(57)【要約】　　　（修正有）【課題】耐熱性に優れた新規なアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、および該蛋白質をコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】６０℃以上の温度条件下において、アセチルオルニチンをアミノ基供与体とするアミノトランスフェラーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質であり、特定の塩基配列によってコードされる蛋白質等である。また上記の塩基配列又は上記塩基配列の一部からなるＤＮＡを含み、適切な宿主細胞に導入することにより上述の蛋白質を生産し得る染色体外増殖性環状ＤＮＡである。またそのＤＮＡによって形質転換された宿主細胞である。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
６０℃以上の温度条件下において、アセチルオルニチンをアミノ基供与体とするアミノトランスフェラーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列によってコードされる蛋白質、又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換され、他のアミノ酸残基が挿入され、若しくは他のアミノ酸残基が付加された蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
パイロコッカス属微生物に由来する他の蛋白質を実質的に含まないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の蛋白質。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列、又は配列番号１の塩基配列の一部からなるＤＮＡを含み、適切な宿主細胞に導入することにより請求項１〜３いずれかに記載の蛋白質を生産し得ることを特徴とする、染色体外増殖性環状ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡによって形質転換されたことを特徴とする宿主細胞。
【請求項６】
大腸菌Ｋ１２株又はその誘導体であることを特徴とする、請求項５に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、６０℃以上の温度条件下においてもアセチルオルニチンをアミノ基供与体としてアミノトランスフェラーゼ活性を有する新規な蛋白質（その誘導体を含む）、該蛋白質をコードする環状ＤＮＡおよびその利用法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（以下、ＡＣＯＡＴと略記）は、α位のアミノ基がアセチル化されたオルニチンのω位のアミノ基をα−ケトグルタル酸やピルビン酸などのケト酸やアルデヒド等に転移し、グルタミン酸やアラニン等のアミノ酸やアミンおよび末端のカルボキシル基がアルデヒドに還元されたアセチルグルタミン酸を合成する酵素で、医薬、農薬の合成中間体等に利用価値のある有用な酵素である。例えば降圧剤の中間体合成としてリジンのα位のアミノ基が修飾された化合物への利用が報告されている（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２７，６，３７６−３８９，２０００年）。これまでに報告されているＡＣＯＡＴとしてエッシェリヒア・コリ由来の酵素（Ｂｉｌｌｈｅｉｍｅｒ．Ｊ．Ｔ．ら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９５，４０１−４１３，１９７９年）、シュードモーナス・アエルギノーサ由来の酵素（Ｒｉｃｈａｒｄ．Ｖ．らＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２２，７９９−８０９，１９７５年）、クレブシーラ・アエロゲネス（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ．Ｂ．らＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３３，６８６−６９１，１９７８年）等が知られるが、これらはいずれも常温にて生育する生物由来であるために至適温度は高くない。そのため我々は至適温度が高いＡＣＯＡＴを求めて超好熱菌に着目した。
【０００３】
超好熱菌は安定性が高く、工業的に有用な酵素を探索する上で貴重な生物資源である。実際にいくつかの酵素については、同様の活性を有する中温菌由来のものに比べて著しく高い耐熱性を有しており、温度ストレスはもとより、温度以外の種々の物理化学的なストレスにも耐性が高く、一般的には酵素が失活したり反応が阻害されるような条件（例えば攪拌によって生じる強い機械的衝撃や高濃度の基質などの存在下、有機溶媒中による反応、酸やアルカリ条件下による反応、界面活性剤存在下による反応）でも反応をし得るものと期待される。
【０００４】
