(57)【要約】【課題】従来の細胞外電位測定デバイスでは被験体細胞を保持する窪み内に、被験体細胞が確実に固定されているかどうかを容易に判断することが困難であった。【解決手段】基板１の一面側にダイアフラム２を設け、このダイアフラム２を構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪み３を設け、この窪み３の最深部より上部に貫通孔４を設け、この貫通孔４の前記窪み３と反対側の開口部に検出電極５を設けることにより、貫通孔４内の培養液のイオン濃度を効率よく測定することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みの最深部より上部に貫通孔を設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイス。
【請求項２】
貫通孔を少なくとも２つ以上設けた請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項３】
貫通孔にそれぞれの検出電極を設けた請求項２に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項４】
基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みの最深部より上部に貫通孔を設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に少なくとも２つ以上の検出電極を設けた細胞外電位測定デバイス。
【請求項５】
基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みに矩形もしくはＵ字形あるいはこれらを組み合わせてなる形状の貫通孔を前記窪みの最深部より上部に設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイス。
【請求項６】
基板がシリコンである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項７】
基板がＳＯＩ基板である請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項８】
窪みの開口部の寸法が１０〜１００μｍであり、貫通孔の最小開口径もしくは幅が１〜１０μｍである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項９】
貫通孔の形状が矩形あるいはＵ字形もしくはこれらの組み合わせである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項１０】
基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みの最深部より上部に貫通孔を設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、基板の他面側からエッチングによって前記ダイアフラムを形成する工程と、このダイアフラムを構成するいずれかの面の上に１枚のフォトマスクを用いてレジストマスクを形成する工程と、ドライエッチングによって前記窪み、前記貫通孔の順に形成する工程と、この貫通孔の窪みとは反対側の開口部に薄膜形成技術により検出電極を形成する工程を含む細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１１】
窪みを形成する際にはエッチングを促進するガスのみを用い、次に貫通孔を形成する際にはエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いて形成する請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１２】
少なくとも２回以上基板を異なる方向に傾け、それぞれにエッチングを行うことにより窪みの中に複数の貫通孔を形成する請求項１１に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１３】
レジストマスクのエッチングホールの形状は所望とする貫通孔の形状とほぼ同じになるように形成する請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１４】
プラズマ中のイオンの進行方向と基板の角度を８９度以下に傾けてエッチングすることにより貫通孔を形成する請求項１３に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１５】
基板がシリコンよりなる細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、エッチングを促進するガスがＳＦ６、ＣＦ４、ＸｅＦ２のうちいずれか一つを含むガスを用い、エッチングを抑制するガスがＣ４Ｆ８、ＣＨＦ３のいずれかまたはこれらを含むガスを用いる請求項１１に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞外電位あるいは細胞の活動に発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法であり、例えば化学物質によって細胞が発する反応を検出する薬品スクリーニングに用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞の電気的活動を指標にして薬品をスクリーニングすることはパッチクランプ法、蛍光色素または発光指示薬を用いる方法により行われている。
