(57)【要約】【課題】  カルス細胞特異的に活性化する新規プロモータおよびその利用を提供することを課題とする。【解決手段】  イネの増殖期カルスのcDNAライブラリーから発現頻度の高いRezA遺伝子のクローンを選択した。RT-PCRによりRezA遺伝子の発現を検討した結果、増殖期及び再分化期カルスで発現し、葉、根ではほとんど発現しないことが判明した。RezA遺伝子の推定プロモータ領域をクローニングし、この推定プロモータ部分を5'端から段階的に削り、その活性に必要な領域の同定を行った結果、コーデイング領域から5'上流の135bpのDNA断片が、カルスにおいてプロモータ活性を維持するのに充分な領域であることが明らかとなった。また135bpのDNA断片は、CaMV ３５Sプロモータ由来のエンハンサーを結合させることによって、よりプロモータ活性を示すことがわかった。  この135bpの領域を含むDNA断片は、形質転換植物の作出において、特に選択マーカーを発現するための新規プロモータとして好適に利用しうる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物のカルス細胞においてプロモータ活性を有する、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：１２に記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号：１２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｃ）配列番号：１２に記載の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなるDNA
（ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列における、少なくとも配列番号：１２に記載の塩基配列を含む塩基配列からなるDNA
【請求項２】
植物の葉で実質的にプロモータ活性を有しない、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
植物の根で実質的にプロモータ活性を有しない、請求項１に記載のDNA。
【請求項４】
植物が単子葉植物である、請求項１に記載のDNA。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のDNAに、エンハンサーが機能的に結合している請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
エンハンサーがCaMV35Sプロモータ由来のエンハンサーである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載のDNAに任意の遺伝子が機能的に結合している請求項５から７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
任意の遺伝子が選択マーカー遺伝子である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
【請求項１１】
単子葉植物由来である、請求項１０に記載の形質転換植物細胞。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物のカルス細胞においてプロモータ活性を有するDNA及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
形質転換体植物を作出する場合、導入したい目的遺伝子以外に選択マーカー遺伝子も同時に導入する必要がある。このため、現在、作出された形質転換植物の多くは選択マーカー遺伝子を発現している。しかし、特に形質転換体植物が農作物である場合、選択マーカー遺伝子が食用となる組織で発現することは不必要かつ望ましくない形質である。そのため選択マーカー遺伝子を発現しない形質転換植物体を取得するための工夫がいくつか考案されている。
【０００３】
そのうちの一つは、二種類のT-DNAカセットを用いる方法である(非特許文献１〜７)。この方法においては、まず、導入したい遺伝子と選択マーカー遺伝子を別々のT-DNAカセットに挿入して共形質転換することにより両遺伝子を独立した箇所に組み込ませる。そして、次世代で両遺伝子を分離させて選択マーカーフリーの個体の選抜を行う。この方法には、多くの時間と労力を必要とするという欠点が存在する。
【０００４】
二つ目の方法としては、形質転換後にcre/lox系やR/RS系を利用した部位特異的切り出しによって選択マーカー遺伝子を除去する方法が挙げられる(非特許文献８〜１１)。この方法においては、選択マーカーの切り出しを誘導するcre遺伝子やR遺伝子を発現させるタイミングの制御が重要なポイントとなる。１つの解決策として、誘導性のプロモータにこれら遺伝子を連結し、適切な時期に遺伝子発現の誘導を行うことで、選択マーカー遺伝子の切り出しを制御している。
【０００５】
三つ目の方法としては、トウモロコシのAc/Dsトランスポゾンを利用してマーカーフリーの個体を取得する方法が挙げられる(非特許文献１２)。しかし、この方法の場合も、一つ目の方法と同様に、目的の個体は次世代で初めて取得することができるため、時間と労力がかかり過ぎるという難点がある。
【０００６】
四つ目の方法としては、カルス細胞でのみ活性化し、カルス細胞から再生された植物体では活性化しないプロモータを用いる方法が挙げられる。この方法に関しては、最近になり、カルスの組織でのみ発現するプロモータを利用したモデル実験での報告がなされた（特許文献１、非特許文献１３）。この方法には、カルス細胞の形質転換後に上記の方法のような煩雑な操作を行う必要がないという利点がある。
【０００７】
【特許文献１】特許第２００３-２６５１８２
【非特許文献１】Depicker A, Herman L, Jacobs A, Schell J, Van Montagu M(1985) Mol Gen Genet 201: 477-484
