(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ）及びそれをコードする遺伝子を提供すること。【解決手段】特定のアミノ酸配列、またはその一部のアミノ酸が欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有するニコチアナミン合成酵素、より詳細にはシロイヌナズナ由来の新規なニコチアナミン合成酵素に関する。また、前記した本発明のニコチアナミン合成酵素をコードし得る遺伝子、それを含有してなるベクター、及び当該遺伝子を含有する遺伝子により形質転換された形質転換細胞に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸が欠失若しくは置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されることにより配列番号２に示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有しているアミノ酸配列を有するニコチアナミン合成酵素。
【請求項２】
ニコチアナミン合成酵素が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものである請求項１に記載のニコチアナミン合成酵素。
【請求項３】
ニコチアナミン合成酵素が、シロイヌナズナ由来のものである請求項１又は２に記載のニコチアナミン合成酵素。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のニコチアナミン合成酵素をコードし得る塩基配列を有する遺伝子。
【請求項５】
遺伝子がＤＮＡである請求項４に記載の遺伝子。
【請求項６】
遺伝子が、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するものである請求項５に記載の遺伝子。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載の遺伝子を含有してなるベクター。
【請求項８】
ベクターが発現ベクターである請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれかに記載の遺伝子を含有する遺伝子により形質転換された形質転換細胞。
【請求項１０】
細胞が、大腸菌である請求項９に記載の形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なニコチアナミン合成酵素、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有してなるベクター、及び当該遺伝子で形質転換された形質転換細胞に関する。ニコチアナミンは、鉄吸収のためのムギネ酸類の合成原料であるばかりでなく、植物体内において鉄などの２価金属と複合体を形成し、鉄などの２価金属の植物体内における輸送、代謝に関与する物質であり、ニコチアナミンは植物の生育を制御したり、強化するために有用な物質である。本発明のニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ）は、植物体内においてニコチアナミンを生合成するための触媒活性を有するものであり有用な酵素である。
【０００２】
【従来の技術】
鉄は地殻上で４番目に存在量が多い元素であり、植物のみならず全ての生物にとって必須な栄養素の一つである。しかし、好気的条件下の土壌では多くの鉄は不溶態の３価鉄Ｆｅ（ＯＨ）３となる。特に塩類集積土壌、土壌がアルカリ性となる母材が石灰岩質の土壌では、土壌中のｐＨが高く、Ｆｅ（ＯＨ）３の溶解度は著しく下がる。植物は不溶態の鉄Ｆｅ（ＯＨ）３を吸収することができないため、このような土壌で生育する植物には深刻な鉄欠乏の症状が顕われる。世界の耕地面積のうち約３分の１は潜在的な鉄欠乏発生土壌といわれている。このため植物の鉄吸収や体内での輸送、分配、代謝のメカニズムを解明し、鉄欠乏に耐性を持つ植物を創り出すことは、昨今問題になっている食料問題の解決にとって非常に重要な課題である。
【０００３】
高等植物は不溶態の３価鉄を利用するための機構を進化的に獲得してきた。植物におけるこのような鉄獲得機構は２つに大別でき、ストラテジー−Ｉ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ−Ｉ）、及びストラテジー−ＩＩ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ−ＩＩ）と呼ばれている。ストラテジー−Ｉはイネ科以外の植物に見られ、次のような特徴を持っている。まず根圏にキレート化合物を分泌し、不溶態の３価鉄を可溶化する。この３価鉄を根の細胞膜上の３価鉄還元酵素（ＦＲＯ２）で２価鉄に還元し、２価鉄トランスポーター（ＩＲＴ１）を介して２価鉄を吸収する。また、３価鉄の溶解度を上げ、３価鉄還元酵素の活性を高めるためにプロトンを放出し根圏のｐＨを下げている。一方、ストラテジー−ＩＩはイネ科植物に見られ、ムギネ酸類という化合物に特徴を持っている。イネ科植物は根からムギネ酸類を分泌し、ムギネ酸類は根圏の不溶態３価鉄をキレートし、可溶化する。植物はこの可溶化した「ムギネ酸類−３価鉄」複合体を根の「ムギネ酸類−３価鉄」トランスポーターを介して再収することにより鉄を獲得している。
【０００４】
ストラテジー−ＩＩの植物に見られるムギネ酸類はこれまでの研究により、図１に示される合成経路により生合成されることが明らかになった。