超好熱菌に由来するアミノトランスフェラーゼの報告例として、エアロパイラム・ペルニクスの酵素（特願２０００−３５７６３０号）、スルフォロバス・ソルファタリカスの酵素（Ｍａｒｉｎｏ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、１２３０５−１２３０９、１９８８年）、サーモコッカス・リトラリスの酵素（Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ，Ｇ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０、５４３−５４９、１９９４年）、パイロコッカス・フリオサスの酵素（Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ，Ｇ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　１２４７、９０−９６、１９９５年）、サーモコッカス・プロファンダスの酵素（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｔｈｅ　５ｔｈ　Ａｎｎｉｖｅｒｓａｒｙ　Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　要旨集２１−２６、１９９７年）、パイロコッカス・ホリコシイの酵素（Ｍａｔｓｕｉ，Ｉ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、４８７１−４８７９、２０００年）等が知られる。しかし、いずれの酵素もα−アミノ酸アミノトランスフェラーゼであるためアセチルオルニチンには作用せず、超好熱菌由来のＡＣＯＡＴは今まで知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、耐熱性に優れた新規なＡＣＯＡＴ、および該蛋白質をコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、パイロコッカス・フリオサスの菌体抽出物より、リジン、オルニチンおよび４−アミノ酪酸をアミノ基供与体にしてα−ケトグルタル酸からグルタミン酸が生成することを見出した。該知見よりパイロコッカス・フリオサスがファミリーＩＩＩに属するアミノトランスフェラーゼ（ＡＣＯＡＴやオルニチンアミノトランスフェラーゼ、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ等が含まれる）を含むことが示され、ＡＣＯＡＴに対する活性を持つ酵素遺伝子を探索した結果、パイロコッカス・フリオサスにＡＣＯＡＴ遺伝子を見出し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
即ち本発明は、６０℃以上の温度条件下において、アセチルオルニチンをアミノ基供与体とするアミノトランスフェラーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質である。また本発明は、配列番号１の塩基配列、又は配列番号１の塩基配列の一部からなるＤＮＡを含み、適切な宿主細胞に導入することにより、上述の蛋白質を生産し得ることを特徴とする、染色体外増殖性環状ＤＮＡである。さらに本発明は、上述のＤＮＡによって形質転換されたことを特徴とする宿主細胞である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の蛋白質は、６０℃以上の温度条件下において、アセチルオルニチンをアミノ基供与体とするアミノトランスフェラーゼ活性を有するものである。このような蛋白質としては特に限定されるものではないが、例えば配列番号１の塩基配列によってコードされる蛋白質、又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換され、他のアミノ酸残基が挿入され、若しくは他のアミノ酸残基が付加された蛋白質があげられる。配列番号１の塩基配列によってコードされる蛋白質は、本発明によって明らかになったパイロコッカス・フリオサスのＡＣＯＡＴであり、より具体的には、例えば後述するように配列番号５のアミノ酸残基配列からなる蛋白質を含むものである。これらの蛋白質は、パイロコッカス属微生物に由来する他の蛋白質を実質的に含まないことが好ましい。
【０００９】
配列番号１の塩基配列、即ちパイロコッカス・フリオサスのＡＣＯＡＴをコードするＤＮＡは、パイロコッカス・フリオサス染色体ＤＮＡの特定の領域を異種遺伝子発現系で発現しやすいよう、超好熱菌エアロパイラム・ペルニクスの酵素を組換え大腸菌にて発現させた例（特願２０００−３５７６３０号）を参考に、改変することにより得ることができる。より具体的には、例えば配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、パイロコッカス・フリオサスの染色体ＤＮＡを材料にＰＣＲ法を実施して特定領域のＤＮＡを増幅し、これを制限酵素ＳａｃＩとＢａｍＨＩで処理した後に、配列番号４のオリゴヌクレオチドをその５’末端側に付加することによって得ることができる。ここで、配列番号４よりなるオリゴヌクレオチドの付加は、予め染色体外増殖性環状ＤＮＡ上に該配列を配置することによって達成することもできる。またこの配列番号４よりなるオリゴヌクレオチドは、その５’末端に位置するＡＴＧ配列が翻訳開始メチオニンとして認識されやすいように上記プラスミドと連結されていることが望ましい。
【００１０】
配列番号２及び３をプライマーＤＮＡとしてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩとＢａｍＨＩで処理した後、配列番号４である人工的な配列をパイロコッカス・フリオサスのゲノムＤＮＡにある配列に連結させることにより融合蛋白質として発現させるように設計し、これらの配列を含む染色体外増殖性環状ＤＮＡを宿主に導入することが、本発明のアミノトランスフェラーゼ活性のある蛋白質を大量に製造するうえで好ましいのである。
