(57)【要約】【課題】特異的なハイブリダイゼーションが起こるような鎖長分布を持ったＤＮＡ断片の調製法を提供する。【解決手段】以下の工程を含むＤＮＡ断片の調製方法。（１）鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡの混合物に、１種類以上のプライマーを混合して特異的にアニールさせた後、デオキシリボヌクレオチド存在下、鎖伸長反応を行う工程、（２）伸長反応後の反応生成物をＤＮＡ中の塩基を除去する作用を持つ酵素と反応させる工程。ＤＮＡ中の塩基を除去する作用を持つ酵素にウラシルＤＮＡグルコシラーゼうを使用することが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むＤＮＡ断片の調製方法。
（１）鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡの混合物に、１種類以上のプライマーを混合して特異的にアニールさせた後、デオキシリボヌクレオチド存在下、鎖伸長反応を行う工程。
（２）伸長反応後の反応生成物をＤＮＡ中の塩基を除去する作用を持つ酵素と反応させる工程。
【請求項２】
第２の工程の後、さらに加熱する工程を含む請求項１記載の調製方法。
【請求項３】
鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡの混合物が、ｍＲＮＡ又はｔｏｔａｌ　ＲＮＡである請求項１又は２記載の調製方法。
【請求項４】
ＤＮＡ中の塩基を除去する作用を持つ酵素が、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼである請求項１〜３のいずれかに記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を検出するための試料調製方法に関する。特に鋳型核酸に相補なＤＮＡ断片を調製する方法に関する。本発明で調製されたＤＮＡ断片は、例えば疾病関連遺伝子等のプローブが固定されたＤＮＡマイクロアレイの検体として使用される。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料中に存在する特定の核酸分子を検出する技術は、特定の条件下で発現する遺伝子の核酸レベルでの解析や、遺伝子疾患の変異遺伝子の検出、さらにはガンの診断、ウイルス関連遺伝子の検出にきわめて重要である。
【０００３】
特定の核酸分子を検出する方法としては、これまで一般的に行われているノーザンハイブリダイゼーション法や、ＤＮＡマイクロアレイによる大規模な核酸検出法が存在する。
【０００４】
これらの手法では通常、生体試料からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出、ｍＲＮＡに精製、逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成し、放射性同位元素や蛍光分子で標識してハイブリダイゼーションさせ特定の核酸分子を検出する。
【０００５】
ｍＲＮＡの平均長は試料にもよるが、およそ平均１．９　ｋｂａｓｅ程度であり、ハイブリダイゼーションさせる時の効率、感度が悪く、インキュベーションに比較的時間がかかるという問題があった。
【０００６】
上記の問題を解決するためにＤＮＡを断片化して用いる方法が例示できる（特許文献１）。この方法では、ＤＮＡ鎖を鋳型とし４種類のｄＮＴＰの１つであるｄＴＴＰをｄＵＴＰに置き換えた反応液中で、Ｕを含んだ増幅産物を合成し、これをウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって断片化した後にハイブリダイゼーションさせるというものである。
【０００７】
通常、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼでＵを含んだ増幅産物を処理すると、１本鎖または２本鎖中のＵのほぼすべての部位で切断が起こり、数ｍｅｒ〜１０ｍｅｒ程度の相当短いＤＮＡ断片となってしまう。これはキャリーオーバーコンタミネーションを防ぐ方法として例示できるが（特許文献２）、このように相当短いＤＮＡ断片ではハイブリダイゼーション時の特異性が低下してしまうという問題が残されていた。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第６，０９０，５５３号
【０００９】
【特許文献２】
米国特許第５，０３５，９９６号
