(57)【要約】【課題】酵素の固定化方法、この方法により製造された架橋結合され固定化された酵素結晶、固定化された酵素の貯蔵、取り扱いおよび処理性質を改良する手段、並びに希望する生成物の製造方法を提供すること。【解決手段】本発明は、１）ａ）少なくとも１種の適切に選択された基質と基質上で作用し且つ架橋結合され固定化された酵素結晶の形状である少なくとも１種の酵素とを組み合わせ、そしてｂ）段階（ａ）で製造された組み合わせ物を酵素が基質上で作用するのに適している条件下に保ち、それにより選択された生成物を製造することを含んでなる、選択された生成物を製造するための酵素で触媒作用を受ける方法を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋された蛋白質結晶であって、該架橋された蛋白質結晶は、外因性蛋白分解に対する抵抗性を有し、その結果、或る濃度のプロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ；登録商標）の存在下で３時間インキュベーションした後の分解によって測定したとき、その安定性の少なくとも９１％が保持されるものであり、該プロナーゼの濃度は、同じ条件で分解によって測定したときに、結晶化されると該架橋された蛋白質結晶を形成する可溶性の未架橋型の蛋白質の安定性を少なくとも９４％失わせるようなものであることを特徴とする、多官能性架橋剤を用いて架橋された蛋白質結晶。
【請求項２】
蛋白質：プロナーゼ（登録商標）のモル比が１：４０である請求の範囲第１項に記載の架橋された蛋白質結晶。
【請求項３】
架橋された蛋白質結晶であって、該蛋白質結晶は、５０％（ｖ：ｖ）の混合水性／有機性溶媒中での少なくとも１時間のインキュベーションの後の、結晶化すると該架橋された蛋白質結晶を形成する該蛋白質の可溶性型の半減期活性より大きい半減期活性を、５０％（ｖ：ｖ）の混合水性／有機性溶媒中での少なくとも１時間のインキュベーションの後に有する程度まで、変性に対して抵抗性である、架橋された蛋白質結晶。
【請求項４】
架橋された蛋白質結晶であって、結晶化すると該架橋された蛋白質の結晶を形成する蛋白質の可溶化型より、高温においてより大きな安定性を有する、架橋された蛋白質結晶。
【請求項５】
前記高温が少なくとも６５℃である、請求の範囲第４項に記載の架橋された蛋白質結晶。
【請求項６】
架橋された蛋白質結晶であって、結晶化して架橋された該蛋白質の結晶を形成する蛋白質の可溶化型と比較して、増強されたｐＨ活性プロフィールを有する、架橋された蛋白質結晶。
【請求項７】
架橋された蛋白質結晶であって、結晶化して架橋された該蛋白質の結晶を形成する蛋白質の可溶化型より、アルカリ性ｐＨにおいてより大きな安定性を有する、架橋された蛋白質結晶。
【請求項８】
架橋された蛋白質結晶であって、結晶化して架橋された該蛋白質の結晶を形成する蛋白質の可溶化型の、少なくとも５０％の触媒活性を有する、架橋された蛋白質結晶。
【請求項９】
該結晶が微小結晶（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａ１）である請求の範囲第１、３、４、６又は８項の何れか１項に記載の架橋された結晶。
【請求項１０】
該結晶が約１０−１ｍｍの断面を有する請求の範囲第９項に記載の架橋された結晶。
【請求項１１】
該結晶が１０−１ｍｍ未満の断面を有する請求の範囲第９項に記載の架橋された結晶。
【請求項１２】
該結晶が凍結乾燥された形態である請求の範囲第１、３、４、６又は８項の何れか１項に記載の架橋された結晶。
【請求項１３】
該蛋白質が酵素である請求の範囲第１、３、４又は６項の何れか１項に記載の架橋された蛋白質結晶。
【請求項１４】
該酵素が、サーモリシン、エラスターゼ、アスパラギナーゼ、リゾチーム、エステラーゼ、リパーゼ及びウレアーゼからなる群より選択される請求の範囲第１３項に記載の架橋された蛋白質結晶。
【請求項１５】
該酵素が、サーモリシン、エラスターゼ、アスパラギナーゼ、リゾチーム、エステラーゼ、リパーゼ及びウレアーゼからなる群より選択される請求の範囲第８項に記載の架橋された酵素結晶。
【請求項１６】
ａ）少なくとも１種の基質と、該基質に対して作用する少なくとも１種の蛋白質であって、請求の範囲第１、３、４又は６項の何れか１項に記載の架橋された蛋白質結晶である蛋白質とを組み合わせ、そして
ｂ）段階ａ）で製造された組合せ物を、該蛋白質を該基質に対して作用させる条件下に保持し、それにより選択された生成物を製造する
段階を含んでなることを特徴とする、蛋白質を用いて選択された生成物を製造する方法。
【請求項１７】
ａ）少なくとも１種の基質と、該基質に対して作用する少なくとも１種の酵素であって、請求の範囲第８、１３、１４又は１５項に記載の架橋された酵素結晶である酵素とを組み合わせ、そして
ｂ）段階ａ）で製造された組合せ物を、該酵素を該基質に対して作用させる条件下に保持し、それにより選択された生成物を製造する
段階を含んでなることを特徴とする、選択された生成物を製造する酵素触媒方法。
【請求項１８】
該生成物が、ペプチド類、炭水化物類及び脂質類からなる群より選択される請求の範囲第１６又は１７項に記載の方法。
【請求項１９】
段階ｂ）における条件が約５ないし約１０の間のｐＨを含むことを特徴とする請求の範囲第１６又は１７項に記載の方法。
【請求項２０】
該基質が有機ポリマーである請求の範囲第１６又は１７項に記載の方法。
【請求項２１】
請求の範囲第８、１３、１４又は１５項に記載の架橋された酵素結晶と、該架橋された酵素結晶のための保有手段とを含んでなる装置であって、該保有手段が該架橋された酵素結晶と酵素がそれに対して作用する基質との間の接触を可能にさせる材料からなり、該基質が流体中に存在することを特徴とする装置。
【請求項２２】
ａ）存在する酵素が、関心のある分析物に対して又は該関心のある分析物が関与する反応における反応物に対して作用するような、請求の範囲第８、１３、１４又は１５項に記載の架橋された酵素結晶；及び
ｂ）該架橋された酵素結晶と、（１）酵素がそれに対して作用する分析物か又は（２）該分析物が関与する反応における反応物かの何れかを含む流体との間の接触を可能にさせる材料からなる、該架橋された酵素結晶のための保有手段
を含んでなることを特徴とする、流体中の関心のある分析物を検出するためのバイオセンサー。
【請求項２３】
該バイオセンサーが検出手段をさらに含んでなることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載のバイオセンサー。
【請求項２４】
該架橋された酵素結晶が、関心のある分析物に対して又は該関心のある分析物が関与する反応の生成物に対して作用するルシフェラーゼの結晶であり、且つ該保有手段が、該架橋されたルシフェラーゼ結晶と、（１）ルシフェラーゼがそれに対して作用する分析物か又は（２）該分析物が関与する反応の生成物かの何れかを含む流体との間の接触を可能にさせる材料からなることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載のバイオセンサー。
【請求項２５】
請求の範囲第２２項に記載のバイオセンサーを用いることを含んでなる流体中の関心のある分析物の検出方法であって、該関心のある分析物が、グルコース、クレアチニン、尿素、ラクテート、グルコース−６−ホスフェート、スクロース、ＡＴＰ、エタノール、酢酸、蟻酸、コレステロール、尿酸、メトトレキセート、二酸化炭素、アミノ酸類、ホスフェート類、ペニシリン類、ナイトレート類、ナイトライト類、サルフェート類及びスクシネートからなる群より選択される上記の検出方法。
【請求項２６】
ａ）存在する酵素が、成分に対して又は該成分が関与する反応における反応物に対して作用するような、請求の範囲第８、１３、１４又は１５項に記載の架橋された酵素結晶；及び
ｂ）該架橋された酵素結晶と、（１）酵素がそれに対して作用する成分か又は（２）該成分が関与する反応の生成物かの何れかを含む流体との間の接触を可能にさせる材料からなる、該架橋された酵素結晶のための保有手段
を含んでなることを特徴とする流体の成分を変更させる際に使用するための体外装置。
【請求項２７】
請求の範囲第２６項に記載の体外装置を用いて流体の成分を変更する方法であって、該成分がアスパラギン、ヘパリン、ビリルビン、メトトレキセート、アミノ酸類、尿素及びアンモニアからなる群より選択される上記の方法。
【請求項２８】
選択された生成物を製造する際に使用するための装置であって、請求の範囲第８、１３、１４又は１５項に記載の架橋された酵素結晶の型の酵素と、該架橋された酵素結晶のための保有手段とを備える、装置。
【請求項２９】
ａ）第１のペプチドが式Ｚ−Ｌ−Ａｓｐを有し且つ第２のペプチドが式Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを有する２種のペプチドと請求の範囲第１４又は１５項に記載の架橋されたサーモリシン結晶とを、該架橋されたサーモリシン結晶の作用による２種のペプチドの縮合に適する条件下で組み合せ、それにより式Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ（式中、Ｚはベンジルオキシカルボニル基を表す）の部分的に保護されたジペプチドを製造し、そして
ｂ）該ジペプチドから該ベンジルオキシカルボニル基を除去し、それによりアスパルテームを製造する
段階を含んでなることを特徴とするアスパルテームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（関連出願）
本出願は１９９０年８月３日に出願されそして「新規な酵素固定化形としての架橋結合された結晶の使用」という名称のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／５６２，２８０の一部継続出願である。Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／５６２，２８０の教示はここでは参考として記しておく。
【０００２】
【従来の技術】
酵素はファインケミカルおよび特殊化学品の規模および研究室規模の経済的製用の工業用触媒として（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｊ．Ｂ．、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、４２：３３５１−３４０３（１９８６））、食品の製造用に（ザックス（Ｚａｋｓ）他、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６：２７２−２７５（１９８８））、並びに有機化合物の合成用手段として（オン（Ｗｏｎｇ），Ｃ．−Ｈ．、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４４：１１４５−１１５２（１９８９）；ＣＨＥＭＴＲＡＣＴＳ−Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３：９１−１１１（１９９０）；リバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ），Ａ．Ｍ．、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２３：１１４−１２０（１９９０））使用されている。
【０００３】
酵素であるニトリルヒドラターゼを使用するアクリルアミドの大規模製造で示されている如く（ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ），Ｔ．およびヤマダ（Ｙａｍａｄａ），Ｈ．、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、７：１５３−１５８（１９８９））、酵素を基にした製造はそうでないと使用できないような化学的中間生成物の大規模製造に内在する環境汚染問題を相当減少させる。
【０００４】
酵素は臨床的、工業的および他の目的の種々の物質を検出するためのバイオセンサー用途でも使用されている（ホール（Ｈａｌｌ），Ｅ．、「バイオセンサーズ（Ｂｉｏｓｅｎｓａｏｒｓ）」、オープン・ユニバーシティ・プレス（１９９０））。臨床的分野では、酵素は例えば血液透析および血液濾過の如き体外治療において使用されており、そこでは酵素が血液から廃棄物および毒性物質を選択的に除去している（クライン（Ｋｌｅｉｎ），Ｍ．およびランガー（Ｌａｎｇｅｒ），Ｒ．、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４：１７９−１３５（１９８６））。酵素は広範囲の反応型に対する触媒として穏やかな温度においてそして基質を特異的且つ立体選択的に用いて有効に作用するため、酵素はこれらの分野で使用されている。それにもかかわらず、工業的および研究室用の化学的方法において用途が限定されている可溶性酵素触媒の使用に伴われる欠点がある（アキヤマ（Ａｋｉｙａｍａ）他、ＣＨＥＭＴＥＣＨ、６２７−６３４（１９８８））。
【０００５】
酵素が正常に機能する水性媒体中で使用される時でさえ、酵素は多くの工業的および研究室用触媒と比べて高価であり且つ比較的不安定である。一般的に実施されている比較的経済的に有利な化学反応の多くは水性媒体とは非相容性であり、そこでは例えば基質および生成物はしばしば不溶性であるかまたは不安定であり、そしてそこでは加水分解がかなり競合する。さらに、供給原料中での生成物および未反応基質からの可溶性酵素触媒の回収では複雑で且つ費用のかかる分離技術の適用が必要である。最後に、酵素は冷蔵（４℃〜−８０℃〜液体Ｎ２温度）または水性媒体中での適当なイオン強度、ｐＨなどにたよらずにそれらの活性および機能保全性を商業的に妥当な期間（数カ月ないし数年間）にわたり保有しているような方法で貯蔵することは困難である。
【０００６】
酵素固定化方法により、多くの場合、これらの欠点が回避される。固定化は酵素触媒の安定性を改良しそして工業的および研究室用の化学的方法の苛酷な溶媒環境および極端な温度特性におけるそれらの機能保全性を守ることができる（ハートマイエル（Ｈａｒｔｍｅｉｅｒ），Ｗ．、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：１４９−１５３（１９８５））。連続流方法をカラム中で固定化された酵素粒子を用いて操作することができ、例えばそこでは可溶性供給原料が粒子上を通過しそして徐々に生成物に転化される。
【０００７】
ここで使用されている酵素固定化という語は肉眼的（１０−１ｍｍ）粒子に対する結合、該粒子のカプセル化、または該粒子中での集塊化による酵素触媒の不溶性化を称している。
【０００８】
酵素固定化方法の多数の有用な論文が文献中に発表されている（マウフ（Ｍａｕｇｈ），Ｔ．Ｈ．、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２３：４７４−４７６（１９８４）、トランパー（Ｔｒａｍｐｅｒ），Ｊ．、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５−５０（１９８５））。マウフは酵素の固定化に関する５種の一般的方式を記載している。これらには、固体担体（例えばイオンー交換樹脂）上の吸着、担体（例えばイオン交換樹脂、多孔性セラミックまたはガラス球）に対する共有結合、重合体状ゲル中での捕獲、カプセル化、および可溶性蛋白質を不規則的且つ不定的方法で二官能性試薬と架橋結合させることによる該蛋白質の沈澱が包含される。さらに、高水準で希望する酵素活性を示す細胞全体（一般的には死んでおりそして透過性にされている）を固定化することもできる（例えば、ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ），Ｔ．およびヤマダ（Ｙａｍａｄａ），Ｈ．、トレンズ・イン・バイオテクノ・ジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、７：１５３−１５８（１９８９））。
