(57)【要約】【課題】肝不全患者等の治療方法や生物学的医薬品として有望な肝幹細胞の増殖方法を提供する。【解決手段】肝幹細胞に肝細胞増殖因子を添加する。【選択図】図１
2004135578.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝幹細胞に肝細胞増殖因子を添加する、肝幹細胞の増殖方法。
【請求項２】
請求項１に記載の肝幹細胞の増殖方法により得られた肝幹細胞を肝細胞に分化させる、肝細胞の増殖方法。
【請求項３】
請求項１に記載の肝幹細胞の増殖方法により得られた肝幹細胞を肝臓に供給し、前記肝臓内において、肝細胞に分化させる、肝細胞の増殖方法。
【請求項４】
肝不全の肝臓組織を採取し、前記採取した肝臓組織中から肝幹細胞を抽出し、前記抽出した肝幹細胞に肝細胞増殖因子を添加し、肝幹細胞を増殖させた後、増殖させた肝幹細胞を門脈内に注入することで、肝臓内において肝細胞に分化させる、肝細胞の増殖方法。
【請求項５】
肝臓組織から採取した肝幹細胞を肝細胞増殖因子で増殖させた肝幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝不全患者等の治療方法や生物学的医薬品として有望な肝幹細胞の増殖方法及び肝細胞の増殖方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、成熟肝細胞の増殖だけでなく、細胞の運動を促進させたり、血管や肺、腎臓などの再生を促す因子として知られている。
【０００３】
また、本発明にとって興味のある技術としては、脂肪前駆細胞に、肝細胞増殖因子を添加すると、脂肪前駆細胞の数が増加することが、特開２００１−３１６２８５号公報に記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、既に患者が肝不全に罹患している場合には、このような患者から肝細胞（成熟細胞）を採取し、採取した肝細胞に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加しても肝細胞が増殖しない、という問題がある。
【０００５】
本発明は、以上のような問題を解決するためになされたものであって、既に患者が肝不全に罹患している場合にも、肝細胞を増殖させることができる、肝幹細胞の増殖方法、肝細胞の増殖方法及び肝幹細胞を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、長年、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の研究及び肝不全の治療方法に従事してきたが、近時、肝幹細胞（好ましくは、肝ｏｖａｌ細胞）が、成熟肝細胞に分化し、肝機能の保持に寄与していることに着目し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が、肝幹細胞（好ましくは、肝ｏｖａｌ細胞）の増殖をさせるのではないか、と考え、鋭意努力した結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、請求項１に記載の肝幹細胞の増殖方法は、肝幹細胞に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加する。
【０００８】
この肝幹細胞の増殖方法は、本発明者の実験による、肝細胞増殖因子が肝幹細胞の増殖を促進する、という知見に基づいてなされたものである。なお、実験例の詳細は、発明の実施の形態の欄において詳細に説明するので、ここでの説明は、省略する。
【０００９】
請求項２に記載の肝細胞の増殖方法は、請求項１に記載の肝幹細胞の増殖方法により得られた肝幹細胞を肝細胞に分化させる。
【００１０】
肝幹細胞は、成熟肝細胞に分化する。従って、肝幹細胞を増殖させれば、増殖させた肝幹細胞と概ね正の関係で、肝細胞を増殖させることができる。
【００１１】
請求項３に記載の肝細胞の増殖方法は、請求項１に記載の肝幹細胞の増殖方法により得られた肝幹細胞を肝臓に供給し、肝臓内において、肝細胞に分化させる。
【００１２】
肝臓内において、肝幹細胞は、成熟肝細胞に分化する。従って、生体外で、増殖させた肝幹細胞を肝臓に供給すれば、肝臓内で、肝幹細胞が成熟肝細胞に分化し、肝臓内において肝臓に供給された肝幹細胞と概ね正の関係で、肝臓において肝細胞を増殖させることができる。
【００１３】
請求項４に記載の肝細胞の増殖方法は、肝不全の肝臓組織を採取し、採取した肝臓組織中から肝幹細胞を抽出し、抽出した肝幹細胞に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加し、肝幹細胞を増殖させた後、増殖させた肝幹細胞を門脈内に注入することで、肝臓内において肝細胞に分化させる。
【００１４】
肝不全の患者から取り出した肝臓組織から肝細胞を抽出し、この肝細胞に肝細胞増殖因子を添加しても、肝細胞は増殖は期待できない。
【００１５】
これに対し、本発明者は、肝不全動物から取り出した肝臓組織から肝幹細胞を抽出し、この肝幹細胞に肝細胞増殖因子を添加した場合は、肝幹細胞が増殖することを見出した。
【００１６】
従って、この肝細胞の増殖方法は、例えば、肝不全の動物から肝臓組織を取り出し、生体外において、肝臓組織中から肝幹細胞を抽出し、生体外において、肝臓組織中から抽出した肝幹細胞に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加し、肝幹細胞を増殖させた後、増殖させた肝幹細胞を門脈内に注入すれば、肝臓において肝幹細胞が肝細胞（成熟細胞）に分化し、肝不全の動物の肝臓を肝臓本来の姿に再生することができる。
【００１７】
即ち、この肝細胞の増殖方法は、臨床分野に適用すれば、肝不全の患者の有望な治療方法や生物学的医薬品となる。
【００１８】
請求項５に記載の肝幹細胞は、肝臓組織から採取した肝幹細胞を肝細胞増殖因子で増殖させた。
【００１９】
