(57)【要約】【課題】培養組織の適性を的確かつ容易に判定して、安全性の高い培養組織を供給する。【解決手段】所定の測定時に、培養組織を構成する特定細胞のテロメラーゼ活性を測定し、測定されたテロメラーゼ活性に基づいて培養組織の特定時期における適性を判定する。また、培養組織のテロメラーゼ活性を経時的に測定し、所定の判定基準を超えた場合は、出荷不可と判定する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定細胞を培養して作製される培養組織の評価方法において、
所定の測定時に、前記培養組織を構成する特定細胞のテロメラーゼ活性を測定する測定工程と、
測定されたテロメラーゼ活性に基づいて、培養組織の特定時期における適性を判定する判定工程とを含むことを特徴とする培養組織の評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載の培養組織の評価方法において、前記特定細胞が、表皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、肝細胞の少なくとも１つであることを特徴とする培養組織の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養組織の評価方法に関し、特に、特定細胞を培養して作製される培養組織の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体外（インビトロ）で細胞を培養し、培養した細胞を治療のために患者に投与したり、医薬品等の毒性試験に利用したり、と細胞培養技術が種々の領域で利用されるようになってきている。例えば、表皮細胞をシート状に培養した後に患者に適用する技術は１９８０年代には確立されており、多くの病院で臨床に供されてきた。また、病院内で細胞を培養して臨床適用することは、培養施設を有する特定の大学病院等に限定されることから、企業において細胞を培養して作製された培養組織を提供しようという動きが盛んになってきている。
このような状況下では、企業にとって、培養組織を製品として提供する際に、より安全性の高い培養組織を供給することが必要不可欠である。培養組織の安全性を担保するためには、的確かつ容易であって、客観的に安全性を判定する指標が必要とされており、有用かつ容易な判定方法が求められている。
【０００３】
一方、細胞の不死化や老化との関わりにおいて注目されているテロメラーゼは、生殖細胞や腫瘍不死化細胞系で多く発現していることが知られている。例えば、非特許文献１には、癌とテロメラーゼの発現との間の関連性が報告されており、広範な種類の癌の組織標本及び不死化細胞系からテロメラーゼ活性を同定し、皮膚、結合組織、脂肪組織、乳房、肺、胃、膵臓、卵巣、子宮頸部、子宮、腎臓、膀胱、大腸、前立腺、神経系組織及び血液細胞の悪性腫瘍組織でテロメラーゼ活性の発現を確認している。また、テロメラーゼ活性を指標として癌組織を判定する方法が、非特許文献２や特許文献１に記載されている。さらに、非特許文献３は、体細胞が不死の腫瘍細胞へ形質転換する際にテロメラーゼ活性が鍵となる役割を演ずる可能性があることを示唆している。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｋｉｍ  ＮＷ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｙ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｏｒｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ，  ”Ｓｃｉｅｎｃｅ”，  ２６６（５１９３），  ｐ．  １１１５−１１１７，  １９９５
【非特許文献２】
Ｊｏｎｅｓ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｒｏｍ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  ”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，  ２４０（２），  ｐ．３３３−３３９，  １９９８
【非特許文献３】
Ｈａｂｅｒ  ＤＡ，  Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ，  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ，  ”Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”，  ３３２（１４），  ｐ．９５５−９５６，  １９９５
【特許文献１】
