(57)【要約】      （修正有）【課題】嫌気性真菌、特にネオカリマスチクスフロンタリスおよびN.パトリシアラムから取り出された組換えキシラナーゼを提供すること。この酵素は、熱およびアルカリpH耐性があり、キシランに対して高い活性と高い特異性を示す。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するキシラナーゼまたはそのキシラン分解性フラグメントの遺伝子をＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ  ｆｒｏｎｔａｌｉｓ及びＮｅｏｃａｌｉｍａｓｔｉｘ  ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍより分離し、大腸菌及び／又はＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａに導入し、大量に発現することができた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号16〜27および32〜33から選択されるアミノ酸配列を有するキシラナーゼまたはそのキシラン分解性フラグメント。
【請求項２】
配列番号26のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のキシラナーゼまたはそのキシラン分解性フラグメント。
【請求項３】
配列番号16〜27および32〜33から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはそのキシラン分解性フラグメントをコードする単離されたDNA配列。
【請求項４】
前記DNAが、配列番号2〜13および29〜30の核酸配列を含む、請求項3に記載の単離されたDNA配列。
【請求項５】
配列番号26のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはそのキシラン分解性フラグメントをコードする請求項3に記載の単離されたDNA配列。
【請求項６】
前記DNAが、配列番号12の核酸配列を含む、請求項3に記載の単離されたDNA配列。
【請求項７】
請求項3のDNAを含む組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項4のDNAを含む、請求項7に記載の組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項5のDNAを含む、請求項7に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１０】
請求項6のDNAを含む、請求項7に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項3に記載のDNA分子で形質移入または形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項4に記載のDNA分子で形質移入または形質転換された請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項5に記載のDNA分子で形質移入または形質転換された請求項12に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項6に記載のDNA分子で形質移入または形質転換された請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
大腸菌およびピキアメタノリカからなる群から選択される請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
大腸菌およびピキアメタノリカからなる群から選択される請求項12に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
大腸菌およびピキアメタノリカからなる群から選択される請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
大腸菌およびピキアメタノリカからなる群から選択される請求項14に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
aactgttgctaaggcccaatggggtまたはaccccatttaccatcgtcatcagtgの配列を有することを特徴とする、キシラナーゼ遺伝子増幅に使用するためのプライマー。
【請求項２０】
aactgttgctaaggcccaatggggtまたはaccccatttaccatcgtcatcagtgの配列を有することを特徴とする、キシラナーゼ遺伝子増幅に使用するためのプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネオカリマスチクスフロンタリス(Neocallimastix frontalisおよびN.パトリシアラム(N.patriciarum)などの嫌気性真菌から取り出された新規の組換えキシラナーゼに関する。本発明のキシラナーゼは、熱およびアルカリpH耐性があり、キシランに対して高い活性をもち、非常に特異的である。本発明はまた、前記のキシラナーゼをコードする関連するDNA配列、ならびに前記DNA配列を保有する宿主にも関する。
【背景技術】
【０００２】
キシラナーゼは、多糖、すなわち植物におけるヘミセルロースの主な構成要素であるキシランを分解する。キシランは、セルロースに次いで最も豊富な再生可能資源であり、β-1,4-D-ピラノキシロースが連結した主鎖および種々の置換された側鎖を有するヘテロ多糖である。その複雑な構造のために、キシランの完全な破壊のための酵素分解システムが必要である。こうした酵素には、主鎖を分解する酵素:すなわちエンドβ-1,4キシラナーゼ(EC 3.2.1.8)およびβ-キシロシダーゼ(EC 3.2.1.37)、ならびに側鎖を分解する酵素:すなわちα-L-アラビノフラノシダーゼ(EC 3.2.1.55)、α-グルクロニダーゼ(EC 3.2.1.139)、およびアセチルキシランエステラーゼ(EC 3.1.1.72)がある(Q.K.Beg、M.Kapoor、L.Mahajan、およびG.S.Hoondal、Microbial xylanases and their industrial applications:a review.Appl Microbiol Biotechnol(2001)56:326〜338)。これらの酵素の中で、エンドβ-1,4キシラナーゼは、キシラン分解の最も多くの部分に寄与する。
【０００３】
