(57)【要約】【課題】細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される腫瘍抗原を見い出すこと。【解決手段】ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ａ３３の少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ拘束性にＣＴＬにより認識されるペプチドまたはポリペプチド、これらの１つをコードする塩基配列またはその相補的配列を含んでなるポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、ペプチドまたはポリペプチドに対する抗体、ペプチドまたはポリペプチドのＣＴＬによる認識を増強する化合物、ペプチドまたはポリペプチドの発現を促進する化合物、ペプチドおよび／またはポリペプチドからなるＣＴＬ誘導剤、これらの１種以上を含む医薬組成物、ペプチドおよび／またはポリペプチドを用いるＣＴＬ誘導方法、ペプチドまたはポリペプチドの製造方法、化合物のスクリーニング方法、これらの測定方法、並びにスクリーニング方法または測定方法に使用する試薬キット。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなり１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチド。
【請求項３】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａが、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３からなる群から選ばれるＨＬＡ−Ａである請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド並びに配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなり１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチドからなる群から選ばれる１つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチドからなる医薬。
【請求項５】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａが、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３からなる群から選ばれるＨＬＡ−Ａである請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド並びに配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなり１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチドからなる群から選ばれる１つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチドを含有する癌ワクチン。
【請求項７】
ＨＬＡ表現型がＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａである癌に用いる請求項６に記載の癌ワクチン。
【請求項８】
癌が前立腺癌、大腸癌、胃癌、子宮頚癌、乳癌、肺癌、食道癌、膀胱癌またはメラノーマである請求項７に記載の癌ワクチン。
【請求項９】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる１つ以上のＨＬＡ−Ａである請求項６から８のいずれか１項に記載の癌ワクチン。
【請求項１０】
配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドより選ばれる１つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチドを含有する、１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項１１】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである請求項１０に記載の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項１２】
配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選ばれる１つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチドを使用することを特徴とする、１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項１３】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである請求項１２に記載の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項１４】
配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列またはその相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなり１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列表の配列番号１５から配列番号１９のいずれか１に記載の塩基配列であって、該塩基配列がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドが１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるものである塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである請求項１５または１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１４から１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１４から１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項２０】
組換えベクターが発現組換えベクターである請求項１９に記載の組換えベクター。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項２２】
請求項２０に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のペプチドまたは請求項２若しくは３に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項２４】
請求項１に記載のペプチドおよび／または請求項２若しくは３に記載のポリペプチドの少なくとも１つに対する、１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、および／または請求項１４から１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、請求項１に記載のペプチド、請求項２または３に記載のポリペプチド、請求項１４から１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１９または２０に記載の組換えベクター、請求項２１に記載の形質転換体、または請求項２３に記載の抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２５】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載のスクリーニング方法により得られた化合物。
【請求項２７】
請求項１に記載のペプチドまたは請求項２若しくは３に記載のポリペプチドの少なくとも１つに対する、１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、または請求項１４から１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を増強する化合物。
【請求項２８】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
請求項１に記載のペプチド、請求項２または３に記載のポリペプチド、請求項１４から１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１９または２０に記載の組換えベクター、請求項２１に記載の形質転換体、または請求項２３に記載の抗体、または請求項２６から２８のいずれか１項に記載の化合物のうちの少なくとも１つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物。
【請求項３０】
癌治療が、ＨＬＡ表現型がＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａである癌に対する癌治療である請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
癌が前立腺癌、大腸癌、胃癌、子宮頚癌、乳癌、肺癌、食道癌、膀胱癌またはメラノーマである請求項２９から３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１に記載のペプチド、請求項２または３に記載のポリペプチド、または請求項１４から１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの定量的あるいは定性的な測定方法。
【請求項３４】
請求項１に記載のペプチド、請求項２または３に記載のポリペプチド、請求項１４から１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１９または２０に記載の組換えベクター、または請求項２３に記載の抗体の少なくとも１つ以上を含んでなる試薬キット。
【請求項３５】
請求項２４若しくは２５に記載のスクリーニング方法または請求項２７に記載の測定方法に使用する試薬キットであって、請求項１に記載のペプチド、請求項２または３に記載のポリペプチド、請求項１４から１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１９または２０に記載の組換えベクター、または請求項２３に記載の抗体の少なくとも１つ以上を含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は腫瘍抗原に関し、さらに詳しくはＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ、例えばＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ａ３３の少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドまたは該ペプチドを含むポリペプチドに関する。また、該ペプチドまたは該ポリペプチドの１つ以上を含む医薬、癌ワクチンおよび細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤に関する。さらに、該ペプチドまたは該ポリペプチドの１つ以上を用いる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に関する。さらにまた、該ペプチドまたは該ポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体に関する。また、該ペプチドおよび／または該ポリペプチドに対する抗体、該ペプチドまたは該ポリペプチドの細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、および該ポリヌクレオチドの発現を促進する化合物に関する。さらに、該ペプチド、該ポリペプチド、該ポリヌクレオチド、該組換えベクター、該形質転換体、該抗体および該化合物から選ばれる少なくとも１つを含む医薬組成物または試薬キットに関する。さらにまた、該ペプチドまたは該ポリペプチドの製造方法、該化合物のスクリーニング方法、該ペプチドまたは該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体における癌の排除には免疫系、特に細胞性免疫に係る細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；以下、ＣＴＬと略称することもある。）が重要な役割を果たしている。癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤が認められている（非特許文献１）。この腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的分子（腫瘍抗原）は、メラノーマにおいて初めて発見された。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて８個乃至１１個のアミノ酸からなるペプチド（腫瘍抗原ペプチド）になり、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡと腫瘍抗原ペプチドとからなる複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡ拘束性に腫瘍細胞を認識する。
【０００３】
ＨＬＡは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。ＨＬＡはクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原に大別されるが、細胞傷害性Ｔ細胞により抗原ペプチドと共に認識されるＨＬＡはクラスＩ抗原である。ＨＬＡクラスＩ抗原はさらにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ等に分類され、ヒトでは有核細胞がそれぞれ異なった量のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃを有する。また、その遺伝子は多型性に富むことが報告されている。例えば、ＨＬＡ−ＡにはＡ１、Ａ２、Ａ２４、Ａ２６、およびＡ３１等の、ＨＬＡ−ＢにはＢ８、Ｂ２７、およびＢ４６等の、ＨＬＡ−ＣにはＣｗ３やＣｗ６等の多型が存在する。そのため、それぞれの個体が有するＨＬＡの型は必ずしも同一ではない。ＨＬＡ−Ａ亜領域の多型の１つであるＨＬＡ−Ａ３１対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は、ブラジルインディアン（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ　Ａｍｅｒｉｎｄｓ）の約６５％、アメリカインディアンの約６０％、モンゴル人の約２０％、日本人の約１２．５％、中国人、韓国人およびブラジル人の約１０％、並びに白人（Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ）およびラテンアメリカ人（Ｈｉｓｐａｎｉｃｓ）の約５％において発現している（非特許文献２−４）。
【０００４】
細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡクラスＩ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識するとき、ＨＬＡの型をも認識する。また、ＨＬＡ分子と結合する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列には、ＨＬＡの型により異なるモチーフ（規則的配列）が存在することが知られている。
【０００５】
近年、腫瘍拒絶抗原遺伝子およびＴ細胞抗原受容体等の特異免疫に関与する分子が、メラノーマ、食道癌およびその他の癌で同定されており、進行癌または転移性癌においてペプチドによる特異的免疫療法が検討されている（非特許文献５−１０）。例えば欧米では、腫瘍抗原投与により癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法の開発がなされつつあり、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原ｇｐ１００ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、インターロイキン−２を静脈内投与することにより、４２％の患者で腫瘍の縮小が認められている（非特許文献１１）。このように腫瘍抗原は、癌ワクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。
【０００６】
しかしながら、癌の多様性を考えると、一種類の腫瘍抗原からなる癌ワクチンを用いて全ての癌を治療することは不可能である。実際、複数ペプチドを用いた免疫療法（ｍｕｌｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ　ｂａｓｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）が、癌治療において有効であることが報告されている（非特許文献１２−１４）。また、癌細胞の種類や組織の違いにより、発現している腫瘍抗原の種類や発現量が異なると考えられる。同定されている腫瘍抗原はメラノーマ由来のものが多く、発病頻度の高い上皮性の癌や腺癌等に由来する腫瘍抗原の報告は少ない。
