(57)【要約】【課題】ハイブリダイゼーションの時間を従来技術に比べて大幅に短縮し、且つ再現性の高い解像度を得ることができ、また、ＤＮＡの密度を向上させ、多種多様な診断を可能とした高性能ＤＮＡ分析用アレイと、それを用いたＤＮＡ分析システムおよび分析方法を提供する。【解決手段】直行性をもって貫通されたホールが規則性をもって多数配列された基板の、前記ホールの内面に、被検ＤＮＡに対して特異親和性を持つＤＮＡ断片を固定したＤＮＡ分析用アレイ、およびそれを用いたＤＮＡ分析システムおよび分析方法。【選択図】  図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
直行性をもって貫通されたホールが規則性をもって多数配列された基板の、前記ホールの内面に、被検ＤＮＡに対して特異親和性を持つＤＮＡ断片を固定したことを特徴とするＤＮＡ分析用アレイ。
【請求項２】
異種のＤＮＡ断片が、各ホールまたは各ホール群に対応して固定されている、請求項１のＤＮＡ分析用アレイ。
【請求項３】
前記基板が陽極酸化ポーラスアルミナからなる、請求項１または２のＤＮＡ分析用アレイ。
【請求項４】
前記基板が陽極酸化ポーラスアルミナを鋳型にして作製されたプリント基材あるいはプレス基材を使用して作製されたホールアレイ構造体基板からなる、請求項１または２のＤＮＡ分析用アレイ。
【請求項５】
前記基板の厚さが１０〜５０μｍの範囲内にある、請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ分析用アレイ。
【請求項６】
前記ホールの配列周期が４００ｎｍ〜１μｍの範囲内にある、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分析用アレイ。
【請求項７】
前記ＤＮＡ断片が前記ホールの内面に、壁面への化学吸着、壁面に塗布した高分子との親和力、あるいは壁面または壁面に塗布した高分子との化学結合によって固定されている、請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡ分析用アレイ。
【請求項８】
前記基板の表面に金属が被覆されている、請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ分析用アレイ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡ分析用アレイと、該ＤＮＡ分析用アレイに被検ＤＮＡを含有する溶液が流通された後の被検ＤＮＡとホール内面に固定されたＤＮＡ断片との特異親和性反応を検出する手段とを有することを特徴とするＤＮＡ分析システム。
【請求項１０】
前記検出手段が、蛍光標識された被検ＤＮＡとホール内面に固定されたＤＮＡ断片との特異親和性反応に基づく発光を検出する手段からなる、請求項９のＤＮＡ分析システム。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡ分析用アレイに、被検ＤＮＡを含有する溶液を流通させ、該溶液流通後の被検ＤＮＡとホール内面に固定されたＤＮＡ断片との特異親和性反応を検出することにより、溶液中に含有されていた被検ＤＮＡを特定することを特徴とするＤＮＡ分析方法。
【請求項１２】
被検ＤＮＡを蛍光標識しておき、前記溶液流通後の被検ＤＮＡとホール内面に固定されたＤＮＡ断片との特異親和性反応を、蛍光により検出する、請求項１１のＤＮＡ分析方法。
【請求項１３】
前記溶液を、流速０．１〜１ｍｌ・ｃｍ−２・ｍｉｎ−１にて３〜５分間、ホール内に流す、請求項１１または１２のＤＮＡ分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ分析用アレイおよびそれを用いたＤＮＡ分析システムおよび分析方法に関し、とくに、試料中の被検ＤＮＡを特異親和性ＤＮＡ断片との反応を利用して検出するために、直行性、配列規則性が高く、微細な（たとえば、ナノメーターレベルの）細孔径を持つ貫通ホールが形成された基板に高密度に特異親和性ＤＮＡ断片を配置し、高い精度で効率よくＤＮＡ分析を行うことができるようにした、ＤＮＡ分析用アレイおよびそれを用いたＤＮＡ分析システムおよび分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体関連物質を高密度に並べ、生物学的な特異親和反応を利用して被検物質を検出する方法が広く用いられるようになってきている。その代表例が、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）である。ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法は、配列の分かったＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）  をガラスなどの基板上に数百から数千並べ、それらのプローブＤＮＡと被検試料から調製した標識ＤＮＡ断片（被検ＤＮＡ）との間で特異親和反応（相補的な塩基配列に基づく二重らせん化反応、ハイブリダイゼーション）を行わせることにより、被検試料中にどのようなＤＮＡが含まれているかを検出する方法である。これらの診断で得られた遺伝子発現頻度情報は、病気の原因の解明や診断ばかりでなく、ヒトゲノム解読以後の遺伝子機能の解明にも非常に重要な役割を果たす方法となることが期待されている。
