(57)【要約】【課題】ヒトミッドカインの発現を強く抑制する。【解決手段】ヒトミッドカインのメッセンジャーＲＮＡの特定の塩基配列に対応するｓｉＲＮＡ配列を用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトミッドカインの発現を抑えるｓｉＲＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトミッドカインの発現を抑制するｓｉＲＮＡ配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ：ＭＫ）は、胚性腫瘍細胞（ＥＣ）のレチノイン酸による分化誘導の過程で一過性に発現する遺伝子の産物として発見された増殖・分化因子で、塩基性アミノ酸とシステインに富む分子量１３ｋＤａのポリペプチドである。（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１：１３１２−１３１８；Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０７６５−１０７７０，１９９０）。ＭＫはヒトからアフリカツメガエルまで見出されているが、種間でのタンパク質の保存度は高く、ヒトとマウスのＭＫでは、アミノ酸配列において、８７％の相同性がある。ＭＫは、様々な生物活性を有する。すなわち、神経突起の伸長、神経細胞の生存を促進し、神経系の構築に関与すると考えられる。損傷時の組織、多くのヒト癌、そしてアルツハイマー病の老人斑にも発見され、組織の修復、線溶系活性化能、そして病態の関連でも注目される。ことにＭＫは多くのヒト癌で発現が上昇し（Ａｒｉｄｏｍｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊａｐ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８６：６５５−６６１，１９９５），またＭＫ  ｃＤＮＡの導入と発現により細胞が癌化する（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７５：３５４−３５９，１９９７）ことからヒト癌の発生と進展に深く関与すると想定される。またＭＫ遺伝子を欠くノックアウトマウスではバルーン障害モデルにおいて新生内膜の形成が著しく低下することから、ＭＫは血管病変の生起にも関与すると考えられる（Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５：４８９−４９５，２０００）。したがってＭＫの生産を抑えるか作用を阻害することによって、いくつかの疾病、ことに癌の治療に寄与することが可能と考えられる。
【０００３】
ＭＫの活性を抑えるためには抗ＭＫ抗体が考えられ、実際、抗ＭＫ抗体は培養ウィルムス腫瘍細胞の増殖を部分的に阻害した（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，１５９：３９２−４０２，１９９３）。しかし、抗体が、すべてのＭＫ分子に接触し得るわけではないので、効率的なＭＫ抑制にはＭＫの生合成そのものをおさえる必要がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトＭＫタンパク質の生合成を特異的に強く抑制する物質を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
特定のタンパク質の生合成を阻害するためには、そのタンパク質の合成を指令するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とすることが考えられる。すなわち、標的遺伝子のｍＲＮＡの働きを抑制し、かつそのｍＲＮＡ自体を分解に導く戦略、つまりＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅを基本原理とする遺伝子発現制御システムを選択した。ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの現象は、１９９８年、Ｆｉｒｅらによって報告された、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに２本鎖ＲＮＡを導入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定遺伝子のノックダウンに成功したという発表（Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ：３９１，８０６−８１１，１９９８．）により広く知られるようになった。使用された２本鎖ＲＮＡのターゲット遺伝子に対する特異性は、非常に高くターゲット配列に相補しない２本鎖ＲＮＡでは一切の発現制御効果を示さなかった。次いで、この実験系を哺乳動物に応用する試みがなされたが、２本鎖ＲＮＡの導入に伴う、インターフェロン作用が働くため、哺乳動物細胞の遺伝子をターゲットとした２本鎖ＲＮＡは使用できない事が大きな問題となった。その後、Ｔｕｓｃｈｌの研究グループがもっとも効率よく遺伝子をノックダウンする２本鎖ＲＮＡの研究をすすめ、３’末端に２塩基のオーバーハングを持った２１−ｍｅｒという短い２本鎖を用いると、哺乳類細胞で問題となっていたインターフェロン作用を引き起こさずにＲＮＡｉを機能させることができると報告した。このような短い２本鎖ＲＮＡをｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ぶ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８，２００１，Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９，２００１）。申請者らは、ヒトＭＫ  ｍＲＮＡに作用し、ＭＫタンパク質の発現を阻害可能なｓｉＲＮＡの塩基配列を見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、（１）ヒトＭＫの生合成を強く抑制するｓｉＲＮＡ配列の決定からなる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下添付の図面に従ってこの発明を詳細に説明する。図１は検討した４種のＭＫ  ｓｉＲＮＡと陰性コントロールとして使用した２種のｓｉＲＮＡの構造を示す。図２は４種のＭＫ  ｓｉＲＮＡをヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）に投与し、回収した上清中のＭＫ発現の抑制を調べるウエスタンブロットとバンドの濃さを定量化したデンシトメーター解析のグラフ、図３は、ＭＫ合成阻害に最も有効であることが判明したＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃４とそのスクランブル配列ＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃４−ＳＣＲ等をＰＣ−３とヒト腎癌細胞（ＡＣＨＮ）に投与し、回収した上清中のＭＫ発現の抑制を図２と同様に検討した結果を示す。
