(57)【要約】【課題】汚染物質を微生物で分解する浄化処理の対象となる土壌について適用すべき浄化処理の処方を合理的に決定する方法および浄化処理方法を提供すること。【解決手段】本発明の浄化処理の処方の決定方法は、複数の汚染土壌の浄化処理例のデータベースを作成すること、浄化処理対象となる汚染土壌に存在する微生物相に関するＤＧＧＥ法によるデータを得ること、前記対象汚染土壌の微生物相のデータに近似する１または複数のデータを前記データベースから抽出すること、前記抽出したデータに基づいて、前記対象汚染土壌に適用する浄化処理の処方を前記データベースから選択することを含む。【選択図】　図１
2004033827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物による汚染土壌の浄化処理の処方の決定方法であって、
複数の汚染土壌の浄化処理過程の少なくとも２の時点における、前記汚染土壌に存在する微生物相に関するデータ、汚染物質に関するデータ、前記浄化処理の処方に関するデータ、前記浄化処理の期間に関するデータを含むデータベースを作成すること、
浄化処理対象となる汚染土壌に存在する微生物相に関するデータおよび汚染物質に関するデータを得ること、
前記対象汚染土壌の微生物相のデータに近似する１または複数のデータを前記データベースから抽出すること、
前記抽出したデータに基づいて、前記対象汚染土壌に適用する浄化処理の処方を前記データベースから選択することを含む、汚染土壌浄化処理の処方の決定方法。
【請求項２】
前記データベースはさらに、非汚染土壌に存在する微生物相に関するデータを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記土壌に存在する微生物相に関するデータは、
複数の土壌から抽出されるＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応で増幅した複数の産物を得、
該産物を変性剤濃度勾配ゲルに適用して電気泳動により分離し、
電気泳動後のゲル中の前記産物の分離パターンを記録し、
前記分離パターンを比較することにより得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリメラーゼ連鎖反応には配列番号１および２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
微生物による汚染土壌の浄化処理方法であって、
浄化処理開始前に、請求項２に記載の決定方法により汚染土壌浄化処理の処方を選択すること、
該処方による浄化処理を施すこと、
汚染土壌浄化処理中の少なくとも１の時点において、前記処方を継続するか、別の汚染土壌処理の処方を採用するかまたは浄化処理を終了するかを決定すべく、請求項２に記載の決定方法により汚染土壌浄化処理の処方を選択することを含む、汚染土壌の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用する汚染土壌の浄化処理に関し、具体的には、汚染土壌の浄化処理の処方を決定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
土壌の浄化処理技術として、汚染物質を分解することができる微生物（分解微生物）による浄化処理が注目されている。分解微生物を利用した汚染土壌浄化処理方法には、汚染土壌にもともと存在する分解微生物を活性化するバイオスティミュレーションと、外来の分解微生物を汚染土壌に添加するバイオオーギュメンテーションとの２つのアプローチがある。バイオスティミュレーションにおいては汚染土壌に存在する分解微生物の性状把握が重要であり、バイオオーギュメンテーションにおいては添加する外来の分解微生物の性状把握が重要である。
【０００３】
土壌に存在する分解微生物の性状把握には、従来、希釈法、平板培養法、メンブレンフィルター法などによる生細胞数を測定する方法が用いられてきた（杉山純多ら編、１９９９年、新版微生物学実験法、講談社サイエンティフィク、８２−８４ページ）。例えば、希釈法では、微生物の懸濁液サンプル中の微生物の生細胞の濃度を以下の方法で決定する。サンプルを一定の希釈倍率で順次希釈し、各希釈倍率の微生物懸濁液を培地の入った数本の試験管に分注して培養する。すると、ある希釈倍率までは全ての試験管で微生物が生育するが、その次の希釈倍率では一部の試験管でのみ微生物の生育が見られる。さらに次の希釈倍率になると全ての試験管において微生物の生育がない。このような結果から、ポアソン分布のような統計的手法に基づいて、もとのサンプルの微生物の生細胞の濃度を推計することができる。これをＭＰＮ（ｍｏｓｔ　ｐｒｏｂａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ）法という。汚染物質などの特定の物質を添加した培地を用いてＭＰＮ法を行うことにより、汚染物質を分解する等の汚染土壌の浄化に関与する微生物についてのデータを得ることができる。しかし、土壌に存在する微生物には培養困難なものが多いため、生細胞数を測定する方法では一部の微生物についてしか性状把握ができないうえ、培養期間に一ヶ月以上を要するという欠点があった。
【０００４】
微生物の培養を要しないで土壌に存在する分解微生物の性状把握をする技術として、キノンプロファイリング法がある（（社）日本下水道協会編、１９９７年、下水試験方法、上巻、７６３−７６７ページ；栗栖太ら、１９９９年、土木学会論文集、Ｎｏ６３６／ＶＩＩ−１３、２３−３３ページ）。これは、電子伝達系に関与する微生物の成分であるイソプレノイドキノンの分子種に多様性があることを利用して、微生物の種あるいは分類群に特異的な分子種が微生物を含むサンプル中に存在するかどうかをＨＰＬＣなどのクロマトグラフィの手法で分析することにより、サンプル中の微生物の種類構成についてのデータを得る方法である。しかし、キノンの分子種の多様性は微生物の生物種の多様性に比べると小さいため、特異的なキノンの分子種がない微生物については検出することはできない。
【０００５】
