(57)【要約】【課題】　新規な組換えウイルス核酸の提供。【解決手段】　天然又は非天然のサブゲノムプロモーターを有する（＋）センス一本鎖RNAウイルスから選択される組換ウイルス核酸であって、当該組換えウイルス核酸は非天然タンパク質をコードする非天然核酸配列を含んで成り、宿主中で前記組換えウイルス核酸が前記非天然核酸を転写し、そして前記非天然タンパク質を生成せしめることが可能となる、ことを特徴とする組換えウイルス核酸。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　天然又は非天然のサブゲノムプロモーターを有する（＋）センス一本鎖RNAウイルスから選択される組換ウイルス核酸であって、当該組換えウイルス核酸は非天然タンパク質をコードする非天然核酸配列を含んで成り、当該非天然核酸配列の転写が前記ウイルスサブゲノムプロモーターによって制御され、これにより、穀類、ポテト、トウモロコシ又はタバコである宿主中で前記組換えウイルス核酸が前記非天然核酸を転写し、そして前記非天然タンパク質を生成せしめることが可能となる、ことを特徴とする組換えウイルス核酸。
【請求項２】
　前記宿主が、ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana benthamiana）である、請求項１に記載の組換えウイルス核酸。
【請求項３】
　前記ウイルス核酸が、前記宿主中で複製可能であるがしかし当該宿主に対して非感染性である、即ち自然条件下で生物学的に封じ込められる、請求項１に記載の組換えウイルス核酸。
【請求項４】
　天然又は非天然のサブゲノムプロモーターを有する（＋）センス一本鎖RNAウイルスから選択される組換ウイルス核酸であって、当該組換えウイルス核酸は非天然タンパク質をコードする非天然核酸配列を含んで成り、当該非天然核酸配列の転写が前記ウイルスサブゲノムプロモーターによって制御され、これにより、タバコである宿主中で前記組換えウイルス核酸が前記非天然核酸を転写し、そして前記非天然タンパク質を生成せしめることが可能となる、ことを特徴とする組換えウイルス核酸。
【請求項５】
　前記ウイルス核酸が、前記宿主中で複製可能であるがしかし当該宿主に対して非感染性である、即ち自然条件下で生物学的に封じ込められる、請求項４に記載の組換えウイルス核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、（ａ）自己複製性であり、（ｂ）宿主における系統的感染を行うことができ、（ｃ）宿主において転写または発現される、自然ウイルスに対して外来である核酸配列を含有するか、またはそれを含有することができ、そして（ｄ）特に外来核酸配列の転写および発現について、安定である、ウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
　ウイルスは、簡単な体制化および複製のメカニズムにおいて独特な特徴を有する、感染因子の１つのユニークなクラスである。事実、完全なウイルス粒子またはヴィリオンは、主として、タンパク質コートにより、時にはアルファウイルスの場合におけるように追加の膜のエンベロープにより、取り囲まれた自律的に複製できる遺伝物質（DNAまたはRNA）のブロックと見なすことができる。コートはウイルスを環境から保護し、そして１つの宿主細胞から他の宿主細胞への伝達のためのビヒクルとして働く。
【０００３】
　細胞と異なり、ウイルスはそれらのコート内にわずかの生合成酵素およびそれらの複製に要求される他の機構を含有する（か、またはそれらを含有しない）ので、大きさで生長せず、次いで分裂しない。むしろ、ウイルスは細胞中でそれらの別々の成分を合成し、次いでそれらを集合することによって増殖する。したがって、ウイルス核酸は、そのコートを脱落し、適当な細胞の機構と接触するようになり、ここでそれはウイルスの複製に必要なタンパク質の合成を特定する。次いで、ウイルス核酸はウイルスの酵素および細胞の酵素の双方を使用してそれ自体複製する。ウイルスのコートの成分が形成され、そして核酸およびコート成分は最終的に集合される。いくつかのウイルスでは、複製はヴィリオンの中に存在する酵素により開始される。
【０００４】
　ウイルスは３つの主要なクラスに再分割される；動物ウイルス、植物ウイルスおよび細菌ウイルス。各クラス内で、各ウイルスは細胞のある種のみを感染することができる。動物および細菌のウイルスでは、宿主範囲は細胞に対する結合の特異性により決定され、この特異性はヴィリオンのコートおよび細胞表面に対する特異的応答の双方に依存する。この制限は、トランスフェクションが起こるとき、すなわち、裸のウイルス核酸により感染が実施されるとき、消失し、その侵入はウイルス特異的レセプターに依存しない。
【０００５】
　所定のウイルスは一本鎖または二本鎖であることができるDNAまたはRNAのいずれかを含有することができる。ヴィリオン中で核酸部分は約１％〜約50％の間で変化する。ヴィリオン当たりの遺伝情報の量は約3kb〜300kb/鎖の間で変化する。ウイルス特異的タンパク質の多様性はそれに応じて変化する。二本鎖DNAを含有する下記のものを包含するが、これらに限定されない：８型肝炎ウイルス、パボガウイルス、例えば、ポリオーマおよびパピロマ、アデノウイルス、ポックスウイルス、例えば、ワクシニア、カリモウイルス群、例えば、カリフラファーモザイクウイルス（CaMV）、シュードモナス（Pseudomonas）ファージPMS2、ヘルペスウイルス、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）ファージSP8、およびＴバクテリオファージ。
【０００６】
　一本鎖DNAである代表的ウイルスは、パルボウイルスおよびバクテリオファージφX174、f1およびM13である。レオウイルス、カイコの細胞質多角体病ウイルス、イネ萎縮ウイルスおよび創傷腫瘍ウイルスは二本鎖RNAウイルスの例である。一本鎖RNAウイルスは、タバコモザイクウイルス（TMV）、カブ黄斑モザイクウイルス（TYMV）、ピコルナウイルス、ミクソウイルス、パラミクソウイルスおよびラブドウイルスを包含する。一本鎖ＲＮＡウイルス中のRNAは、プラスまたはマイナス鎖であることができる。ウイルスに関する一般的情報については、下記の文献を参照のこと：Grierson，D.et al.，Plant Molecular Biology，Blackie，London，pp.126-146(1984)；Gluzman，Y.et al.，Commnication in Molecular Biology：Viral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory，New York，pp.172-189(1989)。
【０００７】
　ウイルスを分類する１つの手段はそのゲノムの体制化に基づく。多数のウイルスはRNAゲノムを有するが、遺伝情報の体制化はグループ間で異なる。例えば、大部分の一連植物RNAウイルスのゲノムは、(+)−センスの一本鎖分子である。このゲノムに属するウイルスの少なくとも11の主要なグループが存在する。ウイルスのこの型の１例はTMVである。植物RNAウイルスの少なくとも６つの主要なグループは二部分ゲノムを有する。これらにおいて、ゲノムは通常別々の粒子の中に包膜された２つの独特の(+)−センス一本鎖RNA分子から成る。双方のRNAは感染性に要求される。ササゲモザイクウイルス（CPMW）は、二部分植物ウイルスの１例である。少なくとも６つの主要な型の植物ウイルスを含有する第３の主要なグループは三連であり、３つの(+)−センス一本鎖RNA分子を有する。各鎖は別々に包膜されており、そしてすべての３つは感染性に要求される。三連植物ウイルスの１例は、アルファルファモザイクウイルス（AMV）である。
【０００８】
　多数の植物ウイルスは、また、より小さいサブゲノムmRNAを有し、それらのmRNAは特定の遺伝子産物を増幅するように感作される。一本鎖DNAゲノムを有する植物ウイルスの１つのグループは、ジェミニウイルス群、例えば、カッサバ潜伏ウイルス（CLV）およびトウモロコシ条斑ウイルス（MSV）である。いくつかの植物ウイルスは、タンパク質の形質転換ウイルスとしての使用を予測して、それらの核酸を研究するためにクローニングされてきている。クローニングされたウイルスの例は下記のものを包含する：BMV，Ahlquist，P.およびM.Janda，Mol.Cell.Biol.，4:2876(1984)；TMV，Dawson W.O.et al.,，roc.Nat.Acad.Sci.USA，83：1832(1986)；CaMV，Lebeurier，G.et al.，Gene 12：139(1980)；およびBGMV、Morinaga,T.et al.，米国特許第4,855,237号。
【０００９】
　生物の多数の種を形質転換するために利用される技術が開発されてきている。これらの技術により形質転換することができる宿主は、細菌、酵母、真菌、動物の細胞および植物の細胞または組織を包含する。形質転換は、自己複製性でありかつ所望の宿主と適合性であるベクターを使用することによって達成される。ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスに基づく。外来DNAをベクターの中に挿入し、次いでこれを使用して適当な宿主を形質転換する。
【００１０】
　次いで、形質転換された宿主を選択またはスクリーニングにより同定する。これらの宿主の形質転換に関するそれ以上の情報については、下記の文献を参照のこと：Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning(第1版)およびSambrook J.et al.(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(1982，1989)；Molecular Cloning，D.M.Clover，編,IRL Press，Oxford(1985)；Grierson，D.et al.，Plant Molecular Biology，Blackie，London，pp.126-146(1984)、およびMethods in Enzymology，Vol.68，100，101，118および152-155(1979，1983，1986および1987)。
【００１１】
　植物宿主の形質転換に有用であることが示されたウイルスは、CaV、TMVおよびBVを包含する。植物ウイルスを使用する植物の形質転換は、下記の文献に記載されている：Mornaga，T.et al.、米国特許第4,855,237号(BGV)、欧州特許出願（EP-A）第67,553号（TMV）、日本国公告特許出願第63-14693号（TMV）、欧州特許出願（EPA）第194,809号（BV）、欧州特許出願（EPA）第278,667号（BV），Brisson，N.et al.，Methods in Enzymology，118：659(1986)(CaV)、およびGuzman，Y.et al.，Commnication in Molecular Biology：Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，pp.172-189(1989)。植物を包含する、多数の宿主においてfrgDNAを発現するとき使用する偽ウイルス粒子は、WO第87/ 06261号に記載されている。
【００１２】
　ウイルスがDNAウイルスであるとき、構築はウイルスそれ自体に行うことができる。また、外来DNAを使用する所望のウイルスベクターの構築を容易にするために、ウイルスをまず細菌プラスミドの中にクローニングすることができる。次いで、ウイルスをプラスミドから切除することができる。ウイルスがDNAウイルスであるとき、細菌の複製起点をウイルスDNAに取付け、次いでこれを細菌により複製させる。このDNAの転写および翻訳は、ウイルスDNAを包膜するコートタンパク質を産生するであろう。ウイルスがDNAウイルスであるとき、ウイルスを一般にcDNAとしてクローニングし、プラスミドの中に挿入する。このプラスミドを使用して、すべての構築物を作る。次いで、プラスミドのウイルス配列を転写し、ウイルス遺伝子を翻訳して、ウイルスRNAを包膜する１または２以上のコートタンパク質を生産することによって、RNAウイルスは生産される。
【００１３】
　植物における非ウイルス外来遺伝子の導入および発現のための植物RNAウイルスの構築は、上記ならびに下記の参考文献により証明される：Dawson，W.O.et al.，Virology，172：285-292(1989)；Takamatsu,N.et al.，EMBO J.，6:307-311(1987)；French，R.et al.，Science，231：1294-1297(1986)；およびTakamatsu，N.et al.，FEBS Letters，269：73-76(1990)。しかしながら、これらのウイルスベクターのいずれも植物の中で全体的い広がることができず、そして全植物中の植物細胞の大部分において非ウイルス外来遺伝子を発現することができない。
【００１４】
　先行技術のウイルスベクターの多数の他の欠点は、それらが非ウイルス外来遺伝子の維持のために安定でないことである。例えば、Dawson，W.O.et al.，Virology,172：286-292(1989）を参照のこと。したがって、ウイルスベクターおよびウイルスを開発するためのこの活動のすべてにかかわらず、宿主における系統的感染および外来ＤＮＡの安定な発現を可能とする、安定な組換えウイルスがなお要求されている。
【発明の開示】
【００１５】
　発明の要約
　本発明は、第１ウイルスサブゲノムプロモーターをコードする自然サブゲノムプロモーター、その転写が第１ウイルスサブゲノムプロモーターにより調節されるウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列、第２ウイルスサブゲノムプロモーター、およびその転写が第２ウイルスサブゲノムプロモーターにより調節される第２核酸配列をプロセシングするRNAウイルスから選択される組換えウイルス核酸に関する。組換えウイルス核酸の第１および第２のウイルスサブゲノムプロモーターは互いに関して相同の配列をもたない。組換えウイルス核酸は、宿主において第２核酸配列を系統的に転写するという特定の利点を提供する。本発明の範囲に入る好ましい生物は動物を包含する。
【００１６】
　本発明は、また、感染性であるウイルスベクター、ウイルスまたはそれらの一部分を産生することができる産生細胞、本発明のウイルスが感染した宿主、動物宿主細胞においてウイルス核酸の発現により産生された遺伝子産物、および動物宿主細胞において感染した宿主を成長させることによって所望の産物を生産する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
　本発明は、動物宿主内の増強された安定性を有し、これにより動物宿主内の核酸配列の持続された系統的転写を可能とする組換えウイルス核酸に関する。動物宿主内の増強された安定性は、組換えの頻度を減少して宿主内の野生型ウイルスの再生に導くと考えられる、二重サブゲノムプロモーター系の使用により達成される。
【００１８】
　詳しくは、本発明は、第１ウイルスサブゲノムプロモーターをコードする自然サブゲノムプロモーター、その転写が第１ウイルスサブゲノムプロモーターにより調節されるウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列、第２ウイルスサブゲノムプロモーター、およびその転写が第２ウイルスサブゲノムプロモーターにより調節される第２核酸配列をプロセシングする（+）センス、一本鎖RNAウイルスから選択される組換えウイルス核酸に関する。組換えウイルス核酸の第１および第２のウイルスサブゲノムプロモーターは互いに関して相同の配列をもたない。組換えウイルス核酸は、宿主において第２核酸配列を系統的に転写するという特定の利点を提供する。本発明の範囲に入る宿主生物は、原核生物および真核生物、特に動物および植物である。本発明の系は、また、植物に適用可能であり、そして以下の説明は、動物宿主にも適用できる、二重プロモーター系のいくつかのによりコードされるを参照する。
【００１９】
　組換えウイルス核酸が第２核酸配列を含んでなり、第２核酸配列が前記核酸が誘導されるプラスセンス一本鎖RNAウイルスと天然に関連しないという要件は、組換えウイルス核酸を自然と区別する。サブゲノムの説明は下記の参考文献に記載されている：R.E.F.Matthews，Plant Virology，第3版、Academic Press，Inc．San Diego p.180(1991)。
【００２０】
　本発明の組換えウイルス核酸は、感染した宿主内で第２核酸配列を系統的に発現する。系統的発現は第１および第２のサブゲノムプロモーターの間の核酸配列の差により可能であり、この差は野生型ウイルスを生ずるサブゲノムプロモーターの互いとの組換えおよびウイルスゲノムとの組換えを阻害する働きをする。その結果、本発明の組換えウイルス核酸は宿主内で第２核酸配列の持続した系統的転写を可能とするために十分に安定である。先行技術のベクターは同一サブゲノムを使用し（Ahlquist，et al.，J.Mol.Biol.，153：23(1981)）そして外来核酸配列の系統的転写を達成することができなかった。対照的に、出願人は、本発明に従い設計されたベクターを使用して、遺伝子操作されたものにおいてこれまで報告された最高の外来タンパク質の蓄積を達成した。参照、Kumagai，et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:427-430(1993)。
【００２１】
　本発明の必須の要件は、組換えウイルス核酸が互いに関して相同の配列を含有しないサブゲノムプロモーターを含有することである。そうでなければ、コートタンパク質配列、外来核酸配列およびサブゲノムプロモーターが組換えウイルス核酸に対して自然または非自然であるという要件は存在しない。むしろ、組換え核酸配列において使用されるコートタンパク質配列は、ウイルス核酸に対して自然または非自然であることができる。同様に、コートタンパク質配列および外来核酸配列のためのサブゲノムプロモーターは、ウイルス核酸に対して自然または非自然であることができる。
【００２２】
　例えば、本発明の１つの態様において、ウイルス核酸のためのコートタンパク質のコーディング配列およびサブゲノムプロモーターが欠失され、そして非自然ウイルスコートタンパク質のコーディング配列およびウイルス核酸に対して非自然であるサブゲノムプロモーターで置換されたウイルス核酸が提供される。非自然コートタンパク質のコーディング配列のためのサブゲノムプロモーターは、宿主において発現され、組換えウイルス核酸をパッケージし、そして組換えウイルス核酸による宿主の系統的感染を保証することができることが好ましい。
【００２３】
　本発明によれば、また、組換えウイルス核酸は２以上の外来核酸配列をコードすることができる。２以上の核酸配列が含まれる場合、各外来核酸配列を促進するために使用される各サブゲノムプロモーターは互いに関して相同の配列をもってはならない。
　第２態様において、組換えウイルス核酸は第１態様におけるように提供されるが、ただし自然コートタンパク質のコーディング配列は、非自然コートタンパク質のコーディング配列の代わりに、非自然コートタンパク質のサブゲノムプロモーターの１つに隣接して配置される。
【００２４】
　第３態様において、自然コートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接し、そして１または２以上の非自然サブゲノムプロモーターがウイルス核酸の中に挿入されている、組換えウイルス核酸が提供される。挿入された非自然サブゲノムプロモーターは宿主において隣接する遺伝子を転写または発現することができ、そして互いとの組換えおよび自然サブゲノムプロモーターとの組換えを行うことができない。外来配列が宿主においてサブゲノムプロモーターの制御下に転写または発現されて所望の産物を産生するように、外来核酸配列はサブゲノムウイルスプロモーターに隣接して挿入することができる。
【００２５】
　第４態様において、組換えウイルス核酸は第３態様におけるように提供されるが、ただし自然コートタンパク質のコーディング配列は非自然コートタンパク質のコーディング配列で置換されている。
【００２６】
　ウイルスベクターは、組換えウイルス核酸によりコードされるコートタンパク質により包膜されて、組換えウイルスを産生する。組換えウイルス核酸または組換えウイルスを使用して、適当な宿主を感染させる。組換えウイルス核酸は宿主において複製し、宿主において系統的に広がり、そして宿主において１または２以上の外来遺伝子を転写または発現して所望の産物を産生することができる。このような産物は治療用または他の有用なポリペプチドまたはタンパク質、例えば、酵素、複合生体分子、リボザイム、またはアンチセンスＲＮＡ発現から生ずるポリペプチドまたはタンパク質を包含するが、これらに限定されない。
【００２７】
　本発明は、また、感染性であるウイルスベクターを含有するウイルス、ウイルスまたはそれらの一部分を産生することができる産生細胞、本発明のウイルスが感染した宿主、ウイルス核酸の発現により産生された遺伝子産物、および感染した宿主を成長させることによる所望の産物を生産する方法に関する。
　明細書および請求の範囲の明瞭なかつ首尾一貫した理解を、このような用語に対する本明細書において与えた範囲を含めて、提供するために、下記の定義を提供する：
【００２８】
　隣接：定義した配列に対して直ぐに５’または３’のヌクレオチド配列中の位置。
　アンチセンスメカニズム：翻訳されるmRNAの少なくとも一部分に対して相補的であるRNA分子の細胞中の存在による、mRNAのタンパク質への翻訳速度を制御することに基づく遺伝子の複製の型。
　細胞培養物：非分化状態または分化状態であることができる細胞の増殖する塊。
【００２９】
　キメラ配列または遺伝子：少なくとも２つの異種部分から誘導されたヌクレオチド配列。配列はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでなることができる。
　コーディング配列：転写または翻訳されるとき、細胞のポリペプチドの形成を生ずるデオキシリボヌクレオチド配列、または翻訳されるとき、細胞のポリペプチドの形成を生ずるリボヌクレオチド配列。
【００３０】
　適合性：系の他の成分で操作する能力。宿主と適合性であるベクターまたはウイルス核酸は、その宿主において複製することができるものである。ウイルスのヌクレオチド配列と適合性であるコートタンパク質は、そのウイルスの配列を包膜することができるものである。
　遺伝子：孤立の細胞産物に関係する孤立の核酸配列。
　宿主：ベクターまたはウイルス核酸を複製することができ、そしてそのベクターまたはウイルス核酸を含有するウイルスが感染することができる、組織または生物。この用語は、適当ならば、原核生物および真核生物の細胞、器官、組織または生物を包含することを意図する。
【００３１】
　感染：その核酸を宿主に転移させるか、またはウイルス核酸を宿主の中に導入するウイルスの能力、宿主においてウイルス核酸は複製され、ウイルスタンパク質は合成され、そして新しいウイルス粒子が集合される。これに関して、用語「伝達性」または「感染性」は本明細書において互換的に使用される。
　非自然：配列が非自然であると言われるウイルスまたは生物の中に天然に存在しない配列。
【００３２】
　表現型特性：遺伝子の発現から生ずる観察可能な性質。
　植物細胞：プロトプラストおよび細胞壁から成る、植物の構造的および生理的単位。
　植物器官：植物の独特の、可視的に差別された部分、例えば、根、幹、葉または胚。
　植物組織：植物界（in planta）または培養における植物の組織。この用語は、全植物、植物細胞、植物器官、プロトプラスト、細胞培養物、または構造的および機能的ユニットに体制化された植物細胞の任意のグループを包含することを意図する。
【００３３】
　産生細胞：ウイルスまたはウイルスベクターを複製できるが、必ずしもウイルスに対する宿主ではない、細胞、組織または生物。この用語は、原核生物および真核生物の細胞、器官、組織または生物、例えば、細菌、酵母、真菌および組織を包含することを意図する。
　プロモーター：コーディング配列の転写の開始に関係するコーディング配列に隣接する、5’−フランキング非コーディング配列。
　プロトプラスト：細胞壁をもたず、細胞培養物および全宿主に再生する潜在能を有する、単離された細胞。
【００３４】
　組換えウイルス核酸：ウイルスに対して自然でない核酸配列を含有するように修飾されたウイルス核酸。
　組換えウイルス：組換えウイルス核酸を含有するウイルス。
　サブゲノムプロモーター：ウイルス核酸のサブゲノムmRNAのプロモーター。サブゲノムプロモーターは下記の参考文献において定義されている：R.E.F.Matthews，Plant Virology，第3版,Academic Press，Inc.San Diego p.180(1991)。
　実質的な配列の相同性：互いに実質的に機能的に同等であるヌクレオチド配列を意味する。実質的な配列の相同性を有するこのような配列の間の差は、このような配列によりコードされる遺伝子産物またはRNAの機能にほとんど影響を与えないであろう。
【００３５】
　転写：DNA配列の相補的コピーとしてのＲＮＡポリメラーゼによるRNA分子の産生。
　ベクター：細胞の間においてDNAセグメントを転移する自己複製するDNA分子。
　ウイルス：タンパク質の中に包膜されている核酸から構成された感染因子。
　本発明は、組換えウイルス核酸を含有する組換えウイルスによる宿主の感染、または宿主の感染した組織において転写または発現される１または２以上の非自然核酸配列を含有する組換えウイルス核酸により宿主感染を提供する。コーディング配列の産物は宿主から回収可能であるか、または宿主において表現型の特性、例えば、雄性不棯を引き起こす。
【００３６】
　本発明は多数の利点を有し、それらの１つは標的生物の形質転換および再生が不必要であることである。他の利点は、標的生物のゲノムにおいて所望のコーディング配列を統合するベクターを開発することが不必要であることである。胚芽細胞を精査する必要なしに、現存する生物を新規なコーディング配列で変更することができる。本発明は、また、所望の生物、組織、器官または細胞にコーディング配列を適用するというオプションを与える。組換えウイルス核酸は、また、外来コーディング配列について安定であり、そして組換えウイルスまたは組換えウイルス核酸は宿主において系統的感染を行うことができる。
【００３７】
　本発明によるキメラ遺伝子およびキメラベクターおよび組換えウイルス核酸は、この分野においてよく知られている技術を使用して構築される。適当な技術は下記の文献に記載されている：Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning(第1版)およびSambrook J.et al.(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(1982，1989)；Methods in Enzymol.，Vol.68，100，101，118および152-155(1979，1983，1986および1987)；Molecular Cloning，D.M.Clover，編，IRL Press，Oxford(1985)。培地組成物は下記の文献に記載されている：Miller，J.H.，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1972)ならびに前述の参考文献。DNAの操作および酵素の処理は、製造業者の推奨した手順に従い実施される。
【００３８】
　本発明の重要な特徴は、適合性宿主において複製することができるが、それら自体宿主を感染することができない、組換えウイルスヌクレオチド配列（RVNA）である。このヌクレオチド配列は、ウイルスヌクレオチド配列に対して実質的な配列の相同性を有する。ウイルスヌクレオチド配列は原核生物または真核生物のウイルスヌクレオチド配列であることができる。適当なウイルスヌクレオチド配列は、細菌、酵母、真菌、動物および植物を感染するウイルスのヌクレオチド配列を包含する。適当なウイルスの部分的リストは前述された。ヌクレオチド配列は、RNA、DNA、cDNAまたは化学的に合成されたRNAまたはDNAであることができる。
【００３９】
　本発明の特徴の任意のものを達成する第１工程は、ウイルス核酸の生物学的機能を破壊しないで、１または２以上の異なるサブゲノムプロモーターがウイルス核酸の中に挿入されるように、既知の慣用技術によりウイルスヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を修飾することである。サブゲノムプロモーターは互いに関して相同配列をもたないとき、それらは異なり、したがって、生ずる組換えウイルス核酸はin vivoにおいて安定である。サブゲノムプロモーター配列における差は、組換えの頻度を減少することによって、安定性を増大させる。サブゲノムプロモーターは、組換えウイルス核酸が感染した宿主において、隣接する核酸配列を転写または発現することができる。
【００４０】
