(57)【要約】　　　（修正有）【課題】弱活性又は不活性のアルカリホスファターゼ突然変異体の作製及び酵母におけるその発現方法の提供。【解決手段】酵母細胞において真核生物アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の突然変異体を組換え手法により産生するか又は発現させる方法に関し、該方法においては、部位特異的に導入された突然変異によってＡＰの比活性が１００分の１以下に低減する。また、メタノール資化性酵母株における発現用のベクター中に対応する核酸配列を挿入する方法に関し、また対応するベクター及び宿主菌株にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体であって、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）　野生型と比較して１００分の１以下に低減した活性を有しており、但し該野生型の配列（突然変異が導入される配列）が、配列番号２に対し少なくとも７７％の相同性を有するものであること、及び
（ｉｉ）　以下に示す突然変異（これらの突然変異の位置は配列番号２における位置に対応して定められている）の１つ以上を有すること：
Ａｓｐ４２のＡｓｎ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒへの置換；
Ｓｅｒ９２のＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ又はＬｅｕへの置換；
Ｓｅｒ１５５のＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ又はＬｅｕへの置換；
Ｇｌｕ３１１のＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＭｅｔへの置換；
Ａｓｐ３１６のＡｓｎ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒへの置換；
Ｈｉｓ３２０のＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ又はＴｙｒへの置換；
Ｇｌｙ３２２の、Ａｓｐより大きい任意のアミノ酸への置換；
Ａｓｐ３５７のＡｓｎ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒへの置換；
Ｈｉｓ３５８のＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ又はＴｙｒへの置換；
Ｈｉｓ４３２のＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ又はＴｙｒへの置換、
を特徴とする、上記突然変異体。
【請求項２】
以下に示す突然変異（これらの突然変異の位置は配列番号２における位置に対応して定められている）の１つ以上を有する、請求項１記載の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体：
Ａｓｐ４２のＶａｌ又はＡｓｎへの置換；
Ｓｅｒ９２のＡｌａ又はＧｌｙへの置換；
Ｓｅｒ１５５のＡｌａ又はＧｌｙへの置換；
Ｇｌｕ３１１のＧｌｎ又はＬｅｕへの置換；
Ａｓｐ３１６のＶａｌ又はＡｓｎへの置換；
Ｈｉｓ３２０のＡｓｎ又はＰｈｅへの置換；
Ｇｌｙ３２２のＰｈｅ又はＬｙｓへの置換；
Ａｓｐ３５７のＶａｌ又はＡｓｎへの置換；
Ｈｉｓ３５８のＡｓｎ又はＰｈｅへの置換；
Ｈｉｓ４３２のＡｓｎ又はＰｈｅへの置換。
【請求項３】
上記野生型の配列を有する酵素が７０００Ｕ／ｍｇを超える比活性を有するものである、請求項１又は２記載の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体。
【請求項４】
野生型と比較して１０００分の１以下に低減した活性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体。
【請求項５】
野生型と比較して１００００分の１以下に低減した活性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体。
【請求項６】
配列番号４〜７から選択されるアミノ酸配列を本質的に有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体をコードする組換えＤＮＡ。
【請求項８】
真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体をコードする組換えＤＮＡであって、該突然変異体が配列番号８〜１１から選択される核酸配列を本質的に有するものである、上記組換えＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号８〜１１から選択される核酸配列を含むベクター。
【請求項１０】
次のベクター：ｐＰＩＣＺαＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺ−Ｅ、ｐＰＩＣＺα−Ｅ；ｐＰＩＣ６、ｐＰＩＣ６αＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺαＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＰＩＣ９；ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＭＥＴ、ｐＭＥＴαＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＹＥＳ−Ｄｅｓｔ５２、ｐＹＥＳ２．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ、ｐＹＣ２−Ｅ、ｐＹＥＳ２．１−Ｅ；Ｙｅｓ−ベクター系、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＴＥＦ１／Ｂｓｄ、及びｐＮＭＴ−ＴＯＰＯからなる群より選択されるベクターに本質的に対応する、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載のベクターで形質転換された宿主株。
【請求項１２】
宿主株としてピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）を使用する、請求項１１記載の宿主株。
【請求項１３】
酵母細胞において請求項１〜６のいずれか１項に記載の真核生物アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の突然変異体を作製する方法であって、以下のａ）〜ｄ）のステップ：
ａ）　請求項７又は８記載の遺伝子配列を異なるベクターにクローニングするステップ；
ｂ）　酵母を形質転換するステップ；
ｃ）　ＡＰの突然変異体を発現させるステップ；及び
ｄ）　アルカリホスファターゼを精製するステップ
を含み、
かつ、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）：
（ｉ）第１ベクターが、第１選択マーカーに対する耐性遺伝子を有すること；
（ｉｉ）該耐性遺伝子及び所望の遺伝子配列がゲノム中に組み込まれた形質転換体を、低濃度の第１選択マーカーを含む栄養培地での増殖により選択すること；
（ｉｉｉ）多重形質転換により該遺伝子のコピー数を増大させ、それにより多重形質転換体を、選択圧を強めた栄養培地での増殖により選択すること；
（ｉｖ）第２選択マーカーに対する耐性遺伝子を有する第２ベクターを添加すること；
（ｖ）第２ベクターでの多重形質転換により該遺伝子のコピー数を増大させ、それにより多重形質転換体を、選択圧を強めた栄養培地での増殖により選択すること；及び
（ｖｉ）該遺伝子配列及びそれらの選択マーカー耐性遺伝子についてそれぞれ数個のコピーがゲノム中に安定に組み込まれたクローンを選択すること；
を特徴とする、上記方法。
【請求項１４】
メタノール資化性酵母細胞を使用する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記酵母細胞としてピヒア・パストリスを使用する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
次のベクター：ｐＰＩＣＺαＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺ−Ｅ、ｐＰＩＣＺα−Ｅ；ｐＰＩＣ６、ｐＰＩＣ６αＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺαＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＰＩＣ９；ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、及びｐＡＯ８１５からなる群より選択されるベクターに本質的に対応するベクターを使用する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、弱活性又は不活性の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体を組換え手法により産生及び発現する方法に関する。さらに本発明は、高活性アルカリホスファターゼをコードし、かつ弱活性しか示さないか又は不活性であるアルカリホスファターゼをコードするように部位特異的突然変異誘発により改変された核酸配列に基づいて作製されたコドン最適化ＤＮＡに関する。本発明はまた、酵母細胞における発現のために変異型ＤＮＡをベクターに挿入する方法、及び酵母におけるアルカリホスファターゼ突然変異体の発現方法に関する。
【０００２】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、原核生物（例えば大腸菌など）及び真核生物（例えば哺乳動物など）に存在する、二量体の亜鉛含有非特異的ホスホモノエステラーゼである（ＭｃＣｏｍｂら、１９７９　Ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮｅｗＹｏｒｋ）。種々のアルカリホスファターゼの一次構造を比較することにより、それらの相同性が高いことが示されている（大腸菌ＡＰと哺乳動物ＡＰとの相同性は２５〜３０％である。Ｍｉｌｌａｎ，　１９８８　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　８，　９９５−１００４；Ｈａｒｒｉｓ，　１９８９　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ　１８６，　１３３−１５０）。
【０００３】
ヒト及び高等動物において、ＡＰファミリーは４つのメンバーから構成され、それらは異なる遺伝子座にコードされている（Ｍｉｌｌａｎ，　１９８８　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　８，　９９５−１００４；Ｈａｒｒｉｓ　１９８９　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ　１８６，　１３３−１５０）。アルカリホスファターゼファミリーには、組織特異的ＡＰ（胎盤ＡＰ（ＰＬＡＰ）、生殖細胞ＡＰ（ＧＣＡＰ）及び小腸ＡＰ（ＩＡＰ））と、主に肝臓、腎臓及び骨に存在する非組織特異的ＡＰ（ＴｎＡＰ）がある。
【０００４】
既知のＡＰの重要な特性として、哺乳動物ＡＰはその触媒活性が大きく異なり、大腸菌ＡＰと比較してＫｃａｔ値が１０〜１００倍高いことがある。哺乳動物ＡＰの中でも、ウシ小腸由来のＡＰ（ｂＩＡＰ）は最も高い比活性を示す。ｂＩＡＰは、この特性のため、生化学的用途、例えば対応する酵素複合体の診断用試薬としての用途、又はＤＮＡの脱リン酸化において非常に有用である。ウシ小腸由来のアルカリホスファターゼには異なる比活性レベルを有する種々のものが存在することが記載されている（ＥＰ　０９５５　３６９；及びＭａｎｅｓら（１９９８），　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７３　Ｎｏ．　３６，　２３３５３−２３３６０）。現在までに、種々の真核細胞系、例えばＣＨＯ細胞（ｂＩＡＰ　Ｉ：ＷＯ　９３／１８１３９；Ｗｅｉｓｓｉｇら、１９９３，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　２６０，　５０３−５０８）及びＣＯＳ細胞（ヒト胎盤ＡＰ：Ｂｅｒｇｅｒら、１９８７　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８４，　４８８５−４８８９）、又はバキュロウイルス発現系（ヒト胎盤ＡＰ：Ｄａｖｉｓら、１９９２，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０，　１１４８−１１５０）において、低活性（最大３０００Ｕ／ｍｇ）の真核生物アルカリホスファターゼの組換え発現が記載されている。高活性（比活性＞３０００Ｕ／ｍｇ）を示すウシ小腸由来ＡＰのＣＨＯ細胞における発現もまた記載されている（ｂＩＡＰ　ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ：Ｍａｎｅｓら、１９９８，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７３　Ｎｏ．　３６，　２３３５３−２３３６０）。しかしながら、上記発現系におけるアルカリホスファターゼの発現には、発現率が低いという欠点があり、このため真核生物アルカリホスファターゼの組換え手法による製造は非経済的となっている。
【０００５】
真核生物アルカリホスファターゼを原核生物発現宿主、例えば大腸菌において発現させることは原理的には可能である（ヒト胎盤ＡＰ：Ｂｅｃｋ及びＢｕｒｔｓｃｈｅｒ，　１９９４　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　５，　１９２−１９７）。しかし、原核生物で発現されたアルカリホスファターゼは、複合体化させる方法に応じて異なる酵素複合体の調製に特に必要とされるグリコシル化をうけていない。
【０００６】
アルカリホスファターゼは、抗体との複合体の形態で酵素複合体として使用されることが多い。この場合、アルカリホスファターゼは、特定の抗原に対する抗体と複合体化される。この抗原は、最初に第１反応において容器の壁に固定化された抗体と結合し、該抗体は、標的抗原上の、抗体−ＡＰ複合体が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識する。続いてこの抗体−抗原複合体は、第２反応において抗体−ＡＰ複合体の結合により検出される。このような試験では擬陽性結果が頻繁に生じるが、これは抗体−ＡＰ複合体が容器の壁又は一次抗体に非特異的に結合することにより生じる。このような干渉作用は、干渉作用抑制タンパク質として不活性又は弱活性のＡＰ変異体を含む複合体を過剰に添加することにより防止することができる。しかし、干渉作用抑制タンパク質として特に特異的に作用させるためには、ＡＰ変異体は、低活性又は不活性であると同時に、同じ三次及び四次構造を本質的に有している必要がある。
【０００７】
従って、本発明は、部位特異的突然変異誘発を利用して、干渉作用抑制タンパク質として、非常に弱活性である又は完全に不活性であるが、そのアミノ酸配列はわずかに改変されるのみで三次及び四次構造はできる限り変化しないアルカリホスファターゼの突然変異体を作製することを目的とする。また本発明は、発現率が高いために対応するアルカリホスファターゼ突然変異体を経済的に製造することが可能な、グリコシル化真核生物アルカリホスファターゼ突然変異体を製造するための強力かつ安定な発現方法を開発することをも目的とする。
【０００８】
本発明は、真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体であって、以下の：
・突然変異が導入される配列が配列番号２に対し少なくとも７７％の相同性を有すること、
・該突然変異体が野生型と比較して１００分の１以下に低減した活性を有すること、及び
・該突然変異体が以下に示す突然変異（これらの突然変異の位置は配列番号２における位置に対応して定められている）の１つ以上を有すること：
Ａｓｐ４２のＡｓｎ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒへの置換；
Ｓｅｒ９２のＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ又はＬｅｕへの置換；
Ｓｅｒ１５５のＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ又はＬｅｕへの置換；
Ｇｌｕ３１１のＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＭｅｔへの置換；
Ａｓｐ３１６のＡｓｎ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒへの置換；
Ｈｉｓ３２０のＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ又はＴｙｒへの置換；
Ｇｌｙ３２２の、Ａｓｐより大きい任意のアミノ酸（例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ又はＩｌｅ）への置換；
Ａｓｐ３５７のＡｓｎ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒへの置換；
Ｈｉｓ３５８のＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ又はＴｙｒへの置換；
