(57)【要約】【課題】本発明は、遺伝性心筋症のモデル動物であるＢＩＯ１４．６ハムスターの眼球における異常の原因を解明し、その原因となっているタンパク質、それをコードする遺伝子、当該遺伝子に関連するオリゴヌクレオチドなどを提供するものである。また、本発明は、成熟ｍＲＮＡの生成における遺伝子のスプライシングに関する分子機構の解明を可能にする基盤を提供するものである。【解決手段】本発明は、ハムスター、好ましくは正常ゴールデンハムスター又はＢＩＯ１４．６ハムスターのβ−クリスタリン、好ましくはβＢ−クリスタリン、より具体的にはβＢ１−クリスタリン、それをコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ、それを増幅するためのプライマー配列、及び塩基の欠損によるスプライシングの制御方法に関する。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常ゴールデンハムスターのβ−クリスタリンをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
β−クリスタリンが、βＢ１−クリスタリンである請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡである請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
β−クリスタリンが、βＢ２−クリスタリンである請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
β−クリスタリンが、βＢ３−クリスタリンである請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
ＢＩＯ１４．６ハムスターのβＢ１−クリスタリンをコードするゲノムＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜６に記載のハムスターのβクリスタリンのＤＮＡを増幅することができるプライマーセット。
【請求項８】
プライマーセットが、βＢ１−クリスタリンのＤＮＡを増幅することができるプライマーセットである請求項７に記載のプライマーセット。
【請求項９】
プライマーセットが、次に示されるオリゴヌクレオチド又はその相補鎖からなる組み合わせである請求項８に記載のプライマーセット。
ＣＲＹＢＢｌＦ　：　ＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＴＣＴＧＣ
ＣＲＹＢＢ１Ｒ　：　ＡＧＧＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＴＧ
【請求項１０】
プライマーセットが、βＢ２−クリスタリンのＤＮＡを増幅することができるプライマーセットである請求項７に記載のプライマーセット。
【請求項１１】
プライマーセットが、次に示されるオリゴヌクレオチド又はその相補鎖からなる組み合わせである請求項１０に記載のプライマーセット。
ＣＲＹＢＢ２Ｆ　：　ＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣ
ＣＲＹＢＢ２Ｒ　：　ＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣ
【請求項１２】
プライマーセットが、βＢ３−クリスタリンのＤＮＡを増幅することができるプライマーセットである請求項７に記載のプライマーセット。
【請求項１３】
プライマーセットが、次に示されるオリゴヌクレオチド又はその相補鎖からなる組み合わせである請求項１２に記載のプライマーセット。
ＣＲＹＢＢ３Ｆ　：　ＴＧＡＣＧＧＴＧＴＡＣＧＡＧＴＴＡＧＡＧ
ＣＲＹＢＢ３Ｒ　：　ＧＡＴＴＣＣＡＣＴＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣ
【請求項１４】
配列表の配列番号７に記載した塩基配列、もしくはストリジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列の全部、又は当該塩基配列の１１３位からの欠失部位を含む少なくとも５０塩基からなるＤＮＡ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のＤＮＡからなるスプライシングの制御剤。
【請求項１６】
ゲノムＤＮＡにおけるイントロン領域の塩基を欠失させることからなる、ｍＲＮＡの生成過程でのスプライシングを制御する方法。
【請求項１７】
ゲノムＤＮＡがβ−クリスタリンをコードするＤＮＡである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
β−クリスタリンが、βＢ１−クリスタリンである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ゲノムＤＮＡが、ハムスターのゲノムである請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１４に記載のＤＮＡの塩基配列を含有するＤＮＡにより形質転換された細胞。
【請求項２１】
