(57)【要約】【課題】  リンホカインのごとき外因性の成長因子、および補助細胞の不存在下でＴ細胞集団のエクス・ビボ(ex vivo)の増殖を選択的に誘導すること。【解決手段】  ａ）Ｔ細胞集団を活性化し；ついでｂ）２７ｋＤ抗原に結合するリガンドでＴ細胞表面の２７ｋD抗原を刺激し、それによって該活性化および刺激工程がＴ細胞の増殖を誘導することを特徴とするＣＤ８+Ｔ細胞集団を誘導して増殖させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を活性化し；ついで
ｂ）２７ｋＤ抗原に結合するリガンドでＴ細胞表面の２７ｋＤ抗原を刺激し、それによって該活性化および刺激工程がＴ細胞の増殖を誘導することを特徴とするＣＤ８+Ｔ細胞集団を誘導して増殖させるエクス・ビボ（ex vivo）方法。
【請求項２】
Ｔ細胞集団を、当該Ｔ細胞と抗-ＣＤ３抗体またはそのフラグメントとを接触させることによって活性化する請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗-ＣＤ３抗体が抗-ヒトＣＤ３モノクローナル抗体である請求項２記載の方法。
【請求項４】
抗-ＣＤ３抗体が表面に結合されている請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｔ細胞集団を、当該Ｔ細胞と抗-ＣＤ２抗体またはそのフラグメントとを接触させることによって活性化する請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｔ細胞集団を、当該Ｔ細胞とプロテインキナーゼＣアクチベーターおよびカルシウムイオノフォアとを接触させることによって活性化する請求項１記載の方法。
【請求項７】
リガンドが、アミノ酸配列：
(Xaa１)ｎ-Gly-Xaa２-Trp-Leu-Xaa３-Xaa４-Asp(Glu)-(Xaa５)ｎ  (配列番号：５)
[式中、Xaa４は存在してもしなくてもよく、Xaa１、Xaa２、Xaa３、Xaa４およびXaa５はいずれかのアミノ酸残基で、ｎ＝０-２０]
を含む２７ｋＤ抗原に結合する請求項１記載の方法。
【請求項８】
Xaa２がCys、IleまたはLeu、Xaa３がLeuまたはArgであって、存在する場合、Xaa４がArg、ProまたはPheである請求項７記載の方法。
【請求項９】
リガンドがモノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８またはそのフラグメントである請求項１−６いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
さらに、Ｔ細胞と抗原またはその一部分とを接触させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
さらに、
ｃ)リガンドへの連続曝露に応答したＴ細胞の増殖をモニターし；ついで
ｄ)Ｔ細胞の増殖速度が低下した場合に、該Ｔ細胞を再活性化および再刺激して、該Ｔ細胞のさらなる増殖を誘導することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
さらに、工程(ｃ)-(ｄ)を繰り返して、元のＴ細胞集団の約１００倍〜約１００,０００倍の数にＴ細胞集団を増加させることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらに、
(ｃ)モノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８への連続曝露に応答したＴ細胞の増殖をモニターし；ついで
(ｄ)Ｔ細胞の増殖速度が低下した場合に、該Ｔ細胞を抗-ＣＤ３抗体およびモノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８で再刺激して、該Ｔ細胞のさらなる増殖を誘導することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１４】
さらに、工程(ｃ)-(ｄ)を繰り返して、元のＴ細胞集団の約１００倍〜約１００,０００倍の数にＴ細胞集団を増加させることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｔ細胞集団と、
(ａ)該Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体-関連シグナルを刺激する第１剤；および
(ｂ)該Ｔ細胞表面上の２７ｋＤ抗原を刺激する第２剤とを接触させることを特徴とするＣＤ８+Ｔ細胞集団を刺激して増殖させるエクス・ビボ方法。
【請求項１６】
第１剤が抗-ＣＤ３抗体またはそのフラグメントである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗-ＣＤ３抗体が抗-ヒトＣＤ３モノクローナル抗体である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
抗-ＣＤ３抗体が表面上に結合されている請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
第２剤が、アミノ酸配列：
(Xaa１)ｎ-Gly-Xaa２-Trp-Leu-Xaa３-Xaa４-Asp(Glu)-(Xaa５)ｎ  (配列番号：５)
[式中、Xaa４は存在してもしなくてもよく、Xaa１、Xaa２、Xaa３、Xaa４およびXaa５はいずれかのアミノ酸残基で、ｎ＝０-２０]
を含む２７ｋＤ抗原に結合するリガンドである請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
Xaa２がCys、IleまたはLeu、Xaa３がLeuまたはArgであって、存在する場合、Xaa４がArg、ProまたはPheである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
第２剤がモノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８またはそのフラグメントである請求項１５−１９いずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
第１剤および第２剤が表面上に結合されている請求項１５−２１いずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
第１剤および第２剤が同じ表面上に結合されている請求項１５−２１いずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
第１剤および第２剤が表面上に直接的に結合されている請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
第１剤および第２剤が表面上に共有的に結合されている請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２６】
表面が固相表面である請求項２２−２５いずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
固相表面がビーズである請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ビーズが磁性ビーズである請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
イン・ビトロ(in vitro)においてＴ細胞集団を増殖させる技術の開発は、抗原のＴ細胞認識およびＴ細胞活性化の理解における最近の多くの進歩に非常に重要であった。ヒト抗原-特異的Ｔ細胞クローンを発生させる培養方法の開発は、Ｔ細胞により認識される病原菌および腫瘍によって発現される抗原を同定し、種々のヒト疾病を治療する免疫療法を確立するのに有用であった。抗原-特異性Ｔ細胞は、抗-腫瘍反応性を有することが示されているかかるＴ細胞を腫瘍-担持宿主に注入する養子細胞性の免疫療法に用いるためにイン・ビトロ(in vitro)で増殖させことができる。養子免疫療法は、免疫無防備状態の個人におけるウイルス感染症を治療するのにも用いられている。
【０００２】
ヒトＴ細胞をイン・ビトロ(in vitro)で増殖させる技術は、補助細胞、およびＩＬ-２のごとき外因性の成長因子の使用に依存してきた。ＩＬ-２および、Ｔ細胞増殖を刺激する、例えばＣＤ３抗体の使用は、Ｔ細胞のＣＤ８+亜集団を増殖させることが知られている。補助細胞としてのＭＨＣ-適合性抗原提示細胞についての要件は、長期培養系に重大な問題を呈する。抗原提示細胞は比較的短命である。かくして、長期培養系においては、抗原提示細胞が供給原から連続して得られ、かつ補充されなければならない。補助細胞の再生可能な供給の必要性は、補助細胞が影響を及ぼす免疫不全の治療には問題がある。加えて、ウイルス感染症を治療する場合、ウイルスを運び得る補助細胞は、長期培養の間にＴ細胞全集団の汚染を起こし得る。外因性の成長因子および補助細胞が存在しないイン・ビトロ(in vitro)においてヒトＴ細胞をクローン化し、増殖させる別の培養方法は、非常に有利であろう。
【０００３】
本発明は、リンホカインのごとき外因性の成長因子、および補助細胞の不存在下でＴ細胞集団のエクス・ビボ(ex vivo)の増殖を選択的に誘導する方法に関する。加えて、Ｔ細胞増殖は、抗原を必要としないで誘導でき、よって抗原反応性に関してポリクローナルである増殖されたＴ細胞集団が提供される。該方法によって、ＣＤ４＋またはＣＤ８+Ｔ細胞の選択した集団の長期間にわたる持続的な増殖が提供され、元のＴ細胞集団に比して、これらの細胞の数がかなり増殖する。
【０００４】
本発明によれば、Ｔ細胞を活性化し、補助分子に結合するリガンドでＴ細胞表面上の当該補助分子を刺激することによって、Ｔ細胞集団が誘導されて増殖する。Ｔ細胞集団の活性化は、Ｔ細胞と、Ｔ細胞においてＴＣＲ/ＣＤ３複合体-関連シグナルを刺激する第１剤とを接触させることによって成し遂げられる。Ｔ細胞におけるＴＣＲ/ＣＤ３複合体-関連シグナルの刺激は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)/ＣＤ３複合体またはＣＤ２表面蛋白質の連結反応によるか、または受容体がカップリングしたシグナル伝達経路を直接刺激するかのいずれかによって成し遂げられる。かくして、抗-ＣＤ３抗体、抗-ＣＤ２抗体、またはカルシウム・イオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣ・アクチベーターを用いてＴ細胞集団を活性化させる。
【０００５】
増殖を誘導するためには、活性化したＴ細胞集団と、Ｔ細胞表面上の補助分子を刺激する第２剤とを接触させる。例えば、Ｔ細胞表面上のＣＤ２８分子に向けての抗-ＣＤ２８抗体でＣＤ４＋Ｔ細胞集団を刺激して、増殖させることができる。ＣＤ８+Ｔ細胞集団の増殖は、活性化Ｔ細胞に存在する約２７ｋＤの分子量を有する補助分子に結合するモノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８を使用することによって成し遂げられる。別法として、活性化Ｔ細胞集団の増殖は、ＣＤ２８のごとき補助分子の連結反応から起こる１またはそれを超える細胞内シグナルの刺激によっても誘導できる。
【０００６】
Ｔ細胞表面上の補助分子を活性化および刺激した後に、リガンドその他細胞内で作用して補助分子によって媒介される経路を刺激する剤への連続した暴露に反応してのＴ細胞の増殖の進展がモニターされる。Ｔ細胞の増殖速度が低下した場合には、さらなる抗-ＣＤ３抗体および同時刺激リガンドによるなどしてＴ細胞を再活性化し、再刺激してさらなる増殖を誘導する。１つの具体例において、Ｔ細胞の増殖速度は、細胞サイズを測定することによってモニターされる。別法として、Ｂ７-１またはＢ７-２のごときリガンドまたは他の剤への暴露に反応しての細胞表面分子の発現につきアッセイすることによっても、Ｔ細胞増殖がモニターされる。Ｔ細胞のモニターおよび再刺激を増殖の持続のために繰り返して、元のＴ細胞集団の約１００〜約１００,０００-倍の数までＴ細胞集団を増大させることができる。
【０００７】
本発明の方法を用いて、感染疾病またはガンを治療するのに用いる選抜したＴ細胞集団を増殖させることができる。得られたＴ細胞集団は、遺伝子的に形質導入して免疫療法に用いることができるか、またはＨＩＶのごとき感染性病原体のイン・ビトロ(in vitro)分析に用いることができる。ＨＩＶに感染した個人から得たＣＤ４＋細胞集団の増殖が達成でき、該細胞はＨＩＶ感染に抵抗性となった。Ｔ細胞を十分な数まで増殖させた後に、増殖したＴ細胞を個人に戻す。同様にして、ガンに悩まされる個人から腫瘍-侵潤性のリンパ球集団を得、Ｔ細胞を刺激して十分な数に増殖させ、該個人に戻す。加えて、本発明の方法により増殖させたＴ細胞の培養物からの上清は、サイトカインに富む供給原であり、イン・ビボ(in vivo)またはエクス・ビボ(ex vivo)でＴ細胞を維持するのに用いることができる。
【０００８】
本発明の方法によると、外因性の成長因子または補助細胞がなくてもＴ細胞集団を選択的刺激して、イン・ビトロ(in vitro)で多数に増殖させ、増殖することができる。Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)/ＣＤ３複合体と、抗原-提示細胞上の主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)クラスＩまたはクラスIIのいずれかと連結して提示された抗原との間の相互作用により、抗原-特異的Ｔ細胞活性化と呼ばれる一連の生化学的事象が開始される。本明細書で用いる「Ｔ細胞活性化」なる語は、必ずしも蛋白質抗原との相互作用によることなく、ＴＣＲ/ＣＤ３複合体を介するごとき一次シグナルによってＴ細胞応答が開始されたか、または活性化された状態と定義される。Ｔ細胞による免疫応答を開始する一次シグナル伝達事象を受けた場合に、該Ｔ細胞が活性化される。
【０００９】
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ/ＣＤ３複合体を刺激するか、またはＣＤ２表面蛋白質の刺激を介することによって成し遂げることができる。抗-ＣＤ３モノクローナル抗体を用いることにより、ＴＣＲ/ＣＤ３複合体を介してＴ細胞集団を活性化できる。多数の抗-ヒトＣＤ３モノクローナル抗体が販売されているが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection）から入手したハイブリドーマ細胞から調製したＯＫＴ３、またはモノクローナル抗体Ｇ１９-４が好ましい。同様に、抗-ＣＤ２抗体の結合によってもＴ細胞が活性化されるであろう。刺激型の抗-ＣＤ２抗体は公知であり入手可能である。抗-ＣＤ２抗体でのＣＤ２を介した刺激は、典型的に、少なくとも２種の異なった抗-ＣＤ２抗体を組み合わせて用いることによって成し遂げられる。記載された抗-ＣＤ２抗体の刺激性の組合せには以下のものが含まれる：Ｔ１１.１もしくはＴ１１.２抗体と組み合わせたＴ１１.３抗体(ミューアー,エス・シイ(Ｍeuer,Ｓ.Ｃ.)ら(１９８４年)セル(Ｃell)第３６巻:８９７-９０６頁)および９-１抗体と組み合わせた(Ｔ１１.１として同一のエピトープを認識する)９.６抗体(ヤン,エス・ワイ(Ｙang,Ｓ.Ｙ.)ら(１９８６年)ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ.Ｉmmunol.)第１３７巻：１０９７-１１００頁)。また、前記したいずれかの抗体と同一のエピトープに結合する他の抗体も用いることができる。さらなる抗体または抗体の組み合わせは、標準的な技術によって調製でき、同定できる。
【００１０】
一次活性化シグナルは、(例えば、ミリスチン酸ホルボール酢酸のような)ホルボールエステルのごときプロテイン・キナーゼＣ(ＰＫＣ)アクチベーターと(例えば、細胞質カルシウム濃度を上昇させるイオノマイシンのような)カルシウム・イオノフォアとを組合せて使用することによってもＴ細胞に伝達できる。これらの剤の使用はＴＣＲ/ＣＤ３複合体を迂回するが、Ｔ細胞に刺激性シグナルを伝達する。これらの剤は、Ｔ細胞に相乗作用を発揮してＴ細胞活性化を促進することも知られており、抗原なしで用いても、Ｔ細胞へ一次活性化シグナルを伝達できる。
【００１１】
ＴＣＲ/ＣＤ３複合体またはＣＤ２分子の刺激にはＴ細胞に一次活性化シグナルが伝達されることが必要であるが、補助分子または同時刺激分子と呼ばれるＴ細胞表面上の多数の分子が、休止Ｔ細胞から芽球化への転移、ならびに続く増殖および分化を調節するのに関与している。従って、ＴＣＲ/ＣＤ３複合体を介して供される一次活性化シグナルに加えて、Ｔ細胞応答の誘導には二次の同時刺激シグナルが必要である。かかる同時刺激分子または補助分子の１つであるＣＤ２８は、ＴＣＲ複合体によって刺激されるものとは区別されるシグナル伝達経路を開始させ、または調節すると考えられている。
