(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素活性の高いグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）を提供すること。【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。（Ａ）イネ由来ＧＡＤのアミノ酸配列からカルモジュリン結合ドメインを欠失させたアミノ酸配列からなるタンパク質。（Ｂ）上記ＧＡＤのイソ型のアミノ酸配列からカルモジュリン結合ドメインを欠失させたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からカルモジュリン結合ドメインを欠失させたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からカルモジュリン結合ドメインを欠失させたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からカルモジュリン結合ドメインを欠失させたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からカルモジュリン結合ドメインを欠失させたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質。
（Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【請求項４】
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【請求項５】
請求項２または請求項４に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現可能な形態で導入された微生物。
【請求項６】
請求項５に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にグルタミン酸脱炭酸酵素を生成蓄積させ、該培養物よりグルタミン酸脱炭酸酵素を採取することを特徴とするグルタミン酸脱炭酸酵素の製造方法。
【請求項７】
請求項２または請求項４に記載のＤＮＡを有するトランスジェニック植物。
【請求項８】
イネ科に属する植物である請求項７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現可能な形態で導入された微生物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にグルタミン酸脱炭酸酵素を生成蓄積させ、該培養物よりグルタミン酸脱炭酸酵素を採取することを特徴とするグルタミン酸脱炭酸酵素の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載のＤＮＡを有するトランスジェニック植物。
【請求項１４】
イネ科に属する植物である請求項１３に記載のトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタミン酸脱炭酸酵素、グルタミン酸脱酸素酵素をコードするＤＮＡ、グルタミン酸脱炭酸酵素が発現可能な形態で導入された微生物、グルタミン酸脱炭酸酵素の製造方法、および、トランスジェニック植物に関し、特に、酵素活性の高いグルタミン酸脱炭酸酵素、グルタミン酸脱酸素酵素をコードするＤＮＡ、グルタミン酸脱炭酸酵素が発現可能な形態で導入された微生物、グルタミン酸脱炭酸酵素の製造方法、および、γ−アミノ酪酸を豊富に含むトランスジェニック植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
非タンパク質性のアミノ酸の一種であるγ−アミノ酪酸（Ｇａｍｍａ  Ａｍｉｎｏ  Ｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ：ＧＡＢＡ）は、血圧降下作用、肥満防止作用、精神安定作用、アルコール代謝促進作用といった人体に対するさまざまな有用な作用を発揮する物質として知られている。ＧＡＢＡは、グルタミン酸を脱炭酸することにより得られる。このとき、グルタミン酸脱炭酸酵素（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ＧＡＤ）を用いることにより脱炭酸反応を効率よく行わせることが可能となる。
【０００３】
また、ＧＡＢＡはイネの細胞内にも含まれており、イネ細胞内のＧＡＤには少なくとも２種類のアイソフォームが知られている。米の中では他の部分と比較して胚芽の部分にＧＡＢＡが多く含まれており、胚芽米や玄米や発芽米を食することにより、白米を食する以上に健康の保持増進が期待できる。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｋａｚｕｈｉｔｏ  Ａｋａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｔｈａｔ  ｌａｃｋｓ  ａｎ  ａｕｔｈｅｎｔｉｃ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１５２２（２００１）  ｐ１４３−ｐ１５０
