(57)【要約】【課題】  蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定法、該法を利用するリアルタイム定量的ＰＣＲ法、及び該ＰＣＲ法により得られるデータを解析する方法において、短時間かつ正確に目的が達成できる方法を提供する。【解決手段】  蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、２−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオチドなどからなるか、またはそれらが介在するオリゴヌクレオチドからなる当該核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定する核酸の新規測定法、該法を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法、及び該ＰＣＲ法で得られるデーターの解析の際、アニーリング反応時の蛍光強度値を、変性反応時のもので補正する過程を有するデータ解析法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法において、前記核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、前記核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする標的核酸の濃度の測定方法。
【請求項２】
蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、前記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において前記蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが当該末端部において標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該プローブにハイブリダイゼーションした標的核酸の末端塩基から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項３】
核酸プローブが３’末端において蛍光色素で標識されている請求項２に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項４】
核酸プローブが５’末端において蛍光色素で標識されている請求項２に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項５】
蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において前記蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが、前記標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項６】
核酸プローブの３’末端塩基がＧ又はＣで、かつ３’末端が蛍光色素で標識されている請求項５に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項７】
核酸プローブの５’末端塩基がＧ又はＣで、かつ５’末端が蛍光色素で標識されている請求項５に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項８】
核酸プローブが、３’末端のリボース若しくはデオキシリボースの３’炭素の水酸基、又は３’末端のリボースの３’若しくは２’炭素の水酸基がリン酸化されている請求項４又は７に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項９】
核酸測定用核酸プローブのオリゴヌクレオチドが、化学的に修飾した核酸である請求項２〜８の何れか１項に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項１０】
化学的に修飾した核酸が2'-O-メチルオリゴヌクレオチド、2'-O-エチルオリゴヌクレオチド、2'-O-ブチルオリゴヌクレオチド、2'-O-エチレンオリゴヌクレオチド、又は2'-O-ベンジルオリゴヌクレオチドである請求項９に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項１１】
核酸測定用核酸プローブのオリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドを含むキメリックオリゴヌクレトチド（chimeric oligonucleotide)である請求項２〜８の何れか１項に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項１２】
キメリックオリゴヌクレトチドが、2'-O-メチルオリゴリボヌクレオチド、2'-O-エチルオリゴヌクレオチド、2'-O-ブチルオリゴヌクレオチド又は2'-O-ベンジルオリゴヌクレオチドを介在するものである請求項１１に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
【請求項１３】
請求項２〜８の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする標的核酸の濃度測定方法。
【請求項１４】
請求項９〜１２の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする標的核酸の濃度測定方法。
【請求項１５】
標的核酸をその高次構造が十分に破壊されるに適した条件で加熱処理後、核酸プローブと標的核酸をハイブリダイゼーションさせる請求項１４に記載の標的核酸の濃度測定方法。
【請求項１６】
加熱処理条件が８０〜１００℃、１〜１５分である請求項１５に記載の標的核酸の濃度測定方法。
【請求項１７】
標的核酸がＲＮＡである請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の標的核酸の濃度測定方法。
【請求項１８】
標的核酸の濃度を測定するキットにおいて、請求項２〜１２の何れか１項に記載の核酸プローブを含有又は付帯することを特徴とする標的核酸の濃度測定用キット。
【請求項１９】
ヘルパープローブを含有又は付帯する請求項１８に記載の標的核酸の濃度測定用キット。
【請求項２０】
標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する方法において、請求項２〜１２の何れか１項に記載の核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、蛍光強度の変化量を測定することを特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定する方法。
【請求項２１】
標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定する測定キットにおいて、請求項２〜１２の何れか１項に記載の核酸プローブを含有することを特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定するための測定キット。
【請求項２２】
ヘルパープローブを含有又は付帯する請求項２１に記載の標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定するための測定キット。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法により得られるデータを解析する方法において、標的核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正処理する過程を有することを特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法。
【請求項２４】
標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定する測定装置において、請求項２３に記載のデータ解析方法を実施するための手段を有することを特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定する測定装置。
【請求項２５】
請求項２３に記載の補正処理過程をコンピュータに実行させるための手順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な記録媒体。
【請求項２６】
請求項２〜１２の何れか１項に記載の核酸プローブ、又は一つの分子内に二つの異なった蛍光色素を有し、標的核酸にハイブリダイゼーションしていないときは、二つの蛍光色素の相互作用により消光若しくは発光しているが、標的核酸にハイブリダイゼーションすると発光若しくは消光するように設計された構造をもつ別の核酸プローブを複数個固体支持体表面に結合させ、それに標的核酸をハイブリダイゼーションさせて標的核酸の濃度を測定することができるようにしたことを特徴とする単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそれぞれ測定するためのデバイス。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸測定用デバイスにおいて、核酸プローブが固体支持体表面にアレー状に配列、結合させた単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそれぞれ測定するためのデバイス（チップ）。
【請求項２８】
固体支持体表面に結合させられた核酸プローブ毎に、反対側の表面に少なくとも一つの温度センサーとヒーターが設置され、核酸プローブ結合領域が最適温度条件になるように温度調節され得る請求項２６又は２７に記載の単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそれぞれ測定するためのデバイス。
【請求項２９】
核酸プローブを蛍光色素で標識していない端部で固体支持体表面に結合させた請求項２６〜２８の何れか１項に記載の単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそれぞれ測定するためのデバイス。
【請求項３０】
請求項２６〜２８の何れか１項に記載の核酸測定用デバイスを用いて標的核酸を測定することを特徴とする標的核酸の濃度測定方法。
【請求項３１】
請求項１、１３〜１７の何れか１項、又は請求項３０に記載の核酸の測定方法において、標的核酸が、純粋分離して得た微生物由来、又は動物由来であることを特徴とする標的核酸の濃度測定方法。
【請求項３２】
標的核酸が、複合微生物系、又は共生微生物系の細胞内若しくは細胞のホモジネートに含まれる核酸である請求項１、１３〜１７の何れか１項、又は請求項３０に記載の標的核酸の濃度測定方法。
【請求項３３】
ＰＣＲ方法において、請求項２、３、５、６、又は請求項８〜１２の何れか１項に記載の核酸プローブを用いて反応を行い、核酸伸長反応時当該プローブがポリメラーゼにより分解除去されている反応系又は核酸変性反応時若しくは核酸変性反応が完了している反応系の蛍光強度値と標的核酸若しくは増幅標的核酸が該核酸プローブとハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者からの蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲで増幅された標的核酸の濃度測定方法。
【請求項３４】
ＰＣＲ方法において、請求項４又は７に記載の核酸プローブをプライマーとして反応を行い、当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸がハイブリダイズしていない反応系の蛍光強度値と該核酸プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸とハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者の蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲで増幅された標的核酸の濃度測定方法。
【請求項３５】
ＰＣＲ方法がリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である請求項３３又は３４に記載のＰＣＲ方法の標的の増幅核酸の濃度測定方法。
【請求項３６】
請求項１、１３〜１７の何れか１項、又は請求項３０〜３５の何れか１項に記載の核酸測定法で得られたデータを解析する方法において、標的核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズした後の反応系の蛍光強度値を、そのように形成されたプローブ−核酸ハイブリッド複合体が解離した後で得られる反応系の蛍光強度値により補正することを特徴とする標的核酸の濃度測定方法のためのデータ解析方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合した後、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズした後の反応系の蛍光強度値を、各サイクルにおける形成された蛍光色素−核酸複合体、あるいはそのようにして形成されたプローブ−核酸ハイブリッド複合体が解離した後で得られる反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程（以下、補正演算処理過程という。）を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の補正演算処理過程が、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕によるものである請求項３７に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n          〔数式１〕
ｆn＝ｆden,n／ｆhyb,n          〔数式２〕
〔式中、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出されたｎサイクルにおける補正演算処理値、
ｆhyb,n：ｎ次サイクルにおいて、増幅した核酸が蛍光色素と結合した後、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズした後の反応系の蛍光強度値、
ｆden,n：ｎ次サイクルにおける、形成された蛍光色素−核酸複合体、あるいは形成されたプローブ−核酸ハイブリッド複合体が解離した後の反応系の蛍光強度値〕
【請求項３９】
請求項３５に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する請求項３８に記載の方法において、各サイクルにおける〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出された補正演算処理値を次の〔数式３〕あるいは〔数式４〕に代入し、各サイクルにおける各サンプル間の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、それらを比較することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
Ｆn＝ｆn／ｆa          〔数式３〕
Ｆn＝ｆa／ｆn          〔数式４〕
〔式中、
Ｆn：ｎ次サイクルにおける、〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値
ｆa：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値で、ｆnの変化が観察される以前の任意のサイクル数のもの〕
【請求項４０】
請求項３５に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する請求項３９に記載の方法において、
１）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデータを用いて、〔数式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による演算処理する過程、
ｌｏｇb（Ｆn）、ｌｎ（Ｆn）          〔数式５〕
ｌｏｇb｛（１−Ｆn）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆn）×Ａ｝      〔数式６〕
ｌｏｇb｛（Ｆn−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆn−１）×Ａ｝      〔数式７〕
〔式中、
Ａ、ｂ：任意の数値、
Ｆn：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出されたｎ次サイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化率〕、
２）前記１）の演算処理値が一定値に達したサイクル数を求める演算処理過程、３）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過程、
４）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー数を求める演算処理過程、
を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
【請求項４１】
標的核酸について請求項２〜１２の何れか１項に記載の核酸プローブを用いてＰＣＲを行い、標的核酸の融解曲線の分析を行って各増幅核酸のＴｍ値を求めることを特徴とする標的核酸の融解曲線の分析方法。
【請求項４２】
標的核酸について請求項４又は７に記載の核酸プローブをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、標的核酸の融解曲線の分析を行って各増幅核酸のＴｍ値を求めることを特徴とする標的核酸の融解曲線の分析方法。
【請求項４３】
請求項３７〜４０の何れか１項に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法において、ＰＣＲ法により増幅された核酸を、低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げる過程、この過程において、所定の時間間隔で蛍光強度を測定する過程、測定結果を時間に対する関数としてデスプレー上に表示して核酸の融解曲線をデスプレー上に描く過程、この融解曲線を微分して微分した値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）を得る過程、前記微分した値を微分値としてデスプレー上に表示する過程、その微分値から変曲点を求める過程、を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
【請求項４４】
請求項３７に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項３８に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項３９に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項４０に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項４３に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、を実施するための手段をそれぞれ有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び／又は解析装置。
【請求項４５】
請求項３７に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項３８に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項３９に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項４０に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項４３に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程を、コンピュータに実行させるための手順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な記録媒体。
【請求項４６】
核酸定量方法において、請求項３７〜４０、４３の何れか１項に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法を利用することを特徴とする核酸の定量方法。
【請求項４７】
核酸定量方法において、請求項４４に記載の装置を利用することを特徴とする核酸の定量方法。
【請求項４８】
核酸定量方法において、請求項４５に記載のコンピュータ読取可能な記録媒体を用いることを特徴とする核酸の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸の濃度を測定する方法、その方法のための核酸プローブ及びその方法によって得られるデータを解析する方法に関する。詳しくは蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる各種核酸の濃度の各種測定方法に関し、蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせたときに、その蛍光色素の発光が減少するという原理に基づき、すなわち、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することによる各種核酸の濃度の各種新規測定方法、それに用いる核酸プローブ及びデバイス（ｄｅｖｉｃｅｓ）、それら測定方法の一つであるＰＣＲ方法によって得られるデータを解析する方法、それぞれの解析方法を実施するための手段を備えた解析装置、解析方法の各手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて核酸濃度を測定する各種方法が知られている。該方法には、以下のようなものがある。
（１）ドットブロッテング法
この方法は、標的核酸と蛍光色素で標識された核酸プローブをメンブラン上でハイブリダイズさせた後、未反応の核酸プローブを洗い流し、標的核酸とハイブリダイズした核酸プローブに標識された蛍光色素分子のみの蛍光強度を測定するものである。
【０００３】
（２）インターカレーター方法（非特許文献１）
この方法は、インターカレーターと称されるある種の蛍光色素が核酸の二重鎖内にはまりこんだときに、強く発光するのでその発光の増加量を測定する方法である。その蛍光色素として、例えば、エチジウムブロマイド（非特許文献２）、SYBR Rグリーン(Green)I（非特許文献３）を挙げることができる。
【０００４】
（３）FRET(fluorescence energy transfer)を利用する方法（非特許文献４)
この方法は、標的核酸に二つの核酸プローブをハイブリダイズさせることからなる。二つの核酸プローブは、各々異なった蛍光色素で標識されている。二つのプローブの内の一方の蛍光色素は、ＦＲＥＴ現象を通して、エネルギーを他方のプローブの蛍光色素に送りこれを発光させることができる。二つのプローブは、蛍光色素が向き合うように、かつ１〜９塩基離れてハイブリダイズするように設計されている。それで、二つの核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズすると後者の蛍光色素の発光が起こり、発光の強さが標的核酸の複製量に比例する。
【０００５】
（４）分子ビーコン方法（非特許文献５)
この方法で使用する核酸プローブは、核酸プローブの一端にレポーター色素、他端にクエンチャー色素が標識さている。そしてその両端部は塩基配列において互いに相補性があるので、プローブ全体としてヘアーピン構造（hairpin stem)を形成するように塩基配列が設計されている。その構造のために液中に浮遊している状態では、Forster共鳴エネルギーのため、レポーター色素の発光は、クエンチャー色素により抑制されている。しかし、標的核酸にハイブリダイズするとヘアーピン構造が壊れるために、レポーター色素とクエンチャー色素の距離が大きくなるので、Forster共鳴エネルギーの移動が起こらなくなる。そのために、レポーター色素の発光が起こるようになる。
【０００６】
（５）デービスの方法（非特許文献６)
デービスは、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素を、炭素原子１８個を有するスペサーを介して結合したプローブを作成した。これをフローサイトメトリーに適用した。３’末端に蛍光色素を直接に結合した場合より、ハイブリダイズした場合、１０倍の蛍光強度が得られることを報告した。
これらの方法は、核酸の各種測定方法、ＦＩＳＨ方法（fluorescent in situ hybridization assays)、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法（ligase chain reaction)、ＳＤ方法(strand displacement assays)、競合的ハイブリダイゼーション方法(competitive hybridization)などに適用されてめざましい発展をとげている。
【０００７】
これらの方法は、現在一般的に使用されいるが、蛍光色素で標識した核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション反応を行った後、ハイブリダイズしなかった当該核酸プローブを反応系から洗い流す必要があるという好ましくない手順を有している。このような手順を除くと測定時間の短縮、測定の簡便性、測定の正確性をもたらすことは明らかである。そこで、このような手順を有さない核酸測定方法の開発が望まれていた。
【０００８】
【非特許文献１】Glazer et al., Nature 359:959,1992
【非特許文献２】実験医学、15巻、7号、46〜51ページ、1997年、羊土社
【非特許文献３】LightCyclerTM System；1999年4月5日、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発行のパンフレット
【非特許文献４】Mergney et al.,Nucleic Acid Res., 22：920-928,1994.
【非特許文献５】Tyagi et al., Nature Biotech.,14：303-308,1996.
