(57)【要約】【課題】軟骨障害を反映する疾患マーカー、該疾患マーカーを利用した軟骨障害の検出方法、該障害の改善に有用な薬物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドを、軟骨障害の疾患マーカーとして利用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の５−ＨＴ７（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ受容体７）遺伝子の塩基配列、配列番号３に記載のＥＤＧ２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　２）遺伝子の塩基配列、配列番号５に記載のＥＤＧ１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　１）遺伝子の塩基配列、配列番号７に記載のＥＴ（Ａ）（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ　Ａ）　遺伝子の塩基配列、配列番号９に記載のＧＰＲ８８（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ８８）遺伝子の塩基配列、配列番号１１に記載のＰＴＨ２Ｒ（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２）遺伝子の塩基配列、配列番号１３に記載のＶＩＰ１Ｒ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ１）遺伝子の塩基配列、配列番号１５に記載のＣＬＩＣ２（Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｈａｎｎｅｌ２）遺伝子の塩基配列、配列番号１７に記載のＳＣＮ２Ａ（Ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）遺伝子の塩基配列、配列番号１９に記載のＡＴＡ１（Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　Ａ１）遺伝子の塩基配列、配列番号２１に記載のＡＢＣＡ１（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ，　ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ　Ａ，ｍｅｍｂｅｒ１）遺伝子の塩基配列、配列番号２３に記載のＡＢＣＧ２（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ，　ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ　Ｇ，　ｍｅｍｂｅｒ２）遺伝子の塩基配列、配列番号２５に記載のＧＡＴ１（ＧＡＢＡ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）遺伝子の塩基配列、配列番号２７に記載のＰＬＴＰ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の塩基配列、配列番号２９に記載のＥＮＴ１（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）遺伝子の塩基配列、配列番号３１に記載のＮＰＴ３（Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ３）遺伝子の塩基配列、または、配列番号３３に記載のＩＲＥＧ１（Ｉｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる、軟骨障害の疾患マーカー。
【請求項２】
軟骨障害の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される請求項１記載の疾患マーカー。
【請求項３】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、軟骨障害の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと請求項１または２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、軟骨障害の罹患を判断する工程。
【請求項４】
配列番号２に記載の５−ＨＴ７のアミノ酸配列、配列番号４に記載のＥＤＧ２のアミノ酸配列、配列番号６に記載のＥＤＧ１のアミノ酸配列、配列番号８に記載のＥＴ（Ａ）のアミノ酸配列、配列番号１０に記載のＧＰＲ８８のアミノ酸配列、配列番号１２に記載のＰＴＨ２Ｒのアミノ酸配列、配列番号１４に記載のＶＩＰ１Ｒのアミノ酸配列、配列番号１６に記載のＣＬＩＣ２のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のＳＣＮ２Ａのアミノ酸配列、配列番号２０に記載のＡＴＡ１のアミノ酸配列、配列番号２２に記載のＡＢＣＡ１　のアミノ酸配列、配列番号２４に記載のＡＢＣＧ２のアミノ酸配列、配列番号２６に記載のＧＡＴ１のアミノ酸配列、配列番号２８に記載のＰＬＴＰのアミノ酸配列、配列番号３０に記載のＥＮＴ１のアミノ酸配列、配列番号３２に記載のＮＰＴ３のアミノ酸配列、または配列番号３４に記載のＩＲＥＧ１のアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体を含有する、軟骨障害の疾患マーカー。
【請求項５】
軟骨障害の検出においてプローブとして使用される請求項４記載の疾患マーカー。
【請求項６】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、軟骨障害の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と請求項４または５に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、軟骨障害の罹患を判断する工程。
【請求項７】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質と５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
【請求項８】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、５−ＨＴ７遺伝子の発現を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質と５−ＨＴ７遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞の５−ＨＴ７遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、５−ＨＴ７遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
【請求項９】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＤＧ２遺伝子の発現を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質とＥＤＧ２遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞のＥＤＧ２遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＤＧ２遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
【請求項１０】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質とＶＩＰ１Ｒ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞のＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
【請求項１１】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＧＡＴ１　遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質とＧＡＴ１　遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞のＧＡＴ１　遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、ＧＡＴ１　遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項１２】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＥＴ（Ａ）　遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質とＥＴ（Ａ）　遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞のＥＴ（Ａ）　遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＴ（Ａ）　遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項１３】
軟骨障害の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、請求項７乃至１２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質と５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１を発現可能な細胞、または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞または細胞画分における、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞もしくは対照細胞画分における上記タンパク質の発現量と比較する工程、
（ｃ）　上記（ｂ）の比較結果に基づいて、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
【請求項１５】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の機能または活性を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分の上記蛋白質の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の機能（活性）を変動させる被験物質を選択する工程。
【請求項１６】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、５−ＨＴ７の機能または活性を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）５−ＨＴ７を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７の機能（活性）を亢進する被験物質を選択する工程。
【請求項１７】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＤＧ２の機能または活性を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＤＧ２を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＤＧ２由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分のＥＤＧ２の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＤＧ２の機能（活性）を亢進する被験物質を選択する工程。
【請求項１８】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＶＩＰ１Ｒの機能または活性を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＶＩＰ１Ｒを含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＶＩＰ１Ｒ由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分のＶＩＰ１Ｒの機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＶＩＰ１Ｒの機能（活性）を亢進する被験物質を選択する工程。
【請求項１９】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＧＡＴ１の機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＧＡＴ１を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＧＡＴ１由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分のＧＡＴ１の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＧＡＴ１の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程。
【請求項２０】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＴ（Ａ）の機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＴ（Ａ）を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＴ（Ａ）由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分のＥＴ（Ａ）の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＴ（Ａ）の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程。
【請求項２１】
軟骨障害の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、請求項１４乃至２０のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現を制御する物質を有効成分とする軟骨障害の改善または治療剤。
【請求項２３】
５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現を制御する物質が請求項７乃至１２のいずれかに記載のスクリーニング法により得られるものである、請求項２２記載の軟骨障害の改善または治療剤。
【請求項２４】
５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、もしくは、ＩＲＥＧ１の発現量または機能（活性）を制御する物質を有効成分とする、軟骨障害の改善または治療剤。
【請求項２５】
５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、もしくは、ＩＲＥＧ１の発現量または機能（活性）を制御する物質が、請求項１４乃至２０のいずれかに記載のスクリーニング法により得られるものである、請求項２４記載の軟骨障害の改善または治療剤。
【請求項２６】
５−ＨＴ７、ＥＤＧ２またはＶＩＰ１Ｒの機能（活性）亢進物質を有効成分とする、軟骨障害の改善または治療剤。
【請求項２７】
ＥＴ（Ａ）またはＧＡＴ１の機能（活性）抑制物質を有効成分とする、軟骨障害の改善または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は軟骨障害の診断に有用な疾患マーカーに関する。より詳細には、本発明は軟骨障害、例えば変形性関節症や軟骨形成異常症、変形性椎間板症、軟骨の欠損、軟骨損傷、半月板損傷、あるいは骨折の修復・治癒不全等の疾患の遺伝子診断において、プライマーまたは検出プローブとして有効に利用できる疾患マーカーに関する。
【０００２】
また本発明は、上記疾患マーカーを利用して、軟骨障害を検出する方法（診断方法）、軟骨障害の改善または治療薬として有効な物質をスクリーニングする方法、および該スクリーニング方法によって得られる物質を有効成分とする軟骨障害の改善または治療薬に関する。
【０００３】
【従来の技術】
軟骨は軟骨細胞とこれを取り囲む基質からなる結合組織であり、関節、脊柱の椎間板、肋軟骨、耳介、外耳道、恥骨結合、咽頭蓋などに存在する。軟骨の作用としては、骨端の摩擦の低減（関節軟骨）、弾性の保持（耳介軟骨）、運動機能（肋軟骨、恥骨軟骨など）が知られており、軟骨は生体の機能維持の上で重要な作用を有している。従来から軟骨の障害に起因する種々の疾患が知られており、例えば、変形性関節症、軟骨形成異常症、変形性椎間板症、骨折の修復・治癒不全などが例示される。特に、高齢化社会の到来、スポーツによる外傷の増加、キーパンチャー病などに代表される職業病の出現などにより、軟骨障害患者は著しく増加しており、この領域における医療の進歩が要望されている。
【０００４】
従来から軟骨障害を治療するために種々の治療法が試みられてきているが、それらは直接的に原因の解消を目的とするものではなく、例えば、抗炎症剤を投与することにより、その疾患に基づく痛みなどの障害を抑制する方法、関節にヒアルロン酸製剤などを注入して関節の動きを潤滑にする方法など、対症療法的なものでしかなかった。また軟骨欠損に対する治療法として、軟骨細胞移植が行なわれているが、移植後のホスト側の軟骨基質との接着が不十分であり、治療法としての確立はなされていない。さらに軟骨細胞移植治療法は侵襲性であることから、患者への負担が大きく、また感染の可能性も否定できない。
【０００５】
以上のように軟骨障害の根治的治療法は見出されていないことから、特に患者数が多い変形性関節症などでは、その有効な治療剤、および当該治療剤探索のための新規なスクリーニング系の構築が期待されている。
【０００６】
また、最近の医療現場では、軟骨障害に限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法を的確に選択することが望まれるようになってきている。高齢化社会でのＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｆｅ）向上の必要性が認識されてきた近年では、特に、万人に共通した治療ではなく、個々の患者の症状に合わせて適切な治療が施されることが強く求められている。このような所謂テイラーメイド治療を行うためには、個々の疾患について患者の症状やその原因（遺伝的背景）を的確に反映する疾患マーカーが有用であり、その探索並びに開発を目指した研究が精力的に行われているのが現状である。
【０００７】
一方、５−ＨＴ７（非特許文献１）、ＥＤＧ２（非特許文献２）、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）（非特許文献３）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ（非特許文献４）、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１（非特許文献５）、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３およびＩＲＥＧ１はそれぞれ公知の因子であるが、これらの因子と軟骨障害との関係は知られていない。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６８（３１），　２３４２２−２３４２６　（１９９３）
【非特許文献２】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２３１（３），　６１９−６２２　（１９９７）
【非特許文献３】
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８８（８），　３１８５−３１８９　（１９９１）
【非特許文献４】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９３（２），　５４６−５５３　（１９９３）
【非特許文献５】
Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６７，　２１０９８−２１１０４　（１９９２）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、軟骨障害の診断及び治療に有用な疾患マーカーを提供することを目的とする。より詳細には、本発明は軟骨の障害に起因する疾患（軟骨障害）を特異的に反映した疾患マーカーを提供することを目的とする。さらに本発明は該疾患マーカーを利用した軟骨障害の検出方法（遺伝子診断方法）、該疾患の改善または治療に有用な薬物をスクリーニングする方法、並びに該疾患の改善または治療に有用な薬物を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行っていたところ、従来は変形性関節症等の軟骨障害との関連が知られていなかった以下の遺伝子：５−ＨＴ７遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１９８５９）、ＥＤＧ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１４００）、ＥＴ（Ａ）遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１９５７）、ＧＰＲ８８遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０２２０４９）、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００５０４８）、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４６２４）、ＣＬＩＣ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１２８９）、ＡＴＡ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３０６７４）、ＡＢＣＡ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００５５０２）、ＰＬＴＰ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００６２２７）、ＮＰＴ３　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｕ９０５４４）、並びに、ＩＲＥＧ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１４５８５）が、軟骨障害のモデル動物であるラット十字靭帯切断モデルの障害軟骨において、正常軟骨と比較して有意に発現が上昇していることを見出した。また、ＥＤＧ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１４０１）、ＳＣＮ２Ａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿２１００７，　およびＡＦ３２７２４６）、ＡＢＣＧ２　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４８２７）、ＥＮＴ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４９５５）、並びに、ＧＡＴ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｘ５４６７３　）が、前記モデルの障害軟骨において、正常軟骨と比較して有意に発現が減少していることを見出した。
このことから、本発明者らは、かかる遺伝子が軟骨障害の疾患マーカーであり、またこれらの遺伝子を標的として軟骨障害を伴う疾患を緩和、抑制する治療薬の候補薬をスクリーニングすることが可能であるとの確信を得た。本発明はかかる知見を基礎として完成するに至ったものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記に掲げるものである：
項１．　配列番号１に記載の５−ＨＴ７（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ受容体７）遺伝子の塩基配列、配列番号３に記載のＥＤＧ２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　２）遺伝子の塩基配列、配列番号５に記載のＥＤＧ１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　１）遺伝子の塩基配列、配列番号７に記載のＥＴ（Ａ）（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ　Ａ）　遺伝子の塩基配列、配列番号９に記載のＧＰＲ８８（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ８８）遺伝子の塩基配列、配列番号１１に記載のＰＴＨ２Ｒ（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）遺伝子の塩基配列、配列番号１３に記載のＶＩＰ１Ｒ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ１）遺伝子の塩基配列、配列番号１５に記載のＣＬＩＣ２（Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｈａｎｎｅｌ２）遺伝子の塩基配列、配列番号１７に記載のＳＣＮ２Ａ（Ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）遺伝子の塩基配列、配列番号１９に記載のＡＴＡ１（Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　Ａ１）遺伝子の塩基配列、配列番号２１に記載のＡＢＣＡ１（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ，　ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ　Ａ，　ｍｅｍｂｅｒ１）遺伝子の塩基配列、配列番号２３に記載のＡＢＣＧ２（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ　Ｇ，　ｍｅｍｂｅｒ２）遺伝子の塩基配列、配列番号２５に記載のＧＡＴ１（ＧＡＢＡｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）遺伝子の塩基配列、配列番号２７に記載のＰＬＴＰ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の塩基配列、配列番号２９に記載のＥＮＴ１（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）遺伝子の塩基配列、配列番号３１に記載のＮＰＴ３（Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ３）遺伝子の塩基配列、または、配列番号３３に記載のＩＲＥＧ１（Ｉｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる、軟骨障害の疾患マーカー。
項２．　軟骨障害の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される項１記載の疾患マーカー。
項３．　　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、軟骨障害の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと項１または２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、軟骨障害の罹患を判断する工程。
項４．　　配列番号２に記載の５−ＨＴ７のアミノ酸配列、配列番号４に記載のＥＤＧ２のアミノ酸配列、配列番号６に記載のＥＤＧ１のアミノ酸配列、配列番号８に記載のＥＴ（Ａ）のアミノ酸配列、配列番号１０に記載のＧＰＲ８８のアミノ酸配列、配列番号１２に記載のＰＴＨ２Ｒのアミノ酸配列、配列番号１４に記載のＶＩＰ１Ｒのアミノ酸配列、配列番号１６に記載のＣＬＩＣ２のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のＳＣＮ２Ａのアミノ酸配列、配列番号２０に記載のＡＴＡ１のアミノ酸配列、配列番号２２に記載のＡＢＣＡ１　のアミノ酸配列、配列番号２４に記載のＡＢＣＧ２のアミノ酸配列、配列番号２６に記載のＧＡＴ１のアミノ酸配列、配列番号２８に記載のＰＬＴＰのアミノ酸配列、配列番号３０に記載のＥＮＴ１のアミノ酸配列、配列番号３２に記載のＮＰＴ３のアミノ酸配列、または配列番号３４に記載のＩＲＥＧ１のアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体を含有する、軟骨障害の疾患マーカー。
項５．　軟骨障害の検出においてプローブとして使用される項４記載の疾患マーカー。
項６．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、軟骨障害の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と項４または５に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、軟骨障害の罹患を判断する工程。
項７．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質と５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
項８．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、５−ＨＴ７遺伝子の発現を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質と５−ＨＴ７遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞の５−ＨＴ７遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、５−ＨＴ７遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
項９．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＤＧ２遺伝子の発現を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質とＥＤＧ２遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞のＥＤＧ２遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＤＧ２遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
項１０．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質とＶＩＰ１Ｒ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞のＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
項１１．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＧＡＴ１　遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質とＧＡＴ１　遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞のＧＡＴ１　遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、ＧＡＴ１　遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
項１２．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＥＴ（Ａ）遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質とＥＴ（Ａ）遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞のＥＴ（Ａ）遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＴ（Ａ）遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
項１３．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＤＧ１遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＬＴＰ遺伝子またはＩＲＥＧ１遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質とＥＤＧ１遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＬＴＰ遺伝子またはＩＲＥＧ１遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞のＥＤＧ１遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＬＴＰ遺伝子またはＩＲＥＧ１遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）　（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＤＧ１遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＬＴＰ遺伝子またはＩＲＥＧ１遺伝子の発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
項１４．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＴ（Ａ）、ＶＩＰ１ＲまたはＳＣＮ２Ａの発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子もしくはＳＣＮ２Ａ遺伝子の発現制御領域の下流にマーカー遺伝子を結合させた融合遺伝子を含む細胞と、被験物質を接触させる工程、
（ｂ）　前記マーカー遺伝子の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照における前記マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＴ（Ａ）、ＶＩＰ１ＲまたはＳＣＮ２Ａの発現を変動させる被験物質を選択する工程。
項１５．　軟骨障害の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、項７乃至１４のいずれかに記載のスクリーニング方法、
項１６．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　被験物質と５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１を発現可能な細胞、または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた細胞または細胞画分における、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞もしくは対照細胞画分における上記タンパク質の発現量と比較する工程、
（ｃ）　上記（ｂ）の比較結果に基づいて、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
項１７．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の機能または活性を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分の上記蛋白質の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の機能（活性）を変動させる被験物質を選択する工程。
項１８．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、５−ＨＴ７の機能または活性を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）５−ＨＴ７を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７の機能（活性）を亢進する被験物質を選択する工程。
項１９．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＤＧ２の機能または活性を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＤＧ２を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＤＧ２由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分のＥＤＧ２の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＤＧ２の機能（活性）を亢進する被験物質を選択する工程。
項２０．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＶＩＰ１Ｒの機能または活性を亢進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＶＩＰ１Ｒを含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＶＩＰ１Ｒ由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分のＶＩＰ１Ｒの機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＶＩＰ１Ｒの機能（活性）を亢進する被験物質を選択する工程。
項２１．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＧＡＴ１の機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＧＡＴ１を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＧＡＴ１由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分のＧＡＴ１の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＧＡＴ１の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程。
項２２．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＴ（Ａ）の機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＴ（Ａ）を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＴ（Ａ）由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分のＥＴ（Ａ）の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＴ（Ａ）の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程。
項２３．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＤＧ１、ＧＰＲ８８、ＰＬＴＰ、またはＩＲＥＧ１の機能または活性を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）　ＥＤＧ１、ＧＰＲ８８、ＰＬＴＰ、またはＩＲＥＧ１を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＤＧ１、ＧＰＲ８８、ＰＬＴＰ、またはＩＲＥＧ１の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＤＧ１、ＧＰＲ８８、ＰＬＴＰ、またはＩＲＥＧ１の機能（活性）を変動させる被験物質を選択する工程。
項２４．　軟骨障害の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、項１６乃至２３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
項２５．　５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現を制御する物質を有効成分とする軟骨障害の改善または治療剤。
項２６．　５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現を制御する物質が請求項７乃至１４のいずれかに記載のスクリーニング法により得られるものである、項２５記載の軟骨障害の改善または治療剤。
項２７．　５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、もしくは、ＩＲＥＧ１の発現量または機能（活性）を制御する物質を有効成分とする、軟骨障害の改善または治療剤。
項２８．　５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、もしくは、ＩＲＥＧ１の発現量または機能（活性）を制御する物質が、項１６乃至２３のいずれかに記載のスクリーニング法により得られるものである、項２７記載の軟骨障害の改善または治療剤。
項２９．　ＥＤＧ１、ＧＰＲ８８、ＰＬＴＰまたはＩＲＥＧ１の機能（活性）制御物質を有効成分とする、軟骨障害の改善または治療剤。
項３０．　５−ＨＴ７、ＥＤＧ２またはＶＩＰ１Ｒの機能（活性）亢進物質を有効成分とする、軟骨障害の改善または治療剤。
項３１．　ＥＴ（Ａ）またはＧＡＴ１の機能（活性）抑制物質を有効成分とする、軟骨障害の改善または治療剤。
項３２．　配列番号１に記載の５−ＨＴ７遺伝子、配列番号５に記載のＥＤＧ１遺伝子、配列番号９に記載のＧＰＲ８８遺伝子、配列番号２７に記載のＰＬＴＰ遺伝子または配列番号３３に記載のＩＲＥＧ１遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる、軟骨障害の疾患マーカー。
項３３．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、軟骨障害の検出方法：（ａ）　被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと項３２に記載の疾患マーカーの疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）　該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドの量を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果が、正常者の生体試料における測定結果よりも大きいか否かを指標として軟骨障害の罹患を判断する工程。
項３４．　配列番号２５に記載のＧＡＴ１遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる、軟骨障害の疾患マーカー。
項３５．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、軟骨障害の検出方法：
