(57)【要約】　　　（修正有）【課題】環境ストレス負荷時に発現誘導することができるプロモーターを提供する。【解決課題】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる環境ストレス応答性プロモーター。（ａ）植物由来の特定な塩基配列からなるＤＮＡ　（ｂ）植物由来の特定な塩基配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、環境ストレス応答性プロモーターとして機能するＤＮＡ　（ｃ）植物由来の特定な塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するＤＮＡ【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる環境ストレス応答性プロモーター。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、環境ストレス応答性プロモーターとして機能するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するＤＮＡ
【請求項２】
上記環境ストレスが、塩ストレス、乾燥ストレス、ＡＢＡストレス及び低温ストレスからなる群から選ばれる少なくとも１以上のストレスであることを特徴とする請求項１記載の環境ストレス応答性プロモーター。
【請求項３】
請求項１又は２記載の環境ストレス応答性プロモーターを含む組換えベクター。
【請求項４】
上記環境ストレス応答性プロモーターに、機能しうるかたちで連結された目的遺伝子を有することを特徴とする請求項３記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求項３又は４記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項３又は４記載の組換えベクターで植物細胞を形質転換し、形質転換された植物細胞から得られた形質転換植物。
【請求項７】
請求項４記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体に対して、環境ストレスを負荷する工程と
上記組換えベクターの目的遺伝子の発現を誘導する工程と
を含む遺伝子発現調節方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、塩ストレス等の環境ストレスによって特異的に発現誘導する環境ストレス応答性プロモーターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在地球の多くの地域で砂漠化あるいは耕作地等の塩類集積が進行しており、これらの環境の変化は、環境問題及び２１世紀の食糧問題との関係から深刻な問題と捉えられている。その解決手段として、潅漑などの工学的解決策とともに、環境ストレスに抵抗性のある植物の育成が注目されている。
【０００３】
塩類集積による害として、（１）蓄積した塩類のために土壌の水分ポテンシャルが低下し、植物体が水分を吸収できなくなる、（２）植物体中に吸収された（侵入した）塩により代謝が撹乱される、（３）塩により生育に必要な他のイオンの吸収が阻害される、などが挙げられている（佐藤　文彦、植物細胞工学、別冊、「環境問題とバイオテクノロジー」、ｐ３３−３９，１９９４）。特に、乾燥や塩害によって引き起こされる水吸収の阻害は、結果的に光合成活性を低下させ、植物の生育を大きく阻害することになる。
【０００４】
乾燥、塩といったストレスに対する適応機構の存在が、微生物や植物において明らかにされてきており、そのなかでも適合溶質（低分子有機化合物、浸透圧調節物質）に関する研究は活発に進められている。適合溶質は低分子で水溶性に富み、代謝されにくく、かつ代謝に影響を及ぼさないなどの特徴を有する物質であり、グリシンベタイン、プロリンなどの両極性化合物、ピニトール、ソルビトール、マンニトールなどのポリオール類が知られている。とりわけ、グリシンベタイン（以下においてベタインと記載する）は、アカザ科、イネ科、ナス科などの高等植物に限らず、微生物においても広く利用されており、高温ストレスに対するタンパク質の保護　（Ｐａｌｅｇ，　Ｌ．Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｕｓｔ．　Ｊ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　８：１０７−１１４，　１９８１、Ａｌｌａｋｈｖｅｒｄｉｅｖ　Ｓ．Ｉ．，　Ｊ．　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｏｔｏｉｏｌ．　３４：１４９１５７，　１９９６）、環境に対する浸透圧バランスの維持（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，　Ｓ．Ｐ．　ａｎｄ　Ｊｏｎｅｓ，　Ｇ．Ｐ．，　Ａｕｓｔ．　Ｊ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１３：６５９−６６８，　１９８６）、塩ストレスに対する可溶性酵素の保護（Ｇａｂｂａｙ−Ａｚａｒｉａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　２６４：３３３−３３９，１９８８）などに機能していると報告されている。
【０００５】