【非特許文献２】McKnight TD, Lillis MT, Simpson RB(1987) Plant Mol Biol 8:439-445、De Block M, Debrouwer D(1991) Theor Appl Genet 82:257-263
【非特許文献３】De Block M, Debrouwer D(1991) Theor Appl Genet 82:257-263
【非特許文献４】De Neve M, De Buck S, Jacobs A, Van Montagu M, Depicker A(1997) Plant J 11:15-29
【非特許文献５】Komari T, Hiei Y, Saito Y, Murai N, Kumashiro T(1996) Plant J 10:165-174
【非特許文献６】De Framond AJ, Back EW, Chilton WS, Kayes L, Chilton MD(1986) Mol Gen Genet 202:125-131
【非特許文献７】Deley M, Knauf VC, Summerfelt KR,Turner JC(1998) Plant Cell Rep 17:489-496
【非特許文献８】Odell J, Caimi P, Sauer B, Russell S(1990) Mol Gen Genet 223:369-378
【非特許文献９】Dale EC, Ow DW(1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:10558-10562
【非特許文献１０】Russell SH, Hoopes JL, Odell JL(1992) Mol Gen Genet 234:49-59
【非特許文献１１】Gleave AP, Mitra DS, Morris BAM(1999) Plant Mol Biol 40:223-235
【非特許文献１２】Yoder JI, Goldsborough AP(1994) Biotechnology 12:263-267、Goldsbrough AP, Lastrella CN, Yoder JI(1993) Biotechnology 11:1286-1292
【非特許文献１３】Huang N., Wu L., Nandi S., Bowman E., Huang J., Sutliff T., Rodriguez R.L.(2001)Plant Science 161:589-595
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
形質転換体植物を作出する場合、多くはカルスを経由して行なわれる。特に主要な穀物は単子葉植物が多い。それ故単子葉植物のカルス細胞で安定して高発現する選択マーカー遺伝子用プロモータが必要である。しかし、現在のところ主に使用されているプロモータはウイルスか双子葉植物由来のものであり、これらは単子葉植物細胞内で必ずしも十分な活性を示さない場合がある(McElroy D, Brettell RIS(1994) Trends Biotechnol 12: 62-68、Wilmink A, van de Ven BC., Dons JJ.(1995) Plant Mol Biol 28: 949-955)。それに対して単子葉植物由来のプロモータは単子葉植物細胞内で期待どおりの高発現をすることが証明されている(Jang IC., Choi WB., Lee KH.,Song SI., Nahm BH., Kim JK. (2002) Plant Physiology 129:1473-1481、McElroy D, Blowers AD, Jenes B, Wu R(1991) Mol Gen Genet 231: 150-160、Kyozuka J, McElroy D, Hayakawa T, Xie Y, Wu R, Shimamoto K(1993) Plant Physiol 102:991-1000、Jang I-C, Nahm BH, KimJ-K(1999) Mol Breed 5:453-461、Uchimiya H, Iwata M, Nojiri C,Smarajeewa PK,Takamatu S, Ooba S, Anzai H,Christensen AH, Quail PH, Toki S（1993）Bio/Techology 11: 835-836)。しかし、実用化されているプロモータの種類は今のところ圧倒的に少ないのが現状である。さらに、目的の形質転換体をつくるために複数個の遺伝子を導入しなければならない場合には(Ye X., Al-Babili S., Kloti A., Zhang J., Lucca P., Beyer P., Potrykus I.(2000) Science 287:303-305、Dhankher O.P,, Li Y., Rosen B.P., Shi J., Salt D., Senecoff J.F., Sashti N.A., Meagher R.B.(2002) Nature Biotechnology 20: 1140-1145)、選択用プロモータも複数必要となり、新たなプロモータへの需要は高い。
