(57)【要約】【課題】標本の固定時間を短縮すると共に、毒性が低く、標本を損傷せず、かつ良好な検査結果が得られる固定液を提供すること。【解決手段】本発明は、エタノール、水、１，２−プロパンジオール、ポリビニルアルコール、及び有効量の少なくとも１種類の単畳体ポリヒドロキシ化合物を含む固定液組成物を開示している。また、同固定液を含むキットとその組織病理学、細胞学及び免疫組織化学における使用をも開示している。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールと、
水と、
１，２−プロパンジオールと、
ポリビニルアルコールと、
有効量の少なくとも１種類の単畳体ポリヒドロキシ化合物とを含有する固定液組成物。
【請求項２】
前記単畳体ポリヒドロキシ化合物は少なくとも３個の炭素原子を含む糖質である、請求項１に記載の固定液組成物。
【請求項３】
前記糖質は６個の炭素原子を有する、請求項２に記載の固定液組成物。
【請求項４】
前記糖質はＤ−ソルビトールなどのヘキシトールである、請求項３に記載の固定液組成物。
【請求項５】
前記単畳体ポリヒドロキシ化合物を０．０５〜２．００重量パーセント含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の固定液組成物。
【請求項６】
エタノール、水、１，２−プロパンジオール及びポリビニルアルコールを各々５０〜８５重量パーセント、１０〜４０重量パーセント、３〜２０重量パーセント、及び０．０５〜３．００重量パーセント含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の固定液組成物。
【請求項７】
前記エタノールの濃度は６５〜７５重量パーセントである、請求項６に記載の固定液組成物。
【請求項８】
添加剤及び補助剤の少なくともいずれかをさらに含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の固定液組成物。
【請求項９】
前記添加剤及び補助剤の少なくともいずれかは許容され得る塩、アルコール、ケトン、カルボン酸、糖及びポリマーから選択される、請求項８に記載の固定液組成物。
【請求項１０】
水、１，２−プロパンジオール、ポリビニルアルコール、及び有効量の少なくとも１種類の単畳体ポリヒドロキシ化合物の混合物を保持するための第一手段とエタノールを保持するための第二手段とを備える組織固定用キット。
【請求項１１】
前記単畳体ポリヒドロキシ化合物は少なくとも３個の炭素原子を含む糖質である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記糖質は６個の炭素原子を有する、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記糖質はＤ−ソルビトールである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記第一手段の内容部と前記第二手段の内容物とは混合されて、エタノールを５０〜８５重量パーセント、水を１０〜４０重量パーセント、１，２−プロパンジオールを３〜２０重量パーセント、ポリビニルアルコールを０．０５〜３．００重量パーセント、及び前記単畳体ポリヒドロキシ化合物を０．０５〜２．００重量パーセント含有する固定液が得られる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
前記第一手段の混合物は添加剤及び補助剤の少なくともいずれかをさらに含有する、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
前記添加剤及び補助剤の少なくともいずれかは許容され得る塩、アルコール、ケトン、カルボン酸、糖及びポリマーから選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の固定液組成物又は請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のキットの組織病理学、細胞学及び免疫組織化学において組織標本の検査における使用。
【請求項１８】
前記組織標本はヒト又は動物に由来する臓器である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
生検標本が検査される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記標本は５時間１５分以内に固定される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
生検標本が２０分以内に固定される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
