(57)【要約】【課題】プロジェステロン代謝に関与する酵素を遺伝的に欠損させることにより、食資源動物の繁殖障害、特に、母体のプロジェステロン代謝異常に起因する流産や産子の発育不良に対する治療法やその早期診断法を確立する上での優れたモデル動物を提供すること。【解決手段】該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子との間の相同組換えにより、該酵素の活性が失活する程度に、該ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の少なくとも一部を欠損させるように設計されたターゲティングベクターを用いて、２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の一部を欠損させた形質転換体。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１で示される塩基配列の１３８〜１１０９位を含む遺伝子、または
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列の１３８〜１１０９位において１つ若しくは数個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加及び／若しくは挿入された塩基配列を有し、かつ２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、または
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
図４および図５に示される塩基配列から構成される遺伝子。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項５】
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項６】
該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子との間の相同組換えにより、該酵素の活性が失活する程度に、該ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の少なくとも一部を欠損させるように設計されたターゲティングベクター。
【請求項７】
該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子との間の相同組換えにより、該酵素の活性が失活する程度に、該ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の少なくとも一部を欠損させるように設計され、かつ欠損させた部分にマーカー遺伝子を導入するように設計されたターゲティングベクター。
【請求項８】
該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子との間の相同組換えにより、該ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン２〜４を欠損させるように設計され、かつ欠損させた部分にマーカー遺伝子を導入するように設計されたターゲティングベクター。
【請求項９】
ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の少なくとも一部を、該酵素の活性が失活する程度に欠損させるためのターゲティングベクターであって、順に以下の領域（１）〜（３）を含むベクター：
（１）ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の欠損させたい部分の上流に相同な領域、
（２）マーカー遺伝子、および
（３）ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の欠損させたい部分の下流に相同な領域。
【請求項１０】
ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン２〜４を欠損させるためのターゲティングベクターであって、順に以下の領域（１）〜（３）を含むベクター：
（１）ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン２の上流に相同な領域、
（２）マーカー遺伝子、および
（３）ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン４の下流に相同な領域。
【請求項１１】
ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン２〜４を欠損させるためのターゲティングベクターであって、順に以下の領域（１）〜（３）を含むベクター：
（１）ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン１の上流域〜エクソン２の一部を含むまでの塩基配列に相同な領域、
（２）マーカー遺伝子、および
（３）ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン４の下流域〜エクソン５の下流域までの塩基配列に相同な領域。
【請求項１２】
ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の一部を欠損させるためのターゲティングベクターｐＴＶ−ＤＴ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６２）。
【請求項１３】
図６に示されるターゲティングベクターｐＴＶ−ＤＴ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６２）。
【請求項１４】
請求項６〜１３の何れか１項に記載のターゲティングベクターを用いて相同組換えを起こすことにより、２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の一部を欠損させた形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子欠損マウスに関する。本発明の遺伝子欠損マウスは、食資源動物の繁殖障害、特に、母体のプロジェステロン代謝異常に起因する流産や産子の発育不良に対する治療法やその早期診断法を確立する上での優れたモデル動物となる。
【０００２】
【従来の技術】
畜産業界において食資源動物を繁殖させる上で、食資源動物の繁殖障害、すなわち、流産や産子の発育不良に対する治療法やその早期診断法を確立することは重要な意味を有する。食資源動物の流産や産子の発育不良の原因として、母体のプロジェステロン代謝異常が知られている。
【０００３】
プロジェステロン代謝に関与する酵素として、２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素（以下、２０α−ＨＳＤともいう）がある。２０α−ＨＳＤは、齧歯類の卵巣において発現し、プロジェステロンを異化することにより、齧歯類の短い性周期の回帰を可能にすることが知られている。また、本酵素は、齧歯類で生殖腺以外の器官においても発現していること、齧歯類のみでなく、ヒトを含む霊長類や家畜の生殖腺、子宮、胸腺、胎盤などで発現していることが明らかになっている。しかし、卵巣以外の器官における本酵素発現の意義や、齧歯類以外の種における本酵素の役割についてはまったく知られていないのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下、本発明は、プロジェステロン代謝に関与する酵素を遺伝的に欠損させることにより、食資源動物の繁殖障害、特に、母体のプロジェステロン代謝異常に起因する流産や産子の発育不良に対する治療法やその早期診断法を確立する上での優れたモデル動物を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、プロジェステロン代謝に関与する酵素のうち２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素（２０α−ＨＳＤ）に着目し、２０α−ＨＳＤ遺伝子欠損マウスを作製することを試み、成功するに至った。本発明により作製された２０α−ＨＳＤ遺伝子欠損マウスは、正常マウスに比較して、産子数には違いが見られないものの、産子の死亡率が有意に高いという特徴を有していることが、本発明で初めて明らかになった。これにより、食資源動物の繁殖障害に対する治療法や早期診断法を確立するためのモデル動物となり得るマウスを獲得するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の手段により達成される。
【０００７】
（１）  （ａ）配列番号１で示される塩基配列の１３８〜１１０９位を含む遺伝子、または
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列の１３８〜１１０９位において１つ若しくは数個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加及び／若しくは挿入された塩基配列を有し、かつ２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（２）  （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、または
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（３）  図４および図５に示される塩基配列から構成される遺伝子。
【０００８】
（４）  （１）に記載の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（５）  （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【０００９】
（６）  該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子との間の相同組換えにより、該酵素の活性が失活する程度に、該ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の少なくとも一部を欠損させるように設計されたターゲティングベクター。
（７）  該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子との間の相同組換えにより、該酵素の活性が失活する程度に、該ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の少なくとも一部を欠損させるように設計され、かつ欠損させた部分にマーカー遺伝子を導入するように設計されたターゲティングベクター。
（８）  該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子との間の相同組換えにより、該ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン２〜４を欠損させるように設計され、かつ欠損させた部分にマーカー遺伝子を導入するように設計されたターゲティングベクター。（９）  ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の少なくとも一部を、該酵素の活性が失活する程度に欠損させるためのターゲティングベクターであって、順に以下の領域［１］〜［３］を含むベクター：
［１］ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の欠損させたい部分の上流に相同な領域、
［２］マーカー遺伝子、および
［３］ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の欠損させたい部分の下流に相同な領域。
（１０）  ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン２〜４を欠損させるためのターゲティングベクターであって、順に以下の領域［１］〜［３］を含むベクター：
［１］ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン２の上流に相同な領域、
［２］マーカー遺伝子、および
［３］ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン４の下流に相同な領域。
（１１）  ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン２〜４を欠損させるためのターゲティングベクターであって、順に以下の領域［１］〜［３］を含むベクター：
［１］ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン１の上流域〜エクソン２の一部を含むまでの塩基配列に相同な領域、
［２］マーカー遺伝子、および
［３］ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子のエクソン４の下流域〜エクソン５の下流域までの塩基配列に相同な領域。
（１２）  ゲノム中の２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の一部を欠損させるためのターゲティングベクターｐＴＶ−ＤＴ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６２）。
（１３）  図６に示されるターゲティングベクターｐＴＶ−ＤＴ２（ＦＥＲＭ
Ｐ−１９０６２）。
【００１０】
（１４）  請求項６〜１３の何れか１項に記載のターゲティングベクターを用いて相同組換えを起こすことにより、２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素遺伝子の一部を欠損させた形質転換体。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１２】
