この測定法で、天然型ＨＧＦがほとんど増殖活性を示さないのに対し（洗浄によって消失してしまうため）、コラーゲン結合性ＨＧＦは添加量に依存した増殖活性を示すことを確認できる。すなわち本発明に用いられるコラーゲン結合性ＨＧＦはコラーゲン結合性と内皮増殖活性を併せ持った蛋白質である。
生体由来脱細胞化組織片に固定化させるうえで、上記のように血管新生因子をコラーゲン結合性に改良したものが適切である。一般的に血管新生因子などの生理活性蛋白質は、生体内では半減期が短く（安定性が悪く）長期間効果が持続しない。また、拡散性であることが多く効果を得るためには多量の投与が必要となる。この２つの問題は、血管新生因子に強固なコラーゲン結合性が付与されていることによって解決される。コラーゲンへの結合性は安定であるため、活性も持続し、多量に投与する必要もなく、また拡散して他の部位で細胞増殖刺激を示すような副作用も起こさない。
【００１２】
本発明の、自己組織化誘導能をもつ移植医療用材料は以下の様に作成することができる。まずブタなど異種動物から採取した心臓弁あるいは血管組織片を脱細胞化する。脱細胞化の方法は、種々報告されているのでそれらに倣っておこなうことができる。例えば生理的塩類溶液でよく洗浄した後、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＮＰ４０などの界面活性剤で長時間処理する。脱細胞化された組織片をさらよく洗浄した後、前記のコラーゲン結合性ＨＧＦの溶液に浸す。溶液としてはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）や細胞培養用の基礎培地など生理的塩濃度のものが望ましく、含まれるコラーゲン結合性ＨＧＦの濃度としては１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度が適切である。組織片全体が浸かる程度の液量に４℃から３７℃の間の温度にて、３０分以上２４時間程度までの時間で、上記融合蛋白を結合させる。この結合処理は必要に応じ、加圧下（たとえば５００ＫＰａ）で行うことが出来る。これにより、効率的に組織内部にまで融合蛋白を結合させることができる。
結合量については、結合操作の前後での濃度変化で計算することができる。あるいは放射性標識した上記因子を結合させた後、脱細胞化組織片のもつ放射能を測定することも可能であろう。直接結合したＨＧＦ融合蛋白を組織片より抽出してその量を測定することも可能である。
【００１３】
融合蛋白質の結合操作後、移植用組織片は生理的塩溶液で繰り返し洗浄してから、目的とする移植部位（弁、血管）に置換移植することができる。移植片の自己組織化は移植後の適切な時間経過の後に移植部位を摘出し組織切片を作成して観察するなどの方法で確認することが可能である。内皮層の確認は、組織切片を血管内皮細胞の指標である蛋白に対する抗体で染色することにより行うことができる。たとえばＶｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、ＣＤ３１、ＶＥＧＦ受容体、ｔｉｅ−１、ｔｉｅ−２などに対する抗体である。
上記の方法でブタ心臓弁をもとに作成された移植片を、イヌ肺動脈弁と置換する手術を行ったところ、図２に示すように、本発明の心臓弁の場合は約１週間で内皮化が完了したことが組織像および免疫染色により確認された。これに対して融合蛋白が結合されていない脱細胞化弁の場合１ヶ月においてようやく内皮化が認められた。
以上のように早期の自己組織化が可能なのは、因子が移植用材料上に固定化されており、かつ活性を長期に維持しているため、隣接する内皮細胞の増殖を刺激して移植片上に内皮層の進展を促進したこと、また血流に循環している血管内皮前駆細胞が移植片に付着した際に、その部位に固定化されている血管新生因子が直ちに刺激効果を発揮したことによっているものと考えられる。
以上の様に、置換移植用の組織片として、脱細胞化組織にコラーゲン結合性血管新生因子を固定化した移植用材料の有用性が認められるが、このように作製された材料にさらに生体外で内皮化操作を行ってから移植することも考えられる。生体外でもコラーゲン結合性ＨＧＦなどが固定化されていることにより、播種した内皮細胞、あるいはその前駆細胞の増殖が持続的に刺激され、培養化で早期に内皮層が形成されると考えられる。このように既に内皮層を持つ移植用材料は、移植後さらに早期の自己組織化につながることが予想される。
【００１４】
【実施例】
（実施例１）  コラーゲン結合性ＨＧＦの製造
