(57)【要約】【課題】増幅効率が高く、かつ、プライマーの設計が容易なＤＮＡの増幅方法を提供する。【解決手段】センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いるＰＣＲによるＤＮＡの増幅方法において、センスプライマーの５’末端に第１の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端に、第１の付加配列に相補的な第２の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスプライマーの存在下でＰＣＲを行い、前記付加配列のＴｍは、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも低く、ＰＣＲにおけるアニーリングの温度は、初期においては前記付加配列がアニーリングしない温度とし、途中で前記付加配列がアニーリングする温度に変更する。【選択図】  図４
2004267093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いるＰＣＲによるＤＮＡの増幅方法において、センスプライマーの５’末端に第１の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端に、第１の付加配列に相補的な第２の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスプライマーの存在下でＰＣＲを行い、前記付加配列のＴｍは、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも低く、ＰＣＲにおけるアニーリングの温度は、初期においては前記付加配列がアニーリングしない温度とし、途中で前記付加配列がアニーリングする温度に変更する前記方法。
【請求項２】
前記付加配列のＴｍが、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも５℃以上低い、請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法に用いるためのキットであって、センスプライマーの５’末端に第１の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端に、第１の付加配列に相補的な第２の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスプライマーを含み、前記付加配列のＴｍは、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも低い、前記キット。
【請求項４】
前記付加配列のＴｍが、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも５℃以上低い、請求項３記載のキット。
【請求項５】
請求項１に記載の方法により目的ＤＮＡを増幅し、増幅産物を検出することを含む、目的ＤＮＡの検出方法。
【請求項６】
検出を、リアルタイムＰＣＲにより行う請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法に用いるためのキットであって、センスプライマーの５’末端に第１の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端に、第１の付加配列に相補的な第２の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスプライマーを含み、前記付加配列のＴｍは、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも低い、前記キット。
【請求項８】
リアルタイムＰＣＲ用のプローブを含む請求項７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ増幅法およびそのためのキットならびにそのＤＮＡ増幅法を利用したＤＮＡの検出法およびそのためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子等のＤＮＡの増幅は、遺伝子検査等において重要な技術であり、ＤＮＡポリメラーゼを利用した、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の増幅法が知られている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、２つのプライマーを用いて、温度サイクルによりＤＮＡの変性、アニーリング及び伸長の反応を繰り返してＤＮＡを増幅する方法である（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
ＬＡＭＰ法は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、６つの領域を認識する４つのプライマーを用いて、一定温度でＤＮＡを増幅する方法である（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】
特公平４−６７９５７号公報
【特許文献２】
国際公開第ＷＯ００／２８０８２号パンフレット
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来の方法には、以下のような問題点がある。ＰＣＲ法は、ＤＮＡの増幅効率は原理的に１サイクル当たり最大で２倍である。ＬＡＭＰ法は、プライマーの設計が難しい。
【０００７】
従って、本発明は、増幅効率が高く、かつ、プライマーの設計が容易なＤＮＡの増幅方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＰＣＲ法において、通常のプライマー対に加えて、５’末端に相補的な配列を有する追加プライマー対を用いるとともに条件を一部変更することによって、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
【０００９】
