(57)【要約】【課題】全身投与した場合に特定の組織や細胞への非特異的な移行が抑制され、かつ細胞受容体を介する感染能を欠損させたアデノウイルスベクターを提供すること。【解決手段】５型アデノウイルスベクターにおいて、ＣＡＲ（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ−Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）への結合能を欠損させるための変異を有するファイバーノブ、５型以外のファイバーシャフトに置換されたファイバーシャフト、及びＲＧＤモチーフ欠失を有するペントンベースを少なくとも含むことを特徴とする、変異型アデノウイルスベクター。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５型アデノウイルスベクターにおいて、ＣＡＲ（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ−Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）への結合能を欠損させるための変異を有するファイバーノブ、５型以外のファイバーシャフトに置換されたファイバーシャフト、及びＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ  （ＲＧＤ）モチーフ欠失を有するペントンベースを少なくとも含むことを特徴とする、変異型アデノウイルスベクター。
【請求項２】
５型以外のファイバーシャフトが、３５型のファイバーシャフトである、請求項１に記載の変異型アデノウイルスベクター。
【請求項３】
ＣＡＲへの結合能を欠損させるための変異が、ファイバーノブのＦＧループ、ＡＢループ、又はＤＥループの変異である請求項１に記載の変異型アデノウイルスベクター。
【請求項４】
ＣＡＲへの結合能を欠損させるための変異が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の４８９番から４９２番までのアミノ酸に相当するファイバーノブのＦＧループのアミノ酸の欠失である、請求項１に記載の変異型アデノウイルスベクター。
【請求項５】
標的とする組織や細胞に特異的な受容体を認識するターゲティングリガンドをさらに含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の変異型アデノウイルスベクター。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の変異型アデノウイルスベクターに、目的遺伝子を結合したことを特徴とする、組換えアデノウイルスベクター。
【請求項７】
組換えアデノウイルスベクターの調製方法であって、以下の工程：
（ａ）    請求項１から５のいずれか１項に記載の変異型アデノウイルスベクターと、目的遺伝子を含むベクターをライゲートし、組換えアデノウイルスベクターを得る工程、
（ｂ）    野生型ファイバーを発現する２９３細胞を作製する工程、
（ｃ）    上記（ａ）で得られた組換えアデノウイルスベクターを、ゲノム両端に存在する制限酵素部位で切断して線状にし、上記（ｂ）の野生型ファイバーを発現する２９３細胞にトランスフェクトし、増殖させる工程、
（ｄ）  上記（ｃ）の増殖操作を複数回繰り返し、野生型ファイバーを一部に有する組換えアデノウイルスベクターを得る工程、
（ｅ）  上記（ｄ）で得られた組換えアデノウイルスベクターを、野生型ファイバーを発現しない２９３細胞にトランスフェクトし、増殖させ、変異型ファイバーのみを有する組換えアデノウイルスベクターを回収する工程、
を含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の組織や細胞への非特異的な移行が抑制され、かつ細胞受容体を介する感染能を欠損させた変異型アデノウイルスベクターに関する。かかる変異型アデノウイルスベクターは、ターゲティング能を有するアデノウイルスベクター開発の基盤ベクターとなる。
【０００２】
【従来技術】
アデノウイルスは、１９５３年、小児の扁桃腺やアデノイド組織培養液中から分離され、現在までにヒト、トリ、ウシ、サル、イヌ、マウスあるいはブタを宿主とする８０以上の血清型の存在が明らかにされている。ヒトを宿主とするアデノウイルスについては、これまで５１種類以上の血清型が発見されており、その中でも２型と５型とが遺伝子治療用ベクターとして用いられている。５型アデノウイルスはエンベロープを持たず、２５２個のカプソメアよりなる正２０面体構造をしている。そのうち頂点にある１２個のカプソメアは突起構造を持ったペントン（ペントンベースとファイバーから成る）と呼ばれ、他の２４０個はヘキソンと呼ばれる。ファイバー遺伝子はウイルス後期遺伝子のＬ５領域に位置し、５型ウイルスのファイバー分子は５８１個のアミノ酸からなり、３量体を形成している。その構造は、テイル、シャフト、ノブ部分に分けられる。
【０００３】
アデノウイルスの細胞への感染は、ウイルス表面上のファイバーノブがアデノウイルス受容体（ＣＡＲ：Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ−Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合し（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ  Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  Ｂ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２  ａｎｄ  ５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７５，  １３２０−１３２３  （１９９７））、その後、ペントンベースのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ  （ＲＧＤ）モチーフが細胞表面上のインテグリン（αｖβ３、αｖβ５など）に結合することによって起こる（Ｗｉｃｋｈａｍ  Ｔ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｖｂ３  ａｎｄ  ａｖｂ５  ｐｒｏｍｏｔｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｖｉｒｕｓ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，  Ｃｅｌｌ，  ７３，  ３０９−３１９  （１９９３））。
【０００４】
