(57)【要約】【課題】Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患の治療剤として有用な、ヒトＦａｓともマウスＦａｓとも結合する抗Ｆａｓ抗体を提供する。【解決手段】霊長類および非霊長類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異的な抗原結合領域を有することを特徴とする分子。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）により産生されるモノクローナル抗体をヒト化した抗体であって、以下の１）乃至５）の特徴を有する抗体：
１）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に特異的な抗原結合領域を有する；
２）下記の一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖ポリペプチドを有する
−ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４−（Ｉ）
（式中、ＦＲＨ１は１８乃至３０個のアミノ酸配列からなる任意のアミノ酸配列を表わし、ＣＤＲＨ１は配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を表わし、ＦＲＨ２は１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、ＣＤＲＨ２は配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を表わし、ＦＲＨ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、ＣＤＲＨ３は配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列を表わし、ＦＲＨ４は１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）および、以下の一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチド；
３）下記の一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する
−ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４−（ＩＩ）
（式中、ＦＲＬ１は２３個のアミノ酸配列からなる任意のアミノ酸配列を表わし、ＣＤＲＬ１は配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列を表わし、ＦＲＬ２は１５個のアミノ酸配列からなる任意のアミノ酸配列を表わし、ＣＤＲＬ２は配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列を表わし、ＦＲＬ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、ＣＤＲＬ３は配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列を表わし、ＦＲＬ４は１０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）；
３）Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス誘導活性を有する；
４）肝臓障害を誘発しない。
５）イムノグロブリンＧ型抗体である。
【請求項２】
抗マウスＦａｓモノクローナル抗体Ｊｏ２により惹起される劇症肝炎に対する治療または予防効果を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
下記のａ）乃至ｃ）の少なくともいずれか一つに記載の生物学的性状を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体：
ａ）ＭＲＬｇｌｄ　／ｇｌｄ　マウスの自己免疫疾患症状の改善効果を有する；
ｂ）コラーゲン誘導関節炎に対する発症予防効果を有する；
ｃ）慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対するアポトーシス誘導活性を有する。
【請求項４】
下記のａ）乃至ｄ）に記載の生物学的性状の全てを有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体：
ａ）ＭＲＬｇｌｄ　／ｇｌｄ　マウスの自己免疫疾患症状の改善効果を有する；
ｂ）抗マウスＦａｓモノクローナル抗体Ｊｏ２により惹起される劇症肝炎に対する治療または予防効果を有する；
ｃ）コラーゲン誘導関節炎に対する発症予防効果を有する；
ｄ）慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対するアポトーシス誘導活性を有する。
【請求項５】
Ｆａｓを発現している異常細胞にアポトーシスを誘導することができ、かつ正常細胞のアポトーシスを防止することができることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の抗体。
【請求項６】
下記の１）に記載の軽鎖ポリペプチドおよび２）に記載の重鎖ポリペプチドから構成される抗体において、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドの少なくともいずれか一つのポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に特異的な抗原結合領域を有し、
Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス誘導活性を有することを特徴とする抗体：
１）配列表の配列番号５０のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号５２のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号５４のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列または配列表の配列番号１０９のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列からなる軽鎖ポリペプチド；
２）配列表の配列番号８９のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列または配列表の配列番号１１７のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列からなる重鎖ポリペプチド。
【請求項７】
配列表の配列番号５０のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ポリペプチド、および、配列表の配列番号８９のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ポリペプチドから構成される抗体において、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドの少なくともいずれか一つのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に特異的な抗原結合領域を有し、Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス誘導活性を有することを特徴とする抗体。
【請求項８】
配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ポリペプチド、および、配列表の配列番号１１７のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ポリペプチドから構成される抗体において、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドの少なくともいずれか一つのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス誘導活性を有することを特徴とする抗体。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１つに記載の抗体中のポリペプチド鎖のいずれか一つをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項１乃至８のいずれか一つに記載の抗体の軽鎖ポリペプチドまたは重鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１乃至８のいずれか１つに記載の抗体を有効成分として含有する医薬。
【請求項１５】
以下の工程１）及び２）を含むことからなる、マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａの製造方法：
１）　Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド系に欠損のある動物をＦａｓで免疫する工程；
２）　Ｆａｓで免疫された動物から摘出した脾臓細胞と、ミエローマ細胞を融合させ、Ｆａｓに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程。
【請求項１６】
以下の工程１）及び２）を含むことからなる、マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａの選別方法：
１）　Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド系に欠損のある動物をＦａｓで免疫する工程：
２）　Ｆａｓで免疫された動物から摘出した脾臓細胞と、ミエローマ細胞を融合させ、Ｆａｓに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程。
【請求項１７】
Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド系に欠損のある動物がＦａｓをコードする遺伝子を発現不能にしたマウス（以下、「Ｆａｓノックアウトマウス」という。）であることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアポトーシスに関与する細胞膜分子であるＦａｓ抗原を認識する抗Ｆａｓ抗体の製造方法及び選択方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内において、正常な細胞交代のために生じる生理的な細胞死はアポトーシスと呼ばれ、病理的な細胞死である壊死（ネクローシス）とは区別される（例えば、非特許文献１参照。）。いわゆるプログラム細胞死は、生体内において予め死滅するべくプログラム化されている、ある種の細胞にみられる細胞死であるが、アポトーシスもその一つである。アポトーシスにおいては細胞表面の湾曲、核クロマチンの凝縮、染色体ＤＮＡの断片化等の現象が特徴的に観察される。
【０００３】
アポトーシスは、リンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞）の分化において、自己抗原を認識する細胞を排除する役割を果たしている。実際、Ｔリンパ球の成熟過程において、自己と反応する細胞など９５％以上の細胞が胸腺において死滅することが知られている（例えば、非特許文献２参照）。いわゆる自己免疫疾患の発症は、リンパ球分化におけるアポトーシスの不全によって自己反応性リンパ球が生じることによるものと考えられている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
このようなアポトーシスに関与する分子としてはＦａｓ（例えば、非特許文献４参照。）をはじめとして、腫瘍壊死因子受容体（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（例えば、非特許文献５参照。）、ＣＤ４０（例えば、非特許文献６参照。）やパーフォリン／グランザイムＡ（例えば、非特許文献７参照。）など種々の分子が同定されてきた。Ｆａｓは細胞表面に存在する膜貫通型タンパク質で、Ｆａｓリガンドと呼ばれるタンパク質がその細胞外領域に結合するとその細胞にアポトーシスを誘導する。このＦａｓ／Ｆａｓリガンド系に異常があると、本来アポトーシスにより除去されるべき、恒常性の維持に悪影響を及ぼす細胞が除去されずに残ったり、逆に恒常性の維持に不可欠な細胞にアポトーシスが誘導されたりすることにより、様々な障害が起こる。本発明においては、それらを総称して「Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患」という。
【０００５】
Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患の発症もしくは病態進行においては、次のような共通した機序を見出すことができる。すなわち、Ｆａｓを発現していながら除去されない異常な細胞（以下「異常細胞」という）が、他の正常な組織または細胞を攻撃したり、異常増殖することにより、正常な組織または細胞に障害が起こり、それぞれの症状の原因となる。場合によっては、これらの障害は異常細胞からの刺激を受けた正常な組織または細胞がＦａｓを発現し、アポトーシスを起こすことにより生じるかまたは増悪する。具体的には、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患として、例えば以下に記載するものを挙げることができる。
【０００６】
自己免疫疾患：　ヒトの各種自己免疫疾患（橋本病、全身性エリテマトーデス、シューグレン症候群、悪性貧血、アジソン氏病、インスリン依存型糖尿病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン氏病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ）とＦａｓ／Ｆａｓリガンド系との関連は多数報告されている。
【０００７】
Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の遺伝的異常として、マウスではＦａｓに異常のあるｌｐｒ（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　）マウス、ｌｐｒｃｇ（ｌｐｒ　ｇｅｎｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇｇｌｄ　ｇｅｎｅ　）マウスやＦａｓリガンドに異常のあるｇｌｄ（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　）が知られており、いずれも特異な全身リンパ節腫脹を伴った種々の自己免疫疾患症状を呈することが明らかとなっている。ヒト全身性エリテマトーデスの自然発症モデルマウスであるＭＲＬｌｐｒマウスでは、著明なリンパ節腫大とともに自己抗体を産生し、免疫複合体による腎炎を発症する。このマウスは、Ｆａｓ遺伝子に異常を有しているために、末梢においてＦａｓを介したアポトーシスによる自己抗原に対する免疫寛容が起こらず、活性化された自己反応性Ｔ細胞が持続的に集積した結果、上記病態を呈するものと推察されている（例えば、非特許文献８参照。）。またヒトでもリンパ節腫脹、高ガンマグロブリン血症、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞の著明な増大を呈した２小児症例（例えば、非特許文献９参照。）をはじめとする自己免疫疾患様症例が、Ｆａｓ遺伝子の異常に起因するものであることが報告され（例えば、非特許文献１０及び１１参照。）、自己免疫性リンパ球増殖症候群（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　Ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ　；ＡＬＰＳ）と命名されている。従って、マウスのみならずヒトにおいても、自己抗原に対する免疫寛容の成立・維持においてＦａｓを介するアポトーシス誘導システムが大きく関与しており、その異常により種々の自己免疫疾患が誘発されると考えられる。
【０００８】
また、慢性関節リウマチ患者の患部に浸潤して組織破壊に関与しているＴ細胞の大多数がＦａｓを発現していることから、慢性関節リウマチが自己免疫疾患としての側面を併せ持つことが知られている（例えば、非特許文献１２参照。）。
【０００９】
インスリン依存性糖尿病の多くは、自己反応性Ｔ細胞による膵ベータ細胞の破壊がインスリン分泌の絶対的不足状態を招くことにより発症することから、自己反応性Ｔ細胞の除去が病態の根本的な治療に重要である。
【００１０】
さらに、骨髄移植後の移植片対宿主病では、障害を受ける標的臓器においてＦａｓの発現が増大しており、その発現増大の程度と標的臓器障害の程度が相関する（例えば、非特許文献１３参照）。従ってこの疾患の予防または治療にあたっては、標的臓器の細胞のアポトーシスを阻止し、かつ標的臓器を攻撃する細胞を減少させることが必要である。
【００１１】
アレルギー性疾患：　アレルギー性疾患に関与する炎症細胞は、通常は活性化されて病巣に浸潤しており、アポトーシスが抑制された状態となって細胞寿命が延長し、局所により長く集族してその機能を発揮する。マウスに好酸球性の気道炎症を起こさせる実験モデルで、アポトーシス誘導活性を有する抗Ｆａｓ抗体を経気道的に投与すると、アレルゲン吸入後にみられる粘膜下への好酸球浸潤が消失することが知られている（例えば、非特許文献１４参照。）。したがって、炎症細胞にアポトーシスを誘導することにより、症状を軽減することが可能である。
【００１２】
慢性関節リウマチ：　前述した慢性関節リウマチの自己免疫疾患的側面とは別に、患部において異常増殖している滑膜細胞がＦａｓを発現していることが知られている（例えば、非特許文献１５参照。）。この患部由来の滑膜細胞をアポトーシス誘導活性を有する抗Ｆａｓ抗体で刺激すると、アポトーシスが誘導される（例えば、非特許文献１６参照。）。すなわち、慢性関節リウマチ患者の患部においてはＦａｓ／Ｆａｓリガンド系が正常に機能しておらず、自己反応性Ｔ細胞も異常増殖する滑膜細胞も、Ｆａｓを発現していながら除去されない状態に陥っている。
【００１３】
動脈硬化：　動脈硬化病変の中心部の細胞死の最終像は壊死（ネクローシス）であるが、その進展過程および退縮過程におけるアポトーシスの関与が報告されている（例えば、非特許文献１７参照。）。動脈硬化病変の電子顕微鏡所見では核の濃縮を伴う平滑筋細胞のアポトーシス像が認められる（例えば、非特許文献１８参照。）。また、動脈硬化の初期病変において動脈内膜層に集まって脂肪を貪食するマクロファージの一種である泡沫細胞がＦａｓを発現しており、アポトーシス誘導活性を有する抗Ｆａｓ抗体によりアポトーシスを起こすことが報告されている（例えば、非特許文献１９参照。）。動脈硬化病変は、リンパ球浸潤を伴う場合が多く、Ｔ細胞のＦａｓリガンドとマクロファージのＦａｓが動脈硬化をコントロールしている可能性が示唆されている（例えば、非特許文献２０参照。）。
【００１４】
心筋炎・心筋症：　虚血性心疾患、ウイルス性心疾患や拡張型心筋症・　慢性心筋症などの自己免疫性心疾患などの病態発症過程にもＦａｓ／Ｆａｓリガンド系が関与している可能性が高い。心筋炎は、コクサッキーウイルスなどのウイルスが主な原因と考えられる心筋の炎症で、典型的には感冒様症状に引き続いて胸痛や不整脈、心不全、ショックなどにより発症する。また心筋症は「原因不明の心筋疾患」と定義されるが、その原因もウイルス感染であると考えられる。心不全を伴うマウスの心筋炎モデルの検討において、ウイルス接種後のマウス心臓でアポトーシスを起こしている細胞（核の濃縮、断片化）が観察される。またマウス心臓でもＦａｓの発現増大が認められ、リンパ球を中心とした浸潤炎症細胞由来のＦａｓリガンドによりアポトーシスが誘導されているものと推察された（例えば、非特許文献２１参照。）。ラット培養心筋細胞が虚血によりアポトーシスを起こし、同時に該細胞においてＦａｓをコードするｍＲＮＡが増加することが知られている（例えば、非特許文献２２参照。）。
【００１５】
腎疾患：　多くの慢性腎疾患においては、糸球体内組織の再構築が細胞外基質の糸球体内蓄積をもたらすことにより、糸球体硬化が進行し、濾過機能の廃絶から慢性腎不全の病態を呈するに至る。進行性糸球体硬化モデルにおいては、電子顕微鏡レベルで硬化部分に典型的なアポトーシス像が観察され、また硬化の進展に伴う糸球体細胞数の減少に一致して糸球体内アポトーシスの増大が認められる（例えば、非特許文献２３参照。）。また急性糸球体腎炎では、過剰に増殖したメサンギウム細胞がアポトーシスにより減少することで腎炎が回復に向かうことが知られている（例えば、非特許文献２４及び２５参照。）。さらに紫斑病性腎炎やループス腎炎などにおいて糸球体内にＦａｓを発現する細胞が顕著に増加していることが報告されている（例えば、非特許文献２６参照。）。
【００１６】
再生不良性貧血：　再生不良性貧血患者の造血前駆細胞表面においては、正常人に比較してＦａｓの発現が顕著であることから、造血幹細胞の減少にＦａｓが関与していることが示唆されている（例えば、非特許文献２７参照。）。
【００１７】
肝炎：　劇症肝炎では、多くの肝細胞にアポトーシスが誘導されていることが知られており、また抗Ｆａｓ抗体Ｊｏ２をマウスの腹腔内に投与すると劇症肝炎様の広範な肝細胞死が認められることから、Ｆａｓを介した肝細胞のアポトーシスがその発症に関与すると考えられている（例えば、非特許文献２８及び２９参照。）。免疫組織学的検討では、慢性肝炎病巣の肝細胞壊死の強い部分の肝細胞質に、また脂肪肝などの肝疾患病巣の肝細胞膜にそれぞれＦａｓ発現の増強が認められた（例えば、非特許文献３０及び３１参照。）。
【００１８】
また、ＦａｓはＣ型慢性持続性肝炎、慢性活動性肝炎の病巣に発現しており、いずれも肝細胞が散在性に染色され、周囲に細胞障害性Ｔ細胞とみられる浸潤リンパ球を伴っている（例えば、非特許文献３２参照。）。細胞障害性Ｔ細胞はその細胞表面のＦａｓリガンドにより感染細胞にアポトーシスを誘導する機能を有するが、同様に近傍の正常な細胞にもアポトーシスを誘導する。この近傍者障害と呼ばれる現象は、体内の多くの細胞が、自身または近傍の細胞が感染した際にＦａｓを発現することに起因する。
【００１９】
なお、Ｃ型慢性肝炎に対するインターフェロン投与により、Ｃ型肝炎ウイルス由来のＲＮＡが消失した症例では、肝組織のＦａｓの発現が顕著に減少する。
【００２０】
急性肝不全患者の肝細胞では細胞表面のＦａｓが増加しており、該細胞はアポトーシス誘導活性を有する抗Ｆａｓ抗体によりアポトーシスを起こす。さらにアルコール性肝炎では偽小葉内部の肝細胞自身にもＦａｓリガンドが発現している（例えば、非特許文献３３参照。）。Ｆａｓリガンド遺伝子発現のｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションによる検討からは、急性肝不全例では肝浸潤リンパ球に、アルコール肝硬変例では偽小葉内部の肝細胞自体にそれぞれ発現が認められることから、ウイルス性肝硬変とアルコール性肝硬変では異なる機序でアポトーシスが誘導されると考えられるが、いずれの場合もＦａｓ／Ｆａｓリガンド系に異常をきたしていると推測されている。また肝炎モデルマウスにおいて、ＦａｓリガンドのＦａｓに対する結合を阻害する性質を有する物質の投与により肝障害が阻害されることが知られている（例えば、非特許文献３４参照。）。
【００２１】
後天性免疫不全症候群：　ヒト免疫不全ウイルス（以下「ＨＩＶ」という）感染患者が免疫不全に陥る原因として、ＨＩＶに感染していない極めて多数の免疫細胞がアポトーシスにより細胞死することが挙げられる。ヘルパーＴ細胞はＨＩＶとの接触により細胞死するが、ヘルパーＴ細胞由来の成長因子が細胞障害性Ｔ細胞のアポトーシス抑制に必須であるため、ヘルパーＴ細胞が消失すると細胞障害性Ｔ細胞がアポトーシスを起こす。ＨＩＶ感染者の末梢血リンパ球でのＦａｓの発現は病態の進行に相関していること（例えば、非特許文献３５及び３６参照。）、非感染者ではＦａｓ陽性の末梢血リンパ球はＦａｓ刺激により容易にアポトーシスになることはないが、感染者の末梢血リンパ球ではＦａｓを介して短時間のうちにアポトーシスが誘導されること（例えば、非特許文献３７参照。）などから、ＨＩＶ感染者における免疫細胞のアポトーシスもＦａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常によるものであると考えられる。
【００２２】
臓器移植後の拒絶反応：　臓器移植後の拒絶反応も、細胞障害性Ｔ細胞の攻撃対象である移植臓器が供与者由来である点を除けば、現象自体は自己免疫疾患と類似しているので、細胞障害性Ｔ細胞の機能を抑制することにより症状の改善を期待することができる。
【００２３】
これら各疾患に対しては、異常細胞（例えば自己免疫疾患における自己反応性Ｔ細胞、動脈硬化における泡沫細胞、急性糸球体腎炎におけるメサンギウム細胞、ウイルス感染症における感染細胞、慢性関節リウマチにおける滑膜細胞等を指す）を除去し、正常組織または細胞を保護することが有効な治療手段となるが、Ｆａｓを介するアポトーシスを誘導するのみの薬物では異常細胞を除去できても正常組織に障害を起こす可能性が高く、またＦａｓを介するアポトーシスを阻害するのみの薬物では正常細胞を保護することはできても異常細胞を除去することができない。実際、アポトーシス誘導活性を有する抗マウスＦａｓモノクローナル抗体Ｊｏ２はマウスに劇症肝炎を発症させる（例えば、非特許文献３８参照。）。これまでに、アポトーシス誘導活性を有しながら、マウスに投与した際に肝臓障害を誘発しないことが確認された抗Ｆａｓ抗体は知られていない。
【００２４】
免疫グロブリンＧ（以下、単に「ＩｇＧ」という。）は、分子量約２３０００の軽ポリペプチド鎖（以下「軽鎖」という。）、分子量約５００００の重ポリペプチド鎖（以下「重鎖」という。）各２本づつから構成される。重鎖、軽鎖とも約１１０残基からなる、アミノ酸配列が保存されている領域のくり返し構造を持ち、これらはＩｇＧの３次元構造の基本単位（以下、「ドメイン」という。）を構成する。重鎖および軽鎖は、それぞれ連続した４個、および２個のドメインから構成されている。重鎖、軽鎖いずれにおいても、アミノ末端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間でのアミノ酸配列の変異が大きく、このドメインは可変ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　：　以下、「Ｖドメイン」という。）と呼ばれる。ＩｇＧのアミノ末端においては、重鎖、軽鎖のＶドメインが相補的に会合し可変領域を形成している。これに対し、残余のドメインは、全体として定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な配列を有し、例えば、マウスＩｇＧの定常領域はヒトＩｇＧの定常領域とは異なっているので、マウスＩｇＧはヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、ヒト抗マウス抗体（Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　：以下「ＨＡＭＡ」という。）応答が起こる（例えば、非特許文献３９参照。）。従って、マウス抗体はヒトに繰返し投与することはできない。このような抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持したままＨＡＭＡ応答を起こさないように抗体分子を修飾する必要がある。
【００２５】
Ｘ線結晶構造解析の結果によれば、一般に、このようなドメインは３本から５本のβ鎖からなる逆平行βシートが二層重なり合った長円筒状の構造をとる。可変領域では、重鎖、軽鎖のＶドメインそれぞれにつき各３個のループが集合し、抗原結合部位を形成する。この各ループは相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　：　　以下、「ＣＤＲ」という。）と呼ばれ、アミノ酸配列の変異が最も著しい。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、一般に、ＣＤＲの構造を保持する役割を有し、「フレームワーク」と呼ばれる。カバトらは、重鎖、軽鎖の可変領域の一次配列を多数収集し、配列の保存性に基づき、それぞれの一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類した表を作成した（例えば、非特許文献４０参照。）。また、各フレームワークは、アミノ酸配列が共通の特徴を有する複数のサブグループに分類された。さらに、ヒトとマウスの間で対応するフレームワークが存在することも見いだされた。
【００２６】
このようなＩｇＧの構造的特徴に関する研究から以下のヒト化抗体の作製法が考案された。
【００２７】
研究初期の段階では、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が提案された（例えば、非特許文献４１参照。）。しかし、そのようなキメラ抗体は、依然として、多くの非ヒトアミノ酸残基を含むので、特に長期間投与した場合にはＨＡＭＡ応答を誘導しうる（例えば、非特許文献４２参照）。
【００２８】
ヒトに対しＨＡＭＡ応答を発現する可能性のある、非ヒトほ乳動物由来のアミノ酸残基を更に少なくする方法として、ＣＤＲ部分のみをヒト由来の抗体に組み込む方法が提案された（例えば、非特許文献４３参照。）が、一般に、抗原に対する免疫グロブリン活性を保持するにはＣＤＲのみの移植では不十分であった。
【００２９】
一方、チョッチアらは、１９８７年、Ｘ線結晶構造解析データを用い、
（ｉ）　ＣＤＲのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位とＣＤＲ自体の構造を維持する部位とが存在し、ＣＤＲの取り得る三次元構造は、複数の典型的なパターン（カノニカル構造）に分類されること、
（ｉｉ）カノニカル構造のクラスは、ＣＤＲのみならずフレームワーク部分の特定の位置のアミノ酸の種類によって決定されること、を見いだした（例えば、非特許文献４４参照。）。
【００３０】
この知見に基づき、ＣＤＲ移植法を用いる場合、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植する必要性が示唆された（例えば、特許文献１参照。）。
【００３１】
一般に、移植すべきＣＤＲを有する非ヒト哺乳動物由来の抗体は「ドナー」、ＣＤＲが移植される側のヒト抗体は「アクセプター」と定義されるが、本発明もこの定義に従うことにする。
【００３２】
ＣＤＲ移植法を実施する際に考慮すべき点は、可能な限りＣＤＲの構造を保存し、免疫グロブリン分子の活性を保持することにある。この目的を達成するため：
（ｉ）　アクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべきか；
（ｉｉ）ドナーのフレームワークからいずれのアミノ酸残基を選択すべきか
の２点に留意する必要がある。
【００３３】
クィーンらは、ドナーのフレームワークのアミノ酸残基が、以下の基準の少なくともひとつに該当する場合、ＣＤＲ配列とともにアクセプターに移植するデザインの方法を提唱した（例えば、特許文献１参照。）：
（ａ）　アクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通である。
（ｂ）　該アミノ酸がＣＤＲのひとつのすぐ近くである。
（ｃ）　該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原とまたはヒト化抗体のＣＤＲと相互作用することができると予想される。
【００３４】
しかしながら、アポトーシス誘導活性を有するＩｇＧ型ヒト化抗Ｆａｓ抗体の取得に成功した例はない。また本発明の抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、従来知られていなかった新規な特徴を有するモノクローナル抗体である。したがって、該モノクローナル抗体をヒト化した例も知られていない。
【００３５】
【特許文献１】
特表平４−５０２４０８号公報
【非特許文献１】
「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ）」、１９７２年、第２６巻、ｐ．２３９−
【非特許文献２】
長田重一、「タンパク質　核酸　酵素」、１９９３年、第３８巻、ｐ．２２０８−２２１８
【非特許文献３】
中山ら、「メビオ（Ｍｅｂｉｏ）」、１９９５年、第１２巻１０号、ｐ．７９−８６
【非特許文献４】
「ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９８９年、第１６９巻、ｐ．１７４７−１７５６
【非特許文献５】
「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９０年、第６１巻、ｐ．３５１−３５９
【非特許文献６】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９３年、第３６４巻、ｐ．６４５−６４８
【非特許文献７】
「イムノロジカル・レビューズ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、１９８８年、第１０３巻、ｐ．５３−７１
【非特許文献８】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９５年、第３７３巻、ｐ．３８５−
【非特許文献９】
「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、１９９２年、第９０巻、ｐ．３３４−
【非特許文献１０】
「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９５年、第８１巻、ｐ．９３５−
【非特許文献１１】
「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９５年、第２６８巻、ｐ．１３４７−
【非特許文献１２】
「ザ・ジャーナル・オブ・リューマトロジー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）」、１９９６年、第２３巻、ｐ．１３３２−１３３７
【非特許文献１３】
「ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９５年、第１８１巻、ｐ．３９３−
【非特許文献１４】
「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、１９９５年、第９６巻、ｐ．２９２４−
【非特許文献１５】
「ザ・ジャーナル・オブ・リューマトロジー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）」、１９９６年、第２３巻、ｐ．１３３２−
【非特許文献１６】
「アルスリティス・アンド・リューマティズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）」、１９９５年、第３８巻、ｐ．４８５−
【非特許文献１７】
原田賢治、「現代医療」、１９９７年、第２９巻、ｐ．１０９−
【非特許文献１８】
「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）」、１９９５年、第９１巻、ｐ．２７０３−
【非特許文献１９】
「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、１９９４年、第２４巻、ｐ．２６４０−
【非特許文献２０】
原田賢治、「現代医療」、１９９７年、第２９巻、ｐ．１０９−
【非特許文献２１】
山田武彦ら、「現代医療」、１９９７年、第２９巻、ｐ．１１９−
【非特許文献２２】
「サーキュレーション・リサーチ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９４年、第７５巻、ｐ．４２６−
【非特許文献２３】
「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、１９９６年、第４９巻、ｐ．１０３−
【非特許文献２４】
「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、１９９５年、第４７巻、ｐ．１１４−
【非特許文献２５】
「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、１９９４年、第９４巻、ｐ．２１０５−
【非特許文献２６】
「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、１９９５年、第４８巻、ｐ．１８８６−
【非特許文献２７】
「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）」、１９９５年、第９１巻、ｐ．２４５−
【非特許文献２８】
「モレキュラー・メディスン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９６年、第３３巻、　ｐ．１２８４−
【非特許文献２９】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９３年、第３６４巻、ｐ．８０６−
【非特許文献３０】
「ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）」、１９９４年、第１９巻、ｐ．１３５４−
【非特許文献３１】
「インターナショナル・ヘパトロジー・コミュニケーション（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）」、１９９６年、第４巻、ｐ．３３４−
【非特許文献３２】
「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９４年、第２０４巻、ｐ．４６８−
【非特許文献３３】
「ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９５年、第１８２巻、ｐ．１２２３−
【非特許文献３４】
「ネイチャー・メディスン（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９７年、第３巻、ｐ．４０９−
【非特許文献３５】
「ベーリング・インスティテュート・ミテルンゲン（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇｅｎ）」、１９９５年、第９６巻、ｐ．１３−
【非特許文献３６】
「サイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」、１９９５年、第２２巻、ｐ．１１１−
【非特許文献３７】
「セル・イムノロジー（Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、１９９２年、第１４０巻、ｐ．１９７−
【非特許文献３８】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９３年、第３６４巻、ｐ．８０６−８０９
【非特許文献３９】
「キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９８５年、第４５巻、ｐ．８７９−８８５
【非特許文献４０】
カバトら、「ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ　ＯＦ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＩＮＴＥＲＥＳＴ」、　５ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　ＮＩＨ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，　Ｎｏ．９１−３２４２，　Ｅ．Ａ．　Ｋａｂａｔｔ　ｅｔ　ａｌ．
【非特許文献４１】
「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）、１９８４年、第８１巻、ｐ．６８５１−６８５５
【非特許文献４２】
「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ）」、１９９０年、第６２巻、ｐ．４８７−
【非特許文献４３】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９８６年、第３２１巻、ｐ．５２２−５２５
【非特許文献４４】
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９８７年、第１９６巻、ｐ．９０１−９１７
【００３６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第一の目的は、前記のような異常細胞に対してはその表面のＦａｓに結合してアポトーシスを誘導し、一方、正常細胞に対しては、ＦａｓリガンドのＦａｓへの結合により誘導されるアポトーシスを阻止する機能を有する新規抗Ｆａｓ抗体、またはそれに類似した分子を提供することにある。
【００３７】
ヒトＦａｓに特異的に結合するモノクローナル抗体は、アポトーシス誘導活性を有するものも含めいくつか知られているが、いずれもマウスＦａｓとは結合しないことが明らかとなっている。同様にマウスＦａｓと結合するモノクローナル抗体もいくつか知られているものの、いずれもヒトＦａｓとは結合しない。すなわち、既存の抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の医薬としての有効性を評価するにあたっては、上記に挙げたような病態モデルマウスを使用することができない。本発明の第二の目的は、ヒトＦａｓともマウスＦａｓとも結合する抗Ｆａｓ抗体、またはそれに類似した分子を提供することにある。
【００３８】
本発明の第三の目的は、上記抗Ｆａｓ抗体、またはそれに類似した分子を有効成分として含有する、上記各種疾患に対する予防または治療剤を提供することにある。
【００３９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）　霊長類および非霊長類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異的な抗原結合領域を有することを特徴とする分子、
（２）　霊長類がヒトであることを特徴とする、（１）記載の分子、
（３）　非霊長類動物が齧歯類動物であることを特徴とする、（１）または（２）記載の分子、
（４）　齧歯類動物がマウスであることを特徴とする、（３）記載の分子、
（５）　哺乳類のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異的な抗原結合領域を有することを特徴とする分子、
（６）　マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）により産生されるモノクローナル抗体、
（７）　マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）により産生される抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体由来の６種のＣＤＲと同一のＣＤＲを全て有することを特徴とする分子、
（８）　マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）により産生されるモノクローナル抗体により認識されるエピトープに特異的な抗原結合領域を有することを特徴とする分子、
（９）　抗体であることを特徴とする、（１）乃至（５）、（７）または（８）のいずれか一つに記載の分子、
（１０）　以下の一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖ポリペプチド：
−ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４−（Ｉ）
（式中、ＦＲＨ１は１８乃至３０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、
ＣＤＲＨ１は配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を表わし、
ＦＲＨ２は１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、
ＣＤＲＨ２は配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を表わし、
ＦＲＨ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、
ＣＤＲＨ３は配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列を表わし、
ＦＲＨ４は１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、
各アミノ酸はそれぞれぺプチド結合で連結している、）
および、以下の一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチド：
−ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４−（ＩＩ）
（式中、ＦＲＬ１は２３個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、
ＣＤＲＬ１は配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列を表わし、
ＦＲＬ２は１５個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、
ＣＤＲＬ２は配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列を表わし、
ＦＲＬ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、
ＣＤＲＬ３は配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列を表わし、
ＦＲＬ４は１０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表わし、
各アミノ酸はそれぞれぺプチド結合で連結している、）
を有することを特徴とする分子、
（１１）　少なくとも下記のａ）乃至ｆ）のいずれか一つに記載の生物学的性状を有することを特徴とする、（１）乃至（５）または（７）乃至（１０）のいずれか一つに記載の分子：
ａ）Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス誘導活性を有する；
ｂ）ＭＲＬｇｌｄ　／ｇｌｄ　マウスの自己免疫疾患症状の改善効果を有する；
ｃ）肝臓障害を誘発しない；
ｄ）抗マウスＦａｓモノクローナル抗体Ｊｏ２により惹起される劇症肝炎に対する治療または予防効果を有する；
ｅ）コラーゲン誘導関節炎に対する発症予防効果を有する；
ｆ）慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対するアポトーシス誘導活性を有する、
（１２）　ａ）乃至ｆ）記載の生物学的性状の全てを有することを特徴とする、（１１）記載の分子、
（１３）　抗体であることを特徴とする、（１０）乃至（１２）のいずれか一つに記載の分子、
