(57)【要約】【課題】本発明の課題は植物に害虫耐性，特に昆虫耐性を与えることにある。この最終目標に到達するのに，他の課題として，殺虫性タンパクをコードする遺伝子を植物細胞のゲノムに安定に挿入すること，この遺伝子を植物細胞で発現させること，調節あるいは構成的に発現させること，およびこの植物組織が正常植物となることである。他の課題は，植物について新規の特殊な殺虫性組織をつくること，特に正常な双子葉植物に，その組織内に殺虫性タンパクを含む瘤を作らせる方法を確立することである。【解決手段】植物で発現可能なプロモーター支配下の殺虫構造遺伝子を有する遺伝的に修飾された植物細胞を有する植物。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物で発現可能なプロモーター支配下の殺虫構造遺伝子を有する遺伝的に修飾された植物細胞を有する植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子操作，農業植物および細菌性生物有効物質，特にバチルス属に由来する物質の分野のものである。
【０００２】
【従来の技術】
バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）近縁の細菌種，バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）は胞子形成の間に蛋白性の結晶含有物を形成する。本結晶は形成胞子と反対の端の細胞内に形成される副胞子である。しばしば，δ−エンドトキシンと称されるこの結晶タンパクは２つの型を有する：分子量（ＭＷ）約１３０キロダルトンの無毒性プロトキシンと分子量約６７キロダルトンを有するトキシン。この結晶は多数の昆虫種（ｉｎｓｅｃｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ）の幼虫の腸内で活性化されるプロトキシンタンパクを含む。Ｍ．Ｊ．Ｋｌｏｗｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：３１２−３１５，はバチルス・チューリンゲンシス　ｖａｒ．イスラエレンシスの可溶化プロトキシンはアエデス・エジプティの成虫に毒性があることを示した。活性化の間，プロトキシンは２本のポリペプチドに分解され，その一方または両者が毒性を有する。インビボでは結晶は可溶化されることにより活性化され，腸内のアルカリ度およびプロテアーゼにより毒性型に変換される。インビトロでは極端は高ｐＨ（例えば，ｐＨ１２），温和な塩基性条件（例えば，ｐＨ１０）での還元剤，あるいは中性条件（ｐＨ７）での強力な変性剤（グアニジン，尿素）により可溶化され，一度可溶化するとプロテアーゼであるトリプシンの作用により活性化されるらしい。結晶タンパクは胞子殻および栄養細胞壁のタンパクと抗原的に関連があることが報告されている。炭水化物はこのタンパクの毒性には関与しない。
【０００３】
結晶タンパクは特に鱗翅目，双翅目のものに共通している１００以上の昆虫種の幼虫に毒性があることが知られている殺虫タンパクであるので，バチルス・チューリンゲンシスおよびその結晶エンドトキシンは有用である。バチルス・チューリンゲンシス結晶タンパクの作用を受ける昆虫は第１表に挙げたものを含むが，これに限らない。これら昆虫種の多くは経済的に重要な害虫である。結晶タンパクの応用により保護され得る植物は第２表に挙げたものを含むが，これに限らない。第３表に挙げたものに含まれるが，これに限定されないバチルス・チューリンゲンシスの種々の変種は異なった宿主域を有する（Ｒ．Ｍ．Ｆａｕｓｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　ｅｄ．Ｎ．Ｊ．Ｐａｎａｐｏｌｏｕｓ，ｐｐ．２２５−２５４）；これは多分ある結晶タンパクが特定の宿主に毒性があることを反映している。結晶タンパクは極めて昆虫に特異的である；２０年以上にわたり胞子形成したバチルス・チューリンゲンシス細胞が市販され作物や鑑賞植物に応用されてきたが，植物あるいは非昆虫動物へ影響した例は知られていない。エンドトキシンの効率および安全性はＲ．Ｍ．Ｆａｕｓｔ　ｅｔ．ａｌ．，前出，によりまとめられている。他の有用な総説にＰ．Ｇ．Ｆａｓｔ（１９８１）ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｅｓｔｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９７０−１９８０，ｅｄ．：Ｈ．Ｄ．Ｂｕｒｇｅｓ，ｐｐ．２２３−２４８と　Ｈ．Ｅ．Ｈｕｂｅｒ　＆　Ｐ．Ｌｕｔｈｙ（１９８１）ｉｎ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｅｄ．：Ｅ．Ｗ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｐｐ．２０９−２３４がある。
【０００４】
結晶タンパク遺伝子はバチルス・チューリンゲンシスのある株では染色体上に存在するらしいが（Ｊ．Ｗ．Ｋｒｏｎｓｔａｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：４１９−４２８），通常この株にある数個の大型プラスミドの１つに見出すことができる。いくつかの遺伝子は大腸菌で増殖できるプラスミドにクローン化された。Ｗｈｉｔｅｌｅｙのグループ（Ｈ．Ｒ．Ｗｈｉｔｅｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂａｃｉｌｌｉ，ｅｄ．：Ａ．Ｔ．Ｇａｎｅｓａｎ　ｅｔ　ａｌ．，ｐｐ．１３１−１４４，Ｈ．Ｅ．Ｓｃｈｎｅｐｆ　＆　Ｈ．Ｒ．Ｗｈｉｔｅｌｅｙ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８，：２８９３−２８９７および　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ｐａｔ．ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　６３，９４９）は酵素Ｓａｕ　３ＡＩ（部分分解条件下）およびＢｇｌ　ＩＩを用いて，夫々バチルス・チューリンゲンシス　ｖａｒ．クルスタキイ　ＨＤ−１−Ｄｉｐｅｌ　および　ＨＤ−７３株のトキシン遺伝子を，エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のプラスミドベクターｐＢＲ３２２　のＢａｍ　ＨＩ部位へ約１２Ｋｂｐおよび１６　Ｋｂｐの大きさの大きな遺伝子を含む断片として挿入した，クローニングを報告した。ＨＤ−１の結晶タンパク遺伝子は６．６　Ｋｂｐ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片上に存在することが示された。幼虫に有毒で，免疫的に同定し得る既知プロトキシンと同一大きさのＨＤ−１−Ｄｉｐｅｌ遺伝子の結晶タンパクがｐＢＲ３２２クローン化またはサブクローンを含む形質転換エセリシア・コリー細胞により生産されることが観察された。これはバチルスの遺伝子がエセリシア・コリー内で多分それ自身のプロモーターから転写され，翻訳されることを示す。さらに，これはタンパク産物の毒性活性は合成の場とは無関係であることを示唆する。この遺伝子を断片がいずれの方向でベクターに挿入されても遺伝子が発現することは転写がそれ自身のプロモーターに支配されていることを示唆する。ＨＤ−１−Ｄｉｐｅｌプロトキシンのアミノ末端から３３３アミノ酸から導かれた配列と共に転写および翻訳開始部位が核酸配列により決定された（Ｈ．Ｃ．Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１９６０−１９６７）。殺虫遺伝子はバチルス・サチルスのようなバクテリアでの転写開始に関与する−１０と−３５（ｍＲＮＡの５’末端に対する）で通常見られる配列に沿って，期待されるリボゾーム結合および翻訳開始（ＡＴＧ）部位を有することが見出された。Ａ．Ｋｌｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ　Ｊ．１：７９１−７９９はバチルス・チューリンゲンシス　ベルリーナ（ｂｅｒｌｉｎｅｒ）１７１５株の結晶タンパク遺伝子のｐＢＲ３２２へのクローニングを報告した。酵素Ｂａｍ　ＨＩを用いて結晶タンパク遺伝子を含む大きな１４キロベース対の断片をエセリシア・コリーとバチルス両者で複製できるベクターｐＨＶ３３に移した。エセリシア・コリーと胞子形成しているバチルス・サチルス両者でこのｐＨＶ３３に基づくクローンは，細胞質封入体を形成し，既知プロトキシンに対する抗体と反応する完全な大きさ（１３０キロダルトン）のプロトキシンの合成をもたらした。ｐＢＲ３２２またはｐＨＶ３３に基づくプラスミドを保持するエセリシア・コリー細胞の抽出物は幼虫に有毒であった。続く研究で　Ａ．Ｋｌｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１：３９７３−３９８７，はベルリーナ結晶タンパク遺伝子をインビトロで転写させ，結晶タンパクの最初の１１コドンと共にプロモーター領域の配列を報告した。細菌のリボゾーム結合および翻訳開始部位が同定された。期待された“−１０”配列が同定されたが，他のプロモーターとの類似性は−３５付近にはまた見つかっていない。Ｈｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：６０６５−６０６９，はクルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）変株の結晶タンパク遺伝子のファージλ由来のクローニングベクター，シャロン４Ａへのクローニングを報告した。シャロンクローンの１つで感染したエセリシア・コリー細胞はプロトキシンと同一大きさ（１３０キロダルトン）で幼虫に有毒な抗原を生成した。このシャロンクローンの４．６ｋｂｐ　Ｅｃｏ　ＲＩ断片がｐＨＶ３３およびエセリシア・コリーのプラスミドベクター　ｐＢＲ３２８に移された。再び１３０キロダルトンの抗原的に同一な結晶タンパクが適当なプラスミドを保持するエセリシア・コリーおよびバチルス・サチルス両株で生産された。クローン化された結晶タンパク遺伝子とクロス−ハイブリダイズするバチルス・チューリンゲンシスの染色体配列が胞子形成の間に結晶タンパクを生成しないバチルス・チューリンゲンシス株中に同定された。
【０００５】
結晶タンパクに加えて，バチルス・チューリンゲンシスは少なくとも３つの他のトキシンを生産する。そのうちの２つ，α−エキソトキシンとγ−エキソトキシンは脂質を分解する酵素フォスフォリパーゼである。バチルス・セレウスもまた昆虫の幼虫に有毒なフォスフォリパーゼ（またはレシチナーゼ）を生産することが知られている。昆虫病原性に関与する他の細菌酵素はヒアルウロニダーゼ，フォスファターゼおよびプロテアーゼを含むが，これに限られない。シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）により生産されるプロテアーゼはガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ　ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）幼虫のタンパクに特異的な親和性があることが示された（Ｏ．Ｌｙｓｅｎｋｏ　＆　Ｍ．Ｋｕｃｅｒａ（１９７１）ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｉｎｓｅｃｔｓ　ａｎｄ　Ｍｉｔｅｓ，ｅｄｓ．：Ｈ．Ｄ．Ｂｕｒｇｅｓ　＆　Ｎ．Ｗ．Ｈｕｓｓｅｙ，ｐｐ．２０５−２２７）。
【０００６】
（シャトルベクター）
Ｇ．Ｂ．Ｒｕｖｋｕｎ　＆　Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９８：８５−８８，により開発されたシャトルベクターは大型プラスミド，ウイルスまたはゲノムの選ばれた位置に外来遺伝子物質を挿入する道を開いた。大型プラスミドまたはゲノムを扱う際に起きる主な問題が二つある。第１に，大型プラスミドは各制限酵素に対する多くの部位がある。特有の部位特異的切断反応は再現性がなく，多部位切断反応とそれに続く結合は，変えたくない多くの断片の順序と方向の混乱による大きな難点を生じる。第２に大型ＤＮＡプラスミドの形質転換効率は非常に低い。シャトルベクターは，外来遺伝子物質を小型プラスミドにしばしばインビトロで挿入し，次いで通常インビボ技術により大型プラスミドに移すことにより，これらの難点を解除させる。
【０００７】
シャトルベクターは究極の受容細菌へ導入可能なＤＮＡ分子，通常プラスミドであるが，より成る。それはまた外来遺伝物質が導入されるべき受容菌ゲノムの断片のコピーと，これまた受容菌ゲノム断片に挿入される選択形質をコードするＤＮＡ断片を含む。選択形質−（“マーカー”）はトランスポソン変異誘発または制限酵素とリガーゼにより容易に挿入される。
【０００８】
シャトルベクターは究極の受容細胞，典型的にはリゾビアッシー（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）科（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属を含む）の細菌に，三親交雑（Ｒｕｖｋｉｎ　＆　Ａｕｓｕｂｅｌ，前出），二親交雑で自己移動性ベクターの直接移送，アグロバクテリウム細胞による外部ＤＮＡの直接取り込み（Ｍ．Ｈｏｌｓｔｅｒｓ　ｅｔ．ａｌ．（１９７８）Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６３：１８１−１８７，の条件を用いる“形質転換”），アグロバクテリウムと他の細菌細胞のスフェロブラスト融合，リボソーム包括ＤＮＡの取り込み，或いはインビトロパッケイジング可能なウイルスに基づくシャトルベクターでの感染，により導入される。三親交雑は，プラスミド移動と接合伝達に関する遺伝子を有する移動性プラスミドを含む株と，シャトルベクターを含む株との交雑を含む。もしシャトルベクダーがプラスミド遺伝子により移動が可能であれば，このシャトルベクターは大型ゲノム，例えばアグロバクテリウム株のＴｉまたはＲｉプラスミド，を有する受容細胞へ移される。
【０００９】
シャトルベクターが受容細胞に導入された後，マーカーのどちらかの側での１回組み換え事象を伴う２重交叉が起こり得る。この事象は挿入を欠く類似区分を置換し，マーカーを含むＤＮＡ区分の受容菌ゲノムヘの移動をもたらす。元のシャトルベクターを失った細胞を選択する為に，本シャトルベクターは究極の宿主細胞で複製出来ないか，受容細胞に既存の独立に選択し得るプラスミドと不和合性でなければならない。これを準備する１つの共通の手段は第３の親にシャトルベクターと不和合性で異なった薬剤耐性マーカーを有する別のプラスミドを用意する事である。したがって，両薬剤の耐性を選別すると，生存細胞のみがシャトルベクターのマーカーが受容菌ゲノムと結合したものである。もしシャトルベクターが余分のマーカーを持っていれば，完全なシャトルベクターが受容菌プラスミドとともに組み込まれる協同組み込みをもたらすシャトルベクターと受容菌プラスミド間の１回交叉現象によるプラスミドを有する細胞を，選別し拾うことができる。もし外来遺伝物質が選択マーカー内あるいは近くに挿入されると，それはまた同じ２重組み換えにより受容菌プラスミドに組み込まれる。またマーカー内あるいは近くではなく，外来遺伝物質とマーカーを遠く離す点での類似断片へ挿入されると，外来遺伝物質とマーカー間で組み換えは起こるが，外来遺伝物質の移送は阻止される。
【００１０】
もしシャトルベクターが表現型として優性な形質（例えば失活した発癌性Ｔ−ＤＮＡ遺伝子でなく新規な発現性殺虫構造遺伝子）の導入に用いられるならば，２重相同組み換えに頼る必要はない。プラスミドの協同取り込みをもたらす１回交叉の結果得られた細胞は所望の形質を植物細胞へ移すことが出来る。単一の分断されていないＴ−ＤＮＡ配列を有するシャトルベクター変種をも使用できる。しかし，得られたＴ−ＤＮＡは繰り返し重複を有しているので，アグロバクテリウムあるいは植物細胞のいずれかにある二つの相同配列間で起こる１回の相同組み換え現象によるシャトルベクターのまれではあるが起こり得る欠失に関して用心せねばならない。
【００１１】
シャトルベクターはアグロバクテリウムのプラスミドの操作に有用であることが示された：Ｄ．Ｊ．Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｃｅｌｌ２７：１４３−１５３，Ａ．Ｊ．Ｍ．Ｍａｔｚｋｅ　＆　Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３９−４９およびＪ．Ｌｅｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：１４９−１６４，彼らはシャトルベクターを“中間ベクター”（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｖｅｃｔｏｒｓ）という語で呼んでいる，を参照。
【００１２】
大型ＤＮＡ分子への挿入変換の為のシャトルベクター系の最近現れた変種は“自殺ベクター”（ｓｕｉｃｉｄｅ　ｖｅｃｔｏｒ）である。この系ではＡ．Ｐｕｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　ａｐｐｌｉ−ｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ　ｎｏ．５１０，３７０およびＲ．Ｓｉｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）印刷中，に示されたように，シャトルベクターは受容細胞内で維持され得ない。この性質は，三親交雑で通常行われるように，シャトルベクターを排除する為に受容細胞へ不和合性プラスミドを導入する必要性をなくす。ある既存のＤＮＡへ有効に取り込まれない全てのベクターは，複製されない事により“自殺する”。シャトルベクターの伝統的な型で行われ得るように，相同性の２つの領域間にない抗生物質耐性遺伝子を選別する事により，２重と単一との相同性を区別できる。ＤＮＡ配列をＴｉプラスミドへ転移させるｐＢＲ３２２に基づく自殺ベクターの利用がＥ．Ｖａｎ　Ｈａｕｔｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ　Ｊ．２：４１１−４１７およびＬ．Ｃｏｍａｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１：２９１−３００により報告された。
【００１３】
相同組み換えによりＴ−ＤＮＡへの新規ＤＮＡ配列の導入の為のシャトルベクターの使用に代わる他の方法として，細菌のトランスポソンがある。ＴＩＰプラスミド上のアグロバクテリウム−遺伝子の項で述べるように，トランスポソンはＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡへ“跳ぶ”ことができる。（例えばＤ．Ｊ．Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｃｅｌｌ　２７：１４３−１５３参照）。トランスポソンはインビトロで新規配列の挿入により修飾されるべきで，この新規ＤＮＡをトランスポソンによりＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡへ転移させ得る。このＴＩＰは次いで，安定に組み込まれた場合，新規ＤＮＡ／トランスポソン／Ｔ−ＤＮＡの組を植物細胞へ移すことができる。
【００１４】
（アグロバクテリウム−概説）
アグロバクテリウム・チューメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）とアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）種はグラム陰性細菌リゾビアシー科，アグロバクテリウム属に含まれる。これら種は夫々植物のクラウンゴール病と毛状根病の原因体である。クラウンゴールは脱分化組織の瘤生育により特徴づけられる。毛状根は感染組織で根の異常な誘導により特徴づけられる奇形種である。両病において異常生育植物組織は感染細菌により異化される，正常には植物により生成されない，オピンとして知られる１つまたはそれ以上のアミノ酸誘導体を生産する。既知のオピンは３つの主な種類，その代表的物質はオクトロン，ノパリンおよびアグロピンであるが，に分類される。異常に増殖している組織の細胞は培養で生育でき，また適当な条件下で，ある形質転換表現型を維持した完全植物体に再生できる。
【００１５】
アグロバクテリウムの野性株はアグロバクテリウム・チューメファシエンスのＴｉ（腫瘍誘導）プラスミド，アグロバクテリウム・リゾゲネスのＲｉ（根誘導）プラスミドとして知られる大型プラスミドを保持する。これらプラスミドを菌株から除去すると病原性を失う。ＴｉプラスミドはＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）と呼ばれる，腫瘍では宿主植物のゲノムに組み込まれる領域を含む。このＴ−ＤＮＡはいくつかの転写物をコードしている。変異実験からこれらのうちのいくつかは腫瘍増殖の誘導に関与することがわかった。ｔｍｌ，ｔｍｒおよびｔｍｓ遺伝子の変異は夫々巨大腫瘍（タバコで），根発生傾向，およびシュート誘導傾向になる。Ｔ−ＤＮＡはまた少なくとも１つのオピンシンターゼの遺伝子をコードし，Ｔｉプラスミドはしばしばそれが合成を司るオピンにより分類される。各Ｔ−ＤＮＡ遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下にある。Ｔ−ＤＮＡプロモーターは構造では真核プロモーターに似ており，それらは形質転換植物細胞でのみ機能するらしい。ＴｉプラスミドはまたＴ−ＤＮＡ領域の外側に遺伝子を有する。これらの遺伝子はオピン異化，発癌性，アグロシン感受性，複製および細菌細胞への自己転移の機能に関与する。ＲｉプラスミドはＴｉプラスミドと類似の様式で組織されている。植物細胞の形質転換に関与する遺伝子およびＤＮＡ配列の組は，以後，集合的に腫瘍誘導説（ＴＩＰ）のとおりに引用する。したがってＴＩＰはＴｉとＲｉプラスミド両者を含む。ＴＩＰの組み込まれた区分をＴｉプラスミドあるいはＲｉプラスミドいずれに由来しようと，ここでは“Ｔ−ＤＮＡ”（転移ＤＮＡ）と呼ぶ。
【００１６】
Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ（Ｊｕｎｅ　１９８３）Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．２４８（６）：５０−５９，は最近ベクターとしてのＴｉプラスミドの利用に関する入門書を著した。アグロバクテリウム起因病の最近の一般的総説には以下のものがある。Ｄ．Ｊ．Ｍｅｒｌｏ（１９８２），Ａｄｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ．１：１３９−１７８，　Ｌ．Ｗ．Ｒｅａｍ＿　＆　Ｍ．Ｐ．Ｇｏｒｄｏｎ（１９８２），Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１８：８５４−８５９，　およびＭ．Ｗ．Ｂｅｖａｎ　＆　Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ（１９８２），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３５７−３８４；Ｇ．Ｋａｈｌ　＆　Ｊ．Ｓｃｈｅｌｌ（１９８２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｕｍｏｒｓ　とＫ．Ａ．Ｂａｒｔｏｎ　＆　Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５２７−５３９．
