(57)【要約】      （修正有）【課題】プラスチックの処理方法として自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、プラスチックは一般に生分解性ではないという問題を有する。本発明は、ウレタン化合物を分解することのできる微生物、および該微生物を用いたウレタン化合物の分解方法を提供する。特に、ポリウレタンの原料となるウレタン化合物を分解することのできる微生物および該微生物を用いたポリウレタンの分解方法を提供することを目的とする。【解決手段】低分子量ウレタン化合物を分解する微生物よりポリウレタン分解能の高いＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉを分離した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス属に属し、ウレタン結合分解能を有する微生物、またはその変異株。
【請求項２】
ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス  エクイである、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス  エクイ  ＴＢ−６０株である、請求項１記載の微生物。
【請求項４】
請求項１乃至３記載の微生物をウレタン化合物と接触させる工程を含む、ウレタン化合物の分解方法。
【請求項５】
ウレタン化合物がポリウレタンの製造原料となる化合物である、請求項４記載の分解方法。
【請求項６】
ウレタン化合物がポリウレタンである、請求項４記載の分解方法。
【請求項７】
ポリウレタンの分解方法であって、
ポリウレタンと請求項１乃至３記載の微生物を接触させる工程、および
ポリウレタンとポリウレタンのエステル結合分解能を有する微生物を接触させる工程、
を含む、前記ポリウレタンの分解方法。
【請求項８】
ポリウレタンのエステル結合分解能を有する微生物が、ペニバチルスアミロリチカスＴＢ−１３株またはコマモナスアシドボランスＴＢ−３５株である、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な微生物、および該微生物を用いる生物学的処理法によるポリウレタンの分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、プラスチック廃棄物の処理が問題になっている。プラスチック廃棄物の処理方法としては焼却や埋め立てが主であるが、焼却は地球温暖化の促進、埋め立ては埋立地の減少等の問題を抱えている。例えばポリウレタンは、全世界で年間約６００万ｔ，国内では約５５万ｔが消費されている。このうち、その発泡緩衝体は断熱性に優れることから冷蔵庫等の断熱材として大量に利用されている。現在、このポリウレタン廃棄物は不燃ゴミとして埋め立て処分される場合が多いが処分場の不足ならびに環境汚染の問題が生じている。一方、自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、ポリウレタンは生分解性ではないという問題を有する。
【０００３】
ポリウレタンは分子内にウレタン結合及びエステル結合またはエーテル結合を含み、それらの結合が切断されることによって分解が進む。ポリオール部分のエステル結合はカビや細菌によって切断されるという報告が数例ある。Ｄａｒｂｙ（Ｄａｒｂｙ  Ｒ．Ｔ．ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ  Ａ．Ｍ．：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，９００−９０５（１９６８））らはカビによる種々のポリウレタン分解試験を行い、エーテル系よりもエステル系ポリウレタンの方が分解を受け易いことや、イソシアネートやポリオールの種類によって分解特性が異なることを報告している。Ｋａｙ（Ｋａｙ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｌ．Ｈ．Ｇ．：Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．，３１，２０９−２２５（１９９１）．）らはエステル系ポリウレタン分解菌として１５種類の菌を単離し、分解力の強かったコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌について分解特性を検討した結果について報告している。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｄａｒｂｙ  Ｒ．Ｔ．ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ  Ａ．Ｍ．著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，９００−９０５（１９６８）
