(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんにおけるＳＣＮ２Ａ遺伝子の疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）の検出方法の提供。【解決手段】本発明者らは７７名の重症乳児ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）または非定型ＳＭＥＩと診断されたの患者のうちの、二次性全般化けいれん性発作を伴う難治症候性局在関連性てんかんの１名の患者のＳＣＮ２Ａ遺伝子において、Ｒ１０２Ｘを生じるナンセンス変異（一塩基変異（ｃ．３０４Ｃ→Ｔ））を見いだした。本発明は疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）を有するＳＣＮ２Ａ遺伝子、およびそれを増幅するためのプライマーならびにプローブに関する。さらに、これらのプライマー及びプローブを用いた変異の検出方法を提供する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＳＣＮ２Ａをコードする配列番号１のＤＮＡ塩基配列において、疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）を有する、単離されたヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡ、またはそのｃＤＮＡ、もしくは対応するｍＲＮＡ。
【請求項２】
ヒトＳＣＮ２Ａをコードする配列番号１のＤＮＡ塩基配列において、膜貫通セグメントＤ１Ｓ１の直前のアミノ酸をコードするコドンよりも上流側にナンセンス変異を有する、単離されたヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡ、またはそのｃＤＮＡ、もしくは対応するｍＲＮＡ。
【請求項３】
ヒトＳＣＮ２Ａをコードする配列番号１のＤＮＡ塩基配列において、１０番目のアミノ酸から、膜貫通セグメントＤ１Ｓ１の直前のアミノ酸をコードする領域にナンセンス変異を有する、単離されたヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡ、またはそのｃＤＮＡ、もしくは対応するｍＲＮＡ。
【請求項４】
ヒトＳＣＮ２Ａをコードする配列番号１のＤＮＡ塩基配列において、アルギニン１０２をコードするコドン（開始コドンからの位置３０４から３０６）にナンセンス変異を有する、単離されたヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡ、またはそのｃＤＮＡ、もしくは対応するｍＲＮＡ。
【請求項５】
ナンセンス変異が、配列番号１のＤＮＡ塩基配列中において位置４０９（開始コドンから３０４番目の位置）のシトシンがチミンに置き換わる変異である、請求項４に記載のＤＮＡ、またはそのｃＤＮＡ、もしくは対応するｍＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１ないし５に記載したＤＮＡまたはｃＤＮＡの一部であって、疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）の上流側および下流側に対応するヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子の領域をそれぞれ含む、連続した塩基配列またはその相補配列を有する一対のＤＮＡ断片からなるプライマー対。
【請求項７】
請求項１ないし５に記載したＤＮＡまたはｃＤＮＡの一部の互いに重複しない塩基配列からなるプライマー対であって、疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）の領域を含むプライマーと、含まないプライマーの対。
【請求項８】
各々が、１０〜１００塩基の連続した塩基配列を有する一対のＤＮＡ断片からなる請求項６または７に記載のプライマー対。
【請求項９】
各々が、２０〜１００塩基の連続した塩基配列を有する一対のＤＮＡ断片からなる請求項８に記載のプライマー対。
【請求項１０】
それぞれ配列番号２および３、配列番号４および５、配列番号６および７、配列番号８および９、配列番号１０および１１、配列番号１２および１３、配列番号１４および１５、配列番号１６および１７、配列番号１８および１９、配列番号２０および２１、配列番号２２および２３、配列番号２４および２５、配列番号２６および２７、配列番号２８および２９、配列番号３０および３１、配列番号３２および３３、配列番号３４および３５、配列番号３６および３７、配列番号３８および３９、配列番号４０および４１、配列番号４２および４３、配列番号４４および４５、配列番号４６および４７、配列番号４８および４９、配列番号５０および５１、配列番号５２および５３、配列番号５４および５５、配列番号５６および５７、または、配列番号５８および５９の塩基配列を有する、請求項６に記載のプライマー対。
【請求項１１】
請求項６ないし１０のいずれか一項に記載のプライマー対を構成する二つのプライマーのうち、いずれか一方のプライマー。
【請求項１２】
請求項１ないし５に記載のＤＮＡの一部であって、ナンセンス変異の上流側の連続した１０〜１００塩基からなる塩基配列であり、その３’末端が上記疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）に隣接した塩基である、プライマー。
【請求項１３】
請求項１ないし５に記載のｃＤＮＡの一部であって、ナンセンス変異の下流側に相当する１０〜１００塩基からなる塩基配列であり、その３’末端が疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）に隣接した塩基である、プライマー。
【請求項１４】
請求項１ないし５に記載のＤＮＡまたはｃＤＮＡ、もしくはｍＲＮＡに含まれる、ヒトＳＣＮ２ＡのＤＮＡ塩基配列における疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）を検出するためのプローブ。
【請求項１５】
請求項１ないし５に記載のＤＮＡまたはｃＤＮＡの一部であって、疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）を含む領域の１０〜１００塩基の連続した塩基配列、またはその相補配列からなるＤＮＡ断片を含む、請求項１４に記載のプローブ。
【請求項１６】
請求項１ないし５に記載のｍＲＮＡの一部であって、疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）を含む領域の１０〜１００塩基の連続した塩基配列、またはその相補配列からなるＲＮＡ断片を含む、請求項１４に記載のプローブ。
【請求項１７】
重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を有する、または重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんであると思われるヒトの血液または組織試料から調製したゲノムＤＮＡ抽出物またはｃＤＮＡを用意し、
請求項６、８、９または１０のいずれか１項に記載のプライマー対の１対ないし全部の対を用い、上記ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡの増幅を行い、
増幅したＤＮＡの塩基配列を解析して、増幅したＤＮＡが請求項１に記載の疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）を含むか否かを調べ、そして、
上記疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）が存在する場合は、当該ヒトの血液または組織試料に含まれるＳＣＮ２Ａ遺伝子に重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんに関連する変異が存在すると判断する方法。
