(57)【要約】【課題】ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２Ｂの可溶性タンパク質およびその変異体、薬剤耐性肺炎連鎖球菌に対して有効な薬剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６株のゲノムＤＮＡからＰＢＰ２Ｂをコードする遺伝子を単離した後、その膜結合領域を欠失させて、可溶化するＰＢＰ２Ｂを作製した。さらに、遺伝子工学的手法を利用し、薬剤との親和性が異なる複数の前記変異体を作製した。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２Ｂの膜結合機能を喪失させたタンパク質。
【請求項２】
以下の（Ａ）および（Ｂ）の特性を有する、請求項１に記載のタンパク質。
（Ａ）トランスペプチダーゼ活性を有し、
（Ｂ）膜結合機能を有するＮ末端領域のアミノ酸配列を欠失している。
【請求項３】
下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有する相同タンパク質、および
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有する改変タンパク質。
【請求項４】
請求項３の（ａ）が、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６からなる群より選択される、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
薬剤親和性を欠くまたは低下した請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来である、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
ＤＮＡであることを特徴とする請求項８に記載の、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５に示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも８５％の相同性を有する塩基配列からなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０（ｉｉ）が、請求項１０（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなる、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０（ｉｉ）が、請求項１０（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有する塩基配列からなる、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ストレプトコッカス属由来である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
肺炎連鎖球菌由来である、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項８〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換えベクターにより形質転換された、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の宿主細胞を培養する工程、および該培養によって得られる宿主細胞もしくはその培養物から請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含んでなる、タンパク質の製造方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の製造方法で生産されたタンパク質。
【請求項１９】
細菌のＰＢＰ２Ｂを結合できる抗体の同定方法において、請求項１〜７および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質を抗体結合アッセイに用い、そのタンパク質に結合する抗体を選択する工程を包含する方法。
【請求項２０】
ＰＢＰ２Ｂに結合する化合物の検定方法において、請求項１〜７および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質を化合物と接触させ、ついで上記化合物がＰＢＰ２Ｂに結合するかどうかを検出することからなる方法。
【請求項２１】
ＰＢＰ２Ｂに結合する化合物の検定方法において、請求項１６に記載の細胞を培養し、上記細胞を溶解させて粗製の細胞抽出物を単離し、上記細胞抽出物をＰＢＰ２Ｂの潜在的インヒビターに暴露し、ＰＢＰ２Ｂと結合することが知られている物質を上記細胞抽出物に導入し、上記物質の非結合分画を除去し、そして細胞抽出物中に残存する上記物質の存在をアッセイすることからなる方法。
【請求項２２】
ＰＢＰ２Ｂに結合する化合物の検定方法において、請求項１〜７および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質のポリペプチドを固体支持体上に固定化しＰＢＰ２Ｂの潜在的インヒビターに暴露し、ＰＢＰ２Ｂと結合することが知られている物質を上記の固定化したポリペプチドに暴露し、上記物質の非結合分画を除去し、そして固定化したポリペプチドに結合した上記物質の存在をアッセイすることからなる方法。
【請求項２３】
ＰＢＰ２Ｂに結合する化合物の検定方法において、請求項１〜７および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質をＰＢＰ２Ｂの潜在的インヒビターに暴露し、ＰＢＰ２Ｂと結合することが知られている物質を固体支持体上に固定化し、これに上記ポリペプチドを暴露し、固定化物質に結合したポリペプチドの存在をアッセイすることからなる方法。
【請求項２４】
ＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼドメインに結合する化合物の検定方法において、請求項１〜７および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質を固体支持体上に固定化させて、該タンパク質のトランスペプチダーゼドメインをＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼ活性の潜在的インヒビターに暴露し、ＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼドメインと結合することが知られている物質を上記の固定化したポリペプチドに暴露し、上記物質の非結合分画を除去し、そして固定化したポリペプチドに結合した上記物質の存在をアッセイすることからなる方法。
【請求項２５】
ＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼドメインに結合する化合物の検定方法において、請求項１〜７および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質のトランスペプチダーゼドメインをＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼ活性の潜在的インヒビターに暴露し、ＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼドメインと結合することが知られている物質を固体支持体上に固定化し、これに上記ポリペプチドを暴露し、固定化物質に結合したポリペプチドの存在をアッセイすることからなる方法。
【請求項２６】
ＰＢＰ２Ｂまたはそのトランスペプチダーゼドメインに結合することが知られている物質がモノクローナル抗体である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＢＰ２Ｂまたはそのトランスペプチダーゼドメインに結合することが知られている物質が標識または標識なしの抗生物質化合物およびそれに類似した化合物である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＢＰ２Ｂの構造を決定する方法において、請求項１〜７および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質のポリペプチドをＸ線結晶解析に利用することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２Ｂの可溶性タンパク質およびその変異体、それをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む組換えベクターおよびそれによって形質転換体された宿主に関する。また、前記ＰＢＰ２Ｂを利用してＰＢＰ２Ｂに高い親和性を有する治療的に有用な化合物の検定および設計する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９５０年以降、ペニシリンの発見をはじめ様々な抗生物質が開発され、感染症治療に使用され、多大な貢献を果たしてきた。しかし、一方では抗生物質の使用に伴い耐性菌の出現が問題視されてきた。特に、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のβ−ラクタム薬耐性は急速に拡がり、耐性の進化を遂げている。肺炎連鎖球菌は呼吸器感染症の主要な起炎菌の一つであるが、１９６７年にオーストラリアにおいてペニシリンＧ（ＰＣＧ）に対する低感受性菌が報告され［Ｈａｎｓｍａｎ  Ｄ．，  Ｂｕｌｌｅｎ  Ｍ．Ｍ．，Ｌａｎｃｅｔ，  ２，  ｐ．２６４−５，  １９６７（非特許文献１）］、１９８０年代には日本においてもＰＣＧ耐性株が報告された。その後、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＰＲＳＰ）の疫学調査が全国的に実施され、ＰＣＧ耐性菌の出現や耐性メカニズムなどについて明らかにされてきた。その結果、ＰＲＳＰの増加が臨床的に問題視されるようになった。
