(57)【要約】【課題】分子生物学的に植物の形態を変化させる手段、特に分子生物学的に植物の側枝の形態を変化させる手段を提供することである。【解決手段】種子を変異処理した後、その種子を発芽・育成し、乱れ毛型形態のシュートを指標として選択した植物から単離した変異アクチンＡｃｔタンパク質およびその変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質ならびにそれらのタンパク質をコードする遺伝子を提供する。更には、当該遺伝子を導入することにより、乱れ毛型の植物を取得する方法を提供する。本発明により、植物において、結束作業の軽減化、受光態勢の改善、誘引結束作業の容易化、耐風性の向上および矮化が可能となる。更に本発明には癌転移を抑制するといった用途もある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子を変異処理した後、その種子を発芽・育成し、乱れ毛型形態のシュートを指標として選択した植物から単離した変異アクチンＡｃｔタンパク質。
【請求項２】
アクチンＡｃｔタンパク質のアミノ酸配列中の２０７位または２７２位の何れか一方またはその両方のアミノ酸が変異した変異アクチンＡｃｔタンパク質。
【請求項３】
アクチンＡｃｔタンパク質のアミノ酸配列とアクチンＡｃｔ相同タンパク質のアミノ酸配列とのアライメントにおいて、当該アクチンＡｃｔタンパク質のアミノ酸配列中の２０７位または２７２位の何れか一方またはその両方のアミノ酸に相当するアミノ酸が変異している変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質。
【請求項４】
変異が置換である、請求項１から３の変異アクチンＡｃｔタンパク質または変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質。
【請求項５】
置換がグルタミン酸からリシンへの置換である、請求項４の変異アクチンＡｃｔタンパク質または変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質。
【請求項６】
請求項１から５の変異アクチンＡｃｔタンパク質または変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項６の遺伝子を導入した植物。
【請求項８】
請求項６の遺伝子を導入することにより、乱れ毛型形態の植物を取得する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異アクチンＡｃｔタンパク質、特に変異アクチンＡｃｔ８タンパク質および変異アクチンＡｃｔ２タンパク質、それらのタンパク質をコードする遺伝子、それらのタンパク質を発現する植物、およびその植物を取得する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
観賞価値を高めるのため、植物の形態、樹形や草姿を変化させることは、従来から為されていることである。植物の形態を変化させるための手段として、物理的手段（例えば、特開２００１−３２０９６４）および化学的手段（例えば、特開２００１−３３５４０６）は既知のものである。ところが、分子生物学的に植物の形態を変化させる手段、特に分子生物学的に植物の側枝の形態を変化させる手段はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
分子生物学的に植物の形態を変化させる手段、特に分子生物学的に植物の側枝の形態を変化させる手段を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
鋭意研究の結果、発明者らは、側枝、本枝その他の部分の形態が乱れ毛のように変化したシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）優性変異株の単離に成功した（図１−３参照）。そこで、本明細書では、乱れ毛型の形態をしたシロイヌナズナ、特に側枝が乱れ毛型の形態をしたシロイヌナズナを提供する。ここで、その乱れ毛型の形態をしたシロイヌナズナは、種子をＥＭＳなどの化学物質により変異処理し、その種子から発芽させ、育成し、得られたものである。また、その形質と類似の形質を示す別のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）優性変異株の単離にも成功した。
【０００５】