【０００８】
１．ｓｉＲＮＡの分子設計について説明する。ヒトＭＫのｍＲＮＡ（Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７６：７９２−７９７，１９９１）は既に報告されている。その翻訳領域の中で工夫をこらして選択を行った。まず、ＡＡ、ＣＡおよびＧＡから始まるターゲット配列よりＧＣ含有量が４５〜５５％の２１塩基の候補配列１５種を選択し、「ＧＣの偏り」が比較的少ない配列７種に候補を絞った。続いて、この７種について、ＢＬＡＳＴサーチによる類似配列の検索を行い、類似配列の少ないターゲットを選択し、かつその近傍二次構造解析結果を参考に、比較的立体障害の影響の少ないと想定できる４種を最終的に選択した。なお、この配列から出発して、ターゲット配列との相補性に影響の少ない置換、付加を行った配列は請求に含まれる。
【０００９】
２．ｓｉＲＮＡによるＭＫの合成抑制の効果判定について説明する。ｓｉＲＮＡをＭＫを合成分泌している細胞に投与し、培養液中に分泌されるＭＫを免疫生化学的に定量する。すなわち、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のウェスタンブロッティング（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１５９；３９２−４０２，１９９３）、そしてデンシトメーターによる定量が考えられる。
【００１０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１１】
（実施例１）ｓｉＲＮＡの作成を行った。ヒトＭＫのｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ３４３２７：Ｔｏｍｏｍｕｒａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０７６５−１０７７０，１９９０）の翻訳領域内から前述の配列選定法に基づいて設計したｓｉＲＮＡ４種をＤｈａｒｍａｃｏｎ社に依託し合成した。合成したｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘは図１に示す如くであり、各ｓｉＲＮＡのｍＲＮＡの標的部位は下記の如くである。
ＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃１（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列２３１番目から２４９番目；ＧＡＡＧＧＡＧＵＵＵＧＧＡＧＣＣＧＡＣ；ＧＣ含有量５２％）、
ＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃２（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列３２４番目から３４２番目；ＧＡＡＧＧＣＧＣＧＣＵＡＣＡＡＵＧＣＵ；ＧＣ含有量５２％）、
ＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃３（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列３９４番目から５１２番目；ＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡ；ＧＣ含有量４７％）、
ＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃４（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列２３７番目から２５５番目；ＧＵＵＵＧＧＡＧＣＣＧＡＣＵＧＣＡＡＧ；ＧＣ含有量５２％）
【００１２】
配列番号１  ５’−（ＡＡ）ＧＡＡＧＧＡＧＵＵＵＧＧＡＧＣＣＧＡＣ−３’
配列番号２  ５’−（ＡＡ）ＧＡＡＧＧＣＧＣＧＣＵＡＣＡＡＵＧＣＵ−３’
配列番号３  ５’−（ＡＡ）ＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡ−３’
配列番号４  ５’−（ＧＡ）ＧＵＵＵＧＧＡＧＣＣＧＡＣＵＧＣＡＡＧ−３’
【００１３】
（実施例２）ｓｉＲＮＡによるＭＫ産生の抑制を行った。ＭＫを分泌しているヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１４３５）を３５ｍｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，３００１）に２×１０５個／ディッシュ［ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％／Ｆ１２Ｋ培地（Ｆ１２Ｋ）］の細胞密度で正確にまき、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で１晩前培養した。あらかじめ、２０μＭに濃度調整したＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃１，＃２，＃３，＃４の各々をそれぞれ５μｌとり、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  １０５μｌと混合し、プラス試薬（インビトロジェン社）１０μｌを加え、よく混合し、室温で１５分反応させた。さらに、リポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社）４μｌを加え、室温で１５分反応させ、ｓｉＲＮＡ・リポソーム処理液の調製を完了した。なお、上記調製量は３５ｍｍディッシュで１枚に投与可能な量である。続いてＰＣ−３細胞に新鮮なＦ１２Ｋ０．８ｍｌを満たし、前述のｓｉＲＮＡ・リポソーム処理液を０．２ｍｌを加えた後、３７℃、４時間トランスフェクションを行った。このとき、ｓｉＲＮＡの投与濃度は１００ｎＭとなる。１０％ＦＢＳ／Ｆ１２Ｋ  １ｍｌを加え、６時間培養した。細胞をＦ１２Ｋで洗浄し、２０μｇ／ｍｌのヘパリンを含むＦ１２Ｋ  １ｍｌを加え、さらに１６時間培養を続け、上清を回収した。回収した培養上清についてＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１５％ゲル）の後、抗ＭＫ抗体を用いたウエスタンブロットを村松らの方法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）によって行った。その結果を図２Ａに示す。
