(57)【要約】　　　（修正有）【課題】複数の異なるサブタイプの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに対して有効なガンボロ病用ワクチンを提供する。【解決手段】伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２タンパク質をコードするｃＤＮＡが、鳥類ヘルペスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に挿入された組み換え鳥類ヘルペスウイルスであって、前記ＶＰ２タンパク質が特定のアミノ酸配列を有するもの、或いは、この配列において、１又は複数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有するものである組み換え鳥類ヘルペスウイルス、およびこれを有効成分とするガンボロ病用ワクチン。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２タンパク質をコードするｃＤＮＡが、鳥類ヘルペスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に挿入された組み換え鳥類ヘルペスウイルスであって、前記ＶＰ２タンパク質が配列番号２記載のアミノ酸配列を有するもの、或いは、この配列において、１又は複数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有するものである組み換え鳥類ヘルペスウイルス。
【請求項２】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスがサブタイプＶａｒｉａｎｔ　ｓｔｒａｉｎに属するウイルス株である請求項１記載の組み換え鳥類ヘルペスウイルス。
【請求項３】
更にβ−アクチンプロモーターが挿入され、且つ当該β−アクチンプロモーターの支配下に前記ＶＰ２タンパク質をコードするｃＤＮＡが位置している請求項１記載の組み換え鳥類ヘルペスウイルス。
【請求項４】
β−アクチンプロモーターが配列番号３記載の塩基配列を有するものである請求項３記載の組み換え鳥類ヘルペスウイルス。
【請求項５】
鳥類ヘルペスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域がＵＬ４５とＵＬ４６遺伝子の間に存在する非翻訳領域である請求項１記載の鳥類ヘルペスウイルス。
【請求項６】
鳥類ヘルペスウイルスが七面鳥ヘルペスウイルスである請求項１記載の組み換え鳥類ヘルペスウイルス。
【請求項７】
鳥類ヘルペスウイルスがマレック病ウイルス血清型２型のＳＢ１株又はマレック病ウイルス血清型１型のＲｉｓｐｅｎｓ株である請求項１記載の組み換え鳥類ヘルペスウイルス。
【請求項８】
請求項１記載の組み換え鳥類ヘルペスウイルスを有効成分とするガンボロ病用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｂｕｒｓａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ；以下、ＩＢＤＶという）のサブタイプＶａｒｉａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓに属するウイルス由来のＶＰ２タンパク質をコードするｃＤＮＡ（以下ＶＰ２　ｃＤＮＡということがある）が挿入された組み換え鳥類ヘルペスウイルスに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガンボロ病は、伝搬性の高いＩＢＤＶによって引き起こされる疾病であり、全世界の養鶏産業に大きな損失をもたらす重大疾病である。ＩＢＤＶにはＩ型およびＩＩ型の二つの血清型があり、血清Ｉ型ウイルスが鶏に対して病原性を示す。この血清Ｉ型ウイルスの中には多くの変異株が存在する。各株は毒性や抗原性などから、Ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ（ＳＴＣ株、５２／７０株、００２−７３株など）、Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ（Ｂｕｒｓｉｎｅ株、Ｂｕｒｓａ−Ｖａｃ−３株、Ｂｕｒｓａ−Ｖａｃ−Ｍ株、ＣＵ−１株、ＰＢＧ９８株など）、Ｖａｒｉａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ（Ｅ株、Ａ株、ＧＬＳ株、ＧＺ９０２株、Ａｒｋ株、ＡＬ−２株など）、Ｖｅｒｙ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ（ＯＫＹＭ株、ＵＫ６６１株、Ｆ９５０２株、ＨＫ４６株など）の４つのサブタイプに大別されている（Ｙ．Ｃ．Ｃａｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４２：３４０−３５１）。
【０００３】
ところでＩＢＤＶのゲノムは、二分節（セグメントＡおよびＢ）の二本鎖ＲＮＡである。セグメントＡは、約１１５ｋｄの前駆体ポリプロテインをコードしており、この前駆体ポリプロテインは、ＶＰ２、ＶＰ３、及びＶＰ４へと、ＶＰ４自身によってプロセスされる。またＶＰ５がセグメントＡから前駆体ポリプロテインとは異なる読み枠で翻訳されるが、このタンパクの機能については病原性の強弱に関係があるらしいという報告があるのみで詳しい機能はわかっていない。ＩＢＤＶに対するモノクローナル抗体の研究から、ＶＰ３には血清特異的な一つの抗原エピトープとそれと重ならないもう一つのエピトープが存在するが、主要な中和エピトープは存在しないと考えられている。
一方、ＶＰ２には、中和抗体と反応する複数の独立したエピトープが存在することが判明している（米国特許第５，３５０，５７５号公報、米国特許第５，８４９，５７５号公報など）。そして、先に述べたサブタイプの抗原性の違いは、主としてこのＶＰ２のアミノ酸配列の違いに起因すると考えられている。ＩＢＤＶ株間でのＶＰ２のアミノ酸配列の相違については、Ｈ．Ｇ．Ｈｅｉｎｅ　ｅｔａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１８３５−１８４３やＴ．Ｖ．　Ｄｏｒｍｉｔｏｒｉｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ　４１：３６−４４及びＹ．Ｃ．Ｃａｏ，ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　４２：３４０−３５１に記載されている。
【０００４】
ところで、鳥類ヘルペスウイルスに、異種の鳥類病原体ウイルスの防御抗原遺伝子を組み込んだウイルスを作製し、それをワクチンとして用いる方法は、米国特許第５，８３４，３０５号公報、米国特許第５，８５３，７３３号公報、米国特許第５，９２８，６４８号公報、米国特許第５，９６１，９８２号公報、ＷＯ８７／０４４６３号公報、ＷＯ９９／１８２１５号公報などで提案されている。