【非特許文献６】Davis et al.、Nucleic acids Res.24：702-706、1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、前記の状況に鑑み、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる標的核酸濃度の測定方法において、より短時間に、より簡便、より正確に標的核酸の濃度を測定できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するにあたり、核酸プローブを用いた核酸の濃度を測定する方法について検討を重ねた。その結果、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズしたときに、蛍光色素の発光が減少するという現象（蛍光消光現象）があり、特定の色素においてはその減少が顕著であり、特にその減少の程度は、蛍光色素が結合した部分の塩基の種類又は塩基配列に依存するということを発見した。本発明はかかる発見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
即ち、本発明は、
１）蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法において、前記核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズしたときに、蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、前記核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする標的核酸の濃度の測定方法、また、
【００１２】
２）蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズしたときに、前記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において前記蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが当該末端部において標的核酸にハイブリダイズしたとき、当該プローブにハイブリダイズした標的核酸の末端塩基から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、
３）核酸プローブが３’末端において蛍光色素で標識されている前記２）に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また
４）核酸プローブが５’末端において蛍光色素で標識されている前記２）に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、
【００１３】
５）蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において前記蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが、前記標的核酸にハイブリダイズしたとき、当該末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッド複合体の複数塩基対が少なくとも一つのＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、
【００１４】
６）核酸プローブの３’末端塩基がＧ又はＣで、かつ３’末端が蛍光色素で標識されている前記５）に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、
７）核酸プローブの５’末端塩基がＧ又はＣで、かつ５’末端が蛍光色素で標識されている前記５）に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、
【００１５】
８）核酸プローブが、３’末端のリボース若しくはデオキシリボースの３’炭素の水酸基、又は３’末端のリボースの３’若しくは２’炭素の水酸基がリン酸化されている前記４）又は前記７）に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、
【００１６】
９）核酸測定用核酸プローブのオリゴヌクレオチドが、化学的に修飾した核酸である前記２）〜８）の何れか１項に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、
１０）化学的に修飾した核酸が2'-O-メチルオリゴヌクレオチド、2'-O-エチルオリゴヌクレオチド、2'-O-ブチルオリゴヌクレオチド又は2'-O-ベンジルオリゴヌクレオチドである前記９）に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、
１１）核酸測定用核酸プローブのオリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドを含むキメリックオリゴヌクレトチド（chimeric oligonucleotide）である前記２）〜８）の何れか１項に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、
【００１７】
１２）キメリックオリゴヌクレトチドが、2'-O-メチルオリゴリボヌクレオチド、2'-O-エチルオリゴヌクレオチド、2'-O-ブチルオリゴヌクレオチド、2'-O-アルキレンオリゴヌクレオチド又は2'-O-ベンジルオリゴヌクレオチドを介在するものである前記１１）に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、
１３）前記２）〜８）の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする標的核酸の濃度測定方法、また、
【００１８】
１４）前記９）〜１２）の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする標的核酸の濃度測定方法、また、
１５）標的核酸をその高次構造が十分に破壊されるに適した条件で加熱処理後、核酸プローブと標的核酸をハイブリダイズさせる前記１４）に記載の標的核酸の濃度測定方法。
１６）ハイブリダイゼーション反応前にハイブリダイゼーション反応実施のためのハイブリダイゼーション反応系にヘルパープローブを添加する前記１４）又は前記１５）に記載の標的核酸の濃度測定方法、また、
【００１９】
１７）ヘルパープローブの塩基配列が（5')TCCTTTGAGT TCCCGGCCGG A(3')又は／及び(5')CCCTGGTCGT AAGGGCCATG ATGACTTGAC GT(3')である前記１６）に記載の標的核酸の濃度測定方法、また、
１８）加熱処理条件が８０〜１００℃、１〜１５分である前記１５）〜１７）のいずれか１項に記載の標的核酸の濃度測定方法、また、
１９）標的核酸がＲＮＡである前記１３）〜１８）のいずれか１項に記載の標的核酸の濃度測定方法、また、
２０）標的核酸の濃度を測定するキットにおいて、前記２）〜１２）の何れか１項に記載の核酸プローブを含有又は付帯することを特徴とする標的核酸の濃度測定用キット、また、
２１）ヘルパープローブを含有又は付帯する前記２０）に記載の標的核酸の濃度測定用キット、また、
【００２０】
２２）標的核酸の多型(polymorphism)又は／及び変異（mutation)を解析若しくは測定する方法において、前記２）〜１２）の何れか１項に記載の核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、蛍光強度の変化量を測定することを特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定する方法、また、
２３）標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定する測定キットにおいて、前記２）〜１２）の何れか１項に記載の核酸プローブを含有又は付帯することを特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定するキット、また、
【００２１】
２４）ハイブリダイゼーション反応系に添加するためのヘルパープローブを含有又は付帯する前記２３）に記載の標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定するキット、また、
２５）前記２２）に記載の方法により得られるデータを解析する方法において、標的核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正処理する過程を有することを特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法、また、
【００２２】
２６）標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定する測定装置において、前記２５）に記載のデータ解析方法を実施するための手段を有することを特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測定する測定装置、また、
２７）前記２５）に記載の補正処理過程をコンピュータに実行させるための手順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、
【００２３】
２８）前記２）〜１２）の何れか１項に記載の核酸プローブ、又は一つの分子内に二つの異なった蛍光色素を有し、標的核酸にハイブリダイズしていないときは、二つの蛍光色素の相互作用により消光若しくは発光しているが、標的核酸にハイブリダイズすると発光若しくは消光するように設計された構造をもつ別の核酸プローブを複数個固体支持体表面に結合させ、それに標的核酸をハイブリダイズさせて標的核酸の濃度を測定することができるようにしたことを特徴とする単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそれぞれ測定するためのデバイス、また、
【００２４】
２９）前記２８）に記載の核酸測定用デバイスにおいて、核酸プローブが固体支持体表面にアレー状に配列、結合させた単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそれぞれ測定するためのデバイス（チップ）、また、
３０）固体支持体表面に結合させられた核酸プローブ毎に、反対側の表面に少なくとも一つの温度センサーとヒーターが設置され、核酸プローブ結合領域が最適温度条件になるように温度調節され得る前記２８）、又は前記２９）に記載の単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそれぞれ測定するためのデバイス、また、  ３１）核酸プローブを蛍光色素で標識していない端部で固体支持体表面に結合させた前記２８）〜３０）の何れか１項に記載の単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそれぞれ測定するためのデバイス、また、
【００２５】
３２）前記２８）〜３０）の何れか１項に記載の核酸測定用デバイスを用いて標的核酸を測定することを特徴とする標的核酸の濃度測定方法、また、
３３）前記１）、１３）〜１９）の何れか１項、又は前記３２）に記載の核酸の測定方法において、標的核酸が、純粋分離して得た微生物由来、又は動物由来であることを特徴とする標的核酸の濃度測定方法、また、
３４）標的核酸が、複合微生物系、又は共生微生物系の細胞内若しくは細胞のホモジネートに含まれる核酸である前記１）、又は前記１３）〜１９）の何れか１項、又は３２）に記載の標的核酸の濃度測定方法、また、
【００２６】
３５）ＰＣＲ方法において、前記２）〜３）、５）、６）、又は前記８）〜１２）の何れか１項に記載の核酸プローブを用いて反応を行い、核酸伸長反応時当該プローブがポリメラーゼにより分解除去されている反応系又は核酸変性反応時若しくは核酸変性反応が完了している反応系の蛍光強度値と標的核酸若しくは増幅標的核酸が該核酸プローブとハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者からの蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲで増幅された標的核酸の濃度測定方法、また、
【００２７】
３６）ＰＣＲ方法において、前記４）又は前記７）に記載の核酸プローブをプライマーとして反応を行い、当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸がハイブリダイズしていない反応系の蛍光強度値と該核酸プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸とハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者の蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲで増幅された標的核酸の濃度測定方法、また、
３７）ＰＣＲ方法がリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である前記３５）又は前記３６）に記載のＰＣＲ方法の標的の増幅核酸の濃度測定方法、また、
【００２８】
３８）前記１）、１３）〜１９）の何れか１項、又は前記３２）〜３７）の何れか１項に記載の核酸測定法で得られたデータを解析する方法において、標的核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズした後の反応系の蛍光強度値を、そのように形成されたプローブ−核酸ハイブリッド複合体が解離した後で得られる反応系の蛍光強度値により補正することを特徴とする標的核酸の濃度測定方法のためのデータ解析方法、また、
【００２９】
３９）前記３７）に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合した後、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズした後の反応系の蛍光強度値を、各サイクルにおける形成された蛍光色素−核酸複合体、あるいはそのようにして形成されたプローブ−核酸ハイブリッド複合体が解離した後で得られる反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程（以下、補正演算処理過程という。）を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法、また、
【００３０】
４０）前記３９）に記載の補正演算処理過程が、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕によるものである前記３９）に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法、また、
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n          〔数式１〕
ｆn＝ｆden,n／ｆhyb,n          〔数式２〕
〔式中、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出されたｎ次サイクルにおける補正演算処理値、
ｆhyb,n：ｎ次サイクルにおいて、増幅した核酸が蛍光色素と結合した後、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズした後の反応系の蛍光強度値、
ｆden,n：ｎ次サイクルにおける、形成された蛍光色素−核酸複合体、あるいは形成されたプローブ−核酸ハイブリッド複合体が解離した後の反応系の蛍光強度値〕、また、
【００３１】
４１）前記３７）に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する前記４０）に記載の方法において、各サイクルにおける〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出された補正演算処理値を次の〔数式３〕あるいは〔数式４〕に代入し、各サイクルにおける各サンプル間の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、それらを比較することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法、また、
Ｆn＝ｆn／ｆa          〔数式３〕
Ｆn＝ｆa／ｆn          〔数式４〕
〔式中、
Ｆn：ｎ次サイクルにおける、〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値
ｆa：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値で、ｆnの変化が観察される以前の任意のサイクル数のもの〕、また、
【００３２】
４２）前記３７）に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する前記４１）に記載の方法において、
（ａ）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデータを用いて、〔数式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による演算処理する過程、
ｌｏｇb（Ｆn）、ｌｎ（Ｆn）          〔数式５〕
ｌｏｇb｛（１−Ｆn）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆn）×Ａ｝      〔数式６〕
ｌｏｇb｛（Ｆn−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆn−１）×Ａ｝      〔数式７〕
〔式中、
Ａ、ｂ：任意の数値、
Ｆn：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出されたｎ次サイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化率〕、
（ｂ）前記（ａ）の演算処理値が一定値に達したサイクル数を求める演算処理過程、
（ｃ）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過程、
（ｄ）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー数を求める演算処理過程、
を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法、また、
【００３３】
４３）標的核酸について前記２）〜１２）の何れか１項に記載の核酸プローブを用いてＰＣＲを行い、標的核酸の融解曲線の分析を行って各増幅核酸のＴｍ値を求めることを特徴とする標的核酸の融解曲線の分析方法、また、
４４）標的核酸について前記４）又は前記７）に記載の核酸プローブをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、標的核酸の融解曲線の分析を行って各増幅核酸のＴｍ値を求めることを特徴とする標的核酸の融解曲線の分析方法、また、
【００３４】
４５）前記３９）〜４２）の何れか１項に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法において、ＰＣＲ法により増幅された核酸を、低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げる過程、この過程において、所定の時間間隔で蛍光強度を測定する過程、測定結果を時間に対する関数としてデスプレー上に表示して核酸の融解曲線をデスプレー上に描く過程、この融解曲線を微分して微分した値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）を得る過程、前記微分した値を微分値としてデスプレー上に表示する過程、その微分値から変曲点を求める過程、を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法、また、
４６）前記３９）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、前記４０）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、前記４１）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、前記４２）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、前記４５）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、を実施するための手段をそれぞれ有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び／又は解析装置、また、
【００３５】
４７）前記３９）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、前記４０）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、前記４１）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、前記４２）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、前記４５）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程を、コンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、
【００３６】
４８）核酸定量方法において、前記３９）〜４２）何れか１項、又は前記４５）に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法を利用することを特徴とする核酸の定量方法、また、
４９）核酸定量方法において、前記４６）に記載の装置を利用することを特徴とする核酸の定量方法、また、
５０）核酸定量方法において、前記４７）に記載のコンピュータ読取可能な記録媒体を用いることを特徴とする核酸の定量方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００３７】
本発明は次のような効果を有する。