ムギネ酸類はまず、メチオニンがＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンに変換されることから合成が開始される。次にＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンが三分子重合しニコチアナミンが合成される。このステップを触媒するニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ）は、最初に１９９９年に鉄欠乏オオムギ根から酵素タンパク質が精製され、これをコードする遺伝子がクローニングされ（非特許文献１参照）、２００１年にはイネから３種類のＮＡＳ遺伝子が（非特許文献２参照）、２００３年にはトウモロコシから同じく３種類のＮＡＳ遺伝子がクローニングされた。また、ニコチアナミン以降のムギネ酸類生合成に関わる酵素であるニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）、デオキシムギネ酸合成酵素（ＤＭＡＳ）、エピヒドロキシデオキシムギネ酸合成酵素（ＩＤＳ２）、ムギネ酸合成酵素（ＩＤＳ３）の各遺伝子もオオムギからクローニングされた。ＮＡＳをはじめとするこれらの酵素の遺伝子は、植物が鉄欠乏条件にさらされると根で発現量が著しく増加し、ムギネ酸類の生合成、鉄の吸収促進に寄与している。
【０００５】
一方、ストラテジー−Ｉ植物は前述したような戦略で鉄を吸収し、ムギネ酸類は合成しない。しかし、図１に示されるニコチアナミンは、ストラテジー−ＩＩ植物だけでなくストラテジー−Ｉ植物にも存在し、体内の様々な部位にニコチアナミンが存在していることが報告されている（非特許文献３参照）。ストラテジー−Ｉ植物のタバコやトマトにおいても、ニコチアナミンがストラテジー−ＩＩ植物と同様の経路で生合成されることが明らかになっている。そのため、ニコチアナミンは、植物の体内でムギネ酸類の前駆体として以外に生理的に重要な役割を担っていると考えられている。
ストラテジー−Ｉ植物であるトマトにおいて、ニコチアナミンを合成できない変異体クロロネルバ（ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ）が知られていた。この変異体は、体内に十分な鉄を含有しているにもかかわらず、葉脈では野生型のトマトと比較して２価鉄が少なく、若い葉で葉脈間クロロシスを呈し鉄欠乏に似た症状を呈す。しかし、この変異体に外部からニコチアナミンを投与すると、この症状が回復することが確認された。ニコチアナミンは２価鉄と熱力学的に安定な複合体を形成することから、ニコチアナミンは植物体内での鉄の輸送、代謝に関与し、ニコチアナミンは植物の全体における２価鉄の維持に重要な役割を担っている（非特許文献４参照）。
また、ニコチアナミンは鉄をはじめとする２価金属と錯体を形成することができ、篩管溶液中のニコチアナミンと２価金属の濃度の関係から鉄をはじめとする２価金属の長距離輸送にも関与していると考えられている。
【０００６】
これまでのところ、ストラテジー−Ｉ植物では、トマト（非特許文献５参照）とシロイヌナズナ（非特許文献６参照）においてＮＡＳ遺伝子がクローニングされている。シロイヌナズナにはＮＡＳ遺伝子が３つ（ＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、ＡｔＮＡＳ３）存在し、それぞれが異なる部位で発現していることが確認されている（非特許文献６参照）。
また、トマトやタバコなどでは、ＮＡＳ活性は鉄欠乏で増加しておらず、ストラテジー−Ｉ植物では、ストラテジー−ＩＩ植物と異なり、ＮＡＳ遺伝子が鉄の栄養状況によって制御を受けていない可能性が考えられた。しかし、ＢＹ−２細胞を用いたシロイヌナズナのＮＡＳ遺伝子の上流解析の結果、ＡｔＮＡＳ１遺伝子が鉄欠乏に応答することが確認され、ストラテジー−Ｉ植物でも鉄の栄養状況によってＮＡＳ遺伝子の発現が変化する可能性が示された（非特許文献７参照）。
【０００７】
このように、ニコチアナミンは、ストラテジー−ＩＩ植物における鉄吸収のための役割のみならず、ストラテジー−Ｉ植物に見られるような鉄などの２価金属の植物体内における輸送、代謝などに深く関与しているものであり、ニコチアナミンの発現を制御することは植物の生育の制御などにおいて重要なことである。とりわけ、ストラテジー−Ｉ植物であるシロイヌナズナは３種類ものＮＡＳ遺伝子を持っていることが知られており、これらの各々の遺伝子がどのように機能しているかということを解明することは、植物体内における鉄などの２価金属の輸送や代謝を制御する上極めて重要なことである。
【０００８】
【非特許文献１】
ヒグチ  ケーら、（１９９９年）、プラント  フィジオロジー、１１９巻、４７１−４８０頁（Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １１９：  ４７１−４８０）
【非特許文献２】
ヒグチ  ケーら、（２００１年）、ソイル  サイエンス  プラント  ニュートリション、４７巻、３１５−３２２頁（Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１），  Ｓｏｉｌ  Ｓｃｉ
Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｔｒ．，  ４７：  ３１５−３２２）
【非特許文献３】
ウオルター  エーら、（１９９５年）、ジャーナル  プラント  ニュートリション、１８巻、１５７７−１５９３頁（Ｗａｌｔｅｒ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５），  Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｎｕ，  １８：  １５７７−１５９３）