Ｈｉｓ４３２のＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ又はＴｙｒへの置換、
を特徴とする、前記突然変異体に関する。
【０００９】
アミノ酸配列の突然変異は、所望の位置にある天然アミノ酸が他の任意のアミノ酸に交換されることであって、その交換は正確な三次及び四次構造への折りたたみを妨害しないが機能的ではないものとして理解される。
【００１０】
突然変異が導入される配列（野生型配列）は、例えばヒトの小腸ＡＰ又はヒトの胎盤ＡＰとすることができる。さらに、低活性又は高活性のウシ小腸由来のＡＰもまた本発明における野生型ＡＰとして包含される。これらの酵素は全て配列番号２に対して少なくとも７７％の相同性を有する。相同性は、ソフトウエア「Ｏｐｅｎ　ＶＭＳ　Ｖａｘ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　Ｖ６．２」（著作権　（ｃ）　１９８２−２００１，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｉｎｃ．（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｉｎｃ．の完全子会社）著作権所有、このソフトウエアを利用した研究を公表する場合は次を引用する必要がある：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１０．２，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ　（ＧＣＧ），　Ｍａｄｉｓｏｎ，　Ｗｉｓｃ．）により決定した。
【００１１】
突然変異が導入されるアミノ酸の位置は、配列番号２の天然アルカリホスファターゼのアミノ酸配列（シグナル配列なし）を基準として記載している。しかし、記載するアミノ酸の位置は、他のウシアルカリホスファターゼ又は他の生物由来のアルカリホスファターゼにも置き換え可能である。この変更は、タンパク質内の高度に保存された機能を有するアミノ酸に影響を及ぼし、それゆえそれぞれのアミノ酸配列に従ってその位置を合わせることが必要となる。
【００１２】
ＤＮＡ配列の特異的突然変異誘発とは、ＰＣＲ突然変異誘発法により１つ以上のコドンを変化させることを意味する。この方法においては、配列番号３に示されるコドン最適化遺伝子の塩基トリプレットにおいて必要最小限のコドンのみを変化させ、最も好ましい場合には一塩基のみを変化させる。
【００１３】
請求項１に記載する本発明の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体は、以下に示す突然変異（これらの突然変異の位置は配列番号２における位置に対応して定められている）の１つ以上を有することが好ましい：
Ａｓｐ４２のＶａｌ又はＡｓｎへの置換；
Ｓｅｒ９２のＡｌａ又はＧｌｙへの置換；
Ｓｅｒ１５５のＡｌａ又はＧｌｙへの置換；
Ｇｌｕ３１１のＧｌｎ又はＬｅｕへの置換；
Ａｓｐ３１６のＶａｌ又はＡｓｎへの置換；
Ｈｉｓ３２０のＡｓｎ又はＰｈｅへの置換；
Ｇｌｙ３２２のＰｈｅ又はＬｙｓへの置換；
Ａｓｐ３５７のＶａｌ又はＡｓｎへの置換；
Ｈｉｓ３５８のＡｓｎ又はＰｈｅへの置換；
Ｈｉｓ４３２のＡｓｎ又はＰｈｅへの置換。
【００１４】
上述した本発明の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体に関して、野生型配列を有する酵素は７０００Ｕ／ｍｇを超える比活性を有することが好ましい。さらに、ＤＮＡ配列は、７０００Ｕ／ｍｇを超える比活性を有する真核生物アルカリホスファターゼ突然変異体をコードし、かつ真核生物アルカリホスファターゼ突然変異体のアミノ酸配列のうち１若しくは数個の位置で改変されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が得られるように数個の位置で特異的に突然変異が導入された遺伝子に基づく遺伝子配列であることが好ましい。ここで上記突然変異は比活性の実質的〜完全な低減をもたらすものである。
【００１５】
本発明の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体において、該突然変異体は、野生型酵素と比較して１０００分の１以下に低減されたＡＰ活性を有することが特に好ましい。さらに、本発明の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体において、該突然変異体は対応する野生型酵素と比較して１０００分の１以下に低減された活性を有することが好ましい。本発明の上記突然変異体においては、比活性の低減が検出限界より低いことが特に好ましい（実施例４に記載の活性試験により測定した場合）。
【００１６】
本発明において好適なものとして以下のアミノ酸位置が明らかにされた：Ａｓｐ３１６／Ｈｉｓ３２０／Ｈｉｓ４３２（亜鉛原子１の結合パートナー）、Ａｓｐ４２／Ａｓｐ３５７／Ｈｉｓ３５８（亜鉛原子２の結合パートナー）、Ｓｅｒ１５５／Ｇｌｕ３１１（マグネシウム原子の結合パートナー）、Ｓｅｒ９２（ヒドロキシル基は基質上での求核攻撃のために脱プロトン化される）（Ｍａ及びＫａｎｔｒｏｗｉｔｚ　（１９９４），　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１６　ｐｐ．　３１６１４−３１６１９；Ｍａら（１９９５），　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　４，ｐｐ，　１４９８−１５０６；Ｋｉｍｕｒａ及び　Ｋｉｋｕｔａ　（２０００）　ＪＢＩＣ，５，　ｐｐ．　１３９−１５５；Ｓｔｅｃら（２０００），　ＪＭＢ　２９９　ｐｐ．　１３０３−１３１１）、並びにＧｌｙ３２２（比活性に関して重要である；ＥＰ　０　９５５　３６９）。本発明によると、上記の位置は、単一突然変異として考慮されてもよいし、又は二重、三重又は多重突然変異として上記位置の可能な組合せ全てを考慮してもよい。特に配列番号４〜７に示される変異型アミノ酸配列が好ましく、配列番号４は９２位に単一突然変異（Ｓｅｒ９２Ａｌａ）を有し、配列番号５は３２２位に単一突然変異（Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ）を有し、配列番号６は３２０位及び３２２位に二重突然変異（Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ）を有し、配列番号７は９２位、３２０位及び３２２位に三重突然変異（Ｓｅｒ９２Ａｌａ／Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ）を有する。それぞれのＤＮＡ配列は配列番号８〜１１に示される。
【００１７】
本発明はまた、本発明の上記突然変異体をコードするＤＮＡに関する。更に本発明は、本発明の核酸配列を含むベクターに関する。特には配列番号４〜７より選択される核酸配列を含むベクターである。適当なベクターは当業者に公知であり、例えば、ｐＰＩＣＺαＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺ−Ｅ、ｐＰＩＣＺα−Ｅ；ｐＰＩＣ６、ｐＰＩＣ６αＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺαＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＰＩＣ９；ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＭＥＴ、ｐＭＥＴαＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＹＥＳ−Ｄｅｓｔ５２、ｐＹＥＳ２．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ、ｐＹＣ２−Ｅ、ｐＹＥＳ２．１−Ｅ；Ｙｅｓベクター系、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＴＥＦ１／Ｂｓｄ、ｐＮＭＴ−ＴＯＰＯ（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられる。対応する遺伝子配列は、例えば、市販されており（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にて本発明の配列番号８〜１１に示される遺伝子配列を含むベクターｐＰＩＣＺαＡ又はｐＰＩＣ９Ｋにクローニングされている。本発明に従って調製されるベクターの例を以下に記載する：ベクターｐＮａＡＰ３１−１（図１）及びｐＮａＡＰ３１−２（図２）。上記ベクターは、それぞれｐＰＩＣＺαＡ（ｐＮａＡＰ３１−１）及びｐＰＩＣ９Ｋ（ｐＮａＡＰ３１−２）に配列番号８に示される遺伝子配列がクローニングされたものである。
