(57)【要約】【課題】大麦焼酎蒸留残液から分取した液体分を培地に使用したナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法を提供する。【解決手段】大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）からなり、Ｂｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行うことを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分を培地に使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養するナイシンを含有する発酵生産物の製造方法であって、前記培地として、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）からなり、Ｂｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行うことを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項２】
前記液体分（Ａ）の少なくとも一部が前記液体分（Ｂ）で占められるように前記液体分（Ａ）と前記液体分（Ｂ）を量配分することを特徴とする請求項１に記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項３】
前記液体分（Ａ）と前記液体分（Ｂ）を夫々水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整することを特徴とする請求項２に記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項４】
前記ナイシンが、ナイシンＡ及び／又はナイシンＺである請求項１乃至３のいずれかに記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項５】
前記培養を、回分培養方式及び／又は連続培養方式で行うことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項６】
前記培養を前記連続培養方式で行い、その際、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）からなり、Ｂｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを基質溶液として供給することを特徴とする請求項５に記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項７】
前記液体分（Ａ）及び／又は前記液体分（Ｂ）の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着処理に付して非吸着画分とすることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項８】
前記合成吸着剤は、芳香族系、芳香族系修飾型、及びメタクリル系の合成吸着剤の中から選ばれるものである請求項７に記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項９】
前記液体分（Ａ）を使用せずに、前記液体分（Ｂ）のみからなり、Ｂｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したもの培地として使用することを特徴とする請求項１に記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項１０】
前記ナイシンが、ナイシンＡ及び／又はナイシンＺである請求項９に記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項１１】
前記培養を、回分培養方式及び／又は連続培養方式で行うことを特徴とする請求項９または１０に記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項１２】
前記液体分（Ｂ）の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着処理に付して非吸着画分とすることを特徴とする請求項９乃至１１のいずれかに記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項１３】
前記合成吸着剤は、芳香族系、芳香族系修飾型、及びメタクリル系の合成吸着剤の中から選ばれるものである請求項１２に記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項１４】
前記培養を、回分培養方式及び／又は連続培養方式で行うことを特徴とする請求項１２または１３に記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項１５】
前記培養を前記連続培養方式で行い、その際、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）のみからなり、Ｂｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを基質溶液として供給することを特徴とする請求項１４に記載のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法。
【請求項１６】
優れた呈味性を有する、請求項１乃至１５のいずれかに記載の製造方法で製造されるナイシンを著量含有する発酵生産物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分を培地に使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養するナイシンを含有する発酵生産物の製造方法であって、前記培地として、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）からなり、Ｂｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行うことを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法に関する。本発明のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法は、前記培養を回分培養方式及び／又は連続培養方式で行う態様を包含する。また、本発明のナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法は、前記液体分（Ａ）の全てを前記液体分（Ｂ）で置き換える態様を包含する。本発明により得られるナイシンを著量含有する発酵生産物は、優れた呈味性を有し、食品として使用できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般にナイシンと呼称されて知られているものは、３４のアミノ酸から成るポリペプチドであり、アミノ酸配列の２７位がヒスチジンであるものをナイシンＡと言い、アミノ酸配列の２７位がアスパラギンであるものをナイシンＺと言う。こうしたナイシンは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓによって生産されるバクテリオシンの一種であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓなどのグラム陽性菌に対して抗菌作用を示し、現在約５０カ国で、特定の食品に限って、保存剤としての使用が認められている。そうした食品の主なものとしては、チーズ、缶詰、牛乳、クリーム、マヨネーズなどを挙げることができる。
【０００３】
ナイシンの製造については、以下に述べるような方法が提案されている。即ち、特開平４−７５５９６号公報［以下、「文献１」と言う］には、乳酸菌を用いるナイシンの発酵生産において、ナイシン生産菌が生産するナイシン以外の代謝産物によりこの生産菌の増殖速度が低下するか或いは増殖が停止する前に、菌体を含む培養液を膜を用いて連続的に濾過し、菌体を含む液と、菌体を含まずナイシンを含む液とに分離し、前記菌体を含む液は培養槽内に返送し、菌体を含まずナイシンを含む液を抜き取り、その抜き取った液の量と同体積の新鮮な液体培地を前記培養槽内のナイシン生産菌培養液に、希釈率０．１〜１０ｈｒ−１で供給しつつ濾過培養を続け、前記菌体を含まずナイシンを含む液、前記培養槽内の培養液、或いは該培養液に含まれる菌体そのものからナイシンを分離することを特徴とするナイシンの製造方法が記載されている。より詳細には、文献１には、培地としてＭＲＳ培地を使用し、ナイシン生産能を有する乳酸菌菌株としてストレプトコッカス・ラクチスＩＦＯ１２００７を使用し、上記濾過培養法を用いて発酵に付すことが記載されており、当該発酵により得られる培養液のナイシン濃度は１．７２×１０５Ｕ／Ｌである旨記載されている。
【０００４】
特開平４−１２６０９３号公報［以下、「文献２」と言う］には、ナイシン生産能を有するストレプトコッカス・ラクチスＳＢＴ１２１２株を培養に付してナイシンを生産するにあたり、培養液中にセリンまたはフェニルアラニンを０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ添加して培養を行い、ナイシンの生産を増強することを特徴とするナイシンの生産方法が記載されている。また、文献２には、セリンを添加した全乳からなる培地を使用し、上述の生産方法により得られる発酵生産物のナイシン生産量は１０００（Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）である旨記載されている。
特開平６−９６９０号公報［以下、「文献３」と言う］には、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９を、１％酵母抽出物を添加したＭＲＳ培地、或いは０．５％酵母抽出物を添加した７％乳清からなる培地を用いて培養するバクテリオシン（ナイシン）の生産方法が記載されており、また当該生産方法において得られる発酵生産物のナイシン力価は１６００ＡＵ／ｍｌである旨記載されている。
【０００５】
しかしながら、文献１乃至３に記載のナイシン製造方法によって達成される発酵生産物中のナイシン濃度は上述した通りいずれも極めて低いことから、これらのナイシン製造方法はナイシンを工業的に多量生産するには適さないものである。因みに、現在のところこれらのナイシン製造方法は工業的に実施されていない。
【０００６】
ところで、焼酎蒸留残液を乳酸菌の培養用培地として使用することが提案されている。即ち、特開２０００−２３６８９１号公報［以下、「文献４」と言う。］には、米焼酎蒸留粕を固液分離することにより固体分から得られる培地に乳酸菌を添加して発酵に付すことを特徴とする乳酸の製造方法が記載されている。特開２０００−２４５４９１号公報［以下、「文献５」と言う］には、蒸気滅菌をしない開放系で、芋焼酎蒸留粕を固液分離した固体分から得られる培地にＬ乳酸を生産する乳酸菌を添加して発酵に付すことを特徴とする高純度Ｌ乳酸の製造方法が記載されている。
