(57)【要約】【課題】緑藻類に外来遺伝子を導入する場合の課題を解決する。【解決手段】抗酸化剤アスタキサンチンを生合成することで工業的にも有用性の高い緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）に外来遺伝子を導入・発現させる場合に有効な方法である。遺伝子を導入できた細胞を多くの細胞の中から選び出す方法として、高感度検出が可能なレポータータンパク質（緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ）を発現する遺伝子、Ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ　系抗生物質Ｚｅｏｃｉｎ　耐性遺伝子、抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）に導入し、安定に発現維持させる。【選択図】　　　図１
2004033070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁の有る状態の緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）にエレクトロポレーション法にて外来遺伝子を導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、緑藻ヘマトコッカスへの外来遺伝子導入方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微細藻類は光合成で増殖し、有用な成分として必須不飽和脂肪酸（ＤＨＡ、ＥＰＡ）、アスタキサンチン等を生合成する事から、工業的利用が期待されている。工業化するためには、培養方法の最適化による生産性を改善ばかりでなく遺伝子操作による改良も期待されている。
【０００３】
一方現状では、微細藻類の真核生物である緑藻類に外来の遺伝子を導入（形質転換）して発現させる事に成功しているとの報告はクラミドモナス、ドナリエラ、クロレラ、クロロコッカムに限られていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
緑藻類に外来遺伝子を導入する場合２つの課題が有った、▲１▼頑丈な細胞壁を細胞膜の外側に持っていることから、遺伝子を導入が困難。▲２▼一旦外来遺伝子断片を細胞内に導入できたとしても、染色体遺伝子に組み込まれず経代培養を繰り返すうちに（分裂、増殖をするうちに）外来遺伝子が脱落または不活性化してしまう。
【０００５】
本発明は、抗酸化剤アスタキサンチンを生合成することで工業的にも有用性の高い緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）に外来遺伝子を導入・発現させる場合に有効な方法を発見した。遺伝子を導入できた細胞を多くの細胞の中から選び出す方法として、高感度検出が可能なレポータータンパク質（緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ）を発現する遺伝子、Ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ　系抗生物質Ｚｅｏｃｉｎ　耐性遺伝子、抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）に導入し、安定に発現維持させる方法である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
第１の発明は、細胞壁の有る状態の緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）にエレクトロポレーション法にて外来遺伝子を導入する方法である。
【０００７】
第２の発明は、細胞壁を取り除いたプロトプラスト状態の緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）にエレクトロポレーション法にて外来遺伝子を導入する方法である。
【０００８】
第３の発明は、細胞壁の有る状態の緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）にデンドリマーを用いたトランスフェクション法にて外来遺伝子を安定的に導入する方法である。
【０００９】
第４の発明は、細胞壁を取り除いたプロトプラスト状態の緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）にデンドリマーを用いたトランスフェクション法にて外来遺伝子を導入する方法である。
【００１０】
第５の発明は、第１ないし第４の発明のいずれかの発明において、酢酸を炭素源とした混合栄養培地で増殖させた緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）を遺伝子導入先とした遺伝子導入方法である。
【００１１】
第６の発明は、第１ないし第４の発明のいずれかの発明において、遺伝子導入後、酢酸を炭素源とした混合栄養培地で増殖させる事を特徴とする遺伝子導入方法である。
【００１２】
第７の発明は、第１ないし第４の発明のいずれかの発明において、栄養増殖期にある緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞を遺伝子導入先とした遺伝子導入方法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００１４】
本発明は、抗酸化剤アスタキサンチンを生合成することで工業的にも有用性の高い緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）に外来遺伝子を導入・発現させる場合に有効な方法である。遺伝子を導入できた細胞を多くの細胞の中から選び出す方法として、高感度検出が可能なレポータータンパク質（緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ）を発現する遺伝子、Ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ　系抗生物質Ｚｅｏｃｉｎ　耐性遺伝子、抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）に導入し、安定に発現維持させる。
【００１５】
［応用］
▲１▼　緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）は酢酸を炭素源とした、従属栄養培養、混合栄養培養で培養できる事は報告されているが、本発明を応用して、グルコースを炭素源と出来るタンパク質発現遺伝子ＧＬＵＴ１、ＨＵＰ１を導入する事でグルコースでも従属、混合栄養培養が可能になり、大量培養が可能となる。
【００１６】
▲２▼　効性物資耐性を遺伝子導入する事で、緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）の培養にとって有害なバクテリア、ウイルス、カビ、原生動物の駆除が可能となる。
【００１７】
▲３▼　β−カロチンの２次代謝経路を部分的に失活させて、アスタキサンチン（Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）に至るまでの中間生成物を生合成させることが可能となる。例えばゼアキサンチン（Ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ）、カンタキサンチンＣａｎｔａｘａｎｔｈｉｎ）等が有る。
【００１８】
［実施例］
広島大学論文を参照
［ヘマトコッカスの種について］
実施例は、緑藻ヘマトコッカスプルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）ＮＩＥＳ−１４４株による実験結果であるが、同じヘマトコッカスプルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）の近縁種で有るＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｕｓｔｒｉｓでも可能である。
【００１９】
［関連特許等］
１．米国パテント　ＵＳ−Ａ１−６０２７９００
１．１カロテノイドとは・・・
カロテノイドは自然界に最も広く分布する色素群の一つである。その基本的な性質として、４００〜６００　ｎｍに極大吸光を有し、黄色、橙色、あるいは赤色を呈する。また空気、光、熱、酸、金属イオンなどに非常に不安定で、異性化、重合、あるいは分解などを起こしやすいことが知られている。カロテノイドは、メバロン酸を出発物質とするテルペン系物質生合成系により生合成される。その基本構造は炭素数５個のイソプレン分子が８個連なったテトラテルペン（炭素数４０個）であり、概して左右対称に近い構造をしている。カロテノイドは、炭化水素であるカロテン類と、それらの酸素誘導体であるキサントフィル類の２種に大別することが出来る。キサントフィル類において酸素原子は、水酸基、カルボキシル基、メトキシ基、あるいはエポキシ基として、主鎖である炭化水素鎖に結合している。キサントフィル類の水酸基は遊離型、高級脂肪酸（炭素数１８あるいは２０個）とのエステル、糖類と結合した配糖体、あるいは硫酸エステルといった様々なかたちで存在している。また、生体内で蛋白質と複合体を形成し、「カロテノプロテイン」となって存在しているものもある。天然に存在するカロテノイドのポリエン部位は主としてトランス型であるが、近年シス型のものの存在も確認されている。現在までのカロテノイドの立体構造に関する研究の結果、１０００種を超えるカロテノイドが知られるに至っている。
【００２０】
カロテノイドは黄色から赤色までの様々な色調を呈することで、植物の果実や花の色、あるいは魚類、甲穀類、鳥類などの体色に寄与し、保護色あるいは婚姻色としての作用を果たしている。さらにカロテノイドは、多くの生物において、その生命維持に関しても重要な役割を担っている。例えば高等植物においては、光合成器官での光受容反応における補助色素としての役割を担っているほか、光酸化反応に対する細胞組織の保護も行っている。また動物細胞においては、カロテノイドの一種であるβ−カロテンが、ビタミンＡ前駆体としてのプロビタミン活性を有することが知られている。さらに微生物でもカロテノイドを有するものがあり、これらは光酸化反応からの細胞の保護、あるいは生体膜の構造強化、といった役割を担っているのではないかと考えられている。植物や微生物は、自ら必要なカロテノイドを合成する能力を有している。一方において、動物はカロテノイド合成能を欠くものの、食料として摂取した植物、微生物、あるいは他の動物に含まれるカロテノイドを生体内に蓄積し、必要に応じてそれらを代謝変換することにより、その需要を満たしている。以上述べた様に、多くの生物の生体組織においてカロテノイドは欠くことの出来ない構成要素となっており、また人間を含む殆どの動物において、必須の栄養素となっているのである。
