(57)【要約】【課題】酵素標識抗体を利用したアッセイ法におけるバックグラウンドの発光量を低減させる。【解決手段】多孔性の吸着性領域を有する滅菌された生化学解析用ユニットの吸着性領域に、リガンドまたはレセプタを結合させる。このリガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。続いて、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させ、この接触によって発生する化学発光を検出する際に、生化学解析用ユニットに接触する部材に滅菌されたものを用いる。【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドまたはレセプタが結合された基体の前記リガンドまたはレセプタに、酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドを特異的に結合させ、前記リガンドまたはレセプタと特異的に結合した前記酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドに基質を接触させ、該接触によって発生する信号を検出するアッセイ法において、
前記基体に接触する部材を滅菌することを特徴とするアッセイ法。
【請求項２】
リガンドまたはレセプタが結合された基体の前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、前記標識物質に特異的に結合する酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に基質を接触させ、該接触によって発生する信号を検出するアッセイ法において、
前記基体に接触する部材を滅菌することを特徴とするアッセイ法。
【請求項３】
前記基体が複数の孔を有する基板と、前記複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットであることを特徴とする請求項１または２記載のアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識レセプタまたは標識リガンドを検出する酵素標識抗体を利用したアッセイ法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、例えば、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどを用いたガラスアレイやメンブレンアレイの担体表面上の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプタをスポッター装置を用いて吸着性領域に滴下した後、これを固定し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質であって、蛍光物質、蛍光色素などの蛍光標識物質によって標識された標識されたレセプタまたはリガンドを、ハイブリダイゼーション等によって吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて励起光を照射して、蛍光物質、色素などの標識物質から発せられた蛍光を光電的に検出して、生体由来の物質を解析する解析システムが開発されている。
【０００３】
この解析システムによれば、メンブレンフィルタなどの担体表面上の吸着性領域の異なる位置に、数多くのリガンドまたはレセプタのスポットを高密度に形成して、蛍光標識物質によって標識されたレセプタまたはリガンドをハイブリダイズさせること等によって、短時間で生体由来の物質を解析することが可能になるという利点がある。
【０００４】
標識されたレセプタまたはリガンドを解析する別の方法として、化学発光法を用いた検出方法が知られている。これは、担体表面上の異なる位置にリガンドまたはレセプタを固定し、抗原などで標識されたレセプタまたはリガンド（以下、標識レセプタまたは標識リガンドという）をハイブリダイゼーションなどによって、担体表面上に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて、標識レセプタまたは標識リガンドを標識している抗原などの物質に対する抗体を、酵素のように化学発光を生じさせる標識物質で標識し（以下、酵素標識抗体という）、この酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドの抗原と特異的に結合させ、さらに酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出する方法である。
【０００５】
【特許文献１】
特許第２８３７２７６号公報
【０００６】
【非特許文献１】
「ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｖｏｌ．２１，　ｐ．２５−ｐ．３２（１９９９）
【０００７】
【非特許文献２】
「バイオインダストリー」Ｖｏｌ．１８，　ｐ．１３−ｐ．１９（２００１）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上述の化学発光法においても、充分な精度で検出できることはもちろん、検出限界の向上が要求されている。しかし、化学発光法ではバックグラウンドが高いために、標識レセプタまたは標識リガンドが結合していない吸着性領域の発光量（ノイズあるいはバックグラウンド）に対する、標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量（信号）の比（Ｓ／Ｎ比）が小さく、吸着性領域に結合する標識レセプタまたは標識リガンドが微量となると検出することが困難になるという問題がある。
【０００９】