（ａ）　被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと項３４に記載の疾患マーカーの疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）　該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果が、正常者の生体試料における測定結果よりも小さいか否かを指標として軟骨障害の罹患を判断する工程。
項３６．　配列番号２に記載の５−ＨＴ７、配列番号６に記載のＥＤＧ１、配列番号１０に記載のＧＰＲ８８、配列番号２８に記載のＰＬＴＰまたは配列番号３４に記載のＩＲＥＧ１のアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体を含有する、軟骨障害の疾患マーカー。
項３７．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、軟骨障害の検出方法：
（ａ）　被験者の生体試料から調製されたタンパク質と項３６に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）　該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドの量を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果が、正常者の生体試料における測定結果よりも大きいか否かを指標として軟骨障害の罹患を判断する工程。
項３８．　配列番号２５に記載のＧＡＴ１のアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体を含有する、軟骨障害の疾患マーカー。
項３９．　下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、軟骨障害の検出方法：
（ａ）　被験者の生体試料から調製されたタンパク質と項３８に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）　該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドの量を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果が、正常者の生体試料における測定結果よりも小さいか否かを指標として軟骨障害の罹患を判断する工程。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１３８：　９　（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１３】
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子（ＤＮＡ）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体、変異体及び誘導体など）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が包含される（本明細書において、これらを総括して上記特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」の「ホモログ」ともいう。）。かかる「ホモログ」としては具体的には、後述の（１−１）項に記載のストリンジェントな条件下で、前記特定塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」とハイブリダイズするものを挙げることができる。
例えば同族体をコードする遺伝子（オルソログ）として、ヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（オルソログ）は、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：　５８７３−５８７７，　１９９３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｔｙが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をＵｎｉｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　ＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との相関を示したリストから、ヒト遺伝子に該当するマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００１４】
従って本明細書において「５−ＨＴ７遺伝子」または「５−ＨＴ７ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒト５−ＨＴ７（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ受容体７）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１に記載の５−ＨＴ７遺伝子（アイソフォームｄ；Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０００８７２）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、５−ＨＴ７ｂ遺伝子、すなわちアイソフォームｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１９８６０）］や、オルソログ［例えば、配列番号１に記載の５−ＨＴ７遺伝子のオルソログである、ラット５−ＨＴ７遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３１６８４）やマウス５−ＨＴ７遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００８３１５）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＥＤＧ２　遺伝子」または「ＥＤＧ２　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ヒトＥＤＧ２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　２）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：３に記載のＥＤＧ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１４０１）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＥＤＧ２，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｖａｒｉａｎｔ　２　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０５７１５９）］や、オルソログ［例えば、ラットＥＤＧ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０５３９３６）やマウスＥＤＧ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１０３３６）］等が挙げられる。また、本明細書において「ＥＤＧ１遺伝子」または「ＥＤＧ１　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＥＤＧ１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　１）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：５に記載のＥＤＧ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１４００）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＥＤＧ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１７３０１）やマウスＥＤＧ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００７９０１）］等が挙げられる。また、本明細書において「ＥＴ（Ａ）遺伝子」または「ＥＴ（Ａ）　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＥＴ（Ａ）（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ　Ａ）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：７に記載のＥＴ（Ａ）遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１９５７）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＥＴ（Ａ）　ｄｅｌｔａ　３遺伝子　（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ０１４８２６）、ＥＴ（Ａ）　（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｓ８１５４５）、　ＥＴ（Ａ）　ｄｅｌｔａ　３−４　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｓ８１５４５）、ＥＴ（Ａ）　ｄｅｌｔａ　４　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｓ８１５４２）］や、オルソログ［例えば、ラットＥＴ（Ａ）　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１２５５０）やマウスＥＴ（Ａ）　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＢＣ００８２７７）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＧＰＲ８８遺伝子」または「ＧＰＲ８８　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＧＰＲ８８（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　８８）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：９に記載のＧＰＲ８８遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０２２０４９）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＧＰＲ８８遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３１６９６）やマウスＧＰＲ８８遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＢ０４２４０８）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＰＴＨ２Ｒ遺伝子」または「ＰＴＨ２Ｒ　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＰＴＨ２Ｒ（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２；　ＰＴＨ２受容体）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１１に記載のＰＴＨ２Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００５０４８）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＰＴＨ２Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３１０８９）やマウスＰＴＨ２Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ３３２０７８，　ＡＦ３３２０７７）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＶＩＰ１Ｒ遺伝子」または「ＶＩＰ１Ｒ　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＶＩＰ１Ｒ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１３に記載のＶＩＰ１Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００４６２４）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＶＩＰＲ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｘ７７７７７）］や、オルソログ［例えば、ラットＶＩＰ１Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１２６８５）や、マウスＶＩＰ１Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１１７０３）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＣＬＩＣ２遺伝子」または「ＣＬＩＣ２　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＣＬＩＣ２（Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｈａｎｎｅｌ２）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１５に記載のＣＬＩＣ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８９）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＣＬＩＣ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＢＦ４１４２０８に記載された配列を含む遺伝子）やマウスＣＬＩＣ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＩ３９１０３４に記載された配列を含む遺伝子）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＳＣＮ２Ａ遺伝子」または「ＳＣＮ２Ａ　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＳＣＮ２Ａ（Ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１７に記載のＳＣＮ２Ａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿２１００７）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＳＣＮ２Ａ、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ　ｓｐｌｉｃｅｄ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ３２７２４６）、ＳＣＮ３Ａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ３３０１３５）］や、オルソログ［例えば、ラットＳＣＮ２Ａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＢＧ３７７９４８）や、マウスＳＣＮ２Ａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＫ０２０７２１）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＡＴＡ１遺伝子」または「ＡＴＡ１　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＡＴＡ１遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１９に記載のＡＴＡ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０３０６７４）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＮＧＴ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ２４７１６６）］や、オルソログ等が挙げられる。
また、本明細書において「ＡＢＣＡ１遺伝子」または「ＡＢＣＡ１　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ，　ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ　Ａ，　ｍｅｍｂｅｒ　１）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２１に記載のＡＢＣＡ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００５５０２）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＡＢＣＡ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３１７６０）やマウスＡＢＣＡ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１３４５４）］等が挙げられる。また、本明細書において「ＡＢＣＧ２遺伝子」または「ＡＢＣＧ２　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＡＢＣＧ２（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ，　ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ　Ｇ，　ｍｅｍｂｅｒ２）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２３に記載のＡＢＣＧ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００４８２７）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＭＸＲ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ０９３７７２）］や、オルソログ［例えば、ラットＡＢＣＧ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０５３７５４）やマウスＡＢＣＧ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１１９２０）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＧＡＴ１遺伝子」または「ＧＡＴ１　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＧＡＴ１（ＧＡＢＡ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２５に記載のＧＡＴ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ５４６７３）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＧＡＴ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０２４３７１）やマウスＧＡＴ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｍ９２３７８）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＰＬＴＰ遺伝子」または「ＰＬＴＰ　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＰＬＴＰ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２７に記載のＰＬＴＰ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００６２２７）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＰＬＴＰ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＡ８１７７５４）やマウスＰＬＴＰ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１１１２５）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＥＮＴ１遺伝子」または「ＥＮＴ１　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＥＮＴ１（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２９に記載のＥＮＴ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００４９５５）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＥＮＴ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３１６８４）やマウスＥＮＴ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０２２８８０）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＮＰＴ３遺伝子」または「ＮＰＴ３　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＮＰＴ３（Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ３）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：３１に記載のＮＰＴ３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｕ９０５４４）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
また、本明細書において「ＩＲＥＧ１遺伝子」または「ＩＲＥＧ１　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＩＲＥＧ１（Ｉｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：３３に記載のＩＲＥＧ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１４５８５）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＩＲＥＧ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿１３３３１５）やマウスＩＲＥＧ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１６９１７）］等が挙げられる。
【００１５】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【００１６】
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定の塩基配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等である「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」（例えば、同族体（オルソログ）、誘導体、および変異体等）が包含される。なお、本明細書において、これらを上記特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」の「ホモログ」ともいう。
該ホモログとしては、例えば同族体（オルソログ）としては、ヒトのタンパク質に該当するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演鐸的に同定することができる。また、変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
【００１７】
従って本明細書において「５−ＨＴ７タンパク質」または単に「５−ＨＴ７」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ヒト５−ＨＴ７　（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ受容体）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２に記載のヒト５−ＨＴ７遺伝子（アイソフォームｄ；Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０００８７２）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、５−ＨＴ７ｂ、すなわちアイソフォームｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１９８６０）］や、オルソログ［例えば、配列番号１に記載の５−ＨＴ７のオルソログである、ラット５−ＨＴ７（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３１６８４）やマウス５−ＨＴ７（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００８３１５）］等が挙げられる。また、本明細書において「ＥＤＧ２タンパク質」または単に「ＥＤＧ２」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ヒトＥＤＧ２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　１）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：４に記載のＥＤＧ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１４０１）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＥＤＧ２，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｖａｒｉａｎｔ　２　（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０５７１５９）］や、オルソログ［例えば、ラットＥＤＧ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０５３９３６）やマウスＥＤＧ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１０３３６）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＥＤＧ１タンパク質」または単に「ＥＤＧ１」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ＥＤＧ１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　２）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：６に記載のＥＤＧ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１４００）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＥＤＧ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１７３０１）やマウスＥＤＧ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００７９０１）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＥＴ（Ａ）タンパク質」または単に「ＥＴ（Ａ）」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ＥＴ（Ａ）（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ　Ａ）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：８に記載のＥＴ（Ａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１９５７）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＥＴ（Ａ）　ｄｅｌｔａ　３　（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ０１４８２６）、ＥＴ（Ａ）　（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｓ８１５４５）、　ＥＴ（Ａ）　ｄｅｌｔａ　３−４　（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｓ８１５４５）、ＥＴ（Ａ）　ｄｅｌｔａ　４　（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｓ８１５４２）］や、オルソログ［例えば、ラットＥＴ（Ａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１２５５０）やマウスＥＴ（Ａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＢＣ００８２７７）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＧＰＲ８８タンパク質」または単に「ＧＰＲ８８」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ＧＰＲ８８（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　８８）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１０に記載のＧＰＲ８８（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０２２０４９）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＧＰＲ８８（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３１６９６）やマウスＧＰＲ８８（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＢ０４２４０８）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＰＴＨ２Ｒタンパク質」または単に「ＰＴＨ２Ｒ」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ＰＴＨ２Ｒ（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２；　ＰＴＨ２受容体）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１２に記載のＰＴＨ２Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００５０４８）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＰＴＨ２Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３１０８９）やマウスＰＴＨ２Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ３３２０７８，　ＡＦ３３２０７７）］等が挙げられる。また、本明細書において「ＶＩＰ１Ｒタンパク質」または単に「ＶＩＰ１Ｒ」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ＶＩＰ１Ｒ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１４に記載のＶＩＰ１Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００４６２４）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＶＩＰＲ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｘ７７７７７）］や、オルソログ［例えば、ラットＶＩＰ１Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１２６８５）や、マウスＶＩＰ１Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１１７０３）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＣＬＩＣ２タンパク質」または「ＣＬＩＣ２」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ＣＬＩＣ２（Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｈａｎｎｅｌ２）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１６に記載のＣＬＩＣ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８９）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＣＬＩＣ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＢＦ４１４２０８に記載された配列を含むタンパク質）やマウスＣＬＩＣ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＩ３９１０３４に記載された配列を含むタンパク質）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＳＣＮ２Ａタンパク質」または「ＳＣＮ２Ａ」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ＳＣＮ２Ａ（Ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１８に記載のＳＣＮ２Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿２１００７）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＳＣＮ２Ａ、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ　ｓｐｌｉｃｅｄ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ３２７２４６）、ＳＣＮ３Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ３３０１３５）］や、オルソログ［例えば、ラットＳＣＮ２Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＢＧ３７７９４８）や、マウスＳＣＮ２Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＫ０２０７２１）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＡＴＡ１タンパク質」または「ＡＴＡ１」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、ＡＴＡ１遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２０に記載のＡＴＡ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０３０６７４）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＮＧＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ２４７１６６）］や、オルソログ等が挙げられる。
また、本明細書において「ＡＢＣＡ１タンパク質」または「ＡＢＣＡ１」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ，　ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ　Ａ，　ｍｅｍｂｅｒ　１）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２２に記載のＡＢＣＡ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００５５０２）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＡＢＣＡ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３１７６０）やマウスＡＢＣＡ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１３４５４）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＡＢＣＧ２タンパク質」または「ＡＢＣＧ２」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、ＡＢＣＧ２（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ　Ｇ，　ｍｅｍｂｅｒ　２）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２４に記載のＡＢＣＧ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００４８２７）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォーム［例えば、ＭＸＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ０９３７７２）］や、オルソログ［例えば、ラットＡＢＣＧ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０５３７５４）やマウスＡＢＣＧ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１１９２０）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＧＡＴ１タンパク質」または「ＧＡＴ１」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、ＧＡＴ１（ＧＡＢＡ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２６に記載のＧＡＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ５４６７３）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＧＡＴ１（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０２４３７１）やマウスＧＡＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｍ９２３７８）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＰＬＴＰタンパク質」または「ＰＬＴＰ」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、ＰＬＴＰ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２８に記載のＰＬＴＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００６２２７）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＰＬＴＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＡ８１７７５４）やマウスＰＬＴＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１１１２５）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＥＮＴ１タンパク質」または「ＥＮＴ１」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、ＥＮＴ１（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：３０に記載のＥＮＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００４９５５）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＥＮＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３１６８４）やマウスＥＮＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０２２８８０）］等が挙げられる。
また、本明細書において「ＮＰＴ３タンパク質」または「ＮＰＴ３」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、ＮＰＴ３（Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ３）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：３２に記載のＮＰＴ３（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＹ６４７３９０）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
また、本明細書において「ＩＲＥＧ１タンパク質」または「ＩＲＥＧ１」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、ＩＲＥＧ１（Ｉｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１）やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：３４に記載のＩＲＥＧ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１４５８５）や、そのホモログが包含される。該ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、ラットＩＲＥＧ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿１３３３１５）やマウスＩＲＥＧ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１６９１７）］等が挙げられる。