【０００５】
そしてＩＢＤＶの抗原タンパク質であるＶＰ２タンパク質をコードするｃＤＮＡまたはＶＰ２タンパク質を含むセグメントＡ全長のｃＤＮＡを、鳥類ヘルペスウイルスに組み込んだ組み換え鳥類ヘルペスウイルスは、米国特許第５，７３３，５５４号公報、ＷＯ８９／０１０４０号公報、９３／２５６６５号公報、ＷＯ９６／０５２９１号公報、ＷＯ９９／１８２１５号公報、Ｒ．Ｄａｒｔｅｉｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｖｉｒｏｌ．２１１：４８１−４９０、Ｋ．Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｖｉｒｏｌ．２５７：３５２−３６２などに記載されている。ＷＯ８９／０１０４０号公報では、ＨＶＴゲノムのＵＬ４３遺伝子（ＢａｍＨＩ＃１６断片）に組み込み、偽狂犬病ｇｐＸプロモーターを用いて、ＩＢＤＶ　Ｓ４０７４７株由来のセグメントＡのｃＤＮＡを組み込んだ組み換えＨＶＴ（Ｓ−ＨＶＴ−００３）を構築している。当該公報中に、Ｓ４０７４７株に関する詳細な記述はなく、また一般的な情報もないため、この株がどのサブタイプに属するか不明である。また同じ発明者によるＷＯ９３／２５６６５号公報によれば、組み込み部位をＨＶＴ−ＵＬ４３遺伝子からＵＳ２領域に変更し、挿入遺伝子をセグメントＡではなくＶＰ２のみとし、プロモーターをＣＭＶ−ＩＥに変更した組み換えＨＶＴ（Ｓ−ＨＶＴ−０９６）を作製している。しかしながら、当該公報には、これらの組み換えＨＶＴ（ｒＨＶＴ）にワクチン効果があることを期待させる十分な記載はない。
【０００６】
Ｒ．Ｄａｒｔｅｉｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｖｉｒｏｌ．２１１：４８１−４９０および同じ発明者による米国特許第５，７３３，５５４号公報によれば、ＩＢＤＶのサブタイプＣｌａｓｓｉｃａｌ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓに属する５２／７０株由来のＶＰ２　ｃＤＮＡをＲＲ２（ＵＬ４０）部位にＲＲ２のプロモーター支配下となるように挿入した組み換えＨＶＴ（ｖＨＶＴ１）、挿入部位をｇＩ（ＵＳ７）とし、プロモーターを外来のＣＭＶ−ＩＥプロモーターにした組み換えＨＶＴ（ｖＨＶＴ２）、挿入部位をＵＬ４３とし、プロモーターを外来のＣＭＶ−ＩＥプロモーターに変えた組み換えＨＶＴ（ｖＨＶＴ４）を作製している。ｖＨＶＴ１とｖＨＶＴ２が利用した挿入部位は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは増殖に非必須であっても、ｉｎ　ｖｉｖｏでの増殖が遅くなったことにより、実際のワクチン効果に問題があることを発明者自らが述べている。一方、ｖＨＶＴ４は、ＳＰＦ鶏に限っては、ＶＰ２　ｃＤＮＡの由来ＩＢＤＶ株による攻撃に対して高いワクチン効果があったとの報告がされている。ただし、通常は強毒ＩＢＤＶやヨーロッパタイプの強毒ＩＢＤＶ攻撃を防御できないとされる不活化ワクチン（陽性コントロール）でも１００％防御したので、このチャレンジ条件は非常に弱い攻撃条件であったと推定される。
【０００７】
また、ＷＯ９９／１８２１５号公報においては、ＵＬ４５とＵＬ４６のＯＲＦ間領域に日本で分離された、サブタイプＶｅｒｙ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓに属するＯＫＹＭ株由来のＶＰ２　ｃＤＮＡを挿入した組み換え体（ＨＦ００３）が例示されているが、ワクチン評価試験ではＯＫＹＭ株に対する感染防御効果しか確認していない。
【０００８】
このように、研究レベルでは、組み換えワクチンも検討されているものの、ガンボロ病ワクチンとして、実際に使用されているのはＩＢＤＶを不活化したもの（Ｋｉｌｌｅｄ　Ｖａｃｃｉｎｅ）である。しかし、こうした市販のガンボロ病ワクチンを接種しても、必ずしもガンボロ病の発症を抑えることはできていない。
例えば米国では、Ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ由来のワクチンを接種したＤｅｌｍａｒｖａ　ｐｅｎｉｎｓｕｌａの養鶏場からいくつかの毒性の強いＶａｒｉａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓが分離されている（Ｈ．Ｇ．Ｈｅｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１８３５−１８４３）。また、欧州においても、ワクチンを親鳥に接種して、高い移行抗体を有していたにも拘わらず、Ｖｅｒｙ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓによる疾病が発生し若鶏が多く死亡した（Ｍ．Ｄ．Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６７５−６８０）。これらの例は、ワクチンに用いられたＩＢＤＶの変異株が、養鶏場付近で流行していたＩＢＤＶの変異株と異なったことが要因であると考えられている。
このことから、複数の異なるサブタイプのＩＢＤＶに対して有効なワクチンが強く望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
我々は、いくつかの組み換え体を作製して鶏でのワクチン効果試験を行った結果、ＩＢＤＶのサブタイプがＶａｒｉａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓであるウイルス株由来のＶＰ２タンパク質をコードするｃＤＮＡを組込んだ鳥類ヘルペスウイルスが、複数の異なるサブタイプに属するＩＢＤＶに対して高い防御効果を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
かくして本発明によれば、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２タンパク質をコードするｃＤＮＡ（以下、ＶＰ２　ｃＤＮＡということがある）が、鳥類ヘルペスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域（以下、非必須領域という）に挿入された組み換え鳥類ヘルペスウイルスであって、前記ＶＰ２タンパク質が配列番号２記載のアミノ酸配列を有するもの、或いは、この配列において、１又は複数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有するものである組み換え鳥類ヘルペスウイルスが提供され、また、当該組み換え鳥類ヘルペスウイルスを有効成分とするガンボロ病用ワクチンが提供される。
以下に本発明を詳述する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（ＶＰ２　ｃＤＮＡ）