特開２００１−３０９７９１号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、培養組織の適性を的確かつ容易に判定して、安全性の高い培養組織を供給することが可能な培養組織の評価方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の培養組織の評価方法は、特定細胞を培養して作製される培養組織の評価方法において、所定の測定時に、前記培養組織を構成する特定細胞のテロメラーゼ活性を測定する測定工程と、測定されたテロメラーゼ活性に基づいて、培養組織の特定時期における適性を判定する判定工程と、を含むことを特徴としている。
【０００７】
ここで、本発明の培養組織の評価方法は、前記特定細胞が、表皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、肝細胞の少なくとも１つであることが好ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の培養組織の評価方法は、所定の測定時に、培養組織を構成する特定細胞のテロメラーゼ活性を測定し、測定されたテロメラーゼ活性に基づいて、その培養組織の特定時期における適性を判定するものである。
このような培養組織の評価方法によれば、培養組織の適性がテロメラーゼ活性に基づいて判定されるので、具体的な判定基準に基づいて的確にかつ容易に培養組織の適性を評価することができる。また、適性がないと判定された場合には排除することにより、出荷時／移植時での培養組織の品質を高い水準に保つことができる。
【０００９】
本発明に適用される培養組織は、特定細胞を培養することによって作製される。ここで、用いられる特定細胞は、当該技術分野で既知のインビトロでの細胞培養技術に用いられる細胞であればいずれのものも該当し、例えば、表皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、肝細胞を挙げることができる。これらの細胞は、可能であれば２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの細胞を培養するために用いられる培養液（培地）には、細胞種に応じた既知の如何なる培地をも選択することができる。また、これらの特定細胞は、細胞のみで培養を行ってもよいが、細胞種によっては、担体（ｓｃａｆｆｏｌｄ）と共に培養を行ってもよい。このような細胞種としては、例えば軟骨細胞が挙げられ、この場合にはコラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、フィブリン、キチン、キトサン、ラミニン、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、絹フィブロイン及びポリロタキサン等の担体が利用される。
【００１０】
本発明での「培養」には、継代培養も含まれる。この継代培養は、一般に、特定細胞を通常の培養条件下で培養し、所定状態に到達した時点で細胞を回収し、細胞数を調整して複数の培養容器に分配して再び播種する一連の工程（継代）を繰り返し行いながら、細胞を増殖培養することを言う。継代を実施する所定状態とは、細胞種、細胞増殖速度、目的などによって適宜決定され、一般に、細胞密度によって判断される。
なお、これらの特定細胞を生体から採取する際には、周辺部等の他の細胞や組織、例えば結合組織を除去するために、特定細胞を単離する必要がある。特定細胞の単離には、適当な酵素、例えばディスパーゼ、トリプシンなどを用いることができる。また、ナイロンメッシュなどを用いてデブリスなどを除去する。
【００１１】
継代は、細胞種によって既知の方法に従い行われる。例えば、表皮細胞の場合には、培養容器に付着している表皮細胞を酵素処理によって剥がし、数回リンスした後に所定の細胞数に調整し、新鮮な培地に懸濁して培養容器に播種する。
【００１２】
本発明の評価方法は、培養組織の適性を判定するためにテロメラーゼ活性を指標とする。テロメラーゼ活性は、生殖細胞と不死化細胞系の細胞以外では検出されないことが知られている。また、表皮や上皮などの再生系の細胞では弱い活性が検出されるが、培養組織の継代回数が増えるにつれてテロメラーゼ活性が減少する傾向にある。このテロメラーゼ活性の減少は、培養によるコンフルエント状態や細胞分化などが要因と考えられている。一方、腫瘍細胞（癌細胞）の特性を示す場合もある不死化細胞は、通常想定できない回数の継代培養を可能とし、顕著に高いテロメラーゼ活性を示す。即ち、正常な細胞では、テロメラーゼ活性は測定されないか測定されても低い値を示し、継代培養するにつれて活性が減少するが、これに対して不死化細胞では高い活性を示す。このため、テロメラーゼ活性を指標として、適切に細胞の不死化を判定し、測定時の培養組織の適性を評価することができる。
また、テロメラーゼ活性については、同種の細胞間において個体差が少なく、同ステージの細胞であれば活性レベルがほぼ同程度であることが、確認されている。このため、個体差が生じやすいテロメア長よりも、判定用の指標として使いやすいという利点がある。