【００２１】
さらにこれまで、多くの研究者によって、β−カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、あるいはアスタキサンチンといったある種のカロテノイドが、紅斑や皮膚癌の予防、抗癌作用の促進効果、あるいはフリーラジカルや一重項酸素といった活性酸素の消去作用等といった、ビタミンＥ（α−トコフェロール）に類似する機能を有することが確認されている。このため近年、食料品などに対する抗酸化剤として、あるいは活性酸素に起因する各種の疾患に対する医薬品としてのカロテノイドの利用が注目を浴びている。また、近年、健康の促進を売り物とするいわゆる「機能性食品」が、その市場を急速に増幅させている事実を鑑みるとき、カロテノイドの食品添加物としての需要も、今後大いに期待できるであろう。
【００２２】
１．２ケトカロテノイド・アスタキサンチンの機能と用途
アスタキサンチン（３，３’−ジヒドロキシ−β，β’−カロテン−４，４’−ジオン）は赤色を呈するキサントフィルの一種であり、１９３３年にＫｕｈｎらによってザリガニより発見された。このカロテノイド色素は、サケ、マス、マダイ、錦鯉、あるいは金魚などの魚類、カニ、エビなどの甲殻類、さらにはフラミンゴなどの鳥類などというように、動物、特に水産生物に広く分布しており、その肉色や体色の発現に深く関与していることが知られている。これらの動物はアスタキサンチン生合成能を欠く。このためこれらの動物は、アスタキサンチンを含む植物、微生物あるいは他の動物を餌として摂取することにより、その需要を満たしている。
【００２３】
文明の進化と共に人口も増加し、特に１９世紀始めの産業革命以降、その増加は急激となっている。このため食料消費も増加しており、今後さらに増加すると考えられる。太古より、魚類及び甲殻類は重要な蛋白源として、人間によって補食されてきた。このため蛋白質の安定的な供給源として、サケ、マス、カニ、エビなどといった魚類及び甲穀類の養殖は、北欧、南米、極東などにおいて古くから行われており、今後益々盛んになると考えられている。さらに近年、特に一定以上の生活水準を得るに至っている先進諸国において、食生活の質的な向上を求める動きが顕著となっている。この動きに関連して、マダイ、伊勢エビ、あるいは車エビといった従来高級品とされてきた魚類及び甲穀類に対する需要が、１９８０年以降急速に増加しており、またスモークサーモンといった高価な加工品に対する需要も急速に伸びている。先にも述べた通り、アスタキサンチンは多くの魚類及び甲穀類に分布し、また多くの場合その主要色素となっている。そしてこれらの生物が自らアスタキサンチンを生合成する能力を欠いていることもまた、前述した通りである。このため、サケ、マス、カニ、エビなどの養殖に際しては、養殖産物に鮮やかな色彩を与え、またその品質を保持するため、アスタキサンチンを飼料に添加することが必須となっている。さらに、スモークサーモンの有する薫製独特の薫りの形成においてアスタキサンチンが重要な役割を担っているという例に見られる様に、これらの養殖魚類及び甲穀類から生産される加工品の品質に対しても、アスタキサンチンの存在の有無、あるいはその多寡は重要な要素となる。以上述べた事実により、魚類及び甲穀類の養殖において、色揚げ剤としてアスタキサンチンは重要であり、その需要は莫大で、また今後益々増加すると言えよう。
【００２４】
一方において、近年、アスタキサンチンがβ−カロテンやビタミンＥよりもはるかに強力な抗酸化作用を有する事実を認めた研究が数多く報告されている。以下、これらの報告に関して、順を追って略述する。まず、リノール酸メチルのフリーラジカル連鎖反応に対する、β−カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンの抑制効果が検討され、β−カロテンよりもむしろアスタキサンチンの様なケトカロテノイド類の方が、より強い抑制効果を示すことが認められている。また、ラットを用いた脂質過酸化反応に対するアスタキサンチンの阻害効果が検討され、アスタキサンチンがビタミンＥの約１０００倍にのぼる強い活性を有することを示されている。また、マダイの養殖において、活性酸素に起因すると考えられる卵及び稚魚の発育障害に対し、微量のアスタキサンチンを親魚の飼料に添加する事で、アスタキサンチン無添加区は勿論、β−カロテンあるいはビタミンＥ添加区と比較しても遥かに優れた改善効果が得られたと報告されている。さらに、マウスＭｅｔｈ　Ａ腫瘍細胞を用いた実験により、ビタミンＡと同様、アスタキサンチンによっても抗腫瘍免疫賦活化効果が発現する事実が報告されている。近年特に先進諸国において、いわゆる健康食品の市場が急速に増大していることは、前述の通りである。加えて、近年、腫瘍性疾患が病気による死因に占める割合が急速に増大しており、これらの疾患に対する治療技術の改善が急務となっている。以上述べてきた事実を合わせ考える時、食品添加物として、あるいは医薬品として、アスタキサンチンは非常に魅力に富んでおり、将来この方面での新規の需要も期待できるであろう。
【００２５】
１．３天然アスタキサンチン源としてのＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓ
１９６７年にＷｅｅｄｏｎらによってアスタキサンチンの化学合成法が考案され、１９８３年にロシュ社によってその工業的な生産法が確立されるに至っている。このため現在、アスタキサンチンは主として化学合成法によって工業的に生産されている。しかし、食品あるいは飼料に対する添加物としての化学合成品の使用は年々規制される方向にあり、また市場においても天然物を指向する向きにある。以上の背景により、今後、天然の、そして安定したアスタキサンチン源の確保が必要となろう。
【００２６】
現在、アスタキサンチン生産能を有する数種の微生物の存在が報告されている。
【００２７】
中でも不完全酵母に類するＰｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａと単細胞緑藻であるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、細胞内に有するところのカロテノイド色素の殆ど（９０％以上）がアスタキサンチンであるため、工業規模におけるアスタキサンチン生産に対し、最も有望な微生物であるとされている。
【００２８】
Ｐ．　ｒｈｏｄｏｚｙｍａのアスタキサンチン生成に関しては多くの報告があり、生成したアスタキサンチンは（３Ｒ，３’Ｒ）型の遊離型で（Ａｎｄｒｅｗｅｓ＆Ｓｔａｒｒ　１９７６）、その含量は０．４ｍｇ／ｇ　ｃｅｌｌと低く（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｌｅｗｉｓ　１９７９）、また細胞壁が非常に硬く抽出が困難なことなどが知られている（Ｏｋａｇｂｕｅ＆Ｌｅｗｉｓ　１９８５）。
【００２９】
一方、緑藻のＨ．　ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、通常、増殖期の細胞は緑色であるが、増殖末期あるいは窒素欠乏等の生育環境の悪化に伴い、細胞内に著量のアスタキサンチンを蓄積することが知られている。また、生成したアスタキサンチンは魚類などと同じ（３Ｓ，３’Ｓ）型のエステル型であり（Ｒｅｎｓｔｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ．　１９８１）、その大部分は遊離型よりも色揚げ効果が高く、安定なモノエステル型として存在している。
【００３０】
また、図１及び２にβ−カロテン合成経路、図３にアスタキサンチン生合成経路を示した。
【００３１】
１．４本研究の目的
本研究室において、Ｈ．　ｐｌｕｖｉａｌｉｓのアスタキサンチン生成に関する研究から以下のことが分かっている。通常一ヵ月程度かかる栄養細胞からシスト細胞への形態変化は、高濃度の酢酸を途中添加することによって、炭素／窒素比を上げて相対的な窒素源の欠乏をもたらせば、１−２日でシスト化が誘導できること、さらに、酢酸で誘導したシスト細胞に高濃度のＦｅ２＋を与えると、アスタキサンチン生成が著しく促進され、この効果がＨ２Ｏ２やスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）、一重項酸素（１Ｏ２）等の活性酸素によって代替できること、および活性酸素に対する捕捉剤や消去剤によって促進効果が消去するかとから、Ｆｅ２＋はＦｅｎｔｏｎ反応（Ｆｅ２＋＋Ｈ２Ｏ２→ＯＨ−＋ＨＯ・＋Ｆｅ３＋）によって、最も反応性の高いヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）を生成することによってアスタキサンチン生成を活性化していることを明らかにした。従って、シスト細胞におけるアスタキサンチン生成促進は酸化的ストレスに対する適応応答の一つであろうと考えられる。
【００３２】
本緑藻の増殖とアスタキサンチン生産を促進するには、他の多くの藻類と同様、光が必須となる。一方で本緑藻の増殖速度は細菌類と比較して極めて低く、またその至適ｐＨは中性付近であるため雑菌の汚染を受けやすく、従来藻類の培養で報告されている開放培養は適用できない。
【００３３】
そこで本研究では、本緑藻における高濃度アスタキサンチン生産と培養が安易な菌株の取得を行うために、外来遺伝子導入法の確立を目的とした。本研究では電気穿孔法及びリポソーム法を用いたＨ．　ｐｌｕｖｉａｌｉｓの形質転換の可能性についての検討を行った。電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）とは、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ・デキストラン法などと並び、遺伝子を導入する有力な手段である。
【００３４】