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、上記問題点を解決した、特異的なハイブリダイゼーションが起こるような鎖長分布を持ったＤＮＡ断片の調製法を提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、本発明は生体試料の核酸を調製するに際し、ｄＮＴＰ及びｄＵＴＰを好適な比率で含む溶液の存在下、伸長反応を実施した後、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを作用させることにより、特異的なハイブリダイゼーションが起こるような鎖長分布を持ったＤＮＡ断片が調製できることを見いだし、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の工程を含むＤＮＡ断片の調製方法、である。
【００１３】
（１）鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡの混合物に、１種類以上のプライマーを混合して特異的にアニールさせた後、デオキシリボヌクレオチド存在下、鎖伸長反応を行う工程。
【００１４】
（２）伸長反応後の反応生成物をＤＮＡ中の塩基を除去する作用を持つ酵素と反応させる工程。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下の工程を含むのＤＮＡ断片の調製方法である。
【００１６】
（１）鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡの混合物に、１種類以上のプライマーを混合して特異的にアニールさせた後、デオキシリボヌクレオチド存在下、鎖伸長反応を行う工程。
【００１７】
（２）伸長反応後の反応生成物をＤＮＡ中の塩基を除去する作用を持つ酵素と反応させる工程。
【００１８】
第１の工程において、まず、生体試料であるＤＮＡまたはＲＮＡの配列の一部に相補な配列を持つプライマーを１種類以上、設計する。プライマーは鋳型ＲＮＡの種類等に応じて適宜、設計される。ＲＮＡを鋳型とする場合、一般的にはオリゴｄＴを使用する。プライマーの種類はハイブリダイゼーションさせるプローブの種類に応じて、複数種、準備することも可能である。
【００１９】
「相補な配列」とはＡに対してはＴまたはＵ、Ｇに対してはＣ、Ｃに対してはＧ、ＵまたはＴに対してはＡに対応した配列を意味する。「核酸」とはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成したＤＮＡ、ｍＲＮＡを含むすべてのＤＮＡ及びＲＮＡを意味する。
【００２０】
次に、生体試料であるＤＮＡまたはＲＮＡと前記プライマーを混合し、互いにアニ−ルさせた後、アニールした部位から３’方向へ酵素によって鎖伸長反応を行う。伸長反応の際、使用する酵素は、例えば、Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｔｈ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＡＭＶ、ＭＭＬＶ、ＭＭＬＶを遺伝子的に改変したスーパースクリプトＴＭ、スーパスクリプトＩＩＴＭ、サーモスクリプトＴＭ等が使用できる。
【００２１】
鎖伸長反応の際、反応溶液としてｄＮＴＰとｄＵＴＰを混合したものを用いる。「ｄＮＴＰ」とは、ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅであり、「ｄＵＴＰ」とはｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅである。ここでＮは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇのいずれかを示す。またＴの代わりにＵを使用しても良い。さらにＡＡ−ｄＵＴＰを加えても良い。「ＡＡ−ｄＵＴＰ」とはａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅである。これはウラシルＤＮＡグリコシラーゼの基質にならない。
【００２２】
伸長反応では、ｄＵＴＰが混合されているため、Ｕを含んだＤＮＡが合成され、これをウラシルＤＮＡグリコシラーゼと反応させることによって、鎖は切断されＤＮＡ断片が調製される。ここで「ＤＮＡ断片」とは、鎖長が数ｍｅｒ〜１０００　ｍｅｒ、上限が２００　ｍｅｒ〜１０００　ｍｅｒ程度のＤＮＡを意味する。
【００２３】
調製されるＤＮＡ断片の鎖長は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで切断される部位の数に依存する。すなわち、Ｕが多く含まれるＤＮＡ鎖はウラシルＤＮＡグルコシラーゼによる切断部位が多いため、より短いＤＮＡ断片を生成する。切断点であるＤＮＡ鎖中のＵの割合は、ｄＵＴＰとｄＴＴＰの混合比を変えることにより調整することができる。ｄＵＴＰ及びｄＴＴＰのモル混合比は、ｄＵＴＰ：ｄＴＴＰ＝１：１〜１：４であることが好ましい。さらには切断されるのであればｄＵＴＰのかわりとなる他のデオキシリボヌクレオチドを使用しても良い。