【０００３】
ＤＮＡアレイの作製及び使用工程は、（１）  ＤＮＡ固定基板へのプローブＤＮＡの固定化によるアレイの作製、（２）  被検ＤＮＡとプローブＤＮＡとの間で相補的な相互作用を起こさせるために、プローブＤＮＡと被検ＤＮＡとを適切な温度で一定時間（数時間から十数時間）反応させることによるハイブリダイゼーション操作、（３）  ハイブリダイゼーション後、被検ＤＮＡとアレイ上のプローブＤＮＡとの間で生じた相補的な相互作用によるスポットシグナル（ラジオアイソトープや蛍光色素  （たとえば、非特許文献１）標識した被検ＤＮＡからのシグナル）の位置とシグナル強度などをスキャナー（ＣＣＤカメラ、共焦点あるいは非共焦点レーザー）を用いて検出することにより、あらかじめ調べておいたプローブＤＮＡの塩基配列から被検ＤＮＡの塩基配列を決定する工程に分けられる。これまで（１）のＤＮＡアレイの作製においては様々な技術が開示されているが、（２）  ハイブリダイゼーション実験、（３）  被検ＤＮＡからのシグナルの検出と塩基配列の決定においては、アレイの構造、ＤＮＡの固定化の違いによる反応条件、及びシグナル検出条件を規定したものが多い。
【０００４】
ＤＮＡアレイの作製においては、これまでほとんどのものが、ガラスあるいはシリコン基板の片面を用い、その面上に、多数のＤＮＡを独立に点着させる方法が用いられている（非特許文献２、非特許文献３）。その他に、特許文献１においては、多孔質基板（厚さ１０から５００  μｍ  、口径５μｍ  から２ｍｍ）の細孔の内壁にプローブＤＮＡを固定化することにより、ＤＮＡ固定基板を三次元的に利用する方法が開示されている。また、プローブアレイを球状粒子に固定することにより、固定化面積を増加させている検出用アレイの例もある（特許文献２）。
【０００５】
さらに、代表的なＤＮＡの配列方法は、二つに大別される。一つは、ＤＮＡを固定する基材表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法であり、この方法により、例えば、光によって脱保護できる保護基を持つアミデート試薬と光リソグラフィーによる集積回路作成技術を応用して、基板に２０塩基前後のＤＮＡプローブを１０  ｍｍ２  ／ＤＮＡの密度で合成することができるという報告がある（特許文献３）。もう一つは、あらかじめ調製したＤＮＡ断片を基板表面に固定化する方法であり、ＤＮＡマイクロアレイに付属するスポット装置を用いて、ポリ陽イオンで表面処理した基板表面にスポットとしてＤＮＡ溶液を打ち付け、ＤＮＡ断片の負電荷との静電的な相互作用により固定化する方法（非特許文献４）、あるいは固定するプローブＤＮＡにあらかじめ反応活性基（アミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチン）を導入しておき、基板表面の官能基、あるいは基板表面に塗布した物質との反応により、化学結合を介して固定化される方法（非特許文献５）がある。プローブＤＮＡを点スポットとしてガラス、あるいはシリコン基板上に打っていく液体吐出技術は、プローブＤＮＡ  をサーマルインク・ジェット・ヘッドにより、液体として付着させる方法（特許文献４）やピエゾ・ジェット・ノズルより供給する方法（特許文献５）があり、特許文献６、特許文献７では、プローブ溶液の液体リザーバーと吐出するためのノズルを複数個、二次元的に備えた吐出ヘッドの集合体が基板表面を走査しながらプローブＤＮＡが塗布されていくことにより、基板上に塗布されるプローブ溶液の占める面積が０．０１  （例えば  ０．１μｍ  ×０．１  μｍ）μｍ２〜４０００  （例えば  ２００μｍ  ×２００  μｍ）μｍ２のＤＮＡのスポットが再現性良く作製できることが開示されている。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５，８４３，７６７号公報
【特許文献２】
特開２００２−１８１８１９号公報
【特許文献３】
米国特許５，４２４，１８６号公報
【特許文献４】
特開平１１−１８７９００号公報
【特許文献５】
米国特許５，  ４２４，１８５号公報
【特許文献６】
特開２００２−３１８２３２  号公報
【特許文献７】
特開  ２００３−３５７１１号公報
【非特許文献１】
Ｆｏｄｏｒ，  Ｓ．  Ｐ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５４，  ５５５  （１９９３）
【非特許文献２】
Ｌｏｃｋｈａｒｔ，  Ｄ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １４，  ６５７  （１９９６）
