(57)【要約】【課題】標的配列を検出するためのターゲットの製造方法、これにより製造されたターゲット、これを用いた標的配列検出方法および標的配列検出用アッセイキットを提供する。【解決手段】３’端付近に標的配列を含む標的核酸における前記標的配列の５’端よりも５’側に存在する配列に対して相補性を有するプライマーと、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。【選択図】    図２
2004290055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の３’端付近に位置する標的配列の５’端よりも５’側の配列に対して相補性を有するプライマーと、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
【請求項２】
標的核酸の５’端付近に位置する標的配列の３’端よりも３’側の配列に対して相補性を有し、且つ３’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、標的核酸の３’端付近の配列に対して相補性を有するプライマーと、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
【請求項３】
第１の標的核酸の３’端付近に位置する第１の標的配列の５’端よりも５’側の配列に対して相補性を有する第１のプライマーと、第１の標的核酸に相補的な第２の標的核酸の５’端付近に位置する第２の標的配列の３’端よりも３’側の配列に対して相補性を有し、３’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、第２の標的核酸の３’端付近の配列に対して相補性を有する第２のプライマーと、伸長活性を有する酵素と、第１および第２の標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
【請求項４】
標的核酸の３’端付近に位置する第１の標的配列の５’端よりも５’側の配列に対して相補性を有する第１のプライマーと、前記標的核酸の５’端付近に位置する第２の標的配列の３’端よりも３’側の配列に対して相補性を有し、３’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
【請求項５】
３’端付近の第１の標的配列と、第１の標的配列よりも５’側に存在する第２の標的配列と、第２の標的配列よりも５’側に存在する第３の標的配列と、５’端付近の第４の標的配列とを含む標的核酸における、第１、第２および第３の標的配列の各々の５’端よりも５’側に存在する夫々の配列に対して相補性を有する第１、第２および第３のプライマーと、第２、第３および第４の標的配列の３’端よりも３’側に存在する夫々の配列に対して相補性を有し、３’末端に伸長不可能な修飾を含む第１、第２および第３のストッパー核酸と、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
【請求項６】
（１）標的核酸の３’端付近に位置する標的配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および前記標的配列の５’端よりも５’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第１のプライマーと、前記標的核酸の５’端付近の配列に相同性を有し、５’端に核酸分解酵素耐性核酸を含む第２のプライマーと、伸長活性を有する酵素と、当該標的核酸とその相補鎖からなる２本鎖核酸とを、適切な増幅反応が得られる条件下で反応することと、
（２）前記（１）の反応することにより得られた増幅産物を、前記分解酵素非耐性核酸を分解することの可能な核酸分解酵素によって消化することと、
を具備する１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
【請求項７】
（１）第１の標的核酸の３’端付近に位置する第１の標的配列に相補的であり、且つ核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および第１の標的配列の５’端よりも５’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第１のプライマーと、
第２の標的核酸の３’端付近に位置する第２の標的配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および第２の標的配列の５’端よりも５’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第２のプライマーと、
伸長活性を有する酵素と、当該第１の標的核酸と第２の標的核酸からなる２本鎖核酸とを、適切な増幅反応が得られる条件下で反応することと、
（２）前記（１）の反応することにより得られた増幅産物を、核酸分解酵素により消化することと、
を具備する１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
【請求項８】
（１）請求項１から７の何れか１項に記載の方法を用いてサンプル中の標的核酸を基にターゲットを製造することと、
（２）前記（１）で製造されたターゲットに対して、前記標的配列に相補的な核酸プローブを、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応することと、
（３）前記（２）の反応により生じた結合を検出することにより、標的配列の存在を検出することと、
を具備する標的配列検出方法。
【請求項９】
請求項１から７の何れか１項に記載の方法により製造されたターゲット。
【請求項１０】
請求項８に記載の検出方法を行うために、プライマー、伸長活性を有する酵素、ストッパー核酸、核酸増幅用酵素、核酸分解酵素および請求項９に記載のターゲットからなる群より少なくとも１選択された構成要素を具備する標的配列検出用アッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法、これにより製造されたターゲット、これを用いた標的配列検出方法、ターゲット製造用キットおよび標的配列検出用アッセイキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
特定の核酸配列を含む核酸鎖を検出するためには一般的に次のような手段が用いられている。例えば、そのような方法は、検出対象である核酸鎖に相補的な１対のプライマーを用いて増幅した後で電気泳動を行ってその存在を検出する方法や、検出対象である標的配列に相補的な核酸鎖を核酸プローブとして固定化した基体を用いて、ハイブリダイゼーションを行う方法である。また、一般的には、これらの検出に用いられるプライマーや核酸プローブは、１５塩基程度以上の連続する特異的な配列をもつオリゴヌクレオチドである。しかしながら、そのようなオリゴヌクレオチドを既存のプライマーまたは核酸プローブ設計ソフトなどを利用して設計したとしても、反応系において標的配列に高次構造が存在したり、部分的に類似する配列が存在していたりすることも多く、このような場合、ミスアニーリングやセルフハイブリダイゼーションなどを招くことになる。このような従来の方法では、目的とする標的配列を高精度に効率よく検出することは容易ではない。また、最適な検出条件を設定するためには、多くの時間と費用を費やさなくてはならない。
【０００３】
例えば、核酸配列を高感度にかつ効率よく検出する方法としては、これまでのところ、「ハイブリダイゼーション法」（特許文献１を参照されたい）や「部分二重鎖ＤＮＡを利用したＤＮＡ検出方法」（特許文献２を参照されたい）などが提案されている。これらの方法は、検出すべき標的核酸の一部領域に相補的な配列を含む核酸プローブと当該標的核酸とをハイブリダイズする際、そのハイブリダイゼーション反応の前またはハイブリダイゼーション反応時に、前記核酸プローブの結合部位以外の標的核酸の配列に対して相補的な核酸鎖を添加し、アニ―リングして一部に２本鎖を形成する方法である。これらの方法は、何れも標的核酸の配列上で、核酸プローブが認識する領域を１本鎖に、残りの領域を２本鎖にすることによって非特異的なハイブリダイゼーションを防ぐことを目的としている。
【０００４】
しかしながら上記の方法には、実際に使用するには解決されるべき多くの問題点が存在している。そのような問題点の幾つかは以下の通りである。
【０００５】
（１）「標的核酸」と「保護鎖」との二種類の分子を１本鎖状態で調製することが必須であるために工程数が多くなってしまうこと；
（２）標的配列の設計が限定されること。非特異的なハイブリダイゼーションを避ける為に、ハイブリダイゼーション反応液中には、核酸プローブ以外の遊離１本鎖核酸分子が出来るだけ存在しないことが望ましい。しかしながら、標的核酸と保護鎖をアニ―リングする際には、長い核酸同士を液体中で分子運動依存的に対合させるために、分子内高次構造などの影響によって理想的なアニ―リングが行われず、ハイブリダイゼーションの効率が著しく低下する場合も多い。これを防止するためには、標的配列の設計が限定されてしまう；
（３）標的核酸作出に多くの時間が掛かること。これは、例えば、保護鎖と標的核酸との間の正確な塩基対形成を行わせる目的から、長い時間をかけてアニーリング反応を行う工程が必須となるためである；
（４）特に、「部分二重鎖ＤＮＡを利用したＤＮＡ検出方法」（特許文献２を参照されたい）では、非対称ＰＣＲを用いて標的鎖と保護鎖とを作出することが必要であること。このため、上記（２）の問題をクリアして定性分析が達成されたとしても、社会的ニーズの高い定量分析には対応できない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平６−７０７９９号公報
【０００７】
【特許文献２】
特開平１１−３３２５６６号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法、これにより製造されたターゲット、これを用いた標的配列検出方法および標的配列検出用アッセイキットを提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の課題を解決するために次のような手段を見出した。即ち、
本発明の第１の側面に従うと、標的核酸の３’端付近に位置する標的配列の５’端よりも５’側の配列に対して相補性を有するプライマーと、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法；
本発明の第２の側面に従うと、標的核酸の５’端付近に位置する標的配列の３’端よりも３’側の配列に対して相補性を有し、且つ３’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、標的核酸の３’端付近の配列に対して相補性を有するプライマーと、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法；
本発明の第３の側面に従うと、第１の標的核酸の３’端付近に位置する第１の標的配列の５’端よりも５’側の配列に対して相補性を有する第１のプライマーと、第１の標的核酸に相補的な第２の標的核酸の５’端付近に位置する第２の標的配列の３’端よりも３’側の配列に対して相補性を有し、３’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、第２の標的核酸の３’端付近の配列に対して相補性を有する第２のプライマーと、伸長活性を有する酵素と、第１および第２の標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法；本発明の第４の側面に従うと、標的核酸の３’端付近に位置する第１の標的配列の５’端よりも５’側の配列に対して相補性を有する第１のプライマーと、前記標的核酸の５’端付近に位置する第２の標的配列の３’端よりも３’側の配列に対して相補性を有し、３’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法；
本発明の第５の側面に従うと、３’端付近の第１の標的配列と、第１の標的配列よりも５’側に存在する第２の標的配列と、第２の標的配列よりも５’側に存在する第３の標的配列と、５’端付近の第４の標的配列とを含む標的核酸における、第１、第２および第３の標的配列の各々の５’端よりも５’側に存在する夫々の配列に対して相補性を有する第１、第２および第３のプライマーと、第２、第３および第４の標的配列の３’端よりも３’側に存在する夫々の配列に対して相補性を有し、３’末端に伸長不可能な修飾を含む第１、第２および第３のストッパー核酸と、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法；
本発明の第６の側面に従うと、（１）標的核酸の３’端付近に位置する標的配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および前記標的配列の５’端よりも５’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第１のプライマーと、前記標的核酸の５’端付近の配列に相同性を有し、５’端に核酸分解酵素耐性核酸を含む第２のプライマーと、伸長活性を有する酵素と、当該標的核酸とその相補鎖からなる２本鎖核酸とを、適切な増幅反応が得られる条件下で反応することと、
（２）前記（１）の反応することにより得られた増幅産物を、前記分解酵素非耐性核酸を分解することの可能な核酸分解酵素によって消化することと、
を具備する１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法；
本発明の第７の側面に従うと、（１）第１の標的核酸の３’端付近に位置する第１の標的配列に相補的であり、且つ核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および第１の標的配列の５’端よりも５’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第１のプライマーと、
