(57)【要約】【課題】本発明は、容易に装填されキャピラリー電気泳動チューブから除去される低粘度媒体を与えることによって、ＤＮＡ配列決定フラグメントの単一塩基分解を達成するための改良された方法と装置を提供すること。【解決手段】ＤＮＡ配列決定の混合物中のＤＮＡフラグメントが大きさによって分離される、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：この方法は、前記ＤＮＡフラグメントをキャピラリー電気泳動のための媒体を含む変性水溶液中でのキャピラリー電気泳動によって分離する工程を、包含し、ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメントに対して単一塩基分解が達成される方法が提供される。また、溶液の低粘性がこの種の溶液のキャピラリーチューブへの迅速な装填と再装填を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ配列決定の混合物中のＤＮＡフラグメントが大きさによって分離される、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：
該方法は、前記ＤＮＡフラグメントを、キャピラリー電気泳動のための媒体を含む変性水溶液中でのキャピラリー電気泳動によって分離する工程であって、ここで該溶液が３０℃で約１０〜約３００センチポアズの粘度を有する工程、を包含し、
ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメントに対して単一塩基分解が達成される、方法。
【請求項２】
ＤＮＡ配列決定の混合物中のＤＮＡフラグメントが大きさによって分離される、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：
該方法は、前記ＤＮＡフラグメントをキャピラリー電気泳動のための媒体を含む変性水溶液中でのキャピラリー電気泳動によって分離する工程を、包含し、
ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメントに対して単一塩基分解が達成される、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（低粘度媒体を用いた高分解ＤＮＡ配列決定法発明の技術分野）
本発明はキャピラリー電気泳動によるＤＮＡフラグメント混合物中のＤＮＡフラグメントの分離に基づくＤＮＡ配列決定に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
（参考文献）
【０００３】
【化１】
2004000227.tif 000002
【０００４】
【化２】
2004000227.tif 000003
電気泳動はＤＮＡ種、タンパク質、ペプチド、および誘導化アミノ酸を含む多くの生物分子の分離のために広く使用されている。迅速で、高分解分離を行うことができるひとつの電気泳動技術はキャピラリー電気泳動（ＣＥ）である（ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＣｏｌｂｕｒｎ，１９９２）。一般的には、ＣＥはその内径が約１０〜２００ミクロン、長さが約５〜１００ｃｍまたはそれ以上の溶融シリカキャピラリーチューブを用いる。
【０００５】
多くの注目を集めたＣＥの用途のひとつはＤＮＡ配列決定フラグメントの分離と同定であった。このような分離はガラスプレート間の架橋したポリアクリルアミドマトリックスの入念な準備を必要とするスラブゲル形態を予め使用して行われた。さらに最近、このような分離をＣＥによって行うため、分離は時間を短くし、試料の大きさを減らし、試料装填を自動化し、そして試料ピークの分解能を潜在的に高くする利点を与える方法が記述されてきた。
【０００６】
Ｇｕｔｔｍａｎら（１９９０）は３〜６％Ｔおよび５％Ｃを含む架橋ポリアクリルアミドを用いるＣＥによって１６０塩基のオーダーで含有するポリヌクレオチドの単一塩基分離を報告した。
【０００７】
Ｃｏｈｅｎら（１９９０）はＣＥと架橋ポリアクリルアミドゲル（３％Ｔ、５％Ｃ）を使用して全長で１８ないし３３０塩基の単一塩基によって長さの異なるＤＮＡ配列決定フラグメントを分離した。Ｓｗｅｒｄｌｏｗら（１９９０ａ）はＣＥによって行われるＤＮＡ配列決定フラグメントの分離と、同一の架橋ポリアクリルアミドマトリックス（６％Ｔ、５％Ｃ）を用いるスラブゲル電気泳動によって行われるそれとを比較した。ＣＥによって行われる分離は従来のスラブゲル形態によって与えられるものよりも３倍早く、２．４倍の良い分解能と５倍のよい分離効率であったといえる。
【０００８】
上記のような架橋ポリアクリルアミドマトリックスはＤＮＡ配列分析に使えることを示したが、一定の制限があった。ひとつの制限はキャピラリーチューブ中で重合化中にポリアクリルアミドマトリックスに気泡が形成し、ピーク分解を妥協して処理し重合化に続く若干のアクリルアミド充填チューブの廃棄を必要とすることであった（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ、１９９０ａ，ｂ）。
【０００９】
他の制限は試料の電気泳動中にキャピラリーチューブの注入端近くに気泡が生成することであった（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ，１９９０ｂ）。
【００１０】
第３の制限は高圧にて、チューブからゲルマトリックスを噴出させる電気浸透が生じることであった。このような噴出を押さえるため、架橋マトリックスをチューブの内壁に共有結合させた（Ｋａｒｇｅｒら、１９８９）。しかしながら、このような共有結合は重合中または電気泳動中に収縮によるマトリックスの空隙の形成を導く（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、１９９２，１４０〜１４２頁）。
【００１１】
第４の制限は、ＤＮＡ配列分析で、配列決定鋳型によるキャピラリー入口の汚れであった。入口で本来固定されている大きい鋳型の蓄積物はその後に装填された試料により達せられる分解度を制限し、これによってキャピラリーはせいぜい数回使用するように限定される。
【００１２】
他の制限は、マトリックスの重合化がキャピラリーチューブで行われるとき、重合化は各チューブに対して個別に行う必要があり、一般的にはキャピラリーを電気泳動のために使用する前にかなりの猶予（例えば夜通しの重合化）を要することである。
【００１３】
線状（非架橋）ポリアクリルアミドマトリックスはまたＤＮＡフラグメントの分離に有用であることが見出された。Ｈｅｉｇｅｒら（１９９０）は６、９、１２％のＴを含有する線状ポリアクリルアミドマトリックスは長さが約７５〜１２，０００塩基対の大きさ（非変性条件）の範囲の制限フラグメントのＣＥによる分離に有用であり、そしてさらに、一層高い％のＴ（例えば９％Ｔ）は、変性条件下に、長さが４０〜６０塩基の範囲のポリデオキシアデニレートの混合物を分解するのに有用であることを示した。著者らはポリマーマトリックスの重合化がキャピラリーチューブ内で行われ、高い粘度が得られ、粘性の溶液の取り扱いの困難性を最小にすることを示唆した。