生検標本又は外科標本がタンパク質及び核酸の少なくともいずれかの検査に供される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
前記標本は抗原検査に供される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
マイクロ波の存在下で固定が行なわれる、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エタノールベースの固定液、ならびに同固定液を含むキットとその組織病理学、細胞学及び免疫組織化学における使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
外科病理学の分野において最も広く用いられている固定液は、ホルマリンと呼ばれる４％のホルムアルデヒド水溶液である。固定液としてホルムアルデヒドを使用した最初の開示は、１８９６年のブルーム（Ｆ．  Ｂｌｕｍ）による開示である（出典：特許文献１参照）。
【０００３】
標本は、固定したのちに、高濃度のエタノールで乾燥して、キシレンで洗浄した後にパラフィンに包埋（ｉｍｐｒｅｇｎａｔｉｏｎ）してブロックを得る。このブロックを切断して厚さ数マイクロメートルの小片にし、標準的なヘマトキシリン−エオジンによって染色し、形態学的評価に供する。
【０００４】
従来の固定法では、標本の処理に２４〜４８時間を要した。やや小さな断片である生検材料の場合、処理時間が数時間に短縮されることもある。
さらに、近年、マイクロ波を利用することによって、固定及び処理に要する時間が大幅に短縮され、外科標本であっても「当日診断」が可能となった。
【０００５】
【非特許文献１】
ブルーム（Ｆ．  Ｂｌｕｍ）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２４巻第３号、２００１年９月、１５５〜１６２ページ
【０００６】
【非特許文献２】
Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２４巻第３号、２００１年９月、１６５〜１７５ページ
【非特許文献３】
Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２４巻第３号、２００１年９月、１５１〜１５２ページ
【０００７】
【非特許文献４】
Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｆｏｒｍａｌｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｅｓ、ガレスピーら［Ｊｏｈｎ  Ｗ．  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ｅｔ  ａｌ．］、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第１６０巻第２号、２００２年２月
【０００８】
【非特許文献５】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻第４号、２０００年１２月、２９９〜３０７ページ
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
アルデヒド類を用いた固定には、重大な不具合があることが公知となっている。ホルマリンは、粘膜を刺激するほか、口腔咽頭及び気道の癌を惹き起こすことが示唆されてきた。これらの理由によって、ホルマリンは、ドラフト内で作業を行なう、保護手袋及び保護ゴーグルを着用する、などの安全基準を遵守する場合にのみ使用が許されており、ホルマリン含有廃液の特別な計測が行なわれている（非特許文献２参照）。
【００１０】
また、ホルマリンが、重要なタンパク質間の架橋、並びに核酸−タンパク質間の架橋を生じさせることが公知となっている（非特許文献３参照）。このため、ホルマリンで固定し、パラフィンで処理した組織から、無損傷のｍＲＮＡやＤＮＡを抽出することは難しい。したがって、ホルマリンで固定し、パラフィンで処理した組織標本から、無損傷のｍＲＮＡ分子やＤＮＡ分子を抽出することが課題となっている。分子生物学の研究が一層重要となり、ｍＲＮＡ分子やＤＮＡ分子を無損傷で回収する必要性が高まっているなかで、架橋効果は、分子生物学の研究、より詳細には遺伝子プロファイリング解析にこの種の材料を用いる上で大きな制約となっている。
【００１１】
近年、分子レベルでの解析に適した材料に対するニーズは非常に高まっており、特にヒトゲノムプロジェクトが完了したことで、この種の研究から多くの疾患の性質に関する重要な知見が得られれば、重要な治療に利用できると考えられている。ホルマリン固定標本から至適な遺伝物質を得るための試みがなされてきたにも関わらず、良好かつ一貫した成果が得られていない。
【００１２】
通常、核酸の変性を防止するため、新鮮な材料が外科手術直後に採取されて液体窒素で冷凍され、−８０℃の特殊な冷蔵庫に保管される。