更に、発明者らは、乱れ毛型の形態をしたシロイヌナズナの原因を調査するため、乱れ毛型の形態をしたシロイヌナズナの遺伝子配列を調べ、その遺伝子配列から得られる推定アミノ酸配列と既知の野生型アミノ酸配列と比較したところ、アクチンＡｃｔ８タンパク質の一部に変異が入っていることがわかった（野生型のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列自体は既知である）。更に、発明者らは、上記と性質の似た別のシロイヌナズナについても原因を調査するため、このシロイヌナズナの遺伝子配列を調べ、その遺伝子配列から得られる推定アミノ酸配列と既知の野生型アミノ酸配列と比較したところ、アクチンＡｃｔ２タンパク質の一部に変異が入っていることがわかった。そのため、変異の入ったアクチンＡｃｔ８タンパク質、および変異の入ったアクチンＡｃｔ２タンパク質がシロイヌナズナの乱れ毛型形態の要因であり、その両タンパク質はシロイヌナズナを乱れ毛型形態とする機能・特徴を有するといえる。なお、アクチンＡｃｔ８タンパク質およびアクチンＡｃｔ２タンパク質とは、シロイズナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）で発見されたアクチンタンパク質の一種である。当該アクチンタンパク質というは、すべての真核細胞中に不偏的に存在し、その多量体はフィラメント状（アクチンフィラメント）となり、細胞形態の維持、またはミオシンとの相互作用により生物、組織、および細胞の運動に関わっている。特に、動物では、ミオシンと共に筋線維を構成し、そのミオシンンとの相互作用により、生体の運動の源となっている。
【０００６】
上記の事実により、本明細書では、種子を変異処理した後、その種子を発芽・育成し、乱れ毛型形態のシュートを指標として選択した植物から単離することにより得られる変異アクチンＡｃｔタンパク質を提供する。なお、本明細書で「アクチンＡｃｔタンパク質」という語句には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の野生型アクチンＡｃｔ８タンパク質および野生型アクチンＡｃｔ２タンパク質の両方のタンパク質が含まれる。更に、本明細書で、「変異」とは、本発明の属する技術分野の当業者が通常用いる解釈の通りであり、塩基またはアミノ酸残基の挿入、置換および欠失をいい、「変異処理」とは、変異を入れるための処理、または変異を誘発させるための処理をいう。なお、当該変異処理、すなわち、植物細胞に突然変異を誘発する方法は、当業界で既知の任意の技術にしたがって実施できる。該方法は、化学物質、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、およびブレオマイシン類よりなる群から選択される化学突然変異誘発物質を使用し得る。また、当該方法は、ＵＶ、γ線、Ｘ線、および高速ニュートロンよりなる群から選択される放射線を照射することによっても実施し得る。
【０００７】
ここで、アクチンＡｃｔ８タンパク質に入っていた変異というのは、当該アクチンＡｃｔ８タンパク質のアミノ酸配列中の２７２位のグルタミン酸がリシンに置換されているものであった（図４参照）。また、アクチンＡｃｔ２タンパク質に入っていた変異というのは、当該アクチンＡｃｔ２タンパク質のアミノ酸配列中の２０７位のグルタミン酸がリシンに置換されているものであった（図４参照）。そこで、本明細書では、野生型アクチンＡｃｔ８タンパク質のアミノ酸配列中の２７２位のグルタミン酸が変異した変異アクチンＡｃｔ８タンパク質、および野生型アクチンＡｃｔ２タンパク質のアミノ酸配列中の２０７位のグルタミン酸が変異した変異アクチンＡｃｔ２タンパク質を提供し、特に当該変異が置換である変異アクチンＡｃｔタンパク質を提供する。本明細書でいう置換は、グルタミン酸からリシンへの置換に限られず、グルタミン酸以外のアミノ酸に置換される場合も含まれる。しかし、好ましくは、グルタミン酸からアルギニン、リシンまたはヒスチジンへの置換であり、特に好ましくは、グルタミン酸からリシンへの置換である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
図４は、アクチンＡｃｔ８タンパク質とアクチンＡｃｔ２タンパク質とのアライメントを示したものであるが、当該図から明らかな通り、アクチンＡｃｔ８タンパク質のアミノ酸配列とアクチンＡｃｔ２タンパク質のアミノ酸配列との間には、相当高い相同性がある。この点を考慮すると、
（１）野生型アクチンＡｃｔ８タンパク質のアミノ酸配列中の２７２位のグルタミン酸が変異した変異アクチンＡｃｔ８タンパク質、
（２）野生型アクチンＡｃｔ２タンパク質のアミノ酸配列中の２０７位のグルタミン酸が変異した変異アクチンＡｃｔ２タンパク質、
（３）野生型アクチンＡｃｔ８タンパク質のアミノ酸配列中の２０７位のグルタミン酸が変異した変異アクチンＡｃｔ８タンパク質、
（４）野生型アクチンＡｃｔ２タンパク質のアミノ酸配列中の２７２位のグルタミン酸が変異した変異アクチンＡｃｔ２タンパク質、
（５）野生型アクチンＡｃｔ８タンパク質のアミノ酸配列中の２０７位および２７２位の両方のグルタミン酸が変異した変異アクチンＡｃｔ８タンパク質、ならびに
（６）野生型アクチンＡｃｔ２タンパク質のアミノ酸配列中の２０７位および２７２位の両方のグルタミン酸が変異した変異アクチンＡｃｔ２タンパク質
の６種類のタンパク質（本明細書において「６種類のタンパク質」と称する）は、すべて同じ機能・特徴を有するといえる。
【０００９】
そのため、本明細書では、アクチンＡｃｔタンパク質のアミノ酸配列中の２０７位または２７２位の何れか一方またはその両方のアミノ酸が変異した変異アクチンＡｃｔタンパク質を提供する。
【００１０】