化学発光法は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質と特異的に結合した酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出して解析を行うが、化学発光基質が酵素と反応する際に、酵素以外の何らかの作用によって発光し、非特異的に円状の発光シグナルが検出されて、バックグラウンドが高くなる傾向にある。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、バックグラウンドを低減させることが可能な酵素標識抗体を利用したアッセイ法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明のアッセイ法は、リガンドまたはレセプタが結合された基体の前記リガンドまたはレセプタに、酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドを特異的に結合させ、前記リガンドまたはレセプタと特異的に結合した前記酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドに基質を接触させ、該接触によって発生する信号を検出するアッセイ法において、前記基体に接触する部材を滅菌することを特徴とする方法である。
【００１２】
本発明のアッセイ法の別の態様としては、リガンドまたはレセプタが結合された基体の前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、前記標識物質に特異的に結合する酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に基質を接触させ、該接触によって発生する信号を検出するアッセイ法において、前記基体に接触する部材を滅菌することを特徴とする方法である。
【００１３】
基体は、複数の孔を有する基板と、前記複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットが好ましいが、リガンドまたはレセプタが固定できるものであれば生化学解析用ユニットに限定されるものではなく、スライドガラス板やニトロセルロース、再生セルロース、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ナイロン、ポリカーボネート、セルロースアセテート等の多孔質膜を構成する高分子材料からなるメンブレンなどを用いることができる。
【００１４】
【発明の効果】
本発明のアッセイ法は、基体に接触する部材を滅菌することとしたので、酵素以外の何らかの作用によって基質が分解または反応等して信号を発生することが抑制され、バックグラウンドを低減させることが可能となる。また、バックグラウンドを低減させることができるため、標識レセプタまたは標識リガンドが結合していない吸着性領域の発光量（ノイズあるいはバックグラウンド）に対する、標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量（信号）の比（Ｓ／Ｎ比）を大きく検出することが可能となるので、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であっても検出可能となり、検出限界を向上させることができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明のアッセイ法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図１に示す生化学解析用ユニット１は、孔３が複数設けられた基板２と、孔３の内部に充填され、多孔性材料が基板２と接着された吸着性領域４とからなる。この吸着性領域４には、構造または特性が既知のリガンドまたはレセプタ５が滴下され、その後の処理により固定化されている。
【００１６】
基板２の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【００１７】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−６やナイロン−６，６などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【００１８】
基板２の厚みは、一般には５０〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、１００〜５００μｍの範囲であることがより好ましい。
【００１９】
基板２に開ける孔３の開口部の面積（サイズ）は、孔３の密度を高めるために、一般には５ｍｍ２　未満であり、好ましくは１ｍｍ２　未満であり、０．３ｍｍ２　未満がより好ましく、さらには０．０１ｍｍ２　未満であることが好ましい。そして、より好ましくは０．００１ｍｍ２　以上であることが好ましい。
【００２０】
孔３のピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）は０．０５〜３ｍｍの範囲であることが好ましく、孔３の間隔（隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離）は、０．０ｌ〜１．５ｍｍの範囲であることが好ましい。孔３の数（密度）は、一般には１０個／ｃｍ２　以上であり、好ましくは１００個／ｃｍ２　以上、より好ましくは５００個／ｃｍ２　以上、さらには１０００個／ｃｍ２　以上であることが好ましい。そして、好ましくは１０００００個／ｃｍ２　以下、さらには１００００個／ｃｍ２　以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔３は全て図１に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック（単位）に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【００２１】
吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。本発明において、吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機／無機複合体であってもよい。
【００２２】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００２３】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【００２４】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えば、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などがあげられる。
【００２５】
基板２に複数の孔３を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に１枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを２つのロール間に連続搬送してもよい。
【００２６】
なお、ここでは基体として生化学解析用ユニットを例にとって説明したが、本発明のアッセイ法に用いられる基体はこれに限られるものではなく、ガラス板やメンブレンを用いることももちろん可能である。
【００２７】
次に、本発明の酵素標識抗体を利用したアッセイ法について、基体として上記の生化学解析用ユニットを用いる場合を例にとって説明する。
まず、生化学解析用ユニットに接触する部材をあらかじめ滅菌する。生化学解析用ユニットに接触する部材としては、アッセイに用いられるハイブリダイゼーションバッグ、反応容器、生化学解析用ユニット上で発生する信号を検出する際に用いるシート等があげられる。なお、生化学解析用ユニットそのものも滅菌しておくことが好ましい。
【００２８】
滅菌には、ガスまたは電気によって直接加熱するか、加熱した空気を循環させて乾燥高温状態を保つ方式によって、乾燥空気中で加熱することによって菌を殺菌する乾熱滅菌法、適当な温度と圧力の飽和水蒸気中で加熱することによって菌を殺菌する高圧蒸気法や加熱水蒸気を直接流通させることによって菌を殺菌する流通蒸気法等の湿熱滅菌法、放射線同位元素を含む線源からのガンマ線あるいは加速器による電子線などの放射線の照射により菌を殺菌する放射線滅菌法、紫外線を照射することで菌を殺菌する紫外線滅菌法などを好ましく用いることができる。
【００２９】
図２は菌の生存曲線とＤ値の関係を示すグラフである。Ｄ値は菌数を１／１０にするのに必要な滅菌時間である。ある菌数をある滅菌方法で滅菌すると、滅菌時間が経過するに従って菌は指数関数的に減少する。図２は、最初に存在した１０６　個の菌数が、６時間処理後には１００　個すなわち１個になり、これをさらに６時間継続させた時に菌数は１０−６個になることを示している。菌数１０−６個は１０６　個の部材を滅菌処理すると、そのうち１個に菌が生存しているという確率的な意味を示すものである。
【００３０】
弱い菌ではＤ値が小さいため、滅菌時間が少なくても充分な滅菌ができるが、強い菌ではＤ値が大きくなるため、滅菌時間を長くする必要がある。生存する菌種はアッセイ環境下によって異なるため、滅菌条件は環境に応じて適宜決定することが好ましいが、例えば、乾熱滅菌法では１００℃以上かつ対象部材の融点以下の温度で１０分以上加熱、湿熱滅菌法では１１０℃以上１３０℃未満で５分以上加熱、放射線滅菌法では吸収線量が０．５ｋＧｙ以上となるように放射、紫外線滅菌法では波長２５０〜２６０ｎｍの紫外線を１ｍＪ／ｃｍ以上で照射することが好ましい。
【００３１】
滅菌の確認は、計器類によるチェック、化学的インジケータ、生化学的インジケータなどによって行うことができる。化学的インジケータは、一般には紙に塗りつけた化学薬品またはガラス管に密封された物質が、滅菌に必要な物理的条件の変化に対応して変質、変性、変色することを応用したものであって、一般に市販されているものを用いることができる。化学的インジケータは、その変色等が明瞭であって滅菌処理の前後で判別が容易であり、希望する滅菌条件になったときに初めて完全に変色等し、使用するまでの保管中に変色したり性能が変化しない等の条件を満たしているものが好ましい。生物学的インジケータは菌を接種した濾紙を包装したものであり、特定の滅菌処理で効果的に滅菌されたか否かを培養によって確認するものである。生物学的インジケータは滅菌装置に積み込んだ部材のうち、滅菌が最も難しいと予想される箇所において、指定された条件により滅菌処理を行い、確認することが好ましい。
【００３２】
生化学解析用ユニットに接触する部材をあらかじめ滅菌したら、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させる。
【００３３】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。リガンドまたはレセプタは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定することができる。なお、滅菌された生化学解析用ユニットの多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【００３４】
次に、ハイブリダイゼーションバッグ内に生化学解析用ユニットを入れ、ここに標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を加え、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識レセプタまたは標識リガンドを対流あるいは拡散によって移動させて、リガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。
【００３５】