【非特許文献４】
ヨシムラ  エーら、（２０００年）、フィトケミカル  アナリシス、１１巻、１６０−１６２頁（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｅ．，  （２０００），  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｌ  ａｎａｌ．  １１：  １６０−１６２）
【非特許文献５】
リング  エイチ  キューら、（１９９９年）、プロシーディング  ナショナルアカデミック  サイエンス、９６巻、７０９８−８１０３頁（Ｌｉｎｇ  Ｈ．  Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．．  ９６：  ７０９８−１０３）
【非特許文献６】
スズキ  ケーら、（１９９９年）、ソイル  サイエンス  プラント  ニュートリション、４５巻、９９３−１００２頁（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９），  Ｓｏｉｌ  Ｓｃｉ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｔｒ．，  ４５：  ９９３−１００２）
【非特許文献７】
スズキ  ケーら、（２００１年）、バイオサイエンス  バイオテクノロジー  バイオケミストリー、６５巻、２７９４−２７９７頁（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ．，  （２００１），  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６５：  ２７９４−２７９７）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ）及びそれをコードする遺伝子を提供する。また、本発明は、複数のニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ）を有する植物体における各々のＮＡＳの役割を解明するための手法を提供できることを目的とし、もって鉄などの２価金属の輸送や代謝などの機構の解明を促進し、植物の育成を制御する手法を提供できようにすることを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
ストラテジー−Ｉ植物であるシロイヌナズナは３種類のＮＡＳ遺伝子を有し、それぞれが異なる部位で発現していることが確認されている（非特許文献６参照）が、本発明者らは、シロイヌナズナには新たに４番目のＮＡＳ遺伝子（ＡｔＮＡＳ４）が存在することを見出した。
【００１１】
本発明は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸が欠失若しくは置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されることにより配列番号２に示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有しているアミノ酸配列を有するニコチアナミン合成酵素、より詳細にはシロイヌナズナ由来の新規なニコチアナミン合成酵素に関する。
また、本発明は、前記した本発明のニコチアナミン合成酵素をコードし得る遺伝子、それを含有してなるベクター、及び当該遺伝子を含有する遺伝子により形質転換された形質転換細胞に関する。
【００１２】
これまでにシロイヌナズナでは３種類のＮＡＳ遺伝子が報告されている（非特許文献６参照）。本発明者らは、これら３種類のＮＡＳ遺伝子の塩基配列をもとに、ＮＣＢＩ  ＢｌＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のデーターベース上で、再度Ｂｌａｓｔ検索を行った。その結果、既知の３種類の遺伝子と非常に相同性の高い遺伝子が１つ見つかったので、これをＡｔＮＡＳ４（シロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素のＮｏ．４）遺伝子とした。
本発明のＡｔＮＡＳ４は、これまでに同定された３種類のシロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素（ＡｔＮＡＳ）遺伝子（ＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、及びＡｔＮＡＳ３）と非常に高い相同性を示す遺伝子であった。そのオープンリーディングフレームの塩基配列を図２に示す。また、この塩基配列を配列表の配列番号１に示し、そのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
予想されるＡｔＮＡＳ４のアミノ酸残基は３２４残基で他の３種類のＡｔＮＡＳに比べ４残基長かった。ＡｔＮＡＳ４とシロイヌナズナの他の３種類のＡｔＮＡＳ（ＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、及びＡｔＮＡＳ３）とのアミノ酸配列の比較を図３に示す。図３のアミノ酸配列は、アミノ酸の１文字表記で示されたものであり、上の段からＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、ＡｔＮＡＳ３、及びＡｔＮＡＳ４の順で示されている。
