(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ＭＥＫ１ペプチドの形態及びＭＥＫ２ペプチドの形態、ＭＥＫ１若しくはＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子複合体の結晶、前記結晶の製造方法、結晶学的データから導き出される３次元構造情報、並びに前記構造情報の使用方法を提供する。【解決手段】アミノ酸配列が修飾されたアミノ酸配列を有するＭＥＫ１ペプチド及び、ＭＥＫ２ペプチドである。【選択図】　図１
2004000135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載の完全長マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１／ＥＲＫキナーゼ１（ＭＥＫ１）ペプチドのＮＨ２末端領域からアミノ酸残基少なくとも３０個〜最大７０個を欠失したＮＨ２末端の先端欠失部を有するＭＥＫ１ペプチド、又は保存的に置換されたそのバリアント；
配列番号２の２８０番目のアミノ酸〜３２３番目のアミノ酸から選択される挿入ループ形成アミノ酸残基の欠失部、又は配列番号２の２６４番目のアミノ酸残基〜３１０番目のアミノ酸の間のアミノ酸少なくとも４０個の欠失部を有するＭＥＫ１ペプチド、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（１）配列番号２に記載の完全長ＭＥＫ１ペプチドのＮＨ２末端領域からアミノ酸残基少なくとも３０個〜最大７０個を欠失したＮＨ２末端の先端欠失部を有し；及び（２）配列番号２の２８０番目のアミノ酸〜３２３番目のアミノ酸から選択される挿入ループ形成アミノ酸残基の欠失部、又は配列番号２の２６４番目のアミノ酸残基〜３１０番目のアミノ酸の間のアミノ酸少なくとも４０個の欠失部を有するペプチド、又は保存的に置換されたそのバリアント；
配列番号４に記載の完全長マイトジェン活性化プロテインキナーゼ２／ＥＲＫキナーゼ２（ＭＥＫ２）ペプチドのＮＨ２末端領域からアミノ酸残基少なくとも３４個〜最大７４個を欠失したＮＨ２末端の先端欠失部を有するＭＥＫ２ペプチド、又は保存的に置換されたそのバリアント；及び
表１又は表２に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチドの構造座標により規定されるペプチド、あるいは表１又は表２に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２の構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標を有する関連するセット
からなる群から選択される単離されたペプチド。
【請求項２】
（ａ）マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１／ＥＲＫキナーゼ１（ＭＥＫ１）ペプチドリガンド結合部位に位置するＭＥＫ１インヒビターの約４Åの内の配列番号２の以下のアミノ酸残基：Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｖ１２７、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、及びＭ２１９の構造座標により規定されるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ１／ＥＲＫキナーゼ１（ＭＥＫ１）ペプチドリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｂ）ＭＥＫ１ペプチドリガンド結合部位に位置するＭＥＫ１インヒビターの約５Åの内の配列番号２の以下のアミノ酸残基：Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｉ１２６、Ｖ１２７、Ｇ１２８、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｄ１９０、Ｎ１９５、Ｌ２０６、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、Ｍ２１９、及びＦ２２３の構造座標により規定されるＭＥＫ１ペプチドリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｃ）マイトジェン活性化プロテインキナーゼ２／ＥＲＫキナーゼ２（ＭＥＫ２）ペプチドリガンド結合部位に位置するＭＥＫ２インヒビターの約４Åの内の配列番号４の以下のアミノ酸残基：Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ１０１、Ｉ１０３、Ｌ１１９、Ｌ１２２、Ｖ１３１、Ｆ１３３、Ｉ１４５，Ｍ１４７、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｆ２１３、Ｇ２１４、Ｖ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１９、Ｉ２２０、及びＭ２２３の構造座標により規定されるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ２／ＥＲＫキナーゼ２（ＭＥＫ２）ＭＥＫ２ペプチドリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｄ）ＭＥＫ２ペプチドリガンド結合部位に位置するＭＥＫ２インヒビターの約５Åの内の配列番号４の以下のアミノ酸残基：Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ１０１、Ｉ１０３、Ｌ１１９、Ｌ１２２、Ｉ１３０、Ｖ１３１、Ｇ１３２、Ｆ１３３、Ｉ１４５、Ｍ１４７、Ｄ１９４、Ｎ１９９、Ｌ２１０、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｆ２１３、Ｇ２１４、Ｖ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１９、Ｉ２２０、Ｍ２２３、及びＦ２２７の構造座標により規定されるＭＥＫ２ペプチドリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｅ）ＭＥＫ１ペプチド補因子結合部位に位置する補因子の約４Åの内の配列番号２の以下の残基：Ｌ７４、Ｇ７５、Ａ７６、Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ８０、Ｖ８１、Ｖ８２、Ａ９５、Ｋ９７、Ｖ１２７、Ｍ１４３、Ｅ１４４、Ｈ１４５、Ｍ１４６、Ｇ１４９、Ｓ１５０、Ｄ１５２、Ｑ１５３、Ｋ１９２、Ｓ１９４、Ｎ１９５、Ｌ１９７、Ｄ２０８、及びＶ２２４の構造座標により規定されるＭＥＫ１ペプチド補因子結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｆ）ＭＥＫ１ペプチド補因子結合部位に位置する補因子の約５Åの内の配列番号２の以下の残基：Ｌ７４、Ｇ７５、Ａ７６、Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、８０、Ｖ８１、Ｖ８２、Ａ９５、Ｋ９７、Ｖ１２７、Ｍ１４３、Ｅ１４４、Ｈ１４５、Ｍ１４６、Ｄ１４７、Ｇ１４９、Ｓ１５０、Ｄ１５２、Ｑ１５３、Ｄ１９０、Ｋ１９２、Ｓ１９４、Ｎ１９５、Ｌ１９７、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｖ２２４、及びＧ２２５の構造座標により規定されるＭＥＫ１ペプチド補因子結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｇ）ＭＥＫ２ペプチド補因子結合部位に位置する補因子の約４Åの内の配列番号４の以下の残基：Ｌ７８、Ｇ７９、Ａ８０、Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８４、Ｖ８５、Ｖ８６、Ａ９９、Ｋ１０１、Ｖ１３１、Ｍ１４７、Ｅ１４８、Ｈ１４９、Ｍ１５０、Ｇ１５３、Ｓ１５４、Ｄ１５６、Ｑ１５７、Ｋ１９６、Ｓ１９８、Ｎ１９９、Ｌ２０１、Ｄ２１２、及びＶ２２８の構造座標により規定されるＭＥＫ２ペプチド補因子結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｈ）ＭＥＫ２ペプチド補因子結合部位に位置する補因子の約５Åの内の配列番号４の以下の残基：Ｌ７８、Ｇ７９、Ａ８０、Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｖ８５、Ｖ８６、Ａ９９、Ｋ１０１、Ｖ１３１、Ｍ１４７、Ｅ１４８、Ｈ１４９、Ｍ１５０、Ｄ１５１、Ｇ１５３、Ｓ１５４、Ｄ１５６、Ｑ１５７、Ｄ１９４、Ｋ１９６、Ｓ１９８、Ｎ１９９、Ｌ２０１、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｖ２２８、及びＧ２２９の構造座標により規定されるＭＥＫ２ペプチド補因子結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；及び
（ｉ）表１又は表２に記載のＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチドの構造座標か、あるいは前記（ａ）〜（ｈ）に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２結合ポケットの結合ポケットコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標を有する関連するセットのいずれかに含まれる各原子により規定される結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント
からなる群から選択される結合ポケットを含むペプチド。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のペプチドを含むペプチド：リガンド：補因子複合体の結晶構造。
【請求項４】
ペプチド；補因子；及びリガンドを含み、表１若しくは表２に記載の原子座標、あるいは表１又は表２に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標を有する関連するセットを有する、ペプチド：リガンド：補因子複合体の３次元構造座標。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載のペプチドを宿主細胞内で生成するための発現ベクターであって、前記修飾ペプチドをコードするポリヌクレオチド並びに前記修飾ペプチドに作動可能に結合していて前記宿主細胞中で機能することができる転写及び翻訳調節配列を含む、前記発現ベクター。
【請求項６】
請求項１若しくは請求項２に記載のペプチド又は保存的に置換されたそのバリアントをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドで安定に形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項７】
構造が不明な分子又は分子複合体に関する構造情報を得るための分子置き換えの利用方法であって、
前記分子又は分子複合体を結晶化し；
結晶化した前記分子又は分子複合体からＸ線回析パターンを生成し；そして
表１又は表２に記載の構造座標の少なくとも一部、あるいは表１又は表２に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標の関連するセットの少なくとも一部を、前記Ｘ線回析パターンに適用して、構造が不明な分子又は分子複合体の少なくとも一部の３次元電子密度マップを生成することを含む、前記方法。
【請求項８】
表１又は表２に記載の原子座標セット、あるいは表１又は表２に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標を有する関連するセットを、コンピューターアルゴリズムに適用して、請求項１若しくは請求項２に記載のペプチド又はその結合ポケットの３次元コンピューター表示物を生成することを含む、前記ペプチド又はペプチド結合ポケットの３次元コンピューター表示物の製造方法。
【請求項９】
表１又は表２に記載の原子座標、あるいは表１又は表２に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標を有する関連するセットを含むデータが格納されている、機械読み取り可能媒体。
【請求項１０】
（ａ）請求項１又は請求項２に記載のペプチド若しくは前記ペプチドの結合ポケットの３次元コンピューター表示物を生成し；そして
（ｂ）前記ペプチド若しくは前記ペプチドの結合ポケットの前記３次元コンピューター表示物に空間的に一致する化学物質を生成することを含む、請求項１又は請求項２に記載のペプチドに関連する可能性のある化学物質の修飾又は設計方法であって、前記化学物質の生成を、（ｉ）分子フラグメントを前記化学物質中にアッセンブルするか；（ｉｉ）前記化学物質又はそのフラグメントを新たに設計するか；（ｉｉｉ）小分子データベースから前記化学物質を選択するか；又は（ｉｖ）公知のＭＥＫ活性インヒビター又はその一部を修飾することを含む方法により実施する、前記の方法。
【請求項１１】
（ａ）請求項１又は請求項２に記載のペプチド又は前記ペプチドの結合ポケットの３次元コンピューター表示物を生成し；
（ｂ）或る化学物質を前記３次元表示物に当てはめて、その化学物質が前記ペプチド又はペプチド結合ポケットに関連するか否かを決定する反復工程を実施し；そして
（ｃ）前記化学物質のペプチド活性への効果を評価して、前記化学物質が活性インヒビター又は活性エンハンサーとして作用するか否かを決定することを含む、請求項１又は請求項２に記載のペプチドの活性の有効なインヒビター又はエンハンサーのスクリーニング及び同定方法。
【請求項１２】
（ａ）請求項１又は請求項２に記載のペプチド又は前記ペプチドの結合ポケットの３次元表示物を生成し；
（ｂ）或る化学物質の３次元表示物を前記３次元表示物に当てはめ；そして（ｃ）前記化学物質と前記結合ポケットとの間の関係を定量することを含む、請求項１又は請求項２に記載のペプチドと関連する化学物質の可能性の評価方法。
【請求項１３】
前記ペプチド結合ポケットが、（ａ）マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１／ＥＲＫキナーゼ１（ＭＥＫ１）ペプチドリガンド結合部位に位置するＭＥＫ１インヒビターの約４Åの内の配列番号２の以下のアミノ酸残基：Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｖ１２７、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、及びＭ２１９の構造座標により規定されるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ１／ＥＲＫキナーゼ１（ＭＥＫ１）ペプチドリガンド−結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｂ）ＭＥＫ１ペプチドリガンド結合部位に位置するＭＥＫ１インヒビターの約５Åの内の配列番号２の以下のアミノ酸残基：Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｉ１２６、Ｖ１２７、Ｇ１２８、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｄ１９０、Ｎ１９５、Ｌ２０６、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、Ｍ２１９、及びＦ２２３の構造座標により規定されるＭＥＫ１ペプチドリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｃ）マイトジェン活性化プロテインキナーゼ２／ＥＲＫキナーゼ２（ＭＥＫ２）ペプチドリガンド結合部位に位置するＭＥＫ２インヒビターの約４Åの内の配列番号４の以下のアミノ酸残基：Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ１０１、Ｉ１０３、Ｌ１１９、Ｌ１２２、Ｖ１３１、Ｆ１３３、Ｉ１４５，Ｍ１４７、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｆ２１３、Ｇ２１４、Ｖ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１９、Ｉ２２０、及びＭ２２３の構造座標により規定されるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ２／ＥＲＫキナーゼ２（ＭＥＫ２）ＭＥＫ２ペプチドリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｄ）ＭＥＫ２ペプチドリガンド結合部位に位置するＭＥＫ２インヒビターの約５Åの内の配列番号４の以下のアミノ酸残基：Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ１０１、Ｉ１０３、Ｌ１１９、Ｌ１２２、Ｉ１３０、Ｖ１３１、Ｇ１３２、Ｆ１３３、Ｉ１４５、Ｍ１４７、Ｄ１９４、Ｎ１９９、Ｌ２１０、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｆ２１３、Ｇ２１４、Ｖ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１９、Ｉ２２０、Ｍ２２３、及びＦ２２７の構造座標により規定されるＭＥＫ２ペプチドリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｅ）ＭＥＫ１ペプチド補因子結合部位に位置する補因子の約４Åの内の配列番号２の以下の残基：Ｌ７４、Ｇ７５、Ａ７６、Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ８０、Ｖ８１、Ｖ８２、Ａ９５、Ｋ９７、Ｖ１２７、Ｍ１４３、Ｅ１４４、Ｈ１４５、Ｍ１４６、Ｇ１４９、Ｓ１５０、Ｄ１５２、Ｑ１５３、Ｋ１９２、Ｓ１９４、Ｎ１９５、Ｌ１９７、Ｄ２０８、及びＶ２２４の構造座標により規定されるＭＥＫ１ペプチド補因子結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｆ）ＭＥＫ１ペプチド補因子結合部位に位置する補因子の約５Åの内の配列番号２の以下の残基：Ｌ７４、Ｇ７５、Ａ７６、Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、８０、Ｖ８１、Ｖ８２、Ａ９５、Ｋ９７、Ｖ１２７、Ｍ１４３、Ｅ１４４、Ｈ１４５、Ｍ１４６、Ｄ１４７、Ｇ１４９、Ｓ１５０、Ｄ１５２、Ｑ１５３、Ｄ１９０、Ｋ１９２、Ｓ１９４、Ｎ１９５、Ｌ１９７、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｖ２２４、及びＧ２２５の構造座標により規定されるＭＥＫ１ペプチド補因子結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｇ）ＭＥＫ２ペプチド補因子結合部位に位置する補因子の約４Åの内の配列番号４の以下の残基：Ｌ７８、Ｇ７９、Ａ８０、Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８４、Ｖ８５、Ｖ８６、Ａ９９、Ｋ１０１、Ｖ１３１、Ｍ１４７、Ｅ１４８、Ｈ１４９、Ｍ１５０、Ｇ１５３、Ｓ１５４、Ｄ１５６、Ｑ１５７、Ｋ１９６、Ｓ１９８、Ｎ１９９、Ｌ２０１、Ｄ２１２、及びＶ２２８の構造座標により規定されるＭＥＫ２ペプチド補因子結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；
（ｈ）ＭＥＫ２ペプチド補因子結合部位に位置する補因子の約５Åの内の配列番号４の以下の残基：Ｌ７８、Ｇ７９、Ａ８０、Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｖ８５、Ｖ８６、Ａ９９、Ｋ１０１、Ｖ１３１、Ｍ１４７、Ｅ１４８、Ｈ１４９、Ｍ１５０、Ｄ１５１、Ｇ１５３、Ｓ１５４、Ｄ１５６、Ｑ１５７、Ｄ１９４、Ｋ１９６、Ｓ１９８、Ｎ１９９、Ｌ２０１、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｖ２２８、及びＧ２２９の構造座標により規定されるＭＥＫ２ペプチド補因子結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；及び
（ｉ）表１又は表２に記載のＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチドの構造座標か、あるいは前記（ａ）〜（ｈ）に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２結合ポケットの結合ポケットコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標を有する関連するセットのいずれかに含まれる各原子により規定される結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント
からなる群から選択される、請求項８、１０、１１、又は１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１又は請求項２に記載のペプチドと前記ペプチド以外の混入タンパク質とを含む発酵ブロスを、ピロール−２−カルボキシレートと、塩化亜鉛と、ニッケル、亜鉛、銅、及びコバルトからなる群から選択される固定化金属とを含む固定化金属キレートクロマトグラフィー処理することを含む、前記発酵ブロスからの請求項１又は請求項２に記載のペプチドの精製方法。
【請求項１５】
前記ペプチド、リガンド、補因子、緩衝剤、還元剤、及びイオン強度源を含むペプチド溶液を用意し；
（ａ）前記ペプチドがＭＥＫ１ペプチドである場合には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、イオン強度源、緩衝剤、及び還元剤を含む沈殿剤溶液を；又は
（ｂ）前記ペプチドがＭＥＫ２ペプチドである場合には、イオン強度源、緩衝剤、及び還元剤を含む沈殿剤溶液を用意し；
前記ペプチド溶液の液滴を前記沈殿剤溶液の液滴と混合し；
前記沈殿剤溶液のウェル（このウェル中の溶液の蒸気圧は、前記混合液滴中で得られる溶液における蒸気圧より低いものとする）上で、得られた混合液滴を浮遊させ；そして
浮遊した前記混合液滴を、ペプチド：リガンド：補因子の３成分複合体の結晶がＸ線回析に適した大きさに成長するまで、長期にわたって放置する
ことを含む、請求項３に記載の結晶の成長方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、概略すると、ＭＥＫ１ペプチドの形態及びＭＥＫ２ペプチドの形態、ＭＥＫ１若しくはＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子複合体の結晶、前記結晶の製造方法、結晶学的データから導き出される３次元構造情報、並びに前記構造情報の使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
マイトジェン−活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼは、多様な種々の細胞外信号によって活性化するので、複数の生化学的信号に対する調整ポイントとして作用すると考えられている。ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードのパターンは、成長因子シグナリングに集中しておらず、そして今では、ホルボールエステル、イオノファ、熱ショック、及び７回膜貫通レセプターに対するリガンドによって開始されるシグナリング経路が、それらの間でほとんど又は全く交差反応性がない独特なＭＡＰキナーゼカスケードを使用することが知られている。
【０００３】
マルチプルＭＡＰキナーゼは、酵母において、例えば、ＳＭＫ１、ＨＯＧ１、ＭＰＫ１、ＦＵＳＳ、及びＫＳＳ１が報告されている。動物においては、前記ＭＡＰキナーゼは、細胞外被シグナル制御キナーゼ〔ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄキナーゼ（ＥＲＫ）〕、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、及びｐ３８キナーゼ〔Ｄａｖｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：４７０（１９９４）〕として確認されている。これらの高度に保存されたＭＡＰキナーゼアイソフォームは、トレオニン残基及びチロシン残基における２重リン酸化によって活性化する。
【０００４】
ＭＡＰキナーゼ媒介シグナリング経路の上流には、ＭＡＰキナーゼの酵素活性を刺激する重要なタンパク質キナーゼが存在する。このタンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫキナーゼ：ＭＥＫ１と称する）の構造は、相補的ＤＮＡ配列から明らかにされており、大きさ及び配列においてＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　ｂｙｒ１遺伝子〔Ｃｒｅｗｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：４７８−４８０（１９９２）〕によってコードされる生成物に比較的最も近似する３９３アミノ酸のタンパク質（４３．５ｋＤ）であることが示されている。前記ＭＥＫ遺伝子は、マウス脳内で高度に発現し、そして細菌中で発現したその生成物は、イン・ビトロでＥＲＫ遺伝子生成物をリン酸化した。ＭＥＫ１は、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の本質的な成分として、多くの細胞工程、例えば、増殖、分化、転写調節、及び生長に関与している。
【０００５】
ＭＥＫ１のヒトホモログをコードするｃＤＮＡが、ヒトＴ−細胞ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた：ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｌ１１２８４〔Ｓｅｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５６２８−２５６３１（１９９２）〕。ＣＯＳ細胞内で過剰に発現する場合には、予期された４３，４３９Ｄａのタンパク質が、ホルボールエステルで刺激されたＭＡＰキナーゼキナーゼ活性の増加をもたらした。ヒトＭＥＫ１は、マウスＭＥＫ１とのアミノ酸配列同一性が９９％であり、そしてヒトＭＥＫ２とのアミノ酸配列同一性が８０％である。ヒトＭＥＫ１及びＭＥＫ２は、それぞれ、アミノ酸残基３９３個及び４００個をコードする。ＭＥＫ１及びＭＥＫ２は、両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてイン・ビトロでヒト組換えＥＲＫ１を活性化することができることが示された。精製された前記ＭＥＫ２ペプチドは、ＥＲＫ１上のトレオニン及びチロシンのリン酸化を刺激し、そしてそれに付随して、ＥＲＫ１キナーゼ活性を１００倍を超えて活性化させた。組換えＭＥＫ２は、組織から精製したＭＥＫ２と比較して、ＥＲＫアクチベーターとして、より低い活性を示した。しかしながら、前記組換えＭＥＫ２は、イン・ビトロで、血清刺激された細胞抽出物により活性化されることができる。ＥＲＫ類と同様に、ＭＥＫ類も、シグナル伝達において重要な役割を果たす関連するタンパク質の群からなりそうである〔Ｚｈｅｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｙ２５；２６８（１５）：１１４３５−９（１９９３）〕。
【０００６】
ＭＥＫ１の構成的活性化（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、結果として、細胞の形質転換を起こす。従って、このプロテインキナーゼは、増殖性疾病及び炎症性疾病における医薬的介入に対する有望な標的の代表である〔Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ３７２，７３９−７４６（１９９４）；Ｄｕｄｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，７６８６−７６８９（１９９５）〕。この経路の小分子インヒビターを確認するために、Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄらは、組換え発現したＭＥＫ１及びＥＲＫ１のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を用いるイン・ビトロカスケードアッセイを開発した〔Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．５：８１０−８１６（１９９９）〕。また、Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄらは、非常に強力で選択的なＭＥＫ１インヒビターである２−（２−クロロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロ−ベンズアミドの発見も報告した。この論文は、このインヒビターで治療した後に、マウス起源及びヒト起源の両方の結腸カルシノマを有するマウスにおいて、腫瘍生長が８０％程度阻害されたことが報告されている。効果は、広い範囲の投与量で、毒性の徴候なしで達成され、そして削除された腫瘍におけるＭＡＰＫレベルの減少に相関していた。ＭＥＫインヒビターが結腸ガンの臨床的管理に対する将来有望な無細胞毒性的アプローチを代表することをこれらのデーターが示していると結論づけられていた。
【０００７】
インフルエンザＡウイルスは、重要な世界的な疾病及び死亡の原因である。毎年更新されるワクチンは、疾病を予防することができ、そして抗ウイルス剤は、症状がしばしば非特異的である場合に、疾病の早期において有効な治療である。ウイルスの複製は、細胞内シグナルイベントによって支持されている。Ｐｌｅｓｃｈｋａらは、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の無毒のインヒビター（従って、ＲＡＦ１／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路のインヒビター）を用いて、インフルエンザＡの感染に対する細胞応答を試験した。前記インヒビターは、ウイルス感染後の初期及び後期両方のＥＲＫ活性化フェーズを抑制した。前記シグナル経路の阻害は、ウイルスＲＮＡ若しくはタンパク質の合成、又はウイルスのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の核へのインポート（ｉｍｐｏｒｔ）を緩和することなく発生し〔Ｐｌｅｓｃｈｋａら，Ｎａｔｕｒｅ　ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．３：３０１−３０５（２００１）〕、その代わりに、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナリング及びウイルスＲＮＰのエクスポート（ｅｘｐｏｒｔ）を、細胞ｍＲＮＡエクスポート経路に影響を与えることなく阻害した。ＥＲＫがウイルス核エクスポートタンパク質の機能に関連する細胞因子を調節することが、提案されている。ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の無毒インヒビターを用いたインフルエンザＡの感染に対する細胞応答を試験するための実験は、ＭＥＫインヒビターの局所的な適用は、薬剤耐性ウイルスバリアントを発生させることなくウイルスの複製を阻害するが、一方、宿主上でわずかな毒性効果しか無いことを示唆した〔Ｐｌｅｓｃｈｋａら，Ｎａｔｕｒｅ　ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．３：３０１−３０５（２００１）〕。
【０００８】
Ｒｙａｎらは、ＭＥＫ１の阻害が、ｐ５３−誘発ＮＦ−カッパ−Ｂの活性化及びアポトーシスを遮断するが、細胞周期停止を遮断しないことを示した。彼らは、ｐ５３が、ＴＮＦＡを用いることにより、ＴＮＦＲ１／ＴＲＡＦ２／ＩＫＫ経路よりもむしろＲＡＦ／ＭＥＫ１／ｐ９０（ｒｓｋ）経路を経て、ＮＦ−カッパ−Ｂを活性化させることを示した〔Ｎａｔｕｒｅ４０４：８９２−８９７（２０００）〕。
【０００９】
前記ＭＥＫ１経路を経るシグナル伝達を媒介する前記手段の１つは、前記ＭＥＫ１ペプチドのエンハンサー又はインヒビターを同定することである。前記同定は、これまで、偶然の発見（ｓｅｒｅｎｄｉｐｉｔｙ）及び／又は多数の天然及び合成化合物の体系的なスクリーニングに頼られていた。優位な薬剤開発の方法は、構造アシスト薬剤設計（ｄｅｓｉｇｎ）による。この場合、或るペプチド−インヒビター複合体の３次元構造を決定し、そしてコンピューターモデリングの助けを得て有効なエンハンサー又は有効なインヒビターをスクリーニング及び／又は設計する［Ｂｕｇｇら，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｄｅｃ．：９２−９８（１９９３）；Ｗｅｓｔら，ＴＩＰＳ，１６：６７−７４（１９９５）；Ｄｕｎｂｒａｃｋら，Ｆｏｌｄｉｎｇ　＆　Ｄｅｓｉｇｎ，２：２７−４２（１９９７）］。しかしながら、Ｘ線結晶学的データを選るのに必要な十分な質を有するＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチドの結晶を生成することができなかったことを本質的な理由として、ＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチドの３次元構造は、これまで知られていなかった。従って、リガンド（例えば、インヒビター）と一緒に結晶化して、得ようと思う前記結晶学的データを選るのに十分な質を有する結晶を形成することができるＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチドの形態を得ることに対する需要がいまだにある。更に、前記結晶に対する需要も存在する。また、前記結晶の３次元構造の決定に対する需要も存在する。最後に、構造的に基づいた関連する医薬設計の方法、及び／又は前記結晶データに基づくスクリーニングの方法に対する需要も存在する。
【００１０】
Ｓｅｇｅｒらに対するＵＳＰ５，６６３，３１４には、ＭＥＫ１ペプチドの２つのタイプ、すなわち、ＭＫＫ１ａ及びＭＫＫ１ｂ、並びにそれらをコードするヌクレオチドが開示されている。ＭＫＫ１ａは、アミノ酸残基３９９個を有し、そしてＭＫＫ１ｂは、１４７〜１７２番目のアミノ酸残基を欠くこと以外はＭＫＫ１ａと同じであるアミノ酸残基３６８個を有する。ＮＨ２−末端領域のトランケーションによるか、挿入ループ形成領域の除去又は置き換えによるか、それらの組み合わせにより前記ＭＥＫ１ペプチドを修飾して、そのペプチドの生物理学的特徴（特に、結晶性に関する特徴）を増強させることは、これまで報告されていない。
本明細書に記載の参考文献の引用は、いずれも、前記参考文献が本出願に対する従来技術となりうることの承認（ａｄｍｉｓｓｉｏｎ）であると解釈されるべきではない。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｄａｖｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：４７０（１９９４）
【非特許文献２】
Ｃｒｅｗｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８：４７８−４８０（１９９２）
【非特許文献３】
Ｓｅｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５６２８−２５６３１（１９９２）
【非特許文献４】
Ｚｈｅｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｙ２５；２６８（１５）：１１４３５−９（１９９３）
【非特許文献５】
Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ３７２，７３９−７４６（１９９４）
【非特許文献６】
Ｄｕｄｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，７６８６−７６８９（１９９５）
【非特許文献７】
Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．５：８１０−８１６（１９９９）
【非特許文献８】
Ｐｌｅｓｃｈｋａら，Ｎａｔｕｒｅ　ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．３：３０１−３０５（２００１）
【非特許文献９】
Ｒｙａｎら，Ｎａｔｕｒｅ４０４：８９２−８９７（２０００）
【非特許文献１０】
Ｂｕｇｇら，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｄｅｃ．：９２−９８（１９９３）
【非特許文献１１】
Ｗｅｓｔら，ＴＩＰＳ，１６：６７−７４（１９９５）
【非特許文献１２】
Ｄｕｎｂｒａｃｋら，Ｆｏｌｄｉｎｇ　＆　Ｄｅｓｉｇｎ，２：２７−４２（１９９７）
【特許文献１】
ＵＳＰ５，６６３，３１４
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、修飾されたＭＥＫ１ペプチド及び修飾されたＭＥＫ２ペプチドアミノ酸配列、並びに前記の修飾されたＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチド配列の製造方法を提供する。或る態様では、前記ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドは、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドのＮＨ２末端領域の重要な一部が損なわれる修飾がなされ（本明細書において、以下、それぞれ「ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチド」及び「ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチド」と称するか、あるいは集合的に「ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチド」と称する）、及び／又はＭＥＫ１挿入ループドメインの欠失によって修飾がなされ、及び／又は或るリンカーペプチドによるＭＥＫ１挿入ループドメインの置き換えによって修飾がなされていることができる（本明細書において、以下、これらの修飾の１つ乃至全てを有するＭＥＫ１又はＭＥＫ２を、「修飾ＭＥＫ１」、「修飾ＭＥＫ２」と称するか、あるいは集合的に「修飾ＭＥＫ１及びＭＥＫ２」と称する）。
【００１３】
前記ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチドは、完全長ペプチドのＮＨ−２末端領域からアミノ酸残基少なくとも３０個を欠く。好ましくは、前記ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチドは、前記完全長ペプチド又は保存的に置換されたそのバリアントのＮＨ−２末端領域から、アミノ酸残基少なくとも３０個〜最大７０個、より好ましくはアミノ酸残基４１個〜６１個を欠く。
前記ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチドは、配列番号４で表される完全長ペプチドのＮＨ−２末端領域からアミノ酸残基少なくとも３４個を欠く。好ましくは、前記ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチドは、完全長ペプチド又は保存的に置換されたそのバリアントのＮＨ−２末端領域から、アミノ酸残基少なくとも３４個〜最大７４個、より好ましくはアミノ酸残基４５個〜６５個を欠く。
【００１４】
別の態様においては、前記修飾ＭＥＫ１ペプチドは、挿入ループ形成アミノ酸残基、特には配列番号２の２８０番目のアミノ酸〜３２３番目のアミノ酸；又は配列番号２の２６４番目のアミノ酸残基と３１０番目のアミノ酸との間のアミノ酸少なくとも４０個の欠失があることができる。前記態様は、（１）配列番号２の２６４番目のアミノ酸〜３１０番目のアミノ酸；（２）配列番号２の２７０番目のアミノ酸〜３１０番目のアミノ酸；（３）配列番号２の２６４番目のアミノ酸〜３０５番目のアミノ酸；（４）配列番号２の２６７番目のアミノ酸〜３０７番目のアミノ酸；あるいは（５）配列番号２の２６５番目のアミノ酸〜３０４番目のアミノ酸の欠失を含むことができる。
【００１５】
あるいは、前記ＭＥＫ１挿入ループドメインは、リンカーペプチド（ここで、前記リンカーペプチドは、アミノ酸残基最大１０個を有することができる）で置き換えられていることができる。前記リンカーペプチドは、好ましくは、Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐのアミノ酸配列を有する。
本発明の修飾ＭＥＫ１ペプチドは、前記ＮＨ２末端トランケーション；挿入ループ形成アミノ酸残基の前記欠損；及び前記リンカーペプチドによる前記ＭＥＫ１挿入ループドメインの置き換え；の任意の１つ又は任意の組み合わせによって修飾されていることができる。
【００１６】
更に、本発明は、表１又は表２にそれぞれ記載されているＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチド、あるいは表１又は表２にそれぞれ記載されているＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチドのコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標を有する関連するペプチドの３次元立体座標により規定されるペプチドも提供する。
更になお、本発明は、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又はＭＥＫ様補因子（ＭＥＫ−ｌｉｋｅ　補因子）、あるいはリガンド結合ポケット（リガンドｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｏｃｋｅｔ）を含むペプチドを提供する。
更に、本発明は、修飾されたＭＥＫ１及び／又はＭＥＫ２ペプチドの配列をコードする単離され精製されたポリヌクレオチドも提供する。前記ポリヌクレオチドは、天然体であるか又は組換体であることができる。
【００１７】
更に、本発明は、宿主細胞内で修飾ＭＥＫ１及びＭＥＫ２を発現させるための発現ベクターを提供する。更に、本発明は、修飾ＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチドを発現することが可能な方法によって、前記修飾ＭＥＫ１ペプチド若しくは修飾ＭＥＫ２ペプチド、又はそのフラグメント、あるいはそのアナログをコードするポリヌクレオチドで安定に形質転換及びトランスフェクションされていることができる宿主細胞を提供する。更に、本発明は、本発明の発現ベクターをトランスフェクション又は形質転換された細胞も包含する。また、本発明は、修飾ＭＥＫ１ペプチド又は修飾ＭＥＫ２ペプチド配列の発現方法であって、前記修飾ＭＥＫ１ペプチド又は修飾ＭＥＫ２ペプチドを発現する細胞を、前記細胞による前記ペプチドの発現を提供する条件下、適当な細胞培養基中で培養することを含む、前記方法も包含する。
【００１８】
また、本発明の修飾ＭＥＫ１ペプチド又は修飾ＭＥＫ２ペプチドそれぞれ及び前記修飾ＭＥＫ１ペプチド又は修飾ＭＥＫ２ペプチドそれぞれ以外の混入タンパク質を含む発酵ブロスから、前記修飾ＭＥＫ１ペプチド又は修飾ＭＥＫ２ペプチドを精製する方法も提供する。前記方法は、前記発酵ブロスを、固定化金属キレートクロマトグラフィー（好ましくは、ピロール−２−カルボキシレート及び／又は亜鉛を含む）で処理することを含む。
【００１９】
また、本発明は、ペプチド：リガンド：補因子の３成分複合体の製造への、精製した前記修飾ＭＥＫ１ペプチド又は修飾ＭＥＫ２ペプチドの使用方法、並びに前記修飾ＭＥＫ１ペプチド又は修飾ＭＥＫ２ペプチドを含む前記ペプチド：リガンド：補因子複合体の結晶の製造方法も提供する。或る態様では、ペプチド：リガンド：補因子複合体の結晶の成長方法は、