上記のように、乱れ毛型の形態をしたシロイヌナズナのアクチンＡｃｔ８タンパク質とアクチンＡｃｔ２タンパク質の推定アミノ酸配列を調べたところ、アクチンＡｃｔ８タンパク質では当該アミノ酸配列中の２７２位のグルタミン酸がリシンに、アクチンＡｃｔ２タンパク質では当該アミノ酸配列中の２０７位のグルタミン酸がリシンに置換されていた。更には、上記６種類のタンパク質はすべて同じ機能・特徴を有する。これらの事実は、上記６種類のタンパク質をコードする変異アクチンＡＣＴ遺伝子（本明細書で「アクチンＡＣＴ遺伝子」という語句には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の野生型アクチンＡＣＴ８遺伝子および野生型アクチンＡＣＴ２遺伝子の両方の遺伝子が含まれる）をシロイヌナズナまたは他の植物に導入すれば、導入されたシロイズナズナまたは他の植物は乱れ毛型の形態となることを意味する。そこで、本明細書では、上記６種類のタンパク質をコードする変異アクチンＡＣＴ遺伝子を提供する。更には、上記６種類のタンパク質をコードする変異アクチンＡＣＴ遺伝子を導入した植物を提供する。また更には、それらの遺伝子を導入することにより、乱れ毛型形態の植物を取得する方法を提供する。
【００１１】
本発明の遺伝子（ＤＮＡ）を植物細胞に導入するプロセスは、慣行の組換えＤＮＡ技術を使用して実施できる。このような技術は、例えば、「秀潤社植物細胞工学シリーズ４『モデル植物の実験プロトコール』、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ３：  ２７１７−２７２２（１９８４）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ：  １９９：１６９−１７７（１９８５）；Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｓｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１００１−１００４（１９８６）；及びＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：  ７０−７３（１９８７）、Ｈｏｅｆｇｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：  ９８７７（１９８８）、特許出願ＥＰ０２９２４３５、ＥＰ０３９２２２５、及びＷＯ９３／０７２７８、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：  ６０３−６１８（１９９０））およびＦｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（１９９０））、ＷＯ９３／０７２７８及びＫｏｚｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：  １９４−２００（１９９３））、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ７：  ３７９−３８４（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：  ２７４−２７７（１９８９）；  Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８；  ７３６−７４０（１９９０）、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：  ９５７−９６２（１９９１）、ＷＯ９３／２１３３５、特許出願ＥＰ０３３２５８１、Ｖａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１５５３−１５５８（１９９３）、Ｖａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６６７−６７４（１９９２））及びＷｅｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０２：  １０７７−１０８４（１９９３）、ＷＯ９４／００９７７及び米国特許第５５９１６１６号、Ｓｖａｂ，  Ｚ．  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，  Ｐ．  （１９９３）ＰＡＮＳ  ９０，  ９１３−９１７、Ｗｅｌｓｈ  Ｊ．  Ｒ．  Ｆｕｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ（１９８１）；  Ｃｒｏｐ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  Ｗｏｏｄ  Ｄ．  Ｒ．（Ｅｄ．）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（１９８１）；  Ｍａｙｏ  Ｏ．，  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）；  Ｓｉｎｇｈ，  Ｄ．Ｐ．，  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｅｓｔｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ＮＹ（１９８６）；  Ｗｒｉｃｋｅ  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ，  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  Ｗａｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｂｅｒｌｉｎ（１９８６）」に見出される。