このため、近時、遺伝子工学的手法を利用して土壌に存在する分解微生物の性状把握をする技術が開発されている。ＤＮＡマイクロアレイ法では、まず、単離された微生物由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの全部もしくは一部あるいはこれらの配列を含むオリゴヌクレオチドのようなプローブをガラススライドのような基質に不動化したＤＮＡチップを用意する。次いで、このプローブと、分析対象の土壌から抽出したＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションを行い、それぞれのプローブと前記ＤＮＡまたはＲＮＡとの結合の程度を測定することにより、それぞれのプローブに相補的なＤＮＡまたはＲＮＡを有する土壌中の微生物の数を推定する（例えば、Ｓｍａｌｌ、Ｊ．ら、２００１年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７巻、４７０８−４７１６ページ；Ｗｕ、Ｌ．ら、２００１年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７巻、５７８０−５７９０ページおよびこれらに引用された論文）。分析対象の土壌からＲＮＡを抽出して、汚染物質の浄化に関与する酵素などの遺伝子のプローブとの反応をさせる場合、前記土壌に存在する微生物が汚染物質の浄化に関与する遺伝子の発現、すなわち転写をしているか否かについてのデータを得ることができる。前記土壌からＤＮＡを抽出して、汚染物質の浄化に関与する微生物の生物種あるいは分類群に特異的なプローブとの反応をさせる場合、前記土壌に存在する微生物が汚染物質の浄化に関与する微生物であるか否かについてのデータを得ることができる。
【０００６】
ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法では、遠心分離その他の手法で得られた微生物の濃縮液を顕微鏡用スライドガラスに滴下し、固定液で処理して微生物を該スライドガラス上に固定し、汚染物質の浄化に関与する微生物の生物種あるいは分類群に特異的な蛍光標識プローブと反応する個体の数と、全微生物数とを顕微鏡下で計測することにより、前記汚染物質の浄化に関与する微生物の微生物全体に占める割合についてのデータを得ることができる（栗栖太ら、１９９９年、前出；Ｉｗａｍｏｔｏ、Ｔ．およびＮａｓｕ、Ｍ．、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９２巻、１−８ページおよびこれらに引用された文献）。
【０００７】
Ｔ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、制限酵素切断断片末端の多様性）法では、異なる種または系統に分類される微生物のゲノムの間で配列相同性が高い生物進化の過程で保存された配列を有する領域、例えば１６Ｓ　リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子のヌクレオチド配列において、異なる種の微生物で配列が共通な不変領域が種特異的な配列多様性がある可変領域を挟むように分布していることを利用する（Ｌｉｕ、Ｗ．ら、１９９７年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３巻、４５１６−４５２２ページ；Ｉｗａｍｏｔｏ、Ｔ．およびＮａｓｕ、Ｍ．、２００１年、前出）。すなわち、分析対象の土壌から抽出したＤＮＡについて前記保存された配列を有する領域に含まれる可変領域を挟む２つの不変領域の間をＰＣＲ法で増幅すると、保存された配列は既知の生物のゲノムだけでなく未知の生物でも同じ配列である可能性が高い。したがって、このようなプライマーを用いると、プライマーと同じ配列を有する全ての生物のゲノム由来の可変領域を含むＤＮＡを増幅することができる。この増幅の際、一方のプライマーのみを蛍光標識しておき、増幅産物を制限酵素または制限エンドヌクレアーゼで切断し、該増幅産物の制限酵素で切断された断片のうち蛍光標識されたプライマーを含む断片の長さおよび量をＤＮＡ配列決定用のゲル電気泳動装置を用いて解析する。使用する制限酵素を可変領域でのＤＮＡ配列の相違により切断部位が変化するように、例えば４塩基を認識する制限酵素のような切断部位の配列の出現頻度の高い制限酵素を選ぶことにより、前記蛍光標識したプライマー部位とこれに最も近い制限酵素切断部位との間のＤＮＡ断片の長さの違いで種の違いを区別することができる。したがって、蛍光標識されたプライマーを含む制限酵素切断断片の長さおよび量を、ＤＮＡ配列決定用のゲル電気泳動装置のようなＤＮＡ断片の長さの相違を１塩基単位で識別することができる分析装置を用いて解析することにより、分析対象の土壌に存在する微生物の構成、すなわちいくつの種の微生物がそれぞれどの程度の構成比率で存在するかを推定することができる。
【０００８】
ＤＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｉｓｉｓ、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法は、分析対象の土壌から抽出したＤＮＡについて、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のような保存された配列相同性の高い領域における可変領域を挟む２つの不変領域の間をＰＣＲ法で増幅する点では前記Ｔ−ＲＦＬＰ法と共通する。しかし、Ｔ−ＲＦＬＰ法とは異なり、ＰＣＲに用いる一方のプライマーは、その末端にＧＣクランプというＤＮＡ変性が起こりにくい配列を含むように設計しておき、ＰＣＲ増幅産物を切断することなく変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法により分離する（Ｍｕｙｚｅｒ、Ｇ．ら、１９９３年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９巻、６９５−７００ページ）。すると、変性剤の濃度勾配のあるゲルの中を移動するＰＣＲ増幅産物の個々のＤＮＡは、前記可変領域の部分の塩基のＧＣ相対量に応じて、前記可変領域が変性を起こす変性剤の濃度の位置で停止してバンドを形成する。すなわち、変性剤の濃度が低い部分のゲルの中のＤＮＡは、２本鎖状態のコンフォメーションをとるのでゲル中を移動することができる。移動とともにゲル中の変性剤の濃度が上昇して、変性剤がＤＮＡ変性を起こす濃度の位置に達すると、前記ＧＣクランプの部分は未変性で二重らせんのままだが、ＧＣクランプ以外の部分は変性して二重らせんが解ける。すると、ＤＮＡは変性した２つの１本鎖部分とＧＣクランプの２本鎖部分とが３方向に伸びた状態のコンフォメーションをとるためＤＮＡは移動することができなくなり停止する。ＤＮＡの変性を起こす変性剤の濃度はＤＮＡの配列によって異なるため、微生物の種ごとにＰＣＲ増幅産物の変性剤濃度勾配ゲルでの移動度が異なる。したがって、電気泳動後のゲル中のＰＣＲ増幅産物の分離パターンの特定のバンドの移動度とそのバンドのＤＮＡ量とから、土壌中の微生物の構成を推定することができる。
【０００９】
