(57)【要約】【課題】バレイショ塊茎形成や花芽形成に深く関与する誘導物質であるジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドを微生物を用いて、容易かつ大量に製造する方法を提供すること。【解決手段】オレンジ樹脂病罹病植物体から分離し、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物を培養し、培養物から該化合物を採取することにより、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を容易かつ大量に製造する。本発明の微生物は、独立行政法人　農業生物資源研究所の農業生物資源ジーンバンクに、ＭＡＦＦ３０６０２７の寄託番号で寄託されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オレンジ樹脂病罹病植物体から分離し、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物を培養し、培養物からジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を採取することを特徴とするジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物の製造方法。
【請求項２】
ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物が、ラシオディプロディア・テオブロマエＯＣＳ７１（ＭＡＦＦ３０６０２７）であることを特徴とする請求項１記載のジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物の製造方法。
【請求項３】
ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物を、バレイショ煎汁液体培地で培養し、培養物からジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を採取することを特徴とする請求項１又は２記載のジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物の製造方法。
【請求項４】
ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物を、液体培地に接種し、２５〜３０℃、暗所条件で培養し、培養物からジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を単離することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物によるジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及び／又はセオブロキシドの製造方法、特には、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及び／又はセオブロキシドを高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエ（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ・ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ）を培養し、培養物から該化合物を採取することを特徴とするジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及び／又はセオブロキシドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジャスミンの花の香気成分の一つとして発見されたジャスモン酸（ｊａｓｍｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）は、式［１］
【０００３】
【化１】
2004033088.tif 000002
【０００４】
で表される化合物であり、メチルエステル体の形で単離されて以来、植物の成長阻害、老化促進、傷害ストレスのシグナル伝達等、種々の生理現象に係わる植物ホルモン物質として知られている。ジャスモン酸の多岐にわたる生理作用については、近年数多くの報告がなされている（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｐｅｒｇａｍｏｎ，　Ｖｏｌ．１（１９９９），　１１７−１３８　；農業及び園芸　第７５巻１０号（２０００年）、Ｐ４５−４８）。
【０００５】
ジャスモン酸は、α−リノレン酸から生合成される。すなわち、図１に示すように、▲１▼α−リノレン酸が１３−リポキシゲナーゼ（１３−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の作用により１３（Ｓ）−ヒドロパーオキシリノレン酸（１３（Ｓ）−ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｌｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ）に変換され、次に、▲２▼アレンオキシシンターゼ（ａｌｌｅｎｅ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）の作用により１２，１３（Ｓ）−エポキシリノレン酸に変換され、更に、▲３▼アレンオキシシクラーゼ（ａｌｌｅｎｅ　ｏｘｉｄｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）の作用により５員環が環化され、中間体１２−オキソ−シス−１０、１５−フィトジエン酸（１２−オキソ−ＰＤＡ）が生成され、更に、▲４▼１２−オキソ−ＰＤＡレダクターゼ（１２−ｏｘｏ−ＰＤＡ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の作用により５員環２重結合が還元され８−［３−オキソ−２−シス−［（Ｚ）−２−ペンテニル］シクロペンチル］オクタン酸（８−［３−ｏｘｏ−２−ｃｉｓ−［（Ｚ）−２−ｐｅｎｔｅｎｙｌ］　ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌ］　ｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）（ＯＰＣ−８：０）とされた後、▲５▼β酸化酵素による３段階のβ酸化による生合成によって形成される。
