(57)【要約】【課題】  生体細胞等の成長過程において、長期に亘り生体細胞等に電気刺激を与えても、培養溶液の液性変化や細胞の定着度が低下することのない磁場刺激装置、該磁場刺激装置を用いた生体細胞等の成長を促進又は抑制方法、及び生体細胞等の変性疾患モデルの作成方法の提供。【解決手段】  パルス電流を発生させ、かつパルス電流の電流特性を調整するためのパルス電流供給手段と、前記パルス電流供給手段より供給されたパルス電流からパルス磁場を発生させ、該パルス磁場を培養容器の外部から前記培養容器内の生体細胞又は生体組織に供給するためのパルス磁場供給手段とを有する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルス電流を発生させ、かつパルス電流の電流特性を調整するためのパルス電流供給手段と、前記パルス電流供給手段より供給されたパルス電流からパルス磁場を発生させ、該パルス磁場を培養容器の外部から前記培養容器内の生体細胞又は生体組織に供給するためのパルス磁場供給手段とを有することを特徴とする磁場刺激装置。
【請求項２】
前記パルス電流供給手段が、少なくとも電源、スイッチ及びロジックＩＣを含む電気回路である請求項１に記載の磁場刺激装置。
【請求項３】
前記パルス磁場供給手段が、前記パルス磁場を発生させ、該パルス磁場を生体細胞又は生体組織に供給するための磁場刺激プローブと、前記培養容器を収納するための磁場刺激ステージとを有する請求項１又は２に記載の磁場刺激装置。
【請求項４】
前記磁場刺激プローブが単一又は複数の磁場刺激コイルである請求項３に記載の磁場刺激装置。
【請求項５】
前記培養容器が、前記パルス磁場供給手段内に嵌着可能な請求項１〜４のいずれか一項に記載の磁場刺激装置。
【請求項６】
生体細胞若しくは生体組織の成長を促進又は抑制するために用いられる請求項１〜５のいずれか一項に記載の磁場刺激装置。
【請求項７】
前記磁場刺激プローブが、パルス磁場を生体細胞又は生体組織の所定の細胞群若しくは所定の部位に選択的に供給して、生体細胞又は生体組織の成長を促進させ又は抑制させるためのものである請求項６に記載の磁場刺激装置。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の磁場刺激装置を用いた生体細胞若しくは生体組織の成長促進又は抑制方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の磁場刺激装置を用いて正常な生体細胞又は生体組織を変性させて生体細胞又は生体組織変性疾患モデルを作成することを特徴とする生体細胞又は生体組織の変性疾患モデルの作成方法。
【請求項１０】
前記生体細胞又は生体組織が神経細胞又は神経組織である請求項９に記載の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体細胞、組織等に電気刺激を与えるための磁場刺激装置、生体細胞、組織等の成長促進又は抑制方法、及び生体細胞、組織等の変性疾患モデルの作成方法に関する。より詳しくは、本発明は、研究所等において実験で用いられる生体細胞、組織等に磁場を介して特定の電気刺激を与えることにより生体細胞、組織等の成長を促進又は抑制させることのできる磁場刺激装置、及びその磁場刺激装置を用いた生体細胞、組織等の成長促進又は抑制方法、並びに前記磁場刺激装置を用いた生体細胞、組織等の変性疾患モデルの作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体細胞、組織等の成育における興奮現象の重要性、あるいは異常興奮によるてんかん性痴呆や低酸素脳症のような変性疾患の病態発現のメカニズム解析と治療法開発において、生体の培養細胞、培養組織等に長期間、電気刺激を導入するシステムの研究は、効果的なin vitro病態モデルとして重要である。
【０００３】
従来より、生体の培養細胞、組織等に長期間に亘り電気刺激を与える試みが行われているが（例えば、非特許文献１参照）、培養細胞、組織等に電極を直接接触させた場合、培養溶液の液性変化、さらには電極材料の影響が現われるという問題があった。この問題は、特に長期間電気刺激を与えた場合に顕著であり、長期間の電気刺激試験では電極と培養溶液とを非接触状態で行うことが必要である。
【０００４】