特開２０００−３４２２４７号公報［以下、「文献６」と言う］には、大麦を原料とする焼酎製造において副生する焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分をろ過して清澄液を得、該清澄液を濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着性画分を有効成分として含有した微生物用培地が、酵母、乳酸菌、及びビフィズス菌の培養用培地として優れ、前記微生物用培地を酵母、乳酸菌、及びビフィズス菌の培養に使用した場合、培養菌体の量が著しく増加する旨記載されている。
【０００７】
また、特開２００２−３６９６７２号公報［以下、文献７と言う。］には、ナイシン等のバクテリオシンを含有する乳酸発酵液による食品の殺菌方法が記載されている。そして、食品に対して、該乳酸発酵液とカルシウムイオンを加えることにより、該乳酸発酵液の有する抗菌作用を長く維持できることが記載されている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平４−７５５９６号公報
【特許文献２】
特開平４−１２６０９３号公報
【特許文献３】
特開平６−９６９０号公報
【特許文献４】
特開２０００−２３６８９１号公報
【特許文献５】
特開２０００−２４５４９１号公報
【特許文献６】
特開２０００−３４２２４７号公報
【特許文献７】
特開２００２−３６９６７２号公報
【０００９】
しかしながら、文献４及び文献５において培地原料として使用する米焼酎蒸留残液の固体分及び芋焼酎蒸留残液の固体分は、本発明において培地原料として使用する、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分及び米を原料とする焼酎製造において副生する米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分とは客観的に区別される明らかに別異なるものである。その上、文献４及び文献５に記載の発明は、米焼酎蒸留残液または芋焼酎蒸留残液から得られる固体分からなる培地を使用して乳酸菌を培養することによって乳酸を生産することを目的とするものであり、ナイシンを含有し、優れた呈味性を有する乳酸菌発酵液の製造方法については示唆すらも全くない。
【００１０】
文献６は、前記微生物用培地がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の乳酸菌、即ちＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ等の菌体の増殖に有効である旨記載しているが、ナイシン生産能を有するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属する乳酸菌の菌体増殖効果については全く記載していない。また文献６には、前記微生物用培地がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の乳酸菌、即ちＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ等の菌体増殖に有効である旨記載されていることから、該微生物用培地を用いて上述したナイシン生産能を有するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属する乳酸菌を培養した場合、同様の菌体増殖効果が奏されることを推測することは容易であるかもしれない。しかしながら、前記ナイシン生産能を有する乳酸菌を培養することによって培養液中に生産されるナイシンの量は、培養液中の菌体量の増加のみによって必然的に高まるものでは到底ない。この点は、上述の菌体増殖効果を有する該微生物用培地を使用する場合であっても同様である。因みに、本発明者らは、該文献６に記載の前記微生物用培地を使用して、ナイシン生産能を有するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属する幾つかの乳酸菌のそれぞれの菌株を培養条件を変えて培養し、得られた発酵生産物中の菌体量及びナイシン濃度を調べたが、いずれの場合にあっても、前記菌体量と前記ナイシン濃度との間には何ら普遍的な相関関係は認められなかった。
【００１１】
文献７には、ナイシン等のバクテリオシンを含有する乳酸発酵液による食品の殺菌方法について記載されている。また、前記乳酸発酵液を得るに際して、培地に使用する窒素源として焼酎粕が使用できる旨記載されている。しかしながら、文献７には、前記焼酎粕を窒素源として使用した場合にナイシンの生産性が顕著に高まり、更に得られる乳酸発酵液が優れた呈味性を有することについては全く記載されていない。
【００１２】
以上述べたことからしても明らかなように、上述した文献を精査してみても、大麦焼酎蒸留残液または米焼酎蒸留残液を固液分離して得られる液体分を培地に使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養した場合、ナイシンが著量生産されること、また得られるナイシンを著量含有する発酵生産物が優れた呈味性を有することは、到底予測できないことである。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べたように、従来のナイシン製造技術においては、上述した各種の培地が使用されているが、それら従来の培地のいずれを使用しても、得られる発酵生産物中のナイシン濃度は極めて低い。こうしたことから、工業的にナイシンを多量生産するためには発酵生産物中に生産されるナイシンの量を更に高める手段の早期提供が強く求められている。
これとは別に、上述したように、文献７には、焼酎粕を窒素源とする培地を使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養して得られるナイシンを含有する乳酸発酵液は抗菌作用を有し、この乳酸発酵液を食品に添加することによる食品の殺菌方法が記載されている。しかしながら、このような従来の培地を使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養して得られるナイシンを含有する乳酸発酵液は、上述したようにナイシン濃度が低く、しかもその呈味性は満足のゆくものでは到底ない。このような乳酸発酵液を食品に添加して使用する場合には、該乳酸発酵液は、ナイシンを著量含有し且つ優れた呈味性を有するものであることが切望される。
【００１４】
本発明は、上述した従来技術における問題点に鑑みて、更なる研究の結果、完成に至ったものである。本発明の目的は、従来のナイシンの製造技術における上記問題点を解決し、ナイシンの多量生産を可能にするナイシンの工業的製造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、ナイシンを著量含有し、且つ優れた呈味性を有し、食品への使用が極めて好適な発酵生産物の効率的製造を可能にする方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、焼酎蒸留残液をより有効に利用して従来のナイシンの製造技術における上述した問題を解決する、即ち、前記焼酎蒸留残液を培地に使用してナイシン生産の増大を可能にする方法を開発すべく実験を介して鋭意検討を行った。その結果、焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分を培地に使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養するナイシンを含有する発酵生産物の製造方法であって、前記培地として、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）からなり、Ｂｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行う方法を採用した場合、ナイシンの生産量が著しく増大し、ナイシンを著量含有する発酵生産物が得られることが判明した。そして該発酵生産物を官能検査に付したところ、従来培地を使用することにより得た発酵生産物に比べて、優れた呈味性を有し、食品として使用に極めて適するものであることが判った。本発明は、以上の発見に基づいて完成に至ったものである。
【００１６】
本発明は、従来のナイシンの製造技術においては、培地として使用されることの全くなかった焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分を培地に使用してナイシン生産能を有する乳酸菌を培養するナイシンを含有する発酵生産物の製造方法であって、前記培地として、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）からなり、Ｂｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行うことを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法を提供するものである。本発明の発酵生産物の製造方法における前記培養は、回分培養方式及び／又は連続培養方式で行ってもよい。本発明により得られる前記ナイシンを著量含有する発酵生産物は、優れた呈味性を有し、食品として好適に使用できるものである。
【００１７】
本発明者らは、文献６に記載の微生物用培地を使用してＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の乳酸菌を培養した場合、得られる培養菌体の量が著しく増加することに鑑み、文献６には、前記微生物用培地を使用してナイシン生成能を有するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ属の乳酸菌を培養することについては触れるところは全くないが、このナイシン生成能を有する乳酸菌を前記微生物用培地を使用して培養した場合、培養菌体量の増大の程度はともかく、もしかするとナイシンの顕著な生産がもたらされるのではと想像して、本発明者らは実験を介して鋭意検討を行った。即ち、本発明者らは、文献６に記載の、大麦を原料とする焼酎製造において副生する焼酎蒸留残液（以下、これを“大麦焼酎蒸留残液”と略称する）を固液分離して液体分を得、該液体分をろ過して清澄液を得、該清澄液を濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着性画分、及び前記液体分を、それぞれＢｒｉｘ濃度８．０に調整後、それぞれに同量のグルコースを添加し、次いでＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属するナイシン生成能を有する乳酸菌をそれぞれ接種して別々に回分培養に付した。対照には、前記と同量のグルコースを添加したＭＲＳ培地を使用し、他は全て上述したのと同様の方法により回分培養に付した。
【００１８】
