(57)【要約】【課題】熱、強酸、強アルカリ、有機溶媒等に対して安定な酵素及びそれを用いてなるバイオリアクターを提供する。【解決手段】シャペロニンと酵素活性を有するタンパク質とがペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であって、前記シャペロニンは５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成しており、前記酵素活性を有するタンパク質は、前記シャペロニンリングの内部に収納されている融合タンパク質。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャペロニンと酵素活性を有するタンパク質とがペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であって、
前記シャペロニンは５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成しており、前記酵素活性を有するタンパク質は、前記シャペロニンリングの内部に収納されている
ことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
シャペロニンは、好熱性古細菌又は超好熱性古細菌に由来することを特徴とする請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
酵素活性を有するタンパク質は、シャペロニンサブユニットのＮ末端、Ｃ末端及び／又はシャペロニンサブユニット同士の連結部にペプチド結合を介して連結されていることを特徴とする請求項１又は２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
酵素活性を有するタンパク質は、ホモ又はヘテロの形態で２量体又はそれ以上の四次構造を形成するものであって、
各々のサブユニットがシャペロニンサブユニットのＮ末端、Ｃ末端及び／又はシャペロニンサブユニットの連結部にペプチド結合を介して連結されていることを特徴とする請求項１、２又は３記載の融合タンパク質。
【請求項５】
酵素活性を有するタンパク質は、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、リガーゼ又は触媒抗体であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１、２、３、４又は５記載の融合タンパク質を用いてなることを特徴とするバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、熱、強酸、強アルカリ、有機溶媒等に対して安定な酵素及びそれを用いてなるバイオリアクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素はタンパク質よりなる生体触媒であって、常温、常圧の穏やかな条件下において効率よく反応を促進し、しかもその特異性が非常に高いという利点を有することから、食品プロセスや化学プロセス、更には治療用医薬等に利用することが試みられている。しかし、酵素はタンパク質であることから、熱、強酸、強アルカリ、有機溶媒等に不安定であり、反応時間の経過とともに比較的早く失活してしまうという欠点を有する。
【０００３】
酵素が不活性化する機構としては、溶液中の水素イオン濃度（ｐＨ）の変化に伴う酵素分子全体変性及び活性中心部位の荷電状態の微妙な変化や、温度の上昇によるアミノ酸側鎖間の水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用、Ｓ−Ｓ結合等の結合の切断による高次構造の崩壊等が挙げられる。
これらの酵素の持つ不安定性を克服する方法としては、例えば、不溶性の担体等に酵素を結合する固定化酵素法、酵素を化学的に修飾する方法、分子レベルで酵素のアミノ酸に改良を加える遺伝子工学・タンパク質工学的な方法等が提案されている。
【０００４】
固定化酵素法としては、例えば、イオン結合又は物理的吸着によってセルロース、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、多孔質ガラス等の担体に結合させる担体結合法：ポリビニルアルコールやポリアクリルアミド、デンプン等のポリマーの微細なゲル格子に酵素を取り込む格子型及びナイロン、ポリウレア、ポリスチレン等の半透膜性の被膜中に酵素を被覆させるマイクロカプセル型とに分類される包括法等が挙げられる。
【０００５】
担体結合法は、固定化酵素法の中でも最も以前から用いられており報告例も多い。しかしながら、酵素タンパク質を構成しているアミノ酸を担体と結合させる際、酵素の活性中心に位置するアミノ酸の官能基も担体と結合してしまったり、固定化によって酵素の高次構造が変化したり、担体の立体障害によって基質の接近が阻まれたりする等の原因によって酵素の活性が低下してしまうという問題があった。また、担体と共有結合させる際の反応条件が過激であるため、高次構造の変化や活性中心の一部に破壊等が起こり、目標とする活性が得られないという問題もあった。
【０００６】
包括法は、酵素自身の官能基は結合反応に寄与していないため高活性が期待される方法である。しかしながら、格子型、マイクロカプセル型ともに調製時に化学的な重合反応が行われることから、過酷な条件下におかれるため酵素が失活しやすい。また、ゲル又は膜を通して酵素と基質との反応が行われるため、基質や生成物のゲル又は膜の透過速度が反応の律速となり、見掛けの酵素活性の低下を避けることができないという問題があった。
【０００７】