（アグロバクテリウム−植物組織の感染）
植物細胞は当業者に既知の以下の多くの方法によりアグロバクテリウムで形質転換されるが，またこれらの方法に限定されない：培養植物細胞とアグロバクテリウムの共存培養，植物の直接感染，植物プロトプラストとアグロバクテリウムのスフェロプラストの融合，植物細胞プロトプラストによる遊離ＤＮＡの取り込みによる直接形質転換，部分的に細胞壁を再生しているプロトプラストの生細菌での形質転換，プロトプラストのＴ−ＤＮＡ含有リポソームによる形質転換，Ｔ−ＤＮＡを有するウイルスの利用，顕微注射（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）など。どの方法も遺伝子が確実に発現し，また有糸分裂，減数分裂を通じて安定に伝達される限り十分である。
【００１７】
アグロバクテリウムによる植物組織の感染は当業者によく知られている単純な技術である（例えば，Ｄ．Ｎ．Ｂｕｔｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）ｉｎＴｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ，ｅｄｓ．：Ｄ．Ｓ．Ｉｎｇｒａｍ　＆　Ｊ．Ｐ．Ｈｅｌｇｅｓｏｎ，ｐｐ．２０３−２０８参照）。典型的には植物を多くの方法のいずれか，例えば刃物で切る，針で穴をあける，あるいは研磨剤でこする，などで傷をつける。次いでこの傷に腫瘍誘導細菌を含む液をつける。生植物体感染に対する別の方法は，ポテトの塊茎ディスク（Ｄ．Ｋ．Ａｎａｄ　＆　Ｇ．Ｔ．Ｈｅｂｅｒｌｅｉｎ（１９７７）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ．６４：１５３−１５８）あるいはタバコ茎の断片（Ｋ．Ａ．Ｂａｒｔｏｎ，ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ　３２：１０３３−１０４３）などの組織片の感染である。感染後，腫瘍を植物ホルモン不含培地での組織培養へ移すことができる。ホルモン非依存性増殖は形質転換植物組織に典型的なものであり，そのような組織の培養での通常の増殖条件とは極めて対照的である（Ａ．Ｃ．Ｂｒａｕｎ（１９５６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１６：５３−５６）。
【００１８】
アグロバクテリウムはまた単離細胞，培養で生育した細胞（Ｌ．Ｍａｒｔｏｎｅｔ　ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ　２７７：１２９−１３１）および単離タバコプロトプラストに感染できる。後者の技術では，新しい細胞壁の部分的再生の時間経過後，アグロバクテリウム細胞をしばらく培養に加え，次いで抗生物質により殺す。Ｔｉプラスミドを保持するアグロバクテリウム・チューメファシエンス細胞にさらされた細胞のみがホルモン不含培地に置かれたとき，カルスを形成し得る。大部分のカルスはオピン同化に関与する酵素活性を有することがわかった。他の研究者（Ｒ．Ｂ．Ｈｏｒｓｃｈ　＆　Ｒ．Ｔ．Ｆｒａｌｅｙ（１８　Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３）１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）は共存培養による形質転換を報告し，高い率（１０％以上）でホルモン非依存増殖をするカルスが得られ，これらカルスの９５％がオピンをつくった。Ｍ．Ｒ．Ｄａｖｅｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）ｉｎ　Ｉｎｇｒａｍ　＆Ｈｅｌｇｅｓｏｎ，　前出，ｐｐ−２０９−２１９，はプロトプラストから再生した古い細胞の感染を報告した。
【００１９】
植物プロトプラストはＴＩＰプラスミドの直接取込みにより形質転換され得る。Ｍ．Ｒ．Ｄａｖｅｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１８：３０７−３１３およびＭ．Ｒ．Ｄａｖｅｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）ｉｎ　Ｉｎｇｒａｍ　＆　Ｈｅｌｇｅｓｏｎ，前出，はポリ−Ｌ−α−オルニチン存在下でＴｉプラスミドを用いてペチュニアのプロトプラストを，オピンを合成し，培養でホルモン非依存性増殖する表現型に，形質転換することができた。ポリエチングリコール促進Ｔｉプラスミド取込みと，あるＴ−ＤＮＡ配列がゲノムに取込れることが後に示された（Ｊ．Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３：４５１−４５８，Ｍ．Ｒ．Ｄａｖｅｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　１９８２，ｅｄ：Ａ．Ｆｕｊｉｗａｒａ，ｐｐ．５１５−５１６）。Ｆ．Ａ．Ｋｒｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ　２９６：７２−７４，はポリエチレングリコールと次いでカルシウムショックにより類似の結果を報告したが，彼らの結果は，組み込まれたＴ−ＤＮＡは隣接するＴｉプラスミド配列を含むことを示唆する。
【００２０】
ＤＮＡを取り込ませる別の方法にリポソームの利用がある。ＤＮＡ含有リポソームの調製は　Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ　により米国特許４，０７８，０５２と４，２３５，８７１に述べられている。リポソームを介したＴｉ−ＤＮＡの取込みに関する調製法が報告された（Ｔ．Ｎａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ｉｎ　Ｆｕｊｉｗａｒａ，前出，ｐｐ．５０９−５１０，およびＴ．Ｎａｇａｔａ（１９８１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８４：１６１−１６５）。類似の系に植物と細菌細胞の細胞壁除去後の融合がある。この方法の例はＳ．Ｈａｓｅｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８２：２０６−２１０により報告された。アグロバクテリウム・スフェロブラストによるビンカ（Ｖｉｎｃａ）・プロトプラストの形質転換である。植物プロトプラストは細胞壁に欠陥のあるアグロバクテリウム細胞を取り入れることができる（Ｓ．Ｈａｓｅｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ｉｎ　Ｆｕｊｉｗａｒａ，前出，ｐｐ，５１７−５１８）。
【００２１】
Ｔ−ＤＮＡを，２つのプロトプラストの融合物から再生した組織へ伝達することができ，そのうちの１つのみが形質転換される（Ｇ．Ｊ．Ｗｕｌｌｅｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．５６：２０３−２０８）。植物の再生の項で詳述するように，Ｔ−ＤＮＡは減数分裂を通して伝わり，単純なメンデルの法則で子孫に伝達される。
【００２２】
（アグロバクテリウム−植物の再生）
正常な形態を有した分化植物組織がクラウンゴール腫瘍から得られた。Ａ．Ｃ．Ｂｒａｕｎ　＆　Ｈ．Ｎ．Ｗｏｏｄ（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７３：４９６−５００，はタバコ奇形腫を正常植物につぎ木し，開花し得る正常に見えるシュートを得ることができた。このシュートはオピンを作り，培地に置くと植物ホルモン非依存性増殖する能力を保持した。選別された植物では，これら腫瘍表現型の子孫への伝達は観察されず，見掛け上，減数分裂の間に失われた（Ｒ．Ｔｕｒｇｅｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７３：３５６２−３５６４）。腫瘍の性質を自然に失った，あるいは奇形腫の種子から生じた植物は，最初すべてのＴ−ＤＮＡを失ったことが示された（Ｆ．−Ｍ．Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１６：８７−９２，Ｆ．Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７７：７０７−７１４，Ｍ．Ｌｅｍｍｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４４：３５３−３７６）。しかし，ホルモン処理（１ｍｇ／ｌカイネチン）後復帰した植物での後の研究は，減数分裂を経過した植物は形質転換表現型に関するＴ−ＤＮＡ遺伝子を失っているが，Ｔ−ＤＮＡの両端に相同な配列を保持し得ることを示した（Ｆ．Ｙａｎｇ　＆　Ｒ．Ｂ．Ｓｉｍｐｓｏｎ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：４１５１−４１５５）。Ｇ．Ｊ．Ｗｕｌｌｅｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｃｅｌｌ　２４：７１９−７２４　はさらに，その植物は雄性不稔であるが，オピン同化に関与する遺伝子は減数分裂を通して伝わり得ること，および変化いていないＴ−ＤＮＡがメンデル法則で遺伝できること示した（Ｇ．Ｗｕｌｌｅｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ｉｎ　Ｆｕｊｉｗａｒａ，前出）。Ｌ．Ｏｔｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌｅｃ　Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８３：２０９−２１３，はシュートを生じる腫瘍生成のｔｍｓ（シュート誘導）部位にＴｎ７　トランスポソン由来Ｔｉプラスミド変異を用いた。これらのシュートが植物体へ再生するとき，彼らは自己稔性花を生ずることを見出した。生じた種子は発芽しＴ−ＤＮＡを含みオピンをつくる植物になった。後の研究において，Ｈ．ＤｅＧｒｅｖｅｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ　３００：７５２−７５５，はオクトピンシンターゼが単一優性メンデル遺伝子として遺伝することができることを見出した。しかし，カルスから再生を行う間にＴ−ＤＮＡはｏｃｓより他の機能の大きな欠失を受けた。ｔｍｒ（根誘導）変異での同様の実験は，完全な長さのＴ−ＤＮＡが減数分裂を通して子孫に伝わり得たこと，これらの子孫でノパリン遺伝子がレベルには変動があるが発現し得たこと，および同時に転送された酵母のアルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子は発現しなかったこと（Ｋ．Ａ．Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ　３２　：１０３３−１０４３）を示した。今のところＴ−ＤＮＡ配列を欠く再生組織は恐らく腫瘍に“混在している”非形質転換細胞に由来するらしい（Ｇ．Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０：５８９−５９７）。Ａ．Ｎ．Ｂｉｎｎｓ（１９８３）Ｐｌａｎｔａ　１５８：２７２−２７９，による最近の研究は腫瘍の遺伝子，この場合ｔｍｒ，は再生の間は阻止されることができ，再生組織を培地に置くことにより“戻ってくる”ことを示す。
【００２３】
アグロバクテリウム・リゾゲネスによる形質転換の結果の根は比較的容易に苗に直接再生することが示された（Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ　２９５：４３２−４３４）。
【００２４】
（アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミド上の遺伝子）
ＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡの中に多くの遺伝子が同定された。約半ダースのオクトピンプラスミドＴ−ＤＮＡの転写物がマップされ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：７６−８０，Ｌ．Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ　Ｊ．１：１３９−１４６）またいくつかの機能が明らかになった（Ｊ．Ｌｅｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ　Ｊ．１：１４７−１５２）。これら転写物のいくつか，特にｔｍｒとｔｍｓをコードする領域のものはまた原核細胞で転写され得る（Ｇ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ　Ｊ．２：４０３−４０９）。トランスポソン変異によりよくわかっているオクトピン型プラスミドの４つの遺伝子にｔｍｓ，ｔｍｒおよびｔｍｌが含まれる（Ｄ．Ｊ．Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｃｅ１ｌ　２７：１４３−１５３）。これらの遺伝子に変異のあるＴｉプラスミドは夫々ニコチアナ・タバカムの腫瘍カルスを刺激し，シュートを発生させ，根を繁殖させ，そして正常より大きくする。他の宿主では，これらの遺伝子の変異は別の表現型となる（Ｍ．Ｗ．Ｂｅｖａｎ　＆　Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ（１９８２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３５７−３８４参照）。ｔｍｓとｔｍｒの表現型は腫瘍に存在する植物ホルモンのレベルの差と相関する。サイトカイニン：オーキシン比の差は，培養で非形質転換カルス組織にシュートを培養するあるいは根を形成する差と似ている（Ｄ．Ｅ．Ａｋｉｙｏｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：４０７−４１１）。ｔｍｓかｔｍｒの一方のみ，但し機能のあるｔｍｌ単独ではないが，の機能する遺伝子を含むＴ−ＤＮＡは顕著な腫瘍増殖を助長できる。シュートとルートの助長は機能のあるｔｍｌにより夫々促進され，阻害される（Ｌ．Ｗ．Ｒｅａｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：１６６０−１６６４）。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子での変異はＴ−ＤＮＡの植物ゲノムヘの挿入には影響がないらしい（Ｌｅｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）前出，Ｒｅａｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）前出）。ｏｃｓ遺伝子はオクトピンシンターゼをコードし，Ｈ．Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４９９−５１１，により配列が決定された。それはイントロン（真核遺伝子に共通して見られる介在配列で，転写後ｍＲＮＡの成熟の間にメッセンジャー前駆体から切り出される）を含まない。それは真核の転写信号（“ＴＡＴＡボックス”）とポリアデニル化部位を有する。ｏｃｓ遺伝子の発現に必要なすべての信号はｏｃｓ転写開始部位の２９５ベースペアー内に見つかる（Ｃ．Ｋｏｎｃｚ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ　Ｊ．２：１５９７−１６０３）。
【００２５】
ノパリンＴｉプラスミドはノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）をコードし，それはＡ．Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７３により配列が決定された。ｏｃｓ遺伝子で見られたようにｎｏｓはイントロンで分断されていない。それは２つの推定されるポリアデニル化部位と可能性のある“ＴＡＴＡボックス”を有する。ｏｃｓと対照的にｎｏｓは“ＣＡＴボックス”として知られる転写信号らしい配列が前にある。ｎｏｓ遺伝子の発現に必要なすべての信号がｎｏｓ転写開始部位の２６１ベースペアー内に見つかった（Ｃ．Ｋｏｎｃｚ　ｅｔ　ａｌ．，前出）。アグロシノピンシンターゼの遺伝子およびｔｍｓとｔｍｒに相当する遺伝子がノパリン型プラスミドで同定され（Ｈ．Ｊｏｏｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ　３２：１０５７−１０６７），また多くの転写物がマップされた（Ｌ．Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ　３２：１０４５−１０５６）。Ｊ．Ｃ．ＭｃＰｈｅｒｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：２６６６−２６７０，はクラウンゴール組織のＴ−ＤＮＡのコードするｍＲＮＡのインビトロ翻訳を報告した。
【００２６】
毛状根Ｔ−ＤＮＡからの転写もまた検出された（Ｌ．Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８６：１６−２２）。機能的には，この毛状根の症状はｔｍｒで変異したＴｉプラスミドにより刺激されたクラウンゴール腫瘍と同様に見える（Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ　＆　Ｅ．Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：７１０−７２０）。
【００２７】
真核生物ではＤＮＡのメチル化（特にシトシン残基の）は転写の不活性化と相関している；比較的メチル化の少ない遺伝子はｍＲＮＡへ転写される。Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１：１５９−１７４，はクラウンゴール腫瘍のＴ−ＤＮＡには常に少なくとも１つメチル化されていないコピーが存在することを見出した。同じゲノムがメチル化されているＴ−ＤＮＡの多コピーを含むであろうことは，１つ以上の過剰のＴ−ＤＮＡのコピーは生物学的には不活性であるらしいことを示唆する（またＧ．Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０：５８９−５９７参照）。
【００２８】
ＴｉプラスミドはＴ−ＤＮＡ領域の外側にあり，感染過程に必要な他の遺伝子をコードしている。（ノバリンプラスミドについてはＭ．Ｈｏｌｓｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｐｌａｓｍｉｄ　３：２１２−２３０，およびオクトピンプラスミドについてはＨ．ＤｅＧｒｅｖｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｐｌａｓｍｉｄ　６：２３５−２４８，Ｄ．Ｊ．Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ａｎｄ　Ｅ．Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：７３２−７４３）およびＧ．Ｏｏｍｓ（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：８２−９１参照）。最も重要なのはｏｎｃ遺伝子であり，それが変異するとＴｉプラスミドの発癌性が失われる。（これらの位置は毒性に対するｖｉｒとしてまた知られている）。いくつかのｏｎｃ遺伝子は正確にマップされており，種々のＴｉプラスミド間で保存されている領域に位置することがわかっている（Ｈ．Ｊ．Ｋｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：８７８−８８３，Ｖ．Ｎ．Ｉｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８８：４１８−４２４）。このｏｎｃ遺伝子はトランスで作用し，異なったプラスミド型のＴ−ＤＮＡでの植物細胞の形質転換を起こすことができ，そして物理的に他のプラスミド上に存在する（Ｊ．Ｈｉｌｌｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｌａｓｍｉｄ　７：１０７−１１８，Ｈ．Ｊ．Ｋｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０：３２７−３３１，Ａ．Ｊ．ｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１：２６２−２６９）。ノパリンＴｉＤＮＡは，Ｔｉプラスミドからの切出しまたは宿主ゲノムヘの取込みに関与するらしいＴ−ＤＮＡの左および右境界にすぐに隣接した２５塩素対の順方向反復配列を有し（Ｎ．Ｓ．Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：６３２２−６３２６），そして類似の配列がオクトピンＴ−ＤＮＡ境界に接していることが観察された（Ｒ．Ｂ．Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ　２９：１００５−１０１４）。オピン異化はオクトピンおよびノパリン型プラスミドの夫々ｏｃｃ遺伝子およびｎｏｃ遺伝子により特異的に起こる。このＴｉプラスミドもまた複製開始点を含むそれ自身の生成に必要な機能をコードする。Ｔｉプラスミドの転写物はＳ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｐｌａｓｍｉｄ　６：１７−２９によりアグロバクテリウム・チューメファシエンス細胞に検出され，彼らはＴ−ＤＮＡ領域は非Ｔ−ＤＮＡ配列に沿って弱く転写されることを見出した。Ｔｉプラスミドが決定する性質についてはＭｅｒｌｏ，前出（特に第２表参照）およびＲｅａｍ　＆　Ｇｏｒｄｏｎ，前出，による総説がある。
【００２９】
（アグロバクテリウム−ＴｉプラスミドＤＮＡ）