高等植物の中でも研究の進んでいるホウレンソウでは、ベタインは、コリンからベタインアルデヒドを経て２段階で合成される。すなわち、フェレドキシン依存性のコリンモノオキシゲナーゼにより第１段階の酸化が触媒され（Ｂｒｏｕｑｕｉｓｓｅ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　９０：３２２−３２９，　１９８９）、第２段階の酸化はＮＡＤ依存性のベタインアルデヒド脱水素酵素（Ｗｅｒｅｔｉｌｎｙｋ，　Ｅ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔａ．　１７８：３４２−３５２，　１９８９）によって触媒される。このような植物を塩ストレスにさらすと、それぞれの酵素活性が上昇し、ベタイン量が増加することが確認されている（Ｈａｎｓｏｎ，　Ａ．Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８２：３６７８−３６８２，　１９８５）。
【０００６】
以上に代表されるように、各種環境ストレスに対する植物の応答性に関する研究が広く行われている。当該研究が進むことによって、各種環境ストレスに対して優れた耐久性を示す植物の作出が期待される。例えば、植物に対して環境ストレス耐性を付与する機能遺伝子を、環境ストレスが負荷された条件下で特異的に発現誘導することによって、環境ストレスに対して優れた耐久性を示す植物を作出することができる。
【０００７】
ところで、機能遺伝子の発現は、ＲＮＡへの転写、タンパク質への翻訳、ＲＮＡの安定性、タンパク質の安定性、タンパク質輸送及びタンパク質修飾など、遺伝子が転写されてから機能性分子が機能するまでの多くの過程で制御されている。プロモーターはその中でもＲＮＡへの転写のタイミング、強度、部位などを制御する主たる発現制御因子として知られ、遺伝子のある一部分を指す調節遺伝子の一種であり、ＤＮＡ分子上にあって、ＲＮＡ合成酵素が結合してオペロンの転写を開始する部位と定義される。
【０００８】
従って、所定の機能遺伝子の発現を制御するためには、プロモーターの開発が有効である。特に、環境ストレス負荷によって、下流に配置された機能遺伝子の発現を誘導できるプロモーターを開発することで、環境ストレスに優れた耐久性を示す植物の作出が期待できる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、環境ストレス負荷時に発現誘導することができるプロモーターを提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる環境ストレス応答性プロモーター。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、環境ストレス応答性プロモーターとして機能するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するＤＮＡ
【００１１】
（２）上記環境ストレスが、塩ストレス、乾燥ストレス、ＡＢＡストレス及び低温ストレスからなる群から選ばれる少なくとも１以上のストレスであることを特徴とする（１）記載の環境ストレス応答性プロモーター。
【００１２】
（３）（１）又は（２）記載の環境ストレス応答性プロモーターを含む組換えベクター。
【００１３】
（４）上記環境ストレス応答性プロモーターに、機能しうるかたちで連結された目的遺伝子を有することを特徴とする（３）記載の組換えベクター。
【００１４】
（５）（３）又は（４）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【００１５】
（６）（３）又は（４）記載の組換えベクターで植物細胞を形質転換し、形質転換された植物細胞から得られた形質転換植物。
【００１６】
（７）請求項４記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体に対して、環境ストレスを負荷する工程と
上記組換えベクターの目的遺伝子の発現を誘導する工程と
を含む遺伝子発現調節方法。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
先ず、本発明に係る環境ストレス応答性プロモーターについて説明する。本発明に係る環境ストレス応答性プロモーターは、以下の１〜３のいずれかのＤＮＡからなる。
１．配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
２．配列番号１で表される塩基配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、環境ストレス応答性プロモーターとして機能するＤＮＡ
３．配列番号１で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ
【００１９】
配列番号１で表される塩基配列は、耐塩植物として知られているシロザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ　ａｌｂｕｍ　Ｌ．）におけるコリンモノオキシゲナーゼ遺伝子（以下、ＣＭＯ遺伝子）の上流に位置し、当該コリンモノオキシゲナーゼ遺伝子の発現を制御している塩基配列である。
【００２０】
シロザにおけるＣＭＯ遺伝子は、定法に従って調製することができる（特に、特開２００１−９５５７５号を参照）。例えば、シロザから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開２００１−９５５７５号に開示されているＣＭＯ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、ＣＭＯ遺伝子を調製することができる。
【００２１】
配列番号１で表される塩基配列は、例えば、ＣＭＯ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、いわゆるインバースＰＣＲによって調製することができる。インバースＰＣＲとは、既知の塩基配列の両端に隣接する未知の塩基配列をＰＣＲ法を用いて増幅する方法である。具体的には、先ず、既知の塩基配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ＰＣＲ増幅に適した大きさのＤＮＡ断片とし、このＤＮＡ断片の両端をライゲーションして環状とする。その後、一対のプライマーを、それぞれ環状分子内のコア領域の両端部分には相補的だが、通常のＰＣＲとは逆に、既知の塩基配列から未知の塩基配列に向かって伸長鎖を合成するように設計する。そして、このように設計された一対のプライマーと、環状化されたＤＮＡ断片を用いてＰＣＲを行う。これにより、既知の塩基配列に隣接する未知の塩基配列を増幅することができる。
