(57)【要約】【課題】ある特定の遺伝子をコードしたＤＮＡ中に、塩基置換や欠失などの変異を簡便かつ短時間で効率良く導入することができる、従来にない新規なＤＮＡの変異導入法を提供することを課題とする。【解決手段】脱塩基部位を含むＤＮＡを調製し、このＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことを特徴とするＤＮＡの変異導入法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱塩基部位を含むＤＮＡを調製し、このＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことを特徴とするＤＮＡの変異導入法。
【請求項２】
アデニン、チミン、グアニン及びシトシン以外の塩基を含むＤＮＡを、当該塩基を選択的に切断するＤＮＡグリコシラーゼにより処理することにより、脱塩基部位を含むＤＮＡを調製することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡの変異導入法。
【請求項３】
ウラシルを含むＤＮＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより処理することにより、脱塩基部位を含むＤＮＡを調製することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡの変異導入法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡの配列中に変異を導入する際に適用される、新規なＤＮＡの変異導入法に関する。このようなＤＮＡへの変異導入は遺伝子、タンパク質の機能改変技術として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡへの変異導入法として、エラープローンＰＣＲ法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。エラープローンＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応中に人為的にランダムなエラーを発生させる方法である。即ち、エラープローンＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応液の中のデオキシヌクレオチドの構成比を、例えば通常の等量からある特定の一塩基だけ１０分の１量にすることにより、ＤＮＡポリメラーゼが誤った塩基を取り込む現象を利用したものである。
【０００３】
【非特許文献１】
生物化学実験法４０「蛋白質工学研究法」、井本黎治著「ランダム変異」ｐ６３−６９、ＩＳＢＮ４−７６２２−９８２２−０　（１９９６年印刷）
【０００４】
しかしながら、エラープローンＰＣＲ法によれば、ヌクレオチドが誤って取り込まれる確率は低く、その最適化は労力と時間を要する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような従来のＤＮＡへの変異導入法の問題点を解消し、塩基置換や欠失などの変異を簡便、かつ短時間で効率良く導入することができる、従来にない新規なＤＮＡの変異導入法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、ある特定の遺伝子をコードしたＤＮＡに対し、特定の塩基対を作れない部位である脱塩基部位を導入し、このＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって、ＤＮＡへの変異導入を簡便、かつ短時間で効率良く行うことができることを見出した。
また、アデニン、チミン、グアニン及びシトシン以外の塩基を含むＤＮＡを、当該塩基を選択的に切断するＤＮＡグリコシラーゼにより処理することにより調製される脱塩基部位を含むＤＮＡを用いることにより、変異を効率よく導入することができ、中でも特に、ウラシルを含むＤＮＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより処理することにより、変異を最も効率よく導入できることを見出した。
本発明は、かかる知見に基づくものである。
【０００７】
すなわち、請求項１記載の本発明は、脱塩基部位を含むＤＮＡを調製し、このＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことを特徴とするＤＮＡの変異導入法を提供するものである。
請求項２記載の本発明は、アデニン、チミン、グアニン及びシトシン以外の塩基を含むＤＮＡを、当該塩基を選択的に切断するＤＮＡグリコシラーゼにより処理することにより、脱塩基部位を含むＤＮＡを調製することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡの変異導入法を提供するものである。
請求項３記載の本発明は、ウラシルを含むＤＮＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより処理することにより、脱塩基部位を含むＤＮＡを調製することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡの変異導入法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のＤＮＡの変異導入法は、脱塩基部位を含むＤＮＡを調製し、このＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことを特徴とする。
【０００９】