（１４）　ヒト化されていることを特徴とする、（９）または（１３）記載の分子、
（１５）　イムノグロブリンＧ型抗体であることを特徴とする、（９）または（１３）記載の分子、
（１６）　ヒト化されていることを特徴とする、（６）記載の抗体、
（１７）　Ｆａｓを発現している異常細胞にアポトーシスを誘導することができ、かつ正常細胞のアポトーシスを防止することができることを特徴とする、（１）乃至（５）または（７）乃至（１５）のいずれか一つに記載の分子、
（１８）　（１）乃至（５）、（７）乃至（１３）、（１５）または（１７）のいずれか一つに記載の分子、もしくは（６）記載の抗体の、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンドの相互作用による影響を受けた病態に対する医薬としての効果を評価する方法であって、前記病態のモデル動物に該分子または該抗体を投与し、次いで、前記病態の変化を該分子または該抗体を投与した動物と非投与動物との間で比較することを特徴とする方法、
（１９）　少なくとも一つのヒトイムノグロブリン軽鎖もしくはその断片、および、少なくとも一つのヒトイムノグロブリン重鎖もしくはその断片のそれぞれに、霊長類および非霊長類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異的に結合する抗体から、該抗体のそれぞれのＣＤＲを移植することによって得ることができる、霊長類および非霊長類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異的な抗原結合領域を有することを特徴とするヒト化抗体、
（２０）　ヒトイムノグロブリン軽鎖およびヒトイムノグロブリン重鎖として、各々、霊長類および非霊長類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異的に結合する抗体との間で可変領域の類似性が最も高いものが選択されていることを特徴とする、（１９）記載のヒト化抗体、
（２１）　霊長類および非霊長類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異的に結合する抗体から、該抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域において該抗体の抗原認識部位の構造を維持するために重要なアミノ酸が、ヒトイムノグロブリン軽鎖もしくはその断片、および／または、ヒトイムノグロブリン重鎖もしくはその断片に移植されていることを特徴とする、（１９）または（２０）記載のヒト化抗体、
（２２）　配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと結合することを特徴とする、（１）乃至（５）、（７）乃至（１５）、（１７）または（１９）乃至（２１）のいずれか一つに記載の分子または抗体、
（２３）　配列表の配列番号５０のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号５２のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号５４のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列または配列表の配列番号１０９のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む軽鎖ポリペプチドを有することを特徴とする、（１）乃至（５）、（７）乃至（１５）、（１７）または（１９）乃至（２２）のいずれか一つに記載の分子または抗体、
（２４）　配列表の配列番号８９のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列または配列表の配列番号１１７のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む重鎖ポリペプチドを有することを特徴とする、（１）乃至（５）、（７）乃至（１５）、（１７）または（１９）乃至（２３）のいずれか一つに記載の分子または抗体、
（２５）　配列表の配列番号５０のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、および、配列表の配列番号８９のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドから構成されることを特徴とする、（２３）または（２４）記載の分子または抗体、
（２６）　配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、および、配列表の配列番号１１７のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドから構成されることを特徴とする、（２３）または（２４）記載の分子または抗体、
（２７）　（１）乃至（５）、（７）乃至（１５）、（１７）または（１９）乃至（２６のいずれか１つに記載の分子または抗体中のポリペプチド鎖のいずれか一つをコードするＤＮＡ、
（２８）　（６）または（１６）記載の抗体の軽鎖ポリペプチドまたは重鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（２９）　配列表の配列番号１１のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３０）　配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４４５に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３１）　配列表の配列番号５０のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号５２のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号５４のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列または配列表の配列番号１０９のアミノ酸番号１から２１８に示されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むことからなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３２）　配列表の配列番号８９のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列または配列表の配列番号１１７のアミノ酸番号１から４５１に示されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むことからなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３３）　配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６１から３９３に示されるヌクレオチド配列を含むことからなる、（２９）記載のＤＮＡ、
（３４）　配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６１から７１４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなる、（２９）記載のＤＮＡ、
（３５）　配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５８から４２０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなる、（３０）記載のＤＮＡ、
（３６）　配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５８から１３９２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなる、（３０）記載のＤＮＡ、
（３７）　配列表の配列番号４９のヌクレオチド番号１００から７５３に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号５１のヌクレオチド番号１００から７５３に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号５３のヌクレオチド番号１００から７５３に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号１０６のヌクレオチド番号１００から７５３に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号１０８のヌクレオチド番号１００から７５３に示されるヌクレオチド配列を含むことからなる、（３１）記載のＤＮＡ、
（３８）　配列表の配列番号８８のヌクレオチド番号８４から２０４２に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号１１６のヌクレオチド番号７８から２０３６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなる、（３２）記載のＤＮＡ、
（３９）　（２７）乃至（３８）のいずれか一つに記載のＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクター、
（４０）　（２９）、（３１）、（３３）、（３４）または（３７）のいずれか一つに記載のＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクター、
（４１）　（３０）、（３２）、（３５）、（３６）または（３８）のいずれか一つに記載のＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクター、
（４２）　（３９）記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、
（４３）　（４０）および／または（４１）記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、
（４４）　（４０）および（４１）記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、
（４５）　哺乳動物由来であることを特徴とする、（４１）乃至（４３）のいずれか一つに記載の宿主細胞、
（４６）　形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−Ｌ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６７）、
（４７）　形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−Ｈ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６８）、
（４８）　形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＭＭ６　ＳＡＮＫ　７３６９７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７１）、
（４９）　形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＭ１７　ＳＡＮＫ　７３５９７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７２）、
（５０）　形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＨ７　ＳＡＮＫ　７３４９７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７３）、
（５１）　形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＭ２　ＳＡＮＫ　７０１９８（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７２）、
（５２）　形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＨ５　ＳＡＮＫ　７０３９８（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７４）、
（５３）　形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＳＬ７Ａ６２　ＳＡＮＫ７３３９７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７４）、
（５４）　形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＰＤＨＶ３　ＳＡＮＫ７０２９８（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７３）、
（５５）　（４４）または（４５）記載の宿主細胞を培養し、次いで該培養物から抗Ｆａｓ抗体を回収することを特徴とする、抗Ｆａｓ抗体の製造方法、
（５６）　マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）、
（５７）　マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）をイムノグロブリン産生が可能な条件下で培養し、次いで該培養物からイムノグロブリンを回収することを特徴とする、（６）記載の抗体の製造方法、
（５８）　（１）乃至（５）、（７）乃至（１５）、（１７）または（１９）乃至（２６のいずれか１つに記載の分子、あるいは、（６）または（１６）記載の抗体を有効成分として含有する、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患の予防または治療剤、
（５９）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン氏病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン氏病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、突発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病）、アレルギー、アトピー、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、肝炎（劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎（Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎）またはアルコール性肝炎）、後天性免疫不全症候群および臓器移植後の拒絶反応からなる群から選択されることを特徴とする、（５８）記載の予防または治療剤、
（６０）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン氏病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン氏病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、突発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病）であることを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防または治療剤、
（６１）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患がアレルギーであることを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防または治療剤、
（６２）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が慢性関節リウマチであることを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防または治療剤、
（６３）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が動脈硬化症であることを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防または治療剤、
（６４）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が心筋炎または心筋症であることを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防または治療剤、
（６５）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が糸球体腎炎であることを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防または治療剤、
（６６）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が再生不良性貧血であることを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防または治療剤、
（６７）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が肝炎（劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎（Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎）またはアルコール性肝炎）であることを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防または治療剤、
（６８）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が後天性免疫不全症候群であることを特徴とする、（５８）または（５９）記載の予防または治療剤、
（６９）　Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患が臓器移植後の拒絶反応であることを特徴とする、（５８または５９）記載の予防または治療剤、を提供するものである。
【００４０】
ヒトとマウスの間でアミノ酸配列が保存されている部分をエピトープとし、ヒトおよびマウスのＦａｓのいずれにも結合するマウスモノクローナル抗体を取得しようとして、ＢＡＬＢ／ｃマウス等の通常のマウスをヒトＦａｓで免疫した場合、マウスＦａｓとも結合するような抗体を産生する細胞は、自己抗原反応性の抗体産生細胞として胸腺において消去される。この胸腺での自己反応性Ｔ細胞の除去にＦａｓ−Ｆａｓリガンド系が関与しているものと推察されること［米原伸（１９９４）　日経サイエンス別冊１１０　、６６−７７　参照］から、Ｆａｓをコードする遺伝子を発現不能にしたマウス（以下「Ｆａｓノックアウトマウス」という）等のＦａｓ−Ｆａｓリガンド系に欠損のあるマウスを免疫動物として用いれば、マウスＦａｓにも結合する抗体も取得することが可能になる。しかしながら、本発明において用いられる免疫動物はＦａｓノックアウトマウスに限定されず、例えばラット、ウサギ等、他の実験動物であっても、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド系に欠損のあるものは本発明の免疫動物として用いられ得る。
【００４１】
本発明者らは、ＦａｓノックアウトマウスをヒトＦａｓで免疫し、該マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合することにより、ヒトおよびマウスのＦａｓと結合する新規抗Ｆａｓモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作出し、その培養上清より該モノクローナル抗体を精製した。この新規抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、Ｆａｓを発現するマウスおよび非ヒト霊長類動物のＴ細胞にアポトーシスを誘導した。すなわち、本発明により、少なくともヒトを含む霊長類のＦａｓと齧歯類Ｆａｓとの間には、本発明の抗体によって共通に認識され得、かつ本発明の抗体が結合することによりアポトーシス誘導が可能なエピトープが存在することが明らかにされた。
【００４２】
また、この新規抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、自己免疫疾患モデルマウスの症状を軽減する効果を有していた。さらに驚くべきことに、この新規抗Ｆａｓモノクローナル抗体には、従来のアポトーシス誘導活性を有する抗Ｆａｓ抗体において知られていた、肝障害を誘発する副作用がないことが判明した。また、本発明者らは、上記ハイブリドーマより、新規抗Ｆａｓモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子をそれぞれクローニングし、そのヌクレオチド配列を解明して、それらの遺伝子にコードされている該重鎖および軽鎖のアミノ酸配列におけるＣＤＲのアミノ酸配列を決定した。本発明者らはまた、該重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を含むことからなる発現ベクターをそれぞれ作製し、これらのベクターで培養動物細胞をコ・　トランスフェクションして得られた培養上清中に、Ｆａｓと反応する組換え抗Ｆａｓ抗体を産生させた。そのようにして得られた抗Ｆａｓ抗体およびその組換え体は、Ｆａｓを介するアポトーシスにより引き起こされる劇症肝炎から肝臓を保護する活性を有しており、しかも慢性関節リウマチの予防および治療にそれぞれ有効であることから、該抗体が異常細胞にはＦａｓを介してアポトーシスを誘導する活性とＦａｓを介する正常細胞のアポトーシスを阻止する活性を併せ持ち、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患に対する予防または治療に有効であることが判明した。本発明者らは、このマウス由来抗Ｆａｓモノクローナル抗体のＣＤＲアミノ酸配列をヒト抗体に移植することにより、抗Ｆａｓ抗体としての活性を保持しながらヒトに対する免疫原性を有さない組換え抗体を作製することに成功し、本発明を完成させた。
【００４３】
異種動物由来の同種タンパク質を共通に認識するモノクローナル抗体がタンパク質抗原に結合する際の、抗原側の結合部位（エピトープ）周辺においては、異種動物間においてアミノ酸配列が保存されている、すなわちアミノ酸配列相同性が高く保たれている場合が多いと考えられるが、本発明の抗体が結合するＦａｓ分子中のエピトープは、そのような一次構造上の相同性が保たれている領域のみに限定されない。すなわち、本発明における「霊長類および非霊長類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープ」は、高次構造上の相同性が異種動物間で保たれ、その結果単一のモノクローナル抗体に共通に認識され得るような領域をも包含する。
【００４４】
本発明において「抗原結合領域」とは、抗体分子中の抗原に対する結合領域と同一の機能を有する分子内領域をいう。この抗原結合領域は、特定の抗体または抗体の組み合わせに由来するものに限定されない。さらに、該抗原結合領域と、特定の抗体分子中の抗原に対する結合領域とは、該抗原に結合可能である点においてのみ類似していればよく、その他の点で類似していることは本発明の抗原結合領域の必須要件ではない。したがって、例えば抗原結合領域が既知の抗体のＣＤＲを基に設計され、ヒト抗体に移植された場合でも、その結果作製される抗原結合領域は該既知の抗体の抗原結合領域と必ずしも類似していなくてもよいが、抗原に対する特異的結合能力を維持するという観点からは、両者の間の類似性が高いことが好ましい。
【００４５】
本発明における「抗原結合領域を有することを特徴とする分子」は、好ましくは抗体であるが、これに限定されず、その抗原結合領域がＦａｓ分子中のエピトープに結合するものであればよい。したがって例えば、該抗原結合領域はアフィニティ精製用カラムの支持体に付加されてもよい。しかしながら、以後は特に言及しない限り「本発明の分子」は通常は抗体を指すものとする。
【００４６】
また、本発明の分子が抗体である場合、該抗体としてはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、同Ａ（ＩｇＡ）、同Ｅ（ＩｇＥ）および同Ｍ（ＩｇＭ）のいずれの型も好適に用いられうるが、通常はＩｇＧがより好適である。
【００４７】
本発明においては、上述したような、非ヒト動物由来の抗体から少なくとも全てのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体に移植することにより、抗体としての機能を保持したままでヒトに対する免疫原性を低減させた人工改変抗体を、「ヒト化抗体」という。
【００４８】
本発明において「ＦＲ」とは、フレームワーク領域を指すものである。例えば、ＦＲＨ１は、重鎖サブユニット可変領域中の最もＮ末端に存在するフレームワーク領域を指し、ＦＲＬ４は、軽鎖サブユニット可変領域中のＮ末端から４番目のフレームワーク領域を指す。同様に、例えばＣＤＲＨ１は、重鎖サブユニット可変領域中の最もＮ末端に存在するＣＤＲを指し、ＣＤＲＬ３は、軽鎖サブユニット可変領域中のＮ末端から３番目のＣＤＲを指す。
【００４９】
【発明の実施の形態】
本発明の抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、例えばＦａｓノックアウトマウスをヒトＦａｓで免疫し、該マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。
【００５０】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下記のような作業工程が必要である。すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、およびその認識特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
【００５１】
以下、抗Ｆａｓモノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使用することもできる。
【００５２】
（ａ）抗原の精製
抗原としては、ヒトＦａｓの細胞外領域とマウスインターロイキン３受容体（以下「ＩＬ３Ｒ」という）の細胞外領域［Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５４，　４３９５−４４０３参照］との融合タンパク質の発現ベクターｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２をサル由来細胞株ＣＯＳ−１に導入し発現させ、部分精製することによって得られる組換えタンパク質（以下「組換えヒトＦａｓ」という）が有効である。ｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２は、ヒトＦａｓとマウスＩＬ３Ｒの融合タンパク質をコードするＤＮＡを、動物細胞用発現ベクターｐＭＥ１８Ｓに組み込むことにより作製できる。ただし、ＦａｓをコードするＤＮＡ、ベクター、宿主等はこれらに限定されない。
【００５３】
具体的には、ｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２でＣＯＳ−１細胞を形質転換して得られた形質転換株を培養し、その培養上清中に産生されるヒトＦａｓとマウスＩＬ３Ｒの融合タンパク質を、リソースＱカラム（商標名；ファルマシア社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーを実施することにより、組換えＦａｓを部分精製することができる。
【００５４】
また、ヒト細胞株の細胞膜上に存在するＦａｓそのものを精製したものも抗原として使用することができる。さらに、Ｆａｓの一次構造は公知である［　Ｉｔｏｈ，Ｎ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　Ｃｅｌｌ　６６，　２３３−２４３　参照］ので、当業者に周知の方法により、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドを化学合成し、これを抗原として使用することもできる。
【００５５】
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全または不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、Ｆａｓノックアウトマウスが最も好適に用いられるが、そのようなマウスは千住らの文献［Ｓｅｎｊｕ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ　（１９９６）　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８，　４２３　参照］に記載する方法により作出することができる。
【００５６】
マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射いずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。
【００５７】
免疫は、一回、または、適当な間隔で（好ましくは１週間から５週間間隔で）複数回繰返し行なうことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用いることが好ましい。
【００５８】
ここで用いられる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（以下「ＲＩＡ法」という）、固相酵素免疫定量法（以下「ＥＬＩＳＡ法」という）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、および操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法がより好適である。
【００５９】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製または部分精製したＦａｓをＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗Ｆａｓ抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【００６０】
（ｃ）ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ，　Ｄ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　８１，　１−７（１９７８）］、Ｐ３／ＮＳＩ　／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）　［Ｋｏｈｌｅｒ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　６，　５１１−５１９　（１９７６）　］、Ｓｐ２　／Ｏ−Ａｇ１４　（ＳＰ−２）　［Ｓｈｕｌｍａｎ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２７６，　２６９−２７０　（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３　（６５３）　［Ｋｅａｒｎｅｙ，　Ｊ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　１２３，　１５４８−１５５０　（１９７９）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）　［Ｈｏｒｉｂａｔａ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｈａｒｒｉｓ，　Ａ．　Ｗ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６，　４９５−４９７　（１９７５）］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、およびウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］　、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地［例えば、１０％　ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００６１】
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
【００６２】
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞と工程（ｃ）で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順よりなる。
【００６３】
脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばＲＰＭＩ１６４０）、またはリン酸緩衝生理食塩液（以下「ＰＢＳ」という）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（以下「ＨＡＴ」という）液およびマウスインターロイキン−２（以下「ＩＬ−２」という）を含む正常培地（以下「ＨＡＴ培地」という）中に懸濁して培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、５％　炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
【００６４】
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。
【００６５】
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。以後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法により抗Ｆａｓ抗体価を測定する。ただし、ＥＬＩＳＡ用の抗原として上記融合タンパク質を用いる場合は、マウスＩＬ３受容体の細胞外領域に特異的に結合する抗体を産生するクローンを選択しないように、該クローンを除外する操作が必要である。そのようなクローンの有無は、例えばマウスＩＬ３受容体またはその細胞外領域を抗原としたＥＬＩＳＡ等により確認することができる。
【００６６】
以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドーマの選択方法に応じて使用することができ、その場合使用する培地組成も変化する。
（ｆ）クローニング
工程（ｂ）の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便でありよく用いられる。
【００６７】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗Ｆａｓモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。さらに、マウスＦａｓに結合する抗体を産生するハイブリドーマを同様の方法で選択することにより、抗Ｆａｓモノクローナル抗体産生細胞を得る。このとき使用されるマウスＦａｓとしては、例えばマウスＦａｓの細胞外領域とマウスＩＬ３受容体の細胞外領域との融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現プラスミドベクター　ｐＭＥ１８Ｓ−ｍＦａｓ−ＡＩＣ［Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５４，　４３９５−４４０３参照］を培養動物細胞に導入して発現させた融合タンパク質や、精製マウスＦａｓ、またはマウスＦａｓを細胞表面に発現している細胞を使用できる。
【００６８】
なお、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体を作製するにあたっての基礎となる抗体として好適な抗Ｆａｓモノクローナル抗体の産生細胞であるマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａは独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業研究所）に平成９年２月１９日付けで国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８が付されている。したがって、例えばマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａを用いて抗体を調製する場合は、工程（ｆ）までを省略して、以下に記載する工程（ｇ）から抗体の調製を行うことができる。
【００６９】
（ｇ）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の予防または治療剤が有効成分として含有する抗Ｆａｓモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内で該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明の予防または治療剤が有効成分として含有する抗Ｆａｓモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
【００７０】
精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ　ＧＩＩキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。
【００７１】
かくして得られるモノクローナル抗体は、ヒトおよびマウスのＦａｓに対して高い抗原特異性を有する。
【００７２】
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
【００７３】
さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、および２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
【００７４】
モノクローナル抗体の認識エピトープの同定は以下のようにして行なうことができる。まず、モノクローナル抗体の認識する分子の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いてその分子の様々な部分ペプチドを作成する方法、遺伝子組換え技術を用いて目的の部分ペプチドをコードするＤＮＡ配列を好適な発現プラスミドに組み込み、大腸菌等の宿主内外で生産する方法等があるが、上記目的のためには両者を組み合わせて用いるのが一般的である。例えば、抗原タンパク質のＣ末端あるいはＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製した後、それらに対するモノクローナル抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定する。
【００７５】
その後、さらに細かく、その対応部分のオリゴペプチド、または該ペプチドの変異体等を、当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、本発明の予防または治療剤が有効成分として含有するモノクローナル抗体のそれらペプチドに対する結合性を調べるか、または該モノクローナル抗体と抗原との結合に対するペプチドの競合阻害活性を調べることによりエピトープを限定する。多種のオリゴペプチドを得るための簡便な方法として、市販のキット（例えば、ＳＰＯＴｓキット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社製）、マルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合成キット（カイロン社製）等）を利用することもできる。
【００７６】
次に、本発明の抗Ｆａｓモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡは、上記抗Ｆａｓモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを調製し、該ｍＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡに変換してから、該抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ単離することにより得られる。
【００７７】
ｍＲＮＡの抽出にあたっては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法なども採用しうるが、グアニジン・チオシアネート・塩化セシウム法が好適である。細胞からのｍＲＮＡの調製は、まず全ＲＮＡを調製し、該全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースやオリゴ（ｄＴ）ラテックスビーズ等のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ精製用担体を用いて精製する方法、または細胞ライセートから該担体を用いて直接精製する方法により実施できる。全ＲＮＡの調製方法としては、アルカリショ糖密度勾配遠心分離法［Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，　Ｗ．　Ｇ．　ａｎｄ　Ｈｉｅｂｅｒｔ，　Ｅ．　（１９８０）　Ｖｉｏｌｏｇｙ　１０１，　４６６−４７４参照］、グアニジンチオシアネート・フェノール法、グアニジンチオシアネート・トリフルオロセシウム法、フェノール・ＳＤＳ法等も採用し得るが、グアニジンチオシアネートおよび塩化セシウムを用いる方法［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，　Ｊ．　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８，　５２９４−　５２９９参照］が好適である。
【００７８】
上記のごとくして得られたポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応により一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成することができる。この方法としてはＳ１ヌクレアーゼ法［Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９７６）　Ｃｅｌ１　７，　２７９−２８８　参照］、グブラー−ホフマン法［Ｇｕｂｌｅｒ，　Ｕ．　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ，　Ｂ．　Ｊ．　（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２５，　２６３−２６９　参照］、オカヤマ−バーグ法［Ｏｋａｙａｍａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｐ．　（１９８２）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２，　１６１−１７０　参照］等を採用し得るが、本発明においては、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）［Ｓａｉｋｉ，　Ｒ．　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９，
４８７−４９　参照］を行なう、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法が好適である。
【００７９】
このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡをクローニングベクターに組み込み、得られた組換えベクターを大腸菌等の微生物に導入して形質転換させ、テトラサイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することができる。大腸菌の形質転換は、ハナハン法［Ｈａｎａｈａｎ，　Ｄ．　（１９８３）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６６，　５５７−５８０　参照］、すなわち塩化カルシウムや塩化マグネシウムまたは塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、該組換えＤＮＡベクターを加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしてブラスミドを用いる場合は、上記の薬剤耐性遺伝子を有することが必要である。また、プラスミド以外のクローニングベクター、例えばラムダ系のファージ等を用いることも可能である。
【００８０】
上記により得られた形質転換株から、目的の抗ヒトＦａｓ抗体の各サブユニットをコードするｃＤＮＡを有する株を選択する方法としては、例えば以下に示す各種方法を採用できる。なお、上記ＲＴ−ＰＣＲ法により目的のｃＤＮＡを特異的に増幅した場合は、これらの操作を省略することが可能である。
【００８１】
（１）ポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法
目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合、該アミノ酸配列の一部に対応するセンスストランドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これらを組合せてポリメラーゼ連鎖反応［Ｓａｉｋｉ，　Ｒ．　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９，　４８７−４９　参照］を行ない、目的の抗ヒトＦａｓ抗体重鎖あるいは軽鎖サブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、例えば抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａを産生するハイブリドーマ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）のｍＲＮＡより逆転写酵素反応にて合成したｃＤＮＡを用いることができる。
【００８２】
このようにして調製したＤＮＡ断片は、市販のキット等を利用して直接プラスミドベクターに組み込むこともできるし、該断片を３２Ｐ、３５Ｓあるいはビオチン等で標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより目的のクローンを選択することもできる。
【００８３】