【００２２】
インバースＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片を用いて、既知の塩基配列に隣接する未知の塩基配列を決定することができる。そして、決定した塩基配列に基づいて、さらに一対のプライマーを設計し、決定した塩基配列に隣接する未知の塩基配列を同様にして増幅することができる。
【００２３】
このように、インバースＰＣＲによってＣＭＯ遺伝子の上流に位置する未知の塩基配列を順次増幅し、定法に従って塩基配列を決定することによって、配列番号１で表される塩基配列を得ることができる。一旦、配列番号１で表される塩基配列が決定されると、その後は、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、シロザから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、配列番号１に表される塩基配列を得ることができる。
【００２４】
配列番号１に表される塩基配列は、環境ストレスに対して応答性を示すプロモーターとして機能する。プロモーターとは、機能遺伝子の上流に配置され、ＲＮＡポリメラーゼが結合することにより、下流に配置された機能遺伝子の発現を調節する塩基配列である。
【００２５】
ここで、環境ストレスとは、生育環境における塩濃度、湿度、温度、光強度等といった環境条件の変化に起因するストレスを意味し、それぞれの環境条件について高塩濃度ストレス（以下、単に塩ストレス）、乾燥ストレス、高温ストレス、低温ストレス、強光ストレス等に分類される。「環境ストレスに対して応答性を示す」とは、生育環境における各種の環境条件を通常の状態から変化させたときに、この変化に伴って特異的に応答することを意味する。したがって、「環境ストレスに対して応答性を示すプロモーター」とは、生育環境における各種の環境条件を通常の状態から変化させたときに、この変化に伴って、下流に配置された機能遺伝子を特異的に発現させることができるプロモーターを意味する。
【００２６】
環境ストレス応答性プロモーターとしての活性を有するか否かは、以下のような手法により確認することができる。すなわち、環境ストレス応答性プロモーターとしての活性は、例えば、種々のレポーター遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）、グリーンフルオレッセントプロテイン遺伝子（ＧＦＰ）等）をプロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、当該ベクターを用いて宿主のゲノムに導入した後、環境ストレスを負荷した条件下で、当該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認することができる。
特に、配列番号１に表される塩基配列は、塩ストレス及び／又は乾燥ストレスに対して顕著な応答性を示す。
【００２７】
具体的に、塩ストレスとしては、培地に１００ｍＭ〜６００ｍＭのＮａＣｌを添加した負荷した環境及び当該環境に相当する環境を例示することができる。また、乾燥ストレスとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度が５０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌである環境及び当該環境に相当する環境を例示することができる。
【００２８】
一方、本発明に係る環境ストレス応答性プロモーターは、配列番号１に表される塩基配列からなるもの限定されず、上記２．に記載したように、環境ストレスに対して応答性を示すプロモーター活性を示す限り、配列番号１に表される塩基配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であってもよい。
【００２９】
例えば、配列番号１に表される塩基配列において、１〜１００個の塩基、好ましくは１〜５０個の塩基、より好ましくは１〜１０個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であっても、環境ストレスに対して応答性を示すプロモーター活性を示す限り本発明に係る環境ストレス応答性プロモーターに含まれる。
【００３０】
また、本発明に係る環境ストレス応答性プロモーターは、配列番号１に表される塩基配列からなるもの限定されず、上記３．に記載したように、環境ストレスに対して応答性を示すプロモーター活性を示す限り、配列番号１で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。
【００３１】
ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的にストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【００３２】
一旦本発明に係る環境ストレス応答性プロモーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明に係る環境ストレス応答性プロモーターを得ることができる。さらに、部位特定変異誘発等によって、配列番号１に表される塩基配列に１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を合成することもできる。
【００３３】
なお、配列番号１に表される塩基配列に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００３４】