【非特許文献２】
Ｋａｙ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｌ．Ｈ．Ｇ．著、Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．，３１，２０９−２２５（１９９１）
しかし、ポリウレタン中のウレタン結合の分解に関する知見はほとんどない。微生物分解に伴って、ウレタン結合が加水分解を受けているという報告は幾つかあるが、ウレタン結合の切断と微生物との因果関係は明らかでない（Ｂ．Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ  Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ．，２７６，３６（１９９１），Ｄａｒｂｙ  Ｒ．Ｔ．ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ  Ａ．Ｍ．：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，９００−９０５（１９６８）（非特許文献１参照））。
【非特許文献３】
Ｂ．Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ  Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ．，２７６，３６（１９９１）
一方、低分子のウレタン化合物が微生物によって分解されることはすでに報告されており、その分解はエステラーゼによるものであることが知られている。しかし、そのほとんどは酒類の品種改良やカルバメート系農薬の分解浄化に関するものであり（特開平０１−３００８９２、特開平０１−２４０１７９、特開平０２−１２８６８９、特開平０３−１７５９８５、特開平０４−１０４７８４、特開平０４−３２５０７９）、ポリウレタンの分解に利用できる技術ではない。ポリウレタン原料となりうる物質の分解菌としてはカビによるものが報告されているが（特開平０９−１９２６３３）、大量培養が容易な細菌によるものはない。
【０００５】
【特許文献１】
特開平０１−３００８９２号公報
【特許文献２】
特開平０１−２４０１７９号公報
【特許文献３】
特開平０２−１２８６８９号公報
【特許文献４】
特開平０３−１７５９８５号公報
【特許文献５】
特開平０４−１０４７８４号公報
【特許文献６】
特開平０４−３２５０７９号公報
【特許文献７】
特開平０９−１９２６３３号公報
固体ポリウレタンの分解菌としては、ポリエステル型のポリウレタン分解菌としてペニバチルスアミロリチカスＴＢ−１３株（特願平２００２−３３４１６２）およびコマモナスアシドボランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）ＴＢ−３５株（Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｋａｍｂｅ，Ｆ．Ｏｎｕｍａ，Ｎ．Ｋｉｍｐａｒａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｈｉｃｈ  ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ  ａｓ  ａ  ｓｏｌｅ  ｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｏｕｒｃｅ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  Ｖｏｌ．  １２９，３９−４２，１９９５）が知られているが、これらの分解菌はウレタン中のエステル結合は分解するが、ウレタン結合はほとんど分解しない。従って、ポリウレタンの細菌による完全分解のために、ウレタン結合を分解する細菌の取得が望まれている。
【０００６】
【非特許文献４】
Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｋａｍｂｅ，Ｆ．Ｏｎｕｍａ，Ｎ．Ｋｉｍｐａｒａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｈｉｃｈ  ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ  ａｓ  ａ  ｓｏｌｅｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｏｕｒｃｅ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  Ｖｏｌ．  １２９，３９−４２，１９９５
