(57)【要約】【課題】物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性をより簡便に検定するための方法を提供すること。【解決手段】物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性の検定方法において、（１）細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞に、被験物質を接触させる第一工程、（２）前記培養細胞の生存率を測定する第ニ工程、（３）第ニ工程により測定された生存率と対照における生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を評価する第三工程、を有することを特徴とする検定方法等が提供可能になった。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性の検定方法において、
（１）細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞に、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記培養細胞の生存率を測定する第ニ工程、
（３）第ニ工程により測定された生存率と対照における生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を評価する第三工程、
を有することを特徴とする検定方法。
【請求項２】
物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性の検定のための試薬としての、細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性の検定方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の物質等による毒性発現の標的として、近年ミトコンドリアが注目されている。ミトコンドリアへの毒性発現機序としては、β酸化抑制や酸化的リン酸化の抑制と並んで、酸化的リン酸化の脱共役活性が古くから研究されている。このミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性の測定方法としては、従来、実験動物等から採取した組織よりミトコンドリアを単離したのち、当該ミトコンドリアに被験物質を接触させながら、グルタミン酸やコハク酸等の特定の呼吸基質存在下で、かつＡＤＰ非存在下における反応液中の溶存酸素濃度を測定し、単位時間当りの溶存酸素量の減少速度を促進させるかどうかを指標として、前記物質のミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性が評価されるような方法が知られている。（例えば、非特許文献１参照）
【０００３】
【非特許文献１】
生化学実験講座１２、日本生化学会編、東京化学同人、ｐ．２８４−２８８、１９７４
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、単離されたミトコンドリアは長期間保存ができず、測定日毎に組織等からミトコンドリアを調製する必要があること、調製されたミトコンドリアの呼吸活性がミトコンドリアを単離する毎に変動するため、異なる実験日間で得られたデータ同士の比較が困難な場合があった。
【０００６】
さらには溶存酸素濃度の測定に用いる酸素電極が一般に普及していないこと、得られた測定結果（記録計からの記録紙）を定量化するために記録紙からの数値読み取り等の手作業が必要であること、また１検体ずつ手作業による測定のため多検体を１度に処理できない等の問題点があった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは、物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性をより簡便に検定するための方法について種々鋭意検討した結果、細胞内に存在する還元型グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）を枯渇させた培養細胞に、ミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を有する物質を接触させると、当該培養細胞の生存率が増加することを見出し、本発明に至った。
【０００８】
即ち、本発明は、
１．物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性の検定方法において、
（１）細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞（以下、本培養細胞と記載することもある。）に、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記培養細胞の生存率を測定する第ニ工程、
（３）第ニ工程により測定された生存率と対照における生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を評価する第三工程、
を有することを特徴とする検定方法（以下、本発明方法と記載することもある。）；
２．物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性の検定のための試薬としての、細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞の使用；等を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法において用いられる培養細胞としては、いわゆる”ロー０（ρ０）細胞”（ミトコンドリアゲノムＤＮＡを欠く細胞）を除けば特に限定されるものではなく、例えば、種々の初代培養細胞や株化細胞等の培養細胞の細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞をあげることができる。
また培養細胞の細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させる方法としては、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７３，１１２−１１９，１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３５，７５６−７６４，２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５９，８３７−８４３，２００１等に記載されるような公知な方法をあげることができる。具体的には、例えば、上記のような培養細胞を５０μＭ〜５００μＭ程度のブチオニンスルホキシイミン（Ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ：以下、ＢＳＯと記すこともある。）で４時間〜３日間程度処理することにより、細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞を調製することができる。
【００１０】
本発明検定方法の第一工程は、細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞（即ち、本培養細胞）と被験物質とを接触させればよい。
本培養細胞と被験物質との接触時間として、例えば、１時間以上を、好ましくは１時間以上３日間以内をあげることができる。当該接触系における保温温度としては、例えば、２０℃〜５０℃を、好ましくは３０℃〜４０℃をあげることができる。
【００１１】
尚、当該工程において、細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞（即ち、本培養細胞）を調製するための処理と、本培養細胞と被験物質とを接触させるための処理とを同時に行うこともできる。
【００１２】
本発明検定方法の第一工程における被験物質の濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１０ｍＭで、好ましくは０．１μＭ〜５ｍＭである。
【００１３】
本発明方法の第二工程において前記培養細胞の生存率を測定するには、例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，４１，１１１８−１１２２，１９９３等に記載されるような公知な方法をあげることができる。具体的には、ＷＳＴ−１を用いた方法等を使用することができ、具体的には、まず市販のキット（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ、  同仁化学社製））のＡ液及びＢ液を使用時に混合したのち、当該混合液を各種培養液と１：９の割合で混合する。次いで、このようにして得られた混合液を培養細胞に添加したのち、１時間〜４時間程度培養する。培養後、４５０ｎｍの吸光度（参照波長６５０ｎｍ）を測定し、例えば下記の計算式に従って生存率を求めることができる。
生存率（％）＝｛被験物質における吸光度−ブランク（本培養細胞を含まない条件）における吸光度｝×１００／｛対照（ネガティブコントロール）における吸光度−ブランク（本培養細胞を含まない条件）における吸光度｝
【００１４】
尚、細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞において、ミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を有する物質を接触させると、当該培養細胞の生存率が増加するのかについては、その作用機構自体は明らかではない。
【００１５】