これらのＡｔＮＡＳ相互のアミノ酸配列及び塩基配列の相同性を次の表１に示す。
【００１３】
【表１】
2004275078.tif 000002
【００１４】
ＡｔＮＡＳ４遺伝子と他の３種類のＡｔＮＡＳ遺伝子との相同性は、塩基配列で、ＡｔＮＡＳ１と６７．６％、ＡｔＮＡＳ２と６８．１％、ＡｔＮＡＳ３とは７９．２％の相同性を示した。またアミノ酸配列でも非常に高い相同性を示し、ＡｔＮＡＳ１とは６１．６％、ＡｔＮＡＳ２とは６２．６％、ＡｔＮＡＳ３とは７８．２％だった。ＡｔＮＡＳ１とＡｔＮＡＳ２はアミノ酸配列で８３．９％の相同性を示し、ともに５番染色体上にコードされていた。分子系統樹でもＡｔＮＡＳ１とＡｔＮＡＳ２は最も近い関係にある。ＡｔＮＡＳ４はＡｔＮＡＳ３とともに１番染色体上にコードされており、分子系統樹でもＡｔＮＡＳ４はＡｔＮＡＳ３と最も近い関係にあった。
図４に各種のニコチアナミン合成酵素の分子系統樹を示す。
【００１５】
次に、この遺伝子がコードするタンパク質がニコチアナミン合成酵素としての活性を有していることを検討した。
本発明のＡｔＮＡＳ４のＮＡＳ活性を測定するために、ＡｔＮＡＳ４のＣ−末端にマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を結合させた融合タンパク質（ＭＢＰ−ＡｔＮＡＳ４）としてＡｔＮＡＳ４を大腸菌内で発現させ、ＮＡＳとしての酵素活性を持っているかを調べた。ベクターコントロールとしてｐＭＡＬｃ２のみ（ＭＢＰのみ）のものと、ポジティブコントロールとしてオオムギのＮＡＳであるＨｖＮＡＳ１とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質ＭＢＰ−ＨｖＮＡＳ１を用いた（非特許文献１参照）。
結果を図５に図面に代わる写真で示す。図５の５つのレーンは、左から１４Ｃ−Ｓ−アデニシルメチオニン（１４Ｃ−ＳＡＭ）、１４Ｃ−ニコチアナミン（１４Ｃ−ＮＡ）、ＭＢＰのみ、融合タンパク質ＭＢＰ−ＨｖＮＡＳ１、及び融合タンパク質ＭＢＰ−ＡｔＮＡＳ４をそれぞれ示す。図５の左側のＮＡはニコチアナミンのバンドの位置を示し、ＳＡＭはＳ−アデニシルメチオニンのバンドの位置を示す。
この結果、ＭＢＰのみではＮＡの合成が確認されないが、ＡｔＮＡＳ４はＨｖＮＡＳ１と同じようにＳＡＭを基質としＮＡを合成していることが確認できた。
【００１６】
シロイヌナズナにはゲノム上にＡｔＮＡＳ遺伝子が４コピー（ＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、ＡｔＮＡＳ３、及びＡｔＮＡＳ４）存在し、全てのタンパク質がニコチアナミン合成酵素としての活性を持っていることになる。ＡｔＮＡＳ１、２及び３遺伝子はそれぞれ生育段階や組織間で異なる発現制御を受けていることが明らかにされており、ＡｔＮＡＳ４も他の３つの遺伝子とは異なる制御を受けていると予想される。ＡｔＮＡＳ４遺伝子の発現時期や部位を調べることにより、シロイヌナズナ植物体内のＮＡＳ遺伝子の発現様式の全貌が解明されることが期待される。
【００１７】
次に、鉄欠乏処理によるＡｔＮＡＳ１、２、３、及び４遺伝子の転写量の変化、植物体内のＮＡＳ活性の変化を検討した。
各ＡｔＮＡＳ遺伝子の転写量が鉄欠乏処理によってどのように変化しているかを定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた。結果を図６に示す。図６の（Ａ）（図６の左上側）はＡｔＮＡＳ１の場合を示し、図６の（Ｂ）（図６の右上側）はＡｔＮＡＳ２の場合を示し、図６の（Ｃ）（図６の左下側）はＡｔＮＡＳ３の場合を示し、図６の（Ｄ）（図６の右下側）はＡｔＮＡＳ４の場合を示す。図６の各グラフの縦軸は、全ＲＮＡ１μｇ中に含有される遺伝子のコピー数を示し、横軸は各々左側から、コントロール区の地上部（Ｃｏｎｔ．  Ｓｈｏｏｔ）、鉄欠乏処理区の地上部（−Ｆｅ  Ｓｈｏｏｔ）、コントロール区の根（Ｃｏｎｔ．  Ｒｏｏｔ）、鉄欠乏処理区の根（−Ｆｅ  Ｒｏｏｔ）をそれぞれ示す。
【００１８】
ＡｔＮＡＳ１遺伝子は、コントロール区の地上部、根共に発現していた。地上部では鉄欠乏処理によって発現量に大きな変化は見られなかったが、根では鉄欠乏処理によって発現が誘導され、約５倍発現量が増加していた。
ＡｔＮＡＳ２遺伝子は、コントロール区の地上部ではほとんど発現が見られなかったが、地下部においてわずかに発現が見られた。地上部では鉄欠乏処理を行っても発現量に大きな変化は見られなかったが、根では約２０倍増加した。
ＡｔＮＡＳ３遺伝子は、コントロール区の地上部で発現が見られたが、根では発現が見られなかった。鉄欠乏処理を行うと、地上部の発現量は著しく減少した。根では大きな変化はなく発現は見られなかった。
ＡｔＮＡＳ４遺伝子は、コントロール区の地上部、根共に発現していた。鉄欠乏処理によって地上部では約５倍発現量が増加していたが、根では発現量に大きな変化は見られなかった。
【００１９】
さらに、本発明者らは、植物体内におけるニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ）の活性を検討した。
シロイヌナズナの植物体内のＮＡＳ活性を測定した。活性は抽出した粗タンパク質１ｍｇあたりの酵素活性として求めた。測定は２回行った。
結果を図７に示す。図７の縦軸は、タンパク質１ｍｇあたりの酵素活性（ｐｋａｔａｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を示し、横軸は左側から、コントロール区の地上部（Ｃｏｎｔ．  Ｓｈｏｏｔ）、鉄欠乏処理区の地上部（−Ｆｅ  Ｓｈｏｏｔ）、コントロール区の根（Ｃｏｎｔ．  Ｒｏｏｔ）、鉄欠乏処理区の根（−Ｆｅ  Ｒｏｏｔ）をそれぞれ示す。