【００１４】
Ｓｕｄｏｒら（１９９１）は３〜１０％のＴ（全アクリルアミドの重量％）と７Ｍの尿素を含有する線状ポリアクリルアミド溶液を用いるＤＮＡフラグメントの分離を報告した。ポリアクリルアミド充填キャピラリーチューブはチューブの外側でポリアクリルアミド溶液を形成し次に重合化溶液を注射器によりチューブ中に押しだして形成されるが、圧力をかけ過ぎて注射器を破損しないよう注意する。３、５、および１０％のＴを含む溶液で行ったＣＥ分離の比較は、１０％Ｔが長さ１０〜３６塩基のオリゴヌクレオチド試験フラグメント（ポリ−ｄｃ）の最良の分解を与えることを示した。
【００１５】
さらに最近は、Ｍａｔｈｉｅｓ、Ｈｕａｎｇ、および共同研究者ら（Ｈｕａｎｇら、１９９２ａ、ｂ、ｃ；Ｍａｔｈｉｅｓら、１９９２）がＣＥによるＤＮＡ配列分析について線状ポリアクリルアミドマトリックス（７Ｍ尿素を含有する９％Ｔ）を記載した。マトリックスはキャピラリーに対し３００〜３５０塩基まで（Ｈｕａｎｇら、１９９２ｂ）、およびプライマーを越えて５００塩基の高さまで（Ｈｕａｎｇら、１９９２ａ）配列決定が一般に可能であると言われている。高い粘度のマトリックスはキャピラリーチューブ中で重合化され物理的に安定で複数（３または４）の試料注入が可能であるといえる。
【００１６】
理想的には、ＤＮＡ配列決定フラグメントを分離する際に使用するマトリックスは、（ｉ）長さが３００塩基、好ましくは、長さが５００塩基、またはそれよりも大きいＤＮＡ配列決定フラグメントに対する単一塩基分解を与え、そして、（ｉｉ）キャピラリーチューブの迅速な充填と再充填を可能にするに充分な低い粘度をもつ。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、容易に装填されキャピラリー電気泳動チューブから除去される低粘度媒体を与えることによって、ＤＮＡ配列決定フラグメントの単一塩基分解を達成するための改良された方法と装置を提供すること。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明において、ＤＮＡ配列決定の混合物中のＤＮＡフラグメントが大きさによって分離される、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：
この方法は、前記ＤＮＡフラグメントを、キャピラリー電気泳動のための媒体を含む変性水溶液中でのキャピラリー電気泳動によって分離する工程であって、ここで該溶液が３０℃で約１０〜約３００センチポアズの粘度を有する工程、を包含し、
ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメントに対して単一塩基分解が達成される方法が提供される。
【００１９】
また、本発明において、ＤＮＡ配列決定の混合物中のＤＮＡフラグメントが大きさによって分離される、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：
この方法は、前記ＤＮＡフラグメントをキャピラリー電気泳動のための媒体を含む変性水溶液中でのキャピラリー電気泳動によって分離する工程を包含し、
ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメントに対して単一塩基分解が達成される方法が提供される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
（発明の概要）
本発明は、容易に装填されキャピラリー電気泳動チューブから除去される低粘度媒体を与えることによって、ＤＮＡ配列決定フラグメントの単一塩基分解を達成するための改良された方法と装置を提供する。
【００２１】
ひとつの局面では、本発明は標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する改良された自動化方法を含み、ＤＮＡ配列決定混合物中のＤＮＡフラグメントはキャピラリー電気泳動チューブ中の大きさによって分離される。改良点は平均分子量が約２０と約１００の間の平均分子量をもつ約４〜約７重量％のポリアクリルアミド分子からなる変性水溶液中のＤＮＡフラグメントの分離を含む。溶液の粘度はチューブの全域で低い圧力差、例えば約１００ｐｓｉ以下を印加してキャピラリー電気泳動チューブの充填を可能にする。フラグメントの分離後、ポリアクリルアミド溶液をチューブから除去し、チューブの両末端全域で圧力差を加えることによって新しい変性水溶液をチューブ中に導入する。
【００２２】
他の局面では、本発明は標的のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する改良された方法を含み、ＤＮＡ配列決定混合物中のＤＮＡフラグメントを大きさによって分離する。この改良は約４〜約７重量％の線状ポリアクリルアミド分子からなる変性水溶液中でのキャピラリー電気泳動によるＤＮＡフラグメントの分離を含む。
【００２３】
好ましくは、線状ポリアクリルアミド分子は約２０と約１００の間の、さらに好ましくは約５５の平均分子量をもつ。
【００２４】
本方法はさらに小さい選択された範囲について、例えば長さが約３０ないし約１００または２００塩基の範囲でのフラグメントについての単一塩基分解を達成するために使用できるが、本発明に使用するための分離媒体（ポリマー溶液）は長さが少なくとも約３００塩基、好ましくは少なくとも５００塩基のフラグメントのための単一塩基分解を達成するために有効である。
【００２５】
これらおよび他の本発明の目的および特徴は次の本発明の詳細な説明を添付図面と共に読み取るとき一層完全に明らかになるであろう。
【００２６】
（定義）
「アクリルアミド」および「アクリルアミド単量体」は構造式ＮＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＣＲ１＝ＣＲ２Ｒ３をもち、式中のＲ１は水素、Ｒ２とＲ３は水素またはメチル基であることができる。
【００２７】
「ポリマー」は鎖を形成するように一緒に共有結合した一層小さい単量体サブユニットからなる大きい分子を伝統的な意味で使用している。
【００２８】
「線状ポリアクリルアミド」または「線状ポリアクリルアミドポリマー」は架橋剤が存在しないでアクリルアミド単量体から形成されたポリマーをさす。
【００２９】
「架橋ポリアクリルアミド」は３次元の共有結合架橋ゲルを生成するように架橋剤（例えば、ビスアクリルアミド）の存在でアクリルアミド単量体から形成されたポリマーをさす。
【００３０】
「変性水溶液」は２次元構造が大部分または完全に欠けている単一鎖状態でポリヌクレオチドを維持するために有効な濃度で変性剤（例えば尿素）を含有する水溶液をさす。
【００３１】
「ポリマー溶液」の語は本発明の線状ポリアクリルアミド分子、すなわち約２０と約１００Ｋｄａの間の平均分子量をもつ分子を含む任意の溶液をさす。このポリマー溶液は前章で定義したような変性剤を含むことができる。
【００３２】