アデノウイルスベクターは多くの組織や細胞への遺伝子導入が可能であるが、細胞表面上の受容体であるＣＡＲへの結合が感染の第一ステップであるため、ＣＡＲの発現がない細胞（気道上皮細胞、平滑筋細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、造血幹細胞、樹状細胞、一部の癌細胞など）には効率良く感染できない。また、ベクターの感染域に組織特異性がなく、全身投与した場合、特定の組織や細胞に非特異的に移行することが知られている。そのため、局所における遺伝子導入を目的とし、標的組織に直接アデノウイルスベクターを投与しても、組織から漏れ出たベクターが他臓器に移行して免疫反応を助長する可能性がある。さらに、ＣＡＲの発現がない、あるいは弱い組織を標的とした場合には、より高濃度のベクターを投与する必要があるため、細胞・組織障害、免疫反応という副作用をもたらすことになる。
【０００５】
従って、細胞受容体を介して感染するのでなく、標的とする細胞に特異的な個々の受容体を認識して感染できるようなアデノウイルスベクターが、これからの遺伝子治療用ベクターに求められている。そのため、ファイバーやペントンベースに変異を導入することにより、ネイティブな受容体であるＣＡＲやαｖインテグリンを認識しないアデノウイルスベクターの構築が、ターゲティング能を有したアデノウイルスベクターの開発への基盤となる。本発明者らは、かかる目的のために、受容体への結合能を欠損させたアデノウイルスとして、ＣＡＲと結合できないようにファイバーノブのＦＧループの４アミノ酸を欠失したアデノウイルスベクターや、ペントンベースのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ  （ＲＧＤ）モチーフを欠失させることでインテグリンと結合できなくしたアデノウイルスベクターを作製し、それらの遺伝子導入活性を培養細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又はマウスへの全身投与（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で検討した（非特許文献１参照）。その結果、ＣＡＲとの結合能を欠損させたアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子導入活性は、野生型のファイバーを有したアデノウイルスベクターの約１％の活性しか有していなかった。また、インテグリンとの結合能を欠損させたアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子導入活性は、野生型の約７０〜９０％の活性を保持していた。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける検討では、野生型のファイバーを有したアデノウイルスベクターを全身投与すると肝臓への遺伝子導入活性が９５％以上と高く、肝臓への非特異的な移行が起こっていると推察された。しかしながら、上記のいずれの変異ベクターを用いても、この肝臓への遺伝子導入活性は低下せず、特定の組織への非特異的な移行を十分に抑制できないことがわかった。
【０００６】
一方、５型アデノウイルスとは別にＣＡＲ以外の受容体を認識して感染するとされている３５型アデノウイルスが存在するが、その受容体は現在のところ不明である。本発明者らは、５型アデノウイルスのファイバー（ノブとシャフト）を３５型アデノウイルスのファイバーと置換することでより広い感染域を持つベクターを開発している（非特許文献２）。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９，  ７６９−７７６  （２００２）；ＣＡＲ−  ｏｒαｖ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｂｌａｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｆｉｂｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅ，  ｄｏ  ｎｏｔ  ｃｈａｎｇｅ  ｔｈｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．
【非特許文献２】
Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ２８５，  ６９−７７  （２００２）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｔｙｐｅ  ５  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ３５  ｆｉｂｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ａｌｔｅｒｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、全身投与した場合に特定の組織や細胞への非特異的な移行が抑制され、かつ細胞受容体を介する感染能を欠損させたアデノウイルスベクターを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ファイバーへの新たな変異導入を検討したところ、５型アデノウイルスのファイバーを３５型に置換したアデノウイルスをマウスへ全身投与した場合、肝臓への遺伝子導入率が１０００分の１に低下するという知見を得た。そこで、本発明者らはかかる知見に着目し、５型アデノウイルスにおいてＣＡＲへの結合能欠損のためのファイバーノブの変異、インテグリンへの結合能欠損のためのペントンベースのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ  （ＲＧＤ）モチーフ欠失に加え、シャフト部分を３５型に置換することによって特定の組織や細胞への非特異的な移行性が飛躍的に抑制されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）    ５型アデノウイルスベクターにおいて、ＣＡＲ（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ−Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）への結合能を欠損させるための変異を有するファイバーノブ、５型以外のファイバーシャフトに置換されたファイバーシャフト、及びペントンベースのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ  （ＲＧＤ）モチーフ欠失を有するペントンベースを少なくとも含むことを特徴とする、変異型アデノウイルスベクター。
（２）    ５型以外のファイバーシャフトが、３５型のファイバーシャフトである、上記（１）の変異型アデノウイルスベクター。
（３）    ＣＡＲへの結合能を欠損させるための変異が、ファイバーノブのＦＧループ、ＡＢループ、又はＤＥループの変異である上記（１）の変異型アデノウイルスベクター。
（４）    ＣＡＲへの結合能を欠損させるための変異が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の４８９番から４９２番までのアミノ酸に相当するファイバーノブのＦＧループのアミノ酸の欠失である、上記（１）の変異型アデノウイルスベクター。
（５）    標的とする組織や細胞に特異的な受容体を認識するターゲッティングリガンドをさらに含む、上記（１）から（４）のいずれかの変異型アデノウイルスベクター。