【０００３】
最近の米国の報告書では、ＰＣＧに対し感受性を示さない、すなわちＰＣＧ耐性肺炎連鎖球菌の臨床分離率は５割を超えていることが報告されている［Ｊａｃｏｂｓ  Ｍ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，  ４３（８），ｐ．１９０１−８，  １９９９（非特許文献２）］。日本においても同様の結果が示され、ペニシリン感受性肺炎連鎖球菌（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＰＳＳＰ）の７割にＰＢＰ遺伝子の変異が認められた［Ｓａｔｏｈ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋａｎｓｅｎｓｈｏｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，  ７６（４），  ｐ．２５４−６２，  ２００２（非特許文献３）］。このＰＲＳＰの耐性機構としては、主にＰＢＰの変異による薬剤親和性の低下が考えられている。ＰＢＰの変異はＰＣＧのみならず、β−ラクタム薬全般の耐性に関与している。さらに、マクロライド系、セフェム系、フルオロキノロン系抗菌剤などに耐性を示す多剤耐性化が進行中であり、最終的にはバンコマイシンに頼らざる状況が来るかもしれないと予測され、耐性菌により有効な抗生物質の早急な開発が望まれている。
【０００４】
ＰＢＰは細菌における細胞壁を構成する構造ユニットであるムレインモノマーを基質として細胞壁ペプチドグリカンを組み立てる一連の酵素群である。このＰＢＰは細菌のペプチドグリカンの重合および架橋反応に働く、膜結合型のタンパク質である。肺炎連鎖球菌には６種類のＰＢＰが確認されているが、ペニシリン中等度耐性肺炎連鎖球菌（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＰＩＳＰ）およびＰＲＳＰでは、主に３種類のＰＢＰ（ＰＢＰ１Ａ、ＰＢＰ２Ｘ、ＰＢＰ２Ｂ）に対するβ−ラクタム薬の親和性が低下している。ＰＢＰはβ−ラクタム薬のターゲットであり、細菌はＰＢＰの酵素活性が阻害されると生育不可能となることが知られている［Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，  ４６（１０），  ｐ．３２６１−４，  ２００２（非特許文献４）］。
【０００５】
これらＰＢＰの変異は、ＰＳＳＰのＰＢＰ遺伝子が外来性、主に口腔内連鎖球菌のＰＢＰ遺伝子の一部とモザイク状に相同性組換えが起こり生じていることが報告されている［Ｄｏｗｓｏｎ  Ｃ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ８７（１５），  ｐ．５８５８−６２，  １９９０（非特許文献５）］。このモザイク状の遺伝子（モザイク遺伝子）挿入により生じたＰＢＰのアミノ酸変異全てが薬剤の親和性、すなわち耐性化に関与しているわけではない。その理由としては、薬剤耐性となった肺炎連鎖球菌のＰＢＰ遺伝子上のモザイク遺伝子領域は、その領域に相当するＰＳＳＰや薬剤感受性口腔内連鎖球菌のＰＢＰ遺伝子と高い相同性を示すからである。すなわち、薬剤耐性はモザイク遺伝子により生じた全てのアミノ酸変異によるものではなく、その一部が関与していると考えられる。したがって、各アミノ酸変異に対する薬剤親和性を定量的に評価することができれば、より耐性に関与するアミノ酸置換、すなわち遺伝子配列が分かり、薬剤耐性菌に対し、治療的に有用な化合物の検定および設計することが可能であることが考えられる。
【０００６】
通常、ＰＢＰは膜結合型タンパク質であり、可溶化は難しく各ＰＢＰを単離、取得するのは困難である。このため、ＰＢＰに対する薬剤親和性評価は、連鎖球菌膜画分を用い、被検薬とＰＢＰに親和性のある標識化合物との競合反応による方法が行なわれている。一般的に、この方法は、タンパク質電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による評価のため多検体を扱うことが難しく、評価に時間が掛かること、各ＰＢＰは分子量が近いものが多く、膜画分を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離では特定のＰＢＰのみを評価することが困難な場合があるなどの問題点がある。
【０００７】
例えば、肺炎連鎖球菌の臨床分離株を用いたＰＢＰに対する薬剤親和性評価として、肺炎連鎖球菌膜画分、すなわち全てのＰＢＰに対する薬剤評価が報告されている［Ｎａｇａｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，  Ｍａｙ，  ４６（５），  ｐ．１２７３−８０，  ２００２（非特許文献６）］。これは、臨床分離株を用いているため目的のＰＢＰ遺伝子に特異的な変異を入れ、特定のアミノ酸配列のみに特異的な変異を起こしているものではない。相同性組換えにより肺炎連鎖球菌のＰＢＰ遺伝子に変異を導入し、目的のＰＢＰの特定なアミノ酸のみに特異的な変異を起こすことはある程度可能である［Ｇｒｅｂｅ  Ｔ．，  Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ  Ｒ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，  Ａｐｒ．，  ４０（４），  ｐ．８２９−３４，  １９９６（非特許文献７）］。
【０００８】
ＰＢＰを薬剤親和性の評価に用いるためには、前述された膜結合型ではなく、可溶性タンパク質にし、単離するのが望ましく、これまでに遺伝子工学的な手法を用いて創出された可溶性ＰＢＰが報告されている［特開平５−３２０１９７号公報（特許文献１）、特表平１０−５１２４３９号公報（特許文献２）、特表２００１−５０２１８０号公報（特許文献３）］。
【０００９】
β−ラクタム薬耐性においては、ＰＢＰ１Ａ、ＰＢＰ２Ｘ、ＰＢＰ２ＢのどのＰＢＰ変異も重要であると考えられるが、ペニシリン系薬剤およびカルバペネム系薬剤の使用において、主にＰＢＰ２Ｂ変異を持った薬剤耐性肺炎連鎖球菌の出現が認められるようになってきた［Ｎａｇａｉ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，  ４６（５），  ｐ．１２７３−８０，  ２００２（非特許文献６）］。また、ＰＢＰ２Ｂは菌の生育に必須なタンパク質であり、この酵素機能を阻害する化合物は菌に対し殺菌的に働くと考えられている［Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．，  Ｓｕｍｍｅｒ，  ５（２），  ｐ．９１−９，  １９９９（非特許文献８）］。このＰＢＰ２Ｂに対し親和性を有する化合物の創出は、細菌感染症、特に肺炎連鎖球菌感染症に対して有用であり、また、ＰＢＰ２Ｂの変異体に対しても親和性を有する化合物は、薬剤耐性菌に対し抗菌作用を発揮し、薬剤耐性菌感染症に対し治療的に有用であると予想される。
【００１０】
【特許文献１】
特開平５−３２０１９７号公報
【特許文献２】
特表平１０−５１２４３９号公報
【特許文献３】
特表２００１−５０２１８０号公報
【非特許文献１】
Ｈａｎｓｍａｎ  Ｄ．，  Ｂｕｌｌｅｎ  Ｍ．Ｍ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ２，  ｐ．２６４−５，  １９６７
【非特許文献２】
Ｊａｃｏｂｓ  Ｍ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，  ４３（８），ｐ．１９０１−８，  １９９９
【非特許文献３】
Ｓａｔｏｈ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋａｎｓｅｎｓｈｏｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，  ７６（４），  ｐ．２５４−６２，  ２００２