【０００７】
さらに、ＨＬＡ遺伝子の多型により各個体において機能する腫瘍抗原ペプチドの種類が異なることから、それぞれのＨＬＡに応じた腫瘍抗原ペプチドを同定することは、癌治療において高い効果を得るために重要である。
【０００８】
勿論、単一の腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法によっても、該腫瘍抗原を有する癌の治療効果は得られる。しかし、癌の治療において抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し、かつ癌の多様性に対応して高い治療効果を得るためには、ＨＬＡ拘束性および癌の多様性に応じた数多くの新たな腫瘍抗原を発見し利用することが重要である。
【０００９】
以下に、本明細書において引用した文献を列記する。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／１１０４４号公報
【非特許文献１】「アーカイブス　オブ　サージェリー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｓｕｒｇｅｒｙ）」、１９９０年、第１２６巻、ｐ．２００−２０５。
【非特許文献２】アイザワ（Ａｉｚａｗａ　Ｍ．）、「ザ　プロシーディングス　オブ　ザ　サード　アジア　オセアニア　ヒストコンパティビリティー　ワークショップ　カンファレンス（Ｔｈｅ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　３ｒｄ　Ａｓｉａ−Ｏｃｅａｎｉａ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）」、オックスフォード：オックスフォード　プレス（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８６年。
【非特許文献３】ベリヒら（Ｂｅｌｉｃｈ　Ｍ．Ｐ．）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９２年、第３５７巻，ｐ．３２６−３２９。
【非特許文献４】セットら（Ｓｅｔｔｅ　Ａ．）、「イムノジェネティクス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、１９９９年、第５０巻、ｐ．２０１−２１２。
【非特許文献５】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９１年，第２５４巻，ｐ．１６４３−１６４７。
【非特許文献６】「ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９６年、第１８３巻、ｐ．１１８５−１１９２。
【非特許文献７】ゴミ（Ｇｏｍｉ，Ｓ．）ら、「ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１６３巻、ｐ．４９９４−５００４。
【非特許文献８】「プロシーディング　オブ　ザ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンシズ　オブ　ザ　ユナイテッド　ステイツ　オブ　アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９５年、第９２巻、ｐ．４３２−４３６。
【非特許文献９】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９５年、第２６９巻、ｐ．１２８１−１２８４。
【非特許文献１０】「ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９７年、第１８６巻、ｐ．７８５−７９３。
【非特許文献１１】「ネイチャー　メディシン（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９８年、第４巻、ｐ．３２１−３２７。
【非特許文献１２】「クリニカル　キャンサー　リサーチ（ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第７巻、ｐ．３９５０−３９６２。
【非特許文献１３】「ジャーナル　オブ　クリニカル　オンコロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第１９巻、ｐ．３８３６−３８４７。
【非特許文献１４】「ネイチャー　メディシン（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９８年、第４巻、ｐ．３２８−３３２。
【非特許文献１５】イトウら（Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．）、「キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第６１巻、ｐ．２０３８−２０４６。
【非特許文献１６】パーカーら（Ｐａｒｋａｒ，ＫＣ．ｅｔ．ａｌ．）、「ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、１９９４年、第１５２巻、ｐ．１６３−。
【非特許文献１７】ワンら（Ｗａｎｇ，ＲＦ．ｅｔ．ａｌ．）、「ジャーナルオブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９５年、第１８１巻、ｐ．７９９−８０４。
【非特許文献１８】ワンら（Ｗａｎｇ，ＲＦ．ｅｔ．ａｌ．）、「ジャーナルオブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９６年、第１８３巻、ｐ．１１３１−１１４０。
【非特許文献１９】ワンら（Ｗａｎｇ，ＲＦ．ｅｔ．ａｌ．）、「ジャーナルオブ　イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６０巻、ｐ．８９０−８９７。
【非特許文献２０】ミサーレら（Ｍｉｓｓａｌｅ，Ｇ．ｅｔ．ａｌ．）、「ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９３年、第１７７巻、ｐ．７５１−７６２。
【非特許文献２１】サムブルック等編［モレキュラークローニング，ア　ラボラトリーマニュアル　第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー、１９８９年。
【非特許文献２２】村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社、１９８８年。
【非特許文献２３】エールリッヒ，Ｈ．Ｅ．編［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス、１９８９年。
【非特許文献２４】ウルマー（Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−。
【非特許文献２５】「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年。
【非特許文献２６】「ペプチド　シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、１９９６年。
【非特許文献２７】「インターナショナル　ジャーナル　オブ　キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ）」、１９９９年、第８１巻、ｐ．４５９−４６６。
【非特許文献２８】「キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９９年、第５９巻、ｐ．４０５６−４０６３。
【非特許文献２９】ニシザカら（Ｎｉｓｈｉｚａｋａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．）、「キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第６０巻、ｐ．４８３０−４８３７。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドとしての作用を有するポリペプチドまたはペプチド、例えば大腸癌患者の特異的免疫療法に有用な、細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチドまたはペプチドを見い出して提供することである。現在、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性の腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドは数多く見出されてきているが、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性のものについては報告されていない。
【００１１】
本発明の課題の１つは、少なくともＨＬＡ−Ａ３１拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するポリペプチドまたはペプチドを提供することである。課題の別の１つは、該ポリペプチドまたは該ペプチドをコードする塩基配列またはその相補的塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供することである。課題のまた別の１つは、該ポリペプチドおよび／またはペプチドに対する抗体、該ポリペプチドまたは該ペプチドの少なくとも１つに対する細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、該ポリヌクレオチドの発現を促進する化合物、該ポリペプチドおよび／または該ペプチドからなる細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤を提供することである。さらに、課題の別の１つは、これらの１つ以上を含む医薬組成物または試薬キットを提供することである。さらに、課題のまた別の１つは、該ポリペプチドおよび／または該ペプチドを用いる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、該化合物のスクリーニング方法、並びに該ポリペプチドまたは該ペプチドまたは該ポリヌクレオチドの測定方法を提供することである。
【００１２】
【課題解決のための手段】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、大腸癌患者由来の腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｕｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）から樹立した腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を用い、当該細胞傷害性Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ３１拘束性に活性化する腫瘍抗原をコードする遺伝子を、ヒト大腸癌細胞株（ｈｕｍａｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）ＳＷ６２０由来のｃＤＮＡクローンから同定した。そして該遺伝子の遺伝子産物から細胞傷害性Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ３１拘束性に活性化するポリペプチドまたはペプチドを取得し、さらに該ペプチドが、ＨＬＡ表現型がＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ａ３３である癌患者の末梢血単核細胞から各ＨＬＡ−Ａ拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを見出して本発明を完成した、
【００１３】
すなわち本発明は、
１．配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
２．配列表の配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなり１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチド、
３．ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａが、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３からなる群から選ばれるＨＬＡ−Ａである前記２．のポリペプチド、
４．配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド並びに配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなり１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチドからなる群から選ばれる１つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチドからなる医薬、
５．ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａが、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３からなる群から選ばれるＨＬＡ−Ａである前記４．の医薬、
６．配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド並びに配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなり１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチドからなる群から選ばれる１つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチドを含有する癌ワクチン、
７．ＨＬＡ表現型がＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａである癌に用いる前記６．の癌ワクチン、
８．癌が前立腺癌、大腸癌、胃癌、子宮頚癌、乳癌、肺癌、食道癌、膀胱癌またはメラノーマである前記７．の癌ワクチン、
９．ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる１つ以上のＨＬＡ−Ａである前記６．から８．のいずれかの癌ワクチン、
１０．配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドより選ばれる１つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチドを含有する、１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
１１．ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである前記１０．の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
１２．配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選ばれる１つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチドを使用することを特徴とする、１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、
１３．ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ前記１２．の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、
１４．配列表の配列番号１から配列番号８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列またはその相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド、
１５．配列表の配列番号９から配列番号１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなり１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド、
１６．配列表の配列番号１５から配列番号１９のいずれか１に記載の塩基配列であって、該塩基配列がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドが１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるものである塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド、
１７．ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである前記１５．または１６．のポリヌクレオチド、
１８．前記１４．から１７．のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、
１９．前記１４．から１８．のいずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
２０．組換えベクターが発現組換えベクターである前記１９．の組換えベクター、