【非特許文献３】
Ｓｃｈｅｎａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７０，  ４６７  （１９９５）
【非特許文献４】
Ｓｃｈｅｎａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７０，  ４６７  （１９９５）
【非特許文献５】
Ｌａｍｔｕｒｅ，  Ｊ．  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２，  ２１２１  （１９９４）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、上記のような従来技術においては、ハイブリダイゼーションの時間が数時間から十数時間と長く、且つ再現性の高い解像度を得ることが未だ困難であり、さらなる改良が望まれている。
【０００８】
そこで本発明の課題は、ハイブリダイゼーションの時間を従来技術に比べて大幅に短縮し、且つ再現性の高い解像度を得ることにある。また、この条件を保ちつつ、例えば個人個人の病気に迅速に対応できるように、ＤＮＡの密度を向上させ、多種多様な診断を可能とした高性能ＤＮＡ分析用アレイと、それを用いたＤＮＡ分析システムおよび分析方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、従来の平板基板上にプローブＤＮＡを固定する方法に対し、直行性、配列規則性が高く、ナノメーターレベルの細孔径を持つ貫通化されたホールが多数形成された基板に、一つ、あるいは複数のホールを組として、違った配列を持つプローブＤＮＡをホール内壁に高密度に固定配置した分析用アレイの作製を考案した。このアレイを用いることで、被検ＤＮＡ溶液を、ホール内を一定時間流すことにより、ハイブリダイゼーションの時間を大幅に短縮することができ、直行性、配列規則性が高い各ホールからの信号は、細孔内を通して発することができることから、解像度良く検出することが可能となる。
【００１０】
すなわち、本発明に係るＤＮＡ分析用アレイは、直行性をもって貫通されたホールが規則性をもって多数配列された基板の、前記ホールの内面に、被検ＤＮＡに対して特異親和性を持つＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）を固定したことを特徴とするものからなる。すなわち、単なる多孔質の基材や、網目状に曲がりくねった管状のホールを有する基材ではなく、直行性をもって貫通された、しかも高い規則性をもって配列された多数のホールを有する基板を使用し、各ホールの内面に、被検ＤＮＡに対して特異親和性を持つＤＮＡ断片を固定したものである。
【００１１】
ＤＮＡ断片の固定の仕方としては、異種のＤＮＡ断片が、各ホールまたは各ホール群に対応して固定されている構成を採用できる。
【００１２】
上記のような基板は、とくに陽極酸化ポーラスアルミナから構成できる。また、この基板は、陽極酸化ポーラスアルミナを鋳型にして作製されたプリント基材あるいはプレス基材を使用して作製されたホールアレイ構造体から構成してもよい。
【００１３】
基板の大きさとしては、５ｍｍ角程度から３ｃｍ角程度が適当である。基板の厚さとしては、たとえば１０〜５０μｍの範囲程度が適当である。また、前記ホールの配列周期としては、４００ｎｍ〜１μｍの範囲程度が適当である。このようにアレイの細孔周期が  ４００  ｎｍから１  μｍの条件は、現在、汎用機器として使われているスキャナー（ＣＣＤカメラ、共焦点あるいは非共焦点レーザー）の分解能の限界に近い値であり、各プローブＤＮＡからのシグナルを得る条件においては、実際に、現在のＤＮＡアレイのシグナル検出法における限界の領域までの高密度化が行えている。
【００１４】
前記ＤＮＡ断片の前記ホールの内面への固定方法としては、壁面への化学吸着、壁面に塗布した高分子との親和力、あるいは壁面または壁面に塗布した高分子との化学結合による方法を採用できる。
【００１５】
また、前記基板の表面に金属を被覆しておくと、特異親和性反応に基づく蛍光観察を行う際に分解能を向上できるようになるので、好ましい。
【００１６】
本発明に係るＤＮＡ分析システムは、上記のようなＤＮＡ分析用アレイと、該ＤＮＡ分析用アレイに被検ＤＮＡを含有する溶液が流通された後の被検ＤＮＡとホール内面に固定されたＤＮＡ断片との特異親和性反応を検出する手段とを有することを特徴とするものからなる。
【００１７】
このＤＮＡ分析システムにおいては、前記検出手段として、蛍光標識された被検ＤＮＡとホール内面に固定されたＤＮＡ断片との特異親和性反応に基づく発光を検出する手段（イメージスキャナー）を使用できる。
【００１８】
本発明に係るＤＮＡ分析方法は、上記のようなＤＮＡ分析用アレイに、被検ＤＮＡを含有する溶液を流通させ、該溶液流通後の被検ＤＮＡとホール内面に固定されたＤＮＡ断片との特異親和性反応を検出することにより、溶液中に含有されていた被検ＤＮＡを特定することを特徴とする方法からなる。
【００１９】