【００１２】
一般に、これは、当業界で既知である標準的クローニング手法を使用して、当該ＤＮＡが異種性である（すなわち通常存在しない）発現系に本発明のＤＮＡ配列を挿入することを含む。植物細胞への導入に用いられる組換えＤＮＡ構築物は、挿入されるタンパク質コード配列の転写および翻訳のため必要なエレメントを含む。多数の当業界で既知のベクター系、例えば、プラスミド、バクテリオファージウイルス、および他の修飾ウイルスを使用できる。好適なベクターは、ウイルスベクター、例えば、ラムダベクター系、λｇｔ１１、λｇｔ１０、およびシャロン４；プラスミドベクター、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＲシリーズ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲＫ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＣＤＮＡＩＩ；および他の類似系を含み得るがこれらに限定されない。形質転換された細胞を、全植物体に再生し、その結果、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を得ることができる。
【００１３】
本発明にしたがって形質転換の対象となる植物は、単子葉または双子葉植物である、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロコッリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、トウガラシ、セルリー、カボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スイカ、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、シロイヌナズナ、および樹木植物、例えば、針葉樹、例えば、スギ、ヒノキ、広葉樹、常緑樹および落葉樹を含み得るがこれらに限定されない。特に、再生可能な植物組織、植物器官および／または植物（個体）が好ましい。
【００１４】
ひとたび望まれるＤＮＡが特定植物種に形質転換されると、その種中で増殖し、または伝統的育種技法を使用して同じ種、とくに商業的変種／品種の他の変種／品種に移し得る。
【００１５】
上記の本発明により得られる植物の形態変化は、予測不可能であり、その変化パターンに法則性はない。そのため、本発明は、観賞用植物を作成する手段としては非常に興味深いものであり、本発明により、観賞価値の高い植物を得ることが出来るといえる。さらに、本発明により、植物における結束作業の軽減化が可能となる。結束作業というのは、誘引ひもおよび結束ひもなどを用い、原則として一箇所ずつ手作業で行う必要があり、非常に煩雑であると同時に多大の労力および時間を必要とし、作物のような植物生産の過程において高コストの要因となり得る。しかし、本発明により得られた植物では、その植物の側枝は乱れ毛型形態となるため、棚、ネットのような支柱に絡むことが容易となり、野生型と比較すれば、断然、結束作業が軽減化されることになる。また、本発明により得られた植物では、主に側枝が乱れ毛型の形態となるため、受光態勢の改善、誘引結束作業の容易化および耐風性の向上などの利点が得られる。更には、本発明によって植物の丈（高さ）は低くなるため、植物の矮化も可能である。
【００１６】
上記したように、アクチンタンパク質というは、すべての真核細胞中に不偏的に存在する。しかも、異種生物間におけるアクチンタンパク質の相同性は非常に高い（図５参照）。そのため、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）以外の植物から由来し、かつアクチンＡｃｔタンパク質に相同であるタンパク質であって、アミノ酸配列の相同性が８５％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは９５％以上であるタンパク質（本明細書において「アクチンＡｃｔ相同タンパク質」と称する）を保有する、シロイズナズナ以外の植物においても、シロイズナズナと同様のことがいえる。
【００１７】