【００１８】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１９】
さらに本明細書において「疾患マーカー」とは、軟骨障害の罹患の有無、罹患の程度、若しくは改善の有無や改善の程度を診断するために、また軟骨障害の予防、改善または治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものをいう。これには、軟骨の障害に関連して生体内での発現が変動する遺伝子またはタンパク質を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドまたは抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内で発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００２０】
さらに本明細書において診断対象となる「関節／軟骨組織」とは、具体的には関節軟骨組織や関節滑膜組織のみならずこれら組織の周辺に存在する血液・滑液などを意味するものであり、特に言及しない限り、本明細書において「関節／軟骨組織」とは上記組織および血液・滑液などの総称として用いられる。
【００２１】
本発明は、前述するように、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子およびＩＲＥＧ１　遺伝子が、軟骨障害に罹患した動物の障害軟骨組織で、正常軟骨組織と比較して有意に発現上昇していることに基づくものである。また、ＥＤＧ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子およびＧＡＴ１　遺伝子が、前記動物の障害軟骨組織で、正常軟骨組織と比較して有意に発現減少していることに基づくものである。尚、以下、上記遺伝子をまとめて本発明遺伝子ともいう。
従って、これらの遺伝子及びその発現産物〔タンパク質、（ポリ）（オリゴ）ペプチド〕は、軟骨障害の解明、診断、予防及び治療に有効に利用することができ、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ることができる。また、これらの遺伝子及びその発現産物並びにそれらからの派生物（例えば、抗体など）は、上記軟骨障害の治療、並びに該治療に有効に用いられる薬剤の開発に好適に利用することができる。さらに、個体または関節／軟骨組織における、上記遺伝子の発現またはその発現産物の検出、または該遺伝子の変異またはその発現不全の検出は、軟骨障害の解明や診断に有効に利用することができる。
【００２２】
以下、これらの本発明遺伝子、並びにその発現産物［５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１、以下まとめて本発明タンパク質ともいう］やそれらの派生物について、具体的な用途を説明する。
【００２３】
（１）軟骨障害の疾患マーカー及びその応用
（１−１）　ポリヌクレオチド
本発明の配列番号１に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の５−ＨＴ７遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１９８５９）、この取得方法についてもＪ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６８　（３１），　２３４２２−２３４２６　（１９９３）、および、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，　６８　（４），　１３７２−１３８１　（１９９７）　に記載されるように公知である。
【００２４】
本発明の配列番号３に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来のＥＤＧ２遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１４０１）、この取得方法についてもＢｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２３１（３），　６１９−６２２　（１９９７）　に記載されるように公知である。
【００２５】
本発明の配列番号５に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来のＥＤＧ１遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１４００）、この取得方法についてもＪ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６５　（１６），　９３０８−９３１３　（１９９０）に記載されるように公知である。
【００２６】
本発明の配列番号７に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＥＴ（Ａ）遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１９５７）、この取得方法についてもＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８８　（８），　３１８５−３１８９　（１９９１）　に記載されるように公知である。
【００２７】
本発明の配列番号９に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＧＰＲ８８遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０２２０４９）、この取得方法についてもＧｅｎｏｍｉｃｓ，　６９　（３），　３１４−３２１　（２０００）に記載されるように公知である。
【００２８】
本発明の配列番号１１に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００５０４８）、この取得方法についてもＪ．　ＢＩｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７０　（２６），　１５４５５−１５４５８　（１９９５）　に記載されるように公知である。
【００２９】
本発明の配列番号１３に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４６２４）、この取得方法についてもＢｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９３　（２），　５４６−５５３　（１９９３）に記載されるように公知である。
【００３０】
本発明の配列番号１５に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＣＬＩＣ２遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１２８９）、この取得方法についてもＧｅｎｏｍｉｃｓ，　４５　（１），　２２４−２２８　（１９９７）に記載されるように公知である。
【００３１】
本発明の配列番号１７に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＳＣＮ２Ａ遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿２１００７）、この取得方法についてもＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８９　（１７），　８２２０−８２２４　（１９９２）、および、Ｇｅｎｅ，　２６４　（１），　１１３−１２２，　（２００１）　に記載されるように公知である。
【００３２】
本発明の配列番号１９に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＡＴＡ１　遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３０６７４）、この取得方法についてもＢｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２７３　（３），　１１７５−１１７９　（２０００）に記載されるように公知である。
【００３３】
本発明の配列番号２１に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＡＢＣＡ１　遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００５５０２）、この取得方法についてもＧｅｎｏｍｉｃｓ　２１　（１），　１５０−１５９　（１９９４）に記載されるように公知である。
【００３４】
本発明の配列番号２３に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＡＢＣＧ２　遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４８２７）、この取得方法についてもＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５８　（２３），　５３３７−５３３９　（１９９８）に記載されるように公知である。
【００３５】
本発明の配列番号２５に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＧＡＴ１　遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ｘ５４６７３　）、この取得方法についてもＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　２６９　（１），　１８１−１８４　（１９９０）に記載されるように公知である。
【００３６】
本発明の配列番号２７に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＰＬＴＰ　遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００６２２７）、この取得方法についてもＪ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９，　９３８８−９３９１　（１９９４）に記載されるように公知である。
【００３７】
本発明の配列番号２９に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＥＮＴ１　遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４９５５）、この取得方法についてもＮａｔ．　Ｍｅｄ．　３　（１），　８９−９３　（１９９７）に記載されるように公知である。
【００３８】
本発明の配列番号３１に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、ＮＰＴ３　遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｕ９０５４４）、この取得方法についてもＧｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　７　（５），　４４１−４５６　（１９９７）に記載されるように公知である。
【００３９】
本発明の配列番号３３に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来の、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子として公知の遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１４５８５）、この取得方法についてもＮａｔｕｒｅ　４０３　（６７７１），　７７６−７８１　（２０００）に記載されるように公知である。
【００４０】
本発明は、前述するように、５−ＨＴ７遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮＭ＿０１９８５９）、ＥＤＧ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１４００）、ＥＴ（Ａ）遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１９５７）、ＧＰＲ８８遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０２２０４９）、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００５０４８）、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４６２４）、ＣＬＩＣ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１２８９）、ＡＴＡ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３０６７４）、ＡＢＣＡ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００５５０２）、ＰＬＴＰ　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００６２２７）、ＮＰＴ３　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｕ９０５４４）、並びに、ＩＲＥＧ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１４５８５）が、軟骨障害に罹患した動物の障害軟骨組織において、正常軟骨組織と比較して有意に発現上昇しているという知見を発端に、これらの遺伝子発現の有無や発現の程度を検出することによって上記軟骨障害の罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。また、ＥＤＧ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１４０１）、ＳＣＮ２Ａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿２１００７）、ＡＢＣＧ２　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４８２７）、ＥＮＴ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００４９５５）、並びに、ＧＡＴ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｘ５４６７３　）が、軟骨障害に罹患した動物の障害軟骨組織において、正常軟骨組織と比較して有意に発現減少しているという知見を発端に、これらの遺伝子発現の有無や発現の程度を検出することによって上記軟骨障害の罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。すなわち、本発明は、被験者における上記遺伝子（あるいは遺伝子産物）の発現の有無またはその程度を検出することによって、被験者について軟骨障害の罹患の有無またはその程度を診断することのできるツールとして有用な疾患マーカーを提供するものである。
【００４１】
また、上記ポリヌクレオチドは、後述の（３−１）項に記載するような軟骨障害病の予防、改善または治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）　遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１遺伝子、ＡＢＣＡ１遺伝子、ＡＢＣＧ２遺伝子、ＧＡＴ１遺伝子、ＰＬＴＰ遺伝子、ＥＮＴ１遺伝子、ＮＰＴ３遺伝子、または、ＩＲＥＧ１遺伝子の発現変動を検出するためのスクリーニングツール（疾患マーカー）としても有用である。
【００４２】
かかる本発明の疾患マーカーは、配列番号１に記載の５−ＨＴ７遺伝子の塩基配列、配列番号３に記載のＥＤＧ２遺伝子の塩基配列、配列番号５に記載のＥＤＧ１遺伝子の塩基配列、配列番号７に記載のＥＴ（Ａ）遺伝子の塩基配列、配列番号９に記載のＧＰＲ８８遺伝子の塩基配列、配列番号１１に記載のＰＴＨ２Ｒ遺伝子の塩基配列、配列番号１３に記載のＶＩＰ１Ｒ遺伝子の塩基配列、配列番号１５に記載のＣＬＩＣ２遺伝子の塩基配列、配列番号１７に記載のＳＣＮ２Ａ　遺伝子の塩基配列、配列番号１９に記載のＡＴＡ１　遺伝子の塩基配列、配列番号２１に記載の、ＡＢＣＡ１　遺伝子の塩基配列、配列番号２３に記載の、ＡＢＣＧ２　遺伝子の塩基配列、配列番号２５に記載のＧＡＴ１　遺伝子の塩基配列、配列番号２７に記載のＰＬＴＰ　遺伝子の塩基配列、配列番号２９に記載のＥＮＴ１　遺伝子の塩基配列、配列番号３１に記載のＮＰＴ３　遺伝子の塩基配列、または、配列番号３３に記載のＩＲＥＧ１　遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とするものである。
【００４３】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ　ａｎｄ　Ｋｉｍｍｅｌ　（１９８７，　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．　１５２，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡ）　に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００４４】
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３に記載の塩基配列またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
【００４５】
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
【００４６】
本発明の軟骨障害の疾患マーカーは、具体的には５−ＨＴ７遺伝子の塩基配列に関する配列番号１、ＥＤＧ２遺伝子の塩基配列に関する配列番号３、ＥＤＧ１遺伝子の塩基配列に関する配列番号５、ＥＴ（Ａ）遺伝子の塩基配列に関する配列番号７、ＧＰＲ８８遺伝子の塩基配列に関する配列番号９、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子の塩基配列に関する配列番号１１、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子の塩基配列に関する配列番号１３、ＣＬＩＣ２遺伝子の塩基配列に関する配列番号１５、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子の塩基配列に関する配列番号１７、ＡＴＡ１　遺伝子の塩基配列に関する配列番号１９、ＡＢＣＡ１　遺伝子の塩基配列に関する配列番号２１、ＡＢＣＧ２　遺伝子の塩基配列に関する配列番号２３、ＧＡＴ１　遺伝子の塩基配列に関する配列番号２５、ＰＬＴＰ　遺伝子の塩基配列に関する配列番号２７、ＥＮＴ１　遺伝子の塩基配列に関する配列番号２９、ＮＰＴ３　遺伝子の塩基配列に関する配列番号３１、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の塩基配列に関する配列番号３３に記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、前記各配列番号で示される本発明遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも１５個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４７】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法を用いた場合は、、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、ＩＲＥＧ１　遺伝子、またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００４８】
そのような本発明の疾患マーカーは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３１、または３３で示される本発明遺伝子の塩基配列をもとに、例えばｐｒｉｍｅｒ　３（　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ）あるいはベクターＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ社製）を利用して設計することができる。
【００４９】
具体的には、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の塩基配列をｐｒｉｍｅｒ　３またはベクターＮＴＩのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００５０】
本発明で用いる疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも１５塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００５１】
本発明において軟骨障害の検出（診断）は、被験者の生体組織、特に関節／軟骨組織における、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の少なくとも１つの発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明の疾患マーカーは、上記遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
【００５２】
上記疾患マーカーを軟骨障害の検出（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜５０ｂｐ、より好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜全配列の塩基数、好ましくは１５ｂｐ〜１ｋｂ、より好ましくは１００ｂｐ〜１ｋｂの塩基長を有するものが例示できる。
【００５３】
本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができ、これによって軟骨障害に関連する、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。なお、測定対象試料としては、使用する検出方法の種類や目的に応じて、被験者の関節／軟骨組織、例えば関節軟骨組織や関節滑膜組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくはこれらの組織周辺の血液・滑液を採取し、そこから常法に従って調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００５４】
また、生体組織における本発明遺伝子の遺伝子発現レベルは、ＤＮＡチップを利用して検出あるいは定量することもできる。この場合、本発明の疾患マーカーは当該ＤＮＡチップのプローブとして使用することができる（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ　Ｃｈｉｐ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｕ９５　Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅの場合、２５ｂｐの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。本発明の疾患マーカーをプローブとするＤＮＡチップは、生体組織から採取したＲＮＡをもとに調製される標識ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズさせることにより、本発明の疾患マーカー（プローブ）と標識ＤＮＡまたはＲＮＡとの複合体が形成されるので、該複合体を該標識ＤＮＡまたはＲＮＡの標識を指標として検出することにより、生体組織中での本発明遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）が評価できる。
【００５５】
本発明の疾患マーカーは、軟骨障害の診断や検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）に有用である。具体的には、該疾患マーカーを利用した軟骨障害の診断は、被験者の関節／軟骨組織と正常者の関節／軟骨組織における、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、または、ＩＲＥＧ１　遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の関節／軟骨組織と正常者の関節／軟骨組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上ある場合が含まれる。
すなわち、軟骨障害に罹患した動物の障害軟骨組織において、正常軟骨組織と比較して有意に発現上昇もしくは発現減少しているという知見を発端に、これらの遺伝子発現の有無や発現の程度を検出することによって上記軟骨障害の罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。
【００５６】
具体的には、５−ＨＴ７遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１９８５９）、ＥＤＧ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１４００）、ＥＴ（Ａ）遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１９５７）、ＧＰＲ８８遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０２２０４９）、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００５０４８）、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４６２４）、ＣＬＩＣ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１２８９）、ＡＴＡ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０３０６７４）、ＡＢＣＡ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００５５０２）、ＰＬＴＰ　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００６２２７）、ＮＰＴ３　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｕ９０５４４）、並びに、ＩＲＥＧ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１４５８５）は、軟骨障害で発現誘導（増大）を示すので、被験者の関節／軟骨組織で特異的に発現しているか、あるいは該発現量が正常な関節／軟骨組織の発現量と比べて１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上多ければ、被験者について軟骨障害の罹患が疑われる。
また、ＥＤＧ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１４０１）、ＳＣＮ２Ａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿２１００７）、ＡＢＣＧ２　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４８２７）、ＥＮＴ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００４９５５）、並びに、ＧＡＴ１　遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｘ５４６７３　）は、軟骨障害で発現抑制（減少）を示すので、被験者の関節／軟骨組織で特異的に発現しているか、あるいは該発現量が正常な関節／軟骨組織の発現量と比べて０．７倍以下、好ましくは１／２倍以下、より好ましくは１／３倍以下であれば、被験者について軟骨障害の罹患が疑われる。
【００５７】
とりわけ、配列番号：１の塩基配列を有する５−ＨＴ７遺伝子、および配列番号：５の塩基配列を有するＥＤＧ１遺伝子、配列番号：９の塩基配列を有するＧＰＲ８８遺伝子、配列番号：２７の塩基配列を有するＰＬＴＰ　遺伝子、配列番号：３３の塩基配列を有するＩＲＥＧ１　遺伝子は、疾患モデル動物の障害軟骨を含む膝関節組織で、正常な膝関節組織に比べて３倍以上の発現増大を示していた。従って、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９、配列番号２７、若しくは配列番号３３の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーが特に有効である。
また、配列番号：２５の塩基配列を有するＧＡＴ１　遺伝子は、疾患モデル動物の障害軟骨を含む膝関節組織で、正常な膝関節組織に比べて１／３以下の発現減少を示していた。従って、配列番号２５の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーが特に有効である。
【００５８】
本発明において軟骨障害の検出（診断）は、被験者の生体組織、特に関節／軟骨組織における配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，または３３の塩基配列を有する本発明遺伝子の少なくとも１つの発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。検出（診断）の精度や正確性を高めるためには、上記本発明遺伝子のうちの２以上、好ましくは複数個の遺伝子、より好ましくは本発明遺伝子の半数以上の遺伝子について、その発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することが望ましい。
【００５９】
（１−２）抗体
また本発明は、軟骨障害の疾患マーカーとして５−ＨＴ７遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「５−ＨＴ７」ともいう）、ＥＤＧ２遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＥＤＧ２」ともいう）、ＥＤＧ１遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＥＤＧ１」ともいう）、ＥＴ（Ａ）遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＥＴ（Ａ）」ともいう）、ＧＰＲ８８遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＧＰＲ８８」ともいう）、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＰＴＨ２Ｒ」ともいう）、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＶＩＰ１Ｒ」ともいう）、ＣＬＩＣ２遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＣＬＩＣ２」ともいう）、ＳＣＮ２Ａ遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＳＣＮ２Ａ」ともいう）、ＡＴＡ１　遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＡＴＡ１」ともいう）、ＡＢＣＡ１　遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＡＢＣＡ１」ともいう）、ＡＢＣＧ２　遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＡＢＣＧ２」ともいう）、ＧＡＴ１　遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＧＡＴ１」ともいう）、ＰＬＴＰ　遺伝子、の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＰＬＴＰ」ともいう）、ＥＮＴ１　遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＥＮＴ１」ともいう）、ＮＰＴ３　遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＮＰＴ３」ともいう）、または、ＩＲＥＧ１遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＩＲＥＧ１」ともいう）を特異的に認識することのできる抗体を提供する。
【００６０】
５−ＨＴ７としては配列番号１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＥＤＧ２としては配列番号３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＥＤＧ１としては配列番号５に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＥＴ（Ａ）としては配列番号７に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＧＰＲ８８としては配列番号９に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＰＴＨ２Ｒとしては配列番号１１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＶＩＰ１Ｒとしては配列番号１３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＣＬＩＣ２としては配列番号１５に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＳＣＮ２Ａとしては配列番号１７に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＡＴＡ１としては配列番号１９に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＡＢＣＡ１としては配列番号２１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＡＢＣＧ２としては配列番号２３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＧＡＴ１としては配列番号２５に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＰＬＴＰとしては配列番号２７に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＥＮＴ１としては配列番号２９に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＮＰＴ３としては配列番号３１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ＩＲＥＧ１としては配列番号３３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を挙げることができる。
【００６１】
なお、配列番号１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号５に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号７に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号９に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号１１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号１３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号１５に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号１７に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号１９に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号２１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号２３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号２５に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号２７に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号２９に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号３１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、また配列番号３３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができる。
【００６２】
なお、ここで配列番号２に示すタンパク質は、ヒト由来の５−ＨＴ７遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６８　（３１），　２３４２２−２３４２６　（１９９３）、および、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，　６８　（４），　１３７２−１３８１　（１９９７））　に記載されるように公知である。
【００６３】
また配列番号４に示すタンパク質は、ヒト由来のＥＤＧ２遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２３１（３），　６１９−６２２　（１９９７））に記載されるように公知である。
【００６４】
また配列番号６に示すタンパク質は、ヒト由来のＥＤＧ１遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６５　（１６），　９３０８−９３１３　（１９９０））に記載されるように公知である。
【００６５】
また配列番号８に示すタンパク質は、ヒト由来のＥＴ（Ａ）遺伝子
によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８８　（８），　３１８５−３１８９　（１９９１））に記載されるように公知である。
【００６６】
また配列番号１０に示すタンパク質は、ヒト由来のＧＰＲ８８遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　６９　（３），　３１４−３２１　（２０００））に記載されるように公知である。
【００６７】
また配列番号１２に示すタンパク質は、ヒト由来のＰＴＨ２Ｒ遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２７０　（２６），　１５４５５−１５４５８　（１９９５））に記載されるように公知である。
【００６８】
また配列番号１４に示すタンパク質は、ヒト由来のＶＩＰ１Ｒ遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９３　（２），　５４６−５５３　（１９９３））に記載されるように公知である。
【００６９】
また配列番号１６に示すタンパク質は、ヒト由来のＣＬＩＣ２遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　４５　（１），　２２４−２２８　（１９９７））に記載されるように公知である。
【００７０】
また配列番号１８に示すタンパク質は、ヒト由来のＳＣＮ２Ａ　遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８９　（１７），　８２２０−８２２４　（１９９２）、および、Ｇｅｎｅ，　２６４　（１），　１１３−１２２，　（２００１））に記載されるように公知である。
【００７１】
また配列番号２０に示すタンパク質は、ヒト由来のＡＴＡ１　遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　２４１３７−２４１４４　（２００１））に記載されるように公知である。
【００７２】
また配列番号２２に示すタンパク質は、ヒト由来のＡＢＣＡ１　遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２５７　（１），　２９−３３　（１９９９））に記載されるように公知である。
【００７３】
また配列番号２４に示すタンパク質は、ヒト由来のＡＢＣＧ２　遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ．　７１，　５２−５８　（１９９５））に記載されるように公知である。
【００７４】
また配列番号２６に示すタンパク質は、ヒト由来のＧＡＴ１　遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６７，　２１０９８−２１１０４　（１９９２））に記載されるように公知である。
【００７５】
また配列番号２８に示すタンパク質は、ヒト由来のＰＬＴＰ　遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９，　９３８８−９３９１　（１９９４））に記載されるように公知である。
【００７６】
また配列番号３０に示すタンパク質は、ヒト由来のＥＮＴ１　遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　３　（１），　８９−９３　（１９９７））に記載されるように公知である。
【００７７】
また配列番号３２に示すタンパク質は、ヒト由来のＮＰＴ３　遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３０５，　８１−８５　（１９９５））に記載されるように公知である。
【００７８】
また配列番号３４に示すタンパク質は、ヒト由来のＩＲＥＧ１　遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　５　（２），　２９９−３０９　（２０００））に記載されるように公知である。
【００７９】
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、前記本発明タンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、さらには当該本発明タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００８０】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）　Ｐｕｂｌｉｓｈ．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ．　Ｓｅｃｔｉｏｎ　１１．１２〜１１．１３）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１を用いて、あるいは常法に従って当該いずれかの本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ．　Ｓｅｃｔｉｏｎ　１１．４〜１１．１１）。
【００８１】
