(57)【要約】【課題】  複合スカフォールド内の哺乳動物細胞の保持率と、好ましい細胞外基質の産出を高める、哺乳動物細胞を播種した複合スカフォールドと、その複合スカフォールドを用いる治療方法を提供する。【解決手段】  本発明に係る、インプラント可能で生体親和性を有するスカフォールドは、生体親和性を有する多孔質のポリマー基質と、このポリマー基質によりカプセル封入され、その内部に配された、生体親和性を有する、多孔質の、繊維からなるマットと、組織スカフォールド内に播種された、複数の哺乳動物細胞とを含む。このスカフォールドを使用して、哺乳動物の疾病または構造欠陥を治療する。【選択図】        図１
2004267754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インプラント可能で生体親和性を有するスカフォールドにおいて、
生体親和性を有する多孔質のポリマー基質と、
当該ポリマー基質によりカプセル封入され、その内部に配された、生体親和性を有する、多孔質の、繊維からなるマットと、
当該組織スカフォールド内に播種された、複数の哺乳動物細胞と
を含むスカフォールド。
【請求項２】
哺乳動物に生体親和性を有するスカフォールドを埋植することを含む、哺乳動物の疾病を治療する方法において、当該スカフォールドが、
生体親和性を有する多孔質のポリマー基質と、
当該ポリマー基質によりカプセル封入され、その内部に配された、生体親和性を有する、多孔質の、繊維からなるマットと、
当該組織スカフォールド内に播種された、複数の哺乳動物細胞と
を含む、哺乳動物の疾病を治療する方法。
【請求項３】
哺乳動物に生体親和性を有するスカフォールドを埋植することを含む、哺乳動物の構造欠陥を治療する方法において、当該スカフォールドが、
生体親和性を有する多孔質のポリマー基質と、
当該ポリマー基質によりカプセル封入され、その内部に配された、生体親和性を有する、多孔質の、繊維からなるマットと、
当該組織スカフォールド内に播種された、複数の哺乳動物細胞と
を含む、哺乳動物の構造欠陥を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟組織または硬組織の疾病や構造欠陥を治療するための、哺乳動物細胞を播種した複合組織スカフォールドに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの人々を苦しめている疾病で治療の臨床的必要性があるものには三つのグループがある。最初のグループの疾病は、軟骨、骨、半月板、または筋肉等の筋骨格組織の疾病や損傷に関する。一般に、骨、軟骨、または筋肉等の筋骨格組織の損傷や疾病を修復するための臨床的アプローチは、組織の元々の機能を実質的に回復するものではない。このような欠陥を治療するためにしばしば使用されてきた関節プロテーゼ／デバイスでは、欠陥の周辺の機能組織のゆるみ、耐用性の限界および組織の消失に帰因される雑多な結果が得られてきた。
【０００３】
第二のグループの疾病は、糖尿病（ＤＭ）等の器官機能の消失に関連する。ＤＭは、膵臓のβ細胞の破壊や、インスリンホルモンに対する筋肉組織または脂肪組織の非感受性から生じる。現在のＤＭの治療は、失明、腎不全、潰瘍といった健康上の厄介な問題を避けるには不十分である。
【０００４】
第三のグループの疾病は、中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷や破損に関連する。脊髄の損傷は、血管に加えて、白質と灰白質の破壊につながり得る。一般的に、外傷や変成過程が脊髄の損傷を引き起こす。ＣＮＳは、成熟した神経細胞に再生能力がないため、他の多くの組織と異なり、その自己修復の能力に限界がある。ＣＮＳの軸索を再生しようとするこれまでの試みには、抑制蛋白質をブロックする抗体の移植、グリア細胞、マクロファージおよび幹細胞の移植、ＣＮＳの損傷後の腫張を減少させるためのメチルプレドニゾロンのようなステロイド剤の使用および、支持構造体と神経細胞の再生をトリガするための細胞または生理活性信号との併用を挙げることができる。これらのアプローチでは、外傷や疾病の後のＣＮＳの修復が不十分なものに終わっていた。このため、現在の臨床的アプローチに関連してよく起こる問題を避けることのできる組織の修復／再生への別のアプローチへのニーズが強く残っている。
【０００５】
近年のヒト組織工学の出現は、損傷組織や疾病組織を修復、再生するもう一つのアプローチを提供する可能性がある。ヒト組織工学の戦略では、生体材料と、最終的には組織の機能を回復しまたは改良できる生体代替物を発達させるための細胞および／または成長因子との併用が検討されてきた。組織修復のために有用な、組織テンプレート、導管、バリアおよびレザバーとしては、スカフォールド材料が広範に研究されてきた。特に、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、繊維製品および不織材の形状の合成材料および天然材料が、生体組織を再構築／再生するためおよび組織の生長を誘引する化学走化性剤を供給するために、インビトロおよびインビボで使用されてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
スカフォールドには、その組成や目標とする組織とは無関係に、保有しなければならないいくつかの基本的特徴がある。スカフォールドは、生体親和性を有し、外科手術の際の負荷に抗するに十分な機械的特性を有していなくてはならない。また、曲げ可能であり、細胞の侵入や生長を許容できるように多孔性が高く、スカフォールド内での細胞の高い保持が可能であり、殺菌が容易で、侵入してくる組織によりリモデリングでき、新組織が形成されるときに分解可能なものである必要がある。スカフォールドは、機械的手段、固定具、縫合糸または接着剤により、周囲の組織に固定してもよい。現在のところ、組織スカフォールドに使用されている従来の材料は、単独でも、組み合わせて使用されている場合であっても、播種された細胞を埋植後保持するには効率的でないことが判明している。
【０００７】
このように、従来の材料の限界を解決することのできる、細胞を播種したスカフォールドへのニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、インプラント可能で生体親和性を有するスカフォールドであって、生体親和性を有する多孔質のポリマー基質と、このポリマー基質によりカプセル封入され、その内部に配された、生体親和性を有する、多孔質の、繊維からなるマット（繊維マット）と、このスカフォールドを哺乳動物の欠陥部位または異所性部位に埋植する前にこの組織スカフォールド内に播種された複数の哺乳動物細胞とを含む、インプラント可能で生体親和性を有するスカフォールドを提供する。本発明は、本発明のスカフォールドを使用して哺乳動物の疾病を治療する方法も提供する。繊維マットは不織マットであることが好ましい。この繊維マットをカプセル封入する、多孔質の、生体親和性を有する基質としては、多孔質のポリマー発泡体が好ましく、凍結乾燥プロセスを使用して発泡させたものが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、複合スカフォールド内の哺乳動物細胞の保持率と、好ましい細胞外基質（ＥＣＭ）の産出を高める。
【００１０】
さらに、この細胞を播種した複合スカフォールドは、細胞分泌生物学的因子を供給するための媒介体として作用することができる。このような生物学的因子が、他の生長因子、蛋白質、サイトカインのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションまたは他の細胞タイプの増殖をコントロールする役割を有する場合もある。欠陥部位や疾病組織部位へ埋植する前またはその後に、このような複合スカフォールドにいくつかの細胞を播種する場合もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、多孔質の生体親和性を有するポリマー基質によりカプセル封入され、その内部に配された、多孔質の、生体親和性を有する、繊維マットを含む、生体親和性を有する複合組織スカフォールドに関する。複合スカフォールドには、哺乳動物の細胞が投与される。すなわち、播種される。播種は、複合スカフォールドを哺乳動物の欠陥部位または異所性部位に埋植する前に行うことが好ましい。
