(57)【要約】【課題】乾燥耐性を増強することにより、長期保存に適し、保存後の生育や発酵能力が高い酵母を得ることが課題である。【解決手段】乾燥耐性機構の解明とそれを利用した乾燥耐性酵母とその育種理論は、今後、他の微生物、植物、動物へも応用が期待できる有用な技術となる。本発明では、乾燥耐性に必要な酵母遺伝子を網羅的に同定し、その情報から乾燥耐性のメカニズムを突きとめた。さらに、液胞をフラグメント化することにより乾燥に強い酵母も育種できた。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液胞のフラグメント化により乾燥耐性が増強された酵母。
【請求項２】
液胞の形態形成に係わる遺伝子を操作することにより乾燥耐性が増強された酵母。
【請求項３】
液胞の形態形成に係わる遺伝子が  ｖａｍ７、ｖｐｓ５、ｖａｍ６，  ｖｐｓ４１、ｐｅｐ３，  ｖｐｓ３３のいずれかである、請求項１または２に記載の乾燥耐性が増強された酵母。
【請求項４】
液胞がフラグメント化を起こすように遺伝子を操作することにより、乾燥耐性が増強された酵母。
【請求項５】
液胞のフラグメント化に係わる遺伝子である  ｖａｍ７、ｖｐｓ５、ｖａｍ６，  ｖｐｓ４１、ｐｅｐ３，  ｖｐｓ３３のいずれかが欠損した、請求項４に記載の乾燥耐性が増強された酵母。
【請求項６】
乾燥耐性のない酵母のリストによりわかった乾燥耐性可能な酵母遺伝子欠損株の乾燥保存輸送法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
乾燥耐性を増強することによる、長期保存に適し、保存後の生育発酵能力が高い酵母に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵母のトレハラーゼ遺伝子の破壊により、乾燥耐性を改良できることが報告されている（非特許文献１）。また改良技術として、パン酵母ＡＴＨ１および／またはＮＴＨ１遺伝子を破壊した１倍体酵母の交配による乾燥耐性パン酵母に関する特許が出願されている（特許文献１）。しかしながら、遺伝子破壊によって発酵製品の風味等が損なわれる例も多く、他の手段による乾燥耐性の改良が望まれている。
【０００３】
Ｗｉｎｚｅｌｅｒ  らは、ＥＵＲＯＦＡＮプロジェクトにより、酵母ゲノムの全遺伝子配列を報告するとともに、すべての遺伝子の一つ一つをノックアウトした酵母ライブラリーを構築している（非特許文献２）。この酵母遺伝子欠損株の保存や輸送においては、冷凍や生細胞の直送が利用されており輸送時も冷やす必要が生じ、輸送の時間と重量増が問題となっている。
【０００４】
また、ＥＵＲＯＦＡＮプロジェクトにより作製された遺伝子欠損株の内から、液胞の小型化やフラグメント化に関連した遺伝子欠損株が取得されている（非特許文献３）。この非特許文献３では液胞がフラグメント化する遺伝子群が同定されていたが、我々の結果では、いずれのフラグメント化変異株も乾燥耐性が低下していないことがわかった。
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−２４３９４４
【非特許文献１】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６２，  １５６３，  １９９６
【非特許文献２】Ｗｉｎｚｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５，  ９０１，  １９９９
【非特許文献３】Ｓｅｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １３，  ７８２，  ２００２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
乾燥耐性を増強することにより、長期保存に適し、保存後の生育や発酵能力が高い酵母を得ることが課題である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
水分は、生物の生存に重要である。しかしながら非常に多くの生物が、完全な脱水状態でも生き残ることが可能であり、酵母はそれらの一つである。なぜ酵母は、乾燥状態でも生き残ることができるのであろうか。どのような遺伝子が、脱水状態での生き残りのためのプロセスに関与しているのであろうか。乾燥への適応の基礎となるメカニズムを解明するため、本発明者らは酵母における研究を行った。生存に必須ではない遺伝子欠損株を用いて、乾燥プロセスに関与している遺伝子を、系統的かつ完全に同定した。
【０００８】