【００１３】
本発明においてテロメラーゼ活性の測定は、当業界で既知の方法により測定することができ、例えば、テロメア反復配列増幅プロトコル（以下、「ＴＲＡＰ」という）に従って測定することができる。このＴＲＡＰアッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法をベースとする技術である。すなわち、細胞から抽出したサンプル中に含まれる可能性のあるテロメラーゼによってテロメアＤＮＡ反復配列の伸長反応が行われる。その伸長反応の程度は、テロメラーゼの量及び活性に依存する。次いで、テロメアＤＮＡ反復配列の伸長反応後のテロメラーゼ産物の増幅反応を行う。この方法によれば、増幅により非常に低いテロメラーゼ活性も検出可能である。なお、テロメラーゼ活性の測定方法は、ＴＲＡＰアッセイに制限されるものではなく、テロメラーゼ活性を測定することができれば如何なる方法であっても本発明に適用することができる。
【００１４】
ＴＲＡＰアッセイによりテロメラーゼ活性を測定するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、単にプライマーという）を使用することができる：（１）テロメラーゼがプライマー配列上でテロメアＤＮＡ反復配列の伸長反応を行うためのプライマー（例えば、ＴＳプライマー：５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号１））、及び（２）テロメアＤＮＡ反復配列の伸長反応後のテロメラーゼ産物の増幅を行うためのプライマー（例えば、ＣＸプライマー：５’−（ＣＣＣＴＴＡ）３  ＣＣＣＴＡＡ−３’（配列番号２））。
【００１５】
ＴＲＡＰアッセイは、（１）プライマーを反応させ、その後（２）プライマーを順次に反応させることが必要であるが、（１）及び（２）プライマーを分けてＰＣＲ用反応液を調製してもよく、又は（１）及び（２）プライマーを一緒に調製してもよい。一緒に調製する場合は、所定の温度で溶解可能なワックスバリアで隔離する公知の方法を行ってもよい。これらのＰＣＲ用反応液に、細胞から抽出されたサンプルを加えて、所定のＰＣＲ条件に基づいて反応させ、サンプル中のテロメラーゼにより最終的に得られたＰＣＲ増幅産物をテロメラーゼ活性として検出することができる。検出には、既知の種々の方法が用いられるが、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、自動ＤＮＡシークエンサー等により検出され、分析することができる。
なお、これらのＴＲＡＰアッセイは、市販のＴＲＡＰＥＺＥ（登録商標）Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）等を使用することができる。
【００１６】
このテロメラーゼ活性の測定は、採取時の採取元（患者又はドナー等）組織、培養中の培養組織、出荷（提供）時の培養組織及び移植時の培養組織における何れの場合でも行うことができるが、これに限定されない。
テロメラーゼ活性の測定を、採取時の採取元（患者又はドナー等）組織に対して行った場合には、採取元組織由来の細胞が不死化しているか否かを確認することができる。例えば、出荷時の培養組織にテロメラーゼ活性が認められた場合に、細胞の不死化の原因が培養工程によるものなのか、採取元組織に由来するものなのか明確にすることができる。
また、テロメラーゼ活性の測定を、培養中の培養組織に対して継代操作ごとに行った場合には、培養された特定細胞のテロメラーゼ活性の経時的な変化を直接確認することできる。これにより、どの時点で特定細胞が不死化したかが明確になるので、継代操作手順の見直しから最適な培養条件の検討を行うことができる。
一方、テロメラーゼ活性の測定を、出荷（提供）時の培養組織に対して行った場合には、製品として出荷する際の培養組織の適性を判断することができる。この結果、不死化した特定細胞で構成された培養組織を移植用組織として出荷（提供）することが防止でき、提供者として移植用組織の安全性を担保することができる。
さらに、テロメラーゼ活性の測定を、移植時の培養組織に対して行った場合には、安全な移植用組織を患者に適用できるか否かを最終的に確認できる。例えば、出荷時の培養組織にはテロメラーゼ活性が確認されなかったが、移植時の培養組織にテロメラーゼ活性が確認できた場合には、このときの輸送及び保存条件において細胞が不死化したと想定されるため、適切な輸送方法又は保存方法の再検討を行うことができる。
【００１７】
ここで「培養組織の特定時期における適性」とは、例えば出荷（提供）時の培養組織についてはその培養組織が出荷（提供）できる状態にあることをいい、移植時の培養組織についてはその培養組織が移植できる状態にあることをいう。
【００１８】