コントロール区では、地上部と根との間に活性に大きな違いは見られなかった。鉄欠乏処理を施すと地上部と根共に活性が上昇した。特に根の方が活性の増加が大きく、コントロール区に比べ約２．４倍に増加した。地上部では約１．７倍に増加した。
【００２０】
これまで双子葉植物では鉄欠乏条件によりＮＡＳの活性が増加しないことが報告されていたが、本発明で双子葉植物のシロイヌナズナにおいて初めて鉄欠乏条件によりＮＡＳの遺伝子発現、活性が増加することが示された。シロイヌナズナでは地上部、根ともに発現、活性が増加しており、シロイヌナズナにおけるＮＡＳの活性の増加は、イネ科植物における鉄吸収のためのムギネ酸類合成と異なり、鉄の輸送、分配、代謝のためと考えられる。
また、地上部では鉄欠乏処理によって子葉、成熟した本葉でＡｔＮＡＳ１遺伝子の上流部位が強く応答していた。また、本葉では維管束、葉肉細胞で強く応答していた。これは鉄欠乏のため成熟した組織の２価金属を、篩管を通して鉄の要求量の高い組織に効率良く再分配するためと考えられる。また、ＡｔＮＡＳ１遺伝子の上流部位は鉄欠乏処理によってコントロール区よりも未成熟の本葉で応答しており、本葉から茎頂分裂組織など金属の要求量のより高い組織に金属を再分配していると考えられる。ＡｔＮＡＳ４遺伝子は地上部でも恒常的に発現し、鉄欠乏によって発現が増加していた。導管を通して輸送され、葉で還元された２価鉄を維持するために、シロイヌナズナでも若い葉でＮＡＳ遺伝子が発現していると考えられ、ＡｔＮＡＳ４遺伝子がその有力な候補ではないかと考えられる。
ＡｔＮＡＳ３遺伝子は鉄欠乏処理によって発現が減少していた。ＡｔＮＡＳ１、２、及び４遺伝子は鉄欠乏処理で発現が増加しており、ＡｔＮＡＳ３遺伝子の鉄栄養に対する応答はＡｔＮＡＳ１、２、及び４遺伝子とは逆であった。また、ＡｔＮＡＳ３遺伝子はＡｔＮＡＳ１、２、４遺伝子と比べ、発現量がはるかに少ないなどの異なる特徴を持つ。ＡｔＮＡＳ３遺伝子は２価金属の再分配以外に別の役割を担っている可能性が考えられる。鉄を過剰に集積すると「ニコチアナミン−鉄」複合体は主に液胞に局在するが、これは過剰の鉄を液胞に隔離し、鉄による害を回避するためと考えられている。ＡｔＮＡＳ３遺伝子の発現量と鉄の栄養状況に正の相関関係があることから、ＡｔＮＡＳ３遺伝子は鉄過剰になるとコントロール区に比べ発現量が増加すると考えられる。
ニコチアナミンはこれまでの研究の結果、ムギネ酸類の前駆体としての役割以外に、２価金属の輸送、２価鉄の維持、過剰の鉄の無害化に関わっていると考えられている。今後この遺伝子の役割を理解できれば、植物におけるニコチアナミンの持つ生理機能、特に過剰の鉄の無害化における役割の解明につなげることができると考えられる。
【００２１】
本発明のニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ）は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するシロイヌナズナ由来のもの（ＡｔＮＡＳ４）に限定されるものではなく、同様の酵素活性を有するものであれば、その一部のアミノ酸が欠失し、若しくはその一部のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、及び／又は他のアミノ酸のいくつかが付加されたものであってもよいが、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上又は９５％以上の相同性を有しているアミノ酸配列を有するニコチアナミン合成酵素である。
また、本発明の遺伝子は、前記した本発明のニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ）をコードするものである。本発明の遺伝子としては、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。好ましい本発明の遺伝子としては、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
【００２２】
本発明は、前記した本発明の遺伝子を含有してなるベクターを提供するものでもある。本発明のベクターは、前記した本発明の遺伝子をコードする塩基配列を含有するものである。本発明のベクターは、必要により任意のプロモーターを付加してもよいし、既に用意されているプロモーター領域の下流側に本発明の遺伝子を有するものであってもよい。また、本発明のベクターは、本発明の遺伝子を含有しているものであれば、如何なる用途に使用されるものであってもよく、例えば、発現用のベクターであってもよいし、クローニング用のベクターであってもよい。
また、本発明は、本発明の遺伝子、又は本発明の遺伝子を含有する遺伝子が導入された形質転換体を提供する。導入される遺伝子は本発明の遺伝子が単独で導入されてもよいし、本発明の遺伝子に、さらに必要なプロモーター領域やシグナル領域などを付加した遺伝子として、導入することもできる。遺伝子の導入方法としては、プラスミドやファージなどを用いる公知の導入手段を採用できる。
本発明の形質転換体の宿主細胞としては、特に制限は無く動物細胞や植物細胞などを任意に選定することができる。本発明のニコチアナミン合成酵素を製造する場合には、大腸菌などを宿主細胞とすることができるし、また本発明の遺伝子を用いて他の植物を形質転換する場合にはイネやトマトなどの植物細胞を宿主細胞とすることができる。
【００２３】
