(57)【要約】【課題】ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌の中からストレプトコッカス・ミュータンスのみを選択的に単離するための方法及びストレプトコッカス・ミュータンスを選択するための培地を開発する。【解決手段】ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地に、サルファ剤を添加することによって、実質的にストレプトコッカス・ミュータンスのみを単離する方法；及びミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地にサルファ剤を添加したストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地に、サルファ剤を添加することによって、実質的にストレプトコッカス・ミュータンスのみを単離する方法。
【請求項２】
ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地にサルファ剤を添加したストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
【請求項３】
口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地が、ミティス・サリバリウス寒天（Ｍｉｔｉｓ  Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ａｇａｒ；  ＭＳ培地，  Ｄｉｆｃｏ社製）であることを特徴とする、請求項２に記載のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
【請求項４】
サルファ剤が、スルフィソキサゾール、スルファメチゾール、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリミジン、スルファフェナゾール、スルファモノメトキシン、スルファメトキサゾール、スルファチアゾール及びスルフィソミジンからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項２又は３に記載のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
【請求項５】
サルファ剤が、スルフィソキサゾールであることを特徴とする、請求項４に記載のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
【請求項６】
サルファ剤を、０．０５〜０．５ｇ／Ｌの濃度で含有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
【請求項７】
イオノフォア抗生物質をさらに含有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
【請求項８】
イオノフォア抗生物質が、バリノマイシン及び／又はニゲリシンであることを特徴とする、請求項７に記載のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
【請求項９】
イオノフォア抗生物質が、バリノマイシンであることを特徴とする、請求項８に記載のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
【請求項１０】
バリノマイシンを０．００１〜０．０５ｇ／Ｌの濃度で、又はニゲリシンを０．００００１〜０．０００５ｇ／Ｌの濃度で含有することを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
【請求項１１】
バシトラシン及び蔗糖を含有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
【請求項１２】
下記組成を有することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地。
ミティス・サリバリウス培地              ９０ｇ／Ｌ
蔗糖                            ５０〜２００ｇ／Ｌ
バシトラシン                  ５０〜５００単位／Ｌ
バリノマイシン          ０．００１〜０．０５ｇ／Ｌ
スルフィソキサゾール        ０．０５〜０．５ｇ／Ｌ
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、口腔に存在する齲蝕（虫歯）の原因菌（ミュータンス・ストレプトコッキィ又はミュータンス連鎖球菌群）のうち、ストレプトコッカス・ミュータンスを選択的に単離する方法及びストレプトコッカス・ミュータンスのみを選択的に増殖させる培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ヒトの齲蝕の原因菌は口腔に生息する連鎖球菌（口腔連鎖球菌）のうちのストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）であると言われてきた。しかしながら、このストレプトコッカス・ミュータンスが細分化され、現在では、ａ〜ｈの異なる血清型によって識別される細菌種からなる、ミュータンス・ストレプトコッキィ（ｍｕｔａｎｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）と呼ばれる菌群によって齲蝕が引き起こされると考えられている。ミュータンス・ストレプトコッキィに分類される口腔連鎖球菌種としては、ストレプトコッカス・クリセタス、ストレプトコッカス・ラッタス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリヌス及びストレプトコッカス・ダウネイが挙げられる。
【０００３】
さらに、ミュータンス・ストレプトコッキィに分類される細菌のうち、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）が、齲蝕において特に重要な役割を有していると近年では認識されてきている。特に欧州においては、ストレプトコッカス・ソブリヌスの重要性がクローズアップされており、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスの両者が口腔中に存在する場合、ストレプトコッカス・ミュータンス単独の場合よりもカリエスリスクが高いことを示す研究報告もある。