　自然コートタンパク質のコーディング配列は保持されるか、または非自然コートタンパク質のコーディング配列と置換されることができる。コートタンパク質のコーディング配列を自然または非自然のサブゲノムプロモーターの制御下に配置することができる。コートタンパク質は宿主の系統的感染に関係する。
【００４１】
　本発明において使用できるウイルスのあるものは下記のものを包含するが、これらに限定されない：アルファウイルス、例えば、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（EEEV）、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（WEEV）、ベネズエラ脳脊髄炎ウイルス（VEV）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（SFV）およびロスリバーウイルス（RRV）、ライノウイルス、例えば、ライノウイルス２（HRV2）およびヒトライノウイルス89型（HRV89）、ポリオウイルス、例えば、ポリオウイルス２（Pv2）およびポリオウイルス３（PV3）、シミアンウイルス40（SV40）、タバコモザイクウイルス群からのウイルス、例えば、タバコモザイクウイルス（TMV）、ササゲモザイクウイルス（CMV）、アルファルファモザイクウイルス（AmV）、キュウリ緑班モザイクウイルススイカ系統（CGMMV-W）およびカラスムギモザイクウイルス（OMV）およびブロムモザイクウイルス（BMV）、ソラマメ斑紋ウイルスおよびササゲ褪緑斑点ウイルス。追加の適当なウイルスは、イネ壊死ウイルス（RNV）、アデノウイルス２型およびジェミニウイルス、例えば、トマト黄色モザイクウイルス（TGMV）、カッサバ潜伏ウイルスおよびトウモロコシ条斑ウイルスを包含する。適当なウイルスのこれらのグループの各々を下記において特徴づける。
【００４２】
　　　　　　　　　　　　　　　アルファウイルス
　アルファウイルスはタガウイルス科のウイルスの１属である。この属のメンバーのほとんどすべてはカにより伝達され、人間および動物において病気を引き起こすことがある。アルファウイルスは、３つの血清学的に規定された複合体に分類される。複合体特異的抗原はウイルスのE1タンパク質に関係付けられ、そして種特異的抗原はウイルスのＥ２タンパク質に関係付けられる。
【００４３】
　セムリキ森林ウイルス複合体は、ベバルウイルス、チクングニヤ熱ウイルス、ゲタウイルス、マヤロ熱ウイルス、オニヨンイヨン熱ウイルス、ロスリバーウイルス、サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびウハウイルスを包含する。ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス複合体は、カバッソウウイルス、エバーグラデスウイルス、ムカンボウイルス、ピクスナウイルスおよびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスを包含する。西部ウマ脳脊髄炎ウイルス複合体は、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ハイランズＪウイルス、キジラガウイルス、シンドビスウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルスおよびワタロラウイルスを包含する。
【００４４】
　アルファウイルスは、約11,703までのヌクレオチドのプラス鎖の425-498 mRNAと複合化した180コピーのキャプシドタンパク質の単一種から成る二十面体のヌクレオキャプシドを含有する。２つのウイルスのコード化された統合膜糖タンパク質（E1およびE2と呼ばれる）を含有する脂質エンベロープにより、前もって集合したヌクレオキャプシドが取り囲まれたとき、アルファウイルスは成熟する。細胞質中で集合したキャプシドが原形質膜を通して出芽したとき、エンベロープは獲得される。エンベロープは宿主細胞から誘導された脂質の２層から成る。
【００４５】
　425-498 mRNAは、非構造的タンパク質および構造的タンパク質に同時翻訳的に分割される糖タンパク質をコードする。RNAゲノムの3’の1/3は、キャプシドタンパク質およびE3、E2、K6およびE1糖タンパク質をコードする265 mRNAから成る。キャプシドタンパク質はＥ３タンパク質から同時翻訳的に分割される。キャプシドタンパク質のCOOH末端におけるHis、AspおよびSerのアミノ酸の三部分は分割に関係するセリンプロテアーゼからなると仮定される。Hahn，C.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82:4648(1985)。同時翻訳の分割は、また、E2およびK6タンパク質の間において起こる。
【００４６】
　したがって、分割前のE3およびE2と、K6およびE1からなるE1タンパク質とから成る２つのタンパク質PE2が形成される。これらのタンパク質は宿主細胞の内形質網状質の中に同時翻訳的に挿入され、グリコシル化され、ゴルジ装置を経て輸送され、ここでそれらは出芽のために使用されることができる。ヴィリオンの成熟の時点において、E3およびE2タンパク質は分離される。E1およびE2タンパク質は脂質エンベロープの中に組込まれる。
【００４７】
　示唆されたように、キャプシドタンパク質の基本的アミノ末端の半分はキャプシドとゲノムＲＮＡとの相互作用を安定化する、Garoff，H.，et al.,Nature，288：236(1980)か、またはゲノムRNAと相互作用して包膜する、Strauss E.G.et al.,Togaviruses and Flaviviruses，S.SchlesingerおよびM.Schlesinger，編，Plenum Press,New York，p.35-90(1980)。これらの示唆が意味するように、集合起点は非包膜ゲノムＲＮＡ上に位置するか、またはキャプシドタンパク質のアミノ末端に位置する。
【００４８】
　E3およびK6は、それぞれ、PE2およびE1を内形質網状質の中に挿入するためのシグナル配列として機能することが示唆された。Garoff，H.，et al.,Nature,288：236(1980);Delgarno,L.et al.,Virology，120:170(1983)。
【００４９】
　アルファウイルスの温度感受性突然変異体を使用する研究は、構造タンパク質の分割の失敗が成熟ヴィリオンの形成の失敗を生ずることが示された。Lindquist，B.H.et al.,Virology，151:10(1986）は、シンドビスウイルス、tg 20の温度感受性突然変異体を特徴づけた。温度感受性はヌクレオチド9502におけるA-U交換から生ずる。tg 損傷はPE2のE2およびE3への分割および非許容性温度における子孫ヴィリオンの最終の成熟を表す。Hahn，C.S.，et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：4648(1985）は、非許容性温度における前駆体ポリタンパク質の分割を防止するキャプシドタンパク質における、３つの温度感受性突然変異体を報告した。分割の失敗はキャプシドの形成を生じず、そして非常にわずかのエンベロープタンパク質を生じた。
【００５０】
　シンドビスウイルスの欠陥のある妨害性RNA（DI粒子）は、相同性標準的ウイルスの複製を特異的に妨害する、ヘルパー依存性欠失突然変異体である。Perrault，J.,Microbiol.Immunol.，93:151(1981)。DI粒子は少なくとも１つの外来遺伝子を細胞の中に導入するのための機能的ベクターであることが見出された。Levs，R.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：4811(1987)。
【００５１】
　DIゲノムの少なくとも1689の内部のヌクレオチドを外来配列で置換すること、および複製しかつ包膜されるRNAを得ることが可能であることが見出された。DIゲノムの欠失は生物学的活性を破壊しない。この系の欠点は、DI粒子が内部のRNA配列のランダム再配列および大きさの変更を明らかに行うということである。Monroe，S.S.et al.,J.Virology，49：865(1984)。内部の配列の中に挿入された遺伝子の発現は、期待したほど高くはない。Levis，R.et al.，上掲は、挿入された遺伝子の複製はきわめてすぐれているが、翻訳は低いことを見出した。これは翻訳部位についての全ウイルス粒子との競合および／または、また、いくつかの継代を通る再配列による遺伝子の崩壊からの結果であろう。
【００５２】
　mRNAの種がアルファウイルスで感染した細胞の中に存在する：42S mRNA、これは自然ヴィリオンの中にパッケージされており、そして非構造タンパク質のメッセージ前記機能する、および26S mRNA、これは構造ポリペプチドをコードする。26S mRNAは42S mRNAの3’の1/3に対して相同である。それは130Kのポリタンパク質に翻訳され、このポリタンパク質はキャプシドタンパク質と、２つのグリコシル化膜タンパク質、E1およびE2に同時翻訳的に分割およびプロセスされる。
【００５３】
　東部ウマ脳脊髄炎（EEE）系統82V-2137の26S mRNAは、Chang et al.,J.Gen.Virol.，68：2129(1987)によりクローニングされ、分析された。26S mRNA領域は、キャプシドタンパク質、E3、E2、6KおよびE1をコードする。キャプシドタンパク質のアミノ末端は、キャプシドとmRNAとの相互作用を安定化するか、またはゲノムRNAと相互作用して包膜を開始すると考えられる。
【００５４】
　非分割E3およびE2タンパク質（PE2と呼ぶ）は、タンパク質合成の間に、宿主内形質網状質の中に挿入される。PE2は、形態形成の間にウイルスヌクレオカプシドと相互作用する、少なくとも５つのアルファウイルスに対して共通の領域を有すると考えられる。
　6Kタンパク質は、膜を通るE1タンパク質の転位に関係するシグナル配列として機能すると考えられる。E1タンパク質はウイルス融合およびウイルスエンベロープへのE1タンパク質の定着を仲介すると考えられる。
【００５５】
　　　　　　　　　　　　　　　ライノウイルス
　ライノウイルスは、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）のウイルスの１属である。ライノウイルスは酸不安定性であり、したがって、約６より低いpHにおいて急速に不活性化れる。ライノウイルスは哺乳動物の呼吸管の上部に通常感染する。
【００５６】
　ヒトライノウイルスは、ふつうのかぜの主要な原因因子であり、そして多数のセロタイプが知られている。ライノウイルスは種々のヒト細胞培養物中で増殖することができ、そして約33℃の最適増殖温度を有する。ライノウイルスの大部分の系統は室温においてまたはそれより低い温度において安定であり、そして凍結に耐えることができる。ライノウイルスはクエン酸、ヨードチンキまたはフェノール／アルコール混合物により不活性化させることができる。
【００５７】
　ヒトライノウイルス２（HRV2）の完全なヌクレオチド配列が配列決定された。ゲノムは7120ヌクレオチドから成り、6450ヌクレオチドの長いオープンリーディングフレームを有し、このオープンリーディングフレームは5’末端から611ヌクレオチドで開始し、ポリ（A）トラクトから42ヌクレオチドで停止する。２つのキャプシドタンパク質およびそれらの分割部位が同定された。
【００５８】
　ライノウイルスRNAは一本鎖であり、そしてプラスセンスである。ＲＮＡはキャップされていないが、5’末端において小さいウイルスコード化タンパク質に接合され、ヴィリオン−タンパク質ゲノム−連鎖されている（VPg）。翻訳は単一のポリタンパク質を生ずると推定され、このポリタンパク質はタンパク質分解的分割により破壊されて個々のウイルスタンパク質を生ずる。
【００５９】
　二十面体のウイルスキャプシドは４つのウイルスタンパク質VP1、VP2、VP3およびVP4の各々の60コピーを含有し、そしてRNAゲノムを取り囲んでいる。Medapp，K.C.etal.,Virology，44:259(1971)。
【００６０】
　長いオープンリーディングフレームに先行する610ヌクレオチドの分析は、いくつかの短いオープンリーディングフレームを示す。しかしながら、機能を翻訳されたタンパク質に帰属させることができない。なぜなら、２つのだけの配列がHRV2、HRV14およびポリオウイルスの３セロタイプを通して相同性を示すからである。これらの２つの配列はウイルスの生活環において重要することがある。それらはHRV2中の436において開始する１６塩基のストレッチ、およびHRV2中の531において開始する２３塩基のストレッチである。非構造タンパク質の配列の残部からこれらの配列を切断または除去することは、成熟ヴィリオンを集合するという努力に対して予測不可能な効果を与えるであろう。
【００６１】
　HRV2のキャプシドタンパク質：VP4、VP2、VP3およびVP1は、それぞれ、ヌクレオチド611、818、1601および2311において開始する。VP1とP2Aとの間の分割点はヌクレオチド3255付近であると考えられる。Skern，T.et al.,Nucleic Acids Research，13：2111(1985)。
　ヒトライノウイルス89型（HRV89）はHRV2に非常に類似する。それは7152ヌクレオチドのゲノムを含有し、2164コドンの単一の大きいオープンリーディングフレームを有する。翻訳はポリ（A）トラクトの前のヌクレオチド619において開始し、そして４２ヌクレオチドにおいて終わる。キャプシド構造タンパク質、VP4、VP2、VP3およびVP1は翻訳すべき最初のものである。
【００６２】
　VP4の翻訳は619において開始する。分割部位は下記に存在する：
　　VP4/VP4 825　決定された
　　VP2/VP3 1627　決定された
　　VP3/VP1 2340　推定
　　VP1/P2-A 3235　推定
　uechler，M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:2605(1987)。
【００６３】
　　　　　　　　　　　　　　　ポリオウイルス
　ポリオウイルスは人間におけるポリオの原因因子であり、エンテロウイルスの３グループの１つである。エンテロウイルスはピコルナウイルス科（Pcornaviridae）（また、ライノウイルスの族）の１属である。大部分のエンテロウイルスは主として哺乳動物の胃腸管中で複製するが、他の組織は引き続いて感染されるようになる。多数のエンテロウイルスは主としてヒトおよびサルの腎細胞の培養においておよびある細胞系（例えば、HeLa、Vero、WI-38）において増殖することができる。エンテロウイルスの不活性化は加熱（約50℃）、ホルムアルデヒド（３％）、塩酸（0.1N）または塩素（約0.3〜0.5ppmのフリーラジカルCl2）により達成することができる。
【００６４】
　ポリオウイルスPV2（Sab）およびPV3（Sab）の完全なヌクレオチド配列が決定された。それらは、それぞれ、7439および7434である。単一の長いオープンリーディングフレームが存在し、これは5’末端から700ヌクレオチドより大きい部位で開始する。ポリオウイルスの翻訳は単一のポリタンパク質を生成し、これはタンパク質分解的プロセシングにより分割される。Kitamura，N.et al.,Nature,291：547 (1981)。
【００６５】
　非翻訳領域におけるこれらの相同配列はウイルスの複製において必須の役割、例えば、下記の役割を演ずる：
　　１．ウイルス特異的ＲＮＡ合成；
　　２．ウイルス特異的タンパク質合成；および
　　３．パッケージング。
　Toyoda，H.et al.,J.Mol.Biol.，174：561(1984)。
【００６６】
　ポリオウイルスのセロタイプの構造は、高度の配列の相同性を有する。それらのコーディング配列は、同一の順序で同一のタンパク質を有する。したがって、構造タンパク質の遺伝子は同様に位置する。PV1、PV2およびPV3において、ポリタンパク質は750ヌクレオチド付近において翻訳を開始する。４つの構造タンパク質VP4、VP2、VP3およびVP1は、それぞれ、約745、960、1790および2495において開始し、VP1は約3410において終わる。それらは，停止／開始コドンによるよりむしろ、タンパク質分解的分割によりin vivoにおいて分離される。
【００６７】
　　　　　　　　　　　　　　シミアンウイルス４０
　シミアンウイルス（SV40）はポリオーマウイルス属のウイルスであり、そしてアカゲザルの腎細胞から最初に単離された。このウイルスはこのような細胞において潜伏形態で普通に見出される。シミアンウイルス40はその自然宿主において通常非病原性である。
【００６８】
　シミアンウイルス40のヴィリオンは、３つの構造タンパク質、VP1、VP2およびVP3により作られる。Girard，M.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.，40:97(1970)；Prives，C.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71：302(1974)；およびRozenblatt，S.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，73:2747(1976)。３つの対応するウイルス遺伝子は、特にオーバーラップする方法で体制化される。それらはゲノムの後期遺伝子部分を構築する。Tooze，3.,Molecular Biology of Tumor Viruses、第２版、部２，p.799-831(1980)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.。
【００６９】
　キャプシドタンパク質VP2およびVP3は、それぞれ、ヌクレオチド545-1601および899-1601によりコードされ、そして双方は同一フレームにおいて読まれる。したがって、VP3はVP2のサブセットである。キャプシドタンパク質VP1はヌクレオチド1488-2574によりコードされる。したがって、VP2-VP3の末端は113ヌクレオチドだけVP1とオーバーラップするが、別のフレームで読まれる。Tooze，3.,Molecular Biology of Tumor Viruses，２版，部２，p.799-831(1980),Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor,N.Y.；Sychowski，C.et al.,J.Virology，61：3862(1987)。
【００７０】
　　　　　　　　　　　　　　　アデノウイルス
　アデノウイルス２型はアデノウイルス族の１メンバーまたはアデノウイルスである。ウイルスのこの族は非エンベロープ、二十面体、線状、二本鎖DNA含有ウイルスであり、哺乳動物または鳥類を感染する。
【００７１】
　アデノウイルスのヴィリオンはコアを取り囲む二十面体のキャプシドから成り、ここでDNAゲノムは基本的（アルギニンに富んだ）ウイルスポリペプチドＶＩに密接にアソシエートする。キャプシドは252キャプソマー、すなわち、240ヘキソン（各キャプソマーは６つの他のキャプソマーにより取り囲まれている）および12ペントン（各頭頂において１つ、各々は５つの「ペリペントンの」ヘキソンにより取り囲まれている）から構成されている。
【００７２】
　各ペントンはペントン塩基（ウイルスのポリペプチドIIIから構成されている）から成り、このペントン塩基は１つ（哺乳動物のアデノウイルスにおいて）または２つ（大部分の鳥類のアデノウイルスにおいて）の糖タンパク質繊維（ウイルスのポリペプチド）とアソシエートしている。繊維は血球凝集素として作用することができ、そして宿主細胞表面レセプターへのヴィリオンの結合部位である。ヘキソンの各々は３分子のウイルスのポリペプチドIIから成る；それらは二十面体の嵩を構成する。種々の他の小さいウイルスのポリペプチドがヴィリオンの中に存在する。
【００７３】
　アデノウイルスｄｓＤＮＡゲノムは、各鎖の５’末端において、疎水性「末端タンパク質」、TP（分子量約55,000）に共有結合している；DNAは異なるアデノウイルスにおいて異なる長さの逆方向末端反復を有する。検査した大部分のアデノウイルスにおいて、5’末端の残基はdCMPである。
【００７４】
　その複製サイクルの間に、ヴィリオンはその繊維を介して特異的細胞表面レセプターに結合し、そしてエンドサイトーシスによるか、または原形質膜の直接的貫入により細胞の中に入る。キャプシドタンパク質の大部分は細胞質の中に除去される。ヴィリオンコアは核の中に入り、ここで脱外被が完結して、ヴィリオンポリペプチドをほとんど含まないウイルスDNAを解放する。次いで、ウイルス遺伝子の発現が開始する。ウイルスのdsDNAは双方の鎖上に遺伝情報を含有する。前期遺伝子（領域E1a、E1b、E2a、E3、E4）は、ウイルスDNA複製の開始前に、発現される。後期遺伝子(領域L1、L2、L3、L4およびL5)は、DNA合成開始後においてのみ、発現される。中間遺伝子(領域E2bおよびIVa２）は、DNA合成の存在または非存在において、発現される。領域E1aは他の前期遺伝子の発現の調節に関係する製造をコードし、そして、また、形質転換に関係する。RNA転写はキャップされ（m7 G5 ppp5 Nで）、核中でアデニル化された後、翻訳のために細胞質に移される。
【００７５】
　ウイルスDNAの複製は末端部分、TP、ならびにウイルスコード化DNAポリメラーゼおよび他のウイルスおよび宿主のタンパク質を必要とする。TPは80Kの前駆体pTPとして合成され、pTPは形成されつつある複製するDNA鎖に共有結合する。pTPはヴィリオン集合の後期に成熟55KのpTPに分割される；多分この段階において、pTPはdCTP分子と反応し、dCMP残基に共有結合するようになり、その3’OHはDNA合成の開始のためのプライマーとして作用すると考えられる。ウイルス構造タンパク質の合成を生ずる後期遺伝子の発現は、細胞のタンパク質合成の停止により達成され、そしてウイルスアセンブリーは105／細胞までのヴィリオンの産生を生ずることがある。
【００７６】
　　　　　　　　　　　タバコモザイクウイルスのグループ
　タバコモザイクウイルス（TMV）は、タバコモザイクウイルス群の１メンバーである。TMVヴィリオンは管状フィラメントであり、そして単一の右らせんで配置されたコートタンパク質のサブユニットことからなり、一本鎖RNAがらせんの回転の間に介在している。TMVはタバコならびに他の植物を感染する。TMVは機械的に伝達され、そして土または乾燥した葉組織の中に１年またはそれ以上の間感染性を維持することができる。
【００７７】
　TMVヴィリオンは３より低いか、または８より高いｐＨを有する環境への暴露によるか、またはホルムアルデヒドまたはヨウ素により不活性化することができる。TMVの調製物は植物組織から（NH4)2SO4 沈澱、引き続く分画遠心分離により得るすることができる。
【００７８】
　TMVの一本鎖RNAゲノムは約6400ヌクレオチドの長さであり、そして5’末端においてキャップされているが、ポリアデニル化されていない。ゲノムRNAは約130,000（130K）の分子量のタンパク質、および約180,000(180K）のリードスルーにより産生される他のタンパク質のためのmRNAとして働くことができる。しかしながら、それはコートタンパク質の合成のためのメッセンジャーとして機能することができない。他の遺伝子は、感染の間において、モノシストロン性3’コターミナル（coterminal）サブゲノムmRNA（17.5Kコートタンパク質をコードするもの（LMC）および30Kタンパク質をコードする他のもの（I2）を包含する）の形成により発現される。30Kタンパク質は感染したプロトプラスト中で検出され、Virology,132:71(1984)、そして感染したタンパク質におけるウイルスの細胞／細胞の輸送に関係づけらた、Deom，C.M.et al.，Science,237：８:389(1987）。２つの大きいタンパク質の機能は未知である。
【００７９】
　ゲノムI2 およびLMCのRNAに相当する二本鎖RNAを包含する、いくつかの二本鎖RNA分子が、TMVで感染した植物組織中で検出された。これらのＲＮＡ分子は、異なるメカニズムにより起こるように思われる、ゲノムの複製および／またはmRNA合成のプロセスにおける中間体であると推定される。
【００８０】
　TMVの集合は植物細胞の細胞質中で明らかに起こるが、ctDNAの転写が精製されたTMVヴィリオン中で検出されたので、多少のTMV集合は葉緑体中で起こることがある。TMV集合の開始はコートタンパク質の環形凝集物（「ディスク」）（各ディスクは17サブユニットの２層から成る）と、RNA中のユニークな内部の核化部位；TMVの共通の系統における３’末端から約900ヌクレオチドのヘアピン領域との間の相互作用により起こる。この部位を含有するサブゲノムRNAを含む、任意のRNAは、ヴィリオンの中にパッケージされることができる。これらのディスクはRNAとの相互作用で明らかにらせん形をとり、そして集合（伸長）が双方向に進行する（が、核化部位から3’-→5’-方向においていっそう急速である）。
【００８１】
　タバモウイルス群の他のメンバー、キュウリ緑班モザイクウイルスのスイカ系統（CGMMV-W）はキュウリウイルスに関係する。Noru，Y.et al.,Virology，45:577(1971)。CGMMV-Wのコートタンパク質は、TMVおよびCGMMVの双方のRNAと相互作用して、in vitroにおいてウイルス粒子を構築する。Kurisu et al.,Virology,70:：14(1976)。
【００８２】
　タバモウイルス群のいくつかの系統は、集合起源の位置に基づいて、２つの下位群に分割される。Fukuda，M.et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA，78：4231(1981)。下位群Ｉ、これは普通系統、OM、およびトマト系統を含み、RNAゲノムの3’末端およびコートタンパク質のシストロンの外側から約800〜1000ヌクレオチドに集合起点を有する。Lebeurier，G.et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA，74:1913(1977)；およびFukuda，M.et al.、Virology，101：493(1980)。下位群ＩＩ、これはCGMMV-Wおよびコーンピー（cornpea）系統（cc）を含み、RNAゲノムの3’末端およびコートタンパク質のシストロンの内部から約300〜500ヌクレオチドに集合起点を有する。Fukuda，M.et al.、Virology，101：493(1980)。CGMMV-Wのコートタンパク質のシストロンは、3’末端からヌクレオチド176-661に位置する。3’非コーディング領域は175ヌクレオチドの長さである。集合起点はコートタンパク質のシストロン内に位置する。Meshi，T.et al.,Virology，127:52(1983)。
【００８３】
　　　　　　　　　　　　　ブロムモザイクウイルス群
　ブロムモザイクウイルス（BV）は、普通にブロムモザイクウイルス群と呼ばれる、三部分の一本鎖ＲＮＡ含有植物ウイルスの１群の１メンバーである。ブロモウイルス群の各メンバーは狭い範囲の植物を感染する。ブロモウイルス群の機械的伝達は容易に起こり、そしていくつかのメンバーは甲虫により伝達される。ＢＶに加えて、他のブロモウイルス群はソラマメ斑紋ウイルスおよびササゲ褪緑斑点ウイルスを包含する。
【００８４】
　典型的には、ブロモウイルスのヴィリオンは二十面体であり、約26mmの直径を有し、コートタンパク質の単一の種を含有する。ブロモウイルスのゲノムは、線状、プラス−センスの、一本鎖RNAの３分子を有し、そしてコートタンパク質のmRNAは、また、包膜されている。各RNAは5’キャップ末端を有し、そして3’末端にtRNA様構造（これはチロシンを受け取る）を有する。ウイルス集合は細胞質中で起こる。BMVの完全なヌクレオチド配列は、下記の参考文献に記載されているように、同定され、特性決定された：Alquist et al.,J.Mol.Biol，153:23(1981)。
【００８５】
　　　　　　　　　　　　　　　イネ壊死ウイルス
　イネ壊死ウイルスは、ジャガイモウイルスＹ群またはポチウイルス群の１メンバーである。イネ壊死ウイルスは、コートタンパク質の１型（分子量約32,000〜約36,000）および線状、プラス−センスの一本鎖RNAの１分子からなる柔軟性フィラメントである。イネ壊死ウイルスはポリブムクサ・アラミニス（Polvmvxa araminis）（植物、藻類および真菌の中に見出される真核生物の細胞内寄生生物である）により伝達される。
【００８６】
　　　　　　　　　　　　　　ジェミニウイルス群
　ジェミニウイルス群は、ユニークな形態のヴィリオンを有する、小さい、一本鎖DNA含有植物ウイルスの１群である。各ヴィリオンは、タンパク質の単一の型（約2.7〜3.4×104 の分子量を有する）から構成された、１対の同じ大きさの粒子（不完全な二十面体）から成る。各ジェミニウイルスのヴィリオンは、１分子の環状プラス−センス一本鎖ＤＮＡを含有する。いくつかのジェミニウイルス（すなわち、カッサバ潜伏ウイルスおよびマメ黄色モザイクウイルス）において、ゲノムは２つの一本鎖DNA分子を含有する二部分であるように見える。
