(57)【要約】【課題】コルディセピンの含有量を向上させる。【解決手段】冬虫夏草用培地にコルディセピンを産生する冬虫夏草菌を接種し、これを５〜２８℃下２０〜９０日間培養する第１工程と、その培養後、３５℃以下の範囲内で前記第１工程の培養温度より温度を上げて培養する第２工程とを含む。第２工程において、冬虫夏草用培地に照度１００〜１５００００ルクスの光照射を行うことが好ましい。光照射が、照度６００〜５００００ルクスであることが好ましい。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
冬虫夏草用培地にコルディセピンを産生する冬虫夏草菌を接種し、これを５〜２８℃下２０〜９０日間培養する第１工程と、その培養後、３５℃以下の範囲内で前記第１工程の培養温度より温度を上げて培養する第２工程とを含むことを特徴とする冬虫夏草の培養方法。
【請求項２】
冬虫夏草用培地にコルディセピンを産生する冬虫夏草菌を接種し、これを５〜２８℃下２０〜９０日間暗所にて培養する第１工程と、その培養後、前記冬虫夏草用培地に照度１００〜１５００００ルクスの光照射を行うことを培養する第２工程とを含むことを特徴とする冬虫夏草の培養方法。
【請求項３】
前記第１工程を暗所で行い、かつ前記第２工程において、前記冬虫夏草用培地に照度１００〜１５００００ルクスの光照射を行うことを特徴とする請求項１記載の冬虫夏草の培養方法。
【請求項４】
前記光照射が、照度６００〜５００００ルクスであることを特徴とする請求項２または請求項３記載の冬虫夏草の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた抗腫瘍効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有する薬用茸の一種である冬虫夏草の培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
冬虫夏草は、薬用茸の一種で、昆虫などを宿主とし、菌糸が増殖して宿主を死に至らしめた後、該宿主の体内で菌糸が充満すると子実体を形成するコルディセプス（ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属の茸の一種であり、冬季には宿主の体内にあり、夏季になると宿主の虫体から穿ち出る子嚢菌に属する茸である。
冬虫夏草は、自然状態では地中又は地上に菌糸又は胞子として存在する菌であり、寄生する昆虫の幼虫期、蛹期及び成虫期全般にわたって体内に侵入して発生する。
冬虫夏草は、優れた抗腫瘍効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有するものとして知られている。冬虫夏草の有効成分はコルディセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）であり、その含有量は、子実体の乾燥体において０．０２〜０．６重量％程度である。
【０００３】
近年、冬虫夏草の菌糸体を人工的に培養する方法としていくつか提案されており、例えば、冬虫夏草の虫体菌糸又は座胞子をセミなどの節足動物の昆虫類の成虫、蛹、幼虫などに定着させて固体培養する方法、米胚を利用した培養液の製造方法などが知られている。しかしながら、成虫、蛹、幼虫などに定着させる固体培養や、米胚を利用した液体培養などの従来の培養方法では、培養方法が複雑であった。また、その収量は、たとえば、さなぎ固体培養による培養生成産物中のコルディセピン含有量は約０．１〜０．５重量％、米胚液体培養の場合は約０．０４重量％といずれも高くなかった（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特開昭６３−２０９５７９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような実情に鑑みなされたものであり、その目的は、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を向上させることができる冬虫夏草の培養方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の冬虫夏草の培養方法は、冬虫夏草用培地にコルディセピンを産生する冬虫夏草菌を接種し、これを５〜２８℃下２０〜９０日間培養する第１工程と、その培養後、３５℃以下の範囲内で前記第１工程の培養温度より温度を上げて培養する第２工程とを含むことを特徴とするものである。
前記第２工程において、前記冬虫夏草用培地に照度１００〜１５００００ルクスの光照射を行うことが好ましい。