また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，　１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，または３３）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　ＣＳＨ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８３），　ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，　ＤＭ．　Ｇｌｏｖｅｒ，　ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ　（１９８５））などに準じて行うことができる。具体的には５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これら５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１は、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，　２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，または３４）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。具体的には、「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋信夫ら著、丸善、１９８７年発行）に記載された液相合成法や固相合成法を用いることができる。
【００８２】
なお、本発明の５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１には、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，または３４に示すタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ上記配列番号で示されるタンパク質の機能と同等の生物学的機能を有するか、及び／または免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
【００８３】
なお、ここで配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，または３４で示されるタンパク質の機能と同等の生物学的機能を有するタンパク質としては、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１と生化学的または薬理学的機能において同等の機能を有するタンパク質を挙げることができ、また上記タンパク質と免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつ５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１に対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
【００８４】
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能及び／または免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ　Ｓｔａｒ　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質が５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の生物学的機能及び／または免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００８５】
また本発明の抗体は、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１のアミノ酸配列において少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドを例示することができる。
【００８６】
かかるポリペプチドに対する抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００８７】
本発明の抗体は５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記本発明タンパク質を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内における５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１のタンパク発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。
【００８８】
具体的には、患者の関節／軟骨組織、例えば関節軟骨組織や関節滑膜組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくはこれらの組織周辺の血液・滑液を採取し、そこから常法に従ってタンパク質画分を調製して、例えばウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従ってプローブとして使用することによって５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１を検出することができる。
【００８９】
軟骨障害の診断に際しては、被験者の関節／軟骨組織における５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、およびＩＲＥＧ１のいずれか少なくとも１つと正常な関節／軟骨組織におけるこれらのタンパク質との量の違いを判定すればよい。この場合、タンパク質量の違いには、タンパクのある／なし、あるいはタンパク量の違いが１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上ある場合が含まれる。具体的には、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、および／または、ＩＲＥＧ１　遺伝子が存在しており、該量が正常な関節／軟骨組織の発現産物量と比べて１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上多いことが判定されれば、被験者について軟骨障害の罹患が疑われる。
また、ＥＤＧ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、および／または、ＧＡＴ１　遺伝子が存在しており、該量が正常な関節／軟骨組織の発現産物量と比べて０．７倍以下、好ましくは１／２倍以下、より好ましくは１／３倍以下であることが判定されれば、被験者について軟骨障害の罹患が疑われる。
【００９０】
とりわけ、配列番号：１の塩基配列を有する５−ＨＴ７遺伝子、配列番号：５の塩基配列を有するＥＤＧ１遺伝子、配列番号：９の塩基配列を有するＧＰＲ８８遺伝子、配列番号：２７の塩基配列を有するＰＬＴＰ　遺伝子、および配列番号：３３の塩基配列を有するＩＲＥＧ１　遺伝子は、疾患モデル動物の障害軟骨を含む膝関節組織で、正常な膝関節組織に比べて３倍以上の発現増大を示していた。このため、配列番号：１、５、９、２７、もしくは３３に示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、具体的には、例えば配列番号：２のアミノ酸配列を有する５−ＨＴ７、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＥＤＧ１、配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＧＰＲ８８、配列番号：２８のアミノ酸配列を有するＰＬＴＰ、もしくは配列番号：３４のアミノ酸配列を有するＩＲＥＧ１を特異的に認識する抗体を有する疾患マーカーが、軟骨障害の検出（診断）に有用である。
また、配列番号：２５の塩基配列を有するＧＡＴ１　遺伝子は、疾患モデル動物の障害軟骨を含む膝関節組織で、正常な膝関節組織に比べて１／３以下の発現減少を示していた。このため、配列番号：２５に示される延期配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、具体的には、例えば配列番号２６のアミノ酸配列を有するＧＡＴ１を特異的に認識する抗体を有する疾患マーカーが、軟骨障害の検出（診断）に有用である。
【００９１】
（２）軟骨障害の検出方法（診断方法）
本発明は、前述する本発明の軟骨障害の疾患マーカーを利用した軟骨障害の診断方法を提供するものである。
【００９２】
具体的には、本発明の診断方法は、被験者の関節／軟骨組織、例えば関節軟骨組織や関節滑膜組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくはこれらの組織周辺の血液・滑液を採取し、そこに含まれる軟骨障害に関連する５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の遺伝子発現レベル、あるいはこれらの遺伝子に由来するタンパク質（５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、ＩＲＥＧ１）を検出し、その発現量またはそのタンパク質量を測定することにより、軟骨障害の罹患の有無またはその程度を診断するものである。
【００９３】
本発明の診断方法は次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ）　被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーを接触させる工程、
（ｂ）　生体試料中の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の遺伝子発現レベル、または５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１のタンパク質の量を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）　（ｂ）の結果をもとに、軟骨障害の罹患を判断する工程。
【００９４】
ここで用いられる生体試料は、被験者の関節／軟骨組織（例えば関節軟骨組織や関節滑膜組織、あるいはこれら組織の周辺に存在する血液・滑液）、該組織から調製されるＲＮＡ若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチド、または上記組織から調製されるタンパク質である。かかるＲＮＡ、ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、被験者の関節軟骨組織や関節滑膜組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくはこれらの組織周辺の血液・滑液を採取し、そこから常法に従って調製することができる。
【００９５】
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
【００９６】
（２−１）　測定対象の生体試料としてＲＮＡを利用する場合
診断に用いる生体試料としてＲＮＡを利用する場合は、本発明の検出方法（診断方法）は該ＲＮＡ中の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。
【００９７】
この場合、本発明の検出方法は次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含む：
（ａ）被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーとを接触させる工程、
（ｂ）上記工程によって本発明の疾患マーカーに特異的に結合した、生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、及び
（ｃ）（ｂ）の測定結果をもとに、軟骨障害の罹患を判断する工程。
本発明の軟骨障害の検出方法（診断方法）は、特に測定対象の生体試料としてＲＮＡを利用して、該ＲＮＡ中の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００９８】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐなど：ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成された疾患マーカー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を、疾患マーカーの標識物（ＲＩ若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、ＡｌｋＰｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＰｈａｒａｍｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、該プロトコールに従って疾患マーカー（プローブＤＮＡ）を標識し、被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００９９】
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント２１００バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　社製）で該プロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ　ＰＲＩＭＥ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　社製）で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【０１００】
また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法によって調製されたｃＲＮＡとハイブリダイズさせて、形成されたＤＮＡとｃＲＮＡとの二本鎖を、本発明の疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記ＤＮＡチップとして、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かかる遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ　Ｃｈｉｐ　Ｈｕｍａｎ　ＧｅｎｏｍｅＵ９５　Ａ，　Ｂ，Ｃ，　Ｄ，　Ｅを挙げることができる。かかるＤＮＡチップを用いた、被験者ＲＮＡ中の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定については、実施例において詳細に説明する。
【０１０１】
（２−２）　測定対象物としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、本発明の検出方法（診断方法）は生体試料中の５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１を検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には、抗体に関する本発明の疾患マーカー（配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２または３４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体）を用いてウエスタンブロット法などの公知方法で、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１を検出、定量する方法を挙げることができる。ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明の上記疾患マーカーを用いた後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素や蛍光物質で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、測定対象タンパク質を標識し、該放射性同位元素若しくは蛍光物質由来のシグナルを放射線測定器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）若しくは蛍光検出器で検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の上記疾患マーカーを用いた後、ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社製）を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社製）で測定することもできる。
【０１０２】
軟骨障害の診断は、被験者の関節／軟骨組織、例えば関節軟骨組織や関節滑膜組織、あるいはこれらの組織周辺に存在する血液・滑液における５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の量を正常な前記組織の当該遺伝子発現レベルまたは当該タンパク質の量と比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
【０１０３】
この場合、正常な関節／軟骨組織から採取調製した生体試料（ＲＮＡまたはタンパク質）が必要であるが、これらは軟骨障害に罹患していない人の関節／軟骨組織、例えば関節軟骨組織や関節滑膜組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくはこれら組織周辺の血液・滑液を採取することによって取得することができる。なお、ここでいう「軟骨障害に罹患していない人」とは、少なくとも軟骨障害の自覚症状がなく、好ましくは他の検査方法、例えばＸ線フィルム撮影による診断の結果、軟骨障害でないと診断された人をいう。なお、当該「軟骨障害に罹患していない人」を以下、本明細書では単に正常者という場合もある。
【０１０４】
被験者の関節／軟骨組織と正常な関節／軟骨組織（軟骨障害に罹患していない人の関節／軟骨組織）との遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行なわない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な関節／軟骨組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の量の平均値または統計的中間値を、正常者の遺伝子発現レベル若しくはタンパク質の量として、比較に用いることができる。
【０１０５】
被験者が、軟骨障害であるかどうかの判断は、該被験者の関節／軟骨組織における前記本発明遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物である本発明タンパク質の量の格差が、正常者のそれらと比較して１．５倍以上、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上であることを指標として行うことができる。また、被験者の上記遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量の格差が、いかなる正常者のそれらのレベルまたは量に比べて大きければ、軟骨障害であると判断することができる。
【０１０６】
なお、上記方法のうち、（２−１）測定対象の生体試料としてＲＮＡを利用して軟骨障害を検出（診断）する場合、すなわち遺伝子の発現の有無または遺伝子発現レベル（発現量）から軟骨障害を検出（診断）する場合は、検出（診断）の精度や正確性を高めるために、本発明遺伝子のうち２以上、好ましくは複数個の遺伝子、より好ましくは本発明遺伝子の半数以上の遺伝子について、発現の有無または発現のレベル（発現量）を評価し、その結果から軟骨障害を検出（診断）することが望ましい。複数個の遺伝子について評価する場合には、個々の遺伝子での評価をスコア化し、総合的に軟骨障害を診断することが可能である。なお、この場合、評価する遺伝子数、スコアあるいは診断基準は限定されない。
【０１０７】
（３）候補薬のスクリーニング方法
（３−１）　遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方法
本発明は、配列番号１に記載の塩基配列を有する５−ＨＴ７遺伝子、配列番号３に記載の塩基配列を有するＥＤＧ２遺伝子、配列番号５に記載の塩基配列を有するＥＤＧ１遺伝子、配列番号７に記載の塩基配列を有するＥＴ（Ａ）遺伝子、配列番号９に記載の塩基配列を有するＧＰＲ８８遺伝子、配列番号１１に記載の塩基配列を有するＰＴＨ２Ｒ遺伝子、配列番号１３に記載の塩基配列を有するＶＩＰ１Ｒ遺伝子、配列番号１５に記載の塩基配列を有するＣＬＩＣ２遺伝子、配列番号１７に記載の塩基配列を有するＳＣＮ２Ａ遺伝子、配列番号１９に記載の塩基配列を有するＡＴＡ１　遺伝子、配列番号２１に記載の塩基配列を有するＡＢＣＡ１　遺伝子、配列番号２３に記載の塩基配列を有するＡＢＣＧ２　遺伝子、配列番号２５に記載の塩基配列を有するＧＡＴ１　遺伝子、配列番号２７に記載の塩基配列を有するＰＬＴＰ　遺伝子、配列番号２９に記載の塩基配列を有するＥＮＴ１　遺伝子、配列番号３１に記載の塩基配列を有するＮＰＴ３　遺伝子、または配列番号３３に記載の塩基配列を有するＩＲＥＧ１　遺伝子の発現を制御する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１０８】
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）　被験物質と５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記の比較結果に基づいて、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の遺伝子発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
【０１０９】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子を発現する細胞であって、かつ軟骨細胞への分化が可能である、未分化間葉系細胞または初代培養軟骨細胞を挙げることができる。軟骨細胞への分化が可能な未分化間葉系細胞としては、具体的には、マウスＡＴＤＣ５細胞（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ；　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｔｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／ＣＥＬＬ／ＨＴＭＬ／ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ．　Ｈｔｍｌから入手可能）などを挙げることができる。なお、マウスＡＴＤＣ５細胞は、分化誘導物質であるインスリンの添加で軟骨細胞に分化することが知られている細胞である（Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１３３：４５７−４６８，　１９９６）。
【０１１０】
また、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子を発現する細胞であって、かつ力学的ストレスに応答可能である、初代培養軟骨細胞、軟骨細胞様細胞株または滑膜細胞様細胞株も挙げることができる。力学的ストレスに応答することが知られている細胞としては、具体的には初代培養軟骨細胞、ウサギ滑膜様細胞株ＨＩＧ−８２（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１８３２；　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ．ｃｆｍより入手可能）、ヒト滑膜様細胞株ＭＨ７Ａ（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ；　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｔｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／ＣＥＬＬ／ＨＴＭＬ／ＲＩＫＥＮ＃Ｃｅｌｌ＃Ｂａｎｋ．ｈｔｍｌ”　から入手可能）、ヒト軟骨様細胞株ＨＣＳ２／８などを挙げることができる。これらの細胞株は力学的負荷に応答して通常とは異なる細胞性質（サイトカイン・ＭＭＰ産生能の亢進等）を示すことが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｎｅ　＆　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．　１３（３）：４４３−５３，　１９９８，　Ｂｏｎｅ　２８：３９９−４０３，　２００１，　Ｈｉｐ　Ｊｏｉｎｔ　２３：２３５−２３９，　１９９７）。
【０１１１】
さらに、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子を発現する細胞であって、かつＬＰＳや炎症性サイトカインによる処理を施した、初代培養軟骨細胞、軟骨細胞様細胞株又は滑膜細胞様細胞株も挙げることができる。これらの細胞株はＬＰＳや炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ）で処理することにより障害を受け、より軟骨障害に近い状態になることが知られている（Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，５０，７５−８０，１９９１）。
【０１１２】
以上に挙げたような細胞の他、細胞の集合体である組織（例えば軟骨障害モデル動物由来の関節／軟骨組織など）も、本発明のスクリーニングに用いられる「細胞」の範疇に含まれる。
【０１１３】
候補物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸（本発明遺伝子のアンチセンス核酸を含む）、ペプチド、タンパク質（本発明タンパク質に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記組織／または細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。
【０１１４】
また、スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用することが好ましい。
【０１１５】
実施例に示すように、軟骨障害に罹患した動物の障害関節（軟骨）組織には、特異的に５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子およびＩＲＥＧ１　遺伝子の発現が増大している。また、軟骨障害に罹患した動物の障害関節（軟骨）組織には、特異的にＥＤＧ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子およびＥＮＴ１　遺伝子の発現が減少している。この知見から、これら本発明の遺伝子の発現はは軟骨障害と関連していると考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、上記の本発明遺伝子の発現またはその発現誘導が軟骨障害と関連していることを利用したものである。よって、該軟骨障害の緩和／抑制作用を有する（軟骨障害に対して改善／治療効果を発揮する）物質の探索には、上記５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現の有無や発現レベルの変動が指標とされる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現を制御する物質を探索することによって、軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
なお、ここで「遺伝子の発現を制御する」とは、「遺伝子の発現を抑制するように制御する」という意味と、「遺伝子の発現を亢進（誘導）するように制御する」という意味の２つの意味を含む。
【０１１６】
上記いずれかの遺伝子の発現を抑制（発現レベルの減少、発現誘導の抑制）するように制御する物質の探索は、具体的には５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなること、またこれら本発明遺伝子の発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質（例えば、マウスＡＴＤＣ５細胞の場合はインスリン）によって誘導される発現が候補物質の存在によって抑制されること、すなわち発現誘導物質存在下で候補物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で候補物質を接触させない対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることをもって、行うことができる。
中でも好適には、ＥＴ（Ａ）遺伝子、またはＧＡＴ１　遺伝子の発現を抑制（発現レベルの減少、発現誘導の抑制）するように制御する物質の探索を挙げることができる。
すなわち本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＥＴ（Ａ）遺伝子の発現を抑制するように制御する物質のスクリーニング方法を包含するものである：
（ａ）被験物質とＥＴ（Ａ）遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞のＥＴ（Ａ）遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞のＥＴ（Ａ）遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＴ（Ａ）遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【０１１７】
また本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＧＡＴ１遺伝子の発現を抑制するように制御する物質のスクリーニング方法を包含するものである：
（ａ）被験物質とＧＡＴ１　遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞のＧＡＴ１　遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞のＧＡＴ１　遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、ＧＡＴ１　遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【０１１８】
また、上記いずれかの遺伝子の発現を亢進（発現レベルの増加、発現誘導の亢進）するように制御する物質の探索は、具体的には５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子が発現している細胞を用いる場合は、被験物質を添加した細胞における５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して高くなること、またこれら本発明遺伝子の発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質（例えば、マウスＡＴＤＣ５細胞の場合はインスリン）によって誘導される発現が候補物質の存在によって亢進されること、すなわち発現誘導物質存在下で候補物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で候補物質を接触させない対照細胞（正のコントロール）に比して高くなることをもって、行うことができる。
中でも好適には、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、またはＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現を上昇（発現レベルの増加、発現誘導の亢進）するように制御する物質の探索を挙げることができる。
【０１１９】
すなわち本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む５−ＨＴ７遺伝子の発現を亢進するように制御する物質のスクリーニング方法を包含するものである：
（ａ）被験物質と５−ＨＴ７遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞の５−ＨＴ７遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の５−ＨＴ７遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、５−ＨＴ７遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
【０１２０】
また本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＥＤＧ２遺伝子の発現を亢進するように制御する物質のスクリーニング方法を包含するものである：
（ａ）被験物質とＥＤＧ２遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞のＥＤＧ２遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞のＥＤＧ２遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＤＧ２遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
【０１２１】
また本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現を亢進するように制御する物質のスクリーニング方法を包含するものである：
（ａ）被験物質とＶＩＰ１Ｒ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞のＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞のＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
【０１２２】
軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質は、上記スクリーニング方法によって、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、およびＩＲＥＧ１　遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の発現変動を指標として選別される、上記遺伝子の発現制御物質に包含される。なお、ここでいう「発現制御物質」の中には、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子またはＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現亢進を指標として選別される上記遺伝子の発現亢進物質や、ＥＴ（Ａ）遺伝子またはＧＡＴ１　遺伝子の発現抑制を指標として選別される上記遺伝子の発現抑制物質が含まれる（以下、同じ）。
【０１２３】
したがって、上記スクリーニング方法は、上記各遺伝子の発現制御物質の探索方法であると同時に、軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質の探索方法として位置付けることができる。
例えば、軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質としては、ＥＴ（Ａ）遺伝子もしくはＧＡＴ１遺伝子の発現抑制物質、または５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子もしくはＶＩＰ１Ｒ遺伝子の発現亢進物質が挙げられる。
また、ＥＴ（Ａ）遺伝子およびＧＡＴ１遺伝子の少なくとも１つの発現を抑制する物質、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子及びＶＩＰ１Ｒ遺伝子の少なくとも１つの発現を亢進する物質もまた、前記候補物質として挙げられる。
【０１２４】
５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する物質（発現制御物質）の選別（探索）または軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質の選別（探索）には、下記の方法を用いることもできる。
例えばＡＴＤＣ５細胞を用いる方法として、インスリンを添加したＡＴＤＣ５細胞（対照細胞）と、インスリンと被験物質とを同時に加えたＡＴＤＣ５細胞とで上記各本発明遺伝子の発現レベルを比較し、その発現レベルの変動（減少／上昇）を指標として発現制御物質または候補物質を選別する方法を挙げることができる。また、インスリンを添加して、既に本発明遺伝子が発現誘導／または発現抑制された状態のＡＴＤＣ５細胞に被験物質を添加し、被験物質を添加しない対照のＡＴＤＣ５細胞と本発明遺伝子の発現レベルを比較して、その発現レベルの低下／または上昇を指標として発現制御物質または候補物質を選別することもできる。この場合、軟骨細胞の分化亢進に起因する軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を選別することが可能となる。
【０１２５】
また、例えばラット初代培養関節軟骨細胞を用いて発現制御物質または候補物質をスクリーニングする方法の一つとしては、細胞伸展装置（フレクサーセルテンションシステム：米国ＦＬＥＸＣＥＬＬ社、培養細胞伸展システム：大阪スカラテック社など）により力学的負荷をかけた初代培養関節軟骨細胞（対照細胞）と、力学的負荷と被験物質とを同時に加えた初代培養関節軟骨細胞とで上記本発明遺伝子の発現レベルを比較し、その発現レベルの減少／上昇を指標として発現制御物質または候補物質を選別する方法を挙げることができる。なお、上記遺伝子のうち５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子もしくはＶＩＰ１Ｒ遺伝子を対象とする場合は、発現レベルの増加（上昇）を指標として発現制御物質（発現上昇物質）または候補物質を選別することができる（以下において同じ）。また、上記遺伝子のうちＥＴ（Ａ）遺伝子もしくはＧＡＴ１遺伝子を対象とする場合は、発現レベルの減少（低下）を指標として発現制御物質（発現抑制物質）または候補物質を選別することができる（以下において同じ）。
また、力学的負荷を加えて既に本発明遺伝子が発現誘導／または発現抑制された状態の初代培養関節軟骨細胞に被験物質を添加し、被験物質を添加しない対照の初代培養関節軟骨細胞と本発明遺伝子の発現レベルを比較して、その発現レベルの低下／または上昇を指標として発現制御物質または候補物質を選別することもできる。この場合、力学的負荷異常に起因する軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を選別することが可能となる。
【０１２６】
またラット初代培養関節軟骨細胞を用いて発現制御物質または候補物質をスクリーニングするもう一つの方法としては、ＩＬ−１若しくはＴＮＦαを添加した初代培養関節軟骨細胞（対照細胞）と、ＩＬ−１若しくはＴＮＦαと被験物質とを同時に加えた初代培養関節軟骨細胞とで上記各本発明遺伝子の発現レベルを比較し、その発現レベルの減少／上昇を指標として発現制御物質または候補物質を選別する方法を挙げることができる。また、ＩＬ−１若しくはＴＮＦαを添加して、既に本発明遺伝子が発現誘導または発現抑制された状態の初代培養関節軟骨細胞に被験物質を添加し、被験物質を添加しない対照の初代培養関節軟骨細胞と本発明遺伝子の発現レベルを比較して、その発現レベルの低下または上昇を指標として発現制御物質または候補物質を選別することもできる。この場合、炎症反応に起因する軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を選別することが可能となる。
【０１２７】
このような本発明のスクリーニング方法における遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したＲＮＡ又は該ＲＮＡから転写された相補的なポリヌクレオチドと本発明の疾患マーカーとを用いて、前記（２−１）項に記述したように、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など公知の方法、あるいはＤＮＡチップなどを利用する方法に従って実施できる。これら公知の方法については、前記本発明の診断方法に関する（２−１）の項を参照されたい。指標とする遺伝子発現の変動（低下（減少）／上昇）の程度は、被験物質（発現制御物質、候補物質）を添加した細胞における５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現が被験物質（発現制御物質、候補物質）を添加しない対照細胞での発現量と比較して１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上の変動（低下（減少）／上昇（増加））を例示することができる。
【０１２８】
また５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、これらの遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することで実施することもできる。本発明の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現制御物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含されるものであり、この意味において請求項７〜１２のいずれかに記載する「５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子」の概念には、これら本発明遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
【０１２９】
なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましく、具体的には上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子もまた使用することができる。ここで５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１ｋｂ、好ましくは約２ｋｂを用いることができる。なおＥＴ（Ａ）遺伝子のプロモーター領域については文献（Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６７　（２６）：　１８７９７−１８８０４　（１９９２））において決定されており、またＶＩＰ１Ｒ遺伝子のプロモーター領域については文献（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　９２　（７），　２９３９−２９４３　（１９９５））において決定されており、またＳＣＮ２Ａ遺伝子のプロモーター領域については文献（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　Ｍｏｌ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，　８１　（１−２），　１８７−１９０　（２０００）、および、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１１　（３），　１７９−１８２　（１９９８））において決定されているため、これらの文献に開示されたプロモーター領域を使用することができる。
【０１３０】
融合遺伝子の作成、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
本発明のスクリーニング方法は、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子のいずれか少なくとも１種の発現を制御（抑制・減少／または亢進・増加）させる物質を探索することによって、軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補化合物を提供するものである。
上記スクリーニング方法によって選別される発現制御物質の中から、さらに軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を選別する方法としては、従来公知である如何なる選別方法をも用いることができるが、代表的な方法として、例えばヒト軟骨様細胞株ＳＷ１３５３（ＡＴＣＣ）あるいはヒト滑膜細胞株ＳＷ９８２（ＡＴＣＣ）を用いて、軟骨破壊因子であるＭＭＰ（例えばＭＭＰ１３）の産生量の変動を指標にして評価する方法を挙げることができる。
