(57)【要約】【課題】薬用人参を起源植物とするカルスの培養方法における課題である継代培養工程および増殖用培養工程における薬用人参カルス培養物収量の低下、ならびに該薬用人参カルス培養物内に生産される二次代謝産物含量の低下を抑制し、種株である薬用人参カルスの特性を長期的に維持することを目的とする。【解決手段】液体培地での継代培養工程およびそれに続く液体培地での増殖用培養工程からなる薬用人参カルスの培養方法であり、継代培養工程および増殖用培養工程を行う培養容器を同一形状とし、さらに継代培養工程の液体培地量を増殖用培養工程の液体培地量の５５〜９０容量％にすることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地での継代培養工程およびそれに続く液体培地での増殖用培養工程を含む薬用人参カルスの培養方法であり、継代培養工程および増殖用培養工程を行う培養容器を同一形状とし、さらに継代培養工程の液体培地量を増殖用培養工程の液体培地量の５５〜９０容量％にすることを特徴とする薬用人参カルスの培養方法。
【請求項２】
継代培養工程および増殖用培養工程における液体培地量を培養容器容量の２０〜５０％とする請求項１記載の薬用人参カルスの培養方法。
【請求項３】
実容量０．１２〜１．３Ｌの三角フラスコを培養容器として使用する請求項１または２の何れか１項記載の薬用人参カルスの培養方法。
【請求項４】
さらに大規模培養工程を含む請求項１記載の薬用人参カルスの培養方法。
【請求項５】
薬用人参カルスがおたね人参、チクセツ人参、アメリカ人参、三七人参、シベリア人参から選ばれる薬用人参のカルスである請求項１記載の薬用人参カルスの培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬用人参を起源植物とするカルスの培養方法に関し、詳しくは、薬用人参カルス培養物収量の低下、および該薬用人参カルス培養物内に生産される二次代謝産物含量の低下を抑制し、その結果として最終目的物である二次代謝産物の生産効率の低下を長期間にわたり抑制する、薬用人参カルスの培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
薬用人参、例えばおたね人参（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ）、チクセツ人参（Ｐａｎａｘ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アメリカ人参（Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ）、三七人参（田七人参とも呼ばれる；Ｐａｎａｘ  ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ）、シベリア人参（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ）などは、古来より有用漢方薬として珍重されており、これら薬用人参から抽出された薬用人参エキスは、医薬品や食品、化粧品などの原料として広く利用されている。
【０００３】
これら薬用人参の薬効としては強壮作用や長生作用、さらに現在では血糖値降下作用、鎮静作用、興奮作用、利尿作用などが明らかにされており、これら薬効は薬用人参中に生産されるパナキサン、サポニン、サポゲニンなどによるものであることが報告されている。
【０００４】
上記薬用人参エキスは、かつては畑などで栽培した薬用人参からの抽出により生産されていたが、利用範囲の広がりとともに一定品質のエキスを大量に生産することが必要となってきた。このような理由から、現在では薬用人参のカルスを液体培地で培養し、大量の薬用人参カルス培養物を短期間で生産する植物組織培養が行われている。
【０００５】