【００８７】
　適当な植物ウイルスの核酸を利用して、本発明の組換え植物ウイルス核酸を製造することができる。植物ウイルスのヌクレオチド配列は、慣用技術を使用して、１または２以上のサブゲノムプロモーターを植物ウイルス核酸の中に挿入することによって修飾される。サブゲノムプロモーターは特定の宿主植物において機能することができる。例えば、宿主がタバコである場合、TMVが利用されるであろう。挿入されたサブゲノムプロモーターはTMV核酸と適合性であり、そしてタバコにおける隣接する核酸配列の転写または発現を指令することができなくてはならない。
【００８８】
　自然コートタンパク質遺伝子は、また、保持されることができそして、後述するように、その中に非自然核酸配列を挿入して融合タンパク質をつくることができる。この例において、また、非自然コートタンパク質が利用される。
【００８９】
　自然または非自然のコートタンパク質遺伝子は、組換え植物ウイルス核酸において利用される。どの遺伝子を利用しても、遺伝子はその自然サブゲノムプロモーターに隣接して、または他の利用可能なサブゲノムプロモーターの１つに隣接して、配置することができる。非自然コートタンパク質は、自然コートタンパク質の場合におけるように、組換え植物ウイルス核酸を包膜し、宿主植物の中に組換え植物ウイルス核酸を系統的に広げることができる。コートタンパク質は、問題の植物における系統的感染を提供するように選択される。例えば、TMV-Oコートタンパク質はニコチナ・ベンタミアナ（N.benthamiana）において系統的感染を提供するが、TMV-U1コートタンパク質はニコチアナ・タバクム（N.tabacum)において系統的感染を提供する。
【００９０】
　組換え植物ウイルス核酸は、適当な産生細胞においてウイルス核酸をクローニングすることによって調製される。ウイルス核酸がDNAである場合、それは慣用技術を使用して適当なベクター中に直接的にクローニングすることができる。１つの技術は、産生細胞と適合性であるウイルスDNAに対して複製起点を結合することである。ウイルス核酸がRNAである場合、ウイルスゲノムの全長のDNAコピーをまずよく知られている方法により調製する。例えば、ウイルスRNAを逆転写酵素を使用してDNAに転写して、サブゲノムDNA片を生成し、そしてDNAポリメラーゼを使用して二本鎖DNAを作る。
【００９１】
　次いで、DNAを適当なベクターの中にクローニングし、そして産生細胞の中にクローニングする。DNA片をマッピングし、適当な配列中で組み合わせて、必要に応じて、ウイルスRNAゲノムの全長のDNAコピーを生成する。次いで、コートタンパク質遺伝子を含むか、または含まない、サブゲノムプロモーターのDNA配列を、利用する本発明の特定の態様に従い、核酸の中に非必須部位において挿入する。非必須部位は、植物ウイルス核酸の生物学的性質に影響を与えない部位である。RNAゲノムは感染因子であるので、RNAが産生細胞において産生されるように、cDNAは適当なプロモーターに隣接して位置する。キャップされたRNAが感染因子である場合、ＲＮＡは慣用技術を使用してキャップされる。
【００９２】
　アルファウイルスの場合において、E1およびE2糖タンパク質はウイルスの伝達性においてある役割を演ずることができる（Garaff，H.et al.,Nature，228：236(1980))。これらの糖タンパク質は、コートタンパク質を取り囲む液体エンベロープの中に組込まれる。E1およびE2糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、アルファウイルスＲＮＡにおいてコートタンパク質のコーディング配列に隣接する。したがって、E1およびE2糖タンパク質のコーディング配列は、既知の慣用技術により、コートタンパク質のコーディング配列とともに除去することができる。
【００９３】
　本発明の第２特徴は、宿主において、ウイルス核酸に対して非自然の１または２以上の核酸配列を転写することができる組換えウイルス核酸である。非自然核酸配列は、自然コートタンパク質遺伝子プロモーターを包含する自然または非自然のウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して配置させることができる。非自然核酸配列は慣用技術により挿入されるか、または融合タンパク質が産生されるように、非自然核酸配列を自然コートタンパク質のコーディング配列に隣接して挿入することができる。
【００９４】
　転写される非自然核酸配列は、アンチセンスメカニズムにより表現型の特性の発現を調節できるRNAとして転写されることができる。また、組換えウイルス核酸中の非自然核酸配列を宿主の中において転写および翻訳して、表現型の特性を生成することができる。１または２以上の非自然核酸配列は、また、２以上の表現型の特性の発現をコードすることができる。非自然核酸配列を含有する組換えウイルス核酸は、慣用技術により、どのウイルスサブゲノムプロモーターを使用しても、１または２以上の非自然核酸配列が適切な向きであるように構築される。
【００９５】
　植物細胞において有用な表現型の特性は下記のものを包含するが、これらに限定されない：熱または冷さ、乾燥、塩分または浸透圧のストレスの極端さに対する改良された耐性；病害虫（昆虫、線虫またはクモガタ網）または病気（真菌、細菌またはウイルス）、酵素または二次代謝物の産生に対して改良された抵抗；雄性および雌性の不棯；矮小性；初期成熟；改良された収量、活力、ヘテロシス、栄養量、香味またはプロセシング性質、およびその他。他の例は、商業的使用のために重要なタンパク質または他の産物、例えば、リパーゼ、メラニン、顔料、抗体、ホルモン、薬剤、抗生物質およびその他を包含する。他の有用な表現型の特性は、分解性または阻害性酵素の産生である、例えば、モルト用オオムギの根の発育の防止または阻害するために利用される。表現型の特性は、また、バイオリアクターにおいてその産生が望まれる二次代謝物質であることができる。
【００９６】
　動物細胞の場合において、有用な表現型の特性は下記のものを包含するが、これらに限定されない：培養において増殖する能力、培養において増殖するとき、基質に結合する特性の排除、免疫応答の増強、不適当な免疫応答、例えば、自己免疫反応の最小化、より効率よい代謝、脂肪のない肉の生産のための脂肪および脂質の代謝の増加、欠陥のある酵素の置換および飼料のよりすぐれた利用。植物細胞と同様に、動物細胞に有用な表現型の特性の他の例は、商業的使用のために重要なタンパク質または他の産物、例えば、リパーゼ、メラニン、顔料、抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）、ヒト成長ホルモンおよびその他を包含するが、二次代謝物投与物の産生はバイオリアクターにおいて望まれる。
【００９７】
　キメラヌクレオチド配列の１例は、TMVに対して実質的な配列の相同性を有する第１ヌクレオチド配列と、チロシナーゼのコーディング配列である第２ヌクレオチド配列とを含有するものである。第２例において、ウイルスはカラスムギモザイクウイルス（OMV）またはイネ壊死ウイルス（RNV）である。第３の例において、第２ヌクレオチド配列はシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼのコーディング配列である。ジャガイモウイルスＹ（PVY）またはジャガイモウイルスＸ（PVX）を第４の例において使用する。
【００９８】
　第４の例において、キメラヌクレオチド配列はジェミニトマト黄色モザイクウイルス（TGMV）と、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）をコードする第２ヌクレオチド配列とを含有する。t-PAはプラスミドpt-PAtrp12，ATCC No.4040から単離される（米国特許第4,766,075号）。TGMVは双子葉植物および単子葉植物の双方の広い変種を感染し、これらの変種はタバコ、トマト、マメ、ダイズ、テンサイ、カッサバ、ワタ、トウモロコシ、カラスムギおよびコムギを包含する。多数の他の例は本明細書において例示される。
【００９９】
　第２ヌクレオチド配列を上記において製造した第１ヌクレオチド配列の中に、それがウイルスプロモーターに隣接するように、挿入することができる。ウイルスコートタンパク質遺伝子のプロモーターの位置はこの配列においてゲルのゲルの結果であることが知られているので、第２ヌクレオチド配列はこのプロモーターに隣接して配置することができる。また、適当なウイルスプロモーターをまず第２ヌクレオチド配列に結合し、次いでこの構築物を第１ヌクレオチド配列の中にまたはそれに隣接して挿入することができる。さらに、第２ヌクレオチド配列を変更されたコートタンパク質のコーディング配列の中にかつそれに隣接して挿入することができる。
【０１００】
　キメラヌクレオチド配列の二本鎖DNA、またはキメラヌクレオチド配列の相補的コピーの二本鎖DNAを産生細胞の中にクローニングする。ウイルス核酸がＲＮＡ分子である場合、キメラヌクレオチド配列をまず産生細胞と適合性であるプロモーターに結合する。次いで、キメラヌクレオチド配列を産生細胞と適合性である任意の適当なベクターの中にクローニングすることができる。この方法において、キメラヌクレオチド配列のRNAコピーのみが産生細胞において産生される。例えば、産生細胞が大腸菌（E.coli）である場合、lacプロモーターを利用することができる。産生細胞が植物細胞である場合、CaMプロモーターを使用できる。ウイルスRNAを生物学的活性のためのキャップしなくてはならない場合、産生細胞は真核細胞、例えば、酵母、植物または動物の細胞であろう。次いで、キメラヌクレオチド配列を産生細胞と適合性である任意の適当なベクターの中にクローニングすることができる。
【０１０１】
　また、キメラヌクレオチド配列は産生細胞と適合性であるプロモーターに隣接するベクターの中に挿入される。ウイルス核酸がDNA分子である場合、それを産生細胞と適合性である複製起点に結合することによって、それを産生細胞の中に直接的にクローニングすることができる。この方法において、キメラヌクレオチド配列のDNAコピーは産生細胞において産生される。
【０１０２】
　アルファウイルスの場合において、E1およびE2糖タンパク質およびコートタンパク質が除去されるとき、より大きい外来タンパク質のコーディング配列を挿入してキメラヌクレオチド配列を形成することができる。E1およびE2糖タンパク質はそれら自身のプロモーターをもたないので、コートタンパク質のプロモーターは、コートタンパク質、E1糖タンパク質およびE2糖タンパク質の隣接するコーディング配列の代わりに挿入された外来コーディング配列のために、使用されるであろう。
【０１０３】
　また、コートタンパク質、E1糖タンパク質およびE2糖タンパク質の隣接するコーディング配列の代わりに、２以上の外来コーディング配列を挿入することができる。しかしながら、この場合において、各外来コーディング配列はそれ自身の適当なウイルスプロモーターを必要とするであろう。しかしながら、コートタンパク質のプロモーターがヌクレオチド配列中で保存されている場合、そのプロモーターは１つのコーディング配列について使用可能であろう。
【０１０４】
　組換え植物ウイルス核酸の二本鎖DNA、または組換え植物ウイルス核酸の相補的コピーの二本鎖DNAを産生細胞の中にクローニングする。ウイルス核酸がRNA分子である場合、核酸（cDNA）をまず産生細胞と適合性であるプロモーターに結合する。次いで、RVNAを産生細胞と適合性である任意の適当なベクターの中にクローニングすることができる。この方法において、キメラヌクレオチド配列のRNAコピーのみが産生細胞において産生される。例えば、産生細胞が大腸菌（E.coli）である場合、lacプロモーターを利用することができる。
【０１０５】
　産生細胞が植物細胞である場合、CaMVプロモーターを使用できる。産生細胞は、また、真核細胞、例えば、酵母、植物または動物の細胞であることができる。また、RVNAは産生細胞と適合性であるプロモーターに隣接するベクターの中に挿入される。ウイルス核酸がＤＮＡ分子である場合、それを産生細胞と適合性である複製起点に結合することによって、それを産生細胞の中に直接的にクローニングすることができる。この方法において、キメラヌクレオチド配列のDNAコピーは産生細胞において産生される。
【０１０６】
　プロモーターは、RNAポリメラーゼを指令してDNAに結合せかつRNA合成を開始させるDNA配列である。強いプロモーターおよび弱いプロモーターが存在する。強いプロモーターの例は、lacuv5、trp、trp-lacuv5、λp1、ompF、およびblaである。大腸菌（E.coli）において外来遺伝子を発現する有用なプロモーターは、強くかつ調節されたプロモーターである。バクテリオファージλのλp1プロモーターは、強い、よく調節されたプロモーターである。Hedgpeth，J.M.et al.,Mol.Gen.Genet.，163：197(1978)；Bernard，H.M.et al.，Gene5：59(1979)；Remaut，E.P.et al.,Gene，15:81(1981)。
【０１０７】
　温度感受性λリプレッサーをコードする遺伝子、例えば、λcIts 857をクローニングベクターの中に含めることができる。Bernard et al.,Gene 5：59(1979)。低温（31℃）において、p1 プロモーターはcI−遺伝子産物により抑制された状態において維持される。低温（31℃）において、p1 プロモーターはcI−遺伝子産物により抑制された状態に維持される。温度を上昇させると、リプレッサーの活性は破壊される。次いで、p1 プロモーターは大量のmRNAの合成を指令する。このようにして、大腸菌（E.coli）産生細胞は所望の濃度に増殖した後、ベクター内でコードされた産物を産生することができる。同様に、培養温度を調節することによって、温度感受性プロモーターを活性化することができる。
【０１０８】
　非常に高いコピー数に条件的に達成できるプラスミドを構築することは有利であろう。例えば、lacまたはtacプロモーターを含有するpAS2プラスミドは42℃において非常に高いコピー数を達成するであろう。次いで、pAS2プラスミド中に存在するlacリプレッサーをイソプロピル-β-D-チオガラクトシドにより不活性化して、mRNAの合成を可能とする。
【０１０９】
　RVNAをつくるときの他の方法は、２以上の核酸を製造することである（すなわち、多部分ウイルスベクター構築物を製造することである）。この場合において、各核酸はそれ自身の集合起点を必要とする。サブゲノムプロモーターおよび非自然核酸を含有するように各核酸を製造することができる。
【０１１０】
　多部分ウイルスが核酸の１つの鎖上にそのコートタンパク質のコーディング配列、および異なる鎖上に伝達可能性因子のコーディング配列を有することが見出された場合、本発明に従い２つのキメラヌクレオチド鎖をつくる。１つの外来コーディング配列を核酸の１つの鎖上にコートタンパク質遺伝子の代わりに挿入し（または変更されたコートタンパク質遺伝子の次に挿入し）、そして核酸の他の鎖上に伝達可能性因子遺伝子の代わりに挿入する（または変更された伝達可能性因子遺伝子の次に挿入する）。
【０１１１】
　また、一部分ウイルスの核酸の中に非自然核酸を挿入すると、２つの核酸（すなわち、二部分ウイルスベクターの生成に必要な核酸）を生成することができる。自然核酸のコーディング配列のあるものの複製および翻訳と別に、非自然核酸の複製および転写または発現を保持しようとするとき、これは有利であろう。各核酸はそれ自身の集合起点をもたなくてはならないであろう。
　本発明の第３の特徴は、ウイルスまたはウイルス粒子である。ウイルスは、前述したように包膜されたRVNAからなる。次いで、生ずる産物は適当な植物宿主を感染することができる。RVNA配列は植物宿主内で転写および／または翻訳されて、所望の産物を産生する。
【０１１２】
　本発明の１つの態様において、組換え植物ウイルス核酸は異種キャプシドにより包膜される。最も普通には、これは態様は、いっそう幾何学的に拘束された二十面体キャプシドまたは球形キャプシドよりも、長いRVNAを包膜する能力を有するので、ロッド形キャプシドを使用する。ロッド形キャプシドの使用は、より長い非自然核酸の組込みを可能としてRVNAを形成する。２以上の非自然核酸がＲＶＮＡの中に存在するとき、このようなロッド形キャプシドは最も有利である。
【０１１３】
　本発明の他の特徴は、前述したようなRVNAを含有するベクターである。RVNAは、産生細胞プロモーターまたは産生細胞と適合性の複製起点から成る群より選択されるヌクレオチド配列に隣接して存在する。このベクターを利用して産生細胞を形質転換し、次いでこの産生細胞はRVNAを定量的に産生するであろう。産生細胞はベクターと適合性である任意の細胞であり、そして原核細胞または真核細胞であることができる。しかしながら、ウイルスRNA(RVNA）をキャップして活性化しなくてはならない場合、産生細胞は、真核産生細胞のように、ウイルスＲＮＡをキャップすることができなくてはならない。
【０１１４】
　本発明の他の特徴は、組換え植物ウイルス核酸またはウイルス核酸が感染した宿主である。宿主の中への導入後、宿主は自己複製、包膜および系統的広がりを行うことができるRVNAを含有する。宿主は慣用技術により組換えウイルスで感染させることができる。適当な技術は下記のものを包含するが、これらに限定されない：葉の摩剥、溶液中の摩剥、高速噴霧および宿主の他の損傷ならびに組換えウイルスを含有する水を使用する宿主種子の膨潤。さらに詳しくは、適当な技術は下記のものを包含する：
【０１１５】
　（ａ）手による接種
　包膜されたベクターの手による接種は、中性のpH、低いモル濃度のリン酸塩緩衝液を使用して、セライトまたはカーボランダム（通常約１％）を添加して実施される。１〜４滴の調製物を葉の上表面に置き、おだやかにこする。
【０１１６】
　（ｂ）植物ベッドの機械化された接種
　植物ベッドの接種は、葉を切断している間に、ベクター溶液をトラクター駆動刈取機の中に噴霧する（CO2 推進）ことによって実施される。また、植物ベッドを刈取り、そしてベクター溶液を直ちに切断された葉上に噴霧する。
　（ｃ）単一の葉の高圧噴霧
　単一の植物の接種は、また、緩衝化ベクター溶液中にほぼ１％のカーボランダムを含有する狭い、方向づけられた噴霧（50psi、葉から６〜12インチ）を葉に噴霧することによって実施される。
【０１１７】
　宿主植物の中にＲＶＮＡを導入する別の方法は、下記の参考文献に記載されている、アグロ感染またはアグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介形質転換（時にはアグロ−感染と呼ばれる）として知られている技術である：Grimsley，N.et al.,Nature、325：177(1987)。この技術はアグロバクテリウム（Agrobacterium）の普通の特徴を使用し、このアグロバクテリウムはそれらのDNA（T-DNA）の一部分を宿主細胞の中に転移させることによって植物に定着する。T-DNAは25塩基対の長さである境界配列により規定され、そしてこれらの境界配列の間のDNAは同様によく植物に転移される。T-DNAの間にRVNAを挿入すると、RVNAは植物細胞に転移され、ここでRVNAは複製し、次いで植物を通して系統的に広がる。
【０１１８】
　アグロ−感染は下記のものを使用して達成された：ジャガイモ紡錘塊茎ウイロイド（PSTV)(Gardner，R.C.et al.,Plant Mol.Biol.，6:221(1986))；CaV(Grimsley，N.et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA，83:3282(1986))；MSV(Grimsley，N.et al.,Nature，325：177(1987)およびLazarowitz，S.C.,Nucl.Acids Res.，16:229(1988))、ジジタリア条斑ウイルス（Donson，J.et al.,Virology，162：248(1988)）、コムギ萎縮ウイルス（Hayes，R.J.et al.,J.Gen.Virol.，69：891(1988)）およびトマト黄色モザイクウイルス（TGMV）（Elmer，J.S.et al.,Plant Mol.Biol.，10：225(1988)およびGardiner，W.E.et al.,EMBO J.，7:899(1988)）。したがって、罹病性植物のアグロ−感染は前述の任意のウイルスのヌクレオチド配列に基づくRVNAを含有するヴィリオンを使用して達成することができる。
【０１１９】
　本発明のなお他の特徴は、特定したポリペプチドまたはタンパク質産物の生産方法である。このようなポリペプチドまたはタンパク質産物は下記のものを包含するが、これらに限定されない：酵素、複合体生体分子、リボザイム、またはアンチセンスＲＮＡから生ずるポリペプチドまたはタンパク質産物。このような産物下記のものを包含するが、これらに限定されない：IL-1、IL-2、IL-3、...IL-12、およびその他；EPO、CSF、例えば、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF、およびその他；因子VIII；因子IX；tPA；hGH；レセプターおよびレセプターアンタゴニスト；抗体；ニューロ−ポリペプチド；メラニン；インスリン；ワクチンおよびその他。RVNAの非自然核酸は、所望の産物の産生に導く転写可能な配列を含んでなる。この方法は、適当な宿主を組換えウイルスまたは組換えウイルス核酸、例えば、前述のもので感染させ、感染した宿主を成長させて所望の産物を産生し、そして必要に応じて、所望の産物を単離することを包含する。感染した宿主の成長、ならびに生ずる産物の単離は慣用技術に従う。
【０１２０】
　例えば、タンパク質、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPTII）、α−トリコサンチン、イネα−アミラーゼのコーディング配列を、欠失されたＴＭＶコートタンパク質のコーディング配列のプロモーターに隣接して挿入する。他の例において、チロシナーゼのコーディング配列、例えば、ストレプトマイセス・アンティバイオディカス（Streptomyces antibioticus）から単離されたコーディング配列を、TMV、カラスムギモザイクウイルス（OMV）またはイネ壊死ウイルス（RNV）の同一プロモーターに隣接して挿入する。生ずる組換えウイルス核酸を使用して、前述したように、組換えウイルスを製造することができる。タバコまたは発芽するオオムギを組換えウイルスまたは組換え植物ウイルス核酸で感染させる。ウイルス核酸は植物組織において自己複製して、酵素アミラーゼまたはチロシナーゼを産生する。このチロシナーゼの活性はメラニンの産生に導く。参照、例えば、Huber，M.et al.,Biochemistry，24：6038(1985)。
【０１２１】
　他の例において、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼのコーディング配列、例えば、バシラス（Bacillus）種、No.17-1から単離されたコーディング配列（参照、米国特許第4,135,977号）を、OMV、RNV、PVYまたはPVXから誘導されたヌクレオチド配列のウイルスコートタンパク質のプロモーターに隣接して挿入し、ここでヌクレオチド配列はコートタンパク質のコーディング配列が除去されており、それゆえ非自然プロモーターおよびコートタンパク質遺伝子を含有する。トウモロコシまたはジャガイモを適当な組換えウイルスまたは組換え植物ウイルス核酸で感染させて、酵素シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを産生させる。この酵素の活性は、香味剤としてまたは薬物の送出しに有用な、シクロデキストリンの産生に導く。
【０１２２】
　ある植物において、産物としてアンチセンスRNAの産生は、ある種の表現型の特性の発現を防止するために有用なすることがある。特に、ある植物は薬物として乱用される物質を産生する（例えば、コカインはコカ植物から誘導され、そしてテトラヒドロカンナビノール（THC）はカンナビスまたはマジョルナ植物から誘導される乱用の活性物質である）。乱用性物質の産生に必要な植物RNAに対して相補的なアンチセンスRNAは、この物質の産生を防止するであろう。これは法律で禁じられている薬物の供給を減少することにおいて有効な道具であることを証明する。
【０１２３】
　本発明のなお他の特徴は、有機化合物の立体特異的触媒反応に適当な酵素を製造する方法である。非自然核酸は、所望の産物の産生に導く転写可能な配列を含む。この方法は、適当な宿主を組換えウイルスまたは組換えウイルス核酸、例えば、前述のもので感染し、感染した宿主を成長させて所望の産物を産生させ、そして所望の産物を単離することを含む。感染した宿主の成長、ならびに生ずる産物の単離は、慣用技術に従う。次いで、立体特異的酵素を利用して、所望の反応を触媒する。立体特異的酵素の１つの使用はラセミ体の分割である。
【０１２４】
　１つの例において、適当なエステラーゼまたはリパーゼのコーディング配列、例えば、適当な微生物から単離されたものを、TMV、カラスムギモザイクウイルス（OMV）またはイネ壊死ウイルス（RNV）のウイルスコートタンパク質のプロモーターに隣接して挿入し、ここでヌクレオチド配列はコートタンパク質のコーディング配列が除去されており、それゆえ非自然プロモーターおよびコートタンパク質遺伝子を含有する。タバコまたは発芽するオオムギを組換えウイルスまたは組換え植物ウイルス核酸で感染させる。この酵素を単離しそして、欧州特許出願（EP-A）第0,233,656号または欧州特許出願（EP-A）第0,227,078号に記載されているように、ナプロキサンのような化合物の立体特異的製造において使用する。
【０１２５】
　エステラーゼのコーディング配列は、適当な微生物、例えば、下記の微生物から単離される：バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）（この種の試料はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ATCC）米国マリイランド州ロックビレ）に受け入れ番号11945で受託された）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（この種の試料は発酵研究所（IFO）、日本国大阪、に受け入れ番号12996で受託された）、シュードモナス・リボフラビナ（Pseudomonas riboflavina）（この種の試料はIFOに受け入れ番号13584で受託された）、
【０１２６】
　シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）（この種の試料は応用微生物研究所（SAM），日本国、東京大学、に受け入れ番号1049で受託された）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（IFO 13130）、ムコル・アングリマクロポルス（Mucor angulimacrosporus）（SAM 6149）、アルトロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）（ATCC 21218）、菌株は下記の通りである：III-25（CBS 666.86）、菌株LK3-4（CBS 667.86）、菌株Sp4（CBS 668.86）、菌株Thai III18-1（CBS 669.86）、および菌株Thai VI12（CBS 670.86）。
【０１２７】
　好都合には、種バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）の培養物は、下記の種の培養物を包含する：バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）Thai1-8（CBS 679.85）、バシラス種（Bacillus species）In IV-8（CBS 680.85）、バシラス種（Bacillus species）Nap 10-M（CBS 805.85）、バシラス種（Bacillus species）Sp 111-4（CBS 806.85）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）1-85（Yuki，S.,et al.，Japn J.Gen.，42:251(1967)）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）1-85/pNAPT-7（CBS 673.86）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）1A-40/pNAPT-8（CBS 674.86）、およびバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）1A-40/pNAPT-7（CBS 675.86）。好都合には、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）の培養物は、種シュードモナス種（Pseudomonas species）Kpr 1-6（CBS 807.85）、およびシュードモナス・フルオレセンス種（Pseudomonas fluorescens species）（IFO3081）を包含する。