【０００４】
ストレプトコッカス・ミュータンスはヒト口腔から頻繁に分離され、ヒト齲蝕の主要原因菌であると考えられている。しかし、ストレプトコッカス・ソブリヌスもストレプトコッカス・ミュータンスと同様に齲蝕を誘発するという報告、あるいはストレプトコッカス・ソブリヌスは齲蝕との関連性は認められるものの齲蝕の初発との関連性については疑問であるとする報告がある。
【０００５】
すなわち、齲蝕中のストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスの分布並びに齲蝕に対する相対的重要性は未だ明らかにされていないのが現状である。
【０００６】
従来より、口腔内の連鎖球菌（ミュータンス・ストレプトコッキィ）に限らず他の連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の選択培地としてミティス・サリバリウス寒天（Ｍｉｔｉｓ  Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ａｇａｒ；  ＭＳ，  Ｄｉｆｃｏ社製）が使われている。これにショ糖と抗生物質バシトラシン（ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ）を添加したものがミュータンス・ストレプトコッキィの選択培地（ＭＳＢ培地；非特許文献１）として広く使われている。
【０００７】
臨床検体中のミュータンス・ストレプトコッキィは、従来よりコロニー形態により判別されており、ＭＳＢ培地は、ストレプトコッカス・ミュータンスに比べてストレプトコッカス・ソブリヌスの回収率が低いことが知られている。つまり、汎用されている選択培地上のミュータンス・ストレプトコッキィの分布は、口腔内の実際の分布とは一致していない可能性が大きい。また、ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスは、コロニー形状等が酷似しているため、これらのコロニー形態を熟知した研究者でなければ、同一平板培地上での肉眼による区別はできない。
【０００８】
このため、歯垢あるいは齲蝕と個々の細菌の相関などの研究には問題が多いところである。
【０００９】
最近、本発明者らは、ストレプトコッカス・ソブリヌスのみを単離できる選択培地（ＭＳ−ＳＯＢ培地）を開発し、特許出願を行った（特許文献１）。ＭＳ−ＳＯＢ培地は、臨床検体を希釈せずに用いた場合であっても、ストレプトコッカス・ミュータンスのみならず他のミュータンス・ストレプトコッキィの増殖を完全に抑制することができ、ストレプトコッカス・ソブリヌスの菌数を正確に計数することができるものである。
【００１０】
これまで、ミュータンス・ストレプトコッキィの中からストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスの２種のみを実質的に選択することができる選択培地は幾つか報告されている。
【００１１】
また、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスのそれぞれを検出し、同定する幾つかの方法が報告されている。これらの方法は、これら２種の細菌を含む口腔連鎖球菌の中から、これら２種の細菌のみを実質的に選択できる上記のような培地によって分離し、次いで生化学的又は血清学的試験によって、これら２種の細菌を分別するか、又はＤＮＡプローブ法によって分別するものである。
【００１２】
しかしながら、ストレプトコッカス・ミュータンスのみを選択的に分離できる培地は未だ見当たらない。
【００１３】
さらに、近年では、培養法よりも検出感度が良いと言われるＰＣＲ法が菌数算定に多用されているが、この方法は、ＤＮＡ断片、死菌あるいは非特異的反応など、かなりの陽性誤差を生じる可能性がある。
【００１４】
【特許文献１】
特願２０００−２２７１３７号公報（特許請求の範囲）
【非特許文献１】
Ｇｏｌｄ  ＯＧら：  Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ，  Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ  １９７３；  １８：１３５７−１３６４
【非特許文献２】
Ｓｃｈａｅｋｅｎ  ＭＪＭら：  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ｏｎ  ｆｉｖｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ，  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｕｍ，  Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  １９８６；  ６５：９０６−９０８
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
上記現状を踏まえ、ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスのヒト口腔内での分布を明らかにするにはそれぞれの菌を単離し、熟練を要することなく正確に菌数算定することができる選択培地が不可欠である。
【００１６】
そこで、本発明は、ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌の中からストレプトコッカス・ミュータンスのみを選択的に単離するための方法及びストレプトコッカス・ミュータンスを選択するための培地を開発することを課題とした。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者らは、ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスとを明確に分別することに焦点を絞り、ミュータンス・ストレプトコッキィ、特にストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスの、種々の薬物に対する感受性を試験し、これら２種の菌の感受性に有意な差が観察される薬物を探索した結果、ストレプトコッカス・ミュータンス以外のストレプトコッカス・ソブリヌスを含むミュータンス・ストレプトコッキィ及び口腔連鎖球菌の増殖を実質的に抑制できる薬物を見出し、本発明に到達した。