標本の一部は、上記の理由によって形態学的解析にはもはや適さないが、冷凍標本で診断を行なう必要がある場合は、冷凍により多くのアーチファクトが発生する。また、別の可能性として、冷凍された材料を通常のように固定して処理する場合があるが、この材料には多くのアーチファクトがみられ、かつ抗原性が損なわれていることがあり、免疫反応の結果を誤って解釈するおそれがある。最後に、新鮮標本から得た遺伝物質には、試験対象の細胞のみならず、標本の全細胞から得られた遺伝物質が存在する可能性がある。
【００１３】
上記の理由によって、標本の完全な形態学的評価が可能となると共に、高品質のＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質を回収できる代替的な固定液に対する関心が高まっている。パラフィンブロックは、冷凍材料よりも取り扱い及び保管が格段に容易である。さらに、今後、レーザー回収マイクロダイセクション（Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を使用することによって、背景基質に存在する他の細胞（結合組織細胞、リンパ球など）による汚染を生じることなく、標本から特定の部位を回収して、腫瘍の異質性を研究できるようなる。
【００１４】
ホルマリンの代替物は、下記の２種類に大きく分けられる。
−アルコールベース
−非アルコールベース
アルコールベースのものは、エタノールを含有しており、公知の混合物（例えば、カルノワ固定液とその誘導物のメタカーン［Ｍｅｔｈａｃａｒｎ］があり、いずれもクロロホルムを含有し、後者はエタノールの代わりにメタノールが使用されている）や、ネオフィックス（ＮｅｏＦｉｘ）やクリオフィックス（Ｋｒｙｏｆｉｘ）などの固定液がある。
【００１５】
非アルコールベースのものは、ホルマリンよりも毒性が低いが、細胞構成要素に対して同様の作用を有するジアルデヒドである、グリオキサールをベースとした固定液がほとんどである。
【００１６】
現在、上記の代替物の分子レベルの研究への利用に関する研究は少ないが、その結果から、エタノールベース及びエタノールベースの固定液のほうが、少なくともホルマリンよりも優れていることが明らかとなっている（出典：非特許文献４）。
【００１７】
エタノールは、核酸をほとんど分解させることなくタンパク質を変性させる固定液として作用する。しかし、分子レベルの研究には、低温固定（４℃）及び低温ポリエステル樹脂包埋（３８℃）によって最善の結果が得られるという制約が存在する。この利用に関する研究は、現在のところ前立腺組織で行なわれているのみである。通常、純エタノールを用いて固定を行なうと、標本の端部が著明に収縮すると共に、核のアーチファクトが形成される。エタノールを小さな生検材料に使用すると、組織の収縮のため正確な診断を下せなくなることもある。
【００１８】
この分野の最近の研究結果から、固定液としてアルコール混合物を用いた場合、許容できる結果は得られるが、至適な結果が得られることはないことが明らかにされた。各種のエタノールベースの固定液が、非特許文献５に記載されている。
【００１９】
したがって、本発明の目的は、迅速な固定が可能で、形態学的構造構造の細部まで正確に観察できると共に核酸及びタンパク質を良好に回収でき、ホルマリンの代替となる固定液を提供することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は、本発明の固定液組成物によって達成される。
本発明は、本出願の請求項１に定義される。
請求項１は、必須成分としてエタノール、水、１，２−プロパンジオール、ポリビニルアルコール、及び有効量の少なくとも１種類の単畳体ポリヒドロキシ化合物を含有する固定液組成物に関する。その従属請求項は、本発明の固定液組成物の好適な実施形態を定義している。
【００２１】
さらに、本発明は、水、１，２−プロパンジオール、ポリビニルアルコールの混合物、及び有効量の少なくとも１種類の単畳体ポリヒドロキシ化合物を保持するための第一手段と、エタノールを保持するための第二手段とを備える組織固定用キットに関する。
【００２２】
その従属請求項は、本発明のキットの好適な実施形態を定義している。
【００２３】
上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、エタノールと、水と、１，２−プロパンジオールと、ポリビニルアルコールと、有効量の少なくとも１種類の単畳体ポリヒドロキシ化合物とを含有することを要旨とする。
【００２４】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の固定液組成物において、前記単畳体ポリヒドロキシ化合物は少なくとも３個の炭素原子を含む糖質である、ことを要旨とする。