まず、本発明を為すにあたり、プロジェステロン代謝に関与する酵素のうち２０α−水酸化ステロイド脱水素酵素（２０α−ＨＳＤ）に着目した理由について説明する。
【００１３】
２０α−ＨＳＤは、プロジェステロンを生物学的に不活性な２０α−ダイハイドロプロジェステロン（２０α−ｄｉｈｙｄｒｏｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，  ２０α−ＯＨＰ）へと代謝する酵素である。他にもプロジェステロンを代謝する主要な酵素としては、１７α−水酸化酵素（１７α−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）が知られているが、１７α−水酸化酵素の代謝産物である１７α−水酸化プロジェステロン（１７α−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）は、ステロイド合成カスケード上の途中に位置し、アンドロジェン、さらにはエストロジェン合成の前駆体となる。一方、２０α−ＨＳＤの代謝産物である２０α−ＯＨＰは、他のステロイドの前駆体にはならず、またプロジェステロン活性が失われている。従って、２０α−ＨＳＤによるプロジェステロンから２０α−ＯＨＰへの代謝は、プロジェステロン自体を不活化すると同時に、１７α−水酸化プロジェステロンを経由したアンドロジェン、エストロジェンの合成をも抑制的に調節するという意義を有する。
【００１４】
ここに示したプロジェステロン、アンドロジェン、エストロジェンは、いわゆる性ステロイドと称されるもので、２０α−ＨＳＤは、これまでに主として、齧歯類の卵巣からのプロジェステロンを主体とする性ステロイド合成の調節に関与するとされてきた。すなわち、通常、多くの哺乳類において、プロジェステロンは、排卵に伴う１７α−水酸化酵素の活性低下を機に、黄体ホルモンとして分泌されるようになる。しかし齧歯類であるラットでは、性周期中、黄体からのプロジェステロン分泌は低く維持されており、代わって２０α−ＯＨＰレベルが高く維持されている。このプロジェステロン分泌の欠如は、結果として次世代の卵胞の発育・排卵を４、５日間隔で行うことを可能にし、小型哺乳類が持つ多産という繁殖形態に大きく貢献している。また妊娠末期にはマウスにおいても、約２０−２２日間の発現抑制を経て２０α−ＨＳＤの活性上昇が見られることから、この酵素が分娩時プロジェステロン濃度の低下に寄与していると考えられる。これらの現象は、単一の酵素の発現の有無が、哺乳類のプロジェステロン分泌相の有無を決定する意義を有する可能性を示し、２０α−ＨＳＤの哺乳類進化における特異な役割を示唆するものである。
【００１５】
しかし、それ以上に興味深いのは、２０α−ＨＳＤの発現は、卵巣以外でも、胎盤や子宮内膜において見られ、その発現が妊娠期に限られることである。このことは高レベルのプロジェステロンが妊娠維持に必須であるにもかかわらず、その環境下では機能発現できない細胞が胎盤や子宮内膜に存在する可能性を示唆する。すなわち、これら発育胎子を取り巻く組織における２０α−ＨＳＤの発現は、妊娠維持に必須とされるプロジェステロンが、一方では胎子の発育に対して負の作用を及ぼすという、逆説的な仮説を導くものである。そこでこれら発育胎子を取り巻く組織における２０α−ＨＳＤ発現の意義を調べるとともに、妊娠維持に必須とされるプロジェステロンが、一方では胎子の発育に対して負の作用を及ぼすという仮説を検証する目的も含めて、今回２０αＨＳＤに着目し、２０α−ＨＳＤ遺伝子欠損マウスの作製を試みるに至った。
【００１６】
［２０α−ＨＳＤ遺伝子のクローニング］
２０α−ＨＳＤ遺伝子欠損マウスを作製するにあたっては、まずターゲティングベクターの構築が必要である。本発明においてターゲティングベクターとは、該ベクターを導入した細胞が有する染色体の配列と該ターゲティングベクターの配列とが相同組換えを起こし、その結果、該細胞内の２０α−ＨＳＤ遺伝子の少なくとも一部を欠損するように構築されたベクターをいう。
【００１７】
ターゲティングベクターの構築にあたり考慮すべき点は、２０α−ＨＳＤが、ａｌｄｏ−ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙという互いに相同性の高い、遺伝子重複による進化が示唆されている大きなファミリーに属するという点である。すなわちターゲティングベクターの構築に際しては、出来る限り長い２０α−ＨＳＤゲノムＤＮＡをクローニングして用いることにより、相同組み替えの特異性を高めることが必要である。しかしながら、２０α−ＨＳＤ  ｃＤＮＡ配列そのものをプローブとして用いてゲノムライブラリーをスクリーニングしたところ、２０α−ＨＳＤとは異なる、ラット３α−ＨＳＤと一部９３  ％の相同性を有する遺伝子が単離された。
【００１８】
そこでこのように相同性を有する他の遺伝子が単離される可能性を極力排除し、２０α−ＨＳＤ  ゲノムＤＮＡをより効率よく単離することを目的とし、
１）まず２０α−ＨＳＤゲノムＤＮＡのイントロンの配列をも含むと考えられる、約２  ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ライブラリーのファージゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅し、
２）これをプローブとしてあらためてマウスゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、２０α−ＨＳＤゲノムクローンを単離した。
【００１９】
１２９Ｓｖマウスゲノムライブラリーより得られた２０α−ＨＳＤ遺伝子断片（λ２４３１、λ１２１２、λ９５２７、λ６１１５、λ３２１７）の塩基配列を決定することにより、２０α−ＨＳＤ遺伝子全長をコードするゲノムＤＮＡの配列、構造を決定した。
【００２０】
これにより、本酵素遺伝子が９つのエクソンから構成されていることが判明した（図１）。９つのエクソンはそれぞれ、５’末端側からエクソン１、２、３、・・・９と称する。
【００２１】
図１は、得られた２０α−ＨＳＤ遺伝子断片（λ２４３１、λ１２１２、λ９５２７、λ６１１５、λ３２１７）の配列から、エクソン／イントロン構造が決定された様子を示す。数字１〜９は各エクソンを、斜体字は制限酵素切断部位を示す。
【００２２】
図４および５には、２０α−ＨＳＤ遺伝子のエクソンの塩基配列を示す。図４および５において、エクソン１〜９（Ｅ１〜Ｅ９）の塩基配列は、大文字で表示する。各エクソンの間に位置するイントロンは、小文字で表示し、イントロンの塩基配列が未知な部分は「・・・」で略して示す。各イントロンのサイズは、それぞれ括弧内に示す。また、２０α−ＨＳＤ遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号１に示し、２０α−ＨＳＤ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２３】
［ターゲティングベクターの作製］
本発明においては、ＥＳ細胞に導入し相同組換えを起こした際に、２０α−ＨＳＤ遺伝子のエクソン２（Ｅ２）からエクソン４（Ｅ４）までが欠損するようなターゲティングベクター（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）を作製した（図２、図６）。
【００２４】
本発明の実施例では、相同組換えにより、２０α−ＨＳＤ遺伝子のエクソン２からエクソン４までを欠損させることが可能なターゲティングベクターを作製したが、本発明は、このターゲティングベクターに限定されるものではない。
【００２５】
すなわち、本発明のターゲティングベクターは、
該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子との間の相同組換えにより、該酵素の活性が失活する程度に、該ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子の少なくとも一部を欠損させることが可能なものであればよい。
【００２６】
好ましくは、本発明のターゲティングベクターは、該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子との間の相同組換えにより、該酵素の活性が失活する程度に、該ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子の少なくとも一部を欠損させることが可能で、かつ欠損させた部分にマーカー遺伝子を導入することが可能なものである。
【００２７】
より好ましくは、本発明のターゲティングベクターは、該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子との間の相同組換えにより、該ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子のエクソン２〜４を欠損させることが可能で、かつ欠損させた部分にマーカー遺伝子を導入することが可能なものである。
【００２８】
具体的には、本発明のターゲティングベクターは、ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子の少なくとも一部を、該酵素の活性が失活する程度に欠損させるためのターゲティングベクターであって、上流から順に以下の領域（１）〜（３）を含むベクターである：
（１）ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子の欠損させたい部分の上流に相同な領域、
（２）マーカー遺伝子、および
（３）ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子の欠損させたい部分の下流に相同な領域。
【００２９】
より具体的には、本発明のターゲティングベクターは、ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子のエクソン２〜４を欠損させるためのターゲティングベクターであって、上流から順に以下の領域（１）〜（３）を含むベクターである：
（１）ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子のエクソン２の上流に相同な領域、
（２）マーカー遺伝子、および
（３）ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子のエクソン４の下流に相同な領域。
【００３０】
本発明のターゲティングベクターにおいて、上述の「ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子の欠損させたい部分の上流に相同な領域」および「ゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子の欠損させたい部分の下流に相同な領域」は、それぞれ、当該相同な領域を利用して、相同組換えを起こすことが可能な長さであればよい。例えば、マーカー遺伝子の両端に位置するこれら２つの相同な領域は、それぞれ１〜１０ｋｂの長さとすることができ、好ましくは５〜１０ｋｂの長さとすることができる。例えば、２つの相同な領域のうち短い方を１〜２ｋｂとすることができる。
【００３１】
本発明のターゲティングベクターに含有させることができるマーカー遺伝子は、該ターゲティングベクターとゲノム中の２０α−ＨＳＤ遺伝子との間の相同組換えにより、該マーカー遺伝子がゲノム中に組込まれたことの標識となり得るものであれば特に限定されない（すなわち、相同組換え体のスクリーニングの際、ポジティブ選別に使用可能なものであれば特に限定されない）。例えば、薬剤耐性遺伝子、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ−Ｂ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ハイグロマイシン−Ｂ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ−Ｂ）、ブラスチシジン−Ｓ−デアミナーゼ（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ−Ｓ−ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ブラスチシジン−Ｓ（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ−Ｓ）などを使用することができ、本発明の実施例においては、その一例としてネオマイシン耐性遺伝子を使用した。
【００３２】
本発明のターゲティングベクターは、他のマーカー遺伝子を更に含んでいてもよい。他のマーカー遺伝子として、例えば、相同組換え体のスクリーニングの際にネガティブ選別に使用されるマーカー遺伝子、あるいは本来２０α−ＨＳＤ遺伝子が発現している細胞を選抜するためのマーカー遺伝子が挙げられる。
【００３３】
図２および図６は、本発明において実際に作製されたターゲティングベクターｐＴＶ−ＤＴ２について図示する。図２は、上から順に、野生型ゲノム、ターゲティングベクター、相同組換え後のゲノムの対応する領域をそれぞれ表す。
【００３４】
ターゲティングベクターを構成する各構成要素に関して、ＤＴはジフテリア毒素遺伝子を、ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰはｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ／ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎを、ｎｅｏｒはネオマイシン耐性遺伝子を表す。更に詳細に、ターゲティングベクターを構成する各構成要素の機能、サイズ、起源について、表１にまとめて示す。
【００３５】
【表１】
2004261075.tif 000002
【００３６】
ジフテリア毒素遺伝子、ｎｅｏｒ遺伝子は、ＥＳ細胞における相同組み換え体のスクリーニングの際に、それぞれネガティブ選別、ポジティブ選別に利用されるが、それぞれは他の選択マーカーでも代替可能である。
【００３７】
ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰは、内因性の２０α−ＨＳＤプロモーターの活性に依存して、ＥＧＦＰを発現させることにより、本来２０α−ＨＳＤが発現する細胞を可視化することを目的としたものである。ＩＲＥＳは、翻訳時、２０α−ＨＳＤのエクソン１とＥＧＦＰとの融合タンパク質の生成を避けるため、ＥＧＦＰ遺伝子の上流に連結した。ＥＧＦＰ遺伝子に関しては、他の公知の蛍光タンパク質、並びにＬａｃＺなど他のレポーター遺伝子の利用も可能である。
【００３８】
本発明のターゲティングベクターは、所望の配列を含むように当業者により設計され、遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
【００３９】
ここで、本発明のターゲティングベクターにおいて、２０α−ＨＳＤ遺伝子のエクソン２〜４を欠損させることが好ましい理由について説明する。すなわち、２０α−ＨＳＤは、ＮＡＤＰ（Ｈ）を補酵素とし、ステロイド骨格の２０位でプロトンを付加あるいは除去することにより、プロジェステロンと２０α−ＯＨＰ（２０α−ダイハイドロプロジェステロン）間の可逆的変換を触媒する酵素である。２０α−ＨＳＤの属するａｌｄｏ−ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙでは、活性部位（補酵素結合部位）を構成する４つのアミノ酸が保存されており、うち２つのアミノ酸に変異が起こると酵素活性が失われる。これら４つのアミノ酸はエクソン２から４にかけてコードされている。そのため遺伝子欠損により本酵素活性を完全に消失させることを目的としてこの領域を欠損させた。他のエクソン部分を破壊した場合にも、三次元構造の変化などから、基質との結合が阻害される可能性があるが、触媒活性部位が残存する場合、変異酵素の構造によっては、機能が欠損するかどうかに差がでると思われる。
【００４０】
本発明において実際に作製されたターゲティングベクターｐＴＶ−ＤＴ２は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成１４年１０月１０日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６２が付与された。
【００４１】
［形質転換体の作製］
作製したターゲティングベクターをエレクトロポレーション法によりＥＳ細胞に導入し、そのなかから、相同組換えにより薬剤耐性となったクローンを選別した。選別したクローンを用いて、集合キメラ法によりキメラマウスを作出した。
【００４２】
得られたキメラマウスのうち、相同組換えを起こしたＥＳ細胞が生殖系列に入ったマウスより子孫を産出し、２０α−ＨＳＤ遺伝子欠損マウスを作出した。
【００４３】
［野生型マウスに対する産子数および死亡率の比較実験］
２０α−ＨＳＤ遺伝子をホモで欠損しているマウス同士を交配させた場合、正常マウス（野生型マウス同士を交配させた場合）に比較して、妊娠の進行や産子数には違いが見られないものの、産子の死亡率が有意に高いことが判明した（図３）。
【００４４】
産子数および死亡率のデータは、ともに分娩後１日目のものである。丸印（白丸および黒丸）は、各個体から得られた産子数および死亡率の値を、横棒は、平均値を表す。またｐの値は危険率を表す。
【００４５】
図３の結果は、妊娠中の母体におけるプロジェステロン代謝の異常が、不育症（習慣性流産）や出生後の産子の発育不良の原因となりうることを示す。すなわち、従来不明とされていた卵巣以外の器官における２０α−ＨＳＤの役割の一つとして、子宮で発現している本酵素が妊娠子宮内における高プロジェステロン環境からの胎子の回避に貢献している可能性が示される。
【００４６】
従って、本発明において作出された２０α−ＨＳＤ遺伝子欠損マウスは、母体内のステロイド代謝異常が産子の生存・発育に及ぼす影響を解明するうえでの優れた実験モデル動物となり得る。
【００４７】
【実施例】
１．遺伝子のクローニングの仕方
１）Ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌの調整
１２９  ＳｖＪ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｉｂｒａｒｙのｈｏｓｔ  ｃｅｌｌには、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡを用いた。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ  １コロニーを、２０  ｍｌのＬＢ培地（０．２  ％  ｍａｌｔｏｓｅ，１０  ｍＭ  ＭｇＳＯ４を添加）で３７  ℃で８時間培養した。次に３，０００  ｒｐｍで１０分間遠心して大腸菌を沈殿させて集め、上清を除去した後１０  ｍＭ  ＭｇＳＯ４でＯＤ６００  ＝  １になるように希釈して用いた。
【００４８】
２）λＦＩＸ  ＩＩ  ｐｈａｇｅのｈｏｓｔ  ｃｅｌｌへの感染
１２９  ＳｖＪ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｉｂｒａｒｙ（東京大学医科学研究所  ヒト疾患モデル研究センター  細胞機能研究分野  岩倉洋一郎博士より分与）を軽く遠心し、上清２０  μｌ（約１００，０００プラーク分）を、１）で調整した大腸菌液６００  μｌに加え、３７  ℃で２０分間加温した。５０  ℃のＮＺＹ  ｔｏｐ  ａｇａｒｏｓｅに加え、３７  ℃に温めておいたＮＺＹプレートの上に流し混ぜ、３７  ℃で９時間培養し、直径約１  ｍｍのプラークを得た。以上の方法により１０プレート、合計１，０００，０００プラーク分を用意した。
【００４９】
３）λＦＩＸ  ＩＩ  ｐｈａｇｅ溶液のストック及びＤＮＡ抽出
４  ｍｌのＳＭ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１  Ｍ  ＮａＣｌ，  ８  ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ７．５，  ０．０１  ％  ｇｅｌａｔｉｎ）を各プレートに加え、４  ℃で３時間穏やかに振とうし、プラーク内のｐｈａｇｅをＳＭ  ｂｕｆｆｅｒ中に浮遊させた（以下、ライセートという）。ライセートを回収し、さらに１  ｍｌのＳＭ  ｂｕｆｆｅｒでプレートを洗い、回収した。４  ℃、３，０００  ｒｐｍで１０分間遠心して上清のｐｈａｇｅ浮遊液を回収し、１  ｍｌをとり、これにｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを数滴加えて４  ℃で保存した。
【００５０】
残りのライセート４  ｍｌに、等量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（ＳＭ  ｂｕｆｆｅｒ  １００  ｍｌ当たり２０  ｇのＰＥＧ  ６０００，１１．７  ｇのＮａＣｌ）を加え混和し、氷上で１時間インキュベートした。４℃、３，０００  ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを７５０  μｌのＬＢ  培地に懸濁し、Ｗｈａｔｒａｎ  ＤＥ  ５２（Ｗｈａｔｍａｎ，  Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を７５０  μｌ加え、３０回穏やかに転倒混和した。５，０００  ｒｐｍ，４  ℃で５分間遠心し，上清を回収した。１  ｍｌの上清に１．７５  μｌの０．１  ｍｇ／ｍｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋと，４２．５  μｌの１０  ％  ＳＤＳを加え，混和して室温で５分間静置した。さらに１７３  μｌの３  Ｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅを加え，８８  ℃で２０分間加熱した。次に氷上で１０分間静置し，４  ℃，１０，０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離し，回収した上清に等量の２−ｐｒｏｐａｎｏｌを加え，−８０  ℃で１０分間冷却した。一度室温に戻してから４  ℃，１０，０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離し，上清を除去した。ペレットを７０  ％  ｅｔｈａｎｏｌで洗浄し，真空条件下短時間でペレットを乾燥させ，ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒに溶解し、分光光度計Ｇｅｎｅ  Ｑｕａｎｔ  ＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて核酸濃度を測定した。
【００５１】
４）ＰＣＲによるイントロン配列の増幅
イントロン配列の増幅には，既知のラット卵巣２０α−ＨＳＤのゲノムＤＮＡ構造［Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８］を元に，エクソン２（Ｅ２），Ｅ４，Ｅ５上に下記のｐｒｉｍｅｒを設計し，Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてゲノムＤＮＡ断片の増幅を試みた。
Ｅ２Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ：    ５’−ＡＴＴＣＴＡＡＧＣＡＡＧＡＴＴＧＡＡＧＡ−３’（配列番号３）
Ｅ２Ｆ−ｕｐ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ＧＧＧＴＴＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＧＡＴＴＧ−３’（配列番号４）
Ｅ４Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ：    ５’−ＡＴＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡ−３’（配列番号５）
Ｅ５Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ：    ５’−ＣＴＣＣＡＧＴＴＧＴＣＴＡＣＧＧＴＴＡＡ−３’（配列番号６）
【００５２】
ＰＣＲ反応液の組成は，全量１００  μｌで，鋳型ＤＮＡとしてｐｈａｇｅから抽出したゲノムＤＮＡを１００  ｎｇ，０．５  μＭの各ｐｒｉｍｅｒ，０．２  ｍＭのｄＮＴＰ，１×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ，２．５  ＵのＥｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとした。ＰＣＲの反応条件は，９４  ℃で１分，６０  ℃（Ｅ２Ｆ−ｕｐ／Ｅ５Ｒ）あるいは５０  ℃（Ｅ２Ｆ／Ｅ４Ｒ）で１分，７２  ℃で１分を１  ｃｙｃｌｅとし，３０  ｃｙｃｌｅ行った。１０プレート分のｐｈａｇｅゲノムＤＮＡサンプルのうち，５サンプルから，Ｅ２Ｆ−ｕｐ／Ｅ５Ｒでは約３  ｋｂ，Ｅ２Ｆ／Ｅ４Ｒでは約２  ｋｂのゲノムＤＮＡ断片の増幅が見られた。
【００５３】
５）ＰＣＲ産物のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
上記４）でゲノムＤＮＡ断片が増幅されたサンプルの１つを取り，１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから切り出して精製し，塩基配列を決定した。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  （Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）により行った。ただしｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ反応に用いる鋳型ＤＮＡはＰＣＲ産物１００  ｎｇを用い，ｐｒｉｍｅｒは，ＰＣＲ反応で用いた下記のものを使用した。
Ｅ２Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ：    ５’−ＡＴＴＣＴＡＡＧＣＡＡＧＡＴＴＧＡＡＧＡ−３’（配列番号３）
Ｅ２Ｆ−ｕｐ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ＧＧＧＴＴＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＧＡＴＴＧ−３’（配列番号４）
Ｅ４Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ：    ５’−ＡＴＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡ−３’（配列番号５）
Ｅ５Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ：    ５’−ＣＴＣＣＡＧＴＴＧＴＣＴＡＣＧＧＴＴＡＡ−３’（配列番号６）
【００５４】
６）Ｐｒｏｂｅの作製
Ｌｉｂｒａｒｙのｓｃｒｅｅｎｉｎｇには，Ｅ２Ｆ／Ｅ４ＲによるＰＣＲで増幅した約２  ｋｂの，イントロン配列を含むゲノムＤＮＡ断片を１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから切り出してｐｒｏｂｅとして用いた。
【００５５】
７）ゲノムクローンλ２４３１のクローニング
ゲノムクローンの単離は，ｐｈａｇｅから抽出したゲノムＤＮＡをＰＣＲで解析し，２０α−ＨＳＤゲノムＤＮＡを含むｐｈａｇｅ溶液を特定する方法で５，０００プラーク内にまで絞り，ｐｌａｑｕｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。すなわち，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによりＥ２，Ｅ４，Ｅ５の塩基配列の存在を確認した後，このゲノムＤＮＡ断片を含むｐｈａｇｅが，まず上記１００，０００プラーク中に存在すると考えて，さらにそこから５０，０００プラークずつ４プレート分（２００，０００プラーク分）作製した。この４プレート由来のゲノムＤＮＡにつき，Ｅ２Ｆ／Ｅ４Ｒ  ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行ったところ，４プレートすべてにおいてＥ２からＥ４の約２  ｋｂのゲノムＤＮＡ断片が増幅された（２−１，  ２，  ３，  ４）。