Ｔ−ＲＦＬＰ法およびＤＧＧＥ法は、ＰＣＲプライマーに用いる領域の配列が保存されている微生物であればプライマーに挟まれた増幅産物の内部の配列に関係なく適用できる。例えば１６Ｓ　ｒＲＮＡは原核生物のリボソームの小サブユニットに含まれるＲＮＡであるためＳＳＵ（Ｓｍａｌｌ　Ｓｕｂｕｎｉｔ）　ｒＲＮＡとも呼ばれるが、１６Ｓ　ｒＲＮＡの全長配列または部分配列は１６，２７７種類以上がアライメントを取ったうえで、データベース化されており、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ、ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｈｔｍｌ／）を通じて利用可能となっている（Ｍａｉｄａｋ、Ｂ．Ｌ．ら、２００１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２９巻、１７３−１７４ページ）。そこで、前記データベースを参照して、全ての系統の微生物か、特定の系統に分類される微生物かという研究者が知りたい微生物の範囲に応じてプライマー配列を選択することにより、所望の範囲の微生物についての個別の種ごとの数を推定することができる。
【００１０】
ＤＮＡマイクロアレイ法およびＦＩＳＨ法は、プローブとして単離されたＤＮＡ断片または合成オリゴヌクレオチドを用いるため、ＤＮＡ断片が既に単離されているかまたはそのヌクレオチド配列が既に知られている特定の微生物または特定の遺伝子にしか適用できない。したがって、ＤＮＡマイクロアレイ法では、土壌中に存在する既知の特定の微生物または遺伝子についてのデータしか得られない。しかし、分解微生物は未同定の生物種が多数あり、浄化処理に関与する分解微生物および分解浄化の生化学的なメカニズムについては不明である。そこで、分解微生物を含む全ての微生物の構成についてのデータが得られるＴ−ＲＦＬＰ法およびＤＧＧＥ法の方が土壌に含まれる汚染物質の種類および量とそれぞれの汚染物質を分解する活性とを反映するので、微生物を利用する浄化処理の処方を検討するうえで利用価値が高い。
【００１１】
Ｔ−ＲＦＬＰ法では、蛍光標識したプライマーの末端に最も近い制限酵素の切断部位が変動するようなＤＮＡ配列の多様性しか検出できないのに対し、ＤＧＧＥ法では同じ長さのＤＮＡ断片の間の１つの塩基対だけの変異のようなより広範なＤＮＡ配列の多様性でも検出することができる。
【００１２】
また、Ｔ−ＲＦＬＰ法では蛍光標識したプライマーの末端から制限酵素切断部位までの長さしかわからない。これに対し、ＤＧＧＥ法では、電気泳動後のゲルから特定のバンドから切り出したＤＮＡをＰＣＲ法および組み換えＤＮＡ技術を用いて単離し、全長のＤＮＡ配列を決定することができる。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイ法およびＴ−ＲＦＬＰ法では、土壌に存在する微生物に対応するデータが得られるだけであるのに対し、ＤＧＧＥ法では、土壌に存在する微生物に対応するデータを得ることができるのにとどまらず、逆に、得られたデータに含まれる特定のバンドから遡って、該特定のバンドに対応する微生物についての情報を得て、その生物種の同定およびその生物種の系統分類上の位置の推定をすることができる。
【００１３】
ＤＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法、キノンプロファイリング法および土壌から抽出したＤＮＡを用いるＤＮＡマイクロアレイ法は、分類学的な見地から微生物群集の構造を解析する方法（構造解析）である。これに対し、ＦＩＳＨ法、汚染物質を添加した培地を用いるＭＰＮ法および土壌から抽出したＲＮＡを用いるＤＮＡマイクロアレイ法は、浄化能力という微生物群集の機能を解析する方法（機能解析）である。ただし、前記構造の解析方法であっても、分解微生物の生物種または分類群に特異的なプライマーまたはプローブを用いる場合には、微生物群集の機能の解析方法として用いることができる。
【００１４】
これらの技術を用いて、分解微生物を利用する汚染土壌の浄化処理の過程における汚染土壌に存在する微生物の変動が調べられてきた（Ｉｗａｍｏｔｏ、Ｔ．およびＮａｓｕ、Ｍ．、２００１年、前出およびこれに引用された文献）。
【００１５】
しかし、対象土壌の浄化処理に当たり、これについて、どのような処方を適用すればよいかについての合理的な決定をすることはできなかった。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、対象土壌について適用すべき浄化処理の処方を合理的に決定する方法および浄化処理方法を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の微生物による汚染土壌の浄化処理の処方の決定方法は、複数の汚染土壌の浄化処理過程の少なくとも２の時点における、前記汚染土壌に存在する微生物相に関するデータ、汚染物質に関するデータ、前記浄化処理の処方に関するデータ、前記浄化処理の期間に関するデータを含むデータベースを作成すること、浄化処理対象となる汚染土壌に存在する微生物相に関するデータおよび汚染物質に関するデータを得ること、前記対象汚染土壌のおける微生物相のデータに近似するデータを前記データベースから抽出すること、前記抽出したデータに基づいて、前記対象汚染土壌に適用する浄化処理の処方を前記データベースから選択することを含む。
【００１８】
前記データベースは、さらに、非汚染土壌に存在する微生物相に関するデータを含むものとすることができ、このデータベースを利用する前記決定方法を用いて汚染土壌の浄化処理を行うことができる。この浄化処理方法は、浄化処理開始前に、前記決定方法により汚染土壌浄化処理の処方を選択すること、該処方による浄化処理を施すこと、汚染土壌浄化処理中の少なくとも１の時点において、前記処方を継続するか、別の汚染土壌処理の処方を採用するかまたは浄化処理を終了するかを決定すべく、前記決定方法により汚染土壌浄化処理の処方を選択することを含む。
【００１９】
本発明における「微生物」には、単細胞生物および多細胞生物を含む真核生物と、古細菌および細菌を含む原核生物とを含み、これらは単独で生活し、あるいは他の真核生物または原核生物に寄生するものを含む。
【００２０】
土壌の「微生物相」とは、その土壌に存在する微生物の構成、すなわちその土壌に存在する全ての微生物の種類およびそれぞれの種類の微生物の細胞数についての情報をいう。換言すれば、ある土壌の優占種の数および優占の程度についての情報である。
【００２１】
前記土壌に存在する微生物相に関するデータは、例えば、ＤＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＦＩＳＨ法、キノンプロファイリング法およびＭＰＮ法を含む、これらに限られない全ての方法により得ることができる。なお、これらの方法を組み合わせることによっても得ることができる。また、前記構造解析と前記機能解析とを併用することによっても得ることができる。