また、本発明の冬虫夏草の培養方法は、冬虫夏草用培地にコルディセピンを産生する冬虫夏草菌を接種し、これを５〜２８℃下２０〜９０日間暗所にて培養する第１工程と、その培養後、前記冬虫夏草用培地に照度１００〜１５００００ルクスの光照射を行うことを培養する第２工程とを含むことを特徴とするものである。
前記第２工程における光照射が、照度６００〜５００００ルクスであることが好ましい。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられる冬虫夏草は、コルディセピンを産生する菌であり、コルディセピンを体外に排出および／または体内に含有する菌である。例えば、コルディセプス属に属するもので、コルディセプス・ミリタリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）等が好ましく用いられる。特にコルディセプス・ミリタリス（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５７、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５８）が好ましく用いられる。
【０００８】
冬虫夏草用培地は、冬虫夏草を培養するものであれば特に限定されるものではないが、好ましくは、（Ａ）グルコース、スクロース、糖蜜、マルトース、米及び／又はとうもろこしから選ばれた少なくとも１種、（Ｂ）ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれた少なくとも１種及び／又は（Ｄ）ビオチン、ビタミンＢ類を含有してなる培地等である。
【０００９】
（Ａ）成分は、冬虫夏草用培地の炭素源として含有するものであり、グルコース、スクロース、糖蜜、マルトース、米及び／又はとうもろこしのいずれか１種又は２種以上である。米、とうもろこしは、使用する培地の形態等にあわせて適宜粉砕して用いることが好ましい。例えば、液体培地の場合は、粒径２００〜３００μｍ程度とするが、これに限定されるものではない。米、とうもろこしは、安価で容易に入手できる材料であるので、低コストで培地を提供することができる。
【００１０】
（Ａ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は、好ましくは１〜１００重量％である。液体培地の場合は、好ましくは１〜６重量％である。なお、（Ａ）成分として、グルコース、スクロース、糖蜜、マルトースのいずれか１種を用いる場合、好ましくは１〜３重量％であるが、米および／またはとうもろこしのみを（Ａ）成分として用いる場合には、他の（Ａ）成分と比較して糖質の含有量が低いので、３〜５重量％であることが好ましい。（Ａ）成分の含有量が１重量％未満では、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向がある。
なお、本発明において重量％とは、水１００重量部に対して、成分ｘ重量部を含有することを意味する。
【００１１】
（Ｂ）成分は、冬虫夏草用培地の窒素源として含有するものであり、ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれるいずれか１種又は２種以上である。イーストまたはモルトはその抽出物を使用してもよい。ミルクとしては、粉乳、脱脂粉乳が挙げられる。
（Ｂ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は、好ましくは１〜７重量％であり、特に好ましくは４〜７重量％である。（Ｂ）成分の含有量が１重量％未満、また、７重量％を超えた場合は、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向がある。
【００１２】
（Ｃ）成分は、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれるいずれか１種又は２種以上である。
アスパラギン、アスパラギン酸、グリシンは、アミノ酸の１種である。アスパラギンとしてはＬ体、Ｄ体どちらも使用できるが、Ｌ体が好ましい。アスパラギン酸においても、Ｌ体、Ｄ体どちらも使用できる。Ｌ−アスパラギン（和光純薬製のもの等）を用いた場合には、低コストに製造できるので工業的に好ましい。
ＤＮＡとしては、例えば、魚等から抽出したＤＮＡが使用でき、鮭精液由来のＤＮＡ等が挙げられる。
【００１３】