植物組織培養は、その実施形態により回分培養方法や連続培養方法などに分類でき、これらの方法により薬用人参培養物の製造が行われている。以下、回分培養方法を例に、薬用人参カルスの培養方法の概要を説明する。
【０００６】
まず、薬用人参の細胞片をオーキシン類やサイトカイニン類などのホルモンを含有した固形培地においてカルス誘導し、薬用人参カルスの種株とする。この工程を発現工程と称する。
【０００７】
ホルモンを含有する液体培地を培養容器に入れ、薬用人参カルスの種株を定期的に植え継ぐことにより、種株の特性変化を抑えつつ長期間培養を行う。この工程を継代培養工程と称する。
【０００８】
ホルモンを含有する液体培地を多数の培養容器に入れ、そこに、継代培養工程により生産した薬用人参カルス培養物を種株として所定量ずつ移して培養を行い、大規模培養の前段階とする。この工程を増殖用培養工程と称する。
【０００９】
上記増殖用培養工程での培養物、複数容器分を１つの大型タンクに移してさらに培養を行う。また、必要であればこの大型タンクでの培養物をさらに大きなタンクに移して多段培養を行う。この工程を大規模培養工程と称する。
【００１０】
これら一連の培養工程により、薬用人参カルス培養物を大量に生産することができる。一連の培養工程において、発現工程から増殖用培養工程は小スケールの培養装置で行われることが多く、ガラスフラスコを培養容器として、恒温室内で振盪装置で振盪しながら培養されるのが一般的である。そして、それに続く大規模培養工程は、工場などに備え付けの金属製の大型タンクで行われることが多い。
【００１１】
以上、回分培養方法を例として薬用人参カルス培養物の製造方法の概要を示したが、発現工程〜増殖用培養工程までの工程は連続培養方法も同じであり、上記記載は回分培養方法のみを対象とするものではなく、連続培養工程にも適用可能である。
【００１２】
薬用人参カルスの培養方法をごく簡単に説明したが、実際の製造では解決すべき問題も残されているのが現実である。具体的には、上記製造工程全体にわたって、種株となる薬用人参カルスの品質を一定に維持することである。
【００１３】
仮に、製造工程全体に渡って種株となる薬用人参カルスの品質が維持されていない場合、大規模培養工程後の植物細胞の品質、例えば薬用人参カルス培養物の生産量が少量となったり、生産した薬用人参カルス培養物中の有効成分の含有量が低下する恐れがある。
【００１４】
そして、薬用人参カルス培養物の生産量が少なくなった場合には薬用人参カルス培養物から抽出される薬用人参エキスの生産量が少なくなり、また、薬用人参カルス培養物中の有効成分の含有量が低下した場合には、生産した薬用人参エキスにおけるサポニンなど有効成分の含有量が低く、低品質のエキスとなってしまう。
【００１５】
従って、高品質の薬用人参エキスを安定的に生産するためには、各工程における工程管理が重要であり、特に大規模培養工程以前、つまり継代培養工程ならびに増殖用培養工程における種株の特性を維持することが必要なのである。
【００１６】
上記理由により薬用人参エキスの大規模生産では、増殖能力に優れ、さらに有効成分の生産能力にも優れた種株を選抜するとともに、継代培養工程および増殖用培養工程の培養条件の最適化により種株の品質を安定に維持しているのである。
【００１７】
植物細胞の培養における培養条件の最適化手段として従来知られているものとしては、培地組成の変更や、培養途中での培地の交換などがある。
【００１８】
培地組成の変更は、主に、一般的に用いられている培地の特定成分の増減、新規成分の追加、または通常の添加成分を添加しないなどの方法により培地組成を変更するものである。具体例としては、一般的なムラシゲスクーグ培地（ＭＳ培地）の組成から硝酸アンモニウムを除く一方でグルコースを追加処方した修正ＭＳ培地が挙げられる。（例えば、特許文献１参照）
【００１９】
また、培養途中での培地の交換の例としては、継代培養途中で培地成分組成を変化させた液体培地で培養する操作を含む方法や（例えば、特許文献２参照）、増殖に適した組成の培地での培養と有用成分生産に適した組成の培地での培養とを交互に繰り返す方法がある。（例えば、特許文献３参照）