【請求項１８】
重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を有する、または重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんであると思われるヒトの血液または組織試料から調製したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを用意し、
必要なら該ＤＮＡを増幅させ、
該ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに請求項１２または１３に記載のプライマーを接触させ、
ダイデオキシヌクレオシドを用いて１塩基のみＤＮＡを増幅し、
その増幅産物の質量分析により請求項１ないし５に記載の疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）の有無を判断し、
上記疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）が存在する場合は、当該ヒトの血液または組織試料に含まれるＳＣＮ２Ａ遺伝子に重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんに関連する変異が存在すると判断する方法。
【請求項１９】
重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を有する、または重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんであると思われるヒトの血液または組織試料から調製したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを用意し、
必要なら該ＤＮＡを増幅させ、
該ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載のプローブが特異的にハイブリダイズするかどうか調べることを含む一塩基多型を検出する方法により、該ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ中の請求項１に記載の疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）の有無を検出し、
上記疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）が存在する場合は、当該ヒトの血液または組織試料に含まれるＳＣＮ２Ａ遺伝子に重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんに関連する変異が存在すると判断する方法。
【請求項２０】
重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を有する、または重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんであると思われるヒトの血液または組織試料から調製したゲノムＤＮＡ抽出物またはｃＤＮＡを用意し、
請求項６から９のいずれか１項に記載のプライマー対の１対を用い、上記ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡの増幅を行い、
増幅したＤＮＡの有無を判断して、
増幅ＤＮＡ断片があれば、当該ヒトの血液または組織試料に含まれるＳＣＮ２Ａ遺伝子に重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんに関連する疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）が存在すると判断する方法。
【請求項２１】
請求項６、８、９または１０のいずれか１項に記載したプライマー対の１対ないし全部の対を含む、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を有するか否かを配列解析により診断するためのキット。
【請求項２２】
請求項１２または１３に記載のプライマーを一つないし全部を含む、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を有するか否かを質量分析法により診断するためのキット。
【請求項２３】
請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載したプローブを一つないし全部を含む、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を有するか否かを診断するためのキット。
【請求項２４】
請求項６から９のいずれか１項に記載したプライマー対の１対ないし全部の対を含む、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を有するか否か増幅産物の有無により診断するためのキット。
【請求項２５】
請求項１ないし５に記載のナンセンス変異を有するヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子にコードされるタンパク質。
【請求項２６】
重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を有する、または重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんであると思われるヒトの血液または組織試料から調製したゲノムＤＮＡ抽出物またはｃＤＮＡを用意し、当該ヒトの血液または組織試料に含まれるＳＣＮ２Ａ遺伝子に重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんに関連する変異を検出し診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんにおける、神経の電位型ナトリウムチャネルタイプＩＩ遺伝子（ＳＣＮ２Ａ）に生じる疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）、およびその変異を利用した重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの診断に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、熱性発作プラスを伴う全般性てんかん（ＧＥＦＳ＋）、および、重症乳児ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）などの、様々なタイプのてんかんの患者および家族に多くの遺伝子異常が報告されており、それらの原因となる遺伝子のいくつかが明らかとなった。
【０００３】
てんかんは特発性てんかんおよび症候性てんかんに分類される。これまでに同定された特発性てんかんの原因遺伝子のほとんどは、中枢神経システム（ＣＮＳ）で発現するイオンチャネル遺伝子をコードする。電位型ナトリウムチャネル遺伝子はてんかんの原因となる遺伝子のグループの一つである。したがって、いくつかのタイプのてんかんは、神経チャネル病の分類に含まれる。
【０００４】
良性のてんかんであるＧＥＦＳ＋においては、神経系における電位型ナトリウムチャネルタイプＩ遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）、ナトリウムチャネルβ１アクセサリーサブユニット遺伝子（ＳＣＮ１Ｂ）および神経系における電位型ナトリウムチャネルタイプＩＩ遺伝子（ＳＣＮ２Ａ）にミスセンス変異が同定されている。Ｗａｌｌａｃｅらは、ＧＥＦＳ＋を患っている大家族における染色体１９上のナトリウムチャネルβ１アクセサリーサブユニット遺伝子（ＳＣＮ１Ｂ）のミスセンス変異を最初に同定した（たとえば、非特許文献１参照。）。この発見に続いて、Ｅｓｃａｙｇらは、ＧＥＦＳ＋ファミリーの中における、染色体２上の電位型ナトリウムチャネルαサブユニット（Ｎａｖ１．１）遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）の接合体ミスセンス変異を同定した（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
