(57)【要約】【課題】　本発明の目的はヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩおよびヘパリナーゼＩＩＩを精製し、そして特徴づける方法を提供することにある。【解決手段】　Ｆ．　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来の３種のヘパリンリアーゼすべてを同時に精製して、明らかに均質にする単一の、再現性のあるスキームが、本明細書で記述される。このヘパリンリアーゼの速度論的性質が示され、そしてこれらの活性および安定性を最適化する条件も示される。この３種のヘパリンリアーゼに対するモノクローナル抗体もまた、記載され、そしてこれらは、これらのヘパリナーゼの検出、単離、および特徴づけのために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
　精製されたヘパリナーゼＩＩＩであって、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ中で発現され、ヘパリナーゼＩＩＩ活性以外のリアーゼ活性がなく、分子量７０，８００であり、ヘパリン硫酸を切断し、そして最適ｐＨが９．９〜１０．１である、ヘパリナーゼＩＩＩ。
【請求項２】
　ヘパリン硫酸を切断しない、請求項１に記載のヘパリナーゼＩＩＩ。
【請求項３】
　アルブミンで安定化される、請求項１に記載のヘパリナーゼＩＩＩ。
【請求項４】
　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍの生物学的に純粋な培養物由来のパリナーゼＩおよびＩＩから請求項１に記載の精製されたタンパク質を精製する方法であって、
　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍの生物学的に純粋な培養物中のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞を溶解する工程、
　該細胞溶解物から細胞残渣および核酸を除去する工程、
　ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩをヒドロキシルアパタイトへ吸着させる工程、
　非ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩタンパク質をＱＡＥ樹脂へ吸着させる工程、
　該ＱＡＥ樹脂に結合しない該ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを回収する工程、
　ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを、ＨＰＬＣによって、ヒドロキシルアパタイトカラム上で分離する工程、
　該ヒドロキシルアパタイトカラム上で分離された該ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを回収する工程、
　分離された該ヘパリナーゼをカチオン交換ＦＰＬＣによって精製する工程、
　該カチオン交換ＦＰＬＣによって分離された該ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを回収する工程、
　分離された該ヘパリナーゼをゲルパーミエーションＨＰＬＣによって精製する工程、および
　ゲルパーミエーションＨＰＬＣによって分離された該ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを回収する工程
を包含する、方法。
【請求項５】
　前記核酸がプロタミンによる沈澱によって除去される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
　前記ヘパリナーゼが、ヒドロキシルアパタイトカラム上で塩グラジエントによる溶出によって分離される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
　前記ヘパリナーゼが、塩濃度を増加させるグラジエントによってカチオン交換カラムから溶出される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
　前記ヘパリナーゼが、グラジエントまたは塩濃度の増加によってカチオン交換カラムから溶出される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
　請求項１に記載のヘパリナーゼＩＩＩに対して特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項１０】
　ヘパリナーゼを検出する方法であって、ヘパリナーゼ活性を有する試料を、請求項９に記載の抗体と反応させる工程、および該反応の程度を決定する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
　前記試料がＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
　前記抗体とヘパリナーゼとの反応性がイムノブロッティングによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
　ヘパリン硫酸を切断する方法であって、該ヘパリン硫酸を、請求項１に記載の精製されたヘパリナーゼＩＩＩと反応させる工程を包含する、方法。
【請求項１４】
　前記ヘパリンが、細胞または組織の細胞外マトリックスである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　（発明の背景）
　本発明は、一般にＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの精製と特徴づけならびにそれらに対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
　ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、ヘキスロン酸に結合した直鎖状の多糖類であるＤ−グルコサミン（１→４）により特徴づけられたグルコサミノグリカンのクラスを代表する（Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．２，４５−５０；Ｃａｓｕ，Ｂ．（１９８５）　Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　４３，　５１−１３４）。ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、炭水化物複合体であって哺乳類の細胞外マトリックスで重要な機能の役割を果たす。これらの多糖類は、正常な状態下での発生または病理学上の状態下で創傷治癒および腫瘍の転移のどちらかの間に起こる組織レベルの事象を調節および制御する。
【０００３】
　ヘパリンおよびヘパラン硫酸配列についての現状の知識は、それらの生合成の研究に依存している（Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｏｇａｎａｔｈａｎ，　Ｄ．，およびＢａｅ，Ｊ．Ｈ．（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，　２３８０−２３８７；　Ｌｉｎｄａｈｌ　Ｕ．，　Ｆｅｉｎｇｏｌｄ，　Ｄ．，およびＲｏｄｅｎ，　Ｌ．　（１９８６）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　１１，　２２１−２２５；　Ｊａｃｏｂｓｏｎ，　Ｉ．，およびＬｉｎｄａｈｌ，　Ｕ．　（１９８０）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５５，　５０９４−５１００；　Ｌｉｎｄａｈｌ，　Ｕ．，およびＫｊｅｌｌｅｎ，　Ｌ．　（１９８７）　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ　（Ｗｉｇｈｔ，　Ｔ．Ｎ．，　およびＭｅｃｈａｍ　Ｒ．，編）　ｐｐ．５９−１０４，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。最近の研究（Ｌｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｒｉｃｅ，　Ｋ．Ｇ．，　Ｋｉｍ，　Ｙ．Ｓ．，　Ｌｏｈｓｅ，　Ｄ．Ｌ．，　Ｗａｎｇ，　Ｈ．Ｍ．およびＬｏｇａｎａｔｈａｎ，　Ｄ．　（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　２５４，　７８１−７８７；　Ｌｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，　Ｊ．Ｅ．，　Ｗａｎｇ，　Ｈ．Ｍ．，　Ｌｏｇａｎａｔｈａｎ，　Ｄ．およびＧａｌｌａｇｈｅｒ，　Ｊ．Ｔ．　（１９９０）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９，　２６１１−２６１７）は、これらの多糖類複合体をオリゴ糖に分解する酵素法の適用に焦点が絞られている。次に、オリゴ糖は構造的に特徴づけられ得る（Ｌｉｎｈａｒｄｔら、（１９９２）　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６７，２３８０−２３８７；　Ｌｉｎｈａｒｄｔら、（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　２５４，　７８１−７８７；　Ｌｏｇａｎａｔｈａｎ，　Ｄ．，　Ｗａｎｇ，　Ｈ．Ｍ．，　Ｍａｌｌｉｓ，　Ｌ．Ｍ．，　およびＬｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．（１９９０）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９，　４３６２−４３６８）。
【０００４】
　ヘパリンおよびヘパラン硫酸を分解する酵素法は、非常に特異的であり、オリゴ糖産物を与える穏やかな状態を必要とする。そして、オリゴ糖産物が由来するグリコサミノグリカンに良く似ている。ヘパリンおよびヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを分解する２つのタイプの酵素は、脱離機構で作用する原核生物起源の多糖類リアーゼ（Ｌｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｇａｌｌｉｈｅｒ，　Ｐ．Ｍ．，およびＣｏｏｎｅｙ，　Ｃ．Ｌ．　（１９８６）　Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　１２，　１３５−１７６）、および加水分解機構で作用する真核生物起源のグルクロニダーゼ（加水分解酵素）である。
【０００５】
　原核生物のヘパリンおよびヘパラン硫酸の分解は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来の酵素を用いて主に研究されてきた（Ｌｉｎｋｅｒ，　Ａ．およびＨｏｖｉｎｇｈ，　Ｐ．　（１９６５）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２４０，　３７２４−３７２８；　Ｌｉｎｋｅｒ，　Ａ．，およびＨｏｖｉｎｇｈ，　Ｐ．　（１９７０）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２４５，　６１７０−６１７５）；　Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，　Ｃ．Ｐ．，　Ｓｉｌｖａ，　Ｍ．Ｅ．，およびＭｉｃｈｅｌａｃｃｉ，　Ｙ．Ｍ．　（１９７３）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２４９，　６４０８−６４１５；　Ｓｉｌｖａ，　Ｍ．Ｅ．，　Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，　Ｃ．Ｐ．，およびＮａｄｅｒ，　Ｈ．Ｂ．　（１９７６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　４３７，　１２９−１４１）。この細菌性分解は、３つ（あるいはそれ以上）のエリミナーゼ（ｅｌｉｍｉｎａｓｅ）作用を伴い開始する。これらのヘパリンリアーゼは、それらの非還元末端に△４，５不飽和ウロン酸残基を有するオリゴ糖を生産する。これらのエリミナーゼは、おそらくヘパリンおよびヘパラン硫酸を二糖類に一斉に変化する作用をする。
【０００６】
　ヘパリンリアーゼは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸中の主なグルコシド結合を特異的に切断する能力を有する酵素の一般的なクラスである。３種のヘパリンリアーゼが、ヘパリン利用微生物である、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ中で同定されたがこの微生物はまた、エキソグリクロニダーゼ、スルホエステラーゼ、およびスルフアミダーゼを生産し、リアーゼにより生じたオリゴ糖産物にさらに作用する。（Ｙａｎｇ，　Ｖ．Ｃ．，　Ｌｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｂｅｒｓｔｅｉｎ，　Ｈ．，　Ｃｏｏｎｅｙ，　Ｃ．Ｌ．，およびＬａｎｇｅｒ，　Ｒ．　（１９８５）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６０，　１８４９−１８５７；　Ｇａｌｌｉｈｅｒ，　Ｐ．Ｍ．，　Ｌｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｃｏｎｗａｙ，　Ｌ．Ｊ．，　Ｌａｎｇｅｒ，　Ｒ．，およびＣｏｏｎｅｙ，　Ｃ．Ｌ．（１９８２）　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１５，　２５２−２５７）。これらのリアーゼは、ヘパリンリアーゼＩ（へパリナーゼ、ＥＣ　４．２．２．７）、　ヘパリンリアーゼＩＩ（へパリナーゼＩＩ、ＥＣ番号なし）およびヘパリンリアーゼＩＩＩ（へパリチナーゼ、ＥＣ　４．２．２．８）として命名された。これらの酵素の特異性は、完全には知られていないので、部分精製酵素をヘパリン、ヘパラン硫酸および構造的に特徴づけられたヘパリンオリゴ糖に用いた研究によって、酵素切断を受けやすい結合が理解された（Ｌｉｎｈａｒｄｔら、（１９９０），　Ｌｏｈｓｅ　（１９９２），　Ｒｉｃｅ，　Ｋ．Ｇ．，およびＬｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．　（１９８９）　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｒｅｓ．　１９０，　２１９−２３３）。３つの精製したヘパリンリアーゼは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を切断する能力が異なる：ヘパリンリアーゼＩは、ヘパリンを主に切断し、ヘパリンリアーゼＩＩＩは、ヘパラン硫酸を特異的に切断し、そしてヘパリンリアーゼＩＩは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に等しく作用する（Ｌｉｎｈａｒｄｔら、１９８６；　Ｌｉｎｈａｒｄｔら、１９９０）。
【０００７】
　いくつかのＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種（Ｓａｙｌｅｒｓ，　Ａ．Ａ．，　Ｖｅｒｃｅｌｌｏｔｔｉ，　Ｊ．Ｒ．，　Ｗｅｓｔ，　Ｓ．Ｅ．Ｈ．，およびＷｉｌｋｉｎｓ，　Ｔ．Ｄ．　（１９７７）　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　３３，　３１９−３２２；　Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｔ．，　Ｓｈｉｂａｔａ，　Ｙ．，およびＦｕｊｉｍｕｒａ，　Ｓ．　（１９８８）　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２５，１０７０−１０７１）もまた、へパリナーゼを生産する。しかし、これらの酵素は良く特徴づけられていない。へパリナーゼはまた、同定されていない土壌細菌から見かけ上均質になるまで精製された（Ｂｏｈｍｅｒ，　Ｌ．Ｈ．，　Ｐｉｔｏｕｔ，　Ｍ．Ｊ．，　Ｓｔｅｙｎ，　Ｐ．Ｌ．，およびＶｉｓｓｅｒ，　Ｌ．　（１９９０）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５，　１３６０９−１３６１７）。この酵素は、分子量（９４，０００）、ｐＩ　（９．２）、アミノ酸組成、および反応速度特性（Ｋｍ　３．４μＭおよびＶｍａｘ　３６．８μｍｏｌ／ｍｉｎ、最適ｐＨ　７．６）という点でＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍから単離した酵素と異なる。