【０００３】
このパッチクランプ法はマイクロピペットの先端部分に付けた細胞膜の微小部分（パッチと呼ぶ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法であり、この方法は一個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
また、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する蛍光色素または発光指示薬により、細胞内のイオンの移動をモニタすることで細胞の電気的活動を測定する方法もある。
【０００５】
しかし、パッチクランプ法はマイクロピペットの作成および操作に特殊な技術を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要することから大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。
【０００６】
また、蛍光色素などを利用する方法は大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングすることができる。しかしながら細胞を染色する工程が必要になるとともに、用いる色素の影響により測定時に検出されるバックグラウンド・レベルが高くなってしまったり、時間とともにこの色素が脱色するためにＳ／Ｎ比が悪くなるという欠点がある。
【０００７】
これに代わる方法として、細胞の保持手段を有した基板およびこれに設けられた電極によって細胞外電位を測定するデバイスも発明者らのグループにより提案されている（例えば、特許文献１参照）。この方法はパッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、しかも蛍光色素を用いる方法のように簡易に高速で大量の試料を測定できるものであり、基板上に設けられた細胞の保持手段を有する少なくとも一つのウエルと、このウエルに電気信号を検出するセンサー手段とを有する細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定するものである。
【０００８】
上記特許文献１で開示される細胞外電位測定デバイスの動作について図面を用いて詳細に説明する。
【０００９】
図２４は上記特許文献１で開示される細胞外電位測定デバイスのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル４０内に培養液４８が入れられ、被験体細胞４７は基板４２に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板４２に形成された窪み４１および開口部を介して、この窪み４１に連絡する貫通孔４４を備えた構成となっている。
【００１０】
さらに、貫通孔４４の中にはセンサー手段である測定電極４５が配置されており、この測定電極４５は配線を経て信号検出部に連結されている。
【００１１】
そして、測定の際には被験体細胞４７を貫通孔４４側から吸引ポンプなどの手段により、この被験体細胞４７が窪み４１部分に密着保持される。このようにして被験体細胞４７の活動により発生する電気信号はウエル４０中の培養液４８側に漏れることなく、貫通孔４４側に設けた測定電極４５によって検出される。
【００１２】
ここで、被験体細胞４７を保持する窪み４１の大きさは１０〜３０μｍ程度であり、貫通孔４４側の大きさが１〜５μｍと２段階にする必要がある。この形状を正確に実現するためには２種類のマスクを用いる必要があり、第一のマスクによりドライエッチングを行って窪み４１を形成した後、第二のマスクによってドライエッチングを行って貫通孔４４を形成する必要があった。
【００１３】
【非特許文献１】
「細胞の分子生物学、第三版」、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社
【特許文献１】
ＷＯ０２／０５５６５３号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような細胞外電位測定デバイスにおいて特に問題となるのは、被験体細胞４７が窪み４１の中に保持された場合でも、貫通孔４４が窪み４１の最深部に形成されていることから、窪み４１の中間部に細胞膜が密着してしまうと貫通孔４４は上部のウエル４０の培養液４８と電気的に導通してしまい、精度の高い測定ができないという問題があった。
【００１５】
さらに、被験体細胞４７が窪み４１の中に保持され、さらに貫通孔４４を覆うように細胞膜が密着しているかどうかを調べる手段がなかった。
【００１６】
