(57)【要約】【課題】　リボザイムを用いる診断応答の増幅または生成のための手段の提供。【解決手段】　溶液中の標的核酸分子を検出する方法であって、以下：溶液中に２つの相補的ヌクレオチド分子がハイブリダイズし得る条件下で：リボザイム分子、標的核酸分子およびリボザイムに対する開裂部位を含む標識された共標的核酸分子を提供する工程、ここで共標的分子および標的分子は異なる配列を有し、リボザイム分子は標識された共標的核酸分子に相補的な領域および標的核酸分子に相補的な領域を含み、ここで相補的な領域は少なくともリボザイム分子と共標的核酸分子と標的核酸分子の間の結合を得るために最小限の数の相補的ヌクレオチドを含み、リボザイム分子を標識された共標的核酸分子および標的核酸分子と反応させる工程および該標的核酸分子が溶液中に存在する場合、標的核酸分子が溶液中に存在しない場合と比較して遊離の標識の存在を検出する工程を包含する方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中の標的核酸分子を検出する方法であって、以下の工程：
　溶液中に、２つの相補的なヌクレオチド分子がハイブリダイズし得る条件下で：リボザイム分子、標的核酸分子、およびリボザイムに対する開裂部位を含む標識された共標的核酸分子、を提供する工程、ここで、該共標的分子および標的分子は異なる配列を有し、そして該リボザイム分子は、該標識された共標的核酸分子に相補的な領域および該標的核酸分子に相補的な領域を含み、ここで、該相補的な領域は、少なくとも、該リボザイム分子と共標的核酸分子と標的核酸分子との間の結合を得るために最小限の数の相補的ヌクレオチドを含み、
　該リボザイム分子を、該標識された共標的核酸分子および標的核酸分子と反応させる工程、および
　該標的核酸分子が溶液中に存在する場合、該標的核酸分子が溶液中に存在しない場合と比較して遊離の標識の存在を検出する工程；
　を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、リボザイムを含む結果として、増幅されるまたは分差応答を有する診断用薬を設計するためのシステムである。
【背景技術】
【０００２】
　（発明の背景）
　感染因子、または、代謝産物、核酸、およびタンパク質を含む病気の指標となる分子の検出は、医学的疾患の診断および治療、ならびに研究における基本的な要素である。多くの方法論が現在検出に使用されている。これらの方法論は、一般に、病気を引き起こす因子または病気の副産物のいずれかの成分であるタンパク質に対する抗体をベースにした診断アッセイ、および病気を引き起こす因子の成分をコードする遺伝物質のような、核酸に対する診断アッセイに分けられる。
【０００３】
　タンパク質に対するアッセイは、さらに、分子（通常抗体）と、検出されるタンパク質との結合反応、または、酵素の活性化をもたらし、検出可能な色の変化を生じる基質を開裂し得る、酵素と酵素に結合する標的された分子間の反応を含む方法に分けられる。多くの結合アッセイは、染料、酵素または放射性または蛍光標識を含み、検出を増強する。タンパク質に対する抗体は、患者、免疫化動物、または抗原特異的モノクローナル細胞株から得られ得る。これらの抗体アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンイムノブロット、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのようなアッセイを包含する。その他のアッセイは、分子の固定化および検出のためにアビジンおよびビオチンのような分子を用いる。これらの試薬を調製する技術およびそれを使用する方法は、当業者に公知である。
【０００４】
　核酸配列アッセイは、核酸分子の存在を検出するための放射性標識プローブを用いるノザンブロットハイブリダイゼーションのような単純な方法から、ハイブリダイゼーション技術による配列の検出に使用され得るところまで非常に少量の特定の核酸配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用までの範囲にわたる。ヌクレオチドプローブは、市販の染料、または酵素、蛍光、化学発光、あるいは放射性の標識を用いて標識され得る。これらのプローブは、ハイブリダイゼーションにより細胞中または組織試料中の遺伝子または関連配列（そこではその遺伝子は通常の成分である）の発現を検出するために、および生物の感染から生じる疾患を有すると疑われるヒトからの血清または組織試料をスクリーニングするために、または催腫瘍性細胞中に見い出されるような新規または改変遺伝子を検出するために使用され得る。核酸プライマーがまた、逆転写酵素、またはＤＮＡポリメラーゼおよびポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製され得、組織または液体中に非常に少量で存在する核酸分子の検出のために使用され得る。
【０００５】
　酵素をベースにした方法論およびＰＣＲ（ポリメラーゼを使用する）のみが、信号の増幅に連結した検出を用いて、固有に触媒的である。ＰＣＲは、非常に少量のＤＮＡを検出し得るがいくつかの欠点を有する：信頼性について高度の技術的能力を必要とし；偽陽性を生じる汚染に顕著に感受性であり；定性的より定量的に使用することが困難である。その他の方法は、酵素が、通常、アッセイの付加的成分への結合により、信号生成および増幅を増加する。これらの付加的リガンドの使用は、より高いバックグラウンドおよび偽陽性を生じ、システムのノイズを増加させ、そして対照反応のいくつかのレベルを必要とする。
【０００６】
　リボザイムは、酵素様の活性を有するＲＮＡ分子として定義される。ＲＮＡで触媒される開裂には３つの一般経路がある：（１）ウイロイド様ＲＮＡによる開裂；（２）ＲＮＡａｓｅ　Ｐ　またはＲＮＡａｓｅ　ＰのＲＮＡ成分による開裂、Ｙａｌｅ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳｉｄｎｅｙ　Ａｌｔｍａｎの研究；および（３）テトラヒメナリボザイムによる開裂、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＣｏｌｏｒａｄｏのＴｈｏｍａｓ　Ｃｅｃｈの研究。現在まで知られている天然に存在するリボザイムは、ＲＮＡａｓｅ　Ｐを除いて、シスに作用しそしてトランスに、即ち、他の分子に作用するためには加工されなければならない。このことは、酵素活性を有するＲＮＡ分子の部分を基質として供される部分から分離すること、および、開裂されるべき標的分子に基質様性質、これは適切な２次および３次構造を含むが、を付与するにより達成される。特異性は、標的分子上の開裂されるべき部位の近傍でハイブリダイズする相補的核酸配列を添加することにより付与され得る。
【０００７】
　各クラスのリボザイムは、異なる作用メカニズムでヌクレオチドの異なる配列を開裂する。その上、各クラスは、酵素的活性に必須なヌクレオチド塩基の数に基づいてさらに区別され得、そしておよび意図される標的の範囲までリボザイムは特異性を変えるために操作され得る。
