(57)【要約】【課題】　遺伝子伝達による治療方法で使用するベクターを提供すること。【解決手段】　レンチウイルスのパッケージングヌクレオチドに対応するヌクレオチド、異種遺伝子および当該ヌクレオチドと当該異種遺伝子に隣接して、パッケージング、ベクターの標的細胞への逆転写および組み込み並びに異種遺伝子の発現に十分なレンチウイルスＬＴＲの内部および近傍のものに対応する配列を含むベクターであって、前記ヌクレオチドがレンチウイルス５’−リーダー配列とＲＥＶ−反応部分に少なくとも実質的に対応するものを含むベクター。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レンチウイルスのパッケージングヌクレオチドに対応するヌクレオチド、異種遺伝子および当該ヌクレオチドと当該異種遺伝子に隣接して、パッケージング、ベクターの標的細胞への逆転写および組み込み並びに異種遺伝子の発現に十分なレンチウイルスＬＴＲの内部および近傍のものに対応する配列を含むベクターであって、前記ヌクレオチドがレンチウイルス５’−リーダー配列とＲＥＶ−反応部分に少なくとも実質的に対応するものを含むベクター。
【請求項２】
レンチウイルスがＨＩＶである、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
パッケージングヌクレオチドを含む複製欠失ＨＩＶ−基本ベクターであって、当該パッケージングヌクレオチドがＨＩＶ５’リーダー配列とＨＩＶのｃｉｓ−作用ＲＥＶ反応要素、異種遺伝子および当該ヌクレオチドと当該異種遺伝子に隣接して、パッケージング、ベクターの標的細胞への逆転写および組み込み並びに異種遺伝子の発現のためのＨＩＶ配列を含んでいるベクター。
【請求項４】
さらにgas遺伝子に対応するヌクレオチドを含んでおり、異種遺伝子によって分解されない、請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
異種遺伝子に対するプロモータとして、ＭＰＭＶまたはＨＩＶＬＴＲ配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
異種遺伝子が治療に有用な生成物のためのものである、請求項１〜５のいずれかに記載のベクター。
【請求項７】
外来遺伝子の伝達による治療に使用する、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ＨＩＶビリオン産生細胞を１またはそれ以上のパッケージング欠失ＨＩＶで形質転換することを含む方法によりＨＩＶビリオンを産生するために使用される、請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
哺乳細胞を請求項８の方法によって産生されたＨＩＶビリオンと接触させることを含む、異種遺伝子を哺乳細胞に伝達する方法。
【請求項１０】
遺伝子伝達による治療方法で使用するための請求項８の方法により産生されたベクター。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
　本発明はベクター及び遺伝子転移でのそれらの用途に関する。ベクターは、レトロウイルスに基づき、それゆえ、それらはそれら自身のＲＮＡをパッケージできず、そして例えば体細胞遺伝子治療用に外来遺伝子を転移するための感染因子として用いることができる。
【０００２】
発明の背景
　レトロウイルスは幾つもの方法で分類される。それらは、それらの形態に基づいて種々のグループに分けられる。それらのグループは、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ型ウイルスである。それらは又、３のつ亜科、即ち、オンコウイルス、スプマウイルス及びレンチウイルスの一つに属するように分類される。
【０００３】
　メイソン−ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）は、アカゲザルの乳癌組織中に最初に発見されたＤ型レトロウイルスである。これ並びにそのオンコウイルス亜科への分類にもかかわらず、それは、確認されたオンコジンを含有せず、それがオンコジン可能性を有するという証拠はない。
【０００４】
　Ｄ型ウイルスは、他のレトロウイルス科、例えばＣ型ウイルスと区別される。後者は、細胞膜でのカプシド組立てにより特徴付けられ、レンチウイルス群のウイルス、たとえばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む。形態学的に、それらのコア構造で、Ｄ型ウイルスは、又、Ｂ型ウイルス、例えばマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）と異なる。即ち、Ｄ型ウイルスは、これらの他の型と完全に異なり、この差異の例のように、それらはＩＣＡＰの細胞膜への輸送を促進するそれらの組立てＩＣＡＰでのアミノ酸シグナル配列の形成に特異的シグナルを有する。この理由その他から、それらはユニークなcis及びtrans作用調整シグナルを有する別の群と考えなければならない。ＭＰＭＰは、又、ヒト補体システムを活性化するウイルスエンベロープの能力によりＣ型ウイルスと区別される。このことは、ウイルスの溶解に導く。
【０００５】
　レトロウイルスは、感染宿主細胞のゲノムに組込まれるＤＮＡプロウイルス中間体を経て増殖するＲＮＡウイルスである。ビリオン粒子は正のストランドゲノムＲＮＡ分子の二量体を含む。このゲノムＲＮＡは、宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩによりプロウイルスＤＮＡから転写された完全長種である。ウイルスのgag及びpol遺伝子をコード化するこれらの完全長ＲＮＡの部分は宿主細胞のリボゾームにより翻訳され、ビリオン粒子の生成に必要とされる構造及び酵素蛋白を生成する。プロウイルスは、又、エンベロープ蛋白をコードする種々の小さな単一及び多重スプライスmＲＮＡ、並びにより複合なレトロウイルスの場合、一群の調整蛋白を生ずる。ゲノム（及びサブケノム）ＲＮＡ分子は、５'m７Ｇcap及びポリアデニル化３'テイルを有する細胞mＲＮＡと構造的に類似する。
【０００６】
　一連の問題は、ゲノムＲＮＡの成功したパッケージングに向けられなければならない。
【０００７】
　完全長ＲＮＡは、それがビリオンの次の産生のための遺伝情報の完全補体を運ぶ唯一のものであるから、スプライスされたウイルスメッセージを優先的にパッケージされなければならない。本ウイルスは、又多くの他のウイルスと異なり、レトロウイルスは一般に宿主ＲＮＡ合成を抑制しないので、莫大な量と種々の物理的に類似する宿主細胞mＲＮＡに対しゲノムＲＮＡを特異的に選択しなければならない。パッケージされるべきゲノムＲＮＡが認識され、それにより、一部が翻訳され、組立て部位に輸送されるのを保護するか、又は、翻訳後、直ちにコードしたgagプレカーサーポリ蛋白と結合する。最後に、３−４０００gagプレカーサー蛋白と関連した正しい数の遺伝子、適切な数の逆転写酵素分子、プロテアーゼ、tＲＮＡプライマー及びある場合には、整調蛋白の多重コピーをパッケージしなければならない化学量論的問題がある。
【０００８】
　このようにゲノムのパッケージングは、ＲＮＡの選択の特異性の問題及びＲＮＡ区画形成能力の考慮を引き起こす。
【０００９】
　ウイルスは、ウイルスゲノムmＲＮＡ中のcis作用要素、即ち「パッケージングシグナル」の存在によりこれらの問題を解決する。自然発生及び実験室構築ウイルスミュータントに関する研究により、特異的配列がＲＮＡ認識及びカプシド化（encapsidation）にとって重要であることが明らかになった。リニアル等、セル １５、1371−1381(1978)、マン等、セル ３３，153−159(1983)、ワタナベ等、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ７９，4986−5990(1979)及びＷＯ−Ａ−9119798は、５'未翻訳リーダー配列での欠失は、それぞれ、ロウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、モロニイマウス白血病ウイルス（ＭoＭＬＶ）、脾壊死ウイルス（ＳＮＶ）及びＨＩＶでのパッケージングに障害となることを開示する。
【００１０】
　欠失ミュータントは、幾つかのレトロウイルスでのＲＮＡパッケージングに必要な配列を明らかにした。これらのあるものでは、パッケージングに十分な配列の程度も位置決定された。もしこの配列が異種ＲＮＡに導入されると、理論的に、異種ＲＮＡはレトロウイルス粒子によりカプシド化されるべきであるとの前提がパッケージングシグナル及びＲＮＡ二次構造の記載に潜在する。パッケージングに対する抑制は、パッケージングシグナル（ＰＳＩ）に隣接する配列はＰＳＩを分裂させるもう一つの二次構造の形成を支持すべきでないという理論的なものを含む（これについて、マン等、ジャーナル・オブ・バイロロジィ ５４，401−407(1985)がある詳細な証拠を提供する）。加えてパッケージされたＲＮＡの全長は一定の大きさのＲＮＡをパッケージするウイルスの能力により物理的に限定される。ＨＩＶでは、異種遺伝子を含むプロウイルス構造物は、ターウイリガー等、ＲＮＡＳ ＵＳＡ　８６，3857−3861（1989）により、生成されたウイルスＲＮＡの全長が元のウイルスのそれよりも有意に超える場合、複製欠損させることが明らかになった。複製欠損はＲＮＡパッケージングの解読効率と一致する。
【００１１】
　さらに、それらのカプシド化配列の性質及び部位で、異なるウイルス間に有意な変異性がある。ＲＮＡ認識の機構は、ほとんど判っていないので実験データなしにカプシド化配列の正確な部位及び性質を予言することは理論的に不可能である。Ｄ型レトロウイルスについては何もない。
【００１２】
　レトロウイルスベクターシステムの開発は、上記した仕事の直接的開発であった。これらのシステムでは、パッケージング欠損「ヘルパー」ウイルスが、高修飾ＲＮＡゲノムをカプシド化する粒子を生産するのに用いられる（ベクター）。ワタナベ等、モレキャラー・アンド・セルラー・バイオロジィ ３，2241−2249(1983)及びエグリティス等、バイオテクニクス　６，608−614(1988)は、最小のウイルス長末端繰り返し配列、パッケージングシグナル及びプライマー結合部位並びに異種マーカー遺伝子を含むベクターが、ビリオン粒子内にカプシド化され、親ウイルスがトロピック（tropic）である細胞に転移されたことを報告する。この方法により、ＲＮＡのウイルス粒子へのカプシド化に必要な最小配列を決定することが可能となった。
【００１３】
　アダム等、ジャーナル・オブ・バイオロジィ　６２，3802−3806(1988)は、ＭoＭＬＶについて、パッケージングするのに十分な配列は、パッケージング欠損に導くものとして欠損により最初に明らかにされた５'リーダー部分を含むことを開示している。付加的配列は、gag配列がベクターのパッケージングを増強したが、必須ではなかった。
【００１４】
　ＷＯ−Ａ−9119798は、潜在的パッケージングシグナルとして５'リーダー配列のみを本質的に含むＨＩＶ基本ベクターがＨＩＶ基本パッケージングシステムによりうまくカプシド化されたとの報告があったことを開示する。この仕事は未だ確認されていない。事実、５'リーダー配列のみを含むＨＩＶ ＲＮＡをカプシド化することは、本明細書中で明らかにしたように失敗した。