【００１８】
ベクターｐＮａＡＰ３１−１及びｐＮａＡＰ３１−２は、本発明に従って調製されるベクターとしての関連性は同等である。なぜなら、最終産物となるクローンはこの両方のベクターのコピーを含むことになるためである。
【００１９】
本発明に従って得られる発現ベクターは、酵母の種々の菌株、例えばピヒア・パストリスに形質転換され、そのゲノム中に安定に組み込まれることが好ましい。酵母ゲノムへの安定な組込みは、特に、例えば弱活性又は不活性のアルカリホスファターゼ突然変異体を大容量の発酵槽で製造する場合に選択圧が必要ない点で有利である。ゲノムへの安定な組込みとは、発現ベクターが相同組換えにより例えばピヒア・パストリスのゲノム中に組み込まれ、そのためそれが酵母ゲノムの永続的な構成要素として世代を越えて遺伝することを意味する（Ｃｒｅｇｇ，　Ｊ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　５　（１９８５），　３３７６−３３８５）。
【００２０】
別の本発明の発明主題は、本発明のベクターの１つを用いて形質転換した酵母株である。酵母宿主としては、メタノール資化性酵母、例えば酵母であるピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウヴィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）が特に好適である。宿主菌株としてピヒア・パストリスを使用するすることが特に好ましい。また上記ベクターの１つを用いてピヒア・パストリスＸ−３３株を形質転換することが特に好ましい。
【００２１】
本発明はまた、酵母細胞において本発明の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体を作製する方法に関し、該方法は、以下のステップ：
ａ）　本発明の遺伝子配列を異なるベクターにクローニングするステップ；
ｂ）　酵母を形質転換するステップ；
ｃ）　アルカリホスファターゼを発現させるステップ；及び
ｄ）　アルカリホスファターゼを精製するステップ
を含み、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）：
（ｉ）第１ベクターが、第１選択マーカーに対する耐性遺伝子を有すること；
（ｉｉ）該耐性遺伝子及び所望の遺伝子配列がゲノム中に組み込まれた形質転換体を、低濃度の第１選択マーカーを含む栄養培地での増殖により選択すること；
（ｉｉｉ）多重形質転換により該遺伝子のコピー数を増大させ、それにより多重形質転換体を、選択圧を強めた栄養培地での増殖により選択すること；
（ｉｖ）第２選択マーカーに対する耐性遺伝子を有する第２ベクターを添加すること；
（ｖ）多重形質転換により該遺伝子のコピー数を増大させ、それにより多重形質転換体を、選択圧を強めた栄養培地での増殖により選択すること；並びに
（ｖｉ）該遺伝子配列及び選択マーカー耐性遺伝子についてそれぞれ数個のコピーがゲノム中に安定に組み込まれたクローンを選択すること；
を特徴とする。
【００２２】
本発明の方法においてはメタノール資化性酵母細胞を使用することが好ましく、酵母細胞としてはピヒア・パストリスを使用することが特に好ましい。
【００２３】
更に、本発明の方法においては、次のベクター：ｐＰＩＣＺαＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＩＺＣＺ、ｐＰＩＣＺ−Ｅ、ｐＰＩＣＺα−Ｅ；ｐＰＩＣ６、ｐＰＩＣ６αＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺαＡ、Ｂ、Ｃ；ｐＰＩＣ９；ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、及びｐＡＯ８１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）より選択されるベクターに本質的に対応するベクターを使用することが好ましい。
【００２４】
メタノール資化性酵母における変異型遺伝子配列のコピー数は多重形質転換により増大させることができ、それと同時に、適当な選択マーカー（例えばＺｅｏｃｉｎ（登録商標）又はＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）などの抗生物質）を用いた選択圧の増大を行うと、その後、発現ベクターの数個のコピーがゲノム中に安定に組み込まれたクローンのみが生存可能となる。選択マーカーとして使用する高濃度の抗生物質に対する耐性を獲得するために、クローンはより多くの量の耐性タンパク質を産生する必要がある。これは、例えば、それぞれのＡＰ突然変異体（例えばアルカリホスファターゼ突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａ）の発現カセットと共に、選択マーカーとして用いる抗生物質に対する耐性遺伝子を含有する、発現ベクターを、多数組み込むことにより達成することができる。
【００２５】
高発現率を示す強力かつ安定な発現方法で、また同時に経済的な収量で、アルカリホスファターゼの突然変異体を製造するという目的は、以下に記載する方法により達成した。
【００２６】
本発明に従って突然変異体を作製するために、特異的突然変異誘発を以下の通り行った。すなわち、ウシアルカリホスファターゼの突然変異体をコードし、かつ合成により調製された遺伝子に基づいて、互いに相補的な又は重複するオリゴヌクレオチドを、配列番号３と比較して１若しくは数個の塩基の位置にて変化しているように設計した。続いて、ＰＣＲ反応においてこれらのプライマーのうちの１つを、後述する５’又は３’プライマーと対にして用いたところ、ＡＰ遺伝子が所望の塩基変化を含む２つの部分断片として増幅された。
【００２７】
次に、アガロースゲル電気泳動を利用して２つの部分断片を解析し、ゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて予想された長さを有する産物を単離し、さらにＰＣＲ反応において合成することにより完全な遺伝子産物を生成した。ＰＣＲ反応の最初の５サイクルは、全長遺伝子の５’末端及び３’末端にてプライマーを添加せずに行った。その結果、最初は２つの部分断片から、予想された長さの遺伝子産物の断片がほんのわずか形成されるにすぎなかった。アニーリング温度は重複領域の融解温度に応じたものとした。続いて、末端プライマーを添加し、融解温度が最も低いプライマーのアニーリング温度に従ってアニーリング温度を高めた。その後、さらに２５サイクル行って予想された長さの遺伝子断片を増幅した。
【００２８】
ＰＣＲ混合物をアガロースゲル電気泳動により分析し、予想されたサイズの遺伝子断片を単離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）。
【００２９】
対応するＰＣＲ断片のクローニング、ピヒア・パストリスにおける形質転換、及び対応するＡＰ突然変異体の発現については実施例２に記載する。
【００３０】
組換えアルカリホスファターゼ突然変異体は、基本的に当業者に公知の抽出法、例えば”Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｓｃｏｐｅｓ編　（１９８２）に記載の方法により生物資源から単離することができる。純粋なバンド産物は、適当なクロマトグラフィー法、特に疎水性カラム材料及び陽イオン交換体を使用する方法などにより得ることができる。
【００３１】
上述したように、本発明が初めて、ＡＰ活性が非常に低減している又はＡＰ活性を全く示さないが、ウシ小腸由来の組換えアルカリホスファターゼ突然変異体の特性に相当する特性を有する、哺乳動物（例えばウシ小腸）由来の組換えアルカリホスファターゼ突然変異体の酵母における経済的な製造を可能にする方法を開示する。これらの突然変異体は、ＡＰを標識として使用する免疫学的試験手法（例えばＭＴＰ−ＥＬＩＳＡ）における干渉作用抑制タンパク質として特に有用である。
【００３２】
実施例１：
ウシアルカリホスファターゼの突然変異体をコードする合成ＤＮＡ配列の突然変異誘発
ＰＣＲ反応を利用して所望の塩基トリプレットに突然変異誘発するために、対応する改変塩基配列を有し、かつ互いに相補的であるか又は部分的に重複して相補的であるオリゴヌクレオチドを設計した。続いて、これらのオリゴヌクレオチドを５’プライマー５’−ｈＡＰ（配列番号１２）又は３’プライマー３’−ｈＡＰ（配列番号１３）の対応するパートナーとして用いた。この５’プライマー及び３’プライマーは、それぞれウシアルカリホスファターゼの突然変異体をコードする遺伝子の５’末端及び３’末端にハイブリダイズするものである。このようにして、第１反応においては変異型遺伝子配列を２つの部分断片として増幅した。ここで第１部分断片は３’末端に突然変異を有し、第２部分断片は５’末端に突然変異を有し、第１部分断片の３’末端における短い塩基配列は第２部分断片の５’末端における短い塩基配列と同一である。