また、前述のように２種類のマスクを用いて行うと、第一のマスクによるドライエッチングを行った後第二のマスクを用いてドライエッチングを行う際にマスクのアライメントずれが生じ、さらに２枚のマスクを用意してフォトリソグラフィをそれぞれ別々に行うことから製造的にも手間がかかり、コスト高を招くことがあった。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の請求項１に記載の発明は、基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みの最深部より上部に貫通孔を設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスであり、この貫通孔が窪みの最深部より上部に設けられていることから培養液と被験体細胞をダイアフラムの窪みが形成されている側より投入したとき、被験体細胞は窪み内に保持されるが、この被験体細胞が窪み内の最深部に到達しなくても、より確実に貫通孔を被験体細胞の細胞膜が隙間無く密着することができるので、貫通孔内の培養液とダイアフラムの上面側の培養液は遮断され、細胞が活動する際に発する物理化学的変化を貫通孔側に設けられた検出電極によって効率よく検出することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１８】
本発明の請求項２に記載の発明は、貫通孔を少なくとも２つ以上設けた請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、被験体細胞が窪み内側にある複数の貫通孔のうち、いずれかを細胞膜によって覆うと、その貫通孔からの信号によって細胞外電位を測定することができるので、より確実に測定ができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。さらに同じ窪み内に２つ以上の貫通孔が設けられているので、貫通孔間の抵抗値を測定することで被験体細胞が貫通孔を覆っているかどうかを判断することができる。つまり、細胞膜がいずれの貫通孔も覆っていない場合は培養液によって貫通孔どうしは導通しているため抵抗値は低いが、いずれかあるいは両方の貫通孔が細胞膜によって覆われている場合には貫通孔どうしの抵抗値は大きなものとなる。これによって、被験体細胞の保持時に貫通孔を確実に細胞膜が覆っているかどうかを判断することができる。
【００１９】
本発明の請求項３に記載の発明は、貫通孔にそれぞれの検出電極を設けた請求項２に記載の細胞外電位測定デバイスであり、それぞれの貫通孔に検出電極が設けられているので同じ貫通孔に複数の検出電極が設けられていることになり、この検出電極間の抵抗値を測定することで、貫通孔内の培養液のイオン濃度変化を測定することができるようになる。
【００２０】
さらに、貫通孔が複数に分かれていることから検出電極を設けやすいという製造上の利点も有する。
【００２１】
本発明の請求項４に記載の発明は、基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みの最深部より上部に貫通孔を設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に少なくとも２つ以上の検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスであり、この検出電極間の抵抗値を測定することにより貫通孔内の培養液のイオン濃度変化を測定することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２２】
本発明の請求項５に記載の発明は、基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みに矩形もしくはＵ字形あるいはこれらを組み合わせてなる形状の貫通孔を前記窪みの最深部より上部に設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスであり、円形状の貫通孔に比べてその直径サイズよりも狭い幅の貫通孔とすることができることから、被験体細胞が貫通孔内に不用意に引き込まれることなく窪み内にとどまりながら貫通孔を細胞膜が覆うことができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２３】
また、被験体細胞の形状が楕円球状に変形しやすい場合は貫通孔を矩形にすることで窪みの形状を楕円球状にすることができる。
【００２４】
さらに、矩形の長さは円形状の貫通孔の直径サイズより長くなるので、同一の貫通孔に２つ以上の検出電極を形成することが容易であるという製造上の利点も有する。
【００２５】
さらに、貫通孔がＵ字形の場合には外形が丸まっていることから、窪みをより球形にしたい場合に容易に実現できるという製造上の利点を有する。つまり、矩形の場合は矩形の貫通孔を中心とする窪みは楕円球形状になるが、Ｕ字形の場合は貫通孔の開口部を中心に集めることができるので、窪みがより球形に近い形になるのである。
【００２６】