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の技術では以下の問題点があった。ＧＡＢＡは、微量の摂取では、人体への作用が少なく、ＧＡＢＡ本来の作用を見込むためにはある程度の摂取量が必要であることがわかっている。したがって、ＧＡＢＡを効率よく製造することが必要であり、酵素活性の高いＧＡＤが望まれている。また、同様に、ＧＡＢＡを多く含むイネが望まれている。
【０００６】
本発明は上記に鑑みてなされたものであって、酵素活性の高いＧＡＤ、当該ＧＡＤをコードするＤＮＡ、当該ＧＡＤが発現可能な形態で導入された微生物、および、当該ＧＡＤの製造方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、ＧＡＢＡを多量に含む植物を創出することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討を行った結果、イネのＧＡＤを変異させることにより本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
１．：
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からカルモジュリン結合ドメインを欠失させたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からカルモジュリン結合ドメインを欠失させたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【０００９】
２．：
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からカルモジュリン結合ドメインを欠失させたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からカルモジュリン結合ドメインを欠失させたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【００１０】
３．：
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質。
（Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【００１１】
４．：
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【００１２】
５．：
上記２．または４．に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現可能な形態で導入された微生物。
【００１３】
６．：
上記５．に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にグルタミン酸脱炭酸酵素を生成蓄積させ、該培養物よりグルタミン酸脱炭酸酵素を採取することを特徴とするグルタミン酸脱炭酸酵素の製造方法。
【００１４】
７．：
上記２．または上記４．に記載のＤＮＡを有するトランスジェニック植物。
【００１５】
８．：
イネ科に属する植物である上記７．に記載のトランスジェニック植物。
【００１６】
９．：
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【００１７】
１０．：
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【００１８】
１１．：
上記１０．に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現可能な形態で導入された微生物。
【００１９】
１２．：
上記１１．に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にグルタミン酸脱炭酸酵素を生成蓄積させ、該培養物よりグルタミン酸脱炭酸酵素を採取することを特徴とするグルタミン酸脱炭酸酵素の製造方法。
【００２０】
１３．：
上記１０．に記載のＤＮＡを有するトランスジェニック植物。
【００２１】
１４．：
イネ科に属する植物である上記１３．に記載のトランスジェニック植物。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明はここに記載した形態のみに限定されるものではなく、本明細書の記載および当分野で公知の技術に基づいて当業者が容易に修飾および改変し得る技術については本発明の範囲内に含まれるものである。本実施の形態では、まず、イネの２種類のＧＡＤを示し、その後、本発明を説明する。
【００２３】