【００１１】
染色体外増殖性環状ＤＮＡの構築から形質転換宿主細胞の培養、そして蛋白質の発現に至る操作は遺伝子工学の分野における常法を採用することができ、プラスミドの種類や宿主細胞の選択、蛋白質の発現方法等は適宜選択可能である。例えば、染色体外増殖性環状ＤＮＡであるプラスミドベクターとしては、ｐＵＣ１８／１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４等を例示することができる。また宿主細胞としては、例えば大腸菌Ｋ１２株や、その誘導体であるＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、Ｗ３１１０、Ｃ６００等を例示できる。
【００１２】
この形質転換された宿主細胞を用いて、本発明のアミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質が生産されるが、用いられる培地は菌株が増殖し得るものであればいずれを使用してもよく、このとき使用する培地として、炭素源にはグルコース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロールなどが、窒素源には肉エキス、ペプトン、トリプトン、酢酸アンモニウムや硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等などが、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩やＮａＣｌなどが、金属イオンには硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸第一鉄・７水和物、塩化カルシウム・２水和物などが使用できる。また、培地には酵母エキス、ビタミン類などを添加することもできる。
【００１３】
培養は通気撹拌、振とうによって好気的条件で行なうことが好ましく、ｐＨは５〜９の範囲に調整する。ｐＨの調整に使用するアルカリとしてはアンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アミン化合物など任意のものが使用でき、酸としては塩酸、硫酸、リン酸などが使用できる。培養時間は酵素の生成量が最大になるまで行なうことが好ましく、１２時間〜７２時間程度が好ましい。培養温度としては２０〜４０℃付近が好ましく、培地中の溶存酸素濃度は５〜５０％付近が好ましい。また、必要に応じて酵素の誘導処理を行なうこともできるが、その際使用する誘導剤としては糖類やその誘導体のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などが使用できる。
【００１４】
このようにして培養した培養液より菌体を回収するが、回収方法としては遠心分離やろ過などを用いることができる。回収した菌体を緩衝液に懸濁し破砕するが、使用する緩衝液は酵素が安定に抽出されればいずれの緩衝液でもよく、例えばリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などがあげられる。濃度やｐＨについても同様に酵素が安定に抽出されればいずれの濃度やｐＨでもよいが、好ましくは濃度は１０〜２００ｍＭ、ｐＨは５〜９である。また必要に応じてキレート剤のＥＤＴＡや酸化防止剤のα−メルカプトエタノールやジチオスレイトールを添加できる。菌体の破砕は浸透圧ショックや超音波処理、フレンチプレス処理、マントン・ゴーリン・ホモジナイザー処理などの通常の方法によって処理できる。
【００１５】
得られた酵素抽出液に対し１回目の加熱処理を行なうが、それに先立ち酵素の安定化剤を添加することが好ましく、アミノトランスフェラーゼにはピリドキサールリン酸やピリドキサミンリン酸、α−ケトグルタル酸などが挙げられる。熱処理条件は目的とする本発明の蛋白質がなるべく安定に回収される条件がよく、好ましくは温度が６０〜１００℃、時間が１０〜１２０分である。また必要に応じて得られた蛋白質を沈殿法や膜を用いて濃縮したり、あるいは透析によって低分子化合物を除去したりすることもできるが、沈殿法による濃縮はアセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ポリエチレングリコールなどの有機溶媒や硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの無機塩による塩析が使用できる。膜を用いた濃縮は限外ろ過膜など用いることができ、膜を用いた透析は市販の透析膜が使用できる。その際に使用する膜の分画分子量は目的の蛋白質が膜外に溶出しなければいずれをも使用できる。
【００１６】
沈殿法による濃縮を行なった場合は緩衝液に再溶解し、不溶物がある場合は遠心分離あるいはろ過により除去し、２回目の加熱処理を行なう。２回目の加熱処理条件は１回目と同様に蛋白質が安定に保たれればいずれの条件でもよいが、１回目より高い温度もしくは長い時間で処理すればより多く夾雑蛋白質を除くことができる。
【００１７】
得られた蛋白質溶液を透析や市販の脱塩カラムにより脱塩を行ない、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを用いることにより更に高純度に精製することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
実施例１　パイロコッカス・フリオサスの培養