１）本発明の標的核酸の濃度を測定する方法、本発明の各種の核酸プローブ、特に２−Ｏ−アルキルオリゴヌクレオチド若しくは２−Ｏ−アルキレンオリゴヌクレオチド、２−Ｏ−ベンジルオリゴヌクレオチドなど化学的修飾オリゴヌクレオチドなどからなる本発明の核酸プローブ、またオリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドが介在するキメリックオリゴヌクレオチドなどからなる本発明の核酸プローブ、それらの本発明の核酸プローブを含有若しくは付帯する、標的核酸の濃度を測定する測定キット、及び前記の本発明の核酸プローブを結合してなるＤＮＡチップなどの核酸チップ若しくは核酸デバイスを用いると、測定系から未反応の核酸プローブを除く等の操作をすることがないので、標的核酸の濃度を短時間でかつ簡便に測定できる。また、複合微生物系又は共生微生物系に適用すると、当該系における特定菌株の存在量を特異的かつ短時間に測定できる。また、本発明は標的核酸若しくは遺伝子のＳＮＰなどの多型又は変異などの解析若しくは測定する簡便な方法を提供している。
２）また、本発明の定量的ＰＣＲ方法は、次のような効果を有する。
ａ．ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる標的核酸の増幅に阻害的に作用する因子が添加されていないことから、従来公知の特異性のある通常のＰＣＲと同様の条件で定量的ＰＣＲを行うことができる。
ｂ．また、ＰＣＲの特異性を高く保つことができるので、プライマーダイマーの増幅が遅くなることから、従来公知の定量的ＰＣＲと比較すると定量限界が約１桁のオーダー低くなる。
ｃ．複雑な核酸プローブを用意する必要がないので、それに要する時間と費用が節約できる。
ｄ．標的核酸の増幅効果も大きく、増幅過程をリアルタイムでモニタリングすることができる。
３）また、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する際、本発明のデータ解析方法を用いて、未知核酸コピー数の核酸試料について核酸のコピー数を求める検量直線を作成すると、検量線の相関係数は従来の方法により得られたものに較べて格段に高い。それで、本発明のデータ解析方法を用いると核酸の正確なコピー数を求めることができる。
４）また、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法によって得られたデータの解析方法に係るデータ解析用ソフトウエア、また、その解析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、相関係数の高い検量直線を自動的に作成することができる。
５）また、本発明の新規な核酸の融解曲線の分析方法を用いると、精度の高い、核酸のＴｍ値を求めることができる。更に、当該方法に係るデータ解析用ソフトウエア、また、その分析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、正確なＴｍ値を求めることができる
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
本発明の第一の特徴は、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる標的核酸の濃度を測定する方法において、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズしたときに生ずる、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することにある。
本発明において、プローブ−核酸ハイブリッド複合体とは、本発明の蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズした状態のもの（複合体）のことを云う。そして簡便化のために、以下、核酸ハイブリッド複合体と略称する。
蛍光色素−核酸複合体とは、蛍光色素が標的核酸と結合した複合体のことを云う。例えば、２重鎖核酸内にインターカレターが結合した状態ものを挙げることができる。
また、本発明において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＸＴＰｓ、ｄＸＴＰｓ、ＮＴＰｓ、ｄＮＴＰｓ、核酸プローブ、ヘルパー核酸プローブ（又は核酸ヘルパープローブ、又は単にヘルパープローブ）、ハイブリダイズ、ハイブリダイゼーション、インターカレーター、プライマー、アニーリング、伸長反応、熱変性反応、核酸融解曲線、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ法、ハイブリダイゼーションアッセイ方法（hybridization assays)、ＦＩＳＨ(fluorescent in situ hybridization assays)方法、ＰＣＲ方法(polymerase chain assays）、ＬＣＲ方法（ligase chain reaction)、ＳＤ方法(strand displacement assays)、競合的ハイブリダイゼーション方法(competitive hybridization)、ＤＮＡチップ、核酸検出用（遺伝子検出用）デバイス，ＳＮＰ（スニップ：一塩基置換多型）、複合微生物系等の用語は、現在、分子生物学、遺伝子工学、微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００３９】
本発明において標的核酸の濃度を測定するとは、測定系の単数種若しくは複数種の核酸について、濃度を定量をすること、定量的検出をすること、単なる検出をすること、または、多型・変異などの解析をすることなどを云う。なお、複数種の核酸の場合は、同時に複数種の核酸の定量的検出、同時に複数種の核酸の単なる検出、または、同時に複数種の核酸の多型・変異などの解析をすることなどは、当然本発明の技術的範囲内のものである。
標的核酸濃度測定用デバイスとは各種のＤＮＡチップなどのことをいう。その具体例としては、とりもなおさず各種のＤＮＡチップを挙げることができる。本発明においては本発明の核酸プローブが適用できるならば、どのような形式のＤＮＡチップでもよい。
蛍光色素で標識された核酸プローブ（以下、単に本発明の核酸プローブ又は本発明のプローブという。）を用いて、標的核酸の濃度を測定する方法（以下、簡便化のために、単に核酸測定方法という。）とは、ハイブリダイゼーション方法(hybridization assays)、ＦＩＳＨ方法(fluorescent in situ hybridization  assays)、ＰＣＲ方法(polymerase  chain assays）、ＬＣＲ方法(ligase chain reaction)、ＳＤ方法(strand displacement assays)、競合的ハイブリダイゼーション方法(competitive hybridization)などの方法により標的核酸の濃度を測定することをいう。
従来、これらの方法では、蛍光色素で標識された核酸プローブを加えた後、標的核酸にハイブリダイズしなかった未反応の当該核酸プローブの蛍光色素を測定系から洗浄等の方法で除去し、標的核酸にハイブリダイズした当該核酸プローブに標識された蛍光色素を当該プローブから直接的に、又は当該プローブに間接的な手段を施して（例えば、酵素を作用させたりして）、発光させて、その発光量を測定する方法である。本発明は、これらの方法においてこのような複雑な操作をしないで目的核酸を測定することに特徴がある。
【００４０】
本発明において標的核酸とは、濃度の測定を目的とする核酸若しくは遺伝子のことを云う。精製の有無を問わない。また、濃度の大小も問わない。各種の核酸が混在していてもよい。例えば、複合微生物系（複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）又は共生微生物系（複数の動植物及び／又は複数の微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）における濃度の測定を目的とする特定核酸である。尚、標的核酸の精製が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例えば、市販されている精製キット等を使用して行うことができる。上記の核酸の具体例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（oligodeoxyribonucleotides)、オリゴリボヌクレオチド(oligoribonucleotides）等、また、前記核酸の化学的修飾核酸を挙げることができる。化学的修飾核酸として2'-O-メチル（Ｍｅ）ＲＮＡ等を例示することができる。
【００４１】
本発明において蛍光色素は、一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられるものが便利に使用できるが、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズしたときに、プローブに標識した当該蛍光色素が、その発光を減少させるものが好適に用いられる。例えば、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類｛例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）（FITC）若しくはその誘導体等、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、EDANS（5-(2'-aminoethyl)amino-1-naphthalene sulfonic acid）｝、ローダミン（rhodamine）6G（R6G）又はその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（teramethylrhodamine）（TMR）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate)(TMRITC)、ｘ−ローダミン（x-rhodamine)、テキサスレッド(Texas red)、ボデピー(BODIPY)FL(商標名;モレキュラー・プローブ(Molecular Probes)社製、米国）、ボデピー(BODIPY)FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes)社製、米国）、ボデピー(BODIPY)FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー(BODIPY)5-FAM（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）TMR（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、又はその誘導体（例えば、ボデピー（BODIPY）TR（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、デピー（BODIPY）R6G（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）564（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）581（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）等を挙げることができる。これらの中でも、FITC、EDANS、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、ボデピー（BODIPY）FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）等を好適なものとして、また、FITC、TMR、6-jeo、ボデピー（BODIPY）FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）をより好適なものとして挙げることができる。
【００４２】
標的核酸にハイブリダイズさせる本発明の核酸プローブは、オリゴデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよいし、オリゴリボヌクレオチドで構成されていてもよい。また、それらの両方を含むキメリックオリゴヌクレオチド（chimeric oligonucleodite）でもよい。それらのオリゴヌクレオチドは化学的修飾を受けたものでもよい。化学的修飾を受けたオリゴヌクレオチドをキメリックオリゴヌクレオチドの鎖中に介在させてもよい。
【００４３】
前記の化学的修飾を受けたオリゴヌクレオチドの修飾部位として、オリゴヌクレオチド末端部の末端水酸基若しくは末端リン酸基、インターヌクレオシドリン酸部位、ピリミジン環の５位の炭素、ヌクレオシドの糖（リボース若しくはデオキシリボース）部位を挙げることができる。好適にはリボース若しくはデオキシリボース部位を挙げることができる。具体的には、2'-O-アルキルオリゴリボヌクレオチド(2'-O-alkyloligoribonucleotideｓ）（以下、2'-O-を2-O-に略記する。）、2-O-アルキレンオリゴリボヌクレオチド（2-o-alkyleneoligoribonucleotides)、2-O-ベンジルオリゴリボヌクレオチド(2-o-benzyloligoribonucleotides)を例示することができる。当該オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドの任意の位置の単数若しくは複数のリボースの２’位炭素のＯＨ基がアルキル基、アルキレン基若しくはベンジル基で修飾（エーテル結合で）されているものである。本発明においては、好適には、2-O-アルキルオリゴリボヌクレオチドのなかでも、2-O-メチルオリゴリボヌクレオチド、2-O-エチルオリゴリボヌクレオチド、2-O-ブチルオリゴリボヌクレオチド、2-O-ベンジルオリゴリボヌクレオチドが、2-O-アルキレンオリゴリボヌクレオチドの中では、2-O-エチレンオリゴリボクレオチドが、及び2-O-ベンジルオリゴリボヌクレオチドが、特に好適には、2-O-メチルオリゴリボヌクレオチド（以下、単に2-O-Meオリゴリボヌクレオチドと略記する。）が用いられる。このような化学的修飾を、オリゴヌクレオチドに施すことにより、標的核酸との親和性が高まり、本発明の核酸プローブのハイブリダイゼーション効率が向上する。ハイブリダイゼーション効率が高まると、本発明の核酸プローブの蛍光色素の蛍光強度の減少率が更に向上するので、標的核酸の濃度の測定が精度が更に向上する。
なお、本発明において、オリゴヌクレオチドなる用語は、オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチド若しくはその双方を意味するもので、それらを総称するものとする。
2-O-アルキルオリゴリボヌクレオチド、2-O-アルキレンオリゴリボヌクレオチド、2-O-ベンジルオリゴリボヌクレオチドは、公知の方法（Nucleic Acids Research、２６巻、２２２４〜２２２９ページ、１９９８年）で合成できる。また、GENSET(株式会社）（フランス）が委託合成を行っているので、容易に入手できる。本発明者らは当該会社に当該化合物の合成を委託して実験を行って、本発明を完成した。
【００４４】
尚、2-O-メチルオリゴリボヌクレオチド（以下、単に2-O-Meオリゴリボヌクレオチドという。）のような修飾されたＲＮＡをオリゴデオキシリボヌクレオチドの中に介在させた本発明の核酸プローブは主にＲＮＡ特にｒＲＮＡの測定に用いると好ましい結果が得られる。
本発明の核酸プローブを使用してＲＮＡを測定する場合、当該プローブとハイブリダイズさせる前に、試料であるＲＮＡ溶液を、８０〜１００℃、好ましくは９０〜１００℃、最適には９３〜９７℃で、１〜１５分間、好ましくは２〜１０分間、最適には３〜７分間、加熱処理してＲＮＡの高次構造を破壊することがハイブリダイゼーション効率を向上させるのに好適である。
【００４５】
更に、本発明の核酸プローブの、ハイブリダイゼーション配列領域へのハイブリダイゼーション効率を更に上げるためにヘルパープローブ（helper probe）をハイブリダイゼーション反応溶液に添加することが好適である。この場合、ヘルパープローブのオリゴヌクレオチドはオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチドでも、また、前記と同様な化学的修飾を受けたオリゴヌクレオチドでもよい。前記のオリゴヌクレオチドの一例として、フォワード（forward）型として（5')TCCTTTGAGT TCCCGGCCGG A(3')、バックワード（back ward）型若しくはリバース(reverse ward)型として（5')CCCTGGTCGT AAGGGCCATG ATGACTTGAC GT(3')なる塩基配列のものを挙げることができる。化学的修飾を受けたオリゴヌクレオチドの好適な例として、2-O-アルキルオリゴリボヌクレオチド、特に2-O-Meオリゴリボヌクレオチドを例示できる。
本発明の核酸プローブの塩基鎖が３５塩基以下の場合、ヘルパープローブの利用は、特に効果的である。３５塩基鎖を超える本発明の核酸プローブを使用する場合は、標的のＲＮＡを熱変性するだけでよい場合もある。
前記のようにして、本発明の核酸プローブをＲＮＡにハイブリダイズさせると、ハイブリダイゼーション効率が高まるので反応液中のＲＮＡの量に応じて蛍光強度が減少し、最終ＲＮＡ濃度が約１５０ｐＭまでＲＮＡを測定できるようになる。
かくして、本発明は、本発明の核酸プローブを含有若しくは付帯する、標的核酸の濃度を測定する測定キットに前記のヘルパープローブを含有、付帯させるなる、標的核酸の濃度を測定する測定キットでもある。
【００４６】
核酸プローブを用いる従来のハイブリダイゼーション方法によるＲＮＡの測定において、核酸プローブとしてオリゴデオキシリボヌクレオチド体又はオリゴリボヌクレオチド体が用いられてきた。ＲＮＡはそれ自体が強固な高次構造をとるため、プローブと標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション効率が悪く、定量性に乏しかった。そのために、ＲＮＡを変性させた後、メンブランに固定してからハイブリダイゼーション反応を行うという繁雑性を従来方法は有していた。これに対して、前記の本発明方法は、ＲＮＡの特定構造部と高い親和性を有するリボース部修飾核酸プローブを用いているので、従来方法に較べて高い温度でハイブリダイゼーション反応を行うことができる。それで、ＲＮＡの高次構造の前記悪影響は、前処理としての加熱変性処理、ヘルパープローブの併用だけで克服可能である。これにより本発明方法においてハイブリダイゼーション効率は実質的に１００％になり、定量性が向上する。また、従来方法に較べて格段に簡便になる。
【００４７】
本発明のプローブの塩基数は５〜５０であり、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１５〜２０である。５０を超える場合は、ＦＩＳＨ方法に用いたとき細胞膜の透過性が悪くなり、本発明の適用範囲を狭めることになる。５未満の場合は、非特異的ハイブリダイゼーションが惹起し易くなり、測定誤差が大きくなる。
【００４８】
そのプローブの塩基配列は、標的核酸に特異的にハイブリダイズするものであればよく、特に限定されない。好ましくは、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズしたとき、
（１）当該プローブにハイブリダイズした標的核酸の末端塩基部から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）がすくなとも１塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されいる塩基配列、
（２）当該プローブの末端部分において核酸ハイブリッド複合体の複数の塩基対が少なくとも１対のＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されている塩基配列、が好ましい。
【００４９】
本発明の核酸プローブのオリゴヌクレオチドは、通常の一般的オリゴヌクレオチドの製造方法で製造できる。例えば、化学合成法、プラスミドベクター、ファージベクター等を使用する微生物法等で製造できる（Tetrahedron letters、22巻、1859〜1862頁、1981年;Nucleic acids Research、14巻、6227〜6245頁、1986年）。尚、現在、市販されている核酸合成機を使用するのが好適である（例えば、ABI394(Perkin Elmer社製、USA)）。
【００５０】
オリゴヌクレオチドに蛍光色素を標識するには、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用することができる（Nature Biotechnology、14巻、303〜308頁、1996年;Applied and Environmental Microbiology、63巻、1143〜1147頁、1997年;Nucleic acids Research、24巻、4532〜4535頁、1996年）。例えば、５´末端に蛍光色素分子を結合させる場合は、先ず、常法に従って５´末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、-(CH2)n-SHを導入する。これらの導入体は市販されているので市販品を購入してもよい（メドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー（Midland Certified Reagent Company））。この場合、ｎは３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明の核酸プローブとすることができる。
【００５１】