一般に、培養組織を移植用として使用する場合には、移植後に効率よく生着し、或いは移植された固体における組織再生が効率よく行われることが培養組織に要求され、このような状態を高い確率で実現可能な場合を、移植できる状態と考えることができる。
【００１９】
本発明における培養組織の適性の判定としては、不死化しているか否かの判定が挙げられる。不死化細胞は移植後に腫瘍細胞に形質変化する可能性が正常細胞よりも高いため、培養組織が不死化細胞で構成されていることは好ましくない。培養工程中に何らかの作用によって不死化した場合には、正常培養細胞の活性よりも高いテロメラーゼ活性が検出される。このため、通常の培養工程を経ているにもかかわらず、高いテロメラーゼ活性が検出させた培養組織は、不死化していると判定し、出荷（提供）不可又は移植不可として評価することができる。
【００２０】
本発明における培養組織の適性の判定は、テロメラーゼ活性の変化に基づいて行う。正常細胞では、テロメラーゼ活性はほとんど無いか、わずかに減少するので、このような培養組織を適性のある培養組織と判定することができる。一方、テロメラーゼ活性が極端に上昇する場合には、不死化している培養組織と判定することができる。また、適性の判定は、予め基準値となるテロメラーゼ活性を判定基準として設定しておき、この設定された判定基準と、測定されたテロメラーゼ活性値とを比較することにより行ってもよい。判定基準の設定は、細胞種や培養条件によって異なるので、種々の条件を考慮して設定する必要がある。また、判定基準は、実験的に得られるデータに基づいて個別に設定することが好ましい。例えば、通常の正常細胞では明らかに検出されない値、例えばＴＲＡＰアッセイによれば１００を予め判定基準値として設定することができる。また、培養組織の作製時に、採取元組織又は第一回継代操作時（Ｐ１）の細胞のテロメラーゼ活性の測定値を基準値として、測定誤差等を考慮して約５０％増（約１．５倍）にした値を判定基準値として設定することもできる。この判定基準を超えている場合は、細胞が不死化していると判定することができる。
【００２１】
このように本発明によれば、培養組織の適性をテロメラーゼ活性に基づいて的確かつ容易に判定して、安全性の高い培養組織を供給することができる。また、培養組織を出荷する際の細胞のテロメラーゼ活性を測定することで定量化された判定基準を得ることができ、その培養組織が出荷に値するか否かを的確かつ容易に判定することができる。さらに、テロメラーゼ活性を測定することによって、細胞の不死化を的確かつ容易に判定することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、表皮細胞を基に作製された培養表皮シートを一実施例として挙げ、本発明を説明する。
【００２３】
＜培養表皮シートの作製＞
６ヶ月男児、５２歳男性のドナーからそれぞれの皮膚組織を採取した後、ディスパーゼ等の酵素処理により表皮細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を単離し、細胞懸濁液を調製した。予め不活化した３Ｔ３マウス線維芽細胞をフィーダー細胞として敷設した培養容器（底面積７５ｃｍ２）に、表皮細胞の懸濁液を７．５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度で播種した。
表皮細胞を播種した後、１０−１０Ｍ  コレラトキシン、５μｇ／ｍｌ  インスリン、５μｇ／ｍｌ  トラスフェリン、２×１０−９Ｍ  トリヨードサイロニン、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１％  ａｎｔｉ  Ｂ（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ：ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ  ｓｏｄｉｕｍ  １００００  ｕ／ｍｌ，  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  １００００  μｇ／ｍｌ，  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ  ２５ｎｇ／ｍｌ  ｉｎ  ０．８５％  ｓａｌｉｎｅ，  ＧＩＢＣＯＴＭ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）を含む１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを培地として注入し、３７℃、１０％ＣＯ２の条件下で培養を行った。一方、６ヶ月男児から得られた皮膚組織に関しては、３Ｔ３マウス線維芽細胞（フィーダー細胞）を敷設することなく培養容器に播種（播種密度：７．５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）し、無血清培地を注入し、３７℃、１０％ＣＯ２の条件下で培養を行った。
