(57)【要約】【課題】効率のよい重金属除去方法および効率のよい重金属を濃縮採取する方法、およびそのためのポリペプチド、生物を提供すること。【解決手段】上記課題は、重金属に選択的に結合し、かつ、形質膜に結合する能力を有するポリペプチドをはじめて見出したことによって達成された。そのような重金属的に選択的に結合するポリペプチドの領域は、たとえば、ＣＸＸＣというアミノ酸配列を有する。ここで、Ｃはシステインであり、そしてＸは任意のアミノ酸をいう。上記形質膜に結合する能力は、例えば機能的な（例えば、疎水性結合性を有する）ファルネシル化領域を有することによって達成される。ファルネシル化領域は、代表的に、ＣａａＹというアミノ酸配列を有する。ここで、ａは脂肪族アミノ酸であり、Ｙは、Ｃ末端アミノ酸である。Ｃ末端アミノ酸は、好ましくは、メチオニンであり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重金属を結合する領域およびファルネシル化領域を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
形質膜結合能を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記重金属を結合する領域は、少なくとも１つのＣＸＸＣを含み、ここでＣはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記重金属を結合する領域は、少なくとも２つのＣＸＸＣを含み、ここでＣはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記重金属を結合する領域は、２つのＣＸＸＣを含み、ここでＣはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ファルネシル化領域は、アミノ酸配列ＣａａＹを含み、ここでＣはシステイン残基を表し、ａは脂肪族アミノ酸を表し、ＹはＣ末端残基を表す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
グリシンリッチ領域をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記重金属を結合する領域は、配列番号２に示す配列のアミノ酸２５位〜８４位および１５５位〜２１５位と、少なくとも７０％の相同性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ファルネシル化領域は、配列番号２に示す配列のアミノ酸３８９位〜３９２位と、少なくとも７０％の相同性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号１に示す配列のヌクレオチド７３位〜２５２および４６３位〜６４５位と、少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１に示す配列のヌクレオチド１１６５位〜１１７６位と、少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１６】
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１７】
植物細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞は、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターで形質転換された、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１９】
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５に記載のベクターを含む、組織。
【請求項２０】
植物組織である、請求項１９に記載の組織。
【請求項２１】
前記組織は、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターで形質転換された、請求項１９に記載の組織。
【請求項２２】
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５に記載のベクターを含む、トランスジェニック生物。
【請求項２３】
植物である、請求項２２に記載のトランスジェニック生物。
【請求項２４】
前記生物は、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターで形質転換された、請求項２２に記載のトランスジェニック生物。
【請求項２５】
有害重金属を環境から除去するためのトランスジェニック植物であって、該植物は、
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５に記載のベクターを含む、
トランスジェニック植物。
【請求項２６】
重金属を濃縮採取するためのトランスジェニック植物であって、該植物は、
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５に記載のベクターを含む、
トランスジェニック植物。
【請求項２７】
重金属結合システムであって、
１）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド；および
２）支持体、
を備える、システム。
【請求項２８】
有害重金属を環境から除去するために使用される、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
重金属を濃縮採取するために使用される、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３０】
前記支持体は、固体支持体である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３１】
前記支持体は、膜または球状である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３２】
環境から重金属を除去する方法であって、請求項２５に記載のトランスジェニック植物を提供する工程、そのトランスジェニック植物を栽培する工程、およびそのトランスジェニック植物を収集する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
希少重金属を濃縮採取する方法であって、請求項２６に記載のトランスジェニック植物を提供する工程、そのトランスジェニック植物を栽培する工程、およびそのトランスジェニック植物を収集する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、重金属を処理することに関する。より詳細には、本発明は、重金属を環境より除去する生物、方法およびシステムならびにそれに有用なポリペプチド、ならびに希少重金属を濃縮および採取するための生物、方法およびシステムならびにそれに有用なポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、生物に対して有害な重金属類に汚染された土壌は、取り除いて地中深く埋めるか、または長期にわたる放置により流失を待つなどの方法がとられている。汚染された水は、限外濾過膜による濃縮、活性炭またはイオン交換樹脂による吸着など、膨大な設備および経費を要する方法しか安全に処理する方法がなく、現実には、十分に対策が行われていないことも多い。
【０００３】
重金属（例えば、カドミウムなど）が土壌や水系など環境中に存在する場合、動植物にとって著しく有害である（Ｓａｎｉｔａ　ｄｉ　Ｔｏｐｐｉ，Ｌ．およびＧａｂｂｒｉｅｌｌｉ，Ｒ．（１９９９）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．４１：１０５−１３０）。しかしながら、現実には、有害重金属は、発電所、金属関連の工場、および焼却場より排出される廃棄物中に広く存在し、土壌汚染の原因となっている。有害重金属によってもたらされる毒性は、食物連鎖を介して生体に蓄積される可能性を有する。そのため、環境中の有害重金属は、現代社会における重要な健康上の問題である。
【０００４】
例えば、重金属（例えば、カドミウムなど）は、非必須重金属であり、そして生細胞に対する毒性は、非常に低濃度においてもたらされる。また、カドミウムは、ヒトに対する発癌物質であると考えられる（Ｃｌｅｍｅｎｓら、（１９９０）ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１８、３３２５−３３３３）。
【０００５】
従って、土壌中の重金属（例えば、カドミウムなどの有害重金属）、を効率的に除去することが、望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
効率のよい重金属除去方法が確立されていないという上記現状に鑑み、当該分野において、そのような効率のよい、重金属除去方法の確立が待ち望まれている。従って、そのような方法およびシステム、ならびにこの方法およびシステムにおい使用するポリペプチド、細胞、および生物（特に植物）を提供することを本発明の課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、重金属に選択的に結合し、かつ、形質膜に結合する能力を有するポリペプチドをはじめて見出したことによって達成された。
【０００８】
具体的には、本明細書において、本発明者らは、ＣｄＩ１９が、原形質膜に局在するメタロシャペロンとして機能すること、およびカドミウムに直接結合し、そして重金属ストレスの際に増加することの実質的な証拠を提供する。
【０００９】
このようなポリペプチドは、例えば、植物が有する有害重金属の無毒化機構の遺伝子レベルにおける解明を進めることにより、特定の重金属を捕捉する特殊なポリペプチドを同定し、その機能を利用することにより達成された。このようなポリペプチドを植物に利用して、ファイトレメディエーション（植物による環境修復）を行うことにより、省エネルギーで、低コスト、かつ広範囲で低レベルの汚染処理を行うことが達成された。
【００１０】
本発明において、有害な重金属を土壌中から効率的に除去するための植物体が提供される。このような植物体は、人体に有害な重金属に対して選択的に結合する膜タンパク質をコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を用いて植物を形質転換することによって可能となった。
【００１１】
植物において、カドミウムは、光合成において活性である、集光性複合体ＩＩ（ｌｉｇｈｔ　ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ＩＩ）（Ｋｒｕｐａ、（１９８８）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ　７３，５１８−５２４）ならびに光化学系Ｉおよび光化学系ＩＩ（ＳｉｅｄｌｅｃｋａおよびＢａｓｚｙｎｓｋｙ（１９９３）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ　８７、１９９−２０２）に対して、損傷を与える。総クロロフィル含量は、カドミウム処理によって減少し、非光化学クエンチングは、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓにおいて増加する（Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｅ．ら、（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｏｔａｎｙ　４９，１０３１−１０３９）。おそらくカドミウムは、気孔の開放を阻害する一方で、孔辺細胞中のＫ＋、Ｃａ２＋およびアブシジン酸の動きもまた妨げる。
【００１２】
そのような重金属的に選択的に結合するポリペプチドの領域は、たとえば、ＣＸＸＣというアミノ酸配列を有する。ここで、Ｃはシステインであり、そしてＸは任意のアミノ酸をいう。上記形質膜に結合する能力は、ファルネシル化領域を有することによって達成される。ファルネシル化領域は、代表的に、ＣａａＹというアミノ酸配列を有する。ここで、ａは脂肪族アミノ酸であり、Ｙは、Ｃ末端アミノ酸である。Ｃ末端アミノ酸は、好ましくは、メチオニンであり得る。
【００１３】
従って、本発明は以下を提供する。
【００１４】
１．　重金属を結合する領域およびファルネシル化領域を含む、ポリペプチド。
【００１５】
２．　形質膜結合能を有する、項目１に記載のポリペプチド。
【００１６】
３．　前記重金属を結合する領域は、少なくとも１つのＣＸＸＣを含み、ここでＣはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す、項目１に記載のポリペプチド。
【００１７】
４．　前記重金属を結合する領域は、少なくとも２つのＣＸＸＣを含み、ここでＣはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す、項目１に記載のポリペプチド。
【００１８】
５．　前記重金属を結合する領域は、２つのＣＸＸＣを含み、ここでＣはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す、項目１に記載のポリペプチド。
【００１９】
６．　前記ファルネシル化領域は、アミノ酸配列ＣａａＹを含み、ここでＣはシステイン残基を表し、ａは脂肪族アミノ酸を表し、ＹはＣ末端残基を表す、項目１に記載のポリペプチド。
【００２０】
７．　グリシンリッチ領域をさらに含む、項目１に記載のポリペプチド。
【００２１】
８．　前記重金属を結合する領域は、配列番号２に示す配列のアミノ酸２５位〜８４位および１５５位〜２１５位と、少なくとも７０％の相同性を有する、項目１に記載のポリペプチド。
【００２２】
９．　前記ファルネシル化領域は、配列番号２に示す配列のアミノ酸３８９位〜３９２位と、少なくとも７０％の相同性を有する、項目１に記載のポリペプチド。
【００２３】
１０．
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、項目１に記載のポリペプチド。
【００２４】
１１．　項目１〜１０に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２５】
１２．
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、ポリヌクレオチド。
【００２６】
１３．　配列番号１に示す配列のヌクレオチド７３位〜２５２および４６３位〜６４５位と、少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド。
【００２７】
１４．　配列番号１に示す配列のヌクレオチド１１６５位〜１１７６位と、少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド。
【００２８】
１５．　項目１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【００２９】
１６．　項目１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは項目１５に記載のベクターを含む、細胞。
【００３０】
１７．　植物細胞である、項目１６に記載の細胞。
【００３１】
１８．　前記細胞は、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターで形質転換された、項目１６に記載の細胞。
【００３２】
１９．　項目１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは項目１５に記載のベクターを含む、組織。
【００３３】
２０．　植物組織である、項目１９に記載の組織。
【００３４】
２１．　前記組織は、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターで形質転換された、項目１９に記載の組織。
【００３５】
２２．　項目１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは項目１５に記載のベクターを含む、トランスジェニック生物。
【００３６】
２３．　植物である、項目２２に記載のトランスジェニック生物。
【００３７】
２４．　前記生物は、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターで形質転換された、項目２２に記載のトランスジェニック生物。
【００３８】
２５．　有害重金属を環境から除去するためのトランスジェニック植物であって、該植物は、
項目１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは項目１５に記載のベクターを含む、
トランスジェニック植物。
【００３９】
２６．　重金属を濃縮採取するためのトランスジェニック植物であって、該植物は、
項目１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは項目１５に記載のベクターを含む、
トランスジェニック植物。
【００４０】
２７．　重金属結合システムであって、
１）項目１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド；および
２）支持体、
を備える、システム。
【００４１】
２８．　有害重金属を環境から除去するために使用される、項目２７に記載のシステム。
【００４２】
２９．　重金属を濃縮採取するために使用される、項目２７に記載のシステム。
【００４３】
３０．　前記支持体は、固体支持体である、項目２７に記載のシステム。
【００４４】
３１．　前記支持体は、膜または球状である、項目２７に記載のシステム。
【００４５】
３２．　環境から重金属を除去する方法であって、項目２５に記載のトランスジェニック植物を提供する工程、そのトランスジェニック植物を栽培する工程、およびそのトランスジェニック植物を収集する工程を包含する、方法。
【００４６】
３３．　希少重金属を濃縮採取する方法であって、項目２６に記載のトランスジェニック植物を提供する工程、そのトランスジェニック植物を栽培する工程、およびそのトランスジェニック植物を収集する工程を包含する、方法。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００４８】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００４９】
本明細書において「重金属」とは、周期表の第四周期以降の金属元素をいう。そのような重金属としては、カドミウム、水銀、鉛、鉄、銅、亜鉛などが含まれる。重金属元素は、カドミウム、水銀、鉛などのように、ほとんどが動植物を含む生物に深刻な影響を与えることが知られている。しかし、鉄、銅および亜鉛などのように、必須元素として生体内で重要な役割を果たす重金属も存在する。従って、好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、そのような生体内で必須の重金属をのぞいた重金属を選択的に結合する活性を有する。本明細書において、「重金属」は、結合について言及されるとき、「重金属イオン」と互換的に使用される。
【００５０】
本明細書において、「有害重金属」とは、重金属のうち、微量で、生体内において有害な作用を有するものをいい、一般に５ｇ／ｃｍ３以上の密度を持つ金属元素であり、生物に取り込まれると生物反応を阻害し、細胞機能の低下、ヒトにおいては健康被害などを引き起こす金属である。そのような有害重金属の代表としては、カドミウム（カルシウム再吸収阻害）、水銀（神経細胞への影響）およびクロム（細胞内反応の異常による発癌性）などがあるがそれらに限定されない。
【００５１】