このＤＮＡ分析方法においては、被検ＤＮＡを蛍光標識しておき、前記溶液流通後の被検ＤＮＡとホール内面に固定されたＤＮＡ断片との特異親和性反応を、蛍光により検出することができる。
【００２０】
検出条件としては、前記溶液を、流速０．１〜１ｍｌ・ｃｍ−２・ｍｉｎ−１にて３〜５分間、ホール内に流すことが好ましい。
【００２１】
本発明に係るＤＮＡ分析用アレイにおいては、直行性をもって貫通されたホールが規則性をもって多数配列された基板のホールの内面に、ＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）が固定されるので、ＤＮＡ断片を高密度で配置でき、ホールが直行性をもって貫通されているので、被検ＤＮＡ含有溶液が容易かつ円滑に流通されて良好に特異親和性反応が示され、微細なホールが高規則性をもって配列されているので、高精度の検出および高い分解能が得られる。
【００２２】
従来のナノメータレベルの細孔径を持つ多孔質膜としては、ニュクリポアーポリカーホネ−ト膜（野村マイクロサイエンス社製）や陽極酸化ポーラスアルミナであるＡｎｏｄｉｓｋ膜（Ｗｈａｔｍａｎ社製）などが知られている。しかし、これらの膜をプローブＤＮＡの固定基板として用いた場合、細孔密度および細孔の配列性が低い、細孔の直行性が著しく悪いなどの問題がある。細孔密度および細孔の配列性が低い構造においては、プローブＤＮＡの高密度化を妨げ、細孔の直行性が低い構造においては、各細孔からのシグナル強度の低下、およびハイブリダイゼーション反応の迅速化を妨げてしまう。このことから本発明における、直行性、配列規則性が高い材料を用いることは、ＤＮＡのさらなる高性能化を実現する上で、非常に重要な点である。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明について、望ましい実施の形態および実施例とともに、詳細に説明する。
【００２４】
〔被検ＤＮＡの標識〕
被検ＤＮＡの追跡可能な標識分子としては、例えば蛍光色素、発光色素等が用いられる。使用可能な標識は、Ｃｙ２，  Ｃｙ３，  Ｃｙ５，  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  （ＦＩＴＣ），  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ等の蛍光色素であるが、これに限定されるものではない。これらの標識は、被検ＤＮＡの５’末端に化学修飾により固定される。被検ＤＮＡとしては、１種類の標識だけでなく、２種類以上の標識した被検ＤＮＡを用いて検出を行うことも可能である。ホール内を流す被検ＤＮＡ溶液は、１μＭ  程度に調製されることが最適であるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
〔プローブＤＮＡの固定基板〕
プローブＤＮＡ固定用の基板は、図１に示すような高規則性陽極酸化ポーラスアルミナ１、または高規則性陽極酸化ポーラスアルミナを鋳型にして作製された直行性、配列規則性が高い突起を持ったプリント基材あるいはプレス基材を使用して作製されたホールアレイ構造体を基板に用いる。図１に示す高規則性陽極酸化ポーラスアルミナ１は、アルミニウムの層２上に、バリアー層３を介して、アルミナの高規則性ポーラス構造が形成されている。高規則性陽極酸化ポーラスアルミナは、酸性溶液中における陽極酸化プロセスによって作製される。広範囲に高規則性が保たれる構造を得るには、たとえば、特開平１０−１２１２９２号公報に開示された複数の突起を表面に備えた基板を陽極酸化するアルミニウム基板に圧着することにより、アルミニウム基板表面に窪みを形成し、この窪みを基点として陽極酸化する方法が用いられるのが望ましい。このようにして形成された細孔は、圧着する基板の窪みの間隔、配列で精密に制御され、真円度、細孔径及び間隔の均一性が向上し、様々なサイズのポーラス構造の作製が可能となる。ポーラス構造の底部に位置するバリアー層３をリン酸でウエットエッチングする、または研磨により除去することにより、図２に示すような、貫通化されたホール４を有する構造を得る。高規則性陽極酸化ポーラスアルミナを鋳型にしたホールアレイ構造は、特開平６−２００３７８号公報に示されているポーラスアルミナの細孔をポリマーで充填し、その後、ポーラスアルミナを溶解させることにより作製されるポーラス構造（多数の突起を有する構造と見ることもできる）の鋳型を用いて、電析などによりポーラスアルミナの細孔構造と同一の形状を有する金属多孔体の製造方法を用いるのが望ましい。この方法により作製された多孔体においては、金、銀、ニッケル、銅などの使用が確認されている。
【００２６】
〔プローブＤＮＡの固定化法〕