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、カルス細胞特異的に活性化する新規プロモータを提供することにある。好ましい態様において、本発明は、単子葉植物由来のプロモータを提供する。該プロモータを利用して有用な形質転換植物を作出することも本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、増殖期カルスで高発現するプロモータを得る目的で、イネの増殖期カルスのcDNAライブラリーを作成し、発現頻度の高いクローンの中からRezA遺伝子を選択した。RT-PCRによりRezA遺伝子の発現を検討した結果、増殖期及び再分化期カルスで発現し、葉、根ではほとんど発現しないことが判明した。そこで、次に、2527bpからなるRezA遺伝子の推定プロモータ領域をクローニングし、さらにカルスでの発現活性を支配する部分を決定するために、この推定プロモータ部分を5'端から段階的に削り、sGFPを利用したレポーター解析を行った。その結果、コーデイング領域から5'上流の233bpのDNA断片が、カルスにおいてプロモータ活性を維持するのに必要充分な領域であり、135bpのDNA断片でも約半分のプロモータ活性を示すことが分かった。次に、イネ種子における233bpと135bpのプロモータ活性を調べるためにGUS遺伝子を結合してイネに導入した。その結果、どちらのプロモータでもGUS遺伝子が胚乳部分では発現しないが、糊粉層においては233bpのプロモータは弱い発現を促し、135bpによるGUS発現は非常に低いかゼロであった。このことより、135bpのDNA断片を選択用プロモータに利用した場合、食べる部分に相当する胚乳では不要な選択マーカー遺伝子産物は蓄積しないような組換え体を作成することができると考えられる。
【００１１】
さらに、135bpのDNA断片のプロモータ活性を高めるために、植物において発現を高める機能を持つことが知られているCaMV35Sプロモータ由来のエンハンサー  −351〜−84部分をタンデムに４個または8個結合して、プロモータ活性を測定した。その結果、135bpプロモータはCaMV35Sプロモータと同等なプロモータ活性を示し、エンハンサーの付加する個数を多くすることにより、より高い発現効果を示すことがわかった。従って、エンハンサーをタンデムに４個または8個付加した135bpプロモータはCaMV35Sプロモータと同程度の高い選択効率を持つことが期待される。
以上の結果は、この135bpの領域を含むDNA断片が、形質転換植物の作出において、特に選択マーカーを発現するための新規プロモータとして好適に利用しうることを示すものである。
【００１２】
即ち、本発明は、カルス細胞で安定かつ高発現するプロモータおよびその利用に関し、より詳しくは、下記発明を提供するものである。
（１）  植物のカルス細胞においてプロモータ活性を有する、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：１２に記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号：１２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｃ）配列番号：１２に記載の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなるDNA
（ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列における、少なくとも配列番号：１２に記載の塩基配列を含む塩基配列からなるDNA
（２）  植物の葉で実質的に活性化しない、（１）に記載のDNA。
（３）  植物の根で実質的に活性化しない、（１）に記載のDNA。
（４）  植物が単子葉植物である、（１）に記載のDNA。
（５）  （１）から（４）のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
（６）  （１）から（４）のいずれかに記載のDNAに、エンハンサーが機能的に結合している（５）に記載のベクター。
（７）  エンハンサーがCaMV35Sプロモータ由来のエンハンサーである、（６）に記載のベクター。
（８）  （１）から（４）のいずれかに記載のDNAに任意の遺伝子が機能的に結合している（５）から（７）のいずれかに記載のベクター。
（９）  任意の遺伝子が選択マーカー遺伝子である、（８）に記載のベクター。
（１０）  （８）に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
（１１）  単子葉植物由来である、（１０）に記載の形質転換植物細胞。
（１２）  （１０）または（１１）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（１３）  （１２）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
（１４）  （１２）または（１３）に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【発明の効果】
【００１３】
形質転換植物の作出技術は、栽培穀物の品種改良のみならず植物を生産工場に見立てた産業用原材料生産、予防医薬効果をもつ機能性食品そして土壌や大気中の汚染物質の浄化等様々な目的をもって利用されようとしている。しかしながら、これら応用例に対して実用化可能な形質転換植物を作出するには、多くの解決すべき技術的課題が残されている。この課題の一つは、導入遺伝子を安定に目的の場所と時期でのみ機能させるプロモータの開発である。
【００１４】
形質転換植物を作出する場合、選抜操作が必須である。そして、選抜マーカー遺伝子の発現を必要とする組織は多くの場合増殖期カルスである。カルス以外の組織において不必要なマーカー遺伝子発現を抑えることは環境や人への影響を考慮する観点からも重要であり、増殖期カルス特異的発現するプロモータの開発はこれを解決する有効な手段である。
【００１５】
本発明者らが見出したRezA遺伝子のプロモータは、イネ増殖期カルスで高い活性を有するため、イネをはじめとする多くの単子葉穀物の形質転換用ベクターに利用されることが期待される。
【００１６】
RezA遺伝子の上流域135bp配列のプロモータ活性は、35Sプロモータの活性と比較すると半分程度の活性を有していた。