【００２５】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の固定液組成物において、前記糖質は６個の炭素原子を有する、ことを要旨とする。
請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の固定液組成物において、前記糖質はＤ−ソルビトールなどのヘキシトールである、ことを要旨とする。
【００２６】
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか１項に記載の固定液組成物において、前記単畳体ポリヒドロキシ化合物を０．０５〜２．００重量パーセント含有する、ことを要旨とする。
【００２７】
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれか１項に記載の固定液組成物において、エタノール、水、１，２−プロパンジオール及びポリビニルアルコールを各々５０〜８５重量パーセント、１０〜４０重量パーセント、３〜２０重量パーセント、及び０．０５〜３．００重量パーセント含有する、ことを要旨とする。
【００２８】
請求項７に記載の発明は、請求項６に記載の固定液組成物において、前記エタノールの濃度は６５〜７５重量パーセントである、ことを要旨とする。
請求項８に記載の発明は、請求項１〜７のいずれか１項に記載の固定液組成物において、添加剤及び補助剤の少なくともいずれかをさらに含有する、ことを要旨とする。
【００２９】
請求項９に記載の発明は、請求項８に記載の固定液組成物において、前記添加剤及び補助剤の少なくともいずれかは許容され得る塩、アルコール、ケトン、カルボン酸、糖及びポリマーから選択される、ことを要旨とする。
【００３０】
請求項１０に記載の発明は、水、１，２−プロパンジオール、ポリビニルアルコール、及び有効量の少なくとも１種類の単畳体ポリヒドロキシ化合物の混合物を保持するための第一手段とエタノールを保持するための第二手段とを備えることを要旨とする。
【００３１】
請求項１１に記載の発明は、請求項１０に記載のキットにおいて、前記単畳体ポリヒドロキシ化合物は少なくとも３個の炭素原子を含む糖質である、ことを要旨とする。
【００３２】
請求項１２に記載の発明は、請求項１１に記載のキットにおいて、前記糖質は６個の炭素原子を有する、ことを要旨とする。
請求項１３に記載の発明は、請求項１２に記載のキットにおいて、前記糖質はＤ−ソルビトールである、ことを要旨とする。
【００３３】
請求項１４に記載の発明は、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のキットにおいて、前記第一手段の内容部と前記第二手段の内容物とは混合されて、エタノールを５０〜８５重量パーセント、水を１０〜４０重量パーセント、１，２−プロパンジオールを３〜２０重量パーセント、ポリビニルアルコールを０．０５〜３．００重量パーセント、及び前記単畳体ポリヒドロキシ化合物を０．０５〜２．００重量パーセント含有する固定液が得られる、ことを要旨とする。
【００３４】
請求項１５に記載の発明は、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のキットにおいて、前記第一手段の混合物は添加剤及び補助剤の少なくともいずれかをさらに含有する、ことを要旨とする。
【００３５】
請求項１６に記載の発明は、請求項１５に記載のキットにおいて、前記添加剤及び補助剤の少なくともいずれかは許容され得る塩、アルコール、ケトン、カルボン酸、糖及びポリマーから選択される、ことを要旨とする。
【００３６】
請求項１７に記載の発明は、請求項１〜９のいずれか１項に記載の固定液組成物又は請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のキットの組織病理学、細胞学及び免疫組織化学において組織標本の検査における使用において、請求項１〜９のいずれか１項に記載の固定液組成物又は請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のことを要旨とする。
【００３７】
請求項１８に記載の発明は、請求項１７に記載の使用において、前記組織標本はヒト又は動物に由来する臓器である、ことを要旨とする。
請求項１９に記載の発明は、請求項１８に記載の使用において、生検標本が検査される、ことを要旨とする。
【００３８】
請求項２０に記載の発明は、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用において、前記標本は５時間１５分以内に固定される、ことを要旨とする。
請求項２１に記載の発明は、請求項２０に記載の使用において、生検標本が２０分以内に固定される、ことを要旨とする。
【００３９】
請求項２２に記載の発明は、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用において、生検標本又は外科標本がタンパク質及び核酸の少なくともいずれかの検査に供される、ことを要旨とする。