２１．前記１９．または２０．の組換えベクターを導入されてなる形質転換体、
２２．前記２０．の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程を含む、前記１．のペプチドまたは前記２．若しくは３．のポリペプチドの製造方法、
２３．前記１．のペプチドを免疫学的に認識する抗体、
２４．前記１．のペプチドおよび／または前記２．若しくは３．のポリペプチドの少なくとも１つに対する、１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、および／または前記１４．から１７．のいずれかのポリヌクレオチドの発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、前記１．のペプチド、前記２．または３．のポリペプチド、前記１４．から１８．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１９．または２０．の組換えベクター、前記２１．の形質転換体、または前記２３．の抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法、
２５．ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである前記２４．のスクリーニング方法、
２６．前記２４．または２５．のスクリーニング方法により得られた化合物、
２７．前記１．のペプチドまたは前記２．若しくは３．のポリペプチドの少なくとも１つに対する、１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、または前記１４．から１７．のいずれかのポリヌクレオチドの発現を増強する化合物、
２８．ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである前記２７．の化合物、
２９．前記１．のペプチド、前記２．または３．のポリペプチド、前記１４．から１７．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１９．または２０．の組換えベクター、前記２１．の形質転換体、または前記２３．の抗体、または前記２６．から２８．のいずれかの化合物のうちの少なくとも１つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物、
３０．癌治療が、ＨＬＡ表現型がＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａである癌に対する癌治療である前記２９．の医薬組成物、
３１．ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡがＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａである前記３０．の医薬組成物、
３２．癌が前立腺癌、大腸癌、胃癌、子宮頚癌、乳癌、肺癌、食道癌、膀胱癌またはメラノーマである前記２９．から３１．のいずれかの医薬組成物、
３３．前記１．のペプチド、前記２．または３．のポリペプチド、または前記１４．から１７．のいずれかのポリヌクレオチドの定量的あるいは定性的な測定方法、
３４．前記１．のペプチド、前記２．または３．のポリペプチド、前記１４．から１７．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１９．または２０．の組換えベクター、または前記２３．の抗体の少なくとも１つ以上を含んでなる試薬キット、
３５．前記２４．若しくは２５．のスクリーニング方法または前記２７．の測定方法に使用する試薬キットであって、前記１．のペプチド、前記２．または３．のポリペプチド、前記１４．から１７．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１９．または２０．の組換えベクター、または前記２３．の抗体の少なくとも１つ以上を含んでなる試薬キット、
からなる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の理解のために、本明細書において用いる用語についてまず説明する。腫瘍抗原とは腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであり、腫瘍細胞が有する蛋白質またはペプチドを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面上に提示されることにより腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドを意味する。さらに、腫瘍抗原が有する腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し得るアミノ酸配列の部位を腫瘍抗原エピトープ（腫瘍抗原決定基）という。
【００１５】
以下、ＨＬＡ−Ａ分子に結合して細胞表面上に提示され細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し得る腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをＨＬＡ−Ａ拘束性腫瘍抗原またはＨＬＡ−Ａ拘束性腫瘍抗原ペプチドということがある。例えばＨＬＡ−Ａ３１分子に結合して細胞表面上に提示され細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し得る腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをＨＬＡ−Ａ３１拘束性腫瘍抗原またはＨＬＡ−Ａ３１拘束性腫瘍抗原ペプチドという、また、かかる腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ということがある。
【００１６】
ここで、「認識する（ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ）」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍細胞あるいは腫瘍抗原ペプチドを認識するとは、細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ分子により提示された腫瘍抗原ペプチドにＴ細胞抗原受容体を介して結合することを意味する。「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するものまたは状態を、さらに増強するまたは作動させることを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞が活性化するとは、細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ分子により提示された抗原を認識することにより、例えばインターフェロン−γ（以下、ＩＦＮ−γと略称する。）を産生すること、あるいは細胞傷害性Ｔ細胞が認識した標的細胞に対し細胞傷害活性を示すことを意味する。「誘導する」とは、ある活性若しくは作用をほとんど持たないものまたは状態から、該活性または該作用を発生させることを意味する。特に、本明細書において、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するとは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を分化および／または増殖させることを意味する。また、本明細書において細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤とは、ある抗原を特異的に認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在しないあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、該抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用を示す薬剤を意味する。
【００１７】
本明細書においては、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドのうち長鎖ペプチドをポリペプチドという。例えば蛋白質も本明細書においてはポリペプチドに含まれる。また、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを、単にペプチドという。以降、アミノ酸配列を表記する場合、１文字にて表記する場合と３文字にて表記する場合がある。
【００１８】
以下、本発明について発明の実施の態様を説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
【００１９】
本発明に係るポリペプチドおよびペプチドは、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ６２０由来のｃＤＮＡクローンがコードするポリペプチドおよび該ポリペプチドの部分ペプチドである。該ｃＤＮＡを細胞に導入して発現させると、該細胞は腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、当該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。より具体的には、ＨＬＡ−Ａ３１を有する細胞で発現させると、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、当該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。
【００２０】
かかるｃＤＮＡがコードするポリペプチドの部分ペプチドのうち腫瘍抗原エピトープを有するペプチドは、その特性の１つとして、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、当該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。より具体的には、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、当該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。
【００２１】
上記ｃＤＮＡの同定は、以下のように行なった。まず、大腸癌患者（ＨＬＡ−Ａ０２０７／３１０１、ＨＬＡ−Ｂ４６／５１、ＨＬＡ−Ｃｗ１）（この大腸癌患者を以下ＯＫと呼ぶこともある。）の腫瘍浸潤リンパ球から既報（非特許文献１５）に記載の方法にしたがって樹立した腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞株ＯＫ−ＣＴＬのサブラインＯＫＡ３１−ＣＴＬを用い、これを活性化する腫瘍抗原を同定した。ＯＫＡ３１−ＣＴＬは、他のサブラインと比べて相対的に強くＨＬＡ−Ａ３１を認識し、その抗原認識はＨＬＡ−Ａ遺伝子座拘束性である。すなわち、ＨＬＡ−Ａ３１陽性（以下、ＨＬＡ−Ａ３１＋と表記する。）細胞により提示された抗原は認識するが、ＨＬＡ−Ａ３１陰性（以下、ＨＬＡ−Ａ３１−と表記する。）細胞により他の型のＨＬＡ分子を介して提示された抗原は認識しない。ＨＬＡ−Ａ３１陽性とは、ＨＬＡ表現型がＨＬＡ−Ａ３１であることを意味する。ＨＬＡ−Ａ３１陰性とは、ＨＬＡ表現型がＡ３１以外のものであることを意味する。
【００２２】
本発明者らは既に、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＯＫ−ＣＴＬサブラインを活性化する腫瘍抗原をコードする遺伝子を、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ６２０のｃＤＮＡライブラリーから遺伝子発現クローニング法を用いて単離・同定している。本発明においては該遺伝子の中から、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性にＯＫＡ３１−ＣＴＬを活性化する腫瘍抗原をコードする５種類の遺伝子を見い出した。
【００２３】
５種類の遺伝子の同定は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＯＫ−ＣＴＬサブラインを活性化する腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡとＨＬＡ−Ａ３１０１　ｃＤＮＡとをサル腎細胞株ＣＯＳ−７に共遺伝子導入し、該導入遺伝子が発現された細胞のうちＯＫＡ３１−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進するものを選択することにより行った（実施例１参照。）。得られた５種類のｃＤＮＡクローンの塩基配列は、配列表の配列番号１５から１９に記載した。これらの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の既存のデータベースを用いた相同性検索により、表１に示した既知遺伝子のものと相同性を有することが判明した。しかし、これら既知遺伝子がＨＬＡ−Ａ３１拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化する腫瘍抗原をコードすることを示すデータは今まで報告されていない。
【００２４】
【表１】
2004000216.tif 000002
【００２５】
これら遺伝子はＨＬＡ−Ａ３１拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子であり、上記のようにＨＬＡ−Ａ３１＋細胞で発現させると、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を活性化してＩＦＮ−γ産生を促進した。これら遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号９から１４に記載した（表１参照）。
【００２６】
ヒト大腸癌細胞株ＳＷ６２０から得た上記遺伝子がコードするポリペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原として使用できる。該ポリペプチドとして好ましくは、配列番号９から１４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。かかるポリペプチを認識する細胞傷害性Ｔ細胞としては、少なくともＨＬＡ−Ａ３１拘束性またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞が挙げられる。また、本ポリペプチドは、腫瘍抗原エピトープを特定して腫瘍抗原ペプチドを得るための材料として用いることもできる。
【００２７】
腫瘍抗原ペプチドは、上記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計し合成したペプチドから細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化するものを選択することにより取得できる。細胞傷害性Ｔ細胞の誘導および／または活性化の判定方法としては、例えば、ペプチドをパルスした細胞とＯＫＡ３１−ＣＴＬ等の細胞傷害性Ｔ細胞とを共に培養して、活性化された細胞傷害性Ｔ細胞から産生されるＩＦＮ−γを測定し、これを指標として判定する方法等を例示できる。当該腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３１と結合して細胞表面上に提示され、かつ細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原エピトープとしての性質を有するものであればよく、少なくとも５個以上、好ましくは７個以上、さらに好ましくは９個乃至１１個のアミノ酸残基からなるペプチドである。さらに好ましくは、配列番号１から８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。これらペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性の腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチドとして使用できる。
【００２８】
配列番号１から８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、具体的には以下の方法により取得した。まず、上記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、ＨＬＡ−Ａ３１結合モチーフに適合する９ｍｅｒから１１ｍｅｒのペプチドを設計し、常法により合成した。ペプチドの設計は、米国国立予防衛生研究所（ＮＩＨ）のバイオインフォーマティクス　アンド　モレキュラー　アナリシス　セクション（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ；ＢＩＭＡＳ）が開示しているデータベース「ＨＬＡペプチド結合予測（ＨＬＡ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ」を用い（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ）、さらに既報（非特許文献１６−１８）を参照して行った。合成したペプチドからの、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドの選択は以下のように行った。各ペプチドを細胞（ＨＬＡ−Ａ３１０１を発現させたＣＯＳ−７細胞またはＯＫ−ＥＢＶ−Ｂ細胞株）にそれぞれパルスした後、ＯＫＡ３１−ＣＴＬと共に培養し、培養上清中に産生されるＩＦＮ−γを測定した。ネガティブコントロール（ＯＫＡ３１−ＣＴＬにより認識されないペプチド）と比較してＯＫＡ３１−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進したペプチドを、ＯＫＡ３１−ＣＴＬにより認識されるペプチドであると判定した。