【０００８】
　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｋ．，　Ｍｉｙａｚｏｎｏ，　Ｈ．，　Ｔａｗａｄａ，　Ａ．，　Ｋｉｋｕｃｈｉ，　Ｈ．，　Ｍｏｒｉｋａｗａ，　Ｋ．，およびＴｏｋｕｙａｓｕ，　Ｋ．　（１９８９）　１０ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｆ　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，　Ｊｅｒｕｓａｌｅｍに記載されたように、その他の３つのヘパリンリアーゼ、特にＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種Ｈｐ２０６から精製したヘパリンリアーゼは、６４，０００、１００，０００、および７２，０００の分子量を有し、ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩと異なる。
【０００９】
　Ｆ．　ｈｅｐａｒｉｎｕｍのヘパリンリアーゼは、最も広範囲で使用され、そして最も良く研究されている（Ｌｉｎｄｈａｒｄｔ，　（１９８６））。ＬｉｎｋｅｒおよびＨｏｖｉｎｇｈ（１９７０）は、これらのリアーゼ活性を最初に分離し、粗リアーゼ画分をヘパリナーゼ（ヘパリンリアーゼＩ）およびヘパリチナーゼ（ヘパリンリアーゼＩＩＩ）に分画した。両方の活性は、５０〜１００倍まで精製されたが、しかし、これらの酵素の物理的な特徴づけは、行われなかった。
【００１０】
　Ｄｉｅｔｒｉｃｈおよび共同研究者（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、１９７３）；　Ｓｉｌｖａら、（１９７６）；　Ｓｉｌｖａ，　Ｍ．Ｅ．，およびＤｉｅｔｒｉｃｈ，　Ｃ．Ｐ．　（１９７４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　５６，　９６５−９７２；　Ｍｉｃｈｅｌａｃｃｉ，　Ｙ．Ｍ．，およびＤｉｅｔｒｉｃｈ，　Ｃ．Ｐ．　（１９７４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　５６，　９７３−９８０）ならびにＯｔｏｔａｎｉおよびＹｏｓｉｚａｗａ（Ｏｔｏｔａｎｉ，　Ｎ．，およびＹｏｓｉｚａｗａ，　Ｚ．　（１９７８）　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（東京）　８４，　１００５−１００８；　Ｏｔｏｔａｎｉ，　Ｎ．，およびＹｏｓｉｚａｗａ，　Ｚ．　（１９７９）　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｒｅｓ．　７０，　２９５−３０６；　Ｏｔｏｔａｎｉ，　Ｎ．，　Ｋｉｋｉｕｃｈｉ，　Ｍ．およびＹｏｓｉｚａｗａ，　Ｚ．，　（１９８１）　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｒｅｓ．　８８，　２９．１−３０３；　Ｏｔｏｔａｎｉ，　Ｎ．およびＹｏｓｉｚａｗａ，　Ｚ．　（１９８１）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　６ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，　ｐｐ．　４１１−４１２，　９月２０〜２５日、東京、Ｊａｐａｎ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　東京）は、Ｆ．　ｈｅｐａｒｉｎｕｍから３種類のリアーゼ（１種類のヘパリナーゼ（ヘパリンリアーゼＩ）および２種類のヘパリチナーゼ）を単離した。ヘパリナーゼは、ヘパリンに作用し、主に三硫酸化二糖類を生じる（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，　Ｃ．Ｐ．およびＮａｄｅｒ，　Ｈ．Ｂ．　（１９７４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　３４３，　３４−４４；　Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，　Ｃ．Ｐ．，　Ｎａｄｅｒ，　Ｈ．Ｂ．，　Ｂｒｉｔｔｏ，　Ｌ．Ｒ．，　およびＳｉｌｖａ，　Ｍ．Ｅ．　（１９７１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　２３７，　４３０−４４１）；　Ｎａｄｅｒ，　Ｈ．Ｂ．，　Ｐｏｒｃｉｎａｔｔｏ，　Ｍ．Ａ．，　Ｔｅｒｓａｒｉｏｌ，　Ｉ．Ｌ．Ｓ．，　Ｐｉｎｈａｌ，　Ｍ．Ｓ．，　Ｏｌｉｖｅｉｒａ，　Ｆ．Ｗ．，　Ｍｏｒａｅｓ，　Ｃ．Ｔ．，およびＤｉｅｔｒｉｃｈ，　Ｃ．Ｐ．　（１９９０）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５，　１６８０７−１６８１３）。精製された２つのヘパリチナーゼ（ヘパリチナーゼＩおよびＩＩと呼ばれていた。これらの酵素の物理的な特性は示されていなかったが、おそらくヘパリンリアーゼＩＩおよびＩＩＩに対応するであろう）を精製し、そしてヘパリンおよびヘパラン硫酸に対する基質特異性を特徴づけた。ヘパリチナーゼＩは、Ｎ−アセチル化およびＮ−スルフェート化ヘパラン硫酸の両方を分解し、一方ヘパリチナーゼＩＩはＮ−スルフェート化ヘパラン硫酸を主に分解した。
【００１１】
　ＭｃＬｅａｎおよび共同研究者は、部分精製ヘパリナーゼＩＩの特異性を記載した（Ｍｏｆｆａｔ，　Ｃ．Ｆ．，　ＭｃＬｅａｎ，　Ｍ．Ｗ．，　Ｌｏｎｇ，　Ｗ．Ｆ．，およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，　Ｆ．Ｂ．　（１９９１）　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９７，　４４９−４５９；　ＭｃＬｅａｎ，　Ｍ．Ｗ．，　Ｌｏｎｇ，　Ｗ．Ｆ．，およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，　Ｆ．Ｂ．　（１９８５）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　８ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，　ｐｐ．　７３−７４，　９月，　Ｈｏｕｓｔｏｎ，　Ｐａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　ＭｃＬｅａｎ，　Ｍ．Ｗ．，　Ｂｒｕｃｅ，　Ｊ．Ｓ．，　Ｌｏｎｇ，　Ｗ．Ｆ．，およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，　Ｆ．Ｂ．　（１９５４）　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１４５，　６０７−６１５）。ヘパリナーゼＩＩに対する均質性の証拠または物理的な特性が示されなかったが、　種々のポリマー性基質に対する広い特異性（Ｍｏｆｆａｔら、（１９９１））は、ヘパリンリアーゼＩＩとして酵素を同定する（Ｌｉｎｄｈａｒｄｔら、（１９９０）；　ＭｃＬｅａｎら、（１９８５）。
【００１２】
　Ｌｉｎｄｈａｒｄｔら、（１９８４）　Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　９，　４１−５５）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単独のバンドのヘパリナーゼ（ヘパリンリアーゼＩ）の精製を報告した。ヘパリン−セファロース上でのヘパリンリアーゼＩのアフィニティー精製は失敗したが、カラムマトリックスの分解によるものであろう。詳細な特徴づけの研究およびアミノ酸配列の分析のために十分な量の純粋なヘパリンリアーゼＩは、Ｙａｎｇら（１９８５）によって最初に調製された。ヘパリンリアーゼＩを用いて、ヘパリンリアーゼＩのアフィニティー精製をするための、ウサギのポリクローナル抗体の調製を行った。しかし、酵素を溶出するための過度の厳しい条件により、活性が相当損失した（Ｌｉｎｄｈａｒｄｔ，　（１９８５））。Ｙａｎｇ，　Ｖ．Ｃ．，　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，　Ｈ．，　Ｃｏｏｎｅｙ，　Ｃ．Ｌ．，およびＬａｎｇｅｒ，　Ｒ．　（１９８７）　Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　１６，　３５−５０））もまた、ヘパリンリアーゼＩの調製方法を記載している。
【００１３】
　Ｓｅｉｋａｇａｋｕ　Ｃｏ．は、最近口頭でヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩに対応する市販の酵素の分子量が、それぞれ４３，０００、８４，０００、　および７０，０００であることを報告した（Ｙｏｓｉｄａ，　Ｋ．　（１９９１）　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，　９月１〜６日、Ｕｐｐｓａｌａ，　Ｓｗｅｄｅｎ）。これらの報告は、本明細書に記載の分子量とほぼ一致するが、しかしそれらの精製または特徴づけの方法の詳細は、公開されていなかった。
【００１４】
　ヘパリンリアーゼは、プロテオグリカン混合液中にヘパリンの存在を確認するため［（Ｋａｎｗａｒ，　Ｙ．Ｓ．，およびＦａｒｑｕｈａｒ，　Ｍ．Ｇ．　（１９７９）　ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ　ｂａｓｅｍｅｍｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ中のヘパリン硫酸の存在。Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ　７６，　１３０３−１３０７）］、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を分解して生じたオリゴ糖構造の特徴づけるために［（Ｌｉｎｄｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｌｏｇａｎａｔｈａｎ，　Ｄ．　Ａｌ−Ｈａｋｉｍ，　Ａ．，　Ｗａｎｇ，　Ｈ．−Ｍ．，　Ｗａｌｅｎｇａ，　Ｊ．Ｍ．，　Ｈｏｐｐｅｎｓｔｅａｄｔ，　Ｄ．，およびＦａｒｅｅｄ，　Ｊ．　（１９９０）低分子量ヘパリンのオリゴ糖マッッピング：　構造および活性の相違。Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　３３，　１６３９−１６４５；　Ｌｉｎｄｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｒｉｃｅ，　Ｋ．Ｇ．，　Ｋｉｍ，　Ｙ．Ｓ．，　Ｌｏｈｓｅ，　Ｄ．Ｌ．，　Ｗａｎｇ，　Ｈ．Ｍ．，およびＬｏｇａｎａｔｈａｎ，　Ｄ．　（１９８８）．ヘパリンの主なオリゴ糖成分の地図作製および定量。Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　２５４，　７８１−７８７；　Ｍｅｒｃｈａｎｔ，　Ｚ．Ｍ．，　Ｋｉｍ，　Ｙ．Ｓ．，　Ｒｉｃｅ，　Ｋ．Ｇ．，およびＬｉｎｄｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．　（１９８５）．ヘパリン由来の四糖類の構造。Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　２２９，　３６９−３７７；　Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，　Ｊ．Ｅ．，およびＧａｌｌａｇｈｅｒ，　Ｊ．Ｔ．　（１９８８）ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動およびナイロンメンブランへのエレクトロトランスファーによるヘパラン硫酸のオリゴ糖マッピング。Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　２５１，　５９７−６０８）］、抗凝血物および補体阻害活性を有する低分子量のヘパリン調製物を生産するために［（Ｌｉｎｄｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｇｒａｎｔ，　Ａ．，　Ｃｏｏｎｅｙ，　Ｃ．Ｌ．，およびＬａｎｇｅｒ，　Ｒ．　（１９８２）細菌のヘパリナーゼを用いて調製したヘパリンフラグメントの特異な抗凝血物活性。Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５７，　７３１０−７３１３；　Ｌｉｎｄｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，およびＬｏｇａｎａｔｈａｎ，　Ｄ．　（１９９０ａ）．　ヘパリン、ヘパリノイドおよびヘパリンオリゴ糖：構造および生物学的活性。Ｃ．Ｇ．　Ｇｅｂｅｌｅｉｎ（編），　Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（ｐｐ．　１３５−１７３）．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｐｌｅｕｍ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｓｈａｒａｔｈ，　Ｍ．Ｄ．，　Ｍｅｒｃｈａｎｔ，　Ｚ．Ｍ．，　Ｋｉｍ，　Ｙ．Ｓ，　Ｒｉｃｅ，　Ｋ．Ｇ．，　Ｌｉｎｄｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，およびＷｅｉｌｅｒ，　Ｊ．Ｍ．　（１９８５）小さなヘパリンフラグメントは、補体増幅経路を制御する。Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　９，　７３−８０）］、および循環からヘパリンを取り除く（Ｌａｎｇｅｒら、１９８２）ために用いられた。ヘパリン分解酵素は、細胞外マトリックスでヘパリン様分子の役割を理解するため、または異なった組織微環境で特異性の高い方法で細胞外マトリックスを調節および変化するために使用するのに優れた道具である。しかし、ヘパリンリアーゼを利用する研究は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｈｅｐａｒｉｎｕｍからの酵素精製、特に３つの酵素をそれぞれを分離することに関する困難性により阻害される（Ｌｉｎｄｈａｒｄｔら、１９８５）。特に、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方を切断するヘパリンリアーゼＩＩの能力が、ヘパリンを切断するヘパリンリアーゼＩとヘパラン硫酸を切断するヘパリンリアーゼＩＩＩとからの区別を困難にする。
【００１５】
　これら３つ全てのヘパリン／ヘパラン硫酸リアーゼは、広く使用されているが、ヘパリンリアーゼＩを除いてヘパリナーゼＩＩおよびヘパリナーゼＩＩＩの純度、または物理的および反応速度論的な特徴に関する情報がない。純粋なヘパリンリアーゼがないことによって、基質特異性のあいまいさが残る。これは、調製物中に他のリアーゼが混入していること、および最適な触媒条件および基質特異性が不明であることに起因し、構造および活性の研究のためにヘパリンおよびヘパラン硫酸を特異的に分解してオリゴ糖にする試薬、ならびに医療への研究のために使用する試薬としてのこれらの酵素の使用の障害となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
　それゆえ、本発明の目的はヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩおよびヘパリナーゼＩＩＩを精製し、そして特徴づける方法を提供することにある。
【００１７】