次に、上述した環境ストレス応答性プロモーターを用いた組換えベクターについて説明する。組換えベクターは、適当なベクターに、上述した環境ストレス応答性プロモーターを連結（挿入）することにより得ることができる。また、上述した環境ストレス応答性プロモーターの下流に目的遺伝子を連結（挿入）したものも、本発明に係る組換えベクターに含まれる。ここで「目的遺伝子」とは、例えば、タンパク質をコードする核酸又はそのアンチセンス核酸、アンチセンスＲＮＡデコイをコードする核酸、リボザイムなどが挙げられる。
【００３５】
タンパク質をコードする核酸はとしては、酵素をコードする遺伝子の核酸であってもよく、例えば、ナトリウムポンプ遺伝子などの環境ストレスに耐性を付与する遺伝子、ＴＦＬ遺伝子などの開花時期や形態などを制御する制御遺伝子、α−チオニンなどの抗菌ペプチド遺伝子や脂肪酸合成遺伝子として知られるＦＡＥ１などの代謝系の遺伝子等が挙げられる。
【００３６】
アンチセンス核酸とは、任意のＲＮＡ（ゲノムＲＮＡ及びｍＲＮＡ）と相補的な塩基配列を有し、これらと２本鎖を形成することによって該ＲＮＡにコードされる遺伝子情報の発現（転写、翻訳）を抑制するものをいう。アンチセンス配列は、遺伝子の翻訳又は転写をブロックする限り任意の核酸物質を使用することができる。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は任意の核酸擬似物が挙げられる。従って、発現を抑制させようとする遺伝子の一部の配列に相補的となるようにアンチセンス核酸（オリゴヌクレオチド）配列を設計する。
【００３７】
本発明の目的のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの分子類似体も使用することができる。分子類似体は、高安定性、分布特異性などを有するものである。分子類似体には、化学的に反応性である基、例えば鉄結合エチレンジアミン四酢酸をアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させたものが挙げられる。
【００３８】
ＲＮＡデコイをコードする核酸とは、転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列又は類似の配列を有するＲＮＡを指し、これらを「おとり」として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制するものをいう。
【００３９】
リボザイムとは、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するものをいい、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものをいう。リボザイムは特定のタンパク質をコードする遺伝子配列より設計することができ、例えば、ハンマーヘッド型リボザイムとしては、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ，　２２８；　２２８−２３０（１９８８）に記載の方法を用いることができる。また、ハンマーヘッド型リボザイムだけではなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイムなどの、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するものであって、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば本発明において使用しうる。
【００４０】
目的遺伝子を挿入するためのベクターは、プラスミド型ベクター、又は宿主生物中のゲノムに組み込み可能な染色体導入型ベクターであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡ（ＹＡＣ：ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）などが挙げられる。
【００４１】
プラスミド　ＤＮＡとしては、例えばｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２又はｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ２又はＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１又はｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６又はｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１５Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）、φＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９などが挙げられる。レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子などが挙げられる。ＹＡＣ用ベクターとしてはｐＹＡＣＣ２などが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００４２】
ベクターに本発明の環境ストレス応答性プロモーター及び目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
【００４３】
組換えベクターにおいて、環境ストレス応答性プロモーターは、目的遺伝子の機能が発揮されるように、目的遺伝子が発現可能な状態でベクターに組み込まれることが必要である。発現可能な状態とは、目的遺伝子が導入される宿主生物において環境ストレス応答性プロモーターの制御下に目的遺伝子が発現されるように、目的遺伝子と環境ストレス応答性プロモーターとを連結してベクターに組み込むことを意味する。そこで、組換えベクターには、環境ストレス応答性プロモーター、目的遺伝子、ターミネーターのほか、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子などの除草剤耐性遺伝子などが挙げられる。