脱塩基部位を含むＤＮＡとは、ＤＮＡに対し特定の塩基対を作れない部位である脱塩基部位を導入したものである。ここで、ＤＮＡとしては、変異を導入したいと考える一本鎖又は二本鎖の全てのＤＮＡを対象とすることができ、生物から抽出した天然のものや、人工的に作製したものを制限なく用いることができる。
脱塩基部位を含むＤＮＡ全体に対する脱塩基部位の割合は、例えば１箇所〜全体の３０％、好ましくは１箇所〜全体の１０％、より好ましくは１箇所〜全体の５％である。また、脱塩基部位はＤＮＡのどの部位にあっても良い。
ＤＮＡの長さについては、特に限定されるものでなく、好ましくは２０ｍｅｒ以上、より好ましくは４０ｍｅｒ以上のＤＮＡを用いることができ、具体的には例えば、２０ｂｐ〜１０００ｋｂｐ、好ましくは３０ｂｐ〜１００ｋｂｐのものを用いることができる
【００１０】
脱塩基部位を含むＤＮＡの調製は、変異の導入を望むＤＮＡに対し、特定の塩基対を作れない部位である脱塩基部位を導入することにより達成される。脱塩基部位の導入方法については特に制限はないが、アデニン、チミン、グアニン及びシトシン以外の塩基を含むＤＮＡを、当該塩基を選択的に切断するＤＮＡグリコシラーゼにより処理することにより、効率よく変異を導入することができるので好ましい。ここで、アデニン、チミン、グアニン及びシトシン以外の塩基を含むＤＮＡとは、例えば、ある特定の遺伝子を含むＤＮＡの一部に、アルキル化アデニン、オキソグアニン、ウラシル、ピリミジンダイマー、ミスマッチ塩基等が１塩基、或いは２〜数百塩基挿入されたＤＮＡのことである。アデニン、チミン、グアニン及びシトシン以外の塩基は、ＤＮＡのどの部位にあっても良いが、その塩基部分に変異が導入されることとなる。
【００１１】
ＤＮＡグリコシラーゼとは、細胞内で損傷塩基であるアルキル化アデニンやオキソグアニンを取り除く働きをするアルキル塩基ＤＮＡグリコシラーゼやオキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼのほか、ピリミジンダイマーＤＮＡグリコシラーゼ、ミスマッチ塩基を取り除くアデニン特異的ＤＮＡグリコシラーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼなどがある。
ＤＮＡグリコシラーゼの反応は特に限定されるものではなく、アデニン、チミン、グアニン及びシトシン以外の塩基を含む一本鎖または二本鎖ＤＮＡを基質として、これをＤＮＡグリコシラーゼで常法により（例えば、４〜６０℃で１分〜２４時間）処理することにより脱塩基部位を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００１２】
このようなＤＮＡグリコシラーゼの中でも、特に、ウラシルを含むＤＮＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより処理することにより、より効率よく変異を導入することができるので好ましい。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとしては、市販のもの例えば実施例で用いたようなＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製のものなどを使用することができる。
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの反応は特に限定されるものではなく、ウラシルを含む一本鎖または二本鎖のＤＮＡを基質として、これをウラシルＤＮＡグリコシラーゼで常法により（例えば、４〜６０℃で１分〜２４時間）処理することにより脱塩基部位を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
なお、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの基質となるウラシルを含むＤＮＡは、本発明の変異導入法により、ウラシルの存在した位置にチミンかシトシンのピリミジン塩基を取り込まれる形で変異が導入されることが多く、まれにプリン塩基が取り込まれる。一般に、チミンかシトシンに変換される場合が７〜１０割程度、欠失変異が０〜３割程度の確率で生じる。チミン：シトシンの比率については、一般に３：２〜１０：０程度であるが、ウラシルの隣接塩基対にグアニンやシトシンがある場合には、シトシンに変換する頻度が高くなる場合がある。
【００１３】
本発明のＤＮＡの変異導入法においては、上述のようにして脱塩基部位を含むＤＮＡを調製し、このＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。
ＰＣＲに用いるプライマーは、鋳型、即ち脱塩基部位を含むＤＮＡの塩基配列に応じて設計することができる。サイズは特に限定されるものではないが、好ましくは５ｍｅｒ以上、より好ましくは１０ｍｅｒ以上のものを用いる。
ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは特に限定されるものではないが、好ましくはＴａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ、Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ、ＫＯＤ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ、Ｔｔｈ　ＤＮＡ　ポリメラーゼを用いる。
ＰＣＲの反応条件は特に限定されるものでなく通常実施される条件を用いればよい。増幅されたＤＮＡ断片を通常の方法でクローニングすることにより変異が導入されたＤＮＡを得る。