本発明者らは以前に、ＧＥＦＳ＋の患者の神経系の電位型ナトリウムチャネルタイプＩＩ（Ｎａｖ１．２）遺伝子であるＳＣＮ２Ａのミスセンス変異について報告し、さらに細胞全体パッチクランプレコーディング（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｐａｔｃｈ  ｃｌａｍｐ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ）によってチャンネルの機能不全を明らかにした（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００６】
一方、より重篤な難治のてんかんの一つであるＳＭＥＩにおいては最近、Ｃｌａｅｓらは、７人のＳＭＥＩ患者においてＳＣＮ１Ａの変異を同定した。これらの変異はヘテロ接合性で新規に発見されたものであった（４つのフレームシフト、１つのナンセンス、１つのスプライスドナー、および１つのミスセンス）（たとえば、非特許文献４参照。）。また、本発明者らは、何人かの日本人のＳＭＥＩ患者においてＳＣＮ１Ａ変異を同定し、それらのほとんどはナンセンス変異であった（たとえば、非特許文献５、非特許文献６、または特願０２／２３６８３８参照。）。このように、ＳＭＥＩの患者においては多くのＳＣＮ１Ａのナンセンス変異が同定されている。このように、重症の難治性てんかんに関して、種々の原因が解明され、その治療指針も次第に確立されつつあるが、しかし、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんには、ＳＣＮ１Ａの変異によっては説明できない症例、すなわち、典型的なＳＭＥＩに属さないと思われる症例が知られている。
【０００７】
重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんは、難治の強直間代発作、に加えて運動失調および精神機能低下を伴うため、ＧＥＦＳ＋に比べて症状が重篤であり、的確な診断により病状の経過を予測し、早期に治療計画を立てることが重要である。したがってその原因遺伝子における変異を同定することは、その変異の有無の検出により早期の診断を可能にする。また、原因遺伝子の変異から重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの症状を引き起こすメカニズムを解明できる可能性がある。したがって、ＳＭＥＩ以外の重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの早期診断・治療のためにも、原因遺伝子の変異の同定が望まれている。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｒ．  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｅｂｒｉｌｅ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎａ＋−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｅｔａ１  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅ，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９９８，  １９（４），  ｐ．３６６−３７０
【０００９】
【非特許文献２】
Ｅｓｃａｙｇ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＳＣＮ１Ａ，  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ，  ｉｎ  ｔｗｏ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ＧＥＦＳ＋２．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２０００，  ２４（４），  ｐ．３４３−３４５
【００１０】
【非特許文献３】
Ｓｕｇａｗａｒａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｌｐｈａ  ＩＩ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅ  Ｎａ（ｖ）１．２  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｆｅｂｒｉｌｅ  ａｎｄ  ａｆｅｂｒｉｌｅ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ２００１，  ９８（１１），  ｐ．６３８４−６３８９
【００１１】
【非特許文献４】
Ｃｌａｅｓ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｏｄｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｇｅｎｅ  ＳＣＮ１Ａ  ｃａｕｓｅ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｏｆ  ｉｎｆａｎｃｙ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２００１，  ６８（６），  ｐ．１３２７−１３３２
【００１２】
【非特許文献５】
Ｓｕｇａｗａｒａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＳＣＮ１Ａ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｃｙ．，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ２００２，  ５８，  ｐ．１１２２−１１２４
【００１３】
【非特許文献６】
Ｆｕｊｉｗａｒａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｔｙｐｅ  １  （ＳＣＮ１Ａ）  ｉｎ  ｉｎｔｒａｃｔａｂｌｅ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｔｏｎｉｃ−ｃｌｏｎｉｃ  ｓｓｅｚｕｒｅｓ．，  Ｂｒａｉｎ，  ２００２，  １２６（３），  ｐ．５３１−５４６
【００１４】
【非特許文献７】
Ｓｕｇａｗａｒａ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｖ１．１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｅ  ｆｅｂｒｉｌｅ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｆｅｂｒｉｌｅ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ２００１，  ５７，  ｐ．７０３−７０５
【００１５】
【非特許文献８】
Ｉｗａｓａｋｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，  ２００２，  ９（２），  ｐ．５９−６２
【００１６】
【非特許文献９】
Ｐｌａｎｅｌｌｓ−Ｃａｓｅｓ，  Ｒ．，  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｎａｔａｌ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｌｐｈａ（ＩＩ）−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．，  ２０００，  ７８，  ｐ．２８７８−２８９１