電子穿孔法は、細胞の浮遊液にＤＮＡを加え、数千Ｖ／ｃｍの高電圧を数十マイクロ秒のパルスで与えて細胞にＤＮＡを導入するもので、高電圧パルスにより細胞膜に短時間、細孔が生じ、それが修復される前に外液とともにＤＮＡが取り込まれるという原理です。他の遺伝子導入法と比べて再現性が良い点、動物細胞のほか、高等植物、酵母、細菌などのプロトプラスト、リンパ球等の浮遊細胞にも適用できる点などが優れています。この方法は、リン酸カルシウム共沈法では導入効率が悪い初代培養細胞、胚性肝細胞などにも有効である。また、電子穿孔法の有効性の確認のためデンドリマーという高分子を用いたリポソーム法による形質転換も行った。この方法は、特別な装置を必要とせず、容易に形質転換が行える。今回用いたＱＩＡＧＥＮのＳｕｐｅｒ　ｆｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔという試薬は、わずか５〜１０分でトランスフェクション複合体形成し、　広範囲の細胞タイプに適応し、　斬新な分子デザインでトランジェントあるいはステーブルトランスフェクションにも高い効率を示し、　活性型デンドリマーの均一なサイズと形状により非常に高い再現性　を得る事のできる試薬である。原理は、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ　Ｒｅａｇｅｎｔが、一定の形状の活性型デンドリマー分子から形成し、これらの分子は中心から枝分かれし、末端にはプラスに電荷したアミノ基を有しており、核酸のリン酸基（マイナスに荷電）と相互作用し結合する。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ　ＲｅａｇｅｎｔはＤＮＡを細胞に導入しやすいようにＤＮＡをコンパクトな形に凝縮する。細胞にいったん入ると、エンドソームと融合後、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ　の緩衝作用によりｐＨを変化させ、リソソームのヌクレアーゼ活性を阻害する。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ−ＤＮＡ複合体の安定性がこのメカニズムにより確実になり、インタクトなＤＮＡが効率良く核に導入される。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔは登録商標である。
【００３５】
これらの２通りの方法を用いてＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける形質転換を行い、ＧｅｎｏｔｙｐｅとＰｈｅｎｏｔｙｐｅの解析及び諸条件の検討を行って、本緑藻における遺伝子導入法の開発を目指した。
【００３６】
図４に電気穿孔法の原理を、図５にデンドリマーによるリポソーム法の原理を示した。
【００３７】
２．実験方法
２．１使用菌株
国立公害研究所微生物系統保存施設（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅ　Ｆｏｒ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｓｔｕｄｉｅｓ）より分譲されたＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓ　Ｆｌｏｔｏｗ（ＮＩＥＳ−１４４）を用いた。
【００３８】
２．２使用培地
Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓの増殖用培地として、表１に示す組成の基本培地（Ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）を用いた。
【００３９】
【表１】
2004033070.tif 000003
【００４０】
２．３培養方法
２．３．１前培養
２００ｍｌ三角フラスコに培地９０ｍｌを入れシリコン栓をしてオートクレーブ（１２０℃、１８ｍｉｎ）で殺菌した。その後、同様の培地で２０℃、１７．１μＥｍ−２ｓ−１（１５００ｌｕｘ）、１２時間間欠照射で４日間静置培養したものを１０％（ｖ／ｖ）接種し、同条件で４日間静置培養を行った。
【００４１】
２．３．２本培養
・通常培養
殺菌済培地９０ｍｌに前培養した培養液を１０％（ｖ／ｖ）接種し、２０℃で４日間、１２時間の間欠照射下で静置培養を行った。この培養液をそれぞれの方法で、形質転換に用いた。
【００４２】
・同調培養
青色のフィルムを巻いたビーカーを培養液の入ったフラスコに被せる事により、照射する光を弱め、増殖をある程度抑えることにより、細胞増殖を同調化した。殺菌済培地５０ｍｌに前培養液５０ｍｌを加え、２０℃で４日間、１２時間の間欠照射下で静置培養を行った。同様の操作を２〜３回繰り返すことにより細胞増殖を同調化した。
【００４３】
２．４プロトプラスト処理
Ｓｏｌｂｉｔｏｌ／Ｍａｎｎｉｔｏｌ（０．２Ｍ　１：１）を前ｓｏｌｕｔｉｏｎへ添加した。まず、ダークサイクルから細胞を遠心分離（１０℃、３６０ｇ、１０ｍｉｎ）で回収した。次に、Ｂ培地で遠心洗浄しＢ培地に２．４×１０６　ｃｅｌｌ／ｍｌになるようにして懸濁し、０．０６％のプロテアーゼＫ（シグマ）を添加する。往復式シェーカーで９０ストローク／ｍｉｎで３５℃、０．５から１Ｈインキュベートした。
【００４４】
以上の操作を行ったサンプルを０．１ｍｌずつそれぞれ１．９ｍｌ　ＴｒｉｔｏｎＸ１００と１．９ｍｌ　Ｓｏｌｂｉｔｏｌ／Ｍａｎｎｉｔｏｌ（０．２Ｍ　１：１）に加えてゆっくりと撹拌し、それぞれの細胞数Ｘ１とＸ２を測定する。また、プロトプラスト処理によりモル濃度浸透圧に対して感受性になった細胞の割合を示す式を以下に示す。
【００４５】
【数１】
2004033070.tif 000004
【００４６】
２．５電気穿孔における形質転換条件の検討
電気穿孔法により、細胞内へ物質が導入されることの確認及びその最適条件を決定するために、蛍光物質であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｄｅｘｔｒａｎ（ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ，７０ｋＤａ）を用いて電気穿孔を行った。電気穿孔条件の決定後、遺伝子導入を形質転換の可能性について検討を行った。
【００４７】
２．５．１　ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎを用いた形質転換条件の検討
ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの細胞内への導入に及ぼす印加電圧およびパルス回数の影響を検討するために、電気穿孔時の細胞濃度を１×１０６Ｃｅｌｌ／ｍｌ、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ濃度を１ｍＭとし、印加電圧およびパルス回数を変化させて電気穿孔を行い、フローサイトメーターで蛍光を測定し、条件の検討を行った。
【００４８】
２．５．２電気穿孔による生存率測定
電気穿孔における印加電圧およびパルス回数による生存率の変化に関する条件検討を行った。
【００４９】
まず、４日間培養後の試料を遠心分離により集菌し５０μＭ　ＭＯＰＳ＋５％Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）に懸濁した。４００μｌキュベット（２ｍｍ　ｇａｐ）に試料３６０μｌとＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ４０μｌを加え、色々な印加電圧とパルス回数において条件の検討を行った。
【００５０】
２．５．３　ｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）とｓｍＲＳ−ＧＦＰ（ＴＡＩＲ社製）の電気穿孔による導入
Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓにプラスミドｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰとｓｍＲＳ−ＧＦＰを導入し、フローサイトメトリーにより発現した蛍光タンパクＧｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｃｅｓｅｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）の検出を行った。また、ｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰにおいては、その後、プレート及び液体培地でハイグロマイシンをｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｍａｒｋａｒとしてスクリーニングを行い、その後の解析に用いた。
【００５１】
２．５．４液体培地におけるハイグロマイシン濃度の検討
液体培地におけるＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のタンパク合成阻害系抗生物質ハイグロマシンに対する感受性をテストするために、さまざまな濃度のハイグロマイシンを培地に加え、ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅのＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓを培養して条件を検討した。
【００５２】
２．５．５プレートにおけるハイグロマイシン濃度の検討
プレートにおけるＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のタンパク合成阻害系抗生物質ハイグロマシンに対する感受性をテストするために、さまざまな濃度のハイグロマイシンをプレートに加え、ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅのＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓを培養して条件を検討した。
【００５３】
２．６高分子デンドリマー（ＳｕｐｒｅＦｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ，ＱＩＡＧＥＮ製）を用いたリポソーム法による形質転換
高分子デンドリマーを用いた、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓの形質転換を以下の方法で行った。
【００５４】
（１）　ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ及び滅菌水に溶解したプラスミドＤＮＡの５μｇ（０．１μｇ／μｌ）を滅菌済培地で希釈し、最終容量１５０μｌにし、ミックスした後、数秒間スピンダウンして溶液を収集する。