本発明の組み換え鳥類ヘルペスウイルスに挿入されるｃＤＮＡは、ＶＰ２タンパク質をコードするものである。当該ＶＰ２タンパク質は、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するものであるか、或いは、この配列において、１又は複数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有するものである。配列番号２記載のアミノ酸配列を有するＶＰ２タンパク質は、ＩＢＤＶのサブタイプがＶａｒｉａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓであるウイルス株であってＤｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅ株由来のものであり、本発明において好ましいＶＰ２タンパク質である。ＩＢＤＶのサブタイプがＶａｒｉａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓである、Ｄｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅ株以外のウイルス株由来のＶＰ２タンパク質は、配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有するものの一例である。
配列番号１記載の塩基配列は、Ｄｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅ株由来のＶＰ２　ｃＤＮＡであり、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードするものの一例である。この配列番号１記載の塩基配列を有するｃＤＮＡは、本発明において最も好ましいＶＰ２　ｃＤＮＡである。
また、ＶＰ２　ｃＤＮＡは、ウイルスゲノム由来をそのまま用いることもできるが、相同ベクターへサブクローニングしやすい様に、終止コドンや制限酵素サイトを付加するなど改変して用いても良い。改変の方法としては、たとえば、配列番号２記載のＶＰ２の４５３番目のアミノ酸に相当する塩基の直後に終止コドンを導入し、ＶＰ２のＮ側末端とＣ側末端に相当する位置にそれぞれ異なる制限酵素サイトを導入する方法が挙げられる。
【００１２】
（プロモーター）
ＶＰ２　ｃＤＮＡを発現させるために用いるプロモーター遺伝子については、鳥類ヘルペスウイルス感染細胞内で機能するものであれば特に限定されない。具体的にはＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）プロモーターや、Ｒｏｕｓｅ　Ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０　ｅａｒｌｙプロモーターの如く異種ウイルスプロモーターや米国特許第６，０１３，２６１号公報で用いられたＭＤＶ−１　ｇＢプロモーターの如く鳥類ヘルペスウイルスの固有プロモーター、あるいは鶏細胞由来のβ−アクチンプロモーター（鶏β−アクチンプロモーター）などが例示される。ＶＰ２　ｃＤＮＡの発現量の高さから、特に鶏β−アクチンプロモーターが好ましい。
鶏β−アクチンプロモーター遺伝子については、Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１：８２８７−８３０１に約１．５Ｋｂの塩基配列が示されており、プロモーター機能を損なわない限り、多少の変異があっても構わない。尚、我々はこのプロモーター遺伝子を独自に鶏細胞ゲノムＤＮＡから取得してシークエンスしたところ、クローニングされたプロモーターは前記文献と少し異なり、配列番号３で示される塩基配列を持っていることを確認している。
【００１３】
（その他の付加配列）
たとえば、ＶＰ２　ｃＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの安定化を目的として、ＶＰ２　ｃＤＮＡの３’下流に、真核生物の発現に一般的に用いられるポリＡ付加シグナルを付加することが可能である。このポリＡ付加シグナルの具体例として、ｐＢＫ−ＲＳＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、カタログ番号＃２１２２１０）が持つＳＶ４０のポリＡ付加シグナルなどが例示される。
【００１４】
（鳥類ヘルペスウイルス）
鳥類ヘルペスウイルスの具体例としては、マレック病ウイルス血清型１型、２型、３型に属するウイルスなどが挙げられ、鶏用ワクチンとしての利用を考慮すると、安全性の観点から、既にワクチンとして使用実績のあるＨＶＴ　ＦＣ１２６株（マレック病ウイルス３型）やＳＢ１株（同２型）、Ｒｉｓｐｅｎｓ株（同１型）などが好適である。
【００１５】
（非必須領域）
ＶＰ２　ｃＤＮＡを挿入する鳥類ヘルペスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域は、公知の組み換え鳥類ヘルペスウイルスで使用された領域（公知の非必須領域）のほか、新たに見出した非必須領域も使用できる。
公知の非必須領域の具体例としては、ＷＯ８９／０１０４０号公報で用いられたＵＬ４３遺伝子、ＷＯ９３／２５６６５号公報で用いられたＵＳ２遺伝子、国際公開ＷＯ９９／１８２１５号公報に示されたＵＬ４４からＵＬ４６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間領域などが例示され、特に好ましい領域は、ＵＬ４５とＵＬ４６のＯＲＦ間領域である。
新たな非必須領域を見つける方法は特に制限されず、たとえば次のような一般的方法が挙げられる。すなわち、鳥類ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ断片をクローニングし、その制限酵素地図を作成し、その適当な制限酵素サイトにプロモーターとともにマーカー遺伝子を組み込んだ組み換えプラスミドを構築して、後述する一般的な組み換え鳥類ヘルペスウイルスの作製方法でもって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでもｉｎ　ｖｉｖｏでも安定な組み換え鳥類ヘルペスウイルスが得られるかどうかを調べれば良い。
【００１６】
（組み換え鳥類ヘルペスウイルスの作製方法）
組み換え鳥類ヘルペスウイルスの作製方法は、既に知られている一般的な方法でよい。その一例は次の如くである。（１）まず、上述した非必須領域を含む鳥類ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ断片がクローニングされたプラスミドを得、このプラスミド中の当該非必須領域に、上述したＶＰ２　ｃＤＮＡを挿入し、組み換えプラスミドを構築する。この際、ＶＰ２　ｃＤＮＡの５’上流にプロモーターを、３’下流にポリＡ付加シグナルを付けてＶＰ２　ｃＤＮＡとともに挿入するのがより好ましい。（２）構築した組み換えプラスミドを鳥類ヘルペスウイルス感染ＣＥＦ細胞に導入する、あるいは、鳥類ヘルペスウイルスから調製した感染性ゲノムＤＮＡとともに組み換えプラスミドをＣＥＦ細胞に導入する。これらの導入方法はエレクトロポレーションなど一般的に用いられている方法でよい。（３）組み換えプラスミドを導入したＣＥＦ細胞を培養皿にまき、プラークが十分大きくなるまで培養する。（４）このプラークには組み換えウイルスと野生型ウイルスが混合して存在しているので、ここから目的とする組み換えウイルスを純化する。この純化の方法も特に限定されるものではないが、たとえばプラークの出現したＣＥＦ細胞を適当に希釈し、９６穴プレートにまき、ＩＢＤＶ　ＶＰ２に対するモノクローナル抗体を１次抗体とした抗原抗体反応により、ＶＰ２タンパク質を発現する組み換えウイルスのプラークを検出するという方法が例示される。