【００１８】
すなわち、本発明は、
ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地に、サルファ剤を添加することによって、実質的にストレプトコッカス・ミュータンスのみを単離する方法；及び
ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地にサルファ剤を添加した、ストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地
を提供する。
【００１９】
本発明においては、口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地が、ミティス・サリバリウス寒天（Ｍｉｔｉｓ  Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ａｇａｒ；  ＭＳ培地，  Ｄｉｆｃｏ社製）であることが好ましい。
【００２０】
本発明において用いられるサルファ剤は、スルフィソキサゾール、スルファメチゾール、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリミジン、スルファフェナゾール、スルファモノメトキシン、スルファメトキサゾール、スルファチアゾール及びスルフィソミジンからなる群から選択される１種以上であることが好ましく、スルフィソキサゾールであることが特に好ましい。
【００２１】
本発明において、サルファ剤は、０．０５〜０．５ｇ／Ｌの濃度で含有されていることが好ましい。
【００２２】
本発明においては、イオノフォア抗生物質をさらに含有することが好ましい。
【００２３】
本発明において、イオノフォア抗生物質は、バリノマイシン及び／又はニゲリシンであることが好ましく、バリノマイシンであることが特に好ましい。
【００２４】
イオノフォア抗生物質が、バリノマイシンである場合には０．００１〜０．０５ｇ／Ｌの濃度で含有することが好ましく、ニゲリシンである場合には０．００００１〜０．０００５ｇ／Ｌの濃度で含有することが好ましい。
【００２５】
本発明においては、バシトラシン及び蔗糖を含有することが好ましい。
【００２６】
本発明のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地は、下記組成を有することが特に好ましい。
ミティス・サリバリウス培地              ９０ｇ／Ｌ
蔗糖                            ５０〜２００ｇ／Ｌ
バシトラシン                  ５０〜５００単位／Ｌ
バリノマイシン          ０．００１〜０．０５ｇ／Ｌ
スルフィソキサゾール        ０．０５〜０．５ｇ／Ｌ
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のストレプトコッカス・ミュータンスの単離方法及び選択用培地は、ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地に、サルファ剤を添加することを特徴とする。
【００２８】
本発明の背景には、ミュータンス・ストレプトコッキィに属する口腔連鎖球菌のうち、齲蝕の主な原因菌として注目されているストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスは、上述のように、コロニー形態等が極めて近似しているため、両者が混在する培地上でコロニー形態学的にこれらを識別するには極めて熟練を要するという事実が存在する。
【００２９】
そこで、本発明においては、ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスとを明確に分別することに焦点を絞り、種々の薬物に対するこれら２種の菌の感受性に有意な差が観察されるものを探索し、実質的にストレプトコッカス・ミュータンスのみが増殖可能な培地を発明した。
【００３０】
ここで、本発明の研究において行った試験で用いた材料及び方法等の試験条件について説明する。
＜材料及び方法＞
細菌株
この研究で用いた全ての細菌株は下記表１及び表２に示すとおりである。
【００３１】
【表１】
2004267089.tif 000002
【００３２】
【表２】
2004267089.tif 000003
【００３３】
上記細菌株のうち、ＮＵＭ−Ｓｍｅ、ＮＵＭ−Ｓｍｆ、ＮＵＭ−Ｓｓｄ及びＮＵＭ−Ｓｓｇで示される株は臨床単離株であり、コロニー形態学的方法、生化学的方法及び血清学的方法の組み合わせによって同定した（Ｈａｍａｄａ，  Ｓ．及びＨ．  Ｄ．  Ｓｌａｄｅ，  １９８０，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ４４：３３１−３８４；Ｈｉｒａｓａｗａ，  Ｍ．ら，  １９８０，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２７：６９７−６９９；及びＴａｋａｄａ，  Ｋ．ら，  １９８４，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ４５：４６４−４６９）。
【００３４】
その他の細菌株のうち、ＡＴＣＣが付されている株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、ＮＣＴＣが付されている株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅから購入し、それ以外の株は、本発明者の所属する研究室に従来より保存されてきたものである。
【００３５】