【００５５】
（２）　ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ２０μｌをプラスミドＤＮＡ溶液に添加する。１０秒間ボルテックスした後、スピンダウンして溶液を収集する。
【００５６】
（３）　ＤＮＡ複合体形成のために室温（１５〜２５℃）で５〜１０分間インキュベートする。
【００５７】
（４）　細胞培養液１ｍｌをトランスフェクション複合体を含むチューブに添加する。ピペットで２回アップダウンを行いミックスする。
【００５８】
（５）　複合体が均一に行き渡るように静かに撹拌する。
【００５９】
（６）　２〜３時間インキュベートする。
【００６０】
（７）　２回遠心洗浄し、滅菌済培地に細胞を懸濁する。
【００６１】
２．７プラスミド調整
Ｅｎｄｏｆｒｅｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｅｇａ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）とＷｉｚａｒｄ　ｐｌｕｓ　ＳＶ　ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて大腸菌からプラスミドを回収した。
【００６２】
２．７．１　Ｗｉｚａｒｄ　ｐｌｕｓ　ＳＶ　ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によるプラスミド調整
（１）　ＬＢ培地から大腸菌を遠心分離により回収した。
【００６３】
（２）　大腸菌をＬｙｓｉｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎに懸濁し、５分間インキュベートした。
【００６４】
（３）　１４０００×ｇで１０分間室温で遠心分離することにより細胞断片の除去を行った。
【００６５】
（４）　上清をＳｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ＋Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅに入れた。
【００６６】
（５）　１４０００×ｇで１分間室温で遠心分離を行い、コレクションチューブから液体を捨てた。
【００６７】
（６）　２回Ｃｏｌｕｍｎ　ｗａｓｈ　ＳｏｌｕｔｉｏｎでＳｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎに付着したＤＮＡを洗浄した。
【００６８】
（７）　Ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎを無菌のマイクロチューブに移し、１００μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒを加え、１４０００×ｇで１分間室温で遠心してプラスミドを回収した。
【００６９】
２．７．２　Ｅｎｄｏｆｒｅｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｅｇａ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によるプラスミド調整
以下に簡単な方法を示す。
【００７０】
（１）　ＬＢ培地から大腸菌を遠心分離により回収した。
【００７１】
（２）　菌体ペレットを５０ｍｌのＲｎａｓｅ入りＢｕｆｆｅｒＰ１に懸濁した。
【００７２】
（３）　５０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＰ２を添加して静かに混合し、５分間室温でインキュベートした。
【００７３】
（４）　５０ｍｌの冷却したＢｕｆｆｅｒＰ３を添加し、静かに混合した。
【００７４】
（５）　ＱＩＡｆｉｌｔｅｒカートリッジの中に
（６）　ライゲートを注ぎ、浮遊層を形成させるために室温で１０分間インキュベートした。
【００７５】
（７）　バキュームのスイッチを入れ、液を通過させた。
【００７６】
（８）　５０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＦＷＢをカートリッジに添加し、滅菌したスパチュラで沈殿をステアして再び液を通過させた。
【００７７】
（９）　１２．５ｍｌのＢｕｆｆｅｒＥＲをろ過したライセートに添加し、混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。
【００７８】
（１０）　３５ｍｌのＢｕｆｆｅｒＱＢＴをＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ２５００に加え、カラムが空になるまで自然流出し、平衡化した。
【００７９】
（１１）　先ほどのライセートを平衡化したＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐに添加し、自然落下によりカラムに浸透させた。
【００８０】
（１２）　２×１００ｍｌのＢｕｆｆｅｒＱＣでＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐを洗浄した。
【００８１】
（１３）　３５ｍｌのＢｕｆｆｅｒＱＮでＤＮＡを溶出した。
【００８２】
（１４）　溶出液に０．７倍容量（２４．５ｍｌ）の室温イソプロパノールを添加してＤＮＡを沈殿した後、４℃、１５０００×ｇ以上で３０分遠心した。
【００８３】
（１５）　上清を丁寧にデカンテーションした。
【００８４】
（１６）　ＤＮＡペレットに室温のエンドトキシンフリー７０％エタノールを７ｍｌ添加し、１５０００×ｇ以上で１０分間遠心しペレットを洗う。
【００８５】
（１７）　再び上清をデカンテーションし、１０〜２０分間、ペレットを乾燥させ、エンドトキシンフリーＴＥバッファーに溶かした。
【００８６】
２．８　ＰＣＲ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ製）というキットを用いて、ＰＣＲを行った。
【００８７】
２．８．１　ＰＣＲプライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ
−ＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＴＡＧＧＡＧＧ−　　　　２２ｍｅｒ　　　　Ｔｍ　６６
Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ
−ＧＣＣＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＣＧＴＴＧＴＧＧＣ−　　　　２２ｍｅｒ　　　　Ｔｍ　６６
以上の２つのプライマーをもちいてｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰ（約５Ｋｂ）のＰＣＲを行った場合、約１ＫｂがＰＣＲ産物として生成される。
【００８８】
２．８．２　ＰＣＲ条件
前処理　　　　９４℃　　　　　　　５ｍｉｎ
熱変性　　　　９４℃　　　　　　　３０ｓ
アニーリング　５７〜６３℃　　　　　３０ｓ　　　←基本的には　６１℃で行った。
【００８９】
伸長反応　　　６８℃　　　　　　　１ｍｉｎ
後処理　　　　６８℃　　　　　　　５ｍｉｎ
【００９０】
３．分析方法
３．１　細胞増殖及び藻体量の測定
微細藻類の生長の過程は、細胞数の増加、細胞体積の増加の増加などで追跡することができる。本実験では、計数法により藻体の増殖を調べた。
【００９１】
３．１．１　細胞数の測定
培養液を懸濁後、トーマの血球計算板（Ｔｈｏｍａ　ｈａｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用い、１５０倍で検鏡し、細胞数を計測した。一つの試料について５回測定を行い、平均値を求めた。
【００９２】
３．２　色素（クロロフィル、カロテノイド）の抽出及び定量
緑藻はクロロフィルａとクロロフィルｂを含有している。なお、クロロフィルａはすべての分類群の藻類に含まれる。本実験では、ＳＣＯＲ−Ｕｎｅｓｃｏ（１９６６）の式を使う吸光光度法によりクロロフィル、カロテノイドを定量した（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ＆Ｐａｒｓｏｎｓ　１９６８）。操作手順を以下に示す。
【００９３】
▲１▼増殖状態に応じて適当に希釈した培養液１ｍｌを、グラスファイバーフィルター（ＧＳ２５，ＡＤＶＡＮＴＥＣ，ＴＯＹＯ）で吸引濾過する。
【００９４】
▲２▼乳鉢を用い、１ｍｌの水を加えフィルターを磨砕する。フィルターがよく磨砕され液状になったら、アセトン４ｍｌを加え試験管に移す。さらに乳鉢を５ｍｌのアセトンで洗浄後、洗浄液を試験管に加え１０ｍｌとする。（最終アセトン濃度：９０％）
▲３▼試験管はブチルゴムで栓をし、ときどき撹拌しながら冷暗所で１時間抽出した後、遠心分離（３５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）し、透明な上清を得る。
【００９５】
▲４▼上清の吸光度（７５０，６６３，６４５，６３０，４８０ｎｍ）を分光光度計を用いて測定する。光路１ｃｍのセルを用いたとき、６６３、６４５、６３０ｎｍにおける吸光度の読みから７５０ｎｍの読みを差し引いた値をそれぞれＥ６６３、Ｅ６４５、Ｅ６３０とすれば次式により９０％アセトン抽出液１．０ｍｌあたりのクロロフィル量（μｇ）が計算される。
【００９６】
クロロフィルａ（μｇ／ｍｌ）＝１１．６４Ｅ６６３−２．１６Ｅ６４５＋０．１Ｅ６３０
クロロフィルｂ（μｇ／ｍｌ）＝−３．９４Ｅ６６３＋２０．９７Ｅ６４５−３．６６Ｅ６３０
カロテノイドに関しては、４８０ｎｍにおける吸光度の読みから７５０ｎｍの読みの３倍を差し引いた値をＥ４８０とすれば、９０％アセトン抽出液１ｍｌ中の含量は次式によって求めることができる。
【００９７】
カロテノイド（μｇ／ｍｌ）＝４．０Ｅ４８０
上式で求めた各値に抽出液量（１０ｍｌ）を掛け、濾過した試水の量（１ｍｌ）で割り、希釈率を掛ければ培養液中のクロロフィル量、カロテノイド量（ｍｇ／ｌ）が得られる。なお本実験では、緑藻において一番多く存在するクロロフィルａをクロロフィルとして示すことにする。
【００９８】
３．３蛍光分光光度計による蛍光の測定