種々のオクトピン型Ｔｉプラスミドは，ＤＮＡハイブリダイゼーション（Ｔ．Ｃ．Ｃｕｒｒｉｅｒ　＆　Ｅ．Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ（１９７６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２６：１５７−１６５）あるいは制限酵素解析（Ｄ．Ｓｃｉａｋｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９７８）Ｐｌａｓｍｉｄ　１：２３８−２５３）で調べたところお互いにほぼ１００％類似している。ノパリン型Ｔｉプラスミドはお互い６７％程度の類似性がある（Ｃｕｒｒｉｅｒ　＆　Ｎｅｓｔｅｒ，前出）。ある研究は異なったＴｉプラスミドがお互いに極めて類似していることを示した（Ｐ．Ｃｏｓｔａｎｔｉｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｐｌａｓｍｉｄ　５：１７０−１８２）。Ｎ．Ｈ．Ｄｒｕｍｍｏｎｄ　＆　Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ（１９７８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３６：１１７８−１１８３，はオクトピンおよびノパリン型Ｔｉプラスミドの比較的小さな区分はお互いに類似していることを示した。これらの類似域はＧ．Ｅｎｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５２：１８３−２０８，により詳しくマップされた。彼らは４つの類似領域のうち３つが３（Ｔ−ＤＮＡに重なる），４（あるｏｎｃ遺伝子を含む）および９（ｏｎｃ遺伝子を有する）類似配列に細分類されることを見出した。連続した類似領域は少なくとも１つのｔｒａ遺伝子（Ｔｉプラスミドの他の細菌細胞への接合伝達に関する）と複製と不和合性に関する遺伝子を含む。この連続した領域はリゾピアシー科の別の属であるリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の一種にあるＳｙｍプラスミド（共生窒素固定に関与する）と類似性がある（Ｒ．Ｋ．Ｐｒａｋａｓｈ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｌａｓｍｉｄ　７：２７１−２８０）。４つの領域はすべて同一方向に配置しているが順序は保存されていない。Ｔ−ＤＮＡ配列の一部はノパリンおよびオクトピンプラスミド間で極めて高度に保存されている（Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ　２７５：１４７−１４９，Ａ．Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ　２７５：１５０−１５３）。Ｒｉプラスミドはそれら自身の間で，およびオクトピン（Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ　＆　Ｅ．Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：７１０−７２０）およびノパリン（Ｇ．Ｒｉｓｕｌｅｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｌａｓｍｉｄ　７：４５−５１）両プラスミドに対し主にｏｎｃ遺伝子をコードする領域に対し，極めて類似性があることが示された。ＲｉＴ−ＤＮＡは両型のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに対し弱いながらも，かなり類似部分を含む（Ｌ．Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８６：１６−２２）。感染していないニコチアナ・グラウカの植物ＤＮＡはｃＴ−ＤＮＡ（細胞Ｔ−ＤＮＡ）と呼ばれる配列を含んでおり，ＲｉＴ−ＤＮＡの一部に類似性を示す（Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　３０１：３４８−３５０，Ｌ．Ｓｐａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１：２９１−３００）。Ｇ．Ａ．Ｈｕｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，は交叉ハイブリダイゼーションの領域をマップし，またＲｉプラスミド，つまり，ｐＲｉＡ４ｂ，はｐＴｉＴ３７よりｐＴｉＡ６（オクトピン型）に近く，このＲｉプラスミドはｔｍｒではなくｔｍｓに類似の配列を有するらしいことを示した。彼らの結果はまたＲｉＴ−ＤＮＡはオクトピンＴ−ＤＮＡの場合に似て不連続であるらしいことを示唆した。
【００３０】
Ｔｉ（Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９７７）Ｃｅｌｌ　１１：２６３−２７１）またはＲｉ（Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ　２９５：４３２−４３４，Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：３１９３−３１９７，Ｌ．Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８６：１６−２２）プラスミドの一部が腫瘍植物細胞のＤＮＡにみられることが示された。転移したＤＮＡはＴ−ＤＮＡとして知られる。Ｔ−ＤＮＡは核内の（Ｍ．Ｐ．Ｎｕｔｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１８：１−６，Ｌ．Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ　２８７：３５９−３６１，Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：４０６０−４０６４）宿主ＤＮＡ（Ｍ．Ｆ．Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：６４４８−６４５２，Ｎ．Ｓ．Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ　２８７：４５８−４６１）に組み込まれる。
【００３１】
Ｍ．Ｆ．Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：６４４８−６４５２およびＭ．Ｆ．Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ　１９：７２９−７３９，はオクトピン型ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡが２つの別の区分，Ｔ−ＤＮＡの夫々の左，右のＴＬ−ＤＮＡとＴＲ−ＤＮＡで組み込まれたことを見つけた。ＴＲとＴＬのコピー数は変動する（Ｄ．Ｊ．Ｍｅｒｌｏ　ｅｔ　ａｌ．、（１９８０）Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７７：６３７−６４３）。Ｔ−ＤＮＡの中芯はノパリンＴ−ＤＮＡが類似性が高く（Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９７８）前出，および　Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９７８）前出），腫瘍維持に必要で，ＴＬにあり，一般に細胞当り１コピー存在し，ｔｍｓ，ｔｍｒおよびｔｍｌ遺伝子をコードする。一方，ＴＲは多いコピー数存在するが（Ｍｅｒｌｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）前出）全くなくても良い（Ｍ．Ｄｅ　Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８３：２８３−２８８，Ｇ．Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：５８９−５９７）。Ｇ．Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｌａｓｍｉｄ　７：１５−２９，はＴＲがＴｉプラスミドから欠失しても，アグロバクテリウム・チューメファシエンスはいくらか毒性を保持していることを見出したが，ＴＲがＴ−ＤＮＡ組み込みに関与すると仮想した。Ｇ．Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０：５８９−５９７はＴ−ＤＮＡは時に植物ゲノムへ組み込まれた後欠失するが，一般に安定であり，またＴ−ＤＮＡの組織化が異なる細胞の混合物を含む腫瘍は多重感染の結果であることを示した。ｏｃｓ遺伝子はＴＬに見つかるが，腫瘍生育に関連する表現型を失うことなく植物ゲノムから欠失し得る。組み込まれたＴＬの左側境界は順方向あるいは逆方向配列いずれかのＴ−ＤＮＡ配列の反復からなることが観察された（Ｒ．Ｂ．Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｃｅ１１２９：　１００５−１０１４）。
【００３２】
オクトピン型腫瘍の立場と対照的に，ノパリンＴ−ＤＮＡは１つの連祝した断片として宿主ゲノムに組み込まれる（Ｍ．Ｌｅｍｍｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４４：３５３−３７６，Ｐ．Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０９：１３８５−１３９１）。順方向に連続した反復配列が見受けられた。奇形腫から再生した植物のＴ−ＤＮＡは挿入ＤＮＡの境界断片でのわずかな修飾を有する（Ｌｅｍｍｅｒｓ　ｅｔａｌ．，前出）。右および左境界間の結合部の配列の解析から多くの順方向反復と１つの逆方向反復が明らかになった。後者は結合部にまたがっていた（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａ１．（１９８０）前出）。左側結合部は少なくとも７０塩基対が変動していたが，他方，右側結合部は１塩基より多くは変わらなかった（Ｐ．Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３６１−３７０）。一連の反復の結合部の左および右境界は１３０塩基対以上の間隔で分析されて存在する。この間隔は起源が不明でまたあるＴ−ＤＮＡ配列を含む。Ｔ−ＤＮＡは両方の繰り返しおよび低コピー数の宿主配列に組み込まれることが見出された。Ｈ．Ｊｏｏｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ　３２　：１０５７−１０６７，は毒性は通常のノパリンＴ−ＤＮＡ境界のどちらかの欠失後もなくならないことを示した。
【００３３】
Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）前出，およびＺａｍｂｒｙｓｋｉｅｔ　ａｌ．（１９８０）前出，は境界領域の順方向反復はＴ−ＤＮＡの植物ＤＮＡへの組み込みに関与することを示唆した。２つの異なったＴｉプラスミド由来の境界を有するＴ−ＤＮＡは，類似の境界を有するものより特異的に組み込まれにくいことはこの示唆を支持する（Ｇ．Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１：２６５−２７６）。
【００３４】
Ｎ．Ｓ．Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：６３２２−６３２６，はバクテリオファージλで１０ｋｂ離れた周囲のＤＮＡに一般組み換えを増大させるｃｈｉ部位をノパリンＴｉプラスミド中のＴ−ＤＮＡの左端のすぐ外側に見出した。Ｒ．Ｂ．Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ２９：１００５−１０１４はオクトピンＴｉプラスミドにはｃｈｉ配列を見出さなかったが，作用の範囲を考えると必ずしも可能性を排除するものでなく，配列された領域の外側にあるかも知れない。Ｔｉプラスミドでのｃｈｉの意義は不明である。もしｃｈｉが機能を有しているとすれば，ｃｈｉがＴ−ＤＮＡ内に見つからないので，それは，多分植物内ではなくアグロバクテリウム細胞内で使われる。
【００３５】
（アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミドの操作）
シャトルベクターの項で詳述したように，変化したＤＮＡ配列を、ＴＩＰプラスミドの所望位置に導入する技術が発達した。トランスポソンはこの技術を用いて容易に挿入され得る（Ｄ．Ｊ．Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｃｅｌｌ２７：１４３−１５３）。Ｊ．−Ｐ．Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎ　ｅｔａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ２８７：６５４−６５６，はＴｉプラスミド中のＴ−ＤＮＡに挿入されたＤＮＡ配列（ここでは細菌のトランスポソン）が受容植物のゲノムに転移し組み込まれることを示した。外来ＤＮＡの挿入が異なった起源の多数の遺伝子を用いて行われたが，今迄のところ外来遺伝子は通常それら自身のプロモーターの支配下では発現されなかった。これら遺伝子の起源とした酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）（Ｋ．Ａ．Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ３２：１０３３−１０４３），トウモロコシのＡｄｈ　Ｉ（Ｊ．Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，未発表）およびゼイン，哺乳類のインターフェロンとグロビン，および哺乳類ウイルス　ＳＶ　４０（Ｊ．Ｓｃｈｅｌｌ，未発表）がある。しかしノパリンシンターゼ遺伝子をオクトピンＴ−ＤＮＡに挿入し植物組織に導入した場合，完全に機能を発揮した（Ｃ．Ｌ．Ｆｉｎｋ（１９８２）Ｍ．Ｓ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ）。豆のファセオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）Ｌ．の種子に存在する貯蔵タンパクであるファセオリンをコードする遺伝子がヒマワリの腫瘍に導入され，発現した。この後者の研究は転移した植物遺伝子が異なる植物組織内で，それ自身のプロモーターの支配下で発現した最初の例である。転写は正しい位置で始まりそして終り，そしてイントロンは転写後に適切に処理された（Ｔ．Ｃ．Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ．ｎｏ．４８５，６１３，これをここで引用文献として採用する）。Ｍ．Ｈｏｌｓｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８５：２８３−２８９，はＴ−ＤＮＡに挿入された細菌トランスポソン（Ｔｎ７）が植物ゲノムに取り込まれた後完全に機能を果たし，かつ形が変化していないらしいことを示した。
【００３６】
欠失はいくつかの方法でＴＩＰプラスミドに起こさせ得る。シャトルベクターを，標準組み換えＤＮＡ技術（Ｃｏｈｅｎ＆Ｂｏｙｅｒ，ＵＳ　Ｐａｔ．４、２３７、２２４）により作られた欠失の導入に用いることができる。一方のあらかじめ決定された末端を有する欠失はトランスポソンの不適当な切出しにより作り出される（Ｂ．Ｐ．Ｋｏｅｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９７９）Ｐｌａｓｍｉｄ２：３４７−３５７，およびＧ．Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｌａｓｍｉｄ７：１５−２９）。Ｊ．Ｈｉｌｌｅ＆Ｒ．Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ（１９８１）Ｐｌａｓｍｉｄ６：１５１−１５４，は両末端があらかじめ決定された位置を有する欠失を２つのトランスポソンを用いて作り得ることを示した。この技術はまたインビボ“組み換えＤＮＡ”分子作成に用いることもできる。
【００３７】
ノパリンシンターゼ遺伝子は，形質転換植物細胞の選別に用いることができる薬剤耐性をコードするＤＮＡ区分の挿入に用いられた。植物細胞では，Ｔｎ５からのカナマイシン耐性遺伝子はそれ自身のプロモーターの支配下で転写されない（Ｊ．Ｄ．Ｋｅｍｐ　ｅｔ　ａｌ．（１８　Ｍａｙ　１９８２）Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ　Ｓｙｍｐ．ＶＩＩ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；（１９８
３）ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔｏ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｅｄ．Ｌ．Ｄ．Ｏｗｅｎｓに掲載される；およびＣ．Ｌ．Ｆｉｎｋ（１９８２），前出）。Ｍ．Ｗ．Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　ａ１．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　３０４：１８４−１８７とＲ．Ｔ．Ｆｒａｌｅｙｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：４８０３−４８０７，はＴｎ５のカナマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ）をノパリンプロモーターの
後（すなわち，その支配下）に挿入した。この作成物は培養でカナマイシンおよびＧ４１８のようなそのアナログに耐性を示す植物細胞への形質転換に用いられた。Ｊ．Ｓｃｈｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．（１８　Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３）１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ．（Ｊ．Ｌ．Ｍａｒｘ（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９：８３０も参照），は同様の作成物を報告し，これにはＴｈ７からのメトトレルキサメート耐性遺伝子（ジハイドロフォレート　リダクターゼ）がノパリンシンターゼのプロモーターの後に位置した。形質転換細胞はメトトレキサメートに耐性であった。同様にＬ．Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０３：２０９−２１３は植物細胞でオクトピンシンターゼおよび細菌でクロラムフェニコール耐性を与える酵素，クロラムフェニコールトランスアセチラーゼの酵素活性，をこれら２つの酵素の構造遺伝子をｎｏｓプロモーター支配下におくことにより発現させた。
【００３８】
ここで引用文献として採用するＴ．Ｃ．Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ．ｎｏ．４８５，６１４，はｏｃｓプロモーターとオクトピンシンターゼ構造遺伝子の５’末端を豆種子タンパク，ファセオリンの構造遺伝子に融合させた。オクトピンシンターゼのアミノ末端を有しファセオリンのアミノ末端を欠く融合タンパクがＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で生産された。ファセオリン配列に介在するイントロンは転写後に正しくプロセッシングされた。
【００３９】
Ａ．Ｊ．ｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１：２６２−２６９，は“小−Ｔｉプラスミド”（ｍｉｎｉ−Ｔｉプラスミド）の作成を報告した。ノパリンＴ−ＤＮＡには制限酵素ＫｐｎＩの切断部位は正常には１ケ所しか存在しない。この部位を欠く変異が作成され，完全なノパリンＴ−ＤＮＡを含むＫｐｎＩ断片が単離された。この断片はカナマ
イシン耐性遺伝子と共にｐＲＫ２９０に挿入され，これによりアグロバクテリウム・チューメファシエンスで維持され，殆どすべての非Ｔ−ＤＮＡＴｉ配列を欠くプラスミドができた。それ自身では，このプラスミドは植物細胞を形質転換できなかった。しかしオクトピンＴｉプラスミドを含むアグロバクテリウム・チューメファシエンス株に入れると両オクトピン，ノパリンを合成する腫瘍が誘導された。この小−Ｔｉプラスミドはまた，それ自身のＴ−ＤＮＡを欠失したＴｉプラスミドで相補した場合，植物細胞に移された。これらの結果は，非Ｔ−ＤＮＡはＴ−ＤＮＡとトランスで作用し，失われたノパリンＴｉプラスミドの機能はオクトピンＴｉプラスミドで相補され，そして非ノパリン“小−Ｔｉ”は植物細胞の形質転換に機能的であることを示した。オクトピンＴ−ＤＮＡあるいはｏｎｃ遺伝子のいずれかを含む類似の各相補プラスミドの対がＡ．Ｈｏｅｋｅｍａｅｔａ１．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０３：１７９−１８０，により作成された。
【００４０】
Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１８　Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３）１５ｔｈＭｉａｍＷｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ．，もまた，小−ＴｉをＳｍａ　Ｉで処理し，本質的にはＴ−ＤＮＡのすべてを欠失させ，ノパリンシンターゼ遺伝子と左右境界のみを残した“徴−Ｔｉ”（ｍｉｃｒｏ−Ｔｉ）プラスミドの構築を報告した。この微−ＴｉをＳｍａＩ部位をなくした修飾ｐＲＫ２９０プラスミドに挿入し，小−Ｔｉと同様にして用い，同じような結果を得た。
【００４１】
【発明が解決しようとする課題】
（発明の要旨）
本発明の課題は植物に害虫耐性，特に昆虫耐性を与えることにある。この最終目標に到達するのに，他の課題として，殺虫性タンパクをコードする遺伝子を植物細胞のゲノムに安定に挿入すること，この遺伝子を植物細胞で発現させること，調節あるいは構成的に発現させること，およびこの植物組織が正常植物となることである。他の課題は，植物について新規の特殊な殺虫性組織をつくること，特に正常な双子葉植物に，その組織内に殺虫性タンパクを含む瘤を作らせる方法を確立することである。他の課題および利点は以下の記述から明らかになるであろう。
【００４２】
【課題を解決するための手段】
ここに開示する発明は，導入され，植物の発現プロモーターの支配下で発現する殺虫構造遺伝子を有する，遺伝的に修飾された植物細胞を含む植物を提供する。さらに本発明は，植物発現プロモーターの支配下で植物細胞内で発現するような，そのプロモーターに関し，方向と位置に挿入された殺虫構造遺伝子を有するＴ−ＤＮＡを，そのゲノムに含む植物細胞を有する植物組織を提供する。またＴ−ＤＮＡを含有し，複製する新規細菌株をも提供する。ここで，Ｔ−ＤＮＡとは，植物細胞内で植物発現プロモーターの支配下で発現するような方向と間隔とを該プロモーターに関し有する挿入殺虫構造遺伝子を含むよう修飾されている。さらに，本発明はエセリシア・コリー内で複製能を有し，かつＴ−ＤＮＡを含み，そしてさらに植物発現プロモーターの支配下で植物細胞内で発現するように，該プラスミド内に含まれるＴ−ＤＮＡ内に挿入された殺虫構造遺伝子を含む新規プラスミドを提供する。さらに本発明は殺虫構造遺伝子がエセリシア・コリーまたはバチルス・サチルス内で発現可能な新規プラスミドを開示し，さらにまた前記細菌発現プラスミドを保持する細菌株を開示する。
【００４３】
本発明は，植物細胞内で発現するプロモーターの支配下にある殺虫構造遺伝子を含む。該プロモーター／遺伝子の組合せは，さらに詳細には，好ましい実施態様において，ここに開示する本発明はさらに，Ｔ−ＤＮＡを介して導入後，すなわち殺虫構造遺伝子をＴ−ＤＮＡへ植物発現プロモーターの支配下に挿入しそして本挿入物を含む該Ｔ−ＤＮＡを既知の方法を用いて植物細胞に導入後，殺菌構造遺伝子を植物細胞内で植物発現プロモーター支配下にて発現させることをも包含する。
【００４４】
本発明は種々の細菌種または株の有用な殺虫構造遺伝子を挿入することにより遺伝的に植物組織および全植物体を修飾するのに有用であるそのような有用殺虫構造遺伝子は以下に定義される殺虫タンパク，特にバチルス・チューリンゲンシスの結晶タンパク，関連タンパク等，をコードする遺伝子を含むが，これに限らない。本発明はバチルス・チューリンゲンシス　ｖａｒ．クルスタキ（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．ｋｕｒｓｔａｋｉ）ＨＤ−７３の結晶タンパクの構造遺伝子の綿またはタバコ植物細胞への導入と発現により例証される。一度植物発現プロモーター支配下で殺虫構造遺伝子の発現する植物細胞が得られれば，植物組織および全植物体をそれから，当業者に周知の方法と技術を用いて，再生させることがでぎる。再生した植物を次いで通常の方法で生育させ，そして導入された遺伝子を通常の植物育種技術により他の株や栽培物に移すことができる。