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの原因解明、診断および治療の可能性を探るため、上記てんかんにおける新規な遺伝子変異を突き止めることを目的とする。
【００１８】
本発明はさらに重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんに伴う、変異遺伝子、該遺伝子同定に使用するプライマーおよびプローブ、それらを用いた変異の検出方法、さらに該方法に用いる診断用キットを提供する。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＳＭＥＩ非典型例と診断されていた患者の一人であり、精神発達遅滞を有する難治の症候性てんかんの患者からＳＣＮ２Ａの新規なナンセンス変異を同定した。
【００２０】
すなわち、重症乳児ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）、非定型ＳＭＥＩまたはＳＭＥＩに類似した疾患であると診断されていた患者のうち、神経系におけるナトリウムチャネルタイプＩタンパク質（Ｎａｖ１．１）をコードする遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）に変異を持たない患者において、神経系におけるナトリウムチャネルタイプＩＩタンパク質（Ｎａｖ１．２）をコードする遺伝子（ＳＣＮ２Ａ）を分析したところ、ＳＣＮ２Ａ遺伝子に一つのナンセンス変異が存在することを見いだした。ＳＣＮ２Ａのナンセンス変異の同定は、従来例がなく、本発明が始めてである。この変異は、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの一つである二次性全般化けいれん発作を伴う症候性局在関連性てんかんと診断された、２９歳の女性の患者の遺伝子から同定された。具体的には、この変異は、１塩基変異（ｃ．３０４Ｃ→Ｔ：３０４は開始コドンから数えた位置、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。以下同様。）により遺伝子内終止コドンＡｒｇ１０２Ｓｔｏｐ（Ａｒｇはアルギニンを、Ｓｔｏｐは終止コドンを示す。以降はＲ１０２Ｘと表記する。）を生じるナンセンス変異であった。また、この変異はヘテロ接合体であることを確認した（図１参照）。この患者においてはＳＣＮ２Ａのナンセンス変異が遺伝子的原因となっていると推測される。
【００２１】
上述のように、ナトリウムチャネルタンパク質の遺伝子ＳＣＮ１Ａの「ナンセンス」変異は重篤なてんかんの原因であることが分かっている。今回、新たに重篤なてんかんの患者において、別のナトリウムチャネルタンパク質の遺伝子ＳＣＮ２Ａに「ナンセンス」変異が見つかったことは、ＳＣＮ２Ａにおいてもナンセンス変異が重篤なてんかんの原因となることを示す。
【００２２】
したがって、本発明はヒトから単離および所望により増幅されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡであって、ＳＣＮ２Ａ遺伝子の塩基配列（配列番号１）中のいずれかの領域において起こるナンセンス変異を有する、単離されたヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡ、もしくはそのｃＤＮＡ、または対応するｍＲＮＡを含む。
【００２３】
本発明において発見されたＳＣＮ２ＡのＲ１０２Ｘナンセンス変異により、変異型の遺伝子からはＮ末端側の１０１アミノ酸からなる短いタンパク質が産生される。ＳＣＮ２Ａの１０２番目のアルギニンは最初の膜貫通セグメントＤ１Ｓ１よりもＮ末端側にあるため（図２参照）、変異型の遺伝子より産生される短いタンパク質は細胞質に可溶であると考えられる。ここで、ＳＣＮ２Ａナンセンス変異が最初の膜貫通セグメントＤ１Ｓ１よりも上流側に存在すれば、結果として産生される変異型タンパク質は細胞質に可溶性となるため、そのような変異による産物はナンセンス変異Ｒ１０２Ｘによる産物と同様の影響を及ぼす可能性が大きい。
【００２４】
したがって本発明の一態様において、本発明はヒトから単離および所望により増幅されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡであって、ＳＣＮ２Ａ遺伝子の塩基配列（配列番号１）中における膜貫通セグメントＤ１Ｓ１の直前のアミノ酸をコードするコドンよりも上流側の領域にナンセンス変異を有する、単離されたヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡ、もしくはそのｃＤＮＡ、または対応するｍＲＮＡを含む。ここで、膜貫通セグメントＤ１Ｓ１の直前のアミノ酸をコードするコドンよりも上流側の領域の変異とは、たとえば１０２番目からＤ１Ｓ１の直前のアミノ酸をコードする領域の変異であってよく、あるいは、１０番目から１０１番目のアミノ酸をコードする領域、３０番目から１０１番目のアミノ酸をコードする領域、５０番目から１０１番目のアミノ酸をコードする領域、７０番目から１０１番目のアミノ酸をコードする領域、または９０番目から１０１番目のアミノ酸のいずれかをコードする領域の変異であってもよい。
【００２５】
本発明のＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの具体例は、ＳＣＮ２Ａ遺伝子の塩基配列（配列番号１）中においてアルギニン１０２をコードするコドン（開始コドンからの位置３０４から３０６）にナンセンス変異を有する、単離されたヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡ、もしくはそのｃＤＮＡ、または対応するｍＲＮＡを含む。そのような変異の例は、開始コドンから３０４番目のシトシンがチミンに置き換わる変異である。
【００２６】
本発明の別の態様において本発明はヒトから単離および増幅されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡであって、ＳＣＮ２Ａ遺伝子の塩基配列（配列番号１）中において、膜貫通セグメントＤ１Ｓ１以後のアミノ酸をコードするコドンのいずれかの領域にナンセンス変異を有する、単離されたヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡ、またはそのｃＤＮＡ、もしくは対応するｍＲＮＡを含む。
【００２７】
上記のヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子の変異情報に基づいて重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を持つ、または、発症中の発作が重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんであると思われる患者の診断を行うことができる。
ＳＣＮ２Ａ遺伝子の配列決定による変異解析