（６）      上記（１）から（５）のいずれかのアデノウイルスベクターに、目的遺伝子を結合したことを特徴とする、組換えアデノウイルスベクター。
（７）    組換えアデノウイルスベクターの調製方法であって、以下の工程：
（ａ）    前記（１）から（５）のいずれかの変異型アデノウイルスベクターと、目的遺伝子を含むベクターをライゲートし、組換えアデノウイルスベクターを得る工程、
（ｂ）    野生型ファイバーを発現する２９３細胞を作製する工程、
（ｃ）    上記（ａ）で得られた組換えアデノウイルスベクターを、ゲノム両端に存在する制限酵素部位で切断して線状にし、上記（ｂ）の野生型ファイバーを発現する２９３細胞にトランスフェクトし、増殖させる工程、
（ｄ）  上記（ｃ）の増殖操作を複数回繰り返し、野生型ファイバーを一部に有する組換えアデノウイルスベクターを得る工程、
（ｅ）  上記（ｄ）で得られた組換えアデノウイルスベクターを、野生型ファイバーを発現しない２９３細胞にトランスフェクトし、増殖させ、変異型ファイバーのみを有する組換えアデノウイルスベクターを回収する工程、
を含む上記方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の変異型アデノウイルスベクターは、５型アデノウイルスベクターにおいて、ＣＡＲへの結合能を欠損させるための変異を有するファイバーノブ、５型以外のファイバーシャフトに置換されたファイバーシャフト、及びＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ  （以下、ＲＧＤという）モチーフ欠失を有するペントンベースを少なくとも含むことを特徴とする。５型アデノウイルスのファイバー部分のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、それをコードする塩基配列を配列番号２に示す。
【００１１】
ファイバーノブの変異は、ＣＡＲへの結合能を欠損させるための変異であればいかなるものでもよいが、好ましくはＦＧループ、ＡＢループ、又はＤＥループの変異、より好ましくはＦＧループの４アミノ酸（配列表の配列番号１に示す５型アデノウイルスファイバー分子のアミノ酸配列における４８９番から４９２番までのアミノ酸に相当）の欠失をいう。
【００１２】
ここで、「ＣＡＲへの結合能を欠損させる」とは、実質的にその結合能を欠損させることをいい、必ずしも結合能を完全になくすという意味ではない。例えば、ファイバーノブの変異によって、ファイバーノブに変異のない野生型の５型アデノウイルスのＣＡＲに対する結合活性を２０％以下、好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下に減少させることをいう。
【００１３】
本発明においてファイバーシャフトの変異は、５型以外のファイバーシャフトに置換するものであれば特に限定はされない。そのような置換ファイバーシャフトの例としては、好ましくは３５型のファイバーシャフトが挙げられるが、３型、７型、１１型、１２型、１６型、１７型、２８型、４０型、４１型、５０型、５１型のファイバーシャフトであってもよい。また、ファイバーシャフトはヒト由来のほか、チンパンジー、イヌ、ヒツジ、トリ、ウシ、マウス由来であってもよい。
【００１４】
本発明の変異型アデノウイルスベクターは、例えば、３５型に置換されたファイバーシャフト、ＣＡＲへの結合能を欠損させるための変異を有するファイバーノブ、及びＲＧＤモチーフ欠失を有するペントンベースを含むプラスミドベクターをそれぞれ構築し、後記実施例に具体的に示すように、これらを順次ライゲートすることによって調製することができる。
【００１５】
本発明の変異型アデノウイルスベクターは、上記の変異を少なくとも有していればよく、ウイルスゲノムは、導入する目的遺伝子の大きさによって、Ｅ１欠損、Ｅ１／Ｅ２Ａ欠損、Ｅ１／Ｅ３欠損、Ｅ１／Ｅ４欠損、Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４欠損、Ｅ１／Ｅ２Ａ／Ｅ４欠損、ガットレス（ウイルスゲノムの複製とパッケージングに必要な領域（左端約０．４ｋｂ、右端約０．２ｋｂ）以外の全てを欠損）を有していもよい。
【００１６】
本発明の変異型アデノウイルスベクターには、標的細胞の受容体を特異的に認識するターゲティングリガンドを結合させてもよい。
ターゲティングリガンドは、アデノウイルスベクターのファイバーのＨＩループ又はＣ末端領域のいずれか又は両方に結合させることが好ましい。ターゲティングリガンドのアデノウイルスベクターへの結合は、該リガンドをコードするＤＮＡをファイバーのＨＩループをコードする遺伝子配列又はＣ末端領域をコードする遺伝子配列のいずれか又は両方に導入することによって行うことができる。
【００１７】
「ファイバーのＨＩループをコードする遺伝子配列」とは、配列表の配列番号１に示す５型アデノウイルスファイバー分子のアミノ酸配列の５３７番から５４９番までの領域をコードする塩基配列をいい、５型アデノウイルスにおいては、ＨＩループをコードする遺伝子配列は、該ウイルスゲノムＤＮＡの３２６４７〜３２６８５番目に相当する。
【００１８】
「ファイバーのＣ末端領域をコードする遺伝子配列」とは、配列表の配列番号１に示す５型アデノウイルスファイバー分子のＣ末端アミノ酸から数えて１０個のアミノ酸をコードする塩基配列をいい、ファイバー分子の最後のアミノ酸（５８１番目）をコードする塩基配列は、５型アデノウイルスにおいて該ウイルスゲノムＤＮＡの３２７８２〜３２７８４番目に相当する。したがって、外来ペプチドコードＤＮＡは、アデノウイルスゲノムＤＮＡの３２７５４〜３２７８５番目の間に、フレームを合わせて導入すればよい。
【００１９】
ＨＩループをコードする遺伝子配列及び／又はＣ末端領域をコードする遺伝子配列に、ターゲティングリガンドをコードするＤＮＡを導入する際には、これら遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列を挿入し、これらの制限酵素認識配列を用いて上記ＤＮＡを導入すればよい。ここで、「ユニークな制限酵素認識配列」とは、アデノウイルスゲノムＤＮＡに本来存在しない制限酵素認識配列をいい、例えば、制限酵素Ｃｓｐ４５Ｉ、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＰａｃＩ、ＸｂａＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩにより認識される配列が挙げられる。好ましい態様として、ＨＩループ領域にＣｓｐ４５Ｉ配列、Ｃ末端領域にＣｌａＩ配列を挿入することが例示される。
【００２０】