修飾ＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチドの水溶液、リガンド、並びに酢酸アンモニウム及びＮ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）の溶液中の補因子を用意し；
（ａ）前記ペプチドがＭＥＫ１ペプチドである場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、イオン強度源、緩衝剤、及び還元剤を含む沈殿剤溶液を；又は
（ｂ）前記ペプチドがＭＥＫ２ペプチドである場合、イオン強度源、緩衝剤、及び還元剤を含む沈殿剤溶液を用意し；
前記ペプチド溶液の液滴を前記沈殿剤溶液の液滴と混合し；
前記混合液滴中で得られる溶液における蒸気圧よりも低くなりつつある前記ウェル中の溶液の蒸気圧において、前記沈殿剤溶液のウェル上で、得られた混合液滴を浮遊（ｓｕｓｐｅｎｄ）させ；そして
浮遊した前記混合液滴を、ペプチド：リガンド：補因子の３成分複合体の結晶がＸ線回析に適した大きさに成長するまで、長期にわたって放置する
ことを含む。
【００２０】
また、本発明は、リガンド及び補因子と一緒の３成分複合体中における前記修飾ＭＥＫ１ペプチドの結晶構造（これから、ＭＥＫ１構造情報を得ることができる）も提供する。好ましくは、前記リガンドが５−ブロモ−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドであり、そして前記補因子がＡＴＰである。前記結晶は、５．０Åよりも好ましくは３．０Åの分解能に関して解析することが好ましい。修飾ＭＥＫ１ペプチド：５−ブロモ−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミド：ＡＴＰ複合体の結晶構造は、前記ＭＥＫ１ペプチド又は全ての関連するＭＡＰＫＫファミリーの、最初に報告された結晶構造である。
【００２１】
更に、本発明は、リガンド及び補因子と一緒の３成分複合体中の修飾ＭＥＫ２ペプチドの結晶構造（これから、ＭＥＫ２構造情報を得ることができる）を提供する。好ましくは、前記リガンドが｛５−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル｝−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミンであり、そして補因子がＡＴＰである。前記結晶は、５．０Åよりも好ましくは３．５Åの分解能に関して解析することが好ましい。修飾ＭＥＫ２：｛５−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル｝−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミン：ＡＴＰ複合体の結晶構造は、ＭＥＫ２ペプチドファミリーの、最初に報告された結晶構造である。
【００２２】
更に、本発明は、表１及び表２に記載のＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子複合体及びＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子複合体の３次元構造座標、あるいは表１又は表２に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２の３次元構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標を有する関連するセットも包含する。前記構造座標は、前記ＭＥＫ１複合体及びＭＥＫ２複合体の３次元構造を反映し、そして原子分解能（ａｔｏｍｉｃ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）に関して、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２リガンド結合部位及び補因子結合部位の周辺の化学的環境を示す。
【００２３】
特には、ＭＥＫ１が、リガンド結合部位に位置するＭＥＫ１インヒビターの約４Åの内の配列番号２の以下のアミノ酸残基：Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｖ１２７、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、及びＭ２１９の構造座標により規定されるペプチドリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント、並びにリガンド結合部位に位置するＭＥＫ１インヒビターの約５Åの内の配列番号２の以下のアミノ酸残基：Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｉ１２６、Ｖ１２７、Ｇ１２８、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｄ１９０、Ｎ１９５、Ｌ２０６、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、Ｍ２１９、及びＦ２２３の構造座標により規定されるペプチドリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアントを含むことが見いだされた。
【００２４】
また、ＭＥＫ１ペプチドが、補因子結合部位に位置する約４Åの補因子（例えば、ＡＴＰ分子）内の配列番号２の以下の残基：Ｌ７４、Ｇ７５、Ａ７６、Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ８０、Ｖ８１、Ｖ８２、Ａ９５、Ｋ９７、Ｖ１２７、Ｍ１４３、Ｅ１４４、Ｈ１４５、Ｍ１４６、Ｇ１４９、Ｓ１５０、Ｄ１５２、Ｑ１５３、Ｋ１９２、Ｓ１９４、Ｎ１９５、Ｌ１９７、Ｄ２０８、及びＶ２２４の構造座標により規定される補因子結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；及び補因子結合部位に位置する補因子の約５Åの内の配列番号２の以下の残基：Ｌ７４、Ｇ７５、Ａ７６、Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、８０、Ｖ８１、Ｖ８２、Ａ９５、Ｋ９７、Ｖ１２７、Ｍ１４３、Ｅ１４４、Ｈ１４５、Ｍ１４６、Ｄ１４７、Ｇ１４９、Ｓ１５０、Ｄ１５２、Ｑ１５３、Ｄ１９０、Ｋ１９２、Ｓ１９４、Ｎ１９５、Ｌ１９７、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｖ２２４、及びＧ２２５の構造座標により規定される補因子結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアントを含むことも見いだされた。
【００２５】
同様に、ＭＥＫ２ペプチドが、リガンド結合部位に位置するＭＥＫ２インヒビターの約４Åの内の配列番号４の以下のアミノ酸残基：Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ１０１、Ｉ１０３、Ｌ１１９、Ｌ１２２、Ｖ１３１、Ｆ１３３、Ｉ１４５、Ｍ１４７、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｆ２１３、Ｇ２１４、Ｖ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１９、Ｉ２２０、及びＭ２２３の構造座標により規定されるリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアント；及びリガンド結合部位に位置するＭＥＫ２インヒビターの約５Åの内の配列番号４の以下のアミノ酸残基：Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ１０１、Ｉ１０３、Ｌ１１９、Ｌ１２２、Ｉ１３０、Ｖ１３１、Ｇ１３２、Ｆ１３３、Ｉ１４５、Ｍ１４７、Ｄ１９４、Ｎ１９９、Ｌ２１０、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｆ２１３、Ｇ２１４、Ｖ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１９、Ｉ２２０、Ｍ２２３、Ｆ２２７の構造座標により規定されるリガンド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアントを含むことも見いだされた。
【００２６】
更に、ＭＥＫ２補因子結合ポケットが、補因子結合部位に位置する補因子の約４Åの内の配列番号４の以下の残基：Ｌ７８、Ｇ７９、Ａ８０、Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８４、Ｖ８５、Ｖ８６、Ａ９９、Ｋ１０１、Ｖ１３１、Ｍ１４７、Ｅ１４８、Ｈ１４９、Ｍ１５０、Ｇ１５３、Ｓ１５４、Ｄ１５６、Ｑ１５７、Ｋ１９６、Ｓ１９８、Ｎ１９９、Ｌ２０１、Ｄ２１２、Ｖ２２８の構造座標により規定されていることが見いだされ、又は保存的に置換されたそのバリアントが見いだされ；そしてポケットが補因子結合部位に位置する補因子の約５Åの内の配列番号４の以下の残基：Ｌ７８、Ｇ７９、Ａ８０、Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｖ８５、Ｖ８６、Ａ９９、Ｋ１０１、Ｖ１３１、Ｍ１４７、Ｅ１４８、Ｈ１４９、Ｍ１５０、Ｄ１５１、Ｇ１５３、Ｓ１５４、Ｄ１５６、Ｑ１５７、Ｄ１９４、Ｋ１９６、Ｓ１９８、Ｎ１９９、Ｌ２０１、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｖ２２８、Ｇ２２９の構造座標により規定されることも見いだされ、又は保存的に置換されたそのバリアントも見いだされた。
【００２７】
また、ＭＥＫペプチド又はＭＥＫ１ペプチド若しくはＭＥＫ２ペプチドに構造的に関連するペプチドのリガンド結合ポケット又は補因子結合ポケットであって、表１又は表２に記載のＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチドの構造座標、あるいはＭＥＫ１又はＭＥＫ２結合ポケットの結合ポケットコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標の関連するセットに記載の原子により規定される、前記リガンド結合ポケット又は補因子結合ポケットも提供する。
【００２８】
また、本発明は、表１又は表２に記載の原子座標、あるいは表１又は表２に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標を有する関連する構造座標のセットを含むデータが格納されている、機械読み取り可能媒体も提供する。
【００２９】
また、本発明は、表１又は表２に記載の原子座標、あるいは表１又は表２に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である原子座標を有する関連するセットの原子座標を、コンピューターアルゴリズムに適用して、本発明のペプチド又はペプチドポケットの３次元表示物［ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ］（「画像［ｉｍａｇｅ］」とも称する）を得ることも提供する。この３次元表示物は、例えば、修飾方法、設計方法、スクリーニング方法、及び同定方法、並びにＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又は構造的に関連するペプチドに関して可能性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）があるがゆえにＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又は構造的に関連するペプチドのインヒビター又はエンハンサーとなる可能性がある化学物質の評価方法において用いることができる。
【００３０】
更に、本発明は、本発明のペプチドに関する可能性を有する化学物質の修飾又は設計方法を提供する。前記方法は、前記ペプチド又は前記ペプチドの結合ポケットの３次元コンピューター表示物を生成し、そして前記ペプチド若しくは前記ペプチドの結合ポケットの前記３次元コンピューター表示物に空間的に一致する化学物質を生成することを含む。前記化学物質は、（ｉ）前記化学物質中に分子フラグメントをアッセンブルする（ａｓｓｅｍｂｌｅ）か；（ｉｉ）前記化学物質又はそのフラグメントを新たに設計するか；（ｉｉｉ）小分子データベース（ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｄａｔａｂａｓｅ）から前記化学物質を選択するか；又は（ｉｖ）ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又は構造的に関連するペプチドのいずれかに関する能力を有する公知のインヒビター又はその一部を修飾することを含む方法により生成することができる。
【００３１】
また、本発明は、本発明のペプチドの活性の有効なインヒビター又はエンハンサーをスクリーニング又は同定する方法も提供する。前記方法は、前記ペプチド又は前記ペプチドの結合ポケットの３次元コンピューター表示物を生成し；或る化学物質を前記３次元表示物に当てはめて、その化学物質が前記ペプチド又はペプチド結合ポケットに関連するか否かを決定する、反復工程を実施し；そして前記化学物質のペプチド活性への効果を評価して、前記化学物質が活性インヒビター又は活性エンハンサーとして作用するか否かを決定することを含む。
また、本発明のペプチドに関する化学物質の可能性の評価方法も提供する。前記方法は、前記ペプチド又は前記ペプチドの結合ポケットの３次元表示物を生成し；或る化学物質の３次元表示物を前記３次元表示物に当てはめ；そして前記化学物質と前記結合ポケットとの間の関連を定量［ｑｕａｎｔｉｆｙ］することを含む。
【００３２】
更に、本発明は、構造が不明な分子又は分子複合体に関する構造情報を得るための分子置き換えの利用方法であって、
前記分子又は分子複合体を結晶化し；結晶化した前記分子又は分子複合体からＸ線回析パターンを得；そして表１又は表２に記載の構造座標の少なくとも一部、あるいは表１又は表２に記載のＭＥＫ１又はＭＥＫ２構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．２５Å以下である構造座標のセットを有する構造座標の少なくとも一部を、前記Ｘ線回析パターンに適用して、構造が不明な分子又は分子複合体の少なくとも一部の３次元電子密度マップを得ることを含む、前記方法も提供する。
【００３３】
《配列表の説明》
配列番号１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）は、ＭＥＫ１ヌクレオチドの完全長。
配列番号２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）は、ＭＥＫ１ペプチドの完全長。
配列番号３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）は、ＭＥＫ２ヌクレオチドの完全長。
配列番号４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）は、ＭＥＫ２ペプチドの完全長。
配列番号５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）は、ＭＥＫ１に対するプローブ。
配列番号６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）は、ＭＥＫ１に対するプローブ。
配列番号７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）は、ＭＥＫ１−Ｃ１／ＭＥＫ１−Ｃ１（ｄ２８０−３２３）に対するＰＣＲプライマー。
配列番号８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）は、ＭＥＫ１−Ｃ１／ＭＥＫ１−Ｃ１（ｄ２８０−３２３）；ＭＥＫ１−Ｃ２／ＭＥＫ１−Ｃ２（ｄ２８０−３２３）；及びＭＥＫ１−Ｃ３／ＭＥＫ１−Ｃ３（ｄ２８０−３２３）に対するＰＣＲプライマーに対するＰＣＲプライマー。
配列番号９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）は、ＭＥＫ１−Ｃ２／ＭＥＫ１−Ｃ２（ｄ２８０−３２３）に対するＰＣＲプライマー。
配列番号１０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）は、ＭＥＫ１−Ｃ３／ＭＥＫ１−Ｃ３（ｄ２８０−３２３）に対するＰＣＲプライマー。
配列番号１１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）は、ＭＥＫ２に対するＰＣＲプローブ。
配列番号１２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）は、ＭＥＫ２に対するＰＣＲプローブ。
配列番号１３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３）は、ＭＥＫ２−Ｃ１に対するＰＣＲプライマー。
配列番号１４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４）は、ＭＥＫ２−Ｃ２に対するＰＣＲプライマー。
配列番号１５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）は、ＭＥＫ２−Ｃ３に対するＰＣＲプライマー。
配列番号１６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６）は、ＭＥＫ２−Ｃ４に対するＰＣＲプライマー。
配列番号１７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７）は、ＭＥＫ２−Ｃ５に対するＰＣＲプライマー。
配列番号１８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８）は、ＭＥＫ２−Ｃ６に対するＰＣＲプライマー。
配列番号１９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）は、ＭＥＫ２−Ｃ１−Ｃ６に対するＰＣＲリバースプライマー。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明は、修飾ＭＥＫ１ペプチド及び修飾ＭＥＫ２ペプチド、並びにペプチド：リガンド：補因子複合体の結晶を提供する。前記結晶は、好ましくは、修飾ＭＥＫ１ペプチド若しくは修飾ＭＥＫ２ペプチド、又はＭＥＫ１ペプチド若しくはＭＥＫ２ペプチドに構造的に関連するペプチドと、リガンドと、補因子との３成分の［ｔｅｒｎａｒｙ］（すなわち、第３の［ｔｅｒｔｉａｒｙ］）複合体を含む。
本発明の或る態様によると、好ましくは原核宿主で発現していてそして精製した、円形状核酸配列から誘導される組換えヒトＭＥＫ１ペプチド又は組換えヒトＭＥＫ２ペプチドから、前記結晶を形成する。前記結晶は、５Åを越える分解能でＸ線を分解する。前記結晶からもたらされる情報は、ＭＥＫ１ペプチド、ＭＥＫ２ペプチド、又はＭＥＫ１ペプチド若しくはＭＥＫ２ペプチドに構造的に関連するペプチドのリガンド結合部位及び補因子結合部位を含む前記ＭＥＫ１複合体及び前記ＭＥＫ２複合体に対する３次元の結晶学的構造情報を提供する。本発明は、修飾、設計、スクリーニング、及び同定、並びにＭＥＫ１ペプチド若しくはＭＥＫ２ペプチド又はそれらに構造学的に関連するペプチドに関する可能性が有るがゆえにＭＥＫ１活性又はＭＥＫ２活性を阻害又は増強することができる化学物質の評価における前記構造情報の使用も包含する。
【００３５】
《定義》
本明細書において、用語「含む［ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ］」及び「包含する［ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ］」は、通常の、非限定的な意味で使用する。
本明細書において、「リガンド」は、或る酵素に特異的に結合するか又は関連［ａｓｓｏｃｉａｔｅ］する小分子を意味し、例えば、インヒビター又はアクチベーターを表すために使用することができる。
本明細書において、「補因子（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）」は、酵素活性に要求される無機分子、有機分子、又は補酵素を意味する。例えば、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）は、リン酸基の転移、すなわち基質のリン酸化をするために、キナーゼ酵素により使用される補因子である。
【００３６】
本明細書において、用語「二乗平均平方根（ＲＭＳ）偏差［ｒｏｏｔ　ｍｅａｎｓｑｕａｒｅ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ］」は、タンパク質又はペプチドの空間２つ以上の間の構造的な相関を示す。二乗平均平方根（ＲＭＳ）偏差は、特に断らない限りオングストローム（Å）単位の、Ｃ−アルファ（Ｃα）原子又はＭＥＫ１ペプチド若しくはＭＥＫ２ペプチドのバックボーントレースからの或るペプチドの３次元構造の距離のＲＭＳの差を意味する。ＲＭＳ偏差は、一方の前記種類の３次元構造を、例えばＸ線結晶学によって解明することができるもう一方の上に重ねることによるか、あるいはＮＭＲ及びＣα原子又はＭＥＫ１ペプチド若しくはＭＥＫ２ペプチドのバックボーントレースから別のペプチドまでの距離のＲＭＳにおける差（オングストローム（Å）単位）の測定によって決定することができる。３次元構造のもう一方への前記重ね合わせは、分子モデリングプログラム、例えばＣＮＸ（商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）、ＸｔａｌＶｉｅｗ（商標）（Ｄｕｎｃａｎ　ＭｃＲｅｅ，Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、又はＯ（商標）（Ｍｏｒｔｅｎ　Ｋｊｅｌｄｇａａｒｄ，Ａａｒｈｕｓ　Ｕｎｉｖ．，Ｄｅｎｍａｒｋ）。前記３次元構造相互間の関係が密接になればなるほど、ＲＭＳ偏差の値が小さくなる。例えば、リガンドタンパク質共複合体構造２つのＣ−アルファ原子の構造座標の間の３次元関連は、典型的には、ＲＭＳ偏差が０．０〜０．５Åの間である。ＲＭＳ偏差（具体的には、本発明のＭＥＫ１及びＭＥＫ２結晶構造の間のＲＭＳ偏差）の計算例を、本明細書の実施例１６に提供する。
【００３７】
従って、本発明の態様の１つは、表１及び表２に記載の、リガンド及び補因子といっしょの３成分複合体中の修飾ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドの３次元構造である。別の態様は、「構造的に関連する（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ）」ペプチド、構造的に関連するペプチドの結晶、及びその３次元構造である。
本明細書において、「構造的に関連する」タンパク質又はペプチドとは、表１又は表２に記載のＭＥＫ１ペプチド若しくはＭＥＫ２ペプチドの構造座標、あるいは表１又は表２ＭＥＫ１ペプチド若しくはＭＥＫ２ペプチド構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．５Å以下から約０．５０Å以下である構造座標を有する関連するセットにより規定されるタンパク質又はペプチドを意味する。前記ＲＭＳ偏差は、好ましくは約０．５０Å以下であり、より好ましくは約０．７５Å以下であり、更により好ましくは約１．００Å以下であり、そして最も好ましくは約１．２５Å以下である。前記の「構造的に関連するペプチド」としては、以下に限定されるものでないが、ＭＥＫ５を挙げることができる。
同様に、本明細書において、「関連する構造座標のセット」とは、表１又は表２に記載のＭＥＫ１若しくはＭＥＫ２構造座標のコアＣアルファ原子からのＲＭＳ偏差が約１．５Å以下から約０．５０Å以下である構造座標のセットを意味する。前記ＲＭＳ偏差は、好ましくは約０．５０Å以下であり、より好ましくは約０．７５Å以下であり、更により好ましくは約１．００Å以下であり、そして最も好ましくは約１．２５Å以下である。
【００３８】
本明細書において「化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｎｔｉｔｙ）」とは、化合物、化合物少なくとも２種の複合体、又は前記化合物若しくは複合体のフラグメントを意味する。前記実在物は、例えば、有効な薬剤の候補となることができ、そしてＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又は構造的に関連するペプチドの活性を阻害又は増強させる能力に関して評価することができる。
本明細書において、用語「インヒビター」又は「阻害」（あるいはそれらの変形）は、リガンド、例えば、ＭＥＫ１若しくはＭＥＫ２の活性又はその作用を、低める、軽減する、減少する、予防する、小さくする、停止する、又はネガティブに干渉する化合物又は物質を意味する。しばしば、前記用語「インヒビター」と「アンタゴニスト」とは、交換可能に使用することができる。阻害は、典型的には、インヒビター不在下の酵素活性上のインヒビター存在下の酵素活性の割合（％）として表される。あるいは、用語ＩＣ５０、すなわち、本来の酵素活性の５０％の酵素活性が観察されるインヒビターの濃度で表される。
【００３９】
本明細書において、用語「エンハンサー」又は「増強」（あるいはそれらの変形）は、リガンド、例えば、ＭＥＫ１若しくはＭＥＫ２の活性又はその作用を、向上する、増やす、刺激する、上昇させる、又はポジティブに干渉する化合物又は物質を意味する。しばしば、前記用語「エンハンサー」と「アゴニスト」とは、交換可能に使用することができる。エンハンサーは、前記酵素の活性を増加させるであろう。
本明細書において、用語「モデル」及び「モデリング」は、立体的制約［ｓｔｅｒｉｃ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ］及び表面／溶媒静電的効果に基づくＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＭＥＫ様結合ポケット、及び化学物質［ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｎｔｉｔｙ］（候補化合物［ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ］とも称する）間の相互作用の親和性の評価手順（「アセッシング」とも称する）を意味する。
【００４０】
《ＭＥＫ１及びＭＥＫ２》
本明細書において、略号「ＭＥＫ１」又は「Ｍｅｋ１」は、前記ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫ１キナーゼをコードするポリヌクレオチド又は前記ペプチド自体を意味する。前記ＭＥＫ１ペプチドは、前記文献及び本明細書において、時々、ＭＡＰＫＫ、ＭＰＫ１、ＭＥＫ１、ＭＡＰキナーゼキナーゼ１、又はＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫ１キナーゼと称することがある。ＭＥＫ１の完全長タンパク質をコードするポリヌクレオチドの核酸配列は、Ｚｈｅｎｇ及びＧｕａｎによって発表されており〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１１４３５−１１４３９（１９９３）〕、そして受付番号Ｌ１１２８４でＧｅｎＢａｎｋに提出されている。その中に記載されている核酸配列は、本明細書に記載されており、配列番号１に見ることができる。　Ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇペプチド　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　前記完全長タンパク質の相当するペプチド配列も本明細書に記載されており、配列番号２に見ることができる。このペプチド配列は、Ｚｈｅｎｇら及びＳｅｇｅｒらによってＧｅｎＢａｎｋに提出され、受付番号ＮＰ＿００２７４６が付された。本明細書に記載の配列番号２のナンバリングが開始コドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）から始まっていることに注意されたい。
【００４１】
本明細書において、略号「ＭＥＫ２」又は「Ｍｅｋ２」は、前記ＭＡＰキナーゼキナーゼ２又はＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫ２キナーゼをコードするポリヌクレオチド、あるいは前記ペプチド自体を意味する。また、前記ＭＥＫ２ペプチドは、時々、ＭＡＰＫＫ２又はＭＰＫ２と称することもある。ＭＥＫ２は、前記文献及び本明細書において、ＭＥＫ１のパラログ［ｐａｒａｌｏｇ］である。ＭＥＫ２ペプチド、及び完全長ＭＥＫ２ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｚｈｅｎｇらによって報告されており〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１１４３５−１１４３９（１９９３）〕、そしてそれらの配列は、それぞれ、受付番号Ｐ３６５０７及びＮＭ＿０３０６６２でＧｅｎＢａｎｋから入手することができる。ＭＥＫ２をコードする核酸配列及びＭＥＫ２ペプチドをコードするアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３及び配列番号４として、本明細書に記載する。
【００４２】
《ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチド結合ポケット》
本明細書において「結合ポケット」は、例えば、「結合部位」、「結合ドメイン」、「基質結合部位」、「触媒ドメイン」、又は「リガンド結合ドメイン」、「リガンド結合部位」、「補因子結合部位」、又は「補因子結合ドメイン」とも称され、その表面特徴〔例えば、以下に限定されるものでないが、容量（孔腔内の内部容量又は合計容量の両方とも）、溶媒アクセシビリティー、並びに表面電荷及び疎水性〕の結果として、他の化学物質又は化合物と関連することができる分子又は分子複合体の領域を意味する。前記領域は、医薬品開発などの分野で有用である。
本明細書において、「ＭＥＫ様（ＭＥＫ−ｌｉｋｅ）」ペプチド結合ポケットは、表１又は表２に記載のＭＥＫ１ペプチド若しくはＭＥＫ２ペプチドの構造座標に記載の原子により規定されるか、又は任意の前記ＭＥＫ１結合ポケット又はＭＥＫ２結合ポケット（例えば、前記「課題を解決するための手段」欄に記載のＭＥＫ１若しくはＭＥＫ２の補因子若しくはリガンド結合ポケット）の結合ポケットＣアルファ原子から約１．５Å以下から約０．５０Å以下、好ましくは約１．２５Å以下離れたＲＭＳ偏差を有する構造座標により規定されるペプチド結合ポケット、又は保存的に置換されたそのバリアントを意味する。
【００４３】
本明細書において、用語「活性」は、全ての活性、すなわち、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２の基質であるＥＲＫ１のリン酸化におけるＭＥＫ１又はＭＥＫ２の機能、並びに。前記酵素の有効性を意味する。用語「活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）」及び「機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」は、しばしば交換可能に用いることができる。
本明細書において、用語「関連する」は、少なくとも２つの分子が互いに可逆的に相互作用、例えば、互いに結合する過程を意味する。また、用語「関連する」は、タンパク質の配置が、リガンドの存在に応じて前記リガンドの立体的及び静電的効果を適応させるより良好にように変化する過程も意味する。ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又は構造的に関連するペプチドとリガンドとの間の関連は、ＭＥＫ１結合ポケット、ＭＥＫ２結合ポケット、又はＭＥＫ様結合ポケットの全部又は一部に生じることができる。前記関連は、非共有〔例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、又は静電的相互作用が並列位置に対してエネルギー的に有利である場合〕であることができるか、あるいは前記関連は、共有であることができる。
【００４４】
《ＭＥＫ１ペプチド及びＭＥＫ２ペプチド》
本発明は、配列番号１及び配列番号３に記載の核酸配列によりコードされるペプチドのアミノ酸配列からなるか、前記アミノ酸配列から本質的になるか、又は前記アミノ酸配列を含む、単離されたペプチド及びタンパク質分子、並びに製造及び使用の点で当該技術の範囲内にある前記ペプチドの明らかなバリアントを提供する。前記バリアントのいくつかを、以下に詳細に記載する。
【００４５】
〈修飾ＭＥＫ１ペプチド〉
或る態様では、本発明は、新規な修飾ＭＥＫ１ペプチド、例えば、フレキシブルなＮＨ２末端尾部（ｔａｉｌ）の重要な部分を欠くように構成された前記ペプチド、又は保存的に置換されたそのバリアント（「ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチド」）を含む実質的に純粋な単離されたポリペプチドを提供する。本発明のＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチドは、ＭＥＫ１ペプチドがその天然補因子であるＡＴＰに結合することができるように、相当する完全長ＭＥＫ１ペプチドの球状コアを保持することが好ましい。前記ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチドは、好ましくは、ＥＲＫ１結合ドメインの一部を含むフレキシブルで部分的に乱れている（ｐａｒｔｉａｌｌｙ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）前記ＮＨ２末端の全て又は重要な部分〔最小で３０アミノ酸、好ましくは４１アミノ酸、より好ましくは多くとも５０アミノ酸、そして更により好ましくは多くとも６１アミノ酸）を欠く。更に、前記ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチドは、記載された配列より前に、最初のアミノ酸としてのメチオニンを有することができる。
【００４６】
前記ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチドは、更に、ＭＥＫ１挿入ループ形成ドメイン、特に、配列番号２の２８０〜３２３番目のアミノ酸、又は配列番号２の２６４〜３１０の間のアミノ酸少なくとも４０個を欠失していることができる。前記態様には、以下のアミノ酸の欠失が含まれる（１）配列番号２の２６４番目のアミノ酸〜３１０番目のアミノ酸；（２）配列番号２の２７０番目のアミノ酸〜３１０番目のアミノ酸；（３）配列番号２の２６４番目のアミノ酸〜３０５番目のアミノ酸；（４）配列番号２の２６７番目のアミノ酸〜３０７番目のアミノ酸；又は（５）配列番号２の２６５番目のアミノ酸〜３０４番目のアミノ酸。
また、前記ＭＥＫ１挿入ループドメインは、リンカーペプチドで置き換えられていることができる。前記リンカーペプチドは、好ましくは、アミノ酸残基が多くとも１０個である。より好ましくは、前記リンカーペプチドは、Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐのアミノ酸配列を有する。
【００４７】
あるいは、前記ＭＥＫ１ペプチドは、ＮＨ２末端トランケーションなしで、前記ＭＥＫ１挿入ループ形成ドメインの欠失及び／又は前記ＭＥＫ１挿入ループドメインの置き換えによって修飾されていることができる。
また、これらの修飾ＭＥＫ１ペプチドは、そのＣＯＯＨ末端に、ヒスチジンオリゴマータグ、例えばヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）を有することもできる。
前記修飾ＭＥＫ１ペプチドは、例えば、以下の任意の群から選択することができる：（１）配列番号２の６２〜３９３番目のアミノ酸を含み、場合により、ＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチド；（２）配列番号２の６２〜３９３番目のアミノ酸を含み、更に前記挿入ループ形成アミノ酸残基が欠失しており、そして場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことがあるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチド；（３）配列番号２に記載の配列の５１〜３９３番目のアミノ酸を含み、場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことがあるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチド；（４）配列番号２の５１〜３９３番目のアミノ酸を含み、更に前記挿入ループ形成アミノ酸残基が欠失しており、そして場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことがあるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチド；（５）配列番号２に記載の配列の４２〜３９３番目のアミノ酸を含み、そして場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことがあるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチド；（６）配列番号２の４２〜３９３番目のアミノ酸を含み、更に前記挿入ループ形成アミノ酸残基が欠失しており、そして場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことがあるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチド；（７）前記挿入ループ形成アミノ酸残基が欠失するように修飾されたＭＥＫ１ペプチド；及び（８）前記ＮＨ２末端トランケーションが存在するか又は存在せず、前記挿入ループ形成アミノ酸残基が、リンカーペプチド、好ましくはＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐで置き換えられるように修飾されたＭＥＫペプチド。
【００４８】
前記修飾ＭＥＫ１ペプチドは、好ましくは、後出の保存されたアミノ酸を保持し、そして約３３１〜３５１アミノ酸残基、又はそのＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチドがペプチド内に欠失を有する場合には、約２８４〜３１１アミノ酸残基を、含む。前記修飾ＭＥＫ１ペプチドは、リン酸化されているか又はリン酸化されていないことができる。同様に、前記修飾ＭＥＫ１ペプチドは、相当する完全長ＭＥＫ１ペプチドの天然由来のメチオニンを置換するセレノメチオニン１個以上を含むことができる。当然のことながら、全体的な修飾、例えば、Ｘ線結晶学研究で一般的な付加的重原子誘導体も、本発明の修飾ＭＥＫ１ペプチドの実施であることができ、そして前記修飾も、本発明の一部に含まれる。
【００４９】
或る好ましい態様では、前記修飾ＭＥＫ１ペプチドは、ヒトＭＥＫ１から誘導され、そして相当する完全長ＭＥＫ１のＮ末端アミノ酸の１番目のアミノ酸〜４１番目のアミノ酸の残基を欠いている。より好ましい態様では、前記修飾ＭＥＫ１ペプチドは、相当する完全長ＭＥＫ１のＮ末端アミノ酸の１番目のアミノ酸〜５０番目のアミノ酸の残基を欠いている。最も好ましい態様では、前記修飾ＭＥＫ１ペプチドは、配列番号２に記載の相当する完全長ＭＥＫ１のＮ末端アミノ酸の１番目のアミノ酸〜６１番目のアミノ酸の残基を欠いている。
本発明の修飾ＭＥＫ１ペプチドは、任意の真核生物由来であることができるが、好ましくは脊椎動物のＭＥＫ１、より好ましくは哺乳動物由来のＭＥＫ１、そして最も好ましくはヒトＭＥＫ１である。
【００５０】
〈修飾ＭＥＫ２ペプチド〉
別の態様では、本発明は、新規な修飾ＭＥＫ２ペプチド、例えば、フレキシブルなＮＨ２末端尾部（ｔａｉｌ）の重要な部分を欠くように構成された前記ペプチド、又は保存的に置換されたそのバリアント（「ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチド」）を含む実質的に純粋な単離されたポリペプチドを提供する。本発明のＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチドは、ＭＥＫ２ペプチドがその天然補因子であるＡＴＰに結合することができるように、相当する完全長ＭＥＫ２ペプチドの球状コアを保持することが好ましい。前記ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチドは、好ましくは、ＥＲＫ２結合ドメインの一部を含むフレキシブルで部分的に乱れている（ｐａｒｔｉａｌｌｙ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）前記ＮＨ２末端の全て又は重要な部分〔最小で３４アミノ酸から多くとも７４アミノ酸、好ましくは最小で４５から多くとも６５アミノ酸）を欠く。更に、前記ＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチドは、記載された配列より前に、最初のアミノ酸としてのメチオニンを有することができる。また、これらの修飾ＭＥＫ２ペプチドは、そのＣＯＯＨ末端に、ヒスチジンオリゴマータグ、例えばヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）を有することもできる。
【００５１】
前記修飾ＭＥＫ２ペプチドは、例えば、以下の任意の群から選択することができる：（１）配列番号４に記載の配列の４６〜４００番目のアミノ酸を含み、場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことがあるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチド；（２）配列番号４に記載の配列の５５〜４００番目のアミノ酸を含み、場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことがあるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチド；（３）配列番号４に記載の配列の６６〜４００番目のアミノ酸を含み、更に場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことができるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチド；（４）配列番号４に記載の配列の５９〜４００番目のアミノ酸を含み、そして場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことができるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチド；（５）配列番号４に記載の配列の，６２〜４００番目のアミノ酸を含み、そして場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことができるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチド；（６）配列番号４に記載の配列の６４〜４００番目のアミノ酸を含み、そして場合によりＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むことができるＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチド。
【００５２】
前記修飾ＭＥＫ２ペプチドは、好ましくは、後出の保存されたアミノ酸を保持し、そして約３２６〜３６６アミノ酸残基を含む。前記修飾ＭＥＫ２ペプチドは、リン酸化されているか又はリン酸化されていないことができる。同様に、前記修飾ＭＥＫ２ペプチドは、相当する完全長ＭＥＫ２ペプチドの天然由来のメチオニンを置換するセレノメチオニン１個以上を含むことができる。当然のことながら、全体的な修飾、例えば、Ｘ線結晶学研究で一般的な付加的重原子誘導体も、本発明の修飾ＭＥＫ２ペプチドの実施であることができ、そして前記修飾も、本発明の一部に含まれる。