また本発明のRezA遺伝子の上流域135bp配列は、CaMV35Sプロモータ由来のエンハンサーを結合することで、CaMV35Sプロモータと同等なプロモータ活性を示すことがわかった。本発明のプロモータの利用は選択マーカー発現用のみならず増殖能の高いカルス細胞を利用したタンパク質生産などへの応用も期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明におけるプロモータとしては、植物のカルス細胞においてプロモータ活性を有するものであれば特に制限はない。好ましくはカルス細胞から再生させた植物の葉および／または根で実質的にプロモータ活性を有しない。ここで「実質的にプロモータ活性を有しない」とは、カルス細胞における活性の5％以下の活性、好ましくは3％以下の活性、より好ましくは1％以下（例えば、0.5％、0.3％、0.1％以下）の活性であることを意味する。
【００１８】
本発明のプロモータとしては、配列番号：２に示す翻訳開始点上流2527bpの塩基配列からなるプロモータ領域において、少なくとも翻訳開始点上流135bpの塩基配列を含む塩基配列からなるDNAが好ましい。このようなDNAには、図３に示す翻訳開始点上流2527bpの塩基配列からなるDNA（配列番号：２）、翻訳開始点上流997bpの塩基配列からなるDNA、翻訳開始点上流478bpの塩基配列からなるDNA、翻訳開始点上流233bpの塩基配列からなるDNA（配列番号：１）、および翻訳開始点上流135bp（配列番号：１２）の塩基配列からなるDNAが含まれる。この中でも翻訳開始点上流233bpの塩基配列からなるDNA（配列番号：１）は短鎖でかつプロモータ活性が高いという観点から好適であり、また翻訳開始点上流135bpの塩基配列からなるDNA（配列番号：１２）は、プロモータ活性は233bpの塩基配列からなるDNAよりも劣るが、カルスのみに発現し発現部位に高い特異性を持つという観点から好適である。本発明におけるプロモータとしては、単子葉植物の形質転換植物体を作出する目的では、単子葉植物由来のものであることが好ましい。単子葉植物としては、代表的にはイネであるが、他の単子葉植物であってもよい。
【００１９】
配列番号：１２に示す塩基配列を有するイネ由来のDNAと同等の機能を示す、イネあるいは他の単子葉植物由来のDNAを単離する場合には、一般的なハイブリダイゼーション技術（Southern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.）、またはPCR技術（Saiki, RK. et al., Science, 1985, 230, 1350.、Saiki, RK. et al., Science, 1988, 239, 487.）を利用することができる。即ち、当業者であれば、配列番号：１２（あるいは配列番号：２）に示すDNAもしくはその一部をプローブとして、または、該DNAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、所望の単子葉植物から配列番号：１２に示すイネ由来のDNAと同等の機能を有するDNAを単離することができる。このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M 尿素、0.4％ SDS、0.5×SSCの条件、または0.1％ SDS（60℃、0.3mol NaCl、0.03M クエン酸ソーダ）のハイブリダイゼーション条件、あるいはこれらと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4％ SDS、0.1×SSCの条件下では、より相同性の高いDNAを単離できることが期待される。
【００２０】
このようにして単離されたDNAは配列番号：１２に示すイネ由来のDNAと有意な相同性を有する。有意な相同性とは、塩基配列全体で好ましくは50％以上、さらに好ましくは60％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、最も好ましくは90％以上（例えば、95,96,97,98,99％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87, 2264-2268.、Karlin, S. & Altschul, SF., Proc Natl Acad Sci USA, 90, 5873.）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul, SF. et al., J Mol Biol, 1990, 215, 403.）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
【００２１】
また、本発明におけるプロモータとしては、カルス細胞においてプロモータ活性を示す限り、配列番号：１２に記載の塩基配列において、1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなるDNAであってもよい。ここで「複数の塩基」とは、好ましくは30塩基以内、より好ましくは10塩基以内、さらに好ましくは5塩基以内（例えば、3塩基以内）である。このようなDNAを調製するために当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.）による変異の導入を挙げることができる。また、DNAにおける塩基の変異は、自然界において生じることもある。
【００２２】
調製されたDNAがプロモータ活性を有するか否かは、例えば、レポーター遺伝子を用いた周知のレポーターアッセイにより検討することが可能である。レポーターアッセイにおいては、調製されたDNAの下流にレポーター遺伝子が発現可能に結合されたベクターを作製し、これをカルス細胞に導入して、該細胞内のレポーター活性を測定する。レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるGFP遺伝子、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびβ−グルクロニダーゼ(以下、GUS)遺伝子等を挙げることができる。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がGFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。また、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００２３】