【００１２】
従って、外因性の成長因子または補助細胞なしに、活性化Ｔ細胞集団を誘導して増殖させる(すなわち、一次活性化シグナルを受けたＴ細胞集団)ためには、補助分子に結合するリガンドまたは細胞内で作用する剤で、または、補助分子の結合によって媒介されるＴ細胞のシグナルを刺激するように細胞内え作用する剤で、ＣＤ２８のごときＴ細胞表面上の補助分子を刺激する。１つの具体例において、活性化Ｔ細胞集団とＣＤ２８に結合するリガンドとを接触させることにより補助分子ＣＤ２８の刺激が成し遂げられる。例えば、抗-ＣＤ３抗体でのＴ細胞の活性化およびＣＤ２８補助分子の刺激により、ＣＤ４＋Ｔ細胞の選択的増殖が起こる。ＣＤ２８分子を架橋させることができる抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体もしくはその断片、またはＣＤ２８についての天然リガンド(例えば、Ｂ７-１(ＣＤ８０)およびＢ７-２(ＣＤ８６)のごときＢ７蛋白質ファミリーのメンバー(フリードマン,エイ・エス(Ｆreedman,Ａ.Ｓ.)ら(１９８７年)ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ.Ｉmmunol.)第１３７巻：３２６０-３２６７頁；フリードマン,ジイ・ジェイ(Ｆreedman,Ｇ.Ｊ.)ら(１９８９年)ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ.Ｉmmunol.)第１４３巻：２７１４-２７２２頁；フリードマン,ジイ・ジェイ(Ｆreedman,Ｇ.Ｊ.)ら(１９９１年)ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(Ｊ.Ｅxp.Ｍed.)第１７４巻：６２５-６３１頁；フリードマン，ジイ・ジェイ(Ｆreedman,Ｇ.Ｊ.)ら(１９９３年)サイエンス(Ｓcience)第２６２巻：９０９-９１１頁;アズマ,エム(Ａzuma,Ｍ.)ら(１９９３年)ネイチャー(Ｎature)第３６６巻：７６-７９頁；フリードマン,ジイ・ジェイ(Ｆreedman,Ｇ.Ｊ.)ら(１９９３年)ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(Ｊ.Ｅxp.Ｍed.)第１７８巻：２１８５-２１９２頁))を用いてＣＤ２８分子の刺激を誘導することができる。加えて、天然のもの、または化学的もしくは組換え技術によって合成したものであるかを問わず、天然リガンドの結合性相同物も本発明により用いることができる。補助分子を刺激するのに有用なリガンドは、本明細書で記載するごとく溶液形態にて、または固相表面上に固定化して用いることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を刺激するのに有用な抗-ＣＤ２８抗体またはその断片には、ＩgＧ２a抗体であるモノクローナル抗体９.３(ワイオミング州、シアトル(Ｓeattle,ＷＡ)のブリストル・マイヤーズ・スクイブ・コーポレイション(Ｂristol Ｍyers Ｓquibb Ｃorporation)社のジェフェリー・レッドベター博士(Ｄr.Ｊeffery Ｌedbetter))、ＩgＧ１抗体であるモノクローナル抗体ＫＯＬＴ-２、ＩgＧ１抗体である１５Ｅ８、ＩgＭ抗体である２４８.２３.２およびＩgＧ２a抗体であるＥＸ５.３Ｄ１０が含まれる。
【００１３】
好ましい抗-ＣＤ２８抗体はモノクローナル抗体９.３またはＥＸ５.３Ｄ１０である。該ＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体は、ヒトＣＤ２８遺伝子でトランスフェクトしたＣＨＯ(チャイニーズ・ハムスター卵巣)細胞(ＣＨＯ-ｈｈと命名)で免疫したＢalb/cマウスに由来するものであった。ジャーカット(Ｊurkat)＃７と命名したジャーカット(ヒトＴ細胞性白血病)ＣＤ２８トランスフェクト体に対する全細胞ＥＬＩＳＡスクリーニングによって、ハイブリドーマを融合物から選抜した。ＣＤ２８とＥＸ５.３Ｄ１０との反応性は、蛍光活性化細胞ソーター分析法(ＦＡＣＳ)による分析によってさらに確認し、その分析ではそれをモノクローナル抗体９.３と並べて試験した(図６)。未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞に結合した抗体およびそれらの結合特性は、いずれも、２種のＣＤ２８トランスフェクト体系、ＣＨＯ-ｈｈおよびジャーカット(Ｊurkat)＃７、ならびに正常なヒト末梢血液リンパ球とは到底同一ではない。モノクローナル抗体ＥＸ５.３Ｄ１０を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１３７３で１９９３年６月４日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。
【００１４】
本発明のもう１つの具体例において、ＣＤ２８のごとき補助分子の結合によって媒介されるＴ細胞のシグナルを細胞内で刺激するように作用する剤とＴ細胞とを接触させることによって、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を刺激して増殖させる。本明細書で用いる「剤」なる語は、Ｔ細胞表面受容体と同時刺激分子もしくは他のリガンドとの間の相互作用を必要としないで、Ｔ細胞における同時刺激シグナルまたは他のシグナルを刺激する化学品および他の医薬化合物を包含することを意図している。例えば、剤は細胞内で作用してＣＤ２８連結反応に関連するシグナルを刺激することができる。１つの具体例において、剤は非-蛋白質性化合物である。本法に用いる剤は天然受容体：リガンド刺激機構を迂回することを意図しているため、剤なる語は天然リガンドを発現する細胞を包含させるつもりではない。ＣＤ２８に対する天然リガンドには、Ｂ７-１(ＣＤ８０)およびＢ７-２(ＣＤ８６)のごときＢ７蛋白質ファミリーのメンバーが包含される。
【００１５】
ＣＤ２８受容体刺激がＴ細胞におけるＤ-３ホスホイノシタイドの産生を誘導すること、およびＴ細胞におけるホスファチジルイノシトール ３-キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)の活性阻害が、リンホカイン産生および細胞増殖のごときＴ細胞応答を阻害できることが知られている。蛋白質のチロシンリン酸化も、ＣＤ２８連結反応に際してＴ細胞で起こることも示されており、蛋白質のチロシンキナーゼ阻害剤であるヘルビマイシン(herbimycin)ＡがＣＤ２８-誘導性のＩＬ-２産生を阻害できることが証明されている(バンデンバーグ,ピイ(Ｖandenberghe,Ｐ)ら(１９９２年)ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(Ｊ.Ｅxp.Ｍed.)第１７５巻：９５１-９６０頁；ルウ,ワイ(Ｌu,Ｙ.)ら(１９９２年)ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ.Ｉmmunol.)第１４９巻：２４-２９頁)。従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を選択的に増殖させるために、ＰＩ３ＫのアクチベーターまたはＴ細胞における蛋白質のチロシンリン酸化を刺激する剤、またはその双方とＴ細胞とを接触させることによってＣＤ２８受容体媒介経路を刺激できる。ＰＩ３Ｋのアクチベータは、Ｔ細胞における少なくとも１種のＤ-３ホスホイノシタイドの産生を刺激するその能力に基づいて同定できる。「Ｄ-３ホスホイノシタイド」なる語は、イノシトール環のＤ-３位でリン酸化されたホスファチジルイノシトールの誘導体を含むことを意味し、化合物ホスファチジルイノシトール(３)一リン酸(ＰtdＩns(３)Ｐ)、ホスファチジルイノシトール(３,４)二リン酸(ＰtdＩns(３,４)Ｐ２)、およびホスファチジルイノシトール(３,４,５)三リン酸(ＰtdＩns(３,４,５)Ｐ３)を包含する。従って、ＰＩ３Ｋアクチベーターの存在下では、該物質が存在しないＴ細胞中のＤ-３ホスホイノシタイドの量に比べてＴ細胞中のＤ-３ホスホイノシタイドの量が増加する。Ｔ細胞における(例えば、ＰtdＩns(３)Ｐ、ＰtdＩns(３,４)Ｐ２、および/またはＰtdＩns(３,４,５)Ｐ３のような)Ｄ-３ホスホイノシタイドの産生は、前記に論じたごとく、高速液体クロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィーのごとき標準的な方法によって評価できる。同様にして、例えば、過バナジウム酸のごとき蛋白質のチロシンキナーゼのアクチベーターとＴ細胞を接触させることによって、蛋白質のチロシンリン酸化をＴ細胞において刺激できる(オーシイ,ジェイ・ジェイ(Ｏ'Ｓhea,Ｊ.Ｊ.)ら(１９９２年)プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８９巻：１０３０６-１０３１０１頁；およびセクリスト,ジェイ・ピイ(Ｓecrist,Ｊ.Ｐ.)(１９９３年)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)第２６８巻：５８８６-５８９３頁参照)。別法として、ＣＤ４５のごとき細胞性蛋白質のチロシンホスファターゼの活性を阻害する剤とＴ細胞を接触させて、Ｔ細胞における蛋白質のチロシンリン酸化の正味の量を増加させることもできる。これらのいずれの剤を用いても、本明細書に記載した発明による活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を増殖させることができる。
【００１６】
ＣＤ８+Ｔ細胞集団の増殖および拡範を誘導するためには、活性化Ｔ細胞上に見い出され、モノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８によって認識される２７ｋＤ補助分子を通して活性化Ｔ細胞集団を刺激する。実施例９に記載するごとく、ＣＤ８+Ｔ細胞集団は、抗-ＣＤ３モノクローナル抗体およびＥＳ５.２Ｄ８モノクローナル抗体での刺激によって優勢的に増殖された。モノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８は、活性化ヒト血液リンパ球でマウスを免疫し、イー・コリ(Ｅ.coli)で産生された組換えヒトＣＴＬＡ４蛋白質で追加免疫することによって産生された。ＥＳ５.２Ｄ８モノクローナル抗体は、ＩｇＧ２ｂイソタイプであり、ヒトＣＴＬＡ４でトランスフェクトした細胞に特異的に結合する。ハイブリドーマ生ＣＴＬＡ４-特異的抗体は、ヒトＣＴＬＡ４蛋白質に対するＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングにより、ならびにヒトＣＴＬＡ４遺伝子でトランスフェクトした野生型ＣＨＯ-ＤＧ４４細胞-対-ＣＨＯ-１０５Ａ細胞に対する示差ＦＡＣＳ(differential ＦＡＣＳ)により同定された。図７に示すごとく、ＥＳ５.２Ｄ８クローンがヒトＴ細胞およびＣＨＯ-１０５Ａの双方と強く反応するが、ＣＨＯ-ＤＣＡ４細胞と反応しないことは、それが実際にＣＴＬＡ４に結合することを示している。表面標識した活性化ヒトＴ細胞の活性剤溶解物の免疫沈降により、ＥＳ５.２Ｄ８も２７ｋＤ細胞表面蛋白質と反応することが判明した(図８)。モノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１３７４で１９９３年６月４日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。
【００１７】
かくして、ＣＤ８+Ｔ細胞集団を増殖させるためには、モノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８のごとき抗体、またはＥＳ５.２Ｄ８と同一の２７ｋＤリガンドを認識する他の抗体を用いることができる。実施例１０に記載するごとく、モノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８によって認識されるエピトープは、ファージ・ディスプレー・ライブラリー(phage display library)(ＰＤＬ)をスクリーニングすることによって同定した。モノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８と同一のエピトープに結合する抗体は、本発明の範囲内のものである。かかる抗体は、エピトープを含むペプチド断片または天然２７ｋＤ抗原で免疫することによって産生できる。本明細書で用いる「エピトープ」なる語は、抗体結合部位によって免疫学的に結合される抗原の実際の構造部位をいう。該語は、「抗原決定部位」と相互変換可能に用いられる。ＣＤ８+Ｔ細胞集団を刺激するのに用いる抗体または他のリガンドにより結合される好ましいエピトープには、アミノ酸配列：
(Xaa１)ｎ-Gly-Xaa２-Trp-Leu-Xaa３-Xaa４-Asp(Glu)-(Xaa５)ｎ (配列番号：５)
[式中、Xaa４は存在してもしなくてもよく、Xaa１、Xaa２、Xaa３、Xaa４およびXaa５はいずれかのアミノ酸残基であって、ｎ＝０-２０、さらに好ましくは０-１０、なおさらに好ましくは０-５、最も好ましくは０-３］
が含まれ、または包含される。好ましい具体例において、Xaa２はＣysまたはＩle、Xaa３はＬeuまたはＡrgであって、存在する場合には、Xaa４はＡrgまたはＰroである。典型的には、Xaa１およびXaa４は天然２７ｋＤ蛋白質のコアエピトープのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれか、またはアミノ末端またはカルボキシ末端の両方に見い出される付加アミノ酸残基である。天然蛋白質において、付加非-隣接アミノ酸残基も抗体によって認識される立体エピトープ構造に寄与し得ることは当業者なら理解できるであろう。コアの７個のアミノ酸残基の両側にある他のアミノ酸を含むエピトープを含有する合成ペプチドは創り出すことができる(すなわち、Ｘaaは天然に見い出されるもの以外の他のアミノ酸残基であってもよい)。これらのフランキングアミノ酸残基は、得られるペプチドの特性を、例えば、該得られたペプチドの溶解性の増大、免疫原性の向上または二量体化の促進のように、変化させるように機能できる。ペプチドを免疫原として用いる場合、１またはそれを超えるアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン)は、ペプチドの溶解性の増大および/またはペプチドの免疫原性の向上に関与できる。別法として、システイン残基は、得られるペプチドの二量体化を増大するように関与できる。
【００１８】
本発明の他の具体例は、細胞内で作用して２７ｋＤ蛋白質の連結反応により媒介されたＴ細胞のシグナルを刺激する剤を用いることによってＣＤ８+Ｔ細胞集団を増殖させることに関する。本明細書で用いる「剤」なる語は、Ｔ細胞表面受容体とリガンドとの間の相互作用を必要とすることなくＴ細胞においてシグナルを刺激する化学および他の医薬化合物を包含する。従って、この剤は２７ｋＤ蛋白質の細胞外部分には結合しないが、むしろ、適当なリガンドによる蛋白質の連結反応に関与する細胞内シグナル(例えば、二次メッセンジャー)を模倣または誘導する。本明細書に記載するリガンド(例えば、モノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８)を用いて、２７ｋＤ蛋白質と(実施例に記載するような)適当なリガンドとの接触により媒介されるＴ細胞増殖に関与する細胞内シグナル(群)を同定し、(例えば、蛋白質のチロシンリン酸化、カルシウム流入、セリン/スレオニンおよび/またはチロシンキナーゼの活性化、ホスファチジル イノシトール代謝等のような)起こる結果的な細胞内シグナル伝達を検査することができる。次いで、２７ｋＤ蛋白質と関連する細胞内シグナルを上昇させる剤を用いて、ＣＤ８+Ｔ細胞を増殖させることができる。別法として、実施例に記載するごとき系を用いてＴ細胞増殖を向上させるその能力につき、剤(例えば、小分子、薬剤等)をスクリーニングすることができる。
【００１９】
さらにもう１つの本発明の態様において、抗原特異的Ｔ細胞集団を増殖させる方法が提供される。抗原特異的Ｔ細胞集団を産生させるためには、Ｔ細胞中の一次活化シグナルを誘発するのに適した形態の抗原とＴ細胞とを接触させる。すなわち、シグナルがＴＣＲ/ＣＤ３複合体を介してＴ細胞中で誘発されるように、抗原をＴ細胞に提示させる。例えば、抗原提示細胞によって、抗原をＭＨＣ分子と結合させてＴ細胞に提示できる。Ｂ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞または抗原をＴ細胞に提示できる他の細胞のごとき抗原提示細胞は、該抗原提示細胞が抗原をＴ細胞に提示するように、（例えば、可溶性抗原のような）抗原の存在下でＴ細胞とインキュベートすることができる。別法として、目的の抗原を発現している細胞をＴ細胞とインキュベートすることもできる。例えば、腫瘍-関連抗原を発現している腫瘍細胞をＴ細胞と一緒にインキュベートして、腫瘍-特異反応を誘導することができる。同様に、例えば、ウイルスのような病原菌に感染し、該病原菌の抗原を提示する細胞をＴ細胞とインキュベートすることができる。Ｔ細胞集団の抗原特異性活性化の後に、本発明の方法により該細胞を増殖させることができる。例えば、抗原特異性が確立された後は、本明細書に記載した方法により抗-ＣＤ３抗体および抗-ＣＤ２８抗体と共に培養することによってＴ細胞を増殖させることができる。