【００１５】
発明の要約
　本発明の第一の局面によれば、ＲＮＡはビリオン内にパッケージできないから、プロウイルスは、ＭＰＭＶ蛋白を生成しうるが複製コンピテントを生成し得ない。このパッケージング欠損プロウイルスベクターを用いると、パッケージング欠損細胞系が創造でき、ウイルスのパッケージング機構を研究し、このパッケージング機構を損なう戦略を開発するのに用いることができる。このようなパッケージング陰性プロウイルスにより産生されたビリオンは、ワクチンとして、又、所望の遺伝子を哺乳動物細胞に効果的に導入するためのシステムとして用いうる。これは、又、今や本発明の第二の局面により、ＨＩＶについて、その結果他のレンチウイルスについて首尾よく達成された。
【００１６】
発明の説明
　本発明の第一の局面は、ＭＰＭＶに関する。
　ＭＰＭＶは、これまで用いられ、ヒトにおいて潜在的使用のための遺伝子ベクターとして開発されている他のレトロウイルスに比べ、レトロウイルスベクターとして幾つかの潜在的利点を有する。特に、
１）それは、アッセーされる全てのヒト細胞に感染性である。
２）それは、ヒトに非病原性である。
３）それは、補体仲介溶解に感受性のエンベロープを有する。これはありそうもないこと、例えば組換えがヒト使用でのレトロウイルスベクターの生成で起きても、ウイルスはそれが細胞外空間に現れるとすぐにインビボで死滅されるので再構成ＭＰＭＶからの危険がないことを意味する。
４）分子生物学及びウイルス組立て機能がよく理解されている。
５）それは、パッケージング機能にとって大きく余分であるように見え、又、従って所望の遺伝子配列により置換できる８キロ塩基よりも大のゲノムを有する。遺伝子治療の候補者である遺伝子をコードするＲＮＡのほとんどのＤＮＡ複写は、これらの次元のウイルスゲノムに適合する。
６）内因性ヒトレトロウイルス配列との明白な検出可能な類似性がなく、従って治療用ベクターとインビボに現れる複製コンピテントウイルスに導く内因性配列との組換えの可能性を最少にする。
７）ＭＰＭＶが、マウスレトロウイルスベクターによりカプシド化され、マウスレトロウイルスベクターシステムにより感染した全ての細胞に伝達される例えばＶＬ３０科のような異種配列をカプシド化するという証拠はない。
【００１７】
　本発明の第一の局面は、分子生物学並びに野生型及びミュータントＭＰＭＰとそれから作られた欠損ウイルス構成（ベクター）との置換の研究に基づき、そこで、ＭＰＭＰにパッケージしているウイルスＲＮＡに含まれるcis作用シグナルを局在させるためにコード機能の主要切片が削除され、マーカー遺伝子と置換された。ＲＮＡのビリオン粒子内へのパッケージングに必要且つ十分なシグナルが明らかにされた。ＲＮＡパッケージングに必要且つ十分なシグナルの局在がこれまで研究された他のウイルスと異なること、又、これらのシグナルの部位は、他のレトロウイルスとの直接相似及びそれらのパッケージング機構の研究により予言できなかったことが明らかである。それ自身は置換欠損であるがそのＲＮＡは野生型ウイルスによりtransにパッケージでき、又、ＭＰＭＶ自体は感染によりトロピックである標的細胞に分配できるベクターが構築された。これらのベクターは標的細胞クロモソームに組込まれ、抗生物質耐性マーカーの場合に、それ自体が抗生物質耐性である標的細胞を生成するのに効果的に十分な標的遺伝子を発現する。
【００１８】
　特に、ＭＰＭＶパッケージング欠損ベクター及び細胞系を作ることが可能であることを発見した。ＭＰＭＶのプライマー結合部位と５'主要スプライスドナーとの間の部分がＭＰＭＶ ＲＮＡをビリオンにパッケージングするのに必要な配列を含むことが判った。パッケージング欠損ＭＰＭＶプロウイルスを含むベクターを調製することができ、そこではベクターは、所望のＭＰＭＶ生成物を発現するためＭＰＭＶゲノムから十分な数のヌクレオチドに対応するが、プライマー結合部位とＭＰＭＶ ＲＮＡを効果的にパッケージするための５'主要スプライスドナーとの間の部分に対応する十分な数のヌクレオチドには対応しないヌクレオチド配列を含む（パッケージング配列）。
【００１９】
　これらの配列は好ましくはＭＰＭＶのゲノムに対応する。用語、対応するのは、保存的保護、削除及び置換が許されることを意味する。プライマー結合部位（１８bp）及び５'主要スプライスドナーは、それぞれ、ソニゴ等、セル ４５、375−385(1986)により与えられたゲノムヌクレオチド配列中の348−365及び475−480である。
【００２０】
　好ましくは、ベクターは、プライマー結合部位のすぐ下流と５'主要スプライスドナーのすぐ上流の切片に対応するＭＰＭＶパッケージング配列を含まない。典型的には、ベクターはプライマー結合部位の約２塩基下流からプライマー結合部位の約３２ないし６３塩基下流の間のヌクレオチドを含み、依然としてパッケージング欠損でありうる。一実地態様では、ベクター欠損パッケージング配列は、本明細書配列番号１に示されるように、１２１−塩基ヌクレオチド配列を含む。他の実地態様では、それは配列番号１の塩基２８ないし５０の２３−塩基切片を含む。配列番号１は、
【表１】
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である。
【００２１】
　ベクターから離さなければならない塩基の数は大きく変化できる。例えばＭＰＭＶ中の一定の２３−塩基対削除は、パッケージング能力を失わせるのに十分である。しかしながら、この部分でのより少しの削除でも、パッケージング効率を失わせるべきである。実際、この部分での約５塩基のような小さな削除が効率的パッケージング能力を失わせることが期待される。特定の削除の大きさは、この分野での通常の知識の者により、本開示に基づいて直ちに決定できる。
【００２２】
　ベクターは、機能的ＭＰＭＶ遺伝子生成物を発現するため、ＭＰＭＶゲノムのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドを含有するＭＰＭＶヌクレオチド切片を含むベきであるが、上記したように、ウイルスＲＮＡのビリオンへの効率的パッケージングを可能にするために、プライマー結合部位と５'主要スプライスドナーとの間の部分に対応する十分な数のヌクレオチドを含むべきでない。ＭＰＭＶパッケージング欠損細胞系を確立するためにこれらのベクターを用いる場合、そのような細胞系は如何なる感染ＭＰＭＶをも生成しないことが好ましい。細胞はパッケージング欠損であるので、これらのパッケージング欠損不足ベクターにより形質転換された細胞系は低感染性を有するが、或るＲＮＡは依然、ビリオンにパッケージングすることができる。従って、ＭＰＭＶヌクレオチド切片は完全なＭＰＭＶゲノムに対応しないことが好ましく、これによりウイルスＲＮＡのあるものがビリオンにパッケージングされても、パッケージングされるものは複製コンピテントウイルスではないであろう。
【００２３】
　好ましくは、選択された細胞系は、各々がＭＰＭＶゲノムの異なる部分を含むがウイルスパッケージングに必要な配列を含まない、少なくとも二つの異なるベクターを用い、形質転換される。従って、各ベクターにより細胞を同時形質転換することにより、細胞は依然、全てのＭＰＭＶ構造及び酵素蛋白を発現し、ビリオンを生成することが可能である。好ましい態様では、その又は各ベクターはＭＰＭＶ ＬＴＲ（長末端繰り返し配列）に対応する配列を含まないが、プロモーター部分及び／又は他のゲノムのポリアデニル化配列に対応する配列を含む。特別なプロモーター及びポリアデニル配列の選択は、特別な宿主細胞に基づいて容易に決定できる。好ましくは、配列が対応しないＬＴＲは、３'ＬＴＲである。
【００２４】
　一つの好ましい態様では、一つのベクターは、enyの上流にＭＰＭＶ蛋白の発現を可能にする配列を含み、第二のベクターは、残留蛋白の発現を可能にする。例えば一つのベクターは、env遺伝子配列に対するgag開始コドンの上流の十分な数のヌクレオチドに対応するＭＰＭＶヌクレオチド切片を含み、５'最大遺伝子生成物を発現する。他のベクターは、gagの下流の十分な数のヌクレオチドに対応し、機能約env遺伝子配列を含むＭＰＭＶヌクレオチド切片を含む。そのようなベクターは、本開示に基づき当業者によって、これらのウイルスの既知の制限エンドヌクレアーゼ部位を利用して、ＭＰＭＶゲノムの報告された遺伝子配列から化学的に合成できるか又は多くの入手可能なＭＰＭＶプロウイルスから誘導できる。
【００２５】
　好ましくは異なるマーカー遺伝子が各ベクターに加えられる。次いで、これらの異なるベクターにより同時形質転換された予め選択された細胞系を用い、そして両マーカーを含んでいる細胞を探すことにより、両ベクターにより同時形質転換された細胞が見出される。そのような細胞は、全てのＭＰＭＶ蛋白を生成しうるであろう。ビリオンが生成されるであろうが、全ウイルス配列に対応するＲＮＡは、これらのビリオン内にパッケージされないであろう。所望により、２以上のベクター、例えばgag／polベクター、プロテアーゼベクター及びenvベクターを用いることができる。
【００２６】
　レトロウイルスは、ある場合には、他のウイルスのエンベロープグリコプロテインにより偽型にできる。続いて異なるレトロウイルス由来のenv遺伝子に対応する十分な数のヌクレオチドを含むベクターを調製できる。好ましくは、本ベクターの５'ＬＴＲはenv遺伝子と同じゲノムのものである。そのようなベクターは、ビリオンを産生するのに、ＭＰＭＶenvパッケージング欠損ベクターの代わりに用いることができる。そのような変更により、生じたベクターシステムは、より広い宿主範囲で用いることができるか、又は例えば細胞範囲をＣＤ４蛋白を有するものに限定するＨＩＶenv遺伝子ベクターを用い、より小さな宿主範囲に限定できる。
【００２７】
　実質的に、どのような細胞系でも用いることができる。好ましくは、哺乳動物細胞系、例えばＣＶ−１、Ｈela、Ｒaji、ＳＷ480又はＣＨＯが用いられる。
【００２８】
　ウイルス細胞生成物の生成を増強するために、例えばＣＶ−１又はＨela細胞中、遺伝子を優先的に発現するであろうプロモーターで５'ＬＴＲを置換することにより、５'ＬＴＲ以外のプロモーターを用いることができる。用いられる特別のプロモーターは、本開示に基づき、用いられる細胞系に依存して、当業者により容易に決定できる。
【００２９】
　ウイルス細胞生成物のレベルを増強するために、ベクターによりエンハンサー配列を加えてＭＰＭＶ ＬＴＲ及び／又はプロモーターの増強を得ることもできる。特別なエンハンサー配列は、宿主細胞系に依存して、当業者により容易に決定できる。
【００３０】
　完全なＭＰＭＶゲノムを共に含む一連のベクターを用いることにより、ＭＰＭＶ ＲＮＡを含まないビリオン以外のＭＰＭＶビリオンと同一であるビリオンを生成する細胞系を創造することができる。これらのビリオンは細胞から容易に得ることができる。例えば細胞を培養し、上清を採取する。望ましい用途によって、ビリオンを含む上清を用いることができるか、又はこれらのビリオンは、標準的技術、例えば勾配遠心、濾過等により上清から分離できる。
【００３１】