【００２９】
合成したペプチドのうち８種類のペプチド（配列番号１から８）が、ＯＫＡ３１−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を用量依存的に促進した（実施例２参照。）。また、これらのペプチドは、癌患者から得た末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｅｌｌ；以下、ＰＢＭＣと略称することもある。）から、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。健常人由来のＰＢＭＣにおいては癌患者由来のＰＢＭＣと比べて細胞傷害性Ｔ細胞が誘導される例が少なかった。誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ３１＋標的細胞、例えばヒト肺腺癌細胞株ＬＣ−１または誘導に用いたペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ３１＋細胞を認識してＩＦＮ−γを産生を促進し且つ該標的細胞を溶解したが、ＨＬＡ−Ａ３１−標的細胞は溶解しなかった（実施例３および４参照。）。細胞傷害性Ｔ細胞の誘導はペプチド特異的であり、誘導に用いたペプチドと、標的細胞により提示されたペプチドとが同一の場合に、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は標的細胞を認識してこれを傷害した（実施例４参照。）。これらから、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡ−Ａ３１拘束性かつペプチド特異的な細胞傷害性Ｔ細胞であることが判明した。かくして、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するおよび／または誘導する８種類の腫瘍抗原ペプチドを得た。これらペプチドは上記遺伝子において、ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍抗原ペプチドとは全く異なる領域にコードされるペプチドであった。
【００３０】
配列番号１から８に記載のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３１＋癌患者由来のＰＢＭＣのみならず、ＨＬＡ表現型がＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ａ３３である癌患者由来のＰＢＭＣからも、同様に各ＨＬＡ−Ａ拘束性に腫瘍細胞を溶解する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した（実施例５および６参照。）。ＨＬＡ−Ａ３１は、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３３およびＨＬＡ−Ａ６８などの対立遺伝子が属するＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ（ｓｕｐｅｒｔｙｐｅ）の１つである。今までに、ウイルス蛋白質あるいはメラノーマ抗原由来の同一のエピトープペプチドが、異なったＨＬＡ−Ａ３スーパータイプにより認識されることが報告されている（非特許文献１９および２０）。これらから、本ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３１分子のみならず、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ、例えばＨＬＡ−Ａ１１分子またはＨＬＡ−Ａ３３分子などと結合し、各ＨＬＡ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することが明らかになった。
【００３１】
本明細書において、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａとは、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３およびＨＬＡ−Ａ６８など、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプであると報告されているＨＬＡ−Ａを意味する。好ましくはＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３３からなる群から選ばれる少なくとも１つのＨＬＡ−Ａであり、より好ましくはＨＬＡ−Ａ３１である。
【００３２】
本ペプチドは好ましくはＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性の腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または該細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチドとして使用できる。また上記のとおり、１つのペプチドがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属する複数のＨＬＡ−Ａ拘束性に腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または該細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチドとして使用できる。さらに、本ポリヌクレオチドは本ペプチドをその一部として有するため、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ表現型を示す細胞内で発現させると本ペプチド同様に該ＨＬＡ−Ａ拘束性の腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または該細胞傷害性Ｔ細胞により認識されると考えられる。
【００３３】
このように特定されたポリペプチドまたはペプチドにおいて１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を有するものも本発明の範囲に包含される。変異を有するペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。好ましくは、かかる変異を有するポリペプチドまたはペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞により、好ましくは少なくともＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチドまたはペプチドが望ましい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等を単独でまたは適宜組合わせて用いることができる。例えば成書に記載の方法（非特許文献２１−２３）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（非特許文献２４）を利用することもできる。変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【００３４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドまたはペプチドをコードする塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号１から８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたは配列番号９から１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。より好ましくは、配列番号１５から１９のいずれか１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。さらに、本発明の範囲には、上記ポリペプチドのアミノ酸配列中でＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性の腫瘍抗原エピトープをコードする領域に対応する１５個以上、好ましくは２１個以上、より好ましくは３３個以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドも包含される。本ポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ表現型を示す細胞で発現させたときに、該ＨＬＡ−Ａ拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化できると考えられる。本ポリヌクレオチドにはその３′末端にポリ（Ａ）〔ｐｏｌｙ（Ａ）〕構造が存在するが、ポリ（Ａ）の数は腫瘍抗原として作用するアミノ酸のコード部位に影響するものではないため、その数は特に限定されない。かかる有用なポリヌクレオチドの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用してポリペプチドまたはペプチドを発現させ、該ポリペプチドまたはペプチドの細胞傷害性Ｔ細胞誘導能および／または活性化能を測定することにより可能である。
【００３５】
さらに、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（非特許文献２１）等に従うことができる。これらポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするものであれば目的のポリヌクレオチドの相補的配列でなくてもよい。
【００３６】
本ポリヌクレオチドは、いずれも本ポリペプチドまたはペプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸としての試薬や標準品としても利用できる。
【００３７】
ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに組込むことにより、組換えベクターを取得できる。用いるベクターＤＮＡは、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等が挙げられる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等を用いることができる。
【００３８】
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等とを構成要素とし、これらを自体公知の方法により組合わせて作製する。ベクターＤＮＡにポリヌクレオチドを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的のポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
【００３９】
ポリヌクレオチドが組込まれたベクターＤＮＡを、自体公知の宿主に導入することにより形質転換体が得られる。宿主に導入するベクターＤＮＡは、１種のベクターＤＮＡであってもよく、２種以上のベクターＤＮＡを導入してもよい。宿主としては、例えば大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞または動物細胞等が例示できる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用できる。例えば成書に記載されている標準的な方法（非特許文献２１）により実施できる。より好ましい方法としては、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。
【００４０】
宿主に導入するベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、該ベクターに組込んだ遺伝子を発現させることが可能である。所望の遺伝子を組込んだ発現ベクターＤＮＡを導入した形質転換体は、各宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、形質転換体により発現される遺伝子産物の機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された遺伝子産物量を指標にして行ってもよく、培地中の形質転換体量を指標にして行ってもよい。
【００４１】
本ポリペプチドまたはペプチドは、該ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクター、または該ベクターを導入した形質転換体を用いて、遺伝子工学的技術により製造可能である。また、通常のペプチド化学において知られる方法でも製造できる。例えば成書に記載の方法（非特許文献２５および２６）が例示できるが、無論既知の方法が広く利用可能である。
【００４２】
本ポリペプチドまたはペプチドの精製および／または回収は、該ポリペプチドまたは該ペプチドの機能、例えば細胞傷害性Ｔ細胞誘導能および／または活性化能を指標にして実施できる。精製および／または回収の方法としては、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段、ゲルろ過、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等が挙げられ、これらを単独でまたは組合わせて使用する。好ましくは、精製および／または回収しようとするポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体を作成し、該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法を使用する。
【００４３】
抗体は、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを抗原として用いて作製する。抗原は該ポリペプチドまたはペプチド、またはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。該ポリペプチドおよび／またはペプチドに特異的な抗体を作成するためには、該ポリペプチドまたはペプチドに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも該ポリペプチドまたはペプチドのものと相同または同一である必要はなく、その立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は免疫学的に該ポリペプチドおよび／またはペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、抗原抗体結合反応を測定する公知方法によって決定できる。
【００４４】
抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体はそれ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等が例示できる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合わせを例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。
【００４５】
ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。
【００４６】
モノクロ−ナル抗体は、免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８細胞等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、本発明に係るポリペプチドおよび／またはペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
【００４７】
かくして得られた、上記ポリペプチドまたはペプチドを認識し結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該ポリペプチドまたは該ペプチドの精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として利用できる。
【００４８】
本発明に係るポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体または抗体は、単独でまたは複数を組合わせて用いることにより、細胞傷害性Ｔ細胞による該ポリペプチドまたは該ペプチドの認識を増強する物質のスクリーニングに有効な手段を提供する。スクリーニング方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。
【００４９】