【０００８】
　テトラヒメナリボザイムは、発見された最初のリボザイムであった。このリボザイムは、その開裂について、グアノシン依存性である。天然にシスで作用するのは大きなリボザイムである。より小さな内部部分は、トランスに、即ち、別の分子に作用するために加工され得、特定の４種のヌクレオチド配列を標的する。
【０００９】
　Ｍ１　ＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＲＮＡａｓｅ　ＰのＲＮＡリボザイムサブユニットであり、約４００塩基のＲＮＡ分子である。このＲＮＡ分子は細胞中の、全種類の別の他の分子を開裂し、ｔＲＮＡ前駆体から成熟ｔＲＮＡを生成する。その他の分子は、Ｍ１　ＲＮＡの基質に転換され得るが、それは外部ガイド配列の使用を通して行われる。この外部ガイド配列はその５’末端に、開裂されるべきＲＮＡ中の開裂部位の３’側のヌクレオチドに相補的な少なくとも７つのヌクレオチド、およびその３’末端に、その相補的なヌクレオチドに直接結合するヌクレオチドＮＣＣＡを有する、単離オリゴリボヌクレオチドとして特徴付けられる。ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、そしてオリゴリボヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドは、これは開裂されるべきＲＮＡ中の相補的ヌクレオチドにハイブリダイズする。ＦｏｒｓｔｅｒおよびＡｌｔｍａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：　７８３−７８６　（１９９０）、「ＲＮＡ酵素のための外部ガイド配列」に記載されている。Ａｌｔｍａｎら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８９　（１７）：８００６−８０１０　（１９９２）、「ヒトＲＮａｓｅ　ＰによるメッセンジャーＲＮＡの標的された開裂」は、最近、前駆体ＴＲＮＡに由来する構造に基づき、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＲＮＡａｓｅ　Ｐの真核性相当物に対する外部ガイド配列の構築について記載した。ＲＮＡａｓｅ　Ｐ反応およびテトラヒメナ反応の両者は、５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル末端を作製するように作用する。
【００１０】
　植物および動物中で見い出されたいくつかの種類のウイロイド様ＲＮＡリボザイムがある。ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイムは、このカテゴリーの１つのクラスであり、そしてデルタ肝炎リボザイムは、第２のクラスである。ＲＮＡａｓｅ　Ｐおよびテトラヒメナリボザイムとは異なり、設計されたトランス作用性植物ウイロイド様リボザイムは、等しく短い基質を有するほんの１８〜２０ヌクレオチド塩基長である。中心的な主題は、特徴的な保存配列であり、Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋが１９８７年に説明し、そしてＮａｔｕｒｅ　３２８：５９６−６００　（１９８７）で公開された。その中で、彼は、すべてのハンマーヘッドは特定の特徴を共有することを提案した。ウイロイド様リボザイムの開裂反応は、２’、３’環状ホスフェートおよび５’ヒドロキシル末端を作製する。従って、Ｍ１　ＲＮＡ反応またはテトラヒメナ反応と比較して、これらウイロイド様ＲＮＡ反応について基本的におよびメカニズム的に異なる化学が存在する。しかし、最終結果は同一、即ち、別のＲＮＡ分子の開裂である。
【００１１】
　いくつかのグループにより、リボザイムが、除かれるのではなく除くべき遺伝子から転写されるウイルスＲＮＡまたはＭＲＮＡのような、標的ＲＮＡを開裂することにより病気または遺伝疾患を治療するために使用される能力を有することが提案された。しかし、それらを診断に使用することは誰も提案しなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
　従って、本発明の目的は、リボザイムを用いる診断応答の増幅または生成のための手段を提供することである。
【００１３】
　本発明のさらなる目的は、核酸、タンパク質、およびその他の分子の検出において、リボザイムを触媒として作用するように利用することである。検出は、リボザイムによる基質の開裂の結果である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
項目１．溶液中の標的核酸分子を検出する方法であって、以下の工程：
　溶液中に、２つの相補的なヌクレオチド分子がハイブリダイズし得る条件下で：リボザイム分子、標的核酸分子、およびリボザイムに対する開裂部位を含む標識された共標的核酸分子、を提供する工程、ここで、該共標的分子および標的分子は異なる配列を有し、そして該リボザイム分子は、該標識された共標的核酸分子に相補的な領域および該標的核酸分子に相補的な領域を含み、ここで、該相補的な領域は、少なくとも、該リボザイム分子と共標的核酸分子と標的核酸分子との間の結合を得るために最小限の数の相補的ヌクレオチドを含み、
　該リボザイム分子を、該標識された共標的核酸分子および標的核酸分子と反応させる工程、および
　該標的核酸分子が溶液中に存在する場合、該標的核酸分子が溶液中に存在しない場合と比較して遊離の標識の存在を検出する工程；
　を包含する方法。
項目２．前記リボザイムが、テトラヒメナリボザイム、ＲＮＡａｓｅ　Ｐ、イモリのサテライトリボザイム由来のリボザイム、植物ウイロイド由来のハンマーヘッドリボザイム、およびデルタ肝炎ウイルス由来のアクスヘッド（ａｘｅｈｅａｄ）リボザイムからなる群に由来する、項目１に記載の方法。
項目３．前記標的核酸分子が共標的の第１の核酸分子により結合される、項目１に記載の方法。
項目４．前記標的核酸分子がタンパク質をコードする、項目３に記載の方法。
項目５．前記標識された共標的核酸分子が固体支持体上に固定化されている、項目１に記載の方法。
項目６．前記標識された共標的核酸分子が、染料、発色性基質と反応性の酵素、蛍光標識、化学発光標識、および放射性標識からなる群から選択される標識で標識される、項目１に記載の方法。
項目７．前記リボザイムが、該リボザイムが前記標的核酸分子に結合するときに、構造的に活性である、項目１に記載の方法。
項目８．前記リボザイムが、該リボザイムが前記標的核酸分子および標識された共標的核酸分子の両者に結合するときに、構造的に活性である、項目１に記載の方法。
項目９．前記リボザイムの酵素活性を変える分子に対する結合に基づいて該リボザイム分子を選択する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