第２の標的核酸の３’端付近に位置する第２の標的配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および第２の標的配列の５’端よりも５’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第２のプライマーと、
伸長活性を有する酵素と、当該第１の標的核酸と第２の標的核酸からなる２本鎖核酸とを、適切な増幅反応が得られる条件下で反応することと、
（２）前記（１）の反応することにより得られた増幅産物を、核酸分解酵素により消化することと、
を具備する１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法；
本発明の第８の側面に従うと、（１）請求項１から７の何れか１項に記載の方法を用いてサンプル中の標的核酸を基にターゲットを製造することと、
（２）前記（１）で製造されたターゲットに対して、前記標的配列に相補的な核酸プローブを、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応することと、
（３）前記（２）の反応により生じた結合を検出することにより、標的配列の存在を検出することと、
を具備する標的配列検出方法；
本発明の第９の側面に従うと、上記第１から第７の側面の何れか１に記載の方法により製造されたターゲット；
本発明の第１０の側面に従うと、上記第８の側面に記載の検出方法を行うために、プライマー、伸長活性を有する酵素、ストッパー核酸、核酸増幅用酵素、核酸分解酵素および第９の側面に従うターゲットからなる群より少なくとも１選択された構成要素を具備する標的配列検出用アッセイキット；
が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
１．発明の概要
本発明の態様に従うと、図１に示すような標的核酸１からターゲットを製造する方法が提供される。標的核酸１は、その一部に標的配列２を含む（図１Ａ）。具体的には、本発明の方法に従うと、標的核酸１の標的配列２以外の部分が２本鎖になるように、プライマーを用いて核酸の伸長を行いターゲット４が製造される（図１Ｂ）。即ち、本発明に従うターゲット製造方法は、基本的には、標的配列２を含む標的核酸１を鋳型として用いて伸長反応または増幅反応を行うことを具備する方法である。このような本発明の態様に従うターゲット製造方法により製造されたターゲット４も本発明の更なる態様である。また、本発明の態様に従うターゲットを利用して、標的配列の検出を行うことが可能である。そのような検出方法は、例えば、図１Ｃに示すようにターゲット４の標的配列２に相補的な核酸プローブ５を用い、これを標的配列２に対して反応させ、生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、例えば、サンプル中に標的配列が存在すること、または標的配列を含む標的核酸が存在することを検出することが可能である。このような標的配列の検出方法も本発明の範囲内である。
【００１１】
２．用語の説明
ここにおいて使用される「サンプル」とは、核酸を含む試料であればよく、ヒトを含む真核生物から採取された組織および細胞、原核生物、ウイルス、ウイロイドなどを含む検体から、必要に応じて抽出、増幅および精製など、それ自身公知の何れかの手段によって調製されればよく、人工合成された核酸分子であってもよい。
【００１２】
ここにおいて使用される「標的配列」の語は、検出しようとする１つの連続する配列を指す。「標的核酸」は標的配列を含む核酸を指し、１つの標的核酸には１以上の標的配列が含まれてもよい。ここにおいて使用される「核酸」の語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｓ−オリゴ、メチルホスホネートオリゴ、ＰＮＡ（即ち、ペプチド核酸）およびＬＮＡ（即ち、ロック核酸）などの核酸および核酸類似体、それらの幾つかを共に含む核酸および核酸類似体、並びにそれらの混合物など、一般的にその一部の構造を塩基配列によって表すことができる物質を総括的に示す語である。また、本発明において用いられる核酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであっても、またはそれらの混合物であってもよい。ここにおいて使用される「ヌクレオチド」とは、上記のような核酸を構成する１つの塩基に対応する単位をいう。また、「オリゴヌクレオチド」とは、上記のような人工的に合成された核酸断片を指し、「オリゴＤＮＡ」はそのうちのＤＮＡ断片を指す。
【００１３】
本発明における「ターゲット」とは、標的配列とそれに対応する核酸プローブとのハイブリダイゼーションを利用して実行される標的配列の検出方法において、核酸プローブを実際に結合させるために、サンプルに含まれる元の標的核酸を基礎にして調製され製造された製造物を指す。特に、本発明の態様に従うターゲット製造方法により得られたターゲットは、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含み、前記１本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記２本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる。即ち、本発明の方法に従い提供されるターゲットとは、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを含む特定の構造を有する核酸である。また、当該ターゲットは、「検出用標的構造核酸」および「標的構造核酸」とも称することも可能である。
【００１４】
本発明における「伸長する」および「伸長反応を行う」は同義であり、鋳型である核酸に対して適切な条件下でプライマーと核酸合成酵素を用い、核酸を伸長して鋳型核酸の相補鎖を形成することをいう。また、本発明における「増幅する」および「増幅反応を行う」は同義であり、鋳型である核酸に対して適切な条件下でプライマーと核酸合成酵素を用い、核酸を伸長して鋳型核酸の相補鎖を形成し２本鎖を与えることと、得られた２本鎖を変性あるいは鎖の置換反応などにより１本鎖を与えることと、得られた１本鎖を鋳型として用い、適切な条件下でプライマーと核酸合成酵素を用いて、再度核酸を伸長して鋳型核酸の相補鎖を形成して２本鎖を与えることとを具備する反応を指す。言い換えれば「増幅」とは、１本鎖への変換を前後の伸長反応の間で行いながら２回以上の伸長反応を繰り返し行うことをいう。
【００１５】
ここで使用される「適切な伸長が得られる条件」とは、伸長されるべき核酸およびプライマー、伸長活性を有する酵素、伸長時に取り込まれる核酸合成基質並びに伸長反応に必要な補酵素などが存在し、且つ温度およびｐＨなどの諸条件が適切に制御され、目的とする核酸が伸長され得る条件をいう。また、ここで使用される「適切な増幅が得られる条件」とは、増幅されるべき核酸およびプライマー、伸長活性を有する酵素、伸長時に取り込まれる核酸合成基質並びに伸長反応に必要な補酵素などが存在し、且つ温度およびｐＨなどの諸条件が適切に制御される条件で行われる伸長反応が、少なくとも２回以上繰り返して行われ、目的とする核酸が増幅され得る条件をいう。
【００１６】
本発明における「保護鎖」とは、本発明の態様に従うターゲット製造方法において標的核酸を鋳型として形成された核酸であり、標的配列とは異なる部分の標的核酸の配列に相補的な配列である。この保護鎖の存在により、標的配列以外の部位に核酸プローブや他の核酸またはその標的核酸自身などが結合することによる予期せぬ２本鎖または立体構造の形成を防ぐことが可能である。
【００１７】
ここにおいて使用される「ハイブリッドを検出する」および「結合を検出する」は同義であり、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で、複数の核酸について反応を行った場合に、その複数の核酸の中に少なくとも１組の相補鎖が存在していれば得られるハイブリッドまたは結合を検出することを示す。例えば、このようなハイブリッドまたは結合は、当該相補鎖の少なくとも何れか１に予め付与した標識物質を検出することにより検出が達成されてもよく、ハイブリッドに存在する結合に対して選択的に結合する挿入剤を利用して検出されてもよい。また、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で複数の核酸について反応を行った場合であっても、その複数の核酸の中に相補鎖が存在していなければハイブリッドは得られない。ここで使用される「適切なハイブリダイゼーションが得られる条件」とは、ある１つの反応系において互いに相補性を有する核酸鎖が存在していれば、反応を行うことによりハイブリダイゼーションが得られる条件をいい、例えば、ストリンジェントな条件であればよい。
【００１８】
３．ターゲット製造方法
（Ｉ）プライマーの結合位置を調節することにより所望のターゲットを製造する方法
以下の第１の例から第３の例は、３’端付近に標的配列を含む標的核酸を基にしてターゲットを製造する方法である。これらの例は、標的核酸に対するプライマーの結合位置を調節する方法である。
【００１９】
（１）第１の例
図２を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第１の例を説明する。標的核酸２１は、３’端付近に標的配列２２を含む（図２Ａ）。標的核酸２１における標的配列２２の位置よりも５’側（即ち、標的配列の５’端よりも５’側）の配列に対してプライマー２３を結合させ、適切な伸長反応が得られる条件下で核酸を伸長する（図２Ｂ）。これによって標的核酸２１に相補的な保護鎖２４が形成され、２本鎖核酸部分と標的配列を含む１本鎖核酸部分とを有するターゲット２５が得られる（図２Ｂ）。
【００２０】
このような本発明の態様に従う反応により得られたターゲット２５は、図２Ｃに示すように、核酸プローブ２６を用いた標的配列の検出に利用することが可能である。標的配列２２に対する核酸プローブ２６の結合を検出することにより標的配列２２または標的核酸２１の検出が可能である。
【００２１】
ここで使用され得るプライマーは何れの種類の核酸であってもよく、その長さは、実施者が選択したプライマーの配列に特異的なハイブリダイゼーションが得られるために充分な長さがあればよい。例えば、そのような特異的なハイブリダイゼーションが得られる長さの例は、５塩基長以上であればよく、好ましくは９塩基長以上である。
【００２２】
ここで使用され得る伸長反応は、プライマー２３が、標的核酸２１を鋳型として核酸を合成して、保護鎖２４を含む２本鎖を形成し得る条件下で行われればよい。そのような条件は、伸長活性を有する酵素と、伸長時に取り込まれる核酸合成基質と、伸長反応に必要な補酵素などが存在し、且つ温度およびｐＨなどの諸条件が適切に制御される条件であればよい。本発明において使用され得る酵素は、例えば、５’から３’へ核酸鎖を伸長する活性を有する酵素であればよい。本明細書では「核酸鎖を伸長する活性」を「伸長活性」と略して用いることもある。例えば、核酸合成酵素であればよく、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼであっても、逆転写酵素であってもよい。また、適切な温度の制御は、ヒーターなどのそれ自身公知の手段により、標的核酸２１およびプライマー２３の配列や、酵素の種類などを基に実施者により選択された温度に制御されてよい。また、ｐＨの制御は、それ自身公知の手段により塩の種類、その組み合わせおよび濃度などによって制御すればよい。また、伸長反応時に取り込まれる核酸合成基質は、一般的に使用されるそれ自身公知の核酸合成基質類であってよい。詳細な条件は、使用する酵素、配列および核酸の種類などに応じて実施者が選択できるであろう。
【００２３】
本発明において使用され得る標的配列２２は、実施者が検出しようとする配列であればよく、長さは、５塩基〜３００塩基、好ましくは９塩基〜５０塩基であればよい。
【００２４】
また、本明細書において用いる「３’端付近」とは、標的核酸の最も３’端に位置する塩基から約Ａ番目までの塩基を示し、後述において用いる「５’端付近」とは５’端に位置する塩基から約Ａ番目目までの塩基を示す。例えば、標的配列が３’端付近に存在する場合には、最も３’端に位置する塩基を含んでも、含まなくてもよい。ここで「Ａ」番目とは、問題となる標的配列の塩基数の２分の１の長さである。即ち：
Ａ＝（標的配列の塩基数）／２
である。
【００２５】
好ましくは、以上のような本発明の態様に従う方法は次のように行ってもよい。即ち、標的核酸の３’端付近に存在する標的配列の５’側に隣接または標的配列よりも５’側に存在する９塩基以上の配列に対して相補的な配列を有する核酸からなるプライマーと、核酸合成酵素とを、当該標的核酸を含むサンプルに対して添加し、標的核酸を鋳型として伸長反応を行う。これにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分を含むターゲットを製造する。
【００２６】
ターゲットを製造する場合には、当該サンプルは標的核酸を含むことが必要であるが、必ずしも標的核酸のみを含む必要はなく、他の核酸と共に含まれてもよい。本発明の態様に従う反応を行うためには、サンプルにおける標的核酸の量が、サンプルに含まれる核酸全体の約３％以上、より好ましくは１０％以上、更に好ましくは２０％以上であることが好ましい。また、必要に応じて、本発明に従う方法に供する前に、それ自身公知の何れかの増幅手段により標的核酸を増幅してもよい。増幅手段の例は、ＰＣＲ増幅、および  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｒａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）、Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）、Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮＮ）および  Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法、Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＬＡＭＰ）法などである。