例えば、腫瘍抗原ペプチドをパルスした細胞を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を刺激し、該細胞傷害性Ｔ細胞による腫瘍抗原ペプチドの認識および／または該細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を測定する実験系を構築し、該実験系を用いて被検物質を試験することにより、本発明に係るペプチドの細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する物質を選別できる。腫瘍抗原ペプチドをパルスする細胞としては、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ表現型を示す細胞、例えばＨＬＡ−Ａ３１＋、ＨＬＡ−Ａ１１＋および／またはＨＬＡ−Ａ３３＋である細胞株が例示できる。あるいは、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ以外の表現型を示す細胞に、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−ＡのいずれかのｃＤＮＡを常法により遺伝子導入して細胞表面上に該ＨＬＡ−Ａ分子を発現させた細胞を用いることもできる。細胞への腫瘍抗原のパルスは、細胞と腫瘍抗原とを常法にしたがって共に培養することにより実施可能である（実施例２参照。）。該細胞傷害性Ｔ細胞としては、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞株、例えばＯＫＡ３１−ＣＴＬ等を用いる。細胞傷害性Ｔ細胞と標的細胞の組合わせは、好ましくは両細胞のＨＬＡ表現型の少なくとも一方が一致することが望ましい。細胞傷害性Ｔ細胞による腫瘍抗原ペプチドの認識および／または細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、簡便には細胞傷害性Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ産生量を指標にして測定できる。この実験系は同定方法の１つを説明するものであり、本発明に係る同定方法はこれに限定されない。
【００５０】
本発明は、上記スクリーニング方法によって得られた化合物も包含する。該化合物は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、例えば配列番号１から８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたは配列番号９から１４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの認識を増強する化合物であり得る。あるいは本発明に係るポリヌクレオチドの発現を増強する化合物であり得る。かくして選別された化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮してさらに選別することにより、医薬組成物として調製可能である。
【００５１】
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性の腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または該細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるため、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドとして使用できる。したがって、本ペプチドおよび／または本ポリペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、並びに本ペプチドおよび／または本ポリペプチドを用いることを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法も本発明の範囲に包含される。本誘導剤および誘導方法により誘導される細胞傷害性Ｔ細胞としては、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞が例示できる。本ポリペプチドまたはペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化するために、単独で使用してもよいし、２つ以上を組合わせて使用してもよい。細胞傷害性Ｔ細胞は種々の抗原を認識する複数の細胞集団であることから、好ましくはこれらを２つ以上組合わせて用いることが推奨される。
【００５２】
細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法は、その一態様として、本発明に係るペプチドを細胞にパルスする工程、および該工程で得られた細胞を用いて細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程を含む。ペプチドをパルスする細胞としては、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ表現型を示す細胞、例えば該表現系を示す公知の細胞株が例示できる。あるいは、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ以外の表現型を示す細胞に、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａのいずれか１つのｃＤＮＡを常法により遺伝子導入して細胞表面上に該ＨＬＡ−Ａ分子を発現させた細胞を用いることもできる。細胞へのペプチドのパルスは、細胞と腫瘍抗原ペプチドとを常法にしたがって共に培養することにより実施可能である（実施例２参照。）。細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞を含む細胞集団は、例えばヒト末梢血より調製した末梢血細胞、より好ましくは末梢血単核細胞、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ表現型を示す末梢血単核細胞が挙げられる。当該細胞集団の刺激は、当該細胞集団とペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ３１＋細胞とを常法にしたがって共に培養することにより実施可能である（実施例３参照。）。細胞集団と標的細胞との組合わせは、好ましくは両細胞のＨＬＡ表現型の少なくとも一方が一致することが望ましい。
【００５３】
本発明に係るポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物を、単独でまたは複数を組合わせて利用することによって、これらからなる群から選ばれる少なくとも１つを含有する医薬組成物を提供できる。
【００５４】
本発明においては、本遺伝子のうちクローン４０、クローン５６、クロー７６およびクローン８５について、腫瘍細胞および組織における発現を検討し、いずれも上皮癌細胞株や腺癌細胞株（食道癌、肺腺癌、大腸腺癌および胃腺癌）で正常組織と比較して高レベルで発現していることを明らかにした（実施例７）。
【００５５】
本医薬組成物は癌の治療、好ましくは本発明に係る５種類の遺伝子の１つ以上を発現している癌の治療、より好ましくは該遺伝子の１つ以上を発現しておりＨＬＡ表現型の一方または両方がＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡである癌の治療に使用できる。より具体的には、胃癌、食道癌、大腸癌、小腸癌、十二指腸癌、肺癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、口腔癌、骨癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、脳腫瘍、神経芽腫、メラノーマ等の固形腫瘍、あるいは血液癌（白血病または悪性リンパ腫等）等の非固形腫瘍等のいずれにも適応可能である。好ましくは前立腺癌、大腸癌、胃癌、子宮癌、乳癌、肺癌、食道癌、膀胱癌またはメラノーマなどの治療に有用であると考えられる。癌のＨＬＡ表現型は、例えば癌患者のＨＬＡクラスＩ表現型を慣用の血清学的方法（非特許文献１５）で測定することにより判定できる。癌のＨＬＡ表現型の判定はこの方法に限らず、慣用の方法のいずれも使用することができる。
【００５６】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプは、世界人口の多くで発現が認められるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子である。例えば、白人、北アメリカ黒人、日本人、中国人およびラテンアメリカ人の、それぞれ３７．５％、４２．１％、４５．８％、５２．７％および４３．１％で認められている。したがって、本発明に係る医薬組成物は、大多数の癌患者の特異的免疫療法に適応できる可能性があり、非常に有用性が高い。
【００５７】
また、本ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原エピトープと、ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原エピトープの両方を有する。そのため、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ＋およびＨＬＡ−Ａ２＋の細胞に本ポリペプチドを発現させることにより、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性およびＨＬＡ−２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞を共に誘導し得ると考えられる。これらから、本ポリペプチド、該ポリペプチドコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、および該組換えベクターを含む形質転換体を含む医薬組成物は、ＨＬＡ表現型としてＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡとＨＬＡ−２とを有する癌の治療、例えばＨＬＡ表現型がＡ３１／Ａ２、Ａ１１／Ａ２またはＡ３３／Ａ２である癌に特に有効である場合があると考えている。
【００５８】
具体的には、例えば本発明に係るポリペプチドおよびペプチドから選ばれる１つ以上からなる医薬、さらに本発明に係るポリペプチドおよびペプチドから選ばれる１つ以上を含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用できる。ここでいう癌ワクチンとは、腫瘍細胞に対する特異的免疫応答の誘導および／または増強により、腫瘍細胞を選択的に傷害する薬物を意味する。その投与量は、細胞傷害性Ｔ細胞による該ポリペプチドまたは該ペプチドの認識の程度により適宜変更を加えて決定可能であるが、一般的には活性本体として０．０１ｍｇ乃至１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは０．１ｍｇ乃至１０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数月に１回投与する。投与方法は、公知の医療用ペプチドの投与方法に準じて行えばよく、好適には皮下、静脈内、あるいは筋肉内投与にて行われる。投与に際して、免疫応答の誘導および／または増強のために、本発明に係るポリペプチドおよび／またはペプチドは適当なアジュバントの存在下または非存在下に、単独でまたは担体に結合して用いることができる。担体は、それ自体が人体に対して有害な作用を及ぼさなければ特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸またはアルブミン等が例示される。アジュバントは、通常のペプチドワクチン接種に用いられるものであればよく、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｖａｃｃｉｎｅ）および鉱物油等が例示される。剤形は自体公知のペプチドを製剤化する手段を応用して適宜選択できる。
【００５９】
または例えば、患者の末梢血より単核細胞画分を採取して、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを用いて刺激した後に、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導および／または細胞傷害性Ｔ細胞の活性化が認められた該単核細胞画分、あるいは該単核細胞画分から精製した細胞傷害性Ｔ細胞を、当該患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果が得られる。ポリペプチドまたはペプチドによる刺激は、単核細胞画分をポリペプチドまたはペプチド、ポリペプチドまたはペプチド発現させた細胞、またはペプチドをパルスした細胞と共に培養することにより行うことができる。培養の条件、例えば単核細胞濃度、ポリペプチドまたはペプチドの濃度、培養時間等は、簡単な実験により決定できる。培養時に、インターロイキン−２等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。細胞傷害性Ｔ細胞の精製は常法により行うことができるが、例えばＣＤ８＋細胞を回収することにより実施可能である。
【００６０】
癌ワクチンとして本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを使用する場合、１種類のポリペプチドまたはペプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、複数の種類の上記ポリペプチドまたはペプチドを組合わせて使用することもできる。複数ペプチドに基づく免疫療法が有効であると報告されていること（非特許文献１２−１４）、および癌患者の細胞傷害性Ｔ細胞は複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、１種類のペプチドを癌ワクチンとして使用するより複数種類を組合わせて使用する方が、より高い効果が得られるときがある。またこのとき、本発明のポリペプチドおよびペプチドからなる群から選ばれるものを組合わせて使用してもよいが、これらから選ばれる少なくとも１種類のポリペプチドまたはペプチドに、公知の腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドから選ばれる少なくとも１種類を組合わせて使用してもよい。組合わせて使用する公知の腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドはＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａ拘束性のものに限定されず、他の型のＨＬＡ、例えばＨＬＡ−Ａ２やＨＬＡ−Ａ２４等と共に細胞傷害性Ｔ細胞に認識される腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドであってもよい。公知の腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドとしては、ｌｃｋ遺伝子およびｓｒｃ遺伝子（特許文献１）、ＳＡＲＴ−１遺伝子（非特許文献２７）、ＳＡＲＴ−３遺伝子（非特許文献２８）、並びにサイクロフィリンＢ遺伝子（非特許文献７）等に由来する腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドが例示されるが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、癌の遺伝子治療に利用することができる。これらポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体内に導入して発現させる方法またはヒトから細胞を採取した後に体外で細胞内に導入して発現させる方法のいずれも利用可能である。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等が知られているが、レトロウイルス系が推奨される。無論これらウイルスは複製欠陥性のものを用いる。その投与量は、細胞傷害性Ｔ細胞による該ポリペプチドまたはペプチドの認識の程度により変化するが、一般的には本発明のポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ含量として０．１μｇ乃至１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ乃至５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数月に１回投与する。
【００６２】
（測定方法および試薬）
本発明に係るポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。また本発明は、これらのうちの１つまたはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは抗体それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。該試薬および試薬キットは、本発明に係る同定方法、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、または該ポリペプチド、ペプチドおよびポリヌクレオチドの定量的または定性的測定に使用できる。当該測定をするための方法は、当業者に周知の方法を利用して構築できる。このような測定法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析および酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）等がある。また、核酸は、例えば増幅、ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベルでの検出および定量が可能である。