エンド-キシラナーゼは、キシラン(植物の一次および二次細胞壁に顕著に見られる一般的な形のヘミセルロース)の主鎖を構成する、キシロース残基間のβ(1-4)結合を無差別に切断する酵素である。(1999年9月7日に発行された)米国特許第5,948,667号、(2001年10月9日に取得された)米国特許第6,300,114号、(1998年10月20日に取得された)米国特許第5,824,533号、および(1993年12月23日に発行された)WO 93/25693などの多くの従来の技術は、様々なキシラナーゼおよびその使用を開示している。キシラナーゼの知られている応用例は、非常に多い。たとえば、酸生成の速度を増すための、(セルラーゼと共に)キシラナーゼを用いた飼料の処理、それによるより良質なサイレージの確保、およびその後の反芻動物による植物細胞壁消化の速度の向上が記載されている。キシラナーゼを使用して、ライ麦、およびアラビノキシラン含有量の高い他の穀類を処理し、家禽およびブタによる穀類の消化率を向上させることができる。キシラナーゼは、キシランの、キシロオリゴ糖とキシロース(微生物のための成長基質として役立つ)への加水分解を含むバイオコンバージョンに使用することができる。これは、同時に起こる糖化と発酵を含む可能性がある。キシラナーゼをバイオパルプ化(biopulping)に使用して、セルロースパルプを処理し、キシラン不純物を除去する、あるいは異なる特性を持つするパルプを製造することができる。ある種のケースでは、これらを応用して、パルプの漂白に必要な塩素の量を減らし、パルプの精製に必要なエネルギーを減らすことができる。さらに、キシラナーゼは、亜麻繊維の浸水、果汁の清澄化、食品用増粘剤として使用するためのデキストランの調製、および植物材料からの液(fluid)および汁(juice)の生成に有用である。
【０００４】
市販されているキシラナーゼならびにそれらの活性および目的は、「Q.K.Beg、M.Kapoor、L.Mahajan、およびG.S.Hoondal、Microbial xylanases and their industrial applications:a review.Appl Microbiol Biotechnol(2001)56:326〜338」に記載されている。
【０００５】
特に、漂白していないクラフトパルプをキシラナーゼを用いて前処理することにより、漂白プロセスのための化学薬品の消費を減少できることが報告された。従来の技術はまた、キシラナーゼを用いた前処理が、Cl2、ClO2、H2O2、およびO3からなる一連の漂白と組み合わせて有用であることも開示している。キシラナーゼ処理後のパルプの漂白能力のこうした向上の直接的な結果として、その後の漂白用化学薬品(塩化物を含有する化学薬品が使用される場合、環境的に望ましくない有機塩素化合物の還元形をもたらす)の消費の減少が存在する。また、キシラナーゼ処理後のパルプの漂白能力の向上の直接的な結果として、他の方法(過酸化物を使用する塩素を全く使用しない(TCF)漂白など)では実現することが難しい最終白色度をもつ生成物を生じることができる。キシラナーゼ酵素の基質特異性のために、セルロース繊維は、損傷を受けず、生成物の強度特性は、十分に許容できる範囲内である。
【０００６】
しかし、これは、キシラナーゼ処理ステップを単に追加するほど簡単なことではない。パルプ漂白のために設計された大抵の市販のキシラナーゼは、特に中性またはアルカリpH条件が使用される場合、あまり耐熱性ではない。実際、キシラナーゼは一般に、60℃より高温では非効率的で不活性である。したがって、WO 9325693には、ネオカリマスチクスパトリシアラム(Neocallimastix patriciarum)から取り出され、XYLAと呼ばれ、5980U/mgの比活性をもつが、パルプおよび紙の製造者の要求を満たさない組換えキシラナーゼが具体的に開示されている。
【０００７】
アルカリpHで活性のあるキシラナーゼは、キシラナーゼ処理前にパルプを酸性化する必要性を低下させることとなる。さらに、最近の多くのクラフト蒸解および漂白プロセスの温度は、比較的高く、50℃をかなり上回り、市販の漂白酵素の多くに適さない。したがって、木材パルプ漂白プロセスで使用するための、アルカリpHで安定である熱安定性のキシラナーゼ調製物が必要である。熱安定性のキシラナーゼを得るために、米国特許第6,300,114号は、コウジカビ属(Aspergillus)またはトリコデルマ属(Trichoderma)などの糸状菌の中の放線菌類(actinomycetes)から生じるタンパク質を生成した。
【０００８】
反芻動物は、繊維質の植物材料を消化するその能力によって賞賛されている。反芻動物自身は、繊維を分解する酵素を生成しないが、彼らは、宿主の生存を支えるために繊維を消化できる細菌、真菌、および原生動物に寄生されている(Russell,J.B.、およびJ.L.Rychlik、2001.Factors that alter rumen microbial ecology.Science 292:1119〜22)。この反芻胃の生態系は、反芻胃の環境の強い選択圧によって定められる嫌気性の細菌、真菌、および原生動物の様々な集団を含む。反芻胃中の微生物は一般に、高活性の繊維分解源になる。現在までに、反芻胃から、多くの繊維分解遺伝子が単離されている(Selinger,B.L.、C.W.Forsberg、およびK.J.Cheng、The rumen:A unique source of enzymes for enhancing livestock production.Anaerobe 2:263〜284(1996))。
【０００９】
しかし、現在まで、反芻胃から単離されたキシラナーゼ関連遺伝子は、まずcDNA遺伝子データベースの構築、次にキシラン関連塩基を用いたその中に含まれるこの遺伝子のスクリーニングによって得られた(Durand,R.、C.Rascle、およびM.Fevre、Molecular characterization of xyn3,a member of the endoxylanase multigene family of the rumen anaerobic fungus Neocallimastix frontalis.Curr Genet Vol.30 Issue 6(1996)531〜540頁)。こうした既知の方法を通して、キシラナーゼ遺伝子配列が、イントロンを欠いた反芻胃真菌から単離された。どちらにしろ、こうした既知の方法は、かなり時間を浪費し、非効率的である。本発明は、前記のcDNA遺伝子データベースを構築せずに、反芻胃の真菌からのDNAを鋳型として直接使用し、PCRを続行するための適切な特異的なプライマーを採用する。このようにすると、キシラナーゼ遺伝子配列を、速やかに得ることができる。さらに、このようにして得られた遺伝子配列によって発現されたいくつかの新規のキシラナーゼは、高温およびアルカリ反応条件下でかなり活性であり、高い比活性をもつ。こうした新規の組換えキシラナーゼは、原核生物または真核生物の発現システムによって生じることができる。
【００１０】
ここに引用したすべての参考文献を、参照により本明細書に組み込む。
【非特許文献１】Q.K.Beg、M.Kapoor、L.Mahajan、およびG.S.Hoondal、Microbial xylanases and their industrial applications:a review.Appl Microbiol Biotechnol(2001)56:326〜338
【特許文献１】米国特許第5,948,667号
【特許文献２】米国特許第6,300,114号
【特許文献３】米国特許第5,824,533号
【特許文献４】WO 93/25693
【非特許文献２】Russell,J.B.、およびJ.L.Rychlik、2001.Factors that alter rumen microbial ecology.Science 292:1119〜22
【非特許文献３】Selinger,B.L.、C.W.Forsberg、およびK.J.Cheng、The rumen:A unique source of enzymes for enhancing livestock production.Anaerobe 2:263〜284(1996)
