(57)【要約】【課題】感度および特異性に優れかつ迅速なクラミジア・トラコマティスの検出方法を提供する。【解決手段】試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することを含む、クラミジア・トラコマティスの検出方法であって、ＰＣＲで用いるプライマーペアを、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を高く設定できる特定の領域に設定する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することを含む、クラミジア・トラコマティスの検出方法であって、ＰＣＲで用いられるプライマーペアが、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号５１５７〜５２０１および５２４５〜５２７６に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、かつ両領域間の塩基配列を増幅できるように設定されている前記方法。
【請求項２】
プライマーペアが、配列番号２、３または４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号５または６に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチドからなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマーペアが、配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号５に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチド、または、配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチドからなる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行うことによるクラミジア・トラコマティスの検出用のキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号５１５７〜５２０１および５２４５〜５２７６に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、かつ、両領域間の塩基配列を増幅できるように設定されたプライマーペアを含む前記キット。
【請求項５】
プライマーペアが、配列番号２、３または４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号５または６に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチドからなる請求項４に記載のキット。
【請求項６】
プライマーペアが、配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号５に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチド、または、配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチドからなる請求項５に記載のキット。
【請求項７】
配列番号１に示す塩基配列の塩基番号５２１０〜５２４５に相当する領域の塩基配列に基づいて設定されたオリゴヌクレオチドと、標識とを含むハイブリダイゼーションプローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出方法および検出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジア・トラコマティスは、非淋菌性尿道炎の病原体の一つであり、その検出方法としては、クラミジア・トラコマティスの菌内に複数コピー存在する潜在プラスミドの一部配列を遺伝子増幅法により増幅し、増幅産物を検出する方法が知られている（特許文献１、特許文献２）。
【０００３】
【特許文献１】
特許第２７１９２２５号公報
【特許文献２】
特許第３１２７１３５号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、感度および特異性に優れかつ迅速なクラミジア・トラコマティスの検出方法およびそのためのキットを提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミドｐＬＧＶ４４０の特定の領域にプライマーを設定してＰＣＲを行うと、クラミジア・トラコマティスの検出を迅速に実施できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することを含む、クラミジア・トラコマティスの検出方法であって、ＰＣＲで用いられるプライマーペアが、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号５１５７〜５２０１および５２４５〜５２７６に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、かつ両領域間の塩基配列を増幅できるように設定されている前記方法（本発明検出方法）を提供する。
【０００７】
また、本発明は、本発明方法のためのキット、すなわち、試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行うことによるクラミジア・トラコマティスの検出用のキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号５１５７〜５２０１および５２４５〜５２７６に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、かつ、両領域間の塩基配列を増幅できるように設定されたプライマーペアを含む前記キット（本発明検出キット）を提供する。
【０００８】
本発明において、プライマーペアは、好ましくは、配列番号２、３または４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号５または６に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチドからなり、さらに好ましくは、プライマーペアが、配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号５に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチド、または、配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチドからなる。