酵素を化学的に修飾することによって酵素活性の低下を防ぐ方法としては、例えば、タンパク質酵素の分子内にＳ−Ｓ結合を形成したり、グルタルアルデヒドやイソシアナート誘導体等を使用して酵素同士を架橋したりして、酵素分子の構造を安定とする方法等が挙げられる。しかしながら、これらの改変は酵素ごとにその方法が異なり、充分な安定性が得られないことも多く、汎用性の点で問題があった。
【０００８】
遺伝子工学的・タンパク質工学的な手法としては、例えば、火山地帯等の高温環境に生育する種々の好熱性菌から酵素を抽出精製して使用する方法等が挙げられる。近年、このようなスクリーニング方法によって、常温で安定なタンパク質と同様な機能を有するタンパク質がいくつか見出されている。しかしながら、その種類は限定されており、充分には実用化されていない。また、酵素の耐熱性とその要因を、酵素の構造やアミノ酸配列のレベルから明らかにしようとする試みも多く行われているが、個々の酵素については構造と耐熱性の関係が徐々に解明されつつあるものの、一般化されるまでには至っておらず、工業的に実用化されるまではさらなる検討が必要である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、熱、強酸、強アルカリ、有機溶媒等に対して安定な酵素及びそれを用いてなるバイオリアクターを提供することを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討の結果、酵素活性を有するタンパク質をシャペロニンとの融合タンパク質として生成させることによって、酵素を反応溶液中で外部環境と隔絶し、更に、シャペロニンの折り畳み機能で高温状態での酵素の変性を修復することにより、酵素を安定化させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、シャペロニンと酵素活性を有するタンパク質とがペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であって、前記シャペロニンは５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成しており、前記酵素活性を有するタンパク質は、前記シャペロニンリングの内部に収納されている融合タンパク質である。
以下に本発明を詳述する。
【００１１】
細胞に熱ショック等のストレスを与えると、一般的に分子シャペロンと呼ばれるタンパク質群の発現が誘導される。分子シャペロンは、エネルギー物質であるＡＴＰの存在下又は非存在下でタンパク質の折り畳みを支援したり、構造安定化に貢献したりする。これらの分子シャペロンの中でも、その分子量が約６０ｋＤａのものはシャペロニンといわれ、バクテリア、古細菌及び真核生物の全ての生物に存在し、タンパク質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。
【００１２】
シャペロニンはグループ１型とグループ２型に大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、コシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状複合体を補因子とする。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌に見られ、それらの構造や機能に関しては不明な点が多く残されており、グループ１型のコシャペロニンに相当するタンパク質も現在のところ見つかっていない。
【００１３】
シャペロニンは、図１に示したように、５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層のリング構造（以下、構造体をシャペロニン複合体、リングをシャペロニンリングという）を形成する。大腸菌シャペロニンの場合、シャペロニン複合体は内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有する。１層シャペロニンリングのキャビティは６０ｋＤａの球状タンパク質１つが充分に納まる空間を有する。シャペロニンはこのキャビティ内部に、ポリペプチドや変性タンパク質を一時的に格納し、タンパク質の折り畳み構造形成を助け、構造を安定化させる機能をもつ。
【００１４】
種々の細胞由来シャペロニン複合体の立体構造が近年、Ｘ線結晶構造解析によって詳細に明らかにされつつある。隣接するサブユニット間及びリング間の相互作用によるシャペロニン複合体の構成は、アミノ酸間の疎水的相互作用及び静電相互作用によっている。また、シャペロニンのＮ末端及びＣ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっており、特に大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬは、Ｃ末端の少なくとも２３アミノ酸はフレキシビリティの高い構造を示すことがわかっている。
【００１５】
バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、遺伝子組換え手法に大腸菌細胞質可溶性画分に容易に大量生産させることが可能である。更に、精製した発現産物を電子顕微鏡観察することによって、様々のシャペロニンが大腸菌でも自己集合し、１０〜２０量体からなる２層リング構造のシャペロニン複合体を形成できることが観察されている。更に、シャペロニンは一般的に熱に対して非常に安定であり、大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬは５０℃においても変性は起こらず、また、好熱好酸性古細菌由来シャペロニンや超好熱性古細菌由来シャペロニンは７０〜８０℃付近の高温においても変性したりや凝集したりしないだけではなく、シャペロニン活性も維持している。