この肝幹細胞は、例えば、既に肝不全に陥っている患者から肝臓組織を採取し、そこから肝幹細胞を抽出できれば、その肝幹細胞を生体外で増殖させたものとすることができる。
【００２０】
従って、この肝幹細胞を、肝臓組織を採取した患者の肝臓に門脈内注入などにより戻すようにすれば、肝臓において、肝幹細胞が肝細胞（成熟細胞）に分化することで、肝臓を本来の姿に再生でき得る。また、本人の肝幹細胞を増殖して本人の肝臓に戻すようにすれば、免疫の拒否反応も生じない。
【００２１】
即ち、この肝幹細胞は、生物学的医薬品となり得る。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る肝幹細胞の増殖方法を実験例に基づいて更に詳しく説明する。
【００２３】
まず、コリン欠乏食投与ラットからの肝臓組織を採取し、採取した肝臓組織から肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）より樹立された細胞株を用いた。
【００２４】
次に、フィブロネクチンコート培養皿を使用し、無血清培養条件下で、肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）に、種々の濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（特殊免疫社製、商品名；「ラットＨＧＦ」、分子量：約８５，０００）を添加し、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２の３Ｈ−チミジンの取り込みを測定した。
【００２５】
結果を、図１に示す。
図１は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、１０ｎｇ／ｍｌのリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌ添加した試料における、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のレセプターである、ｃ−Ｍｅｔ蛋白の残基のバンド（図１中、上段）と、ｃ−ＭＥＴ蛋白のチロシン残基のリン酸化量（図１中、下段）との各々を経時的（肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加直後（図１中、「０」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、１５分経過時点（図１中、「１５ｍｉｎ」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、３０分経過時点（図１中、「３０ｍｉｎ」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、６０分経過時点（図１中、「６０ｍｉｎ」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、１２０分経過時点（図１中、「１２０ｍｉｎ」を参照））に測定した測定結果である。
【００２６】
図１より、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加により、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のレセプターである、ｃ−Ｍｅｔ蛋白のチロシン残基のリン酸化の亢進が認められた。
【００２７】
また、図２は、横軸に試料を、また、縦軸に、試験開始後、２４時間から４８時間の２４時間の、３Ｈ−チミジンの取り込み量（ｄｐｍ）を示している。
【００２８】
図２中、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、リコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を無添加の試料を示しており、「１０ｎｇ／ｍＬ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌ添加した試料を示しており、「２０ｎｇ／ｍＬ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌ添加した試料を示しており、「３０ｎｇ／ｍＬ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、３０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌ添加した試料を示しており、「５０ｎｇ／ｍＬ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、５０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌ添加した試料を示しており、また、「７０ｎｇ／ｍＬ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、７０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌ添加した試料を示している。
【００２９】
なお、各々の試料は、添加したリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の濃度が異なる以外は、同じ条件にされている。
【００３０】
また、各試料の培養条件も同じ条件にした。
【００３１】
より詳しく説明すると、各試料の培養条件は、いずれも、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン添加のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ１２溶液、という条件であった。
【００３２】