　本発明のさらなる目的は精製および特徴づけしたヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩおよびヘパリナーゼＩＩＩを提供することにある。
【００１８】
　本発明のさらなる目的は精製したパリナーゼＩＩおよびヘパリナーゼＩＩＩの最適使用条件とペプチドマップを提供することにある。
【００１９】
　本発明の別の目的は３種のヘパリナーゼのアミノ酸組成を提供することである。本発明の別の目的は、ヘパリナーゼの精製および特徴づけに使用され得るヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩに対する抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
　本発明は、精製されたヘパリナーゼＩＩであって、Ｈｅｐａｒｉｎｕｍ　ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に存在し、ヘパリナーゼＩＩ活性以外のリアーゼ活性がなく、分子量８４，１００であり、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を切断し、そして最適ｐＨが８．９〜９．１である、ヘパリナーゼＩＩである。
【００２１】
　本発明はまた、精製されたヘパリナーゼＩＩＩであって、Ｈｅｐａｒｉｎｕｍ　ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で発現され、ヘパリナーゼＩＩＩ活性以外のリアーゼ活性がなく、分子量７０，８００であり、ヘパラン硫酸を切断し、そして最適ｐＨが９．９〜１０．１である、ヘパリナーゼＩＩＩである。
【００２２】
　好適な実施形態において、上記ヘパリナーゼＩＩＩは、ヘパリン硫酸を切断しない。
【００２３】
　好適な実施形態において、上記ヘパリナーゼＩＩＩは、アルブミンで安定化される。
【００２４】
　本発明はまた、Ｈｅｐａｒｉｎｕｍ　ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの生物学的に純粋な培養物からヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを精製する方法であって、
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍの生物学的に純粋な培養物中の　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞を溶解する工程、
　細胞溶解物から細胞残渣および核酸を除去する工程、
　ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩをヒドロキシルアパタイトへ吸着させる工程、
　非ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩタンパク質をＱＡＥ樹脂へ吸着させる工程、
　ＱＡＥ樹脂に結合しないヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを回収する工程、
　ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを、ＨＰＬＣによって、ヒドロキシルアパタイトカラム上で分離する工程、
　ヒドロキシルアパタイトカラム上で分離されたヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを回収する工程、
　分離されたヘパリナーゼをカチオン交換ＦＰＬＣによって精製する工程、
　カチオン交換ＦＰＬＣによって分離されたヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを回収する工程、
　分離されたヘパリナーゼをゲルパーミエーションＨＰＬＣによって精製する工程、および
　ゲルパーミエーションＨＰＬＣによって分離されたヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを回収する工程
を包含する方法である。
【００２５】
　好適な実施形態において、上記核酸がプロタミンによる沈澱によって除去される。
【００２６】
　好適な実施形態において、上記ヘパリナーゼが、ヒドロキシルアパタイトカラム上で塩グラジエントによる溶出によって分離される。
【００２７】
　好適な実施形態において、上記ヘパリナーゼが、塩濃度を増加させるグラジエントによってカチオン交換カラムから溶出される。
【００２８】
　好適な実施形態において、上記ヘパリナーゼが、グラジエントまたは塩濃度の増加によってカチオン交換カラムから溶出される。
【００２９】
　本発明はまた、Ｈｅｐａｒｉｎｕｍ　ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩに対して異なる親和性で交差反応するモノクローナル抗体である。
【００３０】
　好適な実施形態において、上記抗体が、ヘパリナーゼＩで免疫されたマウスからの白血球とマウス骨髄腫細胞との融合物によって産生され、次いで、次いでヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの３種すべてに対する反応性によってスクリーニングされる。
【００３１】
　本発明はまた、ヘパリナーゼを検出する方法であって、ヘパリナーゼ活性を有する試料を、Ｈｅｐａｒｉｎｕｍ　ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩに対して異なる親和性で交差反応する抗体と反応させる工程、および反応の程度を決定する工程を包含する方法である。
【００３２】
　好適な実施形態において、上記試料がＨｅｐａｒｉｎｕｍ　ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来である。
【００３３】
　好適な実施形態において、上記方法は、上記試料中のヘパリナーゼを単離し、そして１種を超える抗体と反応させて、ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩとの構造類似性を決定する。
【００３４】
　好適な実施形態において、上記抗体と上記ヘパリナーゼとの反応性がイムノブロッティングによって決定される。
【００３５】
　本発明はまた、ヘパリンおよびヘパリン硫酸を切断する方法であって、ヘパリンまたはヘパリン硫酸を、Ｈｅｐａｒｉｎｕｍ　ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに由来し、いかなるリアーゼも混入していない、ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩからなる群から選択される精製されたヘパリナーゼと反応させる工程を包含する方法である。
【００３６】
　好適な実施形態において、上記ヘパリンが細胞外マトリックスである。
【００３７】
　（発明の要旨）
　Ｆ．　ｈｅｐａｒｉｎｕｍからの３つの全てのヘパリンリアーゼを同時に、明らかに均質で、混入するリアーゼがないように精製する単一の再現可能な手法を、本明細書中で開示する。ヘパリンリアーゼＩ（ヘパリナーゼ、ＥＣ　４．２．２．７）、ヘパリンリアーゼＩＩ（ＥＣ番号なし）、およびヘパリンリアーゼＩＩＩ（ヘパリチナーゼ、ＥＣ　４．２．２．８）は、分子量（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動による）および等電点（等電点電気泳動による）がそれぞれＭｒ　４２，８００、ｐＩ　９．１−９．２，　Ｍｒ　７０，８００、ｐＩ　９．９−１０．１を有す。それらのアミノ酸分析およびペプチドマップは、これらのタンパク質はそれぞれ、異なった遺伝子産物であるが非常に関連していることを例証した。ヘパリンリアーゼの反応速度論的特性が決定され、活性および安定性の最適条件も同様に決定された。
【００３８】
　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＨｅｐａｒｉｎｕｍからのヘパリナーゼＩＩの精製と特徴づけが記載される。ミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）定数は以下の通りである：ヘパリンリアーゼＩＩ（ヘパリンに対して）、Ｖ（ｍａｘ）＝１５．０４、Ｋｍ＝９．２３μＭ（０．１２９ｍｇ／ｍｌ）；　ヘパリンリアーゼＩＩ（ヘパラン硫酸に対して）、Ｖ（ｍａｘ）＝４６．９５、Ｋｍ＝４３．４３μＭ（０．８６９ｍｇ／ｍｌ）。９〜１１のｐＨ勾配を用いてアガロースＩＥＦから計算されたリアーゼのおおよそのｐＩは、８．９付近である。ヘパリンリアーゼＩＩの（ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に対する）最適温度は、３５℃である。温度が上昇すれば活性は、さらに高くなるが、安定性が大きく減少する。リアーゼ活性の最適ｐＨ：（ヘパリンに対して）、ｐＨ＝７．３および（ヘパラン硫酸に対して）、ｐＨ＝６．９。
【００３９】
　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＨｅｐａｒｉｎｕｍからのヘパリナーゼＩＩＩ（ＥＣ　４．２．２．８）の精製と特徴づけが記載される。ミカエリス−メンテン定数は、Ｖ（ｍａｘ）＝２７７．０１、Ｋｍ＝１０９．９７μＭ（０．７８０ｍｇ／ｍｌ）。９〜１１のｐＨ勾配を用いてアガロースＩＥＦから計算されたリアーゼのおおよそのｐＩは、９．２であった。ヘパリンリアーゼＩＩＩ活性の最適温度は、３５℃である。酵素の活性は、温度が上昇すればさらに高くなるが、安定性が大きく減少する。ヘパリンリアーゼＩＩＩの最適ｐＨは、ｐＨ＝７．６である。ヘパリナーゼＩＩＩは、ヘパラン硫酸バックボーンのヘキソサミン−グルクロン酸結合に基質特異性がある。酵素は、モノマー性タンパク質であり、ヘパリナーゼＩおよびＩＩとサイズと活性の点で大きく異なる。ヘパリナーゼＩＩＩを用いて、細胞外マトリックスでヘパリン様鎖を放出することが可能であり、配列決定およびヘパリンに基づく細胞応答を引き出すことができる。
【００４０】
　塩の影響は、ヘパリナーゼＩＩまたはヘパリナーゼＩＩＩのどちらにも観察されなかった。４つの異なった塩を用いて、イオンの影響ではなくて塩の影響であることを試験し確かめた。
【００４１】
　３つのヘパリナーゼに対するモノクローナル抗体の調製および使用の方法もまた記載される。抗体は、個々にそしてグループとしてヘパリナーゼの単離、検出および特徴づけに、そして基質特異性、酵素阻害、および活性部位マッピングを含む研究に役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
　（発明の詳細な説明）
Ｉ．ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの精製および特徴づけ
　Ｆ．　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来の３種のヘパリンリアーゼすべてを同時に精製して、明らかに均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）にする単一の、再現性のあるスキームが、本明細書で記述される。
【００４３】
　（実験操作）
　（材料）
　酵素アッセイおよび吸光度測定は、ＳｈｉｍａｄｚｕのＵＶ　１６０分光光度計にＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｓｏｔａｍｐ　ｍｏｄｅｌ　９１００冷却循環水浴（ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ）を接続して測定した。発酵は、Ａｐｐｌｉｋｏｎの２リットルの撹拌タンク発酵器中で行った。遠心分離は、Ｄｕ　ＰｏｎｔのＧＳＡローターを用いてＳｏｒｖａｌ　ＲＣ−５冷却遠心分離で行った。ＨＰＬＣは、ＬＤＣ　Ｍｉｌｔｏｎ−Ｒｏｙ　Ｃｏｎｓｔａｍｅｔｒｉｃ　ＩＩＩＧポンプ、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ　７１２５インジェクター、Ｊｕｌｅ直線グラジエント形成装置（Ｌｉｎｅａｒ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｆｏｒｍｅｒ）、および２８０ｎｍフィルターを有するＩＳＣＯ　ＵＡ−５型吸光度モニターを使用して行った。１×５ｃｍガードカラムと直列に接続したヒドロキシルアパタイトＨＰＬＣカラム（１×３０ｃｍ）はＲｅｇｉｓから入手し、Ｍｏｎｏ−Ｓ　ＦＰＬＣカラムはＰｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．から入手し、Ｃ１８カラムはＶｙｄａｃから入手し、そしてＢｉｏ−ＳｉｌゲルパーミエーションＨＰＬＣカラムはＢｉｏ−Ｒａｄから入手した。キャピラリーゾーン電気泳動システムおよびシリカキャピラリーはＤｉｏｎｅｘから入手した。Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＩ電気泳動チャンバー、１４０５型水平電気泳動セル、および１４２０Ｂ型電源はＢｉｏ−Ｒａｄから入手した。チューブゲル電気泳動装置はＥ−Ｃ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ　Ｃｏｒｐ．から入手した。プレキャストアガロースＩＥＦゲルはＩｓｏ−ｌａｂｓから入手し、そして既染色分子量マーカーおよびＲａｐｉｄ　ＣｏｏｍａｓｓｉｅＴＭ染料はＤｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　ＨＴ　ヒドロキシルアパタイトはＢｉｏ−ｒａｄから入手し、そしてＱＡＥ−セファデックスはＳｉｇｍａから入手した。圧力濾過ユニット、および２５ｍｍおよび４３ｍｍのＰＭ−１０フィルターはＡｍｉｃｏｎから入手した。ヘパリン（ブタ粘膜ナトリウム塩）はＣｅｌｓｕｓから入手し、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、およびコンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥはＳｅｉｋａｇａｋｕから入手した。ウシ血清アルブミン、ラクトース、プロタミン（遊離塩基）、ブロモフェノールブルー、ナフトールレッド、シトクロムｃ（ウシ心臓型ＶＡ）、ヒアルロン酸、ＣＡＰＳ、ビス−Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ジチオトレイトール、ＭＯＰＳ、メルカプトエタノール、ヨードアセトアミド、およびトリプシンはＳｉｇｍａから入手した。タンパク質アッセイのためのクーマシー試薬はＢｉｏ−Ｒａｄから入手した。試薬に使用したすべての水は脱イオン化し、ガラス中で蒸留した。
【００４４】
　（アッセイ）
　分光光度計は、特定のリアーゼをアッセイする最適温度に調節した。４００μｇの基質を含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ヘパリンリアーゼＩのための塩化ナトリウム１００ｍＭを含む）を７００μｌの石英マイクロキュベットで熱平衡化した。所定量のリアーゼを加え、最終容量を４００μｌとし、そしてこのキュベットを穏やかに撹拌した。このマイクロキュベットを、すぐに分光光度計に戻し、そして２３２ｎｍにおける吸光度を３分にわたってで１０秒間隔で測定した。生成物の吸光係数３８００Ｍ−１を用いて、吸光度／単位時間の変化から活性を測定した。次に、１分間当たりに生成した生成物のマイクロモルをキュベット中のタンパク質のミリグラムで割って、比活性を算出した。ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびコンドロイチン硫酸の分子量として用いたのは、それぞれ１４，０００、２０，０００、および２５，０００である（Ｒｉｃｅ，　Ｋ．Ｇ．，　およびＬｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．（１９８９）　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｒｅｓ．　１９０，　２１９−２３３）。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，　Ｍ．Ｍ．（１９７６）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　７２，　２４８−２５４）によって、ウシ血清アルブミン標準曲線に基づき測定した。