或る好ましい態様では、前記修飾ＭＥＫ２ペプチドは、ヒトＭＥＫ２から誘導され、そして配列番号４に記載の相当する完全長ＭＥＫ２のＮ末端アミノ酸の１番目のアミノ酸〜４５番目のアミノ酸の残基を欠いている。より好ましい態様では、前記修飾ＭＥＫ２ペプチドは、配列番号４に記載の相当する完全長ＭＥＫ２のＮ末端アミノ酸の１番目のアミノ酸〜５４番目のアミノ酸の残基を欠いている。最も好ましい態様では、前記修飾ＭＥＫ２ペプチドは、配列番号４に記載の相当する完全長ＭＥＫ２のＮ末端アミノ酸の１番目のアミノ酸〜６５番目のアミノ酸の残基を欠いている。
本発明の修飾ＭＥＫ２ペプチドは、任意の真核生物由来であることができるが、好ましくは脊椎動物のＭＥＫ２、より好ましくは哺乳動物由来のＭＥＫ２、そして最も好ましくはヒトＭＥＫ２である。
【００５３】
本明細書においては、タンパク質又はペプチドが、細胞性材料を実質的に含まないか、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない場合に、前記タンパク質又はペプチドが「単離された」又は「精製された」と称する。本発明のタンパク質又はペプチドは、均質性又は他の純粋の程度に関して精製することができる。精製のレベルは、意図される使用に基づくであろう。重要なことは、他の成分が多量に存在する場合であっても、そのタンパク質又はペプチドの所望の機能が、その調製物から得られることである。
いくつかの使用において、用語「細胞性材料を実質的に含まない」には、他のタンパク質（すなわち、夾雑タンパク質）（乾燥重量で）約３０％未満、好ましくは他のタンパク質約２０％未満、より好ましくは他のタンパク質約１０％未満、更に好ましくは他のタンパク質約５％未満を含有するタンパク質又はペプチド調製物が含まれる。前記タンパク質又はペプチドが、組換え技術により生成されたものである場合には、培養基を実質的に含まない、すなわち、培養基がそのタンパク質調製物の体積の約２０％未満の量で存在することもできる。
【００５４】
用語「化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない」には、そのタンパク質の合成に関連する化学的前駆体若しくは他の化学物質から、前記タンパク質が分離されている、前記タンパク質の調製物が含まれる。或る態様では、用語「化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない」には、化学的前駆体若しくは他の化学物質（乾燥重量で）約３０％未満、好ましくは化学的前駆体若しくは他の化学物質約２０％未満、より好ましくは化学的前駆体若しくは他の化学物質約１０％未満、最も好ましくは化学的前駆体若しくは他の化学物質約５％未満を含有する、タンパク質調製物が含まれる。
本明細書に記載の単離されたタンパク質は、ＭＥＫ１ペプチド若しくはＭＥＫ２ペプチドを自然に発現する細胞から精製するか、又はＭＥＫ１若しくはＭＥＫ２を発現するように変化させた（組換え発現）細胞から精製することができる。例えば、前記タンパク質をコードする核酸を、クローニングして発現ベクター中に入れ、前記発現ベクターを宿主細胞中に導入し、次いで宿主細胞中で前記タンパク質を発現させる。続いて、標準的なタンパク質精製技術を用いる適当な精製工程によって、前記細胞から前記タンパク質を単離することができる。これらの技術の多くを、後に詳細に説明する。
【００５５】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合（すなわち、ペプチド配同体）により相互に結合しているアミノ酸２個以上を含む任意のペプチド又はタンパク質を表す。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプチド、又はオリゴマーと通常称される短鎖、並びにタンパク質と一般に称される長鎖の両方を表す。本明細書では、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」を交換可能に使用する。ポリペプチドは、天然に存在する２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。更に、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸が、自然の工程（例えば、プロセシング及び他の転写後の修飾）によるか、又は当業者に周知の化学的修飾技術によって、修飾されていることができる。ポリペプチドにおいて自然に発生する一般的な修飾は、基本書、専門書、及び調査文献に記載されており、また、それらは当業者に周知である。
【００５６】
従って、置換されたアミノ酸残基がその遺伝子コードによりコードされたものでないか；置換基を含むか；その成熟ポリペプチドが他の化合物〔例えば、前記ポリペプチドの半減期を増やす化合物（例えば、ポリエチレングリコール）〕と融合しているか；あるいは、その成熟ポリペプチドに更なるアミノ酸（例えば、リーダーか、分泌［ｓｅｃｒｅｔａｒｙ］配列か、成熟ポリペプチドの精製のための配列か、又はプロ−タンパク質配列）が融合している誘導体又はアナログも、前記ポリペプチドは、包含する。
【００５７】
更に、本発明は、ＭＥＫ１ペプチド及びＭＥＫ２ペプチドのフラグメントも、前記フラグメントを含む及び前記フラグメントからなるタンパク質及びペプチドに加えて、提供する。本明細書において、フラグメントは、前記プロテインキナーゼからの８以上の連続するアミノ酸残基を含む。前記フラグメントは、前記キナーゼの生物学的活性１つ以上を保持する能力に基づいて選択することができ、あるいは或る機能を実施する（例えば、免疫源として作用する）能力に関して選択することができるであろう。特に重要なフラグメントは、生物学的に活性なフラグメント、すなわち、長さが例えばアミノ酸８個以上のペプチドである。前記フラグメントは、典型的に、前記キナーゼのドメイン又はモチーフ、例えば活性部位を含む。更に、可能なフラグメントには、以下に限定されるものでないが、ドメイン又はモチーフ含有フラグメント、可溶性ペプチドフラグメント、及び免疫原構造を含むフラグメントが含まれる。予測されたドメイン及び機能的部位は、当業者に周知であるか容易に入手することができるコンピュータープログラムによって（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ　ａｎａｌｙｓｉｓによって）容易に同定することができる。
【００５８】
公知の修飾としては、以下に限定されるものでないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋化、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、フェニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡが媒介するタンパク質へのアミノ酸の添加、例えばアルギニル化、及びユビキチン化を挙げることができる。
【００５９】
前記修飾は当業者に周知であり、化学文献中に非常に詳細に記載されている。特に一般的ないくつかの修飾、例えば、グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰ−リボシル化は、殆どの基本書に記載されている。例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク州（１９９３）」を参照されたい。この問題においては多くの詳細なレビューが入手可能であり、例えば、「Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州１−１２（１９８３）」、「Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）」、及び「Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）」を参照されたい。
【００６０】
本発明のペプチドは、異種配列に結合して、キメラタンパク質又は融合タンパク質を形成することができる。前記キメラタンパク質又は融合タンパク質は、前記キナーゼペプチドに実質的に相同でないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に、有効なように結合するペプチドを含む。「有効なように結合する（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ　ｌｉｎｋｅｄ）」とは、前記ペプチドと前記異種タンパク質とがイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）に融合することを表す。前記異種タンパク質は、前記キナーゼペプチドのＮＨ２末端又はＣＯＯＨ末端に融合することができる。融合ペプチド中で結合しているペプチド２つは、典型的には、独立した２つの供給源から誘導され、従って、融合ペプチドは、自然において通常は結合した状態では見いだされない２つの結合ペプチドを含む。前記ペプチド２種は、同じゲノム由来であることもできるし、異なるゲノム由来であることもできる。
【００６１】
いくつかの用途においては、前記融合タンパク質は、前記ペプチド自体の活性に影響しない。例えば、そのような融合タンパク質としては、以下に限定されるものでないが、酵素的（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ）融合タンパク質、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ融合、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ融合、ポリ−Ｈｉｓ融合、ＭＹＣ−タグ付加、ＨＩ−タグ付加、及びＩｇ融合タンパク質を挙げることができる。前記融合タンパク質（特に、ポリ−Ｈｉｓ融合タンパク質）は、組換えキナーゼペプチドの精製を促進することができる。或る宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）においては、タンパク質の発現及び／又は分泌を、異種シグナル配列を用いることによって増加することができる。
キメラタンパク質又は融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードするＤＮＡフラグメントを、通常の技術に従って、イン−フレーム一緒に連結する。別の態様では、通常の技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置によって前記融合遺伝子を合成することができる。あるいは、連続する２つの遺伝子フラグメント（これは、連続的にアニーリングされ、再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成することができる）の間で相補的なオーバーハングを起こすアンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができる（「Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２」を参照されたい）。更に、融合部分（例えば、ＧＳＴタンパク質）を既にコードしている多くの発現ベクターが市販されている。修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードする核酸を、前記融合部分が前記ペプチドにイン−フレームに結合するように前記のような発現ベクター中にクローニングして入れることができる。
【００６２】
《修飾ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドをコードする核酸及びポリヌクレオチド》また、本発明は、本発明の機能的な活性キナーゼをコードする単離された核酸分子を提供する。前記核酸分子は、本発明のキナーゼペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列、その対立遺伝子バリアント、又はそれらのオルソログ［ｏｒｔｈｏｌｏｇ］若しくはパラログ［ｐａｒａｌｏｇ］からなるか、それらから実質的になるか、又はそれらを含むであろう。
〈修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド〉
特定の態様においては、本発明は、新規な修飾ＭＥＫ１ペプチド、例えばＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチド、挿入ループ形成ドメインが欠失しているＭＥＫ１ペプチド、及び／又はリンカーペプチドと置き換えられた前記挿入ループドメインを有するＭＥＫ１をコードする単離され精製されたポリヌクレオチドも提供する。
【００６３】
前記ポリヌクレオチドは、天然であることもできるし、又は組換体であることもできる。或る態様では、その核酸配列は、配列番号２の４２から６２の間のアミノ酸〜３９３番目のアミノ酸の複数のアミノ酸のアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ１ペプチド、又は保存的に置換されたそのバリアントをコードする。特には、前記核酸配列は、配列番号２の４２〜３９３番目のアミノ酸のアミノ酸配列、又は保存的な置換があることのみが配列番号２の４２〜３９３番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードする。あるいは、前記核酸配列は、配列番号２の５１〜３９３番目のアミノ酸のアミノ酸配列、又は保存的な置換があることのみが配列番号２の５１〜３９３番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードする。あるいは、前記核酸配列は、配列番号２の６２〜３９３番目のアミノ酸のアミノ酸配列、又は保存的な置換があることのみが配列番号２の５１〜３９３番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードする。前記ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２の最初の４１〜６１のアミノ残基をコードする部分が欠失した配列番号１に記載の配列を有するポリヌクレオチドであることができる。
【００６４】
更に、前記ポリヌクレオチドは、ＭＥＫ１挿入ループ形成ドメイン、特に、配列番号２の２８０〜３２３番目のアミノ酸、又は配列番号２の２６４〜３１０の間のアミノ酸少なくとも４０個を更に欠失している修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードすることができる。この態様には、以下のアミノ酸の欠失が含まれる：（１）配列番号２の２６４番目のアミノ酸〜３１０番目のアミノ酸；（２）配列番号２の２７０番目のアミノ酸〜３１０番目のアミノ酸；（３）配列番号２の２６４番目のアミノ酸〜３０５番目のアミノ酸；（４）配列番号２の２６７番目のアミノ酸〜３０７番目のアミノ酸；又は（５）配列番号２の２６５番目のアミノ酸〜３０４番目のアミノ酸。
【００６５】
更に、前記ポリヌクレオチドは、ＭＥＫ１挿入ループ形成アミノ酸残基をリンカーペプチド（好ましくは、Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ）で置き換えを、単独で又は前記のＮＨ２末端トランケーションと組み合わせて修飾されたＭＥＫ１ペプチドをコードすることができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、ＮＨ２末端トランケーションがなく、挿入ループ形成アミノ酸残基の前記欠失を有するように修飾されたＭＥＫ１ペプチドをコードすることもできる。
また、これらのアミノ酸配列は、いずれも、メチオニンの換わりにセレノメチオニン１個以上を含有することができる。更に、これらの修飾ＭＥＫ１ペプチド及びその種々のバリアントは、ヒスチジンオリゴマータグ、例えばヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を、それらのＣＯＯＨ末端に有することができる。
【００６６】
〈修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードするポリヌクレオチド〉
別の特定の態様においては、本発明は、新規な修飾ＭＥＫ２ペプチド、例えばＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチドも提供する。前記ポリヌクレオチドは、天然であることもできるし、又は組換体であることもできる。或る態様では、その核酸配列は、配列番号４の４６から６６の間のアミノ酸〜４００番目のアミノ酸の複数のアミノ酸のアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチド、又は保存的に置換されたそのバリアントをコードする。特には、前記核酸配列は、配列番号４の４６〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列、又は保存的な置換があることのみが配列番号４の４６〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする。あるいは、前記核酸配列は、配列番号４の５５〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列、又は保存的な置換があることのみが配列番号４の５５〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする。あるいは、前記核酸配列は、配列番号４の６６〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列、又は保存的な置換があることのみが配列番号４の６６〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする。
【００６７】
あるいは、前記核酸配列は、配列番号４の５９〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列、又は保存的な置換があることのみが配列番号４の５９〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする。あるいは、前記核酸配列は、配列番号４の６２〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列、又は保存的な置換があることのみが配列番号４の６２〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする。更に、前記核酸配列は、配列番号４の６４〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列、又は保存的な置換があることのみが配列番号４の６４〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする。前記ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号４の配列の最初の４５〜６５のアミノ残基をコードする部分を欠失している配列番号３に記載の配列を有するポリヌクレオチドであることができる。
【００６８】
また、これらのアミノ酸配列は、いずれも、メチオニンの換わりにセレノメチオニン１個以上を含有することができる。更に、これらの修飾ＭＥＫ１ペプチド及びその種々のバリアントは、ヒスチジンオリゴマータグ、例えばヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を、それらのＣＯＯＨ末端に有することができる。
本明細書において、「単離された」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸から分離された核酸分子である。「単離された」核酸は、その核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ中で本来前記核酸の側方に位置する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（すなわち、前記核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）が存在しないことが好ましい。しかしながら、或る種の側方ヌクレオチド配列、例えば、約５ＫＢ以下の、特に、連続しているペプチドコード配列、及びゲノム配列中でイントロンにより分割されている複数の遺伝子中のペプチドコード配列が存在していることができる。重要な点は、本明細書に記載の特定の操作、例えば、組換え発現、プローブ及びプライマーの調製、並びに前記核酸配列に特異的な他の使用をすることができるように、無関係で且つ重要でない側方配列から前記核酸が単離されることである。
【００６９】
更に、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術により生成する場合には他の細胞性材料又は培養基を実質的に含まないか、又は化学的に合成する場合には化学的前駆体若しくは他の化学薬品を実質的に含まないことができる。しかしながら、前記核酸分子は、別のコード配列又は調節配列に融合することができるので、従ってその場合も単離されていると考えることができる。例えば、或るベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子を単離するか考えることができる。単離されたＤＮＡ分子の別の例としては、異種宿主細胞中に保持された組換えＤＮＡ分子、又は溶液中の（部分的に若しくは実質的に）精製されたＤＮＡ分子を挙げることができる。単離されたＲＮＡ分子としては、単離された本発明のＤＮＡ分子イン・ビボ又はイン・ビトロＲＮＡ転写物を挙げることができる。更に、本発明による単離された核酸分子には、合成的に生成された前記分子が含まれる。
【００７０】
配列番号１において提供される核酸分子の中には天然に存在する完全な遺伝子のフラグメントであるものも存在するので、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子の好ましい群は、完全長ｃＤＮＡ分子及び遺伝子及びゲノムクローンである。非常に多様なタイプのこれらの核酸分子を容易に製造／単離することができることを、本明細書に簡潔に記載する。
完全長遺伝子は、当業者に公知の多数の方法のうちの任意の方法を用いて、公知の配列からクローニングすることができる。例えば、ＸＬ−ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を使用してＤＮＡの長い断片を増幅する方法を用いることができる。完全長配列を得る複数の別の方法が、当業者に公知である。
【００７１】
単離された前記核酸分子は、前記活性タンパク質に加えて、付加的なアミノ末端アミノ酸若しくはカルボキシル末端アミノ酸、又は（例えば、成熟形態が１を越えるペプチド鎖を有する場合に）その成熟ペプチドに対する内部アミノ酸をコードすることができる。前記配列は、他のものの内で、前駆体から活性形態へのタンパク質のプロセシング、タンパク質輸送の促進、タンパク質半減期の延長若しくは短縮、又はアッセイ若しくは製造に対するタンパク質の操作の容易化などにおいて有用である。一般的に、インシトゥの場合には、付加的な前記アミノ酸は、細胞酵素により成熟活性タンパク質からプロセシングにより除去（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ　ａｗａｙ）することができる。
【００７２】
前記のとおり、単離した前記核酸分子としては、以下に限定されるものでないが、活性キナーゼを単独でコードするか、あるいはコード配列、例えばリーダー若しくは分泌配列（例えば、プレプロタンパク質配列又はプロタンパク質配列）との組合せデコードする配列；付加的なコード配列を含むかあるいは含まずに、更に付加的な非コード配列、例えばイントロン及び非コード５’及び３’配列、例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシング及びポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合、及びｍＲＮＡの安定性の役割を担う転写されるが翻訳されない配列を伴って前記活性キナーゼをコードする配列を挙げることができる。更に、核酸分子を、例えば、精製を容易にするペプチドをコードするマーカー配列に融合させることもできる。
単離された核酸分子は、クローニングによって得るか、あるいは化学的合成技術又はそれらの組み合わせによって生成するＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの形態であるか、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの形態であることができる。前記核酸、特にＤＮＡは、２本鎖であるか又は１本鎖であることができる。１本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）であるか又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であることができる。
【００７３】
更に、本発明は、本発明のペプチドのフラグメントをコードする核酸分子、及び前記の本発明のキナーゼタンパク質の明らかなバリアントをコードする核酸分子も提供する。前記核酸分子は、天然に存在するもの、例えば、対立バリアント（同じ遺伝子座）、パラログ（異なる遺伝子座）、及びオルソログ（異なる生物）であることができるか、あるいは組換えＤＮＡ法又は化学的合成によって造られたものであることができる。このような天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発法（例えば、核酸分子、細胞、又は生体に適用する突然変異誘発法）によって形成することができる。従って、前記のとおり、前記バリアントは、ヌクレオチド置換、欠失、逆位、及び挿入を含むことができる。変化は、コード領域及び非コード領域のいずれか一方又は両方で、発生することができる。前記変化は、保存的なアミノ酸置換及び非保存的なアミノ酸置換のどちらも引き起こすことができる。
【００７４】
フラグメントは、１２を越えるヌクレオチドの連続的な１つのヌクレオチド配列を含む。更に、フラグメントは、長さが、少なくとも３０、４０、５０、１００、２５０、又は５００ヌクレオチドであることができる。本発明のフラグメントの長さは、意図するその用途に基づくことができる。例えば、本発明のフラグメントは、前記ペプチドの領域を有するエピトープをコードすることができるか、あるいはＤＮＡプローブやプライマーとして有用であることができる。前記フラグメントを、公知のヌクレオチド配列を用いて単離して、オリゴヌクレオチドプローブを合成することができる。次いで、標識されたプローブを、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、又はｍＲＮＡのスクリーニングに使用して、前記コード領域に相当する核酸を単離することができる。また、プライマーをＰＣＲ反応に用いて、遺伝子の特定の領域をクローニングすることができる。
プローブ／プライマーは、典型的に、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドペアを含む。前記オリゴヌクレオチドは、典型的に、少なくとも約１２、２０、２５、４０、５０、又はそれ以上の連続的なヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００７５】
オルソログ、ホモログ、及び対立バリアントは、当業者に公知の方法で確認することができる。前記のとおり、これらのバリアントは、配列番号１又は配列番号３に記載のヌクレオチド配列又はこの配列のフラグメントに対して、典型的には６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、又は更により好ましくは７５％以上相同的なペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。或る好ましい態様では、前記バリアントは、配列番号１又は配列番号３に記載のヌクレオチド配列又はこの配列のフラグメントに対して、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上相同的なペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。前記核酸分子は、配列番号１又は配列番号３に記載のヌクレオチド配列又は前記配列のフラグメントに、穏和な（ｍｏｄｅｒａｔｅ）条件下からストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるものとして容易に確認することができる。
【００７６】
本明細書において、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」は、その条件下では、相互に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％相同的なペプチドをコードするヌクレオチド配列が、典型的に、相互にハイブリダイズした状態で残されるような、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を描写することを意図する。前記条件は、相互に少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％相同的な配列が、典型的に、相互にハイブリダイズした状態で残されるような条件であることができる。穏和な条件から非常にストリンジェントな条件に至る標準的ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である〔例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州（１９８９），６．３．１−６．３．６」を参照されたい〕。穏和なハイブリダイゼーション条件は、２Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中における３０℃でのハイブリダイゼーション及び続く５０〜６０℃での１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回又は複数回の洗浄と同等として規定される。非常にストリンジェントな条件は、ａｒｅ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ａｓ　ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｔｏ　ハイブリダイゼーション　ｉｎ　６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中における４５℃でのハイブリダイゼーション及び続く５０〜６５℃での０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回又は複数回の洗浄と同等として規定される。
【００７７】
本発明の核酸分子は、プローブ、プライマー、化学的中間体として、及び生物学的アッセイにおいて、有用である。本発明の核酸分子は、本明細書に記載のペプチドをコードする完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローン［ｇｅｎｏｍｉｃ　ｃｌｏｎｅ］を単離するためのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ、並びに前記と同じペプチド又は本明細書に記載の関連するペプチドを生成するバリアント（対立遺伝子、オルソログなど）に相当するｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するためのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして有用である。
前記プローブは、配列番号１又は配列番号３に記載の核酸分子の全体長さの間の任意の配列に相当することができる。従って、前記プローブは、５’非コード領域、コード領域、及び３’非コード領域から誘導することができる。しかしながら、フラグメントは、前記のとおり、本発明に先駆けて開示されたフラグメントを包含することができると解釈されるべきではない。
【００７８】
また、本発明の核酸分子は、核酸分子の或る任意の領域を増幅するＰＣＲ用のプライマーとしても有用であり、また、所望の長さ及び配列のアンチセンス分子を合成するにも有用である。
また、本発明の核酸分子は、組換えベクターの作成にも有用である。前記ベクターには、前記ペプチド配列の一部又は全部を発現するベクターが含まれる。また、ベクターには、別の核酸分子配列中へ（例えば、細胞ゲノム中へ）組込んで、或る遺伝子及び／又は遺伝子生成物のイン・シトゥ発現を変化させるのに使用する挿入ベクターも含まれる。例えば、特異的に誘導された突然変異１つ以上を含むコード領域の全部又は一部で相同的に組み換えることにより、内因性コード配列が置き換えられていることができる。また、本発明の核酸分子は、前記タンパク質の抗原部分の発現に有用であり；イン・シトゥハイブリダイゼーション法による前記核酸分子の染色体部位の決定用のプローブとして有用であり；本明細書に記載の核酸分子から生成されるｍＲＮＡの全部又は一部に相当するリボザイムの設計に有用であり；並びに、前記核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現する宿主細胞の作成に有用である。また、本発明の核酸分子は、前記核酸分子及びペプチドの全部又は一部を発現するトランスジェニックアニマルの作成に有用であり；及び、前記ペプチドの一部又は全部を発現するベクターの作成に有用である。更に、本発明の核酸分子は、核酸発現の存在、レベル、形態、及び分布を決定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。従って、前記プローブは、細胞、組織、及び生物中の特定の核酸分子の存在の検出又はレベルの決定に用いることができる。レベルを決定する前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。従って、本明細書に記載のペプチドに相当するプローブは、或る細胞、組織、又は生物における発現及び／又は遺伝子複製数の評価に用いることができる。これらの使用は、通常の結果と比較してキナーゼタンパク質の発現が増加又は減少することと関連する障害の診断に関与する。
【００７９】
ｍＲＮＡ検出用のイン・ビトロ検出法としては、ノーザンハイブリダイゼーション及びイン・シトゥハイブリダイゼーションを挙げることができる。ＤＮＡ検出用のイン・ビトロ検出法としては、サザンハイブリダイゼーション及びイン・シトゥハイブリダイゼーションを挙げることができる。
プローブは、例えば、対象からの細胞サンプル中のレセプターコード核酸、例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのレベルを測定することによるか、又はレセプター遺伝子が突然変異されているか否かを決定することにより、或るキナーゼタンパク質を発現する細胞又は組織を確認するための診断的試験キットの一部として用いることができる。
【００８０】
《修飾ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドを製造するためのベクター及び宿主細胞》また、本発明は、宿主細胞中で前記修飾ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドを生成するための発現ベクターも提供する。更に、本発明は、前記修飾ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドを発現することができる方法で、前記修飾ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそのフラグメント若しくはそれらのアナログにより安定に形質転換及びトランスフェクションされていることができる宿主細胞も提供する。また、本発明は、発現制御配列に生産に関して関連する本発明の核酸を含む発現ベクターも提供する。
【００８１】
〈ＭＥＫ１発現ベクター〉
この発現ベクターは、配列番号２の４２から６２の間のアミノ酸〜３９３番目のアミノ酸のアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ１ペプチド、又は保存的に置換されたそのバリアントをコードする核酸を含むことができる。或る態様では、前記発現ベクターが、配列番号２の４２〜３９３番目のアミノ酸のアミノ酸配列又は保存的な置換を有することのみが配列番号２の４２〜３９３番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードする核酸を含む。別の態様においては、前記発現ベクターが、配列番号２の５１〜３９３の間のアミノ酸のアミノ酸配列又は保存的な置換を有することのみが配列番号２の５１〜３９３の間のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードする核酸を含む。更に別の態様においては、前記発現ベクターが、配列番号２の６２〜３９３番目のアミノ酸のアミノ酸配列又は保存的な置換を有することのみが配列番号２の６２〜３９３番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有するＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチドをコードする核酸を含む。前記ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２の配列の最初の４１〜６１アミノ残基をコードする部分が欠失している配列番号１に記載の配列を有するポリヌクレオチドである。
【００８２】
更に、前記発現ベクターは、ＮＨ２末端の先端欠失部（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、並びに挿入ループ形成アミノ酸残基、特に配列番号２の２８０番目のアミノ酸〜３２３番目のアミノ酸；又は配列番号２の２６４番目のアミノ酸残基から３１０番目のアミノ酸の間のアミノ酸少なくとも４０個の欠失部を有する修飾ＭＥＫ１をコードする核酸を含むことができる。この態様は、（１）配列番号２の２６４番目のアミノ酸〜３１０番目のアミノ酸；（２）配列番号２の２７０番目のアミノ酸〜３１０番目のアミノ酸；（３）配列番号２の２６４番目のアミノ酸〜３０５番目のアミノ酸；（４）配列番号２の２６７番目のアミノ酸〜３０７番目のアミノ酸；あるいは（５）配列番号２の２６５番目のアミノ酸〜３０４番目のアミノ酸の欠失を含むことができる。更に、前記ポリヌクレオチドは、挿入ループ形成アミノ酸残基の前記欠失があり、ＮＨ２末端トランケーションが無いように修飾されたＭＥＫ１ペプチドをコードすることができる。
【００８３】
また、前記発現ベクターは、挿入ループ形成アミノ酸残基が、リンカーペプチド、好ましくはＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐで置き換えられて織り、前記ＮＨ２末端トランケーションを有するか又は有さない修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードする核酸を、含むことができる。
また、任意の前記発現ベクターは、場合により、メチオニンの換わりにセレノメチオニンを有する修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードする核酸を含んでいることがある。また、前記発現ベクターは、場合により、そのＣＯＯＨ末端にヒスチジンオリゴマータグ、例えば、ヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有する修飾ＭＥＫ１ペプチドをコードする核酸を含むことがある。
【００８４】
〈ＭＥＫ２発現ベクター〉
また、本発明の発現ベクターは、配列番号４の４６から６６の間のアミノ酸〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチド、又は保存的に置換されたそのバリアントをコードする核酸を含むこともできる。特には、前記発現ベクターは、配列番号４の４６〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列又は保存的な置換を有することのみが配列番号４の４６〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。あるいは、前記発現ベクターは、配列番号４の５５〜４００の間のアミノ酸のアミノ酸配列又は保存的な置換を有することのみが配列番号４の５５〜４００の間のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。あるいは、前記発現ベクターは、配列番号４の６６〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列又は保存的な置換を有することのみが配列番号４の６６〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。あるいは、前記発現ベクターは、前記発現ベクターは、配列番号４の５９〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列又は保存的な置換を有することのみが配列番号４の５９〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。あるいは、前記発現ベクターは、配列番号４の５９〜４００の間のアミノ酸のアミノ酸配列又は保存的な置換を有することのみが配列番号４の５９〜４００の間のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする核酸を含むことができる。あるいは、前記発現ベクターは、配列番号４の６２〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列又は保存的な置換を有することのみが配列番号４の６６〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。更に、前記発現ベクターは、配列番号４の６４〜４００番目のアミノ酸のアミノ酸配列又は保存的な置換を有することのみが配列番号４の６４〜４００番目のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。前記発現ベクターは、例えば、配列番号４の配列の最初の４５〜６５アミノ残基をコードする部分が欠失している配列番号３に記載の配列をコードする核酸を含む発現ベクターであることができる。
【００８５】
また、任意の前記発現ベクターは、場合により、メチオニンの換わりにセレノメチオニンを有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする核酸を含んでいることがある。また、前記発現ベクターは、場合により、そのＣＯＯＨ末端にヒスチジンオリゴマータグ、例えば、ヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有する修飾ＭＥＫ２ペプチドをコードする核酸を含むこともある。
【００８６】
本発明は、更に、本発明の発現ベクターでトランスフェクト又は形質転換された細胞を含む。この方法には以下の任意の細胞を採用することができる。或る態様では、前記細胞は原核細胞である。前記原核細胞は大腸菌細胞であることが好ましい。別の態様では、前記細胞は、真核細胞、例えば昆虫細胞又は脊椎動物細胞であり、脊椎動物細胞は、例えば哺乳類細胞であることができる。
【００８７】
また、本発明は、修飾ＭＥＫ１ペプチド及び修飾ＭＥＫ２ペプチドを発現させる方法も含む。前記方法は、細胞によるタンパク質の発現を可能にする条件下で、適切な細胞培地中に修飾ＭＥＫ１ペプチド又は修飾ＭＥＫ２ペプチドを発現させる細胞を培養することを含む。この方法には、前出のいずれの細胞を採用することができる。特定の態様では、前記細胞は、本発明の修飾ＭＥＫ１ペプチド及び修飾ＭＥＫ２ペプチドを発現させるように操作されている酵母である。好ましい態様では、前記原核細胞は、本発明の修飾ＭＥＫ１ペプチド及び修飾ＭＥＫ２ペプチドを発現させるように操作されている大腸菌細胞である。
【００８８】