【００２２】
「汚染物質」とは、微生物によって分解されあるいは微生物相を変動させる、人体および環境に有害な全ての物質をいう。例えば、原油と、Ａ重油およびＣ重油を含む重油のような原油から精製される全ての液体および固体の石油製品（以下「油」という。）が該当する。
【００２３】
「汚染物質に関するデータ」とは、汚染物質の種類と量についてのデータをいう。「汚染土壌」とは、前記汚染物質を含む土壌をいう。また、「非汚染土壌」とは、前記汚染土壌に隣接し、前記汚染土壌と土質が実質的に同じで、前記汚染物質を含まない土壌をいう。
【００２４】
「汚染土壌の浄化処理の処方」とは、バイオスティミュレーションにあっては、土壌に酸素を供給すること、さまざまな種類および量の栄養塩を土壌に添加すること、水分保持のために散水したり粘土質の土壌や滅菌した堆肥を混合すること、通気性を高めるために砂質土を混合すること、土壌のｐＨを一定に保つことを含むがこれらに限られない、汚染土壌にもともと存在する分解微生物を活性化するための全ての手段をいい、バイオオーギュメンテーションにあっては、予め同じ汚染物質を添加して該汚染物質を分解する微生物が増殖するように馴養した模擬汚染土壌を添加すること、堆肥、活性汚泥など分解微生物を大量に含む物質を添加すること、培養下で増殖させた前記汚染物質を分解する微生物を添加することを含むがこれらに限られない、外来の分解微生物を汚染土壌に添加する全ての手段をいう。
【００２５】
前記土壌に存在する微生物相に関するＤＧＧＥ法によるデータは、複数の土壌から抽出されるＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応で増幅した複数の産物を得て、該産物を変性剤濃度勾配ゲルに適用して電気泳動により分離し、電気泳動後のゲル中の前記産物の分離パターンを記録し、前記分離パターンを比較することにより得られる。
【００２６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応には、異なる種または系統に分類される微生物のゲノムの間で配列相同性が高い領域、すなわち生物進化の過程で保存された配列を有する領域において、異なる種の微生物で配列が共通な不変領域が種特異的な配列多様性を有する可変領域を挟むＤＮＡを増幅できるようなプライマーを用いる。
【００２７】
プライマーは、異なる種の微生物で配列が共通な不変領域が種特異的な配列多様性を有する可変領域を挟むように配置されていることを条件として、ゲノム上のいかなる領域の配列からでも設計することができる。好ましい領域の一つは１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子である。１６Ｓ　ｒＲＮＡには合計９箇所の可変領域があるが、これらのいずれかを挟むようにプライマーを設計してもよい。より好ましくはＶ３という可変領域を挟むようなプライマーである。配列番号１のヌクレオチド配列と、配列番号２のヌクレオチド配列のうちＧＣクランプを除く３’末端から１７塩基の逆配列とは、それぞれ、前記Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔのデータベースを検索すると、１万以上の種の１６Ｓ　ｒＲＮＡの配列に含まれることがわかっている。したがって、配列番号１および２が最も好ましいプライマーである。
【００２８】
【発明の効果】
本発明に係る方法において作成するデータベースは、浄化処理例である複数の汚染土壌の浄化処理の各々の過程について、少なくとも２の時点における、該浄化処理の期間に関するデータと、前記浄化処理の両時点における微生物相および汚染物質に関するデータとを含むことから、各浄化処理の過程における両時点間の浄化進行の程度を知ることができる。
【００２９】
前記データベース中におけるデータ（浄化処理例のデータ）のうち汚染土壌に存在する微生物相に関するデータ（浄化処理例の微生物相データ）には、汚染物質の濃度によって増殖、生存等に影響を受ける微生物と、汚染物質を分解する微生物とについての情報が含まれる。前者の微生物は汚染物質の濃度を反映し、後者の微生物は土壌の浄化能力を反映する。
【００３０】
本発明にあっては、浄化処理対象の土壌に存在する微生物相のデータ（対象の微生物相データ）と近似する１または複数の、浄化処理例の微生物相のデータを前記データベースから抽出する。対象の微生物相データと浄化処理例の微生物相データとが近似することは、浄化処理対象の土壌と汚染土壌との間で、土壌に存在する汚染物質の濃度および微生物の浄化能力が近似することを意味する。
【００３１】
抽出の作業には、対象の微生物相データと浄化処理例の微生物相データとの近似の程度に応じて、前記データベースに格納された複数の浄化処理例のデータを１列に並べる作業と、前記近似の程度に応じて、データベースに格納された土壌の浄化処理例のデータをクラスタに分類する作業とを含む。
【００３２】
抽出により、各浄化処理例について適用された処方に関する前記データベース中のデータをクラスタ分類して表示することができる。
【００３３】
その結果、前記クラスタ分類のパターンに基づいて、浄化対象の汚染土壌に適用するのにふさわしい処方であるかどうかを判断し、浄化対象の汚染土壌に適用する処方の候補を合理的に選択することができる。
【００３４】
例えば、前記データ相互間の近似の程度が比較的低い場合には、対象の微生物相データと最も近似する浄化処理例に適用された処方を、浄化対象の汚染土壌に適用する。
【００３５】
逆に、前記データ相互間の近似の程度が比較的高い場合には、対象の微生物相データと同じ程度に近似する複数の浄化処理例の微生物相データについて適用された処方のうち、最も短い期間にかつ最も速く汚染物質が減少した処方を、浄化対象の汚染土壌に適用する。
【００３６】
前記データベースは、さらに、非汚染土壌に存在する微生物相に関するデータを含むものとすることができる。これによれば、浄化対象土壌に存在する微生物相のデータが前記データベースに格納された非汚染土壌に存在する微生物相のデータに近似するとき、浄化処理が進行して汚染物質が存在しなくなったと判断し、浄化処理を終了するという決定をすることができる。
【００３７】
本発明の浄化方法にあっては、対象の微生物相データと近似するものを、データベースに格納された汚染土壌および非汚染土壌に存在する微生物相のデータから抽出し、抽出された汚染土壌または非汚染土壌についての処方、汚染物質および浄化処理期間のデータに基づいて浄化対象の土壌に適用する処方を決定する。そのため、浄化対象土壌の浄化処理の過程の開始の時点においては、いかなる処方を適用するか、あるいは前記対象土壌は分解微生物を利用する浄化処理に適するか否かについて、合理的に判断することができる。さらに、前記対象の土壌の浄化処理の過程の途中の時点で、処方を変更するか、あるいは浄化処理を終了するかについて合理的に判断することができる。