ターゲティングリガンドは、標的とする組織や細胞に特異的な受容体を認識する、すなわち該受容体と結合する又は相互作用する分子であれば特に限定はされない。そのような分子としては、例えば、メラノーマのＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）受容体と結合する分子、インテグリン受容体と結合する分子、ヘパラン硫酸含有受容体と結合する分子、ラミニン受容体と結合する分子、Ｅ−セレクチンとの親和性を有する分子、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンＮＧ２受容体と結合する分子、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ由来の免疫グロブリンＡ結合ドメイン（ａ  ｓｍａｌｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｚ  ｄｏｍａｉｎ）分子等が挙げられる。例えば、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）受容体と結合する分子としてＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）を含むペプチド、インテグリン受容体と結合する分子としてＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含むペプチド（代表的には、ＲＤＧ−４Ｃペプチド（配列番号４））、ヘパラン硫酸含有受容体と結合する分子としてポリリジン（Ｋ７）（配列番号５）を含む分子、ラミニン受容体と結合する分子としてＴＳ（ＧＹＩＧＳＲ）３ＳＳ（配列番号６）又はＴＳＡＡ（ＳＩＫＶＡＶ）２（配列番号７）、Ｅ−セレクチンとの親和性を有する分子としてＴＲＳＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫＴＳ（配列番号８）、コンドロイチン硫酸プロテグリカンＮＧ２レセプターと結合する分子としてＴＡＡ（Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ）含む分子又はＬＴＬＲＷＶＧＬＭＳ（配列番号９）を含む分子、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ由来の免疫グロブリンＡ結合ドメイン分子としてＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１０）等を用いることができる。ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶはメラノーマ細胞に対して、ＲＧＤモチーフは頭頚部癌、内皮細胞、平滑筋細胞等に対して、７個のリジンが結合したポリリジンＫ７はマクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、Ｔ細胞に対してそれぞれ親和性が高いためこれらの細胞を標的とする場合にそれぞれ適している。
【００２１】
本発明のアデノウイルスベクターには、治療目的となる目的遺伝子を結合させて組換えアデノウイルスベクターを作製し、遺伝子治療用ベクターとして用いることができる。
【００２２】
目的遺伝子としては、いわゆる遺伝子治療に効果が認められる、あるいは効果があるとされる遺伝子であれば何ら限定されないが、例えば、直接又は間接的に標的細胞に対して細胞毒性を示すような分子をコードする遺伝子、細胞増殖因子遺伝子、細胞増殖抑制因子遺伝子、アポトーシス制御遺伝子、癌抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子、免疫調節遺伝子等が挙げられる。更に、非毒性のプロドラッグと組み合わせて使用するための自殺遺伝子を組み込むことも可能である。そのような組み合わせとしては、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）とガンシシクロビルの組み合わせ（ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ）、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシンの組み合わせ（ＣＤ／５ＦＣ）、ウラシルホスホリラーゼと５−フルオロウラシルの組み合わせ（ＵＰ／５ＦＵ）などが挙げられる。このような目的遺伝子は、一般にはアデノウイルスゲノムのＥ１領域（３４２−３５２８）及び／又はＥ３領域（２８１３３−３０８１８）と置換され、又はこの領域に挿入される。
【００２３】
目的遺伝子のアデノウイルスベクターへの導入は、本発明者らが既に開発した簡便な１ステップのｉｎ  ｖｉｔｒｏライゲーションで目的遺伝子をＥ１欠損領域（アデノウイルスゲノムＤＮＡに本来存在しないＩ−ＣｅｕＩ、ＳｗａＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩを有する）に挿入できるプラスミドの一部（ｐＡｄＨＭ４）を利用することが好ましい  （Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ９，  ２５７７−２５８３  （１９９８）；Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．）。
【００２４】
本発明の変異型アデノウイルスベクターは、パッケージング細胞である２９３細胞に対しても感染できないため、増殖させることができない。そこで、本発明者らは、野生型ファイバーを発現する２９３細胞を利用して組換えアデノウイルスベクターを回収する方法を新たに開発した。
【００２５】
本方法は、以下の工程を含むものである。
（ａ）    上記の変異型アデノウイルスベクターと、目的遺伝子を含むベクターをライゲートし、組換えアデノウイルスベクターを得る工程
（ｂ）    野生型ファイバーを発現する２９３細胞を作製する工程
（ｃ）    上記（ａ）で得られた組換えアデノウイルスベクターを、ゲノム両端に存在する制限酵素部位で切断して線状にし、上記（ｂ）の野生型ファイバーを発現する２９３細胞にトランスフェクトし、増殖させる工程
（ｄ）  上記（ｃ）の増殖操作を複数回繰り返し、野生型ファイバーを一部に有する組換えアデノウイルスベクターを得る工程
（ｅ）  上記（ｄ）で得られた組換えアデノウイルスベクターを、野生型ファイバーを発現しない２９３細胞にトランスフェクトし、増殖させ、変異型ファイバーのみを有する組換えアデノウイルスベクターを回収する工程
【００２６】
上記工程（ｂ）で使用する「野生型ファイバーを発現する２９３細胞」とは、通常の２９３細胞に野生型ファイバーを発現させるように操作したものであって、後記実施例１に従って調製することができる。また、「野生型ファイバー」とは変異を施していない５型アデノウイルスのファイバーをいう。一方、最終段階の工程（ｅ）で使用する「２９３細胞」（本明細書において「通常の２９３細胞」と記載する場合がある。）とは、ヒト胎児由来腎細胞をアデノウイルスでトランスフォームして作製された細胞株であり、Ｅ１遺伝子を含むアデノウイルスＤＮＡの一部を持っており、アデノウイルスベクターの増殖に通常用いられるものである。
【００２７】
工程（ｂ）で作製する野生型ファイバー発現２９３細胞において、染色体に組み込まれた野生型ファイバー遺伝子が、アデノウイルスベクター複製中にベクターの変異型ファイバーとの間で組換えをおこす可能性を減らすため、染色体に組み込んだ野生型ファイバー遺伝子にはアミノ酸変異を伴わない変異を少なくとも約５００ｂｐおきに挿入しておくことが好ましい。