【０００９】
また、本発明は、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号５２１０〜５２４５に相当する領域の塩基配列に基づいて設定されたオリゴヌクレオチドと、標識とを含むハイブリダイゼーションプローブを提供する。
【００１０】
なお、配列番号１に示す塩基配列は、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミドｐＬＧＶ４４０の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０６７０７）であり、当業者であれば、ｐＬＧＶ４４０に変異を有する株についても、個体間等に存在し得る塩基配列の相違を考慮して、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号により特定された領域に相当する領域を容易に特定・認識することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明検出方法
本発明検出方法は、試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することを含む、クラミジア・トラコマティスの検出方法であり、ＰＣＲで用いられるプライマーペアが、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号５１５７〜５２０１および５２４５〜５２７６に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、かつ両領域間の塩基配列を増幅できるように設定されていることを特徴とする。
【００１２】
試料は、クラミジア・トラコマティスを含むか又は含む可能性があるものであれば特に限定されない。例としては、初尿、尿道スワブ、頚管スワブ等を挙げることができる。これらの試料から、クラミジア・トラコマティスの潜在的プラスミドを含むＤＮＡが調製される条件での通常の方法によりＤＮＡを得ることができる。
【００１３】
本発明検出方法におけるＰＣＲは、試料から得られるＤＮＡを鋳型とし、特定のプライマーペアを使用する他は、通常の、ＰＣＲの方法に従って行うことができる。
【００１４】
本発明において用いられるプライマーペアは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号５１５７〜５２０１に相当する領域（第１領域）および５２４５〜５２７６に相当する領域（第２領域）の塩基配列に基づいて設定され、かつ両領域間の塩基配列を増幅できるように設定される。
【００１５】
プライマーの長さは、通常には、１０〜４０塩基である。また、プライマーの各領域内の位置および長さは、ＰＣＲのアニーリング温度を比較的高く設定できるように、Ｔｍ値が５５〜７０℃となるように設定することが好ましい。ここで、Ｔｍ値は最近接塩基対法による算出値である。プライマーペアを構成する各プライマーは、Ｔｍ値がほぼ同一となるように設定することが好ましい。
【００１６】
プライマーの具体例としては、第１領域に設定されるものとして、配列番号２に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号５１５７〜５１８５に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマー、配列番号３に示す塩基配列に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号５１７１〜５２０１に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマー、および、配列番号４に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号５１７１〜５１９６に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマー、第２領域に設定されるものとして、配列番号６に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号５２７６〜５２５２に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマー、および、配列番号７に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号５２７６〜５２４６に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００１７】
プライマーペアは、両領域間の塩基配列を増幅できるように、すなわち、一方がセンスプライマーとなり他方がアンチセンスプライマーとなるように設定される。潜在プラスミドは環状であるため、両領域間の塩基配列は２つあるが、通常には短い方の塩基配列が増幅されるように設定される。例えば、第１領域にセンスプライマーが設定された場合は、第２領域にアンチセンスプライマーが設定され、逆に第１領域にアンチセンスプライマーが設定された場合は、第２領域にセンスプライマーが設定される。
【００１８】
好ましいプライマーペアとしては、好ましくは、配列番号２、３または４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号５または６に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。また、さらに好ましいプライマーペアとしては、配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号５に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチドの組み合わせ、ならびに、配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を示すオリゴヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。
【００１９】
上記の特定の領域におけるプライマーペアの設定は、ＰＣＲの条件を考慮して当業者に公知の方法に従って行えばよい。プライマーペアの設定は、プライマー設定用のコンピュータープログラムに基づいて行うことができる。
【００２０】
プライマーは、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの一方又は両方について、複数のプライマーを混合したミックスプライマーとして設定してもよい。プライマー設定部分に塩基の変異が存在する場合には、ミックスプライマーを用いることで検出効率を上げることができる。
【００２１】