【００３８】
【発明の実施の形態】
本発明は、浄化処理対象となる汚染土壌の浄化処理の処方を決定する方法に関し、その決定に当たり、まず、複数の浄化処理例についてのデータベースを作成する。該データベースには、各処理例における汚染土壌の浄化処理の過程について、少なくとも２の時点における、各例の汚染土壌に存在する微生物相に関するデータ、汚染物質に関するデータ、前記浄化処理の処方に関するデータおよび前記浄化処理の期間に関するデータを含む。
【００３９】
これらのデータは各浄化処理例ごとに関連付けて、前記データベースに格納される。したがって、前記データベースに格納された微生物相データを検出することにより、これに対応する汚染物質に関するデータ、前記浄化処理の処方に関するデータ、前記浄化処理の期間に関するデータを関連させて抽出することができる。
【００４０】
前記データベースにおける浄化処理例の微生物相データおよび汚染物質に関するデータは、各汚染土壌から浄化処理過程の少なくとも２の時点におけるサンプルを採取する。前記２の時点の間隔は、例えば、１週間、２週間または１ヶ月のように任意に定めることができる。
【００４１】
前記土壌のサンプルは、土壌を均一に撹拌した後の採取物からなる。あるいは、土壌の数カ所をランダムに選んで採取したサンプルの混合物からなる。汚染物質に関するデータを得るための測定は即時に行う。また、微生物相のデータは、ＦＩＳＨ法、キノンプロファイリング法、ＭＰＮ法、ＤＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法、およびＤＮＡマイクロアレイ法を用いて得ることができる。ただし、ＦＩＳＨ法、キノンプロファイリング法およびＭＰＮ法による土壌に存在する微生物相のデータを得るための測定は即時におこなうが、ＤＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法およびＤＮＡマイクロアレイ法による測定は、前記土壌のサンプルを−２０°Ｃで凍結保存しておき、後日行ってもよい。
【００４２】
前記データベースに含まれる浄化処理例の汚染物質に関するデータは、該汚染物質の種類と量とを含む。
【００４３】
微生物で分解することができる汚染物質には、油の他に、ＴＣＥ（トリクロロエチレン）およびＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）などの有機ハロゲン化合物、２，４，６−ＴＮＴ（トリニトロトルエン）が含まれる（前記Ｉｗａｍｏｔｏ、Ｔ．およびＮａｓｕ、Ｍ．、２００１年およびこれに引用された文献を参照）。微生物で浄化することができる汚染物質には、前記微生物で分解できる汚染物質の他、還元により毒性を低減できる６価クロム、硫化により不溶性の塩にすることができる鉛およびカドミウムのような金属を含む。
【００４４】
汚染物質に関するデータは任意の方法で得ることができる。例えば、汚染物質が油の場合、汚染物質の種類、すなわち油分組成は、イヤトロスキャンを用いたＴＬＣ−ＦＩＤ法により分析する。また、汚染物質の量、すなわち油分濃度は、溶媒抽出−ＩＲ法によるＴＰＨの測定と、ソックスレー抽出重量法によるｎ−Ｈｅｘ（ヘキサン）抽出物質量の測定とにより決定する。
【００４５】
汚染土壌に存在する微生物相に関する、例えば、ＤＧＧＥ法によるデータを得るために、まず、前記汚染土壌に存在する微生物のＤＮＡを抽出する。
【００４６】
前記土壌からのＤＮＡの抽出は、新鮮な土壌のサンプルまたは−２０°Ｃで凍結保存されたサンプルから行う。ＤＮＡ抽出には、例えばＱｂｉｏｇｅｎｅ社（米国カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）のＦａｓｔＤＮＡ（登録商標）　ＳＰＩＮ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｏｉｌを使用して精製することができる。このようにして精製されたＤＮＡは−２０°Ｃで凍結保存する。
【００４７】
ＤＮＡを取り扱う作業およびその他の遺伝子工学の作業は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら編、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第３版、２００１年、米国ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ刊）を参照して行うことができる。
【００４８】
次にＰＣＲ法による前記土壌から抽出されたＤＮＡの増幅を行う。
【００４９】
前記ＰＣＲ法は、石井らの総説（石井浩介ら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ、１５巻、５９−７３ページ）を参照して行うことができる。例えば、配列番号１および２の配列を有するプライマーと、ＴａＫａＲａ　ＬＡ　Ｔａｑ（登録商標）（宝酒造）および付属のバッファーとを用いて前記土壌サンプルから抽出されたＤＮＡを鋳型として増幅することができる。反応条件は、９５°Ｃで３０秒、５５°Ｃで３０秒、７２°Ｃで１５秒のサイクルを２８回繰り返し、その後４°Ｃで保存する。増幅後の反応液のＤＮＡはフィルターに吸着させて精製する。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国、マサチューセッツ州、Ｂｅｄｆｏｒｄ）のＡｍｉｃｏｎ　Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−ＰＣＲ遠心フィルターデバイスを使用することができる。
【００５０】
次に、ＤＧＧＥ法による分析を行う。
【００５１】