上記全ての細菌株を、５％（ｖ／ｖ）ウマ血液を添加したブレイン・ハート・インフュージョン（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ；ＢＨＩブロス、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、デトロイト、ＭＩ）寒天プレート上で、３７℃で嫌気的に増殖及び維持した。
【００３６】
試薬
この研究で用いた試薬（薬物を含む）は下記の通りである。
＜サルファ剤＞
スルフィソキサゾール（ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ；和光純薬社製、大阪）
スルファメチゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｉｚｏｌｅ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．社製，  ＭＯ，  ＵＳＡ）
スルファジメトキシン（ｓｕｌｆａｄｉｍｅｔｈｏｘｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．社製，  ＭＯ，  ＵＳＡ）
スルファメトキシピリミジン（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ；ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｉｎｃ．社製，  ＯＨ，  ＵＳＡ）
スルファフェナゾール（ｓｕｌｆａｐｈｅｎａｚｏｌｅ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．社製，  ＭＯ，  ＵＳＡ）
スルファモノメトキシン（ｓｕｌｆａｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｉｎｅ；和光純薬社製、大阪）
スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ；和光純薬社製、大阪）
スルファチアゾール（ｓｕｌｆａｔｈｉａｚｏｌｅ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．社製，  ＭＯ，  ＵＳＡ）
スルフィソミジン（ｓｕｌｆｉｓｏｍｉｄｉｎｅ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．社製，  ＷＩ，  ＵＳＡ）
＜イオノフォア抗生物質＞
バリノマイシン（ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．社製、ＭＯ，  ＵＳＡ）
ニゲリシン（ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．社製，  ＭＯ，  ＵＳＡ）
＜その他＞
バシトラシン（ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製、ＭＯ．，  ＵＳＡ）
ミティス・サリバリウス培地（ＭＳ培地）（Ｄｉｆｃｏ社製、ＭＤ，  ＵＳＡ）
【００３７】
薬物感受性試験
ストレプトコッカス・ミュータンスに対する選択培地の開発のために、ディスク感受性試験（ｄｉｓｋ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｓ；Ｓｅｎｓｉ−Ｄｉｓｃ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．社製、ＭＤ，  ＵＳＡ）によって薬物選択のための研究を行った。３９種の薬物ディスク中、ストレプトコッカス・ソブリヌスが抑制され、ストレプトコッカス・ミュータンスが抵抗性を示した薬物は、サルファ剤であるスルフィソキサゾールであった。
【００３８】
上記の研究から、実質的にストレプトコッカス・ミュータンスのみを単離するのにサルファ剤であるスルフィソキサゾールが有用であることが判明し、それ以外のサルファ剤についても感受性を調べたところ、スルファメチゾール、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリミジン、スルファフェナゾール、スルファモノメトキシン、スルファメトキサゾール、スルファチアゾール及びスルフィソミジンも有用であることがわかった（後記する試験例２参照）。
【００３９】
次に、本発明のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地は、イオノフォア抗生物質をさらに含有することが好ましい。ここで、イオノフォア抗生物質とは、金属イオンを捕獲する性質を有する抗生物質をいう。本発明において用いるイオノフォア抗生物質は、特定のイオンに対して選択的錯形成能を有しており、イオンチャンネルに作用するものである。特にバリノマイシン及びニゲリシンはカリウムイオンに対して作用するものである。また、サルファ剤は、葉酸の合成を阻害する薬剤である。サルファ剤とイオノフォア抗生物質との組み合わせは、その相乗効果により、ストレプトコッカス・アンギノーサスグループの増殖を抑制するのみならず、ストレプトコッカス・ソブリヌスの増殖を、サルファ剤単独の場合よりも強く抑制することができる。
【００４０】
本発明で用いるイオノフォア抗生物質としては、バリノマイシン及び／又はニゲリシンが好ましく、バリノマイシンが特に好ましい（後記する試験例３参照）。
【００４１】
本発明のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地は、上記薬物以外に、口腔連鎖球菌の増殖を抑制する作用を有するバシトラシンを含有していることが好ましい。
【００４２】
本発明において上記薬物を選択した理由は次の通りである。サルファ剤は、ストレプトコッカス・ソブリヌスの増殖を阻止し、ストレプトコッカス・ミュータンスのみを選択的に増殖させることが可能である。イオノフォア抗生物質は、サルファ剤との相乗効果により、ストレプトコッカス・アンギノーサスグループの増殖を阻止するとともに、ストレプトコッカス・ソブリヌスの増殖をより強く阻止することができる。バシトラシンは、その他の口腔連鎖球菌の増殖を阻止することができる。
【００４３】