【０００９】
これらの固定化工程のそれぞれはそれ自身の利点および限界を有しており、そして誰もどれが最適であるかまたは有力であるか考察することはできない。それらのほとんどでは、酵素触媒が究極的には化学反応器中に存在している物質の合計量の小部分だけに相当している。それ自体では、固定化された媒体の塊は不活性なしばしば高価な担体物質から製造される。それらの全てにおいて、酵素触媒分子同士のおよび／またはそれと担体物質との固定化相互反応は不規則的且つ不定的である傾向がある。その結果として、これらの相互反応は酵素触媒分子にある程度の増加された安定性を与えるが、それらの相対的な非−特異性および不規則性のまた、それの安定化は最適以下のもので且つ不規則的になっている。多くの場合、酵素触媒の活性部位への到達は不適切に規定されたままである。さらに、上記の固定化方法は貯蔵および冷蔵に関する問題の処理に失敗している。酵素の構造的および機能的保全性に危険を与えずに一方または他方の選択溶媒と交換される際に従来法で固定化された酵素を一般的に処理することはできない。実用的見地からは、担体粒子に対する連結された範囲を除くと従来法で固定化された酵素は可溶性酵素と非常に似ており、そして変性に対する敏感性および苛酷な環境下での機能の損失をそれらと共有している。一般的には、固定化方法は観察された酵素で触媒作用を受ける反応速度を溶液中で得られるものと比べて減少させる。これはほとんどが、基質の内部拡散の制限および固定化された酵素粒子内の生成物の外部拡散の結果である（クインチョ（Ｑｕｉｎｃｈｏ），Ｆ．Ａ．およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ），Ｆ．Ｍ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５：４０６２−４０７６（１９６７））。固定化された酵素粒子中での不活性担体の必然的な存在が固定化された酵素粒子と酵素触媒の活性部位との間の平均自由通路を増加させており、従ってこれらの拡散問題を悪化させる。固定化された細胞を処理する時には、細胞壁および膜が基質および生成物に対して何らかの方法で透過性にされていても、拡散問題は特にひどい。さらに汚染性酵素活性、代謝産物、および細胞中に含まれている毒素の程度、並びに苛酷な溶媒中での細胞の安定性または極端な温度操作環境にも関連するであろう。工業的触媒としての酵素の使用を促進させる際には、特に大規模で有用であると示されているなら、現存する方法の制限を避ける改良された固定化技術が役立つであろう（ダニエルズ（Ｄａｎｉｅｌｓ），Ｍ．Ｊ．、メソッズ・イン・エンツィモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１３６：３７１−３７９（１９８７））。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酵素の固定化方法、この方法により製造された架橋結合され固定化された酵素結晶、固定化された酵素の貯蔵、取り扱いおよび処理性質を改良する手段、並びに希望する生成物の製造方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、１）ａ）少なくとも１種の適切に選択された基質と基質上で作用し且つ架橋結合され固定化された酵素結晶の形状である少なくとも１種の酵素とを組み合わせ、そして
ｂ）段階（ａ）で製造された組み合わせ物を酵素が基質上で作用するのに適している条件下に保ち、それにより選択された生成物を製造する
ことを含んでなる、選択された生成物を製造するための酵素で触媒作用を受ける方法を提供する。
【００１２】
１つの実施形態において、選択された生成物がペプチド類、脂質類、偏光性有機分子および炭水化物類からなる群から選択される。
【００１３】
１つの実施形態において、架橋結合され固定化された酵素結晶の寸法が約１０−１ｍｍである。
【００１４】
１つの実施形態において、段階（ｂ）における条件が架橋結合された形状ではない酵素の有効機能にとっては有害なものである。
【００１５】
１つの実施形態において、段階（ｂ）における条件が高い温度、低いｐＨ、高いｐＨ、水性／有機性と混合された有機溶媒、およびほとんど無水の条件からなる群から選択される。
【００１６】
別の局面において、本発明は、ａ）２種の適切に選択された基質と少なくとも１種の適切に選択された基質上で作用し且つ架橋結合され固定化された酵素結晶の形状である少なくとも１種の酵素とを組み合わせ、そして
ｂ）段階（ａ）で製造された組み合わせ物を酵素が少なくとも１種の適切に選択された基質上で作用するのに適している条件下に保ち、それにより選択された生成物を製造する
ことを含んでなる、選択された生成物を製造するための酵素で触媒作用を受ける方法を提供する。
【００１７】
１つの実施形態において、選択された生成物がペプチド類、脂質類、偏光性有機分子および炭水化物類からなる群から選択される。
【００１８】
１つの実施形態において、架橋結合され固定化された酵素結晶の寸法が約１０−１ｍｍである。
【００１９】
１つの実施形態において、段階（ｂ）における条件が架橋結合された形状ではない酵素の有効機能にとっては有害なものである。
【００２０】
１つの実施形態において、段階（ｂ）における条件が高い温度、低いｐＨ、高いｐＨ、水性／有機性と混合された有機溶媒、およびほとんど無水の条件からなる群から選択される。
【００２１】
別の局面において、本発明は、ａ）少なくとも１種の適切に選択された基質、基質上で作用し且つ架橋結合され固定化された酵素結晶の形状である少なくとも１種の酵素、および有機溶媒を組み合わせ、そして
ｂ）段階（ａ）で製造された組み合わせ物を酵素が基質上で作用するのに適している条件下に保ち、それにより選択された生成物を製造する
ことを含んでなる、選択された生成物を製造するための酵素で触媒作用を受ける方法を提供する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、適切に選択された基質と適当に選択された基質上で作用する架橋結合され固定化された酵素結晶とを、架橋結合され固定化された酵素結晶が適当に選択された基質上で作用するのに適している条件下で組み合わせ、それにより基質を変更しそして選択された生成物を製造すること
を含んでなる、選択された生成物を製造するための酵素で触媒作用を受ける方法を提供する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、ａ）第一のペプチドが式Ｚ−Ｌ−Ａｓｐを有しておりそして第二のペプチドが式ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを有している２種のペプチド類と架橋結合され固定化されたサーモリシン結晶とを、架橋結合され固定化された酵素結晶の作用による２種のペプチド類の縮合用に適している条件下で組み合わせ、それにより式Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ（ここでＺはベンジルオキシカルボニル基を表す）の部分的に保護されたジペプチドを製造し、そしてｂ）ベンジルオキシカルボニル基を除去し、それによりアスパルテームを製造する段階を含んでなる、アスパルテームの製造方法を提供する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、酵素を結晶状で供給しそして結晶を架橋結合し、それにより寸法が約１０−１ｍｍの架橋結合され固定化された酵素結晶を製造することを含んでなる、酵素を固定化しそしてそれの活性を保有する方法を提供する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、上記の方法により製造された寸法が約１０−１ｍｍの架橋結合され固定化された酵素結晶を提供する。
【００２６】
１つの実施形態において、上記酵素結晶は、サーモリシン、リパーゼ類、エラスターゼ類、エステラーゼ類、リゾチーム類およびアスパラギナーゼからなる群から選択される。
【００２７】
１つの実施形態において、上記方法は、製造された架橋結合され固定化された結晶を凍結乾燥することをさらに含んでなる。
別の局面において、本発明は、上記の方法により製造された凍結乾燥された架橋結合され固定化された酵素結晶を提供する。
【００２８】
１つの実施形態において、上記酵素結晶は、サーモリシン、リパーゼ類、エラスターゼ類、エステラーゼ類、リゾチーム類およびアスパラギナーゼからなる群から選択される。
【００２９】
別の局面において、本発明は、サーモリシン結晶を供給しそしてサーモリシン結晶を架橋結合し、それにより寸法が約１０−１ｍｍの架橋結合され固定化されたサーモリシン結晶を製造することを含んでなる、サーモリシンを固定化しそしてそれの活性を保有する方法を提供する。
【００３０】
別の局面において、本発明は、上記の方法により製造されたサーモリシンの架橋結合され固定化された結晶を提供する。
【００３１】
１つの実施形態において、上記方法は、製造された架橋結合され固定化された酵素結晶を凍結乾燥することをさらに含んでなる。
【００３２】
別の局面において、本発明は、上記の方法により製造された凍結乾燥された架橋結合され固定化されたサーモリシン結晶を提供する。
【００３３】
別の局面において、本発明は、架橋結合され固定化された酵素結晶および架橋結合され固定化された酵素結晶用の保有手段を含んでいる装置であり、ここで保有手段は架橋結合され固定化された酵素結晶と流体中に存在している酵素がその上で作用する基質との間の接触を可能にさせる物質からなっている装置を提供する。
【００３４】
別の局面において、本発明は、ａ）存在している酵素が関心のある分析物上または関心のある分析物が関与する反応における反応物上で作用するような、架橋結合され固定化された酵素結晶、および
ｂ）架橋結合され固定化された酵素結晶と（１）流体中に存在している酵素がその上で作用する分析物または（２）流体中に存在している分析物が関与する反応における反応物を含有している流体との間の接触を可能にさせる物質からなっている、架橋結合され固定された酵素結晶用の保有手段
を含んでなる、流体中の関心のある分析物を検出するためのバイオセンサーを提供する。
【００３５】
１つの実施形態において、上記バイオセンサーは、検出手段をさらに含んでなる。
【００３６】
１つの実施形態において、上記バイオセンサーは、グルコース、クレアチニン、尿素、ラクテート、グルコース−６−ホスフェート、スクロース、ＡＴＰ、エタノール、酢酸、蟻酸、コレステロール、尿酸、メトトレキセート、二酸化炭素、アミノ酸類、ホスフェート類、ペニシリン、ナイトレート類、ナイトライト類、スルフェート類およびスクシネート類からなる群から選択される関心のある分析物を流体中で検出するためのものである。
【００３７】
別の局面において、本発明は、ａ）ルシフェラーゼが関心のある分析物上または関心のある分析物が関与する反応における反応物上で作用するような、架橋結合され固定化されたルシフェラーゼ結晶、および
ｂ）架橋結合され固定化されたルシフェラーゼ結晶と（１）ルシフェラーゼがその上で作用する分析物または（２）分析物が関与する反応における反応物を含有している流体との間の接触を可能にさせる物質からなっている、架橋結合され固定されたルシフェラーゼ結晶用の保有手段
を含んでなる、流体中の関心のある分析物を検出するためのバイオセンサー。
２９）ａ）酵素が成分上またはこの成分が関与する反応における反応物上で作用するような、架橋結合され固定化された酵素結晶、および
ｂ）架橋結合され固定化された酵素結晶と（１）酵素がその上で作用する流体中に存在している成分または（２）この成分が関与する反応の生成物である流体中に存在している反応物との間の接触を可能にさせる物質からなっている、架橋結合され固定された酵素結晶用の保有手段
を含んでなる、流体の成分を変更させるための体外装置を提供する。
【００３８】
１つの実施形態において、上記体外装置は、成分がアスパラギン、ヘパリン、ビリルビン、メトトレキセート、アミノ酸類、尿素およびアンモニアからなる群から選択される、流体の成分を変更させるためのものである。
【００３９】
別の局面において、本発明は、架橋結合され固定化された酵素結晶および架橋結合され固定化された酵素結晶用の保有手段を含んでなる、選択された生成物を製造するために有用な装置を提供する。
【００４０】
（発明の要旨）
本発明は、酵素の結晶を製造しそして一般的には生じた結晶を二官能性試薬の使用により架橋結合することによる酵素の固定化方法、この方法により製造された架橋結合され固定化された酵素結晶（ＣＬＥＣ類またはＣＬＩＥＣ類と称されている）、固定化された酵素の貯蔵、取り扱いおよび処理性質を改良する手段としてのＣＬＥＣ類の凍結乾燥、並びにＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組により触媒作用を受ける反応による希望する生成物の製造方法に関するものである。
【００４１】
本発明の方法では、酵素触媒がその中で構造的にまたは機能的に安定性であるような水溶液または有機溶媒を含有している水溶液から小さい（１０−１ｍｍ）蛋白質結晶を成長させる。好適態様では、結晶を次に例えばグルタルアルデヒドの如き二官能性試薬を用いて架橋結合する。この架橋結合が結晶を構成している個別酵素触媒分子間の結晶格子接触を安定化させる。この安定化が付与される結果として、架橋結合され固定化された酵素結晶は高温、極端なｐＨおよび苛酷な水性、有機性もしくはほぼ無水の媒体中、またはこれらの混合された条件下で機能することができる。すなわち、本発明のＣＬＥＣは、対応する結晶化されておらず架橋結合されていない天然の酵素または従来法で固定化された酵素触媒の機能保全性とは非相容性である環境下で、機能することができる。
【００４２】
さらに、この方法により製造されるＣＬＥＣ類は凍結乾燥を受けて凍結乾燥されたＣＬＥＣが製造され、それはこの凍結乾燥形で非冷蔵温度（室温）で長期間にわたり貯蔵することができそして非晶質懸濁液を生成せずに且つ最少の変性危険性で選択された水性、有機性、または混合された水性−有機性溶媒中で容易に再構築することができる。
【００４３】
本発明はまた、本方法により製造されたＣＬＥＣ類並びに例えば偏光性有機分子、ペプチド類、炭水化物類、脂質類、または他の化学種の如き選択された物質の研究室用および大規模な工業用製造におけるそれらの使用にも関するものである。現在では、典型的にはこれらは、結晶化されておらず架橋結合されていない天然の酵素触媒の機能保全性と非相容性である苛酷な条件（例えば、水性、有機性もしくはほぼ無水の溶媒、混合された水性／有機性溶媒、または高温）を必要とする従来の化学的方法により、製造されている。これまでに提唱されているＣＬＥＣ技術に触媒活性を有する他の高分子を加えることもできる。これらには触媒性抗体（ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ），Ｒ．Ａ．、ベンコヴィック（Ｂｅｎｋｏｖｉｃ），Ｓ．Ｊ．およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ），Ｐ．Ｇ．、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５２：６５９−６６７（１９９１））および触媒性ポリヌクレオチド類（セッシュ（Ｃｅｃｈ），Ｔ．Ｒ．、セル（Ｃｅｌｌ）、６４：６６７−６６９（１９９１）、セランダー（Ｃｅｌａｎｄｅｒ），Ｄ．Ｗ，およびセッシュ（Ｃｅｃｈ），Ｔ．Ｒ．、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５１：４０１−４０７（１９９１））が包含されるであろう。
【００４４】
本発明はまた、本発明のＣＬＥＣにより触媒作用を受ける反応による選択された生成物の製造方法にも関するものである。