ＤＧＧＥ法の分析は、前記石井らの総説を参照して行うことができる。例えば、ゲルの調製のために、未重合の８％アクリルアミド（アクリルアミド：ビス＝３７．５：１）および０．５ｘＴＡＥ（４０ｍＭ　トリス酢酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に変性剤を５０〜６０％含む高変性剤ゲル溶液と、８％アクリルアミドおよび１ｘＴＡＥに変性剤を２０〜３０％含む低変性剤ゲル溶液とを用意する。ここで変性剤は、４０％　ホルムアミドと、７Ｍ　尿素との混合液を１００％とする。高変性剤ゲル溶液および低変性剤ゲル溶液に重合開始剤である過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ｀，Ｎ｀−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）をそれぞれ最終濃度０．０４％および０．１％になるように添加し、速やかに濃度勾配作成装置に注ぐ。濃度勾配作成装置は、低濃度変性剤を含むゲル溶液用の容器と高濃度変性剤を含むゲル溶液用の容器とを含む。前記２つの容器は連通管で接続されていて、混合された溶液は、チューブを介して２枚のゲル板間の溶液受け入れ空間に静かに注入される。前記溶液受け入れ空間は、高さ１６ｃｍ、幅１ｍｍの寸法を有する。ゲルが重合した後、ゲルを電気泳動装置に固定し、陽極および陰極の電極槽に０．５ｘＴＡＥ（前記１ｘＴＡＥを２分の１に希釈したもの）をバッファーとして注ぎ込む。前記精製されたＰＣＲ産物は、１つのウェルあたり１８０〜３００ｎｇ使用する。泳動条件は４０Ｖで１６時間である。
【００５２】
ＤＧＧＥ法による電気泳動結果は次のようにして記録する。
【００５３】
ＤＧＧＥ法による電気泳動後のゲルを、臭化エチジウムのようなＤＮＡと結合する蛍光色素で染色し、紫外線で励起された蛍光をモノクロＣＣＤカメラのような撮像素子で撮影した後、ＢＭＰ形式、ＪＰＥＧ形式などのデジタル画像として記録する。
【００５４】
次に、前記電気泳動結果のゲルのデジタル画像を次のようにして処理して、前記土壌に存在する微生物相に関するデータを得る。すなわち、複数のゲルに共通のマーカーＤＮＡの分離パターンが一致するように修正して標準化したＤＧＧＥ法による電気泳動後のゲルのデジタル画像から切り出された、それぞれの土壌に対応するレーンのＰＣＲ増幅産物のＤＧＧＥ法による分離パターンの画像データを得る。前記ゲルのデジタル画像の修正および標準化と、各レーンの分離パターンの画像データの切り出しおよびデータベースへの格納の作業は、任意の手法を用いて行うことができる。例えば、アマシャムバイオサイエンス社のＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ、ＰＤＩ社（米国ニューヨーク州）のＤｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｄａｔａｂａｓｅ（登録商標）、Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ社（米国バージニア州）のＧｅｎｅ　Ｐｒｏｆｉｌｅｒ　ｆｏｒ　Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などの市販のソフトウェアを用いて行うことができる。
【００５５】
前記データベースの作成後、浄化処理対象となる汚染土壌に存在する微生物相に関するＤＧＧＥ法によるデータおよび汚染物質に関するデータを得る。この浄化処理対象となる汚染土壌に存在する微生物相に関するＤＧＧＥ法によるデータについても、前記汚染土壌に存在する微生物相に関するＤＧＧＥ法によるデータと同様に、該浄化処理対象となる汚染土壌から、土壌サンプルを採取し、土壌からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡのＰＣＲ法による増幅産物をＤＧＧＥ法により分離し、該分離パターンの画像データを処理して得る。
【００５６】
その後、対象汚染土壌の微生物相データに近似する１または複数のデータを前記データベースから抽出する。その作業は以下のとおり行う。
【００５７】
対象汚染土壌の微生物相のデータと前記データベースに格納されている複数の浄化処理例の微生物相のデータとを相互に比較して、前記対象汚染土壌の微生物相データ（検索対象のデータ）と近似する前記浄化処理例の微生物相データを前記データベースから抽出する。この作業には、階層クラスタ分析の手法を用いる。この手法を用いると、検索対象のデータとの近似の程度を定量化できるとともに、前記データベースに格納されているデータをグループまたはクラスタに分類して、検索対象のデータの近縁関係を系統樹としてデンドログラムで表示することができる。
【００５８】
階層クラスタ分析の手法には、ＵＰＧＭＡ（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ　ｐａｉｒ−ｇｒｏｕｐｉｎｇ）法および近隣結合（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＪ）法のような距離行列法が含まれる（Ｓａｉｔｏｕ　Ｎ．、１９９６年、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ．編、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６巻、４２７−４４９ページ、米国フロリダ州、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ刊）。
【００５９】
ＵＰＧＭＡ法は、一般的には、対象とするデータ間の全ての距離を求めた後、最小の距離を示すデータのペアを見つけ、このクラスターを形成したペアと他のデータ間の距離を算術平均により求め、その後、そのペアをあたかも一つのデータであるかのように扱って、同じことを繰り返し、得られたクラスターから系統樹を作成していくアプローチである。
【００６０】
近隣結合法は、一つのｎｏｄｅ（節）だけでつながった２つのＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　Ｕｎｉｔ、グラフ理論におけるｅｄｇｅに相当する）を表現する「近隣」という概念を用いた、段階的探索を行う距離行列法である。最初に星状の系統樹を仮定し、全ての枝の長さの和が最小になるように近隣を見つけていくアプローチである。
【００６１】
ＵＰＧＭＡ法および近隣結合法は系統樹を段階的に探索する方法であるが、他に系統樹を網羅的に探索する方法もある。階層クラスタ分析のさまざまな手法については、石村貞夫（「グラフ統計の話」、１９９５年、東京図書刊）およびＲｉｃｈａｒｄ　Ａ．ら（「Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９９６年、英国Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ刊）に記載されている。
【００６２】
微生物相に関してＤＧＧＥ法により得られたデータについて階層クラスタ分析の手法で比較をすることは前記ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒをはじめとする市販ソフトウェアを用いて行うこともできる。前記の比較をするインターネット上で入手可能なフリーウェアおよびシェアウェアが多数ある。例えばＥＢＩ（欧州バイオインフォマティクス研究所）の“Ｔｈｅ　ＢｉｏＣａｔａｌｏｇ”のサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｒｂａ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｂｉｏｃａｔａｌｏｇ／Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ｈｔｍｌ）から入手できる。