上記基板に所望するプローブＤＮＡを固定化するための手段は、基材表面へのプローブＤＮＡ、あるいは分子末端が官能基によって修飾されたプローブＤＮＡの化学吸着により固定するもの、基板表面に存在するＯＨ，  ＣＯＯＨ，  ＮＨ２基などの反応活性基を用い、プローブＤＮＡ末端の反応活性基と直接、あるいは間接的に化学結合を形成することにより固定を行う。また、たとえば図３に示すように、ホール内壁面に不溶性高分子６を塗布することにより、高分子とプローブＤＮＡ５との静電相互作用、および化学結合によりプローブＤＮＡ５の固定化を行う。各プローブＤＮＡは、ピエゾ・ジェット・ノズル、あるいはサーマル・インクジェット・ヘットからプローブＤＮＡ溶液を各ホール表面およびホール内に点着させることにより、固定基板に配置する。その後、一定時間待ち、ホール内壁面の相互作用が生じるのを待ち（図３）、余ったプローブＤＮＡを緩衝水溶液で洗浄する。あるいは、化学結合を生じさせるための反応溶液にポーラス基板を浸漬し、一定時間後、基板上の余ったプローブＤＮＡと反応開始物質を洗浄することにより基板に固定される。図４は、シロキサン処理により固定化されたプローブＤＮＡ７を示しており、図５は、チオールの吸着により固定されたプローブＤＮＡ８を示している。
【００２７】
また、アルミナなどの光透過性の良い材料を基材として用いる場合は、ホール内で発生したシグナル（蛍光、発光）が検出器に入るまでに広がってしまい、個々の色素９で標識されたプローブＤＮＡ５から発生するシグナルが重なる可能性が生じる（図６）。図６において、１０は蛍光・発光のシグナル、１１は光の干渉（部分）を示している。そこで図７に示すように、基板表面のホール以外の部分を、光が通りにくい金属などの材料で形成された被覆層１２を設けることにより、各シグナルの分解能を向上させる基板修飾操作を行う。この操作は、プローブＤＮＡ固定後、金属蒸着などによって行う。蒸着角度を大きく採ることにより、ホール内への金属の蒸着は起こらず、プローブＤＮＡへのダメージも生じない。図７における１３は反射光を示している。
【００２８】
〔ハイブリダイゼーション〕
本発明におけるハイブリダイゼーション反応は、通常のハイブリダイゼーション反応に用いられている４５から６５℃前後の恒温状態で行われる。ハイブリダイゼーション用セル１７において、テフロン（デュポン社登録商標）などの材質でできた多孔性（孔径１〜２ｍｍ程度）支持体１７でＤＮＡアレイを固定し（図８）、被検ＤＮＡ溶液が一定流速で、流入口１４から流出口１９に向けて、１回あるいは複数回、プローブＤＮＡが固定された基板１８のホール内を通過する方法により、反応が進行する形体を取る。なお、１５は、シール用Ｏリングを示している。この形体により、プローブＤＮＡと被検ＤＮＡとの接触頻度が増加することから、ハイブリダイゼーション反応の効率が上がり、反応時間の短縮が実現できる。本発明における、流速（０．１から１  ｍｌ・ｃｍ−２・ｍｉｎ  −１）  の条件は、前述したようなアレイの大きさ、厚さ、細孔周期の場合における、汎用機器として用いられるポンプなどにより得られる流速であり、この細孔サイズでより大きな流速を得ることは、基板の耐久性から困難である。これよりも膜厚を小さくすることにより、流速を大きくすることが可能であるが、この値より薄い膜は、取り扱いが困難であり、容易に割れてしまう。また、被検ＤＮＡをプローブＤＮＡが固定されたホール中を流す時間は、検出すべきＤＮＡの条件によって条件を変更することが可能であるが、２２塩基ＤＮＡにおいては、３〜５分間程度の条件が最適である。
【００２９】
〔標識シグナルの検出〕
ハイブリダイゼーション後の標識シグナルの検出は、ＣＣＤカメラ、共焦点あるいは非共焦点レーザーなどのイメージスキャナー装置を用いて行うことができる。たとえば図９に示すように、イメージスキャナー１９を基板１の上部に設置し、違ったプローブＤＮＡが固定された領域からの、該プローブＤＮＡと特異親和性反応を生じた、標識した被検ＤＮＡ２２によるシグナルをレンズ２１を介して検出する。シグナルの検出において、これらのスキャナー装置自身の持つ分解能が問題であるが、これらのどの装置を用いるかによっては、本分析システムにおいては、シグナルの解像度に違いは生じない。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。なお、ここに示す実施例は、本発明の最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【００３１】
実施例１
ＳｉＣモールド（それぞれ５００，  ４００，  ３００  ｎｍの突起周期を持つ）を用いてアルミニウム板（５  ｘ  ５  ｘ  ０．０１４  ｍｍ，  純度９９．９９％）表面に微細な凹凸パターンを転写し、りん酸溶液中で陽極酸化することにより、５００，  ４００，  ３００  ｎｍの細孔周期を持つ高規則性ナノホール構造（図１）を得た。
【００３２】
電解条件：
電解液組成：りん酸  ５．０  ｇ  ／  ｌ
電解電圧  ：２００，  １６０，  １２０  Ｖ  定電圧
電解温度  ：０℃
電解時間  ：６０分
【００３３】
次いで、上記の陽極酸化皮膜を下記の条件でエッチング処理することにより、細孔を貫通孔化した。
エッチング条件：
エッチング溶液組成：りん酸５０  ｇ  ／  ｌ
エッチング溶液温度：３０℃