【００４５】
殺虫タンパクの構造遺伝子の導入と発現はツノムシ（マンドカ種（Ｍａｎｄｕｃａ　ｓｐ．））または，ヨーロッパトウモロコシ喰い虫（オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ））などのような昆虫幼虫の蔓延から作物を守るのに用いることができる。本発明の他の利用，すなわち他の植物種へ導べ入された他の殺虫構造遺伝子の性質の探究は当業者には容易にわかる。本発明は原理的には，外来ＤＮＡ（より具体的にはＴ−ＤＮＡ）が導入され，該ＤＮＡが安定に複製を維持できるいかなる植物種への，殺虫構造遺伝子のいかなる導入にも応用される。一般にこれらの分類群は現在，以下のものを含むが，これに限られない；ヒマワリ（キク（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅａｅ）科），タバコ（ナス（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）科），アルファルファ，大豆および他の豆類（マメ（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓｅａｅ）科），綿（アオイ（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）科）および大部分の野菜などの裸子植物および双子葉植物。本発明の手段により制御されるであろう害虫および保護されるであろう作物は夫々第１，２表に列挙したものを含むが，これに限らない。多くの幼虫に対する感受性の故に綿は殺虫タンパク遺伝子の挿入に最も理想的な候補である。以下の各々は主な綿の害虫であり，またバチルス・チューリンゲンシス殺虫タンパクに感受性である：ヘリオシス・ゼア（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｅａ）（コットンボールウォーム），ペクチオノフォラ・ゴジピエラ（Ｐｅｃｔｉｏｎｏｐｈｏｒａｇｏｓｓｙｐｉｅ１１ａ）（ピンクボールウォーム），ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）（タバコバッドウォーム），トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）（キャベッジルーパー）。胞子形成しているバチルス・チューリンゲンシスから調製した殺虫タンパクは野のワタアカミムシのような昆虫には，その特殊な生活環と食飼習性のために効かない。組織中に殺虫タンパクを含む植物はこの耐性型の昆虫をも制御するし，バチルス・チューリンゲンシスの先の殺虫性利用以上の利点を提供する。殺虫タンパクを植物組織へ取り込ませることにより，本発明は不揃いな応用例を排除し，また殺虫性標品の購入と田畑への応用の価格面でも先の利用法を凌ぐ利点を提供する。また本発明は，小さな幼虫は殺虫タンパクに最も感受性が強く，またこのタンパクは常に存在しまた幼虫のエサとして早期に使われる結果，作物の害を最小にするので，このような標品の応用に注意深く時期を選ぶ必要性もない。
【００４６】
本発明は以下を提供する。
【００４７】
１．植物で発現可能なプロモーター支配下の殺虫構造遺伝子を有する遺伝的に修飾された植物細胞を有する植物。
【００４８】
２．前記細胞がＴ−ＤＮＡを有し，前記殺虫構造遺伝子がその中に挿入されている第１項目に記載の植物。
【００４９】
３．前記殺虫遺伝子が，ｔｍｌ遺伝子，ｏｃｓ遺伝子，あるいは前記Ｔ−ＤＮＡの“１．６”領域のいずれかの中の転写活性のある部位に挿入された第２項目に記載の植物。
【００５０】
４．前記Ｔ−ＤＮＡがｔｍｌ，ｔｍｓあるいはｔｍｒを不活化するよう修飾された第２項目に記載の植物。
【００５１】
５．前記Ｔ−ＤＮＡがさらに機能的ｏｃｓ遺伝子を有する第２項目に記載の植物。
【００５２】
６．前記殺虫構造遺伝子がバチルス・チューリンゲンシスから得られた第１項目に記載の植物。
【００５３】
７．植物で発現可能なプロモーターの支配下にある殺虫構造遺伝子を含有する遺伝的に修飾された植物細胞を有する植物組織。
【００５４】
８．前記細胞がＴ−ＤＮＡを有し，そのＴ−ＤＮＡ中に前記殺虫遺伝子が挿入されている第７項目に記載の組織。
【００５５】
９．前記殺虫遺伝子が前記ｔｍｌ遺伝子，前記ｏｃｓ遺伝子，あるいは，前記Ｔ−ＤＮＡの前記“１．６”領域のいずれかの中の転写活性のある部位に挿入された第８項目に記載の組織。
【００５６】
１０．前記Ｔ−ＤＮＡが修飾された第８項目に記載の組織。
【００５７】
１１．前記修飾によりｔｍｌ，ｔｍｒ，あるいはｔｍｓ，が不活化された第１０項目に記載の組織。
【００５８】
１２．前記Ｔ−ＤＮＡがさらに機能的ｏｃｓ遺伝子を有する第８項目に記載の組織。
【００５９】
１３．前記植物が裸子植物である第８項目に記載の組織。
【００６０】
１４．前記植物が被子植物である第８項目に記載の組織。
【００６１】
１５．前記植物が単子葉植物である第１４項目に記載の組織。
【００６２】
１６．前記植物が双子葉植物である第１４項目に記載の組織。
【００６３】
１７．前記植物がナス科の一員である第１６項目に記載の組織。
【００６４】
１８．前記植物がマメ科の一員である第１６項目に記載の組織。
【００６５】
１９．前記植物がキク科の一員である第１６項目に記載の組織。
【００６６】
２０．．前記植物がアオイ科の員である第１６項目に記載の組織。
【００６７】
２１．前記植物が野菜である第１４項目に記載の組織。
【００６８】
２２．前記構造遺伝子がＴ−ＤＮＡプロモーター支配下にある第７項目に記載の組織。
【００６９】
２３．前記構造遺伝子が，ｔｍｒ，ｔｍｌ，ｔｍｓ，ｎｏｓ，ｏｃｓおよび前記“１．６”転写物から成るＴ−ＤＮＡ遺伝子の群から選択されたプロモーターの支配下にある第２２項目に記載の組織。
【００７０】
２４．前記殺虫構造遺伝子が植物プロモーターの支配下にある第７項目に記載の組織。
【００７１】
２５．前記構造遺伝子が，ファゼオリン，およびリブロース−１・５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットから成る植物遺伝子の群から選択された植物遺伝子のプロモーターの支配下にある第２４項目に記載の組織。
【００７２】
２６．前記殺虫構造遺伝子が，３５Ｓおよび１９Ｓの転写物を支配しているプロモーターの群から選択されたＣａＭＶプロモーターの支配下にある第７項目に記載の組織。
【００７３】
２７．前記殺虫構造遺伝子が修飾されている第７項目に記載の組織。
【００７４】
２８．前記殺虫構造遺伝子が前記殺虫タンパクのどちらかの末端に付加アミノ酸をコードするよう修飾されている第２７項目に記載の組織。
【００７５】
２９．前記修飾が挿入，欠失，あるいは構造遺伝子塩基配列中の１個あるいはそれ以上の塩基置換を含んでいる第２７項目に記載の組織。
【００７６】
３０．前記殺虫構造遺伝子がバチルス・チューリンゲンシスから得られた第７項目に記載の組織。
【００７７】
３１．前記構造遺伝子がｐ１２３／５８−１０の構造遺伝子とハイブリダイズ可能な第３０項目に記載の組織。
【００７８】
３２．殺虫構造遺伝子および植物で発現可能なプロモーターを有するＤＮＡベクターであって，該遺伝子および該プロモーターは，該遺伝子が植物細胞内で該プロモーター支配下で発現するような位置および方向に互いにある，ＤＮＡベクター。
【００７９】
３３．前記殺虫遺伝子がＴ−ＤＮＡ中に挿入されている第３２項目に記載のベクター。
【００８０】
３４．前記Ｔ−ＤＮＡが修飾されている第３３項目に記載のベクター。
【００８１】
３５．前記遺伝子が前記ｔｍｌ遺伝子，ｏｃｓ遺伝子，あるいは前記Ｔ−ＤＮＡの前記”１．６”領域のいずれかの中の転写活性のある部位へ挿入されている第３３項目に記載のベクター。
【００８２】
３６．前記Ｔ−ＤＮＡがさらに機能的ｏｃｓ遺伝子を有する第３３項目に記載のベクター。
【００８３】
３７．前記プロモーターがＴ−ＤＮＡプロモーターである第３２項目に記載のベクター。
【００８４】
３８．前記プロモーターが植物プロモーターである第３２項目に記載のベクター。
【００８５】
３９．前記植物プロモーターがファゼオリン，およびリブロース−１・５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットから成る植物遺伝子の群から選択された第３８項目に記載のベクター。
【００８６】
４０．前記プロモーターが３５Ｓおよび１９Ｓ転写物を支配しているプロモーターの群から選択されたＣａＭＶプロモーターである第３２項目に記載のベクター。
【００８７】
４１．前記殺虫構造遺伝子が修飾されており，その修飾が挿入，欠失，あるいは構造遺伝子塩基配列中の１個あるいはそれ以上の塩基置換を含む第３２項目に記載のベクター。
【００８８】
４２．前記殺虫構造遺伝子がバチルス・チューリンゲンシスからのものである第３２項目に記載のベクター。
【００８９】
４３．前記構造遺伝子が　ｐ１２３／５８−１０の構造遺伝子とハイブリダイズ可能な第４２項目に記載のベクター。
【００９０】
４４．前記プロモーターが修飾されており，その修飾が挿入，欠失，あるいは構造遺伝子塩基配列中の１個あるいはそれ以上の塩基置換を含む第３２項目に記載のベクター。
【００９１】
４５．殺虫構造遺伝子および植物で発現可能なプロモーターを有する細菌株であって，該遺伝子と該プロモーターは，該遺伝子が植物細胞内で該プロモーターの支配下で発現可能であるような，位置と方向に互いにある，細菌株。
【００９２】
４６．前記発現可能な遺伝子がＴ−ＤＮＡ中にある第４５項目に記載の株。
【００９３】
４７．前記Ｔ−ＤＮＡがアグロバクテリウム属から選択した細胞内にある第４６項目に記載の株。
【００９４】
４８．前記殺虫構造遺伝子がバチルス・チューリンゲンシスからのものである第４５項目に記載の株。
【００９５】
４９．前記構造遺伝子が　ｐ１２３／５８−１０の構造遺伝子にハイブリダイズ可能な第４８項目に記載の株。
【００９６】
５０．ｐ１２３／５８−１０および　ｐ１２３／５８−３の群から選択されたプラスミド。
【００９７】
５１．ｐ１２３／５８−１０および　ｐ１２３／５８−３の群から選択されたプラスミドを有する細菌株。
【００９８】
５２．前記細菌がエセリシア・コリーＨＢ１０１である第５１項目に記載の株。
【００９９】
５３．植物細胞を遺伝的に修飾する方法であって，殺虫構造遺伝子と植物発現プロモーターとを含有するように該植物細胞を形質転換し，それにより該遺伝子が該植物細胞内で植物発現プロモーターの支配のもとに発現しうる方法。
【０１００】
５４．前記殺虫遺伝子が植物プロモーター支配下にある第５３項目に記載の方法。
【０１０１】
５５．前記殺虫遺伝子が，ファゼオリン，およびリブロース−１・５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットを含む植物遺伝子のグループから選択されたプロモーターの支配下にある第５４項目に記載の方法。
【０１０２】
５６．前記殺虫構造遺伝子がＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下にある第５３項目に記載の方法。
【０１０３】
５７．前記構造遺伝子がｔｍｒ，ｔｍｌ，ｔｍｓ，ｎｏｓ，ｏｃｓおよび前記”１．６”転写物からなるＴ−ＤＮＡ遺伝子の群から選択されたプロモーターの支配下にある第５６項目に記載の方法。
【０１０４】
５８．前記殺虫遺伝子が３５Ｓおよび１９Ｓの転写物を支配しているＣａＭＶプロモーターの群から選択されたプロモーターの支配下にある第５３項目に記載の方法。
【０１０５】
５９．前記殺虫遺伝子が修飾され，その修飾が挿入，欠失，あるいは前記構造遺伝子塩基配列中の１個あるいはそれ以上の塩基置換を含む第５３項目に記載の方法。
【０１０６】
６０．前記遺伝子がＴ−ＤＮＡへ挿入される第５３項目に記載の方法。
【０１０７】
６１．前記Ｔ−ＤＮＡが修飾され，その修飾が挿入，欠失，あるいは前記Ｔ−ＤＮＡ塩基配列中の１個あるいはそれ以上の塩基置換を含む第６０項目に記載の方法。
【０１０８】
６２．前記形質転換細胞が裸子植物からのものである第６０項目に記載の方法。
【０１０９】
６３．前記形質転換細胞が被子植物からのものである第６０項目に記載の方法。
【０１１０】
６４．前記被子植物が単子葉である第６３項目に記載の方法。
【０１１１】
６５．前記被子植物が双子葉である第６３項目に記載の方法。
【０１１２】
６６．前記双子葉植物がナス科の一員である第６５項目に記載の方法。
【０１１３】
６７．前記双子葉植物がマメ科の一員である第６５項目に記載の方法。
【０１１４】
６８．前記双子葉植物がキク科の一員である第６５項目に記載の方法。
【０１１５】
６９．前記双子葉植物がアオイ科の一員である第６５項目に記載の方法。
【０１１６】
７０．前記双子葉植物が野菜である第６３項目に記載の方法。
【０１１７】
７１．前記殺虫遺伝子が前記ｔｍｌ遺伝子，前記ｏｃｓ遺伝子，あるいは前記Ｔ−ＤＮＡの前記”１．６”領域のいずれかの中の転写活性のある部位に挿入される第６０項目に記載の方法。
【０１１８】
７２．前記植物細胞が細菌から該植物細胞へのＤＮＡの導入により形質転換される第６０項目に記載の方法。
【０１１９】
７３．前記植物細胞が，ＤＮＡの直接取込み，あるいは該植物細胞へのＤＮＡの顕微注入により形質転換される第５３項目に記載の方法。
【０１２０】
７４．前記形質転換細胞を再生して前記殺虫構造遺伝子の発現が可能な形質転換再生植物組織を得る工程をさらに包含する第５３項目に記載の方法。
【０１２１】
７５．前記殺虫構造遺伝子がバチルス・チューリンゲンシスから得られる第５３項目に記載の方法。
【０１２２】
７６．前記殺虫構造遺伝子が，ｐ１２３／５８−１０の中で発見される構造遺伝子とハイブリダイズ可能な第７５項目に記載の方法。
【０１２３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳述する。
【０１２４】
発明の詳細な説明および特許請求の範囲における用語の不明瞭さを除くために以下の定義を採用する。
【０１２５】
Ｔ−ＤＮＡ：植物ゲノムに組み込まれる形質転換誘導説に基づくＤＮＡ区分。
ここで用いる場合，本用語は本来アグロバクテリウム・チューメファシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスを含むアグロバクテリウムの腫瘍誘導株に由来するＤＮＡを含み，後者の細菌の挿入区分は従来の文献では時々Ｒ−ＤＮＡと称された。さらにここで用いる場合，用語Ｔ−ＤＮＡは自然発生的あるいは実験室内操作により加えられたいかなる変化，修飾，変質，置換，挿入および欠失を含み，そのような修飾に要求されまた限定される本質的な構造は，Ｔ−ＤＮＡの特性である形質転換細胞ゲノム内で期待される安定な組み込みを保証するために自然に存在するＴ−ＤＮＡの左右両端が充分に存在するというものである。このＴ−ＤＮＡはそれ自身，自然のあるいは合成の多数の起源に由来する区分の混成物であろう。さらにこのＴ−ＤＮＡは挿入された殺虫構造遺伝子の転写の開始および翻訳の開始を制御するために充分完全な形で，少なくとも１つの植物発現プロモーターを殺虫構造遺伝子の挿入位置の５’側あるいは“上流”に含まなければならない。このプロモーターはＴ−ＤＮＡ遺伝子，植物遺伝子，あるいは少なくとも１つの組織および少なくとも１つの発達段階の植物細胞内で機能するプロモーターを有する他の遺伝子に由来する。できれば挿入部位は，プロモーターにより開始される転写および翻訳の方向の“下流”（プロモーターに対して３’）にあり，したがってプロモーターに関して，そこに挿入された殺虫構造遺伝子がそのプロモーターの支配下で直接あるいは融合タンパクとして発現することができる位置にあるのが良い。本Ｔ−ＤＮＡはまた殺虫構造遺伝子の挿入位置の下流に３’非翻訳領域を含むかも知れない。この領域は転写の終止，ポリアデニル化，および転写後のＲＮＡプロセッシングを制御する機能を有する。さらには融合タンパクもまた殺虫構造遺伝子と３’翻訳領域を提供する構造遺伝子の３’末端との間で形成されるかも知れない。このプロモーターと３’非翻訳領域要素は同一のあるいは異なった既存の遺伝子に由来するかも知れないし，また同一のあるいは異なった植物，Ｔ−ＤＮＡあるいは他の起源に由来するかも知れない。例えばここで例証されるように，殺虫構造遺伝子は植物遺伝子プロモーターと同じ遺伝子の３’配列の間に存在し得るし，また同一のあるいは異なった植物種またはＴ−ＤＮＡに由来する１つの遺伝子の３’非翻訳領域と他のプロモーターからなる物でもあり得る。ここで定義されるように植物遺伝子のコード領域は植物遺伝子の構造部分のｃＤＮＡコピーを含む。プロモーターと３’非翻訳領域または自然あるいは人工的に誘導された修飾を含むし，また化学的に合成された区分も含む。
【０１２６】
植物プロモーター：ここで用いる場合，Ｔ−ＤＮＡ自身の遺伝子に対して外部にある前記植物遺伝子の調節要素を含み，またさらに構造要素を含む。これらはファセオリンおよびリブロース−１・５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットの遺伝子のプロモーターを含むが，これに限らない。さらに植物遺伝子プロモーターは転写の開始と翻訳の開始を堤供しまた調節するであろう遺伝子の領域である。さらにこの植物構造遺伝子配列（部分的にあるいは完全にタンパクをコードし，またイントロンを含まないかも知れないしあるいは１つまたはそれ以上のイントロンを含むかも知れない領域）はＴ−ＤＮＡに導入されるかも知れない。（イントロンはｍＲＮＡが翻訳される以前に転写後に除去される遺伝子転写物の領域である。）植物プロモーター支配下の発現は直接発現の形をとる；ここではプロモーターにより正常に制御されている構造遺伝子の一部または全体を除去挿入殺虫構造遺伝子で置換し，開始コドンは植物構造遺伝子の残りあるいは挿入殺虫構造遺伝子の一部としてのいずれかで提供されるか，または殺虫構造遺伝子の一部またはすべてが既存の植物構造遺伝子内に正しいリーディングフレームで挿入された融合タンパクとして発現する。後者の場合，発現産物は融合タンパクと呼ばれる。プロモーター区分はそれ自身，自然に存在するあるいは合成の多くの起源に由来する区分の混成物かも知れない。植物プロモーターの起源は第２表に挙げた植物を含むが，これに限らない。
【０１２７】
Ｔ−ＤＮＡプロモーター：通常挿入Ｔ−ＤＮＡに関連している自然に存在するプロモーターのいずれも対象とする。これらは“１．６”転写物，オクトピンシンターゼ遺伝子（ＯＣＳ），ノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ），ｔｍｓ，ｔｍｌおよびｔｍｒ遺伝子を含むが，これに限らず，そしてＴ−ＤＮＡのＴＩＰ源に一部依存しうる。Ｔ−ＤＮＡプロモーターの支配下の発現は直接発現の形をとりうる。そこではプロモーターにより正常に制御されている構造遺伝子の一部または全体を除き挿入殺虫構造遺伝子で置換し，開始コドンはＴ−ＤＮＡ構造遺伝子の残りあるいは挿入殺虫構造遺伝子の一部としてのいずれかで提供されるか，または植物構造遺伝子の一部またはすべてが既存のＴ−ＤＮＡ構造遺伝子内に正しいリーディングフレームで挿入された融合タンパクとして発現する。後者の場合，発現産物は融合タンパクと呼ばれる。プロモーター区分はそれ自身，自然に存在するあるいは合成の多くの起源に由来する区分の混成物かも知れない。
【０１２８】
植物発現プロモーター：ここで用いる場合，前述のＴ−ＤＮＡプロモーターと植物プロモーターの定義を含む。しかし，本発明のプロモーター成分の本質的な面は殺虫構造遺伝子が植物細胞で発現するプロモーターの支配下にある点である。したがって植物発現プロモーターはさらに，少なくとも１つの発達段階においてその間少なくとも１つの組織で発現する植物細胞内で発現しうるいかなるプロモーターをも対象とする。起源は以下のものを含むであろうが，それに限らない：植物ウルス（例えばカリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓ転写物のプロモーター），動物ウイルス，非植物真核生物（例えば動物，酵母），あるいは色素体（例えば，クロロプラストあるいは殺虫遺伝子がクロロプラストＤＮＡに挿入されている場合の原核生物プロモーター）。植物ＤＮＡあるいはＴ−ＤＮＡ以外の起源に由来するプロモーターの性質および成分（例えば，“ＴＡＴＡボックス”，ＡＴＧ翻訳開始部位，イントロンスプライシング部位，等）はＴ−ＤＮＡプロモーターに対して先に述べたのと同じであり，そして植物プロモーターはまたこの定義内に含まれる。本プロモーター区分はそれ自身，自然の，あるいは合成の多くの起源に由来する区分の混成物であろう。
【０１２９】
殺虫構造遺伝子：ここで用いる場合，殺虫タンパク，ポリペプチドあるいはその一部をコードするＤＮＡ区分を殺虫遺伝子の部分を含み，翻訳開始コドンを含む場合もあるが，通常プロモーター領域と見なされる転写開始および翻訳開始を制御する細菌遺伝子の他の機能要素を欠く。（本発明ではそのような細菌機能要素は殺虫構造遺伝子のＴ−ＤＮＡへの転移後に存在することに注意。しかし，それらは植物細胞内では作用しないので，そのような要素は用語“殺虫構造遺伝子”の対象としない）。殺虫構造遺伝子はプラスミドＤＮＡ全体または一部，ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡに由来する。殺虫構造遺伝子は，発現産物の生物活性または化学構造，発現速度，あるいは発現制御様式に影響し得る，コード区分または非翻訳領域いずれかに１つまたはそれ以上の修飾を含むかも知れないことがさらに考えられる。そのような修飾は以下のものを含むが，それに限らない：変異，挿入，欠失，置換および発現産物の化学構造を変えないが，発現産物の細胞内局在性，輸送，分泌あるいは安定性に影響する「沈黙」修飾。構造遺伝子は連続してコードしている配列を構成
しうるか，あるいは１つまたはそれ以上のイントロンを含みうる。このイントロンは合成または自然界の起源から得られうる適当な植物機能スプライス連結部に接している。構造遺伝子は，殺虫性のまたは殺虫タンパクの一部に由来する混成タンパクをコードする自然界にあるまたは合成の複数の起源に由来する区分の混成物であってもよい。
【０１３０】
殺虫タンパク：ここで用いる場合，とにかく昆虫に毒性のある細菌タンパクを含む。これは何らかの昆虫に何らかの環境下で直接あるいは間接的に毒性がある，または生育を阻害するタンパクまたはペプチドを含む。これはまた単独であるいは他の物質を組み合わせて，卵，幼虫，さなぎ，若虫および成虫段階を含む，昆虫の生活環のあらゆる時期に，接触，摂取または呼吸により毒性を示すタンパクを含む。これらは特に鱗翅および双翅類科のもの，そしてオストリニア，ヘリオティス，ペクチノフォラ，およびトリコプルシア属のもの，例えばマンドカ・セクスタ，オストリニア・ヌビラリス，ヘリオティス・ゼア，ヘリオティス・ビレセシス，ペクチノフォラ・ゴジピエラおよびトリコプルシア・ニ，の昆虫に毒性のあるタンパクを含む。標的として選ばれるであろう他の分類群は第１表に挙げたものを含むが，これに限らない。殺虫タンパクの例は第３表に挙げたものを含むが，バチルス・チューリンゲンシスまたはバチルスの他の種，例えばバチルス・セレウス，バチルス・ポピリエおよびバチルス・スフェリカス，の種々の変種に限らない。作成に用いられる遺伝子あるいはまた昆虫に有毒なタンパクをコードする配列は，フォスフォリパーゼ，ヒアルロニダーゼ，フォスファターゼ，プロテアーゼおよびバチルス・チューリンゲンシスの種々の結晶タンパクを含み，またこれらに限らない。この用語結晶タンパクはバチルス・チューリンゲンシスの結晶封入体に見られるタンパクに関連する毒性タンパク，および自然界に存在する結晶タンパクの人工的修飾物に対するプロトキシン型およびトキシン型両者を対象にすると解釈されるべきである。関連するタンパクは核酸またはタンパクの構造のあるいは配列の類似性，免疫交叉反応性，または核酸のクロスハイブリダイゼーションにより同定される。植物組織：根，芽，花粉，種子，クラウンゴールのような腫瘍組織および胚，カルスのような培養での植物細胞の集合体の種々の型を含む植物の分化または未分化組織を含むが，これに限らない。植物組織は栽培物または器官，組織あるいは細胞培養に存在し，そして第２表に挙げた，あるいはこれに限らない，植物に由来する。