【００１２】
本発明の細胞が播種された複合スカフォールドは、投与された細胞、すなわち播種された細胞が、多孔質の、繊維マットの繊維と、この繊維マットをカプセル封入する多孔質のポリマー基質の多孔壁との両方に付着できる環境を提供する。繊維マットと多孔質のポリマー基質とを組み合わせたこの独特のデザインは、多孔質の繊維マットや多孔質のポリマー基質を単独で使用した場合に比べ、スカフォールド内に投与された細胞の保持率を高めるのに役立つ。
【００１３】
本発明の多孔質複合スカフォールドの一態様を図１に示す。この図は、多孔質のポリマー基質３０によりカプセル封入され、その内部に配された繊維マット２０を含む複合スカフォールド１０を示している。スカフォールド１０は、マクロポア２５とミクロポア３５とを含有する。ここで用いられるミクロポアには、約５０μｍ未満の平均直径を有する孔が含まれる。ここで用いられるマクロポアには、約５０μｍを超える平均直径を有する孔が含まれる。
【００１４】
スカフォールド１０を作製した後、埋植の前または埋植時に、スカフォールドの中に哺乳動物細胞を投与または播種する。哺乳動物細胞は、予期される用途や治療対象の疾病に応じて、血管組織や無血管組織から分離することができる。これらの細胞は、スカフォールドへの播種の前に、細胞数を増大させ、または所望のフェノタイプへの分化を誘導するため、当業者にとって公知の標準的な条件で培養することができる。別法として、分離した哺乳動物細胞を直接スカフォールド１０に注入し、ついで、埋植に先立って、適切な生体基質の増殖と沈着とを促進する条件下、インビトロで培養することもできる。本開示の恩恵を受ける当業者はこのような条件を容易に認識できるはずである。好ましい態様では、分離された細胞を直接スカフォールド１０に注入し、それ以後、インビボ埋植前にインビトロ培養は行わない。
【００１５】
本発明のスカフォールドは非生分解性であってもよい。すなわち、身体内で容易に分解され、分解した成分が身体内に吸収されまたは身体から排出され得るようなものでなくてもよい。この場合、当該繊維マットの繊維２０および／または多孔質のポリマー基質３０が非生分解性の材料を含んでいてもよい。他の態様では、本発明のスカフォールドは生分解性とすることができる。すなわち、身体により容易に分解され、生分解した成分が身体内に吸収されまたは身体から排出され得るものとすることができる。この場合、繊維マットとポリマー基質が共に生分解性の材料を含んでいてもよい。
【００１６】
繊維マットには、生体親和性を有する金属の非生分解性繊維や生体不活性のセラミックスや生分解性のガラスまたはセラミックスや、生分解性を有する、自己移植、同種移植、異種移植の骨組織を含めることができる。生体親和性を有する金属としては、ステンレススチール、コバルトクロム、チタンおよびチタン合金が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。上記生体不活性のセラミックスとしては、アルミナ、ジルコニアおよび硫酸カルシウムが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。上記生分解性のガラスまたはセラミックスとしてはリン酸カルシウムが挙げられる。
【００１７】
多孔質のポリマー基質または繊維マットには、非生分解性のポリマーを含めることができる。この非生分解性のポリマーとしては、ポリエチレン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シリコーン、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリウレタンが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００１８】
上記ポリマー基質には、生分解性のバイオポリマーを含めることができる。ここで用いられる用語「バイオポリマー」は、天然に生じるポリマーおよびその人工修飾体、またはそれらの誘導体を含むものと解されるものである。このようなバイオポリマーとしては、ヒアルロン酸、コラーゲン、組み替えコラーゲン、セルローズ、エラスチン、アルギネート、コンドロイチン硫酸、キトサン、キチン、ケラチン、シルク、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）およびこれらのブレンド物が挙げられる。ただし、これらによって限定されるわけではない。これらのバイオポリマーは、その機械的特性や分解特性を高めるために、架橋剤を導入し、あるいは、側鎖残基の疎水性を変化させることにより、さらに修飾することができる。
【００１９】
好ましい一態様では、繊維２０と多孔質の基質３０が生分解性のポリマーを含むことが好ましい。このことにより、複合スカフォールドインプラントデバイスは、身体によって完全に分解可能なものとなる。
【００２０】
このような生分解性のスカフォールドでは、哺乳動物細胞を播種した本発明に係る複合スカフォールドインプラントデバイスを構成する繊維マットと多孔質のポリマー基質の両方を造るために、種々の生分解性ポリマーを使用することができる。生体親和性を有する生分解性のポリマーの適切なものとしては、脂肪族ポリエステル、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、ポリアンハイドライドおよびポリフォスファゼンからなる群から選ばれたポリマーを挙げることができる。
【００２１】
現時点では、本発明に係る複合スカフォールドの作製に使用するための生分解性ポリマーとしては、脂肪族ポリエステルが好ましい。脂肪族ポリエステルはホモポリマーでもコポリマー（ランダム、ブロック、セグメント化、テーパーブロック、グラフト、三ブロック等）でもよく、線状、枝分かれまたはスター構造を有していてもよい。脂肪族ホモポリマーやコポリマーを作製するためのモノマーとして適切なものには、乳酸、ラクチド（Ｌ−，Ｄ−、メソ、およびＬ，Ｄ混合物を含む）、グリコール酸、グリコリド、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン、トリメチレンカーボネート、δ−バレロラクトン、β−ブチロラクトン、ε−デカラクトン、２，５−ジケトモルフォリン、ピバロラクトン、α，α−ジエチルプロピオラクトン、エチレンカーボネート、エチレンオキサレート，３−メチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン、３，３−ジエチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン、γ−ブチロラクトン、１，４−ジオキセパン−２−オン、１，５−ジオキセパン−２−オン、６，６−ジメチル−ジオキセパン−２−オンおよび６，８−ジオキサビシクロオクタン−７−オンからなる群から選ばれたものを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００２２】
本発明では、エラストマーコポリマーも特に有用である。エラストマーポリマーとして適切なものには、ポリマーの０．１グラム／デシリットル（ｇ／ｄＬ）ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）溶液を使用して２５℃で測定した場合のインヘレント粘度が約１．２ｄＬ／ｇ〜約４ｄＬ／ｇの範囲のものがある。約１．２ｄＬ／ｇ〜約２ｄＬ／ｇの範囲のものがより好ましい。約１．４ｄＬ／ｇ〜約２ｄＬ／ｇの範囲のものが非常に好ましい。さらに、適切なエラストマーは、良好な引っ張り強度と良好な回復特性を有しつつ、高い％伸度と低いモジュラスとを示す。本発明の好ましい態様では、複合スカフォールドを形成するエラストマーが約２００％を超える伸度を示す。好ましくは約５００％を超える伸度を示す。これらの伸長とモジュラスの特性に加えて、適切なエラストマーは、約５００ｐｓｉ（換算値は０．３５２ｋｇ／ｍｍ2 ）を超える引っ張り強度も有するべきである。約１，０００ｐｓｉ（換算値は０．７０４ｋｇ／ｍｍ2 ）を超える引っ張り強度が好ましい。また、約５０ｌｂｓ／ｉｎｃｈ（換算値は０．８９４ｋｇ／ｍｍ）を超える引き裂き強度を有するべきである。引き裂き強度は約８０ｌｂｓ／ｉｎｃｈ（換算値は１．４３０ｋｇ／ｍｍ）を超えるものであることが好ましい。