【００２０】
これら培地組成の変更や、培養途中での培地の交換を行う場合、その状況ごとに最適な培地を選択することが重要となるのは言うまでもない。しかしながら、最適な培地の選択を行うには、豊富な経験と知識を有する実験者が、その状況ごとに選択した複数の候補培地で培養を行い、その中から適当な種株の選抜を行わなければならず、多くの手間を有するものである。
【００２１】
また、細胞特性を維持するための継代培養であるにもかかわらず、培地を変更したことにより細胞がダメージを受けてしまい、その結果、細胞特性が変わってしまう場合もある。
【００２２】
【特許文献１】
特開昭５９−１６９４８７号公報（請求項１）
【特許文献２】
特開平８−１３１１６０号公報（請求項１）
【特許文献３】
特開平１０−１７９１４７号公報（請求項１）
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記課題、つまり、培地変更による細胞へのダメージを生じさせることなく、さらに経験の浅い実験者であっても、簡易な手段により種株の特性を長期的に維持しうる薬用人参カルスの培養方法を提供することを目的とするものである。なお、ここで言う種株の特性とは、薬用人参カルスの増殖能力が高く、且つ該薬用人参カルス培養物中に生産される、サポニンをはじめとする二次代謝産物の細胞内濃度も高く維持している状態を指す。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、継代培養工程および増殖用培養工程の各工程において、種々の培養条件で薬用人参カルスの培養を行った。その結果、継代培養工程および増殖用培養工程を同一形状の培養容器を用い、さらに継代培養工程を、増殖用培養工程と比較して小容量の培地で行うことが、上記課題を解決するのに効果的であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２５】
すなわち本発明は、液体培地での継代培養工程およびそれに続く液体培地での増殖用培養工程からなる薬用人参カルスの培養方法であり、継代培養工程および増殖用培養工程を行う培養容器を同一形状とし、さらに継代培養工程における液体培地量を増殖用培養工程における液体培地量の５５〜９０容量％にすることを特徴とする薬用人参カルスの培養方法である。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２７】
まず、本発明で使用する薬用人参とは、パナキサン、サポニン、サポニゲンなどの有効成分を多く含む人参を指すものである。特に、その種類としては、上記有効成分の含有量の多さなどから、おたね人参、チクセツ人参、アメリカ人参、三七人参、シベリア人参が好ましい。
【００２８】
次に、本発明で使用する培地について説明するが、培地は何ら特別な組成である必要は無く、植物組織培養に一般的に用いられる培地が使用できる。具体例を挙げれば、ＭＳ培地、ホワイト培地、ガンボルグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地、あるいはこれら培地の成分をそれぞれ至適濃度に修正した修正培地などを使用することができる。また、必要であれば、これらの培地にカゼイン分解酵素、コーンスティープリカー、ビタミン類などを添加しても良い。
【００２９】
本発明では、これら培地に対してホルモン類を添加して培養を行うが、ホルモン類のうち、オーキシン類としては３−インドール酪酸、３−インドール酢酸、１−ナフタリン酢酸などが例示でき、その添加濃度は通常、培地に対して０．１〜１０ｐｐｍの範囲で調節する。これらオーキシン類は薬用人参のカルス誘導および培養カルスの増殖には必須である。
【００３０】