すなわち、アクチンＡｃｔ相同タンパク質をコードする、アクチンＡＣＴ遺伝子に対応する遺伝子（本明細書において「アクチンＡＣＴ対応遺伝子」と称する）を同定・単離し、その遺伝子を変異させる。その変異により、変異した当該アクチンＡＣＴ対応遺伝子は、変異したアクチンＡｃｔ相同タンパク質（本明細書において「変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質」と称する）をコードすることとなる。そして、変異した当該アクチンＡＣＴ対応遺伝子を、ある植物に導入すれば、変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質が発現し、その植物は乱れ毛型の形態となる。ここでいう、「変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質」には、アクチンＡｃｔタンパク質のアミノ酸配列とアクチンＡｃｔ相同タンパク質のアミノ酸配列とのアライメントにおいて、アクチンＡｃｔタンパク質のアミノ酸配列中の２０７位または２７２位の何れか一方またはその両方のアミノ酸に相当するアクチンＡｃｔ相同タンパク質のアミノ酸が変異している当該アクチンＡｃｔ相同タンパク質も含まれている。そこで、本明細書では、アクチンＡｃｔタンパク質のアミノ酸配列とアクチンＡｃｔ相同タンパク質のアミノ酸配列とのアライメントにおいて当該アクチンＡｃｔタンパク質のアミノ酸配列中の２０７位または２７２位の何れか一方またはその両方のアミノ酸に相当するアミノ酸が変異している変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質、そのタンパク質をコードする遺伝子、ならびにその遺伝子を導入した植物を提供する。更には、その遺伝子を導入することにより、乱れ毛型形態の植物を取得する方法を提供する。なお、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）を植物細胞に導入するプロセスおよび対象となる植物は上記定義の通りである。当該方法により、観賞価値の高い植物を得ることが出来、更には、結束作業の軽減化、および受光態勢の改善、誘引結束作業の容易化、耐風性の向上および植物の矮化などが可能となる。
【００１８】
また、
アクチンＡｃｔ８タンパク質の２０７位または２７２位のアミノ酸、
アライメントにおいて当該アミノ酸に相当する、アクチンＡｃｔ８相同タンパク質のアミノ酸、
アクチンＡｃｔ２タンパク質の２０７位または２７２位のアミノ酸、ならびにアライメントにおいて当該アミノ酸に相当する、アクチンＡｃｔ２相同タンパク質のアミノ酸
は、何れも、３次元構造上の存在位置から、アクチンフィラメントの形成に重要な働きをするアミノ酸である。従って、当該アミノ酸に変異を誘発させると、アクチンフィラメントの形成に変化を与える。
【００１９】
そこで、アクチンＡｃｔ８タンパク質の２７２位のアミノ酸をリシンに置換した変異アクチンＡｃｔ８タンパク質およびアクチンＡｃｔ２タンパク質の２０７位のアミノ酸をリシンに置換した変異アクチンＡｃｔ２タンパク質を発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ変異株において、アクチンフィラメントを観察した。すると、アクチンフィラメントの外見に異常は見られなかった。アクチンＡｃｔ１タンパク質などの他のアクチンタンパク質（野生型）が正常に発現している点を考慮すると、変異アクチンＡｃｔ８タンパク質および変異アクチンＡｃｔ２タンパク質は、アクチンフィラメントの一部として（アクチンＡｃｔ８タンパク質やアクチンＡｃｔ２タンパク質のみでアクチンフィラメント全体が構成されるわけではない）、そのアクチンフィラメントを正常に構成している（当該分野では、いずれの野生型Ａｃｔタンパク質も単独でアクチンフィラメントを構成せず、必ず複数のＡｃｔタンパク質によりアクチンフィラメントは構成されると考えられている）。しかし、変異アクチンＡｃｔ８タンパク質および変異アクチンＡｃｔ２タンパク質がアクチンフィラメントに含まれることによって、そのアクチンフィラメント全体の機能が低下し、乱れ毛型形態のシュートの要因となったといえる。
【００２０】
そして、変異アクチンＡｃｔ８タンパク質およびアクチンＡｃｔ２タンパク質は、アクチンフィラメントの一部として、そのアクチンフィラメントを正常に構成するが、アクチンフィラメント全体の機能を低下することから、例えば、以下に記載するように癌の転移を抑制するような用途もある。
【００２１】