レーン１、２、３および４に示す如く、ＭＫｓｉＲＮＡを投与することにより、ＭＫに特異的なバンドの減弱を認めた。リポソームのみの投与群（ｍｏｃｋ，レーン５）では、バンドの減弱をほとんど認めなかった。各バンドの濃度をデンシトメータで測定したところ、無処理細胞のバンドを１００％とすると、ＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃１とＭＫｓｉＲＮＡ  ＃２では８％、ＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃３では３２％、ＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃４では１％以下のバンドの濃さであることが明らかとなった（図２Ｂ）。
【００１４】
（実施例３）ＭＫ  ｓｉＲＮＡによるＭＫ産生の抑制の特異性を検討した。すなわち、実施例２において、ＭＫ産生抑制が最も強かったＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃４のアンチセンス鎖をスクランブルにし、それに相補的な２本鎖ＲＮＡ（ＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃４−ＳＣＲ）を新たに合成し、陰性コントロールとして用いた。また、葉緑体ゲノム配列から選択したｓｉＲＮＡも新たに合成し、哺乳類細胞に対する陰性コントロールとして用いた。
ＭＫを分泌しているヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）およびヒト腎癌細胞（ＡＣＨＮ，ＡＴＣＣ  ＮｕｍｂｅｒＣＲＬ−１６１１）を実施例２で示した如く、３５ｍｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，３００１）にまき、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１晩前培養した。あらかじめ、２０μＭに濃度調整したＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃４等をそれぞれ５μｌとり、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  １０５μｌと混合し、プラス試薬（インビトロジェン社）１０μｌを加え、よく混合し、室温で１５分反応させた。さらに、リポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社）４μｌを加え、室温で１５分反応させ、ｓｉＲＮＡ・リポソーム処理液の調製を完了した。なお、上記調製量は３５ｍｍディッシュで１枚に投与可能な量である。続いてＰＣ−３細胞に新鮮なＦ１２Ｋ  ０．８ｍｌを満たし、前述のｓｉＲＮＡ・リポソーム処理液を０．２ｍｌを加えた後、３７℃、４時間トランスフェクションを行った。このとき、ｓｉＲＮＡの投与濃度は１００ｎＭとなる。１０％ＦＢＳ／Ｆ１２Ｋ  １ｍｌを加え、６時間培養した。細胞をＦ１２Ｋで洗浄し、２０μｇ／ｍｌのヘパリンを含むＦ１２Ｋ  １ｍｌを加え、さらに１６時間培養を続け、上清を回収した。回収した培養上清についてＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１５％ゲル）の後、抗ＭＫ抗体を用いたウエスタンブロットを村松らの方法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）によって行った。その結果を図３に示す。
図３Ａは、ＰＣ−３細胞における結果である。レーン１のＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃４においてのみ、ＭＫの特異バンドが減弱した。レーン２のＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃４−ＳＣＲやレーン３の葉緑体ゲノムに対するｓｉＲＮＡを投与しても、ＭＫの発現は抑制されなかった。図３Ｂは、ＡＣＨＮ細胞における結果である。レーン１のＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ＃４においてのみ、ＭＫの特異バンドの減弱を認めた。
【００１５】
【発明の効果】
以上図示し説明したように本発明のｓｉＲＮＡによってヒトＭＫの発現を強く抑制することが出来る。
【００１６】
【配列表】
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【００１７】
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【００１８】
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【００１９】
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【００２０】
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【００２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明における、４種のＭＫ  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘと２種のコントロールｓｉＲＮＡｄｕｐｌｅｘの構造である。
【図２】この発明の一実施例に関わる、ｓｉＲＮＡなどを投与したＰＣ−３細胞のヒトＭＫ産生抑制を示し、Ａはウエスタンブロットの図であり、ＢはＡで検出したＭＫに特異的なバンドの濃さをデンシトメータ解析によって数値化したグラフである。
【図３】この発明の一実施例に関わるｓｉＲＮＡなどを投与した癌細胞のヒトＭＫ産生を抑制を示し、ＡはＰＣ−３細胞の上清のウエスタンブロットの図であり、ＢはＡＣＨＮ細胞の上清のウエスタンブロットの図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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