図２より明らかなように、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の濃度が、３０ｎｇ／ｍｌまでは、添加する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の量が一定の場合には、添加する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の濃度に依存して、３Ｈ−チミジンの取り込み量（ｄｐｍ）が増加することが明らかになった。即ち、この実験により、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）により肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）のＤＮＡ合成亢進が起こることが明らかになった。
【００３３】
更に、ＭＴＴアッセイにより、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、リコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加した後、７２時間の肝幹細胞の細胞数の変化を測定したところ、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、リコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加すれば、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞の細胞数が有意に増加した。
【００３４】
次に、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）の細胞内シグナル伝達系を検討した。
【００３５】
図３は、上記した試料中、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、リコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を５０ｎｇ／ｍＬを　ｍｌ添加した試料の、ＥＲＫ１とＥＲＫ２（図３中、「ＥＲＫ１／２」と表示）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ７０ｓ６ｋ及びβ−ａｃｔｉｎ（内部コントロール）の各々のリン酸化量を経時的（肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加直後（図３中、「０」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、１５分経過時点（図３中、「１５ｍｉｎ」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、３０分経過時点（図３中、「３０ｍｉｎ」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、６０分経過時点（図３中、「６０ｍｉｎ」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、１２０分経過時点（図３中、「１２０ｍｉｎ」を参照））に測定した測定結果である。
【００３６】
なお、図３中、ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ７０ｓ６ｋの前の、円内にＰを表したマークは、ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ７０ｓ６ｋの各々のリン酸化量を見ていることを明らかにするために付したものである。
【００３７】
図３より、肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の刺激により、ＥＲＫ１とＥＲＫ２（図３中、「ＥＲＫ１／２」と表示）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ７０ｓ６ｋがリン酸化され、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化が認められないことが明らかになった。
【００３８】
また、図４は、肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を投与するとともに、ＥＲＫ１とＥＲＫ２（図４中、「ＥＲＫ１／２」と表示）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ７０ｓ６ｋのインヒビターを、投与した場合の、肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びＥＲＫ１とＥＲＫ２（図４中、「ＥＲＫ１／２」と表示）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）及びｐ７０ｓ６ｋの各々のインヒビターである、Ｕ０１２６、ＬＹ２９４００２及びｒａｐａｍｙｃｉｎを投与後、３０分が経過した時点における、ＥＲＫ１とＥＲＫ２（図４中、「ＥＲＫ１／２」と表示）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ７０ｓ６ｋ及びβ−ａｃｔｉｎ（内部コントロール）の各々のリン酸化量の測定結果である。
【００３９】