【００２３】
生分解性で生体親和性を有するエラストマーとしては、ε−カプロラクトンとグリコリドのエラストマーコポリマーで、ε−カプロラクトン対グリコリドのモル比が約３５／６５〜約６５／３５のもの、より好ましくは３５／６５〜４５／５５のもの、ε−カプロラクトンとラクチドのエラストマーコポリマーで、ε−カプロラクトン対ラクチドのモル比が約３５／６５〜約６５／３５のもの、より好ましくは３５／６５〜４５／５５のもの、ラクチドとグリコリドのエラストマーコポリマーで、ラクチド対グリコリドのモル比が約９５／５〜約８５／１５のもの、ｐ−ジオキサノンとラクチドのエラストマーコポリマーで、ｐ−ジオキサノン対ラクチドのモル比が約４０／６０〜約６０／４０のもの、ε−カプロラクトンとｐ−ジオキサノンのエラストマーコポリマーで、ε−カプロラクトン対ｐ−ジオキサノンのモル比が約３０／７０〜約７０／３０のもの、ｐ−ジオキサノンとトリメチレンカーボネートのエラストマーコポリマーで、ｐ−ジオキサノン対トリメチレンカーボネートのモル比が約３０／７０〜約７０／３０のもの、トリメチレンカーボネートとクリコリドのエラストマーコポリマーで、トリメチレンカーボネート対グリコリドのモル比が約３０／７０〜約７０／３０のもの、トリメチレンカーボネートとラクチドのエラストマーコポリマーで、トリメチレンカーボネート対ラクチドのモル比が約３０／７０〜約７０／３０のもの、またはそれらのブレンド物を例示できるが、これらに限定されるわけではない。
【００２４】
これらの脂肪族ポリエステルは、典型的には、開環重合で合成される。これらのモノマーは、一般的に、昇温して、有機金属触媒と開始剤との存在下、重合される。有機金属触媒としては、たとえばスタナスオクトエートのようなスズベースのものが好ましく、モノマー混合物中に、モノマー対触媒のモル比が約１０，０００／１〜約１００，０００／１の範囲で存在する。開始剤は、典型的には、（ジオールとポリオールとを含む）アルカノール、グリコール、ヒドロキシ酸またはアミンであり、モノマー混合物中に、モノマー対開始剤のモル比が約１００／１〜約５，０００／１の範囲で存在する。重合は、典型的には、約８０℃〜約２４０℃の温度範囲、好ましくは約１００℃〜約２２０℃の温度範囲で、所望の分子量と粘度とが達成できるまで行われる。
【００２５】
当業者ならば、複合スカフォールドを形成するのに適したポリマーまたはコポリマーの選択が、いくつかの因子に依存することが理解できよう。このスカフォールドを形成するために使用される適切なポリマーの選択における、より関連性のある因子としては、生分解（または生分解）速度論、インビボにおける機械的性能、細胞の付着、増殖、移動および分化の観点からの、材料に対する細胞の反応および生体親和性が挙げられる。ポリマーのインビトロおよびインビボ挙動をある程度まで支配するその他の関連因子としては、化学組成、構成要素の空間的分布、ポリマーの分子量および結晶化度が挙げられる。
【００２６】
身体環境内で時宜よく再吸収される材料基質の能力が重要である。しかしながら、インビボ条件における分解時間の相違も、二つの相異なるコポリマーを組み合わせる場合の基礎となり得る。たとえば、３５／６５のε−カプロラクトンとグリコリドのコポリマー（比較的速く分解するポリマー）を、４０／６０のε−カプロラクトンとラクチドのコポリマー（比較的遅く分解するポリマー）とブレンドし、複合スカフォールドを形成する。身体による複合スカフォールドの再吸収速度が、組織によるスカフォールドの置換速度に近似していることが好ましい。すなわち、複合スカフォールドの再吸収速度と組織によるスカフォールドの置換速度との比は、このスカフォールドに要求される構造的完全性が必要とされる期間維持されるようなものでなければならない。このようにすると、本発明のデバイスは、それぞれが、組織の再生や修復にとって好ましいか、有益であるかまたは必要である、生分解性、経時下における再吸収と構造的完全性の諸特性および組織の内殖を促進する能力をうまくバランスさせることができる。
【００２７】
他の一態様では、ポリマーブレンドを使用して、勾配のついた構造で一つの構成からもう一つの構成へ移行する構造体を形成することが好ましい。この勾配のついた構造を有する複合スカフォールドは、軟骨、たとえば、関節軟骨、半月板軟骨、鼻中隔軟骨、気管軟骨等の自然発生の組織の構造を修復または再生するためのヒト組織工学用途に特に有利である。たとえば、ε−カプロラクトンとグリコリドのエラストマーコポリマーとε−カプロラクトンとラクチドのエラストマーコポリマーとを（たとえば、約５／９５のモル比で）ブレンドすることにより、柔軟なスポンジ状の材料からより硬質の材料に、軟骨から骨への移行と同様の仕方で移行するスカフォールドを形成することができる。この開示の利益を享受する当業者ならば、類似の勾配の効果を得るために、または、異種の勾配、たとえば異なる分解プロフィール、ストレス応答プロフィールまたは異なる弾性度を与えるために、他のポリマーブレンドを使用できることが理解できよう。
【００２８】
本発明の多孔質の基質３０によりカプセル封入された繊維２０には、スレッド（thread）、ヤーン、ネット、レース、フェルトおよび不織材から選ばれた形状の繊維が含まれる。繊維２０は、不織繊維マットの形状になっていることが好ましい。本発明の複合スカフォールドの不織繊維マットの作製には公知のウエットレイ（wet-lay）またはドライレイ（dry-lay）の加工技術を使用できる。
【００２９】
他の一態様では、複合スカフォールドの不織繊維マットを形成する繊維は、生分解性のガラスから造られる。紡糸してガラス繊維にでき、繊維マットの作製に使用できる材料の例としては、バイオガラス、シリケート含有リン酸カルシウムガラスまたは、分解時間を制御するために種々の量の鉄粒子を添加したリン酸カルシウムガラスを挙げることができる。
【００３０】
複合スカフォールドの不織繊維マットを形成する繊維には、生分解性のポリマー、コポリマーまたはこれらのブレンド物が含まれることが好ましい。生分解性ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）またはそれらのコポリマーおよびブレンド物からなる群から選ぶことができる。
【００３１】
熱処理を用い、複合スカフォールドの不織繊維マットの繊維を他のポリマーと融合させることにより、複合スカフォールドの不織マットの構造的完全性をさらに高めることができる。たとえば、粉体状のポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）のような生分解性の熱可塑性ポリマーまたはコポリマーを不織繊維マットに添加し、ついで、繊維の構造に影響を与えず、ＰＣＬ粒子を融解させる温和な熱処理に供することができる。この粉体は融点が低く、後の工程で結着剤として作用し、不織繊維マットの引っ張り強度と剪断強度とを高める。ＰＣＬの微粒子の粉体のサイズとしては、直径が１０μｍ〜５００μｍの範囲にあることが好ましい。直径が１０μｍ〜１５０μｍの範囲にあることがより好ましい。結着剤としては、さらに、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）およびポリグリコール酸（ＰＧＡ）からなる群から選ばれた生分解性のポリマーバインダーを含めることができる。
【００３２】
別法として、スプレー法により、あるいは他の生分解性ポリマーの溶液中で不織マットをディップコーティングすることにより、これらの繊維を互いに融着させることもできる。
【００３３】
共押し出しにより芯／鞘構造を有するフィラメントを製造し、不織マットを形成する態様もある。このようなフィラメントには、生分解性のポリマーの鞘が他の生分解性のポリマーを含む一以上の芯を囲むものを含めることができる。組織の内殖に広範な保持体が必要な事例には、速分解性の鞘が遅分解性の芯を囲むフィラメントが好ましい場合がある。
【００３４】
