(57)【要約】【課題】流体に含まれる微生物を迅速かつ高感度に検出する方法を提供すること。【解決手段】微生物の検出方法であって、（１）濾過膜を用いて流体を濾過する工程、（２）濾過膜を液体培地に浸漬し、該濾過膜に捕捉された微生物を培養する工程、（３）培養物を濃縮する工程、（４）濃縮培養物から微生物のＤＮＡを抽出する工程、（５）抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施する工程、および（６）得られたＰＣＲ産物を検出する工程を含む微生物の検出方法。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の検出方法であって、
（１）濾過膜を用いて流体を濾過する工程、
（２）濾過膜を液体培地に浸漬し、該濾過膜に捕捉された微生物を培養する工程、
（３）培養物を濃縮する工程、
（４）濃縮培養物から微生物のＤＮＡを抽出する工程、
（５）抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施する工程、および
（６）得られたＰＣＲ産物を検出する工程
を含む微生物の検出方法。
【請求項２】
前記工程（１）ののち、得られた濾過膜をリンスする工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２）における培養時間が、５時間から２４時間である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が真菌または細菌である請求項１、２または３記載の方法。
【請求項５】
前記濾過膜の孔径が０．２〜０．４５μｍである請求項１、２、３または４記載の方法。
【請求項６】
前記工程（５）におけるＰＣＲが、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される塩基配列からなる２種類のプライマーを用いて実施される請求項１、２、３、４または５記載の方法。
【請求項７】
前記工程（５）におけるＰＣＲが、それぞれ配列番号４および配列番号５に示される塩基配列からなる２種類のプライマー、またはそれぞれ配列番号４および配列番号６に示される塩基配列からなる２種類のプライマーを用いて実施される請求項１、２、３、４または５記載の方法。
【請求項８】
前記工程（６）における検出が、アガロースゲルを用いる電気泳動またはハイブリダイゼーションアッセイにより実施される請求項１、２、３、４、５、６または７記載の方法。
【請求項９】
前記流体が気体または液体である請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載の方法。
【請求項１０】
前記液体が組織もしくは組織等価物の浸漬液、臓器の浸漬液または血液である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記組織等価物が培養皮膚または培養角膜である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記培養皮膚が培養表皮、培養真皮または複合培養皮膚である請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、組織工学の急速な進歩により、培養皮膚などの生細胞を利用した製品が開発されている。そのような製品においては、構成する細胞の安全性はもちろんのこと、微生物の汚染がないという確証が要求される。培養皮膚などの生細胞を利用した製品は最終滅菌ができないため、製造工程において微生物が混入しないよう充分に注意を払う必要がある。また、最終製品の無菌性も保証することが必要となる場合がある。
【０００３】
培養皮膚は、やけどを負った患者などから採取した少量の細胞を培養することによって製造され、細胞を採取した患者本人に移植される（自家培養皮膚移植）か、または他人に移植される（同種培養皮膚移植）。このため、採取した細胞が真菌、細菌またはウイルスに感染していないことを確認する必要がある。とくに、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）などによる深在性（全身性）真菌症は、易感染患者が高率に罹患する感染症として医療上の問題となっている。また、シュードモナス・エルジノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などによる緑濃菌症は、抵抗力の低下した宿主に日和見感染を起こし、皮膚の化膿、尿路感染、呼吸器感染、敗血症の原因となり、院内感染を起こしやすいという問題を有する。
【０００４】
古くからの真菌の検出方法としては、臨床検体を、たとえばペトリ皿上で培養し、臨床検体に含まれる真菌を増殖させて、形成された真菌のコロニーを検出する方法が行なわれてきた。しかしながら、とくに真菌は増殖が遅いため、コロニー形成まで長時間を要した。このため、培養皮膚を患者へ適用する前に検出結果が得られないという不具合が生じた。
【０００５】
医療用具ＧＭＰにおける細菌・真菌否定試験としては、サンプルを濾過した濾過膜を７〜１４日間培養し、培養液が濁っていないことを目視で確認するという方法が一般的に採用されている。しかしながら、この方法による培養皮膚の無菌試験の場合でもやはり、培養皮膚を患者へ適用する前に試験結果を得ることができない。
【０００６】
そのほか、真菌の抗原を免疫学的に検出する方法、真菌の菌体成分または代謝産物を生化学的に検出する方法などがあるが、いずれも検出感度が低く、多くの時間を要する方法である。
【０００７】
試験結果を得るまでに長時間を要するという問題を解決する方法として、真菌ＤＮＡを直接的に検出する方法が数多く公開されている。具体的には、真菌の特定の遺伝子配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲにより遺伝子を増幅して真菌を検出する方法である。このような方法は、前述の方法よりも迅速に真菌を検出することができ、さらに、検出感度も向上した。とくに、特許文献１には、たとえば、カンジダ・アルビカンスの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより、該遺伝子を増幅し、増幅産物を電気泳動法やドットブロットハイブリダイゼーション法などにより検出する方法が開示されている。この方法により、従来、数日から数週間要した真菌の検出を１日以内に終わらせることが可能となった。しかしながら、特許文献１に開示されている方法では従来のＰＣＲ法を適用しており、１〜２ｍｌ程度のサンプルしか利用することができない。該方法を培養上清が数百ミリリットルに達する組織または組織等価物の浸漬液などの液体に適用する場合には、得られた培養上清のごく一部を使用することになる。したがって、微生物の検出感度が不充分であるだけでなく、試験結果の信頼性の低下などの不具合も生じる。
【０００８】
ＰＣＲを用いるそのほかの真菌検出方法についても、検出感度は充分ではない。また、培養皮膚などの組織等価物の浸漬液をサンプルとした真菌の検出方法については、まったく開示されていなかった。
【０００９】
さらに、細菌の迅速検出法としては、培地の炭素原として１４Ｃで標識したブドウ糖を用い、代謝により産生されるＣＯ２を検出する方法も知られている（非特許文献１）。しかしながら、該方法では真菌と細菌を区別して検出することができないという問題点があった。また、生細胞を含有する製品（たとえば組織等価物）に関しては、生細胞自体がＣＯ２を産生するため、該方法を適用することができない。
【００１０】
したがって、組織または組織等価物、とくに培養皮膚において有用な、真菌および細菌などを含む微生物の検出方法が望まれていた。
【００１１】
管理環境中の空気中の微生物の検出方法としては、エアーサンプラーを用いて一定量の空気を吸引し、空気中の微生物を寒天培地に衝突させ、そののち該寒天培地を培養し、生育したコロニー数を測定する方法が知られている（非特許文献２および３）。しかしながら、目視でコロニーが確認できるようになるには、増殖速度が速い菌体でも少なくとも２日、増殖速度が遅い菌体においては４日以上の培養が必要である。また、酵母様真菌および細菌のコロニーの形は円状であることから、コロニーの形から両者を識別することは困難であり、菌の同定を行なう場合には、菌体からＤＮＡを抽出するなど、さらに時間を要するといった問題があった。そのほかにも、たとえば、一定量の空気を吸引する毎に寒天培地を交換する必要があるため、大量の寒天培地が必要となる点、寒天培地での培養期間は日本薬局方により５日以上と定められているため、寒天培地を培養するための場所が数日に渡って必要になる点、または菌体の検出を１日でも早く確認するために、培養期間中コロニーの有無を観察しなければならず、サンプルが多い場合はもちろん、寒天培地の観察に手間がかかるといった点などが問題となっている。
【００１２】
【特許文献１】
特開平８−８９２５４号公報
【非特許文献１】
社団法人日本空気清浄協会編、「クリーンルーム環境の施工と維持管理」、第１版、（株）オーム社、２０００年７月２０日、ｐ．６５〜７５
【非特許文献２】
日本薬局方解説書編集委員会編、「第１４改正　日本薬局方解説書」、東京廣川書店、平成１３年６月２７日、ｐ．Ｆ−１４０〜１６２
【非特許文献３】
佐藤健二ら編、「滅菌済み医療用具ＧＭＰ・バリデーション入門講座」、財団法人　医療機器センター、平成１４年２月２１日、ｐ．８７〜１０７
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来技術の問題点に鑑み、本発明は、迅速かつ高感度に微生物を検出する方法を提供することを目的とする。とくに、本発明は、組織または組織等価物の浸漬液などの液体に含まれる微生物を迅速かつ高感度に検出する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、気体に含まれる微生物を迅速かつ高感度に検出する方法を提供することも目的とする。すなわち、本発明は流体に含まれる微生物を迅速かつ高感度に検出する方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
微生物を迅速かつ高感度に検出する方法について研究を重ねた結果、組織または組織等価物の浸漬液などの液体の濾過膜による濾過、該濾過膜を用いる前培養およびＰＣＲを組み合わせることにより、液体に含まれる微生物が迅速かつ高感度に検出されることを見出した。さらに、液体だけでなく気体に含まれる微生物をも迅速かつ高感度に検出することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、微生物の検出方法であって、
（１）濾過膜を用いて流体を濾過する工程、
（２）濾過膜を液体培地に浸漬し、該濾過膜に捕捉された微生物を培養する工程、
（３）培養物を濃縮する工程、
（４）濃縮培養物から微生物のＤＮＡを抽出する工程、
（５）抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施する工程、および
（６）得られたＰＣＲ産物を検出する工程
を含む微生物の検出方法に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明をより詳細に説明する。
【００１７】
本明細書において、「濾過」とは、液体または気体を濾過膜などの多孔質の物質に通すことを意味する。
【００１８】
本明細書における用語「流体」は、液体または気体を意味する。
【００１９】
本明細書における用語「液体」は、微生物を含む可能性のある液体を意味し、たとえば、組織もしくは組織等価物の浸漬液、臓器の浸漬液または血液などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本明細書における用語「組織」は、生体から摘出された各種組織を意味する。組織の例としては、たとえば、皮膚、角膜、軟骨、脂肪組織、筋肉、血管、神経、羊膜、胎盤またはリンパ節などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本明細書における用語「組織等価物」は、生きた細胞を含有する構造物、または生きた細胞が生体適合性材料に組み込まれた構造物として定義される。組織等価物の例としては、たとえば、生細胞と生体高分子または生細胞のみからなる培養皮膚、培養角膜、培養軟骨、培養骨、培養腎臓、培養肝臓、培養網膜、培養神経、培養心臓または培養内耳などがあり、生きた細胞を含有する構造物である限りこれらに限定されるものではない。