また、本発明は、本明細書中に記載した核酸分子を含有するベクターを提供する。用語「ベクター」は、ベヒクル、好ましくは前記核酸分子を運ぶことの可能な核酸分子を意味する。ベクターが核酸分子の場合、前記核酸分子は、ベクター核酸に共有結合している。前記ベクターには、好ましくは、プラスミド、一本鎖又は二本鎖のファージ、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベクター、又は人工染色体、例えばａＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、又はＭＡＣ〔これらは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）から市販されている〕が含まれる。ＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチドをコード化するポリヌクレオチドを発現させるには、当業者に公知の種々の発現ベクターを使用することができる。
ベクターは、前記核酸分子の更なるコピーを複製して生成する宿主細胞内で、染色体外要素として維持することができる。あるいは、前記ベクターを、宿主細胞ゲノム中に統合して、宿主細胞が複製するときに、核酸分子の更なるコピーを生成することができる。
【００８９】
本発明は、前記核酸分子の維持のためのベクター（クローニングベクター）、又は核酸分子の発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。前記ベクターは、原核細胞又は真核細胞内で、又はその両方において（シャトルベクター）機能することができる。
発現ベクターは、シス活性調節領域を含有する。これらのシス活性調節領域は、ベクター内で核酸分子に作動可能に結合するので、核酸分子の転写が宿主細胞中で可能になる。前記核酸分子は、転写に影響を与えることが可能な別個の核酸分子を有する宿主細胞内に導入することができる。こうして、前記の第２の核酸分子は、シス調節制御領域と相互作用してベクターからの核酸分子の転写を可能にするトランス作用因子を提供することができる。あるいは、宿主細胞によってトランス作用因子が供給されていることもできる。最後に、ベクター自体からトランス作用因子を生成することもできる。しかしながら、いくつかの態様では、無細胞系内で核酸分子の転写及び／又は翻訳が発生することができると考えられる。
【００９０】
本明細書中に記載した核酸分子が作動可能に結合することができる調節配列には、ｍＲＮＡ転写を導くためのプロモーターが含まれる。前記プロモーターとしては、以下に限定されるものでないが、バクテリオファージλからのレフトプロモーター、大腸菌からのｌａｃ、ＴＲＰ、及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルス長末端反復を挙げることができる。
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターは、転写を調節する領域、例えばリプレッサ結合部位及びエンハンサをも含むことができる。その例としては、ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス前初期エンハンサ、ポリオーマエンハンサ、アデノウイルスエンハンサ、及びレトロウイルスＬＴＲエンハンサを挙げることができる。
【００９１】
転写の開始及び制御のための部位を含有することに加えて、発現ベクターは、転写の終結に必要な配列を含有し、そして転写された領域内に、翻訳のためのリボソーム結合部位を含有することもできる。発現のための他の調節制御要素には、開始コドン及び終止コドン、並びにポリアデニル化シグナルが含まれる。発現ベクターに有用な多数の調節配列が、当業者に知られている。前記調節配列は、例えば「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州（１９８９）」に記載されている。
【００９２】
核酸分子を発現させるためには、種々の発現ベクターを使用することができる。このようなベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、及びウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素（例えば、酵母人工染色体）、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、及びレトロウイルス）に由来するベクターを挙げることができる。ベクターは、それらの供給源の組み合わせに由来する、例えばプラスミド及びバクテリオファージの遺伝要素、例えばコスミドやファージミドに由来するベクターであることもできる。原核宿主及び真核宿主に適したクローニングベクター及び発現ベクターは、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州（１９８９）」に記載されている。
【００９３】
前記調節配列は、１種又は複数種の宿主細胞内において構成性発現（すなわち組織特異的）を提供するか、あるいは例えば、温度、栄養添加物、又はホルモン若しくは他のリガンドなどの外因性要因により、１種又は複数種の細胞タイプにおいて誘導性発現を提供する。原核宿主及び真核宿主における構成性及び誘導性の発現を提供する種々のベクターが当業者に知られている。
前記核酸分子を、周知の方法論によって、前記ベクター核酸中に挿入することができる。一般的に、最終的に発現させられることになるＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列及び発現ベクターを１種又は複数種の制限酵素で開裂し、次いでこれらのフラグメントを一緒に連結することにより、発現ベクターに結合させる。制限酵素による消化及び連結反応のための方法は、当業者に公知である。
適切な前記核酸分子を含有するベクターは、周知の技術を用いて、増殖又は発現に適した宿主細胞中に導入することができる。細菌細胞としては、以下に限定されるものでないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｓｅｓ）、及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を挙げることができる。真核細胞としては、以下に限定されるものでないが、酵母、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、動物細胞（例えば、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞）、及び植物細胞を挙げることができる。
【００９４】
本明細書中に記載したように、本発明のペプチドは、融合タンパク質として発現させることが望ましいことがある。従って、本発明は、前記ペプチドの生成を可能にする融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組換えタンパク質の発現を増加し、組換えタンパク質の溶解度を増加し、そして例えば親和精製のためのリガンドとして、作用することにより、タンパク質の精製を補助することができる。融合分の結合部においてタンパク質分解開裂部位を導入することができ、これにより、融合分から所望のペプチドを最終的に分離することができる。タンパク質分解酵素としては、Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼを挙げることができる。典型的な融合発現ベクターには、ｐＲＳ〔Ｓｉｋｏｒｓｋｉ他Ｓｉｋｏｒｓｋｉら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２（１）：１９−２７（１９８９）〕、ｐＧＥＸ〔Ｓｍｉｔｈら，Ｇｅｎｅ６７：３１−４０（１９８８）〕、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，マサチューセッツ州）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー州）を挙げることができる。これらのベクターは、それぞれ、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はタンパク質Ａを、目標の組換えタンパク質に融合する。適切な誘導可能非融合大腸菌発現ベクターとしては、ｐＴｒｃ〔Ａｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５（１９８８）〕及びｐＥＴ１１ｄ〔Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：６０−８９（１９９０）〕を挙げることができる。
【００９５】
組換えタンパク質発現は、組換えタンパク質を分解開裂する能力が弱まっているという遺伝的背景を提供することにより、宿主細菌内で最大化することができる〔Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州，１１９−１２８（１９９０）〕。あるいは、問題の核酸分子の配列を変えて、特定の宿主細胞、例えば大腸菌に対して、優先的なコドンの使用を可能にすることができる〔Ｗａｄａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８（１９９２）〕。
【００９６】
また、前記核酸分子は、酵母内で作用可能な発現ベクターによって発現させることもできる。酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内での発現のためのベクターとしては、ｐＹｅｐＳｅｃ１〔Ｂａｌｄａｒｉら，ＥＭＢＯ　Ｊ．６：２２９−２３４（１９８７）〕、ｐＭＦａ〔Ｋｕｒｊａｎら，Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３（１９８２）〕、ｐＪＲＹ８８〔Ｓｃｈｕｌｔｚら，Ｇｅｎｅ５４：１１３−１２３（１９８７）〕、及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）を挙げることができる。
【００９７】
前記核酸分子は、例えばバキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞内で発現させることもできる。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）内のタンパク質を発現させるのに利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ〔Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５（１９８３）〕、及びｐＶＬシリーズ〔Ｌｕｃｋｌｏｗら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９（１９８９）〕が含まれる。本発明の或る特定の態様では、本明細書中に記載した核酸分子は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞内で発現させる。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８〔Ｓｅｅｄ，Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０（１９８７）〕及びｐＭＴ２ＰＣ〔Ｋａｕｆｍａｎら，ＥＭＢＯ　Ｊ．６：１８７−１９５（１９８７）〕を挙げることができる。
【００９８】
本明細書中に挙げた発現ベクターは、核酸分子を発現させるのに有用となる、当業者に利用可能な周知のベクターの一例として提供したものにすぎない。好ましいベクターとしては、ｐＥＴ２４ｂ（Ｎｏｖａｇｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）、ｐＡｃＳＧ２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）、及びｐＦａｓｔＢａｃ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）を挙げることができる。本明細書に記載した核酸分子の維持、増殖又は発現に適した他のベクターは，当業者に知られている。このようなベクターは、例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州（１９８９）」に見出される。
【００９９】
また本発明は、本明細書中に記載する核酸配列は逆の方向付けでベクター内にクローニングされるが、しかし、アンチセンスＲＮＡの転写を許す調節配列に作動可能に結合する。従って、本明細書中に記載した核酸分子配列の全て又は一部に、コーディング領域及び非コーディング領域の双方を含むアンチセンス転写物を生成することができる。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現に関連する前記パラメータ（調節配列、構成性発現、又は誘導発現、組織特異的発現）のそれぞれに従属する。
【０１００】
また、本発明は、本明細書中に記載したベクターを含有する組換え宿主細胞にも関する。従って宿主細胞には、例えば、原核細胞、低度の真核細、例えば胞酵母、他の真核細胞、例えば昆虫細胞、及び哺乳動物細胞のような高度の真核細胞が含まれる。本発明の好ましい宿主細胞には、大腸菌及びＳｆ９が含まれる。
組換え宿主細胞は、当業者にとって容易に利用可能な技術により、前記細胞内に本明細書中に記載したベクター構造を導入することによって調製される。これらのベクター構造としては、以下に限定されるものでないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを媒介させたトランスフェクション、カチオン性脂質を媒介させたトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染、リポフェクション、及び他の技術、例えば「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州（１９８９）」に見出される技術を挙げることができる。
【０１０１】
宿主細胞は、１を越える（２つ以上の）ベクターを含有することができる。従って、同じ細胞の異なるベクターに、異なるヌクレオチド配列を導入することができる。同様に、核酸分子を単独で、又は発現ベクターにトランス作用因子を提供する核酸分子と関連しない他の核酸分子と一緒に、導入することができる。２つ以上のベクターを細胞内に導入する場合には、これらのベクターを、別個に導入するか、共に導入するか、又は核酸分子ベクターに結合させる。
バクテリオファージベクター及びウイルスベクターの場合、感染及び形質導入のための標準的な手順によって、パッケージング又はカプセル化されたウイルスとしてこれらを導入することができる。ウイルスベクターは、複製能を有することも、複製能を欠損していていることもできる。複製能が欠損している場合には、複製は、欠損を補完する機能を提供する宿主細胞内で発生することになる。
【０１０２】
ベクターは一般に、組換えベクター構造物を含む細胞の小集団の選択を可能にする選択可能なマーカーを含む。前記マーカーは、本明細書中に記載の核酸分子を含有する同じベクター内に含有されていることができるか、あるいは、別個のベクター上にあることもできる。マーカーは、原核宿主細胞に関してはテトラサイクリン又はアンピシリンに対して耐性を有する遺伝子を含み、真核宿主細胞に関してはジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシンに対して耐性を有する遺伝子を含む。しかしながら、表現型特性の選択を可能にする任意のマーカーが有効であろう。
適切な調節配列の制御下で、細菌、酵母、哺乳動物細胞、及び他の細胞内で活性タンパク質キナーゼを生成することができる一方、無細胞転写及び翻訳系を用いても、本明細書中に記載したＤＮＡ構造に由来するＲＮＡを使用してこれらのタンパク質を生成することができる。
【０１０３】
ペプチドの分泌が望まれる場合には、適切な分泌シグナルをベクター内に組み込む。そのシグナル配列は、前記タンパク質に対して内因性であるか、又は前記タンパク質に対して異種であることができる。
また、本明細書中に記載したペプチドの組換え生成における宿主細胞によっては、前記ペプチドが、前記細胞に応じて種々のグリコシル化パターンを有することができ、あるいは細菌内で生成される場合のように、非グリコシル化されていることもできる。更に、前記ペプチドは、宿主媒介プロセスの結果として、或る種の場合には初期修飾メチオニンを含んでいることができる。
【０１０４】
本明細書中に記載したペプチドを発現させる組換え宿主細胞は、種々の用途を有する。第一に、これらの細胞はＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチド、又は所望量のペプチド又はフラグメントを生成するために更に精製可能なペプチドを生成するのに有用である。このように、発現ベクターを含有する宿主細胞はペプチド生成に有用である。
宿主細胞は、タンパク質又はタンパク質フラグメントに関与する、細胞に基づく検定を行うのにも有用である。従って、天然タンパク質を発現させる組換え宿主細胞は、タンパク質機能を刺激又は阻害する化合物をアッセイするのに有用である。
また、宿主細胞は、それらの機能が影響を受けるタンパク質突然変異体を同定するのにも有用である。突然変異体が自然発生して病状を引き起こす場合、突然変異体を含有する宿主細胞は、天然タンパク質においては表れることのない突然変異タンパク質における所望の効果（例えば機能の刺激又は阻害）を有する化合物をアッセイするのに有用である。
【０１０５】
遺伝学的に改変された宿主細胞は、更に、ヒト以外の形質転換動物を造り出すのに使用することができる。形質転換動物は、好ましくは哺乳動物、例えばラットやマウスのような齧歯類の動物である。前記動物においては、前記動物の細胞のうちの１つ又は複数が、導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、細胞のゲノム内（このゲノムから形質導入動物は発生し、そして前記ゲノムは、形質導入動物の組織又は細胞型１つ又は複数において、成熟動物のゲノム内に残る）に組み込まれる外因性ＤＮＡである。これらの動物は、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドの機能を研究し、タンパク質活性のモジュレータを同定し評価するのに有用である。形質導入動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、及び両生類を挙げることができる。
【０１０６】
【修飾ＭＥＫ１及び修飾ＭＥＫ２ペプチドの精製】
本明細書中に挙げた精製の条件及び方法は、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドの精製に用いられるアプローチを説明するために、また、例えばＭＥＫ１：リガンド：補因子の複合体、及びＭＥＫ２：リガンド：補因子の複合体の形成のためのアプローチを説明するために提供される。当然のことながら、当業者には、本明細書中に記載した修飾ＭＥＫ１及び修飾ＭＥＫ２タンパク質の精製に適した他の精製条件及び技術が明らかである。例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻」、「Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編；Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０）」を参照されたい。
【０１０７】
〈修飾ＭＥＫ１の精製〉
本発明は、本明細書中に記載した修飾ＭＥＫ１ペプチドをほぼ均質状態に精製するための、複数のステップからなる方法を提供する。修飾ＭＥＫ１ペプチド、好ましくはＣＯＯＨ−末端にポリ−ヒスチジンタグを有するＭＥＫ１ペプチドが、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて有利に精製することができる。固定化金属はニッケル、亜鉛、コバルト又は銅であることができる。固定化金属は、Ｃｌｏｎ　Ｔｅｃｈから市販されているＴＡＬＯＮ（商標）金属親和性樹脂に見出されるようなコバルトが好ましい。前記ＩＭＡＣステップは、発現したＭＥＫ１ペプチド（このＭＥＫ１ペプチドは、宿主細胞溶菌後に得られる）を含有する発酵培養液の可溶性画分上で実施することができる。前記宿主細胞溶菌プロセスは、当業者に知られており、当業者は困難なく選択することができる。例えば、ＭＥＫ１ペプチドを発現させるための宿主細胞として大腸菌が使用される場合、大腸菌細胞溶菌は酵素的に、例えばリゾチームの使用により、実施することができる。あるいは、フレンチプレス、ソニケータ、又はビード・ミルを使用した機械的プロセスを用いることもできる。ビード・ミル（ＤｙｎｏＭｉｌｌ　ＫＤＬ）を使用した機械的溶菌を用いて、大腸菌細胞溶菌を実施することが好ましい。
【０１０８】
修飾ＭＥＫ１ペプチド、好ましくはＣＯＯＨ末端にＨｉｓタグを含有するＭＥＫ１ペプチドは、固定化金属キレート（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーによって精製することができる。前記ＩＭＡＣステップは、以下の樹脂、例えばＱｉａｇｅｎから入手可能なＮｉ−ＮＴＡ（商標）樹脂、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なＨｉｓＴｒａｐ（商標）樹脂、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＰＯＲＯＳ（商標）ＭＣ樹脂、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なＴＡＬＯＮ樹脂を用いて達成することができる。ＴＡＬＯＮ樹脂を用いることが好ましい。より好ましくは、前記ＩＭＡＣステップを、細胞溶菌に先立って、約１ｇの細胞全体の湿潤重量に対して約２ｍＬの樹脂の比率で樹脂を使用することにより達成する。
【０１０９】
本発明の更なる観点は、ＩＭＡＣ精製中の、夾雑タンパク質除去への、遷移状態アナログ及び金属カチオンの使用を含む。前記ＭＥＫ１ペプチドを発現させるために宿主細胞として大腸菌を用いる場合には、夾雑タンパク質（例えば、大腸菌プロリル異性化酵素）が発酵培養液中に含有されており、好ましくは、この夾雑タンパク質を結晶化の前に除去する。本発明の場合、遷移状態アナログ及び金属カチオンを用いて、ＩＭＡＣ精製のＭＥＫ１結合ステップ及び夾雑物除去ステップの実施中に夾雑タンパク質を置き換える。遷移状態アナログは、例えば、ピロール−２−カルボキシレート、Δ−１−ピロリン−２−カルボキシレート、又はテトラヒドロフラン−２−カルボキシレートであることができる。前記遷移状態アナログは、ピロール−２−カルボキシレートであることが好ましい。前記遷移状態アナログは、もし存在するならば、約０．１ｍＭ〜約２０．０ｍＭの濃度を有し、より好ましくは、約１．０ｍＭの濃度を有する。金属カチオンの源としては、亜鉛カチオンの形を採用することができる。亜鉛カチオンは、任意の塩の形態、例えば酢酸亜鉛、塩化亜鉛又は硫酸亜鉛の形で使用することができる。好ましくは、亜鉛は約０．０５ｍＭの濃度で塩化亜鉛の形で使用する。
【０１１０】
ＩＭＡＣ精製の前記ＭＥＫ１結合ステップ及び夾雑物除去ステップは、適切な緩衝剤の存在下において実施することができる。例えば、前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、Ｔｒｉｓ［トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン］、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、リン酸カリウム、シトレート−ホスフェート、リン酸ナトリウム、第一リン酸アンモニウム、又はＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）であることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、ｐＨ約８．０で約５０．０ｍＭの第一リン酸アンモニウム又は第一リン酸カリウムである。
【０１１１】
ＩＭＡＣ精製の前記結合ステップ及び夾雑物除去ステップは、適切な夾雑タンパク質除去剤［ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ　ａｇｅｎｔ］の存在下において実施することができる。前記夾雑タンパク質除去剤としては、以下に限定されるものでないが、イミダゾール又はヒスチジンであることができる。好ましくは、前記夾雑タンパク質除去剤は、約５．０ｍＭイミダゾールである。
ＩＭＡＣ精製の前記結合ステップ及び夾雑物除去ステップは、適切な還元剤の存在下において実施することができる。前記還元剤は、以下に限定されるものでないが、２−メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシエチルホスフィン］ヒドロクロリド）であることができる。好ましくは、前記還元剤は約２．０ｍＭ−ＴＣＥＰである。
【０１１２】
ＩＭＡＣ精製の前記結合ステップ及び夾雑物除去ステップは、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）の存在下において実施することができる。前記界面活性剤は、以下に限定されるものでないが、ＣＨＡＰＳ〔３−（［３−コルアミドプロピル］−ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスフホネート〕、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、Ｔｗｅｅｎ２０又はＴｗｅｅｎ８０であることができる。好ましくは、前記界面活性剤は、約１０．０ｍＭ−ＣＨＡＰＳである。
ＩＭＡＣ精製の前記結合ステップ及び夾雑物除去ステップは、イオン源の存在下において実施することができる。前記イオン源は、以下に限定されるものでないが、ＫＣｌ、ＮａＣｌ又は硫酸ナトリウムであることができる。好ましくは、前記イオン源は、約０．３Ｍ−ＮａＣｌである。
【０１１３】
ＩＭＡＣ樹脂からのＭＥＫ１の溶離は、当業者に知られたいくつかの様式により達成することができる。例えば、ＩＭＡＣカラムからのＭＥＫ１の溶離は、例えばＥＤＴＡ、ヒスチジン、若しくはイミダゾールを使用することにより、又はｐＨを減少させることにより達成することができる。好ましくは、ＭＥＫ１の溶離は、約１００ｍＭ−ＥＤＴＡを用いて達成することができる。
ＩＭＡＣ精製の溶離ステップは、適切な緩衝剤の存在下において実施することができる。前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、Ｔｒｉｓ、第一リン酸アンモニウム、ＨＥＰＥＳ、又はＭＯＰＳであることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、約２０．０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（又は約８．０のｐＨ）であることができる。ＭＥＫ１の溶離は、適切な任意の有機剤の存在下において実施されていることもできる。前記有機剤は、以下に限定されるものでないが、グリセロール又はエチレングリコールであることができる。好ましくは、前記有機剤は、約１０％のグリセロールである。
【０１１４】
また、本発明は、カチオン及びアニオン交換クロマトグラフィーを用いて、次いでゲルろ過クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＳＥＣ）によって、タンパク質を更に精製するための方法を提供する。カチオン交換クロマトグラフィーをアニオン交換クロマトグラフィーの前に実施するか、あるいはアニオン交換クロマトグラフィーを陽イオンカチオン交換クロマトグラフィーの前に実施することができる。更に、イオン交換ステップは、全て一緒に削除することもできる。好ましい方法は、アニオン交換ステップの前にカチオン交換ステップ（これには、タンパク質濃縮とゲルろ過クロマトグラフィーが続く）を実施することである。
【０１１５】
前記カチオン交換ステップは、いくつかのタイプのクロマトグラフィー樹脂を使用して実施することができる。例えば、カチオン交換樹脂は、以下に限定されるものでないが、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＭｏｎｏＳ（商標）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＳ、又はＰＯＲＯＳ（商標）Ｓであることができる。好ましくは、前記カチオン交換樹脂は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＳである。前記カチオン交換ステップは、適切な任意の緩衝剤の存在下において実施することができる。前記緩衝剤としては、以下に限定されるものでないが、リン酸塩、マロン酸、ブタンジオ酸、酢酸、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、又はＨＥＰＥＳを挙げることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、約２０．０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ約６．４）である。
前記カチオン交換ステップは、適切な任意の還元剤の存在下において実施することができる。前記還元剤は、以下に限定されるものでないが、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ、又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）であることができる。好ましくは、前記還元剤は、約２．０ｍＭのＴＣＥＰである。
【０１１６】
前記カチオン交換ステップは、適切な有機剤の存在下において実施することができる。前記有機剤は、以下に限定されるものでないが、グリセロール又はエチレングリコールであることができる。好ましくは、前記有機剤は約２０．０％のエチレングリコールである。
カチオン交換樹脂からの前記ＭＥＫ１の溶離は、当業者に知られた種々異なる様式により達成することができる。例えば、ＭＥＫ１は、ｐＨを増加させることにより溶離することができる。あるいは、ＭＥＫ１は、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸アンモニウム、又は硫酸ナトリウムを使用することにより塩濃度を増加させることによって溶離することもできる。好ましくは、酢酸アンモニウムを用いて塩濃度を増加させることにより、溶離を引き起こすことができる。
前記陰イオン交換ステップは、いくつかのタイプのクロマトグラフィー樹脂を使用して実施することができる。前記陰イオン交換樹脂は、以下に限定されるものでないが、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＭｏｎｏＱ（登録商標）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＱ、又はＰＯＲＯＳ（登録商標）ＰＩであることができる。好ましくは、前記交換樹脂は、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＱである。
【０１１７】
陰イオン交換ステップは、適切な緩衝剤の存在下において実施することができる。前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓプロパン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、ピペラジン、又は第一リン酸アンモニウムであることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、約２０．０ｍＭのＴｒｉｓ（約８．０のｐＨ）である。
陰イオン前記アニオン交換ステップは、適切な還元剤の存在下において実施することができる。前記還元剤は、以下に限定されるものでないが、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ、又はＤＴＴであることができる。好ましくは、前記還元剤は約２．０ｍＭのＴＣＥＰである。
陰イオン前記アニオン交換ステップは、適切な塩の存在下において実施することができる。前記塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムであることができる。好ましくは、前記塩は、約１０．０ｍＭの酢酸アンモニウムである。
【０１１８】
前記ＳＥＣステップは、種々のタイプのクロマトグラフィー樹脂を使用して実施することができる。例えば、適切なＳＥＣ樹脂としては、以下に限定されるものでないが、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−１００、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２００、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−１００、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−２００、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５、又はＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００を挙げることができる。好ましくは、前記ＳＥＣ樹脂は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００である。
前記ＳＥＣステップは、適切な緩衝剤の存在下において実施することができる。前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓ、又はビス−Ｔｒｉｓプロパンである。好ましくは、前記緩衝剤は、約２０．０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ約７．５）である。
【０１１９】
前記ＳＥＣステップは、適切な任意の還元剤の存在下において実施することができる。前記還元剤は、以下に限定されるものでないが、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ、又はＤＴＴであることができる。好ましくは、前記還元剤は、約２．０ｍＭのＴＣＥＰである。
前記ＳＥＣステップは、適切な任意の塩の存在下において実施することができる。前記塩は、以下に限定されるものでないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸アンモニウム、又は硫酸ナトリウムであることができる。好ましくは、前記塩は、約１５０．０ｍＭの酢酸アンモニウムである。
前記ＳＥＣステップは、適切な任意のキレート剤の存在下において実施することができる。前記キレート剤は、以下に限定されるものでないが、クエン酸ナトリウム又はＥＤＴＡであることができる。好ましくは、前記塩は約０．５ｍＭのＥＤＴＡである。
【０１２０】
また、本発明は、ＭＥＫ１：リガンドの複合体の形成方法も提供する。前記ＭＥＫ１：リガンドの複合体の形成は、ＭＥＫ１精製のいかなる点で実施されていることもできる。好ましくは前記ＭＥＫ１：リガンド複合体形成ステップは、前記ＳＥＣステップに先立って実施することができる。あるいは、ＭＥＫ１：リガンドの複合体形成ステップは、タンパク質が完全に精製された後で実施することもできる。ＭＥＫ１：リガンドの複合体形成ステップは、ＭＥＫ１の種々の濃度で実施することができる。例えば、ＭＥＫ１の濃度は、約０．０２ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの範囲であることができる。好ましくは、ＭＥＫ１の濃度は、約０．２ｍｇ／ｍＬ〜約０．３ｍｇ／ｍＬの範囲である。更に、ＭＥＫ１：リガンドの複合体形成ステップは、リガンドに対するＭＥＫ１の種々のモル比で実施することができる。例えば、ＭＥＫ１：リガンドのモル比は、約１：１〜約１：１０００であることができる。好ましくは、ＭＥＫ１：リガンドのモル比は、約１：１〜約１：１０である。
【０１２１】
〈修飾ＭＥＫ２の精製〉
また、本発明は、本明細書中に記載した修飾ＭＥＫ２ペプチドをほぼ均質状態に精製するための、複数のステップからなる方法も提供する。前記修飾ＭＥＫ２ペプチド、好ましくはＣＯＯＨ−末端にポリ−ヒスチジン・タグを有するＭＥＫ２ペプチドを、固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて、有利に精製することができる。前記固定化金属は、例えば、ニッケル、亜鉛、コバルト又は銅であることができる。前記固定化金属は、Ｃｌｏｎ　Ｔｅｃｈから市販されているＴＡＬＯＮ（商標）金属親和性樹脂に見出されるようなコバルトであることが好ましい。前記ＩＭＡＣステップは、発現したＭＥＫ２ペプチド（このＭＥＫ２ペプチドは、宿主細胞溶菌後に得られる）を含有する発酵培養液の可溶性画分上で実施することができる。宿主細胞溶菌プロセスは、当業者に知られており、当業者は困難なく選択することができる。例えば、ＭＥＫ２ペプチドを発現させるための宿主細胞として大腸菌が使用される場合、大腸菌細胞溶菌は酵素的に、例えばリゾチームの使用により実施することができる。あるいは、フレンチプレス、ソニケータ、又はビード・ミルを使用した機械的プロセスを用いることもできる。ビード・ミル（ＤｙｎｏＭｉｌｌ　ＫＤＬ）を使用した機械的溶菌を用いて、大腸菌細胞溶菌を実施することが好ましい。
【０１２２】
修飾ＭＥＫ２ペプチド、好ましくはＣＯＯＨ末端にＨｉｓタグを含有するＭＥＫ２ペプチドは、固定化金属キレート（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーによって精製することができる。前記ＩＭＡＣステップは、例えば以下の樹脂、例えばＱｉａｇｅｎから入手可能なＮｉ−ＮＴＡ（商標）樹脂、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なＨｉｓＴｒａｐ（商標）樹脂、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＰＯＲＯＳ（商標）ＭＣ樹脂、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なＴＡＬＯＮ樹脂を用いて達成することができる。ＴＡＬＯＮ樹脂を使用することが好ましい。より好ましくは、前記ＩＭＡＣステップを、細胞溶菌に先立って、約５ｇの細胞全体の湿潤重量に対して約１ｍＬの樹脂の比率で樹脂を使用することにより達成する。
【０１２３】
本発明の更なる観点は、ＩＭＡＣ精製中の、夾雑タンパク質の除去への、遷移状態アナログ及び金属の使用を含む。前記ＭＥＫ２ペプチドを発現させるために、宿主細胞として大腸菌を用いる場合には、夾雑タンパク質〈例えば、大腸菌プロリル異性化酵素〉が、その発酵培養液中に含まれており、そして好ましくは、この夾雑タンパク質を、結晶化の前に除去する。本発明の場合、遷移状態アナログ及び二価金属カチオンを用いて、ＩＭＡＣ精製のＭＥＫ２結合ステップ及び夾雑物除去ステップの実施中に夾雑タンパク質を置き換える。前記遷移状態アナログは、例えば、ピロール−２−カルボキシレート、Δ−１−ピロリン−２−カルボキシレート、又はテトラヒドロフラン−２−カルボキシレートであることができる。前記遷移状態アナログは、ピロール−２−カルボキシレートであることが好ましい。前記遷移状態アナログは、もし存在するならば、約０．１ｍＭ〜約２０．０ｍＭの濃度を有し、より好ましくは、約１．０ｍＭの濃度を有する。二価金属カチオンとしては、亜鉛を用いることができる。亜鉛カチオンは、任意の塩の形態、例えば酢酸亜鉛、塩化亜鉛又は硫酸亜鉛の形態で使用することができる。好ましくは、亜鉛は約０．０５ｍＭの濃度で塩化亜鉛の形で使用する。
【０１２４】
ＩＭＡＣ精製の前記ＭＥＫ２結合ステップ及び夾雑物除去ステップは、適切な緩衝剤の存在下において実施することができる。例えば、前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、Ｔｒｉｓ［トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン］、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、リン酸カリウム、シトレート−ホスフェート、リン酸ナトリウム、又はＭＯＰＳ〔３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸〕であることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、ｐＨ約８．０の約５０．０ｍＭリン酸カリウムである。
ＩＭＡＣ精製の前記結合ステップ及び夾雑物除去ステップは、適切な夾雑タンパク質除去剤の存在下において実施することができる。夾雑タンパク質除去剤は、以下に限定されるものでないが、イミダゾール又はヒスチジンであることができる。好ましくは、夾雑タンパク質除去剤は約５．０ｍＭのイミダゾールである。
【０１２５】
ＩＭＡＣ精製の前記結合ステップ及び夾雑物除去ステップは、適切な還元剤の存在下において実施することができる。前記還元剤は、以下に限定されるものでないが、２−メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシエチルホスフィン］ヒドロクロリド）であることができる。好ましくは、前記還元剤は、約２．０ｍＭのＴＣＥＰである。
ＩＭＡＣ精製の前記結合ステップ及び夾雑物除去ステップは、界面活性剤の存在下において実施することができる。界面活性剤は、以下に限定されるものでないが、ＣＨＡＰＳ〔３−（［３−コルアミドプロピル］−ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスフホネート〕、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、Ｔｗｅｅｎ２０、又はＴｗｅｅｎ８０であることができる。好ましくは、前記界面活性剤は、約１０．０ｍＭのＣＨＡＰＳである。
ＩＭＡＣ精製の前記結合ステップ及び夾雑物除去ステップは、イオン源の存在下において実施することができる。前記イオン源は、以下に限定されるものでないが、ＫＣｌ、ＮａＣｌ又は硫酸ナトリウムであることができる。好ましくは、イオン源は、約０．３ＭのＮａＣｌである。
【０１２６】
ＩＭＡＣ樹脂からのＭＥＫ２の溶離は、当業者に知られたいくつかの様式により達成することができる。例えば、ＩＭＡＣカラムからのＭＥＫ２の溶離は、例えばＥＤＴＡ、ヒスチジン、若しくはイミダゾールを使用することにより、又はｐＨを減少させることにより達成することができる。好ましくは、ＭＥＫ２の溶離を、約０．１ＭのＥＤＴＡで達成することができる。
ＩＭＡＣ精製の溶離ステップは、適切な緩衝剤の存在下において実施することができる。前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、又はＭＯＰＳであることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、約２０．０ｍＭのＨＥＰＥＳ（約８．０のｐＨ）であることができる。ＭＥＫ２の溶離は、適切な任意の有機剤の存在下において実施することもできる。前記有機剤は、以下に限定されるものでないが、グリセロール又はエチレングリコールであることができる。好ましくは、前記有機剤は、約１０％グリセロールである。
【０１２７】
また、本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーを用い、次いでタンパク質の濃縮とゲルろ過クロマトグラフィー（ＳＥＣ）とによって、タンパク質を更に精製する方法も提供する。
前記カチオン交換ステップは、いくつかのタイプのクロマトグラフィー樹脂を使用して実施することができる。例えば、前記カチオン交換樹脂は、以下に限定されるものでないが、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＭｏｎｏＳ（商標）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＳ、又はＰＯＲＯＳ（商標）Ｓであることができる。好ましくは、カチオン交換樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＨＳである。カチオン交換ステップは、適切な緩衝剤の存在下において実施することができる。前記緩衝剤としては、以下に限定されるものでないが、リン酸塩、マロン酸、ブタンジオ酸、酢酸、ＭＥＳ〔２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸〕、又はＨＥＰＥＳを挙げることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、約２０．０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ約６．４）である。