一方、マイクロチップによる電極列底面を有する培養容器は、所定の培養条件下で長期に亘り培養試験を行うために開発されたものであるが、細胞の種類によってはその培養容器内における定着性が必ずしも良好とはいえなかった。特に神経細胞を培養する場合、その定着性の悪さは問題とされていた。
【０００５】
このような培養細胞、組織等に対して、培養溶液の液性変化や細胞の定着度の悪さの欠点を克服した電気刺激装置の開発は、生理学、薬理学、生化学のみならず、再生医学やゲノム科学を遂行している研究施設から極めて大きなニーズがある。
【非特許文献１】Wang Q, et al. “Osteogenesis of electrically stimulated bone cell mediated in part by calcium ions”Clin. Orthop. 1998 March;(348) p259-268
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、本発明の目的は、生体細胞又は生体組織（以下、「生体細胞等」ともいう。）の成長過程において、長期に亘り生体細胞等に電気刺激を与えても、培養溶液の液性変化や細胞の定着度が低下することのない磁場刺激装置を提供することにある。また、本発明のもう一つの目的は、前記磁場刺激装置を用いて生体細胞等の成長を促進又は抑制する方法を提供することにある。さらに本発明のもう一つの目的は、前記磁場刺激装置を用いた生体細胞等の変性疾患モデルの作成方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、長期間電気刺激を与えた場合における生体細胞等の成長又は抑制、変性病態誘導、特に興奮受容の重要性について鋭意検討し、生体細胞等と非接触の状態で電気刺激を与えることのできる装置及び方法を開発し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の目的は、以下の磁場刺激装置により達成される。
（１）パルス電流を発生させ、かつパルス電流の強度等を調整するためのパルス電流供給手段と、前記パルス電流供給手段より供給されたパルス電流からパルス磁場を発生させ、該パルス磁場を培養容器の外部から前記培養容器内の生体細胞又は生体組織に供給するためのパルス磁場供給手段を有することを特徴とする磁場刺激装置。
（２）前記パルス電流供給手段が、所定の関数波形の電流と電圧とを発生し得る電気信号発生装置である（１）に記載の磁場刺激装置。
（３）前記パルス電流供給手段が、少なくとも電源、スイッチ及びロジックＩＣを含む電気回路である（１）又は（２）に記載の磁場刺激装置。
（４）前記パルス磁場供給手段が、前記パルス磁場を発生させ、該パルス磁場を生体細胞又は生体組織に供給するための磁場刺激プローブと、前記培養容器を収納するための磁場刺激ステージとを有する（１）〜（３）のいずれかに記載の磁場刺激装置。
（５）前記磁場刺激プローブが、単一又は複数の磁場刺激コイルである（４）に記載の磁場刺激装置。
（６）前記磁場刺激プローブが、マルチウェルプレートのウェル配列に対応可能な形状を有する（４）又は（５）に記載の磁場刺激装置。
（７）前記磁場刺激プローブが、通電されたパルス電流を磁束密度を変化させることによりパルス磁場を発生させるものである（４）〜（６）のいずれかに記載の磁場刺激装置。
（８）前記磁場刺激プローブが、発生させたパルス磁場により前記培養容器内で渦電流を発生させ、該渦電流を電気刺激として生体細胞又は生体組織に供給するものである（４）〜（７）のいずれかに記載の磁場刺激装置。
（９）前記培養容器が前記パルス磁場供給手段内に嵌着可能な（１）〜（８）のいずれかに記載の磁場刺激装置。
（１０）前記生体細胞若しくは生体組織の成長を促進又は抑制するために用いられる（１）〜（９）のいずれかに記載の磁場刺激装置。
（１１）前記磁場刺激プローブが、パルス磁場を生体細胞又は生体組織の所定の細胞群若しくは所定の部位に選択的に供給して生体細胞又は生体組織の成長を促進させ又は抑制させるためのものである（１０）に記載の磁場刺激装置。
【０００９】