【００２２】
前記培養皮膚には、培養表皮、培養真皮および複合培養皮膚などが含まれる。培養表皮とは、たとえば、ケラチノサイトなどの哺乳動物の表皮から得た表皮細胞を培養し増殖させることにより製造する表皮細胞シート、またはコラーゲン、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ラミニン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、フィブリン、ゼラチンなどの生体高分子材料、および／またはポリウレタン、ポリスチレン、ポリアクリレートなどの細胞接着性の良い非生分解性の合成高分子材料に表皮細胞を組み込んだ構造物である。培養真皮とは、たとえば、哺乳類の真皮から得た線維芽細胞を培養し増殖させ、コラーゲン、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ラミニン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、フィブリン、ゼラチンなどの生体高分子材料、および／または合成高分子であるポリウレタン、ポリスチレン、ポリアクリレートなどの細胞接着性の良い非生分解性の合成高分子材料に組み込んだ培養真皮シートである。複合培養皮膚とは、前記培養真皮状の構造物にさらに表皮細胞を組み込んだ生体の皮膚に近い構造物である。
【００２３】
前記培養角膜とは、たとえば、哺乳類の角膜から得られた角膜上皮細胞、実質細胞および／または内皮細胞を培養し増殖させることにより製造したシート状の構造物、またはコラーゲン、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ラミニン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、フィブリン、ゼラチンなどの生体高分子材料、および／または合成高分子であるポリウレタン、ポリスチレン、ポリアクリレートなどの細胞接着性の良い非生分解性の合成高分子材料に哺乳類の角膜から得た角膜上皮細胞、実質細胞および／または内皮細胞などを組み込んだ構造物である。
【００２４】
前記培養軟骨とは、周知の方法により製造される、細胞または細胞が基材に組み込まれた構造物からなる人工軟骨である。培養軟骨としては、たとえば、キトサン、コラーゲンおよび／またはリン酸カルシウムなどの生体適合性材料からなる三次元構造の担体に、軟骨細胞および／または間葉系幹細胞などを組み込むことにより製造された構造物を挙げることができる。
【００２５】
本明細書における用語「組織または組織等価物の浸漬液」は、（ｉ）患者から組織片を採取してから組織または組織等価物供給機関（たとえばメーカー）へ輸送される際に使用された液体、（ｉｉ）前記組織等価物の製造工程で使用された液体、または（ｉｉｉ）製造された組織等価物を保存するために使用された液体などを含む。
【００２６】
「患者から組織片を採取してから組織または組織等価物供給機関へ輸送される際に使用された液体」は、採取した組織片を目的地に輸送する間、該組織片を浸漬した液体である限りとくに限定されるものではない。「患者から組織片を採取してから組織または組織等価物供給機関へ輸送される際に使用された液体」としては、たとえば、哺乳動物から採取した皮膚を保存する際に用いた液体または皮膚を緩衝液でリンスした後に回収される液体などが含まれる。
【００２７】
「組織等価物の製造工程で使用された液体」は、組織等価物の製造中に組織等価物に対して添加され回収される液体であるかぎり、とくに限定されるものではない。「組織等価物の製造工程で使用された液体」は、たとえば、哺乳動物から採取した細胞を緩衝液でリンスした後に回収される液体である。さらに、組織等価物を構成する細胞を培養した後に得られる培養上清、細胞を分散させるためのトリプシン処理を実施した後に回収される液体および組織等価物の培養培地を交換する際に回収される液体などもまた、組織等価物の製造工程で使用された液体に含まれる。
【００２８】
「製造された組織等価物の保存のために使用された液体」は、完成から実際に適用されるまでの間に組織等価物に添加された後に回収される液体であるかぎり、とくに限定されない。
【００２９】
「組織または組織等価物の浸漬液」に使用し得るものの具体例としては、ダルベッコ改変イーグル基本培地（ＤＭＥＭ）、リン酸緩衝液、リンガー液、リンガー−ロック液、タイロード液、アール液、ハンクス液、ロック液、イーグルの最小必須培養液、ハム（Ｈａｍ）の合成培養液Ｆ１２、Ｇｒｅｅｎ培養液、レイボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）のＬ−１５培養液、ならびに無血清培養液ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＥ１５１、ＭＣＤＥ１０４、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ４０２、ＭＣＤＢ２０１、ＭＣＤＢ３０２、ＭＣＤＢ１０５およびＭＣＤＢ１１０などが挙げられる。また、組織等価物を製造後に凍結保存する場合には、前記の培養液または緩衝液に凍結保護剤を添加した凍結保存液を使用することができる。凍結保護剤としてはグリセロール、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、プロピレングリコール、エチレングリコール、蔗糖、カルボキシメチルセルロース塩、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および二糖類（トレハロース等）などを挙げることができ、これらの中から１種類以上選択して前記の培養液または緩衝液に添加することができる。
【００３０】
本明細書における用語「臓器」は、生体から摘出された各種臓器を意味する。臓器の例としては、たとえば、肝臓、すい臓、腎臓または心臓などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本明細書における用語「臓器の浸漬液」は、臓器移植などの際、摘出された臓器を病院間で輸送する場合に一時的に臓器を浸漬、保存するために使用された液体などを含む。
【００３２】
「臓器の浸漬液」に使用し得るものの具体例としては、ＤＭＥＭ、リン酸緩衝液、リンガー液、リンガー−ロック液、タイロード液、アール液、ハンクス液、ロック液、イーグルの最小必須培養液、ハムの合成培養液Ｆ１２、Ｇｒｅｅｎ培養液、レイボビッツのＬ−１５培養液、ならびに無血清培養液ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＥ１５１、ＭＣＤＥ１０４、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ４０２、ＭＣＤＢ２０１、ＭＣＤＢ３０２、ＭＣＤＢ１０５およびＭＣＤＢ１１０などが挙げられる。また、前記の培養液または緩衝液に凍結保護剤を添加した凍結保存液を使用することもできる。凍結保護剤としてはグリセロール、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、エチレングリコール、蔗糖、カルボキシメチルセルロース塩、ＣＭＣおよび二糖類（トレハロース等）などを挙げることができ、これらの中から１種類以上選択して前記の培養液または緩衝液に添加することができる。
【００３３】
さらに、細胞を除去していない採取された血液そのもの、および血液から細胞を除去した液体成分なども、本発明の微生物の検出方法を用いて微生物汚染を検出することができる。血液から細胞を除去した液体成分としては、血清または血漿などが挙げられる。血清は、たとえば、乾燥注射器を用いて採取した血液を放置し、血球といくつかの血液凝固因子（フィブリノーゲンまたはプロトロンビンなど）を含む血餅を血液から取り除くことによって得られる。血漿は、たとえば、採取された血液に血液凝固阻止剤を添加し、該血液を遠心することにより沈殿した血球を血液から取り除くことによって得られる。
【００３４】
本明細書における用語「気体」は、微生物を含む可能性のある気体を意味し、たとえば、少なくとも酸素を含む空気が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本明細書における用語「微生物」は、たとえば、組織もしくは組織等価物の使用前および使用中、または臓器を摘出する際においてその汚染の原因となる真菌および／または細菌などを含む。
【００３６】
真菌としては、たとえば、カンジダ属、ハンセヌラ属、サッカロマイセス属、トリコスポロン属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ブラストマイセス属、コクシジオイデス属、ニュウモシスチス属、マラセジア属またはデバリオマイセス属などに属する真菌が含まれる。さらに具体的に、そのような真菌には、たとえば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・クルゼイ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）またはニュウモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｉｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）が含まれる。
【００３７】
細菌としては、たとえば、バチルス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属、エシェリキア属またはスタフィロコッカス属などに属する細菌が含まれる。さらに具体的に、そのような細菌には、たとえば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・パイオジェン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ・チフムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ボンゴリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｂｏｎｇｏｒｉ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）またはスタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）およびシュードモナス・エルジノーザが含まれる。
【００３８】
本発明の検出方法では、検出結果の信頼性を高めるために、濾過対象が液体の場合には、液体全体をサンプルとして用いる。対象の液体をすべて濾過膜を用いて濾過することにより、該液体に含まれる微生物を捕捉する。濾過対象が気体である場合には、濾過膜をエアサンプラーに適用し、エアーサンプラーによって気体を吸引することにより、該気体に含まれる微生物を捕捉する。
【００３９】
本明細書において「エアサンプラー」とは、空気中の微生物を濾過膜に衝突させることによって微生物を捕捉し得る装置である限り、とくに限定されるものではない。たとえば、寒天培地を微生物が衝突するようにセットされたエアーサンプラーなどを使用することができる。寒天培地がセットされたエアーサンプラーを使用する場合には、該寒天培地に濾過膜を載せ、エアーサンプラーによって気体を吸引することにより、該気体に含まれる微生物を捕捉することができる。なお、寒天培地に濾過膜を載せると、濾過膜は湿った状態になる。乾燥状態の濾過膜を使用した場合、静電気の影響により微生物を濾過膜上に定量的に捕集できない可能性があるため、湿った状態の濾過膜を使用することが好ましい。
【００４０】
本発明において、濾過に使用する濾過膜としては、濾過膜の孔径が０．２μｍ〜０．４５μｍであることが好ましい。濾過膜の孔径が０．２μｍ未満の場合には、目的とする微生物以外の細胞屑などが濾過膜に残存し、濾過膜が目詰まりをおこす傾向がある。濾過膜の孔径が０．４５μｍより大きい場合には、目的とする微生物が濾過膜を通過してしまう傾向がある。濾過膜の目詰まりを防ぐために、さらに孔径の大きい濾過膜（たとえば、孔径８μｍ）を重ねてもよい。また、液体に細胞の残骸が多く含まれるなど、目詰まりをおこす可能性がある液体を濾過対象とする場合には、液体を分割し、それぞれを別の濾過膜で濾過することが好ましい。１つのサンプルを複数の濾過膜で濾過した場合、下記の培養工程においてそれら複数の濾過膜をまとめてもよいし、濾過工程以降はそれぞれ単独に本発明の方法を適用してもよい。