Ｅ２Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ：    ５’−ＡＴＴＣＴＡＡＧＣＡＡＧＡＴＴＧＡＡＧＡ−３’（配列番号３）
Ｅ４Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ：    ５’−ＡＴＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡ−３’（配列番号５）
【００５６】
次に，そのうちの１プレートのｐｈａｇｅストック溶液から，１０，０００プラークずつ４プレートを作製し，同様にＥ２Ｆ／Ｅ４Ｒ  ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行ったところ，２プレートにおいて約２  ｋｂのゲノムＤＮＡ断片の増幅がみられた（２−４−３，  ４）。さらにそのｐｈａｇｅストック溶液を用いて，約５，０００プラークずつ９プレート，合計４５，０００プラークを作製して，ｐｌａｑｕｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。
【００５７】
８）Ｐｈａｇｅ  ＤＮＡのナイロンメンブレンへのｔｒａｎｓｆｅｒ
プラークのできたプレートの上に，直径１５  ｃｍのナイロンメンブレン（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ＋；  Ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  Ｃｈａｒｇｅｄ  Ｎｙｌｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｂａｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を載せ，１分間静置してｐｈａｇｅ  ＤＮＡをメンブレンに移し取った。同時にメンブレンの上からプレートに針で非対称に３ヶ所穴を開けて位置確認の目印とした。次にｐｈａｇｅ  ＤＮＡの付着した面を上にして，アルカリ変性液（０．５  Ｍ  ＮａＯＨ，  １．５  Ｍ  ＮａＣｌ）をしみこませた濾紙の上に載せ，１５分間静置してｐｈａｇｅ  ＤＮＡを１本鎖に変性させた。その後同様にして中和液（０．５  Ｍ  Ｔｒｉｓ，  ３  Ｍ  ＮａＣｌ，  ｐＨ  ７．０）をしみこませた濾紙の上にメンブレンを載せて１５分間静置した。得られたメンブレンを風乾し，ＧＳ  ＧＥＮＥ  ＬＩＮＫＥＲＴＭ  ＵＶ  ＣＨＡＭＢＥＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）内で１５０  ｍＪｏｕｌｅのＵＶを２回照射し，さらに８０  ℃で３０分間乾熱してｐｈａｇｅ  ＤＮＡをメンブレンに固定した。
【００５８】
９）Ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
メンブレンをｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５５  ℃，  ２×ＳＳＣ，  ０．１  ％  ＳＤＳ）中で１時間振とうさせ，メンブレンに付着している余分なａｇａｒｏｓｅや大腸菌蛋白を洗い落とした。メンブレンは，ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒが十分に行き渡るように，ｐｈａｇｅ  ＤＮＡ付着面にナイロンメッシュを挟み，メンブレン５枚につき，ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２．５×ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ，  ５×ＳＳＣ，  ５  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．１  ％  ＳＤＳ，  １００  μｇ／ｍｌ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ）１５  ｍｌを加えて４２  ℃で一晩加温した。
【００５９】
１０）Ｐｒｏｂｅの３２Ｐ  ｌａｂｅｌｉｎｇ
Ｐｒｏｂｅの３２Ｐ  ｌａｂｅｌｉｎｇには，Ｒａｎｄａｍ  Ｐｒｉｍｅｄ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。２５  ｎｇのｐｒｏｂｅ  用ＤＮＡに，α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｂａｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を５０  μＣｉ，ｄＣＴＰ以外の０．５  ｍＭ  ｄＮＴＰ，ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ入り１×ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ，ｋｌｅｎｏｗ  ｅｎｚｙｍｅを２  Ｕ加え，３７  ℃で３０分間加温した。得られた反応液を，３，０００  ｒｐｍで２分間遠心してｂｕｆｆｅｒを排出済みのカラム（ＴＥ  ＳＥＬＥＣＴ−Ｄ−５０，  ５  ｐｒｉｍｅ→３  ｐｒｉｍｅ，  ＵＳＡ）に通し，３，０００  ｒｐｍで４分間遠心して放射性標識されたオリゴヌクレオチドを精製した。１００  ℃で５分間加熱，急冷して熱変性させた後，１０万ｃｐｍ／ｍｌ  以上の活性を有するようにｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに加えた。
【００６０】
１１）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
Ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを除去し，ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２．５×ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ，  ５×ＳＳＣ，  ５  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．１  ％  ＳＤＳ，  １０  ％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ，  １００μｇ／ｍｌ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ）１５  ｍｌで置換し，３２Ｐで標識したｐｒｏｂｅを混ぜ加えて，４２  ℃で１２  時間加温した。
【００６１】
１２）Ｗａｓｈｉｎｇ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを除去し，ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５５  ℃，０．５×ＳＳＣ／０．１  ％  ＳＤＳで１０分間，５５  ℃，０．１×ＳＳＣ／０．１  ％  ＳＤＳで１０分間，６５  ℃，０．１×ＳＳＣ／０．１  ％  ＳＤＳで３０分間）でｗａｓｈした。次に，メンブレンをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）に−８０  ℃で２４時間感光させた。得られたＸ線フィルムを現像し，陽性シグナルを示すプラークを得た。
【００６２】
１３）ゲノムクローンλ２４３１のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）への組み込み
ゲノムクローンλ２４３１のｐｈａｇｅゲノムＤＮＡを，Ｎｏｔ  Ｉで切断し，ｐｈａｇｅ  ＤＮＡとインサートＤＮＡを切り離した。その切断産物を，インサートとベクターのモル比が３：１となるように調整して加え合わせ，Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）／Ｎｏｔ  Ｉ／ＢＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）に組み込んだ。ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓを、得られたｐｌａｓｍｉｄで形質転換し，Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）とＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を塗布したＬＢプレート（５０  μｇ／ｍｌ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを添加，以下ＬＢ／Ａｍｐプレート）で３７  ℃で一晩培養し，ｂｌｕｅ−ｗｈｉｔｅ  ｃｏｌｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎにより，白いコロニーを得た。いくつかのコロニーから大腸菌を少量培養してｐｌａｓｍｉｄを抽出し，Ｎｏｔ  Ｉによりインサートを切り出して，ゲノムＤＮＡの組み込みを確認した。
【００６３】
１４）  全長２０α−ＨＳＤ  ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡのクローニング
ゲノムクローンλ２４３１が，Ｅ１からＥ５までしか含んでいなかったことと，エレクトロポレーション後に組み換え体を検出する際にさらに外側の配列情報も必要であったことから，λ２４３１の時と同様な方法で，さらに４つのゲノムクローンを単離した。すなわち，プロモーター領域とＥ１に設計したｐｒｉｍｅｒｓ，
Ｐ２Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＡＡＧＧＧＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＴ−３’（配列番号７）
Ｅ１Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＡＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＴＴＡ−３’（配列番号８）
を用いてゲノムクローンλ１２１２を，Ｅ６とＥ７に設計したｐｒｉｍｅｒｓ，
Ｅ６Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＴＧＧＣＣＴＡＣＴＧＣＡＡＧＡＴＧＡＡＴ−３’（配列番号９）
Ｅ７Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＡＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡ−３’（配列番号１０）
を用いてλ９５２７を単離した。
【００６４】
ＰＣＲの反応条件は，基本的に全量１００  μｌに対し，ゲノムＤＮＡ  １００  ｎｇ，１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ，０．２  ｍＭのｄＮＴＰ，５０  ｐｍｏｌのｐｒｉｍｅｒ，２．５  ＵのＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの反応組成で行った。ゲノムクローニングに用いたＰＣＲのｐｒｉｍｅｒセット，アニーリング温度，Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの種類，ＰＣＲ産物の長さは，表２にまとめて示した。
【００６５】
【表２】
2004261075.tif 000003
【００６６】
さらに，λ１２１２，λ９５２７のＢａｍＨ  Ｉ切断により生成される，λ１２１２の５’端，λ９５２７の３’端断片をｐｒｏｂｅに用いて，各々λ６１１５，λ３２１７を単離した。
【００６７】
２．ベクターの作成の仕方
共通事項として，ライゲーション反応では，ベクターとインサートのモル比を１：３から１：５に調整し，Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを用いて１６  ℃で一晩反応させ組み込んだ。特記しないかぎりＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓを４２  ℃で４５秒間の反応によりライゲーション産物で形質転換し，ＬＢ／Ａｍｐプレートに播いて一晩３７  ℃で培養し，大腸菌コロニーからｐｌａｓｍｉｄを抽出して，制限酵素反応，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによりインサートを確認した。
【００６８】
制限酵素反応後には，ｐｈｅｎｏｌ抽出，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出，ｅｔｈａｎｏｌ沈殿を行ってＤＮＡを精製した。
【００６９】