　これらの弱毒化ビリオンは、ワクチンを調製するのに非常に有用である。ビリオンは、ＭＰＭＶビリオンに反応する抗体を産生するのに用いることができ、又、これらのビリオンは、これらのビリオンの内部がウイルスＲＮＡを含まない以外、現実のＭＰＭＶビリオンと同一であるので、創造されたワクチンは特に有益である。ＭＰＭＶ gag／pol及びプロテアーゼ遺伝子と同時形質転換された細胞系から生成され、且つ他のウイルスからのenv遺伝子を含む偽型ビリオンは、この他のウイルスに対するワクチンを創造するのに有用である。例えば、細胞中のＨＩＶenvベクターは、ＨＩＶに対する抗体反応を惹起する能力を有するＨＩＶenvを含むが、他のＨＩＶ蛋白又はＨＩＶ ＲＮＡがないので病原性を有しない、ウイルス粒子を生じうる。
【００３２】
　これらのビリオンは、又、種々の目的、例えばビリオンのスクリーニング、ビリオンに対する標的システムの開発等に用いることができるビリオンに対する抗体を得るのに用いることもできる。さらに、これらのＭＰＭＶパッケージング欠損細胞系は、所望の遺伝子、例えば異種遺伝子を下記のように哺乳動物細胞に導入する手段として非常に有用である。
【００３３】
　これらのビリオンは、所望する遺伝配列をパッケージし、ＭＰＭＶにより感染可能な標的細胞にそれらを伝える非常に効率的な方法として用いうる。これはＭＰＭＶのパッケージングヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドを含むヌクレオチド切片（ＭＰＭＶパッケージング部分）、予め決定した遺伝子、並びにパッケージング配列及び予め決定した遺伝子に隣接して、パッケージング、逆転写、ベクターの標的細胞への組込み及びベクターからの遺伝発現のためのＬＴＲ内及び近くからの十分な数の配列に対応する配列を含むベクターを調製することによりなしうる。
【００３４】
　パッケージング部分は、好ましくは、少なくともプライマー結合部位と主要５'スプライスドナーの間の部分と対応する。そのようなベクターのパッケージングについて以下に示された実験データに関して、ベクターは、パッケージング効率を高めるために、ＭＰＭＶのgag遺伝子配列の最初の５００bpを有しうる。さらにそれは、パッケージングを阻害するように見える本配列の不存在がベクターをよりパッケージ化するようなので、５'主要スプライスドナーとgag遺伝子開始コドンの間の第４８１−４９３配列に対応するヌクレオチドを特異的に含まないであろう。例えばパッケージされ、逆転写され、標的細胞に組込まれて発現される十分な数のＭＰＭＶ配列は、ＬＴＲのＵ３、Ｒ及びＵ５配列、パッケージング配列並びに（逆転写に必要な）ＬＴＲに隣接する幾つかの配列を含むであろう。プライマー結合部位と５'主要スプライスドナーの間に記載されるパッケージング配列はそのようなベクターをパッケージングするのに十分であろうが、これはパッケージングをさらに増強するように見えるのでgag遺伝子コード配列の最初の５００ヌクレオチドを含むのが有利でありうるし、又、５'主要スプライスドナーとgag開始コドンの間の配列に対応する部分を省くのが有利であろう。gag開始コドンの変異は、パッケージングに必要なcis作用gagヌクレオチド配列が依然残っている限り、この点から開始する翻訳をさけるために許容されるであろう。例えばgagＡＴＧは部位指定突然変異導入法によりＡＴＣに変異できる。
【００３５】
　このベクターをＭＰＭＰパッケージング欠損細胞の一つを形質転換するのに用いる場合、それはビリオンにパッケージされるであろうこのベクター由来のヌクレオチド配列である。これらのＭＰＭＶパッケージ遺伝子は、次いでＭＰＭＶにより感染されうる標的としうる。この形質転換の方法は、従来の方法よりもはるかに効率的であることが期待される。さらに遺伝子の適当な選択により、ＭＰＭＶ感染の方法はモニターしうる。
【００３６】
　例えば、ベクターは、発現され、逆転写され、取り込まれるＭＰＭＶの５'及び３'ＬＴＲに対応する十分な数のヌクレオチド、パッケージされるＭＰＭＰパッケージング配列に対応する十分な数のヌクレオチド、例えばプライマー結合部位と５'主要スプライスドナーとの間の切片を含むことができる。ベクターは、又、機能遺伝子を生成するために転移させることが望まれる遺伝子の十分な数のヌクレオチド（例えば遺伝子切片）をも含みうる。本遺伝子は以下に記載するように、全ての所望される遺伝子であることができる。
【００３７】
　ＭＰＭＶ pＳＨＲＭ１５の感染プロウイルスクローンは、ワイス等（後記）によりコールド・スプリング・ハーバー発行、ＲＮＡツーモア・ウイルスズに記載された。それは隣接配列中に完全プロウイルスとハイグロマイシン耐性遺伝子を含む（図３）。オリゴヌクレオチド部位指定突然変異導入法を用い、非コード部分の一連の切片をプライマー結合部位（ＰＢＳ）とgag開始コドンの間で削除した。削除ＭＰＳ１は、ＰＢＳから主要スプライスドナーまでの完全部分を含む、即ちヌクレオチド３５６−４６９（ＳＤ）からの削除を含む。ＭＰＳ２は、ＭＰＳ１削除の５'部分の削除、即ちヌクレオチド３７６−４３２からの削除を含み、ＭＰＳ３はＭＰＳ１削除、即ち４０３−４６４の３'部分の削除を含む。ＭＰＳ４はＳＤとgag完全コドンの間、即ちヌクレオチド４８１−４９３からの削除である。全てのこれらのヌクレオチド番号付けは、ガーウィン等、ジャーナル・オブ・バイロロジィ ２４，478−488(1977)により用いられた番号付けによる。
【００３８】
　pＳＨＲＭ１５のサブクローン化断片中のこれらの削除は、無傷の感染プロウイルスへと後にサブクローンされた（要約のための図２参照）。同じ削除は、又、２つの長末端繰り返し配列とエンベロープ遺伝子中のドロール部位由来の３'配列とを含むpＳＨＲＭ１５の欠損誘導体にクローンされた。５'末端で、１.５kＢのgag遺伝子を含むように延びる５'リーダー配列が含まれ、これらの間で、ベクターに対応するセンス内のＳＶ４０初期プロモーター配列の調節の下に、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子カセットがクローンされた（図３）。５'リーダー配列中にＭＰＳ１、２、３及び４削除の一つがクローンされた。続いて削除をgag遺伝子で行い５'０.５kＢのgagのどれかが残るようにした。
【００３９】
　野生型ベクターと削除ミュータントプロウイルス又は削除ユータントベクターとの、及び野生型ウイルス又は削除ミュータントベクターと削除ミュータントプロウイルスとの組合せをcos１細胞に同時形質転換した。上清は濾過されて、Ｈela細胞上にプレートされ、ハイグロマイシン耐性コロニー現出の数は、ハイグロマイシン含有ベクターのパッケージングの効率を示した。実際上、ＲＮＡのパッケージングのための競合がベクターとウイルスの間で確立し、パッケージされた全長ＲＮＡのバランスの上で、ベクター又はプロウイルスのいずれかで削除ミュータントの効果が測定された。
【００４０】
　要約すると、実施例１にも報告されるように、削除ＭＰＳ１はＲＮＡパッケージングを事実上の廃止に導いた。ＭＰＳ２及びＭＰＳ１は等しい過酷さのパッケージング欠損を示し、ＭＰＳ４はパッケージングに全く影響を及ぼさなかった。事実、ＭＰＳ４削除を含んでいるベクターは、ＳＤからgagＡＵＧまで無傷の部分を含むものよりも大きな効率でパッケージするように見えた。５' ０.５kＢのみを残すためのgag配列の削除は、パッケージング効率を増大させ、遠位の部分で削除された配列がＲＮＡカプシド化に阻化作用を有することを示唆した。（ＲＳＶに関してを除き）他のウイルスでのパッケージングにほとんど普遍的に必要とされるＳＤとgagＡＴＧとの間の配列がＭＰＭＰでは必要でなく、除去によりパッケージングを増大させるという点で、ＭＰＭＶは、これまで記載されたレトロウイルスパッケージングシグナルの内でユニークであるパッケージングシグナル要求物を有することが結論づけられうる。従って、効率的にパッケージされるベクターは、好ましくはＳＤとgag開始コドンの間のこれらのヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含まない。パッケージングは、ＰＢＳ−ＳＤ部分の５'半分とそれをＲＳＶと区別する０.５kＢのgag遺伝子に含まれる配列により得ることができる。最初の５００ヌクレオチドに対するgag３'の部分も、明らかにカプシド化に対し相対阻止作用を有し、好ましくは効率的にパッケージされるベクターから排除される。
【００４１】
　これらの知見は、レトロウイルスパッケージングシグナルの一連の定義で、パッケージングに必要且つ十分な両シグナルの記載で、パッケージングのためのＲＮＡの競合の記載で、そして（阻止シグナルと呼ばれうる）ウイルスパッケージングでの減少に導くシグナルの同定で、ユニークである。本開示により当業者はＭＰＭＶに基づく効率的レトロウイルスベクターシステムを構築しうる。
【００４２】
　本発明の第二の局面は、ＨＩＶ及び他のレンチウイルスに関する。それはＭＰＭＶについて上記したものと相似の研究に基づく。結果はＨＩＶに関して報告され、本発明が示したが、同じことは他のレンチウイルスにあてはまることが確信される。
【００４３】
　ＨＩＶに関する結果は、５'リーダー配列がベクターをカプシド化するのに明らかに十分でないという驚くべき発見を含む。ともかく起きるカプシド化について、tatスプライスアクセプターのウイルス３'に第二配列が含まれなければならないことが確立された。この部分は、さらに、塩基7621−8141（ロス・アンゼルス・エイズ・データベースによる）からの切片に位置決定された。これらはＲＥＶ反応性について示された境界を非常に近くに含む。これらの２つの配列の存在で、ベクターは細胞系での及びビリオンでカプシド化したベクターの相対レベルの発現を比較すると、野生型ウイルスの８８％の効率でカプシド化できる。さらにgag遺伝子及び３'のエンベロープ、既に記載した断片、を含むベクターは、cis又はtransで発現したＲＥＶ蛋白の存在で、細胞中に高レベルで発現され、この増強された豊富さよりパッケージングについてのＲＮＡの増強された有用性に導かれる。従って、正しい遺伝因子を伴うgag遺伝子の存在により、ＨＩＶを基にしたベクターの増強されたパッケージングと伝達に導かれる。本パッケージング効率の分析は、しかしながら、gag遺伝子がパッケージングに必要でないが増強機能を有しうることを示した。
【００４４】
　gag遺伝子が削除されるとパッケージングは減少するが、異種配列をgag遺伝子と置換するとパッケージング効率は劇的に減少するという驚くべ発見がなされた。即ち、gag遺伝子の代わりに、異種遺伝子をプロウイルスゲノム内に挿入すると、ある場合に、カプシド化を使用に不適当に無力とすることができる。又、ベクター内でのrev反応性部分（ＲＲＥ）の存在は有利であることも明らかである。これは、核から非スプライスウイルスＲＮＡの放出を増強するrev／ＲＲＥシステムの能力に関して予言し得た。しかしながら、ベクターにＲＲＥを存在させるとヘルパーウイルスシステムによる形質導入に関するその能力を増強することを示した。これは、ＲＮＡのパッケージ能力の増強の直接効果であるように見え、rev／ＲＲＥシステムの予期し得ない機能である。
【００４５】
　本発明は、その範囲内に、それ自身は複製欠損であるが、そのＲＮＡが野生型ウイルスによりtransにパッケージでき、ＨＩＶ自体が感染によりトロピックである標的細胞に伝達できるレンチウイルスベクターを含む。これらのベクターは、標的細胞クロモゾームに組込まれ、抗生物質耐性マーカーの場合、それ自身が抗生物質耐性である標的細胞を生成するのに十分な標的遺伝子を効率的に発現する。