【非特許文献４】Durand,R.、C.Rascle、およびM.Fevre、Molecular characterization of xyn3,a member of the endoxylanase multigene family of the rumen anaerobic fungus Neocallimastix frontalis.Curr Genet Vol.30 Issue 6(1996)531〜540頁
【非特許文献５】Durand,R.、C.Rascle、およびM.Fevre、1996、Molecular characterization of xyn3,a member of the endoxylanase multigene family of the rumen anaerobic fungus Neocallimastix;Fanutti,C.、T.Ponyi、G.W.Black、G.P.Hazlewood、およびH.J.Gilbert、1995、The conserved noncatalytic 40-residue sequence in cellulases and hemicellulases from anaerobic fungi functions as a protein docking domain.J Biol Chem 270:29314〜22
【非特許文献６】Orpin,C.G.他[Orpin,C.G.、およびMunri,E.A.、Trans.Br.Mycol.Soc.86:178181(1986)]
【非特許文献７】Kemp他、J.Gen.Microbiol.130:27〜37(1984)
【非特許文献８】Moncalvo他(Moncalvo,J.M.、H.H.Wang、およびR.S.Hseu、1995、Phylogenetic relation-ships in Ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences、Mycologia 87:223〜238)
【非特許文献９】Current Protocols in Molecular Cloning(Ausubel他、1994)
【非特許文献１０】Teacher,R.M.およびP.J.Wood、Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacterias from the bovine rumen.Appl Environ Microbiol、1982.43(4):777〜80頁
【非特許文献１１】A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia methanolica,Invitrogen
【非特許文献１２】Manual for Operating GST Affinity Column(Amersham Pharmacia Biotech)
【非特許文献１３】Miller,G.L.、Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar、Anal.Chem.31:426〜428、1959
【非特許文献１４】Georis,J.他、Sequence,overproduction and purification of the family 11 endo-beta-1,4-xylanase encoded by the xyll gene of Streptomyces sp.S38.Gene.1999.237(1):123〜33頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、特に、反芻胃中の微生物、好ましくはネオカリマスチクスフロンタリスおよびN.パトリシアラムなどの嫌気性真菌から、適切なプライマーを使用し、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を実施することによって取り出された組換えキシラナーゼに関する。本発明に従うキシラナーゼは、熱およびアルカリpH耐性があり、従来の技術で開示されたキシラナーゼと比較するとかなり高い比活性をもつ。特に、配列番号26のXynsk1-9Eは、基質である1%オートムギ(oat spelt)キシラン中、70℃、pH6で3分間反応させた後、タンパク質1mgあたり10371.04Uの最も高い比活性を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に従うキシラナーゼは、多くの知られているキシラナーゼとは対照的に、カルボキシメチルセルロースおよびオオムギβ-グルカンに対するそれほどの残存活性を持たない。この酵素は、セルロース繊維に損傷を与えずにキシランを除去でき、植物繊維からリグニンを分離できるので、前記の特性は、特に、パルプおよび紙工業に有用である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、本発明によるキシラナーゼをコードするDNA配列を含む組換えベクターを提供することである。このキシラナーゼは、ネオカリマスチクスフロンタリスまたはN.パトリシアラムから取り出されることが好ましい。当該の遺伝子は、(当該の遺伝子を組み込む)ベクターによって提供されるプロモーター配列などのある種の制御配列の制御(すなわち作動可能に連結)下に置かれることが好ましい。所望される場合、こうした制御配列は、挿入の位置の結果として、宿主の染色体によって提供することも可能である。
【００１４】
発現ベクター上の発現制御配列は、ベクターが、原核生物または真核生物の宿主中で、ある遺伝子を発現するように設計されるかどうかに応じて変わることとなり(たとえば、シャトルベクターは、細菌宿主を選択する遺伝子を提供することができる)、さらにエンハンサーエレメント、終結配列、および/または転写開始および終結部位などの転写エレメントを含むことができる。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、前記の組換えベクターが形質転換されている宿主の培養のための培地を提供することである。宿主は、大腸菌(Escherichia coli)などの原核生物の発現宿主、またはピキアメタノリカ(Pichia methanolica)などの真核生物の発現宿主であることが好ましい。宿主は、ピキアメタノリカであることがより好ましい。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、aactgttgctaaggcccaatggggtまたはaccccatttaccatcgtcatcagtgの配列をもつことが特徴である、キシラナーゼの遺伝子増幅に使用するためのプライマーおよびプローブを提供することである。
【００１７】
寄託