標識レセプタまたは標識リガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、標識物質によって標識されたものである。レセプタまたはリガンドを標識する標識物質としては、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。また、ビオチンに対するアビジンのような生物学的結合パートナーであってもよい。
【００３６】
生化学解析用ユニットの多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合しなかった標識レセプタまたは標識リガンドを除去するために、ハイブリダイゼーションバッグに洗浄液を対流あるいは拡散によって移動させて、吸着性領域を洗浄する。これによって多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合していない標識レセプタまたは標識リガンドを、剥離させ、除去することができる。
【００３７】
なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。これによって、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合していない酵素標識抗体を、剥離させ、除去することが可能になる。
【００３８】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに特異的に結合した標識レセプタまたは標識リガンドに酵素標識抗体を結合させる前に、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファで吸着性領域をブロッキングすることが好ましい。ブロッキングによって、酵素標識抗体が標識レセプタまたは標識リガンドの抗原とではなく、吸着性領域に直接結合することを防止することができる。
【００３９】
洗浄後、洗浄液を廃棄し、酵素標識抗体を含む反応溶液をハイブリダイゼーションバッグに入れて、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。酵素標識抗体は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質に対する抗体（標識レセプタまたは標識リガンドが抗体である場合には抗原）を酵素で標識したものである。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。
【００４０】
続いて、生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグから取り出して、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質あるいは色素基質あるいは蛍光基質を接触させる。これによってそれぞれ化学発光、発色、蛍光を放出する。
【００４１】
化学発光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合ジオキセタン、ペルオキシダーゼの場合ルミノール、ルシフェラーゼの場合ルシフェリンを用いることができる。また、色素基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合にはパラニトロフェノールリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の組合せ、ジアミノベンチジン、テトラメチルベンチジン、酵素がベータガラクトシダーゼの場合にはパラニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。蛍光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合４−メチルウンベリフェニルリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には３（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸、酵素がベータガラクトシダーゼの場合には、４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。
【００４２】
化学発光基質と酵素との接触の場合には、各吸着性領域から可視光波長領域の化学発光を生ずるので、生化学解析用ユニットを滅菌済みの透明ＰＥＴベースに挟み込み、化学発光を光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、標識レセプタまたは標識リガンドを検出、測定することができる。また、色素基質と酵素との接触の場合も同様に、生化学解析用ユニットを滅菌済みの透明ＰＥＴベースに挟み込み、発色を光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、標識レセプタまたは標識リガンドを検出、測定することができる。蛍光基質と酵素との接触の場合には、各吸着性領域から蛍光を生ずるので、生化学解析用ユニットを滅菌済みの透明ＰＥＴベースに挟み込み、蛍光を光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、標識レセプタまたは標識リガンドを検出、測定することができる。
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４３】
【実施例】
（実施例１）
ＴＥバッファに溶解した分子量マーカーｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩ（２５０ｎｌ／μｇ：ロッシュ社製）を５分煮沸後、１分間氷冷し、ｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを１本鎖とした。これをメンブレン（ミリポア社製　Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｎｙ）にスポットし、その後紫外線を照射（２５４ｎｍ、３３ｍＪ／ｃｍ２　）して、吸着性領域に１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを固定した。