ＰＣＲの条件は、通常の、ＰＣＲの方法に従って設定すればよいが、上記の特定のプライマーペアが使用されるため、アニーリング温度が比較的高く設定されることになる。通常には、アニーリング温度は５０から７０℃である。アニーリング温度が比較的高いため、アニーリングと伸長を同一の条件で行う２ステップＰＣＲの条件を設定してもよい。
【００２２】
代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
【００２３】
ＤＮＡ断片                  １分子以上
プライマー                      １００〜２０００ｎＭ
ヌクレオチド              各１００〜５００μＭ
ＤＮＡポリメラーゼ                ０．２５〜１．２５単位／μｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７〜９）            １〜５ｍＭ
ＭｇＣｌ２                    １．５〜５ｍＭ
界面活性剤またはゼラチン    ０〜２５％
（最終液量：２５〜１００μｌ）
【００２４】
また、代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常３０〜６０回繰り返す。
【００２５】
（１）  変性、９０〜９５℃、１〜６０秒
（２）  アニーリング、５５〜７０℃、６〜６０秒
（３）  伸長、７２〜７５℃、６〜６０秒
【００２６】
２ステップＰＣＲの代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常３０〜６０回繰り返す。
【００２７】
（１）  変性、９０〜９５℃、１〜６０秒
（２）  アニーリング及び伸長、５５〜７０℃、６〜６０秒
【００２８】
本発明検出方法における増幅産物の検出は、通常の、増幅産物の検出方法に従って行うことができる。例えば、増幅産物をアガロースゲル電気泳動に付して検出してもよいし、増幅産物に結合して蛍光が変化する物質（例えば、二本鎖ＤＮＡに結合し、結合により蛍光強度が変化する蛍光色素、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、ハイブリダイズしたときに蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）等により蛍光強度が変化するように設計されたハイブリダイゼーションプローブ等）の存在下でＰＣＲを行って蛍光を測定するリアルタイムＰＣＲにより検出を行ってもよい。
【００２９】
本発明検出方法によれば、特定された領域では、Ｔｍ値が比較的高いプライマーを設定できるため、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を比較的高くすることができ、従って、変性温度からアニーリング温度まで下げる時間が減少する。また、高いアニーリング温度により非特異的増幅も軽減する。さらに、アニーリング及び伸長を同じ条件で行う２ステップＰＣＲを行うことも可能である。結果として、より迅速な遺伝子増幅が可能となる。
【００３０】
本発明は、ハイブリダイゼーションによる検出に用いるのに適したハイブリダイゼーションプローブも提供する。このようなハイブリダイゼーションプローブとしては、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号５２１０〜５２４５に相当する領域の塩基配列に基づいて設定されたオリゴヌクレオチドと、標識とを含むものが挙げられる。このオリゴヌクレオチドは、センス鎖に相補的であってもよいし、アンチセンス鎖に相補的なものであってもよい。
【００３１】
ハイブリダイゼーションプローブのオリゴヌクレオチドの鎖長やＴｍ値は、ハイブリダイズさせるときの条件に応じて適宜設定される。このオリゴヌクレオチドの長さは、通常には、２５〜４５塩基であり、Ｔｍ値は、通常には、５０〜７０℃である。ハイブリダイゼーションプローブがリアルタイムＰＣＲに用いるものである場合には、オリゴヌクレオチドのＴｍ値は、プライマーより標的配列に先にハイブリダイズするように、プライマーのＴｍ値に比べて、２〜５℃高くなるように設定することが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号７に示す塩基配列を有するものが挙げられる。
【００３２】
ハイブリダイゼーションプローブの標識は、ハイブリダイズさせるときの条件でのハイブリダイゼーションを妨げないような様式で行うことができる。リアルタイムＰＣＲ用のハイブリダイゼーションプローブの標識は、それが一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしたときに蛍光強度が変化するような態様でされることが好ましい。
【００３３】
本発明の検出方法においては、本発明のハイブリダイゼーションプローブを用いる検出方法により増幅産物の検出を行うことが好ましい。
【００３４】
＜２＞本発明検出キット
本発明検出キットは、本発明検出方法に用いることのできるキット、すなわち、試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行うことによるクラミジア・トラコマティスの検出用のキットであり、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号５１５７〜５２０１および５２４５〜５２７６に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、かつ、両領域間の塩基配列を増幅できるように設定されたプライマーペアを含むことを特徴とする。
【００３５】
プライマーペアについては、本発明検出方法に関し、上記に説明した通りである。
【００３６】
本発明キットにおいてプライマーペアは、混合物とされていてもよいし、別個に収容されていてもよい。
【００３７】
本発明キットは、プライマーペアの他に、ＰＣＲおよび／または増幅産物の検出を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。このような試薬類の例には、上記のハイブリダイゼーションプライマーも含まれる。
【００３８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００３９】
【実施例１】ＰＣＲによる検出