ＢＩＯ１４．６ハムスターを他のハムスターと交配させて得られるβＢ１−クリスタリン遺伝子のみに変異を有するハムスター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハムスターのβ−クリスタリンをコードする遺伝子、及びこれを増幅することができるプライマーセットに関する。また、本発明は、βＢ１−クリスタリン遺伝子に異常があるハムスターのゲノムＤＮＡのイントロン領域の塩基配列を有するＤＮＡに関する。さらに、本発明は、当該イントロン領域の塩基配列を有するＤＮＡを利用したｍＲＮＡのスプライシングの制御方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝性心筋症のモデル動物であるＢＩＯ１４．６ハムスターは、ジストロフィンに結合する結合タンパク質の一つであるデルタ−サルコグリカン（δ‐ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ（δ‐ＳＧ））をコードする遺伝子が欠損している（非特許文献１及び非特許文献２参照）。この遺伝性心筋症のモデル動物ＢＩＯ１４．６ハムスターにおけるδ‐ＳＧタンパク質の欠損は、他の３つのサルコグリカン（ＳＧ）であるα−ＳＧ、β−ＳＧ、及びγ−ＳＧの欠損も伴っている。即ち、遺伝性心筋症のモデル動物ＢＩＯ１４．６ハムスターは、α−ＳＧ、β−ＳＧ、γ−ＳＧ、及びδ−ＳＧが欠損している。このＢＩＯ１４．６ハムスターは生まれた直後は赤眼であるが、加齢と共に徐々に黒眼になる。この原因として、従来心筋症により血色の異常が起こり、その血色の変化が黒眼としてみられるものと考えられていた。
しかし、本発明者は、このＢＩＯ１４．６ハムスターの眼球の異常について検討し、この異常が心筋症による血色の異常ではなく、眼球の光の感知に関与する色素合成酵素であるチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）に異常があるためであることを解明してきた（特許文献１参照）。
このように、遺伝性心筋症のモデル動物であるＢＩＯ１４．６ハムスターは、遺伝性心筋症のみならず、眼球にも異常があることが知られていたが、その原因のさらなる解明が求められていた。
【０００３】
また、成熟ｍＲＮＡは、ゲノムの転写後、ゲノム中に存在するイントロン部分がスプライシングを受けてエクソン領域のみが残されることにより生成される。これまでの研究から、隣り合ったエクソンがその間のイントロンを切除してスプライスする分子機構に関してはかなり解明されてきた。すなわち、ほとんどのイントロンはＧＴではじまりＡＧで終わることが分かってきているが、複数のエクソンが順序正しくスプライスされるメカニズムについてはほとんど分かっていない。すなわち、何故第１エクソンは第２エクソンとの間のイントロンのみがスプライスし、決して第３あるいはそれ以降のエクソンとがスプライスされないのかということは、ほとんどわかっていない。このようなｍＲＮＡのスプライシングの分子機構の解明も求められている。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００１‐１１２４８３号公報
【非特許文献１】
Ａ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　１９９７，　９４，　１３８７３‐１３８７８
【非特許文献２】
Ａ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，　１９９９，　４４７，　１２４‐１２８
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝性心筋症のモデル動物であるＢＩＯ１４．６ハムスターの眼球における異常の原因を解明し、その原因となっているタンパク質、それをコードする遺伝子、当該遺伝子に関連するオリゴヌクレオチドなどを提供するものである。また、本発明は、当該原因遺伝子が改善された実験動物、及びその製造方法を提供するものである。
さらに、本発明は、成熟ｍＲＮＡの生成における遺伝子のスプライシングに関する分子機構の解明を可能にする基盤を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、心臓の難病である心筋症を遺伝的に発病するハムスター（ＢＩＯ１４．６ハムスター）の研究の過程で、この動物の水晶体ではβ−クリスタリンのタンパク質が存在しないことを見出した。そして、その背景にある遺伝子異常の原因を解明することで、ｍＲＮＡにおけるスプライシングに関する新たな知見を見出した。
【０００７】
本発明は、ハムスター、好ましくは正常ゴールデンハムスター又はＢＩＯ１４．６ハムスターのβ−クリスタリン、好ましくはβＢ−クリスタリン、より具体的にはβＢ１−クリスタリン、βＢ２−クリスタリン又はβＢ３−クリスタリンをコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡに関する。
また、本発明は、前記したハムスターのβ−クリスタリンのＤＮＡの全部又は一部を増幅することができるプライマーセットに関する。
また、本発明は、βＢ１−クリスタリン遺伝子に異常があるハムスターのゲノムＤＮＡのイントロン領域、より詳細には第３イントロン領域の遺伝子の異常配列を含有してなる塩基配列を有するＤＮＡ、より詳細には、配列表の配列番号９に記載した塩基配列、もしくはストリジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列の全部、又は当該塩基配列の１１４位からの欠失部位を含む少なくとも５０塩基からなるＤＮＡ、及び当該ＤＮＡからなるｍＲＮＡのスプライシングの制御剤に関する。本発明は、当該ＤＮＡの塩基配列を含有するＤＮＡにより形質転換された細胞に関する。
また、本発明は、ゲノムＤＮＡにおけるイントロン領域の塩基を欠失させることからなる、ｍＲＮＡの生成過程でのスプライシングを制御する方法に関する。さらに、本発明は、ＢＩＯ１４．６ハムスターを他のハムスターと交配させて得られるβＢ１−クリスタリン遺伝子のみに変異を有するハムスターに関する。
【０００８】
本発明者は、ＢＩＯｌ４．６ハムスターの水晶体におけるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。その結果を図１に図面に代わる写真で示す。図１のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、Ｂは肥大型心筋症のＢＩＯｌ４．６ハムスターを示し、Ｔは拡張型心筋症のＴＯ−２ハムスターを示す。図１の矢印は分子量２７ｋＤａのタンパク質の位置を示している。図１の左側は、分子量（ｋＤａ）を示す。