本明細書において、「重金属を結合する領域」とは、重金属と相互作用するポリペプチドの部分をいう。好ましくは、この領域は、重金属とキレートし、捕捉する。この重金属を結合する領域は、代表的に、ＣＸＸＣというアミノ酸配列を有する。ここで、Ｃはシステインであり、そしてＸは任意のアミノ酸である。好ましくは、この重金属を結合する領域は、ＣＸＸＣを少なくとも２つ含む。より好ましくは、この重金属を結合する領域は、２つのＣＸＸＣを含む。さらに好ましくは、この２つのＣＸＸＣの間の距離は、１１０〜１４０アミノ酸であり得る。好ましい実施形態において、重金属を結合する領域は、ＺＸＣＸＸＣであり得る。ここで、Ｚは、メチオニンまたはロイシンであり得る。本明細書において好ましい実施形態では、重金属を結合する領域は、配列番号２の２５位〜８４位および１５５位〜２１５位に示す配列（好ましくは、３２位〜４０位および１６３位〜１７１位）と、それぞれ少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を含む。より好ましくは、重金属を結合する領域は、配列番号２の２５位〜８４位および１５５位〜２１５位に示す配列（好ましくは、３２位〜４０位および１６３位〜１７１位）に示す配列、またはその配列に保存的置換を含むもの、あるいは１以上または１もしくは数個の置換、付加もしくは欠失を含むものであり得る。より好ましくは、そのような保存的置換は、１または数個であり得る。好ましくは、ＣＸＸＣにおけるシステインは置換されない。
【００５２】
本明細書において、重金属を「結合（ｂｉｎｄ）」または「結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）」するとは、２つ以上の系に相互作用をもたせて結びつけることをいう。本発明のポリペプチドは、そのポリペプチド中のシステイン残基中の硫黄原子が重金属イオンと配位することによって結合する。従って、本発明のポリペプチドにおいて含まれるＣＸＸＣは、そのポリペプチド中に少なくとも２つ存在し、ここに含まれる少なくとも４つのシステインは、重金属と配位することができる立体位置にあることが好ましい。
【００５３】
このような重金属の結合または、結合後の代謝に関わるポリペプチドは多数報告されてきている（Ｐｕｆａｈｌ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，８５３−８５６；Ｈｉｍｅｌｂｌａｕ，Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１７，１２２７−１２３４）これらのほとんどは、ポリペプチド内にβαββαβ（αはαへリックス、βはβストランドというタンパク質の二次構造を意味する）からなるモチーフ構造を有する。このモチーフ内に、上記ＣＸＸＣというコア配列が存在する。
【００５４】
本明細書において、「αヘリックス」とは、タンパク質またはポリペプチドの二次構造の一つであり、アミノ酸が３．６残基ごとに１回転したピッチが５．４Åの螺旋構造を有するエネルギー的に最も安定な構造の１つをいう。αヘリックスを形成しやすいアミノ酸としては、グルタミン酸、リジン、アラニン、およびロイシンなどが挙げられる。逆に、αヘリックスを形成しにくいアミノ酸としては、バリン、イソロイシン、プロリン、およびグリシンなどが挙げられる。また、本明細書において、「βシート」とは、タンパク質またはポリペプチドの二次構造の一つであり、ジグザグに伸びたコンホメーションを有する二本以上のポリペプチド鎖が平行に並び、ペプチドのアミド基およびカルボニル基が、それぞれ隣接するペプチド鎖のカルボニル基およびアミド基との間に水素結合を形成することによりエネルギー的に安定なシート状により合わさった構造をいう。なお、「平行βシート」とは、βシートのうち、隣接するポリペプチド鎖のアミノ酸配列の並び方が同じ方向のものをいい、「逆平行βシート」とは、βシートのうち、隣接するポリペプチド鎖のアミノ酸の並び方が逆方向のものをいう。さらに、本明細書において、「βストランド」とは、βシートを形成するジグザグに伸びたコンフォメーションを有する１本のペプチド鎖をいう。
【００５５】
本明細書において、「ファルネシル化領域」とは、細胞内でファルネシル化され得る特定のアミノ酸配列を有する領域をいう。本明細書においてファルネシル化領域は、イソプレニル化領域（または部位）とも称する。ファルネシル化とは、ポリペプチドがファルネシル化ピロリン酸と反応することにより、Ｃ末端側に長鎖脂肪酸を付加し、そのポリペプチドの疎水性を増す現象をいう。疎水性を増すことにより、そのポリペプチドは、形質膜などの膜部分または他のタンパク質の疎水性部分と相互作用し、それらの部位へ局在する性質を示す。そのようなファルネシル化領域を示すアミノ酸配列は、ＣａａＹという配列を含む。ここで、Ｃはシステインであり、ａは脂肪族アミノ酸であり、ＹはＣ末端アミノ酸である。ここで、Ｙは好ましくは、メチオニンであり得る。本明細書において、機能的なファルネシル化部位は、例えば、形質膜などに結合し、局在化する機能を示すものをいう。本明細書において好ましい実施形態では、ファルネシル化領域は、配列番号２のＣ末端の４アミノ酸（３８９位〜３９２位）を含む。
【００５６】
ファルネシル化領域は、通常、「膜結合」特性を示す。従って、この膜結合性を利用することにより、本発明のポリペプチドは、重金属の環境からの除去または希少重金属の濃縮を提供する。あるいは、ファルネシル化領域が疎水性部分に親和性を示すことから、この性質を利用して、重金属を疎水性分子にトラップするシステムを作製することに適用することができる。
【００５７】
本明細書において、「膜結合領域」とは、タンパク質を細胞の膜（形質膜、ゴルジ体の膜、小胞体の膜、ミトコンドリアの膜、液胞の膜、葉緑体の膜を含む）にアンカーする領域をいう。本明細書において使用する場合、「膜結合領域」としては、「ファルネシル化領域」、「ＧＰＩアンカー結合領域」が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書において、「メタロシャペロン（ｍｅｔａｌｌｏｃｈａｐｅｒｏｎ）」とは、重金属イオンと結合し、相互作用し、重金属イオンの運搬、隔離、分配などの代謝に関与する（例えば、ポリペプチド）をいう。メタロシャペロンには、ファイトケラチンおよびメタロチオネインが含まれるがそれらに限定されない。メタロシャペロンは、重金属と錯体を形成し、通常、この錯体がトランスポーターなどを通じて液胞に運搬される。液胞に重金属が運搬されることにより、重金属の細胞に対する毒性が抑制される。ファイトケラチン生合成に関与する酵素としては、ＲＳＣ１〜４が公知である。
【００５９】
本明細書において、「液胞」とは、当該分野において使用されるのと同じ意味で使用され、細胞内で周囲の原形質から明確に区画され，水溶液を満たした空間をいう。動物細胞では空胞といわれることが多い。多くの正常な動物細胞や若い未分化の植物細胞では認められないかまたは小形のものがいくつかある。生長した植物細胞では細胞容積の大部分を占める大きさになる。一重の単位膜（液胞膜）で仕切られている。液胞を満たす細胞液は、無機イオン、有機酸、炭水化物、蛋白質、アミノ酸のほかに、配糖体、アルカロイドなどを含む。機能的には代謝産物の貯蔵や分解あるいは解毒を行うとともに、膨圧を発生させ植物体に力学的強度を与える。また、重金属を隔離する機能も有する。構造的には、動・植物細胞を問わず、電子顕微鏡によって観察された細胞内の諸種の袋状の構造（嚢）を形状によって区別し、大きい球状のものを液胞という（例えば、ゴルジ液胞、貪食液胞など）。本発明では、本発明のポリペプチドにより捕捉された重金属は、メタロシャペロンポリペプチドによって、液胞に運ばれ、そこで細胞の他の部分から隔離される。その隔離の過程においてメタロシャペロンポリペプチドによって運搬された重金属は、ＡＢＣトランスポーターにより液胞内に取り込まれる。そのようなＡＢＣトランスポーターは公知である。液胞に蓄積した重金属は、スルフィド（Ｓ２−）などにより、さらに安定な高分子クラスター（高分子量重金属（例えば、Ｃｄ）／Ｓ複合体）を形成し（Ｔｏｐｐｉ　ＬＳ　ｅｔ　ａｌ（１９９９），Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．４１，１０５−１３０）、最終的に液胞内に閉じこめられたまま落葉などにより植物体外へと処理されるか、根などに蓄積される。
【００６０】
このように、重金属を生体内で処理する機構には、本発明のポリペプチドのような疎水性相互作用により一定箇所に局在化させることのほか、従来知られるように、メタロシャペロンにより排出または別の安全な箇所へと移動させること、および生体内の生命維持に必要な部分から重金属を隔離させることなどの機構があった。
【００６１】
本発明のポリペプチドにより膜に一時的または恒常的に固定された重金属は、そのままにしておいて重金属を処理することも可能であるし、あるいはさらなる処理または生体内の機構を利用することによって処理をすることも可能である。そのようなさらなる機構を組み合わせたシステムとしては、例えば、上述のメタロシャペロン（例えば、メタロチオネインまたはファイトケラチンなど）と本発明のポリペプチドとの組み合わせを含むシステムが挙げられる。
【００６２】
そのようなシステムを本明細書の開示に従って利用することにより、例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列と、そのようなメタロシャペロンをコードする核酸配列、および／またはそのような重金属の生合成に関与する酵素をコードする核酸配列とを別々にまたは一緒に発現するようなベクターを作製し、そのベクターを生物（例えば、植物）の細胞に導入して、機能的に重金属を液胞に運搬することによって、さらにより効率的な重金属の排除または濃縮を行うことができる。
【００６３】
本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００６４】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００６５】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００６６】
本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００６７】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００６８】
本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００６９】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【００７０】
本明細書中において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。
【００７１】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００７３】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。本発明の１実施形態である重金属を結合する機能を有するタンパク質の場合は、その生物学的活性は、少なくとも重金属を結合する活性を包含する。別の実施形態では、生物学的活性としては、重金属に結合する活性および形質膜のような疎水性部分に結合する能力の両方が挙げられる。
【００７４】
そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。重金属に結合する活性は、本明細書に記載されるように測定することができ、例えば、円偏光色性（ＣＤ）測定法を利用することができる。具体的にはタンパク質は、金属イオンと相互作用（結合を含む）すると、ほぼ間違いなくその構造を変化させる。よって構造変化をモニターすることで、金属イオンとの結合を測定することができる。
【００７５】
円偏光二色性スペクトルは、タンパク質の構造により独特のスペクトルを与える。スペクトルは、おもにタンパク質を作るペプチド結合の繰り返し構造に由来する。スペクトルが変化したということは、すなわちタンパク質主鎖の繰り返し構造が変化したということになる。金属イオンが存在しないとするときとで、タンパク質のスペクトルを比べることにより、タンパク質が金属イオンと相互作用して構造を変化させた（すなわち結合した）ということを判断することができる。形質膜への結合能力は、例えば、目的のポリペプチドに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなマーカー部分をコードするアミノ酸配列を融合させたものを細胞内で発現させ、その局在状況をそのマーカーの検出により測定することができる。また、疎水性部分への結合は、このほかに、疎水性部分への結合を担うタンパク質内部のアミノ酸配列を人工的に改変し、機能しなくなるようにすることでも確かめられる。結合領域が機能しているタンパク質と、機能していないタンパク質とをそれぞれ細胞内で発現させ、局在部位をモニターして比べることで確認することもできる。
【００７６】
本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば、そのポリペプチドを産生する初代培養細胞または株化細胞を培養し、培養上清などから単離または精製することによりそのポリペプチドを得る方法が挙げられる。あるいは、遺伝子操作手法を利用して、そのポリペプチドをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを用いて発現宿主を形質転換し、この形質転換細胞の培養上清または細胞抽出物から組換えポリペプチドを得ることができる。上記宿主細胞は、生理活性を保持するポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞など）を用いることが可能である。このようにして得られた細胞に由来するポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。
【００７７】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００７８】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００７９】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００８０】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００８２】
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、重金属結合領域および／またはファルネシル化領域におけるシステインが保存されるように改変され得る。
【００８３】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００８４】
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
【００８５】
本明細書において使用されるポリペプチドの核酸形態は、そのポリペプチドのタンパク質形態を発現し得る核酸分子をいう。この核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性（重金属を結合する活性、膜のような疎水性部分に結合する活性などを含む）を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【００８６】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００８７】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、癌マーカー、神経疾患マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００８８】
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され得る。この構成の一般的な議論については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびに、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ＰａｒｔＩ：Ｔｈｅ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして代表的には５０〜３５０アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、βシート（βストランドなど）およびα−ヘリックスのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のような、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様に使用される。したがって、本発明のポリペプチドは、重金属結合能および形質膜結合能を有するような高次構造を有する限り、どのようなアミノ酸配列のポリペプチドをも包含し得る。
【００８９】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
【００９０】
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗｉｌｅｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊら　（１９８７）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
【００９１】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【００９２】
「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。植物の場合、本発明に用いる植物の発現ベクターはさらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いてその植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
【００９３】
「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【００９４】
原核細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４））、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＬ−ｃ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）などが例示される。
【００９５】
酵母細胞に対する「組換えベクター」としては、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などが例示される。
【００９６】
動物細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３））などが例示される。
【００９７】
植物細胞に対する「組換えベクター」としては、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクターなどが例示される。
【００９８】
昆虫細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
【００９９】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
【０１００】
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【０１０１】