【非特許文献４】
Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，  ４６（１０），  ｐ．３２６１−４，  ２００２
【非特許文献５】
Ｄｏｗｓｏｎ  Ｃ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ８７（１５），  ｐ．５８５８−６２，  １９９０
【非特許文献６】
Ｎａｇａｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，  Ｍａｙ，  ４６（５），  ｐ．１２７３−８０，  ２００２
【非特許文献７】
Ｇｒｅｂｅ  Ｔ．，  Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ  Ｒ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，  Ａｐｒ．，  ４０（４），  ｐ．８２９−３４，  １９９６
【非特許文献８】
Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．，  Ｓｕｍｍｅｒ，  ５（２），  ｐ．９１−９，  １９９９
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ＰＢＰ２Ｂ変異を持った薬剤耐性肺炎連鎖球菌に対する、増殖阻止または殺菌作用を示すＰＢＰ２Ｂに親和性を持つ化合物の創出をスクリーニングするための可溶性ＰＢＰ２Ｂはいまだ報告されていない。
可溶性ＰＢＰ２Ｂを創出し、さらにそのアミノ酸配列に特異的な変異を与えた変異体を複数作製すれば、薬剤耐性肺炎連鎖球菌に対して最適な化合物をスクリーニングすることが可能となり、その産業上の価値は計り知れないが、まだそのような可溶性のＰＢＰ２Ｂ変異体およびスクリーニング方法についての報告もない。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、今般、肺炎連鎖球菌由来の野生型ＰＢＰ２Ｂをもとに、膜結合機能を喪失し、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質（可溶性ＰＢＰ２Ｂ）およびその変異体を見出した。
【００１３】
本発明者等は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）のゲノムＤＮＡからＰＢＰ２Ｂを単離し、その膜結合領域を欠失させ、可溶化するＰＢＰ２Ｂを作製することに成功した。トランスペプチダーゼ活性を有するため、可溶性ＰＢＰ２Ｂのペニシリン相互作用領域と相互作用する分子は、野生型ＰＢＰ２Ｂに同様に相互作用できるものと考えられる。したがって、本発明の可溶性ＰＢＰ２Ｂは、可溶型としては単離困難であった膜結合型タンパク質の野生型ＰＢＰ２Ｂと相互作用する化合物の検定に使用する方法を提供するものである。さらに、膜結合タンパク質の野生型ＰＢＰ２Ｂは、結晶化が極めて困難なことも良く知られており、酵素的に活性を保持した可溶性ＰＢＰ２Ｂは結晶化に使用することができる。また、ＰＢＰ２Ｂと親和性を有する化合物のＸ線結晶解析に基づく理論的設計を容易にするタンパク質を提供するものである。
【００１４】
さらに本発明の別の態様では、本発明の可溶性ＰＢＰ２Ｂをコードするポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列に突然変異、人為的変異導入または欠失した変異体を複数提供するものである。トランスペプチダーゼ活性を有する、または化合物がＰＢＰと結合する領域にアミノ酸変異を与えた種々の変異体を用いることで、薬剤耐性菌に対し治療的に有用な化合物の検定が可能であり、各アミノ酸変異に対する薬剤親和性を定量的に評価することができる。また、これにより、薬剤耐性に関与するアミノ酸変異、すなわち遺伝子置換の同定を容易にすることが可能となる。一般的に、薬剤耐性菌に対し治療的に有用な化合物は薬剤感受性菌に対しても治療的に有用であると考えられるため、薬剤耐性菌に対し治療的に有用な化合物の検定および設計をすることが可能となる。このことは、Ｘ線結晶解析により薬剤耐性菌に対し治療的に有用な化合物の設計方法を容易にすることができる。
【００１５】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２Ｂの膜結合機能を喪失させたタンパク質。
（２）以下の（Ａ）および（Ｂ）の特性を有する、（１）に記載のタンパク質。
（Ａ）トランスペプチダーゼ活性を有し、
（Ｂ）膜結合機能を有するＮ末端領域のアミノ酸配列を欠失している。
（３）下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有する相同タンパク質、および
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有する改変タンパク質。
（４）  （３）の（ａ）が、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６からなる群より選択される、（３）に記載のタンパク質。
（５）薬剤親和性を欠くまたは低下した（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質。
（６）ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来である、（１）〜（５）のいずれか一項に記載のタンパク質。
（７）肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来である、（６）に記載のタンパク質。
（８）  （１）〜（７）のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。（９）ＤＮＡであることを特徴とする（８）に記載の、ポリヌクレオチド。
（１０）下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５に示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも８５％の相同性を有する塩基配列からなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（１１）  （１０）（ｉｉ）が、（１０）（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなる、（１０）に記載のポリヌクレオチド。
（１２）（１０）（ｉｉ）が、（１０）（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有する塩基配列からなる、（１０）に記載のポリヌクレオチド。
（１３）ストレプトコッカス属由来である、（８）〜（１２）のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（１４）肺炎連鎖球菌由来である、（１３）に記載のポリヌクレオチド。
（１５）  （８）〜（１３）のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
（１６）  （１５）に記載の組換えベクターにより形質転換された、宿主細胞。
（１７）  （１６）に記載の宿主細胞を培養する工程、および該培養によって得られる宿主細胞もしくはその培養物から（１）〜（７）のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含んでなる、タンパク質の製造方法。
（１８）  （１７）に記載の製造方法で生産されたタンパク質。
（１９）細菌のＰＢＰ２Ｂを結合できる抗体の同定方法において、（１）〜（７）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質を抗体結合アッセイに用い、そのタンパク質に結合する抗体を選択する工程を包含する方法。
（２０）ＰＢＰ２Ｂに結合する化合物の検定方法において、（１）〜（７）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質を化合物と接触させ、ついで上記化合物がＰＢＰ２Ｂに結合するかどうかを検出することからなる方法。
（２１）ＰＢＰ２Ｂに結合する化合物の検定方法において、（１６）に記載の細胞を培養し、上記細胞を溶解させて粗製の細胞抽出物を単離し、上記細胞抽出物をＰＢＰ２Ｂの潜在的インヒビターに暴露し、ＰＢＰ２Ｂと結合することが知られている物質を上記細胞抽出物に導入し、上記物質の非結合分画を除去し、そして細胞抽出物中に残存する上記物質の存在をアッセイすることからなる方法。
（２２）ＰＢＰ２Ｂに結合する化合物の検定方法において、（１）〜（７）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質のポリペプチドを固体支持体上に固定化しＰＢＰ２Ｂの潜在的インヒビターに暴露し、ＰＢＰ２Ｂと結合することが知られている物質を上記の固定化したポリペプチドに暴露し、上記物質の非結合分画を除去し、そして固定化したポリペプチドに結合した上記物質の存在をアッセイすることからなる方法。