【００６３】
前記汚染土壌に存在する微生物相に関してＤＧＧＥ法により得られたデータを含むデータベースを作成し、浄化対象土壌に存在する微生物相に関してＤＧＧＥ法により得られたデータと近似するデータを抽出する作業は、市販ソフトウェアを組み合わせて手作業で行うこともできるが、上記フリーウェアまたはシェアウェアを組み込んだ専用ソフトウェアを用いることにより、ハイスループット化を図ることができる。
【００６４】
その後、抽出したデータに基づいて、浄化対象の汚染土壌に適用する浄化処理の処方を前記データベースから選択して決定する。これは、以下のとおり行う。
【００６５】
すなわち、浄化対象の微生物相データと浄化処理例の微生物相データとの近似の程度に基づいて、データベースから浄化処理の処方を抽出する。前記近似の程度を、前記階層クラスタ分析の手法を用いて決定すると、浄化処理対象となる土壌について適用すべき処方を、対象の微生物相データと浄化処理例の微生物相データとの近似の程度に応じて定量化し分類して、その結果を系統樹として視覚的に理解しやすいように表示することができる。例えば、抽出された処方は、縦軸を汚染物質の濃度、横軸を処理期間の日数または週の数として、予め設定した近似の程度以上にデータが近似するそれぞれの汚染土壌の処理過程を、色および線の種類の異なる折れ線で表すことができる。前記色および線の種類で、近似の程度と分類とを区別するとともに、それぞれの汚染土壌の処理過程で適用された処方を系統樹で表示することができる。
【００６６】
前記データベースに格納された浄化処理に関するデータが十分に多いときには、前記系統樹のパターンに応じて、浄化対象の土壌について適用すべき浄化処理の処方の内容と該処方の適用がどの程度にふさわしいかの判断を自動化して、処方の選択をさらに合理的にすることができる。
【００６７】
例えば、浄化対象の微生物相データと近似する複数の浄化処理例の微生物相データ相互間の近似の程度が比較的低い場合には、近似の程度を比較して、該近似の程度の最も高い浄化処理例について適用された処方を、浄化対象土壌に適用すべき処方として選択する。
【００６８】
逆に、前記近似の程度が比較的高い場合には、単に前記近似の程度を比較して処方に優先順位をつけるのではなく、浄化対象の微生物相データと同程度に近似する複数の浄化処理例の微生物相データについて適用された処方同士を比較して、最も短い期間に最も速く汚染物質が減少した浄化処理例について適用された処方を、浄化対象土壌に適用すべき処方として選択する。
【００６９】
前記データベースは、さらに、浄化処理を行った個々の土壌のケースごとに、非汚染土壌、すなわち、浄化処理を行った土壌に隣接し、該土壌と土質が実質的に同じで、汚染物質を含まない土壌の微生物相に関する前記ＤＧＧＥ法によって得られた分離パターンのデータと、汚染物質の種類およびその濃度のデータとを含むものとすることができる。
【００７０】
任意の時点における汚染物質の種類およびその濃度が、前記非汚染土壌における汚染物質の種類およびその濃度と実質的に同じ場合、またはその土壌について法令等で定められた汚染物質の種類およびその濃度の基準を満たす場合には、浄化処理を終了する。
【００７１】
本発明の汚染土壌の浄化処理方法をそのフローチャートである図１を用いて説明する。
【００７２】
まず、浄化処理開始前に、浄化処理対象の汚染土壌のサンプルを採取し、前記対象の汚染土壌に存在する微生物相のデータを得る。つぎに、前記対象の微生物相データと近似する前記データベースに格納された浄化処理例の微生物相データとの比較を行い、近似の程度に基づいて、浄化対象土壌に適用すべき処方を決定する。前記データベースに格納された浄化処理例の微生物相データとの近似の程度が低い場合には、分解微生物を用いる汚染土壌の浄化処理そのものに適合しない可能性があるので、生物的な処理を中止して、他の浄化処理法を採用することを検討する。
【００７３】
浄化処理中には、適当な時間間隔を置いて浄化処理対象の土壌サンプルを採取し、前記対象の汚染土壌に存在する微生物相のデータを得る。つぎに、前記対象の微生物相データと近似する前記データベースに格納された浄化処理例の微生物相データとの比較を行い、近似の程度に基づいて、浄化対象土壌に適用すべき処方を決定する。すなわち、浄化の進行に応じて、これまでと同じ処方を適用することが決定されるときは、該処方を継続する。また、これまでとは異なる処方を適用することが決定されるときは、処方を変更する。あるいは、適用すべき処方に基づいて浄化処理を終了する。
【００７４】
浄化処理を終了する場合には、全ての作業を終了する他、汚染物質の濃度は低下したが、浄化処理対象の土壌の用途との関係で、例えば、土壌に存在する微生物相が非汚染土壌の微生物相と同一でないと土壌の利用ができない場合には、土壌に存在する微生物相についてのデータを継続的に監視する。この場合には、土壌サンプルを定期的に採取して土壌に存在する微生物相データを得る。次に、前記対象の微生物相データと近似する前記データベースに格納された浄化処理例の微生物相データとの比較を行い、近似の程度に基づいて、浄化対象土壌に適用すべき処方を決定する。そして、土壌の微生物相が土地利用に適するものとなるまでこれを繰り返す。
【００７５】
【実施例】
模擬汚染土壌浄化実験（第１の実験）
第１の実験では、人為的に作成した汚染土壌での浄化処理の過程において、土壌に存在する微生物相のデータ、汚染物質のデータその他を収集した。まず、砂質シルト系の畑地土壌にＡ重油またはＣ重油を１０，０００ｍｇ／ｋｇずつ添加して５ヶ月間馴養を行った。馴養後の残存油分量を表１に示す。これに新たにＡ重油またはＣ重油を添加して、油分濃度を約８，０００ｍｇ／ｋｇとした後、室温（１０〜２０°Ｃ）の屋内でのそれぞれの土壌の浄化の過程を追跡した。適用した浄化処方を表１に示す。
【００７６】
【表１】
2004033827.tif 000003
【００７７】
表１において、１００ｍｇ−Ｐ／ｋｇとは、Ｐすなわちリンを土壌１ｋｇあたり１００ｍｇ添加することをいい、実際には、土壌１ｋｇあたり、０．２８１ｇのＫ２ＨＰＯ４と、０．２１９ｇのＫＨ２ＰＯ４とを添加する。５００ｍｇ−Ｎ／ｋｇとは、Ｎすなわち窒素を土壌１ｋｇあたり５００ｍｇ添加することをいい、土壌１ｋｇあたり１．４３ｇのＮＨ４ＮＯ３を添加する。
【００７８】