【０１２８】
前記カチオン交換ステップは、適切な任意の還元剤の存在下において実施することができる。前記還元剤は、以下に限定されるものでないが、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ、又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）であることができる。好ましくは、前記還元剤は、約２．０ｍＭのＴＣＥＰである。
前記カチオン交換ステップは、適切な有機剤の存在下において実施することができる。前記有機剤は、以下に限定されるものでないが、グリセロール又はエチレングリコールであることができる。好ましくは、前記有機剤は約２０．０％のエチレングリコールである。
カチオン交換樹脂からの前記ＭＥＫ２の溶離は、当業者に知られた種々異なる様式により達成することができる。例えばＭＥＫ２は、ｐＨを増加させることにより溶離することができる。あるいはＭＥＫ２は、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムを使用することにより塩濃度を増加させることにより溶離されていることもできる。好ましくは、酢酸アンモニウムを用いて塩濃度を増加させることにより、溶離を引き起こすことができる。
【０１２９】
前記ＳＥＣステップは、種々のタイプのクロマトグラフィー樹脂を使用して実施することができる。例えば適切なＳＥＣ樹脂としては、以下に限定されるものでないが、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−１００、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２００、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−１００、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−２００、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５又はＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００を挙げることができる。好ましくは、ＳＥＣ樹脂はＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００である。
前記ＳＥＣステップは、適切な任意の緩衝剤の存在下において実施することができる。前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓ、又はビス−Ｔｒｉｓプロパンである。好ましくは、緩衝剤は約２０．０ｍＭのＨＥＰＥＳ（約７．５のｐＨ）である。
【０１３０】
前記ＳＥＣステップは、適切な還元剤の存在下において実施することができる。還元剤は、以下に限定されるものでないが、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ、又はＤＴＴであることができる。好ましくは、前記還元剤は、約２．０ｍＭのＴＣＥＰである。
前記ＳＥＣステップは、適切な塩の存在下において実施することができる。塩は、以下に限定されるものでないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムであることができる。好ましくは、塩は、約１５０．０ｍＭの酢酸アンモニウムである。
前記ＳＥＣステップは、適切なキレート剤の存在下において実施することができる。キレート剤は、以下に限定されるものでないが、クエン酸ナトリウム又はＥＤＴＡであることができる。好ましくは、塩は約０．１ｍＭのＥＤＴＡである。
【０１３１】
また、本発明は、ＭＥＫ２：リガンドの複合体の形成方法も提供する。前記ＭＥＫ２：リガンドの複合体の形成は、ＭＥＫ２精製のいかなる点で実施されていることもできる。好ましくはＭＥＫ２：リガンドの複合体形成ステップは、ＳＥＣステップに続いて実施することができる。あるいは、ＭＥＫ２：リガンドの複合体形成ステップは、ＳＥＣステップに先立って実施することもできる。ＭＥＫ２：リガンドの複合体形成ステップは、種々の濃度のＭＥＫ２を使用して実施することができる。例えば、ＭＥＫ２の濃度は、約０．０２ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの範囲であることができる。好ましくは、ＭＥＫ２の濃度は、約０．２ｍｇ／ｍＬ〜約０．３ｍｇ／ｍＬの範囲である。更に、ＭＥＫ２：リガンドの複合体形成ステップは、リガンドに対するＭＥＫ２の種々のモル比で実施することができる。例えば、ＭＥＫ２：リガンドのモル比は、約１：１〜約１：１０００であることができる。好ましくは、ＭＥＫ２：リガンドのモル比は、約１：１〜約１：１０である。
【０１３２】
《修飾ＭＥＫ１ペプチド複合体及び修飾ＭＥＫ２ペプチド複合体の結晶化》
本発明は、更に、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶を成長させるための、修飾ＭＥＫ１及び修飾ＭＥＫ２ペプチド（例えば、ＮＨ２トランケートしたＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドの使用方法を包含する。本明細書中に挙げた結晶化の条件及び方法は、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶化に用いられるアプローチの１つを説明するために提供するものである。当然のことながら、当業者には、本明細書中に記載した修飾ＭＥＫ１タンパク質の結晶化に適した他の結晶化及び技術が明らかである。例えば、「ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。
【０１３３】
《修飾ＭＥＫ１ペプチド複合体の結晶化》
一般に、修飾ＭＥＫ１ペプチド複合体の結晶化は、ＮＨ２トランケートしたＭＥＫ１ペプチドをリガンド及び補因子と接触させてＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子からなる安定的な３成分複合体を形成することと、次いでこの３成分複合体の溶液を、沈殿剤溶液に添加することにより、ＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶を成長させることとからなる。例えば、ＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶を生成するために、前記ＭＥＫ１ペプチドとリガンドと補因子とを含む溶液（ＭＥＫ１溶液）及び沈殿剤溶液を含有する溶液を用意する。ＭＥＫ１溶液中のＭＥＫ１の濃度は、約２ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１５ｍｇ／ｍＬである。リガンドの濃度はＭＥＫ１の濃度の約２倍〜約２０倍過剰であり、好ましくは、ＭＥＫ１の濃度の約５倍〜約１５倍過剰であり、より好ましくは約１０倍過剰である。ＭＥＫ１溶液中の補因子の濃度は約１ｍＭ〜約１００ｍＭであり、好ましくは約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭであり、より好ましくは約５ｍＭである。
補因子としては、以下に限定されるものでないが、ＡＴＰカチオン、非加水分解性［ｎｏｎ−ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ］ＡＴＰアナログ、例えばＡＭＰ−ＰＮＰ（アデニリル−イミドジホスフェート）又はＡＴＰ−ガンマ−Ｓ（アデノシン５’−Ｏ−３−チオトリホスフェート）を挙げることができる。ＡＴＰカチオンとしては、以下に限定されるものでないが、ＡＴＰのリチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、又はカリウム塩を挙げることができる。好ましくは、前記ＡＴＰカチオンは、ＡＴＰのナトリウム塩又はマグネシウム塩である。より好ましくは、前記ＡＴＰカチオンは、ＡＴＰのマグネシウム塩（Ｍｇ−ＡＴＰ）である。
【０１３４】
前記ＭＥＫ１溶液は、以下に限定されるものでないが、ＭＥＫ１、リガンド、補因子、緩衝剤、還元剤、及びイオン強度源を含むことができる。タンパク質、リガンド、及び補因子の濃度は前記の通りである。前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、リン酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓ、又はビス−Ｔｒｉｓプロパンであることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、濃度約１０ｍＭ〜約１００ｍＭで、ｐＨ値約６．８〜約８．８のＨＥＰＥＳである。より好ましくは、前記緩衝剤は、約２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）である。前記還元剤は、以下に限定されるものでないが、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ、又はＤＴＴであることができる。好ましくは、前記還元剤は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度のＴＣＥＰである。より好ましくは、前記還元剤は、約２．０ｍＭのＴＣＥＰである。前記ＭＥＫ１溶液は、イオン強度源として塩を含有することができる。前記塩は、以下に限定されるものでないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸アンモニウム、又は硫酸ナトリウムであることができる。好ましくは、前記塩は、濃度約５ｍＭ〜約５００ｍＭの酢酸アンモニウムである。より好ましくは、前記塩は、約１５０ｍＭの酢酸アンモニウムである。
前記ＭＥＫ１溶液は、場合により、適切なキレート剤を含有することができる。前記キレート剤は、クエン酸ナトリウムであることができる。前記ＭＥＫ１溶液がキレート剤を含有する場合、キレート剤として、約０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用することが好ましい。
【０１３５】
更に、ＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶化には、任意の沈殿剤溶液（「ＭＥＫ１沈殿剤溶液」）も使用することができる。前記のＭＥＫ１溶液と混合される場合には、その沈殿剤溶液により、その３成分複合体が良好に回折する結晶を形成するようになることが好ましい。前記ＭＥＫ１沈殿剤溶液は、ＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子の複合体の形成を安定化するように構成された種々の成分からなる。例えば、前記沈殿剤溶液は、以下に限定されるものでないが、イオン強度源、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）源、緩衝剤、及び還元剤を含むことができる。
【０１３６】
ＭＥＫ１沈殿剤溶液の前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、リン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、イミダゾール、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、又はビス−Ｔｒｉｓプロパン、あるいはこれらの組み合わせであることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、イミダゾール／リンゴ酸塩／リン酸塩緩衝液の混合緩衝系である。前記緩衝液の濃度は、イミダゾールに関しては約１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲であることができ、リンゴ酸塩に関しては約１０ｍＭ〜約１０００ｍＭの範囲であることができ、リン酸塩に関しては約４０ｍＭ〜約１４００ｍＭであることができる。前記混合緩衝系は、ｐＨ約３．０〜ｐＨ約７．０のｐＨ値を有することができる。リン酸塩緩衝液の場合、第一リン酸アンモニウムを使用することが好ましい。最も好ましくは、前記混合緩衝系は、約１０ｍＭのイミダゾールと、約１００ｍＭのリンゴ酸塩と、約４００ｍＭのリン酸アンモニウムとを含み、約４．５〜約５．５のｐＨ値を有する。
【０１３７】
ＭＥＫ１沈殿剤溶液のイオン強度源は、以下に限定されるものでないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、リン酸アンモニウム、又はリン酸カリウムナトリウムであることができる。ＭＥＫ１沈殿剤溶液の混合緩衝系は、イオン強度源として役立つことができる。好ましくは、第一リン酸アンモニウムを、ｐＨ調節せずに、１００〜１０００ｍＭの濃度又はより好ましくは２００〜６００ｍＭの濃度まで、ＫＯＨ５０％（ｖ／ｖ）溶液でｐＨ値をｐＨ７．０に調節した１０ｍＭイミダゾール／１００ｍＭリンゴ酸塩の酸性緩衝液に添加する。その結果として生じる溶液は、適切なイオン強度と、約４．５〜約５．５のｐＨの範囲の最終ｐＨ値とを有することが好ましい。
【０１３８】
また、前記ＭＥＫ１沈殿剤溶液は、適切な任意の還元剤も含有することができる。前記還元剤としては、以下に限定されるものでないが、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度の２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ又はＤＴＴを挙げることができる。好ましくは、ＤＴＴを使用することができる。最も好ましくは、約２０ｍＭのＤＴＴを、使用することができる。
【０１３９】
ＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶を成長させるには多くの方法を用いることができ、例えば、以下に限定されるものでないが、ハンギング・ドロップ蒸気拡散、シッティング・ドロップ蒸気拡散、マイクロバッチ、バッチ、又はゲル若しくは油における相互拡散を挙げることができる。好ましくは、前記結晶化を、ハンギング・ドロップ蒸気拡散法で実施することができる。ＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子の結晶の成長にハンギング・ドロップ蒸気拡散法を用いる場合には、前記ＭＥＫ１溶液をＭＥＫ１沈殿剤溶液の液滴と混合する。次いで、混合された液滴溶液を、密封容器内の１ウェルの沈殿剤溶液の上で浮遊させる。例えば、ＭＥＫ１溶液約１μＬを、約１：４〜約４：１の比率、好ましくは約１：２〜約２：１の比率で、前記ＭＥＫ１沈殿剤溶液と混合する。より好ましくは、前記ＭＥＫ１溶液の前記ＭＥＫ１沈殿剤溶液に対する比率は、約１：１である。或る態様では、混合された前記液滴は、沈殿剤溶液０．６ｍＬ〜１．２ｍＬ、より好ましくは約１．０ｍＬを含有するウェル溶液の上で浮遊させすることができる。その結晶化温度は、約４℃〜約２０℃、好ましくは約１３℃であり、より好ましくは、前記結晶を１３℃で３〜５日間成長させ、次いで室温に移す。
【０１４０】
前記ＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子の結晶が、結晶学的データ収集に適した大きさ、好ましくは約０．０５ｘ約０．０５ｘ約０．１ｍｍ〜約０．３ｘ約０．３ｘ約０．５ｍｍに達するまで、前記混合液滴溶液は、前記の温度で約５日〜約５週間、ＭＥＫ１沈殿剤溶液を含有するウェル溶液の上で浮遊状態で放置する。
Ｘ線回折品質を有する結晶、すなわち、５．０Åを上回る分解能まで回折するようになる結晶を得るために、標準的なミクロ及び／又はマクロシーディング［ｓｅｅｄｉｎｇ］を用いることもできる。好ましい態様では、回折品質結晶を成長させるのに、シーディングを用いない。
【０１４１】
所望の成長が達成された後、ＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子の複合体からなる結晶を収集し、そして凍結保護溶液［ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ］中で浴処理することができる。前記凍結保護溶液は、約１１０ケルビンの温度で結晶性固体としてＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子の複合体を含有するガラス質固体の構成を安定化するように設計された種々の成分を含有することができる。前記凍結保護溶液は、以下に限定されるものでないが、エチレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の低分子量溶液の適切な供給源、稀釈剤、及び約７０％のパラトン（Ｐａｒａｔｏｎｅ）−Ｎ油と３０％の鉱油とから形成された低温油［Ｃｒｙｏ　ｏｉｌ］溶液を含むことができる。エチレングリコール又はポリエチレングリコールの前記低分子量溶液は、約１００〜約１０００、より好ましくは約２００〜６００の分子量を有することができ、最も好ましくは、エチレングリコールの１００％溶液を使用する。前記エチレングリコール又はＰＥＧは、１００％（ｗ／ｖ）溶液として使用し、次いで結晶化ウェル溶液で５〜２５％の最終濃度に稀釈することができる。最も好ましくは、前記ＰＥＧ溶液は、ウェル溶液で１０％の最終濃度にする。前記低温調製プロセスの間、前記結晶を、先ず母液から取り出し、次いで１０％ＰＥＧ溶液中で１〜２０分間浴処理する。最も好ましくは、前記結晶を、ＰＥＧ／ウェル溶液中に約２分間置くことであろう。次いで、前記結晶を、パラトン−Ｎと鉱油との混合物に移し、そして油中で操作して水溶液を取り除いた後に、その凍結保護された結晶を素早く液体窒素浴中に入れることができる。
【０１４２】
ＮＨ２トランケートしたＭＥＫ１ペプチドには、任意のリガンドを使用することができるが、好ましくは、前記リガンドは、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２インヒビターを含む。好ましくは、前記リガンドは、式：
【化１】
2004000135.tif 000003
で表される化学構造を有する５−ブロモ−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドである。
【０１４３】
本発明の結晶は種々の結晶形態をとることができる。これらの結晶形態の全てが本発明に含まれる。或る態様の場合、前記結晶は、三斜晶系、単斜晶系、斜方晶系、正方晶系、立方晶系、三方晶系、又は六方晶系であることができる。好ましい態様では、前記結晶は、六方晶系である。より好ましい態様では、前記結晶は、六方晶系の対称性を有し、そして空間群Ｐ６２を有する。最も好ましい態様の場合、結晶は空間群Ｐ６２を有し、おおよそａ＝ｂ＝８１．４±０．３Å；ｃ＝１２９．０±０．３Å；α＝β＝９０．０°；γ＝１２０．０°からなる単位格子［ｕｎｉｔ　ｃｅｌｌ］を有する。
【０１４４】
《修飾ＭＥＫ２ペプチド複合体の結晶化》
一般に、修飾ＭＥＫ２ペプチド複合体の結晶化は、ＮＨ２トランケートしたＭＥＫ２ペプチドをリガンド及び補因子と接触させて、ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子からなる安定的な３成分複合体を形成することと、次いでこの３成分複合体の溶液を沈殿剤溶液に添加することにより、ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶を成長させることとからなる。例えば、ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶を生成するために、前記ＭＥＫ２ペプチドとリガンドと補因子とを含有する溶液（ＭＥＫ２溶液）及び沈殿剤溶液を用意する。ＭＥＫ２溶液中のＭＥＫ２の濃度は、約２ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１５ｍｇ／ｍＬである。リガンドの濃度はＭＥＫ２の濃度の約２倍〜約２０倍過剰であり、好ましくは、ＭＥＫ２の濃度の約５倍〜約１５倍過剰であり、より好ましくは約１０倍過剰である。ＭＥＫ２溶液中の補因子の濃度は約１ｍＭ〜約１００ｍＭであり、好ましくは約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭであり、より好ましくは約５ｍＭである。
【０１４５】
補因子としては、以下に限定されるものでないが、ＡＴＰカチオン、非加水分解性ＡＴＰアナログ、例えばＡＭＰ−ＰＮＰ（アデニリル−イミドジホスフェート）又はＡＴＰ−ガンマ−Ｓ（アデノシン５’−Ｏ−３−チオトリホスフェート）を挙げることができる。ＡＴＰカチオンとしては、以下に限定されるものでないが、ＡＴＰのリチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、又はカリウム塩を挙げることができる。好ましくは、ＡＴＰカチオンは、ＡＴＰのナトリウム塩又はマグネシウム塩である。より好ましくは、ＡＴＰカチオンは、ＡＴＰのマグネシウム塩（「Ｍｇ−ＡＴＰ」）である。
【０１４６】
前記ＭＥＫ２溶液は、以下に限定されるものでないが、ＭＥＫ２、リガンド、補因子、緩衝剤、還元剤、及びイオン強度源を含むことができる。タンパク質、リガンド、及び補因子の濃度は前記の通りである。前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、リン酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓ、又はビス−Ｔｒｉｓプロパンであることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、濃度約１０ｍＭ〜約１００ｍＭで、ｐＨ値約６．８〜約８．８のＨＥＰＥＳである。より好ましくは、前記緩衝剤は、約２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）である。前記還元剤は、以下に限定されるものでないが、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ、又はＤＴＴであることができる。好ましくは、前記還元剤は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度のＴＣＥＰである。より好ましくは、前記還元剤は、約２．０ｍＭのＴＣＥＰである。前記ＭＥＫ２溶液は、イオン強度源として塩を含有することができる。前記塩は、以下に限定されるものでないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムであることができる。好ましくは、前記塩は、濃度約５ｍＭ〜約５００ｍＭの酢酸アンモニウムである。より好ましくは、前記塩は、約１５０ｍＭの酢酸アンモニウムである。
前記ＭＥＫ２溶液は、場合により、適切なキレート剤を含有することができる。前記キレート剤は、クエン酸ナトリウムであることができる。前記ＭＥＫ２溶液がキレート剤を含有する場合、キレート剤として、約０．１ｍＭのＥＤＴＡを使用することが好ましい。
更に、ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶化には、任意の沈殿剤溶液（「ＭＥＫ２沈殿剤溶液」）も使用することができる。前記のＭＥＫ２溶液と混合される場合には、その沈殿剤溶液により、その３成分複合体が良好に回折する結晶を形成するようになることが好ましい。前記ＭＥＫ２沈殿剤溶液は、ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体の形成を安定化するように構成された種々の成分からなる。例えば、前記沈殿剤溶液は、以下に限定されるものでないが、イオン強度源、緩衝剤、及び還元剤を含むことができる。
【０１４７】
ＭＥＫ２沈殿剤溶液の前記緩衝剤は、以下に限定されるものでないが、リン酸ナトリウム／カリウム、リン酸アンモニウム、酢酸塩、イミダゾール、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、又はビス−Ｔｒｉｓプロパン、あるいはこれらの組み合わせであることができる。好ましくは、前記緩衝剤は、第一リン酸ナトリウムと第二リン酸カリウムとのｐＨ約６〜約８に緩衝化された混合溶液を用いたイオン強度源でもある。前記リン酸カリウムナトリウム緩衝液の濃度は、好ましくは、約１．４〜約１．９Ｍの範囲の第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸カリウムであることができる。最も好ましくは、前記混合リン酸塩緩衝系は、ｐＨ約６．７〜約７．１に緩衝化された、約１．４〜約１．９Ｍの範囲の第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸カリウムであることができる。
【０１４８】
また、前記ＭＥＫ２沈殿剤溶液は、適切な任意の還元剤も含有することができる。前記還元剤としては、以下に限定されるものでないが、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度の２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ、又はＤＴＴであることができる。好ましくは、ＤＴＴを使用することができる。最も好ましくは、約２０ｍＭのＤＴＴを使用することができる。
ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶を成長させるには多くの方法を用いることができる。この方法としては、以下に限定されるものでないが、ハンギング・ドロップ蒸気拡散、シッティング・ドロップ蒸気拡散、マイクロバッチ、バッチ、又はゲル若しくは油における相互拡散を挙げることができる。好ましくは、前記結晶化を、ハンギング・ドロップ蒸気拡散法で実施することができる。ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の結晶を成長させるためにハンギング・ドロップ蒸気拡散法を用いる場合には、前記ＭＥＫ２溶液をＭＥＫ２沈殿剤溶液の液滴と混合する。次いで、混合された液滴溶液を、密封容器内の１ウェルの沈殿剤溶液の上で浮遊させる。例えば、ＭＥＫ２溶液約１μＬを、約１：４〜約４：１の比率、好ましくは約１：２〜約２：１の比率で、前記ＭＥＫ２沈殿剤溶液と混合する。より好ましくは、前記ＭＥＫ２溶液の前記ＭＥＫ２沈殿剤溶液に対する比率は、約１：１である。或る態様では、混合された液滴は、０．６ｍＬ〜１．２ｍＬ、より好ましくは１．０ｍＬの沈殿剤溶液を含有する、１ウェル溶液の上で浮遊させることができる。その結晶化温度は、約４℃〜約２０℃、好ましくは約１３℃であることができる。ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の結晶が、結晶学的データ収集に適した大きさ、好ましくは約０．０５ｘ約０．０５ｘ約０．１ｍｍ〜約０．３ｘ約０．３ｘ約０．５ｍｍに達するまで、前記混合液滴溶液は、前記の温度で約５日〜約５週間、ＭＥＫ２沈殿剤溶液を含有するウェル溶液の上で浮遊状態で放置する。
【０１４９】
Ｘ線回折品質を有する結晶、すなわち、５．０Åを上回る分解能まで回折するようになる結晶を得るために、標準的なミクロ及び／又はマクロのシーディングを用いることもできる。好ましい態様では、回折品質結晶を成長させるのに、シーディングを用いない。
所望の成長が達成された後、ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体からなる結晶を収集し、そして凍結保護溶液中で浴処理することができる。前記凍結保護溶液は、約１１０ケルビンの温度で結晶性固体としてＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体を含有するガラス質固体の構成を安定化するように設計された種々の成分を含むことができる。前記低温溶液は、以下に限定されるものでないが、低分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール又はエチレングリコール、及び／又は約７０％パラトン−Ｎ油と３０％鉱油とから形成された低温油の溶液を含むことができる。ＭＥＫ１で行ったように、エチレングリコールをパラトン−Ｎと鉱油との混合物と組み合わせることにより、あるいはパラトン−Ｎ／鉱油混合物又はエチレングリコールを別々に使用することにより、前記低温溶液を使用することができる。好ましい形態では、前記エチレングリコールは、エチレングリコールの１００％溶液を前記結晶化条件からの前記ウェル溶液と混合することにより形成されたものを、約５〜３０％の濃度で使用した。最も好ましい形態では、取り付けられたループを用いて、前記母液結晶成長溶液からパラトン−Ｎと鉱油との前記混合物に結晶を直接移し、そして油中で操作して水溶液を取り除いた後に、凍結保護された結晶を素早く液体窒素浴中に入れることができる。
【０１５０】
ＮＨ２トランケートしたＭＥＫ２ペプチドには、任意のリガンドを使用することができるが、好ましくは、前記リガンドは、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２インヒビターを含む。好ましくは、前記リガンドは、式：
【化２】
2004000135.tif 000004
で表される化学構造を有する｛５−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル｝−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミンである。
【０１５１】
本発明の結晶は種々の結晶形態をとることができる。これらの結晶形態の全てが本発明に含まれる。或る態様の場合、前記結晶は、三斜晶系、単斜晶系、斜方晶系、正方晶系、立方晶系、三方晶系、又は六方晶系であることができる。好ましい態様では、前記結晶は、六方晶系である。より好ましい態様では、結晶は、六方晶系の対称性を有し、空間群Ｐ６１２２を有する。最も好ましい態様の場合、前記結晶は、空間群Ｐ６１２２を有し、ほぼａ＝ｂ＝１６１．８９±０．３Å；ｃ＝１２２．９９±０．３Å；α＝β＝９０．０°；γ＝１２０．０°からなる単位格子を有する。
【０１５２】
《Ｘ線データ収集及び構造決定》
本発明は、更に、前記ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の結晶に関するＸ線回折データを収集する方法を含む。本明細書中に挙げたデータ収集の条件及び方法は、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチドの構造決定に用いられるアプローチを説明するために提供するものである。当然のことながら、本明細書に記載した修飾ＭＥＫ１又は修飾ＭＥＫ２タンパク質結晶のＸ線データ収集及び構造決定に適した他の条件や技術が、当業者には明らかである。例えば、「Ｇｌｕｓｋｅｒ，Ｊ．，Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＰｒｅｓｓ（１９９４）」、又は「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｔａｂｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｘ−Ｒａｙ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，第Ｆ巻，Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｓｍａｎ及びＥ．Ａｒｎｏｌｄ編，Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００１）」を参照されたい。
【０１５３】
一般に、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体の結晶に関するＸ線回折データを収集することは、低温ループに結晶を載置し、凍結保護溶液中で前記結晶を浴処理し、前記結晶を約１００Ｋに急速に冷却し、及び振動方式で回折データを収集することを含む。Ｘ線の供給源は、以下に限定されるものでないが、回転陽極ホームソース、例えばＲｉｋａｇｕ　ＲＵ−Ｈ３Ｒジェネレータ、又は高エネルギーシンクロトロン供給源、例えばアルゴンヌ国立研究所新型フォトン源（Ａｒｇｏｎｎｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｐｈｏｔｏｎ　Ｓｏｕｒｃｅ）のビームライン１７（１７−ＩＤ又は１７ＢＭ、ＩＭＣＡ−ＣＡＴ）に見出される高エネルギーシンクロトロン源であることができる。データ収集の好ましい方法は、ホームソースを用いて初期データセットを収集することにより、結晶品質を評価し、次いでＩＭＣＡ−ＣＡＴで完全なデータセットを収集することである。回折データを検出して定量する方法は、画像プレート、例えばＭＳＣ／Ｒｉｇａｋｕから入手可能なＲ−Ａｘｉｓ　ＩＶ＋＋、電荷結合素子、例えばＭＡＲ−ＣＣＤの、又はＡＤＳＣ　Ｑｕａｎｔｕｍ　２１０　Ｘ線検出器を使用することにより実施することができる。好ましくは、結果として生じたＭＥＫ１結晶は、ＭＥＫ１ペプチド：リガンド：補因子の複合体の原子座標の決定に関して、５．０Åよりも良い分解能、より好ましくは３．０Åよりも良い分解能、更に好ましくは２．５Åよりも良い分解能でＸ線を分解する。好ましくは、結果として生じたＭＥＫ２結晶は、ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の複合体の原子座標の決定に関して、５．０Åよりも良い分解能、より好ましくは３．５Åよりも良い分解能でＸ線を分解する。
【０１５４】
データが収集されると、このデータは一般に、ローレンツ効果及び偏光効果に応じて補正され、データ処理ソフトウェア、例えばＤＥＮＺＯ又はＨＫＬ２０００〔Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｘ−ｒａｙ　ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ　ｄａｔａ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３２６（１９９７）〕、ｄ＊Ｔｒｅｋ（Ｒｉｇａｋｕ　ＭＳＣ）、又はＭｏｓｆｉｌｍ〔Ｌｅｓｌｉｅ，Ａ．Ｇ．Ｗ．，Ｊｏｉｎｔ　ＣＣＰ４＋ＥＳＦ−ＥＡＭＣＢ　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ　ｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｎｏ．２６（１９９２）〕を使用して、指数化構造因子振幅に換算される。好ましい処理ソフトウェアは、ＨＫＬ２０００であることができる。前記結晶から得られた、測定され縮小された回折データは、以下の１つ又は複数の方法、又はこのリストには含まれていない他の同様の方法を用いて、三次元結晶構造を決定するのに用いることができる：フーリエ差分法、分子置き換え（ＭＲ）、多波長異常分散（ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ａｎｏｍａｌｏｕｓ　ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ：ＭＡＤ）、単波長異常分散（ｓｉｎｇｌｅ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ａｎｏｍａｌｏｕｓ　ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ：ＳＡＤ）、異常散乱を伴う単一同型置換（ｓｉｎｇｌｅ　ｉｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ａｎｏｍａｌｏｕｓ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＩＲＡＳ），又は多重同型置換（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｉｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ＭＩＲ）。
【０１５５】
《ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の結晶学的構造分析》
本発明は更に、Ｘ線回折データを使用して、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の結晶複合体の三次元構造座標を解明する方法を含む。構造決定に用いられるこれらの方法は、結晶性ＭＥＫ１及びＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子の結晶複合体の構造決定のために用いられるアプローチを説明するために提供するものである。本明細書に記載した修飾ＭＥＫ１タンパク質複合体又は修飾ＭＥＫ２タンパク質複合体のＸ線構造決定に適した他の条件や技術が、当業者には明らかであろう。例えば、「Ｇｌｕｓｋｅｒ，Ｊ．，Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）」、又は「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｔａｂｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｘ−Ｒａｙ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，第Ｆ巻，Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｓｍａｎ及びＥ．Ａｒｎｏｌｄ編，Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００１）」を参照されたい。
【０１５６】
第１のＭＡＰＫキナーゼの構造決定の場合、相の前記問題を解決するために、分子置き換え以外の方法を用いる必要がある。この場合、ＳＡＤ相評価に、結合したリガンド／インヒビター内に含有されるヨウ素原子を使用した。あるいは、ＭＩＲ、ＭＡＤ、又はＳＡＤのような他の方法を用いることもできる。好ましい態様では、ＨＫＬ２０００〔Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３２６（１９９７）〕のＳＣＡＬＥＰＡＣＫモジュールを用いて、データを同型的に測定することができる。あるいは、ｄ＊Ｔｒｅｋ（Ｒｉｇａｋｕ　ＭＳＣ）、又はＳＣＡＬＡ（共同計算プロジェクト（ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥ　ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ　ＰＲＯＪＥＣＴ）Ｎｏ．４「Ｔｈｅ　ＣＣＰ４　Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」〔Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０−７６３（１９９４）〕を使用して測定することもできる。引き続き行われる全ての計算には、ＣＮＸパッケージ（カリフォルニア州Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ在、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を使用することができる。あるいは、ＣＣＰ４プログラム・パッケージソフト又は当業者に周知のソフトウェア・パッケージの組み合わせを用いて、構造座標を同定することもできる。
【０１５７】
ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の構造が解明された後、構造に基づく薬剤の設計に使用するために、三次元構造を調製する。ＭＥＫ１及びＭＥＫ２のテンプレートの調製及び分析は、例えばＳＹＢＹＬ（商標）、ＧＲＩＮ／ＧＲＩＤ（商標）、ＭｏｌＣａｄ（商標）、ＧＯＬＤ（商標）、ＦｌｅｘＸ（商標）を使用することにより実施することができる。更に、場合により、適切なコンピュータ・モデリング・ソフトウェアを用いて、構造決定を行うことができる。前記ソフトウェアとしては、以下に限定されるものでないが、ＱＵＡＮＴＡ（商標）（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ａｃｃｅｌｒｙｓ，カリフォルニア州）、ＣＨＡＲＭｍ（商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）、ＩＮＳＩＧＨＴ（商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）、ＳＹＢＹＬ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（商標）（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，Ｉｎｃ）、及びＩＣＭ（ＭｏｌＳｏｆｔ，ＬＬＣ）を挙げることができ、ＳＹＢＹＬ（商標）が最も好ましいプログラムである。前記コンピュータ・プログラムは、単独で、又はドッキング・コンピュータ・プログラム、例えばＧＲＡＭＭ（Ｉｌｙａ　Ａ．Ｖａｋｓｅｒ（ロックフェラー大学））、ＦｌｅｘＸ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、Ｆｌｅｘｉｄｏｃｋ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、ＧＯＬＤ（英国ケンブリッジ、ケンブリッジ結晶学データセンターを介して市販されている）、ＤＯＣＫ（Ｉｒｗｉｎ　Ｋｕｎｔｚ，カリフォルニア大学薬化学科，サンフランシスコ）、又はＡｕｔｏＤｏｃｋ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）との組み合わせで使用することができる。これらのドッキング・コンピュータ・プログラムは、小分子の既知データベースをスキャニングすることにより、結合部位に概ね適合するコア化合物を見出す。ＧＯＬＤ（商標）が使用されることが最も好ましい。
【０１５８】
必要な場合には、インヒビター及び補因子の原子タイプ、及び存在するあらゆる水分子を改変することにより、ＰＤＢ（タンパク質データベース）中の結晶学データを「クリーンアップ」することができるので、水分子はそれらの最低エネルギー回転異性体を見出す。この「クリーンアップ」を実施するのに適したソフトウェアとしては、以下に限定されるものでないが、ＳＹＢＹＬ（商標）、ＷＡＴＣＨＥＣＫ〔ＣＣＰ４セットの一部、ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥ　ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ　ＰＲＯＪＥＣＴ，Ｎｏ．４，「Ｔｈｅ　ＣＣＰ４　Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．」Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０−７６３（１９９４）〕の一部、及びＲＥＤＵＣＥ〔Ｗｏｒｄら，Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ　ａｎｄ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：ｕｓｉｎｇ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ａｔｏｍ　ｃｏｎｔａｃｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｏｉｃｅ　ｏｆ　ｓｉｄｅ　ｃｈａｉｎ　ａｍｉｄｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２８５：１７３３−４５（１９９９）〕を挙げることができ、ＲＥＤＵＣＥ又はＲＥＤＵＣＥと同等の機能を発揮するソフトウェアが最も好ましいソフトウェアである。適切な任意のドッキング・コンピュータ・プログラムを使用して、最も好都合なプロトン化状態で全ての水素を付加し、また、全ての水分子を回転させてタンパク質との最適な相互作用をもたらすように配向することにより、精製タンパク質構造を更に実証することができる。