【０１２８】
　リパーゼのコーディング配列は、下記の属のような適当な微生物から単離される：カンジダ（Candida）、リゾプス（Rhizopus）、ムコル（Mucor）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、シュードモナス（Pseudomonas）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）、およびゲオトリチウム（Geotrichium）。カンジダ・シリンドラセエ（Candida cylindracea）（Qu-Minget al.，Tetrahedron Letts．27，7(1986)）のリパーゼは特に好ましい。
【０１２９】
　非自然核酸をウイルス核酸の構造遺伝子、例えば、コートタンパク質遺伝子の中に組込むことによって、融合タンパク質を形成することができる。ウイルス構造遺伝子上の調節部位は機能的に止まる。したがって、タンパク質合成は、通常方法において、外来遺伝子上のメチオニンの開始コドンから停止コドンまでにおいて起こり、融合タンパク質を生成する。融合タンパク質はアミノ末端においてウイルス構造タンパク質の一部分またはすべてを含有し、そしてカルボキシ末端において所望の物質、例えば、立体特異的酵素を含有する。その引き続く使用のために、立体特異的酵素をまずこの融合タンパク質からの特異的切断によりプロセスし、次いでさらに精製しなくてはならない。
【０１３０】
　臭化シアンとの反応は、メチオニン残基のカルボキシ末端におけるペプチド配列の切断に導く（5.0.Needlman，″Protein Sequence Determination″，Springer Publishers，1970、N.Y.）。したがって、この目的に対して、第２配列はメチオニンの追加のコドンを含有し、これにより融合タンパク質のＮ−末端の自然タンパク質配列と、Ｃ−末端の外来タンパク質との間にメチオニン残基を配置させることが必要である。しかしながら、他のメチオニン残基が所望のタンパク質の中に存在する場合、この方法は失敗する。したがって、臭化シアンを使用する切断は種々の他のアミノ酸において二次反応を引き出すという欠点を有する。
【０１３１】
　また、「リンカー」と呼ぶオリゴヌクレオチドセグメントを第２配列とウイルス配列との間に配置させることができる。このリンカーはタンパク質分解酵素の伸長された特定の切断部位のアミノ酸配列ならびに特定の切断部位をコードする（参照、例えば、米国特許第4,769,326号および米国特許第4,543,329号）。融合タンパク質中の非自然タンパク質のアミノ末端においてリンカーを使用すると、選択的酵素加水分解による臭化シアンの切断において固有の二次反応が回避される。このようなリンカーの例は、下記の一般式のテトラペプチドである：Pro-Xaa-Gly-Pro（配列識別Ｎｏ．１）（非自然タンパク質のアミノ末端）、式中Ｘａａは任意の所望のアミノ酸である。
【０１３２】
　全体の切断は、まずXaa-Gly結合をコラゲナーゼ（E.C.3.4.24.3、コレストリジオペプチダーゼＡ）で選択的に切断し、次いでアミノアシル−プロリンアミノペプチダーゼ（アミノペプチダーゼ−Ｐ、E.C.3.4.11.9）でグリシン残基を除去し、そしてプロリンアミノペプチダーゼ（E.C.3.4.11.5）でプロリン残基を除去することによって実施される。別の方法において、アミノペプチダーゼ酵素の代わりにポストプロリンデペプチジルアミノペプチダーゼを使用することができる。他のリンカーおよび適当な酵素は米国特許第4,769,326号明細書に記載されている。
【０１３３】
　本発明のなお他の特徴は、植物における雄性不棯を誘導する方法である。雄性不棯はいくつかのメカニズムにより誘導することができ、このようなメカニズムは下記のものを包含するが、これらに限定されない：アンチセンスＲＮＡのメカニズム、リボザイムのメカニズム、または雄性不棯または自己不適合性を誘導するか、または正常の配偶体の発育を妨害するタンパク質のメカニズム。キメラヌクレオチド配列の第２ヌクレオチド配列は、雄性不棯の誘導に導く転写可能な配列を含む。この方法は、ウイルス、例えば、前述のウイルスで適当な植物を感染し、そして感染した植物を成長させて所望の雄性不棯を生成することを含む。感染した植物の成長は慣用技術に従う。
【０１３４】
　雄性不棯は多数のメカニズムにより植物において誘導することができ、このようなメカニズムは下記のものを包含するが、これらに限定されない：（ａ）花粉の形成の非存在、（ｂ）不妊性の形成および／または非機能的花粉の形成、（ｃ）自己不適合性、（ｄ）自己適合性の阻害、（ｅ）ミトコンドリアの１または２以上の機能の混乱、（ｆ）ホルモンまたは正常の配偶体の発育を妨害する他の生体分子の産生の変更、または（ｇ）正常の配偶体組織に必要な発育遺伝子の阻害。これらのメカニズムは、アンチセンスRNA、リボザイム、遺伝子またはタンパク質産物を使用することによって達成することができる。本発明の組換え植物ウイルス核酸は、植物において雄性不棯を誘導するように機能する、１または２以上のヌクレオチド配列を含有する。この機能を達成するために、組換え植物ウイルス核酸は、ヌクレオチド配列、単一の遺伝子または１系列の遺伝子を含有することができる。
【０１３５】
　核コード化雄性不棯遺伝子を単離することによって、雄性不棯の特性を形成することができる。多数のこれらの遺伝子は単一の遺伝子であることが知られている。例えば、Tanksley etal.,Hort Science，23，387(1988)は、密接に連鎖した酵素コーディング遺伝子Prx-2の希有対立遺伝子（アレレ）とともにCISの中にms-10を配置した。Prx-2対立遺伝子（アレレ）は共優性であり、戻し交雑集団において劣性ms-10を有するヘテロ接合性植物についての選択を可能とし、そしてハイブリッド産生のために親の中に遺伝子を転移させるの間の子孫の試験の必要性を排除する。雄性不棯アントシアニン不含植物（ms-10aa/ms-10aa）を、希有ペルオキシダーゼ対立遺伝子が劣性雄性不棯対立遺伝子（ms-10 Prx-2’/+Prx-2+）とともにシスで存在する、ヘテロ接合性、棯性植物に交雑させた。雄性不棯植物を子孫（ms-10 Prx-2’/ms-10aa）から選択した。いったん雄性不棯遺伝子が予期された親系統の中に転移されると、不棯植物を戻し交雑またはＦ２　種子のロットから実生の段階で選択することができる。
【０１３６】
　パールミレットにおいて、劣性雄性不棯遺伝子がvg272およびIP482において見出された。パールミレット系統Vg272およびIP482における雄性不棯は、単一の劣性遺伝子により本質的に制御される。Vg272における雄性不棯は劣性遺伝子msのためであり、このmsは花粉の母細胞における減数分裂に対する効果をもたず、四分子からの微小胞子の分離後であるが、最初の有糸分裂分裂の開始前に作用する。
【０１３７】
　Dewey et al.,Cell，4：439-449(1986)は、雄性不棯（cms-T）トウモロコシのミトコンドリアから3547bpの断片を単離し、特性決定し、TURF243と表示した。TURF243は、12,961Mrおよび24,675Mrのポリペプチドをコードできる、２つの長いオープンリーディングフレームを含有する。TURF243転写物は、核レストーラー遺伝子Rf1およびRf2により棯性に回復した、ユニークに変更されたcms-T植物であるように見えた。Ｔ細胞質からのトウモロコシmtDNAの断片は、ヌクレオチド配列分析により特性決定された。ヌクレオチド配列を得るために、ゼア・マイズ（Zea Mays）L.の６〜７日齢の暗所で成長した実生から、慣用技術により、ミトコンドリアRNA（mtRNA）、およびmtDNAを製造した。
【０１３８】
　雄性不棯特性を形成できる他の手段は、ウイルスから雄性不棯遺伝子を単離することである。植物において雄性不棯を誘導する、いくつかのウイルスまたはウイルス様粒子が存在する。最近の研究が示唆するように、雄性不棯テンサイの中にウイロイド様因子が存在しうる。Pearson，O.N.,Hort Science，16：482(1981)。細胞質雄性不棯を孤立粒子、例えば、プラスミドまたは封入体によりコンディショニングすることができる。ウイルスは細胞不棯系の調節で播種伝達されない。ウイロイドは花粉を通して伝達されることができる。接木接着部を横切るいくつかの種類の因子の転移は、ペチュニア、テンサイ、ヒマワリ、およびアルファルファにおいて証明された。接ぎ穂の棯性に対する直接的作用は存在しないが、接ぎ木された接ぎ穂上のメインテナーによる自殖体または交雑体は次の世代において雄性不棯植物を生成した。
【０１３９】
　36℃において６数週、次いで25℃において成長させたcmsテンサイは、多分「細胞質の球形体」の排除のために新しい苗条から棯性植物を生成したが、植物からの子孫は通常の成長条件において３世代後に不棯に復帰した。ソラマメ植物（Vicia fabal）における細胞質の雄性不棯は、ウイルスまたはウイルス様粒子の存在により引き起こされることが見出された。多分、ｃｍｓ−系に類似する場合がニンニクにおいて起こる。胞子体のｃｍｓ植物に典型的な花粉の変性が見出されたが、電子顕微鏡の研究は他のものにおいてリケッチア様封入体を示し、これらは抗生物質で排除して、花粉を棯性となるようにすることができる。Konvicha et al.，Z.Pfanzenzychtung，80：265(1978)。
【０１４０】
　変更されたタンパク質を導入する第３の方法により、ミトコンドリアの中に輸送されるように特性ペプチド配列を使用し、そしてミトコンドリアの機能を混乱させることによって、雄性不棯特性を形成することができる。このタンパク質は正常のミトコンドリアの機能を圧倒するか、または致命的な経路において要求される代謝物を減少するように働くすることができる。ミトコンドリアにおけるわずかの混乱は雄性不棯に導くであろうことが広く考えられている。Remy et al.,Theor.Appl.Genet.，64：249(1983)は、正常および細胞質雄性不棯B.napus系統からの葉緑体タンパク質の２次元の分析を実施した。
【０１４１】
　B.napusのNおよびcms系統の葉緑体およびミトコンドリアのＤＮＡを特性決定し、そして制限酵素分析を使用して比較した。B.napusの中へcms特性を転移するために使用された、cms B.napusおよび日本ハツカダイコンのcms系統からの葉緑体ＤＮＡについて、同一の制限パターンが見出された。Remyの研究において、B.napusのＮおよびcms系統のストロマおよびチラコイドからの葉緑体タンパク質が、2-Dポリアクリルアミドゲルの分割により特性決定され、比較された。下記の事実が示された：（１）２つの系統のストロマ区画は非常に類似した、そして（２）系統はATPアーゼ複合体からのカップリング因子CPのβサブユニットに相当するスポットにより区別することができた。
【０１４２】
　植物において雄性不棯を誘導する第４の方法は、正常の配偶体の発育を変更するホルモンを誘導または阻害する、例えば、次の段階の前またはその段階においてジベレリン酸の産生を阻害して花粉の形成を混乱する、か、または次の段階の前またはその段階においてエチレンの産生を変更して花の形成および／または性の発現を変更することである。
【０１４３】
　植物において雄性不棯を誘導する第５の方法は、正常の雄性配偶体組織に必要な発育遺伝子を阻害する、例えば、発育シグナルＲＮＡまたはｍＲＮＡに対して相補的であるアンチセンスＲＮＡを使用する、ことである。Padmaja et al.,Cytologia，53：585(1988)は、ペチュニア同系交配系統から単離された自発的雄性不棯突然変異体についての細胞発生研究を論じている。雄性不棯はタペートの異形挙動に関連することが見出され、延長した核分裂および腺型から周辺細胞質型への変換の結果としての究極的変性により特徴づけられた。
【０１４４】
　植物において雄性不棯を誘導する第６の方法は、自己不適合性遺伝子を単離し、そしてこの遺伝子を本発明のベクターにおいて使用することである。異系交配を促進する自己不適合性（Ｓ）遺伝子系は、被子植物植物族の50％より多くにおいて存在する。Ebert，et al.,Cell，56：255(1989)。多数のＳ遺伝子合成はいくつかの種において知られている。いくつかの系において、豊富な花柱糖タンパク質（Ｓ糖タンパク質）が同定された。これらの遺伝子産物は多形であり、そして同定されたＳ対立遺伝子（アレレ）と相関づけることができる。Ｓ遺伝子は、N.alabaおよびB.oleraceaeの花柱糖タンパク質に相当し、クローニングされ、配列決定された。アミノ酸の置換および欠失／挿入は、配列を通じて存在するが、アレレ特異的をコードするようである、超可変性の領域において群化する傾向がある。
【０１４５】
　植物において雄性不棯を誘導する第７の方法は、自己不適合性をブロッキングすること、適合性部位に結合しかつそれを不活性化するタンパク質を操作すること、または自己適合性をオフにすること、mRNAを自己適合性タンパク質に結合するアンチセンスRNAを操作することである。
【０１４６】
　雄性不棯を生ずる特定の効果は、胞子形成細胞の前期段階から生活可能な花粉を含有する葯が開裂しない条件までの範囲であることができる。この範囲内の発育段階の一部分またはすべては影響を受けることができる。いっそう明らかな特定の効果のいくつかは、下記の例を包含する：
【０１４７】
　１）減数分裂が崩壊され、花粉母細胞または初期微小胞子の変性に導き、この場合において、花粉は流産し、そして他の発育は初期段階において阻止される。
　２）外膜の形成が崩壊され、そして微小胞子は形状が薄い壁の、多分歪んでおり、そして非生活可能性である。葯は一般に外膜よりも発育するが、まだ正常ではない。
　３）微小胞子の空胞の異常性、澱粉沈着の減少、およびタペートの持続性が明らかである。花粉は非生活可能であり、そして葯はなお正常ではない。
　４）花粉が存在し、生活可能であり、そして葯は正常に見えるが、開裂しないか、または非常に遅延した開裂を示す。
　５）自己不適合性のメカニズムは、花粉粒による花柱の酵素消化を崩壊または妨害する。
【０１４８】
　植物における雄性不棯は、花粉の落下の前の任意の段階における前述のメカニズムにより誘導することができる。選択した雄性不棯のメカニズムは、野外（温室）における植物に、実生の発生後にかつ花粉の落下前における任意の時に適用可能である。適用の正確な時期は、使用する雄性不棯メカニズムおよび雄性不棯植物の産生における最適な有効性に依存するであろう。
【実施例】
【０１４９】
　下記の実施例において、特記しない限り、酵素反応は製造業者の推奨した手順に従い実施された。特記しない限り、ベクターの構築および形質転換のために、標準的技術、例えば、下記の参考文献に記載されている技術を使用した：Maniatis，T.et al.,Molecular Cloning（第１版）およびSambrook J.et al.（第２版），Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(1982，1989)，Methods in Enzymol.,Vol.68，100，101，118および152-155（1979，1983，1986および1987)、およびDNA Cloning，D.M.Clover，編，IRL Press、Oxford(1985)。
【０１５０】
　例
　以下の例では、相反する指示のないかぎり、酵素反応は、メーカーが推奨する手順に従って行なわれた。相反する規定のないかぎり、Maniatis，T etal.，分子クローニング（第一版）及びSambrook J，et al.，（第２版），Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(1982、1989)，Meth.in Enzymol．第68，100，101，188及び152-155巻（1979，1983，1986及び1987年）及びDNAクローニング、D.M.Clover Ed.,IRL Press，Oxford(1985)に記述されているもののような標準的技術が、ベクターの構築及び形質転換のために利用された。
【０１５１】
　比較例
　以下の比較例は、宿主植物の全身感染の間の先行技術の組換え型ウイルス核酸の不安定性、又は植物を全身感染させ挿入された非未変性遺伝子の産物を効率良く産生することに関する無能性、のいずれかを実証するものである。
【０１５２】
　比較例１．
　TMVの30K及び外皮タンパク質の間にＴＭＶサブゲノミックRNAプロモータの背後に融合されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）を挿入することによって、組換え型植物ウイルス核酸を調製した。PTMV-CAT-CPをDawson，W.O et al.,Virology（ウイルス学）172：285-2921(1989)により記述されている通りに調製した。簡単に言うと、NcoI(nt，5460)でTMV菌株u1のフルゲノミックcDNAクローンであるPTMV204(Dawson,W.O.et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA.83：1832(1986)を切断し、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端化し、PstIリンカー（Boehringer-Mannheim BiochemicalsからのCCTGCACG）を添加し、PstI及びNsiI（nt6207）で切除し、この747-bpフラグメントを、外被タンパク質ORFについて置換されたCAT ORFを伴う修飾されたTMVであるpTMV-S3-CAT-28のNsiI部位（nt、6207）の中に連結することによってpTMV-CAT-CPを構築した。
【０１５３】
　Dawson，W.O et al.,Phytopathology(植物病理学) 78：783。TMVヌクレオチドの番号づけは、Goelct，P．etal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA，79：5818(1982)のものである。各々の構成体の正しい連結及び配向を、制限地図作製及び配列決定によってチェックした。
　接種：プラスミドDNA構成体のインビトロ転写及び接種手順は、前述の通りであった。Ahlguist，P．及びM．Janda，Mol.Cell Biol. 4：2876(1984)。Xanthiタバコ（Nicotiana tabacum L.）及びNicotiana svlvestrisの中でウイルスを全身的に伝播させた。Xanthi-ncタバコは局所的病巣宿主として用いられた。接種に先立って、植物を温室で成長させ、その後ひきつづき、植物成長チャンバ内で、約2000 1×の16時間光周期で25°で維持した。
【０１５４】
　CAT検定
　CAT活性の量を、基本的に記述された手順（Shaw，W．V.,Meth.Enzymology 53：737(1975)）により検定し、200mgの葉組織を、検定緩衝液中で解離させ、それに続いて0.5mMのアセチルCoAと0.1μCi〔14C〕-クロラムフェニコールを付加し、37°で45分間インキュベートし、抽出し、薄層クロマトグラフィそして最後にオートラジオグラフィにより解像した。
【０１５５】
　RNA分析
　接種から４日後に、感染を受けた葉からの全RNAを記述の通り（47a）に抽出した。ブロットハイブリダイゼーション分析のため、RNAを1.2％のアガロースゲル内で電気泳動させ、ニトロセルロースにトランスファし、CAT ORFを含有するpUC119又はpCM1（Pharmacia）内でTMV（rts、5080-6395）のニックトランスレーションを受けたcDNAとハイブリッド形成させた。感染を受けた葉からの合計ＲＮＡを同様に、基本的にAusubel，F．M，et al.,Current Protocols in Mol.Biol.，Wiley，N．Y，(1987)の中で記述されている通りに、野生型配列のためのＲＮアーゼ防御検定によって分析した。
【０１５６】
　pTMV204の3’半分（BamHI：nt，3332-PstI：nt、6401）をpT7/TM-19にクローニングした（BRLから）。EcoRI消化（nt，4254）の後、3’ウイルス配列に相補的な32Pで標識づけされた写しを産生させた。余分な量のプローブをRNA標本に対しハイブリッド形成させ、抽出された300UのRNアーゼT1（ＢRL）及び40μg/mlのRNase A（Sigma）で処理し、DMSO及びグリオキサルで変性させ、1.2％のアガロースゲル内で電気泳動させ、これをその後乾燥させてＫｏｄａｋ　Ｘ線フイルムに露光させた。
【０１５７】
　Progen ＹウイルスのcDNAクローンの構築
　精製されたビリオン（ウイルス粒子）からRNAを抽出し、cDNAを前述のDawson，W．O．et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：1822(1986)の通りに調製した。
　２本鎖cDNAをBamHI（nt，3332）及びSacI（nt，6142）で消化し、BamHI及びSacIで消化されたpUC19へとクローニングした。DNAのヌクレオチド配列決定はジデオキシヌクレオチドチェインターミネータ法によるものであった。Zagursky，R．et al.,Gene Anal.Tech. 2:89(1985)。
【０１５８】
　結果：外皮タンパク質遺伝子の上流に挿入されたCATカートリッジをもつpTMC-CAT-CPのインビトロ写しは、長さが7452ヌクレオチドで126K、183K、30K、CAT及び外皮タンパク質という遺伝子順序をもつハイブリッドウイルスであるCAT-CPを結果としてもたらした。インビドロ写しは、N．tabacum L.変種Xanthi及びXanthi-nc及びN．sylvestrisの葉に接種するのに用いられた。結果を、野生型ウイルス、TMV204又は、外皮タンパク質の代替物としてCATを発現する遊離RNAウイルス、S30CAT-28（Dawson，W．O．et al.、Phytopathology 78：783(1988)、有効に複製されTMV204と類似した形で接種された葉の中で細胞からから細胞へと移動したCAT-CPでの感染を受けた植物からのものと比較した。
【０１５９】
　Xanthi-ncタバコ上でほぼ同時に壊死病斑が発生し、これらはTMV204及びS3-CAT-2Bによりひき起こされるものと同サイズであった。CAT-CPは、全身性宿主Xanthiタバコ及びN．sylvestrisの接種された葉の中でいかなる症状も誘発しなかったが、TMV204により産生されたものに類似した葉を発生させるにあたりモザイク症状を生成した。ビリオンの精製後に得られた収量及び接種された葉の薄い切片の透過型電子顕微鏡検査法により見積られたCAT-CPでの感染を受けた細胞内のビリオンの濃度は、TMV204感染からのものとほぼ等しいと思われた。
【０１６０】
　CAT-CPは、TMV204についての6395ヌクレオチドに比して7452ヌクレオチドの長さをもち、これは結果として、野生型TMVの300nmビリオンに比べ長さ350nmのCAT-CPビリオンをもたらすことになる。CAT-CP感染を受けた植物の接種された葉からウイルスを精製し、透過型電子顕微鏡検査法により分析した。CAT-CP感染からのビリオンの大部分は、長さ350nmであった。電子顕微鏡検査法により調べられた。TMVU1のビリオンの長さを査定する上での１つの問題点は、調製物が通常、個々のゲノミック長のビリオンに加えて、断片化され末端同士凝集させられたビリオンを含む、という点にある。
【０１６１】
　350nm対300nmのビリオンの割合を決定するために、各サイズの全く異なる個々のビリオンを計数した。CAT-CPを接種した葉の中の350/300nmのビリオンの比率は、野生型感染からの12:253に比べ、191:21であった。野生TMV感染における350nmのビリオンは、TMVU1が末端同士で凝集する傾向をもち全ての長さのビリオンが見い出せることから、おそらくは、断片化されたビリオンの末端同士の凝集の結果としてもたらされたものである。これらのデータは、CAT-CPの余分な遺伝子が、これらの接種された葉の中で維持され、包膜されたということを示唆している。
【０１６２】
　CAT活性は、インビトロRNA写し又はその後の第１又は第２継代の局所的病巣を用いてCAT-CPの接種を受けた葉の中に検出された。検定した100以上の標本から、異なる陽性標本の間で一定範囲の変動が見られた。外皮タンパク質の無い突然変異体S3-CAT-2Bでの感染を受けたものと類似のレベルのCATが、CAT-CPで感染された葉の中に見られた。TMV204感染を受けた葉又は健康な葉の中にはバックグラウンド量しか検出されなかった。
【０１６３】
　TMVの複製を支持するものとして知られている一連の宿主を接種することにより及びCAT活性についてスクリーニングすることにより、CAT-CPの宿主範囲を野生型TMVのものと比較した。Solanaceaeに加えて３つの植物系統群を表わすZinnia eleaans Jacq.、Lunaria annua L.、Beta wlaaris L.、Calendula officinalis L.、及びSpinacia olraeea L.、の接種葉の中にCAT活性が検出された。このことはすなわち、TMVゲノムのこの変化が宿主範囲を変えると思われないということを表わしていた。
【０１６４】
　挿入された配列の結果として付加的なサブゲノミックRNAをCAT-CPが産生したか否かを見極めるためには、感染を受けた葉からの合計RNAを抽出し、TMV又はCATDNAプローブを用いてブロットハイブリダイゼーション分析により野生型TMVのものと比較した。Xanthi-ncタバコの中で予め２回継代されたCAT-CPでの感染を受けたXanthiタバコの葉を選んだが、その理由は、それらが、野生型TMVに比較すべき欠失をもつCAT-CP及び後代ウイルスの個体群を含んでいたからである。全く異なる２つのゲノミックＲＮＡが検出された。最大のものはTMV及びCATプローブの両方に対しハイブリッド形成したが、一方より小さいゲノミックRNAはTMVプローブに対してのみハイブリッド形成し、野生型のTv ゲノミックRNAと同時移動した。
【０１６５】
　TMV204に感染した葉からは２つであったのに対して、CAT-CPに感染した葉からのRNAの中には３つの全く異なる小さなＲＮＡが発見された。野生型TMVの外皮及び30Kタンパク質のためのサブゲノミックメッセージと同時移動したより小さなRNAは、Tv は特異的プローブに対してのみハイブリッド形成した。CAT-CPでの感染を受けた葉からのより大きなサブゲノミックRNAは、CAT及びTMVプローブの両方に対してハイブリッド形成した。
【０１６６】
　野生型TMVのサブゲノミックmRNAに関して、この大きい方のサブゲノミックRNAがゲノミックRNAと3’同末端であると仮定すると（Goelet，P．及びKarn，J.，J.Mol.Biol.154：541(1982)）、これらの結果は、CATの発現について予測された余分なCAT-CP mRNAと一貫性をもつものである。30K、CAT及び外皮タンパク質ORFを含む30Kのタンパク質のための推定上のCAT-CPサブゲノミックＲＮＡは観察されなかったが、これは恐らく、電気泳動中に宿主rRNAに付着しているウイルスRNAによって2.4〜4.4kbの間の領域内のバンドがおおい隠され、解像が困難であったせいと思われる。（Goelet，Pand Karn，J.，J.Mol.Biol.154：541(1982))；Dougherty，W．G.，Virology 131:473(1983)）。
【０１６７】
　上部の全身性感染を受けた葉の中のCAT活性の量は可変的であり、未接種の葉よりもはるかに低く、数多くのケースにおいて何も検出されなかった。Tv 及びCATプローブとのハイブリダイゼーションにより、ウイルスが保持するCAT配列の割合が急速に検出不能レベルまで減少したことが実証された。挿入されたCATORFが欠失された状態でのCAT-CPからウイルス個体群への遷移は、植物への全身的侵入の間、そして時として接種された葉の中で発生した。これとは対照的に、CAT配列及びCAT活性は往々にして、３回又は４回単一病巣を通して継代されたウイルスの接種を受けた葉の中で検出された。
【０１６８】
　全身的に感染を受けたXanthiタバコの葉から、接種後約30日を経て、CAT-CPビリオンが検査された。CAT-CPでの感染を受けた植物の最上部の葉からのビリオンの定量化は、78:716という350nm対300nmビリオン比を生み出した。これを未接種の葉における191:21という比と比較した結果、個体群の主要成分が、全身性感染中に300nmのビリオンへと移行したことをわかった。連続的なCAT-CPの複製の後に回収した欠失された後代ウイルスは、宿主範囲及び総体的症状に関して野生型TMVと同一であった。
【０１６９】