【００４１】
組織または組織等価物の浸漬液などの液体は、微生物の増殖を予防するために抗生物質を含む場合がある。そのような場合には、浸漬液を濾過した後の濾過膜に抗生物質が吸着され、続く培養工程に悪影響を与える。したがって、本発明の微生物の検出方法においては、組織または組織等価物の浸漬液などの液体を濾過した後、濾過膜をリンスすることが好ましい。濾過膜をリンスすることにより、濾過膜に吸着した抗生物質を洗い流すことができ、続く培養工程における微生物の増殖が阻害されないため、より確実に微生物を検出することができる。そのような濾過膜のリンスには、たとえばレシチン、ポリソルベート希釈液（ＬＰ希釈液）、ブドウ糖・ペプトン液体培地（ＧＰ液体培地）、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト液体培地（ＳＣＤ液体培地）、チオグリコール酸培地（ＴＧ培地）、サブロー・ブドウ糖培地、ブドウ糖・ペプトン培地（ＧＰ培地）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、リン酸緩衝食塩水液（ｐＨ７．２）、ペプトン・食塩緩衝液（ｐＨ７．０）、ならびに前記培地にまたは前記緩衝液にレシチンもしくはポリソルベートを添加した培地または緩衝液などを使用することができる。真菌を検出対象とする場合の濾過膜のリンスには、ＧＰ液体培地、ＳＣＤ液体培地、ポテト・デキストロース液体培地、サブロー・デキストロース液体培地、またはこれらの培地にレシチンもしくはポリソルベートを添加した培地などを使用することが好ましい。細菌を検出対象とする場合の濾過膜のリンスには、ＳＣＤ液体培地、ＴＧ培地、プレインハートインフュージョン液体培地、ニュートリエント液体培地、またはこれらの培地にレシチンもしくはポリソルベートを添加した培地などを使用することが好ましい。
【００４２】
本発明の微生物の検出方法において、濾過膜に捕捉された微生物は一定時間培養される。濾過膜に捕捉された微生物を培養することにより、流体に含まれる数個の微生物の検出が可能となる。
【００４３】
前記培養で使用する培養培地は、少なくとも組織等価物を生体材料として使用する際に問題となる真菌および／または細菌が増殖する培地であればとくに限定されず、当業者により適宜選択され得る。たとえば、真菌および細菌を検出対象とする場合は、ＳＣＤ培地またはＧＰ培地などの培地を用いることができる。真菌のみを検出対象とする場合はＧＰ液体培地、ＳＣＤ液体培地、サブロー・ブドウ糖液体培地、ポテト・デキストロース液体培地またはサブロー・デキストロース液体培地を用いることが好ましい。細菌のみを検出対象とする場合はＳＣＤ液体培地、ＴＧ液体培地、プレインハートインフュージョン液体培地またはニュートリエント液体培地を用いることが好ましい。
【００４４】
本発明の微生物の検出方法において、培養方法は振とう培養または撹拌培養であることが好ましい。
【００４５】
本発明の微生物の検出方法において、微生物の培養時間は５時間から２４時間が好ましく、１２時間から２４時間がより好ましい。細菌のみを検出対象とする場合は、培養時間を５時間から２４時間とすることが好ましい。真菌を検出の対象とする場合は、培養時間を８時間から２４時間とすることが好ましい。細菌の場合で５時間未満、真菌の場合で８時間未満の培養では、検出に充分な程度に微生物が増殖していない傾向がある。培養時間が２４時間を超える場合には、２４時間の培養と比較して検出感度が変わらない傾向がある。
【００４６】
本発明の微生物の検出方法において、微生物の培養温度は、たとえば２０〜３７℃とすることができる。また、細菌においては培養温度を３０〜３５℃とすることが好ましく、真菌においては培養温度を２０〜２５℃とするのが好ましい。しかしながら、培養温度はこれらに限定されるものではなく、検出対象の微生物に最適な培養温度は当業者により適宜設定され得る。
【００４７】
微生物の培養速度はそれぞれ異なり、真菌は細菌と比べて増殖速度が遅い傾向にある。したがって、培養物の一部を使用するのみでは、検出感度が充分とはいえない場合がある。したがって培養終了後は、増殖した微生物すべてを回収してつぎの工程で使用することが好ましいため、培養物を遠心などにより濃縮する。遠心により上清を除去し、沈殿した培養物からＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出法としては、たとえばトリトンＸ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤を用いるＤＮＡ抽出法など、あらゆる常法を適用することができる。抽出したＤＮＡは、フェノール処理やクロロホルム処理を行ない、ついでエタノール沈殿法またはイソプロパノール沈殿法を実施することにより精製してもよい。
【００４８】
本発明の微生物の検出方法におけるＰＣＲには、通常のＰＣＲ法を適用することができ、鋳型として前述の工程を経て抽出されたＤＮＡを、かつ目的の微生物のＤＮＡ配列を検出し得るプライマーを用いる限り、とくに限定されない。
【００４９】
ＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡの一本鎖への変性、一本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼによる相補性ＤＮＡの合成というサイクルの繰り返しである。アニーリング温度は、通常、プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）以下に設定する。Ｔｍを求める式は当業者に公知であり、たとえば以下の式によりＴｍを算出することができる（細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」▲３▼本当に増えるＰＣＲ、１３〜４３頁、１９９６年、（株）秀潤社発行）。
【００５０】
Ｔｍ（℃）＝４×（％ＧＣ）＋２×（％ＡＴ）−２ｎ
（％ＧＣ）：オリゴヌクレオチド中のＧＣ含量（％）
（％ＡＴ）：オリゴヌクレオチド中のＡＴ含量（％）
ｎ：オリゴヌクレオチドの長さ
【００５１】
本発明の微生物の検出方法において、ＰＣＲは、たとえば真菌と細菌とに分けて実施することができる。あるいは、１つのＰＣＲ用反応液中に２組以上のプライマー、たとえば目的の真菌に対するプライマーと目的の細菌に対するプライマーを同時に使用して、ＰＣＲを実施してもよい。
【００５２】
前記ＰＣＲに用いるプライマーの配列は、たとえば、真菌または細菌において保存されており、かつ特異的な遺伝子またはその一部を増幅し得る配列を選択して設計する。真菌または細菌において保存され、かつ特異的な遺伝子としては、ｒＲＮＡ遺伝子が好ましい。プライマーとして最も適当な配列は、一般的に入手可能なデータベース（たとえば、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ）またはＲＤＰ（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ））に基づく調査により適宜選択することができる。なお、ｒＲＮＡを増幅するプライマーとしては、以下の各組み合わせが知られている。
【００５３】
真菌を検出し得るプライマーは、１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子またはその一部の配列に基づいて設計することが好ましい。そのようなプライマーの組み合わせとしては、５’−ＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＧＧＡＴＡＧ−３’（配列番号１）からなるプライマーと５’−ＴＧＡＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＴＣＣＣＣＴＡ−３’（配列番号２）からなるプライマーとの組み合わせ、および配列番号２と５’−ＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴ−３’（配列番号３）との組み合わせが知られており（Ｋ．　Ｍａｋｉｍｕｒａ，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９４），　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　４０，　３５８−３６４）、本発明の検出方法に使用することができる。これらのプライマーにより、カンジダ属、サッカロマイセス属、アスペルギルス属およびハンセヌラ属などの臨床的に重要な感染症を引き起こす真菌を含む２５種７８菌株の１８Ｓ　ｒＲＮＡを増幅することができる。それぞれ配列番号１および配列番号２に示す塩基配列からなる二種類のプライマーをＰＣＲに用いた場合、そのＰＣＲ産物は約６８７ｂｐである。それぞれ配列番号２および配列番号３に示す塩基配列からなる二種類のプライマーをＰＣＲに用いた場合には、そのＰＣＲ産物は約６００ｂｐである。
【００５４】
細菌を検出し得るプライマーとしては、５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡ−３’（配列番号４）からなるプライマー（Ｔｓｕｇｕｏ　Ｓａｓａｋｉ，　ｅｔ　ａｌ．（１９９６），　ＰＤＡ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　＆　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　５１，　２４２−２４７）と５’−ＡＣＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号５）からなるプライマー（Ｋｕｉ　Ｃｈｅｎ，　ｅｔ　ａｌ．（１９８９），　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　５７，　１９−２４）との組み合わせ、および配列番号４からなるプライマーと５’−ＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号６）からなるプライマー（前掲Ｋｕｉ　Ｃｈｅｎ，　ｅｔ　ａｌ．）との組み合わせが知られており、本発明の検出方法に使用することができる。これらのプライマー配列は、少なくともバチルス・ズブチルス、ストレプトコッカス・パイオジェン、シュードモナス・エルジノーザ、サルモネラ・チフムリウム、サルモネラ・ボンゴリ、エシェリキア・コリおよびストレプトコッカス・エピダーミディスの間で１００％一致しており、約６７７ｂｐまたは約８７６ｂｐの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅することができる。このほか、細菌検出用のフォワードプライマーとしては５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号７）（Ｐ．Ａ．　Ｅｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　４１，　３２４（１９９１）；　Ｗ．　Ｇ．　Ｗｅｉｓｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７３，　６９７（１９９１）；および　Ｄ．　Ａ．　Ｒｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６，　１８０１（１９９２））、５’−ＴＣＡＡＡＫＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣ−３’（配列番号８）（ＫはｄＴまたはｄＧを示す。Ｄ．　Ａ．　Ｒｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．，　３２７，　２９３（１９９２）；および　Ｄ．　Ａ．　Ｒｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．，　３２３，　１５７３（１９９０））、５’−ＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴ−３’（配列番号９）（前掲Ｄ．　Ａ．　Ｒｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．，　３２３，　１５７３（１９９０）；およびＫ．　Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ．　４８，　１９（１９８９））などが知られており、細菌検出用のリバースプライマーとしては５’−ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’（配列番号１０）（前掲Ｄ．　Ａ．　Ｒｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．，　３２７，　２９３（１９９２）；およびＫ．　Ｈ．　Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２８，　１９４２（１９９０））５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号１１）（前掲Ｐ．Ａ．　Ｅｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，；　前掲Ｗ．　Ｇ．　Ｗｅｉｓｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ．；および前掲Ｄ．　Ａ．　Ｒｅｌｍａｎ　ｅｔａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６，　１８０１（１９９２））などが知られている。