【００４５】
本発明の方法および実施の第一例では、酵素サーモリシンである亜鉛メタロプロテアーゼを使用してジペプチジル人工甘味料であるアスパルテームの偏光性先駆体を合成した。酵素サーモリシンを４５％のジメチルスルホキシド、および５５％の１．４Ｍ酢酸カルシウム、０．０５Ｍカコジル酸ナトリウムからなるｐＨ６，５の出発水溶液から結晶化させた。隼じた結晶をグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、サーモリシンＣＬＥＣを生成した。次にサーモリシンＣＬＥＣを、それが製造された粥結晶化水溶液から、基質類であるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸（Ｚ−Ｌ−ＡＳｐ）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ）を含有している酢酸エチルの溶液中に移した。次にサーモリシンＣＬＥＣを使用して、２種の基質類の縮合反応に触媒作用を与えて、人工甘味料であるアスパルテームのジペプチジル先駆体であるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチル、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ）を合成した。多くの既知の技術（例えば、リンデベルグ（Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ），Ｇ．、ジャーナル・オブ・ケミカル・エジュケーション（Ｊ．Ｃｈｅｍ　Ｅｄ．），６４：１０６２−１０６４（１９８７））を使用して、合成されたジペプチジノレ先駆体中のＬ−アスパラギン酸をベンジルオキシカルボニル（Ｚ−）基の除去により保護基を除いてアスパルテーム（Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ）を製造することができる。
【００４６】
本発明の方法および実施の第二例では、酵素サーモリシンを使用してサーモリシンＣＬＥＣ類を製造した。サーモリシンＣＬＥＣ類の活性および安定性を、有機溶媒の存在下での培養後および外因性プロテアーゼの存在下での培養後に、最適条件下並びに極端なｐＨおよび温度の条件下で、可溶性サーモリシンのものと比較した。
【００４７】
酵素サーモリシンを１．２Ｍ酢酸カルシウムおよび３０％ジメチルスルホキシドのｐＨ８．０の溶液から結晶化させた。生じた結晶を１２．５％の濃度のグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、サーモリシンＣＬＥＣを生成した。次にサーモリシンＣＬＥＣを標準的工程（クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ），Ｔ．Ｇ．、ザ・ツールズ・オブ・バイオケミストリー（Ｔｈｅ　Ｔｏｏｌｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３７９−３８０頁（ジョーン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（１９７７））により凍結乾燥して、サーモリシンの凍結乾燥された酵素ＣＬＥＣを生成した。次に凍結乾燥されたＣＬＥＣを、溶媒交換工程の介在なしに、非晶質懸濁液を生成せずに、且つ最少の変性危険性で、選択された収率の水性、有機性、および混合された水性／有機性溶媒中に直接移す。これらの溶媒には、アセトニトリル、ジオキサン、アセトン、およびテトラヒドロフランが包含されるが、他のものであってもよい。培養後に、活性を分光計的にジペプチド基質ＦＡＧＬＡ（フリルアクリロイル−グリシル−Ｌ−ロイシンアミド）の切断により評価した。
【００４８】
本発明の方法および実施の第三例では、酵素エラスターゼ（豚の膵臓）を５．５ｍｇ／ｍｌの蛋白質の０．１Ｍ酢酸ナトリウム中のｐＨ５．０の水溶液から室温において結晶化させた（ソーヤー（Ｓａｗｙｅｒ），Ｌ．他、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１１８：３７−２０８）。生じた結晶を５％の濃度のグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、エラスターゼＣＬＥＣを生成した。エラスターゼＣＬＥＣを実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。
【００４９】
本発明の方法および実施の第四例ではそしてここに開示されている如く、酵素エステラーゼ（豚の肝臓）を１５ｍｇ／ｍｌの蛋白質の０．２５Ｍ酢酸ナトリウム中のｐＨ５．６の水溶液から室温において結晶化させた。生じた結晶を１２．５％のグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、エステラーゼＣＬＥＣを生成した。エステラーゼＣＬＥＣを実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。
【００５０】
本発明の方法および実施の第五例ではそしてここに開示されている如く、酵素リパーゼ（ジオトリクム・カンジズム）を２０ｍｇ／ｍ１の蛋白質の５０ｍＭトリス中のｐＨ７の水溶液から室温において結晶化させた。生じた結晶を１２，５％のグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、リパーゼＣＬＥＣを生成した。リパーゼＣＬＥＣを実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。
【００５１】
本発明の方法および実施の第六例では、酵素リゾチーム（鶏卵白）を４０ｍｇ／ｍｌの蛋白質の５％塩化ナトリウム含有４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中のｐＨ７．４の水溶液から室温において結晶化させた（ブレーキ（Ｂｌａｋｅ），Ｃ．Ｃ，Ｆ．他、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９６：１１７３（１９６２））。生じた結晶を２０％の濃度のグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、リゾチームＣＬＥＣを生成した。リゾチームＣＬＥＣを実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。
【００５２】
本発明の方法および実施の第七例では、酵素アスパラギナーゼ（大腸菌）を２５ｍｇ／ｍ１の蛋白質の５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび３３％エタノール中のｐＨ５．０の水溶液から４℃において結晶化させた。結晶化はグラブナー（Ｇｒａｂｎｅｒ）他により記されている工程の変法であった［米国特許３，６６４，９２６（１９７２）］。ここで開示されている如くして、生じた結晶を７．５％の濃度のグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、アスパラギナーゼＣＬＥＣを生成した。アスパラギナーゼＣＬＥＣを実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。
【００５３】
同様な方法で固定化しそして適切な反応に触媒作用を与えるために使用することのできる他の酵素には、ルシフェラーゼおよびウレアーゼが包含される。例えば表１−５に挙げられているものの如き他の酵素を本方法を用いて結晶化しそして架橋結合して希望するＣＬＥＣを製造することもでき、それを選択された生成物を製造する反応に触媒作用を与えるためまたは選択された生成物の製造における中間段階（すなわち一連の反応の一段階）である反応に触媒作用を与えるために使用することができる。架橋結合は結晶の大部分を安定化させるのに役立つが全ての場合に必要であったりまたは望ましいとは限らないということを認識すべきである。ある種の結晶性酵素は架橋結合なしでも苛酷な環境下で機能的および構造的保全性を保有している。好適態様では結晶は架橋結合されているが、本方法で有用な酵素結晶を製造するために架橋結合は必ずしも常に必要なものではない。
【００５４】
ＣＬＥＣ類は現在使用されている従来の酵素固定化方法と比べて相当な利点を与えるいくつかの重要な特徴を有している。不活性担体なしということにより、ＣＬＥＣ類内の基質および生成物の拡散性質が改良され、そしてそのような寸法の分子に関する理論的充填限度に近い結晶内での酵素濃度を与えることとなろう。高い酵素濃度は、一定容量の触媒の有効活性の増加、酵素との基質接触時間の短縮、並びにプラント寸法および容積費用の全体的減少により、相当な操作上の経済性をもたらすことができる（ダニエルズ（Ｄａｎｉｅｌｓ），Ｍ．Ｊ，、メソッズ・イン・エンツィモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ１．）、１３６：３７１−３７９（１９８７））。ＣＬＥＣ類中の成分酵素の結晶容量および安定性増加に関する均一性により、例えば高温、および水性、有機性またはほぼ無水の溶媒、並びにこれらの混合物の如き苛酷な条件下での酵素触媒の使用に関する新しい機会が生まれる。さらに、制限された溶媒入手性および結晶格子中に内在する規則的な蛋白質環境が、従来法で固定化された酵素系と比べて改良された金属イオンおよびＣＬＥＣ類に関する補助因子保有性をもたらすはずである。
【００５５】
【発明の実施の形態】
合成化学者にとって興味があり且つ現在利用できる方法を用いて酵素と共に使用するには苛酷すぎる条件下で一定の酵素または酵素組に関する安定性および機能を保証するような簡単な一般的工程は非常に有用であろう。ここに開示されているような架橋結合され固定化された酵素結晶（ＣＬＥＣ類またはＣＬＩＥＣ類と称されている）をこの目的用に使用することができる。架橋結合反応による結晶格子および結晶内の成分酵素触媒の安定化により、現在利用できる方法を用いる際には酵素機能と非相容性である水性、有機性またはほぼ無水の溶媒、これらの溶媒の混合物、極端なｐＨおよび高温などの環境下でＣＬＥＣ類を使用することができる。さらに、ＣＬＥＣ類中での結晶格子の安定化により標準的方法によるＣＬＥＣ類の凍結乾燥も可能になる。凍結乾燥されたＣＬＥＣ類は冷蔵せずに商業的に魅力のある期間（数カ月ないし数年間）にわたり貯蔵することができ、溶媒交換方法の介在なしに選択された溶媒の単なる添加により工業用および研究室規模の方法におけるＣＬＥＣ類の急速且つ簡単な利用を促進させることができる。ＣＬＥＣ類はまた、外因性蛋白分解による消化に対しても高度に耐性である。本発明の方法は主流の工業化学方法並びに研究用の新規化合物の研究室合成における多様な酵素触媒の使用を促進させる。
【００５６】
架橋結合は結晶性酵素の安定性に寄与するが、全ての場合に必要であったりまたは望ましいものでもない。ある種の結晶化された酵素は架橋結合なしでも苛酷な環境下で機能的および構造的保全性を保有している。本発明の好適態様は結晶酵素の架橋結合を含んでおり、そして以下の章に詳細に記されている。しかしながら、後で架橋結合されない結晶化された酵素を本発明のある態様で使用できるということを理解すべきである。
【００５７】
ＣＬＥＣの結晶酵素中の成分酵素分子間の規則的相互作用がＣＬＥＣの本体内の酵素分子に通じる限定された寸法の良く規定された孔を生じる。その結果、利用できる孔寸法より大きい基質はＣＬＥＣ粒子の本体を透過しない。
【００５８】
限定された孔寸法のために、ＣＬＥＣ類の孔寸法より大きい基質を含む商業的および学術的に興味のある多くの酵素反応は本発明の範囲を越えている。これには例えば蛋白質、ポリヌクレオチド類、多糖類、および他の有機重合体の如き大きい重合体を含むほとんどの反応が包括されており、そこでは多数の重合体副単位はＣＬＥＣ内の結晶孔寸法より大きい重合体を製造するようなものであろう。しかしながら、そのような場合には触媒作用をＣＬＥＣ表面上で行うことができる。
【００５９】
本発明は、選択された蛋白質、特に酵素、を結晶化しそして架橋結合して、例えばペプチド、炭水化物、脂質または偏光性有機分子の如き選択された生成物の製造に触媒作用を与えるために使用できる架橋結合され固定化された酵素結晶（ＣＬＥＣ）を生じることによる、選択された蛋白質、特に酵素、の固定化方法である。本発明はさらにそのようなＣＬＥＣ類およびＣＬＥＣで触媒作用を受ける反応または一連の反応中のＣＬＥＣで触媒作用を受ける段階による選択された生成物の製造方法にも関するものである。本発明の一態様では、本方法により製造された架橋結合され固定化されたサーモリシンにより触媒作用を受ける縮合反応においてアスパルテームのジペプチジル先駆体が製造された。本発明の他の態様では、指示剤基質ＦＡＧＬＡを切断してそれの存在がサーモリシンＣＬＥＣ中の酵素活性を指示するような比色計生成物を製造する。ＦＡＧＬＡ加水分解をモデル反応として使用して、通常では酵素活性と非相容性であろう多くの環境下でのサーモリシンＣＬＥＣの強さを示す。
【００６０】
本発明の他の態様では、酵素類であるエラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、およびリゾチームを使用して、例えば酢酸ｐ−ニトロフェニル（エステラーゼおよびリパーゼ）、スクシニルー（ａｌａ）３−ｐ−ニトロアニリド（エラスターゼ）、４−メチルアンベリフェリルＮ−アセチルーチトリオシド（リゾチーム）およびＮＡＤＨ（アスパラギナーゼ）の如き種々の指定基質を切断する。
【００６１】
本発明の方法により、当技術の専門家は固定された酵素により触媒作用を受ける反応により希望する生成物を製造するための処方を応用することができる。適当な溶液から結晶化される時には当該酵素をグルタルアルデヒドまたは他の適当な二官能性試薬を用いて結晶化溶液中で架橋結合して該酵素のＣＬＥＣを製造することができる。次に、選択された酵素のＣＬＥＣを実施例２に記されている如くして凍結乾燥することができる。
【００６２】
ＣＬＥＣの使用が現在利用できる酵素で触媒作用を受ける方法と比べて提供できるいくつかの利点がある。例えば、ＣＬＥＣ中の架橋結合された結晶マトリックスはそれ自身で担体を供する。現在利用できる工程か方法におけるような高価な担体であるビーズ、ガラス、ゲル、またはフィルムは酵素触媒を固定させるために必要ではない。その結果、ＣＬＥＣ中の酵素の濃度は一定寸法の分子に関して達成できる理論的充填限度近くとなり、濃縮溶液中で得られる濃度を大きく越える。全体的ＣＬＥＣは活性酵素（および不活性でない担体）からなっており、従って溶液中の酵素に関して従来法で固定された酵素で一般的に観察される酵素反応速度の拡散−関連性減少が最少になるはずであり、その理由は活性酵素および遊離溶媒の間の基質および生成物に関する平均自由通路が（従来法で固定された酵素担体粒子と比べて）大きく短縮されるからである。これらの高い蛋白質密度は、大量の蛋白質を小容量で必要とするバイオセンサー、分析および他の用途において特に有用である。工業的方法では、ＣＬＥＣ類の優れた性能および高密度性が一定容量の触媒の有効活性を増加させ、それによりプラント寸法並びに資本費用の減少を可能にすることにより、相当な操作上の経済性がもたらされる（ダニエルズ（Ｄａｎｉｅｌｓ），Ｍ．Ｊ，、メソッズ・イン・エンツィモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１３６：３７１−３９（１９８７））。ＣＬＥＣ類は相対的に単分散性であり、肉眼的寸法および形が個々の酵素触媒の天然結晶成長特徴を反映している。現存している担体で固定化された酵素媒体を、ＣＬＥＣ類で置換することは困難でないはずであり、その理由は両方の系は寸法および形において匹敵しておりそして両者とも例えば濾過、遠心、溶媒の傾斜、および他の方法の如き基本的に経済的な操作を含む簡単な方法により供給原料から同様に回収できるためである。