Xynsk1-9遺伝子(配列番号12)を保有するピキアメタノリカPXYNsk1-9は、2002年8月20日にAmerican Type Culture Collection、10801 University Blvd.、Manassas、VA 20110-2209に寄託され、受託番号ATCC PTA-4605が付与された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、特に、反芻胃中の微生物、好ましくは嫌気性真菌から取り出された、適切なプライマーを使用し、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を実施することによって得られる組換えキシラナーゼに関する。消化管(特に反芻胃の)真菌であり得る嫌気性真菌の例には、N.パトリシアラム、N.フロンタリス、N.ハーレイエンシス(N.hurleyensis)、およびN.スタンソルペンシス(N.stanthorpensis)などのネオカリマスチクス種;S.コミュニス(S.communis)などのスファエロモナス(Sphaeromonas)種;C.エクイ(C.equi)などのカエコミセス(Caecomyces)種;P.コミュニス、P.エクイ、P.ドウンボニカ(P.dwnbonica)、P.レサルギカス(P.lethargicus)、およびP.マット(P.mat)などのピロミセス(Piromyces)種;P.エレガンス(P.elegans)などのルミノミセス(Ruminomyces)種;A.ミュークロナタス(A.mucronatus)などのアナエロミセス(Anaeromyces)種、ならびにO.ボビス(O.bovis)およびO.ジョイオニ(O.joyonii)などのオルピノミセス(Orpinomyces)種がある。ネオカリマスチクス種、特にネオカリマスチクスフロンタリスおよびN.パトリシアラムが好ましい。
【００１９】
ネオカリマスチクスフロンタリスまたはN.パトリシアラムから取り出された、本発明による好ましい組換えキシラナーゼには、配列番号16〜27および32〜33のものが含まれる。配列番号26の組換えキシラナーゼ、Xynsk1-9Eが、特に好ましい。
【００２０】
本発明に従うキシラナーゼは、熱およびアルカリpH耐性があり、従来の技術で開示されたキシラナーゼよりもかなり高い可能性がある高比活性をもつ。特に、配列番号26のXynsk1-9Eは、基質である1%オートムギキシラン中で、70℃でpH6で3分間反応させた後、タンパク質1mgあたり10371.04Uの最も高い比活性を示す。
【００２１】
本発明によるキシラナーゼは、GenBankに記載されたキシラナーゼ遺伝子またはアミノ酸配列から設計された特異的なプライマーを使用し、スイギュウ(Bubalus befullus)およびタイワンシカ(Cervus Nippon taiwanus)の反芻胃から単離された嫌気性真菌のDNAをPCRのDNA鋳型として使用することによって独自に得られる。反芻胃から得られたキシラナーゼ遺伝子残留部分(すなわち不完全なキシラナーゼ遺伝子配列)は、従来の技術から知ることができる通りの酵素活性を依然として示す可能性があるので、設計されたプライマーが、完全なキシラナーゼ遺伝子配列を増幅する必要はない(Durand,R.、C.Rascle、およびM.Fevre、1996、Molecular characterization of xyn3,a member of the endoxylanase multigene family of the rumen anaerobic fungus Neocallimastix;Fanutti,C.、T.Ponyi、G.W.Black、G.P.Hazlewood、およびH.J.Gilbert、1995、The conserved noncatalytic 40-residue sequence in cellulases and hemicellulases from anaerobic fungi functions as a protein docking domain.J Biol Chem 270:29314〜22)。本発明によって以下で証明される通り、不完全な遺伝子配列も、酵素活性を示す可能性がある(図8参照)。本発明で使用されるプライマーは、好ましくはaactgttgctaaggcccaatggggtまたはaccccatttaccatcgtcatcagtgあるいは類似の配列をもつことが特徴である。反芻胃中の微生物からのDNA配列の獲得、ならびにPCRは、以下の実施例に含まれる教示に従って、当技術分野で一般に知られていることを考慮して、実施することができ、当分野の技術者によって、本発明の趣旨を逸脱することなく容易に適合させることができる。
【００２２】
組換えタンパク質の大規模発現に関する限りでは、本発明によるキシラナーゼのアミノ酸配列および関連するDNA配列が、本出願によって同定されたので、本発明に従うキシラナーゼは、どんな適切な手段によって調製することもできる。形質転換された宿主の回分発酵を行うことは可能であり、有機化学の技術によるポリペプチド合成も試みることができるが、好ましい調製法は、一般に、組換えDNA技術を使用することとなる。したがって、本発明のキシラナーゼは、好ましくは真核生物の発現宿主または原核生物の発現宿主におけるキシラナーゼをコードする異種DNAの発現産物ということになる。本発明によるキシラナーゼ遺伝子は、真核細胞由来であるので、真核生物の発現宿主が好ましい。形質転換された宿主を、通常使用される宿主に適した知られている条件下で培養し、所望の酵素が宿主に含まれるようにする、あるいは所望の酵素を宿主から培地に分泌させ、酵素調製物を、前記の培地から、当技術分野で知られた方法によって回収する。
【００２３】
酵素調製物は、形質転換された宿主細胞を含むまたは含まない培地である、あるいは、培地から当技術分野でよく知られた方法を適用することによって回収される。たとえば、ピキアメタノリカなどの真核生物の発現宿主を使用する場合、キシラナーゼ酵素は、培地に分泌されるので、本発明の利点は、本発明の酵素調製物が、さらなる精製を伴わずに培地から直接利用できることである。所望される場合、こうした調製物を凍結乾燥してもよいし、保管のために酵素活性を他の方法で濃縮および/または安定化することもできる。(1)酵素が未精製の形で使用でき、培養液からの特定の酵素の単離が不必要であるので、また、(2)酵素が培地に分泌され、所望の酵素調製物を得るために培地を回収する必要があるだけで、宿主から酵素を抽出する必要がないので、いったん真核生物の発現宿主が使用されれば、本発明の酵素調製物は、提供および使用するのに非常に経済的である。しかし、大腸菌などの原核生物の発現宿主が使用される場合、宿主から酵素を抽出することが望ましい。
【００２４】
所望される場合、発現されたタンパク質は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動など、通常の条件に従ってさらに精製することができる。
【００２５】
しばしば、全長より短いタンパク質が、完全なタンパク質の機能を持つことも知られている。たとえば、N末端、内部、またはC末端部分を欠く切断型タンパク質は、しばしば、完全な本来のタンパク質の生物活性および/または酵素活性を持つ。当分野の技術者であれば、切断型タンパク質および内部欠失を伴うタンパク質の作製法を承知している。本発明では、切断型キシラナーゼタンパク質または内部欠失を伴うキシラナーゼタンパク質の機能は、以下に述べるキシラナーゼ分析法を用いて、当技術分野で一般に知られていることを考慮して、容易に試験することができる。
【００２６】
本明細書で具体的に開示されたキシラナーゼと実質上同じ酵素活性を保持する置換型および切断型のキシラナーゼ誘導体は、特に、置換型または切断型のキシラナーゼ誘導体の比活性が、具体的に例示されたキシラナーゼの少なくとも約10%である場合、例示されたキシラナーゼと同等であるとみなし、本発明の範囲の範囲内である。当分野の技術者であれば、本明細書で教示した分析手順を使用し、当技術分野で一般に知られていることを考慮して、容易に切断型または置換型のキシラナーゼの活性を測定することができるであろう。
【００２７】