「平均分子量」は多数の分子量をもつポリマー種から作られた試料母集団の数平均分子量（Ｍｎ）をさす。この数は次式で定義される：
Ｍｎ＝（Σｎｉ×ＭＷｉ）／Σｎｉ
式中のｎｉは種ｉの分子数を示し、ＭＷｉは種ｉの分子量である。
【００３３】
「電気泳動移動度」は選択された分子種について単位電界強度につき誘導される定常状態速度をさす。電気泳動移動度はチューブ内の特定地点を通過するための分子種に要求される時間で、あるいは選択された時間でのチューブ長に沿った参照地点からの分子種の距離で判定できる。「相対的電気泳動移動度」は他の分子種のそれと比較した分子種の電気泳動移動度をさす。
【００３４】
「ＤＮＡ配列決定フラグメント」の語は選択されたＤＮＡ標的配列について配列情報を得るために生成したＤＮＡポリヌクレオチドをさす。このようなフラグメントは酵素により、例えばサンガージデオキシ方法によって、または化学的に、例えばマキサムおよびギルバートのアプローチによって生成することができる。さらに、フラグメントは単一配列決定反応（例えば、ジデオキシシチジントリフォスフェートの存在で行われるジデオキシ配列決定反応）から、または１以上の配列決定反応から（例えば、各フラグメントの３’末端塩基を同定するために適している標識５’プライマーを含む４種のジデオキシ配列決定反応から）始めることができる。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ポリヌクレオチド、そして特に、ＤＮＡ配列決定フラグメントを分離するための篩分け媒体（ポリマー溶液）に有用な約２０〜約１００の平均分子量をもつ線状ポリアクリルアミド製剤を提供する。電気泳動用に、ポリマー溶液は約４〜約７重量％の濃度にて、溶液のｐＨを制御するための選択された緩衝液と変性剤と共に、線状ポリアクリルアミドを含む。
【００３６】
本発明のポリマー溶液はチューブの両端を横切る小さい圧力差を加えてキャピラリーチューブに導入することができる。ポリヌクレオチド試料はキャピラリーチューブの一端に導入されて電場はチューブの端部を浸した電極貯槽を横切って印加される。ポリヌクレオチドフラグメントは電場を通って移動するので、ポリマー溶液によって安定させた篩分けマトリックスを通る特異な移動によって長さに基づき分別される。
【００３７】
本発明のポリマー溶液は特に標的ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子中の隣接するヌクレオチド配列を決定するのに有用であるが、溶液の他の用途は２またはそれ以上の配列間の差（例えば、突然変異体）の検出、合成オリゴヌクレオチドの純度の評価、および制限フラグメントの分解とサイジングを含む。
【００３８】
（Ｉ．キャピラリー電気泳動装置）
図１は、本発明の方法を行うために適したキャピラリー電気泳動システム２０（アプライド　バイオシステムズ、フォスターシティ　ＣＡ）の簡略化された概略図である。このシステムは好ましくは約１０〜２００ｃｍ、一般には約１００ｃｍ以下の長さ、および好ましくは約１０〜２００μｍ（ミクロン）、一般には約５０μｍの内径（ｉ．ｄ．）を有するキャピラリーチューブ２２を含む。図に示した例では、チューブを水平位置に支持し下方に曲げられた末端領域をもつ。このキャピラリーチューブは電気泳動中に電気浸透を制御でき（例えば、電気浸透が約２×１０−５ｃｍ２／秒−Ｖ以下であるように）、これは試料と最小に影響し合うかあるいは全く影響しない。ひとつの好ましいキャピラリーチューブは内径が５０μｍの（ポリミクロテクノロジーズ、フェニックス、ＡＺから入手できる）溶融シリカチューブであり、その内側表面は以下のセクションＩＩ．Ｂで詳述するように化学的にコーティングされている。
【００３９】
さらに一般に、キャピラリーチューブは、好ましくは２００μｍまたはそれ以下の内径をもつ、ポリマー溶液のカラムを支持することができるチューブまたは導管のいずれかであることができる。例えば、チューブはガラススライド等に形成された導管の形にすることができる。
【００４０】
システム２０の陰極貯槽２６はさらに次のセクションに述べる電気泳動ポリマー溶液２８を含む。２２ａで示されるチューブの陰極端を貯槽２６内に密封し、図に示されるように、電気泳動中に、ポリマー溶液中に浸漬する。貯槽２６の第２のチューブ３０は細かく制御した空気圧システム（図には示していない）に連結し、例えばポリマー溶液を正の圧力によりチューブに装填するため、ポリマー溶液より上のヘッドスペースで圧力を制御するために使用することができる。加圧システムは約１００−３００ｐｓｉまたはそれ以下のキャピラリーチューブの末端を横切る圧力差を発生させることができる。
【００４１】
追加として、空気圧システムはキャピラリーチューブを通って溶液を引き出すための真空システムを含むことができる。
【００４２】
システム２０の試料貯槽３１はチューブの陰極端に装填される試料混合物を含む。好ましくは、試料は一本鎮形態で試料のポリヌクレオチドを維持する変性溶液に溶解した。例えば配列決定反応からの乾燥ＤＮＡ試料は１容量の５ｍＭ水性ＥＤＴＡ、および１２容量のフォルムアミドの混合物に溶解し、試料装填前に２分間９０℃で加熱する。試料と陰極貯槽はチューブの陰極端を貯槽流体に浸漬することができる位置に配置するため、カルーセル等で運ぶことができる。ここには示していないが、カルーセルは、例えば、電気泳動工程の間のクリーニングおよびフラッシングのための溶液、または異なるポリマー溶液を含む追加の貯槽を運ぶことができる。
【００４３】
２２ｂで示されるチューブの反対側の陽極端を、陽極貯槽３４に含まれる陽極電解質溶液３２に浸す。貯槽２６のチューブ３０に類似の貯槽３４の第２のチューブ３６は、例えば、貯槽２６のチューブ３０のように、ポリマー溶液をチューブに装填するため、溶液３２の上の圧力を制御することを含ませることができる。代表的には、電解質溶液２８と３２の組成はキャピラリーチューブ中のポリマー溶液と同一である。
【００４４】
試料装填と続く電気泳動による試料分離のため、充填したキャピラリーチューブと電極貯槽は好ましくはチューブを通る正味の液体流が少ししかまたはないように配置する。これは同じ高さに電極貯槽溶液の表面を保ち、あるいは２つの溶液の上の大気圧を制御して行うことができる。
【００４５】
システムの高電圧供給器４０は図に示されるように陰極および陽極の貯槽に連結し、２つの貯槽間に選択された電位を印加する。電圧供給リード線は、それぞれ、陰極および陽極貯槽のプラチナ電極４１と４２に連結される。電圧供給は、好ましくは６ｋＶと２０ｋＶの電圧設定で、電極を横切って定電圧（ＤＣ）を印加するように設計することができる。
【００４６】
システム中の検出器４４はチューブの陽極端付近に配置され、チューブ内の光学検出ゾーン４５を通って移動する試料ピークをモニターする。一般的には、キャピラリーチュービングは小さい窓を作るように外部のポリイミドコーティング（ポリイミド被覆キャピラリーの場合には）の小さい領域を除くように処理された。検出器はＵＶまたは可視吸収光検出のために、および／または例えば蛍光放射検出またはラジオアイソトープ検出のために設計される。
【００４７】