【００２４】
また、
伸長反応の際、蛍光標識されたｄＮＴＰを加えておくことにより、蛍光標識されたＤＮＡ断片を調製することも可能である。また、反応性基をもつｄＮＴＰ、例えばアミノアリル基、ヘキシルアミノ基を持つｄＮＴＰを加えておくことも可能である。例えば、前記ｄＮＴＰを鎖伸長反応に取り込ませておけば、断片にポストラベルすることも可能である。
【００２５】
上記方法により調製されたＤＮＡ断片は、プローブが固定されたマイクロアレイ等に添加され、疾病関連遺伝子等の特定の核酸検出に使用される。
【００２６】
【実施例】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。
【００２７】
＜実施例１＞
以下の組成からなる２溶液を調製した。
【００２８】
（溶液１の組成）
・鋳型ポリヌクレオチド鎖（１μｇ／μｌ）
〔マウス脳ｍＲＮＡ（クロンテック社製）〕　　　　　　２μｌ
・オリゴｄＴプライマー（インビトロジェン社）　　　　　　　１μｌ
・ＤＥＰＣ処理水　　　　　　　　　　　　　　　　７μｌ
（溶液２の組成）
・　　ｃＤＮＡ合成用バッファー　　　　　　　　　　　　　　４μｌ
（クロンテック社Ａｔｌａｓ　ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ付属）
・　　ｄＮＴＰミックス　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
（５ｍＭ　ｄＡＴＰ、５ｍＭ　ｄＣＴＰ、５ｍＭ　ｄＧＴＰ、２ｍＭ　ＡＡ―ｄＵＴＰ、１ｍＭ　ｄＵＴＰ、２ｍＭ　ｄＴＴＰ）
・ＤＴＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
・ＤＥＰＣ処理水　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
・ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　　　　　　　　　１μｌ
次に、溶液１を７０℃で５分加熱した後、４８℃まで冷却し、溶液２を加え混合、２０μｌとした。これを４８℃で３０分間反応させた。反応後、７０℃で５分加熱した後、３７℃まで冷却しＲＮａｓｅを０．５μｌ加え混合、３７℃で１５分間反応させた。反応後は５　ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ　８．０）を０．５μｌ、ＱｕｉｃｋＣｌｅａｎ樹脂（クロンテック社　Ａｔｌａｓ　ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ付属）２μｌを加え、１分間ボルテックスを行った。この混合溶液を０．２２μｍのスピンフィルターにのせ１６０００ｒｐｍで遠心した。通過液に酢酸ナトリウム水溶液２．２μｌ、冷１００％エタノール５５μｌを加え、エタノール沈殿を行った。−２０℃で１時間冷却後、１６０００ｒｐｍで３０分遠心した。上清を除いた後７０％エタノール水溶液を５０μｌ加え１６０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除き、風乾した。１０μｌの０．１　Ｍ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ約９．０）に溶解させた後、Ｃｙ３　ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅ（アマシャムバイオサイエンス社）に４５μｌのＤＭＳＯを加えてよく攪拌した溶液から１０μｌをとりこれに加えて混合し、３０分間暗所で室温に保ち静置した。この後、酢酸ナトリウム水溶液２μｌ、冷１００％エタノール５０μｌを加え、エタノール沈殿を行った。‐２０℃で１時間冷却後、１６０００ｒｐｍで３０分遠心した。上清を除いた後７０％エタノール水溶液を５０μｌ加え１６０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除き、風乾した。１００μｌの滅菌水を加えた後、Ｑｉａｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により精製を行い、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡを得た。
【００２９】