本発明の第2の態様によれば、本発明のキシラナーゼをコードする単離されたまたは組換えのDNA分子が提供される。これらのDNA配列は、キシラナーゼをコードする領域(CDS、タンパク質コード配列)を含むことが好ましい。遺伝的変異形には、同種または異種起原から由来する、プロモーター、リーダーペプチド、および終結シグナルなどの調節領域と融合したキシラナーゼCDSを含むハイブリッドDNA配列が含まれる。遺伝的変異形には、酵素のキシラン分解活性が保持された、突然変異型キシラナーゼタンパク質をコードするDNA配列、および縮重したDNA配列も含まれる。本発明は、「第2世代の」キシラナーゼ、すなわちここで単離された酵素の性質と異なる性質を持つ突然変異型キシラナーゼの作成のための出発材料、あるいは遺伝暗号の縮重または異種間の変異を反映して変化した(このキシラナーゼCDSをコードする)DNA配列を提供する。遺伝子は、当技術分野で知られている処置(たとえば化学薬品による突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ランダムポリメラーゼ連鎖反応による突然変異誘発など)によって容易に変異し、それによって性質(たとえば最適温度またはpH、比活性、あるいは基質特異性)が変化した遺伝子産物を作ることができる。本発明のキシラナーゼ遺伝子を、他の天然源からのキシラナーゼをコードする遺伝子の単離を対象とする異種ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応実験に使用することもできる。
【００２８】
本来のmRNAの全長複製物は、本発明のこの態様に従うDNA中には存在しないが、本発明は、切断型cDNAに限定されないことを理解されたい。対応する野生型の遺伝子に本来存在するイントロン(存在する場合は)のいくつかまたはすべても存在可能であると考えられる。しかし、全長のcDNA中に存在する少なくともいくつかの配列は、本発明のこの態様に従うDNA中に存在しない。本発明のこの態様は、本発明によるキシラナーゼの全長をコードするDNAを含み、このDNAの無い部分は、3'および/または5'非翻訳領域に(ある種の実施形態では、好ましくは)存在することも理解されたい。したがって、実質上全長または切断型のキシラナーゼは、(a)3'非翻訳領域を実質上欠いている、あるいは(b)5'非翻訳領域を実質上欠いている、あるいは(c)3'と5'両方の非翻訳領域を実質上欠いている、本発明のこの態様に従うDNAから生じることができる。
【００２９】
本発明に従う好ましい組換えDNAには、配列番号2〜13および29〜30のDNAが含まれる。配列番号12の組換えDNA、すなわちXynsk1-9が、特に好ましい。
【００３０】
本発明に従う組換えDNAは、ベクターの形でもよい。ベクターは、たとえば、プラスミド、コスミド、またはファージでもよい。ベクターは、しばしば、それを用いて形質移入した(あるいは形質転換した:これらの用語は、この明細書では互換的に使用される)細胞の選択を可能にするために、好ましくは異種DNAを組み込んだベクターを含む細胞の選択を可能にするために、1種または複数の選択可能な標識を含むこととなる。一般に、適切な開始および停止シグナルが存在することとなる。さらに、ベクターが、発現のためのものである場合、発現を引き起こすための十分な制御配列が存在することとなる。制御配列を含まないベクターは、クローニングベクターとして有用であり、当然、発現ベクターも、クローニングベクターとして有用である。
【００３１】
クローニングベクターは、大腸菌、ピキアメタノリカ、またはその操作を容易にする別の適切な宿主に導入することができる。本発明のキシラナーゼを生じるために有用な宿主には、クロカビ(Aspergillus niger)、アスペルギルスフィッカム(Aspergillus ficcum)、アスペルギルスアワモリ(Aspergillus awamori)、コウジカビ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマリーセイ(Trichoderma reesei)、ムコールミエヘイ(Mucor miehei)、クルイヴェルモイセスラクティス(Kluyvermoyces lactis)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、ピキアメタノリカ、サッカロミセスセルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、大腸菌、枯草菌、またはバチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)などの微生物の工業用の株、あるいはアブラナ(canola)、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物の宿主が含まれる。すべての系は、遺伝子発現のための同様の手法を使用する。発現構成体は、当該のタンパク質をコードする配列ならびにプロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなどの制御配列を含むように作成する。シグナルペプチド配列および選択可能な標識などの他の配列も、含むことができる。キシラナーゼの細胞外発現を実現するために、本発明の発現構成体は、分泌シグナルペプチド配列を利用する。細胞質発現が所望される場合、このシグナルペプチド配列は、発現構成体上には含まれない。効率的な転写を確実にするために、転写ターミネーターが含まれる。発現構成体中に、発現またはタンパク質精製を促進する補助的な配列も、含めることができる。プロモーター、エンハンサー、シグナルペプチド、およびターミネーターエレメントは、宿主細胞中で動作可能であり、キシラナーゼを効率的に発現および分泌させる。
【００３２】
したがって、本発明の別の態様によれば、上で述べた通りのDNAで形質移入または形質転換した宿主細胞が提供される。宿主は、大腸菌またはピキアメタノリカであることが好ましい。ピキアメタノリカが特に好ましい。
【００３３】
本発明に従うキシラナーゼは、食物、飼料、ならびにパルプおよび紙工業においていくつかの応用例がある。これらの工業における本明細書で述べたキシラナーゼの使用は、本発明の範囲内に含まれる。本発明のキシラナーゼは、特に紙およびパルプ工業に適用できると考えられている。
【００３４】
定義
この本文全体を通して、組換えDNA技術で使用されるところのいくつかの用語は、以下のように定義される。
【００３５】
キシラナーゼ。キシラナーゼは、キシランのキシロース鎖内のβ-1,4結合を切断するヘミセルラーゼである(キシランは、β-1,4結合を介して結びついたD-キシロース残基のポリマーである)。キシラナーゼ活性は、キシラン分解活性と同義である。
【００３６】
キシラナーゼ活性の単位は、生成物1μモルを遊離させる酵素の量と定義され、キシロース当量として37℃で1分測定される。
【００３７】
特定のアミノ酸配列に「等価な」アミノ酸配列とは、特定のアミノ酸配列と同一ではないが、ある所望の目的に使用される場合、特定のアミノ酸配列の同様の活性と比較した場合、そのタンパク質の生物活性に本質的に影響を与えないような、少なくともいくつかのアミノ酸の変化(欠損、置換、反転、挿入など)を含むアミノ酸配列を意味する。「等価な」アミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列に対して、アミノ酸レベルで少なくとも85%〜99%の相同、最も好ましくは少なくとも90%、特に、非常に好ましい実施形態では、アミノ酸レベルで少なくとも95%の相同を含むことが好ましい。
【００３８】