【００２７】
上述のような本発明の態様では、標的核酸におけるプライマーの結合部位により、結果として得られるターゲットの１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分の境界が決定される。当該ターゲットにおいては、標的配列の両側に１本鎖のヌクレオチドが約１００塩基まで存在してもよいが、標的配列のみが１本鎖であることが好ましい。
【００２８】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で標的配列の設計が自由にでき、且つ短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【００２９】
（２）第２の例
図３を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第２の例を説明する。上述した第１の例においては標的核酸が１本鎖であったが、第２の例では、２本鎖の標的核酸が用いられる例を示す。
【００３０】
図３を参照されたい。まず、２本鎖の標的核酸３１を用意する。標的核酸３１は、第１の標的核酸３１ａと、３’端付近に標的配列３２を含む第２の標的核酸３１ｂとを含む（図３Ａ）。
【００３１】
適切な伸長が得られる条件下で、標的核酸３１に対して、第１のプライマー３３ａと第２のプライマー３３ｂとを添加して伸長反応を行う（図３ＢおよびＣ）。その結果、第１の伸長産物である２本鎖３６（図３Ｂ）と、第２の伸長産物であるターゲット３５が得られる（図３Ｃ）。得られたターゲット３５は、標的配列３２を含む１本鎖核酸部分と、標的配列を含まない第２の標的核酸３１ｂおよび保護鎖３４ｂを含む２本鎖核酸部分とを含む。
【００３２】
また、第２の例において適切な伸長が得られる条件とは、標的核酸３１に対してプライマー３３ａおよびｂが適切に結合することも具備する。例えば、当該伸長に先駆けてそれ自身公知の変性手段、例えば、熱、アルカリ、および塩の添加などの手段によって２本鎖の標的核酸３１を１本鎖に解離されてもよい。
【００３３】
以上の本発明の態様に従う第２の例は、標的核酸が２本鎖であること以外は、第１の例と同様に実施することが可能である。また、第２の例において使用され得る反応の条件や、標的核酸、プライマーおよびターゲットについての各条件も、第１の例に従って変更してもよい。
【００３４】
当該伸長反応により得られたターゲット３５を、核酸プローブ３７を用いた標的配列の検出に利用することが可能である（図３Ｄ）。例えば、第１の例に記載の方法と同様に、標的配列３２に対する核酸プローブ３６の結合を検出することによって標的配列の検出が可能である。
【００３５】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【００３６】
（３）第３の例
図４を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第３の例を説明する。第２の例においては、２本鎖標的核酸３１から１つのターゲット３５が得られたのに対して、第３の例では２本鎖標的核酸４１から２つのターゲット４５ａおよび４５ｂが得られる。このこと以外は第２の例と同様の手順により第３の例を実施することが可能である。
【００３７】
図４を参照されたい。２本鎖の標的核酸４１は、３’端付近に第１の標的配列４２ａを含む第１の標的核酸４１ａと、３’端付近に第２の標的配列４２ｂを含む第２の標的核酸４１ｂとを含む（図４Ａ）。
【００３８】
適切な伸長が得られる条件下で、標的核酸４１に対して、第１のプライマー４３ａと第２のプライマー４３ｂとを添加し、核酸の伸長反応を行う（図４Ｂ）。その結果、第１の伸長産物である第１のターゲット４５ａと、第２の伸長産物である第２のターゲット４５ｂが得られる（図４Ｂ）。各々のターゲット４５ａおよびｂは、標的配列４２ａまたはｂを含む１本鎖核酸部分と、標的核酸４１ａまたはｂの一部分およびそれに対して相補的な保護鎖４４ａまたはｂを含む２本鎖核酸部分とを含む。
【００３９】
以上のような本発明の態様に従う第３の例は、２本鎖の標的核酸から２つのターゲットが得られること以外は、第２の例の方法と同様に実施することが可能である。従って、第３の例における適切な伸長が得られる条件、その他の第３の例において使用され得る反応の条件、並びに標的核酸、プライマーおよびターゲットについての条件も、上述した第２の例において記載された条件と同様の条件であってよく、また、第２の例と同様に種々の変更を行ってもよい。
【００４０】
当該伸長反応により得られたターゲット４５ａおよび／またはターゲット４５ｂは、核酸プローブ４６ａおよび／または核酸プローブ４６ｂを用いた標的配列の検出に利用することが可能である（図４Ｃ）。例えば、第１の例に記載された方法と同様に、標的配列４２ａおよび／またはｂに対する核酸プローブ４６ａおよび／またはｂの結合を検出することによって標的配列の検出が可能である。
【００４１】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。更に、第３の例に従えば、２箇所の標的配列を同時に検出することが可能になる。
【００４２】
（ＩＩ）ストッパー核酸を使用する方法
以下の第４の例から第６の例は、５’端付近に標的配列を含む標的核酸を基にしてターゲットを製造する方法である。
【００４３】
（４）第４の例
図５を用いて、本発明の態様に従うターゲットの製造方法の第４の例を説明する。標的核酸５１は、標的配列５２を５’端付近に含む（図５Ａ）。まず最初に、標的核酸５１の３’端付近にプライマー５３の結合するための配列を選択する。また、標的核酸５１における標的配列５２の位置よりも３’側にストッパー核酸５５の結合するための配列を選択する。ストッパー核酸５５の３’末端は、それ以上３’側に伸長反応が進まないように伸長不可能な修飾がなされている。
【００４４】
ストッパー核酸５５が、標的核酸５１における標的配列５２よりも３’側の部位に結合して存在した状態で、標的核酸５１の３’端付近の配列に結合するプライマー５３を用いて、適切な伸長反応が得られる条件下で、５’から３’に向けて核酸を伸長する。その結果、保護鎖５４が形成される（図５Ｂ）。上記の通りストッパー核酸５５の３’末端は、それ以上伸長反応を受けないように修飾がなされている。そのため、ストッパー核酸５５よりも先には伸長反応は進まない。従って、標的核酸５１に含まれる標的配列５２は１本鎖のままで維持される。
【００４５】
ここで使用され得るプライマー５３は、何れの種類の核酸であってもよく、その長さは、実施者が選択したプライマーの配列に特異的なハイブリダイゼーションが得られるために充分な長さがあればよい。例えば、そのような特異的なハイブリダイゼーションが得られる長さの例は、上述の第１の例に記載される通りでよい。
【００４６】
ここで使用され得るストッパー核酸は、何れの種類の核酸であってよく、所望する位置の配列に特異的に結合するのに充分な長さがあればよい。例えば、そのような特異的な結合が得られる長さの例は、５塩基長以上であればよく、好ましくは９塩基長以上である。ストッパー核酸の３’末端の修飾は、それ以上３’側に伸長反応が進まないような修飾であれば何れの修飾がなされてもよい。これらに限定されるものではないが、例えば、３’末端のリン酸化およびダイデオキシヌクレオチドの使用などの手段であればよい。また、使用される伸長活性を有する酵素の種類に応じて、それらの修飾の種類が選択されてもよい。図５では、当該修飾の１例としてストッパー核酸５５の３’末端がリン酸化された例を示した。図中、当該修飾は丸印に「Ｐ」で示す。
【００４７】
ここで使用され得る伸長反応は、プライマー５３が、標的核酸５１を鋳型として核酸の伸長を開始し、保護鎖５２を含む２本鎖を形成し得る条件下で行われればよい。そのような条件は、例えば、伸長活性を有する酵素と、伸長時に取り込まれる核酸合成基質類と、伸長反応に必要な補酵素などが存在し、且つ温度およびｐＨなどの諸条件が適切に制御される条件であればよい。本発明において使用され得る酵素は、上述した第１の例に記載の通りであってよい。また、適切な温度の制御およびｐＨの制御も上述した第１の例の記載の通りであってよい。
【００４８】
本発明において使用され得る標的配列５２は、実施者が検出しようとする配列であればよく、長さは、５塩基〜３００塩基、好ましくは９塩基〜５０塩基であればよい。また、標的配列５２は、標的核酸５１の５’端付近に存在するが、５’末端を含む塩基を含んでいても、５’末端を含む塩基を含まなくてもよい。
【００４９】
以上のような本発明の態様に従う方法は、好ましくは以下のように行ってもよい。即ち、標的核酸の５’端付近に存在する標的配列の３’側に隣接または標的配列よりも３’側に存在する９塩基以上の配列に対して相補的な配列を有し、且つその３’末端が水酸基（−ＯＨ）以外の官能基となるように修飾された核酸であるストッパー核酸と、標的核酸の３’端付近の配列に相補的な核酸であるプライマーと、核酸合成酵素とを、当該標的核酸を含むサンプルに対して添加し、当該標的核酸を鋳型として伸長反応を行う。それにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを具備するターゲットが製造される。
【００５０】
また、上述の方法では、当該プライマーに対する伸長反応は、標的配列の検出方法において使用される標的配列に相補的な核酸プローブ配列と同じ極性の保護鎖を合成する。
【００５１】
このような本発明の態様に従う反応により得られたターゲット５７を、核酸プローブ５６を用いた標的配列の検出に利用することが可能である（図５Ｃ）。標的配列５２に対する核酸プローブ５６の結合は、上述した第１の例に記載の手段により行ってよい。
【００５２】
上述のような本発明の態様では、標的核酸を鋳型として用い、プライマーとストッパー核酸を用いて核酸を伸長する方法が示された。即ち、ターゲットに含まれる１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分との境界は、伸長反応の停止位置をストッパー核酸の結合する部位を選択することによって制御されることにより決定される。それにより、得られるターゲットは標的核酸上の標的配列の領域が１本鎖であり、他の領域が２本鎖となる。
【００５３】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【００５４】
（５）第５の例
図６を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第５の例を説明する。上述した第４の例においては標的核酸５１が１本鎖であったが、第５の例では、２本鎖の標的核酸を用いる。
【００５５】
図６を参照されたい。２本鎖の標的核酸６１を用意する。標的核酸６１は、５’端付近に標的配列６２を含む第１の標的核酸６１ａと、第２の標的核酸６１ｂとを含む（図６Ａ）。
【００５６】
まず最初に、標的核酸６１ａの３’端付近にプライマー６３の結合するための配列を設定する。また、標的核酸６１ａにおける標的配列６２の位置よりも３’側にストッパー核酸６５の結合するための配列を設定する。ストッパー核酸６５の３’末端は、それ以上３’側に伸長反応が進まないように修飾がなされている。
【００５７】
ストッパー核酸６５が、標的核酸６１ａにおける標的配列６２の位置よりも３’側の配列に結合して存在する状態で、標的核酸６１ａの３’端付近の配列に結合するプライマー６３ａと、標的核酸６１ｂの３’端付近の配列に結合するプライマー６３ｂとを用いて、適切な伸長反応が得られる条件下で、５’から３’に向けて核酸を伸長する（図６Ｂ）。当該伸長により保護鎖６４ａと６４ｂが形成される。
【００５８】
当該伸長反応の後に、第１の標的核酸６１ａを基に第１の伸長産物であるターゲット６７が得られ、第２の標的核酸６１ｂを基に第２の伸長産物である２本鎖６８が得られる。
【００５９】
第５の例における適切な伸長が得られる条件とは、標的核酸６１ａおよびｂに対して、プライマー６３ａおよびｂが適切に結合することも具備する。例えば、当該伸長に先駆けて、それ自身公知の変性手段、例えば、熱、アルカリ、および塩の添加などの手段により２本鎖の標的核酸６１を１本鎖に解離してもよい。
【００６０】
以上の態様に従う第５の例は、標的核酸が２本鎖であること以外は、第４の例と同様に実施することが可能である。また、第５の例において使用され得る反応の条件や、標的核酸、ストッパー核酸、プライマーおよびターゲットなどについての条件も、第４の例に従って変更してよい。
【００６１】
当該伸長反応により得られたターゲット６７を、核酸プローブ６９を用いた標的配列の検出に利用することが可能である（図６Ｃ）。標的配列６２に相補的な核酸プローブ６９の当該標的配列６２への結合を検出することによって、標的配列の検出が可能である。当該結合の検出は、上述の第１の例と同様の方法により行ってもよい。
【００６２】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【００６３】
（６）第６の例
図７を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第６の例を説明する。前述の第５の例においては、２本鎖標的核酸６１から１つのターゲット６７が得られたのに対して、以下に記載する第６の例では、２本鎖標的核酸７１に含まれる各々の核酸７１ａおよび７１ｂから夫々ターゲット７６ａと７６ｂが得られる。このこと以外は第５の例に記載の方法と同様に第６の例を実施することが可能である。
【００６４】
図７を参照されたい。２本鎖の標的核酸７１は、５’端付近に第１の標的配列７２ａを含む第１の標的核酸７１ａと、５’端付近に第２の標的配列７２ｂを含む第２の標的核酸７１ｂとを含む。