本発明の磁場刺激装置は、パルス電流供給手段とパルス磁場供給手段とを有する構造である。このため、本発明の磁場刺激装置であれば、構造が簡単で装置の作製も容易である。また、本発明の磁場刺激装置は、生体細胞等を入れた培養容器がパルス磁場供給手段内に嵌着可能であるため、簡単に着脱作業が行え、しかも生体細胞等に直接接触させることなく、培養容器の外部から生体細胞等に所望の強度、波形等を有する渦電流（パルス信号）を供給して、培養過程において生体細胞等の成長や変性を適宜調整できる。さらに、本発明の磁場刺激装置であれば、磁場刺激プローブから所望の強度、波形等を有する渦電流（パルス信号）を生体細胞等の特定の細胞群若しくは特定の部位に選択的に発生させ、生体細胞又は組織細胞の成長を促進させ又は抑制させることができる。
【００１０】
また、本発明のもう一つの目的は、前記磁場刺激装置を用いた生体細胞若しくは生体組織の成長促進又は抑制方法により達成される。本発明の方法によれば、従来の刺激装置のように直接電極を接触させることなく生体細胞等の成長を促進、又は生体細胞等に損傷を与えて生体細胞及び生体組織の成長を抑制することができる。
【００１１】
また、本発明のもう一つの目的は、前記磁場刺激装置を用いて正常な生体細胞又は生体組織、好ましくは神経細胞又は神経組織を変性させて生体細胞又は生体組織変性疾患モデルを作成することを特徴とする生体細胞又は生体組織の変性疾患モデルの作成方法により達成される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の磁場刺激装置は、所望のパルス磁場を培養容器内の生体細胞等に与え、培養容器内で渦電流を発生させることのできる刺激装置としては、構造が簡単で製作も容易かつ安価である。また本発明の磁場刺激装置は、磁場刺激を与えるべき培養容器の着脱が簡単であり、所望の生体細胞等に局所的に磁場刺激を与えることができ、しかも培養容器内の培地と直接接触することのない磁場刺激装置である。したがって、本発明の磁場刺激装置であれば、培養容器内の培地の特性を変化させずに長期間に亘り所望の生体細胞に磁場刺激（電気刺激）を与えることができ、かつ生体細胞等の培地に対する定着性を向上させることができる。
【００１３】
また、本発明の磁場刺激装置を用いれば、パルス磁場を制御することにより生体細胞等に電気刺激を与えて生体細胞等の成長を促進又は抑制する方法を提供することができる。特に、本発明の磁場刺激装置を用いて生体細胞等を成長させると、従来の組織の培養装置では静置か、せいぜい攪拌下で培養できたに過ぎないのに対し、本発明ではパルス信号、好ましくは実験の目的に応じて予め設定された渦電流を原組織等に直接接触させることなく、培養容器の外部から原組織等に与えて、渦電流を介する興奮入力により発生し得る細胞内カルシウムイオン濃度変動を考慮した生体細胞等の成長を促進させ又は抑制させることができる。さらに本発明の磁場刺激装置により正常な生体細胞又は生体組織、好ましくは神経細胞又は神経組織を変性させて生体細胞又は生体組織変性疾患モデルを簡単に作成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明の磁場刺激装置、該磁場刺激装置を用いた生体細胞等の成長促進又は成長抑制方法、及び生体細胞又は生体組織の変性疾患モデルの作成方法につき詳細に説明する。
【００１５】
先ず、本発明の磁場刺激装置の構成について、図面を参酌しながら以下に説明する。
【００１６】
図１は、本発明の磁場刺激装置の好適な一実施例を示した概略図である。図１において、符号１は磁場刺激装置本体、符号２はパルス電流供給手段、符号３はパルス磁場供給手段、符号４は磁場刺激プローブ、符号５は磁場刺激ステージ、符号６は培養容器、符号７は電源、符号８はスイッチ、符号９はロジックＩＣ、符号１０は発光素子、符号１１は電解コンデンサー、符号１２はトランジスタ、符号１３はコイル、符号１４は培地、符号１５は生体細胞又は生体組織、符号１６は電源切替スイッチ、符号１７は磁場刺激切替スイッチをそれぞれ表す。
【００１７】
パルス電流供給手段２は、図１及び図２に示されるように、少なくとも電源７、スイッチ８及びロジックＩＣ９を有し、好ましくは発光素子１０、電解コンデンサー１１及びトランジスタ１２をさらに有する。一方、パルス磁場供給手段３は、磁場刺激プローブ４と磁場刺激ステージ５とを有する。
【００１８】
次に、本発明の磁場刺激装置について具体的に説明する。