（Ｃ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は好ましくは０．１〜０．５重量％であり、特に好ましくは、０．３〜０．４重量％である。（Ｃ）成分の含有量が０．１重量％未満の場合は、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向があり、かつコルディセピン含有量の増加効果が少ないので好ましくない。また、（Ｃ）成分の含有量が０．５重量％を超えた場合は、菌体の成長及びコルディセピン含有量の増加効果の極限を超えるため好ましくない。
【００１４】
（Ｄ）成分は、ビタミンとして冬虫夏草用培地に含有させるものであり、ビオチン、ビタミンＢ類のいずれか１種又は２種以上である。
ビオチンはビタミンの一種である。
ビタミンＢ類は、ビタミンＢであれば特に限定されず、好ましくは、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等であり、これらは単独のものでも、又は二種以上の混合物であってもよい。
【００１５】
（Ｄ）成分の含有量は、特に限定されないが、微量であることがよく、例えば冬虫夏草用培地１００ｍｌに対して２〜１０μｇ程度である。（Ｄ）成分の含有量が２μｇ未満の場合は、得られる培養生成物中のコルディセピン含有量の増加効果が少ないので好ましくない。また、（Ｄ）成分の含有量が１０μｇを大きく超えた場合は、菌体の成長およびコルディセピン含有量の増加効果の極限を超えるので好ましくない。
【００１６】
冬虫夏草用培地のｐＨは、２〜９であることがことが好ましく、特に好ましくは、５〜７である。ｐＨの調製は、調製が行えるならばどのようにしてもよく、例えば、塩酸や水酸化ナトリウムを使用する調製方法が挙げられる。
【００１７】
本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）〜（Ｄ）成分以外はほとんど水であるが、この水としては、特に限定されず、水道水、井戸水、蒸留水等が挙げられる。
さらに、（Ａ）〜（Ｄ）成分、水以外にも、コルディセピンの含有量を向上させるために他の成分を含有させてもよい。
他の成分としては、例えば（Ｂ）成分以外の窒素源としてはおから、それ以外には例えばマグネシウム、カルシウム等のミネラルが挙げられる。
【００１８】
本発明の第１の冬虫夏草の培養方法は、冬虫夏草用培地に冬虫夏草菌を接種し、これを５〜２８℃下２０〜９０日間培養する第１工程と、その培養後、３５℃以下の範囲内で前記第１工程の培養温度より温度を上げて培養する第２工程とを有するものである。
【００１９】
また、本発明の第１及び第２の冬虫夏草の培養方法において冬虫夏草用培地は、固体培地でも液体培地でも適用できるが、好ましくは液体培地がよい。液体培地を使用した場合は、固体培地を用いた場合よりも効率よく菌糸を大量に得ることができ、かつ、冬虫夏草が産生したコルディセピンが菌体内のみならず培養液中に大量に存在する。したがって、菌体から複雑な工程を経て分離せずとも大量のコルディセピンを培養液から効率的に精製分離することができる。
【００２０】
第１工程における培養温度は５〜２８℃の範囲であり、好ましくは１６〜２５℃、特に好ましくは２１〜２５℃である。培養温度が５℃未満では得られる培養生成物中のコルディセピン含量が少なく、また、培養温度が２８℃を越えると、得られる培養生成物中のコルディセピン量がそのピークを超え、減る傾向がある。
【００２１】
第１工程における培養時間は２０〜９０日であり、好ましくは４０〜９０日である。培養時間が２０日未満では得られる培養生成物中のコルディセピンの量が十分でない。また、培養時間が９０日を越えると得られる培養生成物中のコルディセピン量がそのピークを超え、減る傾向がある。
【００２２】
第２工程は、第１工程終了後、第１工程の培養温度より培養温度を上昇させ、熱ショックを与え、その温度で培養するものである。第２工程での培養温度は３５℃以下であり、３５℃を超えると、菌が死滅する恐れがある。第２工程の温度は、第１工程の温度等の培養条件によって、最も効果的にコルディセピン産生量を増大させる温度を選択することが好ましい。例えば、第１工程で２１〜２５℃で培養した場合、第２工程にて２８℃〜３０℃で培養すると、培養生成物中のコルディセピン量の増加効果がもっとも高く、好ましい。
【００２３】
上述のように第１工程後、第２工程にて熱ショックを与えることによって、培養生成物中のコルディセピン含量を増大させる効果を得ることができる。
【００２４】
本発明の第２の冬虫夏草の培養方法は、冬虫夏草用培地に冬虫夏草菌を接種し、これを５〜２８℃下２０〜９０日間暗所にて培養する第１工程と、その培養後、前記冬虫夏草用培地に照度１００〜１５００００ルクスの光照射を行う第２工程とを有するものである。
すなわち、第２の冬虫夏草の培養方法は、５〜２８℃下２０〜９０日間で培養する第１工程を暗所で行い、その後第２工程において照度１００〜１５００００ルクスの光を培地に照射するものである。