本発明の多孔質基質３０はポリマー発泡体の形状が好ましい。複合スカフォールドインプラントデバイスのポリマー発泡体は、当業者によく知られた種々の技術により形成することができる。たとえば、出発ポリマー材料を、凍結乾燥、超臨界溶媒発泡、ガス注入押し出し、ガス注入射出成形により、あるいは抽出可能な材料（たとえば、塩、砂糖またはこれらに類似の適当な材料）と共に注型成形して発泡させることができる。
【００３５】
本発明の複合スカフォールドデバイスのポリマー発泡体基質を、凍結乾燥のようなポリマー−溶媒間相分離技術により作製できる態様もある。しかしながら、一般的に、ポリマー溶液は、次の四つの技術の内のどれか一つで二層に分離することができる。（ａ）熱的に誘導されるゲル化／結晶化、（ｂ）非溶媒で誘導される溶媒とポリマー相の分離、（ｃ）化学的に誘導される相分離、（ｄ）熱的に誘導されるスピノーダル分解の四つである。ポリマー溶液は、制御された仕方で、二つの全く別個の相または二つの共連続相に分離される。これに続いて溶媒相を除去すると、通常、バルクポリマーの密度より小さい密度とマイクロメータ領域の孔とを有する多孔質の基質が得られる。
【００３６】
これらの発泡体の作製に関与するステップには、凍結乾燥すべきポリマーのための適切な溶媒の選択とこの溶媒によるポリマーの均一溶液の作製とが含まれる。ポリマー溶液は、ついで、凍結と真空乾燥のサイクルに供せられる。凍結ステップではポリマー溶液が相分離され、真空乾燥ステップでは、昇華および／または乾燥により溶媒が除去され、多孔質のポリマー基質または、孔が相互に結合した、オープンセル型の多孔発泡体が残される。
【００３７】
発泡スカフォールド要素の作製に使用することができる適切な溶媒としては、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、環状エーテル（たとえば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびジメチレンフルオリド（ＤＭＦ）、アセトン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、１，４−ジオキサン、ジメチルカーボネート、ベンゼン、トルエン、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、クロロホルムおよびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これらの溶媒の中でも、１，４−ジオキサンが好ましい溶媒である。この溶媒によるポリマーの均一溶液は標準的な技術を用いて作製される。
【００３８】
複合スカフォールドの不織マットの繊維は溶解せず、ポリマー発泡体の生分解性のポリマーのみを溶解する溶媒系が好ましいことは、当業者ならば理解できよう。
【００３９】
適用できるポリマーの濃度や使用できる溶媒の量はそれぞれのシステムごとに異なる。一般的に、溶液中のポリマー量は約０．５重量％〜約９０重量％の範囲にあり、好ましくは、所与の溶媒中でのポリマーの溶解度や発泡体スカフォールド中で希望される最終特性のごとき因子に依存して、約０．５重量％〜約３０重量％の範囲にある。
【００４０】
生成する発泡体の表面組成を変更するためにポリマー−溶媒系に固体を添加できる態様もある。添加された粒子が溶媒から底表面に沈積すると、発泡したポリマー材料ではなく、添加した固体の組成を有する領域が造られる。別法として、添加した固体を、作製される複合スカフォールドの所望の領域（たとえば、上部、側面部または底部近傍）により濃縮させ、これにより、これらのすべての領域で組成変化を生じさせることもできる。たとえば、磁性材料から造られたモールド中に置いた溶液中に金属の固体を添加すること（またはこの逆）により、選択した場所における固体の濃縮を実現することができる。
【００４１】
ポリマー−溶媒系には種々のタイプの固体を添加できる。固体はポリマーまたは溶媒と反応しないタイプのものであることが好ましい。一般的に、添加される固体は、約１ｍｍ未満の平均直径を有する。約５０μｍ〜約５００μｍの平均直径であることが好ましい。固体は、好ましくは、粒子とポリマー−溶媒混合物の全体積を１００体積％とした場合に、その約１体積％〜約５０体積％を構成するような量で存在する。
【００４２】
固体としては、鉱質除去処理した骨の粒子、リン酸カルシウム粒子、骨の修復用のバイオガラス粒子または炭酸カルシウム粒子、孔形成用の浸出可能な固体および、溶媒系に不溶で、補強材料として効果的であり、または分解される際に孔を形成する、生分解性のポリマーの粒子、非生分解性の材料および生体由来の生分解性の材料が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４３】
浸出可能な固体の適切なものとしては、塩（たとえば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酒石酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等）、生体親和性のある単糖類および二糖類（たとえば、グルコース、フルクトース、デキストロース、マルトース、ラクトースおよびスクロース）、多糖類（たとえば、デンプン、アルギネート、キトサン）、水溶性蛋白質（たとえば、ゼラチンおよびアガロース）等の無害で浸出可能な材料が挙げられる。浸出可能な材料は、その浸出可能な材料を有する発泡体を、十分な時間が与えられると粒子が溶解して、実質的にすべての粒子が浸出できるが、発泡体を溶解せずあるいは発泡体に有害な変化を与えない溶媒中に浸漬することにより除去することができる。好ましい抽出溶媒としては水が挙げられる。非常に好ましくは、蒸留脱イオン水である。発泡体は、発泡体の分解を促進することが望まれる場合の他は、その加水分解を最小限にとどめるため、浸出処理が完了した後、低温および／または真空下乾燥することが好ましい。
【００４４】
適切な非生分解性の材料としては、ステンレススチール、コバルトクロム、チタンおよびチタン合金のような生体親和性を有する金属および生体不活性セラミックス粒子（たとえば、アルミナ粒子およびジルコニア粒子）が挙げられる。さらに、非生分解性材料には、ポリエチレン、ポリビニルアセテート、ポリメチルメタクリレート、シリコーン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリウレタンおよび天然のバイオポリマー（たとえば、セルローズ粒子、キチン、ケラチン、シルクおよびコラーゲン粒子）およびフッ素化ポリマーやコポリマー（たとえば、ポリフッ化ビニリデン）等のポリマーを含めることができる。
【００４５】
複合スカフォールドを放射線に対し不透過性とする固体（たとえば硫酸バリウム）を添加することもできる。添加することのできる固体には、組織の再生と再増殖とを促進するものや、バッファ、補強材または多孔性変更剤として作用するものを含めることもできる。
【００４６】
適切な生体物質としては、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、アルギネート、コンドロイチン硫酸、キトサンおよびこれらのブレンド物の固体粒子が挙げられる。これらの固体には、生体材料の構造体の全体または完全な構造体内に見出される生体活性フラグメントを含めることができる。
【００４７】
本発明の複合スカフォールドには、目標とする組織のための埋植に先立って、哺乳動物細胞が播種されるか培養される。複合スカフォールドに播種されあるいはそこで培養される細胞としては、骨髄細胞、平滑筋細胞、間質細胞、幹細胞、間葉幹細胞、滑膜由来の幹細胞、胚幹細胞、血管細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪組織に由来する前駆細胞、骨髄由来の前駆細胞、腎臓細胞、腸細胞、膵島（islet）、β細胞、セルトリ細胞、末梢血前駆細胞、線維芽細胞、グロムス細胞、ケラチン生成細胞、髄核細胞、線維輪細胞、線維軟骨細胞、成人の組織から分離した幹細胞、卵円形細胞、神経幹細胞、グリア細胞、マクロファージおよび遺伝的に形質転換した細胞または上記の細胞の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。細胞は、スカフォールドに、埋植直前の短時間（＜１日）で播種できるが、埋植に先立って、播種されたスカフォールド内で、細胞の増殖と細胞外基質の合成ができるように、より長期間（＞１日）培養することもできる。