市販の培地（商品名；マリンブロス２２１６、Ｄｉｆｃｏ社製）を１リットル容のメジュームビンに３７．４ｇ取り、純水１リットルを加えて溶解し、更に少量のリサズリンを酸化還元指示薬として加えて１２０℃で２０分間加圧滅菌した。滅菌後、薬サジ一杯分の元素硫黄粉末を加え、窒素雰囲気下で密栓して９７℃に加熱した。この溶液に２％の２−メルカプトエタノールをリサズリンの赤色が消失するまで滴下し、さらにパイロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８株を植菌して９７℃で一晩培養を行なった。
【００２０】
培養終了後、室温まで培養液を冷却し、残存する元素硫黄及び硫黄酸化物の沈殿を培養液を傾斜させて分離、除去し、８０００回転、２０分の遠心分離により微生物菌体を回収した。
【００２１】
実施例２　パイロコッカス・フリオサスの菌体抽出液からの酵素活性測定
実施例１で得られた菌体の一部を５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）に懸濁し、超音波で菌体の破砕を行ない、遠心分離により沈殿を除去した。得られた上清を分画分子量１２０００〜１４０００の膜にて一晩透析（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６））を行なったのち、ピリドキサールリン酸を１ｍＭの濃度になるよう加えた。酵素反応はアミノ基受容体にα−ケトグルタル酸、アミノ基供与体にＬ−リジン塩酸塩、Ｌ−オルニチン塩酸塩または４−アミノ酪酸をそれぞれ２０ｍＭの濃度で用い、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）中、７０℃６０分間保温した。この溶液１０μｌを取り、エタノール３５μｌ、トリエチルアミン５μｌ、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）５μｌを加え、室温で２０分間反応させたのち、デシケーター内で９０分間減圧乾固させ、一部を高速液体クロマトグラフィー（Ｔｓｋ−ｇｅｌ　ＯＤＳ−８０ＴＭ、商品名、東ソー（株）製を使用）によって生成したグルタミン酸を定量した。
【００２２】
溶離液として０．１４Ｍ酢酸ナトリウム−０．０５％トリエチルアミン（ｐＨ６．３５）を用い、アセトニトリルの直線濃度勾配で溶出させ、２５４ｎｍでの吸光度で検出を行ない、１分間に１μｍｏｌｅのグルタミン酸を生成する活性を１Ｕとした。その結果、表１に示すようにパイロコッカス・フリオサスの菌体抽出液を用いて、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、または４−アミノ酪酸をアミノ基供与体としてα−ケトグルタル酸からグルタミン酸の生成が確認された。また酵素活性の高い順はＬ−オルニチン、Ｌ−リジン、４−アミノ酪酸だった。
【００２３】
【表１】
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実施例３　パイロコッカス・フリオサス染色体ＤＮＡの調製
実施例１で得られた菌体の一部を１ｍｌのＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。これに１０％ＳＤＳを０．１ｍｌ加えて室温に１０分間静置し、溶菌させた。
【００２４】
これに水相と等容のフェノール−クロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）を加えて穏やかに攪拌し、遠心操作によって水相を回収した。この操作を３回繰り返した後、水相と等容のクロロフォルムによる抽出を行なった。得られた水相に２．５容のエタノールを加え、室温で１０分間静置した後、遠心によって核酸を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、再度遠心して核酸をペレットとして回収し、これを４００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解した。
【００２５】
この溶液に１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（あらかじめＤＮａｓｅを熱処理により除去）を最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように２μｌ加え、３７℃で１時間保温した。これに２０％ＰＥＧ６０００／２．５ＭＮａＣｌを２４０μｌ加えてから０℃で２時間静置した。これを４℃で遠心し、ペレットを７０％エタノールで洗浄して再度遠心した。得られたペレットを乾固させた後４００μｌのＴＥ緩衝液に溶解してＤＮＡ標品とした。これにより１４０μｇのＤＮＡが回収された。
【００２６】
実施例４　ＰＣＲによる特異的ＤＮＡ配列の増幅
実施例３で得られた染色体ＤＮＡを鋳型として特定の配列をもつＤＮＡを以下の手順により増幅した。まずプライマーとしては、増幅させようとするＤＮＡ配列に相当する配列を２０ないし２５塩基含み、かつその５’側に適当な制限酵素認識配列と、さらにその５’側に１ないし３塩基の余分な配列を持つように設計した。この余分な配列は制限酵素が効率的に働くことを助けるものであり、その配列と長さは用いる制限酵素によって異なる。ＳａｃＩについてはＡＴＣＣなる４塩基、ＢａｍＨＩについてはＣＧよりなる２塩基が付加することにより制限酵素が十分に切断活性をもつことが知られているので（ＮＥＢ社カタログ）、これを用いることにした。すなわち配列番号２及び３よりなるＤＮＡ配列をプライマーとすることに決定し、これらのオリゴヌクレオチドを常法により合成した。