変異の有無を判断するためのの一方法として、被験者のＳＣＮ２Ａ遺伝子を取り出し、その塩基配列を決定し、上記の変異のいずれかが含まれているか調べることが可能である。ＳＣＮ２Ａ遺伝子はたとえば、（非特許文献３）に記載された方法によって、ヒトの組織または血液から単離することができる。簡単に述べると、被験者のヘパリン処理した血液サンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡはＰＣＲなどの適当な手段により増幅し、配列決定により解析する。ＰＣＲプライマーは、ＳＣＮ２Ａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．  Ｍ９４０５５；配列番号１）およびゲノム配列（ＢＡＣクローンがカバーするコーディング領域；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を比較することで同定したＳＣＮ２Ａの２６のエキソンの全てを増幅するように設計すればよい。このように、本発明の変異を含む領域を増幅できるよう設計したプライマーは本発明に含まれる。具体的には、たとえば、配列番号２ないし５９に示す塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対が使用でき、これらもまた本発明に含まれる。ＰＣＲ産物の塩基配列を解析してＳＣＮ２Ａのナンセンス変異の有無を確認する。変異解析の方法は、たとえば、非特許文献７に記載されている。ヒト組織からのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの抽出、そのＰＣＲ増幅操作およびＰＣＲ産物の配列解析は、いずれも市販のキットおよび／または装置を用いて行うことができる。
【００２８】
ＳＣＮ２Ａ遺伝子は患者の組織または血液からｍＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製してもよい。得られたｃＤＮＡは必要に応じてＰＣＲなどにより増幅させ、配列解析に用いてもよい。
変異領域を増幅させるためのプライマー
重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの診断は、上述のように被験者から単離したゲノムＤＮＡを、配列番号２ないし５９に示すプライマーを含むプライマーを用いて、本発明の変異の少なくとも一つを含む領域を増幅するプライマー対によって増幅し、ＰＣＲ産物をクローニングしてＳＣＮ２Ａの遺伝子の塩基配列を解析を行うことで、または、ＰＣＲ産物を後述するプローブと結合させる方法などによって、本発明の変異の有無を調べることにより行うことができる。本発明は、本発明の変異を含む領域を増幅するためのプライマーを提供する。
【００２９】
本発明のプライマーは、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子の領域であって、上記の変異の少なくとも一つの領域の上流側および下流側に対応するヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子の領域をそれぞれ含む、連続した塩基配列またはその相補配列を有する一対のＤＮＡ断片からなるプライマー対を含む。望ましくはこのプライマーの長さは、各々が１０〜１００塩基の連続した塩基配列を有するＤＮＡ断片からなるプライマー対であり、さらに望ましくは２０〜１００塩基の連続した塩基配列を有するＤＮＡ断片からなるプライマー対である。プライマーは必要により標識を結合させて用いてもよい。本発明のプライマーは、当業者に既知のホスホロアミダイト法などの核酸合成法により合成することができ、また、この操作は市販の核酸合成装置を用いて行うことも可能である。
【００３０】
通常はプライマーは上記の変異を含む領域を挟んだ１対のＤＮＡ断片からなる。対の一方のプライマーが変異領域を含んでも、含まなくてもよい。プライマー対の一方が変異領域を含む場合、被験者のＳＣＮ２Ａ遺伝子に変異が存在する場合にのみ、ＤＮＡが増幅されるようににすることができ、この方法によっても変異の検出が可能である（たとえば、非特許文献８参照）。
マススペクトルによる変異検出用のプライマー
上記の変異を有する領域を増幅するプライマーに加えて、本発明は変異をマススペクトルにより検出するためのプライマーも提供する。
【００３１】
マススペクトルによる変異の検出法では、ＳＮＰ部位に隣接するプライマー、すなわち、プライマーの３’末端がＳＮＰ部位の直前にあたる塩基であるもの、を作成し、ＰＣＲなどによって増幅された変異を含む領域のＤＮＡを鋳型として、ｄｄＮＴＰを用いて１塩基分だけプライマー伸長を行う。ｄｄＮＴＰは、通常のＰＣＲで用いるヌクレオシドｄＮＴＰと異なり、リボースの３’水酸基が水素に置き換わっている。ｄｄＮＴＰを用いて伸長反応を行うと、１塩基付加された後は、伸長反応生成物には３’末端に水酸基がないため、それ以上の伸長反応は起こらない。その結果、伸長反応生成物はプライマーに１塩基付加したオリゴヌクレオチドとなる。生成物の質量分析により、付加したｄｄＮＴＰを識別し、変異の有無および変異の塩基を同定することができる。
【００３２】
本発明のマススペクトルによる変異検出に用いてもよいプライマーは、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子の領域の塩基配列の一部であって、上記ナンセンス変異のうちの一つの上流側の連続した１０〜１００塩基からなる塩基配列であり、３’末端が上記ナンセンス変異に隣接した塩基であるプライマーである。または、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子の領域の塩基配列の相補鎖の一部であって、上記ナンセンス変異のうちの一つの下流側に相当する１０〜１００塩基からなる塩基配列であって、３’末端が上記ナンセンス変異の部位に隣接した塩基であるプライマーである。望ましくはこれらのプライマーは１０〜５０塩基からなる塩基配列であり、さらに望ましくは１０〜４０塩基、さらに望ましくは１０〜２０塩基である。
【００３３】
本発明のマススペクトルによる変異検出に用いてもよいプライマーは、上記の遺伝子増幅用のプライマーと同様に合成し入手することができる。
プローブ
本発明は、上記のＳＣＮ２Ａ遺伝子における疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）を検出するためのプローブも提供する。プローブはＤＮＡであってもよく、またはＲＮＡであってもよい。
【００３４】
本発明の一つの態様において、本発明のプローブはヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子の領域のＤＮＡ配列またはそのｃＤＮＡの一部であって、本発明の疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）の一つを含む領域の１０〜１００塩基、好ましくは２０〜１００塩基の連続した塩基配列、またはその相補配列からなるＤＮＡ断片を含むプローブである。
【００３５】
本発明の別の態様において、本発明のプローブはヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のｍＲＮＡのＲＮＡ配列の一部であって、本発明の疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）の一つを含む領域の１０〜１００塩基、好ましくは２０〜１００塩基の連続した塩基配列、またはその相補配列からなるＲＮＡ断片を含むプローブである。
【００３６】
本発明のプローブはＳＣＮ２Ａ遺伝子またはその断片とのハイブリダイゼーションの確認を容易にする手段、たとえば蛍光ラベル、放射性同位体元素（ＲＩ）、およびビオチンなどによる標識を付してもよい。また、本発明のプローブには上記の配列の他のＤＮＡ配列を付加してもよく、付加するＤＮＡの配列はＳＣＮ２Ａ遺伝子配列とは関連がない、すなわち、該遺伝子との相同性がなくてもよい。
【００３７】
さらに、プローブは、遺伝子チップの形式で適当な担体に付着させておくこともできる。または、プローブをビーズまたはマルチウェルプレート中の担体等に固定化しておくこともできる。
【００３８】
本発明のプローブは、上述のプライマーと同様、ホスホロアミダイト法などの化学合成により調製でき、この操作は市販の核酸合成装置を用いて行うことができる。
【００３９】
プローブおよびヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子またはその断片である試料ＤＮＡまたは試料ＲＮＡのハイブリダイゼーションの条件には、反応の特異性が保たれる限りは特別の制限はない。反応の特異性を保つためには、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを調節して行う。