【００１６】
本発明の融合タンパク質は、シャペロニンと酵素活性を有するタンパク質とがプチド結合を介して連結されたものであって、シャペロニンは５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成しており、酵素活性を有するタンパク質は、シャペロニンリングの内部に収納されている構造を有する。
酵素活性を有するタンパク質をシャペロニンとペプチド結合を介して連結し、熱等に対して安定なシャペロニンリング内に格納しキャビティ内部の親水的な環境に恒久的に位置させることによって、酵素の耐熱化や安定化を達成することができる。
【００１７】
上記シャペロニンとしては、バクテリア、古細菌及び真核生物のいずれの由来のものでも用いることができが、酵素への耐熱性付与を行う場合には、好熱性古細菌又は超好熱性古細菌由来のシャペロニンを用いることが好ましい。好熱性古細菌又は超好熱性古細菌由来のシャペロニンは、７０〜８０℃においても変性することなくタンパク質の折り畳み活性を含むシャペロニン活性を有する（Ｙｏｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，２７３，６３５−６４５）。従って、シャペロニン内に格納された酵素が比較的高温でも維持されるだけではなく、酵素活性を失活するような高温のステップを含むプロセスにおいても、シャペロニン活性による酵素活性の復元によって再び酵素反応のステップを行うことが可能である。
【００１８】
本発明の融合タンパク質におけるシャペロニンと酵素活性を有するタンパク質との連結パターンとしては、酵素活性を有するタンパク質がシャペロニンリングのキャビティ内に確実に納まるように、シャペロニンサブユニットのＮ末端、Ｃ末端及び／又はシャペロニンサブユニット同士の連結部にペプチド結合を介して連結されることが好ましい。
更に、上記酵素活性を有するタンパク質が、ホモ又はヘテロの形態で２量体又はそれ以上の四次構造を形成するものである場合には、酵素活性を有するタンパク質を構成する１種又は２種のサブユニットが、互いに連結したシャペロニンサブユニットのＮ末端、Ｃ末端及び／又はシャペロニンサブユニット同士の連結部にペプチド結合を介して連結されることが好ましい。例えば、シャペロニンサブユニット８個でシャペロニンリングを構成する超好熱性古細菌由来シャペロニンに２量体を形成することにより酵素活性を発現するタンパク質を収納する場合、シャペロニンサブユニットを８個連結した８量体シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に、２量体を形成することにより酵素活性を発現するタンパク質を構成するそれぞれのサブユニットをペプチド結合を介して連結することにより、シャペロニンリング内の極めて近接した領域でそれぞれのサブユニットが存在するため、２量体からなる四次構造を形成しやすく、安定した酵素活性の発現が可能となる。
【００１９】
本発明の融合タンパク質に用いる酵素活性を有するタンパク質としては特に限定されないが、例えば、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ等の酸化還元酵素；各種の転移酵素；ペプチターゼ、エステラーゼ等の加水分解酵素；デカルボキシラーゼ、アルドラーゼ等の脱離酵素；各種異性化酵素；リガーゼ等が挙げられる。また、酵素活性を有するタンパク質とシャペロニンとの融合タンパク質を担体等に結合させて用いる場合には、酵素活性を有するタンパク質としては、例えば、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、チロシナーゼ、アミノアシラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、インベルターゼ、カルボキシペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ＡＭＰデアミナーゼ、パパイン、Ｄ−オキシニトリラーゼ、アスパルターゼ、グルコースイソメラーゼ等が挙げられる。更に、抗体断片に触媒活性を付与した触媒抗体もまた、本発明の融合タンパク質において酵素活性を有するタンパク質として利用することができる。
【００２０】
本発明の融合タンパク質を作製する方法としては特に限定されないが、シャペロニンと目的とする酵素活性を有するタンパク質の融合タンパク質を発現する遺伝子を組み込んだ発現ベクターを調製し、これを宿主内で発現させる方法が好適である。例えば、シャペロニンと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、シャペロニン又はシャペロニン連結体のみをコードする遺伝子とをポリシストロニックに連結したプラスミドを宿主内で共発現させる方法：シャペロニンと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、シャペロニン又はシャペロニン連結体のみをコードする遺伝子とを同一の宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドにそれぞれ導入し、同一の宿主内で共発現させる方法等が挙げられる。
この方法によれば、どのような酵素でもシャペロニンと融合したタンパク質として画一的な条件での生産及び精製が可能で、更に酵素の安定化や耐熱化のための修飾が融合タンパク質を発現・精製した時点で完了していることとなる。
【００２１】