【００４５】
　（発酵および酵素の回収）
　Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（Ｐａｙｚａ，Ａ．Ｎ．，およびＫｏｒｎ，　Ｅ．Ｄ．（１９５６）　Ｎａｔｕｒｅ　１７７，　８８−８９）（ＡＴＣＣ　１３，１２５）を−７０℃で、ジメチルスルホキシド（Ｍｅ２ＳＯ）を含有する定義された培地中に保存した（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，　Ｊ．Ｊ．，　Ｏｄｄｉｅ，　Ｋ．，　Ｌａｎｇｅｒ，　Ｒ．，　およびＣｏｏｎｅｙ，　Ｃ．Ｌ．（１９９１）　Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　３０，　１３７−１４８）。この微生物を　、２リットルの撹拌タンク発酵器中で、ヘパリンを唯一の炭素源として、Ｇａｌｌｉｈｅｒ，　Ｐ．Ｍ．，　Ｃｏｏｎｅｙ，　Ｃ．Ｌ．，　Ｌａｎｇｅｒ，　Ｒ．Ｓ．，　およびＬｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．（１９８１）　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１，　３６０−３６５の方法によって定義された培地中で増殖させた。５リットルの発酵ブロスから、４℃で１５分間、１２，０００×ｇの遠心分離によって、８０ｇの湿細胞ペレットが得られた。このペレットを、ｐＨ７．０で４℃の１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー５００ｍｌ中に懸濁した。細胞懸濁液（１回に２０ｍｌ）を５０ｍｌのステンレススチールカップに入れ、そして冷却しながら１０分間、１００ワットで、４０％パルスモードで超音波処理した。破壊された細胞を４℃で３０分間、１２，５００×ｇで遠心分離して、そしてペレットを捨てた。超音波処理および遠心分離によって得られた上清５００ｍｌはタンパク質１６．３ｍｇ／ｍｌを含んでいた。プロタミンを含まない塩基（２．０ｇ）を１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）２０ｍｌ中に溶解し、そして上清５００ｍｌ中に撹拌しながら滴下した。１０，０００×ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によって沈澱したＤＮＡを除去し、そして上清５１０ｍｌを得た。
【００４６】
　（Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリンリアーゼの精製）
　（バッチのヒドロキシルアパタイト吸着および脱離）
　１５．６ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有する上清５１０ｍｌを凍結せずに直接使用し、２５０ｍｌのポリプロピレン製遠心分離容器４個に等量づつ分けて、氷浴中に置いた。乾燥ヒドロキシルアパタイト（ＨＡ）（２０ｇ）を各容器に加え、穏やかに撹拌し、１０００×ｇ、４℃で２分間の遠心分離によって軽く凝縮し、そして上清をこのＨＡマトリックスからデカントした。次いでＨＡ結合タンパク質を、リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム濃度を上昇させたバッファー中に再懸濁させ、そして遠心分離によって再び凝縮した。上清をマトリックスから再びデカントし、そして酵素活性およびタンパク質濃度についてアッセイした。ＨＡマトリックスを洗浄するために使用したバッファーは、ｐＨ６．８の１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーと、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ６．８の２５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーとを４℃において、６：０、５：１、４：２、３：３、２：４、および０：６（ｖ／ｖ）比で混合することによって調製した。タンパク質上清溶液を分子量カットオフが１４，０００の透析チューブに入れ、４℃で終夜、ｐＨ７．０の５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーに対して透析した。
【００４７】
　（ＱＡＥ−セファデックスクロマトグラフィー）
　バッチＨＡによって精製されたリアーゼ活性を、凍結せずに、ただちに使用した。エチル４級アンモニウム（ＱＡＥ）−セファデックスクロマトグラフィー工程は４℃で行った。ヘパリンに対する活性が８９％を超え、そしてヘパラン硫酸に対する活性が８８％を超えるＨＡ精製画分３バッチ（４：２、３：３、および２：４）（総容量１．５リットル）を合わせて（１．８１ｍｇ／ｍｌタンパク質、およびヘパリンに対して１．７２単位／ｍｌおよびヘパラン硫酸に対して２．１６単位／ｍｌ）、そして６００ｍＬのＱＡＥ−セファデックスを含む３本のカラム（２．５×２０ｃｍ）に等量かけた。このＱＡＥ−セファデックスカラムはあらかじめ、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０、４℃）で平衡化しておいた。次に、各カラムを１カラム容量の５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０、４℃）で洗浄した。相互作用することなくカラムを通過した、リアーゼ活性を含む画分を集め、そして合わせた。次に、この２．６リットルの溶出液を、４３ｍｍのＰＭ−１０膜（カットオフ分子量１０，０００）を使用し、Ａｍｉｃｏｎ圧力濾過によって、６０ｐｓｉ、４℃で、６３ｍｌ（タンパク質８．２３ｍｇ／ｍｌを含有する）まで濃縮した。
【００４８】
　（ヒドロキシルアパタイトＨＰＬＣ）
　ＱＡＥ−セファデックス精製し、そして濃縮した溶液６３ｍｌを５ｍｌのアリコート１２個に分け、そして必要になるまで−７０℃で保存した。５ｍｌの試料１個（タンパク質４３ｍｇ）を冷凍庫から取り出し、室温で解凍し、そして５ｍｌループを使用してＨＡのＨＰＬＣカラムにインジェクトした。このＨＡ−ＨＰＬＣカラムは５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化しておいた。試料をロードした後、カラムを５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を用いて、０．５ｍｌ／分で２０分間洗浄した。カラムを溶出するために、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）から、７５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）までの直線グラジエント６０ｍｌを使用した。溶出は２８０ｎｍで連続的にモニターした。グラジエントが完了した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム）（ｐＨ７．０）５．０ｍｌでカラムを洗浄し、強く結合したタンパク質を除去し、そして次に５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で再平衡化した。この分画工程を、残りの１１個のアリコートについて繰り返した。１２画分それぞれからのヘパリンリアーゼＩ、ヘパリンリアーゼＩＩ、およびヘパリンリアーゼＩＩＩに対応する画分をプールし、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）２０容量に対して１２時間、４℃で透析し、そしてＰＭ−１０膜を装備したＡｍｉｃｏｎ圧力濾過を使用して、６０ｐｓｉ、４℃で濃縮した。この３種のリアーゼ調製物を各々１ｍｌのアリコートに分け、そして−７０℃で凍結した。
【００４９】
　（ヘパリンリアーゼＩおよびＩＩＩのＭｏｎｏ−Ｓ　ＦＰＬＣ）
　ＨＡ−ＨＰＬＣから単離された、濃縮されたヘパリンリアーゼＩ調製物およびヘパリンリアーゼＩＩＩ調製物を−７０℃の冷凍庫から取り出し、室温で解凍し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したＭｏｎｏ−Ｓ　ＦＰＬＣ　ＨＲ　５／５カチオン交換カラムにかけた。１．７５ｍｇのタンパク質を含有する、各リアーゼ調製物の一部（３５０μｌ）をインジェクトし、そして５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（Ｈ７．０）によって、１ｍｌ／分で５分間、カラムを洗浄し、相互作用しないタンパク質を溶出した。５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）から５００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）までの直線グラジエントを使用し、そして溶出を２８０ｎｍでモニターした。活性なヘパリンリアーゼＩ画分およびヘパリンリアーゼＩＩＩ画分を４℃で、２００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に対して１２時間、透析し、そしてＰＭ−１０膜（カットオフ分子量１０，０００）を用いたＡｍｉｃｏｎ圧力濾過を使用して濃縮した。
【００５０】
　（ゲルパーミエーションＨＰＬＣ）
　Ｍｏｎｏ−Ｓ　ＦＰＬＣから得られたヘパリンリアーゼＩおよびＩＩＩ調製物、およびＨＡ−ＨＰＬＣから得られたヘパリンリアーゼＩＩ調製物を、２００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化しておいたＢｉｏ−Ｓｉｌゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）ＨＰＬＣカラム（１×２５ｃｍ）にかけた。各リアーゼをインジェクトし（ヘパリンリアーゼＩおよびＩＩＩの場合、タンパク質８００μｇを含有する試料２５０μｌ；ヘパリンリアーゼＩＩの場合タンパク質１．５ｍｇを含有する試料２００μｌ）、流速１ｍｌ／分で溶出し、そして２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩについて、この分離を５回繰り返した。活性画分を一緒にプールし、そしてリアーゼ活性およびタンパク質濃度をアッセイした。各ヘパリンリアーゼを５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に対して透析し、６０ｐｓｉ、４℃で、２５ｍｍのＰＭ−１０膜（分子量カットオフ１０，０００）によって圧力濾過することにより濃縮し、そしてさらに１０μｌのアリコートに分けて、−７０℃で保存した。
【００５１】
　（３種のヘパリンリアーゼの特徴づけ）
　（電気泳動による純度の評価）
　Ｌａｅｍｍｌｉ，　Ｕ．Ｋ．（１９７０）　ｎａｔｕｒｅ　２２７，６８０−６８５に記載された操作を少し変えて、３種のヘパリンリアーゼについて非連続的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図４）。ゲルを１２％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸で固定し、脱イオン蒸留水ですすぎ、そしてＲａｐｉｄ　Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染料溶液によって染色し、そして脱色した。
【００５２】
　あらかじめ成形したアガロースゲル（８５×１００ｍｍ）上で、ＩＥＦゲル電気泳動を行った。２つの電極芯を１Ｍリン酸（アノライト）および１Ｍ水酸化ナトリウム（カソライト）で濡らした。５ワットで５分間、次いで１０ワットで１時間、電圧が１２００Ｖで一定になるまで、電気泳動した。このゲルを、１５％トリクロロ酢酸水溶液でただちに固定し、ブロットし、そして水ですすぎ、終夜乾燥し、クーマシーＧ−２５０で染色し、そして脱色した。
【００５３】
　連続的な酸−尿素ゲル電気泳動を１０％ポリアクリルアミドチューブゲル中で行った（Ｐａｎｙｉｍ，　Ｓ．，およびＣｈａｌｋｌｅｙ，　Ｒ．（１９６９）　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　１３０，　３３７−３４６）。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩ試料（１０μｇ）を、グリセロールおよびナフトールレッドを追跡染料（ｔｒａｃｋｉｎｇ　ｄｙｅ）として含有する酸−尿素バッファー中で調製した。２．５ｍＡ／チューブゲルの定常電流で電気泳動した。１００μｇのシトクロムｃ標準（茶色のバンド）がチューブの底に来るまで、タンパク質をカソードに向かって約２時間泳動させた。染色および脱色は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで記載したのと同様に行った。
【００５４】
　３種のヘパリンリアーゼに対するキャピラリーゾーン電気泳動はＤｉｏｎｅｘキャピラリー電気泳動システムを用いて、３７５μｍ×７０ｃｍキャピラリーで、既に刊行されているタンパク質分析方法（Ｌａｕｅｒ，　Ｈ．Ｈ．，　およびＭｃＭａｎｉｇｉｌｌ，　Ｄ．　（１９８６）　Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．　５８，　１６６−１７０）によって、１０ｍＭ塩化カリウムを含有する２０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１１．０）中で、２０ｋＶで、室温で行い、そして検出は２８０ｎｍの吸光度で行った。各々２．７４、２．０７、および２．４５ｍｇ／ｍｌのヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩ試料（２０ｎｌ）をそれぞれ分析した。
【００５５】
　（逆相ＨＰＬＣ）
　逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ（ＨＰ−１０９０　Ｈｅｗｉｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ，　ＣＡ）はＶｙｄａｃ　Ｃ１８カラムを用いた（Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，　Ｒ．　（１９９１）　博士論文、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍからのヘパリナーゼのクローニングおよび生化学的特徴づけ、Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。精製された各酵素１ｎｍｏｌをＲＰ−ＨＰＬＣカラムにインジェクトし、そして０．１〜１のＴＦＡ、Ｈ２Ｏ中の０〜８０％アセトニトリルのグラジエントで、１２０分間溶出した。これらの溶出プロファイルを２１０ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターした。酵素のピークを単離してアミノ酸の組成分析を行い、そしてペプチドマッピングのためにトリプシンで消化した。
【００５６】
　（トリプシンによるペプチドマッピング）
　ＲＰ−ＨＰＬＣ精製された各酵素１ナノモルを、４００ｍＭ炭酸アンモニウムおよび５ｍＭジチオトレイトールを含有する８Ｍ尿素５０μｌ中、５０℃で変性した（Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，　Ｒ．　（１９９１）博士論文）。室温まで冷却した後、このタンパク質を、１０ｍＭヨードアセトアミドで、１５分間、暗所でアルキル化した。全反応容量は２００μｌであった。各リアーゼ溶液にトリプシン（４％、ｗ／ｗ）を添加し、そしてこのタンパク質を３７℃で２４時間、消化した。タンパク質分解は、６５℃で２分間加熱することによって停止させた。各消化により形成されたペプチドは完全に可溶であり、そしてこれをＲＰ−ＨＰＬＣカラムにインジェクトし、そして０〜８０％アセトニトリルのグラジエントで１２０分間、溶出した。トリプシンによる（ｔｒｙｐｔｉｃ）ペプチドマップを２８０ｎｍでモニターした。
【００５７】
　（アミノ酸の組成分析およびＮ末端分析）