【００４８】
埋植の部位は、治療を要する疾病／傷害組織に依存する。たとえば、関節軟骨、半月板および骨の構造的欠陥を治療するためには、損傷を受けた組織の修復を促進するため、細胞を播種した複合スカフォールドを欠陥部位に設置する。
【００４９】
別法として、糖尿病のような疾病の治療には、細胞を播種したスカフォールドを、皮下間隙や網のような臨床的に便利な部位に設置してもよい。この特定の場合、複合スカフォールドは、異所性部位にインビボの移植を行った後、投与された膵島をその場に捕らえておく（entrap）ための媒介体として作用する。
【００５０】
投与された細胞の位置決めは、糖尿病の治療に著しい利益をもたらす。本発明の細胞を播種した複合スカフォールドが、膵島を長期間適切に機能させるために必須の栄養分の輸送やグラフトの血管新生のための多孔質構造体を提供すると共に、細胞相互間の接触を強制することになるからである。
【００５１】
門脈循環の流れに膵島を注入することによるこれまでの膵島の直接移植の試みは、糖尿病の長期の治療には不十分であった。さらに、同種のまたは異種の膵島を生分解性のまたは非分解性のミクロスフェアでカプセル封入する方法の多くは、血糖レベルの長期間のコントロールを維持できなかった。これらの失敗は、移植された膵島の不十分な血管系および／または免疫の拒絶反応に起因するものであった。
【００５２】
投与された異種または同種の膵島を、同種または異種のセルトリ細胞と共に使用すると、これらの失敗を回避できる場合がある。セルトリ細胞は、膵島の生存と移植された膵島の免疫反応の防止に役立ち得る。異種、同種または形質転換したセルトリ細胞は、同種または異種の膵島を免疫保護すると共に、腎臓被膜中で自分自身を保護できる。本発明の細胞を播種した複合スカフォールドは、セルトリ細胞や膵島を共播種され、皮下に埋植された場合、アクセスの困難な臨床的部位である腎臓被膜の使用を回避できる。複合スカフォールドは、血管新生床が生成できる環境を提供すると共に、二つの細胞タイプのものをともに位置決めして、セルトリ細胞が近傍にある膵島を免疫保護できるようにすることができる。
【００５３】
別法として、異所性部位に移植する前の複合スカフォールドでセルトリ細胞を培養し、ついで、ある程度時間をおいてから、膵島をグラフトの部位に投与する方法もある。他の一態様では、膵島とセルトリ細胞をインビボの移植に先立って、同時に、複合スカフォールドに注入することもできる。さらに他の一態様では、スカフォールドへの注入前に、膵島またはセルトリ細胞を、ヒアルロン酸、コラーゲンまたはアルギネートのようなバイオポリマー、商品名MATRIGEL（コラボラティブバイオメディカルプロダクト社（Collaborative Biomedical Products, Inc.），ベッドフォード，マサチューセッツ州））で販売されているコラーゲン／ラミニン材料、あるいは、ポリエチレングリコールのような合成ポリマー、ポリエチレングリコールとポリリシンのコポリマー、アルキドポリエステルのヒドロゲルまたはこれらの組み合わせ中に懸濁させることができる。
【００５４】
中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷の場合、複合スカフォールドは、成人の神経幹細胞、胚幹細胞、グリア細胞およびセルトリ細胞の組み合わせにより播種することができる。この好ましい一態様では、形質転換細胞、異種または同種の細胞由来のセルトリ細胞を神経幹細胞と組み合わせて、複合スカフォールドに播種できる。これらのセルトリ細胞は、幹細胞の添加とその後の損傷部位への埋植に先立って、所定期間、複合スカフォールドで培養することができる。この手法では、ＣＮＳへ細胞療法を適用する場合の主要な障碍の一つを回避できる。すなわち、移植後の幹細胞の生存が可能となる。多くのセルトリ細胞を捕らえておく（entrap）複合スカフォールドは、幹細胞の生存により好ましい環境を提供できる。
【００５５】
本発明のさらに他の一態様では、細胞を播種した複合スカフォールドは、物理的または化学的手段により、目標とするタイプの細胞の付着、増殖、分化および細胞外基質の合成を促進する生物学的因子または合成因子（synthetic factor）を含むように修飾することができる。さらに、生物学的因子に所望の生物学的機能を顕在化させるために、この因子の放出を調節するための複合スカフォールド部分を含めることもできる。内因性の生長因子の上方制御に影響する小分子を供給することを含む他の一態様もある。本発明の基質と共に使用できる、生長因子、細胞外基質蛋白質および生物学的に関連するペプチドフラグメントには、ＴＧＦ−β１，２，３等のＴＧＦ−β群のもの、骨の形態形成蛋白質（ＢＭＰ−２，−４，−６，−１２，−１３）、線維芽細胞成長因子−１，−２、血小板由来の生長因子−ＡＡ，−ＢＢ、高血小板血漿、インスリン生長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、生長分化因子（ＧＤＦ−５，−６，−８，−１０）、血管内皮細胞由来の生長因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリン、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ，−ＩＩ、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来のペプチド、ラミニン、フィブロネクチンやビトロネクチン等の接着性細胞外基質蛋白質の細胞結合領域およびヘパリン結合領域を含む生体ペプチドおよびそれらの組み合わせを含めることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００５６】
生物学的因子は、商業ソースから入手することも、組織から分離し、精製して得ることもできる。
【００５７】
さらに、細胞を播種した複合スカフォールドを構成するポリマーやブレンド物は、治療薬、医薬品またはリリースデポー剤（release depot）として使用することができる。本発明と関連して使用できる種々異なる治療薬の範囲は広い。一般的に、本発明の構成により投与できる治療薬には、抗拒絶反応剤、鎮痛剤、酸化防止剤、エリスロポエチンのような抗細胞消滅剤、抗腫瘍壊死因子αのような抗炎症剤、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１５４、ｐ３８キナーゼ抑制因子、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ抑制因子、抗ＣＤ２８、アセトアミノフェン、ラパマイシン等の細胞増殖抑制剤、抗ＩＬ２剤およびこれらの組み合わせを含めることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００５８】
このリリースデポー剤を形成するには、複合スカフォールドを形成する前に、ポリマーを治療薬と混合することができる。別法として、治療薬をポリマーにコーティングすることができる。薬学的に使用可能なキャリアを用いてコーティングすることが好ましい。ポリマーを溶解しないものならばどのような医薬キャリアを使用してもよい。治療薬は、液体、細分した固体またはその他の適当な物理的形態とすることができる。典型的には、デポー剤に、希釈剤、キャリア、賦形剤、安定剤等の一つ以上の添加剤を、必要に応じて含めることができる。
【００５９】
治療薬の量は、採用される特定の薬剤および治療の医学的条件に依存して決まる。治療薬の量は、典型的には、デポー剤の約０．００１重量％〜約７０重量％、より典型的には約０．００１重量％〜約５０重量％、もっとも典型的には約０．００１重量％〜約２０重量％である。治療薬供給用のデポー剤に組み込まれるポリマーの量とタイプとは、希望するリリースのプロフィールと使用される剤の量とに依存して変わる。
【００６０】