【００３３】
続いて第２のＰＣＲ反応において上記２つの部分断片を融合させて全長産物を生成した。このために、最初は配列番号１２及び１３に示す５’−ｈＡＰ及び３’−ｈＡＰプライマーを用いないでＰＣＲ反応を開始し、５サイクル行った。数個の全長産物の分子がこの過程で生成される。この５サイクルにおけるアニーリング温度は、２つの部分断片の重複領域の融解温度に応じたものである。続いて、配列番号１２及び１３に示す５’及び３’プライマーを添加し、アニーリング温度を融解温度がより低いプライマーの融解温度に合うように変更し、さらに２５サイクル行って全長産物を増幅させる。
【００３４】
単一突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａを生成する突然変異誘発
単一突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａを生成するために、配列番号３の塩基トリプレットＴＴＧ（高活性ウシアルカリホスファターゼの最初のアミノ酸をコードする）を基準とした２７４−２７６位における塩基トリプレットＴＣＴをＧＣＴに変異させた。この目的のために、互いに部分的に相補的なプライマー５’−Ｓ９２Ａ（配列番号１４）及び３’−Ｓ９２Ａ（配列番号１５）を設計した。続いて、配列番号３に示す遺伝子配列を鋳型として用い、プライマー対５’−ｈＡＰ及び３’−Ｓ９２Ａ、並びに５’−Ｓ９２Ａ及び３’−ｈＡＰを互いに別々に用いて最初のＰＣＲ反応を開始した。その結果、変異型遺伝子配列は最初に２つの部分断片として増幅された。これらの部分断片は、アガロースゲルで分析し、アガロースゲルから単離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）後、第２のＰＣＲ反応において用いた。この第２ＰＣＲ反応においては、２つの部分断片が上述したように融合されて全長産物が生成した。このようにして生成された変異型遺伝子配列をＰＣＲクローニングベクター（ＰＣＲクローニングキット−平滑末端、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてクローニングし、制限分析及び配列決定により解析した。
【００３５】
単一突然変異体Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅを生成する突然変異誘発
単一突然変異体Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅを生成するために、配列番号３の塩基トリプレットＴＴＧ（高活性ウシアルカリホスファターゼの最初のアミノ酸をコードする）を基準とした９６４−９６６位における塩基トリプレットＧＧＴをＴＴＴに変異させた。この目的のために、互いに部分的に相補的なプライマー５’−Ｇ３２２Ｆ（配列番号１６）及び３’−Ｇ３２２Ｆ（配列番号１７）を設計した。続いて、配列番号３に示す遺伝子配列を鋳型として使用し、プライマー対５’−ｈＡＰ及び３’−Ｇ３２２Ｆ、並びに５’−Ｇ３２２Ｆ及び３’−ｈＡＰを互いに別々に使用して最初のＰＣＲ反応を開始した。その結果、変異型遺伝子配列は最初に２つの部分断片として増幅された。これらの部分断片をアガロースゲルで分析し、アガロースゲルから単離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）後、第２のＰＣＲの反応で使用した。この第２ＰＣＲ反応においては、上述したように２つの部分断片が融合されて全長産物が生成した。このように生成された変異型遺伝子配列をＰＣＲクローニングベクター（ＰＣＲクローニングキット−平滑末端、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてクローニングし、制限分析及び配列決定により解析した。
【００３６】
二重突然変異体Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅを生成する突然変異誘発
二重突然変異体Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅを生成するために、配列番号３の最初の塩基トリプレットＴＴＧ（高活性ウシアルカリホスファターゼの最初のアミノ酸をコードする）を基準とした９５８−９６０位及び９６４−９６６位の塩基トリプレットをそれぞれＣＡＴからＡＡＴに及びＧＧＴからＴＴＴに変異させた。このために互いに部分的に相補的なプライマー５’−Ｈ３２０Ｎ／Ｇ３２２Ｆ（配列番号１８）及び３’−Ｈ３２０Ｎ／Ｇ３２２Ｆ（配列番号１９）を設計した。続いて、配列番号３に示される遺伝子配列を鋳型として使用しプライマー対５’−ｈＡＰ及び３’−Ｈ３２０Ｎ／Ｇ３２２Ｆ、並びに５’−Ｈ３２０Ｎ／Ｇ３２２Ｆ及び３’−ｈＡＰを互いに別々に用いて最初のＰＣＲ反応を開始した。その結果、変異型遺伝子配列は最初に２つの部分断片として増幅された。これらの部分断片は、アガロースゲルで分析し、アガロースゲルから単離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット，Ｑｉａｇｅｎ）後、第２のＰＣＲ反応において使用した。この第２ＰＣＲ反応においては、２つの部分断片が上述したように融合されて全長産物が生成した。このようにして生成された変異型遺伝子配列をＰＣＲクローニングベクター（ＰＣＲクローニングキット−平滑末端，Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてクローニングし、制限分析及び配列決定により解析した。
【００３７】
三重突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａ／Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅの作製
三重突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａ／Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅは、単一突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａ及び二重突然変異体Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅを組み合わせることにより作製した。この目的のため、上記２つの変異型遺伝子配列をそれぞれＰＣＲクローニングベクター（ＰＣＲクローニングキット−平滑末端、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にクローニングしたものを、制限エンドヌクレアーゼＭｕｎＩ及びＡｓｐ７１８でそれぞれ別々に切断し、制限処理した混合物をアガロースゲル電気泳動により分離した。ＭｕｎＩはトリプレットＳｅｒ９２位置とＨｉｓ３２０位置との間で切断する。アガロースゲル中から、単一突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａからは約３７００塩基長のベクター断片が単離され、二重突然変異体Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅの変異型遺伝子配列の３’側領域の約９００塩基長の断片が単離された。これら２つの断片を次のステップで１つに連結した。得られた遺伝子配列は配列決定により確認した。
【００３８】
実施例２：
ピヒア・パストリスのための発現ベクターｐＰＩＣＺαＡへの変異型遺伝子配列のクローニング