それぞれの回分培養において得られた発酵生産物について乳酸菌菌体量及びナイシン濃度を測定した。その結果、文献６に記載の前記液体分からなる培地を使用した場合及び前記非吸着性画分からなる培地を使用した場合、これら二つの場合で得られた発酵生産物中の乳酸菌菌体量及びナイシン濃度は実質的に同じであることが判明した。更に該乳酸菌菌体量及び該ナイシン濃度は、対照のＭＲＳ培地を使用した場合と比較しても有意差は認められず、実質的に同等であることが判明した。即ち、文献６に記載の微生物用培地を単に使用するだけでは、前記対照のＭＲＳ培地を顕著に上回るナイシン生産性を達成できないことが明らかになった。
【００１９】
そこで、本発明者らは大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分からなる培地を使用してナイシンの生産に係る検討を実験を介して行った。
即ち、前記液体分からなる培地を使用してナイシンを生産するに当たり、該液体分のＢｒｉｘ濃度がナイシンの生産に痛切に影響するのではないかと推測して、ナイシン生産に適した該液体分のＢｒｉｘ濃度を決定することを目的として実験を介して検討を行った。即ち、前記液体分のＢｒｉｘ濃度を０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、及び１５．０に調整し、それぞれに同量のグルコースを添加して、下記のナイシン生成能を有する乳酸菌のナイシン生産に係る至適ｐＨ値に調整した液体培地を得、それぞれの液体培地にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種して別々に回分培養に付した。対照には、上記と同量のグルコースを添加して上記と同じｐＨ値に調整したＭＲＳ培地を使用し、それ以外は全て上述と同様の方法により回分培養に付した。その結果、前記液体分のＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整して得た液体培地を使用した場合、前記対照のＭＲＳ培地を使用した場合と比較して、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が高まる傾向が認められた。
【００２０】
そこで、上記液体分からなる培地を使用してナイシン生産を目的とした培養に付すに当たり、ナイシンの多量生産に至適なｐＨ条件を決定することを目的として実験を介して検討を行った。即ち、Ｂｒｉｘ濃度４．０に調整した上記液体分に所定量のグルコースを添加してｐＨ値を３．０乃至８．０に調整した複数の液体培地を得た。得られたｐＨ値の異なる各々の液体培地にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属するナイシン生成能を有する乳酸菌をそれぞれ接種し、調整したｐＨ値を保持しながら別々に回分培養に付した。対照には、上記と同量のグルコースを添加してｐＨ６．８に調整したＭＲＳ培地を使用し、それ以外は全て上述と同様の方法により回分培養に付した。その結果、前記液体培地のｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に保持して培養を行った場合、前記対照のＭＲＳ培地（ｐＨ６．８に保持）を使用して培養を行った場合と比較して、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が顕著に高まることが判明した。
【００２１】
以上のことから、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分のＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整し、これに糖を添加してｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に保持してＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種して回分培養に付すことにより、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が、従来のＭＲＳ培地を使用して培養を行った場合と比較して、顕著に高まることが明らかとなった。
【００２２】
上記
【００１９】及び
【００２０】に述べた実験を、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分の場合と同様にして、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分について行ったところ、上述した大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分の場合と同様の結果が得られた。即ち、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分のＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整し、これに糖を添加してｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に保持してＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種して回分培養に付すことにより、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が、従来のＭＲＳ培地を使用して培養を行った場合と比較して、顕著に高まることが明らかとなった。
【００２３】
次に、上記大麦焼酎蒸留残液の液体分からなる培地及び上記米焼酎蒸留残液の液体分からなる培地の夫々を使用して、連続培養法によるナイシン生産について実験を介して検討を行った。即ち、これら液体分の夫々のＢｒｉｘ濃度を４．０に調整し、これにグルコースを３重量％添加してｐＨ値を５．５に調整することにより液体培地を得、該液体培地にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種し、ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用し、ｐＨコントローラーによりｐＨ値を５．５に保持し、更に文献１に記載の濾過培養法、即ち、菌体を含まずナイシンを含む液を抜き取り、その抜き取った液量と同体積の新鮮な前記液体培地をジャーファーメンターに供給する連続培養を行った。対照としては、前記濾過培養において新鮮な前記液体培地を使用する代わりに、グルコース３重量％を添加したＭＲＳ培地を使用した以外は、全て同様の方法により連続培養を行った。その結果、濾過培養においてジャーファーメンターに供給する新鮮培地に前記大麦焼酎蒸留残液の液体分を使用して調製した培地または前記米焼酎蒸留残液の液体分を使用して調製した培地を使用することにより、該新鮮培地に前記ＭＲＳ培地を使用した場合よりも、得られる発酵生産物中のナイシン濃度が顕著に高まることが判明した。
【００２４】
更に文献１の表１には、新鮮培地として使用するＭＲＳ培地のグルコース含量が高いほど、培養液中のナイシン濃度が高まる旨記載されているが、同文献１の第４図及び第５図から明らかなように、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度は、供給するＭＲＳ培地のグルコース濃度に関わらずいずれの場合においても実質的に限りなく０ｇ／Ｌに近い値を示している。そこで、本発明者らは、連続培養時における培養液中のグルコース濃度がナイシン生産性に影響を及ぼすのではないかと推察し実験を介して検討を行った。
【００２５】
即ち、上記大麦焼酎蒸留残液の液体分のＢｒｉｘ濃度を４．０に調整し、これにグルコースを３重量％添加してｐＨ値を５．５に調整することにより液体培地を得、該液体培地にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属するナイシン生成能を有する乳酸菌を接種し、ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用し、ｐＨコントローラーによりｐＨ値を５．５に保持し、更に文献１記載の濾過培養法、即ち、菌体を含まずナイシンを含む液を抜き取り、その抜き取った液量と同体積の新鮮な前記液体培地をジャーファーメンターに供給する連続培養を行った。その際、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーを用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養に移行後、前記液体培地をジャーファーメンターに供給して培養液のグルコース濃度を０．０１、０．１、１．０、５．０、及び１０．０ｇ／Ｌに保持して、それぞれ別々に連続培養を行った。その結果、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度を０．１、１．０、５．０、及び１０．０ｇ／Ｌに維持した場合には、培養液中のグルコース濃度を０．０１ｇ／Ｌに維持した場合に比べて、培養液中のナイシン濃度が飛躍的に高まることが明らかになった。このことから、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度を０．１ｇ／Ｌ以上に維持することにより、極めて高濃度のナイシンを含有する培養液を連続的に生産することが可能となることが判明した。
【００２６】
しかも、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより液体分（Ａ）からなる培地であって、そのＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行う方法により得られたナイシンを著量含有する発酵生産物と、従来培地を使用することにより得た発酵生産物を１０名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００２７】
また、上記米焼酎蒸留残液の液体分を使用して
【００２５】に述べた手法で実験を行ったところ、上記麦焼酎蒸留残液の液体分を使用した場合と同様に、連続培養に移行後の培養液中のグルコース濃度を０．１ｇ／Ｌ以上に維持することにより、極めて高濃度のナイシンを含有する培養液を連続的に生産することが可能となることが判明した。そして、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより液体分（Ｂ）からなる培地であって、そのＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行う方法により得られたナイシンを著量含有する発酵生産物と、従来培地を使用することにより得た発酵生産物を１０名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００２８】
また、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）からなる培地であって、そのＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行う方法により発酵生産物を得た。その結果、得られた発酵生産物のナイシン濃度は、従来のＭＲＳ培地を使用することにより得た発酵生産物のナイシン濃度と比較して、顕著に高まることが明らかとなった。そして、該発酵生産物を１０名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００２９】