【００４４】
次にジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液（ロッシュ社製）１０ｐｇを熱変性し、ハイブリダイゼーションバッファ（０．５ＭＣｈｕｒｃｈリン酸バッファ（０．５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４をＨ３ＰＯ４でｐＨ７．２に調整したもの），１ｍＭ　ＥＤＴＡ，７％ＳＤＳ）５ｍｌに添加した。
【００４５】
上記メンブレンをハイブリダイゼーションバッグに入れて、バッグ内に６５℃のプレハイブリダイゼーションバッファ（上記ハイブリダイゼーションバッファと同じもの）５ｍｌを入れ１時間振盪させた。次に、ＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液が添加されたハイブリダイゼーションバッファを６５℃の条件下１８時間振盪させてハイブリダイゼーションを行った。続いて、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて洗浄バッファ１（４０ｍＭ　Ｃｈｕｒｃｈリン酸バッファ，１％ＳＤＳ）で５分間振盪させて２回洗浄し、洗浄バッファ２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で５分間振盪させて２回洗浄した（バッファ温度はいずれも６５℃）。
【００４６】
洗浄液を廃棄し、ブロッキングバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）をＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過し、濾過したブロッキングバッファを加えて室温で６０分間振盪させた。
【００４７】
次に、アルカリホスファターゼ標識ＤＩＧ抗体をあらかじめ、孔径０．２２μｍのウルトラフリー（ミリポア社製）にて濾過し、濃度が１／１００００となるように、ＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過したブロッキングバッファで希釈し、これを加えて室温で６０分間振盪させた。
【００４８】
続いて、ケミルミ洗浄液（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）で１５分間振盪して洗浄し、これを３回繰り返した。洗浄後ディテクションバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）で５分間浸漬の後、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄ　ｔｏ　ｕｓｅ）を含む溶液と１時間接触させ、あらかじめオートクレーブで３０分１１５℃の条件で滅菌した透明ＰＥＴベースにメンブレンを挟み込み、放出される化学発光を冷却ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ１０００：富士写真フィルム社製）によって光電的に検出した。
【００４９】
（比較例１）
メンブレンを挟み込む透明ＰＥＴベースの滅菌をしなかった以外は、実施例１と同様にして化学発光を行い、発光量を検出した。
【００５０】
実施例１と比較例１のスポット位置以外で検出された円状発光の発生頻度を測定した結果を表１に示す。
【表１】
2004117299.tif 000002
【００５１】
（実施例２）
大きさが９０ｍｍ×９０ｍｍ、厚み１００μｍのＳＵＳ３０４シート（基板材料シート）に、孔径０．３ｍｍの開口部が円形の微細孔を、エッチングによって孔ピッチ０．４ｍｍ、孔間隔０．１ｍｍで、計４００個形成した。
【００５２】
次に、基板材料シートの片面に接着剤を塗工し、続いて基板材料シートに形成した孔内部に入り込んだ接着剤を吸引除去した後、乾燥した。続いて、基板材料シートの接着剤を塗工した面に、ポアサイズ０．４５μｍ、厚み１７０μｍのナイロン６，６メンブレンを重ね、１５０℃に加熱しながら、圧力が１ｃｍ２　当たり３００ｋｇとなるようにプレスして、基板材料シートの孔内部にナイロン６，６メンブレンを圧入することで、ステンレス障壁と多数孔のポリマー充填領域とからなる生化学解析用ユニットを作製した。次いで、この生化学解析用ユニットを波長２５３．７ｎｍの紫外線を１ｍＪ／ｃｍ以上照射し紫外線滅菌を行った。
【００５３】
ＴＥバッファに溶解した分子量マーカーｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩ（２５０ｎｌ／μｇ）を５分煮沸後、１分間氷冷しｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを１本鎖とした。これを上記で作製した生化学解析用ユニットの吸着性領域にスポットし、その後紫外線照射（２５４ｎｍ、３３ｍＪ／ｃｍ２　）して、吸着性領域に１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを固定した。
【００５４】
次にジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液（ロッシュ社製）１０ｐｇを熱変性し、ハイブリダイゼーションバッファ（０．５ＭＣｈｕｒｃｈリン酸バッファ（０．５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４をＨ３ＰＯ４でｐＨ７．２に調整したもの），１ｍＭ　ＥＤＴＡ，７％ＳＤＳ）５ｍｌに添加した。