クラミジア・トラコマティス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０６７０７）の潜在プラスミドの塩基配列（配列番号１）の第１の領域（塩基番号５１５７〜５２０１）および第２の領域（塩基番号５２４５〜５２７６）において、ＧＣ含量に富み（４８−５５％）、高いＴｍ値を有する（６３−６５℃（最近接塩基対法により算出））塩基配列を選択した。すなわち、４種類の上流プライマー（配列番号：３、４、６）および３種類の下流プライマー（配列番号：５、７）の標的結合配列を選択した。そしてこれらの標的結合配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成した。
【００４０】
【表１】
上流（フォワード）プライマー：
ＣＴ−Ｆ５１５７−２９：  ｃａｇ  ｔｃａ  ｃａｃ  ｃｃａ  ａａａ  ｇｃｔ  ｃｔｇ  ｇｇａ  ｇｃａ  ｔｇ（配列番号２）
ＣＴ−Ｆ５１７１−３１：  ａｇｃ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ａｇｃ  ａｔｇ  ｔｔｃ  ｔｔａ  ｇｔｃ  ｔｃａ  ｇｃａ  ｇ（配列番号３）
ＣＴ−Ｆ５１７１−２６：  ａｇｃ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ａｇｃ  ａｔｇ  ｔｔｃ  ｔｔａ  ｇｔｃ  ｔｃ（配列番号４）
下流（リバース）プライマー：
ＣＴ−Ｒ５２７６−２５：  ｔｃｇ  ｃｇｔ  ａｇｇ  ｇｃｔ  ｔａｇ  ａａｔ  ｃａｃ  ｃｔｔ  ｃ（配列番号５）
ＣＴ−Ｒ５２７６−３１：  ｔｃｇ  ｃｇｔ  ａｇｇ  ｇｃｔ  ｔａｇ  ａａｔ  ｃａｃ  ｃｔｔ  ｃｔｃ  ｇｔａ  ｃ（配列番号６）
【００４１】
上記の上流および下流増幅プライマーの３対の組み合わせ（配列番号：２−５、３−５および４−６）をＰＣＲに用いた。反応液２５μＬは、１×ＧｅｎｅＴａｑバッファー、０．６２５ＵのＧｅｎｅＴａｑポリメラーゼ（ニッポンジーン）、各０．２ｍＭのｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＡＴＰ，  ｄＵＴＰ、各０．５μＭの上流および下流プライマー、およびクラミジア・トラコマティス菌体ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ株ＣＴ−ＶＲ８７８）２〜２０００コピーを含んだ。適切な反応温度を検討するため、増幅反応はｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてアニーリング温度にグラジエント機能を適用し、ＰＣＲを行った。反応温度は次の通りであった。９５℃４分、（９５℃３０秒、６２−７２℃グラジエント３０秒、７２℃３０秒）×５０サイクル、７２℃７分。増幅の有無は、生成物を３％アガロースゲル電気泳動にかけることにより確認を行った。
【００４２】
どのプライマーペアを用いた場合も、アニーリング温度が６４．０−６８．２℃の比較的高温の条件下で、クラミジア・トラコマティス菌体ゲノムＤＮＡ２コピーを検出可能であった。
【００４３】
以上の結果から、上記プライマー配列は、感度および特異性に優れ、反応時間短縮にも有効であることが示された。
【００４４】
【実施例２】２ステップＰＣＲを用いる検出
実施例１で用いたプライマーペアのうち、配列番号３−５および４−６のプライマーペアを２ステップＰＣＲに用いた。反応液２５μＬは、１×ΔＴｔｈバッファー、０．６２５ＵのΔＴｔｈ（ＴＯＹＯＢＯ）、各０．２ｍＭのｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＡＴＰ，  ｄＵＴＰ、各０．５μＭの上流および下流プライマー、およびクラミジア・トラコマティス菌体ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ株ＣＴ−ＶＲ８７８）２〜２０００コピーを含んだ。反応温度は次の通りであった。９５℃１分、（９５℃１５秒、６５℃または６８℃２０秒）×２サイクル、（９０℃１５秒、６５℃または６８℃２０秒）×５８サイクル。サーマルサイクラー（ＴａＫａＲａ）で反応を行った。増幅の有無は、生成物を３％アガロースゲル電気泳動にかけることにより確認を行った。
【００４５】
配列番号：４−５のプライマーペアについては、アニーリング温度６８℃でクラミジア・トラコマティス菌体ゲノムＤＮＡ２コピーを検出可能であった。配列番号：６−７のプライマーペアについては、アニーリング温度６５℃でクラミジア・トラコマティス菌体ゲノムＤＮＡ２コピーを検出可能であった。
【００４６】
以上の結果から、さらに反応時間の短縮が可能な２ステップＰＣＲを行うことができることが示された。
【００４７】
【実施例３】リアルタイムＰＣＲを用いる検出
実施例１で用いたプライマーペアのうち配列番号３−５のプライマーペアを２ステップＰＣＲに用いた。反応液２５μＬは、１×ΔＴｔｈバッファー、０．６２５ＵのΔＴｔｈ（ＴＯＹＯＢＯ）、各０．２ｍＭのｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＵＴＰ、１μＭの上流プライマ−、０．５μＭの下流プライマー、０．２μＭリアルタイム検出用プローブ（５ＦＬ−ＣＴ−５２１０−３６：  ５’−ｃａａ  ａｇｃ  ｔａｇ  ａａｃ  ａａｃ  ｇｃｃ  ｇｃｃ  ｔｔｃ  ｃａｔ  ｔｃｔ  ｔｇａ  ｔｇｃ−３’（配列番号７）、５’末端のｃを蛍光色素で標識。標識の種類：ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ（モレキュラープローブ社））、及びクラミジア・トラコマティス菌体ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ株ＣＴ−ＶＲ８７８）２〜２０００コピーを含んだ。反応温度は次の通りであった。９５℃１分、（９５℃１５秒、６５℃２０秒）×２サイクル、（９０℃１５秒、６５℃２０秒）×５８サイクル。ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で反応を行った。リアルタイム検出手法は特開２００１−２８６３００号に記載の方法に従った。
【００４８】
結果を図１に示す。本実施例で用いたプライマーペアではアニーリング温度６５℃でクラミジア・トラコマティス菌体ゲノムＤＮＡ２コピーをリアルタイムで検出可能であった。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、感度および特異性に優れかつ迅速なクラミジア・トラコマティスの検出方法が提供される。
【００５０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】増幅産物の生成の経過（リアルタイムＰＣＲの検出結果）を示す。ａ：コピー無し、ｂ：２コピー、ｃ：２０コピー、ｄ：２００コピー、ｅ：２０００コピー。
【図１】
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