乾燥酵母はドライイーストとしてパンや醸造に利用されている。乾燥された酵母は長期の保存も可能であり、かつ、重量が軽減するため輸送においても高いメリットがある。しかも、乾燥酵母を利用したパンは、風味もよいことが知られている。乾燥後には必ず酵母の何割かは死んでおり、よい乾燥法と乾燥に強い酵母が求められてきた。乾燥に強い酵母は、これまで経験的にしか取得されておらず，乾燥適応のメカニズムはほとんどわかっていない。そのしくみを知ることで、より乾燥に強い酵母が育種できる。育種した酵母は、パン、醸造へ利用することで長期の保存と、保存後に再生させたときの発酵能力が高いことが見込まれ、有用な酵母となる。また、どのような遺伝子が乾燥酵母作製に必要かがわかれば、酵母株の保存や輸送においても有用な情報となり、大量の種類の酵母を乾燥させて輸送することができる。
【０００９】
酵母以外にも様々な微生物が食品に関わっている。例えば、麹菌やキノコなど利用される形態は乾燥状態が多い。これらの微生物においても共通する乾燥耐性機構が存在していると考えられ、酵母で解明した乾燥耐性機構を応用し、長期保存に適し、再生利用時に能力の高い食品微生物を育種することが可能である。
【００１０】
食品微生物に限らず、産業用酵母や産業用微生物においても輸送重量の軽減、長期保存と保存後の再生において能力の高い状態を達成できれば、タンパク生産宿主や流通輸送に利用しやすい産業用微生物としても価値がある。
【００１１】
さらに、微生物のみならず、乾燥耐性は植物においても重要な問題である。現在、植物の乾燥耐性機構は将来の食料難を見越し、乾燥土壌でも生育能力の高い植物が精力的に研究されているが、乾燥耐性機構それ自体の解明が遅れている現在、いくつかの乾燥耐性に関わる遺伝子が知られているに過ぎない。ゲノムレベルでの系統的な研究は、植物では全くないのが現状である。酵母における乾燥耐性機構の解明により、その原理を植物へ応用し、乾燥耐性植物を育種することは現実的に可能である。
【００１２】
以上のように、乾燥耐性機構の解明とそれを利用した乾燥耐性酵母とその育種理論は、今後、他の微生物、植物、動物にも応用が期待できる有用な技術となる。本発明では、乾燥耐性に必要な酵母遺伝子を網羅的に同定し、その情報から乾燥耐性のメカニズムを突きとめた。さらに、液胞をフラグメント化することにより乾燥に強い酵母も育種できた。
【００１３】
【発明の実施の形態】
発明の実施の形態を、実施例にもとづき図面を参照して説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００１４】
【実施例】
ＥＵＲＯＦＡＮプロジェクトにより作製された遺伝子欠失株の内から、酵母の生存に必須ではない遺伝子欠失株４，７７９株を選択し、乾燥状態での生存状態を試験した。９６ウェルプレート上の各ウェルに、それぞれ異なる遺伝子欠失株を植菌して５０μｌのＹＰＤ培地中で２８℃、２４時間培養した。次に、各々のウェルに２５μｌのＹＰＤ培地を入れてある別の９６ウェルプレートにレプリケーターを用いて植菌し、２８℃、２４時間培養した。その後に、蓋を取り外した状態の９６ウェルプレートを、シリカゲルを敷き詰めたドライボックス中に入れ、ドライボックスの蓋を密閉した。ドライボックスには温度計と湿度計が装備されており、乾燥条件は２８〜３１℃、１２〜２６時間であった。また、乾燥後のボックス内の湿度は、０％であった。乾燥後のプレートは、室温で２〜３日間、密封状態で保存した（図１）。なお、乾燥後の遺伝子欠損株は、均等に乾燥されていた。
【００１５】
乾燥酵母の再生法は、乾燥後のプレートの各ウェルに３０μｌの蒸留水を添加し、ボルテックスによりプレートを振とうして乾燥菌体を再懸濁させた後、各ウェルから５μｌの懸濁液を分取してＹＰＤ寒天プレート上にスポットした。２８℃、２日間の培養後の菌体の生育状態を調べた（図２）。ここで生育状態が悪い場合は、該当する遺伝子の欠損が、乾燥耐性に影響している遺伝子となる。
【００１６】
９６ウェルプレートＮｏ．０３３９の結果を、一例として図３に示した。遺伝子名（Ｇｅｎｅ  Ｎａｍｅ）が未定の遺伝子が含まれているため、図３左側の各ウェル中の記号は、ＯＲＦ（  Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  ）名で遺伝子を示してある。図３右側は、ＹＰＤ寒天プレート上２８℃、２日間培養後の菌体の生育状態を示す写真である。マイナス記号を付した菌株は、まったく生育しなかった。プラス記号を付した菌株は、生育状態が悪いことを示している。
【００１７】
最初のスクリーニングにより、遺伝子欠損株４，７７９株から、まったく生育しなかった株および生育状態が悪い株として、１１８株を選択した。ピックアップした１１８株を再試験にかけ、８１株を選抜した（表１）。その結果、乾燥耐性に関与している可能性がある遺伝子として、ミトコンドリア機能に関与している遺伝子群と液胞機能に関与している遺伝子群の２種類の主要グループを見出した。そこで、これらの機能に包含されているいくつかの形質について試験してみた。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