【００６５】
まず最初に、標的核酸７１ａの３’端付近にプライマー７３ａの結合するための配列を設定する。また、標的核酸７１ａの標的配列７２ａよりも３’側にストッパー核酸７５ａが結合するための配列を設定する。ストッパー核酸７５ａの３’末端は、それ以上３’側に伸長反応が進まないように修飾されている。同様に、標的核酸７１ｂの３’端付近にプライマー７３ｂの結合するための配列を設定する。また、標的核酸７１ｂの標的配列７２ｂよりも３’側にストッパー核酸７５ｂの結合するための配列を設定する。ストッパー核酸７５ｂの３’末端は、それ以上３’側に伸長反応が進まないように修飾されている。図７では、ストッパー核酸７５ａおよびｂの３’末端がそれ以上３’側に伸長反応が進まないように修飾されていることを丸印により示した。
【００６６】
ストッパー核酸７５ａおよび７５ｂが、夫々、標的核酸７１ａおよび７１ｂにおける標的配列７２ａおよび７２ｂよりも３’側の配列に結合して存在する状態で、標的核酸７１ａおよび７１ｂの３’端付近に結合するプライマー７３ａおよび７３ｂを用いて、適切な伸長反応が得られる条件下で、５’から３’方向に核酸を伸長する。その結果、保護鎖７４ａおよびｂが形成され、第１の伸長産物であるターゲット７６ａと、第２の伸長産物であるターゲット７６ｂが得られる。標的配列７２ａおよびｂの部分は、両者とも１本鎖のままで維持される。夫々のターゲット７６ａおよびｂは、標的配列７２ａおよびｂを含む１本鎖核酸部分と、標的核酸７１ａおよびｂの一部分とそれに対して相補的な保護鎖７４ａおよびｂとを含む２本鎖核酸部分とを夫々含む。
【００６７】
以上の本発明の態様に従う第６の例は、標的核酸をなす２本鎖から、２つのターゲットが得られること以外は、第５の例の方法と同様に実施することが可能である。従って、第６の例における適切な伸長が得られる条件、その他の使用され得る反応の条件や、標的核酸、ストッパー核酸、プライマーおよびターゲットについての条件は、上述した第５の例における条件と同様の条件であってよく、また、第５の例と同様に種々の変更を行うことが可能である。
【００６８】
また、当該伸長反応により得られたターゲット７６ａおよびターゲット７６ｂを、核酸プローブ７７ａおよび核酸プローブ７７ｂを用いた標的配列の検出に利用することが可能である。例えば、前述した何れのか例と同様に、標的配列７２ａおよびｂに対する核酸プローブ７７ａおよびｂの結合を検出することにより標的配列の検出が可能である。
【００６９】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。更に、第６の例に従えば、２箇所の標的配列を同時に検出することが可能になる。
【００７０】
（ＩＶ）プライマーの結合位置を調節することと、ストッパー核酸を用いることによって核酸プローブ結合部分を形成する方法
上述の（Ｉ）と（ＩＩ）に記載の方法を組み合わせることにより、更に種々のタイプの標的配列を自由に設計することが可能になる。そのような例を以下の第７の例から第９の例に示す。
【００７１】
（７）第７の例
図８を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第７の例を説明する。前述の第６の例においては、第１の標的核酸と第２の標的核酸は、何れもその５’端付近に標的配列を有していた。これに対して、以下に説明する第７の例においては、第１の標的核酸においては３’端付近に標的配列が存在し、第２の標的核酸では５’端付近に標的配列が存在する。
【００７２】
図８を参照されたい。２本鎖である標的核酸８１は、第１の標的核酸８１ａと第２の標的核酸８１ｂとを含む。第１の標的核酸８１ａの３’端付近には第１の標的配列８２ａが存在する。第２の標的核酸８１ｂの５’端付近には第２の標的配列８２ｂが存在する。第１の標的核酸８２ａと第２の標的配列８２ｂは、互いに相補的であっても、相補的ではなくてもよい。
【００７３】
第１の標的核酸から第１のターゲット８６ａを作出することは、上述した第１の例に示した方法と同様の方法により行うことが可能である。即ち、第１の標的核酸における標的配列８２ａの存在する位置よりも５’側の配列に相補的な配列を有するプライマー８３ａを用いて適切な伸長が得られる条件下で伸長反応を行って保護鎖８４ａを与え、ターゲット８６ａを作出すればよい。また、第１の例に記載したのと同様に種々の変更を行ってもよい。
【００７４】
第２の標的核酸から第２のターゲット８６ｂを作出することは、上述の第５の例に示した方法と同様の方法により行うことが可能である。即ち、第２の標的核酸の３’端付近に一部の配列に相補的なプライマー８３ｂを用いて、ストッパー核酸８５の存在する条件下で、適切な伸長が得られる条件下で伸長反応を行って保護鎖８４ｂを与え、ターゲット８６ｂを作出すればよい。ここで、ストッパー核酸８５は、標的核酸８１ｂにおける標的配列８２ｂの存在する位置よりも３’側の配列に相補的な配列を有する。このような第２の標的核酸からのターゲットの作出は、また、上述した第５の例に記載したのと同様に種々の変更を行ってもよい。また、図８では、３’側方向への伸長反応を阻害するためのストッパー核酸８５の３’末端における修飾を丸印によって示した。
【００７５】
上述の第１の標的核酸に対する伸長と、第２の標的核酸に対する伸長は、同時に行ってもよく、または順次に行ってもよい。例えば、同時に行う場合は、上述した２本鎖を標的核酸として用いる他の例と同様に、第１の標的核酸と第２の標的核酸の両方について適切な伸長反応が得られる条件下で、伸長反応を行えばよい。
【００７６】
また、第１の標的配列と第２の標的配列は、同じ長さで１００％の相補性を有していてもよく、一方が他方よりも長くてもよく、同じ長さで両末端が多少ずれていてもよい。
【００７７】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能であるので、経済性および操作性が向上される。また更に、第７の例に従えば、１箇所の標的配列を２本の相補鎖について同時または順次に検出することが可能である。従って、目的とする標的配列の検出を確実に行うことが可能であり、判定精度の向上が可能である。例えば、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下、ＳＮＰと記す）を検出場合などに特に有利である。
【００７８】
また、当該ターゲットを用いての標的配列検出は、上述した他の例と同様に、第１の標的配列８２ａに対して相補的な核酸プローブ８７ａと、第２の標的配列８２ｂに対して相補的な核酸プローブ８７ｂとを用いて、それらの標的核酸への結合を検出することにより行えばよい。
【００７９】
（８）第８の例
図９を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第８の例を説明する。図９を参照されたい。１本鎖である標的核酸９１は、３’端付近に第１の標的配列９２を有し、５’端付近に第２の標的配列９３を有する（図９Ａ）。このような標的核酸９１からターゲット９７を製造する（図９Ｂ）。標的核酸９１における第１の標的配列９２の存在する位置よりも５’側の一部の配列に相補的なプライマー９４と、標的核酸９１における第２の標的配列９３の存在する位置よりも３’側の一部の配列に相補的なストッパー核酸９５が存在し、適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反応を行って保護鎖９６を与え、ターゲット９７を作出する。図９では、３’側方向への伸長反応を阻害するためのストッパー核酸９５の３’末端における修飾を丸印によって示した。
【００８０】
検出は、第１の標的配列９２に対して相補的な第１の核酸プローブ９８と、第２の標的配列９３に対して相補的な第２の核酸プローブ９９とを用いて、それぞれの標的配列への核酸プローブの結合を、上述した他の例と同様の方法により検出すればよい。
【００８１】
上記した第８の例では、標的核酸として１本鎖を用いたが、２本鎖の標的核酸に対しても同様に第８の例の方法を適用することが可能である。また、第８の例は、上述した第１の例、第２の例、第４の例および第５の例の方法に従ってそれらの変更と同様に所望の変更を行ってもよい。
【００８２】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能であるので、経済性および操作性が向上される。
【００８３】
（９）第９の例
図１０を用いて、３以上の標的配列を含む標的核酸についてのターゲットを製造する方法の例を説明する。図１０を参照されたい。１本鎖である標的核酸１０１は、３’側、即ち３’端付近の第１の標的配列１０２ａ、第２の標的配列１０２ｂ、第３の標的配列１０２ｃ、最も５’側、即ち５’端付近の第４の標的配列１０２ｄを有する（図１０Ａ）。このような標的核酸１０１からターゲットを製造する。まず、標的核酸１０１における第１の標的配列１０２ａの５’端よりも５’側の配列に相補的な第１のプライマー１０３ａと、第２の標的配列１０２ｂの５’端よりも５’側の配列に相補的な第２のプライマー１０３ｂと、第３の標的配列１０２ｃの５’端よりも５’側の配列に相補的な第３のプライマー１０３ｃを用意する。更に、３つのストッパー核酸を用意する。第１のストッパー核酸１０５ａは、標的核酸１０１における第２の標的配列の存在する位置よりも３’側の配列に相補的な配列を有する。第２のストッパー核酸１０５ｂは、第３の標的配列の存在する位置よりも３’側の配列に相補的な配列を有する。第３のストッパー核酸１０５ｃは、第３の標的配列の存在する位置よりも３’側の配列に相補的な配列を有する。
【００８４】
第１のプライマー１０３ａ、第２のプライマー１０３ｂおよび第２のプライマー１０３ｃと、第１のストッパー核酸１０５ａ、第２のストッパー核酸１０５ｂおよび第３のストッパー核酸１０５ｃが存在し、適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反応を行って第１の保護鎖１０６ａ、第２の保護鎖１０６ｂおよび第３の保護鎖１０６ｃを与え、ターゲット１０７を作出する（図１０Ｂ）。
【００８５】
このように作出されたターゲット１０７は、一度に４箇所の標的配列の存在について検出することが可能である。そのような検出は、上述の何れかの例と同様に、第１の標的配列１０２ａ、第２の標的配列１０２ｂ、第３の標的配列１０２ｃおよび第４の標的配列１０２ｄに対する、夫々の核酸プローブ１０８ａ、１０８ｂ、１０８ｃおよび１０８ｄの結合を検出することにより行えばよい。
【００８６】
上記の第９の例では、１つの標的核酸上に標的配列が４つある例を示したが、標的配列の数が３以上ある場合には第９の例の方法を適用してよい。また、標的配列は、必ずしも標的核酸の５’および／または３’端に接して存在しなくともよく、幾つかの塩基を残した何れかの端に存在してもよく、標的核酸の中央付近にのみ存在してもよい。また、図１０では、３’側方向への伸長反応を阻害するためのストッパー核酸１０５ａ、ｂおよびｃの夫々の３’末端における修飾を丸印によって示した。
【００８７】
また上記の第９の例では、標的核酸として１本鎖を用いたが、２本鎖の標的核酸に対しても同様に第９の例の方法を適用することが可能である。その場合、２本鎖から１つのターゲットを得ても２つのターゲットを得てもよい。また、第９の例は、上述した第１の例、第２の例、第４の例および第５の例の方法に従ってそれらの例における変更と同様に所望の変更を行ってもよい。
【００８８】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能であるので、経済性および操作性が向上される。
【００８９】
（Ｖ）酵素により核酸プローブ結合部分を形成する方法
以下の第１０および１１の例は、一旦、標的核酸の全長を複製して２本鎖を作成した後に、所望する標的配列部分のみを１本鎖にする方法の例である。具体的には、核酸増幅に用いられるプライマーの少なくとも一部配列を予め核酸分解酵素耐性となるよう修飾しておき、このプライマーを用いて試料を伸長または増幅し、伸長または増幅後に得られた２本鎖核酸をエキソヌクレアーゼを用いて修飾部分まで消化する。これにより、１本鎖核酸部分と２本鎖核酸部分とを有するターゲットを作出することが可能である。
【００９０】
（１０）第１０の例
図１１を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第１０の例を説明する。ターゲットの基礎となる標的核酸１１１は、第１の標的核酸１１１ａと第２の標的核酸１１１ｂとからなる２本鎖標的核酸１１１である。第１の標的核酸１１１ａの３’端付近に標的配列１１２が存在する。このような標的核酸１１１を、第１のプライマー１１３ａと第２のプライマー１１３ｂとを用いて、保護鎖１１４ａおよびｂを伸長する。
【００９１】
ここで第１のプライマー１１３ａは、第１の標的核酸１１１ａの３’端付近の配列に相補的なプライマーであり、標的配列１１２に相補的な配列と、当該標的配列よりも５’側の標的核酸上の配列に対して相補的な配列を含む。また、第１のプライマー１１３ａに含まれる標的配列に相補的な配列部分は、核酸分解酵素非耐性のヌクレオチドで構成される。また、少なくとも当該標的配列よりも５’側の配列に相補的な配列の一部分、好ましくは標的配列に隣接する配列を含む一部分の配列が核酸分解酵素耐性核酸である。一方、第２のプライマー１１３ｂは、第２の標的核酸１１１ｂの３’端付近の配列に相補的なプライマーである。第２のプライマー１１３ｂは、少なくとも５’端が核酸分解酵素耐性であるので、核酸分解酵素による消化は受けない。
【００９２】
上記のような標的核酸１１１と第１のプライマー１１３ａおよび第２のプライマー１１３ｂとを存在させ、適切な伸長反応が得られる条件下で、核酸を伸長する（図１１Ａ）。その後、得られた２本鎖を変性して１本鎖にする。更に得られた１本鎖を鋳型として、上述と同じ第１のプライマー１１３ａと第２のプライマー１１３ｂを用いて、適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反応を行う（図１１Ｂ）。その後、５’末端側から核酸を分解する核酸分解酵素を、適切な分解活性が得られる条件下で反応させる（図１１Ｃ）。この反応系に存在する核酸のうち、露出された５’末端に核酸分解酵素耐性ヌクレオチドが含まれない核酸は、当該核酸分解酵素によって分解される。これにより、保護鎖１１４ａ’と保護鎖１１４ｂとを具備するターゲット１１６が得られる（図１１Ｃ）。