【０１３１】
植物細胞：ここで用いる場合，栽培物の植物細胞および培養物の植物細胞とプロトプラストを含み，また第２表に挙げたものを含む，あるいはこれに限らない，植物に由来する。
【０１３２】
Ｔ−ＤＮＡを介して挿入された殺虫構造遺伝子を発現する遺伝的に修飾された植勃の生産は，本明細書の知見と当業者に既知の種々の技術と手段を結合させる。多くの場合，別の手段が全体のプロセスの各段階で存在する。手段の選択は，発現殺虫構造遺伝子の挿入と安定維持に対する基本的ＴＩＰまたは他のベクター系の選択，修飾されるべき植物種と所望の再生方針，および用いられる特殊な殺虫構造遺伝子などの変動因子に依存し，それらのすべてが当業者が選択でき，かつ所望の結果を達成するのに使用できる別のプロセス段階を提供する。｛例えば，殺虫構造遺伝子を得るための出発点はバチルス・チューリンゲンシスｖａｒ．クルスタキＨＤ−７３からのＤＮＡ単離により本願で示されているが，適切な修飾が遺伝子単離と操作手順になされる限り，他の殺虫タンパク遺伝子を有する細菌株のＤＮＡまたは組み換えＤＮＡ分子が代用される。植物細胞内での外来遺伝子の制御された発現および／または安定な挿入に対して，新規な手段が開発される場合，当業者は所望の結果を達成するために，これらの中から別のプロセス段階を選択できる。本発明の基本的考え方は殺虫構造遺伝子の性質と構造，および植物ゲノムヘの挿入と発現の手段にある。遺伝的に修飾された植物を得るために残っている望まれる具体的な段階は，修飾Ｔ−ＤＮＡが植物細胞ゲノムの一部として安定に組み込まれる植物細胞へ，この修飾Ｔ−ＤＮＡが移るようなＴ−ＤＮＡへのプロモーター／殺虫構造遺伝子の組合せの挿入であり，インビトロ培養と完全植物体への事実上の再生に対する技術は，形質転換植物細胞の選択と検出の段階，および導入遺伝子の最初に形質転換された株から実用的に受け入れられる栽培物への転移，の段階を含む。
【０１３３】
その好ましい態様での本発明の基本的特徴は，植物発現プロモーターあるいは最も好ましくはＴ−ＤＮＡプロモーターの制御下に挿入殺虫構造遺伝子を有するＴ−ＤＮＡの作成であり，これらの用語は前述のように定義した。この殺虫構造遺伝子は所望のプロモーターに関し正しい位置と方向で挿入されねばならない。位置については２つの問題がある。第１は構造遺伝子がプロモーターのどちら側に挿入されるかに関するものである。大部分のプロモーターは転写翻訳の開始をＤＮＡに沿って一方向のみで制御することが知られている。プロモーター制御下にあるＤＮＡの領域はプロモーターの“下流に”，または別の言葉で“後に”あるいは“３’側に”あると言われる。したがってプロモーターによって制御されるには，植物構造遺伝子挿入の正しい位置はプロモーターから“下流に”なければならない。（少しの既知プロモーターは２方向制御を行うことが知られており，その場合はプロモーターのどちらかの側がそれから“下流に”あると考えることができる。）位置についての第２の問題は，プロモーターの既知の機能要素，例えば転写開始部位，と構造遺伝子の翻訳開始部位間の塩基対での距離に関するものである。この距離に関してはプロモーターによりかなりの変動がある。したがってこれに関して構造上の要求は機能性という用語で最も良く表現される。第１近似として，無理のない作動性はプロモーターと挿入殺虫構造遺伝子間の距離が，正常に作動しているプロモーターとＴ−ＤＮＡ間の距離に近い場合に達し得る。方向は構造遺伝子の方向性に帰する。最終的に植物タンパクのアミノ末端をコードする構造遺伝子の部分を構造遺伝子の５’末端と呼び，一方タンパクのカルボキシル末端付近のアミノ酸をコードする端を構造遺伝子の３’末端と呼ぶ。殺虫構造遺伝子の正しい方向はその５’末端がプロモーターの近くにあるものである。融合タンパク発現をもたらす作成物の場合にさらに要求されることは，プロモーターを提供している構造遺伝子配列への殺虫構造遺伝子の挿入は両遺伝子のコードしている配列が同一のリーディングフレーム相になければならず，その構造の要求性は当業者によく知られている。本発明に関連するこの要求性の例外は，イントロンが殺虫タンパク遺伝子由来のコード配列を殺虫構造遺伝子の最初のコード区分から分けている場合に存在する。その場合，殺虫構造遺伝子は非殺虫性コード配列によりもたらされる上流のスプライス結合部と適合するスプライス部位を持っていなければならず，そしてイントロンのスプライス部位は，プロモーターが提供する構造遺伝子と殺虫構造遺伝子の正しいリーディングフレームがイントロンが転写後のプロセッシングで除去された後に回復するような，位置になければならない。発現速度あるいは発達の制御の差は，ある殺虫構造遺伝子が異なった植物発現プロモーターの制御下に挿入される場合に見られる。発現されたタンパク自身の安定性，細胞内または細胞内局在性または分泌，溶解性，標的特異性，および他の機械的性質などの性質を含む。しかしこれに限定されない。異なった性質は，融合タンパクの場合に，融合タンパク内に含まれるＴ−ＤＮＡタンパクの区分の挿入部位，長さおよび性質，およびその立体構造に影響する融合タンパクの成分間での相互作用に依存して見られるであろうし，これらのすべてに，植物細胞，植物組織，および完全植物体内で期待される生理学的性質に依存して，殺虫タンパク産物の機能性を操作し，制御するための多数の機会が存在する。
【０１３４】
プロモーター／殺虫構造遺伝子組合せの挿入の位置は，Ｔ−ＤＮＡ境界のすぐ近くにある配列の転移機能が破壊されない限り，厳密ではない。何故なら，これらの領域は，先行技術の研究によれば修飾Ｔ−ＤＮＡの植物ゲノムヘの挿入に不可欠であるらしいので。望ましい挿入部位は最も活発に転写されている領域，特にｔｍｌ遺伝子と図２に示すように転写物２４に相当するＨｉｎｄＩＩＩ−ｆ断片中にある“１．６”と名付けた領域にあるものである。ここで用いる用語“１．６”はこの活発に転写されるＴ−ＤＮＡの領域を指す。このプロモーター／殺虫遺伝子の組合せが挿入されるＴ−ＤＮＡは何らかのＴＩＰプラスミドから得られる。この殺虫遺伝子は当業者によく知られた標準技術により挿入される。内在Ｔ−ＤＮＡの転写翻訳の方向に対して挿入植物遺伝子の方向は厳密ではなく，２つの可能な方向の方が機能的である。発現速度の差はある遺伝子がＴ−ＤＮＡ内の異なった位置に挿入された場合に見られ，恐らくこれはＤＮＡメチル化やクロマチン構造などの要因によるためである。ファセオリン遺伝子の植物プロモーターの容易に検知できるレベルの発現は，その遺伝子をアグロバクテリウム・チューメファシエンスのオクトピン型プラスミド，ｐＴｉ１５９５５のｔｍｌ遺伝子内のＳｍａ　Ｉ部位あるいはｔｍｒ内のＨｐａ　Ｉ部位に挿入したときに得られた。
【０１３５】
プロモーター／殺虫構造遺伝子の組合せをＴ−ＤＮＡに挿入するための簡便な方法にエセリシア・コリー内で複製できるプラスミドに取り込まれたＴ−ＤＮＡの区分（その間に挿入が望まれる区分）を有する，先に述べた，シャトルベクターの使用がある。このＴ−ＤＮＡは，できればシャトルベクター内で特殊な，制限部位を含む。殺虫構造遺伝子をＴ−ＤＮＡ配列内のこの特殊な部位に挿入することができ，このシャトルベクターは適当なアグロバクテリウム株の細胞内，できればそのＴ−ＤＮＡがシャトルベクターのＴ−ＤＮＡと類似している，に移される。形質転換されたアグロバクテリウム株を，Ｔｉプラスミドの既存の区分をシャトルベクターのＴ−ＤＮＡ区分で置換させる２重相同組み換え現象の選択を可能にする条件下で，できれば生育させる。しかし，本発明はプロモーター／殺虫構造遺伝子の組合せをＴ−ＤＮＡへ２重相同組み換え機構によって導入することに限定されないことに注意すべきである；シャトルベクター（多分Ｔ−ＤＮＡと相同な唯一つの連続した領域を持つ）の単一部位での相同組み換え事象またはプロモーター／遺伝子含有細菌トランスポソンの挿入もまた，その組合せのＴ−ＤＮＡへの挿入に有効な手段となるであろう。
【０１３６】
今述べた方針により修飾Ｔ−ＤＮＡを当業者に既知の何れかの技術により植物細胞へ移すことができる。例えば，この移送は，Ｔ−ＤＮＡ内に取り込まれた殺虫遺伝子を含む新規のアグロバクテリウム株による植物の直接感染，あるいはアグロバクテリウム株と植物細胞の共存培養のいずれかにより最も容易に達成される。前者の技術，直接感染は感染部位に腫瘍物体あるいはクラウンゴールの出現の経過をたどらす。クラウンゴール細胞を次いで培養で生育させることができ，そして当業者に既知の適当な環境下で，挿入Ｔ−ＤＮＡ区分を含む完全植物体へ再生させる。共存培養の方法を用いて植物細胞群の一部は，それはそこに移されたＴ−ＤＮＡを有しているが，植物細胞ゲノムに挿入されたものに形質転換される。いずれの場合にも形質転換細胞を非形質転換細胞と区別するために選別または分別しなければならない。選別は殺虫構造遺伝子に加えＴ−ＤＮＡに取り込まれた選択マーカーを用いて容易に達成される。例として，ノパリンシンターゼのプロモーター支配下に発現するジハイドロフォレートリダクターゼあるいはネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼがある。これらのマーカーは夫々メトトレキサートまたはカナマイシン，あるいはそのアナログを含む培地での生育により選別される。さらにこのＴ−ＤＮＡは培養でＴｉ誘導腫瘍のホルモン非依存性生育を制御する遺伝子または遺伝子群，Ｒｉ誘導腫瘍根の異常な形態を制御する遺伝子または遺伝子群，およびオピンシンターゼによりもたらされるアミノ酸アナログのような有毒物質に対する耐性制御する遺伝子，のような内在マーカーをも提供する。当業者によく知られている選別方法にオピン生産の測定，特徴的ＲＮＡまたはＴ−ＤＮＡ配列との特異的ハイブリダイゼーション，あるいはＥＬＩＳＡｐ（“酵素連関免疫吸着分析”の略），放射免疫分析，“ウエスタン”ブロットを含む特異タンパクに対する免疫分析，がある。さらに発現した殺虫タンパクの有毒性を形質転換組織の同定につかうことができる。
【０１３７】
シャトルベクター方策の代わりに殺虫構造遺伝子が挿入されるＴ−ＤＮＡまたは修飾Ｔ−ＤＮＡ，を含むプラスミドの利用があり，このプラスミドはアグロバクテリウム株内で独立に複製できるものである。本発明の背景の項で述べた最近の証拠によれば，アグロバクテリウム株がＴ−ＤＮＡの植物細胞への転移を促進する機能のある，あるトランスに働く遺伝子を含んでいれば，そのようなプラスミドのＴ−ＤＮＡをアグロバクテリウム株から植物細胞へ移すことができる。Ｔ−ＤＮＡを含み，アグロバクテリウム株内で複製できるプラスミドを，ここで“副−ＴＩＰ”プラスミドと呼ぶ。この副−ＴＩＰプラスミドはその含有するＴ−ＤＮＡの量に違いがあると，作用の変動が可能である。変動の一方の極端はＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡすべてが残っているもので，時々これを“小−ＴＩＰ”プラスミドと呼ぶ。他方の極端はＴ−ＤＮＡ境界付近の最少のＤＮＡを除いたすべてが欠失している場合で，残っている部分は転移能と宿主細胞への取込み能に最少必要物である。このようなプラスミドを“微−ＴＩＰ”と呼ぶ。副−ＴＩＰプラスミドは相同組み換えによりシャトルベクターからＴ−ＤＮＡへ遺伝子を移す必要がなく，小さくて直接操作するのに比較的容易であるという利点がある。希望する構造遺伝子を挿入した後，それらをＴ−ＤＮＡ転移を促進するトランスに作用する遺伝子を含む植物細胞へ容易に直接導入することができる。アグロバクテリウム株への導入は，アグロバクテリウム株の，形質転換あるいは供与細菌細胞から接合伝達，のいずれかにより容易に達成され，この技術は通常の熟練技術者によく知られている。新規ＤＮＡ配列を植物ゲノムに導入する目的に対して，ＴＩＰプラスミドと副−ＴＩＰプラスミドは機能的に同等に考えられるべきである。
【０１３８】
本発明が提供する好ましい態様は，昆虫耐性（ｉｎｓｅｃｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）にさせる植物のゲノムに殺虫遺伝子を取り込ませるＴ−ＤＮＡに基づくアグロバクテリウム仲介系を含むが，遺伝子の転移および導入のための他の手段もまた本発明の領域に含まれる。殺虫遺伝子の植物ゲノムヘの安定な取込みに対する他の手段はさらに，ウィルスゲノム，小染色体，トランスポソン，および植物染色体への相同性または非相同性組み換え，に基づくベクターの利用を含むが，これらに限らない。これらベクターの植物細胞への伝達の別の方法に，核酸の直接取込み，ベクター含有リポソームとの融合，顕微注入，およびウィルス・コート・タンパクヘの包入後の感染様過程，があるが，これに限らない。アグロバクテリウム細胞とＴＩＰに基づく系は細菌のＤＮＡを植物細胞へ移すことによる双子葉類および裸子植物の形質転換に利用できる；別のベクターあるいはベクター伝達の別の方法に基づく系は単子葉，双子葉類両者を含むすべての裸子植物とすべての被子植物の形質転換に用いられる。
【０１３９】
形質転換細胞と組織の再生は既知技術を用いて達成される。再生段階の目的は挿入Ｔ−ＤＮＡを保持しつつ正常に生育と生殖する全植物体を得ることである。再生の技術はＴ−ＤＮＡの起源，それに与えられた修飾の性質，および形質転換細胞の種により，技術的に既知の原理に従ってある程度変動する。Ｒｉ型Ｔ−ＤＮＡにより形質転換された植物細胞は，当業者によく知られた技術で，余分の実験なしに容易に再生される。Ｔｉ型Ｔ−ＤＮＡで形質転換された植物細胞は，ある例では，培養のホルモンレベルを適当に操作することにより再生が可能である。しかし，できればＴｉ−形質転換組織は，Ｔ−ＤＮＡがｔｍｒとｔｍｓ遺伝子の一方または両方で変異していると，最も容易に再生する。これら遺伝子の失活は形質転換組織のホルモンバランスを正常に向かわせ，培養の組織ホルモンレベル操作を楽にし，より正常なホルモン生理のために植物を容易に再生させる。もしｔｍｒおよびｔｍｓでの変異がシャトルベクターを用いた２重相同組み換えにより導入されるならば，この変異の導入はプロモーター／殺虫構造遺伝子の導入とは異なった方法で選択されねばならないことは重要な点である。例えば，前者の場合，クロラムフェニコール耐性を選択し，一方後者の選択はカナマイシン耐性で行われる。ｔｍｓおよびｔｍｒ部位の不活化は，これら遺伝子のコード領域またはプロモーター内での挿入，欠失，あるいは１つまたはそれ以上の塩基の置換により達成され，この変異はプロモーター失活，あるいはタンパクの構造破壊と呼ばれる。（適当な変異の作成はＴ．Ｃ．Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，ｓｅｒ．ｎｏｓ．４８５，６１３および４８５，６１４に例証されている。）ある例では腫瘍細胞は，挿入Ｔ−ＤＮＡを有し，ノパリンシンターゼのようなＴ−ＤＮＡ遺伝子を発現し，また挿入殺虫構造遺伝子をも発現する，シュートを再生し得る。このシュートは根を有する植物に継木することにより生長能を維持することができ，また稔性のある花をつけることができる。このようにして，このシュートは親植物の物質を，Ｔ−ＤＮＡを有し，かつそこへ挿入された殺虫構造遺伝子を発現する正常な子孫植物へ提供する。
【０１４０】
形質転換された植物組織の遺伝子型は，その細胞がインビトロ培養で生育，再生しやすいという条件で選ばれる。農耕に利用される栽培物はこれらの操作には不適当であり，もっと扱い易い植物種をまず形質転換する。再生後，新しく導入された外来殺虫タンパク遺伝子は，植物育種，植物遺伝学の分野の当業者によく知られている方法で，希望する農耕栽培物へ容易に移される。形質転換植物と農耕栽培物の有性交雑は最初の雑種を生ずる。これらの雑種を次いで望みの遺伝的背景を持った植物と戻し交雑させることができる。子孫を常に選別し，挿入Ｔ−ＤＮＡを持ち続けていること，あるいは挿入殺虫タンパク遺伝子の発現の結果新しい表現型を持つものを選択する。このようにして多くの回数の戻し交雑と選択後，挿入殺虫タンパク遺伝子に加えて，農耕的に望まれる植物と本質的に同一の遺伝子型を有する植物を作ることができる。
【０１４１】
農作物に昆虫耐性を賦与することとは別の方法に，保護したい田畑にある植物を発現殺虫タンパク遺伝子を持つ有用なＴ−ＤＮＡを含むＴＩＰプラスミドを保持するアグロバクテリウム細胞で感染させてもよい。我々は幼虫がクラウンゴール組織を喰うことを見つけた。田畑に群がる昆虫の幼虫が殺虫遺伝子を含む形質転換組織を喰うと，それらは組織内にある殺虫タンパクの影響を受ける。アグロバクテリウムとＴＩＰに昆虫誘引物質の遺伝子をさらにコードさせる。形質転換組織中のそのような誘引物質の存在は，田畑の他の農作物に比べ，食飼源としてのその組織に対する昆虫の嗜好性を増大させる。
【０１４２】
【実施例】
以後の実施例は，よく知られており，分子生物学および，ＴＩＰｓとアグロバクテリウムとの操作に熟練した者には容易な，多くの技術を利用している。そのような方法は，ここで記述されていなくても，１つあるいはそれ以上の参照文献中に完全に記述されている。酵素は市販品および業者の推薦品，あるいは当該分野に既知の種々の方法により入手したものを用いる。試薬，緩衝液および培養条件も当業者に知られている。そのような標準技術を含む参照できる研究には次のようなものがある：Ｒ．Ｗｕ，ｅｄ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８，Ｒ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００および１０１，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ　＆　Ｋ．Ｍｏｌｄａｖｅ，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｒ．Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｒ．Ｆ．Ｓｃｈｌｅｉｆ　＆　Ｐ．Ｃ．Ｗｅｎｓｉｎｋ（１９８２）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．加えてＲ．Ｆ．Ｌａｔｈｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇｉｎ．４：１−５６，にはＤＮＡ操作に関する有用な論評がなされている。
【０１４３】
単独で制限エンドヌクレアーゼの名前の文字どおりの使用，例えば“Ｂｃｌ　Ｉ”，とは，酵素分解における酵素の使用のことである。ただし，制限酵素の名前がその酵素が作用し得る配列部位，たとえば制限部位，を表すことが可能な場合にはその旨を表示する。本文中では，制限部位は“部位”，たとえば“ＢｃｌＩ部位”，という言葉を付けて表している。“断片”，たとえば“Ｂｃｌ　Ｉ断片”，という言葉を付けて用いる場合，それは該酵素の作用により生じる末端を有する線状２本鎖ＤＮＡ分子（たとえば制限断片）を表している。“Ｂｃｌ　Ｉ／Ｓｍａ　Ｉ断片”のような言い回しは，２つの異なる酵素，ここではＢｃｌＩとＳｍａ　Ｉ，により生じた制限断片を表す。異なる酵素の作用の結果として２つの末端が生ずる。該末端は“平滑”あるいは“粘着”（すなわち相補的一本鎖オリゴヌクレオチドにより塩基対形成が可能な一本鎖の突起をもつ）の性格をもち，そして，粘着末端の配列はそれを作り出す酵素の特異性により決まる，ということに注意しなければならない。
【０１４４】
これらの実施例においては，配列をより容易に理騨できるように特別の記号を用いている。タンパクをコードしている配列には下線を引き，コドンは斜線（／）で区切ってある。制限エンドヌクレアーゼなどにより生じた各鎖の切断箇所や，隙間は星印（＊）をつけて示している。
【０１４５】
プラスミド，およびプラスミドのみに，先頭には“ｐ”，たとえばｐＴｉ１５９５５あるいはｐＫＳ−４，をつけ，菌株がプラスミドを有している場合プラスミドを挿入句的に示す；たとえばアグロバクテリウム・チューメファシエンス（ｐＴｉ１５９５５）あるいはＫ８０２（ｐＫＳ−４）。プラスミドとそれらの相互関係を同定するのに便利な索引を第４表に示す。第５表は，寄託菌株のリストである。
【０１４６】
（実施例１）
昆虫耐性作物の開発における第１段階は，バチルス・チューリンゲンシス　ｖａｒ．クルスタキ　ＨＤ−７３，の殺虫タンパクをクローン化することである。このバチルス・チューリンゲンシス　ｖａｒ．クルスタキ　ＨＤ−７３は　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬに，寄託してあり，ＮＲＲＬ番号Ｂ−４４８８をもっている。
【０１４７】
１．１　バチルス・チューリンゲンシス殺虫タンパク遺伝子のクローニング
５０メガダルトン（ＭＤ）のプラスミドを蔗糖勾配遠心分離を用いてＨＤ−７３から濃縮した。ＨＤ−７３ライブラリイをＨｉｎｄＩＩＩによる該プラスミドの一次分解により作成した。結果として生じた断片をＨｉｎｄＩＩＩで線状化したｐＢＲ３２２（Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９７８）Ｇｅｎｅ　２：９５−１１３）と混合し連結後エセリシア・コリーＨＢ１０１を形質転換した。アンピシリン耐性テトラサイクリン感受性の形質転換株について，各々が有するプラスミドＤＮＡを単離し，それをＨｉｎｄＩＩＩで分解することで６．６キロベースペアー（ｋｂｐ）の挿入があるクローンを選別した。ＨＤ−７３ライブラリーから昆虫バイオアッセイ（実施例８を参照）を用いるさらに進んだ解析のために，プラスミドｐ１２３／５８−３およびｐ１２３／５８−１０を選別した。これらのコロニーをＬ培地中で生育させ２５０倍に濃縮した細胞懸濁液を超音波処理した。そして抽出液を昆虫のエサの表面にかけた。新生のマンヂューカ・セクスタ（タバコ角虫）の幼虫をそのエサの上に１週間置いた。ｐ１２３／５８−３あるいはｐ１２３／５８−１０を有する株の抽出液を食べた幼虫は成長せず，２〜５日の間にすべてが死滅した。これらの抽出液はエサにあたえた幼虫と，バチルス・チューリンゲンシスの細胞から精製した殺虫タンパクをエサに与えた幼虫との間に明らかな差異はなかった。
【０１４８】
ｐ１２３／５８−３とｐ１２３／５８−１０の制限酵素解析から，２つのプラスミドはｐＢＲ３２２ベクターに６．６ｋｂｐのバチルス・チューリンゲンシスＤＮＡ断片が逆方向に挿入されている以外は同一であった。これらのプラスミドのどちらもＨｉｎｄＩＩＩで分解し，再連結し，ＨＢ１０１に形質転換し，適当な選択，選別段階によって，相互に変わることができるということに注意されたい。
【０１４９】
ＨＤ−７３プラスミドイブラリーからの形質転換株をさらに厳密に調べるためにｐ１２３／５８−１０を用いた。５７２個のコロニーのうちで１６個がクローンｐ１２３／５８−１０の挿入物とハイブリダイズした。そして，すべてが６．６ｋｂｐの性格のＨｉｎｄＩＩＩ断片を有していた。さらに制限酵素解析を行った結果，すべてのクローンではｐＢＲ３２２中で同一のＤＮＡ断片が２つの可能な配置のうちの１つをとっていた。これはＨＤ−７３株の中に単一の結晶タンパク遺伝子が存在し得ることを示唆した。これらのクローンがＨＤ−７３中に唯一の殺虫タンパク遺伝子の存在を表していることを，標識したｐ１２３／５８−１０をプローブとして，ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｂｇｌ　ＩＩあるいはＳａｌ　Ｉで分解したＨＤ−７３プラスミドＤＮＡのサザンブロットを行って確認した。これらの酵素の制限部位は，我々のクローン化した結晶タンパク遺伝子中には存在しなかった。ハイブリダイゼーションの結果により，バチルス・チューリンゲンシス細胞のＤＮＡの単一バンドがｐ１２３／５８−１０にハイブリダイズすることがわかった。さらに，ＨＤ−７３は単一の殺虫タンパク遺伝子を有していることが示された。我々は多くの他のクローンをｐ１２３／５８−１０から作ったプローブによるハイブリダイゼーションにより同定した。制限地図により，これらのクローンはすべてｐ１２３／５８−３あるいはｐ１２３／５８−１０と同一であること，さらに，ＨＤ−７３が単一結晶タンパク遺伝子を有しているとの結論を支持すること，が示された。