他の一態様では、本発明の細胞を播種された複合スカフォールドが、連続した期間または長期間、分散された治療薬の放出を同時に伴いつつ、（主として加水分解による）分解を徐々に受けるようにすることができる。これにより、有効量の薬剤供給、たとえば０．０００１ｍｇ／ｋｇ／時間〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間の治療薬の供給が、たとえば１時間〜５，０００時間、好ましくは２時間〜８００時間可能となる。この投薬形態では、治療を受ける患者、苦痛の大きさ、処方を決める医師の判断等に応じて、必要なだけ投与される。その後、または類似の処置の後は、当業者ならば各種の製剤を調合できる。
【００６１】
インプラントの構造は、組織の内殖を効果的に促進できなければならない。組織の内殖を促進する構造は、複合スカフォールド要素の孔が開放型であり、その中で細胞が生長できるのに十分なサイズを有するものが好ましい。効果的な孔のサイズは、孔が約５０μｍ〜約１，０００μｍの範囲の平均直径を有する場合である。孔が約５０μｍ〜約５００μｍの範囲の平均直径を有することがより好ましい。
【００６２】
本発明の原理とその実際のやり方を次の例で説明する。ただし、これらの例は、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の範囲と精神を逸脱せずに、種々の付加的態様が可能であることは、当業者にとって明白である。
【００６３】
これらの例において、ポリマーやモノマーについては、化学的組成と純度（ＮＭＲ，ＦＴＩＲ）、熱分析（ＤＳＣ）および慣用的分析技術による分子量の測定を行った。
【００６４】
ポリマーとコポリマーのインヘレント粘度（Ｉ．Ｖ．，ｄＬ／ｇ）は、３０℃に温度調節された温水バス中に浸漬し、５０口径のカノン−ウベローデ（Cannon-Ubbelhode）希釈粘度計を使用し、クロロホルムまたはヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を溶媒として、０．１ｇ／ｄＬの濃度で測定した。
【００６５】
これらの例では略号を使用した。ＰＣＬはε−カプロラクトンの重合体、ＰＧＡはグリコリドの重合体、ＰＬＡは（Ｌ）ラクチドの重合体、ＰＤＯはｐ−ジオキサノンの重合体である。さらに、コポリマーの識別表示の前に付けた割合はそれぞれの構成要素のモル％を表す。
【実施例１】
【００６６】
（複合スカフォールドの作製）
９０／１０のＰＧＡ／ＰＬＡ繊維から構成されたニードルパンチ不織マット（厚さ２ｍｍ）を下記のようにして作製した。ＰＧＡ／ＰＬＡ（９０／１０）コポリマーを溶融押し出しし、ヤーンを造る慣用的方法により、連続マルチフィラメントヤーンとし、ついで、配向して、強度、伸度および破断に要するエネルギーを高めた。このヤーンは直径が約２０μｍのフィラメントからなっていた。これらのヤーンを一様な２インチ（換算値は５．０８ｃｍ）の長さに切断、捲縮して、２インチの長さのステープルファイバーとした。
【００６７】
ついで、この９０／１０のＰＧＡ／ＰＬＡコポリマーのステープルファイバーを使用して、ドライレイのニードルパンチ不織マットを作製した。このステープルファイバーを標準の不織材製造装置で、開繊しカージングした。このようにして得たマットは、ウエブ状の（webbed）ステープルファイバーとなっていた。このウエブ状のステープルファイバーにニードルパンチ処理を施し、ドライレイのニードルパンチ不織繊維マットを得た。
【００６８】
このマットは、酢酸エチルで６０分間、ゴシゴシ洗い、ついで、真空下で乾燥した。
【００６９】
ついで、凍結乾燥により発泡体とするためのポリマーの溶液を作製した。発泡体要素を製造するために使用するポリマーは、バーミンガムポリマーズ社（Birmingham Polymers Inc.）（バーミンガム、アラバマ州）が製造した、Ｉ．Ｖ．が１．４５ｄＬ／ｇの３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡコポリマーであった。３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡを、１，４−ジオキサン溶媒中に、前者と後者の割合が重量比５／９５となるように秤量した。ポリマーと溶媒をフラスコに入れ、ついで、このフラスコを水浴に入れ、７０℃で５時間撹拌して、溶液を作製した。ついで、この溶液を、円筒ろ紙（特に粗い孔の（extra coarse porosity）、ＡＳＴＭ  １７０−２２０タイプ（ＥＣ））を使用してろ過し、フラスコに貯えた。
【００７０】
実験室スケールの凍結乾燥機またはフリーズドライヤー（モデル  デュラドライ（Duadry）、エフティーエス・キネチックス社（FTS Kinetics），ストーンリッジ（Stone Ridge），ニューヨーク）を使用して、複合スカフォールドを作製した。ニードルパンチ不織マットを４インチ（換算値は１０．１６ｃｍ）×４インチのアルミニウムモールド中に置いた。モールド中にポリマー溶液を加え、この溶液が不織マットを覆い、モールド内で２ｍｍの高さになるようにした。
【００７１】
ついで、このモールドアセンブリを凍結乾燥機の棚に置き、凍結乾燥のサイクルを開始した。この例では、凍結乾燥のサイクルは、１）−１７℃で６０分間、２）１００ｍＴ（換算値は１３．３Ｐａ）の真空下、−５℃で６０分間、３）２０ｍＴ（換算値は２．７Ｐａ）の真空下、５℃で６０分間、４）２０ｍＴの真空下、２０℃で６０分間であった。
【００７２】
このサイクルが完了した後、モールドアセンブリをフリーズドライヤーから取り出し、真空フード中で２時間〜３時間掛けて脱揮した。ついで、複合スカフォールドを窒素下に保存した。
【００７３】
このようにして得たスカフォールドでは、不織繊維マットが、ポリマー発泡体基質によってカプセル封入され、その中に配されていた。スカフォールドの厚さは、約１．５ｍｍであった。図１は、複合スカフォールドの切断面の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。このＳＥＭには、凍結乾燥によって作製された発泡体スカフォールドが、不織繊維を囲み、カプセル封入していることが明確に示されている。
【実施例２】
【００７４】
（複合スカフォールドの作製）
凍結乾燥により発泡体としたポリマーが、バーミンガムポリマーズ社、バーミンガム、アラバマ州が製造した、Ｉ．Ｖ．が１．４５ｄＬ／ｇの６０／４０のＰＬＡ／ＰＣＬコポリマーである以外は実施例１の処理と同様にして、生分解性複合スカフォールドを作製した。この複合スカフォールドの孔サイズは、水銀ポロシメトリー分析法で決定した。孔サイズは１μｍ〜３００μｍの範囲にあり、メジアン孔サイズは４５μｍであった。
【実施例３】
【００７５】
（複合スカフォールドの作製）
凍結乾燥により発泡体としたポリマーが、バーミンガムポリマーズ社、バーミンガム、アラバマ州が製造した、Ｉ．Ｖ．がそれぞれ１．５０ｄＬ／ｇと１．４５ｄＬ／ｇの、６０／４０のＰＬＡ／ＰＣＬコポリマーと３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡコポリマーとの５０：５０ブレンド物である以外は実施例１の処理と同様にして、生分解性複合スカフォールドを作製した。
【実施例４】
【００７６】
（複合スカフォールドの作製）
凍結乾燥により発泡体としたポリマーが、Ｉ．Ｖ．が１．５０ｄＬ／ｇの６０／４０のＰＬＡ／ＰＣＬ（バーミンガムポリマーズ社、バーミンガム、アラバマ州）とＩ．Ｖ．が１．７８ｄＬ／ｇの８５／１５のＰＬＡ／ＰＧＡ（ピュラック社（Purac），リンコルシャイン（Lincolshine），イリノイ州）との７０：３０ブレンド物である以外は実施例１の処理と同様にして、生分解性複合スカフォールドを作製した。
【実施例５】
【００７７】
（複合スカフォールドの作製）
凍結乾燥により発泡体としたポリマーが、Ｉ．Ｖ．が１．５０ｄＬ／ｇの６０／４０のＰＬＡ／ＰＣＬ（バーミンガムポリマーズ社、バーミンガム、アラバマ州）とＩ．Ｖ．が１．７８ｄＬ／ｇの８５／１５のＰＬＡ／ＰＧＡ（ピュラック社，リンコルシャイン，イリノイ州）との３０：７０ブレンド物である以外は実施例１の処理と同様にして、生分解性複合スカフォールドを作製した。
【実施例６】
【００７８】
（複合スカフォールドの作製）
凍結乾燥により発泡体としたポリマーが、Ｉ．Ｖ．が１．５０ｄＬ／ｇの６０／４０のＰＬＡ／ＰＣＬ（バーミンガムポリマーズ社、バーミンガム、アラバマ州）とＩ．Ｖ．が１．７８ｄＬ／ｇの８５／１５のＰＬＡ／ＰＧＡ（ピュラック社，リンコルシャイン，イリノイ州）との５０：５０ブレンド物である以外は実施例１の処理と同様にして、生分解性複合スカフォールドを作製した。