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８を用いて制限処理することにより、確認された変異型遺伝子配列をＰＣＲクローニングベクターから切り出し、制限処理した混合物をアガロースゲル電気泳動を利用して分離させ、アガロースゲルから約１４８０塩基長の断片を単離（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット，Ｑｉａｇｅｎ）した。続いて、この変異型遺伝子配列をＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８で直鎖化した発現ベクターｐＰＩＣＺαＡから得られたベクター断片と連結した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８に必要な切断部位は、コード配列の上流及び下流にそれぞれ制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８の認識配列を有するプライマー５’−ｈＡＰ及び３’−ｈＡＰによって、変異型遺伝子配列中に組み込んだ。これにより得られたアルカリホスファターゼ突然変異体のための発現ベクターは以下のように命名された：ｐＮａＡＰ３１−１（Ｓｅｒ９２Ａｌａ）、ｐＮａＡＰ４３−１（Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ）、ｐＮａＡＰ５１−１（Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ）及びｐＮａＡＰ６−１（Ｓｅｒ９２Ａｌａ／Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ）。上記ベクターにおいて、変異型遺伝子配列はＡＯＸ　１プロモーター（ピヒア・パストリス由来のアルコールオキシダーゼ１のプロモーター）の制御下にある。このプロモーターはメタノールにより誘導可能であり、サッカロミセス・セレビシエ由来のα因子のシグナルペプチドの後に正確な読み枠でクローニングされる。このようにして挿入された遺伝子断片を、続いて制限分析及び配列決定により塩基配列に誤りがないことを確認した。こうして得られた、真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体をコードする配列番号８〜１１に示される変異型遺伝子配列の１つをそれぞれコードする発現ベクターの一例として、ｐＮａＡＰ３１−１を示す（図１参照）。
【００３９】
ピヒア・パストリスにおける変異型遺伝子配列を含有する発現ベクターの形質転換
変異型遺伝子配列を含有する発現ベクターでピヒア・パストリスＸ−３３株を形質転換し、そのゲノム中に組み込みを行うために、最初にＳａｃＩ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ）を用いてベクターを直鎖化した。Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　ＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションにより形質転換を行った。
【００４０】
このために、ピヒア・パストリス野生型株のコロニーを５ｍｌのＹＰＤ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に接種し、３０℃にて振とうしながら一晩インキュベートした。続いてこの一晩培養液を２００ｍｌの新鮮なＹＰＤ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１：２０００となるよう接種し、ＯＤ６００が１．３〜１．５に達するまで３０℃にて振とうしながら一晩インキュベートした。細胞を遠心（１５００×ｇ／５分）し、ペレットを２００ｍｌの氷冷滅菌水（０℃）に懸濁した。細胞を再度遠心（１５００×ｇ／５分）し、１００ｍｌの氷冷滅菌水に再懸濁した。この細胞を再度遠心分離してから１０ｍｌの氷冷（０℃）１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）に再懸濁した。また再度細胞を遠心分離した後、０．５ｍｌの氷冷（０℃）１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）に再懸濁した。以上のようにして得られた細胞を氷上で維持し、すぐに形質転換に使用した。
【００４１】
上記の細胞８０μｌに約１μｇの直鎖化発現ベクターＤＮＡを加え、この混合物を全て氷冷（０℃）エレクトロポレーションキュベットに移し、氷上でさらに５分間インキュベートした。次にキュベットをＧｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　ＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ）に移し、１ｋＶ、１ｋΩ及び２５μＦで形質転換を行った。エレクトロポレーションの後、上記の混合物に１ｍｌの１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）を加え、続いてその１００〜１５０μｌを１００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＹＰＤＳ寒天プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播いた。次にプレートを３０℃にて２〜４日間インキュベートした。
【００４２】
クローンをラスタ型ＭＤ（最少デキストロース）プレートに接種し、さらに解析した。増殖したクローンを採取し、２０μｌの滅菌水に再懸濁し、１７．５Ｕの溶解酵素（ｌｙｔｉｃａｓｅ、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ）で３７℃にて１時間かけて溶解させ、適当な変異型遺伝子配列を含有する発現カセットが正確に組み込まれていることをＰＣＲにより直接確認した。
【００４３】
その後、形質転換において完全な発現カセットがゲノム中に組み込まれているクローンを発現実験において使用した。
【００４４】
実施例３：
アルカリホスファターゼ突然変異体の発現
陽性クローンを３ｍｌのＢＭＧＹ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に接種し、３０℃にて振とうしながら一晩インキュベートした。次に、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定し、ＯＤ６００が１となるように１０ｍｌのＢＭＭＹ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に接種した。ＢＭＭＹ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＡＯＸ　１プロモーターを介してアルカリホスファターゼ突然変異体の発現を誘導するメタノール（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　Ｂａｋｅｒ　Ｂ．Ｖ．）を含有する。
【００４５】
振とうフラスコを振とうしながら３０℃にてインキュベートし、サンプルを２４時間毎に取り出してＯＤ６００を測定し、アルカリホスファターゼ突然変異体の発現について活性試験を行った。各時点においてその後の誘導のために０．５％メタノール（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　Ｂａｋｅｒ　Ｂ．Ｖ．）を供給した。発現実験は９６時間にわたり実施した。
【００４６】
実施例４：
アルカリホスファターゼ突然変異体の活性試験
実施例３で得られる発現培養物の５００μｌアリコートを取り出し、ＯＤ６００を測定し、細胞を遠心した。上清を保存し、細胞ペレットを細胞溶解のためにＯＤ６００に従って所定量のＹ−ＰＥＲＴＭ（５０〜３００μｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）に再懸濁し、室温にて１時間振とうした。次に、溶解物を遠心（１５０００×ｇ／５分間）して細胞破砕物を分離し、上清を新たな反応容器に移した。その後、５μｌの溶解物を活性試験に使用した。
【００４７】
活性試験は、以下の原理に従って行う。
【００４８】
2004000170.tif 000002
４０５ｎｍにおける吸光度の上昇を測定した。
【００４９】
５０μｌの４−ニトロフェニルリン酸溶液（０．６７ｍｏｌ／ｌ　４−ニトロフェニルリン酸，ナトリウム塩（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ））を３ｍｌのジエタノールアミンバッファー（１ｍｏｌ／ｌジエタノールアミン（Ｍｅｒｃｋ）ｐＨ９．８、０．５　ｍｍｏｌ／ｌ　ＭｇＣｌ２（Ｒｉｅｄｅｌ　ｄｅ　Ｈａｅｎ））に添加し、この混合物を３７℃にてインキュベートした。続いて、５μｌの溶解物を添加して反応を開始し、３７℃における吸光度の変化を３分間測定し、これよりΔＡ／分　を算出した。
【００５０】
続いて、下記式に従って活性を算出した：
【数１】
2004000170.tif 000003
【００５１】
同様にして発現培養物の培地上清の活性を測定した。この場合、５０μｌの上清を用いて反応を開始したが、０．５ｍＭ　ＺｎＣｌ２をさらに添加した。続いて、係数ｘを使用しないで活性を算出した。配列番号３に示される高活性アルカリホスファターゼを発現するクローンの上清を陽性対照として使用し、標的遺伝子を含有しない最初のベクターｐＰＩＣＺαＡを用いて形質転換したクローンを陰性対照として使用した。
【００５２】
以下に記載する通り、突然変異体の残存活性を本活性試験により測定した：
単一突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａ：比活性が約５０００分の１に低減した
単一突然変異体Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ：比活性が約２５００分の１に低減した