また、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素を結合させることもできる。この場合は、リボース又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、-(CH2)n-NH2を導入する。これらの導入体も前記と同様にして市販されているので市販品を購入してもよい（メドランド・サーテイファイフド・レージント・カンパニー（Midland Certified Reagent Company））。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペサーとして、例えば、-(CH2)n-SHを導入する。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７である。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明の核酸プローブとすることができる。このアミノ基を導入する場合、キット試薬（例えば、Uni-link  aminomodifier（CLONTECH社製、米国）、フルオ・リポターキット（FluoReporter Kit)F-6082、F-6083、F-6084、F-10220（いずれもモレクキュラー・プローベ（Molecular Probes）社製、米国））を用いるのが便利である。そして、常法に従って当該オリゴリボヌクレオチドに蛍光色素分子を結合させることができる。また、プローブ核酸の鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能である（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 225,32-38頁（1998年））。
【００５２】
以上のようにして本発明の核酸プローブが調製できるが、好ましいプローブの形態は、３’又は５’末端が蛍光色素が標識されたものであり、その標識されている末端の塩基がＧ又はＣであるものである。５’末端が標識され、３’末端が標識されていない場合、３’末端のリボース又はデオキシリボースの３’位炭素のＯＨ基をリン酸基等、また３’末端のリボースの２’位炭素のＯＨ基をリン酸基等で修飾してもよく何ら制限されない。
【００５３】
本発明の核酸プローブは、単に核酸測定だけでなく、標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する方法に好適に利用できる。特に標的核酸濃度測定用デバイス｛ＤＮＡチップ（蛋白質  核酸  酵素、43巻、2004〜2011ページ、1998年）｝に応用することによりより便利な標的核酸濃度測定用デバイスを提供する。また、当該デバイスを用いて標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する方法は極めて便利な方法である。すなわち、本発明の核酸プローブとのハイブリダイゼーションにおいて、ＧＣペアーを形成するかどうかにより、蛍光強度が変化する。それで、本発明の核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、発光強度を測定することにより、標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測定することができる。具体的方法は、実施例１４、１５に記した。この場合、標的核酸は各種の核酸増幅方法のうちの一つの方法により増幅された増幅物でもよいし、抽出されたものでもよい。また標的核酸はその種類を問わない。ただ、鎖中又は末端にグアニン塩基又はシトシン塩基が存在しておればよい。鎖中又は末端にグアニン塩基又はシトシン塩基が存在しないと蛍光強度が減少しない。よって、本発明方法により、Ｇ→Ａ、Ｇ←Ａ、Ｃ→Ｔ、Ｃ←Ｔ、Ｇ→Ｃ、Ｇ←Ｃの変異、又は置換、すなわち、１塩基多型（single nucleotide polymorphism(SNP)）などの多型（polymorphism）等を解析若しくは測定することができる。なお、現在、多型分析は、マキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert)法、ジデオキシ（dideoxy）法を用いて標的核酸の塩基配列を決定することにより行われているのが現状である。
【００５４】
それで、本発明の核酸プローブを標的核酸の多型（polymorphism）及び変異（mutation）を解析若しくは測定する測定キットに含有させることにより、標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する測定キットとして好適に使用することができる。
【００５５】
本発明の標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する方法により得られるデータを解析する場合に、標的核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正する処理過程を設けると、処理されたデータは信頼性の高いものになる。
それで本発明は、標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutation)を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法を提供する。
【００５６】
また、本発明の特徴は、標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する測定装置において、標的核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正処理する手段を有することを特徴とする標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する測定装置である。
【００５７】
また、本発明の特徴は、標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する方法により得られるデータを解析する場合に、標的核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正する処理過程をコンピュータに実行させるための手順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。
【００５８】
本発明の核酸プローブは固体（支持層）表面、例えばスライドガラスの表面に固定されていてもよい。この場合、蛍光色素で標識されていない端が固定されているのが好ましい。この形式は現在ＤＮＡチップと言われる。遺伝子発現（gene  expression）のモニタリング、塩基配列（base  sequence）の決定，変異解析（mutation analysis），１塩基多型（single nucleotide polymorphism(SNP)）などの多型解析（polymorphism analysis）等に使用できる。勿論、核酸測定用デバイス（チップ）として使用することもできる。
【００５９】
本発明の核酸プローブを例えばスライドガラスの表面に結合させるには、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンをコートしたスライドガラス、アルデヒド基を導入したスライドガラス、アミノ基を導入したスライドガラスを先ず用意する。そして、i)ポリ陽イオンをコートしたスライドガラスには、プローブのリン酸基を反応させる、ii)アルデヒド基を導入したスライドガラスには、アミノ基を導入したプローブを反応させる、iii)アミノ基を導入したスライドガラスには、ＰＤＣ（pyridinium dichromate）導入、アミノ基又はアルデヒド基導入したプローブを反応させる、などにより達成できる(Fodor,P.A.,et al.,Science,251,767-773(1991);Schena,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,93,10614-10619(1996);McGal,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,93,13555-13560(1996);Blanchad,A.P.,et al.,Biosens.Bioelectron.,11,687-690(1996))。
【００６０】
本発明の核酸プローブを固体表面にアレー状に配列、結合させたデバイスは核酸測定がより便利になる。
この場合、塩基配列の異なる多くの本発明の核酸プローブを、個別に同一固体表面上に結合しているデバイスをつくることにより、同時に多種類の標的核酸を測定できる。
このデバイスにおいては、プローブ毎に、前記固体の本発明の核酸プローブを結合した面と反対側の面に少なくとも一つの温度センサーとヒーターが設け、そのプローブを結合した前記固体の領域が最適温度条件になるように温度調節され得るように設計されているのが好適である。
【００６１】
このデバイスにおいては、本発明の核酸プローブ以外のプローブ、例えば、一つの分子内に二つの異なった蛍光色素を有し、標的核酸にハイブリダイズしていないときは、二つの蛍光色素の相互作用により、消光若しくは発光しているが、標的核酸にハイブリダイズすると発光若しくは消光するように設計された構造をもつ核酸プローブ、即ち、前記の分子ビーコン(Tyagi et al.,Nature Biotech.,14:303-308,1996)等を結合したものも好適に使用できる。それで、このようなデバイスも本発明の技術的範囲内に含まれる。
【００６２】
本発明のデバイスを用いる測定方法の基本的操作は、核酸プローブを結合した固体表面上にｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ等の標的核酸を含む溶液をのせ、ハイブリダイズさせるだけである。これにより、標的核酸量に応じて蛍光量の変化がおこり、その蛍光変化量から標的核酸の測定が可能となる。また、一つの固体表面上に塩基配列の異なる本発明の核酸プローブを多数種結合させることにより、一度に多くの標的核酸の濃度を測定することができる。それで、ＤＮＡチップと全く同じ用途で標的核酸の測定に使用できるので新規のＤＮＡチップである。最適の反応条件では標的核酸以外の核酸は蛍光の発光量を変化させないために、未反応な核酸を洗浄する操作は必要がない。更に、微小ヒーターにて本発明の核酸プローブ毎に温度コントロールすることにより、当該プローブ毎に最適反応条件にコントロールできるために正確な濃度の測定が可能となる。また、微小ヒーターにて温度を連続的に変化させ、その間、蛍光量を測定することにより、本発明の核酸プローブと標的核酸との解離曲線を解析することができる。その解離曲線の違いからハイブリダイズした核酸の性質の判定や、ＳＮＰの検出ができる。
【００６３】
従来の標的核酸の濃度測定用デバイスは、蛍光色素で修飾されていない核酸プローブを固体表面に結合（固定：fix）し、それに蛍光色素で標識した標的核酸をハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズしていない標的核酸を洗い流して、残存している蛍光色素の蛍光強度を測定していた。
蛍光色素で標的核酸を標識するには、例えば、特定ｍＲＮＡを標的とした場合、次のステップ（steps）を取る：（１）細胞から抽出されたｍＲＮＡ全部を抽出する。（２）それから、逆転写酵素（reverse transcriptase）を用いて、蛍光色素で修飾されヌクレオサイドをとり込ませながらｃＤＮＡを合成する。本発明ではこのような操作は必要がない。
【００６４】
当該デバイスには各種のプローブが多数スポットしてあるが、その各々のプローブにハイブリダイズする核酸の最適ハイブリダイゼーション条件、例えば、温度等は各々異なる。よって本来であれば、プローブ毎（スポット毎）に、ハイブリダイゼーション反応、洗浄操作を最適な条件で行う必要がある。しかし、それは物理的に不可能であるので、すべてのプローブ毎に同一の温度でハイブリダイゼーションを行い、また、洗浄も同一温度で同一洗浄液で行われている。それで、ハイブリダイゼーションが期待されている核酸がハイブリダイズしなかったり、ハイブリダイズしてもハイブリダイゼーションが強固でないので容易に洗い流されてしまう等の欠点を有していた。そのような原因で核酸の定量性が低いものであった。本発明ではこの洗浄操作が必要ないのでこのような欠点を有しない。また、スポットの底に微小ヒータを設け、ハイブリダイゼーション温度をコントロールすることで、本発明のプローブ毎に最適温度でハイブリダイゼーション反応を行わせることができる。それで、本発明は定量性が格段に向上したものである。
【００６５】
本発明においては、前記した本発明の核酸プローブ又はデバイスを使用することで、標的核酸の濃度を短時間で、簡便かつ特異的に測定することができる。以下に測定法を述べる。
本発明の測定方法において、先ず、測定系に本発明の核酸プローブを添加し、標的核酸にハイブリダイズさせる。その方法は、通常の既知方法で行なうことができる（Analytical Biochemistry、183巻、231〜244頁、1989年;Nature Biotechnology、14巻、303〜308頁、1996年;Applied and Environmental Microbiology、63巻、1143-1147頁、1997年）。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、塩濃度が０〜２モル濃度、好ましくは０．１〜１．０モル濃度、ｐＨは６〜８、好ましくは６．５〜７．５である。
【００６６】
反応温度は、本発明の核酸プローブが標的核酸の特異的部位にハイブリダイズして得られる核酸ハイブリッド複合体のＴｍ値±１０℃の範囲内であるのが好ましい。このようにすることにより非特異的なハイブリダイゼーションを防止することができる。Ｔｍ−１０℃未満のときは、非特異的ハイブリダイゼーション起こり、Ｔｍ＋１０℃を越えるときは、ハイブリダイゼーションが起こらない。尚、Ｔｍ値は本発明の核酸プローブを設計するのに必要な実験と同様にして求めることができる。すなわち、本発明の核酸プローブとハイブリダイズする（当該核酸プローブに対して相補する塩基配列の）オリゴヌクレオチドを前記の核酸合成機等で化学合成し、当該核酸プローブとの核酸ハイブリッド複合体のＴｍ値を通常の方法で測定する。
【００６７】
また、その反応時間は１秒間〜１８０分間、好ましくは５秒間〜９０分間である。１秒間未満のときは、ハイブリダイゼーションにおいて未反応の本発明の核酸プローブが多くなる。また、反応時間を余り長くしても特に意味がない。なお、反応時間は核酸種、すなわち、核酸の長さ、あるいは塩基配列によって大きく影響を受ける。
前記のようにして、本発明の核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせる。そして、ハイブリダイゼーションの前後で、蛍光色素の発光量を蛍光光度計で測定し、発光の減少量を計算する。その減少量の大きさは標的核酸の濃度と比例するので、標的核酸の濃度を求めることができる。
【００６８】
反応液中の標的核酸の濃度：０．１〜１０．０ｎＭであるのが好ましい。反応液中の本発明の核酸プローブの濃度：１．０〜２５．０ｎＭであるが好ましい。検量線を作成する場合は、標的核酸に対して、本発明の核酸プローブを１．０〜２．５の比率で用いるのが望ましい。
【００６９】
実際、試料中の未知濃度の標的核酸を測定する場合、上記の条件で先ず、検量線を作成する。そして、複数の濃度の対応する本発明の核酸プローブを試料に添加して、それぞれ蛍光強度値の減少を測定する。そして、測定された蛍光強度の減少値のうちの最大なものに対応するプローブ濃度を好ましいプローブ濃度とする。好ましい濃度のプローブで測定された蛍光強度の減少値もって、検量線から標的核酸の定量値を求めることになる。
【００７０】
本発明の核酸測定法の原理は、前記のごとくであるが、本発明は各種の核酸測定方法、例えば、ＦＩＳＨ方法、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法、ＳＤ方法、競合的ハイブリダイゼーション方法、ＴＡＳ方法、などに適用できる。
【００７１】
以下にその例を記す。
ａ）ＦＩＳＨ方法に適用した場合
即ち、本発明は色々の種類の微生物が混在するか、若しくは一種類以上の微生物が動物や植物由来の細胞と共に混在していて、相互に単離できない微生物系（複合微生物系、共生微生物系）の細胞内若しくは細胞のホモジネート等の核酸測定に好適に適用できる。ここでいう微生物とは一般的にいう微生物のことで、特に限定されるものではない。例えば、真核微生物、原核微生物、その他、マイコプラズマ、ウイルス、リッケチャ等を挙げることができる。そして、ここの系でいう標的核酸とは、これらの微生物系において、例えば、どのように活躍しているのか調べたい菌株の細胞に特異性を有する塩基配列をもつ核酸のことである。例えば、特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡの特定配列である。
【００７２】
本発明の核酸プローブを複合微生物系又は共生微生物系に添加し、特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡの量を測定することにより、当該系における特定菌株の存在量を測定することできる。尚、複合微生物系又は共生微生物系のホモジネートに前記核酸プローブを添加して、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定して特定菌株の存在量を測定する方法も、本発明の技術的範囲内とする。
【００７３】
前記の測定方法は、例えば、以下の如くである。即ち、本発明の核酸プローブを添加する前に、複合微生物系又は共生微生物系の温度、塩濃度、ｐＨを前記の条件に調整する。複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株は、細胞数として１０7〜１０12個／ｍｌ、好ましくは１０9〜１０10個／ｍｌに調整することが好適である。それは希釈、又は遠心分離等による濃縮等で行うことができる。細胞数が１０7個／ｍｌ未満のときは、蛍光強度が弱く、測定誤差が大きくなる。１０12個／ｍｌを超えるときは、複合微生物系又は共生微生物系の蛍光強度が強すぎるため、特定微生物の存在量を定量的に測定することができなくなる。
【００７４】
添加する本発明の核酸プローブの濃度は、複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株の細胞数に依存する。細胞数１×１０8／ｍｌに対して０．１〜１０．０ｎＭ濃度、好ましくは０．５〜５ｎＭ濃度、より好ましくは１．０ｎＭ濃度である。０．１ｎＭ未満のときは、特定微生物の存在量を正確に反映したデータにならない。しかし、最適な本発明の核酸プローブの量は、細胞内の標的核酸量に依存するために一概にはいえない。
【００７５】
次に本発明において前記核酸プローブと特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子ＤＮＡにハイブリダイズさせるときの反応温度は、前記した条件と同様である。また、その反応時間も前記の条件と同様である。
前記のような条件で本発明の核酸プローブを特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれの遺伝子ＤＮＡにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後の複合微生物系又は共生微生物系の蛍光色素の発光の減少量を測定する。
【００７６】
前記のようにして測定された蛍光色素の発光の減少量は、複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株の存在量と比例する。それは５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡの量と特定菌株の存在量とが比例するからである。
【００７７】
尚、本発明において、複合微生物系又は共生微生物系における微生物以外の成分は、本発明の核酸プローブと特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを阻害しない限り、また、本発明の核酸プローブの蛍光色素の発光を阻害をしない限り、特に限定されない。例えば、KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4等のリン酸塩、硫安、硝安、尿素等の無機窒素類、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムイオン等の金属イオンの各種塩類、マンガン、亜鉛、鉄、コバルトイオン等の微量金属イオンの硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩等の各種塩類、更にビタミン類等が適当に含まれていてもよい。もし、上記の阻害が観察される場合は、遠心分離等の操作で複数の微生物が混在する細胞系から細胞を分離し、再び緩衝液系等に懸濁すればよい。
【００７８】
上記の緩衝液としては、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、トリス・グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、グット緩衝液等の各種緩衝液をも用いることができる。緩衝液の濃度は、ハイブリダイゼーション、ＦＲＥＴ現象、蛍光色素の発光を阻害しない濃度である。その濃度は緩衝液の種類に依存する。緩衝液のｐＨは４〜１２、好ましくは５〜９である。
【００７９】
ｂ）ＰＣＲ方法に適用する場合
ＰＣＲ方法であればどのような方法でも適用できるのであるが、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法に適用する場合を以下に記す。
即ち、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法において、本発明の特定の核酸プローブを用いてＰＣＲを行い、反応前後の蛍光色素の発光の減少をリアルタイムで測定するものである。
本発明のＰＣＲとは各種方法のＰＣＲを意味するものである。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ法等をも含む。また、定量的とは、本来の定量測定の他に、検出程度の定量測定をも意味するのは前記同様である。
【００８０】
前記のとおり、標的核酸とは、存在量を測定する核酸のことを云う。精製の有無を問わない。また、濃度の大小も問わない。各種の核酸が混在していてもよい。例えば、複合微生物系（複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）又は共生微生物系（複数の動植物及び／又は複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）における増幅目的の特定核酸である。尚、標的核酸の精製が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例えば、市販されている精製キット等を使用して行うことができる。
【００８１】