【００４０】
請求項２３に記載の発明は、請求項２２に記載の使用において、前記標本は抗原検査に供される、ことを要旨とする。
請求項２４に記載の発明は、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の使用において、マイクロ波の存在下で固定が行なわれる、ことを要旨とする。
【００４１】
（作用）
【００４２】
【発明の実施の形態】
本発明による固定液組成物並びにキットは、組織検査用標本及び細胞検査用標本の検査に最適である。この固定液組成物並びにキットは、エタノールの含有量のために極めて毒性が低く、従来型やマイクロ波誘導型のヒストプロセッサなどで使用できることがわかっている。
【００４３】
エタノール、水、１，２−プロパンジオール及びポリビニルアルコールの混合物に有効量の単畳体ポリヒドロキシ化合物を導入すると、組織検査、細胞検査及び免疫組織化学の検査に非常に有効な固定液が得られることが判明している。本発明の固定液は、マイクロ波誘導による迅速な固定及び処理に適すると共に、形態学的構造構造の細部まで正確に観察でき、種々の組織の抗原性を至適に発現させ、核酸及びタンパク質を良好に保存する。
【００４４】
単畳体ポリヒドロキシ化合物として、少なくとも３個の炭素原子を含む糖質を使用すると最良の結果が得られることが判明している。実験では、６個の炭素原子を有する糖質を使用すると最良の結果が得られた。６個の炭素原子を有する糖質の例には、ソルビトール、マンニトール及びズルシトールなどのヘキシトール類があり、好適にはＤ−ソルビトールである。
【００４５】
固定液に含まれる単畳体ポリヒドロキシ化合物の量は、好適には０．０５〜２．００重量パーセントである。
エタノールは、本発明の固定液組成物の主成分である。アルコールの量は５０〜８５重量パーセントでなければならず、好適には６５〜７５重量パーセントである。
【００４６】
上に記載したように、エタノールは病理学において既に用いられており、通常は７０％の濃度で使用される。さらに、エタノールは強力な殺菌作用を有する。エタノールの機能は、脱水作用によってタンパク質の三次構造を破壊し、タンパク質を変性させることにある。この作用は、少なくとも部分的にはタンパク質の再生過程によって復元可能である。
【００４７】
本発明の固定液組成物においては、毒性を下げるためにメタノールが選択されてもよい。さらに、メタノールは、イソプロピルアルコールのように組織化学的染色を妨害しないことが知られている。
【００４８】
さらに、変性エタノールを使用することによって固定液を極めて安価に調整することができる。本固定液における最終濃度は、好適には７２％である。
本発明の固定液組成物は、水溶性成分をエタノールに溶解させるための水を含む。水は安価であり、完全に無害である。本発明の固定液組成物における水の分量は、好適には１０〜４０重量パーセントである。
【００４９】
別の重要な成分には、凍結防止作用を有する１，２−プロパンジオールがある。１，２−プロパンジオールは水の凝固点を下げると共に、水と相互溶解する。１，２−プロパンジオールは、水中油型乳剤の形で水にも脂質にも完全に溶解し、かつ公知となっている可塑剤である。無毒であり、化粧品、食品及び医薬品に広く用いられている。分子量が比較的低いため、組織及び細胞に迅速に浸透して、その凍結防止作用によって低温による影響から組織を保護する。本発明の固定液組成物における１，２−プロパンジオールの量は、好適には３〜２０重量パーセントであることが判明している。
【００５０】
ポリビニルアルコールは、酵素組織化学の分野において、冷凍、切断及び解凍の結果生ずるアーチファクトを低減させる組織保護剤として公知となっている。ポリビニルアルコールの機能は、水分子を補足することにあり、これによって、組織断面から分子が拡散する溶媒となる水を低減させる。このため、多くの細胞構成要素が細胞内の部位において「封鎖」され、その特定が容易となる。細胞検査用標本での別の利点として、染色工程で細胞が失われるのを防止することがある。ポリビニルアルコールの機能は、外科標本（壊死組織や粘膜など）にみられる無定形物質から細胞が分離するのを防止し得る。
【００５１】
本発明の固定液組成物に含まれる少なくとも３個の炭素原子を含む単畳体ポリヒドロキシ化合物は、油吸収剤、有機溶媒、甘味料（人口甘味料）として工業分野で広く用いられている。
【００５２】
例えば、ソルビトール、マンニトール及びズルシトールは分子量が小さく、水に可溶であるため、組織及び細胞に迅速に浸透する。ポリヒドロキシ化合物の主な機能は、エタノールの有害作用、特に可塑化作用の防止にある。上記のポリヒドロキシ化合物は、タンパク質熱安定剤及び変性防止剤として作用し、冷凍保護機能を有することが知られている。
【００５３】