コラーゲン結合性ＨＧＦは組み換え蛋白として以下のように製造される。まずＦＮのコラーゲン結合性ドメイン配列の中から、アミノ酸番号２６０から４８４までをコードする遺伝子配列含むＤＮＡ配列をＰＣＲ法により取得した。この配列には上記の２６０−４８４のコード配列とそれをベクターに連結するための配列がＰＣＲの過程で付加されている。またＨＧＦ遺伝子配列は、卵巣腫瘍細胞株から精製した血管新生活性をもつ蛋白をコードする遺伝子配列として以前に取得されたもの（特開平６−９６９１号参照）を用いた。この配列から、ＨＧＦ成熟蛋白としてのＤＮＡ配列部分をＰＣＲにより取得して、上記のＦＮコラーゲン結合ドメイン配列とを連結して融合遺伝子を作製した。その配列は配列表配列番号１に示されている。
【００１５】
配列表配列番号１の
塩基番号１から６２はメリチンシグナル配列をコードする塩基配列（ｐＡｃＹＭ１−Ｍｅｌに由来）。
塩基番号６３から６８は、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列
塩基番号６９は、フレーム合わせのために挿入された塩基
塩基番号７０から７４４はファイブロネクチンのアミノ酸番号２６０から４８４をコードする配列
塩基番号７４８から７６２はエンテロキナーゼの認識配列をコードする配列
塩基番号は７６３から２８５６は、ＨＧＦの成熟ポリペプチドをコードする配列
塩基番号２８５４から２９５６は終止コドン。
【００１６】
融合遺伝子配列は、ベクターｐＡｃＹＭ１−Ｍｅｌ（Ｔｏｍｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３１２，  ８４７−８５３  （１９９５））のメリチンシグナルペプチドをコードする配列の直後に挿入され、トランスファー・ベクターｐＡｃＨＨ７を得た。このベクターＤＮＡと野生型バキュロウィルスＤＮＡとを同時に昆虫細胞にトランスフェクションし、昆虫細胞内で相同組み換えによって融合遺伝子を有する組み換えウイルスがえられる。単一の組み換えウイルスクローン（ＡｃＨＨ７）を選別し、多量に増幅させ、昆虫細胞Ｓｆ９に感染させた。
コラーゲン結合性ＨＧＦ（ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ）は、Ｓｆ９細胞から培養液中に分泌される際にシグナルペプチドが除去される。感染後３日間培養の後、その培養液上清を回収し、ｈｅｐａｒｉｎカラムによって、融合蛋白（ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ）を精製した。精製標品は５０μｇ／ｍｌに濃度を調整し凍結保存した。
ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦのアミノ酸配列は配列表配列番号２に示されている。このアミノ酸配列は配列番号１のＤＮＡ配列の塩基番号６４から２８５３に対応している。
【００１７】
配列表配列番号２の
アミノ酸番号１から２は、ベクター作製の際のＤＮＡ連結部に生じた配列でコードされるアミノ酸
アミノ酸番号３から２２７はファイブロネクチンのアミノ酸番号２６０から４８４
アミノ酸番号２２８から２２９はフィブロネクチン配列とＨＧＦ配列の連結部に生じたＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸
アミノ酸番号２２９から２３３は  エンテロキナーゼ認識配列
アミノ酸番号２３３から９３０は  ＨＧＦ成熟ポリペプチドのアミノ酸配列
【００１８】
（実施例２）  ＨＧＦ固定化移植用材料の作製
１．脱細胞化弁組織あるいは血管は以下のように処理し、脱細胞化組織片とした。
１）脱細胞化弁の作製
ブタ大動脈根部（大動脈弁を含む）を摘出し、円筒容器にいれ、生理食塩水で２４時間回転させながら洗浄した。次に、界面活性剤溶液（ＳＤＳ）に代えて４８時間以上処理した。さらにＮＰ−４０溶液で４８時間以上処理して脱細胞化弁を得た。脱細胞化弁は生理食塩水で４８時間以上洗浄し、保存液に入れ、室温保存した。
２）脱細胞化小口径血管
ブタ末梢動脈を上記１の弁組織と同様の操作によって脱細胞処理を行い、保存した。
２．コラーゲン結合性ＨＧＦの固定化。