本発明の磁場刺激装置は、パルス電流供給手段２とパルス磁場供給手段３とからなる。パルス電流供給手段２は、パルス電流を発生させ、かつパルス電流の強度、頻度等を調整できるものであれば特に制限はない。パルス電流供給手段２は、好ましくは所定の関数波形の電流と電圧とを発生し得る電気信号発生装置であり、図１に示されるように、少なくとも電源７、スイッチ８及びロジックＩＣ９を有する電気回路であり、さらに好ましくは発光素子１０、電解コンデンサー１１及びトランジスタ１２を装備する。
【００１９】
本発明の磁場刺激装置におけるパルス電流供給手段２から供給されるパルス電流の波形、強度、サイクル、通電時間等については、後述する磁場刺激に対応して適宜調整することができる。
【００２０】
パルス電流供給手段２において、電源７は、電気供給装置による電源又は電池類による電源のいずれであってもよい。電池類の場合、乾電池やボタン電池であることが好ましい。ボタン電池は、水銀電池又はリチウムのような使い捨て型の電池はもちろん、ニッケル−カドミニウム電池、電気二重層コンデンサー、リチウム蓄電池等の再充電可能な蓄電池であってもよい。
【００２１】
一方、電源７が電気供給装置である場合、電気供給装置はＡＣアダプター、ＡＣ／ＤＣスイッチング電源、ＡＣ／ＤＣコンバーター、各種電源トランス製品のような直流電源であることが好ましい。
【００２２】
パルス電流供給手段２において、スイッチ８は、通常のスイッチと同様、磁場刺激装置１のパルス電流供給手段２におけるパルス電流をオン／オフ制御する装置である。スイッチ８は、人が操作することにより機械的に切り替わるスイッチであってもよいし、圧力により電流が自動的にオン／オフ制御可能な、例えば圧電素子を用いたスイッチであってもよい。さらに、パルス電流供給手段２は、複数のスイッチを含んでいてもよく、例えば、図１及び図２に示されるように、トグルスイッチ８の他に、電源切り替えスイッチ１６や磁場刺激切替スイッチ１７を有していてもよい。
【００２３】
パルス電流供給手段２において、ロジックＩＣ９は、汎用ＩＣやプログラマブルＩＣのように、一連の作業指示が設定され又はプログラムにより一連の作業指示を与え得る集積回路（ＩＣ）を用いることができる。本発明の磁場刺激装置では、ロジックＩＣ９は、コイルに注入するパルス電流の大きさを時間軸で変化させる役割を有する。
【００２４】
高出力磁場を発生させる目的で、コイルに大きな電流パルスを注入したい場合、その大電流パルス注入用の電源をパルス電流供給手段２とは別に設け、電流供給手段２より得られたパルス電流で駆動するリレー回路をもって該別電源からコイルへの電流供給経路を開閉する様式であってもよい。リレー回路の例としては、PhotoMOSリレー AQV−１０２（最大60V(600mA））を挙げることができ、このリレー回路は複数個を並列して使用することもできる。
【００２５】
ロジックＩＣ９としては、例えば、汎用ロジックＩＣ、ＰＬＤ（プログラマブル  ロジック  ディバイス）、ＣＰＬＤ（コンプレックス  プログラマブル  ロジック  ディバイス）、ＦＰＧＡ（フィールド  プログラマブル  ゲート  アレイ）、カスタムＩＣ等の公知のものを挙げることができる。汎用ロジックＩＣにはＣＭＯＳ系のものとバイポーラ系のものとがあるが、ＣＭＯＳ系のものであることが好ましい。ロジックＩＣ９は市場で容易に入手できる。ロジックＩＣ５は、さらにコンデンサー等の周辺素子を有していてもよい。
【００２６】
本発明の磁場刺激装置は、ロジックＩＣ９により調整されたパルス電流をパルス磁場供給手段３に流すように設定されている。このパルス電流は、ロジックＩＣ９により実験の目的に応じて、電圧（強度）、発生の頻度（サイクル）、発生パターン（波形）等を一連のプロトコールとして変更可能であることが好ましい。このような変更可能な刺激のプロトコールを実現する方法としては、ロジックＩＣ９へのプロトコールの書き込みと消去がある。
【００２７】
パルス電流供給手段２の形成方法は特に限定されないが、例えば、プリント基板上に導電性塗料を塗布してプリント基板上にプリント印刷する方法、あるいは細い導線等を溶接する方法などを挙げることができる。中でも基板上にプリント印刷する方法が回路をコンパクトにできる観点から好ましい。
【００２８】
本発明の磁場刺激装置を構成するパルス磁場供給手段３は、パルス電流供給手段２より供給されたパルス電流からパルス磁場を発生させ、該パルス磁場を培養容器の外部から該培養容器内の生体細胞又は生体組織に供給することができる。
なお、本明細書において「パルス磁場」とは、パルス電流供給手段２より供給されたパルス電流を、例えばコイル内で磁束密度を変化させた場合に発生するパルス状の磁場をいう。