【０００６】
シス体である７−エピジャスモン酸（１ａ）の７位の側鎖は、ケトンのα位であり容易に異性化し、熱力学的により安定なトランス体のジャスモン酸（１ｂ）となる。シス体（１ａ）の方がトランス体（１ｂ）よりもいくつかのアッセイ系において高い活性を持つことから、天然型のジャスモン酸はシス体（１ａ）の形で存在し、トランス体のジャスモン酸は精製過程において異性化されたものであると考えられている。
【０００７】
ツベロン酸（ｔｕｂｅｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）は、式［２］（式中、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｈ：２ａ）
【０００８】
【化２】
2004033088.tif 000003
【０００９】
で表される化合物であり、本発明者らがバレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ　　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　Ｌ．）塊茎形成研究において、バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　Ｌ．）葉部から上記式［１］で表される配糖体として、単離したものである（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９（１９８８），１０４７−１０５１）。現在までに、バレイショの葉部からのツベロン酸グルコシド（式［２］中、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ：２ｂ）以外に、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）葉部からツベロン酸メチルエステルグルコシド（式［２］中、Ｒ１＝ＣＨ３、Ｒ２＝β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ：２ｃ）が、単離され、いずれも塊茎形成誘導作用があることが明らかにされている（Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，５３（１９８９），２８５３−２８３７；Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７（１９９３），１２５３−１２５６）。
【００１０】
これらの化合物は、その構造からジャスモン酸を経由して合成されるものと考えられている。放射性同位体ラベルしたジャスモン酸の代謝実験により、ジャスモン酸は１２位の炭素に水酸基が導入されてツベロン酸等となり、その水酸基がグルコシル化を受けてより極性の高い移動型のツベロン酸グルコシド等へと代謝されることがわかった。しかしながら、このジャスモン酸からツベロン酸や、ツベロン酸グルコシド等への酸化過程の詳細は未だ解明されていない。
【００１１】
１１−ヒドロキシジャスモン酸（１１−ｈｙｄｒｏｘｙｊａｓｍｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）は、式［３］で表される化合物であり、
【００１２】
【化３】
2004033088.tif 000004
【００１３】
酸化酵素により、ジャスモン酸の１１位に水酸基が導入され、より極性の高い化合物へと代謝されることにより生成されると考えられている。
【００１４】
セオブロキシド（ｔｈｅｏｂｒｏｘｉｄｅ）は、式［４］
【００１５】
【化４】
2004033088.tif 000005
【００１６】
で表される化合物であり、本発明者の研究室においてバレイショ塊茎形成誘導活性を持つ物質として、糸状菌ラシオディプロディア・テオブロマエ（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ・ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ）から分離された。セオブロキシドは、現在、バレイショ塊茎形成誘導活性のほかに、アサガオなどのヒルガオ科植物等の種々の植物の花芽形成誘導活性があることが、本発明者によって見い出されてている（農業及び園芸第７５巻１０号（２０００年）、Ｐ４５−４８；特開平１０−１０９９１０号公報）。また、本発明者の研究室の実験により、セオブロキシドを外部から投与すると内生のジャスモン酸量が増加することが、確認されている。この現象は、セオブロキシドがジャスモン酸生合成経路におけるいずれかの段階（酵素系）を促進し、それによって増加した化合物がバレイショ塊茎誘導や花芽形成の促進に直接関与しているものと思われる。
【００１７】