この他に、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着画分とし、前記液体分（Ａ）を前記非吸着画分を含有するものにした液体分（Ａ’）と、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）の少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着画分とし、前記液体分（Ｂ）を前記非吸着画分を含有するものにした液体分（Ｂ’）を用意し、前記液体分（Ａ’）と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）〔前記非吸着画分を含有しないもの〕を使用しＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したもの、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）〔前記非吸着画分を含有しないもの〕と前記液体分（Ｂ’）を使用しＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したもの、及び前記液体分（Ａ’）と前記液体分（Ｂ’）を使用しＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したもの、を夫々培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行う方法により発酵生産物を得た。得られた発酵生産物のナイシン濃度を調べたところ、いずれの発酵生産物のナイシン濃度も従来のＭＲＳ培地を使用することにより得られる発酵生産物のナイシン濃度と比較して、顕著に高いことが判った。そして、これらの発酵生産物を１０名のパネラーによる官能検査に付したところ、後者は、雑味と刺激味を有し呈味性に問題があったのに対して、前者は、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味からなる極めて優れた呈味性を有し、食品素材として極めて好適であることが判明した。
【００３０】
【実施態様例】
以下、本発明の好ましい実施態様例について述べるが、本発明は、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより液体分（Ａ）を得る工程（イ）、米焼酎蒸留残液を固液分離することにより液体液体分（Ｂ）を得る工程（ロ）、前記液体分（Ａ）及び前記液体分（Ｂ）のＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整する工程（ハ）、Ｂｒｉｘ濃度を調整した前記液体分（Ａ）及び前記液体分（Ｂ）からなるものに糖を添加して培地を得る工程（ニ）、前記培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行う工程（ホ）を有することを特徴とするナイシンを著量含有する発酵生産物の製造方法を提供する。工程（ハ）では、前記液体分（Ｂ）のみを使用してＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整し、工程（ニ）でこれに糖を添加して培地を得、該培地を工程（ホ）の培養に付すようにしてもよい。また、工程（イ）で得られる前記液体分（Ａ）又は／及び工程（ロ）で得られる前記液体分（Ｂ）は、これらの少なくとも一部を合成吸着剤を用いる吸着分離処理に付して得られる非吸着画分を含有するものにしてもよい。工程（ホ）における培養は、回分培養方式及び／又は連続培養方式で行うことができる。
【００３１】
本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液は、大麦又は精白大麦を原料として大麦麹及び蒸麦を製造し、得られた大麦麹、及び蒸麦中に含まれるでんぷんを麹、及び／又は酵素剤を使用して糖化し、酵母によるアルコール発酵に付して熟成もろみを得、該熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生するもの、即ち、大麦焼酎の蒸留残液を意味する。また、米焼酎、甘藷焼酎、そば焼酎の製造においても、これらの焼酎製造において原料の一部として大麦を使用する場合に副生する焼酎蒸留残液も本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液に包含される。
前記大麦焼酎蒸留残液を得るに際して、大麦焼酎の製造に用いる大麦麹は、通常の大麦焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に大麦焼酎製造で使用する白麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ）が好ましい。或いは泡盛製造で使用する黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）及び清酒製造等で使用する黄麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）などのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の菌株を用いることもできる。また大麦焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
【００３２】
本発明において使用する米焼酎蒸留残液は、米を原料として米麹及び蒸米を製造し、得られた米麹、及び蒸米中に含まれるでんぷんを麹、及び／又は酵素剤を使用して糖化し、更に酵母によるアルコール発酵に付して熟成もろみを得、該熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生するもの、即ち、米焼酎の蒸留残液を意味する。また、大麦焼酎、甘藷焼酎、そば焼酎の製造においても、これらの焼酎製造において原料の一部として米を使用する場合に副生する焼酎蒸留残液も本発明において使用する米焼酎蒸留残液に包含される。
前記米焼酎蒸留残液を得るに際して、米焼酎の製造に用いる米麹は、通常の米焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に米焼酎製造で使用する白麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ）が好ましい。或いは泡盛製造で使用する黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）及び清酒製造等で使用する黄麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）などのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の菌株を用いることもできる。また米焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
【００３３】
工程（イ）において、大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分（Ａ）を得る理由は、該大麦焼酎蒸留残液から原料大麦及び大麦麹由来の水不溶性の発酵残渣を除去して液体分のみを使用することにある。前記固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法を介するか、或いはろ過圧搾式の固液分離機を用いて予備分離を行い、次いで遠心分離機、ケイソウ土ろ過装置、セラミックろ過装置、或いはろ過圧搾機等を用いた固液分離処理を行い、前記液体分を得る。
【００３４】
工程（ロ）において、米焼酎蒸留残液を固液分離して液体分（Ｂ）を得る理由は、該米焼酎蒸留残液から原料米及び米麹由来の水不溶性の発酵残渣を除去して液体分のみを使用することにある。前記固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法を介するか、或いはろ過圧搾式の固液分離機を用いて予備分離を行い、次いで遠心分離機、ケイソウ土ろ過装置、セラミックろ過装置、或いはろ過圧搾機等を用いた固液分離処理を行い、前記液体分を得る。
【００３５】
工程（イ）で得られる前記液体分（Ａ）及び／又は工程（ロ）で得られる前記液体分（Ｂ）を合成吸着剤を用いる吸着分離処理に付すことにより非吸着画分にするのは、前記液体分（Ａ）及び／又は前記液体分（Ｂ）に含まれる雑味を呈する成分を除去することを目的として行うものである。前記合成吸着剤の好適な具体例としては、オルガノ（株）製のアンバーライトＸＡＤ−４、アンバーライトＸＡＤ−１６、アンバーライトＸＡＤ−１１８０及びアンバーライトＸＡＤ−２０００、三菱化学（株）製のセパビーズＳＰ８５０及びダイヤイオンＨＰ２０等の芳香族系（又はスチレン系とも言う）合成吸着剤、オルガノ（株）製のアンバーライトＸＡＤ−７、及び三菱化学（株）製のダイヤイオンＨＰ２ＭＧ等のメタクリル系（又はアクリル系とも言う）合成吸着剤を挙げることができる。これらの他、場合によっては三菱化学（株）製のセパピーズＳＰ２０７等の芳香族系修飾型合成吸着剤を用いることができる。このようにして得られる前記非吸着画分は、前記液体分の少なくとも一部に代えて使用することができる。
【００３６】
工程（ハ）において、工程（イ）から供給される前記液体分（Ａ）〔前記非吸着画分を包含する〕及び工程（ロ）から供給される前記液体分（Ｂ）〔前記非吸着画分を包含する〕の夫々のＢｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整するのは、ナイシン生産能を有する乳酸菌のナイシン生産性に適した培地成分濃度に調整することを目的として行うものであり、これによりナイシンの生産性を高めることができる。前記Ｂｒｉｘ濃度は、２．０乃至４．０の範囲に調整するのがより好ましい。即ちこの場合、ナイシン生産性の顕著な向上を図ることができる。
【００３７】
工程（ニ）において添加する前記糖の好ましい具体例としては、グルコース、キシロース、スクロース、フラクトース、マルトース、リボース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、セロビオース、サッカロース、及びトレハロースを挙げることができる。この際の糖濃度は、使用する糖の種類により異なるが、一般的には、５乃至７０ｇ／Ｌの範囲となるようにする。これらの糖の中で、グルコースが特に好ましく、その場合のグルコース濃度は、５乃至７０ｇ／Ｌの範囲に設定するのが好ましい。
【００３８】