　CAT挿入を包含した領域（nts．3332-6142）のcDNAを、全身性感染を受けたXanthiの葉からの後代CAT-CPビリオンRNAからクローニングして、ウイルス個体群の標本−抽出した。サイズ及び制限地図作製による９つのcDNAクローンの特徴づけは、８つが野生型TMVと同一であることを表わした。
【０１７０】
　１つのcDNAクローンは、CAT-CP構成体について予測されたサイズであると思われたが、制限地図はCAT-CPについて予測されたものから変動していた。サイズ及び制限分析により野生型として評価された５つのクローンをCAT挿入の領域そして同時に外皮タンパク質遺伝子の一部分を通して配列決定され親の野生型ウイルスと同一であることがわかった。このことは、挿入された配列を切除して野生型TMVを発生させることができるということを示唆していた。
【０１７１】
　この考えられる切除を確証するため、ブロットハイブリダイゼーション分析において使用した全葉ＲＮＡの標本を、接種された葉の中に相補的なＴ７産生されたマイナス鎖ＲＮＡを用いたＲＮアーゼ防御検定によって分析した。これとは対照的に、単一病巣を通して３回又は４回継代されたウイルスの接種を受けた葉の中に、往々にしてＣＡＴ配列及びＣＡＴ活性が検出された。
【０１７２】
　接種から約30日後に、全身的に感染を受けたXanthiタバコの葉からCAT-CPビリオンが検査された。CAT-CPでの感染を受けた植物の最上部の葉からのビリオンの定量化は、78:716という350nm対300nmビリオン比を生み出した。これを未接種の葉における191:21という比と比較した結果、個体群の主要成分が、全身性感染中に300nmのビリオンへと移行したことをわかった。連続的なCAT-CPの複製の後に回収した欠失された後代ウイルスは、宿主範囲及び総体的症状に関して野生型TMVと同一であった。
【０１７３】
　CAT挿入を包含した領域（nts．3332-6142）のcDNAを、全身性感染を受けたXanthiの葉から後代CAT-CPビリオンRNAからクローニングして、ウイルス個体群の標本を抽出した。サイズ及び制限地図作製による９つのcDNAクローンの特徴づけは、８つが野生型TMVと同一であることを表わした。
【０１７４】
　１つのcDNAクローンは、CAT-CP構成体について予測されたサイズであると思われたが、制限地図はCAT-CPについて予測されたものから変動していた。サイズ及び制限分析により野生型として評価された５つのクローンをCAT挿入の領域そして同時に外皮タンパク質遺伝子の一部分を通して配列決定され親の野生型ウイルスと同一であることがわかった。このことは、挿入された配列を切除して野生型TMVを発生させることができるということを示唆していた。
【０１７５】
　この考えられる切除を確証するため、ブロットハイブリダイゼーション分析において使用した全葉RNAの標本を、野生型TMVのヌクレオチド4254-6395に相補的なT7産生されたマイナス鎖ＲＮＡを用いたRNアーゼ防御検定によって分析した。この領域内に野生型配列が存在する結果として、2140個のヌクレオチドの防御されたRNAがもたらされることになる。CAT-CPRNAからのこのサイズのバンドが、プローブを防御するべく野生型RNAを求めて産生された類似のバンドと同時移動した。
【０１７６】
　これらのデータは、CAT-CPの挿入された配列を精確に欠失させ得たことを確証している。CAT-CPと野生型TMVプローブRNAの間のハイブリッド内のバルジループが反復内の一定の位置範囲全体にわたり発生できるようにするCAT-CP RNA内の反復配列の存在を考慮に入れると、CAT-CP RNAによる野生型プローブのRNアーゼ防御は、683-935及び1202-1458という２つのヌクレオチドサイズ範囲内に入れることになるバンドセットを生成するはずである。見受けられたその他の２つの主要バンドはこれらのサイズのものであり、これらの標本中のCAT-CP RNAの存在を確証している。
【０１７７】
　CAT-CPの挿入された配列の喪失は、２つの逐次的プロセスに起因するものと思われた。第１のものは、後代ウイルスのcDNAクローンの配列分析により示されているような、個々の分子内の挿入された配列の喪失であった。欠失は反復配列間で発生したことから、これが、その他のプラスセンスRNAウイルスについて記述されているような相同な組換えによって発生した可能性がある。（Kirkegaard，K．and Baltimore，D.，Cell 47：433(1986)；Bujarski，J．and Kaesberg，P.，Nature 321：28(1986)；King，A．M．Q.，in RNA Genetics,，.Domingo et al.,Eds.,Vol.II，149-165，CRC Press，Inc.,Boca Raton，Fla．(1988)）。第２のプロセスは、結果としてウイルス個体群内の選択されたシフトを結果としてもたらした。
【０１７８】
　ウイルス個体群の標本を抽出したRNアーゼ防御検定は、CAT-CP及び野生型ウイルスの両方が、接種された葉の中の個体群の構成要素であり得ることを実証した。全身性感染を受けた葉の中のＣＡＴ−ＣＰの欠如は、恐らくウイルス個体群内のシフトに起因するものであったが、その理由は、もとのハイブリッドが複製及び全身性移動に関して欠失した後代野生型ウイルスと有効に競合できなかったことにあると思われた。
【０１７９】
　比較例２．
　外皮タンパク質遺伝子とTMVの非翻訳の3’領域の間にTMVサブゲノミックRNAプロモータの背後に融合されたCAT遺伝子を挿入することによって、組換え型植物ウイルス核酸を調製した。Dawson et al.(II）により記述されたとおりにpTMV-CP-CATを調製した。簡単に言うと、HindIII（nt．5081）でpTMV-S3-CAT-28を切断し、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端化し、PstI及びNsiI（nt．6207）を付加し、この1434-bpフラグメントをpTMV204のNsiI部位（nt．6207）の中に連結することによって、pTMV-CP-CATを構築した。各構成体の正しい連結及び配向を、制限地図作製及び配列決定によりチェックした。
【０１８０】
　比較例Ｉに記述されている通りに、植物接種、CAT検定、RNA分析及び後代のcDNAクローンの構築を実施した。大きい方のハイブリッドウイルス構成体であるpTMV-CP-CATは、30K遺伝子のうち外皮タンパク質サブゲノミックプロモータ及びアッセンブリ起源を含む部分の628ヌクレオチドの反復を内包していた。この構成体は、長さ7822ntで126K、183K、30K、外皮タンパク質及びCATという遺伝子順序をもつウイルスCP-CATを産生するはずである。CP-CATの複製は貧弱なものであった。
【０１８１】
　これは、小さく、野生型ウイルス病巣の直径の約半分であるXanthi-nc内の壊死病斑を生成し、その出現は２日だけ遅延していた。これらの病巣からのCP-CATの伝達性は、CAT-CP又は野生型TMVのものの約100分の１のレベルであった。Xanthi又はN．Sylvestris植物の中には全身性の症状は全く表われず、ウイルス感染は、接種された葉からのみ移入可能であった。CP-CATの感染を受けた葉の中では、再現可能なレベルのCAT活性が見い出された。このキメラウイルスの複製はこのように損なわれたことから、それ以上の特徴づけは進まなかった。
【０１８２】
　CAT-CPとは対照的に、全身的宿主内でさらに長い期間CP-CATを複製させた場合、植物の上部葉の中には野生型様のウイルスの徴候は一度も観察されず、それらからのウイルス回収は全く無く、このハイブリッドウイルスが野生型様のウイルスを作り出すような形で挿入配列を欠失させることはなかったということを示唆している。
【０１８３】
　比較例３．
　TMVゲノムの全長ＤＮＡコピーを調製し、Dawson，W．O．et al.(t)に記述されている通りにpBR322のPstI部位内に挿入した、ウイルス外皮タンパク質遺伝子を、30Kタンパク質遺伝子に隣接してTMVゲノムの位置5711に位置設定する。TMＶゲノムのDNAコピーを含むベクターを適切な制限酵素及びエキソヌクレアーゼで消化させる。例えば、外皮タンパク質コーディング配列はClaI及びNsiIでの部分消化によって除去されその後ウイルスの3’-テイルに再付着させるべく再連続される。
【０１８４】
　代替的には、ベクターを、ウイルス核酸の３’末端で切断する。ウイルスDNAを、外皮タンパク質コーディング配列の開始コドンまで、Bal31又はエキソヌクレアーゼでの消化により除去する。次に、ウイルス3’-テイルの配列を含む合成DNA配列を残りの5’末端に連結させる。ウイルス外皮タンパク質についてのコーディング配列の欠失を、TMV RNAを分離しそれを用いてタバコ植物を感染させることによって確認する。分離したTMV RNAは自然の条件下では感染力をもたないことがわかっている。
【０１８５】
　pNEOからの314bpのSau3Aフラグメント（Tn5NPTII遺伝子のNH2 末端）にクレノウポリメラーゼを充てんし、これをSalI（pd〔GGTCGACC〕）リンカーに連結した。次にこれをSalI及びPstIで消化し、PstI/SalIで消化されたpUC128内に挿入して（Keen，N．T. et al.，Gene，70：191(1988)）pNU10を得た。pNEOプラスミドをAsuIIで消化し、これにクレノウポリメラーゼを充てんし、これをXhoIリンカー（pd〔CCTCGAGG〕）に連続させて、pNX1を得た。pNX1をXhoIで消化し、クレノウポリメラーゼをこれに充てんし、PstIでこれを消化し、PstI/SalI消化したpNU10内に連結してpNU116を得た。
【０１８６】
　pNU116（NPTII配列）からのXhoI/SalIフラグメントを、外皮タンパク質プロモータに隣接して連結させる。NPTII遺伝子インサートを含む結果として得られたRFVNAを、TMV耐性のためＮ遺伝子を含むように戻し交配された栽培品種である12のNicotiana tabacum（cv，Xanthi-NC）及びＮ遺伝子を含まない栽培品種である12のN、tabacum（cv，Xanthi）に適用した。両方のタバコ栽培品種において、接種を受けたどの植物の中にも全身的展着は全く見られなかった。N、tabacum（cv．Xanthi NC）は、ウイルスに対する耐性を表わす接種葉上の特徴的な小斑点を示した。N、tabacum（cv．Xanthi）は、いかなる小斑点も全身的特徴も示さなかった。
【０１８７】
　比較例４．
　比較例１及び３に記述されている通りに、NFTIIコーディング配列を含む組換え型植物ウイルス核酸を調製した。NFTII及び外皮タンパク質コーディング配列は各々、「０」外皮タンパク質プロモータに隣接していた。外皮タンパク質遺伝子の存在は、ベクターを全身的に展着され得るものにするはずであった。NPTIIが挿入された遺伝子を含む結果として得られたRFVNAを、12のN．tabacum（cv．Xanthi NC）上で接種し、12のN．tabacum（cv．Xanthi NC）は、比較例１と同様に、12の植物の各々の中で小斑点を示した。N．tabacum（cv．Xanthi）植物）は、全ての12の植物の中でのベクターの全身的展着を示した。
【０１８８】
　N．tabacum（cv．Xanthi）の葉からの葉の円盤組織と、カナマイシン含有培地上で培養した。培地内で存続した組織は全くなく、NFTII遺伝子の喪失又は機能不全を示した。処置を受けたN．tabacum（cv．Xanthi）植物の葉から回収されたNFII遺伝子を含む当該ベクターのその後の電子顕微鏡写真検査は、このベクターがNPTII遺伝子に対応するベクターの一切断を失なったことを示し、ベクターの切断及び組換えを表わした。
【０１８９】
　好ましい実施形態例
　以下の例はさらに本発明を例示している。最初の一連の例は、植物内の２重プロモータ系の使用を例示している。これらは、その後に続く例において示されている動物宿主に対して２重プロモータ系をいかに応用できるかについて例示することを目的としている。これらの例は、本発明を例示することのみを意図されたものであり、制限的意味をもつものとみなされるべきものではない。
【０１９０】
　例１．細菌プラスミドの構築
　カッコ内の数字はTMV-U1配列を意味する。Goelet，P．et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.79:：818(1982)。DNA操作を、基本的にAusubel，M.et al.,のCurrrent Protocols in Mol.Biol.，Wiley、N.Y(1987)の中で記述されている通りに実施した。全てのプラスミドは、pTBN62を除きE.coli菌株JM109の中で増殖させた。（DH5α：Gibco BRL：及びH8101）。
【０１９１】
　ｐＴＫＵ１（図１）
　7.3kbのpTMV204、Dawson W．O．et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：1832(1982)、PstIフラグメント（TMV-U1ゲノム及びpPM1からのλファージプロモータ、Ahlguist．P、及びM．Janda，Mol.Cell Biol. 4：2876(1984)を、pUC19内にサブクローニングしてpTP5を得た。pTMV ApaIフラグメント（5455-6389）をオリゴヌクレオチドpd〔CAGGTACCCC〕及びd〔GGGTACCTGGGCC〕（配列番号２）に連結させ、KpnI（ヌクレオチド配列内の下線部分）及びNcoI(5459)で消化させ、NcoI/KpnIで消化されたpTP5の中に連結させてpTPK10を産生した。pTPK10からの7.3kbのPstI/KpnIフラグメントをPstI/Kpn-I消化したpUCl18の中にサブクローニングすることにより、pTKU1を構築した。
【０１９２】
　pTKU1は、pPM1からのλファージプロモータの下流に全TMV-VIゲノムのDNAコピーを内含していた。KpnI消化及びpTKUIのインビトロ転写により、感染性TMV RNAが提供された。オドントグロッサム輪点ウイルス（ORSV、時としてTMV-Oとも呼ばれる）外皮タンパク質、DHFR及びNFTIIORF内のPstI部位が、ハイブリッド構成体のプラスミドDNAを消化し感染性のインビトロ写しを産生するのにこの制限酵素（pTMV204:4を線形化するのに利用されたもの）を使用することを禁じていたことを理由として、pTKUIが構築された。
【０１９３】
　pT82（図１）
　pTMVS3-28、Dawson，W．O．et al.，Phytp pathology 78：783(1988)は、外皮タンパク質開始コドンがＡＣＧに対し突然変異させられ、XhoI部位が全外皮タンパク質コーディング配列に置換した、pTMV204の誘導体であった。pTMVS3-28からの1.9kbのNcoI/SalIフラグメント（p8R322内の5459-SaI1部位）を、NcoI/SalI消化したpNEO内に連結させ（Beck，E．et al.，Gene19：27(1982)）て、PNS283を得た。PBabsIは、TMV-U1（nts4254-6370）とヌクレオチド、ORF及びアミノ酸配列の類似性をもつORSVビリオンRNAからの2.4kbのｎのEcoRI cDNAクローンであった。
【０１９４】
　680bpのpBabs1 HincII/EarI（クレノウポリメラーゼで充てんされたもの）フラグメント（そのAUGの下流にORSV外皮タンパク質ORF及び203の塩基を含む）を、pNS283のNstI部位（6202：T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端化されたもの）内に連結させて、pB31を産生した。次にp831からのNcoI/SalIフラグメントを、NcoI/SalIで消化されたpTMV204内に連結させ（pBR322内の対応する野生型フラグメント5459-SalI部位と置換するもの）て、pTB281を得た。pTB281からのBamHI/SplIフラグメントをBamHI/SalIで消化されたpTKUI（対応する野生型フラグメント3332-6245と置換するもの）内に連結させることによってpTB2を構築した。
【０１９５】
　pNC4X、Brisson，Net．et al.,Nature 310：511(1984)
　pNC4Xは、pUC8X内にクローニングされたR67DHFR遺伝子で構成されていた。プラスミドは、DHFR遺伝子についての開始コドンの上流にXhoI部位の８つの遺伝子を含んでいた。さらに、DHFR配列の５つの塩基及び停止コドンを欠失させ、SalI部位で置換した。
【０１９６】
　pNU116
　315bpのpNEOSau3S（クレノウポリメラーゼが充てんされたもの）フラグメント（Tn5 NPTII遺伝子のNH2 末端）をSalI（pd〔GGTCGACC〕リンカーに連結させ、SalI/FstIで消化させ、FstI/SalI消化されたpUC128内に挿入して（Keen，N．T．el al.，Gene 70：191(1988）pNU10を得た。pNEOをAsuIIで消化し、クレノウポリメラーゼを充てんし、XhoIリンカー（pd〔CCTCGAGG〕）に連結させてpNX1を生成した。pNUII6は、XhoIでpNX1を消化させ、クレノウポリメラーゼを充てんさせ、PstIで消化させ、結果として得られた632bpのフラグメント（Tn5 NPTII遺伝子のCOOH末端）をPstI/SmaI消化したpNU10内に結合させることによって構築した。NFTII遺伝子のこの操作により、形質転換された植物細胞中のNFTII活性をその存在が減少させた開始コドンの上流の付加的なATCコドン16塩基が除去された。Rogers，S．G．et al.,Plant Mol.Biol.Rep. 3：111(1985)。
【０１９７】
　pTBD4及びpTBN62（図１）
　それぞれpNC4X（DHFR配列）及びpNU116（NPTII配列）からのXhoI/SalIフラグメントを、TMVコーディング配列と同じセンスでpT82のXhoI部位内に連結させた。
【０１９８】
　植物のインビトロ転写及び接種
　Dawson，W．O．etal.，Phyto patholosy 78：783(1988)内にあるように成長させられた植物に、それぞれKpnI消化されたpTBD2、pTBD4及びpTBN62からのインビトロ写しTB21（nt6602）、TBD4（nt．6840）及びTBN62（nt。7434）を接種した。インビトロ転写方法は、前述のとおりであった。
【０１９９】
　後代ビリオンＲＮＡの分析
　ウイルスの精製は基本的にGooding Jr.，G．V．及びHerbert T．T．Phyto pathology 57：1285(1967)により記述されている通りであり、ポリエチレングリコール（８％PEG、０．1M NaCl：０℃、１時間）での１回の沈降及び１回の超遠心分離（151000-235000×ｇ；90分）を伴っていた。１0mMのトリスHCl、pH7.5、1mM MEDTA、0.1％のSDS内の0.2μgのプロテイナーゼＫで37℃で１時間1mgのウイルスを消化させ、その後フェノール／クロロホルムでの抽出を行なうことによって、ビリオンRNAを抽出した。
【０２００】
　RNA標本を、DMSO変性し、グリオキサール化し、１％のアガロースゲル中で電気泳動させ、ニトロセルロース（孔径0.45μm；Schleicher and Schull;Ausubel，F．M．t al.，Current Protocols in Mol.Biol.，Wiley,N.Y.(1987)）にトランスファした。〔α-35 S〕-dATP（New England Nuclear）で標識づけされたGoolet,P.及びKaru，J．,J．Mol.Biol. 154：541(1982)、制限フラグメントで、このトランスファをプローブ探索した。RNアーゼ防御検定は、Ausubel，F．M．et la.，Current Protocols in Mol.Biol.，Wiley，N．Y．(1987)の中に記述されている通りであった。TBD4-38及びpTBN62-38は、それぞれBamHI/KpnI−消化されたpBluescripts KI（Stratagene）内にクローニングされたpTBD4及びpTBN62からのBamHI/KpnIフラグメント（nt．3332-6396）を含んでいた。
【０２０１】
　NPTIIの免疫学的検出
　標本の調製及びウェスタン分析は、先に記述されたとおりであった。Dawson，W．O．et al.，Phytopathology 78：783(1988)。液体N2 及び抽出緩衝液（10％のグリセロール、62.5mMのトリスHCl、ph7.5％メルカプトエタノール、5mMのフェニルメチルスルフォニルフルオライド）の中で葉の標本を磨砕した。等価のタンパク質濃度を決定し、ウシ血清アルブミンを標準として用いてBradford検定（Strategene；Bradford，M．M.，Aral.Biocehm.72：248(1976)）により、絶対濃度を見積った。ウエスタントランスファを、NPTIIに対する抗血清（1:500；5Prine，3Prime，Inc.）でプローブ探索し、次にアルカリ性ホスファターゼで接合されたヤギ抗ウサギIgG（1:1000）でプローブ探索した。
【０２０２】
　NFIII活性検定
　その硫酸ネオマイシンのリン酸化によって、NPTII活性を検出した。酵素検定は、抽出緩衝液が上述のとおりでありかつ健康な組織内の精製されたNPTII（５Prime、３Prime，Inc.）の希釈段階が内含されていたという点を除いて、McDonnell，R．E．et al.，Plant Mol.Biol.Rep.5：380(1987)の中に記述されている通りであった。
【０２０３】
　硫酸カナマイシンに対する耐性についてスクリーニングするための葉の円盤組織の検定
　NPTIIは、アミノグリコシドカナマイシンに対する耐性を付与する。Beck，E．et al.，Gene 19：327(1932)。接種12日後の若い全身性の葉を表面殺菌し、約0.01％のTween20（５分）、0.25％の次亜塩素酸ナトリウム、70％のエタノール（30秒）、精製水（４×10秒）の中で洗浄した。葉の円盤組織を、葉から対状に切断した。１つは、単独のMurashige and Skoog（MS）培地上に置き、もう１つは硫酸カナマイシンで補足されたＭＳ培地上に置いた。16時間の光周期で32℃で植物をインキュベートした。７日毎に、調製したばかりの培地に葉の円盤組織をトランスファした。
【０２０４】
　N.benthamiana植物に対しそれぞれDNA構築体pTB2、pTBD4及びpTBN62から誘導されたインビトロ写しを機械的に接種した結果、標準的なTMV形状及び収量（組織１グラムあたり1.5〜5.8mgのウイルス）のウイルスでの症候性感染が得られた。症候は、TVM-U1に感染した植物に比べるとさほど重症ではなく、全身性の葉の穏やかな白化と奇形を伴う植物の萎縮から成るものであった。それぞれTB2、TBD4及びTBN62での接種を受けた植物の全身性感染を受けた組織からのビリオン及びＲＮＡのサイズは、それぞれのプラスミドからインビトロで転写されたRNAの予測された長さと一貫性をもっていた。これらのRNA種は、TMV配列とそれに加えてそのそれぞれの細菌遺伝子インサートを内含していた。それぞれのゲノムの操作済み部分に対して相補的なプローブは、RNアーゼ防御検定の中で後代TBD4及びTBN62のウイルスRNAにより防御された。
【０２０５】
　このことはすなわち、以前の構成体（Dawson，W．O．et al.，Virology 172：285-292(1982)）について問題点であった挿入された配列の精確かつ急速な欠失がTBD4又はTBN62の場合に発生しなかったことを表わしていた。以前に報告された構成体の場合、外来性インサートは反復されたサブゲノミックプロモータ配列の間の組換えのせいで欠失していたという仮説が立てられた（Dawson，W．O．et al.，Virology 172：285-292(1989)）。TBD4及びTBN62では、このような反復配列は、非相同なサブゲノミックmRNAプロモータを利用することによって削減された。プローブより小さく全長ウイルスRNAよりも小さい観察された付加的なバンドは、TBN62個体群の一部分の中での変化を表わしている可能性があるが、この場合、全長バンド及び付加的な小さなバンドの総体的な割合は、その後の継代の後も変わらなかった。
【０２０６】
　N.benthamianaを通しての連続継代において、TBD4及びTBN62ビリオンRNAの配列安定性を調査した。それぞれpTBD4及びpTBN62からの２回及び４回の独立したインビトロ写しイオン反応で植物を接種し、全身的に感染を受けた葉組織を、11〜12日毎に一回連続継代させた。48日間の全身性感染の後、ノーザントランスファハイブリダイゼーションによりDHFR配列を含むTBD4の全長ビリオンＲＮＡがなおも検出され、RNアーゼ防御検定内でゲノムの操作された部分に対し相補的なプローブをなおも防御していた。ビリオンRNAの５つのクローン個体群を、N.tabacum Yanthi-nc上の局所的病巣の分離により、170日間増殖されたTBD4感染植物から誘導した。
【０２０７】
　個体群のうちの３つについてのコンセンサスDHFR配列は、コーディング配列のヌクレオチド７２における翻訳時に沈黙した第３の塩基変化（U→C）を除いて、公開されたDHFR配列と一致していた。DHFRコーディング配列の位置７２におけるヌクレオチド変化は、48日間増殖されたTBD4感染植物からの後代RNAの中では明らかでなかった。TBN62による連続的感染を受けた植物からのビリオンRNAは、独立した一連の継代の各々において欠失されつつあるNPTII配列の異なる部分と比較的低い安定性を有していた。これらの配列の喪失時間は、最初の継代の後（12-24日）と第３の継代（36→47日）の間で変動していた。TBN62のNPTII配列内の欠失の出現の理由はわかっていない。しかしながら、TBD4内のDHFR配列の安定性に基づくと、挿入された外来性配列のこのような不安定性は、発現ベクターTB2の固有の特長であるとは思われない。
【０２０８】
　それとは対照的に、このような欠失は、挿入された外来性配列自体のヌクレオチド組成により指示されるものであるかもしれない。DNA植物ウイルスベクターの間の類似の不安定性も見受けられた。
【０２０９】
　広く使用されている選択可能なマーカーNPTIIのための感受性酵素検定及び抗血清の市販供給原（McDonnell，R．E．et al.，Plant Mol.Biol.Rep.5：380(1987)）により、TBN62での感染を受けた組織をさらに分析することができた。ウエスタンブロット分析、酵素活性及び葉の円盤組織検定は、TBN62での全身性感染を受けた植物組織内で機能的NPTII酵素の存在及びその表現型発現が見られるものの、TB2での感染を受けた植物及び健康な植物の中ではそれが見られないことを実証した。NPTIIタンパク質及び酵素活性は、36日間増殖されたいくつかのTBN62感染植物の中でさえ検出された。
【０２１０】
　抽出可能なNPTIIタンパク質のレベルが、最高に発現されたTMVタンパク質である外皮タンパク質よりもかなり低いものであったというこは明らかであった。このような低レベルは、植物細胞内のそれぞれのタンパク質の相対的安定性又は分節を反映するものでもあり得るし、又は、サブゲノミックmRNAの合成又はリポータ遺伝子の転写後の発現に影響を及ぼすベクター又は外来性遺伝子配列の単数又は複数の様相に起因するものでもあり得る。ベクター構成体での感染を受けた植物からのウイルスの比較的高い収量は、ウイルス複製の効率の劇的な低下を排除するものと思われる。
【０２１１】
　しかしながら、低い発現のための１つの可能性は、ゲノムの3’末端との関係におけるリポータ遺伝子の位置であるかもしれない。異なるTMV突然変異体により産生される30kDaタンパク質の量は、ゲノムの3’末端からの30kDaのタンパク質ORFの距離に反比例することが示された。この関係は、French，R．及びAhlguist，P.，J.Virol，62：2411(1988)の観察事実すなわちブロムモザイクウイルスRNA3からのサブゲノミックＲＮＡのレベルが、3’末端に対してのプロモータの挿入が近ければ近いほど漸進的に高くなるという事実と一貫性あるものであった。
【０２１２】
　例２．
　例１のRPMは、N.benthaniana内で全身的に展着することができるものの、N.tabacum内で全身的に展着することはできない。この例は、N.tabacum内で全身的に展着することのできるRPMの合成について記述する。
　pTB2内に含まれたO外皮タンパク質コーディング配列を、AhaIIIでの消化によりpTB2から切断した。UI外皮タンパク質コーディング配列を、AhaIIIでの消化によりpTMV204から除去させ、AhaIII消化されたpTB2内に挿入してベクターpT8U5（図１）を産生した。
【０２１３】
　それぞれpNC4X（PHFR配列）及びpNU116（NPTII配列）からのXhoI/SalIフラグメントを、TMVコーディング配列と同じセンスでpTBU5のXhoI部位の中に連結させた。N.tabacum植物に例１に記述した通りに接種を施し、これを分析した。全身性感染を受けた植物内では、機能的酵素が見られたが、対照植物内では見られなかった。
【０２１４】
　例３．