第１の実験における汚染物質のデータを図２に示す。油分濃度の分析は、ソックスレー抽出重量によるｎ−Ｈｅｘ（ヘキサン）抽出物質量の測定と、溶媒抽出−ＩＲ法によるＴＰＨの測定とで行った。また、油分の組成分析は、イヤトロスキャンを用いたＴＬＣ−ＦＩＤ法により行った。図２の線グラフはｎ−Ｈｅｘ抽出物質量、棒グラフはＴＰＨである。Ａ重油は飽和分、芳香族分などの比較的微生物による分解が容易な成分が多かったため、４ヶ月の浄化処理期間で約９５％の除去が確認された。Ｃ重油のほうは、レジン分、アスファルテン分などの難分解性成分を多く含むため、Ａ重油に比べると浄化は進まなかったが、７〜８割の除去が確認された。
【００７９】
第１の実験におけるそれぞれの土壌に存在する微生物相について土壌サンプルから抽出したＤＮＡを配列番号１および２の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。得られた増幅産物をＤＧＧＥ法により分離したゲルの泳動パターンを図３に示す。レーン１、２、３および４は、それぞれ、Ａ重油・実験開始時、Ａ重油・実験終了時、Ｃ重油・実験開始時およびＣ重油・実験終了時の土壌サンプル由来の増幅産物の分離パターンである。
【００８０】
これらの分離パターンの比較から、Ａ重油を含む土壌における優占種とＣ重油を含む土壌における優占種とに違いがあることがわかった。これらの土壌はもともと同じものであったことから、汚染物質の種類によって微生物相が大きく変化することが確認された。また、Ａ重油を含む土壌では、実験開始時の土壌に比べて実験終了時の土壌の優占種が少ないのは、分解微生物が優占化したためであると考えられる。
【００８１】
実際の油で汚染された土壌の浄化実験（第２の実験）
第２の実験では、実際の油で汚染された土壌での浄化処理の過程において、土壌に存在する微生物相のデータ、汚染物質のデータその他を収集した。Ｃ重油系の油で汚染され数十年経過した土壌を土粒子同士を擦り合わせる間に水を加えて土壌を水で洗浄する処理である磨砕処理した砂質土壌を用いた。この土壌を水で洗浄し、油分濃度を３，０００ｍｇ／ｋｇとして、実験を開始した。汚染土壌を５つに分け、それぞれのケースに表２に示す処方を施した。
【００８２】
【表２】
2004033827.tif 000004
【００８３】
実験は土壌は３０°Ｃで行い、第１の実験と同じ栄養塩を全ての処方のケースの汚染土壌に添加した。ケース１〜４には、土壌の保水性を高めることを目的として、バーク堆肥（平和農園）を添加した。ケース１、４および５の土着菌とは、汚染土壌にもともと含まれる微生物以外には微生物を添加しないことをいう。ケース２に添加する培養菌とは、実験開始時の汚染土壌から集積培養した菌群を、前記水による汚染土壌の洗浄の際に回収した汚染物質であるＣ重油を炭素源として大量培養した液体培養をいう。ケース３には市販製剤を添加した。ケース４では、堆肥に由来する微生物の影響を減らすため、滅菌処理した前記堆肥を添加した。ケース５は対照実験であった。
【００８４】
図４に第２の実験における油分濃度の経時的変化を示す。ケース５以外の４つのケースでは順調に浄化が進行し、１２週間後には、約８５％の油分の減少が確認された。特にケース３では汚染物質の浄化が速く進行した。
【００８５】
第２の実験におけるそれぞれの土壌に存在する微生物相について、土壌サンプルから抽出したＤＮＡを配列番号１および２の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。得られた増幅産物をＤＧＧＥ法により分離したゲルの泳動パターンを図５に示す。レーン１はケース１の実験開始時における土壌サンプル由来の増幅産物の分離パターンである。レーン２〜６は、それぞれケース１〜５の実験終了時における土壌サンプル由来の増幅産物の分離パターンである。
【００８６】
これらの分離パターンの比較から、レーン６、すなわち、対照実験であるケース５が土壌に存在する微生物相の多様性が最も大きかった。これは、レーン６では分解微生物による浄化が行われていないため、分解微生物が優占種となっていないからであると考えられる。レーン４、すなわち汚染物質の浄化が速く進んだケース３の土壌に存在する微生物相の多様性がレーン６に続いて大きいのは、浄化が速く進行して、土壌サンプルを採取した時点では微生物による分解がほぼ終了していたためであると考えられる。
【００８７】
レーン１〜６の分離パターンは同一のゲルでの分離パターンであり、ゲル内の変性剤の濃度勾配は同一であるから、これらのレーンの分離パターン同士を直接比較することができる。そこで、アマシャムバイオサイエンス社のＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒを利用して、各レーンの分離パターンの近似の程度をＵＰＧＭＡ法によって定量化し、クラスタ分類を行った。
【００８８】
第２の実験の実験開始時と、それぞれの処方の浄化処理を１２週間行った後との土壌に存在する微生物相のデータの相互の近似の程度をＵＰＧＭＡ法で定量化しクラスタ分類した結果を図６に示す。図６から、実験開始時の土壌に存在する微生物相のデータは、ケース１および２の処理後の土壌に存在する微生物相のデータとの近似の程度が最も高く、ケース４のデータとの近似の程度が次に高く、ケース３のデータとの近似の程度は低く、ケース５のデータとの近似の程度が最も低かった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る汚染土壌の浄化処理方法のフローチャート。
【図２】第１の実験における汚染物質の変化を示すグラフ。
【図３】第１の実験のそれぞれの土壌のＤＧＧＥ法によるゲル電気泳動パターン。
【図４】第２の実験における汚染物質の変化を示すグラフ。
【図５】第２の実験のそれぞれの土壌のＤＧＧＥ法によるゲル電気泳動パターン。
【図６】第２の実験における微生物相のデータ相互の近似の程度を示すデンドログラム
【配列表フリーテキスト】
配列１：ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法のためのＧＣクランプ配列を含む微生物１６Ｓ　リボソームＲＮＡ遺伝子のＶ３領域を増幅するための逆方向プライマー
配列２：微生物１６Ｓ　リボソームＲＮＡ遺伝子のＶ３領域を増幅するための順方向プライマー
【配列表】
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2004033827.tif 000006
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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