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、生物（例えば、植物）の部位（例えば、植物の場合、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実など）におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、生物（たとえば、植物）の発達段階（例えば、植物であれば生長段階（例えば、発芽後の芽生えの日数））に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。
【０１０２】
本明細書において、本発明のプロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「ストレス応答性」であるとは、少なくとも１つのストレスが生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を「ストレス誘導性」といい、発現量が減少する性質を「ストレス減少性」という。「ストレス減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。ストレス誘導性のプロモーターを本発明のポリペプチドをコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された植物または植物の部分（特定の細胞、組織など）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での重金属の除去または濃縮を行うことができる。
【０１０３】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。植物において使用する場合、エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好ましい。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１０４】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１０５】
本発明を植物において利用する場合、植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウムを介する方法および直接細胞に導入する方法、が用いられ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｎａｇｅｌ　ら（１９９０）、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ．，６７，３２５）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物発現ベクターでエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＧｅｌｖｉｎら（Ｇｅｌｖｉｎら編（１９９４）、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３８：２７４−２７６；およびＲｈｏｄｅｓら（１９８９）、　Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４０：２０４−２０７を参照のこと）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９５７−９６２を参照のこと）ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（Ｄａｔｔａら（１９９０）、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：７３６−７４０を参照のこと）が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【０１０６】
植物発現ベクターを導入された細胞は、まずカナマイシン耐性などの薬剤耐性で選択される。次いで、当該分野で周知の方法により、植物組織、植物器官および／または植物体に再分化され得る。さらに、植物体から種子が取得され得る。導入した遺伝子の発現は、ノーザンブロット法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、ウェスタンブロット法により確認し得る。
【０１０７】
植物において本発明を利用する場合、ベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、以下を用いた形質転換などが挙げられる：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７、特開２００１−２９０７５、特開２０００−２４５４８５）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等が例示される。
【０１０８】
本発明は、動物または微生物など、他の生物においても利用することができる。そのような動物または微生物における利用のための技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊら　（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【０１０９】
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
【０１１０】
原核細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。
【０１１１】
酵母細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ等を挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等が例示される。
【０１１２】
動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５などが例示される。
【０１１３】
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞などを用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ　ア・ラボラトリー・マニュアル）など、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ　５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）など、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ４などが例示される。
【０１１４】
植物細胞としては、本明細書において以下に記載されるものが挙げられ、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻、シダ、ペチュニア、ホテイアオイ、アズキのほか、木本植物（例えば、ポプラ、コーヒー、スギ、ヒノキ、ユーカリ、マングローブなど）の細胞などを挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、本明細書において他の場所で詳述したように、いずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７、特開２００１−２９０７５、特開２０００−２４５４８５）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等が例示される。
【０１１５】
本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、クロロフィル、かたい細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。代表的には、植物は、細胞壁の形成・クロロフィルによる同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、樹木、芝生、雑草などが挙げられ、例えば、シロイヌナズナ、アブラナおよびヒマワリが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の植物は、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物、、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴであってもよい。好ましい植物は樹木、芝生、雑草などに限られず、花、作物も含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。特定の実施形態では、植物は、植物体を意味し得る。
【０１１６】
別の実施形態において、本発明において使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科、イネ科、アブラナ科の植物が挙げられる。
【０１１７】
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【０１１８】
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
【０１１９】
木本植物の例としては、ポプラ、コーヒー、スギ、ヒノキ、ユーカリ、マングローブなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２０】
本発明の方法およびシステムに用いられる植物は、好ましくは木本植物であり、より好ましくは、ポプラ、ユーカリなどであるがこれらに限定されない。
【０１２１】
本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物および無脊椎動物を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２２】
本発明のポリペプチド、システム、組成物および方法は、単子葉植物だけでなく双子葉植物を含む植物全体、および動物を含む他の生物において機能することが企図される。なぜなら、本発明のポリペプチドは、疎水性相互作用を通じて形質膜に結合すること、および重金属への結合の機構は生物においてほぼ共通すると考えられるからである。
【０１２３】
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、臓器（器官）の一部であり得る。臓器（器官）内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
【０１２４】
本明細書において、「器官（臓器）」とは、１つ独立した形態をもち、１種以上の組織が組み合わさって特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。植物では、カルス、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実などが挙げられるがそれらに限定されない。動物では、胃、肝臓、腸、膵臓、肺、気管、鼻、心臓、動脈、静脈、リンパ節（リンパ管系）、胸腺、卵巣、眼、耳、舌、皮膚等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２５】
本明細書において、「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子をある生物に組み込むことまたはそのような遺伝子が組み込まれた生物（例えば、植物または動物（マウスなど）を含む）をいう。
【０１２６】
本明細書では、植物の栽培は当該分野において公知の任意の方法により行うことができる。植物の栽培方法は、例えば、モデル植物の実験プロトコール−イネ・シロイヌナズナ編−」：細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４；イネの栽培法（奥野員敏）ｐｐ．２８−３２、およびアラビドプシスの栽培法（丹羽康夫）ｐｐ．３３−４０（監修　島本功、岡田清孝）に例示されており、当業者であれば容易に実施することができることから本明細書では詳述する必要はない。例えば、シロイヌナズナの栽培は土耕、ロックウール耕、水耕いずれでも行うことができる。白色蛍光灯（６０００ルクス程度）の下、恒明条件で栽培すれば播種後４週間程度で最初の花が咲き、開花後１６日程度で種子が完熟する。１さやで４０〜５０粒の種子が得られ、播種後２〜３ケ月で枯死するまでの間に１００００粒程度の種子が得られる。種子の休眠期間は短く、完熟種子は１週間程度乾燥させれば吸水後２〜３日で発芽する。
【０１２７】
木本植物の栽培方法もまた当該分野において周知慣用技術であり、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｗｏｏｄｙ　Ｐｌａｎｔｓ（Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ）（ｅｄ．Ｓ．Ｍｏｈａｎ　Ｊａｉｎ，Ｓｕｂｈａｓｈ　Ｃ．Ｍｉｎｏｃｈａ）、Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２０００に記載されている。
【０１２８】
植物細胞の培養、分化および再生のためには、当該分野で公知の手法および培地が用いられる。このような培地には、例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地、ＧａＭｂｏｒｇ　Ｂ５（Ｂ）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｓｃｈ＆Ｎｉｔｓｃｈ（Ｎｉｔｓｃｈ）培地などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの培地は、通常、植物生長調節物質（植物ホルモン）などが適当量添加されて用いられる。
【０１２９】
本明細書において、植物の場合、その植物を「再分化」するとは、個体の一部分から個体全体が復元される現象を意味する。例えば、再分化により、細胞（葉、根など）のような組織片から器官または植物体が形成される。
【０１３０】
形質転換体を植物体へと再分化する方法は当該分野において周知である。そのような方法としては、Ｒｏｇｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１１８：６２７−６４０　（１９８６）；　Ｔａｂａｔａｅｔ　ａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；Ｓｈａｗ，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ　ｐｒｅｓｓ　（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３３８：２７４　（１９８９）；　Ｍａｌｉｇａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｃｏｕｒｓｅ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９５）など。木本植物については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　Ｗｏｏｄｙ　Ｐｌａｎｔｓ（Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ）　（ｅｄ．Ｓ．Ｍｏｈａｎ　Ｊａｉｎ，Ｓｕｂｈａｓｈ　Ｃ．Ｍｉｎｏｃｈａ）、Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（２０００）に記載されている。木本植物では、たとえば、コーヒーについては、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９９）１９：１０６−１１０に詳細に記載されており、具体的には、本明細書において実施例において記載されるように実施することができる。従って、当業者は、上記周知方法を目的とするトランスジェニック植物に応じて適宜使用して、再分化させることができる。このようにして得られたトランスジェニック植物には、目的の遺伝子が導入されており、そのような遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１３１】
本発明の生物が、動物の場合、トランスジェニック生物は、マイクロインジェクション法（微量注入法）、ウィルスベクター法、ＥＳ細胞法（胚性幹細胞法）、精子ベクター法、染色体断片を導入する方法（トランスゾミック法）、エピゾーム法などを利用したトランスジェニック動物の作製技術を使用して作製することができる。そのようなトランスジェニック動物の作成技術は当該分野において周知である。
【０１３２】
形質転換体が本発明における所望の活性（例えば、重金属を結合する活性、形質膜結合活性など）を有するかどうかは、本明細書に記載したアッセイを用いて測定することができる。
【０１３３】
本明細書において「環境」とは、対象生物（例えば、ヒト）が生活をしていくうえで関わりをもつ自然界の空間をいう。従って、そのような環境には、いわゆる自然環境、社会環境といった生体外の環境から、血液循環や神経伝達系などの生体内環境が包含され得る。
【０１３４】
本明細書において使用される「支持体」とは、本発明のポリペプチドを担持することができる物質をいう。支持体の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用されるポリペプチドに結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
【０１３５】
支持体として使用するための材料には、固体表面を形成し得る任意の物質が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、支持体は、疎水性結合を行う部分を含む。支持体は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、尿素樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。あるいは、支持体として、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。
【０１３６】
（本発明のポリペプチドの分離）
重金属は、生物にとって高度に毒性である可能性がある。植物は損傷を最小限にする能力を有するが、その分子メカニズムは詳細にはわかっていない。アラビドプシスにおいてカドミウム応答性遺伝子をスクリーニングして、本発明者らは、金属結合タンパク質であると推定されるＣｄＩ１９をコードする遺伝子を同定した。この遺伝子は、酵母細胞に導入された場合、カドミウム曝露に対する顕著な耐性を付与する。本件明細書において、本発明者らは、円偏光二色性（ＣＤ）分析によって明らかなように、細菌において発現させたＣｄＩ１９が、そのＣＸＸＣモチーフにおいて直接カドミウムと相互作用し、そしてグリーン蛍光タンパク質との融合タンパク質のＢＹ２細胞における異種発現によって、ＣｄＩ１９がもっぱら形質膜に局在することを、開示する。ノーザンブロット分析によって、ＣｄＩ１９転写物が、カドミウムばかりではなく、Ｈｇ、ＦｅおよびＣｕの２価カチオン形態によっても誘導されることを示した。ＣｄＩ１９プロモーター：：ＧＵＳを発現するトランスジェニックアラビドプシスを使用する組織化学的アッセイによって、ＣｄＩ１９が葉柄、花柄、および根組織の維管束において発現することが示された。ＣｄＩ１９　ｃＤＮＡの過剰発現によって、トランスジェニックアラビドプシスがカドミウム耐性となった。これらの結果は、ＣｄＩ１９が重金属の恒常性の維持、および／または遊離の重金属イオンの細胞内への流入に対する最初の障壁として作用する能力を形質膜に与えることによる解毒において重要な役割を担うことを示唆する。