【００４４】
このように作製された組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。すなわち、形質転換体は、上述した組換えベクターを、目的遺伝子が発現しうるように宿主に導入することによって作製することができる。宿主としては、特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げられ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはＳｆ９等の昆虫細胞が挙げられる。
【００４５】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＤＨ５α、Ｙ１０９０などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ，　Ｓ．Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．：Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　６９：２１１０（１９７２）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４６】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ，　Ｄ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１９４：　１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．：Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　７５：　１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ，　Ｈ．：Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１５３：１６３（１９８３）］等が挙げられる。
【００４７】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００４８】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００４９】
宿主が植物である場合は、形質転換植物は以下のようにして得ることができる。本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、例えばアカザ科、ナス科、イネ科、マメ科、バラ科、キク科、ユリ科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、アブラナ科等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
【００５０】
組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等によって植物中に導入することができる。
【００５１】
例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、組換えベクターを適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　ＬＢＡ４４０４株に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著，植物遺伝子操作マニュアル，１９９０，２７−３１ｐｐ，講談社サイエンティフィック，東京）等に従って宿主（例えばシロザ）の無菌培養葉片に感染させ、形質転換タバコを得ることができる。
【００５２】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【００５３】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００５４】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５６】
〔実施例１〕環境ストレス応答性プロモーターの単離
（１）ＣＭＯ遺伝子上流に存在するプロモーター領域の塩基配列決定
先ず、配列番号２に示すシロザにおけるＣＭＯ（ＴｙｐｅＣ）ｃＤＮＡの塩基配列（特開２００１−９５５７５号を参照）に基づいて、インバースＰＣＲに用いるプライマーを設計した。配列番号２に示すＣＭＯ（ＴｙｐｅＣ）ｃＤＮＡの塩基配列と設計したプライマーとの関係を図１に示す。設計したプライマーは、図１に示すように、ｃｍｏＴ１（配列番号３）、ｃｍｏＴＲ２（配列番号４）及びｃｍｏＴＲ３（配列番号５）と命名した。
【００５７】
また、配列番号２に示すＣＭＯ（ＴｙｐｅＣ）ｃＤＮＡの塩基配列から、開始コドンから数えて５３塩基から始まる配列にＡｃｃＩ認識配列（ＡｃｃＩサイト）を見出したためインバースＰＣＲの際に用いる制限酵素としてＡｃｃＩを選択した。
【００５８】
シロザのゲノムＤＮＡは以下のように調製した。すなわち、上郷圃場で採取したシロザＳ３種子を播種した後、約１ヵ月間栽培してシロザ植物体を準備した。シロザ植物体の成葉２ｇを採取し、Ｄｎｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、シロザゲノムを調製した。その結果、シロザ植物体成葉２ｇからゲノムＤＮＡ２５μｇ（図２）を調製することができた。
【００５９】
次に、ゲノムＤＮＡ２μｇを用いて、表１に示す組成となるように反応溶液を調製し、３７℃で６時間反応させゲノムＤＮＡをＡｃｃＩで消化した。ＡｃｃＩで処理した後の反応溶液及びサイズマーカを電気泳動した結果を図３に示す。