エッチング時間    ：２０〜３０分
【００３４】
このエッチング処理により、細孔周期  ３００から５００  ｎｍ，  細孔径１５０から２５０  ｎｍを持つ上記の高規則性ナノホール構造を得た。
【００３５】
得られたそれぞれの細孔内壁をポリ−Ｌ−リシンで被覆する操作を行った。ＤＮＡの固定化は、ポリ−Ｌ−リシンの持つ正電荷とＤＮＡの持つ負電荷の静電的相互作用に基づく。ポリ−Ｌ−リシンの被覆には、０．００５  ｗｔ％ポリ−Ｌ−リシン／エタノール溶液を用い、基板表面にポリ−Ｌ−リシン溶液を滴下し（１０  ｍｌ）、１０分間乾燥させ、またポリ−Ｌ−リシン溶液を滴下して、乾燥させる操作を１０回繰り返すことにより行った。その後、基板表面にあるポリ−Ｌ−リシンを除去するために、表面をイオンミリングした。
【００３６】
各細孔からのシグナルの分解能を確認するために、蛍光色素で標識したＤＮＡをポリ−Ｌ−リシンを利用して固定し、蛍光観察を行った。用いたＤＮＡは、５’末端に蛍光色素Ｃｙ３を有する２２塩基（５’−ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＣＴＡ−３’）の一本鎖合成ＤＮＡである。用いた蛍光顕微鏡システムは、Ｕ−ＭＷＩＧ２，  ＵＰｌａｎＡｐｏ  ／  １００  ｘ  ／  ＮＡ  ＝１．３５  ／  Ｏｉｌである。固定化法は、１μＭ  の蛍光標識したＤＮＡ溶液中に基板を３０分浸漬した後、水で洗浄することにより行った。５００，  ４００，  ３００  ｎｍの細孔周期における基板の表面ＳＥＭ像を図１０（ａ）、（ｂ）、（ｃ）にそれぞれ示す。これらを蛍光観察した結果、５００ｎｍ  および４００ｎｍ  周期の細孔からの蛍光シグナルは、分解能を十分持って観察できたが、３００ｎｍ  細孔周期からのシグナルは、各細孔からのシグナルが重なり合ってしまい、検出限界の細孔径であることが分かった。
【００３７】
実施例２
実施例１と同条件において作製した５００  ｎｍ細孔周期の基板（細孔径２００  ｎｍ）、ニュクリポアーポリカーホネ−ト膜（細孔径  ２００  ｎｍ）およびＡｎｏｄｉｓｋ  （細孔径  ２００  ｎｍ）の内壁にポリ−Ｌ−リシンで蛍光色素で標識したＤＮＡを固定し、蛍光観察を行うことにより、各細孔からのシグナル強度の比較を行った。各スポットの蛍光強度（相対値）の平均値、スポットの蛍光強度の変動係数ＣＶ％（Ｎ＝５）を求めた（表１）。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
表１に示した結果から分かるように、本発明で用いる直行性、配列規則性が高い構造の基板は、各ホールからのシグナル検出が高い感度で行えることがわかる。
【００４０】
実施例３
実施例１と同条件において作製した５００ｎｍ  細孔周期の基板（細孔径２００ｎｍ）に、０．００５  ｗｔ％ポリ−Ｌ−リシン／エタノール溶液を用いて、細孔内壁にポリ−Ｌ−リシンを被覆した。その後、ピリジン（１０％）−ジメチルホルムアミド（９０％）の溶液に０．２％  （ｗ  ／ｖ）１，４−フェニレンジイソシアネ−ト（ＰＤＩＴＣ）を溶解した溶液に固定基板を１時間、室温で浸漬し、洗浄後、５’末端をＣｙ３標識、３’末端をアミノ化したＤＮＡの１μＭ  溶液に浸漬することにより、ＤＮＡをポリ−Ｌ−リシンに化学結合により固定した（Ａｎｄｒｅｗ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ６９  ４９４８  （１９９７））。ＤＮＡの塩基配列は、実施例１のものと同様である。蛍光顕微鏡により、各細孔からのシグナルの強度と分解能を評価した。
【００４１】
実施例４
実施例１と同条件において作製した５００  ｎｍ細孔周期の基板（細孔径２００ｎｍ）を鋳型にして作製した金の高規則性ホールアレイ構造（特開平６−２００３７８号公報）に０．００５  ｗｔ％ポリ−Ｌ−リシン／エタノール溶液を用いて、細孔内壁にポリ−Ｌ−リシンを被覆した。１μＭ  の蛍光標識したＤＮＡ溶液中に基板を３０分浸漬した後、水で洗浄することによりＤＮＡの固定化を行った。ＤＮＡは、実施例１と同様のものを用いた。蛍光顕微鏡により、各細孔からのシグナルの強度と分解能を評価した。
【００４２】
実施例５
実施例４で作製した金の高規則性ホールアレイ構造に実施例３と同様の固定化法を施すことにより、金のホール内壁のポリ−Ｌ−リシンにＤＮＡを固定したアレイを作製した。蛍光顕微鏡により、各細孔からのシグナルの強度と分解能を評価した。
【００４３】
実施例６
実施例４で作製した金の高規則性ホールアレイ構造に５’末端をＣｙ３標識、３’末端をチオール化したＤＮＡを固定化した。固定化法は、１μＭ  の蛍光標識したＤＮＡ溶液中に基板を３０分浸漬した後、水で洗浄することにより行った。ＤＮＡの塩基配列は、実施例１のものと同様である。蛍光顕微鏡により、各細孔からのシグナルの強度と分解能を評価した。
【００４４】
実施例７