継代培養操作は培養容器底面の約８０％が細胞で覆われた時点で行った。継代培養操作では、０．１％  トリプシンＥＤＴＡ（０．５％トリプシン，  ５．３ｍＭ  ＥＤＴＡ／４Ｎａ、ＧＩＢＣＯＴＭ、  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、  ＮＹ、  ＵＳＡ）含有ＰＢＳで５分間処理した後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで１回洗浄して細胞を回収した。その後、回収した細胞を２系統に播種し、一方は所定の被覆率（約８０％）になった時点で継代培養操作を継続して行い、他方ではコンフルエント状態を越えて重層化するまで培養し、培養表皮シートを作製した。
上述のように作製した種々の培養表皮シートに関して、細胞のテロメラーゼ活性を測定した。テロメラーゼ活性の測定はＴＲＡＰアッセイにより行った。
【００２４】
＜テロメラーゼの抽出＞
培養表皮シート１００ｍｇを１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ  ＣＯ．，  ＬＴＤ．，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）を添加した１×ＣＨＡＰＳ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ７．５，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １ｍＭ  ＥＧＴＡ，  ０．１ｍＭ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ，  ５ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，  ０．５％  ＣＨＡＰＳ，  １０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）２００μｌに再懸濁し、氷上にて３０分間インキュベートした。そして、１２０００ｇ、４℃で、２０分間遠心分離した。得られた上清（以下、「試料抽出物」という）の１６０μｌを取り、各チューブに分注後、−８０℃に凍結保存した。
【００２５】
＜テロメアＤＮＡの伸長反応＞
次いで、凍結保存していた試料抽出物を解凍し、タンパク質濃度測定試薬（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ，  ピアス社製）を用いて試料抽出物のタンパク質濃度を測定した。試料抽出物（タンパク質量換算で１μｇ）２μｌに、１０×ＴＲＡＰ  ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．３，  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ６３０ｍＭ  ＫＣｌ，  ０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０，  １０ｍＭ  ＥＧＴＡ）５．０μｌと、５０×ｄＮＴＰｓ  Ｍｉｘ（２．５ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＴＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ）１．０μｌと、ＴＳ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１）１．０μｌと、ＴＲＡＰ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（ＲＰ  ｐｒｉｍｅｒ，  Ｋ１  ｐｒｉｍｅｒ，  ＴＳＫ１  ｔｅｍｐｌａｔｅ）１．０μｌと、ｄＨ２Ｏ  ３９．６μｌとを混合した。この混合物を、４９．６μｌずつ各検体のＰＣＲチューブに分注し、３０℃、３０分間でテロメラーゼによるテロメアＤＮＡ伸長反応を行った。上記試薬は、市販のＴＲＡＰＥＺＥ（登録商標）Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）の付属物を使用した。
なお、該試料抽出物を加熱処理したものをコントロールとして用意し、同様に伸長反応を行った（これを、加熱処理抽出物（Ｘ０）という）。また、これに対して上記試料抽出物を非加熱処理抽出物（Ｘ）という。
【００２６】
＜伸長テロメアＤＮＡの増幅＞
下記の条件でＰＣＲ法を行い、伸長テロメアＤＮＡを増幅させた。