実施例１で精製された蛋白質標品（ＨＧＦ量５０μｇ／ｍｌ）１００μｌを融解し、牛胎児血清（ＦＢＳ）を２μｌ加え，３７℃で１５分間加温し、ヘテロダイマー化した。次に処理された溶液をＰＢＳ  で５０ｍｌに希釈した。この希釈溶液に上記１の脱細胞化組織片を浸し、弁の場合は組織の深部まで浸透させるため，５００ＫＰａで２時間加圧した。血管の場合は室温でｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ攪拌浸漬した。ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦが結合された脱細胞化組織片はさらに、ＰＢＳ、５００ｍｌで洗浄を３回行った。
以上の操作によって、融合蛋白は、ＨＧＦ量として少なくとも１ｇ弁組織片重量当たり２０μｇの割合で結合されていた。
【００１９】
（実施例３）  ＨＧＦ固定化脱細胞組織片の移植評価実験
１．上記実施例２により作製された、ＨＧＦ固定化脱細胞弁３個を用意した（Ｆ群：ｎ＝３）。対照群として、脱細胞化されだけの５個の弁も用意しＣ群とした（ｎ＝５）。これらを、繰り返しＰＢＳで洗浄したのち、ビーグル犬の肺動脈に移植した。すなわち、Ｆ群、Ｃ群それぞれの弁の１／３周（弁尖部を含む）（径１５×２０ｍｍ）をビーグル犬（８ｋｇ）左開胸で肺動脈主幹部に部分遮断下にパッチ縫着した。
２．移植用血管（小口径）の脱細胞化組織も上記実施例２と同様の方法で作製し、ビーグル犬の大腿動脈および総頚動脈に端々吻合で間置した。
３．移植された実験動物を経時的（１週，１ヶ月，２ヶ月）に犠牲死させ，移植部位の組織学的評価（ＨＥ染色，ｖＷＦ免疫染色，α−ＳＭ  ａｃｔｉｎ免疫染色等）を行った。
移植後、組織学的評価を行ったところ、Ｆ群では、１週後で単層均一の内皮細胞層を認めることが出来た（図２）。一方、Ｃ群は再細胞化が不十分であり，１ヵ月後で内皮化を認めた。
この結果から、異種脱細胞化組織片をコラーゲン結合性ＨＧＦと複合化した本発明の移植医療用材料は、生体内での早期再組織化が可能な新規材料であることが示された
【００２０】
【発明の効果】
本発明の移植用材料は、組織再生の足場材料としての機能と、内皮細胞の持続的な増殖刺激効果を併せ持つため、生体内に埋め込まれた後、それ自体が早期に内皮化される効果を示す。従って早期に自己血管組織との一体化が可能であり、移植片の確実な生着が図られ、かつ長期間その機能が維持されるという効果を持つ。このような効果は心臓弁、血管など長期の機能持続が必要な組織の置換移植において特に重要であり、これらの組織の修復・治癒に有効である。
本発明で開示される、異種動物由来の脱細胞化心臓弁および脱細胞化血管に血管新生因子を固定化する方法は、早期の自己組織化が可能で高い治療効果が期待できる移植医療用材料の製造法として、産業上有用である。さらにこのような材料は、心・血管の再生医療技術の開発に貢献出来るものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】コラーゲン結合性ＨＧＦの模式的な構造を示す図である（実施例１）。
【図２】コラーゲン結合性ＨＧＦを固定化した脱細胞化心臓弁の移植後早期内皮化を示す図である。１週間後の因子固定化移植片の組織切片像で、図左はヘマトキシリン＆エオシン染色で、図右は抗ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体染色である、
【配列表フリーテキスト】
配列番号１
人工配列の説明：コラーゲン結合性ＨＧＦ（ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ）を発現させるためのＤＮＡ配列。
配列番号２
人工配列の説明：コラーゲン結合性ＨＧＦ（ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ）のアミノ酸配列。細胞外に分泌された際の蛋白質としての配列
【配列表】
2004267482.tif 000002
2004267482.tif 000003
2004267482.tif 000004
2004267482.tif 000005
2004267482.tif 000006
2004267482.tif 000007
2004267482.tif 000008
2004267482.tif 000009
2004267482.tif 000010
2004267482.tif 000011
2004267482.tif 000012
2004267482.tif 000013
2004267482.tif 000014
2004267482.tif 000015
2004267482.tif 000016
2004267482.tif 000017
【図１】
2004267482.tif 000018
【図２】
2004267482.tif 000019