上記のとおり、多くの活性を有するジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドの利用を図るためには、これらの物質を大量に入手する必要がある。それらの入手方法として、植物体に含まれるこれらの成分を抽出する方法が考えられるが、植物体中におけるこれらの物質の生成量はごく微量であり、植物体からの抽出方法は、これらの物質の利用に際しての入手方法としては現実的ではない面がある。そこで、これらの物質を比較的容易に製造できる方法として、微生物を用いる方法、即ち、糸状菌であるラシオディプロディア・テオブロマエ（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ・ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ）を培養して、製造する方法が本発明者らにより報告されている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５，［４］（１９９４）８３５−８３９；Ｊ．Ｐｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｒｅｇｕｌ，１９（２０００），４５７−４６１）。
【００１８】
ラシオディプロディア・テオブロマエは、熱帯・亜熱帯にかけて広く分布する不完全菌亜門に属する糸状菌であり、バナナ、パパイヤなどの熱帯果樹の果実腐敗や枝幹病害を引き起こす植物病害菌であり、日本でも、ナシボトリオディプロディア枝枯病、バナナ黒腐病およびパパイヤ軸腐病の病害菌として知られている。
この糸状菌を用いてジャスモン酸類及びセオブロキシドを製造することが試みられているが、現在取得されている菌株は、これらの物質の利用に際しての該物質の生産株としては、まだ十分な生産能を有しているものではないという問題がある。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の課題は、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及び／又はセオブロキシドを、容易かつ大量に製造する方法、特には、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及び／又はセオブロキシドを微生物を用いて、容易かつ大量に製造する方法を提供するにある。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決すべく、鋭意探索の結果、本発明者はオレンジ樹脂病罹病植物体から分離した糸状菌である、ラシオディプロディア・テオブロマエの菌株がジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドを高生産量で産生することを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明の微生物は、独立行政法人　農業生物資源研究所の農業生物資源ジーンバンクに、ＭＡＦＦ３０６０２７の寄託番号で寄託されている。
【００２２】
すなわち本発明は、オレンジ樹脂病罹病植物体から分離し、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物を培養し、培養物からジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を採取することを特徴とするジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物の製造方法（請求項１）や、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物が、ラシオディプロディア・テオブロマエＯＣＳ７１（ＭＡＦＦ３０６０２７）であることを特徴とする請求項１記載のジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物の製造方法（請求項２）や、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物を、バレイショ煎汁液体培地で培養し、培養物からジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を採取することを特徴とする請求項１又は２記載のジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物の製造方法（請求項３）や、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物を、液体培地に接種し、２５〜３０℃、暗所条件で培養し、培養物からジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を単離することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物の製造方法（請求項４）からなる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明は、オレンジ樹脂病罹病植物体から分離し、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸、及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物を培養し、培養物からジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を採取することからなる。
本発明のジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を高生産量で産生する能力を有するラシオディプロディア・テオブロマエの微生物としては、オレンジ植物体から分離したラシオディプロディア・テオブロマエＯＣＳ７１株が挙げられる。該菌株は、独立行政法人　農業生物資源研究所の農業生物資源ジーンバンクに、ＭＡＦＦ３０６０２７の寄託番号で寄託されている。
【００２４】