【０１５０】
１．２　免疫的分析
エセリシア・コリー　クローンで産生されるタンパクの分析により，ｐ１２３／５８−３およびｐ１２３／５８−１０のコードしているタンパクはオクテロニー拡散スライド中で，バチルス・チューリンゲンシスの殺虫タンパクに対する抗血清と沈降線を形成することが示された。細胞抽出液を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し，ニトロセルロースに移し，抗体と１２５Ｉ−プロテインＡによる免疫反応（ウエスタン　ブロット，実施例７）を行った。変性したプロトキシンが見られる１３０ｋＤ（キロダルトン）にはバンドは見られなかった。しかしながら約６７ｋＤのペプチドが見られ，それは結晶タンパク抗体と結合していた（実施例７で行われたウエスタンブロット），そして，それは活性型トキシンと同じ大きさであった。このペプチド断片はエセリシア・コリーの全タンパクの約０．１％であった。
【０１５１】
１．３　配列分析
我々は，ＤＮＡ配列（例えばＡ．Ｍ．Ｍａｘａｍ　＆　Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：４９９−５６０）の分野の当業者によく知られた方法により得た我々のＤＮＡ配列結果を（図１）既報の配列（本発明の背景の項を参照）と比較した。既報の配列と我々の配列とは部分的にしか相同部分がなかった。約２．８ｋｂｐのオープンリーディングフレームがあり，それは翻訳開始信号（ＡＴＧ）により５’末端でつながり，バチルス・チューリンゲンシスＤＮＡとｐＢＲ３２２ベクターの間の接続点のＨｉｎｄＩＩＩ部位にあたるまでの間には終止しなかった。このＡＴＧからＨｉｎｄＩＩＩ部位までオープンリーディングフレームにコードされるタンパクの大きさは，我々がエセリシア・コリー細胞中で翻訳されているのを認めた６７ｋＤのタンパクより大きいが，１３０ｋＤ本来の結晶タンパクをコードするには小さい。ｐＢＲ３２２にコードされているリードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｕ）のペプチドにおいての翻訳終止の正確な方法が重要でないということは，殺虫活性がｐＢＲ３２２ベクター中でバチルス・チューリンゲンシスＤＮＡの挿入物がどちらの方向を向いていてもコードされているという知見により示唆された。多分，最初に翻訳されたペプチドのカルボキシル末端から最終物のカルボキシル末端までの部分が，自然の結晶タンパクを活性化するのと同様にエセリシア・コリー中でタンパク分解過程により除かれたのであろう。
【０１５２】
（実施例２）
この実施例は次のことを示している；バチルス・チューリンゲンシス殺虫遺伝子をＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモーターとポリアデニル化（ｐｏｌｙ（Ａ）　ａｄｄｉｔｉｏｎ）信号の間に挿入し，Ｔｉプラスミドを通して殺虫遺伝子を様々な植物に導入し，Ｔ−ＤＮＡプロモーターの支配下でこの遺伝子を発現する植物を再生する。この構成に用いる大部分の方針は図３に図式化してある。図３は図式化してプラスミドを表してあり，必ずしも，正確な縮尺で描かれてはいない。
【０１５３】
２．１　殺虫タンパク遺伝子へのＢａｍ　ＨＩ部位の導入
Ｂａｍ　ＨＩ部位をｐ１２３／５８−１０の殺虫タンパク遺伝子に，コードしている配列の開始点の丁度５’の位置へ導入する。野性型の塩基配列（ｂ）とオリゴヌクレオチドプライマー中の変化した塩基（ａ）は次に示すとおりである：
【０１５４】
【化１】
2004000239.tif 000002
この変化した塩基は（ａ）で下線を引いたＡＴＣ配列である。２７塩基対中わずか３塩基が変わっただけなので，良好なハイブリダイゼーション特性は保証されることに注意されたい。
【０１５５】
ｐ１２３／５８−１０をＨｉｎｄＩＩＩで分解し，ＨｉｎｄＩＩＩで線状化した　ｍＷＢ２３４４　ＲＦ（複製型）ＤＮＡと混ぜ連結する。混合物を　ＪＭ１０３に形質転換し，そして形質転換したコロニーをプラスミド単離，次いで制限分析により単一コピーの殺虫タンパク遺伝子をもつ断片の挿入の有無を調べることにより，選別する。２つの可能な配置を有するベクターをそれぞれＭ１３−Ｂｔ−ＡおよびＭ１３−Ｂｔ−Ｓと命名した。それらは，ウイルスの形態のときにはそれぞれ殺虫タンパク構造遺伝子の意味のない鎖と意味のある鎖を有する。
【０１５６】
Ｍ１３−Ｂｔ−Ａは，実施例１０．１に述べたように既に合成された，オリゴヌクレオチドプライマー５’ＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴ３’とハイブリダイズする。該オリゴヌクレオチドとＭ１３−Ｂｔ−Ａとのハイブリッドをエセリシア・コリーのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片と一緒に保温し，そして共有結合的閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を増やし，そして混合物をＪＭ１０３へ形質転換する。形質転換株により作られたウイルス粒子を単離して低感染比で細胞を感染させるのに用いる。ＲＦ　ＤＮＡを多数の感染したコロニーから単離し，制限地図作成により性格づけを行う。変異オリゴヌクレオチドにより開始された鎖に由来したクローンは殺虫構造遺伝子の５’末端に新しいＢａｍ　ＨＩ部位が存在することにより同定される。そしてそのようなベクターをＭ１３−Ｂｔ−Ａ（Ｂａｍ）とした。
【０１５７】
Ｍ１３−Ｂｔ−Ａ（Ｂａｍ）ＲＦ　ＤＮＡをＢａｍ　ＨＩとＨｉｎｄ　ＩＩＩで分解し，実施例１０．１で記述したように合成した，次に示す構造を有する，リンカーと混合しそして連結する。
【０１５８】
【化２】
2004000239.tif 000003
このリンカーは，すべての３種の可能な読みとり相における翻訳終止信号（下線部）を有していることに注意されたい。該リンカーをＢａｍ　ＨＩによる分解により末端をそろえ，そして殺虫構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。
【０１５９】
２．２プロモータービークルの作成および修飾
該Ｔ−ＤＮＡ“１．６”遺伝子は下記のように要約される：
【０１６０】
【化３】
2004000239.tif 000004
Ｃｌａ　Ｉ断片を除くことにより“１．６”遺伝子のプロモーター領域は，遺伝子の３’下流領域の隣にくることができる。この３’領域はポリアデニル化信号を有している。結果として生じる。構造は次のように要約される：
【０１６１】
【化４】
2004000239.tif 000005
Ｔ−ＤＮＡクローンｐ４０３（詳細な記述の項に述べた“１．６”遺伝子，図２の転写物２４をコードする，また，Ｃ．Ｆ．Ｆｉｎｋ（１９８２）Ｍ．Ｓ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｈａｄｉｓｏｎを参照）に相当するｐＲＫ２９０クローンである，ｐＫＳ１１１をＣｌａ　Ｉで分解し，次いで再連結する。（代わりに，ここに記述したこれらの操作を，ｐＢＲ３２２に基づくクローンである，ｐ４０３において選択の間にテトラサイクリンの代わりにアンピシリンを用いることにより直接行うことができる。連結混合物をエセリシア・コリーＫ８０２（Ｗ．Ｂ　Ｗｏｏｄ（１９６６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１１８）に形質転換するそしてテトラサイクリン耐性で選択する。プラスミドを“ミニプレップ”（小容量の細胞培養からのプラスミド調製）を行い単離して，厳密に構造を決定するために制限地図を作製する。新しいビークルであるｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉ（Ｔ．Ｃ．Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｅｒ．ｎｏ．４８５，６１４参照）はＣｌａ　Ｉによって線状化することができる。
【０１６２】
Ｋ８０２中で成育したｐＫＳ−ｐｒｏ　ＩをＣｌａ　Ｉで切り，５’−リン酸をもたないＢａｍ　ＨＩ／Ｃｌａ　Ｉリンカー５’ＣＧＧＡＴＣ３’と混合し連結した。結果として生じた混合物を再連結したｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉを省くためにＣｌａ　Ｉで分解し，Ｋ８０２へ形質転換した。テトラサイクリン耐性形質転換株から得たプラスミドを制限分析により選別し，そしてＡＴＧ翻訳開始点のＣｌａ　Ｉ部位がＢａｍ　ＨＩ部位に代わったプラスミドをｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉ（Ｂａｍ）とする。
【０１６３】
２．３　ｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉ（Ｂａｍ）へのカナマイシン耐性遺伝子の導入
該プロモーター／殺虫遺伝子結合物の隣にカナマイシン耐性（ｋａｎ）遺伝子を配置することは，三親交雑後の二重相同組み換え体を選択するために有利である。ｋａｎの源はｐＫＳ−４（実施例２．５）であった。ｐＫＳ−４において，ｋａｎ遺伝子の片端はＣｌａ　Ｉ部位に隣接している。ｋａｎ遺伝子を有する断片をｐＫＳ−４からＣｌａ　Ｉ（すなわち“Ｃｌａ　Ｉ／ｋａｎ”断片上）で取り出すために，プラスミドに新たなＣｌａ　Ｉ部位を，既に存在するＣｌａ　Ｉ部位の反対側の位置に導入する必要がある。これはちょうど良い場所にあるＢａｍ　ＨＩ部位（５’．．．Ｇ＊ＧＡＴＣＣ．．．３’）をＣｌａ　Ｉ（５’．．．ＡＴ＊ＣＧＡＴ．．．３’）に変えることで達成される。
【０１６４】
ｐＫＳ−４をＢａｍ　ＨＩ分解で線状化すると次に示す構造を有する粘着末端を生ずる：
【０１６５】
【化５】
2004000239.tif 000006
この構造の引っ込んでいる末端をエセリシア・コリーＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントと保温することにより埋めて，次に示す平滑末端を形成する：
【０１６６】
【化６】
2004000239.tif 000007
これらの平滑末端を互いに連結すると結果として生じる構造は次の配列をもつ：
【０１６７】
【化７】
2004000239.tif 000008
結果として生じる構造に，Ｃｌａ　Ｉは作用するがＢａｍ　ＨＩは作用しない，ということに注意されたい。
【０１６８】
上記の構築の代わりに，Ｂａｍ　ＨＩ部位あるいは，もう１つの都合の良い部位にある制限部位を適当なリンカーを用いてＣｌａ　Ｉ部位に変えてもよい。
【０１６９】
ｐＫＳ−４をＳｍａ　Ｉで分解し，５’ＣＡＴＣＧＡＴＧ３’の配列を有するＣｌａ　Ｉ／平滑末端リンカーと混合し，連結した。そして，Ｃｌａ　Ｉで分解し再び連結し，Ｋ８０２へ形質転換した。カナマイシン耐性の形質転換株から単離したプラスミドを通常は，Ｓｍａ　Ｉ部位の所に新しいＣｌａ　Ｉ部位が存在するかどうかで選別した。Ｃｌａ　Ｉ／Ｋａｎ断片はそのようなプラスミドから単離することができる。
【０１７０】
エセリシア・コリーＫ８０２中で成育させたとき，ｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉ（Ｂａｍ）は２個の残っているＣｌａ　Ｉ部位において，メチル化される：Ｃｌａ　Ｉ部位のうちの１個はプロモーター−ポリアデ二ル化接続部（これは２番目のポリアデ二ル化部位を過ぎて約３０ベースのところである）から約１４５ベースにある。そしてもう１つは，ｐ４０３の右側のＥｃｏ　ＲＩ部位から約２００ベースのところである（図２参照）。メチル化によりＣｌａ　Ｉで切断されるべき部位がＣｌａ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼにより切断されなくなる。このように，これらのメチル化によりこれらの部位は保護される。また，他の部位へのＣｌａ　Ｉ酵素の直接作用も効果的に抑えられる。ｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉ（Ｂａｍ）をエセリシア・コリーＧＭ３３へ導入し増やす。エセリシア・コリーＧＭ３３はＤＮＡのアデニン残基をメチル化しない株であり，それゆえに，他の場合はメチル化されるＣｌａ　Ｉ部位も切断され得る。ＧＭ３３から該プラスミド（ｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉ（Ｂａｍ））を精製し，Ｃｌａ　Ｉで部分分解する。結果として生じた混合物を，前述のＣｌａ　Ｉ／Ｋａｎ断片と連結する。エセリシア・コリーＫ８０２へ形質転換後，形質転換株をテトラサイクリンおよびカナマイシンを含む培地上で選択する。プラスミドの単離，および制限地図作製後，希望の構成を有するクローンを同定し，そのクローンに存在するプラスミドをｐ１１−８３ａ（図３）とする。
【０１７１】
ｐ１１−８３ａは，２番目のポリアデニル化部位を約３０ｂｐ過ぎた“中央の”Ｃｌａ　Ｉ部位へ連結されたＫａｎ遺伝子を有する，断片を有している。実施例２．１で構成された修飾型ベクターから単離した，殺虫遺伝子のＢａｍ　ＨＩ断片を，Ｋ８０２に導入して成育させた結果メチル化されているｐ１１−８３ａのＢａｍ　ＨＩ部位へ，Ｂａｍ　ＨＩで線状化後，連結する。Ｋ８０２へ形質転換し，テトラサイクリンとカナマイシンで選択し，プラスミドを単離し，そして制限地図作製を行った後で，ｐＴｉ１５９５５の“１．６”プロモーターとポリアデニル化部位との間に挿入された殺虫構造遺伝子を有する構成を同定し，そして，それを有するプラスミドをｐ１１−８３ｂ（図３）と称する。
【０１７２】
２．４　Ｔｉプラスミドヘのｐ１１−８３ｂの導入
ｐ１１−８３ｂをｐＴｉ１５９５５，ｐＴｉＡ６６（機能しないｔｍｓ遺伝子を有する以外はｐＴｉ１５９５５と同様），および相同部位組み換えにより再生に影響を及ぼす遺伝子中に欠失を有する変異物（実施例１０），に導入する。タバコ植物を実施例６で記述した方式により形質転換し，形質転換株を，適当なプローブによるサザンおよびノーザンブロット（当業者にはよく知られた技術）そしてオクトピンおよび結晶タンパクの存在により同定する。形質転換したタバコ組織はタバコホーンウォームに対して致死的である。実施例６に記述したように形質転換細胞からタバコ植物を再生させ，そのタバコ植物を育種過程へ移す。再生植物およびそれらの殺虫タンパクを有する子孫の田畑は，タバコホーンウォームのような昆虫の幼虫の侵略に対して耐性である。それは，そのような幼虫がそのような植物から生じた組織を食べたとき毒性効果があるからである。
【０１７３】
２．５　カナマイシン耐性遺伝子のクローニングと単離
ｐＲＺ１０２（Ｒ．Ａ．Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７７：６５−７２）は１コピーのトランスポソンＴｎ５を有するＣｏｌＥｌプラスミドである。そのｐＲＺ１０２をＢａｍ　ＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで分解し，前もって同じ２つの酵素で線状化しておいたｐＢＲ３２２と混合し連結し，Ｋ８０２へ形質転換した。アンピシリンおよびカナマイシン両耐性の形質転換株を選択し，それから単離したプラスミドの制限地図作製を行い，図３に示した構成を有するものをｐＫＳ−４とした。
【０１７４】
（実施例３）
この実施例はバチルス・チューリンゲンシスの殺虫タンパクの発現可能な遺伝子を植物ゲノムに挿入するもう一つの方法を示す。該シャトルベクターはＣ．Ｌ．Ｆｉｎｋ（１９８２）Ｍ．Ｓ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍｅｄｉｓｏｎ，により用いられたものと似ており，オクトピンＴｉプラスミドにｎｏｓ遺伝子を導入するのに用いる。ここに示す発明においてＴｉプラスミドへ挿入する前に，タンパクをコードしているｎｏｓ遺伝子を取り除き殺虫遺伝子と交換している。その結果，ノバリンシンターゼプロモーターの支配下で植物細胞中で発現する殺虫遺伝子を有したオクトピン型のプラスミドができる。
【０１７５】
３．１　ｎｏｓ遺伝子のＭ１３ｍｐ７への移動
ｐＣＦ４４（Ｆｉｎｋ，前出）をＸｈｏＩで分解し，それ自身で再連結させ再びＫ８０２へ形質転換した。アンピシリン耐性形質転換株から単離したプラスミドを制限酵素により分析した。Ｔｉプラスミド由来のＤＮＡ配列中に唯一のＸｈｏＩ部位を有するプラスミドをｐＣＦ４４Ａとした。唯一のＸｈｏ　Ｉ部位はｐＣＦ４４の２つのＸｈｏ　Ｉ部位の間のＤＮＡ断片欠失の結果である。このＸｈｏ　Ｉ断片の除去により不都合な２つのＣｌａ　Ｉ部位を完全に除くことができた。
【０１７６】
ｐＣＦ４４をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍ　ＨＩで分解し，あらかじめ同じ２つの酵素で分解しておいたｐＢＲ３２２と混合し連結し，Ｋ８０２へ形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換株を選択し，プラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択し，ｐＮＳ５と命名された，ｎｏｓ遺伝子を有するプラスミドを有するコロニーを同定した。
【０１７７】
ｐＮＳ５をＢｃｌ　ＩおよびＢａｍ　ＨＩで分解し，すでにＢａｍ　ＨＩで線状化した一本鎖ＤＮＡベクターＭ１３ｍｐ７の二本鎖環状複製型（ＲＦ）と混合し連結した。混合物をＪＨ１０３に形質転換し，白いプラークを選択した。２つのコロニーを，ＲＦ単離後の制限地図作製により同定した。それらをＭ１３−１およびＭ１３−３と命名した。それらは一本鎖型のときそれぞれ意味のある鎖と意味のない鎖を有していた。
【０１７８】
３．２　ｎｏｓプロモーターの後へのＮｃｏ　Ｉ部位の設置
５’ＡＧＴＣＴＣＡＴＡＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＡＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴ３’の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを実施例１０．１に記述したように合成した。このオリゴヌクレオチドは下線部がｎｏｓ構造遺伝子の５’末端の本来の配列と変化していた。この変化により，ｎｏｓ遺伝子のＡＴＧ翻訳開始点にＮｃｏ　Ｉ部位５’．．．Ｃ＊ＣＡＴＧＧ．．．３’が導入された。該オリゴヌクレオチドを，培養培地から沈降させたウィルス粒子から単離した環状一本鎖Ｍ１３−３ＤＮＡとハイブリダイズさせた。該オリゴヌクレオチド：Ｍ１３−３ハイブリッドをＤＮＡリザーゼおよびエセリシア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片と共に保温し，共有結合的閑環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を増やし，その混合物をＪＭ１０３へ形質転換した。形質転換株から産生されたウィルス粒子を単離し，低感染比で細胞の感染に用いた。ＲＦ　ＤＮＡを多くのこれらの感染コロニーから単離し，制限地図作製により性格づけを行った。変異オリゴヌクレオチドプライマーにより複製された鎖から派生レたクローンは，唯一のＮｃｏ　Ｉ部位の存在（もし存在すればこの酵素で線状化できる）により同定した。変異クローンをさらに，Ｃｌａ　Ｉ，Ｂａｍ　ＨＩ（線状化分子の同定のため），およびＣｌａ　ＩをＮｃｏ　Ｉと共に作用させて分解することにより，Ｎｃｏ　Ｉ部位の位置を調べる性格づけを行った。該変異Ｍ１３−３ベクターをＭ１３−３Ａ／Ｂ１８ａとした。
【０１７９】
３．３　殺虫遺伝子のＭ１３ｍｐ８への移動
ｐ１２３／５８−１０　ＤＮＡ（実施例１．１）をＥｃｏ　ＲＩで分解し，Ｅｃｏ　ＲＩで線状化したＭ１３ｍｐ８　ＲＦ　ＤＮＡと混合し連結した。混合物をＪＭ１０３へ形質転換し，白いプラークを選択後，殺虫遺伝子を含む断片をそれぞれ反対の方向で有する２つのコロニーを，制限地図作製により同定した。それらをそれぞれＮＢＴ１４およびＭＢＴ３と命名した。それらはそれぞれ一本鎖型のとき，意味のある鎖および，意味のない鎖を有していた。
【０１８０】
３．４　殺虫遺伝子の翻訳開始点へのＮｃｏＩ部位の設置
５’ＧＡＧＧＴＡＡＣＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴ３’の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを実施例１０．１に記述しているとおりに合成する。このオリゴヌクレオチドでは，下線部の２つの塩基が殺虫構造遺伝子の５’末端に本来ある配列と変化している。その変化の結果，殺虫遺伝子のＡＴＧ翻訳開始点にＮｃｏ　Ｉ部位，５’．．．Ｃ＊ＣＡＴＧＧ．．．３’，を導入することになる。このオリゴヌクレオチドを，培養培地から沈降させたウィルス粒子から単離した環状一本鎖　ＭＢＴ３　ＤＮＡとハイブリダイズさせる。このオリゴヌクレオチド：ＭＢＴ３　ハイブリッドをＤＮＡリガーゼとエセリシア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片と共に保温しｃｃｃＤＮＡを増やし，混合物をＪＭ１０３へ形質転換する。形質転換株が産生したウィルス粒子を単離し細胞を低感染比で感染をさせるのに用いる。多くのこれらの感染コロニーからＲＦ　ＤＮＡを単離し，制限地図作製により性格づけする。変異オリゴヌクレオチドにより複製が開始された鎖から派生したクローンを唯一のＮｃｏ　Ｉ部位（もし存在すればこの酵素でそれらは線状化できる）の存在により同定する。変異クローンを制限酵素分析によりさらに性格づけし，変異配列の存在を配列決定により確認する。希望の配列を有するプラスミドをＭＢＴ３（Ｎｃｏ）とする。
【０１８１】
３．５　シャトルベクター内での植物で発現可能な殺虫遺伝子の組立
Ｎｃｏ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで分解したＭＢＴ３（Ｎｃｏ）ＲＦ　ＤＮＡを実施例１１．１に記述したように合成し，次に示す構造を有するリンカーと混合し連結する：
【０１８２】
【化８】
2004000239.tif 000009
このリンカーはすべての３つの読み取りフレームにおいて終止コドン（下線）をコードしており，そして，このリンカーは機能するＢａｍ　ＨＩ部位の末端と，ＨｉｎｄＩＩＩの粘着末端と和合するが，再びＨｉｎｄＩＩＩ部位を再構成することができない粘着末端で有する。殺虫遺伝子を有するＤＮＡ断片をＮｃｏ　ＩとＢａｍ　ＨＩによる分解により端をそろえ，アガロースゲル電気泳動により単離する。
【０１８３】
ｐＫＳ１１１−Ｎ（Ｆｉｎｋ，前出）は，機能的Ｋａｎ遺伝子を有するＴｎ５ＤＮＡ（ｐＫＳ−４から）中に挿入されたｎｏｓ遺伝子を有しているプラスミドで，それ自身がｐＫＳ１１１のＴ−ＤＮＡ中に挿入されている。ｐＫＳ１１１−ＮをＳｓｔ　ＩＩで線状化し，Ｂａｍ　ＨＩで完全分解する。Ｍ１３−３Ａ／Ｂ１８ａ　をＮｃｏ　ＩとＳｓｔ　ＩＩで分解しＳｓｔ　ＩＩ／Ｎｃｏ　Ｉプロモーター断片をアガロースゲル電気泳動によって単離する。このＳｓｔ　ＩＩ／Ｎｃｏ　ＩプロモーターとＮｃｏ　Ｉ／Ｂａｍ　ＨＩ遺伝子の断片をｐＫＳ１１１−Ｎ　Ｓｓｔ　ＩＩ／Ｂａｍ　ＨＩ反応産物と混合し連結する。連結混合物をエセリシア・コリーＫ８０２へ形質転換する。カナマイシンとテトラサイクリン耐性の形質転換株から単離したプラスミドを制限酵素分析し，ｎｏｓ遺伝子の５’部分が殺虫構造遺伝子に置換された以外はｐＫＳ１１１−Ｎと同一のプラスミドを有するコロニーを同定する。そのようなプラスミドをｐＫＳ１１１−ＮｐＢｔとする。