【実施例７】
【００７９】
（複合スカフォールドの作製）
ドライレイのニードルパンチ不織マットをＰＤＯ繊維から構成した以外は実施例１の処理と同様にして、生分解性複合スカフォールドを作製した。
【実施例８】
【００８０】
（複合スカフォールドの作製）
ドライレイのニードルパンチ不織マットをＰＧＡ繊維から構成した以外は実施例１の処理と同様にして、生分解性複合スカフォールドを作製した。
【実施例９】
【００８１】
（複合スカフォールドの作製）
ドライレイのニードルパンチ不織マットをＰＧＡ繊維から構成した以外は実施例４の処理と同様にして、生分解性複合スカフォールドを作製した。
【実施例１０】
【００８２】
（細胞を播種した複合スカフォールドの作製）
この例は、複合スカフォールド中のポリマー発泡体またはドライレイのニードルパンチ不織マットの構成が、軟骨細胞のインビトロの反応に影響を与えたことを示すものである。
【００８３】
原始（primary）軟骨細胞を、ブッシュマン等（Buschmann），「ジャーナル・オルソプ・レス（J. Orthop. Res.）」，第１０巻，７４５頁，１９９２年の記述に従い、牛の肩から分離した。牛の軟骨細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２０μｇ／ｍＬのＬ−プロリン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢ（生長媒質）を加えたダルベッコ（Dulbecco）の改良イーグル（eagles）培地（ＤＭＥＭ−高グルコース）中で培養した。培地の半分を一日おきに補充した。
【００８４】
複合スカフォールドを、実施例１，４，８，９の記述に従って作製した。直径５ｍｍ、厚さ１．５ｍｍのスカフォールドを、７０％エタノール中で２０分間殺菌し、ついで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５回すすいだ。
【００８５】
新たに分離したウシの軟骨細胞を、それぞれのスカフォールドに細胞の懸濁液（１５μＬ）を添加することにより、２４ウエルの低クラスターシャーレに、１スカフォールドあたり５×１０6 個の細胞濃度で播種した。細胞は１．５ｍＬの培地の添加前に３時間スカフォールドに付着させた。スカフォールドは、細胞培養シャーレ中で７日間培養してから、サンプルの半分を回転バイオリアクターに移し、残りのスカフォールドを静止条件で培養した。この研究のために、ＮＡＳＡで開発された、微小重力をシミュレートした低回転ラテラルベッセル（Slow Turning Lateral Vessel, STLV）回転バイオリアクター（シンセコン社（Synthecon, Inc.），ヒューストン，テキサス州）を使用した。それぞれのバイオリアクターには、細胞を入れた四つのスカフォールドを積載し、容器の回転速度を細胞を播種したスカフォールドの重量の増大に合わせて調節した。スカフォールドは連続自由落下の段階に維持した。スカフォールドを、ＣＯ2 が５％、空気が９５％の雰囲気中、３７℃の加湿インキュベータで６週間までインキュベートした。バイオリアクターの培養株のため、培地の半分（〜５０ｍＬ）を一日おきに入れ替えた。６ウエルのシャーレ中に維持した静止状態の培養株には、一日おきに培地（５ｍＬ）を供給した。それぞれの時点で三つのサンプルについて組織染色で評価した。種々の時点（１，７，２１，４２日）で回収したスカフォールドは、１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンで埋包し、ツアイス（Zeiss）のミクロトームを使用して、切片を造った。ポリマースカフォールド中の細胞の分布は、細胞の播種の２４時間後、スカフォールドの断面のヘマトキシリン染色により評価した。さらに、サフラニン−Ｏを使用して、切片を、硫酸化プロテオグリカン（ＳＯ；硫酸化ＧＡＧ’ｓ）の存在確認についても染色し、タイプＩおよびタイプＩＩのコラーゲンについて、免疫組織化学的染色をおこなった。免疫染色の特異性を検証するため、生のウシの軟骨と皮膚についても、タイプＩおよびタイプＩＩのコラーゲンに関する染色を行った。タイプＩＩのコラーゲンは軟骨様基質の指標として、タイプＩのコラーゲンは、線維状基質の指標として使用した。コンピュータ像は、ニコン社のＣＣＤビデオカメラを備えたニコン社のマイクロフォト−ＦＸＡ（Microphot-FXA）顕微鏡（ニコン、日本国）を使用して得た。
【００８６】
バイオリアクター条件で６週間培養した、実施例１，４，８，９で作製した複合スカフォールドの組織学的切片（１００×）を得た。実施例４から得た、９０／１０のＰＧＡ／ＰＬＡ不織繊維を含んだ複合スカフォールドは、実施例９から得た、１００％のＰＧＡ不織繊維を含んだ複合スカフォールドに比し、細胞の分布とプロテオグリカンの生成とが均一であった。しかしながら、バイオリアクター条件で６週間培養した、実施例１，８で形成した二つの複合スカフォールドの組織学的断片については、ＧＡＧの生成と細胞の分布とに著しい相違は示されなかった。このことは、複合スカフォールドの発泡体要素と不織材要素との構成が細胞の分布と細胞外基質の生成とに影響を与え得ることを示している。
【００８７】
要約すると、細胞の移動とスルホン化プロテオグリカン基質の沈着が、不織繊維マットをカプセル封入した発泡体スカフォールドの構造により支持されていた。
【実施例１１】
【００８８】
（細胞を播種した複合スカフォールドの生成）
この例は、複合スカフォールド中のポリマー発泡体またはドライレイのニードルパンチ不織マットの構成が、セルトリ細胞のインビトロの反応に影響を与えたことを示すものである。
【００８９】
セルトリ細胞は、９日齢〜１２日齢の雄のＢａｌｂ／ｃマウスの精巣から得た。精巣はハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中に集め、刻んで１ｍｍの細片とし、ＨＢＳＳ中、３７℃下、コラゲナーゼ（２．５ｍｇ／ｍＬ，シグマタイプＶ）で１０分間消化させた。消化物は、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡと０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含まないＨＢＳＳで三回すすぎ、ＨＢＳＳ中、３７℃下、トリプシン（２５μｇ／ｍＬ，ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））とＤＮＡ分解酵素（４μｇ／ｍＬ，ベーリンガーマンハイム）とで１０分間消化させ、ついで、ＨＢＳＳ中で四回洗浄した。最終の細胞ペレットは、１０％の熱的に不活化したウマの血漿を加えた、Ｍ１９９培地（ギブコライフテクノロジーズ（Gibco Life Technologies，ロックビル，メリーランド州）中に再分散し、５００μｍのフィルターでろ過し、超低クラスターシャーレ（コーニング社（Corning Inc.），コーニング，ニューヨーク州）で２日間培養して、セルトリ細胞を凝集させた。
【００９０】
スカフォールドを実施例１のように作製し、１２０万のマウスセルトリ細胞を播種し、１０％の熱的に不活化したウマの血漿とペニシリンとストレプトマイシンとを加えたＭ１９９培地で３週間培養した。３週間後、これらのデバイスを、１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで埋包し、ツアイスのミクロトームを使用して切片を造った。この構造物中の細胞の分布は、ヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色により評価した。図２は、セルトリ細胞を有するスカフォールドのＨ＆Ｅ切片を示している。
【００９１】
本発明の具体的な実施態様は以下の通りである。
（１）前記スカフォールドが生分解性を有する、請求項１に記載のスカフォールド。
（２）前記ポリマー基質が生分解性のポリマーからなる群から選ばれたポリマーを含み、前記繊維からなるマットが、リン酸カルシウムを含む生分解性ガラスとセラミックスおよび生分解性ポリマーからなる群から選ばれた材料を含む繊維を含有する、請求項１に記載のスカフォールド。