【０１５９】
更に、例えばＧＲＩＮ／ＧＲＩＤ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＭＯＬＣＡＤ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）コントゥアリング［ｃｏｎｔｏｕｒｉｎｇ］、ＣＡＶＥＡＴ〔Ｐ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔら，ＣＡＶＥＡＴ：Ａ　ｐｒｏｇｒａｍ　ｔｏ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｂｌｅｍｓ，ｓｐｅｃｉａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｏｙａｌ　Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，１８２−１９６（１９８９），カリフォルニア大学から入手可能，Ｂｅｒｋｅｌｙ，カリフォルニア州）、ＧＲＡＳＰ（Ａ．Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，コロンビア大学）、ＳｉｔｅＩＤ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、ＩＮＳＩＧＨＴ（商標）、又はＳＹＢＹＬ（商標）を使用して、結合部位を特徴付けすることができる。これらのソフトウェアは、単独で又は組み合わせて使用することができる。例えば、ＧＲＩＮ／ＧＲＩＤ（商標）と、ＭｏｌＣａｄ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）と、ＳＹＢＹＬ（商標）とを組み合わせて用いることが好ましい。
【０１６０】
本発明の或る態様によれば、前記ＭＥＫ１ペプチドが、リガンド結合ポケット（これは、リガンド結合部位に位置する４ÅのＭＥＫ１インヒビター内の以下のアミノ酸残基、すなわち配列番号２のＧ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｖ１２７、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、Ｍ２１９の構造座標により規定されるか、又はリガンド結合部位に位置する５ÅのＭＥＫ１インヒビター内の以下のアミノ酸残基、すなわち配列番号２のＧ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｉ１２６、Ｖ１２７、Ｇ１２８、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｄ１９０、Ｎ１９５、Ｌ２０６、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、Ｍ２１９、Ｆ２２３の構造座標により規定される）を含むことが見いだされた。
【０１６１】
更に、前記ＭＥＫ１ペプチドが、補因子結合ポケット（これは、補因子結合部位に位置する４ÅのＡＴＰ分子内の以下の残基、すなわち配列番号２のＬ７４、Ｇ７５、Ａ７６、Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ８０、Ｖ８１、Ｖ８２、Ａ９５、Ｋ９７、Ｖ１２７、Ｍ１４３、Ｅ１４４、Ｈ１４５、Ｍ１４６、Ｇ１４９、Ｓ１５０、Ｄ１５２、Ｑ１５３、Ｋ１９２、Ｓ１９４、Ｎ１９５、Ｌ１９７、Ｄ２０８、Ｖ２２４の構造座標により規定されるか、又は補因子結合部位に位置する５ÅのＡＴＰ分子内の以下の残基、すなわち配列番号２のＬ７４、Ｇ７５、Ａ７６、Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、８０、Ｖ８１、Ｖ８２、Ａ９５、Ｋ９７、Ｖ１２７、Ｍ１４３、Ｅ１４４、Ｈ１４５、Ｍ１４６、Ｄ１４７、Ｇ１４９、Ｓ１５０、Ｄ１５２、Ｑ１５３、Ｄ１９０、Ｋ１９２、Ｓ１９４、Ｎ１９５、Ｌ１９７、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｖ２２４、Ｇ２２５の構造座標により規定される）を含むことが見いだされた。
【０１６２】
また、前記ＭＥＫ２ペプチドが、リガンド結合ポケット（これは、リガンド結合部位に位置する４ÅのＭＥＫ２インヒビター内の以下のアミノ酸残基、すなわち配列番号４のＧ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ１０１、Ｉ１０３、Ｌ１１９、Ｌ１２２、Ｖ１３１、Ｆ１３３、Ｉ１４５、Ｍ１４７、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｆ２１３、Ｇ２１４、Ｖ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１９、Ｉ２２０、Ｍ２２３、又はこれらの同類置換変異型の構造座標により規定されるか、あるいはリガンド結合部位に位置する５ÅのＭＥＫ２インヒビター内の以下のアミノ酸残基、すなわち配列番号４のＧ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ１０１、Ｉ１０３、Ｌ１１９、Ｌ１２２、Ｉ１３０、Ｖ１３１、Ｇ１３２、Ｆ１３３、Ｉ１４５、Ｍ１４７、Ｄ１９４、Ｎ１９９、Ｌ２１０、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｆ２１３、Ｇ２１４、Ｖ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１９、Ｉ２２０、Ｍ２２３、Ｆ２２７、又はこれらの同類置換変異型の構造座標により規定される）を含むことも見いだされた。
【０１６３】
更に、前記ＭＥＫ２ペプチドが、補因子結合ポケット（これは、補因子結合部位に位置する４ÅのＡＴＰ分子内の以下の残基、すなわち配列番号４のＬ７８、Ｇ７９、Ａ８０、Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８４、Ｖ８５、Ｖ８６、Ａ９９、Ｋ１０１、Ｖ１３１、Ｍ１４７、Ｅ１４８、Ｈ１４９、Ｍ１５０、Ｇ１５３、Ｓ１５４、Ｄ１５６、Ｑ１５７、Ｋ１９６、Ｓ１９８、Ｎ１９９、Ｌ２０１、Ｄ２１２、Ｖ２２８、又はこれらの同類置換変異型の構造座標により規定されるか、あるいは補因子結合部位に位置する５ÅのＡＴＰ分子内の以下の残基、すなわち配列番号４のＬ７８、Ｇ７９、Ａ８０、Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｖ８５、Ｖ８６、Ａ９９、Ｋ１０１、Ｖ１３１、Ｍ１４７、Ｅ１４８、Ｈ１４９、Ｍ１５０、Ｄ１５１、Ｇ１５３、Ｓ１５４、Ｄ１５６、Ｑ１５７、Ｄ１９４、Ｋ１９６、Ｓ１９８、Ｎ１９９、Ｌ２０１、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｖ２２８、Ｇ２２９、又はこれらの同類置換変異型の構造座標により規定される）を含むことも見いだされた。
【０１６４】
ペプチド、又はペプチド：リガンド：補因子の複合体、又はその下位集合に対応する構造座標集合が、複合的な三次元的な表面を画定する空間内の相対的な点集合であることは、当業者には明らかである。従って、全体的に異なる座標集合を使用して、同じ表面を表すことが可能である。また、全ての結晶学的データの測定誤差が小さいため、個々の座標が僅かに変動しても、この変動が表面全体に影響を及ぼすことは、ほとんどないか又は全くない。従って、同様の表面構成要件、例えば、以下に限定されるものでないが、体積（キャビティ内の内部体積又は合計体積）、溶媒接近可能性、及び表面電荷、並びに疎水性をなおも維持しつつ構造座標を変動させることに基づいて、表１又は表２に示す構造座標から結合ポケットを生成させることが可能である。更に、前記構造座標を、結晶学的交換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）、例えば、以下に限定されるものでないが、分数化（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）、正数加算若しくはサブストラクション（ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ）、逆転（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、又はそれらの任意の組み合わせによって、修飾することができる。
【０１６５】
更に、若干異なる三次元座標を得るために、前記の結合ポケットを改変可能であることは、当業者に明らかである。
また、ペプチド：リガンド：補因子の複合体の成分のいずれか又は全てを僅かに改変する結果、三次元構造の基本的な構成要件をなおも維持する構造座標を発生させることも、本発明の部分と考えるべきである。
【０１６６】
《コンピュータ、コンピュータソフトウェア、コンピュータモデリング》
原子座標がわかれば、ＭＥＫ１ペプチド、ＭＥＫ２ペプチド、又は構造的に関連したペプチドの３次元表現を作成するのにコンピュータを用いることができる。同様に、原子座標、又は構造的座標の関連したセットを用いて、ＭＥＫ１ペプチド結合ポケット、ＭＥＫ−２ペプチド結合ポケット又はＭＥＫ様ペプチド結合ポケットの３次元表現を作成することができる。このように、本発明の別の観点は、第１表又は第２表に示したＭＥＫ１及びＭＥＫ２複合体から作成される構造的座標、又は構造的座標の関連したセットを用いて、ＭＥＫ１ペプチド、ＭＥＫ２ペプチド、又は構造的に関連したペプチド、又はＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様ペプチド結合ポケットを作成することを含んでいる。このことは、原子座標のセットから分子又はその部分の３次元のグラフ表示を作成することができる市販され入手可能なソフトウェアを使用することにより達成する。
【０１６７】
適切なコンピュータは、当業者に公知であり、そして典型的には中央処理装置（ＣＰＵ）、及びランダムアクセスメモリ、コアメモリ、大容量記憶メモリ又はそれらの組み合わせであることができる、作業メモリを含んでいる。ＣＰＵは、１つ又はそれ以上のプログラムをエンコードすることができる。コンピュータは、典型的には、ディスプレー、入力装置及び出力装置、例えば、１つ又はそれ以上のブラウン管ディスプレー末端、キーボード、モデム、入力線及び出力線も含んでいる。更に、コンピュータは、コンピュータサーバ（大量の計算をバッチで実施することができるマシン）及びファイルサーバ（すべての集中化されたデータベース用のメインマシン）にネットワーク接続することができる。
【０１６８】
データ、例えば、第１表又は第２表に示した原子座標、又は原子座標の関連したセットを含む、機械可読の媒体は、モデム、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ディスクドライブ、又はキーボードを含む種々のハードウェアを用いてインプットすることができる。
【０１６９】
機械可読のデータ媒体は、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、又はメモリのみを読取り可能であるか又は書換え可能である、光学的可読データ記憶媒体、例えば、光磁気ディスクであることができる。
【０１７０】
出力ハードウェア、例えば、ＣＲＴディスプレー末端は、本明細書に記載した、構造的に関連したペプチド、又はＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又はＭＥＫ様結合ポケットの、第１表又は第２表それぞれに示したＭＥＫ１ペプチド又はＭＥＫ２ペプチドプチドの３次元の構造的座標のグラフ表現を表示するために用いることができる。出力ハードウェアは、プリンタ及びディスクドライブも含んでいることができる。
【０１７１】
前記ＣＰＵは、種々の入力及び出力装置の使用をコーディネートし、作業メモリへの及び作業メモリからのアクセス及び記憶（ｓｔｏｒａｇｅ）からのデータアクセスをコーディネートし、そしてデータ処理工程の順序を決定する。多数のプログラムを用いて機械可読のデータを処理することができる。前記プログラムは、薬剤発見のコンピュータ的な方法に関して本明細書に記載されている。
【０１７２】
本発明の好ましい態様において、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又はＭＥＫ様ペプチド結合ポケットを含む分子又は分子複合体の３次元表現に処理することができる原子座標を、機械可読の記憶媒体に記憶させる。以下に記載のように、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又はＭＥＫ様ペプチド結合ポケットを含む分子又は分子複合体の３次元構造は、種々の目的に対して、例えば、薬剤の発見及び薬剤の設計において有用である。例えば、原子座標データから得られる３次元構造は、化学物質と結合するその能力をコンピュータ的に評価することができる。
【０１７３】
《ＭＥＫ１又はＭＥＫ２活性インヒビター及び／又はエンハンサ》
天然のリガンドの、レセプタ又は酵素上のその対応する結合ポケットとの結合は、作用の多くの生物学的機構の基礎である。同様に、多くの薬剤は、レセプタ又は酵素の結合ポケットとの相互作用を介してその生物学的効果を発揮する。前記結合の理解は、薬剤の標的たるレセプタ又は酵素とのより好ましくかつ特異的な相互作用を有し、そしてこのように改善された生物学的な効果を有する薬剤の設計に導くことができる。従って、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又はＭＥＫ様ペプチド結合ポケットとのリガンド結合に関する情報は、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又はそれに構造的に関連したペプチドの潜在的なインヒビター又はエンハンサを設計し及び／又は同定するのに有用である。更に、潜在的な薬剤の設計がより特異的であればあるほど、その薬剤が同様なタンパク質とは相互作用せず、このように、望ましくない不都合な相互作用による潜在的な副作用を最少にすることがより期待できる。
【０１７４】
コンピュータプログラムを用いて、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又はＭＥＫ様結合ポケットに対するリガンドの誘引、反発及び立体障害を評価することができる。例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又はＭＥＫ様結合ポケットに対して、全体で又は部分で結合することができる化学物質又は化合物に対して低分子データベースをコンピュータ的にスクリーニングすることができる。このスクリーニングにおいて、前記実体又は化合物の結合部位への適合（ｆｉｔ）の質は、形状相補性により又は見積もられた相互作用エネルギーにより判断することができる〔Ｍｅｎｇら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，１３：５０５−５２４（１９９２）〕。一般に、適合が緊密であればあるほど、例えば、立体障害がより低下すればするほど及び／又は誘引力がより大きくなればなるほど、これらの性質がより緊密な結合の定数と一致するので、より有効である薬剤が計画される。
【０１７５】
本発明は、限定されることなく、アポプトシス、分化、脈管形成及び炎症を含む種々の細胞プロセスを包含する疾病の状態を限定されることなく含むＭＥＫ１及びＭＥＫ２に関連した種々の疾病の治療のための潜在的な治療剤として候補的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。前記疾病の状態の例として、癌、乾癬、関節炎、敗血症性ショック、ウイルス性感染及び心臓血管疾患を挙げることができる。
【０１７６】
更に詳しくは、本発明は、Ｘ線結晶学的データ、又は構造的座標の関連したセットから作成される、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２及び構造的に関連したペプチド又はそれらの結合ポケットの３次元表現を用いて、候補的化合物の結合をモデル化する方法を提供する。この方法には、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又は構造的ペプチドの潜在的なインヒビター又はエンハンサをスクリーニング及び同定する方法；及びＭＥＫ１、ＭＥＫ２、構造的に関連したペプチド、又はそれらの結合ポケットに結合する可能性を有している化学物質の設計又は修飾のための方法が含まれる。
【０１７７】
化合物設計又は修飾の工程は、標的、例えば、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチドの構造を５．０Åより大きい、好ましくは、３．５Åより大きい構造まで分解（ｒｅｓｏｌｖｅ）した後で開始する。上記のように、分解された結晶構造から作成されるデータをコンピュータアルゴリズムに適用して、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２及び構造的に関連したペプチド及びＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＭＥＫ様ペプチド結合ポケットの３次元表現を、そして最終的には、モデルを作成する。上記のように、Ｘ線結晶学的座標を用いてＭＥＫ１及びＭＥＫ２の３次元構造を分解することは、化合物が、第４図及び第５図に示される、リガンド又は補助因子結合部位、又はＭＥＫ様結合ポケットを占有することができるかを決定することを可能にする。
【０１７８】
ＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチド分子、構造的に関連したペプチド分子、又はＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様結合ポケットの３次元表現を作成した後、ペプチド又は結合ポケットと結合する可能性を有するリガンドを、例えば、（ｉ）分子フラグメントを化学物質にアッセンブルすること；（ｉｉ）化学物質の新たな設計；（ｉｉｉ）低分子データベースから化学物質を選択すること；又は（ｉｖ）ＭＥＫ１又はＭＥＫ２活性の公知のインヒビター又はその部分を修飾することにより作成する。
【０１７９】
化学物質を設計する場合、下記因子を考慮することができる。第１に、その実体は、一部の又は全部のＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様結合ポケットと物理的にかつ構造的に結合することができなければならない。第２に、その実体は、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様結合ポケットと直接に結合することを可能とするコンホメーションを帯びていなければならない。その実体のある部分はこれらの結合において直接に関与しないであろうが、前記実在物のこれらの部分は分子の全コンホメーションに依然として影響を与えることができる。次に、これは、可能性に有意な影響を与えることができる。前記コンホメーション要件は、結合ポケットの全体又は部分に関する化学物質の全体の３次元構造及び配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）、及びＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様結合ポケットと直接に相互作用するいくつかの化学物質を含む実体の官能基間の間隔（ｓｐａｃｉｎｇ）を含んでいる。
【０１８０】
新規化合物の設計又は公知化合物の修飾は、基質アナログ構造に関係なく、立体的及び静電的な相補性に基づいて標的の結合部位（複数を含む）中にフラグメント又は原子を築き及び連結するコンピュータプログラムを介して、化合物又はそのフラグメントを合成し又は修飾することを含んでいることができる。コンピュータプログラムは分子構造及び相互作用を分析する。コンピュータ分析は、例えば、以下のコンピュータプログラム：ＱＵＡＮＴＡ（商標）、ＣＨＡＲＭＭ（商標）、ＩＮＳＩＧＨＴ（商標）、ＳＹＢＹＬ（商標）、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥＬ（商標）又はＩＣＭ［Ｄｕｎｂｒａｃｋら，１９９７，前掲］の一つ又はそれ以上を用いて実施することができる。選択された化合物、又はそのフラグメントは、原子座標により定義されたＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様結合ポケット（複数を含む）内で種々の配向に位置させ、又はドッキングさせることができる。化合物の選択を終えたら、次にそれらの化合物を単一の複合体内にアッセンブルすることができる。フラグメントの選択を終えたら、次にそれらのフラグメントを単一の化合物内にアッセンブルすることができる。集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）は、原子座標に関してコンピュータスクリーン上に表示された３次元のＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様結合ポケット表現において化合物又はフラグメントの互いに他との関係の視覚的検査（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）により先行させることができる。この視覚的イメージ工程の後に、適切なソフトウェアプログラムを用いて手動によるモデル構築を行うことができる。これに代えて、化合物は、空の結合ポケット（複数を含む）又は天然のリガンドを含有する結合ポケットのいずれかを用いて全体として設計することができる。
【０１８１】
潜在的なリガンドの設計又は修飾において用いることができるコンピュータプログラムは、限定的でなく、単独で又は組み合わせて、ＱＵＡＮＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ　Ｉｎｃ．）及び／又はＳＹＢＹＬ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）及び／又はドッキングコンピュータプログラム、例えば、ＧＯＬＤ〔Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｄａｔａ　Ｃｅｎｔｒｅ、ケンブリッジ、英国を介して市販され入手可能；Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４５：４３−５３（１９９５）〕、ＦｌｅｘＸ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、ＧＲＡＭＭ（Ｉｌｙａ　Ａ．Ｖａｋｓｅｒ，ＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒＵｎｉｖ．）、Ｆｌｅｘｉｄｏｃｋ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、Ｄｏｃｋ〔Ｅｗｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．−Ａｉｄｅｄ　Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１５：４１１−４２８（２００１）〕、又はＡｕｔｏＤｏｃｋ〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔ．）；Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．９：１−５（１９９６）〕を含んでいる。更に、他の関連したコンピュータプログラムを用いることができる。
【０１８２】
化学物質の、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様ペプチド結合ポケットへの潜在的な阻害又は結合効果は、コンピュータモデリング技術の使用により、その実際の合成及び試験の前に分析することができる。「モデリング」は、個々の又は複数の潜在的なリガンド又はそのフラグメントに反復の又は合理的なプロセスを適用して、それらとＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様結合ポケットとの結合を評価しそしてそれらのＭＥＫ１又はＭＥＫ２活性の阻害及び／又は増加を評価することを含んでいる。この方法は、例えば、潜在的なリガンドをＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様ペプチド結合部位（複数を含む）中にコンピュータ適合（ｆｉｔ）させて、潜在的なリガンドの形状及び化学的構造がどれだけ十分にペプチドを補足するか又は妨害するかを確認することを含んでいることができる。コンピュータプログラム、例えば、プログラムＧＯＬＤ（商標）を用いて、リガンドのＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様結合部位への誘引、反発及び立体障害を見積もることもできる。一般に、適合が緊密であればあるほど、例えば、立体障害が少なければ少ないほど及び／又は誘引力が強ければ強いほど、これらの特性がより緊密な結合定数と一致するので、潜在的なリガンドはより拮抗性（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）又は作用性（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）となろう。理論的構造、すなわち、コンピュータ的構造が不十分な誘引及び結合を示す場合、一層の試験は不要とすることができる。しかしながら、コンピュータモデリングが強い誘引を示す場合は、次いでリガンドを合成しそしてそのＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様結合部位への結合能力を試験することができる。このように、潜在的なインヒビター又はエンハンサを、結合部位のいずれか一つ又は全部の中に見出されるアミノ酸残基と潜在的に結合するそのコンピュータ上の能力に基づいて、同定し及び選択することができる。
【０１８３】
コンピュータモデリングに使用されるのに適切なコンピュータプログラムの例として、限定的でなく、ＱＵＡＮＴＡ（商標）、ＣｈａｒｍＭ（商標）、ＩＮＳＩＧＨＴ（商標）、ＳＹＢＹＬ（商標）、ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（商標）及びＩＣＭ（Ｄｕｎｂｒａｃｋら，１９９７，前掲）を挙げることができる。ＳＹＢＹＬ（商標）が好ましく用いることができる。コンピュータプログラムは、ドッキングコンピュータプログラム、例えば、ＧＲＡＭ（商標）、ＦｌｅｘＸ（商標）、Ｆｌｅｘｉｄｏｃｋ（商標）、ＧＯＬＤ（商標）又はＡＵＴＯ　ＤＯＣＫ［Ｄｕｎｂｒａｃｋら，１９９７，前掲］と組み合わせて又は単独で用いることができる。
【０１８４】
潜在的なリガンドのスクリーニング方法及び引き続きの同定は、インビボ、インビトロ又はエクスビボ（エクス・ビボ）で達成することができる。最初のリガンドコンピュータ的分析は必要に応じたものである。その代わりとして、又は付加的に、化合物ライブラリの大量のコレクションをスクリーニングすることができるようにロボットワークステーション（ｒｏｂｏｔｉｃ　ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎｓ）で全自動を可能とすることができるハイスループット（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）スクリーニングを用いることができる。
【０１８５】
スクリーニング法及び同定法の一つの態様において、最初のコンピュータモデリングプログラムは、以下のドッキングコンピュータモデリングプログラム：Ｄｏｃｋ〔Ｅｗｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．−Ａｉｄｅｄ　Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１５：４１１−４２８（２００１）〕、ＡｕｔｏＤｏｃｋ〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．９：１−５（１９９６）〕、ＧＯＬＤ〔Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｄａｔａ　Ｃｅｎｔｒｅ，ケンブリッジ，英国を介して市販され入手可能；Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４５：４３−５３（１９９５）〕、又はＦｌｅｘＸ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）の一つ又はそれ以上を用いて実施する。ドッキングプログラム（複数を含む）によって最初に同定された潜在的なリガンドは、例えば、ＳＹＢＹＬ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、ＱＵＡＮＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ　Ｉｎｃ．）、ＩＮＳＩＧＨＴ（商標）−ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ　Ｉｎｃ．）、ＧＲＩＮ／ＧＲＩＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｌｔｄ．）、ＵＮＩＴＹ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、ＬｉｇＢｕｉｌｄｅｒ〔Ｗａｎｔ，Ｒ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｏｄｅｌ　６：４９８−５１６（２０００）〕、又はＳＰＲＯＵＴ〔Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｅｅｄｓ（英国）のＩＣＡＭＳ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により開発されそして配給されている（Ｇｉｌｌｅｔ，Ｖ．ら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ　Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ　７：１２７−１５３（１９９３））〕に見出される標準的なモデリング方法を用いて作り上げることができる。
【０１８６】
潜在的な活性のインヒビター及び／又はエンハンサを同定した後、化合物の市販のライブラリからそのインヒビター及び／又はエンハンサを選択することができるか又はそれに代えてその潜在的なインヒビター及び／又はエンハンサを合成してＭＥＫ１、ＭＥＫ２又は構造的に関連したペプチドの活性へのその効果（複数を含む）をアッセイすることができる。必要により、アッセイは放射性であることができる。しかしながら、好ましい態様においては、アッセイは非放射性ＥＬＩＳＡである。
【０１８７】
コンピュータモデリングを介して潜在的なリガンドをスクリーニングし同定する一つの態様において、方法は、（ａ）ＭＥＫ−１ペプチド、ＭＥＫ−２ペプチド、構造的に関連したペプチド又はＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様ペプチド結合ポケットの３次元表現を作成すること；（ｂ）潜在的なリガンドを新たに（例えば、コンピュータ的に）設計する及び／又は構築すること；及び（ｂ）ＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様結合部位（複数を含む）と結合するリガンドを同定すること、を含んでいる。前記リガンドは、例えば、そのリガンドをＭＥＫ１又はＭＥＫ２を表現する細胞と接触させることによって、同定することができる。ＭＥＫ１又はＭＥＫ２インヒビターは、例えば、細胞内でＥＲＫ１のＭＥＫ１又はＭＥＫ２触媒されるリン酸化を阻害する化合物として、同定することができる。細胞は、限定的でなく、酵母細胞又は脊椎動物を含む、真核細胞であることができる。好ましくは、細胞は哺乳動物の細胞である。さらに好ましくは、細胞はヒトの細胞である。タンパク質アッセイは、インビボ、インサイチュ又はインビボであることができるが、好ましくはインビトロアッセイである。一つの前記態様において、ＥＲＫ１のＭＥＫ１又はＭＥＫ２触媒されるリン酸化は、細胞内でＭＥＫ活性の直接的リードアウトとしてＥＲＫホスホ特異的抗体を用いたＥＲＫジリン酸化のウェスタンブロット分析により測定することができる。ＭＥＫ１又はＭＥＫ２リガンドの阻害活性もインビトロ、エクスビボ又はインビボアッセイによりスクリーニングすることができる。別の態様において、アッセイは、基質としてキナーゼ不活性ＥＲＫ１（ＧＳＴＥＲＫ１Ｋ７１Ｒ）のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を用いて実施する。
【０１８８】
コンピュータモデリングを介して潜在的なリガンドをスクリーニングし及び同定する別の態様において、その方法は、（ａ）ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、構造的に関連したペプチド又はＭＥＫ−１、ＭＥＫ−２又はＭＥＫ様ペプチド結合ポケットの３次元表現を作成すること；（ｂ）公知の潜在的なリガンドを（例えば、コンピュータ的に）構築し、必要により修飾すること；及び（ｃ）ＭＥＫ−１、ＭＥＫ−２又はＭＥＫ様結合ポケット結合部位（複数を含む）と結合するリガンドを同定すること、を含んでいる。
【０１８９】
別の態様において、化合物スクリーニング及び同定方法は、例えば、（ａ）ＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様仮想的結合空洞であって、結合部位によって規定される結合空洞を作成すること；（ｂ）結合空洞に空間的に一致する化合物構造を（例えば、コンピュータ的に）設計すること；（ｃ）化合物及び必要によりそのアナログを合成すること、及び（ｄ）その化合物が結合部位の少なくとも一つと結合するかどうかを決定するために試験すること、によってＭＥＫ１又はＭＥＫ２活性インヒビター及び／又はエンハンサとして機能する新たな化合物の能力を評価することを含んでいる。
【０１９０】
別の態様において、化合物スクリーニング及び同定方法は、例えば、（ａ）結合部位により規定されるＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ様仮想的結合空洞を作成すること；（ｂ）公知の化合物構造を（例えば、コンピュータ的に）作成し、及び、必要により修飾すること；（ｃ）その化合物が結合空洞と空間的に一致するかどうかを決定すること；（ｄ）化合物及び必要によりそのアナログを合成すること；及び（ｅ）その化合物が少なくとも一つの結合部位に結合するかどうかを試験して決定することにより、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２活性インヒビター及び／又はエンハンサとして機能する公知化合物の能力を評価することを含んでいる。
【０１９１】
別の態様において、潜在的なリガンドが選択されている場合、同定方法は、（ａ）潜在的なリガンドを結合させたＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又は構造的に関連したペプチドの３次元表現を作成すること；（ｂ）その３次元表現に基づいて潜在的なリガンドを修飾すること；及び（ｃ）修飾した潜在的なリガンドを結合させた第二の３次元表現を作成することを含んでいる。次いで、所望ならば、当業者に公知の生化学的アッセイにおいて潜在的なリガンドを試験することができる。
【０１９２】
更に、潜在的なリガンドを同定する場合、補足的結晶は、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又は構造的に関連したペプチド、及び必要により補助因子と複合のリガンドを含んで増殖（ｇｒｏｗ）させることができる。例えば、分子置き換え分析を用いて補足的結晶の３次元構造を決定することができる。分子置き換え分析は、最初の結晶構造決定にも用いることができる。
【０１９３】
本発明において提供される、構造を基礎とする薬剤設計ストラテジーのすべてにおいて、任意の又はすべての工程の多数の反復サイクルを実施して選択を最適化することができる。
【０１９４】
このように、別の態様に従って、本発明は、上記の方法の任意の一つ又は組み合わせによって生成される又は同定される、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２及びＭＥＫ様ペプチド結合ポケット（複数を含む）と結合する化合物を提供する。
【０１９５】
《ＭＥＫ１及びＭＥＫ２バリアント》
上記のように、本発明は、本発明によるタンパク質のアミノ酸配列の明白なバリアント、例えば、天然に存在する成熟型のタンパク質、対立遺伝子（ａｌｌｅｌｉｃ）／配列のバリアントのタンパク質、天然には存在しない組換え的に誘導されたバリアントのタンパク質、及びオルソログ及びパラログのタンパク質も提供し及び可能とする。前記バリアントは、組換え核酸技術及びタンパク質生化学の分野における当業者により公知の技術を用いて作成することができる。しかしながら、バリアントは本発明の前に開示されたタンパク質又はペプチドを除外していることは理解されよう。
【０１９６】
前記バリアントは、本明細書に開示の分子技術及び配列情報を用いて容易に同定／製造することができる。更に、前記バリアントは、本発明のタンパク質に相同な配列及び／又は構造に基づいて他のタンパク質から容易に識別することができる。存在する相同／同一の程度は、主としてペプチドが機能的なバリアント又は非機能的なバリアントであるかどうかということ、パラログファミリーに存在する分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）の量、及びオルソログ間の進化的な距離に基づいているであろう。２つのタンパク質又はペプチド間の構造的関係を述べるために一次配列を用いるための別の方法は、２つの関連したタンパク質の３次元構造を使用することである。この方法において、２つの構造は、Ｘ線結晶学により又はＮＭＲにより解明され、そして次いで類似性は、２つの種の主鎖ＣαトレースのＲＭＳ（ＲＭＳ）偏差を比較することにより決定される。
【０１９７】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の一致（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）率を決定するために、配列を最適の比較の目的に対してアラインさせる（例えば、ギャップを、最適なアラインメントのために第一及び第二のアミノ酸又は核酸の一方又は両方の中に導入することができ、そして非相同配列を比較の目的に対して無視することができる）。本発明の一つの観点において、比較目的のためにアラインされる参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）配列の長さは、少なくとも３０％、好ましくは４０％、更に好ましくは５０％、一層更に好ましくは６０％である。一つの好ましい態様において、その長さは、参照配列の長さの、好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは８０％、又は最も好ましくは９０％又はそれ以上である。次いで、対応するアミノ酸位置又は核酸位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置が、第二の配列における対応する位置として同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占有される場合には、その分子はその位置で同一である（本明細書に用いる場合、アミノ酸又は核酸「一致（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」はアミノ酸又は核酸「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」と同等である）。２つの配列間の一致率は、２つの配列の最適なアラインメントに対して導入されることが必要である、各ギャップの長さ、及びギャップの数を考慮に入れて、配列により分けられる同一の位置の数の関数である。
【０１９８】
配列の比較並びに２つの配列間の一致率及び類似率の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ１，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー州，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州，１９９１）。好ましい態様において、２つのアミノ酸配列間の一致率は、市販され入手可能なコンピュータプログラム（例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰ）内に組み込まれている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０）］アルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、及び１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重量及び１、２、３、４、５又は６の長さ重量を用いて、決定する。更に別の好ましい態様において、２つのヌクレオチド配列間の一致率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ［Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４）］内にＧＡＰプログラムを含んでいる市販され入手可能なコンピュータプログラム、ＮＷＳギャップＤＮＡ　ＣＭＰマトリックス及び４０、５０、６０、７０又は８０のギャップ重量及び及び１、２、３、４、５又は６の長さ重量を用いて決定することができる。別の態様において、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の一致率は、市販され入手可能なコンピュータプログラム［例えば、ＡＬＩＧＮ（ヴァージョン２．０）］内に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ　ａｎｄ　Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ［ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７（１９８９）］のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、１２のギャップ長さペナルティー及び４のギャップペナルティーを用いて決定する。
【０１９９】
本発明の核酸及びタンパク質配列は、更に、配列データベースに対する調査を実施するための「クエリー配列」として用いて、例えば、他のファミリーメンバー又は関連した配列を同定することができる。前記調査は、市販され入手可能なサーチエンジン、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）］のＢＬＡＳＴＮ　ａｎｄ　ＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．０）を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド調査は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長さ＝１２を用いて実施して、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質調査は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３を用いて実施して、本発明のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップドアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７）］に記載のように利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータを用いることができる。