まず、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎについては、蛍光を測定するためにｅｘｃｉｔａｔｉｏｎおよびｅｍｉｓｓｉｏｎ決定する必要性があったことから、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎをＤ．　ｂａｒｄａｗｉｌの増殖用培地に適当な濃度になるように懸濁し、蛍光分光光度計でｅｘｃｉｔａｔｉｏｎを固定してｅｍｉｓｓｉｏｎのスキャンを行い、そのデータから特異的だと思われる波長にｅｍｉｓｓｉｏｎを固定してｅｘｃｉｔａｔｉｏｎのスキャンを行った。さらにこのデータから特異的であると思われる波長にｅｘｃｉｔａｔｉｏｎを固定しｅｍｉｓｓｉｏｎのスキャンを行った。この操作を数回繰り返しｅｘｃｉｔａｔｉｏｎを５００ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎを５５５ｎｍと決定した。
【００９９】
ＧＦＰについては、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４００−４５０ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５００−５４０ｎｍの範囲で測定を行った。
【０１００】
３．４蛍光顕微鏡による細胞の観察
ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎおよびＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｄｉａｃｅｔａｔｅ　、ＧＦＰの顕微鏡による蛍光の観察は、Ｖ励起法　（励起フィルタ：ＩＦ３９５〜４２５、接眼側吸収フィルタ：ＢＡ５１０／４０）　およびＢ２励起法　（励起フィルタ：　ＩＦ４６０〜４８５、接眼側吸収フィルタ：５２０Ｗ）
により行った。
【０１０１】
３．５サザンハイブリダイゼイション
ハイブリダイゼーションは、Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＬＩＦＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ社のＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＫＩＴを用いて行った。その方法を以下に示す。
【０１０２】
３．５．１　ＤＮＡのラベリング
ｐ３５Ｓ−ＧＦＰ　（１・ｇ）を制限酵素処理により切断した。フェノール・クロロホルム処理し、エタノール沈殿を行った。沸騰水中で１０分間加熱し、氷／ＮａＣｌ上で急冷して、ＤＮＡを一本鎖に変性した。そこに２・ｌのヘキサヌクレオチド混合液、２・ｌ　ｄＮＴＰ標識混合液、１・ｌ　Ｋｌｅｎｏｗ　酵素を加え、フラッシュ後、１時間から２０時間　（オーバーナイト）、３７℃でインキュベートした。２・ｌの０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８．０）を加えてラベリング反応を停止させた。エタノール沈殿処理後、５０・ｌのＴＥ　ｂｕｆｆｅｒに溶解した。
【０１０３】
３．５．２　ＤＮＡの抽出
ＤＮＡの抽出には、Ｆａｓｔ　ＤＮＡ　ｓｐｉｎ−ｋｉｔ　を用いた。試料培養液を３５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して藻体を集菌した。そこにＳｏｄｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加し、塩濃度をあげて細胞を破壊した。次にたんぱく質を沈殿させ、遠心により沈殿物をペレット化した。上清を回収し、バインディングシリカマトリックスにＤＮＡを吸着させ、これにＴＥ　ｂｕｆｆｅｒを添加してＤＮＡを遠心分離、回収した。抽出したＤＮＡは、ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒに溶解し、４℃で保存した。
【０１０４】
３．５．３　アガロースゲル電気泳動
抽出したＤＮＡおよびｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰを制限酵素　（ｂｇｌ　ＩＩ）　で３７℃、６０分間切断し、　０．８〜１．０％のアガロースゲル　（ＬＯ３　「ＴＡＫＡＲＡ」）　にて電気泳動を行った。
【０１０５】
３．５．４　ブロッティング
電気泳動の終わったアガロースゲルをメンブレントランスファーを行う前に、ｇｅｎｅｔｉｃ　ＤＮＡのシングルコピーの検出を行った。その方法は、まず０．２５Ｎ塩酸中に浸し室温で１５分ゆっくり浸透し、滅菌蒸留水で２回洗った。アガロースゲルを０．５Ｎ　ＮａＯＨに浸し、室温で３０分間ゆっくり振とうした。ゲル中のＤＮＡをバキュームブロット法　（５ｉｎ．　Ｈｇ．）　でメンブレンにトランスファーした。その後、湿った状態のメンブレンをＵＶでクロスリンクした。
【０１０６】
３．５．５　ハイブリダイゼーション
ＡｌｋＰｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ａｍｅｒｓｈａ　ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製Ｋｉｔ）に０．５Ｍ　ＮａＣｌと４％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを加え、室温でゆっくりとインキュベートし、ハイブリバッファーを調整した。メンブレンに対し、０．２５ｍｌ／ｃｍ２で先のオリジナルバッファーを添加し、予め暖めておいて、メンブレンとともにプラスチックシールドパックに入れシールし、ゆっくり浸透しながら（６０ストローク／分）５５℃で１５分間インキュベートし、プレハイブリダイゼーションを行った。ラベリングされたプローブを暖めておいたハイブリダイゼーション液に（５〜１０μｇ／ｍｌ）添加し、よく混合した。そのまま、５５℃でオーバーナイトインキュベーションを行った。その後、あらかじめ暖めておいたＰｒｉｍａｒｙ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒをメンブレン当り２〜５ｍｌ／ｃｍ２添加し、５５℃で１０分間、２回ゆっくりと振とう洗浄を行った。次に、Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒで５分間、室温で２回ゆっくりと振とう洗浄を行った。
【０１０７】
３．５．６　化学発光による検出
Ｄｉｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔを３０〜４０μｌ／ｃｍ２添加して２〜５分間静置し、ＤＮＡをトランスファーした面を上にしてＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂａｇに入れて、フィルムカセットに入れた。Ｘ−ＲＡＹ　ｆｉｌｍ（オートラジオグラフィー・フィルム）を当てて、暗室、室温で１時間静置して検出を行った。
【０１０８】
2004033070.tif 000005
【０１０９】
３．６フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｎ（ＢＥＣＴＯＮＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）
フローサイトメターを用いて、形質転換体における蛍光タンパクＧＦＰの発現及び、細胞の大きさの検討を行った。フローサイトメターは、細胞の大きさをＦＳＣ、５１５から５２５ｎｍの蛍光波長をＦＬ１として検出できる。図８，図９にフローサイトメターの原理を示す。
【０１１０】
３．７ウエスタンブロット
Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおけるタンパク発現を確認するためのウエスタンブロットは、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＡｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔとＡＰ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｋｉｔを用いて行った。方法を以下に示す。
【０１１１】
３．７．１タンパク質調整
試料を遠心し、クロロフィルを除去するために適当量の−２０℃アセトンに懸濁する。それをＦｉｌｔｅｒ　ｐａｐｅｒ（ｓｉｚｅ　４７ｍｍ，Ｔｏｙｏ　Ｒｏｓｈｉ　社製）で吸引濾過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを加え、超音波処理を行った。これを−２０℃で保存した。
【０１１２】
３．７．２　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
タンパクを変性させるためにサンプルを１００℃で１０分間ボイルし、その後２００Ｖ、４０分間ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０１１３】
３．７．３　メンブレントランスファー
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルとメンブレンとをサンドウィッチし、ミニ−トランスブロット−セル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて３５０ｍＡ，１００Ｖ，１ｈという条件で、冷やしながらメンブレントランスファーを行った。
【０１１４】
３．７．４　イミュノブロット
１．メンブレンに２０ｍｌのブロッキングソリューションを加え１時間室温でインキュベートした。
２．ＴＴＢＳを用いて５〜１０分間洗浄を行った。（同じ作業を２回繰り返す）
３．第一抗体ソリューションを添加し、オーバーナイトインキュベーション。
４．ＴＴＢＳを用いて５〜１０分間洗浄を行った。（同じ作業を２回繰り返す）
５．第二抗体を添加し、１〜２時間撹拌しながらインキュベーション。
６．ＴＴＢＳを用いて５〜１０分間洗浄を行った。（同じ作業を２回繰り返す）
７．ストレプトアヴィジン−ビオチン標識アルカリフォスファターゼ・コンプレックスを添加し、１〜２時間撹拌しながらインキュベーション。
８．ＴＴＢＳを用いて５〜１０分間洗浄を行った。（同じ作業を２回繰り返す）
【０１１５】
３．７．５　発色
ニトロセルロースメンブレンを発色ソリューションに液浸し、発色させる。その後、超純水に１０分間、丁寧に浸して浸透することにより発色を止める。少なくとも、もう一度同じ作業を行う。
【０１１６】
３．７．６　試薬
ストックソリューション
Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ，×１０（×１０　ＴＢＳ）（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ，５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ　７．５）
Ｃｌｏｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｂｕｆｆｅｒｍ，×２５　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ
ワーキングシソリューション（ｂａｓｅｄ　ｏｎ　２０　ａｓｓａｙｓ　ｏｆ　５ｍｌ　ｅａｃｈ）
Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ　７．５）：１００ｍｌの×１０　ＴＢＳを９００ｍｌの超純水に添加（１×　ＴＢＳ）
洗浄バッファー（ＴＴＢＳ）（ｐＨ　７．５）
：４５０μｌのＴｗｅｅｎ−２０を×１ＴＢＳ９００ｍｌに添加
ブロッキングソリューション（５％　ｎｏｎ−ｆａｔ　ｄｒｙ　ｍｉｌｋ　ｉｎ　ＴＢＳ）
：５．０ｇの脱脂粉乳を１００ｍｌのＴＢＳに添加し、溶けるまで撹拌
第一抗体ソリューション
：第一抗体を適当な力価のＴＴＢＳ　１００ｍｌに希釈
（ＴＴＢＳ　２．５ｍｌに「リビングカラー」を２μｌ添加
第二抗体ソリューション
：１０ｍｌのＴＴＢＳにビオチン標識された「羊−抗ウサギ抗体」を３．３μｌ添加
ストレプトアヴィジン−ビオチン標識アルカリフォスファターゼ・コンプレックス
：１０ｍｌのＴＴＢＳに３．３μｌのストレプトアヴィジンとビオチン標識アルカリフォスファターゼを添加し、１〜３時間インキュベートした
ＡＰ発色バッファ
：ＡＰ発色バッファは、×２５でストックし、超純水で希釈した
【０１１７】
３．８　使用機器
人工気象器
日本医科機器製作所製、　ＬＨ−２００−ＲＤ
日本医科機器製作所製、　ＬＨ−３００−ＲＤＳ
分光光度計
島津製作所製、　ＵＶ−１６００
蛍光分光光度計
日本分光社製、　ＦＰ−７７０
蛍光顕微鏡
Ｎｉｋｏｎ製、　生物顕微鏡ＯＰＴＩＰＨＯＴ
Ｎｉｋｏｎ製、　落射蛍光装置ＥＦＤ
遠心分離器
久保田商事製、　ＫＲ−２００００Ｔ
久保田商事製、　１７１０
久保田商事製、　１７２０
電気穿孔装置
ＢＴＸ社製、　　　　　　ＥＣＭ６３０
電気泳動ゲル撮影機
ＴＯＹＯＢＯ社製　　　　　　ＦＡＳ−ＩＩＩ
ＰＣＲ用Ｐｒｏｇｒａｍ　ｔｅｍｐ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｙｓｔｅｍ
ＡＳＴＥＣ社製　　　　　　ＰＣ８０８
ハイブリオーブン
ＫＵＲＡＢＯ社製　　　　　　ＤＮＡ　Ｏｖｅｎ　Ｍｌ−１００
クリーンベンチ
ＨＩＴＡＣＨＩ社製　　　　　ＣＣＶ　ｃｌｅａｎ　Ｂｅｎｃｈ
ＮＫ　ｓｙｓｔｅｍ社製
Ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ　Ｓｈａｋｅｒ
ＴＡＩＴＥＣ社製　　　　　ＭＭ−１０
電気泳動機
ＴＯＹＯＢＯ社製　　　　　ＧｅｌＭａｔｅ
バキュームブロッター
【０１１８】
４．実験結果および考察
４．１　Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の増殖とアスタキサンチン生成について
Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、強照射、栄養源の減少、塩ストレスなどの環境ストレスに対応してシスト細胞を形成する。また、本菌の最適増殖温度は２０℃であり、３０℃の場合においてもシスト細胞を形成し、細胞数の増殖がほとんど見られない。（図１０）しかし、アスタキサンチン生成に関しては、栄養細胞状態ではなく、ストレスに対応したシスト細胞状態で多量に蓄積さる。従って、２０℃の培養条件よりも、３０℃の方が多量にアスタキサンチンを生産した（図１１）。
【０１１９】
４．２蛍光物質を用いた電気穿孔
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｄｅｘｔｒａｎ（ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ，７０ｋＤａ、濃度０．１ｍＭ）は、細胞内に取り込まれた場合、微量でもフローサイトメトリーによりその蛍光が検出できることから、モデル物質として使用し、電気穿孔により物質が細胞内に導入されることの確認とその条件について検討を行った。
【０１２０】
４．２．１印加電圧に関する細胞の生存率
印加電圧を変化させた時の細胞の生存率について検討を行った。尚、印加時間は、５０μｓｅｃとし、印加電圧は、０から２００Ｖ／２ｍｍ　ｇａｐまで５０Ｖ／２ｍｍ　ｇａｐ刻みで変え、細胞の生存率の変化を調べた。（図１２）印加電圧に依存して、細胞の生存率が減少していくことが確認できた。また、１００Ｖ以上の電圧では、細胞がくっつきあって、凝集していることが確認できた。
【０１２１】
４．２．２通常細胞における印加電圧に関するモデル物質ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの細胞内への導入効率
細胞濃度を２×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとし、０．１ｍＭのＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎを含む溶液中で印加電圧を変化させて電気穿孔を行い、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入について比較した。測定は、フローサイトメトーターを用いてトータルセル２×１０４について行った。（図１３）そして、ゲート内の細胞の割合を図１４に示した。印加電圧に依存してＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入効率は良くなったが、７５Ｖ／２ｍｍ　ｇａｐ以上では細胞が凝集してしまうため、細胞の生存率も考慮して、以降の実験では通常細胞を用いる場合、印加電圧を５０Ｖ／２ｍｍ　ｇａｐと設定して実験を行った。
【０１２２】
４．２．３プロトプラスト細胞における印加電圧に関するモデル物質ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの細胞内への導入効率
Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞には、細胞壁の外側に厚い外膜が存在し、それがＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ　の導入の妨げになっていると考え、外膜及び細胞壁を取り去った浸透圧感受性のプロトプラスト細胞において、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ　の導入を行った。（図１５）この場合、電圧を加えることにより細胞が破裂してしまうため、有効なＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ　の導入効率が得られなかった。そのため、以降の実験では、通常栄養細胞において条件の検討を行った。
【０１２３】
４．２．４パルス回数に関する細胞の生存率
印加電圧と同様に、導入効率に大きく影響するといわれるパルス回数に関する検討を行った。まず、パルス回数に依存した細胞の生存率の検討を行った。（図１６）その結果、パルス回数を増やすと、細胞の生存率が低下していくことが確認できた。これは、パルス回数を増やすことにより細胞が破壊される為だと考えられる。
【０１２４】
４．２．５通常細胞におけるパルス回数に関するＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入効率
印加電圧を５０Ｖ／２ｍｍ　ｇａｐと設定し、パルス回数に依存したＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入効率の検討を行った。（図１７）パルス回数１回の場合よりも２回の場合の方が導入効率がよく、また３回以上だと細胞が破壊されてしまう為に導入効率が低下した。そのため以降の実験では、通常細胞を用い、印加電圧５０Ｖ／２ｍｍ　ｇａｐ、パルス回数２回、印加時間５０μｓｅｃと設定し、遺伝子の導入実験を行った。
【０１２５】
４．２．６ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ導入細胞の顕微鏡確認
ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入された細胞のフローサイトメーターによる確認だけではなく、蛍光顕微鏡を用いた確認も行った。（図１８）５３０ｎｍ付近の蛍光波長で観察を行ったところ、きちんと細胞内にＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎが導入されていることが確認できた。ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎが導入された細胞では黄緑色の発色を呈し、ＵＶを照射した場合では、クロロフィルが赤色に発色した。
【０１２６】
４．３　形質転換方法に関する発現効率
２種類のプラスミド及び、２種類の外遺伝子導入法をもちいることによる、外来遺伝子の発現効率の検討を行った。そして、これらの方法により、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおいて外来遺伝子が発現するかの確認を行った。
【０１２７】
４．３．１通常細胞における電気穿孔法を用いた形質転換