二重突然変異体Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ：比活性が約１００００分の１に低減した（ほぼ検出限界）
三重突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａ／Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ：比活性が約１００００分の１に低減した（ほぼ検出限界）。
【００５３】
実施例５：
ウエスタンブロットによるＡＰ突然変異体の発現の検出：
細胞溶解後の未濃縮上清又は粗抽出物１０μｌを１０％ＳＤＳゲル（Ｎｏｖｅｘプレキャストゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にアプライし、電場を印加して存在するタンパク質をサイズに従って分離させた。このように分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ　ＸＣｅｌｌ　ＩＩＴＭ　Ｂｌｏｔ　Ｍｏｄｕｌｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にブロッティングした。ブロッティング後、この膜を２０ｍｌの高純度水を用いた５分間の洗浄で２回洗浄し、続いて１０ｍｌのブロッキング溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３０分間振とうした。次に、この膜を再度２０ｍｌの高純度水で５分間２回洗浄し、その後、抗体１（抗ＡＰ−ウサギ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ　Ｉｎｃ．）を１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液から５０００倍希釈したもの）を含む１０ｍｌのブロッキング溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１時間インキュベートした。続いて、この膜を各回２０ｍｌの抗体洗浄溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた５分間の洗浄により４回洗浄した後、１０ｍｌの２次抗体溶液（抗ウサギ抗体を含む、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３０分間インキュベートした。その後、膜を各回２０ｍｌの抗体洗浄溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた５分間の洗浄により４回洗浄し、各回２０ｍｌの高純度水を用いた２分間の洗浄により３回洗浄した。続いて、染色のために膜を色素溶液（発色基質、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１〜６０分間インキュベートした。インキュベーション時間は染色の度合に応じて変更する。最適な染色の後、膜を各回２０ｍｌの高純度水を用いた２分間の洗浄により３回洗浄し、続いて膜を室温で乾燥させた。高純度水以外の溶液は全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｒｅｅｚｅ発色免疫検出キットのものであり、インキュベーションステップは全て室温にて行った。実験手順は製造業者の説明書に従った。
【００５４】
実施例６：
多重形質転換による発現率の増大
次に、エレクトロポレーションのために発現実験からの最良のクローンを実施例２に記載のように調製し、１μｇの直鎖化発現ベクターＤＮＡで再度形質転換し、形質転換混合物を１０００〜２０００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＹＰＤＳ寒天プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播いた。以上のようにして、発現ベクターの数個のコピーが組み込まれ、従って各耐性遺伝子（この場合にはＺｅｏｃｉｎ（登録商標））の数個のコピーがゲノム中に組み込まれたクローンのみが増殖可能な程度に選択圧を増大させる。Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）　耐性タンパク質は、ストレプトアロテイカス・ヒンダスタヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ　ｈｉｎｄｕｓｓｔａｎｕｓ）のブレオマイシン遺伝子の産物であり（Ｃｈａｌｍｅｌｓ，　Ｔ．ら、Ｃｕｒｒ．　Ｇｅｎｅｔ．　２０　（１９９１），　３０９−３１４；Ｄｒｏｃｏｕｒｔ，　Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１８　（１９９０），　４００９）、これが化学量論的濃度比でＺｅｏｃｉｎ（登録商標）と結合することにより、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）に対する細胞耐性が確立する。ＹＰＤＳ寒天プレートにおけるＺｅｏｃｉｎ（登録商標）の濃度が高くなると、細胞は、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）と量的に結合して増殖可能となるために耐性タンパク質を多く生成する必要がある。これは、例えば耐性遺伝子の複数個のコピーがゲノム中に組み込まれた場合に可能となる。上述したようにラスタ型ＭＤプレートにクローンを接種し、実施例２に記載したようにＰＣＲ分析により各発現カセットが正確に組み込まれていることを同様に調べた。続いて、実施例４及び５に記載のようにこれらのクローンをＡＰ活性試験又はウエスタンブロット分析により再度試験した。
【００５５】
実施例７：
第２の選択圧を用いた発現率の増大
Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）濃度を２０００μｇ／ｍｌ以上に増大させても、アルカリホスファターゼの突然変異体の発現率の増大にはつながらない。実施例６で得られた、最大発現率を示し第２の選択圧（好ましくはＧ４１８（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ））により選択された発現クローンのゲノム中にさらなる発現ベクターを組み込むことによって、アルカリホスファターゼの突然変異体をコードし、かつ酵母における発現のためのコドンが最適化されている配列番号８〜１１に示される遺伝子のコピー数を発現クローンにおいてさらに増大させた。このために、ＡＯＸ　１プロモーター、サッカロミセス・セレビシエ由来のα因子のシグナルペプチド、配列番号８〜１１に示されるアルカリホスファターゼ突然変異体のコドン最適化遺伝子、及びＡＯＸ　１転写終結領域からなる、ｐＮａＡＰ３１−１由来の発現カセット全体を適当に選択したプライマーを用いたＰＣＲにより単離し、これを後述するようにベクターｐＩＣ９Ｋに組み込んだ。このベクターは、ピヒア・パストリスのゲノムへの組み込みをＧ４１８（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ）により選択することができる。この場合に使用したプライマー５’　ｅｘｐｒ及び３’　ｅｘｐｒは、配列番号２０及び配列番号２１の配列を有するものである。
【００５６】
ＰＣＲ調製物をアガロースゲル電気泳動により解析し、予想されたサイズを有する遺伝子断片を単離し（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ）を用いて再度切断した後、またアガロースゲルから単離し（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）し、これを、ＳａｃＩ／ＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ）で直鎖化したｐＰＩＣ９Ｋから単離したベクター断片に連結した。これにより各々の発現ベクターからの発現カセット全体がｐＰＩＣ９Ｋ中に同じ形態で存在することになった。挿入された断片を制限分析及びフランキング領域を用いた配列決定により調べた。得られたアルカリホスファターゼ突然変異体の発現ベクターをｐＮａＡＰ３１−２（Ｓｅｒ９２Ａｌａ）、ｐＮａＡＰ４３−２（Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ）、ｐＮａＡＰ５１−２（Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ）及びｐＮａＡＰ６−２（Ｓｅｒ９２Ａｌａ／Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ）と称した。
【００５７】