（２３）ＰＢＰ２Ｂに結合する化合物の検定方法において、（１）〜（７）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質をＰＢＰ２Ｂの潜在的インヒビターに暴露し、ＰＢＰ２Ｂと結合することが知られている物質を固体支持体上に固定化し、これに上記ポリペプチドを暴露し、固定化物質に結合したポリペプチドの存在をアッセイすることからなる方法。
（２４）ＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼドメインに結合する化合物の検定方法において、（１）〜（７）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質を固体支持体上に固定化させて、該タンパク質のトランスペプチダーゼドメインをＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼ活性の潜在的インヒビターに暴露し、ＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼドメインと結合することが知られている物質を上記の固定化したポリペプチドに暴露し、上記物質の非結合分画を除去し、そして固定化したポリペプチドに結合した上記物質の存在をアッセイすることからなる方法。
（２５）ＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼドメインに結合する化合物の検定方法において、（１）〜（７）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質のトランスペプチダーゼドメインをＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼ活性の潜在的インヒビターに暴露し、ＰＢＰ２Ｂのトランスペプチダーゼドメインと結合することが知られている物質を固体支持体上に固定化し、これに上記ポリペプチドを暴露し、固定化物質に結合したポリペプチドの存在をアッセイすることからなる方法。
（２６）ＰＢＰ２Ｂまたはそのトランスペプチダーゼドメインに結合することが知られている物質がモノクローナル抗体である、（２１）〜（２５）のいずれか一項に記載の方法。
（２７）ＰＢＰ２Ｂまたはそのトランスペプチダーゼドメインに結合することが知られている物質が標識または標識なしの抗生物質化合物およびそれに類似した化合物である、（２１）〜（２５）のいずれか一項に記載の方法。
（２８）ＰＢＰ２Ｂの構造を決定する方法において、（１）〜（７）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質のポリペプチドをＸ線結晶解析に利用することを特徴とする方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
トランスペプチダーゼ活性を有し、膜結合機能を有するＮ末端領域を欠失したＰＢＰ２Ｂの可溶性タンパク質
本明細書において、「トランスペプチダーゼ」とは、細菌細胞壁の一つの成分であるペプチドグリカンの生合成の最終段階に関与し、ペプチドグリカン連鎖を構成しているＮ−アセチルムラミン酸から伸びるポリペプチド鎖の架橋を触媒する酵素を意味する。また「トランスペプチダーゼ活性」とは、上記ポリペプチド鎖を架橋する能力を有し、β−ラクタム薬との結合が可能であることを意味する。「トランスペプチダーゼ活性」は、例えば後述する実施例の方法に従い、放射性ペニシリンを阻害物質として用いれば、これらのトランスペプチダーゼは同定し試験することができる。
【００１７】
本発明のタンパク質は、ストレプトコッカス属、好ましくは肺炎連鎖球菌、より好ましくは肺炎連鎖球菌Ｒ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）またはその変異株由来のタンパク質である。
【００１８】
さらに、本発明のタンパク質は、典型的には、ＰＢＰ２Ｂの膜結合機能を喪失させたタンパク質である。
【００１９】
本発明によれば、ストレプトコッカス属由来の、下記の特性を有するタンパク質が提供される：
（Ａ）トランスペプチダーゼ活性を有し、
（Ｂ）膜結合機能を有するＮ末端領域のアミノ酸配列を欠失している。
【００２０】
ＰＢＰ２Ｂの膜結合機能を有するＮ末端領域（膜結合領域）とは、生体膜を構成するタンパク質のうち、生体膜の内部に埋まっているタンパク質、すなわち膜内在性タンパク質を意味する。その領域を確認するために当業者に自明の方法で行なうことが可能である。例えば、ＳＯＳＵＩプログラム（Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  １４（４），  ｐ．３７８−９，  １９９８）を利用し、野生型ＰＢＰ２Ｂのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列情報をもとに、膜結合領域のアミノ酸残基を推定することができる。しかし、推定した配列が膜結合領域であるとは限らないため、推定した膜結合領域のアミノ酸残基をコードする領域を除いたＰＢＰ２Ｂを単離するため、所望のプライマーを設計し、ＰＣＲ反応によって膜結合領域を欠失したＰＢＰ２Ｂを作成することができる。
【００２１】
膜結合領域を欠失したＰＢＰ２Ｂが可溶性であることは、ＰＢＰ２Ｂを発現させた宿主細胞を適当な緩衝溶液に懸濁、破砕し、遠心により宿主細胞の破砕断片と液層を分離し、ＰＢＰ２Ｂが液層に存在することを確認すれば良い。
【００２２】
また、下記からなる群より選択されるタンパク質が提供される。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有する相同タンパク質、および
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有する改変タンパク質。
【００２３】
本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ３〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２７，  １４３５−１４４１  （１９８５）；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ２４４４−２４４８  （１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ〕においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値を示す。
【００２４】
本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号２のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、「置換、欠失、付加もしくは挿入」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜６個である。
【００２５】
さらに、改変タンパク質には、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列を含んでなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質を包含する。ここで、「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように１個もしくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体的には、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００２６】
本発明の相同タンパク質および改変タンパク質の具体例として、例えば後述する実施例２の方法に準じて行うことができ、例えば配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６からなる群より選択されるタンパク質が挙げられる。
【００２７】
また本発明のタンパク質は、後述のように遺伝子組換え技術により本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主において発現させ、生産されたタンパク質を単離、精製することによっても得ることができる。
【００２８】