　アミノ酸の組成分析をマサチューセッツ工科大学のバイオポリマー研究所（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４２０／１３０型Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｒ／Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ａｎａｌｙｚｅｒで、フェニルイソチオシアネートによるプレカラム誘導体化化学反応を用いて行った。試料の気相加水分解をＷａｔｅｒｓ　Ｐｉｃｏ　Ｔａｇ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて行った。プレカラム誘導体化において、遊離のアミノ酸がフェニルイソチオシアネートと結合し、フェニルチオカルバミルアミノ酸を形成し、これは逆相カラムから溶出されると２５４ｎｍで検出される。加水分解は、６Ｎ塩酸、０．１％フェノールを用いて、１５５℃で１時間、または１００℃で２２時間のいずれかで行った。タンパク質が完全に加水分解され、アミノ酸残基の分解が最小であることを確実にするために、３６時間または４８時間の加水分解時間もまた、試験した。Ｎ−末端分析は１ｎｍｏｌのヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩで行った。
【００５８】
　（活性に対するｐＨの影響）
　コハク酸（４．０〜６．５）、ビス−トリスプロパン（ＢＴＰ）−ＨＣｌ（６．５〜９．０）、および、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびリン酸ナトリウムの両方（６．０〜７．５）を用いて、各リアーゼに対して最適な活性のｐＨを得た。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩアッセイ溶液を、精製されたリアーゼの試料１０μｌ（タンパク質濃度２〜３ｍｇ／ｍｌ）をリン酸ナトリウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で希釈することによって作成し、そしてアッセイのために必要になるまで氷上に置いた。次に、各リアーゼの活性（Ｉはヘパリンに対して作用、ＩＩはヘパリンとヘパラン硫酸の両方に対して作用、そしてＩＩＩはヘパラン硫酸に対して作用）を異なるｐＨ値において求めた。
【００５９】
　（最適活性のためのバッファーの選択）
　各ヘパリンリアーゼに対して最適な活性を与えるバッファーは、先の実験で算出された最適ｐＨの近傍での緩衝能についてバッファーをテストすることによって選択した。これらのバッファーは：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、およびＢＴＰ−ＨＣｌである。各バッファーは５０ｍＭで調製し、そしてそのｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムで、ヘパリンに作用するヘパリンリアーゼＩＩについては６．９、ヘパリンリアーゼＩについては７．１５、ヘパラン硫酸に作用するヘパリンリアーゼＩＩについては７．３、およびヘパリンリアーゼＩＩＩについては７．６に調製した。ヘパリンリアーゼアッセイ溶液は、酵素を、上記の適切なｐＨに調節した５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中で希釈することによって作成した。ヘパリンリアーゼ活性を、各バッファーについて求めた。各バッファーの添加直後およびそれに続く２４時間、３７℃のインキュベーションの後の両方で、活性をアッセイした。
【００６０】
　（活性に対する２価金属および添加する塩の影響）
　ＢＴＰ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ）を、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０μＭまたは１ｍＭの塩化銅（ＩＩ）、１０μＭまたは１ｍＭの塩化水銀（ＩＩ）、および１ｍＭ塩化亜鉛（ＩＩ）のいずれかを含有するように調製した。各溶液を、リアーゼをテストするための最適ｐＨに調節し、そしてヘパリンリアーゼの活性を、２価金属の存在下または非存在下で測定した。
【００６１】
　最適活性のための塩濃度を研究した。塩化ナトリウム、塩化カリウム、および、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムを用いて、イオン強度と特定のイオンの影響（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｏｎ　ａｆｆｅｃｔｓ）とを区別した。添加する塩の濃度は５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中０から５００ｍＭまでの間で変化させて調製し、その後、ｐＨを各酵素の最適値に調節し、そしてヘパリンリアーゼ活性を測定した。
【００６２】
　（最適活性のための温度）
　最適活性のための温度を、各ヘパリンリアーゼについて、それらの最適ｐＨにおいて、リン酸ナトリウムバッファー（ヘパリンリアーゼＩアッセイバッファーは１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する）中で、１５℃から５５℃の間５°づつ温度上昇させて求めた。温度は温度調節分光光度計中で調節し、そして１０分間、平衡化してからアッセイを開始した。
【００６３】
　（温度安定性の最適値）
　リアーゼアッセイのストック溶液を適切なバッファー中で調製し、そして以下の温度で水浴中に置いた：ヘパリンリアーゼＩは３０℃、ヘパリンリアーゼＩＩは３５℃、そしてヘパリンリアーゼＩＩＩは３５℃および４０℃。種々の時間間隔（１〜２２時間）をおいて、アリコートを一部取り出して、残存する酵素活性を測定した。
【００６４】
　（速度定数の決定）
　上記の最適化された条件を用いて、ミカエリス−メンテン定数を求めた。トータルのポリマー分解の最終吸光度を２０で割って、反応が５％完了したことを表す値を求めた。精製されたリアーゼ調製物を希釈して、トータルのポリマー分解の５％が、わずか３分間のアッセイの終わりには達成されるようにした。各リアーゼおよびその基質についての特定のモル濃度における反応速度を、Ｐｅｒｅｌｌａ，Ｆ．Ｗ．（（１９８８）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１７４，　４３７−４４７）のＥＺ−ＦＩＴ双曲線カーブフィッティングプログラムを用いて速度論的に分析した。基質溶液は、５０ｍｇ／ｍｌヘパリンおよび４０ｍｇ／ｍｌのヘパラン硫酸ストック溶液から調製した。これらの定数は、ヘパリンリアーゼＩについては、３０℃で、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．１５）で、そしてヘパリンリアーゼＩＩについては３５℃で、ヘパリン対してはｐＨ７．３の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで、そしてヘパラン硫酸に対してはｐＨ６．９の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで、そしてヘパリンリアーゼＩＩＩについては３５℃で５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で求めた。
【００６５】
　（複合多糖類に対するヘパリンリアーゼの活性）
　各ヘパリンリアーゼを、複合多糖類溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に、最適化されたアッセイ条件下で添加し、反応を２３２ｎｍで３０分間モニターした。使用した精製されたリアーゼの量は、ヘパリンまたはヘパラン硫酸基質を３０分以内に完全に分解するのに充分であった。各多糖類の分解の初期速度を測定し、次いで、この反応を２４時間続け、そして多糖類の分解の最終レベルを、２３２ｎｍにおける最終吸光度を測定し、そして活性パーセントで表現することによって評価した。
【００６６】
　（ヘパリンリアーゼの安定性）
　凍結解凍および凍結乾燥に対するヘパリンリアーゼの安定性を、２種の賦形剤、すなわち２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．５ｗｔ％のラクトースを用いて研究した。各リアーゼを、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、または０．５％のラクトースを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーのいずれかに、濃度１〜３単位／ｍｌで溶解した。これらのリアーゼ溶液を３つの等量のアリコートに分け、そして各々のうち１つを、凍結解凍、凍結乾燥、または対照として氷浴中に保持のいずれかで保存した。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩの活性を賦形剤の存在下または非存在下で、以下の後に求めた：１）４℃で短期間貯蔵；２）−７０℃で凍結し、そして解凍；および３）−７０℃で凍結し、凍結乾燥し、そして等量の冷水で再構成。
【００６７】
　（結果）
　超音波処理による、最適化されたＦ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍの細胞溶解は、遊離した酵素が失活しない４０％パルスモードを用いて１００ワットで１０分間で達成された。プロタミンによる沈澱によって、全活性および比活性の両方を４２倍増加し、タンパク質濃度は減少しなかった。これはヘパリンリアーゼを競争的に阻害し得る多価アニオン性核酸の除去によるものと思われる。バッチのＨＡ精製工程は、タンパク質濃度、およびヘパリン／ヘパラン硫酸代謝に関連する他の夾雑物の活性を大幅に減少させるが、３種のヘパリンリアーゼ活性を分離しない。ＱＡＥ−セファデックスを使用して混入した酸性タンパク質を除去する。ＨＡ−ＨＰＬＣは、３種のリアーゼ活性を分離する。図１に示すように、塩化ナトリウムの直線グラジエントを用いて、ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩを、それぞれ塩化ナトリウムが３３０ｍＭ、５５５ｍＭ、および４３５ｍＭのところで溶出させる。コンドロイチン／デルマタン硫酸リアーゼもまたこの細菌中に見いだされるが、これらはグラジエントの最後、ヘパリンリアーゼＩＩのすぐ後でＨＡ−ＨＰＬＣカラムから溶出される。この手法によって、タンパク質濃度を低減しながら全ヘパリンリアーゼ活性が良好に回収される。図２に示すように、ヘパリンリアーゼＩおよびＩＩＩを、カチオン交換ＦＰＬＣによって、さらに精製した。ヘパリンリアーゼＩは、活性を良好に保持しながら回収され、そしてタンパク質濃度は大幅に減少した。ヘパリンリアーゼＩＩＩの比活性は、Ｍｏｎｏ−Ｓ　ＦＰＬＣを使用しても改良されず、全活性の実質的な減少が示された。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、この工程の後、ヘパリンリアーゼＩＩＩの純度の向上が明らかになった。ヘパリンリアーゼＩＩはＭｏｎｏ−Ｓ　ＦＰＬＣによって精製されなかった。なぜならカラムと結合しないからである。図３に示すように、最終精製工程において、ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩはＧＰＣを用いて分画された。
【００６８】
　ＧＰＣの後、各ヘパリンリアーゼ調製物は、均質であることが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、酸−尿素ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、キャピラリーゾーン電気泳動、および逆相ＨＰＬＣによって示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩの推定分子量は、それぞれ４２，８００、８４，１００、および７０，８００であった。
【００６９】
　３種のヘパリンリアーゼについてこの精製スキームを用いて得られた結果を、表Ｉにまとめる。ヘパリンリアーゼＩは、細胞ホモジネートに比べて３４００倍精製された。このスキームは、質量基準の全収率０．０３％、全活性回収率を基準とした収率１０．８％を与え、そして比活性１３０単位／ｍｇであった。ヘパリンリアーゼＩＩは細胞ホモジネートに対して５２００倍精製され、質量基準の収率は０．０２％であった。この酵素は、ヘパリンに対して比活性１９単位／ｍｇを有し、全活性回収率１．０２％であった。この酵素調製物はまた、ヘパラン硫酸に対して、比活性３６．５単位／ｍｇを有し、全活性回収率１．５４％であった。ヘパリンリアーゼＩＩＩは細胞ホモジネートに対して５１００倍精製され、質量基準の収率０．０２％であり、全活性基準の収率２．７４％であり、そして比活性６３．５単位／ｍｇであった。
【００７０】
　表Ｉ：ヘパリンリアーゼの精製のまとめ
【００７１】
【表１】
2004135684.tif 000002
　（ヘパリンリアーゼ純度および物理的性質の特徴づけ）
　３種のヘパリンリアーゼの物理的、速度論的、および安定性の性質を研究した。非連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，　Ｕ．Ｋ．（１９７０））によって、この３種のヘパリンリアーゼが明らかに均質であることが例証された。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩの分子量は、それぞれ４２，８００、８４，１００、および７０，８００と推定された。β−メルカプトエタノールを用いない非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、同様のバンドパターンを明らかにし、これはサブユニットが存在しないことを示唆する。３種のヘパリンリアーゼの等電点を求め、そしてその純度を評価するために、ＩＥＦを使用した。種々のｐＨグラジエント（ｐＨ３〜１０、７〜１０、および８．５〜１０．５）を用いたＩＥＦは、３種のリアーゼについての正確なｐＩ値を与えなかった。３種のリアーゼがそれぞれ、カソードに非常に近い位置に移動したからである。次に、ｐＨグラジエントが９〜１１のアガロースゲルを用い、シトクロムｃ標準（ｐＩ＝１０．２５）のバンドの下の３つのタンパク質をフォーカシングした。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩについて測定されたｐＩ値は、それぞれ、９．１〜９．２、８．９〜９．１、そして９．９〜１０．１であった。Ｐａｎｙｉｍ，　Ｓ．，　およびＣｈａｌｋｌｅｙ，　Ｒ．（１９６９）の方法を用いたチューブゲル中での尿素−酢酸ＰＡＧＥによって、３種のヘパリンリアーゼの均質性が確認された。各ヘパリンリアーゼのキャピラリーゾーンエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓ）（Ｌａｕｅｒ，　Ｈ．Ｈ．，　およびＭｃＭａｎｉｇｉｌｌ，　Ｄ．（１９８６））　は、単一の対称なピークを与える。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩは、それぞれ、移動時間１２．７分、１２．４分、および１３．４分であった。
【００７２】
　ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して３種のヘパリンリアーゼを脱塩し、アミノ酸組成分析およびペプチドマッピングのためのトリプシン消化に供した。（Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，　Ｒ．　（１９９１）博士論文）。興味深いことに、各クロマトグラムは、異性体の存在を示唆する非常に近接した二重のピークを示し、これはおそらく翻訳後修飾によるものであろう。ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの異性体についてのアミノ酸分析は同一であった。異性体は、親水性がわずかに異なり、これはおそらく、グリコシル化またはホスホリル化のようなある種の翻訳後修飾によるものと思われる。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩの主要な異性体は、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいてそれぞれ保持時間３８．５分、４４．３分、および４２．７分であった。
【００７３】