項目１０．項目９に記載の方法であって、さらに前記リボザイム分子を繰り返し合成する工程；該リボザイム分子と、活性を変える分子とを、いくつかのリボザイム分子が該分子に結合し得る条件下で反応させる工程；
　該活性を変える分子と結合しないリボザイムを除去する工程、
　該リボザイムの活性について結合分子の影響をスクリーニングする工程、
　該活性を変える分子に結合し、そしてそれによってその活性が変化し得るリボザイム分子を単離する工程、および
　該分子と結合しそしてその活性が該分子との結合により変化し得るリボザイム分子が単離されるまで、このプロセスを繰り返す工程；を包含する方法。
項目１１．前記リボザイムが３７℃を超える高温で安定で、そして標的核酸分子が３７℃を超える条件下で結合する、項目１に記載の方法。
項目１２．前記標的核酸分子が前記リボザイム分子により結合されるときに、該標的核酸分子が結合されない場合に比べ検出される標識がより少ない、項目１に記載の方法。
項目１３．前記標的核酸分子が前記リボザイム分子により結合されるときに、該標的核酸分子が結合されない場合に比べ検出される標識がより多い、項目１に記載の方法。
項目１４．リボザイム分子、標的核酸分子、および該リボザイムに対する開裂部位を含む標識された共標的核酸分子を含む組成物であって、ここで、該共標的分子および標的分子は異なる配列を有し、そして該リボザイム分子は、該標識された共標的核酸分子に相補的な領域および該標的核酸分子に相補的な領域を含み、ここで、該相補的な領域は、少なくとも、該リボザイム分子と共標的核酸分子と標的核酸分子との間の結合を得るために最小限の数の相補的ヌクレオチドを含む、組成物。
項目１５．前記共標的核酸分子が、標的核酸分子に結合し、そして前記リボザイム分子により結合されおよび開裂される、項目１４に記載の組成物。
項目１６．前記標的核酸分子がタンパク質をコードする、項目１４に記載の組成物。
項目１７．前記リボザイムが、テトラヒメナリボザイム、ＲＮＡａｓｅ　Ｐ、イモリのサテライトリボザイム由来のリボザイム、植物ウイロイド由来のハンマーヘッドリボザイム、およびデルタ肝炎ウイルス由来のアクスヘッドリボザイムからなる群に由来する、項目１４に記載の組成物。
項目１８．前記リボザイムが、前記共標的核酸分子上の第１の部分に結合するときに、構造的に活性である、項目１４に記載の組成物。
項目１９．前記リボザイムが、第１の相補的な領域が共標的分子に結合し、そして第２の相補的な領域が標的分子上の第２の部分に結合するときに、構造的に活性である、項目１４に記載の組成物。
項目２０．前記リボザイムの酵素的活性が、該リボザイムへの制御性分子の結合により変えられる、項目１４に記載の組成物。
項目２１．前記リボザイム分子が、３７℃と６０℃との間の温度で構造的に活性である、項目１４に記載の組成物。
項目２２．前記標識された共標的核酸分子が、固体支持体上に固定化されている、項目１４に記載の組成物。
項目２３．前記標識された共標的核酸が、染料、発色性基質と反応性の酵素、蛍光標識、化学発光標識、および放射性標識からなる群から選択される標識で標識される、項目１４に記載の組成物。
項目２４．前記標的核酸分子が、前記リボザイムまたは共標的分子のいずれかにハイブリダイズする場合、該標的核酸分子が結合されない場合に比べ検出される標識がより少ない、項目１４に記載の組成物。
項目２５．前記標識核酸が、前記リボザイムまたは第２の分子のいずれかにハイブリダイズする場合、該標識核酸が結合されない場合に比べ検出される標識がより多い、項目１４に記載の組成物。
項目２６．リボザイム分子を選択する方法であって、該リボザイム活性が制御性分子との結合により変えられ得、以下の工程；
　該リボザイム分子を繰り返し合成する工程、
　該リボザイム分子と、活性を変える分子とを、いくつかのリボザイム分子が該分子に結合し得る条件下で反応させる工程、
　該活性を変える分子と結合しないリボザイムを除去する工程、
　該リボザイムの活性に関して結合分子の影響をスクリーニングし、該リボザイム分子を単離する工程、ここで、該分子が該リボザイムを結合しそしてその活性に影響を与え、および
　該分子と結合し、そしてその活性が該分子との結合により変えられ得るリボザイム分子が単離されるまで、このプロセスを繰り返す工程、を包含する方法。
項目２７．トランスに作用するリボザイム診断システムであって、染料、発色性基質と反応性の酵素、蛍光標識、化学発光標識、および放射性標識からなる群から選択される標識で標識され、そして標的分子に相補的な２つの領域を有するリボザイムを含み、ここで、該標識は、該リボザイムが該標的分子に結合する場合、該リボザイムから開裂される、システム。
項目２８．前記標識リボザイムが、テトラヒメナリボザイム、ＲＮＡａｓｅ　Ｐ、イモリのサテライトリボザイム由来のリボザイム、植物ウイロイド由来のハンマーヘッドリボザイム、およびデルタ肝炎ウイルス由来のアクスヘッドリボザイムからなる群に由来する、項目２７に記載のリボザイム診断システム。
項目２９．溶液中の標的された核酸分子を検出する方法であって、　トランスに作用するリボザイム診断システムを提供する工程であって、該システムは、染料、発色性基質と反応性の酵素、蛍光標識、化学発光標識、および放射性標識からなる群から選択される標識で標識され、そして該標的された分子に相補的な２つの領域を有するリボザイムを含み、ここで、該標識は、該リボザイムが該標的された分子に結合するときに開裂され；および
　該リボザイムから開裂された該標識を検出することにより該標的された分子を検出する工程、を包含する方法。
項目３０．溶液中の標的された核酸分子を検出する方法であって、前記リボザイムが、テトラヒメナリボザイム、ＲＮＡａｓｅ　Ｐ、イモリのサテライトリボザイム由来のリボザイム、植物ウイロイド由来のハンマーヘッドリボザイム、およびデルタ肝炎ウイルス由来のアクスヘッドリボザイムからなる群に由来する、項目２９に記載の方法。
項目３１．染料、発色性基質と反応性の酵素、蛍光標識、化学発光標識、および放射性標識からなる群から選択される標識で標識され、そして標的分子に相補的な２つの領域を有し、ここで、該標識は、該リボザイムが該標的分子に結合するときに開裂される、リボザイム。
項目３２．テトラヒメナリボザイム、ＲＮＡａｓｅ　Ｐ、イモリのサテライトリボザイム由来のリボザイム、植物ウイロイド由来のハンマーヘッドリボザイム、およびデルタ肝炎ウイルス由来のアクスヘッドリボザイムからなる群に由来する、項目３１に記載のリボザイム。
【００１５】
　（発明の要旨）