【００６０】
【表１】
2004033026.tif 000002
【００６１】
次に、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＳＰＩＮ　Ｋｉｔｓ（ＢＩＯ　１０１）を用いて、反応溶液２００μｌから１００μｌの精製ゲノム断片溶液を得た。そして、得られた精製ゲノム断片溶液のうち９０μｌについて、表２に示す組成となるようにライゲーション反応溶液を調製し、ライゲーション反応を行った。このライゲーション反応により、精製ゲノム断片溶液に含まれるゲノム断片を環状化することができる。
【００６２】
【表２】
2004033026.tif 000003
【００６３】
次に、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＳＰＩＮ　Ｋｉｔｓ（ＢＩＯ　１０１）を用いて、ライゲーション反応後の精製ゲノム断片溶液５００μｌから環化ゲノム断片を精製し、蒸留水に溶解して４０μｌの精製環化ゲノム溶液を得た。そして、得られた精製環化ゲノム溶液及びＴａｋａｒａ　ＬＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて１回目のインバースＰＣＲのための反応溶液を、表３に示す組成で調製した。なお、１回目のインバースＰＣＲにおいては、ｍｏＴ１プライマーとｃｍｏＴＲ２プライマーとを用い、９４℃で１分間の変性工程、５５℃で２分間のアニーリング工程及び７２℃で３分間の伸長工程からなる１サイクルを３０サイクル行った。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
１回目のインバースＰＣＲの後、反応溶液とサイズマーカとをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図４に示す。図４から判るように、１回目のインバースＰＣＲの結果、１．４ｋｂ、１．６ｋｂ及び２．０ｋｂの増幅ＤＮＡ産物を得た。
【００６６】
１回目のインバースＰＣＲの結果として得られた増幅ＤＮＡ産物が不十分なケース、ミスアニーリングによるミミック増幅なども想定されることから、１回目のインバースＰＣＲとは異なるプライマーを用いて２回目のインバースＰＣＲを行った。２回目のインバースＰＣＲにおいては、ｃｍｏＴ１プライマーとｃｍｏＴＲ３プライマーとを用いた以外は、表３に示した組成で行った。２回目のインバースＰＣＲの後、反応溶液とサイズマーカとをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図５に示す。図５から判るように、２回目のインバースＰＣＲの結果、０．７ｋｂ、１．１ｋｂ、１．４ｋｂ及び２．５ｋｂの増幅ＤＮＡ産物を得た。
【００６７】
次に、２回目のインバースＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ産物を、それぞれＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。増幅ＤＮＡ産物をクローニングしたＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１ベクターを用いて、増幅ＤＮＡ産物の塩基配列を決定したところ、２回目のインバースＰＣＲで得られた１．４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片がＣＭＯ遺伝子の上流に隣接する領域を含んでいることが明らかとなった。なお、塩基配列の決定の際には、Ｔ７プライマー、Ｍ１３リバースプライマー、ｐｒｃｍｏ２（配列番号６）、ｐｒｃｍｏ３（配列番号７）及びｐｒｃｍｏ４　Ｒｅｖ．（配列番号８）を用いた。
【００６８】
これらプライマーを用いて決定した塩基配列を配列番号９及び図６に示す。配列番号９及び図６に示したように、２回目のインバースＰＣＲで得られた１．４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片には、ＮｄｅＩ認識配列（ＮｄｅＩサイト）が存在していた。２回目のインバースＰＣＲで得られた１．４ｋｂのさらに上流の領域を特定するため、ＮｄｅＩサイトを用いて３回目のインバースＰＣＲを行うこととした。
【００６９】
３回目のインバースＰＣＲにおいては、配列番号９及び図６に示した塩基配列に基づいて設計したｐｒｃｍｏ２（配列番号１０）及びｐｒｃｍｏＰ２Ｒｅｖ．（配列番号１１）を用いた。ゲノムＤＮＡの調製、ゲノムＤＮＡのＮｄｅＩ処理、環化処理は、上述した方法と同様に行った。３回目のインバースＰＣＲの結果、増幅ＤＮＡ産物を確認することはできなかった（図７）。そこで、３回目のインバースＰＣＲの後、反応溶液５μｌを用いて４回目のインバースＰＣＲを行うこととした。
【００７０】
４回目のインバースＰＣＲでは、ｃｍｏＴ１（配列番号３）及びｃｍｏＴＲ３（配列番号５）を用い、３回目のインバースＰＣＲの後の反応溶液に含まれる環状ＤＮＡ断片を鋳型とした。３回目のインバースＰＣＲ後及び４回目のインバースＰＣＲ後の反応溶液それぞれを、アガロースゲル電気泳動に供した結果を図７に示す。図７から判るように、４回目のインバースＰＣＲの結果、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、１．０ｋｂ、１．７ｋｂ及び２．４ｋｂ相当の増幅ＤＮＡ産物を得た。
【００７１】
これら増幅ＤＮＡ産物について、ＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、Ｔ７プライマー及びＭ１３プライマーを用いて同様に塩基配列を決定したところ、０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ産物が、２回目のインバースＰＣＲで得られた１．４ｋｂのさらに上流の領域を含んでいることが判った。