この結果から、ＢＩＯｌ４．６ハムスターでは、水晶体においてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約２７ｋＤａのタンパク質が欠損していることがわかった（図１の矢印の箇所）。
ＢＩＯｌ４．６ハムスターの水晶体において欠損していた分子量約２７ｋＤａのタンパク質をさらに解析するために、正常ゴールデンハムスターにおける対応するタンパク質のバンドをゲルから切り出し、リジルエンドペプチターゼ（ｌｙｓｉｌ　ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）で消化し、消化物を逆相のＨＰＬＣで分取し、得られたいくつかのペプチドのアミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列が決定された６種のペプチドのアミノ酸配列を図２の配列の欄に、アミノ酸の１文字表記で示す。これらのアミノ酸配列をデータベースで検索した結果、βＢ１−、βＢ２−、βＢ３−クリスタリン（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ）であることが分かった。即ち、アミノ酸の１文字表記でＡＡＡＴＴＡＶＮＰＧのアミノ酸配列を有する第１のペプチドは、βＢ１−クリスタリンの７−１６位のアミノ酸配列に相当し、同じくＧＥＱＦＶＦＥＫのアミノ酸配列を有する第２のペプチドは、βＢ２−クリスタリンの６９−７６位のアミノ酸配列に相当し、同じくＳＨＧＧＬＧＧＳＹのアミノ酸配列を有する第３のペプチドは、βＢ３−クリスタリンの１６−２４位のアミノ酸配列に相当し、同じくＶＴＶＹＥＬＥＮＦＱＧＫのアミノ酸配列を有する第４のペプチドは、βＢ３−クリスタリンの２６−３７位のアミノ酸配列に相当し、同じくＲＡＦＲＧＥＱＦＶＬＥＫのアミノ酸配列を有する第５のペプチドは、βＢ３−クリスタリンの７２−８３位のアミノ酸配列に相当し、同じくＧＤＹＰＲＷＤＡのアミノ酸配列を有する第６のペプチドは、βＢ３−クリスタリンの８４−９１位のアミノ酸配列に相当していることがわかった。
これらの結果をまとめて図２に示す。図２の左側は得られたペプチドのアミノ酸配列を示し（アミノ酸の１文字表記）、右側はそれぞれβＢ１−、βＢ２−、βＢ３−クリスタリン（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ）の対応する位置番号を示している。
【０００９】
次に、シリアンハムスターのβＢ１−、βＢ２−、βＢ３−クリスタリンのｃＤＮＡをクローニングするためのプライマーセットを調製した。調製したプライマーセットを以下に示す。
βＢ１−クリスタリン用のプライマーセット。
ＣＲＹＢＢｌＦ　：　ＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＴＣＴＧＣ
ＣＲＹＢＢ１Ｒ　：　ＡＧＧＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＴＧ
βＢ２−クリスタリン用のプライマーセット。
ＣＲＹＢＢ２Ｆ　：　ＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣ
ＣＲＹＢＢ２Ｒ　：　ＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣ
βＢ３−クリスタリン用のプライマーセット。
ＣＲＹＢＢ３Ｆ　：　ＴＧＡＣＧＧＴＧＴＡＣＧＡＧＴＴＡＧＡＧ
ＣＲＹＢＢ３Ｒ　：　ＧＡＴＴＣＣＡＣＴＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣ
【００１０】
これらのプライマーセットを用いて正常ゴールデンハムスターの眼球から調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行った。このＲＴ−ＰＣＲ産物を２％アガロース電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３のレーン１はβＢ１−クリスタリンを示し、レーン２はβＢ２−クリスタリンを示し、レーン３はβＢ３−クリスタリンを示し、レーンＭはマーカー（ｋｂ）を示す。
得られた３種のＰＣＲ産物をプローブとして、正常ゴールデンハムスターの眼球から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、それぞれに対応する完全長ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡの塩基配列、及び対応するアミノ酸配列（アミノ酸の１文字表記）をそれぞれ図４、図５、図６に示す。図４はβＢ１−クリスタリンの配列を示し、図５はβＢ２−クリスタリンの配列を示し、図６はβＢ３−クリスタリンの配列をそれぞれ示す。各図中の番号は翻訳領域を対象にして付しており、下線はポリアデニル配列を示している。
図４中の「ｅｘｏｎ」は６つのエクソン領域（ｅｘｏｎ１〜ｅｘｏｎ６）を示しており、縦線はこれらのエクソン領域の境界を示している。
【００１１】
次に、ＢＩＯ１４．６ハムスターのクリスタリン遺伝子の異常を解析するために、βＢ１−、βＢ２−、βＢ３−クリスタリンの完全長ｃＤＮＡをプローブとして、ゴールデンハムスターとＢＩＯ１４．６ハムスターの眼球のＲＮＡプロット解析を行った。結果を図７に図面に代わる写真で示す。図７の１はβＢ１−クリスタリンの場合を示し、２はβＢ２−クリスタリンの場合を示し、３はβＢ３−クリスタリンの場合を示す。各々のＧはゴールデンハムスターの場合を示し、ＢはＢＩＯ１４．６ハムスターの場合を示す。図の右側の数字はマーカー（ｋｂ）の位置を示す。
この結果、ＢＩＯ１４．６ハムスターでは、βＢ１−クリスタリンの転写は、正常ハムスターと同一サイズ（０．９ｋｂ）（図７の１の楔印）のものが極少量存在するが、ほとんどは小さい（０．６ｋｂ）（図７の１の矢印）ことが分かった。
【００１２】