　各ヘパリンリアーゼに対応する主要なＲＰ−ＨＰＬＣピークを、トリプシンで徹底的に処理して、ペプチドフラグメントを調製した。これらのペプチドフラグメントを、再び、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。図６Ａおよび６Ｂに示すように、各リアーゼのペプチドマップは、いくつかの共通なペプチドフラグメントが観察されるとはいえ、明らかに異なる。
【００７４】
　３種のヘパリンリアーゼのアミノ酸分析を表ＩＩに示す。Ｎ−末端アミノ酸は修飾され、それゆえ、３種のリアーゼすべてについてのアミノ酸配列決定によって検出され得ない。このアミノ酸組成物およびペプチドマッピングは、ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩは異なる遺伝子産物であり、そしてヘパリンリアーゼＩおよびＩＩＩは、単に、より大きなヘパリンリアーゼＩＩから翻訳後処理によって生成されたものではないことを示す。
【００７５】
　このリアーゼはすべて、このリアーゼの高い等電点に寄与し得る多量のリシンを含む。ヘパリンリアーゼＩのアミノ酸組成を用いたコンピューターモデル化によって等電位点の計算値９．３３が与えられ、これは等電点フォーカシングを用いて得られた実験値と一致した。
【００７６】
　表ＩＩ：ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩについてのアミノ酸組成
【００７７】
【表２】
2004135684.tif 000003
ヘパリナーゼＩＩ（８４，０００ダルトン）については７２７アミノ酸と仮定され、そしてヘパリナーゼＩＩＩ（７０，０００ダルトン）については６３６アミノ酸と仮定される。ＣｙｓおよびＴｒｐは報告されない。
【００７８】
　（ヘパリンリアーゼについての最適な触媒活性の特徴づけ）
　３種のヘパリンリアーゼの各々についての最適な反応条件を、一連の実験によって求めた。最初に試験したパラメータは最適ｐＨであった。ヘパリンリアーゼＩおよびＩＩについてはヘパリン濃度２．５ｍｇ／ｍｌ、およびヘパリンリアーゼＩＩおよびＩＩＩについてはヘパラン硫酸濃度１．０ｍｇ／ｍｌが、刊行されている値（１４、２６）および予備実験に基づいて十分であることが示された。反応温度３７℃は、最初に、文献に報告されている値の平均値として選択した（Ｌｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，　Ｊ．Ｅ．，　Ｗａｎｇ，　Ｈ．Ｍ．，　Ｌｏｇａｎａｔｈａｎ，　Ｄ．，　およびＧａｌｌａｇｈｅｒ，　Ｊ．Ｔ．（１９９０）；　Ｓｉｌｖａ，　Ｍ．Ｅ．，　Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，　Ｃ．Ｐ．，　およびＮａｄｅｒ，　Ｈ．Ｂ．　（１９７６）；　Ｙａｎｇ，　Ｖ．Ｃ．，　Ｌｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｂｅｒｓｔｅｉｎ，　Ｈ．，　Ｃｏｏｎｅｙ，　Ｃ．Ｌ．，およびＬａｎｇｅｒ，　Ｒ．　（１９８５））。この温度は、その後、各リアーゼについての最適値が決定した後で修正した。
【００７９】
　決定したｐＨ最適値は、リアーゼＩについてヘパリンに対して７．１５であり、リアーゼＩＩについてヘパリンに対して７．３、およびヘパラン硫酸に対して６．９であり、そしてリアーゼＩＩＩについてヘパラン硫酸に対して７．６であった。
【００８０】
　各ヘパリンリアーゼについて最適な活性を与えるバッファーは、各々、研究する酵素および基質のための最適ｐＨに調節した、６種の異なるバッファーを用いて選択した。ヘパリンリアーゼＩは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＢＴＰ−ＨＣｌ中で同様の初期反応速度を示し、リン酸ナトリウム中で中程度の活性を示し、そしてＭＯＰＳ、ＴＥＳ、およびＨＥＰＥＳ中で低い活性を示した。各バッファー中で３７℃で２４時間インキュベートしたところ、活性は初期値の１〜２０％にまで低下した。ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、およびＨＥＰＥＳ中でインキュベートしたヘパリンリアーゼＩは、活性のほとんどを保持した。ヘパリンに対するヘパリンリアーゼＩＩ活性は、６種のバッファーすべてにおいて、きわだって同様であった。しかし、ヘパラン硫酸に対して作用する場合、ヘパリンリアーゼＩＩはまた、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、およびＨＥＰＥＳ中における活性が顕著に低下することを示した。各バッファー中でインキュベートした後、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、およびＨＥＰＥＳは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に対して、ヘパリンリアーゼＩＩ活性を最も保護することが分かった（３０〜７０％の活性を保持）。ヘパリンリアーゼＩＩＩは、研究した６種のバッファー中において、ほんのわずかの活性の違いを示した。ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳは、インキュベーションの後、ヘパリンリアーゼＩＩＩの活性を保護した（１５〜３０％の活性を保持）。
【００８１】
　ヘパリンリアーゼの初期反応速度に対するカルシウム、銅（ＩＩ）、水銀（ＩＩ）、および亜鉛（ＩＩ）イオンの影響を、先行文献（Ｓｉｌｖａ，　Ｍ．Ｅ．，　Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，　Ｃ．Ｐ．，　およびＮａｄｅｒ，　Ｈ．Ｂ．　（１９７６）；Ｈｏｖｉｎｇｈ，　Ｐ．，　およびＬｉｎｋｅｒ，　Ａ．　（１９７０））に基づいて検討した。これらのイオンとの適合性のためＢＰＴ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ）を選択した。
【００８２】
　最適活性のためのイオン強度（０〜５００ｍＭ）を、各ヘパリンリアーゼについて、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中でその最適ｐＨで検討した。塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、および酢酸カリウムは、同じイオン強度において共通した活性を与えた。ヘパリンリアーゼＩは、塩濃度の増加に応じて活性の増加を示し、１００ｍＭで最適な活性を示した。ヘパリンリアーゼＩＩおよびＩＩＩは各々、添加した塩の濃度が増加するにつれて活性の低下を示す。４００ｍＭの塩において、ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩの活性は、ほぼ完全に阻害された。
【００８３】
　ヘパリンリアーゼについての最適活性の温度は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中で、その最適ｐＨ（ヘパリンリアーゼＩは１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む）で、１５℃と５５℃との間の温度を用いて、決定した。最大活性の温度はヘパリンリアーゼＩについて３５℃であり、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に作用するヘパリンリアーゼＩＩについて４０℃であり、そしてヘパリンリアーゼＩＩＩについては４５℃であった。ヘパリンリアーゼについての温度安定性最適値は、熱失活が、速度定数を求めることを目的とする実験に影響しないことを確実にするために、確立した。ヘパリンリアーゼＩおよびＩＩＩ（タンパク質濃度６５０ｎｇ／ｍｌ）は活性の指数関数的な減少を示した。ヘパリンリアーゼＩは３０℃、５時間でその活性の８０％を失った。ヘパリンリアーゼＩＩＩは、３５℃および４０℃、３．５時間および０．５時間で、それぞれ、その活性の８０％を失った。ヘパリンリアーゼＩＩ（タンパク質濃度１〜２μｇ／ｍｌ）は、より活性の低下が緩慢であり、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に対して、３５℃、２５時間で、その活性の７０％を保持していた。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩに対する、他のすべての実験において、３０、３５、および３５℃をそれぞれ使用し、酵素の安定性を維持しながら、高い活性を保持した。
【００８４】
　ヘパリンリアーゼは、コンドロイチン硫酸Ｃおよびデルマタン硫酸に対して０．５％未満の活性を示し、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｄ、およびＥに対する活性を示さなかった。ヒアルロニダーゼ活性、グルクロニダーゼ活性は観察されず、そして０．５％未満のスルファターゼ活性が観察された。
【００８５】
　３種のヘパリンリアーゼの特異性を、それらの多糖類基質を用いて試験した。ヘパリンおよびヘパラン硫酸の分解の初期速度、および最終レベルを測定した。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩは、それぞれ、平均してヘパリンポリマーの７、１４、および１部位に作用し、そしてヘパラン硫酸ポリマーの５、２５、および２０部位に作用した。ヘパリンリアーゼＩＩは、ヘパラン硫酸に対し、ヘパリンに対して観察される初期速度の１．７倍の速度で作用した。オリゴ糖産物が、強いアニオン交換ＨＰＬＣおよびグラジエントＰＡＧＥ（Ｌｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊ．Ｅ．，　Ｗａｎｇ，　Ｈ．Ｍ．　Ｌｏｇａｎａｔｈａｎ，　Ｄ．，　およびＧａｌｌａｇｈｅｒ，　Ｊ．Ｔ．　（１９９０））によって分析されるオリゴ糖マップを、ヘパリンおよびヘパラン硫酸に対して作用する各ヘパリンリアーゼについて調製した（Ｌｏｈｓｅ，　Ｄ．Ｌ．　（１９９２）博士論文、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｈｅｐａｒｉｎｕｍのヘパリンリアーゼ、Ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｏｗａ）。これらのデータは、図５に示すヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩについての特異性と一致する。
【００８６】
　（ヘパリンリアーゼについてのミカエリス−メンテン定数の決定）
　ミカエリス−メンテン定数は、最適反応条件を用いて、１０％未満が消費される各基質濃度における反応速度を計算するために設計された実験によって求めた（表ＩＩＩ）。
【００８７】
　（ヘパリンリアーゼの安定性）
　ヘパリンリアーゼの最適な貯蔵条件の研究が必要であった。なぜならこれらの酵素の不安定性を例示する文献が多いからである。賦形剤の非存在下において、１回の凍結−解凍および凍結−乾燥の後、４℃で貯蔵されたヘパリンリアーゼＩは、それぞれ、５０、４５、および２５％の活性を保持していた。２．０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡの添加によって貯蔵安定性が向上し、その結果８５％を超える活性が保持され、同様に、５％のラクトースの添加によって活性が４０〜８０％保持された。ヘパリンリアーゼＩＩは、すべての貯蔵条件下で７５％を超える活性を保持し、そしてＢＳＡまたはラクトースの添加によって、追加される安定性はわずかであった。ヘパリンリアーゼＩＩＩは凍結−解凍および凍結乾燥に対して、非常に不安定である。ヘパリンリアーゼＩＩＩは、４０℃での短期間の保存ではその活性のほとんどを保持するが、凍結−解凍または凍結−乾燥では７０〜８０％を失う。ＢＳＡの存在によって活性は２０〜２５％回復するが、ラクトースを添加するとヘパリンリアーゼＩＩＩは不安定となる。
【００８８】
　表ＩＩＩ：精製されたヘパリンリアーゼの速度定数
【００８９】
【表３】
2004135684.tif 000004
　ａ　見かけのＫｍおよびＶｍａｘは、ヘパリンまたはヘパラン硫酸のいずれかに対する８つまたはそれ以上の濃度（３〜５００μＭ）において得た初期速度から求めた。ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩについてのタンパク質濃度はそれぞれ、８０、９９４、および６８ｎｇ／ｍｌであった。見かけのＫｍおよびＶｍａｘの値の標準誤差は、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の初期速度および対応する濃度の、「材料および方法」の項に記載したミカエリス−メンテン式へのフィッティングの精度を示す。
【００９０】
　ｂ　Ｖｍａｘはμｍｏｌ／分ｍｇタンパク質で表される。
【００９１】
　ｃ　Ｋｃａｔ／Ｋｍは（ｓ−μＭ）−１で表される。
【００９２】
　ヘパリンリアーゼＩについて算出された最適ｐＨは７．１５であった。この値は、Ｙａｎｇら（１９８５）によって、そしてＬｉｎｋｅｒおよび共同研究者（ＨｏｖｉｎｇｈおよびＬｉｎｋｅｒ，　（１９６５および１９７０））によって報告されたｐＨ６．５よりも高かった。両グループとも、そのリアーゼ調製物を６時間までの時間を用いてアッセイし、ここでは熱不安定性がファクターとなり得る。本研究で用いた最大時間は、わずか３分間であった。ヘパラン硫酸に作用するヘパリンリアーゼＩＩのｐＨ最適値は６．９であった。ヘパリンリアーゼＩＩＩについてのｐＨ最適値は７．６であった。Ｈｏｖｉｎｇｈ　およびＬｉｎｋｅｒ、ならびにＤｉｅｔｒｉｃｈおよびその共同研究者は、この酵素についてのｐＨ最適値は６．０と７．０との間であることを報告した。再度述べるが、両グループによって使用されたアッセイ時間間隔は６時間までであり、熱不安定性はこれらの値の間の差異の原因となり得る。
【００９３】
　ヘパリンリアーゼＩの活性は、１ｍＭ亜鉛によってわずかに減少し、そして１０μＭおよび１ｍＭの水銀および１ｍＭの銅によって顕著に減少した。１０ｍＭのカルシウムは活性を３０％増加させた。ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に作用するヘパリンリアーゼＩＩの、２価の金属イオンの存在下における活性は、１０μＭの銅の場合を除いて、すべてのテストされた金属によって阻害されることが示された。カルシウムでさえ、ヘパリンリアーゼＩＩ活性を劇的に減少させる結果となった。ヘパリンリアーゼＩＩＩはカルシウムによって活性化され（２０％）、銅および水銀（両者とも１０μＭ）によって影響をうけず、そして亜鉛、水銀、および銅（すべて１ｍＭ）によって阻害された。一般に２価金属イオンの添加は、ヘパリンリアーゼの活性を低下させた。ヘパリンリアーゼＩの最適活性は、イオン強度１００ｍＭにおいて観察された。ヘパリンリアーゼＩＩおよびＩＩＩ活性は塩濃度が増加するにつれ、減少した。
【００９４】
　表ＩＩＩに、ヘパリンおよびヘパラン硫酸に作用するヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩについての見かけのミカエリス−メンテン定数をまとめた。ヘパリンリアーゼＩについての見かけのＫｍ値が０．３〜４２μＭの範囲であること、およびＶｍａｘが１９．７μｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質であることが報告されている（Ｒｉｃｅら、（１９８９）；　Ｙａｎｇら、（１９８５）；　Ｌｉｎｄｈａｒｄｔ，　（１９８４））。ヘパリン硫酸に作用する精製されたヘパリンリアーゼＩＩＩの見かけのＫｍが５．７μＭであり、そしてＶｍａｘが３．５７×１０−３μｍｏｌ／分であることが報告されている（Ｒｉｃｅ　およびＬｉｎｄｈａｒｄｔ，（１９８９））。
【００９５】
　ヘパリンリアーゼＩおよびＩＩはヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に作用し、他方ヘパリンリアーゼＩＩＩはヘパラン硫酸のみに作用する。３種の酵素すべてがエンド型で作用する。しかし、ポリマー内のすべての切断可能な部位が等しく作用されやすいわけではない（Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．Ｍ．およびＬｉｄｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．（１９９０）　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　３０，　７３３−７４１）。これらのポリマー性基質内の、各酵素で切断される主要な（ｐｒｉｍａｒｙ）結合はオリゴ糖マッピング実験から推定された。ヘパリンおよびヘパラン硫酸に対するヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩの特異性はそれらの部分的に精製された、工業的に調製された対応物について、先に報告された特異性と同一である。同等の部位を有するオリゴ糖基質（すなわち、四糖類および六糖類）は基質となりにくい。四糖類基質に作用するヘパリンリアーゼＩおよびＩＩＩについて測定されたＶｍａｘ／Ｋｍは、ポリマー基質について測定されたＶｍａｘ／Ｋｍのわずか０．０１〜１％である。