一方、サイトカイニン類としては、カイネチン、ゼアチン、ジベレリンなどが例示でき、通常、培地に対して０．０１〜５ｐｐｍの濃度で添加する。これらサイトカイニン類は細胞増殖を促進するとともに細胞分化の促進に有効であり、葉などの栄養器官の老化を防ぐ物質である。
【００３１】
上記原料を用いて薬用人参カルスを誘導させるが、この発現工程では小容量の培養容器を用いる。発現工程での培養容器は特に限定されるものではないが、取り扱い性を考えると、ガラス製三角フラスコやガラス製ビーカーを使用するのが好ましく、特に実容量０．１２〜１．３Ｌのガラス製三角フラスコを好適に用いることができる。
【００３２】
なお、本発明で言う実容量とは、培養容器開口部まで内容物を満たした場合の内容量を示すものであり、上記実容量範囲に含まれる培養容器としては０．１〜１Ｌ容量用三角フラスコとして一般に市販されているガラス製三角フラスコを例示することができる。以後、本発明で言う培養容器容量とは、この実容量を指すものである。
【００３３】
発現工程では、上記培養容器中に培地、ホルモン、そして寒天を加えて固形培地を作製し、そこに薬用人参組織を接種して培養を行う。培養は、薬用人参のカルス培養において一般的に採用されている温度範囲、具体的には２０〜２８℃の恒温室で静置培養を行えば良い。この際、使用する固形培地量は特に重要ではなく、薬用人参カルスが誘導されれば良い。こうして得られた薬用人参カルスを、以後の工程で種株として用いる。
【００３４】
上記工程により誘導された種株を用いて継代培養を行うが、継代培養に用いる培養容器としては、発現工程と同様に三角フラスコやビーカーが使用可能であり、取扱い性の点から培養容器容量０．１２〜１．３Ｌのガラス製三角フラスコが好ましく、特に０．３Ｌ〜１Ｌ容量用として市販されているガラス製三角フラスコを使用するのが好ましい。
【００３５】
ガラス製三角フラスコを利用した継代培養では、培地に所定濃度のホルモン類を添加した液体培地をガラス製三角フラスコに入れ、そこに種株を接種して、２０〜２８℃の温度範囲の恒温室で振盪培養を行う。この振盪は、市販の振盪装置で任意の速度で振盪すれば良い。
【００３６】
培養容器として１Ｌ容量用として市販されているガラス製三角フラスコを使用し、液体培地量を５００ｍｌとして、高崎科学機械株式会社製ＴＡ−２１６振盪装置を用いて振盪を行う場合を例に挙げれば、毎分７０〜１００ストロークの振盪速度で培養を行うのが適当である。
【００３７】
この毎分７０〜１００ストロークという振盪速度範囲は、毎分７０ストローク未満では弱すぎて種株が充分に振盪されず、一方、毎分１００ストロークを超える強い振盪では、飛散した液体培地が培養容器の開口部周辺の壁面や開口部に設けた蓋部材に付着して微生物汚染を引き起こすとの問題を解消するために設定した範囲であり、他の条件で振盪を行う場合にも、これら問題を解消できる程度の振盪の程度であれば問題はない。
【００３８】
本発明では、継代培養工程および増殖用培養工程の振盪速度を一定に設定したうえで、増殖用培養工程の液体培地量に対する継代培養工程の液体培地量の割合（以下、「容量割合」とする）を５５〜９０容量％に設定し、継代培養工程および増殖用培養工程を行う。
【００３９】
容量割合を９０容量％を超えるものとした場合には、継代培養工程と増殖用培養工程とのあいだの培養条件の差が小さく、本発明の効果が小さいことから、好ましくない。
【００４０】
一方、容量割合を５５容量％未満とした場合には、継代培養工程と増殖用培養工程との間の培養条件、例えば薬用人参カルスが受ける機械的ストレスなどの程度の差が非常に大きなものとなり、その結果、種株の特性が変化してしまう恐れがあるので好ましくない。
【００４１】
よって、種株の特性を長期的に維持するという本発明の目的を達するためには、容量割合を５５〜９０容量％、好ましくは６０〜８０容量％、より好ましくは６５〜８０容量％の範囲とする。
【００４２】