【００９３】
このように得られたターゲット１１６に対して、核酸プローブ１１５をハイブリダイズし、上述の他の例と同様にこの結合を検出することにより標的配列の検出を行うことが可能である（図１１Ｄ）。
【００９４】
ここで使用される核酸分解酵素は、５’末端側から核酸を分解するエクソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼであればよく、例えば、Ｔ７  Ｇｅｎｅ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅなどを好ましく使用できる。
【００９５】
上述したように本発明において使用され得る標的配列は、実施者が検出しようとする配列であればよく、長さは、５塩基〜３００塩基、好ましくは９塩基〜５０塩基であればよい。また、標的配列１１２は、標的核酸の３’端付近に存在し、上述した他の例と同様に、３’末端を含んで存在してもよく、３’末端を含まずに端から離れた位置に配置してもよい。
【００９６】
ここで使用され得る第１のプライマーは、上述したように特定の位置が核酸分解酵素に耐性であり、標的配列に対応する部分は核酸分解酵素非耐性の核酸である。第１のプライマーは、そのような条件が得られれば何れの種類の核酸であってもよい。その長さは、実施者が選択した第１のプライマーの配列に特異的なハイブリダイゼーションが得られるために充分な長さであり、且つ上述のような標的配列の塩基長よりも長い塩基長であればよい。例えば、本例において使用され得る第１のプライマーの長さの例は、６塩基長以上であればよく、好ましくは１０塩基長以上である。また、上述したように、本例において使用される第１のプライマーは、標的核酸の３’端付近に存在する標的配列よりも５’側に隣接またはより５’側に存在するヌクレオチドに相補的な部分が核酸分解酵素耐性である。核酸分解酵素耐性であるヌクレオチドの数は、１から３００塩基であればよく、好ましくは１塩基から５０塩基、より好ましくは１塩基から３０塩基であればよい。第１のプライマーの結合する標的配列に相補的な部分は、核酸分解酵素非耐性のヌクレオチドで構成される。また、第１のプライマーは、当該核酸分解酵素耐性ヌクレオチドよりもさらに３’側に核酸分解酵素非耐性ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００９７】
ここで使用される第２のプライマーは、少なくともその５’末端に核酸分解酵素に耐性であるヌクレオチドを含み、それ以外の部分は核酸分解酵素非耐性ヌクレオチドを含めばよい。第２のプライマーの全長は、５から１００塩基であればよく、好ましくは６塩基から５０塩基、より好ましくは１０塩基から３５塩基であればよい。また、第２のプライマーの核酸分解酵素非耐性核酸は、約４塩基から約９９塩基であればよく、好ましくは約５塩基から約４９塩基、より好ましくは９塩基から３４塩基である。
【００９８】
本例において所望するヌクレオチドを、核酸分解酵素耐性とするには、それ自身公知の何れかの核酸分解酵素耐性化手段を用いてヌクレオチドを修飾すればよい。例えば、そのような手段は、フォスフォジエステル結合部分へのホスホロチオエート修飾などであるが、これに限定されるものではない。
【００９９】
また、適切に伸長反応が得られる条件下とは、例えば、伸長活性を有する酵素と、伸長時に取り込まれる核酸合成基質と、伸長反応に必要な補酵素などが存在し、且つ温度およびｐＨなどの諸条件が適切に制御される条件であればよい。本発明において使用され得る酵素は、上述した第１の例において使用可能な酵素であってよい。また、適切な温度の制御やｐＨの制御などの条件も上述の第１の例に記載した条件を用いてよい。
【０１００】
また上記の例では、図１１の（Ａ）の後に更なる１回の伸長を行っているが、これを更に繰り返してもよい。即ち、本例のような本発明の態様に従う方法においては、２回以上の伸長することを含む増幅反応を具備していてもよい。このような増幅は、それ自身公知の何れかの増幅手段により行ってよい。増幅手段の例は、ＰＣＲ増幅、および  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｒａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）、Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）、Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮＮ）および  Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法、Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＬＡＭＰ）法などである。本例においては、増幅反応を行うことにより、より多くのターゲットが同時に製造される。
【０１０１】
サンプルに含まれる標的核酸を用いて、上述の第１０の例を用いて本発明に従うターゲットを製造する場合、ここでサンプルは標的核酸を含めばよいが、必ずしも標的核酸のみを含む必要はなく、他の核酸と共に含まれてもよい。しかしながら、好ましく本発明の態様に従う反応を行うためには、サンプルにおける標的核酸の量が、サンプルに含まれる核酸全体の約３％以上であればよく、より好ましくは１０％以上、更に好ましくは２０％以上である。また、必要に応じて、本発明に従う方法に供する前に、それ自身公知の何れかの増幅手段により標的核酸を増幅してもよい。増幅手段の例は、ＰＣＲ増幅および  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｒａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）、Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）、Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮＮ）および  Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法、Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＬＡＭＰ）  法などである。
【０１０２】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【０１０３】
（１１）第１１の例
図１２を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第１１の例を説明する。ターゲット製造の基礎となる標的核酸１２１は、第１の標的核酸１２１ａと第２の標的核酸１２１ｂとからなる２本鎖標的核酸１２１である（図１２Ａ）。第１１の例は、第１および第２の標的核酸の両方の３’端付近に標的配列１２２ａおよびｂが存在する場合の例である。従って、上述の第１０の例の変形例である。
【０１０４】
第１の標的核酸１２１ａの３’端付近の第１の標的配列１２２ａに相補的な配列を有する第１のプライマー１２３ａと、第２の標的配列１１２ｂに相補的な配列を有する第２のプライマー１２３ｂとを用いて伸長反応を行う（図１２Ａ）。次に、得られた２本鎖を変性し、得られた１本鎖について同様の第１のプライマー１２３ａと第２のプライマー１２３ｂと伸長活性を有する酵素を用いて、再度伸長を行う（図１２Ｂ）。次に核酸分解酵素により５’末端から核酸分解酵素非耐性核酸を分解する。それにより、１本鎖核酸部分として存在する標的配列１２２ａおよびｂと相補鎖１２４ａ’およびｂ’からなる２本鎖核酸部分とを具備する点対称なターゲット１２６が得られる（図１２Ｃ）。
【０１０５】
ここで、プライマー１２３ａとｂは、各々５’端側に核酸分解酵素非耐性ヌクレオチドを含むが、この核酸分解酵素非耐性ヌクレオチドは標的配列１２２ａおよびｂに対応する部分に存在すればよい。また、各標的核酸における標的配列の存在位置よりも５’側のと領域相補的な配列中に核酸分解酵素耐性ヌクレオチド部分が存在する。
【０１０６】
本第１１の例では、当該伸長反応に続いて、核酸分解酵素により各保護鎖１２４ａおよびｂの５’端に存在する核酸分解酵素非耐性ヌクレオチドが分解される。従って、本第１１の例において使用される第１のプライマー１２３ａと第２のプライマー１２３ｂは、両者とも基本的な構造は、第１０の例において記載した第１のプライマーと同様でよい。即ち、標的配列に相補的な配列となる部分に核酸分解酵素に対して非耐性であるヌクレオチドが含まれ、それよりも３’側に存在する配列の一部が、好ましくは標的配列に相補的な配列に隣接する部分の配列が、核酸分解酵素耐性ヌクレオチドである。このような第１のプライマー１２３ａと第２のプライマー１２３ｂの構成以外は、本第１１の例は、上述した第１０の例と同様の方法により行ってよく、更に第１０の例の変更と同様に所望の変更を行ってもよい。
【０１０７】
このように得られたターゲット１２６に対して、核酸プローブ１２５ａおよびｂを同時または順次にハイブリダイズし、上述した他の例と同様の方法によりこの結合を検出することによって標的配列を検出することが可能である（図１２Ｄ）。
【０１０８】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【０１０９】
４．ターゲット
上述のような本発明の方法に従って製造されたターゲットも本発明に含まれる。また、このような本発明に従うターゲットは、標的配列またはこれを含む標的核酸の検出に好ましく使用される。また、本発明に従い製造されたターゲットは、溶液中で遊離した状態で使用されても、ビーズおよび基板などの基体に固定化された状態で使用されてもよい。即ち、遊離型のターゲットおよび基体に固定化されたターゲットの何れも本発明として提供される。
【０１１０】
一般的に、標的配列の検出は、目的とする標的配列に対して相補的な核酸プローブを結合させ、その結合を検出することにより行われる。多くの場合において標的配列は、サンプル中で単独で存在するよりも、複数の異なる配列を有する核酸と共に存在したり、一部に標的配列を含む標的核酸に含まれて存在したり、また等しい配列を有する標的配列や標的核酸が数多く集まって存在する。従って、標的配列やそれを含む標的核酸の自己相補性による二次構造や、他の配列とのクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性は低くない。そのような予期しない結合が生じれば、その結果、標的配列の検出の精度は低くなる。しかしながら、本発明のターゲットによれば、自己相補性や他の配列との相補性による意図しないハイブリダイゼーションの発生を抑制することが可能である。
【０１１１】
５．標的配列検出方法
上述のような本発明に従い製造されたターゲットを用いて標的配列または標的核酸を検出する方法も本発明に含まれる。
【０１１２】
即ち、当該検出の対象となるサンプルを用意する。次に所望に応じて目的の配列を含む核酸を増幅する。その後、上述した本発明の態様に従う方法によりターゲットを製造する。次に、検出の対象となる標的核酸に対して相補的な核酸プローブを、製造された当該ターゲットに対して、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させる。その結果、当該サンプル中に標的核酸が存在する場合には、当該核酸プローブと標的配列との間にハイブリダイゼーションが生じる。従って、このハイブリダイゼーションによる結合を検出すれば、サンプル中の標的配列または標的核酸の存在を検出することが可能である。
【０１１３】
本発明において使用され得る核酸の増幅手段は、それ自身公知の増幅手段であればよく、例えば、ＰＣＲ増幅、および  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｒａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）、Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）、Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮＮ）および  Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法、Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＬＡＭＰ）法などであればよい。本発明において、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件とは、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブ固定化基体に具備される核酸プローブの種類、試料核酸の種類およびそれらの状態などの諸条件に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１１４】
また、本発明に従うターゲットを使用する標的配列の検出方法において用いられる検出手段は、核酸プローブを使用して実施されるそれ自身公知の一般的な検出手段であればよい。例えば、そのような検出手段は、核酸プローブに予め蛍光標識、化学発光物質および色素などの検出可能な標識物質を付与しておき、これを検出する検出方法や、当該結合部分に対して特異的に結合可能なインタカレータを検出することを利用した検出方法、並びに電気化学的に当該結合部分を認識する物質を用いて電気化学的検出方法などである。
【０１１５】
６．アッセイキット
（１）ターゲット製造用キット
本発明の態様に従うと、上述のような本発明の態様に従うターゲットを製造するためのターゲット製造用キットも本発明に含まれる。