本発明のＮＡＳの１種であるシロイヌナズナのＮＡＳ（ＡｔＮＡＳ４）は、鉄欠乏時において、地上部で約５倍の発現量となることから、地上部での鉄の輸送を強化したい場合に、本発明のＮＡＳ遺伝子を他の植物に導入して形質転換することにより地上部における鉄欠乏を改善することが期待される。
根における鉄吸収性の改善だけでなく、地上部における鉄輸送の改善を同時に行うことにより、アルカリ土壌などにおける植物の育成の本発明のＮＡＳは極めて有効となることが期待される。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２５】
実施例１  （ＡｔＮＡＳ４の同定）
既知のシロイヌナズナの３種類のＮＡＳ遺伝子（非特許文献６参照）の塩基配列をもとに、ＮＣＢＩ  ＢｌＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のデーターベース上で、Ｂｌａｓｔ検索を行った。その結果、既知の３種類の遺伝子と非常に相同性の高い遺伝子が１つ見つかった。これをＡｔＮＡＳ４（シロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素のＮｏ．４）遺伝子とした。そのオープンリーディングフレームの塩基配列を図２に示す。また、この塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００２６】
実施例２  （ＡｔＮＡＳ４のＮＡＳ活性の測定）
（１）  ｐＭＡＬｃ２−ＡｔＮＡＳ４のコンストラクトの作成
プライマーとして、
ＡｔＮＡＳ４  Ｆ：  ５’−ＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣ−３’
ＡｔＮＡＳ４  Ｒ：  ５’−ＣＴＧＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＡＧＧＴＡＡＧＴＴＧ−３’
を用いて、シロイヌナズナのゲノムを鋳型にしてＡｔＮＡＳ４のＯＲＦ部位をＰＣＲで増幅した。増幅断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて配列の確認を行った。配列確認後、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩでプラスミドからＡｔＮＡＳ４のＯＲＦ部位を切り出し、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで処理したｐＭＡＬｃ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に導入した。
【００２７】
（２）  ＭＢＰ−ＡｔＮＡＳ４融合タンパク質の単離
ヒグチらの方法（非特許文献１参照）に準拠して行った。前記（１）で作成したプラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換した。形質転換大腸菌をＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬ  アンピシリン）で３７℃、一晩前培養した。前培養液０．３ｍＬを３０ｍＬのＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬ  アンピシリン，１０ｍＭグルコース）に添加し、３７℃で本培養した。培養液の濁度がＡ６００≒０．５になった時点でＩＰＴＧを終濃度０．３ｍＭになるように培養液に添加した。ＩＰＴＧ添加後３７℃で２時間培養した。２時間後集菌し、５ｍＬのカラムバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，３ｍＭＤＴＴ，０．１ｍＭ  Ｅ−６４）に懸濁した。菌体を超音波粉砕器（ＵＬＴＲＡＳ．  ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＥＲ  ＴＡＩＴＥＣ）で破砕し、遠心後上清を回収した。カラムバッファーで平衡化した０．５ｍＬのアミロースカラム（Ａｍｙｌｏｓｅ  Ｒｅｓｉｎ，  ＢｉｏＬａｂｓ）に上清を添加した。カラムを５ｍＬのカラムバッファーにより洗浄した後、溶出バッファー（マルトースを１０ｍＭ含むカラムバッファー）を０．２ｍＬ、０．５ｍＬ、０．５ｍＬと３回に分けカラムに添加した。最後２回の溶出液を採取し、タンパク質が含まれていた溶出液を酵素活性の測定に用いた。タンパク質の濃度はプロテインアッセイキット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ））を用いて求めた。
【００２８】
（３）  ＭＢＰ−ＡｔＮＡＳ４融合タンパク質のＮＡＳ酵素活性の測定
前記（２）で精製したタンパク質５μｇと終濃度２０μＭになるように１４Ｃで標識したＳＡＭを５０μＬの反応バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ，３ｍＭ  ＤＴＴ，２０μｇ／ｍＬアンチパイン，０．１ｍＭ  Ｅ−６４、ｐＨ８．７）に加えた。２５℃で１５分間処理した後、１／４０容の５Ｎ塩酸を加え反応を停止した。反応溶液をＴＬＣで展開し、イメージプレート（ＢＡＳ２０００  Ｆｕｊｉｘ）に１晩露光させて活性を検出した。尚、展開溶媒の組成は、フェノール：ｎ−ブタノール：ギ酸：水が１２：３：２：３とした。
結果を図５に示す。
【００２９】
実施例３  （定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
（１）  植物材料の調整