【００２０】
本明細書で用いる「抗体」なる語は、イムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＣＤ３、ＣＤ２８のような抗原に特異的に結合する(と免疫反応する)抗原結合部位を含む分子を示す。構造的には、最も単純な天然発生の抗体(例えば、ＩgＧ)は、ジスルフィド結合によって鎖間連結された４本のポリペプチド鎖(２本の重(Ｈ)鎖および２本の軽(Ｌ)鎖)より構成されている。抗体の抗原-結合機能が、天然発生の抗体の断片によっても行えることが示されている。従って、これらの抗原結合断片も、「抗体」なる語によって指定されることを意味している。抗体なる語の範囲内に包含される結合断片の例には、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインよりなるＦab断片；(ii)ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインよりなるＦd断片；(iii)抗体の１本のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインよりなるＦv断片；(iv)ＶＨドメインよりなるdＡb断片(ワード(Ｗard)ら(１９８９年)ネイチャー(Ｎature)第３４１巻：５４４-５４６頁)；(ｖ)単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)；および(vi)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された２本のＦab断片よりなる二価の断片であるＦ(ab')２断片が含まれる。さらに、Ｆv断片の２個のドメインは別々の遺伝子によってコードされているが、それらを単一の蛋白質鎖として作製することができる合成リンカーを組換え技術によって作製することもできる(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られている；バード(Ｂird)ら(１９８８年)サイエンス(Ｓcience)第２４２巻：４２３-４２６頁；およびハストン(Ｈuston)ら(１９８８年)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第８５巻：５８７９-５８８３頁)。かかる一本鎖抗体も「抗体」なる語に包含される。Ｔ細胞増殖に用いる好ましい抗体断片は、例えば、Ｆ(ab')２断片のごとき二価の断片のようなその標的抗原を架橋することができるものである。別法として、それ自体ではその標的抗原を架橋できない(例えば、Ｆab断片のような)抗体断片を、当該抗体断片を架橋するように作用する二次抗体と組み合わせて用いて、それによって標的抗原を架橋することもできる。抗体は、本明細書に記載するような常法を用いて断片化でき、該断片を全抗体で記載したのと同様の効果につきスクリーニングできる。さらに、本発明の抗体は、(例えば、ＣＤ２８のような)所望の結合部位を有する二方特異的分子およびキメラ分子も包含することを意図している。
【００２１】
「エピトープに対する所望の結合特異性」なる言いまわし、ならびに「特異的に結合する(と免疫反応する)抗原結合部位」なるさらに一般的な言いまわしは、例えばＣＤ２８のようなＴ細胞表面分子と特異的に免疫反応する個々の抗体の能力をいう。すなわち、それは、抗体分子とＴ細胞表面分子の抗原決定部位との間の非-ランダムな結合反応をいう。望ましい結合特異性は、典型的には、Ｔ細胞表面分子および無関連性の抗原に異なって結合し、それゆえ、特に２種の抗原がユニークなエピトープを有する場合には、２種の異なった抗原の間を識別する抗体の能力の基準点から判断される。特定のエピトープに特異的に結合する抗体を「特異的抗体」という。
【００２２】
本明細書で用いる「抗体結合部位」とは、抗原に特異的に結合する(と免疫反応する)重鎖および軽鎖の可変領域および超可変領域よりなる抗体分子の構造部位をいう。本明細書でその種々の形態にて用いる「免疫反応する」または「と反応性の」なる語は、抗原決定部位-含有分子と全抗体分子またはその一部分のごとき抗体結合部位を含有する分子との間の結合をいう。
【００２３】
可溶性形態の抗体を用いてＴ細胞を活性化してもよいが、抗-ＣＤ３抗体は(例えば、ビーズのような)固相表面に固定化されているのが好ましい。抗体は、直接的、または二次抗体のようなものによって間接的に、組織培養フラスコまたはビーズのごとき固体表面上に固定化できる。例示的な具体例として、以下の記載が、抗-ＣＤ３抗体をビーズ上に固定化するプロトコールである。(例えば、抗-ＣＤ２８抗体のような)他の抗体またはその断片をビーズ上に固定化するのにも、同一のプロトコールを用いることができることは理解されるべきである。
【００２４】
プロトコール
Ｉ．ＯＫＴ３でのヤギ抗-マウスＩgＧのプレ-吸着
Ａ）バイオマグ(ＢioＭag)ヤギ抗-マウスＩｇＧ(アドバンスト・マグネティクス,インコーポレイテッド(Ａdvanced Ｍagnetics,Ｉnc.)社、カタログ番号８-４３４０Ｄ)を、ＰＢＳ中の５×１０８磁性粒子当たり少なくとも２００μｇのＯＫＴ-３と共に５℃にて１時間インキュベートする。
Ｂ）磁気分離ユニットで援助しつつ、粒子をＰＢＳ中で３回洗浄する。
注記：抗-ヒトＣＤ３に直接結合させたアドバンスト・マグネティックもあり(カタログ番号８-４７０３Ｎ)、それはＴ細胞刺激を誘導するであろう。
【００２５】
II．ＯＫＴ-３でのリンパ球のプレ-標識
Ａ）１×１０６細胞(ＰＢＭＣ)を、１０μｇ/ｍｇのＯＫＴ-３と共にＰＢＳ中で、室温にて１５分間インキュベートする。
Ｂ）細胞をＰＢＳで２回洗浄する。
【００２６】
III．刺激させるためのＰＢＭＣへの磁性粒子の結合
Ａ）静かに撹拌させつつ２０℃にて３０分間インキュベートした後に、ＯＫＴ-３で標識したＰＢＭＣ表面を、細胞１個当たり１個のビーズにて、ヤギ抗-マウスＩgＧ(前記参照)と共に培養する。
Ｂ）すでにＯＫＴ-３に吸着させたヤギ抗-マウスＩｇＧビーズをＰＢＭＣ(１：１)と共に、静かに撹拌しつつ、２０℃にて３０分間インキュベートし、培養する。
【００２７】
IV．分離するためのＰＢＭＣへの磁性粒子の結合
細胞に対するビーズの比を１:１ではなく２０:１に上げる以外は前記(パートIII)と同じである。
【００２８】
本発明の方法を実施するためには、Ｔ細胞原を対象から得る。対象なる語は、例えば哺乳動物のような、免疫反応を誘導できる生きている生物を包含することを意味している。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血液リンパ球、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織および腫瘍を含む多くの供給原から得ることができる。好ましくは、末梢血液白血球はロイコフェレーシス(leukopheresis)によって個人から得る。Ｔ細胞を末梢血液白血球から単離するためには、赤血球細胞を溶解し、例えば、パーコール(PERCOLLＴＭ)勾配を通す遠心によって、単球から末梢血液白血球を分離することが必要となり得る。ＣＤ４＋またはＣＤ８+Ｔ細胞のごとき、特異的なＴ細胞亜集団は、さらにポジティブまたはネガティブ選抜技術によって単離できる。例えば、Ｔ細胞集団のネガティブ選抜は、ネガティブ選抜した細胞にユニークな表面マーカーに向けた抗体を組み合わせて成し遂げることができる。好ましい方法は、ネガティブ選抜した細胞上に提示された細胞表面マーカーに向けたモノクローナル抗体のカクテルを利用するネガティブ磁気免疫付着を介した細胞ソーティングである。例えば、ＣＤ４＋細胞を単離するには、モノクローナル抗体カクテルには、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ-ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体が含まれる。さらなるモノクローナル抗体カクテルを表１に掲載する。
【００２９】
ネガティブ選抜のプロセスにより、実質的に均一なＣＤ４＋またはＣＤ８+Ｔ細胞集団となる。Ｔ細胞は、固相表面に固定化した抗-ＣＤ３抗体または抗-ＣＤ２抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わせた(例えば、ブリオスタチンのような)プロテインキナーゼＣアクチベーターと接触させることによるごとく、本明細書に記載したごとくに活性化できる。Ｔ細胞表面上の補助分子を刺激するためには、該補助分子に結合するリガンドを用いる。例えば、ＣＤ４＋細胞集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗-ＣＤ３抗体および抗-ＣＤ２８抗体と接触させることができる。同様に、ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を刺激するためには、抗-ＣＤ３抗体およびモノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８を用いることができる。Ｔ細胞の培養に適した条件には、(例えば、ウシ胎児血清のような)動物血清および(例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンのような)抗生物質を含む増殖性および生存性に必要な因子を含有していてもよい(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０のような)適当な培地が含まれる。Ｔ細胞は、例えば、適当な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)のような、増殖を支持するのに必要な条件下で維持する。
【００３０】
初期活性化および刺激の後にＴ細胞集団の長期刺激を維持するためには、暴露期間の後に(例えば、抗-ＣＤ３抗体のような)活性化刺激物からＴ細胞を分離することが必要である。Ｔ細胞は、培養期間を通して、同時-刺激リガンドと接触させて維持する。Ｔ細胞の増殖速度は、例えば、コールター・カウンターを用いるなどしてサイズを検査するか、またはＴ細胞の容量を測定することによって、(例えば、毎日)定期的にモニターする。休止Ｔ細胞は、約６.８μｍの平均直径を有する。刺激剤の存在下における初期活性化および刺激の後で、Ｔ細胞平均直径は４日目までに１２μｍ以上に増大し、約６日目までには減少し始めるであろう。平均Ｔ細胞直径が約８μｍまで減少した場合には、Ｔ細胞を再活性化し、再刺激して、Ｔ細胞のさらなる増殖を誘導する。別法として、Ｔ細胞増殖の速度およびＴ細胞再刺激の時間は、活性化Ｔ細胞上に誘導されたＢ７-１、Ｂ７-２のごとき細胞表面分子の存在につきアッセイすることによってもモニターできる。実施例５に記載するごとく、ＣＤ４＋Ｔ細胞は最初はＢ７-１受容体を発現しておらず、培養すると発現が誘導されることが測定された。さらに、Ｂ７-１発現は一時的であることが判明し、繰り返しの抗-ＣＤ３再刺激で再-誘導できた。従って、Ｂ７-１発現の周期変化を、Ｔ細胞増殖性をモニターする手段として用いることができる；初期もしくは以前刺激した後の発現レベルまたは非刺激細胞における発現レベルに比してＢ７-１発現のレベルが低下した場合が、再刺激の時を示している。
【００３１】
ＣＤ４＋またはＣＤ８+Ｔ細胞集団の長期刺激を誘導するためには、抗-ＣＤ３抗体および抗-ＣＤ２８抗体またはモノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８で数回にわたり、Ｔ細胞を再活性化し再刺激して、元のＴ細胞集団の約１０〜約１,０００倍の数まで増加したＣＤ４＋またはＣＤ８+細胞集団を産生させることが必要である。この方法論を用いれば、元の休止Ｔ細胞集団の約１００〜約１００,０００倍まで増加したＴ細胞集団を得ることができる。さらに、実施例６に記載するごとく、本発明の方法によって増殖させたＴ細胞は、培養上清に高レベルのサイトカイン(例えば、ＩＬ-２、ＩＮＦγ、ＩＬ-４、ＧＭ-ＣＳＦおよびＴＮＦα)を分泌する。例えば、ＩＬ-２での刺激に比して、抗-ＣＤ３および抗-ＣＤ２８同時刺激を用いることによって増殖させたＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＧＭ-ＣＳＦおよびＴＮＦαを培養培地に分泌する。これらのサイトカインは、培養上清または細胞を培養に維持するのに直接用いることができる上清から精製することができる。同様に、培養上清およびサイトカインと共に本発明の方法によって増殖させたＴ細胞を投与して、イン・ビボ(in vivo)の細胞増殖を支持することができる。例えば、腫瘍を患う個人においては、該個人からＴ細胞を得、イン・ビトロ(in vitro)で増殖し、得られたＴ細胞集団およびＴＮＦαのごときサイトカインを含有する上清を該個人に再投与して、イン・ビボ(in vivo)でＴ細胞増殖を増大させることができる。
【００３２】
本明細書に記載した方法で用いる抗体は、ＡＴＣＣのごとき公共の供給原から容易に得ることができるが、Ｔ細胞表面補助分子に対する抗体でＣＤ３複合体またはＣＤ２は標準的な技術によって作製することができる。本発明の方法で用いる抗体を生成させる方法論は、以下にさらに詳細に記載する。
【００３３】
Ｉ．抗体産生
Ａ．免疫原  本明細書で用いる「免疫原」なる語は、(例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８のような)抗原に対する抗体の調製に用いる有効成分としてペプチドまたは蛋白質を含有する組成物を示している。抗体を誘導するのにペプチドもしくは蛋白質を用いる場合、該ペプチドは単独、または結合物として担体に結合させるか、あるいはペプチドポリマーとして用いることができることは理解されよう。
【００３４】
適当な抗体を産生させるためには、所望により担体に結合させた結合物であってもよい、有効な免疫原量のペプチドまたは蛋白質が免疫原に含まれていなければならない。ユニット用量当たりのペプチドの有効量は、他のものの中でも、接種する動物種、動物の体重および当該分野でよく知られている選択した免疫様式に依存する。免疫原調製物には、典型的に、免疫用量当たり約１０μg〜約５００ｍｇ、好ましくは免疫用量当たり約５０μｇ〜約５０ｍｇの濃度のペプチドが含まれるであろう。また、免疫調製物には、希釈剤の一部としてアジュバントを含ませることができる。完全フロイント(Ｆreund)アジュバント(ＣＦＡ)、不完全フロイントアジュバント(ＩＦＡ)およびミョウバンのごときアジュバントが、当該分野でよく知られている物質であり、幾つかの供給原から販売されている。
【００３５】
当業者であれば、免疫に(例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８のような)天然発生形態の抗原を用いる代わりに、別法として、本発明で使用するために産生できる抗体に向けた合成ペプチドを用いることもできることは理解されるであろう。可溶性および膜結合形態の双方の蛋白質またはペプチド断片が免疫原として用いるのに適しており、その上、これらは免疫アフィニティー精製法によって単離することもできる。前記または当該分野で知られているごとく単離できるごとき精製形態の蛋白質は、それ自体で免疫原として直接使用でき、または別法として、化学カップリング手段、ならびに蛋白質のクローン化遺伝子を用いた遺伝子組換え技術によるものを含む慣用技術によって適当な担体蛋白質に結合させることもできる。精製蛋白質は、脂質または炭水化物のごとき非-蛋白質性物質で共有的または非共有的に修飾して、免疫原性または溶解性を向上させることもできる。別法として、精製蛋白質は、免疫原性を向上させるために、ウイルス粒子、複製性ウイルスまたは他の微生物とカップリングさせるか、またはそれらに導入することもできる。蛋白質は、例えば、ウイルス粒子もしくは微生物またはそれらの免疫原性部位に化学的に結合させることもできる。
【００３６】