例えば、本発明の抗Ｆａｓモノクローナル抗体として好適なモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａは、イムノグロブリンＧ１（以下「ＩｇＧ１」という）分子であり、重鎖（γ１鎖）、軽鎖（κ鎖）の各サブユニットからなる複合体である。これらの各サブユニットの部分アミノ酸配列を調べる方法としては、電気泳動やカラムクロマトグラフィーなどの周知の方法を用いて各サブユニットを単離してから、自動プロテインシークエンサー（例えば、島津製作所（株）製　ＰＰＳＱ−１０）等を利用してそれぞれのサブユニットのＮ末端アミノ酸配列を解析する方法が好適である。
【００８４】
上記のごとくして得られた目的の形質転換株より、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体タンパク質の各サブユニットをコードするｃＤＮＡを採取する方法は、公知の方法［Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ．　参照］に従い実施できる。例えば細胞よりベクターＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡより目的とするサブユニットをコードするＤＮＡ領域を切り出すことにより行うことが可能である。
【００８５】
（２）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法
目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、目的タンパク質のどの領域のものでもよい）、該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合、コドン使用頻度を参考に推測されるヌクレオチド配列、または考えられるヌクレオチド配列を組み合わせた複数個のヌクレオチド配列のいずれも採用でき、また後者の場合イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる）、これをプローブ（３２Ｐ、３５Ｓあるいはビオチン等で標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を選別する。
【００８６】
このようにして得られるＤＮＡの配列の決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法［Ｍａｘａｍ，　Ａ．　Ｍ．　ａｎｄ　Ｇｉｌｂｅｒｔ，　Ｗ．　（１９８０）　ｉｎ　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”　６５，　４９９−５７６参照］やジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Ｍｅｓｓｉｎｇ，　Ｊ．　ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ，　Ｊ．　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９，　２６９−２７６参照］等により実施することができる。
【００８７】
また近年、蛍光色素を用いた自動塩基配列決定システムが普及している（例えばパーキンエルマージャパン社製シークエンスロボット”ＣＡＴＡＬＹＳＴ　８００”およびモデル３７３ＡＤＮＡシークエンサ一等）。
【００８８】
こうしたシステムを利用することで、ＤＮＡヌクレオチド配列決定操作を能率よく、かつ安全に行うことも可能である。このようにして決定された本発明のＤＮＡの各ヌクレオチド配列、および重鎖および軽鎖の各Ｎ末端アミノ酸配列データから、本発明のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の全アミノ酸配列を決定することができる。
【００８９】
イムノグロブリンの重鎖および軽鎖は、いずれも可変領域および定常領域からなり、可変領域はさらに相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」と記す；重鎖・軽鎖ともに各３か所）およびそれらに隣接するフレームワーク領域（重鎖・軽鎖ともに各４か所）からなる。
【００９０】
このうち、定常領域のアミノ酸配列は、抗原の種類に関係なく、イムノグロブリンサブクラスが同一である抗体間では共通である。一方、可変領域、特にＣＤＲのアミノ酸配列は各抗体に固有のものであるが、数多くの抗体のアミノ酸配列データを比較した研究によれば、ＣＤＲの位置やフレームワーク配列の長さは、同じサブグループに属する抗体サブユニットの間ではほぼ類似していることが知られている［Ｋａｂａｔ，　Ｅ．　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　ｉｎ　”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　Ｖｏｌ．ＩＩ”：　Ｕ．Ｓ．　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ参照］。従って、例えば抗Ｆａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａ等の抗体の重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列とそれら公知のアミノ酸配列データとを比較することにより、各アミノ酸配列におけるＣＤＲやフレームワーク領域および定常領域の位置を決定することができる。なお、ＦＲＨ１、すなわち重鎖の最もＮ末端側のフレームワーク領域の鎖長については、通常（３０アミノ酸）より短いことがあり、例えば、マウスＩｇＧ１のＨＦＥ７Ａと同じサブタイプとしては該フレームワーク領域が最小１８アミノ酸である例などが知られている［前出　Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ．　参照］。このことから本発明の抗体においては、抗Ｆａｓ抗体としての機能を損なわない限りにおいて、重鎖のＮ末端のフレームワーク領域の鎖長を１８アミノ酸以上３０アミノ酸以下とするが、好適には３０アミノ酸である。なお、本発明におけるイムノグロブリン重鎖のアミノ酸番号は、特に言及しない限りＦＲＨ１が３０アミノ酸である場合のものとする。
【００９１】
なお、上記のようにして決定された軽鎖または重鎖のそれぞれのＣＤＲと同じアミノ酸配列、もしくはその中の連続した部分アミノ酸配列を有するペプチドを、人為的な修飾操作を施して該ＣＤＲが抗Ｆａｓ抗体分子中で形成する立体構造に近付けることにより、単独でＦａｓに対する結合活性を付与せしめることが可能である［例えば、米国特許第５３３１５７３号公報参照］。したがって、そのように修飾された、ＣＤＲと同じアミノ酸配列、もしくはその中の連続した部分アミノ酸配列を有するペプチドも、本発明の分子に包含され、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患に対する予防または治療のために用いることができる。
【００９２】
アミノ酸配列中の任意の一つもしくは二つ以上のアミノ酸を欠失させた改変体を作製するにあたっては、カセット変異法［岸本利光、”新生化学実験講座２・核酸ＩＩＩ　　組換えＤＮＡ技術”　２４２−２５１参照］などに従うことができる。
【００９３】
この様な各種のＤＮＡは、例えばフォスファイト・トリエステル法［Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１０，　１０５−１１１参照］等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体が公知であり、その選択も任意でよく、例えば使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定することも可能である。これらヌクレオチド配列コドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的変異導入法（サイトスペシフィック・ミュータジェネシス）［Ｍａｒｋ，　Ｄ．Ｆ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８１，　５６６２−５６６６参照］等に従うことができる。
【００９４】
また、あるＤＮＡが本発明の抗Ｆａｓモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡとハイブリダイズするか否かは、例えば、該ＤＮＡを、ランダムプライマー法［Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，　Ａ．Ｐ．　ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，　Ｂ．　（１９８３）　Ａｎａｌ．　ｂｉｏｃｈｅｍ．　１３２，　６−１３　参照］やニックトランスレーション法［Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ．　参照］等に従い［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ等で標識したプローブＤＮＡを用いて、以下に記載するような実験を行うことにより調べることができる。
【００９５】
まず調べようとするＤＮＡを、例えばニトロセルロース膜やナイロン膜等に吸着させ、必要に応じてアルカリ変性等の処理を行なってから、加熱あるいは紫外線等により固相化させる。この膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ　クエン酸三ナトリウム溶液）と５％　デンハート溶液、０．１％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むプレハイブリダイゼーション溶液に浸し、５５℃で４時間以上保温してから、先に調製したプローブを同様のプレハイブリダイゼーション溶液に最終比活性１×１０６ｃｐｍ／ｍｌとなるように加え、６０℃で一晩保温する。その後、膜を室温下で６×ＳＳＣで５分間の洗浄する操作を数回繰り返し、さらに２×ＳＳＣで２０分間洗浄してから、オートラジオグラフィーを行う。
【００９６】
上記のような方法を利用して、任意のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーから、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体の基礎となる抗Ｆａｓモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを単離することができる［Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ．　参照］。
【００９７】
上記のごとくして得られる各ＤＮＡを、それぞれ発現ベクターに組み込むことにより、原核生物または真核生物の宿主細胞に導入し、それらの宿主細胞で各遺伝子を発現させることが可能である。
【００９８】
原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコン、すなわち複製起点およびｌａｃ　ＵＶ５　等のプロモーター配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換すればよい。またべクターは、形質転換した細胞での表現形質による選択性を付与することができる配列を有するものが望ましい。例えば大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２株由来のＪＭ１０９株等がよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドがよく用いられるが、これらに限定されず、公知の各種の菌株およびベクターをいずれも使用できる。またプロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ　）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ　）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ　）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ　）プロモーター、バクテリオファージ由来のラムダ（λ）ＰＬプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８［Ｏｈｍｕｒａ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９５，　８７−９３　参照］等が用いられるが、これに限定されない。またプロモーターとしては、枯草菌αアミラーゼ遺伝子の調節配列がよく用いられ、さらに必要に応じてαアミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外への分泌も可能となる。
【０１００】
真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサル由来の細胞株であるＣＯＳ−１［Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２　参照］等が用いられる。酵母としては、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やアルコール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等が用いられる。ここに例示したような細胞が一般に宿主細胞としてよく用いられているが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
脊椎動物細胞の発現べクターとしては、通常は発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これにはさらに必要により複製起点を有してもよい。該発現べクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ［Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏ．　１，　８５４−８６４　参照］等を例示できるが、これに限定されない。
【０１０２】
酵母の発現べクターとしては、例えばアルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター［Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，　Ｊ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈａｌｌ，　Ｂ．　Ｄ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５７，　３０１８−３０２５　参照］や、ガラクトース代謝系酵素遺伝子（ｇａｌ　１０など）のプロモーター［Ｉｃｈｉｋａｗａ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　５７，　１６８６−１６９０　参照］等を利用でき、必要により酵母遺伝子のシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、細胞外への分泌も可能となるが、これに限定されるものではない。
【０１０３】
宿主細胞としてＣＯＳ−１を用いる場合を例に挙げると、発現べクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ−１において自立増殖が可能であり、さらに転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を備えた発現ベクターを用いることができる。該発現ベクターは、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１１，　１２９５−１３０８　参照］、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法［Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７　参照］および電気穿孔法［Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５　参照］などによりＣＯＳ−１に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【０１０４】
特に、重鎖をコードするＤＮＡを含むことからなる発現べクターおよび同軽鎖をコードするＤＮＡを含むことからなる発現べクターでＣＯＳ−１をコ・トランスフェクションすることにより、これらのＤＮＡを同時に発現させ、組換え抗Ｆａｓ抗体を産生する形質転換体を得ることができる。しかしながら、組換え抗Ｆａｓ抗体を生産する方法は上記に限定されず、例えば、重鎖および軽鎖のそれぞれをコードするＤＮＡを両方とも保持し、これらを同時に発現させることができる単一の発現ベクターを構築し、該ベクターでＣＯＳ−１細胞を形質転換する方法等も用いることができる。
【０１０５】
上記で得られる所望の形質転換体は、当業者に周知の方法に従って培養することができ、該培養により、形質転換体細胞内または細胞外に組換え抗Ｆａｓ抗体が産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ−１の場合、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）などの血清成分を添加したものを使用できる。
【０１０６】
該形質転換体の培養の際の培養温度は、細胞内のタンパク質合成能を著しく低下せしめない温度であればいずれでもよいが、好適には３２〜４２℃、最も好適には３７℃で培養する。また必要に応じて、１〜１０％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスを含む空気中で培養することができる。
【０１０７】
なお、本発明の抗Ｆａｓモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを動物細胞で発現させる組換えＤＮＡベクターで形質転換された大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−ＨおよびＥ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−Ｌは、それぞれ平成９（１９９７）年３月１２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５８６８およびＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６７が付されている。従って、該寄託菌株から単離された組換えＤＮＡベクターでＣＯＳ−１等の培養動物細胞を形質転換し、この形質転換細胞を培養することにより、培養物中に組換え抗Ｆａｓ抗体を産生させることができる。
【０１０８】
上記により形質転換体の細胞内または細胞外に生産される、抗Ｆａｓ抗体タンパク質を含む画分は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種公知のタンパク質分離操作法により、分離・精製することができる。かかる方法としては、具体的には例えば通常のタンパク質沈澱剤による処理、限外ろ過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種クロマトグラフィー、透析法、およびこれらの組み合わせ等を採用できる。
【０１０９】
抗Ｆａｓマウスモノクローナル抗体をヒト化するためには、決定されたＣＤＲ配列全体およびＦＲ配列の一部のアミノ酸残基をヒト抗体へ移植するように、可変領域のアミノ酸配列を設計する必要がある。この設計は、以下の方法に従う。
【０１１０】
従来、ヒト化のデザインを行う場合、アクセプターのサブグループの選択指針としては、
▲１▼天然のアミノ酸配列を有する公知のヒト抗体の重鎖、軽鎖の天然の組合せをそっくりそのまま用いる、
▲２▼重鎖、軽鎖が属するサブグループとしての組合せは保存するが、重鎖、軽鎖としては、それぞれ異なるヒト抗体に由来し、ドナーの重鎖、軽鎖のアミノ酸配列と同一性が高いアミノ酸配列、または、コンセンサス配列を用いる、
のいずれかが選択されている。本発明においても、上記の指針に従うことができるが、これらと異なる方法として、
▲３▼サブグループの組合せを考慮することなく、ドナーのＦＲと最も同一性の高い重鎖、軽鎖のＦＲをヒト抗体の一次配列のライブラリーの中から選択する、
という方法を採用することも可能である。これらの選択法により、ドナーおよびアクセプター間での、ＦＲ部分のアミノ酸の同一性を少なくとも７０％以上とすることが可能となる。この方法を採用することにより、ドナーより移植するアミノ酸残基の数をより少なくすることが可能となり、ＨＡＭＡ応答誘導を減少させることができる。
【０１１１】
また、抗体分子の一次配列より三次構造を予測する操作（以下、この操作を「分子モデリング」という）はその予測精度に限界があり、そのドナーが属するサブグループにおいて稀にしか出現しないアミノ酸残基の役割を十分に特定することができない。クィーンらの方法に従い、かかる位置においてドナー、アクセプターのいずれのアミノ酸残基を選択すべきかを判断することは一般に困難である。▲３▼の選択法によれば、このような判断をする機会を著しく減少することができる。
【０１１２】
本発明者らは、ドナーのＣＤＲの構造および機能を維持するために重要なドナーのＦＲ由来のアミノ酸を同定するための新規な方法を提供することによって、このヒト化の方法をさらに改良している。
【０１１３】
軽鎖、重鎖それぞれのヒトアクセプター分子が選択された後、ドナーのＦＲより移植するアミノ酸残基を選択する方法は、以下に記載する通りである。
【０１１４】
ドナーとアクセプターのアミノ酸配列を並べ、両者のＦＲの対応する位置でアミノ酸残基が異なっていた場合、どちらの残基を選択するべきかを決定する必要があるが、この選択においては、ドナー由来のＣＤＲの三次元構造を損なわないよう選択を行う必要がある。
【０１１５】
クィーンらは前述の特表平４−５０２４０８号において、ＦＲ上のアミノ酸残基が、以下の要件の少なくともひとつに該当する場合、ＣＤＲ配列とともにアクセプターに移植する方法を提唱した：
１）アクセプターのヒトＦＲ領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通である；
２）該アミノ酸がＣＤＲのひとつのすぐ近くである；
３）該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原とまたはヒト化抗体のＣＤＲと相互作用することができると予想される。
【０１１６】
ここで２）で示された残基はしばしば３）の性質を示すことより、本発明ではこの２）の要件を削除し、別に新たに２種の要件を設ける。すなわち、本発明では、ＣＤＲと共に移植すべきドナーのＦＲ上のアミノ酸残基については：
ａ）アクセプターのＦＲ中のアミノ酸がその位置において稀でありドナーの対応するアミノ酸が当該位置において普通であるか；
ｂ）該アミノ酸が三次元構造モデルにおいて、ＣＤＲの構成アミノ酸原子と抗原または移植すべきＣＤＲループとの相互作用が予想されるか；
ｃ）当該位置がカノニカルクラス決定残基であるか；
ｄ）当該位置が重鎖と軽鎖の接触面を構成するか、
である場合に、ドナーのＦＲから当該アミノ酸残基を移植することにする。
【０１１７】
ａ）の要件では、前述したカバトの表に従い、同一サブクラスの抗体について当該位置で９０％以上の頻度で見いだされるアミノ酸を「普通」、１０％未満の頻度で見いだされるアミノ酸を「稀」と定義する。
【０１１８】
ｃ）の要件では、「当該位置がカノニカルクラス決定残基であるか」否かについては、前述したチョッチアの表に従い、一義的に決定することができる。
【０１１９】
ｂ）、ｄ）の要件については、予め抗体可変領域の分子モデリングが必要となる。分子モデリング用ソフトウェアとしては、市販のものならいずれのものも採用し得るが、好適には、ＡｂＭ（オックスフォード・モレキュラー・リミティッド社製）を使用することができる。
【０１２０】
分子モデリングの予測精度には一定の限界があるので、本発明においては、種々の抗体の可変領域のＸ線結晶解析の実験結果を参照することにより、分子モデリングから得られる構造予測の確からしさを２段階に区別する。
【０１２１】
本発明においては、ＡｂＭ等の分子モデリング用ソフトウェアによって構築されたところの可変領域の３次元構造において、２原子間の距離が、各々のファンデルワールス半径の和に０．５Åを加えた値より短いとき、当該２原子間はファンデルワールス接触していると推定した。主鎖および側鎖のアミド窒素、カルボニル酸素など極性の原子間距離が平均の水素結合距離である２．９Åに０．５Å加えた距離より短い場合は、その間に水素結合が存在すると推定した。さらに、相反する電価を持つ原子間が、２．８５Åに０．５Å加えた距離より短い場合は、その間にイオン対が形成されているものと推定した。
【０１２２】
一方、種々の抗体の可変領域のＸ線結晶構造解析の実験結果から、サブグループと無関係に、高頻度にＣＤＲとの接触が見いだされるＦＲ上の位置として、軽鎖では、１、２、３、４、５、２３、３５、３６、４６、４８、４９、５８、６９、７１、８８番の位置、重鎖では、２、４、２７、２８、２９、３０、３６、３８、４６、４７、４８、４９、６６、６７、６９、７１、７３、７８、９２、９３、９４、１０３番の位置が特定される（数字はいずれも前出カバトらの文献において定義されるアミノ酸番号を表わす。以下において同じ）。分子モデリングと同じ基準を適用した場合、これらの位置のアミノ酸残基は、公知の抗体可変領域の３分の２においてＣＤＲのアミノ酸残基との接触が認められる。これらの知見に基き、ｂ）の「該アミノ酸が三次元構造モデルにおいて、ＣＤＲの構成アミノ酸原子が抗原または移植すべきＣＤＲループとの相互作用が予想される」とは、以下の要件を意味する。
【０１２３】
分子モデリングにおいて、ＦＲとＣＤＲとの接触の可能性が予見されたＦＲの位置が、Ｘ線結晶解析により実験的にＦＲとＣＤＲとの接触が高頻度に検出される位置のいずれかに一致する場合は、ドナーのアミノ酸残基の移植を優先する。それ以外の場合は、この要件ｂ）は考慮しない。
【０１２４】
ｄ）の「当該位置が重鎖と軽鎖の接触面を構成する」とは、以下の要件を意味する。種々の抗体の可変領域のＸ線結晶解析の実験結果から、軽鎖においては、３６、３８、４３、４４、４６、４９、８７、９８番目のアミノ酸残基、重鎖においては、３７、３９、４５、４７、９１、１０３、１０４番目のアミノ酸残基が、高頻度に重鎖−軽鎖間接触をすることが認められている。分子モデリングにおいて、重鎖−軽鎖間接触の可能性が予見され、その位置が上述の位置のいずれかに一致する場合は、ドナーのアミノ酸残基の移植を優先する。それ以外の場合は、この要件ｄ）は考慮しない。
【０１２５】
本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、以下に記載する方法で製造することができる。
【０１２６】
例えば、６０乃至７０ヌクレオチドの、該ＤＮＡの部分ヌクレオチド配列からなる複数のポリヌクレオチド断片を、センス側およびアンチセンス側において互い違いになるように化学合成し、その後各ポリヌクレオチド断片をアニーリングし、ＤＮＡリガーゼにより結合し、所望のヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを有するＤＮＡを得ることができる。
【０１２７】
別の方法として、アクセプターの可変領域の全アミノ酸配列をコードするＤＮＡをヒトリンパ球より分離し、ＣＤＲをコードする領域に当業者に周知の方法でヌクレオチド置換を行うことにより、制限酵素切断配列を導入する。対応する制限酵素で該領域を切断した後、ドナーのＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を合成し、ＤＮＡリガーゼにより結合して、所望のヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを得ることができる。
【０１２８】
さらに、本発明では、好適には以下に述べるオーバーラップ・エクステンション・ＰＣＲ法（ホルトンら、Ｇｅｎｅ，　７７，　６１−６８，　（１９８９）　参照）に従い、所望のヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを得ることができる。
【０１２９】
すなわち、接続を所望する２種のアミノ酸配列をそれぞれコードする２種のＤＮＡを、便宜的に（Ａ）および（Ｂ）とする。（Ａ）の５’側にアニールする２０乃至４０ヌクレオチドのセンスプライマ−（以下、このプライマーを（Ｃ）とする。）および（Ｂ）の３’側にアニールする２０乃至４０ヌクレオチドのアンチセンスプライマー（以下、このプライマーを（Ｄ）とする）を化学合成する。さらに、（Ａ）の３’側の２０乃至３０ヌクレオチドと（Ｂ）の５’側２０乃至３０ヌクレオチドを連結した、キメラ型のセンスプライマー（以下、このプライマーを（Ｅ）とする）およびこれに相補的なアンチセンスプライマー（以下、このプライマーを（Ｆ）とする）を合成する。（Ａ）を含む適当なベクターＤＮＡを基質にして、センスプライマ−（Ｃ）およびキメラ型アンチセンスプライマー（Ｆ）を用いたＰＣＲを行うことにより、（Ａ）の３’末端に（Ｂ）の５’末端側２０乃至３０ヌクレオチドが付加したＤＮＡを得ることができる（この新たに得られたＤＮＡを（Ｇ）とする）。同様に、（Ｂ）を含む適当なベクターＤＮＡを基質にして、アンチセンスプライマー（Ｄ）およびキメラ型センスプライマー（Ｅ）を用いたＰＣＲを行うことにより、（Ｂ）の５’末端に（Ａ）の３’末端側２０乃至３０ヌクレオチドが付加したＤＮＡを得ることができる（この新たに得られたＤＮＡを（Ｈ）とする。）。このようにして得られた（Ｇ）と（Ｈ）は、（Ｇ）の３’側４０乃至６０ヌクレオチドと（Ｈ）の５’側４０乃至６０ヌクレオチドにおいて相補的なヌクレオチド配列を保持している。増幅された（Ｇ）および（Ｈ）を混合してＰＣＲを行った場合、１回目の変性反応で（Ｇ）と（Ｈ）は１本鎖になり、その後のアニーリング反応で殆どのＤＮＡは元に戻るが、一部のＤＮＡについては相補的ヌクレオチド配列領域でアニーリングするヘテロＤＮＡ２本鎖を形成する。その後の伸長反応で、突出した１本鎖部分が修復され、（Ａ）と（Ｂ）が連結したキメラ型のＤＮＡ（以下、このＤＮＡを（Ｉ）とする。）を得ることができる。さらにこの（Ｉ）を基質として、センスプライマー（Ｃ）とアンチセンスプライマー（Ｄ）を用いＰＣＲを行うことにより、（Ｉ）を増幅することができる。本発明では、抗ヒトＦａｓマウスモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域をコードするＤＮＡおよびヒト免疫グロブリンＩｇＧのＦＲ領域をコードするＤＮＡ、さらには、ヒト免疫グロブリンＩｇＧの分泌シグナルをコードするＤＮＡを、それぞれケース・バイ・ケースにより（Ａ）および（Ｂ）として上記の連結反応を行うことができる。
【０１３０】
なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。これらヌクレオチド配列コドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したサイトスペシフィック・ミュータジェネシス（ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　）（Ｍａｒｋ，　Ｄ．　Ｆ．，　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８１，　５６６２−５６６６参照）等に従うことができる。したがって、各プライマーを化学合成する際に、予め点突然変異を導入するように各プライマーを設計することにより、所望の抗Ｆａｓ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを得ることができる。
【０１３１】
このようにして得られた本発明の各ＤＮＡをそれぞれ発現ベクターに組み込むことにより、原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらベクターに適当なプロモーターおよび形質発現に関わる配列を導入することにより、各々の宿主細胞において各遺伝子を発現させることが可能である。
【０１３２】
なお、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ３種の形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＭＭ６　ＳＡＮＫ　７３６９７株、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＭ１７　ＳＡＮＫ　７３５９７株およびＥ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＨ７　ＳＡＮＫ　７３４９７株、ならびに、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＳＬ７Ａ６２　ＳＡＮＫ７３３９７株は、平成９年（１９９７年）８月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７１、ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７２およびＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７３、ならびにＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７４が付されている。さらに、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ２種の形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＭ２　ＳＡＮＫ　７０１９８株およびＥ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＨ５　ＳＡＮＫ　７０３９８株、ならびに、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＰＤＨＶ３　ＳＡＮＫ　７０２９８株は、平成１０年（１９９８年）２月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７２およびＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７４、ならびにＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７３が付されている。従って、該寄託菌株からプラスミドを単離するか、もしくは該寄託菌株の抽出物を鋳型にしてＰＣＲを行うなどの方法によりヒト化抗Ｆａｓ抗体タンパク質の各サブユニットをコードするＤＮＡを取得することができる。
【０１３３】
上記方法により、容易に高収率、高純度で組換え抗Ｆａｓ抗体を製造できる。
【０１３４】
このようにして作製される組換え抗Ｆａｓ抗体がＦａｓと特異的に結合することを確認する方法としては、例えば、マウス免疫時に抗体価の評価を行う場合と同様のＥＬＩＳＡ法が好適である。
【０１３５】
本発明の分子（抗体に限定されない）は下記のａ）乃至ｆ）の機能的特性を有し、それぞれの特性は例えば各項目に記載の方法により確認することができる：
ａ）Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス誘導活性：　本発明の分子を投与したマウスから胸腺を摘出し、得られた胸腺細胞を、抗マウスＦａｓ抗体およびＴ細胞を特異的に認識する抗体と接触させ、両方の抗体が結合した細胞の割合をフローサイトメトリーで測定することにより、Ｆａｓを発現しているＴ細胞に対するアポトーシス誘導活性を調べる；
ｂ）ＭＲＬｇｌｄ　／ｇｌｄ　マウスの自己免疫疾患症状の軽減：　Ｆａｓリガンドをコードする遺伝子に突然変異が生じており、自己免疫疾患様の症状を示すＭＲＬｇｌｄ　／ｇｌｄ　マウス［米原伸　（１９９４）　日経サイエンス　別冊１１０　、６６−７７　参照］に本発明の分子を腹腔内投与することにより、該マウスの自己免疫疾患様症状である手足の腫れが軽減するか否かを調べる；
ｃ）肝臓障害を誘発しない：　本発明の分子を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスから末梢血を採取し、血中のグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（以下「ＧＯＴ」という）値およびグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（以下「ＧＰＴ」という）値を、自動分析装置（例えば７２５０型；日立製作所（株）社製）および同装置用試薬（例えばトランスアミナーゼ−ＨＲＩＩ；和光純薬（株）社製）を用いて測定する。本発明の分子は、生体に投与されても肝臓障害の指標である血中のＧＯＴ値およびＧＰＴ値を上昇させない；
ｄ）劇症肝炎に対する治療または予防効果：　抗マウスＦａｓモノクローナル抗体Ｊｏ２をマウスに投与して劇症肝炎を誘発する実験系において、Ｊｏ２投与と同時、もしくはＪｏ２投与後に本発明の分子を投与した場合の効果を調べる；
ｅ）コラーゲン誘導関節炎に対する発症予防効果：　コラーゲンおよび完全フロイントアジュバントからなるエマルジョンをマウスに投与することにより惹起される慢性関節リウマチモデルに対する、本発明の分子の投与の効果を調べる；
ｆ）慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対するアポトーシス誘導活性：　慢性関節リウマチ患者患部より採取された滑膜細胞を培養し、本発明の分子を培地に含有せしめた時の該細胞の生存率を調べる。
【０１３６】
本発明の分子は上記ａ）およびｆ）記載の活性、すなわち異常細胞に対してアポトーシスを誘導する活性と、上記ｃ）およびｄ）記載の活性、すなわち正常細胞にはアポトーシスを誘導せず、むしろアポトーシスを阻害する活性とを併せ持つ、新規な特性を有する物質であり、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の異常に起因する疾患に対する予防または治療剤に含有せしめる成分として有用である。
【０１３７】
また、本発明の分子がアポトーシス誘導活性を有することは、被検検体を添加した培地中で細胞（例えば、ヒトリンパ球細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ（Ｍｏｒｉｋａｗａ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９７８）　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　２１，　１６６−１７０参照）またはＪｕｒｋａｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｎｏ．　ＴＩＢ−１５２　）等）を培養し、その生存率をＭＴＴアッセイ（Ｇｒｅｅｎ，　Ｌ．　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　７０，　２５７−２６８参照）等の方法で測定することにより確認することができる。
【０１３８】
本発明の分子、特に、ヒトに対する免疫原性がヒト抗体とほぼ同等の抗Ｆａｓ抗体は、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の以上に起因する疾患（自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン氏病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン氏病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、突発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病）、アレルギー、アトピー、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、肝炎（劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎（Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎）またはアルコール性肝炎）、後天性免疫不全症候群または臓器移植後の拒絶反応）に対し、このものを有効成分とする予防または治療剤として使用することができる。かかる予防または治療剤は、種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、または、注射剤、点滴剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
【０１３９】
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日約０．１ｍｇ乃至１０００ｍｇであり、これらを１回、または数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回０．１ｍｇ乃至１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
【０１４０】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【０１４１】
実施例１　抗原の調製
細胞膜貫通領域を含まない可溶性ヒトＦａｓを得るため、ヒトＦａｓの細胞外領域とマウス・インターロイキン３（ＩＬ３）受容体［Ｇｏｒｍａｎ，　Ｄ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８７，　５４５９−５４６３　参照］の細胞外領域との融合タンパク質（以下「ヒトＦａｓ融合タンパク質」という）発現プラスミドベクターを作製した。ヒトＦａｓ融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法により作製した。
【０１４２】
ａ）　鋳型
ＰＣＲを行うにあたり、鋳型として用いたのは、マウスＦａｓの細胞外領域とマウスＩＬ３受容体の細胞外領域との融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現プラスミドベクター　ｐＭＥ１８Ｓ−ｍＦａｓ−ＡＩＣ［Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５４，　４３９５−４４０３参照］およびヒトＦａｓをコードするｃＤＮＡを保持するプラスミドベクターｐＣＥＶ４［Ｉｔｏｈ，　Ｎ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　Ｃｅｌｌ６６，　２３３−２４３参照］である。
【０１４３】
ｂ）　プライマー
ＰＣＲを行うにあたり、以下に記載するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
５’−　ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣ　ＡＧＴＡＣＧＧＡＧＴ　ＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴ　ＣＴＴＴ　−３’　　（Ｎ１：配列表の配列番号１２）、
５’−　ＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧ　ＣＣＴＣＴＧＴＣＡＣ　ＣＡＡＧＴＴＡＧＡＴ　ＣＴＧＧＡ　−３’　（Ｃ３Ｎ：配列表の配列番号１３）、
５’−　ＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡ　ＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣ　ＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡ　ＧＡＡＡＣ　−３’　（Ｎ３Ｎ：配列表の配列番号１４）、
５’−　ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣ　ＧＣＧＴＣＡＣＧＴＧ　ＧＧＣＡＴＣＡＣ　−３’　（ＣＴＮ２：配列表の配列番号１５）。
【０１４４】
ＰＣＲ用プライマー等のオリゴヌクレオチドの合成は、全てＤＮＡ自動合成機（モデル３８０Ｂ；（株）パーキンエルマー・ジャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）を用いて、そのマニュアルに従って行った［Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．（１９８１）　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３，３１８５−３１９１　参照］。各オリゴヌクレオチドは合成終了後、支持体から開裂させ脱保護を行い、得られた溶液を凍結乾燥することにより粉末状にした。この粉末を蒸留水に溶解し、使用するまで−２０℃で凍結保存した。
【０１４５】
ｃ）　第一段階ＰＣＲ
ヒトＦａｓの細胞外領域をコードするＤＮＡ断片　ＨＦＡＳは、以下の条件で作製された。なお、ＰＣＲを実施するにあたっては、ＬＡ　ＰＣＲキット（宝酒造（株）社製）を使用した。
2004000228.tif 000002
温度条件：　９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分の温度サイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温した（以下、実施例中のすべてのＰＣＲの反応温度調節は、ジーンアンプＰＣＲシステム９６００；（株）パーキンエルマー・ジャパン社製を使用した）。
【０１４６】
一方、マウスＩＬ３受容体の細胞外領域をコードするＤＮＡ断片　ＭＡＩＣは以下の条件で作製された。
2004000228.tif 000003
温度条件：　上記に同じ。
【０１４７】
ＰＣＲ後の増幅されたＨＦＡＳ　ＤＮＡおよびＭＡＩＣ　ＤＮＡは、それぞれフェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動され、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムにより染色された後、紫外線照射下で検出された。検出されたそれぞれのバンド部分のゲル片を剃刀刃で切り取り、遠心管型限外濾過器セントリコン１０（アミコン社製）を装着したセントリリューター（アミコン社製）を用いてＤＮＡを電気的に溶出した。さらにこの溶出液の入ったセントリコン１０を取り出して、７５００×ｇ、約１時間の遠心分離を行うことによりＤＮＡを濃縮した。このＤＮＡをエタノール沈澱の後、２０μｌの蒸留水に溶解した。
【０１４８】
ｄ）　第二段階ＰＣＲ
ヒトＦａｓ融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片　ＦＡＳＡＩＣは、以下の条件で作製された。
2004000228.tif 000004
温度条件：　第一段階に同じ。
【０１４９】
ＰＣＲ後の増幅されたＦＡＳＡＩＣ　ＤＮＡは、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムにより染色され、紫外線照射下で検出された。検出されたバンド部分のゲル片を剃刀刃で切り取り、このゲル片よりセントリリューターおよびセントリコンを用いてＤＮＡを溶出、濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０１５０】