（１）センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いるＰＣＲによるＤＮＡの増幅方法において、センスプライマーの５’末端に第１の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端に、第１の付加配列に相補的な第２の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスプライマーの存在下でＰＣＲを行い、前記付加配列のＴｍは、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも低く、ＰＣＲにおけるアニーリングの温度は、初期においては前記付加配列がアニーリングしない温度とし、途中で前記付加配列がアニーリングする温度に変更する前記方法。
【００１０】
（２）前記付加配列のＴｍが、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも５℃以上低い、（１）の方法。
【００１１】
（３）（１）の方法に用いるためのキットであって、センスプライマーの５’末端に第１の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端に、第１の付加配列に相補的な第２の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスプライマーを含み、前記付加配列のＴｍは、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも低い、前記キット。
【００１２】
（４）前記付加配列のＴｍが、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも５℃以上低い、（３）のキット。
【００１３】
（５）（１）の方法により目的ＤＮＡを増幅し、増幅産物を検出することを含む、目的ＤＮＡの検出方法。
【００１４】
（６）検出を、リアルタイムＰＣＲにより行う（５）の方法。
【００１５】
（７）（５）の方法に用いるためのキットであって、センスプライマーの５’末端に第１の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端に、第１の付加配列に相補的な第２の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスプライマーを含み、前記付加配列のＴｍは、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも低い、前記キット。
【００１６】
（８）リアルタイムＰＣＲ用のプローブを含む（７）のキット。
【００１７】
本発明によれば、相補的な配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを５’末端にそれぞれ付加した追加プライマー対を追加的に用いる以外は、通常のＰＣＲと同様に実施でき、プライマーの設計がＬＡＭＰ法に比べて容易である。さらに、追加プライマーの付加部分により増幅産物同士が連結するため、増幅される配列が１サイクル当たり２倍を超えて増加する。増幅効率が増加するので、プローブを用いたリアルタイム検出の時間短縮やシグナルの増加が期待される。そして、通常のＰＣＲを実施するのに必要な装置に加えて特別な追加的装置を必要としない。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「センス」および「アンチセンス」の語は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖とそれに相補的な鎖との相対的な関係を示す意味で用い、センス鎖が必ずしも転写産物と同じ塩基配列を有する鎖を示すものではない。また、Ｔｍ値は最近接塩基対（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ）法により算出した値である。
【００１９】
＜１＞本発明増幅方法およびそのためのキット
本発明増幅方法は、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いるＰＣＲによるＤＮＡの増幅方法であって、センスプライマーの５’末端に第１の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端に、第１の付加配列に相補的な第２の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスプライマーの存在下でＰＣＲを行い、前記付加配列のＴｍは、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのＴｍよりも低く、ＰＣＲにおけるアニーリングの温度は、初期においては前記付加配列がアニーリングしない温度とし、途中で前記付加配列がアニーリングする温度に変更することを特徴とする。
【００２０】
本発明増幅方法は、追加センスプライマーと追加アンチセンスプライマーからなる追加プライマー対を用い、アニーリングの温度をＰＣＲの途中で低下させることの他は、通常のＰＣＲの方法に従って行うことができる。
【００２１】
センスプライマーおよびアンチセンスプライマーからなるプライマー対は、通常のＰＣＲにおけるプライマー対の設定方法と同様にして設定することができる。センスプライマー及びアンチセンスプライマーの長さ及びＴｍは、通常には、１５ｍｅｒ〜４０ｍｅｒで５０〜７２℃、好ましくは２５ｍｅｒ〜３２ｍｅｒで５５〜７０℃である。センスプライマー及びアンチセンスプライマーの長さは同一でなくてもよいが、センスプライマーとアンチセンスプライマーのＴｍはほぼ同一（通常には、相違が２℃以内）であることが好ましい。
【００２２】
追加センスプライマーは、センスプライマーの５’末端に第１の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結されたものであり、追加アンチセンスプライマーは、アンチセンスプライマーの５’末端に、第１の付加配列に相補的な第２の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結されたものである。付加配列とセンスまたはアンチセンスプライマーの配列との間には、本発明増幅方法の効果が得られる限り介在配列が存在してもよい。通常には１〜１０塩基の配列が存在してもよい。この介在配列の長さは追加センスプライマーと追加アンチセンスプライマーとの間で異なっていてもよい。