【００５５】
細菌の前記プライマー配列と、細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子に相当するヒトの１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子配列との相同性は６０％以下と低く、適切なＰＣＲの条件を選択すればヒトの１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子断片が増幅されることはない。また、真菌の前記プライマーを用いた場合においても、適切なＰＣＲの条件を選択すればヒトの１８Ｓ　ｒＲＮＡの遺伝子断片が増幅されることはない。ＰＣＲの条件は当業者により適宜設定され得る。
【００５６】
本発明の微生物の検出方法において、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、当分野において一般的に実施されている方法により、検出することができる。ＰＣＲ産物の検出法としては、たとえば、アガロースゲルなどを用いる電気泳動、ＰＣＲ産物に対する標識プローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイ、またはＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ法などの本分野における公知の検出法を適用することができる。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）の塩基配列をＤＮＡシーケンサーで解析することにより、菌種の同定も可能であると考えられる。
【００５７】
ハイブリダイゼーションアッセイの場合には、ＰＣＲ産物またはその一部の配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドと検出可能な標識とからなる標識プローブを使用する。標識としては、当分野において通常使用されるあらゆる標識を利用することができ、たとえば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼもしくはベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの酵素類、蛍光色素またはラジオアイソトープを使用することができる。アルカリホスファターゼなどの酵素類を標識として使用する場合には、ＰＣＲ産物と標識プローブとをハイブリダイゼーションさせ、酵素とその基質（発色物質、蛍光物質または発光物質など）とを反応させ、ついで基質の発色、蛍光または発光などを検出することにより、ＰＣＲ産物を検出することができる。
【００５８】
ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ法の場合、たとえば、ＰＣＲ増幅の際にジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識した塩基を取り込ませ、ついでＤＩＧに対する抗体を用いるＥＬＩＳＡを行なうことにより、ＰＣＲ産物を検出することができる。
【００５９】
以上のようにしてＰＣＲ産物が検出された場合は、組織、組織等価物、臓器、血液または気体などが微生物に汚染されていることを意味する。
【００６０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６１】
【実施例】
以下に記載したＧＰ液体培地、ＬＰ希釈液およびＳＣＤ液体培地などの試薬ならびに試験管、マイクロチューブ、ピンセットなどの器具はすべて、事前にオートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。ジャンボコニカルチューブは、日本ベクトン・ディッキンソン（株）製、カタログ番号ＦＡＬＣＯＮ２０７５を用いた。酢酸カリウムに関しては、実施例１において、フルカ（Ｆｌｕｋａ）社製、カタログ番号６００３５、実施例２〜４において、和光純薬工業（株）製、カタログ番号１６６−０３５４５を用いた。イソプロパノールおよびエタノールは、それぞれ、和光純薬工業（株）製、カタログ番号１６６−０４８３６、および和光純薬工業（株）製、カタログ番号０５７−００４５６を用いた。ＴＥ（ｐＨ８．０）に関しては、実施例１において、ニッポンジーン（株）製、カタログ番号３１６−９００２５、実施例２〜４において、ニッポンジーン（株）製、カタログ番号００５７９Ｊを用いた。濾過膜に関しては、実施例１において、孔径０．２μｍの濾過膜（ザルトリウス（株）製、カタログ番号１３１０７−４７−ＡＣＮ）、実施例２〜４において、孔径０．２μｍの濾過膜（ポール（株）製、カタログ番号４８０３）、実施例５において、孔径０．４５μｍの濾過膜（ザルトリウス（株）製、カタログ番号１３１０６−４７−ＡＣＮ）、実施例６において、孔径０．４５μｍの濾過膜（ザルトリウス（株）製、カタログ番号１３１０６−４７−ＡＣＮ）および孔径０．２μｍの濾過膜（ポール（株）製、カタログ番号４８０３）、実施例７において孔径０．２２μｍの濾過膜（ミリポア（株）製、カタログ番号ＡＴＳＭＴＴＤ６０）を用いた。フィルターホルダーおよびマニホールドは、アドバンテック東洋（株）製、カタログ番号ＫＧＳ−４７ＴＦおよびアドバンテック東洋（株）製、型番ＫＭ−３を用いた。ディスポループ（ガンマー滅菌済み）は、アズワン製、カタログ番号ＧＩ−０４５７−０５を用いた。ミリフレックス（正式名：ツインヘッドＭｉｌｌｉｆｌｅｘ　センサーＩＩ吸引濾過）およびアダプター（正式名：ＭＦＰＰ　アダプター改良型）は、それぞれ、ミリポア（株）製、カタログ番号ＭＸＰＳ２００１５、およびポール（株）製、カタログ番号Ｙ−０７０５−２を用いた。エアーサンプラーとして、Ｍ　Ａｉｒ　Ｔミリポアテスター（ミリポア（株）製、カタログ番号ＡＴＡＳ　ＰＬＲ０１）を用い、微細孔サンプリングプレートは、ミリポア（株）製、カタログ番号ＡＴＡＨ　ＥＡＤ０１を用いた。ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰは、宝酒造（株）製、型名ＴＰ３０００を用い、ポラロイドカメラは、フナコシ（株）製、型番ＤＳ−３００（Ｍ）を用いた。ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎに関しては、実施例１および５において、ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ（×１００００）（宝酒造（株）製、コード番号Ｆ０５１３）、実施例２〜４および６において、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ（ＢＭＡ社製、カタログ番号５０５１３）を用いた。
【００６２】
実施例１
＜菌液の調製＞
（Ａ）　試験管１本に、ＧＰ液体培地（ブドウ糖、ペプトン液体培地（粉末）（日本製薬（株）製、カタログ番号３９７−００２２５）２８．５ｇ／超純水１ｌ）１０ｍｌを分注した。つぎに、該ＧＰ液体培地にカンジダ・アルビカンス（財団法人発酵研究所における受託番号ＩＦＯ　１５９４菌株）のコロニー１個を接種し、ピペッティングにより菌体を充分に分散させた。この菌液を、室温（約２５）℃で１８時間培養した。
【００６３】
（Ｂ）　試験管１０本に、ＧＰ液体培地を９ｍｌずつ分注した。ＧＰ液体培地を分注した試験管の１本に、マイクロピペットを用いて前記（Ａ）で調製した菌液１ｍｌを添加して混合し、１０倍希釈液を調製した。チップを交換し、以後同様にして、１０１０倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。以下、実施例１においては、１０６〜１０１０倍希釈菌液を使用した。
【００６４】
（Ｃ）　容量２２５ｍｌのジャンボコニカルチューブ６本それぞれに、ウシ胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｉｎｃ．）製）を３％含有するＧｒｅｅｎ培地（Ｇｒｅｅｎ＋３％ＦＢＳ）１５０ｍｌを入れ、さらに、ストレプトマイシン、ペニシリンおよびアンホテリシンＢからなる抗生物質（ライフテックオリエンタル（株）製、カタログ番号１５２４０−０９６、最終濃度：ストレプトマイシン　１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン　１００単位／ｍｌ、アンホテリシンＢ　０．２５μｇ／ｍｌ）１．５ｍｌを各チューブに添加し、混合した。ついで、前記（Ｂ）で調製した１０６〜１０１０倍希釈菌液をそれぞれ１．０ｍｌずつ添加し、混合した。なお、希釈菌液のかわりにＧＰ液体培地１．０ｍｌを添加したものを、ネガティブコントロールとした。
【００６５】
＜菌液の濾過＞
孔径０．２μｍの濾過膜をフィルターホルダーにセットし、ついでフィルターホルダーをマニホールドにセットした。つぎに、５０ｍｌピペットを用いて前記（Ｃ）で調製したサンプル５０ｍｌをファネルに入れ、すべて吸引濾過した。吸引濾過をさらに２回繰り返し、サンプルのすべてを吸引濾過した。
【００６６】
＜濾過膜のリンス＞
ＬＰ希釈液（ＬＰ希釈液「ダイゴ」（日本製薬（株）製、カタログ番号３９７−００２８１）２本／超純水２ｌ、最終濃度：ポリペプトン　１ｇ／ｌ、レシチン　０．７ｇ／ｌ、ポリソルベート８０　２０ｇ／ｌ、ｐＨ７．０〜７．４）５０ｍｌをファネルに添加し、ついで吸引濾過することにより、ファネルの内壁をリンスした。同様のリンスをさらに２回繰り返した。
【００６７】
＜濾過膜に捕捉された菌体の培養＞
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、３０ｍｌのＧＰ液体培地を入れた５０ｍｌ遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで室温（２５℃）で一晩（１５〜２０時間）、振とう培養を実施した。
【００６８】
＜菌体の回収＞
一晩培養した後、ピンセットによりＧＰ液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。ＧＰ液体培地を遠心し（２０００ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。沈殿を１．０ｍｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。マイクロチューブを４℃で遠心し（１５０００ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。
【００６９】
＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞
各マイクロチューブに溶解液（１００ｍＭ　トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．５％（重量／容量）ＳＤＳ）を１００μｌずつ添加し、菌体を懸濁した。ボルテックスミキサーにより菌体を５秒間撹拌し、ついで、１００℃で１５分間インキュベーションした。各マイクロチューブに２．５Ｍの酢酸カリウム溶液１００μｌを添加、混合したのち、氷上で６０分間インキュベーションした。各マイクロチューブを４℃で遠心し（１２０００ｒｐｍ、５分間）、上清を新しいマイクロチューブに移した。上清と同量のイソプロパノールを添加し、ＤＮＡの沈殿物を得た。各マイクロチューブを遠心し（１５０００ｒｐｍ、１０分間）、静かに上清を除去した。ついで、９９％エタノール０．５ｍｌを添加し、混合したのち、４℃で遠心して（１５０００ｒｐｍ、１０分間）上清を除去した。沈殿物に７０％エタノール０．５ｍｌを添加し、混合したのち、さらに４℃で遠心して（１５０００ｒｐｍ、１０分間）上清を除去した。沈殿物をペーパータオル上で軽く乾燥させたのち、５０μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）を添加し、ＤＮＡを溶解した。
【００７０】
＜ＰＣＲ＞
反応混合液５０μｌを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに調製し、氷上で保持した。反応混合液の組成は、５μｌの（１０×）ＰＣＲ緩衝液（Ｔａｑポリメラーゼの付属品）、４μｌのｄＮＴＰ混合液（Ｔａｑポリメラーゼの付属品）、プライマー各０．３μＭ、２．５μｌの鋳型ＤＮＡ、０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）（宝酒造（株）製、カタログ番号Ｒ００１Ａ）および超純水である。プライマーとしては、配列番号１および配列番号２に示す配列を有する２種のプライマーを用いた。また、鋳型ＤＮＡとしては、実施例１の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製されたカンジダ・アルビカンス　ＩＦＯ　１５９４菌株のＤＮＡを用いた。なお、本実施例で用いたｄＮＴＰ混合液は、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰを各２．５ｍＭ含有する溶液である。
【００７１】
ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰに各ＰＣＲチューブをセットし、つぎのプログラムでＰＣＲを実施した。本実施例において、ＰＣＲは、９５℃で５分間インキュベーションし、ついで９５℃で４５秒間、５５℃で１分間および７２℃で２分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行ない、さらに７２℃で１０分間インキュベーションすることで実施した。アニーリング温度は、前述の式により算出したプライマーの融解温度を参考にして設定した。
【００７２】
＜アガロース電気泳動＞
泳動バッファー（１×ＴＡＥ）を、つぎのようにして調製した。９．６ｇのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．４８ｇのＥＤＴＡおよび２．２８ｍｌの酢酸を超純水１９００ｍｌに溶解した。１ＮのＮａＯＨで溶液をｐＨ８．１に調整したのち、さらに超純水を加えて２０００ｍｌとした。
【００７３】
前記ＰＣＲ産物５０μｌに１０μｌのローディングバッファー（ブロモフェノールブルー０．２５％（重量／容量）、グリセロール２５％（容量／容量）、超純水）を加えて混合した。ついで、これらのサンプル２０μｌをアガロースゲル（アガロースＳ（ニッポンジーン（株）製、カタログ番号３１２−０１１９３）１．２ｇ／１×ＴＡＥ　１００ｍｌ）にローディングし、１００Ｖで２５分間、電気泳動を実施した。
【００７４】
＜ＰＣＲ産物の染色＞
１００ｍｌの１×ＴＡＥにＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ（×１００００）を１０μｌ加え、染色液を調製した。電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で２時間静置させた。ついで、アガロースゲルにＵＶ（λ＝２５４ｎｍ）を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。
【００７５】
ＰＣＲ産物の染色の結果、１０６倍希釈菌液および１０７倍希釈菌液からカンジダ・アルビカンス　ＩＦＯ　１５９４菌株のＤＮＡが検出された。以下の試験例に記載のように、１０７倍希釈菌液中の生菌数は１個であった。
【００７６】
試験例１
実施例１の菌液の調製（Ｂ）において調製した希釈菌液中の生菌数を、以下の混釈法により測定した。すなわち、前記１０５〜１０１０倍希釈菌液１ｍｌを直径９０ｍｍシャーレに分注した（ｎ＝２）。各シャーレに、オートクレーブ後４５℃に保持していたサブロー・ブドウ糖寒天培地（サブロー・ブドウ糖寒天培地（粉末）（日本製薬（株）製、カタログ番号３９０−０１０１１）３２．５ｇ／超純水５００ｍｌ）を１５ｍｌずつ分注して、穏かに撹拌し、寒天が固化するまで静置した。寒天が固化したのち、各シャーレを倒置して２５℃のインキュベータ内で培養した。培養から４日後および５日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。
【００７７】
測定の結果、１０７倍希釈菌液に含まれるカンジダ・アルビカンス　ＩＦＯ　１５９４菌株は１個であった。
【００７８】
実施例２
＜菌液の調製＞
（Ａ）　カンジダ・アルビカンス　ＩＦＯ　１５９４菌株のコロニー１個を採取し、サブロー・ブドウ糖寒天培地（試験例１と同様に作製）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。
【００７９】
（Ｂ）　試験管１０本に、ＧＰ液体培地を９ｍｌずつ分注した。ＧＰ液体培地を分注した試験管の１本に、前記（Ａ）で培養したコロニーをディスポループ２ループ分を接種し、１０ｍｌピペットで菌を懸濁して１０倍希釈液を調製した。得られた菌液１ｍｌを、ＧＰ液体培地を分注した試験管の１本にマイクロピペットを用いて添加して混合し、１０２倍希釈液を調製した。チップを交換し、以後同様にして、１０８倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。以下、実施例２においては１０５〜１０８倍希釈菌液を使用した。
【００８０】
（Ｃ）　容量２２５ｍｌのジャンボコニカルチューブ１本に、１８０ｍｌのＧＰ培地を入れ、さらに、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（インビトロジェン（株）製、カタログ番号１５７５０−０６０）および２５０μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（インビトロジェン（株）製、カタログ番号１５２９０―０１８）をそれぞれ９００μｌを添加し、混合した。
【００８１】
＜菌液の濾過＞
ミリフレックスにアダプターをセットし、ついで孔径０．２μｍの濾過膜を装着したファネルをアダプターにセットした。つぎに、２５ｍｌピペットを用いて前記（Ｃ）で調製したＧＰ液体培地３０ｍｌおよび（Ｂ）で調製した１０５倍希釈菌液１．０ｍｌをそれぞれファネルに入れて混合し、吸引濾過した。１０６〜１０８倍希釈菌液についても、同様に操作を行なった。なお、希釈菌液のかわりにＧＰ液体培地を１．０ｍｌ添加したものを、ネガティブコントロールとした。
【００８２】
＜濾過膜のリンス＞
ＬＰ希釈液（実施例１と同様に作製）５０ｍｌをファネルに添加し、ついで吸引濾過することにより、ファネルの内壁をリンスした。同様のリンスをさらに２回繰り返した。
【００８３】
＜濾過膜に捕捉された菌体の培養＞
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、２５ｍｌのＧＰ液体培地を入れた５０ｍｌ遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで室温（２５℃）で２０時間、振とう培養を実施した。
【００８４】
＜菌体の回収＞
培養後、ピンセットによりＧＰ液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。ＧＰ液体培地を遠心し（１３１０ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。沈殿を１．０ｍｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。マイクロチューブを４℃で遠心し（１６１００ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。
【００８５】
＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞
ＰＣＲ用の鋳型の調製は、実施例１の＜菌体の回収＞において回収された菌体の代わりに、実施例２の＜菌体の回収＞において回収された菌体を使用するほかは、実施例１の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞と同様に行なった。
【００８６】
＜ＰＣＲ＞
ＰＣＲは、実施例１の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製された鋳型ＤＮＡの代わりに、実施例２の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製された鋳型ＤＮＡを使用するほかは、実施例１の＜ＰＣＲ＞と同様の条件で行なった。
【００８７】
＜アガロース電気泳動＞
アガロース電気泳動は、実施例１の＜ＰＣＲ＞において増幅されたＰＣＲ産物の代わりに、実施例２の＜ＰＣＲ＞において増幅されたＰＣＲ産物を使用するほかは、実施例１の＜アガロース電気泳動＞と同様に行なった。
【００８８】
＜ＰＣＲ産物の染色＞
１００ｍｌの１×ＴＡＥにＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを１０μｌ加え、染色液を調製した。電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で２時間静置させた。ついで、アガロースゲルにＵＶ（λ＝２５４ｎｍ）を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。
【００８９】
ＰＣＲ産物の染色の結果、１０５倍、１０６倍および１０７倍希釈菌液からカンジダ・アルビカンス　ＩＦＯ　１５９４菌株のＤＮＡが検出された。
【００９０】
試験例２
実施例２の菌液の調製（Ｂ）において調製した希釈菌液中の生菌数を、以下の混釈法により測定した。すなわち、前記１０５〜１０８倍希釈菌液１ｍｌを直径９０ｍｍシャーレに分注した（１０５倍、１０６倍および１０８倍希釈菌液に関してはｎ＝２、１０７倍希釈菌液に関してはｎ＝４）。各シャーレに、オートクレーブ後５０℃に保持していたサブロー・ブドウ糖寒天培地（実施例１と同様に作製）を１４ｍｌずつ分注して、穏かに撹拌し、寒天が固化するまで静置した。寒天が固化したのち、各シャーレを倒置して２５℃のインキュベータ内で培養した。培養から４日後および５日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。
【００９１】
測定の結果、１０５倍、１０６倍および１０７倍希釈菌液に含まれる生菌数は、それぞれ、１１１個、９．５個および２．５個であった。
【００９２】
実施例３
＜菌液の調製＞
（Ａ）　サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）における受託番号ＡＴＣＣ　９７６３菌株）のコロニー１個を採取し、サブロー・ブドウ糖寒天培地（試験例１と同様に作製）に塗抹し、３２℃で２４時間培養した。
【００９３】
（Ｂ）　試験管１０本に、ＧＰ液体培地を９ｍｌずつ分注した。ＧＰ液体培地を分注した試験管の１本に、前記（Ａ）で培養したコロニーをディスポループ２ループ分を接種し、１０ｍｌピペットで菌を懸濁して１０倍希釈液を調製した。得られた菌液１ｍｌを、ＧＰ液体培地を分注した試験管の１本にマイクロピペットを用いて添加して混合し、１０２倍希釈液を調製した。チップを交換し、以後同様にして、１０８倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。以下、実施例３においては１０４〜１０８倍希釈菌液を使用した。
