(57)【要約】【課題】遺伝子改変の方法により確実な品種改良を行い、巨大粒を結実する多収性植物を作出すること。【解決手段】植物３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子が欠損すると、種子が短粒になることが知られていた。よって、植物３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子を恒常的に活性型にすることにより、粒型の大きい種子を結実する形質転換体が得られる。本発明は、植物３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子が常に活性型を示すように遺伝子改変を行い、当該遺伝子を穀類（イネ等）に導入することにより多収性植物を育種するものである。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
恒常的に活性型に改変した穀類３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の改変遺伝子を組み込んだ植物形質転換用ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを、３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子の欠損した宿主に導入する方法。
【請求項４】
請求項３の方法で、請求項１に記載の改変遺伝子が導入された形質転換細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の改変遺伝子を含み、請求項４に記載の形質転換細胞からの再生植物体。
【請求項６】
請求項５に記載の植物体に結実した種子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は農業における植物品種改良技術に属し、さらに詳しくは、遺伝子工学的手法を用いた植物新品種の作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、植物新品種の作出は交配育種あるいは突然変異などを基盤としてきた。しかし、交配や突然変異による方法では、基本的に個体差や偶然に期待せざるを得ないため、品種改良の成功率が必ずしも高くなく、目的の品種を得るために多大な費用と時間を要した。そこで、より確実性の高い方法として、遺伝子工学的手法による品種改良が注目されている。
【０００３】
双子葉植物タバコ３量体Ｇタンパク質において、アミノ酸置換により恒常的活性型を示すことが報告されている（Ａｈａｒｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４２４，１７−２１，１９９８）。この活性型Ｇタンパク質は細胞膜カルシウムチャンネルを活性化すると推定されているが、この活性型Ｇタンパク質が形態形成に関与したという報告はない。
【０００４】
また、双子葉植物シロイヌナズナ３量体Ｇタンパク質において、アミノ酸置換により恒常的活性型を示すことが報告されている（Ｏｋａｍｏｔｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ１３，１６３９−１６５１，２００１）。この活性型Ｇタンパク質は光情報伝達系を活性化すると推定されているが、この活性型Ｇタンパク質が形態形成に関与したという報告はない。
【０００５】
当該技術分野では従来、植物３量体Ｇタンパク質を用いて巨大粒を結実する多収性植物を確実に作出することができていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
当該技術分野では単位面積当たりの農作物収量の増加が望まれているところである。本発明は３量体Ｇタンパク質に着目し、従来実現できなかった多収性植物の確実な育種という課題を、多収性に関与すると考えられる遺伝子の改変によって、解決しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
恒常的に活性型に改変した穀類３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変遺伝子を植物形質転換用ベクターに組み込み、当該ベクターを３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子の欠損した宿主に導入し、形質転換細胞を得る。その形質転換細胞によって得られた再生植物体に結実した種子は、平均粒径または平均重量において親品種の種子より増大している。
【０００８】
【発明の実施の形態】
いま、宿主となる植物をイネとする。イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子（ＲＧＡ１）を欠質した変異体，大黒ｄ１（ＤＫ２２）は、矮性でかつ短粒を示す。このことは、３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子が背丈と粒型の形成に必要であることを示している。この結果を参考にし、上記の変異体と逆の状態、すなわち、３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子の機能を増大させれば、背丈が長く、粒の大きなイネが作出できるものと推定される。そこで、３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子を恒常的に活性型を示すように改変し、改変した遺伝子を大黒ｄ１（ＤＫ２２）に導入したところ、巨大粒が結実することを確認した。
【０００９】
まず、植物３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子の機能を増大させるために、動物での研究成果（Ｋａｊｉｒｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０，３４９−４００，１９９１）を参考にし、遺伝子工学的手法により遺伝子内の一部のアミノ酸を置換し、恒常的活性型を示す高機能遺伝子ＲＧＡ１ＱＬ（イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子改変型遺伝子）を別紙配列表のように作出した。
【００１０】
シロイヌナズナ、イネなど多数の植物から、３量体Ｇタンパク質のゲノム塩基配列、ｃＤＮＡ塩基配列、アミノ酸配列が報告されている。イネ由来の３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子（ＲＧＡ１）は、３８０個のアミノ酸から構成されている（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ｄ３８２３２）。試験管内変異法（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて、２２３番目のグルタミン（Ｇｌｎ）をロイシン（Ｌｅｕ）に置換したイネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変型遺伝子を作成し、融合タンパク質を大腸菌にて生産させ、精製後の酵素機能を検証した。
【００１１】
その結果、当該イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変型遺伝子産物はＧＴＰ加水分解活性を失っているが、ＧＴＰ結合能を保持していることが確認された。よって、当該イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変型遺伝子産物は恒常的に活性型を示した。