【００２３】
第１の付加配列は、通常には、１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒで４５〜６７℃、好ましくは１８ｍｅｒ〜２３ｍｅｒで５０〜６５℃である。付加配列２は付加配列１と相補的なので、長さ及びＴｍは付加配列１と同じである。付加配列のＴｍは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーのＴｍ（両者のＴｍが異なる場合に低い方のＴｍ）より低く、好ましくは５℃以上低い。付加配列の設計は、上記のようなＴｍを有するようにする他は、通常のプライマーの設計と同様に、分子内高次構造の形成の可能性のある配列を避けるなどの必要条件を考慮して行うことができる。
【００２４】
追加センスプライマーと追加アンチセンスプライマーとの比率は１：１（モル比）であることが好ましい。追加センスプライマーと追加アンチセンスプライマーとからなる追加プライマー対の量は、センスプライマーとアンチセンスプライマーとからなるプライマー対の量に対して、通常には０．１〜１倍（モル比）である。
【００２５】
ＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡを変性させ一本鎖ＤＮＡにし（変性工程）、プライマーを一本鎖ＤＮと対合させ（アニーリング工程）、ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーの３’末端側へ鎖を伸長させる（伸長工程）ことを繰り返すことにより行われる。
【００２６】
本発明増幅方法においては、アニーリングの温度は、ＰＣＲの初期においては前記付加配列がアニーリングしない温度とし、ＰＣＲの途中で前記付加配列がアニーリングする温度に変更する。
【００２７】
これらの工程は、一つの反応液を用いて、通常のＰＣＲ法と同様にサーマルサイクラーにより行うことができる。
【００２８】
代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
【００２９】
【表１】
2004267093.tif 000003
【００３０】
また、代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常２５〜３５回繰り返す。
【００３１】
（１）  変性、９４〜９８℃、１０〜３０秒
（２）  アニーリング、初期（通常には最初の５〜１５サイクル）：５０〜６５℃、１０〜３０秒、後期：６０〜９５℃、１０〜３０秒
（３）  伸長、７０〜７４℃、２０〜６０秒
【００３２】
以下、本発明増幅方法の原理を、図１〜３を参照して説明する。
標的配列に基づき、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとしてプライマー▲１▼及び▲２▼を設計する。また、設計されたプライマー▲１▼及び▲２▼に基づき追加センスプライマー及び追加アンチセンスプライマーとしてプライマー▲３▼及び▲４▼を設計する。プライマー▲１▼の５’端に付加配列１を付加したものがプライマー▲３▼、プライマー▲２▼の５’端に付加配列２を付加したものがプライマー▲４▼である。付加配列１と付加配列２とは相補的である。
【００３３】
ＰＣＲの初期においては、付加配列がアニーリングしない温度でアニーリングが行われるため、ＰＣＲ反応により標的部位（モノマー）が増幅される（図１中＜１＞）。追加モノマーは、付加配列を有するため標的部位をその一部として含む最初の鋳型ＤＮＡにはアニーリングしにくいが、モノマーが増えてくるに従い、追加プライマーもアニーリングするようになる（図１中＜２＞）。この間（及びアニーリング温度変更後）、プライマー▲１▼及び▲２▼によるモノマーの増幅も反応がプラトーに達するまで進む（図１中＜３＞）。
【００３４】
アニーリングの温度を付加配列がアニーリングする温度に変更すると、付加配列のアニーリングが生じる。末端の付加配列で一本鎖ＤＮＡがアニーリングして生じたハイブリッドは、各鎖がプライマー及びテンプレートとして機能して二本鎖ＤＮＡ（連結産物）生じる（図２中＜４＞）。また、追加プライマーは、連結産物の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズすることでき、これにより生じたハイブリッドも二本鎖ＤＮＡを生じる。このような様々な反応が起こり得るため、全体としての反応がプラトーに達しにくくなり、通常のＰＣＲを行うより目的配列が多量に増幅される（図３中＜５＞）。従って、目的配列に特異的なプローブを用いる検出方法を用いた場合には、そのプローブがハイブリダイズする部分が多量に増幅されるため、強いシグナルが得られる（図１中＜３＞及び図２中＜４＞）。
【００３５】
本発明は、本発明増幅方法に用いるためのキット（本発明増幅キット）も提供する。このキットは、上記の追加センスプライマー及び追加アンチセンスプライマーを含むことを特徴とする。
【００３６】
追加センスプライマーおよび追加アンチセンスプライマーについては、本発明増幅方法に関し、上記に説明した通りである。
【００３７】
本発明増幅キットは、追加センスプライマーおよび追加アンチセンスプライマーの他に、ＰＣＲを行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。
【００３８】
本発明増幅キットにおいて各プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【００３９】
＜２＞本発明検出方法およびそのためのキット
本発明検出方法は、本発明増幅方法により目的ＤＮＡを増幅し、増幅産物を検出することを含む。
【００４０】
本発明検出方法における増幅産物の検出は、通常の、増幅産物の検出方法に従って行うことができるが、増幅産物の一分子のおける目的配列の数は一定ではないので、目的配列に特異的な検出方法を用いることが好ましい。例えば、増幅産物に結合した際に、蛍光が変化するように蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、ハイブリダイズしたときに蛍光強度が変化するように設計されたハイブリダイゼーションプローブ等）の存在下でＰＣＲを行って蛍光を測定するリアルタイムＰＣＲにより検出を行ってもよい。
【００４１】