【００２９】
本発明の磁場刺激装置では、パルス磁場供給手段３により培養容器の外部、すなわち培養容器内の培地に電極等を直接接触させることなく、培養容器の外側、好ましくは培養容器の底部から培養容器内の生体細胞等にパルス磁場を供給し、培養容器内で渦電流を発生させて、該渦電流をパルス信号として生体細胞等に供給することができる。このため、本発明の磁場刺激装置であれば、従来の刺激装置と比較して長期間の電気刺激を与えても培養容器内の培地の液性は変化することなく、かつ培地に対する電極材料の影響が全くなく、しかも良好な生体細胞等の定着性が得られるというメリットがある。
【００３０】
パルス磁場供給手段３から供給されるパルス磁場は、パルス電流供給手段２より供給されたパルス電流の波形、強度、サイクル、持続時間等に対応して適宜決定することができる。例えば、パルス磁場の波形については、パルス電流の波形に対応して、三角形、矩形、その他の各種関数波形（例えば、サイン波形、指数関数波形など）などを選択でき、矩形であることが好ましい。
【００３１】
また、パルス磁場の強度は、生体細胞等の成長促進と成長抑制（損傷）の二つの培養目的に応じて適宜決定することができる。例えば、生体細胞等の成長促進を目的として培養する場合、パルス磁場の強度は０．０１〜１ｍＴであり、０．０３〜０．３ｍＴであることが好ましく、０．０５〜０．１５ｍＴであることがさらに好ましい。一方、生体細胞等の成長抑制（損傷）を目的として培養する場合、パルス磁場の強度は０．０５〜５００ｍＴであり、１〜１００ｍＴであることが好ましく、３〜３０ｍＴであることがさらに好ましい。
【００３２】
また、パルス磁場のサイクルについては、例えば、０．００１〜１０００Ｈｚであり、０．００５〜１００Ｈｚであることが好ましく、０．０１〜１０Ｈｚであることがさらに好ましい。また、パルス磁場の持続時間は、例えば、１μ秒〜１０秒であり、５μ秒〜１秒であることが好ましく、１０μ秒〜０．１秒であることがさらに好ましい。
【００３３】
パルス磁場供給手段３から供給されたパルス磁場により培養容器６内では渦電流を発生させることができる。渦電流とは、培養容器内の培地にパルス磁場を供給した場合に、そのパルス磁場による磁束密度の変化を打ち消す方向に電磁誘導により発生する渦状の電流のことである。渦電流は、培養容器６内においてパルス電流供給手段２より供給されるパルス電流のパルスに対応して発生させることができる。渦電流の強度は、パルス磁場供給手段３より供給されるパルス磁場の強度と培養容器内の抵抗とに対応して適宜決定することができる。渦電流の強度は、例えば、図７に示されるような導電性部材７１と測定用リード線７２とかなる各種の渦電流検出プローブを用いて測定することができる。
【００３４】
パルス磁場供給手段３は、好ましくは、図１に示されるように磁場刺激プローブ４と磁場刺激ステージ５とからなる。磁場刺激プローブ４は、生体細胞等にパルス磁場を供給し、培養容器内で渦電流を発生できるものであれば特に制限はない。磁場刺激プローブ４は、好ましくは図２に示されるような単一又は複数の磁場刺激コイル１３の構造を有する場合である。特に磁場刺激プローブ４がダブルコイル構造を有する場合、２つの磁場刺激コイル１３，１３’は、Ｎ極とＳ極とを培養容器６の底部に接触させることができるような構造を有することがさらに好ましい。磁場刺激コイル１３に必要な性能としては、１Ｈ以下、好ましくは１μＨ〜５００ｍＨ程度のインダクタンスを有していることが好ましい。
【００３５】
磁場刺激コイル１３の材料としては、例えばフェライト、磁性粒子などを挙げることができ、好ましくはコアをフェライト系、アモルフォス系、金属圧粉、パーマロイ等の磁性体で被覆した磁場刺激コイルである。
【００３６】
磁場刺激プローブ４の大きさ、形状、本数などは、使用される培養容器６の大きさ、形状等に応じて適宜決定することができる。磁場刺激プローブ４は、好ましくはマルチウェルプレートのウェル配列に対応可能な形状を有する。