【００２５】
第１工程における培養温度及び培養時間は、前記第１の培養方法と同じであるので説明を省略する。
第２工程における光照射は、照度１００〜１５００００ルクス、好ましくは、照度６００〜５００００ルクスである。光照射が照度１００ルクス未満では得られる培養生成物中のコルディセピン量の増加効果が少ない。また、光照射が照度１５００００ルクスを越えると得られる培養生成物中のコルディセピン量がそのピークを超え、減る傾向がある。
光照射の色（光種）は、特に限定されないが、好ましくは白、緑、黄、青、赤等であることが好ましい。
【００２６】
このように第１工程後、第２工程にて光照射し、ショックを与えることによって、培養生成物中のコルディセピン含量を増大させる効果を得ることができる。
【００２７】
また、本発明の第１の培養方法の第２工程において、熱ショックと共に第２の培養方法と同様の光照射を行うと、培養生成物のコルディセピン量をさらに増大させることができ、好ましい。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれになんら限定されるものではない。実施例及び比較例におていは、下記の菌株を種菌培養として下記前々培養及び前培養して使用した。
【００２９】
（使用菌株）
菌株としては、コルディセプス・ミリタリス（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５７）を、保存菌株用培地（スラント培地：ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン  ２μｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）で保存したものを用いた。
【００３０】
（前々培養）
平板寒天培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン２μｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）をシャーレに２０ｍｌ充填した。このシャーレ培地に、前記保存した菌株を約１５ｍｍ＊１５ｍｍ切り出して接種し、これを２１℃下２週間培養した。
【００３１】
（前培養）
液体培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン２μｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１２１℃下２０分間滅菌処理した。処理後、液温度が室温まで下がったとき、この液体培地に、前々培養したシャーレ培地から切り出した約１ｃｍ角のコロニ−三つを接種した。これを回転振盪機を用いて８０ｒｐｍで、２１℃下１０日間培養し、分生子の発生を顕微鏡で確認後、本培養に使用した。
【００３２】
（本培養）
冬虫夏草用培地（グルコース３ｇ、ペプトン４ｇ、Ｌ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４０．０５ｇ、ビオチン２μｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）１００ｍｌを１２１℃下２０分間滅菌処理した。なお、各例毎に（１種につき）それぞれ３つ同じ実験を行った。処理後、それぞれ液温度が室温まで下がったとき、この液体培地に、前培養で得られた菌体含有培地約１ｍｌを接種し、これを下記実施例及び比較例に示した培養方法にて本培養を行った。
なお、得られた生成物中の総コルディセピン量は下記のようにして求めた。
【００３３】
（培養生成物中の総コルディセピン量の測定）
本培養後、各培養液１００ｍｌをろ紙（５Ｂ：アドバンテック東洋社製）を用いてろ過した。得られた菌体を５日間凍結乾燥した後、精密天秤で測定しその重量（以下、菌体重量とする）を測定した。
また、ろ過した培養液を凍結乾燥し、その重量（以下、培養液乾燥重量とする）を測定した。
【００３４】
凍結乾燥した菌体１ｇを水（蒸留水）を用いて１０分間超音波（サンフレックス、ＤＧ−１、５０Ｗ、４３ＫＨｚ）処理した。この処理液をろ紙（５Ｂ：アドバンテック東洋社製）を用いてろ過してコルディセピン含有量分析用試料とした。
この試料を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ（ＬＣ−１０：株式会社島津製作所製））を用いて分析し、コルディセピンの含有量を測定した（以下、菌体コルディセピン含有量とする）。
【００３５】