【０１８４】
３．６　ＴＩＰプラスミドヘの挿入，植物の感染および再生
エセリシア・コリーＫ８０２（ｐＫＳ１１１−ＮｐＢｔ）をアグロバクテリウム・チューメファシエンスと実施例９に記述したように交雑させる。アグロバクテリウム株は発明の背景の項で記述したような，再生を容易にする変異を有するｐＴｉ１５９５５に基づくＴＩＰプラスミドを持つ。相同部位組み換え体を，実施例９に記述したように選択し，制限地図作製により性格づけを行う。作製物の効能をヒマワリの茎に感染させることにより迅速に試験する。結果として生ずる瘤について，実施例７で記述したように，ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにより，また，実施例８に記述したように，バイオアッセイにより試験を行う。実施例６に記述してあるように，アグロバクテリウム株をタバコ細胞に感染させて，それから再生させる。結果として生じた植物を，昆虫耐性の特性が望まれる種々の商業作物と交叉させるための，栽培材料として用いる。再生した植物およびこれらの殺虫タンパクを有する子孫の範囲は，タバコ角虫のような昆虫の幼虫の侵略に対して耐性である。それはそのような幼虫がそのような植物の組織を食べたとき，毒性効果があるからである。
【０１８５】
（実施例４）
この実施例は，バチルス・チューリンゲンシスの殺虫タンパクの発現し得る遺伝子を植物ゲノムへ挿入するもう一つの方法を示す。方針はＴ−ＤＮＡプロモーターの代わりに植物プロモーターを用いること以外は，実施例３に記述したものと同様である。プロモーターを提供する植物遺伝子はファゼオリンであり，これはその起源である豆科植物ファゼオラス・ブルガリス　Ｌ．以外の種においても活性を有することが既に示されている。
【０１８６】
４．１　ファゼオリン遺伝子のＭ１３ｍｐ７への移動
５’ＧＧＡＴＣＣ３’の配列を有するＢａｍ　ＨＩリンカーをアニールさせ２本鎖の構造を形成させる。そして平滑末端連絡を行い連鎖物を形成する。これらの連鎖物をＢａｍ　　ＨＩで部分分解して５’ＧＡＴＣ．．．３’の粘着末端を露出させる。この粘着末端はＢａｍ　ＨＩ，Ｂｃｌ　Ｉ，Ｂｇｌ　ＩＩ，ＭｂｏＩ，Ｓａｕ　３ＡＩ，およびＸｈｏ　ＩＩなどの酵素により生じた粘着末端（５’ＧＡＴＣ．．．３’）と和合する。ファゼオリンのシャロン２４Ａファージクローンである１７７．４（Ｓ．Ｍ．Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２８９：３７−４１，Ｊ．Ｌ．Ｓｌｉｇｈｔｏｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：１８９７−１９０１，ＡＧ−ＰＶＰｈ１７７．４とも記される）を，Ｂｇｌ　ＩＩおよびＢａｍＨＩで分解し，連鎖状リンカーと連結する。そしてＢａｍ　ＨＩで完全分解し，リンカーの端をそろえ，Ｂａｍ　ＨＩ粘着末端を露出させる。ファゼオリン遺伝子とその５’−および３’−近辺の配列を有する３．８ｋｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動およびその後の抽出とにより単離する。この断片は，Ｂａｍ　ＨＩ／Ｂｇｌ　ＩＩの連鎖部位で両酵素のどちらかの作用に対して非感受性であり，どちらかの末端にＢａｍ　ＨＩ部位を有している。この３．８ｋｂｐのＢｇｌ　ＩＩ／Ｂａｍ　ＨＩ断片は，ｐＢＲ３２２に基づく１７７．４のサブクローンであるｐ８．８からも，得ることができる。
【０１８７】
該３．８ｋｂｐ断片をＢａｍ　ＨＩで線状化したＭ１３ｍｐ７ＲＦと混合し，連結する。混合物をＪＭ１０３へ形質転換し，白いプラークを選択し，制限酵素による性格づけ，およびＲＦｓおよびファージＤＮＡのハィブリダイゼーション分析により２つのコロニーを選択する。Ｍ１３−３．８ＡおよびＭ１３−３．８Ｓのウイルス型はそれぞれファゼオリン遺伝子の意味のない鎖と意味のある鎖を有していることが判明する。
【０１８８】
４．２　ファゼオリンプロモーターの後へのＮｃｏＩ部位の設置
Ｍ１３−３．８ＡのファセオラスＤＮＡはファゼオリンの転写開始点から約４５０ｂｐ上流部分にＮｃｏ　Ｉ部位を有している。この部位の存在は，ファゼオリンの翻訳開始点に導入するために，Ｎｃｏ　Ｉ部位でプラスミドを切断しようとするときに不都合になるであろう。単離したＭ１３−３．８ＡのＲＦ　ＤＮＡをＮｃｏ　Ｉで線状化し，５’−突出末端をエセリシア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片の作用で埋める。平滑末端連結後，ＪＭ１０３へ形質転換する。ＲＦ　ＤＮＡｓを単離し制限地図作製により性格づけする。ファセオラスＤＮＡのＮｃｏ　Ｉ部位は欠失しているが他はＭ１３−３．８Ａと変わっていない，Ｍ１３−３．８Ａｃと命名したベクターを有するコロニーを選別する。
【０１８９】
５’ＡＴＡＣＴＡＣＴＣＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＧ３’の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを実施例１０．１に記述したように合成する。このオリゴヌクレオチドは下線部分がファゼオリン遺伝子の５’末端に本来存在する配列と異なっている。該オリゴヌクレオチドを，培養培地から沈降させたウィルス粒子から単離した環状１本鎖　Ｍ１３−３．８Ａｃ　ＤＮＡとハイブリダイズさせる。このオリゴヌクレオチド：Ｍ１３−３．８Ａｃ　ハイブリッドをＤＮＡリガーゼとエセリシア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片と共に保温し，ｃｃｃＤＮＡを増やし，その混合物をＪＭ１０３へ形質転換する。形質転換株が産生するウィルス粒子を単離し，低感染比で細胞を感染させるのに用いる。ＲＦ　ＤＮＡを多くの感染コロニーから単離し，制限地図作製により性格づけを行う。変異オリゴヌクレオチドで複製が開始された鎖から派生したクローンは，コードしている配列の５’末端に新しいＮｃｏ　Ｉ部位が存在していることにより同定する。変異クローンをさらに，Ｃｌａ　Ｉ，およびＮｃｏ　Ｉと共にＣｌａ　Ｉで，分解することにより，Ｎｃｏ　Ｉ部位の位置に関する性格づけをする。変異したＭ１３−３．８ＡｃベクターをＭ１３−３．８Ａａとする。
【０１９０】
４．３　ファゼオリン遺伝子の３’末端へのＨｉｎｄＩＩＩ部位の設置
殺虫遺伝子をファゼオリン遺伝子に簡単に導入するには，２つの変化をファゼオリン遺伝子に与えねばならない。第１は，ファゼオリン遺伝子のポリアデニル化部位および３’末端付近にＨｉｎｄＩＩＩ部位（５’…Ａ＊ＡＧＣＴＴ
…３’）を付加することある。他の重要な変化はすべての３種の読み取りフレームに対する翻訳終止コドン（例えば下記に下線で示してあるＴＡＡ，ＴＡＧあるいはＴＧＡ）を配置することである。オリゴヌクレオチド５’ＡＧＧＧＴＧＣＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＡＡＧＴＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＣ３’（ａ）と，ファゼオリン遺伝子をコードしている配列の３’末端（ｂ）と比べるとき次に示すように所望の特性を有することがわかる：
【０１９１】
【化９】
2004000239.tif 000010
この３８個にはわずか６個の適合しないものがあるだけなので，プライミングに際し良好なハイブリダイゼーション特性が保証されることに注意されたい。
【０１９２】
該オリゴヌクレオチド５’ＡＧＧＧＴＧＣＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＡＡＧＴＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＣ３’を実施例１０．１に記述したように合成し，培養培地から遠心分離によって単離したウィルス粒子より精製した１本鎖環状Ｍ１３−３．８Ａａ　ＤＮＡとハイブリダイズさせる。このオリゴヌクレオチド：Ｍ１３−３．８ＡａハイブリッドをＤＮＡリガーゼおよびエセリシア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片と保温し，ｃｃｃＤＮＡを増やし，混合物をＪＭ１０３へ形質転換する。該形質転換株が産生するウィルス粒子を単離し，低感染比で細胞を感染させるために用いる。ＲＦ　ＤＮＡを多くの感染コロニーから単離し，制限酵素分析により性格づけを行う。変異オリゴヌクレオチドで複製が開始された鎖から派生したクローンを，ファゼオリンの３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位が存在するかどうかで同定した。そして，構造遺伝子の両末端に変異配列が存在することを，塩基配列決定により確認する。希望する配列を有するベクターをＭ１３−３．８Ａｂとする。
【０１９３】
４．４　殺虫遺伝子の挿入
ＭＢＴ３（Ｎｃｏ）ＲＦ　ＤＮＡをＮｃｏ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで分解し，Ｎｃｏ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで分解したＭ１３−３．８Ａｂ　ＤＮＡと混合し，連結する。混合物をＫ８０２へ形質転換し，カナマイシンおよび／あるいはテトラサイクリン耐性形質転換株からのプラスミドＤＮＡを単離し，制限酵素分析により性格づけを行った。ファゼオリンプロモーターとポリアデニル化部位との間に挿入された殺虫構造遺伝子を有するプラスミドをＭ１３−ＰｐＢｔとし，それを有するコロニーを選別する。
【０１９４】
４．５　修飾型ファゼオリン遺伝子のシャトルベクターヘの移動
ｐＫＳ１１１−Ｋ（Ｆｉｎｋ，前出）は，ｐＫＳ１１１　Ｔ−ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入された　ｐＫＳ−４由来のＴｎ５Ｋａｎ遺伝子を有している。Ｍ１３−ＰｐＢｔ／ＲＦ　ＤＮＡをＢａｍ　ＨＩで分解し，Ｂａｍ　ＨＩで線状化したｐＫＳ１１１−Ｋ（Ｆｉｎｋ，前出）と混合し，連結する。カナマイシンおよび／あるいはテトラサイクリン耐性のＫ８０２形質転換株からのプラスミドを単離し，制限地図作成により性格づけを行った。ｐＫＳ１１１−ＰｐＢｔと命名されたプラスミドを有するコロニーを選別し，それはファゼオリンプロモーター／殺虫構造遺伝子／ポリアデニル化部位の組合せ（それはｋａｎ遺伝子と共にオクトピンＴ−ＤＮＡに囲まれている。）を有している。
【０１９５】
４．６　ＴＩＰプラスミドヘの挿入，植物への感染および植物の再生
エセリシア・コリーＫ８０２（ｐＫＳ１１１−ＰｐＢｔ）をアグロバクテリウム・チューメファシエンス，実施例９に述べたように，交雑する。ｐＴｉ１５９５５に基づく，発明の背景の順に記述しているような再生させる場合都合がよい変異を有する，ＴＩＰプラスミドを有するアグロバクテリウム・チューメファシエンス株を選別する。相同部位組み換え体を，実施例９に記述しているように，選別し制限地図作成により性格づけを行う。その作成物の効力をヒマワリの茎に感染させて迅速に試験する。結果として生じる瘤を，実施例７に記述しているように，ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットでそして，実施例８に記述しているように，バイオアッセイによって試験する。実施例６に記述しているように，アグロバクテリウム株を，タバコ細胞の感染に用い，次いでそのタバコ細胞は再生する。得られた植物を，昆虫耐性の特性が要求されるさまざまな商業品種と交叉するために，育種用の貯蔵株として用いる。再生した植物および殺虫タンパクを有する子孫の田畑は，タバコホーンウォームのような昆虫の幼虫の侵略に対して耐性である。これは，幼虫が植物組織を食べた際に幼虫に対して毒性があるからである。
【０１９６】
（実施例５）
この実施例における再生は，Ｒｉプラスミドに基づくＴＩＰプラスミドによりおこされたニンジンの腫瘍についでであり，基本的にはＭ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ　２９５：４３２−４３４に記述されたとおりに行われている。
【０１９７】
５．１　毛根への感染
ニンジンのディスクに０．１ｍｌの水中に１０９のバクテリアを植菌する。得られた毛の末端の１．５ｃｍの小片を切取り，ホルモンを欠いた固体（１−１．５％寒天）モニエル培地（Ｄ．Ａ．Ｔｅｐｆｅｒ　＆　Ｊ．Ｃ．Ｔｅｍｐｅ（１９８１）Ｃｒ．ｈｅｂｄ．Ｓｅａｎｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｉｓ　２９５：１５３−１５６）に置き，そして暗所で２５℃〜２７℃で成育させる。バクテリアが混在していない培養物を２〜３週間毎に移し代え，ホルモンおよび寒天を欠くモニエル培地に縫代培養する。形質転換された根は異常な形態で識別および選別することができる。
【０１９８】
５．２　根の植物への再生
実施例５．１で記述している培養根組織を０．３６μＭ　２，４−Ｄおよび０．７２μＭカイネチンを含む固体（０．８％寒天）モニエル培地上に置く。４週間後，結果として生じたカルス組織をホルモンを欠く液体モニエル培地に移す。２２〜２５℃で振盪機（１５０ｒ．ｐ．ｍ．）上で１ケ月間培養している間にカルスが懸濁培養中へ分離してくる。それをホルモンを欠くモニエル培地の入ったペトリ皿に置くと，そこから胚が分化し，それは小植物へ成長する。これらの植物は培養中で成育し，徐々に湿気を減らしていくことによる“強化”の後で，温室あるいは野外の土壌へ移す。
【０１９９】
５．３　非毛状根ベクターの使用
機能的ｔｍｒ遺伝子を有しないＴｉに基づくベクターを，Ｔ．Ｃ．Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｓｅｒ．ｎｏｓ．４８５，６１３　ａｎｄ　４８５，６１４らに記述されたように，Ｒｉに基づくベクターの代わりに用いる。適当な変異の作成は専門家によって可能であり，そしてそれについては発明の背景の項で述べてある。
【０２００】
（実施例６）
この実施例における再生はＴｉに基づくＴＩＰプラスミドいよりおこされた，基本的にはＫ．Ａ．Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ　３２：１０３３−１０４３によって記述されたように行われたタバコ腫瘍を含む。
【０２０１】
６．１　クラウンゴールによる感染
タバコ組織を，Ａ．Ｃ．Ｂｒａｕｎ（１９５６）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１６：５３−５６によって初めに述べられた，逆転した茎の小片を利用する方法を用いて形質転換する。茎は表面を７％市販クロロックス（Ｃｈｌｏｒｏｘ）および８０％エタノールで殺菌し，殺菌水で洗い，寒天で固形化したホルモンを欠くＭＳ培地（Ｔ．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｆ．Ｓｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３−４９７）の入ったペトリ皿に根本の端を上にして置く。植菌は，注射器の針で茎の基本面の切片に穴をあけ，バクテリアを注入することにより行う。茎を２５℃で１日当り１６時間，光を照射して培養する。成育したカルスを茎の小片の表面から採り，０．２ｍｇ／ｍｌカルビニシリンを含み，ホルモンを欠く固体ＭＳ培地上に置く。そして約１ケ月の期間をおいて，３回新鮮なＭＳ−カルベニシリン培地に移し変える。そして培養中にバクテリアが存在していなかったかどうか試験する。無菌組織を前述の培養条件（２５℃；１６時間：８時間，明：暗）で添加物を欠く固体ＭＳ培地上で保存する。
【０２０２】
６．２　形質転換組織の培養
形質転換した無菌組織からＡ．Ｂｉｎｎｓ　＆　Ｆ．Ｍｅｉｎｓ（１９７９）Ｐｌａｎｔａ　１４５：３６５−３６９，により記述されたようにしてクローンを得る。カルスを０．０２ｍｇ／ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）中で２５℃，２あるいは３日間，１３５ｒ．ｐ．ｍ．で振盪しながら培養し，５４３および２１３μｍのステンレススチールメッシュを順番に通して濾過することにより懸濁細胞へ転換させる。濾過物を濃縮し，０．５％の溶解した寒天，２．０ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ，０．３ｍｇ／ｌカイネチンおよび０．４ｇ／ｌディフコ酵母エキスを含む５　ｍｌのＭＳ培地に約８×１０３細胞／ｍｌの密度で移植する。約１ｍｍの直径に達したコロニーをメスの先でつまみ取り，２．０ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ，０．３ｍｇ／ｌカイネチンおよび約１０μｇ／ｍｌ　Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）を含む固体ＭＳ培地に置く。（ＡＥＣの濃度の範囲は，２μｇ／ｍｌと３０μｇ／ｍｌの間について試される。なぜなら，選別における正確な濃度の効果は，用いるタバコの種類，および元の植物およびそれから派生した組織に適用される成育条件，に依存しているため。）ＡＥＣはオクトピンシンターゼを有する組織を選別することが可能な試薬ということは知られている（Ｇ．Ａ．Ｄａｈｌ　＆　Ｊ．Ｔｅｍｐｅ（１９８３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，印刷中）。代わりに，低密度（数　１００細胞／ｍｌ）で固体　ＭＳ／ＮＡＡ／カイネチン／酵母エキス培地上で成育したタバコ細胞のフィーダー層の上に濾紙をおおいその上に濾液を置いてもよい。１ｍｍのコロニーが生じたら，全濾紙を固体　ＭＳ／ＮＡＡ／カイネチン／ＡＥＣ培地の入ったペトリ皿に移す。結果として生じたカルスからＡＥＣ毒性効果を示さないものを選別し，小片に分割し，オクトピン産生能およびホルモンに独立的な成育などのような，他の形質転換表現型について試験を行う。
【０２０３】
６．３　植物の再生
形質転換したクローンを０．３ｍｇ／ｌカイネチンを含む固体ＭＳ培地上に移植し，そして実施例６．１に記述したように培養する。形成したシュートを，１／１０強度のＭＳ培地塩および０．４ｍｇ／ｌチアミンを含み，蔗糖およびホルモンを欠く，ｐＨ７．０の固形（１．０％寒天）培地上に移植して根を出させる。根の出た植物を培養して成育させ，実施例５．２で記述したように，強化し，そして温室あるいは野外の土壌に移す。植物は，専門家にはよく知られている方法，例えば適当なプローブを用いるサザン，ノーザンおよびドットブロット，オクトピン試験，結晶タンパクの存在に関する免疫的（実施例７を参照）あるいは生物学的（実施例８を参照）試験などにより，形質転換された表現型の保持について選別する。
【０２０４】
６．４　使用するベクター
Ｔ．Ｃ．Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ．ｎｏｓ．４８５，６１３　ａｎｄ　４８５，６１４によって示された作成物は，機能的ｔｍｒ遺伝子を欠く，適したＴｉに基づくベクターである。実施例６．１に示した逆転した茎の小片の感染についての方法は，ＴＩＰ−形質転換植物細胞系列を確立するのに，しばしば有用である。
【０２０５】
（実施例７）
抗殺虫タンパク抗体を，免疫学の当業者にはよく知られている方法で，作成した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後に抗原を発見するための“ウエスタン”ブロットを，基本的にはＲ．Ｐ．Ｌｅｇｏｃｋｉ　＆　Ｄ．Ｐ．Ｓ．Ｖｅｒｍａ（１９８１）Ａｎａｌｙｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ　１１１：３８５−３９２に記述してあるのと同様にして行った。
【０２０６】
マイクロ　ＥＬＩＳＡ（酵素連関免疫吸着分析）試験を，９６個のウェルを有したイムロン−２型プレートを用いて，以下に示す手順で行った：
７．１　抗体のプレートヘの結合
１日目，コーティング用緩衝液中で１：１０００に希釈した抗体（ウサギ抗殺虫タンパク　ＩｇＧ）でウェルをコーティングする。２００μｌ／ウェルを３７℃で２〜４日間保温する。保温中，プレートはサランラップで覆う。それから，プレートをリン酸緩衝液で緩衝化したサリン−ツイーン（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で，各々の洗いの段階の間を５分間保ち，３回洗う。次いで１％の仔牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を洗いのために加え，そしてウェルに加えて捨てる前に，２０分間静置する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回以上洗う。
【０２０７】
７．２　組織の破壊
組織を小片に切り，ポリトロンを用いて，１　ｍｇの組織あたり１　ｍｌのリン酸で緩衝化したサリン−ツイーン−２％ポリビニルピロリドン−４０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２％　ＰＶＰ−４０）を加えてすりつぶす。すりつぶしの前後，すべての標品を氷中に保ち，標準曲線を得る。組織のホモジェネート中で行われる標準曲線もあれば，すりつぶされた組織や細胞からの殺虫タンパクの回収率を知るために緩衝液中で行われる標準曲線もある。続いてすりつぶした標品を遠心分離し，１００μｌずつの各々の標品をウェルに入れ，４℃で一晩放置する。失敗を避けるために各々の標品について２通りずつ行う。保温中，プレートはシールしておく。
【０２０８】
７．３　結合酵素
一晩保温した後，抗原を捨て，そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで各洗浄の間５分間置きながら５回ウェルを洗う。
【０２０９】
接合物（アルカリ性ホスファタージが結合したウサギ抗殺虫タンパク　ＩｇＧ）を，０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２％　ＰＶＰで１：３０００に希釈し，１５０μｌを各ウェルに加える；続いて３７℃で３〜６時間保温する。保温後，接合物を捨て，ウェルを各々の洗いの間は５分間あけ，ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗う。
【０２１０】
７．４　分析
分析を行う直前，５ｍｇの錠剤状のｐ−ニトロフェニルフォスフェート（シグマから購入し，暗所で凍結保存）を１０ｍｌの基質に対して加え，錠剤が溶けるまで攪拌して溶かす。室温に保った２００μｌの溶液を素早く各ウェルに入れる。反応は様々な時間（ｔ）に，例えばｔ＝０，１０，２０，４０，６０，９０そして１２０分，Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏ−ＥＬＩＳＡ　ｒｅａｄｅｒを用いて測定する。無色のｐ−ニトロフェニルフォスフェートがアルカリ性フォスファターゼにより加水分解されて，無機リン駿とｐ−ニトロフェノールになり，後者は溶液を黄色にし，これは分光光度計の４１０ｎｍで測ることができる。
【０２１１】
（実施例８）