本発明増幅方法によれば、目的配列の増幅効率が上昇するので、目的配列の数に依存する検出方法を用いることが好ましい。このような検出方法としては、例えば、プローブを用いるリアルタイム検出が挙げられる。プローブを用いるリアルタイム検出では、検出の時間短縮やシグナルの増加が期待される。
【００４２】
本発明は、本発明検出方法に用いるためのキット（本発明検出キット）も提供する。このキットは、上記の追加センスプライマー及び追加アンチセンスプライマーを含むことを特徴とする。
【００４３】
追加センスプライマー及び追加アンチセンスプライマーについては、本発明増幅方法に関し、上記に説明した通りである。
【００４４】
本発明検出キットは、追加センスプライマーおよび追加アンチセンスプライマーの他に、ＰＣＲおよび／または増幅産物の検出を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。好ましくは、リアルタイム検出用のプローブを含む。
【００４５】
本発明検出キットにおいて各プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【００４６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００４７】
【実施例１】クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の潜在プラスミド（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ）  ｐＬＧＶ４４０の検出
既知のクラミジアの潜在プラスミドｐＬＧＶ４４０の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０６７０７）に基づいて下記の塩基配列を有するプライマー▲１▼〜▲４▼及びプローブを調製した。プライマー▲３▼及び▲４▼における付加配列１と付加配列２とは相補的である。プライマー▲１▼及び▲２▼のＴｍはそれぞれ６５℃及び６４．８℃であり、付加配列のＴｍは６０．６℃であった。ここで、Ｔｍは最近接塩基対法に従って算出した。プローブの５’末端のＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（モレキュラープローブ社）による修飾は通常の方法に従って行った。
【００４８】
【表２】
プライマー
▲１▼：ＡＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＴＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＴＣＡＧＣＡＧ（配列番号１）
（Ｘ０６７０７の塩基番号５１７１〜５２００に相当）
▲２▼：ＴＣＧＣＧＴＡＧＧＧＣＴＴＡＧＡＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣ（配列番号２）
（Ｘ０６７０７の塩基番号５２７６〜５２４６に相当）
▲３▼：ＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＴＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＴＣＡＧＣＡＧ（配列番号３）（付加配列１＋▲１▼）
▲４▼：ＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＴＣＧＣＧＴＡＧＧＧＣＴＴＡＧＡＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣ（配列番号４）（付加配列２＋▲２▼）
プローブ
（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）−ＣＡＡＡＧＣＴＡＧＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＴＴＣＴＴＧＡＴＧＣ−（リン酸化）（配列番号５）
（Ｘ０６７０７の塩基番号５２４５〜５２１０に相当）
【００４９】
ＡＴＣＣ株ＣＴ−ＶＲ８７８から通常の方法により分離精製を行って得たクラミジアのゲノムＤＮＡを鋳型として、下記の反応液組成及び反応条件でＤＮＡの増幅を行った。
【００５０】
【表３】
2004267093.tif 000004
【００５１】
【表４】
反応条件
９５℃，１ｍｉｎ
（９５℃，１５ｓｅｃ  ６７℃，１５ｓｅｃ    ７２℃，３０ｓｅｃ）×１０サイクル
（９５℃，１５ｓｅｃ  ６２℃，１５ｓｅｃ    ７２℃，３０ｓｅｃ）×４０サイクル
７２℃，３ｍｉｎ
【００５２】
６７℃，１５ｓｅｃと６２℃，１５ｓｅｃのステップで蛍光（励起：４９５ｎｍ、検出：５２５ｎｍ）を検出した。この条件では、増幅産物にプローブがハイブリダイズすると蛍光が消光するので、増幅産物の生成を蛍光強度の減少により検出できる。
【００５３】
また、プライマーとしてプライマー▲１▼及び▲２▼のみを用いる他は同条件で増幅を行った。
【００５４】
結果を図４に示す。点線は、プライマー▲１▼〜▲４▼を用いた場合（通常プライマー対＋追加プライマー対）、実線は、プライマー▲１▼及び▲２▼のみを用いた場合（通常プライマー対のみ）の結果をそれぞれを示す。この結果から、プライマー▲１▼及び▲２▼に加えてプライマー▲３▼及び▲４▼を用いることにより、増幅産物の生成が増加することが判明した。従って、潜在プラスミドｐＬＧＶ４４０の有無をより高感度で判別し得ることが明らかである。
【００５５】
【発明の効果】
本発明によれば、増幅効率が高く、かつ、プライマーの設計が容易なＤＮＡの増幅方法が提供される。
【００５６】
【配列表】
2004267093.tif 000005
2004267093.tif 000006
2004267093.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法の原理の説明図。
【図２】図１の続き。
【図３】図２の続き。
【図４】増幅産物の生成の経過を示す。点線：通常プライマー対＋追加プライマー対、実線：通常プライマー対のみ。
【図１】
2004267093.tif 000008
【図２】
2004267093.tif 000009
【図３】
2004267093.tif 000010
【図４】
2004267093.tif 000011