また、本発明の薬用人参カルスの培養方法は、継代培養工程の液体培地量と増殖用培養工程の液体培地量の容量比を５５〜９０％に設定するとともに、両工程の液体培地量を培養容器容量に対する特定割合、具体的には培養容器容量の２０〜５０％の容量とする薬用人参カルスの培養方法である。
【００４３】
液体培地量を培養容器容量の２０％未満にすると、上述した程度の振盪を加えた場合でも、カルス同士の衝突やカルスの培養容器に対する衝突、また、液体培地によるせん断力などの機械的ストレスが過剰なものとなり、これにより細胞集塊であるカルスが崩れてしまったり、また、種株の特性が変わってしまう恐れがある。
【００４４】
一方、液体培地量を培養容器容量の５０％を超えるものとした場合、上記の問題は生じにくいが、逆に上述の振盪条件を適用しても十分な振盪が与えられなかったり、また、充分振盪するために振盪を強く設定していた場合には、飛散した液体培地が培養容器の開口部周辺の壁面や開口部に設けた蓋部材に付着して微生物汚染を引き起こす恐れがある。
【００４５】
上記の理由から、継代培養工程および増殖用培養工程の液体培地量は培養容器容量の２０〜５０％の範囲内とするのが好ましく、特に、継代培養工程の液体培地量は２０〜３５％がより好ましく、さらに好ましいのは２５〜３０％である。そして、増殖用培養工程の液体培地量については３０〜５０％がより好ましく、さらに好ましいのは３０〜４０％である。
【００４６】
上記説明の通り、本発明では培養容器容量や容量割合や各工程の液体培地量を所定範囲に設定するが、通常は、最初に培養容器容量を設定し、その後で残りの条件、つまり、容量割合および各工程における液体培地量を設定する。
【００４７】
容量割合および各工程における液体培地量を決定する順番は特に規定されるものではなく、例えば容量割合を設定してから、それに合わせて継代培養工程および増殖用培養工程の液体培地量を設定しても良い。
【００４８】
また、継代培養工程もしくは増殖用培養工程のどちらか一方の液体培地量を設定したうえで容量割合を設定し、それに合わせて残り一方の液体培地量を設定してもよい。
【００４９】
継代培養工程を行うには、培養容器に上記のように設定した量の液体培地、ホルモン類、および種株を入れ、振盪培養を行う。振盪の条件については特別な条件を設定する必要はなく、先述の振盪条件のような植物の組織培養で一般的に用いられる条件を適用すればよい。
【００５０】
継代培養工程は、通常は数週間ごと、好ましくは２〜４週間ごとに新しい培地に交換して薬用人参カルスの培養を繰り返して行う。
【００５１】
この継代培養工程の後に増殖用培養工程を行うが、液体培地や種株、ホルモンなどの培養原料の量が異なる点を除けば、増殖用培養工程は継代培養工程と同じ培養方法である。
【００５２】
ただし、増殖用培養工程は、大規模培養工程で使用する多量の種株を製造する工程であるから、継代培養工程よりも多数の培養容器で培養を行う必要がある。
【００５３】
続く大規模培養工程は、大量の薬用人参カルス培養物を製造する工程であるため、培養容器は継代培養工程、並びに増殖用培養工程で用いたよりも大型のものを用いる。この工程で使用する培養容器としては、数十〜数万Ｌの実容量を持つ培養容器、特に、撹拌機構を備えた金属製培養容器（培養装置）を用いるのが適当である。
【００５４】
このような培養装置の例としては、培養容器内部を撹拌するための撹拌機を装備した金属製培養容器を挙げることができる。
【００５５】
この工程では、１つの培養装置、複数の培養容器分の増殖用培養工程培養物、培地、ならびにホルモン類を入れて培養を行う。そして、製造した薬用人参カルス培養物をさらに大きな培養装置に移し、上記培養を多段工程で培養を繰り返すことにより、大量の薬用人参カルス培養物を製造することができるのである。
【００５６】
【実施例】
以下、実施例および比較例をもって本発明の薬用人参カルスの培養方法を詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００５７】