トランスペプチダーゼ活性を有し、膜結合機能を有するＮ末端領域を欠失したＰＢＰ２Ｂの可溶性タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明によれば、配列番号２で表わされるアミノ酸配列、その相同タンパク質、および改変タンパク質（以下、単に「本発明のタンパク質」という）をコードするポリヌクレオチドが提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、よって、本発明のタンパク質をコードする種々の塩基配列を選択することができる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれ、ＤＮＡが好ましい。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５に示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも８５％の相同性を有する塩基配列からなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００３０】
前記（ｉ）の塩基配列において、置換、欠失、付加もしくは挿入されてもよい塩基の数は、具体的には１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１８個、さらに好ましくは１〜９個である。
【００３１】
ここで、前記（ｉｉｉ）における「ストリンジェントな条件下」とは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５に示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列を含んでなるプローブと、相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドとがハイブリダイズする程度に制御された条件を意味する。より具体的には、例えば、プローブとして標識化した配列番号１の可溶性ＰＢＰ２Ｂのアミノ酸配列をコードする塩基配列の全長を有するものを用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）の添付の操作方法に従って、４２℃で１時間のプレハイブリダイゼーションの後、前記プローブを添加し、４２℃で１５時間のハイブリダイゼーションを行った後、０．４％ＳＤＳおよび６ｍｏｌ／Ｌ尿素添加０．４倍以下の濃度のＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣ；１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で４２℃にて２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度のＳＳＣで室温にて１０分間の洗浄を２回行うような条件が挙げられる。
【００３２】
本発明によるポリヌクレオチドは、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよく、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。本発明によるポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば肺炎連鎖球菌Ｒ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）のゲノムＤＮＡのライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。
【００３３】
組換えベクターおよび形質転換された宿主
本発明においては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列（以下「本発明によるポリヌクレオチド」という）を、宿主微生物内で複製可能で、かつ、その塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる組換えベクターが提供される。当該組換えベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、当該組換えベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明による組換えベクター構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００３４】
本発明による組換えベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明のタンパク質の他に、その発現を制御する塩基配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御する塩基配列としては、プロモーターおよびターミネーターをコードする塩基配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する塩基配列として得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００３５】
さらに、本発明によれば、当該組換えベクターによって形質転換された宿主微生物が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌、連鎖球菌属に属する菌種などを用いた系、および、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
【００３６】
さらに、この形質転換体を適当な培地で培養し、その宿主細胞又は培養物から前記の本発明のタンパク質を単離して得ることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、前記の本発明のタンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養およびその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
【００３７】
また、本発明における好ましい態様によれば、本発明によるポリヌクレオチドの塩基配列によってコードされる、本発明のタンパク質を発現させ得る大腸菌、連鎖球菌属に属する菌種などが提供される。本発明における連鎖球菌属に属する菌種としては、例えば、肺炎連鎖球菌、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、緑色連鎖球菌、腸球菌などが挙げられ、好ましくは肺炎連鎖球菌である。
【００３８】
可溶性ＰＢＰ２Ｂおよびその変異体の製造方法
本発明のタンパク質は、例えば本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主において発現させ、形質転換体の細胞抽出液を慣用の方法に従い回収し、得られた細胞抽出液中に所望のＰＢＰ２Ｂが含有しているか、例えばＰＢＰに親和性のあるＢｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬ（蛍光標識ベンジルペニシリン，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）の結合試験によって確認することができる。ここで、本発明のタンパク質に付加的ポリペプチド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＧＳＴに実質的に類似したポリペプチド、またはヒスチジン残基に富むポリペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を融合タンパク質として製造することも慣用の技術により可能である。
【００３９】
粗製の細胞抽出物からの可溶性ＰＢＰ２Ｂおよびその変異体の精製方法
ＧＳＴと融合させた本発明のタンパク質は、ＧＳＴとアフィニティーのあるＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製することができる。また、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いることでＧＳＴを切断でき、ＧＳＴを含有する所望のＰＢＰ２ＢからＧＳＴを容易に除くことが可能である。これにより所望のＰＢＰ２Ｂは容易に単離でき、可溶性であるため結晶化しやすいという特徴がある。