　核酸、タンパク質、またその他の分子の存在を検出する診断道具としてリボザイムを使用するシステムが記載され、このシステムでは、活性リボザイムの形成およびアッセイ可能なマーカーの開裂が、特定の標的分子の存在に依存する。必須の成分は、リボザイムであり、このリボザイムは、好ましくは支持体構造上に固定化された、標識された共標的と組み合わせて選択された標的と特異的であるが可逆的に結合する。標的および共標的が結合する場合、リボザイムが共標的から標識を開裂し、それは次いで定量される。このリボザイムは標的および共標的により可逆的に結合されるので、別の共標的と再結合し得、より多くの標識を開裂し、それによって、反応シグナルを増幅する。１つの実施態様では、標的は、リボザイムの部分を形成する相補的配列にハイブリダイズする核酸であり；第２の実施態様では、標的は、リボザイム分子の部分との相互作用により結合されるタンパク質またはその他の高分子である。別の実施態様では、熱安定性のリボザイムが使用され、不適切に結合したリボザイムは、脱安定化されそして高温で不活性化される。
【００１６】
　制御可能なリボザイムを単離する方法がまた記載される。制御可能なリボザイムは、特定の高分子の存在を検出する方法において有用であり、または標的ＲＮＡ分子の開裂の不活性化または活性化のための方法としてインビトロまたはインビボで使用され得る。
【発明の効果】
【００１７】
　本発明によって、リボザイムを用いる診断応答の増幅または生成のための手段が提供された。
【００１８】
　本発明によって、核酸、タンパク質、およびその他の分子の検出において、リボザイムを触媒として作用するように利用することが提供された。検出は、リボザイムによる基質の開裂の結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
　リボザイムをもとにした診断方法は、既存の診断方法に比べていくつかの利点を有する。本方法は、高度に特異的なリガンドの相互作用を固有の触媒性の性質と組み合わせており、従って単純で感度が良く、そして定量性がある。この特異性は、リボザイムのアームと標的ＲＮＡ間の特異的な相補性だけでなく、開裂認識部位の存在と正しい空間的な配向、例えばトリプレット（ＮＵＸ）、に依存する。さらに、リボザイムは主として他のＲＮＡ分子と相互作用しているように見えるが、最近の研究は、インビトロでＲＮＡおよびＤＮＡが選択されて結合するかまたは薬剤および代謝物を含む他の分子、または核酸およびタンパク質を含むマクロ分子の反応を触媒することを示している。Ｊｏｙｃｅ，Ｇｅｎｅ　８２：８３，１９８９；　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ　ａｎｄ　Ｊｏｙｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ　３４４：４６７，１９９０；　Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ　ａｎｄ　Ｓｚｏｓｔａｋ，　Ｎａｔｕｒｅ　３４６：８１８，１９９０；　Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６：１４２０，１９９２；　Ｎｏｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２５６：１４１６，１９９２；　Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ　ａｎｄ　Ｓｚｏｓｔａｋ，　Ｎａｔｕｒｅ　３５５：８５０，１９９２；　Ｂｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３５５：５６４　１９９２を参照されたい。これらの教示を特にここで援用する。
【００２０】
　リボザイム診断システムは、単一分子、シス−作用性リボザイムを２分子または３分子のトランス作用性システムに分割する能力を利用する：２分子システムでは、活性リボザイムはリボザイム分子と疾患標的分子との複合体により形成され、このリボザイム分子には開裂部位があり；あるいは３分子システムでは、活性リボザイムは、リボザイム分子、開裂部位を有する共標的分子、および疾患標的分子の複合体により形成される。
（リボザイム増幅診断検出法）
　図１Ａで示したように、リボザイム増幅診断（ＲＡＤ）の方法論は、３つの重要な構成物を含む：リボザイム１０、ＮＵＸ開裂部位を有し、「共標的」と呼ばれ、固体支持体１６に固定されている標識されたＲＮＡ分子１４と塩基対を形成するように設計された１本のアーム１２、および検出されるＲＮＡ上の予め定められた配列、「標的」ＲＮＡ２０と塩基対を形成するためのリボザイムのもう１本のアーム１８。
【００２１】
　リボザイム１０が共標的ＲＮＡ１４を開裂する場合、共標的の部分２２は、支持体１６に結合したまま残り、標識されたＮＵＸを持つ部分２４は解離される。未知のサンプルから標識をはずすことにより存在するおよその分子数を決定し得る；すなわち、種々の量の標的存在下で共標的の開裂の検量線を引くことにより、サンプル中のおよその標的分子数を決定し得る。
【００２２】
　図１Ｂに見られる変化において、３つの塩基対形成が関与している。１つは、リボザイム１０と支持体１６に結合した共標的２６の間の２６ｂであり、１つは、リボゾーム１０と標的２８の間であり、そして１つは、共標的２６と標的２８の間の２６ａである。標的ＲＮＡ２８が存在し、リボザイム１０および共標的２６がそれに結合している場合にのみ、触媒的に活性なリボザイムコンホメーションを形成する。リボザイム１０、共標的２６および標的２８の活性３分子複合体は、標識された共標的２６がＮＵＸ部位で開裂し、標識オリゴヌクレオチド２６ａが固体支持体１６から溶液中に解離する。塩基対形成は可逆的なので、リボザイム１０、開裂した共標的２６および標的２８は、お互いに自由に解離して、リボザイム、開裂していない新しい共標的分子、および標的分子の間で新しい活性複合体を形成する。この再循環によってラベル、そして従ってシグナルの解離が増幅し、システムの感度を高め、そして疑陰性のレベルを低くするすることにつながる。システムの高い特異性は、疑陽性のレベルを低くすることになる。
【００２３】
　本方法のさらなるバリエーションを図１Ｃに示す。デルタ肝炎ウイルス由来の設計したリボザイムは、２つのサブドメインに分離し得、これらは再構築された場合、開裂の結果得られたドメインの一つを用いて活性リボザイムを再形成する（Ｂｒａｎｃｈ　ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　８８：１０１６３（１９９１）　この文献の教示はここに取り入れている）。デルタリボザイムは、ドメインＩ中の指定した配列を、標的ＲＮＡ３４中の選ばれた配列に相補的な配列３２および３６と置き換えることによって再び標的とされ得る。指定した部位３８での開裂の結果、リボザイム３０の活性なコンホメーションを再構築するために適切な標的ＲＮＡ　３４と複合体化するまで、再び標的となったドメインＩ　３０は不活性なまま残る。
【００２４】
　リボザイムのドメインＩ　３０が固体支持体１６に固定され、検出可能なラベル（例えば、放射活性ラベル、蛍光物質ラベル、染色、化学発光ラベル、発色性物質と反応性の酵素）で標識される場合、それを臨床サンプルに存在する標的ＲＮＡ　３４の存在を検出するために用い得る。活性リボザイムのコンホメーションは、次に標的ＲＮＡ　３４と結合し、標識されたオリゴヌクレオチド３６ａの開裂と解離に終わる。この方法は、デルタリボザイムのみならず同様の形式で分離し得るいかなるリボザイムにも適用し得る。