【００１２】
イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変型遺伝子を自身のプロモーターに連結し、植物形質転換用ベクターを構築した。バイナリーベクターにはｐＢＩ１０１Ｈｍを用いた。イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変型遺伝子は、このＧタンパク質自身のプロモーターにより、正常な３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子の発現パターンと合致させるように設計した。
【００１３】
アグロバクテリア法を用いて、上記の改変遺伝子をイネに導入した。薬剤選別マーカーにはハイグロマイシンを用いた。改変遺伝子を発現している形質転換体をＲＴ−ＰＣＲ法により選別した（Ｔ１世代）。選抜個体を閉鎖系温室にて生育させ、種子を得た（Ｔ２世代）。個々の形質転換体を独立の系統として扱い、さらに１世代生育させた（Ｔ３世代）。Ｔ２世代イネの節間長、Ｔ３世代種子の長さ、重量を測定した。その結果、恒常的に活性型遺伝子を発現した形質転換体から得られた種子は、平均で種子重量が１５％増加した。
【００１４】
【実施例】
イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子（ＲＧＡ１）のｃＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ｄ３８２３２）を鋳型として用いて、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ，Ｍｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造株式会社）を用いて、２２３番目のグルタミン（Ｇｌｎ）をロイシン（Ｌｅｕ）に置換した。
【００１５】
Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓに用いたプライマーは以下の通りである。この配列はアンチセンス鎖である。アンダーラインで示したところが正規の遺伝子配列からの変更点である。正常な遺伝子の配列はＴ，変更後の配列は下記の通りＡである。
（５ダッシュ末端）ＣＴＣ　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＧＣＣ　ＴＣＣ　ＴＡＣ（３ダッシュ末端）
【００１６】
この操作によって、２２３番目のアミノ酸はグルタミン（Ｇｌｎ）からロイシンに（ｌｅｕ）に変更された。アミノ酸配列番号は登録アミノ酸配列番号（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ｄ３８２３２）に対応している。正常型および改変型αサブユニットの２２３番目のアミノ酸は次の通りである。
正常型（ＲＧＡ１）の２２３番目のアミノ酸：　Ｇｌｎ
改変型（ＲＧＡ１ＱＬ）の２２３番目のアミノ酸：　Ｌｅｕ
【００１７】
この改変遺伝子をヒスチジンタグを有する大腸菌専用の発現ベクターｐＱＥ３０（キアゲン社）に組み込み、融合タンパク質を定法にしたがって誘導し、目的のタンパク質を精製した。そのタンパク質の酵素活性の測定結果によって、改変遺伝子産物は恒常的に活性型であることが示された。この改変遺伝子を「イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変遺伝子（ＲＧＡ１ＱＬ）」と命名する。
【００１８】
上記の結果を受けて、イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変遺伝子をバイナリーベクターｐＢＩ１０１Ｈｍに組み込んだ後、アグロバクテリアを用いる形質転換法にしたがってイネに当該遺伝子を導入した。宿主となるイネとして、３量体Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子欠損株である大黒ｄ１（ＤＫ２２）を用いた。
【００１９】
宿主イネより、ハイグロマイシンを用いて１次選抜した。
【００２０】
ハイグロマイシン耐性個体からおのおのＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてイネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変遺伝子領域を増幅し、塩基配列を解析し、導入した改変遺伝子断片が挿入されていることを確認した。初代形質転換体をＴ１世代（形質転換第１世代）と呼び、Ｔ１世代から結実した種子をＴ２世代、以下同様にＴ３世代、Ｔ４世代などと呼ぶ。
【００２１】
Ｔ２世代の種子を播種し、全生活環にわたり節間長および結実した種子（Ｔ３世代）の粒径などを測定した。その結果、Ｔ２世代の形質転換イネは背丈が平均５％伸長し、結実したＴ３世代の種子の重量は平均１５％増加していた。こうして、３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変遺伝子を人為的に導入した形質転換イネから結実した種子の粒径および重量の増加が確認された。したがって、この植物は、個体１本あたりに結実する数は原品種と同程度であるが、それぞれの種子重量の増加により多収性となっている。
【００２２】
【発明の効果】
本発明に示す方法により、イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変型遺伝子を人為的にイネに導入した場合、種子の形状および重量を増加する、多収性の効果が現れた。ゲノム研究の成果により、単子葉植物と双子葉植物はそれぞれ特徴的に進化してきたことが明らかである。よって単子葉植物内のイネ科植物に限定した場合、本発明にしたがえばイネ科植物に巨大粒を結実させることが可能である。本発明によって得られた多収性植物を栽培することは、世界的な食糧不足を回避するための一つの解決策となろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】日本晴由来の大黒ｄ１（ＤＫ２２）に、イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変型遺伝子を導入した場合、親品種である日本晴より粒型の大きい種子が得られた結果を示す。
【符号の説明】
ａ　　　日本晴
ｂ　　　大黒ｄ１（ＤＫ２２）
ｃ５　　イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変型遺伝子を導入した形質転換体
【図２】日本晴由来の大黒ｄ１（ＤＫ２２）に、イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変型遺伝子を導入した場合、親品種である日本晴より重量の大きい種子が得られた結果を示す。
【符号の説明】
ａ　　日本晴
ｂ　　大黒ｄ１（ＤＫ２２）
ｃ１、ｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５　　イネ３量体Ｇタンパク質αサブユニット改変型遺伝子を導入した形質転換体（５つはそれぞれ独立の形質転換体）
【図１】
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【図２】
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