【００９６】
　ヘパリンリアーゼＩ〜ＩＩＩのデルマタンおよびコンドロイチン硫酸Ａ〜Ｅに対する作用もまた研究した。これらの基質は、硫酸エステル化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）の位置および度合い、およびそのウロン酸のキラリティーが異なる。これらの酵素が、コンドロイチン硫酸Ｃおよびデルマタン硫酸に対してわずかに活性であることは、ヘパリンリアーゼに混入物があるか、あるいはこれらの基質が少量のヘパリンまたはヘパラン硫酸を含有していることを示唆した。この２つの可能性を区別するために、反応を長時間にわたって追跡した。最初は、すべての活性が観察され、その後、基質は、新鮮な酵素の繰り返し添加に対して安定になった。このことにより、観察されるわずかな活性は、基質が混入した（コンドロイチン硫酸Ｃおよびデルマタン硫酸中に約１％のヘパリン／ヘパラン硫酸が混入）ことに起因するものであり、酵素が混入したことによるものではないことが確認された。ヘパリンリアーゼはいずれも、ヒアルロン酸に対する活性を示さなかった。ヘパリンリアーゼがこれら他のグリコサミノグリカンに対して作用しないということは、ヘパリン／ヘパラン硫酸に対するその特異性、およびリアーゼ活性の混入がないことの両方を、明白に示している。精製されたリアーゼには、グルクロニダーゼ活性（Ｗａｒｎｉｃｋ，　Ｃ．Ｔ．，　およびＬｉｎｋｅｒ，　Ａ．　（１９７２）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１，　５６８−５７２）は観察されず、そして０．５％未満のスルファターゼ活性（ＭｃＬｅａｎ，　Ｍ．Ｗ．，　Ｂｒｕｃｅ，　Ｊ．Ｓ．，　Ｌｏｎｇ，　Ｗ．Ｆ．，　およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，　Ｆ．Ｂ．　（１９５４）　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１４５，　６０７−６１５）が検出された。
【００９７】
　（ＩＩ．ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、およびヘパリナーゼＩＩＩに対するモノクローナル抗体の調製）
　ヘパリンリアーゼＩをマウスに注射し、そしてそのＢリンパ球を使用して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成した。３種の各ヘパリンリアーゼに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性を試験した。
【００９８】
　（材料および方法）
　（抗体産生のためのヘパリンリアーゼの調製）
　上記のように、ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩをＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍから単離し、そして均質に精製した。ヘパリンリアーゼ濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，　ＣＡ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して測定した。
【００９９】
　（モノクローナル抗体の調製）
　６つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製した。簡単に述べると、精製されたヘパリンリアーゼＩを、７０日間にわたって３回、マウスに注射した。マウスの脾臓を取り出し、そして脾臓細胞混合物からリンパ球を単離した。このリンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマを生成した。このハイブリドーマを培養し、そしてヘパリンリアーゼＩに対する抗体の産生についてスクリーニングした。ヘパリンリアーゼＩに対するｍＡｂを産生することが見いだされた６つのハイブリドーマをＭ−１Ａ、Ｍ２−Ｂ７、Ｍ２−Ａ９、Ｍ−３２、Ｍ−３３、およびＭ−３４と命名した。ｍＡｂ溶液のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＢＣＡタンパク質アッセイ試薬を使用して、測定した。
【０１００】
　各モノクローナル抗体の濃度を表ＩＶに示す。
【０１０１】
　表ＩＶ：ＭＡｂ濃度
【０１０２】
【表４】
2004135684.tif 000005
　ＭＡｂ溶液のタンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイ　　　　（Ｐｉｅｒｃｅ）によって求めた。
【０１０３】
　（イムノアッセイ操作のためのバッファー）
　ニトロセルロース膜、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体、トリス｛ヒドトキシメチル｝アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ゼラチン、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびＨＲＰ発色試薬（Ｃｏｌｏｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ）（４−クロロ−１−ナフトール）は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）から購入した。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）は、塩化ナトリウム５００ｍＭを含有する２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）であった。ブロッキング溶液はＴＢＳ中に３．０％ゼラチンを含んでいた。ＴＢＳで希釈したＴｗｅｅｎ−２０洗浄溶液（ＴＴＢＳ）は、ＴＢＳ中に０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含んでいた。抗体バッファーはＴＢＳ中に１％のゼラチンを含んでいた。ＨＲＰ発色溶液は、使用の直前に、ＨＲＰ発色試薬６０ｍｇを０℃のメタノール１００ｍＬ中に、０．０１５％Ｈ２Ｏ２のＴＢＳ溶液とともに混合することによって作成した。
【０１０４】
　（モノクローナル抗体を用いたヘパリンリアーゼのイムノアッセイ）
　ドットブロッティングイムノアッセイ法を、Ｂｉｏ−Ｒａｄイムノブロットアッセイプロトコル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，　ＣＡ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）で推奨された方法で、行った。簡単に述べると、ニトロセルロース膜を２×３ｃｍの小片にカットし、そしてこの膜上に１×１ｃｍの四角形を、軟らかい鉛筆を用いて描いた。この膜をＴＢＳ中に１５分間浸漬し、そして濾紙上で１５分間、風乾した。種々の濃度のヘパリンリアーゼ（ＴＢＳ中１μＬ）を各四角形の中央に置き、そしてこの膜を１５分間風乾し、次に、この膜をブロッキング溶液中に１時間浸漬し、残りの疎水性部分を被覆した。これをＴＴＢＳ中で４回洗浄し（２回すばやくすすぎ、次に５分間の撹拌を２回）、次に、０．２％（ｖ／ｖ）ｍＡｂを含む抗体バッファー溶液中に終夜浸漬し、次に、この膜をＴＴＢＳで４回洗浄し、そしてヤギ抗マウスＨＲＰ溶液（抗体バッファー中０．１％）に加え、４時間、穏やかに撹拌した。この膜をＴＴＢＳで４回洗浄し、次に、ＴＢＳで２回洗浄した。ＨＲＰ発色溶液をこの膜に添加し、そして紫色のバンドが明確に可視化したとき、膜を蒸留水中に置いて発色を停止した。次にこの膜を濾紙上で１５分間乾燥し、そしてアルミニウム箔で覆って光から保護した。
【０１０５】
　（電気泳動）
　（材料）
　電気泳動は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，　Ｃａ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ　ＩＩ電気泳動セルを使用して行った。アクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．　（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，　ＣＴ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手したものか、あるいは調製した４０％アクリルアミド溶液（３７．５（アクリルアミド）：１（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｆａｉｒｌａｗｎ，　ＮＪ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．））である。トリス｛ヒドロキシメチル｝アミノメタン（Ｔｒｉｓ）はＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，　ＣＡ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）はＢｏｅｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，　ＩＮ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）および氷酢酸は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　Ｉｎｃ．　（Ｐａｄｓ，　ＫＹ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。尿素およびグリセロールはＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　（Ｆａｉｒ　Ｌａｗｎ，　ＮＪ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）はＢＤＨ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ．（Ｐｏｏｌｅ，　Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手した。ナフトールレッドはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．　（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。２−β−メルカプトエタノールはＥＭ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，　ＮＪ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。ブロモフェノールブルーはＭＣＢ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，　Ｉｎｃ．　（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，　ＯＨ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。分子量標準およびＲａｐｉｄ　Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染料はＤｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　（Ｎｅｗｔｏｎ　Ｃｅｎｔｒｅ，　ＭＡ，　Ｓ．Ｓ．Ａ．）から入手した。
【０１０６】
　（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ））
　ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞ホモジネートを上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。上記のように、蒸留水４．３５ｍＬ、１．５ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）２．５ｍＬ、および市販の、３７．５（アクリルアミド）：１（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）調製溶液（Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｆａｉｒｌａｗｎ，　ＮＪ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）３．０ｍＬを混合して、分離ゲル（１２％アクリルアミド、１０％ＳＤＳ）を調製した。この溶液を真空下で少なくとも１５分間、脱気した。次に、ＡＰＳ５０μＬ（１０％）およびＴＥＭＥＤ５μＬをモニター溶液に添加して、重合を開始した。このゲル溶液を、０．７５ｍｍのスペーサーで隔てられた２枚のガラス板の間にすばやく流し込み、γ−ブタノールで飽和した蒸留水で重層し、２５℃で６０分間、重合させた。
【０１０７】
　蒸留水６．４ｍＬ、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）２．５ｍＬ、アクリルアミド／ビス溶液（Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１．０ｍＬ、ＡＰＳ（１０％）５０μＬ、およびＴＥＭＥＤ１０μＬを混合して、スタッキングゲルを調製した。分離ゲルからγ−ブタノール壁を除去し、このゲルを蒸留水ですすぎ、そしてスタッキングゲル溶液を、分離ゲルの上に注意深く加えた。ウエル形成用電気泳動コームを、重合の前にスタッキングゲルに挿入した。スタッキングゲルを６０分間重合させ、そしてウエル形成用コームを、試料をロードする直前に、取り外した。
【０１０８】
　試料バッファーは、蒸留水４．０ｍＬ、０．５ＭＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）１．０ｍＬ、グリセロール０．８ｍＬ、ＳＤＳ（１０％）１．６ｍＬ、２−β−メルカプトエタノール０．４ｍＬ、およびブロモフェノールブルー（０．０５％ｗ／ｖ）０．２ｍＬを混合することによって調製した。電気泳動のための試料および分子量標準マーカーを、スタッキングゲル中の先の工程で形成したウエル中にロードする直前に、試料バッファーで１：４に希釈し、そして１００℃で４分間加熱した。泳動バッファー（０．１２５ＭＴｒｉｓ、１．０Ｍグリシン、０．５％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）を、スタッキングゲル上に注意深く重層し、そして２００Ｖの一定電圧で、ブロモフェノールブルーマーカーが、ゲルの底から０．３ｃｍ以内に移動するまで（典型的には約４５分）、電気泳動を行った。電気泳動に続いて、このゲルを、ニトロセルロース膜にエレクトロトランスファー（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）するか、あるいはＲａｐｉｄ　Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染料で４５分間染色して、次に７．５％メタノール／５％酢酸溶液で脱色した。
【０１０９】
　（尿素／酢酸ＰＡＧＥ）