【００２５】
　反応は、マイクロタイターウェルプレートのようなアッセイ用の標準反応容器で行い得る。好ましい実施態様においては、固体物質はマイクロタイタープレートの壁、マイクロビーズ、あるいはその他の診断アッセイに一般用いる不活性な物質であり得る。固定方法は、例えばＮａｔｕｒｅ　３５７：５１９−５２０（１９９２）に記載のように、当業者には公知であり、この教示はここに取り入れる。
【００２６】
　上記の方法論は、病原性の分子、または核酸以外の高分子、例えばタンパク質、を検出し得るように改変し得、これを図２に示す。図２Ａを参照して、設計した共標的４２に完全に関係している（すなわちリボザイムの両方のアーム４０ａおよび４０ｂは、共標的４２ａおよび４２ｂに相補的である）リボザイム配列４０を構築する。次いでリボザイム４０を配列４４に結合させる。この配列４４は、タンパク質のような非核酸リガンド４６と結合するため、そして結合した場合にはリボザイム４０の全配列およびリガンド結合部位４４をリボザイムが活性であるコンホメーションにするように選択された。従って、リボザイムの活性化を用いて共標的４２を開裂し、ラベルされ検出し得るオリゴヌクレオチド４２ｂを放出させ得る；ラベルの放出は、与えられたリガンド４６の存在を示す。この調節可能なリボザイム４０は、可逆的に共標的４２に結合し、従って開裂していない共標識と相互作用を続け得、その結果シグナルを増幅し得る。リボザイム４０の不活性なコンホメーションを図２Ｂに示す。ここではリガンド結合配列４４は、リボザイム４０の上に折り返され、このリボザイム４０は、不活性なコンホメーションをとっていて、共標的４２を開裂し得ない。
【００２７】
　図１および２で示す方法論の触媒速度を上げるために、および／または、反応の特異性を上げるために、耐熱性微生物から単離された（Ｂｒｏｗｎら、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ　ＲＮＡ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，ｐ５５ａｂｓ，１９９２）、または「インビトロ遺伝学」（Ｓｚｏｓｔａｋ，ＴＩＢＳ　１７：８９，１９９２）を用いて選択したより熱安定性のリボザイムを、より高い温度で上記の方法を行うために、用い得る。ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来の熱安定性ＲＮａｓｅ　Ｐもまた用い得る。より高い反応温度では、リボザイムのガイド配列と標的との間のミスマッチは、安定で、活性な複合体の形成にとって熱力学的に好ましくない、すなわちアームはターゲットに対して正確な相補性を伴ったハイブリダイズをしないままになる。従って、温度が上昇しても触媒中心がコンホメーション的に活性であるリボザイムは、標的および全ての起こりうる部分的に相同な非標的配列の間を識別し得る。標準反応温度では、プロティピカル（ｐｒｏｔｙｐｉｃａｌ）なリボザイムは、本質的に同じ反応速度論で、類似してはいるが同一ではない配列、例えば、１０個中２個がミスマッチであるような配列、に結合し、厳密な区別をし得ない。これは、１塩基対のミスマッチを、標準ハイブリダイゼーションプローブ技術、またはＰＣＲによって同定するのと類似している。
【００２８】
　インビトロの選択については、上記のインビトロ遺伝学についての方法論を適用して、３７℃で最適に機能するリボザイムの配列においてランダムな遺伝的変化を有するリボザイム集団を生成する。従って、温度が上昇しても効果的に機能するそれらのリボザイムについてアッセイし選択する。例としてＢｅａｕｄｒｙ　ａｎｄ　Ｊｏｙｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：６３５−６４１（１９９２）を参照されたい。この教示をここでは援用する。例えば、遺伝子産物は、そのリガンドへの結合能または化学反応能によって選択され得る。選択された遺伝子産物に相当する遺伝子、または特定のリボザイムは、反復プライマー方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応、によって増幅され得る。２つのポリメラーゼ酵素の組み合わせを用いて、実質的にはいかなるＲＮＡも増幅し得る。ＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）を用いて相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、そして得られたｃＤＮＡを、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡに転写する。増幅は、Ｔ７ポリメラーゼがｃＤＮＡテンプレートの１コピー当たり２００〜１２００コピーのＲＮＡ転写物を生じる能力の結果として、転写の間に起こる。増幅は選択的に行われ、そこでは集団内の個々のＲＮＡが、増幅に好適となるために、特定の化学反応を触媒することが要求される。選択は、リボザイムがオリゴヌクレオチドまたはオリゴデオキシヌクレオチド基質が関与する配列特異的反応を触媒する能力に基づく。反応産物は、リボザイムの３’末端に付着した３’部分の物質を含む分子である。選択は、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーが連結接合点を越えてハイブリダイズし、ｃＤＮＡ合成を始めるために使われる場合に起こる。
【００２９】
　変異は、発生の頻度が固定されているランダムな置換を含む変異誘発性オリゴデオキシヌクレオチドのセットを使用して誘導し得る。これらの部分的にランダマイズしたオリゴヌクレオチドは、自動化したＤＮＡ合成機で不正確なモノマーを数％含むヌクレオシド３’−ホスホルアミダイト溶液を用いて生成される。選択的増幅の各ラウンドの後、ランダムな変異を変異誘発性条件下でＰＣＲを行うことにより誘発する。選択的増幅によって得られたＲＮＡを、逆転写し、得られたｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物を転写して変異ＲＮＡの子孫の分布（ｐｒｏｇｅｎｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を生じる。
【００３０】
　図３Ａに示すように、温度安定性リボザイム５０は、上昇した温度で標的５２および共標的５４に対して特異的で、たとえば、６０℃対４５℃、である。温度は、各リボザイムのシステム、例えば、ハンマーヘッド、ＲＮａｓｅ　Ｐ、またはＨＤＶリボザイム、によって変化する。図３Ｂに示すミスマッチは、温度が３７℃より上がる場合、すなわち４５〜６０℃の場合は、開裂しない。
【００３１】