医療の分野では、癌の転移を防ぐため、癌細胞のアクチンフィラメントの機能を欠失させる試みが為されている。しかし、アクチンフィラメントのモノマータンパク質であるアクチンタンパク質の遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）同様、哺乳類にあっても複数存在し、癌細胞のアクチンフィラメントの機能を欠失させるためには、その複数あるアクチン遺伝子をすべて欠失させる必要があり、その欠失は遺伝子治療により行わなければならず非常に困難な操作となる。一方、本願発明の変異アクチンＡｃｔタンパク質または変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質を用いれば、非常に簡単に癌転移を抑制することができる。すなわち、当該タンパク質は、アクチンフィラメントの一部に含まれると当該アクチンフィラメントを正常に構成するが、当該アクチンフィラメント全体の機能を低下してしまうことから、例えば、他の発現系で大量発現させた、変異アクチンＡｃｔタンパク質または変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質を癌細胞中に注入するだけで、癌細胞のアクチンフィラメントの機能を低下させ、結果として癌細胞の転移を抑制することもできる。更に変異アクチンＡｃｔタンパク質または変異アクチンＡｃｔ相同タンパク質をコードする遺伝子を癌細胞に導入する事でも癌細胞のアクチンフィラメントの機能を低下させ、結果として癌細胞の転移を抑制する事ができる。
【００２２】
なお、本明細書の用語の意味は、特記した用語以外、本発明の属する技術分野の当業者が通常用いる意味に解釈すべきである。また、変異処理、遺伝子またはタンパク質の変異、遺伝子導入、塩基配列の決定および植物の発芽・育成は、本発明の属する技術分野の当業者に既知の方法により行う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （１９８９））。
【００２３】
【実施例】
実施例１．
乱れ毛型形態を示す、変異アクチンＡｃｔ８を持つ変異植物体ｆｉｚ１−１の単離。
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の変異体の誘導にＥＭＳを変異原として用いた。０．４％のＥＭＳ溶液にシロイヌナズナ種子（エコタイプはＣｏｌ）を室温で８時間浸した。変異原処理した種子より発芽し、生育した植物体（Ｍ１植物体）がつけた種子（Ｍ２種子）を回収した。Ｍ２種子を播種し、生育させ、その植物の花茎が乱れ毛型形態を示す変異体を単離した。
【００２４】
実施例２．
乱れ毛型形態を示す、変異アクチンＡｃｔ２を持つ変異植物体ｆｉｚ２−１の単離。
ＥＭＳによる変異原処理を施したシロイヌナズナＭ２種子（エコタイプはＣｏｌ）をＬＥＨＬＥ  ＳＥＥＤＳ社より購入した。そのＭ２種子を播種し、生育させ、その植物の花茎が乱れ毛型形態を示す変異体を単離した。
【００２５】
実施例３．
植物の育成条件
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇプレートで発芽後、１−２週間で土に移植する。
培養室の温度は２３℃に保ち、白色蛍光灯による終日照射の条件下で生育させる。種子の回収までこの条件で育てる。
土は、バーミキュライトとメトロミックスを９：１で混合し、表面にパーライト１型を敷く。水は原液のハイポネックス（ハイポネックス  ジャパン）を２０００倍に薄めたものを土が乾燥しないように与える。
【００２６】
実施例４．
植物の発芽条件
種子を滅菌し、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇプレートに播種する。種子の滅菌は、２％次亜塩素酸、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む滅菌水に１０分以上浸した後、１回、滅菌水で洗浄する。
ＭＳプレートの組成は、
４．６５ｇ／ｌ  ＭＳ培地用混合塩
５ｇ／ｌ  ゲランガム
１０ｇ／ｌ  ショ糖
０．１ｇ／ｌ  ミオ・イノシトール
０．０５％  ＭＥＳ（ＫＯＨでｐＨ５．７に調整した）
２０μｇ／ｌ  チアミン塩酸塩
１μｇ／ｌ  ニコチン塩酸塩
１μｇ／ｌ  ピリドキシン塩酸塩
１μｇ／ｌ  ビオチン
となっている。
【００２７】
実施例５．
遺伝子の単離
遺伝子の単離にはポジショナルクローニング法を用いた。ｆｉｚ１−１、ｆｉｚ２−１のエコタイプは共にＣｏｌである。そこで、野性株Ｌｅｒと各変異株とを交配して種子（Ｆ１種子）を得た。さらに、Ｆ１種子を発芽、生育させてＦ２種子を得た。ｆｉｚ１−１花茎の乱れ毛型形態は半優性の遺伝形質である。そこで、Ｆ２種子を播種し、花茎が野生型を示した植物体を選び出した。通常の方法により、選抜された植物体ごとにＤＮＡを抽出し、ＣｏｌとＬｅｒで多型を示すＤＮＡマーカーを用いてＦＩＺ１遺伝子のマッピングを行った。最初、１６本の染色体について調べたところ、第１染色体上のｎｇａ２８０マーカーと強い連鎖が見られ、ＦＩＺ１が第１染色体に座上する事が明らかになった。さらに約１６００染色体を調べたところ、遺伝子座Ａｔ１ｇ４９２４０に存在するＡＣＴ８遺伝子に変異があることが明らかになった。
【００２８】
一方、ＦＩＺ２遺伝子のマッピングについては、最初、１６本の染色体について調べたところ、第３染色体上のｎｇａ１６２と強い連鎖が見られＦＩＺ２が第３染色体に座上する事が明らかになった。さらに約６０染色体を調べたところ、遺伝子座Ａｔ３ｇ１８７８０に存在するＡｃｔ２に変異があることが明らかになった。
【００２９】
実施例６．
遺伝子配列の決定
ｆｉｚ１−１における、ＡＣＴ８遺伝子の変異を同定するために、
ＡＣＴ８＿Ｄ１  ５’−  ＣＣＴＧＧＴＴＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＡＧＴＧ  −３’