【００４６】
　特に新規ベクターは、ＨＩＶゲノムに対応する十分な数のヌクレオチドを含み、機能的ＨＩＶ遺伝子生成物を発現するが、ＨＩＶゲノムのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドを含有せず、感染ウイルスを生成する。ＨＩＶビリオン粒子にカプシド化されるべきＨＩＶゲノムに対応する十分な数のヌクレオチドを含むが、ＨＩＶゲノムのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドを含まず、感染ＨＩＶビリオンの生成に必要とされるＨＩＶ遺伝子生成物を生成するベクターが同定された。
【００４７】
　さらに特異的に、そのようなベクターに含まれなければならない配列は、主要スプライスドナー部位とベクターカプシド化に十分であることがＷＯ−Ａ−9119798に示唆されるgag遺伝子に関する開始コドンとの間のＨＩＶ非翻訳部分に対応するこれらのヌクレオチドであると思われる。これらのシグナルだけではベクターカプシド化に十分ではないが、７１６７から８２６７まで番号が付されたＨＩＶ（ＨＸＢ２Ｒ）のヌクレオチド配列（ロス・アンゼルス・エイズ・データベースからと同じ番号付）、rev反応性要素(ＲＲＥ）を含む配列の存在で、ベクターカプシド化が起きる。このカプシド化は、gag遺伝子が異種配列、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするものにより置換されても依然非効率的である。しかしながら、ヌクレオチド1642（ロス・アンゼルス・エイズ・データベースによる番号付け）でＢglＩＩ部位のcis作用gag配列５'の含有は、以下の実施例３に示すように５'未翻訳部分及び３と５倍の間のＲＲＥを含むベクターのパッケージ性を増強する。
【００４８】
　これら３つの重要なcis作用配列の全てを含むベクターは、それらに治療的利用のものでありうる遺伝子をクローンしうる能力を有する。５'未翻訳部分及びＲＲＥを含むベクターは、カプシド化でき、カプシド化の増強をより大きく投与するＲＲＥの存在は、未スプライスＲＮＡのみの輸送及び安定性に対するその効果から予言できた。適切な遺伝子が、そのようなベクターにクローンされ、所望の標的細胞に送達されうる。
【００４９】
　しかしながら、異種配列がgag遺伝子配列の代わりに挿入されるとパッケージ性及び形質転換性に重大な減少がありうる。この発見は、治療的に有用な異種遺伝子を転換するかも知れないベクターの潜在的設計を大きく変える。
【００５０】
　本発明の第二の局面は、所望のＨＩＶ生成物を発現するため、ＨＩＶゲノムからの十分に数のヌクレオチドに対応するが、ＨＩＶ ＲＮＡを効率的にパッケージするため、プライマー結合部位と５'主要スプライスドナーとの間の部分に対応する十分な数のヌクレオチドに対応しないヌクレオチド配列（５パッケージング配列）を含むベクターの一部として、パッケージング欠損ＨＩＶプロウイルスを利用する。ＨＩＶ−１パッケージングシグナル及び主要スプライスドナー部分の保存安定二次構造は、ハリソン等、ジャーナル・オブ・バイロロジィ ６６、4144−4153（1992）により記載され、その内容を引用して明細書記載の一部とする。
【００５１】
　そのようなパッケージング欠損プロウイルスは、ＨＩＶビリオン粒子を生成することができるが、それらの粒子内にそれ自身のＲＮＡをカプシド化することができない。この欠損プロウイルスは、又、それらの間でＨＩＶの実質構造、酵素及び調整蛋白を全て生成するのに十分であるＨＩＶの相補的遺伝子配列を含む２つのコードプラスミド構造物中に分割することもできる。可能な配置は、gag及びpol遺伝子生成物をコードする一つの構造物とenv、tat及びrev遺伝子生成物をコードする他方とを有する。これらの構造物はいずれもカプシド化に必要な５'リーダー配列を含まず、従って、それ自身のＲＮＡをパッケージすることはできないが、今、明らかにされた３つの重要なパッケージングシグナル配列を含む適当なベクターからtrans ＲＮＡにパッケージできる。同様にベクターは、ＨＩＶゲノムから本明細書に記載したパッケージングシグナルを含むが、他のＨＩＶコード遺伝子配列を含まない十分な数のヌクレオチドに対応して調製できる。このベクターは、次いでパッケージングシグナルを削除した欠損プロウイルスから誘導された蛋白によりtransにパッケージでき、次いでベクターは、野生型ＨＩＶにより通常感染可能な標的細胞に送達される。
【００５２】
　これらの配列は、好ましくはＨＩＶのゲノムに対応する。用語、対応するのは、保存付加的、削除及び置換が可能であることを意味する。
【００５３】
　上記したように、レトロウイルスは、ある場合には他のウイルスのエンベロープグリコプロテインで偽型化できる。続いて、異なるレトロウイルスからのenv遺伝子に対応する十分な数のヌクレオチドを含むベクターを調製できる。好ましくは、このベクターの５'ＬＴＲはenv遺伝子と同じゲノムのものである。そのようなベクターは、ＨＩＶ envパッケージング欠損ベクターの代わりにビリオンを創造するのに用いることができる。そのような変更により、得られるベクターシステムは、広い宿主範囲の標的細胞に用いることができる。
【００５４】
　ＭＰＭＶについて上述したように、事実上、全ての細胞系を用いることができる。好ましくは哺乳動物細胞系、例えばＣＶ−１、Ｈela、Ｒaji、ＳＷ４８０又はＣＨＯが用いられる。
【００５５】
　ウイルス細胞生成物の生成を増加するために、ＭＰＭＰについて上記したように、異なるプロモーターを用いうる。
【００５６】
　ウイルス細胞生成物のレベルを増強するために、ＭＰＭＶについて上記したように、エンハンサー配列を付加することができる。
【００５７】
　完全ＨＩＶゲノムを共に含む一連のベクターを用いることにより、ＭＰＭＶについて上記したように、ビリオンがＨＩＶ ＲＮＡを含まない以外、ＨＩＶビリオンと同じであるビリオンを生成する細胞系を創造することができる。
【００５８】
　これらの弱毒化ビリオンは、ＭＰＭＶについて上記したように、抗体等を作るワクチンを調製するのに特に有用である。特に、これらのビリオンは、所望の遺伝配列をパッケージし、それらをＨＩＶにより標的細胞に伝達するための非常に効率的な手段として用いうる。これは、ＨＩＶのパッケージングヌクレオチド(ＨＩＶパッケージング部分)に対応する十分な数のヌクレオチド断片、予め決定した遺伝子、並びに、パッケージング配列及び予め決定した遺伝子に隣接して、パッケージング、逆転写、ベクターの標的細胞への組込み及びベクターからの遺伝子発現のための、ＬＴＲ内部、及び近くからの十分な数の配列に対応する配列を含むベクターを調製することにより行ないうる。
【００５９】
　本発明の他の局面において、伝達される外来遺伝子は、全ての所望される遺伝子、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(ＮeＯＲ)についての遺伝子又はハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(ＨygroＲ)についての遺伝子であることができる。より好ましくは遺伝子は、遺伝子、例えばアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ）についての、アリールスルファターゼＡについての、又はＢドメイン推定因子ＶＩＩＩについての遺伝子、これらはそれぞれＡＤＡ欠損症、異染性ロイコジストロフィー及び血友病の患者に欠けている、の欠損した患者に治療価値のある生成物を発現する。これらはベクターにクローンされ、所望の標的細胞に伝達されうる。遺伝子は、病原性有機体、例えばトランス優性インヒビター、ウイルス組込みのインヒビター、アンチセンスＲＮＡ、触媒ＲＮＡ又は可溶性ウイルスレセプター誘導体、例えば可溶性ＣＤ４に逆に影響を及ぼす生成物を発現しうる。
【００６０】
　遺伝子は、病原体又は腫瘍に対する防禦又は他の有利な免疫応答を促進するために、治療用途、例えば病原体の抗原的に重要なエピトープの、又は標的細胞表面への腫瘍細胞の提示を有しうる。遺伝子は、Ｔリンパ球レセプター分子の抗原認識切片を暗号化し、それにより、リンパ球が本ベクターで形質転換されると、それらは所望の抗原特異性のＴ細胞レセプターを発現しうる。そのようなＴ細胞レセプター特異性は、好ましくは、病原性微生物の重要なエピトープに、又は腫瘍特異抗原に向けられる。そのようなＴ細胞(モノクローナルＴ細胞)のクローン拡大は、感染病原体に対する治療様式として、又は悪性疾患に対する作用物質として有用である。
【００６１】
　確認されたＭＰＭＶ及びＨＩＶでのパッケージングシグナルに関するこれまで知られていなかったデータが与えられることで、当業者は、それ自体のＲＮＡをカプシド化することはできないが、実質的ウイルス構造及び酵素、蛋白を全てコードすることができ、ウイルスＲＮＡの欠けたウイルス粒子を創造する他のパッケージング欠損ＭＰＭＶ又はＨＩＶを構築しうる。当業者は、又、必要とするcis作用配列を有するベクターを構築し、それによりそれらはそのようなゲノムＲＮＡ欠損粒子にカプシド化され、ウイルスが通常トロピックである標的細胞に伝達されうる。ベクターのＲＮＡは、次いで、ビリオン逆転写酵素により逆転写され、ウイルスインテグラーゼ酵素により細胞ＤＮＡに組込まれる。当業者は本情報によりＭＰＭＶ又はＨＩＶに基づくレトロウイルスベクターシステムを創り出すことができる。このシステムは、ベクター内の異種遺伝子プロモーター配列の使用により、及び組織特異配列、例えば組織特異プロモーター又は特別組織中に遺伝子の発現を明らかにするイントロン配列の使用により改良することが可能である。
【００６２】
　好ましくは、ＬＴＲ配列自体はプロモーターとして役立つことができるが所望の遺伝子に関するベクターが含まれる。実質的には全てのプロモーターを用いることができるが、好ましくは、それは、遺伝子が形質転換される宿主細胞中、遺伝子の発現を促進する。好ましいプロモーターは、ウイルスプロモーター、例えばＳＬ−３、マウスレトロウイルスＬＴＲ等を含む。エンハンサー配列もベクター中に好んで用いられる。遺伝子に関しポリアデニル化配列が好んで含まれる。ベクターに関するセンス定位での遺伝子の場合、本機能は３'ＬＴＲにより達成できる。ベクターに関するアンチセンスでの遺伝子の場合、遺伝子(即ち、ベクターに対するアンチセンスで)の３'末端に付加的ポリアデニル化シグナルが好んで取込まれる。ベクターは１以上の遺伝子又は偽似遺伝子配列を含むことができ、関心の多重遺伝子の発現を可能にする。
【００６３】
　このベクターは、好ましくは、上記したパッケージング欠損ベクターと用いることができる。そのような情況では、ＭＰＭＶ／ＨＩＶ ＬＴＲは、好ましくは、パッケージング欠損ベクターのゲノムに対応するベクターにおいて、パッケージング効率を促進する。しかしながら、パッケージング欠損ウイルスとの使用に加えて、このベクターは、遺伝子伝達についてのヘルパーウイルスと用いることもできる。
【００６４】
　本発明を、さらに以下の実施例により示す。これらの実施例は、本発明を理解することを目的として提供され、その限定として構成されたものではない。実施例はＭＰＭＶを基にしたベクターに関し、実施例２はＨＩＶを基にしたベクターに関する。
【００６５】
　実施例は、以下の引例を言及し、それらの内容を引用して明細書記載の一部とする。