　いくつかの実験においては、尿素／酢酸ＰＡＧＥシステム（ｐａｎｙｉｍ，　Ｓ．，およびＣｈａｌｋｌｅｙ，　Ｒ．（１９６９）　「ヒストンの高分解能アクリルアミドゲル電気泳動」Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｌｏｐｈｙｓ．　１３０，　３３７−３４６）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのかわりに使用して、ウェスタンブロットにおいてｍＡｂがヘパリンリアーゼを検出する能力に対するＳＤＳの影響を比較した。尿素／酢酸ＰＡＧＥの調製に使用するストック溶液は、６０％アクリルアミド溶液を、アクリルアミド６０ｇ、およびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．４ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解することによって、調製した。４３．２％酢酸／ＴＥＭＥＤストック溶液を、酢酸４３．２ｍＬ、ＴＥＭＥＤ４．０ｍＬ、および蒸留水５２．８ｍＬを混合することによって、調製した。ＡＰＳ／尿素を、ＡＰＳ５Ｍｇを１０Ｍ尿素２５ｍＬ中に溶解することによって調製した。
【０１１０】
　尿素／酢酸ＰＡＧＥを、６０％アクリルアミド溶液４．０ｍＬ、４３．２％酢酸／ＴＥＭＥＤ３．０ｍｌ、および蒸留水２．０ｍＬを混合することによって、形成した。この溶液およびＡＰＳ／尿素溶液を、１５分間脱気した。ＡＰＳ／尿素１５ｍＬをアクリルアミドモノマーに添加し、混合し、そして２枚の０．７５ｍｍスペーサーで隔てられた２枚のガラス板の間に注意深く流し入れた。ウエル形成用電気泳動コームを、このゲルの上に挿入し、そしてゲルを６０分間重合させた。
【０１１１】
　ヘパリンリアーゼを尿素／酢酸試料バッファーで１：４に希釈した。この試料バッファーは、酢酸５２０μＬ、グリセロール１．０ｍｌ、ナフトールレッド１．０ｍｇ、および尿素６．０ｇを、蒸留水（最終容量を１０ｍＬにする）中で混合することによって調製した。ウエル形成用コームを取り外し、そしてウエル中に試料をロードし、そして泳動バッファー（０．９Ｍ酢酸）で重層した。一定電流２０ｍＡで３時間（ゲルのプレフォーカシング）、そして次に１０ｍＡで、ナフトールレッドがゲルの底から約０．３ｃｍまで移動するまで（約３時間）、電気泳動を行った。
【０１１２】
　（アクリルアミドゲルからニトロセルロース膜へのヘパリンリアーゼのエレクトロトランスファー）
　半乾燥トランスブロッティング（ｔｒａｎｓｂｌｏｔｔｉｎｇ）を、Ｈｏｅｆｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　（Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，　ＣＡ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＳｅｍｉＰｈｏｒ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｕｎｉｔ　（Ｔｅ−７０）を使用しておこなった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは尿素／酢酸ＰＡＧＥからニトロセルロース膜へのヘパリンリアーゼのエレクトロトランスファーは、Ａｌ−Ｈａｋｉｍ，　Ａ．，　およびＬｉｎｈａｒｄｔ，　Ｒ．Ｊ．　（１９９０）　「半乾燥エレクトロトランスファーによる、ポリアクリルアミドゲルからの酸性オリゴ糖の単離および回収」Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　１１，　２３−２８に記載された半乾燥トランスブロッティング法を用いて行ったが、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）を転写バッファーとして使用したことが異なる。転写は、８Ｖ、４０分間で完了した。
【０１１３】
　（モノクローナル抗体を用いたヘパリンリアーゼのウェスタンブロット検出）
　ニトロセルロース膜上のヘパリナーゼを、ドットブロッティングイムノアッセイ操作に関する上記記載と同じようにウェスタンブロッティング法を用いて検出した。
【０１１４】
　（モノクローナル抗体の検出に対するＳＤＳの影響）
　ｍＡｂ　Ｍ−３２およびＭ−３３によるヘパリンリアーゼの免疫検出に対するＳＤＳおよび２−β−メルカプトエタノールの影響について試験した。ヘパリンリアーゼＩおよびＩＩのドットブロッティングイムノアッセイは、ヘパリンリアーゼを、ＳＤＳおよび／または２−β−メルカプトエタノールを含有する溶液中に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で使用したのと同じ割合で、ニトロセルロース膜上にブロッティングする前に溶解したこと以外は、前述と同様に行った。
【０１１５】
　（結果）
　６種の各ｍＡｂの、３種のヘパリンリアーゼに対する反応性を試験した。種々の量の３種の各ヘパリンリアーゼをニトロセルロース膜上にスポットし、そして抗ヘパリンリアーゼｍＡｂを用いて検出した、次いで、ヤギ抗マウスＩＧＧ−ＨＲＰおよびこの免疫結合体の発色剤を添加した。表Ｖに、イムノアッセイ操作で検出された各ヘパリンリアーゼの最低濃度をまとめる。表Ｖからわかるように、ｍＡｂは、３種のヘパリンリアーゼの免疫検出に対して広範囲の感受性を有する。例えば、Ｍ２−Ａ９およびＭ２−Ｂ７は、１０ｐｇほどの少量のヘパリンリアーゼＩＩを検出し得、他方Ｍ−３２、Ｍ−３３、およびＭ−３４は、ヘパリンリアーゼＩＩＩを検出するためには１μｇのヘパリンリアーゼＩＩＩの存在を必要とする。
【０１１６】
　表Ｖ．ニトロセルロース膜上のヘパリンリアーゼのｍＡｂ検出ａ
【０１１７】
【表５】
2004135684.tif 000006
　ａ　ドットブロッティング免疫検出を用いる６種の各ｍＡｂによって検出可能なヘパリンリアーゼの最小量。
【０１１８】
　各データは、ｍＡｂが、ヘパリンリアーゼＩおよびＩＩが、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞ホモジネート中のような２種一緒に存在する場合の、この２種の識別のために使用し得ることを示す。特にＭ−３２は、ヘパリンリアーゼＩを、ヘパリンリアーゼＩＩより１０倍低いレベルで検出し得る。反対に、Ｍ２−Ａ９およびＭ２−Ｂ７はヘパリンリアーゼＩＩを、ヘパリンリアーゼＩの１０倍低いレベルで検出し得る。Ｍ−３３、Ｍ−３４およびＭ−１Ａは、ヘパリンリアーゼＩとＩＩとの間の識別のためには使用し得ない。さらに、６種のｍＡｂはすべてヘパリンリアーゼＩおよびＩＩを、ヘパリンリアーゼＩＩＩより低いレベルで検出し得、従って、ヘパリンリアーゼＩＩＩとヘパリンリアーゼＩまたはＩＩとの間の識別が可能となる。ヘパリンリアーゼＩとＩＩとの間の識別は重要である。なぜなら両方の酵素とも、ヘパリンおよびヘパラン硫酸に対して作用し、従って、その基質特異性に基づく識別が容易でないからである。
【０１１９】
　（ヘパリンリアーゼのウェスタンブロット分析）
　３種のヘパリンリアーゼおよびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞ホモジネート試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くウェスタンブロット免疫検出によって分析した（図５ａに示す）。図５ｂは、クーマシーブルーと分子量マーカーで染色された３種のヘパリンリアーゼの典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを含む。ｍＡｂがヘパリンリアーゼを検出する能力を、３種のヘパリンリアーゼおよびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞ホモジネートを６つのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通して泳動し、次いでこのゲルの内容物をウェスタンブロット免疫検出によって試験した。ヘパリンリアーゼＩ（１８ｎｇ）、ヘパリンリアーゼＩＩ（５７０ｎｇ）、ヘパリンリアーゼＩＩＩ（１．６３μｇ）、および細胞ホモジネート（８７ｎｇ）を、各ゲルにロードした。Ｍ−３４、Ｍ１−Ａ、Ｍ２−Ａ９、およびＭ２−Ｂ７を含むニトロセルロース膜上での検出のために用いた発色時間は、それぞれ２０、１０、１５および４０分間であった。４種のｍＡｂ（Ｍ−３４、Ｍ−１Ａ、Ｍ２−Ａ９、およびＭ２−Ｂ７）が、精製されたヘパリンリアーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩと、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞ホモジネート中に存在するヘパリンリアーゼを検出することができた。２種のｍＡｂ（Ｍ−３２およびＭ−３３）は、精製されたヘパリンリアーゼまたは細胞タンパク質のいずれをも、ウェスタンブロットで検出できなかった。
【０１２０】
　Ｍ−３２およびＭ−３３がヘパリンリアーゼを免疫検出する能力を破壊する原因となる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムの試薬を決定した。Ｍ−３２およびＭ−３３を使用したヘパリンリアーゼのドットブロッティングイムノアッセイを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムの各成分を評価した。ヘパリンリアーゼＩおよびＩＩを、ＳＤＳおよび／または２−β−メルカプトエタノールの存在下または非存在下において、ニトロセルロース膜上にブロットし、そしてドットブロッティングイムノアッセイ法を用いて試験した。ｍＡｂは、ＳＤＳが存在するとリアーゼを検出できず、これは、ＳＤＳが、ウェスタンブロッティング操作の間のこれらの２種のｍＡｂの感受性を低下させる原因となることを例証する。この実験は、Ｍ−３２およびＭ−３３が、リアーゼ上のエピトープを認識しなければならないことを示唆する。このエピトープは、３種すべてのヘパリンリアーゼに存在する折り畳み構造のような二次コンホメーション（これはＳＤＳ変性によって破壊される）を必要とする。
【０１２１】
　ＳＤＳが、Ｍ−３２およびＭ−３３のヘパリンリアーゼに対する反応性を低下させることの原因となることをさらに例証するために、３種のヘパリンリアーゼおよびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞ホモジネートを、Ｍ−３２およびＭ−３３を用いた尿素／酢酸ＰＡＧＥとそれに続くウェスタンブロッティング免疫検出を用いて分析し、システム中のリアーゼを検出した。検出感度は顕著に低下した。ヘパリンリアーゼＩ（２．７μｇ）、ヘパリンリアーゼＩＩ（３．４μｇ）。ヘパリンリアーゼＩＩＩ（４．７μｇ）、および細胞ホモジネート（７．７μｇ）が検出可能であった。従って、ＳＤＳが、Ｍａｂ（Ｍ−３２およびＭ−３３）のヘパリンリアーゼに対する反応性を低下させる、主要な原因である。ＰＡＧＥとそれに続くウェスタンブロッティング免疫検出で分析した場合、６種のＭＡｂすべてが、３種のヘパリンリアーゼすべてを、精製された形態または天然形態のいずれにおいても検出し得る。
【０１２２】
　６種のＭＡｂのうち少なくとも１種が、単一のヘパリンリアーゼを特異的に検出し、細胞ホモジネートのようなヘパリンリアーゼの複合混合物中におけるそのリアーゼの検出を可能とすることが予期された。ドットブロッティングおよびウェスタン分析によって、ｍＡｂのすべてが、３種のリアーゼすべてを検出し得ることが明らかとなった。この観察は、これらの３種のヘパリンリアーゼが、６つの共通するエピトープを有しているので、顕著に類似した構造であることを示唆する。これらの３種の酵素のペプチドマッピングは、多数の共通ペプチドフラグメントを示し、そしてこれらが、３種のヘパリンリアーゼ内の高度に免疫原性の領域に位置し得ることを示唆する。ドットブロッティング分析における、個々のｍＡｂの各リアーゼに対する感受性は大幅に変化し、従って、ドットブロッティング分析が３種のリアーゼ間の識別のために使用し得る可能性を与える。
【０１２３】
　ＰＡＧＥ（ＳＤＳまたは尿素／酢酸）の使用は、ドットブロッティング操作に比べてより多くのタンパク質を必要とし、そしてｍＡｂの、各リアーゼに対する感受性は、ドットブロッティング分析で示された感受性とは異なる。これはおそらく、ＰＡＧＥおよび転写工程の間に二次構造が変化することに起因する。
従って、ｍＡｂを使用したヘパリンリアーゼの検出は、本明細書中で記載されるドットブロッティング法を用いることによって、最も効果的に行われる。さらに、６種すべてのｍＡｂが、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞ホモジネート中に存在する３種すべてのリアーゼを検出可能であり、従って、これらのｍＡｂを使用して、細胞ホモジネート中のヘパリンリアーゼの存在を迅速に示し得る可能性が与えられる。リアーゼ精製に便利なように、これらのｍＡｂは、最初に固定化され、そしてヘパリンリアーゼに対するこれらの結合活性が評価される。抗体を固定化するための方法および材料は市販されており、そして当業者に公知である。
【０１２４】
　要約すれば、本明細書に記載された結果は、ｍＡｂがヘパリンリアーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを、その精製状態において、またはホモジナイズしたＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞の溶液中に一緒に存在する場合のいずれかで、検出し得ることを示す。これらのｍＡｂはまた、リアーゼのドットブロッティング分析にも使用し得、３種の各リアーゼについてのそれらの感受性の違いに基づいて、３種のリアーゼを識別する。
【０１２５】
　精製されたヘパリナーゼの修飾および改変、それらの精製法、およびそれらに対するモノクローナル抗体は、上記の詳細な説明から当業者に自明である。これらの修飾および改変は、添付の請求項の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１はヘパリンリアーゼのＨＡ−ＨＰＬＣ分画のグラフである。タンパク質（Ａ２８０）は、実線である。ヘパリンに対する活性（単位／ｍｌ）（黒丸）およびヘパラン硫酸に対する活性（単位／ｍｌ）（黒四角）は、集めたピークの部分を示すためにクロスハッチングで示された。
【図２】図２は、ヘパリンリアーゼのＭｏｎｏ−Ｓ　ＦＰＬＣ分画である：ａ、ヘパリンリアーゼＩ：ｂ、ヘパリンリアーゼＩＩＩ。矢印は、塩グラジエント溶出の開始を示し、そしクロスハッチングは、集めたピークの部分を示す。
【図３】図３は、ヘパリンリアーゼのＧＰＣ−ＨＰＬＣ分画である：ａ、ヘパリンリアーゼＩ；ｂ、ヘパリンリアーゼＩＩ；ｃ、ヘパリンリアーゼＩＩＩ；およびｄ、サイログロブリン（ウシ、６７０，０００）、ガンマグロブリン（１５８，０００）、オボアルブミン（４４，０００）、ミオグロビン（ウマ、１７，０００）およびシアノコバラミン（１３５０）からなる分子量標準（Ｍｒ）。クロスハッチングは、集めたピークの部分を示す。
【図４】図４は、還元条件下における１２％の不連続ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ヘパリンリアーゼＩ（レーンａ）、ヘパリンリアーゼＩＩ（レーンｂ）、ヘパリンリアーゼＩＩＩ（レーンｃ）、および分子量標準（レーンｄ）を２μｇずつ。ｋＤａでの分子量標準を右に示す。
【図５】図５。パネルＡ：Ｍ２−Ａ９を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロット。（ａ）ヘパリンリアーゼＩ；（ｂ）ヘパリンリアーゼＩＩ；　（ｃ）ヘパリンリアーゼＩＩＩ；（ｄ）Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞のホモジネート。矢印は、目的のバンドを示す。この分析は、ヘパリンリアーゼの存在（精製されているか、またはホモジナイズした細胞物質に存在するかのどちらかである）を検出するＭＡｂの能力を例証する。
【０１２７】
　パネルＢ：精製したヘパリンリアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（ａ）ヘパリンリアーゼＩ；（ｂ）ヘパリンリアーゼＩＩ；　（ｃ）ヘパリンリアーゼＩＩＩ；（ｄ）分子量マーカー。　矢印は、目的のバンドを示す。
【図６】図６は、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩのトリプシン消化マップである。パネルＡはヘパリナーゼＩＩであり、そしてパネルＢはヘパリナーゼＩＩＩである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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