こうして、本発明の変異導入法により、ＤＮＡに対し塩基置換や欠失などの変異を効率よく導入することができるので、本発明の変異導入法は、遺伝子、タンパク質の機能改変技術として有用である。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１（脱塩基部位を１箇所含むＤＮＡを鋳型とした場合）
（１）脱塩基部位を１箇所含む１本鎖ＤＮＡの準備
本実施例では、５０量体のＤＮＡのうち２２番目の塩基がウラシルであるが、ウラシルの隣接塩基対が異なる６種類のＤＮＡを、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの基質として合成した。なお、この基質ＤＮＡの具体的な配列は、それぞれ配列表の配列番号１〜６に示すとおりである。以下、それぞれの基質ＤＮＡのサンプルを、２１〜２３番目の配列（Ｘ１ＵＸ２）の配列であるＡＵＡ（配列表の配列番号１参照）、ＡＵＴ（配列表の配列番号２参照）、ＴＵＡ（配列表の配列番号３参照）、ＴＵＴ（配列表の配列番号４参照）、ＴＵＧ（配列表の配列番号５参照）及びＴＵＣ（配列表の配列番号６参照）と略記することにする。
以上の基質それぞれについて、以下の組成の反応溶液５０μｌを準備し、ウラシル除去反応を行った。
【００１５】
（反応溶液の組成）
・ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ　　　１．０Ｕ
・基質ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　１００ｐｍｏｌ
【００１６】
ここで、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼはＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製であり、保存溶液に溶解したものである。なお、反応溶液は上記の組成に対し１０Ｘ反応緩衝液を加え、終濃度２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　８．２），１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１０ｍＭ　ＮａＣｌで構成されたものである。
以上の組成の反応溶液をそれぞれ３７℃、３時間反応させると、完全にＤＮＡ中からウラシルが完全に除去され、脱塩基部位を１箇所含む１本鎖ＤＮＡを得ることができた。
【００１７】
（２）ＤＮＡへの変異導入
（１）でそれぞれの基質ＤＮＡから得られた脱塩基部位を含むＤＮＡを鋳型として、以下の組成の反応溶液５０μｌを準備しＰＣＲを行った。
【００１８】
（反応溶液の組成）
・（１）で得られた脱塩基部位を含むＤＮＡ　　　　　　２０ｆｍｏｌ
・Ｐｒｉｍｅｒ−１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｐｍｏｌ
・Ｐｒｉｍｅｒ−２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｐｍｏｌ
・ＤＮＴＰｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０μｍｏｌ
・ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍＭ
・Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　１．２５Ｕ
【００１９】
なお、Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼは東洋紡社製であり、保存溶液に溶解したものである。また、Ｐｒｉｍｅｒ−１は配列表の配列番号７に示す塩基配列を持ち、Ｐｒｉｍｅｒ−２は配列表の配列番号８に示す塩基配列を持つ。
サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。まず９５℃、３０秒のＤＮＡ変性、５７℃、３０秒のアニーリング反応及び７２℃、３０秒の伸長反応を１サイクルとして３０サイクル行った。
【００２０】
（３）形質転換及びクローニング
（２）で得られたＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴＯＰＯ　ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇＲ　を用いてプラスミドｐＣＲＲ　２．１−ＴＯＰＯＲ　に挿入した。このプラスミドをエレクトロポレーション法にてＯｎｅ　ＳｈｏｔＲ　大腸菌コンピテントセルを形質転換した。そして、形質転換した大腸菌細胞を、５００μｌのＳＯＣ培養液（２％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭ　ＮａＣｌ　、２．５ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２０ｍＭグルコース）を加え、３７℃、１時間培養した。そして培養した大腸菌細胞を１０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１．６ｍｇのＸ−ｇａｌ、９５２μｇのＩＰＴＧを含むＬＢ個体培地で３７℃にて１２時間培養し、目的のＰＣＲ産物が挿入したプラスミドを有する白いコロニーを得た。
【００２１】
（４）ＤＮＡシークエンシング
（３）で得られた白いコロニーからアマシャムバイオサイエンス社製のＴｅｍｐｌｉｐｈｉ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　を用いてプラスミドの増幅を行った。即ちまず、白いコロニーをプラスチックチップの先端で掻き取り、５μｌのサンプル緩衝液に懸濁した。この懸濁液を９５℃で３分間処理して、大腸菌細胞よりプラスミドを遊離させた。その後、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む５μｌの反応溶液を加え、３０℃、１８時間反応させた。