イネは単子葉植物であり、少なくとも２種類のＧＡＤを有することが知られている。ここでは、そのうち、双子葉植物ＧＡＤのＣ末端側に普遍的に見出されているカルモジュリン結合ドメイン（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ：ＣａＭＢＤ）と相同性の高い部位を備えるＧＡＤをＯｓＧＡＤ１と称し、当該ドメインが無いともいえる相同性の低い部位を備えるＧＡＤをＯｓＧＡＤ２と称することとする。配列表２は、ＯｓＧＡＤ１のアミノ酸配列を示したものである。配列表５は、ＯｓＧＡＤ２のアミノ酸配列を示したものである。
【００２４】
（実験概要）
本発明者は、鋭意検討の結果、ＯｓＧＡＤ１およびＯｓＧＡＤ２に基づいて、酵素活性の高い新規なグルタミン酸脱炭酸酵素を創出するに至った。まず、ＯｓＧＡＤ１とＯｓＧＡＤ２に基づくｃＤＮＡであって、Ｃ末端側の約４０〜５０アミノ酸残基をコードする領域を制限酵素により切断し、この部分を欠失させたｃＤＮＡを作製した（このｃＤＮＡを便宜的にそれぞれＯｓＧＡＤ１ΔＣおよびＯｓＧＡＤ２ΔＣと適宜称することとする）。なお、制限酵素は、ＯｓＧＡＤ１に対してはＢｇｌＩＩを、ＯｓＧＡＤ２に対してはＡｐａＩを用いた。
【００２５】
次に、ＯｓＧＡＤ１、ＯｓＧＡＤ１ΔＣ、ＯｓＧＡＤ２、ＯｓＧＡＤ２ΔＣそれぞれのｃＤＮＡをプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３０２（ＣＡＭＢＩＡ社製（オーストラリア））のＴ−ＤＮＡ上のカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータの下流に組み込み、アグロバクテリウム株に導入した。これらの菌株をイネカルスに感染・共存培養することで、ゲノムＤＮＡ中にＴ−ＤＮＡを組み込んだ。組換えカルスは抗生物質ハイグロマイシンを含む培地で選抜し、作製した。
【００２６】
得られた４種類の遺伝子組換えカルスからアミノ酸を抽出し、ＧＡＢＡ含量を調べて野生型（ｗｔ）と比較して評価した。なお、ＲＴ−ＰＣＲを行ないＧＡＤの発現も確かめた。このとき、アクチンｍＲＮＡを内在性のコントロールとして用いた。
【００２７】
また、作製したカルスが実際に形質転換体であるか、すなわち、トランスジェニック植物であるかどうかを確認した。その方法としては、カルスから全ＤＮＡを抽出して、ハイグロマイシン耐性遺伝子領域を挟み込むプライマーを用いてＧＡＤの部分をＰＣＲにより増幅して確認した。
【００２８】
以降に実験例を説明する。
（形質転換カルスの作製）
イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の２種類のＧＡＤｃＤＮＡ（ＯｓＧＡＤ１およびＯｓＧＡＤ２）と、２種類の変異ｃＤＮＡ（ＯｓＧＡＤ１ΔＣおよびＯｓＧＡＤ２ΔＣ（ＯｓＧＡＤ１とＯｓＧＡＤ２のそれぞれのＣ末端側約４０〜５０アミノ酸残基をコードする領域を除いたもの））とを作製し、アグロバクテリウムを介した遺伝子導入法によってイネ細胞に導入し、形質転換カルスを作製した。
【００２９】
（形質転換カルスの作製：カルスの誘導および前培養）
イネの成熟した種子を次に示した培地に２８℃、３０００ｌｕｘの状態で２週間静置した。
・種子を静置させた培地の組成
Ｎ６  基本塩混合物
ショ糖                        ３．９８ｇ／ｌ
カザミノ酸                    ３．００％
プロリン                      ０．２８％
２，４−Ｄ                    ２ｍｇ／ｌ
ゲルライト                    ０．４％
【００３０】
カルスの誘導を行った完熟種子の胚乳と芽の部分を除去し、増殖のよいカルスの部分を新しいＮ６Ｄ固形培地に置床した。これを、２８℃で連続照射下において３週間培養した。
【００３１】
（形質転換カルスの作製：アグロバクテリウムの前培養、懸濁および感染）
アグロバクテリウムをＡＢ固形培地に塗布し菌体を広げた。これを、２８℃で暗所において２〜３日培養した。培地上で増殖した菌体を採取し、これをアセトシリンゴン１０ｍｇ／ｌの濃度で加えたＡＡ培地３０ｍｌによく懸濁させた。つぎに、前培養したカルスをステンレスメッシュのかごに入れ、アグロバクテリウムの懸濁液にかごごと１．５分〜２分間浸した。その後、かごを引き上げ余分な菌液を除去し、感染させたカルスをＮ６Ｄ（上記濃度のアセトシリンゴンを含む）固形培地に置床した。この状態で２８℃で暗所において２〜３日培養した。
【００３２】
（形質転換カルスの作製：アグロバクテリウムの除去および選抜）
共存培養でカルス表面を菌体が覆ったのを確認し、ステンレスメッシュかごに感染カルスを投入し、かごごとＮ６Ｄ液体培地に浸してアグロバクテリウムを洗い流した。その後、かごを引き上げ、余分な水分を除去した。続いて、Ｎ６Ｄ液体培地にクラフォランを５００ｍｇ／ｌになるように加え、この培地でさらに数回カルスを洗浄した。余分な水分を除去した後、カルスをＮ６Ｄ固形培地（クラフォラン２５０〜５００ｍｇ／ｌを含む）に置床した。これを、２８℃で連続照射下において３週間〜４週間培養した。
【００３３】
（形質転換カルスの評価：ＣＴＡＢ法によるＤＮＡの抽出）