【００６３】
測定される試料としては、個体由来の細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等が挙げられる。また、測定される核酸は、上記各試料から自体公知の核酸調製法で得られる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲまたはその他の増幅法を用いて酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検出できる。増幅ＤＮＡを標識した上記ポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。
【００６４】
かかる測定により本発明に係るポリペプチド、ペプチドまたはポリヌクレオチドの変異、減少または増加を検出することにより、当該ポリペプチドまたはペプチドが関連する疾患、例えば上皮性癌または腺癌等の診断が可能になる。
【００６５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
また、実施例においてヒト由来の試料を用いた実験は、試料提供者である全ての患者のインフォームドコンセントを得て行なったものである。
【００６６】
【実施例１】
（腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡクローンの同定）
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞として、大腸癌患者（ＨＬＡ−Ａ０２０７／３１０１、ＨＬＡ−Ｂ４６／５１、ＨＬＡ−Ｃｗ１）の腫瘍浸潤リンパ球から文献（非特許文献７および１９）に記載の方法に準拠して樹立したＯＫ−ＣＴＬのサブラインであるＯＫＡ３１−ＣＴＬを用いた。ＯＫＡ３１−ＣＴＬは、他のサブラインと比較して相対的に強くＨＬＡ−Ａ３１に反応し、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性に腫瘍抗原を認識して活性化する。例えば、ヒト胃腺癌細胞株ＭＫＮ２８（遺伝子型はＨＬＡ−Ａ３１であるが、表現型としてはＨＬＡ−Ａ３１が検出されない細胞株）にＨＬＡ−Ａ３１を遺伝子導入により発現させたもの（以下、ＭＫＮ２８−Ａ３１と称する。）、またはヒト肺腺癌細胞株ＬＣ−１（Ａ３１０１／３３０２）などのＨＬＡ−Ａ３１＋標的細胞を認識してＩＦＮ−γ産生を促進した。さらに、５１Ｃｒで標識したこれら標的細胞を用いた慣用の細胞傷害性試験において、標的細胞からの５１Ｃｒ遊離が認められたことから、ＯＫＡ３１−ＣＴＬがこれら標的細胞を傷害して溶解することが明らかになった。しかし、ＨＬＡ−Ａ３１−腫瘍細胞（例えばＭＫＮ２８、大腸腺癌細胞株ＳＷ６２０（Ａ０２０１／２４０２）および肺腺癌細胞株１−８７（Ａ０２０７／１１０１））、およびＰＨＡで刺激したＨＬＡ−Ａ３１＋正常Ｔ細胞に対して細胞傷害活性を示さなかった。ＯＫＡ３１−ＣＴＬによるＭＫＮ２８−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３１＋ＬＣ−１の認識の結果認められたＩＦＮ−γ産生の促進は、抗ＨＬＡ−クラスＩ　モノクローナル抗体または抗ＣＤ８モノクローナル抗体により阻害された。これらから、ＯＫＡ３１−ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性に腫瘍抗原を認識するＣＴＬであると考えられる。
【００６７】
本発明者らは既に、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ６２０のｃＤＮＡライブラリーから遺伝子発現クローニング法を用いて、ＨＬＡ−Ａ２に強く反応するＨＬＡ−Ａ２拘束性ＯＫ−ＣＴＬサブラインを活性化する腫瘍抗原をコードする遺伝子を単離・同定した。これらの遺伝子を対象にして、ＯＫＡ３１−ＣＴＬをＨＬＡ−Ａ３１拘束性に活性化する腫瘍抗原をコードする遺伝子を同定した。
【００６８】
ＳＷ６２０細胞のｃＤＮＡライブラリーからの、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＯＫ−ＣＴＬサブラインを活性化する腫瘍抗原をコードする遺伝子の単離・同定は以下のように行った。まず、ＳＷ６２０細胞のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをｃＤＮＡに転換してＳａｌＩアダプターにライゲーションし、発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。また、ＨＬＡ−Ａ０２０７のｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって得、真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）　にクローン化した。
【００６９】
ＳＷ６２０細胞ｃＤＮＡライブラリーは１００クローンずつプールし、各ウエル毎にプールしたｃＤＮＡ２００ｎｇとＨＬＡ−Ａ０２０７ｃＤＮＡ２００ｎｇとを、１００μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１：２００混液中で３０分間混合した。この混合物の５０μｌをＣＯＳ−７細胞（細胞数１×１０４）に加え、６時間インキュベーションして共遺伝子導入した。次いで１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて２日間培養した後、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＯＫ−ＣＴＬサブライン（細胞数２×１０５）を各ウエルに添加した。さらに１８時間インキュベーション後、上清を１００μｌ採り、産生されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ法で測定した。このとき、ネガティブコントロールとして遺伝子を導入していないＣＯＳ−７細胞を用い、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＯＫ−ＣＴＬサブラインによるＩＦＮ−γ産生を検討し、産生されたＩＦＮ−γの値をバックグランドとして各測定値から減算した。ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＯＫ−ＣＴＬサブラインからのＩＦＮ−γ産生の促進が認められたｃＤＮＡをＣＴＬ活性化能が陽性であると判定し、この判定基準によりｃＤＮＡライブラリーのプールをスクリーニングした。
【００７０】
ＣＴＬ活性化能が認められた上記ＳＷ６２０ｃＤＮＡライブラリーのプールから個別にクローンを取り出してさらにスクリーニングを行うことにより、ＣＴＬ活性化能陽性クローンを選別した。得られたクローンのＨＬＡ−Ａ２拘束性ＯＫ−ＣＴＬサブライン活性化における用量依存性を検討し、最終的に６５個のクローンを得た。得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列の決定は、ＤＮＡシーケンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＴＭ３７７ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ダイデオキシヌクレオチドシーケンシング法で行った。さらに、ｃＤＮＡクローンがコードするアミノ酸配列を塩基配列から推定した。
【００７１】
次に、上記６５個の各ｃＤＮＡクローンを、ｐＣＲ３にクローン化したＨＬＡ−Ａ３１０１　ｃＤＮＡと共に、上記同様の方法でＣＯＳ−７細胞に共遺伝子導入した。このＣＯＳ−７細胞によるＯＫＡ３１−ＣＴＬの活性化を上記同様の方法で検討した。
【００７２】
その結果、クローン４０、クローン４５、クローン５６、クローン７６およびクローン８５の５個のｃＤＮＡクローンが、それぞれＨＬＡ−Ａ３１拘束性かつ用量依存的にＯＫＡ３１−ＣＴＬを活性化し、ＩＦＮ−γ産生を促進した。一方、発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−２のみをＨＬＡ−Ａ３１０１と共に共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞では、ＯＫＡ３１−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生は促進されなかった。
【００７３】
得られた５個の各遺伝子についてＧｅｎＢａｎｋに対して相同性検索を行った。その結果、上記表１に示した遺伝子と高い相同性を有することが明らかになった。しかし、これら遺伝子がＨＬＡ−Ａ３１拘束性にＣＴＬを誘導および／または活性化する腫瘍抗原をコードするというデータは、今まで報告されていない。
【００７４】
【実施例２】
（腫瘍抗原ペプチドの同定）
腫瘍抗原をコードする上記遺伝子から腫瘍抗原ペプチドを得るために、クローン４０、クローン４５、クローン５６、クローン７６およびクローン８５がそれぞれコードするアミノ酸配列に基づいて、ＢＩＭＡＳが開示しているデータベース「ＨＬＡペプチド結合予測（ＨＬＡ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ）」（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ）を用い、さらに既報（非特許文献１６−１８）を参照して、それぞれ異なる複数個の９ｍｅｒから１１ｍｅｒのペプチドを設計し合成した。
【００７５】
ＨＬＡ−Ａ３１０１を常法により遺伝子導入して発現させたＣＯＳ−７細胞またはＯＫ−ＥＢＶ−Ｂ細胞に、合成したそれぞれのペプチドをパルスした後、ＯＫＡ３１−ＣＴＬと共に培養し、ＯＫＡ３１−ＣＴＬから産生されるＩＦＮ−γを定量することにより、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性にＣＴＬを活性化するペプチドを選択した。ＯＫ−ＥＢＶ−Ｂ細胞は、大腸癌患者ＯＫの末梢血Ｂ細胞にエプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）を感染させて得た無限増殖性を有する培養細胞株である。すなわち、ＯＫＡ３１−ＣＴＬとＯＫ−ＥＢＶ−Ｂ細胞は同一個体に由来する細胞株である。
【００７６】
詳しくは、ＨＬＡ−Ａ３１０１遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞またはＯＫ−ＥＢＶ−Ｂ細胞を上記合成された各ペプチド（１０μＭ）と共に、５％ＣＯ２−９５％エア（Ａｉｒ）の下で３７℃にて３時間インキュベーションすることにより、細胞表面上に発現されたＨＬＡ−Ａ３１にペプチドを結合させた。このようにペプチドをパルスしたＣＯＳ−７細胞またはＯＫ−ＥＢＶ−Ｂ細胞を標的細胞（Ｔ）として用いた。また、ＯＫＡ３１−ＣＴＬをエフェクター細胞（Ｅ）として用いた。細胞数１×１０４の標的細胞と標的細胞の５倍乃至２０倍量のエフェクター細胞とを混合し（Ｅ／Ｔ比＝５〜２０）、１８時間インキュべーションした。このとき、エフェクター細胞の誘導に用いたペプチドと標的細胞にパルスしたペプチドとが同じものになるように、エフェクター細胞と標的細胞とを組合わせた。インキュベーション後の上清１００μｌを回収してＥＬＩＳＡでＩＦＮ−γを測定した。ＯＫＡ３１−ＣＴＬに認識されないペプチドをパルスしたＣＯＳ−７細胞をネガティブコントロールとして用いて同様に測定を行った。その結果、配列番号１から８のいずれか１に記載したアミノ酸配列からなる８種類のペプチドがＯＫＡ３１−ＣＴＬにより認識され、該ＯＫＡ３１−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進した。得られた８種類のペプチドは、クローン４０由来の４０−Ｐ４７（配列番号１）、クローン４５由来の４５−Ｐ５４（配列番号２）、クローン５６由来の５６−Ｐ２８、５６−Ｐ３１、および５６−Ｐ３２（配列番号３から５）、クローン７６由来の７６−Ｐ２０（配列番号６）、並びにクローン８５由来の８５−Ｐ１０（配列番号７）および８５−Ｐ１１（配列番号８）である。結果は図１から図７に示した。
【００７７】
【実施例３】
（ペプチドによる癌患者末梢血単核細胞からのＣＴＬの誘導）
実施例２で得た８種類のペプチドのうち、４０−Ｐ４７（配列番号１）、５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、８５−Ｐ１０（配列番号７）および８５−Ｐ１１（配列番号８）について、ヒトＰＢＭＣからのＣＴＬ誘導能を検討した。ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ３１＋癌患者１０例（前立腺癌患者４例、大腸癌患者２例、胃癌患者１例、子宮頚癌患者２例および乳癌患者１例）およびＨＬＡ−Ａ３１＋健常人６例の各血液試料から常法に従って調製した。ＰＢＭＣのＨＬＡクラスＩ表現型の決定は慣用の血清学的方法により行った（非特許文献１５）。
【００７８】
各ＰＢＭＣ（細胞数１×１０５）を、培養培地〔４５％ＲＰＭＩ−１６４０培地、４５％ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、０．１ｍＭのＭＥＭノンエッセンシャルアミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）からなる。〕２００μｌを加えた９６ウエルＵ底型マイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ）の各ウエル中で、ペプチド各１０μＭとインキュベーションした。培養３日目および６日目に半量の培地を除き、対応する各ペプチドを含む上記組成の培地と交換した。培養９日目に細胞を回収し、ＩＬ−２のみを加えてペプチド非存在下でさらに培養し、培養１２日目に細胞を回収して洗浄しエフェクター細胞（Ｅ）として用いた。エフェクター細胞は、種々の標的細胞（Ｔ）とＥ／Ｔ比１０で混合し、５％ＣＯ２−９５％Ａｉｒの条件下で３７℃にて１８時間インキュベーションした。インキュベーション後の上清１００μｌを回収して、産生されたＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡにより測定した。標的細胞として、ＨＬＡ−Ａ３１＋ヒト肺腺癌細胞株ＬＣ−１（Ａ３１０１／３３０２）、ＨＬＡ−Ａ３１−腫瘍細胞（例えば大腸腺癌細胞株ＳＷ６２０（Ａ０２０１／２４０２）、肺腺癌細胞株１−８７（Ａ０２０７／１１０１）、およびＭＫＮ２８細胞）、ＭＫＮ２８−Ａ３１細胞、または培養に用いたペプチドと同じペプチドをパルスした細胞を用いた。ペプチドをパルスする細胞としては、ＨＬＡ−Ａ３１　ｃＤＮＡを導入したＣ１Ｒ細胞（以下、Ｃ１Ｒ−Ａ３１と略称する。）を用いた。また、標的細胞としてペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３１を用いる場合は、ネガティブコントロールとしてＨＬＡ−Ａ３１拘束性ＣＴＬを誘導しないヒト免疫不全ウイルス由来ペプチド（ＨＩＶペプチド：ＲＬＲＦＬＬＬＩＶＴＲ、配列番号２０）を用い、ＨＩＶペプチドをパルスした細胞を認識したＣＴＬのＩＦＮ−γ産生量をバックグランドとして各測定値から減算した。Ｃ１Ｒ−Ａ３１以外の標的細胞を用いる場合は、エフェクター細胞のみをインキュベーションした時のＩＦＮ−γ産生量をバックグランドとして各測定値から減算した。算出された各測定値（ＮＥＴ）はスチューデントｔ検定で統計処理し、Ｐ値が０．０５以下であるものを有意差があると見なした。
【００７９】
ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３１細胞を標的細胞として用いた結果の代表的な例を表２に示した。４０−Ｐ４７（配列番号１）、５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、８５−Ｐ１０（配列番号７）または８５−Ｐ１１（配列番号８）と共にそれぞれ培養した１０例の癌患者由来のＰＢＭＣのうち、それぞれ５例（５０％）、３例（３０％）、４例（４０％）、４例（４０％）、５例（５０％）、５例（５０％）、および７例（７０％）のＰＢＭＣがＩＦＮ−γ産生を促進した。すなわち、これらペプチドが標的細胞に対する反応における癌患者由来ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進したと考えられる。一方、６例の健常人由来のＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生については、５６−Ｐ３１（配列番号４）が２例、４０−Ｐ４７（配列番号１）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）および８５−Ｐ１０（配列番号７）がそれぞれ１例で促進したが、５６−Ｐ２８（配列番号３）および８５−Ｐ１１（配列番号８）は促進しなかった。
【００８０】
【表２】
2004000216.tif 000003
【００８１】