　要するに、開示する方法論は、リボザイムの開裂が起こるためには多数の要件があるため、高度に特異的である；シグナルの増幅をさせるリボザイムの固有の触媒的性質のために高感度である；このシステムは、あらゆるＲＮＡ分子を標的にするように容易に改変され得（リボザイムのたった１つのアームだけが配列を変えればよい）、リボザイムの再合成のみが要求される；マイクロタイタープレートリーダーのような、既に存在しているハードウエアを簡単に使用し得る；ロジスティックに単純で迅速であり、連続的ではなく同時に相互作用するいくつかの構成物が必要である；そして最後には、容易に定量し得る。
（リボザイム）
　種々のリボザイムが上記の方法で用いられ得る。リボザイムの選択は開裂特異性を決定し、そして固定化される共標的は適宜に設計されなければならない。リボザイム活性は、標的および／または共標的への結合により影響されるリボザイムのコンホメーションの変化、または共標的と同程度に非核酸リガンドに結合し得るリボザイムの構築により調節され得る。このリボザイムは、リガンドの非存在下では、リボザイムのコンホメーションが立体的に結合を阻害するので、共標的に結合し得ない。あるいはこのリボザイムは、リボザイムが不活性なコンホメーションを保持するので、結合するが開裂し得ない。リガンドが存在する場合、リボザイムはそのリガンドに結合し、それによりそのリボザイムが共標的に結合し、活性コンホメーションをとり、そして標的を開裂し得る。
【００３２】
　調節され得るリボザイムは、以下に記載の方法により調製され単離され得る。適切なオリゴヌクレオチドがＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ　（ＡＢＩ，　８５０　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｄｒ．，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ　９４４０４）３９２型シンセサイザーで同社の試薬を用いて合成される。一般的な設計基準は図面を参照して上記で説明される。これらは、すべてリボザイムの機能を変えないような改変および変形が可能である。
【００３３】
　共標的分子の開裂部位は、リボザイム系の選択に依存する。開裂される配列は、リボザイムの選択に依存する。例えば、リボザイムがイモリサテライトＲＮＡに由来する場合、開裂部位はＮＵＸに従う：ここでＮはいずれのヌクレオチドでもよく、ＸはＧ以外のいずれかのヌクレオチドであり、そしてＵはウリジンである。ＲＮａｓｅ　Ｐについて、公知の配列特異的要求性を図４Ａおよび４Ｂに示す（それぞれ細菌性ＲＮＡａｓｅ　Ｐおよび真核生物ＲＮＡａｓｅ　Ｐ）。開裂部位に対しては選択基準が必要とされない。なぜなら、これは共標的に備わっており、公知のシス開裂リボザイム配列に由来するからである。本明細書中に記載の方法のストラテジーは、常に、共標的中に開裂部位配列要求性を完全に配置するようにしてリボザイム系を分離することであり、よってリボザイム／共標的と疾患標的との間の相互作用に対する要求性のみが、いずれの特異的配列要求性をも伴わないで、相補的ヌクレオチドの範囲となる。
【００３４】
　ハイブリダイゼーションのための塩基対のセット数は存在しない。リボザイムと標的との間、リボザイムと共標的との間、および共標的と標的との間の塩基対の長さは、各リボザイム系および特定の診断状況により変化し得る。例えば、塩および温度、または他の反応条件は、シグナル／ノイズ比を最大にするために、各場合について経験的に最適化され得る。
（標的ＲＮＡおよび共標的ＲＮＡの選択）
　いずれのＲＮＡ分子も、本発明の方法での使用のために標的にされ得る。好ましいＲＮＡ分子は、少なくとも部分配列が知られているＲＮＡ分子であって、リボザイム配列が標的分子および共標的分子の両方に結合するように相補的配列を生成させ得る。標的される分子の例には、タンパク質をコードするｍＲＮＡ、特に特定の症状、障害、あるいは疾患で特徴づけられているかまたは病原因子に由来するタンパク質をコードするｍＲＮＡ、および、ウイルスタンパク質をコードするＲＮＡあるいはＲＮＡゲノムが包含される。標的されるＲＮＡの例には、内因性ＲＮＡまたは外因性ＲＮＡが包含される。内因性ＲＮＡは、タンパク質をコードするｍＲＮＡあるいは非コーディングＲＮＡのいずれかであり、特定の障害、状態、あるいは疾患の病因に関連する。外因性ＲＮＡは細胞の内部あるいは外部に存在するが、疾患状態に直接または間接的に関わる病原因子（ウイルス、細菌、真菌など）に由来する。標的される非核酸分子の例には、タンパク質類、例えば、腫瘍特異的タンパク質あるいは癌タンパク質（例えば、ｒａｓ変異体）；ホルモン類、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン、薬物使用を示す代謝産物；および毒素（環境試験または法医学試験により同定される）が包含される。
（リボザイム活性の制御）
　制御可能なリボザイムの構築方法は、以下に記載する。ここで、リボザイム配列はリガンド結合配列に連結されており、これによりリボザイムの活性がそのリガンドの調節下に置かれ、そしてその存在は活性化または不活化に必要とされる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｔ７プロモーターおよび所定のリボザイムをコードする配列が、長さｎのランダム配列の前または後に存在するように合成する。得られるＤＮＡは分子の混合物である（複雑度４ｎ）。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写は、ＲＮＡ分子の複合プールを生じ、それぞれは、長さｎのランダム配列に連結した所定のリボザイム配列を有する。リボザイム配列は規定されているが、リボザイムに対応する部分を含む全体分子のコンホメーションは、ランダム配列と、それ自身およびリボザイム配列との相互作用により決定される。折り畳みにより所望のリガンド、好ましくは、結合を可能にするのに十分な複雑度の小有機分子、またはタンパク質のような高分子を結合させるコンホメーションになる分子を選択するには、ＲＮＡ分子の複合プールをアフィニティークロマトグラフィーの繰り返しラウンドにかける。ここで、リガンドがマトリックスに共有結合し、結合するそれらのＲＮＡ分子がカラム上に保持され、その後特異的に溶出する。溶出したリガンド結合ＲＮＡを、このリガンド結合分子を富化するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅する。ＰＣＲ試薬および方法論は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，　７６１　Ｍａｉｎ　Ａｖｅ．，　Ｎｏｒｗａｌｋ，　Ｃｏｎｎ．　０６８５０；またはＲｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　１１４５　Ａｔｌａｎｔｉｃ　Ａｖｅ．，　Ｓｕｉｔｅ　１００，　Ａｌａｍｅｄａ，　ＣＡ　９４５０１から入手可能である。このようなサイクルをいくらか行った後で、事実上すべての分子がリガンドに結合し得るＲＮＡ集団が生じる。