ＨＰＬＣの条件は、カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（ＯＤＳ）  ２５０Ｌ＊４．６φｍｍ（ジーエルサイエンス株式会社製）を用い、移動相は５０ｍＭリン酸カリウム：アセトニトリル（Ｖ／Ｖ＝９５：５）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出波長２６０ｎｍで行った。
前記ろ過培養液の凍結乾燥物についても、同様にしてコルディセピン含有量を測定した（以下、培養液コルディセピン含有量とする）。
【００３６】
これらの値から、次式に基づいて総コルディセピン量を求めた。
2004267004.tif 000002
上記の測定は、各培養条件において三連で実験して得られた培養物のそれぞれについて行い、３つの値の平均値をその培地における値とした。
【００３７】
〔実施例１〜３、比較例１〕
前記本培養において作成した冬虫夏草菌を接種した冬虫夏草用培地を２３℃下２０日間暗所にて静置培養した（第１工程）。その培養後、下記表１に示した実施例１〜３の培養温度下１４日暗所にてそれぞれ静置培養し（第２工程）、それぞれ得られた菌体の総コルディセピン量を求めた。また、比較のため（比較例）、第２工程における培養温度を第１工程の培養温度と同じ温度（２３℃）で培養し、得られた菌体の総コルディセピン量を求めた。温度毎の評価は、比較例で得られた総コルディセピン量１とし、比を求めることで行い、その結果を表１に示した。
【００３８】
【表１】
2004267004.tif 000003
【００３９】
表１に示した結果から、本発明の第２工程の培養温度が規定範囲にある実施例１〜３の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が比較例と比較して増加した。
【００４０】
〔実施例４〜８〕
前記本培養において作成した冬虫夏草菌を接種した冬虫夏草用培地を２３℃下２０日間暗所にて静置培養した（第１工程）。その培養後、下記表２に示した実施例４〜８の照度で白色の光照射を行いながら２３℃下１４日それぞれ静置培養し（第２工程）、それぞれ得られた菌体の総コルディセピン量を求めた。その結果を表２及び図１に示した。
【００４１】
【表２】
2004267004.tif 000004
【００４２】
表２及び図１に示した結果から、本発明の第２工程の光照射が規定範囲にある実施例４〜８の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が従来と比べて増加した。
【００４３】
〔実施例９〜１２〕
前記本培養において作成した冬虫夏草菌を接種した冬虫夏草用培地を２３℃下２０日間暗所にて静置培養した（第１工程）。その培養後、下記表３に示した実施例９〜１２の色（光種）で照度８００Ｌｕｘの光照射を行うと共に２３℃下１４日それぞれ静置培養し（第２工程）、それぞれ得られた菌体の総コルディセピン量を求めた。その結果を表３及び図２に示した。
【００４４】
【表３】
2004267004.tif 000005
【００４５】
表３及び図２に示した結果から、本発明の第２工程の光照射の色（光種）が白、緑、黄、青、赤の実施例６、９〜１２の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が従来と比べて増加した。
【００４６】
〔実施例１３〜１５〕
前記本培養において作成した冬虫夏草菌を接種した冬虫夏草用培地を２３℃下２０日間暗所にて静置培養した（第１工程）。その培養後、下記表４に示した実施例１３〜１５の照度で白色の光照射を行うと共に室内２５℃下１４日それぞれ静置培養し（第２工程）、それぞれ得られた菌体の総コルディセピン量を求めた。その結果を表４及び図３に示した。
【００４７】
【表４】
2004267004.tif 000006
【００４８】
表４及び図３に示した結果から、本発明の第２工程の培養温度及び光照射がそれぞれ規定範囲にある実施例１３〜１５の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が増加した。
【００４９】
【発明の効果】
本発明によれば、培養生成物中のコルディセピン量を顕著に増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】照度と総コルディセピン量との関係を示すグラフである。
【図２】光の色と総コルディセピン量との関係を示すグラフである。
【図３】熱ショックを与えた後、光照射した場合の照度と総コルディセピン量との関係を示すグラフである。
【図１】
2004267004.tif 000007
【図２】
2004267004.tif 000008
【図３】
2004267004.tif 000009