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ウレタン化合物を分解することのできる新規微生物、および該微生物を用いたウレタン化合物の分解方法を提供することを目的とする。特に、ポリウレタンの原料となるウレタン化合物を分解することのできる微生物および該微生物を用いたポリウレタンの分解方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この問題を解決するため、我々はポリウレタン合成原料として用いられる低分子量ウレタン化合物を分解する微生物のスクリーングを行い、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物が該ウレタン化合物を分解できることを見出した。尚、ロドコッカス属に属する微生物がウレタン化合物の分解能を有することはこれまで知られていなかった。また、本発明者らはロドコッカス属に属する微生物を用いるポリウレタンの分解方法を見出した。
【０００９】
即ち、本発明はウレタン化合物、特にポリウレタン合成原料として用いられる低分子量ウレタン化合物を分解する能力を有するロドコッカス属に属する微生物を提供するものであり、また、ロドコッカス属に属する微生物を用いたポリウレタンの分解方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
ロドコッカス属に属し、ウレタン化合物分解能を有する微生物は、既に公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。微生物のスクリーニングの一例を示せば、各地より採取した土壌をポリウレタン合成原料として用いられる低分子量ウレタン化合物を含む培地の入った試験管に入れ、３０℃にて振とう培養し、一週間ごとに植え継ぎを繰り返した後、培養液中に白濁や変色が認められたサンプルについて、培養上清をＮＢ平板に希釈塗布し、３０℃で１〜３日培養後、生育してきたコロニーをピックアップし、ウレタン結合分解菌の候補菌株とする。それから、得られた候補株を、トルエンジイソシアネートとブタノールを反応させて得た低分子量ウレタン化合物（ウレタン化合物Ｉ）を炭素源として含んだ液体培地にて培養し、培養液中にウレタン化合物Ｉのウレタン結合加水分解産物であるトルエンジアミンの生成が確認された菌を取得することにより行うことができる。
【００１１】
本発明の微生物は、ウレタン結合を有する化合物を分解する能力を有するロドコッカス属菌であればよい。具体的には、代表例として、平成１５年２月２６日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請し、寄託を拒否されたロドコッカス  エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）ＴＢ−６０株が挙げられる。尚、本菌株は自己寄託とし、申請により分譲を認めることとする。ロドコッカス属菌の菌学的性質は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（第１巻１９８４年、第２巻１９８６年、第３巻１９８９年、第４巻１９８９年）に記載されている。
【００１２】
更に本発明の微生物は、ウレタン結合を分解する能力を有するロドコッカス属菌であれば、野生株、変異株のいずれでも良い。
変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるエチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、或いは変異剤処理なしで得られる、いわゆる自然突然変異によって取得することも可能である。
【００１３】
ロドコッカス属に属する微生物の培養に用いる培地としては、ロドコッカス属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる塩類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００１４】
本発明において分解できるウレタン化合物は、分子構造中にウレタン結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、トルエン−２，４−カルバミン酸ジブチルエステル、トルエン−２，６−ジカルバミン酸ジブチルエステル、メチレンビスフェニルジカルバミン酸ジブチルエステル、ヘキサメチレン−ジカルバミン酸ジブチルエステル、ノルボルネンジカルバミン酸ジブチルエステルおよびそれらを合成原料とするポリウレタンが挙げられる。
【００１５】
ポリウレタンとは、分子中にウレタン結合（−ＮＨＣＯＯ−）を有する高分子化合物の総称で、多官能イソシアネートとヒドロキル基含有化合物との反応により得られ、エステル、エーテル、アミド、ウレア、カルバメートなどの基を有するポリマーである。ヒドロキシル基もしくはイソシアネート基の官能性数を変化させることで多種多様の分岐あるいは架橋ポリマーを調製することができる。用いるポリオールの種類によってエステル系とエーテル系に大別できる。ポリウレタンは、易加工性、耐腐敗性、耐変質性、低比重等の優れた特性により、弾性体、発泡体、接着剤、塗料、繊維、合成皮革など幅広い用途を持っており、自動車部品としても広く使用されている。本発明の分解方法において適用し得るポリウレタン樹脂の数平均分子量は、特に制限はない。