【００６３】
さらに、凍結乾燥されたＣＬＥＣ類の使用により、使用前のこれらの物質の日常的な取り扱いおよび貯蔵が可能になる（冷蔵せずに室温において長期間にわたり乾燥貯蔵）。凍結乾燥されたＣＬＥＣ類は、当該溶媒および基質の直接的添加により、時間のかかる溶媒交換方法なしに非晶質懸濁液が生成することなく、日常的な調合を可能にする。凍結乾燥されたＣＬＥＣ形により、触媒としての酵素の一般的利用がより広い分野の酵素および機能的条件に拡大される。
【００６４】
ＣＬＥＣの第二の利点は、結晶化された酵素の架橋結合が安定化しそして結晶格子および成分酵素分子を機械的および化学的に強化する。その結果、ＣＬＥＣは苛酷な水性、有機性、ほぼ無水の溶媒中での、または水性一有機性溶媒混合物中での活性酵素触媒の相当な濃度を得るための唯一の手段となるであろう。有機合成における触媒としての酵素の使用は、非水性溶媒の存在下でのそして特に水性および非水性溶媒の混合物中でのそれらの変性傾向により妨害されていた（リバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ），Ａ．Ｍ．、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンセス（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１４：１４１−１４４（１９８９））。ＣＬＥＣ類では、安定性をもたらす構造的移動度の制限は媒体中で水がほぼ存在しないということよりむしろ分子内接触および結晶格子を構成している成分酵素分子間の架橋結合により供されている。その結果、中間の水濃度はこれまでは可能でなかったようなＣＬＥＣ類として調合された時には酵素により耐性がある（表１２参照）。商業的用途では、生成物および基質の相対的溶解度を利用することにより、水性−有機性溶媒混合物が生成物生成の処理を可能にする。水性媒体中でさえ、固定化されたかまたは可溶性である酵素触媒は化学反応器中で機械的力を受け、それが変性および短縮された半減期をもたらすことがある。ＣＬＥＣ内の化学的な架橋結合が必要な機械的強度を与え（クインチョ（Ｑｕｉｎｃｈｏ）およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ））、５２：８３３−８３９（１９６４））、それが酵素触媒に関する反応器寿命の増加をもたらす。
【００６５】
ＣＬＥＣの第三の利点は、それの結晶性質の結果としてＣＬＥＣが架橋結合された結晶容量全体にわたり均一性を得られることである。ここに記載されている結晶性酵素は水性環境下で成長しそして架橋結合されており、従って結晶格子内の分子の配列は均一で且つ規則的のままである。この均一性は、他の水性、有機性もしくはほぼ無水の媒体、または混合された水性／有機性溶媒中で交換される時でさえも、分子内接触および結晶格子を構成している酵素分子の間の化学的架橋結合により保たれている。これらの溶媒の全ての中で、酵素分子は互いに均一な距離を保っており、ＣＬＥＣ類内に良く規定された安定な孔を形成しており、基質の酵素触媒への到達並びに生成物の除去を促進させる。酵素活性の均一性は、再現性および一貫性が至上であるような工業的、医学的および分析的用途において必須なものである。
【００６６】
ＣＬＥＣを使用する第四の利点はそれが操作および貯蔵半減期の増加を示すことである。架橋結合なしでさえも、格子相互作用は、一部は蛋白質変性に必要な構造的自由度の制限により、蛋白質を安定化させることが知られている。ＣＬＥＣ類では、化学的架橋結合により固定される時には格子の相互作用は水性および非水性溶媒の混合物中で変性を防止する際に特に重要である（リバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ），Ａ．Ｍ．、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンセス（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１４：１４１−１４４（１９８９））。数カ月または数年間にわたり結晶状態のままである酵素は日常的に高い百分率でそれらの触媒活性を保有している。無水溶媒中に貯蔵された架橋結合され固定化された酵素結晶は栄養分に富んだ水性環境下で大量の蛋白質を貯蔵する際の重要な問題である微細物汚染および損傷からもさらに保護されるであろう。凍結乾燥されたＣＬＥＣの場合には、固定化された酵素は溶媒の不存在下で貯蔵される。従って、架橋結合により得られる安定化のために冷蔵せずに長期間にわたり貯蔵することが可能になる。
【００６７】
ＣＬＥＣの使用の第五の利点は、架橋結合が結晶格子を安定化させる結果として温度安定性の増加を示すことである。従来法で使用されるものより高い温度において反応を実施すると、熱力学的におよびＣＬＥＣ類の結晶格子の内外での拡散速度が増加することの両者により、当該化学反応に関する反応速度が増加するであろう。これらの組み合わせ効果は、一般的に反応方法の最も高価な成分である一定量の酵素触媒の生産性を最大にするために、反応効率における主要改良点である（ダニエルズ（Ｄａｎｉｅｌｓ），Ｍ．」．、メソッズ・イン・エンツィモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１３６：３７１−３９（１９８７））。ほとんどの酵素系が穏やかな反応条件を必要とするため、ＣＬＥＣ類により示される温度安定性は顕著なことである。ＣＬＥＣは貯蔵中の一時的高温による変性に対しても安定化されるであろう。
【００６８】
ＣＬＥＣ使用の最後の利点は、規則的寸法および形の孔が基礎的な結晶格子中の個々の酵素分子間で創造されることである。この制限された溶媒到達性が従来法で固定された酵素および溶液中の酵素と比べて金属イオンまたはＣＬＥＣの補助因子保有特性を大きく促進させている。ＣＬＥＣのこの性質により、状況に応じて経済的に優れている連続流方法（例えば、オヤマ（Ｏｙａｍａ）他、メソッズ・イン・エンツィモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１３６　５０３−５１６（１９８７））が使用可能になり、そこでは酵素はそうでないと金属イオンまたは補助因子の浸出により不活性化されるであろう。例えば、ジペプチジルアスパルテーム先駆体のサーモリシン介在合成においては、従来法で固定化された酵素Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅは連続流カラム方法では一部はサーモリシンに関して必須であるカルシウムイオンの浸出により触媒活性を失うことが知られている。実際に、カルシウムイオンの進出のために比較的効率の良くないバッチ方法が必然的に使用されている（ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）他、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５９−４６４（１９８５））。酵素の表面上の天然カルシウム結合部位と競合して基質Ｚ−Ｌ−Ａｓｐを用いてカルシウムイオン複合体が製造される時には浸出が起きて、触媒活性が失われる。高密度の酵素およびＣＬＥＣ類の格子内の溶媒に対する到達可能な対応する限定された容量が、金属イオン浸出に起因する競合するＬ−Ａｓｐ−Ｃａ＋＋複合体の生成を促進させる。
【００６９】
（ＣＬＥＣ類の製造−酵素結晶化）
本発明の方法では、架橋結合され固定化された酵素結晶（すなわちＣＬＥＣ）は下記の如くして製造された。
酵素結晶を水溶液または有機溶媒を含有している水溶液からの蛋白質の調節沈澱により成長させた。調節される条件には、例えば、溶媒の蒸発速度、適当な補助溶質および緩衝液の存在、並びにｐＨおよび温度が包含される。蛋白質の結晶化に影響を与える種々の因子の包括的論文はマックファーゾン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）により発表されているメソッズ・イン・エンツィモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．）、１１４：１１２（１９８５））。さらに、マックファーゾン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）およびギリランド（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）の両者（ジャーナル・オブ・クリスタル・グロウス（Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ）、９０：５１−５９）は結晶化されると報告されている全ての蛋白質類および核酸類の包括的リスト並びにそれらの結晶化をもたらす条件を編纂している。結晶および結晶化方法の概略並びに溶解された蛋白質および核酸結晶構造の配位陳列はプロテイン・データ・バンク（バーンスタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）他、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１１２：５３５−５４２（１９７７））によりブルックハーヴェン・ナショナル・ラボラトリーに保有されている。そのような参考文献を使用して適当なＣＬＥＣの生成の発端としてこれまでに結晶化されている一定の蛋白質または酵素の結晶化に必要な条件を決めることができ、そしてこれまでにない蛋白質に関する結晶化戦略の構築に指針を与えることができる。一方、知的な試行錯誤研究戦略（例えば、カーター（Ｃａｒｔｅｒ），Ｃ．Ｗ．Ｊｒ．およびカーター（Ｃａｒｔｅｒ），Ｃ．Ｗ．、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５４：１２２１９−１２２２３（１９７９）は多くの場合に、許容可能な純度水準が得られるとしたら、以上で論じられているものを含むがそれらに限定されないようなほとんどの蛋白質に関して適している結晶化条件を与えることができる。要求される純度水準は蛋白質毎に大きく変動することがあり得る。例えば、リゾチームの場合には、酵素はそれの未精製源である鶏卵白から直接結晶化することができる（グリランド（Ｇｌｌｉｌａｎｄ），Ｇ．Ｌ．、ジャーナル・オブ・クリスタル・グロウス（Ｊ，Ｃｒｙｓｔａｌ．Ｇｒｏｗｔｈ）、９０：５１−５９（１９８８））。
【００７０】
本発明の方法におけるＣＬＥＣ類としての使用のためには、Ｘ−線回折分析用に必要な大きい単独結晶は必要ではなく、そして実際にはそれは結晶寸法に関する拡散問題のために望ましくないこともある。微結晶性シャワー（すなわち寸法／断面で１０−１ｍｍの桁の結晶）がＣＬＥＣ類用に適しておりそしてしばしば観察されているが、Ｘ−線結晶図文献中にはめったに報告されていない。微結晶は本発明の方法において拡散関連問題を最少にするために非常に有用である（例えば、クインチョ（Ｑｕｉｎｃｈｏ），Ｆ．Ａ．およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ），Ｆ．Ｍ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５：４０６２−４０７６（１９６７））。
【００７１】
一般的には、結晶化しようとする蛋白質を適当な水性溶媒または例えば塩類もしくは有機物類の如き適当な沈澱剤を含有している適当な水性溶媒と組み合わせることにより結晶が製造される。結晶化の導入用に適しており且つ蛋白質安定性および活性の維持にとって許容可能であると実験的に決められた温度において溶媒を蛋白質と組み合わせる。溶媒は任意に補助溶質、例えば二価カチオン、補助因子またはチャオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅｓ）、並びにｐＨを調節するための緩衝液種を含むこともできる。補助溶質およびそれらの濃度に関する条件は結晶化を促進させるために実験的に決められる。工業的規模の方法では、結晶化をもたらす調節沈澱は蛋白質、沈澱剤、補助溶質、および任意の緩衝液の簡単な組み合わせによりバッチ方法で最良に行うことができる。例えば透析または蒸気拡散の如き別の研究室用結晶化方法を応用することもできる。マックファーゾン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）（メソッズ・イン・エンツィモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．）、１１４：１１２（１９８５））およびギリランド（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）（ジャーナル・オブ・クリスタル・グロウス（Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ）、９０：５１−５９（１９８８））は結晶化文献の彼らの論文中に適切な条件の包括的リストを含んでいる。場合によっては、架橋結合試薬および結晶化媒体の間の非相容性のために結晶をさらに適切な溶媒系中に交換する必要があるかもしれない。
【００７２】
結晶化条件が文献中にすでに記されているような多くの蛋白質は工業的および研究室用化学方法における実際的な酵素触媒としてかなりの将来性を有しており、そして本発明の方法でＣＬＥＣ類として直接調合される。表１はこれまでに結晶化されている酵素の試料である。これらの参考文献のほとんどに報告されている条件はしばしば大きな労力を要する大きい拡散性質結晶の成長用に最適化されているということに注意すること。ＣＬＥＣ類の製造において使用される比較的小さい結晶用に条件をある程度調節することがある場合には必要であろう。
【００７３】
【表１】
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2004000230.tif 000007
2004000230.tif 000008
（ＣＥＬＣ類の製造−架橋結合反応）
結晶が適当な媒体中で成長したら、それらを架橋結合することができる。結晶中での成分酵素分子間に共有結合を加えることにより、架橋結合が結晶格子を安定化させる。これにより、そうでないなら結晶格子の存在とまたは内接非変性蛋白質の存在とも非相容性であるかもしれない別の反応環境に酵素を移すことができる。架橋結合は多種の二官能性試薬により達成できるが、実際には簡単で安価なグルタルアルデヒドが選択試薬となっている。（他の入手可能な架橋結合試薬の代表的リストに関しては、ピアース・ケミカル・カンパニーの１９９０カタログを参照することができる）。
【００７４】
グルタルアルデヒドを用いる架橋結合が、結晶を構成している結晶格子中の酵素分子内でおよび該分子間で主としてリシンアミノ酸残基の間で強力な共有結合を形成する。架橋結合相互作用は結晶中の成分酵素分子が溶液中に戻るのを防止しており、酵素分子を微結晶性（理想的には１０−１ｍｍ）粒子に有効に不溶性化または固定化する。次に固定化され不溶性化された肉眼的結晶を生成物および未反応の基質を含有している供給原料から例えば濾過、傾斜などの如き簡単な工程により容易に分離することができる。それらはＣＬＥＣ充填カラム中で連続流方法で使用することもでき、そこではそれらは強化された補助因子および金属イオン保有性質を示している。
【００７５】
本発明の方法により、現存する環境下および新規な環境下での酵素触媒としての使用のためのＣＬＥＣ類が得られる。架橋結合反応により生じたＣＬＥＣ類の安定性強化により、そうでなければ非相容性である溶媒（例えば、水性、有機性もしくはほぼ無水の溶媒、またはこれらの混合物）中にＣＬＥＣを移すことができ、そして化学反応器操作を高温で極端なｐＨにおいて行うことができる。肉眼的なＣＬＥＣ触媒粒子は容易に処理することもでき、例えば濾過、遠心、または溶媒の傾斜の如き簡単な方法により供給原料から回収することができる。さらに、これらは充填カラム中で連続流方法で使用することができる。