【００９４】
（Ｃ）　容量２２５ｍｌのジャンボコニカルチューブ１本に、１８０ｍｌのＧＰ培地を入れ、さらに、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（インビトロジェン（株）製、カタログ番号１５７５０−０６０）および２５０μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（インビトロジェン（株）製、カタログ番号１５２９０―０１８）をそれぞれ９００μｌを添加し、混合した。
【００９５】
＜菌液の濾過＞
ミリフレックスにアダプターをセットし、ついで孔径０．２μｍの濾過膜を装着したファネルをアダプターにセットした。つぎに、２５ｍｌピペットを用いて前記（Ｃ）で調製したＧＰ液体培地３０ｍｌおよび（Ｂ）で調製した１０４倍希釈菌液１．０ｍｌをそれぞれファネルに入れて混合し、すべて吸引濾過した。１０５〜１０８倍希釈菌液についても、同様に操作を行なった。なお、希釈菌液のかわりにＧＰ液体培地を１．０ｍｌ添加したものを、ネガティブコントロールとした。
【００９６】
＜濾過膜のリンス＞
ポリソルベート加洗浄液「ダイゴ」（日本製薬（株）製、カタログ番号３９５−０１５６１）約１００ｍｌをデカンテーションでファネルに添加し、ついで吸引濾過することにより、ファネルの内壁をリンスした。同様の操作をさらに２回繰り返し、合計３００ｍｌの洗浄液で濾過膜をリンスした。
【００９７】
＜濾過膜に捕捉された菌体の培養＞
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、３０ｍｌのＧＰ液体培地を入れた５０ｍｌ遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで室温（２５℃）で２０時間、振とう培養を実施した。
【００９８】
＜菌体の回収＞
培養後、ピンセットによりＧＰ液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。ＧＰ液体培地を遠心し（２０００ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。沈殿を１．０ｍｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。マイクロチューブを４℃で遠心し（１５０００ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。
【００９９】
＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞
ＰＣＲ用の鋳型の調製は、実施例１の＜菌体の回収＞において回収された菌体の代わりに、実施例３の＜菌体の回収＞において回収された菌体を使用するほかは、実施例１の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞と同様に行なった。
【０１００】
＜ＰＣＲ＞
ＰＣＲは、実施例１の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製された鋳型ＤＮＡの代わりに、実施例３の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製された鋳型ＤＮＡを使用するほかは、実施例１の＜ＰＣＲ＞と同様の条件で行なった。
【０１０１】
＜アガロース電気泳動＞
アガロース電気泳動は、実施例１の＜ＰＣＲ＞において増幅されたＰＣＲ産物の代わりに、実施例３の＜ＰＣＲ＞において増幅されたＰＣＲ産物を使用するほかは、実施例１の＜アガロース電気泳動＞と同様に行なった。
【０１０２】
＜ＰＣＲ産物の染色＞
１００ｍｌの１×ＴＡＥにＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを１０μｌ加え、染色液を調製した。電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で２時間静置させた。ついで、アガロースゲルにＵＶ（λ＝２５４ｎｍ）を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。
【０１０３】
ＰＣＲ産物の染色の結果、１０４倍、１０５倍、１０６倍および１０７倍希釈菌液からサッカロマイセス・セレビシエ　ＡＴＣＣ　９７６３菌株のＤＮＡが検出された。１０８倍希釈菌液からはサッカロマイセス・セレビシエ　ＡＴＣＣ　９７６３菌株のＤＮＡは検出されなかった。
【０１０４】
試験例３
実施例３の菌液の調製（Ｂ）において調製した希釈菌液中の生菌数を、以下の混釈法により測定した。すなわち、前記１０４〜１０８倍希釈菌液１ｍｌを直径９０ｍｍシャーレに分注した（ｎ＝３）。各シャーレに、オートクレーブ後５０℃に保持していたサブロー・ブドウ糖寒天培地（実施例１と同様に作製）を１４ｍｌずつ分注して、穏かに撹拌し、寒天が固化するまで静置した。寒天が固化したのち、各シャーレを倒置して３２．５℃のインキュベータ内で培養した。培養から４日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。
【０１０５】
測定の結果、１０４倍、１０５倍、１０６倍および１０７倍希釈菌液に含まれる生菌数は、それぞれ、１００個以上、４２．３個、２．３個および０．３個であった。１０８倍希釈菌液に関しては、コロニーは検出されなかった。
【０１０６】
実施例４
＜菌液の調製＞
（Ａ）　試験管１本に、ＧＰ液体培地（実施例１と同様に作製）１０ｍｌを分注した。つぎに、該ＧＰ液体培地にアスペルギルス・フミガタス（財団法人発酵研究所における受託番号ＩＦＯ　３３０２２菌株）の胞子および菌子をディスポループ１ループ分を接種し、ＧＰ液体培地に懸濁した。この菌液を、２５℃で２０時間培養した。
【０１０７】
（Ｂ）　試験管５本に、ＧＰ液体培地を９ｍｌずつ分注した。ＧＰ液体培地を分注した試験管の１本に、５ｍｌピペットを用いて前記（Ａ）で調製した菌液１ｍｌを添加して混合し、１０倍希釈液を調製した。ピペットを交換し、以後同様にして、１０３倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。以下、実施例４においては前記（Ａ）で調製した菌液（原液）〜１０３倍希釈菌液を使用した。
【０１０８】
＜菌液の濾過＞
ミリフレックスにアダプターをセットし、ついで孔径０．２μｍの濾過膜を装着したファネルをアダプターにセットした。つぎに、２５ｍｌピペットを用いてＧＰ液体培地３０ｍｌおよび（Ｂ）で調製した菌液（原液）１．０ｍｌをそれぞれファネルに入れて混合し、すべて吸引濾過した。１０１〜１０３倍希釈菌液についても、同様に操作を行なった。なお、希釈菌液のかわりにＧＰ液体培地を１．０ｍｌ添加したものを、ネガティブコントロールとした。
【０１０９】
＜濾過膜のリンス＞
実施例４においては抗生物質を使用しなかったので、ファネルの内壁をリンスしなかった。
【０１１０】
＜濾過膜に捕捉された菌体の培養＞
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、３０ｍｌのＧＰ液体培地を入れた５０ｍｌ遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで２７℃で２０時間、振とう培養を実施した。
【０１１１】
＜菌体の回収＞
培養後、ピンセットによりＧＰ液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。ＧＰ液体培地を遠心し（１３１０ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。沈殿を１．０ｍｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。マイクロチューブを４℃で遠心し（１６１００ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。
【０１１２】
＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞
ＰＣＲ用の鋳型の調製は、実施例１の＜菌体の回収＞において回収された菌体の代わりに、実施例４の＜菌体の回収＞において回収された菌体を使用するほかは、実施例１の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞と同様に行なった。
【０１１３】
＜ＰＣＲ＞
ＰＣＲは、実施例１の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製された鋳型ＤＮＡの代わりに、実施例４の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製された鋳型ＤＮＡを使用するほかは、実施例１の＜ＰＣＲ＞と同様の条件で行なった。
【０１１４】
＜アガロース電気泳動＞
アガロース電気泳動は、実施例１の＜ＰＣＲ＞において増幅されたＰＣＲ産物の代わりに、実施例４の＜ＰＣＲ＞において増幅されたＰＣＲ産物を使用するほかは、実施例１の＜アガロース電気泳動＞と同様に行なった。
【０１１５】
＜ＰＣＲ産物の染色＞
１００ｍｌの１×ＴＡＥにＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを１０μｌ加え、染色液を調製した。電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で２時間静置させた。ついで、アガロースゲルにＵＶ（λ＝２５４ｎｍ）を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。
【０１１６】
ＰＣＲ産物の染色の結果、１倍、１０倍、１０２倍および１０３倍希釈菌液からアスペルギルス・フミガタス　ＩＦＯ　３３０２２菌株のＤＮＡが検出された。
【０１１７】
試験例４
アスペルギルス・フミガタス　ＩＦＯ　３３０２２菌株は菌糸をもち胞子を形成するカビであるため、菌体の希釈菌液の検出感度をコロニー数（ｃｆｕ）で示すことができない。そこで、アスペルギルス・フミガタス　ＩＦＯ　３３０２２菌株の希釈菌液の検出感度をコロニー数（ｃｆｕ）で示すのではなく、ＤＮＡ量で表示した。すなわち、１倍、１０倍、１０２倍および１０３倍希釈菌液のＰＣＲ用鋳型（ＤＮＡ）を抽出し（実施例１と同様）この鋳型８μｌをマイクロチューブに入れ、ＴＥ７２μｌと混合して１０倍希釈した。ＴＥを対象として、この鋳型の２６０ｎｍの吸光度をＵＶ可視分光光度計（ベックマンコールター製、型番ＤＵ６４０）を用いて測定した。ＤＮＡ量を求める式は当業者に公知であり、例えば以下の式によりＤＮＡ量を算出することができる（細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」▲１▼分子生物学の基礎、６１〜６２頁、１９９５年、（株）秀潤社発行）。
【０１１８】
２本鎖ＤＮＡ（μｇ／μｌ）＝（２６０ｎｍ吸光度）×０．０５×希釈倍率
【０１１９】
２６０ｎｍの吸光度の測定の結果、１倍、１０倍、１０２倍および１０３倍希釈菌液に含まれるアスペルギルス・フミガタス　ＩＦＯ　３３０２２菌株のＤＮＡ量はそれぞれ０．９μｇ、０．６７μｇ、６８．３ｎｇおよび４．２５ｎｇであった。このことから、アスペルギルス・フミガタス　ＩＦＯ　３３０２２菌株のＤＮＡ量が４．２５ｎｇあれば、同様の方法で検出できることが明らかとなった。
【０１２０】
実施例５
＜菌液の調製＞
（Ｄ）　試験管１本に、ＳＣＤ液体培地（ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト粉末培地（日本製薬（株）製、カタログ番号３９６−００９９１）８．５ｇ／超純水５００ｍｌ）１０ｍｌを分注した。つぎに、該ＳＣＤ液体培地にバチルス・ズブチルス（財団法人発酵研究所における受託番号ＩＦＯ　３１３４）のコロニー１個を接種し、ピペッティングにより菌体を充分に分散させた。
【０１２１】
（Ｅ）　試験管１０本に、ＳＣＤ液体培地を９ｍｌずつ分注した。ＳＣＤ液体培地を分注した試験管の１本に、マイクロピペットを用いて前記（Ｄ）で調製した菌液１ｍｌを添加して混合し、１０倍希釈液を調製した。チップを交換し、以後同様にして、１０８倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。以下、実施例５においては、１０５〜１０８倍希釈菌液を使用した。