【００１６】
更に本発明は、ウレタン結合を有する化合物を微生物の作用により分解処理する方法を提供する。該方法は、微生物の増殖過程でウレタン結合が分解され栄養源として消費されることを利用する、あるいは微生物の有する酵素の作用によりウレタン結合を分解する作用を利用するもの、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用するものである。あるいは、菌体を常法により凍結乾燥した粉末状の、あるいはその粉末と各種ビタミンやミネラル、必要な栄養源、例えば酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン等を配合した後に打錠した錠剤等固形状の形態の調製物としてウレタン化合物の処理に提供しても良い。また、菌株を活性汚泥およびコンポストの成分として利用することもできる。
【００１７】
分解に供されるウレタン化合物は、例えば液体の培地中にエマルジョンとして、あるいは粉体の形で加えても良いし、フィルム、ペレット等の塊として加えても良い。なお、培地に対するウレタン化合物の投入量は、０．０１〜１０重量％が望ましい。添加する微生物量は極少量であってもよいが、分解効率を考慮してウレタン化合物に対して０．１重量％以上（湿重量）が好ましい。また、分解に供するウレタン化合物は、１種類であっても複数種類であっても良い。
【００１８】
微生物の増殖過程でウレタン結合が分解され栄養源として消費されることを利用する態様では、ウレタン化合物を単一の炭素源として、あるいは単一の炭素・窒素源として与えることも、他の炭素源、窒素源とともに与えることもできる。使用し得る培地としては、炭素源としては、ウレタン化合物あるいはグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００１９】
微生物の有する酵素のウレタン結合を分解する作用を利用する態様、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用する態様では、ウレタン結合の分解に際し、該微生物の増殖を伴わないため、緩衝液にウレタン化合物を添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００２０】
ウレタン化合物の分解に要する時間は、分解に供するウレタン化合物の種類、組成、形状及び量、使用した微生物の種類及びウレタン化合物に対する相対量、その他種々の培養条件等に応じて変化しうる。
【００２１】
本発明において、上記微生物に対し、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養を行えばウレタン化合物の分解がみられる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養条件としては、培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００２２】
培地中のウレタン化合物の分解の確認は、例えば、分解に供したウレタン化合物の重量減少の測定、残存ウレタン化合物量の高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による測定、あるいはウレタン結合加水分解産物であるジアミン化合物の生成の測定により確認することができる。ジアミン化合物の生成の確認は、例えば薄層クロマトグラフィにて生成が予想されるジアミン化合物を標準物質として用いることにより、またはガスクロマトグラフィにより行うことができる。
【００２３】
固体ポリウレタンの分解方法の一態様として、ポリエステル型のポリウレタンのエステル結合分解菌として知られるペニバチルスアミロリチカスＴＢ−１３株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０４、特願平２００２−３３４１６２参照）および／またはコマモナスアシドボランスＴＢ−３５株と、ウレタン結合分解能を有する本発明の菌を用いることにより、ポリウレタンの完全分解を行うことができる。
【００２４】
【実施例】本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１  ウレタン結合分解菌のスクリーニング
ウレタン化合物の合成方法
分解菌のスクリーニングには、合成したウレタン化合物を使用した（図１）。これらの化合物は、トルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）、メチレンビスフェニルジイソシアネート（ＭＤＩ）、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）、ノルボルネンジイソシアネート（ＮＢＤＩ）などポリウレタンの工業原料として用いられる代表的な５種類のイソシアネートとブタノールを反応させ、ウレタン化したものである。これらの化合物（ウレタン化合物Ｉ〜Ｖ、図１参照）はいずれも分子内にウレタン結合を有する物質で、常温では固体で、水に対して不溶であった。