従来公知の定量的ＰＣＲ方法はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、Ｔａｑポリメラーゼ、プライマー、並びに蛍光色素で標識した核酸プローブ若しくはインターカレーターを用いてＭｇイオンの存在下に、温度を低温、高温を繰り返しつつ標的核酸を増幅し、増幅過程の蛍光色素の発光の増加量をリアルタイムでモニタリングするものである（実験医学、１５巻、７号、４６〜５１ページ、１９９７年、羊土社）。
【００８２】
本発明の定量的ＰＣＲ方法は、本発明の核酸プローブを用いて標的核酸を増幅させ、増幅過程において、蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とするものである。本発明の定量的ＰＣＲにおいて、好ましい本発明の核酸プローブとしては、その塩基数は５〜５０であり、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１５〜２０で、ＰＣＲサイクル中に標的核酸の増幅産物とハイブリダイズするものであれば、どのようなものでもよい。また、フォワード（forward）型、リバース（reverse）型のどちらに設計してもよい。
【００８３】
例えば、以下のものを挙げることができる。
（１）核酸プローブの末端部、好ましくは末端が、本発明の蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズしたとき、当該プローブの蛍光色素で標識された末端部もしくは末端にハイブリダイズした標的核酸の末端塩基から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されている。
（２）前記（１）のうち、核酸プローブが３’末端において蛍光色素で標識されている。
【００８４】
（３）前記（１）のうち、核酸プローブが５’末端において蛍光色素で標識されている。
（４）核酸プローブが、標的核酸にハイブリダイズしたとき、プローブ末端部分において核酸ハイブリッド複合体の複数塩基対が少なくとも一つのＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されている。
（５）前記（４）のうち、核酸プローブの３’末端塩基がＧ又はＣで、かつ３’末端が蛍光色素で標識されている。
（６）前記（４）のうち、核酸プローブの５’末端塩基がＧ又はＣで、かつ５’末端が蛍光色素で標識されている。
（７）前記（１）〜（６）の核酸プローブが、３’末端のリボース若しくはデオキシリボースの３’位炭素の水酸基、又は３’末端のリボースの３’位若しくは２’位炭素の水酸基がリン酸化されている。
（８）前記（１）〜（６）の核酸プローブのオリゴヌクレオチドが、化学的に修飾されている。
【００８５】
前記（６）の場合、標的核酸の塩基配列から、どうしても３’若しくは５’末端がＧ又はＣに設計できない場合は、標的核酸の塩基配列から設計したプライマーであるオリゴヌクレオチドの５’末端に、５’−グアニル酸若しくはグアノシン又は５’−シチジル酸若しくはシチジンを付加しても、本発明の目的は好適に達成できる。３’末端に５’−グアニル酸若又は５’−シチジル酸を付加しても、本発明の目的は好適に達成できる。よって、本発明において、３’、又は５’末端の塩基がＧ又はＣになるように設計した核酸プローブとは、標的核酸の塩基配列から設計したプローブの他に、当該のプローブの５’末端に５’−グアニル酸若しくはグアノシン又は５’−シチジル酸もしくはシチジンを付加してなるプローブ、並びに当該のプローブの５’末端に５’−グアニル酸又は５’−シチジル酸を付加してなるプローブを含むものと定義する。
【００８６】
特に上記の（７）の本発明の核酸プローブはプライマーとして利用されないように設計したものである。ＦＲＥＴ現象を用いるリアルタイム定量的ＰＣＲ方法において使用する（蛍光色素で標識した）二つのプローブの代わりに、一つの本発明の核酸プローブを用いてＰＣＲを行うものである。ＰＣＲの反応系に当該プローブを添加し、ＰＣＲを行う。核酸伸長反応時、標的核酸若しくは増幅標的核酸にハイブリダイズしていた当該プローブがポリメラーゼにより分解され、核酸ハイブリッド複合体から分解除去される。このときの反応系又は核酸変性反応が完了した反応系の蛍光強度値を測定する。また、標的核酸若しくは増幅した増幅標的核酸が当該プローブとハイブリダイズしている反応系（アニーリング反応、若しくはポリメラーゼにより当該プローブが核酸ハイブリッド複合体から除かれるまでの核酸伸長反応時の反応系）の蛍光強度値を測定する。そして、前者からの蛍光強度値の減少率を算出することにより増幅された核酸を測定する。当該プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸から、核酸変性反応により完全に解離するか、又は核酸伸長時にポリメラーゼにより当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸との核酸ハイブリッド複合体から分解除去されたときは蛍光強度値は大きい。しかし、当該プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸に十分にハイブリダイズしているアニーリング反応が完了している反応系若しくは核酸伸長反応時にポリメラーゼにより当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸との核酸ハイブリッド複合体から分解除去されるまでの反応系の蛍光強度値は前者より減少している。蛍光強度値の減少は増幅された核酸量に比例する。
【００８７】
この場合、当該プローブが標的核酸とハイブリダイズしたときのその核酸ハイブリッド複合体のＴｍが、プライマーの核酸ハイブリッド複合体のＴｍ値の±１５℃、好ましくは±５℃の範囲になるように、（７）のプローブの塩基配列が設計されることが望ましい。プローブのＴｍ値が、プライマーのＴｍ値−５℃、特に−１５℃未満であると、プローブがハイブリダイズしないために、蛍光色素の発光の減少は起こらない。反対にプライマーのＴｍ値＋５℃、特に＋１５℃を超えると、プローブが標的核酸以外の核酸ともハイブリダイズするので、プローブの特異性が失われる。
【００８８】
上記（７）以外のプローブ、特に（６）のプローブは、プライマーとしてＰＣＲの反応系に添加するものである。蛍光色素で標識されたプライマーを用いるＰＣＲ方法は本発明以外未だ知られていない。ＰＣＲの反応が進むに従い、増幅された核酸は本発明の実施に有用な蛍光色素で２次標識される。それで、核酸変性反応が完了している反応系の蛍光強度値は大きいが、アニーリング反応が完了しているか若しくは核酸伸長反応時の反応系においては、反応系の蛍光強度は前者の蛍光強度より減少する。
【００８９】
ＰＣＲの反応は通常のＰＣＲ方法と同様の反応条件で行うことができる。それで、Ｍｇイオン濃度が低濃度（１〜２ｍＭ）である反応系で標的核酸の増幅を行うことができる。勿論、従来公知の定量的ＰＣＲにおいて使用されている高濃度（２〜４ｍＭ）のＭｇイオン存在下の反応系でも本発明は実施できる。
【００９０】
尚、本発明のＰＣＲ方法において、本発明のＰＣＲを行い、その増幅産物について核酸の融解曲線を分析を行ってＴｍ値を求めるできる。この方法は新規な核酸の融解曲線の分析方法である。本方法において本発明のＰＣＲ方法に用いた核酸プローブ又はプライマーとして用いた本発明の核酸プローブが好適に利用できる。
この場合、本発明の核酸プローブの塩基配列を、ＳＮＰ（スニップ；一塩基置換多型）を含む領域と相補的な配列にすることで、ＰＣＲ終了後、その核酸の本発明の核酸プローブから解離曲線を解析することにより、その解離曲線の違いからＳＮＰの検出ができる。本発明の核酸プローブの配列としてＳＮＰを含む配列と相補的な塩基配列を使用すれば、プローブ配列とＳＮＰを含む配列との解離曲線より得られるＴｍ値は、ＳＮＰを含まない配列との解離曲線から得られるＴｍ値より高くなる。
【００９１】
本発明の第二の特徴は、前記のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法ので得られるデータを解析する方法の発明である。
リアルタイム定量的ＰＣＲ方法は、現在、ＰＣＲを行わせる反応装置、蛍光色素の発光を検出する装置、ユーザーインターフェース、即ち、データ解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体（別称：Sequence Detection Software  System）、及びそれらを制御し、データ解析するコンピュータから構成される装置で、リアルタイムで測定されている。それで、本発明の測定もこのような装置で行われる。
【００９２】
以下に、先ず、リアルタイム定量的ＰＣＲの解析装置から説明する。本発明において用いる装置は、ＰＣＲをリアルタイムでモニタリングできる装置であればどのような装置でもよいが、例えば、ABI PRISMTM 7700塩基配列検出システム（Sequence Detection System SDS 7700)(パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステム社(Perkin Elmer Applied Biosytems社、USA))、ライトサイクラーTMシステム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ドイツ）等を特に好適なものとして挙げることができる。
【００９３】
尚、前記のＰＣＲ反応装置は、標的核酸の熱変性反応、アニーリング反応、核酸の伸長反応を繰り返し行う装置（例えば、温度を９５℃、６０℃、７２℃に繰り返し行うことができる。）である。また、検出システムは、蛍光励起用アルゴンレーザー、スペクトログラフ並びにＣＣＤカメラからなっている。更に、データ解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、コンピュータにインストールされて使用され、コンピュータを介して上記のシステムを制御し、検出システムから出力されたデータを解析処理するプログラムを記録したものである。
【００９４】
コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されているデータ解析用プログラムは、サイクルごとの蛍光強度を測定する過程、測定された蛍光強度を、サイクルの関数として、すなわちＰＣＲのamplification plotとしてコンピュータのデスプレー上に表示する過程、蛍光強度が検出され始めるＰＣＲサイクル数（threshold cycle number:Ct）を算出する過程、Ｃｔ値から試料核酸のコピー数を求める検量線を作成する過程、前記各過程のデータ、プロット値を印字する過程、からなっている。ＰＣＲが指数的に進行している場合、ＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー数のＬｏｇ値と、Ｃｔとの間には直線関係が成り立つ。従って標的核酸の既知量のコピー数を用いて検量線を作成し、未知コピー数の標的核酸を含有するサンプルのＣｔを検出することにより、標的核酸のＰＣＲ開始時のコピー数を計算できる。
【００９５】
上記のデータ解析方法等のＰＣＲ関連発明は、前記のようなリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する方法である。以下に各特徴について記す。
第一の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、各サイクルにおける前記の蛍光色素と核酸が結合したもの、すなわち蛍光色素−核酸複合体、あるいは前記本発明の核酸プローブと標的核酸がハイブリダイズしたもの、すなわち核酸ハイブリッド複合体が解離したときの反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程、即ち、補正演算処理過程である。
【００９６】
「増幅した標的核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した標的核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系」とは、具体的に例示すると、ＰＣＲの各サイクルにおける４０〜８５℃、好ましくは５０〜８０℃の反応温度を有する核酸伸長反応あるいはアニーリングのときの反応系を挙げることができる。そして、反応が完了した反応系を意味する。実際の温度は増幅した核酸の長さに依存する。
また、「前記の蛍光色素−核酸複合体、あるいは前記の核酸ハイブリッド複合体が解離したときの反応系」とは、ＰＣＲの各サイクルにおける核酸の熱変性の反応系、具体的には、反応温度９０〜１００℃、好ましくは９４〜９６℃のときのもので、反応が完了した系を例示できる。
【００９７】
補正演算処理過程の補正演算処理としては本発明の目的に合致するものであればどのようなものでもよいのであるが、具体的には、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕による処理過程を含むものを例示することができる。
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n          〔数式１〕
ｆn＝ｆden,n／ｆhyb,n          〔数式２〕
〔式中、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出されたｎ次サイクルにおける補正演算処理値、
ｆhyb,n：ｎ次サイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値、
ｆden,n：ｎ次サイクルにおける、前記の蛍光色素−核酸複合体、あるいは核酸ハイブリッド複合体が解離したときの反応系の蛍光強度値〕
尚、本過程においては、上記の処理で得られた補正演算処理値をコンピュータのデスプレー上に表示及び／又は当該値を各サイクル数の関数としてグラフの形で同様に表示及び／又は印字するサブステップを含むものである。
【００９８】
第二の特徴は、各サイクルにおける〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値を次の〔数式３〕あるいは〔数式４〕に代入し、各サンプル間の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、それらを比較するデータ解析方法である。
【００９９】
Ｆn＝ｆn／ｆa          〔数式３〕
Ｆn＝ｆa／ｆn          〔数式４〕
〔式中、
Ｆn：ｎ次サイクルにおける、〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率、
ｆn：ｎ次サイクルにおける〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値
ｆa：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値で、ｆnの変化が観察される以前の任意のサイクル数のものであるが、通常は、例えば、１０〜４０サイクルのもの、好適には１５〜３０サイクルのもの、より好適には２０〜３０サイクルのものが採用される。〕
尚、本過程においては、上記処理で得られた算出値コンピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字する、又は比較値若しくは当該値を各サイクル数の関数としてグラフの形で同様に表示及び／又は印字するサブステップを含むものであるが、〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値については、上記サブステップを適用しても、しなくともよい。
【０１００】
第三の特徴は、
（３．１）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデータを用いて、〔数式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による演算処理する過程、
ｌｏｇb（Ｆn）、ｌｎ（Ｆn）          〔数式５〕
ｌｏｇb｛（１−Ｆn）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆn）×Ａ｝    〔数式６〕
ｌｏｇb｛（Ｆn−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆn−１）×Ａ｝    〔数式７〕
【０１０１】
〔式中、
Ａ、ｂ：任意の数値、好ましくは整数値、より好ましくは自然数である。そして、Ａ＝１００、ｂ＝１０のときは、｛（Ｆn−１）×Ａ｝は百分率（％）で表わされる。
Ｆn：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出されたｎサイクルにおける蛍
光変化割合あるいは蛍光変化率〕、
（３．２）前記（３．１）の演算処理値が一定値に達したサイクル数を求める演算処理過程、
（３．３）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過程、
（３．４）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー数を求める演算処理過程、
を有するデータ解析方法である。そして、（３．１）→（３．２）→（３．３）→（３．４）の順からなる過程が好適である。
【０１０２】
前記（３．１）〜（３．３）の各過程は、それぞれの処理で得られた演算処理値をコンピュータのデスプレー上に表示及び／又は当該値を各サイクル数の関数としてグラフの形で前記同様に表示及び／又は印字するサブステップを含むものであってもよい。前記（３．４）の過程で得られた演算処理値は、少なくとも印字される必要があるので、当該過程は印字するサブステップを含む。前記（３．４）で得られた演算処理値を更にコンピュータのデスプレイ上に表示してもよい。
尚、〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値、〔数式３〕あるいは〔数式４〕による算出処理値を、各サイクル数の関数としてにグラフの形でコンピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字しても、しなくてもよいので、それらの表示及び／又は印字のサブステップは必要に応じて追加すればよい。
【０１０３】
前記データ解析方法は、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法が蛍光色素の発光の減少量を測定するものである場合に特に有効である。その具体例として、前記の本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である。
【０１０４】
第４の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲの解析装置において、前記本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法を実行する演算及び記憶手段を有するリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び／又は解析装置である。
【０１０５】
第５の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲの解析装置を用いてＰＣＲを解析するデータ解析方法の各手順をプログラム化して、そのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体において、前記本発明のデータ解析方法の各手順をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。
【０１０６】
第６の特徴は、核酸測定方法において、前記本発明のデータ解析方法、測定及び／又は解析装置、記録媒体を利用する新規な核酸の測定方法である。
【０１０７】
また、第７の特徴は、前記の本発明の核酸の融解曲線の分析方法、即ち、本発明のＰＣＲ方法を行って核酸のＴｍ値を求める方法によって得られるデータを解析する方法である。
即ち、本発明のＰＣＲ法により増幅された核酸について、低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げる過程（例えば、５０℃から９５℃まで）、この過程において、短い時間間隔（例えば、０．２℃〜０．５℃の温度上昇に相当する間隔）で蛍光強度を測定する過程、測定結果を時間の関数としてデスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の融解曲線を表示する過程、この融解曲線を微分して微分値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）を得る過程、その値を微分値としてデスプレー上に表示する過程、その微分値から変曲点を求める過程からなる、解析方法である。本発明においては、蛍光強度は温度が上がるごとに増加する。本発明においては、各サイクルにおける核酸伸長反応時、好ましくはＰＣＲ反応終了時の蛍光強度値を熱変性反応時の蛍光強度値を用いて割る演算処理する過程を上記の過程に追加することにより、より好ましい結果が得られる。
【０１０８】
前記の本発明の新規なＰＣＲ方法のデータ解析方法に、本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法を追加してなる本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び／又は解析装置も本発明の技術的範囲内である。
【０１０９】
更に、本発明の特徴の一つは、本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法の各手順をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、前記本発明のＰＣＲ方法のデータ解析方法の各手順をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体において、本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法の各手順をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを追加して記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。
【０１１０】
本発明の前記のデータ解析方法、装置、及び記録媒体は、医学、法医学、人類学、古代生物学、生物学、遺伝子工学、分子生物学、農学、植物育種学等の各種の分野で利用できる。また、複合微生物系、共生微生物系と云われ、色々の種類の微生物が混在するか若しくは少なくとも一種類の微生物が他の動物、植物由来の細胞と共に混在していて相互に単離できない微生物系等に好適に利用できる。ここで云う微生物とは一般的に云う微生物のことで、特に限定されるものではない。例えば、真核微生物、原核微生物、その他マイコプラズマ、ウイルス、リッケチャ等を挙げることができる。