エレクトロポレーションのために、実施例２に記載のようにＺｅｏｃｉｎ（登録商標）を選択マーカーとして用いた多重形質転換により得られたＡＰ突然変異体の発現率が最も高いクローンを調製し、さらに、実施例２に記載のように１μｇのベクター断片ｐＮａＡＰ３１−２及びＳａｃＩ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ）で直鎖化した誘導体を用いて形質転換した。続いて形質転換調製物を、（Ｇ４１８耐性を生じるように）１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）中で４℃にて１〜３日間保存し、次にこの１００〜２００μｌを１、２又は４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ）を含有するＹＰＤプレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播いて３０℃にて３〜５日間インキュベートした。得られたクローンを、真核生物アルカリホスファターゼ突然変異体の発現の増大に関する活性試験を用いて上述の通り再度調べた。
【００５８】
配列番号１〜２１の配列内容の凡例
配列番号１：シグナル配列を含まない、高活性ウシＡＰをコードする天然ＤＮＡ配列
配列番号２：高活性ウシＡＰのアミノ酸配列
配列番号３：高活性ＡＰをコードする合成遺伝子のＤＮＡ配列。制限切断部位ＥｃｏＲＩはコード配列の上流に位置し、制限切断部位Ａｓｐ７１８はコード配列の下流に位置する。
【００５９】
配列番号４：ＡＰの単一突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａ（野生型：高活性ウシＡＰ）のアミノ酸配列
配列番号５：ＡＰの単一突然変異体Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ（野生型：高活性ウシＡＰ）のアミノ酸配列
配列番号６：ＡＰの二重突然変異体Ｈｉｓ３２０／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ（野生型：高活性ウシＡＰ）のアミノ酸配列
配列番号７：ＡＰの三重突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａ／Ｈｉｓ３２０／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅ（野生型：高活性ウシＡＰ）のアミノ酸配列
配列番号８：ＡＰの単一突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａをコードする合成遺伝子のＤＮＡ配列。切断部位ＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８はそれぞれコード配列の上流及び下流に位置する。
【００６０】
配列番号９：ＡＰの単一突然変異体Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅをコードする合成遺伝子のＤＮＡ配列。切断部位ＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８はそれぞれコード配列の上流及び下流に位置する。
【００６１】
配列番号１０：ＡＰの二重突然変異体Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅをコードする合成遺伝子のＤＮＡ配列。切断部位ＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８はそれぞれコード配列の上流及び下流に位置する。
【００６２】
配列番号１１：ＡＰの三重突然変異体Ｓｅｒ９２Ａｌａ／Ｈｉｓ３２０Ａｓｎ／Ｇｌｙ３２２Ｐｈｅをコードする合成遺伝子のＤＮＡ配列。切断部位ＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８はそれぞれコード配列の上流及び下流に位置する。
【００６３】
配列番号１２〜２１：プライマーとして使用したＤＮＡ配列
【００６４】
略語
ＹＰＤ：酵母ペプトンデキストロース
ＹＰＤＳ：酵母ペプトンデキストロースソルビトール
ＢＭＧＹ：緩衝化グリセロール複合培地
ＢＭＭＹ：緩衝化メタノール複合培地
ＭＴＰ：マイクロタイタープレート
【００６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＩＣＺαＡ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に配列番号８に示される変異型遺伝子配列を結合させた発現ベクターｐＮａＡＰ３１−１のプラスミド地図を示す図である。
【図２】ｐＩＣ９Ｋ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に配列番号８に示される変異型遺伝子配列を結合させた発現ベクターｐＮａＡＰ３１−２のプラスミド地図を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月7日(2003.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体であって、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）　野生型と比較して１００分の１以下に低減した活性を有しており、但し該野生型の配列（突然変異が導入される配列）が、配列番号２に対し少なくとも７７％の相同性を有するものであること、及び
（ｉｉ）　以下に示す突然変異（これらの突然変異の位置は配列番号２における位置に対応して定められている）の１つ以上を有すること：
Ａｓｐ４２のＡｓｎ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒへの置換；
Ｓｅｒ９２のＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ又はＬｅｕへの置換；
Ｓｅｒ１５５のＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ又はＬｅｕへの置換；
Ｇｌｕ３１１のＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＭｅｔへの置換；
Ａｓｐ３１６のＡｓｎ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒへの置換；
Ｈｉｓ３２０のＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ又はＴｙｒへの置換；
Ｇｌｙ３２２の、Ａｓｐより大きい任意のアミノ酸への置換；
Ａｓｐ３５７のＡｓｎ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒへの置換；
Ｈｉｓ３５８のＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ又はＴｙｒへの置換；
Ｈｉｓ４３２のＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ又はＴｙｒへの置換、
を特徴とする、上記突然変異体。
【請求項２】
請求項１に記載の真核生物アルカリホスファターゼの突然変異体をコードする組換えＤＮＡ。
【請求項３】
酵母細胞において請求項１に記載の真核生物アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の突然変異体を作製する方法であって、以下のａ）〜ｄ）のステップ：
ａ）　請求項２に記載の遺伝子配列を異なるベクターにクローニングするステップ；
ｂ）　酵母を形質転換するステップ；
ｃ）　ＡＰの突然変異体を発現させるステップ；及び
ｄ）　アルカリホスファターゼを精製するステップ
を含み、
かつ、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）：
（ｉ）第１ベクターが、第１選択マーカーに対する耐性遺伝子を有すること；
（ｉｉ）該耐性遺伝子及び所望の遺伝子配列がゲノム中に組み込まれた形質転換体を、低濃度の第１選択マーカーを含む栄養培地での増殖により選択すること；
（ｉｉｉ）多重形質転換により該遺伝子のコピー数を増大させ、それにより多重形質転換体を、選択圧を強めた栄養培地での増殖により選択すること；
（ｉｖ）第２選択マーカーに対する耐性遺伝子を有する第２ベクターを添加すること；
（ｖ）第２ベクターでの多重形質転換により該遺伝子のコピー数を増大させ、それにより多重形質転換体を、選択圧を強めた栄養培地での増殖により選択すること；及び
（ｖｉ）該遺伝子配列及びそれらの選択マーカー耐性遺伝子についてそれぞれ数個のコピーがゲノム中に安定に組み込まれたクローンを選択すること；
を特徴とする、上記方法。
【外国語明細書】
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