【０１１６】
本発明の態様に従うターゲット製造用キットは、上述したような種々のプライマー、核酸合成酵素、核酸合成基質、ストッパー核酸を得るための必要な試薬、核酸分解酵素、核酸の核酸分解酵素耐性化のために必要な試薬、核酸プローブ、核酸プローブを標識するための標識物質および他の試薬、並びに所望の基体の少なくとも１を具備すればよく、それらの幾つかを組み合わせて具備してもよい。
【０１１７】
（２）標的配列検出用アッセイキット
本発明はまた、上述したような本発明の態様に従うターゲットを用いて標的配列を検出するための標的配列検出用アッセイキットも提供する。本発明の態様に従う標的配列検出用アッセイキットは、本発明の態様に従うターゲット、核酸プライマー、結合を検出するための検出可能な標識物質および検出を行うための種々の試薬の少なくとも１を具備すればよく、それらの幾つかを組み合わせて具備してもよい。また更に、上述したターゲット製造用キットに具備される上述したような種々のプライマー、核酸合成酵素、核酸合成基質、ストッパー核酸を得るための必要な試薬、核酸分解酵素、核酸の核酸分解酵素耐性化のために必要な試薬、核酸プローブ、核酸プローブを標識するための標識物質および試薬、ビーズおよび基板などの基体、並びに核酸プローブ固定化基体なども、少なくとも１またはそれらの幾つかを組み合わせた形態で具備してもよい。
【０１１８】
【実施例】
実施例１
上述したストッパー核酸を用いる図５に示すような第４の例を本発明に係る実施例１として行い、更にその結果を従来法により得られる結果と比較した。ＭＢＬ遺伝子コード領域のＳＮＰを含む領域に対応する１本鎖ＤＮＡを標的核酸として利用し、本発明および従来法の両方法によってターゲットを作出した。次に、同領域上のＳＮＰを検出するための核酸プローブ固定化基体をもちいてＭＢＬ遺伝子のＳＮＰ検出を行った。具体的な方法は以下の通りである。
【０１１９】
ＭＢＬ遺伝子中で検出したいＳＮＰを含む領域と同じ配列（即ち、配列番号１）を持つ１本鎖ＤＮＡを標的核酸とし、これを終濃度１０１２コピー／ｍＬ程度となるように調整した。
【０１２０】
また、保護鎖の伸長は、ストッパー核酸の存在下でプライマーを用いて行った。即ち、終濃度０．４μＭの３’リン酸化オリゴＤＮＡ（配列番号２）をストッパー核酸として用い、終濃度０．２μＭのオリゴＤＮＡ（配列番号３）をプライマーとして用いた。これらのストッパー核酸とプライマーとを終濃度０．０４Ｕ／μＬの耐熱性ＤＮＡ合成酵素Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔａｋａｒａ）と共に前記標的核酸に添加した。ストッパー核酸とプライマーの配列は以下の通りである。
【０１２１】
配列番号２：ＧＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＣ
配列番号３：ＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴ。
【０１２２】
次に、至適酵素反応溶液組成にて６６℃１０分間の反応を行った。反応後、１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液、１／９量の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加して、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、３’末端にチオール基を導入することにより基板に具備される金電極に固定化された配列番号４および配列番号５に示される核酸を核酸プローブとして含む。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１２３】
比較対照である従来法は以下のように行った。標的核酸である１本鎖ＤＮＡと別途合成した１本鎖の保護鎖（即ち、配列番号６の核酸鎖）とを混合し２ｘＳＳＣ緩衝液中で９５℃で５分の熱変性後９５℃から３０℃まで３０分間かけて徐々に冷却することでアニーリングを行なった。核酸プローブとして配列番号４および配列番号５を含む核酸を基板の金電極上に固定化した、前述と同様の核酸プローブ固定化チップに対して前記アニーリング後に得られた従来法によるターゲットを添加した。次に、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１２４】
また、もう１つの従来法として、保護鎖を含まない１本鎖の標的核酸（配列番号１）をターゲットとして用いて標的配列を検出した。核酸プローブとして配列番号４および配列番号５を含む前述と同様の核酸プローブ固定化チップに添加し、上記と同様にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１２５】
以上の結果を図１３に示す。以上のハイブリダイゼーションの結果、ストッパー核酸としての配列番号２の３’リン酸化オリゴＤＮＡと、プライマーとしての配列番号３のオリゴＤＮＡとを使用し、これに耐熱性ＤＮＡ合成酵素を添加して作出したターゲットを用いて行った本発明の方法に係る実験区のみから、対応するＳＮＰを検出する核酸プローブに対する特異的なハイブリダイゼーションが生じたことを示す電流信号を検出することができた（図１３）。
【０１２６】
更に、同様の比較実験を異なる配列を有する標的核酸を用いて行ったが、何れの場合にも本発明に係る方法で作出したターゲットを用いて検出した場合からのみ、安定的かつ特異的な信号が検出された。また、保護鎖を伴わずに標的核酸を１本鎖ＤＮＡのままでターゲットとして検出を行った場合や、標的核酸と別途合成した保護鎖とを混合して熱変性およびアニ―リングによりターゲットを作出して検出を行った場合など、従来法を用いた場合では、図１３に示す結果と同様にほとんどの場合において好ましい結果は得られなかった。
【０１２７】
また、図７に示す本発明の第６の例に従ってターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。即ち、標的核酸として２本鎖核酸を用い、互いに異なる部位を標的配列とし、２本鎖標的核酸に含まれる各々の鎖から夫々にターゲットを作成し、同様に標的配列の検出を行った。その結果、本発明に従う方法によりターゲットを作出した場合にのみ、特異的なハイブリダイゼーションを確認することができた。
【０１２８】
以上の結果から、本発明の方法による検出は、従来法に比べて、特異的、効率的および高感度に標的核酸を検出することが可能であった。従って、標的ＤＮＡを作出する際の経済性および操作性が向上される。
【０１２９】
実施例２
図２に示す本発明の第１の例に係る方法、即ち、プライマーの結合位置を調節することにより所望のターゲットを製造する方法を行い、それにより得られたターゲットを用いる標的配列の検出を、実施例２とし行った。それにより得られた結果を従来法による結果と比較した。
【０１３０】
ＭｘＡ遺伝子を含む溶液をサンプルとし、ＭｘＡ遺伝子プロモーターのＳＮＰを含む領域に対応する１本鎖ＤＮＡ（配列番号７）を標的核酸とした。また、当該ＳＮＰを含む配列を標的配列とした。これらについて、本発明に係る方法および従来法の両方法を用いて夫々にターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。標的配列の検出手段は、標的配列に相補的な配列を有する核酸プローブを基体に固定化して得た核酸プローブ固定化基体に対するハイブリダイゼーションの有無の検出により行った。この検出により、ＭｘＡ遺伝子プロモーターのＳＮＰの遺伝子型を検出することが可能である。
【０１３１】
ＭｘＡ遺伝子中で検出したいＳＮＰを含む領域と同じ配列を持つ標的１本鎖ＤＮＡを標的核酸として、終濃度１０１２コピー／ｍｌ程度となるように調整した。プライマーとしてオリゴＤＮＡ（配列番号８）を用意した。終濃度０．４μＭの当該プライマーと終濃度０．０４Ｕ／μｌのＰＣＲ用酵素Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔａｋａｒａ）を前記標的核酸に添加した。プライマーの配列は以下の通りである；
配列番号８：ＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣ。
【０１３２】
伸長反応は、至適酵素反応溶液組成にて６６℃１０分間行った。反応後１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液、１／９量の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加して、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、５’末端にチオール基を導入することにより金電極に固定化された配列番号９および配列番号１０を夫々核酸プローブとして含む。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１３３】
比較対照である従来法は以下のように行った。標的核酸である１本鎖ＤＮＡと別途合成した１本鎖の保護鎖（即ち、配列番号１１の核酸鎖）とを混合し、２ｘＳＳＣ緩衝液中で９５℃で５分の熱変性後９５℃から３０℃まで３０分間かけて徐々に冷却することでアニーリングを行なった。核酸プローブとして配列番号９および配列番号１０を含む核酸を基板の金電極上に固定化した、前述と同様の核酸プローブ固定化チップに対して前記アニーリング後に得られた従来法によるターゲットを添加した。次に、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１３４】
また、もう１つの従来法として、保護鎖を含まない１本鎖の標的核酸（配列番号７）をターゲットとして用いて標的配列を検出した。核酸プローブとして配列番号９および１０を夫々に含む上記と同様の核酸プローブ固定化チップに添加し、上記と同様にハイブリダイゼーションを行い、電流応答を測定した。
【０１３５】
その結果、本発明に係る方法により作出したターゲットを用いて検出を行った実験区のみから、対応するＳＮＰを検出する核酸プローブに特異的なハイブリダイゼーションが行われたことを示す電流信号が検出された（図１４）。さらに、複数種の異なる配列を有する標的核酸についても同様に比較実験を行ったが、何れの場合にも、本発明に基づく方法で作出したサンプルからのみ安定的かつ特異的な信号が検出された。これに対して、保護鎖なしで標的核酸を１本鎖ＤＮＡのままでターゲットとして検出を行った場合や、標的核酸と別途合成した保護鎖を混合して熱変性およびアニ―リングによりターゲットを作成して検出を行った場合など、従来法を用いた場合では、図１４と同様にほとんどの場合において好ましい結果は得られなかった。
【０１３６】
また、図４に示す本発明の第３の例に従ってターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。即ち、標的核酸として２本鎖核酸を用い、互いに異なる部位を標的配列とし、２本鎖標的核酸に含まれる各々の鎖から夫々にターゲットを作成した。また更に、図８に示す本発明の第７の例に従ってターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。即ち、標的核酸として２本鎖核酸を用い、互いに相補的な部位を夫々標的配列とし、２本鎖標的核酸に含まれる各々の鎖から夫々にターゲットを作成した。以上のような本発明の方法に従って２本鎖標的核酸から２種類のターゲットを作出し、それを用いて標的配列を検出する方法を行った結果は何れの場合にも、標的配列に対する特異的なハイブリダイゼーションが確認された。また、これらの結果と従来の方法と比較すると、本発明に係る方法は、何れの従来の方法よりも高感度に標的配列を検出することが可能であった。
【０１３７】
以上の結果から、本発明の方法による検出は、従来法に比べて、特異的、効率的および高感度に標的核酸を検出することが可能であった。従って、標的ＤＮＡを作出する際の経済性および操作性が向上される。
【０１３８】
実施例３
上述したストッパー核酸を用いる本発明に係るターゲット作出方法における種々の条件を検討した。ＭＢＬ遺伝子コード領域のＳＮＰを含む領域に対応する１本鎖ＤＮＡを標的核酸として利用し、プライマーとして使用する添加するオリゴＤＮＡの種類を変えて標的核酸構造を作出した。その後、同領域上のＳＮＰを検出するための核酸プローブ固定化基体をもちいてＭＢＬ遺伝子のＳＮＰの検出を行った。
【０１３９】
ＭＢＬ遺伝子中で検出したいＳＮＰを含む領域と同じ配列（配列番号１）を持つ標的１本鎖ＤＮＡを標的核酸として用意した。これを終濃度１０１２コピー／ｍｌ程度となるように合成および増幅して調整した。ストッパー核酸は、以下のような配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４で示される３’リン酸化オリゴＤＮＡを用意した。終濃度０．４μＭの何れかのストッパー核酸、即ち、３’リン酸化オリゴＤＮＡ（配列番号２、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４）と、プライマーとして終濃度０．２μＭのオリゴＤＮＡ（配列番号３）と、終濃度０．０４Ｕ／μｌの耐熱性ＤＮＡ合成酵素Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔａｋａｒａ）を標的核酸に添加した。使用したストッパー核酸およびプライマーの配列は以下の通りである；
配列番号２：ＧＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＣ
配列番号１２：ＧＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡ
配列番号１３：ＣＡＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡ
配列番号１４：ＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＣ
配列番号３：ＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴ。
【０１４０】
続いて、至適酵素反応溶液組成にて６６℃１０分間反応を行って核酸を伸長した。反応後、１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液および１／９量の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加し、予め３’末端にチオール基を導入し金電極上に固定化した配列番号４および配列番号５により示される配列を有する核酸プローブと３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１４１】
その結果、何れの実験区からも特異的な信号が得られたが、ストッパー核酸である３’リン酸化オリゴＤＮＡとして配列番号２または配列番号１２を用い、これとプライマーであるオリゴＤＮＡ配列番号３と耐熱性ＤＮＡ合成酵素を添加した実験区については、ストッパー核酸である３’リン酸化オリゴＤＮＡとして配列番号１３または配列番号１４を用いた場合に比べて、対応するＳＮＰを検出する核酸プローブに特異的なハイブリダイゼーションが行われたことを示す電流信号がより高感度に検出された。即ち、以上の結果から、本発明の方法により標的ＤＮＡを作出する際には、ストッパー核酸である３’リン酸化オリゴＤＮＡの３’末端と核酸プローブの５’末端とが隣接するように設計することがより好ましいことが明らかになった。
【０１４２】
実施例４
本発明に係る、プライマーの結合位置を調節することにより所望のターゲットを製造する方法について、そのターゲット製造条件を更に検討した。ＭｘＡ遺伝子プロモーター領域のＳＮＰを含む領域に対応する１本鎖ＤＮＡを標的核酸として用いた。使用するプライマーの配列を複数用意し、それらを用いてターゲットを作出した。得られたターゲットを、同領域上のＳＮＰを検出するための核酸プローブ固定化基体に添加して反応させ、ＭｘＡ遺伝子のＳＮＰ検出を行った。
【０１４３】
ＭｘＡ遺伝子中で検出したいＳＮＰを含む領域と同じ配列を持つ１本鎖ＤＮＡ（配列番号７）を標的核酸として用いた。このような標的核酸を合成し増幅して調整した。プライマーとして、３種類の配列（配列番号８、配列番号１５または配列番号１６）の何れかを有する核酸を用意した。終濃度０．４μＭのプライマーと終濃度０．０４Ｕ／μｌのＰＣＲ用酵素Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔａｋａｒａ）を当該標的核酸に添加した。添加したプライマーの配列は以下の通りである；
配列番号８：ＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣ
配列番号１５：ＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣ
配列番号１６：ＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣ。
【０１４４】
前記標的核酸、プライマーおよび酵素の混合物を至適酵素反応溶液組成にて６６℃１０分間反応を行った。反応後、１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液、１／９量の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加し、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、５’末端にチオール基が導入され基板に具備される金電極に固定化された配列番号９および配列番号５に示される核酸を夫々核酸プローブとして含む。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１４５】
その結果、何れの実験区からも対応するＳＮＰを検出する核酸プローブに特異的なハイブリダイゼーションが行われたことを示す電流信号が検出された。特に、使用したプライマーの配列によって得られた信号強度に差が見られたことは興味深い。信号強度とプライマー配列の関係は、配列番号８＞＞配列番号１５＞配列番号１６の順であった。即ち、以上の結果から、本発明の方法によりターゲットを作出する際には、添加するプライマーの５’末端と核酸プローブの３’末端とが、隣接するように設計することがより好ましいことが分かった。
【０１４６】
実施例５
上述した図６に示す第５の例に係る方法によりターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。本実施例では、２本鎖核酸を標的核酸として用いる場合の条件について検討した。即ち、ＭＢＬ遺伝子コード領域のＳＮＰを含む領域に対応するＰＣＲ産物を標的核酸として用い、幾つかの異なる条件下で本発明に係るターゲットを作出した。得られたターゲットを、同領域上のＳＮＰを検出するための核酸プローブを固定化した基体である核酸プローブ固定化チップを用いて、ＭＢＬ遺伝子のＳＮＰ検出を行った。
【０１４７】
予めＳＮＰ型の判明しているヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７と配列番号３を夫々に含むオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ法を行った。このＰＣＲにより、ＭＢＬ遺伝子における検出しようとするＳＮＰの含まれる領域が増幅された。この増幅産物に対して、終濃度０．４μＭのストッパー核酸である３’リン酸化オリゴＤＮＡ（配列番号２）および終濃度０．０４Ｕ／μｌの耐熱性ＤＮＡ合成酵素Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔａｋａｒａ）、並びに終濃度０．２μＭの第１のプライマーであるオリゴＤＮＡ（配列番号１７）および／または終濃度０．２μＭの第２のプライマーであるオリゴＤＮＡ（配列番号３）を添加した。使用したオリゴＤＮＡの配列は以下の通りである；
配列番号１７：ＧＴＣＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＴＧＣ
配列番号３：ＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴ
配列番号２：ＧＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＣ。
【０１４８】
次に、至適酵素反応溶液組成にて９５℃５分、６６℃１０分間の反応を行った。反応後、１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液、１／９量の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加し、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、３’末端にチオール基を導入することにより、基板に具備される金電極に固定化された配列番号４および配列番号５に示される核酸を各々核酸プローブとして含む。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１４９】
その結果、ＰＣＲ産物に対してプライマーとしての配列番号１７のオリゴＤＮＡおよび配列番号３のオリゴＤＮＡ、ストッパー核酸としての配列番号２の３’リン酸化オリゴＤＮＡ、並びに耐熱性ＤＮＡ合成酵素を全て添加した実験区のみから、対応するＳＮＰを検出する核酸プローブに特異的なハイブリダイゼーションの行われたことを示す信号が検出された。更に異なる複数種の標的核酸を用意し、それらに対して同様な実験を行った。その結果、何れの場合も、安定的且つ特異的に信号を検出できたのは、上述と同様の方法でターゲットを作出した場合にのみであった。それに対して、それ以外の方法でターゲットを作出した場合には、ほとんどの場合に好ましい結果は得られなかった。また、上述のように増幅産物を標的核酸として使用する場合、上述のようなＰＣＲ法以外の何れの増幅手段により得られた増幅産物であっても標的核酸として使用することが可能である。例えば、ＩＣＡＮ産物に関しても上記と同様な方法でターゲットを作出し（図１５を参照されたい）、得られたターゲットを用いても同様に良好な標的配列の特異的検出が確認された。以上の結果から、２本鎖核酸を標的核酸として用いて本発明に係るターゲットを作出する場合には、核酸プローブとの反応時に、標的核酸に対して相補的な鎖が遊離した１本鎖核酸としてハイブリダイゼーション溶液中に存在しないことが望ましいことが明かになった。従って、標的核酸である２本鎖の両方の鎖が、当該ハイブリダイゼーション時には２本鎖となるように、プライマーが添加されることが望ましい。
【０１５０】
実施例６
本実施例では、上述した図３に示す第２の例に係る方法によりターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。本実施例では、２本鎖核酸を標的核酸として用いる場合の条件について検討した。即ち、ＭｘＡ遺伝子プロモーター領域のＳＮＰを含む領域に対応するＰＣＲ産物を標的核酸として用い、幾つかの異なる条件下で本発明に係るターゲットを作出した。得られたターゲットを、同領域上のＳＮＰを検出するための基体に核酸プローブを固定化した核酸プローブ固定化チップを用いて、ＭｘＡ遺伝子のＳＮＰを検出した。
【０１５１】
予めＳＮＰ型の判明しているヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８と配列番号１９を夫々に含むオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ法を行った。このＰＣＲにより、ＭｘＡ遺伝子における検出しようとするＳＮＰの含まれる領域が増幅された。この増幅産物に対して、終濃度０．４μＭの第１のプライマーであるオリゴＤＮＡ（配列番号１８）および／または第２のプライマーであるオリゴＤＮＡ（配列番号８）、並びに終濃度０．０４Ｕ／μｌのＰＣＲ用酵素Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔａｋａｒａ）を添加した。添加したオリゴＤＮＡの配列は以下の通りである；
配列番号１８：ＧＡＧＣＴＡＧＧＴＴＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣ
配列番号１９：ＣＧＣＴＡＧＴＣＴＣＣＧＣＣＡＣＧＡＡＣ
配列番号８：ＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣ。
【０１５２】
次に、至適酵素反応溶液組成にて９５℃５分、６６℃１０分間の反応を行った。反応後、１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液、１／９量の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加し、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、５’末端にチオール基を導入することにより、基板に具備される金電極上に固定化された配列番号９および配列番号１０に示される核酸を各々核酸プローブとして含む。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１５３】
その結果、ＰＣＲ産物に対してプライマーとしての配列番号１９のオリゴＤＮＡおよび配列番号８のオリゴＤＮＡ、並びに耐熱性ＤＮＡ合成酵素を添加した実験区のみから、対応するＳＮＰを検出する核酸プローブに特異的なハイブリダイゼーションの行われたことを示す信号が検出された。更に異なる複数種の標的核酸を用意し、それらに対して同様な実験を行った。その結果、何れの場合も、安定的且つ特異的に電流信号を検出できたのは、上述と同様の方法でターゲットを作出した場合にのみであった。それに対して、それ以外の方法でターゲットを作出した場合には、ほとんどの場合に好ましい結果は得られなかった。また、上述のように増幅産物を標的核酸として使用する場合、上述のようなＰＣＲ法以外の何れの増幅手段により得られた増幅産物であっても標的核酸として使用することが可能である。例えば、ＩＣＡＮ産物に関しても上記と同様な方法でターゲットを作出し（図１６を参照されたい）、得られたターゲットを用いても同様に良好な標的配列の特異的検出が確認された。以上の結果から、２本鎖核酸試料を標的核酸として用いて本発明に係るターゲットを作出する場合には、核酸プローブとの反応時に、標的核酸に対して相補的な核酸が遊離した１本鎖核酸としてハイブリダイゼーション溶液中に存在しないことが望ましいことが明らかになった。従って、標的核酸である２本鎖の両方の鎖が当該ハイブリダイゼーション時には２本鎖となるようのに、プライマーが添加されることが望ましい。
【０１５４】
実施例７
本実施例では、上述した図１１に示す第１０の例および図１２に示す第１１の例のように酵素により１本鎖核酸部分を形成する方法に従って、ターゲットを製造した。このターゲットにより標的配列を検出した結果と、従来法により作成したターゲットを用いて標的配列を検出した結果を比較した。標的核酸としてイネゲノムを用い、標的配列を含むイネゲノムＰＣＲ増幅断片の存否判定を、核酸プローブを固定化した基体を用いて行った。
【０１５５】
まず、精米からイネゲノムＤＮＡを抽出し調整した。このイネゲノムＤＮＡを以下の４つのプライマーを用いて、これらのプライマーによって挟まれる領域をＰＣＲによって増幅した。使用したプライマーの配列は以下の通りである；
プライマー；
配列番号２０：ｔａｃＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＴＡＴＡＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴ
配列番号２１：ＡＴＣＣＣＴＣＧＡＴＣＣＣＴＣｔａｇＣＡＴＴＡＴ