【０１３１】
具体的には下記の方法を例示することができる：
すなわち、１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を添加したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）で前記細胞を継代し、実験時、９６ウエルプレートに２Ｘ１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度で０．１　ｍｌ／ｗｅｌｌずつまきこむ。終濃度１０　ｎｇ／ｍｌのＨｕｍａｎ　ＩＬ−１βを添加することで刺激を加え、同時に、被験物質（前記発現制御物質）を終濃度５　μｇ／ｍｌの濃度で添加する。培養は２４時間行い、上清を回収して−８０℃に保存する。上清中のＭＭＰ１３量は、ＭＭＰ１３アッセイシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用い、添付のプロトコールに従って培地を２倍希釈したものの濃度を測定する。被験物質に３０％以上のＭＭＰ１３産生抑制能が認められる場合は、軟骨障害治療薬としての効果がある可能性が高いと判断する。
また同様の実験を、ＩＬ−１βの代わりに他の炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１８等）を用いることによっても行うことができる。さらにＭＭＰの代わりにＰＧＥ２産生量の変動を指標にすることによっても行うことができる。
【０１３２】
また、本発明のスクリーニング方法を実施する前に、上記に掲げる本発明の各遺伝子について、あらかじめ下記に説明する実験をすることにより、該遺伝子の発現を抑制する物質が軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分（候補物質）として有用なのか、また発現を誘導する物質が軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分（候補物質）として有用なのかを判断することができる。各々の遺伝子について、その発現を抑制する物質が候補物質として有用と判断された場合は、該遺伝子についての上記スクリーニング方法は、その発現の抑制を指標として実施することができ、逆にその発現を誘導する物質が候補物質として有用と判断された場合は、該遺伝子についての上記スクリーニング方法は、その発現の誘導を指標として実施することができる。
【０１３３】
かかる実験としては、例えば、ヒト滑膜細胞株ＳＷ９８２（ＡＴＣＣ）を用いて炎症性メデイエーターであるＰＧＥ２の産生量の変動を指標にする方法を挙げることができる。
具体的には、下記の実験においてＰＧＥ２の産生量が阻害される場合は、その遺伝子発現抑制物質を選別することによって、より高い精度で軟骨障害の改善薬または治療薬の候補物質を取得することが可能となる：
細胞は通常１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を添加したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）培地で培養する。実験時、１　Ｘ　１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地で希釈し、１２穴プレートに１　ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞を播きこむ。２４時間培養の後、本発明遺伝子のアンチセンスオリゴＤＮＡを遺伝子導入する。その後、培地交換とともに終濃度１０　ｎｇ／ｍｌのＨｕｍａｎ　ＩＬ−１βを添加することで刺激を加える。Ｈｕｍａｎ　ＩＬ−１β　添加後２４時間培養を行ったのち培養上清を回収し、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２　ＥＩＡシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて培養上清中のＰＧＥ２量を測定する。本発明遺伝子のアンチセンスオリゴＤＮＡの導入により当該ＰＧＥ２の産生量が３０％以上阻害される場合は、その遺伝子発現抑制物質が治療薬になる可能性が高いと考えられる。
また下記の実験においてＰＧＥ２の産生量が阻害される場合は、その遺伝子発現誘導（亢進）物質を選別することによって、より高い精度で軟骨障害の改善薬または治療薬の候補物質を取得することが可能となる：
哺乳動物細胞発現ベクター（ストラタジーン社ｐＳＧ５等）を用い、本発明遺伝子の発現ベクターを作製し、これを対象とする上記の細胞に導入する。なお、導入は上記の方法と同様にして行うことができる。本発明遺伝子の導入により前記ＰＧＥ２の産生量が３０％以上阻害される場合は、その遺伝子発現誘導（亢進）物質が治療薬になる可能性が高いと考えられる。
【０１３４】
以上のスクリーニング方法により被験物質から選別される物質は、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子のいずれか少なくとも１種の発現制御剤として位置づけることができる。これらの物質が有する本発明遺伝子に対する発現制御作用は軟骨障害の抑制に深く関っているものと考えられる。よって、これらの物質は、軟骨障害を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となりえる。
【０１３５】
（３−２）　タンパク質の発現量を指標とするスクリーニング方法
本発明は、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の発現を制御する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明スクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：（ａ）被験物質と５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１を発現可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞または該細胞から調製した細胞画分における５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞または対照細胞画分における上記タンパク質の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の発現を低下させる被験物質を選択する工程。
【０１３６】
本発明スクリーニング方法に用いられる細胞は、内在性および外来性を問わず、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１を発現し、発現産物としての５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１を有する培養細胞全般を挙げることができる。具体的には上記（３−１）項に記載された細胞を挙げることができる。
５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１の発現は、遺伝子発現産物であるタンパク質を検出することにより、容易に確認することができる。細胞画分とは、上記細胞に由来する各種画分を意味し、これには、例えば、細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分などが含まれる。
本発明のスクリーニング方法には、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１のタンパク質の発現レベルを指標として、その発現量を制御する物質（発現レベルを正常レベルに戻す物質）を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によって、変形性関節症の緩和／抑制作用を有する（変形性関節症に対して改善／治療効果を発揮する）候補物質を提供することができる。
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、または、ＩＲＥＧ１のタンパク質発現量を変動させる物質を探索することによって、変形性関節症の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
なお、ここで「タンパク質発現量を制御（変動）する」とは、「タンパク質の発現量が減少するように制御する」という意味と、「タンパク質の発現量が増加するように制御する」という意味の２つの意味を含む。
【０１３７】
上記いずれかのタンパク質の発現を抑制（発現レベルの減少、発現誘導の抑制）するように制御する物質の探索は、具体的には５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１を発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１のタンパク質量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のタンパク質量（レベル）に比して低くなることを指標として、行うことができる。また、これらの本発明タンパク質の発現に、発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質（例えば、マウスＡＴＤＣ５細胞の場合はインスリン）によって誘導される発現が、候補物質の存在によって抑制されること、すなわち発現誘導物質存在下で候補物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で候補物質を接触させない対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることをもって、行うことができる。
なかでも好適には、ＥＴ（Ａ）またはＧＡＴ１の発現を抑制（タンパク質量の減少）するように制御する物質の探索を挙げることができる。
【０１３８】
また、上記いずれかのタンパク質の発現を亢進（発現レベルの増加、発現誘導の亢進）するように制御する候補物質の選別は、具体的には５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１を発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１の蛋白量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して高くなることを指標として、行うことができる。また、これらの本発明タンパク質の発現に、発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質（例えば、マウスＡＴＤＣ５細胞の場合はインスリン）によって誘導される発現が、候補物質の存在によって亢進されること、すなわち発現誘導物質存在下で候補物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で候補物質を接触させない対照細胞（正のコントロール）に比して高くなることをもって、行うことができる。
なかでも好適には、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２またはＶＩＰ１Ｒの発現を亢進（タンパク質量の増加）するように制御する物質の探索を挙げることができる。
【０１３９】
本発明のスクリーニング方法にかかる５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３およびＩＲＥＧ１のいずれかの発現量は、前述したように、例えば抗体に関する本発明疾患マーカー（例えばヒト５−ＨＴ７タンパク質またはそのホモログ、ヒトＥＤＧ２タンパク質またはそのホモログ、ヒトＥＤＧ１タンパク質またはそのホモログ、ヒトＥＴ（Ａ）タンパク質またはそのホモログ、ヒトＧＰＲ８８タンパク質またはそのホモログ、ヒトＰＴＨ２Ｒタンパク質またはそのホモログ、ヒトＶＩＰ１Ｒタンパク質またはそのホモログ、ヒトＣＬＩＣ２タンパク質またはそのホモログ、ヒトＳＣＮ２Ａタンパク質またはそのホモログ、ヒトＡＴＡ１タンパク質またはそのホモログ、ヒトＡＢＣＡ１タンパク質またはそのホモログ、ヒトＡＢＣＧ２タンパク質またはそのホモログ、ヒトＧＡＴ１タンパク質またはそのホモログ、ヒトＰＬＴＰタンパク質またはそのホモログ、ヒトＥＮＴ１タンパク質またはそのホモログ、ヒトＮＰＴ３タンパク質またはそのホモログ、およびヒトＩＲＥＧ１タンパク質またはそのホモログを認識する抗体）を用いたウェスタンブロット法等の公知方法に従って定量できる。ウェスタンブロット法は、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（ＢＡＩ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム　ファルマシアバイオテク社製）を利用して該プロトコールに従って検出し、マルチバイオメージャーＳＴＯＲＭ８６０（アマシャム　ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
【０１４０】
候補物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸（本発明遺伝子のアンチセンス核酸を含む）、ペプチド、タンパク質（本発明タンパク質に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記組織／または細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。
軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質は、上記スクリーニング方法によって得られる５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３またはＩＲＥＧ１の少なくとも１つのタンパク質の発現を制御する物質（発現制御物質）に包含される。
【０１４１】
（３−３）　タンパク質の機能を指標とするスクリーニング方法
本発明は、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１の機能（活性）を制御する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１４２】
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）　５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分の上記５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１の機能（活性）を変動させる被験物質を選択する工程。
【０１４３】
かかるスクリーニングは、上記の本発明のタンパク質の少なくとも１つを含むものを対象として行うことができ、具体的には、本発明タンパク質の機能（活性）に応じて、水溶液、細胞またはその細胞画分のいずれかの形態のものを例示することができる。ここで水溶液とは、本発明タンパク質を含むものであればよく、特に制限されないが、例えば通常の水溶液の他、細胞溶解液、核抽出液あるいは培養上清なども含まれる。また細胞としては、内在性及び外来性などの由来に関わらず、本発明遺伝子を発現しており、本発明タンパク質を有する細胞を挙げることができる。また細胞画分とは、かかる細胞に由来する各種の画分を意味するものであり、例えば細胞膜画分、細胞質画分、および細胞核画分などを挙げることができる。
【０１４４】
実施例に示すように、本発明タンパク質である、５−ＨＴ７、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＰＬＴＰ、ＮＰＴ３、並びに、ＩＲＥＧ１は、ラット十字靭帯切断モデルの障害軟骨において、正常軟骨と比較して発現上昇していた。
また、ＥＤＧ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＢＣＧ２、ＥＮＴ１、並びに、ＧＡＴ１は、ラット十字靭帯切断モデルの障害軟骨において、正常軟骨と比較して発現減少していた。
これらの知見から、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子がコードするタンパク質は、軟骨障害の発生、進行または抑制などにおいて関連性があるものと考えられる。すなわち本発明のスクリーニング方法は、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ　遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子によりコードされるタンパク質が、軟骨障害と関連していることを利用したものである。よって、該軟骨障害の緩和／抑制作用を有する（軟骨障害に対して改善／治療効果を発揮する）物質の探索には、上記本発明タンパク質の機能または活性の変動（低下または抑制／上昇または亢進）が指標とされる。
【０１４５】
すなわち軟骨障害の緩和／抑制作用を有する（軟骨障害に対して改善／治療効果を発揮する）物質の探索には、まず上記に掲げる少なくとも１つの本発明タンパク質の機能または活性の変動（低下または抑制／上昇または亢進）を指標として、当該タンパク質の機能または活性を制御する物質（制御物質）を探索することが必要である。なお、ここでいう「タンパク質の機能または活性を制御する物質（制御物質）」の中には、「タンパク質の機能または活性を抑制するように制御する物質」と「タンパク質の機能または活性を亢進するように制御する物質」の２つが含まれる。本発明は、上記に掲げる少なくとも１つの本発明タンパク質の機能または活性を制御する物質（制御物質）をスクリーニングする方法を提供し、それによって得られた制御物質を軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質として提供するものである。
【０１４６】
本発明タンパク質の機能（活性）制御の１つの態様として、該タンパク質の機能（活性）を抑制（低下）させる方向に制御する物質の探索は、例えば５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ　、ＡＴＡ１　、ＡＢＣＡ１　、ＡＢＣＧ２　、ＧＡＴ１　、ＰＬＴＰ　、ＥＮＴ１　、ＮＰＴ３　、またはＩＲＥＧ１　を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分に被験物質を接触させた場合に得られる上記の少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）が、被験物質を添加しない対照の水溶液、細胞または細胞画分の上記対応するタンパク質の機能（活性）に比して低くなることを指標として行うことができる。
【０１４７】
なかでも好適には、ＥＴ（Ａ）またはＧＡＴ１の機能（活性）を抑制（低下）させる方向に制御する物質の探索を挙げることができる。すなわち本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＥＴ（Ａ）の機能または活性を抑制するように制御する物質のスクリーニング方法を包含するものである：
（ａ）　ＥＴ（Ａ）を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＴ（Ａ）由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分の上記ＥＴ（Ａ）の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＴ（Ａ）の機能（活性）を低下させる被験物質を選択する工程。
【０１４８】
また、本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＧＡＴ１の機能または活性を抑制するように制御する物質のスクリーニング方法を包含するものである：
（ａ）　ＧＡＴ１を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＧＡＴ１由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分の上記ＧＡＴ１の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＧＡＴ１の機能（活性）を低下させる被験物質を選択する工程。
【０１４９】
一方、本発明タンパク質の機能（活性）制御のもう１つの態様として、該タンパク質の機能（活性）を亢進（上昇、増加）させる方向に制御する物質の探索は、例えば５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分に被験物質を接触させた場合に得られる上記の少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）が、被験物質を添加しない対照の水溶液、細胞または細胞画分の上記対応するタンパク質の機能（活性）に比して高くなることを指標として行うことができる。
【０１５０】
中でも好適には、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２またはＶＩＰ１Ｒの機能（活性）を亢進（上昇）させる方向に制御する物質の探索を挙げることができる。すなわち本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む５−ＨＴ７の機能または活性を亢進するように制御する物質のスクリーニング方法を包含するものである：
（ａ）　５−ＨＴ７を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分の上記５−ＨＴ７の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分の５−ＨＴ７の機能（活性）を亢進させる被験物質を選択する工程。
【０１５１】
また、本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＥＤＧ２の機能または活性を亢進するように制御する物質のスクリーニング方法を包含するものである：
（ａ）　ＥＤＧ２を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＤＧ２由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分の上記ＥＤＧ２の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＥＤＧ２の機能（活性）を亢進させる被験物質を選択する工程。
【０１５２】
また、本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＶＩＰ１Ｒの機能または活性を亢進するように制御する物質のスクリーニング方法を包含するものである：
（ａ）　ＶＩＰ１Ｒを含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）　被験物質を接触させた水溶液、細胞またはその細胞画分のＶＩＰ１Ｒ由来の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞またはその細胞画分の上記ＶＩＰ１Ｒの機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、上記水溶液、細胞またはその細胞画分のＶＩＰ１Ｒの機能（活性）を上昇させる被験物質を選択する工程。
【０１５３】
軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質は、上記スクリーニング方法によって、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１の少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）の変動を指標として選別される上記タンパク質の機能（活性）制御物質に包含される。なお、ここでいう「タンパク質の機能（活性）制御物質」の中には、ＥＴ（Ａ）もしくはＧＡＴ１の少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）の抑制を指標として選別される上記タンパク質の機能（活性）抑制物質、または５−ＨＴ７、ＥＤＧ２もしくはＶＩＰ１Ｒの少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）の亢進を指標として選別される上記タンパク質の機能（活性）亢進物質が含まれる（以下、同じ）。
したがって、上記スクリーニング方法は、上記各本発明タンパク質の制御物質の探索方法であると同時に、軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質の探索方法として位置付けることができる。
【０１５４】
ここで軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸（本発明遺伝子のアンチセンス核酸を含む）、ペプチド、タンパク質（本発明タンパク質に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記水溶液、細胞またはその細胞画分と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。
【０１５５】
５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、ＶＩＰ１Ｒ、ＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１の少なくとも１つの本発明タンパク質の機能（活性）を制御する物質（以下、単に「制御物質」ともいう）の選別（探索）、言い換えれば軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質（以下、単に「候補物質」ともいう）の選別（探索）には、以下の方法を用いることができる。
【０１５６】
Ｉ．本発明のタンパク質が受容体である場合
Ｉ−１．　受容体結合阻害活性の測定
本発明タンパク質がＧ蛋白共役型受容体（ＧＰＣＲ）である場合、すなわち本発明タンパク質が５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＧＰＲ８８、ＰＴＨ２Ｒ、またはＶＩＰ１Ｒである場合、被験物質が、本発明タンパク質（ＧＰＣＲ）と該タンパク質の既知のリガンドとの結合を阻害するか否かを測定することによって、候補物質を選別するスクリーニング方法が挙げられる。
該スクリーニング方法は、当業者の常識の範囲より適宜選択されるが、一例としては、（ａ）本発明タンパク質に標識リガンドを接触させた場合に、該タンパク質に結合する標識リガンド量と、（ｂ）本発明タンパク質に標識リガンドおよび被験物質を接触させた場合に、該タンパク質に結合する標識リガンド量とを比較評価することを含むスクリーニング方法が挙げられる。
また、本発明タンパク質を発現する細胞膜画分をチップ上に固定し、該チップ上に被験物質溶液をロードして、表面プラズモン共鳴法により被験物質の膜への結合及び解離を測定し、結合及び解離の速度あるいは結合量から、被験物質と本発明タンパク質との親和性を算出する方法を用いることもできる。
ここで用いられる本発明タンパク質は、天然物であっても組み換え体であってもよい。また、ヒト型であることが好ましいが、マウス型などの他の種由来のものも利用できる。
本発明タンパク質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｔ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）等の基本書に従い、当業者にとって公知の方法で調製することができる。例えば、本発明タンパク質のｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ１０８，　１９３−１９９（１９９１））、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ３．１誘導体（インビトロジェン社）などの公知の発現ベクターに挿入する。その後、適当な宿主に導入し、培養することにより、導入した本発明タンパク質のＤＮＡに対応するタンパク質を発現させた形質転換細胞を作製することができる。宿主としては、一般的に広く普及している、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＯＳ細胞などを用いることができるが、これに限定されることなく、酵母、細菌、昆虫細胞などを用いることもできる。
本発明タンパク質のｃＤＮＡを有する発現ベクターの宿主細胞への導入方法としては、公知の発現ベクターの宿主細胞への導入方法であれば、どのような方法でもよく、例えばリン酸カルシウム法（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．，　５２，　４５６−４６７（１９７３））、ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ社製）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を用いる方法などが挙げられる。
以上のようにして得られた本発明タンパク質を発現する形質転換細胞は、そのままスクリーニングに用いることができるが、細胞膜をスクリーニングに用いる場合は、例えば以下のようにして細胞膜画分を得ることができる。すなわちまず細胞に低張バッファーを添加し、細胞を低張破壊した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより細胞膜画分の沈殿物を得る。そしてこの沈殿物をバッファーに懸濁することにより、本発明タンパク質である受容体を含有する細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分は、抗体を結合させたカラム等により常法で精製することもできる。
上記スクリーニング方法には、本発明タンパク質を発現する細胞、または前記細胞の細胞膜画分を用いることもできる。該細胞は、天然の細胞であっても形質転換細胞であってもよい。
【０１５７】
上記のスクリーニング方法で用いられる標識リガンドは、本発明タンパク質のリガンドとして既知のものを適宜標識して用いることができる。
標識リガンドとしては、リガンドの任意の１または複数の原子を放射性同意元素で標識したリガンド、蛍光・ビオチン等で標識したリガンドなどが挙げられ、放射性同位体元素で標識したリガンドとしては、具体的には水素原子を３Ｈ（トリチウム）で標識する方法、炭素原子を１４Ｃで標識する方法、または、硫黄原子を３５Ｓで標識する方法が挙げられる。または、リガンドがベンゼン環を含む場合該ベンゼン環の任意の水素原子を、１２５Ｉで置換して標識することもできる。
具体的には、５−ＨＴ７の標識リガンドとしては［３Ｈ］５−ＨＴ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製等）または［３Ｈ］５−カルボキサミドトリプタミン（［３Ｈ］５−ＣＴ；Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＴＲＫ．１０３８）を、ＥＤＧ２の標識リガンドとしては１−Ｏｌｅｏｙｌ［ｏｌｅｏｙｌ−９，１０−３Ｈ］−ＬＰＡ（ＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔ社製等）を、ＥＤＧ１の標識リガンドとしては［３Ｈ］Ｓ−１−Ｐ　（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７２：５２９１−９７，１９９７）を、ＥＴ（Ａ）の標識リガンドとしては［１２５Ｉ］Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１，　［３Ｈ］ＢＱ１２３（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製等）を、ＰＴＨ２Ｒの標識リガンドとしては［１２５Ｉ］（Ｎｌｅ８，Ｎｌｅ１８，Ｔｙｒ３４）ＰＴＨ（１−３４）ａｍｉｄｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製等）を、ＶＩＰ１Ｒの標識リガンドとしては［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ＶＩＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製等）等を、それぞれ用いることができる。
また、ペプチド化合物の標識リガンドについては蛍光標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製Ａｌｅｘａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔｓ等）、ビオチン標識（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＥＺ−Ｌｉｎｋ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓ等）、化学発光色素標識（Ａｓｓａｙ　Ｄｅｓｉｇｎｓ社製Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ等）を用いる非放射ラベル化が可能である。
【０１５８】
受容体結合阻害活性の測定は、具体的には、以下の手順で行うことができる。すなわち、本発明タンパク質（受容体）を含有する水溶液（通常緩衝液が用いられる。）、細胞膜画分、もしくは形質転換細胞に、１０−３〜１０−１０Ｍの適当な濃度に調製した被験化合物溶液（通常溶媒には水もしくは緩衝液が用いられるが、溶解度に応じてエタノールやＤＭＳＯを添加することもできる。）を加えた後、標識リガンドを加え、室温で一定時間（通常、１０分〜２時間）反応させる。
本発明タンパク質を含有する形質転換細胞もしくは細胞膜画分を用いる場合、遠心分離等により上清を単離して放射活性を測定し、上清中に含まれる標識リガンド量を計測することができる。あるいは、形質転換細胞もしくは細胞膜画分を含む沈殿物を界面活性剤、塩基を含む溶液に溶解し、その放射活性を測定し、沈殿物に含まれる標識リガンド量を計測することができる。
上記の数値を、被験化合物の代わりに溶媒をブランクとして用いて実施した場合の値と比較することにより、被験化合物が本発明タンパク質（受容体）と標識リガンドの結合を阻害するか否かを評価することができる。具体的な阻害率（％）については、以下の式：
｛１−（被験物質を添加した場合に本発明タンパク質と結合した標識リガンド量）／（被験物質非添加時における本発明タンパク質と結合した標識リガンド量）｝Ｘ１００
で算出することによって求めることができる。
【０１５９】
尚、前記スクリーニング方法においては本発明タンパク質の機能を阻害する物質および亢進する物質が共に選択されるため、該物質が本発明タンパク質の機能を阻害するか亢進するかを決定するには、更に別のスクリーニング方法を実施することが望ましい。
【０１６０】
Ｉ−２．　ＧＴＰとの結合活性を測定する方法
本発明タンパク質がＧ蛋白共役型受容体（ＧＰＣＲ）である場合、該タンパク質の機能の測定は、Ｇ蛋白共役型受容体（ＧＰＣＲ）がＧＤＰ存在下でＧＴＰアナログであるＧＴＰγＳと結合する性質を利用して行うことも出来る。すなわち、被験物質が、本発明タンパク質（ＧＰＣＲ）とＧＴＰγＳの結合を制御（阻害もしくは亢進）するか否かを調べることにより、被験物質が本発明タンパク質の機能を制御するか否かを評価することができる。すなわち、当業者に公知の方法を用いて、本発明タンパク質（ＧＰＣＲ）の発現ベクターを作製し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞・ＨＥＫ２９３細胞等に過剰発現させ、培養する。ここで、必要に応じて、Ｇタンパク質の発現ベクターを共発現させることもできる。遠心分離等の操作により、細胞膜画分を調製する。これを、適当な緩衝液などの溶媒中で、被験物質とともに混合し、一定時間（例えば、３０分〜２時間）インキュベートする。更に、［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳを混合し、一定時間（例えば、３０分〜２時間）インキュベートする。グラスフィルター上で、緩衝液で洗浄することにより結合反応を終了させた後、フィルター上の放射活性を測定することにより、本発明タンパク質（ＧＰＣＲ）とＧタンパク質複合体に結合した［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ量を算出することができる。被験物質存在下での結合量と、被験物質非存在下での結合量を比較することにより、被験物質を、本発明タンパク質（受容体）の活性を制御する候補物質として選別することができる。
【０１６１】
上記スクリーニング方法において、被験物質の存在下で放射活性（Ｇタンパク質複合体に結合した［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ　量）が増加すれば、該被験物質はアゴニストであり、放射活性が減少すればインバースアゴニストである。
また、上記スクリーニング方法を、アゴニストリガンドの共存下に行うことにより、本発明タンパク質のアンタゴニストをスクリーニングすることができる。すなわち、アゴニストリガンドおよび被験物質の共存下で放射活性が被験物質非存在下における放射活性よりも小さければ被験物質はアンタゴニストである。
【０１６２】
あるいは、ＧαへのＧＴＰアナログの結合を表面プラズモン共鳴法等を用いてモニタリングすることによってもスクリーニングが可能である。
【０１６３】
上記の方法で、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２、ＥＤＧ１、ＥＴ（Ａ）、ＰＴＨ２Ｒ、およびＶＩＰ１Ｒの機能を制御する候補物質のスクリーニングを実施することができる。
尚、アゴニストリガンドが不明であるＧＰＲ８８については、ＧＰＲ８８およびＧタンパク質の融合タンパク質を用いる方法等を用いることにより、より効率的にアゴニストリガンド非存在下で上記のスクリーニングを実施することができる。これについては、本明細書実施例、および　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．　３４３：２６０−７３，２００２，　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　２７６：　３５８８３−９０，２００１　に記載された方法に従って実施することができる。
【０１６４】
Ｉ−３．　受容体の生理活性の測定
本発明タンパク質がＧ蛋白共役型受容体（ＧＰＣＲ）である場合、該タンパク質にアゴニストリガンドが結合することによって生ずる生理活性を指標として、該タンパク質の機能を制御する候補物質を選別することもできる。すなわち、（ａ）本発明タンパク質にアゴニストリガンドを接触させた場合における、本発明タンパク質（受容体）を介した前記生理活性と、（ｂ）本発明タンパク質（受容体）にアゴニストリガンドおよび被験化合物を接触させた場合に生ずる生理活性とを比較評価することを含むスクリーニング方法が挙げられる。該方法により、アンタゴニスト作用を有する被験物質を選別することができる。
また、（ｃ）本発明タンパク質に被験物質を接触させた場合における、本発明タンパク質（受容体）を介した生理活性と、（ｄ）本発明タンパク質に溶媒などのブランクを接触させた場合における生理活性とを比較評価することにより、被験物質がアゴニスト作用又はインバースアゴニスト作用を有するか否かを評価することができる。
該生理活性としては、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、イノシトールリン酸産生（ホスホリパーゼＣβ活性）、ＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）応答エレメント（ＴＲＥ）のレポータージーンアッセイ、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ応答性エレメントのレポータージーンアッセイ、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、細胞膜電位変動、またはｐＨの低下等を促進もしくは抑制する等の活性が挙げられる。
該生理活性は、公知の方法、または市販の測定用キットを用いて測定することができる。すなわち、本発明タンパク質（ＧＰＣＲ）を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。新鮮な培地、あるいは細胞毒性を示さない適当なバッファーに交換し、被験化合物、および／またはアゴニストリガンド等を添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出、あるいは上清液を回収して生成した産物をそれぞれ該当する方法に従って定量する。生理活性の指標とする物質（例えばアラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって測定不能な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を併用することもできる。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の産生量を増大させて、感度良く測定することもできる。
【０１６５】
具体的には、以下の方法が挙げられる。
（１）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いる方法
１）本発明タンパク質遺伝子の発現ベクターと、Ｇｑ蛋白、Ｇｑｓ５蛋白（Ｇｑｓ５とは、Ｃ末端に、Ｇｓ蛋白のＣ末端アミノ酸５残基を置換したＧｑ蛋白を意味する。）もしくはＧｑｉ５蛋白（Ｇｑｉ５とは、Ｃ末端に、Ｇｉ蛋白のＣ末端アミノ酸５残基を置換したＧｑ蛋白を意味する。）の発現ベクターを作製する。ここで、細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞等を用いることができ、上記発現ベクターを遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いて共導入することができる。
２）次に該細胞を、ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（色素を細胞内に保持するために、ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｕｍｐの阻害剤として用いる。）、およびＦｌｕｏ−３　ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社）等のＣａ２＋によって蛍光活性を示す色素を含むＦ１２培養培地中で、ＣＯ２インキュベーターにて一定時間（例えば３０分〜２時間）培養する。
３）アゴニストリガンドをｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを含むＨＢＳＳ等の培養培地に溶解した溶液を添加し、２分後までＦＬＩＰＲにて計測する。検出は、４８８ｎｍのアルゴンレーザーで細胞を励起し、カルシウムイオンが結合したＦｌｕｏ−３の蛍光を５００−５６０ｎｍの波長でとらえることによって行う。アゴニストリガンド添加直後から６０秒後までの蛍光強度から、添加前の値をバックグラウンドとして差し引いた値を活性とする。被験物質を添加する場合はアゴニストリガンドを添加する前に添加し、その後アゴニストリガンドを添加する。
４）被験物質の存在下における本発明タンパク質の生理活性と、被験物質非存在下における該生理活性の差異を求めることにより、差異の大きい被験物質を、本発明タンパク質の生理活性を抑制もしくは亢進する候補物質として選別することができる。すなわち、被験物質及びアゴニストリガンドの共存下における蛍光強度が、被験物質非存在下におけるアゴニストリガンドの蛍光強度よりも小さければ、該被験物質はアンタゴニストである。
また、上記３）においてアゴニストリガンドの代わりに被験物質を添加してアッセイを行うことにより、アゴニスト活性もしくはインバースアゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、被験物質存在下における蛍光強度が被験物質非存在下における蛍光強度よりも大きければ被験物質はアゴニストであり、被験物質存在下における蛍光強度が被験物質非存在下における蛍光強度よりも小さければ被験物質はインバースアゴニストである。　ここで、本発明タンパク質がアゴニスト不明であるＧＰＲ８８である場合、前記１）〜４）の工程を実施するにあたって、３）の工程においてアゴニストのかわりに被験物質を用いることにより、被験物質が本発明タンパク質のアゴニスト活性を有するか否かを調べることができる。