選抜した８１株を５０μｌのＹＰＤ培地に植菌し、２８℃で２４時間培養した。１００倍に希釈した後、それぞれ５μｌずつ寒天プレート上にスポットし、２８℃で２４時間培養した。試験した形質は、温度感受性（ＹＰＤ３７℃）、高浸透圧（１Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ＮａＣｌ  感受性（０．９Ｍ  ＮａＣｌ）、カルシウム感受性（０．１Ｍ  ＣａＣｌ２）、液胞機能欠損（ｐＨ７．５）、ミトコンドリア機能欠損（ＹＰＧ）の７種類である。
【００２０】
結果の詳細は、表１に示した。脱水後の生存率が減少した８１株中の５０株は、唯一の炭素源としてグリセロールを含むＹＰＧ培地中では生育できなかった。この結果は、脱水状態への適応の間に、呼吸機能が主要な役割を果たしていることを示している。１７株は、ｐＨ７．５という培養条件下では生育できなかった。中性域のｐＨ条件下で生育できないという形質は、液胞機能の欠損を示している。実際、これら１７株中の１０株は、液胞中のＡＴＰ分解酵素であるＶ−ＡＴＰａｓｅをコードしている遺伝子が破壊されていた。この結果は、乾燥条件下における生き残りには液胞機能が重要であることを示している。
【００２１】
表１以外の遺伝子破壊株は、乾燥後にも野生株と同じか、再生後の酵母を利用する上で十分量の生育を保証できる酵母株であることがわかった。したがって、ＥＵＲＯＦＡＮプロジェクトにより作製された遺伝子欠損株の内で、表１以外の酵母株を保存または輸送するときに乾燥酵母を利用することが可能となる。なお、乾燥後１年を経ても十分な生存率を維持していることも確認している。
【００２２】
酵母の乾燥実験において、液胞機能欠損株が多かった（８１株中１７株）ことに着目した。酵母の液胞は細胞内のかなりの体積を占め、通常一つである。大きな液胞が脱水することで、液胞内外の物質輸送や浸透圧、イオン濃度などの平衡が崩れると液胞が破壊されてしまうと考えられる。このことは，液胞の物質輸送に深く関与するＡＴＰａｓｅの欠損株が、乾燥に弱い株としていくつも同定されたことからも推測される。しかも、大きな液胞が一つしかないので、一つの液胞が壊れるともう再生が不能となり、細胞に重大な障害を与える。もし、液胞の体積が小さく細胞内に多数存在していれば、液胞の恒常性の維持にとっても好都合であり、かつ、いくつかの液胞が壊れても残りの液胞が機能することができれば、再生後にも機能回復が十分可能であると考えられる。従って、液胞のフラグメント化変異体に注目した。
【００２３】
ＥＵＲＯＦＡＮプロジェクトにより作製された遺伝子欠損株の内から、液胞の小型化やフラグメント化に関連した遺伝子欠損株が取得されている（非特許文献３）。この文献では液胞がフラグメント化する遺伝子群が同定されていた。我々の結果とこのフラグメント化変異とを比較すると、いずれのフラグメント化変異株も乾燥耐性が低下していないことがわかった。そこで、これらのフラグメント化変異株の乾燥耐性能を野生型株と比較した。まず、遺伝子欠損により液胞がフラグメント化する変異株としてｖａｍ７，  ｖｐｓ５，ｖａｍ６，ｖｐｓ４１，ｐｅｐ３，  ｖｐｓ３３の６株の液胞を観察した（図４）。液胞を特異的に染色する蛍光試薬ＦＭ４−６４による染色像を比較すると、野生型のＢＹ４７４３株では、細胞内に大きな液胞が１個だけ存在していた。それに対して、遺伝子欠損により液胞がフラグメント化する変異株  ｖａｍ７，  ｖｐｓ５，ｖａｍ６，ｖｐｓ４１，ｐｅｐ３，  ｖｐｓ３３の６株は、予想どおり、いずれの欠損変異株も液胞がフラグメント化して複数個存在しており、個々の液胞のサイズも小型化して、細胞質全体が染まる形質を示した。これらの株を乾燥後，生存率を野生型株と比較した（図５）。その結果、これらの６株は野生型株よりも乾燥耐性能が増強されていることがわかった。また、表１の乾燥後の生育ができない株としてｖｍａ２２，  ｓｐｔ２０，  ｖｍａ２の３株を選択して乾燥後の生存率を調べてみると、全く生存するコロニーが現れなかった。この結果から、液胞のフラグメント化により乾燥に強くなったことを、明確に示すことができた。
【００２４】
【発明の効果】
本発明により、乾燥耐性を増強することによる長期保存に適した、乾燥生存率が向上し発酵能力を維持できる酵母を、得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵母の乾燥試験の概要を示す図である。
【図２】乾燥試験後の酵母の再生法を示す図である。
【図３】乾燥試験後の酵母の再生状態の一例を示す図である。
【図４】液胞がフラグメント化している変異株を示す図である。
【図５】液胞のフラグメント化により乾燥耐性が増強されることを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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