工程（ホ）で使用する前記ナイシン生産能を有する乳酸菌は、ナイシン生産能を有する菌株であればいかなるものでも良く、特にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓに属する乳酸菌が好ましい。具体的には、生産するナイシンがナイシンＡである場合の菌株として、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＣＤＯ４９７、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＩＺＯ　Ｒ５、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＡＴＣＣ　７９６２及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＡＴＣＣ１１４５４を好ましいものとして挙げることができる。また、生産するナイシンがナイシンＺである場合の菌株として、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＩＺＯ　２２１８６、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５８３、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＣＦＢ２１１８、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＣＦＢ２０５４、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＩＺＯ　Ｎ９、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＩＺＯ　２２１１８６、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１（ＪＣＭ７６３８）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｃｈｉｚｕｋａ（ＪＣＭ１１１８０）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　５Ｂ（ＪＣＭ１１１８１）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　７Ｂ（ＪＣＭ１１１８２）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　８Ｂ（ＪＣＭ１１１８３）、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　９Ｂ（ＪＣＭ１１１８４）、を好ましいものとして挙げることができる。
【００３９】
工程（ホ）における、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つ培養液のｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら培養を行う工程は、回分培養方式或いは連続培養方式で行うことができる。この他、流加培養方式を採用することができる。前記培養液のｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御するに際しては、上述したように、培養槽にｐＨ測定用複合ガラス電極を装着し、ｐＨメーターで測定し、実側ｐＨ値が設定ｐＨ値よりも低くなった時に、ｐＨコントローラー等を用いて水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を培養槽に供給することにより、設定ｐＨ値に保持することができ、好ましくはｐＨ値５．０乃至６．５の範囲に調整する。尚、前記所定のｐＨ値の変動範囲は０．１以下にすることが好ましい。また、前記培養液の糖濃度（グルコース濃度）を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御するに際しては、前記培養を連続培養方式または流加培養方式で行う場合には、グルコースアナライザー等を使用して制御することができる。当該工程においてはグルコースの他に酵母エキスやポリペプトンからなる窒素源を含有する基質溶液又は上記液体製培地からなる基質溶液を培養槽に供給することにより行うことができ、これにより培養工程にある液体培地のグルコース濃度を所望の値に保持することができる。当該グルコース濃度は少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上とするが、好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上に保持することによりナイシン生産能を有する乳酸菌の活性及び比ナイシン生産速度を高い値に維持することができる。前記培養を行う際の培養温度は、使用する乳酸菌の生育に最適な温度に設定すればよく、一般的には２０乃至４０℃の範囲、好ましくは２５乃至３７℃の範囲とする。攪拌速度は１０乃至１０００ｒｐｍ、好ましくは５０乃至３００ｒｐｍが好適である。
【００４０】
工程（ホ）における培養を連続培養方式で行う場合には、上述の培養条件に従って培養を開始し、菌体濃度が上昇して、対数増殖期の後期に到達した段階で連続培養に移行する。該連続培養法においては、培養槽にｐＨ測定用複合ガラス電極を装着し、ｐＨメーターで測定し、実側ｐＨ値が設定ｐＨ値よりも低くなった時に水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を培養槽に供給することにより、該設定ｐＨ値に保持することができる。この際、培養槽に供給された前記液体培地又はアルカリ溶液と同量の除菌液を限外濾過膜或いは精密濾過膜等を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持することができる。また、前記ｐＨ制御とは別に、培養槽にプロセスオンライン濁度計プローブを装着し、その出力をＤＤＣコントローラーに入力し、培養槽に供給した滅菌水又は液体培地と同量の培養液（菌体を含む）を培養槽から抜き出すことにより、培養槽の濁度制御を行い、培養液中の菌体濃度及び培養液液量を一定に保持することができる。該菌体濃度は４．０乃至１８．０ｇ／Ｌの範囲、好ましくは８．０乃至１５．０ｇ／Ｌの範囲に設定する。培地の希釈率は培養液の菌体濃度及びナイシン生産速度等により任意の値に設定することができ、一般的には０．１乃至２．０ｈｒ−１の範囲とするが、好ましくは０．２乃至１．２ｈｒ−１の範囲とする。
【００４１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４２】
以下の実施例に供する目的で大麦焼酎の製造を行った。原料としては、大麦（７０％精白）を用いた。
〔大麦麹の製造〕
大麦を４０％（ｗ／ｗ）吸水させ、４０分間蒸した後、４０℃まで放冷し、大麦トンあたり１ｋｇの種麹（白麹菌）を接種し、３８℃、ＲＨ９５％で２４時間、３２℃、ＲＨ９２％で２０時間保持することにより、大麦麹を製造した。
〔蒸麦の製造〕
大麦を４０％（ｗ／ｗ）吸水させ、４０分間蒸した後、４０℃まで放冷することにより、蒸麦を製造した。
〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕
１次仕込みでは前述の方法で製造した大麦麹（大麦として３トン）に、水３．６キロリットル及び酵母として焼酎酵母の培養菌体１ｋｇ（湿重量）を加えて１次もろみを得、得られた１次もろみを５日間の発酵（１段目の発酵）に付した。次いで、２次仕込みでは、上記１段目の発酵を終えた１次もろみに、水１１．４キロリットル、前述の方法で製造した蒸麦（大麦として７トン）を加えて１１日間の発酵（２段目の発酵）に付した。発酵温度は１次仕込み、２次仕込みとも２５℃とした。上記２段目の発酵を終えた２次もろみを常法により単式蒸留に付し、大麦焼酎１０キロリットルと大麦焼酎蒸留残液１５キロリットルを得た。得られた大麦焼酎蒸留残液を以下の実施例に用いた。
【００４３】
以下の実施例に供する目的で米焼酎の製造を行った。原料としては、精米（７０％精白）を用いた。
〔米麹の製造〕
米麹の製造は米を３５％（ｗ／ｗ）吸水させ、４０分間蒸した後、４０℃まで放冷し、米ｋｇ当り１ｇ量の白麹菌を接種し、３８℃、ＲＨ９５％で２４時間、３２℃、ＲＨ９２％で２０時間で行った。
〔蒸米の製造〕
蒸米は米を３５％（ｗ／ｗ）吸水させ、４０分間蒸した後、４０℃まで放冷することにより、蒸米を製造した。
〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕
１次仕込みでは前述の方法で製造した米麹（米として３トン）に、水３．６キロリットル及び酵母として焼酎酵母の培養菌体１ｋｇ（湿重量）を加えて１次もろみを得、得られた１次もろみを５日間の発酵（１段目の発酵）に付した。次いで、２次仕込みでは、上記１段目の発酵を終えた１次もろみに、水１１．４キロリットル、前述の方法で製造した蒸米（米として７トン）を加えて１５日間の発酵（２段目の発酵）に付した。発酵温度は１次仕込み、２次仕込みとも２５℃とした。上記２段目の発酵を終えた２次もろみを常法により単式蒸留に付し、米焼酎１０キロリットルと米焼酎蒸留残液１５キロリットルを得た。得られた米焼酎蒸留残液を以下の実施例に用いた。
【００４４】
【実施例１】
１．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記
【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを３．６重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
２．米焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記
【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを３．６重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
３．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１の保存株５０μｌを１０ｍｌのＴＧＣ培地に接種し、３７℃で１８時間静置培養することにより培養液を得、該培養液１０ｍｌをＣＭＧ培地１００ｍｌに接種し、３７℃で３時間、１００ｒｐｍで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
４．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
２Ｌ容ジャーファーメンターに、上記１で得た乳酸菌培養用培地２５０ｍｌ、上記２で得た乳酸菌培養用培地２５０ｍｌ、及び上記３で得た乳酸菌前培養液２５ｍｌを導入し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、培養時間２４時間、ｐＨ５．５の条件で回分培養を行った。
【００４５】
【比較例１】
１．ＭＲＳ培地の調製
ＭＲＳ培地（ペプトン１重量％、肉エキス１重量％、酵母エキス０．５重量％、Ｋ２ＨＰＯ４０．２重量％、クエン酸二アンモニウム０．２重量％、グルコース３．６重量％、Ｔｗｅｅｎ８０　０．１重量％、酢酸ナトリウム０．５重量％、ＭＧＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０５８重量％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ　０．０２８重量％）を、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