【００２８】
上記工程（ｃ）で増殖された組換えアデノウイルスベクターは、ファイバー部分の一部が野生型ファイバーに置換される。従って、この増殖過程で生じるウイルスは、その一部の野生型ファイバーを利用して２９３細胞に感染することが可能である。
上記工程（ｄ）では、工程（ｃ）の増殖操作を複数回、例えば３〜５回繰り返すが、回数はアデノウイルスベクターの増殖の状況により適宜調整すればよい。
【００２９】
以上のようにして増殖させたアデノウイルスベクターを、最終段階（工程（ｅ））で増殖させるときに野生型ファイバーを発現していない通常の２９３細胞に感染させる。その結果、最終産物として変異型ファイバーのみを有する組換えアデノウイルスベクターが２９３細胞から回収される。従って、この組換えアデノウイルスベクターは、もはや２９３細胞などの通常の細胞にはほとんど全く感染できない。
【００３０】
本発明の組換えアデノウイルスベクターを用いる遺伝子治療の形態としては、標的細胞を体外に取り出して遺伝子導入を行う体外法（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）、体内に遺伝子を導入する体内法（ｉｎ  ｖｉｖｏ法）があるが、いずれの治療形態にも適用される。体外法では患者由来の細胞を一旦体外で培養し、本発明の組換えアデノウイルスベクター導入処理をした後に患者に投与すればよいし、体内法では本発明の組換えアデノウイルスベクターを直接患者体内（皮膚、筋肉、肝臓、肺、血管内など）へ投与すればよい。
【００３１】
上記組換えアデノウイルスベクターの投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、特に癌治療を目的とする場合は、癌原病巣に対して又は癌種に対応した予想転移部位に対して局所注射等の局所投与を行うことが好ましい。
【００３２】
本発明の変異型アデノウイルスベクターの標的細胞への遺伝子導入効率は、上記の目的遺伝子に代えてあるいは目的遺伝子と共にリポーター遺伝子をベクターに挿入し、細胞内のルシフェラーゼ活性を測定することによって評価できる。このようなリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、グリーン蛍光タンパク質（いわゆるＧＦＰ）をコードする遺伝子等を用いることができる。
【００３３】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
（実施例１）  トリプル変異型アデノウイルスベクターの作製
（１）  アデノウイルスベクター作製のためのベクタープラスミドｐＡｄＨＭ５４の作製
ｐＡｄＨＭ５４（変異ファイバーノブ、Ａｄ３５型シャフト、及びＲＧＤモチーフ欠失ペントンベースを有するアデノウイルスベクター作製のためのベクタープラスミド）は以下のように作製した。
【００３４】
（１−１）  Ａｄ３５型ファイバーシャフト部分含有プラスミド
まず、Ａｄ３５のファイバー周辺の遺伝子を含むプラスミドであるｐＦ３５−２．２  ［Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  Ｈａｙａｋａｗａ  Ｔ．，  Ｇｅｎｅ，  ２８５，  ６９−７７  （２００２）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｔｙｐｅ  ５  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ３５  ｆｉｂｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ａｌｔｅｒｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ．］  をＡｇｅＩ  で切断し、Ｔ４ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理後、ＸｂａＩ  ｌｉｎｋｅｒとライゲーションした。ライゲーション産物をＸｂａＩで切断し、セルフライゲーションしてｐＦ３５−２．３を得た。ｐＦ３５−２．３のファイバーシャフトとノブの間にｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）  、ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １（５’−ａ  ａａｇ  ｇａｔ  ａｇｔ  ａｔｔ  ａａｔ  ａｃｃ  ｔｔａ  ｔｇｇ  ａｃｔ  ｇｇａ−３’：配列番号１１）  と  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ２（５’−  ｔｃｃ  ａｇｔ  ｃｃａ  ｔａａ  ｇｇｔ  ａｔｔ  ａａｔ  ａｃｔ  ａｔｃ  ｃｔｔ  ｔ  −３’：配列番号１２）を用いてＡｓｅＩ部位を作製し、ｐＦ３５−２．３（ＡｓｅＩ）を得た。
【００３５】
（１−２）  Ａｄ３５型ファイバーシャフト及びＡｄ５型ファイバーノブ（ＦＧループ変異）含有プラスミド
次に、Ａｄ３５型ファイバーシャフトとＡｄ５型ファイバーノブ（ＦＧループの変異）を持つプラスミドｐＨＭ−Ｓ３５−Ｋ５−ＣＡＲ（−）を作製するために以下の▲１▼〜▲４▼のフラグメントをライゲートした。
▲１▼ｐＦ３５−２．３（ＡｓｅＩ）をＡｓｅＩとＡｆｌＩＩで切断したフラグメント（Ａｄ３５型ファイバーシャフトを含む。）
▲２▼ｐＡｄＨＭ４２（Ｅ１／Ｅ３欠損領域を除く全てのアデノウイルスゲノムを有したプラスミドであり、Ｅ１欠損領域にＩ−ＣｅｕＩ、ＳｗａＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位を有したベクタープラスミド。ＦＧループ領域が４アミノ酸欠失しており、ＨＩループ領域にＣｓｐ４５Ｉ部位を有する。）を鋳型とし、ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ３（５’−ａａｔ  ａａｔ    ａｃｔ  ｔｔｇ  ｔｇｇ  ａｃｃ  ａｃａ  ｃｃａ  ｇｃｔ−３’：配列番号１３）  と  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ４（５’−ｔｔｃ  ｇａａ  ｇｔｔ  ｇｔｇ  ｔｃｔ  ｃｃｔ  ｇｔ−３’：配列番号１４）をプライマーとして用いてＰＣＲで増幅した産物をＴＡクローニングにてプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ社）に組み込んでｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ−ｋｎｏｂＣＡＲ（−）−Ｆを作製し、これをＡｓｅＩとＣｓｐ４５Ｉで切断したフラグメント（Ａｄ５型ファイバーノブの始めからＨＩ  ループまでを含んでおり、ＣＡＲとの結合部位であるＦＧ  ループの４アミノ酸が欠失している。）