更に、アゴニストリガンド非存在下に本発明のタンパク質（受容体）を活性化させるためにＧＰＲ８８およびＧタンパク質を融合タンパク質として発現させる方法を用いることができる。すなわち、前記１）〜４）の工程を実施するにあたって、１）の工程において、ＧＰＲ８８とＧタンパク質を融合させたタンパク質を共発現させ、前記３）の工程をアゴニストリガンド非存在下に実施することにより、被験物質が本発明タンパク質の機能を阻害するか否かを調べることができる。ここで用いられるＧタンパク質は、通常Ｇタンパク質のαサブユニットであり、４種類のクラス（αＳ、αｉ／０、αｑ、α１２）が挙げられる。具体的なＧタンパク質としては、ＧｑファミリーのＧα１６、ＧｉファミリーのＧαｉ２、ＧｓファミリーのＧαＳ２が挙げられる。すなわち、それぞれのＧタンパク質とＧＰＲ８８との融合タンパク質を発現させ、細胞内ｃＡＭＰを上昇させる活性等のＧＰＣＲの活性化に伴う生理活性を測定することによって、最もスクリーニングに適したＧタンパク質を選択することができる。
【０１６６】
また、上記ＦＬＩＰＲを用いる方法以外に、３Ｈ標識したホスファチジルイノシトール−４，５−ニリン酸を添加し、生成するイノシトールリン酸量を公知の手法を用いて測定することもできる。
また、Ｃａ２＋により活性化されるＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）応答エレメント（ＴＲＥ）の下流にルシフェラーゼ、　クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、成長ホルモン、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子を連結し、レポータージーンアッセイを行う方法が挙げられ、以下の（２）と同様の手順で実施することができる。
【０１６７】
（２）ｃＡＭＰ応答性エレメントのレポータージーンアッセイを用いる方法
ｃＡＭＰ応答性エレメントのレポータージーンアッセイを用いる方法は、本発明タンパク質にアゴニストが結合して生じるシグナル伝達により活性化されるｃＡＭＰ応答性エレメント（ＣＲＥ）の下流にルシフェラーゼ、　クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、成長ホルモン、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子を連結し、レポータージーンアッセイを行う方法である。すなわち、
１）本発明遺伝子、ＧｓまたはＧｉ、およびｃＡＭＰ応答性エレメント（ＣＲＥ）の下流にルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、成長ホルモン、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子を連結した遺伝子を発現するベクターを作製する。ここで、細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞等を用いることができ、上記発現ベクターを遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いて共導入することができる。
２）次に該細胞を、適当な培地中で、ＣＯ２インキュベーターにて一定時間（例えば４〜８時間）培養する。
３）培地交換後、被験物質及び／またはアゴニストリガンドを適当な培養培地に溶解した溶液を添加し、一定時間（４時間〜２４時間）後、レポーター活性を測定する。例えばルシフェラーゼの場合は、細胞溶解液で細胞を溶かし、その一部分を用いてルシフェラーゼ基質溶液（プロメガ社Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ等）と反応させた際の発光をルミノメーターで測定する。
４）被験物質の存在下における本発明タンパク質の生理活性と、被験物質非存在下における該生理活性の差異を求めることにより、差異の大きい被験物質を、本発明タンパク質の生理活性を抑制もしくは亢進する候補物質として選別することができる。ＧαがＧｉαの場合、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば該被験物質はインバースアゴニストであり、活性が減少すればアゴニストである。一方ＧαがＧｓαの場合、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば該被験物質はアゴニストであり、活性が減少すればインバースアゴニストである。
また、アゴニストリガンドの共存下に被験物質が該アゴニストの生理活性を抑制すれば該被験物質はアンタゴニストである。
ここで、本発明タンパク質がアゴニスト不明であるＧＰＲ８８である場合、前記のとおり、ＧＰＲ８８およびＧタンパク質を融合タンパク質として発現させる方法を用いて前記１）の工程を実施し、２）から３）を前記と同様に実施することができる。
【０１６８】
（３）アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性を測定する方法
本発明タンパク質（ＧＰＣＲ）が、Ｇｓ蛋白もしくはＧｉ蛋白と共役して存在し、アゴニスト刺激によりアデニレートサイクラーゼを活性化、細胞内ｃＡＭＰを上昇させる活性を用いて、スクリーニングを行うことができる。すなわち、本発明タンパク質（ＧＰＣＲ）がＧｓαと相互作用する場合、アゴニストリガンドが結合することによってＡＣ活性を奏する。一方本発明タンパク質（ＧＰＣＲ）がＧｉαと相互作用する場合、アゴニストリガンドが結合することによってＡＣ活性が抑制される。
ＡＣ活性の測定には公知の方法を用いることができる。例えば、ＡＣを含む膜画分にＡＴＰを添加し、生成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗体を用いてＲＩ（１２５Ｉ）、酵素（アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で標識したｃＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定する方法や、ＡＣを含む膜画分に［α−３２Ｐ］ＡＴＰを添加し、生成する［３２Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法等が挙げられる。
具体的には、被験物質及び／またはアゴニストリガンドの存在下でＡＣ活性を測定・比較する。ＧαがＧｉαの場合、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば該被験物質はインバースアゴニストであり、活性が減少すればアゴニストである。一方ＧαがＧｓαの場合、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば該被験物質はアゴニストであり、活性が減少すればインバースアゴニストである。
また、アゴニストリガンドの共存下に被験物質が該アゴニストの生理活性を抑制すれば該被験物質はアンタゴニストである。
また、細胞を［３Ｈ］アデニンで標識し、生成した［３Ｈ］ｃＡＭＰの放射活性を測定することによって、ＡＣ活性を評価することもできる。
【０１６９】
上述の方法を用いて、本発明タンパク質（受容体）の機能に基づくスクリーニングを実施することができる。本発明タンパク質（ＧＰＣＲ）それぞれについて、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）に例示する。
（ｉ）　５−ＨＴ７：
５−ＨＴ７は、５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ受容体ファミリーの一つであって、Ｇｓ蛋白と共役しアデニレートサイクラーゼを活性化する（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８　（３１），　２３４２２−２３４２６　（１９９３））。５−ＨＴ７受容体は、海馬ＣＡ２，ＣＡ３領域に高密度に存在すること、また、抗精神病薬や抗うつ薬と高親和性を示すこと等から、神経機能との関わりが指摘されている。また、末梢血リンパ球、脾臓、および胸腺でも発現が見られることから免疫機能との関わりも指摘されている（Ｂｒａｉｎ，　Ｂｅｈａｖｉｏｒ，　＆　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１４：２１９−２４、２０００）。５−ＨＴ７受容体活性の測定は、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ２７０：２４２−８，１９９９，　ＰＮＡＳ９５：３５２−７，１９９８に記載された方法に基づき、前記の方法で行うことができる。
また、公開特許公報：特開２００３−１２６４８に記載された、ラット５−ＨＴ７受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞を用いて被験物質による［３Ｈ］−５−カルボキサミドトリプタミンの受容体結合阻害活性を測定する方法、前記細胞を用いて被験物質のアデニル酸シクラーゼ活性を測定する方法を用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様として、５−ＨＴ７の機能を促進する物質、即ち５−ＨＴ７のアゴニストを選別する方法が挙げられる。
【０１７０】
（ｉｉ）　ＥＤＧ２：
ＥＤＧ２は、リゾリン脂質（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）に対する受容体ＥＤＧファミリーの一つであり、ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ　ａｃｉｄ（ＬＰＡ）をアゴニストとするＧ蛋白共役型受容体である（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　＆　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　２３１：　６１９−２２，１９９７）。ＬＰＡによるＥＤＧ２を介した細胞内カルシウム上昇作用は主としてＧｉ蛋白を介することが百日咳毒素を用いた実験から示されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ５４：　８８１−８，１９９８）。
ＥＤＧ２活性は、当業者に公知の任意の方法で測定することができる。例えば本受容体がアゴニストであるＬＰＡにより活性化すると細胞内カルシウムが上昇することを利用しｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いて行うことができる。また、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７３，　４６５３−４６５９　（１９９８）に記載されたＧ１２／１３由来のシグナル伝達を用いる方法、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　９５，６１５１−６１５６　（１９９８）、Ｍｏｌ．　Ｂｒａｉｎ．　Ｒｅｓ．，　５０，　１２１−１２６　（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ．，　１５８２，　１９０−１９６　（２００２）に記載された方法等を用いることもできる。本発明のスクリーニング方法の好ましい態様として、ＥＤＧ２の機能を促進する物質、すなわちアゴニストを選別する方法が挙げられる。
【０１７１】
（ｉｉｉ）　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，　ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ　ａｃｉｄ　Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　１：
ＥＤＧ１は、リゾリン脂質（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）に対する受容体ＥＤＧファミリーの一つであり、Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓ１Ｐ）をアゴニストとするＧ蛋白共役型受容体である（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９　（５３５６），　１５５２−１５５５　（１９９８））。Ｓ１ＰによるＥＤＧ１を介した細胞内カルシウム上昇作用は主としてＧｉ蛋白を介することが百日咳毒素を用いた実験から示されている（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ２７３：２７１０４−１１０，１９９８）。
ＥＤＧ１活性の測定は、本受容体がアゴニストであるＳ１Ｐにより活性化すると細胞内カルシウムが上昇することを利用し（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ２７３：２７１０４−１１０，１９９８）、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いて行うことができる。
【０１７２】
（ｉｖ）　ＥＴ（Ａ）：
ＥＴ（Ａ）　（ＥＤＮＲＡ）は強力な持続性血管収縮作用を持つＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ（ＥＴ）の受容体として同定された因子である（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８８　（８），　３１８５−３１８９　（１９９１））。これまでの研究によりＥＴが血管以外の心臓・肺・腎臓・内分泌組織にも作用すること、それらの器官にもＥＤＮＲＡが発現していることが明らかにされている（タンパク質核酸酵素４５（６）９６１−６，２０００）。
ＥＤＮＲＡの活性測定は、ＥＤＮＲＡがＧｓ蛋白を介してｃＡＭＰの上昇をもたらすことから（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６７：１２４６８−７４，１９９２，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７０１００７２−８，１９９５）、Ｇ蛋白としてＧｑｓ５を用いて、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いて行うことができる。
また、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｓｃｉ．，　１５，　３１３　（１９９４）、Ｂｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　１１２，　２０７−２１３（１９９４）、Ｅｕｒ　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　２５２，　２，　Ｒ３−Ｒ４　（１９９４）に記載された方法を用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様として、ＥＴ（Ａ）の機能を抑制する物質、すなわちアンタゴニストもしくはインバースアゴニストを選別する方法が挙げられる。
【０１７３】
（ｖ）　ＧＰＲ８８：
ＧＰＲ８８はラット脳の部位特異的に発現が変動している遺伝子としてクローニングされてきたＧ蛋白共役型受容体遺伝子である（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．　２０００　Ｎｏｖ　１；６９（３）：３１４−２１）。内在性のアゴニストについては同定されておらず、従って機能も不明である。
ＧＰＲ８８の活性測定は、Ｇ蛋白共役型受容体がＧＤＰ存在下でＧＴＰアナログであるＧＴＰγＳと結合する性質を利用して行うことが出来る。すなわち、被験物質が、ＧＲＰ８８とＧＴＰγＳの結合を制御（阻害もしくは亢進）するか否かを調べることにより、被験物質がＧＲＰ８８の活性を制御するか否かを評価することが出来る。
【０１７４】
（ｖｉ）　ＰＴＨ２Ｒ：
ＰＴＨ２Ｒ（ＰＴＨ２Ｒ）はＰＴＨの第２の受容体として同定された因子であり、いわゆるＰＴＨ１Ｒと比較するとＰＴＨｒＰをアゴニストとしない、組織発現分布が限定されている、などの特徴がある（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９９５　Ｊｕｎ　３０；２７０（２６）：１５４５５−８）。
ＰＴＨ２Ｒの活性測定は、アゴニスト刺激により細胞内ｃＡＭＰが上昇するという性質を用い、文献（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ２７０：２４２−８，１９９９，　ＰＮＡＳ９５：３５２−７，１９９８）に従って、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いて以下のように行うことができる。
【０１７５】
（ｖｉｉ）　ＶＩＰ１Ｒ：
ＶＩＰ１Ｒは５２Ｋｄａの細胞膜上Ｇ蛋白共役型受容体遺伝子であり、神経系・免疫系等に作用を及ぼすＶＩＰのシグナルを受容する受容体である。ＶＩＰ・ＰＡＣＡＰについては近年強い抗炎症作用が報告されていることから、共通の受容体であるＶＩＰ１Ｒがその作用を担っていると考えられている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　７：５６３−８，２００１）。
ＶＩＰ１Ｒの活性測定は、アゴニスト刺激により細胞内ｃＡＭＰが上昇するという性質を用い、文献（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ２７０：２４２−８，１９９９，　ＰＮＡＳ９５：３５２−７，１９９８）に従って、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いることができる。
また、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．，　Ｒｅｓ．　４９，　２７−３７　（２００１）、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１４，　６１−６８（２０００）、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　Ｒｅｖ．，　９４，　３１−３６　（１９９６）、Ａｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　８４０，　５４０−５５０　（１９９８）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　７０，　３８２　（１９７３）に記載された方法等を用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様として、ＶＩＰ１Ｒの機能を促進する物質、すなわちアゴニストを選別する方法が挙げられる。
【０１７６】
ＩＩ．本発明のタンパク質がトランスポーターである場合
ＩＩ−１．　輸送基質の輸送量の測定　
本発明タンパク質がトランスポーターである場合、すなわち、本発明タンパク質がＣＬＩＣ２、ＳＣＮ２Ａ、ＡＴＡ１、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ２、ＧＡＴ１、ＰＬＴＰ、ＥＮＴ１、ＮＰＴ３、またはＩＲＥＧ１である場合、被験物質が、本発明タンパク質が輸送基質を細胞内から細胞外へ、もしくは細胞外から細胞内へ輸送する能力を阻害又は亢進するか否かを測定することによって、候補物質を選別することができる。本発明タンパク質（トランスポーター）、および該タンパク質の輸送基質を用いて、被験物質が該タンパク質による輸送基質の細胞内外から細胞内へ、もしくは細胞内から細胞外への輸送を阻害するか否かを評価するスクリーニング方法は、当業者の常識の範囲より適宜選択されるが、一例としては、ａ）本発明タンパク質を発現する細胞に、標識された輸送基質を接触させた場合と、ｂ）本発明タンパク質を発現する細胞に、標識された輸送基質および被験物質を接触させた場合とを、比較評価することを含むスクリーニング方法が挙げられる。
具体的には、以下の手順でスクリーニングを実施することができる。すなわち、
１）本発明タンパク質（トランスポーター）を発現する培養細胞に、標識された輸送基質を添加する。該培養細胞としては、通常本発明タンパク質をコードするｃＤＮＡを挿入した発現ベクターを安定導入した細胞が用いられる。
２）細胞外液を交換する。
３）細胞内に取り込まれた輸送基質量、あるいは培養上清中の輸送基質量を計測する。ここで、空ベクターのみを導入した細胞を用いて前記の測定を行い、これをバックグラウンド（在性のトランスポーター活性）として差し引くことにより導入トランスポーター活性を算出することができる。
前記１）〜３）の工程を、被験物質の存在下および非存在下でそれぞれ実施し、各トランスポーター活性を比較することにより、被験物質が該活性を制御するか否かを判別し、候補物質を選別することができる。標識された輸送基質量の測定方法としては、放射活性を測定する方法、電圧変化を指標として測定する方法、蛍光量を測定する方法など、リガンドの標識方法に応じた公知の測定方法が挙げられる。
放射活性を測定するための標識された輸送基質としては、該輸送基質の任意の１または複数の原子を放射性同位体元素で標識した輸送基質が挙げられる。具体的には水素原子を３Ｈ（トリチウム）で標識する方法、炭素原子を１４Ｃで標識する方法、または、硫黄原子を３５Ｓで標識する方法等が挙げられる。具体的な標識された輸送基質としては、ＡＢＣＡ１（ＡＢＣＡ１）については１４Ｃで標識したα−（Ｍｅｔｈｙｌ−　ａｍｉｎｏ）ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ（［１４Ｃ］ＭｅＡＩＢ）、ＧＡＴ１についてはγ−Ａｍｉｎｏ−ｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ（［３Ｈ］ＧＡＢＡ）、ＰＬＴＰ　については［３Ｈ］ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（Ｌ−ａ−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−［２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−９，１０−３Ｈ（Ｎ）］−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、　ＥＮＴ１　については［１４Ｃ］ａｄｅｎｏｓｉｎｅ、ＮＰＴ３については、ＫＨ２３２ＰＯ４もしくはＫＨ２３３ＰＯ４、ＩＲＥＧ１についてはＦｅ５５（ＮＥＮ）等が挙げられる。
また、輸送基質が当業者に公知の方法で検出可能な場合、標識されていない輸送基質を用いることもできる。一例として、ＡＢＣＧ２については、輸送基質として蛍光物質であるＤａｕｒｕｂｉｃｉｎを用いることができる。
また、輸送基質がイオンである場合、ＮａＩ、ＫＨ２ＰＯ４等の無機塩を含む培養液中で細胞を培養し、トランスポーターの輸送基質である、Ｉ−、ＰＯ４−等のイオンの細胞内から細胞外への放出量を、電圧変化を計測することにより測定する方法が挙げられる。例えば、ＣＬＩＣ２については、Ｉ−の輸送量をヨウ素検出電極を用いて電圧変化を計測することができる。
【０１７７】
ＩＩ−２．　輸送基質が輸送されることによる生理活性の測定
本発明タンパク質がトランスポーターである場合、該タンパク質に輸送基質が結合することによって生ずる生理活性を指標として、該タンパク質の機能を制御する候補物質を選別することもできる。すなわち、ａ）本発明タンパク質に輸送基質を接触させた場合における、本発明タンパク質（トランスポーター）を介した前記生理活性と、ｂ）本発明タンパク質（トランスポーター）に輸送基質および被験化合物を接触させた場合に生ずる生理活性とを比較評価することを含むスクリーニング方法が挙げられる。
該生理活性としては、細胞内カルシウムの増加、細胞内ｐＨの上昇等が挙げられる。該生理活性は、公知の方法、または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的な測定手順としては、例えばＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いて、細胞内カルシウムの増加を測定する、以下の方法が挙げられる。すなわち、
１）本発明タンパク質遺伝子の発現ベクターを作製する。ここで、細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞等を用いることができ、上記発現ベクターを遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて共導入することができる。
２）該細胞をｄｙｅ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｆｌｕｏ−３等を含むバッファー等を用いることができる。）中で、マルチウェルプレート等を用いて一定時間（例えば、３０分〜２時間）培養する。
３）新鮮な培地、あるいは細胞毒性を示さない適当なバッファーに交換した後、被験物質、および輸送基質を添加して、一定時間インキュベートする。培養液はそのまま次の工程で用いる測定サンプルとすることができる。また、細胞を抽出して測定サンプルを調製したり、あるいは細胞上清を回収して測定サンプルとして用いたりすることもできる。
４）３）の測定サンプルをＦＬＩＰＲ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で測定する。すなわち、４８８ｎｍのアルゴンレーザーで細胞を励起し、カルシウムイオンが結合したｆｌｕｏ−３の蛍光を５００−５６０ｎｍの波長で検出する。被験物質や輸送基質の添加直後から６０秒後までの蛍光強度から、実測値からバックグラウンドを差し引いたものを測定値とする。
５）被験物質の存在下における本発明タンパク質の生理活性と、被験物質非存在下における該生理活性の差異を求めることにより、差異の大きい被験物質を、本発明タンパク質の生理活性を抑制もしくは亢進する候補物質として選別することができる。すなわち、被験物質存在下における本発明タンパク質の生理活性が被験物質非存在下における生理活性よりも大きければ、該被験物質は本発明タンパク質の機能を亢進する物質であり、被験物質存在下における本発明タンパク質の生理活性が被験物質非存在下における生理活性よりも小さければ、該被験物質は本発明タンパク質の機能を抑制する物質である。また、輸送基質非存在下に被験物質のみを添加して上記３）および４）を実施することにより、輸送基質となり得る物質をスクリーニングすることもできる。すなわち、被験物質存在下における測定値と既知の輸送基質存在下における測定値を比較することにより、既知の輸送基質と同等以上の測定値を示す被験物質を選択すればよい。
【０１７８】
以下、本発明タンパク質（トランスポーター）の機能に基づくスクリーニングを実施する方法について、具体的に例示する。
（ｉ）　ＣＬＩＣ２：
ＣＬＩＣ２は細胞膜に発現してチャネル活性を発現することが知られている遺伝子である。ＫＯマウスの解析より、網膜・精巣機能に重要な役割を果たしていると考えられている（ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ２０：１２８９−９９，２００１）。ＣＬＩＣ２の活性測定は、ヨウ素をあらかじめ取り込ませておいた細胞からのヨウ素放出を指標に行うことが出来る。
【０１７９】
（ｉｉ）　ＳＣＮ２Ａ：　　ＳＣＮ２Ａは電位依存性Ｎａチャネル（ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ感受性）の一種で、後根神経節や脳で発現し、活動電位の発生や伝搬に関与している。ＳＣＮ２Ａの活性測定は、このチャネルが活性化される際に細胞内カルシウムの増加が起こる性質を利用して文献記載（ＰＮＡＳ９８：　７５９９−６０４，　２００１）の方法に従いｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いて行うことができる。
【０１８０】
（ｉｉｉ）　ＡＴＡ１：
Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　（アミノ酸トランスポーター）は、栄養分の取り込み、エネルギー代謝、化学的代謝、解毒、および神経伝達物質のサイクリングなどに重要である（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７６，　２４１３７　（２００１）　）。その中でｓｙｓｔｅｍ　Ａ１は短鎖の中性アミノ酸を細微膜内外のＮａ勾配を利用して取り込む。α−（Ｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏ）ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ（ＭｅＡＩＢ）はこの輸送系の特異的基質と言われている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２７３，　１１７５−１１７９，　（２０００））。ＡＴＡ１活性の測定は文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２７３，　１１７５−１１７９，　（２０００））記載の方法にて実施することができる。
【０１８１】
（ｉｖ）　ＡＢＣＡ１：
ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　（ＡＢＣ）　タンパク質は保存されたＡＴＰ結合ドメインと６回膜貫通型ドメインを持つ膜タンパク質である。ＡＢＣ１は細胞内の脂質を細胞外へ運び出すトランスポーターで、タンジアー病（劣性遺伝性の脂質代謝異常で、血漿中の　ＨＤＬ　がほとんど完全に欠損し、泡沫細胞中でのコレステロールの蓄積、リンパ節腫大、末梢神経傷害などの様々な所見がみとめられる）の原因遺伝子の一つであることが知られている（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　１０４，　Ｒ２５，　１９９９、　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　９６，　１２６８５，　１９９９）。
ＡＢＣＡ１活性の測定は文献（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　１０４，　Ｒ２５，　１９９９）記載の方法にて実施することができる。具体的には、　［３Ｈ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌおよび　ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　ＬＤＬを、内在性ＬＤＬ受容体により、細胞に取り込ませた後、ＡＢＣＡ１によるＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）依存的なコレステロールの逆輸送をモニターする方法が挙げられる。
【０１８２】
（ｖ）　ＡＢＣＧ２：
ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　（ＡＢＣ）　タンパク質は保存されたＡＴＰ結合ドメインと６回膜貫通型ドメインを持つ膜タンパク質である。ＡＢＣＧ２は抗がん剤のｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎやｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎなどを細胞外へ排出して、薬剤耐性に関与することが報告されている（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　９５，　１５６６５，　１９９８）。
ＡＢＣＧ２活性の測定は文献（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ　Ａ
ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　９５，　１５６６５，　１９９８）記載の方法にて実施することができる。具体的には、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ（蛍光を発する物質である。）を細胞外に排出する性質を利用して、フローサイトメトリーにて、細胞内に保持されたｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎの量を定量することができる。
【０１８３】
（ｖｉ）　ＧＡＴ１：
ＧＡＴ１は脳の多くの部位に発現しているＧＡＢＡ輸送体でシナプス間隙に存在するニューロンやグリア細胞でＧＡＢＡ　の再取り込みを行い、神経伝達の終了に関与することが報告されている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６７，　２１０９８，　１９９２）。
ＧＡＴ１活性の測定は文献：Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　９５，　１５６６５，　１９９８；Ｃａｎ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　６８，　１１９４　（１９９０）；Ｐｈａｒｍ．　Ｒｅｓ．，　１０，　１４４２　（１９９３）、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　２６９，　２１９　（１９９４）に記載の方法にて実施することができる。具体的には、ＧＡＴ１を発現する細胞（例えばＣＯＳ−７細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞を用いることができる。）を用いて、標識された輸送基質：［３Ｈ］ＧＡＢＡのおよび／または被験物質を添加し、３７℃１０分間インキュベートした後細胞内に保持された輸送基質量を測定すればよい。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様として、ＧＡＴ１の機能を抑制する物質を選別する方法が挙げられる。
【０１８４】
（ｖｉｉ）　ＰＬＴＰ：
ヒトの血漿はｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ｅｓｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＣＥＴＰ）やＰＬＴＰなどの脂質輸送タンパク質を含み、ＰＬＴＰはｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ｒｉｃｈ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓからｈｉｇｈ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＤＬ）へｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓの移行を行い、ＨＤＬの変換に関与することが報告されている（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　９５，　１５６６５，　１９９８）。ＰＬＴＰ活性の測定は文献（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　１０３，　９０７，　１９９９）　記載の方法にて実施することができる。具体的には、　［３Ｈ］ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ　−ｃｈｏｌｉｎｅ（Ｌ−ａ−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−［２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−９，１０−３Ｈ（Ｎ）］−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）でｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｖｅｓｉｃｌｅを標識し、ＨＤＬと混合することによりｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓの移行を測定することができる。
【０１８５】
（ｖｉｉｉ）　ＥＮＴ１：
Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒはｄｅ　ｎｏｖｏ　のｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ合成経路を欠く造血系細胞などでのサルベージ経路によるｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ合成に必須であり、また癌やウイルス感染症の化学療法剤として用いられている細胞障害性ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅの細胞への取り込みを行なうことが報告されている（Ｎａｔｕｒｅｖ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．，　３，　８９，　１９９７）。
ＥＮＴ１活性の測定は文献（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．，　３，　８９，　１９９７）記載の方法にて実施することができる。
【０１８６】
（ｉｘ）　ＮＰＴ３：
Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒはナトリウムイオン依存的に無機リン酸の近位尿細管における再吸収を調節し、無機リン酸のホメオスタシスに関与することが報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　３０５，　８１，　１９９５）。
ＮＰＴ３活性の測定は文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　３０５，　８１，　１９９５）に記載の方法にて実施することができる。
【０１８７】
（ｘ）　ＩＲＥＧ１：
哺乳類では鉄分は必須の栄養素であり、鉄分の吸収や利用に欠損があると成体では貧血、子では知能発達障害をおこす。鉄分は成体では十二指腸から、胚では胎盤から吸収される。ＩＲＥＧ１は十二指腸で吸収された鉄分の門脈への移行に関与することが報告されている（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ，　５，　２９９，　２０００）。
ＩＲＥＧ１活性の測定は文献（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ，　５，　２９９，　２０００）記載の方法にて実施することができる。具体的には、プロトン共役型２価カチオントランスポーターＤＣＴ１よりＦｅ５５を細胞に取り込ませ、ＩＲＥＧ１によって細胞外に輸送されたＦｅ５５量を測定することができる。
【０１８８】
また、本発明のスクリーニング方法を実施する前に、上記に掲げる各本発明タンパク質をコードする遺伝子について、あらかじめ実験により、該遺伝子の発現を抑制する物質が軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分（候補物質）として有用なのか、また発現を誘導する物質が軟骨障害の改善薬または治療薬の有効成分（候補物質）として有用なのかを判断することは可能であり、その具体的な方法については前述の通りである。当該実験によって本発明遺伝子の発現抑制物質が候補物質になる可能性が高いと判断された場合は、当該遺伝子がコードする本発明タンパク質の機能（活性）の抑制を指標としてスクリーニングを行うことにより、より高い精度で候補物質を選別することができ、また当該実験によって本発明遺伝子の発現誘導物質が候補物質になる可能性が高いと判断された場合は、当該遺伝子がコードする本発明タンパク質の機能（活性）の亢進を指標としてスクリーニングを行うことにより、より高い精度で候補物質を選別することができる。
【０１８９】
上記（３−１）〜（３−３）に記載する本発明のスクリーニング方法および上記さらなる選別によって選択された制御物質または候補物質は、さらに軟骨障害のモデル動物、すなわち十字靭帯切断モデル動物や半月板切除モデル動物、あるいはコラゲナーゼ注入モデル動物などを用いた薬効試験、安全性試験、さらに軟骨障害に罹患した患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な軟骨障害の改善または治療薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【０１９０】
なおラット十字靱帯切断モデルは、公開特許公報：特開２００１−１３１０７３、または、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　＆　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ　４３，　（９），　２１２１−２１３１　（２０００）　に記載の方法により作製することができる。具体的には、６週齢以上のラット後肢膝関節部の皮膚および膝蓋靭帯、滑膜をメスで切開し、切開した部分より関節腔内の前十字靭帯を切断する。切開した皮膚は外科用クリップで留める等の処置をし、その後は通常の飼育を数日間行う。その後、被験動物を屠殺し、大腿骨、脛骨の関節軟骨部分サンプルを採取する。
【０１９１】
変形性関節症様の軟骨変性等の症状について、通常は、組織標本を作製してサフラニンＯの染色性およびトルイジンブルーまたはアルシアンブルーの異染性等を指標にして評価することができる。具体的には、１０％中性緩衝ホルマリンで固定後、脱灰、脱水、透徹を経て、パラフィン包埋し、矢状面に薄切する。その後、通常のパラフィン除去を行った後サフラニンＯとファーストグリーンまたはトルイジンブルーまたはアルシアンブルーで染色を行う。
（４）軟骨障害の改善・治療剤
本発明は、軟骨障害の改善・治療剤を提供するものである。すなわち、本発明は変形性関節症、軟骨形成異常症、変形性椎間板症、軟骨の欠損、軟骨損傷、半月板損傷、骨折の修復・治癒不全といった軟骨障害の改善・治療剤、および軟骨細胞移植時の補助療法剤を提供するものである。
本発明は５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現が軟骨障害と関連しているという新たな知見から、５−ＨＴ７遺伝子（配列番号１）、ＥＤＧ２遺伝子（配列番号３）、ＥＤＧ１遺伝子（配列番号５）、ＥＴ（Ａ）遺伝子（配列番号７）、ＧＰＲ８８遺伝子（配列番号９）、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子（配列番号１１）、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子（配列番号１３）、ＣＬＩＣ２遺伝子（配列番号１５）、ＳＣＮ２Ａ遺伝子（配列番号１７）、ＡＴＡ１　遺伝子（配列番号１９）、ＡＢＣＡ１　遺伝子（配列番号２１）、ＡＢＣＧ２　遺伝子（配列番号２３）、ＧＡＴ１　遺伝子（配列番号２５）、ＰＬＴＰ　遺伝子（配列番号２７）、ＥＮＴ１　遺伝子（配列番号２９）、ＮＰＴ３　遺伝子（配列番号３１）、またはＩＲＥＧ１　遺伝子（配列番号３３）の発現を制御（抑制／亢進）する物質、あるいは、５−ＨＴ７（配列番号２）、ＥＤＧ２（配列番号４）、ＥＤＧ１（配列番号６）、ＥＴ（Ａ）（配列番号８）、ＧＰＲ８８（配列番号１０）、ＰＴＨ２Ｒ（配列番号１２）、ＶＩＰ１Ｒ（配列番号１４）、ＣＬＩＣ２（配列番号１６）、ＳＣＮ２Ａ（配列番号１８）、ＡＴＡ１　（配列番号２０）、ＡＢＣＡ１　（配列番号２２）、ＡＢＣＧ２　（配列番号２４）、ＧＡＴ１　（配列番号２６）、ＰＬＴＰ　（配列番号２８）、ＥＮＴ１　（配列番号３０）、ＮＰＴ３　（配列番号３２）、またはＩＲＥＧ１　（配列番号３４）の発現や機能（活性）を制御（抑制／亢進）する物質が、上記疾患の改善または治療に有効であるという考えに基づくものである。すなわち、本発明の軟骨障害の改善・治療剤は前記本発明遺伝子の発現を制御する物質、あるいは前記本発明タンパク質の機能（活性）を制御する物質を有効成分とするものである。
【０１９２】