制限酵素断片の末端平滑化は，基本的にＫｌｅｎｏｗ  Ｆｉｌｌ−ｉｎ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて行った。１  μｇのＤＮＡに，１×ｆｉｌｌ−ｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ（６  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ７．５，  ６  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ６  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．０５  ％  ｇｅｌａｔｉｎ，  １  ｍＭ  ＤＴＴ），各０．４  ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｎｏｔ  Ｉ断端の場合はｄＧＴＰとｄＣＴＰ，Ａｆｌ  ＩＩ断端の場合はｄＡＴＰとｄＴＴＰ，ＢａｍＨ  Ｉ断端の場合はｄＡＴＰとｄＴＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ），１０  Ｕのｋｌｅｎｏｗ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加えて全量を２５  μｌとして２２  ℃で２０分間反応させ，これに４７５  μｌの１×ＳＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  （１００  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ７．５，  １０  ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えてｐｈｅｎｏｌ抽出，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出，ｅｔｈａｎｏｌ沈殿により精製し，１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから切り出し精製した。
【００７０】
１）ＥＧＦＰ発現用カセットの作製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  ＩＩ  （＋）内に組み込まれているｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）とＥＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１由来）の連結遺伝子を，ＥｃｏＲ  ＩとＮｏｔ  Ｉで切り出し，ｐＥＧＦＰ−Ｎ１／ＥｃｏＲ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、  ＣＡ，  ＵＳＡ）にライゲーションし，下流にＳＶ４０  ｐｏｌｙ  Ａを連結した。ライゲーション産物でＪＭ  １０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓを形質転換し，ＬＢプレート（５０  μｇ／ｍｌ  ｋａｎａｍｙｃｉｎを添加）に播いて，３７  ℃で一晩培養して大腸菌のコロニーを得た。コロニーからｐｌａｓｍｉｄを抽出し，ＥｃｏＲ  ＩとＮｏｔ  Ｉで切断して約１  ｋｂのインサートを確認した（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１’）。
【００７１】
このｐｌａｓｍｉｄのＥＧＦＰの下端をＮｏｔ  Ｉで切断し，１  μｇのｐＥＧＦＰ−Ｎ１’／Ｎｏｔ  Ｉの断端を平滑化した。この１０  ｎｇを用いて，Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅにより全量１０  μｌにして１６  ℃で一晩反応させ，セルフライゲーションさせてＮｏｔ  Ｉサイトを破壊した（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１’）。
【００７２】
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１’をＡｆｌ  ＩＩで切断し，１  μｇを用いて，Ａｆｌ  ＩＩ断端を平滑化した。さらにこれをＥｃｏＲ  Ｉで切断し，１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから切り出した。このＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ断片を，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）／ＥｃｏＲ  Ｉ／ＥｃｏＲ  Ｖ／ＢＡＰにライゲーションした。得られたｐｌａｓｍｉｄをＥｃｏＲ  ＩとＳａｌ  Ｉで切断し，約１．５  ｋｂのＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ断片を確認した（Ｉ−ｐＢｓ）。
【００７３】
２）ＰＣＲによるＥ２への停止コドンの挿入
ゲノムクローンλ２４３１を鋳型にして，Ｅ２上流のイントロン上に
Ｓｔｏｐ−Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＧＧＡＴＴＡＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＧＧ−３’（配列番号１７）
Ｅ２上に停止コドン（下線部）とＢｇｌ  ＩＩ認識配列を含む
Ｓｔｏｐ−Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＧＣ−３’（配列番号１８）
を設計し，ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は，１０  ｎｇのλ２４３１に，１×ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ８．８，  ２  ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  １０  ｍＭ  ＫＣｌ，  １０  ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４，  ０．１  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １００  μｇ／ｍｌ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＢＳＡ），各々５０  ｐｍｏｌのｐｒｉｍｅｒ，０．２  ｍＭ  ｅａｃｈのｄＮＴＰｓ，５  Ｕのｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加えて全量１００  μｌとした。ＰＣＲの反応条件は，９４  ℃で３０秒，６２  ℃で１０秒，７２  ℃で３０秒を１  ｃｙｃｌｅとして，３５  ｃｙｃｌｅ行い，４  ℃で保存した。この約２５０  ｂｐのＰＣＲ産物を２  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）／ＥｃｏＲ  Ｖ／ＢＡＰにライゲーションした。ライゲーション産物はＢｇｌ  ＩＩで切断してｐｌａｓｍｉｄが直鎖状になることを確認した。さらにｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによりＥ２上の停止コドンを確認した。
【００７４】
３）Ｅ２の下流へのＩＲＥＳの連結
上記停止コドンの挿入されたＥ２を，Ｎｏｔ  ＩとＢｇｌ  ＩＩで切断し，２  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから約３００  ｂｐのインサートを切り出した。これを，Ｂｇｌ  ＩＩ断端とＢａｍＨ  Ｉ断端が結合することを利用して，Ｉ−ｐＢｓ／Ｎｏｔ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉにライゲーションし，得られたｐｌａｓｍｉｄを，Ｅ２上流のイントロン配列内のＥｃｏＲ  Ｖと，ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ下流のマルチクローニングサイト内のＳａｌ  Ｉで切断し，約１．７  ｋｂのインサートを確認した（Ｉ−ｐＢｓ’）。また、下記のＭ−１３  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとＭ−１３  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを用いたｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによっても確認した。
Ｍ−１３  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１９）
Ｍ−１３  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：          ５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号２０）
【００７５】
４）ネオマイシン耐性遺伝子の連結
ネオマイシン耐性（ｎｅｏｒ）遺伝子の組み込まれたｐＰＧＫ−ＮｅｏｂｐＡ（東京大学医科学研究所  ヒト疾患モデル研究センター  細胞機能研究分野  岩倉洋一郎博士より分与）を，Ｘｈｏ  ＩとＳａｌ  Ｉで切断後，１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌからＰＧＫプロモーターに連結したｎｅｏｒ遺伝子（約１．５  ｋｂ）を切り出した。これを，Ｘｈｏ  Ｉ断端とＳａｌ  Ｉ断端が結合することを利用して，Ｉ−ｐＢｓ’／Ｓａｌ  Ｉ／ＢＡＰにライゲーションし，得られたｐｌａｓｍｉｄを，ＥｃｏＲ  Ｉで切断して約３．３  ｋｂのインサートを切り出してｎｅｏｒ遺伝子の挿入方向を確認した。またＭ−１３  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとＭ−１３  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを用いたｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによっても確認した（Ｉ−ｐＢｓ’−ｎｅｏ）。
【００７６】
Ｉ−ｐＢｓ’−ｎｅｏを，Ｅ２上流のＢａｍＨ  ＩサイトとベクターのマルチクローニングサイトのＸｈｏ  Ｉで切断し，１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから約３．２  ｋｂのインサートを切り出して精製し，下記６）のステップに用いた。
【００７７】
５）ジフテリアトキシン遺伝子と５’側ｌｏｎｇ  ａｒｍの連結
ジフテリアトキシンＡ断片（ＤＴ−Ａ）遺伝子の組み込まれたｐＭＣ１ＤＴｐＡ（岡崎国立共同研究機関  生理学研究所  神経情報部門  八木健博士より分与）は、以下に述べる方法でＭＣ１プロモーターとジフテリアトキシンＡ遺伝子間のＢａｍＨ  Ｉサイトを破壊した。すなわち，ｐＭＣ１ＤＴｐＡをＢａｍＨ  Ｉで切断し，このＤＮＡ  １  μｇを用いて，ＢａｍＨ  Ｉ断端を平滑末端化した。この１５  ｎｇのｐＭＣ１ＤＴｐＡ／ＢａｍＨ  Ｉを，Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを用いてセルフライゲーションし，得られたｐｌａｓｍｉｄをもう一度ＢａｍＨ  Ｉと反応させ１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌで電気泳動し，未処理のｐＭＣ１ＤＴｐＡ／ＢａｍＨ  Ｉと長さを比較して，ＢａｍＨ  Ｉサイトが破壊されていることを確認した。
【００７８】
ＢａｍＨ  Ｉサイトを破壊したｐＭＣ１ＤＴｐＡを，Ｘｈｏ  ＩとＮｏｔ  Ｉで切断し，１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから約１．５  ｋｂのＤＴ−Ａ遺伝子を切り出して精製した。
【００７９】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）に挿入されたゲノムＤＮＡをＳａｌ  Ｉで切断してインサートを切り離し，そのままＢａｍＨ  Ｉにより切断した。１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから，Ｅ１を含み上端がＳａｌ  Ｉ断端，下端がＢａｍＨ  Ｉ断端の約５  ｋｂのＤＮＡフラグメントを５’  ｌｏｎｇ  ａｒｍとして切り出し精製した。これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）／ＢａｍＨ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉにライゲーションし，得られたｐｌａｓｍｉｄをＢａｍＨ  Ｉで切断して約８  ｋｂの直鎖状フラグメントの生成を確認した。このｐｌａｓｍｉｄをＸｈｏ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで切断し，１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから，Ｅ１を含み上端がＸｈｏ  Ｉ断端，下端がＢａｍＨ  Ｉ断端の約５  ｋｂのＤＮＡフラグメントを切り出し精製した。
【００８０】
上記約１．５  ｋｂのＤＴ−Ａ遺伝子と，約５  ｋｂの５’  ｌｏｎｇ  ａｒｍを，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）／Ｎｏｔ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉにトリプルライゲーションし，得られたｐｌａｓｍｉｄをＸｈｏ  Ｉで切断して，約５  ｋｂの５’  ｌｏｎｇ  ａｒｍと，ベクターとＤＴ−Ａ遺伝子が連結した約４．５  ｋｂのフラグメントの２つが切り出されることを確認した（ｐＤＴ−５’）。
【００８１】