このＣｙ３標識ｃＤＮＡをエタノール沈殿によりペレットにして風乾した後、１４μｌの滅菌水と１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ−５００ｍＭ　ＫＣｌ−２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液を２μｌ加えた後９４℃２分間加熱し２０℃まで冷却した。ここでウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（１Ｕ／μｌ）を４μｌ加えピペッティングにより今後した後、２０℃で１２０分間インキュベートした。その後続けて９０℃で３０分間加熱した後４℃まで冷却した。操作後、電気泳動（３％アガロースゲル）により、合成されたＤＮＡ鎖長の分析を行った結果、約１０〜３００ｍｅｒの分布を持ったＤＮＡ断片となることが明らかとなった（図１参照）。
【００３０】
＜実施例２＞
溶液２において、２μｌのｄＮＴＰミックスの組成を（５ｍＭｄＡＴＰ、５ｍＭｄＣＴＰ、５ｍＭｄＧＴＰ、２ｍＭＡＡ―ｄＵＴＰ、１．５ｍＭｄＵＴＰ、１．５ｍＭｄＴＴＰ）とした以外は、実施例１と同様の操作を行った。操作後、電気泳動（３％アガロースゲル）により合成されたＤＮＡ鎖長の分析を行った結果、約数ｍｅｒ〜１００ｍｅｒの分布を持ったＤＮＡ断片となることが明らかとなった（図１参照）。
【００３１】
＜実施例３＞
溶液２において、２μｌのｄＮＴＰミックスの組成を（５ｍＭｄＡＴＰ、５ｍＭｄＣＴＰ、５ｍＭｄＧＴＰ、２ｍＭＡＡ―ｄＵＴＰ、０．６ｍＭｄＵＴＰ、２．４ｍＭｄＴＴＰ）とした以外は、実施例１と同様の操作を行った。操作後、電気泳動（３％アガロースゲル）により合成されたＤＮＡ鎖長の分析を行った結果、約２０ｍｅｒ〜５００ｍｅｒの分布を持ったＤＮＡ断片となることが明らかとなった（図１参照）。
【００３２】
＜比較例１＞
溶液２において、２μｌのｄＮＴＰミックスの組成を（５ｍＭｄＡＴＰ、５ｍＭｄＣＴＰ、５ｍＭｄＧＴＰ、２ｍＭＡＡ―ｄＵＴＰ、３ｍＭｄＵＴＰ、０ｍＭｄＴＴＰ）とした以外は、実施例１と同様の操作を行った。操作後、電気泳動（３％アガロースゲル）により合成されたＤＮＡ鎖長の分析を行った結果、約数ｍｅｒ〜１０ｍｅｒの分布を持ったＤＮＡ断片となることが明らかとなった（図１参照）。
【００３３】
＜実施例４＞
以下の組成からなる２溶液を調製した。
【００３４】
（溶液１の組成）
・鋳型ポリヌクレオチド鎖（２．５μｇ／μｌ）
〔マウス脳ｔｏｔａｌＲＮＡ（クロンテック社製）〕　　　　　８μｌ
・オリゴｄＴプライマー（インビトロジェン社）　　　　１μｌ
・ＤＥＰＣ処理水　　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
（溶液２の組成）
・　　ｃＤＮＡ合成用バッファー　　　　　　　　　　　　　　　　４μｌ
（クロンテック社Ａｔｌａｓ　ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ付属）
・ｄＮＴＰミックス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
（５ｍＭｄＡＴＰ、５ｍＭｄＣＴＰ、５ｍＭｄＧＴＰ、２ｍＭＡＡ―ｄＵＴＰ、１ｍＭｄＵＴＰ、２ｍＭｄＴＴＰ）
・ＤＴＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
・ＤＥＰＣ処理水　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
・ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　　　　　　　　　　１μｌ
次に溶液１を７０℃で５分加熱した後、４８℃まで冷却し、溶液２を加え混合、２０μｌとした。これを４８℃で６０分間反応させた。反応後、７０℃で５分加熱した後、３７℃まで冷却し、２．５　Ｍ　ＮａＯＨを２μｌ加え混合、６５℃で３０分間反応させた後、４℃まで冷却し、２．５　Ｍ　ＨＣｌを２μｌ加えて中和した。中和後は５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を０．５μｌ、ＱｕｉｃｋＣｌｅａｎ樹脂（クロンテック社　Ａｔｌａｓ　ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ付属）２μｌを加え、１分間ボルテックスを行った。この混合溶液を０．２２μｍのスピンフィルターにのせ１６０００ｒｐｍで遠心した。通過液に酢酸ナトリウム水溶液２．２μｌ、冷１００％エタノール５５μｌを加え、エタノール沈殿を行った。‐２０℃で１時間冷却後、１６０００ｒｐｍで３０分遠心した。上清を除いた後、７０％エタノール水溶液を５０μｌ加え１６０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除き、風乾した。