上記薬物を組み合わせることで、より確実にストレプトコッカス・ミュータンスのみを単離、増殖させることが可能である。また、上記薬物以外のストレプトコッカス・ミュータンス以外のミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌の増殖を阻止しうる薬物を添加することもできる。
【００４４】
本発明のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地は、蔗糖１０％を添加した、ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地（例えば、ＭＳ寒天）を滅菌し、約５０℃に放冷した後、サルファ剤、イオノフォア抗生物質及びバシトラシンを添加して調製することができる。
【００４５】
ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地としては、ＭＳ培地が好ましいが、本発明はこれに限定されず、ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖できる培地であれば、如何なる培地であってもよい。
【００４６】
本発明において、薬物の添加濃度は、上記試験結果から、ストレプトコッカス・ミュータンスのみが増殖可能で、且つ、他のミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌の増殖を有意に抑制できる範囲で設定する。
【００４７】
スルフィソキサゾールを含むサルファ剤の濃度は、通常０．０５〜０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．１５〜０．２５ｇ／Ｌである。
【００４８】
イオノフォア抗生物質であるバリノマイシンの濃度は、通常０．００１〜０．０５ｇ／Ｌ、好ましくは０．００５〜０．０２ｇ／Ｌであり、ニゲリシンの濃度は、通常０．００００１〜０．０００５ｇ／Ｌ、好ましくは０．００００５〜０．０００２ｇ／Ｌである。
【００４９】
バシトラシンの濃度は、通常５０〜５００単位／Ｌ、好ましくは２００〜４００単位／Ｌである。
【００５０】
本発明のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地の組成としては、各成分を下記の範囲で含有しているものが特に好ましい。
ミティス・サリバリウス培地              ９０ｇ／Ｌ
蔗糖                            ５０〜２００ｇ／Ｌ
バシトラシン                  ５０〜５００単位／Ｌ
バリノマイシン          ０．００１〜０．０５ｇ／Ｌ
スルフィソキサゾール        ０．０５〜０．５ｇ／Ｌ
【００５１】
【実施例】
次に、実施例によって本発明をより具体的に説明する。本発明者らは、サルファ剤であるスルフィソキサゾールを添加したストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地を試作し、評価した。
【００５２】
実施例：選択用培地の作製
下記表３に示す組成を有するストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地（以下、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地と称する）を作製した。
【００５３】
【表３】
2004267089.tif 000004
【００５４】
表３中のミティス・サリバリウス培地（ＭＳ培地）は、Ｄｉｆｃｏ社製であり、ミュータンス・ストレプトコッキィだけでなく他の口腔連鎖球菌の単離のために一般に使用されているものであり、表４に示す組成からなっている。
【００５５】
【表４】
2004267089.tif 000005
【００５６】
ＭＳ−ＭＵＴＶ培地は、蔗糖１０％を添加したＭＳ寒天を滅菌し、５０℃に放冷した後、スルフィソキサゾール、バリノマイシン及びバシトラシンを添加して調製した。
【００５７】
試験例１：ＭＳ−ＭＵＴＶ培地の選択性能評価試験
ＭＳ−ＭＵＴＶ培地及びミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌が増殖できる培地としてＭＳ培地を比較対照として用い、ストレプトコッカス・ミュータンスを含むミュータンス・ストレプトコッキィ及び口腔連鎖球菌の回収率を求め、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地のストレプトコッカス・ミュータンスの選択性能を評価した。
【００５８】
下記表５及び表６に示す細菌株をＢＨＩブロス中、３７℃で一晩、細菌を予め嫌気的に培養した。０．９ｍｌのトリス−塩酸バッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ７．２）で培養液の１０倍希釈物を作製し、０．１ｍｌをプレーティングし、試験培地（ＭＳ−ＭＵＴＶ培地及びＭＳ培地）上に播いた。プレートを３７℃で２〜３日間嫌気的に培養し、コロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ；ＣＦＵ／ｍＬ）を算定した。
【００５９】
結果を下記表５及び表６に示す。結果は５回の試験の平均値で示した。表中、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地での回収率（％）とは、ＭＳ培地でのＣＦＵを１００％としたときの、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地でのＣＦＵのパーセンテージを示す数値である。
【００６０】
【表５】
2004267089.tif 000006
【００６１】
【表６】
2004267089.tif 000007
【００６２】