【０１１１】
また、本発明の前記データ解析方法、装置及び記録媒体の一つ又はそれ以上を用いて、複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡのコピー数を定量することにより、当該系における特定菌株の存在量を測定することができる。それは、５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡの遺伝子ＤＮＡのコピー数は菌株よって一定であるからである。本発明においては、複合微生物系又は共生微生物系のホモジネートを用いて、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲを行い、特定菌株の存在量を測定することが可能である。この方法も、本発明の技術的範囲内とする。
【実施例】
【０１１２】
次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
大腸菌（Escherichia coli）の１６ＳｒＲＮＡの核酸塩基配列にハイブリダイズする、即ち、(3')CCGCTCACGC ATC(5')の塩基配列を有する核酸プローブの調製を以下の通りに行った。
【０１１３】
核酸プローブの調製：(3')CCGCTCACGC ATC(5')の塩基配列をもつオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端のデオキシリボースの３’位炭素のＯＨ基に、−（ＣＨ2）7−ＮＨ2を結合したものを、メドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。更に、モレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kit）F-6082（ボデピーＦＬのプロピオン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記購入のオリゴヌクレオチドに作用させて、本実施例で使用するボデピーＦＬで標識した核酸プローブを合成した。
【０１１４】
合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾固物を得た。それを０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。当該溶解物をＮＡＰ−２５カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC（B gradient：１５〜６５％、２５分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２３％の収率で核酸プローブを得た。
【０１１５】
2004267215.tif 000002
【０１１６】
実施例２
殺菌したニュウトリエントブロス（ＮＢ）（Difco社製）液体培地５０ｍｌ（組成：ＮＢ、０．０８ｇ／１００ｍｌ）が添加された２００ｍｌ容の（殺菌された）三角フラスコを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を３７℃で一晩振蘯培養した。次に、本培養液に９９．７％エタノールを当量添加した。このエタノール添加培養液２ｍｌを２．０ｍｌ容量のエッペンドルフ遠心チューブで遠心分離し、菌体を得た。３０ｍＭリン酸緩衝液（ソーダ塩）（ｐＨ：７．２）１００μｌで菌体を一回洗浄した。菌体を１３０ｍＭのＮａＣｌ含有の前記リン酸緩衝液１００μｌに懸濁した。当該懸濁液を氷冷中で４０分間超音波処理し（出力：３３ｗ、発振周波数：２０ｋＨｚ、発振法：０．５秒発振、０．５秒休止）、ホモジネートを作製した。
【０１１７】
前記ホモジネートを遠心分離した後、上澄液を採取し蛍光光度計のセルに移した。それを３６℃に温調した。それに３６℃に予め加温した前記核酸プローブの溶液を最終濃度で５ｎＭとなるように添加した。３６℃に温調しながら９０分間大腸菌１６ＳｒＲＮＡと核酸プローブとをハイブリダイズさせた。そして蛍光光度計で蛍光色素の発光量を測定した。
【０１１８】
ハイブリダイゼーション前の蛍光色素の発光量は、上記の上澄液の代りに、１３０ｍＭのＮａＣｌ含有の３０ｍＭのリン酸緩衝液（ソーダ塩）（ｐＨ：７．２）を用いて測定した値を採用した。核酸プローブの量と上澄液の量の比を変えて発光量を測定した（励起光５０３ｎｍ；測定蛍光色５１２ｎｍ）。その結果を図１に示した。図１から分かるように、上澄液の量比が増加することにより蛍光色素の発光が減少した。即ち、本発明においては、核酸プローブにハイブリダイズする標的核酸量に比例して、蛍光色素の発光の減少量の大きさが大きくなることが分かる。
【０１１９】
実施例３
核酸プローブの調製：大腸菌ＪＭ１０９株の２３ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする(5')CCCACATCGTTTTGTCTGGG(3')の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドの３’位炭素のＯＨ基に、−（ＣＨ2)7−ＮＨ2を結合したものを、実施例１と同様にメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。更に、実施例１と同様にモレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kit)F-6082(ボデピーＦＬのプロピオン酸サクシニミジルエステル(BODIPY FL propionic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記オリゴヌクレオチドに作用させて、ボデピーＦＬで標識した核酸プローブを合成した。得られた合成物を実施例１と同様に精製して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２５％の収率でボデピーＦＬで標識した核酸プローブを得た。
【０１２０】
実施例４
実施例２で得られた大腸菌ＪＭ１０９株の菌体に実施例２と同一の培地及び培養条件で調製したシュウドモナス・プウシモビルス  ４２１Ｙ株（Pseudomonas paucimobilis）（現在名：スフィンゴモナス・プウシモビルス）（FERM P-5122）の菌体をＯＤ６６０値で大腸菌ＪＭ１０９株と同濃度混合し、複合微生物系を調製した。得られた混合液（大腸菌ＪＭ１０９株の菌体濃度は実施例２と同一）について実施例２と同じ方法によりホモジネートを調製した。実施例３で調製した核酸プローブを用いて、励起光を５４３ｎｍ、また、測定蛍光色を５６９ｎｍにする以外は、実施例２と同様な実験を行った結果、実施例２と同様な結果を得た。
【０１２１】
実施例５
蛍光消光現象における標的核酸の塩基選択性、即ち、本発明の塩基特異性を検討した。下記に示す標的合成デオキシリボオリゴヌクレオチド（３０mer）の１０種類（poly a〜poly j）をＤＮＡ合成機ABI394（Perkin Elmer社製、米国)で調製した。
【０１２２】
更に、上記の合成ＤＮＡに対応するデオキシリボオリゴヌクレオチドの５’末端にボデピーＦＬで標識した下記に示す本発明のプローブを調製した。
上記の合成ＤＮＡに対応するプライマーＤＮＡの５’末端のリン酸基に、−（CH2)6-NH2を結合したものをメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。更に、モレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kit）F-6082（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinidyl ester)の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記購入のプライマーＤＮＡに作用させて下記のボデピーＦＬで標識した本発明のプローブprobe a〜d、及びf〜hのを合成した。そして対応する合成デオキシリボオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたときに、蛍光色素の発光がどの程度減少するかを下記の条件下に調べ、本発明のプローブの特異性を検討した。
【０１２３】
2004267215.tif 000003
【０１２４】
2004267215.tif 000004
【０１２５】
2004267215.tif 000005
【０１２６】
2004267215.tif 000006
【０１２７】
2004267215.tif 000007
【０１２８】
2004267215.tif 000008
【０１２９】
その結果を表１に示した。表１から分かるように、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的ＤＮＡ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）にハイブリダイズしたときに、当該末端部において、当該プローブと標的ＤＮＡとがハイブリダイズした末端塩基部から１〜３塩基離れて、標的ＤＮＡの塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることが好適である。また、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的ＤＮＡにハイブリダイズしたときに、当該末端部において核酸ハイブリッド複合体の複数の塩基対がＧとＣのペアーを少なくとも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることが好適であることが表１から分かる。
【０１３０】
実施例６
下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プローブを調製した。標的核酸内のＧ及び本発明の核酸プローブ内のＧの数の影響について、前記実施例と同様にして調べた。
【０１３１】
2004267215.tif 000009
【０１３２】
2004267215.tif 000010
【０１３３】
2004267215.tif 000011
【０１３４】
2004267215.tif 000012
【０１３５】
2004267215.tif 000013
【０１３６】
表２から分かるように、標的核酸内のＧの数、本発明のプローブ内のＧの数はそれほど蛍光強度の減少に影響しないことが認識される。
【０１３７】
実施例７
前記と同様にして下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プローブを調製した。なお、本実施例における本発明の核酸プローブはオリゴヌクレオチドの５’末端部をボデピーFL/C6で標識したものである。標的核酸内の塩基種及び本発明の核酸プローブ内の塩基種の影響について、前記実施例と同様にして調べた。
【０１３８】
2004267215.tif 000014
【０１３９】
2004267215.tif 000015
【０１４０】
2004267215.tif 000016
【０１４１】
表３及び前記の実施例から分かるように、(i)蛍光色素で標識される本発明のプローブの末端がＣで構成され、標的核酸がハイブリダイズしたとき、ＧＣペアーを形成するとき、(ii)蛍光色素で標識される本発明のプローブの末端がＣ以外の塩基で構成された場合、蛍光色素で標識されている個所の塩基と、標的核酸の塩基との塩基ペアーより、標的核酸の３’末端側にＧが少なくとも１個以上存在する場合に、蛍光強度の減少率が大きい。
【０１４２】
実施例８
本発明の核酸プローブに標識する色素の種類について、前記実施例と同様にして調べた。なお、本発明のプローブは、前記実施例７のプローブｚを、また、標的核酸は前記実施例７のオリゴヌクレオチドｚを用いた。
その結果を、表４に示した。表から分かるように、本発明に用いる蛍光色素として好適なものは、FITC、BODIPY FL、BODIPY FL/C3、6-joe、TMRなどを挙げることができる。
【０１４３】
2004267215.tif 000017
【０１４４】
実施例９（標的核酸（１６ＳｒＲＮＡ）の加熱処理の効果の実験）
本発明の核酸プローブの調製：大腸菌ＪＭ１０９株の１６ＳｒＲＮＡの１１５６塩基目から１１９０塩基の塩基配列に相当するＫＹＭ−７株の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列に特異的にハイブリダイズする(5')CATCCCCACC TTCCTCCGAG TTGACCCCGG CAGTC(3')（３５塩基対）の塩基配列をもち、１〜１６及び２５〜３５塩基目がデオキシリボヌクレオチド、１７〜２４塩基目が２’位炭素のＯＨ基をメチル基で修飾（エーテル結合で修飾）したリボオリゴヌクレオチドからなり、その５’末端のリン酸基のＯＨ基を-(CH2)7-NN2で修飾して結合したオリゴヌクレオチドを、実施例１と同様にメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。また、2-O-Meプローブ（2-O-Meオリゴヌクレオチドからなるプローブを単に2-O-Meプローブという。）に使用する2-O-Meオリゴヌクレオチドは、ＧＥＮＳＥＴ株式会社（フランス）に合成を委託し、得たものである。
更に実施例１と同様にモレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kit)F-6082（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FL/C6 propionic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記オリゴヌクレオチドに作用させて、ボデピーFL/C6で標識した本発明の核酸プローブを合成した。得られた合成物を実施例１と同様に精製して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２３％の収率でボデピーFL/C6で標識した本発明の核酸プローブを得た。このプローブを３５塩基鎖2-O-Meプローブと名づけた。
【０１４５】
(5')TCCTTTGAGT TCCCGGCCGG A(3')の塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチドを前記同様にしてＤＮＡ合成機を用いて合成して、フォワード（forward）型のヘルパープローブとした。一方、(5')CCCTGGTCGT AAGGGCCATG ATGACTTGAC GT(3')の塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチドを前記同様にしてＤＮＡ合成機を用いて合成して、バックワード(back ward)型すなわちリバース型ヘルパープローブとした。
【０１４６】
３５塩基鎖2-O-Meプローブ、フォワード型のヘルパープローブ及びリバース型ヘルパープローブを各々25nMになるように下記に示す組成の緩衝液に溶解させ、７５℃に加温した（プローブ溶液）。
前記の１６ＳｒＲＮＡを９５℃で５分加熱処理した後、それを下記に示す反応条件においた前記のプローブ溶液に添加した後、蛍光測定機器パーキンエルマー（Perkin  Elmer)LS-50Bで蛍光強度を測定した。その結果を図２に示した。尚、上記の加熱処理しない１６ＳｒＲＮＡを用いたものをコントロールとした。加熱処理した実験区においては、蛍光強度の減少が大きいことが図２から分かる。この結果は、１６ＳｒＲＮＡを９５℃で加熱処理することで本発明のプローブとより強いハイブリダイゼーションをしていることを示している。
2004267215.tif 000018
【０１４７】
実施例１０（2'-O-Meオリゴヌクレオチド及びヘルパープローブのハイブリダイゼーション効率向上への寄与の実験）
前記の１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする下記の各種の本発明の核酸プローブ及び各種のヘルパープローブを前記実施例９と同様にして調製した。また、2-O-Meプローブに使用する2-O-Meオリゴヌクレオチドは、すべてGENSET株式会社(フランス)に合成を委託し、得たものである。そして下記の条件にて、本発明の2-O-Meプローブの効果、当該プローブの塩基鎖の長さの影響、及びヘルパープローブの効果について、下記の図３Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの実験系で前記実施例９と同様にして検討した。その結果を図３に示した。
図から、本発明の2-O-Meプローブがハイブリダイゼーション効率に寄与していることが分かる。また、2-O-Meプローブの塩基鎖が短い場合にヘルパープローブがハイブリダイゼーション効率を高めるのに役立っている。
【０１４８】
１）３５塩基鎖2-O-Meプローブ：  前記実施例９と同じプローブ、
２）３５塩基鎖ＤＮＡプローブ：  前記１）の３５塩基鎖2-O-Meプローブと同じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキシリボースで構成されているプローブ、
３）１７塩基鎖2-O-Meプローブ：  前記１）の３５塩基鎖2-O-Meプローブと同じ塩基配列であるが、５’末端から８塩基分、３’末端から１０塩基分のヌクレオチドを削除したプローブ、
４）１７塩基鎖ＤＮＡプローブ：  前記２）の３３塩基鎖DNAプローブと同じ塩基配列であるが、３’末端から１６塩基分のヌクレオチドを削除したプローブ、
【０１４９】
５）フォワード型2-O-Meヘルパープローブ: 前記実施例９のフォワード型ヘルパープローブの中央８塩基分（５’末端から数えて９塩基〜１６塩基分）のリボースの２’位炭素のＯＨ基を、メチル基で修飾（エーテル結合）したヘルパープローブ、
６）リバース型2-O-Meヘルパープローブ：  前記実施例９のリバース型ヘルパープローブの中央８塩基分（５’末端から数えて９塩基〜１６塩基分）のリボースの２’位炭素のＯＨ基を、メチル基で修飾（エーテル結合）したヘルパープローブ、
７）フォワード型ＤＮＡヘルパープローブ: 前記実施例９のフォワード型ヘルパープローブの塩基配列と同じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されているヘルパープローブ、
８）リバース型ＤＮＡヘルパープローブ:  前記実施例９のリバース型ヘルパープローブの塩基配列と同じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されているヘルパープローブ、
９）３５塩基オリゴリボヌクレオチド: (5')CATCCCCACC TTCCTCCGAG TTGA CCCCGG CAGTC(3')なる塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチド、
１０）１７塩基鎖オリゴリボヌクレオチド：  (5')CCTTCCTCCG AGTTGAC(3')なる塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチド。
【０１５０】
2004267215.tif 000019
【０１５１】
2004267215.tif 000020
【０１５２】
2004267215.tif 000021
【０１５３】
2004267215.tif 000022
【０１５４】
2004267215.tif 000023
【０１５５】
実施例１１（ｒＲＮＡ測定のための検量線の作成）
前記ｒＲＮＡを、０．１〜１０ｎＭの範囲のさまざまな濃度において、９５℃で５分間加熱後、得られた核酸溶液を予め下記反応条件においた反応液に添加し、１０００秒後、蛍光強度の減少をパーキンエルマーLS-50Bを使用して測定した。その結果を図４に示した。図から検量線は０．１〜１０ｎＭにおいて直線性を示すことが分かる。なお、下記の３５塩基鎖2-O-Meプローブは実施例９と同じプローブである。
2004267215.tif 000024
【０１５６】
実施例１２(FISH方法)
セルロモナス（Cellulomonas）sp.KYM-7（FERM P-11339）及びアグロバクテリウム（Agrobacterium)sp. KYM-8(FERM P-16806)の各々のｒＲＮＡにハイブリダイズする下記の本発明の35又は36塩基鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド2-O-Meプローブを前記と同様にして調製した。各プローブの塩基配列は下記の通りである。
【０１５７】
セルロモナスsp.KYM-7のｒＲＮＡ測定のための３５塩基鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド2-O-Meプローブ：
（5')CATCCCCACC TTCCTCCGAG TTGACCCCGG CAGTC(3')（アンダーライン部分がメチル基で修飾されている。）。
アグロバクテリウムsp.KYM-8のｒＲＮＡ測定のための３６塩基鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド2-O-Meプローブ：
(5')CATCCCCACC TTCCTCTCGG CTTATCACCG GCAGTC(3')（アンダーライン部分がメチル基で修飾されている。）。
【０１５８】
セルロモナスsp.KYM-7及びアグロバクテリウムsp.KYM-8を下記の培地組成の培地で下記の培養条件で混合培養し、培養時間毎に培養物を採取した。それらから、ｒＲＮＡをRNeasy Maxikit（QIAGEN社）を用いて調製した。当該ｒＲＮＡを９５℃で５分加熱後、予め反応条件においた反応液に添加し、７０℃、１０００秒間反応させた後、蛍光強度をパーキンエルマーLS-50Bを使用して測定した。その結果を図５に示した。尚、全rＲＮＡはリボグリーン（RiboGreen)total RNA Quantification Kit（会社名：モレキュラープローブ（molecular probes)、所在地名：Eugene,Oregon,USA）を用いて測定した。
図から分かるように、各菌株のｒＲＮＡの動態は全rＲＮＡの動態と一致した。また、各菌株のｒＲＮＡの合計量は全ｒＲＮＡと一致した。このことは、本発明方法はFISH方法において有効な方法になることを示している。
【０１５９】
・培地組成（g/l）：デンプン，10.0；アスパラギン酸，0.1；K2HPO4，5.0;KH2PO4,2.0;MgSO4・7H2O,0.2;NaCl，0.1;(NH4)2SO4;0.1.