【００３５】
　一定数の分子は、分子のリボザイム部分のアームが標的ＲＮＡに結合する能力を立体的に妨げることによりリボザイムを不活化するように、および／または、リボザイムの触媒中心のコンホメーションを変化させるように折り畳まれ、それにより開裂が阻害されるが、しかし、続く共リガンドへの結合がリボザイムを活性化するように折り畳まれる。リガンドの例には、標的として上記で規定されたようなタンパク質が包含される。あるいは、一定数の分子は、リガンドの存在下でのみ折り畳まれて不活性コンホメーションになり、そしてその非存在下では触媒的に活性なコンホメーションになる。
【００３６】
　次に、リガンド結合ＲＮＡ集団を、共薬剤リガンドによりリボザイムの活性化または不活化に対してスクリーニングする。選択は、少なくとも２つの方法で達成され得る。第一に、リガンド結合ＲＮＡ分子の純集団を逆転写酵素により二本鎖ＤＮＡ分子に変換し、次にインビトロ発現ベクターにクローニングする。クローニングされた配列を有する個々の細菌形質転換体を生育させ、組換えプラスミドを精製し、リガンド結合／リボザイムＲＮＡをコードする遺伝子を転写させる。次に、各クローン由来の相同的ＲＮＡをリガンドの存在下または非存在下で開裂に対してアッセイする。あるいは、スクリーニングをロジステッィクに簡易化するためのストラテジーが用いられ得、これは単離し転写しアッセイするクローンの総数を減少させる。このような方法の１つは、リガンド結合分子の複合プールの限界希釈を行うことである。ＲＮＡ濃度および既知のサイズの分子から、単位体積当たりの分子数、ＲＮＡ溶液のモル濃度が容易に決定され得る。ＲＮＡの希釈は、統計上好ましいように、例えば、アッセイウェルあたり１０ＲＮＡ分子で行われる。１００マイクロタイタープレート（９６ウェル）では、約１０５分子が開裂に対してアッセイされ得た。ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）は、１０１５の異なる配列の原集団中では、所定のリガンドに結合するように折り畳まれている１０１０ＲＮＡ分子あたり１つが存在し、最終調製物では１０２〜１０３配列が存在すると評価した。リガンド結合に対して精製した後では、事実上１００％の分子がリガンドに結合する。１０５の異なるリガンド結合分子から１つの分子のみが、リガンドの存在により活性化または不活化したリボザイムを有するとすれば、このスキームによりその単離が可能になるであろう。リガンド結合ＲＮＡは、ＰＣＲによりアフィニティークロマトグラフィーのサイクルで１０１０倍オーダーに富化されているので、かなり低い割合で存在するリガンド制御リボザイムであっても過度の実験を行うことなく単離することが可能である。共リガンドの存在または非存在下で開裂が生じるそれらのウェルは、ＰＣＲ増幅されてクローニングされ、そして個々のクローンの転写物は、リガンドによる不活化または活性化についてアッセイされる。
【００３７】
　共リガンドの性質が、外生的に供給されるように選択され得る（例えば、少なくとも標的分子に容易に入り込むいくつかの非毒性分子）か、あるいは完全な内生系が設計され得る（ここでは、調節リガンドが、病原に直接または間接的に関連する標的細胞内の低分子代謝産物または高分子である）。例えば、標的ＲＮＡによりコードされるタンパク質はリガンドとなり得る。制御可能なリボザイムの活性は、病原性タンパク質への結合に依存する。標的ＲＮＡレベルはリガンド活性化リボザイムによる開裂のため低下するので、タンパク質リガンド濃度は低下する。濃度が調節可能なＲＮＡ分子が全て占められる濃度以下に低下する場合、リボザイム開裂速度が低下し始める。リボザイム−リガンドアフィニティーの差異について選択することにより、標的ＲＮＡがリボザイムの仲介で破壊される適切なレベルの制御がいかなる与えられた条件下でも達成され得る。例えば、ＲＮＡプールは、目的のタンパク質をカラムに結合したアフィニティークロマトグラフィーにかけられる。タンパク質に結合し得るリボザイム分子は、カラム上に保持され、その後溶出する。ＰＣＲおよびクロマトグラフィーを繰り返し行って、このようにタンパク質に結合するリボザイム分子を富化する。次に、この集団を上記のようにスクリーニングし、リガンドの存在下でのみ活性リボザイムとなる分子を単離する。
【００３８】
　本発明は、以下の限定されない実施例を参照することにより、さらに理解される。
【実施例】
【００３９】
　（実施例１：Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原ｍＲＮＡの一部分に対応する短い配列の検出）
　図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ハンマーヘッドリボザイムの構造に基づいて、２つの構築物を設計した。１つは「リボザイム」６０（配列番号１）と称し、１つは「共標的」６２（配列番号２）と称した。疾患標的ＲＮＡ　６４の存在下で、ステムＡ〜Ｄ　７０（配列番号４）、７２（配列番号５）、７４、７６（配列番号３）からなる３分子複合体が形成される。得られた複合体は、図５Ａに示されるように、リボザイムおよび基質の活性コンホメーションを生じ、続いて共標的分子　６２（配列番号２）が開裂し、標識オリゴヌクレオチド　６２ａが遊離する。疾患標的ＲＮＡ　６４の非存在下では、ステムＡ　７０（配列番号２）およびＢ　７２（配列番号１）のみが完全に形成されている。ステムＣ　７４（配列番号１）は２つの塩基対のみからなるので、従って、３分子複合体に比較して、共標的　６２（配列番号４）の効果的な開裂を支持するには十分に安定ではない。
【００４０】
　図６は、リボザイムおよび共標的のみで構成される２分子複合体に比較した、リボザイム、共標的、および疾患標的で構成される完全複合体の活性を示す。疾患標的は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）ｍＲＮＡに対応する、２０ヌクレオチドでなるＲＮＡである。レーン１には、３つの全反応物が存在するがＭｇ＋＋が存在しない：開裂は観察されない。レーン２では、Ｍｇ＋＋とともに３つの全反応物が存在し、そして開裂が生じている。重要なことには、疾患標的の存在しないレーン３に見られるように、共標的の開裂量がレーン２よりも明らかに少ない。
【００４１】
　（実施例２：Ｂ型肝炎表面抗原ｍＲＮＡの一部分に対応する８００ヌクレオチドフラグメントの検出）
　図７Ａおよび７Ｂは、リボザイムの模式図であり、これは標的の非存在下での共標的の開裂が標的の存在下よりも多いことを示す。
【００４２】
　図７Ｃの結果は、疾患標的の存在または非存在下におけるリボザイムおよび共標的の効果を実証する。ＨＢＶ転写物が存在する場合、リボザイム活性は低い。これは本明細書に記載の方法の好例である。ここでは、分子の存在が、標識の遊離が増加することにより検出される。これはおそらく別の塩基対合による。
【００４３】