　(１)　リー等(1990)ジャーナル・オブ・バイロロジィ　６４、3844−3854。
　(２)　ソニゴ等(1986)セル　４５、375−385。
　(３)　ターウィリガー等(1989)ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８６、3857−3861。
　(４)　ローセン等(1986)ジャーナル・オブ・バイロロジィ　５７、379−384。
　(５)　マドン等(1986)セル　４７、333−348。
　(６)　フィッシャー等(1985)ネイチャー(ロンドン)　３１６、262−265。
　(７)　ロサルド等(1990)ジャーナル・オブ・バイロロジィ ６４、1756−1763。
　(８)　モーゲンスターン等(1980)ヌクレイック・アシッズ・リサーチ　１８、3587−3596。
　(９)　ソーグ等(1983)ジャーナル・オブ・バイロロジィ　４８、667−675。
　(10)　コムジンスキー等(1987)アナリティカル・バイオケミストリィ　１６２、156−159。
　(11)　ファィンバーグ等(1983)アナリティカル・バイオケミストリィ　１３２、６−１３。
　(12)　キングストン(1987)イン・カレント・プロトコールス・イン・モレキュラー・バイオロジィ、１巻、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウィリィ・インターサイエンス、ニューヨーク。
　(13)　ポッツ(1990)テクニクス・イン　ＨＩＶリサーチ．ストックトン・プレス，ニューヨーク、103−106頁。
　(14)　コワルスキィ等(1987)サイエンス　２３７、1351−1355。
　(15)　シマダ等(1991)ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション　８８、1043−1047。
　(16)　レーバー等(1989)ジャーナル・オブ・バイロロジィ ６３、4085−4087。
　(17)　セルドン(1987)トランスフェクション・ユージング，ＤＥＡＥ−デキストラン、ユニット　９、２。　カレント・プロトコールス・イン・モレキュラー・バイオロジィ、１巻、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウィリィ・インターサイエンス,ニューヨーク。
　実施例は、又、添付の図面を引用する。
【実施例】
【００６６】
実施例１
　本実施例では、既に記述したプロウイルスとスクローンpＳＨＲＭ１５(図３)をヘルパーウイルスとして用い、transに、ＭＰＭＶビリオンの全ての構造及び酵素蛋白を与えた。ＭＰＭＶ５'　ＬＴＲ配列、gag開いた読み取り枠中位置１３２０にＢall制限部位の下流の５'リーダー配列、続いてベクターに対しアンチセンス定位にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ポリアデニル化配列を存在させることなく、そして最後に３'ＬＴＲの末端に延びる７４４０にドロール部位からのＭＰＭＶプロウイルスの３'末端を含むベクターを構築した(図３)。ヘルパーウイルス及び／又はベクターを、種々の欠失を既に記載したそれらに、即ちＭＰＳ１、ＭＰＳ２、ＭＰＳ３又はＭＰＳ４に導入した。ベクター及びヘルパーはＣos−１細胞に同時形質転換し、得られるビリオンを集めて、Ｈela細胞を感染するのに用いた。次いでヘラ細胞は抗生物質ハイグロマイシンを含む媒体に保持し、そしてベクターが取り込まれなければならない薬物に対し耐性のコロニーの数をカウントした。これは、ベクターのパッケージ性の措置及びＲＮＡビリオン粒子へのカプシド化で津失した配列の役割を与える。
【００６７】
　最初の実験では、ベクターpＨＬＭＰを、その野生型形でpＳＨＲＭ１５プロウイルスＤＮＡにより、又は５'未翻訳部分でＭＰＳ１、２、３又は４欠失によりＣos−１細胞に同時形質転換した。４８時間後、形質転換からの上清を集めてＨela細胞を感染するのに用い、２４時間後、細胞は、ハイグロマイシンＢ(Ｈyg．)による選択に取りかかった。結果を表１に示す。
【表２】
2004000280.tif 000003
【００６８】
　ＨＬＭＰだけが伝達できないこと、又、野生型ウイルスがミュータントＭＰＳ１、２及び３ら比べて貧弱なヘルパーであることは明らかである。これら後者の全てが、正常なビリオン蛋白を生成するので、野生型ウイルスＲＮＡがカプシド化についてベクターＲＮＡと競合していると結論されなければならない。
【００６９】
　ＭＰＳ４欠失が野生型のように作用することも注目に値し、これが野生型と同様にそれ自身をパッケージできること及びパッケージングに含まれた全く重要でないcis作用配列がＳＤとgag開始コドンの間に存在することを示唆する。ＭＰＳ１、２及び３変異は、それらがパッケージングに関し、ＨＬＭＰと競合しないので、パッケージングシグナルの有意な部分を分解した。
【００７０】
　第二実験では、pＨＬＭＰベクターも５'パッケージング部分に導入された変異を有する以外第一を繰り返した。即ち、ハイグロマイシン含有ベクターは、その一方又は両方がパッケージング部分に欠失を有するヘルパーウイルスと同時形質転換した。表２に与える結果は、上清の感染後、新鮮なＨela細胞へのこれら形質転換及びハイグロマイシンＢ選択から得たハイグロマイシン耐性コロニーを示す。
【表３】
2004000280.tif 000004
【００７１】
　ＷＴヘルパーウイルスにより、どのＲＮＡもごくわずかパッケージされた。しかしながらＭＰＳ４欠失は、ベクターをパッケージングするのに有利であるようであり、この部分にパッケージングに対し負の効果を有する配列があることを示唆する。ＨＬＭＰＳ１及びＨＬＭＰＳ２は極めてわずかしかパッケージせず、又、転換せず、これがＲＮＡカプシド化にとって最も重要な部分であることを示唆する。ＨＬＭＰＳ３はＨＬＭＰと同様にパッケージするように見える。量的には異なるけれども、ＭＰＳ３を用いる結果は、質的に同一であり、その数は、多分形質転換後得られたビリオンの力価の間の変化を反映する。ＨＬＭＰＳ１はそのプライマー結合部位に欠失を有し、本実施例で転換を達成するため:ＭＰＳ３で組換えなければならない。
【００７２】
　第三実験では、これがベクターパッケージングを増強するか減少させるかを見るため、ＨＬＭＰベクターのgagコード部分の位置７７８及び１７９３でＨpa１部位の間の配列を除去した。欠失は最初の０.５kＢのgagコード配列のみを無傷のままとする。得られるプラスミドはpＨＬＭＰδgagと呼ばれる。結果を表３に示す。
【表４】
2004000280.tif 000005
【００７３】
　gagコード配列での欠失は、明らかにＨＬＭＰベクターのパッケージングを増強させ、gagの１７９３でのＨpa１部位の部分３'がＲＮＡカプシド化に対し、阻害効果を有することを示唆する。
【００７４】
　第４実験では、第三を繰り返したが、ウイルス粒子の数の定量が転換するので、逆転写酵素(ＲＴ)を測定することにより上清の感染性の標準感度を用いることをしなかった。表４参照。ＲＴは放射標識ＴＴＰのポリＡ鋳型への組込みのシンチレーションカウントにより測定し、１分当りの放射活性カウント(cpm)として表わした。
【表５】
2004000280.tif 000006
【００７５】
　gag配列を欠失することによる影響を測定した。それは、pＨＬＭＰのパッケージングで約４倍増加させる。パッケージングについてのヘルパーウイルス競合も明らかであり、ＷＴウイルスは、ＭＰＳ１欠失ミユータントよりも約６０倍少ないＨＬＭＰベクターのパッケージングを示す。
【００７６】
実施例２
　細胞及びウイルス
　細胞系ジャルカット、ジャルカット−tat(４)及びヘラＴ４(５)を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ　１６４０中で生育した。これらの細胞系及びＨＩＶ−１分離ＨＴＬＶ−ＩＩＩ８はメディカル・リサーチ・カウンシル(ＵＫ)エイズ・リエイジェント・プログラムより供給された。
【００７７】
　ベクター(図４参照)、
　全ベクターはpＳＶＣ２１に由来し、最初にプラスミド(pＨＸＢc２)からのＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ分離物の感染プロウイルスクローンは、Ｒ．ガロ及びＦ．ウォングーストール博士(６)により提供された。pＳＶＣ２１は複製のＳＶ４０オリジンを組込む。ベクターは図４に示す。あるベクターでは、gag開始コドンをオリゴヌクレオチド指定突然変異導入法によりＧＡＧＡＴＧＧＧＴからＧＡＧＴＡＴＡＣＴに変更した。与えられた制限部位は、ＨＸＢc２ゲノムの位置を示す(ロス・アンゼルス・データベース番号付け、ここで位置１は５'ＬＴＲの最初の塩基である)。
【００７８】
　ＬＣＮＬ。Ｃla １(８３０)及びＫpnl(９０１５)の間のＨＩＶ配列をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)及びＧ４１８耐性(neo)遺伝子により置換した。ＣＡＴは５'ＬＴＲプロモーターを用い、neoはセンス(ＬＣＮＬ＋)又はアンチセンス(ＬＣＮＬ−)でマウス白血病ウイルスＳＬ３−３(７)由来のプロモーターを用い発現する。
【００７９】
　ＬＣＰＬ.ＣＸ, ＬＣＰＬ.ＨＸ, ＬＣＰＬ.ＰＸ。これらのベクターは、５'ＬＴＲから発現されたＣＡＴ遺伝子及びＳＶ４０初期プロモーター(pＢabe　Ｐuro(８)由来)により誘導されたプロマイシン遺伝子(puro)を含む。ＣＡＴ−ＳＶ４０−puro カセットは、ＬＣＰＬ.ＣＸでＣlal−Ｋpnl切片(８３０−９０１５)と、ＬＣＰＬ.ＨＸ中でＨindＩＩＩ−Ｋpnl切片(１０８５−９０１５)と、そしてＬＣＰＬ.ＰＸ中Ｐstl−Ｋpnl切片と置き換える。
【００８０】
　ＬＰＬ.ＣＸ, ＬＰＬ.ＨＸ, ＬＰＬ.ＰＸ。これらはＣＡＴ遺伝子の除去により上記３ベクターから誘導された。
【００８１】
　ＬＮＬ。これはＬＰＬ.ＣＸと同様で、puroの代りにＳＬ３−Ｎeo−ＳＶ４０−ポリＡカセットを有する。ＨＶＢと同様、ＷＯ−Ａ−９１１９７９８に記載される。
【００８２】
　ＬＣＰＬ２Ｍ、ＬＨＰＬ。ＬＣＰＬ２Ｍは内部ＳＶ４０プロモーターがtatスプライスアクセプター部位を含むpＳＶＣ２１の４３bpＥcoＲ１−Ｓal １切片(５７４３−５７８６)により置換されること以外ＬＣＰＬ.ＣＸと同一である。ＬＨＰＬでは、pＬＧ９０由来のハイグロマイシン耐性遺伝子（hygro）をＬＣＰＬ２ＭのＣＡＴ遺伝子の代りとする。
【００８３】
　ＨＶＰ、ＨＶＰＭ、ＨＶＨ。これらのベクターでは、ＳＶＣ２１のＢal １−ＥcoＲ１切片(２６８９−５７４３)を除去し、palの逆転写酵素及びインテグラーゼドメインを除き、env内のＢglＩＩ断片(７０４１−７６２１)をも除く。Ｎot１部位をenvの３'末端に近い既に創造されたＸbal部位にリンカー挿入により導入した(９)。プロモーター不存在のpuro(ＨＶＰ)及びhygro(ＨＶＨ)遺伝子を、本Ｎotl遺伝子と８８９７のＸhol部位の間で、nef遺伝子に類似の位置で挿入した。ＨＶＰ及びＨＶＨベクターを含む細胞はgag　p５５を発現し、処理を受ける。ＨＶＰＭは変異gag開始コドンを有するが、それ以外はＨＶＰと同一である。
【００８４】