【００１７】
（ガンボロ病用ワクチン）
本発明の組み換え鳥類ヘルペスウイルスは、ガンボロ病の原因ウイルスであるＩＢＤＶの防御抗原遺伝子ＶＰ２タンパク質を有することから、鶏用のガンボロ病ワクチンとして利用されるが、鳥類ヘルペスウイルスとしてＭＤＶ（血清型１型又は２型、３型）を使用した場合は、ガンボロ病と同時にマレック病にも有効な鶏多価ワクチンとなる。
本発明の組み換え鳥類ヘルペスウイルスを主成分とするワクチンは、本発明の組み換えＭＤＶ（血清型１型又は２型、３型）以外に、細胞や培地成分などを含んでいても構わない。この組み換えウイルス以外の成分は、保存安定剤など薬理学的に問題のない成分であれば特に限定されない。更に、組み換えウイルス以外の成分として、他の組み換えあるいは非組み換えウイルスを混合しても良い。具体的には、ＭＤＶ−１又はＭＤＶ−２のワクチン株を本発明の組み換えＭＤＶ−３に混合して使用することがその一例として挙げられる。
本発明の鶏多価ワクチンの調製方法は特に限定されないが、たとえば次の方法によって調製される。本発明の組み換えＭＤＶを当該ウイルスが増殖可能なＣＥＦ細胞などに感染させ増殖させた後、感染細胞をスクレーパーまたはトリプシンではがし、遠心分離によって細胞と上清に分離する。得られた細胞を１０％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む培養用培地に懸濁させ液体窒素中に保存する。
【００１８】
本発明の鶏多価ワクチンの鶏への投与方法も特に限定されず、マレック病ワクチンに用いられている一般的な方法が使用できる。即ち、１０〜１０５、好ましくは１０２〜１０４ＰＦＵ／ｄｏｓｅになるように適量のリン酸緩衝液などに溶かして、初日齢の鶏の頸部皮下に、あるいは孵化前の卵に注射や接種用機器を使って投与する。
本発明の鶏多価ワクチンを投与された鶏は、複数の異なるサブタイプに属するＩＢＤＶの各々に対して、感染防御能が付与される。具体的には、Ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓに属するＳＴＣ株、Ｖａｒｉａｎｔｓｔｒａｉｎｓに属するＥ株やＡＬ−２株という３種類の異なるサブタイプのＩＢＤＶのいずれに対しても感染防御能が付与される。
【００１９】
感染防御能は、次のテストにおいて防御判定された鶏数の、テストした鶏数に対する割合で求められ、その値が５０％以上、好ましくは７０％以上である場合に、感染防御能がある、と判断できる。
すなわち、１０３ＥＩＤ５０／ｄｏｓｅのＩＢＤＶを点眼から攻撃し、攻撃の１週間後にその鶏を解剖して、攻撃ウイルスによる病変がない鶏を防御されたと判定する。攻撃ウイルスによる病変がない鶏とは、（１）Ｆ嚢と体重比の割合（Ｂ／Ｂ　ｒａｔｉｏ）を算出して、非免疫・非攻撃群のＢ／Ｂ　ｒａｔｉｏの統計的なバラツキの範囲内にある、及び（２）Ｆ嚢の形態異常（ｅｄｅｍａｔｉｚａｔｉｏｎ，ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ，ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ　ｅｘｕｄａｔｅ，ｄｉｓｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ，ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ　ｅｘｕｄａｔｅ）が見られない鶏である。尚、コントロールである非免疫の鶏は全て攻撃ウイルスによる病変を示していなければ（即ち非免疫で被攻撃鶏群の防御能は０％でなければ）、攻撃試験として不適である。
【００２０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明のプラスミド構築は特に記載がない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ．Ｎ．Ｙ．１９８９）記載の標準的な分子生物学手法を用いて行った。尚、制限酵素断片はアガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、カタログ番号＃２８７０４）を使って精製した。
七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）はＡｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（アメリカ農務省）のＤｒ．Ｗｉｔｔｅｒが分離した七面鳥ヘルペスウイルスＦＣ１２６株を使用した（ＷｉｔｔｅｒＲ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．１９７０．３１．５２５−５３８）。
【００２１】
§１　Ｄｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅ株とＳＴＣ株からのＶＰ２タンパク質をコードするｃＤＮＡの取得
１．１　Ｄｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅ株からのＶＰ２タンパク質をコードするｃＤＮＡの取得
デラウエア大学Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ＆Ｆｏｏｄ　ＳｃｉｅｎｃｅｓのＲｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ博士より分与されたＩＢＤＶのＤｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅ株を鶏に感染させ、１週間後に感染鶏からＦ嚢を採取してＦ嚢ライセートを調製した。そのＦ嚢ライセートのＩＢＤＶ力価は１０５．３２ＥＩＤ５０／ｍｌであった。まずＦ嚢ライセート０．１ｍｌからＣａｔｒｉｍｏｘ−１４ＴＭ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２．１１（宝酒造社製、カタログ番号＃ＷＡ００５）を使って全ＲＮＡを回収した。具体的には、ホモジネート１００μｌをＣａｔｒｉｍｏｘ−１４が１ｍｌ入ったチューブに加え、攪拌し、室温で１０分間放置後、４℃で一晩置いた。翌日、室温で１０，０００×ｇで５分間遠心分離後、上清を除き乾燥させた。２Ｍ塩化リチウム溶液０．５ｍｌを加え、１５秒で２回、ｖｏｒｔｅｘを行い、再び遠心によって、上清を除いた。冷やした７０％エタノール１ｍｌで沈殿を洗い、乾燥し、ＲＮＡを得た。得られたＲＮＡからＶＰ２　ｃＤＮＡをクローニングするために、引き続き、プライマーＶＰ２−３Ｒ（配列番号４）とＢｃａＢＥＳＴ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて逆転写反応後、プライマーＶＰ２−３−１（配列番号５）とＶＰ２−５−１（配列番号６）を用いてＢｃａ−Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応でｃＤＮＡを合成した。尚、このＲＴ−ＰＣＲ法に用いた酵素はＢｃａＢＥＳＴＴＭ　ＲＮＡ　ＰＣＲ　ｋｉｔ　Ｖｅｒ１．１（宝酒造社製、カタログ番号＃ＲＲ０２３Ａ）内の試薬を用いた。