本発明の融合タンパク質では、酵素活性を有するタンパク質をシャペロニンとペプチド結合を介して連結し、熱等に対して安定なシャペロニンリング内に格納しキャビティ内部の親水的な環境に恒久的に位置させることによって、酵素の耐熱化や安定化を達成している。更にシャペロニンの有する酵素活性の復元効果により、いったん熱等により失活した酵素も再び酵素活性を取り戻すことが可能である。
【００２２】
本発明の融合タンパク質は、セルロース、シリカゲル、ポリアクリルアミド、メンブレン等の担体に固定することにより、固定化酵素バイオリアクターとして使用することが可能である。本発明の融合タンパク質はシャペロニンを介して担体と固定することができるため、酵素タンパク質を直接固定させる方法に比べて酵素の活性中心が保持され、基質との反応効率の低下を抑制することができる。更に、固定する際は、常にシャペロニンを固定させる条件で固定することができるため、これまでのように、種々の酵素を固定するための煩雑な条件検討が不要となる。
このような本発明の融合タンパク質を用いてなるバイオリアクターもまた、本発明の１つである。
【００２３】
本発明の融合タンパク質は、更に、酵素電極に利用することもできる。この場合、酵素活性を有するタンパク質を収納した本発明の融合タンパク質をポリアクリルアミドゲルや限外ろ過膜等に固定して電極表面を覆うことになる。従来は、酵素の種類ごとに固定条件等を検討する必要があったが、本発明の融合タンパク質を用いることによりシャペロニンを固定化する画一的な条件での酵素の固定が可能となり、更にシャペロニンを介しているために酵素の活性中心が保持され、活性の維持が可能となる。
【００２４】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２５】
（実施例１）（シャペロニン融合タンパク質の耐熱性）
Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）の遺伝子を５’末端にＳｐｅＩサイトを、３’末端にＨｐａＩサイトをＰＣＲによって設け、この遺伝子をＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理が施されたＣ末端に６残基のヒスチジンが付加されている発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４に組み込んだ。これにより、シャペロニンβサブユニットＴＣＰβ４量体とＧＦＰとの融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４・ＡｂＨを構築した。
得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４・ＡｂＨを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で３０℃、２４時間培養し、シャペロニンβサブユニットＴＣＰβ４量体とＧＦＰとの融合タンパク質を発現させた。
【００２６】
菌体抽出液を５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で７５℃で３０分間加熱処理を行い、大腸菌由来タンパク質の大部分を変性沈殿させた。遠心分離によって上清を回収し、ニッケルキレートセファロースカラムにアプライした。１ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で充分に洗浄後、１００ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でニッケルキレートセファロースに吸着した画分を溶出した。透析によってイミダゾールを除いた後、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む展開液を用いるＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィーによってＴＣＰβ４量体とＧＦＰの融合タンパク質を精製した。
【００２７】
精製されたＴＣＰβ４量体とＧＦＰの融合タンパク質をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を用いて１ｇ／ｍＬ（ＧＦＰ濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ）となるように調製した。この溶液の励起波長３９６．０ｎｍ、蛍光波長５１０．５ｎｍでその蛍光強度を測定した。
７０℃、３０分の熱処理後、再度、溶液の蛍光強度を測定し、熱処理前の値に対する相対値を算出したところ、その値は０．９２であり蛍光強度の低下は認められなかった。
一方、市販のＧＦＰを濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるよう、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を用いて調製し、７０℃、３０分の熱処理前後の蛍光強度を同条件で測定した。その結果、熱処理前の値に対する熱処理後の相対値は０．２４であり、熱処理によってＧＦＰの発光は大幅に減少していた。
これにより、ＴＣＰβ４量体とＧＦＰの融合タンパク質は、ＧＦＰに比べて極めて耐熱性に優れることがわかった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、熱、強酸、強アルカリ、有機溶媒等に対して安定な酵素及びそれを用いてなるバイオリアクターを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌シャペロニン（ＧｒｏＥＬ）複合体の立体構造を模式的に表す図である。
【図１】
2004026713.tif 000002