昆虫は市販のものを購入し，基本的には，Ｒ．Ａ．Ｂｅｌｌ　＆　Ｆ．Ｇ．Ｊｏａｃｈｉｍ（１９７６）Ａｎｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｓｏｃ．Ａｍｅｒ．６９：３６５−３７３あるいはＲ．Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ（１９６９）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．６２：１４２７−１４３１に記述されているようにして，保存した。殺虫タンパクに関する生物試験は，基本的には，Ｊ．Ｈ．Ｓｃｈｅｓｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９７７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：８７８−８８０に記述してあるのと同様にして，殺虫タンパクの抽出物をマンドゥカ・セクスタ（Ｍａｍｄｕｃａ　ｓｅｘｔａ）の幼虫に与えることにより行った。
【０２１２】
（実施例９）
三親交雑は通常下記のようにして行った；当業者にはよく知られている他の変法もまた用いることは可能である。エセリシア・コリー　Ｋ８０２（ｐＲＫ２９０に基づくシャトルベクター含有）をエセリシア・コリー（ｐＲＫ２０１３），およびＴＩＰを有しストレプトマイシン耐性のアグロバクテリウム・チューメファシエンス株と交雑させる。ｐＲＫ２０１３をシャトルベクターを有する株へ導入し，転移さすためにシャトルベクターをアグロバクテリウムへ移動させる。ストレプトマイシンと，シャトルベクターが耐性を示す薬剤，大体カナマイシンかクロラムフェニコール，両者を含む培地上で成育させ，結果として，シャトルベクターの配列を有するアグロバクテリウム細胞を選別する。これらの細胞と，エセリシア・コリー（ｐＰＨ１Ｊ１）を交雑させてｐＰＨ１Ｊ１をアグロバクテリウム細胞へ導入する。ｐＰＨ１Ｊ１とｐＲＫ２９０に基づくシャトルベクターは，同一細胞内に長時間共存することはできない。ｐＰＨ１Ｊ１が耐性遺伝子を有しているゲンタマイシン上で成育させた結果，ｐＲＫ２９０の配列を失った細胞を選別する。ストレプトマイシン，ゲンタマイシン，およびカナマイシンに耐性な細胞のみがシャトルベクターと二重相同部位組み換えを経験したＴｉプラスミドを有し，また希望する配列を有している。ｐＲＫ２９０およびｐＲＫ２０１３はＧ．Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：７３４７−７３５７により発表され，ｐＰＨ１Ｊ１はＰ．Ｒ．Ｈｉｒｓｈ（１９７８）Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖ．Ｅ．Ａｎｇｌｉａにより発表されている。
【０２１３】
（実施例１０）
この実施例は，オリゴヌクレオチドの合成および使用について記述しているものである。他の有用な参照研究は，これらの実施例の冒頭部分に引用してある研究のリストを見ればさがし出すことができる。
【０２１４】
１０．１　オリゴヌクレオチドの合成
これらの実施例中で用いているＤＮＡ断片の化学合成の技術は多くのＤＮＡ合成の当業者によく知られた技術を利用している。ヌクレオシドの修飾は，Ｈ．Ｓｃｈａｌｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９６３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：３８２０とＨ．Ｂｕｃｈｉ　＆　Ｈ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ（１９６５）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８７：２９９０，によって述べられている。デオキシヌクレオシドホスフォアミダイトの調製は，Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ　＆　Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２２：１８５９により述べられた。固相樹脂の調製はＳ．Ｐ．Ａｄａｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．により述べられている。２本鎖合成リンカーの形成の期間中，有用なハイブリダイゼーション過程は，Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１１０７０，により述べられている。
【０２１５】
１０．２　オリゴヌクレオチドの使用
遺伝子の欠失した部分を再構成するための合成オリゴヌクレオチドの使用は，Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ．ｎｏ．４８５，６１４により例示されている。また不和合性の制限部位の粘着末端を連結するための合成オリゴヌクレオチドの使用は，Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ．ｎｏ．４８５，６１４に例示されており，また，それらは組み換えＤＮＡ操作の当業者にはよく知られている。
【０２１６】
１０．３　オリゴヌクレオチドによる直接変更
直接の一般的方法は，最近，Ｄ．Ｓｈｏｒｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５：２６５−２９４によって総説が出されている。遺伝子の操作において特に有用なのは，オリゴヌクレオチドによる直接的特定部位の変更である。これは最近，Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｍ．Ｓｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００とＭ．Ｓｍｉｔｈ　＆　Ｓ．Ｇｉｌｌａｍ（１９８１）ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３，ｅｄｓ．：Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ　＆　Ａ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ，ａｎｄ　Ｍ．Ｓｍｉｔｈ（１９８２）Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．７：４４０−４４２，によって総説が出されている。この技術を用いると，ＤＮＡ配列中の１ないしそれ以上のベースペアーの変換，あるいは小さい挿入あるいは欠失を，導入することができる。最近のオリゴヌクレオチドを用いた直接変異には次のようなものがる：Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｍ．Ｓｍｉｔｈ（１９８３）ｓｕｐｒａ，Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｍ．Ｓｍｉｔｈ（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００，Ｇ．Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：６４０９−６４１３，Ｇ．Ｆ．Ｍ．Ｓｉｍｏｎｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０：８２１−８３２および　Ｃ．Ａ．ＨｕｔｃｈｉｓｏｎＩＩＩ　ｅｔ　ａｌ．（１９７８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１−６５６０。有用なＭ１３に基づくベクター（例えば　ｍＷＢ２３４４）がＷ．Ｍ．Ｂａｒｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：９８−１２２，と　Ｗ．Ｍ．Ｂａｒｎｅｓ　＆　Ｍ．Ｂｅｖａｎ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１：３４９−３６８，によって報告されている。
【０２１７】
修飾されるべき配列は，通常当業者にはよく知られた標準技術により，１本鎖バクテリオファージベクター，ここではＭ１３から派生したもの，に移される。該ＤＮＡベクターは一般的に２本鎖複製型（ＲＦ）の状態である。なぜなら，１本鎖ウィルス型では，通常，制限酵素およびリガーゼで“切断および結合”ができないからである。インビトロでのＲＦへの断片の連結後，適当な宿主へ形質転換し，それからベクターの生活環の一部としての１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を産生させる。ｓｓＤＮＡをファージ粒子から単離し，充分な長さを有し，適当な場所でベクターとハイブリダイズするべく配列の相同性を有したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。オリゴヌクレオチドは，変化させるべき配列以外は変化のない最終産物が希望できる，配列を有するべきである。一旦，変異配列を有するオリゴヌクレオチドと塩基対をなしたｓｓＤＮＡ環を含むハイブリッドが形成されると，５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性がないエセリシア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片により，オリゴヌクレオチドからＤＮＡの相補鎖が合成される。該ベクターを随意に，ＤＮＡリガーゼと共に保温すると，リガーゼとポリメラーゼの反応が同時に行なえる。優先的に共有結合的閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）分子を，形質転換する前に，アルカリ性蔗糖勾配遠心分離，アルカリ性条件でのフェノール抽出およびＳ１ヌクレアーゼとの保温などの技術を用いて，該ベクターは現在，適当な細菌宿主細胞へ形質転換することができる。この初期の感染からのウィルス粒子を単離して，バクテリアのローンに感染させてプラークを形成させるために用いる。制限部位を変化させた場合には，制限酵素分析により容易にＲＦｓをスクリーニングできる。また，合成変異オリゴヌクレオチドプライマーをプローブとして用いて注意深く選んだ条件下でのハイブリダイゼーション，またはＤＮＡ配列を決定することによっても選別できる。希望する変異を有するクローンを単離したとき，当業者によく知られた技術を用いて，必要に応じて変異ＤＮＡを操作することができる。
【０２１８】
（実施例１１：殺虫遺伝子の作成，形質転換および発現）
完全なプロトキシン遺伝子を再構成するために，隣接ＤＮＡの制限部位を既知技術である制限酵素分解物のサザンブロットにより同定し，そして重複クローンを５０ＭＤ（メガダルトン）プラスミド濃縮ＤＮＡから作成したＰｓｔ　Ｉライブラリーから選別した。プロトキシン遺伝子の５’および３’末端を次いで特殊なＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位を用いて融合させ，当業者に既知であるｐＢｔ７３−１６と呼ばれるプラスミドに含まれる完全なプロトキシン遺伝子を作成した。エセリシア・コリーＨＢ１０１（ｐＢｔ７３−１６）はＮＲＲＬ　Ｂ−１５７５９として寄託されている。
【０２１９】
ｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉを本質的には実施例２．２に示したように作成した。ｐＫＳ−ｐｒｏ　ＩＤＮＡをＣｌａ　Ｉで分解し，Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで埋め，そして５’ＣＧＧＡＴＣＣＧ３’リンカーと連結しｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉ（Ｂａｍ）を作成した。エセリシア・コリーＧＭ４８（Ｍ．Ｇ．Ｍａｒｉｎｕｓ（１９７３）Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１２７：４７−５５）中で増殖させたｐＢＲ３２５（Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒ（１９７８）Ｇｅｎｅ　４：１２１−１３６）ＤＮＡをＢｃｌ　ＩとＢａｍ　ＨＩで分解し，そしてそれ自身を再結合することにより，ｐＢＲ３２５のＢｃｌ　Ｉ／Ｂａｍ　ＨＩ断片を欠失したｐＢＲ３２５ａＢＢと名付けたプラスミドを作成した。ｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉ（Ｂａｍ）の４．２ｋｂｐ（キロベースペアー）Ｅｃｏ　ＲＩ断片をｐＢＲ３２５ａＢＢのＥｃｏ　ＲＩ部位にクローン化することにより，ｐ４０３Ｂと称するプラスミドを作成した。このプラスミドは，ｐＲＫ２９０に基づくベクターからｐＢＲ３２５に基づくベクターへ移されたｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉ（Ｂａｍ）のＴ−ＤＮＡを持つ。
【０２２０】
ｐＢｔ７３−１６　ＤＮＡをＮｄｅ　Ｉで分解し，Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした後，この平滑末端バチルスＤＮＡを二本鎖のＳｍａ　Ｉで線状にしたＭ１３ｍｐ１９　ＲＦ　ＤＮＡ（Ｊ．Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｇｅｎｅ　２６：１０１−１０６）と混ぜ，連結し，１．６．４．と称するベクターを作成した。このベクターは，一本鎖型が結晶タンパクｍＲＮＡと相補的である（すなわち，ファージが意味のない鎖を有する）ように配置された３．６ｋｂｐバチルスＤＮＡを有する。Ｂａｍ　ＨＩ部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを５’ＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＡＡＣ３’の配列の殺虫構造遺伝子の５’末端に対して用いる本質的には実施例１０に述べたように，Ｂａｍ　ＨＩ部位をバチルスＤＮＡに，結晶タンパクの翻訳開始部位のすぐ５’側に導入し，１．６．４Ｂ−３．８．３と名付けたベクターを得た。殺虫タンパク構造遺伝子は３．７５ｋｂｐ　Ｂａｍ　ＨＩ断片上の二本鎖１．６．４Ｂ−３．８．３　ＲＦ　ＤＮＡから除かれうる。
【０２２１】
Ｂａｍ　ＨＩで分解したｐ４０３Ｂおよび１．６．４Ｂ−３．８．３ＤＮＡを混ぜそして連結してｐ４０３Ｂ／ＢＴＢ＃３と称するプラスミドを作成した（図４）。このプラスミドは，“１．６”プロモーターとポリアデニル化部位の間にある完全な長さの殺虫タンパク構造遺伝子を有する。この作成物の方向は“１．６”プロモーターから転写されたとき，結晶タンパクをコードするｍＲＮＡの合成をもたらす。
【０２２２】
エセリシア・コリーＣ６００（ｐＲＫ−２０３−Ｋａｎ−１０３−Ｌｅｃ）はＮＲＲＬ　Ｂ−１５８２１として寄託されており，これは，Ｔ−ＤＮＡの５，５１２ＨｉｎｄＩＩＩ部位と９，０６２Ｂａｍ　ＨＩ部位の間がＴｎ５由来のｋａｎ遺伝子とレクチン遺伝子で置換されている以外は，Ｒ．Ｆ．Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２：３３５−３５０により決定されたように，ｐＴｉ１５９５５のＴ−ＤＮＡ配列を４，４９４と１２，８２３のＥｃｏ　ＲＩ部位の間で有するｐＲＫ２９０誘導体である。レクチン遺伝子はＨｉｎｄＩＩＩで分解し次いで再連結することによりｐＲＫ−２０３−Ｋａｎ−１０３−Ｌｅｃから除かれ，ｐＲＫ−２０３−Ｋａｎ−１０３と称されるベクターになる。ｐＲＫ−２０３−Ｋａｎ−１０３は，本質的には実施例９に述べたように，アグロバクテリウム・チューメファシェンス　ＡＴＣＣ１５９５５へ導入された。ＲＳ２０１４と呼ぶ二重相同組み換え体は同定され，それば変異　ｐＴｉ１５９５５　Ｔ−ＤＮＡを有していた。この置換は詳細な記述の項で述べたように，あるｔｍｒおよびｔｍｓ配列を欠失する。ＲＳ２０１４　Ｔ−ＤＮＡは植えつけられた植物組織をホルモン非依存増殖の表現型を与えることなく形質転換する。ＲＳ２０１４誘導体により形質転換されたタバコ組織は，当業者によく知られている手法により，正常植物へ再生されうる。
【０２２３】
アグロバクテリウムにおいては，ｐＢＲ３２５誘導体は，発明の背景のシャトルベクターの項で述べたように，“自殺ベクター”である。エセリシア・コリーＭＣ１０６１（ｐ４０３／ＢＴＢ＃３），エセリシア・コリー（ｐＲＫ２０１３）およびアグロバクテリウム・チューメファシエンス　ＲＳ２０１４を交雑させた。単一相同組み換え事象によりポリアデニル化部位の例，すなわち“１．６”構造遺伝子の左側，にｔｍｒ−ｔｍｓ−ｐＴｉ１５９５５へ同時に取り込まれたｐ４０３／ＢＴＢ＃３を有するアグロバクテリウム・チューメファシエンス細胞を含むＲ３−１１と名付けた株が分離された。（この“１．６”遺伝子はＢａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，前出，のＯＲＦ２４に相当する）。
【０２２４】
ニコチアナ・タバカム　ｖａｒ．キサンチの茎部分にＲ３−１１細胞を，本質的には実施例６に述べたように，植歯した。刺激細菌を除き，形質転換植物組織を培養し，単細胞をクローン化し，植物組織培養の当業者によく知られている方法を用いて正常細胞に再生させる。
【０２２５】
植物発現性の全長の殺虫タンパク遺伝子を含む形質転換タバコカルス組織を喰ったタバコホーンウオームは，バチルス・チューリンゲンシス結晶タンパク毒性による症状を示すことが観察された。
【０２２６】
ウエスタンブロット（実施例７）に類似の免疫学的ドットブロットは，バチルス・チューリンゲンシス結晶タンパク抗原が植物発現性の全長殺虫タンパク遺伝子を有する形質転換組織の抽出物中に存在することを示した。
【０２２７】
（発明の要旨）
発現殺虫タンパクの構造遺伝子を植物ゲノムヘ導入する方法を提供した。提供された具体例では，本発明は，バチルス・チューリンゲンシスの結晶タンパクの構造遺伝子を植物あるいはＴ−ＤＮＡのプロモーターの支配下，さらにポリアデニル化部位の前に置き，次いで前記プロモーター／構造遺伝子の組をアグロバクテリウム・チューメファシエンスＴｉプラスミドに基づく形質転換系を用いて植物ゲノムに挿入すること，を含む。次いで修飾Ｔｉプラスミドは受容植物細胞を形質転換するのに用いられる。さらに提供されたものはこの方法で生産された植物および組織，そして本発明遂行に有用な細菌株，プラスミドおよびベクターである。
【０２２８】
【発明の効果】
植物に害虫耐性，特に昆虫耐性を与えることが達成された。殺虫性タンパクをコードする遺伝子を植物細胞のゲノムに安定に挿入すること，この遺伝子を植物細胞で発現させること，調節あるいは構成的に発現させること，およびこの植物組織が正常植物となることが達成された。植物について新規の特殊な殺虫性組織をつくること，特に正常な双子葉植物に，その組織内に殺虫性タンパクを含む瘤を作らせる方法を確立することが達成された。
【０２２９】
【表１Ａ】
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【０２３０】
【表１Ｂ】
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【０２３１】
【表１Ｃ】
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【０２３２】
【表１Ｄ】
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【０２３３】
【表１Ｅ】
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【０２３４】
【表１Ｆ】
2004000239.tif 000016
【０２３５】
【表１Ｇ】
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【０２３６】
【表１Ｈ】
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【０２３７】
【表１Ｉ】
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【０２３８】
【表１Ｊ】
2004000239.tif 000020
【０２３９】
【表１Ｋ】
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【０２４０】
【表１Ｌ】
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【０２４１】
【表１Ｍ】
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【０２４２】
【表１Ｎ】
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【０２４３】
【表１Ｏ】
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【０２４４】
【表１Ｐ】
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【０２４５】
【表１Ｑ】
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【０２４６】
【表１Ｒ】
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【０２４７】
【表２】
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【０２４８】
【表３】
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【０２４９】
【表４Ａ】
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【０２５０】
【表４Ｂ】
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【０２５１】
【表４Ｃ】
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【０２５２】
【表４Ｄ】
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【０２５３】
【表５】
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【０２５４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１に示したｐ１２３／５８−１０の結晶タンパク質遺伝子の配列を示す部分配列図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの続きであり、実施例１に示したｐ１２３／５８−１０の結晶タンパク質遺伝子の配列を示す部分配列図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ｂの続きであり、実施例１に示したｐ１２３／５８−１０の結晶タンパク質遺伝子の配列を示す部分配列図である。
【図２】図２は、ｐＴｉ１５９５５５のＴ−ＤＮＡの制限位置地図と転写物を示す図である。
【図３】図３は、実施例２に示した植物発現プロモーターの支配下にある殺虫構造遺伝子を有する組換えＤＮＡベクター作製を示す模式図である。
【図４】図４は、殺虫構造遺伝子を有するｐ４０３Ｂ／ＢＴＢ＃３プラスミドの作製およびこれのアグロバクテリウム・チューメファシエンスの導入を説明する模式図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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