例えば、ＥＴ（Ａ）遺伝子（配列番号７）および／またはＥＴ（Ａ）（配列番号８）の発現を抑制する物質、あるいは、ＥＴ（Ａ）（配列番号８）の機能（活性）を抑制する物質が、上記疾患の改善または治療に有効である。具体的には、ＢＱ−１２３（Ｄ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ−Ｄ−ｖａｌｙｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ　ｃｙｃｌｉｃ　ａｍｉｄｅ；　Ｍｏｒｅｌ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　２５２，　Ｒ３−Ｒ４　（１９９４）、Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　１９９２，　３５（１１），　２１３９−２１４２）、ＰＤ−１４５０６５（Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　Ｒｅｓ．，　１９９３，　３（３），　１５４）、ＰＤ−１６１７２１（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　２００１，　４３２（１），　７１）、ＦＲ１３９３１７（ＴＯＣＲＩＳ社品；Ｓｏｇａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．，　２６４，１０４０　（１９９３））、ＢＭＳ１８２８７４（ＴＯＣＲＩＳ社品；５−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−Ｎ−（３，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｉｓｏｘａｚｏｌｙｌ）−１−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ；Ｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　３７，　３２９　（１９９４））、Ｓｕｌｆｉｓｏｘａｚｏｌｅ（ＴＯＣＲＩＳ社品；Ｃｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．，　２０１，２２８　（１９９４））等を例示することができる。
【０１９３】
また、ＧＡＴ１遺伝子（配列番号２５）および／またはＧＡＴ１（配列番号２６）の発現を抑制する物質、あるいは、ＧＡＴ１（配列番号２６）の機能（活性）を抑制する物質が、上記疾患の改善または治療に有効である。具体的には、ＣＩ９６６（ＴＯＣＲＩＳ社品；
Ｇｅｎ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　１９９５，　２６（５），　１０６１）、Ｔｉａｇａｂｉｎｅ（　　（　−　）　−　（Ｒ）　−　１　−　［４，４　−　Ｂｉｓ（３　−　ｍｅｔｈｙｌ　−　２　−　ｔｈｉｅｎｙｌ）　−　３　−　ｂｕｔｅｎｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ　−　３　−　ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　；Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　３６，　１７１６　（１９９３））、ＳＫ＆Ｆ８９９７６−Ａ（Ａｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　２８，　６５３　（１９８５））、およびＮＮＣ−７１１（１−（２−（（（ジフェニルメチレン）アミノ）オキシ）エチル）−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジンカルボキシリック　アシッド　塩酸塩（Ｋｕｂｏｖａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ　Ａｒｃｈ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　３５８，　３３４−３４１　（１９９８））等が挙げられる。
【０１９４】
また、５−ＨＴ７（配列番号１）および／または５−ＨＴ７（配列番号２）の発現を促進する物質、あるいは、５−ＨＴ７（配列番号２）の機能（活性）を促進する物質が、上記疾患の改善または治療に有効である。具体的には、１−［６−（ピリジン−３−イルメトキシ）ピリジン−２−イル］ピペラジン等の公開特許公報：特開２００３−１２６４８に記載された５−ＨＴ７アゴニスト、または６−［４−（１，２−ベンズイソキサゾール−３−イル）ピペラジン−１−イル］−１−（２−ヒドロキシフェニル）ヘキサン−１−オンもしくは６−［４−（１，２−ベンズイソキサゾール−３−イル）ピペラジン−１−イル］−１−（２−メトキシフェニル）ヘキサン−１−オン（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　４６，　４，　６４６　（２００３））が挙げられる。
【０１９５】
また、ＥＤＧ２（配列番号３）および／またはＥＤＧ２（配列番号４）の発現を促進する物質、あるいは、ＥＤＧ２（配列番号４）の機能（活性）を促進する物質が、上記疾患の改善または治療に有効である。具体的には、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ；１−Ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ　３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；シグマ社カタログＮｏ．Ｌ７２６０；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，　１５８２，　２８９−２９４　（２００２））、ＬＰＡ（１２：０）、ＬＰＡ（１４：０）、ＬＰＡ（１６：０）、ＬＰＡ（１８：１）、又はＬＰＡ（１８：２）等が挙げられる。（ここで、括弧内の最初の整数はＬＰＡにおける脂肪酸部分の総炭素数を表し、２番目の整数は二重結合の数を表す。）また、式（１）：
【化１】
2004000209.tif 000002
で表されるサイクリック　ホスファチジン酸（ｃＰＡ）、および式（２）：
【化２】
2004000209.tif 000003
で表されるＤＯＸＰ−ＯＨなども、ＥＤＧ２のアゴニストとして挙げられる（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ．　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ．，　１５８２，　３０９−３１７　（２００２））。
【０１９６】
また、ＶＩＰ１Ｒ（配列番号１３）および／またはＶＩＰ１Ｒ（配列番号１４）の発現を促進する物質、あるいは、ＶＩＰ１Ｒ（配列番号１４）の機能（活性）を促進する物質が、上記疾患の改善または治療に有効である。具体的には、生理活性リガンドであるＶＩＰ（シグマ社製；Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７０，　３８２　（１９７３））が挙げられる。
【０１９７】
当該有効成分となる本発明遺伝子の発現制御物質、あるいは本発明タンパク質の機能（活性）制御物質は、上記のスクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、選別された物質に関する情報に基づいて常法に従って工業的に製造されたものであってもよい。
【０１９８】
本発明遺伝子の発現制御物質、あるいは本発明タンパク質の機能（活性）制御物質は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、１日投与用量として、数百ｍｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
【０１９９】
また、上記の物質がＤＮＡによりコードされるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。さらに、上記の物質が本発明の５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、またはＩＲＥＧ１　遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチド（アンチセンス核酸）の場合は、そのまま、若しくは遺伝子治療用ベクターに組み込むことにより、遺伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、投与量、投与方法は患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０２００】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
実施例１　ラット十字靭帯切断モデルの作製および軟骨採取
日本チャールス・リバー社より６週齢の雄性ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳを１週間おきに３回、合計１００匹購入した。１週間予備飼育後外見上異常の認められない個体を実験に供した。
【０２０１】
エーテル麻酔下でラット後肢膝関節部の毛をバリカンで剃り、８０％エーテルで切開部分を消毒した。後肢を屈曲した状態で関節腔部分の皮膚および膝蓋靭帯、滑膜をメスで５ｍｍ程度切開した。切開した部分よりマイクロ剪刀を関節腔内に差し入れ、前十字靭帯を切断した。切開した皮膚は外科用クリップで留めた。処置後は通常の飼育を行った。対照は無処置とした。
【０２０２】
処置１、２、３週間後に過剰エーテル麻酔下で安楽死させ、心拍の停止を確認した後、大腿骨、脛骨の関節軟骨部分のみをメスでそぎ採取した。軟骨採取した後、ただちに凍結させた。各時点２５匹使用した。対照は、処置２週間後の週齢とそろえた。
【０２０３】
実施例２　ラット膝関節軟骨からのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
実施例１で採取したラット十字靭帯切断モデルの膝関節軟骨（以下、本明細書において「病態モデル軟骨」ともいう。）からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。具体的には十字靭帯切断モデルを作製後、１，　２，および　３週間経過後の膝関節から採取した軟骨にＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）　５ｍｌ添加し、ホモゲナイザーでつぶしてからそれぞれｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。なお、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製は、ＴＲＩＺＯＬを用いて付属のプロトコールに従って行った。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡはＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）に溶解した。
【０２０４】
同様にして、比較対照のため何も処理しないで飼育したラットの膝関節軟骨（以下、本明細書において「未処理軟骨」ともいう。）からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。
【０２０５】
実施例３　ＤＮＡチップ解析
実施例２で調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用いてＤＮＡチップ解析を行った。なお、ＤＮＡチップ解析はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｇｅｎｅ　Ｃｈｉｐ　Ｒａｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｕ３４Ａ、Ｕ３４Ｂ、Ｕ３４Ｃを用いて行った。具体的には、解析は、（１）　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの調製、（２）　該ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製、（３）　ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、（４）　フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ、（５）　プローブアレイの染色、（６）　プローブアレイのスキャン、及び（７）　遺伝子発現解析、の手順で行った。
【０２０６】
（１）　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの調製
実施例２で得られた各ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　１０μｇとＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１００ｐｍｏｌを含む１１μＬの混合液を、７０℃、１０分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｃｈｏｉｃｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に含まれる５×Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ、該キットに含まれる０．１Ｍ　ＤＴＴ　（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）２μＬ、該キットに含まれる１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　１μＬを添加し、４２℃で２分間加熱した。更に、該キットに含まれるＳｕｐｅｒ　ＳｃｒｉｐｔＩＩ　ＲＴ　２μＬ（４００Ｕ）を添加し、４２℃で１時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＤＥＰＣ処理水　９１μＬ、該キットに含まれる５×Ｓｅｃｏｎｄ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　３０μＬ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　３μＬ、該キットに含まれるＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　１μＬ（１０Ｕ）、該キットに含まれるＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ　４μＬ（４０Ｕ）、該キットに含まれるＥ．　ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　１μＬ（２Ｕ）を添加し、１６℃で２時間反応させた。次いで、該キットに含まれるＴ４　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　２μＬ（１０Ｕ）を加え、１６℃で５分間反応させた後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　１０μＬを添加した。次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）１６２μＬを添加し、混合した。該混合液を、予め室温、１４，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離しておいたＰｈａｓｅ　Ｌｏｃｋ　Ｇｅｌ　Ｌｉｇｈｔ（エッペンドルフ社製）に移し、室温で１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離した後、１４５μＬの水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液７２．５μＬ、エタノール３６２．５μＬを加えて混合した後、４℃で１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したｃＤＮＡを含むペレットを得た。その後、該ペレットに８０％エタノール０．５ｍＬを添加し、４℃で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水１２μＬに溶解した。以上の操作から実施例２で調製した各ｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、各ｃＤＮＡを取得した。
【０２０７】
（２）　ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
各ｃＤＮＡ溶液５μＬに、ＤＥＰＣ処理水１７μＬ、ＢｉｏＡｒｒａｙ　Ｈｉｇｈ　Ｙｉｅｌｄ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０×ＨＹ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ、該キットに含まれる１０×Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌａｂｅｌｅｄ　Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　４μＬ、該キットに含まれる１０×ＤＴＴ　４μＬ、該キットに含まれる１０×ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｍｉｘ　４μＬ、該キットに含まれる２０×Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させて、ラベル化ｃＲＮＡを調製した。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加えたのち、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＧＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
【０２０８】
（３）　ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化
各ラベル化ｃＲＮＡ　２０μｇを含む溶液に、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭトリス−酢酸　ｐＨ８．１（Ｓｉｇｍａ社製）、　５００ｍＭ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ社製）、１５０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社製））８μＬを加えた反応液４０μＬを、９４℃で３５分間加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化ｃＤＮＡをフラグメント化した。
【０２０９】
（４）　フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ
各フラグメント化ｃＲＮＡ　４０μＬに、５ｎＭ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｏｌｉｇｏ　Ｂ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）４μＬ、１００×Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃＲＮＡ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ　４μＬ、Ｈｅｒｒｉｎｇ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）４０μｇ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）２００μｇ、２×ＭＥＳ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ　ＭＥＳ、２Ｍ　［Ｎａ＋］，　４０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０　（Ｐｉｅｒｃｅ社製）、ｐＨ６．５〜６．７）　２００μＬ、及びＤＥＰＣ処理水１４４μＬを混合し、４００μＬのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを９９℃で５分間加熱し、更に４５℃で５分間加熱した。加熱後、室温で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
【０２１０】
一方、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーで満たしたＲａｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｕ３４Ａ、Ｕ３４Ｂ、Ｕ３４Ｃプローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を、ハイブリオーブン（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）内で、４５℃、６０ｒｐｍで１０分間回転させた後、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清２００μＬを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間回転させ、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
【０２１１】
（５）　プローブアレイの染色
上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイそれぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ（６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０（Ｓｉｇｍａ社製））で満たした。次にＮｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　Ｗａｓｈ　ＢｕｆｆｅｒおよびＳｔｒｉｎｇｅｎｔ　Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　ＭＥＳ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）をセットしたＧｅｎｅＣｈｉｐ　Ｆｌｕｉｄｉｃｓ　Ｓｔａｔｉｏｎ　４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置にフラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２に従って、１次染色液（１０μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　（ＳＡＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）、２ｍｇ／ｍＬ　Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　ＢＳＡ、１００ｍＭ　ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ）、１Ｍ　ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）、　２次染色液（１００μｇ／ｍＬ　Ｇｏａｔ　ＩｇＧ　（Ｓｉｇｍａ社製）、３μｇ／ｍＬ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２ｍｇ／ｍＬ　Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　ＢＳＡ、１００ｍＭ　ＭＥＳ、１Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）により染色した。
（６）　プローブアレイのスキャン、及び　（７）　遺伝子発現解析
染色した各プローブアレイをＨＰ　ＧｅｎｅＡｒｒａｙ　Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにＧｅｎｅＣｈｉｐ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ、遺伝子発現の比較解析を行った。
【０２１２】
実施例４　十字靭帯切断モデル関節軟骨を用いた変形性関節症での遺伝子発現の変動解析
十字靭帯切断後、１，　２，及び３週間経過後の各関節軟骨における遺伝子発現量（ａｖｅｒａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を、未処理関節軟骨における発現量と、ＧｅｎｅＣｈｉｐ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にある解析ツールＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて比較した。Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓは解析プロトコールに基づいて行った。
これらの比較解析の結果から得られた、遺伝子発現の増減の判定（Ｄｉｆｆ　Ｃａｌｌ）および発現変動倍率（Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅ）の値から、発現変動遺伝子を選抜した。選抜方法は、各処理時間において、病態モデル軟骨での遺伝子発現量（ａｖｅｒａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）が、未処理軟骨での遺伝子発現量と比較して、１．５倍以上の発現変動（Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅが−１．５以下あるいは１．５以上）を示したプローブを選抜した。同様の解析をすべての処理時間における軟骨について行って、いずれかの処理時間において１．５倍以上の発現変動を示したプローブを選抜した。
【０２１３】
選抜した該プローブの中から、さらに病態との相関が高いプローブを選抜した。具体的には、ＤＮＡチップ解析結果から得られる遺伝子発現量（ａｖｅｒａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を指標にして、病態モデル軟骨での遺伝子発現量（ａｖｅｒａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）がいずれの障害時間においても発現減あるいは発現増の傾向にあるプローブを選抜した。
【０２１４】
実施例５　病態モデル軟骨での発現変動を示した遺伝子のヒトホモログ配列の同定
実施例４において病態モデル軟骨で発現変動を示したラット遺伝子のヒトホモログ遺伝子の同定は、遺伝子名、タンパク質名をもとに、あるいはＨｏｍｏｌｏｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）を用いて行った。
【０２１５】
【表１】
2004000209.tif 000004
表中、Ｒａｔ　Ｕ３４プローブ名は　Ｒａｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｕ３４　Ｃｈｉｐ　におけるプローブ名を示す。また表中、変動倍率は、Ｒａｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｕ３４　Ｃｈｉｐで解析した未処理膝軟骨組織の遺伝子発現量を１とした場合における変形性関節症モデル動物の膝関節軟骨組織での遺伝子発現量を示す。また各遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を示す後記配列表の配列番号も合わせて示す。
以上のように、これら１７個の遺伝子は、ラット十字靭帯切断モデルの障害軟骨において、正常軟骨と比較して発現低下あるいは発現増加していた。さらにこれらの遺伝子の発現は、いずれの障害時間においても発現減あるいは発現増の傾向を示した。これらの結果より、これら１７遺伝子は軟骨障害を伴う疾患に関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。また、これらの遺伝子を用いることによって軟骨障害を伴う疾患を緩和、抑制する治療薬の候補薬をスクリーニングすることが可能であると考えられた。
【０２１６】
実施例６　５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、および／またはＩＲＥＧ１　遺伝子発現制御剤のスクリーニング
マウスＡＴＤＣ５細胞（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ；　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｔｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／ＣＥＬＬ／ＨＴＭＬ／ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ．　Ｈｔｍｌから入手可能）を５％ウシ胎児血清ヒトトランスフェリン（終濃度１０μｇ／ｍｌ）・３ｘ１０８Ｍ　セレン酸ナトリウム含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用い、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で培養する。計数したＡＴＤＣ５細胞を１ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でプレートに播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養する。当該細胞に対して、ウシインスリン（終濃度１０μｇ／ｍｌ）と被験物質含有溶液（１００μＭ、１０μＭ、および１μＭの各濃度の被験物質を含む溶液）とを同時に添加するか、若しくはインスリンをあらかじめ添加して数日間培養した後に前記被験物質含有溶液を添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で３〜２１日間、もしくは３７℃、ＣＯ２濃度５％で２１日間培養した後３７℃、ＣＯ２濃度３％で培養する。ここで、対照実験として、被験物質無添加の細胞についても同様の培養を行う（コントロール）。これらの各培養細胞より抽出したＲＮＡを用いて実施例３に記載された方法で、５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、および／またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現量を調べる。その発現量からコントロールと比べて５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ２遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＴＡ１　遺伝子、ＡＢＣＡ１　遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＧＡＴ１　遺伝子、ＰＬＴＰ　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、ＮＰＴ３　遺伝子、および／またはＩＲＥＧ１　遺伝子の発現量が１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上変動している培養系に添加した被験物質を、軟骨障害の緩和、抑制（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【０２１７】
実施例７　：受容体結合阻害活性の測定
受容体結合阻害活性の測定は以下の手順で行うことができる。
１）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明タンパク質（受容体）発現ＣＨＯ細胞を、緩衝液（Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたものなどを用いることができる。）１ｍｌで２回洗浄した後、測定用緩衝液を各穴に加える。
２）１０−３〜１０−１０Ｍの適当な濃度に調製した被験化合物溶液（通常溶媒には水もしくは緩衝液が用いられるが、溶解度に応じてエタノールやＤＭＳＯを添加することもできる。）５μｌを加えた後、標識したリガンド５μｌを加え、室温で１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには、被験化合物の代わりに１０−３Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
３）反応液を除去し、１ｍｌの緩衝液（前記と同じものを使用できる。）で３回洗浄する。細胞に結合した標識したリガンドを０．２Ｎ　ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
４）液体シンチレーションカウンターを用いて放射活性を測定する。阻害率については、以下の式［数１］で求めることができる。
［数１］
ＰＭＢ（Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ）＝　［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］Ｘ１００
（Ｂ：被験化合物を加えたときの値、ＮＳＢ：Ｎｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＢＩｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）、Ｂ０：最大結合量）
尚、標識したリガンドとしては、以下のものをそれぞれ用いることができる。すなわち、
５−ＨＴ７：　［３Ｈ］５−ＨＴ
ＥＤＧ２：１−Ｏｌｅｏｙｌ［ｏｌｅｏｙｌ−９，１０−３Ｈ］−ＬＰＡ
ＥＤＧ１：［３Ｈ］Ｓ−１−Ｐ
ＥＴ（Ａ）：［１２５Ｉ］Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１，　［３Ｈ］ＢＱ１２３
ＰＴＨ２Ｒ：［１２５Ｉ］（Ｎｌｅ８，Ｎｌｅ１８，Ｔｙｒ３４）ＰＴＨ（１−３４）ａｍｉｄｅ
ＶＩＰ１Ｒ：［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ＶＩＰ
【０２１８】
実施例８　５−ＨＴ７受容体活性を指標としたスクリーニング方法
５−ＨＴ７受容体活性の測定は、文献（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ２７０：２４２−８，１９９９，　ＰＮＡＳ９５：３５２−７，１９９８）に記載された方法、すなわちｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いる方法で、以下のように行うことができる。
まず、当業者に公知の方法で５−ＨＴ７受容体遺伝子の発現ベクターとＧｑｓ５蛋白（Ｇｑｓ５はＣ末端に、Ｇｓ蛋白のＣ末端アミノ酸５残基を置換したＧｑ蛋白）の発現ベクターを作製する。
細胞株はＣＨＯ−Ｋ１細胞を用い、上記発現ベクターを遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて共導入する。２４時間後、１ウエル当たり５０，０００細胞を９６穴黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播きこむ。２４時間後、培養上清をアスピレーションで除去し、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　２．５ｍＭ　ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ社：５０％　Ｈａｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（ＨＢＳＳ），　５０％　１Ｎ　ＮａＯＨに溶解した２５０ｍＭのストック溶液を用いる），　４μＭ　Ｆｌｕｏ−３　ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社：１０％　ｐｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄの含まれたＤＭＳＯに溶解した４ｍＭのストック溶液を用いる）を含んだＦ１２培養培地を１００μｌ／ｗｅｌｌ加える。（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄは、ｄｙｅを細胞内に保持するためｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｕｍｐの阻害剤として用いる。）ＣＯ２インキュベーターにて１時間培養した後、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　２．５ｍＭ　ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを含んだＨＢＳＳで４回洗浄する。ただし最後の洗浄時には９０μｌの液を残す形で行う。アゴニストリガンドである５−ＨＴ（５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）は２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　２．５ｍＭ　ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを含んだＨＢＳＳで２μＭに希釈し９０μｌ加えることで終濃度１μＭとし、添加した２分後までＦＬＩＰＲにて計測する。検出は４８８ｎｍのアルゴンレーザーで細胞を励起し、カルシウムイオンが結合したｆｌｕｏ−３の蛍光を５００−５６０ｎｍの波長でとらえることで行う。リガンド添加直後から６０秒後までの蛍光強度（Ｖｒｅｆ）から、添加前の値（Ｖ０）をバックグラウンドとして差し引いた値を活性とする。被験物質を添加する場合はアゴニストリガンドを添加する前に添加し、その後アゴニストリガンドを添加し、リガンド添加直後から６０秒後までの蛍光強度（Ｖｓａｍ）から、添加前の値（Ｖ０）をバックグラウンドとして差し引いた値と、被験物質非存在下での活性（Ｖｒｅｆ−Ｖ０）とを比較することにより、被験物質が、５−ＨＴ７受容体活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質が５−ＨＴ７受容体活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝（Ｖｓａｍ−Ｖ０）／（Ｖｒｅｆ−Ｖ０）
また、被験物質のアゴニスト作用を測定する場合、上記においてアゴニストリガンドのかわりに被験物質を用いて上記の測定を行う。
【０２１９】
上記と同様の方法で、アゴニストリガンドにＰＴＨ（１−３４）（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ）を用いることにより、ＰＴＨ２Ｒ活性を指標としたスクリーニングを、アゴニストリガンドにＶＩＰを用いることによりＶＩＰ１Ｒ活性を指標としたスクリーニングを、実施することができる。
【０２２０】
実施例９　ＥＤＧ２活性を指標としたスクリーニング方法
ＥＤＧ２活性の測定は、本受容体がリガンドであるＬＰＡにより活性化すると細胞内カルシウムが上昇することを利用しｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いて、以下のように行うことができる。
まず、当業者に公知の方法でＥＤＧ２遺伝子の発現ベクターとＧｑｉ５蛋白（Ｇｑｉ５はＣ末端に、Ｇｉ蛋白のＣ末端アミノ酸５残基を置換したＧｑ蛋白）の発現ベクターを作製する。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現ベクターを遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて共導入する。２４時間後、１ウエル当たり５０，０００細胞を９６穴黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播きこむ。２４時間後、培養上清をアスピレーションで除去し、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　２．５ｍＭ　ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ社：５０％　Ｈａｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（ＨＢＳＳ），　５０％　１Ｎ　ＮａＯＨに溶解した２５０ｍＭのストック溶液を用いる），　４μＭ　Ｆｌｕｏ−３　ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社：１０％　ｐｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄの含まれたＤＭＳＯに溶解した４ｍＭのストック溶液を用いる）を含んだＦ１２培養培地を１００μｌ／ｗｅｌｌ加える。（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄは、ｄｙｅを細胞内に保持するためｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｕｍｐの阻害剤として用いる。）ＣＯ２インキュベーターにて１時間培養した後、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　２．５ｍＭ　ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを含んだＨＢＳＳで４回洗浄する。ただし最後の洗浄時には９０μｌの液を残す形で行う。アゴニストリガンドであるＬＰＡは２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　２．５ｍＭ　ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを含んだＨＢＳＳで２０μＭに希釈し９０μｌ加えることで終濃度２０μＭとし、添加した２分後までＦＬＩＰＲにて計測する。検出は４８８ｎｍのアルゴンレーザーで細胞を励起し、カルシウムイオンが結合したｆｌｕｏ−３の蛍光を５００−５６０ｎｍの波長でとらえることで行う。リガンド添加直後から６０秒後までの蛍光強度（Ｖｒｅｆ）から、添加前の値（Ｖ０）をバックグラウンドとして差し引いた値を活性とする。被験物質を添加する場合はアゴニストリガンドを添加する前に添加し、その後アゴニストリガンドを添加し、リガンド添加直後から６０秒後までの蛍光強度（Ｖｓａｍ）から、添加前の値（Ｖ０）をバックグラウンドとして差し引いた値と、被験物質非存在下での活性（Ｖｒｅｆ−Ｖ０）とを比較することにより、被験物質が、ＥＤＧ２受容体活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質がＥＤＧ２受容体活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝（Ｖｓａｍ−Ｖ０）／（Ｖｒｅｆ−Ｖ０）
ＥＤＧ１活性についても、アゴニストリガンドとしてＳ１Ｐ（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈａｓｐｈａｔｅ）を用いることにより、また、ＥＤＮＲＡ活性についても、アゴニストリガンドとしてＥＴ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）を用いることにより、同様に測定することができる。
【０２２１】
実施例１０　ＧＰＲ８８（ＧＰＲ８８）の機能（活性）に基くスクリーニング方法
ＧＰＲ８８の活性測定は、Ｇ蛋白共役型受容体がＧＤＰ存在下でＧＴＰアナログであるＧＴＰγＳを結合する性質を利用して、以下のように行うことが出来る。
ＧＰＲ８８の発現ベクターを作製し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞・ＨＥＫ２９３細胞等に過剰発現させる。超遠心により細胞の膜画分を調製し−８０℃で保存する。１ｍＭ　ＤＴＴ，　１ｍＭ　ＮｇＣｌ２，　１ｍＭ　ＥＧＴＡ，　１００ｍＭ　ＮａＣｌ，　１００μＭ　ＧＤＰを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ．７．４）バッファーに１０μｇの膜蛋白・被験物質を混合して最終容量５００μｌとし、３０℃で３０分間インキュベートする。５０μｌの［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳを終濃度０．２５ｎＭになるよう混合し、さらに３０℃で３０分間インキュベートする。結合反応はグラスフィルター（ＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｂグレード）上で氷冷バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　ｐＨ．７．４）にて５回洗浄することにより終了する。液体シンチレーションカウンターにてフィルター上の放射能をカウントし、５０μＭの放射能標識されていないＧＴＰγＳをサンプルとしたときの値をバックグラウンドとして特異的結合値を産出する。