本発明におけるプロモータDNAは、ゲノムDNAであっても、化学合成DNAであってもよい。ゲノムDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物細胞からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PAC等が利用できる）を作製し、配列番号：１２に記載のイネ由来のDNAまたは他の単子葉植物由来の対応するDNAを基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、これらDNAに特異的なプライマーを作成し、植物細胞から抽出されたゲノムDNAを鋳型にPCRを行うことによって調製することも可能である。
また、本発明のプロモータDNAは、エンハンサーを結合することで、そのプロモータ活性を高めることが出来る。
【００２４】
本発明におけるプロモータDNAとエンハンサーとが「機能的に結合している」とは、プロモータ活性が高まるように、本発明のプロモータ活性を有するプロモータDNAとエンハンサーとが結合していることをいう。従って、プロモータDNAとエンハンサーの距離が離れていたり、間に他の遺伝子が挿入された場合であっても、本発明のプロモータDNAのプロモータ活性が高まるのであれば、上記の「機能的に結合している」の意に含まれる。エンハンサーは本発明のプロモータDNAの上流下流どちらに存在していても良い。
【００２５】
本発明においてエンハンサーとは、転写により生成するメッセンジャーRNA(mRNA)  の量を結果的に増加させるものであれば限定されない。エンハンサーはプロモータの作用を促進する効果を持つ塩基配列であり、一般的には100bp前後からなるものが多い。エンハンサーは配列の向きにかかわらず転写を促進することができる。又、エンハンサー自体はプロモータ活性を持っていないのであるが、エンハンサーは数千塩基対も離れた所から転写を活性化することができる。さらに、エンハンサーは転写される遺伝子領域の上流、下流、および遺伝子内にも存在し、転写の活性化することができる。また、上述したように本発明のエンハンサーは、転写により生成するmRNAの量を増加させるものであれば限定されないので、mRNAの転写後にmRNAの分解を阻害したり、mRNAを安定化することによって、細胞内に存在するmRNAの量を増加させ、アミノ酸の翻訳効率を上げるものも本発明のエンハンサーに含まれる。
本発明で用いられるエンハンサーは１種類でもよく、又、２つ以上の同一のエンハンサーを複数用いたり、あるいは異なる複数のエンハンサーを組み合わせて用いても良い。
【００２６】
本発明において用いられるエンハンサーとしては種類は限定されないが、好ましくはCaMV35Sプロモータ由来のエンハンサーであり、より好ましくは該エンハンサーの-351〜-84部分である。該エンハンサーは、タンデムに付加する個数を多くすると、プロモータ活性をより高めることが出来る。付加する個数はプロモータ活性を高める限り限定されるものではないが、より好ましくは４個または8個である。
【００２７】
このようにして調製されたプロモータを利用して植物体において任意の遺伝子を発現させるには、該プロモータに任意の遺伝子が機能的に結合しているベクターを作製し、これを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる。ここで「機能的に結合している」とは、任意の遺伝子が本発明のプロモータの制御下で発現するように、任意の遺伝子と本発明のプロモータが結合していることを意味する。プロモータの下流に連結する遺伝子としては、特に制限はなく、植物細胞内で発現させたい所望の遺伝子である。本発明の目的からして選択マーカー遺伝子が特に好適に用いられるが、これに限られず、有用タンパク質をコードする遺伝子、アンチセンス遺伝子、2本鎖RNA又はリボザイムRNAを発現する遺伝子などを用いることも考えられる。選択マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。農業的に優れた形質を付与する遺伝子としては、例えば、耐病性、耐虫性、耐ウイルス性、細菌抵抗性、カビ抵抗性、ストレス耐性、花色関連遺伝子、形態形成に関与する遺伝子、生理活性物質の生合成系遺伝子、有用物質生産遺伝子等がある。医薬産業等において有用な物質の生産に関与する遺伝子としては、ワクチン遺伝子、抗体遺伝子、医薬原料生産遺伝子等が挙げられる。化学工業等においては、有用な物質の生産に関与する遺伝子、例えば、油脂の生合成系遺伝子、工業用酵素遺伝子等が考えられる。研究目的では、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等が考えられる。これらは自然界の生物からクローン化した遺伝子、化学合成遺伝子、あるいはそれらの組み合わせやそれらの改変遺伝子でも良い。植物細胞に導入する遺伝子の数も1つに限らず、目的に応じて複数であってもよい。形質転換された植物細胞を効率的に選択するためには、ベクターは、目的の遺伝子の他に選抜マーカー遺伝子を含むことが好ましい。この場合、目的の遺伝子は、本発明のプロモータと異なるプロモータに支配されていてもよい。目的の遺伝子を含むベクターを選抜マーカー遺伝子を含むベクターと共に植物細胞へ導入することにより、形質転換された植物細胞の選抜を行うこともできる。
【００２８】
