(57)【要約】【課題】鋭敏な活性測定法を持たない酵素の阻害剤スクリーニングに際し、希薄で微量の候補物質を用いて選択することを可能とする方法を提供する。【解決手段】以下の工程を含む酵素阻害ペプチドのスクリーニング方法。（１）電気泳動により酵素をゲル上に展開する工程（２）ゲル上に展開した酵素を膜に転写する工程（３）候補となるペプチドを含む溶液に、酵素が転写された膜を浸漬する工程（４）膜に転写された酵素が活性を示すかどうか確認する工程【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む酵素阻害ペプチドのスクリーニング方法。
（１）電気泳動により酵素をゲル上に展開する工程
（２）ゲル上に展開した酵素を膜に転写する工程
（３）候補となるペプチドを含む溶液に、酵素が転写された膜を浸漬する工程
（４）膜に転写された酵素が活性を示すかどうか確認する工程
【請求項２】
候補となるペプチドが、酵素との親和性を指標として選択されたペプチドである請求項１記載の酵素阻害ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項３】
酵素が、オキシダーゼ又はペルオキシダーゼである請求項１又は２記載の酵素阻害ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項４】
酵素が、セルロプラスミンである請求項１乃至３のいずれか１項記載の酵素阻害ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチド。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつセルロプラスミンのオキシダーゼ活性を阻害する作用を持つペプチド
【請求項６】
請求項５記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素の活性を阻害する作用を持つペプチドのスクリーニング方法、並びにこのスクリーニング方法により選択された酵素阻害作用を持つペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素活性の測定は液相系で行われる。すなわち、酵素溶液に基質となる物質を加え、反応後、基質の変化した物を吸光度計等を用いて測定する。阻害剤のスクリーニングは酵素溶液に阻害剤の候補となる物質を加え、基質を加え活性を測定し、阻害剤を加えなかったものに比して活性の低下が認められたものを選択するというものである。しかしながら、酵素によってはその反応は鋭敏なものでなく、また、阻害剤の候補物質に関しても、スクリーニングに際して濃厚な溶液の調製が困難であったり、多量のサンプルの調製が困難なものがあった。そのため、阻害作用をより鋭敏に測定する方法の開発が望まれていた。
【０００３】
また、ヒト血清セルロプラスミン（ＥＣ１．１．１４７：　以下、セルロプラスミン）は、銅のトランスポーターとしてまた、芳香族アミン、ポリフェノール、２価の鉄、およびフリーラジカルの中間体等様々な物質を酸化する酸化酵素として知られる。さらにラジカル、活性酸素の消失を通じ、炎症等の起こった部位で急激にその濃度が上昇することから、急性期タンパク質としても知られている。
【０００４】
セルロプラスミンの特異的阻害剤はないが、モノクローナル抗体が開発されている。しかしながら、低分子の特異的阻害剤は現在までまだ無い。その一方で、分子設計等によるペプチド阻害剤の開発も近年急速に進み、行われているが、まだ具体的な方法論は確立されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、鋭敏な活性測定法を持たない酵素の阻害剤スクリーニングに際し、希薄で微量の候補物質を用いて選択することを可能とする方法を提供することを目的とする。
【０００６】
また、従来知られている酸化酵素阻害剤よりも特異的で、かつモノクローナル抗体よりも低分子のペプチド酸化酵素阻害剤の開発も目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、１）対象となる酵素を電気泳動、ブロッティングすることにより液相から固相へ移す、２）固相化された酵素に対し、阻害活性候補物質を反応させる、３）反応後、基質溶液を加え、阻害活性を見ることにより阻害物質を選択する、という操作により、対象となる酵素が鋭敏な活性測定法を持たない場合や候補物質が微量な場合であっても、効率的に阻害物質を選択できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の工程を含む酵素阻害ペプチドのスクリーニング方法である。
（１）電気泳動により酵素をゲル上に展開する工程
（２）ゲル上に展開した酵素を膜に転写する工程
（３）候補となるペプチドを含む溶液に、酵素が転写された膜を浸漬する工程
（４）膜に転写された酵素が活性を示すかどうか確認する工程