本発明の固定液組成物をなす成分の特定の組み合わせから、組織の完全な形態学的評価を可能とし、損傷することなくタンパク質及び核酸を回収できる理想的な固定液が得られることが判明している。この混合固定液の作用機序はいかなる理論にも制約されないにも関わらず、混合物に含まれる他の有効成分によってエタノールの作用が影響され、組織に含まれる水の少なくとも一部が脱出するのを防止し、細胞及び背景の細胞間物質が「収縮」して見えることを防ぐ。
【００５４】
また、本発明による固定液組成物は、固定液の有効性を改善する添加剤及び補助剤の少なくともいずれかを含有してもよい。
添加される添加剤及び補助剤の少なくともいずれかの例は、許容され得る塩、アルコール、ケトン、カルボン酸、糖、ポリマー、アグリコン、及びポリフェノールのうちから選択される。
【００５５】
適した塩には、炭酸カルシウム（リン脂質キレート剤）、酢酸カルシウム（リン脂質キレート剤）、ＥＤＴＡ、ｓｔａｇｎｕｓ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（膜の保存剤）、Ｎａ２ＨＰＯ４（膜の保存剤）、ＭｇＣ１２、ＮａＣｌ、及び硫酸亜鉛がある。
【００５６】
固定液組成物に添加し得るアルコールには、１価、２価及び３価のアルコールがある。１価アルコールの例に、ブタノールのほかオクタノール、デカノール等の長鎖脂肪アルコールがある。２価アルコールには、エチレングリコール、分子量の異なるポリエチレングリコール、ペンチレングリコール及びヘキシレングリコールグリコールがある。
【００５７】
３価アルコールの例には、グリセロール、ポリグリセロール等のトリオール及びポリトリオールがある。
場合によっては、キシリトール及びマルチトールなどのポリオールの添加が有益であり得る。アルコール性の添加剤は、本発明の固定液組成物に含まれるポリヒドロキシ化合物と異なることがあり得る。
【００５８】
また、酢酸（核酸の凝固剤）、又は５〜８個の炭素原子を有するカルボン酸などのカルボン酸を適宜添加してもよい。
糖の例には、フルクトース、スクロース、トレハロースのほか、ローカストビーンガム、キサンタンガム、アラティックガム（ａｒａｔｉｃ  ｇｕｍ）、カルボキシメチルセルロース及びペクチン等の多糖類、カルボマー（半合成多糖類）がある。
【００５９】
特定の組織標本では、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリフェノール及びアグリコンを含むポリマーを添加することが望ましい。
本発明の固定液組成物に使用される添加剤及び補助剤の少なくともいずれかの量はさほど重要ではないが、本発明による固定液組成物の有効性が損なわれないように１０ｇ未満でなければならない。
【００６０】
本発明の固定液組成物は、固定用のキットとして提供され得る。このキットは、水、１，２−プロパンジオール、ポリビニルアルコールの混合物、及び有効量の少なくとも１種類の単畳体ポリヒドロキシ化合物を保持するための第一手段と、エタノールを保持するための第二手段とを備える。第一手段及び第二手段の内容物は、固定液組成物を使用する直前に混合され得る。本キットの固定液貯蔵寿命は６ヵ月から９ヵ月である。必要に応じて、第一手段の内容物を別個に出荷して、使用者がエタノールを追加して、新鮮な固定液組成物を調整してもよい。
【００６１】
内容物を保持するための手段は、保存及び出荷に適した任意の手段であり得る。これら手段は、プラスチック製又はガラス製であり得、かつさまざまな寸法や形状を有し得る。
【００６２】
本キットの好適な実施形態においては、単畳体ポリヒドロキシ化合物は、少なくとも６個の炭素原子を有する糖質である。この糖質は、より好適にはソルビトール、マンニトール及びズルシトール等のヘキシトールであり、最も好適にはＤ−ソルビトールである。
【００６３】
第一手段及び第二手段の内容物を混合したときに、固定液は、好適にはエタノールを５０〜８５重量パーセント、水を１０〜４０重量パーセント、１，２−プロパンジオールを３〜２０重量パーセント、ポリビニルアルコールを０．０５〜３．００重量パーセント、及び少なくとも１種類の単畳体ポリヒドロキシ化合物を０．０５〜２．００重量パーセント含有する。
【００６４】
本キットの好適な実施形態においては、第一手段の混合物は、添加剤及び補助剤の少なくともいずれかをさらに含有する。
補助剤の機能は、固定液の有効性を高めることにある。適切な添加剤及び補助剤の少なくともいずれかは、検査対象の組織によって決まる。
【００６５】
第一手段の混合物に添加される添加剤及び補助剤の少なくともいずれかは、許容され得る塩、アルコール、ケトン、カルボン酸、糖及びポリマーのうちから選択される。添加剤及び補助剤の例については、上記に記載したとおりである。
【００６６】
本発明による固定液組成物並びに本発明によるキットは、組織病理学、細胞学及び免疫組織化学における組織標本の検査に使用することができる。検査対象の組織標本は、ヒト又は動物に由来する任意の材料であり得る。