上記表５の結果から、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地においては、ストレプトコッカス・ミュータンス（血清型ｃ、ｅ、ｆ）の回収率は、１３５．１〜５８．９％の変動範囲であり、平均で８３．３％であった。ストレプトコッカス・ラッタス（血清型ｂ）の回収率は、平均で６６．４％であったが、それ以外のミュータンス・ストレプトコッキィである、ストレプトコッカス・クリセイテス（血清型ａ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（血清型ｄ、ｇ）及びストレプトコッカス・ドネイ（血清型ｈ）は、いずれもＭＳ−ＭＵＴＶ培地では殆ど増殖しないことがわかる。
【００６３】
ＭＳ−ＭＵＴＶ培地上でのストレプトコッカス・ミュータンスの平均回収率は８３．３％と高く、十分に正確な菌数の算定が行えるレベルである。
【００６４】
ここで、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地上で増殖できる血清型ｂのストレプトコッカス・ラッタスは、ヒト口腔からの検出が極めて稀であり、殆ど無視できる。
【００６５】
なお、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型ｃの一部の菌種で回収率が１００％を超えているのは、培地組成物の相互作用のためと考えられる。また、血清型ｆの一部は集落の大きさが、ＭＳ培地と比較してかなり小さかった。
【００６６】
上記表６の結果から、一般的な口腔連鎖球菌であるストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・マイティス、ストレプトコッカス・サングイヌス、ストレプトコッカス・オラーリス、ストレプトコッカス・ゴードニィ及びストレプトコッカス・アンギノーサスは、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地では全く増殖しないことがわかる。
【００６７】
コロニー形態学的にストレプトコッカス・ミュータンスと区別が難しいストレプトコッカス・ソブリヌスは、スルフィソキサゾールの添加によってほぼ完全に増殖が抑制できる。
【００６８】
ストレプトコッカス・アンギノーサス群は、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地に添加されているバリノマイシンとスルフィソキサゾールとの相乗効果によるものと考えられる。
【００６９】
上記のように、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地はストレプトコッカス・ソブリヌス及びストレプトコッカス・ラッタス以外の口腔連鎖球菌の増殖をほぼ完全に抑制するので、熟練した細菌学者でなくともストレプトコッカス・ミュータンスを正確に算定することができる。
【００７０】
ＭＳ−ＭＵＴＶ培地のストレプトコッカス・ミュータンス検出感度は、臨床検体０．１ｍＬ中１ＣＦＵと非常に高く、前述したＰＣＲ法と比較しても遜色がなく、ＰＣＲ法で高頻度に生じるような陽性誤差は皆無である。
【００７１】
試験例２：スルフィソキサゾール以外のサルファ剤を添加したストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地の選択性能評価試験
試験例１と同様にして、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地において、スルフィソキサゾールの代わりに、スルフィソキサゾール以外のサルファ剤を同濃度（０．２ｇ／Ｌ）で添加した培地の選択性能を評価した。結果を下記表７及び表８に示す。
【００７２】
【表７】
2004267089.tif 000008
【００７３】
【表８】
2004267089.tif 000009
【００７４】
上記表７及び表８の結果から、スルフィソキサゾール以外のサルファ剤を添加した場合も、ストレプトコッカス・ミュータンスは増殖するが、ストレプトコッカス・ソブリヌスの増殖は有意に阻止されることがわかる。
【００７５】
従って、本発明のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地に添加するサルファ剤はスルフィソキサゾールに限定されず、その他のサルファ剤でもよい。
【００７６】
試験例３：イオノフォア抗生物質としてバリノマイシンの代わりにニゲリシンを添加したストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地の選択性能評価試験
試験例１と同様にして、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地において、バリノマイシンの代わりに、ニゲリシンを０．１ｍｇ／Ｌの濃度で添加した培地の選択性能を評価した。結果を下記表９に示す。
【００７７】
【表９】
2004267089.tif 000010
【００７８】
表９の結果から、ストレプトコッカス・ミュータンス以外の菌株はいずれも有意に増殖が阻止されており、イオノフォア抗生物質はバリノマイシンに限定されず、ニゲリシンでもよいことがわかる。
【００７９】
上記試験例１〜３の結果から、ＭＳ−ＭＵＴＶ培地では、ストレプトコッカス・ミュータンス以外の口腔連鎖球菌の増殖を阻止する薬物としてスルフィソキサゾール、バリノマイシン及びバシトラシンを使用しているが、本発明はこれに限定されず、スルフィソキサゾール、スルファメチゾール、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリミジン、スルファフェナゾール、スルファモノメトキシン、スルファメトキサゾール、スルファチアゾール及びスルフィソミジンからなるサルファ剤群のうちの少なくとも１種を含んでいればよく、また、イオノフォア抗生物質としてバリノマイシンの代わりにニゲリシンを含んでいればよい。
【００８０】
【発明の効果】
本発明によって、初めてストレプトコッカス・ミュータンスのみを分離選択するための培地が提供された。
【００８１】
本発明のストレプトコッカス・ミュータンス選択用培地によれば、臨床検体中のストレプトコッカス・ミュータンスの菌数を正確に算定できる。
【００８２】
本発明の選択用培地によれば、コロニー形態学的に区別が難しいストレプトコッカス・ソブリヌスをほぼ完全に抑制できるので、本発明の選択用培地は、ストレプトコッカス・ソブリヌス及びストレプトコッカス・ミュータンスの齲蝕への関与等の解明に貢献できるものである。