電気穿孔法による２種類のプラスミドｐＳｍＲＳ−ＧＦＰ（図７）とｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰ（図６）の導入を行った。どちらのプラスミドもＧＦＰ（緑色蛍光たんぱく質）をレポーター遺伝子として含んでいる。両方のプラスミドともｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ（ＣａＭＶ）の３５Ｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｒをコードしており、このｐｒｏｍｏｔｅｒは、類縁緑藻Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉで電気穿孔による外来遺伝子の導入で使用され、発現が確認されている。ＧＦＰはアメリカ沿岸に生息するオワンクラゲがもつ、全２３８アミノ酸残基からなる分子量２６９００のタンパク質で、その遺伝子はすでにクローニングされている。そして、ＧＦＰは紫外線を当てると緑色の蛍光を発するが、その際に特別な基質やＡＴＰなどのエネルギー源を必要としない。さらに、このタンパク質の遺伝子を導入・発現させると、様々な生物中で発光することが出来る。今回用いたＧＦＰは、異種生物においても発現しやすく、また蛍光強度を高める操作がなされている。これらのプラスミドを用いて、電気穿孔によるこれまでに決定した条件でのＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓの形質転換を行った。プラスミド導入後、フローサイトメーターによって、処理した細胞の蛍光を測定した。（図１９）コントロールと比較して、どちらのプラスミドを用いた場合でも蛍光を発する細胞の数が増加し、ＧＦＰが発現していることが確認できた。そして、プラスミド１μｇ当りの効率で考えた場合、約２０００ＧＦＰ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌが得られ、これは類縁緑藻Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおいて初めて外来遺伝子発現が報告された時と同等の効率でした。
【０１２８】
４．３．２通常細胞におけるデンドリマーを用いた形質転換
電気穿孔法の場合と同様に２種類のプラスミドｐＳｍＲＳ−ＧＦＰ（図７）とｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰ（図６）を用いて、デンドリマーによるＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓの形質転換を行った。（図２０）デンドリマ−を用いた場合においても電気穿孔法の場合と同様に、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞におけるＧＦＰの発現が確認できた。また、その効率については、電気穿孔法の場合とほぼ同じ程度だった。
【０１２９】
４．３．３プロトプラスト細胞におけるデンドリマーを用いた形質転換
Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞には厚い外膜が存在し、これが遺伝子導入の妨げになるのではないかと考え、外膜および細胞壁を取り去った浸透圧感受性のプロトプラスト細胞に関して、デンドリマーを用いて外来遺伝子の導入を行った。（図２１）プロトプラストにおいて外来遺伝子を導入した時は、通常細胞において外来遺伝子を導入した時とほぼ変わらない効率であったので、今後、デンドリマーを用いて形質転換を行う場合は、方法を簡略化するために、通常細胞において形質転換を行うことにした。
【０１３０】
【表２】
2004033070.tif 000006
【０１３１】
４．４　スクリーニング条件
ｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰを導入した形質転換体におけるスクリーニング条件を検討した。また、スクリーニングによって得られた細胞は、後の遺伝的解析に用いた。
【０１３２】
４．４．１プレート条件
スクリーニングを行うために、プレート条件の検討を行った。（表３）培養温度を２５℃、３０℃と設定し、ゲルをフィタジェルとアガロースを用い、培地を通常のＢ培地とＢ培地を５倍希釈したＢ／５培地を使用した８種類の条件について検討を行った。その結果、表３に示したように、培養温度２５℃で、Ｂ／５培地を用いた条件でコロニー生成が確認された。そこで、プレート条件を一番培養に適した、培養温度２０℃、培地をＢ／５培地を用い、ゲルに関してはアガロースよりも透明度が高く、光を透し易いフィタジェルを用いることに決定した。
【０１３３】
４．４．２プレートにおける選択圧
プレートにおける選択圧の検討をおこなった。その結果、ハイグロマイシンを５μｇ／ｍｌでプレートに添加した場合が最適条件であることが確認できた。（Ｄａｔａ　Ｎｏｔ　Ｓｈｏｗｎ）この濃度で、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅは生えず、ハイグロマイシン耐性株が得られた。
【０１３４】
４．４．３　液体培地における選択圧
液体培地における選択圧の検討を行った。その結果、ハイグロマイシンを５〜１０μｇ／ｍｌで液体培地に添加した場合が最適条件であることが確認できた。（Ｄａｔａ　Ｎｏｔ　Ｓｈｏｗｎ）この濃度で、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅは生えず、ハイグロマイシン耐性株が得られた。しかし、ハイグロマイシン入りの液体培地でＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓを培養した場合、シスト化してしまい、あまり増殖しなかった。これは選択圧をかける事により、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞がストレスを感じ、ストレス対応でシスト化したためであると思われる。また、３０℃でコロニーが形成されなかったのは、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞がシスト化し、増殖しない状態だったためだと推測される。
【０１３５】
【表３】
2004033070.tif 000007
【０１３６】
４．５　形質転換体における遺伝子的解析
形質転換体における遺伝子的解析を行うために、ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔによる解析を行った。プラスミドｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰを、デンドリマーと電気穿孔という２種類の方法で導入した細胞を様々な方法で培養し、ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔに用いた。形質転換後の培養方法を以下に示した。
【０１３７】
１．形質転換後１日培養後のサンプル
２．プレートにおけるスクーリニング後のコロニーを選択圧なしの液体培地で培養したサンプル
３．プレートにおけるスクーリニング後のコロニーを選択圧をかけた液体培地で培養したサンプル
【０１３８】
以上のサンプルを用いてｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔを行ったが、バンドは検出できなかった。これは、ＤＮＡ濃度が低かったためであると推測される。そのために、ＰＣＲを用いたｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔを行うことにした。
【０１３９】
４．５．１　ＰＣＲ−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いた遺伝子的解析
形質転換体より得られるＤＮＡ濃度が低いため、回収したゲノムをＰＣＲ増幅し（図２２，図２３）、レポーター遺伝子を増幅させた後で、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−ｂｌｏｔによる解析を行った（図２４，図２５）。用いたサンプルを以下に示す。
【０１４０】
１．形質転換後１日培養後のサンプル
２．形質転換後１日培養後の細胞をフローサイトメーターによりＧＦＰ発現したものをソーティングにより分離したサンプル（Ｔｏｔａｌ　ｃｅｌｌ　２×１０４）
３．プレートにおけるスクリーニング後のコロニーを選択圧をかけた液体培地で培養したサンプル
４．プレートにおけるスクリーニング後のコロニーを集めたサンプル
【０１４１】
これらのサンプルについてＰＣＲ−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔを行った結果、形質転換を行った後、時間が経つと導入した遺伝子が抜け落ちてしまうことが確認された。これは、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞はジプロイドであるために２本鎖の遺伝子のどちらか一方で組換えが起きたとしても、もう一方のＷｉｌｄ−ｔｙｐｅの遺伝子の方が優勢であるために、細胞分裂を繰り返すと組換え遺伝子が除去されてしまうものと推測される。また、ＰＣＲについては、目的の断片の割合が低い場合には、上手くＰＣＲ増幅が行われなかった。これは、他の遺伝子が邪魔をするためにプライマーが鋳型にくっ付きにくくなり、ＰＣＲの増幅効率が低下しているためであると推測される。しかし、以上の結果から、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞中にｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰが取り込まれていることが確認でき、それは時間が経つと抜け落ちてしまう事が明らかとなった。
【０１４２】
４．６発現タンパクの確認（ウエスタンブロット）
プラスミドｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰを導入したＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞において発現すると予想されるＧＦＰについて、ウエスタンブロットによる確認を行った。
【０１４３】
５．総括
単細胞緑藻Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、アスタキサンチンを生成する微生物であり、細胞内に有するところのカロテノイド色素の殆ど（９０％以上）がアスタキサンチンであるため、工業規模におけるアスタキサンチン生産に対し、最も有望な微生物であるとされている。しかし、至適ｐＨが中性付近であり、増殖速度が遅く、栄養源が豊富な条件でしか培養できないため、雑菌による汚染を受け易く工業的に大量生産することが難しい。また、アスタキサンチン生成には、強い光が必要であり多大なコストを要する。また、近年、アメリカ合衆国のハワイ島において、太陽光を利用したＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓのアスタキサンチン生成が行われるようになったが、生産性が低く、今後予想される需要拡大に伴い、供給が滞ることが予想される。そこで本研究では、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓの細胞増殖とアスタキサンチン生産性の向上を目的として、遺伝子導入条件と形質転換の可能性についての検討を行った。