実施例１と同条件において作製した陽極酸化ポーラスアルミナ（細孔周期  ５００  ｎｍ，細孔径２００  ｎｍ）基板を１μＭ  の蛍光標識したＤＮＡ溶液中に３０分浸漬した後、水で洗浄することによりホール内壁面にＤＮＡを吸着させた。ＤＮＡは、実施例１と同様のものを用いた。蛍光顕微鏡により、各細孔からのシグナルの強度と分解能を評価した。これら実施例の評価結果を表２に示す。
【００４５】
【表２】
2004286579.tif 000004
【００４６】
実施例３から６と実施例７の比較から分かるように、ホール内へのＤＮＡの固定化操作により蛍光強度が大きく増加していることがわかり、この操作によりホール内へのプローブＤＮＡの固定化量が増加することが分かる。また、実施例３、５と実施例４、６の比較により、ポリ−Ｌ−  リシンに化学結合を用いてＤＮＡを固定化することにより、ＤＮＡがより多くホール内に固定化されることも分かる。固定基板の材質による蛍光強度の違いは、金基材への固定の場合は、アルミナへの固定に比べて、蛍光の消失（または、失活）が起こりやすいことによる。すべての実施例における、各蛍光スポットは、十分な分解能を持って観察された。
【００４７】
実施例８
実施例１と同条件において作製したＤＮＡ固定基板を作製し、蛍光スポットの中心、及び蛍光スポット間の中間の位置での蛍光強度（相対値）の平均値、蛍光強度の変動係数ＣＶ％（Ｎ＝５）を求めた。ＤＮＡは、実施例１と同様のものを用いた。蛍光スポットの中心の位置での蛍光強度、及び蛍光スポット間の中間の位置での蛍光強度（バックグランド強度）を比較することにより、各蛍光スポットの見えやすさを評価した。
【００４８】
実施例９
実施例１と同条件において作製したＤＮＡ固定基板表面に金蒸着装置を用いて金のコーティング（厚さ１μｍ  程度）を行った。ＤＮＡは、実施例１と同様のものを用いた。蛍光顕微鏡により、ＤＮＡ固定基板からの蛍光強度を測定し、蛍光スポットの中心、及び蛍光スポット間の中間の位置での蛍光強度（相対値）の平均値、蛍光強度の変動係数ＣＶ％（Ｎ＝５）を求めた。これら実施例の評価結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
2004286579.tif 000005
【００５０】
表３の結果より、基板表面部分を金などの光を透過しにくい、材料で被覆することにより、蛍光スポットとバックグラウンド蛍光の強度差が大きくなることにより、蛍光シグナルが分解能良く、高感度に検出することができることを確認した。
【００５１】
実施例１０
実施例１で作製した陽極酸化ポーラスアルミナの高規則性ホールアレイ構造内に、同条件によりポリ−Ｌ−リシンを被覆し、プローブＤＮＡ１（２２塩基（５’−ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＣＴＡ−３’）の一本鎖合成ＤＮＡ）  を固定化した。被検ＤＮＡ１（２２塩基（５’−ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＧＡＴ−３’）  ，  ５’末端Ｃｙ３標識の一本鎖合成ＤＮＡ）  の溶液（１μＭ，  ０．５  ｍｌ）を０．１  ｍｌ・ｃｍ−２・ｍｉｎ−１の流速で、５分間流すことによりハイブリダイゼーションを行わせた。蛍光顕微鏡により、各細孔からのシグナルの強度と分解能を評価した。
【００５２】
実施例１１
実施例１で作製した陽極酸化ポーラスアルミナの高規則性ホールアレイ構造内に、同条件によりポリ−Ｌ−リシンを被覆し、プローブＤＮＡ１（２２塩基（５’−ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＣＴＡ−３’）の一本鎖合成ＤＮＡ）  を固定化した。被検ＤＮＡ２（２２塩基（５’−ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＣＴＡ−３’）  ，  ５’末端Ｃｙ３標識の一本鎖合成ＤＮＡ）  の溶液（１μＭ，  ０．５  ｍｌ）を０．１  ｍｌ・ｃｍ−２・ｍｉｎ  −１の流速で、５分間流すことによりハイブリダイゼーションを行わせた。蛍光顕微鏡により、各細孔からのシグナルの強度と分解能を評価した。
【００５３】
実施例１２
実施例１で作製した陽極酸化ポーラスアルミナの高規則性ホールアレイ構造内に、同条件によりポリ−Ｌ−リシンを被覆し、プローブＤＮＡ２（２２塩基（５’−ＴＡＧ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＣＡＡ−３’）の一本鎖合成ＤＮＡ）  を固定化した。被検ＤＮＡ１（２２塩基（５’−ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＧＡＴ−３’）  ，  ５’末端Ｃｙ３標識の一本鎖合成ＤＮＡ）  の溶液（１μＭ，  ０．５  ｍｌ）を０．１  ｍｌ・ｃｍ−２・ｍｉｎ−１の流速で、５分間流すことによりハイブリダイゼーションを行わせた。蛍光顕微鏡により、各細孔からのシグナルの強度と分解能を評価した。
【００５４】
実施例１３