配列番号２２：ＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＴＡｔａｃＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴ
配列番号２３：ａｔｃＣＣＴＣＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＧＣＡＴＴＡＴ
ここで、これらの配列、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３において小文字表記した塩基は、その３’側に存在するフォスフォジエステル結合部分にホスホロチオエート修飾が施されている。
【０１５６】
当該増幅産物に、Ｔ７  Ｇｅｎｅ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅと添付バッファーを添加し、至適条件下で完全消化を行った。反応後、酵素反応液に１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液、１／９量の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加し、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、５’末端にチオール基を導入することにより、基板に具備される金電極上に固定化された配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６により示される核酸を各々核酸プローブとして含む。
【０１５７】
核酸プローブ；
配列番号２４：ＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＴＡ
配列番号２５：ＡＴＣＣＣＴＣＧＡＴＣＣＣＴＣ
配列番号２６：ＡＣＡＡＣＧＣＣＴＣＣＧＡＴＧ（対照用）。
【０１５８】
また、このハイブリダイゼーション反応を行なう際には、対照実験としてＰＣＲ産物にＴ７  Ｇｅｎｅ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理を行っていないもの、ホスホロチオエート修飾を行っていないプライマーでＰＣＲ増幅を行ったもの、Ｔ７  Ｇｅｎｅ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理を行ったもの、従来法である「部分二重鎖ＤＮＡを利用したＤＮＡ検出方法」（特開平１１−３３２５６６）の方法に従って作出した標的構造についても同様にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１５９】
その結果、ＰＣＲ産物にＴ７  Ｇｅｎｅ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理を行っていない場合、およびホスホロチオエート修飾を行わないプライマーでＰＣＲ増幅しＴ７  Ｇｅｎｅ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理を行った場合、ＰＣＲをプライマー配列番号２０と配列番号２３の組み合わせで行ってＴ７  Ｇｅｎｅ６Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅで処理した場合においては、ハイブリダイゼーションが生じたことを示す結果は得られなかった。また、「部分二重鎖ＤＮＡを利用したＤＮＡ検出方法」（特開平１１−３３２５６６）に従って作出した標的では、ある程度の信号が得られるもののバックグラウンドの信号が大きくなりＳ／Ｎ＝１．２程度であった。これに対し、当該ＰＣＲを、プライマー配列番号２０と配列番号２１の組み合わせで行った場合では核酸プローブ配列番号２４により、またプライマー配列番号２２と配列番号２３の組み合わせでＰＣＲを行った場合では核酸プローブ配列番号２５によって特異的な信号がＳ／Ｎ＞＞２で得られた（図１７）。また、配列番号２１と配列番号２２の組み合わせでＰＣＲを行った場合では、配列番号２４と配列番号２５の両方の核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションがＳ／Ｎ＞＞２で行われたことを確認することができた。更に、複数のＰＣＲ断片が同時に存在するマルチプレックスＰＣＲ産物についても実験を行った。その結果、本発明の方法によりターゲットを作出した場合、従来の方法に比べて高い特異性が観察された。以上の結果から、本発明の方法によりターゲットを作出する場合では、従来に比べて経済性および操作性が向上し、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能となることが示された。
【０１６０】
実施例８
マルチプレックスＰＣＲによる増幅産物に対して本発明に従うターゲット製造方法を適用し、それにより得られた産物をハイブリダイゼーションによる検出に使用した例を以下に説明する。
【０１６１】
予めＳＮＰ型の判明しているヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＭｘＡ遺伝子プロモーター領域およびＭＢＬ遺伝子コード領域のうちのＳＮＰを含む領域を増幅するために、プライマー配列番号１７、配列番号３、配列番号１８および配列番号１９を用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。反応後ＰＣＲ産物に終濃度０．４μＭのプライマー（配列番号８）と終濃度０．４μＭのストッパー核酸としての３’リン酸化オリゴＤＮＡ（配列番号２）と、各々終濃度０．２μＭの２種類のプライマー（各々配列番号１７または配列番号１９を有す）と終濃度０．０４Ｕ／μｌのＰＣＲ用酵素Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔａｋａｒａ）、を添加して、９５℃５分間、６６℃１０分間で反応を行った。
【０１６２】
ここで使用した夫々のオリゴＤＮＡの配列は以下の通りである。
【０１６３】
配列番号１７：ＧＴＣＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＴＧＣ
配列番号３：ＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴ
配列番号１８：ＧＡＧＣＴＡＧＧＴＴＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣ
配列番号１９：ＣＧＣＴＡＧＴＣＴＣＣＧＣＣＡＣＧＡＡＣ
配列番号２：ＧＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＣ
配列番号８：ＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣ。
【０１６４】
当該反応後、酵素反応液に１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液、１／９量の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加し、これを予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加して、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、固定化核酸プローブとして、予め３’末端にチオール基を導入され基板に具備される金電極上に固定化された配列番号４および配列番号５の核酸と、予め５’末端にチオール基を導入され基板に具備される金電極上に固定化された配列番号９および配列番号１０の核酸を具備する。当該ハイブリダイゼーションの後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。その結果、対応するＳＮＰを検出する核酸プローブにおいてハイブリダイゼーションの生じたことを示す特異的な電流信号が検出された。
【０１６５】
以上の結果から、本発明に従う方法によりターゲットを形成し、それを標的配列の検出に用いると、複数種のＤＮＡ断片混合液を試料とした場合であっても高い特異性をもって標的配列の検出が可能であることが明らかとなった。
【０１６６】
実施例９
本実施例では、上述した図９に示す第８の例のように、１本鎖核酸である標的核酸上に存在する２ヶ所の標的配列を同時に検出することの出来るターゲットを作成し、これを用いたハイブリダイゼーションによって標的配列の検出を行った。
【０１６７】
ＭＢＬ遺伝子の配列であって、ＳＮＰ領域を両端に含むＤＮＡ領域と同一の配列（配列番号２７）を有する標的１本鎖ＤＮＡを標的核酸とした。この標的核酸を合成し増幅して、終濃度１０１２コピー／ｍｌ程度となるように調整した。これに、終濃度０．４μＭのプライマー配列番号２８、ストッパー核酸としての終濃度０．４μＭの３’リン酸化オリゴＤＮＡ配列番号２、および終濃度０．０４Ｕ／μｌのＰＣＲ用酵素Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔａｋａｒａ）を添加し、６６℃１０分間で反応を行った。ここで、使用したオリゴＤＮＡの配列は以下の通りである。
【０１６８】
配列番号２：ＧＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＣ
配列番号２８：ＣＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧＡＡＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＣＣ
当該反応後、酵素反応液に１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液、１／９量の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加した。これを、予め３’末端にチオール基を導入し金電極上に固定化した配列番号４を有する核酸プローブおよび配列番号５を有する核酸プローブ、並びに予め５’末端にチオール基を導入し金電極上に固定化した配列番号２９を有する核酸プローブおよび配列番号３０を有する核酸プローブに対して添加し、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【０１６９】
その結果、対応するＳＮＰを検出する核酸プローブに対してハイブリダイゼーションの生じたことを示す特異的な信号が検出された。また、同様な設計により図１０に示す第９の例のような本発明に従う方法によっても、１本鎖の標的核酸上に３箇所以上の標的配列が存在する場合のターゲットを作成した（図１０）。作成されたターゲットを用いて当該４箇所の標的核酸を検出したところ、特異的なハイブリダイゼーションの得られたことが確認された。
【０１７０】
以上の結果から、本発明に従う方法によって、１本鎖の標的核酸上に存在する複数箇所の標的配列を同時に検出することが可能である。
【０１７１】
また、上述の実施例１から実施例９におけるターゲットの検出は、金電極上での電流応答を利用した電気化学的検出方法により行った例を示した。しかしながら、実施例１から実施例９の何れも、製造したターゲットに対して蛍光標識物質をそれ自身公知の方法により付与し、対応する核酸プローブを固定化した基体に対して夫々反応させた後で蛍光強度を測定することによっても、同様に検出を行うことが可能であった。
【０１７２】
【発明の効果】
本発明に基づく方法を用いると、標的核酸設計の際の自由度が得られると共に標的核酸検出における特異性、効率性および感度が向上され、且つ低費用および／または短時間で標的核酸構造を作出することが可能になる。
【０１７３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の概要を示す図。
【図２】本発明の１態様である第１の例を示す図。
【図３】本発明の１態様である第２の例を示す図
【図４】本発明の１態様である第３の例を示す図
【図５】本発明の１態様である第４の例を示す図
【図６】本発明の１態様である第５の例を示す図
【図７】本発明の１態様である第６の例を示す図
【図８】本発明の１態様である第７の例を示す図
【図９】本発明の１態様である第８の例を示す図
【図１０】本発明の１態様である第９の例を示す図
【図１１】本発明の１態様である第１０の例を示す図
【図１２】本発明の１態様である第１１の例を示す図
【図１３】実施例１において、本発明に従う方法により製造したターゲットを用いて標的配列を検出した結果を示す図。
【図１４】実施例２において、本発明に従う方法により製造したターゲットを用いて標的配列を検出した結果を示す図。
【図１５】実施例５において用いた本発明の１例を示す図。
【図１６】実施例６において用いた本発明の１例を示す図。
【図１７】実施例７において、本発明に従う方法により製造したターゲットを用いて標的配列を検出した結果を示す図。
【符号の説明】
１，２１，３１，４１，５１，６１，７１，８１，９１，１０１，１１１，１２１，１５１，１６１．標的核酸    ２，２２，３２，４２，５２，６２，７２，８２，９２，９３，１０２，１１２，１２２，１５２，１６２．標的配列    ３，２４，３４，４４，５４，６４，７４，８４，９６，１０６，１１４，１２４，１５４，１６４．保護鎖    ４，２５，３５，４５，５７，６７，７６，８６，９７，１０７，１１６，１２６，１５６，１６５．ターゲット    ５，２６，３７，４６，５６，６９，７７，８７，９８，９９，１０８，１１５，１２５，１５８，１６７．核酸プローブ    ２３，３３，４３，５３，６３，７３，８３，９４，１０３，１１３，１２３，１５３，１６３．プライマー    ３６，６８，１５７，１６６．２本鎖核酸    ５５，６５，７５，８５，９５，１０５，１５５，．ストッパー核酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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