【００２７】
配列番号２
５’　ＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＴＡＡＧＧＣＴＣＧＴＡＡＡＡ　３’
（下線部はＳａｃＩの切断部位を示す）
配列番号３
５’　ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＴＴＣＣＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡ３’
（下線部はＢａｍＨＩの切断部位を示す）。
【００２８】
ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）を用い、以下の手順で行なった。すなわち１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液（宝酒造製）を１０μｌ、各２．５ｍＭになるように調製されたｄＮＴＰ混合溶液を８μｌ、鋳型となる染色体ＤＮＡ標品を３５０ｎｇ、上記プライマーＤＮＡを各々１００ｐｍｏｌ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ加えて、全量を１００μｌとした。Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを用いて、＜９４℃、２０秒−６０℃、６０秒−７２℃、１２０秒＞のサイクルを３０回繰り返し、その後７２℃、１０分の伸長反応を行なって終了させた。その一部を１．０％アガロースで分析することにより、約１４００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることが観察された。この反応によって得られたＤＮＡ量は約１０μｇであった。
【００２９】
実施例５　組換え大腸菌の作製
実施例４で得られたＤＮＡを常法に従いフェノール−クロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）抽出で除蛋白し、次いでクロロフォルムによる抽出を行なった。エタノール沈殿により回収したＤＮＡのうち５μｇに６ＵのＳａｃＩと６ＵのＢａｍＨＩによる酵素消化を各々３７℃で９０分間行なった。一方、５μｇのプラスミドｐＵＫ０２−Ａ３（特開平３−１５５７８８号参照）ＤＮＡを用いて、これを同様に６ＵのＳａｃＩと６ＵのＢａｍＨＩで各々３７℃で２時間酵素消化を行なった。こうして得られた両方の酵素消化物を１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。
【００３０】
次に前記ｐＵＫ０２−Ａ３由来の４ｋｂｐ断片とＰＣＲ産物の１．２ｋｂｐ断片を等モル混合し、ライゲーション反応に供し、ｐＰＦＯＡＴ４を得た。ｐＰＦＯＡＴ４を図１に示す。図中、Ａ３／ｌａｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒは大腸菌Ｔ３ファージＡ３プロモーターと大腸菌ｌａｃオペレーターとの融合プロモーターを、ＳａｃＩは制限酵素ＳａｃＩの切断部位を、ＢａｍＨＩは制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位を、ＰｓｔＩは制限酵素ＰｓｔＩの切断部位を、ＥｃｏＲＶは制限酵素ＥｃｏＲＶの切断部位を、ＡＣＯＡＴはパイロコッカス・フリオサスのＡＣＯＡＴがコードされている領域を、ｒｒｎＢ　Ｔ１Ｔ２は大腸菌ｒｒｎＢオペロンの転写終結シグナルを、Ａｍｐはアンピシリン耐性の遺伝子を、Ｏｒｉはプラスミドの複製開始部位を、そしてｌａｃＩｑは大腸菌のｌａｃリプレッサーバリアントの遺伝子をそれぞれ示す。これを常法に従って大腸菌ＪＭ１０９に導入した。形質転換菌は５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む寒天培地で選択し、生じたコロニーからプラスミドを常法によって抽出、分析することにより、約１．４ｋｂｐのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ挿入断片を有するプラスミドを保有する菌株を同定した。これをＪＭ１０９／ｐＰＦＯＡＴ４と呼び、以下の実験に供した。
【００３１】
実施例６　酵素の調製
実施例５で得られた組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＰＦＯＡＴ４を２００ｍｌ容のバッフル付き３角フラスコを用い５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）４０ｍｌで３４℃で１４時間振とう培養を行なった。この培養液３０ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ４Ｙ培地（１％バクトトリプトン、２％バクトイーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）３リットルに植菌し、５リットル容の発酵槽を用いて３０℃で２０時間好気的培養を行なった。この培養物を常法に従って菌体を集めると５３ｇであった。集めた菌体を１５０ｍｌの５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で洗浄後、同じ緩衝液２００ｍｌで再度懸濁し、超音波で菌体の破砕をなった。この菌体破砕物にピリドキサールリン酸を１ｍＭの濃度になるよう加え、７０℃の湯浴にて３０分間浸し熱処理を行なった。生じた沈殿物を遠心分離により除去し、上清を回収した。