【００７６】
（ＣＬＥＣ類の製造−凍結乾燥）
１容量の架橋結合されたサーモリシン結晶の１０容量の脱イオン水中のｐＨ７．０の懸濁液をヴルチスモデル＃２４凍結乾燥器を使用して一夜凍結乾燥した。凍結乾燥された結晶を再構築前に室温または４℃において貯蔵し、該再構築は１０容量の選択された溶媒を貯蔵から採取された結晶上に加えることにより行われた。再一水和された結晶をｐＨ７．０の１０ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液中でＦＡＧＳＡ切断実験用に再構築した。再構築された凍結乾燥ＣＬＥＣ類を日常的に室温において貯蔵した。それとは対照的に、可溶性酵素は１週間以上にわたり特異的活性を保つためには−７０℃における貯蔵を必要とした。この処方はここに含まれている例示中に記されている酵素の全てに関して使用された。
【００７７】
（サーモリシンＣＬＥＣを用いるアスパルテーム先駆体の合成）
架橋結合された結晶酵素を製造するための本発明の方法が以下に記載されており、そしてそれはほぼ無水の有機溶媒である酢酸エチル中でのアスパルテームのジペプチジル先駆体の製造において使用するためのサーモリシンの架橋結合され固定化された酵素結晶の製造により例示されている。結晶化されそしてそれの構造が１．６Ａ分解能において解明されている蛋白質であるサーモリシン（ホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ）およびマチユース（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１６０：６２３−６３９（１９８２））が、本方法でＣＬＥＣとして使用できる酵素の一例である。サーモリシンは人工甘味料アスパルテームの製造において使用されている（イソワ（Ｉｓｏｗａ）他、米国特許番号４，４３６，９２５（１９８４）、リンデベルグ（Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ）、ジャーナル・オブ・ケミカル・エジュケーション（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．）、６４：１０６２−４（１９８７）、ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）他、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５９−４６４（１９８５）、オヤマ（Ｏｙａｍａ）他、メソッズ・イン・エンツィモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１３６：５０３−５１６（１９８７））。現時点では、ほとんどのアスパルテームは従来の合成化学方式により製造されているようであるが、ほぼ無水の媒体中での従来法で固定化されたサーモリシンの使用が奨励されるような結果を生じている（オヤマ（Ｏｙａｍａ）他、ザ・ジャーナル・オブ・ザ・オーガニック・ケミストリイ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、４６：５２４２−５２４４（１９８１）、ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）他、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５９−４６４（１９８５））。本方法の使用により可能になるようなアスパルテーム製造の酵素方式における改良によって、該方式は簡便性および価格の両者に関して現在使用されている方法と匹敵するであろう（オヤマ（Ｏｙａｍａ）他、メソッズ・イン・エンツィモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１３６：５０３−５１６（１９８７））。
【００７８】
（サーモリシンＣＬＥＣ類の評価）
本発明の方法を使用してサーモリシンＣＬＥＣ類を製造し、それらをそれらのｐＨ依存性および安定性、高温安定性、外因性蛋白分解に対する耐性および有機溶媒の存在下での安定性に関して評価した。実施例２および図１−４に詳細に記されている如く、サーモリシンＣＬＥＣ類を可溶性サーモリシンと比較した。評価の結果は以下のことを示していた。
１．ｐＨ依存性および安定性に関すると、両方の形がｐＨ７において最大活性を示しておりそして酸性範囲では同様な活性を示した。アルカリ性ｐＨ範囲では、ＣＬＥＣはｐＨ１０まで最大活性を示しており、可溶性サーモリシンはｐＨ８．５では７５％の活性を、ｐＨ８．５では２５％の活性を有しており、そしてｐＨ９．５では完全に不活性であった。
２．ＣＬＥＣ類中で達成された追加安定性により、可溶性サーモリシンを用いて可能な温度より高い温度における酵素活性が生じる。比較的低温におけるＣＬＥＣサーモリシンの強化された安定性により、可溶性酵素より貯蔵が簡単になる。サーモリシンＣＬＥＣ類に関しては熱安定性および自己融解に対する耐性も示され、それは６５℃における５日間の培養後に最大活性を保有していた。それとは対照的に、可溶性サーモリシンは２日間の培養後にそれの初期活性の５０％を損失し、そして６５℃における２４時間後にはほとんど活性を示さなかった。
３．サーモリシンＣＬＥＣ類の酵素活性は強力なストレプトコッカル・プロテアーゼであるプロナーゼ（登録商標）（Ｐｒｏｎａｓｅ（登録商標））の存在下での４日間の培養により影響を受けなかった。それとは対照的に、可溶性サーモリシンは急速に劣化し、そして９０分の培養後に全ての活性を失った。
４．サーモリシンＣＬＥＣ類および可溶性サーモリシンは表１２に示されている如く有機溶媒の存在下では著しく異なる安定性を示した。評価された全ての有機溶媒を用いた培養後に、サーモリシンＣＬＥＣ類は９５％以上の最大活性を保有していた。
【００７９】
サーモリシンＣＬＥＣ類および他の酵素ＣＬＥＣ類のこれらの特徴によって、それらは対応する可溶性酵素より容易に貯蔵され、より安定性でありそして容易に不活性化または劣化されないため、それらは特に有用となる。
【００８０】
（エラスターゼＣＬＥＣ類の評価）
本発明の方法を使用してエラスターゼＣＬＥＣ類を製造し、それらをそれらの活性および外因性蛋白分解に対する耐性に関して評価した。実施例３並びに図５および６に詳細に記されている如くして、エラスターゼＣＬＥＣ類を可溶性エラスターゼと比較した。評価の結果は以下のことを示していた。
１．エラスターゼＣＬＥＣ類は可溶性酵素と比べて約５０％の活性を保有していた。
２．可溶性エラスターゼはプロテアーゼにより急速に劣化された。可溶性エラスターゼの活性はプロテアーゼの存在下での１０分間の培養後に初期活性の５０％まで減少した。１時間の培養後に可溶性酵素はそれの初期活性の９０％以上を損失していた。それとは対照的に、エラスターゼＣＬＥＣの酵素活性はプロテアーゼを用いる培養により影響を受けなかった。
【００８１】
（エステラーゼＣＬＥＣ類の評価）
本発明の方法を使用してエステラーゼＣＬＥＣ類を製造し、それらをそれらの活性および外因性蛋白分解に対する耐性に関して評価した。実施例４並びに図７および８に詳細に記されている如くして、エステラーゼＣＬＥＣ類を可溶性エステラーゼと比較した。評価の結果は以下のことを示していた。
１．エステラーゼＣＬＥＣ類は可溶性酵素と比べて約５０％の活性を保有していた。
２．可溶性エステラーゼは蛋白分解劣化に対して高度に敏感性であった。
可溶性エステラーゼの活性はプロテアーゼの存在下での１０分間の培養後に初期活性の５０％まで減少した。１時間の培養後に可溶性酵素はそれの初期活性の９０％以上を損失していた。それとは対照的に、エステラーゼＣＬＥＣの酵素活性はプロテアーゼを用いる培養により影響を受けなかった。
【００８２】
（リパーゼＣＬＥＣ類の評価）
本発明の方法を使用してリパーゼＣＬＥＣ類を製造し、それらをそれらの活性に関して評価した。実施例５並びに図９に詳細に記されている如くして、リパーゼＣＬＥＣ類を可溶性リパーゼと比較した。評価の結果は、リパーゼＣＬＥＣ類は可溶性酵素と比べて約９０％の活性を保有していたことを示していた。
【００８３】
（リゾチームＣＬＥＣ類の評価）
本発明の方法を使用してリゾチームＣＬＥＣ類を製造し、それらをそれらの活性および外因性蛋白分解に対する耐性に関して評価した。実施例６並びに図１０に詳細に記されている如くして、リゾチームＣＬＥＣ類を可溶性リゾチームと比較した。評価の結果は、リゾチームＣＬＥＣ類は可溶性酵素と比べて約５０％の活性を保有していたことを示していた。
【００８４】
（アスパラギナーゼＣＬＥＣ類の評価）
本発明の方法を使用してアスパラギナーゼＣＬＥＣ類を製造し、それらをそれらの活性に関して評価した。実施例７並びに図１１に詳細に記されている如くして、アスパラギナーゼＣＬＥＣ類を可溶性アスパラギナーゼと比較した。評価の結果は、下記のアスパラギナーゼＣＬＥＣ類は可溶性酵素と比べて約７７％の活性を保有していたことを示していた。
【００８５】
（ＣＬＥＣ類の一般的用途）
ここに開示されている如く、ＣＬＥＣ類は工業的規模の合成、研究室用手段、バイオセンサー、および医学的用途を含むがそれらに限定されるものではない多くの分野において広く使用される新規な技術となる。従来法で固定化された酵素方法を用いる種々の系の実行例は下表２−５に示されている。当技術の専門家はこれらの系および同様な系を本出願に開示されているＣＬＥＣ技術に応用することができるはずである。これを説明するために、挙げられている範疇のそれぞれから個別例がさらに詳細に論じられている。
【００８６】
下表２には工業的方法で従来法で固定された酵素を使用する例が挙げられており、それらの例はここに開示されているＣＬＥＣ技術に容易に応用することができる。
【００８７】
【表２】
2004000230.tif 000009
2004000230.tif 000010
2004000230.tif 000011
2004000230.tif 000012
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2004000230.tif 000015
2004000230.tif 000016
（ＣＬＥＣ技術を用いるアクリルアミドの製造）
下記のものは本発明の方法の一使用の記載である：ニトリルヒドラターゼ酵素を過剰製造する固定化された細胞からのアクリルアミド製造（ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ），Ｔ．およびヤマダ（Ｙａｍａｄａ），Ｈ．、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、７：１５３−１５８（１９８９））のこれまでにここに開示されているＣＬＥＣ技術への応用である。
【００８８】
重要な必需化学物質であるアクリルアミドはヤマダおよび共同研究者により記載されている（ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ），Ｔおよびヤマダ（Ｙａｍａｄａ），Ｈ．、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、７：１５３−１５８（１９８９））。酵素ニトリルヒドラターゼの過剰製造剤として選択される捕獲された細胞が充填されている化学反応器中で毎年数キロトンのアクリルアミドが製造されている。ニトリルヒドラターゼは２種類の源であるブレヴィバクテリウムＲ３１２（ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ）他、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１３９：１３０５−１３１２（１９８６）およびＰ．クロロラフィスＢ２３（ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ）他、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１６２：６９１−６９８（１９８７）から精製されそして結晶化されたことも報告されている。ここに開示されている如く、グルタルアルデヒドまたは他の適当な架橋結合試薬を用いて架橋結合してＣＬＥＣを製造することにより、これらの結晶性酵素はそれぞれ固定化される。次にニトリルヒドラターゼＣＬＥＣ類を最近使用されている捕獲された細胞の代わりに従来の反応器で使用することができる。この方法をＣＬＥＣ技術に応用すると、直ちに利点をもたらす。これらには、ＣＬＥＣ類中の比較的高い酵素濃度に内在する単位容量当たりの強化された活性から生じるプラント寸法の減少および生産量の改良、並びに基質および生成物拡散速度の改良、比較的高純度のＣＬＥＣ類から生じる望ましくない汚染および副反応の減少、並びに細胞の不存在下での微生物汚染に対する敏感性の減少が包含される。さらに、ＣＬＥＣを基にした方法にとってのみ得られる他の利点もある。これらの利点には、反応速度を改良するための比較的高温における操作、アクリルアミド製造反応の最適化を可能にする水性、有機性およびほぼ無水の溶媒中での操作性、並びに特に従来法の溶媒中でのＣＬＥＣ類の比較的高い化学的および機械的安定性から生じる操作および貯蔵における半減期の増加が包含される。
【００８９】
（ＣＬＥＣ技術の医学的用途−体外処置）
本発明の方法および適当に選択されたＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組を医学的用途用に使用することもできる。例えば、ＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組を例えば血液の如き流体の一成分を一般的には該成分を変更させそしてそこでそれを患者にとって有害でない物質または正常な身体的工程により（例えば、解毒すなわち肝臓中での劣化により、腎臓を通しての排泄により）除去できるような物質に転化させることにより除去するために使用できる。この用途では、適当に選択されたＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組を、変更しようとする成分を含有している体液またはＣＬＥＣ類中の酵素がそこで作用する成分が関与する反応の反応物（生成物もしくは基質）と接触させる。その結果、酵素は変更しようとする成分にまたは変更しようとする成分が関与する反応の生成物である他の基質と作用することができる。酵素の活性が除去しようとする成分の直接的変更または成分が関与する反応の生成物の変更をもたらし、（その結果、反応の連続性を不可能にする）。これは、適当に選択されたＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組および例えばその上にＣＬＥＣが保有されているような多孔性物質またはＣＬＥＣが内部に存在することのできる管の如き物質から製造されている残りの手段を含んでいる体外装置の使用により行うことができ、それにより成分自身または変更しようとする成分が関与する反応の生成物である流体中の基質の間の接触が可能になる。
【００９０】
これは、例えば腹膜またはリンパ節の如き適当な身体部分中への適当なＣＬＥＣの挿入によっても達成され、そこではＣＬＥＣが体液に到達するであろう。この挿入は外科的にまたはＣＬＥＣスラリーの挿入により行うことができるであろう。高い代謝産物の危険性を仮定すると、血液流中へのＣＬＥＣの直接的挿入は適切でないであろう。
【００９１】
この分野での適当なＣＬＥＣ類の使用は、例えばフェニルケトン尿症の如き自然欠如を補正するための酵素置換療法における普遍的方法の代用として作用する。
【００９２】
表３は、ＣＬＥＣ類を使用することのできる医学的用途の一部を示している。これらの場合の大部分に関しては、体外処置は依然として研究段階であるが、ＣＬＥＣ類が与える利点がこれまでは代用処置がなかった分野における新規な治療法を与えることができるであろう。