例示的な具体例において、精製ＣＤ２８蛋白質または(例えば、限定的蛋白質加水分解またはＤＮＡ組換え技術によって作製したような)そのペプチド断片を、動物において免疫原性がある担体に結合させる。好ましい担体には、アルブミン、(例えば、グロブリンおよびリポ蛋白質のような)血清蛋白質およびポリアミノ酸のごとき蛋白質が含まれる。有用な蛋白質の例には、ウシ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、チログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、卵白アルブミンおよびウシ・ガンマ-グロブリンが含まれる。ポリリジンまたはポリアルギニンのごときポリアミノ酸も有用な担体である。適当な免疫原性担体へのＣＤ２８の蛋白質またはペプチド断片の共有結合に関しては、当業者に知られている数多くの化学架橋剤がある。好ましい架橋剤は、段階的な様式で蛋白質に結合するのに用いることができるヘテロ二官能性の架橋剤である。広範な種々のヘテロ二官能性架橋剤が当該分野で知られており、スクシンイミジル ４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(ＳＭＣＣ)、ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド エステル(ＭＢＳ)；Ｎ-スクシンイミジル(４-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(ＳＩＡＢ)、スクシンイミジル ４-(ｐ-マレイミドフェニル)ブチレート(ＳＭＰＢ)、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸(ＥＤＣ)；４-スクシンイミジル-オキシカルボニル-ａ-メチル-ａ-(２-ピリジルジチオ)-トルエン(ＳＭＰＴ)、Ｎ-スクシンイミジル ３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル ６-[３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート]ヘキサノエート(ＬＣ-ＳＰＤＰ)が含まれる。
【００３７】
(例えば、ＣＤ２８のような)目的の蛋白質をその表面に発現している全細胞で動物を単純に免疫することも望ましい。種々の細胞系を免疫原として用いて、抗原に対するモノクローナル抗体を産生することができ、限定するものではないがＴ細胞が含まれる。例えば、末梢血液Ｔ細胞は、構成的にＣＤ２８を発現している対象から得ることができるが、抗-ＣＤ３抗体、ＰＨＡまたはＰＭＡでイン・ビトロ(in vitro)で活性化することができる。別法として、(例えば、アロ反応性の)抗原特異的Ｔ細胞クローンは、同時刺激シグナルと共に抗原を該Ｔ細胞に提示することによって、活性化してＣＤ２８を発現することができる。ＣＤ２８特異的抗体を産生するのに免疫原として用いることができる全細胞には、組換えトランスフェクト細胞も含まれる。例えば、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞は、ＣＤ２８ ｃＤＮＡでトランスフェクトすることによって再構成して、その表面上にＣＤ２８を発現する細胞を作製できる。次いで、これらのトランスフェクト細胞を免疫原として用いて、抗-ＣＤ２８抗体を産生することができる。他のトランスフェクト細胞の例も知られており、特に真核生物細胞はＣＤ２８蛋白質に糖付加することができるが、トランスフェクトしたＣＤ２８遺伝子を細胞表面上に発現するよう作動するいずれの方法を用いても全細胞免疫原を作製できる。
【００３８】
ＣＤ２８-発現細胞または単離ＣＤ２８蛋白質の別法として、ＣＤ２８のペプチド断片または２７ｋＤ抗原のごとき他の表面抗原を免疫原として用いて抗体を産生することもできる。例えば、ＥＳ５.２Ｄ８モノクローナル抗体によって結合するエピトープは、アミノ酸配列：
(Xaa１)ｎ-Gly-Xaa２-Trp-Leu-Xaa３-Xaa４-Asp(Glu)-(Xaa５)ｎ(配列番号：５)
[式中、Xaa４は存在してもしなくてもよく、Xaa１、Xaa２、Xaa３、Xaa４およびXaa５はいずれかのアミノ酸残基であって、ｎ＝０-２０、さらに好ましくは０-１０、なおさらに好ましくは０-５、最も好ましくは０-３である]よりなる。好ましい具体例において、Xaa２はＣysまたはＩle、Xaa３はＬeuまたはＡrgであって、存在する場合には、Xaa４はＡrgまたはＰroである。かくして、配列番号：５のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として用いることができる。従って、本発明には、さらに、アミノ酸配列：
(Xaa１)ｎ-Gly-Xaa２-Trp-Leu-Xaa３-Xaa４-Asp(Glu)-(Xaa５)ｎ(配列番号：５)
[式中、Xaa４は存在してもしなくてもよく、Xaa１、Xaa２、Xaa３、Xaa４およびXaa５はいずれかのアミノ酸残基であって、ｎ＝０-２０、さらに好ましくは０-１０、なおさらに好ましくは０-５、最も好ましくは０-３である]よりなる単離ペプチドが包含される。好ましい具体例において、Xaa２はＣysまたはＩle、Xaa３はＬeuまたはＡrgであって、存在する場合には、Xaa４はＡrgまたはＰroである。さらに、(実施例３に記載するようなファージ・ディスプレー(phage display)技術により測定したところ)ＥＳ５.２Ｄ８モノクローナル抗体は、他の多くのペプチド配列とも交差反応することが判明した。これらの他のペプチド配列の例を以下に示す：
【００３９】
【表１】
2004267220.tif 000002
【００４０】
これらのペプチド、または、恐らくは別のアミノ酸残基により挟まれている太字タイプで一括されている７個の範囲のアミノ酸を含有する他のペプチドはいずれも、本発明の方法で用いる抗体を産生するための免疫原として用いることができ、本発明により包含される。免疫原として使用する場合には、前記のようにペプチドを修飾して、溶解性を上昇させ、および/または、免疫原性を向上させることができる。
【００４１】
Ｂ．ポリクローナル抗体  精製蛋白質またはそのペプチド断片に対するポリクローナル抗体は、一般に、蛋白質の細胞外ドメインのごとき適当な免疫原およびアジュバントの複数回の皮下(ｓｃ)または腹腔内(ｉｐ)注射により動物に産生させることができる。ポリクローナル抗血清は、例えば、リンドステン,ティイ(Ｌindsten,Ｔ.)ら(１９９３年)ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ.Ｉmmunol.)第１５１巻：３４８９-３４９９頁に記載されているように産生させることができる。例示的な具体例において、典型的には、約１μｇ〜１ｍｇの蛋白質をフロイント(Ｆreund)完全アジュバントと合わせ、該溶液を皮内的に複数の部位に注射することによって免疫原性蛋白質、ペプチドまたは誘導体に対して動物を免疫する。１カ月後に、複数の部位に皮下注射することによって、フロイント完全アジュバントに入れた元の１/５〜１/１０の量の免疫原によって動物を追加免疫する。７〜１４日後に、動物を採血し、(例えば、ＥＬＩＳＡにより)抗-蛋白質またはペプチド力価につき血清をアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物を追加免疫する。また、ミョウバンのごとき凝集剤を用いて、免疫反応を向上することもできる。
【００４２】
かかる哺乳動物-産生抗体分子集団は「ポリクローナル抗体」という。なぜなら、該集団は、抗原に対して異なった免疫特異性およびアフィニティーを有する抗体よりなるからである。次いで、抗体分子を哺乳動物(例えば、血液から)から採取し、プロテインＡクロマトグラフィーのごときよく知られた技術によって単離し、ＩgＧ画分を得る。抗体の特異性を上昇させるためには、固相-付着免疫原を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製してもよい。免疫原が抗体分子と免疫反応して固相-付着免疫複合体を形成するのに十分な期間、抗体を固相-付着免疫原と接触させる。結合抗体は、標準的な技術によって複合体から分離する。
【００４３】
Ｃ．モノクローナル抗体  本明細書で用いる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」なる語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応できる１種類のみの抗原結合部位を含む抗体分子集団を示す。従って、モノクローナル抗体組成物は、典型的に、それと免疫反応する特定の蛋白質に対し単一の結合アフィニティーを示す。主題の方法で用いるモノクローナル抗体は、ヒト由来の蛋白質と免疫反応させてさらに特徴付けするのが好ましい。
【００４４】
本発明の方法に有用なモノクローナル抗体は、抗体および抗原の間の複合体の形成(本明細書では連結反応とも示す)が刺激およびＴ細胞増殖を誘導するように、Ｔ細胞上の抗原(群)のエピトープに向けられている。(例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８のような)抗原のエピトープに対するモノクローナル抗体は、培養物中の継代細胞系による抗体分子の産生に関して提供されている技術を用いることによって調製できる。これらには、限定するものではないが、コーラー(Ｋohler)およびミルスタイン(Ｍilstein)(１９７５年、ネイチャー(Ｎature)第２５６巻：４９５-４９７頁)により元来記載されているハイブリドーマ技術、およびさらに最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(コズボール(Ｋozbor)ら(１９８３年)イムノル・トゥデイ(Ｉmmunol.Ｔoday)第４巻：７２頁)、ＥＢＶ-ハイブリドーマ技術(コール(Ｃole)ら(１９８５年)、「モノクローナル抗体およびガン治療(Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy)」、アラン・アール・リス,インコーポレイテッド(Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.)社、７７-９６頁)およびトリオーマ(trioma)技術が含まれる。本発明に有用なモノクローナル抗体を効果的に得ることができる他の方法には、ファージ・ディスプレー技術(マークス(Ｍarks)ら(１９９２年)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)１６００７-１６０１０頁)が含まれる。
【００４５】
１つの具体例において、主題の方法に適用される抗体調製物は、ハイブリドーマ細胞系によって産生されたモノクローナル抗体である。ハイブリドーマ融合技術は、コーラー(Ｋohler)およびミルスタイン(Ｍilstein)により最初に導入された(コーラー(Ｋohler)ら、ネイチャー(Ｎature)(１９７５年)第２５６頁:４９５-４９７頁；ブラウン(Ｂrown)ら(１９８１年)ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ.Ｉmmunol.)第１２７巻：５３９-４６頁；ブラウン(Ｂrown)ら(１９８０年)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)第２５５頁：４９８０-８３頁；イェイ(Ｙeh)ら(１９７６年)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第７６巻：２９２７-３１頁；およびイェイ(Ｙeh)ら(１９８２年)インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(Ｉnt.Ｊ.Ｃancer)第２９巻：２６９-７５頁)。従って、本発明のモノクローナル抗体組成物は、以下の工程よりなる方法によって作製できる：
【００４６】
(ａ)動物を(例えば、ＣＤ２８のような)蛋白質またはその断片で免疫する。典型的に、免疫は、免疫学的に有効な量、すなわち、免疫反応を作り出すのに十分な量で免疫原を免疫学的に反応性を有する哺乳動物に投与することによって成し遂げられる。好ましくは、哺乳動物は、ウサギ、ラットまたはマウスのごとき齧歯類である。次いで、免疫原と免疫反応する抗体分子を分泌する細胞を産生するのに十分な期間、該哺乳動物を維持する。かかる免疫反応は、免疫原蛋白質の調製物と免疫反応するような抗体分子をスクリーニングすることによって検出する。所望により、例えば、(例えば、ＣＤ２８のような)膜-結合形態の免疫原のような、アッセイにおける抗体によって検出すべき形態の蛋白質の調製物で該抗体分子をスクリーニングするのも望ましい。例えば、酵素-結合免疫ソルベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)および/またはフロー・サイトメトリーのようなこれらのスクリーニング法は、当業者によく知られている。
【００４７】
(ｂ)次いで、所望の抗体を分泌する各免疫哺乳動物から取り出した抗体-産生細胞の懸濁液を調製する。十分な時間の後に、マウスを解剖し、体細胞抗体-産生リンパ球を得る。抗体-産生細胞は、準備した動物のリンパ節、脾臓および末梢血液由来であってもよい。脾臓細胞が好ましく、当業者によく知られた方法を用いて、生理学的に許容できる培地中にて個々の細胞に機械的に分離できる。マウスリンパ球は、以下に記載するマウスメラノーマと高パーセントの安定な融合を供する。ラット、ウサギおよびカエルの体細胞も用いることができる。所望の免疫グロブリンをコードする脾臓細胞染色体は、一般的にはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)のごとき融合剤の存在下にて、脾臓細胞をミエローマ細胞と融合することによって不死化する。いずれのメンバーのミエローマ細胞系も、標準的な技術による融合パートナーとして用いることができる；例えば、Ｐ３-ＮＳ１/１-Ａrg４-１、Ｐ３-ｘ６３-Ａg８.６５３またはＳp２/Ｏ-Ａg１４ミエローマ系。これらのミエローマ系は、メリーランド州、ロックビル(Ｒockville,Ｍｄ)のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)から入手可能である。
【００４８】
次いで、所望のハイブリドーマを含む得られた細胞を、非融合の親ミエローマまたはリンパ球が最終的に死滅するＨＡＴ培地のごとき選択培地で増殖させる。ハイブリドーマ細胞のみが生存し、単離クローンを得るための限外希釈条件下で増殖させることができる。ハイブリドーマの上清は、例えば、免疫に用いた抗原を用いる免疫アッセイ技術により、所望の特異性を有する抗体の存在性につきスクリーニングする。次いで、ポジティブクローンは限外希釈条件下でサブクローン化でき、産生されたモノクローナル抗体を単離できる。他の蛋白質および他の汚染物からモノクローナル抗体が分離されるような該モノクローナル抗体を単離または精製するための種々の常法がある。モノクローナル抗体を精製するのに通常用いられる方法には、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー(例えば、ゾーラ(Ｚola)ら「モノクローナル・ハイブリドーマ抗体：技術および適用(Ｍonoclonal Ｈybridoma Ａntibodies:Ｔechniques Ａnd Ａpplications)」ヒューレル(Ｈurell)(編)５１-５２頁(シイアールシイ・プレス(ＣＲＣ Ｐress)社)１９８２年参照)。これらの方法により作製したハイブリドーマは、当該分野で知られている技術を用いて、イン・ビトロ(in vitro)およびイン・ビボ(in vivo)(腹水液中)で増殖させることができる。
【００４９】
一般的に、個々の細胞系は、例えば、研究室の培養容器の中のようなイン・ビトロ(in vitro)で増殖させてもよく、高濃度の単特異性のモノクローナル抗体を含有する培養培地はデカンテーション、濾過または遠心によって採取できる。別法として、モノクローナル抗体の収率は、元の融合に提供した体細胞およびミエローマ細胞に用いたタイプの組織適合性の動物にハイブリドーマの試料を注射することによって上昇できる。融合細胞ハイブリッドによって産生された腫瘍が分泌する特異的モノクローナル抗体は注射動物中で増える。腹水液体または血清のごとき動物の体液は、高濃度でモノクローナル抗体を提供する。ヒト・ハイブリドーマまたはＥＢＶ-ハイブリドーマを用いる場合には、マウスのごとき動物に注射した異種移植の拒絶反応を避けることが必要である。免疫不全またはヌードマウスを用いるか、またはハイブリドーマを固形皮下腫瘍として照射ヌードマウスに最初に継代し、イン・ビトロ(in vitro)で培養し、次いで、多量の特異的ヒトモノクローナル抗体を分泌する腹水腫瘍を発病しているプリスタン処理し照射したヌードマウスに腹内注射する。
【００５０】
これらの組成物の調製に有用な培地および動物は、双方とも、当該分野でよく知られており、販売されていおり、また、合成培地、近交マウス等が含まれる。例示的な合成培地は、４.５ｇｍ/lのグルコース、２０ｍＭのグルタミンおよび２０％ウシ胎児血清を補給したダルベッコ最小必須培地(ＤＭＥＭ；ダルベッコ(Ｄulbecco)ら(１９５９年)ウイロロジー(Ｖirol.)第８巻：３９６頁)である。例示的な近交マウス系統はＢalb/cである。