好ましくは、蛍光放射検出は、試料分子と会合した蛍光種によって、約２４０〜６００ｎｍに調整できる１またはそれ以上の選択された励起波長で行われる。一般的には、検出器は励起源としてアルゴンレーザーを用いる。好ましくは、共焦の光学配置を使用する（例えば、Ｈｕａｎｇら、１９９２）。電気泳動ピークを記録するため、検出器を積分器／プロッター４６に連結し、磁気媒体等のデーター貯蔵のためのコンピューターの形をとることができる。
【００４８】
ラジオアイソトープ検出は３Ｈまたは１４Ｃのための改良されたＨＰＬＣアイソトープ検出器を使用して行うことができる（ラジオマチック　インストルメンツアンド　ケミカル社、メリデン、ＣＴ）。３２Ｐ標識ピークの検出のため、半導体またはシンチレーションに基づくラジオアイソトープ検出器装置を使用することができる（Ｐｅｎｔｏｎｙら、１９８９ａ、ｂ）。ガンマ線検出のために配列した検出器も使用できる（例えば、Ａｌｔａｒｉａら、１９９０）。
【００４９】
操作において、キャピラリーチューブは適当な溶液貯槽の上のヘッドスペースに正圧を印加してチューブを通る適当なすすぎ溶液をフラッシングして完全に洗浄する。あるいは、キャピラリーを注射器によって手で洗浄できる。本発明の実施において、ポリマー含有電解質溶液それ自身を使用して試料操作間のシステムをフラッシングする。ポリマー電解質溶液とは異なる洗浄溶液を使用する場合、次にチューブを数容量のポリマー溶液でフラシングする。
【００５０】
次に試料は、一般的には動電学的な注入によって、チューブの陰極端に装填する。チューブの陰極端を試料溶液中におき、短い高電圧パルスをチューブの両端を横切って印加する（例えば、６ｋＶを５秒間）。次にチューブ端を陰極貯槽２６の溶液に戻し、所望の数のフラグメントピークが検出ゾーンを通過するまで分離電圧（例えば、１２ｋＶ）を印加する。
【００５１】
多数の試料の自動化電気泳動のために、装置はチューブ内の試料の移動を同時にモニターするためのキャピラリーチューブと適当な検出手段の配列を含むように適合させることができる。このような配置によって、同じ試料または多くの異なる試料をこのような配列を用いて同時に分析することができる。
【００５２】
（ＩＩ．線状ポリアクリルアミド組成物）
上記のように、本発明は選択された濃度の線状ポリアクリルアミド分子を選択された分子量の範囲で含む低粘度溶液を使用してキャピラリー電気泳動中の大きいＤＮＡ配列決定フラグメントの単一塩基分解を与えるという発見に基づく。本発明のポリマー溶液は粘度が、ＤＮＡ配列決定フラグメントの高分解分離のために予め使用した線状ポリアクリルアミド媒体よりもかなり低い。
【００５３】
（ＩＩ．Ａ　線状ポリアクリルアミドの調製）
本発明の線状ポリアクリルアミドの分子は平均分子量が約２０と約１００の間によって特徴づけられる。
【００５４】
ポリマー母集団の平均分子量は多くのファクターによって調整することができる。ひとつのアプローチでは、重合化の条件が最終のポリマー母集団のＭＷを変えるために変えられる。平均分子量は（１）反応温度を高くする、（２）ラジカル開始剤とアクリルアミド単量体の比を増加する、または（３）鎖移動試薬の量を増加することによって減らすことができる。使用できる移動試薬は低級アルキルアルコールを含み、好ましくはイソプロパノールを用いる。
【００５５】
実施例１は本発明による線状ポリアクリルアミド製剤を調製するための方法を記載する。この方法では、水（２２２ｍｌ）中のイソプロパノール（６．５５ｍｌ）の混合物を３５℃で１０分間撹拌し、その間ヘリウムで脱気する。次にアクリルアミド（２５ｇ）を加えて完全に溶解させる。アクリルアミドが溶解した後、約０．０５％（それぞれＴＭＥＤおよびＡＰＳに対するｗ：ｖおよびｖ：ｖ）の最終濃度まで、ＴＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）およびＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）を添加して重合を開始し、そして９０分間激しく撹拌しながら重合を続ける。
【００５６】
好ましくは、ポリマー溶液は数日間にわたって緩衝液の複数の変化に対して１２〜１４のＭＷカットオフ透析管で透析し低分子量の反応物を除去する。透析に続いて、ポリマー溶液を凍結乾燥し、約４０％の収率で乾燥ポリマーを得る。
【００５７】
ポリマーの平均ＭＷを調整するための第２の方法はポリマーを異なるＭＷフラクションに分別して単離と精製を行う。ポリマーの水溶液を大きさに依存するクロマトグラフィー分離（例えばゲル浸透クロマトグラフィー）またはメタノールのような水混合性溶媒を用いる分別沈澱によって分別する。
【００５８】
都合のよいことには、このようにして得られたポリマーの分子量分布は上で定義したような数平均分子量として示される。平均分子量は当該分野でよく知られている方法（例えば、Ｈｉｅｍｅｎｚ、１９８６、４２〜４９頁参照）に従ってゲル浸透クロマトグラフィーを用いて決定される。簡単には、既知の分子量組成のいくらかのポリアクリルアミド標準品の保持時間は分子量と溶出時間の相関関係を算定する標準曲線を確立するように決定される。標準曲線を使用して溶出時間に基づいた試料の平均分子量を決定する。例示的な分子量の決定は実施例２に与えられる。
【００５９】
（ＩＩ．Ｂ　ポリマー溶液）
単一鎖ポリヌクレオチドを分離するため、ポリマー溶液は大きくまたは全体的に二次構造が全くない単一鎖状態でポリヌクレオチドを維持するために有効な濃度で変性剤を含む。一般的に、７〜８Ｍの濃度での尿素が使用される。一般に、本発明でのＤＮＡフラグメントを分離するために用いられるポリマー溶液は３０℃で測定するとき、約１０〜約３００センチポアズの粘度をもつ。
【００６０】
また溶液は約４〜９の間の選択された値で溶液のｐＨを維持するための緩衝液を含む。使用した任意所定の緩衝液種に対して、最大の試料ピーク分解のための最適濃度が存在する。バンド幅を広げるには低すぎる濃度（低いイオン強度）または高すぎる濃度（高いイオン強度）にて発生させることができる。一般に、双極性イオン緩衝液は分解を改善しバックグラウンドＵＶ吸収の変動を減らす。
【００６１】
単一鎖ポリヌクレオチドの高分解を達成するため、本発明のポリマーは約４〜約７重量％の濃度でポリマー溶液中に存在する。
【００６２】
本発明の重要な局面によれば、本発明のポリマー溶液は容易に流れ、キャピラリーチューブの容易に迅速な充填と再充填を行うことができる。好ましくは、約１００ｐｓｉ以下、好ましくは５０ｐｓｉ以下のチューブを横切る圧力差を用いて、５０ｃｍ×内径５０μｍのキャピラリーチューブを３０分以内に充填することができるように粘度は充分に低くする（３０℃で測定して、約１０ないし約３００センチポアズ）。あるいは、注射器を使用して軽く圧力を加えて、実施例４のポリマー溶液を６０秒以下でこのようなキャピラリーに装填することができる。迅速な充填の特徴は特にＤＮＡ配列分析用の自動化キャピラリー電気泳動法に敏感に反応することである。
【００６３】
以下の表１は１０ないし３００センチポアズのポリマー粘度（η）での上記キャピラリーチューブのための計算した充填時間を示す。