図４中、「０」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、リコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を無添加の試料を示しており、「ＨＧＦ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、５０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のみを１０ｍｌ添加した試料を示しており、「ＬＹ２９４００２＋ＨＧＦ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、５０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌと、５０μＭの濃度のＬＹ２９４００２を添加した試料を示しており、「Ｕ０１２６＋ＨＧＦ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、５０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌと、１０μＭ濃度のＵ０１２６とを添加した試料を示しており、「ｒａｐａｍｙｃｉｎ＋ＨＧＦ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、５０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌと、１００ｎＭ濃度のｒａｐａｍｙｃｉｎを添加した試料を示している。
【００４０】
なお、図４では、対比のため、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を無添加の試料（図４中、「０」と表示）、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、５０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のみを１０ｍｌ添加した試料（図４中、「ＨＧＦ」と表示）の３０分経過後のＥＲＫ１とＥＲＫ２（図３中、「ＥＲＫ１／２」と表示）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ７０ｓ６ｋ及びβ−ａｃｔｉｎ（内部コントロール）の各々のリン酸化量も測定した。
【００４１】
また、図４中、ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ７０ｓ６ｋの前の、円内にＰを表したマークは、ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ７０ｓ６ｋの各々のリン酸化量を見ていることを明らかにするために付したものである。
【００４２】
また、各々の試料は、上記した点のみが異なる以外は同じ条件にされている。
【００４３】
また、各試料の培養条件も同じにした。
【００４４】
より詳しく説明すると、各試料の培養条件は、いずれも、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン添加のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ１２溶液、という条件であった。
【００４５】
図４より、肝幹細胞に、ＥＲＫ１とＥＲＫ２のインヒビターである、Ｕ０１２６を肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とともに投与した試料（図４中、「Ｕ０１２６＋ＨＧＦ」と表示）では、肝幹細胞の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の増殖刺激作用は消失することが明らかになった。
【００４６】
また、図４より、肝幹細胞に、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）のインヒビターである、ＬＹ２９４００２を肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とともに投与した試料（図４中、「ＬＹ２９４００２＋ＨＧＦ」と表示）では、肝幹細胞の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の増殖刺激作用は消失することが明らかになった。
【００４７】
また、図４より、肝幹細胞に、ｐ７０ｓ６ｋのインヒビターである、ｒａｐａｍｙｃｉｎを肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とともに投与した試料（図４中、「ｒａｐａｍｙｃｉｎ＋ＨＧＦ」と表示）では、肝幹細胞の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の増殖刺激作用がやや消失することが明らかになった。
【００４８】
また、図５は、横軸に試料を、また、縦軸に、試験開始後、２４時間から４８時間の２４時間の間の、３Ｈ−チミジンの取り込み量（ｄｐｍ）を示している。
【００４９】
図５中、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、リコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を無添加の試料を示しており、「３０ｎｇ／ｍＬ　ＨＧＦ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のみを１０ｍｌ添加した試料を示しており、「ＬＹ２９４００２＋ＨＧＦ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、３０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌと、５０μＭのＬＹ２９４００２とを添加した試料を示しており、「Ｕ０１２６＋ＨＧＦ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、３０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌと、１０μＭの濃度のＵ０１２６とを添加した試料を示しており、また、「ｒａｐａｍｙｃｉｎ＋ＨＧＦ」は、ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、３０ｎｇ／ｍｌの濃度のリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌと、１００ｎＭの濃度のｒａｐａｍｙｃｉｎとを添加した試料を示している。