酵素調製物。「酵素調製物」とは、微生物またはこうした微生物を増殖するのに使用した培地から抽出された(培地から部分的または完全に精製された)酵素を含有する組成物を意味する。「からの抽出」は、所望の酵素を細胞集団から分離する任意の方法を意味し、細胞を破壊すること、また、使用済みの細胞から培地を簡単に取り除くことを含む。したがって、用語「酵素調製物」とは、所望の1種または複数の微生物を培養するためにあらかじめ使用される培地を含む組成物、およびこれらの1種または複数の微生物が培養中にこうした培地に分泌したどんな酵素も含む。
【００３９】
相同。本発明の宿主に「相同」な酵素とは、宿主の種と同じ種の形質転換されていない株が、ある量の天然の該タンパク質を、自然に生成することを意味し、本発明の宿主に「相同」な遺伝子とは、宿主の種と同じ種の形質転換されていない株のゲノム中に見られる遺伝子を意味する。本発明の宿主に「非相同」な酵素とは、宿主の種と同じ種の形質転換されていない株が、ある量の天然の該タンパク質を自然には生成しないことを意味し、本発明の宿主に「非相同」な遺伝子とは、宿主の種と同じ種の形質転換されていない株のゲノム中に見られない遺伝子を意味する。
【００４０】
クローニングビークル。当該の遺伝子を宿主細胞に移入するための適切な核酸環境を提供するプラスミドまたはファージDNAまたは他のDNA配列(線状DNAなど)。本発明のクローニングビークルは、原核生物および真核生物の宿主中で自律的に複製するために設計することができる。ピキアなどの真菌の宿主では、クローニングビークルは一般に、自律的に複製せず、ピキアゲノムへのその後の挿入のために、当該の遺伝子をピキア宿主に運ぶためのビークルを単に提供するに過ぎない。クローニングビークルは、さらに、1つまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位で特徴付けることができる。この認識部位では、こうしたDNA配列を、ビークルの本質的な生物学的機能を失わないように、決定可能な様式で、切断することができ、DNAを複製させる、またクローニングするためにDNAを接合することができる。クローニングビークルは、さらに、クローニングビークルで形質転換された細胞の同定に使用するのに適した標識を含むことができる。標識は、たとえば抗生物質耐性である。あるいは、こうした標識は、当該の遺伝子をもたらすものから分離されたクローニングビークル上に提供することができる。用語「ベクター」は時として、「クローニングビークル」の代わりに使用される。
【００４１】
発現ビークル。所望の宿主に形質転換した後に、当該の遺伝子を発現する能力ががあることを除けば、クローニングビークルに類似しているビークルまたはベクター。
【００４２】
真菌の宿主が使用される場合、当該の遺伝子は、真菌の染色体に組み込むクローニングまたは発現ビークルの一部として真菌の宿主に提供されることが好ましい。クローニングビークルまたは発現ビークル由来の配列はまた、組み込みプロセス中に、当該の遺伝子を組み込むことができる。
【００４３】
当該の遺伝子は、(当該の遺伝子を組み込む)ベクターによって提供されるプロモーター配列などのある種の制御配列の制御(すなわち作動可能に連結)下に置かれることが好ましい。所望される場合、こうした制御配列は、挿入の位置の結果として、宿主の染色体によって提供することも可能である。
【００４４】
発現ベクター上の発現制御配列は、ベクターが、原核生物のまたは真核生物の宿主中である種の遺伝子を発現するために設計されるかどうかに応じて変わることとなり(たとえば、シャトルベクターは、細菌の宿主中における選択のための遺伝子を提供することができる)、エンハンサーエレメント、終結配列、および/または転写開始および終結部位などの転写エレメントをさらに含むことができる。
【００４５】
本発明を、以下の実施例中で、より詳細に述べるが、これらの実施例は、本発明の実際のいくつかの適用例のみを示す。当分野の技術者であれば、いくつかの同様の適用例を考案できることは自明である。したがって、これらの実施例は、本発明の使用を明らかにするだけであり、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１
嫌気性真菌ネオカリマスチクスフロンタリス(sk1)およびN.パトリシアラム(w1)からDNA配列を得る
嫌気性真菌ネオカリマスチクスフロンタリス(sk1)およびN.パトリシアラム(w1)を、Orpin,C.G.他[Orpin,C.G.、およびMunri,E.A.、Trans.Br.Mycol.Soc.86:178181(1986)]によって記載された通りに、スイギュウ(Bubalus befullus)およびタイワンシカ(Cervus Nippon taiwanus)の反芻胃から単離した。ネオカリマスチクスフロンタリス(sk1)およびN.パトリシアラム(w1)を、反芻胃液を含有する培地(Kemp他、J.Gen.Microbiol.130:27〜37(1984))中で、39℃で、1%アビセルの存在下かつ嫌気性条件下で、48時間増殖させた。
【００４７】
Moncalvo他(Moncalvo,J.M.、H.H.Wang、およびR.S.Hseu、1995、Phylogenetic relation-ships in Ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences、Mycologia 87:223〜238)によって記載された通りに、ネオカリマスチクスフロンタリス(sk1)およびN.パトリシアラム(w1)株の全DNAを抽出した。凍結乾燥した菌糸体を、乳鉢と乳棒ですりつぶして粉末にした。材料を、500μl溶解バッファー(0.2M Tris、0.25M NaCl、0.025M EDTA、0.5% SDS(pH8.5))に懸濁させた。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)500μlを加えた後、この混合物を、十分に混合し、15分間遠心した。上清を、クリーンチューブに移し、体積0.1の3M酢酸ナトリウムおよび体積0.6のイソプロパノールを加えた。混合後、この溶液を、5分間放置した。この試料を、15分間遠心し、水を捨てた。このペレットを、70%エタノールですすぎ洗いし、真空中で短時間乾燥させ、次いでTE(10mM Tris、1mM EDTA(pH8.0))100μlに溶解した。適当に希釈(500x)した後、このDNA溶液を、PCRの鋳型として使用した。PCRは、適切なプライマーを使用することによって実施される。これらのプライマーおよびそのヌクレオチド配列、ならびにその目的を、表1に示す。前記のPCRに使用するための反応試薬を、表2に記載する。前記のPCRの反応条件は、以下の通りである:94℃で2分、その後次の4つの状態を35回連続して繰り返す:(1)94℃で45秒(DNAの変性)、(2)50℃で45秒、(3)72℃で45秒、(4)72℃で10分。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
【表２】
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【００５０】