さらに磁場刺激プローブ４は、例えば、図４（Ａ）に示されるように、微小のダブルコイルを用いて局所刺激用の磁場刺激プローブ４１や径の大きなコイルを用いた広範囲な磁場刺激を可能とするシングル磁場刺激用プローブ４２を形成することができる。例えば、図４（Ｂ）の磁場検出素材（マグナビュワー）から分かるように、局所刺激用微小ダブルコイル型磁場刺激プローブ４１では、局所的に磁場を供給することができ、またシングルコイル型の磁場刺激プローブ４２では広範囲に亘りパルス磁場を供給することができる。本発明の磁場刺激装置では、磁場刺激プローブ４によりパルス磁場を所定の細胞群又は所定の組織部位に選択的に供給することができ、これにより局所的（例えば、１×１０2〜９×１０6μｍ2の範囲、好ましくは９×１０2〜２．５×１０5μｍ2の範囲）に生体細胞等の成長を促進させ又は抑制させることができる。
【００３７】
磁場刺激ステージ５は、その大きさ、形状、厚さ等には特に制限はないが、単一又は複数の培養容器６を収納、好ましくは載置できる大きさ、形状等を有することが好ましい。磁場刺激ステージ５の材質については、特に制限はないが、加工の容易さと材料の費用の観点からアクリル樹脂であることが好ましい。
【００３８】
培養容器６は、磁場刺激ステージ５の大きさ及び形状に合わせて、その大きさ及び形状を自由に選択できる。例えば、培養容器６は、市販の３５ｍｍ、６０ｍｍ、９０ｍｍ、１５０ｍｍのペトリデイッシュ、６穴〜３８４穴マルチウェルプレート、及び直径１０〜３０ｍｍの組織培養チューブ、各種スクエアデイッシュを用いることができる。好ましくは、マルチウェルプレートである。本発明の磁場刺激装置では、培養容器６はパルス磁場供給手段３内に、好ましくは磁場刺激ステージ４内に嵌着可能であり、さらに上記の種々のペトリデイッシュ、マルチウェルプレートのウェルに対して独立して磁場刺激（電気刺激）を供給できることが好ましい。
【００３９】
培養容器６の材質は、ガラス、プラスチック等、種々の材料が使用可能である。培養容器は、培養した生体細胞等を観察しやすいよう透明性に優れ、かつ取り扱い時に破損しにくいプラスチック製が好ましく、特に高透明で剛性に優れたアクリル樹脂製が好ましい。
【００４０】
培養容器６は、その中に培地１４を充填できる。培地１４は、通常は、Ｎａ、Ｍｇ、Ｃａ等の金属イオンを含んだ生理食塩水に各種アミノ酸、例えばＬ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｈｉｓ及び各種ビタミン、例えば、葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド、ピリドキサール、リボフラビン等を含んだ培地等をそのまま液体培地として、あるいはコラーゲン等を添加したゲル状培地として用いることができる。
【００４１】
培地１４には従来から組織の培養において提案されている各種サイトカイン類や増殖因子類、例えばインターロイキン類、ニューロトロピン類、血小板由来成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子を０．０１ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲の量で配合することが好ましい。また培地１４は、固体培地及び液体培地のいずれであってもよい。
【００４２】
本発明の磁場刺激装置を用いて生体細胞等の成長を促進又は抑制するように培養する場合、図２に示されるように、培地１４には、生体細胞又は生体組織１５（以下「原組織等」という。）を培地表面又は培地中に装入する。この原組織等としては、公知の細胞又は組織として用いられている各種の原組織等を使用することが可能である。例えば、原組織等を構成する細胞（群）及びその幹細胞（群）、原組織等を培養すべき組織の一部、培養すべき組織に類似した組織、胚細胞、ＥＳ細胞等であってもよい。
【００４３】
本発明の磁場刺激装置により電気刺激（渦電流）が与えられる生体細胞等の「生体」とは、人間をはじめ、犬、ねこ、馬、豚、羊、マウス、ラット等の哺乳動物のほか、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、細菌、ウイルス等の微生物、植物をも包含する概念である。
【００４４】
また、本発明の磁場刺激装置により刺激を与える「組織」には、生体のあらゆる組織、臓器、それらの一部が包含される。例えば、中枢神経、末梢神経、骨、軟骨、関節、リンパ管、血管、心臓（心筋、弁）、肺、肝臓、脾臓、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、腎臓、膀胱、子宮、卵巣、精巣、横隔膜、筋肉、腱、皮膚、眼、鼻、気管、舌、唇、爪、毛髪等それらの１部をいう。本発明の磁場刺激装置で用いられる組織は、これらの臓器、組織の中でも生体内で興奮性の電気刺激が常在する組織、例えば心臓、骨格筋、平滑筋、末梢神経、脳等の中枢神経等の組織を主な対象とすることができる。