【００５０】
なお、各々の試料は、上記の条件以外は、同じ条件にされている。
【００５１】
また、各試料の培養条件も同じにした。
【００５２】
より詳しく説明すると、各試料の培養条件は、いずれも、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン添加のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ１２溶液、という条件であった。
【００５３】
図５より、肝幹細胞に、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）のインヒビターである、ＬＹ２９４００２を肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とともに投与した試料（図５中、「ＬＹ２９４００２＋ＨＧＦ」と表示）では、肝幹細胞の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の増殖刺激作用は消失することが明らかになった。
【００５４】
また、図５より、肝幹細胞に、ＥＲＫ１とＥＲＫ２のインヒビターである、Ｕ０１２６を肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とともに投与した試料（図５中、「Ｕ０１２６＋ＨＧＦ」と表示）では、肝幹細胞の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の増殖刺激作用が、やや弱まることが明らかになった。
【００５５】
また、図５より、肝幹細胞に、ｐ７０ｓ６ｋのインヒビターである、ｒａｐａｍｙｃｉｎを肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とともに投与した試料（図５中、「ｒａｐａｍｙｃｉｎ＋ＨＧＦ」と表示）では、肝幹細胞の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の増殖刺激作用が弱まることが明らかになった。
【００５６】
以上の結果から、図６に示すように、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）の細胞内シグナル伝達系は、ＭＥＫ、ＥＲＫを通る伝達系、Ｐ１３Ｋ、ＡＫＴを通る伝達系、及び、Ｐ１３Ｋ、ｐ７０ｓ６ｋを通る伝達系があるが、Ｐ１３Ｋ、ＡＫＴを通る伝達系が主たる伝達系であることが明らかになった。
【００５７】
また、本発明者は、肝不全誘発ラットから肝臓組織を採取し、採取した肝臓組織から肝幹細胞を抽出し、抽出した肝幹細胞に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加することで、ラットの生体外において、肝幹細胞を増殖させ、この増殖させた肝幹細胞を、肝臓組織を採取したラットに門脈内に注入をすることで、このラットの肝臓に供給し、その後の経過を調べた所、門脈内注入後、１４日経過した時点で、ラットの肝臓に肝細胞が増殖することを確かめた。
【００５８】
以上の実験例によって、肝幹細胞に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加すれば、肝幹細胞が増殖することが明らかになった。
【００５９】
また、肝幹細胞は、肝細胞（成熟細胞）に分化する。
【００６０】
従って、肝幹細胞に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加して肝幹細胞を増殖させれば、増殖させた肝幹細胞と概ね正の関係で、肝細胞を増殖させることができる。
【００６１】
また、肝臓内において、肝幹細胞は、成熟肝細胞に分化する。従って、生体外で、増殖させた肝幹細胞を肝臓に供給すれば、肝臓内で、肝幹細胞が成熟肝細胞に分化し、肝臓内において肝臓に供給された肝幹細胞と概ね正の関係で、肝臓において肝細胞を増殖させることができる。
【００６２】
また、肝不全動物から取り出した肝臓組織から肝幹細胞を抽出し、この肝幹細胞に肝細胞増殖因子を添加した場合は、肝幹細胞が増殖することを見出した。
【００６３】
従って、この肝細胞の増殖方法は、例えば、肝不全の動物から肝臓組織を取り出し、生体外において、肝臓組織中から肝幹細胞を抽出し、生体外において、肝臓組織中から抽出した肝幹細胞に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加し、肝幹細胞を増殖させた後、増殖させた肝幹細胞を門脈内に注入すれば、肝臓において肝幹細胞が肝細胞（成熟細胞）に分化し、肝不全の動物の肝臓を肝臓本来の姿に再生することができる。
【００６４】
即ち、この肝細胞の増殖方法は、臨床分野に適用すれば、肝不全の患者の有望な治療方法となる。
【００６５】
また、上記した肝幹細胞の増殖方法（肝幹細胞の製造方法）によって製造される肝幹細胞は、例えば、既に肝不全に陥っている患者から肝臓組織を採取し、そこから肝幹細胞を抽出できれば、その肝幹細胞を生体外で増殖させたものとすることができる、という長所がある。
【００６６】
従って、既に肝不全に陥っている患者から肝臓組織を採取し、そこから肝幹細胞を抽出できれば、その肝幹細胞を生体外で増殖させた肝幹細胞を、肝臓組織を採取した患者の肝臓に門脈内注入などにより戻すようにすれば、肝臓において、肝幹細胞が肝細胞（成熟細胞）に分化することで、肝臓を本来の姿に再生でき得る。また、本人の肝幹細胞を増殖して本人の肝臓に戻すようにすれば、免疫の拒否反応も生じない。
【００６７】
即ち、この肝幹細胞は、生物学的医薬品となり得る。
【００６８】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、請求項１に記載の肝幹細胞の増殖方法に従えば、肝幹細胞を増殖させることができる。
【００６９】