【０１２２】
（Ｆ）　容量２２５ｍｌのジャンボコニカルチューブ８本それぞれに、１５０ｍｌのＧｒｅｅｎ＋３％ＦＢＳを入れ、さらに、ゲンタマイシン（インビトロジェン（株）製のカタログ番号１５７５０−０６０）およびアンホテリシンＢ（商品名「ファンギゾン」、インビトロジェン（株）製、カタログ番号１５２９０−０１８）をそれぞれ５０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した。ついで、前記（Ｅ）で調製した１０５〜１０８倍希釈菌液をそれぞれ１．０ｍｌずつ添加し、混合した。なお、希釈菌液のかわりにＳＣＤ液体培地１．０ｍｌを添加したものを、ネガティブコントロールとした。
【０１２３】
＜菌液の濾過＞
孔径０．４５μｍの濾過膜をフィルターホルダーにセットし、ついでフィルターホルダーをマニホールドにセットした。つぎに、５０ｍｌピペットを用いて前記（Ｆ）で調製したサンプル５０ｍｌをファネルに入れ、すべて吸引濾過した。吸引濾過をさらに２回繰り返し、サンプルのすべてを吸引濾過した。
【０１２４】
＜濾過膜のリンス＞
ＬＰ希釈液（実施例１と同様に作製）５０ｍｌをファネルに添加し、ついで吸引濾過することにより、ファネルの内壁をリンスした。同様のリンスをさらに２回繰り返した。
【０１２５】
＜濾過膜に捕捉された菌体の培養＞
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、３０ｍｌのＳＣＤ液体培地を入れた５０ｍｌ遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで３５℃で一晩（１２〜１８時間）、振とう培養を実施した。
【０１２６】
＜菌体の回収＞
一晩培養した後、ピンセットによりＳＣＤ液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。ＳＣＤ液体培地を遠心し（２０００ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。沈殿を１．０ｍｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。マイクロチューブを４℃で遠心し（１５０００ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。
【０１２７】
＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞
各マイクロチューブの懸濁液０．５ｍｌを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、４℃で遠心した（１５０００ｇ、１０分間）。遠心後、上清を除去し、沈殿をトリトンＸ−１００を含むＴＥ（１０ｍＭ　トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．０％（重量／容量）トリトンＸ−１００）５０μｌに懸濁した。ついで、各サンプルを１００℃で２０分間処理し、氷上に静置した。
【０１２８】
＜ＰＣＲ＞
反応混合液５０μｌを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに調製し、氷上で保持した。プライマーとしては、配列番号４および配列番号５に示す配列を有する２種のプライマーを用いた。また、鋳型ＤＮＡとしては、実施例５の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製されたバチルス・ズブチルス　ＩＦＯ　３１３４のＤＮＡを用いた。反応混合液の組成は、プライマー各０．５μＭおよび２．０μｌの鋳型ＤＮＡを用いたほかは実施例１の反応混合液と同様の組成である。
【０１２９】
ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰに各ＰＣＲチューブをセットし、つぎのプログラムでＰＣＲを実施した。本実施例において、ＰＣＲは、９４℃で２分間インキュベーションし、ついで９４℃で１分間、６１℃で１分間および７２℃で１分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行ない、さらに７２℃で１分間インキュベーションすることで実施した。アニーリング温度は、前述の式により算出したプライマーの融解温度を参考にして設定した。
【０１３０】
＜アガロース電気泳動＞
前記ＰＣＲ産物５０μｌに１０μｌのローディングバッファーを加えて混合した。ついで、これらのサンプル１５μｌをアガロースゲル（アガロースＳ　２．９ｇ／１×ＴＡＥ　１００ｍｌ）にローディングし、１００Ｖで３０分間、電気泳動を実施した。
【０１３１】
＜ＰＣＲ産物の染色＞
１００ｍｌの１×ＴＡＥにＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ（×１００００）を１０μｌ加えて混合し、染色液を調製した。電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で２時間静置させた。ついで、アガロースゲルにＵＶ（λ＝２５４ｎｍ）を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。
【０１３２】
ＰＣＲ産物の染色の結果、１０５〜１０８倍希釈菌液すべてからバチルス・ズブチルス　ＩＦＯ　３１３４のＤＮＡが検出された。以下の試験例５に記載のように、１０６倍、１０７倍、および１０８倍希釈菌液に含まれるバチルス・ズブチルスは、それぞれ３０個、４個および０．５個であった。
【０１３３】
試験例５
実施例５の菌液の調製（Ｅ）において調製した希釈菌液中の生菌数を、以下の混釈法により測定した。すなわち、前記１０５〜１０８倍希釈菌液１ｍｌを直径９０ｍｍシャーレに分注した（ｎ＝２）。各シャーレに、オートクレーブ後４５℃に保持していたＳＣＤ寒天培地（ＳＣＤ寒天培地（日本製薬（株）製、カタログ番号３９６−００９９１）８．０ｇ／超純水２００ｍｌ）を１５ｍｌずつ分注して、穏かに撹拌し、寒天が固化するまで静置した。寒天が固化したのち、各シャーレを倒置して３５℃のインキュベータ内で培養した。培養から４日後および５日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。
【０１３４】
測定の結果、１０５倍、１０６倍、１０７倍、および１０８倍希釈菌液に含まれるバチルス・ズブチルス　ＩＦＯ　３１３４は、それぞれ２００個、３０個、４個および０．５個であった。
【０１３５】
実施例６
＜菌液の調製＞
（Ｄ）　シュードモナス・エルジノーザ（財団法人発酵研究所における受託番号ＩＦＯ　１３２７５菌株）のコロニー１個を採取し、ＳＣＤ寒天培地（試験例５と同様に作製）に塗抹し、３２．５℃で２４時間培養した。
【０１３６】
（Ｅ）　試験管１１本に、ＳＣＤ液体培地（実施例５と同様に作製）を９ｍｌずつ分注した。ＳＣＤ液体培地を分注した試験管の１本に、前記（Ｄ）で培養したコロニーをディスポループ２ループ分を接種し、１０ｍｌピペットで菌を懸濁した。得られた菌液１ｍｌを、ＳＣＤ液体培地を分注した試験管の１本にマイクロピペットを用いて添加して混合し、１０倍希釈液を調製した。チップを交換し、以後同様にして、１０１０倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。以下、実施例６においては、１０６〜１０１０倍希釈菌液を使用した。
【０１３７】
（Ｆ）　容量２２５ｍｌのジャンボコニカルチューブ６本それぞれに、１５０ｍｌのＳＣＤ液体培地を入れ、さらに、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（インビトロジェン（株）製、カタログ番号１５７５０−０６０）および２５０μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（インビトロジェン（株）製、カタログ番号１５２９０―０１８）をそれぞれ１５０μｌを添加し、混合した。ついで、前記（Ｅ）で調製した１０６〜１０１０倍希釈菌液をそれぞれ１．０ｍｌずつ添加し、混合した。なお、希釈菌液のかわりにＳＣＤ液体培地１．０ｍｌを添加したものを、ネガティブコントロールとした。
【０１３８】
＜菌液の濾過＞
孔径０．４５μｍの濾過膜をフィルターホルダーにセットし、ついでフィルターホルダーをマニホールドにセットした。つぎに、５０ｍｌピペットを用いて前記（Ｆ）で調製したサンプル５０ｍｌをファネルに入れ、すべて吸引濾過した。吸引濾過をさらに２回繰り返し、サンプルのすべてを吸引濾過した。
【０１３９】
＜濾過膜のリンス＞
ＬＰ希釈液（実施例１と同様に作製）５０ｍｌをファネルに添加し、ついで吸引濾過することにより、ファネルの内壁をリンスした。同様のリンスをさらに２回繰り返した。
【０１４０】
＜濾過膜に捕捉された菌体の培養＞
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、３０ｍｌのＳＣＤ液体培地を入れた５０ｍｌ遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで３５℃で１９時間、振とう培養を実施した。
【０１４１】
＜菌体の回収＞
培養後、ピンセットによりＳＣＤ液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。ＳＣＤ液体培地を遠心し（１３１０ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。沈殿を１．０ｍｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。マイクロチューブを４℃で遠心し（１６１００ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。
【０１４２】
＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞
ＰＣＲ用の鋳型の調製は、実施例５の＜菌体の回収＞において回収された菌体の代わりに、実施例６の＜菌体の回収＞において回収された菌体を使用するほかは、実施例５の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞と同様に行なった。
【０１４３】
＜ＰＣＲ＞
ＰＣＲは、実施例５の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製された鋳型ＤＮＡの代わりに、実施例６の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製された鋳型ＤＮＡを使用するほかは、実施例５の＜ＰＣＲ＞と同様に行なった。
【０１４４】
＜アガロース電気泳動＞
アガロース電気泳動は、実施例５の＜ＰＣＲ＞において増幅されたＰＣＲ産物の代わりに、実施例６の＜ＰＣＲ＞において増幅されたＰＣＲ産物を使用するほかは、実施例５の＜アガロース電気泳動＞と同様に行なった。
【０１４５】
＜ＰＣＲ産物の染色＞
１００ｍｌの１×ＴＡＥにＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを１０μｌ加えて混合し、染色液を調製した。電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で２時間静置させた。ついで、アガロースゲルにＵＶ（λ＝２５４ｎｍ）を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。
【０１４６】
ＰＣＲ産物の染色の結果、１０６倍、１０７倍および１０８倍希釈菌液からシュードモナス・エルジノーザＩＦＯ　１３２７５菌株のＤＮＡが検出された。１０９倍および１０１０倍希釈菌液からはシュードモナス・エルジノーザＩＦＯ　１３２７５菌株のＤＮＡは検出されなかった。
【０１４７】
試験例６
実施例６の菌液の調製（Ｅ）において調製した希釈菌液中の生菌数を、以下の混釈法により測定した。すなわち、前記１０６〜１０１０倍希釈菌液１ｍｌを直径９０ｍｍシャーレに分注した（ｎ＝３）。各シャーレに、オートクレーブ後５０℃に保持していたＳＣＤ寒天培地（試験例５と同様に作製）を１５ｍｌずつ分注して、穏かに撹拌し、寒天が固化するまで静置した。寒天が固化したのち、各シャーレを倒置して３５℃のインキュベータ内で培養した。培養から３日後および５日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。