ＡＣＴ８＿Ｄｒ  ５’−  ＡＧＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＧＴＴＴＴＣ  −３’
のプライマーの組を用いて、ＡＣＴ８遺伝子のゲノム断片をＰＣＲにより増幅した。増幅したＰＣＲ断片を次に示した各プライマーを用いてシーケンスすることで、変異を同定した。
ＡＣＴ８＿Ｄ１  ５’−  ＣＣＴＧＧＴＴＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＡＧＴＧ  −３’
ＡＣＴ８＿Ｄ２  ５’−  ＴＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＡＣ  ３’
ＡＣＴ８＿Ｄｆ  ５’−  ＧＡＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡ  ３’
ＡＣＴ８＿Ｄｒ  ５’−  ＡＧＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＧＴＴＴＴＣ  −３’
【００３０】
ｆｉｚ２−１における、ＡＣＴ２遺伝子の変異を同定するために、
ＡＣＴ２＿Ｆ１  ５’−  ＣＣＡＧＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＣＴＣＣＧＴＴＴＴ  ３’
ＡＣＴ２＿Ｒ２  ５’−  ＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＡＡＧＣＣＴＴＴＧ  ３’
のプライマーの組を用いて、ＡＣＴ２遺伝子のゲノム断片をＰＣＲにより増幅した。増幅したＰＣＲ断片を次に示した各プライマーを用いてシーケンスすることで、変異を同定した。
ＡＣＴ２＿Ｆ１  ５’−  ＣＣＡＧＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＣＴＣＣＧＴＴＴＴＧ  −３’
ＡＣＴ２＿Ｆ２  ５’−  ＴＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＴＴＴＡＴＡＣＴＣＡＴＴＧ  ３’
ＡＣＴ２＿Ｒ１  ５’−  ＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＧ  ３’
ＡＣＴ２＿Ｒ２  ５’−  ＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＡＡＧＣＣＴＴＴＧ  −３’
【００３１】
ＰＣＲ反応液の組成は、１サンプルあたり
０．２５μｌ  ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造株式会社）
５μｌ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑに添付）
５μｌ  １０ｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑに添付）
１．２５μｌ  ｐｒｉｍｅｒ  （ＡＣＴ８＿Ｄ１）
１．２５μｌ  ｐｒｉｍｅｒ  （ＡＣＴ８＿Ｄｒ）
３７．５μｌ  Ｈ２Ｏ
に、サンプルのＤＮＡ溶液を１μｌ加えたものである。
【００３２】
ＰＣＲ反応の条件は、
2004290048.tif 000002
である。
【００３３】
シーケンス反応は、ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）キットを用いて、その説明書に従った。シーケンスの解析には、ＡＢＩ  ３１００  ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【００３４】
実施例７．
アライメント
ＴＡＩＲやＮＣＢＩによる検索結果を元に、Ｇｅｎｂａｎｋより遺伝子配列、アミノ酸配列を入手した。遺伝子名、遺伝子座ナンバー（ＡｔＸｇＸＸＸＸＸ）は、ＴＡＩＲ等に示された情報に従った。
遺伝子解析ソフトとして、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  Ｖｅｒｓｉｏｎ１０．１  （ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  ＣＯ．，  ＬＴＤ．）を用いた。
ホモロジー検索のために、
Ｔａｉｒ  （Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）の提供する
ＴＡＩＲ  ＢＬＡＳＴ  ２．０  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／Ｂｌａｓｔ／）
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の提供する
ＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）
などを用いた。
マルチアライメントには、