▲３▼ｐＨＭ１４−Ｅｃｏ３（Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｎ．，  Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  Ｕｔｏｇｕｃｈｉ  Ｎ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｙ．，  Ｈａｙａｋａｗａ  Ｔ．；  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ＨＩ  ｌｏｏｐ  ａｎｄ  Ｃ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ．  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．）をＣｓｐ４５ＩとＭｕｎＩで切断したフラグメント（Ａｄ５型ファイバーノブのＨＩ  ループ領域から後半部分を含みファイバーノブのＣ末端領域にＣｌａＩ部位を含む。）
▲４▼ｐＨＭＣＭＶ６（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  Ｋａｙ  ＭＡ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １０，  ２０１３−２０１７  （１９９９）；  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｅ１  ａｎｄ  Ｅ１／Ｅ４  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ．）をＭｕｎＩとＡｆｌＩＩで切断したフラグメント
【００３６】
上記▲１▼〜▲４▼のフラグメントをライゲーションし、Ａｄ３５型ファイバーシャフトに続きＡｄ５型ファイバーノブを持つプラスミドｐＨＭ−Ｓ３５−Ｋ５−ＣＡＲ（−）を得た。ｐＨＭ−Ｓ３５−Ｋ５−ＣＡＲ（−）は、ファイバーノブ領域はＣＡＲとの結合能を欠損させるようにＦＧループの欠失を持ち、ＨＩ  ループをコードする部分にＣｓｐ４５Ｉ  部位、Ｃ末端にＣｌａＩ  部位を持つ。
【００３７】
（１−３）  Ａｄ３５型ファイバーシャフト、Ａｄ５型ファイバーノブ（ＦＧループ欠失）、及びＡｄ５型ファイバーテイル含有プラスミド
上記で得られたｐＨＭ−Ｓ３５−Ｋ５−ＣＡＲ（−）をＭｕｎＩとＡｆｌＩＩで切断し、ｐＦ３５−２．２のＭｕｎＩとＡｆｌＩＩで切断したものとライゲーションしてｐＳ３５−Ｋ５−２．２ＣＡＲ（−）を得た。ｐＳ３５−Ｋ５−２．２ＣＡＲ（−）はＡｄ５型ファイバーテイルを持ち、Ａｄ３５型ファイバーシャフトに続きＡｄ５型ファイバーノブを持つ（ファイバーノブ領域はＣＡＲとの結合能を欠損させるようにＦＧループの欠失を持ち、ＨＩ  ループをコードする部分にＣｓｐ４５Ｉ  部位、Ｃ末端にＣｌａＩ  部位を持つ）。
【００３８】
（１−４）  Ａｄ３５型ファイバーシャフト、Ａｄ５型ファイバーノブ（ＦＧループ欠失）、Ａｄ５型ファイバーテイル、及びＲＧＤモチーフ欠失ペントンベース含有プラスミド
上記で得られたｐＳ３５−Ｋ５−２．２ＣＡＲ（−）をＳｒｆＩとＭｕｎＩで切断し、ｐＨＭ１４−Ｅｃｏ２（Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｎ．，  Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  Ｕｔｏｇｕｃｈｉ  Ｎ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｙ．，  Ｈａｙａｋａｗａ  Ｔ．；  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ＨＩ  ｌｏｏｐ  ａｎｄ  Ｃ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ．  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．）をＳｒｆＩとＭｕｎＩで切断したものとライゲーションしてｐＨＭ１４−Ｅｃｏ２−Ｓ３５を得た。ｐＨＭ１４−Ｅｃｏ２−Ｓ３５はＡｄ５型ゲノムの２７３３２から３’末端までを含み、ファイバーシャフトの部分のみＡｄ３５型に置換されている（ファイバーノブ領域はＣＡＲとの結合能を欠損させるようにＦＧループの欠失を持ち、ＨＩ  ループをコードする部分にＣｓｐ４５Ｉ  部位、Ｃ末端にＣｌａＩ  部位を持つ）。ｐＨＭ１４−Ｅｃｏ２−Ｓ３５をＥｃｏＲＩとＣｌａＩで切断し、ｐＡｄＨＭ４３（Ｅ１／Ｅ３欠損領域を除く全てのアデノウイルスゲノムを有し、Ｅ１欠損領域にＩ−ＣｅｕＩ、ＳｗａＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位を有したベクタープラスミド。ペントンベースのＲＧＤモチーフコード領域を欠失）をＥｃｏＲＩとＣｌａＩで切断したものとライゲーションすることによってｐＡｄＨＭ５４を作製した（図１）。ｐＡｄＨＭ５４  は以下の特徴を有する。
【００３９】
（ｉ）  Ｅ１／Ｅ３欠損領域を除く全てのアデノウイルスゲノムを有している。
（ｉｉ）  ペントンベースのＲＧＤモチーフコード領域を欠失し、ファイバーノブ領域はＣＡＲとの結合能を欠損させるようにＦＧループの欠失を持ち、ＨＩ  ループをコードする部分にＣｓｐ４５Ｉ  部位、Ｃ末端にＣｌａＩ  部位を持つ。
（ｉｉｉ）ファイバーシャフト領域は３５型アデノウイルス由来である。
（ｉｖ）Ｅ１欠損領域にＩ−ＣｅｕＩ、ＳｗａＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位を持つ。
【００４０】
（２）  組換えアデノウイルスベクターの作製
（２−１）  野生型ファイバー発現２９３細胞の作製
ハイグロマイシン耐性遺伝子を有し、ＣＭＶプロモーターに制御された野生型ファイバー発現プラスミドｐＣＭＶｍｆｉｂｅｒ−Ｈｙｇ−Ｒ（野生型の５型アデノウイルスのファイバーシャフト、ノブ、テイルを発現）を、２９３細胞にＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（キアゲン社）を用いてトランスフェクトした。野生型ファイバー遺伝子には計３１塩基のナンセンス変異を少なくとも５００ｂｐおきに挿入し、アデノウイルスベクター複製中にベクターの変異ファイバーとの間で組換えを起こす可能性を減少させた。ハイグロマイシンで選択することにより、野生型ファイバー発現細胞株ファイバー−２９３を得た。尚、ファイバーの発現は抗−ファイバーポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにて確認した。
【００４１】
（２−２）  組換えアデノウイルスベクターの構築及び増幅
組換えアデノウイルスベクターは文献  （Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ９，  ２５７７−２５８３  （１９９８）：  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．及びＭｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １０，  ２０１３−２０１７  （１９９９）；  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｅ１  ａｎｄ  Ｅ１／Ｅ４  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ．）に記載された手法に基づいてｉｎ  ｖｉｔｒｏライゲーション反応によって構築した。