　ＨＶＣＰ、ＨＶＸＰ。ＨＶＰのＢssＨＩＩ(７０８)−Ｓal １(もとは５７８６)断片をＬＣＰＬ２Ｍ又はＬＨＰＬ由来の同等の断片で置換した。挿入断片は５'リーター部位及びtatスプライスアクセプターを保持するが、結果はＣＡＴ(ＨＶＣＰ)又はhygro(ＨＶＨＰ)でgag配列を置き換える。
【００８５】
　ＨＶＰΔＥＣ。本ベクターでは、gag−pro部分のほとんどを含むＣla１(８３０)−ＥcoＲ１（正式にはＢal１、２６８９）断片はＨＶＰから除く。ＬＧＰＬ、ＬＧＲＰＬ、ＬＧＲＰＬΔＢＨ、ＬＲＰＬ。ＬＧＰＬは、Ｓal １(５７８６)と上で引用したＮot１部位の間の配列を除去することによりＨＶＰから導いた。puro遺伝子は、tatスプライスアクセプターを用いて発現され、env、tat及びrev配列は全て除かれる。ＬＧＲＰＬはgag及びenv(２０９６−７６２１)のＢglＩＩ部位の間のＶＨＰ配列を除去することにより作られた。この結果、枠外gag−env融合並びにtat及びrev機能の損失となるが、、Ｒev反応要素は残る。ＬＧＲＰＬΔＢＨは、tat及びrevの第二エキソンを含むＨindＩＩＩ−ＢamＨ１切片（８１４１−８４７５）を除去することによりＬＧＲＰＬから導いた。ＬＲＰＬはＣla １(８３０)とＢglＩＩ(７６２１)の間のＨＶＰ配列を除去することにより構築した。
【００８６】
　パッケージングプラスミド／ヘルパーウイルス構築物(図５)、
　(ｉ)　pＳＶＣ２１、これは完全感染プロウイルスクローンＨＸＢc２及び複製のＳＶ４０オリジンを含む。
　(ｉｉ)　pＳＶΔＰ１、主要スプライスドナーとgag開始コドンの間の１９bp欠失を有し、その結果、損傷ウイルス複製となるpＳＶＣ２１の既に記載されたミュータント(１６)。
　(ｉｉｉ)　pＳＶΔＰ２、これはスプライスドナーとpＳＶＣ２１のgag開始コドンとの間の３６ｂｐ欠失を有する。本欠失は、結果としてよりひどい複製障害となる。
　(ｉｖ)　pＳＶΔＰlΔＬＴＲ、Ｘhal部位(８８９７)の下流の配列を除去することにより得られたpＳＶΔＰlの非感染誘導体。これは、ウイルス蛋白システムに影響を及ぼすことなく全３'ＬＴＲを除く。
　(ｖ)　pＳＶΔＰlΔenv、env遺伝子中、ＢglＩＩ切片(７０４１−７６２１)を欠損しているpＳＶΔＰlの非感染ミュータント。無傷のビリオンを生成するため、本プラスミドは、env発現プラスミドpＬenvと同時形質転換され、そしてそれは３'ＬＴＲの除去によりpＩＩＩenv３から誘導されたものであり、その結果、下流ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが用いられる。
【００８７】
　方法
　puro及びhygro選択可能マーカーを含むベクタープラスミドをエレクトロポレーションによりＴ細胞系ジャルガット及びジャルガットtatに移入した。ベクター含有細胞の選択のため、プロマイシンをml当り０.５μgで用い、ハイグロマイシンはml当り５００μgで用いた。ジャルガットtat細胞は移入neo遺伝子を既に含むので、ＬＣＮＬベクターはジャルガット細胞だけにエレクトロポレーションを付した。Ｇ４１８は選択のため、ml当り２mgで用いた。移入システムに無傷のベクターが存在することをノーザン及びサウザンプロッティングにより、並びにＣＡＴ活性及び適当な薬剤耐性の証明により確認した。
【００８８】
　ベクターＲＮＡを安定に発現する細胞系をＨＩＶ−１分離ＨＴＬＶ−ＩＩＩ８で感染し、７日後、後代ウイルスを集めた。ベクター形質導入を評価するために、１−２mlの後代ウイルス原料は０.４５μm膜を濾過させて２×１０６ジャルガットtat細胞(ＬＣＮＬの場合のジャルガット細胞)を感染するのに用いた。選択は、２４時間後、上で与えられた濃度で適用し、フラスコは１０−１４日後、生細胞の存在を試験した。形質導入されていることが判ったこれらのベクターの力価は、以下の限界希釈法を用いて計算した。ジャルガットtat細胞を平底９６−ウエルプレート中、ウエル当り５×１０４細胞で系列４倍希釈ウイルスとインキュベートした。６つの増殖ウエルを各希釈で作り、選択は感染２４時間後に適用した。プレートは媒体の半分を取りかえることによりその後各５−６日ごとにフィードした。ウエルは３週間後生細胞の固りを記録した。ヘラＴ４細胞についてベクター力価測定のため、前日０.５×１０６細胞をシードした９０mmペトリ皿はウイルスの希釈液で感染した。プロマイシン(ml当り０.７５μg)又はハイグロマイシン(ml当り２００μg)選択は、感染後２４時間に適用した。１０日後、４％正式食塩水中でプレートを固定し、０.１％トルイジンで染色したのち、コロニーをカウントした。
【００８９】
　全細胞ＲＮＡを酸グアニジウム−チオシアネート法(１０)を用いて調製した。同様の方法を、以下のようなポリエチレングリコール(ＰＥＧ)沈殿及び高速遠心によりウイルスをまず濃縮したのち、ビリオンＲＮＡに用いた。−７０℃で保存したウイルスの原料を解かし、０.５容量の０.４Ｍ ＮaＣl中３０％ＰＥＧ８０００と一晩インキュベートした。沈殿を、４℃で４０分間２０００rpmの遠心により集め、０.５mlのＴＮＥ(１０mＭトリスＨＣl、１５０mＭ ＮaＣl,１mＭ ＥＤＴＡ pＨ７.５)に再び懸濁した。これを２％シュークロースを含む同容量のＴＮＥ上に層状とし、ベックマンＴＬＡ４５ローター中、４℃で１時間４０,０００rpm(９８,０００×g)で遠心した。ＲＮＡは１０μgのキャリヤーtＲＮＡの添加によりウイルスペレットより抽出した。ビリオンＲＮＡをＯＥＰＣ処理蒸留水中、最初のウイルス原料の約１／１００の容量に再び懸濁した。
【００９０】
　ノーザンブロッティングのために、５μgの全細胞ＲＮＡ又は５μのビリオンＲＮＡをホルムアルデヒド１％アガロースゲル上に延ばし、１０×ssc中ゼタプローブ膜(バイオラブ)上に移し、ベイク(bake)し、０.２５Ｍリン酸ナトリウムpＨ７.４、７％ラウリル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)中、６５℃で一晩ハイブリダイズした。高特異活性プローブを、クレノウポリメラーゼを用い任意初回免疫法(１１)により調製した。膜は、オートラジオグラフィーに先だち、６５℃で３×ssc、０.１％ＳＤＳで３回、次いで０.１×ssc、０.１％ＳＤＳで４回、洗浄した。ＥcoＲ１切片４６４８−５７４３をpol遺伝子プローブとして用い、ＬＴＲ配列をＫpnl−ＨindＩＩＩ断片９０１５−９６１６でプローブした。
【００９１】
　スロットブロット分析のために、逆転写酵素活性を正常化し、約０.５mlの未濃縮ウイルス原料に相当するビリオンＲＮＡ試料を緩和な変性条件(氷冷１０mＭ ＮaＯＨ,１mＭ ＥＤＴＡ)下、ゼタプローブ膜に適用した。完全ＲＮＡ加水分解のために、試料は２Ｍ ＮaＯＨ中、８０℃で３０分間インキュベートし、次いで上記の膜に適用した。膜はベイクし、ノーザンブロットと同じ方法でハイブリダイズした。
【００９２】
　ベクターＲＮＡパッケージングを計算するために、ビリオンＤＮＡのスロットブロットを正副２つ調製し、ベクター特異(puro遺伝子)及びウイルス特異(pol遺伝子)プローブとハイブリダイズした。結合プローブをシンチレーション計数により測定した。２つのプローブの長さと特異活性の違いを克服するため、puro及びpolハイブリダイズ配列のストイキオメトリーが１：１である標準試料を含めた。標準試料は、nefの代りにpuro遺伝子を含むプロマイシン耐性ＨＩＶ−１ウイルス由来のＲＮＡよりなった。野生型ヘルパーウイルスレベルのパーセントとして現わされるベクターカプシド化を、式
　１００×(puro試料×plo ref)／(puro ref×ＰＯＬ試料)
を用いて計算した。
【００９３】
　以上のデータは、どのベクターがパッケージされるかを示すが、異なるＲＮＡのパッケージング効率についての正確な情報を与えるものではない。そこで第二の計算を実施した。パッケージ可能なベクター各々について、パッケージング効率を、細胞中の完全長ベクターＲＮＡの量を決定すること及びこれをスロットブロット分析によりビリオン中にその後検出された量と比較することにより計算した。ＨＴＬＶ−ＩＩＩ８感染ベクター系由来の全ＲＮＡのノーザンブロットは、ベクター特異遺伝子プローブ（puro）とハイブリッドし、完全長ベクターＲＮＡの相対量を密度計測により決定した。感染細胞を分析に用い、それによりベクターＲＮＡ発現は、パッケージングに関して、tat及びrevにより完全にトランス活性化（transactivated）された。ＬＴＲプローブによる選択試料のハイブリダイゼーションによりベクターとＨＴＬＣ−ＩＩＩ８ゲノムＲＮＡのレベルを直接比較できるようになった。野生型ゲノムのパッケージング効率は、１.０の値を付与し、完全長ベクター（ＦＬＶ）ＲＮＡのパッケージング効率は、式
　　（細胞中のパッケージされたＦＬＶ×ＩＩＩ８ゲノム）／（細胞中のＦＬＶ×パッケージされたＩＩＩ８ゲノム）
を用い計算した。
【００９４】
　５−１０μgの各ベクター及びパッケージングプラスミドを、ＤＥＡＥデキストラン技術（１７）を用いＣＯＳ細胞に同時移入した。ウイルスは、７２時間後集め、０.４５μmフィルターを通過させて混入細胞を除き、次いで２×１０６ジャルカットtat細胞上でインキュベートした。プロマイシン選択は、２４時間後０.５μg／mlで適用し、ベクター含有細胞は、分子及びウイルス学的分析用に発展された。ＲＮＡは酸−グアニジウムチオシアネートを用い抽出した。種々のヘルパープラスミドによるベクター形質導入効率は、感染１０−１２日後、５％正式食塩水中でプレートを固定し、０.１％トルイジンブルーで染色したのち、プロマイシン耐性ヘラ細胞コロニーを計算することにより測定した。
【００９５】
　移入に続いてプロマイシン選択細胞から調製された高分子量ＤＮＡは、サザンブロッティングにより結合ベクターとヘルパーウイルスＤＮＡの存在を試験した。ＳaＣlによる一晩の分解と０.８％アガロースでの電気泳動後、５μgＤＮＡ試料を０.４Ｍ ＮaＯＨ中、毛細管ブロッティングにより、ゼタプローブ膜（バイオラブ）上に移した。高特異活性プローブを任意初期免疫法（１２）により調製し、一晩のハイブリダイゼーションを、０.２Ｍリン酸ナトリウムpＨ７.４、１００μg／ml剪断サケ精子ＤＮＡ含有７％ラウリル硫酸ナトリウム中、６５℃で実施した。
【００９６】
　ＣＡＴ分析は、ブラッドフォードの方法により定められるように、等量の蛋白を用いる標準的方法（１２）を用い実施した。逆転写酵素活性は、Ｐ３２標識ＴＴＰ及びポッツのミクロプレート（１３）を用い測定した。
【００９７】
　図４は、研究されたＨＩＶ−１ベクターの系列を示す。全てが５'及び３'ＬＴＲ、５'未翻訳部分並びにgag遺伝子の初めの４３bpを含む。複製コンピテントヘルパーウイルスによりベクターの形質導入を研究するために、ベクターはＴ細胞系ジャルカット及びジャルカットtatに安定に移入した。次いでこれらのベクター系をＨＩＶ−１分離ＨＴＬＶ−ＩＩＩ８により感染させ、後代ウイルスをＨＩＶレセプターＣＤ４を発現する標的細胞に接種した。表５は、表４に示されるベクターに関する２つの標的細胞系により得られた形質導入度数を要約する。同一原料中のヘルパーウイルス力価は、一般にジャルカットtat細胞に関し、ml当り１×１０５−５×１０５の範囲であった。
【００９８】