本発明において、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を製造するには、ラシオディプロディア・テオブロマエの上記高生産株を用いて、該菌株を培地に接種して培養し、その培養物からジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を採取することにより製造する。使用する培地としては、通常糸状菌の培養に使用される適宜の固体或いは液体培地を使用することができるが、大量製造に供する培地としては、液体培地を使用することが好ましい。本発明のラシオディプロディア・テオブロマエの菌株の培養用の培地としては、バレイショ煎汁液体培地が特に好ましい。
【００２５】
本発明のラシオディプロディア・テオブロマエの菌株を培養する際の培養条件としては、特に限定はないが、本発明の菌株を液体培地に接種し、２５〜３０℃、暗所条件で培養し、培養物からジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドから選択される１以上の化合物を採取する方法が特に好ましい。本発明の化合物を培養物から分離精製するには、公知の分離精製手段を用いて行うことができる。例えば、それぞれの化合物について、培養物中の化合物を活性炭で吸着し、ＭｅＯＨで溶出する。これを濃縮後、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３によるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。本発明の生成物の同定は、ＧＣ−ＭＳ等適宜の同定手段により行うことができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
本発明において、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドの高生産製造方法を構築するために、糸状菌ラシオディプロディア・テオブロマエの高生産量産生菌株の探索を行った。この探索を行うために、種々の植物から取得したラシオディプロディア・テオブロマエの菌株について、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドの生産についての定量実験を行った。
【００２７】
［ラシオディプロディア・テオブロマエ菌株の調製］
ラシオディプロディア・テオブロマエは、熱帯・亜熱帯にかけて広く分布する不完全菌亜門も属する糸状菌であり、バナナ、パパイヤなどの熱帯果樹の果実腐敗や枝幹病害を引き起こす植物病害菌である。日本でも、ナシボトリオディプロディア枝枯病、バナナ黒腐病およびパパイヤ軸腐病の病害菌として有名である。この糸状菌はジャスモン酸をはじめとするジャスモン酸関連化合物を生産することが知られているので、種々の植物からこの菌を分離し、該菌を用いて定量実験を行った。用いた菌株を表１に示す。１つの菌株につき暗所で２週間と３週間培養を行った。ＩＦＯ３１０５９については暗所と明所の２通りで培養を行った。
【００２８】
【表１】
2004033088.tif 000006
【００２９】
［ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸、セオブロキシドの定量］
（ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸、及びセオブロキシドの生成及び精製）
表１に示したラシオディプロディア・テオブロマエの菌株を、２％Ｐ．Ｄ．培地で暗所、２５℃で２週間と３週間、それぞれ静地培養した。ラシオディプロディア・テオブロマエ　ＩＦＯ３１０５９の菌株については明所で同様の培養を行った。培養終了後、ガーゼ濾過により菌体と培養濾液にわけ、培養濾液を分液、固相抽出、各種クロマトグラフィーにより精製を行った。ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸はＬＣ−ＭＳで、セオブロキシドはトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化しＧＣ−ＭＳで分析を行った。ジャスモン酸類及びセオブロキシドの生成及び精製の概略を、図２に示す。
【００３０】
（ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸の同定、定量）
ジャスモン酸、ツベロン酸は、重水素ラベル体である［１０，１１，１１，１２，１２，１２−２Ｈ６］−ジャスモン酸（［Ｄ］−ＪＡ）（化合物１）、［１０，１１，１１，１２，１２−２Ｈ５］−ツベロン酸（［Ｄ］−ＴＡ）（化合物２）を内部標準として培養濾液に加え（図３）、ＬＣ−ＭＳ分析により、化合物１，２のピーク面積との比較によって生産量を決定するという定量法が確立されていたので、その方法に従い定量を行った。なお、［Ｄ］−ＪＡ、［Ｄ］−ＴＡはシス体である立体異性体を含む混合物である。
【００３１】
ＬＣ−ＭＳにおけるツベロン酸と１１−ヒドロキシジャスモン酸の同定は、次の方法に従った。
即ち、ＬＣ−ＭＳ分析では、ジャスモン酸、ツベロン酸をネガティブモード（［Ｍ−Ｈ］−）で検出するため、検出質量はそれぞれｍ／ｚ＝２０９、２２５である。ツベロン酸と１１−ヒドロキシジャスモン酸は構造を見ればわかるように、水酸基の位置が異なるだけであるので、分子量が同じであり、かつ極性も非常に近いことから、２つの化合物はこの検出法ではリテンションタイムが接近した２つのピークとして現れる。このことから、ピーク１とピーク２のどちらがツベロン酸であるかを同定することが困難であった。そこでラシオディプロディア・テオブロマエ　ＩＨＳ１２１の菌株を用いて、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸をそれぞれ単独で加えて、どちらのピークが増加をするかを確認することにした（図４）。ラシオディプロディア・テオブロマエ　ＩＨＳ１２１はこれら２つの化合物の生産量がほぼ同量であることからこの菌株を用いて実験を行った。