本発明の請求項６に記載の発明は、基板がシリコンである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、ダイアフラム、窪み、貫通孔をドライエッチングにより高精度に形成した細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２７】
本発明の請求項７に記載の発明は、基板がＳＯＩ基板である請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、より高精度で生産性に優れた細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２８】
本発明の請求項８に記載の発明は、窪みの開口部の寸法が１０〜１００μｍであり、貫通孔の最小開口径もしくは幅が１〜１０μｍである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、このような形状は数〜数十μｍの被験体細胞を効率的に窪み内に保持することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２９】
本発明の請求項９に記載の発明は、貫通孔の形状が矩形あるいはＵ字形もしくはこれらの組み合わせである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、貫通孔が矩形となることで、円形状に比べて狭い幅の貫通孔とすることができる。このことにより、被験体細胞が貫通孔内に不用意に引き込まれることなく、窪みの内にとどまりながら貫通孔を細胞膜が覆うことができるようになることから測定が確実にできる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００３０】
また、被験体細胞の形状が楕円球状に変形しやすい場合は、貫通孔を矩形にすることで窪みの形状を楕円球状に容易にすることができる。
【００３１】
さらに、矩形の長さは円形の貫通孔に比べて長くなるので、同一の貫通孔に２つ以上の検出電極を形成することが容易であるという製造上の利点も有する。
【００３２】
さらに、貫通孔がＵ字形の場合では、上記と同様の効果が得られる上、外形が丸くなっているために窪みをより球形にしたい場合において、容易に実現できるという製造上の利点を有する。つまり、矩形の場合は、矩形の貫通孔を中心とする窪みは楕円球形状になるが、Ｕ字の場合は貫通孔の開口部が中心に集めることができるので、窪みがより球に近い形になるのである。
【００３３】
本発明の請求項１０に記載の発明は、基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みの最深部より上部に貫通孔を設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、基板の他面側からエッチングによって前記ダイアフラムを形成する工程と、このダイアフラムを構成するいずれかの面の上に１枚のフォトマスクを用いてレジストマスクを形成する工程と、ドライエッチングによって前記窪み、貫通孔の順に形成する工程と、この貫通孔の窪みとは反対側の開口部に薄膜形成技術により検出電極を形成する工程を含む細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、１枚のフォトマスクによってレジストマスクを形成することができるので、窪み内の正確な位置に貫通孔を形成できるようになる細胞外電位測定デバイスの製造方法を提供することができる。
【００３４】
本発明の請求項１１に記載の発明は、窪みを形成する際にはエッチングを促進するガスのみを用い、次に貫通孔を形成する際にはエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いて形成する請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、エッチングを促進するガスおよびエッチングを抑制するガスを用いることにより、窪みおよび貫通孔の形状を容易に形成できる。
【００３５】
本発明の請求項１２に記載の発明は、少なくとも２回以上基板を異なる方向に傾け、それぞれにエッチングを行うことにより窪みの中に複数の貫通孔を形成する請求項１１に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、これにより貫通孔を窪み内に複数設けることができる細胞外電位測定デバイスの製造方法を提供することができる。
【００３６】
本発明の請求項１３に記載の発明は、レジストマスクのエッチングホールの形状は所望とする貫通孔の形状とほぼ同じになるように形成する請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、窪みおよび貫通孔の大きさは被験体細胞の大きさによって決められるものであるがフォトマスクで形成するエッチングホールは必要とする貫通孔の大きさにしておくことにより、窪みの大きさは貫通孔の大きさ以上であれば自由に決めることができるので、窪みおよび貫通孔の形状をより容易に形成することができる。
【００３７】