　ベクターのＬＣＮＬ、ＬＨＰＬ及びＬＣＰＬ／ＬＰＬ系列は、ヘルパーウイルスによりＣＤ４発現細胞系に移入できなかった（表５）。これらのベクターは、一時的ＣＯＳ細胞パッケージング系を用いても転換できなかった。ベクター形質転換に対する阻止は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ８によるベクター系の感染後、ビリオンから抽出したＲＮＡのスロットブロット分析が検出しうるベクターＲＮＡを示さなかったので、ＲＮＡパッケージングのレベルで作動しているように見える。ビリオンＲＮＡ試料は、ヘルパーウイルスゲノムを検出し、ＲＮＡ修復の有用な方法を提供するpol遺伝子プローブに強くハイブリダイズした。
【００９９】
　カプシド化されるべきこれらのベクターの失敗がベクターＲＮＡの低いレベル発現により説明できるかどうかを決定するため、これらのベクター系由来の全細胞ＲＮＡをノーザンブロッティングにより分析した。完全長ベクターＲＮＡは、スプライ又は内部開始mＲＮＡが通常より豊富であったが、全てのベクター系に検出された。感染ベクター系の完全長ベクターＲＮＡの相対量が密度計測により決定され、表６に示す。完全長ＬＣＰＬ.ＰＸ ＲＮＡの量は、伸長gag部分のcis作用抑制配列の結果かも知れないが、非常に低かった。他の非移入可能ベクターはより豊富で、完全長ＲＮＡはヘルパーウイルスゲノムＲＮＡレベルの６.８％まで存在した。幾つかのパッケージ可能ベクターは、これ（例えばＨＶＰＭ、ＬＲＰＬ）より低濃度で発現した。従ってベクターカプシド化の欠如は完全長ベクターＲＮＡの低い豊富さに帰することはできない。５'リーダー部分に存在するパッケージングシグナルがＨＩＶ−１基礎ベクターのカプシド化を行わせるのに十分でないと結論しうる。
【０１００】
　gag及びプロテアーゼコード部分、機能tat及びrev遺伝子並びに部分env遺伝子を含むベクターＨＶＰ及びＨＶＨは、野生型ヘルパーウイルスゲノムと同様に効率的に、それぞれ６０％及び１９％パッケージされた（それぞれのパッケージング効率０.３３及び０.２２）。これらのベクターは、又、大略、ＨＶＰについて２×１０４cfu、ＨＶＨについて２×１０３cfu／mlの力価でＣＤ４発現標的細胞に移入できた（表５）。現実の力価は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ８ヘルパーウイルスにより死滅する細胞は、特にジャルカットtat細胞では生じないので、これよりも高いであろう。これらの複合ベクターは、非常に高レベルで転写され、完全長ＲＮＡに加えて３つのスプライスＲＮＡ種を生じた。豊富なパッケージ可能ＲＮＡ、例えばＨＶＰの存在は、野生型ゲノムのカプシド化を阻害するか、又は感染ウイルスの力価を減ずるとは見えず、ＨＩＶ−１ ＲＮＡパッケージング能力は急性感染の間には飽和されないことを示唆した。
【０１０１】
　ビリオンＲＮＡのノーザンブロット分析は、ＨＶＰ及び他のベクターのカプシド化についての直接的証拠を提供した。ＬＴＲプローブを用い、２つのＲＮＡ種を観察した。一つは、又、polプローブにハイブリダイズし、ヘルパーウイルスゲノムに対応する。他はpuroプローブにハイブリダイズし、puroプローブにより未感染ＨＰＶベクター中で検定しうる未スプライスＨＶＰ ＲＮＡと同時移動した。全てのこれらの場合に、野生型ヘルパーウイルスＲＮＡに対応する、高分子量種も見ることができた。この種は、非パッケージ可能ベクター系由来の上清で検出された唯一のものである。ＨＶＰ由来のスプライスＲＮＡは、puroで又はＬＴＲでプローブしたＨＶＰベクター系から見出すことができるが、検出可能なスプライスＨＶＰ生成物は、puroプローブＨＶＰビリオンＲＮＡにより示されるようにカプシド化されない。同じpuroプローブは、ＬＧＲＰＬ、ＬＲＰＬ及び他のパッケージ可能なものからパッケージベクターＲＮＡを証明する（示さず）、しかしながら、ベクター、例えばＬＣＰＬは明らかに検出可能ではない。puroプローブビリオンＨＶＰの長い暴露は、野生型ウイルスゲノムの大きさに対応する弱い（faint）高分子量種を明らかにした。これは、多分、ＨＶＰ／ＨＩＶ組換え体である（この種は後で議論される）。それは、明らかに、ベクターカプシド化効率の算出に影響を及ぼすのに不十分な量で存在する。
【０１０２】
　ウイルス仲介伝達に続く標的細胞中の無傷のＨＶＰベクターの存在は、puro遺伝子プローブを用いノーザンブロット分析により確認した。標的細胞は、元のベクターと同じ長さ（５.８kb）の豊富なpuroハイブリダイズＲＮＡ及びスプライスベクター転写体を含んだ。細胞は、又、元のベクターに存在しない約９kbの長さのpuroハイブリダイズＲＮＡを発現する。このＲＮＡは、ＨＶＰとヘルパーウイルスの間の組換えの結果であるようである。９kb組換体ゲノムは複製コンピテントであり、二番目に、主要なpuroハイブリダイズＲＮＡ種と続いて起きるpuro遺伝子形質導入のラウンド（round）を形成した。組換え体ゲノムは、ＨＶＰベクターがＣＯＳ細胞にパッケージされた場合は観察されなかった。
【０１０３】
　ベクターＨＶＰＭでは、gag開始コドンは、オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法によりＧＡＧＡＴＧＧＧＴからＧＡＧＴＡＴＡＣＴに分裂した。変異ベクターのカプシド化レベルと形質導入力価は共に、親ＨＶＰベクターに比べると７倍減じた（表５）。しかしながら、gag変異の予期されない結果は、細胞内のベクターＲＮＡの定常状態レベルでの著しい減少とスプライスベクター転写物の割合の増加であった。
【０１０４】
　細胞内のその低濃度のために、ＨＶＰＭの分子当りのパッケージング効率は、カプシド化された全体量、従って形質導入効率は低くなったが、ＨＶＰのそれよりも大であった。
【０１０５】
　ベクターＨＶＰΔＥＣをgag−pro部分を除くことによりＨＶＰから導き、それによりgag部分の最初の４３bpのみとした。ベクターは１０％の野生型レベルでパッケージされ、ＨＶＰのそれより１０倍低い、２×１０３cfu／mlの力価で形質導入された。ＨＶＰΔＥＣのパッケージング効率は野生株ゲノムのそれと類似したが、その低カプシド化レベルはＲＮＡ豊富さを減少させる原因することができる（表６）。即ち、無傷のgag遺伝子は、ＲＮＡの高レベル発現を増強するようであるのに、それはベクターパッケージングにとって明らかに必須ではない。これらの発見は、他のベクター対、ＬＲＰＬ及びＬＧＲＰＬの分析により確認された（以下参照）。
【０１０６】
　別の一連のプラスミドを作って、env遺伝子のＲＮＡパッケージングへの貢献を測定した。考慮される因子は、ＨＩＶ−１の構造遺伝子が、mＲＮＡ発現を阻害するが、Ｒev蛋白とenv遺伝子内にあるcis作用Ｒev反応要素（ＲＲＥ）との相互作用により克服できるcis作用抑制配列（ＣＲＳ）を含むことであった。ＣＲＳ含有ＲＮＡの効率的発現のために、ＲＲＥは保存されなければならない。これは、全てのenv配列（ＲＲＥを含む）が除去されたベクターＬＧＰＬにより明らかに示される。puroを暗号化しているスプライスmＲＮＡは発現されるが、ごくわずかな未スプライスベクターＲＮＡがＨＩＶ−１による感染の前又は後にベクター系に見られる。このベクターは、検出できるほどにはカプシド化されず、巨大ウイルス接種材料（５μlに達して）を用いた場合に、まれにジャルカットtat細胞に移入された（表５）。ＬＧＰＬの非効率的カプシド化は、未スプライスＲＮＡの極端に低い豊富さによるものであろう。別途には、３.５kbＬＧＰＬ ＲＮＡは短じかすぎてパッケージできないか、又は特異３'パッケージングシグナルに欠けるのかも知れない。これらの可能性を識別するために、さらに３つのベクターを分析した。
【０１０７】
　ベクターＬＧＲＰＬは、gag配列に加えてＲＲＥを補う（span）１.１kb env断片を含む。従って、完全長ベクターＲＮＡは、Ｒevの存在で蓄積され、ヘルパーウイルスにより本実施例に供される。ＬＧＰＬと対象的に、このＲＲＥ含有ベクターは高レベルでカプシド化され、ほとんど野生型効率を伴い、５×１０３cfr／mlの力価を与えた（表６）。従って、ＬＧＲＰＬベクターは効率的ＲＮＡカプシド化に必要な全てのシグナルを含み、５'env配列は必要とされない。
【０１０８】
　ＲＲＥの下流のenv配列がＲＮＡパッケージングに貢献するかどうかを研究するため、ＬＧＲＰＬΔＢＨを産生するＬＧＲＰＬのＨindＩＩＩ−ＢamＨ１断片（ヌクレオチド８１４１−８４７５）を除去した。本ベクターのカプシド化レベル及び力価は、ＬＧＲＰＬに比べ約３倍減少した。ＬＧＲＰＬΔＢＨの細胞内濃度は極端に低いが、しかし、それゆえに分子当りのパッケージング効率は野生型ゲノムのそれよりも有意に大であった（表６）。これは、失われた配列がＲＮＡパッケージングに直接貢献しないことを示唆し、１％の野生型ゲノムＲＮＡレベルよりも少なく発現されたベクターＲＮＡが効率的に転移できることを示す。
【０１０９】
　ＬＲＰＬベクターは、gagの最初の４３bp以外は全てを欠いている点でＬＧＲＰＬと異なる。長さわずか２.６kbの本ベクターＲＮＡが発現され、野生型の６％レベルでパッケージされ、gag配列がパッケージングに必須でないことを示した（表５）。
【０１１０】
　ＬＲＰＬに類似するが３'env配列にかけているベクター（例えばＬＣＰＬ.２Ｍ）はカプシド化されなかったので、１.１kb env断片は重要なパッケージングシグナルを含み、又、cis作用抑制配列を含むベクターの安定な発現に必要であることが想像されうる。
【０１１１】
　gag遺伝子に欠けているベクターは緩和な効率で形質導入できるので、これは外来遺伝子の挿入に適切な部分を明らかにした。しかしながら、ＨＶＰＭのgag−pro部分のＣＡＴ又はベクターＨＶＣＰ及びＨＶＨＰ中のhygro遺伝子による交換は、ベクターカプシド化の有意な減少となった。パッケージングのより感受性のインディケーターである、これらベクターの形質導入力価は、ＨＶＰＭのそれよりも２０ないし４０倍低かった（表５）。これらのベクターのパッケージング効率もＨＶＰＭにより低く、ベクターカプシド化に対するＣＡＴ及びhygro遺伝子の直接阻害作用は排除されなかった(表６）。
【０１１２】
　これらのベクターの形質導入は、標的細胞由来のＲＮＡのノーザンブロット分析により明らかなように非常に高程度の組換えと関係した。大量の９kb組換えゲノムが検出されたが元のベクターはごくわずか又は全く検出されなかった。無傷のベクターの幾らかの転位を示すＣＡＴ活性がＨＶＣＰの形質導入後の細胞に検出され、又低レベルのＣＡＴ活性が二次転移に続いて時々検出された。ＨＶＨＰ転移から生じる本ベクターによるpuro遺伝子転移が常に組換の結果であることを示すプロマイシン耐性細胞はハイグロマイシンには耐性でなかった。９kb組換えＲＮＡの存在を示すが検出可能なＨＶＨＰベクターを示さないノーザンブロッティングが、これを確認した。
【０１１３】
　ベクターＲＮＡ豊富さとパッケージング効率との間には、明らかに絶対的な相関はなかった。例えばＬＧＲＰＬは細胞内にＨＶＰのレベルの１／３で発現したが、しかし２−３倍高いパッケージング効率を有した（表６）。同様の矛盾は、ＨＶＰ及びＨＶＰＭについても見ることができた。異なる細胞系での異なるベクターの使用も、異なるレベルの発現により、パッケージされた量と直接相関のないことを示した。
【０１１４】