【００７２】
以上、２回目のインバースＰＣＲで得られた１．４ｋｂの増幅ＤＮＡ産物及び４回目のインバースＰＣＲの結果で得られた０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ産物の塩基配列から、配列番号１に示す塩基配列を同定することができた。配列番号１に示す塩基配列には、転写開始点の位置決定に機能するとされるＴＡＴＡボックスモチーフ、乾燥ストレス・塩ストレス等のシグナル伝達に寄与するｍｙｂ／ｍｙｃモチーフと推定される配列が含まれていた。
【００７３】
〔実施例２〕ＣＭＯ遺伝子の発現解析
実施例１の解析の結果として得られた環境ストレス応答性プロモーターの機能を検証するため、ＣＭＯ遺伝子の発現解析を行った。
ＣＭＯ遺伝子の発現量
ＣＭＯ遺伝子の発現量は、後述する方法で各種の環境ストレスを負荷したシロザから、ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡを合成した後、各種の環境ストレス負荷によるｃＤＮＡ量の差異を検出することで行った。
【００７４】
本例では、環境ストレスとして、塩ストレス、乾燥ストレス、ＡＢＡストレスについて検討した。いずれの実験にも、バーミキュライトをつめた直径６ｃｍのポット上で約４０日間栽培（３０℃、６０ｗｔ％、１６ｈｒ明所及び８ｈ暗所のサイクル）した野生型のシロザを植物材料として用いた。
【００７５】
塩ストレスは、５００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液２５ｍｌをポット土壌に添加することで負荷した。乾燥ストレスは、１５０ｇ／ＬのＰＥＧ水溶液２５ｍｌをポット土壌に添加することで負荷した。ＡＢＡストレスは、１００ｍＭのＡＢＡ水溶液２５ｍｌをポット土壌に添加することで負荷した。また、コントロールとしては、水２５ｍｌをポット土壌に添加したものを使用した。
【００７６】
上述したように各種環境ストレスが負荷された日から２日間経過後、シロザの成葉を採取し、採取した成葉から全量ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの抽出には、ＱＩＡＧＥＮ　ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。そして、抽出したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡの調製には、ＲｅｔｒｏＳｃｒｉｐｔ　（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いた。上述した方法によって調整したｃＤＮＡを用いて、ＣＭＯ遺伝子の発現解析を行った。結果を図８に示す。
【００７７】
なお、図８において、左レーンから右レーンに向かって、サイズマーカー、コントロール、塩ストレス負荷、乾燥ストレス負荷及びＡＢＡストレス負荷を示している。図８から、ＣＭＯ遺伝子は、塩ストレス又は乾燥ストレスを負荷した条件下で特異的に発現量が増大していることが判る。一方、ＡＢＡストレスを負荷した条件下におけるＣＭＯ遺伝子の発現量は、コントロールの発現量とほぼ同程度であった。この結果から、ＣＭＯ遺伝子の転写は、塩ストレス及び乾燥ストレスに応答性を示すプロモーターによって制御されていることが明らかとなった。したがって、実施例１の解析の結果として得られた環境ストレス応答性プロモーターは、塩ストレス及び乾燥ストレスのいずれに対しても、下流の遺伝子の転写量を増大させる機能を有することが明らかとなった。
【００７８】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明により、環境ストレス負荷時に発現誘導することができる新規な環境ストレス応答性プロモーターを提供することができる。また、本発明に係る環境ストレス応答性プロモーターを用いることによって、環境ストレス負荷により下流の目的遺伝子の発現誘導を行うことができる組換えベクターを提供することができる。さらに、本発明に係る環境ストレス応答性プロモーターを用いることによって、環境ストレス負荷により発現誘導される目的遺伝子を有する形質転換体を提供することができる。
【００７９】
【配列表】
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【００８０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３〜８、１０、１１は、プライマーである。
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号２に示す塩基配列におけるプライマーの位置を表す図である。
【図２】シロザから調製したゲノムＤＮＡを示す電気泳動写真である。
【図３】ＡｃｃＩで処理したゲノムＤＮＡを示す電気泳動写真である。
【図４】１回目のインバースＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図５】２回目のインバースＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図６】２回目のインバースＰＣＲで得られた１．４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片の塩基配列及び当該塩基配列におけるプライマーの位置を表す図である。
【図７】３回目及び４回目のインバースＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図８】各種の環境ストレスを負荷した条件下で、ＣＭＯ遺伝子の発現量を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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