　この例は、未変性外皮タンパク質遺伝子がその未変性サブゲノミックプロモータの制御下にあり、非未変性サブゲノミックプロモータが非未変性核酸の発現を駆動するべく挿入されているようなRVNAの合成について記述している。
【０２１５】
　TMOプロモータ及びTMV-UI外皮タンパク質配列を、XhoI及びKpnIでの消化によりpTB2から除去する。平滑末端化及びPstIリンカーの添加により、XhoI末端をPstI部位に変換する。このPstI/KpnIフラグメントをBluescriptベクターの中にサブクローニングさせる。以下のような部位特異的突然変異誘発により、このBluescriptベクターの２つのサブクローンを作り出す：ATG（外皮タンパク質）出発部位において突然変異を強制しATG部位の近くにXhoI部位を作り出すことになる、部位特異的フラグメントを作製する。PCT技術を用いることによって、Bluescript SubIを調製する。
【０２１６】
　Bluescript Sub2は、TAA（外皮タンパク質）停止部位における突然変異を強制し、TAA部位近くにXhoI部位を作り出すことになる、部位特異的フラグメントを作製するＰＣＲ技術を用いることによって調製する。Bluescript SubIのPstI/XhoI切断及びBluescript Sub2のXhoI/KpnI切断は、連結してTMV-Oプロモータから下流にあるXhoIクローニングインサート部位を有するPstI/KonIフラグメントを提供することのできる２つのフラグメントを与えることになる。このPstI/KpnIフラグメントを、NsiI/KpnIフラグメントが除去されたpTKUIベクタの中に挿入する。（PstI末端をNsiIに連結することが可能である）。結果として得られたクローンは、3’側及びXhoIインサート部位上にTMV-Oプロモータを伴うpTKU1-aであり、この部位の中に、TMV-Oプロモータが駆動する選択された遺伝子を挿入することができる。
【０２１７】
　それぞれpNC4×(DHFR配列）及びpNU116（NPTII配列）からのXhoI/SalIフラグメントを、TMVコーディング配列と同じセンスでpTBU1-aのXhoI部位の中に連結させる。N.tabacum植物には、例１に記した通りに接種を施し、これを分析する。全身性感染を受けた植物には機能的酵素が見られたが、対照植物にはみられなかった。
【０２１８】
　例４．
　O外皮タンパク質（例１）又はU1外皮タンパク質遺伝子（例２）のいずれかを有するRVPNAの中への挿入のため、付加的なDNAコーディング配列を調製した。各々の場合において、コーディング配列と同じセンスで、pTB2（例１）又はpTBU5（例２）のXhoI部位を含むようにコーディング配列を合成した。
【０２１９】
　E.coli内にプラスミドを形質転換し、一晩の培養からDNAを分離するために、標準的手順を使用した。プラスミドDNAの抽出に続いて、DNA指向のRNAポリメラーゼを用いて、（選択された遺伝子を伴うか又は伴わない）TB2又はTBV5ベクターのRNAコピーを作った。以前に公開された通り、転写反応中にm7 GpppGを添加することによって、反応中にRNAをキャッピングした。次に、このＲＮＡを用いてタバコ植物に接種を行なった。多数の植物の接種のための幅広い濃度の過渡的ベクターを精製するためには、標準的ウイルス分離技術を用いることができる。
　XhoIリンカーを含む中国産キュウリのα−トリコサンチンのためのコーディング配列が、配列番号３に示されており、対応するタンパク質が配列番号４として示されている。
【０２２０】
　XhoIリンカーを含むイネのα−アミラーゼのためのコーディング配列が配列番号５に示され、対応するタンパク質が配列番号６に示されている。この配列は、以下のように調製された：すなわち、酵母発現ベクターpEno/I03 64をHindIIIで消化し、一本鎖DNAの張出し（オーバーハング）を除去するため緑豆エキソヌクレアーゼで処理した。全イネα−アミラーゼcDNA05103 65 1990；Gen Bank受入れ番号M24286）を含む0.16kbのHindIII（平滑末端）フラグメントをScaIで消化し、XhoIオリゴヌクレオチド（5’CCTCGAGG3’）でリンカ形成した。低融点アガロースゲル電気泳動を用いて修飾されたα−アミラーゼcDNAフラグメントを分離し、pBluescript Kst（Stratagene,La Jolla,Calif.）内のアルカリ性ホスファターゼで処理されたXhiI部位内にサブクローニングしE.coliK-12菌株C-600内に維持した。
【０２２１】
　短かい3’-未翻訳領域を含むイネのα−アミラーゼコーディング配列は、以下のようにして調製した：すなわち、E.coliベクターPVC18/13，Kurnagi，M．H．et al.，Gene 94：209(1990)を、KpnI、XhoIで消化し、ExoIII及び緑豆エキソヌクレアーゼで処理した。修飾されたプラスミドを、DNAリガーゼ、DNApollで処理し、C-600へと形質転換した。分離株クローンpUC18/3 #8は、05103の停止コドンにきわめて近い3’欠失を有していた。このプラスミドをEcoRIで消化し、緑豆エキソヌクレアーゼで処理し、XhoIオリゴヌクレオチド（5’CCTCGAGG3’）でリンカー形成した。結果として得られたプラスミド（pUC18/3 #8X）からの1.4kbのHindIII-XhoIフラグメントを、低融点アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、pBluescript Ks-(Stratagene，La Jolla，Calif.）にサブクローニングし、E.coli K-12菌株C-600及びJM109の中で維持した。
【０２２２】
　１本鎖鋳型を用いてジテオキシ終端により、欠失を配列決定した。欠失は、イネα−アミラーゼ停止コドンを過ぎて14bpのところにあることが見極められた。プラスミドpUC18/3 #8XをHindIIIで消化し、緑豆エキソヌクレアーゼで処理し、ＸｈｏＩオリゴヌクレオチド（5’CCTCGAGG3’）でリンカー形成した。トラフ溶出により1.4kbのXhoIフラグメントを分離し、pBluescript KS+内のアルカリ性ホスファターゼ処理されたXhoI部位の中へサブクローニングし、JM109内に維持した。
【０２２３】
　ヒトα−ヘモグロブリン又はβ−ヘモグロビン又はペチュニアEFSPシンターゼのシグナルペプチドについてのコーディング配列を含む配列が、配列番号７又は配列番号８に示されており、対応するタンパク質配列は、それぞれ配列番号９及び10として示されている。
【０２２４】
　例５．圃場試験
　圃場現場設計には２つの実験（１及び２）が含まれていた。実験１は、全ての外周畦ならびに内部畦上のタバコの未処理畦畔を含む標準的な条植え作物構成であった（分子クローニング、D．M．Clover，Ed.，IRL Press，Oxford(1985)。その上、畦４本につき１本のスペーサ畦（Ｓ）があり、これは、処理済みの畦（Ｔ）のどれとも直接接触することなく圃場内に大型農場機器が入れるよう（例えば、殺虫剤噴霧のため）植付けせずに残された。各々の接種は、個々の植物の単葉に対しベクターを直接塗布することによって投与された。噴霧接種物は全く使用しなかった。
【０２２５】
　実験２は、標準的な苗床の構成であった。トラクタの動力伝導機構にとりつけられた改造型草刈り機を用いて均等な高さで１平方フィートあたり高い密度の植物を成長させた。この実験は、ベクター接種を受けなかった苗床の完全な周囲畦畔を含んでいた。処置済み苗床の接種を、改造型草刈り機ブレードアセンブリを通しての下向き噴霧を用いて行ない、隣接する苗床に対する過剰噴霧を防ぐように管理した。
【０２２６】
　実験１は、任意配列ブロック内の主要試験区としての７つの遺伝子型及び４つの複製での畦栽培を用いた分割区法であった。各試験区は、長さ13フィートで３本の畦から成り、各中心畦の中央の３本又は４本の植物のみが試験に使用されていた。畦は中央で４フィートであり、畦の中で植物の間隔は20〜22インチであった。
　実験２は、４つの遺伝子型及び３つの複製での苗床栽培を用いた任意配列完全ブロック法であった。各試験区は、４フィート×12フィートの苗床で構成されていた。
【０２２７】
　遺伝子型
　実験１：（Nicotiana tabacum）K-326、Sp G-28、TI-560、Md-609、Galpas、Wisc-503B及びNicotiana benthamiana
　実験２：（Nicotiana tabacum)K-326、TI-560、Md-609、Galpas。
【０２２８】
　化学肥料投与：
　実験１：移植後800ポンド、6-12-8；第１回収穫後100ポンド、33-0-0；第２の収穫後200ポンド15-0-14。
　実験２：苗床形成時点で2400ポンド、12-6-6；第１回収穫後300ポンド、33-0-0；第２回収穫後670ポンド、15-0-14。
【０２２９】
　刈込み
　実験２は、植物に対して均質性を与えるべく、２週間、週２度の割合で刈込みした。
　雑草、害虫及び疾病の防除
　実験１：畦の形成に先立ち、Paarlan 6B（１gt（英トン）／回）、Temik 15G（20ポンド／回）及びRidomil（2gts／回）を全面散布し、円板すきで耕すことによって取込ませた。畦の形成中、Telone C-17を施用した。移植後、Dipel（1/2ポンド／回）を施用して芽を食う青虫やイモムシを防除した。必要に応じてアリマキ及びイモムシを防除するためのOrthene（2/3ポンド／回）を施用した。
【０２３０】
　実験２：播種時及び（必要に応じて）播種後60〜70日目に始めて週毎にRidomil 2G（１gt／回；１oz／150平方ヤード）を施用した。炭疽病及び苗立枯れ病を防除するため、初期苗床段で必要に応じて葉全散布としてCarbamate 78WP（100ガロンの水につき３ポンド）も使用した。通常の移植サイズで、Dipel（1/2ポンド／回）を施用した。アリマキやイモムシを防除するため、必要に応じてOrthene（2/3ポンド／回）を施用した。
【０２３１】
　移植：
　実験１は、実験２の苗床から引き出された実生苗を用いて移植された。
　接種：
　実験１：各々の非対照植物上の単葉に、NPTII、α−トリコサンチン又はイネα−アミラーゼを含む選択された組換え型植物ウイルス核酸を手で接種した。各々の個々の植物に単一のベクターを接種した。
【０２３２】
　実験２：
　植物を最終的に刈込みしている間に刈込み用草刈り機のデッキを通しての噴霧を用いて、実験１に記述したベクターを植物に接種する。各々の非対照試験区は、単一のベクター構成体のみを受けた。対照植物はいかなるベクターの接種も全く受けなかった。
【０２３３】
　データ収集
　実験１：植物の背丈が約30インチとなるまで、第１成長中に、接種植物と対照植物の両方の葉の標本採取を予定通り（約週一度）に行なった。その後、茎を６インチ地上に露呈した状態に残すよう回転ブラシブレードを用いて植物を切断した（収穫１）。その後植物を、約30インチの高さまで成長し続けさせた（第２の成長）、収穫２の直前に葉の標本を採取した。ベクター内に挿入された問題の遺伝子が検出可能な量だけ発見された場合、切断、成長及び標本採取のためのこの手順を、第３の成長及び第４の成長のために反復した。
【０２３４】
　実験：各試験区からの10本の植物の標本採取を、接種から収穫１そして収穫１から収穫２まで予定通りに（約一週間に一度）行なった。収穫２の後、標本採取は収穫３においてのみ行なった。
【０２３５】
　標本のサイズ及び分析方法
　植物の頂端近くの単葉から1.6cmの円盤組織を切除した。各々の葉の円盤組織を、無水エタノールを含むねじ込み口金付きの25ml入りガラス製バイアルの中か又は密封可能なプラスチック袋の中に入れた。
　葉の円盤組織を、無水エタノールの中に保存するか又は凍結乾燥させた。検出すべき特定の遺伝子産物に応じて、ノーザン又はウエスタンブロット分析又は特定の酵素活性のための標準的技術に従って葉の標本を調製した。
【０２３６】
　第１の成長中、RVNAでの処理を受けたpIアリの視覚的監視を、ベクター系のあらゆる外部表現型発現の観察を目的として行なった。いくつかのケースでは、表現型発現はタバコモザイクウイルス感染に典型的なものであった（葉の中の明暗「モザイク」模様）。その他のケースでは、見られた唯一の症状は接種を受けた葉の上のものであり、直径約２ｍｍの白色又は褐色の小斑点及び／又は葉の中央葉脈の延長の削除が含まれていた。
【０２３７】
　例６．
　Dawn，W．O．et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：1832(1986)によって記述されている通りに、OMVゲノムの全長DNAコピーを調製する。OMVゲノムのDNAコピーを含有するベクターを適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼで消化させて外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。OMVを分離させそれを用いて発芽中の大麦植物を感染させることによって、ウイルス外皮タンパク質のためのコーディング配列の欠失を確認する。分離されたOMV RNAは、自然の条件下では病巣を超えて展着することはできない。例１〜３に記述されている通りに、OMV配列を含むベクターを調製する。
【０２３８】
　例７．
　Dawn，W．O．.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：1832(1986)によって記述されている通りに、ゲノムの全長DNAコピーを調製する。ENVゲノムのDNAコピーを含有するベクターを適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼで消化させて外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。RNV RNAを分離させそれを用いて発芽中の大麦植物を感染させることによって、ウイルス外皮タンパク質のためのコーディング配列の欠失を確認する。分離されたものは、自然の条件下では病巣を超えて展着することはできない。例１〜３に記述されている通りに、OMV配列を含むベクターを調製する。
【０２３９】
　例８．
　Dawn，W．O。t al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：1832(1986)によって記述されている通りに、PVY又はPVXゲノムの全長DNAコピーを調製する。PVY又はPVXゲノムのDNAコピーを含有するベクターを適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼで消化させて外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。PVY又はPVX RNAを分離させそれを用いて、ジャガイモ植物を感染させることによって、ウイルス外皮タンパク質のためのコーディング配列の欠失を確認する。分離されたPVY又はPVX RNAは、自然の条件下では病巣を超えて展着することはできない。例１〜３に記述されている通りに、OMV配列を含むベクターを調製する。
【０２４０】
　例９．
　Dawn，W．O．et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：1832(1986)によって記述されている通りに、トウモロコシ線条ウイルス（MSV）ゲノムの全長DNAコピーを調製する。MSVゲノムのDNAコピーを含有するベクターを適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼで消化させて外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。MSVを分離させそれを用いて、ジャガイモ植物を感染させることによって、ウイルス外皮タンパク質のためのコーディング配列の欠失を確認する。分離されたＭＳＶは、自然の条件下では病巣を超えて展着することはできない。例１〜３に記述されている通りに、OMV配列を含むベクターを調製する。
【０２４１】
　例10．
　Dawn，W．O．et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：1832(1986)によって記述されている通りに、TGMVゲノムの全長DNAコピーを調製する。TGMVゲノムのDNAコピーを含有するベクターを適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼで消化させて外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。TGMV RNAを分離させそれを用いて、ジャガイモ植物を感染させることによって、ウイルス外皮タンパク質のためのコーディング配列の欠失を確認する。分離されたTGMV RNAは、自然の条件下では病巣を超えて展着することはできない。例１〜３に記述されている通りに、TGMA配列を含むベクターを調製する。
【０２４２】
　例11．
　ベーターシクロテキストリングルコトランスフェラーゼについてのコーディング配列を、以下の要領でアルカリ親和性Bacillus種菌株No.38-2から分離する。
【０２４３】
　菌株No.38-2の染色体DNA（Hanamoto，T．et al.,Agric.Biol.Chem. 51：2019(1987)をSau3AIで部分的に分割させ、フラグメントを、BamHIで消化したｐＢＲ３２２の中で連結させる。産生菌株のゲノムからの3.2kbのDNAフラグメントを含む形質転換体支持プラスミドpCS115が、CGT活性を有している。この形質転換体によって産生されたCGTは、オクタロニー２重拡散試験によりNo.38-2のCGTについてのものと完全に融合する１本の沈降ラインを与える。pUC19を用いたジデオキシチェインターミネータ法及びエキソヌクレアーゼ欠失方法を用いて、フラグメントのヌクレオチド配列を発見する。Henikoff，S．、Gene 28：351(1984)。フラグメントのヌクレオチド配列は、CGT遺伝子に対応する単一の読取り枠を示す。1758bpのこの読取り枠から、66kDalの分子質量のタンパク質を翻訳することができる。詳細なヌクレオチド配列については、Hanamoto，T．et al.，Agric.Biol.Chem.51：2019(1987)を参照のこと。
【０２４４】
　細胞外形態のＣＧＴのＮ末端アミノ酸の配列を、ペプチドシークエンサを用いて見い出す。NH2 -Ala-Pro-Asp-Thr-Ser-Val-Ser-A5n-Lys-Gln-Asn-Phe-Ser-Thr-Asp-Val-Ile（配列番号６）は、DNA配列から演繹されるものと同一である（残基１〜17）。この結果は、27個のアミノ酸残基（残基−27〜−１）が、CGTの分泌中に除去されるシグナルペプチドを表わす、ということを示唆している。DNA配列から計算された成熟CGTの分子量は63,318である。
【０２４５】
　シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列の一部分に基づいて、プローブを調製し、これを用いてこの酵素についてのコーディング配列を分離する。代替的には、ベータシクロデキストリングルコトランスフェラーゼコーディング配列を、逆転写に従って分離する。コーディング配列を含むフラグメントを分離し、例６〜10で調製されたベクター内の未変性ウイルス外皮タンパク質遺伝子のサブゲノミックプロモータに隣接してクローニングする。
【０２４６】
　例12．
　トウモロコシ植物（OMV、RNV又はTGMVに基づくウイルス／又はジャガイ植物（PVY又はPVXに基づくウイルス）を感染させるのに、例11のRVNAを使用する。感染させた植物を、通常の成長条件下で成長させる。この植物は、植物組織内のでんぷんからシクロデキストリンへの変換の触媒として作用するシクロデキストリングルコトランスフェラーゼを産生する。シクロデキストリンは従来の技術で分離する。
【０２４７】
　例13．
　Ａ．エステラーゼについてのコーディング配列をBacillus subtilis Thai 1-8（CBS679,85）から以下の通りに分離する。正の選択ベクターpUN121 Nilsson et al.,Nucl.Acids.Res.11：8019(1983)を用いる。このベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びC1 -抑制遺伝子を支持している。C1 -抑制遺伝子の遺伝子産物により、テトラサイクリン遺伝子の転写が防止される。C1 -抑制遺伝子のBclI部位への外来性DNAの挿入は、テトラサイクリン遺伝子の活性化を結果としてもたらす。こうして、アンピシリン／テトラサイクリン寒天植物上の組換え体の正の選択が可能となる。
【０２４８】
　部分的にSau3aで消化されたBacillus subtillis Thai 1-8DNAを、BclIで消化されたpUN121 DNAと混合させる。ポリヌクレオチドリガーゼを用いた再循環の後、CaCl2 形質転換手順を用いてE.coli DH1（ATCCNo.33849）内にDNA混合物を導入する。アンピシリン及びテトラサイクリンに対する耐性をもつ1000個のE.coliコロニーが得られる。全ての形質転換体を保管し、Gergan et al.，Nucl.Acids.Res.7：2115(1979)に従ってレプリカ平板法に付す。エステラーゼ活性を検出するべく予め記述された手順に基づいて、軟寒天オーバーレイ技術を用いて、複製されたコロニーをスクリーニングする。Higerd et al.，J.Baeteri al.114：1184(1973)。
【０２４９】
　基本的に、形質転換体の上に0.5％の低融点アガロース、0.5Mのリン酸カリウム（pH7.5）、0.5mg/lのβ−酢酸ナフチル及び、0.5mg/mlのファーストブルーの混合物を展延させる。数分以内で、エステラーゼ又はリガーゼ活性をもつコロニーが紫色を呈する。このようなコロニーを、2x YT（16g/lのバクトトリプトン、10g/lの酵母エキス、5g/lのNaCl）培地の中で一晩成長させ、その後、Ｓ−ナプロキセンエステルをＳ−ナプロキセンに変換するその能力について検定する（EP-A0233656の例１の方法）。１つのE.coli形質転換体は、Ｓ−ナプロキセンエステルを変換することができる。この形質転換体から分離されたプラスミドはpNAPT-2（CBS67186）と呼ばれる。そのサイズは9.4kbである。
【０２５０】
　pNAPT-2のHindIII制限酵素フラグメントをpPNEO/ori内に連結させる。これは、以下に記述する通りに実施される。まずpUB110の2.5kbのEcoRI-SnaBI制限フラグメントに対してpUC19の2.7kbのEcoRI/SmaI制限フラグメントを連結することによってpPNeo/oriを構築する。結果として得られるシャトルプラスミドpPNeo/ori（5.2kb）は、pUC19起点及びpUB110起点の存在に起因してE.coli及びBacillus種の両方において複製する能力をもつ。さらにpPNeo/oriは、アンピシリン耐性をコードする遺伝子及びネオマイシン耐性をコードする遺伝子を支持している。
【０２５１】
　サブクローニングのため、HindIIIで消化されたpNAPT-2を、HindIIIで消化されたpPNeo/oriと混合し連結させる。混合物を、Maniatis et al.、分子クローニング（第１版）に記述されている通りに、E.coli JM101 hsdsに形質転換させる。E.coli JM102 hsdsはPhabagen収集機関から入手する（受入れ番号PC2493、Utrecht、オランダ）。β−酢酸ナフテルを加水分解することのできるコロニーを、EPA0233656の例56に記述された通りに選択する。２つの陽性コロニーpNAPT-7及びpNAPT-8から、プラスミドDNAを分離し、いくつかの制限酵素認識位置を決定することにより詳細に特徴づけする。
【０２５２】
　Ｂ．E.coliエテスラーゼについてのコーディング配列を、以下の通りに調製する：
　プラスミドpIP1100（E.coli BM2195から分離）及びpBR322を混合し、AvaIで消化し、E.coli内に連結し形質転換し、クローンをEm（200/g/ml）上で選択する。Ap及びEmのみならずSmに対しても耐性をもつ形質転換体を、粗製リゼイトのアガロースゲル電気泳動によって分析する。最小のハイブリッドプラスミドを宿す形質転換体を選択しそのプラスミドDNAをAvaIで消化させ、3.5kbのpIP1100インサートを精製し、Sau3Aで部分的に消化する。
【０２５３】
　得られた制限フラグメントをpBR322のBamHI部位内にクローニングし、Em上で選択された形質転換体をSm上でレプリカ平板培養する。Ap及びAmのみに対する耐性をもつ形質転換体のプラスミド含有量を、アガロースゲル電気泳動により分析する。最小のハイブリッドpAT63からのDNAを精製し、Sau3A、EcoRI、PstI又はHindIII-BamHIエンドヌクレアーゼ（図示せず）での消化の後アガロースゲル電気泳動法により分析する。プラスミドpAT63は、pBR322と1.66kbのpIP1100 DNAインサートから成る。pAT63の精製済みのEcoRI-HindIII（1750-bp）及びBamHI-PstI（970-bp）フラグメントはpUC8内にサブクローニングされ、Em耐性を付与しないものであることがわかっている。
【０２５４】
　Sanger技術に従ってpAT63のHpaII-BamHIフラグメントを配列決定する。完全な配列は、Ounissi，H．et al.，Gene 35:271(1985)に示されている。
【０２５５】
　Ｃ．アシラーゼからのコーディング配列をArthrobacter viscosus8895GU、ATCC27277から以下の通りに分離する。
　pACYC184のEcoRI分割部位内にEcoRIで分割されたA．viscosus染色体DNAを挿入することにより、A．viscosus8895GUの遺伝子ライブラリを構築する。ベクターDNA及びA.viscosus DNAの両方をEcoRIで消化させる。ベクターDNAの5’末端を子ウシ腸内アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。脱リン酸化したベクターDNA及び消化させたA．Viscosus DNAをT4 DNAリガーゼでインキュベートし、E．coli HB101へと形質転換させる。
【０２５６】
　E．coliの形質転換されたコロニーをSerratia warcescensオーバーレイ技術によりスクリーニングした。ペニシリンＧを培地に添加した。S．marcescensは、ペニシリンＧの脱アシル化産物、６−アミノペニシラン酸（6-APA）に対し感応性をもつ。（aminopenicillamic）形質転換されたE．coliのコロニーは、一晩の培養においてS．marcescens阻害の部域を産生する。形質転換されたE．coliが支持するプラスミドをpHYM-1と呼ぶ。相対するDNA配向をもつプラスミドをpHYM-2と呼ぶ。Ohashi，H．et al.，Appl.Environ.Microbiol.54：2603(1988)。
【０２５７】
　Ｄ．凍結された組織のイソチオシアン酸グアニジウム抽出によって、ヒト胃リパーゼmRNAについてのコーディング配列を調製する。ポリアデニル化RNAを、オリゴ（dT）−セルロースクロマトグラフィにより分離する。当該技術分野において周知の手順により、ヒトの胃のｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。cDNAをPstI-切断されdBテーリングされたpBR322にアニールする。ハイブリッドプラスミドをE．coli DH1内へ形質転換させる。形質転換体を、ニトロセルロースフイルタ上でのコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングする。使用されるプローブは、ラットの舌のリパーゼ遺伝子から合成し、ニックトランスレーションによりこれを標識づけする。陽性コロニーを成長させ、制限エンドヌクレアーゼマッピングによりプラスミドを分析する。
【０２５８】
　上述の通りに調製されたエキステラーゼアシラーゼ又はロパーゼ遺伝子を適切なベクターから除去し、緑豆ヌクレアーゼ又はDNAポリメラーゼＩを用いて平滑末端化し、XhoIリンカーを付加する。XhoIリンカーを伴うこのエステラーゼをXhoIで分割し、例1-3又は6-10に記述されたベクター内に挿入する。例２に従って調製されたRVNAによる適切な宿主植物の感染の結果植物組織内には、エステラーゼ、アシラーゼ又はリパーゼの合成がもたらされる。従来の技術により酵素を分離し精製し、これを立体特異的化合物の調製に使用する。
【０２５９】
　例14．