本発明の請求項１４に記載の発明は、プラズマ中のイオンの進行方向と基板の角度を８９度以下に傾けてエッチングすることにより貫通孔を形成する請求項１３に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、これにより窪みの最深部より上部に貫通孔を形成することができる。
【００３８】
本発明の請求項１５に記載の発明は、基板がシリコンよりなる細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、エッチングを促進するガスがＳＦ６、ＣＦ４、ＸｅＦ２のうちいずれか一つを含むガスを用い、エッチングを抑制するガスがＣ４Ｆ８、ＣＨＦ３のいずれかまたはこれらを含むガスを用いる請求項１１に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、所望とする形状を効率よく得ることができる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法について実施の形態および図面を用いて説明する。
【００４０】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１および図１〜図２３により請求項１〜１４に記載の発明について説明する。
【００４１】
図１は本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスを示す斜視図であり、図２はこれを上面から見た平面図であり、図３、図１０は同断面図である。図４、図５、図１１は貫通孔の周辺部の拡大図であり、図６〜図９は本発明の細胞外電位測定デバイスの動作を説明するための要部拡大断面図である。また図１２〜図２１は製造工程を説明するための断面図であり、図２２、図２３は他の細胞外電位測定デバイスの構成を示す斜視図である。
【００４２】
次に、その構成を説明する。図１〜図３において、基板１はシリコンで形成されており、基板１の一面側にはダイアフラム２が形成されている。このダイアフラム２の材質は基板１と同じシリコンであり、厚みは約２５μｍである。３は窪みであり半球形の曲面で構成されており、開口部の大きさは約２０μｍである。窪み３には貫通孔４がダイアフラム２を貫通するごとく形成されている。この貫通孔４は図３に示すように窪み３の最深部より上部に位置する箇所に設けられており、ダイアフラム２の厚み方向に対して約４５°傾いている。なお、この貫通孔４は円もしくは楕円形状をしており、円または楕円の長径が約５μｍである。さらに、ダイアフラム２の下面側において図４および図５の貫通孔４の周辺部の拡大図に示すように、図４では金を主体とする検出電極５が貫通孔４の開口部に近接して形成されており、図５では複数の検出電極５ａ、５ｂが貫通孔４の開口部に近接して形成されている。
【００４３】
以下、図面を用いて本発明の細胞外電位測定デバイスの動作を説明する。
【００４４】
まず、培養液の物理化学的変化を検出する手順に付いて説明する。図６、図７はダイアフラム２において窪み３、貫通孔４、検出電極５ａ、５ｂが形成された箇所の拡大断面図である。図７に示すように、ダイアフラム２の上部を培養液６で満たすと、窪み３、貫通孔４は培養液６によって順に満たされる。そこで、ダイアフラム２の上部空間を加圧、もしくはダイアフラム２の下部空間を減圧にすると培養液６は貫通孔４から外方へ飛び出すが、加圧あるいは減圧を適度な値にすると貫通孔４の先端においては開口部より培養液６がメニスカス形状を形成して定常状態となる。
【００４５】
これにより、培養液６は検出電極５ａおよび５ｂに安定的に接触することになる。検出電極５ａと５ｂは図５でも明らかなように、電気的には絶縁された箇所に形成されている。しかし、培養液６が貫通孔４からメニスカス形状によって検出電極５ａ、５ｂに接触することにより、電解質である培養液６を介して、両者の電気的接続が行われるのである。ここで検出電極５ａ、５ｂ間の抵抗値は培養液６のイオン濃度と関係している。
【００４６】
つまり、培養液６のイオン濃度の変化は検出電極５ａ、５ｂ間の抵抗値の変化によって検出することができるのである。さらに、この抵抗値を測定すれば培養液６が貫通孔４において適当なメニスカスを形成しているかどうかがわかる。その理由はメニスカスが不十分であれば検出電極５ａ、５ｂへの接触も不十分となり、抵抗値が大きな値を示すからである。
【００４７】
次に、被験体細胞の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する手順について説明する。
【００４８】
図８に示すように、被験体細胞８を培養液６と共に投入し、ダイアフラム２の上部空間を加圧もしくはダイアフラム２の下部空間を減圧すると、被験体細胞８および培養液６は共に窪み３内へ引き込まれる。さらに引き込みを続けると、ついには図９に示すように貫通孔４側へも引き込まれ、被験体細胞８の細胞膜は貫通孔４の開口部を塞ぐように吸着する。ここで、本実施の形態１では貫通孔４の開口部は窪み３内の最深部より上部に形成されているために被験体細胞８が窪み３の開口部より若干大きいような場合においても、窪み３および貫通孔４側に引き込まれる際、図９のＡ部のように最深部に隙間ができるなど窪み３の最深部に到達しなくても、被験体細胞８が若干の変形を起こすだけで貫通孔４の開口部を塞ぐことができるようになる。つまり、より確実に被験体細胞８の窪み３内への保持を可能にすることができる。