次に、形質転換カルスと非形質転換カルスからＣＴＡＢ法により全ＤＮＡを抽出した。図１は、カルスからＤＮＡを抽出する手順を示した図である。抽出後、アガロース電気泳動を行った。ゲルは１％ゲル（０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む）を用いた。マーカーはλＤＮＡをＳｔｙＩで切断したものを用いた。
【００３４】
（形質転換カルスの評価：形質転換の確認）
抽出したＤＮＡを用いて、ＰＣＲにより形質転換されているかどうか確認した。
プライマーはＨＰＴ−Ｅ（センスプライマー）とＨＰＴ−Ｎ（アンチセンスプライマー）を用いた。このプライマーの配列をそれぞれ配列番号７および配列番号８に示した。図２は、ＰＣＲの条件を示した図である。ＰＣＲの結果、野生型ＤＮＡを除き、すべての形質転換カルスで、約１ｋｂの予想される増幅産物が観察された。図３は、組換えＤＮＡのＰＣＲ解析を示した図である。
【００３５】
（形質転換カルスの評価：ＲＮＡの抽出）
次に、形質転換カルスにおける導入遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現量を調べるために、改変グアニジウム法により、全ＲＮＡを単離した。抽出手順を図４に示した。なお、次に説明するＲＴ−ＰＣＲの際にゲノムＤＮＡの増幅を防ぐため、ＲＮＡの抽出後にＤＮａｓｅＩ処理をおこなった。ＤＮａｓｅＩ処理の手順を図５に示した。
【００３６】
（形質転換カルスの評価：ｍＲＮＡの蓄積量の測定）
次に、ＯｓＧＡＤ１とＯｓＧＡＤ２に特異的なプライマーを用いて逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてＯｓＧＡＤ１で２０サイクル、ＯｓＧＡＤ１Δで２５サイクル、ＯｓＧＡＤ２で３３サイクル、ＯｓＧＡＤ２Δで３０サイクルとしてＰＣＲを行った。この際に、アクチンｍＲＮＡを内在性のコントロールとして用いた。ＯｓＧＡＤ１に特異的なセンスプライマーを配列番号９に示し、アンチセンスプライマーを配列番号１０に示した。また、ＯｓＧＡＤ２に特異的なセンスプライマーを配列番号１１に示し、アンチセンスプライマーを配列番号１２に示した。また、ＧＡＤ部分のＲＴ−ＰＣＲの処理手順を図６に示した。アクチンのセンスプライマーを配列番号１３に示し、アンチセンスプライマーを配列番号１４に示した。
【００３７】
（形質転換カルスの評価：導入遺伝子の発現評価）
処理後の溶液を１．５％のアガロースゲル電気泳動に掛けて、分画後に泳動パターンを画像として取り込み、ＧＡＤの発現量を調べた。結果を図７に示す。野生型と比較したｍＲＮＡの蓄積量を推定すると、ＯｓＧＡＤ１では〜３倍、ＯｓＧＡＤ１ΔＣでは〜２２倍であった。一方、ＯｓＧＡＤ２とＯｓＧＡＤ２ΔＣでは野生型の発現が低すぎて数値化出来なかったが、相対的に著しく増大していることが確認できた。
【００３８】
（形質転換カルスの評価：アミノ酸含有量の定量）
また、形質転換カルスからＴＣＡ法により遊離アミノ酸を単離し、ＧＡＢＡを含めて各種アミノ酸含量を定量した。定量には自動アミノ酸分析装置を用いた。なお、アミノ酸の抽出手順を図８に示した。また、図９は、組換えカルスにおけるＧＡＢＡ含有量を示した図である。このうち図９（ａ）は、カルスごとに示した図であり、図９（ｂ）は、平均による比較を表した図である。分析の結果、ＯｓＧＡＤ２ΔＣは野生型に比べて、ＧＡＢＡ含量が１００倍近く増大した系統が見つかった。また、ＯｓＧＡＤ１ΔＣは野生型に比べて２０倍近く増大した系統が見つかった。
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、酵素活性の高いＧＡＤ、当該ＧＡＤをコードするＤＮＡ、当該ＧＡＤが発現可能な形態で導入された微生物、および、当該ＧＡＤの製造方法を提供することができた。また、ＧＡＢＡを多量に含む植物を創出することができた。
【００３９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】カルスからＤＮＡを抽出する手順を示した図である。
【図２】ＰＣＲの条件を示した図である。
【図３】組換えＤＮＡのＰＣＲ解析を示した図である。
【図４】ＲＮＡの抽出手順を示した図である。
【図５】ＤＮａｓｅＩ処理の手順を示した図である。
【図６】ＧＡＤ部分のＲＴ−ＰＣＲの処理手順を示した図である。
【図７】ＧＡＤの発現量を示した図である。
【図８】アミノ酸の抽出手順を示した図である。
【図９】組換えカルスにおけるＧＡＢＡ含有量を示した図である。
【符号の説明】
【図１】
2004290069.tif 000034
【図２】
2004290069.tif 000035
【図３】
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【図４】
2004290069.tif 000037
【図５】
2004290069.tif 000038
【図６】
2004290069.tif 000039
【図７】
2004290069.tif 000040
【図８】
2004290069.tif 000041
【図９】
2004290069.tif 000042