【００４２】
まず、（１）で得られたｐＡｄＨＭ５４をＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩで切断し、これをＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩ切断したｐＣＭＶＬ１  （Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ８，  ７３０−７３５  （２００１）；  Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＨＩ  ｌｏｏｐ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ．）とライゲートし、ｐＡｄＨＭ５４−Ｌ２を得た。同様に、ｐＡｄＨＭ４（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ９，  ２５７７−２５８３  （１９９８）；  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．）をＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩで切断し、これをＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩ切断したｐＣＭＶＬ１  （Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  同上）とライゲートし、ｐＡｄＨＭ４−Ｌ２を作製した。
【００４３】
ｐＡｄＨＭ５４−Ｌ２は、以下のように組換えアデノウイルスベクターとして構築した。先ず、ｐＡｄＨＭ５４−Ｌ２をＰａｃＩで消化し、（２−１）で調製したファイバー−２９３細胞へトランスフェクトした。トランスフェクション後、１０〜１４日で細胞変性効果が観測され、Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２が増幅していることを確認した。ウイルス懸濁液を凍結融解して回収し、１０〜２０倍量の細胞数のファイバー−２９３細胞に作用させた。２〜３日で細胞変性効果が観測された。以後上記操作を３回行い、組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２）を増幅した。最終増幅ステップは、Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２を通常の２９３細胞に作用させ、増幅した。以上の増幅工程を図１に示す。
【００４４】
一方、Ａｄ−Ｌ２は、ｐＡｄＨＭ４−Ｌ２をＰａｃＩで消化し、２９３細胞にトランスフェクトすることによりＡｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２と同様に調製した。ただし、パッケージング細胞としては全行程を通常の２９３細胞を用いた。
図２に、変異型アデノウイルスベクター（Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２）及び従来型アデノウイルスベクター（Ａｄ−Ｌ２）の構造を示す。また、Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２のファイバー部位のアミノ酸配列を配列番号１５に、またそれをコードする塩基配列を配列番号１６に示す。
【００４５】
得られた各組換えベクター由来のウイルスは、定法（Ｌｉｅｂｅｒ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０，  ８９４４−８９６０（１９９６）；  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｉｒｓｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．）に従って精製した。その結果、Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２の収量は、１０１２ウイルス粒子（ｖｅｃｔｏｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  （ＶＰ）／ｍｌの濃度で約１ｍｌ）であった。これは、従来型のアデノウイルスベクターＡｄ−Ｌ２の場合とほぼ同等の収量であった。ウイルス粒子力価の測定は、Ｍａｉｚｅｌ  ＪＶＪ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３６，  １１５−１２５  （１９６８）；  Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．  Ｉ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅｓ  ２，  ７Ａ，  ａｎｄ  １２．に記載された方法に準じて行った。
【００４６】
（実施例２）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
ＳＫ  ＨＥＰ−１細胞（ＣＡＲ陽性）とＬＮ４４４細胞（ＣＡＲ陰性）にＡｄ−Ｌ２、Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｌ２、Ａｄ／ΔＦ−Ｓ３５−Ｌ２、Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２（下記表１参照）を３０００  ＶＰ（ｖｅｃｔｏｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）／ｃｅｌｌで１．５時間作用させ、４８時間培養後、ルシフェラーゼ発現量を定量した。
【００４７】
【表１】
2004290018.tif 000003
【００４８】
（Ａｄ−Ｌ２：従来型のヒト５型アデノウイルスベクター、  Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｌ２：ファイバーノブとペントンベースに変異を挿入したアデノウイルスベクター、  Ａｄ／ΔＦ−Ｓ３５−Ｌ２：ファイバーノブに変異を挿入し、ファイバーシャフトを３５型アデノウイルスのものに置換したアデノウイルスベクター、Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２：ファイバーノブとペントンベースに変異を挿入し、かつファイバーシャフトを３５型アデノウイルスのものに置換したアデノウイルスベクター）
【００４９】