ｅ）　ベクターの構築
上記ｄ）で得られたＦＡＳＡＩＣ　ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化した（ＦＡＳＡＩＣ　ＤＮＡ溶液全量を使用した）後、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行った。この沈澱を２μｌの滅菌脱イオン水に懸濁した。
【０１５１】
一方、プラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ｍＦａｓ−ＡＩＣ　２μｇをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化してから脱リン酸化したＤＮＡ断片を調製し、このものと上記ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化したＦＡＳＡＩＣ　ＤＮＡとライゲーションキット（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、ハナハンの方法［Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０　参照］に従って大腸菌ＤＨ５α株（ギブコ・ビーアールエル社製）の形質転換を行なった。この形質転換大腸菌株よりアルカリＳＤＳ法［Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ参照］でプラスミドを調製し、目的のプラスミド　ｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２を得た。
【０１５２】
このプラスミドをプラスミド大量調製キット（マキシプレップ・　ＤＮＡ精製システム：プロメガ社製）を用いて調製し、２０μｇ相当のＤＮＡをエタノール沈澱させた後、沈澱を滅菌したダルベッコＰＢＳ（−）（以下「ＰＢＳ」という；日水製薬（株）社製）　２０μｌに溶解した。
【０１５３】
ｆ）　発現
ＣＯＳ−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．　ＣＲＬ−１６５０　）を、１０％　ウシ胎児血清（ギブコ社製）（以下「ＦＣＳ」という）を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という：日水製薬（株）社製）を入れた細胞培養用フラスコ（培養面積２２５ｃｍ２；住友ベークライト（株）社製）中でセミコンフルエントになるまで３７℃、５％　炭酸ガス下で培養した後、培地を除去してから、フラスコに５ｇ／リットル　トリプシンおよび２ｇ／リットル　エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含む溶液（以下「トリプシン−ＥＤＴＡ溶液」という；シグマ社製）３ｍｌを入れて３７℃で３分間保温した。フラスコから遊離した細胞をＰＢＳに懸濁して回収し、ＰＢＳで２回洗浄してから、ＰＢＳで６×１０７細胞／ｍｌとなるように調整した。この細胞懸濁液２０μｌ（１．２×１０６細胞）と上記で調製したプラスミド溶液２０μｌずつを混合し、電極間隔２ｍｍのチャンバー（島津製作所（株）社製）に入れ、遺伝子導入装置（ＧＴＥ−１；島津製作所（株）社製）にセットしてから６００Ｖ−３０μｓｅｃのパルスを１秒間隔で２回加えた。チャンバー内の細胞−ＤＮＡ混合液を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ　１０ｍｌに加え、細胞培養用フラスコ（培養面積７５ｃｍ２）中で３７℃、７．５％　炭酸ガス下で２４時間培養した。次いで培養上清を除去し、無血清ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ　１０ｍｌを加えて、３７℃、７．５％　炭酸ガス下でさらに２４時間培養し、培養上清を回収した。
【０１５４】
得られた培養上清を透析チューブ（排出限界分子量１２０００−１４０００；ギブコ・ビーアールエル社製）に入れ、１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）に対して透析した後、ファルマシア社製ＦＰＬＣ装置を用いて以下に記載する条件でヒトＦａｓ融合タンパク質の粗精製を行った：
カラム：　リソースＱカラム（商標名；φ６．４×３０ｍｍ、ファルマシア社製）；
溶媒：　１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）
流速：　５ｍｌ／分；
溶出：　塩化ナトリウム　０．１Ｍ−０．３Ｍ、３０分間の直線濃度勾配。
溶出液を５ｍｌずつ分画し、以下に記載するＥＬＩＳＡ法によりＦａｓ遺伝子発現産物の検定を行った。まず、各溶出分画　１００μｌを９６穴マイクロプレート（コースター社製）のウェルに入れ、３７℃で１時間保温した。各ウェル中の液を除去後、０．１％　ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ　２０）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）１００μｌ／ウェルで３回洗浄し、２％　ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）を含むＰＢＳ　１００μｌ／ウェルを入れて３７℃で１時間保温した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　１００μｌ／ウェルで３回洗浄した後に、抗マウスＩＬ−３受容体βサブユニットモノクローナル抗体ＨＣ（１ｍｇ／ｍｌ；医学生物学研究所（株）社製）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０００倍希釈した溶液　１００μｌ／ウェルを入れて３７℃で１時間保温した。さらに、各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　１００μｌで３回洗浄した後に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（アマシャム社製）１００μｌ／ウェルを入れて３７℃で１時間保温してから、各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　１００μｌで３回洗浄した。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（バイオラッド社製）１００μｌ／ウェルを入れて５分間静置してから、マイクロプレートリーダー（モデル４５０；バイオラッド社製）を用いて４１５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、吸光度が高かった１９乃至２３番目の分画を集めて、粗精製ヒトＦａｓ融合タンパク質試料とした。
【０１５５】
実施例２　マウスの免疫およびハイブリドーマの調製
（２−１）　免疫
実施例１で得られた粗精製ヒトＦａｓ融合タンパク質溶液　１ｍｌ（全タンパク質量；　１００μｇ）に対し、２Ｎ　塩酸　２５μｌ、９％　カリミョウバン　２５０μｌ（終濃度１．１％）、２Ｎ　水酸化ナトリウム　２５μｌを添加した後、１０％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウム水溶液　約１２０μｌを添加することによりｐＨ６．５乃至７．０に調整した。室温で約３０分間放置後、Ｔ細胞の活性化のために百日咳菌死菌（和光純薬（株）社製；１．２×１０１１菌／ｍｌ）２００μｌを添加し、これをＦａｓノックアウトマウス腹腔内に投与した。Ｆａｓノックアウトマウスは、千住らの文献に記載する方法により取得されたものを使用した［Ｓｅｎｊｕ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８，　４２３　参照］。２週間後、粗精製ヒトＦａｓ融合タンパク質のみ（２０μｇタンパク質／マウス）を腹腔内に投与し追加免疫した。
【０１５６】
（２−２）　細胞融合
追加免疫３日後のマウスより脾臓を摘出し、これを２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）、３５０ｍｇ／ｍｌ　炭酸水素ナトリウム、０．０５ｍＭ　β−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌ　ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、３００μｇ／ｍｌ　Ｌ−グルタミン酸を含む無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（１０．４ｇ／リットル　ＲＰＭＩ１６４０「ニッスイ」▲１▼：日水製薬（株）社製）（以下「無血清ＲＰＭＩ培地」という）１０ｍｌ中に入れ、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社製）上でスパーテルを用いてつぶした。メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心して脾臓細胞を沈澱させた後、この脾臓細胞を無血清ＲＰＭＩ培地で２回洗浄してから、無血清ＲＰＭＩ培地に懸濁して細胞数を測定した。
【０１５７】
一方、１０％　ＦＣＳ（ギブコ・ビーアールエル社製）を含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）（以下「血清入りＡＳＦ培地」という）にて、３７℃、５％　炭酸ガス存在下で細胞濃度が１×１０８細胞／ｍｌを越えないように培養したミエローマ細胞　ＮＳ１（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ＴＩＢ−１８　）を同様に無血清ＲＰＭＩ培地で洗浄し、無血清ＲＰＭＩ培地に懸濁して細胞数を測定した。
【０１５８】
３×１０７個相当のＮＳ１細胞懸濁液と、３×１０８個相当の脾臓細胞懸濁液を混合し、遠心後、上清を完全に除去した。以下の細胞融合の操作は、ペレットの入ったプラスチック遠沈管を温水を入れたビーカー中で３７℃に保温しながら実施した。このぺレットに、５０％（ｗ／ｖ）　ポリエチレングリコール　１５００（ベーリンガーマンハイム社製）１ｍｌを、ピペットの先でぺレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＲＰＭＩ培地１ｍｌを２回に分けてゆっくり添加し、さらに７ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地を添加した。遠心後、上清を除去し、１０％　ＦＣＳを含むヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地（以下「ＨＡＴ培地」という；ベーリンガー・マンハイム社製）１０ｍｌを、ピペットの先でゆっくり撹拌しながら添加した。さらに１０％　ＦＣＳを含むＨＡＴ培地　２０ｍｌを添加した後に、細胞培養用９６穴マイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガス下で培養した。７〜８日後、培地が黄色味を帯びたウエルには新しいＨＡＴ培地を１００μｌ／ウェルずつ加えた。このようにして得られた融合細胞を、以下に記載する限界希釈法によるスクリーニングに供した。
【０１５９】
（２−３）　限界希釈
４〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウス雌（日本エスエルシー社より購入）より胸腺を摘出後、メッシュ（セルストレイナー；ファルコン社製）上でスパーテルを用いてつぶし、メッシュを通過した細胞を１０％　ＦＣＳを含むヒポキサンチン・チミジン培地（以下「ＨＴ培地」という；ベーリンガー・マンハイム社製）で２回洗浄した。マウス１匹分の胸腺細胞を１０％　ＦＣＳを含むＨＴ培地　３０ｍｌに懸濁したものをフィーダー細胞液とした。上記（２−２）で得られた融合細胞を含む培養液を、細胞密度に応じてフィーダー細胞液で１０乃至１００倍に希釈し、さらに融合細胞の密度が５細胞／ｍｌ、１細胞／ｍｌ、０．５細胞／ｍｌとなるように、フィーダー細胞液で段階希釈した。このようにして調製した各試料を、細胞培養用９６穴マイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガス下で５日間培養した。
【０１６０】
（２−４）　選別
マウスＴリンパ腫細胞ＷＲ１９Ｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ＴＩＢ−５２　）にヒトＦａｓをコードする遺伝子を発現させたＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞［Ｉｔｏｈ，　Ｎ．　ｅｔ．　ａｌ．　（１９９１）　Ｃｅｌｌ　６６，　２３３−２４３参照］を、１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、５％炭酸ガス下で培養し増殖させてから、１×１０７細胞／ｍｌに調整した細胞懸濁液を、Ｕ字底９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に５０μｌ／ウェルずつ分注し、遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）した。上清を除去し、上記（２−３）で培養した融合細胞の培養上清を５０μｌ／ウェル加えて撹拌した後、氷上で１時間静置してから、遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）して上清を除去した。ペレットを１００μｌ／ウェルのフローサイトメトリー用緩衝液（５％　ＦＣＳ、０．０４％（ｗ／ｖ）　アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で２回洗浄した後、５００倍希釈したフルオレッセイン−５−イソチオシアネート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；以下「ＦＩＴＣ」という）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体ＩｇＧ画分（オルガノン・テクニカ社製）５０μｌを二次抗体として加え、氷上で１時間静置した。遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）して上清を除去してから、ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液１００μｌ／ウェルで２回洗浄後、３．７％　ホルマリン溶液　５０μｌを添加し、氷上で１０分静置することにより細胞を固定した。遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）して上清を除去してから、再度フローサイトメトリー用緩衝液１００μｌ／ウェルで洗浄し、ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液１００μｌ／ウェルに懸濁したものをフローサイトメトリー用試料とした。各試料中の細胞のＦＩＴＣ蛍光強度をフローサイトメーター（エピックス・エリート；コールター社製）で測定した（励起波長：４８８ｎｍ、検出波長：５３０ｎｍ）。その結果、融合細胞培養上清を添加しなかったＷＲ１９Ｌ１２ａ（ＦＩＴＣ蛍光強度約０．３）よりも明らかに高値（約１００−１０００）のＦＩＴＣ蛍光強度を示した試料に対応する融合細胞を選別した。
【０１６１】
（２−５）　クローニング
上記（２−４）で選別された細胞群について、上記（２−３）から（２−４）の一連の工程を５回繰返すことにより、ＷＲ１９Ｌ１２ａと結合するがＷＲ１９Ｌと結合しない単一な抗体を産生するハイブリドーマを数クローン得た。それらのハイブリドーマが産生する抗体について、（２−４）と同様の方法を用いて、マウスＦａｓに対する結合能を調べた。マウスＦａｓを発現する細胞としては、Ｆａｓをほとんど発現しない細胞株Ｌ５１７８Ｙ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．　ＣＲＬ−１７２２　）にマウスＦａｓ発現ベクターを導入したＬ５１７８ＹＡ１細胞を使用した。その結果、Ｌ５１７８ＹＡ１細胞に結合し、Ｌ５１７８Ｙ細胞と結合しない抗体を産生するマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａを選別した。マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａは平成９年２月２０日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８が付された。
【０１６２】
またマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａが産生する抗体（以下「ＨＦＥ７Ａ」という）のサブクラスを、モノクローナル抗体アイソタイピングキット（ピアース社製）を用いて調べた結果、ＩｇＧ１、κであることが判明した。
【０１６３】
実施例３　ＨＦＥ７Ａモノクローナル抗体の精製
実施例２で作出されたマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）を、１０％　ＦＣＳを含むＡＳＦ培地　１リットル中で、３７℃、５％　炭酸ガス下で培養し、１×１０６細胞／ｍｌとなるまで増殖させた。培養液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、２分間）し、上清を捨て、沈澱した細胞を無血清ＡＳＦ培地で１回洗浄後、無血清ＡＳＦ培地１リットルに再懸濁し、３７℃、５％　炭酸ガス下で４８時間培養した。この培養液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、２分間）し、上清を回収して透析チューブ（排除限界分子量１２０００−１４０００；ギブコ・ビーアールエル社製）に入れ、１０倍量の１０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。この透析チューブ内液からのＩｇＧの粗精製を、高速液体クロマトグラフィー装置（ＦＰＬＣシステム；ファルマシア社製）を用いて以下に記載する条件で行った：
カラム：　ＤＥＡＥ−セファロース　ＣＬ−６Ｂカラム（カラムサイズ１０ｍｌ；ファルマシア製）；
溶媒：　１０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）
流速：　１ｍｌ／分；
溶出：　１Ｍ　塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０−５０％、１８０分）。
溶出液を５ｍｌずつ分画し、各分画中の抗Ｆａｓ抗体価を、ヒトＦａｓ融合タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法により検定した。まず、実施例１で調製した粗精製ヒトＦａｓ融合タンパク質溶液をＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート中に１００μｌ／ウェル入れ、３７℃で１時間保温した後、この溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　１００μｌ／ウェルで３回洗浄した。次に２％　ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ　１００μｌ／ウェルを入れて３７℃で１時間保温した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　１００μｌ／ウェルで３回洗浄した後に、各溶出分画１００μｌを入れて３７℃で１時間保温した。さらに、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　１００μｌ／ウェルで３回洗浄した後に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（アマシャム社製）１００μｌ／ウェルを添加して３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　１００μｌ／ウェルで３回洗浄した。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（バイオラッド社製）１００μｌ／ウェルを入れて５分間静置した後、マイクロプレートリーダーで各ウェルの４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１６４】
その結果、吸光度の大きかった２１−３０番目の分画を集め、抗体アフィニティー精製用カラム（ハイトラップ・プロテインＧカラム、カラム体積　５ｍｌ；ファルマシア社製）２本に供与した。カラム内を２５ｍｌ／カラムの平衡化緩衝液（２０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））にて洗浄した後に、１５ｍｌ／カラムの溶出緩衝液（０．１Ｍ　グリシン−塩酸（ｐＨ２．７））にて抗体を溶出した。それぞれの溶出液は、１．１２５ｍｌの１Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ９．０）を入れた試験管内に受け、溶出終了後ただちに遠心管型限外濾過器（セントリプレップ１０；グレースジャパン（株）製）の上部に入れて、３０００×ｇ、４℃で２時間遠心した。濾過器下部に回収された濾液を除去後、上部に１５ｍｌのＰＢＳを加えて、再び３０００×ｇ、４℃で２時間遠心する操作を５回繰り返した。ただし５回目の遠心は濾過器上部内の液量が０．５ｍｌになるまで行ない、この濾過器上部に残った液をＨＦＥ７Ａ試料とした。
【０１６５】
実施例４　ｃＤＮＡクローニング
（４−１）　ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの調製
実施例２で作製したマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）を１０％　ＦＣＳを含むＡＳＦ培地　１リットルにて、３７℃、５％　炭酸ガス下で１×１０６細胞／ｍｌまで増殖させた後に、細胞を遠心分離により回収し、グアニジンチオシアネート溶液（４Ｍ　グアニジンチオシアネート、１％　サルコシル、２０ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２５ｍＭ　クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０．１％　アンチフォームＡ）で溶解し、溶液を回収した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの単離は本質的に、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　”［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（１９８２）　ｐｐ．１９６−１９８参照］に記載されているようにして実施した。具体的には、以下の手順で行った。
【０１６６】
回収した細胞溶解液は、各々２１Ｇの注射針を装填した１０ｍｌ容の注射筒を用いて、数回吸入排出を繰り返した。日立製作所（株）製ＲＰＳ４０−Ｔローター・バケット用のポリアロマー製の遠心管に３ｍｌの５．７Ｍ　塩化セシウム−０．１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を先に加えておき、その上に上記細胞溶解液を重層して遠心管を満たした。これを３００００ｒｐｍ、２０℃で１８時間遠心した後、得られたペレットを４００μｌの蒸留水に溶解し、エタノール沈澱を行った。得られたペレットを再び４００μｌの蒸留水に溶解した後、等量のクロロホルム／１−ブタノール（４：１、ｖ／ｖ）を加え撹拌し、遠心分離後水層を回収した。これを再度エタノール沈澱した後、沈澱を６００μｌの蒸留水に溶解したものを、全ＲＮＡ試料とした。
【０１６７】
このようにして得られた全ＲＮＡ　６００μｇから、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラム・クロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。すなわち、全ＲＮＡを吸着緩衝液（０．５Ｍ　塩化ナトリウム、２０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））に溶解し、６５℃で５分間加熱した後、同溶液にて充填されたオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（タイプ７；ファルマシア社製）に供与し、溶出溶液（１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％　ＳＤＳ）でポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出し、回収した。このような操作により１００μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ画分を得た。
【０１６８】
（４−２）　ＨＦＥ７Ａの重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例３で精製した抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａを含む溶液の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」という）した（ゲル濃度１２％、１００Ｖ定電圧、１２０分）。泳動終了後のゲルを転写緩衝液（２５ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ９．５）、２０％　メタノール、０．０２％　ＳＤＳ）に浸した後、転写装置（ＫＳ−８４５１；マリソル社製）を用いて、予め転写緩衝液に浸しておいたポリビニリデンジフルオリド膜（以下「ＰＶＤＦ膜」という；ポアーサイズ　０．４５μｍ；ミリポア社製）にゲル中のタンパク質を転写した（１０Ｖ定電圧、４℃、１４時間）。転写後のＰＶＤＦ膜を洗浄緩衝液（２５ｍＭ　塩化ナトリウム、１０ｍＭ　ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄した後、染色液（５０％　メタノール、２０％　酢酸、０．０５％　クマシーブリリアントブルー）に５分間浸して染色してから、９０％　メタノールで脱色した。このようにしてＰＶＤＦ膜上で可視化された重鎖（移動度が小さい方のバンド）および軽鎖（移動度が大きい方のバンド）に相当するバンド部分を切りとり、脱イオン水にて洗浄した後に、気相式プロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−１０；島津製作所（株）社製）を用いて、自動エドマン法［Ｅｄｍａｎ，　Ｐ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９６７）　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１，　８０　参照］によりそれぞれのＮ末端アミノ酸配列を決定した。
【０１６９】
その結果、重鎖に相当するバンドのＮ末端アミノ酸配列は、
Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ　　（配列表の配列番号１６）
であり、軽鎖に相当するバンドのＮ末端アミノ酸配列は、
Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ　−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ　（配列表の配列番号１７）
であった。
【０１７０】
これらのアミノ酸配列を、カバトらにより作成された抗体のアミノ酸配列データベース［Ｋａｂａｔ，　Ｅ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９１）　ｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　Ｖｏｌ．　ＩＩ，　Ｕ．Ｓ．　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ参照］と比較したところ、ＨＦＥ７Ａの重鎖（γ１鎖）は、サブタイプ２ｂであり、軽鎖（κ鎖）は、サブタイプ３であることが判明した。そこで、これらのマウスサブタイプに属する遺伝子の５’末端側非翻訳領域の一部および３’末端側翻訳領域の最末端部分とハイブリダイズする、下記のオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した［前出カバトらの文献、Ｍａｔｔｉ　Ｋａｒｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８）　２５，８５９−８６５およびＨｅｉｎｒｉｃｈ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１５９，　４１７−４３５参照］：
５’−　ＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡ　ＴＧＧＧＡＴＧＧＡ　−３’　（Ｈ１：配列表の配列番号１８）；
５’−　ＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡ　ＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡ　−３’　　（Ｈ２：配列表の配列番号１９）；
５’−　ＡＡＧＡＡＧＣＡＴＣ　ＣＴＣＴＣＡＴＣＴＡ　−３’　　（Ｌ１：配列表の配列番号２０）；
５’−　ＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣ　ＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ　−３’　　（Ｌ２：配列表の配列番号２１）。
【０１７１】
（４−３）　ｃＤＮＡクローニング
マウス抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａの重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを、逆転写酵素（ＲＴ）反応およびＰＣＲ反応を組み合わせて、上記（４−１）で調製したＨＦＥ７Ａ産生ハイブリドーマ由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ画分より任意の配列を特異的に増幅する方法（ＲＴ−ＰＣＲ）によりクローニングした。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ　ＰＣＲキット（ＡＭＶ）バージョン２（宝酒造（株）社製）を使用して行なった。
【０１７２】
ａ）　逆転写酵素反応
ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーは、上記（４−２）で合成したオリゴヌクレオチドプライマーのセット（５’末端側および３’末端側プライマー）を用い、重鎖用または軽鎖用各プライマーセットを使用したＲＴ−ＰＣＲ反応を個別に実施した。
【０１７３】
2004000228.tif 000005
温度条件：　５５℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５分間の順にインキュベートした。
【０１７４】
ｂ）　ＰＣＲ
2004000228.tif 000006
温度条件：　９４℃で２分間加温した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１．５分間の温度サイクルを２８回繰り返した。
【０１７５】
反応終了後、反応液の一部をとり、１．５％　アガロースゲル電気泳動を行なった結果、重鎖用プライマーを入れた反応液では約１．４ｋｂｐのバンドが増幅されており、軽鎖用プライマーを入れた反応液では約０．７ｋｂｐのバンドが増幅されていた。
【０１７６】
これらＰＣＲで増幅されたｃＤＮＡを、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてクローニングした。まず、ＰＣＲ反応液とｐＣＲＩＩベクター（ＴＡクローニングキットに添付）５０ｎｇを、１μｌの１０倍濃度リガーゼ反応緩衝液（６ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．５）、６ｍＭ　塩化マグネシウム、５ｍＭ　塩化ナトリウム、７ｍＭ　β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ　ＡＴＰ、２ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　スペルミジン、０．１ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン）中に溶解し、４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）を加え、滅菌脱イオン水で全量を１０μｌとして、１４℃で１５時間保温した。次いで、０．５Ｍ　β−メルカプトエタノール　２μｌを加えたコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（ＴＡクローニングキットに添付）５０μｌに上記リガーゼ反応液２μｌを添加し、氷上で３０分間静置した後に、４２℃で３０秒間加温してから、再び氷上で５分間冷却した。このものにＳＯＣ培地（２％　トリプトン、０．５％　イーストエキストラクト、０．０５％　塩化ナトリウム、２．５ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　塩化マグネシウム、２０ｍＭ　グルコース）５００μｌを加え、３７℃で１時間振盪培養した。この培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−ブロス寒天培地（１％　トリプトン、０．５％　イーストエキストラクト、０．５％　塩化ナトリウム、０．１％　グルコース、０．６％　バクト・　アガー（ディフコ社製））プレート上に塗り広げ、３７℃にて一晩静置培養した。プレート上に現れた単一のアンピシリン耐性コロニーを選択し、このコロニーを白金耳で掻きとって、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−ブロス培地にて培養した後に、遠心分離して回収した菌体からアルカリ法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このようにして得られたプラスミドを、それぞれｐＣＲ−Ｈ（ＨＦＥ７Ａ重鎖をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミド）およびｐＣＲ−Ｌ（ＨＦＥ７Ａ軽鎖をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミド）と命名した。
【０１７７】
（４−４）　ヌクレオチド配列の解析
（４−３）で得られたプラスミドｐＣＲ−ＨおよびｐＣＲ−Ｌがそれぞれ保持する、ＨＦＡ７Ａ重鎖をコードするｃＤＮＡ（１．４ｋｂｐ）およびＨＦＥ７Ａ軽鎖をコードするｃＤＮＡ（０．７ｋｂｐ）のヌクレオチド配列を、遺伝子配列解析装置（３１０ジェネティックアナライザー；（株）パーキンエルマージャパン社製）を用いてジデオキシ法［Ｓａｎｇｅｒ，　Ｆ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９７７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７４，　５４６３−５４６７参照］により決定した。
【０１７８】
その結果決定された、ＨＦＥ７Ａ重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、それぞれ配列表の配列番号８および１０に示した。また、これらｃＤＮＡにコードされる、ＨＦＥ７Ａ重鎖および軽鎖の全アミノ酸配列を、それぞれ配列表の９および１１に示した。上記（４−１）で判明したＨＦＥ７Ａ重鎖のＮ末端アミノ酸配列（配列表の配列番号１６）は、配列表の配列番号９のアミノ酸番号１〜１１の配列と、不明の１残基を除き一致した。また、ＨＦＥ７Ａ軽鎖のＮ末端アミノ酸配列（配列表の配列番号１７）は、配列表の配列番号１１のアミノ酸番号１〜２２の配列と一致した。すなわち、ＨＦＥ７Ａ重鎖および軽鎖の成熟型タンパク質のＮ末端は、それぞれ配列番号９および１１のアミノ酸番号１のアミノ酸であることが明らかとなった。
【０１７９】
また、この重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、カバトらによる抗体のアミノ酸配列のデータベース［Ｋａｂａｔ，　Ｅ．　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　ｉｎ　”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　Ｖｏｌ．ＩＩ”：　Ｕ．Ｓ．　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ参照］と比較検討した結果、重鎖については、配列番号９のアミノ酸番号１から１２１が可変領域であり、アミノ酸番号１２２から４４５が定常領域であること、また軽鎖については、配列番号１１のアミノ酸番号１から１１１が可変領域であり、アミノ酸番号１１２から２１８が定常領域であることが明らかとなった。
【０１８０】
さらに、上記のごとく決定されたＨＦＥ７Ａの重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列における、それぞれのＣＤＲの位置および配列は、カバトらの文献［前記Ｋａｂａｔ，　Ｅ．　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　参照］による抗体のアミノ酸配列のデータベースとの相同性を比較検討することによって決定された。該文献によれば、異なる抗体間でもサブタイプが同じであれば可変領域中のフレームワーク領域の鎖長はほぼ一定であり、またそのアミノ酸配列には共通性が認められる。一方、ＣＤＲは、それらのフレームワーク領域にはさまれて存在する固有の配列である。そこで、ＨＦＥ７Ａの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を同じサブタイプのものと比較検討した結果、ＨＦＥ７Ａの重鎖のＣＤＲは、配列表の配列番号９のアミノ酸番号３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、同アミノ酸番号５０〜６６（ＣＤＲＨ２）および同アミノ酸番号９９〜１１０（ＣＤＲＨ３）で示されるアミノ酸配列と決定された。またＨＦＥ７Ａの軽鎖のＣＤＲは、配列表の配列番号１１のアミノ酸番号２４〜３８（ＣＤＲＬ１）、同アミノ酸番号５４〜６０（ＣＤＲＬ２）および同アミノ酸番号９３〜１０１（ＣＤＲＬ３）で示されるアミノ酸配列と決定された。
【０１８１】
実施例５　組換え抗体の調製
（５−１）　発現プラスミドの構築
実施例４でクローニングされたＨＦＥ７Ａの重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを動物細胞用発現ベクターｐＭＳ１８Ｓ［Ｈａｒａ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１１，　１８７５参照］に組み込んだ組換え発現ベクターを、以下に記載する方法で構築した。まず、プラスミドｐＣＲ−Ｈが保持するｃＤＮＡの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を付加し、３’末端部分に制限酵素ＸｂａＩ認識部位および終止コドンを付加するためのオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧ　ＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴ　ＧＧＧＡＴＧＧＡ　−３’（Ｈ３：配列表の配列番号２２）
５’−　ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣ　ＴＡＴＴＴＡＣＣＡＧ　ＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡ　ＧＡ　−３’　（Ｈ４：配列表の配列番号２３）
を合成した。また、プラスミドｐＣＲ−Ｌが保持するｃＤＮＡの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を付加し、３’末端部分に制限酵素ＮｏｔＩ認識部位および終止コドンを付加するためのオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡ　ＡＧＡＡＧＣＡＴＣＣ　ＴＣＴＣＡＴＣＴＡ　−３’　　（Ｌ３：配列表の配列番号２４）
５’−　ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧ　ＣＴＴＡＣＴＡＡＣＡ　ＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧ　ＴＴＧＡＡＧＣ　−３’　（Ｌ４：配列表の配列番号２５）を合成した。この重鎖用および軽鎖用それぞれのプライマーを用い、以下の条件でＰＣＲを実施した。
2004000228.tif 000007
温度条件：　９４℃で２分間加温した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７５℃で１．５分のサイクルを２８回繰り返した。
【０１８２】
上記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩ（重鎖）あるいはＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ（軽鎖）で消化した後に、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩ（重鎖用）あるいはＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ（軽鎖用）で消化し脱リン酸化した動物細胞用発現プラスミドベクター　ｐＭＥ１８Ｓ［Ｈａｒａ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１１，　１８７５参照］と混合し、１０倍濃度リガーゼ反応緩衝液（６ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．５）、６ｍＭ　塩化マグネシウム、５ｍＭ　塩化ナトリウム、７ｍＭ　β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ　ＡＴＰ、２ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　スペルミジン、０．１ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン）中で、４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１４℃で１５時間保温した。このリガーゼ反応液２μｌをコンピテント大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造（株）社製）５０μｌに加え、氷上で３０分間放置した後に、４２℃で３０秒、氷上で５分間静置した。このものにＳＯＣ培地（２％　トリプトン、０．５％　イーストエキストラクト、０．０５％　塩化ナトリウム、２．５ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ　グルコース）５００μｌを加え、１時間振とう培養した。以下、実施例４（４−３）に記載した方法で形質転換大腸菌株を単離し、該菌株からプラスミドＤＮＡを調製した。このようにして得られたプラスミドを、プラスミドｐＭＥ−Ｈ（ＨＦＥ７Ａ重鎖をコードするｃＤＮＡを保持する発現プラスミドベクター）およびプラスミドｐＭＥ−Ｌ（ＨＦＥ７Ａ軽鎖をコードするｃＤＮＡを保持する発現プラスミドベクター）と命名した。これらのプラスミドを保持する形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−ＨおよびＥ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−Ｌは、平成９（１９９７）年３月１２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、それぞれ寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６８およびＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６７が付された。
【０１８３】
（５−２）　ＣＯＳ−７細胞での発現
上記（５−１）で得られたプラスミドｐＭＥ−ＨおよびｐＭＥ−ＬのＣＯＳ−７細胞への形質転換は、遺伝子導入装置（ＥＣＭ６００：ビーティーエックス社製）を用いて、電気穿孔法により行なった。まず、ＣＯＳ−７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．　ＣＲＬ−１６５１　）を１０％　ＦＣＳを含むＤＭＥＭを入れた細胞培養用フラスコ（培養面積２２５ｃｍ２；住友ベークライト（株）社製）中でセミコンフルエントになるまで培養した後、培地を除去してから、３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）を入れて３７℃で３分間保温した。遊離した細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄してから、ＰＢＳで５×１０６細胞／ｍｌとなるように調整した。また、プラスミド大量調製キット（マキシプレップ・ＤＮＡ精製システム：プロメガ社製）を用いて調製したプラスミドｐＭＥ−ＨおよびｐＭＥ−Ｌ各２０μｇをエタノール沈澱した後、それぞれ滅菌したＰＢＳ２０μｌに溶解した。なお、２種類のプラスミドでコ・トランスフェクションを行なった場合は、各プラスミドは２０μｇずつ使用した。上記のように調製した細胞懸濁液　２０μｌ（１．２×１０６細胞）とプラスミド溶液２０μｌとを混合し、電極間隔２ｍｍのチャンバー（ビーティーエックス社製）に入れ、遺伝子導入装置にセットして、１５０Ｖ、９００μＦの設定で１０ミリ秒のパルスを１回加えた。チャンバー内の細胞−ＤＮＡ混合液を１０％　ＦＣＳを含むＤＭＥＭ　４０ｍｌに加え、細胞培養用プラスチックシャーレ中で３７℃、５％炭酸ガス下で２４時間培養した。次いで培養上清液を除去し、無血清ＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ　４０ｍｌを加えて３７℃、５％炭酸ガス下でさらに７２時間培養し、培養上清を回収した。
【０１８４】
上記の方法により、以下に記載するプラスミドまたはプラスミドの組み合わせでそれぞれＣＯＳ−７細胞を形質転換して、形質転換体の培養上清を回収した：
［Ａ］　ｐＭＥ−Ｈのみ；
［Ｂ］　ｐＭＥ−Ｌのみ；