また、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドである。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつセルロプラスミンのオキシダーゼ活性を阻害する作用を持つペプチド
更に、本発明は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）スクリーニング方法
本発明の酵素阻害ペプチドのスクリーニング方法は、以下の（１）〜（４）の工程を含むものである。
【００１０】
工程（１）：この工程では、電気泳動により酵素をゲル上に展開する。
【００１１】
ここで使用する酵素は特に限定されないが、呈色反応を伴う活性測定法を持つ酵素が好ましい。このような酵素としては、酸化酵素、エステラーゼ、リパーゼ、転移酵素、浸潤酵素、リガーゼ、加水分解酵素等々を例示でき、これらの中ではオキシダーゼ又はペルオキシダーゼが好適である。また、オキシダーゼとしては、セルロプラスミンを好適なものとして例示できる。セルロプラスミンは、生体内で様々な物質を酸化するオキシダーゼとして機能する。代表的な基質としては芳香族アミン、ポリフェノール、フェノチアジン薬、フリーラジカル中間体、鉄イオンなどがある。
【００１２】
酵素を展開するゲルは、タンパク質の電気泳動に使用され得るものであればどのようなものでもよく、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどが使用できる。
【００１３】
工程（２）：この工程では、ゲル上に展開した酵素を膜に転写する。
【００１４】
ここで使用する膜は、ブロッティング操作に使用される一般的なものでよく、例えば、ＰＶＤＦ膜、ニトロセルロース膜などが使用できる。
【００１５】
酵素を膜に転写する方法も一般的なブロッティング操作と同様に行うことができる。
【００１６】
工程（３）：この工程では、候補となるペプチドを含む溶液に、酵素が転写された膜を浸漬する。
【００１７】
候補となるペプチドは、特定の配列のものであってもよく、また、ランダムに合成されたものであってもよい。ペプチドの長さは特に限定されないが、７〜１２残基程度のペプチドが好ましい。また、ペプチドは直鎖状、環状のいずれもでもよい。
【００１８】
候補となるペプチドの状態は、酵素と反応し得る状態にあれば特に制限はないが、ファージディスプレー法などに従い、ファージや酵母などのタンパク質の一部として提示された状態であることが好ましい。
【００１９】
溶液中のペプチドの濃度は特に限定されないが、ファージに提示された状態のペプチドを用いる場合、ファージ濃度が１０１０〜１０１２ｔ．ｕ．／ｍｌ程度にすることが好ましい。
【００２０】
膜の浸漬時間も特に限定されないが、３０分〜１時間程度が好ましい。
【００２１】
スクリーニング対象とするペプチドの数は特に限定されないが、ランダムペプチドの場合、１０１０以上をスクリーニングの対象とすることが好ましい。但し、このような膨大な数のペプチドのスクリーニングを行うのは困難なので、本発明のスクリーニング方法を実施する前に、予めスクリーニング対象とするペプチドの数を絞り込んでおくことが望ましい。ペプチドの数を絞り込むための選択方法は特に限定されないが、例えば、酵素との親和性を指標としてペプチドを選択する方法を挙げることができる。具体的には、酵素を固相化し、これにペプチドを反応させ、酵素と結合したものだけを選択する方法（バイオパニング）やＥＬＩＳＡ法による選択法などを例示できる。
【００２２】
工程（４）：この工程では、膜に転写された酵素が活性を示すかどうか確認する。
【００２３】
酵素活性の確認は、酵素の種類に応じて決めればよく、例えば、呈色反応を伴う活性測定法を持つ酵素の場合は、呈色の有無を指標として酵素が活性を示すかどうかを確認できる。ここで、酵素活性が維持されていれば、候補となるペプチドは酵素阻害ペプチドではないと判断でき、酵素活性が消失していれば、候補となるペプチドは酵素阻害ペプチドである判断できる。
【００２４】
本発明の酵素阻害ペプチドのスクリーニング方法は、酵素を膜に固定化しているので、効率的に酵素阻害ペプチドをスクリーニングすることができる。液相中で阻害活性の有無を判断するためには、ペプチドを高濃度にしなければならないが、ファージに提示されたペプチドを高濃度にするのは困難である。本発明のスクリーニング方法では、酵素が膜に固定されているため、低濃度のペプチドでも阻害の有無を識別することが可能である。
【００２５】
（Ｂ）ペプチド
本発明のペプチドは、上述した本発明のスクリーニング方法により、見出されたペプチドであり、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すものである。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつセルロプラスミンのオキシダーゼ活性を阻害する作用を持つペプチド