被験物質存在下での結合値（Ｖｓａｍ）と、被験物質非存在下での結合値（Ｖｒｅｆ）との比より、ＧＰＲ８８活性を制御する候補物質を選別することができる。すなわち、
ＧＰＲ８８制御率＝Ｖｓａｍ／Ｖｒｅｆ　ｘ１００　（％）
【０２２２】
実施例１１　ＣＬＩＣ２　（ＣＬＩＣ２）の機能（活性）に基くスクリーニング方法
ＣＬＩＣ２の活性測定は、ヨウ素をあらかじめ取り込ませておいた細胞からのヨウ素放出を指標に行うことが出来る。すなわち、１３６ｍＭ　ＮａＩ，　４ｍＭ　ＫＮＯ３，　２ｍＭ　ＣａＮＯ３／４Ｈ２Ｏ，　２ｍＭ　ＭｇＮＯ３／６Ｈ２Ｏ，　１１ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ，　２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４の窒素リンゲルｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　１ｍｌを用い、５％　ＣＯ２，　３７℃で１時間培養する。その後、被験物質の溶液もしくは溶媒のみ（ブランク）を添加し、浸透圧をＳｕｃｒｏｓｅで３００ｍＯｓｍに調製した窒素リンゲルｅｆｆｌｕｘ　ｂｕｆｆｅｒ（１１０ｍＭ　ＮａＮＯ３，　４ｍＭ　ＫＮＯ３，　２ｍＭ　ＣａＮＯ３／４Ｈ２Ｏ，　２ｍＭ　ＭｇＮＯ３／６Ｈ２Ｏ，　１１ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ，　２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　ｐＨ７．４）を用い、細胞を合計で１５秒間、３回洗浄する。この洗浄操作の後、細胞からのヨウ素放出を等張液あるいは２２８ｍＯｓｍに調製した低張液にて、ヨウ素検出電極（Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いた５分以上の電圧（ｍＶ）変化を指標として測定することができる。被験物質を添加した場合の電圧変化（Ｖｓａｍ）とブランクにおける電圧変化（Ｖｒｅｆ）を比較することにより、被験物質がＣＬＩＣ２　（ＣＬＩＣ２）の活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、該活性制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝Ｖｓａｍ／Ｖｒｅｆ
【０２２３】
実施例１２　ＳＣＮ２Ａの機能（活性）に基づくスクリーニング方法
ＳＣＮ２Ａの活性測定は、このチャネルが活性化される際に細胞内カルシウムの増加が起こる性質を利用して文献記載（ＰＮＡＳ９８：７５９９−６０４，２００１）の方法に従いｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を用いて行う。すなわち、９６穴プレートに細胞をまきこみ、翌日接着を確認した後、１ウエル当たり１００　μｌのｄｙｅ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ（４μＭ　ｆｌｕｏ−３　ＡＭ，　０．０４％　ｐｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄの含まれたＬｏｃｋｅ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒ，　Ｌｏｃｋｅ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒ　：１５４ｍＭ　ＮａＣｌ／５．６ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ／０．１ｍＭ　ｇｌｙｃｉｎｅ，　ｐＨ．７．４）に培地交換し１時間培養する。その後、各ウエル２００　μｌのＬｏｃｋｅ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄後、１ウエル当たり１００　μｌ　のＬｏｃｋｅ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒ　を入れ、ＦＬＩＰＲ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）に載せる。
アゴニストリガンドであるａｎｔｉｌｌａｔｏｘｉｎは終濃度１００ｎＭとし、添加した２分後までＦＬＩＰＲにて計測する。検出は４８８ｎｍのアルゴンレーザーで細胞を励起し、カルシウムイオンが結合したｆｌｕｏ−３の蛍光を５００−５６０ｎｍの波長でとらえることで行う。リガンド添加直後から６０秒後までの蛍光強度（Ｖｒｅｆ）から、添加前の値（Ｖ０）をバックグラウンドとして差し引いた値を活性とする。被験物質を添加する場合はアゴニストリガンドを添加する前に添加し、その後アゴニストリガンドを添加し、リガンド添加直後から６０秒後までの蛍光強度（Ｖｓａｍ）から、添加前の値（Ｖ０）をバックグラウンドとして差し引いた値と、被験物質非存在下での活性（Ｖｒｅｆ−Ｖ０）とを比較することにより、被験物質が、ＳＣＮ２Ａ活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質がＳＣＮ２Ａ受容体活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝（Ｖｓａｍ−Ｖ０）／（Ｖｒｅｆ−Ｖ０）
また、被験物質のアゴニスト作用を測定する場合、上記においてアゴニストリガンドを用いず被験物質のみを用いて上記の測定を行う。
【０２２４】
実施例１３　ＡＴＡ１の機能（活性）に基くスクリーニング方法
ＡＴＡ１活性の測定は、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２７３，　１１７５−１１７９，２０００）記載に準じて行う。すなわち、トランポートバッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ　８．５）、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、５．４ｍＭ　ＫＣｌ、１．８ｍＭ　ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ　ＭｇＳＯ４、および５ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ）中において、ヒトＡＴＡ１を発現するヒト培養細胞（Ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ）に１６μＭ　［１４Ｃ］ＭｅＡＩＢ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を基質として添加し、３７℃で１５分間静置したのち、細胞外液を交換し、細胞内に取り込まれた放射活性をβ−カウンターにて計測する。内在性のトランスポーター活性を空ベクターのみを導入した細胞を用いて測定し、これを差し引くことにより導入ＡＴＡ１活性を求めることができる。被験物質を添加する場合は基質を添加する前に添加し、被験物質を添加した場合のＡＴＡ１活性（Ｖｓａｍ）と、被験物質非存在下でのＡＴＡ１活性（Ｖｒｅｆ）とを比較することにより、被験物質が、ＡＴＡ１活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質がＡＴＡ１活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝Ｖｓａｍ／Ｖｒｅｆ
【０２２５】
実施例１４　ＡＢＣＡ１の機能（活性）に基づくスクリーニング方法
ＡＢＣＡ１活性の測定は文献（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　１０４，　Ｒ２５，　１９９９）記載の方法にて実施することができる。すなわち、ヒトＡＢＣＡ１を発現する培養細胞（ＲＡＷ２６４．７（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にヒトＡＢＣＡ１　ｃＤＮＡ挿入ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターを安定導入した細胞）を２ｍｇ／ｍｌ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ−ｆｒｅｅ　ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）で馴化後、０．５μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（基質）および５０μｇ／ｍｌ　ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　ＬＤＬを添加、２４時間保温して細胞を標識後、５μｇ／ｍｌ　Ａｐｏ　Ａ−Ｉ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を６時間添加した細胞の培地中の放射活性とＡｐｏ　Ａ−Ｉ無添加の細胞の、培地中の放射活性を測定することによりＡｐｏ　Ａ−Ｉ特異的なｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ流出量を測定することができる。内在性のトランスポーター活性を空ベクターのみを導入した細胞を用いて測定し、これを差し引くことにより導入ＡＢＣＡ１活性を求める。被験物質を添加する場合は基質を添加する前に添加し、被験物質を添加した場合のＡＢＣＡ１活性（Ｖｓａｍ）と、被験物質非存在下でのＡＢＣＡ１活性（Ｖｒｅｆ）とを比較することにより、被験物質が、ＡＢＣＡ１活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質がＡＢＣＡ１活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝Ｖｓａｍ／Ｖｒｅｆ
【０２２６】
実施例１５　ＡＢＣＧ２の機能（活性）に基づくスクリーニング方法
ＡＢＣＧ２活性の測定は文献（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　９５，　１５６６５，　１９９８）記載の方法にて実施することができる。すなわち、ＡＢＣＧ２を発現する培養細胞（ＭＣＦ−７（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＡＢＣＧ２　ｃＤＮＡ挿入ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターを安定導入した細胞）に１μｇ／ｍｌ　ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を添加し、３７℃で１８０分間培養したのち、細胞を生理食塩水で洗浄、細胞外液を３７℃に加温したｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ（基質）を含まない培地に交換し、１６時間培養後、細胞内に保持されたｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ量をｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて計測することができる。内在性のトランスポーター活性を空ベクターのみを導入した細胞を用いて測定し、これを差し引くことにより導入ＡＢＣＧ２活性を求めることができる。被験物質を添加する場合は基質を添加する前に添加し、その後基質を添加し、被験物質を添加した場合の蛍光強度（Ｖｓａｍ）から、基質添加前の値（Ｖ０）をバックグラウンドとして差し引いた値と、被験物質非存在下での活性（Ｖｒｅｆ−Ｖ０）とを比較することにより、被験物質が、ＡＢＣＧ２活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質がＡＢＣＧ２活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝（Ｖｓａｍ−Ｖ０）／（Ｖｒｅｆ−Ｖ０）
【０２２７】
実施例１６　ＧＡＴ１の機能（活性）に基くスクリーニング方法
ＧＡＴ１活性の測定は文献（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　９５，　１５６６５，　１９９８）記載の方法にて実施することができる。すなわち、ＧＡＴ１を発現する培養細胞（ＣＯＳ−７（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にヒトＧＡＴ１　ｃＤＮＡ挿入ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターを安定導入した細胞）をＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＨＢＳ；　２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ　７．４），　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　１ｍＭ　ＣａＣｌ２，　１０ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ，　５ｍＭ　ＫＣｌ，　１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）で洗浄、細胞外液を３７℃に加温した培地に交換し、１０分間３７℃にて保温後、５０ｎＭ［３Ｈ］ＧＡＢＡ（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を基質として添加し、３７℃で１０分間保温したのち細胞内に保持されたＧＡＢＡ　量をβ−カウンターにて計測する。内在性のトランスポーター活性を空ベクターのみを導入した細胞を用いて測定し、これを差し引くことにより導入ＧＡＴ１活性を求めることができる。
被験物質を添加する場合は基質を添加する前に添加し、被験物質を添加した場合のＧＡＴ１活性（Ｖｓａｍ）と、被験物質非存在下でのＧＡＴ１活性（Ｖｒｅｆ）とを比較することにより、被験物質が、ＧＡＴ１活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質がＧＡＴ１活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝Ｖｓａｍ／Ｖｒｅｆ
上記制御率が小さい被験物質、すなわち、ＧＡＴ１活性を阻害する被験物質を、軟骨疾患治療剤候補化合物として選抜することができる。
【０２２８】
実施例１７　ＰＬＴＰの機能（活性）に基くスクリーニング方法
ＰＬＴＰ活性の測定は文献（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　１０３，　９０７，　１９９９）　記載の方法にて実施することができる。すなわち、１０ｎＭ　［３Ｈ］ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（Ｌ−ａ−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−　［２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−９，１０−３Ｈ（Ｎ）］−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）を基質として含む鶏卵ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ　１０μｍｏｌを窒素気流下にて乾燥後、１ｍｌのｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）にて懸濁し、超音波プローブにて拡散後、スピンダウンし、標識ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｖｅｓｉｃｌｅを調製する。マウス血漿３μｌと該標識ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｖｅｓｉｃｌｅ　（１２５ｎｍｏｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ　ｃｈｏｌｉｎｅ）、ＨＤＬ（２５０μｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を混合し、トータルボリューム４００μｌで３７℃、１時間保温する。その後、３００μｌのｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ　ＮａＣｌ、２１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２，　４４５Ｕ／ｍｌ　ｈｅｐａｒｉｎ）を添加し、ｖｅｓｉｃｌｅを沈殿させ、上清５００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンターにて計測することによりＰＬＴＰ活性を測定することができる。
被験物質を添加する場合は基質を添加する前に添加し、被験物質を添加した場合の放射活性（Ｖｓａｍ）と、被験物質非存在下での活性（Ｖｒｅｆ）とを比較することにより、被験物質が、ＰＬＴＰ活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質がＰＬＴＰ活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝Ｖｓａｍ／Ｖｒｅｆ
【０２２９】
実施例１８　ＥＮＴ１の機能（活性）に基くスクリーニング方法
ＥＮＴ１活性の測定は文献（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．，　３，　８９，　１９９７）記載の方法にて実施することができる。すなわち、Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ　（Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｊｉｋｋｅｎｎ）のｏｏｃｙｔｅｓの小塊をカルシウムイオンフリーのＯＲＩＩ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（８２．５ｍＭ　ＮａＣｌ，　２ｍＭ　ＫＣｌ，　１ｍＭＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５）中において２ｍｇ／ｍｌ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）にて９０分間２回処理し、ＯＲＩＩ　ｓｏｌｕｔｉｏｎにて１回洗浄、改変Ｂａｒｔｈ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（８８ｍＭ　ＮａＣｌ，　１ｍＭ　ＫＣｌ，　０．８２ｍＭ　ＭｇＳＯ４，　０．４ｍＭ　ＣａＣｌ２，　０．３３ｍＭ　Ｃａ（ＮＯ３）２，　２．４ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５）で洗浄することによりｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｌａｙｅｒを除去後、ｏｏｃｙｔｅを改変Ｂａｒｔｈ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　中にて１８℃で一晩静置する。ＳｔａｇｅＶ　ｏｏｃｙｔｅにＤＥＰＣ処理水にて１ｍｇ／ｍｌに濃度調整したヒトＥＮＴ１　ｃＲＮＡ　１０ｎｇをｍａｎｕａｌ　ｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）にて注入する。２０℃にて３日間培養した後、１０μＭ　［１４Ｃ］ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を基質として含むｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｂｕｆｆｅｒ（１μＭ　ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ，　１００ｍＭ　ＮａＣｌ，　２ｍＭ　ＫＣｌ，　１ｍＭ　ＣａＣｌ２，　１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５）に溶液を交換し、２０℃で６０分間保温した保温した後、ｏｏｃｙｔｅを氷冷ｔｒａｎｓｐｏｒｔｂｕｆｆｅｒで６回洗浄する。各々のｏｏｃｙｔｅをシンチレーションバイアルに入れ、０．２ｍｌの１０％　ＳＤＳにて溶解後、５ｍｌの液体シンチレーションカクテル（ＤｕＰｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を添加・混合することにより、ｏｏｃｙｔｅ内に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンターにて計測する。ヒトＥＮＴ１　ｃＲＮＡの代わりにＤＥＰＣ処理水を注入したｏｏｃｙｔｅを用いて同様に測定し、これを差し引くことにより導入ＥＮＴ１　活性を求めることができる。
被験物質を添加する場合は基質を添加する前に添加し、被験物質を添加した場合のＥＮＴ１活性（Ｖｓａｍ）と、被験物質非存在下でのＥＮＴ１活性（Ｖｒｅｆ）とを比較することにより、被験物質が、ＥＮＴ１活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質がＥＮＴ１活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝Ｖｓａｍ／Ｖｒｅｆ
【０２３０】
実施例１９　ＮＰＴ３の機能（活性）に基くスクリーニング方法
ＮＰＴ３活性の測定は文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　３０５，　８１，　１９９５）に記載の方法にて実施することができる。すなわち、Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ　（Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｊｉｋｋｅｎｎ）のｏｏｃｙｔｅｓの小塊をカルシウムイオンフリーのＯＲＩＩ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（８２．５ｍＭ　ＮａＣｌ，　２ｍＭ　ＫＣｌ，　１ｍＭＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５）中において２ｍｇ／ｍｌ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）にて９０分間２回処理し、ＯＲＩＩ　ｓｏｌｕｔｉｏｎにて１回洗浄、改変Ｂａｒｔｈ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（８８ｍＭ　ＮａＣｌ，　１ｍＭ　ＫＣｌ，　０．８２ｍＭ　ＭｇＳＯ４，　０．４ｍＭ　ＣａＣｌ２，　０．３３ｍＭ　Ｃａ（ＮＯ３）２，　２．４ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５）で洗浄することによりｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｌａｙｅｒを除去後、ｏｏｃｙｔｅを改変Ｂａｒｔｈ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　中にて１８℃で一晩静置した。ＳｔａｇｅＶ　ｏｏｃｙｔｅにＤＥＰＣ処理水にて１ｍｇ／ｍｌに濃度調整したＮＰＴ−３　ｃＲＮＡ　５ｎｇをｍａｎｕａｌ　ｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）にて注入する。２０℃にて３日間培養した後、ナトリウムイオンフリーｕｐｔａｋｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ（１００ｍＭ　ｃｈｏｌｉｎｅ　ｃｈｏｒｉｄｅ，　２ｍＭ　ＫＣｌ，　１ｍＭ　ＣａＣｌ２，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５）にて洗浄し、ナトリウムイオン含有ｕｐｔａｋｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｍＭ　ＮａＣｌ，　２ｍＭ　ＫＣｌ，　１ｍＭ　ＣａＣｌ２，　１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５，　０．５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（３０μＣｉ／ｍｌ））中にて６０分間保温した後、ｏｏｃｙｔｅを５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４を添加した氷冷ナトリウムイオンフリーｕｐｔａｋｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉにて３回洗浄した。各々のｏｏｃｙｔｅをシンチレーションバイアルに入れ、０．２ｍｌの１０％　ＳＤＳにて溶解後、５ｍｌの液体シンチレーションカクテル（ＤｕＰｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）（基質）を添加・混合することにより、ｏｏｃｙｔｅ内に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンターにて計測する。ナトリウムイオン非依存性のトランスポーター活性をナトリウムイオンフリーｕｐｔａｋｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ＩＩ（１００ｍＭ　ｃｈｏｌｉｎｅ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ，　２ｍＭ　ＫＣｌ，　１ｍＭ　ＣａＣｌ２，　１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５，　０．５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（３０μＣｉ／ｍｌ））を用いて測定し、これを差し引くことにより導入ＮＰＴ３活性を求めることができる。
被験物質を添加する場合は基質を添加する前に添加し、被験物質を添加した場合のＮＰＴ３活性（Ｖｓａｍ）と、被験物質非存在下でのＮＰＴ３活性（Ｖｒｅｆ）とを比較することにより、被験物質が、Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質がＮＰＴ３活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝Ｖｓａｍ／Ｖｒｅｆ
【０２３１】
実施例２０　ＩＲＥＧ１の機能（活性）に基くスクリーニング方法
ＩＲＥＧ１活性の測定は文献（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ，　５，　２９９，　２０００）記載の方法にて実施することができる。すなわち、Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ　（Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｊｉｋｋｅｎｎ）のｏｏｃｙｔｅｓの小塊をカルシウムイオンフリーのＯＲＩＩ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（８２．５ｍＭ　ＮａＣｌ，　２ｍＭ　ＫＣｌ，　１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５）中において２ｍｇ／ｍｌ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）にて９０分間２回処理し、ＯＲ　ＩＩ　ｓｏｌｕｔｉｏｎにて１回洗浄、改変Ｂａｒｔｈ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（８８ｍＭ　ＮａＣｌ，　１ｍＭ　ＫＣｌ，　０．８２ｍＭ　ＭｇＳＯ４，　０．４ｍＭ　ＣａＣｌ２，　０．３３ｍＭ　Ｃａ（ＮＯ３）２，　２．４ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５）で洗浄することによりｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｌａｙｅｒを除去後、ｏｏｃｙｔｅを改変Ｂａｒｔｈ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　中にて１８℃で一晩静置した。Ｓｔａｇｅ　ＶＩ　ｏｏｃｙｔｅにＤＥＰＣ処理水にて０．５ｍｇ／ｍｌに濃度調整したヒト　プロトン共役型２価カチオントランスポーターＤＣＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＮＭ＿０００６１７）　ｃＲＮＡ　２５ｎｇおよびＩＲＥＧ１ｃＲＮＡ　２５ｎｇをｍａｎｕａｌ　ｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）にて注入した。２０℃にて２４時間培養した後、Ｆｅ５５（ＮＥＮ）を含む　ｕｐｔａｋｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（９８ｍＭ　ＮａＣｌ，　２．０ｍＭ　ＫＣｌ，　０．６ｍＭ　ＣａＣｌ２，　１．０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１．０ｍＭ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ，　１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ６．０）に溶液を交換し、室温で３０分間保温することによりＦｅ５５をプレロードする。ｏｏｃｙｔｅをＦｅ５５（ＮＥＮ）を含まない　ｕｐｔａｋｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎで３回洗浄し、９６ウェルプレートに移した後、５０μｌのｅｆｆｌｕｘ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（９８ｍＭ　ＮａＣｌ，　２．０ｍＭ　ＫＣｌ，　０．６ｍＭ　ＣａＣｌ２，　１．０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．４）中にて保温する。６０分間保温した後、ｅｆｆｌｕｘ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを除去し、０．２ｍｌの１０％　ＳＤＳにて溶解後、５ｍｌの液体シンチレーションカクテル（ＤｕＰｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）（基質）を添加・混合することにより、ｏｏｃｙｔｅ内に保持された放射活性を液体シンチレーションカウンターにて計測する。ＩＲＥＧ１非依存性のトランスポーター活性をＤＣＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＮＭ＿０００６１７）　ｃＲＮＡ　２５ｎｇのみを注入したｏｏｃｙｔｅを用いて同様に計測し、ＩＲＥＧ１依存性のトランスポーター活性からＩＲＥＧ１非依存性のトランスポーター活性を差し引くことにより導入ＩＲＥＧ１活性を求めることができる。
被験物質を添加する場合は基質を添加する前に添加し、被験物質を添加した場合のＩＲＥＧ１活性（Ｖｓａｍ）と、被験物質非存在下でのＩＲＥＧ１活性（Ｖｒｅｆ）とを比較することにより、被験物質が、ＩＲＥＧ１活性を制御するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質がＩＲＥＧ１活性を制御する場合、その制御率は、下記の式により算出する。
制御率＝Ｖｓａｍ／Ｖｒｅｆ
【０２３２】
実施例２１　ＨＥＫ−２９３細胞で発現した５Ｈ−７受容体結合阻害活性の測定
ラット５−ＨＴ７受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞を用いて、ラット５−ＨＴ７受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞を、公知の方法により生育させる。培地を除去することにより細胞を回収し、燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、次いで、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを加える。細胞を遠心チューブにて、４０，０００ｘｇで１０分間遠心機にかける。上澄を捨て、この時点で残ったペレットをホモゲナイザーで５０ｍＭのトリスＨＣｌバッファー（４℃でｐＨ７．４）中で均質化する。ホモジネートを、４０，０００ｘｇで更に１０分間遠心機にかける。上澄を捨て、ペレットを、新たな氷冷５０ｍＭのトリスＨＣｌ（４℃でｐＨ７．４）バッファー中に再懸濁し、再度遠心機にかける。得られるペレットを、測定用バッファー（０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウムを含有する５０ｍＭトリス塩酸バッファー（２５℃でｐＨ７．７））にペレット湿潤重量５−１５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で（２Ｘ最終濃度）再懸濁する。
測定用プレートに得られたペレット懸濁液（初めの湿潤重量５−１５ｍｇ／ｍＬ）１００μＬ、５０μＬの［３Ｈ］−５−ＣＴ（０．４ｎＭ最終濃度）、および５０μＬの被験物質（またはバッファー）を加える。これを２時間インキュベートする。ワットマンＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターで濾過することにより、インキュベーションを終える。フィルターの放射能を液体シンチレーション計数により定量する。特異的結合のパーセント阻害を、各濃度の被験物質について算定し、ＩＣ５０値（特異的結合の５０％を阻害する濃度）を決定する。
【０２３３】
実施例２２　５−ＨＴ７受容体が仲介するアデニル酸シクラーゼ活性
ラット５−ＨＴ７受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞を、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する燐酸緩衝生理食塩水に培地を置き替えることにより、細胞を回収する。ホモジネートを、３５，０００ｘｇで１０分間４℃で遠心分離する。ペレットを、チューブ当たり４０マイクログラム蛋白質の最終蛋白質濃度になるように、１ｍＭのＥＧＴＡを含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）に再懸濁する。
４．０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＡＴＰ、１．０ｍＭのｃＡＭＰ、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１０ｍＭのホスホクレアチン、０．３１ｍｇ／ｍＬのクレアチンホスホキナーゼ、および１００μＭのＧＴＰ、０．５−１マイクロキュリーの［３２Ｐ］−ＡＴＰを、これらの最終濃度になるように反応液を調製する。
２０μＬの細胞懸濁液、２０μＬの被験物質（またはバッファー）および４０μＬの反応液を混合し３７℃で１５分間インキュベーションする。４０，０００ｄｐｍ［３Ｈ］−ｃＡＭＰを含有する１００μＬの２％ＳＤＳ、１．３ｍＭのｃＡＭＰ、４５ｍＭのＡＴＰ溶液を添加してインキュベーションを終了し、ｃＡＭＰ回収量を測定する。［３２Ｐ］−ＡＴＰおよび［３２Ｐ］−ｃＡＭＰを分離し（Ｓａｌｏｍｏｎ，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５８：　５４１−５４８，　１９７４の方法を用いることができる。）、放射能を、液体シンチレーション計数により定量する。
【０２３４】
実施例２３　ラット十字靭帯切断モデルによる薬効評価
ＥＤＧ２アゴニスト、ＥＴ（Ａ）アンタゴニスト、ＶＩＰ１ＲアゴニストおよびＧＡＴ１阻害剤の変形性関節症に対する治療効果を、ラット十字靭帯切断変形性関節症モデルを用いて評価した。
７週齢のＣｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳ（ＳＰＦ）系雄ラットを用い、実施例１に記載の方法により変形性関節症発症モデル動物を作製した。ＥＤＧ２アゴニストであるリゾフォスファチディック　アシッド（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ　ａｃｉｄ；ＬＰＡ）（シグマ社製；カタログ番号　Ｌ７２６０）、ＥＴ（Ａ）アンタゴニストであるＢＱ−１２３（シグマ社製；カタログ番号　Ｂ１５０）、ＶＩＰ１ＲアゴニストであるＶＩＰ（シグマ社製；カタログ番号　Ｖ６１３０）およびＧＡＴ１阻害剤であるＣＩ９６６（ＴＯＣＲＩＳ社製；カタログ番号　１２９６）を、十字靭帯切断手術後７〜２７日まで隔日で１１回、膝関節腔内投与（０．０５ｍＬ／ｂｏｄｙ）した。最終投与の翌日にモデル作製部位である左側膝関節を摘出し、大腿骨及び脛骨の内側及び外側顆の関節軟骨病変を病理組織学的に評価した。対照群として生理食塩液（大塚生食注、Ｌｏｔ　Ｎｏ．Ｋ２Ｃ８５，大塚製薬）投与群を設定し、この対照群との比較により薬効を評価した。
病理組織学的評価は、公知の評価基準（菊地ら：応用薬理、４４、５４７−５５７（１９９２）に基づく）により行った。
すなわち軟骨病変の指標である各関節軟骨の構造変化（評点０〜１０）、浅在帯細胞変化（評点０〜２）、中間帯及び深在帯細胞変化（評点０〜１０）、サフラニンＯ染色性低下（評点０〜４）及びパンヌス形成（評点０〜３）をそれぞれ評価し、その合計評点（最大２９点）を算出した。結果を表３に示した。
【表２】
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対照群には，大腿骨関節軟骨の外側顆及び内側顆で合計評点が３．７及び４．１，脛骨関節軟骨の外側顆及び内側顆で合計評点が８．６及び９．６の軟骨病変が認められた。これら変化を示した対照群と比較し、ＬＰＡ投与群では大腿骨関節軟骨の内側顆および脛骨関節軟骨の内側顆で合計評点がそれぞれ２．１及び４．６といずれも有意に低下した。またＢＱ−１２３投与群では脛骨関節軟骨の内側顆で合計評点が４．４、ＶＩＰ投与群では脛骨関節軟骨の外側顆および内側顆で合計評点がそれぞれ４．３及び３．３、ＣＩ９６６投与群では大腿骨関節軟骨の内側顆および脛骨関節軟骨の外側顆および内側顆で合計評点がそれぞれ２．１、４．４及び３．０と有意に低下した。
以上の結果から、ＥＤＧ２アゴニストであるＬＰＡ、ＥＴ（Ａ）アンタゴニストであるＢＱ−１２３、ＶＩＰ１ＲアゴニストであるＶＩＰおよびＧＡＴ１阻害剤であるＣＩ９６６は、いずれも関節軟骨病変抑制作用を有することが明らかとなった。
【０２３５】
実施例２４　未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化に対するＧＡＴ１阻害剤の薬効
マウス未分化間葉系細胞ＡＴＤＣ５（理研；ＲＣＢ０５６５）は増殖条件（５％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）含有　ＤＭＥ／Ｆ１２培地（シグマ）、５％ＣＯ２、３７℃）から分化条件（５％ウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌウシインスリン（和光純薬）、１０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、３０ｎＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ）含有αＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、３％ＣＯ２、３７℃）にシフトさせることにより軟骨細胞に分化することが知られている（ＣＥＬＬ　ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ　＆　ＦＵＮＣＴＩＯＮ，　２５，　１９５−２０４，　２０００）。軟骨細胞は未分化間葉系細胞と比較して酸性ムコ多糖合成活性が高いため、酸性ムコ多糖量を指標に軟骨細胞への分化程度を定量化することができる。そこで、これらの公知の性質に基いて、ＧＡＴ１阻害剤：ＣＩ９６６の軟骨細胞への分化に対する効果を調べた。
すなわち、増殖条件で培養したＡＴＤＣ５細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ）にて洗浄、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）にて剥がした後、増殖培地で３ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに懸濁し、２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に各ウェルあたり１ｍｌずつまいた。増殖条件で２日間培養した後、分化誘導条件にシフトさせ、以後２日置きに培地交換をおこなった。ＣＩ９６６の効果の測定は分化誘導時にＣＩ９６６（ＴＯＣＲＩＳ；カタログ番号　１２９６）をそれぞれ０．１μＭ、１μＭ、１０μＭを含有する分化培地を用いた点以外は上記同様に実施した。分化条件にて１５日間培養した後、簡易型・酸性ムコ多糖定量キット（ホクドー；カタログ番号ＯＰ０３）を用いて軟骨細胞から産生された酸性ムコ多糖量を波長６５０ｎｍの吸光度（ＯＤ６５０）で測定することによりＣＩ９６６の軟骨細胞への分化に対する効果を定量した。対照群として化合物を含有しない分化誘導条件群を設定し、この対照群との比較により薬効を評価した。
酸性ムコ多糖増加率（％）＝１００＊｛（Ａ／Ｃ）−１｝　Ａ＝実験群における吸光度（６００ｎｍ）、Ｃ＝対象群における吸光度（６００ｎｍ）
その結果、対照群と比較して１０μＭ　ＧＡＴ１阻害剤：ＣＩ９６６で１４．２％と有意に酸性ムコ多糖量が増加した。
以上の結果から、ＧＡＴ１阻害剤：ＣＩ９６６は、軟骨分化促進作用を有することが明らかとなった。以上の知見から、ＧＡＴ１阻害剤が軟骨障害治療剤となり得ることがわかった。
【表３】
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＊Ｐ＜０．０５　（ｔ−検定、Ｎ＝３）
【０２３６】
【発明の効果】
本発明によって、ラット十字靭帯切断モデルの障害軟骨において、正常軟骨と比較して特異的に増大している遺伝子（５−ＨＴ７遺伝子、ＥＤＧ１遺伝子、ＥＴ（Ａ）遺伝子、ＧＰＲ８８遺伝子、ＰＴＨ２Ｒ遺伝子、ＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ＣＬＩＣ２遺伝子、ＡＴＡ１遺伝子、ＡＢＣＡ１、ＰＬＴＰ遺伝子、ＮＰＴ３遺伝子、および、ＩＲＥＧ１遺伝子）が明らかになった。また、ラット十字靭帯切断モデルの障害軟骨において、正常軟骨と比較して特異的に減少している遺伝子（ＥＤＧ２遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＡＢＣＧ２　遺伝子、ＥＮＴ１　遺伝子、および、ＧＡＴ１　遺伝子）が明らかになった。
かかる遺伝子は軟骨障害の遺伝子診断に用いられるマーカー遺伝子（プローブ、プライマー）として有用である。該マーカー遺伝子の利用によれば、軟骨障害が検出でき、またその病因の究明および高精度の診断が可能であり、これらによりより適切な治療を施すことも可能となる。
また、上記遺伝子の発現と軟骨障害との関連から、該遺伝子の発現を制御する化合物は、軟骨障害の治療薬として有用と考えられる。例えば、５−ＨＴ７、ＥＤＧ２またはＶＩＰ１Ｒの機能亢進剤、及びＥＴ（Ａ）またはＧＡＴ１の機能抑制剤が軟骨障害治療薬として有効である。
従って、これらの遺伝子の発現の変動、または当該遺伝子がコードするタンパク質の機能（活性）変動を指標とすることによって、軟骨障害の治療薬となり得る候補薬をスクリーニングし選別することが可能である。本発明は、このような軟骨障害治療薬の開発技術をも提供する。
【０２３７】
【配列表】
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