前記したＲＮＡプロット解析の結果から明らかになったＢＩＯ１４．６ハムスターのβＢ１−クリスタリン遺伝子の転写の異常の原因を解明するために、５’−及び３’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄ）を行った。５’−ＲＡＣＥの結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８のレーンＭはマーカー（ｋｂ）を示し、レーンＧはゴールデンハムスターの場合を示し、レーンＢはＢＩＯ１４．６ハムスターの場合を示す。ゴールデンハムスターでは、０．４ｋｂの１本のバンドが認められた（図８中の楔印）のに対して、ＢＩＯ１４．６ハムスターでは０．１５ｋｂの濃いバンド（図８中の矢印）と０．４ｋｂの薄いバンド（図８中の楔印）の２本のバンドが認められた。このように、ＢＩＯ１４．６ハムスターの場合の５’−ＲＡＣＥでは、正常ハムスターと同一サイズのＰＣＲ産物も少量増幅されるが、大部分のＰＣＲ産物は小さかった（図８参照）。尚、３’−ＲＡＣＥに関しては、ゴールデンハムスターとＢＩＯ１４．６ハムスターで同一サイズのバンドが増幅された。
【００１３】
そこで、ＢＩＯ１４．６ハムスターにおける小さな５’−ＲＡＣＥ産物をプラスミドベクターにクローニングして、５’端の最も長いクローンの塩基配列を決定した。決定された塩基配列を図９に示す。図９のＥｘ１は第１エクソン領域を示し、Ｅｘ４は第４エクソン領域を示す。図９の矢印は、５’−ＲＡＣＥに用いたβＢ１−クリスタリンに特異的なプライマーに対応する領域を示す。このｃＤＮＡは前記のＲＮＡプロット解析（図７参照）におけるＢＩＯ１４．６ハムスターの０．６ｋｂの転写産物に対応するものである。そして、解析された塩基配列及びβＢ１−クリスタリンのゲノム遺伝子の解析から、このｃＤＮＡは、第１エクソンと第４エクソンが直接融合したもの、即ち第２エクソン及び第３エクソンが共に切除してスプライされた産物であることが判明した（図９参照）。
【００１４】
ハムスターのファージ・ゲノムライブラリーを完全長のβＢ１−クリスタリンｃＤＮＡでスクリーニングした結果、βＢ１−クリスタリン遺伝子のゲノムは６つのエクソンからなっていることが分かった。図１２にシリアンハムスターのβＢ１−クリスタリン遺伝子のゲノム構造を示す。６つのエクソン領域をＥｘ１〜Ｅｘ６で示す。
次に、βＢ１−クリスタリン遺伝子の第１エクソンと第２エクソン、第２エクソンと第３エクソン、第３エクソンと第４エクソンの間のゲノムをＰＣＲで増幅した。結果を図１０に図面に代わる写真で示す。図１０の１−２は第１エクソンと第２エクソンを挟むプライマーセットで増幅した場合を示し、２−３は第２エクソンと第３エクソンを挟むプライマーセットで増幅した場合を示し、３−４は第３エクソンと第４エクソンを挟むプライマーセットで増幅した場合を示す。それぞれのＧはゴールデンハムスターの場合を示し、ＢはＢＩＯ１４．６ハムスターの場合を示す。図１０中のＭはマーカー（ｋｂ）を示す。その結果、ＢＩＯ１４．６ハムスターでも正常ゴールデンハムスターとほぼ同一サイズのゲノム領域が増幅され、それらの間に大きな欠失は無いことが分かった。
【００１５】
そこで、前記のＰＣＲの結果得られた各ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。得られた塩基配列の第３イントロンと第４エクソンの周辺の塩基配列を図１１Ａに示す。図１１Ａの枠で囲った部分は第４エクソン領域を示し、その前の部分は第３イントロン領域を示す。図１１Ａの番号は第４エクソンの先頭を１番にしている。この結果、ＢＩＯ１４．６ハムスターのβＢ１−クリスタリン遺伝子では、第４エクソンの５’上流３０４から３０７塩基までの４塩基（図１１Ａで下線を付した部分）が欠失していることが分かった。次に、この４塩基の欠失領域を含む部分のゲノムについてＰＣＲを行った。４塩基の欠失領域の周辺のＤＮＡ断片の増幅に用いたプライマーセットは、
ＣＲＹ−Ｆ　：　ＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＧ
ＣＲＹ−Ｒ　：　ＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＴＴＣＡＣＧＣ
である。この結果を図１１Ｂに図面に代わる写真で示す。図１１ＢのＧはゴールデンハムスターの場合を示し、ＢはＢＩＯ１４．６ハムスターの場合を示し、ＴはＴＯ−２ハムスターの場合を示す。この結果、この４塩基の欠失は、他の心筋症ハムスターであるＴＯ−２ハムスターには無く、ＢＩＯ１４．６ハムスターに特異的であることも分かった。
【００１６】
この結果は非常に興味深いものがある。即ち、ＢＩＯ１４．６ハムスターは、βＢ１−クリスタリン遺伝子のエクソン領域に異常があるのではなく、イントロン領域に、しかもイントロン領域の４塩基のみが欠失していると異常が有るだけであった。この結果として、ＢＩＯ１４．６ハムスターのβＢ１−クリスタリン遺伝子のゲノムにおける第２エクソン及び第３エクソン領域が切除してスプライシングされ、異常に小さなβＢ１−クリスタリンしか発現されないことになってしまったのである。
図１２にシリアンハムスターのβＢ１−クリスタリン遺伝子のゲノム構造を示す。６つのエクソン領域がＥｘ１〜Ｅｘ６で示されている。図１２の楔印はＢＩＯ１４．６ハムスターにおける４塩基の欠失位置を示している。これは第３イントロン領域に有る。この結果、図１２の斜線で示されるように、第１エクソンと第４エクソンが直接融合した異常なβＢ１−クリスタリが産生されたのである。
このような結果になる原因として次の図１３に示されることが考えられる。即ち、正常ゴールデンハムスターにおける第３エクソン、及び第４エクソンのスプライス受容サイト（ｓｐｌｉｃｅ　ａｃｃｅｐｔｏｒ　ｓｉｔｅ）は、第２エクソンが第１エクソンとスプライスしない限り、不活性化状態にあると考えられる（図１３Ａ。各エクソンのスプライス受容サイトの活性化の状態を丸印とバツ印で示している。）。