【００５１】
Ｄ．組合せ抗体  本発明のモノクローナル抗体組成物は、組換えＤＮＡ技術の当業者によく知られた他の技術によっても作製できる。「組合せ抗体ディスプレー(combinatorial antibody display)」と呼ばれる別の方法は、特定の抗原特異性を有する抗体断片を同定し単離するために開発され、モノクローナル抗体を作製するのに利用することができる(組合せ抗体ディスプレーの記載に関しては、例えば、サストリー(Ｓastry)ら(１９８９年)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第８６巻:５７２８頁；ヒューズ(Ｈuse)ら(１９８９年)サイエンス(Ｓcience)第２４６巻：１２７５頁；およびオーランディ(Ｏrlandi)ら(１９８９年)プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第８６巻：３８３３頁参照)。前記のごとく(例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８のような)適当な免疫原で動物を免疫した後に、得られたＢ細胞の抗体レパートリーをクローン化する。オリゴマー・プライマーおよびＰＣＲの混合を用いることによりイムノグロブリン分子の多様性集団の可変領域のＤＮＡ配列を直接得るための方法が一般的に知られている。例えば、５'リーダー(シグナル・ペプチド)配列および/またはフレームワーク１(ＦＲ１)配列に対応する混合オリゴヌクレオチド・プライマーならびに保存された３'定常領域プライマーに対するプライマーを、数多くの齧歯類抗体からの重鎖および軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅に用いることができる(ラーリック(Ｌarrick)ら(１９９１年)バイオテクニックス(Ｂiotechniques)第１１巻：１５２-１５６頁)。同様な戦略は、ヒト抗体からヒトの重鎖および軽鎖可変領域を増幅するのにも用いることができる(ラーリック(Ｌarrick)ら(１９９１年)「方法：酵素学における方法への随伴(Ｍethods:Ｃompanion to Ｍethods in Ｅnzymology)」第２巻：１０６-１１０頁)。
【００５２】
例示的な具体例において、(例えば、米国特許第４,６８３,２０２号；オーランディ(Ｏrlandi)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)(１９８９年)第８６巻：３８３３-３８３７頁；サストリー(Ｓastry)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)(１９８９年)第８６巻：５７２８-５７３２頁；およびヒューズ(Ｈuse)ら(１９８９年)サイエンス(Ｓcience)第２４６巻：１２７５-１２８１頁のような)標準的なプロトコールを用いて、例えば、末梢血液細胞、骨髄または脾臓調製物の活性化Ｂ細胞からＲＮＡを単離する。重鎖(群)の定常領域および各κおよびλ軽鎖について特異的なプライマー、ならびにシグナル配列についてのプライマーを用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成する。可変領域ＰＣＲプライマーを用いることにより、重鎖および軽鎖の双方の可変領域を、各々単独または組み合わせて増幅し、ディスプレー・パッケージを作製するさらなる操作のために適当なベクターに連結反応させる。増幅プロトコールに有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、ユニークまたは変性していてもよく、または変性部位にイノシンを含んでいてもよい。制限エンドヌクレアーゼ認識配列を該プライマーに導入し、増幅した断片を発現させるために予め決定した読み枠でベクターにクローニングすることもできる。
【００５３】
免疫-由来抗体レパートリーからのＶ-遺伝子ライブラリーは、好ましくは繊維状ファージ由来のディスプレー・パッケージ集団によって発現させて、抗体ディスプレー・ライブラリーを形成できる。理想的には、ディスプレー・パッケージは、変化に富む多量の抗体ディスプレー・ライブラリーのサンプリング、各アフィニティー分離ラウンドの後の迅速なソート、および精製ディスプレー・ライブラリーからの抗体遺伝子の容易な単離を可能とする系よりなる。ファージ・ディスプレー・ライブラリーを作製するための販売されているキット(例えば、ファルマシア組換えファージ抗体系(Ｐharmacia Ｒecombinant Ｐhage Ａntibody Ｓystem)カタログ番号２７-９４００-０１;およびストラタジーン社(Ｓtratagene)サーフザップＴＭ(ＳurfＺＡＰＴＭ)ファージ・ディスプレーキット、カタログ番号２４０６１２)に加えて、変化に富んだ抗体ディスプレー・ライブラリーを作製するのに用いる特に適する方法および試薬の例は、例えば、ラドナー(Ｌadner)ら米国特許第５,２２３,４０９号；カン(Ｋang)ら国際公開番号ＷＯ ９２/１８６１９；ドーアー(Ｄower)ら国際公開番号ＷＯ ９１/１７２７１；ウィンター(Ｗinter)ら国際公開番号ＷＯ ９２/２０７９１；マークランド(Ｍarkland)ら国際公開番号ＷＯ ９２/１５６７９；ブリートリング(Ｂreitling)ら国際公開ＷＯ ９３/０１２８８；マッカファーティー(ＭcＣafferty)ら国際公開番号ＷＯ ９２/０１０４７；ガーラード(Ｇarrard)ら国際公開番号ＷＯ ９２/０９６９０；ラドナー(Ｌadner)ら国際公開番号ＷＯ ９０/０２８０９；フッチス(Ｆuchs)ら(１９９１年)バイオ/テクノロジー(Ｂio/Ｔechnology)第９巻：１３００-１３７２頁；ヘイ(Ｈay)ら(１９９２年)「フン・アンチボッド・ハイブリドーマ(Ｈum Ａntibod Ｈybridomas)」第３巻８１-８５頁；ヒューズ(Ｈuse)ら(１９８９年)サイエンス(Ｓcience)第２４６巻:１２７５-１２８１頁;グリフィス(Ｇriffths)ら(１９９３年)ジ・エンボ・ジャーナル(ＥＭＢＯ Ｊ)第１２巻：７２５-７３４頁；ホーキンス(Ｈawkins)ら(１９９２年)ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.)第２２６巻:８８９-８９６頁；クラックソン(Ｃlackson)ら(１９９１年)ネイチャー(Ｎature)第３５２巻：６２４-６２８頁；グラム(Ｇram)ら(１９９２年)プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第８９巻：３５７６-３５８０頁；ガラッド(Ｇarrad)ら(１９９１年)バイオ/テクノロジー(Ｂio/Ｔechnology)第９巻：１３７３-１３７７頁；ホーゲンボーム(Ｈoogenboom)ら(１９９１年)ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucl.ＡcidsＲes.)第１９巻：４１３３-４１３７頁;およびバーバス(Ｂarbas)ら(１９９１年)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第８８巻：７９７８-７９８２頁に見い出すことができる。
【００５４】
ある種の具体例において、重鎖および軽鎖のＶ領域ドメインは、同一のポリペプチド上に発現させ、柔軟なリンカーによって連結して一本鎖Ｆｖ断片を形成させ、続いてｓｃＦＶ遺伝子を所望の発現ベクターまたはファージゲノムにクローン化することができる。マッカーファーティ(ＭaＣafferty)ら、ネイチャー(Ｎature)(１９９０年)第３４８巻：５２２-５５４頁に一般的に記載されているごとく、柔軟な(Ｇly４-Ｓer)３リンカーによって連結された抗体の完全なＶＨおよびＶＬドメインを用いて、抗原アフィニティーに基づいて分離可能なディスプレー・パッケージにすることができる一本鎖抗体を作製できる。続いて、抗原と免疫反応する単離ｓｃＦＶ抗体を、主題の方法で用いるために、医薬調製物に処方化できる。
【００５５】
(例えば、繊維状ファージのような)ディスプレー・パッケージ表面上にディスプレーされれば、抗体ライブラリーを蛋白質またはそのペプチド断片でスクリーニングして、該蛋白質に対して特異性を有する抗体を発現するパッケージを同定し単離する。選抜抗体をコードする核酸は、(例えば、ファージゲノムのような)ディスプレー・パッケージから回収し、標準的な組換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクターにサブクローン化できる。
【００５６】
Ｅ．ハイブリドーマおよび調製方法  本発明に有用なハイブリドーマは、(例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８のような)目的の抗原と特異的に免疫反応するであろうモノクローナル抗体を産生する能力を有するとして特徴付けられるものである。例えば、ＣＤ２８抗原と免疫反応する能力を有するような、所望の免疫特異性を有し、および/またはＣＤ２８のエピトープを同定できる抗体分子を産生(例えば、分泌)するハイブリドーマを作製する方法は当該分野でよく知られている。特に適応可能なのは、ニーマン(Ｎiman)ら(１９８３年)プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第８０巻：４９４９-４９５３頁；およびガルフレ(Ｇalfre)ら(１９８１年)メソッズ・イン・エンザイモロジー(Ｍeth.Ｅnzymol.)第７３巻：３-４６頁によって記載されているハイブリドーマ技術である。
【００５７】
II．本発明の方法の使用
本発明の方法は、感染疾病、ガンおよび免疫療法の治療に使用するＣＤ４＋またはＣＤ８+Ｔ細胞集団を選択的に増殖させるために用いることができる。本明細書に記載する方法の結果として、抗原反応性に関してはポリクローナルであるが、ＣＤ４＋またはＣＤ８+のいずれかに関して実質的に均一なＴ細胞集団を産生できる。加えて、この方法によって、個人の総ＣＤ４＋またはＣＤ８+Ｔ細胞集団を再構成するのに十分な数(個人に含まれるリンパ球集団は約１０１１である)にＴ細胞集団を増殖させることができる。得られたＴ細胞集団は、遺伝子的に形質導入して、免疫治療に用いることができ、または感染病原菌のイン・ビトロ(in vitro)分析方法に用いることができる。例えば、腫瘍-侵潤性リンパ球の集団は、ガンを患った個人から得ることができ、Ｔ細胞を刺激して十分な数に増殖できる。得られたＴ細胞集団は、遺伝子的に形質導入して、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)または他の因子を発現させて、個人に戻すことができる。
【００５８】
本発明により増殖させたＣＤ４＋Ｔ細胞の１つの特定の使用は、個人のＨＩＶ感染の治療においてである。ＨＩＶの長期の感染は、最終的にＣＤ４＋Ｔリンパ球の数の著しい減少を起こす。この減少は、順番に、根深い免疫不全状態を引き起こし、整然とした生活を脅かす日和見感染に対して個人を感受性とする。ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を正常なレベルに戻すことにより、意義深い程度まで免疫機能が回復することが期待できる。かくして、本明細書に記載する方法により、ＨＩＶ感染患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞を再構成するに十分な数まで該ＣＤ４＋Ｔ細胞を選択的に増殖させる手段が提供される。また、長期の刺激の間のＴ細胞の感染を避けることも必要であり、Ｔ細胞を持続的にＨＩＶ感染に抵抗性とすることが望ましい。Ｔ細胞を、ＨＩＶ感染に対して抵抗性とするか、または感染した個人にＴ細胞を戻す前にウイルスを産生できないようにする技術が多数ある。例えば、増殖する前に、１またはそれを超える抗-レトロウイルス剤をＣＤ４＋Ｔ細胞と共に培養して、ＨＩＶ複製またはウイルス産生を阻害することができる(例えば、逆転写酵素および/またはウイルス機構の他の成分を標的とする薬剤、例えばチャウ(Ｃhow)ら(１９９３年)ネイチャー(Ｎature)第３６１巻、６５０-６５３頁参照)。
【００５９】
幾つかの方法を用いて、Ｔ細胞を遺伝子的に形質導入し、ＨＩＶ感染または複製を阻害する分子を作製することができる。例えば、１つの具体例において、Ｔ細胞を遺伝子的に形質導入して、正常なＨＩＶ遺伝子産物の変異させた、非機能性形態であるトランスドミナント(transdominant)阻害剤を作製することができる。トランスドミナント阻害剤は、野生型ＨＩＶ蛋白質をオリゴマー化し、またはそれとの結合を競合するように機能する。幾つかのトランスドミナント阻害剤は、tat、revおよびgagを含むＨＩＶ蛋白質由来である。tatの機能は、大部分のＨＩＶ遺伝子のプロモーター領域に見い出されるトランス活性化反応エレメント(tar)に結合することによってウイルス遺伝子の転写を上昇させることである。revは、非スプライシングＨＩＶ転写物の５'末端に見い出されるrev反応エレメント(ＲＲＥ)への結合を通して、ビリオンへパッケージングするための核から細胞質への非修飾ｍＲＮＡの運搬を容易にする。gagは、一本鎖ポリペプチドとして最初は合成され、続いてウイルスがコードするプロテアーゼによって分解されて、三次元構造の蛋白質ｐ１５、ｐ１７およびｐ２４が得られる。これらの遺伝子産物由来のトランスドミナント阻害剤は、lab petＨＩＶ単離株と共に培養した細胞の感染を阻害することが証明された。野生型Ｒevと非機能性マルチマーを形成することによって作用するようであるトランスドミナント阻害剤の１つの例は、ＲevＭ１０である。ＲevＭ１０構築物は、ＨＴＬＶ-IIIＢによるＣＥＭ細胞の感染を２８日まで遮断した(マリム(Ｍalim)ら、ジェム(ＪＥＭ)第１７６巻：１１９７頁、ベベック(Ｂevec)ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第８９巻：９８７０頁)。これらの実験においては、増殖速度およびＩＬ-２分泌の評価基準によって判定したところ、Ｒev Ｍ１０が正常なＴ細胞機能の逆に作用することを証明できなかった。
【００６０】
もう１つのアプローチにおいて、Ｔ細胞を形質導入して、複製または集合に重要なウイルス蛋白質に対する結合エレメントである、ＴＡＲのごとき「分子おとり」として知られる分子を作製することができる。ＲＴアッセイにより測定したところ、ＣＥＭ ＳＳ細胞におけるＴＡＲの高レベルのレトロウイルス-媒介発現がＡＲＶ-２ＨＩＶ単離株を効率的に遮断することが判明した(スレンジャー(Ｓullenger)ら、セル(Ｃell)第６３巻：６０１頁)。重要なことには、それがＳＩＶ(ＳＩＶmac２５１)感染をも遮断することは、分子おとりでのＨＩＶ感染の阻害が種々の単離株に一般的に適用でき、それによって超可変性の問題点を多少とも解決することを示している。さらに、ＴＡＲ発現が細胞生存性に対して識別できる効果を有さないことも証明された(スレンジャー(Ｓullenger)ら、ジャーナル・オブ・ウイロロジー(Ｊ.Ｖirol.)第６５巻：６８１１頁)。Ｔ細胞を形質導入して作製できるもう１つの「分子おとり」は、ＥＲ保持のシグナルであるＫＤＥＬ(リジン-アスパラギン酸-グルタミン酸-ロイシン)配列がカルボキシ末端に付加された可溶性ＣＤ４である(ブオノコア(Ｂuonocore)およびローズ(Ｒose)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第９０巻:２６９５頁)(ネイチャー(Ｎature)第３４５巻：６２５頁)。ｓＣＤ４-ＫＤＬＥ遺伝子発現は、ＨＩＶ ＬＴＲによって作動される。ｓＣＤ４-ＫＤＥＬを形質導入したＨ９細胞は、ＨＩＶ感染時に細胞内ＣＤ４の発現の調節を示す。この戦略は、感染後６０日までのＨＩＶ ＭＮの産生を効果的に遮断した。この阻害剤の提唱された利点は、ＣＤ４結合性がＨＩＶ感染性に必須であるために、ウイルスが突然変異によりその効果を回避できないであろうということである。
【００６１】
Ｔ細胞を形質導入して、ウイルス複製または感染を遮断するアンチセンス分子およびリボザイムを発現させることもできる。ウイルス複製は、種々のアンチセンス戦略で阻害できる。ＨＩＶインテグラーゼを切断する１つの特定のリボザイムが開発され(シオウド(Ｓioud)およびダーリカ(Ｄrlica)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第８８巻：７３０３頁)、単純にウイルス産生による感染を遮断するアプローチを提供できる。
【００６２】