【０１３７】
多くの遷移金属は、植物の栄養のために必須である。しかし、毒性の可能性があるために、これらイオンの厳密な調節が、植物細胞にとって重要である。金属の恒常性を維持するために、植物は、必須金属イオンの適切な濃度を確保するため、そして非必須形態の金属の蓄積、分布および隔離を制御することによる、その除去のための多様なメカニズムを進化させた。（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｓ．（２００１）Ｐｌａｎｔａ，２１２，４７５−４８６．；ｄｉ　Ｔｏｐｐｉ，Ｌ．Ｓ．およびＧａｂｂｒｉｅｌｌｉ，Ｒ．（１９９９）Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂｏｔａｎｙ，４１，１０５−１３０．１７；Ｚｅｎｋ，Ｍ．Ｈ．（１９９６）Ｇｅｎｅ，１７９，２１−３０）。例えば、植物は、キレート剤（小ペプチド、有機酸、およびアミノ酸を含む）を含み、このキレート剤は、遊離の金属イオンに結合する。これらキレート剤は、細胞質内の金属イオンを緩衝化することによって、金属の解毒に寄与する（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｓ．（２００１）Ｐｌａｎｔａ，２１２，４７５−４８６）。公知の金属器レート剤の第１のクラスは、ファィトケラチンおよびメタロチオネインである。ファィトケラチンのチオール部分であるシステインに富む小ペプチドを、グルタチオンおよびキレート金属イオン（例えば、Ｃｄ、Ｃｕ、ＺｎおよびＡｇ）から酵素合成した。例えば、無細胞抽出液内において、９７％までのカドミウムがファィトケラチンと結合することが、実験的に示されている（Ｚｅｎｋ，Ｍ．Ｈ．（１９９６）Ｇｅｎｅ，１７９，２１−３０）。メタロチオネインは、同様にシステインに富むタンパク質であり、おもに遊離のＣｕ（代表的には、その細胞質濃度が金属排除によって非常に低レベルに維持される（１０−１８Ｍ））に結合する低分子量のタンパク質である（Ｏ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｔ．Ｖ．およびＣｕｌｏｔｔａ，Ｖ．Ｃ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２５０５７−２５０６０；Ｒａｅ，Ｔ，Ｄ，．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｐ．Ｊ．，Ｐｕｆｈａｌ，Ｒ．Ａ．，Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．Ｃ．およびＯ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｔ．Ｖ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８４，８０５−８０８）。ファィトケラチンおよびメタロチオネインが金属の解毒の最終工程において機能することが、一般的に認められているが、吸収された金属イオンが植物細胞においてどのような経路を通るのかについては、限られた情報しかない。
【０１３８】
金属イオンの細胞内輸送において、可溶性の金属レセプタータンパク質は、「メタロシャペロン」として知られる。ＡＴＸ１は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて酸化防止タンパク質として最初に単離され（Ｌｉｎ，Ｓ．およびＣｕｌｏｔｔａ，Ｖ．Ｃ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，３７８４−３７８８）、そしてＣｕイオンを、細胞質内のポストゴルジ小胞の膜中の銅トランスポーターに送達することが報告された。ＡＴＸ１は、ＭＸＣＸＸＣ配列中の２つのシステインによって、１つのＣｕイオンに結合する（ここで、Ｍはメチオニンであり、Ｘは任意のアミノ酸、そしてＣはシステインである（Ｐｕｆａｈｉ，Ｒ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｃ．，Ｐｅａｒｉｓｏ，Ｋ．Ｌ．，Ｌｉｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｐ．，Ｆａｈｒｎｉ，Ｃ．，Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．Ｃ．，Ｐｅｎｎｅｒ−Ｈａｈｎ，Ｊ．Ｅ．およびＯ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｔ．Ｖ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，８５３−８５６）。このモチーフは、多くの金属結合タンパク質（ＣＣＣ２、Ｐ型銅トランスポーター（Ｙｕａｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｓｔｅａｒｍａｎ，Ｒ．，Ｄａｎｃｉｓ，Ａ．，Ｄｕｎｎ，Ｔ．，Ｂｅｅｌｅｒ，Ｔ．およびＫｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，２６３２−２６３６）、ＭｅｒＰ水銀イオンの細菌のキャリア（Ｐｏｗｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．およびＳａｈｌｍａｎ，Ｌ．（１９９９）Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３３３２０−３３３２６；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｓ．およびＰｈｕｎｇ，Ｌ．Ｔ．（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０，７５３−７８９）、およびＣＣＳＳＯＤ１の銅シャペロン（Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．Ｃ．，Ｋｌｏｍｐ，Ｌ．Ｗ．，Ｓｔｒａｉｎ，Ｊ．，Ｃａｓａｒｅｎｏ，Ｒ．Ｌ．，Ｋｒｅｍｓ，Ｂ．およびＧｉｔｌｉｎ，Ｊ．Ｄ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２３４６９−２３４７２）において見出された。
【０１３９】
重金属代謝がどのように調節されているのかを解明するために、本発明者らは以前に、カドミウムストレスに供されたアラビドプシスの実生におけるカドミウム誘導性遺伝子をスクリーニングした（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｎ．およびＳａｎｏ，Ｈ．（２００１）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２４，１１７７−１１８９）。同定した３１個の遺伝子のうち、本発明者らは、カドミウム耐性を酵母細胞に付与する金属結合タンパク質推定されるタンパク質をコードする特定のクローンを見出した（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｎ．およびＳａｎｏ，Ｈ．（２００１）前出）。
【０１４０】
本明細書において、その産物ＣｄＩ１９を構造分析したことによって、ＣｄＩ１９が２つの金属結合モチーフＣＸＸＣ、およびカルボキシル末端にコンセンサスファルネシル化領域（イソプレニル化部位）を含むことが示された。本明細書において、本発明者らは、ＣｄＩ１９が、原形質膜に局在するメタロシャペロンとして機能すること、およびカドミウムに直接結合し、そして重金属ストレスの際に増加することの実質的な証拠を提供する。
【０１４１】
（好ましい実施形態の説明）
１つの局面において、本発明は、重金属を結合する領域およびファルネシル化領域を含む、ポリペプチドを提供する。従来、重金属を結合する領域を含むポリペプチドは知られていたが、ファルネシル化領域コンセンサス配列を含むものはあまり知られていない。また、そのファルネシル化領域が機能するポリペプチドはまったく知られていなかった。従って、本発明は、重金属を結合し、かつ、機能的なファルネシル化部位を含むポリペプチドとしてははじめてのポリペプチドを提供する。重金属を結合する能力は、本明細書において記載される技術または当該分野において周知であり、慣用される技術を用いて測定することができる。従って、本発明の好ましい実施形態において、そのような重金属を結合する能力は、モル比で約０．２以上、より好ましくは約０．５以上、さらにより好ましくは約０．８以上、もっとも好ましくは約０．９以上であり得る。
【０１４２】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、形質膜結合能を有する。形質膜結合能は、本明細書において記載される技術または当該分野において周知であり、慣用される技術をもちいて測定することができる。形質膜結合能は、形質膜への局在化を、例えば、ＧＦＰのような標識タンパク質との融合したものを発現させ、その標識を見ることによって観測することができる。従って、好ましい実施形態では、形質膜結合能を有するポリペプチドは、形質膜において、拡散による単純分布を超える分布を呈示する。好ましくは、形質膜と細胞内の形質膜以外の部分との分布比が約２：１以上のもの、より好ましくは、約５：１以上のもの、さらに好ましくは約１０：１以上のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、形質膜結合能を有するポリペプチドには、形質膜における存在が見られるポリペプチドもまた含まれ得る。
【０１４３】
本発明のポリペプチドにおいて、上記重金属を結合する領域は、少なくとも１つのＣＸＸＣを含み、ここでＣはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す。システイン残基の硫黄原子が重金属イオンと配位することによってこの領域は重金属への結合能を示す。このＣＸＸＣ配列は、好ましくはＭＸＣＸＸＣという配列であり得、ここでＭはメチオニンを表す。このＣＸＸＣ配列は、好ましくは、上記重金属を結合する領域において、少なくとも２つ含まれる。より好ましくは、上記重金属を結合する領域において、２つのＣＸＸＣ配列が含まれる。２つ以上のＣＸＸＣ配列を含むことにより、少なくとも４つの硫黄原子が金属イオンとの配位に利用され得、それにより、金属イオンとポリペプチドとの強固な結合を生じる。
【０１４４】
１つの好ましい実施形態において、この重金属を結合する領域は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列のうち、配列番号２の２５位〜８４位および１５５位〜２１５位に示す配列（好ましくは、３２位〜４０位および１６３位〜１７１位）と、少なくとも約７０％の、好ましくは約８０％の、より好ましくは約９０％の相同性を有する配列を含む。もっとも好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号２の２５位〜８４位および１５５位〜２１５位に示す配列（さらに好ましくは、３２位〜４０位および１６３位〜１７１位）の配列を含む。
【０１４５】
１つの実施形態において、上記ファルネシル化領域は、アミノ酸配列ＣａａＹを含み得る。ここで、Ｃはシステインであり、ａは脂肪族アミノ酸（天然のアミノ酸である場合、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）であり、ＹはＣ末端の任意のアミノ酸である。好ましくは、Ｙは、メチオニンであり得る。
【０１４６】
１つの好ましい実施形態において、この重金属を結合する領域は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列のうち、配列番号２の２５位〜８４位および１５５位〜２１５位に示す配列（好ましくは、３２位〜４０位および１６３位〜１７１位）と、少なくとも約７０％の、好ましくは約８０％の、より好ましくは約９０％の相同性を有する配列を含む。もっとも好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号２の２５位〜８４位および１５５位〜２１５位に示す配列（好ましくは、３２位〜４０位および１６３位〜１７１位）の配列を含む。
【０１４７】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、グリシンリッチ領域をさらに含む。
【０１４８】
別の実施形態において、ファルネシル化領域は、配列番号２の３８９位〜３９２位に示す配列とそれぞれ、少なくとも約７０％の、好ましくは約８０％の、より好ましくは約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、２５位〜８４位および１５５位〜２１５位に示す配列（好ましくは、３２位〜４０位および１６３位〜１７１位）およびに配列番号２の３８９位〜３９２位（ファルネシル化領域）を含む。
【０１５０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、以下のポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド。
【０１５１】
そのような配列としては、配列番号２０、２２に記載される配列が挙げられるがそれらに限定されない。また、ゲノムデータベース（例えば、イネゲノム、アラビドプシスゲノム、ヒトゲノムなどのデータベース）に対して、本発明のポリペプチドの配列のすべてまたは一部をもとに相同性検索を行って得られた相同配列であって、本発明のポリペプチドの生物学的活性（重金属を結合する活性、疎水性部分への結合能力などを含む）を有するものもまた、本発明の範囲内にあることが当業者には理解される。
【０１５２】
他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、天然のアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸アナログを含み得る。本発明のポリペプチドはまた、ペプチドアナログであり得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの配列に対して、同一性が少なくとも約７０％、より好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、さらにより好ましくは約９５％であるアミノ酸配列を有し得る。
【０１５３】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、生物学的活性として、重金属を結合する活性および形質膜に結合する能力を有する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、重金属を選択的に結合する。そのような選択的に結合される重金属は、生体にとって有害な重金属であり得る。
【０１５４】
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１５５】
好ましくは、本発明は、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【０１５６】
そのようなポリヌクレオチドの配列としては、配列番号１９、２１のような配列が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１５７】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチド７３位〜２５２位および４６３位〜６４５位（好ましくは、９４位〜１２０位および４８７位〜５１３位）と、少なくとも約７０％の、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは約９０％、さらに好ましくは約９５の相同性を有する配列を含む。別の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチド７３位〜２５２位および４６３位〜６４５位（好ましくは、９４位〜１２０位および４８７位〜５１３位）において、１または数個の置換、付加もしくは置換を、好ましくは保存的置換またはサイレント置換をコードする配列を含む配列を含み得る。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチドヌクレオチド７３位〜２５２位および４６３位〜６４５位（好ましくは、９４位〜１２０位および４８７位〜５１３位）を含む。
【０１５８】
別の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチド１１６５位〜１１７６位と、少なくとも約７０％の、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは約９０％、さらに好ましくは約９５の相同性を有する配列を含む。別の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチド１１６５位〜１１７６位において、１または数個の置換、付加もしくは置換を、好ましくは保存的置換またはサイレント置換をコードする配列を含む配列を含み得る。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチド１１６５位〜１１７６位を含む。
【０１５９】
より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチド７３位〜２５２位および４６３位〜６４５位（好ましくは、９４位〜１２０位および４８７位〜５１３位）およびヌクレオチド１１６５位〜１１７６位と、それぞれ少なくとも約７０％の、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは約９０％、さらに好ましくは約９５の相同性を有する配列を含む。別の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチド１１６５位〜１１７６位において、それぞれ１または数個の置換、付加もしくは置換を、好ましくは保存的置換またはサイレント置換をコードする配列を含む配列を含み得る。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチドヌクレオチド７３位〜２５２位および４６３位〜６４５位（好ましくは、９４位〜１２０位および４８７位〜５１３位）およびヌクレオチド１１６５位〜１１７６位を含む。
【０１６０】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする配列のアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドであり得る。アンチセンス配列を含むことにより、そのようなポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの発現を低減させることができる。
【０１６１】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオチドのアナログを含み得る。ヌクレオチドアナログを含むそのようなポリヌクレオチドは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドへと翻訳され得るが、翻訳されなくてもよい。
【０１６２】