一方、ＢＩＯ１４．６ハムスターにおける第４エクソンのスプライス受容サイトは、その上流の４塩基が欠失しているために恒常的に強い活性化状態にあり、その結果、第４エクソンは第２エクソンより優先的に第１エクソンとスプライスすると考えられる。この活性化と不活性化状態の分子レベルの実体としては、ＲＮＡ自体の高次構造、あるいは、４塩基が欠失した周辺にＲＮＡの制御タンパク質が結合する可能性などが考えられる。
【００１７】
一般には、エクソンのスプライスは、遺伝情報の正しい発現に必須である。本発明は、遺伝子のスプライスの順序制御に関する本質的な新規な知見を提供するのみでなく、一連の「制御分子」の探索も可能にするものである。正常ゴールデンハムスターあるいはＢＩＯ１４．６ハムスターのβ−Ｂ１クリスタリンのゲノムｃＤＮＡをエクソントラッピングベクター（ｅｘｏｎ　ｔｒａｐｐｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ）に組み込んだ組換えＤＮＡを培養細胞に遺伝子導入した発現系は、スプライス異常の研究ツールとして大いに期待できるだけでなく、スプライスの制御を可能にするものでもある。
仮に、ヒトでこうした「制御分子」に突然変異が生ずれば、全遺伝子のスプライスも異常になり、間違いなく致死的であろう。これまで流産としてしか分からなかった症例の多くが、こうした「制御分子」の異常が原因であることが分かり、それに対する新たな治療法の開発も期待される。
本発明は、水晶体の主要タンパク質の一つであるβクリスタリン遺伝子に異常を有するハムスターを同定した。この動物では、β−Ｂ１クリスタリン遺伝子の第３イントロンに４塩基の欠失があり、第１エクソンは第４エクソンとスプライスする。その結果、βクリスタリン複合体が存在しない。本発明は、βクリスタリンの機能のみでなく、一般に遺伝子のスプライシング順序の分子機構の解明をも可能にするものである。
【００１８】
以上のように、本発明は、ＢＩＯ１４．６ハムスターがサルコグリカン遺伝子のみならず、βＢ１−クリスタリン、βＢ２−クリスタリン、及びβＢ３−クリスタリン遺伝子にも異常があるハムスターであることを明らかにし、かつβＢ１−クリスタリン遺伝子の異常がゲノムのイントロンにおける４塩基の欠失であることを明らかにしてきた。したがって、本発明は、ハムスター、具体的には正常ゴールデンハムスター及びＢＩＯ１４．６ハムスターのβ−クリスタリン、具体的にはβＢ−クリスタリン、より具体的にはβＢ１−クリスタリン、βＢ２−クリスタリン又はβＢ３−クリスタリンをコードするｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡなどのＤＮＡを提供するものである。これらのＤＮＡ及びその断片からなるオリゴヌクレオチドは、実験動物などとして有用なハムスターにおけるクリスタリンの検出、同定に有用である。
【００１９】
本発明のＤＮＡの具体例としては、配列番号１、３及び５のそれぞれβＢ１−クリスタリン、βＢ２−クリスタリン又はβＢ３−クリスタリンをコードするｃＤＮＡなどが挙げられるが、これに限定されるものではなく、そのアレル変異体などの多型を包含するものである。
【００２０】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、前記したハムスターのβ−クリスタリンのＤＮＡの全部又は一部を増幅することができるプライマーとして有用である。本発明のオリゴヌクレオチドとしては、前記した本発明のβ−クリスタリンの部分配列からなるものであれば特に制限はないが、好ましくは１０〜２００塩基、１０〜１００塩基、さらには１５〜５０塩基程度の長さのものが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドはゲノムのエクソン部分に相当するものであってもよいし、イントロン部分に相当するものであってもよい。
本発明のこのようなオリゴヌクレオチドとしては、具体的には、本明細書においてプライマーとして使用しているもの、例えば、
βＢ１−クリスタリン用のプライマーセットである、
ＣＲＹＢＢｌＦ　：　ＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＴＣＴＧＣ、
ＣＲＹＢＢ１Ｒ　：　ＡＧＧＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＴＧ、
βＢ２−クリスタリン用のプライマーセットである、
ＣＲＹＢＢ２Ｆ　：　ＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣ、
ＣＲＹＢＢ２Ｒ　：　ＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣ、
βＢ３−クリスタリン用のプライマーセットである、
ＣＲＹＢＢ３Ｆ　：　ＴＧＡＣＧＧＴＧＴＡＣＧＡＧＴＴＡＧＡＧ、
ＣＲＹＢＢ３Ｒ　：　ＧＡＴＴＣＣＡＣＴＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣ、
など。また、βＢ１−クリスタリン遺伝子の第１と第２、第２と第３、第３と第４エクソンの間のゲノムをＰＣＲで増幅したときに使用されるプライマーセットである、
ＥｘｌＦ　：　ＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧ
Ｅｘ２Ｒ　：　ＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＣＴＴＴＧ
Ｅｘ２Ｆ　：　ＣＡＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣ
Ｅｘ３Ｒ　：　ＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＡＣ
Ｅｘ３Ｆ　：　ＧＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴＣＡＧ
Ｅｘ４Ｒ　：　ＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＧＡＡＣＡＴＣＴＣ
などや、４塩基が欠失している箇所周辺の増幅に使用したプライマーセットである、
ＣＲＹ−Ｆ　：　ＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＧ
ＣＲＹ−Ｒ　：　ＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＴＴＣＡＣＧＣ
などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２１】
また、本発明は、ＢＩＯ１４．６ハムスターのβＢ１−クリスタリン遺伝子の異常がゲノムのイントロン領域における４塩基の欠失によるものであることを明らかにしてきた。そして、このようなイントロン領域における塩基の欠失によりｍＲＮＡのスプライシングが制御されることを明らかにしてきた。したがって、本発明はスプライシングを制御し得るＤＮＡ配列、当該塩基配列を含有してなるＤＮＡを提供するものである。本発明は、ハムスターのゲノムＤＮＡのイントロン領域、より詳細には第３イントロン領域の遺伝子の異常配列を含有してなる塩基配列を有するＤＮＡ、より具体的には、配列表の配列番号９に記載した塩基配列、もしくはストリジェントな条件下でこれにハイブリダイズすることができる塩基配列の全部、又は当該塩基配列の１１４位からの欠失部位を含む少なくとも５０塩基、好ましくは１００塩基以上の塩基を有するＤＮＡを提供するものであり、当該ＤＮＡはｍＲＮＡのスプライシングの制御をすることができる。したがって、本発明は当該ＤＮＡからなるｍＲＮＡのスプライシングの制御剤を提供するものである。
【００２２】
また、本発明は、当該ＤＮＡの塩基配列を含有するＤＮＡにより形質転換された細胞に関する。本発明の細胞としては、ｍＲＮＡのスプライシングを行う細胞であって、培養可能な細胞が好ましい。
さらに、本発明は、ゲノムＤＮＡにおけるイントロン領域の塩基を欠失させることからなる、ｍＲＮＡの生成過程でのスプライシングを制御する方法を提供するものであり、本明細書で明らかにしてきたハムスターのβＢ１−クリスタリン遺伝子の場合と同様な方法により、イントロン領域における連続する４〜１０塩基を欠失させることによりスプライシングを制御する。これにより標的遺伝子の発現を制御することが可能となる。より具体的には、例えば、ＢＩＯ１４．６ハムスターを他のハムスターと交配させて、ゲノムのβＢ１−クリスタリン遺伝子のイントロン領域に塩基の欠失した個体をスクリーニングすることからなる、βＢ１−クリスタリン遺伝子のみに変異を有するハムスターを創製することも可能となる。したがって、本発明はこのようなハムスターを提供するものでもある。
【００２３】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１　（ＢＩＯ１４．６ハムスターの水晶体における欠損タンパク質の同定）
正常ゴールデンハムスター、ＢＩＯｌ４．６ハムスター、及び拡張型心筋症ハムスターであるＴＯ−２ハムスターの水晶体におけるタンパク質を常法により同定した。結果を図１に示す。
この結果、ＢＩＯｌ４．６ハムスターでは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約２７ｋＤａのタンパク質が欠損していた。正常ゴールデンハムスターにおける対応するタンパク質のバンドをゲルから切り出し、リジルエンドペプチターゼ（ｌｙｓｉｌ　ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）で消化し、逆相のＨＰＬＣでペプチド断片を分取した。これらのいくつかのペプチドのアミノ酸配列を決定し、データベースで検索した結果を図２に示す。この結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約２７ｋＤａのタンパク質は、βＢ１−、βＢ２−、βＢ３−クリスタリンであることが分かった。
【００２５】
実施例２　（シリアンハムスターのβＢ１−、βＢ２−、及びβＢ３−クリスタリンのｃＤＮＡのクローニング）
ヒトとラットのβＢ１−、βＢ２−、及びβＢ３−クリスタリンの塩基配列が保存されている領域からそれぞれに対応したプライマーをデザインし、正常ゴールデンハムスターの眼球から調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーセットは以下の通りである。
βＢ１−クリスタリン用のプライマーセット。
ＣＲＹＢＢｌＦ　：　ＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＴＣＴＧＣ
ＣＲＹＢＢ１Ｒ　：　ＡＧＧＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＴＧ
βＢ２−クリスタリン用のプライマーセット。
ＣＲＹＢＢ２Ｆ　：　ＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣ
ＣＲＹＢＢ２Ｒ　：　ＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣ
βＢ３−クリスタリン用のプライマーセット。
ＣＲＹＢＢ３Ｆ　：　ＴＧＡＣＧＧＴＧＴＡＣＧＡＧＴＴＡＧＡＧ
ＣＲＹＢＢ３Ｒ　：　ＧＡＴＴＣＣＡＣＴＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣ
【００２６】
ＰＣＲは、９４℃、２分の後、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３５サイクル行った。このＲＴ−ＰＣＲ産物を２％アガロース電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。結果を図３に図面に代わる写真で示す。