結果を図３に示す。データは平均値±  Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）で表した。ＳＫ  ＨＥＰ−１細胞（ＣＡＲ陽性）においては、トリプル変異型Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２を作用させた細胞は従来型Ａｄ−Ｌ２導入細胞を作用させた細胞に比べ１％以下のルシフェラーゼ発現しか示さず、その差が顕著であった。ダブル変異型Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｌ２、Ａｄ／ΔＦ−Ｓ３５−Ｌ２を作用させた細胞もトリプル変異型Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２ほどではないが、低いルシフェラーゼ発現しか示さなかった。この傾向はＬＮ４４４細胞（ＣＡＲ陰性）においても認められた。
【００５０】
（実施例３）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
Ｃ５７  Ｂｌ６マウス（メス）にＡｄ−Ｌ２、Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｌ２、Ａｄ／ΔＦ−Ｓ３５−Ｌ２、Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２を３．０×１０１０ＶＰ尾静脈内から投与した。４８時間後、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓を回収し、ルシフェラーゼ発現量を定量した。
結果を図４（Ａ）に示す。データは各投与群につき６〜８匹から得られた結果の平均値±  Ｓ．Ｅ．で表した。
従来型Ａｄ−Ｌ２投与の場合は、肝臓をはじめ各臓器で高いルシフェラーゼ発現を示した。特に、肝臓への遺伝子導入活性は約９９％を示した。一方、ダブル変異型Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｌ２，  Ａｄ／ΔＦ−Ｓ３５−Ｌ２の肝臓におけるルシフェラーゼ発現は２００倍以上減少し、他臓器においても低い活性を示した（図４（Ａ））。トリプル変異型Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２では、さらに各臓器での活性が低下し、肝臓においては、３００００倍以上ルシフェラーゼ発現が低下した（図４（Ａ），（Ｂ））。従って、Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２は積極的に特定の臓器に移行する活性を有しないベクターであり、ターゲッティングアデノウイルスベクターのための基盤ベクターになりうる。
【００５１】
（実施例４）  ファイバー−２９３細胞で増殖させたアデノウイルスベクターの遺伝子導入試験
野生型ファイバー発現２９３細胞（以下、ファイバー−２９３細胞という）でベクターを増殖させる方法、又は実施例１の記載に従い、最終段階を除く段階はファイバー−２９３細胞でベクターを増殖させ、最終段階のみを通常の２９３細胞でベクターを増殖させる方法で回収したＡｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２について、各ベクターの遺伝子導入活性をＳＫ  ＨＥＰ−１細胞（ＣＡＲ陽性）において検討した。各ベクターは３００  ＶＰ（ｖｅｃｔｏｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）／ｃｅｌｌでＳＫ  ＨＥＰ−１細胞（ＣＡＲ陽性）に１．５時間作用させ、４８時間培養後、ルシフェラーゼ発現量を定量した。結果を図５に示す。データは平均値±  Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）で表した。野生型ファイバー発現２９３細胞で回収したＡｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２は、通常の２９３細胞で回収したＡｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２に比べ約１０倍のルシフェラーゼ発現を示した。このことから、ファイバー−２９３細胞で回収したＡｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２のファイバー部分の一部は通常のファイバーに置換され、その結果高いルシフェラーゼ発現を示したと考えられる。これに対し、ベクター増殖の最終段階を通常の２９３細胞で回収したＡｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２では、ファイバー部分は変異ファイバーになっているため、通常の細胞への遺伝子導入能は減弱されている。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、全身投与した場合に特定の組織や細胞への非特異的な移行が抑制され、かつ細胞受容体を介する感染能を欠損させた変異型アデノウイルスベクターが提供される。かかる変異型アデノウイルスベクターは、標的となる組織や細胞に特異的な受容体を認識するようなターゲティングリガンドを結合させることによって、細胞受容体を介して感染するのでなく、標的とする細胞に特異的な個々の受容体を認識して感染できることから、ターゲティング能を有するアデノウイルスベクター開発の基盤ベクターとなる。
【００５３】
【配列表】
2004290018.tif 000004
2004290018.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＡｄＨＭ５４の構造、及びベクター増幅工程を示す。
【図２】図２は、変異型アデノウイルスベクター（Ａｄ／ΔＦΔＰ−Ｓ３５−Ｌ２）及び従来型アデノウイルスベクター（Ａｄ−Ｌ２）の構造を示す。
【図３】図３は、従来型アデノウイルベクター、変異型（ダブル、トリプル）アデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける遺伝子導入試験の結果を示す。
【図４】図４（Ａ）は、従来型アデノウイルベクター、変異型（ダブル、トリプル）アデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子導入試験の結果を示す。図４（Ｂ）は、従来型アデノウイルベクター、変異型（トリプル）アデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏによる遺伝子導入試験の結果を示す。
【図５】野生型ファイバー発現２９３細胞で増殖させたアデノウイルスベクターの遺伝子導入試験の結果を示す。
【図１】
2004290018.tif 000019
【図２】
2004290018.tif 000020
【図３】
2004290018.tif 000021
【図４】
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【図５】
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