【００４９】
ここで、窪み３は曲面で構成されているので、被験体細胞８を保持するためにより効率的な形状となっている。
【００５０】
さらに、被験体細胞８が窪み３内に保持された後に培養液６が貫通孔４の開口部で適当なメニスカスを形成するように上下の圧力を調整する。このときには前述のように検出電極５ａ、５ｂ間の抵抗値を測定しながら圧力調整を行うことができる。
【００５１】
また、被験体細胞８を窪み３内で貫通孔４の開口部を塞ぐように保持した後は被験体細胞８への刺激となりうる行為を施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激などがある。
【００５２】
そして、前記被験体細胞８がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、被験体細胞８は細胞膜が保有するイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この反応は被験体細胞８が培養液６と接している箇所において起こり、貫通孔４内の培養液６と被験体細胞８の間でもイオン交換が行われる。
【００５３】
この結果として、貫通孔４内の培養液６のイオン濃度は変化し、前述したように検出電極５ａ、５ｂによってその変化を検出することができるようになる。
【００５４】
なお、ここでは検出電極５ａ、５ｂの２つの電極を形成したが、検出電極は一つでも測定は可能である。その方法は図４に示すように、ダイアフラム２の上部を満たす培養液６と同電位の参照電極（図示せず）と検出電極５との間の電圧を測定することで貫通孔４内のイオン濃度の変化を測定することができるので被験体細胞８の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定することができる。
【００５５】
なお、イオン濃度の変化は抵抗値だけではなく、電流値、電荷量、電位などの別の物理量を測定することでも測定可能である。
【００５６】
また、貫通孔４は窪み３内の最深部より上部に設けられ、ダイアフラム２の厚み方向に対して４５°の角度で傾いている。これにより、本実施の形態１の応用として、図１０に示すように貫通孔１０ａ、１０ｂとして窪み３内に複数個設けることが可能である。この場合は図１１に示すように、金を主体とする検出電極１１ａ、１１ｂをそれぞれの貫通孔１０ａ、１０ｂに設けることによって、前記貫通孔が一つの場合と同様にダイアフラム２の上部を培養液６で満たすと、窪み３、貫通孔１０ａ、１０ｂが満たされ、上下の圧力差によって培養液６が貫通孔１０ａ、１０ｂの先端でメニスカス形状を形成し、検出電極１１ａ、１１ｂにそれぞれ接触する。こうして検出電極１１ａ、１１ｂ間の抵抗値を測定することにより、貫通孔１０ａ、１０ｂの先端で適当なメニスカスが形成されているかがわかり、貫通孔１０ａ、１０ｂ内のイオン濃度の変化もわかる。
【００５７】
そして、被験体細胞８を培養液６と共に投入した場合は貫通孔１０ａ、１０ｂを被験体細胞８の細胞膜が覆うように保持されているかどうかが判断できる。たとえば貫通孔１０ａのみを細胞膜が塞ぎ、貫通孔１０ｂは塞がれていない場合は検出電極１１ａとダイアフラム２の上部の培養液６からとる参照電極（図示せず）間の抵抗値は高く、検出電極１１ｂと参照電極間は低くなることで判断できる。
【００５８】
なお、貫通孔１０ａ、１０ｂは離れて形成されているので検出電極１１ａ、１１ｂを容易に形成できるという製造上の利点も有する。
【００５９】
上記の状態で被験体細胞８に外部より刺激を与えると被験体細胞８の活動が起こり、貫通孔１１ａ、１１ｂ内のイオン濃度が変化するので被験体細胞８の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化が測定できる。
【００６０】
また、本実施の形態１では窪み３の最深部より上部に貫通孔４、１０ａ、１０ｂを形成したが、図２１に示すように貫通孔１４を最深部に設けることは後述する製造方法によれば全く難しいことではない。この場合には、被験体細胞８が容易に最深部にまで到達できるように被験体細胞８に応じて適当な窪み３の大きさ、形状のものを選択する必要がある。
【００６１】
次に、本実施の形態１では貫通孔４、１０ａ、１０ｂの大きさは丸形状あるいは楕円形状としたが、矩形あるいはＵ字形状とすることもできる。
【００６２】
図２２、図２３はそれぞれ貫通孔１５、１７を矩形、Ｕ字形状にした細胞外電位測定デバイスの斜視図である。図２２に示すように貫通孔１５が矩形の場合は窪み１６の形状はカマボコ状に丸みを持った形状となり、図２３に示すように貫通孔１７がＵ字形状の場合には窪み１８の形状はほぼ半球状になる。
【００６３】