２．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１の保存株５０μｌを１０ｍｌのＴＧＣ培地に接種し、３７℃で１８時間静置培養することにより培養液を得、該培養液１０ｍｌをＣＭＧ培地１００ｍｌに接種し、３７℃で３時間、１００ｒｐｍで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
３．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
２Ｌ容ジャーファーメンターに、上記１で調製したＭＲＳ培地５００ｍｌと上記２で得た乳酸菌前培養液２５ｍｌを導入し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、培養時間２４時間、ｐＨ５．５の条件で回分培養を行った。
【００４６】
【実施例２】
１．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記
【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを３．６重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
２．大麦焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記
【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを１．０重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
３．米焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記
【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して米焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分をＢｒｉｘ４に調整し、グルコースを３．６重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
４．米焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記
【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを１．０重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
【００４７】
５．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１の保存株５０μｌを１０ｍｌのＴＧＣ培地に接種し、３７℃で１８時間静置培養することにより培養液を得、該培養液１０ｍｌをＣＭＧ培地１００ｍｌに接種し、３７℃で３時間、１００ｒｐｍで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
６．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、３Ｌ容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記３Ｌ容ジャーファーメンターに、上記１で得た乳酸菌培養用培地９００ｍｌ、上記３で得た乳酸菌培養用培地９００ｍｌ、及び上記５で得た乳酸菌前培養液９０ｍｌを導入し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ５．５の条件で回分培養に付し、培養開始後８時間目に培養液のグルコース濃度が４ｇ／Ｌに達した時点で、ｐＨ制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を４ｇ／Ｌに保持して培養開始後４２時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記ｐＨ制御は、ｐＨセンサーを使用して、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してｐＨ５．５に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーＢＦ−４１０（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、前記２で得たグルコース濃度調整用基質溶液と前記４で得たグルコース濃度調整用基質溶液を１：１の割合で混合することにより得た混合液を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を４ｇ／Ｌに保持することにより行った。また、前記ｐＨ制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記５Ｎ水酸化ナトリウム溶液及び前記グルコース濃度調整用基質溶液と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス０．５重量％、ポリペプトン０．５重量％）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００４８】
【比較例２】
１．ＭＲＳ培地の調製
ＭＲＳ培地（ペプトン１重量％、肉エキス１重量％、酵母エキス０．５重量％、Ｋ２ＨＰＯ４０．２重量％、クエン酸二アンモニウム０．２重量％、グルコース３．６重量％、Ｔｗｅｅｎ８０　０．１重量％、酢酸ナトリウム０．５重量％、ＭＧＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０５８重量％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ　０．０２８重量％）を、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用ＭＲＳ培地を得た。
２．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１の保存株５０μｌを１０ｍｌのＴＧＣ培地に接種し、３７℃で１８時間静置培養することにより培養液を得、該培養液１０ｍｌをＣＭＧ培地１００ｍｌに接種し、３７℃で３時間、１００ｒｐｍで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
３．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、３Ｌ容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記３Ｌ容ジャーファーメンターに上記１で得た乳酸菌培養用培地１８００ｍｌと上記３で得た乳酸菌前培養液９０ｍｌを導入し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ５．５の条件で回分培養に付し、培養開始後１２時間目に培養液のグルコース濃度が０．１ｇ／Ｌ未満に達した時点で、ｐＨ制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を０．１ｇ／Ｌ未満に保持して培養開始後４２時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記ｐＨ制御は、ｐＨセンサーを使用して、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してｐＨ５．５に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーＢＦ−４１０（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、基質溶液（グルコース１重量％、酵母エキス０．５重量％、ポリペプトン０．５重量％、ＮａＣｌ０．５重量％）を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を０．１ｇ／Ｌ未満に保持することにより行った。また、前記ｐＨ制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記５Ｎ水酸化ナトリウム溶液及び前記基質溶液と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス０．５重量％、ポリペプトン０．５重量％）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００４９】
【実施例３】
実施例２で使用したＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１に代えて、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓＮＩＺＯ　２２１８６、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５８３、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＣＦＢ２１１８、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＣＦＢ２０５４、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＩＺＯ　Ｎ９、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＩＺＯ　２２１１８６、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｃｈｉｚｕｋａ（ＪＣＭ１１１８０）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　５Ｂ（ＪＣＭ１１１８１）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　７Ｂ（ＪＣＭ１１１８２）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　８Ｂ（ＪＣＭ１１１８３）、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　９Ｂ（ＪＣＭ１１１８４）、を使用した以外は、全て実施例２と同様にして連続培養を行った。
【００５０】
【比較例３】