【００４０】
ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、塩強度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、および、温度の条件によって変化させることができる。すなわち、塩強度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによってストリンジェンシーは増大する。また、ストリンジェンシーはその他の条件によっても変化させることができる。すなわち、ハイブリダイゼーション時間、洗浄時間によっても変化させることができる。
【００４１】
通常は、ハイブリダイゼーションの条件は低いストリンジェンシーでおこなうことで、ハイブリダイゼーションが確実に起こるようにする。その後の洗浄は、ストリンジェンシーを増大させた条件でおこなうことで、特異性の低いものを解離させ、特異性の高いもののみがハイブリダイゼーションを保っていられるようにする。洗浄は、そのストリンジェンシーを増大させながら複数回繰り返すことが望ましい。ストリンジェンシーの最適条件の設定は、それぞれのプローブの特質により異なっており、この様な条件設定は当業者が通常行っているものである。したがって、本発明のプローブを用いる方法において、そのプローブに最適のストリンジェンシーを設定し、これを使うことは、本発明の範囲内である。
【００４２】
一つの好ましい態様としては、たとえば、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で、５０℃以上の温度で一晩以上ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションの条件は低いストリンジェンシーで行う。
【００４３】
ハイブリダイゼーション後の洗浄は、塩強度の減少、温度の増大などハイブリダイゼーションの条件よりは高いストリンジェンシーで行う。たとえば、１００−５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０−５０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む洗浄緩衝液液で室温以上で５−２０分程度洗浄した後、さらに、１０−１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１−１０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む洗浄緩衝液を用いて５０℃以上で１０−３０分間程度洗浄する。
変異の検出方法
上述のヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子の変異を検出は、上記の本発明のプライマーおよびプローブを用いて、組織ＤＮＡのＳＮＰｓを検出する方法として当業者によく知られている方法で行うことができる。
【００４４】
たとえば、上述したように、ＳＣＮ２Ａ遺伝子の本発明に記載した変異の領域の塩基配列を解析することで、変異の有無およびその塩基を同定することができる。
【００４５】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法も利用可能である。ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、上記の変異を含む領域のＤＮＡをＰＣＲ等の方法により増幅し、増幅産物を変性させて一本鎖ＤＮＡとして単離する。この１本鎖ＤＮＡをアニーリングした後、非変性ゲル電気泳動に供し、正常ＤＮＡとは異なるバンドが現れた場合に、そのサンプルには変異が存在すると判断するものである。これは、変異が導入されることで、ヌクレオチド分子内の水素結合の様式が変化し、正常ＤＮＡと変異ＤＮＡとでは異なる三次元構造を取りうることに基づくものである。したがって、この方法では、変異の位置およびその塩基は同定できないが、何らかの変異の有無は知ることができる。
【００４６】
ＰＣＲ増幅産物の有無から変異を検出することもできる。用いたプライマーに対応する変異が試料中のＳＣＮ２Ａ遺伝子に存在する場合にのみ、その変異領域のＤＮＡを特異的に増幅するようにプライマーを設計することで行うことができる。この様なプライマーも本発明の範囲内である。
【００４７】
上述したマススペクトルを用いた変異の検出方法により、得られたＤＮＡ断片の質量から変異の有無およびその塩基を同定してもよい。
変異ＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズするプローブのハイブリダイゼーションの有無に基づいて検出することもできる。その場合のプローブは、蛍光標識、放射性標識、酵素標識などの適当な標識により、検出を容易にすることも可能である。また、プローブはＤＮＡチップ上の担体に固定し、マイクロアレーとして用いることもできる。別の態様においては、プローブはビーズまたはマルチウェルプレート中の担体等に固定化してもよい。
【００４８】
上記の例を含む、変異を検出する方法であって、本発明のプライマーまたはプローブを用いる方法は全て本発明の範囲内である。
診断
本発明の方法により変異を含むＤＮＡの増幅が認められたときは、被験者に重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因がある、または重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんであると診断する。
診断用キット
本発明は、上述の本発明のプライマー対の少なくとも一つ以上を含む、被験者が重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんであるか否かを診断するためのキットも提供する。このキットは、プライマー対の他に、組織または体液ＤＮＡの抽出手段、ＤＮＡ希釈用緩衝液、反応容器、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、説明書、パッケージなどを適宜含んでよい。キットはさらに、ＤＮＡ増幅のための試薬を含んでもよい。
【００４９】
本発明は、上述の本発明のマススペクトルによる変異の分析に用いてもよいプライマーの少なくとも一つ以上を含む、被験者が重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんであるか否かを診断するためのキットも提供する。このキットは、プライマーの他に、組織または体液ＤＮＡの抽出手段、ＤＮＡ増幅のための試薬、ＤＮＡ希釈用緩衝液、反応容器、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、説明書、パッケージなどを適宜含んでよい。キットはさらに、マススペクトル測定用試薬（例えば、マトリックス）を含んでもよい。
【００５０】
本発明は、上述の本発明のプローブの少なくとも一つ以上含む、被験者が重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんであるか否かを診断するためのキットも提供する。このキットは、プローブの他に、組織または体液ＤＮＡの抽出手段、ＤＮＡ希釈用緩衝液、ハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーの緩衝液、ハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーの洗浄液、反応容器、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、説明書、パッケージなどを適宜含んでよい。一態様においては、プローブはマルチウェルプレート中の担体に固定化されていてもよい。
タンパク質
本発明のＳＣＮ２Ａのミスセンス変異を含む遺伝子によりコードされる、不完全長Ｎａｖ１．２のタンパク質も本発明の範囲に含まれる。この様なタンパク質は、イオンチャネルタンパク質の機能を制御する分子となり得る。さらに、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの症状の発生原因を突き止めることによる治療法の開発に貢献する。