６）ｐＴＶ−ＤＴ１の作製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）に挿入されたゲノムクローンλ２４３１を，ＢａｍＨ  Ｉで切断することによりＥ１と下流のイントロンを含む約５  ｋｂのゲノムＤＮＡ断片，その下流Ｅ２からＥ５の下流のイントロンを含む約４．５  ｋｂのゲノムＤＮＡ断片，その下流の，Ｅ５下流のイントロンとベクターを含む約５．４  ｋｂのゲノムＤＮＡ断片とに分けた。このうち両端がＢａｍＨ  Ｉ断片の約４．５  ｋｂのゲノムＤＮＡ断片を，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）／ＢａｍＨ  Ｉ／ＢＡＰにライゲーションし，得られたｐｌａｓｍｉｄは，Ｈｉｎｃ  ＩＩで切断してベクター／Ｅ２／イントロン２を含む約４  ｋｂの断片，Ｅ３／イントロン３を含む約８００  ｂｐの断片，Ｅ４／イントロン４を含む約１  ｋｂの断片，Ｅ５／イントロン５を含む約１．５  ｋｂの断片に分離してインサートの挿入方向を確認した（ｐＥ２−Ｅ５）。
【００８２】
３’  ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ用ゲノムＤＮＡには，上記約１．５  ｋｂの断片を用いたが，この断片の上流断端をＨｉｎｃ  ＩＩサイトからＸｈｏ  Ｉサイトに換えるため，一度ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）に組み込んだ。Ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＥ２−Ｅ５をＢａｍＨ  ＩとＨｉｎｃ  ＩＩで切断し，１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから，上流がＨｉｎｃ  ＩＩ断端，下流がＢａｍＨ  Ｉ断端である約１．５  ｋｂのゲノムＤＮＡ断片を切り出して精製し，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）／Ｈｉｎｃ  ＩＩ／ＢａｍＨ  Ｉにライゲーションした。得られたｐｌａｓｍｉｄを，再度ＢａｍＨ  ＩとＨｉｎｃ  ＩＩで切断してインサートを確認した（ｐＥ５）。Ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＥ５を，Ｘｈｏ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで切断し，１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌから，３’  ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ用の約１．５  ｋｂの断片を切り出して精製した。
【００８３】
この３’  ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ用の約１．５  ｋｂの断片と，上記４）で作製した約３．２  ｋｂの断片を，ｐＤＴ−５’／ＢａｍＨ  Ｉ（約９．５  ｋｂ）にトリプルライゲーションし，得られたｐｌａｓｍｉｄをＳａｌ  Ｉで切断し，Ｅ５を含む約１．５  ｋｂの断片が切り出すことにより，インサートの挿入方向を確認した（ｐＴＶ−ＤＴ１）。
【００８４】
７）ｐＴＶ−ＤＴ１へのジフテリアトキシンＡ遺伝子の再挿入
ターゲティングベクターは，上流のＤＴ−Ａ側のマルチクローニングサイト内Ｓａｃ  ＩＩにより直鎖状にするが，ベクターの両端はＥＳ細胞内のｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅの働きにより削られる可能性がある。ターゲティングベクターの３’端にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来の配列があるが，５’側のＤＴ−Ａ遺伝子には断端まで数塩基しかない。ＤＴ−Ａの作用の有無は，ＥＳ細胞のｓｃｒｅｅｎｉｎｇのネガティブ選別の効率に影響するため，さらにｐＴＶ−ＤＴ１の上流にもう一つＤＴ−Ａ遺伝子を繋いだ。
【００８５】
ｐＭＣ１ＤＴｐＡをＸｈｏ  Ｉで切断し，ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて断端を平滑化した。すなわち，１  μｇのｐＭＣ１ＤＴｐＡ／Ｘｈｏ  Ｉに，１×ｂｕｆｆｅｒを加えて全量を９  μｌにし，７０  ℃で５分間加熱した。これを３７  ℃に移して１  μｌのＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え，３７  ℃で５分間反応した。Ｐｈｅｎｏｌ抽出，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出，ｅｔｈａｎｏｌ沈殿後，５  μｌのＭｉｌｌＱ水に懸濁した。
【００８６】
あらかじめ７０  ℃で１０分間加熱し，徐冷してアニールさせたＮｏｔ  Ｉ  ｌｉｎｋｅｒ（ｐＮｏｔ  Ｉ  ８ｍｅｒ，ｐｄ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ））と，平滑末端化ｐＭＣ１ＤＴｐＡ／Ｘｈｏ  Ｉを，モル比１００：１で加え合わせ，全量５  μｌでライゲーションした。得られたｐｌａｓｍｉｄを，Ｎｏｔ  Ｉで切断して１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌで電気泳動し，ＤＴ−Ａ遺伝子が切り出されることを確認した。両端がＮｏｔ  Ｉ断端のＤＴ−Ａ遺伝子を，ｐＴＶ−ＤＴ１／Ｎｏｔ  Ｉ／ＢＡＰにライゲーションし，得られたｐｌａｓｍｉｄをＮｏｔ  Ｉで切断して，１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌで電気泳動し，ＤＴ−Ａ遺伝子が切り出されることを確認した（ｐＴＶ−ＤＴ２）。また，ｐＴＶ−ＤＴ２をＢａｍＨ  Ｉで切断し，その切断パターンから，ＤＴ−Ａ遺伝子は２つとも，２０α−ＨＳＤ遺伝子と逆向きに挿入されていることを確認した。
【００８７】
３．形質転換体の作成の仕方
１）ターゲティングベクターの希釈と無菌化
エレクトロポレーションに用いるターゲティングベクターｐＴＶ−ＤＴは，Ｓａｃ  ＩＩで切断し，ｐｈｅｎｏｌ抽出，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出後，ｅｔｈａｎｏｌ沈殿により精製し，７０  ％  ｅｔｈａｎｏｌで洗浄後，クリーンベンチ内で風乾し，１×ＰＢＳ（１  Ｌ当たりＮａＣｌ  ８  ｇ，  ＫＣｌ  ０．２  ｇ，  Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ  １．１５  ｇ，  ＫＨ２ＰＯ４  ０．２  ｇ）に懸濁して核酸濃度を測定して１  μｇ／μｌとなるように調整し，使用するまで４  ℃で保存した。
【００８８】
２）フィーダー細胞の培養と継代
ネオマイシン耐性遺伝子を導入したマウス胎子繊維芽細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ，フィーダー細胞）（東京大学医科学研究所  ヒト疾患モデル研究センター  細胞機能研究分野  岩倉洋一郎博士より分与）は，
フィーダー培地
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）
１０  ％  ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，  Ｂｉｏｓｅｒｕｍ）
１  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）
１×ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）
５０  μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（明治製菓，東京）
５０  Ｕ／ｍｌ  ペニシリンカリウム（明治製菓，東京）
を用いて０．１  ％  ｇｅｌａｔｉｎコートしたディッシュで培養した。凍結フィーダー細胞を３７  ℃で解凍し，フィーダー培地を１滴ずつ２  ｍｌ加え，さらに穏やかに懸濁しながら９  ｍｌまでメスアップし，１，０００  ｒｐｍ，４  ℃で５分間遠心して細胞を集めた。細胞を１  ｍｌのフィーダー培地によく懸濁してから，２０  ｍｌのフィーダー培地入りφ  １５ディッシュ（ＩＷＡＫＩ，千葉）に播き，３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件で培養した。継代は，コンフルエントに達したディッシュの培地を吸引除去し，１０  ｍｌの１×ＰＢＳで２回置換し，０．０５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎを３  ｍｌ加えて３７  ℃で約５分間反応させて細胞を剥がした。これに３  ｍｌのフィーダー培地を加えて細胞を遠沈管に回収し，さらに４  ｍｌのフィーダー培地を加えて回収し合わせて，１，０００  ｒｐｍ，４  ℃で５分間遠心して細胞を集め，１  ｍｌのフィーダー培地に懸濁し，血球計算盤で細胞数を数えて約１×１０６  ｃｅｌｌｓ／φ  １５ディッシュとなるように播いて，継代した。
【００８９】
０．０５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎは，２．５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を以下の組成のＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ溶液（１  Ｌ当たり）で希釈して作製した。
ＥＤＴＡ．Ｎａ２            ０．４  ｇ
ＮａＣｌ                ７．０  ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ        ０．３  ｇ
ＫＣｌ                ０．３７  ｇ
Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ          １．０  ｇ
ｔｒｉｚｍａ  ｂａｓｅ        ３．０  ｇ
【００９０】
ＥＳ細胞培養の下地に用いるフィーダー細胞は，予めマイトマイシンＣ（ＭＭＣ，  ＳＩＧＭＡ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）処理により増殖を抑制した。コンフルエントなφ  １５ディッシュのフィーダー培地を吸引除去し，ＭＭＣ培養液（フィーダー培地に１０  μｇ／ｍｌ  ＭＭＣを添加）を加え，３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件下で約２時間培養した。その後１０  ｍｌの１×ＰＢＳで３回洗浄し，０．０５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎを３  ｍｌ加えて３７  ℃で約５分間反応させて細胞を剥がした。これに３  ｍｌのフィーダー培地を加えて細胞を遠沈管に回収し，さらに４  ｍｌのフィーダー培地を加えて回収し合わせて，１，０００  ｒｐｍ，４  ℃で５分間遠心して細胞を集め，１  ｍｌのフィーダー培地に懸濁し，血球計算盤で細胞数を数えてφ  １０ディッシュ（ＩＷＡＫＩ，千葉）に約１．５×１０６  ｃｅｌｌｓずつ播いた。
【００９１】
３）エレクトロポレーション用ＥＳ細胞の培養と継代
エレクトロポレーションに用いる１２９系統由来のＥＳ細胞（Ｅ１４．１）（Ｄｒ．  Ｋｌａｕｓ  Ｒａｊｅｗｓｋｙ，  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｇｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙより分与）は，フィーダー細胞上で
ＥＳ培地
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）
１５  ％  ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，  Ｂｉｏｓｅｒｕｍ）
１  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）
１×ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）
５０  μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（明治製菓，東京）
５０  Ｕ／ｍｌ  ペニシリンカリウム（明治製菓，東京）
０．１  μＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１，０００  Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ，  ＥＳＧＲＯＴＭ，  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）
を用いて培養した。凍結ＥＳ細胞の解凍は，フィーダー細胞の時と同様に行ったが，遠心は８００  ｒｐｍで行った。集めた細胞をＭＭＣ処理フィーダー細胞６×１０５  ｃｅｌｌｓ入りのφ  ６ディッシュ（ＩＷＡＫＩ，千葉）に播き，３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件で培養した。ＥＳ細胞は，分化の開始に注意しながら，顕微鏡視野でＥＳ細胞の割合が約５０  ％以上に達すると継代した。継代方法はフィーダー細胞の方法と同様に行ったが，遠心は８００  ｒｐｍで行った。
【００９２】
４）エレクトロポレーション（電気穿孔法）