＜実施例１＞
水洗いしたおたね人参を７０％エタノール水溶液に３０秒間浸漬した後、さらに２％−次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１０分間浸漬して滅菌した後、滅菌水でよく洗浄し、その後で根の部分を無菌的に０．５〜１ｃｍの大きさに切断した。
【００５８】
この切断片を使い、固形培地を用いた通常の植物組織培養方法によりカルス誘導し、このおたね人参カルスを実施例１の種株として使用した。
【００５９】
１Ｌ容量用として市販されているガラス製三角フラスコ（実容量１．２Ｌ。以下、１Ｌ三角フラスコと示す。）に３ｐｐｍの３−インドール酪酸および０．２ｐｐｍのカイネチンを添加した修正ＭＳ培地４００ｍｌ、ならびに液体培地量に対して８％（ｗｔ／ｖｏｌ）（３２ｇ）のおたね人参カルスを入れ、２５℃の恒温室内で毎分約８０ストロークの速度で振盪培養を行い、継代培養工程とした。継代培養工程中は４週間ごとに同条件で新しい培地に植え継ぎを繰り返し、最終的に１２ヶ月間培養を行った。
【００６０】
継代培養工程終了後、１Ｌ三角フラスコに、継代培養工程と同組成の液体培地４５０ｍＬを入れ、そこに継代培養工程後のおたね人参カルス４０ｇを移植して４週間振盪培養を行い、増殖用培養工程とした。
【００６１】
実施例１の継代培養工程の液体培地量は、増殖用培養工程の液体培地量の８９容量％である。
【００６２】
＜実施例２＞
継代培養工程における液体培地の量およびおたね人参カルスの量をそれぞれ３５０ｍＬ、２８ｇとした以外は実施例１と同じにして培養を行った。
【００６３】
実施例２の継代培養工程の液体培地量は、増殖用培養工程の液体培地量の７８容量％である。
【００６４】
＜実施例３＞
継代培養工程における液体培地の量およびおたね人参カルスの量をそれぞれ３００ｍＬ、２４ｇとした以外は実施例１と同じにして培養を行った。
【００６５】
実施例３の継代培養工程の液体培地量は、増殖用培養工程の液体培地量の６７容量％である。
【００６６】
＜実施例４＞
継代培養工程における液体培地の量およびおたね人参カルスの量をそれぞれ２５０ｍＬ、２０ｇとした以外は実施例１と同じにして培養を行った。
【００６７】
実施例４の継代培養工程の液体培地量は、増殖用培養工程の液体培地量の５６容量％である。
【００６８】
＜比較例１＞
継代培養工程における液体培地の量およびおたね人参カルスの量をそれぞれ４５０ｍＬ、３６ｇとした以外は実施例１と同じにして培養を行った。比較例１では継代培養工程ならびに増殖用培養工程の液体培地の量ならびにおたね人参カルスの量が同じ（１００容量％）であり、両工程における機械的ストレスの程度に差は無い。
【００６９】
＜比較例２＞
継代培養工程における液体培地の量およびおたね人参カルスの量をそれぞれ２００ｍＬ、１６ｇとした以外は実施例１と同じにして培養を行った。
【００７０】
比較例２の継代培養工程の液体培地量は、増殖用培養工程の液体培地量の４４容量％である。
【００７１】
実施例１〜４ならびに比較例１〜２について、増殖用培養工程終了時のおたね人参カルス培養物の乾燥収量、ならびに乾燥おたね人参カルス培養物の単位重量あたりのサポニン含量を測定した。
【００７２】
それら測定値を、予め測定しておいた継代培養開始時点でのおたね人参カルス培養物の培養後乾燥重量、ならびに乾燥おたね人参カルス培養物の単位重量あたりのサポニン含量と比較し、結果を表１に示した。
【００７３】
ここで、上記測定においては、おたね人参カルスを十分乾燥させた後に重量を測定し、乾燥収量とした。また、得られた乾燥カルス培養物をエタノールにより抽出したエキスについてＨＰＬＣでジンセノサイド類の定量分析を行い、ジンセノサイド類の濃度の総和をサポニン含量とした。
【００７４】
【表１】
2004290082.tif 000002
【００７５】