ベクターを導入する「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、カルス細胞、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片などが含まれる。好ましくはカルス細胞である。植物細胞は、好ましくは単子葉植物由来であり、最も好ましくはイネ由来である。
【００２９】
植物細胞へのベクターの導入には、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。アグロバクテリウム（例えば、EHA101）を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法（特許第3141084号）を用いることが可能である。また、パーティクルガン法においては、例えば、バイオラッド社のものを用いることが可能であり、遺伝子導入装置としては、例えば、GIE-III型IDERA（タナカ社）を用いることができる。
【００３０】
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1995）。例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P, et al: Biotechnology 9: 957, 1991）、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta SK: In Gene Transfer To Plants （Potrykus I and Spangenberg, Eds） pp.66-74, 1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1992）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y, et al: Plant J 6: 271, 1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００３１】
ゲノム内に目的の遺伝子が導入された形質転換植物体が一旦得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により、さらに本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。
【００３３】
[実施例１]   イネのcDNAライブラリー作成
イネ（japonica）の各組織（根、葉、穂、カルス）からmRNAを抽出しSuperScript TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning CAT.NO.182448-031のkit（ GIBCO BRL社）を用いてinstruction Manualに従って作成した。ベクターにcDNAをクローニングする際、Okubo et.al 1992の方法(Okubo K, Hori N, Matoba R,NiiyamaT,Fukushima A,Kojima Y,Matubara K(1992)  Nature genetics 2:173-179)を利用して3'UTRをクローニングし,クラスタリングし易くした。
【００３４】
[実施例２]   カルス培養細胞で高発現する遺伝子の探索
各組織ごとに発現しているクローンをクラスタリングした結果をヒストグラムで示し、組織間で比較した。カルスでとくに高発現しているクローンの中からRezA遺伝子を選択した。
【００３５】
[実施例３]   RT-PCRによるRezA遺伝子の各組織における発現レベル比較
イネ（japonica）のシュート、根、2.4D(2mg/l)存在下で培養した増殖期カルス、NAA(1mg/l)+BA(2mg/l)存在下で培養した再分化期カルスから全RNAをSepasolRNA I CAT.NO.306-55 （nacalai tesque）を用いてマニュアルに従って抽出した。cDNA はSuperScript TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning CAT.NO.182448-031のkit （GIBCO BRL社）を用いて合成した。RT-PCRによるRezA遺伝子の葉、根、増殖期カルスと再分化期カルスにおける発現レベルの検出には、次のプライマーを用いた。
5'cgacgacgacgccatccatcc3'／配列番号：３
5'actcgggtacgtggtgaaacc3'／配列番号：４
このプライマー対はRezA遺伝子のコーデイング領域3'側の318bpを増幅する。PCRはPCR SuperMix High Fidelity, CAT.NO.1090-020 （GIBCO BRL社）を用いて94℃で30秒を1サイクルに続いて94℃で30秒, 58℃で30秒,72℃で30秒を25サイクル行なった。
【００３６】
その結果、増殖期カルスと再分化期カルスにおいて予想通りのサイズである318bpのPCR産物が検出された。増殖期カルスと再分化期カルスとの間での発現レベルはほとんど差異はみとめられなかった。葉と根においてはRezA遺伝子の発現は検出以下であったが、PCRサイクルを25回から30回にふやすと葉と根においても低いレベルではあるが発現しているといえる結果を得た（図１）。この結果からカルス特異的発現をするRezA遺伝子の5'上流域にはカルスで活性の高いプロモータ機能を持つ配列があると予想出来る。
【００３７】
[実施例４]   RezA遺伝子の推定プロモータ部位のクローニング