【００９３】
【表３】
2004000230.tif 000017
2004000230.tif 000018
2004000230.tif 000019
本方法の特別な用途は血液ヘパリン除去用のヘパリンリアーゼ系であり（ベルンステイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）他、メソッズ・イン・エンツィモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１３７：５１５−５２９（１９８７））、それは以下で論じられている。
【００９４】
血液が灌流されている全ての体外装置、例えば腎臓透析、連続的な動静脈血液濾過または体外膜酸素供給器、は凝血を避けるために患者のヘパリン化を必要とする。しかしながら、患者のヘパリン化は出血合併症を引き起こしそして人間安全性に対する脅威を残している。これらの問題は例えば膜酸素供給器では灌流時間が増加するにつれて増加し、そして重大出血を引き起こすことがある。体外療法後に、体外装置の流出部のところでヘパリナーゼ装置を使用することによりヘパリンを血液から除去することができ、該装置は患者に戻される血液から全てのヘパリンを除去しそしてその結果として現在のヘパリン化の問題点を避ける。
【００９５】
発表された研究（ランゲル（Ｌａｎｇｅｒ）他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１７：２６１−２６３（１９８２）、ベルンステイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）他、メソッズ・イン・エンツィモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１３７：５１５−５２９（１９８７））は、体外装置中で使用されている従来法で固定化された酵素により生じた問題点を詳記している。原則的問題は、従来法の固定化が単位容量当たりの酵素活性の低い保有性を生じるため必要なヘパリン化を行うために大量の固定化された酵素を必要とすることである。この量は人間において実際的に使用するには多すぎるものである。しかしながら、不活性担体がないことによるＣＬＥＣ中の単位容量当たりの高い活性の保有性によりこの問題が回避されそして人間のヘパリン化除去に対する実用的な解決法を与える。ＣＬＥＣの安定性増加が架橋結合された結晶からの酵素の解離を減少させるであろう。酵素切断から生じる免疫応答が減じられるため、これは比較的不安定な従来法で固定された酵素より優れている。ＣＬＥＣ温度安定性が貯蔵中の一時的高温による酵素の変性を防止し、室温で貯蔵した時でさえＣＬＥＣは高い活性を保有するようである。さらに、ＣＬＥＣはそれらの比較的長い操作および貯蔵寿命のためにそれらの従来法で固定化された相手より安価であり且つ使用し易い。
【００９６】
（ＣＬＥＣ技術の別の用途：バイオセンサー）
例えば体液（例えば、血液、尿）、化学的および研究室用反応媒体、有機媒体、水、培養媒体並びに飲料の如き流体中での当該分析物を検出および／または定量化するために有用なバイオセンサーと称されているセンサーの一成分として、ＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組を使用することができる。ある場合には、当該流体はアルコール呼吸分析器中の如く気体であることができる（バルザナ（Ｂａｒｚａｎａ），Ｅ．、リバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ），Ａ．およびカレル（Ｋａｒｅ１１），Ｍ．、ナサ・テクニカル・ブリーフズ（ＮＡＳＡ　Ｔｅｃｈ　Ｂｒｉｅｆｓ）、１３：１０４（１９８９））。この用途では、適当に選択されたＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組を当該分析物に関して分析しようとする流体と接触させる。当該分析物は直接的に（例えば、血液グルコース水準）または間接的に（例えば当該分析物が関与する反応における反応物（生成物もしくは基質）である物質を検出もしくは定量化することにより）測定することができる。各場合とも、ＣＬＥＣは分析物または分析物も関与する反応における反応物である物質に作用することができる。酵素の活性が検出可能な変化（例えばｐＨにおける変化、発光、発熱、電位における変化）を生じ、それは適当な検出手段（例えばｐＨ電極、光または熱感知装置、電気的変化を測定するための手段）により検出および／または定量化される（ジャナタ（Ｊａｎａｔａ），Ｊ．他、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．）６２：３３Ｒ−４４Ｒ（１９９０））。酵素で触媒作用を受ける方法から生じる変化を検出するために使用できる手段を用いることができる。本発明のバイオセンサーには、ＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組並びにＣＬＥＣ（類）と当該分析物または当該分析物が関与する反応における反応物である流体中での基質との間の接触を可能にさせるＣＬＥＣ用の保有手段が包含されている。
【００９７】
表４は、ＣＬＥＣを内部で使用することができるバイオセンサー用途の一部を示している。現在固定化されている酵素がこれらの用途において使用されているが、低い安定性、低い酵素密度、短い寿命および再現性欠如を被っている。これらの例をここで開示されているＣＬＥＣ技術に容易に応用することができる。
【００９８】
【表４】
2004000230.tif 000020
2004000230.tif 000021
2004000230.tif 000022
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バイオセンサー中で試料の分析用に実施される如き本発明の方法においては、最少可能量の基質および触媒から最大可能量の検出可能な信号を生じることが特に望ましい。これに関すると、ここに開示されているＣＬＥＣ技術は一定容量で最高の可能な酵素触媒濃度を得たので、該技術は特に魅力的である。
【００９９】
究極的な当該酵素反応を直接的にまたは適当な中間生成物を介してルシフェラーゼのような酵素による発光と組み合わせるために、しばしば相当な努力がなされている（カーキジャルヴィ（Ｋｕｒｋｉｊａｒｖｉ）他、メソッズ・イン・エンツィモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１３７：１７１−１８１（１９８８））。これは光子検出装置の非平行感度および効率という利点を得るために行われており、それにより適当な条件下での酵素反応生成物のフェムトモル濃度の検出が可能になる。この原則により、従来法で固定化された酵素を用いるバイオセンサー系が設計されており臨床的および他の関心のある種々の基質を検出する。発光反応はとりわけＤ−グルコース、Ｌ−ラクトース、Ｌ−グルタメートおよびエタノールのような基質を検出する評価反応と極端に低い濃度で組み合わせられる。
【０１００】
この用途に関すると、ヴィブリオ・ハルヴェヴィイからのルシフェラ−ゼ酵素が結晶化されたと報告されている（スワンソン（Ｓｗａｎｓｏｎ）他、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．）、２６０：１２８７−１２８９（１９８５））。このルシフェラーゼの結晶をグルタルアルデヒドまたは他の適当な試薬を用いて架橋結合してルシフェラーゼのＣＬＥＣを生成することができる。バイオセンサーおよび分析用途用には、ルシフェラーゼのＣＬＥＣは従来法で固定化された酵素より多くの利点を与える。ＣＬＥＣでは、ルシフェラーゼＣＬＥＣの全容量は発光性酵素からなっている。しかしながら、従来法で固定化された酵素系では、合計容量の９５％程度が「不活性な」担体物質により占められており、それは酵素により発生した光の吸収剤として機能するようである。さらに、ＣＬＥＣ類の安定性増加が室温における貯蔵を促進させるはずであり、そして苛酷な環境および高温における新しい感知用途が可能になる。
【０１０１】
（ＣＬＥＣ技術の別の用途−研究室用反応）
ＣＬＥＣ類は小カラムまたはバッチ方法での研究室用試薬として使用することもでき、それらは研究室用反応を行うために使用できる。広い範疇の反応の一部を表５に示す。
【０１０２】
【表５】
2004000230.tif 000024
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2004000230.tif 000026
シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）他（アンゲヴァンドテ・ヘミイ・インターナショナル・エディッション・イン・イングリッシュ（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ１．）、２３（Ｎｏ．１）：６４−６８（１９８４））はどのようにして酵素を有機合成において使用できるかを示している。豚の肝臓エステラーゼを水性燐酸塩緩衝液中で偏光性モノーエステルヘのメソーエステル交換において使用した。
【０１０３】
研究室用途用のＣＬＥＣで触媒作用を受ける反応の利点は３種ある。第一に、ＣＬＥＣは研究室用の化学的合成実験の典型である苛酷な環境（例えば、水性、有機性、ほぼ無水の溶媒およびこれらの混合物、並びに高温）下で高い活性を保有している。第二に、ＣＬＥＣは高い操作および貯蔵安定性を示しており、それは間欠的な研究室用実験に適している。第三に、単位容量当たりのそれらの高い活性が比較的短い反応時間を可能にしそして（活性単位当たり）少量の酵素を必要とする。従って、ＣＬＥＣが遊離または固定化された酵素に対して供する利点が有機化学者に別の高度に選択的な合成手段を与えるものである。これらの上記の場合の全てにおけるがこれらに限定されるものではないが、本発明の方法を当技術の専門家が応用して従来法で固定化された酵素触媒を使用する方法を適当な酵素のＣＬＥＣの使用に転換させることができる。ＣＬＥＣ類は従来法で固定化された酵素を置換することができるだけでなく、細胞介在転換においても使用することができる。本発明を次に下記の実施例により説明するが、それらは何ら限定しようとするものではない。
【０１０４】
【実施例】
（実施例１）
（アスパルテーム先駆体であるＺ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの合成用のサレーモリシンの結晶化および架橋結合）
（結晶化）
２５０ｍｇのバシラス・サーモプロテオリチクスからのサーモリシンをベーリンゲル・マンハイムＧｍｂＨから購入し、そして４ｍｌの４５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および５５％の１．４０Ｍ酢酸カルシウム、０．５０Ｍカコジル酸ナトリウム中にｐＨ６．５において溶解させた。これらの出発条件は回折等級サーモリシン結晶の製造に関してマテウス（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）他により記されているものと同様であった（例えば、ホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ）およびマテウス（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．）、１６０：６２３−６３９（１９８２）参照）。次にセントリコン１０マイクローコンセントレーター中で蛋白質溶液を１ｍｌに濃縮した。ここで今開示されている断熱蒸発晶出方法により良好な収率の微結晶が得られ、該方法では１ｍ１の水、または１．４０Ｍ酢酸カルシウム、０．５０Ｍカコジル酸ナトリウムをｐＨ６．５において上記の各サーモリシン−ＤＭＳＯ溶液中に急速注入した。ほぼ均一寸法（長さが約１０４ｍｍ）の六角形の微結晶シャワーが生じた。
【０１０５】
（サーモリシン微結晶の架橋結合）
本発明の方法のこの特定例で使用される処方はナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）・他（バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５９−４６４（１９８５））により記されているものの応用であり、その処方ではサーモリシンを最初にイオン−交換樹脂アンベルライトＸＡＤ−７からなる担体ビーズ上に吸着させ、そしてグルタルアルデヒドを用いて架橋結合させることにより固定化した（クイチョ（Ｑｕｉｃｈｏ）およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンセス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、（ＵＳＡ））、５２：８３３−８３９（１９６４））。この例示では、上記で得られたサーモリシンの微結晶を遠心し、粒状化し、そして上澄み液を廃棄した。次に５ｍ１の２．５％ＤＭＳＯ中の１７．５％工業用等級グルタルアルデヒド、０．０５Ｍ酢酸カルシウムおよび０．０２５Ｍカコジル酸ナトリウムをｐＨ６．５において微結晶に加えた。混合物を静かに撹拌しながら３７℃において４時間培養した。結晶を１０ｍ１部分の水で繰り返し洗浄してグルタルアルデヒド溶液を除去することにより、架橋結合反応を停止させた。洗浄された架橋結合されたサーモリシン結晶は以下で触媒として使用されるサーモリシンＣＬＥＣを構成していた。
【０１０６】
（水溶液中でのＺ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの合成）
５ｍ１のサーモリシンＣＬＥＣ懸濁液を３７℃において培養されている連続的に撹拌されているバッチ反応器に加えた。遠心および上澄み液の傾斜後に、水性反応混合物をＣＬＥＣに加えた。この溶液は、１ｍ１の水中の８０ｍｇのＺ−Ｌ−Ａｓｐおよび８０ｍｇのＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ−ＨＣ１を７．０のｐＨを得るために加えられた酢酸と混合することにより、製造された。ＨＰＬＣによる分析用に試料を採取した。下表６は、時間ｔ＝０において１に規格化されている指定反応時間後のＺ−Ｌ−Ａｓｐ基質ピークのＨＰＬＣピーク高さを示している。Ｚ−Ｌ−Ａｓｐはこの反応においては速度限定性であるため、それの消耗量の測定値が生成物であるＺ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの測定値である（ナカニシ他バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５９−４６４（１９８５））。表６は、残存している限定用Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ基質の規格化されたピーク高さおよび反応の完了度の推定値も示している。反応は最初の３０秒間以内に約２０％の完了度まで進行しそしてそこで平らになることが明白である。これらの結果は上記の水性反応混合物中で従来法で固定化されたサーモリシンを使用した時にはナカニシ他の観察と一致しており（バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５９−４６４（１９８５））、そしてそれは水中でのＺ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ生成物の微溶性に寄与している。
【０１０７】
【表６】
2004000230.tif 000027
（ほぼ無水の溶液中でのＺ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの合成）