別の局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。そのようなベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含むことができるものであれば、どのようなポリヌクレオチドでもよい。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体など、好ましくは植物の宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能なベクターあるいは一過性のベクターが挙げられる。そのようなベクターとしては、発現ベクター、組換えベクターまたはクローニングベクターが挙げられる。好ましくは、そのようなベクターは発現ベクターであり得る。そのようなベクターは、プロモーターを含み得る。プロモーターとしては、宿主細胞において、プロモーター活性を有するか、または転写誘導活性を有するように誘導され得るものであれば、どのようなものでも使用可能である。そのようなプロモーターは、構成的に誘導性であるものも、特異的に誘導性であるものでもよい。そのような特異性は、部位（組織）（例えば、葉、根、果実など）特異的なものであっても、時期特異的なものであってもよい。あるいは、そのような特異性は、ストレス特異的（例えば、ある薬剤に対する特異性など）なものであってもよい。
【０１６３】
本発明のベクターはまた、エンハンサーなどの他の転写調節エレメントおよび／または翻訳調節エレメント、および／または翻訳後調節エレメントを含み得る。これらプロモーターなどの転写、翻訳および翻訳後の調節エレメントは、ベクター中で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結されるように配置される。
【０１６４】
本発明のベクター中に本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを導入する方法は、当該分野において周知慣用の技術を用いて過度の実験を要することなく、当業者が実施することができる。そのような周知慣用技術（例えば、分子生物学の技術、微生物学技術など）は、本明細書において記載されているか、または本明細書において参考として援用される文献において記載されている。また、そのような技術の例示は、本明細書の実施例において記載されているが、そのような技術は、周知慣用技術の例示であり、本発明において用いられる方法は、そのような技術に限定されると解釈されるべきではない。
【０１６５】
別の局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞を提供する。そのような細胞は、そのポリヌクレオチドまたはベクターが機能するような形態でそのポリヌクレオチドまたはベクターを含む。従って、そのポリヌクレオチドまたはベクターが機能する限り、そのベクターは、細胞中で、染色体とは別個に存在してもよく、染色体内に組み込まれていてもよい。
【０１６６】
本明細書において、本発明の細胞に本発明のベクターまたはベクターを導入する技術は、当該分野において周知慣用されており、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターが所望の細胞（例えば、植物細胞）に導入される限り、どのような技術でも使用され得る。そのような技術としては、トランスフェクション、形質導入、アグロバクテリウムを利用した形質転換、エレクトロポレーション、直接導入、パーティクルガン、ＰＥＧ法などが挙げられる。そのような周知慣用技術（例えば、分子生物学の技術、微生物学技術など）は、本明細書において記載されているか、または本明細書において参考として援用される文献において記載されている。また、そのような技術の例示は、本明細書の実施例において記載されているが、そのような技術は、周知慣用技術の例示であり、本発明において用いられる方法は、そのような技術に限定されると解釈されるべきではない。
【０１６７】
本発明の細胞が、所望のベクターまたはポリヌクレオチドを有するかどうかは、本明細書において記載されるかまたは周知慣用される技術（例えば、ノーザンブロット法またはウェスタンブロット法）を用いて確認することができる。具体的には、例えば、そのような細胞から、当該分野において周知の技術を用いてｍＲＮＡまたはタンパク質を抽出し、そのｍＲＮＡまたはタンパク質に対してそれぞれ特異的なオリゴヌクレオチドまたは抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）との反応を検出することによって、所望のベクターまたはポリヌクレオチドがその細胞に入ったかどうかが確認され得る。
【０１６８】
本発明の細胞は、本発明のポリペプチドを発現することができるものであれば、どのような細胞でもよい。好ましくは、本発明の細胞は植物細胞である。より好ましくは、そのような植物細胞は、重金属への暴露後に回収可能な細胞であり得る。そのような植物細胞としては、ポプラ、ユーカリ、シダ植物が挙げられる。好ましくは、本発明の細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質されたものであり得る。
【０１６９】
別の局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む組織（または生体の部分、部位など）を提供する。本明細書では、植物の組織が好ましい。そのような植物の組織としては、例えば、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実などからの組織が挙げられるがそれらに限定されない。好ましい植物組織の起源としては、根、種子、葉、果実などが挙げられる。根、種子、葉、果実などであれば、本発明のポリペプチドが重金属を結合し、その後に形質膜に結合した後、回収することが容易であるからである。従って、結合後の回収が容易である組織であれば、どのような組織でも使用され得る。好ましくは、本発明の組織は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質されたものであり得る。本発明の組織は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで一過的に形質転換されていても恒常的に形質転換されていてもよい。そのような形質転換によって導入された本発明のポリヌクレオチドは、構成的にまたは特異的に発現され得る。
【０１７０】
他の局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む器官（または臓器）を提供する。本明細書では、植物の器官が好ましい。そのような植物の器官としては、例えば、カルス、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましい植物器官としては、根、種子、葉、果実などが挙げられる。本発明のポリペプチドが重金属を結合し、その後に形質膜に結合した後、回収することが容易であるからである。従って、結合後の回収が容易である器官であれば、どのような器官でも使用され得る。
【０１７１】
他の好ましい局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む生物を提供する。そのような生物は、本明細書においてトランスジェニック生物ともいう。好ましくは、そのような生物は、植物である。好ましい植物としては、アブラナ科、コーヒー科、ポプラ、ユーカリ、シダ植物の植物が挙げられる。好ましくは、本発明の植物は、木本植物（例えば、ポプラ）であり得る。
【０１７２】
そのような植物は、本明細書においてトランスジェニック植物ともいい、本発明の植物細胞または組織から当該分野において周知の技術を用いて再分化（再生）させることによって得ることができる。
【０１７３】
一旦所望のポリヌクレオチド（例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはベクター）で形質転換された細胞（例えば、植物細胞）が得られたなら、一定の割合以上でそのような形質転換細胞から所望のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック生物（例えば、植物）が得られることは、当該分野において周知である。従って、形質転換することができる生物の細胞が利用可能な生物であれば、どのような生物でも本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含むトランスジェニック生物を生産することができる。
【０１７４】
そのようなトランスジェニック生物を作製する方法は、当該分野において周知である。本発明の生物が植物である場合、トランスジェニック植物は、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換された細胞を増殖させ、組織または器官とし、それを再分化させることによって植物体とすることができる。そのような組織または器官は、どのようなものでもよく、例えば、カルス、根、茎などが挙げられるがそれらに限定されない。植物はどのような器官であっても、基本的に全能性を有していることから、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む器官または組織であれば、どのような組織または器官であっても植物体の再分化に利用することができる。本発明が木本植物の場合、当該分野において慣用されるプロトコルを利用してトランスジェニック植物を作出することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｗｏｏｄｙ　Ｐｌａｎｔｓ（Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ）　（ｅｄ．Ｓ．Ｍｏｈａｎ　Ｊａｉｎ，ＳｕｂｈａｓｈＣ．Ｍｉｎｏｃｈａ）、Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２０００）。
【０１７５】
このようなトランスジェニック生物は、重金属（例えば、有害重金属（特に、ヒトに対して有害である重金属（例えば、カドミウム、水銀、鉛などが含まれるがそれらに限定されない））を環境（陸、川、湖、海、住環境などが挙げられるがそれに限定されない）から除去するために使用することができる。従って、そのような場合、重金属を結合した後に、結合した生物体（例えば、植物体）を収集することが容易で、かつ、処理することが容易なものが好ましい。そのような植物としては、例えば、ポプラ、ユーカリ、シダ植物が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１７６】
重金属を結合した後の生物の処理は、好ましくは、環境から隔離された閉鎖空間にその生物を隔離し、重金属を濃縮したり、無毒化したりすることによって環境に再循環されないようにすることによって行うことができる。
【０１７７】
１つの好ましい局面において、本発明は、有害重金属を環境から除去するためのトランスジェニック植物を提供する。このトランスジェニック植物は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む。従って、このようなトランスジェニック植物は、本発明のポリペプチドを発現する。好ましくは、そのようなポリペプチドの発現は、所望の時期または組織（または細胞、器官など）において行わせることができる。そのような詳細な制御の方法は、本明細書において詳述されており、例えば、時期または組織特異的なプロモーターを用いて遺伝子操作することにより達成され得る。そのような技術は、当該分野において周知慣用されている。
【０１７８】
そのようなトランスジェニック植物を利用することができる場所としては、重金属の除去が必要とされる土地または海底であればどのような土地または海底でもよく、例えば、工場跡地、工場排水が流れた後の土地または海底などが挙げられるがそれらに限定されない。所望の土地に本発明のトランスジェニック植物を重金属を結合するに十分な期間（例えば、数日間、数週間、数カ月から数年間）栽培した後、その植物を回収し、焼却するなどして、重金属を回収することができる。トランスジェニック植物の除去後の土地または海底などに含まれる重金属の濃度または含量は、一般に、顕著に減少している。そのような減少は、当該分野において慣用される土質調査または水質検査を行うことによって確認することができる。
【０１７９】
好ましくは、このようなトランスジェニック植物は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターに加え、生長を促進するポリペプチド（例えば、植物生長ホルモン、そのホルモンの分泌を促進するタンパク質またはそのようなホルモン（例えば、ジベレリン、２，４−Ｄなど）を合成するタンパク質など）、特殊な環境（例えば、乾燥、高湿など）での生存に適合させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。そのようなさらなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドと同じ調節エレメント（例えば、プロモーター）の制御下にあっても、別個の調節エレメントの制御下にあってもよい。そのようなさらなるポリヌクレオチドは、本発明のトランスジェニック植物中に１つまたは複数含まれ得る。
【０１８０】
別の好ましい局面において、本発明は、重金属を濃縮採取するためのトランスジェニック植物を提供する。このトランスジェニック植物は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む。従って、このようなトランスジェニック植物は、本発明のポリペプチドを発現する。好ましくは、そのようなポリペプチドの発現は、所望の時期または組織（または細胞、器官など）において行わせることができる。そのような詳細な制御の方法は、本明細書において詳述されており、例えば、時期または組織特異的なプロモーターを用いて遺伝子操作することにより達成され得る。そのような技術は、当該分野において周知慣用されている。
【０１８１】
そのようなトランスジェニック植物を利用することができる環境としては、目的とする希少重金属を含むことが予測される環境であればどのような環境（例えば、土地または海底）でもよい。そのような環境としては、例えば、鉱山または鉱山跡地、あるいは工場跡地などが挙げられるがそれらに限定されない。所望の土地に本発明のトランスジェニック植物を重金属を結合するに十分な期間（例えば、数日間、数週間、数カ月から数年間）栽培した後、その植物を回収し、焼却するなどして、希少重金属を回収し、その後目的の用途に利用することができる。そのような希少重金属としては、例えば、金、銀、ウラン、レアメタルのうち重金属（スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、ニッケル、ガリウム、ゲルマニウム、セレン、ルビジウム、ストロンチウム、イッテリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、アンチモン、テルル、セシウム、バリウム、ランタノイド（例えば、ランタンなど）、ハフニウム、タリウム、タングステン、レニウム、白金、タンタル、ビスマスなど）が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１８２】
本発明のポリペプチドは、ある特定の重金属に対して選択性を有するように改変させることができる。そのような改変方法は、本明細書に記載されるかまたは当該分野において周知である。そのような改変方法によって得られたポリペプチドがどの重金属を結合するかは、本明細書において記載される方法において特定の金属を確認すべき重金属に置き換えることによって確認することができる。
【０１８３】
別の局面において、本発明は、本発明のトランスジェニック植物を利用した、環境から重金属（例えば、有害重金属）を除去する方法および重金属を濃縮採取する方法を提供する。
【０１８４】
本発明の環境から重金属を除去する方法は、本発明のトランスジェニック植物を提供する工程、そのトランスジェニック植物を栽培する工程、およびそのトランスジェニック植物を収集する工程を包含する。好ましくは、この方法は、収集されたトランスジェニック植物をさらに処理（例えば、焼却）する工程をさらに包含する。そのような収集は、環境から隔離された空間において行うことができる。
【０１８５】
本発明の希少重金属を濃縮採取する方法は、本発明のトランスジェニック植物を提供する工程、そのトランスジェニック植物を栽培する工程、およびそのトランスジェニック植物を収集する工程を包含する。好ましくは、この方法は、収集されたトランスジェニック植物をさらに処理（例えば、焼却、濃縮）する工程をさらに包含する。そのように濃縮採取された希少重金属は、当該分野において周知の精錬技術を用いて精錬することができる。
【０１８６】
別の局面において、本発明は、重金属結合システムを提供する。このシステムは、１）本発明のポリペプチド；および２）支持体、を備える。ある実施形態において、このシステムは、有害重金属を環境から除去するために使用される。別の実施形態において、このシステムは、重金属を濃縮採取するために使用される。好ましくは、本発明のシステムにおいて使用される支持体は、固体支持体である。別の実施形態では、この支持体は、膜または球状であり得る。そのようなシステムは、重金属結合膜として製造することができる。そのような重金属結合膜は、流体（液体または気体）に配置することによって、重金属（例えば、重金属）を除去するシステムを構成するために使用することができる。別の実施形態では、上記支持体には、本発明のトランスジェニック生物または形質転換細胞が付着されていてもよい。本発明のトランスジェニック生物が付着した支持体は、非生物を支持体として用いたときと同様に有害重金属を環境から除去するためまたは重金属を濃縮採取するために使用され得る。
【０１８７】
好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック植物は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのほか、メタロシャペロン（例えば、メタロチオネイン、ファイトケラチンなど）をコードするポリヌクレオチドまたはメタロシャペロンの生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。別の好ましい実施形態では、本発明のトランスジェニック植物は、液胞表面上のＡＢＣトランスポーター、金属吸収能を高めるトランスポーター（細胞外から細胞内に取り込む機能をもつ）（例えば、ＩＲＴ１、ＺＩＰ１などの金属トランスポータータンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明のトランスジェニック植物は、液胞を増大させるように改変され得る。
【０１８８】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【０１８９】
【実施例】
（実施例１：ＣｄＩ１９のクローニングおよび配列決定）
（材料および方法）