得られた３種のＰＣＲ産物をプローブとして、正常ゴールデンハムスターの眼球から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、それぞれに対応する完全長ｃＤＮＡを得た。得られた完全長のβＢ１−、βＢ２−、及びβＢ３−クリスタリンの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を、それぞれ図４、図５、及び図６に示す。また、それぞれの塩基配列を配列番号の１、３、及び５にそれぞれ示し、それぞれのアミノ酸配列を配列番号の２、４、及び６にそれぞれ示す。
次に、βＢ１−、βＢ２−、及びβＢ３−クリスタリンの完全長ｃＤＮＡをプローブとして、正常ゴールデンハムスターとＢＩＯ１４．６ハムスターの眼球のＲＮＡプロット解析を行った。結果を図７に図面に代わる写真で示す。
【００２７】
実施例３　（ＢＩＯ１４．６ハムスターにおける変異βＢ１−クリスタリン遺伝子の転写　　　　　産物の解析）
正常ゴールデンハムスター及びＢＩＯ１４．６ハムスターのそれぞれの眼球由来の全ＲＮＡ（１μｇ）からオリゴｄＴプライマーで合成したｃＤＮＡにアダプターを連結させ、アダプターに特異的なプライマーとβＢ１−クリスタリンに特異的なプライマーでＰＣＲを行った。この５’−ＲＡＣＥの結果を図８に図面に代わる写真で示す。
その結果、ＢＩＯ１４．６ハムスターの５’−ＲＡＣＥでは、正常と同一サイズのＰＣＲ産物も少量増幅されるが、大部分のＰＣＲ産物は小さかった（図８参照）。そこで、ＢＩＯ１４．６ハムスターにおける小さな５’−ＲＡＣＥ産物をプラスミドベクターにクローニングし、５’端の最も長いクローンの塩基配列を決定した。この塩基配列を図９に示す。このクローンは、βＢ１−クリスタリン遺伝子の第１エクソンと第４エクソンが融合したものであることが判明した（図９参照）。
【００２８】
実施例４　（ハムスターのβＢ１−クリスタリン遺伝子のゲノム構造とＢＩＯ１４．６ハ　　　　　ムスターにおける塩基の欠失）
ハムスターのファージ・ゲノムライブラリーを完全長のβＢ１−クリスタリンｃＤＮＡでスクリーニングし、βＢ１−クリスタリン遺伝子のゲノムの構造を解明した。結果を図１２に示す。この結果、βＢ１−クリスタリン遺伝子は６つのエクソンからなっていることが分かった（図１２参照）。
次に、βＢ１−クリスタリン遺伝子の第１エクソンと第２エクソン、第２エクソンと第３エクソン、第３エクソンと第４エクソンの間のゲノムをＰＣＲで増幅した。ゲノムの増幅に用いたプライマーセットは、
第１エクソンと第２エクソン、
ＥｘｌＦ　：　ＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧ
Ｆｘ２Ｒ　：　ＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＣＴＴＴＧ
第２エクソンと第３エクソン、
Ｅｘ２Ｆ　：　ＣＡＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣ
Ｅｘ３Ｒ　：　ＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＡＣ
第３エクソンと第４エクソン、
Ｅｘ３Ｆ　：　ＧＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴＣＡＧ
Ｅｘ４Ｒ　：　ＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＧＡＡＣＡＴＣＴＣ
を使用した。ＰＣＲは９４℃で２分の後、９４℃で２０秒、６５℃で３０秒、７２℃で２分の３５サイクルで行った。結果を図１０に図面に代わる写真で示す。この結果、ＢＩＯ１４．６ハムスターでも正常ゴールデンハムスターとほぼ同一サイズのゲノム領域が増幅され、それらの間に大きな欠失は無いことが分かった（図１０参照）。
【００２９】
次に、前記したＰＣＲ産物の各ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、ＢＩＯ１４．６ハムスターのβＢ１−クリスタリンでは、　第４エクソンの５’上流３０４から３０７塩基までの４塩基が欠失していることが分かった。この塩基配列を図１１Ａに示す。この塩基配列のイントロン領域を配列番号９に示す。
【００３０】
そして、ＢＩＯ１４．６ハムスターにおける４塩基が欠失している周辺のＤＮＡ断片を、正常ゴールデンハムスター、ＢＩＯ１４．６ハムスター、及びＴＯ−２ハムスターのゲノムについてＰＣＲで増幅した。増幅に用いたプライマーセットは、
ＣＲＹ−Ｆ　：　ＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＧ
ＣＲＹ−Ｒ　：　ＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＴＴＣＡＣＧＣ
である。ＰＣＲは、９４℃で１分の後、９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルで行った。結果を図１１Ｂに図面に代わる写真で示す。この結果、この塩基の欠失は、他の心筋症ハムスターＴＯ−２には無く、ＢＩＯ１４．６ハムスターに特異的であることが分かった（図１１Ｂ参照）。
【００３１】
【発明の効果】
本発明は、ハムスターのβ−クリスタリンの遺伝子を提供する。β−クリスタリンは水晶体のタンパク質の１種であり、白内症や緑内症などの水晶体に関連する疾患の実験動物の創製に有用である。