【００３２】
得られた上清に硫酸アンモニウムを８０％飽和濃度になるようゆっくり添加し、生じた沈殿を遠心分離により回収した。この沈殿物を２０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に溶解し、８０℃の湯浴にて２０分間浸し生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を回収した。得られた上清を分画分子量１２０００〜１４０００の膜にて一晩透析（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６））を行ない、市販のゲル（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ、商品名、東ソー（株）製）により分画し、ＳＤＳ−ポリクリルアミドゲル電気泳動による分析にて目的の蛋白質を含む画分を回収した。得られた画分を濃縮後、高速液体クロマトグラフィーによるイオン交換（ＴＳＫ−ｇｅｌ　ＤＥＡＥ−５ＰＷ、商品名、東ソー（株）製を使用）、高速液体クロマトグラフィーによるゲルろ過（ＴＳＫ−ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷＸＬ、商品名、東ソー（株）製を使用）による分画を順次行い、ＳＤＳ−ポリクリルアミドゲル電気泳動による分析にて目的の蛋白質を含む画分を回収した。
【００３３】
実施例７　組換え体の酵素活性測定
２０ｍＭのＬ−アラニン及び２０ｍＭのα−ケトグルタル酸を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）中７０℃６０分間保温し酵素反応を行ない、等量の１Ｎ酢酸水溶液を加え反応を停止させた。この溶液１０μｌを取り、エタノール３５μｌ、トリエチルアミン５μｌ、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）５μｌを加え、室温で２０分間反応させたのち、デシケーター内で９０分間減圧乾固させ、一部を高速液体クロマトグラフィー（ＴＳｋ−ｇｅｌ　ＯＤＳ−８０ＴＭ、商品名、東ソー（株）製を使用）によって生成したグルタミン酸を定量した。溶離液として０．１４Ｍ酢酸ナトリウム−０．０５％トリエチルアミン（ｐＨ６．３５）を用い、アセトニトリルの直線濃度勾配で溶出させ、２５４ｎｍでの吸光度で検出した。１分間に１μｍｏｌｅのグルタミン酸を生成する活性を１Ｕとした。実施例６で得られた酵素の活性は０．６３Ｕ／ｍｇだった。
【００３４】
実施例８　酵素活性の温度プロファイル
実施例７に記載した酵素反応を５０、６０、７０、８０、９０、１００℃の各温度で行ない、温度による活性の変化を図２に示した。図中、横軸は反応温度（℃）、縦軸は相対活性（％）である。その結果本酵素は６０℃の温度において最も高い活性を有していた。
【００３５】
実施例９　酵素活性のｐＨプロファイル
実施例７に記載した酵素反応をｐＨ５．１から１０．３の間で行ない、ｐＨによる活性の変化を図３に示した。図中、横軸はｐＨ、縦軸は相対活性（％）である。その結果本酵素は７．３から１０．３の間で高い活性を有していた。
【００３６】
実施例１０　アミノ基供与体に対する基質特異性
アミノ基受容体をα−ケトグルタル酸として、表２に記載した化合物をアミノ基供与体に用いて実施例７に記載した酵素反応を行なった。その結果、表２に示すように本酵素は様々なアミノ酸に作用し、アセチルオルニチンに対して最も高い活性を示した。
【００３７】
【表２】
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実施例１２　アミノ基受容体に対する基質特異性
アミノ基供与体をアセチルオルニチンに固定し、表３に記載した化合物をアミノ基受容体に用いて実施例７に記載した酵素反応を行なった。その結果、表３に示すように本酵素はα−ケトグルタル酸よりもピルビン酸に対して高い活性を示した。
【００３８】
【表３】
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【発明の効果】
本発明によって至適温度が高いＡＣＯＡＴをコードするＤＮＡが新規に提供される。このＤＮＡを使用することにより、安価かつ安定的に、大量のＡＣＯＡＴを製造することや、天然に存在するＡＣＯＡＴのアミノ酸残基の一部を置換等した変異型ＡＣＯＡＴを製造することが可能となる。
【００３９】
本発明は更に、前記ＡＣＯＡＴを用いることにより、医薬品あるいは農薬等の原料として重要なω−アミノ酸やアミノ化合物を安価に製造することが可能となる。
【００４０】
前記した本発明の蛋白質は、６０℃以上の温度条件下でもＡＣＯＡＴ活性を発現し得るものである。このように高い至適温度を有する酵素は、一般的な酵素が失活したり反応が阻害されるような温度以外の条件、例えば攪拌によって生じる強い機械的衝撃や高濃度の基質などの存在下等においても高い耐性が期待できることから、産業的な有用性が高い。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＰＦＯＡＴ４の概要を示す図である。
【図２】実施例８で得られた反応温度と相対活性との関係を示す図である。
【図３】実施例９で得られたｐＨと相対活性との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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