【００２２】
更に、このｃＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＶＰ２−５−２Ｅ（配列番号７）とＶＰ２−３−２（配列番号８）を用いてＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ法で約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片増幅した。このＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ法では、ＤＮＡポリメラーゼにＴａＫａＲａ　ｒＴａｑＴＭ（宝酒造社製、カタログ番号＃Ｒ００１Ａ）、あるいはＰｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、カタログ番号＃６００１５３）を用い、アニーリング温度５５℃、３０サイクルで反応を行った。
増幅ＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社製、カタログ番号＃２８１０４）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ　ｖｅｃｔｏｒ　（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製、カタログ番号＃Ｋ４５００−０１）、又は制限酵素ＳｍａＩで切断した後、アルカリフォスファターゼ処理したｐＵＣ１８にクローニングした。
【００２３】
クローニングされたＤｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅ株のＶＰ２　ｃＤＮＡ（以下ＶＰ２−Ｅと略す）の塩基配列を確認するために、独立してクローニングされた５つの候補プラスミドをそれぞれテンプレートにして８種類のシークエンスプライマー（配列番号７〜１４）とＤＴＣＳ　Ｋｉｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社製、カタログ番号＃Ｐ／Ｎ６０８０００）とを使ってＰＣＲを行い、シークケンスサンプルを調製した後、自動ＤＮＡシークエンサーＣＥＱ２０００（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社製）により、配列分析を行った。
塩基配列分析の結果、調べた５つの候補クローンは全てＤｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅ株由来のＶＰ２　ｃＤＮＡであったが、お互いに少しずつ異なっていた。その結果を表１に示す。また、塩基配列から予想されたＶＰ２　ＯＲＦのアミノ酸配列の違いを表２に示す。
表２から明らかなようにクローン＃５のＯＲＦのアミノ酸配列が文献のＤｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅのアミノ酸配列と１００％一致したので、このクローン＃５のｃＤＮＡをＶＰ２−Ｅとして組み換えウイルス作製に使用した。ＶＰ２−Ｅの５’末端のＸｂａＩサイトから３’末端のＳａｌＩサイトまでの塩基配列を配列番号１に示す。
【００２４】
【表１】
2004000111.tif 000002
【００２５】
【表２】
2004000111.tif 000003
【００２６】
１．２　ＳＴＣ株からのＶＰ２タンパク質をコードするｃＤＮＡの取得
ＩＢＤＶ　Ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｓｔｒａｉｎに属するＳＴＣ株を接種した受精卵から回収した漿尿液０．１ｍｌ（ＳＴＣのウイルス力価は１０４ＥＩＤ５０）を出発材料とし、プライマーＶＰ２−５−２Ｅ（配列番号７）の代わりにプライマーＶＰ２−５−２Ｓ（配列番号１５）を使用すること以外は全て前記１．１と同様にしてＳＴＣ株のＶＰ２　ｃＤＮＡをクローニングした。約１．４ｋｂｐの挿入断片を持つ４つの候補クローン（＃１、＃９、＃１１、＃１７）が得られたので、この４クローンの塩基配列の分析を行った。塩基配列分析で使用したプライマーとして、プライマーＶＰ２−５−２Ｅ（配列番号７）の代わりにプライマーＶＰ２−５−２Ｓ（配列番号１５）を使用すること以外は前記１．１に記載した方法と同じである。
【００２７】
塩基配列分析の結果、クローン＃１と＃９については途中で塩基の欠損が見られた。また、クローン＃１１と＃１７については塩基の欠損は見られなかったが、ＳＴＣ株の文献の配列とＤＮＡレベルでそれぞれ２６個と２９個異なっていた。また、塩基配列から予想されるアミノ酸配列では、クローン＃１１と＃１７でそれぞれ６個と８個、文献の配列と異なっていた。従って、文献情報により近いクローン＃１１のＤＮＡをＳＴＣ株ＶＰ２　ｃＤＮＡ（以下、ＶＰ２−ＳＴＣ＃１１と略す）として組み換えウイルスの作製に用いた。このＶＰ２−ＳＴＣ＃１１の５’末のＸｂａＩサイトから３’末端のＳａｌＩサイトまでの塩基配列を配列番号１６に示す。
【００２８】
§２　鶏β−アクチンプロモータ遺伝子の単離
鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰｒＢａｃ１（配列番号１７）とプライマーＰｒＢａｃ２（配列番号１８）を用いてＰＣＲにより鶏β−アクチンプロモーターを含むＤＮＡ断片（約１．５Ｋｂｐ）を得た。このＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩで二重切断して切り出さしたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１８にクローニングして、前述のＤＮＡシークエンサーを用いて、このＤＮＡ断片の塩基配列分析をした。その結果、配列番号３で示される１，５２５ｂｐの鶏β−アクチンプロモーターであることを確認した。
【００２９】
§３　組み換えベクターの構築
３．１　プラスミドｐＧＩＢａｃｐＡの構築