【００６４】
【表１】
2004000227.tif 000004
（ＩＩ．Ｃ　キャピラリーチューブの調製と充填）
本発明に使用するキャピラリーチューブは電気泳動中に電気浸透を抑えることができ、試料とは最小限の相互作用があるかまたは全くないタイプのものである（例えば、電気浸透が約２×１０−５ｃｍ／秒−Ｖ以下である）。好ましいキャピラリーチューブは内径が約２００ミクロン以下、好ましくは約１００ミクロン以下のものであり、２５ミクロン以下の寸法も考えられるが、さらに好ましくは約２５〜５０ミクロンの範囲内である。
【００６５】
一般的に、チューブは構造上の剛性を与えるように外部ポリイミドコーティングをもつ溶融シリカからなる。電気浸透はチューブの内側シリカ表面に沿って負の電荷をマスキングして抑えることができる。このようなマスキングは、当該分野で知られているアプローチを用い、内側表面に共有結合または非共有結合している化学コーティングを適用して行われる。Ｃｏｂｂら（１９９０）の方法に基づく適当な共有コーティングを調製するための方法の詳細は実施例３に提供される。選択したコーティングは、少なくとも１日の複数の操作（例えば、約８時間にわたって行われる連続５操作にわたる）に対し、使用した分離条件下に安定でなければならず、好ましくは長さが３００塩基で、好ましくは長さが５００塩基まで、またはそれ以上のフラグメントのための単一塩基分解を与える。
【００６６】
実施例３に記載されるコーティング方法では、溶融シリカキャピラリーチューブを１．０ＭのＮａＯＨで洗い流し次に３工程方法を用いてコーティングする。第１の工程では、内壁のシリカ表面は塩化チオニルを用いて塩素化される。塩素化に先だって、チューブは約８０カラム容量の乾燥蒸留テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を用いて洗い流して、内壁表面を乾燥する。残りのＴＨＦを（例えば、ヘリウムによって）除去した後、少量のジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）を含む塩化チオニル溶液をチューブに通過させてシリカ表面を塩素化する。反応は互いにチューブの両端を結合しチューブをオーブン中で５５℃にてインキュベートすることにより一晩中続けられる。
【００６７】
第２の工程では、チューブは乾燥蒸留ＴＨＦをカラムの数倍容量用いて洗い流して塩化チオニル溶液を除去し、次に、ＴＨＦ中のビニルマグネシウムブロミド（グリニヤ試薬）の１Ｍ溶液を用いて（〜１００倍のカラム容量を約５時間）洗い流す。チューブを間欠的にヒートガンを用いて加熱し反応を容易にする。５時間洗い流す工程の後、チューブの両端を再び相互に連結して終夜７０℃にて加熱する。
【００６８】
第３の工程では、表面ビニル基をアクリルアミドと反応させる。まずキャピラリーをＴＨＦ（グリニヤ試薬を除くため）、メタノール水で逐次洗い流して条件を整える。次にチューブを３０分間新しく調製した３％（ｗ：ｖ）アクリルアミド単量体、０．１％（ｖ：ｖ）ＴＭＥＤ、および０．１％（ｗ：ｖ）ＡＰＳを含む重合化水溶液で洗い流す。この工程に続いて、チューブを水で洗い流してヘリウム流で乾燥させる。乾燥したコーティングチューブを使用するまで−２０℃で貯蔵することができる。
【００６９】
ポリマー溶液の試料分離用キャピラリーチューブへの装填は注射器により、あるいはキャピラリーチューブの一端を浸す貯槽溶液上のヘッドスペースに正の圧力をかけて、手軽に行われる。注射器による装填のために、キャピラリーチューブの一端は注射器に連結し、ポリマー溶液を注射器のプランジャに軽く圧力をかけてチューブに装填する。５０ｃｍ×内径５０μｍのキャピラリーチューブを注射器により６０秒以内に充填でき、チューブ内に気泡をトラップすることがない。
【００７０】
好ましくは、自動化ＣＥ装置に使用するため、貯槽溶液上のヘッドスペースでチューブに正の圧力をかけてポリマー溶液を装填または再装填する。このアプローチではキャピラリーチューブの一端（例えば陽極端）を貯槽に含まれるポリマー溶液に（例えば上記セクションＩのようなＣＥ装置の陽極貯槽中で）浸す。貯槽溶液上のヘッドスペースはキャピラリーチューブの一端を貯槽溶液に通過させるように採用した適当なシーリング手段によって外側の大気から密閉される。さらにシーリング手段は制御できる気体圧力源（例えば適当な制御手段をもつ圧搾気体シリンダー）に貯槽のヘッドスペースを接近させる。正の圧力を陽極溶液上のヘッドスペースに加えて、チューブ端を横切る圧力差を生じさせ、陽極貯槽溶液をチューブに移動させる。上記のように、本発明に使用される低粘度溶液は低圧、例えば１００ｐｓｉまたはそれ以下でキャピラリーチューブに迅速に導かれる。圧力差は、溶液がチューブの陰極端に出るまで、陰極端が陰極溶液に浸される時間保持される。
【００７１】
先に述べたように、充填したキャピラリーチューブと電極貯槽は好ましくはチューブを通る正味の液体流が殆どないかまたはないように配置される。これは同じ高さに電極貯槽溶液表面を保持し、または２つの溶液上の大気圧を制御して行うことができる。
【００７２】
（ＩＩＩ．電気泳動法）
電気泳動により分離されるポリヌクレオチド試料は標準法によって調製される。一般的には試料は１またはそれ以上の配列決定反応から誘導されるＤＮＡ配列決定フラグメントの混合物である。ＤＮＡ配列決定のための２つの最初の技術は化学法（例えば、ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔ、１９７０）と酵素法（例えば、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）である。両者の技術のためのルーチンプロトコルは広く入手可能である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）。アプローチにおいてこれらの技術は異なるが、両者は限定された５’末端塩基部位で始まり選択された塩基または選択された塩基の組み合せでランダムに終わるポリヌクレオチド（配列決定フラグメント）の母集団を生成する。（ＤＮＡのためのこの４つの標準ヌクレオチド塩基はデオキシアデニレート、デオキシシチジレート、デオキシグアニレート、およびチミジレートであり、それぞれＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴとして略記される）。一般的にはフラグメントは、高められた検出のためにレポーター標識（「レポーター」または「標識」と交互に呼ばれる）を含み、１またはそれ以上の異なる選択された末端塩基で終わる他のフラグメントから選択された塩基で終わるフラグメントを区別するために適する。いずれかまたは両方の目的のために適している任意の標識を使用することができ、蛍光標識が好適である。例えば、フラグメントを蛍光またはラジオ標識５’プライマーを使用して、蛍光標識ジデオキシ末端ヌクレオチド（例えば、Ｂｅｒｇｏｔら、１９９１）を使用して、または放射化ヌクレオチド（例えは、３５Ｓ標識ｄＡＴＰ）を使用して標識を付けることができる。
【００７３】