【００３２】
これによると、１１−ヒドロキシジャスモン酸を加えた場合はリテンションタイムのより早いピーク１が増加しているが、ツベロン酸を加えた場合はピーク２が増加していることがわかる。ピーク２の後にある小さなピークは、標品に含まれていたツベロン酸の７位の側鎖が異性化したシス体の立体異性体ではないかと考えられる。このことから、ピーク１は１１−ヒドロキシジャスモン酸由来のピークであり、ピーク２がツベロン酸のピークであると判断した。
この実験により、ＬＣ−ＭＳ分析ではリテンションタイムが３５．５分のピークを１１−ヒドトロキシジャスモン酸、３７．５分のピークをツベロン酸として定量を行った。
【００３３】
（セオブロキシドの同定、定量）
セオブロキシドは、以前、当研究室で行っていた定量法をもとに、少し修正を加えＧＣ−ＭＳによる定量を行った。セオブロキシドは、ＧＣ−ＭＳによる分析に先立って、ＴＭＳ誘導体化された。
セオブロキシドは、バレイショ塊茎誘導物質として糸状菌ラシオディプロディア・テオブロマエから単離されたエポキシ環と水酸基を２つ有する極性の高い化合物である。そのため、そのままでは揮発性が低く、直接ＧＣ−ＭＳで定量することが困難である。そこでセオブロキシドをトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化し（図５）、揮発性を増加させＧＣ−ＭＳ分析を行うことにした。シリル化試薬は加えて密栓し、加熱するだけの容易な操作によってシリル化が可能な、Ｎ，Ｏ−Ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−ａｃｅｔａｍｉｄｅ（ＢＳＡ）を用いた。
【００３４】
［ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸、セオブロキシドの定量結果］
定量の結果を、表２に示す。
【００３５】
【表２】
2004033088.tif 000007
【００３６】
定量の結果、ラシオディプロディア・テオブロマエでは菌株によって化合物の生産能が大きく異なることがわかった。ジャスモン酸の生産についてはＯＣＳ７１の３週間培養したものが最も多く、次いでＯＣＳ７１の２週間培養したものが多かった。一方、ＮＨ５、ＮＣ３ｒｅｄ、ＢＢ６２の菌株はほとんどジャスモン酸を生産していないことがわかった。ツベロン酸の生産については、ジャスモン酸の場合と同様にＯＣＳ７１が最も多く生産しており、次にＮＣ３　ｒｅｄの３週間、ＳＣＴ４の３週間と続く。全体的にツベロン酸の生産量はジャスモン酸の生産量よりも少ない傾向にある。１１−ヒドロキシジャスモン酸の生産についても、ジャスモン酸、ツベロン酸と同様に、ＯＣＳ７１株が大量に生産していることがわかった。
【００３７】
セオブロキシドの生産については、ＯＣＳ７１の２および３週間培養したものが圧倒的に多く、次いでＩＦＯ３１０５９の２週間、暗所で培養したものが多かった。その他の菌株は検出限界以下か、あるいは生産していてもごく微量であった。
セオブロキシドとジャスモン酸の量的な相関であるが，ＯＣＳ７１のみに関して言えば、あるといえそうであるが、他の菌株ではジャスモン酸、ツベロン酸の生産量に比べてセオブロキシドをほとんど生産しない菌株もあるので、量的相関があるとは考えにくい。また、暗所と明所での培養による生産量の違いはこの結果からはほとんど判断できる。
しかし、実験に用いた１０種の菌株のうち、ＯＣＳ７１がセオブロキシドを多く生産することが分かった。
この実験結果から、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸、及びセオブロキシドの高生産株としてラシオディプロディア・テオブロマエＯＣＳ７１株が同定された。
【００３８】
［上記実施例の実験に用いた使用器具、試薬類及び実験条件の詳細］
以下に、上記実験に用いた使用器具、試薬類及び実験条件について詳述する
（使用機器及び試薬類）
１．測定機器
ＭＳ：ＪＥＯＬ　ＪＭＳ−ＤＸ３００　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
ＨＰＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ　６００　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ
Ｗａｔｅｒｓ　４８４　Ｔｕｎａｂｌｅ　Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｗａｔｅｒｓ　７４１　Ｄａｔａ　Ｍｏｄｕｌｅ
Ｗａｔｅｒｓ　５１５　ＨＰＬＣ　Ｐｕｍｐ
ＷａｔｅｒｓＴＭ　４８６　Ｔｕｎａｂｌｅ　Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｄ−２５００　Ｃｈｒｏｍａｔｏ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ
Ｗａｔｅｒｓ　６００Ｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ
ＬＣ−ＭＳ：ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｌ−６２００　Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｐｕｍｐ
ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｍ−１２００Ｈ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
ＧＣ−ＭＳ：Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ　ＧＣＱｐｌｕｓ−ＴＲＡＣＥ　ＧＣ　２０００　ｓｅｒｉｅｓ
【００３９】
２．クロマトグラフィー担体、カラムと分析機器