ＨＩＶ感染を遮断するもう１つのアプローチには、Ｔ細胞をＨＩＶ-調節毒素で形質導入することが含まれる。このタイプのアプローチの２つの例は、ジフテリア・トキシンＡ遺伝子(ハリソン(Ｈarrison)ら、エイズ・リサーチ・ヒュム・レトロ(ＡＩＤＳ Ｒes.Ｈum.Ｒetro.)第８巻：３９頁)および単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ遺伝子(ＨＳＶ ＴＫ)(カルソ(Ｃaruso)およびクラッツマン(Ｋlatzmann)プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ)第８９巻：１８２頁)である。双方のケースにおいて、転写はＨＩＶ調節配列の制御下であった。ジフテリアトキシンはそれ自体が毒性であるのに対して、ＨＳＶ ＴＫは感染細胞を殺すためのアサイクロバーの添加を要する。例えば、ＨＳＶ ＴＫの使用に続いて１０μｍアサイクロバーを合計１７日間添加することにより、培養５５日までＨＵＴ７８細胞のＨＩＶ感染が遮断された。
【００６３】
抗原特異的Ｔ細胞集団を刺激し増殖させる方法は、Ｔ細胞を対象に投与する際の(例えば、反応を誘導するか、または存在する反応を高めるかの)免疫反応をこ上昇調節するのが望ましい治療状態に有用である。例えば、該方法を用いて腫瘍関連抗原に対するＴ細胞反応を向上させることができる。対象からの腫瘍細胞は、典型的に、腫瘍-関連抗原を発現しているが、(例えば、それらが同時刺激分子の発現を欠損しているために)Ｔ細胞における同時刺激シグナルを刺激することができないこともあり得る。従って、腫瘍細胞と対象からのＴ細胞とをイン・ビトロ(in vitro)で接触させ、本発明の方法により抗原特異的Ｔ細胞を増殖させ、対象にＴ細胞を戻すことができる。別法として、本明細書に記載するようにＴ細胞を刺激して増殖させ、(例えば、ヒト免疫不全ウイルスのような)ウイルス、細菌、寄生虫および真菌のごとき病原体に対する反応性を誘導または向上させることができる。
【００６４】
本発明を、限定することを意味するものでは決してない以下の実施例によってさらに説明する。本適用を通して引用される全ての参照および公開された特許出願の内容は、出典明示して本明細書の一部とみなす。材料および方法のセクションに記載した以下の方法論を、後記する実施例を通して用いた。
【００６５】
方法および材料
固定化抗-ＣＤ３抗体の調製
組織培養フラスコは、抗-ＣＤ３モノクローナル抗体でコートした。数多くの抗-ヒトＣＤ３モノクローナル抗体が入手可能であるが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得たハイブリドーマ細胞から調製したＯＫＴ３をこの方法で用いた。いずれの抗-ＣＤ３抗体に関しても、組織培養フラスコをコートすべき最適濃度は実験的に決定しなければいけない。ＯＫＴ３では、最適濃度は、典型的に０.１〜１０μｇ/ｍlの範囲であると測定された。コート溶液を調製するために、抗体を０.０５Ｍのトリス-ＨＣl、ｐＨ９.０(ミズーリ州、セントルイス(Ｓt.Ｌouis，ＭＯ)のシグマ・ケミカル,コーポレイション(ＳigmaＣhemical,Ｃo.)社)に懸濁した。組織培養フラスコ(ファルコン(Ｆalcon)、ヌンク(Ｎunc)またはコスター(Ｃostar)社)の底部をコートするに十分なコート溶液を添加し、４℃にてインキュベートした。フラスコは、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸生理食塩水緩衝液(ＰＢＳ w/o ＣａまたはＭｇ)で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液(ＰＢＳ ｗ/ｏ ＣａまたはＭｇ＋５％ウシ血清アルブミン)を添加してフラスコの底部を被覆し、室温にて２時間インキュベートした。このインキュベート後に、ブロッキング溶液をフラスコに残しつつ、フラスコを直接用いるか、または保存するために冷凍した。
【００６６】
末梢血液白血球(ＰＢＬ)の単離
試料は、健全な供与者のロイコフェレーシスによって得た。無菌条件を用いて、白血球をＴ８００培養フラスコに移した。カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクスの平衡塩類溶液(ＨＢＳＳ ｗ/ｏ)(メリーランド州、ウォーカースビル(Ｗalkersville,ＭＤ)ウィッタカー・バイオプロダクツ,インコーポレイテッド(Ｗhittaker Ｂioproducts,Ｉnc.)社)で容器を洗浄した。細胞をＨＢＳＳ ｗ/ｏで希釈しよく混合した。次いで、２つの２００ｍlの円錐-底の無菌プラスチック組織培養管の間に等分に分配した。各管をＨＢＳＳ ｗ/ｏで２００ｍlとし、ベックマン(Ｂeckmann)ＴＪ-６遠心器で１８００RPMにて１２分間遠心した。上清を蒸発させ、各ペレットを５０ｍlのＨＢＳＳ ｗ/ｏに再懸濁した。細胞を２つの５０ｍl円錐底管に移し、１５００RPMにて８分間遠心した。再度、上清を蒸発させた。
【００６７】
赤血球を溶解させるために、細胞ペレットを５０ｍlのＡＣＫ溶解緩衝液(メリーランド州、ロックビル(Ｒockville ＭＤ)のバイオフルーイッズ,インコーポレイション(Ｂiofluids,Ｉnc.)社、カタログ＃３０４)３分間静かに撹拌しつつ、室温にて再懸濁した。１５００RPMにて８分間遠心することによって、細胞を再度ペレット化した。上清を蒸発させた後に、ペレットを３２ｍlのＨＢＳＳ ｗ/ｏを入れた１つの５０ｍl試験管に合わせた。
【００６８】
単球からのＰＢＬの分離は、パーコールＴＭ(PERCOLLＴＭ)勾配を通した遠心によって成し遂げた。１lのパーコールＴＭ(PERCOLLＴＭ)溶液(PERCOLLＴＭ-ＭＯ)を調製するために、７１６ｍlのパーコールＴＭ(PERCOLLＴＭ)溶液(ニュージャージー州、ピスカタウェイ(Ｐiscataway,ＮＪ)のファルマシア(Ｐharmacia)社、カタログ＃１７-０８９１-０１)を、１００ｍlの１.５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍlの１Ｍ ナトリウム-ＨＥＰＥＳおよび１６４ｍlの水と合わせた。全ての試薬は、組織培養グレードであって、濾過滅菌されていなければならない。混合した後に、滅菌０.２μｍ３フィルターを通してこの溶液を濾過し、４℃にて保存した。２４ｍlのパ−コールＴＭ(PERCOLLＴＭ)-ＭＯを２本の５０ｍl円錐底試験管に各々添加した。各試験管に１６ｍlの細胞懸濁液を添加した。試験管を静かに倒立することによって、溶液をよく混合した。試験管を２８００RPMにて３０分間、ブレーキないしに遠心した。層が混合しないように注意して、試験管を遠心器から取り出した。ＰＢＬは試験管の底部にあった。次いで、上清を蒸発させ、１５００RPMで８分間遠心することによって、ＰＢＬをＨＢＳＳ ｗ/ｏ中で洗浄した。
【００６９】
ネガティブ磁気免疫付着を介した細胞ソート
ネガティブ磁気免疫付着を介した細胞ソートは、４℃にて行わなければならない。前記のパーコールＴＭ(PERCOLLＴＭ)勾配から得た洗浄細胞ペレットをコート培地(ＲＰＭＩ-１６４０(メリーランド州、ウォーカースビル(Ｗalkersville,ＭＤ)のバイオ・ウィッターカー(Ｂio Ｗhittaker)社、カタログ＃１２-１６７Ｙ、３％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)(または１％ヒトＡＢ−血清または０.５％ウシ血清アルブミン)、５ｍＭ ＥＤＴＡ(メリーランド州、ガイサースバーグ(Ｇaithersburg,ＭＤ)のクオリティー・バイオロジカル,インコーポレイテッド(Ｑuality Ｂio-logical，Ｉnc.)社、カタログ＃１４-１１７-１)、２ｍＭ Ｌ-グルタミン(メリーランド州、ウォーカースビル(Ｗalkersville,ＭＤ)のバイオ・ウィッターカー(Ｂio Ｗhittaker)社、カタログ＃１-９０５Ｃ)、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(メリーランド州、ウォーカースビル(Ｗalkersville,ＭＤ)のバイオ・ウィッターカー(Ｂio Ｗhittaker)社、カタログ＃１７-７５７Ａ)、５０μｇ/ｍlゲンタマイシン(メリーランド州、ウォーカースビル(Ｗalkersville,ＭＤ)のバイオ・ウィッターカー(Ｂio Ｗhittaker)社、カタログ＃１７-９０５Ｃ)に再懸濁して細胞密度２０×１０６/ｍlとした。細胞表面マーカーに向けたモノクローナル抗体のカクテルを各抗体につき最終濃度１μｇ/ｍlで添加した。このカクテルの組成物は、ＣＤ４＋またはＣＤ２８+Ｔ細胞のいずれかにつき富んでいるように設計されている。従って、典型的に、カクテルには、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ-ＤＲおよび(ＣＤ４＋細胞のみについて)ＣＤ８が含まれているであろう。(モノクローナル抗体カクテルソートの掲載に関する表１参照)。細胞および抗体を含有する試験管は、４℃にて３０-４５分間回転撹拌した。このインキュベートの後に、細胞をコート培地で３回洗浄し、非結合抗体を除去した。ヤギ抗-マウスＩｇＧコートし、コート培地で予め洗浄した磁性ビーズ(ダイナビーズ(Ｄynabeads)Ｍ-４５０、カタログ＃１１００６、メリーランド州、ガイサースバーグ(Ｇaithersberg,ＭＤ)のピイ・アンド・エス・バイオケミカルズ(Ｐ＆Ｓ Ｂiochemicals)社)を細胞当たり３個のビーズの比にて添加した。次いで、細胞およびビーズを４℃にて１-１.５時間回転撹拌した。抗体-コート細胞は、製造業者の指示書に従って、磁性粒子コンセントレーター(ＭＰＣ-１、カタログ＃１２００１(メリーランド州、ガイサースバーグ(Ｇaithersberg,ＭＤ)のピイ・アンド・エス・バイオケミカルズ(Ｐ＆Ｓ Ｂiochemicals)社)を用いて取り出した。非付着細胞をコート培地で洗い落とし、適当な培養培地に再懸濁した。
【００７０】
表１：ソート用モノクローナル抗体カクテル：
(イタリック文字のｍＡｂはＡＴＣＣから入手可能である)
【００７１】
【表２】
2004267220.tif 000003
【００７２】
【表３】
2004267220.tif 000004
【００７３】
長期刺激：
抗-ＣＤ３モノクローナル抗体で予めコートした組織培養フラスコを解凍し、ＰＢＳで３回洗浄した。精製Ｔ細胞を２×１０６/ｍlの密度で添加した。抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体ｍＡｂ９.３(ワシントン州、シアトル(Ｓeattle,ＷＡ)のブリストル・マイヤーズ・スクイブ(Ｂristol Ｍyers Ｓquibb Ｃorporation)社のジェフェリー・レッドベター博士)またはＥＸ５.３Ｄ１０(ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１３７３(マサチューセッツ州、ケンブリッジ(Ｃambridge,ＭＡ)のレプリゲン・コーポレイション(Ｒepligen Ｃorporation)社)を１μｇ/ｍlの濃度で添加し、細胞を３７℃にて一晩培養した。次いで、激しくピペッティングすることによって細胞をフラスコから脱着させ、新たな非処理フラスコに０.５×１０６/ｍlの密度で移した。その後に、激しくピペッティングすることによって細胞を一日おきに再懸濁し、０.５×１０６/ｍlに希釈した。細胞の平均直径は、コールター・チャンネライザー(Ｃoulter Ｃhannelyzer)に接続したコールター・カウンター(Ｃoulter Ｃounter)２Ｍで毎日モニターした。休止Ｔ細胞は６.８μｍの平均直径を有する。この刺激プロトコールでは、平均直径が４日目までに１２μｍ以上に増大し、次いでおよそ６日目までに減少し始めた。平均直径が約８μｍまで減少したら、前記の抗-ＣＤ３および抗-ＣＤ２８抗体で細胞を一晩再刺激した。細胞を休止直径まで戻らせてはならないことが重要であった。この周期を３ヶ月間繰り返した。再刺激の間の期間は進行的に減少するであろうと予想できる。
【００７４】
実施例１:抗-ＣＤ３抗体および抗-ＣＤ２８抗体によるＣＤ４＋Ｔ細胞の長期増殖  イン・ビトロ(in vitro)でＴ細胞を培養する以前知られていた方法には、外因性の支持細胞または(インターロイキン２または４のごとき)細胞増殖因子、および抗原または分裂促進性の植物レクチンの供給原を添加する必要がある。末梢血液ＣＤ２８+Ｔ細胞は、前記の方法および材料のセクションに記載した磁性免疫ビーズおよびモノクローナル抗体を用いたネガティブ選抜によって単離した。Ｔ細胞を抗-ＣＤ８モノクローナル抗体で処理し、ＣＤ８+細胞を磁性免疫ビーズで除去することによって、ＣＤ４＋細胞をＴ細胞集団からさらに単離した。簡単には、Ｔ細胞を、正常な供与者のロイコフェレーシスから得、フィルコールＴＭ(FICOLLＴＭ)密度勾配遠心に続く磁性免疫ビーズソートによって精製した。得られたＣＤ２８+、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、プラスティック-吸着ヤギ抗-マウスＩgＧ(メリーランド州、ガイサースバーグ(Ｇaithersberg,ＭＤ)のキルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ(Ｋirkegaard and Ｐerry Ｌaboratories)社)および抗-ＣＤ３ｍＡｂＧ１９-４を含有する培養皿に細胞を添加することにより、初期密度２.０×１０６/ｍlで明確な培地(ゲンタマイシンおよびＬ-グルタミンを含有するＸ-ビボ１０(Ｘ-Ｖivo１０)(ウィッタカー・バイオプロダクツ(Ｗhittaker Ｂioproducrs)社))で培養した。４８時間後に、細胞を取り出し、ｈＩＬ-２(５％、カルバイオケム(ＣalＢiochem)社)または抗-ＣＤ２８mＡb(５００ng/ｍl)のいずれかを含有するフラスコに入れた。ＩＬ-２と共に培養した細胞は、２日間隔で新たなＩＬ-２を補給した。新たな培地は、０.５×１０６/ｍlの細胞密度を維持するのに必要なように全ての培地に添加した。プラスティック-吸着抗-ＣＤ３ｍＡｂ上で２４時間培養し、細胞を取り出して、ＩＬ-２または抗-ＣＤ２８ｍＡｂのいずれかを含有するフラスコ中の新たな培地に１.０×１０６/ｍlで入れることによって、細胞を約一週間間隔で再刺激した。
【００７５】
図１に示す例において、培養容器には５０×１０６細胞が最初に含まれており、該細胞を最適量の分裂促進性のレクチンＰＨＡ中で培養するか、またはインターロイキン-２または抗-ＣＤ２８ｍＡｂ９.３の存在下のプラスチック固定化抗-ＣＤ３ｍＡｂで周期的に刺激しつつ培養した。ＰＨＡ単独で培養した細胞は増殖せず、全ての細胞がおよそ培養２０日目までに死滅したことは、補助細胞の機能がないことを証明している。それに対して、ＩＬ-２または抗-ＣＤ２８と共に抗-ＣＤ３中で増殖させた細胞は、培養の最初の３週間に等しい成長速度で対数増加期に入った。しかしながら、ＩＬ-２を補給した細胞が〜２.８log１０増殖の後に定常期に入るのに対して、抗-ＣＤ３培養は培養第４週の間に増殖速度が分かれ始めた。それに対して、抗-ＣＤ２８の存在下にて増殖させた培養物は、〜３.８log１０増殖となっている時期である培養第６週まで対数増加期にとどまっていた。従って、恐らくは抗-ＣＤ２８架橋によるＣＤ２８受容体刺激は、ウシ胎児血清または補助細胞がなくてもＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を刺激でき、さらには、外因性のＩＬ-２を添加するのとは反対に、抗-ＣＤ２８を用いて約１０倍を超える細胞を得ることができる。繰り返し実験において、抗-ＣＤ２８抗体を用いたＣＤ４＋Ｔ細胞増殖により、一貫して、ＩＬ-２を用いた増殖よりもさらに多い(例えば、１０００倍に至るさらなる細胞)ＣＤ４＋Ｔ細胞が得られた。この系は、補助細胞の存在を必要としないさらなる利点を有しており、このことは、補助細胞が限られているか、またはない臨床状態で有利となり得る。
【００７６】
実施例２：ウシ胎児血清を含有する培地における抗-ＣＤ２８-処理Ｔ細胞の長期培養
ＣＤ２８受容体刺激の優勢な増殖が、ウシ胎児血清に通常存在する因子の置換によるものか否かを、もう１つの一連の実験で試験した。Ｔ細胞は、正常な供与者のロイコフェレーシスから得、フィコールＴＭ(FICOLLＴＭ)密度勾配遠心に続く磁性免疫ビーズソートで精製した。得られたＣＤ２８+、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、当該細胞をプラスチック-吸着ＯＫＴ３を含有する培養皿に添加することによって、培地(１０％熱-不活化ウシ胎児血清[ユタ州、ローガン(Ｌogan,Ｕtha)のハイクロン(Ｈyclone)社]およびゲンタマイシンおよびＬ-グルタミンを含有するＲＰＭＩ-１６４０)中、初期密度２.０×１０６/ｍlで培養した。４８時間後に、細胞を取り出し、ｈＩＬ-２(１０％最終濃度、カルバイオケム(ＣalＢiochem)社)または抗-ＣＤ２８ｍＡｂ９.３(８００ｎｇ/ｍl)のいずれかを含有するフラスコに入れた。必要に応じて、細胞に新たな培地を補給し、細胞密度を０.５×１０６/ｍlに維持し、プラスチック吸着抗-ＣＤ３ｍＡｂ上で２４時間培養することによっておよそ１週間間隔で再刺激した。