【０１４４】
５．１　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｄｅｘｔｒａｎ（ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ，７０ｋＤａ）を用いた電気穿孔条件の検討
Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓに外来遺伝子を導入するための電気穿孔条件の検討を行った。その結果、細胞の生存率及び、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入効率を考慮し、最適条件を印加電圧５０Ｖ／２ｍｍ　ｇａｐ、パルス回数２回、印加時間５０μｓｅｃと決定した。また、この条件での電気穿孔後の細胞に関する増殖の検討を行ったが、問題なく増殖することが確認できた。
【０１４５】
５．２形質転換体の可能性
電気穿孔法及びデンドリマーを用いた外来遺伝子導入を行い、それぞれの形質転換体における発現効率の違いと遺伝子的解析を行った。その結果、フローサイトメーター及びウエスタンブロットによりＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現が確認できた。また、ＰＣＲ−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔにより外来遺伝子が、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞内に取り込まれていることも確認できた。
【０１４６】
しかし、選択圧をかけたプレートにおける形質転換体のスクリーニングを行った場合、デンドリマーにより形質転換を行ったものでは、ハイグロマイシン耐性株の得られる効率が、電気穿孔によるものに比べてはるかに悪かった。これについては、デンドリマーとトランスフェクション複合体を形成する遺伝子の濃度を検討する必要があると考えられる。また、スクリーニング後に得られたハイグロマイシン耐性株を液体培地で培養した場合、強い選択圧をかけると、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞がシスト化してしまい、増殖しなくなって死滅した。また、弱い選択圧をかけた場合でも、培養していくに従い遺伝子が抜け落ちてしまうために死滅した。これは、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓがジプロイドであり、片側の一本鎖だけが組み換わっているだけで、もう一方がｗｉｌｄ−ｔｙｐｅの配列であるために、このようなことが起こったと推測される。
【０１４７】
今後は、安定的な菌株を取得するために、更なる外来遺伝子導入条件の検討を行う必要がある。また、発現効率を向上させるためにプロモーターの選択を行い、有効なベクターの構築が必要である。
【０１４８】
図２５は、代謝工学的手法を用いた藻類Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓの炭素源資化性の改良示す図である。図２６は、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ示す図である。図２７は、ＦＡＣＳの原理示す図である。図２８は、エレクトロポレーションにおけるＶｏｌｔａｇｅの影響示す図である。図２９は、エレクトロポレーションにおけるパルス回数の影響示す図である。図３０は、ＦＩＴＣ導入時の細胞の様子示す図である。
【０１４９】
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【０１５０】
【発明の効果】
本発明は、抗酸化剤アスタキサンチンを生合成することで工業的にも有用性の高い緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）に外来遺伝子を導入・発現させる場合に有効な方法である。遺伝子を導入できた細胞を多くの細胞の中から選び出す方法として、高感度検出が可能なレポータータンパク質（緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ）を発現する遺伝子、Ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ　系抗生物質Ｚｅｏｃｉｎ　耐性遺伝子、抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を緑藻ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）に導入し、安定に発現維持させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アセチルＣｏＡからβ−カロテンの合成経路を示す図である。
【図２】アセチルＣｏＡからβ−カロテンの合成経路を示す図である。
【図３】β−カロテンからアスタキサンチンまでの合成経路を示す図である。
【図４】電気穿孔法の原理を示す図である。
【図５】デンドリマーの原理を示す図である。
【図６】Ｍａｐ　ｏｆ　ｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰを示す図である。
【図７】Ｍａｐ　ｏｆ　ｐＳｍＲＳ−ＧＦＰを示す図である。
【図８】フローサイトメーターの検出原理を示す図である。
【図９】フローサイトメーターにおける細胞検出原理を示す図である。
【図１０】Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｔｈ　ｉｎ　Ｈ．ｐｌｕｖｉｓｌｉｓを示す図である。
【図１１】Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　Ｈ．ｐｌｕｖｉｓｌｉｓを示す図である。
【図１２】Ｖｏｌｔａｇｅに対する生存率（パルス回数　１回）を示す図である。
【図１３】通常細胞における印加電圧に対するＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入効率を示す図である。
【図１４】通常細胞における印加電圧に対するＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入効率を示す図である。
【図１５】プロトプラスト細胞における印加電圧に対するＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入効率を示す図である。
【図１６】パルス回数に対する生存率（印加電圧　５０Ｖ／２ｍｍ　ｇａｐ）を示す図である。
【図１７】通常細胞におけるパルス回数に関するＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入効率を示す図である。
【図１８】顕微鏡によるＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの導入確認を示す図である。
【図１９】通常細胞における電気穿孔による形質転換を示す図である。
【図２０】通常細胞におけるデンドリマーによる形質転換を示す図である。
【図２１】プロトプラスト細胞におけるデンドリマーによる形質転換を示す図である。
【図２２】ＰＣＲによるｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰ導入確認を示す図である。
【図２３】ＰＣＲによるｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰ導入確認を示す図である。
【図２４】サザンブロットによるｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰ導入確認を示す図である。
【図２５】サザンブロットによるｐＨｙｇ−ｅ−ＧＦＰ導入確認を示す図である。
【図２６】代謝工学的手法を用いた藻類Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓの炭素源資化性の改良示す図である。
【図２７】Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ示す図である。
【図２８】ＦＡＣＳの原理示す図である。
【図２９】エレクトロポレーションにおけるＶｏｌｔａｇｅの影響示す図である。
【図３０】エレクトロポレーションにおけるパルス回数の影響示す図である。
【図３１】ＦＩＴＣ導入時の細胞の様子示す図である。
【図１】
2004033070.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004033070.tif 000019
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2004033070.tif 000022
【図１１】
2004033070.tif 000023
【図１２】
2004033070.tif 000024
【図１３】
2004033070.tif 000025
【図１４】
2004033070.tif 000026
【図１５】
2004033070.tif 000027
【図１６】
2004033070.tif 000028
【図１７】
2004033070.tif 000029
【図１８】
2004033070.tif 000030
【図１９】
2004033070.tif 000031
【図２０】
2004033070.tif 000032
【図２１】
2004033070.tif 000033
【図２２】
2004033070.tif 000034
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2004033070.tif 000037
【図２６】
2004033070.tif 000038
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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