本発明のポリペプチドを単離するために、まず、ＣｄＩ１９の３７０−ｂｐ　ｃＤＮＡフラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲ　ＦＤＤ（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎら（２００１）　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２４，１１７７−１１８９）によって単離し、５’および３’配列それぞれを、製造業者の指示に従って（Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）５’および３’ＲＡＣＥ法を使用して単離した。二本鎖ｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマー５’−ＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣ−３’（配列番号９）および５’−ＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＧＣ−３’（配列番号１０）を用いてＰＣＲによって増幅し、ｐＴ７ブルークローニングベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中にサブクローニングした。ヌクレオチド配列を、自動配列決定装置（Ｍｏｄｅｌ　３１０，ＡＢＩ）を用いて、ジデオキシチェーンターミネーション法（Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｋｉｔ，ＡＢＩ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって決定し、Ｇｅｎｅ　Ｗｏｒｋｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　（Ｉｎｔｅｌｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＡ，ＵＳＡ），を使用して予測されるアミノ酸配列を分析し、そしてＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）を用いて、比較した。
【０１９０】
（ＣｄＩ１９は、２つのＣＸＸＣモチーフ、およびファルネシル化部位を有する新規のタンパク質をコードする遺伝子である）
最初に５’および３’ＲＡＣＥ　ＰＣＲ産物の配列を結合することによって、ＣｄＩ１９の１．７ｋｂの全長ｃＤＮＡ（配列番号１）を得た。推定ＯＲＦは、推定分子量４２．２ｋＤおよび等電点９．１６を有する３９２アミノ酸残基長のポリペプチド（配列番号２）をコードする。このＯＲＦは、２セットの重金属結合モチーフＣＸＸＣ（Ｐｕｆａｈｉ，Ｒ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｃ．，Ｐｅａｒｉｓｏ，Ｋ．Ｌ．，Ｌｉｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｐ．，Ｆａｈｒｎｉ，Ｃ．，Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．Ｃ．，Ｐｅｎｎｅｒ−Ｈａｈｎ，Ｊ．Ｅ．およびＯ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｔ．Ｖ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，８５３−８５６）およびＣ末端にファルネシル化（イソプレニル化）モチーフ（Ｄｙｋｅｍａ，Ｐ．Ｅ．，Ｓｉｐｅｓ，Ｐ．Ｒ．，Ｂｒｅｎｄａ，Ａ．Ｍ．，Ｂｉｅｒｍａｎｎ，Ｊ．，Ｃｒｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｎ．およびＲａｎｄａｌｌ，Ｓ．Ｋ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１，１３９−１５０）を含む（図１ａ）。このタンパク質は非常に疎水的であり、そして重金属結合領域およびファルネシルモチーフとの間に、グリシンに富む可撓性領域を有する。２つの重金属結合領域が、ＳＳＴｈｒｅａｄプログラム（Ｉｔｏ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｏ，Ｙ．およびＮｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．（１９９７）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３，４１５−４２３）を用いて、βαββαβ二次構造をとることが見出された。データベースのホモロジーサーチによって、ＣｄＩ１９がアラビドプシスのＡＴＦＰ３と類似する推定タンパク質（ＩＤ；ＣＡＢ８３２９５．１）と同一であることが示された。ＣｄＩ１９は、金属結合領域、ファルネシル化モチーフ、またはその両方について、他のタンパク質との部分的類似性を示す（図１ｂ）。しかし、配列サーチは、ＣｄＩ１９がアラビドプシス中に単一コピーとして存在することを示唆した。
【０１９１】
（実施例２：ＣｄＩ１９改変体の調製）
（領域特異的変異誘発）
ＣｄＩ１９の領域特異的変異誘発を、Ｔａｋａｒａ　ＬＡ　ＰＣＲＴＭ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ，京都、日本）を使用して、ｐＴ７ブルークローニングベクター中で行った。クローンを含むＤＮＡフラグメントを、直接配列決定することによって同定し、適切な制限酵素で消化し、そしてｐＢＩ１２１　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）　ｏｒ　ｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＮＪ，ＵＳＡ）　プラスミド中に連結した。ファルネシル化領域におけるシステイン３８９位をグリシンに変異したものを配列番号３および４に示す。金属結合部位におけるＣＸＸＣのすべてのシステインをグリシンに変異したものを配列番号５および６に示す。機能的に等価な置換を配列番号１９〜２２に示す。
【０１９２】
（グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質）
ＣｄＩ１９　ｃＤＮＡの６７５ｂｐ（１〜６７５）フラグメントを、その５’末端にＥｃｏＲＩ領域またはＸｈｏＩ領域を有するプライマー：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＣ−３’（配列番号１１）および５’−ＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＣＧＧＡＡ−３’（配列番号１２）を用いてＰＣＲによって調製した。増幅したフラグメントをｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ領域にクローニングし、そして生じたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α中に形質転換した。１ｍＭ　ＩＰＴＧを用いる４時間の誘導後、タンパク質を、製造業者の指示に従って（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、グルタチオンセファロース４Ｂを用いてバッチ精製した。グルタチオンセファロースに結合したＧＳＴ融合タンパク質（野生型は配列番号２７（核酸）および２８（アミノ酸）、変異型は配列番号２９（核酸）および３０（アミノ酸））を、トロンビンプロテアーゼを用いて２４時間２２℃でインキュベーションすることによって切断した。細菌培養物１ｌあたり、約１〜２ｍｇの純粋なＣｄＩ１９タンパク質を得た。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準とするブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）　によって決定した。
【０１９３】
（実施例３：細胞内局在）
（材料および方法）
ＣａＭＶ３５Ｓ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ３’（Ｃｈｉｕ，Ｗ．ら、（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６，３２５−３３０）から、ＰＣＲによって、ＸｂａＩ領域またはＸｈｏＩ領域を含むｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）フラグメントを調製した。その５’末端にそれぞれＸｈｏＩ領域およびＳａｃＩ領域を有する適切な正方向および逆方向プライマーを、ＰＣＲのために設計し、ＣｄＩ１９　ｃＤＮＡを増幅した。ｐＴ７ブルーベクター中にサブクローニングした後、サブクローニングしたフラグメントを対応する制限酵素を用いて消化し、そしてｐＢＩ１２１ベクターのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域に一定の方向で、挿入した。この結果生じる構築物を、それぞれｐＧＦＰ−ＣｄＩ１９Ｗ（配列番号２３（核酸）および２４（アミノ酸））およびｐＧＦＰ−ＣｄＩ１９Ｍ（配列番号２５（核酸）および２６（アミノ酸））と称する。これらのベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｃ５８）中に形質転換した。４日間ＬＳ培地（ＭＳ培地用混合塩類（１Ｌ分）、２００ｍｇ　ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍｇミオイノシトール、１ｍｇチアミンＨＣｌ、０．２ｍｇ　２，４−Ｄおよび３０ｇスクロース、１Ｌの蒸留水に溶かした後、ｐＨを５．８にあわせる）中で培養したＢＹ２細胞懸濁液のアリコートを、ＬＳ培地のプレート（ＬＳ培地のプレートは、このＬＳ培地に１％アガロースを加えて固めたものである）上に配置し、０．１　ｍｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物（ＯＤ６００，１．０）と混合し、２日間インキュベートした。３回洗浄し、そして、１ｍｌの新鮮なＬＳ培地に懸濁した。その後、細胞を、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む固形ＬＳ培地にプレーティングし、３週間インキュベートした。生長するカルスを、２７℃暗所にて維持し、その後の実験に使用した。ＧＦＰ融合タンパク質の局在を、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ　５１０，Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ、東京）を用いて直接的に観察した。Ｚｅｉｓｓ　Ｐｌａｎ−ＮＥＯＦＬＵＡＲレンズ１０×／０．３、２０×／０．３、４０×／０．３を用いてサンプルをスキャンし、画像化して、１０μｍの深度で収集した。
【０１９４】
（ＣｄＩ１９は、そのファルネシルモチーフによって、形質膜に局在化する）ファルネシル化は、疎水性のイソプレノイドの翻訳後の付着である。ファルネシル化は、しばしば、アンカーとして機能し、タンパク質を膜に固定化する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ，Ｍ．，Ｔｏｌｅｄｏ−Ｏｒｔｉｚ，Ｇ．，Ｙａｌｏｖｓｋｙ，Ｓ．，Ｃａｌｄｅｌａｒｉ，Ｄ．およびＧｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．（２０００）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．２４，７７５−７８４）。ＣｄＩ１９の細胞内局在を決定するために、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって駆動されるＧＦＰ−ＣｄＩ１９融合ベクター（ｐＧＦＰ−ＣｄＩ１９Ｗ）を構築して、ＢＹ２細胞に形質転換した（図２）。コントロールとして、ＧＦＰのみを発現するトランスジェニックＢＹ２細胞を使用した。レーザースキャン顕微鏡によって観察した場合、ＧＦＰのみを発現する細胞において、液胞以外の細胞質全体が、拡散して標識された（図２ｂ）。対照的に、ＧＦＰ−ＣｄＩ１９ＷのＧＦＰ蛍光は、形質膜のみにおいて見ることができた（図２ｂ）。ファルネシル化モチーフがこの原因であることを確認するために、Ｃｙｓ３８９残基を、Ｇｌｙに置換した変異ベクター（ＧＦＰ−ＣｄＩ１９Ｍ）を構築した（この分子の核酸配列を配列番号３として、アミノ酸配列を配列番号４として示す）。このベクターによって形質転換された細胞は、コントロールと実質的に同一の蛍光イメージを示した（図２ｂ）。従って、この結果は、そのファルネシルモチーフによって、形質膜に局在化することが明確に示された。Ｄｙｋｅｍａ　Ｐ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．は、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１，１３９−１５０において、重金属結合をする部位と、ファルネシル化領域に類似する部位とを有するポリペプチドを報告したが、このタンパク質は、可溶性であり細胞質に存在することが報告された。このように、重金属を結合するポリペプチドが形質膜に局在化する（すなわち、ファルネシル化領域本来の性質を発揮する）ということは従来報告されていなかったことであり、このことにより、本発明は、従来予想外の顕著な効果を提供する。
【０１９５】
（実施例４：ＣｄＩ１９の金属結合能）
（円偏光二色性測定）
ＣｄＩ１９アポタンパク質を、連続する攪拌のもとで、４℃での段階的な透析によって調製した。１０ｍＭのＥＤＴＡおよび飽和尿素を含有する３ｍｌの組換えタンパク質溶液を、最初に２時間、１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび４Ｍ尿素を含有する２００ｍｌの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して透析した。次に、溶液を、２Ｍ尿素を含む同一の緩衝液および尿素を含まない同一の緩衝液に対して、連続的に各２時間透析した。サンプルを、最後に、１ｍＭのＤＴＴを含む５００ｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．０）に対して、１２時間透析し、回収されたタンパク質を、２５＆＃６１６１６；Ｃで、Ｊａｓｃｏ分光偏光計（Ｊ−７２０Ｗ）において１ｍｍの石英セルを使用する円偏光二色性（ＣＤ）測定に供した。
【０１９６】
（ＣｄＩ１９は、そのＣＸＸＣモチーフとの相互作用によって、金属種に選択的に結合し得る）
ＣｄＩ１９の金属結合能力を試験するために、２つの金属結合領域を含む２２５アミノ酸のＮ末端フラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、ＧＳＴとの融合タンパク質とした発現した。２つの構築物を調製した：通常のＣＸＸＣモチーフを有する野生型（ＧＳＴ−ＣｄＩ１９Ｗ）（配列番号２５（核酸）および配列番号２６（アミノ酸））、およびＧＸＸＧ（ＧＳＴ−ＣｄＩ１９Ｍ）モチーフを有する変異体（図３ａ；ＣｄＩ１９部分の核酸配列は配列番号５であり、アミノ酸配列は配列番号６に示され；融合タンパク質をコードする配列は配列番号２５でありアミノ酸配列は配列番号２６に示される）。精製後、生じたタンパク質を、２５℃でのＵＶ−ＣＤスペクトルを試験することによって、金属結合についてモニターした。カドミウムの添加の際に、ΔＣｄＩ１９Ｗのスペクトルが、大きく変化した。このことは、複合体形成を示す（図３ｂ）。対照的に、そのようなスペクトルの変化は、ΔＣｄＩ１９Ｍでは、ほとんど見られなかった（図３ｃ）。このことは、ＣＸＸＣモチーフが、金属結合の原因であることを示す。同様のスペクトルパターンが、ＣｕおよびＨｇイオンにおいてもまた、観察された（図４ｃ、ｄ、ｅ）ＣｄＩ１９が、そのＣＸＸＣモチーフとの相互作用によって、金属種に選択的に結合し得ると、結論づけられた。
【０１９７】
（実施例４．ＣｄＩ１９の発現およびその調節）
（組織化学的分析）
ＣｄＩ１９遺伝子のプロモーター領域を得るために、コード領域のすぐ上流の１ｋｂフラグメントを、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ品種）のゲノムＤＮＡから、プライマー：５’−ＧＣＡＴＧＣＡＡＣＴＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＧＣＧＧ−３’（配列番号１３）および５’−ＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣ−３’（配列番号１４）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。生じたフラグメントを、ＸｂａＩ領域およびＨｉｎｄＩＩＩ領域でｐＢＩ１２１にクローニングし、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｃ５８）中に移入した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ品種）の形質転換を、浸潤法（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、１９９８）によって、２００ｍｌのＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ懸濁液中で行い、そして形質転換体を、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む固体１／２　ＭＳ培地プレートで選択した。生じた植物を、１ｍＭ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−グルクロン酸（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を基質として使用して、ＧＵＳ活性についてアッセイした。金属処理を、３７℃で、４時間５００μＭ　ＣｄＣｌ２を用いて４時間、その後、０．５ｍＭ　Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．５ｍＭ　Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、０．３％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００および１．９ｍＭ　Ｘ−Ｇｌｕｃを用いて１２時間行った。７０％エタノール中で洗浄することによって反応を終了し、そしてクロロフィルを、１００％エタノール中でインキュベーションすることによって除去した。３つのトランスジェニック株を、独立して、アッセイに使用し、そして各々の場合に、同様の結果を得た。
【０１９８】
（ＲＮＡブロットハイブリダイゼーション）