比較例２で使用したＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１に代えて、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＩＺＯ　２２１８６、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５８３、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＣＦＢ２１１８、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＣＦＢ２０５４、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＩＺＯ　Ｎ９、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ＮＩＺＯ　２２１１８６、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｃｈｉｚｕｋａ（ＪＣＭ１１１８０）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　５Ｂ（ＪＣＭ１１１８１）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　７Ｂ（ＪＣＭ１１１８２）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　８Ｂ（ＪＣＭ１１１８３）、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｌａｃｔｉｓ　Ａ．　Ｉｓｈｉｚａｋｉ　Ｙａｓａｋａ　９Ｂ（ＪＣＭ１１１８４）、を使用した以外は、全て比較例２と同様にして連続培養を行った。
【００５１】
【実施例４】
１．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記
【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分をセラミックろ過装置に付して清澄液を得、該清澄液を真空蒸発装置に付して約３倍まで濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を充填したカラムに接触させ、当該充填カラムから溶出してきた当該合成吸着剤に対して非吸着性を示す非吸着性画分溶液を得、該非吸着性画分溶液を水で希釈そのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを３．６重量％添加し、次いで水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整した後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
２．米焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記
【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを３．６重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
３．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１の保存株５０μｌを１０ｍｌのＴＧＣ培地に接種し、３７℃で１８時間静置培養することにより培養液を得、該培養液１０ｍｌをＣＭＧ培地１００ｍｌに接種し、３７℃で３時間、１００ｒｐｍで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
４．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
２Ｌ容ジャーファーメンターに、上記１で得た乳酸菌培養用培地２５０ｍｌ、上記２で得た乳酸菌培養用培地２５０ｍｌ、及び上記３で得た乳酸菌前培養液２５ｍｌを導入し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、培養時間２４時間、ｐＨ５．５の条件で回分培養を行った。
【００５２】
【実施例５】
１．大麦焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記
【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分をセラミックろ過装置に付して清澄液を得、該清澄液を真空蒸発装置に付して約３倍まで濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を充填したカラムに接触させ、当該カラムから溶出してきた前記合成吸着剤に対して非吸着性を示す非吸着性画分溶液を得、該非吸着性画分溶液を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを３．６重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
２．大麦焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記
【００４２】に記載の〔大麦焼酎製造及び大麦焼酎蒸留残液の製造〕で得られた大麦焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分をセラミックろ過装置に付して清澄液を得、該清澄液を真空蒸発装置に付して約３倍まで濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を充填したカラムに接触させ、当該カラムから溶出してきた前記合成吸着剤に対して非吸着性を示す非吸着性画分溶液を得、該非吸着性画分溶液を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを１．０重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
３．米焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記
【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して米焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分をＢｒｉｘ４に調整し、グルコースを３．６重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
４．米焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記
【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを１．０重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
【００５３】
５．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１の保存株５０μｌを１０ｍｌのＴＧＣ培地に接種し、３７℃で１８時間静置培養することにより培養液を得、該培養液１０ｍｌをＣＭＧ培地１００ｍｌに接種し、３７℃で３時間、１００ｒｐｍで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
６．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、３Ｌ容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記３Ｌ容ジャーファーメンターに、上記１で得た乳酸菌培養用培地９００ｍｌ、上記３で得た乳酸菌培養用培地９００ｍｌ、及び上記５で得た乳酸菌前培養液９０ｍｌを導入し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ５．５の条件で回分培養に付し、培養開始後８時間目に培養液のグルコース濃度が４ｇ／Ｌに達した時点で、ｐＨ制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を４ｇ／Ｌに保持して培養開始後４２時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記ｐＨ制御は、ｐＨセンサーを使用して、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してｐＨ５．５に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーＢＦ−４１０（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、前記２で得たグルコース濃度調整用基質溶液と前記４で得たグルコース濃度調整用基質溶液を１：１の割合で混合することにより得た混合液を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を４ｇ／Ｌに保持することにより行った。また、前記ｐＨ制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記５Ｎ水酸化ナトリウム溶液及び前記グルコース濃度調整用基質溶液と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス０．５重量％、ポリペプトン０．５重量％）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００５４】
【実施例６】
１．米焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記
【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを３．６重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
２．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１の保存株５０μｌを１０ｍｌのＴＧＣ培地に接種し、３７℃で１８時間静置培養することにより培養液を得、該培養液１０ｍｌをＣＭＧ培地１００ｍｌに接種し、３７℃で３時間、１００ｒｐｍで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
３．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
２Ｌ容ジャーファーメンターに、上記１で得た乳酸菌培養用培地５００ｍｌ、及び上記３で得た乳酸菌前培養液２５ｍｌを導入し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、培養時間２４時間、ｐＨ５．５の条件で回分培養を行った。
【００５５】
【実施例７】
１．米焼酎蒸留残液からの乳酸菌培養用培地の調製
上記
【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して米焼酎蒸留残液の液体分を得、該液体分をＢｒｉｘ４に調整し、グルコースを３．６重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行い乳酸菌培養用培地を得た。
２．米焼酎蒸留残液からのグルコース濃度調整用基質溶液の調製
上記
【００４３】に記載の〔米焼酎製造及び米焼酎蒸留残液の製造〕で得られた米焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して液体分を得、該液体分を水で希釈してそのＢｒｉｘ濃度を４に調整し、グルコースを１．０重量％添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整後、１２１℃、１５分間の条件で滅菌処理を行いグルコース濃度調整用基質溶液を得た。