ＷＯ９９／１８２１５号公報に記載されたプラスミドｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉ（２，７７３ｂｐ）を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＡｐａＩで切断し、合成オリゴヌクレオチドＡｄ−Ｂ−Ａ−Ｕ（配列番号１９）と合成オリゴヌクレオチドＡｄ−Ｂ−Ａ−Ｌ（配列番号２０）をアニールさせて調製した合成二本鎖ＤＮＡアダプターを挿入してプラスミドｐＧＩＭＣＳ２（２，７６５ｂｐ）を作製した。次に、前記§２で、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩで二重切断して切り出した鶏β−アクチンプロモーター（１，５２３ｂｐ）とｐＧＩＭＣＳ２を同じく制限酵素ＰｓｔＩ／ＸｂａＩで切断したプラスミド断片とを連結させ、ｐＧＩＢａｃ（４，２７２ｂｐ）を作製した。
【００３０】
更にプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、カタログ番号＃２１２２０９）をテンプレートにして、プライマーＰｏｌｙＡ−Ｆ（配列番号２１）とプライマーＰｏｌｙＡ−Ｒ（配列番号２２）でＰＣＲを行い、ＳＶ４０のｐｏｌｙＡシグナルのＤＮＡ断片（３３４ｂｐ）を増幅し、これを制限酵素ＡｐａＩ／ＫｐｎＩで切断して切り出したＤＮＡ断片（３２４ｂｐ）を、同じく制限酵素ＡｐａＩ／ＫｐｎＩで二重切断したｐＧＩＢａｃに挿入し、ｐＧＩＢａｃｐＡ（４，５８４ｂｐ）を作製した。ｐＧＩＢａｃｐＡまでの構築過程を図１に示す。
【００３１】
３．２　プラスミドｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡの構築
上記のようにして作製したｐＧＩＢａｃｐＡを制限酵素ＢｇｌＩで切断して、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ断片を分離し、１，９３１ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。この回収ＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩで切断したＷＯ９９／１８２１５号公報記載のプラスミドｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５，４９３ｂｐ）に挿入して、ｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡ（７，４２４ｂｐ）を構築した。この構築過程を図２に示す。
【００３２】
３．３　プラスミドｐ４５／４６ｂａｃＶＰ２−Ｅの構築
前記１．１で得られたＶＰ２−ＥのＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片（１，３７２ｂｐ）と、ｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡを制限酵素ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで二重切断して得られたＤＮＡ断片（２．５ｋｂ）と、同じくｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで二重切断して得られたＤＮＡ断片（４．９ｋｂ）の併せて３断片を連結して、ｐ４５／４６ＢａｃＶＰ２−Ｅ（８，７７９ｂｐ）を構築した。この構築過程を図３に示す。
【００３３】
３．４　プラスミドｐｌａｓｍｉｄｐ４５／４６ｂａｃＶＰ２−ＳＴＣ＃１１の構築
ＶＰ２−Ｅの代わりに、前記１．２で得られたＶＰ２−ＳＴＣ＃１１のＤＮＡを用いるほかは全て前記３．３と同じようにして、ｐ４５／４６ＢａｃＶＰ２−ＳＴＣ＃１１（８，７７９ｂｐ）を構築した（図４参照）。
【００３４】
§４　組み換えＨＶＴの単離精製
４．１　ｒＨＶＴ／ＩＢＤ−Ｅ（ＢａｃＶＰ２）の単離
Ｍｏｒｇａｎらの方法（Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３４：３４５−３５１（１９９０）によって、親株ＨＶＴ（以下ｗｔＨＶＴ）のＤＮＡを調製し、前記３．３で構築したプラスミドｐ４５／４６ＢａｃＶＰ２−Ｅとともに電気穿孔法を用いてＣＥＦ細胞に導入し、ＶＰ２に対する抗体を用いて組み換えＨＶＴの純化を行った。その具体的方法は以下の通りである。
【００３５】
Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｖｅｃｔｏｒとしてｐ４５／４６ＢａｃＶＰ２−ＥのＤＮＡ５μｇと２５μｇのＨＶＴゲノムＤＮＡを１００μｌのＳａｌｉｎｅＧ（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カリウム、１．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、１．５ｍＭリン酸二水素一ナトリウム０．５ｍＭ塩化マグネシウム・６水和物、０．０１１％グルコース）に懸濁した。２×１０６個の鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を０．７ｍｌのＳａｌｉｎｅＧに懸濁し、上記ＤＮＡ液を加え、室温でジーンパルサー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて２５μＦ、１．２ｋＶ、０．４ミリ秒の条件にて遺伝子導入した。細胞を室温で１０分間静置した後、４％牛血清を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ−１５とＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　Ｍｅｄｉｕｍと（ともにＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製、カタログ番号＃４１３００−０３９，＃２１５００−０６１）を同容量比で混合した培地（以下、ＬＭ（＋）培地と略す）を加え、直径６０ｍｍの細胞培養皿で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６日、培養した。この細胞を適当に希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁したＣＥＦと混ぜ、９６穴培養プレートに分注し、プラークがでるまで培養した。プレートの各ｗｅｌｌの細胞をトリプシン処理して、新鮮なＣＥＦ細胞を追加して９６穴培養プレート２枚の各ウエルに移した。こうして作製したレプリカプレートをプラークが出現するまで培養した。その後、その１枚のプレートの細胞をメタノールで固定し、ＩＢＤＶ　ＶＰ２に対するモノクローナル抗体Ｒ６３（ハイブリドーマはＡＴＣＣから入手、ＡＴＣＣ：ＨＢ−９４９０）を１次抗体とした抗原抗体反応により、ＶＰ２タンパク質を発現する組み換えＨＶＴが存在しているかどうかの確認を行った。組み換えＨＶＴの確認されたｗｅｌｌに相当するレプリカより細胞を回収、希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁した新鮮なＣＥＦ細胞とまぜて９６穴プレートに分注し、培養した。この、希釈・レプリカの作製・組み換えＨＶＴの確認の繰り返しを、１ｗｅｌｌから由来する全てのプラークがほぼ１００％組み換えＨＶＴであることを確認できるまで行った。この組み換えＨＶＴを１０５ｐｆｕ程度までＣＥＦで増殖後、超音波破砕処理を行い、遠心上清を、９６穴プレートのＣＥＦ細胞に感染させた。１週間培養後、再び、この操作を繰り返して組み換えＨＶＴが１００％になるまで繰り返した。こうして純化した組み換えＨＶＴウイルスをｒＨＶＴ／ＩＢＤ−Ｅと命名した。