［Ｃ］　ｐＭＥ−ＨおよびｐＭＥ−Ｌのコ・トランスフェクション。
【０１８５】
（５−３）　形質転換体培養上清中の抗Ｆａｓ抗体の検出
上記（５−２）で調製された形質転換ＣＯＳ−７細胞培養上清中に抗Ｆａｓ抗体が産生されているか否かを、実施例３に記載したヒトＦａｓ融合タンパク質を抗原とするＥＬＩＳＡ法により調べた。その結果、ｐＭＥ−ＨおよびｐＭＥ−Ｌでコ・トランスフェクションした場合（上記［Ｃ］）のみ、培養液上清にヒトＦａｓ融合タンパク質と反応する抗体が産生されていることが確かめられた。
【０１８６】
実施例６　エピトープ限定
（６−１）　ＥＬＩＳＡ
以下に記載するペプチドを、自動ペプチド合成機（モデル４３０Ａ；（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部）を使用して、Ｆｍｏｃ固相合成法［Ｃａｒｐｉｎｏ，　Ｌ．　Ａ．　ａｎｄ　Ｈａｎ，　Ｇ．Ｙ．　（１９７０）　Ｊ．　Ａｍｅｒ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　９２，　５７４８−５７４９　参照］により合成した：
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ　（Ｐ１：配列表の配列番号２６）；
Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ　−Ｇｌｕ　（Ｐ２：配列表の配列番号２７）；
Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ　−Ｈｉｓ−Ａｓｐ　（Ｐ３：配列表の配列番号２８）；
Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　（Ｐ４：配列表の配列番号２９）；
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ　−Ｔｈｒ−Ｖａｌ　（Ｐ５：配列表の配列番号３０）；
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ　（Ｐ６：配列表の配列番号３１）；
Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ−Ａｌａ　（Ｐ７：配列表の配列番号３２）；
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ　−Ａｒｇ　（Ｐ８：配列表の配列番号３３）；
Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　（Ｐ９：配列表の配列番号３４）；
Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ　−Ａｓｎ−Ｔｈｒ　（Ｐ１０：配列表の配列番号３５）；
Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ　（Ｐ１１：配列表の配列番号３６）；
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ　−Ａｓｐ−Ｐｒｏ　（Ｐ１２：配列表の配列番号３７）；
Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ　−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ　（Ｐ１３：配列表の配列番号３８）；
Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ　（Ｐ１４：配列表の配列番号３９）；
Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ　　（Ｐ１５：配列表の配列番号４０）；
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ　−Ｖａｌ−Ｇｌｕ　（Ｐ１６：配列表の配列番号４１）。
【０１８７】
Ｐ１乃至Ｐ１５は、ヒトＦａｓ細胞外領域の１−１５７番目までのアミノ酸配列の部分配列であり、それぞれ９乃至１１残基のアミノ酸配列が他のペプチドと重複している。Ｐ１６は陰性対照用のペプチドであり、ヒトＦａｓとの間に相同性はない。
【０１８８】
Ｐ１乃至Ｐ１６は、それぞれ４８μｌのジメチルスルホキシド（以下「ＤＭＳＯ」という）で完全に溶解した後、１ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを加えて全量が０．８ｍｌとなるように調整し、ペプチド溶液とした。
【０１８９】
Ｃ末端にカルボキシル基を付加したヒトＦａｓ分子細胞外領域に対応するペプチドを、１０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む０．０５Ｍ　炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で５０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（ヌンク社製）に５０μｌ／ウェルずつ入れた。このプレートを４℃で一晩静置することにより、ウェル内面にペプチドを吸着させた。各ウェル内の液を捨て、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（シグマ社製Ａ３８０３）を含むＰＢＳを１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１時間保温した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄後、ＰＢＳで５μｇ／ｍｌに調製したＨＦＥ７Ａ、およびＣＨ１１を各ウェルに５０μｌ添加した。３７℃で１時間保温した後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（アマシャム社製）をＰＢＳで１０００倍希釈したものを、５０μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１時間保温した後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（バイオラッド社製）を各ウェルに１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で１５分間静置した後、マイクロプレートリーダー（コロナ社製）で各ウェルの４１５ｎｍの吸光度を測定した。なお、陽性対照としては、実施例１で調製したヒトＦａｓ融合タンパク質を合成ペプチドの代わりに用いた。
【０１９０】
その結果、上記合成ペプチドのうちＰ１１を吸着させたウェルのみが高い吸光度を示したことから、ＨＦＥ７ＡはＰ１１に含まれるアミノ酸配列と特異的に結合することが判明した（図３）。
【０１９１】
（６−２）　合成ペプチドと細胞表面のヒトＦａｓとの競合によるエピトープの限定（競合アッセイ法）
まず、以下に記載するペプチドを合成した：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ　　（Ｐ９５：配列表の配列番号４２）；
Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ　　（Ｐ１００：配列表の配列番号４３）；
Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ　　（Ｐ１０５：配列表の配列番号１）；
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ　　（Ｐ１１０：配列表の配列番号４４）；
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ　　（Ｐ１１５Ｌ：配列表の配列番号４５）；
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ　　（Ｄ３５５−３６４：配列表の配列番号４６）。
【０１９２】
Ｐ９５、Ｐ１００、Ｐ１０５およびＰ１１０は、ヒトＦａｓの細胞外領域中においてＰ１１に対応するアミノ酸配列の近傍（ヒトＦａｓ細胞外領域の９５−１２８番目に相当）の、１０残基からなる部分配列であり、それぞれ５残基ずつ他のペプチドとアミノ酸配列が重複する。Ｐ１１５Ｌは、Ｐ１１０と５残基重複する１０残基のアミノ酸配列：
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ　　（Ｐ１１５：配列表の配列番号４５のアミノ酸番号１〜１０）
の溶解度の低さを予測して、Ｃ末端側４残基分を伸長したものである。Ｄ３５５−３６４はヒトＦａｓと相同性のないペプチドで、陰性対照として使用した。Ｐ１１５Ｌ以外の上記各ペプチドはそれぞれ１６μｌのＤＭＳＯに溶解後、１ｍＭ２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを加えて全量が０．８ｍｌとなるように調製し、ペプチド溶液とした。Ｐ１１５Ｌは４８μｌのＤＭＳＯに溶解後、１ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを加えて全量が０．８ｍｌとなるように調製した。
【０１９３】
ＨＦＥ７Ａ　０．２５μｇと、上記ペプチド溶液（ペプチド２００μｇ相当）のそれぞれとをマイクロ試験管中で混合し、１ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳで全量１００μｌとした。これを３７℃、１０−２０ｒｐｍで撹拌しながら２時間保温した後、ＦＣＳを最終濃度が５％となるように添加し、ペプチド−抗体混合液とした。
【０１９４】
ＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞を、実施例２に記載した方法で増殖させてから遠心して回収し、無血清ＲＰＭＩ培地を用いて細胞密度が１×１０７細胞／ｍｌとなるように調整した。この細胞浮遊液をＵ字底９６穴プレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、マイクロプレート用スウィングローターを使用して、４℃、１０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離を行い、上清を除去した。ペレットに各ペプチド−抗体混合液を１００μｌ添加し、１〜２回ピペッティングした。、４℃で３０分間静置した後、遠心し上清を除去した。ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液で３回洗浄してから、フローサイトメトリー用緩衝液で２５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社製）を５０μｌ／ウェルずつ加え、１〜２回ピペッティングした。プレートを遮光して４℃で３０分間静置した後、遠心し上清を除去した。ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液で３回洗浄し、組織固定用１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業（株）社製）をＰＢＳで１０倍希釈したものを５０μｌ／ウェルずつ加え、１〜２回ピペッティングしてからプレートを遮光して４℃で１２時間以上静置して細胞を固定した。フローサイトメトリー用緩衝液　１００μｌ／ウェルを加えて懸濁後、遠心し上清を除去した。ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液で３回洗浄した後、５００μｌ／ウェルのフローサイトメトリー用緩衝液に懸濁したものをフローサイトメーター（サイトエース−１５０；日本分光（株）社製）で解析し（励起波長：４８８ｎｍ、検出波長：５３０ｎｍ）、細胞１個あたりのＦＩＴＣ蛍光強度の平均値を算出した。さらに、ペプチド−抗体混合液を加えなかった場合の値を０％、Ｄ３５５−３６４の値を１００％として各試料の蛍光強度平均値を算出した。
【０１９５】
その結果、Ｐ１０５はＨＦＥ７ＡとＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞との結合を強力に阻害し、Ｐ１０５のアミノ酸配列とそれぞれ半分づつ重複するＰ１００およびＰ１１０は、ＨＦＥ７ＡとＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞との結合をそれぞれ５０％および６０％程度阻害することが判明した。Ｐ１０５のアミノ酸配列と全く重複しないＰ９５およびＰ１１５Ｌでは結合阻害はみられなかった（図４）。以上の結果から、Ｐ１０５はＨＦＥ７ＡとヒトＦａｓの結合を阻害するのに十分なアミノ酸配列であり、ＨＦＥ７Ａのエピトープは、Ｐ１０５に相当するアミノ酸配列中に含まれることが示された。なお、Ｐ１０５に相当する部分は、ヒトＦａｓとマウスＦａｓとの間でアミノ酸配列が保存されている領域である。
【０１９６】
実施例７　ＨＦＥ７ＡのサルＦａｓに対する結合能
チンパンジー（三和化学研究所熊本霊長類パーク）の末梢血４０ｍｌ、ニホンザルの末梢血２０ｍｌ、カニクイザルの末梢血２０ｍｌまたはマーモセットの末梢血３ｍｌを用いて、以下に記載する試験を行った。まず、ヘパリン（ノボヘパリン：ノボ社製）を加えた末梢血を等量のフィコール・パック溶液（比重１．０７７、ただしカニクイザル用は比重１．０７２となるように調整した：ファルマシア社製）に静かに積層し、１７００ｒｐｍで３０分間遠心して、末梢血単核球画分を回収した。この末梢血単核球画分をハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６細胞／ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液にフィトヘマグルチニン−Ｐ（シグマ社製）を終濃度　５μｇ／ｍｌとなるように加えて、３７℃、５％炭酸ガス下で２４時間培養した後、遠心して細胞を回収・洗浄してから、１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁した。この懸濁液にインターロイキン２（アマシャム社製）を終濃度　１０単位／ｍｌとなるように加え、３７℃、５％炭酸ガス下で７２時間培養することにより、活性化リンパ球を得た。
【０１９７】
次に、この活性化リンパ球　１×１０６個を試験管に入れ、２０μｇ／ｍｌのＨＦＥ７Ａ５０μｌもしくはＰＢＳ　５０μｌに懸濁し、氷上で１時間静置してから、５００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。この細胞を２０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（バイオリソース社製）５０μｌに懸濁し、氷上で３０分間静置した後、５００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。この細胞を５００μｌのＰＢＳで再懸濁したものを試料として、フローサイトメーター（サイトエース：日本分光　（株）　社製）を用いて蛍光強度を測定した。蛍光強度による細胞数の度数分布を取得し、全細胞数中に占める染色細胞数の割合を計算した。その結果、ＨＦＥ７Ａを加えなかった試料では、上記のいずれの種においても染色細胞が３％未満であったのに対し、ＨＦＥ７Ａを加えた試料では、少なくとも１７％、最大で８２％の細胞が染色されていた。従って、ＨＦＥ７Ａはヒトを含む広い範囲の霊長類Ｆａｓと結合することが示された。
【０１９８】
実施例８　マウス生体内のＴ細胞に対するＨＦＥ７Ａのアポトーシス誘導活性
６週令の雌のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（日本クレア社より購入）に対して、０．０５ｍｇまたは０．１ｍｇ／個体のＨＦＥ７Ａモノクローナル抗体（いずれも５００μｌのＰＢＳに溶解したもの）、あるいは５００μｌのＰＢＳのみを腹腔内投与し（一群あたり３匹）、投与４２時間後にマウスをエーテル麻酔し、胸腺を摘出した。この摘出した胸腺を１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で洗浄した後に、メッシュ（セルストレイナー；ファルコン社製）上でスパーテルを用いてつぶし、メッシュを通過した細胞を１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。細胞数を測定した後、１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６細胞／５０μｌとなるように懸濁した胸腺細胞を、Ｕ字底９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に５０μｌ／ウェルずつ分注し、遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）した。
【０１９９】
上清を除去し、各ウェルに以下の（ａ）または（ｂ）の蛍光標識抗体溶液を加えた：
（ａ）０．５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ９５（Ｆａｓ）抗体（Ｊｏ２：ファーミンジェン社製）１０μｌ／ウェルおよび０．５ｍｇ／ｍｌのフィコエリトリン（以下「ＰＥ」という）標識抗マウスＣＤ９０抗体（Ｔｈｙ−１．２：セダレーン社製）１０μｌ／ウェル（なお、ＣＤ９０はＴ細胞に特異的に発現する表面抗原である）；
（ｂ）０．５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体（Ｌ３Ｔ４：ファーミンジェン社製）１０μｌ／ウェルおよび０．２ｍｇ／ｍｌのＰＥ標識抗マウスＣＤ８抗体（Ｌｙ−２：ファーミンジェン社製）１０μｌ／ウェル。
【０２００】
プレートを振盪してウェル内を撹拌し、氷上で１時間静置した後、遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）した。上清を除去し、フローサイトメトリー用緩衝液１００μｌ／ウェルで２回洗浄した後、３．７％　ホルマリン溶液　５０μｌ／ウェルを加え、氷上で１０分静置することにより細胞を固定した。遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）して上清を除去し、沈澱した細胞を再度フローサイトメトリー用緩衝液　１００μｌ／ウェルで洗浄後、フローサイトメトリー用緩衝液　１００μｌ／ウェルに懸濁した。このようにして得られた各ウェル中の細胞懸濁液を試料とし、フローサイトメーター（エピックス・エリート：コールター社製）を用いて、１×１０４細胞／試料の蛍光を、以下に記載する条件で測定した：
励起波長：　４８８ｎｍ；
検出波長：　５３０ｎｍ（ＦＩＴＣ）、６００ｎｍ（ＰＥ）。
【０２０１】
この測定データから、各試料の細胞集団のＦＩＴＣおよびＰＥの蛍光分布を作成し、上記（ａ）の蛍光標識抗体を加えた試料については、Ｆａｓ陽性でかつＣＤ９０陽性の細胞（以下「Ｆａｓ＋ＣＤ９０＋」という）数の全細胞数中に占める割合を算出した。同様に、上記（ｂ）の蛍光標識抗体を加えた試料については、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞（以下「ＣＤ４＋ＣＤ８＋」という）またはＣＤ４陽性ＣＤ８陰性細胞（以下「ＣＤ４＋ＣＤ８−」という）の数の全細胞数中に占める割合を算出した。
【０２０２】
その結果を表１に示す。
【０２０３】
【表１】
2004000228.tif 000008
（数値は％）
ＨＦＥ７Ａ投与群マウスの胸腺細胞では、ＰＢＳのみ投与した群と比較して、Ｆａｓを発現しているＴ細胞（Ｆａｓ＋ＣＤ９０＋）の割合が、どの投与量の場合でも顕著に減少していた。また、Ｆａｓの発現が顕著であることが知られているＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞群およびＣＤ４＋ＣＤ８−細胞群も、ＰＢＳのみ投与した群と比較してＨＦＥ７Ａ投与により顕著にその数が減少していた。
【０２０４】
以上の結果より、抗Ｆａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａは、生体内でＦａｓ分子を発現しているＴ細胞に対するアポトーシス誘導活性を有することが示された。
【０２０５】
実施例９　自己免疫疾患モデルに対するＨＦＥ７Ａの効果
Ｆａｓリガンド遺伝子の突然変異体であり、全身性エリテマトーデス様自己免疫疾患のモデルマウスであるＭＲＬｇｌｄ　／ｇｌｄ　マウスを用いて、抗Ｆａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａ投与の自己免疫疾患症状に対する効果を以下に記載する方法に従って検討した。
【０２０６】
１８週令のＭＲＬｇｌｄ　／ｇｌｄ　マウス（日本エスエルシー（株）社より購入）の腹腔内に、実施例３で調製したＨＦＥ７Ａ　０．２ｍｇまたは０．５ｍｇ／個体（５００μｌのＰＢＳに溶解したもの）、もしくは５００μｌ　ＰＢＳをそれぞれ単回投与した。
【０２０７】
自己免疫疾患症状により生じる各被検マウスの手首および足首の腫れを観察し、腫れの程度を評価して、各群の経時的な変化を調べた［米原伸　（１９９４）　日経サイエンス　別冊１１０　、６６−７７　参照］。その結果、ＨＦＥ７Ａ投与により、手足首の腫れの程度が著明に減少していることが明らかとなった。
【０２０８】
また、これらの被検マウスから胸腺を摘出し、上記試験例１に記載した方法により胸腺でＦａｓを発現しているＴ細胞の割合を調べた結果、試験例１と同様にＨＦＥ７Ａ投与により胸腺中のＦａｓ発現Ｔ細胞数は著しく減少していた。
【０２０９】
実施例１０　肝毒性試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスに以下のいずれかのものを腹腔内投与した：
ｉ）　ＨＦＥ７Ａ　０．２ｍｇ（５００μｌのＰＢＳに溶解）；
ｉｉ）　ＨＦＥ７Ａ　０．５ｍｇ（５００μｌのＰＢＳに溶解）；
ｉｉｉ）　Ｊｏ２（ファーミンジェン社製）０．１ｍｇ（５００μｌのＰＢＳに溶解）；
ｉｖ）　５００μｌのＰＢＳのみ。
【０２１０】
上記のうち、Ｊｏ２はアポトーシス誘導活性を有する公知の抗マウスＦａｓ抗体である。投与８時間後、２４時間後および７２時間後のマウス（Ｊｏ２投与マウスのみ投与３時間後のマウス）から軽エーテル麻酔下で後大静脈より全採血し、各試料血液中のグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（以下「ＧＯＴ」という）値およびグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（以下「ＧＰＴ」という）値を、自動分析装置（７２５０型；日立製作所（株）社製）および同装置用試薬（トランスアミナーゼ−ＨＲＩＩ；和光純薬（株）社製）を用いて測定した。その結果、Ｊｏ２投与群では３時間後にＧＯＴ値およびＧＰＴ値が急上昇したのに対し、ＨＦＥ７Ａを投与した群のＧＯＴ値およびＧＰＴ値は、ＰＢＳのみ投与した群同様ほとんど変化しなかった（図５）。以上の結果より、ＨＦＥ７Ａは肝臓障害を誘発しないことが示された。
【０２１１】
実施例１１　劇症肝炎モデルに対する効果
抗マウスＦａｓ抗体Ｊｏ２をマウス腹腔内に投与すると、マウスは数時間の内に劇症肝炎を発症して死亡することが知られている［Ｏｇａｓａｗａｒａ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　Ｎａｔｕｒｅ　３６４，　８０６参照］。そこで、このＪｏ２による肝障害に対するＨＦＥ７Ａ効果を検討するため、Ｊｏ２と同時もしくは後からＨＦＥ７Ａを投与した場合のマウスの生存率を調べた。６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス雌（一群３匹：日本エスエルシー（株）より購入）の腹腔内に、下記の条件で抗体を投与し、経時観察を行なった：
（Ａ）　Ｊｏ２　０．１ｍｇ／０．５ｍｌ；
（Ｂ）　Ｊｏ２　０．０１ｍｇ／０．５ｍｌ；
（Ｃ）　Ｊｏ２　０．１ｍｇとＨＦＥ７Ａ　０．５ｍｇ／０．５ｍｌ（同時投与）；
（Ｄ）　Ｊｏ２　０．１ｍｇとＨＦＥ７Ａ　０．０５ｍｇ／０．５ｍｌ（同時投与）；
（Ｅ）　Ｊｏ２　０．０１ｍｇ／０．２ｍｌ投与後、
２０分後にＨＦＥ７Ａ　０．１ｍｇ／０．２ｍｌを投与。
【０２１２】
その結果を図６に示した。Ｊｏ２の単独投与では、０．１ｍｇ／個体および０．０１ｍｇ／個体いずれの場合（（Ａ）および（Ｂ））も９時間以内にすべてのマウスが死亡した。しかしながら、Ｊｏ２投与時にＨＦＥ７Ａを同時投与（０．５ｍｇ／個体、０．０５ｍｇ／個体）した場合（（Ｃ）および（Ｄ））、マウスは投与数週間経過後も異常を示さなかったことから、ＨＦＥ７Ａ投与により劇症肝炎の発症を阻止できることが判明した。さらに、Ｊｏ２投与２０分後にＨＦＥ７Ａを投与した場合でも、マウスは正常であり外的症状も何ら認められなかったことから、肝臓等でのＦａｓ／Ｆａｓリガンド系を介した正常組織の障害に由来する種々の疾病に対して、ＨＦＥ７Ａが予防および治療効果を有することが示された。
【０２１３】
実施例１２　慢性関節リウマチに対する効果
１）　コラーゲン誘導関節炎に対する発症予防効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスの雌とＤＢＡ／１Ｊマウスの雄との交配で得られたＦ１マウスであるＣＤ１Ｆ１マウス（６週齢の雌、日本チャールスリバー（株）より購入）を１週間馴化させた。文献に記載の方法［Ｐｈａｄｋｅ，　Ｋ．　（１９８５）　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．　１０，　５１−６０参照］に準じて、ウシＩＩ型コラーゲン　０．３％溶液（５０ｍＭ　酢酸溶液、コラーゲン技術研修会製）を５０ｍＭ　酢酸により０．２％（２ｍｇ／ｍｌ）に希釈し、等用量の完全フロイントアジュバント（ディフコ社製）を加えて乳化後、ツベルクリン針を装着したプラスチック製１ｍｌ注射筒を用い、静注用保定器に保定したマウスの尾根部皮内に１００μｌ（ウシＩＩ型コラーゲンとして１００μｇ相当）投与した。初回感作の１週間後に上記と同じ条件で追加免疫した。追加免疫時に１００μｇのＨＦＥ７Ａまたは対照用のマウスＩｇＧを腹腔内投与した（各群６匹）。初回感作後５週目から四肢の腫れが認められるようになった。肉眼的に四肢の関節を観察し、文献記載の方法［Ｗｏｏｄ，　Ｆ．　Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．　（１９６９）　Ｉｎｔ．　Ａｒｃｈ．　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　３５，　４５６−４６７参照］に準じてその腫れの程度をスコア化した。スコアは、各四肢について以下の基準で判定した：
０：症状なし；
１：四肢の指などの小関節が一本のみ腫脹発赤；
２：小関節二本以上あるいは手首や足首などの比較的大きな関節が腫脹発赤；
３：一本の手や足全体が腫脹発赤。
【０２１４】
すなわち、四肢とも最大に腫れた場合の１個体のスコアは１２となる。また、四肢の合計スコアが１以上の個体を「発症マウス」とした。
【０２１５】
結果を図７に示した。非特異的なマウスＩｇＧを投与した対照群では初回感作後７週目までに全てのマウスが発症したのに対し、ＨＦＥ７Ａ投与群のうち半数のマウスは８週目までに全く発症しなかった（図７Ａ）。また、ＨＦＥ７Ａ投与群では対照群と比較して平均スコアが低かった（図７Ｂ）。
【０２１６】
２）　リウマチ患者由来滑膜細胞に対するアポトーシス誘導能
慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞の生存率に与えるＨＦＥ７Ａの影響を、ミトコンドリアの還元能を指標とする以下に記載の方法により検討した。まずヒト慢性関節リウマチ患者患部より採取した滑膜組織を１０％　ウシ胎児血清（サミット社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社製）中でハサミで細切し、脂肪を除去後、終濃度５μｇ／ｍｌとなるようにコラゲナーゼ（シグマ社製）を添加し、９０分間３７℃でインキュベートした。１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で３７℃、５％　炭酸ガスの条件下培養したものを、リウマチ患者由来滑膜細胞とした。
【０２１７】
かくして得られたリウマチ患者由来滑膜細胞をトリプシン処理により単細胞化した後１０％　ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で１×１０５細胞／ｍｌとなるように懸濁してから、９６穴プレートに２×１０４細胞／２００μｌ／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％　炭酸ガス条件で６日間培養した。培養上清を除去後、ハンクス緩衝液（ギブコ社製）で３回洗浄し、ＨＦＥ７Ａを１０ｎｇ／ｍｌ乃至１０００ｎｇ／ｍｌ（１０倍希釈系列）および１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地　２００μｌを添加した。３７℃、５％炭酸ガス条件で２０時間培養後、１ｍｇ／ｍｌ　ＸＴＴ（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド　イナーソルト：シグマ社製）、２５μＭ　ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート：シグマ社製）を５０μｌ（終濃度：２５０μｇ／ｍｌ　ＸＴＴ；５μＭ　ＰＭＳ）を添加してさらに４時間培養後、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０２１８】
各ウェルの細胞の生存率を、下記式により算出した：
生存率（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）
（式中、ａは被検ウェルの測定値、ｂは無細胞ウェルの測定値、ｃは抗体無添加のウェルの測定値をそれぞれ表す。）
その結果を表２に示した。ＨＦＥ７Ａは濃度依存的にリウマチ患者由来滑膜細胞の生存を阻害した。
【０２１９】
【表２】
2004000228.tif 000009
実施例１３　ＨＦＥ７Ａヒト化抗体の設計
（１）ＨＦＥ７Ａの可変領域の分子モデリング
ＨＦＥ７Ａの可変領域の分子モデリングは、一般にホモロジーモデリングとして知られる手法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２０３，　１２１−１５３　（１９９１）　参照］を用いて行なった。すなわち、プロテイン・データ・バンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，　Ｂｕｉｌｄｉｎｇ　５５５，　Ｂｒｒｏｋｈｅａｖｅｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｐ．Ｏ．　Ｂｏｘ　５０００，　Ｕｐｔｏｎ，　ＮＹ　１１９７３−５０００，　Ｕ．Ｓ．Ａ．参照：以下「ＰＤＢ」という）に登録されている、Ｘ線結晶構造解析が行なわれたヒト免疫グロブリンの可変領域の一次配列を、ＨＦＥ７Ａのフレームワーク部分と比較し、相同性の最も高いフレームワークの三次元構造として、軽鎖については１ＧＧＩ、重鎖として２ＨＦＬを選択した。両者を組合せて、フレームワーク部分の三次元構造（以下「フレームワークモデル」という）を構築した。
【０２２０】
チョッチアらの分類に従うと、ＨＦＥ７ＡのＣＤＲのうち、ＣＤＲＬ２はカノニカルクラス１、ＣＤＲＬ３はカノニカルクラス１、ＣＤＲＨ１はカノニカルクラス１に分類された。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３は、特定のカノニカルクラスに対応しなかった。ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ１のＣＤＲループは、各カノニカルクラス固有のコンホメーションに固定し、フレームワークモデルに組み込んだ。ＣＤＲＬ１はソロントンらの分類［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２６３，　８００−８１５　（１９９６）　参照］に従いクラスター１５Ｂのコンホメーションを用いた。ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３については、相同性の高い配列のコンホメーションをＰＤＢより検索し、エネルギー計算を併用することによって、最も確からしいＣＤＲループのコンホメーションを構築し、フレームワークモデルに組み込んだ。最終的には、エネルギー的に不利な原子間の接触をなくすようにエネルギー計算を行ない、ＨＦＥ７Ａの分子モデルを得た。上述の操作は市販の一般的な分子モデリングシステムを用いて行い得るが、本発明では、ＡｂＭ（オックスフォード・モレキュラー・リミテッド社製）を用いた。
【０２２１】
得られた分子モデルについては、ソフトウエアのプロチェック（ＰＲＯＣＨＥＣＫ：Ｊ．Ａｐｐｌ．　Ｃｒｙｓｔ．　（１９９３）　２６，　２８３−２９１参照）を用いて、構造の精度を評価した後、各残基の表面露出度を計算し、原子間接触の有無を検索した。
【０２２２】
（２）アクセプターの選択
ＨＦＥ７Ａの軽鎖、重鎖のサブグループは、ヒト抗体の各サブグループのコンセンサス配列との比較において、軽鎖ではサブグループκＩＶと７９％、重鎖ではサブグループＩと７９％の同一性を示した。しかし、この組合せを持つヒト抗体は存在しなかった。軽鎖、重鎖が同一の抗体に由来し、かつ、いずれも７０％以上の同一性を示すヒト抗体として、軽鎖がサブグループκＩＩＩ、重鎖がサブグループＩである８Ｅ１０’ＣＬを選択した。
【０２２３】
（３）アクセプターに移植するドナー残基の選択
ソフトウエアのカメレオン（オックスフォード・モレキュラー・リミテッド社製）を用いて、ＨＦＥ７Ａの軽鎖、重鎖それぞれとアクセプターのアミノ酸配列を整列し、先に述べたａ）からｄ）の要件に従い、以下の実施例に示すヒト化可変領域配列をデザインし、抗ヒトＦａｓヒト化抗体をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を含む組換えベクターとして、以下のプラスミドを構築した。
【０２２４】
実施例１４　ヒト化軽鎖をコードするＤＮＡの調製
（１）ヒト軽鎖（κ鎖）の全長をコードするｃＤＮＡのクローニング
マウス抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａの軽鎖アミノ酸配列をヒト化するに先立ち、定常領域を含むヒトイムノグロブリン（以下「Ｉｇ」という）軽鎖ｃＤＮＡのクローニングを行なった。
【０２２５】
１）プライマーの合成
ヒト軽鎖をコードするｃＤＮＡの分離は、ＰＣＲにより行なった。ＰＣＲを行なうにあたり、以下に記載する２種のプライマーを合成した：
５’−　ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＧ　ＣＣＴＴＧＡＣＴＧＡ　ＴＣＡＧＡＧＴＴＴＣ　ＣＴＣＡ　−３’　（ＨＶＫＩＩ５−４：配列表の配列番号４７）；
５’−　ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧ　ＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡ　ＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧ　ＧＡ　−３’　（ＨＫＣＬ３−３：配列表の配列番号４８）。
【０２２６】
２）ヒトＩｇ軽鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドの構築
ヒトＩｇ軽鎖の全長を含むｃＤＮＡは、ＰＣＲ法により作製され、プラスミド中に挿入された後、大腸菌でクローニングされた。
【０２２７】
ヒトＩｇ軽鎖の全長をコードするＨＬ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
2004000228.tif 000010
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量１００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２２８】
このようにして作製されたＨＬ−ＤＮＡ断片は、真核生物用ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）を用い、メーカー指定のプロトコールに従って、プラスミドｐＣＲ３ＤＮＡに挿入し、同キットに予め添付されているコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’株に導入した。これにより、ヒトＩｇ軽鎖のｃＤＮＡであるＨＬ−ＤＮＡ断片を保持するプラスミドｐＨＬ１５−２７を得た。
【０２２９】
（２）　ＨＦＥ７Ａのヒト化抗体軽鎖発現ベクターの構築
１）ヒト化ＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現ベクタープラスミドの構築
マウス抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａの軽鎖アミノ酸配列をヒト化するにあたり、ＨＦＥ７Ａ軽鎖アミノ酸配列のＮ末端側から４７番目のアミノ酸（プロリン）と４９番目のアミノ酸（リジン）（以下「領域Ｉ」という）をそれぞれヒト軽鎖（κ鎖）で保存されているアラニンおよびアルギニンに置き換えるとともに、８０番目のアミノ酸（ヒスチジン）、８１番目のアミノ酸（プロリン）、８２番目のアミノ酸（バリン）、８４番目のアミノ酸（グルタミン酸）、８５番目のアミノ酸（グルタミン酸）、８７番目のアミノ酸（アラニン）および８９番目のアミノ酸（スレオニン）（以下「領域ＩＩ」という）をそれぞれヒト軽鎖（κ鎖）で保存されているセリン、アルギニン、ロイシン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリンに置き換えたものを「ＨＨタイプ」とした。
【０２３０】
また、領域Ｉをヒトのアミノ酸残基に置き換え、領域ＩＩをマウスのアミノ酸残基のままとしたものを「ＨＭタイプ」とした。
【０２３１】
さらに、領域Ｉ、領域ＩＩともマウスのアミノ酸残基のままとしたものを「ＭＭタイプ」とした。
【０２３２】
以下、この３種類のヒト化抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ−軽鎖アミノ酸配列を有する発現プラスミドをそれぞれ構築した。
【０２３３】
２）ヒト化ＨＦＥ７Ａの軽鎖可変および定常領域作製用プライマーの合成
各ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可変領域とヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域を融合した、ＨＨタイプポリペプチド鎖（配列表の配列番号５０）をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号４９）、ＨＭタイプポリペプチド鎖（配列表の配列番号５２）をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号５１）およびＭＭタイプポリペプチド鎖（配列表の配列番号５４）をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号５３）の合成は、それぞれＰＣＲ法を組み合わせて行なった。
【０２３４】
ＰＣＲを行うにあたり、以下に記載する１３種のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
５’−　ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡ　ＡＧＡＡＧＣＡＴＣＣ　ＴＣＴＣＡＴＣＴＡＧ　ＴＴＣＴ　−３’（７ＡＬ１Ｐ：配列表の配列番号５５）；
５’−　ＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧ　ＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣ　ＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡ　ＧＡＣＡＡＡＧＴＡＣ　ＣＴＧＧ　−３’（７ＡＬ１Ｎ：配列表の配列番号５６）；
５’−　ＣＣＡＧＧＴＡＣＴＴ　ＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣ　ＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧ　ＡＧＧＧＣＣＡＣＣＣ　ＴＣＴＣ　−３’（７ＡＬ２Ｐ：配列表の配列番号５７）；
５’−　ＧＡＴＴＣＧＡＧＡＴ　ＴＧＧＡＴＧＣＡＧＣ　ＡＴＡＧＡＴＧＡＧＧ　ＡＧＴＣＴＧＧＧＴＧ　ＣＣＴＧ　−３’（７ＡＬ２Ｎ：配列表の配列番号５８）；
５’−　ＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡ　ＡＴＣＴＣＧＡＡＴＣ　ＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡ　ＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡ　ＧＴＧＧＣ　−３’　（７ＡＬ３ＰＡ：配列表の配列番号５９）；
５’−　ＡＡＡＡＴＣＣＧＣＣ　ＧＧＣＴＣＣＡＧＡＣ　ＧＡＧＡＧＡＴＧＧＴ　ＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧ　ＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧ　ＡＣ　−３’　（７ＡＬ３Ｎ：配列表の配列番号６０）；
５’−　ＣＴＣＧＴＣＴＧＧＡ　ＧＣＣＧＧＣＧＧＡＴ　ＴＴＴＧＣＡＧＴＣＴ　ＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡ　ＧＣＡＡＡＧＴＡＡＴ　ＧＡＧＧＡＴＣＣ　−３’　（７ＡＬ４Ｐ：配列表の配列番号６１）；
５’−　ＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡ　ＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣ　ＡＣＡＧＴＣＣＧＴＴ　ＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧ　ＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴ　ＴＧＡＣＣ　−３’（７ＡＬ４Ｎ：配列表の配列番号６２）；
５’−　ＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡ　ＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡ　ＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧ　ＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧ　ＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴ　ＣＴＴＣＡ　−３’（７ＡＬＣＰ：配列表の配列番号６３）；
５’−　ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴ　ＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴ　ＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴ　ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴ　ＧＴＧＡＣ　−３’　（７ＡＬＣＮ：配列表の配列番号６４）；
５’−　ＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧ　ＡＣＣＣＡＣＴＧＣＣ　ＡＣＴＡＡＡＣＣＴＧ　ＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣ　ＣＡＧＡＴＴＣＧＡＧ　ＡＴＴＧＧ　−３’（Ｍ７ＡＬ２Ｎ：配列表の配列番号６５）；
５’−　ＧＴＴＴＡＧＴＧＧＣ　ＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧ　ＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴ　ＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣ　ＡＴＣＣＡＴＣＣＴＧ　ＴＧＧＡＧ　−３’（Ｍ７ＡＬ３ＰＡ：配列表の配列番号６６）；
５’−　ＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣ　ＣＡＣＡＧＴＣＣＧＴ　ＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡ　ＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣ　ＴＴＧＡＣＣＧＡＡＣ　ＧＴＣＣＧ　−３’（７ＡＬ４ＮＡ：配列表の配列番号６７）。
３）プラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨの構築（ヒト化ＨＨタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミド）
配列表の配列番号５０に示すアミノ酸をコードする配列表の配列番号４９に示すＶＨＨ−ＤＮＡ断片は、三段階のＰＣＲを実施することにより作製され、プラスミドベクター中に挿入された後、大腸菌でクローニングされた。
【０２３５】
ａ）第一段階ＰＣＲ
ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図８に示した。
【０２３６】
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加した、分泌シグナル配列およびＦＲＬ１領域の一部をコードするＬ７Ａ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｌ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｎ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２３７】
ＦＲＬ１の一部、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２およびＣＤＲＬ２領域の一部をコードするＬ７Ａ２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｌ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ２Ｐ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ２Ｎ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２３８】
ＣＤＲＬ２およびＦＲＬ３の一部をコードするＬ７Ａ３−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｌ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ３ＰＡ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ３Ｎ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２３９】