【０２００】
本発明のタンパク質の一つを含む完全長のクローンは、本発明のキナーゼの一つに対して完全な配列一致を有しており、並びに本発明において提供されるＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチドとして同じ遺伝子座によりコードされるものとして容易に同定することができる。
【０２０１】
ペプチドの対立遺伝子のバリアントは、タンパク質の少なくとも一部に対して高度の（有意な）配列相同／一致を有しており、並びに本発明において提供されるＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチドと同じ遺伝子座によりコードされるものとして容易に同定することができる。本明細書で用いる場合、２つのタンパク質（又はタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が典型的には少なくとも７０％、好ましくは７５％、更に好ましくは８０％、又は一層更に好ましくは８５％又はそれ以上相同である場合に有意な相同を有している。一つの好ましい態様において、それは少なくとも９０％、又は好ましくは９５％又はそれ以上相同である。本発明によれば、有意に相同なアミノ酸配列は、以下で更に十分に記載されるストリンジェントな条件下でタンパク質コード核酸分子にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。
【０２０２】
タンパク質のパラログは、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチドの少なくとも一部に対してある程度の有意な配列相同／一致を有しており、同じ種由来の遺伝子によりコードされ、及び同様な活性又は機能を有しているものとして容易に同定することができる。２つのタンパク質は典型的には、アミノ酸配列が典型的には、所定の領域又はドメインを介して少なくとも７０％、好ましくは７５％、更に好ましくは８０％、一層更に好ましくは８５％又はそれ以上相同である場合にパラログと考えられる。好ましい態様において、２つのタンパク質は典型的には、所定の領域又はドメインを介してアミノ酸配列が典型的には９０％又はそれ以上、好ましくは９５％又はそれ以上相同である場合にパラログと考えられる。前記パラログは、以下で更に十分に記載されるストリンジェントな条件下でキナーゼペプチドコード核酸分子にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。パラログの一例は、ＭＥＫ２とＭＥＫ１との間の関係である。これらのタンパク質は全体で８０％相同であり、キナーゼドメインにおいて８５％相同であり、そしてＡＴＰ−及びリガンド−結合ドメインにおいて１００％相同である。更に、ＭＥＫ２がＭＥＫ１インヒビターにより阻害される場合、及び活性部位が同一であることが見出された場合、ＭＥＫ１ペプチドの３次元構造又はＸ線結晶学的座標を用いてＭＥＫ２インヒビターを同定することができる。逆に、ＭＥＫ２ペプチドの３次元構造又はＸ線結晶学的座標を用いてＭＥＫ１インヒビターを同定することができる。
【０２０３】
タンパク質のオルソログは、タンパク質の少なくとも一部に対してある程度有意な配列相同／一致を有しており、並びに他の生物由来の遺伝子によりコードされるものとして容易に同定することができる。好ましいオルソログは、ヒトの治療標的及び治療剤の開発のために、哺乳動物、好ましくはヒトから単離され、又は殺虫剤及び殺虫標的の開発のために、他の無脊椎動物、とりわけ、経済的／農業的に重要な昆虫、例えば、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）目及び甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）目のメンバーから単離される。前記オルソログは、タンパク質を生成する２つの生物の関連性の程度に応じて、以下に更に記載するように、穏和（ｍｏｄｅｒａｔｅ）からストリンジェントまでの条件下で、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる。
【０２０４】
本発明のＭＥＫ１又はＭＥＫ２ペプチドの天然に存在しないバリアントは、組換え技術を用いて容易に作成することができる。前記バリアントの例として、限定的でなく、タンパク質のアミノ酸配列における欠失、付加及び置換を挙げることができる。例えば、置換の一つの種類は、保存されたアミノ酸置換である。前記置換は、同様な特徴の他のアミノ酸によりタンパク質中の所定のアミノ酸を置換するものである。典型的には、保存的な置換として、脂肪族のアミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの中での、相互の置換；ヒドロキシ残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換；アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎ間の置換；塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換；及び芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｈｒの中の置換が見られる。アミノ酸変化が表現型的に活動しない（ｓｉｌｅｎｔ）ようにすることに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出せる。
【０２０５】
バリアントは、一つ又はそれ以上の活性において充分に機能的であることができるか又は機能を欠いていることができる。充分に機能的であるバリアントは、典型的には、保存的変更（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）又は重要でない（ｎｏｎ−ｃｒｉｔｉｃａｌ）残基における若しくは重要でない領域における変更のみを含んでいる。機能的なバリアントは、機能において何も変化を生じないか又は有意でない変化を生じる、同様なアミノ酸の置換も含んでいることができる。これに代えて、前記置換は、機能にある程度まで正に又は負に影響を与えることがある。
【０２０６】
機能について本質的であるアミノ酸は、当業者に公知の方法、例えば、部位突然変異又はアラニンスキャンニング変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］により同定することができる。後者の方法は、分子内のすべての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られたバリアント分子を生物学的活性、例えば、レセプター結合又はインビトロ増殖活性について試験する。結合に対して重要な部位も、構造的分析、例えば、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴又は光親和性標識によって決定することができる［Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）；ｄｅ　Ｖｏｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：３０６−３１２（１９９２）］。
以下の実施例により本発明の好ましい態様及び観点を説明するが、これらにより限定されないことを意図する。
【０２０７】
【実施例】
【実施例１】
《修飾ＭＥＫ１のクローニング》
ヒトＭＥＫ１ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｌ１１２８４、配列番号１）をＰＣＲにより修飾し、５’Ｎｄｅｌ／３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位でｐＥＴ２４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にサブクローニングした。以下のオリゴヌクレオチドを有する５’Ｎｄｅｌ及び３’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の付加により、ｐＥＴ２１ｂ及びｐＥＴ２４ｂ発現ベクター中へのクローニングのために、ＰＣＲにより野生型ＭＥＫ１を修飾した：
５’ＣＡＴＡＴＧＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＴＣＣＡＧ３’（配列番号５）
５’ＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＴＴ３’（配列番号６）
【０２０８】
ＰＣＲの条件は以下のとおりとした：１００μＬの反応容積中に２０ｎｇのＭＥＫ　ＤＮＡ、２０ｐｍｏｌの５’及び３’プライマー、２００μＭのｄＮＴＰミックス、１ｘＰＣＲ１０ｘＶｅｎｔ緩衝液、１単位ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ。反応は、９５℃で５分間（１サイクル）、その後９５℃で１分間、５６℃で１分間、７２℃で１分３０秒間を２５サイクル実行した。大腸菌中のｔＲＮＡバイアスに関するｂｐ７３からｂｐ９９に及ぶ領域で野生型ＭＥＫ１（「ＭＥＫ１（ｗｔ）」）配列を変更し、太字及び下線で強調した以下の塩基変化を生じた：
【化３】
2004000135.tif 000005
（配列番号２の７３〜９９番目のアミノ酸残基）。ＭＥＫ１のＮＨ２末端トランケート［配列番号２番目のアミノ酸５１〜３９３をコードし、Ｃ１（「ＭＥＫ１−Ｃ１」）と称する］も、ＰＣＲにより生成した。５’Ｎｄｅｌ／３’Ｘｈｏｌ部位でｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）中に、ＭＥＫ１−Ｃ１クローンをサブクローニングした。更に、残基２８０〜３２３からなる富プロリン挿入ループの欠失によりＭＥＫ１（ｗｔ）及びＭＥＫ１−Ｃ１クローンの両方を修飾し、それぞれＭＥＫ１（ｗｔ）（ｄ２８０−３２３）及びＭＥＫ１−Ｃ１（ｄ２８０−３２３）を得た。この欠失は、以下の配列：ＡＡＧ（Ｋ２８０）ＣＴＴ（Ｌ３２３）を有する残基３２４及び３２５をコードする内部ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入することにより作製した。アミノ酸２７９（Ｖ）の下流３‘末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有するよう、ＰＣＲにより、前記欠失に対するＮ末端のコード配列を含有する断片Ａ［（ＭＥＫ１（ｗｔ）に関してはアミノ酸１〜２７９、ＭＥＫ１−Ｃ１に関しては５１〜２７９）］を修飾した。次にこの断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位になるようアミノ酸３２４及び３２５に関するコドン変化を含めた残基３２４〜３９３に関する配列を含有する０．２ｋｂ断片である断片Ｂに連結した。ＭＥＫ１（ｗｔ）（ｄ２８０−３２３）及びＭＥＫ１−Ｃ１（ｄ２８０−３２３）クローンの両方を、５’Ｎｄｅｌ／３’Ｘｈｏｌ部位でｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）中にサブクローニングした。自動シーケンシング装置（ＡＢＩ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でＭＥＫ１特異的シーケンシングプライマーを用いて、全修飾ＭＥＫｃＤＮＡ配列を立証した。一旦ヌクレオチド配列が得られたら、それをＭＥＫ１に関する寄託配列と比較して、配列完全性を確証した。
【０２０９】
同様の手法に従って、以下のＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチドを調製した：
ＭＥＫ１−Ｃ２：配列番号２の配列のアミノ酸残基６２〜３９３のペプチドを有するＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１。
ＭＥＫ１−Ｃ２（ｄ２８０−３２３）：配列番号２の配列のアミノ酸残基２８０〜３２３の欠失を有するＭＥＫ１−Ｃ２。
ＭＥＫ１−Ｃ３：配列番号２の配列のアミノ酸残基４２〜３９３のペプチドを有するＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１。
ＭＥＫ１−Ｃ３（ｄ２８０−３２３）：配列番号２の配列のアミノ酸残基２８０〜３２３の欠失を有するＭＥＫ１−Ｃ３。
ＭＥＫ１（ｄ２８０−３２３）：配列番号２番目のアミノ酸残基２８０〜３２３の欠失を有するＭＥＫ１。
ＭＥＫ１（ｄ２６４−３１０）：配列番号２番目のアミノ酸残基２６４〜３１０の欠失を有するＭＥＫ１。
ＭＥＫ１（ｄ２７０−３１０）：配列番号２番目のアミノ酸残基２７０〜３１０の欠失を有するＭＥＫ１。
ＭＥＫ１（ｄ２６４−３０５）：配列番号２番目のアミノ酸残基２６４〜３０５の欠失を有するＭＥＫ１。
ＭＥＫ１（ｄ２６７−３０７）：配列番号２番目のアミノ酸残基２６７〜３０７の欠失を有するＭＥＫ１。
ＭＥＫ１（ｄ２６５−３０４）：配列番号２番目のアミノ酸残基２６５〜３０４の欠失を有するＭＥ（ソフトウェアは、標準化ジオメトリーでのＰＤＢ分子構造ファイルに水素を付加するために用いられて、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ３＋、Ｍｅｔメチル、Ａｓｎ及びＧｌｎ側鎖アミド及びＨｉｓ環の配向を最適化し得る）Ｋ１。
【０２１０】
修飾ＭＥＫ１のＰＣＲのために、以下のプライマーを用いた。
2004000135.tif 000006
【０２１１】
【実施例２】
《修飾ＭＥＫ２のクローニング》
ヒトＭＥＫ２ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＮＭ＿０３０６６２、配列番号３）をＰＣＲにより修飾し、５’Ｎｄｅｌ／３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位でｐＥＴ２４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にサブクローニングした。以下のオリゴヌクレオチドを有する５’Ｎｄｅｌ及び３’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の付加により、ｐＥＴ２４ｂ発現ベクター中へのクローニングのために、ＰＣＲにより野生型ＭＥＫ２を修飾した：
2004000135.tif 000007
ＰＣＲの条件は以下のとおりとした：１００μＬの反応容積中に２０ｎｇのＭＥＫ　ＤＮＡ、２０ｐｍｏｌの５’及び３’プライマー、２００μＭのｄＮＴＰミックス、１ｘＰＣＲ１０ｘＶｅｎｔ緩衝液、１単位ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ。反応は、９５℃で５分間（１サイクル）、その後９５℃で１分間、５６℃で１分間、７２℃で１分３０秒間を２５サイクル実行した。
野生型ヒトＭＥＫ２ｃＤＮＡの６つのＮ末端トランケートをＰＣＲ増幅により生成し、ｐＥＴ２０１　ＴＡ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。各々をＣ末端Ｈｉｓ６タグと融合する。
【０２１２】
テンプレートＤＮＡｐＥＴ２４ｂＭＥＫ２野生型のシーケンシングは、アミノ酸残基Ｖ６４上のサイレント突然変異（ＧＴＣからＧＴＴ）を明示した。
ＰＣＲの条件は、以下のとおりとした：１００μＬの反応容積中にｐＥＴ２４ｂＭＥＫ２野生型ＤＮＡ１ｎｇ／μＬ、５’及び３’プライマー１μΜ、１ｘＰｆｘ増幅緩衝液、０．３ｍＭ−ｄＮＴＰ混合物、５単位プラチナＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ。反応は、９４℃で３分間（１サイクル）、その後９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分３０秒間を３５サイクル実行し、更に６８℃で１０分間（１サイクル）実行した。０．１ｍＭｄＡＴＰ及び２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加えた前記ＰＣＲ混合物中での６８℃で１０分間（１サイクル）により、ＰＣＲ産物の３’Ａオーバーハングを付加した。
【０２１３】
６つの変更ＮＨ２末端トランケートを修飾ＭＥＫ２ペプチドの作製に用いた。６つの構築物は各々、ＣＯＯＨ末端に融合されたヘキサヒスチジンタグを保有した：
ＭＥＫ２−Ｃ１：配列番号３の配列のアミノ酸残基４６〜４００；
ＭＥＫ２−Ｃ２：配列番号３の配列のアミノ酸残基５５〜４００；
ＭＥＫ２−Ｃ３：配列番号３の配列のアミノ酸残基６６〜４００；
ＭＥＫ２−Ｃ４：配列番号３の配列のアミノ酸残基５９〜４００；
ＭＥＫ２−Ｃ５：配列番号３の配列のアミノ酸残基６２〜４００；
ＭＥＫ２−Ｃ６：配列番号３の配列のアミノ酸残基６４〜４００；
【０２１４】
ＭＥＫ２Ｎ末端トランケートのＰＣＲ生成のために、以下のプライマーを用いた：
ＭＥＫ２−Ｃ１：フォワードプライマー：５’ＡＴＧＣＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧ３’（配列番号１３）
ＭＥＫ２−Ｃ２：フォワードプライマー：５’ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣ３’（配列番号１４）
ＭＥＫ２−Ｃ３：フォワードプライマー：５’ＡＴＧＧＣＣＴＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣ３’（配列番号１５）
ＭＥＫ２−Ｃ４：フォワードプライマー：５’ＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＡＧＧＴＴＧＧ３’（配列番号１６）
ＭＥＫ２−Ｃ５：フォワードプライマー：５’ＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＴＣＧＧＣＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＣ３’（配列番号１７）
ＭＥＫ２−Ｃ６：フォワードプライマー：５’ＡＴＧＧＴＣＧＧＣＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣ３’（配列番号１８）
【０２１５】
前記の６つのＭＥＫ２トランケートすべてに関する共通リバースプライマー：５’ＴＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＣＧＣＧＴＧＧＧＴＧ３’（配列番号１９）。
自動シーケンシング装置（ＡＢＩ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でｐＥＴ２０１ベクターシーケンシングプライマー（Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネータープライマー）を用いて、前記６つのＭＥＫ２トランケートに関する配列を立証した。一旦ヌクレオチド配列が得られたら、それをＭＥＫ２に関する寄託配列と比較して、配列完全性を確証した。
【０２１６】
【実施例３】
《大腸菌における修飾ＭＥＫ１の大規模発現》
実施例１から得られた組換えＭＥＫ１構築物を、富栄養（ｒｉｃｈ）培地を含有する１０リットル発酵機中の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で３７℃で増殖させた。１００μＬのグリセロールストックをＬＢ培地の１Ｌ振盪フラスコに接種することにより、カナマイシン耐性ＭＥＫ１の出発培養を増殖させた。２５０ｒｐｍに設定した振盪インキュベーター中で３０℃で一夜、培養を増殖させた。翌朝、培養の全量を、スーパーブロス（ＫＤ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）、あるいは、レシピを用いて調製した富栄養培地を含有する１０リットル発酵機に添加した。なお、前記レシピでは、酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ　０１２７）２６０．０ｇ、ＢＢＬアシジカーゼペプトン２６０．０ｇ、カシトン（Ｄｉｆｃｏ　０２５９）２６０．０ｇ）を蒸留水中に溶解して４．０Ｌとする。ドライゲラトン（Ｄｉｆｃｏ　０６５７）２６０．０ｇ、次に無水ＫＨ２ＰＯ４２６．０ｇ、無水Ｋ２ＨＰＯ４２６．０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ２６．０ｇ（蒸留水で溶解して、２．０Ｌとしたもの）を添加し、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロールを添加する。６００ｎｍでの光学濃度１０で、温度を２２〜２５℃に１時間低減し、１．０ｍＭの濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）の付加により、組換えタンパク質発現を誘導した。グリセロール補充を伴わない富栄養培地調製に関しては、誘導後１８時間目に発酵機をハーベストした。グリセロール補充を伴う富栄養培地調製又はスーパーブロス調製に関しては、誘導後３６時間目に発酵機をハーベストした。典型的収量は、約７００ｇ全細胞／１０Ｌ発酵であった。
【０２１７】
細胞ペレットを、５０ｍＭ−Ｋ２ＨＰＯ４、２ｍＭ−ＴＣＥＰ［トリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン］、３００ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ−ＣＨＡＰＳ［３−（［３−コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート］、ｐＨ８．０中に１：５（ｗ／ｖ）で再懸濁した。Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ　ＫＤＬを用いて、細胞破砕を実行した。５０μＬのベンゾナーゼ（ＥＭ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，ニューヨーク州）を溶解中に含入した。４℃で１３，６００ｘｇで４５分間の遠心分離により、溶解物を清澄化した。
【０２１８】
【実施例４】
《大腸菌における修飾ＭＥＫ２の大規模発現》
実施例２から得られた組換えＭＥＫ２構築物を、富栄養培地を含有する１０リットル発酵機中の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で３７℃で増殖させた。１００μＬのグリセロールストックをＬＢ培地の１Ｌ振盪フラスコに接種することにより、カナマイシン耐性ＭＥＫ１の出発培養を増殖させた。２５０ｒｐｍに設定した振盪インキュベーター中で３０℃で一夜、培養を増殖させた。翌朝、培養の全量を、スーパーブロス（ＫＤ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）、あるいは、レシピを用いて調製した富栄養培地を含有する１０リットル発酵機に添加した。なお、前記レシピでは、酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ　０１２７）２６０．０ｇ、ＢＢＬアシジカーゼペプトン２６０．０ｇ、カシトン（Ｄｉｆｃｏ　０２５９）２６０．０ｇ）を蒸留水中に溶解して４．０Ｌとする。ドライゲラトン（Ｄｉｆｃｏ　０６５７）２６０．０ｇ、次に無水ＫＨ２ＰＯ４２６．０ｇ、無水Ｋ２ＨＰＯ４２６．０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ２６．０ｇ（蒸留水で溶解して、２．０Ｌとしたもの）を添加し、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロールを添加する。６００ｎｍでの光学濃度１０で、温度を２２〜２５℃に１時間低減し、１．０ｍＭの濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）の付加により、組換えタンパク質発現を誘導した。グリセロール補充を伴わない富栄養培地調製に関しては、誘導後１８時間目に発酵機をハーベストした。グリセロール補充を伴う富栄養培地調製又はスーパーブロス調製に関しては、誘導後３６時間目に発酵機をハーベストした。典型的収量は、約７００ｇ全細胞／１０Ｌ発酵であった。
【０２１９】
細胞ペレットを、５０ｍＭ−Ｋ２ＨＰＯ４、２ｍＭ−ＴＣＥＰ［トリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン］、５ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、２ｍＭピロール−２−カルボキシレート及び１００μＭ−ＺｎＣｌ２、１０ｍＭ−ＣＨＡＰＳ［３−（［３−コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート］、ｐＨ８．０中に１：３（ｗ／ｖ）で再懸濁した。Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ　ＫＤＬを用いて、細胞破砕を実行した。５０μＬのベンゾナーゼ（ＥＭ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，ニューヨーク州）を溶解中に含入した。４℃で１３，６００ｘｇで４５分間の遠心分離により、溶解物を清澄化した。
【０２２０】
【実施例５】
《修飾ＭＥＫ１の精製》
細胞溶解物を１：１で２ｘ結合緩衝液（５０ｍＭ−Ｋ２ＨＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、４ｍＭ−ＴＣＥＰ、３００ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣＨＡＰＳ、２ｍＭピロール−２−カルボキシレート及び１００μＭ−ＺｎＣｌ２、ｐＨ＝８．０）と混合し、洗浄タロン［ＴＡＬＯＮ（商標）］金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号８９０８−２）と樹脂２ｍＬ／細胞１ｇの比率で一緒にした。混合物を４℃で１時間攪拌し、次に５−Ｌアミコン（Ｖａｎｔａｇｅ−Ｓ）カラム中にバッチ投入した。ベースライン読取値に達するまで、洗浄緩衝液（５０ｍＭ−Ｋ２ＨＰＯ４、５ｍＭイミダゾール、２ｍＭ−ＴＣＥＰ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭピロール−２−カルボキシレート、５０μＭ−ＺｎＣｌ２）であらゆる付加的非結合タンパク質／不純物を溶離した。タンパク質を、４〜５カラム容積の溶離緩衝液（２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ−ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、２ｍＭ−ＴＣＥＰ、ｐＨ８．０及び１０％ｖ／ｖグリセロール）で溶離し、ミリポア（Ｓ１Ｙ１０）らせんカートリッジを用いて１０倍に濃縮した。次にタンパク質濃縮物をＨＳ緩衝液Ａ［２０ｍＭ−ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、２ｍＭ−ＴＣＥＰ、ｐＨ６．４及び２０％エチレングリコール］中で１０倍に希釈し、予備平衡ＨＳカラム（ＰＯＲＯＳＨＳ／２０　２５ｘ１００、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に投入した。０〜１００％ＨＳ緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ及び１Ｍ酢酸アンモニウム）の線状勾配でタンパク質を溶離した。タンパク質含有分画を一緒にプールし、ミリポア限外濾過攪拌セル（ＹＭ１０膜）を用いて濃縮した。次にタンパク質濃縮物をＨＱ緩衝液Ａ［２０ｍＭ−ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、２ｍＭ−ＴＣＥＰ、ｐＨ８．０及び１０ｍＭ酢酸アンモニウム］中で５０倍希釈し、予備平衡ＨＱカラム（ＰＯＲＯＳ　ＨＳ／２０　１６ｘ１００、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に投入した。タンパク質を非結合分画中で溶離し、そして直ちにミリポア限外濾過攪拌セル（ＹＭ１０膜）を用いて濃縮した。１０倍モル過剰量の阻害剤を付加し、４℃で一夜攪拌することにより、タンパク質：阻害剤複合体を精製した。次に０．２２μｍポリエーテルスルホンフィルターを用いて試料を濾過し、ＹＭ１０膜適合攪拌セルを用いて更に濃縮し、８０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し、予備平衡サイズ排除カラム（ＨｉＬｏａｄ２６／６０スーパーデックス２００調製グレード、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，＃１７−１０７１−０１）に投入した。サイズ排除クロマトグラフィー緩衝液（２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、２ｍＭ−ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５及び１５０酢酸アンモニウム及び５０ｎＭ阻害剤）を用いて、約５時間でタンパク質を溶離した。３成分複合体を生成するために用いられた阻害剤は、５−ブロモ−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−プロピル）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドであった。タンパク質含有分画を一緒にプールし、ミリポア限外濾過攪拌セル（ＹＭ１０膜）を用いて濃縮し、１４，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離し、微小遠心管中にアリコートし、液体窒素中に急速冷凍した。結晶化のために必要となるまで、−８０℃でタンパク質アリコートを貯蔵した。アポタンパク質の精製のために同一手法に従ったが、但し、濃縮ＨＱフロースルーを予備平衡サイズ排除カラムに直接投入した。
【０２２１】
【実施例６】
《修飾ＭＥＫ２の精製》
細胞溶解物を、洗浄タロン［ＴＡＬＯＮ（商標）］金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号８９０８−２）と細胞５ｇあたり樹脂１ｍＬの比率で一緒にした。混合物を４℃で１時間攪拌し、次にＢｉｏｒａｄ　Ｅｃｏｎｏカラム中にバッチ投入した。ベースライン読取値に達するまで、洗浄緩衝液（５０ｍＭ−Ｋ２ＨＰＯ４、５ｍＭイミダゾール、２ｍＭ−ＴＣＥＰ、ｐＨ８．０及び３００ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭピロール−２−カルボキシレート、５０μＭ−ＺｎＣｌ２）であらゆる付加的非結合タンパク質／不純物を溶離した。タンパク質を、４〜５カラム容積の溶離緩衝液（２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ−ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、２ｍＭ−ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５及び１０％ｖ／ｖグリセロール）で溶離した。次に、溶離タンパク質をＨＳ緩衝液Ａ［２０ｍＭ−ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、２ｍＭ−ＴＣＥＰ、ｐＨ６．４及び２０％エチレングリコール］中で１０倍に希釈し、予備平衡ＨＳカラム（ＰＯＲＯＳ　ＨＳ／２０　２５ｘ１００、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に投入した。０〜１００％ＨＳ緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ及び１Ｍ酢酸アンモニウム）の線状勾配でタンパク質を溶離した。タンパク質含有分画を一緒にプールし、ミリポア限外濾過攪拌セル（ＹＭ１０膜）を用いて濃縮した。次にタンパク質濃縮物を予備平衡サイズ排除カラム（ＨｉＬｏａｄ２６／６０スーパーデックス２００調製グレート、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，＃１７−１０７１−０１）に投入した。ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、２ｍＭ−ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５及び１５０酢酸アンモニウム）を用いて、約５時間でタンパク質を溶離した。タンパク質含有分画をプールし、絶えず攪拌しながら、タンパク質溶液中に１０倍モル過剰量のリガンド｛５−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル｝−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミン（ＤＭＳＯ中に溶解）を滴下することにより、タンパク質：リガンド複合体を生成した。４℃で一夜攪拌後、ＹＭ１０膜適合攪拌セルを用いて複合体を濃縮し、８，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し、微小遠心管中にアリコートし、液体窒素中に急速冷凍した。結晶化のために必要となるまで、−８０℃でタンパク質アリコートを貯蔵した。
【０２２２】
【実施例７】
《イン・ビボ及びイン・ビトロＭＥＫ１及びＭＥＫ２活性検定》
基質としてキナーゼ不活性ＥＲＫ１のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（ＧＳＴＥＲＫ１Ｋ７１Ｒ）を用いて、修飾ＭＥＫ１ペプチドのキナーゼ活性を検定した。２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）ｐＨ７．５、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１ｍＭ−ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）、１０μＭ−ＡＴＰ（５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含む）中で、修飾ＭＥＫペプチド（５０ｎｇ）を検定した。適切な試料は、付加された０．５単位のＲａｆ−１（ＵＢＩ）を有し、１μｇ−ＧＳＴＥＲＫ１（Ｋ７１Ｒ）の付加により反応は開始した。反応物を室温で２０分間インキュベートし、次に５μＬの６ｘＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液で急冷した。次にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試料を分離し、オートラジオグラフィーによりホスホプロテインを可視化した。ゲルからのタンパク質バンドの切取りによりＥＲＫ中に取り込まれた放射能標識を定量し、標準シンチレーション計数器で計数した。修飾ＭＥＫ１を用いた初期実験は、Ｒａｆ活性化後に、ｐｍｏｌＰＯ４／分／ｍｇの単位で以下の特異的活性を生じた：ＷＴ：８３８０．６、
【外１】
2004000135.tif 000008
：４０．１、Ｃ１ＦＬ：７７３．３、
【外２】
2004000135.tif 000009
：３５．９、Ｃ２ＦＬ：５３７．５、
【外３】
2004000135.tif 000010
：２４．１、Ｃ３ＦＬ：４４１．７、
【外４】
2004000135.tif 000011
：２６．９。
【０２２３】
ＭＥＫ１：リガンド：補因子複合体の三次元構造情報を用いて設計されたリガンドの評価に際して、５−ブロモ−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−プロピル）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドを、フィルター底ウエルを有する９６ウエルフォーマットプレートに添加した。次にＨＥＰＥＳ緩衝液中のキナーゼ不活性ＥＲＫ１（Ｋ７１Ｒ突然変異体）を、各ウエルに添加する。プレートに添加する前にトリス緩衝液で希釈されたＭＥＫ１（２Ｄ突然変異体）のその後の添加後に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈された放射性ＡＴＰの添加により反応を開始する。室温で１時間インキュベーション後、氷冷２０％ＴＣＡを各ウエルに添加して、反応を停止し、そして溶液中のタンパク質を沈澱させる。翌日、濾過を実行し、その後、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｗａｌｌａｃ　ｍｉｃｒｏＢｅｔａ　１４５０計数機を用いて、取込まれた放射能のシンチレーション計数を実行する。抑制は、ベヒクル対照のパーセンテージとして表される。
【０２２４】
（１）ｐＭＡＰＫレベルに関するエクス・ビボ組織試料の評価
５０ｍＭリン酸グリセロール、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１％トリトンｘ−１００、７０ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−Ｎａ３ＶＯ４、１００μＭ−ＰＭＳＦ、１０μＭロイペプチン及び１０μＭペプスタチン（使用の用意ができたときに抑制剤を付加するだけである）の溶解緩衝液を調製した。−７０℃で腫瘍を除去し、直ちにドライアイス上に載せる。４０〜５０ｍｇの各腫瘍を計量し、小刀を用いてスライスする。混合物をポリトロンでホモジェナイズし、２５００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離した。上清を１５ｍＬファルコン管に移した。次にタンパク質検定を実行して、タンパク質を規準化して、約１５μｇとした。溶解物の量によって、５μＬ〜１０μＬの６Ｘ　ｌａｅｍｍｌｉを各管に添加した。混合物を３分間沸騰させ、回転し、１０％トリス−グリシン（ｔｒｉｓ−ｇｌｙ）ゲル上を１４０Ｖで泳動させた（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。１２５Ｖで１．５〜２時間、転写を行った。膜を水中ですすぎ、次にＴＢＳＴ（トリス緩衝化食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０）、１％ＢＳＡ及び１％卵白アルブミンのブロッキング溶液中に入れた。膜をＴＢＳＴ中で５分間３回すすぎ、次に第一抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に３〜４時間入れた。次に膜をＴＢＳＴ中で５分間洗浄し、第二抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄヤギ抗ウサギＨＲＰ）中に１．５時間入れた。ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）によりブロットを可視化した。リン酸化ＭＡＰＫとして同定されるタンパク質バンドを、ＢｉｏｒａｄＦｌｕｒ−Ｓマルチイメージャーマックスを用いた濃度測定により測定した。
【０２２５】
（２）イン・ビボＣｏｌｏｎ２６細胞ＭＡＰキナーゼウエスタン検定：
１日目：Ｃｏｌｏｎ２６（ネズミ）細胞を、およそ２ｘ１０５細胞／ウエル（１．５　ｍＬ／ウエル）で１２ウエルプレート中に植付けた。ＤＭＥＭ／Ｆ１２＃１１３３０−０３２（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ及び１％抗生物質／抗真菌剤からなる培地中で細胞を増殖させて、３７℃、５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。
２日目：９６ウエルプレート中で（１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３、及び０．００１μＭ）の濃度で、ＤＭＳＯ中で化合物を調製した。細胞調製におけるＤＭＳＯ濃度は、０．２％より高くてはならず、従って、総計３μＬの各ＤＭＳＯ溶液を、細胞を含有する１．５ｍＬウエルに添加した。次に、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で１時間、細胞をインキュベートした。
【０２２６】
プレート及びエッペンドルフ管を氷上に保持した。細胞をＰＢＳ（１ｍＭ−Ｎａ３ＶＯ４含有）１ｍＬ中で洗浄し、その後、ＰＢＳを除去した。７０ｍＭ−ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸グリセロール、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ−Ｎａ３ＶＯ４、１００μＭ−ＰＭＳＦ、１０μＭロイペプチン及び１０μＭペプスタチンを含有する溶液１００μＬ中で細胞を溶解することによる処理後、細胞ＭＡＰＫのトレオニン及びチロシンリン酸化の状態を測定した。細胞をウエルから掻き取り、エッペンドルフ管に移した。エッペンドルフ管を１３，０００ｒｐｍで４℃で５分間回転させた。次に上清を冷却エッペンドルフ管に移し、ペレットを捨てた。次にＰｉｅｒｃｅＢＣＡタンパク質検定を実行して、タンパク質を２０μｇに規準化した。１０％トリス−グリシン１０ウエル又は１５ウエルゲルにロードし、１３０Ｖで１．５時間、ゲルを泳動させた。１２５Ｖで２時間又は２５Ｖで一夜、転写を行った。膜を水中ですすぎ、次にブロッキング溶液中に１〜１８時間置いた。膜をＴＢＳＴ中で５分間３回すすぎ、次に第一抗体（ｐＭＡＰＫ）中に３〜１８時間置いた。次に膜をＴＢＳＴ中で５分間洗浄し、第二抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄヤギ抗ウサギＨＲＰ）中に１時間置いた。最後に膜をＴＢＳＴ中で１５分間３回洗浄した。ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）によりブロットを可視化した。リン酸化ＭＡＰＫとして同定されるタンパク質バンドを、ＢｉｏｒａｄＦｌｕｒ−Ｓマルチイメージャーマックスを用いた濃度測定により測定した。総ＭＡＰＫレベルを評価するために、次にブロットを「ストリップ化」し、非リン酸化ＥＲＫ１及びＥＲＫ２を認識するポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，カリフォルニア州）の１：１混合物を用いて再プローブした。
【０２２７】
（３）材料一覧：
ＴＢＳＴ緩衝液０．９％ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５
ｐＭＡＰＫ　　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｐＭＡＰＫ：（０．５％ＢＳＡ中に１：５，０００）＃Ｖ８０３１−ポリクローナル
第二　　ＢｉｏＲａｄヤギ抗ウサギＨＲＰ（０．５％ＢＳＡ中に１：１０，０００）カタログ番号１７０−６５１５
ブロッキング溶液：ＴＢＳＴ中１％ＢＳＡ、１％卵白アルブミン、フィルター滅菌（０．０１％アジ化ナトリウム）。
【０２２８】
【実施例８】
《ＭＥＫ１：リガンド：補因子複合体の結晶化》
実施例４に記載した精製タンパク質：リガンド複合体［ＭＥＫ１−Ｃ２、ＭＥＫ１−Ｃ１、ＭＥＫ１−Ｃ１（ｄ２８０−３２３）］を急速解凍し、前記のようにサイズ排除クロマトグラフィー緩衝液中に溶解された５ｍＭ−Ｍｇ−ＡＴＰからなる補因子溶液と共に４℃で一夜インキュベートした。インキュベーション後、タンパク質：リガンド：補因子複合体を１４，０００ｘｇで４℃で３０分間遠心分離した。３成分複合体の１μＬ滴を用いて、１３℃でハンギング・ドロップ蒸気拡散により、ＭＥＫ１Ｃ２ペプチド：リガンド：補因子複合体の結晶を成長させた。タンパク質対沈澱剤の比は、１ｍＬウエル溶液全体で１：１であった。用いた沈澱剤は、６〜１６％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８Ｋ、１５０〜４５０ｍＭ−ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、２０ｍＭ−ＤＴＴ及び１００ｍＭイミダゾール／マレート緩衝液、ｐＨ７．０であった。結晶は、約８日で約０．２ｘ０．１ｘ０．１ｍｍに成長した。