実施例１で作製した陽極酸化ポーラスアルミナの高規則性ホールアレイ構造内に、同条件によりポリ−Ｌ−リシンを被覆し、プローブＤＮＡ２（２２塩基（５’−  ＴＡＧ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＣＡＡ  −３’）の一本鎖合成ＤＮＡ）  を固定化した。被検ＤＮＡ２（２２塩基（５’−ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＣＴＡ−３’），  ５’末端Ｃｙ３標識の一本鎖合成ＤＮＡ）  の溶液（１μＭ，  ０．５  ｍｌ）を０．１  ｍｌ・ｃｍ−２・ｍｉｎ−１の流速で、５分間流すことによりハイブリダイゼーションを行わせた。蛍光顕微鏡により、各細孔からのシグナルの強度と分解能を評価した。これら実施例の評価結果を表４に示す。
【００５５】
【表４】
2004286579.tif 000006
【００５６】
プローブＤＮＡ１と被検ＤＮＡ１、及びプローブＤＮＡ２と被検ＤＮＡ２は、相補的な塩基配列の関係にある。このことから実施例１０及び１２の結果は、特異的な親和性に基づき、各細孔内に蛍光標識された被検ＤＮＡが保持され、細孔周期に対応した蛍光スポットが観察できることを示している。図１１に実施例１１において観察された蛍光顕微鏡観察結果を示す。
【００５７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の直行性、配列規則性が高い、ナノメータレベルの細孔径を持つホール構造を利用すれば、従来のＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）の１万倍以上に圧縮してＤＮＡを修飾することができ、多種多様な診断が可能である高性能ＤＮＡアレイを提供することができる。一般的にＤＮＡの高密度化の問題として挙げられる高密度化に伴って生じる標識された被検ＤＮＡに対してＤＮＡのプローブＤＮＡの分子数が少ない条件でハイブリダイゼーション反応を行わせることによる解析の定量性の確保の困難さは、長さが十数μｍ  から数十μｍ  の長さのホール内壁面にプローブＤＮＡを大量に固定化することにより、平板基板上において生じる問題は、十分に解決される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における高規則性陽極酸化ポーラスアルミナを示す断面図である。
【図２】プローブＤＮＡ固定基板の斜視図である。
【図３】不溶性高分子を固定基材へのプローブＤＮＡの固定法を示す断面図である。
【図４】アルミナ基材表面へのプローブＤＮＡの固定法を示す断面図である。
【図５】金属基材表面への別のプローブＤＮＡの固定法を示す断面図である。
【図６】プローブＤＮＡからの発光の様子を示す模式図である。
【図７】表面を被覆させたプローブＤＮＡ固定基板の断面図である。
【図８】本発明に係るＤＮＡアレイを使用してハイブリダイゼーションを行うための好ましい例を示す概略構成図である。
【図９】本発明に係るＤＮＡアレイから得られるシグナルを検出するための好ましい例を示す概略構成図である。
【図１０】５００，  ４００，  ３００ｎｍ  細孔周期の固定基板の表面ＳＥＭ像を示す図である。
【図１１】５００  ｎｍの細孔周期の基板に固定されたプローブＤＮＡと被検ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによる蛍光スポットの観察結果を示す図である
【符号の説明】
１  アルミナ
２  アルミニウム
３  バリアー層
４  貫通化ホール
５  プローブＤＮＡ
６  プローブＤＮＡ固定のための不溶性高分子
７  シロキサン処理により固定化されたプローブＤＮＡ
８  チオールの吸着により固定されたプローブＤＮＡ
９  標識色素
１０  蛍光・発光
１１  光の干渉
１２  シグナル分解能向上のための表面被覆層
１３  反射光
１４  被検ＤＮＡ溶液の流入口
１５  Ｏ−リング
１６  ハイブリダイゼーション用セル
１７  プローブＤＮＡを固定した基板支持体
１８  プローブＤＮＡを固定した基板
１９  被検ＤＮＡ溶液の流出口
２０  イメージスキャナー
２１  レンズ
２２  標識した被検ＤＮＡ
【図１】
2004286579.tif 000007
【図２】
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【図３】
2004286579.tif 000009
【図４】
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【図５】
2004286579.tif 000011
【図６】
2004286579.tif 000012
【図７】
2004286579.tif 000013
【図８】
2004286579.tif 000014
【図９】
2004286579.tif 000015
【図１０】
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【図１１】
2004286579.tif 000017