５ｍｌのサーモリシンＣＬＥＣ懸濁液を３７℃において培養されている連続的に撹拝されているバッチ反応器に加えた。遠心および上澄み液の傾斜後に、ほぼ無水の有機反応混合物をＣＬＥＣに加えた。この溶液は、１ｍｌの水中の８０ｍｇのＺ−Ｌ−Ａｓｐおよび８０ｍｇのＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを９９％の酢酸エチルおよび１％の水と混合することにより、製造された。ＨＰＬＣによる分析用に試料を採取した。下表７は、時間ｔ＝０において１に規格化されている指定反応時間後のＺ−Ｌ−Ａｓｐ基質ピークのＨＰＬＣピーク高さを示している。
Ｚ−Ｌ−Ａｓｐはこの反応においては速度限定性であるため、それの消耗量の測定値が生成物であるＺ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの測定値である（ナカニシ他、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５９−４６４（１９８５））。表７は、残存している限定用Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ基質の規格化されたピーク高さおよび反応の完了度の推定値も示している。この場合には、反応は最初の３０秒間以内に約７０％の完了度まで進行しそしてそこで平らになることが明白である。これらの結果は上記のほぼ無水の反応混合物中で従来法で固定化されたサーモリシンを使用した時にはナカニシ他の観察と一致しており（バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５９−４６４（１９８５））、そしてそれは酵素の生成物抑制に寄与している。
【０１０８】
【表７】
2004000230.tif 000028
（実施例２）
（サーモリシンの結晶化、架橋結合および凍結乾燥並びに生じた生成物の特性の評価）
（サーモリシンの結晶化）
サーモリシン（ダイワ・カセイＫ．Ｋ．、日本）をｐＨ１０．０の１０ｍＭ酢酸カルシウム（シグマ）中に溶解させて１０％（重量／容量）の濃度とした。溶液のｐＨを２ＭＮａＯＨを用いる滴定により１０．０に保った。完全な溶解後に、蛋白質溶液を２ＭＨＣ１を用いてｐＨ８．０まで滴定した。酢酸カルシウムナトリウムを１．２Ｍとなるまで加えた。次にジメチルスルホキシド（シグマ）を３０％まで加えた。アミコン撹拌細胞（１０，０００ＭＷＣＯ膜）中での限外濾過により、蛋白質を１００ｍｇ／ｍ１に濃縮した。濃縮された酵素を分割しそして−７０℃において貯蔵した。１容量の濃縮された（１００ｍｇ／ｍ１）蛋白質溶液に９容量の脱イオン水に添加することにより、サーモリシンを結晶化させた。溶液を簡単に撹拌し、そして室温に一夜放置した。結晶を１０容量のｐＨ７．０の１０Ｍｍ酢酸カルシウムで洗浄し、そして低速遠心（１０分、１５００×Ｇ、ベックマンＧＰＲセントリフュージ）により回収した。
【０１０９】
サーモリシンの濃縮（１００ｍｇ／ｍ１）溶液に対する水の急速添加が結晶の生成を誘発させ、それは低い倍率下で１０分以内に見え始めた。結晶寸法は最終的な蛋白質濃度に再現可能式に依存していた。１容量のサーモリシン濃縮物（１００ｍｇ／ｍ１）に対する３容量の水が０．５ｍｍ長さのＸ−線回折等級の六角形の棒を生成し、それはコルマン（Ｃｏｌｍａｎ）他（コルマン，Ｐ，Ｍ．、ジャンソニウス（Ｊａｎｓｏｎｉｕｓ），Ｊ．Ｎ．およびマテウス（Ｍａｔｔｅｗｓ），Ｂ．Ｗ．、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、７０：７０１−７２４（１９７２））により以前に記されており我々が回折分析により確認した結晶に対応していた。１容量の蛋白質濃縮物に対する１０容量の水の添加は生じる結晶の長さを０．０５ｍｍだけ減少させた。これらの微結晶は結晶寸法に関する拡散問題を最少にさせるという傾向があるため、それらはＣＬＥＣ用途において好適である。一定バッチの蛋白質内では、結晶寸法は常に均一であった。（結晶性懸濁液の正確なピペット添加を促進させるために長さが０．０５−０．１０ｍｍの結晶がこの研究で使用された。）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの密度計走査は、結晶化に関する酵素の６倍の精製を示し、ＣＬＥＣの特異的活性を相当増加させた。下記の如きジペプチド基質フリルアクリロイル−グリシル−Ｌ−ロイシン−アミド（ＦＡＧＬＡ）の分光計的切断により評価する時には、結晶化は可溶性サーモリシンと比べてＣＬＥＣ蛋白質の合計活性において２０％の減少をもたらした。
【０１１０】
（サーモリシン結晶の架橋結合）
サーモリシン結晶を室温で１２．５％のグルタルアルデヒド（シグマ）、５％のＤＭＳＯおよび５０ｍＭトリスのｐＨ６．５の溶液中で３時間にわたり架橋結合した。架橋結合された結晶を脱イオン水中で３回洗浄し、そしてサーモリシンの結晶化に関して記されている如き低速遠心により回収した。酵素結晶の化学的架橋結合は結晶格子および結晶中の成分酵素分子を充分に安定化させて、そうでないなら酵素機能と非相容性である環境中でのＣＬＥＣの実際的な使用を可能にした。ジペプチド基質ＦＡＧＬＡ（以下に記されている）の切断を監視することにより（分光計的に）評価した時には、架橋結合された結晶および架橋結合されていない結晶の間には酵素活性において測定可能な差はなかった。さらに、架橋結合はＣＬＥＣをそれらを凍結乾燥可能な点まで安定化させ、図１および表８に示されている如く水性、有機性、および混合された水性−有機性溶媒中での再構築で完全な酵素活性の保有を示していた。結晶化はＣＬＥＣ蛋白質の特異的活性において可溶性サーモリシンと比べての３０％の減少を生じたが、ＣＬＥＣの架橋結合および凍結乾燥はそれ以上特異的活性を減少させなかった。
【０１１１】
【表８】
2004000230.tif 000029
（可溶性およびＣＬＥＣサーモリシンの酵素活性）
遮蔽されたジペプチド基質フリルアクリロイル−グリシル−Ｌ−ロイシン−アミド（ＦＡＧＬＡ）（シュヴァイツエルハール）の加水分解により可溶性およびＣＬＥＣサーモリシンの触媒活性を評価した（フェーダー（Ｆｅｄｅｒ），Ｊ．およびシュック（Ｓｃｈｕｃｋ），Ｊ．Ｍ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、９：２７８４−２７９１（１９７０））。アミド結合の切断は分光計的に３４５ｎｍにおける吸収減少により測定された。ブラッドフォード蛋白質測定およびクーマッシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの密度計走査（ファーマシアＬＫＢウルトロスカンＸＬ）による初期酵素濃度は１０−７Ｍであった。ＣＬＥＣ酵素は再構築された凍結乾燥された架橋結合されたサーモリシン結晶であると定義されていた。可溶性酵素は１００ｍｇ／ｍ１に濃縮されたサーモリシンとして定義されていた。酵素を５ｍ１の反応容量含有基質に加えた。反応混合物の−部を指定時間に除去し、そして３４５ｎｍにおける吸収を測定した。ＣＬＥＣサーモリシンを反応混合物から吸収の読み取り前に短時間の遠心（ベックマン、マイクロセントリフュージＥ）により分離した。吸収は疑似第一桁速度式に合致しており、そして合致した値を酵素濃度により割算することによりｋｃａｔ／Ｋｍを計算した（アップル・マンキントッシュ・コンピューター用のマルチフィット２．０カーブ・フィッティング（Ｍｕｌｔｉｆｉｔ２．Ｏ　Ｃｕｒｖｅ　Ｆｉｔｔｉｎｇ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ａｐｐｌｅ　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、英国、ケンブリッジＣＢ４６ＷＬ、デイ・コンピューティングＰ．０．ボックス３２７）。
【０１１２】
（ｐＨ依存性および安定性）
可溶性酵素のｐＨ最適性および安定性をジペプチド基質ＦＡＧＬＡの切断によるサーモリシンＣＬＥＣのものと比較した。結果を図２および表９に示した。可溶性および結晶性酵素の両者がｐＨ７において最大活性を示した。ＣＬＥＣおよび可溶性サーモリシンは酸性範囲においても同様な活性を示しており、そして可溶性酵素により生じたベル形ｐＨ輪郭は発表されているデータと一致した（フェーダー（Ｆｅｄｅｒ），Ｊ．およびシュック（Ｓｃｈｕｃｋ），Ｊ．Ｍ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、９：２７８４−２７９１（１９７０））。しかしながら、アルカリ性ｐＨ範囲では、結晶性酵素はｐＨ１０まで最大活性を保ったが、可溶性酵素はｐＨ８．５において７５％活性を有しておりそしてｐＨ９においては２５％だけの活性を有していた。ｐＨ９．５において、可溶性酵素は完全に不活性であった。
【０１１３】
【表９】
2004000230.tif 000030
（高温における安定性）
あるものは比較的高温において一定の化学的工程を操作することにより比較的高い反応速度並びに基質および生成物に関する比較的低い拡散時間を得ることができたが、あるものは基質および生成物の温度安定性により一般的に限定されていた。しかしながら、酵素を基にした触媒作用においては工程を実施できる温度に呈するための実際的な限度を設定することはしばしば酵素活性の損失となる。ＣＬＥＣにおいて得られる追加安定性により、可溶性酵素に関して可能であるものよりはるかに高い温度における酵素活性が可能になった。
【０１１４】
比較的低い温度における強化された安定性がＣＬＥＣ触媒の日常的な長期間貯蔵を簡単にした。例えば、最大の特異的活性を保有するためには可溶性サーモリシンの濃縮（＞５０ｍｇ／ｍ１）溶液を貯蔵することが必要であった。室温においては、活性は普通は１日以内で失われた。それとは対照的に、再水和されたサーモリシンＣＬＥＣは室温において活性の明白な損失なしに数カ月間日常的に貯蔵することができた。サーモリシンの再構築されていない凍結乾燥されたＣＬＥＣは無期限に成長可能に見えた。
【０１１５】
熱安定性および自己融解に対する耐性は連続５日間にわたる６５℃における培養後のサーモリシンＣＬＥＣ中で示された（図３および表１０）。サーモリシンＣＬＥＣは高温における５日間の培養後に最大活性を保有していた。それとは対照的に、可溶性サーモリシンは２日間だけの培養後にそれの初期活性の５０％を失いそして６５℃における２４時間の培養後にはわずかな活性だけを示していた。
【０１１６】
【表１０】
2004000230.tif 000031
可溶性およびＣＬＥＣサーモリシンの活性を６５℃における培養後に測定した。可溶性サーモリシンを１０ｍＭ酢酸カルシウム、ｐＨ７．０の５０ｍＭトリス中で６５℃の水浴中で培養した。反応容量は５００μ１であった。最終的蛋白質濃度は１０ｍｇ／ｍｌであった。部分試料を０、１、２、４、６、１０および１８時間の時点で除去した。試料を上記の如く室温におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＦＡＧＬＡ切断により評価した。サーモリシンＣＬＥＣに関しては、１０ｍＭ酢酸カルシウムおよび５０ｍＭトリス中の２５０μ１の結晶懸濁液も６５℃の水浴中で培養した。活性を０、１、６、２４、４８、７２、９６および１２０時間の時点でＦＡＧＬＡ切断により評価した。
【０１１７】
（外因性蛋白分解に対する耐性）
外因性プロテアーゼの作用に対するサーモリシンＣＬＥＣの耐性の評価も行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析は、商業用酵素が相当な百分率の不純物を含有している可能性があり、それらの一部は主要な可溶性酵素種に対して蛋白分解活性を有するかもしれないことを示唆していた。結晶格子中の酵素分子の充填と仮定すると、ＣＬＥＣ中の内部酵素分子は蛋白分解から保護されるであろうと思われる。この可能性を試験するために、サーモリシンＣＬＥＣおよび可溶性酵素調合物をほとんどの輩白質を消化させて遊離アミノ酸類にさせることのできる非特異的プロテアーゼであるストレプトコッカル・プロアテーゼ、プロナーゼ（登録商標）（Ｐｒｏｎａｓｅ（登録商標））の存在下で培養した（カルビオケミ１９９０カタログ、ラジョッラ、カリフォルニア）。
【０１１８】
可溶性およびＣＬＥＣサーモリシンをｐＨ７．５の５０ｍＭトリス中で４０℃においてプロテアーゼであるプロナーゼ（登録商標）（Ｐｒｏｎａｓｅ（登録商標））（カルビオケミ）の存在下で培養した。プロナーゼ（登録商標）（Ｐｒｏｎａｓｅ（登録商標））対サーモリシンの比は１／４０であった。サーモリシンの自己融解を抑制しそしてサーモリシンによるプロテアーゼの蛋白分解的破壊を防止するために、ＥＤＴＡを可溶性酵素反応に加えて１００ｍＭの最終的濃度とした（ＥＤＴＡはサーモリシン活性を抑制するがプロナーゼ（登録商標）（Ｐｒｏｎａｓｅ（登録商標））は抑制しない）。指定時間に、部分試料を反応混合物から除去し、そして活性を分光計的にジペプチド基質ＦＡＧＬＡの切断により評価した。ＥＤＴＡの存在によるサーモリシン抑制を相殺するために、可溶性酵素活性の分光計的評価はｐＨ７．０の０．５Ｍ酢酸カルシウム緩衝液中でおこなわれ、そして酵素濃度を２倍に増加させた。架橋結合された結晶性酵素は上記の如く評価された。
【０１１９】
図４および表１１に示されている如く、可溶性サーモリシンは急速に劣化しそして９０分の培養後には全ての活性を失った。それとは対照的に、サーモリシンＣＬＥＣの活性はプロテアーゼの存在下での４日間の培養により影響を受けなかった。この蛋白分解に対してほとんど敏感性でないことは、適当なＣＬＥＣが未知の天然産出蛋白分解酵素のカクテルの存在下で作用するように要求されているような診断用のバイオセンサー用途において特に有利である。
【０１２０】
【表１１】
2004000230.tif 000032
（有機溶媒の存在下での安定性）
酵素が生存可能な産業触媒として理想的に受け入れられるためには、これらの酵素は、製造プロセスの実際の環境への過剰の介入なしに、機能し得なければならない。特に、このことは、水性溶媒、極性有機溶媒、および非極性有機溶媒、ならびにこれらの混合物の使用を包含する。市販の適用において、水性−有機性溶媒混合物は、生成物および基質の相対的溶解度を利用して、生成物形成の操作を可能にする。
【０１２１】
可溶性サーモリシンおよびサーモリシンＣＬＥＣは、有機溶媒の存在下で、顕著に異なる安定性を示した（表１２）。有機溶媒中で培養できるであろう可溶性酵素濃度は最高１０ｍｇ／ｍｌに限定されていた。この値より大きい濃度は有機溶媒の添加でサーモリシンの瞬間的沈澱を生じた。それとは対照的に、サーモリシンＣＬＥＣ濃度は結晶により占拠されている容量によってのみ限定されていた。可溶性サーモリシンはアセトン中での培養後に最大活性（７５％）をそしてテトラヒドロフラン中で最少活性（３６％）を保有していた。アセトニトリルまたはジオキサンの存在下での１時間の培養後に、可溶性酵素はそれの初期活性の約５０％を失った。ＣＬＥＣサーモリシンは評価された全ての有機物質を用いる培養後に９５％より大きい最大活性を保有していた。
【０１２２】
【表１２】
2004000230.tif 000033
（有機溶媒中での安定性）
サーモリシンＣＬＥＣまたは可溶性サーモリシン調合物を指定された有機溶媒の５０％（容量／容量）溶液中で培養した。１００μ１のサーモリシンＣＬＥＣ（１０ｍｇ／ｍ１）のｐＨ７の１０ｍＭトリス中スラリーを１／２ドラムガラス瓶中に入れた。等量の指定有機溶媒を加え、そして混合物を短時間撹拌した。１／２ドラムガラス瓶中で２０μ１の可溶性サーモリシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を８０μ１のｐＨ７．０の０．０１５Ｍトリス緩衝液中で希釈した。培養後に、上記の如きジペプチド基質ＦＡＧＬＡの切断により酵素活性を評価した。
【０１２３】