　ベクターパッケージングは、ＣＯＳ細胞中にベクター及びヘルパーウイルスプラスミドを一過性に同時発現することによっても達成された。全てのプラスミドは複製のＳＶ４０オリジンを含有した。本システムにより、弱毒化又は非感染パッケージング構築物を用いることによって感染ウイルスの生成を減少させるか又は排除することが可能であった。弱毒化ウイルス、ＨＸＢΔＰ１及びＨＸＢΔＰ２は、パッケージングを分裂させる５'未翻訳部分に欠失を含む。非感染プロウイルスＨＸＢΔＰ１Δenvは、env遺伝子内に付加的欠失を含み、無傷のビリオンの生成のため相補env発現プラスミドを必要とする。
【０１１５】
　小ベクターＬＣＰＬ.ＰＸは、感染又は非感染ヘルパーシステムにより形質導入できなかった。同じ結果は、５'未翻訳部分を含み、gagの長さを変えるがＨＩＶ−１ゲノムの３'末端から配列を欠いている他のベクターでも得られた。ＨＶＰベクターは、感染及び非感染パッケージング構築物により緩和な効率で形質導入された。逆転写酵素活性が正常化されると、本システムでのＨＶＰ形質導入はＴ細胞においてよりも５−１０倍少なく効率的であった。形質導入ウイルスのＣＤ４特異性を示す、コロニーはヘラＴ８細胞を用いて得られなかった。ＬＧＲＰＬベクターも転移したが、ＨＶＰよりも約３倍少なく効率的であった。tat又はrevを発現しない本ベクターの形質導入は、感染ウイルスの不存在で有意に減少した。標的細胞中ウイルス蛋白の存在は、恐らくその発現を増強することにより、ベクターのコロニー形成能力を改良するように見える。
【０１１６】
　ＣＯＳ細胞上清中の感染ウイルスの力価は、ＴＣＩＤ５０分析ジャルカットtat細胞で測定した。結果は、ミュータントプロウイルスＨＸＢΔＰ１及びＨＸＢΔＰ２の減少した効率を示すが、本レベルの弱毒化がヘルパーウイルス伝播を防止するのに十分でないことをも示す（表７）。感染ウイルスは、ＨＶＰベクターが３'ＬＴＲを欠く非感染プロウイルスＨＸＢΔＰ１ΔＬＴＲを同時移入した場合にも回収された。これは、ベクター及びパッケージングウイルスの間の単一組換え事件のみが感染ゲノムを産生するのに必要とされるので、予期し得なかった。感染ウイルスは、gag−pol及びenv蛋白を分離プラスミドから発現させることにより、完全に除去し、これにより２つの組換え事件は感染ゲノムを産生するのに必要とされるであろう。この「二重性（dual）プラスミド」ヘルパーシステムを用い形質導入した、ＨＶＰ又はＬＧＲＰＬを含む標的細胞は、６週間のモニター期間の間、逆転写酵素活性又は細胞変性効果の証拠は示さなかった。さらに、これらの培養物由来の上清はプロマイシン耐性を新鮮なジャルカットtat細胞に伝え（二次転移）なかった（表７）。
【０１１７】
　ノーザンブロット分析は、標的細胞中に無傷のベクターＲＮＡの存在を確認し、二重性プラスミドシステムを用いた場合、感染ウイルスの証拠を示さなかった。puro遺伝子プローブによるハイブリダイゼーションは、予期されたベクター転写物を明らかにした。polプローブ（ＥcoＲ１断片４６４８−５７４３）を用い、ウイルスＲＮＡは、感染ヘルパーウイルス（野生型ＨＸＢc２及びΔＰ１）を用いた場合に示すことができたが、ベクター形質導入を二重性プラスミドヘルパーシステムを用いて達成した場合、検出できなかった。
【０１１８】
　サザンブロット分析も、二重性プラスミドパッケージングシステムを用いた場合、ヘルパーウイルスＤＮＡの不存在を確認した。Ｓacl分解ゲノムＤＮＡをプローブするためのＬＧＲＰＬのＳcal断片を用い、ＨＶＰ（２.２０kb及び３.５０kb）及びＬＧＲＰＬ（３.８８kb)について予期された大きさの断片が見られた。ヘルパーウイルスに対応する３.５７kb及び５.３３kbのバンドは、感染ヘルパーウイルスを用いた場合に見られたが、二重性プラスミドヘルパーシステムを用いる転移後は見られなかった。感染ウイルスが存在した場合には、付加的断片が見られた。０.４kbのその長さから、本断片はベクターおよびヘルパーウイルスの間の組換えの結果であることが推定されうる。これは４.０８kbの伸張env＋puro断片を生成する。これらの細胞では、組換えＲＮＡ（即ち、puroプローブとハイブリダイズするゲノム長ＲＮＡ）はほとんどないか全くないことが明らかである。従って、組換えプロウイルスは発現されないか又はベクター含有細胞の選択に続いて産生されない。
【表６】
2004000280.tif 000007
　ａ　１０４cpm／μlのＲＴ活性に正常化した
　ｂ　３又はそれ以上の実験の意味
　ｃ　野生型ウイルスに対応するカプシド化レベル
　ｄ　ジャルカット標的細胞
　ｅ　試験せず
　ｆ　検出できず
　ｇ　ＬＣＰＬ.ＣＸ、ＬＣＰＬ.ＨＸ、ＬＣＰＬ、ＰＸ、ＬＣＰＬ２Ｍ
　ｈ　　ＬＣＰＬ.ＣＸ、ＬＰＬ.ＨＸ、ＬＰＬ.ＰＸ
【表７】
2004000280.tif 000008
　ａ　感染ベクター系中の完全長ヘルパーウイルスＲＮＡの量のパーセントとして表した
　ｂ　ビリオン中に存在するヘルパーウイルスＲＮＡのパーセントとして表した
　★　形質導入力価から評価された値
　ＮＤ　検出できず
【表８】
2004000280.tif 000009
　ａ　ローマ数字は上記したプラスミドを示す
　ｂ　1000cpm／μlのＲＴ活性に正常化した
　ｃ　ジャルカットtat細胞に関する感染ウイルス力価
　ｄ　実施せず
　ｅ　適用できず
【０１１９】
　結論として、ベクターＬＲＰＬ及びＨＶＰΔＥＣの成功したパッケージングから示されるように、ＨＩＶ−１のgag遺伝子はＲＮＡパッケージングに必須ではない。これらのgagベクターは、それらのgag対照物よりも低レベルで発現されたが、それらのパッケージング効率は高く保持された。パッケージング効率の減少は、外来遺伝子がgagの代わりに挿入されたときに観察され、これは外来配列の阻害効果によるであろう。
【０１２０】
　env遺伝子配列は、ベクター転移でより重要な役割を演じているように見える。ＨＩＶ−１遺伝子発現の重要な特徴は、gag及びenv遺伝子内でのcis作用反応配列（ＣＲＳ）の存在である。これらの配列はmＲＮＡ発現を阻害するが、その標的ＲＮＡ配列、env内に位置するＲev反応要素（ＲＲＥ）とＲev蛋白との相互作用により克服できる。gag配列を含むがＲＲＥに欠けているベクターは、完全長ＲＮＡとして発現されなかったし、カプシド化もされなかった。ＲＲＥを含む１.１kb env断片の含有は、Ｒevの存在で、未スプライスベクターＲＮＡを蓄積させ、１０４の因子によりそのようなベクターの形質導入を増強させた。cis作用反応配列を含むベクターの発現に対するその影響に加えて、このenvの部分は必須パッケージングシグナルを含むように思われ、ＬＲＰＬのパッケージング、さもなければ最小ベクターを指令することが可能であった。
【０１２１】
　ＨＩＶ−１ベクターの全ての実用的な応用において、パッケージングウイルスの伝播が排除されなければならない。ベクター、エンベロープ欠損プロウイルス及び分離env発現プラスミドがＣＯＳ細胞に同時移入された一過性パッケージングシステムを用い、実施例２はＨＩＶ−１ベクターのウイルスフリー転移が可能であり、ＣＤ４特異性であることを示す。２つの組換え事件は感染ゲノムを生成するのに必要とされ、そうでない場合にこれが観察された。最適形質転換条件で、ベクター力価は、Ｔ細胞（ベクター系）システムでよりもＣＯＳ細胞システムで１００倍低かった。ベクターパッケージングを必要としたcis配列は、両細胞型で同一であるように思われ、システムがないと３'env配列に欠けるベクターの転移が観察できた。
【０１２２】
　幾つかの実験室が、ＬＴＲ、５'リーダー部分及びある場合には、gagの部分のみを含むＲＮＡの成功したカプシド化又は形質導入を報告した。本明細書での発見はこれらの発表された報告、例えばＷＯ−Ａ−9119798と対照的であるが、ここに示したベクター転移データは広範なＲＮＡ分析及びＲＮＡカプシド化の注意深い測定により支持される。ベクター力価はカプシド化レベルと非常によく相関するが、envの３’部分に欠けるベクターのパッケージングも転移も示さなかった。
【０１２３】
　これらの結果とＷＯ−Ａ−9119798で報告されたものとの間の矛盾は、用いた実験システムに関係しうる。これまで発表された全ての研究は、ＲＮＡカプシド化を分析するのに一過性プラスミド発現システムを使用し、これに対し本研究では、ＨＩＶ−１ベクターがＴ細胞系で安定に発現され、天然感染の間、複製コンピテントヘルパーウイルスによりパッケージされた。このシステムは、安定に組込まれプロウイルスの発現を模擬し、ＤＮＡ仲介遺伝子転移の全ての可能性（例えばウイルス粒子をコートングする残余プラスミドＤＮＡとして）を厳格に排除する利点を有する。
【０１２４】
　ベクターに基づいたＨＩＶ−１のパッケージングは主にcis作用シグナルの存在により決定されるが、ベクターＲＮＡ豊富さ及び５'異種配列の存在も、パッケージされる量に影響するようである。本明細書に記載される理解されやすい研究に基づけば、５'リーダー部分は明らかにＨＩＶ−１ベクターのパッケージングに十分ではなく、３'env配列は、重要なパッケージングシグナルを含む。ＨＩＶ−１スプライスドナー部位の下流の５'リーダー配列が明らかにＲＮＡパッケージングに十分でない一方で、ＨＩＶ−１のenv mＲＮＡが検出可能にカプシド化されないので、これらの配列は、カプシド化のためのＲＮＡの選択で決定的役割を演じなければならない。
【０１２５】
　ＨＩＶ−１パッケージングシグナルの同定は、遺伝子転移の手段としてＨＩＶの開発に導く。抗ウイルス遺伝子を運ぶＨＩＶ−１レトロウイルスベクターは、エイズ治療への潜在的に有効な接近を示し、そのような遺伝子のＣＤ４−発現細胞への特異標的の範囲を与える。本明細書に示されるように安定に組込まれたベクターからＲＮＡをカプシド化する野生型ウイルスの能力は、一群の工業製品ＣＤ４＋細胞に導入されたパッケージング可能な抗ウイルス構築物が患者自身のウイルスにより伝播される場合、ＨＩＶに感染した患者に有用でありうる。ＲＮＡカプシド化及びウイルス組立てのより完全な理解が、又、抗ウイルス治療への新しい標的を確認しうる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１はpＨＬＭＰ及びpＨＬＭＰδgagベクターを示す。後者はgagの欠失を伴う前者である。
【図２】図２は欠失ミュータントＭＰＳ１等の図表である。
【図３】図３は、ＭＰＭＶプロウイルスを含み、並びにＳＶ４０初期プロモーター配列により誘導されたハイグロマイシンＢ耐性遺伝子(ハイグロマイシン)を伴い、且つＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを伴うpＴ２１８Ｒバックボーンに基づくプラスミド、pＳＨＲ１５の図表である(ＬＴＲ,gag,pol,env切片はウイルスヌクレオチド配列を引用する)。
【図４】図４は、ＨＩＶ−１ベクターを示す(各末端の未標識ボックスはＬＴＲである。星印は、変異gag開始コドンを示す。ハッチングした及び黒ぬりのボックスは、それぞれtot及びrevのエキソンを示す。envのＲev反応要素は下線から引かれる。波状線により中断されたボックスは部分欠失を含む。ＳＬ３及びＳＶを印すボックスはＳＬ３−３ＬＴＲ及びＳＶ４０初期プロモーターである)。そして
【図５】図５は、以下に記載されるパッケージングプラスミド(ｉ)ないし(ｖ)を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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