（ｂ）のペプチドにおける欠失等されたアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常は７個以下であり、好ましくは５個以下であり、更に好ましくは２個以下である。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例に限定されるものではない。
（１）セルロプラスミン親和性クローンの選択
精製したヒト血清セルロプラスミンをポリスチレンのカラムに固相化し、次いで、２％カゼイン溶液によりセルロプラスミンの付着していない部分をブロッキングした。ランダムペプチドライブラリーを加え、１〜数時間反応させた。ランダムペプチドライブラリーは、ＮＥＢ社の♯８１２０　Ｐｈ　Ｄ．１２ｋｉｔを用いた。このライブラリーでは、１２アミノ酸残基からなる約１０１２種類のペプチドがファージのコートタンパク質ＰＩＩＩと融合した状態で提示される。
【００２７】
反応終了後、０．０５〜０．５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で１０〜数１０回洗浄し、その後、５％カゼイン溶液を加え１〜数時間静置した。再びＴＰＢＳにて洗浄したのち、トリエチルアミン（１００ｍＭ）を加え、１０分間、ゆっくりと室温で揺すった後、半量の１Ｍトリス塩酸ｐＨ７．４を加えヴォルッテクスし、得られた画分を溶出画分とした。
【００２８】
溶出画分をＥ．ｃｏｌｉ　（ＥＲ２５３７）に感染させ、ＩＰＴＧ−Ｘ　Ｇａｌ　プレート上に生育させた。そこから１００クローンを拾い培養した後、セルロプラスミン固相化プレートを用いてＥＬＩＳＡを行い、各クローンとセルロプラスミンとの親和性を調べた。ＥＬＩＳＡは、以下のように行った。まず、精製セルロプラスミン（１０μｇ／ｍｌ，　１００μｌ）をプレートに固定し、これにペプチド提示ファージ溶液（１００μｌ）を加え、室温で２時間静置した。次に、プレートを洗浄し、未結合のファージを取り除いた後、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体（ファルマシア社製抗Ｍ１３ファージ抗体、２０００倍希釈）１００μｌを加え、室温で２時間静置した。プレートを洗浄後、ＡＢＴＳ基質溶液（フナコシ社製）を加え、発色させた。１００クローン中特にセルロプラスミンに親和性を示した２０クローンを選択し、次の酵素阻害試験に供した。
【００２９】
（２）酵素阻害試験
精製セルロプラスミンをＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。前述した２０クローンについて、ペプチド提示ファージ濃縮液（１０１０ｔ．ｕ．／ｍｌ、１ｍｌ）を調製した。各々のファージ溶液にＰＶＤＦ膜を浸漬し、１時間室温で静置した。ファージ溶液に浸漬したＰＶＤＦ膜を、０．０５％ＴＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼの発色基質溶液に浸漬した。発色基質溶液は、ジアミノベンジジン１０ｍｇを１０ｍｌの精製水に溶解し、これに１ｍｌの酢酸バッファー（ｐＨ　４．５）を加えた後、過酸化水素水を１２．５μｌ加えて調製した。基質溶液浸漬後のＰＶＤＦ膜の発色状態から各々のファージ提示ペプチドのセルロプラスミンのオキシダーゼ活性に対する阻害作用を調べた。この結果、試験に供した２０のペプチドのうち、１のペプチドに活性阻害作用が認められた。図１右のＰＶＤＦ膜が阻害作用を示したペプチドを加えたものであり、左のＰＶＤＦ膜が阻害活性を示さないペプチドを加えたもの（コントロール）である。この図に示すように、コントロールには、オキシダーゼ活性により出現する発色がみられるが、阻害ペプチドを添加した場合には、そのような発色はみられない。
【００３０】
（３）阻害作用を示すペプチドの解析
上記で阻害作用が確認されたクローン（陽性クローン）の培養上清中に含まれるＤＮＡを、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ　Ｍ１３システムにより精製した。得られたＤＮＡをエタノール沈殿し、配列解析の鋳型とした。ＡＢＩ社製３７００シークエンサーで配列を解析し、陽性クローンが提示していたペプチドのアミノ酸配列を決定した。このペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に、また、このペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１にそれぞれ示す。
【００３１】
【発明の効果】
本発明は、酵素阻害ペプチドの新規なスクリーニング方法、及びその方法により選択された新規なペプチドを提供する。本発明のスクリーニング方法は、対象となる酵素が鋭敏な活性測定法を持たない場合や候補ペプチドが微量な場合であっても酵素阻害ペプチドを効率的に選択することが可能である。
【００３２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】オキシダーゼ活性阻害試験の結果を示す図である。
【図１】
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