また、各ペプチドで培養したＰＢＭＣは、標的細胞としてＨＬＡ−Ａ３１＋腫瘍細胞ＬＣ−１を用いたときにもＩＦＮ−γ産生を促進した。一方、ＨＬＡ−Ａ３１−腫瘍細胞（ＳＷ６２０、１−８７、ＭＫＮ−２８）を標的細胞として用いたときにはＩＦＮ−γ産生を促進しなかった。しかし、ＨＬＡ−Ａ３１　ｃＤＮＡを導入して発現させたＭＫＮ２８細胞に対しては反応し、ＩＦＮ−γ産生を促進した。代表的な結果を患者例４（前立腺癌）、患者例５（大腸癌）および患者例８（子宮頚癌）について図８に示した。標的細胞に対する反応における癌患者ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−クラスＩ抗体または抗ＣＤ８抗体により阻害されたが、抗ＨＬＡ−クラスＩＩ抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体または抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体によっては阻害されなかった。すなわち、各ペプチドで培養したＰＢＭＣ中のＩＦＮ−γ産生細胞は、ＣＤ８＋の表現型を有するＨＬＡ−クラスＩ拘束性のＣＴＬであると考えられる。
【００８２】
また、各ペプチドで培養したＰＢＭＣは、培養に用いたペプチドを同じペプチドをコードするｃＤＮＡとＨＬＡ−Ａ３１　ｃＤＮＡとを共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞と共に培養したときに、ＩＦＮ−γ産生を促進した。
【００８３】
これらから、４０−Ｐ４７（配列番号１）、５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、８５−Ｐ１０（配列番号７）および８５−Ｐ１１（配列番号８）が、癌患者ＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ３１拘束性ＣＴＬを誘導することが判明した。
【００８４】
【実施例４】
（ペプチドにより誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性）
実施例３においてペプチドで１２日間培養したＰＢＭＣをさらにＩＬ−２の存在下で１０日間以上培養後にエフェクター細胞として用い、各種標的細胞に対する細胞傷害活性を標準的な６時間の５１Ｃｒ遊離試験（非特許文献１５）で測定した。すなわち、エフェクター細胞と５１Ｃｒ標識した各標的細胞とを、Ｅ／Ｔ比３、１０または３０で混合して６時間インキュベーションした後に、上清中に遊離された５１Ｃｒの放射活性を測定した。得られた結果は、標的細胞を完全に溶解したときの放射活性を１００％として算出した％溶解（％ｌｙｓｉｓ）で表した。標的細胞として、ＨＬＡ−Ａ３１＋腫瘍細胞ＬＣ−１、ＨＬＡ−Ａ３１−腫瘍細胞ＳＷ６２０または１−８７、ＨＬＡ−Ａ３１＋正常細胞であるＰＨＡ芽球化Ｔ細胞（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔｏｉｄ　Ｔ　ｃｅｌｌ）、エプスタインバーウイルスで形質転換したＢ細胞株（ＥＢＶ−Ｂ）およびＣ１Ｒ−Ａ３１を用いた。
【００８５】
各ペプチドで培養したＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ３１＋腫瘍細胞を特異的に溶解した。代表的な結果を図９に示した。このことから、４０−Ｐ４７（配列番号１）、５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、８５−Ｐ１０（配列番号７）および８５−Ｐ１１（配列番号８）は癌患者のＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ３１拘束性の腫瘍特異的ＣＴＬを誘導することが明らかになった。
【００８６】
さらにペプチドによるＰＢＭＣからのＣＴＬ誘導がペプチド特異的であることを実証するために、コールドターゲットインヒビションアッセイを行った。すなわち、エフェクター細胞と５１Ｃｒ標識したＭＫＮ２８−Ａ３１細胞（ｈｏｔということもある。）とを用いて行う５１Ｃｒ遊離試験において、エフェクター細胞を得るために用いたペプチドと同じペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３１細胞（ｃｏｌｄということもある。）を、ｃｏｌｄ／ｈｏｔ比１０になるように添加し、６時間インキュベーション後に上清中に遊離した５１Ｃｒの放射活性を測定した。ネガティブコントロールとして、ＨＩＶペプチド（配列番号２０）でパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３１細胞を用いた。図１０に代表的な例として、５６−Ｐ２８（配列番号３）で培養した患者例５（大腸癌）由来のＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた結果を示す。エフェクター細胞は、ＭＫＮ２８−Ａ３１細胞に対して細胞傷害活性を示し、ＭＫＮ２８−Ａ３１細胞を溶解した。しかし、標的細胞としてＭＫＮ２８−Ａ３１細胞にｃｏｌｄを添加したものを用いたとき、エフェクター細胞のＭＫＮ２８−Ａ３１細胞に対する細胞傷害活性は有意に低下した。一方、ネガティブコントロールを加えても、エフェクター細胞の細胞傷害活性に影響は見られなかった。このことから、ペプチドによりＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬは該ペプチドに特異的であることが判明した。
【００８７】
【実施例５】
（ペプチドによる癌患者末梢血単核細胞からのＣＴＬの誘導）
ペプチド４０−Ｐ４７（配列番号１）、５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、８５−Ｐ１０（配列番号７）および８５−Ｐ１１（配列番号８）について、ヒトＰＢＭＣからのＣＴＬ誘導能を検討した。ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者６例（肺癌患者２例、前立腺癌患者３例および大腸癌患者１例）およびＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者９例（肺癌患者２例、前立腺癌患者５例、膀胱癌患者１例およびメラノーマ患者１例）の各血液試料から常法に従って調製した。
【００８８】
各ＰＢＭＣ（細胞数１×１０５）はペプチド各１０μＭと共に実施例３に記載の方法で培養し、エフェクター細胞として用いた。標的細胞として、各ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞またはＣ１Ｒ−Ａ１１細胞を用いた。Ｃ１Ｒ−Ａ３３細胞およびＣ１Ｒ−Ａ１１細胞はそれぞれ、Ｃ１Ｒ細胞にＨＬＡ−３３　ｃＤＮＡおよびＨＬＡ−Ａ１１　ｃＤＮＡを常法により遺伝子導入して作作成した。エフェクター細胞と標的細胞とは、培養またはパルスに用いたペプチドが一致するように組合わせて、Ｅ／Ｔ比１０で混合し、５％ＣＯ２−９５％Ａｉｒの条件下で３７℃にて１８時間インキュベーションした。インキュベーション後の上清１００μｌを回収して、産生されたＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡにより測定した。また、ネガティブコントロールとしてＨＬＡ−Ａ３１拘束性ＣＴＬを誘導しないＨＩＶペプチド（配列番号２０）を用い、ＨＩＶペプチドをパルスした細胞を認識したＣＴＬのＩＦＮ−γ産生量をバックグランドとして各測定値から減算した。ポジティブコントロールとしてはインフルエンザウイルス由来ペプチド（Ｆｌｕペプチド：ＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫ、配列番号２１）およびエプスタインバーウイルス由来ペプチド（ＥＢＶペプチド：ＩＶＴＤＦＳＶＩＫ、配列番号２２）を用いた。算出された各測定値（ＮＥＴ）はスチューデントｔ検定で統計処理し、Ｐ値が０．０５以下であるものを有意差があると見なした。ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者由来のＰＢＭＣおよびＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者由来のＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた結果をそれぞれ表３および４に示した。これらの表中で、ＩＦＮ−γ産生の促進が有意であると認められたものを下線で示した。
【００８９】
５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、８５−Ｐ１０（配列番号７）または８５−Ｐ１１（配列番号８）と共にそれぞれ培養した６例のＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者由来のＰＢＭＣのうち、それぞれ２例（３３％）、１例（１７％）、１例（１７％）、１例（１７％）、４例（６７％）、および４例（６７％）のＰＢＭＣがＩＦＮ−γ産生を促進した（表３）。すなわち、これらペプチドが、ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対する反応におけるＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者由来ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進したと考えられる。
【００９０】
また、４０−Ｐ４７（配列番号１）、５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、または８５−Ｐ１０（配列番号７）と共にそれぞれ培養した９例のＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者由来のＰＢＭＣのうち、それぞれ２例（２２％）、４例（４４％）、２例（２２％）、１例（１１％）、２例（２２％）、および４例（４４％）のＰＢＭＣがＩＦＮ−γ産生を促進した（表４）。すなわち、これらペプチドが、ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞に対する反応におけるＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者由来ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進したと考えられる。
【００９１】
【表３】ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者由来のＰＢＭＣからのＣＴＬ誘導
2004000216.tif 000004
【００９２】
【表４】ＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者由来のＰＢＭＣからのＣＴＬ誘導
2004000216.tif 000005
表３および４において、ＮＴとは試験しなかったこと意味する。
【００９３】
８５−Ｐ１１（配列番号８）で培養したＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者由来ＰＢＭＣの、該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生の促進は、抗クラスＩ抗体または抗クラスＣＤ８抗体により阻害された（図１１Ａ）。また、８５−Ｐ１０（配列番号７）で培養したＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者由来ＰＢＭＣの、該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生の促進も、抗クラスＩ抗体または抗クラスＣＤ８抗体により阻害された（図１１Ｂ）。これらから、上記ペプチドによりＩＦＮ−γ産生が促進された細胞は、クラスＩ抗原およびＣＤ８の表現型を示す細胞、すなわちＣＴＬであると考えられる。
【００９４】
このように、本ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３１＋癌患者のみならず、ＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者またはＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者のＰＢＭＣから各ＨＬＡ−Ａ拘束性のＣＴＬを誘導することが明らかになった。
【００９５】
【実施例６】
（ペプチドにより誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性）
実施例５においてペプチドで１２日間培養したＰＢＭＣをさらにＩＬ−２の存在下で１０日間以上培養後にエフェクター細胞として用い、各種標的細胞に対する細胞傷害活性を標準的な６時間の５１Ｃｒ遊離試験（非特許文献１５）で測定した。標的細胞として、肺腺癌細胞株ＬＣ−１（Ａ３１０１／３３０２）、子宮頚癌細胞株ＲＫＮ細胞（Ａ３３０２／）、肺腺癌細胞株１１−１８（Ａ０２０１／Ａ２４０２）、肺腺癌細胞株１−８７（Ａ０２０７／１１０１）、肺扁平上皮癌細胞株ＱＧ５６（Ａ２６０１／）、食道癌細胞株ＫＥ５（Ａ１１０１／）、大腸癌細胞株ＳＷ６２０（Ａ０２０１／２４０２）、ＨＬＡ−Ａ３３＋またはＨＬＡ−Ａ１１＋正常細胞であるＰＨＡ芽球化Ｔ細胞を用いた。
【００９６】
各ペプチドで培養したＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者由来ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ３３＋腫瘍細胞を特異的に溶解した。代表的な結果を図１２に示した。このことから、５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、８５−Ｐ１０（配列番号７）または８５−Ｐ１１（配列番号８）はＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者のＰＢＭＣから腫瘍特異的ＣＴＬを誘導することが明らかになった。
【００９７】
また、各ペプチドで培養したＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者由来ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ１１＋腫瘍細胞を特異的に溶解した。代表的な結果を図１３に示した。このことから、４０−Ｐ４７（配列番号１）、５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、または８５−Ｐ１０（配列番号７）はＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者のＰＢＭＣから腫瘍特異的ＣＴＬを誘導することが明らかになった。
【００９８】
さらに実施例４と同様の方法により、コールドターゲットインヒビションアッセイを行った。エフェクター細胞として、５６−Ｐ３１（配列番号４）と共に培養した肺癌患者由来ＰＢＭＣ（ＨＬＡ−Ａ１１／）または８５−Ｐ１０（配列番号７）と共に培養した肺癌患者由来ＰＢＭＣ（ＨＬＡ−Ａ１１／）を用いた。ポジティブコントロールとして、Ｆｌｕペプチド（配列番号２１）と共に培養したこれらＰＢＭＣを用いた。ｈｏｔとして、５１Ｃｒ標識した肺扁平上皮癌細胞株ＱＧ５６（Ａ２６０１／）または食道癌細胞株ＫＥ５（Ａ１１０１／）を用いた。ｃｏｌｄとして、５６−Ｐ３１（配列番号４）、８５−Ｐ１０（配列番号７）またはＨＩＶペプチド（配列番号２０）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞を用いた。
【００９９】
図１４Ａに示したように、５６−Ｐ３１（配列番号４）と共に培養した肺癌患者由来ＰＢＭＣ（ＨＬＡ−Ａ１１／）は、ＫＥ５細胞に対してＱＧ５６細胞と比較して強い細胞傷害作用を示した。このことから、該ＰＢＭＣはＨＬＡ−Ａ１１拘束性に細胞傷害活性を示すことが明らかになった。標的細胞としてＫＥ５細胞にｃｏｌｄ（５６−Ｐ３１（配列番号４）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞）を添加したものを用いたとき、ＫＥ５細胞に対する該ＰＢＭＣの細胞傷害活性は有意に低下した。一方、ＨＩＶペプチド（配列番号２０）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞を加えても、ＫＥ５細胞に対する該ＰＢＭＣの細胞傷害活性に影響は見られなかった。また、図１４Ｂに示したように、８５−Ｐ１０（配列番号７）と共に培養した肺癌患者由来ＰＢＭＣ（ＨＬＡ−Ａ１１／）のＫＥ５細胞に対する細胞傷害活性も同様に、ｃｏｌｄ（８５−Ｐ１０（配列番号７）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞）の添加により有意に低下した。
【０１００】
これらから、これらペプチドによりＰＢＭＣから誘導されたＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＣＴＬはペプチド特異的であることが判明した。また、該ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ１１と該ペプチドとの複合体を認識することが明らかになった。
【実施例７】
（組織および各種癌細胞における各クローンの発現）