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ品種）の種子の表面を、７０％エタノール中で１０分間インキュベートし、そして０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する５％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム（活性な塩素８．５−１３．５％、Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）中で２０分間インキュベーションすることによって滅菌した。蒸留水での３回の洗浄の後、種子を、温室中で２３℃一定の光のもとで、１０ｇ／ｌのスクロースを補充した１０ｍｌの１／２強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地中で培養した（１０〜１５種子／容器）。培地に浮かぶ２週齢の植物を、ＦｅＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＨｇＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２またはＣａＣｌ２を含む０．１Ｍ溶液５０μｌの添加によって、金属処理に供した。４時間のインキュベーションの後、サンプルを、収集して、総ＲＮＡを酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法（ＡＧＣＴ）（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎら（２００１）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２４，１１７７−１１８９）によって単離した。総ＲＮＡ（２０μｇ）を、２．２Ｍ　ホルムアルデヒドおよび１×ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）緩衝液を含む１．２％アガロースゲルでサイズ分画し、キャピラリーブロッティング法によって、２０×ＳＳＣ中のナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーした。ＵＶでの照射による架橋後、ハイブリダイゼーションを、４２℃で１６時間、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％　ＳＤＳ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１×デンハルト溶液、３×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストランを含む溶液中で、ゆるやかに振盪して、行った。全長ｃＤＮＡプローブを、Ｍ１３／ＲＶプライマーの対を用いるＰＣＲによって、ｐＴ７ブルー−ＣｄＩ１９ベクターから調製し、ランダムプライミングキット（ＢｃａＢＥＳＴ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ、タカラ酒造）を用いて、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いて標識した。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中で６２℃で洗浄して、最初に、バイオイメージ分析（ｂｉｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＡＳ−２５００，フジフィルム、東京）に供して、次にＸ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行った。
【０１９９】
（転写物の蓄積）
カドミウムは、ＣｄＩ１９転写物を誘導することが示されたので、本発明者らは、他の金属（ＣｄＩ１９に結合する金属種を含む）を、転写誘導に対するその効果について試験した。ノーザンハイブリダイゼーションアッセイによって、ＣｄＩ１９転写物が、カドミウム処理の１時間以内に効率的に誘導されることが明らかとなった（図５ａ）。このことは、本発明者らの以前の観察と一致する（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｎ．およびＳａｎｏ，Ｈ．（２００１）Ｐｌａｎｔ　ＣｅｌｌおよびＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２４，１１７７−１１８９）。使用した実験条件では、転写誘導は、Ｈｇ、Ｆｅ、およびＣｕでの処理においてもまた明らかであったが、ＭｎおよびＣｏでの処理では、明らかでなかった。
【０２００】
（組織特異的発現）
ＣｄＩ１９プロモーター：：ＧＵＳ融合構築物を発現するトランスジェニックアラビドプシス植物を生成し、ＣｄＩ１９の組織特異的局在化について試験した。ＧＵＳ活性を、アッセイの４時間前に５００μＭのカドミウムを用いて処理した、１週齢および１月齢の形質転換体において分析した。未処理のコントロール植物において、低ＧＵＳ活性が、胚軸のみにおいて検出された（データ示さず）。一方、カドミウム処理した植物において、強力なＧＵＳ活性が、葉柄、胚軸、花柄、維管束および根の分裂組織において観察された（図６）。１週齢の胚軸は、特に顕著なＧＵＳ反応を示した（図６ｈ）。
【０２０１】
（実施例５：ＣｄＩ１９を過剰発現するトランスジェニック植物）
（材料および方法）
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ品種）の形質転換に使用したベクターを、バイナリーベクターであるｐＢＩ２１中にセンス方向で、ＸｂａＩおよびＳａｃＩ領域中にクローニングしたＣｄＩ１９の全長ｃＤＮＡを用いて構築した。５’末端にそれぞれＸｂａＩおよびＳａｃＩ領域を含む、適切な正方向および逆方向プライマーをＰＣＲのために設計し、ＣｄＩ１９のｃＤＮＡを増幅した。ｐＴ７ブルーベクターへのサブクローニング後、生じたフラグメントを、対応する制限酵素で消化し、ｐＢＩ１２１ベクターに、方向を決めて挿入した。この構築したベクターを、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｃ５８）中に形質転換した。形質転換および形質転換植物の選択を、ＣｄＩ１９プロモーター：：ＧＵＳを用いたアラビドプシスの形質転換について記載される方法と同一の方法によって行った（Ｃｌｏｕｇｈ，ＳＪ．，ｅｔ　ａｌ．、（１９９８）、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１６：７３５−７４３）。
【０２０２】
（双子葉植物の形質転換および形質転換植物の選択）
導入したい遺伝子を有するアグロバクテリウムを培養し、培養液に開花直前のシロイヌナズナを数分間浸す。その後、ラップなどで植物体をくるみ、１−２日間、暗所に保管する。明所に戻し、通常の方法で栽培し、種を収穫する。得られた種は、抗生物質のカナマイシンを含む１／２ＭＳ寒天培地上にまき、抗生物質体制を持つ株のみを選抜する。
【０２０３】
（単子葉植物の形質転換および形質転換植物の選択）
アグロバクテリウムを用いる単子葉植物の形質転換方法は、例えば、ＨｉｅｉＹ．，ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．６；２７１−２８２（１９９４）、特許公報第３１４１０８４号、および特許公報第２６４９２８７号に記載されるように周知である。
【０２０４】
（Ａ）特許公報第３１４１０８４号に記載される方法に従って、以下のように形質転換および形質転換植物の選択を行う：
（１：種子の前処理）
イネの種子（例えば、代表的品種である日本晴）を、籾殻の除去後、無傷の状態で、２．５％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）溶液中で殺菌した。水での十分な洗浄の後、イネを以下の無菌操作に供する。
【０２０５】
（２：前培養）
種子を、２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌプロリン、２ｍｇ／ｌ　２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）に播種し、５日間、２７℃〜３２℃で保温する。この間に種子は発芽する。
【０２０６】
（３：アグロバクテリウム感染）
形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液に、前培養した上記種子を浸漬した後、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０ｇ／ｌスクロース、１０ｇ／ｌグルコース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ　２，４−Ｄ、１０ｍｇ／ｌ　アセトシリンゴン、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．２）に移植した。暗黒下で３日間、２８℃で保温して共存培養する。
【０２０７】
（４：除菌および選抜）
共存培養の完了後、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を用いて、種子から、アグロバクテリウムを洗い流す。次いで、形質転換された種子の選抜を、以下の条件で行う。
【０２０８】
第１回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に、種子を置き、７日間、２７℃〜３２℃で保温する。
【０２０９】
第２回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、２〜４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に、種子を置き、さらに７日間、２７℃〜３２℃で保温する。
【０２１０】
（５：再分化）
選抜された形質転換種子を、以下の条件で再分化させる。
【０２１１】
第１回目の再分化：再分化培地（カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充したＭＳ培地（３０ｇ／ｌスクロース、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌカイネチン、０．００２ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）上に、選抜した種子を置き、２週間、２７℃〜３２℃で保温する。
【０２１２】
第２回目の再分化：第１回目の再分化において使用したのと同じ再分化培地を使用して、さらに２週間、２７℃〜３２℃で保温する。
【０２１３】
（６：鉢上げ）
再分化した形質転換体を、発根培地（ハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、ホルモンを含まないＭＳ培地）上に移して、根の発育を確認した後に、鉢上げする。
【０２１４】
（Ｂ）あるいは、特許公報第２６４９２８７号に記載される方法に従って、以下のように形質転換および形質転換植物の選択を行う：
（１：形質転換する培養組織の調製）
イネの完熟種子を７０％エタノールに１分間、１％次亜塩素酸ナトリウムに３０分間浸漬することによって消毒した後、２Ｎ６固体培地（Ｎ６の無機塩類及びビタミン類（Ｃｈｕ　Ｃ．Ｃ．１９７８；Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ　Ｐｅｋｉｎｇ，ｐｐ．４３−５０）、１ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ　２，４−Ｄ、３０ｇ／ｌショ糖、２ｇ／ｌゲルライト）に置床する。完熟種子を約３週間培養後、形成された胚盤由来のカルスを２Ｎ６培地に移植し、４〜７日経過したカルスを胚盤カルスとして用いる。
【０２１５】
（２：奇主アグロバクテリウム）
Ｔ−ＤＮＡ領域を削除した菌系、ＬＢＡ４４０４とＥＨＡ１０１とを寄主細菌として使用した。ＬＢＡ４４０４はヘルパープラスミド（ｖｉｒ領域を完全な形で持つ）ＰＡＬ４４０４を有する菌系であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｔｉｏｎより入手可能である（ＡＴＣＣ　３７３４９）。ＥＨＡ１０１はヘルパープラスミドのｖｉｒ領域が強病原性アグロバクテリウムＡ２８１由来であり、Ｈｏｏｄ　Ｅ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．１９８６から入手可能である。種々の周知のバイナリーベクターをこれら２種類のアグロバクテリウムに導入し、以下の菌系を遺伝子導入用として用いる。これらのプラスミドをアグロバクテリウムに導入する方法は細菌の三系交雑手法（ＤｉｔｔａＧ．ｅｔａｌ．１９８０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：７３４７−７３５１）による。
ＬＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ２３２）
ＬＢＡ４４０４（ｐＩＧ１２１Ｈｍ）
ＥＨＡ１０１（ｐＩＧ１２１Ｈｍ）。
【０２１６】
（３：アグロバクテリウム懸濁液の調製）
ハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＡＢ培地（Ｄｒｌｉｃａ　Ｋ．Ａ．ａｎｄ　Ｋａｄｏ　Ｃ．Ｉ．１９７４；Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７１：３６７７−３６８１）上で３〜１０日間培養したアグロバクテリウムのコロニーを白金耳でかきとり、修正ＡＡ培地（ＡＡ培地（ＡＡ液体培地（ＡＡ主要無機塩類、ＡＡアミノ酸及びＡＡビタミン類（Ｔｏｒｉｙａｍａ　ａｎｄ　Ｈｉｎａｔａ１９８５；Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ４１：１７９−１８３，ＭＳ微量塩類（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　１９６２；　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，１５：４７３−４９７）、０．５ｇ／ｌカザミノ酸、１ｍｇ／ｌ　２，４−Ｄ、０．２ｍｇ／ｌカイネチン、０．１ｍｇ／ｌジベレリン、２０ｇ／ｌショ糖））において、ショ糖を０．２Ｍ、グルコースを０．２Ｍに変更し、アセトシリンゴンを１００μＭ添加、ｐＨ５．２）に懸濁し、菌濃度を３〜５×１０９細胞／ｍｌに調整し接種に用いる。
【０２１７】
（４：接種条件）
供試組織を滅菌水で洗浄後、上述のアグロバクテリウムの懸濁液に３〜１０分間浸漬した。浸漬処理後、茎頂組織は１００μＭアセトシリンゴン、１０ｇ／ｌグルコース、２０ｇ／ｌショ糖を含むＮ６Ｓ３固体培地（１／２Ｎ６主要無機塩類、Ｎ６微量塩類、Ｎ６ビタミン類、Ｃｈｕ　Ｃ．Ｃ．１９７８、ＡＡアミノ酸（Ｔｏｒｉｙａｍａ　ａｎｄ　Ｈｉｎａｔａ１９８５），１ｇ／ｌカザミノ酸、０．２ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、１．０ｍｇ／ｌカイネチン、３ｇ／ｌゲルライト）に、胚盤カルスなどのその他の培養組織はアセトシリンゴン、グルコース、ショ糖を同濃度で含む２Ｎ６固体培地に移植し、２５℃、暗黒下で２〜５日間培養する。その後、接種組織を２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムを含む滅菌水で洗浄し、同濃度のセフォタキシムを含むそれぞれの固体培地で培養を続ける。
【０２１８】
（５：ＧＵＳ活性の調査方法）
共存培養処理直後、組織を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置する。リン酸緩衝液でアグロバクテリウムを洗浄除去した後、０．１ｍＭ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）及び２０％メタノールを含むリン酸緩衝液を添加する。３７℃で２４時間処理した後、青色の呈色を示す組織を顕微鏡下で観察し、供試組織数に対する百分率で表す。なお、選抜処理後得られた形質転換体と考えられる植物体でのＧＵＳ活性の判定に際しては、植物体から葉片を採取し、同様な方法に従ってＧＵＳ染色を行う。個体ごとの発現様式で、葉片全体又は葉片の切り口が一様に青色に呈色するものを陽性個体、キメラ状に呈色するものをキメラ個体とする。
【０２１９】
（６：形質転換細胞、組織の選抜）
３日間共存培養した培養組織を、２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムを含む２Ｎ６培地で１週間培養した後、同培養組織を５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含む２Ｎ６培地で３週間培養してハイグロマイシン抵抗性の培養組織を選抜する（１次選抜）。得られた抵抗性組織をさらに５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むＮ６−１２培地（Ｎ６無機塩類、Ｎ６ビタミン類、２ｇ／ｌカザミノ酸、０．２ｍｇ／１２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌ　６ＢＡ、５ｍｇ／ｌ　ＡＢＡ、３０ｇ／ｌソルビトール、２０ｇ／ｌショ糖、２ｇ／ｌゲルライト）で２〜３週間培養し（２次選抜）、この培地上で増殖したカルスを０、２０、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含む個体再生用培地Ｎ６Ｓ３に移す。なお、共存培養後の培地には全て２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムを添加する。
【０２２０】
（７：形質転換次世代における導入遺伝子の発現）
形質転換次世代の種子を７０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含む４００倍ホーマイ水和剤水溶液中に播種後、２５℃で１０日間処理し、ハイグロマイシン抵抗性を調査する。また、形質転換次世代の種子を各２０粒づつ播種し、約３週間後の苗から葉片を採取し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査する。
【０２２１】
（８：サザン法による導入遺伝子の分析）
品種、朝の光、月の光の形質転換体当代について、小鞠らの方法（Ｋｏｍａｒｉ　ｅｔａｌ．，１９８９；Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７７：５４７−５５２）に従いＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを処理し、ＨＰＴ遺伝子をプローブとし、サザン法による導入遺伝子の検出を行う。なお、サザン法についてはＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．１９８９；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法に従って行う。
【０２２２】
（９：形質転換植物の再生）
得られた抵抗性カルスをさらに２次選抜にかけ、抵抗性カルスから個体を再生させる。再分化用の培地Ｎ６Ｓ３にハイグロマイシンを添加した区と無添加の区を設定したが、無添加の場合には、ＧＵＳ活性がない個体あるいはキメラ状に活性を示す個体が多数出現する。しかし、再分化培地にハイグロマイシンを添加した場合はこのような個体は大幅に減少し、個体全体でＧＵＳ活性を示す再生個体が増加する。このようなハイグロマイシン抵抗性カルスから再生したＧＵＳ活性を全面に示す個体は形質転換体と考えられる。
【０２２３】
（灌木の形質転換および形質転換植物の選択）
灌木（例えば、コーヒー）の形質転換および形質転換体の選択を、以下のように実施する。
【０２２４】
（１：胚発生カルスの誘導）
コーヒー（Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ　Ｃｏｎｉｌｌｏｎ）の葉の外植片を、ＷｏｏｄｙＰｌａｎｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＷＰＭ）無機塩、０．９％の寒天、ビタミンＢ５及び３％スクロースを含むＷＰＭ培地（ｐＨ５．７）上で培養した。３〜４カ月間培養した後に葉の外葉片より胚発生能を持つカルスが誘導される。そのカルスを増殖させるためにＭＳ無機塩、ビタミンＢ５、３％のスクロース及び０．２５％ゲランガムを含むＣＭ培地（ｐＨ５．７）に移植する。培養室は、２５℃で１６時間の日長に保つ。
【０２２５】
コーヒー植物の胚発生能を持つカルスの感染には、ｐｌＧ１２１Ｈｍを持つ、アグロバクテリウムツメファシエンスの系ＥＨＡ１０１などを使用する。
【０２２６】
（２：アグロバクテリウムによる形質転換）
細菌の懸濁液をＡＢ寒天培地上で増殖させ、６００ｎｍにおける吸光度が０．６になるように液体ＷＰＭ培地で希釈する。１０μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を含む上述ＣＭ培地中で胚発生能を持つカルスを３日間前培養する。このカルスに細菌の懸濁液を加えて、２５℃で４日間暗所で共存培養する。残りの細菌を除去する目的でカルスを洗浄した後、３００ｍｇ／ｌセフォタキシムと５μＭのイソペンテニルアデノシン（２−ｉＰ）を含むＷＰＭに植え換える。２週間後に同一培地に植え換えた後、１カ月後に５ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含むＷＰＭ（３００ｍｇ／ｌセフォタキシムと５μＭの２−ｉＰ共存下）に植え換えて、選抜を開始する。２カ月後に５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含むＷＰＭ培地に植え換えた後、さらに１カ月後にハイグロマイシン濃度を１００ｍｇ／ｌに上げ、選抜を確かなものとする。