シロイヌナズナの種子を消毒液（２％次亜塩素酸、２％Ｔｗｅｅｎ２０）に１０分間浸し、滅菌水で３回洗浄しＭＳプレートに播いた。３日間、４℃、暗所に静置したのち、２３℃１６時間明期／８時間暗期で１０日間生育させた。その後植物体を新しいＭＳプレートに植え継ぎ、さらに５日間それまでと同じ条件で生育させた物を地上部と根とに分けそれぞれ採取した。鉄欠乏処理を施す植物体は植え継ぎの際、鉄を添加していないＭＳプレートに植え継ぎ、５日間生育させたものを採取した。
【００３０】
（２）  ＲＮＡの抽出
前記（１）で採取したサンプルを液体窒素で凍結後、乳鉢内ですりつぶし、抽出バッファー（１５０ｍＭ  ＬｉＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８），５％ＳＤＳ，８０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９））に溶解した。次に、フェノール−クロロホルムによる処理を２回行った。得られた上清に終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムと１容量のイソプロパノールを入れて遠心した。沈殿物を３Ｍ塩化リチウムで溶解し１０分間氷冷した後、さらに遠心した。その沈殿物を８０％エタノールで洗浄した後、滅菌水によりＲＮＡを溶解した。保存は−８０℃で行った。
【００３１】
（３）  ＲＮＡの逆転写
前記（２）で抽出したＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（ＴａＫａＲａ）で処理した。処理後のＲＮＡ  ３μｇを逆転写酵素スーパースクリプトＩＩＲＴ（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＲＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて逆転写した。逆転写後の溶液を２０倍に希釈したものをＲＴ−ＰＣＲ用の鋳型として用いた。
【００３２】
（４）  ＲＴ−ＰＣＲ
スマートサイクラー（Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＴａＫａＲａ））を用いて測定した。使用したプライマー、ＰＣＲの条件は次の通りにした。尚、検量線はＲＴ−ＰＣＲで増幅する部位の配列を含んだプラスミドを用い作成した。
（イ）  ＡｔＮＡＳ１
プライマーの配列
ＡｔＮＡＳ１−１  ：  ５’−ＧＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡ−３’
ＡｔＮＡＳ１−２  ：  ５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＡＴＡＡＧＣＧＴＡＧ−３’
ＰＣＲの条件
９５℃で３０秒、９５℃で３０秒、４６℃で３０秒を４５サイクル。
（ロ）  ＡｔＮＡＳ２
プライマーの配列
ＡｔＮＡＳ２−１  ：  ５’−ＴＡＡＡＣＡＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＴＡＡＣ−３’
ＡｔＮＡＳ２−２  ：  ５’−ＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＣＡＡＡＣＡＴ−３’
ＰＣＲの条件
９５℃で１２０秒、９５℃で３０秒、４８℃で３０秒を４５サイクル。
（ハ）  ＡｔＮＡＳ３
プライマーの配列
ＡｔＮＡＳ３−Ｆ  ：  ５’−ＴＣＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＧ−３’
ＡｔＮＡＳ３−２  ：  ５’−ＡＡＧＡＡＣＡＡＴＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＣ−３’
ＰＣＲの条件
９５℃で１２０秒、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒を５０サイクル。
（ニ）  ＡｔＮＡＳ４
プライマーの配列
ＡｔＮＡＳ４−１  ：  ５’−ＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＴＡＴＣＧＡＧＧ−３’
ＡｔＮＡＳ４−２  ：  ５’−ＡＧＣＣＡＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＡＡＴＴＡ−３’
ＰＣＲの条件
９５℃で１２０秒、９５℃で３０秒、６５℃で３０秒を４５サイクル。
結果を図６に示す。
【００３３】
実施例４  （シロイヌナズナの植物体内のＮＡＳ活性の測定）
（１）  植物材料の調整
前記実施例３の（１）と同様の方法で栽培した植物体を用いた。
【００３４】
（２）  タンパク質の抽出
以下の操作は氷上、並びに低温条件下（４℃）で行った。