【００５６】
３．ナイシン生産能を有する乳酸菌の前培養
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ　ＩＯ−１の保存株５０μｌを１０ｍｌのＴＧＣ培地に接種し、３７℃で１８時間静置培養することにより培養液を得、該培養液１０ｍｌをＣＭＧ培地１００ｍｌに接種し、３７℃で３時間、１００ｒｐｍで振とう培養することにより乳酸菌前培養液を得た。
４．ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養
ナイシン生産能を有する乳酸菌の本培養は、３Ｌ容ジャーファーメンターからなる連続培養装置を使用して連続培養方式で行った。
即ち、上記３Ｌ容ジャーファーメンターに、上記１で得た乳酸菌培養用培地１８００ｍｌ、及び上記３で得た乳酸菌前培養液９０ｍｌを導入し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ５．５の条件で回分培養に付し、培養開始後８時間目に培養液のグルコース濃度が４ｇ／Ｌに達した時点で、ｐＨ制御、グルコース濃度制御、及び濁度制御を伴う連続培養に移行し、培養液のグルコース濃度を４ｇ／Ｌに保持して培養開始後４２時間目まで該連続培養を行った。
なお、前記ｐＨ制御は、ｐＨセンサーを使用して、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を培養槽に供給してｐＨ５．５に保持することにより行った。前記グルコース濃度制御は、グルコース電極を付したオンラインバイオケミカルコントローラーＢＦ−４１０（エイブル（株）社製）を用いて培養液のグルコース濃度を測定し、連続培養時において、前記２で得たグルコース濃度調整用基質溶液を培養槽に供給して培養液のグルコース濃度を４ｇ／Ｌに保持することにより行った。また、前記ｐＨ制御及び前記グルコース濃度制御に際しては、培養槽に供給された前記５Ｎ水酸化ナトリウム溶液及び前記グルコース濃度調整用基質溶液と同量の除菌液を精密濾過膜を介して培養槽から抜き出すことにより、培養槽の液量を一定に保持した。前記濁度制御は、レーザー濁度計を使用して、培養槽に供給した濁度制御用供給液（酵母エキス０．５重量％、ポリペプトン０．５重量％）と同量の培養液（菌体を含有）を培養槽から抜き出すことにより行い、これにより培養槽の菌体濃度及び液量を一定に保持した。
【００５７】
実施例１、実施例２、実施例４乃至実施例７、比較例１及び比較例２で得た発酵生産物のそれぞれを以下の試験例１に供し、該発酵生産物のナイシン濃度を測定した。
【００５８】
【試験例１】
実施例１、実施例２、実施例４乃至実施例７、比較例１及び比較例２で得たそれぞれの発酵生産物を９０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎの条件で遠心分離に付すことにより該発酵生産物の上清１を得、それぞれの発酵生産物の上清１に濃塩酸を加えてｐＨ３．０に調整後、４℃で一晩放置し、再度９０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎの条件で遠心分離に付すことによりそれぞれの発酵生産物の上清２を得、得られたそれぞれの発酵生産物の上清２を試料として以下の方法に従って、培養液のナイシン濃度を測定した。即ち、指標菌としてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｕｔｅｕｓ（ＩＦＯ　Ｎ０．３３３３）を用い、ナイシン（ＩＣＮ製）を３０００ＩＵ／ｍｌとなるように０．０１Ｎ　ＨＣｌに溶解したものをナイシンＡ標準液として用いた。前記指標菌をＬＢ液体培地１０ｍｌに一白金耳接種し、培養温度３０℃、攪拌速度１００ｒｐｍ、培養時間１８時間の条件で振とう培養を行い培養液を得、該培養液１００μｌを適温まで冷ましたソフトアガー２．０ｍｌに懸濁して懸濁液を得、該懸濁液をＬＢ寒天培地上に重層して１時間放置後、０．０１Ｎ　ＨＣｌで適当な濃度に希釈した前記発酵生産物上清２を該ＬＢ寒天培地上に１０μｌづつスポットし、３０℃で２４時間培養後、スポット箇所周辺の増殖阻害を起こした生育阻止円の有無を確認し、該生育阻止円が現れる時の試料の最大希釈率Ｄを求め、ナイシン抗菌活性（ＡＵ／ｍｌ）＝１／Ｄ×試料添加量（ｍｌ）の関係式からナイシン抗菌活性値を算出した。
【００５９】
【評価１】
実施例１及び比較例１において培養開始後２４時間目に得たそれぞれの発酵生産物のナイシン抗菌活性値を表１に示す。表１に示す結果から以下のことが判明した。即ち、培養開始後２４時間目のナイシン抗菌活性値は、比較例１で得た発酵生産物は１２００ＩＵ／ｍｌと低い値であったのに対して、実施例１で得た発酵生産物は４３００ＩＵ／ｍｌと極めて高い値を示した。即ち、大麦焼酎蒸留残液から得た前記乳酸菌培養用培地を使用する本発明のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、ＭＲＳ培地を使用する従来のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値の約３．６倍に達することが判明した。
実施例２及び比較例２の連続培養におけるナイシン抗菌活性値を表２に示す。表２に示す結果から以下のことが判明した。即ち、ナイシン抗菌活性値は、比較例２においては、回分培養から連続培養に移行した培養開始後１２時間目において最大値を示した後は漸減し、培養開始後４２時間目には１０００ＩＵ／ｍｌとなったのに対して、実施例２においては、回分培養から連続培養に移行した培養開始後１２時間目において極大値を示した後、２４時間目までは減少したが、２４時間目以降は再び上昇し、培養開始後４２時間目には６２００ＩＵ／ｍｌに達した。即ち、大麦焼酎蒸留残液から得た前記乳酸菌培養用培地を使用し、且つ連続培養時の培養液のグルコース濃度を４ｇ／Ｌに保持して培養を行う本発明のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、ＭＲＳ培地を使用し、且つ連続培養時の培養液のグルコース濃度を０．１ｇ／Ｌ未満に保持して培養を行う従来公知のナイシンの製造方法により得られる発酵生産物のナイシン抗菌活性値の６．２倍に達することが判明した。
実施例３及び比較例３の結果からは以下のことが判明した。即ち、実施例３においてナイシン生産能を有する各種乳酸菌菌株を連続培養に付すことにより得られるそれぞれの発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、いずれの菌株を使用した場合であっても、比較例３に示す従来公知のナイシンの製造方法を採用した場合よりも顕著に高い値を示した。
【００６０】
実施例４及び実施例５の結果からは以下のことが判明した。即ち、本発明において使用する、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）の少なくとも一部が米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）で占められるように、前記液体分（Ａ）と前記液体分（Ｂ）を量配分することに代えて、前記液体分（Ａ）をろ過して清澄液を得、該清澄液を濃縮して濃縮液を得、該濃縮液を合成吸着剤を用いる吸着処理に付すことにより得られる非吸着性画分（Ａ’）と前記液体分（Ｂ）からなる培地を使用した実施例４及び実施例５で得られた発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、実施例１及び実施例２のそれぞれにおいて得た発酵生産物のナイシン抗菌活性値と同等であることが判った。
【００６１】
実施例６及び実施例７の結果からは以下のことが判明した。即ち、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）を、前記液体分（Ａ）の少なくとも一部が前記液体分（Ｂ）で占められるように前記液体分（Ａ）と前記液体分（Ｂ）を量配分することに代えて、前記液体分（Ｂ）のみを培地に使用した実施例６及び実施例７において得られた発酵生産物のナイシン抗菌活性値は、実施例１及び実施例２のそれぞれにおいて得た発酵生産物のナイシン抗菌活性値と同等であることが判った。
【００６２】
【試験例２】
実施例１、実施例２、実施例４乃至実施例７、比較例１及び比較例２で得た発酵生産物のそれぞれを呈味性について官能試験に供した。即ち、実施例１、実施例２、実施例４乃至実施例７、比較例１及び比較例２で得た発酵生産物のそれぞれを１０名のパネラーによる官能試験に付し、該発酵生産物の呈味性を評価した。
【００６３】
【評価２】
実施例１、実施例２、実施例４乃至実施例７、比較例１及び比較例２で得たそれぞれの発酵生産物の官能試験結果を表３に示す。表３に示す結果から以下のことが判明した。即ち、比較例１及び比較例２で得たそれぞれの発酵生産物は極めて単調な香味と好ましくない雑味を有することから官能評価の値が極めて低かったのに対して、実施例１、実施例２、及び実施例４乃至実施例７で得た発酵生産物は、いずれも、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味を呈することから官能評価の値が顕著に高く、調味料あるいは食品素材として好適であることが判明した。そして上記パネラーのコメントから、実施例１、実施例２、実施例４乃至実施例７で得た発酵生産物の中で、実施例４及び実施例５で得た発酵生産物は、いずれも特に際立ったまろやかな香味を呈するという特徴を有し、実施例６及び実施例７で得た発酵生産物は、いずれも、実施例１及び実施例２で得た発酵生産物よりも更に味わいのある豊かな旨味を呈するという特徴を有していることが明らかになった。
【００６４】
以上の結果から、本発明のナイシンの製造方法によれば、従来公知のナイシンの製造方法と比較して飛躍的に優れたナイシン生産性を高めることが可能となることが判明した。そして、本発明のナイシンの製造方法によって得られる発酵生産物は、優れた抗菌活性に加えて、まろやかで調和のとれた香味と豊かな旨味を呈することから、食品として極めて好適に使用できることが判明した。
【００６５】
【表１】
2004000168.tif 000002
【００６６】
【表２】
2004000168.tif 000003
【００６７】
【表３】
2004000168.tif 000004
【００６８】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ａ）と米焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分（Ｂ）からなり、Ｂｒｉｘ濃度を０．５乃至６．０の範囲に調整した液体に糖を添加したものを培地として使用し、該培地にナイシン生産能を有する乳酸菌を加えて培養を行い、該培養は、培養液の糖濃度を少なくとも０．１ｇ／Ｌ以上に制御し且つそのｐＨ値を４．０乃至７．０の範囲に制御しながら行う方法を採用することにより、ナイシンを著量含有する発酵生産物を効率的に製造することができる。そして、得られるナイシンを著量含有する発酵生産物は、優れた呈味性を有し、食品として好適に使用することができる。