【００２５】
培地
分解菌のスクリーニングには、内径２２ｍｍの大型試験管に、表１に示した無機塩培地を各１０ｍｌ分注し、炭素源としてウレタン化合物Ｉ〜Ｖのウレタン化合物をそれぞれ約０．１ｇ添加した後、１２１℃で２０分間滅菌したものをスクリーニング培地とした。培地調製に使用した試薬類はいずれも和光純薬工業社製の特級又はそれに準ずるものを用いた。
【００２６】
【表１】
2004261103.tif 000002
【００２７】
スクリーニング
日本各地から収集した土壌３５０サンプルをスクリーニング源とした。ウレタン化合物Ｉ〜Ｖそれぞれに対して５０本、計２５０本の試験管を用いた。土壌２０サンプルずつを混合して得た土壌サンプルを、上述のスクリーニング培地の入った試験管１本につき０．２ｇ添加した。これを３０℃、１２５ｏｓｃ／ｍｉｎで振盪培養し、１週間毎に上清０．５ｍｌを新たなスクリーニング用培地に移した。この操作を３回繰り返した後、培養液中に白濁や変色が認められた２６本の試験管サンプルについて、培養上清を生理食塩水で希釈してＮＢ平板培地上に塗布し、３０℃で１〜３日培養後、生育してきたコロニーを一つずつピックアップした。これらをウレタン結合分解菌の候補菌株とし、ＮＢ平板培地で３０℃にて培養後、菌体を２０％グリセロール溶液に懸濁し、−８０℃で凍結保存した。
【００２８】
得られた候補株を、ウレタン化合物Ｉを炭素源として含んだスクリーニング用液体培地で３０℃、１２５ｏｓｃ／ｍｉｎにて培養し、ウレタン化合物Ｉのウレタン結合加水分解産物であるトルエンジアミンの培養液中における生成を薄層クロマトグラフィにて確認した。培養上清０．５ｍｌに等量の酢酸エチルを加えて抽出し、酢酸エチル層を薄層プレート（Ｍｅｒｃｋ社製  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ２５４）に６０μｌスポットした。展開溶媒には酢酸エチル、メタノール、水を８０：３５：３の比率で混合したものを使用した。標準物質としてトルエンジアミンを同様にスポットし、Ｒｆ値、およびＵＶ照射下においての吸収による黒色スポットの生成で確認した。その結果、ウレタン結合加水分解産物であるトルエンジアミンを生成した菌株が１株得られた。これをＴＢ−６０株として−８０℃にて凍結保存した。尚、本菌株は、化合物Ｉを用いたスクリーニング系より得られたものである。
【００２９】
実施例２  ウレタン結合分解菌ＴＢ−６０株の同定
生理学的試験は一般的な方法に従って行った。同定にはＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：ＷＩＬＬＩＡＭＳ＆ＷＩＬＫＩＮＳ  Ｃｏ．，（１９８４）を参考にした。また、米国ＢＩＯＬＯＧ社製の微生物同定システム（Ｍｉｃｒｏｌｏｇ  ３）も使用した。１６ｓｒＤＮＡの配列決定と解析はダイレクトＰＣＲ法を用い、プライマーには真正細菌１６ＳｒＤＮＡのほぼ全長を増幅することのできる２７Ｆおよび１４９２Ｒのプライマーセットを使用した。
【００３０】
形態学的・生理学的諸性質試験
ＴＢ−６０株に関する形態学的・生理学的諸性質試験の結果は表２に示した。本菌株はグラム陽性のコリネ型細菌で、運動性はなく、胞子形成も見られなかった。また、本菌は非常に水分量の多い白色の半液体状コロニーを形成した。オキシダーゼ試験は陰性で、カタラーゼ試験は陽性、ＯＦ試験では陰性を示した。
【００３１】
【表２】
2004261103.tif 000003
【００３２】
ＢＩＯＬＯＧ同定システムによる同定
ＢＩＯＬＯＧ細菌同定システムを用いた同定試験の結果、本菌株は９５％の確率でロドコッカス  エクイと同定された。また、そのほかに５０％以上の類似性を持つ菌種は見つからなかった。
【００３３】
【表３】
2004261103.tif 000004
【００３４】
１６ＳｒＤＮＡ塩基配列
コロニーダイレクトＰＣＲによって本菌株の１６ＳｒＤＮＡのほぼ全長を増幅し、そのうちの上流領域５３５ｂｐ（配列番号１）と下流領域４９７ｂｐ（配列番号２）の塩基配列を決定した。
【００３５】
この配列に基づいてＢＬＡＳＴにより相同性検索を行ったところ、上流領域で９８％、下流領域で１００％の一致率でロドコッカス  エクイと認められた。配列より求めた既知の菌種との系統樹を図２に示した。
【００３６】
以上の結果から、本菌株はロドコッカス  エクイであると同定した。
実施例３  ロドコッカス  エクイ  ＴＢ−６０株によるウレタン化合物分解試験
供試菌株
ウレタン化合物分解菌として得られた、ロドコッカス  エクイ  ＴＢ−６０株を用いた。
【００３７】
培地および試薬