前記のような形状とすることで、窪み１６がカマボコ状の場合には被験体細胞８の固定形状が細長くなるような場合（例えば、モノアラガイ由来の神経節細胞）に最適であり、窪み１８の形状を半球にして貫通孔１７の形状をＵ字形状にした場合には、例えば被験体細胞８が変形しやすく、丸形状にした貫通孔４では通り抜けてしまうような場合において有効である。つまり、貫通孔１７をＵ字にすると、貫通孔１７内を満たす培養液６の容量をさほど減らすことなく開口部の最小幅部分を小さくできることから、不用意に被験体細胞８が貫通孔１７内に進入して破壊されることが少なくなる。
【００６４】
なお、窪み３、１６、１８、貫通孔４、１５、１７の大きさは測定する被験体細胞８の大きさ、形状、性質によって決められるものであるが、窪み３、１６、１８の大きさを１０〜１００μｍとし、貫通孔４、１５、１７の大きさを１〜１０μｍにすることによって５〜１００μｍ程度の大きさの被験体細胞８を測定することができる。
【００６５】
次に本発明の細胞外電位測定デバイスの製造方法について図１２〜図２１を用いて説明する。
【００６６】
図１２〜図２１は本実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための断面図である。
【００６７】
この細胞外電位測定デバイスの製造方法は図１２に示すようにシリコンからなる基板１を用意し、基板１の他面にレジストマスク１２を形成した後、図１３のように下面から所定の深さだけエッチングすることによって、上部にダイアフラム２を形成する。
【００６８】
そして、エッチングした後、前記レジストマスク１２は除去する。
【００６９】
次に、図１４に示すようにダイアフラム２の外表面にレジストマスク１３を形成する。このときのレジストマスク１３のエッチングホールの形状は必要とする貫通孔４の形状とほぼ同じになるよう設計しておく。
【００７０】
その後、図１５に示すようにドライエッチングによってダイアフラム２側からエッチングを行う。このとき、エッチングガスとしてはエッチングを促進するガスのみを用いる。
【００７１】
基板１がシリコンの場合、このエッチングを促進するガスにはＳＦ６、ＣＦ４、ＸｅＦ２などを用いることができる。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、横方向へのエッチングも促進する作用があるからである。実験ではＸｅＦ２を用いて効果を確認している。これによって、エッチング形状は図１５に示すように開口部を中心とする半球形となり、窪み３が形成される。またレジストマスク１３はほとんどエッチングされないので、図１５のように最初の形状を保っている。
【００７２】
次に、図１６に示すように基板１をイオンの進行方向に対して４５°傾けて、ドライエッチングを行う。このときのエッチングガスとしてはエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを交互に用いる。エッチングを促進するガスとしてはＸｅＦ２、ＣＦ４、ＳＦ６などがある。またエッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ３、Ｃ４Ｆ８などがある。これらのガスを混合してエッチングすることで、エッチングされた壁面にＣＦ２のポリマーである保護膜を形成するので、ドライエッチングによる貫通孔４の形成をレジストマスク１３の下方のみに進行させることが可能となる。
【００７３】
ここで、エッチングが下方のみに進行する仕組みを少し詳しく説明する。
【００７４】
まず、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができる。この工程ではエッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に、外部コイルによる誘導結合法によって生成されたプラズマ中で高周波を基板１に加えることで、基板１にマイナスのバイアス電圧が発生することによりプラズマ中のプラスイオンであるＳＦ５＋やＣＦ３＋が基板１に向かって衝突するのでドライエッチングは垂直下方方向に進むことになり、ドライエッチングを抑制させる際には基板１に高周波を加えなければ基板１にはバイアス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となるＣＦ＋が偏向を受けなくなり、基板１のドライエッチング穴の壁面へ均一な保護膜の形成ができることになる。実験ではエッチングを促進するガスとしてＳＦ６、抑制するガスとしてＣ４Ｆ８を用いて確認している。
【００７５】
これによって、エッチングは垂直下方のみに進行し、レジストマスク１３は前述のように最初の形状を保っているので、結果として図１７のようにダイアフラム２の厚み方向に対して４５°傾いて貫通孔４を形成することができる。
【００７６】
また、上記のような構成とすることにより貫通孔４は窪み３内の最深部より上部に形成されることになる。なお、斜めに傾けてエッチングするので貫通孔４の断面形状はレジストマスク１３の開口部の形状より少し歪む。これが問題な場合は斜めにしたときに円形状に見えるようにレジストマスク１３の形状を変えておく必要がある。これにともない、窪み３のエッチング形状も少し変わるので、これらを総合的に鑑み、レジストマスク１３の形状を決定すると良い。