精製したPCR産物を、制限酵素EcoRIおよびBamHI 10単位を用いて消化し、同じ制限酵素であらかじめ消化しておいたpGEX4T-1またはpMETαA 50ngに結合した。生じたベクター構成体を用いた大腸菌の形質転換を、Current Protocols in Molecular Cloning(Ausubel他、1994)に記載されたCaCl2法を利用することによって実施した。成功裡に形質転換された株を、0.3%オートムギキシランを含有するLuria Broth培地中で培養し、コンゴレッド(Congo Red)染色法(Teacher,R.M.およびP.J.Wood、Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacterias from the bovine rumen.Appl Environ Microbiol、1982.43(4):777〜80頁)を介してスクリーニングした。P.メタノリカの形質転換およびスクリーニングは、「A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia methanolica,Invitrogen」に従って実施した。採用された株およびベクターの詳細を、表3に明確に列挙する。これらのベクター構造を、図1および図2に示す。このようにして得られたキシラナーゼ遺伝子の詳細なDNA配列を、図3(a)および図4(a)に列挙する。このようにして得られたキシラナーゼの推定されるアミノ酸配列を、図3(b)および図4(b)に示す。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
実施例２
組換えタンパク質の大規模発現
2.1  成功裡に形質転換された大腸菌株の各コロニーを、150μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地150ml中でそれぞれ培養した。増殖は、OD600=0.6〜0.9までのUV吸収によって測定する。非加水分解性のラクトース類似体であるイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いて16時間、誘導発現を実施した。細胞を、遠心分離によってペレット化した。その後、これらの収集された細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、pH7.4)に懸濁させた。これらの細胞を収集し、直接使用することができる、あるいは超音波、機械力、酵素、化学薬品、または高圧によって破壊した後に使用することができる。得られた溶解物は、キシラナーゼ活性を示すために直接使用してもよいし、遠心分離などのさらなる処理にかけてもよい。遠心分離を実施する場合、上清に含まれる組換えタンパク質は、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)アフィニティカラムによって精製することができる。詳細な操作方法は、Manual for Operating GST Affinity Column(Amersham Pharmacia Biotech)に示されている。
【００５３】
2.2  成功裡に形質転換されたP.メタノリカ株の各コロニーを、YAPD(酵母エキス/寒天/ペプトン/デキストロース)培地200ml中で16時間、それぞれ培養した。細胞を、遠心分離によってペレット化し、BMMY培地に懸濁させた。その後、24時間あたり約1mlのメタノールを、メタノールの濃度が0.5%に達するまで前記の培地に加えた。上清の一部分を、特定の間隔毎に採取し、タンパク質および酵素分析を続行した。
【００５４】
ピキアメタノリカにおけるキシラナーゼの発現を増大するために、有効容積5Lの水ジャケット付きガラス容器を備え付けたBiostat(登録商標)B fermentor(B.Braun biotech international)を、回分および流加(fed-batch)発酵のために使用した。P.メタノリカの発酵には、2つの相を使用した:第1のデキストロースの増殖相、それに続いてメタノールの誘導相。発酵はすべて、緩衝したデキストロース複合培地(BMDY、1%酵母エキス、2%ペプトン、100mMリン酸カリウム、pH6.0、1.34% YNB、4×10-5%ビオチン、および2%デキストロース)2.0Lの回分増殖相で、30℃で開始した。接種の前に、濃縮した水酸化アンモニウム(28%(v/v))および2N硫酸を用いてpHを6.0に調整した。接種材料は、50ml BMDY培地を含む250mlのバッフル付きフラスコ中で増殖させ、30℃で16〜18時間、250rpmでインキュベートした。培養物を終夜に発酵槽に加え、600nmで約0.1の最終光学濃度にした。空気ポンプ(HIBLOW SPP-25GA)によって制御された一定の(2.5vvm)空気の流れを使用することによって、酸素を供給し、攪拌を800rpmにセットした。培地のpHは、水酸化アンモニウムおよび硫酸を用いて自動的に6.0に保たれるようにした。
【００５５】
デキストロースがなくなった後、細胞を、室温で1,500xgで5分間遠心分離することによって収集した。上清を捨て、これらの細胞を、緩衝したメタノール複合培地(BMMY、1%酵母エキス、2%ペプトン、100mMリン酸カリウム、pH6.0、1.34% YNB、4×10-5%ビオチン、および0.5%メタノール)2リットルに再懸濁させ、発酵槽に注入した。4時間毎に0.5%メタノールを加えた。光学濃度測定、生菌測定、キシラナーゼ活性分析、ならびに可溶性タンパク質すべての定量およびゲル電気泳動分析のために、12時間毎に試料を抜き取った。
【００５６】
実施例３
培養上清から得られたエンド-β-1,4-キシラナーゼ活性の最適pHおよび温度の決定
精製後に得られた組換えタンパク質を、エンド-β-1,4-キシラナーゼの活性を検出するために10-3〜10-4mg/mlに希釈した。活性検出は、ジニトロサリチル酸試薬(Miller,G.L.、Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar、Anal.Chem.31:426〜428、1959)を使用し、基準としてキシロースを使用することによって行い、、還元糖の量を求める。キシラナーゼ活性は、実施例全体を通して、以下の変更を施して測定した(Georis,J.他、Sequence,overproduction and purification of the family 11 endo-beta-1,4-xylanase encoded by the xyll gene of Streptomyces sp.S38.Gene.1999.237(1):123〜33頁):基質溶液0.36mlをそれぞれ40、50、60、70、80、および90℃で5分間あらかじめ温め(ウォーターバス)、希釈した酵素溶液0.04mlを加え、ほんの一瞬ボルテックスにかけ、それぞれ40、50、60、70、80、および90℃で3分間インキュベートする。続いてDNS試薬0.5m1を加えて反応を停止させ、コロニー形成のために、この反応混合物を100℃で10分間インキュベートする。540nmでの吸収を測定することによって、還元糖を求めた。最大活性を、100%と定める。これら試験結果を図7(a)に示す。
【００５７】
得られた組換えタンパク質の最適pHを求めるために、使用されたバッファーは、25mMクエン酸緩衝液(pH3〜6)、リン酸緩衝液(pH6〜8)、Tris緩衝液(pH8〜9)、およびグリシン緩衝液(pH9〜10)であった。振盪フラスコ培養物からの試料(培養上清)を、各バッファーで希釈し、次いで3分間インキュベートした。単位はすべて、使用するバッファーのpHまたは温度範囲において、基質バックグラウンドの還元糖群に対して補正した。キシラナーゼ活性を、各pHで、70℃で測定した。最大活性を、100%と定める。これらの試験結果を図7(b)に示す。