通常は、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ（酵素）法を使用する。この方法ではＤＮＡ鋳型は簡単な溶液の加熱（例えば、６０℃で１０分間）、続いて２０〜３０分間、４〜２０℃までのゆっくりした冷却によって溶液中で５’プライマーオリゴヌクレオチドにアニールする。好ましくは、プライマーは、プライマー中で５’末端塩基に共有結合する蛍光標識を含む。使用できる適当な蛍光染料および標識を付す方法は、ここに参考文献として組み込まれる米国特許４，８５５，５２５に記載されている。次に、鋳型−プライマー溶液は（ｉ）４つの標準ヌクレオチド塩基の選択された濃度、（ｉｉ）選択された末端塩基のジデオキシ形態の選択された濃度、および（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼの存在で、インキュベートされる。ポリメラーゼ触媒反応は選択された時間行われ、次に適当な手段によって（例えば冷エタノール中で反応を静めることによって）停止させる。望ましい場合には、１またはそれ以上の標準塩基を選択されたヌクレオチド類似体：例えば、ピーク圧縮を避けるため、ｄＧＴＰの代わりにｃ７ｄＧＴＰと置換することができる。ＤＮＡポリメラーゼのこの働きは、（標識を付けた）５’プライマー配列で開始し、選択された末端塩基のジデオキシ形態でそれらの３’末端で終端し、配列において鋳型ＤＮＡに相補的である標識を付けたＤＮＡフラグメントを生成するために効果的である。
【００７４】
隣接する塩基の配列を決定する場合、４つの別々の配列決定反応を、各標識塩基に対して１つに行うことが好ましい。さらに、また各反応に対して、異なる標識を使用し、各配列決定反応に生成したフラグメントを他の３つの反応に生成したフラグメントから区別できるようにすることが好ましい。この目的にあったスペクトルで分解できる蛍光染料の種類は記載されており（例えば米国特許４，８５５，５２５；Ｓｍｉｔｈら、１９８５）、これによって４つの配列決定反応からのフラグメントを同じレーン（移動路）で電気泳動により分離することができる。４種のスペクトルで分解できる蛍光染料（ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸと呼ぶ）で各々標識を付された４種の「ユニバーサル」Ｍ１３　５’−プライマーをアプライド　バイオシステムズから市販品として入手できる。
【００７５】
各配列決定反応で生成したＤＮＡ配列決定フラグメントは通常遠心分離によって冷エタノール溶液から単離される。ペレットを冷７０％エタノールで洗浄した後、得られたペレットを簡単に、例えば３分間真空遠心によって乾燥し、次に電気泳動分析の準備をする。あるいは、試料は暗室で−２０℃にて貯蔵する場合、数ヶ月間この乾燥した形態で安定である。
【００７６】
キャピラリーチューブに装填する前に、乾燥したＤＮＡフラグメント試料を変性溶液中に再懸濁して簡単に加熱しＤＮＡフラグメント全部を一本鎖形態に変換する。例えば、変性溶液は１容量の５ｍＭの水性ＥＤＴＡ、および１２容量のフォルムアミドの混合物からなることができる。変性溶液中で懸濁した後、試料を９０℃にて２分間加熱し、次に、ポリマー溶液充填キャピラリーチューブの陰極端に、一般に上述のような動電学的な注入によって、装填する。１以上の反応からのフラグメントをキャピラリーチューブに装填する場合、反応からのフラグメントは好ましくは装填前に混合する。
【００７７】
図２Ａ〜２Ｅは、実施例４に述べたように生成させたＣ（３’末端）にて終端する配列決定フラグメントの混合物を用いて得られた電気泳動図の時間区分を示す。これらの図では、蛍光強度（任意の単位で）は検出器を過ぎる溶出時間の関数としてプロットされる。ｍ１３ｍｐ１８（＋）鎖の既知の配列から決定された各フラグメントの長さは、各ピークの頂部に示される。フラグメントの溶出時間の間隔はシチジレート残基の既知の配列位置と密接に相関関係があった。
【００７８】
図２Ａは長さが約２０ないし５０塩基の範囲のフラグメントの分離を示す。図に示されるように、単一塩基による長さが異なるピークはほぼベースラインで分解された。図２Ｂは長さが約２２０ないし２６０塩基の範囲のフラグメントの分離を示す。また、単一塩基分解が達成された。図２Ｃは長さが約３５０ないし３７１塩基の範囲のフラグメントの分離を示す。図から分かるように、長さが３００塩基よりも大きいフラグメントはよく分解されている。図２Ｄと２Ｅは約４０５ないし４５２塩基（図２Ｄ）および約５００ないし５２５塩基（図２Ｅ）の大きさの範囲のフラグメントの分離を各々示す。これらの図は、長さが４００塩基まで、５００塩基まで、またはそれ以上のフラグメントが本方法で分解されることを示す。
【００７９】
実施例４からのＤＮＡ配列決定試料の電気泳動分離もまた従来のスラブゲル形態を用いて行った（アプライド　バイオシステムズ　モデル３７０Ａ　ＤＮＡ配列決定システム、アプライド　バイオシステムズ、ＣＡ）。４％Ｔおよび５％Ｃを含有する架橋マトリックスを使用した。得られた電気泳動図は前記キャピラリー電気泳動分析で得られたものと比較できるピーク分解を示した。さらに重要なことは、相対的ピーク強度は本質的にキャピラリー電気泳動によって見出されたものと同じであり、図２Ａ〜２Ｅの変化するピーク高はＤＮＡ試料（すなわち、試料中の各フラグメントの実際の分量）に帰するものであり、分離方法の欠点に帰するものでないことを示した。
【００８０】
所望の数の配列決定フラグメントの移動度を記録した後、電気泳動を中止し、キャピラリーチューブ中のポリマー溶液を置き換えることができる。例えば、陽極貯槽溶液の上のヘッドスペースに正の加圧を用いてキャピラリーチューブを通る数カラム容量の新しいポリマー溶液を押し流すことができる。キャピラリーの他端は処分用の廃物収集器に向けられる。次に新しく充填したキャピラリーチューブを用意して他の試料を分離する。
【００８１】
（ＩＶ．用途）
本発明のポリマー組成物と方法は特に選択されたポリヌクレオチド標的配列について配列情報を得るために有用である。ひとつの局面では、ヌクレオチドの隣接する範囲の配列の認識を望むことができ、その場合には配列決定フラグメントは上記セクションＩＩＩで述べたように４種の配列決定反応で調製される。４つの反応からのフラグメントを同じ移動路（同じキャピラリーチューブ）で分離する場合、各反応からのフラグメントは他の３つの反応からのフラグメントと区別できるように標識を付けられる。４つのスペクトルにより分解できる標識を用いることが望ましいが他の標識付けする図式、例えば２つの識別できる標識を用いる二元図（Ｈｕａｎｇら、１９９２ｂ）を用いることができる。Ｈｕａｎｇらのアプローチでは、４つの配列決定反応は次の４つの標識の組み合せを用いて識別され、ＡとＢは、標識Ａのみ、標識Ｂのみ、ＡとＢの両方、ＡでもＢでもない、と使用される２つの標識を示す。他の選択肢として、４種の大きさで使用される単一標識を使用する（Ｐｅｎｔｏｎｅｙら、１９９２）。
【００８２】