実験には前述のスクリーニング用培地の他に、それから窒素源を除いた培地を使用し、ウレタン化合物Ｉを炭素源または炭素・窒素源として培養を行った。実験に用いた試薬類はすべて和光純薬製特級かそれに準ずるものを使用した。
【００３８】
培養条件
内径１６ｍｍの小型試験管に、ジエチルエーテルに溶解した２％ウレタン化合物Ｉを０．１ｍｌずつ分注し、ドラフト内でジエチルエータルを十分に揮発させた後、培地２ｍｌを加え、オートクレーブで１２０℃で２０分間滅菌した。ロドコッカス  エクイ  ＴＢ−６０株を滅菌済み生理食塩水にＯ．Ｄ．６６０＝０．２となるように懸濁したものを各試験管に１００μｌ植菌し、３０℃、３００ｒｐｍで０〜１０日間回転振盪培養を行った。実験は各３連で行い、無植菌のものをコントロールとした。
【００３９】
菌体生育量の測定
菌体生育量は、培養液のＯ．Ｄ．６６０を吸光度計で測定した。吸光度の測定にはジャスコエンジニアリング社製の吸光度計Ｖ−５５０を用いた。
【００４０】
ウレタン分解量の測定
ウレタン化合物Ｉ残存量の測定は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にて行った。培養液にアセトニトリル２ｍｌを加え、よく攪拌した後２０分間静置し、上清をマイクロチューブに移して１２，０００ｒｐｍ、４℃で遠心し、さらにその上清を２ｍｌ容のバイアル瓶に移し、各１０μｌを試料としてＨＰＬＣに供した。カラムには東ソー社製ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  ４．６ｍｍ×１５ｃｍを用い、移動相には７０％アセトニトリル、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで分析を行った。検出器にはＵＶ（２４０ｎｍ）を用いた。
【００４１】
ジアミン生成量の測定
ウレタン結合の分解に伴って生成するトルエンジアミン量は、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）にて定量した。培養終了後、培養上清０．５ｍｌをマイクロチューブに移し、内部標準物質としてジフェニルアミン１００ｐｐｍを含む酢酸エチル溶液０．５ｍｌを加え１０分間よく攪拌した。これを１２，０００ｒｐｍ、４℃で遠心した後、上層を新しいマイクロチューブに移し、約８０ｍｇの無水硫酸ナトリウムを加えて水分を除去したものを試料として各２μｌをＧＣに供した。ＧＣ分析には島津製作所製のＧＣ−２０１０を使用し、ジフェニルアミンを内部標準として濃度を算出した。カラムにはＪ＆Ｗ社製ＤＢ−１（０．２５ｍｍ×３０ｍ）を用い、カラム温度１８０℃、インジェクター温度３００℃、検出にはＦＩＤを用いた。
【００４２】
結果
各培養条件におけるウレタン化合物Ｉ残存量の測定結果を図３に示した。ウレタン化合物Ｉを炭素源として与えた系では培養開始１０日でウレタン化合物Ｉの約６割が減少した。一方、炭素・窒素源として与えた培地においては、ウレタン化合物Ｉの減少は観察されたものの、その減少量は少なかった。
ジアミン生成量
ジアミン生成量の測定結果を図４に示した。ウレタン化合物Ｉを炭素源として与えた系では１０日間の培養で約１５０ｐｐｍのトルエンジアミンの生成が認められた。一方、炭素・窒素源として与えた培地においては培養初期に顕著なジアミンが生成は認められたものの、その後の生成量はわずかであった。
【００４３】
菌体生育量
菌体生育量の測定結果を図５に示した。ウレタン化合物Ｉを炭素源として与えた系では培養初期に顕著な生育が認められた。一方で炭素・窒素源として与えた培地においては３日目以降も緩やかな増殖が認められた。
【００４４】
【発明の効果】本菌株の純粋培養系を用いたウレタン化合物、特にポリウレタンの集約的分解処理、土壌中やコンポスト中に添加することによる分解処理や肥料として再資源化等への応用が期待される。また、本菌株は細菌であり、一般的に細菌のほうが大量培養が容易であるため、微生物分解処理にはコスト面で有利である点からも有用である。ウレタン中のエステル結合分解菌であるペニバチルスアミロリチカスＴＢ−１３株またはコマモナスアシドボランスＴＢ−３５株と本発明の微生物を共存させることにより、ポリウレタンの細菌による完全分解が可能となる。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ウレタン結合分解菌のスクリーニングに使用した合成ウレタン化合物の構造を示す。
【図２】図２は、ｒＤＮＡ塩基配列に基づいて求めた既知の菌種との系統樹を示す。
【図３】図３は、各培養条件におけるウレタン化合物Ｉ残存量の測定結果を示す。
【図４】図４は、各培養条件におけるジアミン生成量の測定結果を示す。
【図５】図５は、各培養条件における菌体生育量測定結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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