抗体
重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの診断は、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかん患者の変異したＳＣＮ２Ａ遺伝子がコードする変異タンパク質またはその断片に特異的な抗体を用いて行うことが可能である。
【００５１】
本発明の一態様として、抗体はポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体は、本発明のＳＣＮ２Ａのナンセンス変異のいずれか１つを含むヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡまたは当該変異を含むＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡ断片がコードする、タンパク質またはペプチドを哺乳類動物に投与して免疫し、免役した動物の血液からの抗血清またはＩｇＧ画分として得られる。哺乳類動物の免疫方法、または血液からの抗血清の抽出方法およびＩｇＧ画分の分離の方法は当業者に周知である。
【００５２】
本発明の望ましい態様では、抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、本発明のＳＣＮ２Ａの疾患変異（ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト変異など）のいずれか１つを含むヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡまたは当該変異を含むＳＣＮ２Ａ遺伝子ＤＮＡ断片がコードする、タンパク質またはペプチドを哺乳類動物に投与して、該動物の抗体産生細胞を抽出し、該細胞をミエローマ細胞と融合させ、融合細胞から上記のいずれか一つの変異によるタンパク質またはペプチドに特異的な抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、得られたハイブリドーマを抗体産生条件で培養することにより製造できる。
【００５３】
本発明の抗体を用い、免疫化学的検査法（例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法、蛍光標識法、ラジオイムノアッセイ等）により患者の神経組織標本と特異的に反応するか否かに基づいて、患者が重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの素因を有するか否か、または、てんかんの発作が重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんによるものであるか否かを診断することが可能である。
以下に、実施例を記載して本発明をより詳細に説明する。
【００５４】
【実施例】
実施例１  ＳＭＥＩ患者のＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ２Ａの変異解析
患者
重症乳児ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）、非定型ＳＭＥＩまたはＳＭＥＩに類似した疾患であると臨床的に診断された７７人のお互いに関連のない日本人患者を募った。参加した患者またはその保護者からは、それぞれ、国立療養所静岡神経医療センターの倫理審査委員会に承認された書面でのインフォームド・コンセントを得た。
【００５５】
また、正常人１００人についても同様にインフォームド・コンセントを得た。
変異解析
ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ２Ａの変異解析方法は、発明者らの以前の論文に記載された方法により行った（非特許文献３、５）。簡単に述べると、患者および正常人のヘパリン処理した血液サンプルからゲノムＤＮＡを市販の製品（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（商標）、キアゲン）を用いて抽出した。ゲノムＤＮＡはＰｙｒｏｂｅｓｔ（商標）（ＴａＫａＲａ、東京、日本）を用いてＰＣＲにより増幅し、配列決定により解析した。
【００５６】
ＳＣＮ１Ａの変異を配列決定により解析するためにＳＣＮ１Ａ遺伝子の増幅に用いたＰＣＲプライマーは、特願０２／２３６８３８に記載のプライマーである。簡単に述べると、ＳＣＮ１Ａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．  ＡＹ０４３４８４）およびゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏｓ．  Ａｃ０１０１２７およびＡｃ０２１６７３）を比較することで同定したＳＣＮ１Ａの２６のコーディングエキソンのすべてを増幅するように設計したプライマーである。ＳＣＮ２Ａの変異を解析するために用いたＰＣＲプライマーは、ＳＣＮ２Ａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．  Ｍ９４０５５）およびゲノム配列（ＢＡＣクローンがカバーするコーディング領域；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を比較することで同定したＳＣＮ２Ａの２６のエキソン、のすべてを増幅するように設計した。ＳＣＮ２Ａのエキソンを増幅するために用いたプライマーの塩基配列は配列番号２ないし５９に示した。患者および正常人からのそれぞれのＰＣＲ産物はダイデオキシ・ターミネーター・キットを用いて直接配列決定をし、自動シークエンサー（モデルＡＢＩ３７００、アプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州、米国）で解析した。
【００５７】
結果
非定型のＳＭＥＩ患者においては、以前よりＳＣＮ１Ａの変異が多く発見されていたので、最初にＳＣＮ１Ａの変異を解析した。７７人のＳＭＥＩまたは非定型のＳＭＥＩ患者からのＳＣＮ１Ａの２６のエキソンの完全な配列決定の後、それらのＳＣＮ１Ａコーディング領域に全く変異のなかった２７人の患者をさらなるＳＣＮ２Ａの変異の解析のために選抜した。これらのサンプルのうちの１つに、発明者らは１塩基変異（ｃ．３０４Ｃ→Ｔ）により遺伝子内終止コドンＲ１０２Ｘを生じるナンセンス変異を発見した。
実施例２  ヘテロ接合体変異の確認
患者
実施例１において、ＳＣＮ２Ａにナンセンス変異が認められた患者は、２９歳の女性である。その患者の家族の病歴およびその患者自身の症状は以下の通りである。その患者の母親はいくつかの熱性けいれんを６歳まで患っていた。その患者の兄（弟）の息子は２歳で熱性けいれんを患った。その患者は同様の病歴がなく、精神運動性の発達は、２歳で運動過剰症および自閉症になるまでは正常であった。
【００５８】
発作は、１歳７ヶ月の時に顕れた。その患者は１日に何度か突然に前に倒れた。その患者はフェノバルビタールを服用し始め、そして間もなく発作はなくなった。薬物療法は４歳５ヶ月の時に中断した。脳波は、最初は遅い波のみを示したが、３年後にはスパイク活性が現れ、そして増加したことが報告された。６歳の時、主に睡眠中にけいれん性の発作が発症し、そして週に１−２度、しばしば群をなして繰り返した。発作の前に、頭が左前方にいく偏向運動、または、左上肢の間代性の運動が起こった。そして薬物療法が再開されたが、投薬量が増えると、その患者は無感情な表情（放心様の発作）の短時間の症状を断続的に示し、および手の短時間の筋弛緩の症状により、手にあったものを落としてしまうようになった。そのとき、脳波図（ＥＥＧ）は、頻繁な左右対称の鋭い波、または、中心部−頭頂部−側頭部において最大振幅のスパイク波を示した。
【００５９】