実施例１で得られたクローン４０、クローン４５、クローン５６、クローン７６およびクローン８５のうち、クローン４０、クローン５６、クローン７６およびクローン８５について、組織および各種癌細胞におけるｍＲＮＡの発現をノザンブロッティング分析により検討した。ノザンブロッティング分析は、各種腫瘍細胞（肺腺癌細胞株１−８７、胃腺癌細胞株ＭＫＮ−２８、肺腺癌細胞株ＬＣ−１、大腸癌細胞株ＳＷ６２０および食道癌細胞株ＫＥ４）または健常人由来のＰＢＭＣから抽出した総ＲＮＡ、あるいは各組織由来の総ＲＮＡを用いて、既報（非特許文献２９）に記載の方法に準じて行った。プローブｃＤＮＡは、３２Ｐ標識した以下のものを用いた；ＥｃｏＲＩで消化したクローン４０の第４２０〜１，３１４番目の０．９ｋｂ断片ｃＤＮＡ；ＸｂａＩで消化したクローン５６の第３３４〜１，５９８番目の１．３ｋｂｐ断片ｃＤＮＡ；ＢａｒＩおよびＮｃｏＩで消化したクローン７８の第４９４〜１，１６９番目の０．７ｋｂｐ断片ｃＤＮＡ；ＨｉｎｄＩＩＩで消化したクローン８５の第８５８〜１，７９８番目の０．９ｋｂｐ断片ｃＤＮＡ。また、β−アクチンｍＲＮＡを発現程度のコントロールとして同様に検出した。β−アクチンｍＲＮＡ検出用プローブとして、ヒトβ−アクチンｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いた。得られた結果を基に、下記式１により相対的発現レベルを算出し、表５に示した。
【０１０１】
【式１】
インデックス＝（試料の各クローン濃度／試料のβ−アクチン濃度）×（ＳＷ６２０細胞のβ−アクチン濃度／ＳＷ６２０細胞の各クローン濃度）
【０１０２】
【表５】
2004000216.tif 000006
【０１０３】
クローン４０、クローン５６、クローン７６およびクローン８５はいずれも、検討した全ての腫瘍細胞で高いレベルで発現していた。クローン４０、クローン５６、およびクローン７６は精巣においても発現していたが、そのレベルは腫瘍細胞と同等か、より低かった。一方、精巣以外の正常組織における発現レベルは低かった。クローン８５は、正常組織においても発現レベルが高く、精巣において強く発現していたが、それ以外の正常組織にける発現レベルは腫瘍細胞における発現レベルより低かった。
【０１０４】
【発明の効果】
ＨＬＡ−Ａ３１拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子を、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ６２０から単離・同定した。さらに得られた遺伝子にコードされるポリペプチドに基づいて、該腫瘍抗原のエピトープを有するペプチドを見出した。
本ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３１＋癌患者、ＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者またはＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者の血液より調製した末梢血単核細胞から、該ペプチドおよびポリペプチドを認識して腫瘍細胞を傷害する腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。ＨＬＡ−Ａ３１対立遺伝子、ＨＬＡ−Ａ１１対立遺伝子またはＨＬＡ−Ａ３３対立遺伝子はＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡであり、世界人口の多くで発現が認められるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子である。このように本ペプチドは、１つのペプチドであってもＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属する１つまたは複数のＨＬＡ−Ａ拘束性に腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るという特徴を有する。したがって、本発明は、大多数の癌患者の特異的免疫療法に適応できる可能性があり、非常に有用性が高い。
また、本ポリペプチドまたはペプチドは、既に報告されている腫瘍抗原ペプチドと組合わせて使用することにより、複数種類のＨＬＡ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導および／または活性化が可能であるため、本発明により癌の多様性に対応することが可能になる。
このように本発明により、癌等の、例えば前立腺癌、大腸癌、胃癌、子宮頚癌、乳癌、肺腺癌、食道癌、膀胱癌またはメラノーマ等の特異的免疫療法が可能になり、癌治療において多大な貢献を期待できる。特に、ＨＬＡ表現型の一方または両方がＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡである癌患者の特異的免疫療法の開発に有用である。また、本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞による癌の認識に関する分子の基礎的研究にも多大に寄与するものである。
【０１０５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：ＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列番号２：ＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列番号３：ＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列番号４：ＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列番号５：ＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列番号６：ＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列番号７：ＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列番号８：ＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列番号２０：ＨＩＶ蛋白質から設計したペプチド
配列番号２１：インフルエンザウイルス蛋白質から設計したペプチド
配列番号２２：ＥＢＶ蛋白質から設計したペプチド
【０１０６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチド４０−Ｐ４７（配列番号１）がＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＯＫＡ３１−ＣＴＬ）を活性化してＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。図中、ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図２】ペプチド４５−Ｐ５４（配列番号２）および４０−Ｐ４７（配列番号１）がＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＯＫＡ３１−ＣＴＬ）を活性化してＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。図中、ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図３】ペプチド５６−Ｐ２８（配列番号３）がＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＯＫＡ３１−ＣＴＬ）を活性化してＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。図中、ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図４】ペプチド５６−Ｐ２８（配列番号３）および５６−Ｐ３１（配列番号４）がＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＯＫＡ３１−ＣＴＬ）を活性化してＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。図中、ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図５】ペプチド５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）および７６−Ｐ２０（配列番号６）がＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＯＫＡ３１−ＣＴＬ）を活性化してＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。図中、ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図６】ペプチド８５−Ｐ１０（配列番号７）がＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＯＫＡ３１−ＣＴＬ）を活性化してＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。図中、ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図７】ペプチド８５−Ｐ１１（配列番号８）がＨＬＡ−Ａ３１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＯＫＡ３１−ＣＴＬ）を活性化してＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。図中、ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図８】図８Ａは、ペプチド８５−Ｐ１１（配列番号８）または５６−Ｐ２８（配列番号３）で培養したＨＬＡ−Ａ３１＋癌患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、ＨＬＡ−Ａ３１＋肺腺癌細胞株に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生を促進したが、ＨＬＡ−Ａ３１−腫瘍細胞（１−８７およびＳＷ６２０）に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生は促進しなかったことを示す図である。図８Ｂは、ペプチド８５−Ｐ１１（配列番号８）で培養したＨＬＡ−Ａ３１＋癌患者由来ＰＢＭＣが、ＨＬＡ−Ａ３１−腫瘍細胞ＭＫＮ２８に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生を促進しないが、ＨＬＡ−Ａ３１　ｃＤＮＡを導入したＭＫＮ２８（ＭＫＮ２８−Ａ３１）に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生は促進したことを示す図である。図８Ｃは、ペプチド５６−Ｐ２８（配列番号３）で培養したＨＬＡ−Ａ３１＋癌患者由来ＰＢＭＣが、当該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３１細胞に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生を促進したが、ＨＩＶペプチド（配列番号２０）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３１細胞に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生は促進しなかったことを示す図である。図８ＡからＣにおいて、ペプチドにより促進されたＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−クラスＩ抗体または抗ＣＤ８抗体により阻害された。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ検定により有意差が認められたことを示す。
【図９】ペプチド４０−Ｐ４７（配列番号１）、５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、５６−Ｐ３２（配列番号５）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、８５−Ｐ１０（配列番号７）または８５−Ｐ１１（配列番号８）で培養したＨＬＡ−Ａ３１＋癌患者由来の末梢血単核細胞が、ＨＬＡ−Ａ３１＋肺腺癌細胞株ＬＣ−１を溶解したが、ＨＬＡ−Ａ３１−肺腺癌細胞株１−８７およびＨＬＡ−Ａ３１＋ＰＨＡ芽球化正常Ｔ細胞は溶解しなかったことを示す図である。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ検定により有意差が認められたことを示す。
【図１０】コールドターゲットインヒビションアッセイにおいて、ペプチド５６−Ｐ２８（配列番号３）で培養したＨＬＡ−Ａ３１＋癌患者由来の末梢血単核細胞のＭＫＮ２８−Ａ３１細胞に対する溶解作用が、当該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３１細胞の添加により阻害されたが、ＨＩＶペプチド（配列番号２０）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３１では阻害されなかったことを示す図である。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ検定により有意差が認められたことを示す。
【図１１】図１１Ａは、ペプチド８５−Ｐ１１（配列番号８）で培養したＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３１に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。一方、ＨＩＶペプチド（配列番号２０）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３１は認識せずＩＦＮ−γ産生を促進を促進しなかった。また、ＩＦＮ−γ産生の促進は、抗ＨＬＡ−クラスＩ抗体または抗ＣＤ８抗体により阻害された。図１１Ｂは、ペプチド８５−Ｐ１０（配列番号７）で培養したＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。一方、ＨＩＶペプチド（配列番号２０）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１は認識せずＩＦＮ−γ産生を促進を促進しなかった。また、ＩＦＮ−γ産生の促進は、抗ＨＬＡ−クラスＩ抗体または抗ＣＤ８抗体により阻害された。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ検定により有意差が認められたことを示す。
【図１２】ペプチド５６−Ｐ２８（配列番号３）、５６−Ｐ３１（配列番号４）、７６−Ｐ２０（配列番号６）、８５−Ｐ１０（配列番号７）または８５−Ｐ１１（配列番号８）で培養したＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者由来の末梢血単核細胞が、ＨＬＡ−Ａ３３＋腫瘍細胞株（ＬＣ−１およびＲＫＮ）を溶解したが、ＨＬＡ−Ａ３１−腫瘍細胞株（１１−８７および１−８７）およびＨＬＡ−Ａ３３＋ＰＨＡ芽球化正常Ｔ細胞（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ）は溶解しなかったことを示す図である。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ検定により有意差が認められたことを示す。
【図１３】ペプチド４０−Ｐ４７（配列番号１）、５６−Ｐ２８（配列番号３）、７６−Ｐ２０（配列番号６）または８５−Ｐ１０（配列番号７）で培養したＨＬＡ−Ａ１１＋癌患者由来の末梢血単核細胞が、ＨＬＡ−Ａ１１＋腫瘍細胞株（１−８７およびＫＥ５）を溶解したが、ＨＬＡ−Ａ１１−腫瘍細胞株（ＭＫＮ２８、ＲＫＮおよびＳＷ６２０）およびＨＬＡ−Ａ１１＋ＰＨＡ芽球化正常Ｔ細胞（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ）は溶解しなかったことを示す図である。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ検定により有意差が認められたことを示す。
【図１４】図１４Ａは、コールドターゲットインヒビションアッセイにおいて、ペプチド５６−Ｐ３１（配列番号４）で培養したＨＬＡ−Ａ１１＋肺癌患者由来の末梢血単核細胞のＫＥ５細胞に対する溶解作用が、当該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞の添加により阻害されたが、ＨＩＶペプチド（配列番号２０）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１では阻害されなかったことを示す図である。図１４Ｂは、同アッセイにおいてペプチド８５−Ｐ１０（配列番号７）で培養したＨＬＡ−Ａ１１＋膀胱癌癌患者由来の末梢血単核細胞のＫＥ５細胞に対する溶解作用が、当該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞の添加により阻害されたが、ＨＩＶペプチド（配列番号２０）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１では阻害されなかったことを示す図である。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ検定により有意差が認められたことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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