本発明方法の第三工程において、上記のようにして測定された生存率と対照における生存率（即ち、基準物質、ネガティブコントロール等）における生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を評価する。この場合、被験物質における生存率が対照（基準物質）における生存率よりも高い値であれば、当該被験物質は当該基準物質よりもミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性が高いと評価する。すなわち、当該被験物質は当該基準物質よりもミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性化物質として優れていることになる。このようにして被験物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性の検定（本発明検定方法）を行うことができる。
本発明検定方法において、測定された活性と対照における活性とを比較する場合には、異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質がミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を有さない物質（例えば、溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等のネガティブコントロールであってもよい。）とすることで、他方の被験物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を評価してもよいし、また前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質（例えば、基準物質）が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を基準としながら他方の被験物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を評価してもよい。もちろん両者で評価してもよい。
【００１６】
より具体的には、例えば、下記の式に従って生存率に係る増加率を求めるとよい。
生存率に係る増加率（％）＝被験物質における生存率×１００／対照（ネガティブコントロール）における生存率
そして算出された増加率によりミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を評価すればよい。
【００１７】
例えば、対照としてネガティブコントロールを用いた場合には、ミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を評価するための指標となる生存率に係る増加率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、上記の式における生存率に係る増加率が３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、ミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を有する物質として選抜する。
【００１８】
ミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性化物質を探索するには、本発明検定方法により評価されたミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性に基づきミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を有する物質を選抜すればよい。尚、当該物質は、ミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を有する限り、低分子化合物、蛋白質又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
【００１９】
本発明の細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞は、上記のように、ミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を検定するための試薬として使用することができる。
【００２０】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例はこれらの例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
日本チャールスリバー（株）より購入したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄ラット（６週齢）を使用し、ペントバルビタール麻酔下で肝門脈より、図説  動物実験の手技手法、共立出版、ｐ．５７−６３、１９８１に記載される通常の方法に従い、コラゲナーゼ還流を行うことにより、肝組織を消化した。消化された肝組織を回収し、当該組織を下記の培養液（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅに下記添加物を添加したもの）２０ｍｌ中でハサミによる細切及びピペッティングを行なうことにより肝細胞懸濁液を調製した。調製された肝細胞懸濁液を低速遠心（１００×ｇ、１分間）し、その沈殿を再度２０ｍｌの下記培養液に懸濁した。前記の低速遠心を３回繰り返して回収された肝細胞を下記培養液中に再度懸濁し、当該懸濁液をＴｙｐｅ  Ｉ  コラーゲンコート済み９６ウエルプレート（Ｉｗａｋｉ）に撒き（１×１０５ｃｅｌｌ／ｃｍ２）、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて４時間培養した。
【００２２】
培養液
Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ：５％  （ｖ／ｖ）
ペニシリン：１００ＩＵ
ストレプトマイシン：１００μｇ／ｍＬ
グルタミン：２ｍＭ
インスリン：１×１０−７Ｍ
デキサメタゾン：１０−６Ｍ
ニコチンアミド：１０ｍＭ
アスコルビン酸：０．２ｍＭ
【００２３】
その後、培養液を交換し、さらに１晩培養することにより培養細胞を調製した。
次に、ブチオニンスルホキシイミン（ＢＳＯ）を２００μＭ又は４００μＭ含有する培養液（細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞を用いる試験系において用いられる培養液）、或いは、ＢＳＯを含有しない培養液（細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させていない培養細胞を用いる比較試験系において用いられる培養液）に、ミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を有するジニトロフェノール（ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）を０μＭ〜１００μＭの濃度で添加した。
このようにして調製された培養液を、上記のようにして調製された培養細胞に添加し、さらに３日間培養を続けることにより、培養細胞に前記被験物質を接触させた。
培養終了後、当該培養細胞の生存率を、市販のキット（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ、  同仁化学社製））を用いて、当該キットに添付される説明書に従い、測定した。その結果を図１に示した。
図１から明らかなように、細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞を用いる試験系では、細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させていない培養細胞を用いる比較試験系と比較して、培養細胞の生存率が低下した。
次いで、そこにミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を有するジニトロフェノールを添加することにより、培養細胞に前記被験物質を接触させた結果、前記被験物質の濃度に依存して培養細胞の生存率が増加することが確認された。
【００２４】
【発明の効果】
本発明により、物質が有するミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性をより簡便に検定するための方法が提供可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞を用いる試験系、及び、細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させていない培養細胞を用いる比較試験系において、ミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役活性を有するジニトロフェノールを添加することにより、培養細胞に前記被験物質を接触させる実験での培養細胞の生存率を示す図である。図中の黒丸（●）は細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させていない培養細胞を用いる比較試験系を表し、黒三角（▲）及びバツ（×）は細胞内に存在する還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞を用いる試験系を表している。尚、黒三角（▲）では、ブチオニンスルホキシイミン（ＢＳＯ）を２００μＭ含有する培養液を用いて還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞を調製した試験系を表してあり、またバツ（×）では、ブチオニンスルホキシイミン（ＢＳＯ）を４００μＭ含有する培養液を用いて還元型グルタチオンを枯渇させた培養細胞を調製した試験系を表している。
【図１】
2004261142.tif 000002