　CMS-Tについてのコーディング配列をDewey，R．E．et al.，Cell 44：39(1986)により記述された通りに、BamHIトウモロコシmtDNAライブラリから分離する。ORF-13コーディング配列を、制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続く開始コドンへの5’-エキソヌクレアーゼ消化により分離する。代替的には、部位特異的オリゴヌクレオチド突然変異誘発によりORF-13コーディング配列の開始コドンに隣接して制限部位を工学処理する。適切な制限酵素での消化によりORF-13に対するコーディング配列が生成される。ORF-13コーディング配列を含有するフラグメントを分離し、例６、７及び10で調製されたベクター内で未変性ウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
【０２６０】
　例１に従って調製されたRVNAによりトウモロコシ植物を感染させる。感染を受けた植物を、通常の成長条件下で成長させる。植物は、感染を受けたトウモロコシ植物内で雄性不稔を誘発するcms-Tを産生する。
【０２６１】
　例15．
　（自家和合性についての）S2-タンパク質のコーディング配列を、EP-A0222526内に記述する通りに、Nicotiana alataから分離する。S2-タンパク質コーディング配列を制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続く開始コドンへの5’-エキソヌクレアーゼ消化により分離する。代替的には、部位特異的オリゴヌクレオチド突然変異誘発によりS2-タンパク質コーディング配列の開始コドンに隣接して制限部位を工学処理する。適切な制限酵素での消化によりS2-タンパク質に対するコーディング配列が生成される。S2-タンパク質コーディング配列を含有するフラグメントを分離し、例１〜３で調製されたベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
【０２６２】
　花粉形成に先立ち例１に従って調製されたRVNAによりタバコ植物を感染させる。感染を受けた植物を、通常の成長条件下で成長させる。植物は、自家不和合性メカニズムを介して雄性不稔を誘発するＳ−タンパク質を産生する。
　以下の例は、本発明の植物ＲＮＡウイルスベクターを用いて、治療用タンパク質を高レベルで発現させることができるということを実証している。
【０２６３】
　例16．新しいRNAウイルスベクターを用いた、トランスフェクションを受けた植物内での生物活性をもつα−トリコサンチンの急速かつ高レベルの発現
　トリコサンチンは、中国薬草の根に見られる真核性リボソーム不活性化タンパク質である。Wang，Y．Qian，R.-Q.,Gu.，Z.-W.,Jin，S,-W.，Zhang，L.-Q.,Xia,Z.-X.，Tian，C,-Y.& Ni，C.-Z,Pure appl.chem.58：89-798(1986)。Trichosanthes kirilowii Maximowiczの中では、α-トリコサンチンは、285rRNA内のＮ−グリコシド結合の分割に触媒として作用する単量体タンパク質である（Jimenez，A．& Vazquez D.Annu.Rev.Microbiol.39：49-672(1985)；Endo，Y．O.,Mitsui，K.ｆ Motizuui，M．& Tsurugi，K，J.Biol.Chem.262：5908-5912(1987)）。この反応は、延長因子と相互作用する60Sリボソームサブユニットの能力に影響を及ぼすことにより、タンパク質合成を阻害する。
【０２６４】
　成熟化合物は27kDaというおおよその相対的分子質量をもち、プレタンパク質として当初産生される。Maraganore，J．M．Joseph，M．& Bailey，M．C.，J．Biol．Chem．262：11628-11633(1987)。その生合成の間、推定上の23アミノ酸分泌シグナルペプチドが除去され、恐らくは19アミノ酸ペプチドがカルボキシ末端から切除される。精製されたT．kirilowii由来のα−トリコサンチンは、急性的に感染を受けたCD4+リンパ球様細胞内及び慢性的に感染を受けたマクロファージ内でHIV複製の濃度依存性阻害をひき起こす。（Collins，E．J.，Robertus，J．D，LoPresti，K．,Stone，K．L.，Williams，K．R.，Wu，P.，Hvang，6 Piatak，M.，J.Biol.Chem. 265；8665-8669(1990)；McGrath.,M．S.，Hwang，K．M.，Caldwell，S．E.，Gaston，I.Lux，K.-C.，Wu，P．,Ng，V．L.，Crowe，S.，Daniels，J.，Marsh，I.，Dienhart，T.，Lekas，P．V.，Vennari，J．C.，Yeung，H．J．& Lifson，D．Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A. 86：2844-2848(1989)）。
【０２６５】
　この化合物は現在、臨床研究の中で、HIV感染の治療における潜在的な治療薬として評価されつつある。Shaw，P.-C.，Yung,M.-H.,Zhu，R.-H.，Ho,W.K.-K.,Ng，T.-B.& Yeung，H.-W.Gene 97：267-272(1991)。α−トリコサンチンによる抗ＨＩＶ感染の正確なメカニズムはわかっていない。HIV複製の解媒作用及び阻害に関与するアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発を用いて同定することができる。詳細な構造／機能分析には豊富な組換え型タンパク質供給源ならびに突然変異体を生成し分析する迅速な方法が必要となるだろう。E.coli内のα−トリコサンチンの発現については以前に報告されてきたが（Ahlquist，P.，French，R.，Janda，M.& Loesch-Fries，S.，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A. 81：7066-7070(1984)；Piatak，et al.，U.S.Patent No.5,128,460(1992)）合成された量は少ないものであり（合計細胞タンパク質約0.01％）、カルボキシ末端延長は除去されず、化合物の生物活性は決定されなかった。
【０２６６】
　ゲノムが約6.4kbの１つのプラスセンスＲＮＡ鎖から成っているTobamovirusesが、非相同タンパク質を産生するのに使用されてきた。ウイルスcDNAクローンからのRNA写しは、ＲＮＡの複製、移動及び包膜に関与するタンパク質をコードする感染性鋳型として役立つ。Miller，W．A.，Dreher，T．W.& Hall，T．C.，Nature 313：66-70(1985)。伝令RNA合成のためのサブゲノミックRNAは、マイナスセンスRNA鎖上にある内部プロモータによって制御される。Takamatsu，N.，Watanabe，Y.，Yanagi，H.，Meshi，T.，Sbiba，T. & Okada，Y. EPBS Lett. 269，73-76(1990)。
【０２６７】
　以前には、タバコの原形質体内のロイエンケフリンを発現するため（Talcamatsu，N.，Ishiloawa，M.，Meshi，T.& Okada，Y. EMBO J. 6：307-311(1987)及び接種を受けたタバコの葉の中の細菌クロラムフェニコールアセテルトランスフェラーゼ（Dawson，W.O.，Lewandowski，.J．，Bilf,M.E.，Bubrick，P.，Raffo，A.J.，Shaw，J.J.，Grantbham，G.L. & Desjardins，P.R.Virology 172：285-292(1989)；Donson，J.，Kearney，C.M.，Hile，M.E. & Davson，W.O. Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A. 88：7204-7208(1991)）を発現するために、TMV RNAウイルスが使用されてきた。外来性遺伝子を発現しようとするこれまでのこれらの試みは、結果として、不安定な構成体又は長距離ウイルス移動の損失のいずれかをもたらした。
【０２６８】
　最近になって、タバコモザイクウイルス、菌株U1（TMV-U1）及びオドントグロッサム輪斑ウイルス（ORSV）からの付加的なRNAサブゲノミックプロモータから成るハイブリッドウイルスでのトランスフェクションを受けたNicotiana benthamiana植物が、ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼの全身性の安定した発現を生成している。Chow，T.P.，Feldman，R.A.，Lovett，M. & Piatak,M. J.Biol.Chem. 265：8670-8674(1990)。
【０２６９】
　pBGC152の構築
　プラスミドpSP6-TKUIは、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によりSP6プロモータに融合され、XhoI/KpnIフラグメントとしてpUC118内に挿入された全TMV-U1ゲノムを内含している。TMVゲノムに対してSP6プロモータ配列を付着させるのに用いられる突然変異誘発プライマの配列は、以下の通りである：5’-GGGCTCGAGATTTAGGTGACACTATAGTATTTTTACAACAATTACCA-3’。なおここで、XhoI部位はイタリック体で表わされ、SP6プロモータはボールド体で表わされ、TMV配列には下線が施こされている。プライマは、pC48と呼ばれるＴＭＶサブクローンに付着された。（Raffo，et al.，Virology 184：277-289(1991)）。上述のプライマ及びTMV配列5673〜5692に対して相補的なプライマを用いてPCRによりプロモータを付着させた。この増幅は、約614bpのフラグメントを産生し、このフラグメントを次にXhoI及びEcoRI（TMV270）で消化させて約292bpのフラグメントを産生し、これを次に同様に切断されたpUC129内にサブクローニングして、プラスミドpSP6-T1を結果として得た。
【０２７０】
　pSP6-T1をXhoI及びXmaI（TMV256で切断するSmaIアイソシゾマー）で切断し、結果として得られた約278bpフラグメントを、すでにゲノム5’末端にある唯一のPstI部位で切断しT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化しXhoIリンカーを添加することにより修飾されていたpTKU1（Donson，et al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88：7204-7208(1991)）の中に連結させた。この結果、感染性クローンpSP6-TKU1がもたらされ、XmaIで消化された。
【０２７１】
　図４に示されているように、pBR322内のEcoRI部位を、EcoRI、DNAポリメラーゼ（クレノウ）Ｒ及びKpnIリンカーを用いてKpnI部位に突然変異誘発した。結果として得られたプラスミド、pBSG121のKpnI/BamHIフラグメントを、pTB2のKpn2/BamHIフラグメント（1992年7月24日に寄託されたATCC番号75280）で置換した。結果として得られたプラスミドpBSG122のSalI/KpnIフラグメントを、pSP6-TKUI（T1としても知られている）のXhoI/KpnIフラグメントと置換し、結果としてプラスドpBGC150を得た。
【０２７２】
　pBGC150のBamHI/KpnIフラグメントをpTB2/QのBamHI/KpnIフラグメントと置換させて、プラスミドpBGC152を結果しとて得た。本書にその内容が参考として内含されているPiatak，Jr.,et al、米国特許第5128460号に記述されたプラスミドpQ21D（ATCC No.67907）で始めて、pTB2/Qを構築した。pQ21D内にTCS配列のPCR増幅された0.88kbのXhoIフラグメントを含むプラスミド「クローン5B」は、5’-CTCGAGGATG ATC --- ---//--- ---ATT TAG TAA CTCGAG-3’（XhoI部位はイタリック体）という配列が得られるような形で、開始及び停止コドンにおいてXhoIクローニング部位を導入するようオリゴヌクレオチド突然変異誘発を用いて得られた。「クローンＢ」からの0.88kbのXhoIフラグメントを、プラスミドpTB2/Qを作り出すべくセンス配向でプラスミドpTB2のXhoI部位の中にサブクローニングさせた。
【０２７３】
　トランスフェクションを受けた植物のインビトロ転写、接種及び分析
　以前に記述された通りにKpnIで消化されたpBGC152のインビトロ写しを、N.benthamiana植物に接種した。Hiatt，A.，Cafferkey，R. & Bowdish，K. Nature 342：76-78(1989)。ビリオンを、BGC152写しで感染させたN. benthamianaの葉から分離し、２％の酢酸ウラニル水溶液で染色し、Zeiss CEM902計器を用いて透過型電子顕微鏡写真をとった。
【０２７４】
　α−トリコサンチンの精製、免疫学的検出及びインビトロ検定
　接種から２週間後に、30グラムの上部の未接種N. benthamiana葉組織から、全可溶性タンパク質を分離した。葉を液体窒素の中で凍結させ、3mlの５％の２−メルカプトエタノール、10mMのEDTA、50mMのリン酸カルシウムpH6.0の中で磨砕した。懸濁液を遠心分離に付し、α−トリコサンチンを含む上清を2mMのNaCl、50mMのリン酸カリウム、pH6.0で平衡化したSephadex G-50カラムに投入した。次に、標本をセファロース−Ｓ高速流イオン交換カラムに拘束した。50mMのリン酸カリウム、pH6.0の中の0.002〜1MのNaClの線形勾配で、アルファトリコサンチンを溶出させた。
【０２７５】
　α−トリコサンチンを含有する分画をCentricon-20（Amicon）で濃縮し、ダイアフィルトレーションにより緩衝液を交換した（Centricon-10、50mMのリン酸カリウム、pH6.0、1.7Mの硫酸アンモニウム）。次に標本をHR5/5アルキルスーパーローズFPLCカラム（Phermacia）上に投入し、線形硫酸アンモニウム勾配（50mMのリン酸カリウム、pH6.0中の1.7〜0Mの硫酸アンモニウム）で溶出した。全可溶性植物タンパク質濃度を、標準としてBSAを用いて決定した。Sijmons，P.C.，Dekker，B.M.M.，Schrammeijer，B.，Varwoerd，T.C.，van den Elzen，P.J.M. & Hoekema，A. Bio/Technology 8: 217-221(1990)。α−トリコサンチンの濃度は、E280 =1.43のモル吸光係数を用いて決定した。
【０２７６】
　精製されたタンパク質を0.1％のSDS、12.5％のポリアクリルアミドゲル、Hewick，R.M.，Hunkapiller，N.W.，Hood，L.E. & Dreyer，W.J．J.Biol.Chem.256：7990-7997(1981)上で分析し、電気ブロット法により１時間、ニトロセルロース膜にトランスファした。Von Heijne，G．Nucleic.Acid.Res.14：4683-4690(1986)。ブロッティングされた膜をヤギ抗αトリコサンチン抗血清の2000倍希釈で一時間インキュベートした。メーカー（Amersham）の仕様に従って、増強されたケミルミネッセンスホースラディッシュペルオキシダーゼ連鎖されたウサギ抗ヤギIgG（Cappel）を発達させた。１秒未満の間、オートラジオグラムを露光した。粗製抽出物のオートラジオグラムシグナルを精製された既知の量のGLA223から得たシグナルと比較することによって、抽出された葉の標本の中の全組換え型α−トリコサンチンの量を決定した。ウサギ網状赤血球リセイト系の中のタンパク質合成の阻害を測定することによって、リボソーム不活性化活性を決定した。
【０２７７】
　生物活性をもつα−トリコサンチンの高レベル発現の確認
　本発明の植物ウイルスベクターは、トランスフェクションを受けた植物の中のα−トリコサンチンの発現を誘導する。ゲノミッククローンpQ21Dからのα−トリコサンチンのための読取り枠（ORF）Saiki，R.K.，Scharf，S.，Faloona，F.，Mullis，K.B.，Horn，G.T.，Erlich，H.A．& Amheim，N．Science 230：1350-1354(1985)をタバコモザイクウイルス（TMV）外皮タンパク質のサブゲノミックプロモータの制御下に置いた。
【０２７８】
　SP6DNA-依存性RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって、pBGC152（図２）からの感染性RNAを調製し、これを用いてN. benthamianaを機械的に接種した。ハイブリッドウイルスは、透過型電子顕微鏡局所的病巣感染が検定及びポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅（20：データ示さず）によって確認される通り、全ての未接種上部葉の全体にわたり展着した。27kDaのα−トリコサンチンが、全可溶性タンパク質の少なくとも２％のレベルまで上部葉（接種後14日目）内に蓄積した。感染を受けていないN. benthamiana対照植物抽出物の中には、検出可能な交叉反応タンパク質は全く見られなかった。葉の粗製抽出物７μｇの中に、組換え型α−トリコサンチンが容易に検出された。
【０２７９】
　これまでの研究者により、任意の遺伝子工学処理された植物の中に、外来性タンパク質が最大で合計可溶性タンパク質の２％蓄積したことが報告されている。抗体及びヒト血清アルブミンといったような潜在的に価値あるタンパク質の発現がこれまでに報告されてきているものの（Laemmli，U.K．Nature 227：680-685(1970)；Bradford，M.M．Anal.Biochem.72：248-254(1976)）これらは、Agrobacteriumを媒介としたトランスジェニック植物内で産生されたものである。この植物ウイルス発現系と以前の方法の間の主要な差異は、産生されるタンパク質の量及び遺伝子工学処理された植物を得るのに必要とされる時間にある。α−トリコサンチンの全身性感染及び発現は、２週間以内に発生するのに対し、単一のトランスジェニック植物を作り上げるのには数ケ月もかかる。
【０２８０】
　トランスフェクションを受けたN. benthamiana（接種後１４日）内の上部葉から産生され精製されたα−トリコサンチンは、構造的に未変性α−トリコサンチンと同一であった。27kDaのタンパク質は、抗−α−トリコサンチン抗体と交叉反応し、GLQ223標準と同一のFPLC精製プロフィールを有していた。組換え型タンパク質のＣ末端配列は、分析されていないが、GLQ223及び精製済み組換え型α−トリコサンチンは両方共同一の電気泳動易動性を有するように思われた。組換え型α−トリコサンチンの正確なＣ末端アミノ酸が今後決定されなくてはならない。Ｎ−末端配列Asp-Val-Ser-Phe-Arg-Leu-Serは、自動式タンパク質シークエネータを用いて精製タンパク質から入手した。
【０２８１】
　Towbin，E.，Staehelin，T.，Gordon，J．Proc.Natl.Acad.U.S.A. 76：4350-4354(1979)この結果は、調製物の推定的のシグナルペプチドが図１に示されている部位で正しく処理されたことを表わしていた。この部位における推定上のシグナルペプチドの除去は、Von Heije，Piatak et al.、米国特許第5,128,460号（1992）の方法による統計的予測と一貫性をもっていた。α−トリコサンチンシグナルペプチドが、細胞外空間内にタンパク質をターゲティングすることによりその高レベル発現に寄与した可能性がある。α−トリコサンチン開始コドンをとり囲むヌクレオチド配列は翻訳開始の効率に対しても効果をもつ可能性がある。
【０２８２】
　高レベルで発現されたTMV-U1（5’TTAAATATGTCT 3’）及びORSV（5’TGAAATATGTCT3’）外皮タンパク質遺伝子の翻訳開始部位にフランキングするヌクレオチドが保存され、一方pBGC152/α−トリコサンチン（5’TCGAGGATGATC 3’）内の対応する領域がほとんど類似性を示さないということを指摘するのは興味深いことである。α−トリコサンチンの翻訳開始部位近くのヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発がその発現を増大させるかもしれないという可能性もある。
【０２８３】
　組換え型α−トリコサンチンは、細胞無しのウサギ網状赤血球翻訳検定においてタンパク質合成の濃度依存性阻害をひき起こした。ID50（50％の阻害に必要な用量）は約0.1ng/mlであり、これはT. kirilowii由来のα−トリコサンチン（GLQ223）と比較可能な値であった。ID50及び用量応答に基づき、トランスフェクションを受けた植物内で産生される酵素は、未変性タンパク質と同じ特異的活性を有していた。この結果は、ウイルス増幅中の外来性配列内の塩基対の置換及び欠失が組換え型酵素の特異的活性を低下させることになることから、ウイルスRNA依存性ＲＮＡポリメラーゼの適合度が比較的高いものであったことを示唆している。
【０２８４】
　開示され請求されている発明が実証しているように、pBGC152は、トランスフェクションを受けた植物内で生物活性をもつα−トリコサンチンの非相同発現を誘導することができる。接種された植物のサイズ及び数を増大させることにより、RNAのウイルスベースの系を用いて、組換え型タンパク質の大規模産生を容易に得ることができる。α−トリコサンチンを高濃度で含有する組織を接種から２週間後に収穫できることから、部位特異的突然変異の効果を急速にスクリーニングするためにこの系を使用することができる。インビボでのＨＩＶ複製の阻害に関与する重要なアミノ酸の同定は、潜在的なエイズ治療薬としてのα−トリコサンチンの効能を改善する一助となるかもしれない。
【０２８５】
　例17．
　非伝達性TMVヌクレオチド配列の調製TMＶゲノムの全長DNAコピーを、Dawson，W.O．et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83，1832(1986)によって記述された通りに調製し、pBR322のPstI部位の中に挿入する。ウイルス外皮タンパク質遺伝子は、30Kタンパク質遺伝子に隣接してTMＶゲノムの位置5711にある。TMVゲノムのDNAコピーを含むベクターを適切な制限酵素及びエキソヌクレアーゼで消化して外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。
【０２８６】
　例えば、外皮タンパク質コーディング配列は、ClaI及びNsiIで部分消化させその後再連結してウイルスの3’-テイルを再付着させることによって除去される。代替的には、ウイルス核酸の3’末端でベクターを切断する。外皮タンパク質コーディング配列の開始コドンまで、Bal31又はエンドヌクレアーゼIIIでの消化によりウイルスDNAを除去する。TMV RNAを分離しそれを用いてタバコ植物を感染させることによって、ウイルス外皮タンパク質のための配列を含む合成DNA配列を確認する。分離されたTMV RNAは、自然の条件下では非感染性すなわち生物学的に封じ込められていることがわかる。
【０２８７】
　例18．非伝達性OMVヌクレオチド配列の調製
　Dawson，W.O.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.83 1832(1986)に記述されている通りに、OMVゲノムの全長DNAコピーを調製する。OMＶゲノムのDNAコピーを含むベクターを例４に記述されているような適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼで消化させ、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウイルス外皮タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、OMV RNAを分離しそれを用いて発芽中の大麦植物を感染させることによって確認される。分離されたOMV RNAは、自然の条件下で生物学的に封じ込められていることがわかる。
【０２８８】
　例19．非伝達性ＲＮＡヌクレオチド配列の調製
　Dawson，W.O.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.83 1832(1986)に記述されている通りに、RNVゲノムの全長DNAコピーを調製する。OMＶゲノムのDNAコピーを含むベクターを例４に記述されているような適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼで消化させ、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウイルス外皮タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、RNV RNAを分離しそれを用いて発芽中の大麦植物を感染させることによって確認される。分離されたRNV RNAは、自然の条件下で非感染性であることがわかる。
【０２８９】
　例20．非伝達性PVY又はPVXヌクレオチド配列の調製
　Dawson，W.O.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.83 1832(1986)に記述されている通りに、PVY又はPVXゲノムの全長DNAコピーを調製する。PVY又はPVXゲノムのDNAコピーを含むベクターを例17に記述されているような適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼで消化させ、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウイルス外皮タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、PVY又はPVXのRNAを分離しそれを用いてジャガイモ植物を感染させることによって確認される。分離されたPVY又はPVXのRNAは、自然の条件下で生物学的に封じ込められていることがわかる。
【０２９０】
　例21．チロシンコーディング配列を含むキメラヌクレオチド配列の調製
　チロシナーゼについてのコーディング配列を、BclIでの消化とそれに続く開始コドンへの5’-エキソヌクレアーゼ消化により、Streptococcus antibioticusから分離させる。代替的には、部位特異的オリゴヌクレオチド突然変異誘発によりチロシナーゼコーディング配列の開始コドンに隣接して、制限部位を工学処理する。適切な制限酵素での消化は、チロシナーゼについてのコーディング配列を生み出す。チロシナーゼコーディング配列を含むフラグメントを分離し、例17、18及び19において調製されたベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
【０２９１】
　動物宿主例
　例23．東部ウマ脳炎ウイルスベクターの調製
　Chang，G-J.J.et al.，J.Gen.Virol. 68.2129(1987)により記述された通りに、東部ウマ脳炎ウイルス（EEEV）ゲノムの全長cDNAコピーを調製し、pUC18のPst1部位の中に挿入する。ウイルス外皮タンパク質及びその隣接するE1及びE2糖タンパク質伝達性因子についての配列は、265PNA領域に対応する領域上にある。EEEVゲノムのcDNAコピーを含むベクターを、適切な制限酵素及びエキソヌクレアーゼで消化して、外皮タンパク質及びE1及びE2タンパク質のコーディング配列（構造タンパク質コーディング配列）を欠失させる。
【０２９２】
　例えば、構造タンパク質コーディング配列は、Mbolで部分消化し次に再連結させて構造遺伝子の極めて重要な部分を除去することによって、除去される。代替的には、ベクターをウイルス構造遺伝子の3’末端で切断する。ウイルスDNAは、構造タンパク質配列の開始コドンまでBal31又はMicrococcal S1ヌクレアーゼでの消化により逐次的に除去される。その後、ウイルス3’-テイルの配列を含むDNA配列を残りの5’末端に連結させる。構造タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、EEEV RNAを分離しこれを使用してウマ細胞培養を感染させることによって確認される。分離されたEEEV RNAは、自然の条件下で非感染性であることがわかる。
【０２９３】
　代替的には外皮タンパク質についてのコーディング配列のみが欠失され、E1及びE2糖タンパク質についての配列は、EEEVゲノムのcDNAコピーを含むベクターの中にとどまる。この場合、外皮タンパク質コーディング配列は、MboIで部分消化させ次にウイルスの３’テイルを再付着させることによって除去される。こうして、外皮タンパク質遺伝子の極めて重要な部分が除去されることになる。
【０２９４】
　外皮タンパク質配列のみを除去するための第２の代替的方法は、ウイルス外皮タンパク質遺伝子の３’末端でベクターを切断することにある。外皮タンパク質配列の開始コドンまでBal31又はMicrococcal S1ヌクレアーゼで消化することにより、ウイルスDNAを除去する。次に、3’-テイルの配列を含む合成DNA配列を残りの5’末端に連結させる。