また、エクソンのスプライスは、遺伝情報の正しい発現に必須であり、本発明は、遺伝子スプライスの順序制御に関する本質的な理解を与えるのみでなく、一連の「制御分子」の探索も可能にある。正常ゴールデンハムスターあるいはＢＩＯ１４．６ハムスターのβＢ１−クリスタリンのゲノムｃＤＮＡをエクソントラッピングベクター（ｅｘｏｎ　ｔｒａｐｐｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ）に組み込んだ組換えＤＮＡを培養細胞に遺伝子導入した発現系は、スプライス異常の研究ツールとして大いに期待でき、スプライス異常に起因する各種疾患の治療・予防の開発に有用である。例えば、仮に、ヒトでこうした「制御分子」に突然変異が生ずれば、全遺伝子のスプライスも異常になり、間違いなく致死的であろう。これまで流産としてしか分からなかった症例の多くが、こうした「制御分子」の異常が原因であることが分かり、それに対する新たな治療法の開発も期待される。
【００３２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＢＩＯｌ４．６ハムスターの水晶体におけるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す図面に代わる写真である。図１のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、Ｂは肥大型心筋症のＢＩＯｌ４．６ハムスターを示し、Ｔは拡張型心筋症のＴＯ−２ハムスターを示す。図１の矢印は分子量２７ｋＤａのタンパク質の位置を示している。図１の左側は、分子量（ｋＤａ）を示す。
【図２】図２は、ＢＩＯｌ４．６ハムスターの水晶体において欠損していた分子量約２７ｋＤａのタンパク質の断片のペプチドのアミノ酸配列、及び当該アミノ酸配列をデータベースで検索した結果を示す。
【図３】図３は、正常ゴールデンハムスターの眼球から調製したｃＤＮＡライブラリーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す図面に代わる写真である。図３のレーン１はβＢ１−クリスタリンを示し、レーン２はβＢ２−クリスタリンを示し、レーン３はβＢ３−クリスタリンを示し、レーンＭはマーカー（ｋｂ）を示す。
【図４】図４は、本発明のβＢ１−クリスタリンの完全長ｃＤＮＡの塩基配列、及び対応するアミノ酸配列（アミノ酸の１文字表記）を示す。図４中の番号は翻訳領域を対象にして付しており、下線はポリアデニル配列を示している。図４中の「ｅｘｏｎ」は６つのエクソン領域（ｅｘｏｎ１〜ｅｘｏｎ６）を示しており、縦線はこれらのエクソン領域の境界を示している。
【図５】図５は、本発明のβＢ２−クリスタリンの完全長ｃＤＮＡの塩基配列、及び対応するアミノ酸配列（アミノ酸の１文字表記）を示す。図５中の番号は翻訳領域を対象にして付しており、下線はポリアデニル配列を示している。
【図６】図６は、本発明のβＢ３−クリスタリンの完全長ｃＤＮＡの塩基配列、及び対応するアミノ酸配列（アミノ酸の１文字表記）を示す。図６中の番号は翻訳領域を対象にして付しており、下線はポリアデニル配列を示している。
【図７】図７は、βＢ１−、βＢ２−、βＢ３−クリスタリンの完全長ｃＤＮＡをプローブとして、ゴールデンハムスターとＢＩＯ１４．６ハムスターの眼球のＲＮＡプロット解析を行った結果を示す図面に代わる写真である。図７の１はβＢ１−クリスタリンの場合を示し、２はβＢ２−クリスタリンの場合を示し、３はβＢ３−クリスタリンの場合を示す。各々のＧはゴールデンハムスターの場合を示し、ＢはＢＩＯ１４．６ハムスターの場合を示す。図の右側の数字はマーカー（ｋｂ）の位置を示す。
【図８】図８は、ＢＩＯ１４．６ハムスターのβＢ１−クリスタリン遺伝子の転写の異常の原因を解明するために行った５’−ＲＡＣＥの結果を示す図面に代わる写真である。図８のレーンＭはマーカー（ｋｂ）を示し、レーンＧはゴールデンハムスターの場合を示し、レーンＢはＢＩＯ１４．６ハムスターの場合を示す。
【図９】図９は、ＢＩＯ１４．６ハムスターにおける小さい方の５’−ＲＡＣＥ産物の塩基配列を示す。図９のＥｘ１は第１エクソン領域を示し、Ｅｘ４は第４エクソン領域を示す。図９の矢印は、５’−ＲＡＣＥに用いたβＢ１−クリスタリンに特異的なプライマーに対応する領域を示す。
【図１０】図１０は、βＢ１−クリスタリン遺伝子の第１エクソンと第２エクソン、第２エクソンと第３エクソン、第３エクソンと第４エクソンの間のゲノムをＰＣＲで増幅した。結果を図１０に図面に代わる写真で示す。図１０の１−２は第１エクソンと第２エクソンを挟むプライマーセットで増幅した場合を示し、２−３は第２エクソンと第３エクソンを挟むプライマーセットで増幅した場合を示し、３−４は第３エクソンと第４エクソンを挟むプライマーセットで増幅した場合を示す。それぞれのＧはゴールデンハムスターの場合を示し、ＢはＢＩＯ１４．６ハムスターの場合を示す。図１０中のＭはマーカー（ｋｂ）を示す。
【図１１】図１１Ａは、βＢ１−クリスタリンのゲノムにおける第３イントロンと第４エクソンの周辺の塩基配列を示す。図１１Ａの枠で囲った部分は第４エクソン領域を示し、その前の部分は第３イントロン領域を示す。図１１Ａの番号は第４エクソンの先頭を１番にしている。
図１１Ｂは、ＢＩＯ１４．６ハムスターのβＢ１−クリスタリンのゲノムにおける４塩基の欠失領域を含む断片領域を、各ハムスターのゲノムについてＰＣＲを行った結果を示す図面に代わる写真である。図１１ＢのＧはゴールデンハムスターの場合を示し、ＢはＢＩＯ１４．６ハムスターの場合を示し、ＴはＴＯ−２ハムスターの場合を示す。
【図１２】図１２は、シリアンハムスターのβＢ１−クリスタリン遺伝子のゲノム構造を示す。６つのエクソン領域がＥｘ１〜Ｅｘ６で示されている。図１２の楔印はＢＩＯ１４．６ハムスターにおける４塩基の欠失位置を示している。
【図１３】図１３は、ＢＩＯ１４．６ハムスターのゲノムのイントロン領域における４塩基の欠失による異常ｍＲＮＡの発現を説明するものである。図１３Ａは正常なスプライシングを示す。図１３Ｂは、ＢＩＯ１４．６ハムスターにおける異常なスプライシングを示す。各エクソンのスプライス受容サイトの活性化の状態を丸印とバツ印で示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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