他の局面では、本発明の方法は２種の試料からの２つの標的配列領域が同一であるかどうかを決定するために使用できる。ここでは、期待される配列は既に知られており、少なくともひとつの配列決定反応は、識別できる標識を含む配列決定プライマーを用いて各標的配列で行われる。末端塩基は２つの反応の各々が等しいように選択される。各反応からの配列決定フラグメントは共にキャピラリーチューブに装填され、得られた電気泳動図（必要により各標識によって生じる移動差に対して補正される）は２つの標的配列を示す溶出プロフィルが同じかどうか決定するために点検される。標的配列における単一部位変化が生じることが知られ、そして選択された末端塩基が突然変異の基本特性であることが選択される場合、本方法はこのような突然変異が存在するかどうか迅速な評価を与える。
【００８３】
また本発明の方法を使用して標的配列の配列「サイン」を決定することができ、選択された塩基タイプ（例えばシチジレート）に属する塩基間の相対的間隔は標的配列を同定する特徴（定性的または限定的）として記録される。好ましくは、相対的間隔は既知の長さの標準フラグメント混合物の存在で決定され、電気泳動の移動度のラン対ランの変化性を補正することができる。
【００８４】
上記の用途は説明のために厳密に示しているが、本発明の精神と範囲内で多くの変化が可能である。
【００８５】
上述から、本発明の目的にいかに合致しているかを高く評価できる。本発明のポリマー溶液は長さが約３０ないし約５００塩基の範囲またはそれ以上のＤＮＡフラグメントの単一塩基分解を提供することができる。低粘度の溶液はチューブ内の溶液を容易に置換し試料混合物の分離を行うことができ、これによって前のランからの試料のビルドアップやゴーストピークの問題を回避できる。さらに、複数の試料分離のためのキャピラリーチューブの使用はキャピラリーの消耗を減らし、複数の試料分析の自動化も能率化される。
【００８６】
【実施例】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明を限定するものではない。
【００８７】
（材料と方法）
化学品はアルドリッチケミカル社（ミルウォーキー、ＷＩ）から、また比較できる品質の市販品から入手した。
【００８８】
（実施例１）
（線形ポリアクリルアミドの調製）
次の方法に対し、ＴＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、１０％ｖ：ｖ水溶液）のストック水溶液とＡＰＳ（過硫酸アンモニウム、１０％ｗ：ｖ水溶液）のストック水溶液を調製した。
【００８９】
水浴中３５℃に保持された５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに、２２２ｍｌの水と６．５５ｍｌのイソプロパノールを添加した。溶液を約１０分間撹拌しながらヘリウムを溶液中に泡立たせた。次にアクリルアミド（２５ｇ）を添加した（〜１．５Ｍ最終濃度）。アクリルアミドが完全に溶解したとき、ＴＭＥＤとＡＰＳの上記各ストック溶液１．２５ｍｌを添加し、激しく撹拌しながら９０分間重合化を行って、蜂蜜状の濃度をもつ溶液を生成した。
【００９０】
ポリマー溶液を１２〜１４のカットオフ透析膜（スペクトラ／ポア＃２、スペクトラム　メディカル　インダストリーズ、ロサンジェルス、ＣＡ）を用いて４℃にて３日間にわたって水（各３．５リットル）の５変化に対して透析した。透析に続いて、ポリマー溶液を凍結乾燥し９．５８ｇの乾燥ポリマーを生成した。
【００９１】
（実施例２）
（分子量の決定）
実施例１からのポリマー物質の分子量はゲル浸透クロマトグラフィーによって決定した。連続して連結した２個のウォーターズ　ウルトラヒドロゲル　リニアーカラム、およびピークの検出のためのウォーターズ　Ｒ４０１　ディフェレンシャル　リフラクトメーターを備えたウォーターズ　５９０　ソルベント　デリバリ　システム（ミルフォード、ＭＡ）を用いて、試料と標準物を実験した。他の条件：注入した試料、８０μｌの〜４ｍｇ／ｍｌストック液；流速、０．６ｍｌ／分；移動相、１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０。　分子量決定に使用した４つの非イオン性線形ポリアクリルアミド標準物（ポリサイエンシーズ　インコーポレイテッド、ワーリントン、ＰＡ）の性質をを表２に示す：
【００９２】
【表２】
2004000227.tif 000005
これらの標準物の溶出時間と既知の平均分子量から、較正曲線を確定した。この較正曲線に基づいて、実施例１からのポリマー試料を５５の数平均分子量をもつように決定した。
【００９３】
（実施例３）
（被覆したキャピラリーチューブの調製）
次の寸法をもつ溶融したシリカキャピラリーチュービング（ＴＳＰ　０５０３７５、Ｐａｒｔ　＃　２００００１７）はポリミクロ　テクノロジーズ、ツクソン、ＡＺからのものであった：長さ＝２０ｍ、内径＝５０μｍ、外径＝３６１μｍ、外側ポリイミド層の厚さ＝１６μｍ。このチューブから、５メートルセグメントを除去し、一連の平均に間隔をおいた８個の２ｍｍウィンドウをチュービング中に熱ワイヤでポリイミドコーティングを焼き取って形成させた。ウインドウは約５５ｃｍの間隔を置いており８または９本のキャピラリーチューブはそれぞれ入口から４０ｃｍで出口から１５ｃｍのウインドウを含み、５メートルセグメントから調製できた。
【００９４】
下記のコーティング処置の前にチュービングは注射器により手動でＮａＯＨの１．０Ｍ溶液で洗い流し、次にシリンジポンプ（モデル３５１、オリオンリサーチ、ケンブリッジ、ＭＡ）を用いて水で自動的に洗い流した。
【００９５】
キャピラリーチューブの内壁はＣｏｂｂら（１９９０）の方法の改良を用いて３段階で化学的にコーティングした。
【００９６】
第１段階では、内壁のシリカ表面は塩化チオニル（ＳＯＣｌ２）を用いて活性化した。塩素化の前に、チューブを４時間周期で上記シリンジポンプを用い、蒸留した乾燥テトラヒドロンフラン（ＴＨＦ）で洗い流し内壁表面を乾燥させた。２ｍｌの気密注射器を用い流速を「０．４」、そして寸法を「５」にセットした。チューブを通過したＴＨＦの全容量は約８００μｌであった（約〜８０カラム容量）。次に残りのＴＨＦをヘリウム流を用いて手動で追い出し、上記ＴＨＦに関する限りは、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ、１０μｌ）とＳＯＣｌ２（２ｍｌ）の混合物をシリンジポンプによってチューブを通過させた。（〜４時間、〜８００μｌ）。次にチューブの両端部を気密なプラスチックスリーブと連結し、５５℃にて一晩オーブン中でインキュベートした。
【００９７】
第２の段階ではチューブの塩化物活性化内壁をビニル臭化マグネシウム（「グリニヤ試薬」）と反応させた。まず塩化物活性化チューブを蒸留した乾燥ＴＨＦ（１時間、〜３００μｌ）でシリンジポンプによって洗い流しＳＯＣｌ２溶液を除去し、次にグリニヤ試薬のＴＨＦ中の１Ｍ溶液で洗い流した（シリンジポンプ、２ｍｌ注射器、〜１ｍｌ、５時間）。反応を容易にするようチューブをヒートガンで断続的に加熱した。５時間の洗浄期間後、チューブの両端部を再び気密なプラスチックスリーブで連結し、まだグリニヤ試薬を含んでいるキャピラリーチューブを一晩７０℃にてインキュベートした。