【００５８】
実施例４
ヌクレオチド配列決定およびアミノ酸配列決定の分析
PCRを続けるための鋳型としてネオカリマスチクスフロンタリス(sk1)およびN.パトリシアラム(w1)DNAを使用して、約1000bpの増幅産物を成功裡に得た。DNA配列決定の後、これらの増幅産物の中に、w1から5つの異なる配列が生じ、sk1から9つの異なる配列が生じることが判明した。配列を比較すると、w1から生じる4つの配列[すなわちw1-Al(配列番号8)、w1-A2(配列番号9)、w1-4(配列番号14)、およびw1-11(配列番号10)]、ならびにsk1から生じる8つの配列[すなわちsk1-2(配列番号4)、sk1-9(配列番号12)、sk1-11(配列番号3)、sk1-12(配列番号5)、sk1-14(配列番号2)、sk1-15(配列番号11)、sk1-18(配列番号6)、およびsk1-20(配列番号7)]は、反芻胃真菌のエンド-β-1,4-キシラナーゼ遺伝子に属することが判明した(図3(a)参照)。さらに、従来の技術と比較すると、N.パトリシアラムから得られ、米国特許第5,948,667号から知ることができる配列AAE25847(配列番号14)、およびオルピノミセス種PC-2から得られ、米国特許第5,824,533号から知ることができる配列AAE12389(配列番号15)は、本発明のDNAおよびアミノ酸配列と最も近い。DNA配列の同一性行列(identity matrix)およびアミノ酸配列の同一性行列を、それぞれ表4(a)および4(b)に示す。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
【表５】
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【００６１】
さらに、配列比較により、タンパク質Sk1-6(配列番号32)およびWI-6(配列番号33)が、反芻胃真菌のアセチルキシランエステラーゼに属することが示される。これらのアミノ酸配列は、N.パトリシアラムから取り出されたAAB69092(配列番号31)のアミノ酸配列に最も近い。これについて、DNA配列の同一性行列およびアミノ酸配列の同一性行列を、それぞれ図4(a)および4(b)に示す。これらの配列同一性を、表5(a)および5(b)に示す。
【００６２】
【表６】
2004261173.tif 000007
【００６３】
【表７】
2004261173.tif 000008
【００６４】
驚いたことに、配列aactgttgctaaggcccaatggggtまたはaccccatttaccatcgtcatcagtgのプライマーが、エンド-キシラナーゼだけでなくキシランエステラーゼ遺伝子も増幅できることが判明した。これは、前記のプライマーが、キシラン分解酵素をコードする遺伝子を成功裡に増幅できる理由であろう。
【００６５】
実施例５
エンド-β-1,4-キシラナーゼの活性検出
GSTアフィニティカラム精製後に大腸菌によって発現された組換えタンパク質を、SDS-PAGE分析に投じた(図5参照)。最終的に、分子量が約29kDaであるタンパク質(レーン4、Xynsk1-9Eと名付けられた)が単離された。活性検出により、これは、エンド-β-1,4-キシラナーゼ活性をもつことが示された。
【００６６】
P.メタノリカの培養上清を収集し、その本来の体積の10分の1に濃縮した。前記の上清それ自体およびその濃縮物のSDS-PAGE分析では、33〜118kDaのバンドが示され、この関連するタンパク質を、Xynsk1-9P(レーン1〜2)と名付けた(図6参照)。
【００６７】
最適温度およびpH、ならびに基質特異性の決定により、Xynsk1-9EとXynsk1-9Pが、これらの点で、同じ傾向をもつことが示された。さらに、70℃、pH6で基質が1%オートムギキシランである場合に、最も高い活性が認められた(図7(a)および7(b)参照)。すなわち、Xynsk1-9Eは、1%オートムギキシランの基質中で、70℃、pH6で、3分間反応した後、タンパク質1mgあたり10371.04Uの最も高い比活性を示す(表6参照)。
【００６８】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】pGEXxynsk1-9Eの構造を示す図である。
【図２】pMETxynsk1-9Eの構造を示す図である。
【図３Ａ１】DNA配列の整列結果を示す図である。
【図３Ａ２】DNA配列の整列結果を示す図である。
【図３Ａ３】DNA配列の整列結果を示す図である。
【図３Ｂ１】アミノ酸配列の整列結果を示す図である。N.パトリシアラムから得られるキシラナーゼのアミノ酸配列AAE25847は、米国特許第5,948,667号から知ることができる。オルピノミセス種PC-2から単離されるキシラナーゼのDNA配列U57819およびアミノ酸配列AAE12389は、米国特許第5,824,533号から知ることができる。
【図３Ｂ２】アミノ酸配列の整列結果を示す図である。N.パトリシアラムから得られるキシラナーゼのアミノ酸配列AAE25847は、米国特許第5,948,667号から知ることができる。オルピノミセス種PC-2から単離されるキシラナーゼのDNA配列U57819およびアミノ酸配列AAE12389は、米国特許第5,824,533号から知ることができる。
【図４Ａ】DNA配列の整列結果を示す図である。
【図４Ｂ】アミノ酸配列の整列結果を示す図である。N.パトリシアラムから単離されるアセチルキシランエステラーゼ(ETS)のDNA配列(U66253)およびアミノ酸配列(AAB69092)は、GenBankに記載されている。
【図５】大腸菌中で発現したXynsk1-9EのSDS-PAGE結果を示す図である。レーン1および5は、タンパク質標識を意味し、レーン2は、細胞溶解物を意味し、レーン3は、試料流を意味し、レーン4は、Xynsk1-9Eを意味し、レーン6は、GSTを意味する。
【図６】P.メタノリカ中で発現したXynsk1-9PのSDS-PAGE結果を示す図である。レーン1は、限外濾過後の培養上清を意味し、レーン2は、培養上清を意味し、レーン3は、タンパク質標識を意味する。
【図７Ａ】大腸菌(●)およびP.メタノリカ(○)中でそれぞれ発現したXynsk1-9EおよびXynsk1-9Pの最適温度を示す図である。
【図７Ｂ】大腸菌(●)およびP.メタノリカ(○)中でそれぞれ発現したXynsk1-9EおよびXynsk1-9Pの最適pHを示す図である。
【図８】クローン化されたキシラナーゼ遺伝子sk1-9の位置に関して欠失と活性分析を模式的に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ１】
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【図３Ａ２】
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【図３Ａ３】
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【図３Ｂ１】
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【図３Ｂ２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【配列表】
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