　図７Ｃに示されるように、レーン１では、３つの全反応物が存在するがＭｇ＋＋が存在しない：開裂は観察されない。レーン２では、Ｍｇ＋＋とともに３つの全反応物が存在し、そして開裂が生じている。重要なことには、疾患標的の存在しないレーン３に見られるように、共標的の開裂量がレーン２よりも明らかに多い。
【００４４】
　本発明の方法および組成物の改変および変形は、前述の詳細な説明から当業者に明らかである。このような改変および変形は、特許請求の範囲にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１Ａは、リボザイム増幅診断用組成物の略図である。これは標識したＮＵＸ開裂部位を持つ標識したＲＮＡ分子であって、固体支持体にしっかりと固定され、「共標的」ＲＮＡというＲＮＡ分子と塩基対を形成するために設計された１本のアーム、および「標的」ＲＮＡとして検出されるＲＮＡ上の予め定められた配列と塩基対を形成するために設計されたもう１本のアームを持つリボザイムである。
【図１Ｂ】１Ｂは、リボザイム増幅診断用組成物の略図である。これは標識したＮＵＸ開裂部位を持つ標識したＲＮＡ分子であって、固体支持体にしっかりと固定され、「共標的」ＲＮＡというＲＮＡ分子と塩基対を形成するために設計された１本のアーム、および「標的」ＲＮＡとして検出されるＲＮＡ上の予め定められた配列と塩基対を形成するために設計されたもう１本のアームを持つリボザイムである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、リボザイム増幅診断用組成物の略図である。これは標識したＮＵＸ開裂部位を持つ標識したＲＮＡ分子であって、固体支持体にしっかりと固定され、「共標的」ＲＮＡというＲＮＡ分子と塩基対を形成するために設計された１本のアーム、および「標的」ＲＮＡとして検出されるＲＮＡ上の予め定められた配列と塩基対を形成するために設計されたもう１本のアームを持つリボザイムである。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、非核酸分子検出のためのリボザイム増幅診断用組成物である。これは、リガンド結合部位が、検出されるべきリガンド、および活性リボザイムによって開裂され検出可能な標識された配列を遊離する共標的分子と結合した時に、酵素的に活性なコンホメーションを形成するリボザイムである。図２Ａは、リボザイムがリガンドに結合して活性なコンホメーションをとっている場合；図２Ｂは、リボザイムがリガンドに結合せず、不活性なコンホメーションをとっている場合である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、熱安定性リボザイム増幅診断システムの略図である。ここで、標的および共標的と適切に適合し、コンホメーション的にも活性であるこのリボザイムを、図３Ａに示し、不安定化し、コンホメーション的にも不活性なリボザイムを図３Ｂに示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＲＮＡａｓｅ　Ｐを適切なＥＧＳと接触させて細菌のＲＮＡｓｅ　Ｐ（図４Ａ）に誘導することを用いる標的の開裂の略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＲＮＡａｓｅ　Ｐを適切なＥＧＳと接触させてヒトのＲＮＡａｓｅ　Ｐ（図４Ｂ）のどちらかに誘導することを用いる標的の開裂の略図である。
【図５Ａ】図５Ａは、共標的および標的に結合した活性リボザイム（図５Ａ）の略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、共標的のみに結合した不活性リボザイム（図５Ｂ）の略図である。
【図６】図６は、１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルを１×ＴＢＥ中で８００ボルトで電気泳動したものである。反応は、５０ｍＭ　トリス、３０ｍＭ　Ｍｇ＋＋で行い、３７℃で２時間インキュベートした。各組成物：酵素（Ｅ）、共標的（ＣＴ）、および疾患標的（ＤＴ）を、およそ同等の比活性で添加した。レーン１では、反応物の３つ全てが存在したがＭｇ＋＋は存在しなかった；レーン２では反応物の３つ全てがＭｇ＋＋とともに存在した；そしてレーン３では、酵素および共標的のみが存在した。開裂産物（ＣＰ）は、レーン２で見ることができ、そしてレーン３でそれよりは少なく見える。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、リボザイム／共標的システムの略図である。このシステムは、疾患標的が存在するときの方がそれが存在しないときよりはるかに活性である。図７Ｃは、４％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルを１×ＴＢＥ中で８００ボルトで電気泳動したものである。反応物は、図７Ａおよび７Ｂにおけるそれらに対応する。反応は、５０ｍＭ　トリス中で３０ｍＭ　Ｍｇ＋＋を伴うかまたは伴わないかのどちらかで３７℃で３時間行った。反応物は以下の量存在した：リボザイム　７ｐｍｏｌｅ；共標的（ＣＴ）　１１．４ｐｍｏｌｅ；疾患標的（ＤＴ）　０．３７ｐｍｏｌｅ。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、リボザイム／共標的システムの略図である。このシステムは、疾患標的が存在するときの方がそれが存在しないときよりはるかに活性である。図７Ｃは、４％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルを１×ＴＢＥ中で８００ボルトで電気泳動したものである。反応物は、図７Ａおよび７Ｂにおけるそれらに対応する。反応は、５０ｍＭ　トリス中で３０ｍＭ　Ｍｇ＋＋を伴うかまたは伴わないかのどちらかで３７℃で３時間行った。反応物は以下の量存在した：リボザイム　７ｐｍｏｌｅ；共標的（ＣＴ）　１１．４ｐｍｏｌｅ；疾患標的（ＤＴ）　０．３７ｐｍｏｌｅ。
【図７Ｃ】図７Ａおよび７Ｂは、リボザイム／共標的システムの略図である。このシステムは、疾患標的が存在するときの方がそれが存在しないときよりはるかに活性である。図７Ｃは、４％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルを１×ＴＢＥ中で８００ボルトで電気泳動したものである。反応物は、図７Ａおよび７Ｂにおけるそれらに対応する。反応は、５０ｍＭ　トリス中で３０ｍＭ　Ｍｇ＋＋を伴うかまたは伴わないかのどちらかで３７℃で３時間行った。反応物は以下の量存在した：リボザイム　７ｐｍｏｌｅ；共標的（ＣＴ）　１１．４ｐｍｏｌｅ；疾患標的（ＤＴ）　０．３７ｐｍｏｌｅ。
【００４６】
　(配列表)
【００４７】
【数１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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