【００７７】
図２に示すごとく、細胞は、培養の最初の３週間と同等の培養速度にて、対数増加期に入った。しかしながら、ＩＬ-２補給細胞が〜４.０log１０増殖の後に定常期に入っているのに対して、抗-ＣＤ３培養物は培養第４週目の間に増殖速度が分かれ始めた。それに対して、抗-ＣＤ２８の存在下で増殖させた培養物は、〜５.１１log１０増殖となっている時期である培養第５週目まで、対数増加期のままであった。従って、ＣＤ２８刺激が初期培養物の〜１２５,０００-倍増殖となるのに対して、ＩＬ-２補給は１０,０００-倍増殖の細胞となった。
【００７８】
実施例３：ホルボールエステル、イオノマイシンおよび抗-ＣＤ２８-刺激Ｔ細胞におけるＴ細胞の長期培養
Ｔ細胞を活性化させる別法においてもＣＤ２８刺激増殖が可能か否かをさらなる実験で試験した。ＰＭＡおよびイオノマイシンでのＴ細胞の薬理学的活性化は、ＴＣＲ/ＣＤ３複合体を介したＴ細胞の抗原受容体誘発を模倣すると考えられる。Ｔ細胞は、正常な供与者のロイコフェレーシスから得、一連のフィコールＴＭ(FICOLLＴＭ)およびパーコールＴＭ(PERCOLLＴＭ)密度勾配遠心に続く磁性免疫ビーズソートによって精製した。得られたＣＤ２８+、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ミリスチン酸ホルボール(ＰＭＡ  ３ｎｇ/ｍl、シグマ(Ｓigma)社)およびイオノマイシン(１２０ｎｇ/ｍl、カルバイオケム(Ｃalbiochem)社、ロット＃３７１０２３２)を含有する培養皿に細胞を添加することによって、初期密度２.０×１０６/ｍlで培養した。２４時間後に、細胞を０.５×１０６/ｍlに希釈し、ｒＩＬ-２(５０ＩＵ/ｍl、ベーリンガー・マンハイム(Ｂoerhinger Ｍannheim)社、ロット＃１１８４４９００)または抗-ＣＤ２８ｍＡｂ(１μｇ/ｍl)のいずれかを含有するフラスコに入れた。必要に応じて、細胞に新たな培地を補給して細胞密度を０.５×１０６/ｍlに維持し、ＰＭＡおよびイオノマイシンを添加することによって、およそ１週間おきに周期的に再刺激した。新たなＩＬ-２は、１日おきにＩＬ-２含有培養物に添加した。
【００７９】
この実験の結果を図３に示す。補助細胞を精製したＴ細胞は、その細胞数において、ＩＬ-２を含有するか、またはしないかのＰＭＡ(図中の「Ｐ」)およびイオノマイシン(図中の「Ｉ」)の存在下で増殖しなかった。サイズ分析によって示されたごとく細胞が凝集し、増殖することは、細胞が誘導されて細胞周期のＧ１期には入るが、ＤＮＡ合成および細胞分裂には進行しないことを示している。それに対して、ＣＤ２８ｍＡｂをＰＭＡ＋イオノマイシン処理細胞に添加すると、対数的な細胞増殖を起こした。従って、Ｔ細胞活性化を提供するのに抗-ＣＤ３ｍＡｂを要しない。ブリオスタチンまたはジアシルグリセロールのごとき、プロテインキナーゼＣの他のアクチベーターを、ＰＭＡの替わりに用いることもできることは理解されるべきである。
【００８０】
実施例４：抗-ＣＤ３と共に培養した細胞の免疫表現型ＩＬ-２または抗-ＣＤ２８ｍＡｂの刺激および添加
増殖したサブセットのＴ細胞を検査するために、抗-ＣＤ３およびＩＬ-２、または抗-ＣＤ３および抗-ＣＤ２８のいずれかを用いて、ＰＢＬを１６日間増殖させた。図４は、末梢血液リンパ球からの選択性に富んだＣＤ４細胞を証明している。単球細胞は、フィコール・ハイパーク(hypaque)密度勾配遠心によって血液から単離した。細胞をＣＤ４およびＣＤ８モノクローナル抗体で染色し、０日目の％ポジティブ細胞に関して分析した。次いで、細胞を、抗-ＣＤ３モノクローナル抗体Ｇ１９-４固定化プラスチック＋ＩＬ-２、または抗-ＣＤ３モノクローナル抗体Ｇ１９-４＋抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３(０.５μｇ/ｍl)固定化プラスチック上で培養した。細胞は、１６日目に培養物から単離し、フロー・サイトメトリーによってＣＤ４およびＣＤ８抗原についての繰り返し染色を行った。データは、通したリンパ球集団の前方散乱光および側散乱光である。この分析によって、ＩＬ-２中で増殖させた細胞中の％ＣＤ４およびＣＤ８細胞は８.０％および８４.５％であり、ＣＤ２８中で増殖させたそれらは４４.６％および５２.２％であった。これらの結果は、ＩＬ-２中で増殖させた細胞においてはＣＤ８+細胞が優勢であるとのよく確立された知見(例えば、ディイ・エイ・カントレル(Ｄ.Ａ.Ｃantrell)およびケイ・エイ・スミス(Ｋ.Ａ.Ｓmith)、(１９８３年)、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(Ｊ.Ｅxp.Ｍed.)第１５８巻:１８９５頁、ならびにガルバーグ,エム(Ｇullberg,Ｍ.)およびケイ・エイ・スミス(Ｋ.Ａ.Ｓmith)(１９８６年)ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(Ｊ.Ｅxp.Ｍed.)第１６３巻、２７０頁)とは反対に、ＣＤ２８増殖がＣＤ４＋細胞を好むことを示している。
【００８１】
この可能性をさらに試験するために、前記のモノクローナル抗体および磁性免疫ビーズでのネガティブ選抜を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を９８％純度まで高めた。蛍光活性化細胞ソート(ＦＡＣＳ)分析を用いて、抗-ＣＤ３および抗-ＣＤ２８と共に培養したＴ細胞の表現型を検査した。細胞は、遠心によってペレット化し、ＰＢＳ/１％ＢＳＡ中に再懸濁した。次いで、この工程を２回繰り返すことによって、細胞を洗浄した。細胞をペレット化し、１００μlの一次抗体溶液中に再懸濁し、激しく撹拌し、１時間氷上に保持した。ＰＢＳ/１％ＢＳＡで２回洗浄した後に、細胞を１００μlのフルオレセイン-標識ヤギ-抗-マウスＩgＧ中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。このインキュベート終了時に、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒド５００μl中に再懸濁した。標識細胞は、オルト・サイトフルオログラフ(Ｏrtho Ｃytofluoro-graph)上で分析した。単離後または培養２６日後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３(Ｌeu-４)、ＣＤ４(Ｌeu-３Ａ)、ＣＤ８(ＯＫＴ８)、またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体細胞で細胞を染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した。抗-ＣＤ３、およびＩＬ-２または抗-ＣＤ２８のいずれかを用いて細胞を１ヶ月間培養し、細胞を増殖させた。培養の初めの２６日間は同等な細胞増殖であったが(示さず)、しかしながら、図５に示すごとく、培養２６日までに、抗-ＣＤ２８培養物中の優勢な細胞がＣＤ４＋であるのに対して、ＩＬ-２培養物中の優勢な細胞はＣＤ８+であるように、時間の経過に伴って細胞の表現型が進行的に分かれた。従って、恐らくは架橋によるＣＤ２８受容体刺激によってＣＤ４表現型のＴ細胞を選択的に増殖できるのに対して、イン・ビトロ(in vitro)Ｔ細胞培養の従来法ではＣＤ８表現型の細胞が得られた。さらなる実験を行っても同様な結果が得られたことは、初期混合細胞集団のＣＤ２８刺激により優勢的または独占的にＣＤ４Ｔ細胞を含有する培養を得ることができ、従って、限定された量で最初に存在したＣＤ４細胞を増殖でき、「救出」することができる。
【００８２】
実施例５：Ｔ細胞増殖をモニターするための細胞サイジングまたはＣＤ４＋Ｔ細胞上の周期発現Ｂ７の使用
Ｔ細胞再刺激の時間を測定するために、コールター(Ｃoulter)と接続したコールター・カウンター(Ｃoulter Ｃounter)ＺＭを用いて細胞容量の変化をモニターした。ＣＤ２８+、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、磁性免疫選抜によって記載したごとく単離し、抗-ＣＤ２８ｍＡｂ９.３(０.５μｇ/ｍｇ)の存在下で培養し、示したプラスティック固定化抗-ＣＤ３モノクローナル抗体Ｇ１９-４で再刺激した。図９は、実施例１に記載したごとく実質的に行った６回の連続した再刺激(「S１」〜「S6」)の間に、細胞容量の変化を証明している。簡単には、細胞を抗-ＣＤ３および抗-ＣＤ２８と共に培養し３週間以上増殖させる。細胞は、抗-ＣＤ３抗体での各々の再刺激時に新たな培地に変えた。刺激は、１０日間隔の間隔を置いて行った。細胞容量が＜４００flまで減少した場合に細胞を再刺激する。
【００８３】
もう１つの実験において、Ｂ７-１抗原の周期発現を用いて、Ｔ細胞刺激の時期を測定した。図１０に示す実験から得た細胞は、(レプリゲン・コーポレイション(Ｒepligen Ｃorporation)社から得た；また、リンスリー,ピイ・エス(Ｌinsley,Ｐ.Ｓ.)ら(１９９１年)ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(Ｊ.Ｅxp.Ｍed.)第１７４巻、５６１-５６９頁も参照)ＣＴＬＡ-４Ig融合蛋白質で染色し、フロー・サイトメトリーによって分析してＢ７-１受容体発現を測定した。ＣＤ４＋細胞は最初にＢ７-１受容体を発現しておらず、培養によって発現が誘導されることが測定された。さらに、Ｂ７-１発現は経時的であって、繰り返し抗-ＣＤ３再刺激で再-誘導されることが判明した。
【００８４】
実施例６：抗-ＣＤ２８刺激後のＴ細胞によるサイトカインの産生
抗-ＣＤ２８刺激後のＴ細胞によって産生されるサイトカインを分析するために実験を行った。ＣＤ２８+/ＣＤ４＋Ｔ細胞は以前の例に記載したごとく単離した。細胞は、プラスチック固定化抗-ＣＤ３ｍＡｂおよびＩＬ-２(２００Ｕ/ｍl)、またはリンホカインを添加していない抗-ＣＤ３および抗-ＣＤ-２８で刺激した。実施例５に記載したごとく細胞の変化容量の変化により測定したように、細胞を抗-ＣＤ３抗体で再刺激した。細胞培養物上清を示した時点で取り出し、ＩＬ-２(図１１)、ＧＭ-ＣＳＦ(図１２)およびＴＮＦ-α(図１３)につき分析した。ＩＬ-２はＣＴＬＬ-２上のバイオアッセイによって測定したが、ＴＮＦ-αおよびＧＭ-ＣＳＦは製造業者の指示書(ＴＮＦα、ＧＭ-ＣＳＦ：ミネソタ州、ミネアポリス(Ｍinneapolis,ＭＮ)のアール・アンド・ディイ・システムズ(Ｒ＆Ｄ Ｓustems)社)に従ってＥＬＩＳＡによって測定した。種々のサイトカインについて示したデータは、別の実験からのものである。もう１つの実験において、これらのＩＬ-４およびＩＬ-５は培養初期には少量しか存在しないにも拘わらず、抗-ＣＤ３＋抗-ＣＤ２８刺激がおよそ培養１０日後の培養物上清で高レベルのこれらのサイトカインを引き起こすことが示された(示さず)。
【００８５】
実施例に記載したプロトコールに従った幾つかの再刺激により増殖させた細胞でのサイトカイン分泌のパターンを、培養３週間にわたり抗-ＣＤ３＋ＩＬ-２で増殖させた細胞と比較した。細胞は、抗-ＣＤ３抗体で再刺激する度に新たな培地に交換した。刺激は１０日間隔を空けた。さらに２４時間培養した後に、アリコートの細胞培養物上清をアッセイ用に取り出した。個々のサイトカインについてのＥＬＩＳＡアッセイは、種々の供給業者からのキット(ＩＬ-２：マサチューセッツ州、ケンブリッジ(Ｃambridge,ＭＡ)のＴセル・ダイアグノスティクス(Ｔ Ｃell Ｄiagnostics)社；ＩＮＦ-γ:マサチューセッツ州、ボストン(Ｂoston,ＭＡ)のエンドジェン・インコーポレイテッド(Ｅndogen,Ｉnc)社；ＩＬ-４、ＴＮＦα、ＧＭ-ＣＳＦ：ミネソタ州、ミネアポリス(Ｍinneapolis,ＭＮ)のアール・アンド・ディ・システムズ(Ｒ＆Ｄ Ｓystems)社)で、そのキットに付されている指示書に従って行った。表２に示す代表的な実験の結果から明らかなように、２つのプロトコールは、同様なレベルのＩＬ-２およびＩＬ-４分泌を起こした。抗-ＣＤ３および抗-ＣＤ２８同時刺激での高レベルのＧＭ-ＣＦＳおよびＴＮＦ-α分泌は、この組合せの刺激の増殖能力が、部分的に、自己溶解回路を刺激するその能力に起因するかも知れないことを示している。
【００８６】
【表４】
2004267220.tif 000005
【００８７】
実施例７：抗-ＣＤ２８刺激後のＴ細胞のポリクローナル性
前の実施例に記載した、抗-ＣＤ３および抗-ＣＤ２８抗体で刺激した後のＴ細胞集団のポリクローナル性を測定した。ＣＤ２８+/ＣＤ４＋Ｔ細胞は、前の実施例に記載したごとく単離した。細胞を、プラスチック固定化抗-ＣＤ３ｍＡｂおよび抗-ＣＤ２８ｍＡｂで刺激し、ファルミンゲン(Ｐharmingen)社から得た一連の抗-ＴＣＲ抗体(Ｖβ５ａ、Ｖβ５ｂ、Ｖβ５ｃ、Ｖβ６ａ、Ｖβ８ａ、Ｖβ１２ａおよびＶα２ａ)を用いて実質的に実施例４に記載のごとくＦＡＣＳ分析を行った。Ｔ細胞集団のポリクローナル性は、刺激前(１日目)および刺激後(２４日目)に測定した。図１４に示すごとく、ＣＤ２８を通して刺激したＴ細胞集団のＴＣＲ多様性は、２４日目に維持されていた。
【００８８】
実施例８：抗-ＣＤ２８刺激後のＨＩＶ＋およびＨＩＶ−個人からのＴ細胞の細胞表面染色性の比較
前の実施例に記載した方法に従って増殖させたＨＩＶ血清型ポジティブおよび血清型ネガティブの個人からの細胞上の種々のＴ細胞表面マーカーの発現性を測定するために、もう１つの一連の実験を行った。ＣＤ２８+/ＣＤ４＋Ｔ細胞は本明細書に記載したごとく得た。これらの実験において、抗-ＣＤ３ｍＡｂを(例えば、ローダミンで)一次標識し、(例えば、抗-ＣＤ２８、抗-ＣＤ４、抗-ＣＤ８のような)適当な二次抗体を(例えば、フルオレセインのような)二次標識で標識した。Ｔ細胞は、プラスチック固定化抗-ＣＤ３ｍＡｂおよび抗-ＣＤ２８ｍＡｂで本明細書に記載したごとく刺激し、異なった刺激時(すなわち、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４)の種々の細胞表面マーカーを発現しているＴ細胞のパーセント(％)をＦＡＣＳ分析によって測定した。図１５および１６に示すごとく、ＨＩＶ血清型ポジティブおよび血清型ネガティブの個人から得たＴ細胞上の全体の細胞表面マーカーの分布は、刺激アッセイを通してほぼ同一であった。天然のＴ細胞のマーカーである、１つの細胞表面マーカーＣＤ４５ＲＡの存在が、ＣＤ２８刺激Ｔ細胞増殖にわたり減少することは注目すべきである。それに対して、メモリーＴ細胞表面マーカーであるＣＤ４５ＲＯを発現するＴ細胞の％は、ＣＤ２８刺激により増加する。従って、ＣＤ２８刺激を通したＴ細胞増殖は、優先的にメモリーＴ細胞を増殖させ、または天然Ｔ細胞をメモリーＴ細胞に転換する。ＣＤ２８を発現するＴ細胞の％における減少が、アッセイを通したＴ細胞培養の抗-ＣＤ２８抗体の存在による実験の人為的なものであることは注意すべきである。抗-ＣＤ２８抗体が存在すると、ＣＤ２８抗原の染色性が阻害される。
【００８９】
実施例９：抗-ＣＤ３およびモノクローナル抗体２Ｄ８でのＣＤ８+Ｔ細胞の長期培養
抗-ＣＤ３ｍＡｂおよびモノクローナル抗体２Ｄ８で刺激することによってＣＤ８+Ｔ細胞を優先的に増殖させることができるか否かを判断するために実験を行った。ＣＤ２８Ｔ＋細胞は、実施例１に記載したごとく実質的に得た。ＣＤ８発現性をアッセイするために、一次抗-ＣＤ８抗体および標識した適当な二次抗体をＦＡＣＳ分析に用いて、％ポジティブ細胞を測定した。図１７に示すごとく、抗-ＣＤ３ｍＡｂＧ１９-４ｓｐおよびｍＡｂ ２ｄ８でＴ細胞を刺激した７日後に、ＣＤ８+画分が約２０％から４０％以上まで増加した。(７Ｇ１１と呼ばれる)もう１つのモノクローナル抗体ＥＲ４.７Ｇ１１も、ＣＤ８+Ｔ細胞を刺激することが判明した。この抗体は、組換えヒトＣＴＬＡ４に対して産生したものであって、受託番号            で１９９４年６月３日にＡＴＣＣに寄託している。この結果は、異なる領域のＣＴＬＡ４または交差反応性の細胞表面蛋白質のいずれかの結合が、ＣＤ８+Ｔ細胞を選択的に活性化することを示している。
【００９０】
実施例１０：モノクローナル抗体２Ｄ８のエピトープの明確化