RezA遺伝子配列を用いてホモロジー検索をしゲノムシーケンス（GenBank accession Number: AP000570）とアノテーションを求めた。それらの情報よりRezA遺伝子コーデイング領域開始点から-2541位の5'上流にはESTが存在することが予想されていたため、RezA遺伝子のプロモータ領域は最大で2541bpと仮定した。また報告されている（GenBank accessionNumber:U46138）完全長 RezA遺伝子のcDNA情報から転写開始点は翻訳開始点(ATG)の-65位であることが予想された。翻訳開始点からこの5'UTRを含む全長2527bpをプロモータ部位と推定し、PCR用プライマー(5'tcaagcttgaccgctaccctgggcc3'／配列番号：５, 5'gctctagatcggatcactcgatcggacggc3'／配列番号：６)を、5'側に HindIIIサイトを3'側にXbaI サイトを付加するように設計した。
【００３８】
イネ（japonica）の葉からゲノミックDNAを抽出しこれをテンプレートにしてPCRを行なった（図２）。PCRはPCR SuperMix High Fidelity, CAT.NO.1090-020（GIBCO BRL社）を用いて94℃で30秒を1サイクル、続いて94℃で30秒, 58℃で30秒,72℃で2分30秒を25サイクル行ない、この生成産物はエタノール沈殿によって精製回収した。
精製回収したDNA断片は制限酵素のHindIIIとXbaIで酵素処理しCaMV35S-sGFP(S65T)-NOS3'(丹羽康夫博士  静岡県立大学大学院より分譲)をHindIIIとXbaIで開いたベクターに組み込みシーケンスして確認した。
【００３９】
[実施例５]   RezA遺伝子推定プロモータ部位を5'端から段階的に削ったディレーションミュータント作成
クローニングした2527bpのシーケンスデーターに基づいて997bpのディレーションミュータント用プライマー（5'tcaagcttttctagggaagataaagcg3'／配列番号：７, 5'gctctagatcggatcactcgatcggacggc3'／配列番号：６）、478bpのディレーションミュータント用プライマー（5'tcaagctttaggaactaattacacaacg3'／配列番号：８, 5'gctctagatcggatcactcgatcggacggc3'／配列番号：６）、233bpのディレーションミュータント用プライマー（5'tcaagcttccctcgacccgtcacg3' ／配列番号：９, 5'gctctagatcggatcactcgatcggacggc3'／配列番号：６）、135bpのディレーションミュータント用プライマー（5' tcaagcttcgcctctttaaatgcg3'／配列番号：１０, 5'gctctagatcggatcactcgatcggacggc3'／配列番号：６）、95bpのディレーションミュータント用プライマー（5'tcaagcttcacagagctcacaagcc5'／配列番号：１１, 5'gctctagatcggatcactcgatcggacggc3'／配列番号：６）を合成してPCRを行いHindIIIとXbaIで開いたCaMV35S-sGFP(S65T)-NOS3'にクローニングした。各ディレーションミュータント（図３）はシーケンスを行なって塩基配列の確認を行なった。
【００４０】
[実施例６]   ディレーションミュータントの一過的発現によるプロモータ活性の測定
遺伝子導入においては、遺伝子導入装置GIE-III型IDERA（タナカ社）を用いて1μMの金粒子CAT.NO.165-2263 （Bio Rad社）にプラスミドDNAをコートしてカルス細胞あるいは葉に打ち込んだ。導入するプラスミドDNAの精製はplasmid mini Kit CAT.NO.12125（QIAGEN社）で精製抽出し、コーテイングはDNA10μgと金粒子suspension buffer(0.3mg gold particles/50μl water)と2.5M CaCl2 50μlと0.1M spermidine 20μlを混合し、30分攪拌して行なった。攪拌後 金粒子は70%エタノールで二回洗浄し50μl の100%エタノールを加えて懸濁した。遺伝子導入条件は真空圧-80Kpa,He圧0.6Mpa、試料との距離9cm、噴出時間0.025秒, 金粒子液5μl(プラスミドDNA量1μg)で行なった。導入処理後の試料はホルモン無添加のLS培地で28℃一晩培養した。
【００４１】
プロモータ活性は、蛍光顕微鏡下（OLYMPUS IX70）で検出したsGFP蛍光をCCDカメラ(CoolSNAP NipponRoper)に取り込み、画像シグナルを蛍光強度測定用ソフト(Proper scienceTM RSimage version1.7.3)を利用して測定した。測定は一つのディレーションミュータントにつき20個の細胞を選んで行い、平均値と標準誤差値を出した。
【００４２】
その結果、カルスにおける発現は233bpのDNA断片（配列番号：１）で必要充分な活性をもつことが明らかとなり（図４）、135bpのDNA断片（配列番号：１２）では半分のプロモータ活性を持つことがわかった。一方、葉での発現は最長の2527bpから全てのディレーションミュータントが最短の95bpのDNA断片と同程度の低い値を示した（データは示していない）。これら一過的発現による組織特異性の違いはRT-PCRの結果とも一致している。
【００４３】
[実施例７]   形質転換体種子における233bp,135bpの発現
イネ種子における233bpと135bpのプロモータ活性を調べるためにGUS遺伝子を結合してイネに導入した（図５）。その結果、どちらのプロモータでもGUS遺伝子が胚乳部分では発現していないことが明らかとなった。しかし233bpのプロモータは糊粉層で弱い発現を示していた。これに対して135bpによるGUS発現は糊粉層においても非常に低いかゼロであった。この結果より135bpを選択用プロモータに利用した場合、食べる部分に相当する胚乳では不用な選択マーカー遺伝子産物は蓄積しないような組み換え体をつくることが出来ることがわかる。
【００４４】
[実施例８]   135bpプロモータへのCaMV 35S由来のエンハンサーの付加