【０２２７】
（３：組織化学的β−グルクロニダーゼアッセイ）
組織化学的β−グルクロニダーゼアッセイは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド溶液中において、３７℃で１６時間インキュベートして染色することにより、Ｖｏｎ　Ｂｏｘｔｅｌらの方法を以下のように改変して行う。すなわち、５０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．３％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、０．５ｍＭ　Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．５ｍＭ　Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６および抗酸化物質（０．５％カフェイン、１％ＰＶＰおよび１％アスコルビン酸ナトリウム）を使用する。ハイグロマイシン耐性の胚発生のカルスは強いβ−グルクロニダーゼ活性を示す。しかし、共培養しなかった胚発生能を持つカルスは、β−グルクロニダーゼ活性を示さない。
【０２２８】
（４：体細胞胚の形成および植物の再生）
１００ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む培地中で生存している（ハイグロマイシン耐性）胚発生のカルスより体細胞胚を誘導する。ハイグロマイシン耐性の胚発生能を持つカルスより形成された体細胞胚のβ−グルクロニダーゼ活性は陽性を示す。形質転換していない胚発生のカルス由来の体細胞胚は、β−グルクロニダーゼ活性を示さない。２−ｉＰを欠いたＷＰＭ培地（１００ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む）において、形質転換していない幼植物は全く生長しないが、形質転換した幼植物は非常に良く生長し、約１カ月後に多数の独立な幼植物体を得る。形質転換したと推定される幼植物の葉および根は、β−グルクロニダーゼ活性反応で深い青色を示す。形質転換していない幼植物由来の葉及び根は、β−グルクロニダーゼ活性を示さない。
【０２２９】
（５：β−グルクロニダーゼおよびＨＰＴ遺伝子のＰＣＲ解析）
β−グルクロニダーゼ活性が陽性であるコーヒー植物の葉からのＤＮＡ抽出は、改変（溶液１に３％２−メルカプトエタノールを添加）ベンジルクロライド法（ＩＳＯＰＬＡＮＴキット、和光）を用いて、Ｋｉｋｕｃｈｉらの方法（Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１５：４５−４８）により行う。β−グルクロニダーゼ遺伝子を増幅するのに用いたプライマーは、５’−ＡＡＴＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＧＧＴＧＧ−３’　（配列番号１５）および、５’−ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１６）である。また、ＨＰＴ遺伝子を増幅するのに用いたプライマーは、５’−ＧＣＧＴＧＡＣＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＣＣ−３’　（配列番号１７）および５’−ＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣ−３’　（配列番号１８）である。ＰＣＲの反応溶液をＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ，９７００）の中で、下記の条件でインキュベートする。すなわち、９６℃で１５分、続いて９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で２分間を３０サイクルそして最終的な伸長反応を７２℃で５分間行う。β−グルクロニダーゼ活性が陽性である形質転換植物の葉をＰＣＲにより試験したところ、β−グルクロニダーゼおよびＨＰＴに相当する増幅断片が示される。形質転換していない幼植物においては、β−グルクロニダーゼ遺伝子もＨＰＴ遺伝子も検出されない。
【０２３０】
（実施例６：カドミウム耐性およびクロロフィル含量の測定）
トランスジェニックアラビドプシスの表面を滅菌した種子を、温室内で、２３℃で、１４時間／１０時間−明所／暗所の光サイクル下で栽培した。植物を、１５０μＭのＣｄＣｌ２を含む１／２強度の固体上で６週間生長させた。クロロフィルを、３０−４０ｍｇの植物から、１ｍｌの８０％アセトン（和光純薬、大阪）中に抽出した（Ｙａｎｇ　Ｓ．Ｈ．ら、（２００１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７，２３−３２）。ホモジナイズした後に、サンプルを１５分間インキュベートして、１５，０００ｇで１０分間遠心し、そして上清画分のアリコートを回収して、分光光度計（ＤＵ６４０，Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、Ａ６６３を測定した。
【０２３１】
（ＣｄＩ１９過剰発現は、植物にカドミウム耐性を付与する）
センス配向のＣｄＩ１９を、アラビドプシスに導入し、３５Ｓプロモーターの制御下において構成的発現をした。１５のトランスジェニック株の中で、１２株を、カドミウムストレスに供し、そして６週間の栽培に後に、生存について分析した。野生型植物の生長は、著しく阻害され、重篤な白化が見られ、そして明らかな根の伸張が見られなかった（図７ａ）。トランスジェニック株の生長もまた影響を受けたが、阻害は、コントロール植物よりも軽度であった（図７ａ）。耐性は、トランスジーンの発現量の増加と比例しているようであった。このことは、代表的に、他の株との比較において、柱頭のより高度な生長を示す株３において見られた（図７ｃ）。トランスジェニック植物のクロロフィル含量もまた、トランスジーンの転写レベルの増加と比例して、増加した（図７ｂ、ｃ）。例えば、株３において転写レベルおよびクロロフィル含量は、コントロール野生型植物の場合と比較して、それぞれ４倍および２倍であった。これらの結果は、ＣｄＩ１９がカドミウムを捕捉および固定化し、そして細胞におけるその毒性効果を低下させることを示すと結論付けられる。
【０２３２】
（考察）
本明細書は、金属結合ファルネシル化タンパク質であるアラビドプシスのＣｄＩ１９の機能的特長について記載する。この高度に疎水的な４２．２ｋＤａタンパク質（各々がＭ／ＬＸＣＸＸＣからなる、２セットの金属結合モチーフを有する）は、効率的にＣｄ、Ｈｇ、およびＣｕに結合する。このモチーフを含む多数のタンパク質が、金属イオン代謝に関与することが見出されている。その例としては、ＭｅｒＰ、ＡＴＸ１、ＣＣＣ２、ＣＣＳならびにウィルソン病およびメンケズ病の銅輸送ＡＴＰａｓｅである（Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．Ｃ．，Ｋｌｏｍｐ，Ｌ．Ｗ．，Ｓｔｒａｉｎ，Ｊ．，Ｃａｓａｒｅｎｏ，Ｒ．Ｌ．，Ｋｒｅｍｓ，Ｂ．およびＧｉｔｌｉｎ，Ｊ．Ｄ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２３４６９−　２３４７２；Ｈｉｍｅｌｂｌａｕ，Ｈ．，Ｍｉｒａ，Ｈ．，Ｌｉｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｃｉｚｅｗｓｋｉ，Ｖ．，Ｐｅｎａｒｒｕｂｉａ，Ｌ．Ｃ．およびＡｍａｓｉｎｏ，Ｍ．Ｒ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１７，１２２７−１２３４；Ｈｕｆｆｍａｎ，Ｄ．Ｌ．およびＯ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｔ．Ｖ．（２００１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０，６７７−７０１；Ｐｕｆａｈｉ，Ｒ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｃ．，Ｐｅａｒｉｓｏ，Ｋ．Ｌ．，Ｌｉｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｐ．，Ｆａｈｒｎｉ，Ｃ．，Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．Ｃ．，Ｐｅｎｎｅｒ−Ｈａｈｎ，Ｊ．Ｅ．およびＯ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｔ．Ｖ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，８５３−８５６；Ｙｕａｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｓｔｅａｒｍａｎ，Ｒ．，Ｄａｎｃｉｓ，Ａ．，Ｄｕｎｎ，Ｔ．，Ｂｅｅｌｅｒ，Ｔ．およびＫｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，２６３２−２６３６）。細菌のＭｅｒＰが、形質膜を横切ってＨｇを輸送することを示した（Ｐｏｗｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．およびＳａｈｌｍａｎ，Ｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３３３２０−３３３２６）。酵母のＡＴＸ１、ＣＣＣ２、ＣＣＳもまた、Ｃｕに結合して、Ｃｕを他のメタロチオネインに送達することが報告されている（Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．Ｃ．，Ｋｌｏｍｐ，Ｌ．Ｗ．，Ｓｔｒａｉｎ，Ｊ．，Ｃａｓａｒｅｎｏ，Ｒ．Ｌ．，Ｋｒｅｍｓ，Ｂ．およびＧｉｔｌｉｎ，Ｊ．Ｄ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２３４６９−　２３４７２；Ｐｕｆａｈｉ，Ｒ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｃ．，Ｐｅａｒｉｓｏ，Ｋ．Ｌ．，Ｌｉｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｐ．，Ｆａｈｒｎｉ，Ｃ．，Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．Ｃ．，Ｐｅｎｎｅｒ−Ｈａｈｎ，Ｊ．Ｅ．およびＯ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｔ．Ｖ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，８５３−８５６；Ｙｕａｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｓｔｅａｒｍａｎ，Ｒ．，Ｄａｎｃｉｓ，Ａ．，Ｄｕｎｎ，Ｔ．，Ｂｅｅｌｅｒ，Ｔ．およびＫｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，２６３２−２６３６）。ＡＴＸ１はさらに、その２つのシステインの硫黄による金属イオン結合の際に、そのコンフォメーションを変化することが示された（Ｈｕｆｆｍａｎ，Ｄ．Ｌ．およびＯ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｔ．Ｖ．（２００１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０，６７７−７０１）。本発明者らの結果は、この結果と一致し、さらに、ＣＸＸＣモチーフ内の２つのシステインが、本当に金属結合の原因であるという証拠を提供する。
【０２３３】
ＣｄＩ１９タンパク質の別の独特な特徴は、そのＣ末端システイン残基におけるファルネシル化であり、そのような疎水性のイソプレノイドの翻訳後の付着は、真核生物が、生物学的機能（例えば、膜付着およびタンパク質間相互作用）のためにタンパク質を活性化することにおいて、必須である。例えば、小胞輸送において機能する多くの低分子Ｇタンパク質が、ファルネシル化によって修飾される（Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｌ．およびＣａｓｅｙ，Ｐ．Ｊ．（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５，２４１−２４９）。本発明者らの結果は、ファルネシル化がＣｄＩ１９の形質膜への局在化の原因であることを、明確に示す。ＣｄＩ１９の注目すべき特徴は、このＣｄＩ１９が、金属結合モチーフと機能的なファルネシルモチーフの両方を備えるということである。この特徴は、本発明の特徴のひとつであり、この特徴によって、本願発明の種々の効果が奏される。
【０２３４】
（実施例７：別の変異体を用いたトランスジェニック植物）
ＣｄＩ１９と同様の機能を有する本発明のポリペプチドの変異体を上記の実施例に記載されるプロトコルと同様に作製した。その配列は、配列番号２０および２２に示す。このアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを配列番号１９および２１に示すように調製し、上記実施例と同様にベクターに導入し、細胞を形質転換し、そしてトランスジェニック植物を得た。このようにして得たトランスジェニック植物もまた、同様に、重金属を特異的に結合し、かつ、形質膜への局在化という特性を示すことが示された。従って、本発明は、機能を保持する改変体を利用することによっても達成され得ることが実証された。
【０２３５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【０２３６】
【発明の効果】
本発明により、重金属（特に、有害重金属）を環境から効率よく除去することが可能になった。また、本発明により、希少重金属を濃縮採取することも可能になった。本発明のポリペプチドが提供されたことにより、このような除去または濃縮採取を省エネルギーで、低コスト、かつ広範囲で行うことが達成された。
【０２３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＣｄＩ１９タンパク質、およびＣＸＸＣ型金属結合ドメインのアラインメントを図示する。
（ａ）模式図：
ＣｄＩ１９タンパク質（配列番号２）は、２つの金属結合領域（ＨＭＲ）、ファルネシル化モチーフ、および重金属結合領域とファルネシルモチーフとの間のＧｌｙに富む可撓性領域を有する。金属結合領域のコア配列およびファルネシルモチーフは、それぞれ、ＣＸＸＣ（Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸である）、およびＣａａＸ（Ｃはシステインであり、ａは脂肪族アミノ酸であり、Ｘは、Ｃ末端残基である）。
（ｂ）アミノ酸アラインメント：
ＣＸＸＣ型金属結合ドメインを含むタンパク質配列を、ＧｅｎＢａｎｋから入手した。登録番号は、それぞれ、ＡＴＸ１（Ｐ３８６３６）、ＣＣＨ（ＡＡＣ３３５１０）およびＡＴＦＰ３（ＡＡＤ０９５０７）である。ＨＭＲは、重金属結合領域を意味する。影を付けた残基は、保存されたシステイン残基および疎水性残基である。下線を引いた残基は、金属結合領域のコア配列である。
【図２】図２は、ＧＦＰ−ＣｄＩ１９の細胞内局在を示す。
（ａ）ＧＦＰ−ＣｄＩ１９融合タンパク質の模式図：
変異タンパク質は、Ｃｙｓ−３８９をＧｌｙで置換した（配列番号４）。
（ｂ）ＧＦＰのみを発現するＢＹ２細胞（コントロール；上のパネル）、ＧＦＰと融合したＣｄＩ１９（野生型；中央のパネル）、ＧＦＰと融合した変異ＣｄＩ１９（変異型；下のパネル）：
蛍光を、共焦点レーザースキャン顕微鏡を使用して、蛍光を観察した。左のパネルは蛍光画像であり、中央のパネルはノマルスキー顕微鏡の写真であり、右のパネルは蛍光画像とノマルスキー顕微鏡写真とを合わせた合成画像である。
【図３】図３は、組換えＣｄＩ１９タンパク質およびそのＣＤスペクトルを示す。
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された、野生型（ＧＳＴ−ＣｄＩ１９Ｗ）および変異型（ＧＳＴ−ＣｄＩ１９Ｍ）の金属結合領域を含む組換えタンパク質の模式図：
変異型（ＧＳＴ−ＣｄＩ１９Ｍ）は、金属結合領域内に、ＣｙｓのＧｌｙへの置換を含む。
（ｂ）組換えタンパク質のＣＤスペクトル：
カドミウム存在下および非存在下での、ＧＳＴ−ＣｄＩ１９Ｗ（左）およびＧＳＴ−ＣｄＩ１９Ｍ（右）を測定した。最終濃度として、０μＭ（黒）、３００μＭ（灰色）、５００μＭ（薄い灰色）を、３０μＭのタンパク質溶液に添加した。Ｘ軸およびＹ軸は、それぞれ、波長（ｎｍ）およびΘ（ｍｄｅｇ）である。
【図４】図４は、金属イオンの存在下および非存在下での組換えタンパク質のＣＤスペクトルである。Ｃｕ（ａ）、Ｈｇ（ｂ）、Ｃｏ（ｃ）、Ｍｎ（ｄ）およびＣａ（ｅ）を、３０μＭのタンパク質溶液に添加した。カドミウム存在下および非存在下で、ＧＳＴ−ＣｄＩ１９Ｗ（左）およびＧＳＴ−ＣｄＩ１９Ｍ（右）を２５℃で測定した。金属イオンの濃度は、０μＭ（黒）、３００μＭ（灰色）、５００μＭ（薄い灰色）である。Ｘ軸およびＹ軸は、それぞれ、波長（ｎｍ）およびΘ（ｍｄｅｇ）である。
【図５】図５は、重金属処理をした際の、ＣｄＩ１９転写物の蓄積である。
総ＲＮＡ（２０μｇ）を、抽出して、電気泳動によってサイズ分画し、ノーザンハイブリダイゼーション分析に供した。５Ｓ　ｒＲＮＡを、ＲＮＡをロードする際の標準とした。使用した重金属の最終濃度は、５００μＭであった。
（ａ）２週齢の植物を、図中に示された期間、カドミウムに曝露した結果。
（ｂ）４時間、図中に示された金属イオンに対して曝露した結果。
【図６】図６は、ＣｄＩ１９プロモーター：：ＧＵＳ融合遺伝子を発現するトランスジェニックアラビドプシスのＧＵＳ活性の組織化学的局在を示す。
植物を、５００μＭのカドミウムで、アッセイの４時間前に処理した。使用した植物は、１月齢（ａ、ｃ〜ｇ）、および１週齢（ｂ、ｈ〜ｋ）であった。使用した組織は、植物全体（ａ、ｂ）、葉（ｃ）、花柄（ｇ）、胚軸（ｈ）、根の分裂組織（ｉ）、維管束（ｊ）および成熟した根の維管束（ｋ）である。
【図７】図７は、ＣｄＩ１９を発現するトランスジェニックアラビドプシスの表現型および特性である。
（ａ）植物の生長に対するカドミウムの効果：
野生型植物およびトランスジェニック植物（株３）の両方を、１５０μＭのＣｄＣｌ２を補充した１／２強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地を含む固体プレート上で、温室中で６週間、生長させた。
（ｂ）ＣｄＩ１９転写物の蓄積：
６週齢のトランスジェニック植物および野生型植物の総ＲＮＡ（２０μｇ）を、ノーザン分析に供した。５Ｓ　ｒＲＮＡを、ＲＮＡをロードする標準として使用した。
（ｃ）クロロフィル含量に対するカドミウムの効果：
クロロフィルを、８０％アセトンを用いて抽出し、そしてアリコートの吸収（Ａ６６３）を測定した。相対的なクロロフィル含量を、吸収に基づいて計算した。野生型植物およびトランスジェニック株のそれぞれを、ＷＴおよび適切な番号によって示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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