【００９８】
第３の段階では、ビニール被覆内壁をアクリルアミドと反応させてアクリルアミドコーティングを与えた。まずキャピラリーをシリンジポンプによってＴＨＦで洗い流してグリニヤ溶液を除き（１ｍｌ注射器、〜２００μｌ、２０分間）、メタノール（〜１５０μｌ）、次に水（〜２００μｌ）で洗い流した。次にチューブを３００μｌの１０％ｗ：ｖアクリルアミド水溶液、７００μｌの水、１μｌのＴＭＥＤ、および１０μｌの１０％（ｗ：ｖ）ＡＰＳ水溶液を含む新しく調製した重合化溶液（１ｍｌ）で３０分間洗い流した。次にチューブを水（１００μｌ）で洗い流し、１．５時間ヘリウム流で乾燥し、使用するまで−２０℃のフリーザーに貯蔵した。
【００９９】
（実施例４）
（ＤＮＡポリヌクレオチドの配列分析）
キャピラリー電気泳動装置は、高電圧供給器（ガンマハイボルテージリサーチ社、オーマンドビーチ、ＦＬ）およびデータ収集のためのモデル６００データアナリシスシステム（アプライド　バイオシステムズ社、フォスターシティー、ＣＡ）を備えた。実施例３で調製したキャピラリーチューブ（５０μｍの内径、５５ｃｍの長さ、検出器に対し４０ｃｍ）を配置し、陽極貯槽を電気的に接地した陰極貯槽に連結した。
【０１００】
標識を付けたポリヌクレオチドの検出は、実施例３と同様に、陰極端から４０ｃｍのキャピラリーチューブの表面に形成された長さ２ｍｍのウインドウ付近に位置した蛍光検出器を用いて行った。アルゴンイオンレーザーからの励起光（モデル２２１−４０ＭＬＡ、シオニクス、サン　ノゼ、ＣＡ）は０．５の光密度の中性密度フィルター（＃ＦＮＧ　０８５、メルスグリオット、アービン、ＣＡ）を通過して６４ｍｍの焦点距離長（ｆ．１．）の直径７ｍｍの正レンズおよび８５ｍｍのｆ．１．の直径５ｍｍの負レンズからなる一組の集束光学部に入り、キャピラリーチューブに１００μｍのレーザースポットの大きさの入射光線となった。蛍光放出線は直角に１２ｍｍのｆ．１．の１４ｍｍの直径の非球面コレクタレンズによって収集され、５３０ｎｍのＲＤＦバンドパスフィルター（オメガオプチカル社、ブラットルボロ、ＶＴ）を通過した。フィルターを通過後、放出光は１７ｍｍの１０ｍｍ直径の非球面ファブリレンズによって随伴された４８ｍｍ　ｆ．１．の１９ｍｍ直径の非球面ファブリレンズからなるファブリセットを通過した。次に光電子増倍管（＃Ｒ９８−２１、ハママツ、サン　ノゼ、ＣＡ）に像を造った。検出用レンズはすべてアプライド　バイオシステムズ、フォスターシティー、ＣＡによって製造されたものであった。
【０１０１】
Ｃにて終端するフラグメントの単一色配列決定「はしご」は、アプライド　バイオシステムズ、フォスターシティー、ＣＡからの配列決定キットと添付の配列決定使用説明書を用いて（パーツ番号４０１１１９、Ｔａｑ　ＤｉｐｒｉｍｅｒＣｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ）ジデオキシ配列決定法によって調製した。Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ鋳型（ｍ１３ｍｐ１８（＋）鎖、０．１ｐモル）を蛍光染料プライマー（ＦＡＭＭ１３（−２１）プライマー）に対してアニールし、３’末端塩基として与えられたジデオキシシチジン（ｄｄＣＴＰ）と共に、Ｔａｑポリメラーゼを用いてプライマー伸長を行った。得られた反応混合物を暗室で−２０℃にて乾燥したエタノール沈澱物として貯蔵した。
【０１０２】
ＤＮＡ配列決定フラグメントを分解するためのポリマー溶液を次のように調製した。２．４ｇの尿素と実施例１からの０．３１ｇの乾燥した線状ポリアクリルアミド試料に、５．６ｇのトリス（シグマケミカル社）、４０ｍｌのメタノール、および２２０ｍｌの水からなりリン酸でｐＨ８．０に調整してなる３．５ｍｌの緩衝液（トリスフォスフェート緩衝液）を添加した。混合物を約３時間撹拌し次に０．４５μｍの孔径のシリンジフィルターによって濾過した。溶液の粘度は、３７℃で測定したとき、１８０センチポアズであった。
【０１０３】
ポリマー溶液をシリンジを介して手動によりキャピラリーチューブに装填した。シリンジプランジャに軽く圧をかけて６０秒以内にポリマー溶液を充分に充填した。充填したキャピラリーチューブ内には気泡は認められなかった。チューブを充填すると、キャピラリーチューブ内に装填した同じポリマー溶液を含む各陽極と陰極の貯槽溶液にチューブの末端を浸漬した。
【０１０４】
充填したキャピラリーチューブ内に試料を装填する直前に、上記からの乾燥した配列決定反応混合物を、５ｍＭの水性ＥＤＴＡ（０．５μｌ）とフォルムアミド（６μｌ）の混合物に再懸濁させた。懸濁物を９０℃で２分間加熱し、次に氷浴に移した。試料をキャピラリーチューブに装填するため、チューブの陰極端をまず簡単に水の圧搾容器で洗浄して、チューブ端の外側からポリマー溶液の小滴を除去した。次に陰極電極とキャピラリーチューブの陰極端を試料溶液に置き、６ｋｖの電圧を５秒間印加した。試料フラグメントの分離は、陰極貯槽へ電極とチューブ端を戻し、１２ｋｖの運転電圧を印加して開始された。試料を用いて得られた電気泳動図の部分図を図２Ａ〜２Ｅに示す。
【０１０５】
本発明は特定の方法と具体例を参照して記載したが、本発明の精神と範囲から離れずに種々の改良や改変を行うことができることは高く評価されるであろう。
【０１０６】
【発明の効果】
キャピラリーチューブ内で一本鎖ＤＮＡ配列決定フラグメントの混合物を電気泳動により分離することによって、長さが３００塩基以上のＤＮＡ標的配列を決定する際に使用するＤＮＡ配列決定方法が提供される。
【０１０７】
溶液の低粘性がこの種の溶液のキャピラリーチューブへの迅速な装填と再装填を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明によるキャピラリー電気泳動装置の概略図を示す。
【図２ＡＢ】図２Ａ〜２ＢはＤＮＡ配列決定フラグメントの混合物を用いる本発明の方法によって得られた電気泳動の選択された時間部分の電気泳動図を示す。このフラグメントはサンガー法により生成し、シチジンのジデオキシ形態をもち３’末端で終端した。
【図２ＣＤ】図２Ｃ〜２ＤはＤＮＡ配列決定フラグメントの混合物を用いる本発明の方法によって得られた電気泳動の選択された時間部分の電気泳動図を示す。このフラグメントはサンガー法により生成し、シチジンのジデオキシ形態をもち３’末端で終端した。
【図２Ｅ】図２ＥはＤＮＡ配列決定フラグメントの混合物を用いる本発明の方法によって得られた電気泳動の選択された時間部分の電気泳動図を示す。このフラグメントはサンガー法により生成し、シチジンのジデオキシ形態をもち３’末端で終端した。
【図１】
2004000227.tif 000006
【図２ＡＢ】
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【図２ＣＤ】
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【図２Ｅ】
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