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
Ｍｅｒｃｋ　Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０Ｆ２５４Ａｒｔ．５７４４
Ｍｅｒｃｋ　Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０Ｆ２５４Ａｒｔ．５７１５
固相抽出用カラム
ｖａｒｉａｎ　ＢｏｎｄＥｌｕｔ　Ｃ１８
ｖａｒｉａｎ　ＢｏｎｄＥｌｕｔ　ＤＥＡ
ｖａｒｉａｎ　Ｓｅｐ−ｐａｋ　Ｖａｃ　１２ｃｃ（２ｇ）
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用カラム
Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　１０ｍｍ×３００ｍｍ
Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ８　４ｍｍ×２５０ｍｍ
Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ　ＲＰ−１８　ＧＰ　Ａｑｕａ　２５０−４，６（５μｍ）
Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　７．５ｍｍ×３００ｍｍ
【００４０】
（実験条件）
１．培地の調整
水洗いをし、皮をむいたバレイショ１ｋｇを２ｃｍ角に切り、水道水を加えて１２１℃、５分間オートクレーブで煮た。３枚重ねのガーゼで濾過した後、Ｄ−グルコース１００ｇを加え、水道水で５ｌにメスアップし２％Ｐ．Ｄ．培地を作成した。この２％Ｐ．Ｄ．培地を５００ｍｌ三角フラスコに２００ｍｌずつ分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブにより減菌した。
【００４１】
２．前培養
調整した２％Ｐ．Ｄ．培地を１００ｍｌ三角フラスコに４０ｍｌ分注し、オートクレーブで減菌した。放冷後、スラントから１０種の菌株をそれぞれ無菌的に接種し、２日間、３０℃で振とう培養した。
【００４２】
３．本培養
前培養したラシオディプロディア・テオブロマエの各菌株を、前記１．で用意した三角フラスコに無菌的に接種した。培養は菌株１種につき２週間培養５本、３週間培養５本を２５℃、暗所で行った。
ＩＦＯ３１０５９については暗所条件に加え、人工気象器内で明所、２５℃の条件で同様の培養を行った。
【００４３】
４．培養濾液からのジャスモン酸、ツベロン酸及びセオブロキシドの抽出
培養終了後、３枚重ねのガーゼにより濾過し、培養濾液と菌体に分けた。菌体の方は冷凍庫に保存しておいた。培養濾液は、ほぼ乾固するまで減圧濃縮をし、少量の脱塩水を加え、重水素ラベルした［１０，１１，１１，１２，１２，１２−２Ｈ６］−ジャスモン酸ＭｅＯＨ溶液として［１０，１１，１１，１２，１２−２Ｈ５］−ツベロン酸ＭｅＯＨ溶液からＤ−ＪＡ、Ｄ−ＴＡそれぞれ５０μｇずつシリンジではかりとり加えた。ｐＨが２から３になるまで４Ｎ塩酸を加え、酢酸エチル（５０ｍｌ×３）で抽出した。次に、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５０ｍｌ×３）を加え、水層と有機層に振り分けた。セオブロキシドが含まれる有機層には無水硫酸ナトリウムを加え乾燥し、ジャスモン酸、ツベロン酸が含まれる水層は再び４Ｎ塩酸を加えて酸性とし、酢酸エチル（６０ｍｌ×３）で振り分け、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
【００４４】
５．ジャスモン酸、ツベロン酸の精製
ジャスモン酸、ツベロン酸の含まれる有機層を減圧濃縮後、Ｈ２Ｏ（１ｍｌ）に溶解し、ＭｅＯＨで膨潤させたＳｅｐ−ｐａｋＣ１８に供した。そしてＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（８ｍｌ）で溶出した。次にその溶出液を減圧濃縮した後ＭｅＯＨ（１ｍｌ）に溶解し、１ＮＡｃＯＨ／ＭｅＯＨで膨潤したＢｏｎｄＥｌｕｔＤＥＡに供した。そして１ＮＡｃＯＨ／ＭｅＯＨ（８ｍｌ）で溶出した。溶出液を減圧濃縮した後少量のＭｅＯＨに溶解してＨＰＬＣ分取を行った。まず、標品のジャスモン酸、ツベロン酸をＨＰＬＣに供し、それぞれのリテンションタイムの前後１．５分、計３分の分画を分取し、精製を行った。ＨＰＬＣ分取条件を以下に示す。
ＨＰＬＣ分取条件
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　１０ｍｍ×３００ｍｍ
Ｓｏｌｖｅｎｔ：ＭｅＯＨ／０．２％ＡｃＯＨ・Ｈ２Ｏ＝７０／３０−１００／０
Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ：２．５ｍｌ／ｍｉｎ
Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２５４ｎｍ
【００４５】
６．ＬＣ−ＭＳによるジャスモン酸、ツベロン酸の定量
ＨＰＬＣ分取した分画を減圧濃縮した後、１００μｌのＭｅＯＨに溶解しＬＣ−ＭＳによりジャスモン酸、ツベロン酸の定量を行った。定量は内部標準として用いた重水素ラベルしたジャスモン酸、ツベロン酸とのピーク面積の比較により決定した。ＬＣ−ＭＳ分析条件を以下に示す。
ＬＣ−ＭＳ分析条件
（ＨＰＬＣ）
ＪＡ　Ｃｏｌｕｍｎ：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ８　４ｍｍ×２５０ｎｍ
Ｓｏｌｖｅｎｔ：ＭｅＯＨ／０．２％ＡｃＯＨ・Ｈ２Ｏ＝５０／５０
ＴＡ　Ｃｏｌｕｍｎ：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ　ＲＰ−１８　ＧＰ　Ａｑｕａ　２５０−４，６（５μｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：ＭｅＯＨ／０．２％ＡｃＯＨ・Ｈ２Ｏ＝２５／７５
Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　０．５ｍｌ／ｍｉｎ
（ＭＳ）
検出質量：ＪＡ；ｍ／ｚ＝２０９（［Ｍ−Ｈ］−）、［Ｄ］−ＪＡ；ｍ／ｚ＝２１５（［Ｍ−Ｈ］−）
ＴＡ；ｍ／ｚ＝２２５（［Ｍ−Ｈ］−）、［Ｄ］−ＴＡ；ｍ／ｚ＝２３０（［Ｍ−Ｈ］−）
【００４６】
７．ＬＣ−ＭＳにおけるツベロン酸と１１−ヒドロキシジャスモン酸の同定
ラシオディプロディア・テオブロマエ　ＩＨＳ１２１の３週間培養の菌株をＨＰＬＣ分取後、減圧濃縮し、１００μｌのＭｅＯＨに溶解した。そして、そのうちの５μｌをシリンジではかり、標品である１１−ヒドロキシジャスモン酸とツベロン酸をそれぞれ０．８μｇ含まれるように加え、
ＩＨＳ１２１３ｗｅｅｋｓ５μｌ
ＩＨＳ１２１３ｗｅｅｋｓ５μｌ＋１１−ｈｙｄｒｏｘｙｊａｓｍｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（０．８μｇ）
ＩＨＳ１２１３ｗｅｅｋｓ５μｌ＋ｔｕｂｅｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（０．８μｇ）
の３通りでＬＣ−ＭＳに供した。ＬＣ−ＭＳ分析条件は、上記６．と同様である。
【００４７】
８．セオブロキシドの精製
セオブロキシドの含まれる有機層を減圧濃縮した後、少量のＣＨＣｌ３に溶解しＳｅｐ−Ｐａｋｓｉｌｉｃａ（２ｇ）に供した。そして３％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３（８ｍｌ）で溶出した。その溶出液を再び減圧濃縮した後、Ｈ２Ｏ（１ｍｌ）に溶解し、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８に供した。そして３０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（８ｍｌ）で溶出した。溶出液を減圧濃縮し、少量のＭｅＯＨに溶解した後、ＨＰＬＣ分取を行った。ＨＰＬＣ分取は、まず標品のセオブロキシドをＨＰＬＣに供し、そのリテンションタイムの前後１．５分、計３分の分画を分取した。ＨＰＬＣ分取条件を以下に示す。
ＨＰＬＣ分取条件
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　７．５ｍｍ×３００ｍｍ
Ｓｏｌｖｅｎｔ：ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝３０／７０
Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２１０ｎｍ
【００４８】
９．セオブロキシドのＴＭＳ誘導体化
ＨＰＬＣ分取した分画を減圧濃縮し、少量のＭｅＯＨに溶解した。パスツールペピットから作成した自家製のアンプル管にシリンジではかり、デシケーターで十分乾燥した。乾燥後、ＢＳＡ２０μｌを加え、ガスバーナーで素早く密栓をし、７６℃、３時間、オイルバーナーで加熱した（Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．　Ｓｃｉ．　９（１９７１），９８−１０４）。
【００４９】
１０．ＧＣ−ＭＳによるセオブロキシドの定量
セオブロキシドを定量するにあたり、検量線を作成した。検量線は、標品のセオブロキシドを用いて５ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、３５ｐｐｍの濃度になるように調整し、第２節８．と同様の操作を行った。
常温で３０分以上放冷したサンプルを開封し、シリンジで１μｌとり、ＧＣ−ＭＳに供し、ＧＣ−ＭＳ条件を以下に示す。
ＧＣ−ＭＳ分析条件
Ｃｏｌｕｍｎ：ＤＢ−１（０．２５ｍｍ×３０ｍ）
Ｉｎｉｔｉａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：１００℃
Ｉｎｉｔｉａｌ　ｔｉｍｅ：１．０ｍｉｎ
Ｒａｔｅ：１０℃／ｍｉｎ
Ｆｉｎａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：３００℃
Ｆｉｎａｌ　ｔｉｍｅ：１０ｍｉｎ
【００５０】
【発明の効果】
本発明は、花芽や塊茎形成を誘導促進する植物ホルモン様物質としての利用が期待される、ジャスモン酸、ツベロン酸、１１−ヒドロキシジャスモン酸及びセオブロキシドの微生物を用いた、容易かつ大量の製造方法を提供する。本発明の方法により、これらの物質の実用的な生産コストでの工業的生産を可能とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で製造される化合物のジャスモン酸の、生合成経路の概略を示す図である。
【図２】本発明の実施例におけるジャスモン酸、ツベロン酸、セオブロキシドの生成及び精製方法の概略を示す図である。
【図３】本発明の実施例において、重水素ラベルしたジャスモン酸及びツベロン酸の構造を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、ツベロン酸及び１１−ヒドロキシジャスモン酸のＬＣ−ＭＳ分析におけるピークの同定を行った結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例におけるセオブロキシドの定量に際して、ＧＣ−ＭＳ分析のためにセオブロキシドをトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化した場合の構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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