（３）前記ポリマー基質および前記繊維からなるマットが、生分解性ポリマーを含む、実施態様（２）に記載のスカフォールド。
（４）前記生分解性ポリマーが、脂肪族ポリエステル、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、ポリアンハイドライドおよびポリフォスファゼンのホモポリマーおよびコポリマーからなる群から選ばれたものである、実施態様（３）に記載のスカフォールド。
（５）前記繊維からなるマットが９０／１０のポリグリコリド／ポリ乳酸のコポリマーを含む、実施態様（４）に記載のスカフォールド。
【００９２】
（６）前記繊維からなるマットがポリジオキサノンを含む、実施態様（４）に記載のスカフォールド。
（７）前記ポリマー基質が、ポリ乳酸／ポリグリコリドのモル比が約９５／５〜約８５／１５の範囲のポリ乳酸とポリグリコリドのコポリマーを含む、実施態様（４）に記載のスカフォールド。
（８）前記多孔質のポリマー基質が、ポリカプロラクトン／ポリグリコリドのモル比が約３５／６５〜約４５／５５の範囲のポリカプロラクトンとポリグリコリドのコポリマーを含む、実施態様（５）に記載のスカフォールド。
（９）前記多孔質のポリマー基質が発泡体を含む、実施態様（８）に記載のスカフォールド。
（１０）前記多孔質のポリマー基質が、ポリ乳酸／ポリカプロラクトンのモル比が約３５／６５〜約６５／３５の範囲のポリ乳酸とポリカプロラクトンのコポリマーを含む、実施態様（４）に記載のスカフォールド。
【００９３】
（１１）前記繊維からなるマットが、スレッド、ヤーン、ネット、レース、フェルトおよび不織材からなる群から選ばれた形状の繊維を含む、請求項１に記載のスカフォールド。
（１２）前記哺乳動物細胞が、骨髄細胞、平滑筋細胞、間質細胞、幹細胞、間葉幹細胞、滑膜由来の幹細胞、胚幹細胞、血管細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪組織に由来する前駆細胞、骨髄由来の前駆細胞、腎臓細胞、腸細胞、膵島、β細胞、セルトリ細胞、末梢血前駆細胞、線維芽細胞、グロムス細胞、ケラチン生成細胞、髄核細胞、線維輪細胞、線維軟骨細胞、成人の組織から分離した幹細胞、卵円形細胞、神経幹細胞、グリア細胞、マクロファージおよび遺伝学的に形質転換した細胞からなる群から選ばれたものである、請求項１に記載のスカフォールド。
（１３）前記細胞が、膵島とセルトリ細胞とからなる群から選ばれたものである、実施態様（１２）に記載のスカフォールド。
（１４）前記細胞が、成人の神経幹細胞、胚幹細胞およびグリア細胞からなる群から選ばれたものである、実施態様（１２）に記載のスカフォールド。
（１５）さらに、生物学的因子を含む、請求項１に記載のスカフォールド。
【００９４】
（１６）前記生物学的因子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、線維芽細胞成長因子−１、線維芽細胞成長因子−２、血小板由来の生長因子−ＡＡ、血小板由来の生長因子−ＢＢ、高血小板血漿、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１０、血管内皮細胞由来の生長因子、プレイオトロフィン、エンドセリン、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ、グルカゴン様ペプチド−ＩＩ、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来のペプチド、ラミニン、細胞結合領域を含む生体ペプチドおよびヘパリン結合領域を含む生体ペプチドからなる群から選ばれた生長因子である、実施態様（１５）に記載のスカフォールド。
（１７）さらに、治療薬を含む、請求項１に記載のスカフォールド。
（１８）前記治療薬が、抗拒絶反応剤、鎮痛剤、酸化防止剤、抗細胞消滅剤、エリスロポエチン、抗炎症剤、抗腫瘍壊死因子α、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１５４、ｐ３８キナーゼ抑制因子、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ抑制因子、抗ＣＤ２８、アセトアミノフェン、細胞増殖抑制剤、ラパマイシンおよび抗ＩＬ２剤からなる群から選ばれたものである、実施態様（１７）に記載のスカフォールド。
（１９）前記スカフォールドが生分解性を有する、請求項２に記載の方法。
（２０）前記ポリマー基質が生分解性のポリマーからなる群から選ばれたポリマーを含み、前記繊維からなるマットが、リン酸カルシウムを含む生分解性ガラスとセラミックスおよび生分解性ポリマーからなる群から選ばれた材料を含む繊維を含有する、請求項２に記載の方法。
【００９５】
（２１）前記ポリマー基質および前記繊維からなるマットが、生分解性ポリマーを含む、請求項２に記載の方法。
（２２）前記生分解性ポリマーが、脂肪族ポリエステル、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、ポリアンハイドライドおよびポリフォスファゼンのホモポリマーおよびコポリマーからなる群から選ばれたものである、実施態様（２１）に記載の方法。
（２３）前記繊維からなるマットが９０／１０のポリグリコリド／ポリ乳酸のコポリマーを含む、実施態様（２２）に記載の方法。
（２４）前記ポリマー基質が、ポリカプロラクトン／ポリグリコリドのモル比が約３５／６５〜約４５／５５の範囲のポリカプロラクトンとポリグリコリドのコポリマーを含む、実施態様（２３）に記載の方法。
（２５）前記ポリマー基質が発泡体を含む、実施態様（２４）に記載の方法。
【００９６】
（２６）前記哺乳動物細胞が、骨髄細胞、平滑筋細胞、間質細胞、幹細胞、間葉幹細胞、滑膜由来の幹細胞、胚幹細胞、血管細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪組織に由来する前駆細胞、骨髄由来の前駆細胞、腎臓細胞、腸細胞、膵島、β細胞、セルトリ細胞、末梢血前駆細胞、線維芽細胞、グロムス細胞、ケラチン生成細胞、髄核細胞、線維輪細胞、線維軟骨細胞、成人の組織から分離した幹細胞、卵円形細胞、神経幹細胞、グリア細胞、マクロファージおよび遺伝学的に形質転換した細胞からなる群から選ばれたものである、請求項２に記載の方法。
（２７）前記疾病が糖尿病である、請求項２に記載の方法。
（２８）前記スカフォールドがセルトリ細胞と膵島とを播種したものである、実施態様（２７）に記載の方法。
（２９）前記デバイスがさらに生物学的因子を含む、実施態様（２７）に記載の方法。
（３０）前記スカフォールドが生分解性を有する、請求項３に記載の方法。
（３１）前記哺乳動物細胞が、骨髄細胞、平滑筋細胞、間質細胞、幹細胞、間葉幹細胞、滑膜由来の幹細胞、胚幹細胞、血管細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪組織に由来する前駆細胞、骨髄由来の前駆細胞、腎臓細胞、腸細胞、膵島、β細胞、セルトリ細胞、末梢血前駆細胞、線維芽細胞、グロムス細胞、ケラチン生成細胞、髄核細胞、線維輪細胞、線維軟骨細胞、成人の組織から分離した幹細胞、卵円形細胞、神経幹細胞、グリア細胞、マクロファージおよび遺伝学的に形質転換した細胞からなる群から選ばれたものである、請求項３に記載の方法。
（３２）前記構造欠陥が、関節軟骨、半月板および骨からなる群から選ばれた組織中のものである、請求項３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】９０／１０のＰＧＡ／ＰＬＡの不織マットをカプセル封入した６０／４０のＰＧＡ／ＰＣＬ発泡体を含む複合スカフォールドの一部の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】マウスのセルトリ細胞を播種した本発明の組織スカフォールドのＨ＆Ｅ切片である。
【符号の説明】
【００９８】
１０  スカフォールド
２０  繊維マット
２５  マクロポア
３０  ポリマー基質
３５  ミクロポア
【図１】
2004267754.tif 000003
【図２】
2004267754.tif 000004
【外国語明細書】
2004267754000001.pdf