表１から明らかなように、継代培養工程および増殖用培養工程の液体培地量を同じ（１００容量％）にした比較例１では、増殖用培養工程後のおたね人参カルスの乾燥収量およびサポニン含量が、継代培養工程前に比べて著しく低下した。
【００７６】
また、継代培養工程の液体培地量を増殖用培養工程の液体培地量に対して４４容量％にした比較例２では、乾燥重量については比較的高い値を示していたが、サポニン含量の低下が著しく、継代培養工程前の半分以下の値となった。
【００７７】
それに対し、本発明の培養方法を適用した実施例１〜４では、いずれの実施例も増殖用培養工程後のおたね人参カルスの乾燥収量およびサポニン含量が比較例１に比べて高く、さらに、実施例３では継代培養工程前と比べても同等の乾燥収量およびサポニン含量を示した。
【００７８】
＜実施例５＞
水洗いしたアメリカ人参を７０％エタノール水溶液に３０秒間浸漬した後、さらに２％−次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１０分間浸漬して滅菌した後、滅菌水でよく洗浄し、その後で根の部分を無菌的に０．５〜１ｃｍの大きさに切断した。
【００７９】
この切断片を、固形培地を用いた通常の植物組織培養方法によりカルス誘導し、このアメリカ人参カルスを実施例６の種株として使用した。
【００８０】
１Ｌ三角フラスコに４ｐｐｍの３−インドール酪酸および０．１ｐｐｍのベンジルアデニンを添加したガンボルグＢ５培地を３５０ｍｌ入れ、さらにアメリカ人参カルス２８ｇを入れて、２５℃の恒温室内で毎分約８０ストロークの速度で振盪培養を行い、継代培養工程とした。継代培養工程中は１ヶ月ごとに新しい培地に植え継ぎを繰り返し、最終的に１２ヶ月間培養を行った。
【００８１】
継代培養工程終了後、上記ガンボルグＢ５培地４５０ｍｌを入れた１Ｌ三角フラスコを新たに用意し、継代培養終了後のアメリカ人参カルス培養物３６ｇを移植して４週間培養を行い、増殖用培養工程とした。
【００８２】
実施例５の継代培養工程の液体培地量は、増殖用培養工程の液体培地量の７８容量％である。
【００８３】
＜実施例６＞
継代培養工程における液体培地の量およびアメリカ人参カルスの量をそれぞれ３００ｍＬ、２４ｇとした以外は実施例５と同じにして培養を行った。
【００８４】
実施例６の継代培養工程の液体培地量は、増殖用培養工程の液体培地量の６７容量％である。
＜比較例３＞
継代培養工程における液体培地の量およびアメリカ人参カルスの量をそれぞれ４５０ｍＬ、３６ｇとした以外は実施例６と同じにして培養を行った。比較例３では継代培養工程ならびに増殖用培養工程の液体培地の量、ならびにアメリカ人参カルスの量が同じ（１００容量％）であり、両工程における機械的ストレスの程度に差は無い。
【００８５】
実施例５および６、比較例３についても、増殖用培養工程終了時のアメリカ人参カルス培養物の乾燥収量、ならびに乾燥アメリカ人参カルス培養物の単位重量あたりのサポニン含量を測定し、予め測定しておいた継代培養開始時点でのアメリカ人参カルス培養物の培養後乾燥重量、ならびに乾燥アメリカ人参カルス培養物の単位重量あたりのサポニン含量と比較し、結果を表２に示した。
【００８６】
【表２】
2004290082.tif 000003
【００８７】
継代培養工程および増殖用培養工程の液体培地量を同じ（１００容量％）にした比較例３では、増殖用培養工程後には、継代培養工程前と比較してサポニン含量が著しく低下したのに対し、本発明の培養方法を適用した実施例５および６では、サポニン含量、乾燥物収量ともに継代培養工程前と比べてほとんど低下していなかった。
【００８８】
【発明の効果】
本発明の培養方法により、薬用人参カルス培養における乾燥物収量、および二次代謝物であるサポニンの含有量を安定的に維持することが可能となった。特に本発明は、従来行われていたような培地組成の変更や、特定培地の交換を必要とせず、継代培養工程と増殖用培養工程における液体培地量を変化させるのみという非常に簡便な方法により、上記効果を奏するものである。