【０２２９】
あるいは、実施例４に記載した精製アポタンパク質溶液６０μＬを、約０．２ｍｇの阻害剤と２〜８時間の期間、一緒にした。次にＭＥＫ１ペプチド：リガンド複合体の溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー緩衝液中に溶解した５ｍＭ−Ｍｇ−ＡＴＰからなる補因子溶液と共に４℃で一夜インキュベートし、前記と同様に結晶化した。
ウエル溶液で希釈した１０％エチレングリコールからなる凍結防止剤溶液中に結晶を浸すことにより、低温データ収集のために結晶を調製した。本手法は、１μＬ滴の１００％エチレングリコール溶液を、結晶を含有する倒立カバーガラスに添加することを含む。低温溶液を９μＬのウエル溶液と充分に混合して、１０％エチレングリコール低温溶液を作製した。次に混合低温溶液を１：１（ｖ／ｖ）の比で、結晶を含有する滴に添加して、拡散により徐々に混合させた。母液と呼ばれる、結晶を含有する滴は、ここでは、５％エチレングリコールからなる。約２分後、低温／母液溶液から結晶を取り出し、７０％パラトン−Ｎ（Ｈａｍｐｔｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｇｕｎａ　Ｎｉｇｕｅｌ，ＣＡから取得）と３０％軽質白色鉱油混合物との混合物に移した（据付低温ループを使用；同様にＨａｍｐｔｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｇｕｎａ　Ｎｉｇｕｅｌ，ＣＡから取得）。次に結晶を油混合物中で操作して、水性溶液を完全に除去し、液体窒素中への直接的浸漬により急速に冷却した。あるいは結晶は、約１００Ｋで冷却窒素ガス流中に浸漬することができる。
【０２３０】
【実施例９】
《ＭＥＫ２：リガンド：補因子複合体の結晶化》
実施例６に記載した精製タンパク質：リガンド複合体ＭＥＫ２−Ｃ２を急速解凍し、前記のようにサイズ排除クロマトグラフィー緩衝液中に溶解された５ｍＭ−Ｍｇ−ＡＴＰからなる補因子溶液とともに４℃で一夜インキュベートした。インキュベーション後、タンパク質：リガンド：補因子複合体を１４，０００ｘｇで４℃で３０分間遠心分離した。３成分複合体の１μＬ滴を用いて、１３℃でハンギング・ドロップ蒸気拡散により、ＭＥＫ２ペプチド：リガンド：補因子複合体の結晶を成長させた。タンパク質対沈澱剤の比は、１ｍＬウエル溶液全体で１：１であった。用いた沈澱剤は、１．４〜１．８５Ｍ−ＮａＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、０〜２０ｍＭ−ＤＴＴ、ｐＨ６．７〜７．１であった。結晶は、約８日で約０．２ｘ０．１ｘ０．１ｍｍに成長した。
７０％パラトン−Ｎ（Ｈａｍｐｔｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｇｕｎａ　Ｎｉｇｕｅｌ，ＣＡ）と３０％軽質白色鉱油混合物との混合物（据付低温ループを使用；同様にＨａｍｐｔｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｇｕｎａ　Ｎｉｇｕｅｌ，ＣＡから取得）からなる凍結防止剤溶液中に結晶を浸すことにより、低温データ収集のために結晶を調製した。次に結晶を油混合物中で操作して、水性溶液を完全に除去し、液体窒素中への直接的浸漬により急速に冷却した。あるいは結晶は、約１００Ｋで冷却窒素ガス流中に浸漬することができる。
【０２３１】
【実施例１０】
《ＭＥＫ１及びＭＥＫ２：リガンド：補因子複合体結晶の結晶学的データ収集》（１）回析データの企業内分析及び収集：
オスミック共焦点鏡を装備した５０ｋＶ及び１００ｍＡで操作するＲｉｇａｋｕ　ＲＵ−Ｈ３Ｒ回転アノードＸ線源に据付けられたＲ−ＡＸＩＳ　ＩＶ＋＋で、１００ケルビンにて、相決定のために用いられる初期データセットを収集した。結晶と検出器との距離を２２５ｍｍとし、０度の２θ値で検出器を配置した。０．５度／フレームの回転角度を用い、曝露時間は１０分／フレームであった。逆ビーム法を用い、１８０°離れて２つの８０°区域を収集した。
【０２３２】
（２）シンクロトロンデータ収集：
Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｐｈｏｔｏｎ　Ｓｏｕｒｃｅ　Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬで１７−ＩＤビームライン（ＩＭＣＡ）で１００Ｋにてそれぞれ２．４Å及び３．２Å解像度で、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２のシンクロトロンデータセットを収集した。ＭＥＫ１データ収集に関しては、１．０Åの波長を用い、検出器までの結晶の距離は１７０ｍｍであり、ＭＡＲ　ＣＣＤを用いて回転角度は０．５度／フレーム、そして曝露時間は１０秒／フレームであった。１．０Åの波長を用い、検出器までの結晶の距離は２００ｍｍであり、ＡＤＳＣ　ＱＵＡＮＴＵＭ２１０ＣＣＤ検出器を用いた０．５度／フレームの回転角及び１０秒／フレームの曝露時間をＭＥＫ２データ収集のために用いた。
【０２３３】
【実施例１１】
《初期ＭＥＫ１：リガンド：補因子複合体の構造決定》
３成分複合体の典型的結晶は、ヘキサゴナル空間群Ｐ６２に属し、単位セル寸法は約ａ＝ｂ＝８１．４、ｃ＝１２９．２Å、１分子／非対称単位である。
リガンド中のヨウ素原子により作製される変則シグナルからの企業内データを用いたＳＡＤ法を用いて、ＭＥＫ１の初期結晶構造を解明した。データ収集統計は、測定された２５３３６からの６６９９変則対の総計であり、反射は３６〜３．４Åの分解能範囲で見出された。約８３％の反射が冗長度４で測定され、１１％の反射が冗長度３で測定され、全体的Ｒｓｙｍｍ＝０．０５１であった。
【０２３４】
データはすべて、ＨＫＬ２０００で処理し、ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで評価した［Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｘ−ｒａｙ　ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ　ｄａｔａ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３２６（１９９７）］。その後の計算はすべて、ＣＮＸパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて実行した。ヨウ素原子の単一位置は、３．５Å変則差Ｐａｔｔｅｒｓｏｎマップから見出され、その後、自動Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ検索プログラムを用いて確証した。１０サイクルの重原子パラメーター（位置的及び熱的）及び相算定を実施した。全体的ＦＯＭ（ｆｉｇｕｒｅ−ｏｆ−ｍｅｒｉｔ）は、３６〜３．５Åの反射に関して０．２５８であった。密度修正を用いて、相情報における任意の多義性を最小化した。Ｍａｔｔｅｗｓ分析［Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｂ．Ｗ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９１−４９７（１９６８）］に従って、６４％の溶媒含量を仮定した。密度修正手法後、新規の相はＦＯＭ＝０．８５８を有した。的確な鏡像体を見出すために、ヨウ素原子の反転位置座標を有するＰ６５空間群で同様の算定を実行した。両空間群で算定された電子密度の分析は、Ｐ６２を的確なものであると確証した。より高い分解能データが利用可能になった後、相を２．３８Åに拡張した。これらの新規相を用いて算定した２．３８Å電子密度マップを、ＱＵＮＡＴＡ−２０００グラフアプリケーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いてタンパク質モデルトレーシング及び阻害剤及びＡＴＰの適合のために使用した。ＣＮＸ改良プログラム（最小化及び個々の）を用いて、完全性の異なる段階での原子モデルを改良した。２．３８Å分解能に関して、ネイティブデータセットは、ＡＰＳの１７ＩＤラインでの１．０Åの波長で収集し、データの７２０度の完全区域を収集した。放射線誘導性結晶崩壊を最小限にするために、７２０フレームからの最初の２４０のみをＨＫＬ２０００で処理し、ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで評価した。この結晶の単位セル寸法は、ａ＝ｂ＝８１．６、ｃ＝１２９．２Åと概算された。データは、Ｒｓｙｍｍ＝０．０４４で３６〜２．３８Å解像度範囲（約９５％カバレッジ）で測定された３５８１６からの１８５９０のユニークな反射を含んでいた。
【０２３５】
【実施例１２】
《ＭＥＫ１：リガンド：補因子構造複合体の改良》
２５〜２．４Åからのデータに対してプログラムＸ−ＰＬＯＲバージョン９８．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で実行される多段階最大見込み最小化手法（ｍｕｌｔｉ−ｓｔａｇｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ　ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いて、初期構造座標に対する位置的及び模擬的アニーリング改良を実行した。緩徐寒冷（ｓｌｏｗ−ｃｏｏｌ）手法（２５Ｋの過程において３０００Ｋ〜３００Ｋ）を用いた１ラウンドの模擬的アニーリングとその後の数サイクルの標準位置的改良は、Ｒｗｏｒｋを０．３７２（Ｒｆｒｅｅ＝０．４２８）に低減した。（２Ｆｏ−Ｆｃ）及び（Ｆｏ−Ｆｃ）の異なる電子密度マップは明らかに、モデルの側鎖及び阻害剤化合物［５−ブロモ−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）ベンズアミド］、ＡＴＰ及びＭｇ２＋のための結合部位のほとんどを明示した。初回のモデル再構築及び位置的改良と、その後の個別拘束Ｂ因子改良は、Ｒｗｏｒｋを０．３０２（Ｒｆｒｅｅ＝０．３４７）に低減した。大量溶媒補正の適用は更に、Ｒｗｏｒｋを０．２７７（Ｒｆｒｅｅ＝０．３１９）に低減した。連続回のモデル再構築、溶媒分子の付加並びに阻害剤及びＭｇＡＴＰにおけるモデリングと、その後の位置的及び拘束個別Ｂ改良は、０．２２３（Ｒｆｒｅｅ＝０．２７６）のＲｗｏｒｋを有する最新モデルを生じた。最新モデルは、１つのＡＴＰ分子、１つのＭｇ２＋イオン、１つの阻害剤分子及び８０の水分子を有する３成分複合体中において、ＮＨ２−末端トランケートＭＥＫ１の２７６個の残基に対応する２１５９個の非水素タンパク質原子を含有する。
ＭＥＫ１ペプチド（ＭＥＫ１−Ｃ１）：Ｍｇ−ＡＴＰ：５−ブロモ−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）ベンズアミドの結晶座標を、表１に示す。
【０２３６】
【実施例１３】
《ＭＥＫ２：リガンド：補因子構造複合体の構造決定及び改良》
３成分ＭＥＫ２複合体の典型的結晶は、ヘキサゴナル空間群Ｐ６１２２に属し、単位セル寸法は約ａ＝ｂ＝１６１．８９、ｃ＝１２２．９９Å、２分子／非対称単位である。データはすべて、ＨＫＬ２０００で処理し、ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで評価した［Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｘ−ｒａｙ　ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ　ｄａｔａ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３２６（１９９７）］。ＭＥＫ２−Ｃ２、ＭｇＡＴＰ及び｛５−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミド）−フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル｝−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミンの３成分共複合体に関しては、総計１５２，３８６の測定反射を同定し、１６，１３１が３６〜３．２Åの範囲の分解能範囲で独特の反射を示し、全体的Ｒｓｙｍｍ＝０．０８８であった。
【０２３７】
ＣＣＰ４（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ　４．１９９４．”Ｔｈｅ　ＣＣＰ４　Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”．Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０−７６３）におけるプログラムＭｏｌｒｅｐを用いて、検索モデルとして表１からのＭＥＫ１：ＭｇＡＴＰ：阻害剤複合体座標を用いた分子置換により、構造を解明した。ＣＣＰ４におけるＲｅｆｍａｃを用いて剛体改良を実施し、その後１サイクルの位置的改良を実施した。３．２Å電子密度マップを算定し、プログラムＱＵＮＡＴＡ−２０００グラフアプリケーション（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてタンパク質のマニュアル適合のために用いた。ＣＮＸ改良プログラム（最小化及び個々の）を用いて、完全性の異なる段階での原子モデルを改良した。
【０２３８】
２５〜３．２Åからのデータに対してプログラムＣＮＸバージョン２００２（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で実行される多段階最大見込み最小化手法を用いて、初期構造座標に対する位置的及び模擬的アニーリング改良を実行した。緩徐寒冷手法（２５Ｋの過程において２５００Ｋ〜３００Ｋ）を用いた１ラウンドの模擬的アニーリングとその後の数サイクルの標準位置的改良は、Ｒｗｏｒｋを０．３３８（Ｒｆｒｅｅ＝０．４３９）に低減した。（２Ｆｏ−Ｆｃ）及び（Ｆｏ−Ｆｃ）の異なる電子密度マップは明らかに、モデルの側鎖及び阻害剤化合物｛５−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル｝−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミン、ＡＴＰ及びＭｇ２＋のための結合部位のほとんどを明示した。初回のモデル再構築及び位置的改良後に、阻害剤及びＭｇＡＴＰにおけるモデリングを実施した。次に位置及び群拘束Ｂ因子改良は、Ｒｗｏｒｋを０．２９（Ｒｆｒｅｅ＝０．３７）に低減した。ＭＥＫ２ペプチド（ＭＥＫ２−Ｃ２）：Ｍｇ−ＡＴＰ：｛５−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル｝−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミンの結晶座標を、表２に示す。
【０２３９】
【実施例１４】
《ＭＥＫ１：リガンド：補因子複合体の結晶構造の分析》
３成分複合体の結晶構造をＰＤＢファイルフォーマットで取得し、ＳＹＢＹＬ（商標）及びＲＥＤＵＣＥ（商標）ソフトウェアにより実施されるファンクションを実施するソフトウェアを用いて分析した。最初に、リガンド及び補因子の原子型並びに存在した任意の水を修正することにより、構造データを処理した。次にソフトウェアを用いて、最も好ましい陽子化状態における水素のすべてを付加することにより、並びにタンパク質との最適相互作用を生じる配向で全水分子を回転することにより、タンパク質を滴定した。この修正後、タンパク質複合体は、結合部位特性化及びドッキングシミュレーションのための準備ができた。ＧＲＩＮ／ＧＲＩＤ（商標）及びＭＯＬＣＡＤ（商標）輪郭付け（ｃｏｎｔｏｕｒｉｎｇ）を用いて、リガンド及び補因子結合部位を特性化した。この手法では、リガンド及び補因子の各原子の周囲で半径４及び５Åをトレースし、その半径内のすべてのアミノ酸残基を同定した。
【０２４０】
Ｘ線結晶学的構造データを用いた結合部位特性化及びドッキング試験の分析後、ＭＥＫ１ペプチドが、リガンド結合部位に位置するＭＥＫ１阻害剤の４Å内の以下のアミノ酸残基の構造座標により規定されるリガンド結合ポケットを含む、ということを見いだした：配列番号２のＧ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｖ１２７、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、Ｍ２１９。更に、ＭＥＫ１ペプチドが、リガンド結合部位に位置するＭＥＫ１阻害剤の５Å内の以下のアミノ酸残基の構造座標により規定されるリガンド結合ポケットを有する、ということを見いだした：配列番号２のＧ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｖ１２７、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｄ１９０、Ｎ１９５、Ｌ２０６、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、Ｍ２１９、Ｆ２２３。
【０２４１】
ＭＥＫ１ペプチドが、補因子結合部位におけるＡＴＰ分子の４Å内の以下の残基の構造座標により規定される補因子結合ポケットを包含する、ということも見いだした：配列番号２のＬ７４、Ｇ７５、Ａ７６、Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ８０、Ｖ８１、Ｖ８２、Ａ９５、Ｋ９７、Ｖ１２７、Ｍ１４３、Ｅ１４４、Ｈ１４５、Ｍ１４６、Ｇ１４９、Ｓ１５０、Ｄ１５２、Ｑ１５３、Ｋ１９２、Ｓ１９４、Ｎ１９５、Ｌ１９７、Ｄ２０８、Ｖ２２４。更に、ＭＥＫ１ペプチドが、補因子結合部位におけるＡＴＰ分子の５Å内の以下の残基の構造座標により規定される補因子結合ポケットを包含する、ということを見いだした：配列番号２のＬ７４、Ｇ７５、Ａ７６、Ｇ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、８０、Ｖ８１、Ｖ８２、Ａ９５、Ｋ９７、Ｖ１２７、Ｍ１４３、Ｅ１４４、Ｈ１４５、Ｍ１４６、Ｄ１４７、Ｇ１４９、Ｓ１５０、Ｄ１５２、Ｑ１５３、Ｄ１９０、Ｋ１９２、Ｓ１９４、Ｎ１９５、Ｌ１９７、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｖ２２４、Ｇ２２５。
【０２４２】
【実施例１５】
《ＭＥＫ２：リガンド：補因子複合体の結晶構造の分析》
３成分複合体の結晶構造をＰＤＢファイルフォーマットで取得し、ＳＹＢＹＬ（商標）及びＲＥＤＵＣＥ（商標）ソフトウェアにより実施されるファンクションを実施するソフトウェアを用いて分析した。最初に、リガンド及び補因子の原子型並びに存在した任意の水を修正することにより、構造データを処理した。次にソフトウェアを用いて、最も好ましい陽子化状態における水素のすべてを付加することにより、並びにタンパク質との最適相互作用を生じる配向で全水分子を回転することにより、タンパク質を滴定した。この修正後、タンパク質複合体は、結合部位特性化及びドッキングシミュレーションのための準備ができた。ＧＲＩＮ／ＧＲＩＤ（商標）及びＭＯＬＣＡＤ（商標）輪郭付けを用いて、リガンド及び補因子結合部位を特性化した。この手法では、リガンド及び補因子の各原子の周囲で半径４及び５Åをトレースし、その半径内のすべてのアミノ酸残基を同定した。
【０２４３】
Ｘ線結晶学的構造データを用いた結合部位特性化及びドッキング試験の分析後、ＭＥＫ２ペプチドが、リガンド結合部位に位置するＭＥＫ２阻害剤の４Å内の以下のアミノ酸残基の構造座標により規定されるリガンド結合ポケットを含む、ということを見いだした：配列番号４のＧ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ１０１、Ｉ１０３、Ｌ１１９、Ｌ１２２、Ｖ１３１、Ｆ１３３、Ｉ１４５、Ｍ１４７、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｆ２１３、Ｇ２１４、Ｖ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１９、Ｉ２２０、Ｍ２２３。更に、ＭＥＫ２ペプチドが、リガンド結合部位に位置するＭＥＫ２阻害剤の５Å内の以下のアミノ酸残基の構造座標により規定されるリガンド結合ポケットを有する、ということを見いだした：配列番号４のＧ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｋ１０１、Ｉ１０３、Ｌ１１９、Ｌ１２２、Ｉ１３０、Ｖ１３１、Ｇ１３２、Ｆ１３３、Ｉ１４５、Ｍ１４７、Ｄ１９４、Ｎ１９９、Ｌ２１０、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｆ２１３、Ｇ２１４、Ｖ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１９、Ｉ２２０、Ｍ２２３、Ｆ２２７。
【０２４４】
ＭＥＫ２ペプチドが、補因子結合部位におけるＡＴＰ分子の４Å内の以下の残基の構造座標により規定される補因子結合ポケットを包含する、ということも見いだした：配列番号４のＬ７８、Ｇ７９、Ａ８０、Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８４、Ｖ８５、Ｖ８６、Ａ９９、Ｋ１０１、Ｖ１３１、Ｍ１４７、Ｅ１４８、Ｈ１４９、Ｍ１５０、Ｇ１５３、Ｓ１５４、Ｄ１５６、Ｑ１５７、Ｋ１９６、Ｓ１９８、Ｎ１９９、Ｌ２０１、Ｄ２１２、Ｖ２２８。更に、ＭＥＫ２ペプチドが、補因子結合部位におけるＡＴＰ分子の５Å内の以下の残基の構造座標により規定される補因子結合ポケットを包含する、ということを見いだした：配列番号４のＬ７８、Ｇ７９、Ａ８０、Ｇ８１、Ｎ８２、Ｇ８３、Ｇ８４、Ｖ８５、Ｖ８６、Ａ９９、Ｋ１０１、Ｖ１３１、Ｍ１４７、Ｅ１４８、Ｈ１４９、Ｍ１５０、Ｄ１５１、Ｇ１５３、Ｓ１５４、Ｄ１５６、Ｑ１５７、Ｄ１９４、Ｋ１９６、Ｓ１９８、Ｎ１９９、Ｌ２０１、Ｃ２１１、Ｄ２１２、Ｖ２２８、Ｇ２２９。
【０２４５】
Ｘ線結晶学的構造データを用いた結合部位特性化及びドッキング試験の分析後、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２のある種の特徴がＭＥＫ１又はＭＥＫ２リガンド結合部位とのリガンドの高親和性結合に関与する、ということを見いだした。前記の阻害剤を用いて、活性化ループのいくつかの残基との水素結合供与体及び受容体相互作用を有する疎水性プライムポケットへのリガンドの配向を包含する結合様式を観察した。しかしながら、他の種類の化合物の連続結晶化は、現在のところ観察されていない新規の結合様式を明示することができる、と予測される。例えば、モデリング及びドッキングシミュレーションは、その他のより新規の種類の化合物に関する代替的結合様式を明示している。この情報は、例えば、ＭＥＫ１又はＭＥＫ２と結合することができ、従ってＭＥＫ１又はＭＥＫ２活性を抑制することができる化学物質の評価、スクリーニング及び／又は設計及び修飾に用いることができる。
本発明の結合部位は、当業界で公知の種々のスクリーニング技法、例えば、ＵＮＩＴＹ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）及び任意のその他の３Ｄデータベーススクリーニングソフトウェアを用いたバーチャルライブラリーをスクリーニングするための基礎として使用することができる。例えば、表１に見出されるＸ線結晶学的データは、ＭＥＫ１の三次元構造の詳細な同定をはじめて可能にした。同様に、表２に見出されるＸ線結晶学的データは、ＭＥＫ２の三次元構造の詳細な同定をはじめて可能にした。
【０２４６】
【実施例１６】
《ＭＥＫ１及びＭＥＫ２構造間のＲＭＳＤの算定》
本明細書中では、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）のスーパーインポーズコマンドを用いて、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２構造のＣα及び／又は主鎖（Ｎ、Ｃ、Ｏ及びＣα）原子間のＲＭＳ偏差（ＲＭＳＤ）を算定した。ＲＭＳＤは、その他のモデリングプログラム又はスクリプトを用いても算定することができる。スーパーインポーズコマンドが行うのは、各分子からの選定セットの原子上で２つの分子の最小ＲＭＳアラインメントを実施し、スーパーインポーズした分子の選定原子間のＲＭＳＤ値を出力することである。
ＭＥＫ１及びＭＥＫ２構造の数組の選定Ｃα及び／又は主鎖原子間のＲＭＳＤ値が算定されており、それを表８に列挙した。全体的ＭＥＫ１及びＭＥＫ２構造のＣα及び／又は主鎖原子に関するＲＭＳＤを、以下の残基を用いて算定した：ＭＥＫ１のＥ６２〜Ｎ２２１、Ｖ２２４〜Ｐ２６６及びＰ３０７〜Ｌ３８１；並びにＭＥＫ２のＥ６６〜Ｎ２２５、Ｖ２２８〜Ｐ２７０及びＰ３１５〜Ｌ３８９。ＭＥＫ１及びＭＥＫ２のキナーゼドメインのＣα及び／又は主鎖原子に関するＲＭＳＤを、以下の残基を用いて算定した：ＭＥＫ１のＦ６８〜Ｎ２２１、Ｖ２２４〜Ｐ２６６及びＰ３０７〜Ｉ３６１；並びにＭＥＫ２のＦ７２〜Ｎ２２５、Ｖ２２８〜Ｐ２７０及びＰ３１５〜Ｉ３６９。
【０２４７】
配列番号２（ＭＥＫ１）のＧ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｖ１２７、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６及びＭ２１９、並びにＭＥＫ２におけるそれらの対応する残基を用いて、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の４Å阻害剤結合部位残基のＣα及び／又は主鎖原子に関するＲＭＳＤを算定した（表２）。配列番号２（ＭＥＫ１）のＧ７７、Ｎ７８、Ｇ７９、Ｇ８０、Ｋ９７、Ｉ９９、Ｌ１１５、Ｌ１１８、Ｉ１２６、Ｖ１２７、Ｇ１２８、Ｆ１２９、Ｉ１４１、Ｍ１４３、Ｄ１９０、Ｎ１９５、Ｌ２０６、Ｃ２０７、Ｄ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１５、Ｉ２１６、Ｍ２１９、並びにＭＥＫ２におけるそれらの対応する残基を用いて、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の５Å阻害剤結合部位残基のＣα及び／又は主鎖原子に関するＲＭＳＤを算定した（表２）。
【０２４８】
本明細書中に引用された参考文献はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中に含まれる。
本発明をその実施例と関連させて説明してきたが、前記の説明は実際に例示的及び説明的なものであって、本発明及びその好ましい態様を例証するよう意図される、と理解されるべきである。ルーチン実験により、本発明の精神を逸脱しない限りにおいて成され得る明白な修正及び変更を当業者は認識する。従って、本発明は、前記の説明によっては限定されないが、しかし以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物により限定されるよう意図される。
以下の表は、本明細書に含まれる。
【０２４９】
2004000135.tif 000012
2004000135.tif 000013
2004000135.tif 000014
2004000135.tif 000015
2004000135.tif 000016
2004000135.tif 000017
2004000135.tif 000018
2004000135.tif 000019
2004000135.tif 000020
2004000135.tif 000021
2004000135.tif 000022
2004000135.tif 000023
2004000135.tif 000024
2004000135.tif 000025
2004000135.tif 000026
2004000135.tif 000027
2004000135.tif 000028
2004000135.tif 000029
2004000135.tif 000030
2004000135.tif 000031
2004000135.tif 000032
2004000135.tif 000033
2004000135.tif 000034
2004000135.tif 000035
2004000135.tif 000036
2004000135.tif 000037
2004000135.tif 000038
2004000135.tif 000039
2004000135.tif 000040
2004000135.tif 000041
2004000135.tif 000042
2004000135.tif 000043
2004000135.tif 000044
2004000135.tif 000045
2004000135.tif 000046
2004000135.tif 000047
2004000135.tif 000048
2004000135.tif 000049
2004000135.tif 000050
2004000135.tif 000051
2004000135.tif 000052
2004000135.tif 000053
2004000135.tif 000054
2004000135.tif 000055
2004000135.tif 000056
2004000135.tif 000057
2004000135.tif 000058
2004000135.tif 000059
2004000135.tif 000060
2004000135.tif 000061
2004000135.tif 000062
2004000135.tif 000063
2004000135.tif 000064
2004000135.tif 000065
2004000135.tif 000066
2004000135.tif 000067
2004000135.tif 000068
2004000135.tif 000069
2004000135.tif 000070
2004000135.tif 000071
2004000135.tif 000072
2004000135.tif 000073
2004000135.tif 000074
2004000135.tif 000075
2004000135.tif 000076
2004000135.tif 000077
2004000135.tif 000078
2004000135.tif 000079
2004000135.tif 000080
2004000135.tif 000081
2004000135.tif 000082
2004000135.tif 000083
2004000135.tif 000084
2004000135.tif 000085
2004000135.tif 000086
2004000135.tif 000087
2004000135.tif 000088
2004000135.tif 000089
2004000135.tif 000090
2004000135.tif 000091
【０２５０】
2004000135.tif 000092
2004000135.tif 000093
2004000135.tif 000094
2004000135.tif 000095
2004000135.tif 000096
2004000135.tif 000097
2004000135.tif 000098
2004000135.tif 000099
2004000135.tif 000100
2004000135.tif 000101
2004000135.tif 000102
2004000135.tif 000103
2004000135.tif 000104
2004000135.tif 000105
2004000135.tif 000106
2004000135.tif 000107
2004000135.tif 000108
2004000135.tif 000109
2004000135.tif 000110
2004000135.tif 000111
2004000135.tif 000112
2004000135.tif 000113
2004000135.tif 000114
2004000135.tif 000115
2004000135.tif 000116
2004000135.tif 000117
2004000135.tif 000118
2004000135.tif 000119
2004000135.tif 000120
2004000135.tif 000121
2004000135.tif 000122
2004000135.tif 000123
2004000135.tif 000124
2004000135.tif 000125
2004000135.tif 000126
2004000135.tif 000127
2004000135.tif 000128
2004000135.tif 000129
2004000135.tif 000130
2004000135.tif 000131
2004000135.tif 000132
2004000135.tif 000133
2004000135.tif 000134
2004000135.tif 000135
2004000135.tif 000136
2004000135.tif 000137
2004000135.tif 000138
2004000135.tif 000139
2004000135.tif 000140
2004000135.tif 000141
2004000135.tif 000142
2004000135.tif 000143
2004000135.tif 000144
2004000135.tif 000145
2004000135.tif 000146
2004000135.tif 000147
2004000135.tif 000148
2004000135.tif 000149
2004000135.tif 000150
2004000135.tif 000151
2004000135.tif 000152
2004000135.tif 000153
2004000135.tif 000154
2004000135.tif 000155
2004000135.tif 000156
2004000135.tif 000157
2004000135.tif 000158
2004000135.tif 000159
2004000135.tif 000160
2004000135.tif 000161
2004000135.tif 000162
2004000135.tif 000163
2004000135.tif 000164
2004000135.tif 000165
2004000135.tif 000166
2004000135.tif 000167
2004000135.tif 000168
2004000135.tif 000169
2004000135.tif 000170
2004000135.tif 000171
2004000135.tif 000172
2004000135.tif 000173
2004000135.tif 000174
2004000135.tif 000175
2004000135.tif 000176
2004000135.tif 000177
2004000135.tif 000178
2004000135.tif 000179
2004000135.tif 000180
2004000135.tif 000181
2004000135.tif 000182
2004000135.tif 000183
2004000135.tif 000184
2004000135.tif 000185
2004000135.tif 000186
2004000135.tif 000187
2004000135.tif 000188
2004000135.tif 000189
2004000135.tif 000190
2004000135.tif 000191
2004000135.tif 000192
2004000135.tif 000193
2004000135.tif 000194
2004000135.tif 000195
2004000135.tif 000196
2004000135.tif 000197
2004000135.tif 000198
2004000135.tif 000199
2004000135.tif 000200
2004000135.tif 000201
2004000135.tif 000202
2004000135.tif 000203
2004000135.tif 000204
2004000135.tif 000205
2004000135.tif 000206
2004000135.tif 000207
2004000135.tif 000208
2004000135.tif 000209
2004000135.tif 000210
2004000135.tif 000211
2004000135.tif 000212
2004000135.tif 000213
2004000135.tif 000214
2004000135.tif 000215
2004000135.tif 000216
2004000135.tif 000217
2004000135.tif 000218
2004000135.tif 000219
2004000135.tif 000220
2004000135.tif 000221
2004000135.tif 000222
2004000135.tif 000223
2004000135.tif 000224
2004000135.tif 000225
2004000135.tif 000226
2004000135.tif 000227
2004000135.tif 000228
2004000135.tif 000229
2004000135.tif 000230
2004000135.tif 000231
2004000135.tif 000232
2004000135.tif 000233
2004000135.tif 000234
2004000135.tif 000235
2004000135.tif 000236
2004000135.tif 000237
2004000135.tif 000238
2004000135.tif 000239
2004000135.tif 000240
2004000135.tif 000241
2004000135.tif 000242
2004000135.tif 000243
2004000135.tif 000244
2004000135.tif 000245
2004000135.tif 000246
2004000135.tif 000247
2004000135.tif 000248
2004000135.tif 000249
2004000135.tif 000250
2004000135.tif 000251
2004000135.tif 000252
2004000135.tif 000253
2004000135.tif 000254
2004000135.tif 000255
【０２５１】
〔表３：４Ａ又は５ＡのＭＥＫ１インヒビター結合部位内のＭＥＫ１及びＭＥＫ２のインヒビター結合部位残基の複数配列アラインメント〕
【表１】
2004000135.tif 000256
【０２５２】
〔表４：４Ａ又は５ＡのＭＥＫ１補因子結合部位内のＭＥＫ１及びＭＥＫ２のインヒビター結合部位残基の複数配列アラインメント〕
【表２】
2004000135.tif 000257
【０２５３】
〔表５：ＭＥＫファミリーの他のメンバーに対するヒトＭＥＫ１のキナーゼドメインとインヒビター結合部位との間の配列同一性〕
【表３】
2004000135.tif 000258
【０２５４】
〔表６：ＭＥＫファミリーの他のメンバーに対するヒトＭＥＫ１のキナーゼドメインとＡＴＰ−結合部位との間の配列同一性〕
【表４】
2004000135.tif 000259
【０２５５】
〔表７：Ｘ線結晶学的構造解析によって決定したＭＥＫ１の二次構造の詳細な説明〕
【表５】
2004000135.tif 000260
【０２５６】
〔表８：Ｘ線結晶学的構造解析によって決定したＭＥＫ１の二次構造の詳細な説明〕
【表６】
2004000135.tif 000261
【０２５７】
【配列表】
2004000135.tif 000262
2004000135.tif 000263
2004000135.tif 000264
2004000135.tif 000265
2004000135.tif 000266
2004000135.tif 000267
2004000135.tif 000268
2004000135.tif 000269
2004000135.tif 000270
2004000135.tif 000271
2004000135.tif 000272
2004000135.tif 000273
2004000135.tif 000274
2004000135.tif 000275
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、５−ブロモ−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミド及びＭｇＡＴＰと一緒の３成分複合体中のＮＨ２末端トランケートＭＥＫ１ペプチド構造の３次元構造のリボン状表示物である。前記ペプチドのアルファらせん領域はブルーで着色されており、ベータシート領域はグリーンで着色されており、ＡＴＰ補因子はパープルであり、マグネシウム原子はシアンで着色されており、そしてインヒビターはレッドで着色されている。Ｍｇ−ＡＴＰ分子は、他のキナーゼ構造において見られるように、ＮＨ２末端ローブ［ｌｏｂｅ］とＣＯＯＨ末端ローブとの間で分裂した［ｃｌｅｆｔ］活性部位において結合し、一方、インヒビターは、活性ループにより部分的に形成される裂け目［ｃｌｅｆｔ］の後部に存在するポケット中に結合する。
【図２】図２は、｛５−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル｝−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミン及びＭｇＡＴＰと一緒の３成分複合体中のＮＨ２末端トランケートＭＥＫ２ペプチド構造の３次元構造のリボン状表示物である。前記ペプチドのアルファらせん領域はブルーで着色されており、ベータシート領域はグリーンで着色されており、ＡＴＰ補因子はパープルであり、マグネシウム原子はシアンで着色されており、そしてインヒビターはレッドで着色されている。ＭｇＡＴＰ分子は、他のキナーゼ構造において見られるように、ＮＨ２末端ローブ［ｌｏｂｅ］とＣＯＯＨ末端ローブとの間で分裂した［ｃｌｅｆｔ］活性部位において結合し、一方、インヒビターは、活性ループにより部分的に形成される裂け目［ｃｌｅｆｔ］の後部に存在するポケット中に結合する。
【図３】図３は、共通して観察される残基のＣアルファ原子を利用したＭＥＫ１ペプチド（ブルー）及びＭＥＫ２ペプチド（レッド）の３次元構造の重ね合わせである。
【図４】図４は、ＭＥＫ１活性部位内の特定の（図４中で「ｐｄ０３１８０８８」と表される）リガンドの配向に関連する相互作用を示す。図４の右後側には、Ｓｅｒ２１２の主鎖窒素原子とインヒビターの４−フルオロ基との間に形成されるＨ−ドナー及びアクセプター結合が見られる。また、図４の頂上部には、Ｖａｌ１２７の主鎖カルボニルと静電的な相互作用を形成するインヒビターのヨウ素原子が見られる。最後に、Ｌｅｕ１１５、Ｌｅｕ１１８、及びＰｈｅ２０９は、主要な疎水性ポケットの形成に関連する。
【図５】図５は、ＭＥＫ２活性部位内の特定の（図５中で「ＰＤ０３３４５８１」と表される）リガンドの配向に関連する相互作用を示す。図４の右後側には、Ｓｅｒ２１６の主鎖窒素原子とインヒビターの４−フルオロ基との間に形成されるＨ−ドナー及びアクセプター結合が見られる。また、図４の頂上部には、Ｖａｌ１３１の主鎖カルボニルと静電的な相互作用を形成するインヒビターのヨウ素原子が見られる。最後に、Ｌｅｕ１１９、Ｌｅｕ１２２、及びＰｈｅ２１３は、主要な疎水性ポケットの形成に関連する。
【図１】
2004000135.tif 000276
【図２】
2004000135.tif 000277
【図３】
2004000135.tif 000278
【図４】
2004000135.tif 000279
【図５】
2004000135.tif 000280