【００５５】
上記生化学解析用ユニットを図３に示すリアクタに固定した（図３に示すリアクタは、反応容器１０と流動手段２０とからなり、反応容器１０は、反応容器上半部１３と反応容器下半部１４とからなり、反応容器上半部１３は反応容器下半部１４に取り外し可能に設けられており、生化学解析用ユニット１は上側挟持片１１と下側挟時片１２からなる取付部によって固定される構成となっている。流動手段２０は溶液循環パイプ２１とポンプ２２から構成され、溶液循環パイプ２１の一端は反応容器１０の溶液流入口１５に、他端は溶液流出口１６に取り外し可能に取り付けられている。反応溶液はポンプ２２によって溶液流入口１５から反応容器１０内に入り、生化学解析用ユニット１の吸着性領域４を横切るように強制的に流動した後、溶液流出口１６から出て、溶液循環パイプ２１を通って循環するように構成されている。）。
【００５６】
生化学解析用ユニットを固定した反応容器に６８℃のプレハイブリダイゼーションバッファ（上記ハイブリダイゼーションバッファと同じもの）５ｍｌを１時間循環させた（線速度０．２ｃｍ／ｓｅｃ）。次に、６５℃のＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液が添加されたハイブリダイゼーションバッファを１８時間循環させてハイブリダイゼーションを行った。続いて、洗浄バッファ１（４０ｍＭ　Ｃｈｕｒｃｈリン酸バッファ，１％ＳＤＳ）で５分間２回、洗浄バッファ２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で５分間２回循環洗浄した（バッファ温度はいずれも６８℃）。
【００５７】
その後、ＤＩＧウオッシュバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの、組成はケミルミ洗浄液と同じ）を５分間循環させた後、ブロッキングバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）を室温で１０分間循環した後、５０分間循環を停止した。
【００５８】
次に、アルカリホスファターゼ標識ＤＩＧ抗体をあらかじめ、孔径０．２２μｍのウルトラフリー（ミリポア社製）にて濾過し、濃度が１／１００００となるように塩濃度を調整したブロッキングバッファで希釈し、これを１分間循環した後、６０分間停止した。
【００５９】
続いて、ケミルミ洗浄液（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）を１５分間循環させた。これを３回繰り返し、ディテクションバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）でｐＨ調整した後、最後に化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄ　ｔｏ　ｕｓｅ）を含む溶液と１時間反応させて、生化学解析用ユニットをあらかじめオートクレーブで３０分１１５℃の条件で滅菌した透明ＰＥＴベースに挟み込み、放出される化学発光を冷却ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ１０００：富士写真フィルム社製）によって光電的に検出した。
【００６０】
（比較例２）
生化学解析用ユニットを挟み込む透明ＰＥＴベースの滅菌をしなかった以外は、実施例１と同様にして化学発光を行い、発光量を検出した。
【００６１】
実施例２と比較例２のスポット位置以外で検出された円状発光の発生頻度を測定した結果を表２に示す。
【表２】
2004117299.tif 000003
【００６２】
実施例１および比較例１は、メンブレンに１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを固定しＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡを検出したもの、実施例２および比較例２は、生化学解析用ユニットの吸着性領域に１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩが固定しＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡを検出したものである。表１および表２から明らかなように、メンブレンあるいは生化学解析用ユニットを挟み込む透明ＰＥＴベースを滅菌した実施例１および２は、円状発光の発生頻度が滅菌しなかった比較例１および２に比較して明らかに低減された。
【００６３】
以上のように、本発明のアッセイ法は基体に接触する部材を滅菌することとしたので、酵素以外の何らかの作用によって基質が分解または反応等して信号を発生することが抑制され、バックグラウンドを低減させることが可能となった。
【００６４】
なお、上記実施例では、生化学解析用ユニットに接触する部材として透明ＰＥＴベースを滅菌する場合を例にとって実施したものであるが、滅菌する部材はこれに限られるものではない。また、ハイブリダイゼーションバッファ、プレハイブリダイゼーションバッファ、洗浄バッファ、ケミルミ洗浄バッファ、ブロッキングバッファ、ディテクションバッファなどの生化学解析用ユニットに接触する溶液について滅菌してもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図２】菌の生存曲線とＤ値の関係を示すグラフ
【図３】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの実施の形態を示す概略断面図
【符号の説明】
１　　生化学解析用ユニット
２　　基板
３　　孔
４　　吸着性領域
５　　リガンドまたはレセプタ
【図１】
2004117299.tif 000004
【図２】
2004117299.tif 000005
【図３】
2004117299.tif 000006