さらに具体的には、例えば後述する実施例４に記載の方法により行なうことができる。前記細胞抽出液に所望のＰＢＰ２Ｂが発現されたことを確認した後、反応条件を低温（例えば４℃）に保持し、粗製抽出物を予めリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム担体にバッチ法で結合させる。これを５カラム担体容量のＰＢＳで洗浄する。カラム担体容量と等量の溶出液（１０ｍｍｏｌ／ｌ  還元型グルタチオン、５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス，  ｐＨ８．０）で溶離し、溶出液を５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス，  ｐＨ８．０に一晩透析後、陰イオン交換カラムＰＯＲＯＳ  ＨＱ／２０（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にアプライする。このカラムを５カラム容量の５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス，  ｐＨ８．０で洗浄し、５カラム容量の５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス，  ｐＨ８．０中の０〜１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌの直線勾配液で溶離する。溶離したタンパク質溶液を５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス，  ｐＨ８．０に一晩透析する。このタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＢｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬ結合検定により、粗製細胞抽出液からＰＢＰ２Ｂが上記両カラムに結合することが分かる。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７２，ｐ．２４８−２５４，１９７６］の方法により測定することができる。Ｂｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬ結合を用いる検定は、Ｚｈａｏ  Ｇら［Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，  ４３（５），  ｐ．１１２４−８，  １９９９］の方法により行うことができる。
【００４０】
精製された可溶性ＰＢＰ２Ｂまたはその変異体を用いた酵素アッセイ
９６ウェル付きマイクロタイタープレートをＳＡＧＩＡＮ  Ｃｏｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓロボット（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）に設置し、以下のような反応処理を施し、ペニシリン結合能を解析することができる。被検薬に［３Ｈ］ベンジルペニシリンを加え、混合する。被検薬としては、カルバペネム系抗菌薬であるイミペネム（Ｉｍｉｐｅｎｅｍ）、ビアペネム（Ｂｉａｐｅｎｅｍ）、パニペネム（Ｐａｎｉｐｅｎｅｍ）／ベタミプロン（Ｂｅｔａｍｉｐｒｏｎ）（合剤）、メロペネム（Ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）などが挙げられる。本混合液に、前述の精製された可溶性ＰＢＰ２Ｂまたはその変異体を加え、室温で混合する。次に、反応液中のＰＢＰ２Ｂをエタノールで沈殿させ、ユニフィルターＧＦ／Ｂ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）上に集めて、非結合［３Ｈ］ベンジルペニシリンをエタノールで洗い流し、ユニフィルターＧＦ／Ｂを乾燥させる。乾燥したユニフィルターＧＦ／Ｂにマイクロシンチ２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を加え、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で、フィルター上に存在する放射能の量を測定し、ペニシリン結合能を解析する。なお、被検薬のＰＢＰ２Ｂに対する親和性の強さは［３Ｈ］ベンジルペニシリンとの競合反応の５０％抑制濃度（５０％  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ＩＣ５０）として算出する。
また、別法として、［３Ｈ］ベンジルペニシリンの結合の程度のアッセイにオートラジオグラフィーを使用することができる。上述の方法に基づき、競合アッセイを本発明のタンパク質のトランスペプチダーゼ部位に結合する試験化合物の能力の評価に使用することができる。このアッセイにおいては、［３Ｈ］ベンジルペニシリンと試験化合物の混合液に本発明のタンパク質を反応させる。陽性の結果は、ガラスフィルター上に存在する放射能の量の低下によって判定される。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１．肺炎連鎖球菌由来の可溶性ＰＢＰ２Ｂをコードする遺伝子の構築
（１）肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来のゲノムＤＮＡの単離
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）を血液寒天基礎培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で二酸化炭素５％、３７℃の条件下で１８時間培養し、低速遠心によって集菌した。得られた菌体からＤｎｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付の説明書記載の方法に従って、ゲノムＤＮＡを調製した。
（２）肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来の可溶性ＰＢＰ２Ｂの単離
ＳＯＳＵＩプログラム（Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  １４（４），  ｐ．３７８−９，  １９９８）にて、ＰＢＰ２ＢのＯＲＦの配列情報（ＮＣ＿００３０９８）をもとに、膜結合領域のアミノ酸残基を推定した。推定した膜結合領域のアミノ酸残基をコードする領域を除いたＰＢＰ２Ｂを単離するため、以下のようなプライマーを設計した。
【００４３】
ｗｔ１−Ｎ：５’−ＡＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＣＧＡＡＡＡ−３’  （配列番号１７）  （下線はＢａｍＨＩ認識部位）ｗｔ１−Ｃ：５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＴＣＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＴＴＴＴＧ−３’  （配列番号１８）（下線はＸｈｏＩ認識部位）
【００４４】
実施例１の（１）で単離したゲノムＤＮＡを鋳型に、前記プライマーを用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い行なった。ＰＣＲはＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で実施した。ＰＣＲにて増幅されたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動の結果、約１．９ｋｂのＤＮＡ断片であることを確認した。この断片をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した。このＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断片（約１．９ｋｂ）を、予めＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断したベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。
【００４５】
得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ  ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミド（ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔ）をＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて調製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にてＤＮＡ配列を解析した。この解析の結果、膜結合領域を欠失したＰＢＰ２ＢをコードするＤＮＡ（可溶性ＰＢＰ２Ｂ）であることを、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている野生型のＰＢＰ２Ｂ配列（ＮＣ＿００３０９８）と比較し確認した（配列番号１）。
【００４６】
実施例２．可溶性ＰＢＰ２Ｂおよびそのアミノ酸部位特異的変異体の作製
（１）可溶性ＰＢＰ２Ｂの３９０番目、３９１番目のアミノ酸がＴｈｒ、ＧｌｎからＬｙｓ、Ｌｅｕに置換された変異体
実施例１の（２）で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔを鋳型として、以下のプライマーを用い、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）で、添付の説明書の方法に従い、可溶性ＰＢＰ２ＢをコードするＤＮＡに変異を導入し、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ１を作製した。このプラスミドを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  ＳｅｑｕｅｎｃｅｒにてＤＮＡ配列を解析した（配列番号３）。この解析の結果、可溶性ＰＢＰ２Ｂのアミノ酸配列（配列番号２）の３９０番目、３９１番目のアミノ酸がＴｈｒ、ＧｌｎからＬｙｓ、Ｌｅｕに置換された変異体であることを確認した（配列番号４）。