【０２９５】
　外皮タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、EEEV PNAを分離しそれを用いてウマ細胞培養を感染させることによって確認される。分離されたEEEA PNAは自然の条件下で非感染性であることがわかる。東部ウマ脳炎配列をもつベクターを、例１〜３に従って調製する。例えば、適当なサブゲノミックプロモタに対して作動的に連鎖されている非未変性ウイルス外皮タンパク質配列を、ウイルスベクターに挿入することが可能である。非未変性ウイルス外皮タンパク質は望まれる宿主細胞にとって適切なものとなり、ベクターは、感染性ウイルス粒子を組立てるための適当な配列を内含することになる。ベクターは又、未変性外皮タンパク質（すでに欠失させられたもの）についてのサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖される望ましい外因性遺伝子も内含することになる。
【０２９６】
　もう１つの実施形態においては、適当なサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖された望ましい外因性遺伝子を、未変性外皮タンパク質遺伝子をもつウイルスベクターの適切な部位の中にクローニングする。
【０２９７】
　例24．シンドビスウイルスベクターの調製
　Lindquist，B.H et al．Virology.151，10(1986)により記述された通りに、シンドビスウイルスの全長NDAコピーを調製し、pBR322から誘導したプラスミドのSmaI部位の中に挿入する。ウイルス外皮タンパク質及び隣接するE1及びE2糖タンパク質伝達性因子についての配列は、265PNA領域に対応する領域上にある。シンドビスウイルスゲノムのcDNAコピーを含むベクターを、適切な制限酵素及びエキソヌクレアーゼで消化して、構造タンパク質についてのコーディング配列を欠失させる。
【０２９８】
　例えば、構造タンパク質コーディング配列は、BinIで部分消化し次に再連結させて構造遺伝子の極めて重要な部分を除去することによって除去される。代替的には、ベクターをウイルス構造遺伝子の3’末端で切断する。ウイルスDNAは、構造タンパク質配列の開始コドンまでBal31又はMicrococcal S1ヌクレアーゼでの消化により除去される。その後、ウイルス3’-テイルの配列を含む合成DNA配列を残りの5’末端に連結させる。構造タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、シンドビスRNAを分離しこれを使用して細胞培養を感染させることによって確認される。分離されたシンドビスDNAは、自然の条件下で非感染性であることがわかる。
【０２９９】
　代替的には、外皮タンパク質についてのコーディング配列のみが欠失され、E1及びE2糖タンパク質についての配列は、シンドビスゲノムのcDNAコピーを含むベクターの中にとどまる。この場合、外皮タンパク質コーディング配列は、AflIIで部分消化させ次にウイルスの３’テイルを再付着させることによって除去される。
【０３００】
　外皮タンパク質配列のみを除去するための第２の代替的方法は、ウイルス核酸の３’末端でベクターを切断することにある。外皮タンパク質配列の開始コドンまでBal31又はMicrococcal S1ヌクレアーゼで消化することにより、ウイルスＤＮＡを除去する。（全ての構造タンパク質のための配列の場合と同じ開始コドン）。次に、3’-テイルの配列を含む合成DNA配列を残りの5’末端に連結させる。
　外皮タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、シンドビスPNAを分離しそれを用いて鳥類細胞培養を感染させることによって確認される。分離されたシンドビスPNAは自然の条件下で非感染性であることがわかる。
【０３０１】
　シンドビスウイルス配列をもつベクターを、例１〜３に従って調製する。例えば、適当なサブゲノミックプロモータに対して作動的に連鎖されている非未変性ウイルス外皮タンパク質配列を、ウイルスベクターに挿入することが可能である、非未変性ウイルス外皮タンパク質は望まれる宿主細胞にとって適切なものとなり、ベクターは、感染性ウイルス粒子を組立てるための適切な配列を内含することになる。ベクターは又、未変性外皮タンパク質（すでに欠失させられたもの）についてのサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖される望ましい外因性遺伝子も内含することになる。
　もう１つの実施形態においては、適当なサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖された望ましい外因性遺伝子を、未変性外皮タンパク質遺伝子をもつウイルスベクターの適切な部位の中にクローニングする。
【０３０２】
　例25．西部ウマ脳炎ウイルスベクターの調製
　Hahn，C.S．et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5997(1988)により記述された通りに、西部ウマ脳炎ウイルス（WEEV）ゲノムの全長cDNAコピーを調製する。ウイルス外皮タンパク質及びその隣接するE1及びE2糖タンパク質伝達性因子についての配列は、265PNA領域に対応する領域上にある。WEEVゲノムのcDNAコピーを含むベクターを、適切な制限酵素及びエキソヌクレアーゼで消化して、外皮タンパク質及びE1及びE2タンパク質のコーディング配列（構造タンパク質コーディング配列）を欠失させる。
【０３０３】
　例えば、構造タンパク質コーディング配列は、NacIで部分消化し次に再連結させて構造タンパク質配列の極めて重要な部分を除去することによって、除去される。代替的には、ベクターを構造タンパク質DNA配列の3’末端で切断する。ウイルスDNAは、構造タンパク質配列の開始コドンまでBal31又はMicrococcal S1ヌクレアーゼでの消化により除去される。その後、ウイルス3’-テイルのDNA配列を残りの5’末端に連結させる。構造タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、WEEV PNAを分離しこれを使用してVero細胞培養を感染させることにって確認される。分離されたWEEV PNAは、自然の条件下で非感染性であることがわかる。
【０３０４】
　代替的には、外皮タンパク質についてのコーディング配列のみが欠失され、E1及びE2糖タンパク質についての配列は、WEEVゲノムのcDNAコピーを含むベクターの中にとどまる。この場合、外皮タンパク質コーディング配列は、HgiAIで部分消化させ次にウイルスの３’テイルを再付着させることによって除去される。
【０３０５】
　外皮タンパク質配列のみを除去するための第２の代替的方法は、ウイルス外皮タンパク質配列の3’末端でベクターを切断することにある。外皮タンパク質配列の極めて重要な部分までBal31又はMicrococcal S1ヌクレアーゼで消化することにより、ウイルスDNAを除去する。次に、3’-テイルの配列を含むDNA配列を残りの5’末端に連結させる。
　外皮タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、WEEV PNAを分離しそれを用いてVero細胞培養を感染させることによって確認される。分離されたWEEA PNAは自然の条件下で非感染性であるすなわち生物学的に封じ込められていることがわかる。
【０３０６】
　西部ウマ脳炎ウイルス配列をもつベクターを、例１〜３に従って調製する。例えば、適当なサブゲノミックプロモータに対して作動的に連鎖されている非未変性ウイルス外皮タンパク質配列を、ウイルスベクターに挿入することが可能である、非未変性ウイルス外皮タンパク質は望まれる宿主細胞にとって適切なものとなり、ベクターは、感染性ウイルス粒子を組立てるための適当な配列を内含することになる。ベクターは又、未変性外皮タンパク質（すでに欠失させられたもの）についてのサブゲノミックプロモータに作動的に連
　鎖される望ましい外因性遺伝子も内含することになる。もう１つの実施形態においては、適当なサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖された望ましい外因性遺伝子を、未変性外皮タンパク質遺伝子をもつウイルスベクターの適切な部位の中にクローニングする。
【０３０７】
　例26．チロシナーゼコーディング配列を含有するキメラヌクレオチド配列の調製
　チロシナーゼに対するコーディング配列を例20で記述した通りに分離し、例23、24及び25の中で調製したベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
【０３０８】
　例27．チロシナーゼを含有するウイルスの調製。
　従来の技術に従って例２６のキメラヌクレオチド配列にプロモータを付着させる。結果として得られたベクターを用いて、ここでは酵母である生産細胞を形質転換させる。
【０３０９】
　ベクターpAHS内のADCIプロモータに隣接して、例23、24及び25で分離されたウイルス構造タンパク質コーディング配列を挿入することによって、第２のベクターを調製する。このベクターは、適合性あるキメラヌクレオチド配列をもつベクターを有する生産細胞を形質転換するのに使用される。生産細胞を成長させ、結果として得られるウイルスを分離する。代替的には、第２のベクターを使用して、構造タンパク質を産生する第２の酵母菌株を形質転換する。次に構造タンパク質及びウイルスベクターを組合わせてウイルスを形成する。
【０３１０】
　例28．インビトロでのメラニンの調製
　キメラヌクレオチド配列と外皮タンパク質の組合せによって作られた例27で分離されたウイルスを用いて、ウマ細胞培養（EEEV及びWEEVに基づくウイルス）又は鳥類細胞培養（シンドビスウイルスに基づくウイルス）を感染させる。通常の細胞培養成長条件下で、感染を受けた細胞培養を成長させる。細胞はチロシナーゼを産生し、このチロシナーゼは細胞内に存在する成分と反応して中間体を産生し、この中間体は次にメラニンに変換される。メラニンは従来の技術によって分離される。
【０３１１】
　例29．インビトロでのメラニンの調製
　キメラヌクレオチド配列及び構造タンパク質（外皮タンパク質、E1糖タンパク質及びE2糖タンパク質）の組合せによって作られる例２７で分離されたウイルスを用いて、ウマ（EEEV及びWEEVに基づくウイルス）、又はニワトリ（シンドビマウイルスに基づくウイルス）を感染させる。感染を受けた動物を通常の条件（例えば給餌、運動、睡眠）下に維持する。動物は、チロシナーゼを産生し、これは動物の体内に存在する成分と反応して中間体を産生し、この中間体は次にメラニンに変換される。メラニンは、従来の技術により分離する。
【０３１２】
　例30．ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）コーディング配列を含有するキメラヌクレオチド配列の調製
　ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子についてのコーディング配列をプラスミドpt-PA trp12、ATCC No.40404（米国特許第4766075号）から分離し、例23、24又は25で調製されたベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
【０３１３】
　例31．ヒトｔ-PAについてのコーディング配列を含有するウイルスの調製
　ヒトt-PAに対するコーディング配列を含有するウイルスを、例27に記述した手順に従って調製する。
【０３１４】
　例32．インビトロでのヒトt-PAの調製
　キメラヌクレオチド配列と外皮タンパク質の組合せによって作られた例31で分離されたウイルスを用いて、ウマ細胞培養（EEEV及びWEEVに基づくウイルス）又は鳥類細胞培養（シンドビスウイルスに基づくウイルス）を感染させる。通常の細胞培養成長条件下で、感染を受けた細胞培養を成長させる。細胞はヒトt-PAを産生し、これを従来の技術により分離する。
【０３１５】
　例33．インビボでのヒトｔ−ＰＡの調製
　キメラヌクレオチド配列及び構造タンパク質（外皮タンパク質、E1糖タンパク質及びE2糖タンパク質）の組合せによって作られる例31で分離されたウイルスを用いて、ウマ（EEEV及びWEEVに基づくウイルス）、又はニワトリ（シンドビスウイルスに基づくウイルス）を感染させる。感染を受けた動物を通常の条件（例えば給餌、運動、睡眠）下に維持する。細胞はヒトt-PAを産生し、これを従来の技術により分離する。
【０３１６】
　例34．ライノウイルス２ベクターの調製
　Skern，T.et al.，Nucleic Acid Res.，13，2111によって記述された通りに、ヒトライノウイルス２（HPV2）の全長cDNAコピーを調製しプラスミドpUC9のPstI部位の中に挿入する。ウイルス外皮タンパク質VP1のためのヌクレオチド配列は、ゲノムの位置2644にある。HRV2ゲノムのDNAコピーを含有するベクターを適切な制限酵素及びエキソヌクレアーゼで消化して、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。
【０３１７】
　例えば、外皮タンパク質コーディング配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼで部分消化し次に再連結させて外皮遺伝子の極めて重要な部分を除去することによって、除去される。代替的には、ベクターとウイルス外皮タンパク質遺伝子の３’末端で切断する。ウイルスDNAは、外皮タンパク質配列の開始コドン（プロモータ）までBal31又はMicrococcal S1ヌクレアーゼでの消化により除去される。その後、ウイルス3’-テイルの配列を含む合成DNA配列を残りの5’末端に連結させる。外皮タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、HRV2 PNAを分離しこれを使用してヒト細胞培養を感染させることによって確認される。分離されたHPV2 PNAは、自然の条件下で非感染性であることがわかる。
【０３１８】
　ライノウイルス２配列をもつベクターを、例１〜３に従って調製する。例えば、適当なサブゲノミックプロモータに対して作動的に連鎖されている非未変性ウイルス外皮タンパク質配列を、ウイルスベクターに挿入することが可能である、非未変性ウイルス外皮タンパク質は望まれる宿主細胞にとって適切なものとなり、ベクターは、感染性ウイルス粒子を組立てるための適当な配列を内含することになる。ベクターは又、未変性外皮タンパク質（すでに欠失させられたもの）についてのサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖される望ましい外因性遺伝子も内含することになる。
【０３１９】
　もう１つの実施形態においては、適当なサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖された望ましい外因性遺伝子を、未変性外皮タンパク質遺伝子をもつウイルスベクターの適切な部位の中にクローニングする。
【０３２０】
　例35．チロシナーゼコーディング配列を含有するキメラヌクレオチド配列の調製
　チロシナーゼについてのコーディング配列を例２１に記述されている通りに分離し、例33で調製されたベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
【０３２１】
　例36．チロシナーゼを含有するウイルスの調製
　チロシナーゼコーディング配列を含有するHRV2に基づくウイルスを、例34及び35で産生された出発物質を用いて、例27に記述した通りに調製する。
【０３２２】
　例37．メラニンの調製
　例35において分離されたウイルスを用いてヒト細胞培養を感染させる。感染を受けた細胞は、チロシナーゼを産生し、このチロシナーゼはヒト細胞内に存在する成分と反応して中間体を産生し、この中間体は次に細胞内でメラニンに変換される。このメラニンを、従来の技術により分離する。
【０３２３】
　例38．ヒトt-PAコーディング配列を含有するキメラヌクレオチド配列の調製
　チロシナーゼについてのコーディング配列を例30に記述されている通りに分離し、例３４で調製されたベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
【０３２４】
　例39．ヒトt-PAについてのコーディング配列を含有するウイルスの調製
　ヒトt-PAについてのコーディング配列を含有するウイルスを、例35の手順に従って調製する。
【０３２５】
　例40．ヒトt-PAの調製
　例39において分離されたウイルスを用いてヒト細胞培養を感染させる。感染を受けた細胞を通常の成長条件下で成長させる。細胞はヒトt-PAを産生し、これを従来の技術により分離する。
【０３２６】
　例41．ポリオウイルス２型ベクターの調製
　Toyoda，H.et al.，J.Mol.Biol.，174，561(1984)により記述されている通りに、ポリオウイルス２型（PV2）ゲノムの全長cDNAコピーを調製し、プラスミドpBR322のHindIII部位の中に挿入する。ウイルス外皮タンパク質VP1のヌクレオチド配列は、ゲノムの位置2499にある。PV2ゲノムのDNAコピーを含有するベクターを適切な制限酵素及びエキソヌクレアーゼで消化して外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。プロテアーゼ消化配列を無欠の状態に残しておくことが重要である。
【０３２７】
　例えば、外皮タンパク質コーディング配列の一部分を、まず適切な制限エンドヌクレアーゼで部分的に消化し次に再連結してウイルスの3’-テイルを再付着させることによって除去する。外皮タンパク質についてのコーディング配列の欠失は、PV2 ENAを分離しそれを用いて、撹拌培養されたHeLa S3細胞を感染させることによって確認される。分離されたPV2 PNAは自然の条件下で非感染性であるすなわち生物学的に封じ込められていることがわかる。
【０３２８】
　ポリオウイルス型配列をもつベクターを、例１〜３に従って調製する。例えば、適当なサブゲノミックプロモータに対して作動的に連鎖されている非未変性ウイルス外皮タンパク質配列を、ウイルスベクターに挿入することが可能である。非未変性ウイルス外皮タンパク質は望まれる宿主細胞にとって適切なものとなり、ベクターは、感染性ウイルス粒子を組立てるための適当な配列を内含することになる。ベクターは又、未変性外皮タンパク質（すでに欠失させられたもの）についてのサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖される望ましい外因性遺伝子も内含することになる。
　もう１つの実施形態においては、適当なサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖された望ましい外因性遺伝子を、未変性外皮タンパク質遺伝子をもつウイルスベクターの適切な部位の中にクローニングする。
【０３２９】
　例42．チロシナーゼコーディング配列を含有するキメラヌクレオチド配列の調製
　チロシナーゼについてのコーディング配列を例21に記述されている通りに分離し、例３３で調製されたベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
　例43．チロシナーゼを含有するウイルスの調製
　チロシナーゼについてのコーディング配列を含有するPV2に基づくウイルスを、例41及び42で産生された出発物質を用いて、例27に記述した通りに調製する。
　例44．メラニンの調製
　例43において分離されたウイルスを用いて、撹拌培養されたHeLa S3細胞を感染させる。感染を受けた細胞は、チロシナーゼを産生し、このチロシナーゼは細胞内に存在する成分と反応して中間体を産生し、この中間体は次に細胞内でメラニンに変換される。このメラニンを、従来の技術により分離する。
　例45．ヒトt-PAコーディング配列を含有するキメラヌクレオチド配列の調製
　チロシナーゼについてのコーディング配列を例40に記述されている通りに分離し、例３４で調製されたベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
【０３３０】
　例46．ヒトt-PAコーディング配列を含有するウイルスの調製
　ヒトt-PAについてのコーディング配列を含有するウイルスを、例43の手順に従って調製する。
【０３３１】
　例47．ヒトt-PAの調製
　例46のウイルスを用いて、撹拌培養されたHeLa53細胞を感染させる。感染を受けた細胞を通常の成長条件下で成長させる。
　細胞はヒトt-PAを産生し、これを従来の技術により分離する。
【０３３２】
　例48．シミアンウイルス40ベクターの調製
　シミアンウイルス40（SV40）ゲノムの全長cDNAコピーを、Wychowski，C et al.，J.Virol.61，3862(1987)に記述されている通りに、調製し、プラスミドpCW1SのAccI部位の中に挿入する。ウイルス外皮タンパク質VP1のヌクレオチド配列は、ゲノムの位置1488及び2574の間にある。SV40ゲノムのDNAコピーを含有するベクターを、適切な制限酵素及びエンドヌクレアーゼで消化して外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。
【０３３３】
　例えば、VP1外皮タンパク質コーディング配列を、BamHIヌクレアーゼで部分的に消化することによって除去し、その後EcoRIで処理し、クレノウ酵素で充てんし、再循環させる。
　外皮タンパク質VP1についてのコーディング配列の欠失は、SV40 RNAを分離しそれを用いてサル細胞培養を感染させることによって確認される。分離されたSV40 RNAは自然の条件下で非感染性であるすなわち生物学的に封じ込められていることがわかる。
【０３３４】
　シミアンウイルス40配列をもつベクターを、例１〜３に従って調製する。例えば、適当なサブゲノミックプロモータに対して作動的に連鎖されている非未変性ウイルス外皮タンパク質配列を、ウイルスベクターに挿入することが可能である。非未変性ウイルス外皮タンパク質は望まれる宿主細胞にとって適切なものとなり、ベクターは、感染性ウイルス粒子を組立てるための適当な配列を内含することになる。ベクターは又、未変性外皮タンパク質（すでに欠失させられたもの）についてのサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖される望ましい外因性遺伝子も内含することになる。
　もう１つの実施形態においては、適当なサブゲノミックプロモータに作動的に連鎖された望ましい外因性遺伝子を、未変性外皮タンパク質遺伝子をもつウイルスベクターの適切な部位の中にクローニングする。
【０３３５】
　例49．チロシナーゼコーディング配列を含有するキメラヌクレオチド配列の調製
　チロシナーゼについてのコーディング配列を例２２に記述されている通りに分離し、例48で調製されたベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
【０３３６】
　例50．チロシナーゼを含有するウイルスの調製
　チロシナーゼコーディング配列を含有しSV40に基づくウイルスを、例２７で記述した通りに調製する。例４９のキメラヌクレオチド配列及び例４７で分離した外皮タンパク質コーディング配列を利用する。
【０３３７】
　例51．メラニンの調製
　例50において分離されたウイルスを用いてサル細胞培養を感染させる。感染を受けた細胞は、チロシナーゼを産生し、このチロシナーゼは細胞内に存在する成分と反応して中間体を産生し、この中間体は次に細胞内でメラニンに変換される。このメラニンを、従来の技術により分離する。
【０３３８】
　例52．ヒトt-PAコーディング配列を含有するキメラヌクレオチド配列の調製
　シクロデキストリングルコトランスフェラーゼについてのコーディング配列を例30に記述されている通りに分離し、例48で調製されたベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングさせる。
【０３３９】
　例53．ヒトt-PAコーディング配列を含有するウイルスの調製
　ヒトt-PAについてのコーディング配列を含有するウイルスを、例50の手順に従って調製する。
【０３４０】
　例54．ヒトt-PAの調製
　例53のウイルスを用いてサル細胞培養を感染させる。感染を受けた細胞を通常の成長条件下で成長させる。細胞はヒトt-PAを産生し、これを従来の技術により分離する。
　特許手続きを目的とする微生物の寄託の国際的認知に関するブダペスト条約及びそれに基づく規則（ブダペスト条約）の条件に基づいて、米国標準培養収集機関（ATCC）に以下のプラスミドを寄託した。かくしてこれらのプラスミドはブダペスト条約の条件に従って維持され、利用可能な状態となっている。このようなプラスミドの利用可能性は、いずれかの政府の権限の下でその特許法に従って付与される権利に違反して本発明を実施することの許諾としてみなされるべきものではない。
【０３４１】
　寄託された培養には、以下の通りのATCC寄託番号が割当てられた：
　　プラスミド　　　　　　　　　　ATCC No.
　　　pTB2　　　　　　　　　　　　　75280
　　　pTBU5　　　　　　　　　　　 　75281
　37.C.F.R.§1,808に準じて、出願人は、寄託されたプラスミドの公共に対する利用提供に関して寄託者が課す全ての制約条件が、本出願に関する特許の付与時点で取り消し不能な形で撤回されることに同意する。
　本発明はこの特許出願においてその好ましい実施形態の詳細を参照しながら開示されてきたが、本開示が制限的な意味をもたない一例として意図されたものであることを理解すべきであり、当業者であれば本発明の精神及び添付のクレームの範囲内で容易に変更を考えつくことができると思われる。
【０３４２】
【表１】
2004000274.tif 000002
【０３４３】
【表２】
2004000274.tif 000003
【０３４４】
【表３】
2004000274.tif 000004
【０３４５】
【表４】
2004000274.tif 000005
【０３４６】
【表５】
2004000274.tif 000006
【０３４７】
【表６】
2004000274.tif 000007
【０３４８】
【表７】
2004000274.tif 000008
【０３４９】
【表８】
2004000274.tif 000009
【０３５０】
【表９】
2004000274.tif 000010
【０３５１】
【表１０】
2004000274.tif 000011
【０３５２】
【表１１】
2004000274.tif 000012
【０３５３】
【表１２】
2004000274.tif 000013
【０３５４】
【表１３】
2004000274.tif 000014
【０３５５】
【表１４】
2004000274.tif 000015
【０３５６】
【表１５】
2004000274.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【０３５７】
【図１】図１は、本発明に従い製造されたいくつかのベクターおよび制限部位を示す。U1は自然ウイルス核酸であり、０は非自然ウイルス核酸であり、そしてハッチングを施した区域は非自然ウイルスサブゲノムプロモーターである。制限部位は下記の通りである：X-XhoI、N-NsiI、K-KpnI、S-SplI、B-BamHI、No-NcoI、p-PstI。ハッチングを施したボックス（例えば、TB2において）はTMV-oのプロモーター、すなわち、コートタンパク質の開始コドンの203bp上流を表し、そして点描ボックスはファージのプロモーターを表す。白抜きボックスはオープンリーディングフレームを表し、そして充実ボックスはクローニングベクターの配列を表す。ベクターは下記の通りである：Ａ）およびＢ）pTKU1、Ｃ）pTMVS3-28、Ｄ）pTB2、E）pTBN62およびF）pTBU5。
【図２】図２は、α−トリコサンシンの発現ベクター、pBGC152を示す。このプラスミドはTMV-U1の126-、183-および30-kDaのオープンリーディングフレーム（ORF）、ORSVコートタンパク質遺伝子（Ocp）、SP6プロモーター、α−トリコサンシン遺伝子、およびpBR322プラスミドの一部分を含有する。30K ORFのTAA停止コドンには下線が引かれており、そしてバー（｜）は成熟ペプチドからの推定上のシグナルペプチドを分割する。30K ORFのマイナス鎖内に位置するTMV-U1サブゲノムプロモーターは、α−トリコサンシンの発現を制御する。サブゲノムRNAの推定上の転写開始点（tsp）は点（．）で示されている。
【図３】図２の続きを示す。
【図４】図４は、pBGC152プラスミドの構築を示す。
【図１】
2004000274.tif 000017
【図２】
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【図３】
2004000274.tif 000019
【図４】
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