低い水濃度は酵素変性への経路に対する中間段階の出現を好まないようである。ＣＬＥＣでは、立体配座移動度のこの制限は、媒体中で水がほぼ存在しないということによってではなくむしろ、分子内接触および結晶格子を構成している成分酵素分子間の架橋結合により供されている。その結果、中間的な水一有機溶媒濃度は一部はこれまでの酵素を用いては観察されていないＣＬＥＣとして調合される時には酵素により容易に耐えられるものとなる（表１２参照）。この発見により、全ての新分野の合成化学が酵素触媒作用を用いる開発が展望される。
【０１２４】
しかしながら、ほぼ無水の有機溶媒中でさえ酵素の日常的使用はそれらが塊状化および他の集塊問題を受けて不満足と定義される懸濁液を生成するというそれらの傾向により妨害されていた。この性質により、これらの調合物が大規模な工業的方法を元々魅力のないものにしている。それとは対照的に、結晶格子内のＣＬＥＣおよび成分酵素は全てのこれらの溶媒中で単分散性を保っていた。
【０１２５】
（他の固定化方法との比較）
多数の使用できる酵素固定化方法の論文が文献中に見られる（マウフ（Ｍａｕｇｈ），Ｔ．Ｈ．、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２３：４７４−４７６（１９８４）、トランパー（Ｔｒａｍｐｅｒ），Ｊ．、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５−５０（１９８５））。これらでは、酵素は常に固定化された粒子の合計量の小部分を構成しており、それの塊は不活性担体物質である。担体は固定化された酵素粒子の溶媒外側と酵素活性部位との間の平均自由通路を増加させ、拡散問題を悪化させている（クイオチョ（Ｑｕｉｏｃｈｏ），Ｆ．Ａ．およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ），Ｆ．Ｍ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５：４０６２−４０７６（１９６７））。
【０１２６】
ＣＬＥＣでは、架橋結合された結晶マトリックスがそれ自身担体を供して、担体の必要性が除かれる。その結果、ＣＬＥＣ中の酵素の濃度は一定寸法の分子に対して得られる理論的充填限度に近付いて、濃縮溶液中で得られる密度さえも大きく越えることとなる。全体的ＣＬＥＣは活性酵素を含んでおり、従って活性酵素と遊離溶媒との間の基質および生成物に関する平均自由通路が（従来法で固定化された酵素担体粒子と比べて）ＣＬＥＣに関しては大きく短縮されるため溶液中の酵素に関して従来法で固定化された酵素で一般的に見られる酵素反応の拡散−関連減少は最少になった（図１参照）。重要なことに、ＣＬＥＣ中の成分酵素は本質的に単分散性であり、そして例えば濾過、遠心または溶媒の傾斜の如きＣＬＥＣ粒子の簡単な処理により回収することができる。
【０１２７】
（実施例３）
（エラスターゼの結晶化、架橋結合および凍結乾燥並びに生じた生成物の特性の評価）
（エラスターゼの結晶化）
凍結乾燥された豚の膵臓のエラスターゼ（サーヴァ）を室温においてｐＨ５．０の０．１Ｍ酢酸カルシウム中に溶解させて５ｍｇ／ｍｌ（重量／容量）の濃度とした。蛋白質の完全溶解から１分以内に棒形のエラスターゼ結晶が見られた。結晶化溶液を４℃に移行させそして結晶化を一夜で完了させた。結晶を前記の如くして遠心により回収した。
【０１２８】
（エラスターゼ結晶の架橋結合）
２００μ１量のエラスターゼ結晶を室温で５．７７％のグルタルアルデヒドおよびｐＨ５．０の１．５Ｍトリスの１．３ｍ１溶液に加えた。結晶を穏やかに撹拌しながら（撹拌板）１時間にわたり架橋結合した。架橋結合後に、結晶を１５ｍ１量のｐＨ８．０の０．２Ｍトリスで３回洗浄した。エラスターゼＣＬＥＣを実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。
【０１２９】
（可溶性およびＣＬＥＣエラスターゼの酵素活性）
基質スクシニルー（Ａｌａ）３ｐ−ニトロアニリド（バケム）の加水分解を測定することにより可溶性およびＣＬＥＣエラスターゼの触媒活性を評価した［ベイス（Ｂｅｉｔｈ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．、１１：３５０−３５７（１９７４）］。結合の切断は分光計的に４１０ｎｍにおける吸収増加により測定された。初期基質濃度は２×１０−４であった。酵素濃度は２．８×１０−７であった。ＣＬＥＣまたは可溶性酵素を、５ｍ１反応量の基質を含有しているｐＨ８．０の０．２Ｍトリスに加えた。前記の如く、ＣＬＥＣを反応混合物から吸収測定前に除去した。
【０１３０】
【表１３】
2004000230.tif 000034
（外因性蛋白分解に対する耐性）
プロテアーゼの作用に対するエラスターゼＣＬＥＣの耐性の評価もサーモリシンに関して記載されているのと同一条件下で行った（実施例２）。プロテアーゼを用いる培養後に、上記の如きニトロアニリド基質の加水分解により可溶性およびＣＬＥＣ酵素の活性を評価した（表１４および図６）。
【０１３１】
【表１４】
2004000230.tif 000035
（実施例４）
（エステラーゼの結晶化、架橋結合および凍結乾燥並びに生じた生成物の特性の評価）
（エステラーゼの結晶化）
ここに開示されている如く、３０ｍｇ／ｍｌの豚の肝臓エステラーゼ（フルカ）の硫酸アンモニウム懸濁液を室温においてｐＨ５．６の０．２５Ｍ酢酸カルシウム中に溶解させた。酢酸カルシウム溶液の添加後数分以内にエステラーゼ結晶が見られた。結晶化溶液を室温に放置しそして結晶化を一夜で完了させた。結晶を以上で実施例２に記されている如くして遠心により回収した。
【０１３２】
（エステラーゼ結晶の架橋結合
ここに開示されている如く、３００μ１量のエステラーゼ結晶を１２．５％のグルタルアルデヒドおよびｐＨ５．５の０．５酢酸カルシウムの５ｍｌ溶液に加えた。結晶を穏やかに撹拌しながら（撹拌板）１時間にわたり架橋結合した。架橋結合後に、結晶を１５ｍｌ量のｐＨ６．３の０．５Ｍ酢酸カルシウムで３回洗浄した。エステラーゼＣＬＥＣを以上で実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。
【０１３３】
（可溶性およびＣＬＥＣエステラーゼの酵素活性）
基質である酢酸ｐ−ニトロフェニル（フルカ）の加水分解を監視することにより可溶性およびＣＬＥＣエステラーゼの触媒活性を評価した（表１５および図７）。切断は分光計的に４００ｎｍにおける吸収増加により測定された。初期基質濃度は０．００１％であった。酵素濃度は１×１０−８Ｍであった。ＣＬＥＣまたは可溶性酵素を５ｍ１反応量の基質を含有しているｐＨ６．３の０．２５Ｍ酢酸カルシウムに加えた。以上で実施例２に記されている如く、ＣＬＥＣ酵素を反応混合物から吸収測定前に除去した。
【０１３４】
【表１５】
2004000230.tif 000036
（外因性蛋白分解に対する耐性）
プロテアーゼの作用に対するエステラーゼＣＬＥＣの耐性の評価もサーモリシンに関して記載されているのと同一条件下で行った（実施例２）。プロテアーゼを用いる培養後に、上記の如き基質ｐ−ニトロアニリドの加水分解により可溶性およびＣＬＥＣ酵素の活性を評価した（表１６および図８）。
【０１３５】
【表１６】
2004000230.tif 000037
（実施例５）
（リパーゼの結晶化、架橋結合および凍結乾燥並びに生じた生成物の特性の評価）
（リパーゼの結晶化）
ここに開示されている如く、酵素リパーゼ（ジオトリクム・カンジズム）を２０ｍｇ／ｍｌの蛋白質のｐＨ７の５０ｍＭトリス含有８％硫酸アンモニウム中溶液から蒸気拡散により結晶化させた。室温における２０−３０日間の培養後に、ビピリミダル結晶が見られた。結晶を以上で実施例２に記されている如くして遠心により回収した。
【０１３６】
（リパーゼ結晶の架橋結合）
ここに開示されている如く、リパーゼ結晶を１２．５％のグルタルアルデヒドおよびｐＨ５．６の５０ｍＭトリスの溶液に加えた。結晶を１時間にわたり架橋結合した。架橋結合後に、結晶を１５ｍ１量のｐＨ７．０の５０ｍＭトリスで３回洗浄した。リパーゼＣＬＥＣを以上で実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。
【０１３７】
（可溶性およびＣＬＥＣリパーゼの酵素活性）
基質である酢酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解を監視することにより可溶性およびＣＬＥＣリパーゼの触媒活性を分光計的に評価した（表１７および図９）。切断は分光計的に４００ｎｍにおける吸収増加により測定された。初期基質濃度は０．００５％であった。酵素濃度は１．５×１０−８Ｍであった。ＣＬＥＣまたは可溶性酵素を５ｍ１の反応量の基質を含有しているｐＨ７．０の０．２Ｍトリスに室温で加えた。以上で実施例２に記されている如く、ＣＬＥＣ酵素を反応混合物から吸収測定前に遠心により除去した。
【０１３８】
【表１７】
2004000230.tif 000038
（実施例６）
（リゾチームの結晶化、架橋結合および凍結乾燥並びに生じた生成物の特性の評価）
（リゾチームの結晶化）
ブレーク（Ｂｌａｋｅ），Ｃ．Ｃ．Ｆ．他、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）１９６：１１７３（１９６２）の方法に従い、２００ｍｇの凍結乾燥された鶏卵白のリゾチーム（べーリンゲル・マンハイム）を２．５ｍ１のｐＨ４．７の０．０４Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中に室温において溶解させた。蛋白質の溶解後に、２．５ｍｌの１０％塩化ナトリウムをリゾチーム溶液に撹拌しながら滴々添加した。結晶化溶液を室温に一夜放置し、そして結晶化を４８時間で完了させた。結晶を以上で実施例２に記されている如くして遠心により回収した。
【０１３９】
（リゾチーム結晶の架橋結合）
ここに開示されている如く、５００μ１量のリゾチーム結晶を１０ｍ１の２４％のグルタルアルデヒドおよびｐＨ５．６の５０ｍＭトリス含有２０％塩化ナトリウムの溶液に加えた。結晶を穏やかに撹拌しながら（撹拌板）２０分間にわたり架橋結合した。架橋結合後に、結晶を５０ｍｌ量の２０ｍＭ酢酸カルシウムおよびｐＨ５．３の５０ｍＭ塩化カリウムで３回洗浄した。リゾチームＣＬＥＣを以上で実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。
【０１４０】
（可溶性およびＣＬＥＣリゾチームの酵素活性）
基質である酢酸４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチルーチトリオシド（フルカ）の加水分解速度を測定することにより可溶性およびＣＬＥＣリゾチームの触媒活性を評価した（ヤング（Ｙａｎｇ），Ｙ．およびハマグチ（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ），Ｋ．、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、８：１００３−１０１４（１９８０）（表１８および図１０）。４−メチルウンベリフェロンの放出は蛍光計により追跡された（パーキン・エルマー・モデルＬＳ−５０）。初期基質濃度は１．４２×１０−３であった。酵素濃度は３×１０−７であった。ＣＬＥＣまたは可溶性酵素を２ｍ１の反応量の基質含有しているｐＨ５．３の０．２Ｍトリスに４２℃において加えた。４５０ｎｍにおける蛍光強度を３６０ｎｍにおける励起と共に測定することにより、４−メチルウンベリフェロンの量を蛍光計により測定した。励起および発光の両者に関するスリット幅は１０ｍｍであった。以上で実施例２に記されている如く、ＣＬＥＣ酵素を反応混合物から吸収測定前に遠心により除去した。
【０１４１】
【表１８】
2004000230.tif 000039
（実施例７）
（アスパラギナーゼの結晶化、架橋結合および凍結乾燥並びに生じた生成物の特性の評価）
（アスパラギナーゼの結晶化）
グラブナー（Ｇｒａｂｎｅｒｅ）他［米国特許３，６６４，９２６（１９７２）］により記されている工程の変法として、２５ｍｇの凍結乾燥されたアスパラギナーゼ（ワーシングトン）を５００μ１のｐＨ７．２の５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中に溶解させた。溶液を４℃に冷却し、そして１Ｍ酢酸を用いてｐＨを５．０に調節した。冷たい（−２０℃）エタノールを次にアスパラギナーゼ溶液に滴々添加して３３％の最終的濃度にした。溶液を４℃において培養した。結晶化を４８時間で完了させた。結晶を以上で記されている如く遠心により回収した。
【０１４２】
（アスパラギナーゼ結晶の架橋結合）
ここに開示されている如く、アスパラギナーゼ結晶を７，５％のグルタルアルデヒドのｐＨ５．６の５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中溶液の中で架橋結合した。架橋結合後に、結晶を１５ｍ１量のｐＨ７．０の５０ｍＭトリスで５回洗浄した。アスパラギナーゼＣＬＥＣを以上で実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。
【０１４３】
（可溶性およびＣＬＥＣアスパラギナーゼの酵素活性）
以下に記されている一緒にされた酵素反応におけるアンモニウムイオンの発生を測定することにより可溶性およびＣＬＥＣアスパラギナーゼの触媒活性を評価した（全ての試薬はベーリンゲル・マンハイムから購入された）（表１９および図１１）。
【０１４４】
【化１】
2004000230.tif 000040
３４０ｎｍにおける吸収減少により、ＮＡＤＨの酸化が測定された。初期基質濃度は１．４ｍｇ／ｍ１であった。アスパラギン酵素濃度は１０−３Ｍであった。アルファケトグルタレート濃度は１０−４Ｍであった。グルタメートデヒドロゲナーゼ濃度は２．３×１０−８Ｍであった。以上で実施例２に記されている如く、ＣＬＥＣ酵素を反応混合物から吸収測定前に遠心により除去した。
【０１４５】
【表１９】
2004000230.tif 000041
【０１４６】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素の固定化方法、この方法により製造された架橋結合され固定化された酵素結晶、固定化された酵素の貯蔵、取り扱いおよび処理性質を改良する手段、並びに希望する生成物の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は可溶性およびサーモリシンＣＬＥＣの酵素活性の評価の結果のグラフ表示である。
【図２】図２はサーモリシンＣＬＥＣおよび可溶性サーモリシンのｐＨ依存性の比較の結果のグラフ表示である。
【図３】図３は６５℃における培養後の可溶性および結晶性サーモリシンの活性の測定値のグラフ表示である。
【図４】図４は外因性蛋白分解劣化に対する可溶性およびサーモリシンＣＬＥＣの耐性の評価の結果のグラフ表示である。
【図５】図５は可溶性エラスターゼおよび対応するエラスターゼＣＬＥＣに関する酵素活性の評価の結果のグラフ表示である。
【図６】図６は外因性蛋白分解劣化に対する可溶性エラスターゼおよび対応するエラスターゼＣＬＥＣの耐性のグラフ表示である。
【図７】図７は可溶性エステラーゼおよび対応するエステラーゼＣＬＥＣに関する酵素活性の評価の結果のグラフ表示である。
【図８】図８は外因性蛋白分解劣化に対する可溶性エステラーゼおよび対応するエステラーゼＣＬＥＣの耐性のグラフ表示である。
【図９】図９は可溶性リパーゼおよび対応するリパーゼＣＬＥＣに関する酵素活性の評価の結果のグラフ表示である。
【図１０】図１０は可溶性リゾチームおよび対応するリゾチームＣＬＥＣに関する酵素活性の評価の結果のグラフ表示である。
【図１１】図１１は可溶性アスパラギナーゼおよび対応するアスパラギナーゼＣＬＥＣに関する酵素活性の評価の結果のグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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