【００７７】
なお、基板１を傾ける場合の可能な角度はレジストマスク１３の開口部の形状と厚みによって決定されるものであり、例えば１μｍの開口部で１μｍの厚みを持つレジストマスクの場合はエッチングの幾何的な位置からして４５°よりも小さな傾きでなければエッチングはできない。
【００７８】
また、基板１を傾けてエッチングを行わない場合には図２１のように窪み３の最深部に貫通孔１４が形成されることになる。これは被験体細胞８の大きさが窪み３に対して適当であり、最深部まで容易に到達するような場合にはこのような形状でも構わない。
【００７９】
なお、レジストマスク１３の形状には丸形や楕円形の他に矩形、Ｕ字形あるいはこれらを組み合わせた形状も形成することができる。レジストマスク１３の形状を矩形とした場合には、エッチングを促進するガスによって、図２２のように窪み１６の形状がカマボコ状となり、貫通孔１５はレジストマスク１３と同じ矩形となる。
【００８０】
また、レジストマスク１３の形状をＵ字形とした場合には、図２３のように窪み１８の形状は半球形になり、貫通孔１７はレジストマスク１３と同じＵ字形となる。
【００８１】
なお、本実施の形態１の別の応用例として上述した同一の窪み３内に複数の貫通孔を形成する場合には、図１９のように貫通孔４を形成する工程を角度を変えてエッチングを行うことで達成される。なお、レジストマスク１３はエッチング後に除去する。
【００８２】
次に、図１８に示すように基板１の下面から通常の薄膜形成工程により、金を主体とする検出電極５ａ、５ｂをそれぞれの貫通孔４に近接して形成する。基板１の下面には凸凹があるが、このような凸凹のある面でもフォトレジストの塗布、露光、パターニングといったことは可能である。しかし、極めて解像度の高いパターンが要求される場合には、基板１にダイアフラム２を形成後、図２０に示すように、窪み３を形成する面をダイアフラム２の下面としても構わない。本発明では窪み３のパターンの方が検出電極５ａ、５ｂのパターンほど解像度が要求されないので、より簡単な製造工程となる。
【００８３】
なお、窪み３内に複数の貫通孔１０ａ、１０ｂが形成されている場合にも上記と同様に、通常の薄膜形成工程によって、図１１に示すように検出電極１１ａ、１１ｂを形成する。この場合は、窪み３内に形成された貫通孔が一つの場合より要求されるパターンの解像度が低いので、より簡単な製造工程である。
【００８４】
なお、本実施の形態１では最初にダイアフラム２を形成した後、窪み３、貫通孔４を形成する方法について説明してきたが、この他の方法として最初に、窪み３、貫通孔４を形成した後、基板１の下部よりエッチングを行ってダイアフラム２を形成する方法によっても同じ構成の細胞外電位測定デバイスを得ることができる。
【００８５】
なお、基板１としてシリコンを用いたが、シリコンの中に酸化シリコンが埋め込まれた基板を用いることもできる。このような基板はＳＯＩ基板と呼ばれ、上部のダイアフラム２の厚みを高精度にしたり、貫通孔４をエッチングによって形成する際、酸化シリコン層がエッチングストップ層となるのでより簡単な製造方法とすることができる。
【００８６】
【発明の効果】
以上のように本発明の細胞外電位測定デバイスの構成によれば、被験体細胞の細胞膜が隙間無く密着するので、細胞が活動する際に発する物理化学的変化を貫通孔側に設けられた検出電極によって効率よく検出することが可能となり、窪み内の正確な位置に容易に貫通孔を形成できるとともに培養液を一定に保つことにより安定して測定することができる細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの斜視図
【図２】同平面図
【図３】同断面図
【図４】同貫通孔周辺部の拡大断面図
【図５】同拡大断面図
【図６】同動作を説明するための要部拡大断面図
【図７】同要部拡大断面図
【図８】同要部拡大断面図
【図９】同要部拡大断面図
【図１０】本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの断面図
【図１１】同要部拡大図
【図１２】本実施の形態１における製造方法を示すための細胞外電位測定デバイスの断面図
【図１３】同断面図
【図１４】同断面図
【図１５】同断面図
【図１６】同断面図
【図１７】同断面図
【図１８】同断面図
【図１９】同断面図
【図２０】同断面図
【図２１】同細胞外電位測定デバイスの一例を示す断面図
【図２２】同斜視図
【図２３】同斜視図
【図２４】従来の細胞外電位測定デバイスの一例を示す断面図
【符号の説明】
１  基板
２  ダイアフラム
３  窪み
４  貫通孔
５  検出電極
５ａ、５ｂ  検出電極
６  培養液
８  被験体細胞
１０ａ、１０ｂ  貫通孔
１１ａ、１１ｂ  検出電極
１２  レジストマスク
１３  レジストマスク
１４  貫通孔
１５  貫通孔
１６  窪み
１７  貫通孔
１８  窪み
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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