また、肝幹細胞は、成熟肝細胞に分化するので、請求項２に記載の肝細胞の増殖方法において提案するように、請求項１に記載の肝幹細胞の増殖方法により増殖させた肝幹細胞を分化させることで、肝細胞を増殖させることができる。
【００７０】
また、肝臓内において、肝幹細胞は、成熟肝細胞に分化するので、請求項３に記載の肝細胞の増殖方法において提案するように、生体外で、増殖させた肝幹細胞を肝臓に供給すれば、肝臓内で、肝幹細胞が成熟肝細胞に分化し、肝臓内において肝臓に供給された肝幹細胞と概ね正の関係で、肝臓において肝細胞を増殖させることができる。
【００７１】
また、肝不全動物から取り出した肝臓組織から肝幹細胞を抽出し、この肝幹細胞に肝細胞増殖因子を添加した場合は、肝幹細胞が増殖するので、請求項４に記載の肝細胞の増殖方法に提案するように、肝不全の動物から肝臓組織を取り出し、生体外において、肝臓組織中から肝幹細胞を抽出し、生体外において、肝臓組織中から抽出した肝幹細胞に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加し、肝幹細胞を増殖させた後、増殖させた肝幹細胞を門脈内に注入すれば、肝臓において肝幹細胞が肝細胞（成熟細胞）に分化し、肝不全の動物の肝臓を肝臓本来の姿に再生することができる。即ち、この肝細胞の増殖方法は、臨床分野に適用すれば、肝不全の患者の有望な治療方法となる。
【００７２】
また、請求項５に記載の肝幹細胞は、例えば、既に肝不全に陥っている患者から肝臓組織を採取し、そこから肝幹細胞を抽出できれば、その肝幹細胞を生体外で増殖させたものとすることができる。
【００７３】
従って、この肝幹細胞を、肝臓組織を採取した患者の肝臓に門脈内注入などにより戻すようにすれば、肝臓において、肝幹細胞が肝細胞（成熟細胞）に分化することで、肝臓を本来の姿に再生でき得る。また、本人の肝幹細胞を増殖して本人の肝臓に戻すようにすれば、免疫の拒否反応も生じない。
【００７４】
即ち、この肝幹細胞は、生物学的医薬品となり得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、１０ｎｇ／ｍｌのリコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を１０ｍｌ添加した試料における、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のレセプターである、ｃ−Ｍｅｔ蛋白の残基のバンド（図１中、上段）と、ｃ−ＭＥＴ蛋白のチロシンリン酸化量（図１中、下段）との各々を経時的に測定した測定結果である。
【図２】横軸に試料を、また、縦軸に、試験開始後、２４時間から４８時間の２４時間の、３Ｈ−チミジンの取り込み量（ｄｐｍ）を示す図である。
【図３】ラット肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ細胞株ＯＣ／ＣＤＥ２２に、リコンビナント肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を５０ｎｇ／ｍＬを　ｍｌ添加した試料の、ＥＲＫ１とＥＲＫ２（図３中、「ＥＲＫ１／２」と表示）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ７０ｓ６ｋ及びβ−ａｃｔｉｎ（内部コントロール）の各々のリン酸化量を経時的（肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加直後（図３中、「０」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、１５分経過時点（図３中、「１５ｍｉｎ」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、３０分経過時点（図３中、「３０ｍｉｎ」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、６０分経過時点（図３中、「６０ｍｉｎ」を参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）添加後、１２０分経過時点（図３中、「１２０ｍｉｎ」を参照））に測定した測定結果である。
【図４】肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を投与するとともに、ＥＲＫ１とＥＲＫ２（図４中、「ＥＲＫ１／２」と表示）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ７０ｓ６ｋのインヒビターを、投与した場合の、肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びＥＲＫ１とＥＲＫ２（図４中、「ＥＲＫ１／２」と表示）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）及びｐ７０ｓ６ｋの各々のインヒビターである、Ｕ０１２６、ＬＹ２９４００２及びｒａｐａｍｙｃｉｎを投与後、３０分が経過した時点における、ＥＲＫ１とＥＲＫ２（図４中、「ＥＲＫ１／２」と表示）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ７０ｓ６ｋ及びβ−ａｃｔｉｎ（内部コントロール）の各々のリン酸化量の測定結果である。
【図５】横軸に試料を、また、縦軸に、試験開始後、２４時間から４８時間の２４時間の、３Ｈ−チミジンの取り込み量（ｄｐｍ）を示す図である。
【図６】肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の肝幹細胞（この例では、肝ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）の細胞内シグナル伝達系を概略的に説明する説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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