予め新しいＥＳ培地で３−４時間培養したＥＳ細胞の培地を除去し，１×ＰＢＳで２回洗浄後，０．０５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎを加えて３７  ℃，３分間反応させ，ディッシュ上でピペッティングによりｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌにしてから培地を加えて反応を停止した。８００  ｒｐｍ，４  ℃，５分間の遠心で細胞を回収し，１×ＰＢＳに懸濁して細胞数を数え，前細胞数からＭＭＣ処理した時のフィーダー細胞数を引いた数をＥＳ細胞数とした。もう一度遠心して１×ＰＢＳに懸濁し１．２５×１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍｌとし，うち０．８  ｍｌ（１×１０７  ｃｅｌｌｓ）をエッペンチューブにとり，２０  μｇのｐＴＶ−ＤＴ／Ｓａｃ  ＩＩを加えてキュベットへ移し，Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて２５０  Ｖ，５００  μＦの条件でエレクトロポレーションを行った。この時ターゲティングベクターを混合しないネガティブコントロールも用意した。室温に５−１０分間キュベットを静置し，２  ｍｌのＥＳ培地に懸濁してＭＭＣ処理済フィーダー細胞が敷かれているφ  １０ディッシュ（ＩＷＡＫＩ，千葉）に播き，３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件で培養した。
【００９３】
５）Ｇ４１８によるポジティブ選別
エレクトロポレーション後一晩培養してから，２５０  μｇ  （ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ）／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）入りＥＳ培地に交換し，７日間毎日培地交換を行って培養した。
【００９４】
６）Ｇ４１８耐性コロニーのｐｉｃｋ  ｕｐ
実体顕微鏡下で，ピペットマンを用いて，輪郭が滑らかで中心部に密な盛り上がりを観察できるコロニーをかきとって吸い上げ，予め１００  μｌの０．０５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎが入った９６穴プレートに移し，３７  ℃で３−５分間反応させた。４連ピペットマンを用いてコロニーをしっかりピペッティングしてほぐした後，予めＭＭＣ処理済フィーダー細胞６×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌが敷いてある２４  ｗｅｌｌプレートに移し，Ｇ４１８の入っていないＥＳ培地で３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件下培養した。エレクトロポレーションは合計２回行ったが，１回目（ｐＴＶ−ＤＴ１を用いた場合）では，Ｇ４１８選別後の５枚のφ  １０ディッシュから４２０個，２回目（ｐＴＶ−ＤＴ２を用いた場合）は同じく５枚のφ  １０ディッシュから７２０個の耐性コロニーをｐｉｃｋ  ｕｐした。
【００９５】
７）２４  ｗｅｌｌプレートでの培養
Ｐｉｃｋ  ｕｐしたＥＳ細胞の入った２４  ｗｅｌｌプレートは毎日培地交換し，１  ｗｅｌｌの面積の７０−８０  ％ほどにコロニーが増殖したものから順に，１  ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄後，１５０μｌの０．０５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎを加えて３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件で５分間反応させ，さらに１５０μｌのＥＳ培地を加えてピペッティングによりｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌにした。その１／６量（５０μｌ）を凍結保存用に，予めＭＭＣ処理済フィーダー細胞６×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌが敷いてある２４  ｗｅｌｌプレートに播き，残りをＳｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ用に，０．１  ％  ｇｅｌａｔｉｎコート済２４  ｗｅｌｌディッシュに播いて可能な限り増殖させた。
【００９６】
８）ＥＳ細胞の２４  ｗｅｌｌプレート内での凍結
１  ｗｅｌｌの面積の７０−８０  ％ほどにコロニーが増殖したら，ＥＳ培地とＤＭＳＯを９：１の割合で混合した凍結保存液を，培地除去した２４  ｗｅｌｌに０．２５  ｍｌずつ加え，プレートをキムタオルで包んで  −８０  ℃で凍結保存した。
【００９７】
９）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ用ＥＳゲノムＤＮＡの抽出
ＥＳ細胞の培地を除去し，１  ｍｌの１×ＰＢＳで３回洗浄後，１  ｗｅｌｌ当たり４００  μｌの０．５  ｍｇ／ｍｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ／ＳＥＴ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ８，  １００  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８，  ０．５  ％  ＳＤＳ）を加えてプレートを密閉し，５５  ℃で一晩ゆっくり揺らしながら細胞を溶解させた。細胞溶解液は，半量（２００  μｌ）をとり，ＭｉｌｌｉＱ水５００  μｌにメスアップしてから自動ＤＮＡ抽出機（ＫＵＲＡＢＯ，大阪）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００９８】
１０）制限酵素によるＥＳゲノムＤＮＡの消化
ＥＳ細胞のｓｃｒｅｅｎｉｎｇは制限酵素Ｐｓｔ  Ｉ消化による，３’  ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ側のｐｒｏｂｅ（３’  ｐｒｏｂｅ）を用いるＳｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより行った。３’  ｐｒｏｂｅにより相同組み換えを同定できたＥＳゲノムＤＮＡのみを，さらにＢｇｌ  Ｉ消化による５’  ｌｏｎｇ  ａｒｍ側のｐｒｏｂｅ（５’  ｐｒｏｂｅ），ＢａｍＨ  Ｉ消化によるネオマイシン耐性遺伝子ｐｒｏｂｅにより相同組み換えを確認した。
【００９９】
自動ＤＮＡ抽出機を用いて得られたゲノムＤＮＡは，５連チューブのまま，５０  μｌの１×ｂｕｆｆｅｒ  Ｈ，５０  ＵのＰｓｔ  Ｉ液を加えてパラフィルムで密封し，３７  ℃で一晩ゆっくり揺らしながら反応させた。
【０１００】
１１）電気泳動
蒸発により適度に液量の減少したＰｓｔ  Ｉ消化液を，そのまま１  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（１３．５×１３．５  ｃｍ）に，Ｂｇｌ  Ｉで反応したものは０．８  ％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（１３．５×１３．５  ｃｍ）にアプライし、３０  Ｖで６時間電気泳動した。
【０１０１】
１２）メンブレンへのｔｒａｎｓｆｅｒ
泳動後のｇｅｌを，２  μｇ  ／ｍｌのＥｔＢｒに浸して振とうさせながら５分間染色し，ＵＶ下ゲノムＤＮＡが消化されていることを確認した。次に蒸留水中で１０分間振とう洗浄し，ＥｔＢｒを除いた後，０．２５  Ｎ  ＨＣｌ中で１５分間振とうさせ，分子量の大きなＤＮＡを加水分解した。次に０．５  Ｍ  ＮａＯＨ／１．５  Ｍ  ＮａＣｌ中で１５分間振とうさせて２本鎖ＤＮＡを１本鎖にアルカリ変性させた。アルカリ変性はさらにもう１５分間溶液を交換して行った。Ｔｒａｎｓｆｅｒには，アルカリ変性液をそのまま用いた。メンブレン（Ｇｅｎｅ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ，  ＮＥＮ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）は使用前に１０分間ＭｉｌｌｉＱ水に浸しておき，気泡を除きながら泳動ｇｅｌの底面に重ね，キャピラリー法により，ｇｅｌの中のＤＮＡをメンブレンにｔｒａｎｓｆｅｒした。メンブレンはＧＳ  ＧＥＮＥ  ＬＩＮＫＥＲＴＭ  ＵＶ  ＣＨＡＭＢＥＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）内で１５０  ｍＪｏｕｌｅのＵＶを照射して，ＤＮＡをメンブレンに固定した後，さらに８０  ℃で３０分間加熱して固定し，４  ℃で保存した。
【０１０２】
１３）相同組み換え検出用ｐｒｏｂｅの作製
ゲノムクローンλ２４３１をＮｏｔ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで切断して約２．４  ｋｂのイントロン５以降のフラグメントを切り出し，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）／Ｎｏｔ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉ（ｐ３’）に組み込んだ。３’  ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ用ｐｒｏｂｅには，ｐ３’から，Ｐｓｔ  ＩとＢａｌ  Ｉ消化により約５００  ｂｐのフラグメントを切り出して用いた。ゲノムクローンλ６１１５も同様にＮｏｔ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで切断してプロモーター領域を含む約８  ｋｂのフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）／Ｎｏｔ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉに組み込み，ここからＫｐｎ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで切り出した約１．１  ｋｂのフラグメントを５’  ｌｏｎｇ  ａｒｍ用のｐｒｏｂｅとして使用した。また，ｐＰＧＫ−ＮｅｏｂｐＡからＸｈｏ  Ｉによりネオマイシン耐性遺伝子を切り出し，ｎｅｏｒ  ｐｒｏｂｅとして使用した。Ｇｅｌからの切り出しには，ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン，東京）を用いた。
【０１０３】
１４）Ｐｒｏｂｅの３２Ｐ  ｌａｂｅｌｉｎｇ及び精製
Ｐｒｏｂｅの３２Ｐ  ｌａｂｅｌｉｎｇには，ＲＡＮＤＯＭ  ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ  ＬＡＢＥＬＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭ（ＮＥＮ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を用いた。Ｐｒｏｂｅ用ＤＮＡ  ３０  ｎｇに，１×ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ，１×ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ，５０  μＣｉのα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ，１  Ｕのｋｌｅｎｏｗ  ｅｎｚｙｍｅを加えて全量３０  μｌとし，３７℃で１−３時間加温した。反応後７０  μｌのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ  ８）を加えて全量１００  μｌとしたものを，予めＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを通したＮＩＣＫＴＭ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＮＥＮ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）で精製した。Ｃｏｌｕｍｎには，ｐｒｏｂｅ反応液１００  μｌを含むＴＥ溶液４００  μｌを一度通した後，４００  μｌのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを通して回収したものを用いた。２  μｌのｐｒｏｂｅ精製溶液の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し，１０万ｃｐｍ／ｍｌ以上となるようにｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに加えた。Ｐｒｏｂｅは使用直前に１００  ℃で１０分間加熱後，急冷して用いた。
【０１０４】
１５）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
メンブレンを２×ＳＳＣになじませてから，１０  ｍｌのｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０  ％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，  ５×ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ，  ５×ＳＳＣＰ（７５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ８５  ｍＭ  Ｃ６Ｈ５Ｎ３Ｏ７，  ５２  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏ，  ５  ｍＭ  ＥＤＴＡ），  １  ％  ＳＤＳ，  ２００  μｇ／ｍｌ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ）を入れたＤＮＡボトルＬ（ＫＵＲＡＢＯ，大阪）に入れ，４２  ℃で一晩インキュベートした後，３２Ｐ標識されたｐｒｏｂｅを加えてさらに４２  ℃で一晩インキュベートした。
【０１０５】
１６）シグナルの検出