【００４７】
ｍｔ１−Ｎ：５’−ＴＣＡＡＴＴＣＴＴＧＧＴＡＴＡＡＡＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＣ−３’  （配列番号１９）
ｍｔ１−Ｃ：５’−ＧＡＡＴＧＡＡＣＣＧＴＡＡＧＣＣＡＡＴＴＴＡＴＡＣＣＡＡＧＡＡＴＴＧＡ−３’  （配列番号２０）
（２）可溶性ＰＢＰ２Ｂの４１０番目のアミノ酸がＴｈｒからＡｌａに置換された変異体
実施例１の（２）で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔを鋳型として、下記のプライマーを用い、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）で、添付の説明書の方法に従い、可溶性ＰＢＰ２ＢをコードするＤＮＡに変異を導入し、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ２を作製した。このプラスミドを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  ＳｅｑｕｅｎｃｅｒにてＤＮＡ配列を解析した（配列番号５）。この解析の結果、可溶性ＰＢＰ２Ｂのアミノ酸配列（配列番号２）の４１０番目のアミノ酸がＴｈｒからＡｌａに置換された変異体であることを確認した（配列番号６）。
【００４８】
ｍｔ２−Ｎ：５’−ＧＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＧＣＴＴＡＴＡＴＧＧＴＣＣＡＡＡＣＡＧＣ−３’  （配列番号２１）
ｍｔ２−Ｃ：５’−ＧＣＴＧＴＴＴＧＧＡＣＣＡＴＡＴＡＡＧＣＡＴＴＴＧＡＴＧＡＡＴＡＣＴＣ−３’  （配列番号２２）
【００４９】
（３）可溶性ＰＢＰ２Ｂの５８３番目のアミノ酸がＡｌａからＧｌｙに置換された変異体
実施例１の（２）で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔを鋳型に、下記のプライマーを用い、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）で、添付の説明書の方法に従い、可溶性ＰＢＰ２ＢをコードするＤＮＡに変異を導入し、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ３を作製した。このプラスミドを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  ＳｅｑｕｅｎｃｅｒにてＤＮＡ配列を解析した（配列番号７）。この解析の結果、可溶性ＰＢＰ２Ｂのアミノ酸配列（配列番号２）の５８３番目のアミノ酸がＡｌａからＧｌｙに置換された変異体であることを確認した（配列番号８）。
【００５０】
ｍｔ３−Ｎ：５’−ＧＧＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＡＧＡ−３’  （配列番号２３）
ｍｔ３−Ｃ：５’−ＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＴＴＴＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣ−３’  （配列番号２４）
【００５１】
（４）可溶性ＰＢＰ２Ｂの３９０番目、３９１番目、４１０番目のアミノ酸がＴｈｒ、Ｇｌｎ、ＴｈｒからＬｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａに置換された変異体
実施例２の（１）で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ１を鋳型に、前記のｍｔ２−Ｎとｍｔ２−Ｃの変異導入用プライマーを用い、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）で、添付の説明書の方法に従い、可溶性ＰＢＰ２ＢをコードするＤＮＡに変異を導入し、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ４を作製した。このプラスミドを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  ＳｅｑｕｅｎｃｅｒにてＤＮＡ配列を解析した（配列番号９）。この解析の結果、可溶性ＰＢＰ２Ｂのアミノ酸配列（配列番号３）の４１０番目のアミノ酸がＴｈｒからＡｌａに置換された変異体であることを確認した（配列番号１０）。
【００５２】
（５）可溶性ＰＢＰ２Ｂの３９０番目、３９１番目、５８３番目のアミノ酸がＴｈｒ、Ｇｌｎ、ＡｌａからＬｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙに置換された変異体
実施例２の（１）で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ１を鋳型に、前記のｍｔ３−Ｎとｍｔ３−Ｃの変異導入用プライマーを用い、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）で、添付の説明書の方法に従い、可溶性ＰＢＰ２ＢをコードするＤＮＡに変異を導入し、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ５を作製した。このプラスミドを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  ＳｅｑｕｅｎｃｅｒにてＤＮＡ配列を解析した（配列番号１１）。この解析の結果、可溶性ＰＢＰ２Ｂのアミノ酸配列（配列番号３）の５８３番目のアミノ酸がＡｌａからＧｌｙに置換された変異体であることを確認した（配列番号１２）。
【００５３】
（６）可溶性ＰＢＰ２Ｂの４１０番目、５８３番目のアミノ酸がＴｈｒ、ＡｌａからＡｌａ、Ｇｌｙに置換された変異体
実施例２の（２）で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ２を鋳型に、前記のｍｔ３−Ｎとｍｔ３−Ｃの変異導入用プライマーを用い、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）で、添付の説明書の方法に従い、可溶性ＰＢＰ２ＢをコードするＤＮＡに変異を導入し、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ６を作製した。このプラスミドを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  ＳｅｑｕｅｎｃｅｒにてＤＮＡ配列を解析した（配列番号１３）。この解析の結果、可溶性ＰＢＰ２Ｂのアミノ酸配列（配列番号４）の５８３番目のアミノ酸がＡｌａからＧｌｙに置換された変異体であることを確認した（配列番号１４）。
【００５４】
（７）可溶性ＰＢＰ２Ｂの３９０番目、３９１番目、４１０番目、５８３番目のアミノ酸がＴｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、ＡｌａからＬｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙに置換された変異体
実施例２の（４）で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ４を鋳型に、前記のｍｔ３−Ｎとｍｔ３−Ｃの変異導入用プライマーを用い、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）で、添付の説明書の方法に従い、可溶性ＰＢＰ２ＢをコードするＤＮＡに変異を導入し、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７を作製した。このプラスミドを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  ＳｅｑｕｅｎｃｅｒにてＤＮＡ配列を解析した（配列番号１５）。この解析の結果、可溶性ＰＢＰ２Ｂのアミノ酸配列（配列番号６）の５８３番目のアミノ酸がＡｌａからＧｌｙに置換された変異体であることを確認した（配列番号１６）。
【００５５】
実施例３．可溶性ＰＢＰ２Ｂおよびそのアミノ酸部位特異的変異体の製造方法