各検体が９４℃に加熱されてから、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ，  ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．，  Ｏｔｓｕ，  Ｊａｐａｎ）０．４μｌを添加、さらに９４℃／３０ｓｅｃ、５９℃／３０ｓｅｃにて３３サイクルＰＣＲを施行した。なお、同時に、各加熱処理抽出物のサンプル（８５℃、１５分間インキュベート）、ポジティブコントロール細胞抽出液、ネガティブコントロール（プライマーダイマー／ＰＣＲコンタミネーションコントロール）、ＴＳＲ８コントロールテンプレート（０．１ａｍｏｌｅ）に対してもＰＣＲを施行した。
【００２７】
＜テロメラーゼ活性の測定＞
得られたＰＣＲ増幅産物１０μｌとｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．０２％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，  ０．０２％  ｘｙｌｅｎ  ｃｙａｎｏｌ  ＦＦ，  ５０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  １％  ＳＤＳ，  Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ．，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）１．３μｌとを混合し、１２．５％非変性ポリアクリルアミドゲル（１２．５％  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ｍｏｎｏ：ｂｉｓ＝１９：１）Ｓｔｏｃｋ  ｉｎ  ０．５×ＴＢＥ，  ０．１％  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ，  ０．７７５μｇ／ｍｌ  ＴＥＭＥＤ）を用いて、０．５×ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ中、室温、１１．０ｍＡ、３０分間の条件下で電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを０．０１％ＳＹＢＲ（登録商標）  ＧＲＥＥＮ  Ｉ  ｎｕｃｌｅｉｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．）で室温３０分染色したあと、ＵＶ  ｔｒａｎｓ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（ＣｈｅｍｉＤｏｃ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）にて検出し、次いで、解析ソフト（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）にて、各レーンに分離しているバンドの発光濃度を集合的に測定し、解析を行った。各電気泳動用サンプルには、前記Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ付属のインターナルコントロール（塩基長＝３６塩基）が含有されている。
【００２８】
＜テロメラーゼ活性の定量＞
本実施例では、電気泳動結果から下記式（１）よりテロメラーゼ活性（Ｕ）を定量した。その結果を表１に示す。
また、本実施例では判定基準を１００とした。
【００２９】
【数１】
［｛（Ｘ−Ｘ０）／Ｃ｝／｛（Ｒ−Ｒ０／Ｃｒ｝］×１００  ……（１）
Ｘ：非加熱処理抽出物
Ｘ０：加熱処理抽出物
Ｒ：ＴＳＲ８定量化コントロール
Ｒ０：プライマーダイマー／ＰＣＲコンタミネーションコントロール
Ｃ：非加熱処理抽出物内のインターナルコントロール
Ｃｒ：ＴＳＲ８定量化コントロール内のインターナルコントロール
【００３０】
【表１】
2004261062.tif 000002
【００３１】
表１に示されるように、血清含有培地及び無血清培地のいずれの場合においても、培養表皮シートの作製に必要な通常想定される継代回数におけるテロメラーゼ活性を測定したところ、わずかな活性が確認されたのみであった。
一方で、無血清培地で培養したものの中に、通常想定できない回数の継代操作を行うことができたものが存在したため、テロメラーゼ活性を測定したところ、Ｐ２０において４７９．８であった。この値は判定基準（１００）を大きく上まわり、通常の正常細胞では想定できないものであった。なお、無血清培地で培養した細胞（Ｐ１）の活性が１７．５であるので、これを１．５倍にした値２６．２５を判定基準として設定しても同様の結果となる。
したがって、このような培養表皮シートは、出荷不可と判定されたので、再度正常細胞から培養表皮シートを作製した。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、培養組織の適性を的確かつ容易に判定して、安全性の高い培養組織を供給することが可能な培養組織の評価方法を提供することができる。
【００３３】
【配列表】
2004261062.tif 000003