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを除去後ＤＮＡボトルに２×ＳＳＣ／０．１  ％  ＳＤＳを入れ，４２  ℃で１５分間の洗浄を２回行った。次にタッパー内で０．１×ＳＳＣ／０．１  ％  ＳＤＳに浸して振とうしながら６５  ℃で３０分間の洗浄を２回行った。メンブレンはハイブリバック内に密封し，ＩＭＡＧＩＮＧ  ＰＬＡＴＥ（ＩＰ，ＦＵＪＩＦＩＬＭ，神奈川）に一晩露光させた。ＩＰはＦＬＡ  ３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ，神奈川）により読みとり，ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ  Ｖｅｒ．３．１１を用いて解析した。
【０１０６】
１７）  相同組み換え体ＥＳクローンの解凍融解
２４  ｗｅｌｌ内の凍結細胞に，３７  ℃のＥＳ培地を０．５  ｍｌ加え，速やかに培地を吸引除去した。再度３７  ℃のＥＳ培地を０．５  ｍｌ加え，培地を十分溶かしてから吸引除去し，ＭＭＣ処理済フィーダー細胞６×１０４  ｃｅｌｌｓの入ったＥＳ培地を０．５  ｍｌ加えて一晩３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件で培養し，毎日培地交換した。１  ｗｅｌｌの面積の７０−８０  ％ほどにコロニーが増殖したら，ＭＭＣ処理済フィーダー細胞１×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの敷かれた６  ｗｅｌｌプレートの２  ｗｅｌｌに継代した。２４  ｗｅｌｌプレートの組み換えＥＳコロニーのｗｅｌｌを１  ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄後，０．０５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎを１５０  μｌ加え，３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件で５分間反応させた。これにＥＳ培地を１５０  μｌ加え，ピペッティングによりｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌにほぐし，１５０  μｌずつ１．９  ｍｌのＥＳ培地の入った６  ｗｅｌｌプレート２  ｗｅｌｌ分に播き，３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件で培養した。１  ｗｅｌｌの面積の７０−８０  ％ほどにコロニーが増殖したら，２  ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄し，０．５  ｍｌの０．０５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎを加え，３７  ℃で５分間反応させた。これにＥＳ培地を１  ｍｌ加えて細胞を回収し，さらに２  ｍｌのＥＳ培地で回収し，８００  ｒｐｍ，４  ℃で５分間遠心して細胞を集め，ＥＳ培地２  ｍｌに懸濁した。このうち０．２５  ｍｌ（１／８量）をさらにＭＭＣ処理済フィーダー細胞入り６  ｗｅｌｌプレート２  ｗｅｌｌに播いた。これは増殖を待って，１  ｗｅｌｌは染色体分析用に，１  ｗｅｌｌは凍結保存用に用いた。さらに０．２５  ｍｌ（１／８量）をＳｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ用のゲノムＤＮＡ回収用に０．１  ％  ｇｅｌａｔｉｎコート６  ｗｅｌｌプレート１  ｗｅｌｌに播き，可能な限り増殖させた。残りの１．５  ｍｌには，１．５  ｍｌの２×ｆｒｅｅｚｉｎｇ培地（３０  ％  ＦＢＳ，２０  ％  ＤＭＳＯをＥＳ培地に添加）を加え，１  ｍｌずつ凍結用チューブ３本に分注して−８０  ℃で凍結保存した。凍結保存用には，上記１  ｗｅｌｌ分のＥＳ細胞もあわせて５本を保存した。
【０１０７】
１８）  染色体分析（ｋａｒｙｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
あらかじめ２時間前に培地交換して増殖を促したＥＳ細胞（６  ｗｅｌｌプレート１  ｗｅｌｌ分）を，０．０２  μｇ／ｍｌコルセミド入りＥＳ培地で培地交換し，２時間３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件で培養した。２時間後，浮遊細胞を培地ごと回収し，１  ｍｌの０．１５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎで細胞表面を軽く洗い同じ遠沈管に回収した。もう一度１  ｍｌの０．１５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎを加え，３７  ℃，５  ％  ＣＯ２で５分間反応させ，ピペッティングによりｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌにして同じ遠沈管に回収した。これを８００  ｒｐｍ，４  ℃で５分間遠心して細胞を集め，ペレットをタッピングによりほぐした。これに２  ｍｌの０．５６  ％  ＫＣｌ溶液をタッピングしながら加えて懸濁し，３７  ℃で２０分間インキュベートした。冷固定液（ＣＨ３ＣＯＯＨ  ：  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ＝  １：３）を，最初の２  ｍｌはタッピングしながら，その後６  ｍｌの冷固定液を加え混ぜた。８００  ｒｐｍ，４  ℃で５分間遠心して細胞を集め，再び冷固定液５  ｍｌを加えて８００  ｒｐｍ，４  ℃で５分間の遠心を２回繰り返し，最後に冷固定液０．５  ｍｌに懸濁して４  ℃で保存した。
【０１０８】
固定ＥＳ細胞溶液をスライドグラスに滴下して展開し，速やかに乾燥させた。これをギムザ染色し，ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄後，風乾して顕微鏡で１細胞当たりの染色体数を１クローンにつき３０細胞数え，染色体数が４０本の細胞の割合を調べた。
【０１０９】
１９）  キメラマウスの作製
１９−１）マウスの系統
キメラマウスの作製は，集合キメラ法により行った。ＥＳ細胞と共培養する胚は，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの雌とＢＤＦ１（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＤＢＡ／２のＦ１）の雄との交配により得られた２．５日胚を用いた。ＥＳ細胞と集合させた３．５日胚を移植する仮親マウスには，精管切除したＩＣＲの雄と交配して偽妊娠させたＩＣＲマウスの雌を用いた。
【０１１０】
マウスは，明１２時間（８：００−２０：００），暗１２時間（２０：００−８：００）で飼育し，ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）環境下で飼育したものを用いた。ＰＭＳ（ＰＥＡＭＥＸ）及びｈＣＧ（ＰＵＢＥＲＯＧＥＮ）は，三共（東京）より購入した。麻酔は，１０  ％希釈ネンブタールを体重１  ｇ当たり０．０１  ｍｌ腹腔内注射した。胚の培養は，３７  ℃，５  ％  ＣＯ２条件下のＣＯ２インキュベーター内で行い，採卵・酸性タイロード処理など，ＣＯ２インキュベーター外での胚操作にはＭ２培地（Ｈｅｐｅｓ＋，ＳＩＧＭＡ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）を，採卵後の胚・集合胚のＣＯ２インキュベーター内での培養にはＭ  １６培地（Ｈｅｐｅｓ−，ＳＩＧＭＡ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）を用いた。
【０１１１】
１９−２）マウスの準備
４−５週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊの雌に交配の２日前の夕方（１７：００−１８：００）にＰＭＳ，交配直前（１６：００−１７：００）にｈＣＧをそれぞれ５  ＩＵ腹腔内投与し，過剰排卵させてＢＤＦ１の雄と交配した。翌朝膣栓形成を確認できたものを採卵用マウスとした。また，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの雌を交配した翌日に，６週齢以上のＩＣＲの雌の中から膣部分を見て発情しているものを選択し，精管切除したＩＣＲの雄と自然交配し，翌朝膣栓形成を確認して偽妊娠マウスとした。
【０１１２】
１９−３）ＥＳ細胞の準備
先に述べた方法でＭＭＣ処理済フィーダー細胞を準備し，その上に凍結保存していたＥＳ細胞を戻した。培地は毎日交換し，培養状態の良好なＥＳ細胞を０．０５  ％  ｔｒｙｐｓｉｎで弱く処理して解離させ，１０−２０個よりなるＥＳ細胞の塊を回収して，キメラマウスの作製に用いた。
【０１１３】
１９−４）採卵
膣栓形成確認後２日で，採卵用マウスを解剖し，卵管及び子宮をＭ２培地の中に取り出し，３０  Ｇの胚採取用シリンジを用いて灌流した。子宮は子宮頸のところから，卵管は卵管漏斗から灌流し，８細胞から桑実胚期にある２．５日胚を回収した。
【０１１４】
１９−５）集合キメラ法（ｓａｎｄｗｉｃｈ法）
シャーレに刺しゅう針で穴をあけ，Ｍ１６培地のドロップを作り，ミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ用，ＳＩＧＭＡ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）で覆ったものを用意した。酸性タイロード液（ｐＨ  ２．５）（１００  ｍｌ当たりＮａＣｌ  ０．８  ｇ，  ＫＣｌ  ０．０２  ｇ，  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０．０２４  ｇ，  ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ，  ｇｌｕｃｏｓｅ  ０．１  ｇ，  ＢＳＡ  ０．４  ｇ）で処理して透明帯を除去した２．５日胚２個と，解離させたＥＳ細胞の塊をその穴に落とし，２胚でＥＳ細胞を挟むようにして集合させて一晩培養した。
【０１１５】
１９−６）子宮内移植
翌日，１個の胚盤胞になったもの，及び桑実胚のままであるが１個の胚になって形の良いものを偽妊娠させた仮親マウスの子宮に移植した。仮親（偽妊娠）マウスの腹腔内にネンブタールを注射して麻酔をかけ，背中から筋層を開いて子宮部分を引き出した。実体顕微鏡下で２７  Ｇシリンジを用いて子宮に穴をあけ，その穴に移植用ピペットをさして３．５日胚を注入した。
【０１１６】
１９−７）帝王切開
移植の１７日後に生まれなかったものは帝王切開を行った。妊娠マウスを解剖し，子宮内の胎子を取り出してキムワイプでよく拭き，肺呼吸をさせた。新生子の体が赤くなり，よく動くようになるまで白熱灯下で暖めながら蘇生を行った。別の仮親が妊娠している場合にはそこに里子に出し，仮親がいない場合には，前日か当日に出産した他のマウスを里親にした。
【０１１７】
１９−８）キメラ率の判定
生まれたマウスの毛色は，生後１週間ぐらいでわかるようになり，宿主胚由来のものはｂｌａｃｋ色，ＥＳ細胞由来のものは由来する細胞により異なる色を呈する。キメラ率は，離乳時に，宿主胚由来の毛色の割合で判定した。
【０１１８】
１９−９）生殖系列キメラの判定
ＥＳ細胞は雄（ＸＹ）に由来する。６−８週齢に達したキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊの雌と交配し，子マウスの毛色で，生殖系列の判定を行った。本実験で用いたＥ１４．１  ＥＳ細胞に由来する生殖系列キメラの子は野生色（ａｇｏｕｔｉ）となる。２０匹以上の子マウスが黒色で，ａｇｏｕｔｉの子が産まれなかった場合には，生殖系列キメラでないと判定した。
【０１１９】
４．産子数、死亡率実験の仕方
マウスは室温２２±１℃，７：００−１９：００明期の光条件で飼育し，餌（ラボＭＲストック，日本農産工業，神奈川）および水は自由に摂取させた。
【０１２０】
１）マウスの系統
ノックアウト（ＫＯ）マウスは，キメラマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊとの交配によるヘテロ遺伝子型産子（Ｆ１，ａｇｏｕｔｉ）どうしを交配して得られた産子（Ｆ１Ｎ１）及び，Ｆ１Ｎ１どうしを交配して得られた産子（Ｆ１Ｎ２）を用いた。いずれも，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを戻し交配の対象とし，戻し交配回数が１回のＦ１である。
【０１２１】
２）妊娠マウスの作出
Ｆ１雌マウスは，Ｆ１雄マウスと交配し，膣栓を確認した日を０日として妊娠を誘起した。
【０１２２】
３）  統計処理
統計処理は全てＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて行った。危険率５  ％未満をもって統計的に有意であるとみなした。
【０１２３】
【発明の効果】
以上説明したとおり、本発明の２０α−ＨＳＤ遺伝子欠損マウスは、野生型マウスと比べて妊娠の進行や産子数には違いが見られないものの、産子の死亡率が有意に高い特徴を示す。そのため、母体内のステロイド代謝異常が産子の生存・発育に及ぼす影響を解明するうえでの優れた実験モデル動物となり得る。
【０１２４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】マウス２０α−ＨＳＤ遺伝子全長の構造を示す図。
【図２】本発明で作製したターゲティングベクター、および予想される相同組換え後の２０α−ＨＳＤゲノム領域を示す図。
【図３】野生型マウス同士もしくは２０α−ＨＳＤ遺伝子欠損マウス同士の交配によって得られた産子の数（上段）とその死亡率（下段）を示すグラフ図。
【図４】２０α−ＨＳＤ遺伝子の配列を示す図。
【図５】２０α−ＨＳＤ遺伝子の配列を示す図（図４のつづき）。
【図６】本発明で作製したターゲティングベクターを模式的に示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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