【００４５】
本発明の磁場刺激装置では、パルス電流供給手段２が培養容器６の直下の磁場刺激コイル１３へ供給されるパルス電流の供給状況を監視するためのモニタリング装置をさらに有することができる。モニタリング装置として、例えば本発明の好適な実施例で示されるように発光素子（ＬＥＤ）１０などが設けられていることが好ましい。
本発明の磁場刺激装置において好ましく用いられる発光素子１０は、パルス電流がパルス電流供給手段２内に流れると、このパルス電流を光に変換可能とする素子であり、流れるパルス電流の強弱が光の強弱として表すことができる。このため、発光素子１０は、培養容器６内の培地へ供給されるパルス磁場の供給状況を目で認識できる役割を果たす。このような発光素子１０として、例えば、発光ダイオード等が用いられることが好ましい。
【００４６】
本発明の磁場刺激装置におけるパルス電流供給手段２のロジックＩＣ９、電源７、スイッチ８、モニタリング装置（発光素子１０）及びコイル１３の回路配置は特に限定されるものではなく、磁場刺激ステージ５の形状、大きさ等に応じて適宜決定することができる。例えば、本発明の磁場刺激装置１は、図３（Ａ）〜（Ｃ）に示されるような回路配置をとることが可能である。
【００４７】
図３（Ａ）は、ロジックＩＣ９がＣＭＯＳ系ＩＣ（７４ＨＣ）である場合の回路配置を示す。電源７から発生した電流はＣＭＯＳ系ＩＣにおいて、所望の波形のパルス電流に変換され、さらに周辺素子である電解コンデンサーや抵抗により所望の電流強度、サイクル、通電時間に調整される。調整されたパルス電流は、発光素子（ＬＥＤ）１０でモニタリングされながらコイルへ供給される。
図３（Ｂ）は、周辺素子がすべてロジックＩＣ９の中に盛り込まれている場合の回路配置を示す。図３（Ｂ）で示される回路配置では、周辺素子の占有スペースが省けるため、装置の小型化に寄与できるというメリットがある。
図３（Ｃ）は、周辺素子をすべてロジックＩＣ９の中に盛り込み、さらにスイッチ８がロジックスイッチとなっている場合の回路配置を示す。図３（Ｃ）で示されるロジックスイッチを使用すると、フェザータッチのスイッチとなるため、軽いタッチとなり、特に好ましい。
【００４８】
本発明の磁場刺激装置の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、通常の単一容器適用のコイルと、刺激回路及びマルチウェルプレート適用のコイル配列と、刺激回路とを可能な限り半導体技術により一つのマイクロチップとして一体形成し、コイルを追加して構築することができる。
【００４９】
本発明の磁場刺激装置は、好ましくは生体細胞等の成長を促進又は抑制するために用いられる。さらに好ましくは、本発明の磁場刺激装置における磁場刺激プローブは、所定の強度のパルス磁場を生体細胞等のうち所定の細胞群若しくは所定の部位に選択的に供給することにより、生体細胞等の成長を促進させ又は抑制させるために用いられる。本発明の磁場刺激装置を生体細胞等の成長促進又は抑制方法に用いると、実験の目的に応じて予め設定されたパルス磁場を渦電流（パルス信号）として原組織に与えることができ、興奮入力により発生し得る細胞内カルシウムイオン濃度変動を考慮した生体細胞等の成長を促進又は抑制することができる。
【００５０】
さらに本発明の磁場刺激装置は、正常な生体細胞又は生体組織を変性させて生体細胞等の変性疾患モデルを作成する方法で用いることができる。このような方法で得られた生体変性疾患モデルは、種々の疾患モデルの研究に活用できるため、今後の病態誘導の研究において有用である。
【実施例】
【００５１】
以下に、本発明の好適な実施例を示す。なお、下の実施例に示される材料、使用量、割合、手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
【００５２】
（実施例１）
温度３７℃、湿度９９％、ＣＯ2濃度５％の条件下で、本発明の磁場刺激装置を用いて知覚神経細胞とシュワン細胞の混合標本に成長促進を目的とした条件の磁場刺激（０．０３ｍＴ、持続時間１ｍｓｅｃ、０．６Ｈｚ）を１０日間与えながら培養した。結果を図５（Ａ）に示す。
【００５３】