ＦＲＬ３の一部、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４および定常領域の一部をコードするＬ７Ａ４−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｌ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ４Ｐ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ４Ｎ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２４０】
ＦＲＬ４の一部および定常領域をコードし、３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加したＬ７Ａ５−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＨＬ１５−２７　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＰ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２４１】
ＰＣＲ後の各生成物２００μｌに、等量のフェノール・クロロホルム（５０％水飽和フェノール、４８％　クロロホルム、２％　イソアミルアルコール）を加え、１分間、激しく攪拌した。その後、１００００×ｇの遠心分離を行い、水層を回収した。得られた水層に、等量のクロロホルム・イソアミルアルコール（９６％　クロロホルム、４％　イソアミルアルコール）を加え、再び１分間激しく攪拌し、１００００×ｇの遠心分離により、水層を回収した（以後、この一連の操作を「フェノール抽出」という）。
【０２４２】
回収された上清に、１／１０倍量の３Ｍ　酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と、２．５倍量のエタノールを加え、ドライアイスにより凍結後、１００００×ｇの遠心分離を行ない、ＤＮＡを沈澱として回収した（以後、この一連の操作を「エタノール沈澱」という）。
【０２４３】
得られたＤＮＡ沈澱物は、真空乾燥後、再蒸留水に溶解し、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＬ７Ａ１−ＤＮＡ、Ｌ７Ａ２−ＤＮＡ、Ｌ７Ａ３−ＤＮＡ、Ｌ７Ａ４−ＤＮＡおよびＬ７Ａ５−ＤＮＡに相当するＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０２４４】
ｂ）第二段階ＰＣＲ
ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図９に示した。
【０２４５】
前出Ｌ７Ａ１−ＤＮＡ断片とＬ７Ａ２−ＤＮＡ断片を融合したＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ１−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ２−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ２Ｎ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２４６】
前出Ｌ７Ａ４−ＤＮＡ断片とＬ７Ａ５−ＤＮＡ断片を融合したＬ７Ａ４．５−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ４−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ５−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ４Ｐ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２４７】
ＰＣＲ後の増幅されたＬ７Ａ１．２−ＤＮＡおよびＬ７Ａ４．５−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出した各融合ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０２４８】
ｃ）第三段階ＰＣＲ
ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要を図１０に示した。
【０２４９】
前出Ｌ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片とＬ７Ａ４．５−ＤＮＡ断片およびＬ７Ａ３−ＤＮＡを融合したＶＨＨ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第二段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ溶液　　　１０μｌ
第二段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ４．５−ＤＮＡ溶液　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ３−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２５０】
ＰＣＲ後の増幅されたＶＨＨ−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＶＨＨ−ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００ｘｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０２５１】
ＶＨＨ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラスミド作製方法の概要は図１１に示した。
【０２５２】
得られたＶＨＨ−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化した。
【０２５３】
クローニング用プラスミドｐＨＳＧ３９９　ＤＮＡ（宝酒造（株）社製）１μｇを、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、アルカリフォスファターゼ（ウシ腸由来：以下「ＣＩＰ」という）で脱リン酸化した。このようにして得られた脱リン酸化プラスミドｐＨＳＧ３９９　ＤＮＡと、予め制限酵素で消化したＶＨＨ−ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット　バージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用い、メーカー指定のプロトコールに従って連結した。
【０２５４】
連結したＤＮＡは、エタノール沈澱で回収し、５μｌの再蒸留水に溶解し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９エレクトロ−セル（宝酒造（株）社製）と混合した。混合物を、ジーンパルサー／Ｅ．ｃｏｌｉパルサーキュベット　０．１ｃｍ（バイオラッド社製）に移し、メーカー指定のプロトコールに従い、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド社製）にて大腸菌ＪＭ１０９株に導入した（以下、この一連の操作を「形質転換」という）。形質転換操作を終えた菌体は、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド、宝酒造（株）社製）、０．１％のＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、宝酒造（株）社製）および５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）　１０ｇ、バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）　５ｇ、塩化ナトリウム　１０ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）　１５ｇ。蒸留水に溶解し、１リットルとする］上に塗布し、３７℃で一晩培養し、大腸菌形質転換体を得た。
【０２５５】
得られた白色を呈する形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）　１０ｇ、バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）　５ｇ、塩化ナトリウム　１０ｇ。蒸留水に溶解し、１リットルとする］２ｍｌ中で、３７℃にて一晩培養し、得られた培養物からアルカリ・ＳＤＳ法［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８９）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ．”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ．］に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０２５６】
抽出したプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、１％　アガロースゲル電気泳動解析により、ＶＨＨ−ＤＮＡ断片を保持するクローンを選択した。
【０２５７】
以上の操作により、ヒト化ＨＨタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡとの融合断片を保持するプラスミドｐＨＳＧＨＨ７を得た。なお、プラスミドｐＨＳＧＨＨ７を保持する形質転換大腸菌　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＨ７　ＳＡＮＫ　７３４９７は、平成９年８月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７３が付された。
【０２５８】
ヒト化ＨＨタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖ポリペプチド（配列表の配列番号５０）をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号４９）を保持する発現ベクタープラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨは、前出プラスミドｐＨＳＧＨＨ７を用いて作製した。
【０２５９】
哺乳動物細胞用発現プラスミドベクターｐＥＥ．１２．１（ロンザ社製）ＤＮＡ　１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＥＥ．１２．１　ＤＮＡ　１００ｎｇと、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＨＳＧＨＨ７　ＤＮＡ断片１０μｇとをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。
【０２６０】
得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、１％　アガロースゲル電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認した。このようにして、ヒト化ＨＨタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡとの融合断片が、サイトメガロウイルス（以下ＣＭＶという）プロモーター下流に正方向で挿入されたプラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨを得た。
【０２６１】
４）プラスミドｐ７ＡＬ−ＨＭの構築（ヒト化ＨＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミド）
配列表の配列番号５２に示すアミノ酸をコードする配列表の配列番号５１に示すＶＨＭ−ＤＮＡ断片は、二段階のＰＣＲを実施することにより作製され、プラスミドベクター中に挿入された後、大腸菌でクローニングされた。
【０２６２】
ａ）第一段階ＰＣＲ
ＶＨＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図１２に示した。
【０２６３】
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加した、分泌シグナル配列およびＦＲＬ１の一部をコードするＬ７Ａ１−ＤＮＡ断片、ＦＲＬ１の一部、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２およびＣＤＲＬ２の一部をコードするＬ７Ａ２−ＤＮＡ断片、およびＦＲＬ４の一部および定常領域をコードし、３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加したＬ７Ａ５−ＤＮＡ断片は、ＶＨＨ−ＤＮＡ断片作製で得られたものを用いた［”（２）プラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨの構築（ヒト化ＨＨタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミド）”および”ａ）第一段階ＰＣＲ”参照］。
【０２６４】
ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４および定常領域の一部をコードするＭＬ７Ａ３−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｌ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ３ＰＡ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ４ＮＡ　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２６５】
ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＭＬ７Ａ３−ＤＮＡに相当するＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００ｘｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０２６６】
ｂ）第二段階ＰＣＲ
ＶＨＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図１３に示した。
【０２６７】
前出Ｌ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片とＭＬ７Ａ３−ＤＮＡ断片および前出Ｌ７Ａ５−ＤＮＡ断片を融合したＶＨＭ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第二段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ溶液　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＭＬ７Ａ３−ＤＮＡ溶液　　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ５−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ　とし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２６８】
ＰＣＲ後の増幅されたＶＨＭ−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＶＨＭ−ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０２６９】
ＶＨＭ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラスミド作製方法の概要は図１４に示した。
【０２７０】
得られたＶＨＭ−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した。
【０２７１】
クローニング用プラスミドｐＨＳＧ３９９　ＤＮＡ（宝酒造（株）社製）１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９　ＤＮＡと、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＶＨＭ−ＤＮＡ断片とをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた白色を呈する形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、１％　アガロースゲル電気泳動解析を行って、ＶＨＭ−ＤＮＡ断片を保持するクローンを選択した。
【０２７２】
以上の操作により、ヒト化ＨＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡとの融合断片を保持するプラスミドｐＨＳＧＨＭ１７を得た。なお、プラスミドｐＨＳＧＨＭ１７を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＭ１７　ＳＡＮＫ　７３５９７は、平成９年８月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７２が付された。
【０２７３】
配列表の配列番号５２に例示したヒト化ＨＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖ポリペプチドをコードする配列表の配列番号５１に例示したＤＮＡを保持する発現ベクタープラスミドｐ７ＡＬ−ＨＭは、前出プラスミドｐＨＳＧＨＭ１７を用いて作製した。
【０２７４】
哺乳動物細胞用発現プラスミドベクターｐＥＥ．１２．１　ＤＮＡ　１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＥＥ．１２．１　ＤＮＡ　１００ｎｇと、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＨＳＧＨＭ１７−ＤＮＡ断片１０μｇとをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認した。このようにして、ヒト化ＨＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡとの融合断片が、ＣＭＶプロモーター下流に正方向で挿入されたプラスミドｐ７ＡＬ−ＨＭを得た。
【０２７５】
５）プラスミドｐ７ＡＬ−ＭＭの構築（ヒト化ＭＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミド）
配列表の配列番号５４に示すアミノ酸をコードする、配列表の配列番号５３に示すＶＭＭ−ＤＮＡ断片は、三段階のＰＣＲを実施することにより作製され、プラスミドベクター中に挿入された後、大腸菌でクローニングされた。
【０２７６】
ａ）第一段階ＰＣＲ
ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図１５に示した。
【０２７７】
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を付加した、分泌シグナル配列およびＦＲＬ１の一部をコードするＬ７Ａ１−ＤＮＡ断片、ならびに、ＦＲＬ４の一部および定常領域をコードし、３’末端にＥｃｏＲＩ切断部位を付加したＬ７Ａ５−ＤＮＡ断片は、ＶＨＨ−ＤＮＡ断片作製で得られたものを用いた［”（２）プラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨの構築（ヒト化ＨＨタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミド）”および”ａ）第一段階ＰＣＲ”参照］。
【０２７８】
ＦＲＬ１の一部、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２およびＦＲＬ３の一部をコードするＭＬ７Ａ２Ｍ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｌ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ２Ｐ　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭ７ＡＬ２Ｎ　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２７９】
ＦＲＬ３の一部、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４および定常領域の一部をコードするＭＬ７Ａ３Ｍ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｌ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　Ｍ７ＡＬ３ＰＡ　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬ４ＮＡ　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２８０】
ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＭＬ７Ａ２Ｍ−ＤＮＡおよびＭＬ７Ａ３Ｍ−ＤＮＡに相当するＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０２８１】
ｂ）第二段階ＰＣＲ
ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図１６に示した。
前出Ｌ７Ａ１−ＤＮＡ断片とＭＬ７Ａ２Ｍ−ＤＮＡ断片を融合したＭＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ１−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＭＬ７Ａ２Ｍ−ＤＮＡ溶液　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬ１Ｐ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　Ｍ７ＡＬ２Ｎ　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２８２】
ＰＣＲ後の増幅されたＭＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出した融合ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０２８３】
ｃ）第三段階ＰＣＲ
ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要を図１７に示した。
【０２８４】
前出ＭＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片とＭＬ７Ａ３Ｍ−ＤＮＡ断片およびＬ７Ａ５−ＤＮＡ断片を融合したＶＭＭ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第二段階ＰＣＲで作製したＭＬ７Ａ１．２−ＤＮＡ溶液　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＭＬ７Ａ３Ｍ−ＤＮＡ溶液　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＬ７Ａ５−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬ１Ｐ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬＣＮ　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌ　とし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０２８５】
ＰＣＲ後の増幅されたＶＭＭ−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＶＭＭ−ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０２８６】
ＶＭＭ−ＤＮＡ断片を保持するプラスミド作製方法の概要は図１８に示した。
【０２８７】
得られたＶＭＭ−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した。
【０２８８】
クローニング用プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）社製）ＤＮＡ　１μｇをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９　ＤＮＡと、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＶＭＭ−ＤＮＡ断片とをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた白色を呈する形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、１％　アガロースゲル電気泳動解析により、ＶＭＭ−ＤＮＡ断片を保持するクローンを選択した。
【０２８９】
以上の操作により、ヒト化ＭＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡとの融合断片を保持するプラスミドｐＨＳＧＭＭ６を得た。なお、プラスミドｐＨＳＧＭＭ６を保持する形質転換大腸菌　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＭＭ６　ＳＡＮＫ　７３６９７は、平成９年８月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７１が付された。
【０２９０】
配列表の配列番号５４に例示したヒト化ＭＭタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖ポリペプチドをコードする配列表の配列番号５３に例示したＤＮＡを保持する発現ベクタープラスミドｐ７ＡＬ−ＭＭは、前出プラスミドｐＨＳＧＭＭ６を用いて作製した。
【０２９１】
哺乳動物細胞用発現プラスミドベクターｐＥＥ．１２．１　ＤＮＡ　１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＥＥ．１２．１　ＤＮＡ　１００ｎｇと、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＨＳＧＭＭ６　ＤＮＡ断片１０μｇとをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認した。このようにして、ヒト化ＨＦＥ７Ａ−軽鎖ＭＭタイプの可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡとの融合断片が、ＣＭＶプロモーター下流に正方向で挿入されたプラスミドｐ７ＡＬ−ＭＭを得た。
【０２９２】
６）ヌクレオチド配列の確認
プラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨ、ｐ７ＡＬ−ＨＭおよびｐ７ＡＬ−ＭＭの挿入ＤＮＡが、目的とするヌクレオチドの配列を保持していることを確認するため、ヌクレオチド配列の決定を行なった。ヌクレオチドの配列を決定するにあたり作製したオリゴヌクレオチドプライマーは以下に記載する通りであった：
５’−　ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡ　ＡＧＡＡＧＣＡＴＣＣ　−３’　　（ＳＰ１：配列表の配列番号６８）；
５’−　ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧ　ＣＡＴＣＣＡＡＴＣＴ　−３’　　（ＳＰ２：配列表の配列番号６９）；
５’−　ＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣ　ＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡ　−３’　　（ＳＰ３：配列表の配列番号７０）；
５’−　ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴ　ＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴ　−３’　　（ＳＰ４：配列表の配列番号７１）；
５’−　ＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡ　ＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣ　−３’　　（ＳＰ５：配列表の配列番号７２）；
５’−　ＡＧＡＴＴＧＧＡＴＧ　ＣＡＧＣＡＴＡＧＡＴ　−３’　　（ＳＰ６：配列表の配列番号７３）。
【０２９３】
各プライマーが結合する位置を、図１９に示した。ヌクレオチド配列の決定は、アルカリ・ＳＤＳ法と塩化セシウム法［いずれもＳａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９　）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ．”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ．参照］により精製した各プラスミドＤＮＡを鋳型とし、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Ｓａｎｇｅｒ，　Ｆ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．（１９７７）　Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　７４，　５４６３参照］で行なった。すなわち、３μｇの精製したプラスミドＤＮＡを１３μｌの再蒸留水に溶解し、２μｌの２ｍＭ　ＥＤＴＡと２μｌの２Ｎ　ＮａＯＨを加え、室温で５分間静置した。その後、４μｌの１０Ｍ　酢酸アンモニウム溶液と１００μｌのエタノールを加え、撹袢の後ドライアイス上で１０分間静置した。１５０００×ｇの遠心分離の後、得られた沈澱を８０％　エタノールで洗浄後、真空乾燥した。真空乾燥したＤＮＡを７μｌの再蒸留水に溶解し、ヌクレオチド配列決定反応に用いた。ヌクレオチド配列決定反応は７−デアザ−シークエナーゼ・バージョン２．０・キット（ｄＣＴＰ用：アマシャム社製）を用いた。前出プラスミド溶液７μｌに、予め合成したプライマー１ｐｍｏｌと、１μｌの反応緩衝液（キットに予め添付されている緩衝液）を加え、６５℃で２分間保温した。その後、室温まで徐冷しプライマーとアニーリングさせ、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム社製）で標識した。反応産物は、１×ＴＢＥ（１００ｍＭ　トリス、１００ｍＭ　ホウ酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）緩衝液中、８Ｍ尿素を含む５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。ゲルを乾燥した後、オートラジオグラフィーを行いヌクレオチド配列を解読した（以後、ヌクレオチド配列の決定は、上記方法により行なった）。
【０２９４】
その結果、ｐ７ＡＬ−ＨＨは、配列表の配列番号５０に示したポリペプチドをコードする配列表の配列番号４９に示すヌクレオチド配列を、ｐ７ＡＬ−ＨＭは、配列表の配列番号５２に示したポリペプチドをコードする配列表の配列番号５１に示すヌクレオチド配列を、ｐ７ＡＬ−ＭＭは、配列表の配列番号５４に示したポリペプチドをコードする配列表の配列番号５３に示すヌクレオチド配列をそれぞれ保持していることが確認された。
【０２９５】
実施例１５　ＨＦＥ７Ａのヒト化抗体重鎖発現ベクターの構築
（１）ヒト化ＨＦＥ７Ａの重鎖可変領域ＤＮＡを保持するプラスミドの構築
１）ヒト化重鎖可変領域作製用プライマーの合成
ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ−重鎖の可変領域と、ＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端側５残基のアミノ酸を含むポリペプチド鎖（配列表の配列番号７５）をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号７４）の合成は、ＰＣＲ法を組み合わせて行なった。
【０２９６】
ＰＣＲを行なうにあたり、以下に記載する８種のプライマーを作製した：
５’−　ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧ　ＧＣＴＴＧＡＣＣＴＣ　ＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴ　ＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴ　−３’　（７ＡＨ１Ｐ：配列表の配列番号７６）；
５’−　ＴＧＡＡＧＣＣＣＣＡ　ＧＧＣＴＴＣＴＴＧＡ　ＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣ　ＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣ　ＡＧＴＴＧＧＡＣ　−３’（７ＡＨ１ＮＮＥＷ：配列表の配列番号７７）；
５’−　ＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧ　ＣＣＴＣＴＧＴＣＣＡ　ＧＧＧＧＣＣＴＧＴＴ　ＴＴＡＣＣＣ　−３’　（７ＡＨ２Ｎ：配列表の配列番号７８）；
５’−　ＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴ　ＧＡＧＧＴＣＡＡＧＡ　ＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣ　ＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧ　ＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡ　ＡＧ　−３’（７ＡＨ２ＰＮＥＷ：配列表の配列番号７９）；
５’−　ＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧ　ＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴ　ＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧ　ＧＧＡＧＡＧＡＴＴ　−３’（７ＡＨ３Ｐ：配列表の配列番号８０）；
５’−　ＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡ　ＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧ　ＣＴＣＣＡＴＧＴＡＧ　ＧＣＴＧＴＧＣＴＡＧ　ＣＧＧＡＴＧＴＧＴＣ　−３’（７ＡＨ３Ｎ：配列表の配列番号８１）；
５’−　ＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧ　ＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡ　ＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡ　ＣＧＧＣＧＧＴＣＴＡ　ＴＴＡＣ　−３’（７ＡＨ４Ｐ：配列表の配列番号８２）；
５’−　ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴ　ＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣ　ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧ　ＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧ　ＴＣＣＣＴＴＣＧＣＣ　ＣＣＡＧＴ　−３’（７ＡＨ４Ｎ：配列表の配列番号８３）。
【０２９７】
２）プラスミドｐＢＬ７Ａ２７の構築
配列表の配列番号７５に示すアミノ酸をコードする配列表の配列番号７４に示すＶＤ−ＤＮＡ断片は、三段階のＰＣＲを実施することにより作製され、プラスミドへ挿入された後、大腸菌でクローニングされた。
【０２９８】
ａ）第一段階ＰＣＲ
ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図２０に示した。
【０２９９】
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加した、分泌シグナル配列およびＦＲＨ１のＮ末端側をコードするＨ７Ａ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｈ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ１Ｐ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ１ＮＮＥＷ　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３００】
ＦＲＨ１の一部、ＣＤＲＨ２およびＦＲＨ２の一部をコードするＨ７Ａ２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｈ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ２Ｎ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ２ＰＮＥＷ　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３０１】
ＦＲＨ２の一部、ＣＤＲＨ２およびＦＲＨ３の一部をコードするＨ７Ａ３−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｈ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ３Ｐ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ３Ｎ　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３０２】
ＦＲＨ３の一部、ＣＤＲＨ３、ＦＲＨ４およびＣＨ１領域のＮ末端側５アミノ酸残基をコードするＨ７Ａ４−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ−Ｈ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ４Ｐ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ４Ｎ　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３０３】
ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１　μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＨ７Ａ１−ＤＮＡ、Ｈ７Ａ２−ＤＮＡ、Ｈ７Ａ３−ＤＮＡおよびＨ７Ａ４−ＤＮＡに相当するＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３０４】
ｂ）第二段階ＰＣＲ
ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図２１に示した。
【０３０５】
前出Ｈ７Ａ１−ＤＮＡ断片とＨ７Ａ２−ＤＮＡ断片を融合したＨ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第一段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ１−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ２−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ１Ｐ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ２Ｎ　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３０６】
前出Ｈ７Ａ３−ＤＮＡ断片とＨ７Ａ４−ＤＮＡ断片を融合したＨ７Ａ３．４−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第一段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ３−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ４−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ３Ｐ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ４Ｎ　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３０７】
ＰＣＲ後の増幅されたＨ７Ａ１．２−ＤＮＡおよびＨ７Ａ３．４−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出した各融合ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３０８】
ｃ）第三段階ＰＣＲ
ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要を図２２に示した。
【０３０９】
前出Ｈ７Ａ１．２−ＤＮＡ断片とＨ７Ａ３．４−ＤＮＡ断片を融合したＶＤ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第二段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ１．２−ＤＮＡ溶液　　　１０μｌ
第二段階ＰＣＲで作製したＨ７Ａ３．４−ＤＮＡ溶液　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ１Ｐ　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ４Ｎ　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３１０】
ＰＣＲ後の増幅されたＶＤ−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＶＤ−ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３１１】
ＶＤ−ＤＮＡ断片を保持するプラスミド作製方法の概要は図２３に示した。
【０３１２】
得られたＶＤ−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩで消化した。
【０３１３】
プラスミドベクター　ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＩＩ　ＳＫ＋　ＤＮＡ（ストラタジーン社製）１μｇをＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＩＩ　ＳＫ＋　ＤＮＡと、ＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩで消化したＶＤ−ＤＮＡ断片とをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド、宝酒造（株）社製）、０．１％のＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、宝酒造（株）社製）および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた白色を呈する形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドをＡｐａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認した。このようにして、ＶＤ−ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＢＬ７Ａ２７を得た。
【０３１４】
（２）ヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡを保持するプラスミドの構築
１）ヒトＩｇＧ１　ゲノム５’側ＤＮＡ断片作製用プライマーの合成
ヒトＩｇＧ１ゲノム５’側ＤＮＡ断片の合成は、ＰＣＲ法を用いて作製した。ＰＣＲを行なうにあたり、以下に記載する２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを作製した：
５’−　ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣ　ＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡ　ＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣ　ＴＣＴＣＴＴＧＣＡ　−３’（５’Ｈｉｎｄ：配列表の配列番号８４）；
５’−　ＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡ　ＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧ　ＧＧＡＧＴＴＡＣＴＧ　ＧＡＡＴＣ　−３’（ＩＧＧＣＰＳＴＮ：配列表の配列番号８５）。
【０３１５】
２）プラスミドｐＩＧ５’０３の構築
ＨｉｎｄＩＩＩ切断配列に続き、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域とイントロンを含むゲノムＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により目的ＤＮＡ断片を分離増幅した後に、プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）社製）中に挿入され、大腸菌でクローン化された。目的とするヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域とイントロンを含むＤＮＡ（以下「ＩＧ５’−ＤＮＡ」という）断片の作製法の概要を図２４に示した。