モノクローナル抗体２Ｄ８のエピトープを決定するために、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー(ＰＤＬ)スクリーニングによってエピトープ・マッピングを行い、合成ペプチドを用いて確認した。変性オリゴヌクレオチドをクワイラ,エス・イイ(Ｃwirla,Ｓ.Ｅ.)ら(１９９０年)プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８７巻：６３７８-６３８２頁に記載のごとく、ｆＵＳＥ５ベクターにクローン化することによって、ランダムな２０個のアミノ酸ＰＤＬを調製した(スコット,ジェイ・ケイ(Ｓcott,Ｊ.Ｋ.)およびスミス,ジイ・ピイ(Ｓmith,Ｇ.Ｐ.)(１９９０年)サイエンス(Ｓcience)第２４９巻：３８６-３９０頁)。ＰＤＬを用いて、ジェリス,シイ・エル(Ｊellis,Ｃ.Ｌ.)ら(１９９３年)ジーン(Ｇene)第１３７巻：６３-６８頁に記載されているミクロパニング(micropanning)技術によりｍＡｂ２Ｄ８に特異的に結合する短鎖ペプチドを同定した。個々のファージクローンを、固定化ｍＡｂに対するそのアフィニティーによってライブラリーから精製し、ランダムなペプチドをＤＮＡシークエンシングによって同定した。簡単には、ｍＡｂ ２Ｄ８をヌンク・マキシソープ(Ｎunc Ｍaxisorp)９６穴プレート上にコートし、ランダムな２０個のアミノ酸ペプチドを示している８×１０６個の異なったファージに代表される５×１０１０のファージと共にインキュベートした。特異的に結合するファージを溶出し、増幅させ、次いで抗体と共に２回目のインキュベートを行った。３ラウンド後に、７個のファージを単離し、シークエンシング用にＤＮＡを調製した。
【００９１】
これらのクローンの配列分析により、７配列のうち３つが同一であり、４つ目は類似していた：
【００９２】
【表５】
2004267220.tif 000006
【００９３】
このデータに基づいてＧＸＷＬＸＤ/Ｅ(配列番号：５)のエピトープが提唱された。
【００９４】
同等のもの
当業者であれば、本明細書に記載した特定の本発明の具体例に多数の同等なものがあることは認識でき、またはただ日常の実験を用いるだけで確認できるであろう。かかる同等のものも、以下の請求の範囲により包含されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、抗-ＣＤ３抗体およびインターロイキン-２(ＩＬ-２)(黒塗り円形)、抗-ＣＤ３抗体および抗-ＣＤ２８抗体ｍＡｂ９.３(白抜き菱形)、またはＰＨＡのみ(白抜き三角形)のいずれかを含有する培養に反応してのＣＤ４＋末梢血液Ｔ細胞のイン・ビトロ(in vitro)増殖曲線を描いている。
【図２】図２は、ウシ胎児血清と、抗-ＣＤ３抗体およびＩＬ-２(黒塗り円形)または抗-ＣＤ３抗体および抗-ＣＤ２８抗体ｍＡｂ９.３(白抜き菱形)のいずれかとの中で培養したＣＤ４＋末梢血液Ｔ細胞の増殖曲線を描いている。
【図３】図３は、ＩＬ-２を含有するかまたは含有しない、または抗-ＣＤ２８抗体ｍＡｂ９.３を含有するミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）およびイオノマイシンの存在下で培養したＣＤ４＋末梢血液Ｔ細胞の増殖曲線を描いている。符号は以下の通りである：ＰＭＡおよびイオノマイシン(Ｐ＋Ｉ)は(白抜き四角)によって表す；ＰＭＡ、イオノマイシンおよびＩＬ-２(Ｐ＋Ｉ＋ＩＬ-２)は(黒塗り円形)によって表す；およびＰＭＡ、イオノマイシンおよび抗-ＣＤ２８抗体(Ｐ＋Ｉ＋９.３)は(黒塗り菱形)によって表す。
【図４】図４は、ＩＬ-２で刺激したＴ細胞と比較しての、ＣＤ２８刺激後のＣＤ４＋Ｔ細胞の選択的な増殖の模式図である。
【図５Ａ】図５Ａは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｂ】図５Ｂは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｃ】図５Ｃは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｄ】図５Ｄは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｅ】図５Ｅは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｆ】図５Ｆは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｇ】図５Ｇは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｈ】図５Ｈは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｉ】図５Ｉは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｊ】図５Ｊは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｋ】図５Ｋは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図５Ｌ】図５Ｌは、単離後(０日目、パネルＡ)、またはＣＤ２８刺激(パネルＢ)もしくはＩＬ-２培養(パネルＣ)のいずれかと共に培養２６日した後に、フィコエリスリン結合抗-ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＩgＧ２a対照モノクローナル抗体で染色し、フロー・サイトメーターで蛍光定量した細胞の蛍光活性化細胞ソーター分析(ＦＡＣＳ)を描いている。
【図６Ａ】図６Ａは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｂ】図６Ｂは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｃ】図６Ｃは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｄ】図６Ｄは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｅ】図６Ｅは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｆ】図６Ｆは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｇ】図６Ｇは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｈ】図６Ｈは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｉ】図６Ｉは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｊ】図６Ｊは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｋ】図６Ｋは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図６Ｌ】図６Ｌは、抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体９.３に比しての、ＣＤ２８と反応性を示すＥＸ５.３Ｄ１０モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す。以下の細胞系を試験した；パネルＡ、未トランスフェクトＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-ＨＨ細胞；パネルＣ、未活化末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ジャーカット(Ｊurkat)番号７細胞。
【図７Ａ】図７Ａは、以下の細胞系との結合反応性を示すＥＳ５.２Ｄ８モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す；パネルＡ、ＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-１０５Ａ細胞；パネルＣ、未活性化ヒト末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ＰＭＡ活性化末梢血液リンパ球。
【図７Ｂ】図７Ｂは、以下の細胞系との結合反応性を示すＥＳ５.２Ｄ８モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す；パネルＡ、ＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-１０５Ａ細胞；パネルＣ、未活性化ヒト末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ＰＭＡ活性化末梢血液リンパ球。
【図７Ｃ】図７Ｃは、以下の細胞系との結合反応性を示すＥＳ５.２Ｄ８モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す；パネルＡ、ＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-１０５Ａ細胞；パネルＣ、未活性化ヒト末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ＰＭＡ活性化末梢血液リンパ球。
【図７Ｄ】図７Ｄは、以下の細胞系との結合反応性を示すＥＳ５.２Ｄ８モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す；パネルＡ、ＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-１０５Ａ細胞；パネルＣ、未活性化ヒト末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ＰＭＡ活性化末梢血液リンパ球。
【図７Ｅ】図７Ｅは、以下の細胞系との結合反応性を示すＥＳ５.２Ｄ８モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す；パネルＡ、ＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-１０５Ａ細胞；パネルＣ、未活性化ヒト末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ＰＭＡ活性化末梢血液リンパ球。
【図７Ｆ】図７Ｆは、以下の細胞系との結合反応性を示すＥＳ５.２Ｄ８モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す；パネルＡ、ＣＨＯ-ＤＧ４４細胞；パネルＢ、ＣＨＯ-１０５Ａ細胞；パネルＣ、未活性化ヒト末梢血液リンパ球；およびパネルＤ、ＰＭＡ活性化末梢血液リンパ球。
【図８】図８は、モノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８が２７ｋＤの細胞表面蛋白質と反応することを示す、表面標識ヒト活性化Ｔ細胞の活性剤溶解物の免疫沈降分析を描いている写真である。
【図９】図９は、培養期間にわたり抗-ＣＤ３モノクローナル抗体および抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激(Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５およびＳ６)した後のＣＤ４＋Ｔ細胞の平均細胞容量における増加を描いている。
【図１０】図１０は、培養期間にわたり抗-ＣＤ３モノクローナル抗体および抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激(Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５およびＳ６)した後のＣＤ４＋Ｔ細胞上のＢ７-１の周期的発現を描いている。
【図１１】図１１は、培養期間にわたり抗-ＣＤ３モノクローナル抗体および抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体またはＩＬ-２で刺激した後にＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生されたＩＬ-２の量を描いている棒グラフである。
【図１２】図１２は、培養期間にわたり抗-ＣＤ３モノクローナル抗体および抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体またはＩＬ-２で刺激した後にＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生された顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)の量を描いている棒グラフである。
【図１３】図１３は、培養期間にわたり抗-ＣＤ３モノクローナル抗体および抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体またはＩＬ-２で刺激した後にＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生された腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)の量を描いている棒グラフである。
【図１４】図１４は、培養１日目および２４日目に抗-ＣＤ３モノクローナル抗体および抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激した後のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体(ＴＣＲ)多様性を描いている棒グラフである。
【図１５】図１５は、培養期間にわたり抗-ＣＤ３モノクローナル抗体および抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激(Ｓ１、Ｓ２およびＳ３)した後のＨＩＶ血清型ネガティブの個人から得たＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面染色性を描いている。
【図１６】図１６は、培養期間にわたり抗-ＣＤ３モノクローナル抗体および抗-ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激(Ｓ１、Ｓ２およびＳ３)した後のＨＩＶ血清型ポジティブの個人から得たＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面染色性を描いている。
【図１７】図１７は、培養４日目および７日目に抗-ＣＤ３モノクローナル抗体およびモノクローナル抗体ＥＳ５.２Ｄ８で刺激した後のＣＤ８+Ｔ細胞の増殖性を描いている。
【図１】
2004267220.tif 000007
【図２】
2004267220.tif 000008
【図３】
2004267220.tif 000009
【図４】
2004267220.tif 000010
【図５Ａ】
2004267220.tif 000011
【図５Ｂ】
2004267220.tif 000012
【図５Ｃ】
2004267220.tif 000013
【図５Ｄ】
2004267220.tif 000014
【図５Ｅ】
2004267220.tif 000015
【図５Ｆ】
2004267220.tif 000016
【図５Ｇ】
2004267220.tif 000017
【図５Ｈ】
2004267220.tif 000018
【図５Ｉ】
2004267220.tif 000019
【図５Ｊ】
2004267220.tif 000020
【図５Ｋ】
2004267220.tif 000021
【図５Ｌ】
2004267220.tif 000022
【図６Ａ】
2004267220.tif 000023
【図６Ｂ】
2004267220.tif 000024
【図６Ｃ】
2004267220.tif 000025
【図６Ｄ】
2004267220.tif 000026
【図６Ｅ】
2004267220.tif 000027
【図６Ｆ】
2004267220.tif 000028
【図６Ｇ】
2004267220.tif 000029
【図６Ｈ】
2004267220.tif 000030
【図６Ｉ】
2004267220.tif 000031
【図６Ｊ】
2004267220.tif 000032
【図６Ｋ】
2004267220.tif 000033
【図６Ｌ】
2004267220.tif 000034
【図７Ａ】
2004267220.tif 000035
【図７Ｂ】
2004267220.tif 000036
【図７Ｃ】
2004267220.tif 000037
【図７Ｄ】
2004267220.tif 000038
【図７Ｅ】
2004267220.tif 000039
【図７Ｆ】
2004267220.tif 000040
【図８】
2004267220.tif 000041
【図９】
2004267220.tif 000042
【図１０】
2004267220.tif 000043
【図１１】
2004267220.tif 000044
【図１２】
2004267220.tif 000045
【図１３】
2004267220.tif 000046
【図１４】
2004267220.tif 000047
【図１５】
2004267220.tif 000048
【図１６】
2004267220.tif 000049
【図１７】
2004267220.tif 000050
【配列表】
2004267220000001.app