前記（１）で採取した植物体を液体窒素で凍結後、乳鉢内ですりつぶし、０．５ｇを、０．０５ｇのポリビニルピロリドンを加えた１ｍＬの抽出バッファー（０．２Ｍトリス−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，５％（ｖ／ｖ）グリセロール，０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ，１０ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  Ｅ−６４、ｐＨ８．０）に溶解した。遠心して上清を採取し、これに１／９容の硫安飽和溶液を加え再び遠心した。この上清を０．５ｍＬのカラム（ブチルトヨパール６５０Ｍ，ＴＯＳＨＯ）に流し、さらに５ｍＬの吸着バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．４Ｍ硫安，０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ，３ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０）を流した。０．３ｍＬの溶出バッファー（５％（ｖ／ｖ）グリセロール，０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ，１０ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  Ｅ−６４）を流した後、さらに１．５ｍＬの溶出バッファーを流し、この溶出液を採取した。微量試料用限外濾過ユニット（モルカットＩＩ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いてバッファーを反応バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ，３ｍＭ  ＤＴＴ，２０μｇ／ｍＬアンチパイン，０．１ｍＭ  Ｅ−６４、ｐＨ８．７）に交換した。タンパク質の濃度は、プロテインアッセイキット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用いて求めた。
【００３５】
（３）  ＮＡＳ活性の測定
前記（２）で抽出したタンパク質溶液に、終濃度２０μＭになるように１４Ｃで標識したＳＡＭを加え２５℃で１５分間処理した後、１／４０容の５Ｎ  ＨＣｌを加え反応を止めた。反応溶液をＴＬＣで展開し、イメージプレート（ＢＡＳ２０００  Ｆｕｊｉｘ）に２晩露光させて活性を検出した。尚、展開溶媒の組成は、フェノール：ｎ−ブタノール：ギ酸：水が１２：３：２：３とした。
結果を図７に示す。
【００３６】
【発明の効果】
本発明は、新規なニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ）を提供するものであり、本発明のＮＡＳは植物体内における鉄などの２価金属の輸送や代謝に深く関与していることから、植物の地上部における鉄欠乏の改善のための新規な酵素として有用とされる。また、アルカリ土壌などの鉄欠乏土壌においても生育できる植物の開発においても、植物体内における鉄などの２価金属の輸送や代謝を強化するために本発明のＮＡＳを利用することは極めて有用である。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ストラテジー−ＩＩの植物に見られるムギネ酸類の生合成の合成経路の概要を示す。
【図２】図２は、本発明のＡｔＮＡＳ４のオープンリーディングフレームの塩基配列を示す。
【図３】図３は、シロイヌナズナの４種類のニコチアナミン合成酵素（ＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、ＡｔＮＡＳ３、及びＡｔＮＡＳ４）のアミノ酸配列の比較を示したものである。図３のアミノ酸配列は、アミノ酸の１文字表記で示されたものであり、上の段からＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、ＡｔＮＡＳ３、及びＡｔＮＡＳ４の順で示されている。
【図４】図４は、各種のニコチアナミン合成酵素の分子系統樹を示す。
【図５】図５は、本発明のＡｔＮＡＳ４のＮＡＳ活性を測定した結果を示す図面に代わる写真である。図５の５つのレーンは、左から１４Ｃ−Ｓ−アデニシルメチオニン（１４Ｃ−ＳＡＭ）、１４Ｃ−ニコチアナミン（１４Ｃ−ＮＡ）、ＭＢＰのみ、融合タンパク質ＭＢＰ−ＨｖＮＡＳ１、及び融合タンパク質ＭＢＰ−ＡｔＮＡＳ４をそれぞれ示す。図５の左側のＮＡはニコチアナミンのバンドの位置を示し、ＳＡＭはＳ−アデニシルメチオニンのバンドの位置を示す。
【図６】図６は、鉄欠乏処理によるＡｔＮＡＳ１、２、３、及び４遺伝子の転写量の変化を定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた結果を示す。図６の（Ａ）（図６の左上側）はＡｔＮＡＳ１の場合を示し、図６の（Ｂ）（図６の右上側）はＡｔＮＡＳ２の場合を示し、図６の（Ｃ）（図６の左下側）はＡｔＮＡＳ３の場合を示し、図６の（Ｄ）（図６の右下側）はＡｔＮＡＳ４の場合を示す。図６の各グラフの縦軸は、全ＲＮＡ１μｇ中に含有される遺伝子のコピー数を示し、横軸は各々左側から、コントロール区の地上部（Ｃｏｎｔ．  Ｓｈｏｏｔ）、鉄欠乏処理区の地上部（−Ｆｅ  Ｓｈｏｏｔ）、コントロール区の根（Ｃｏｎｔ．  Ｒｏｏｔ）、鉄欠乏処理区の根（−Ｆｅ  Ｒｏｏｔ）をそれぞれ示す。
【図７】図７は、植物体内におけるニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ）の活性を検討した結果を示す。図７の縦軸は、タンパク質１ｍｇあたりの酵素活性（ｐｋａｔａｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を示し、横軸は左側から、コントロール区の地上部（Ｃｏｎｔ．  Ｓｈｏｏｔ）、鉄欠乏処理区の地上部（−Ｆｅ  Ｓｈｏｏｔ）、コントロール区の根（Ｃｏｎｔ．  Ｒｏｏｔ）、鉄欠乏処理区の根（−Ｆｅ  Ｒｏｏｔ）をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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