【０３１６】
ＩＧ５’−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
ヒトゲノミックＤＮＡ（クローンテック社製）　　　　　　　２μｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　５’Ｈｉｎｄ　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＩＧＧＣＰＳＴＮ　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３１７】
ＰＣＲ後の増幅されたＩＧ５’−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１　μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＩＧ５’−ＤＮＡバンドを、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３１８】
得られたＩＧ５’−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化した。
【０３１９】
プラスミドｐＨＳＧ３９９　ＤＮＡ（宝酒造（株）社製）１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化プラスミドｐＨＳＧ３９９　ＤＮＡと、ＨｉｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化したＩＧ５’−ＤＮＡ断片とをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた白色を呈する形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドをＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認した。このようにして、ＩＧ５’−ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＩＧ５’０３を得た。
【０３２０】
（３）ヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡを保持するプラスミドの構築
１）ヒトＩｇＧ１ゲノム３’側ＤＮＡ断片作製用プライマーの合成
ヒトＩｇＧ１ゲノム３’側ＤＮＡ断片の合成は、ＰＣＲ法を用いて作製した。ＰＣＲを行なうにあたり、以下に記載する２種類のプライマーを作製した：
５’−　ＴＣＴＣＴＧＣＡＧＡ　ＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴ　ＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡ　ＣＴＣＡＣ　−３’（ＩＧＧＣＰＳＴＰ：配列表の配列番号８６）；
５’−　ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧ　ＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣ　ＴＴＧＣＣＧＧＣＣＧ　ＴＣＧＣＡＣＴＣＡ　−３’（Ｅｃｏ３’：配列表の配列番号８７）。
【０３２１】
２）プラスミドｐＩＧ３’０８の構築
ヒトＩｇＧ１のイントロン、ヒンジ領域、イントロン、ＣＨ２領域、イントロン、ＣＨ３領域およびＥｃｏＲＩ切断配列を保持するＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により目的ＤＮＡ断片を分離増幅した後に、プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）社製）中に挿入され、大腸菌でクローン化された。目的とするヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域および、イントロンを含むゲノムＤＮＡ（以下「ＩＧ３’−ＤＮＡ」という）断片の作製法の概要を図２５に示した。
【０３２２】
ＩＧ３’−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
ヒトゲノミックＤＮＡ（クローンテック社製）　　　　　　　２μｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＩＧＧＣＰＳＴＰ　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　Ｅｃｏ３’　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３２３】
ＰＣＲ後の増幅されたＩＧ３’−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出した各ＤＮＡ断片を、剃刀で切り出し、セントリコン−１０およびセントリリューターを用いてゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３２４】
得られたＩＧ３’−ＤＮＡ断片を、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化した。
【０３２５】
プラスミドｐＨＳＧ３９９　ＤＮＡ（宝酒造（株）社製）１μｇをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９ＤＮＡと、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したＩＧ３’−ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。白色コロニーを選択し、ＩＧ３’−ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＩＧ３’０８を得た。
【０３２６】
（４）ヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖発現ベクタープラスミドの構築
配列表の配列番号８９に示したヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖ポリペプチドをコードする、配列表の配列番号８８に示したＤＮＡを保持する発現ベクタープラスミドｐＥｇ７ＡＨ−Ｈは、前出プラスミドｐＢＬ７Ａ２７、ｐＩＧ５’０３および、ｐＩＧ３’０８を用いて作製した。作製手順の概要を図２６に示した。
【０３２７】
ヒトＩｇＧ１−重鎖のＣＨ１領域とイントロンを含むｐＩＧ５’０３プラスミドＤＮＡ　１０μｇを、制限酵素ＡｐａＩと制限酵素ＫｐｎＩで消化した。一方、前出プラスミドｐＢＬ７Ａ２７　ＤＮＡ　１　μｇを、制限酵素ＡｐａＩとＫｐｎＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＢＬ７Ａ２７　ＤＮＡ　１００ｎｇと、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＩＧ５’０３　ＤＮＡ１０μｇとをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株でクローニングした。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドをＡｐａＩとＫｐｎＩ、あるいはＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行うことにより目的の挿入断片の有無を確認した。このようにして、ヒト化ＨＦＥ７ＡのＶＤ−ＤＮＡ断片とＩＧ５’−ＤＮＡ断片が接続され、挿入されたプラスミドｐＢＬ７ＡＦ１８４を得た。
【０３２８】
次に、得られたプラスミドｐＢＬ７ＡＦ１８４　ＤＮＡ　１０μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化した。一方、前出プラスミドｐＩＧ３’０８ＤＮＡ　１μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＩＧ３’０８　ＤＮＡ　１００ｎｇと、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＢＬ７ＡＦ１８４　ＤＮＡ　１０μｇを、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造（株）社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株でクローニングした。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドをＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩあるいはＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認した。このようにして、ヒト化ＨＦＥ７ＡのＶＤ−ＤＮＡ断片と、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードするゲノミックＤＮＡ断片が接続され、挿入されたプラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２を得た。なお、プラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２を保持する形質転換大腸菌　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＳＬ７Ａ６２　ＳＡＮＫ７３３９７は、平成９年８月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７４が付された。
【０３２９】
得られたプラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２ＤＮＡ　１０μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより切断した。一方、哺乳動物細胞用発現プラスミドｐＥＥ．６．１　ＤＮＡ　１μｇをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化ｐＥＥ．６．１　ＤＮＡ　１００ｎｇと、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐｇＨＳＬ７Ａ６２　ＤＮＡ　１０μｇを、ライゲーションキットを用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株でクローニングした。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って目的の挿入断片の有無を確認した。このようにして、ヒト化ＨＦＥ７ＡのＶＤ−ＤＮＡ断片と、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードするゲノミックＤＮＡとの融合断片が、ＣＭＶプロモーター下流に正方向で挿入されたプラスミドｐＥｇ７ＡＨ−Ｈを得た。
【０３３０】
（５）ヌクレオチド配列の確認
ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈの挿入ＤＮＡが、目的とするヌクレオチドの配列を保持していることを確認するため、ヌクレオチド配列の決定を行なった。ヌクレオチドの配列を決定するにあたり作製したオリゴヌクレオチドプライマーは以下に記載する通りであった：
５’−　ＡＣＡＧＣＣＧＧＧＡ　ＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣ　−３’　　（ＩＧ０１：配列表の配列番号９０）；
５’−　ＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣ　ＣＣＴＣＣＣＴＧＴＧ　−３’　　（ＩＧ０２：配列表の配列番号９１）；
５’−　ＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣ　ＴＧＧＧＴＴＡＧＧＧ　−３’　　（ＩＧ０３：配列表の配列番号９２）；
５’−　ＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧ　ＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧ　−３’　　（ＩＧ０４：配列表の配列番号９３）；
５’−　ＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧ　ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ　−３’　　（ＩＧ０５：配列表の配列番号９４）；
５’−　ＣＣＡＧＴＣＣＴＧＧ　ＴＧＣＡＧＧＡＣＧＧ　−３’　　（ＩＧ０６：配列表の配列番号９５）；
５’−　ＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣ　ＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣ　−３’　　（ＩＧ０７：配列表の配列番号９６）；
５’−　ＣＧＴＧＧＴＣＴＴＧ　ＴＡＧＴＴＧＴＴＣＴ　−３’　　（ＩＧ０８：配列表の配列番号９７）；
５’−　ＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣ　ＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣ　−３’　　（ＩＧＰ５：配列表の配列番号９８）；
５’−　ＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡ　ＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧ　−３’　　（ＩＧＰ６：配列表の配列番号９９）；
５’−　ＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡ　ＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧ　−３’　　（ＩＧＰ７：配列表の配列番号１００）；
５’−　ＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡ　ＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧ　−３’　　（ＩＧＰ８：配列表の配列番号１０１）；
５’−　ＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣ　ＴＧＡＧＧＡＣＴＣ　−３’　（Ｈ５＋：配列表の配列番号１０２）；
５’−　ＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧ　ＡＴＧＴＣＡＧＧＣ　−３’　（Ｈ５−：配列表の配列番号１０３）；
５’−　ＧＡＧＣＡＧＴＡＣＴ　ＣＧＴＴＧＣＴＧＣＣ　ＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡ　ＣＣＡＧ　−３’
（ＰＥＥＦ：配列表の配列番号１０４）；
５’−　ＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧ　ＡＴＴＡＡＴＧＡＴＣ　ＡＡＴＧ　−３’　（ＰＥＥＢ：配列表の配列番号１０５）。
【０３３１】
各プライマーが結合する位置を、図２７に示した。ヌクレオチド配列の決定は、アルカリ・ＳＤＳ法と塩化セシウム法により精製した各プラスミドＤＮＡを鋳型とし、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法で行なった。その結果、ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈは配列表の配列番号８９に示したポリペプチドをコードする、配列表の配列番号８８に示すヌクレオチド配列を保持していることが確認された。
【０３３２】
実施例１６　ＣＯＳ−１細胞での発現
上記で得られたヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖発現プラスミドおよび各ヒト化ＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミドのサル腎臓由来細胞株ＣＯＳ−１細胞への導入を、電極間２ｍｍのチャンバー／ＦＣＴ−１３（島津製作所（株）社製）を装着した遺伝子導入装置ＧＴＥ−１（島津製作所（株）社製）を用いて、電気穿孔法により行った。まず、ＣＯＳ−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．　ＣＲＬ−１６５０　）を、１０％のウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という：モアゲート社製）を含む最小必須アルファー培地（以下「α（＋）ＭＥＭ」という：ギブコ・ビーアールエル社製）を入れた細胞培養用フラスコ（培養面積２２５ｃｍ２：住友ベークライト（株）社製）中でセミコンフルエントになるまで培養した。その後、培地を除去し、３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）中、３７℃、３分間処理することによりＣＯＳ−１細胞をフラスコから遊離させた。遊離した細胞は、８００ｒｐｍ、２分間の遠心分離により回収し、リン酸緩衝液［０．０２％　塩化カリウム、０．０２％　リン酸２水素カリウム、０．８％　塩化ナトリウム、１．１５％　リン酸水素２ナトリウム。以下「ＰＢＳ（−）」という；日水製薬（株）社製］で２回洗浄した。洗浄したＣＯＳ−１細胞をＰＢＳ（−）で１×１０８細胞数／ｍｌとなるよう調製し、ＣＯＳ−１細胞懸濁液とした。
【０３３３】
一方、アルカリ・ＳＤＳ法と塩化セシウム密度勾配遠心分離法を用いて調製したヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖発現プラスミドＤＮＡ　４μｇおよびヒト化ＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現プラスミドＤＮＡ　４μｇを混合した後、同一チューブ内でエタノール沈澱し、ＰＢＳ（−）　２０μｌに懸濁した。得られたプラスミド懸濁液２０μｌを、先に調製したＣＯＳ−１細胞懸濁液２０μｌ（２×１０６細胞数）と混合し、電極間隔２ｍｍのチャンバー／ＦＣＴ−１３（島津製作所社製）に移し、遺伝子導入装置ＧＴＥ−１（島津製作所（株）社製）にセットした。その後、６００Ｖ、５０μＦのパルスを、１秒間隔で２回与えることにより、目的とするプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−１細胞内に導入した。パルスを与えた後のチャンバー内の細胞−ＤＮＡ混合液を、１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭ　５ｍｌに懸濁し、細胞培養用フラスコ（培養面積２５ｃｍ２：住友ベークライト（株）社製）に移した。５％炭酸ガス下、３７℃、７２時間培養した後に培養上清を回収し、本培養上清中に含まれる発現生成物を解析した。
【０３３４】
上記の方法により、以下に記載するプラスミドの組み合わせでそれぞれＣＯＳ−１細胞を形質転換し、培養上清を回収した：
［Ａ］：プラスミドＤＮＡを含まない条件；
［Ｂ］：ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈおよびｐ７ＡＬ−ＭＭのコ・トランスフェクション；
［Ｃ］：ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈおよびｐ７ＡＬ−ＨＭのコ・トランスフェクション；
［Ｄ］：ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈおよびｐ７ＡＬ−ＨＨのコ・トランスフェクション。
【０３３５】
実施例１７　ＥＬＩＳＡ法による発現産物の定量
実施例１６で調製した培養上清中のヒト化抗体の発現の確認および発現生成物の定量検定を、抗ヒトＩｇＧに対する抗体を用いた酵素結合抗体法（以下「ＥＬＩＳＡ法」という）により行なった。すなわち、９６穴プレート（マキシソープ：ヌンク社製）の各ウエルに、最終濃度１μｇ／ｍｌで固相化緩衝液（０．０５Ｍ　炭酸水素ナトリウム、０．０２％　アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）に溶解したヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（カペル社製）１００μｌを加え、３７℃、２時間保温し、抗体をプレートに固相化した。その後、０．０５％のツイーン−２０（バイオラッド社製）を含むＰＢＳ（−）（以後、「ＰＢＳ−Ｔ」という）３５０μｌで４回洗浄した。洗浄の終わった各ウエルに、１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで希釈した培養上清を加え、３７℃、２時間保温した。再び、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄の後、ＰＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（カルタグ・ラボ社製）１００μｌを、各ウエルに加え、３７℃、２時間保温した。再び、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄の後、ｐ−ニトロフェニル燐酸を１０％　ジエタノールアミン（ｐＨ９．８）で１ｍｇ／ｍｌに調製した基質溶液を加えた。３７℃、３０分間から１時間保温し、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。なお、本実験において、培養上清中に含まれるヒト化ＨＦＥ７Ａ抗体の濃度対照としては、１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで一定濃度に希釈したヒトプラズマイムノグロブリンＧ／サブクラス１（ＩｇＧ１）（バイオピュアＡＧ社製）を用いた。
【０３３６】
その結果、実施例１６で調製した培養上清中の発現生成物のうち、［Ｂ］、［Ｃ］および［Ｄ］の条件のものは、抗ヒトＩｇＧ抗体により特異的に検出された。
【０３３７】
実施例１８　Ｆａｓに対する結合活性の測定
以下に記載する方法に従って、実施例１６で調製した形質転換細胞培養上清中のＦａｓへの結合活性のＥＬＩＳＡ法による検定を行った。まず、実施例１で調製したヒトＦａｓ融合タンパク質発現ＣＯＳ−１細胞培養上清を固相化緩衝液で５倍に希釈し、９６穴プレート（マキシソープ：ヌンク社製）の各ウエルに５０μｌづつ入れ、４℃で一晩保温することにより、ウエル表面にヒトＦａｓ融合タンパク質を吸着させた。その後、各ウエルをＰＢＳ−Ｔ　３５０μｌで４回洗浄した。洗浄後、５％　ウシ血清アルブミン（和光純薬（株）社製）を含むＰＢＳ−Ｔを、各ウエルに５０μｌづつ加え、３７℃、１時間保温することによりブロッキングし、その後再び、各ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。実施例１６で調製した培養上清は、予め、実施例１７に記載した方法により、含有する目的発現生成物の濃度を算出し、最終的な目的生成物濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭ培地で調製しておいた。１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した各発現生成物溶液を、１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭ培地で２倍希釈を繰り返し、希釈系列を作製した。作製された各発現生成物希釈系列溶液５０μｌを、各ウエルに添加し、３７℃下、２時間反応させた。その後、再びＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔにより１００００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（カルタグ・ラボ社製）５０μｌを各ウエルに分注し、３７℃下、２時間反応させた。なお、対照として用いた、マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａより精製したＨＦＥ７Ａ（ＩｇＧ１）の検出は、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体の代わりに、ＰＢＳ−Ｔにより５，０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（ギブコ・ビーアールエル社製）を用いた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄したのち、５０μｌのｐ−ニトロフェニル燐酸を１０％　ジエタノールアミン（ｐＨ９．８）で１ｍｇ／ｍｌに調製した基質溶液を加え、３７℃で３０分間から１時間保温した。各ウエルの４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、各培養上清中に含まれる発現生成物のヒトＦａｓ融合タンパク質に対する結合活性を調べた。
【０３３８】
その結果、実施例１６で調製した培養上清中の発現生成物のうち、［Ｂ］、［Ｃ］および［Ｄ］の条件のものは、ヒトＦａｓ融合タンパク質との結合性を有するものであることが確認された（図２８）。
【０３３９】
実施例１９　ＨＦＥ７ＡのＦａｓへの結合に対する競合阻害
本発明で得られるヒト化抗Ｆａｓ抗体のＦａｓに対する結合は、ヒト化設計の基礎となった抗Ｆａｓマウスモノクローナル抗体であるＨＦＥ７Ａの結合を阻害するはずである。そこで、ＨＦＥ７Ａと実施例１６で調製した発現生成物とのヒトＦａｓ融合タンパク質に対する競合阻害活性を測定した。
【０３４０】
実施例３で得られた精製ＨＦＥ７Ａモノクローナル抗体　１ｍｇを、市販のアルカリフォスファターゼ標識キット（イムノ−リンク　ＡＰ　アンド　ＡＰＬラベリング　キット：ジェノシス社製）を添付のプロトコールに従って用いることにより標識した（以下、この標識抗体を「ＡＰ−ＨＦＥ７Ａ」という）。
【０３４１】
ヒトＦａｓ融合タンパク質を含むＣＯＳ−１培養上清を、固相化緩衝液で５倍希釈し、発光検出用９６穴プレート（ルミネッセント　ソリッド　アッセイ　プレート、高結合特性：コースター社製）の各ウエルに５０μｌづつ入れ、４℃で一晩保温することにより、ウエル表面にヒトＦａｓ融合タンパク質を吸着させた。吸着後、各ウエルをＰＢＳ−Ｔ３５０μｌで４回洗浄した。洗浄後、５％　ウシ血清アルブミン（和光純薬（株）社製）を含むＰＢＳ−Ｔを、各ウエルに１００μｌづつ加え、３７℃、１時間保温することによりブロッキングし、その後再び、各ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。実施例１６で調製した培養上清は、予め、実施例１７で示す方法により、含有する目的発現生成物の濃度を算定し、最終的な目的生成物濃度が１μｇ／ｍｌとなるように１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで調製しておいた。１μｇ／ｍｌの濃度に調製した各発現生成物溶液を、１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで二倍希釈を繰り返し、希釈系列を作製した。一方、ＡＰ−ＨＦＥ７Ａを、１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭにより５０ｎｇ／ｍｌに希釈し、作製した希釈系列と等量混合した。発現生成物希釈系列とＡＰ−ＨＦＥ７Ａ混合液を、洗浄の終わった各ウエルに５０μｌづつ加え、室温で一晩静置した。その後再び、各ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、各ウエルに１００μｌのＣＤＰ−スター緩衝液（９．５８ｍｌ　ジエタノールアミン、０．２ｇ　塩化マグネシウム、０．２５ｇ　アジ化ナトリウム、ｐＨ８．５）を加え、１０分間、室温で静置した。その後、ＣＤＰ−スター緩衝液を除去し、ＣＤＰ−スター基質（１．２ｍｌ　サファイアＩＩ（トロピックス社製）、２００μｌ　ＣＤＰ−スター（トロピックス社製）、ＣＤＰ−スター緩衝液で１２ｍｌとする）を５０μｌ／ウエル加え、さらに室温で４０分間静置した。各培養上清中に含まれる発現生成物のヒトＦａｓ融合タンパク質に対するＨＦＥ７Ａとの競合阻害活性は、発光強度をルミノスキャン（タイターテック社製）により測定することにより行なった。
【０３４２】
その結果、実施例１６で調製した発現生成物は、マウスハイブリドーマより調製したＨＦＥ７ＡのヒトＦａｓ融合タンパク質に対する結合を、特異的に阻害することが確認された（図２９）。
【０３４３】
実施例２０　アポトーシス誘導活性
マウスＴリンパ腫細胞にヒトＦａｓ分子を発現させたＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞［Ｉｔｏｈ，　Ｎ．　ｅｔ．　ａｌ．　（１９９１）　Ｃｅｌｌ　６６，　２３３−２４３］を用いて、ヒト化抗Ｆａｓ抗体を発現させたＣＯＳ細胞培養上清のアポトーシス誘導活性を検討した。まず、１０％　ＦＣＳ（ギブコ・ビーアールエル社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、３７℃、５％　炭酸ガス存在下で３日間培養したＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞（１×１０５細胞／５０μｌ）を、９６穴マイクロプレート（住友ベークライト（株）社製）の各ウエルに５０μｌずつ分注した。実施例１６で調製した培養上清は、予め実施例１７に記載した方法により、含有する目的発現生成物の濃度を算定し、最終的な目的生成物濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で調製しておいた。１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した各発現生成物溶液を、１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で二倍希釈を繰り返し、希釈系列を作製した。各発現生成物希釈液　５０μｌを、各ウエルに添加し、３７℃で１時間保温した。その後、１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を洗浄した後、各ウエルの細胞を７５μｌの１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁した。その後、各ウエルに二次抗体として、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１．２５μｇ／ｍｌに調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（カペル社製）を７５μｌ加えた。３７℃下、１２時間反応させた後、１ｍｇ／ｍｌのＸＴＴ（２、３−ビス２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド　イナーソルト：シグマ社製）を含む２５μＭのＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート：シグマ社製）５０μｌ（終濃度２５０μｇ／ｍｌ　ＸＴＴ、５μＭ　ＰＭＳ）を添加した。３時間培養した後、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定し、ミトコンドリアの還元能を指標とし、細胞の生存率を算定した。
【０３４４】
各ウェルの細胞の生存率を、下記式により算出した：
生存率（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）
（式中、ａは被検ウエルの測定値を、ｂは無細胞ウエルの測定値を、ｃは抗体無添加のウエルの測定値をそれぞれ表わす）。
【０３４５】
その結果、実施例１６で調製した発現生成物は、ヒトＦａｓ抗原を発現したＴリンパ腫細胞株に対してアポトーシスを誘導することが示された（図３０）。
【０３４６】
実施例２１　ＨＦＥ７Ａの軽鎖のヒト化発現ベクターの構築
（１）　ヒト化ＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現ベクタープラスミドの構築
実施例１４で作成されたＨＨタイプヒト化軽鎖をよりヒトに近づけるべく、ＨＨタイプ軽鎖アミノ酸のＮ末端から１番目のアミノ酸（アスパラギン酸）、８５番目（アラニン）および１０７番目（アルギニン）をそれぞれヒト軽鎖（κ鎖）で保存されているグルタミン酸、グルタミン酸およびリジンに置き換えたものを設計し、これを「ＰＤＨＨタイプ」とした。同様に、ＨＭタイプ軽鎖アミノ酸のＮ末端から１番目のアミノ酸（アスパラギン酸）および１０７番目（アルギニン）をそれぞれヒト軽鎖で保存されているグルタミン酸およびリジンに置き換えたものを設計し、これを「ＰＤＨＭタイプ」とした。以下、この２種類のヒト化抗ヒトＦａｓ抗体軽鎖アミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持する発現プラスミドをそれぞれ構築した。
【０３４７】
１）プライマーの合成
ＰＤＨＨタイプポリペプチド鎖（配列表の配列番号１０７）をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号１０６）およびＰＤＨＭタイプポリペプチド鎖（配列表の配列番号１０９）をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号１０８）の合成は、ＰＣＲ法を組み合わせて行なった。
【０３４８】
ＰＣＲを行なうにあたり、前出２種のオリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬ１Ｐ（配列表の配列番号５５）および７ＡＬＣＮ（配列番号６４）に加え、さらに６種の配列表のプライマー：
５’−　ＧＧＴＧＡＧＡＴＴＧ　ＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡ　ＡＴＣＴＣＣＡＧＧ　−３’　（ＬＰＤ１Ｐ：配列番号１１０）；
５’−　ＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴ　ＧＧＧＴＧＡＧＣＡＣ　ＡＡＴＣＴＣＡＣＣ　−３’　（ＬＰＤ１Ｎ：配列番号１１１）；
５’−　ＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧ　ＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧ　ＧＡＧＧＡＴＴＴＴＧ　Ｃ　−３’　（ＬＰＤ２Ｐ：配列番号１１２）；
５’−　ＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴ　ＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧ　ＡＣＧＡＧＡＧＡＴＧ　Ｇ　−３’　（ＬＰＤ２Ｎ：配列番号１１３）；
５’−　ＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡ　ＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴ　ＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴ　Ｇ　−３’　（ＬＰＤ３Ｐ：配列番号１１４）；および
５’−　ＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴ　ＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣ　ＴＴＧＧＴＧＣＣＴＴ　Ｇ　−３’　（ＬＰＤ３Ｎ：配列番号１１５）を作製した。
【０３４９】
２）ＰＤＨＨタイプヒト化軽鎖発現プラスミドｐＬＰＤＨＨ７５の構築
配列表の配列番号１０７に示されるアミノ酸配列をコードするＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片（配列表の配列番号１０６）は、ＰＣＲ法を３回繰り返すことにより作製され、プラスミド中に挿入された後、大腸菌でクローニングされた。
【０３５０】
ａ）第一段階ＰＣＲ
ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図３１に示した。
【０３５１】
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加した、分泌シグナル配列およびＦＲＬ１領域の一部をコードするＬＰＤ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＨＳＧＨＨ７ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬ１Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＬＰＤ１Ｎ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３５２】
ＦＲＬ１領域の一部、ＣＤＲＬ１領域、ＦＲＬ２領域、ＣＤＲＬ２領域およびＦＲＬ３領域の一部をコードするＬＰＤＨＨ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＨＳＧＨＨ７ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＬＰＤ１Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＬＰＤ２Ｎ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３５３】
ＦＲＬ３領域の一部、ＣＤＲＬ３領域およびＦＲＬ４領域をコードするＬＰＤＨＨ２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＨＳＧＨＨ７ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＬＰＤ２Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＬＰＤ３Ｎ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３５４】
ＦＲＬ４領域の一部および定常領域をコードし、３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加したＬＰＤＣ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＨＳＧＨＨ７ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＬＰＤ３Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬＣＮ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３５５】
ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出されたＬＰＤ１−ＤＮＡ、ＬＰＤＨＨ１−ＤＮＡ、ＬＰＤＨＨ２−ＤＮＡおよびＬＰＤＣ−ＤＮＡに相当するＤＮＡのバンドを剃刀で切り出し、それぞれセントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３５６】
ｂ）第二段階ＰＣＲ
ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図３２に示した。
【０３５７】
前出ＬＰＤ１−ＤＮＡ断片、ＬＰＤＨＨ１−ＤＮＡおよびＬＰＤＨＨ２−ＤＮＡ断片を融合したＬＰＤＨＨ１．２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤ１−ＤＮＡ溶液　　　　　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＨＨ１−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＨＨ２−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬ１Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＬＰＤ３Ｎ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３５８】
ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出されたＬＰＤＨＨ１．２−ＤＮＡに相当するＤＮＡのバンドを剃刀で切り出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
ｃ）第三段階ＰＣＲ
ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要を図３３に示した。
【０３５９】
前出ＬＰＤＨＨ１．２−ＤＮＡ断片とＬＰＤＣ−ＤＮＡ断片を融合したＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
第二段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＨＨ１．２−ＤＮＡ溶液　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＣ−ＤＮＡ溶液　　　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬ１Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬＣＮ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３６０】
ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出されたＬＰＤＨＨ−ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３６１】
ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラスミド作製方法の概要を図３４に示した。
【０３６２】
得られたＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片は、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化した。
【０３６３】
クローニング用プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造社製）ＤＮＡ１μｇを、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰでで脱リン酸化した。このようにして得られた脱リン酸化プラスミドｐＨＳＧ３９９ＤＮＡと、予め制限酵素で消化したＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造社製）を用い、メーカー指定のプロトコールに従って連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。これを３７℃で培養後、白色を呈するコロニーを単離して、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、この培養物よりアルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動で解析することにより、ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片を保持するクローンを選択した。
【０３６４】
以上の操作により、ＰＤＨＨタイプヒト化軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡと、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡとの融合断片を保持するプラスミドｐＨＳＨＨ５を得た。なお、プラスミドｐＨＳＨＨ５を保持する形質転換大腸菌　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＨ５　ＳＡＮＫ　７０３９８は、平成１０年２月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７４が付された。
【０３６５】
次に、プラスミドｐＨＳＨＨ５を用いて、以下に記載する方法によりＰＤＨＨタイプヒト化軽鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡを保持する発現ベクタープラスミドｐＬＰＤＨＨ７５を作製した。
【０３６６】
哺乳動物細胞用発現プラスミドｐＥＥ．１２．１（ロンザ社製）ＤＮＡ１μｇを、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化プラスミドｐＥＥ．１２．１ＤＮＡ１００ｎｇと、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＨＳＨＨ５ＤＮＡ断片　１０μｇをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。
【０３６７】
得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、アルカリ・ＳＤＳ法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動により挿入断片の有無を確認した。以上の操作により、ヒト化ＰＤＨＨタイプＨＦＥ７Ａ−軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡとの融合断片とが、ＣＭＶプロモーター下流に正方向で挿入されたプラスミドｐＬＰＤＨＨ７５を得た。
【０３６８】
（３）ＰＤＨＭタイプヒト化軽鎖発現プラスミドｐＬＰＤＨＭ３２の構築
配列表の配列番号１０９に示されるアミノ酸配列をコードするＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片（配列表の配列番号１０８）は、ＰＣＲ法を３回繰り返すことにより作製され、プラスミド中に挿入された後、大腸菌でクローニングされた。
【０３６９】
ａ）第一段階ＰＣＲ
ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図３５に示した。
【０３７０】
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加した、分泌シグナル配列、およびＦＲＬ１領域の一部をコードするＬＰＤ１−ＤＮＡ断片、および、ＦＲＬ４領域の一部と定常領域をコードし、３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加したＬＰＤＣ−ＤＮＡ断片は、いずれも上記（２）記載のＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片の作製過程で得られたものを用いた。