（比較例１）
磁場刺激を与えなかったことを除き、実施例１と同様の方法で知覚神経細胞とシュワン細胞の混合標本を培養した。結果を図５（Ｂ）に示す。
【００５４】
図５（Ａ）（Ｂ）に示されるように、磁場刺激を与えて培養した標本（図５（Ａ））では、磁場刺激を与えないで培養した標本（図５（Ｂ））と比べると、顕著な神経突起の伸張及び分枝とシュワン細胞の増殖が見られた。このことから、本発明の磁場刺激装置であれば、シュワン細胞と神経細胞の培地での定着性がよく、シュワン細胞及び神経細胞の成長を大幅に促進し、かつそれにより神経突起の伸張と分岐とを促進できることが分かる。
【００５５】
（実施例２）
温度３７℃、湿度９９％、ＣＯ2濃度５％の条件下で、本発明の磁場刺激装置を用いて、知覚神経細胞とシュワン細胞の混合標本に成長抑制（細胞障害付与）を目的とした条件の電気刺激（３ｍＴ、持続時間２０μｓｅｃ、５０Ｈｚ）を３日間与えた結果を図６に示す。
【００５６】
図６に示されるように、磁場刺激前の状態（図６（Ａ））と比べて、磁場刺激後には神経突起を中心に遅発性のネクローシス（壊死）が見られた（図６（Ｂ））。また極小コイルと金属遮蔽により、磁場の及ぶ範囲を局所に限定して磁場刺激を行うと、髄鞘を形成していたシュワン細胞にのみ選択的にネクローシス（壊死）を起こさせることが可能で、神経突起を露出した状態すなわち脱髄現象を起こさせることに成功した（図６（Ｃ））。これより、本発明の磁場刺激装置であれば、シュワン細胞に選択的な変性モデルを容易に作製することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の磁場刺激装置は、生体細胞、組織等に特定の電気刺激を与えて生体細胞、組織等の成長を促進又は抑制可能な磁場刺激装置、及びその磁場刺激装置を用いた生体細胞、組織等の成長方法又は抑制方法、並びに前記磁場刺激装置を用いた生体細胞、組織等の変性疾患モデルの作成方法に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の磁場刺激装置の一実施例を示す概要図である。
【図２】本発明の磁場刺激装置における電気回路の回路配置を示す説明図である。
【図３】本発明の磁場刺激装置におけるロジックＩＣを用いた回路配置を示す説明図である。
【図４】本発明における磁場刺激プローブ及び磁場刺激ステージの好適な一実施例を示す説明図である。（Ａ）磁場刺激プローブ及び磁場刺激ステージの異なる態様を示す写真である。（Ｂ）磁場検出素材（マグナビューワ）を用いた磁場の及ぶ領域を示す写真である。
【図５】本発明の磁場刺激装置を用いて神経細胞に磁場刺激を与え、成長を促進した場合の状態を表す写真である。（Ａ）磁場刺激を与えて培養した場合における結果を示す写真である。（Ｂ）磁場刺激を与えないで培養した場合における結果を示す写真である。
【図６】本発明の磁場刺激装置を用いて神経細胞に磁場刺激を与え、成長を抑制した場合の状態を表す写真である。（Ａ）磁場刺激を与える前の神経細胞の状態を示す写真である。（Ｂ）磁場刺激を与えた後の神経細胞の状態を示す写真である。（Ｃ）極小コイルと金属遮蔽により磁場の及ぶ範囲を局所に限定して磁場刺激与えた後の神経細胞の状態を示す写真である。
【図７】本発明の磁場刺激装置を用いて培養容器内に発生する渦電流を測定するための検出プローブの態様を示す説明図である。（Ａ）渦電流測定用プローブの正面図である。（Ｂ）渦電流測定用プローブの概略説明図である。
【符号の説明】
【００５９】
１  磁場刺激装置
２  パルス電流供給手段
３  パルス磁場供給手段
４  磁場刺激プローブ
５  磁場刺激ステージ
６  培養容器
７  電源
８  スイッチ（トルグスイッチ）
９  ロジックＩＣ
１０  発光素子（モニタリング装置）
１１  電解コンデンサー
１２  トランジスタ
１３  磁場刺激コイル
１４  培地
１５  生体細胞又は生体組織
１６  電源切替スイッチ
１７  磁場刺激切替スイッチ
４１  局所刺激用微小ダブルコイル型磁場刺激プローブ
４２  広域刺激用シングルコイル型磁場刺激プローブ
７１  導電性部材
７２  測定用リード線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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