１０μｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ約９．０）に溶解させた後、ｃｙ３　ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅ（アマシャムバイオサイエンス社）に４５μｌのＤＭＳＯを加えてよく攪拌した溶液から１０μｌをとり、これに加えて混合し、３０分間暗所で室温に保ち静置した。この後、酢酸ナトリウム水溶液２μｌ、冷１００％エタノール５０μｌを加え、エタノール沈殿を行った。‐２０℃で１時間冷却後、１６０００ｒｐｍで３０分遠心した。上清を除いた後７０％エタノール水溶液を５０μｌ加え１６０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除き、風乾した。１００μｌの滅菌水を加えた後、Ｑｉａｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により精製を行い、ｃｙ３標識ｃＤＮＡを得た。
【００３５】
このｃｙ３標識ｃＤＮＡをエタノール沈殿によりペレットにして風乾した後、７μｌの滅菌水と１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ−５００　ｍＭ　ＫＣｌ−２５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液を１μｌ加えた後９４℃２分間加熱し２０℃まで冷却した。ここでウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（１Ｕ／μｌ）を２μｌ加えピペッティングにより今後した後、２０℃で１２０分間インキュベートした。その後続けて９０℃で３０分間加熱した後４℃まで冷却した。操作後、電気泳動（３％アガロースゲル）により、合成されたＤＮＡ鎖長の分析を行った結果、約１０〜３００ｍｅｒの分布を持ったＤＮＡ断片となることが明らかとなった（図２参照）。
【００３６】
＜実施例５＞
溶液１において、鋳型ポリヌクレオチド鎖（２．５μｇ／μｌ）〔マウス脳ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ（クロンテック社製）〕を４μｌ、ＤＥＰＣ処理水を５μｌとした以外は、実施例４と同様の操作を行った。操作後、電気泳動（３％アガロースゲル）により合成されたＤＮＡ鎖長の分析を行った結果、約１０〜３００ｍｅｒの分布を持ったＤＮＡ断片となることが明らかとなった（図２参照）。
【００３７】
＜実施例６＞
溶液１において、鋳型ポリヌクレオチド鎖（２．５μｇ／μｌ）〔マウス脳ｔｏｔａｌＲＮＡ（クロンテック社製）〕を２μｌ、ＤＥＰＣ処理水を７μｌとした以外は、実施例４と同様の操作を行った。操作後、電気泳動（３％アガロースゲル）により合成されたＤＮＡ鎖長の分析を行った結果、約１０〜３００ｍｅｒの分布を持ったＤＮＡ断片となることが明らかとなった（図２参照）。
【００３８】
＜比較例２＞
実施例１においてウラシルＤＮＡグリコシラーゼ４μｌを加える代わりに、滅菌水４μｌ加えた以外は、実施例１と同様の操作を行った。操作後、電気泳動（０．７％アガロースゲル）により合成されたＤＮＡ鎖長の分析を行った結果、約５００〜４０００ｍｅｒの分布を持ったＤＮＡ鎖となることが明らかとなった（図３参照）。
【００３９】
【発明の効果】
本発明を用いることにより、特異的にハイブリダイゼーションさせるのに好適な鎖長のＤＮＡ断片を調製することが出来る。さらにはハイブリダイゼーション時間の短縮、感度の上昇を達成することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１、２、３及び比較例１で調製されたＤＮＡ断片の電気泳動結果を示す図である。
【図２】実施例４、５、６で調製されたＤＮＡ断片の電気泳動結果を示す図である。
【図３】比較例２で調製されたＤＮＡ断片の電気泳動結果を示す図である。
【符号の説明】
１・・・１００ｂａｓｅラダーの電気泳動パターンを示す。
２・・・１０ｂａｓｅラダーの電気泳動パターンを示す。
３・・・比較例１の結果を示す。
４・・・実施例２の結果を示す
５・・・実施例１の結果を示す。
６・・・実施例３の結果を示す
１１・・・１０ｂａｓｅラダーの電気泳動パターンを示す。
１２・・・実施例６の結果を示す。
１３・・・実施例５の結果を示す。
１４・・・実施例４の結果を示す。
２１・・・λＨｉｎｄＩＩＩの切断パターンを示す。
２２・・・比較例２の結果を示す。
【図１】
2004135602.tif 000002
【図２】
2004135602.tif 000003
【図３】
2004135602.tif 000004