【００６７】
本発明による固定液組成物は、ヒト又は動物から採取した任意の材料に使用できることが判明している。この例は、中枢神経系、甲状腺、副腎、下垂体、膵臓、肺、気管支、心臓、消化管（食道、胃、小腸、大腸）、肝臓、腎臓、膀胱、睾丸、卵巣、子宮、前立腺、乳房、柔組織、骨、骨髄、リンパ節、脾臓などであった。
【００６８】
材料は、臓器の全体、或いはその一部を浸漬固定したのちに検査した。適宜、小さな断片に切断して、生検を模倣することもあれば、通常どおり標本に日常的な組織病理学検査を行なうこともあった。一般的な標本は、大きさが２５ｍｍ×２０ｍｍで、厚さが３〜４ｍｍであった。
【００６９】
材料の一部を、ホルマリンで固定して、同じ手順によって通常どおり染色を施し、比較のための「ミラーブロック」を得た。
マイクロ波を使用すれば、固定を早く行なうことができる。この際、時間予定を変更せずに通常の処理手順を行うことも、時間を短縮して通常の処理手順を行なうことも、或いはマイクロ波プロセッサを用いることも可能である。固定時間は、生検用標本では２０分程度、大きな標本では２〜３時間であり得る。本発明の固定液組成物を使用すれば、これまで約１６時間かかっていた固定処理の時間を、大きく脂肪分の多い標本（例えば、乳房）では厚さを約２ｍｍに薄くすることによって４〜５時間に短縮することができる。このような時間の短縮は固定液の特性によるものであり、これは処理液の一種であるとみなし得る。
【００７０】
その後の処理方法を問わず、処理された標本は最終的にはパラフィンブロックに包埋される。
さらに、本発明の固定液組成物及びキットは、固定液にスライドを浸漬するか、固定液をスライドに噴霧することによって、幾つかの臓器（中枢神経系、乳房、甲状腺等）の細胞検査標本の作成にも利用することができる。この場合、細胞学的な構造が細部まで良好に保存される。
【００７１】
本発明の固定液組成物によって処理された各種標本に、数種類の組織化学的染色を施した。染色法の例に、ＰＡＳ染色、グロコット銀メタンアミン染色、マッソン三色染色、ギムザ染色、レチクリン、トルイジンブルー染色、アルシアンブルー−ｐａｓ染色、オルセイン染色、ＰＡＳ−オレンジ、及びチール−ネールセン染色がある。
【００７２】
本発明による固定液組成物によって固定した標本と、ホルマリンによって固定した標本との間には、染色特性の差はみられなかった。
多くの標本（生検用標本及び外科標本）について免疫組織化学的反応を検査したところ、至適な結果が得られた。
【００７３】
抗原回復のための手順が不要なこともあるが、例えば、温度を下げる、緩衝液を変更するなど、条件を若干変更しなければならないこともある。本発明による固定液で固定した標本とホルマリンで固定した標本とで、結果を比較した。
【００７４】
検査対象の抗原は、上皮発現抗原（サイトケラチン、上皮膜抗原）、ＣＤ抗原（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ）、増殖マーカー（Ｋｉ６７、ＭＩＢ１）、中間径フィラメント（ビメンチン、デスミン、ＯＦＡＰ、神経細線維）、下垂体性マーカー（プロラクチン、ＡＣＴＨ、ＯＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ）、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、Ｓ１００タンパク質、アクチン、ｃ−ｅｒｂ２、クロモグラニン、シナプトフィシン、ガストリン、前立腺特異抗原等であった。
【００７５】
分子レベルでの生検を実施して、本発明による固定液で固定した標本とホルマリンで固定した標本とで比較を行なった。その結果、本発明の固定液組成物によって固定した組織標本のほうが良好に核酸を回収できることが明らかであった。検査は、脾臓、扁桃、中枢神経系の腫瘍（乏突起細胞腫）、甲状腺、肝臓（肝細胞癌）及び肺について行なった。ホルマリン固定標本ではＤＮＡが変性していたが、本発明の固定液組成物によって固定した標本からは、無損傷のＤＮＡ、特に高分子量のＤＮＡが多量に得られた。
【００７６】
【発明の効果】
本発明の本発明の固定液組成物及びキットは、ホルマリン、エタノールなどの一般的に使用される固定液よりも優れた特性を備える。本発明の固定液組成物及びキットは下記の点において有利である。本発明の固定液組成物及びキットは、固定、脱水及び脂質抽出を同時に行なうことができる。また、組織の収縮を生じさせない。毒性が極めて低い。さらに、形態学的構造の細部を至適に保存する。組織の抗原性を至適に保存し、抗原回復のための手順を用いる必要が少ない。至適な染色特性（ヘマトキシリン染料、エオシン染色、組織化学的染色）を提供する。また、分子レベルでの検査のために核酸を至適に保存する。細胞検査用の標本のための固定液として適し、組織を長時間冷凍した後でも形態学的構造を至適に保存する。