実施例１の（２）で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔ、実施例２で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ１〜ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７の組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、得られた各々の形質転換体について以下の反応を行った。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．６に達するまで増殖させ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＩＰＴＧで４時間誘導した。４時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、−８０℃で冷凍保存した。菌体を前記ＬＢ培地の１／５０量の５０ｍｍｏｌ／ｌトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した後、リゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）、プロテアーゼインヒビターカクテル  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を菌体懸濁液５０ｍｌに対し１錠加え、この懸濁液を４℃で３０分間撹拌した。１分間の超音波処理を３回施し、細胞を破砕した。遠心分離（３０分間、１０，０００ｒｐｍ）とそれに続くガラスウールによる上清の濾過によって、超音波処理の残骸を除去し、細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液中に、所望のＰＢＰ２Ｂが含有していることを確認するため、ＰＢＰに親和性のあるＢｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬ（蛍光標識ベンジルペニシリン，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００５６】
実施例４．粗製の細胞抽出物からの可溶性ＰＢＰ２Ｂおよびそのアミノ酸部位特異的変異体の精製方法
以下の精製方法は４℃で行った。粗製抽出物を予めリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム担体にバッチ法で結合させた。これを５カラム担体容量のＰＢＳで３回洗浄した。カラム担体容量と等量の溶出液（１０ｍｍｏｌ／ｌ  還元型グルタチオン、５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス，  ｐＨ８．０）で溶離した。溶出液を５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス，  ｐＨ８．０に一晩透析後、陰イオン交換カラムＰＯＲＯＳ  ＨＱ／２０（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にかけた。このカラムを５カラム容量の５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス，  ｐＨ８．０で洗浄し、５カラム容量の５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス，  ｐＨ８．０中の０〜１ｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウムの直線勾配液で溶離した。溶離したタンパク質溶液を５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス，  ｐＨ８．０に一晩透析した。このタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＢｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬ結合検定により、粗製細胞抽出液から所望とするＰＢＰ２Ｂが上記両カラムに結合することが分かった。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７２，  ｐ．２４８−２５４，  １９７６）により測定した。Ｂｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬ結合を用いる検定は、Ｚｈａｏ  Ｇらの方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，  ４３（５），  ｐ．１１２４−８，  １９９９）に準じて行った。
【００５７】
実施例５．精製された可溶性ＰＢＰ２Ｂおよびそのアミノ酸部位特異的変異体を用いた酵素アッセイ
９６ウェル付きマイクロタイタープレートをＳＡＧＩＡＮ  Ｃｏｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓロボット（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）に設置し、以下のような反応処理を施し、ペニシリン結合能を解析した。被検薬１０μｌに［３Ｈ］ベンジルペニシリン（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ２１．０ｕＣｉ／ｍｍｏｌ）を１０μｌ（０．０５ｕＣｉ相当量）加え、混合する。被検薬としては、カルバペネム系抗菌薬であるイミペネム、ビアペネム、パニペネム／ベタミプロン（合剤）、メロペネムの４種類である。本混合液に、実施例４によって精製された可溶性ＰＢＰ２Ｂまたはそのアミノ酸部位特異的変異体を１０μｌ（３４０ｎｇ相当量）加え、室温で３０分間混合した。次に、反応液中のＰＢＰ２Ｂをエタノール９０μｌで沈殿させ、ユニフィルターＧＦ／Ｂ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）上に集めて、非結合［３Ｈ］ベンジルペニシリンをエタノールで洗い流し、ユニフィルターＧＦ／Ｂを乾燥させた。乾燥したユニフィルターＧＦ／Ｂにマイクロシンチ２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を加え、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で、フィルター上に存在する放射能の量を測定し、ペニシリン結合能を解析した。なお、被検薬のＰＢＰ２Ｂに対する親和性の強さは［３Ｈ］ベンジルペニシリンとの競合反応のＩＣ５０として算出した。その結果を第１表に示す。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
単独変異導入ＰＢＰ２Ｂでは、カルバペネム薬の結合親和性は薬剤間で大きな差は認められなかった。変異未導入ＰＢＰ２Ｂと単独変異導入ＰＢＰ２Ｂに対する親和性に優位な差が認められたのは、イミペネム、ビアペネムにおいては、可溶性ＰＢＰ２Ｂの４１０番目のアミノ酸がＴｈｒからＡｌａに置換された変異体（配列番号６）、パニペネム／ベタミプロン（合剤）、メロペネムにおいては、可溶性ＰＢＰ２Ｂの５８３番目のアミノ酸がＡｌａからＧｌｙに置換された変異体（配列番号８）であった。複数変異導入ＰＢＰ２Ｂにおいては、可溶性ＰＢＰ２Ｂの３９０番目、３９１番目、５８３番目のアミノ酸がＴｈｒ、Ｇｌｎ、ＡｌａからＬｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙのアミノ酸置換された変異体（配列番号１２）、可溶性ＰＢＰ２Ｂの４１０番目、５８３番目のアミノ酸がＴｈｒ、ＡｌａからＡｌａ、Ｇｌｙのアミノ酸置換された変異体（配列番号１４）、および可溶性ＰＢＰ２Ｂの３９０番目、３９１番目、４１０番目、５８３番目のアミノ酸がＴｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、ＡｌａからＬｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙのアミノ酸置換された変異体（配列番号１６）に対する結合親和性は薬剤間で差が認められた。
【００６０】
本結果より、可溶性ＰＢＰ２Ｂのアミノ酸部位特異的変異体の種類、すなわちアミノ酸変異導入箇所の違いにより被検薬の親和性に差があることが分かった。被検薬に対するＰＢＰ２Ｂの親和性が低下したアミノ酸変異導入箇所は、耐性菌におけるＰＢＰ２Ｂの薬剤耐性に関与するアミノ酸であると考えられ、可溶性ＰＢＰ２Ｂのアミノ酸部位特異的変異体に対し高い親和性を示す化合物を検定および設計をすることで、薬剤耐性菌に対し治療的に有用な薬剤の開発が可能であると考えられる。
【００６１】
【発明の効果】
本発明のタンパク質を用いて、ＰＢＰ２Ｂのタンパク質立体構造の解明、その結果をもとにそれらタンパク質に親和性を有する化合物の検定および設計を容易にすることができる。また、本発明を利用し、ＰＢＰ２Ｂに親和性を有する化合物の検定を大量かつ短時間で効率的に実施し、細菌に対し増殖阻止または殺菌作用が期待できる化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【００６２】
【配列表】
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