【００３６】
４．２　ｒＨＶＴ／ＩＢＤ−ＳＴＣ＃１１（ＢａｃＶＰ２）の単離
Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｖｅｃｔｏｒとして、ｐ４５／４６ＢａｃＶＰ２−Ｅの代わりにｐ４５／４６ＢａｃＶＰ２−ＳＴＣ＃１１を用いること以外は全て前記４．１と同じ様にして組み換えＨＶＴウイルスを作製し、ｒＨＶＴ／ＩＢＤ−ＳＴＣ＃１１と命名した。
【００３７】
§５　組み換えゲノム構築物の確認とその安定性試験
５．１　サザンハイブリダイゼーション
純化の終了した組み換えＨＶＴウイルスをＣＥＦ細胞とともに２枚の１５０ｍｍ径培養皿で全面にプラークが出現するまで培養し、その感染細胞をスクレーパーで培養皿から剥がして遠心分離（１，５００ｒｐｍ、５分）して感染細胞を集め、ＰＢＳで洗浄後ＰＢＳ　１．２ｍｌに再懸濁し、Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（１．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２５０ｍＭ　２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ　ＥＤＴＡがＰＢＳに入ったもの）０．８ｍｌを加えてＶｏｒｔｅｘ（３０”）して細胞を可溶化した。３，０００ｒｐｍ、５分間で細胞残さを除去し、上澄をエッペンドルフチューブに移して１５，０００ｒｐｍ、２０分間、２２℃で遠心してウイルスを落とした。１２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）を１ｍｌ加えて、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ（０．２５ｍｇ／ｍｌＤＮａｓｅＩ、０．２５ｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅＡ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）を４μｌ加えて３７℃、３０分間静置した。その後、５００ｍＭ　ＥＤＴＡ２５μｌ、１０％ＳＤＳ１２５μｌ、水８７μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｋ　１２．５μｌ、２−メルカプトエタノール０．５μｌ加えて、５５℃、３０分間静置した。その液をフェノール／クロロホルムで２回抽出した。
【００３８】
その水層に５Ｍ塩化ナトリウム１６μｌを加え、水層の２．５倍量の（−２０℃で冷やした）１００％エタノールを加えて沈殿させ、遠心分離で沈殿させた沈殿物（ＤＮＡ）を７０％エタノールで洗浄後、再度遠心分離して沈殿させた後乾燥させ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）５０μｌに溶かした。
こうして回収されたウイルスＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ／ＳｆｕＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、制限酵素で切断されたＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにブロットし、サザンハイブリダイゼーションを行った。プローブは“ＰＣＲ　ＤＩＧ　Ｐｒｏｂｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ”（ＲＯＣＨＥ　ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ社製、カタログ番号＃１６３６０９０）の試薬を用いて２種類のＤＩＧ標識されたＤＮＡプローブを調製した。そのＤＮＡプローブは、ＶＰ２　ｃＤＮＡ領域内のプローブ（以下ＶＰ２プローブ）と外来遺伝子の挿入部位のＨＶＴゲノム領域（以下４５／４６プローブ）である。前者のプローブはＶＰ２−Ｆ（配列番号２３）とＶＰ２−Ｒ（配列番号２４）の２本のプライマー及びプラスミドｐ４５／４６ＢａｃＶＰ２−Ｅをテンプレートとして、後者は、４５／４６−Ｆ（配列番号２５）と４５／４６−Ｒ（配列番号２６）の２本のプライマー及びプラスミドｐＮＺ４５／４６ＳｆｉをテンプレートとしてＰＣＲ反応によって調製した。
【００３９】
この２種類のプローブを使ったサザンハイブリダイゼーションの結果、ＶＰ２プローブでは４．７ｋｂｐのバンドがハイブリダイズし、４５／４６プローブでは４．７ｋｂと０．８５ｋｂの２本のバンドがハイブリダイズした。この結果は、どちらのプローブも予期した通りのバンドであったので、組み換えウイルスは設計どおり正しい組み換え体であることが確認された。
【００４０】
５．２　ゲノム安定性試験
組み換えＨＶＴをＣＥＦ細胞で１０代継代した組み換えウイルスについても前記５．１と同様にサザンブロッティングを実施し、１０代継代後の組み換えウイルスも正しい遺伝子構造を持っていることが確認されたので、安定な組み換え体であることが確認された。
【００４１】
§６　組み換え体の発現確認
６．１　免疫沈降
ＶＰ２に対するモノクローナル抗体Ｒ６３とＳｅｉｚｅ　Ｘ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カタログ番号＃４５２２５）を用いて免疫沈降サンプルを調製した。具体的には、７５ｃｍ２フラスコに新鮮な１×１０７のＣＥＦと１×１０５ｐｆｕのｒＨＶＴ／ＩＢＤ−Ｅをまき、約７２時間後に、感染細胞をスクレーパーにて回収した。遠心分離（２，０００ｒｐｍで５分）で感染細胞を回収し、１０ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄し、再び遠心分離で細胞を集めた。その細胞ペレットの１０倍量のＭ−ＰＥＲ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔを添加し、エッペンドルフチューブに移した。軽く振とうしながら１０分間インキュベートし、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１５分）し、上清を回収した。予め、キットの指示書に従ってＲ６３モノクローナル抗体１ｍｇを担体に付けたアフィニティカラムを調製した。アフィニティカラムへのサンプルの吸着及び溶出は、キットの指示書に従って行った。