【０１４８】
測定の結果、１０６倍、１０７倍および１０８倍希釈菌液に含まれる生菌数は、それぞれ、１００個以上、３４個および２．７個であった。１０９倍および１０１０倍希釈菌液に関しては、コロニーは検出されなかった。なお、同様の実験を４回繰り返し行なったが、いずれも生菌数が１〜数個でも検出が可能であった。
【０１４９】
さらに、０．４５μｍの孔径の濾過膜の代わりに孔径０．２μｍの濾過膜を用いて同様の実験を行なった場合も、シュードモナス・エルジノーザ　ＩＦＯ　１３２７５菌株のＤＮＡは検出された。
【０１５０】
実施例１〜３、５および６ならびに試験例１〜３、５および６の結果より、濾過前の生菌数が１〜数個の場合でも、菌体の存在を検出できることが分かった。また、実施例１〜３、５および６の結果より、培地に抗生物質が含まれている場合でも、濾過前に１〜数個の菌体が存在すれば、菌体の存在を検出できること、および、実施例４の結果より、抗生物質が含まれていない場合でも、数個の菌体が存在すれば、菌体の存在を検出できることが分かった。このことは、組織もしくは組織等価物の浸漬液、臓器の浸漬液または血液に少数の菌体が存在すれば、抗生物質が含まれているか否かにかかわらず、菌体の存在を検出できることを意味する。
【０１５１】
濾過膜の孔径に関しては、実施例６の結果より、孔径０．２μｍおよび孔径０．４５μｍの濾過膜のどちらの濾過膜を使用しても、細菌の存在を検出できることが分かった。また、一般的に真菌は細菌よりもサイズが大きいことから、実施例６の結果は孔径０．４５μｍの濾過膜を使用した場合でも、真菌の存在を検出できることを意味する。
【０１５２】
実施例７
＜気体の濾過＞
Ｍ　Ａｉｒ　ＴミリポアテスターにＭ　Ａｉｒ　ＴカセットＴＳＡ培地充填済み（以下、ＴＳＡ培地をＳＣＤ寒天培地と称する）をセットし、ついでＳＣＤ寒天培地の蓋を開け、ピンセットを用いてＳＣＤ寒天培地上に滅菌した孔径０．２２μｍの濾過膜を載せた。ついでＭ　Ａｉｒ　Ｔミリポアテスターに微細孔サンプリングプレートをセットし、蓋をした。つぎに、微生物を含むと思われる非清浄区域（メニコンＢＩＯセンター、２階機械室）における空気２００リットルを、Ｍ　Ａｉｒ　Ｔミリポアテスターを用いて吸引した。なお、濾過膜は直径７０ｍｍのサイズに切断し、高圧蒸気滅菌（１２１℃、２０分）したものを使用した。
【０１５３】
＜濾過膜に捕捉された菌体の培養＞
吸引濾過後、微細孔サンプリングプレートを外し、ピンセットで濾過膜を取りだし、５０ｍｌのＳＣＤ液体培地（日本製薬（株）製、カタログ番号３９６−００９９１）８．５ｇ／蒸留水５００ｍｌ）を入れたγ線滅菌済みのコンテナ（アシスト（株）製、カタログ番号７５．９９２２．４１４Ｓ）に濾過膜を浸漬し、ついで３０℃で２２時間、振とう培養を実施した。なお、コンテナにＳＣＤ液体培地５０ｍｌを入れたものを、ネガティブコントロールとし、３０℃で２２時間、振とう培養を実施した。
【０１５４】
＜菌体の回収＞
培養後、培養物をそれぞれ５０ｍｌ遠沈管に移し、ついで遠心し（３０００ｇ、１５分間）、上清を静かに除去した。沈殿を１．０ｍｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。マイクロチューブを４℃で遠心し（１５０００ｇ、１０分間）、上清を静かに除去した。
【０１５５】
＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞
各マイクロチューブにトリトンＸ−１００を含むＴＥ（実施例５と同様に作製）を１００μｌずつ添加し、菌体を懸濁した。ついで、各サンプルを１００℃で２０分間処理し、氷上に静置した。
【０１５６】
＜ＰＣＲ＞
反応混合液５０μｌを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに調製し、氷上で保持した。プライマーとしては、配列番号４および配列番号５に示す配列を有する２種のプライマーを用いた。また、鋳型ＤＮＡとしては、実施例７の＜ＰＣＲ用の鋳型の調製＞において調製されたＤＮＡを用いた。反応混合液の組成は、０．５μＭの配列番号４に示す配列を有するプライマー、１μＭの配列番号５に示す配列を有するプライマー、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）および２．０μｌの鋳型ＤＮＡを用いたほかは実施例１の反応混合液と同様の組成である。
【０１５７】
ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰに各ＰＣＲチューブをセットし、実施例５の＜ＰＣＲ＞と同様のプログラムでＰＣＲを実施した。
【０１５８】
＜アガロース電気泳動＞
アガロース電気泳動は、実施例５の＜ＰＣＲ＞において増幅されたＰＣＲ産物の代わりに、実施例７の＜ＰＣＲ＞において増幅されたＰＣＲ産物を使用するほかは、実施例５の＜アガロース電気泳動＞と同様に行なった。
【０１５９】
＜ＰＣＲ産物の染色＞
１００ｍｌの１×ＴＡＥにＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを１０μｌ加えて混合し、染色液を調製した。電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で２時間静置させた。ついで、アガロースゲルにＵＶ（λ＝２５４ｎｍ）を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。
【０１６０】
ＰＣＲ産物の染色の結果、メンブレンを入れて培養した培地から６８０ｂｐ付近にバンドが検出された。なお、ネガティブコントロールからはバンドは検出されなかった。６８０ｂｐ付近にバンドが検出されたことから、配列番号４および配列番号５に示す配列を有する２種のプライマーによって検出される細菌であることが推測された。
【０１６１】
比較例１
Ｍ　Ａｉｒ　ＴミリポアテスターにＭ　Ａｉｒ　ＴカセットＴＳＡ培地充填済み（以下、ＴＳＡ培地をＳＣＤ寒天培地と称する）をセットし、ついでＳＣＤ寒天培地の蓋を開けたのち、微細孔サンプリングプレートをセットし、蓋をした。つぎに、実施例７と同様、微生物を含むと思われる非清浄区域（メニコンＢＩＯセンター、２階機械室）における空気２００リットルを、Ｍ　Ａｉｒ　Ｔミリポアテスターを用いて吸引した。なお、空気の吸引は、実施例７とほぼ同時に行なった。微細孔サンプリングプレートを外し、寒天培地に蓋をし、２７℃のインキュベータ内で培養した。培養から１日後、２日後、３日後、４日後および７日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。
【０１６２】
測定の結果、１日後、２日後、３日後、４日後および７日後に検出されたコロニー数は、それぞれ、０個、４個、６個、８個および８個であった。したがって、比較例１の方法では、菌体の捕捉から微生物を検出するまでに少なくとも２日以上必要であることが分かる。
【０１６３】
一方、実施例７の方法を用いれば、菌体を午後に採取した場合、次の日の午後には検査結果を得ることができる（約３０時間）。また、実施例７の方法を用いると、菌体は濾過膜上に捕捉されるため、濾過対象の気体が大量である場合でも、エアーサンプラーに設置する寒天培地を一定量の気体を吸引する毎に交換することなく、濾過膜を交換することによって、１枚の寒天培地だけで微生物の検出が可能である。さらに、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）の塩基配列をＤＮＡシーケンサーで解析することにより、菌種の同定も可能である。
【０１６４】
【発明の効果】
本発明の微生物の検出方法を用いれば、流体における微生物の存在の有無を確認することができ、たとえば、組織または組織等価物の浸漬液における微生物の存在の有無を、培養皮膚などの移植前に確認することができる。従来の方法では約１ｍｌのサンプルを使用しており、その検出感度は菌体１００個／ｍｌ以上であったが、本発明の方法を用いれば、約１５０ｍｌのサンプルを処理することができ、そのサンプルに含まれる微生物１個を検出することが可能である。また、これまでの細菌・真菌の検出は、サンプルを濾過した濾過膜を７〜１４日間培養し、培養液が濁っていないことを目視で確認する方法と、浸漬液の一部をサンプルとするＰＣＲ法であった。前者においては、７〜１４日間という長い期間が必要という問題があった。後者においては、期間は１〜２日間と短いが１〜２ｍｌ程度のサンプルしか利用することができないために、数百ミリリットルに達する組織または組織等価物の浸漬液に適用する場合には、得られた培養上清のごく一部を使用することになり、微生物の検出感度が不充分であるだけでなく、試験結果の信頼性の低下という問題があった。しかしながら、本発明の微生物の検出方法は、組織または組織等価物の浸漬液などの液体を午後に採取した場合、次の日の午後には検査結果を得ることができるため（約２４時間）、非常に優れている。
【０１６５】
さらに、本発明の微生物の検出方法は、気体にも適用することができる。従来の方法では、濾過対象の気体が大量である場合、エアーサンプラーに設置する寒天培地を一定量の気体を吸引する毎に交換する必要があるため、大量の寒天培地が必要となり、大量の使用済みの寒天培地を処理しなければならないという問題点があった。しかしながら、本発明の微生物の検出方法を用いると、廃棄物の量を減らすことができる。
【０１６６】
本発明の微生物の検出方法を用いると、使用するプライマーの種類により、微生物の検出結果が得られるだけでなく検出された微生物が真菌であるか細菌であるかを識別することができる。また、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）の塩基配列をＤＮＡシーケンサーで解析することにより、流体の採取から短時間で菌種の同定をすることも可能である。さらに、菌種に特異的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用すれば、菌種の同定を同時に行なうことも可能である。
【０１６７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：真菌の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用フォワードプライマー
配列番号２：真菌の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用リバースプライマー
配列番号３：真菌の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用フォワードプライマー
配列番号４：細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用フォワードプライマー
配列番号５：細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用リバースプライマー
配列番号６：細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用リバースプライマー
配列番号７：細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用フォワードプライマー
配列番号８：細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用フォワードプライマー
配列番号９：細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用フォワードプライマー
配列番号１０：細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用リバースプライマー
配列番号１１：細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出用リバースプライマー
【０１６８】
【配列表】
2004000200.tif 000002
2004000200.tif 000003
2004000200.tif 000004
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