１０歳で発明者らの所属する病院に入院したときには、脳波図（ＥＥＧ）でスパイク波の放出に付随して、上肢の筋弛緩が頻繁にみられた。頭は前方に傾き、その患者は手を垂れた。これらの弛緩性の運動は、多剤投与（カルバマゼピン（ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎ）を含む５種類の薬剤）をバルプロ酸（ｖａｌｐｒｏａｔｅ）単一薬剤療法に切り替えると生じなくなった。そして脳波図（ＥＥＧ）は大きく改善された：左右対称性の放出が消え、そして右側の中心部−頭頂部−側頭部における鋭い波のみが観察された。しかしながら、発作時の脳波図（ＥＥＧ）記録による脳の一部分の始まりで示されるけいれん性の発作は、さまざまな治療法の試みにも関わらず、治療が困難であり、そしてその患者はなお、週ごとのけいれんを起こしていた。発作を誘発するどんな要因も見つからなかった。
【００６０】
神経学的な異常はなかったが、その患者は重度の知的および精神運動発達の遅滞があった。ＭＲＩは中程度の広汎性の脳萎縮を示した。てんかんの診断は重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの一つである、二次性全般化けいれん発作を伴う症候性局在関連性てんかんである。その患者は現在保護作業所に参加している。
【００６１】
サブクローニングと変異解析
患者のゲノムＤＮＡは実施例１と同様に調製し、配列番号３および４に示したプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物はＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）を用いてｐＣＲ  ２．１（登録商標）ｖｅｃｔｏ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）にサブクローニングし、３７のＰＣＲ陽性コロニーを選抜した。ＰＣＲ陽性コロニーは、エキソン２特異的プライマー（５’−ＧＡＡＧＣＡＴＣＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣ−３’（配列番号３）および５’−ＧＣＴＡＡＣＧＡＴＴＧＡＧＴＡＡＡＡＧＧ−３’（配列番号４））によりＰＣＲ増幅性を確かめて選抜した。それぞれのコロニーからのプラスミドクローンはＭ１３  ｆｏｒｗａｒｄ  （５’−ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ）  およびｒｅｖｅｒｓｅ  （５’−ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ）プライマーを用いて挿入配列を解析した。プラスミドクローンの挿入配列を解析することで、それぞれの対立遺伝子の配列を解析した。
【００６２】
結果
配列解析した３７クローンのうち１５はＲ１０２Ｘのナンセンス変異を示した（図１）。この結果から、この患者のヘテロ接合性が示された。
【００６３】
この変異は１００人の正常対照群にはみられなかった。また、この患者の両親はＳＣＮ２Ａのコーディング領域に変異を持たなかった。
図２にこのＳＣＮ２Ａの変異の位置を図示する。変異残基Ｒ１０２ＸはＮ末端の間に位置し、ＳＣＮ２ＡがコードするＮａｖ１．２の第１の膜貫通セグメントＤ１Ｓ１にも届かない位置である。
【００６４】
考察
Ｒ１０２Ｘナンセンス変異により生体内では、１０１アミノ酸のみからなる切りつめられた形のタンパク質を産生すると考えられる。上記のように、Ａｒｇ１０２はＳＣＮ２ＡがコードするＮａｖ１．２の第１の膜貫通セグメントＤ１Ｓ１よりもＮ末端側にあるため、変異型の遺伝子産物である切りつめられた形のタンパク質は、細胞内Ｎ末端側の短い形であるといえる。したがって、この変異型のタンパク質は細胞質に可溶であり、そして、電位型ナトリウムチャネルとしての機能を持たないはずである。この患者はヘテロ接合体変異であることから、単純にはＳＣＮ２Ａの機能は５０％損失するものと推測できる。
【００６５】
しかしながら、マウスにおける研究では、ＳＣＮ２Ａ欠損ヘテロ接合体（＋／−、ホモ接合体は致命的であった）マウスには、脳における重大な病理学上の変化、重大な行動異常、およびけいれんはみられなかった（たとえば、非特許文献９参照。）。それにも関わらず、ＳＣＮ２ＡのＲ１０２Ｘナンセンス変異の患者は、頻繁に起こるけいれん発作を伴う重症のタイプのてんかんであり、中程度の広汎性脳萎縮がみられた。ヒトにおけるＮａｖ１．２のナンセンス変異のヘテロ接合性と、＋／−マウスとは同等の関係にないのかもしれない。しかしながら、ナンセンス変異のヘテロ接合性においては、ＳＣＮ２Ａの５０％機能損失の影響以外の作用、すなわち、変異タンパク質の優性阻害効果により、けいれん発作と萎縮をともなう重症のてんかんを引き起こす可能性が浮かび上がる。
【００６６】
実際に、Ｒ１０２Ｘナンセンス変異による変異型Ｎａｖ１．２を発現するヒト培養細胞の電気生理学的な性質を評価したところ、このタンパク質はナトリウムチャネルとしての機能は持たないことがわかった。さらに、この変異型タンパク質を天然型タンパク質とを同時に発現するヒト培養細胞においては、ＳＣＮ２Ａの機能は５０％の低下ではなく、８０％の低下を示し、変異型タンパク質に優性阻害効果があるという結果が認められた。したがって、ナンセンス変異による産物はイオンチャネルとして機能しないばかりでなく、天然型の機能を低減させる効果を有すると考えられる。
【００６７】
また、これまでに良性のてんかんであるＧＥＦＳ＋患者においては、ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ２Ａ遺伝子にミスセンス変異が見いだされてきた。一方で重篤な難治性のてんかんであるＳＭＥＩにおいてはＳＣＮ１Ａに多くのナンセンス変異が同定されてきた。これは、イオンチャネルにおけるナンセンス変異はより重篤なてんかんを引き起こす傾向を示唆するものと考えられる。したがって、ＳＣＮ２Ａ全領域においても、ナンセンス変異の存在は難治てんかんの原因となると示唆される。
【００６８】
【発明の効果】
本発明は、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの原因である新たな遺伝子変異を突き止め、この難病の診断ならびに新治療法の開発に貢献する。また、本発明は、重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんの分子病理学的な原因解明のためのＮａｖ１．２（電位型ナトリウムチャネルタイプＩＩ型）および変異型（短縮型）Ｎａｖ１．２の機能および動物モデルによる研究の突破口になると期待される。
【００６９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａは、熱性けいれん（母親）と重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかん（発端者：矢印で示す）の日本人家族の家系樹である。ｃ．３０４Ｃ→Ｔナンセンス変異は発端者にのみ見られた。丸は女性、四角は男性、塗りつぶされた四角は重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかん、塗りつぶされた半円は熱性けいれんを表す。図１ｂは、ナンセンス変異Ｒ１０２Ｘのエレクトロフェログラムである。ゲノムＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１プラスミドベクターにサブクローニングし、別々に配列決定した（実施例参照）。独立したクローンから得られた配列を例としてＩからＩＶまでに示す。ＩおよびＩＩは天然型の配列を示し、ＩＩＩおよびＩＶはアルギニン残基が終止コドンに変異した配列を示す。
【図２】図２は、ＳＣＮ２Ａにコードされるタンパク質における変異Ｒ１０２Ｘの位置を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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