・培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のコニカルフラスコに分注し、該フラスコを１２０℃で１０分間、オートクレーブ釜を用いて殺菌した。
・培養条件：前記の菌株を斜面培地で予め培養した。該斜面培地より１白金耳の菌体をとり、前記の殺菌したコニカルフラスコの培地に接種した。３０℃、１５０ｒｐｍで撹拌培養した。
【０１６０】
2004267215.tif 000025
【０１６１】
以下実施例１３に、標的核酸の多型及び変異を解析若しくは測定する方法を記す。
実施例１３
下記に示した塩基配列をもつ４種類のオリゴヌクレオチドを前記実施例５のＤＮＡ合成機を用いて合成した。また、前記実施例５と同様にして、下記の塩基配列の本発明の核酸プローブを合成した。該プローブと各々のオリゴヌクレオチドを溶液中でハイブリダイズさせた後、蛍光強度の変化から１塩基置換の評価ができるかどうか検討した。本発明の核酸プローブの塩基配列は、標的オリゴヌクレオチドのうちのいずれかの３’末端にＧが存在する場合に、そのオリゴヌクレオチドの塩基配列に１００％マッチするように設計されている。ハイブリダイゼーション温度は、プローブと標的オリゴヌクレオチドとの間の全塩基対（base-pairs）が１００％ハイブリダイズできる４０℃に設定した。プローブ及び標的オリゴヌクレオチドの濃度、緩衝液の濃度，蛍光測定装置、蛍光測定条件、実験操作などは、前記実施例５と同様である。
【０１６２】
2004267215.tif 000026
【０１６３】
その結果を表５に示した。表から、標的オリゴヌクレオチドＮｏ．１〜３においては、蛍光強度に変化は観察されなかったが、標的オリゴヌクレオチドＮｏ．４においては８４％の減少が観察された。
【０１６４】
2004267215.tif 000027
【０１６５】
本発明において、標的核酸（例えば上記標的オリゴヌクレオチドＮｏ．１〜４）の多型及び／又は変異を解析若しくは測定する方法により得られるデータ（例えば表５のカラムＡ及びＢのデータ）を解析する方法において、標的核酸が本発明の核酸プローブ（上記の核酸プローブ）とハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正演算処理するとは、表３の（Ａ−Ｂ）／Ｂの計算をいう。
以上の結果より、標的核酸が２本鎖の場合、Ｇ→Ａ、Ｇ←Ａ、Ｃ→Ｔ、Ｃ←Ｔ、Ｇ→Ｃ、Ｇ←Ｃの置換を検出できることが明らかになった。
【０１６６】
実施例１４
図６に本発明のＤＮＡチップのモデルの一例を図示した。先ず、実施例１３で調製した本発明のプローブである3'TTTTTTTTGGGGGGGGC5'BODIPY FL/C6のの３’末端のリボースの３’位炭素のＯＨ基にアミノ基を導入して調製した修飾プローブ、また、スライドガラスを反応基としてエポキシ基を有するシランカップリン剤でスライドガラスの表面を処理した表面処理済スライドガラスを用意した。上記の修飾プローブを含む溶液をＤＮＡチップ作成装置GMSTM417ARRAYER(TAKARA)で該表面処理済スライドガラス上にスポットした。そうすると、３’末端で上記修飾プローブがガラス面に結合した。該スライドガラスを密閉容器内に４時間位おき反応を完結させた。そして該スライドガラスを０．２％ＳＤＳ溶液、水に１分程度交互に２回づつ漬けた。更にホウ素溶液（水３００ｍｌにNaBH4１．０ｇを溶かしたもの。）に５分位つけた。９５℃の水に２分つけてから、素早く０．２％ＳＤＳ溶液、水に１分程度交互に２回づつ漬けて試薬を洗い流した。室温で乾燥した。このようにして本発明のＤＮＡチップを調製した。
【０１６７】
更に、ガラスの下面の修飾プローブの各スポットに対応する位置に図のような微小な温度センサーとヒータを設けることにより、本発明のＤＮＡチップに高性能を付与することができた。
このＤＮＡチップを用いて標的核酸を測定する場合を説明する。該プローブに標的核酸がハイブリダイズしていないとき、又はハイブリダイズしても蛍光色素標識末端でＧＣペアーを形成しないとき、若しくは当該プローブと標的核酸とがハイブリダイズした末端塩基部分から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）又はシトシン（Ｃ）が少なくとも１つ存在しないときは、蛍光強度に変化ない。しかし、その反対に、該プローブに標的核酸がハイブリダイズしているとき、又はハイブリダイズしても蛍光色素標識末端でＧＣペアーを形成しているとき、若しくは当該プローブと標的核酸とがハイブリダイズした末端塩基部分から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）又はシトシン（Ｃ）が少なくとも１つ存在するときは蛍光強度が減少する。この蛍光強度はＤＮＡチップ解析装置ＧＭＳTM４１８アレースキャナー（Array Scanner）（TAKARA）を使用して測定できる。
【０１６８】
実施例１５：本発明のＤＮＡチップを用いた一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出実験  Ｉ）標的核酸の調製：(5')AAACGATGTG GGAAGGCCCA GACAGCCAGG ATGTTGGCTT AGAAGCAGCC(3')の塩基配列をもつオリゴデオキシリボヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、標的核酸とした。
II）核酸プローブの調製：標的核酸の５’末端から１５塩基の配列（アンダーライン部）にハイブリダイズする塩基配列をもつ、下記の６個のオリゴデオキシリボヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成した。そして、3'-Amino-Modifier C7 CPG（グレンリサーチ、カタログ番号20ー2957）を用いて、３’末端のデオキシリボースの３’位のＯＨ基をアミノ化した。更に５’末端のリン酸基を実施例５と同様な方法でBODIPY FLで標識した。
【０１６９】
１）プローブ100（１００％マッチ）：（5')CCTTCCCACA TCGTTT(3')、
２）プローブ−T（１塩基ミスマッチ）：(5')CCTTCCCATA TCGTTT(3')、
３）プローブ−A（１塩基ミスマッチ）:(5')CCTTCCCAAA TCGTTT(3')、
４）プローブ−G（１塩基ミスマッチ）:(5')CCTTCCCAGA TCGTTT(3')、
５）プローブ−TG（２塩基ミスマッチ）:(5')CCTTCCCTGA TCGTTT(3')、
６）プローブ−TGT（３塩基ミスマッチ）:(5')CCTTCCCTGT TCGTTT(3')、
【０１７０】
III）ＤＮＡチップの調製
全てのＤＮＡプローブを、滅菌蒸留水に溶解して、１μＭ濃度の溶液にした。ＤＮＡマイクロアレイヤー装置（ＤＮＡマイクロアレイヤーNo.439702、３２ピン型、およびＤＮＡスライドインデックスNo.439701からなる手動式のチップアレイヤーである。greiner社）を用いて、ＤＮＡチップ用スライドグラス（Black silylated slides、greiner社）の上に、前記プローブ溶液をスポテイング（spotting）した。スポット終了後１０分間反応させ、プローブをスライドグラス上に固定化した。その後、５０ｍＭのＴＥ緩衝液（ｐＨ：７．２）にて洗浄した。なお、各プローブ溶液につき、４スポットづつスポッテングした。
本発明のＤＮＡチップの模式図を図６に示した。スライドグラス上に固定化された本発明のプローブは、標的核酸にハイブリダイズしないときはBODIPY FLは発色しているが、ハイブリダイズしているときは発色が、ハイブリダイズしないときのものよりも少ない。すなわち減少する。スライドグラスはマイクロヒーターで加熱されるようになっている（本発明では、下記に示すように顕微鏡用透明加熱板（MP-10MH-PG、（株式会社）北里サプライ）で行われた。）。
【０１７１】
IV）ＳＮＰｓの検出測定
１００μＭ濃度の標的核酸溶液｛５０ｍＭのＴＥ緩衝液（ｐＨ：７．２）使用｝を上記のごとくに調製したＤＮＡチップの上にのせた。カバーグラスで覆い、標的核酸が漏れないようにマニキュアにてカバーグラスをシールした。
検出測定のための装置類の概略は図７に示した。先ず、オリンパス正立顕微鏡（AX80型）の試料台に顕微鏡用透明加熱板（MP-10MH-PG、（株式会社）北里サプライ）をのせた。当該板上に前記に調製した本発明のＤＮＡチップを置き、９５℃から３３℃まで３℃刻みで変化させ、３０分かけて反応させた。各スポットの反応過程の蛍光強度変化を、冷却ＣＣＤカメラ（C5810型、浜松フォトニクス社）にて画像取り込み形式で測定した。
取り込み画像を画像解析装置（画像解析ソフト（TPlab  spectrum；Signal Analytics社，Verginia）がインストールされたパソコン（NEC））にて解析し、各スポットの輝度を算出し、温度と輝度の関係を求めた。
【０１７２】
実験結果を図８に示した。図から全てのプローブで蛍光強度が減少していることが分かる。従って、本発明の方法により、本発明のプローブと標的核酸との解離曲線を簡便にモニタリングすることができる。また、標的核酸と１００％マッチするプローブ100と一塩基ミスマッチするプローブとのＴｍ値の差は１０℃以上あるので、解離曲線から両者を容易に識別することができる。すなわち本発明のＤＮＡチップを使用することによりＳＮＰｓの解析が容易にできることがわかる。
【０１７３】
以下、実施例１６〜１９に本発明のＰＣＲ方法を記す。
実施例１６
大腸菌のゲノムＤＮＡにおける１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を標的核酸として、当該核酸の増幅のための（BODIPY FL/C6で標識した）プライマー（本発明の核酸プローブ）を調製した。
【０１７４】
プライマー１（Eu800R：リバース型）の調製：(5')CATCGTTTAC GGCGTGGAC(3')の塩基配列をもつオリゴデオキシリボヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、更に当該オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端のリン酸基をホスファターゼ処理してシトシンとし、そのシトシンの５’位の炭素OH基に、-(CH2)9-NH2を結合したオリゴヌクレオチドを、ミドランド・サーテイファイド・レージンド・カンパニー社（米国）から購入した。更に、モレキュラープローブ社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kits)F-6082（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。前記購入したオリゴヌクレオチドに当該キットを作用させて、本発明のボデピーFL/C6で標識したプライマー１を合成した。
【０１７５】
合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾固物を得た。それを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。当該溶解物をＮＡＰ−２５カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC（B gradient：１５〜６５％、２５分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して本発明のプライマー１を、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより５０％の収率で得た。
【０１７６】
2004267215.tif 000028
【０１７７】
実施例１７
プライマー２（Eu500R/forward：フォワード型）の調製：(5')CCAGCAGCCG CGGTAATAC(3')の塩基配列をもつオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端に蛍光色素（BODIPY FL/C6）で標識したプライマー２を実施例１４と同様にして収率５０％で調製した。
【０１７８】
実施例１８
殺菌したニュトリエントブロス(NB)（Difco社製）液体培地５ml（組成：NB、0.08g/100ml）を含有する試験管を用いて、大腸菌JM109株を３７℃で一晩振蘯培養した。培養液１．５mlを１．５ml容量の遠心チューブで遠心分離し、菌体を得た。この菌体から、DNeasy Tissue Kit（キアゲン（QIAGEN）社、ドイツ国）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。その抽出は本キットのプロトコルに従った。その結果、17ng/μlのＤＮＡ溶液を得た。
【０１７９】
実施例１９
上記の大腸菌のゲノムＤＮＡ、プライマー１及び／又はプライマー２を使用して、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のライトサイクラーTMシステム（LightCyclerTM System）を用いて常法通りにＰＣＲ反応を行った。操作は当該システム機器の手順書に従った。
また、上記システムにおいてＰＣＲは、当該手順書に記されている核酸プローブ（FRET現象を利用する二個のプローブ）と通常のプライマー（蛍光色素で標識されていない通常のプライマー）の代りに本発明プライマー１及び／又は２を用いる以外は当該手順書通りに行った。
【０１８０】
ＰＣＲは次のコンポーネントのハイブリダイゼーション溶液中で行った。
2004267215.tif 000029
尚、標的核酸である大腸菌１６ＳｒＤＮＡは、図９の説明欄に示される実験区の濃度で、また、プライマーは、同様に図９の説明欄に示される実験区のプライマー１及び／又は２の組合せで実験を行った。
【０１８１】
また、上記のTaq溶液は次の試薬の混合液である。
2004267215.tif 000030
【０１８２】
尚、Taq溶液、Taq DNAポリメラーゼ溶液はロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ（DNA Master Hybridization Probes)キットのものである。特にTaq DNAポリメラーゼ溶液は10×conc.（赤いキャップ）を１０倍に希釈して用いた。また、Taqスタートは、クローンテック社（ＵＳＡ）より販売されているTaq DNAポリメラーゼ用の抗体で、これを反応液に添加することで７０℃までTaq DNAポリメラーゼの活性を抑えることができる。即ち、ホット・スタート(hot start)を行うことができるものである。
【０１８３】
2004267215.tif 000031
測定は、ライトサイクラーTMシステムを用いて行った。その際、該システムにあるＦ１〜３の検出器にうち、Ｆ１の検出器を用い、その検出器のゲインは１０、励起強度は７５に固定した。
【０１８４】
その結果を図９及び１０に示した。図９及び１０から、蛍光色素の発光の減少が観察される時点のサイクル数と標的核酸の大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数が比例していることが分かる。尚、図においては、蛍光色素の発光の減少量を蛍光強度の減少値として表現した。
図１１は、サイクル数の関数として、大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数を表現した大腸菌１６ＳｒＤＮＡの検量線を示す。相関係数は０．９９７３で、極めてよい相関を示した。
以上の結果から分かるように、本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いると標的核酸の当初のコピー数を測定できるようになる。即ち、標的核酸の濃度の測定ができる。
【０１８５】
実施例２０
実施例１９においては、本発明のプローブをプライマーとしてＰＣＲを行ったが、本実施例では従来法に用いるＦＲＥＴ現象を利用する二個のプローブの代わりに本発明のプローブを用いて下記の条件で本発明のＰＣＲを行った。
ａ）標的核酸：大腸菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡ
ｂ）使用プライマー：
・フォワードプライマー  E8F：(5')AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG(3')
・リバースプライマー  E1492R：(5')GGTTACCTTG TTACGACTT(3')
ｃ）使用プローブ：BODIPY FL-(5')CGGGCGGTGT GTAC(3')
ｄ）使用ＰＣＲ測定機器：ライトサイクラーTMシステム
ｅ）ＰＣＲの条件：
変性反応        ：９５℃、１０秒（第一回のみ、６０秒間、９５℃）
アニーリング反応：５０℃、５秒
核酸伸長反応    ：７２℃、７０秒
全サイクル数    ：７０サイクル
【０１８６】
2004267215.tif 000032
【０１８７】
その結果を図１２に示した。図から、蛍光色素の発光の減少が観察される時点のサイクル数と標的核酸の大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数が比例していることが分かる。
以上の結果から分かるように、本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いると標的核酸の当初のコピー数を測定できるようになる。即ち、標的核酸の測定ができる。
【０１８８】
次に以下の実施例に、上記の本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いて得られるデータを解析する本発明のデータ解析方法について記す。
実施例２１
ヒトゲノムＤＮＡ（ヒトβ−グロビン（globin）（TaKaRaカタログ商品番号  ９０６０）（TaKaRa株式会社製）（以下、ヒトゲノムＤＮＡという。）を標的核酸として、当該核酸の増幅のためのボデピーFL/C6で標識したプライマーを調製した。
【０１８９】
プライマーKM38+C（リバース型）の調製：（5')CTGGTCTCCT TAAACCTGTC TTG(3')の塩基配列をもつオリゴデオキシリボヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、更に当該オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端のリン酸基をホスファターゼ処理してシトシンとし、そのシトシンの５’位の炭素ＯＨ基に、-(CH2)9-NH2を結合したものを、ミドランド・サーテイファイド・レージンド・カンパニー社から購入した。更に、モレキュラープローブ社からリポーターキット（FluoReporter Kit)F-6082（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステル(BODIPY FL propionic acid succinimidyl esters)の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。前記購入したオリゴヌクレオチドに当該キットを作用させて、本発明のボデピーFL/C6で標識したプライマーKM38+Cを合成した。
【０１９０】
合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾固物を得た。それを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液(pH9.0)に溶解した。当該溶解物をNAP-25カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC(B gradient:15〜65%、25分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して本発明のプライマーKM38+Cを、最初のオリゴヌクレオチド原料2mMより５０％の収率で得た。
【０１９１】
2004267215.tif 000033
【０１９２】
実施例２１
プライマーKM29（フォワード型）の調製：(5')GGTTGGCCAA TCTACTCCCA GG(3')の塩基配列をもつオリゴデオキシリボヌクレオチドを実施例１８と同様に合成した。
【０１９３】
比較実験例１
本比較実験例は、核酸伸長反応時の蛍光強度値を、熱変性反応時の蛍光強度値を用いて割る演算処理過程（数式（１）の処理）を有しないデータ解析用ソフトウエアの使用に係るものである。
上記のヒトゲノムＤＮＡ、プライマーKM38+C及びプライマーKM29を使用して、ライトサイクラーTMシステムを用いてＰＣＲ反応を行い、各サイクル毎の蛍光強度を測定した。
尚、本比較実施例のＰＣＲは、前記に説明した蛍光色素色素で標識したプライマーを用いるものであり、蛍光発光の増加でなく、減少を測定する新規なリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である。データ解析は当該システムのソフトウエアを用いて行った。本比較実験例のＰＣＲは、当該手順書に記されている核酸プローブ（ＦＲＥＴ現象を利用する二個のプローブ）と通常のプライマー（蛍光色素で標識されていない通常のプライマー）の代りに本発明プライマーKM38+C及びKM29を用いる以外は当該装置の手順書通りに行った。
【０１９４】
ＰＣＲは次のコンポーネントのハイブリダイゼーション溶液中で行った。
2004267215.tif 000034
尚、ヒトゲノムＤＮＡは、図１３の簡単な説明欄に示される実験区の濃度で実験を行った。MgCl2の最終濃度は2mMであった。
【０１９５】
また、上記のTaq溶液は次に試薬の混合液である。
2004267215.tif 000035
【０１９６】