ＥＭＢＬ−ＥＢＩ  （Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｉｒａｔｏｒｙ  −  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の提供するＣｌｕｓｔａｌＷのインターフェース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）を用いた。
マルチアライメント整形ソフトとして、フリーソフトである、ＢｉｏＥｄｉｔ  ｖｅｒ．  ５．０．９：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｅｄｉｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９５／９８／ＮＴ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）を入手し、
これを用いてｃｌａｓｔａｌＷの結果をグラフィック表示した。
【００３５】
【配列表】
2004290048.tif 000003
2004290048.tif 000004
2004290048.tif 000005
2004290048.tif 000006
2004290048.tif 000007
2004290048.tif 000008
2004290048.tif 000009
2004290048.tif 000010
2004290048.tif 000011
2004290048.tif 000012
2004290048.tif 000013
2004290048.tif 000014
2004290048.tif 000015
2004290048.tif 000016
2004290048.tif 000017
2004290048.tif 000018
2004290048.tif 000019
2004290048.tif 000020
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2004290048.tif 000022
2004290048.tif 000023
2004290048.tif 000024
2004290048.tif 000025
2004290048.tif 000026
2004290048.tif 000027
2004290048.tif 000028
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2004290048.tif 000030
2004290048.tif 000031
2004290048.tif 000032
2004290048.tif 000033
2004290048.tif 000034
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、これまでになかった分子生物学的手段による植物の形態を変化させる手段が得られる。そして、この手段により、観賞価値の高い植物を得ることができる。また、本発明により得られた植物では、結束作業が軽減化され、更には、植物における、受光態勢の改善、誘引結束作業の容易化、耐風性の向上および植物の矮化なども可能である。また、更に、本発明により提供される変異アクチンＡｃｔタンパク質は、アクチンフィラメントの一部として、そのアクチンフィラメントを正常に構成するが、アクチンフィラメント全体の機能を低下することから、将来的には、癌の転移を抑制する製剤の材料ともなり得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ）は野生型の花茎（本枝）。（Ｂ）はｆｉｚ１−１がヘテロ接合体の変異体の花茎。
【図２】（Ｃ）はｆｉｚ１−１がホモ接合体の変異体の花茎。（Ｄ）はｆｉｚ２−１がホモ接合体の変異体の花茎。
【図３】（Ｅ）は野生型の側枝。（Ｆ）はｆｉｚ１−１がヘテロ接合体の変異体の側枝。
【図４】野生型アクチンＡｃｔ８タンパク質と、野生型アクチンＡｃｔ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。変異アクチンＡｃｔ８のアミノ酸配列は野生型Ａｃｔ８の２７２位がリシンに置換されている。また、変異アクチンＡｃｔ２のアミノ酸配列は野生型Ａｃｔ２の２０７位がリシンに置換されている。  （矢じりが変異箇所である）。
【図５】異種生物間におけるアクチンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示している（Ｐｌａｎｔ：シロイヌナズナのＡＣＴ８、Ｙｅａｓｔ：酵母［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ］のＡｃｔ１ｐ、Ｈｕｍａｎ：ヒトのｂｅｔａ  ａｃｔｉｎ）。
【図１】
2004290048.tif 000035
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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