【０３７１】
ＣＤＲＬ１領域の一部、ＦＲＬ２領域、ＣＤＲＬ２領域、ＦＲＬ３領域、ＣＤＲＬ３領域、およびＦＲＬ４領域をコードするＬＰＤＨＭ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐＨＳＧＨＭ１７ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＬＰＤ１Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＬＰＤ３Ｎ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３７２】
ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出したＬＰＤ１−ＤＮＡ、ＬＰＤＨＭ１−ＤＮＡおよびＬＰＤＣ−ＤＮＡに相当するＤＮＡバンドを剃刀で切り出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３７３】
ｂ）第二段階ＰＣＲ
ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図３６に示した。
【０３７４】
前出ＬＰＤ１−ＤＮＡ断片とＬＰＤＨＭ１−ＤＮＡ断片とを融合したＬＰＤＨＭ１．２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０３７５】
反応液組成：
第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤ１−ＤＮＡ溶液　　　　　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＨＭ１−ＤＮＡ溶液　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬ１Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＬＰＤ３Ｎ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３７６】
ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出されたＬＰＤＨＭ１．２−ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３７７】
ｃ）第三段階ＰＣＲ
ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要を図３７に示した。
【０３７８】
前出ＬＰＤＨＭ１．２−ＤＮＡ断片とＬＰＤＣ−ＤＮＡ断片とを融合したＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０３７９】
反応液組成：
第二段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＨＭ１．２−ＤＮＡ溶液　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＬＰＤＣ−ＤＮＡ溶液　　　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬ１Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＬＣＮ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
【０３８０】
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３８１】
ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出されたＬＰＤＨＭ−ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０３８２】
ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラスミド作製方法の概要は図３８に示した。
【０３８３】
まず、上記で得られたＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片を、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化した。
【０３８４】
次にクローニング用プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造社製）ＤＮＡ１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化プラスミドｐＨＳＧ３９９　ＤＮＡと、予めＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片とを、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造社製）を用い、メーカー指定のプロトコールに従って連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。これを３７℃で培養後、白色を呈するコロニーを単離して、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、この培養物よりアルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動で解析することにより、ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片を保持するクローンを選択した。
【０３８５】
以上の操作により、ＰＤＨＭタイプヒト化軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡとの融合断片を保持するプラスミドｐＨＳＨＭ２を得た。なお、プラスミドｐＨＳＨＭ２を保持する形質転換大腸菌　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＭ２　ＳＡＮＫ　７０１９８は、平成１０年２月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７２が付された。
【０３８６】
次に、プラスミドｐＨＳＨＭ２を用いて、以下に記載する方法によりＰＤＨＭタイプヒト化軽鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡを保持する発現ベクタープラスミドｐＬＰＤＨＭ３２を作製した。
【０３８７】
哺乳動物細胞用発現プラスミドｐＥＥ．１２．１（ロンザ社製）ＤＮＡ　１μｇを、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化プラスミドｐＥＥ．１２．１　ＤＮＡ（１００ｎｇ）と、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＨＳＨＭ２−ＤＮＡ断片（１０μｇ）とをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、該培養物からアルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により挿入断片の有無を確認した。以上の操作により、ＰＤＨＭタイプヒト化軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡと、ヒトＩｇκ鎖定常領域をコードするＤＮＡとの融合断片が、ＣＭＶプロモーター下流に正方向で挿入されたプラスミドｐＬＰＤＨＭ３２を得た。
【０３８８】
（４）ヌクレオチド配列の確認
上記（２）および（３）で作製されたプラスミドｐＬＰＤＨＨ７５およびｐＬＰＤＨＭ３２が、それぞれ目的とするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを保持していることを確認するため、ヌクレオチド配列の決定を行なった。ここで使用したプライマーは、前出ＳＰ１（配列表の配列番号６８）、ＳＰ２（配列表の配列番号６９）、ＳＰ３（配列表の配列番号７０）、ＳＰ４（配列表の配列番号７１）、ＳＰ５（配列表の配列番号７２）およびＳＰ６（配列表の配列番号７３）であった。各プライマーが結合する位置を、図１９に示した。ヌクレオチド配列の決定は、アルカリ・ＳＤＳ法と塩化セシウム法により精製した各プラスミドＤＮＡを鋳型とし、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法で行なった。その結果、ｐＬＰＤＨＨ７５は配列表の配列番号１０６に示されるヌクレオチド配列を、ｐＬＰＤＨＭ３２は配列表の配列番号１０８に示されるヌクレオチド配列をそれぞれ保持していることが確認された。
【０３８９】
実施例２２　ヒト化重鎖発現ベクターの構築
実施例１５で作製されたヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖をよりヒトに近づけるべく、該ヒト化重鎖のアミノ酸配列のＮ末端から４４番目のアミノ酸（アルギニン）および７６番目のアミノ酸（アラニン）をそれぞれヒト重鎖で保存されているグリシンおよびトレオニンに置き換えたものを設計し、これを「ＨＶタイプ」とした。このＨＶタイプヒト化重鎖アミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持する発現プラスミドを、以下に記載する方法により構築した。
【０３９０】
（１）プライマーの合成
ＨＶタイプヒト化重鎖ポリペプチド鎖（配列表の配列番号１１７）をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号１１６）の合成を、ＰＣＲ法を組み合わせて行なった。
【０３９１】
ＰＣＲを行なうにあたり、前出のプライマー７ＡＨ１Ｐ（配列表の配列番号７６）に加え、さらに３種のプライマー：
５’−　ＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧ　ＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴ　ＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧ　−３’　（ＨＰＤ１Ｐ：配列表の配列番号１１８）；
５’−　ＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡ　ＡＧＧＣＣＣＴＧＴＣ　ＣＡＧＧＧＧＣＣＴＧ　−３’　（ＨＰＤ１Ｎ：配列表の配列番号１１９）；および
５’−　ＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣ　ＡＴＧＴＡＧＧＣＴＧ　ＴＧＣＴＡＧＴＧＧＡ　ＴＧＴＧＴＣＴＡＣ　−３’　（ＨＰＤ２Ｎ：配列表の配列番号１２０）を作製した。
【０３９２】
（２）プラスミドｐｇＨＰＤＨＶ３の構築
配列表の配列番号１１７のアミノ酸番号−１９から８４に示されるアミノ酸配列をコードするＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ法を２回繰り返すことにより作製され、プラスミドへ挿入された後、大腸菌でクローニングされた。
【０３９３】
ａ）第一段階ＰＣＲ
ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要を図３９に示した。
【０３９４】
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加した、分泌シグナル配列、ＦＲＨ１領域、ＣＤＲＨ１領域およびＦＲＨ２領域の一部をコードするＨＰＤ１−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
反応液組成：
プラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２　ＤＮＡ　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ１Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＨＰＤ１Ｎ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
【０３９５】
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３９６】
次に、ＦＲＨ２領域の一部、ＣＤＲＨ３領域およびＦＲＨ３領域の一部をコードするＨＰＤ２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０３９７】
反応液組成：
プラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２　ＤＮＡ　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＨＰＤ１Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＨＰＤ２Ｎ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
【０３９８】
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０３９９】
ＰＣＲ後の各生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出されたＨＰＤ１−ＤＮＡおよびＨＰＤ２−ＤＮＡに相当するＤＮＡバンドを剃刀で切り出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４００】
ｂ）第二段階ＰＣＲ
ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要を図４０に示した。
【０４０１】
前出ＨＰＤ１−ＤＮＡ断片とＨＰＤ２−ＤＮＡ断片とを融合したＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片は、以下の条件で作製された。
【０４０２】
反応液組成：
第一段階ＰＣＲで作製したＨＰＤ１−ＤＮＡ溶液　　　　　　　１０μｌ
第一段階ＰＣＲで作製したＨＰＤ２−ＤＮＡ溶液　　　　　　　１０μｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　７ＡＨ１Ｐ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＨＰＤ２Ｎ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
【０４０３】
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０４０４】
ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出された融合ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４０５】
ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片を保持するプラスミド作製方法の概要を図４１に示した。
【０４０６】
上記で得られたＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片を、フェノール抽出とエタノール沈澱によりさらに精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＳａｃＩにより消化した。
【０４０７】
前出プラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２ＤＮＡ　１μｇを、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化プラスミドｐｇＨＳＬ７Ａ６２　ＤＮＡと、予めＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで消化したＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、この培養物からアルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って、ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片を保持するクローンを選択した。
【０４０８】
以上の操作により、ＨＶタイプヒト化重鎖の可変領域をコードするＤＮＡと、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードするゲノミックＤＮＡ断片との融合断片を保持するプラスミドｐｇＨＰＤＨＶ３を得た。なお、プラスミドｐｇＨＰＤＨＶ３を保持する形質転換大腸菌　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＰＤＨＶ３　ＳＡＮＫ　７０２９８は、平成１０年２月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（工業技術院生命工学工業技術研究所）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７３が付された。
【０４０９】
次に、ｐｇＨＰＤＨＶ３　ＤＮＡ　１０μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化した。一方、哺乳動物細胞用発現プラスミドｐＥＥ．６．１（ロンザ社製）１μｇを、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化プラスミドｐＥＥ．６．１　ＤＮＡ（１００ｎｇ）と、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したｐｇＨＰＤＨＶ３　ＤＮＡ（１０μｇ）とを、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株でクローニングした。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、該培養物からアルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出た。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って挿入断片の有無を確認した。以上の操作により、ＨＶタイプヒト化重鎖をコードするＤＮＡが、ＣＭＶプロモーター下流に正方向で挿入されたプラスミドｐＥｇＰＤＨＶ３−２１を得た。
【０４１０】
（３）ヌクレオチド配列の確認
上記（２）で得られたプラスミドｐＥｇＰＤＨＶ３−２１が、目的とするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを保持していることを確認するため、ヌクレオチド配列の決定を行なった。ここで用いられたプライマーは前出ＰＥＥＦ（配列表の配列番号１０４）、ＨＰＤ１Ｐ（配列表の配列番号１１８）、ＨＰＤ１Ｎ（配列表の配列番号１１９）およびＨＰＤ２Ｎ（配列表の配列番号１２０）であった。各プライマーが結合する位置を、図４２に示した。ヌクレオチド配列の決定は、アルカリ・ＳＤＳ法と塩化セシウム法により精製したプラスミドＤＮＡを鋳型とし、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法で行なった。その結果、ｐＥｇＰＤＨＶ３−２１は配列表の配列番号１１６に示されヌクレオチド配列を保持していることが確認された。
【０４１１】
実施例２３　ＣＯＳ−１細胞用発現ベクターの構築
実施例１４および実施例２１で作製された各種ヒト化ＨＦＥ７Ａ−軽鎖発現ベクター（ｐ７ＡＬ−ＨＨ、ｐ７ＡＬ−ＨＭ、ｐ７ＡＬ−ＭＭ、ｐＬＰＤＨＨ７５およびｐＬＰＤＨＭ３２）と、実施例１５および実施例２２で作製された各種ヒト化ＨＦＥ７Ａ−重鎖発現ベクター（ｐＥｇ７ＡＨ−ＨおよびｐＥｇＰＤＨＶ３−２１）を用いて、ＣＯＳ−１細胞を用いた遺伝子発現のために最適化した発現ベクターを以下に記載する方法により作製した。
【０４１２】
１．ＣＯＳ−１細胞用軽鎖発現ベクターの構築
各種ヒト化ＨＦＥ−７Ａ軽鎖のＣＯＳ−１細胞用発現ベクターの構築法の概要を図４３に示した。
【０４１３】
（１）プロモーター増幅用プライマー（軽鎖用）の合成
ＳＲαプロモーター領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより作製するにあたり、以下に記載する２種のオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ＴＧＣＡＣＧＣＧＴＧ　ＧＣＴＧＴＧＧＡＡＴ　ＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴ　ＴＡＧ　−３’　（ＭＬＵＡ：配列表の配列番号１２１）；および
５’−　ＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴ　ＴＴＡＧＡＧＣＡＧＡ　ＡＧＴＡＡＣＡＣＴＴ　Ｃ　−３’　（ＨＩＮＤＢ：配列表の配列番号１２２）を作製した。
【０４１４】
（２）発現ベクター（軽鎖用）の構築
ＳＲαプロモーター領域を含み、５’末端にＭｕｌＩ制限酵素切断部位、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位がそれぞれ付加されたＬＳＲα−ＤＮＡ断片は、プラスミドｐＭＥ１８Ｓを鋳型とし、以下の条件で作製された。
【０４１５】
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ１８Ｓ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＭＬＵＡ　　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＨＩＮＤＢ　　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
【０４１６】
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０４１７】
ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出されたＬＳＲα−ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４１８】
次に、実施例１４および実施例２１で作製されたプラスミドｐ７ＡＬ−ＨＨ、ｐ７ＡＬ−ＨＭ、ｐ７ＡＬ−ＭＭ、ｐＬＰＤＨＨ７５またはｐＬＰＤＨＭ３２　１μｇを、制限酵素ＭｕｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化プラスミドＤＮＡと、予めＭｕｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＬＳＲα−ＤＮＡ断片とをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、該培養物よりアルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＭｕｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って、ＬＳＲα−ＤＮＡ断片を保持するクローンを選択した。
【０４１９】
以上の操作により、各種のヒト化軽鎖をコードするＣＯＳ−１細胞用発現ベクターｐＳＲＨＨ（ＨＨタイプ、ｐ７Ａ−ＨＨ由来）、ｐＳＲＨＭ（ＨＭタイプ、ｐ７Ａ−ＨＭ由来）、ｐＳＲＭＭ（ＭＭタイプ、ｐ７Ａ−ＭＭ由来）、ｐＳＲＰＤＨＨ（ＰＤＨＨタイプ、ｐＬＰＤＨＨ７５由来）およびｐＳＲＰＤＨＭ（ＰＤＭＭタイプ、ｐＬＰＤＨＭ３２由来）を得た。
【０４２０】
２．ＣＯＳ−１細胞用重鎖発現ベクターの構築
各種ヒト化重鎖のＣＯＳ−１細胞用発現ベクターの構築法の概要を図４４に示した。
【０４２１】
（１）プロモーター増幅用プライマー（重鎖用）の合成
ＳＲαプロモーター領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより作製するにあたり、前出のプライマーＨＩＮＤＢ（配列表の配列番号１２２）に加え、さらに１種のプライマー：
５’−　ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧ　ＣＴＧＣＴＡＧＣＴＴ　ＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡ　ＴＧＴＧＴＧ　−３’（ＮＯＴＡ：配列表の配列番号１２３）を作製した。
【０４２２】
（２）発現ベクター（重鎖用）の構築
ＳＲαプロモーター領域を含み、５’末端にＮｏｔＩ制限酵素切断部位、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位がそれぞれ付加されたＨＳＲα−ＤＮＡ断片は、プラスミドｐＭＥ１８Ｓを鋳型とし、以下の条件で作製された。
【０４２３】
反応液組成：
プラスミドｐＭＥ１８Ｓ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　２００ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＮＯＴＡ　　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー　ＨＩＮＤＢ　　　　　　　８０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０単位
上記組成の反応液を、再蒸留水にて最終容量２００μｌとし、ＰＣＲに供試した。
【０４２４】
ＰＣＲ反応温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温した。
【０４２５】
ＰＣＲ後の生成物は、フェノール抽出とエタノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。電気泳動後のアクリルアミドゲルを、１μｇ／ｍｌの濃度のエチジウムブロミドにより染色し、生成物ＤＮＡを紫外線照射下で検出した。検出されＨＳＲα−ＤＮＡに相当するバンドを剃刀で切り出し、セントリコンおよびセントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出したＤＮＡを７５００×ｇの遠心分離により濃縮し、エタノール沈澱の後、５０μｌの蒸留水に溶解した。
【０４２６】
次に、実施例１５および実施例２２で作製されたプラスミドｐＥｇ７ＡＨ−ＨまたはｐＥｇＰＤＨＶ３−２１　１μｇを、制限酵素ＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。この脱リン酸化プラスミドＤＮＡと、予めＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＨＳＲα−ＤＮＡ断片とをＤＮＡライゲーションキットバージョン２．０（宝酒造社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、最終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、該培養物からアルカリ・ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って、ＨＳＲα−ＤＮＡ断片を保持するクローンを選択した。
【０４２７】
以上の操作により、各種のヒト化重鎖をコードするＣＯＳ−１細胞用発現ベクターｐＳＲｇ７ＡＨ（ｐＥｇ７ＡＨ−Ｈ由来）およびｐＳＲｇＰＤＨ（ｐＥｇＰＤＨＶ３−２１由来）を得た。
【０４２８】
実施例２４　ヒト化ＨＦＥ７Ａの各サブユニットをコードする遺伝子のＣＯＳ−１細胞での発現
実施例２３で得られたＣＯＳ−１細胞用発現ベクターによるＣＯＳ−１細胞の形質転換は、実施例１６に記載した方法により行なった。まず、ＣＯＳ−１細胞を、１０％ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭ（ギブコ・ビーアールエル社製）を入れた細胞培養用フラスコ（培養面積２２５ｃｍ２：住友ベークライト（株）社製）中でセミコンフルエントになるまで培養した。その後、培地を除去し、３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）中、３７℃で３分間保温することにより、ＣＯＳ−１細胞をフラスコから遊離させた。遊離した細胞を、８００ｒｐｍ、２分間の遠心分離により回収し、ＰＢＳ（−）（日水製薬（株）社製）で２回洗浄してから、ＰＢＳ（−）で１×１０８細胞数／ｍｌとなるように調製したものを、ＣＯＳ−１細胞懸濁液とした。
【０４２９】
一方、アルカリ・ＳＤＳ法と塩化セシウム密度勾配遠心分離法を用いて調製したヒト化重鎖発現ベクター（ｐＳＲｇ７ＡＨまたはｐＳＲｇＰＤＨ）ＤＮＡ　４μｇ、およびヒト化軽鎖発現ベクター（ｐＳＲＨＨ、ｐＳＲＨＭ、ｐＳＲＭＭ、ｐＳＲＰＤＨＨまたはｐＳＲＰＤＨＭ）ＤＮＡ　４μｇを下記に記載する組み合わせで混合した後、エタノール沈澱を行って、得られた沈澱をＰＢＳ（−）２０μｌに溶解した。得られたプラスミド溶液２０μｌを、先に調製したＣＯＳ−１細胞懸濁液２０μｌ（２×１０６細胞）と混合したものを電極間隔２ｍｍのチャンバー（ＦＣＴ−１３：島津製作所（株）社製）に入れ、遺伝子導入装置ＧＴＥ−１（島津製作所（株）社製）にセットした。その後、６００Ｖ下、５０μＦのパルスを、１秒間隔で２回与えることにより、目的とするプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−１細胞内に導入した。パルスを与えた後のチャンバー内の細胞−ＤＮＡ混合液を、１０％ウシ胎児血清を含むα（＋）ＭＥＭ　５ｍｌに懸濁し、細胞培養用フラスコ（培養面積２５ｃｍ２：住友ベークライト社製）に移した。これを５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間培養した後に培養上清を回収した。
【０４３０】
上記の方法により、下記［Ａ］−［Ｆ］の条件でそれぞれＣＯＳ−１細胞を形質転換し、培養上清を回収した。
【０４３１】
［Ａ］：プラスミドＤＮＡを含まない条件；
［Ｂ］：ｐＳＲｇＰＤＨおよびｐＳＲＰＤＨＨのコ・トランスフェクション；
［Ｃ］：ｐＳＲｇＰＤＨおよびｐＳＲＰＤＨＭのコ・トランスフェクション；
［Ｄ］：ｐＳＲｇ７ＡＨおよびｐＳＲＨＨのコ・トランスフェクション；
［Ｅ］：ｐＳＲｇ７ＡＨおよびｐＳＲＨＭのコ・トランスフェクション；
［Ｆ］：ｐＳＲｇ７ＡＨおよびｐＳＲＭＭのコ・トランスフェクション。
【０４３２】
実施例２５　Ｆａｓに対する結合能の検定
実施例２４で調製されたそれぞれの培養上清試料について、実施例１７に記載した方法により、含有する目的発現生成物の濃度を算出し、最終的な目的生成物濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで調製した。なお、培養上清試料中の目的生成物濃度が１００ｎｇ／ｍｌを下回った場合、得られた培養上清は、まずセントリプレップ−１０（アミコン社製）を用いて濃縮された。すなわち、培養上清５ｍｌをセントリプレップ−１０に移し、３０００×ｇの遠心分離により濃縮してから、再び実施例１７に記載した方法により目的生成物濃度を算出した。
【０４３３】
次に、１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製された各試料溶液を１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで２倍希釈する操作を繰り返し、希釈系列を作製した。これらの試料について、ヒトＦａｓ融合タンパク質に対する結合能を実施例１８に記載したＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０４３４】
その結果、実施例２４で調製された培養上清試料のうち、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］および［Ｆ］の条件のものは、ヒトＦａｓ融合タンパク質との結合能を有するものを含んでいることが確認された（図４５）。
【０４３５】
実施例２６　ＨＦＥ７ＡのＦａｓへの結合に対する競合阻害
実施例２４で調製された各培養上清試料について、予め実施例１７で示す方法により、それぞれが含有する目的発現生成物の濃度を算定し、１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで最終的な目的生成物濃度が１μｇ／ｍｌとなるように調製した。なお、培養上清試料中の目的生成物濃度が１μｇ／ｍｌを下回った場合は、その培養上清をセントリプレップ−１０を用いて濃縮してから１μｇ／ｍｌとなるように調製した。
【０４３６】
次に、この１μｇ／ｍｌの濃度に調製した試料を１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭで二倍希釈する操作を繰り返し、希釈系列を作製した。一方、ＡＰ−ＨＦＥ７Ａを、１０％　ＦＣＳを含むα（＋）ＭＥＭにより５０ｎｇ／ｍｌの濃度に調整し、上記希釈系列試料と等量混合した。その後、実施例１９記載の方法により、各試料のＨＦＥ７Ａに対する競合阻害活性を測定した。
【０４３７】
その結果、実施例２４で調製された培養上清試料のうち、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］および［Ｆ］の条件のものは、ハイブリドーマ培養物より調製したＨＦＥ７ＡのヒトＦａｓ融合タンパク質に対する結合を特異的に阻害することが確認された（図４６）。
【０４３８】
実施例２７　アポトーシス誘導活性
実施例２４で調製された培養上清試料を、実施例２２記載の方法で最終的な目的生成物濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように調整した（ただし、調整用培地としては１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた）。この１００ｎｇ／ｍｌの試料を１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で二倍希釈する操作を繰り返し、希釈系列を作製した。その後、実施例２０記載の方法により、各試料のＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞に対する細胞傷害活性を測定した。
【０４３９】
その結果、実施例２４で調製された培養上清試料のうち、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］および［Ｆ］の条件のものは、ハイブリドーマ培養物より調製されたＨＦＥ７Ａと同様に、ヒトＦａｓ抗原を発現したＴリンパ腫細胞株に対してアポトーシスを誘導することが示された（図４７）。
【０４４０】
製剤例
本発明の分子は、水またはそれ以外の薬理学的に許容し得る溶液に溶解した無菌性溶液または懸濁液のアンプルとして使用に供される。また、無菌粉末製剤（本発明の分子を凍結乾燥するのが好ましい）をアンプルに充填しておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈してもよい。
【０４４１】
【発明の効果】本発明により、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系に起因する各種の疾病（自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン氏病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン氏病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、突発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病）、アレルギー、アトピー、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、肝炎（劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎（Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎）またはアルコール性肝炎）、後天性免疫不全症候群または臓器移植後の拒絶反応）に対する予防または治療薬として有用な、霊長類および非霊長類動物のＦａｓの間で保存されているエピトープに特異的な抗原結合領域を有する分子が提供された。
【０４４２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１２：Ｎ１
配列番号１３：Ｃ３Ｎ
配列番号１４：Ｎ３Ｎ
配列番号１５：ＣＴＮ２
配列番号１８：Ｈ１
配列番号１９：Ｈ２
配列番号２０：Ｌ１
配列番号２１：Ｌ２
配列番号２２：Ｈ３
配列番号２３：Ｈ４
配列番号２４：Ｌ３
配列番号２５：Ｌ４
配列番号４１：コントロールペプチド
配列番号４６：コントロールペプチド
配列番号４７：ＨＶＫＩＩ５−４
配列番号４８：ＨＫＣＬ３−３
配列番号４９：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＨＨタイプ軽鎖
配列番号５０：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＨＨタイプ軽鎖
配列番号５１：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＨＭタイプ軽鎖
配列番号５２：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＨＭタイプ軽鎖
配列番号５３：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＭＭタイプ軽鎖
配列番号５４：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＭＭタイプ軽鎖
配列番号５５：７ＡＬ１Ｐ
配列番号５６：７ＡＬ１Ｎ
配列番号５７：７ＡＬ２Ｐ
配列番号５８：７ＡＬ２Ｎ
配列番号５９：７ＡＬ３ＰＡ
配列番号６０：７ＡＬ３Ｎ
配列番号６１：７ＡＬ４Ｐ
配列番号６２：７ＡＬ４Ｎ
配列番号６３：７ＡＬＣＰ
配列番号６４：７ＡＬＣＮ
配列番号６５：Ｍ７ＡＬ２Ｎ
配列番号６６：Ｍ７ＡＬ３ＰＡ
配列番号６７：７ＡＬ４ＮＡ
配列番号６８：ＳＰ１
配列番号６９：ＳＰ２
配列番号７０：ＳＰ３
配列番号７１：ＳＰ４
配列番号７２：ＳＰ５
配列番号７３：ＳＰ６
配列番号７４：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ重鎖可変領域とＩｇＧ−ＣＨ１のＮ末端の５アミノ酸
配列番号７５：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ重鎖可変領域とＩｇＧ−ＣＨ１のＮ末端の５アミノ酸
配列番号７６：７ＡＨ１Ｐ
配列番号７７：７ＡＨ１ＮＮＥＷ
配列番号７８：７ＡＨ２Ｎ
配列番号７９：７ＡＨ２ＰＮＥＷ
配列番号８０：７ＡＨ３Ｐ
配列番号８１：７ＡＨ３Ｎ
配列番号８２：７ＡＨ４Ｐ
配列番号８３：７ＡＨ４Ｎ
配列番号８４：５’Ｈｉｎｄ
配列番号８５：ＩＧＧＣＰＳＴＮ
配列番号８６：ＩＧＧＣＰＳＴＰ
配列番号８７：Ｅｃｏ３’
配列番号８８：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ重鎖
配列番号８９：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ重鎖
配列番号９０：ＩＧ０１
配列番号９１：ＩＧ０２
配列番号９２：ＩＧ０３
配列番号９３：ＩＧ０４
配列番号９４：ＩＧ０５
配列番号９５：ＩＧ０６
配列番号９６：ＩＧ０７
配列番号９７：ＩＧ０８
配列番号９８：ＩＧＰ５
配列番号９９：ＩＧＰ６
配列番号１００：ＩＧＰ７
配列番号１０１：ＩＧＰ８
配列番号１０２：Ｈ５＋
配列番号１０３：Ｈ５−
配列番号１０４：ＰＥＥＦ
配列番号１０５：ＰＥＥＢ
配列番号１０６：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＰＤＨＨタイプ軽鎖
配列番号１０７：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＰＤＨＨタイプ軽鎖
配列番号１０８：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＰＤＨＭタイプ軽鎖
配列番号１０９：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＰＤＨＭタイプ軽鎖
配列番号１１０：ＬＰＤ１Ｐ
配列番号１１１：ＬＰＤ１Ｎ
配列番号１１２：ＬＰＤ２Ｐ
配列番号１１３：ＬＰＤ２Ｎ
配列番号１１４：ＬＰＤ３Ｐ
配列番号１１５：ＬＰＤ３Ｎ
配列番号１１６：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＨＶタイプ重鎖
配列番号１１７：ヒト化抗Ｆａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ　ＨＶタイプ重鎖
配列番号１１８：ＨＰＤ１Ｐ
配列番号１１９：ＨＰＤ１Ｎ
配列番号１２０：ＨＰＤ２Ｎ
配列番号１２１：ＭＬＵＡ
配列番号１２２：ＨＩＮＤＢ
配列番号１２３：ＮＯＴＡ
【０４４３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２の構築図。
【図２】ｐＭＥ−ＨおよびｐＭＥ−Ｌの構築図。
【図３】ＨＦＥ７Ａのエピトープ限定のためのＥＬＩＳＡの結果を表す図。
【図４】ＨＦＥ７Ａのエピトープ限定のための競合アッセイの結果を表す図。
【図５】ＨＦＥ７Ａの毒性試験の結果を表す図。
【図６】劇症肝炎モデルを用いた試験の結果を表す図。
【図７】コラーゲン誘導関節炎の発症予防試験の結果を表す図。
【図８】ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要。
【図９】ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要。
【図１０】ＶＨＨ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要。
【図１１】ＶＨＨ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラスミド作製方法の概要。
【図１２】ＶＨＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要。
【図１３】ＶＨＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要。
【図１４】ＶＨＭ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラスミド作製方法の概要。
【図１５】ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要。
【図１６】ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要。
【図１７】ＶＭＭ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要。
【図１８】ＶＭＭ−ＤＮＡ断片を保持するプラスミド作製方法の概要。
【図１９】ヒト化軽鎖シークエンシングプライマーの結合位置を示す図。
【図２０】ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要。
【図２１】ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要。
【図２２】ＶＤ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要。
【図２３】ＶＤ−ＤＮＡ断片を保持するプラスミド作製方法の概要。
【図２４】ヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域とイントロンを含むＤＮＡ（ＩＧ５’−ＤＮＡ）断片の作製法の概要。
【図２５】ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域およびイントロンを含むゲノムＤＮＡ（ＩＧ３’−ＤＮＡ）断片の作製法の概要。
【図２６】発現ベクタープラスミドｐＥｇ７ＡＨ−Ｈの作製手順の概要。
【図２７】ヒト化重鎖シークエンシングプライマーの結合位置を示す図。
【図２８】ヒト化抗Ｆａｓ抗体のヒトＦａｓ融合タンパク質に対する結合活性を示す図。
【図２９】ヒトＦａｓ融合タンパク質に対するＨＦＥ７Ａとヒト化抗Ｆａｓ抗体との競合阻害を示す図。
【図３０】ヒト化ＨＦＥ７ＡのＷＲ１９Ｌ１２ａに対する細胞障害活性を示す図。
【図３１】ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要。
【図３２】ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要。
【図３３】ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要。
【図３４】ＬＰＤＨＨ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラスミド作製方法の概要。
【図３５】ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要。
【図３６】ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要。
【図３７】ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ作製のための第三段階ＰＣＲの概要。
【図３８】ＬＰＤＨＭ−ＤＮＡ断片を保持する発現プラスミド作製方法の概要。
【図３９】ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ作製のための第一段階ＰＣＲの概要。
【図４０】ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ作製のための第二段階ＰＣＲの概要。
【図４１】ＨＰＤ１．２−ＤＮＡ断片を保持するプラスミド作製方法の概要。
【図４２】ＨＶタイプヒト化重鎖をコードするＤＮＡのシークエンシングプライマー結合位置を示す図。
【図４３】各種ヒト化軽鎖をＣＯＳ−１細胞で発現させるために最適化した発現ベクターの構築図。
【図４４】各種ヒト化重鎖をＣＯＳ−１細胞で発現させるために最適化した発現ベクターの構築図。
【図４５】各種形質転換ＣＯＳ−１細胞培養上清中のヒトＦａｓ融合タンパク質に対する結合活性を示す図。
【図４６】各種形質転換ＣＯＳ−１細胞培養上清中の、ヒトＦａｓ融合タンパク質とＨＦＥ７Ａの結合に対する競合阻害活性を示す図。
【図４７】各種形質転換ＣＯＳ−１細胞培養上清中のＷＲ１９Ｌ１２ａに対する細胞障害活性を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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