カルスでの 135bpプロモータ活性の強さは図4(b)に示したように35Sの約半分であるので選択用にそのまま使うには弱すぎる。CaMV 35Sプロモータ由来のエンハンサーは植物で発現を高める機能を持つことが知られている（Odell J.T., Knowlton  S., Lin W.,  Mauvais  C.J.(1988) Plant Molecular Biology 10:263-272）。そこで発現を高める工夫としてCaMV ３５Sプロモータ由来のエンハンサー-351〜-84部分（配列番号：１３）をタンデムに４個又は８個結合した。その結果135bpプロモータはCaMV 35Sプロモータと同等な強さにまで上昇した（図６）。図６に示すようにエンハンサーの効果は付加する個数を多くするとより高い発現効果を示した。従ってエンハンサーをタンデムに４個又は８個付加した135bpプロモータはCaMV 35Sプロモータと同程度の高い選択効率をもつことが期待される。
【００４５】
[実施例９]   イネ種子におけるエンハンサーを付加した135bpDNA断片のプロモータ活性
135bpプロモータの発現はCaMV 35Sプロモータ由来のエンハンサーの付加によってカルス細胞では大いに高められたがイネ種子の胚乳においてもエンハンサー効果があるのかあるいは無いのかを知るために一過的発現で調べた。その結果、135bpの発現はエンハンサーが８個付加されていても胚乳での発現は認められなかった（図７）。
【００４６】
しかし糊粉層での発現が新たに検出された。この糊粉層での発現が果たしてエンハンスされた結果、検出可能の程度にまで高められたのかあるいはエンハンサーに含まれているといわれているシス(Benfey PN., Ren L., Chua NH. (1990) The EMBO Journal 9:1677-1684)が働いて新たに糊粉層でも発現するようになったのかは現在のところどちらともいえない。ただし胚乳において135bpプロモータはCaMV 35Sプロモータ由来のエンハンサーの付加とは無関係に依然として発現が無く、対照的に１個の同エンハンサーを含むCaMV ３５Sプロモータは胚乳で発現が認められている（図７）ことから胚乳の組織に関して言えば付加したエンハンサーは組織特異性を変えるようなシスを持っていないといえる。
【００４７】
RezA遺伝子の上流域135bpには95bpの5’UTRが含まれており（KOME database Accession No.AX069098 http://www.nias.affrc.go.jp）、実質は40bpがプロモータとみなされるがここをPLACE data base(Higo K., Ugawa Y., Iwamoto M.,Korenaga T. (1999) Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE)database. 27:397-300)でサーチするとplant bZIP proteinであるDof-1のbinding siteを一箇所持っていると予測しているので、カルスで高発現する少なくとも一種類以上のbZIPに類する転写因子によって発現が制御されているのであろう。またこのプロモータにはTATA配列は存在せず代わりにinitiator element様配列を含んでいるのでTATA-lessタイプのものである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】RT-PCRによる各遺伝子の葉、根、カルス組織における発現レベルの比較を示す写真である。イネ（japonica）のシュート、根、2.4D(2mg/l)存在下で培養した増殖期カルス、NAA(1mg/l)+BA(2mg/l)存在下で培養したカルスから全RNAを抽出しRT-PCRによってRezA遺伝子の発現レベルを比較した。
【図２】ロングPCRによるRezA遺伝子の5'端側非翻訳領域の単離の結果を示す写真である。Mはマーカーを示す。Lane１では、RezA遺伝子の5'側上流域2527bpのPCR断片（矢印）が増幅された。
【図３】RezA遺伝子のプロモータ解析に用いたディレーションミュータントを示す図である。ｓGFPはレポータ遺伝子を示し、tNOSはNOSターミネーター配列を示す。
【図４】イネカルス培養細胞を用いたRezA遺伝子プロモータの一過的発現アッセイの結果を示す図である。（ａ）は、一過的発現を示すイネカルス細胞の蛍光写真である。遺伝子はパーティクルガンを用いて導入した。各ディレーションミュータントについて蛍光を発する細胞を20個ずつサンプリングして統計処理した。（ｂ）は、GFPの一過的発現の蛍光強度を測定した結果を示す図である。約200bp以下の個所から発現が低下している。
【図５】形質転換体イネ種子におけるRezA遺伝子プロモータ活性を示す写真である。（a）の135bpのDNA断片のプロモータにおいては発現していないことがわかり、（b）の233bpのDNA断片のプロモータでは、糊粉層のみで発現していることがわかる。（c）233bpの長さのプロモータを導入した転換体イネ種子を縦割に切ったものを示す。胚乳部分での発現は起こっていない。
【図６】イネカルスにおけるエンハンサーを付加した135bpのプロモータの発現を示す写真である。１は135bpのみ、２はエンハンサーを2個付加したもの、３はエンハンサーを4個付加したもの、４はエンハンサーを8個付加したもの、５はポジティブコントロール（CaMV ３５Sプロモータの発現活性）を示す。
【図７】イネ種子におけるCaMV 35SプロモータとRezA遺伝子プロモータ（8個のエンハンサーを付加した135bp）の発現部位の違いを示す写真である。（a）はCaMV 35Sプロモータの発現部位を示し、胚乳部位で発現していることがわかる。（b）はRezA遺伝子プロモータの発現部位を示し、胚乳部位では発現せず、糊粉層のみで発現していることがわかる。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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