【００４２】
溶出サンプル２０μｌにキット添付のＳＤＳサンプルバッファー５μｌを加えて５分間ボイルし、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにアプライした。電気泳動終了後、５０％メタノール／１０％酢酸で固定しＣｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅで１時間染色、５０％メタノール／７％酢酸で脱色した。その結果、約４０ｋＤａのタンパク質が検出された。この大きさは、文献で知られているＩＢＤＶのＶＰ２の大きさであり、組み換えウイルスは期待通り目的とする大きさのＶＰ２が発現していた。
【００４３】
§７　組み換え体のワクチン効果動物試験
７．１　動物試験（１）
前記４．１で得られたｒＨＶＴ／ＩＢＤ−Ｅについて、３種類のＩＢＤＶ攻撃株に対するワクチン効果を調べる鶏試験を実施した。８，０００ｐｆｕのｒＨＶＴ／ＩＢＤ−ＥをＳＰＡＦＡＳから購入したＳＰＦ鶏の発育鶏卵の１８日胚あるいは、孵化直後の鶏の背部皮下に接種した。孵化３週齢の鶏に、１０３．５ＥＩＤ５０ドーズのＩＢＤＶ　ＳＴＣ株又はＤｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅ株、又はＡＬ−２株（ローゼンバーガー博士分離）を点眼から攻撃した。攻撃後、１週間後に全ての鶏を解剖し、各個体毎のＦ嚢／体重比を算出し、非免疫、非攻撃鶏群の｛Ｆ嚢／体重比の平均値−２σ（標準偏差）｝より大きい個体、それとＦ嚢の異常（水腫、出血、チーズ様沈着物、黄変、ゼリー様病変）の有無も確認して異常がない個体　を防御されたと判定した（表３）。
【００４４】
【表３】
2004000111.tif 000004
【００４５】
本実験は孵化後３週目にＩＢＤＶで攻撃するという厳しい攻撃条件で行ったため、防御率が全般に低く出ているが、ｒＨＶＴ／ＩＢＤ−ＥはＶＰ２　ｃＤＮＡの由来株と同じＤｅｌａｗａｒｅ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｅ株攻撃のみならず、ＡＬ−２株や別のサブタイプであるＳＴＣ株の攻撃に対しても５０％以上の感染防御率を示し、ＩＢＤＶの異なるサブクラスに対してワクチン効果のあることが確認された。
【００４６】
７．２　動物試験（２）
前記４．２で得られたサブクラスがＣｌａｓｓｉｃａｌ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓであるＳＴＣ株由来のＶＰ２　ｃＤＮＡを組み込んだｒＨＶＴ／ＩＢＤ−ＳＴＣ＃１１についても前記７．１と同様な鶏試験を実施した。その結果（表４）、ｒＨＶＴ／ＩＢＤ−ＳＴＣ＃１１は、ＶＰ２　ｃＤＮＡの由来株と同じＳＴＣ株の攻撃に対しては９０％と優れた防御効果を示したが、別のサブタイプに属するＡＬ−２株の攻撃に対しては５０％以下しか防御せず、前記７．１でワクチン効果を確認した本発明の組み換えウイルスｒＨＶＴ／ＩＢＤ−Ｅの優位性は明らかである。
【００４７】
【表４】
2004000111.tif 000005
【００４８】
§８　移行抗体保有鶏のワクチン効果
８．１　動物試験（３）
前記§４で得られた組み換えウイルスの移行抗体保有鶏でのワクチン効果を調べるため鶏試験を実施した。２，２００ｐｆｕのｒＨＶＴ／ＩＢＤ−Ｅ又はｒＨＶＴ／ＩＢＤ−ＳＴＣ＃１１を孵化後２日目のＤｅｋａｌｂ　ＴＸ鶏（Ｉｓｅ　Ｆａｒｍ社製）の背部皮下に接種した。６週齢（ワクチン接種４０日後）で１０３ＥＩＤ５０ドーズのＩＢＤＶのＳＴＣ攻撃株を点眼から攻撃した。攻撃後、１週間後に全ての鶏を解剖し、Ｆ嚢の状態を調べるとともにＦ嚢／体重比（Ｂ／Ｂｒａｔｉｏ）を算出した。その値及びＦ嚢に病変が現れていないかどうかの所見から防御の有無を判定した。その結果を表５に示す。尚、対照として市販のＩＢＤＶ生ワクチンＫａｋｅｔｓｕｋｅｎ　Ｋ（Ｃｈｅｍｏ−Ｓｅｒｏ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を１０日目にメーカー指示書どおり接種した。ｒＨＶＴワクチン接種時（孵化後２日目）の試験鶏のＩＢＤＶに対する移行抗体価を市販のＥＬＩＳＡキットであるＦｌｏｃｋ　Ｃｈｅｃｋ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｂｕｒｓａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｓｔ　Ｋｉｔｓ（ＩＤＥＸＸ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）で調べたところ、Ｓ／Ｐｖａｌｕｅが平均１．２を示し、試験鶏が高い移行抗体を持っていることが明らかとなった。
【００４９】
【表５】
2004000111.tif 000006
【００５０】
表５の結果からも判るように、高い移行抗体を有する鶏（高移行抗体保有鶏）に対しても、本発明に関わるどちらの組み換え体も９０％以上の防御率を示した。このように攻撃株由来のＶＰ２　ｃＤＮＡが挿入された組み換え体ｒＨＶＴ／ＩＢＤ−ＳＴＣ＃１１の防御率（９５％）には少し及ばなかったものの、高移行抗体保有鶏でもｒＨＶＴ／ＩＢＤ−Ｅは、ＶＰ２　ｃＤＮＡの由来株と異なるサブタイプであるＳＴＣ攻撃に対しても高いワクチン効果を示した。
【００５１】
【配列表】
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【００５２】
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2004000111.tif 000009
2004000111.tif 000010
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【００５３】
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2004000111.tif 000013
2004000111.tif 000014
【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
2004000111.tif 000042
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＧＩＢａｃｐＡの構築過程を説明した図である。
【図２】プラスミドｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡの構築過程を説明した図である。
【図３】プラスミドｐ４５／４６ｂａｃＶＰ２−Ｅの構築過程を説明した図である。
【図４】プラスミドｐ４５／４６ｂａｃＶＰ２−ＳＴＣ＃１１の構築過程を説明した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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