尚、Taq溶液、Taq DNAポリメラーゼ溶液はロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ（DNA Master Hybridization Probes）キットのものである。特にＴaq DNAポリメラーゼ溶液は10×conc.（赤いキャップ）を１０倍に希釈して用いた。また、Ｔaqスタートは、クローンテック社（ＵＳＡ）より販売されているTaq DNAポリメラーゼ用の抗体で、これを反応液に添加することで７０℃までTaq DNAポリメラーゼの活性を抑えることができる。即ち、ホット・スタートを行うことができるものである。
【０１９７】
反応条件は次の如くである。
2004267215.tif 000036
測定は、ライトサイクラーTMシステムを用いて行った。その際、該システムにあるＦ１〜３の検出器にうち、Ｆ１の検出器を用い、その検出器のゲインは１０、励起強度は７５に固定した。
【０１９８】
前記の如くにＰＣＲを行って、各サイクルの蛍光強度を実測した。その結果を図１３に示す。即ち、各コピー数のヒトゲノムＤＮＡについて、各サイクルの変性反応時及び核酸伸長反応時の蛍光強度を測定し、印字したものである。どのサイクルにおいても変性反応時には蛍光強度値は一定であるが、核酸伸長反応時には、２５サイクル目当たりから蛍光強度が減少しているのが観察される。そうして、減少はヒトゲノムＤＮＡのコピー数が多い順に起こることが分かる。
【０１９９】
図１３に示すようにヒトゲノムＤＮＡの各コピー数について初期のサイクル数の蛍光強度値が一様でなかった。それで、本比較例で使用するデータ解析方法に以下の過程（ｂ）〜（ｊ）を追加した。
（ｂ）１０サイクル目の蛍光強度値を１として各サイクルの蛍光強度値を換算する過程、即ち、下記の〔数式８〕による計算をする過程、
Ｃn＝Ｆn（７２）／Ｆ10（７２）          〔数式８〕
ただし、Ｃn＝各サイクルにおける蛍光強度値の換算値、Ｆn（７２）＝各サイクルの７２℃の蛍光強度値、Ｆ10（７２）＝１０サイクル目の７２℃における伸長反応後の蛍光強度値。
（ｃ）前記（ｂ）の過程で得られた各換算値を、サイクル数の関数として、デスプレー上に表示及び／又は印字する過程、
【０２００】
（ｄ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイクルの換算値から下記の〔数式９〕による蛍光強度の変化率（減少率、消光率）を計算をする過程、
〔数式９〕
Ｆdn  ＝ｌｏｇ10｛１００−Ｃn×１００）｝
Ｆdn  ＝２ｌｏｇ10｛１−Ｃn｝
ただし、Ｆdn＝蛍光強度変化率（減少率、消光率）、Ｃn＝〔数式８〕で得られた値。
（ｅ）前記（ｄ）の過程で得られた各換算値を、サイクル数の関数として、デスプレー上に表示及び／又は印字する過程、
【０２０１】
（ｆ）前記（ｄ）の過程で処理されたデータを、スレッシュホールド（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）としての０．５と比較し、その値に達したサイクル数を計数する過程、
（ｇ）前記（ｆ）の過程で計数した値をＸ軸に、反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットしたグラフを作成する過程、
（ｈ）前記（ｇ）の過程で作成したグラフをデスプレー上に表示及び／又は印字する過程、
（ｉ）前記（ｈ）の過程で描かれた直線の相関係数又は関係式を計算する過程、（ｊ）前記（ｉ）の過程で計算された相関係数又は関係式をデスプレー上に表示及び／又は印字する過程。
【０２０２】
上記のデータ解析用ソフトウエアを用いて、前記図１３で得られたデータを前記に引き続いて以下のように処理した。
図１４は、上記（ｂ）の過程で処理されたデータを印字した（前記（ｃ）過程）したものである。即ち、１０サイクル目の蛍光強度値を１として各サイクルの蛍光強度を換算し、その換算値を対応するサイクル数に対してプロットしたものである。
図１５は、前記（ｄ）の過程で処理したデータを印字した（前記（ｅ）過程）ものである。即ち、図１４の各プロット値から蛍光強度の減少率（消光率）を計算して、各計算値を各サイクル数に対してプロットしたものである。
【０２０３】
図１６は、前記（ｆ）の過程で処理したデータについて、前記（ｇ）の過程で作成したグラフを印字した（前記（ｈ）の過程）ものである。即ち、蛍光強度減少率＝０．５をスレッシュホールド（threshold）し、その値に達したサイクル数をＸ軸に、ヒトゲノムＤＮＡの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットしたグラフである。このグラフの直線の相関係数（Ｒ２）を前記（ｉ）の過程で計算し、印字した（前記（ｊ）の過程）もので、０．９５１４であった。このように、この相関係数では正確なコピー数を求めるは無理であった。
【０２０４】
実施例２３（本発明のデータ解析方法を用いてデータ処理がなされた実験例）
ＰＣＲは比較実験例１と同様に行った。
データ処理は、比較実験例１の（ｂ）の過程の前に下記の（ａ）の過程をおき、（ｂ）、（ｄ）の過程を以下のように変更する以外は比較実験例１と同様な過程で行った。
（ａ）各サイクルにおける増幅した核酸が本発明の核酸プローブである（蛍光色素で標識された）核酸プライマーとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値（即ち、核酸伸長反応時（７２℃）の蛍光強度値）を、核酸ハイブリッド複合体（増幅した核酸が核酸プライマーとハイブリダイズしたもの）が解離したときに測定された反応系の蛍光強度値（即ち、核酸熱変性反応完了時（９５℃）の蛍光強度値）で割る補正演算処理過程、即ち、実測の蛍光強度値を次の〔数式１〕で補正した。
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n          〔数式１〕
［式中、ｆn＝サイクルの蛍光強度の補正値、ｆhyb,n＝各サイクルの７２℃の蛍光強度値、ｆden,n＝各サイクルの９５℃の蛍光強度値］
得られた値を各サイクル数に対してプロットしたのが図１７である。
【０２０５】
（ｂ）各サイクルにおける〔数式１〕における補正演算処理値を〔数式３〕に代入し、各サイクルにおける各サンプル間の蛍光変化率（減少率又は消光率）を算出する演算処理過程、即ち、下記の〔数式１０〕で演算処理する過程、
Ｆn＝ｆn／ｆ25          〔数式１０〕
［式中、Ｆn＝各サイクルの演算処理値、ｆn＝〔数式１〕で得られた各サイクルの値、ｆ25＝〔数式１〕で得られた値で、サイクル数が２５回目のもの］。
〔数式１０〕は〔数式３〕において、ａ＝２５とした場合におけるものである。
【０２０６】
（ｄ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイクルの演算処理値を〔数式６〕による蛍光強度の変化率（減少率又は消光率）の対数値を得るための演算処理に付す過程、即ち、下記の〔数式１１〕で演算処理する過程、
ｌｏｇ10｛（１−Ｆn）×１００｝          〔数式１１〕
［式中、Ｆn＝［数式１０］で得られた値］。
〔数式１１〕は〔数式６〕において、ｂ＝１０、Ａ＝１００とした場合におけるものである。
【０２０７】
上記の結果を図１８及び１９に示した。
図１８は、前記（ａ）及び（ｂ）の過程で処理された値をサイクル数に対してプロットし、印字したものである。
図１９は、図１８で得られた値を前記（ｄ）の過程のように処理して得られた値を、サイクル数に対してプロットし、印字したものである。
【０２０８】
次に、図１９のグラフを基に、前記（ｆ）、（ｇ）、及び（ｈ）の過程で処理した。即ち、図１９のグラフを基に比較実験例１と同様に、ｌｏｇ10（蛍光強度変化率）のスレッシュホールド値として、０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．２を選び、その値に達したサイクル数をＸ軸に、ヒトゲノムＤＮＡの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットし、検量線を描かせた。その結果を図２０に示した。これらの検量線について前記（ｉ）及び（ｊ）の過程で処理して求めた相関係数（Ｒ2）は、前記各スレッシュホールド値に対して、各々０．９９８、０．９９９、０．９９９３、０．９９８５、０．９９８９、０．９９８８であった。これらの相関係数から、スレッシュホールド値として０．５（相関係数０．９９９３）を採用することが望ましいことが認識できた。この相関係数をもつ検量線であれば、未知コピー数の核酸試料について反応開始前のコピー数を精度よく求めることができることが分かる。
【０２０９】
実施例２４（核酸の融解曲線分析及びＴｍ値分析の例）
本発明の新規なＰＣＲ法により増幅された核酸について、５１）低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げるあるいは下げる過程（例えば、５０℃から９５℃まで）、５２）前記５１）過程において、短い時間間隔（例えば、０．２℃〜０．５℃の温度上昇に相当する間隔）で蛍光強度を測定する過程、５３）前記５２）過程の測定結果を時間の関数としてデスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の融解曲線を表示する過程、５４）前記５３）過程の融解曲線を一次微分する過程、５５）前記５４）過程の微分値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）をデスプレー上に表示する過程、５６）前記５５）から得られる微分値から変曲点を求める過程からなるソフトウエアを作成し、前記本発明のデータ解析用ソフトウエアに合体した。当該データ解析用ソフトウエアを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体をインストールした前記ライトサイクラーTMシステムを用いて本発明の新規リアルタイム定量的ＰＣＲ反応を行い、核酸融解曲線の分析を行った。本発明においては、蛍光強度は温度が上がるごとに増加する。
【０２１０】
実施例２３と同じヒトゲノムＤＮＡの１コピーと１０コピーについて、実施例２１と同様のＰＣＲを行い、前記５１）、５２）、５３）、５４）及び５５）の過程で処理されたデータを印字したものが図２１である。１コピーと１０コピーの７５回目の増幅産物について、本実施例の５１）、５２）及び５３）の過程で処理した核酸融解曲線の図が図２２である。５４）の過程でこの曲線を微分し、５５）及び５６）の過程で変曲点（Ｔｍ値）を求めたものが図２３である。図２３から、１コピーと１０コピーの増幅産物のＴｍ値が異なる故に、各増幅産物は異なる産物であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０２１１】
本発明は次のような効果を有する。
１）本発明の標的核酸の濃度を測定する方法、本発明の各種の核酸プローブ、特に2-O-アルキルオリゴヌクレオチド若しくは2-O-アルキレンオリゴヌクレオチド、2-O-ベンジルオリゴヌクレオチドなど化学的修飾オリゴヌクレオチドなどからなる本発明の核酸プローブ、またオリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドが介在するキメリックオリゴヌクレオチドなどからなる本発明の核酸プローブ、それらの本発明の核酸プローブを含有若しくは付帯する、標的核酸の濃度を測定する測定キット、及び前記の本発明の核酸プローブを結合してなるＤＮＡチップなどの核酸チップ若しくは核酸デバイスを用いると、測定系から未反応の核酸プローブを除く等の操作をすることがないので、標的核酸の濃度を短時間でかつ簡便に測定できる。また、複合微生物系又は共生微生物系に適用すると、当該系における特定菌株の存在量を特異的かつ短時間に測定できる。また、本発明は標的核酸若しくは遺伝子のＳＮＰなどの多型又は変異などの解析若しくは測定する簡便な方法を提供している。
【０２１２】
２）また、本発明の定量的ＰＣＲ方法は、次のような効果を有する。
ａ．ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる標的核酸の増幅に阻害的に作用する因子が添加されていないことから、従来公知の特異性のある通常のＰＣＲと同様の条件で定量的ＰＣＲを行うことができる。
ｂ．また、ＰＣＲの特異性を高く保つことができるので、プライマーダイマーの増幅が遅くなることから、従来公知の定量的ＰＣＲと比較すると定量限界が約１桁のオーダー低くなる。
ｃ．複雑な核酸プローブを用意する必要がないので、それに要する時間と費用が節約できる。
ｄ．標的核酸の増幅効果も大きく、増幅過程をリアルタイムでモニタリングすることができる。
【０２１３】
３）また、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する際、本発明のデータ解析方法を用いて、未知核酸コピー数の核酸試料について核酸のコピー数を求める検量直線を作成すると、検量線の相関係数は従来の方法により得られたものに較べて格段に高い。それで、本発明のデータ解析方法を用いると核酸の正確なコピー数を求めることができる。
【０２１４】
４）また、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法によって得られたデータの解析方法に係るデータ解析用ソフトウエア、また、その解析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、相関係数の高い検量直線を自動的に作成することができる。
【０２１５】
５）また、本発明の新規な核酸の融解曲線の分析方法を用いると、精度の高い、核酸のＴｍ値を求めることができる。更に、当該方法に係るデータ解析用ソフトウエア、また、その分析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、正確なＴｍ値を求めることができる
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】実施例１で得た核酸プローブを用いて大腸菌の１６ＳｒＲＮＡの５´末端から数えて３３５から３５８番目の核酸塩基配列を測定した場合の蛍光強度測定データを示す図。
【図２】３５塩基鎖2-O-Meプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションに対する熱処理の効果。  点線：rRNAを加熱処理後，標的核酸が添加された。  実線：非加熱処理rRNA．
【図３】プローブと標的核酸１６ＳｒＲＮＡのハイブリダイゼーションに対するプローブの塩基鎖の塩基数、ヘルパープローブ及びプローブの５’末端のリボースの２’位炭素ＯＨ基のメチル基修飾の効果。
【図４】本発明方法によるｒＲＮＡ測定のための検量線。
【図５】ＫＹＭ７株及びＫＹＭ８株の複合培養系のｒＲＮＡ量の時間経過についての本発明のＦＩＳＨ方法による分析。
【図６】本発明のＤＮＡチップを説明する図。
【図７】本発明のＤＮＡチップを用いるＳＮＰｓ検出測定のための装置類を説明する図。
【図８】本発明のＤＮＡチップを用いるＳＮＰｓ検出測定の実験結果を示す図。
【図９】ボデピーＦＬ／Ｃ６で標識したプライマー１及び２を用いた定量的ＰＣＲ方法：サイクル数と蛍光色素の発光の減少量の関係を示す図。図中の（１）〜（８）なる記号は、下記の意味を表す。  (1)大腸菌ゲノムＤＮＡコピー数：０；プライマー：プライマー１＋プライマー２、  (2)大腸菌ゲノムＤＮＡコピー数：２．４×１０6；プライマー：プライマー１＋プライマー２、  (3)大腸菌ゲノムＤＮＡコピー数：２．４×１０5；プライマー：プライマー１＋プライマー２、  (4)大腸菌ゲノムＤＮＡコピー数：２．４×１０4；プライマー：プライマー１＋プライマー２、  (5)大腸菌ゲノムＤＮＡコピー数：２．４×１０3；プライマー：プライマー１、  (6)大腸菌ゲノムＤＮＡコピー数：２．４×１０2；プライマー：プライマー１、  (7)大腸菌ゲノムＤＮＡコピー数：２．４×１０1；プライマー：プライマー１、  (8)大腸菌ゲノムＤＮＡコピー数：２．４×１０0；プライマー：プライマー１
【図１０】ボデピーＦＬ／Ｃ６で標識したプライマー１及び２を用いた定量的ＰＣＲ方法：サイクル数と蛍光色素の発光の減少量の対数値の関係を示す図。図中の（１）〜（８）なる記号は、図９と同じ意味を表す。
【図１１】本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いて作成した大腸菌１６ＳｒＤＮＡの検量線を示す図。  ｎ：１０n
【図１２】上図は、ＦＲＥＴ現象を用いるリアルタイム定量的ＰＣＲ方法において使用する蛍光色素で標識した二つのプローブの代わりに、本発明の一つのプローブを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行った場合の蛍光強度の減少率の変化を示す図である。下図は蛍光強度の減少が有為に観察され始めるサイクル数（threshold number：Ct値）を算出し、検量線を作成した図である。
【図１３】本発明の補正演算処理しない場合の、本発明のボデピーFL/C6で標識したプライマーを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲによって得られた蛍光減少曲線を示す図。  ■：標的核酸＝１０コピー；蛍光強度測定の反応系の温度＝７２℃、  ●：標的核酸＝１００コピー；蛍光強度測定の反応系の温度＝７２℃、  ▲：標的核酸＝１０００コピー；蛍光強度測定の反応系の温度＝７２℃、  ◆：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定の反応系の温度＝７２℃、  □：標的核酸＝１０コピー；蛍光強度測定の反応系の温度＝９５℃、  ○：標的核酸＝１００コピー；蛍光強度測定の反応系の温度＝９５℃、  △：標的核酸＝１０００コピー；蛍光強度測定の反応系の温度＝９５℃、  ◇：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定の反応系の温度＝９５℃
【図１４】各曲線の１０サイクル目の値を１として補正する以外は、図１３の曲線の場合と同様にしたリアルタイム定量的ＰＣＲによって得られた蛍光減少曲線を示す図。  ■：標的核酸＝１０コピー；蛍光強度測定温度＝７２℃、  ●：標的核酸＝１００コピー；蛍光強度測定温度＝７２℃、  ▲：標的核酸＝１０００コピー；蛍光強度測定温度＝７２℃、  ◆：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定温度＝７２℃、  ５：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定温度＝７２℃
【図１５】図１４の各曲線の各プロット値について、［数式９］の蛍光強度減少率（変化率）を計算し、計算値をプロットした曲線を示す図。  ■：標的核酸＝１０コピー、  ●：標的核酸＝１００コピー、  ▲：標的核酸＝１０００コピー、  ◆：標的核酸＝１００００コピー
【図１６】図１５のデータから求めたヒトゲノムＤＮＡの検量直線を示す図。  ｙ＝ヒトβ−グロビン遺伝子コピー数、  ｘ＝サイクル数（Ｃｔ）、  Ｒ2＝相関係数
【図１７】図１３の各サイクルの測定値を〔数式１〕で補正演算処理した値を各サイクル 数に対してプロットした曲線を示す図。  ■：標的核酸＝１０コピー、  ●：標的核酸＝１００コピー、  ▲：標的核酸＝１０００コピー、  ◆：標的核酸＝１００００コピー
【図１８】図１７の各サイクルの演算処理値を〔数式３〕で演算処理した値をサイクル数に対してプロットした曲線を示す図。  ■：標的核酸＝１０コピー、  ●：標的核酸＝１００コピー、  ▲：標的核酸＝１０００コピー、  ◆：標的核酸＝１００００コピー
【図１９】図１８の各サイクルの演算処理値を〔数式６〕の式で演算処理した値をサイクル数に対してプロットした曲線を示す図。  ■：標的核酸＝１０コピー、  ●：標的核酸＝１００コピー、  ▲：標的核酸＝１０００コピー、  ◆：標的核酸＝１００００コピー
【図２０】図１８の各log（蛍光変化率）値からＣｔ値の候補として、０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．２を適当に選んで、それに対応する検量直線を描かせた場合の図。尚、各検量線における相関係数を下記に示した。  ▲：log10（蛍光変化率）＝０．１；相関係数＝０．９９８、  ■：log10（蛍光変化率）＝０．３；相関係数＝０．９９９、  ●：log10（蛍光変化率）＝０．５；相関係数＝０．９９９３、  △：log10（蛍光変化率）＝０．７；相関係数＝０．９９８５、  □：log10（蛍光変化率）＝０．９；相関係数＝０．９９８９、  ○：log10（蛍光変化率）＝１．２；相関係数＝０．９９８８
【図２１】１コピー及び１０コピーのヒトゲノムＤＮＡについて、本発明のボデピーFL/C6で標識したプライマーを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行った場合の蛍光減少曲線を示す図。ただし、〔数式１〕の補正演算処理を施した。  １：標的核酸＝０コピー、  ２：標的核酸＝１コピー、  ３：標的核酸＝１０コピー
【図２２】図２１に示されるＰＣＲの増幅産物についての核酸の融解曲線分析を行った場合の核酸の融解曲線を示す図。  １：標的核酸＝０コピー、  ２：標的核酸＝１コピー、  ３：標的核酸＝１０コピー
【図２３】図２２の曲線を微分して得られた、Ｔｍ値を示す曲線を示す図（谷がＴｍ値）。  ２：標的核酸＝１コピー、  ３：標的核酸＝１０コピー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2004267215.tif 000048
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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