増幅したＤＮＡ溶液２μｌを８μｌの滅菌水に加え、９５℃、１分間処理し、シークエンス反応用の鋳型として用いた。以下の組成の反応溶液１０μｌを準備し、シークエンス反応を行った。
【００２２】
（反応溶液の組成）
・鋳型ＤＮＡ溶液　　　　　　　　　　１０μｌ
・Ｍ１３フォーワードプライマー　　　２μｌ（４ｐｍｏｌ）
・ＤＴＣＳ　Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　　　　８μｌ
【００２３】
ここで、Ｍ１３フォーワードプライマーの配列は配列表の配列番号９に示す塩基配列を有するものであり、ＤＴＣＳ　Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　はＢｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　社が提供したものをそのまま用いた。
【００２４】
サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。まず９５℃、２０秒のＤＮＡ変性、５０℃、３０秒のアニーリング反応及び６０℃、４分の伸長反応を１サイクルとして３０サイクル行った。シークエンス溶液はエタノール沈殿法でＤＮＡを精製し、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　社のＣＥＱ２０００　を用いてＤＮＡ配列解析をした。
６種類のサンプルそれぞれの結果を第１表に示した。第１表において、それぞれのサンプルで用いた基質ＤＮＡのウラシルに相当する位置に相補塩基として取り込まれた塩基の種類、及び、塩基が取り込まれなかった場合（欠失）の割合をパーセントで示した。
【００２５】
【表１】
第１表　変異の種類
2004135628.tif 000002
【００２６】
第１表から明らかなように、基質のＤＮＡのうち、もともとウラシルがあった位置にはチミン（Ｔ）かシトシン（Ｃ）のいずれかが良く取り込まれ、チミン又はシトシンに変換される場合が８〜９割程度の確率で生じた。一方、欠失変異が１５％程度の確率で生じた。
また、チミン：シトシンの比率については、３：２〜１０：０程度であったが、ウラシルの隣接塩基対にグアニン（Ｇ）やシトシン（Ｃ）がある場合は、シトシンに変換する頻度が高くなった。
このことから、ウラシルを１つ含むＤＮＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより処理することにより、脱塩基部位を含むＤＮＡを調製し、このＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、ＤＮＡに変異を効率良く導入できることが明らかとなった。
【００２７】
実施例２（脱塩基部位を１０箇所含むＤＮＡを鋳型とした場合）
先の実施例１では、比較的短いＤＮＡにウラシルを１つ含まれたものを鋳型とした。次に、ウラシルが多数含まれた比較的長いＤＮＡを基質としても、同じように、変異が導入されることを確認するために、以下の実施例２を行った。
ウラシルを１０塩基含む配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を持つ鋳型ＤＮＡ（１３８塩基）を化学合成した。
５’　側の２０塩基の配列は、先に使用したＰｒｉｍｅｒ−１（配列表の配列番号７参照）と同一である。また、３’側の２７塩基は、先に使用したＰｒｉｍｅｒ−２（配列表の配列番号８参照）と相補的である。
この二つの塩基配列に挟まれている部分は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ　由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子の、Ｎ末端部分の遺伝子配列情報であり、１０塩基毎にウラシル塩基を導入した。
このウラシルを複数含むＤＮＡにウラシルＤＮＡグリコシラーゼを作用させ、得られるＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を実施した。実験条件は、先の実施例１と全く同一である。
ＰＣＲにより得られた遺伝子増幅産物を、実施例１と同様にしてクローニングし、それらのシークエンス解読した。
【００２８】
その結果、ウラシル（Ｕ）のあった部位にチミン（Ｔ）が導入されたものは７６％、シトシン（Ｃ）は９％、アデニン（Ａ）は２％、グアニン（Ｇ）は１％、欠失は１２％であった。
このことから、ウラシルを複数含むＤＮＡであっても、これをウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより処理することにより脱塩基部位を含むＤＮＡを調製し、このＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、ＤＮＡに変異を効率良く導入できることが確認された。
【００２９】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明の変異導入法によれば、ＤＮＡ上に塩基置換や欠失などの変異を簡便、かつ短時間で効率よく導入することができる。
従って、本発明の変異導入法は、遺伝子、タンパク質の機能改変技術として有用である。
【００３０】
【配列表】
2004135628.tif 000003
2004135628.tif 000004
2004135628.tif 000005
2004135628.tif 000006