(57)【要約】【課題】非特異吸着を抑制し、かつ安定した測定ベースラインを与えることができる、表面プラズモン共鳴測定装置に用いられる測定チップを提供すること。【解決手段】誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化され、かつ前記金属膜が疎水性高分子化合物でコーティングされている上記の測定チップ。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化され、かつ前記金属膜が疎水性高分子化合物でコーティングされている上記の測定チップ。
【請求項２】
疎水性高分子化合物でコーティングされた金属膜の表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有する、請求項１に記載の測定チップ。
【請求項３】
生理活性物質を固定化することができる官能基が、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ３ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基である、請求項２に記載の測定チップ。
【請求項４】
生理活性物質が共有結合により表面に結合している、請求項１から３の何れかに記載の測定チップ。
【請求項５】
請求項１から３の何れかに記載の測定チップと生理活性物質とを接触させて、該測定チップの表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程を含む、測定チップに生理活性物質を固定化する方法。
【請求項６】
生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項１から３の何れかに記載の測定チップと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項７】
請求項１から３の何れかに記載の測定チップを有する表面プラズモン共鳴測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面プラズモン共鳴測定装置に用いられる測定チップ、及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。
【０００６】
一方、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定する場合、検体物質は必ずしも単一成分ではなく、例えば細胞抽出液中などのような不均一系で検体物質を測定することも要求される。その場合、種々の蛋白質、脂質などの夾雑物が検出表面に非特異的な吸着を起こすと、測定検出感度が著しく低下する。上記の検出表面では、非特異吸着が極めて起こりやすく問題があった。
【０００７】
この問題を解決するためにいくつかの方法が検討されている。例えば、金属表面にリンカーを介し、親水性のハイドロゲルを固定化することで、物理吸着を抑制する方法も使用されてきた（特許文献１、特許文献３及び特許文献４を参照）。しかしながら、この方法でも非特異吸着の抑制性は十分なレベルではなかった。
【０００８】
【特許文献１】
特許第２８１５１２０号
【特許文献２】
特開平９−２６４８４３号
【特許文献３】
米国特許第５４３６１６１号
【特許文献４】
特開平８−１９３９４８号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、非特異吸着を抑制し、かつ安定した測定ベースラインを与えることができる、表面プラズモン共鳴測定装置に用いられる測定チップを提供することを解決すべき課題とした。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、誘電体ブロックと金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化され、かつ前記金属膜が疎水性高分子化合物でコーティングされている測定チップを、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜、光源、光学系、および光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置において用いることにより、非特異吸着を抑制し、かつ安定した測定ベースラインを与えることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明によれば、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化され、かつ前記金属膜が疎水性高分子化合物でコーティングされている上記の測定チップが提供される。
【００１２】
好ましくは、本発明の測定チップは、疎水性高分子化合物でコーティングされた金属膜の表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有する。
好ましくは、生理活性物質を固定化することができる官能基は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ３ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基である。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している上記の測定チップが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の測定チップと生理活性物質とを接触させて、該測定チップの表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程を含む、測定チップに生理活性物質を固定化する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している上記の測定チップと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の測定チップを有する表面プラズモン共鳴測定装置が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の測定チップは、本明細書中に記載した構成を有する表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、誘電体ブロックとこの誘電体ブロックの一面に形成された金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化され、かつ前記金属膜が疎水性高分子化合物でコーティングされていることを特徴とする。
【００１５】
本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００１６】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００１７】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００１８】
疎水性高分子化合物の金属膜へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００１９】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。
【００２０】
金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記金属膜への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２１】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００２２】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２３】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２４】
疎水性高分子化合物でコーティングした金属膜においては、最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「最表面」とは、「金属膜から最も遠い側」という意味である。
【００２５】
好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ３ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００２６】
最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、それらの官能基の前駆体を含有する疎水性高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。例えば−ＣＯＯＣＨ３基を含有する疎水性高分子化合物であるポリメチルメタクリレートを金属膜上にコーティングした後、その表面をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間接触させると、最表面に−ＣＯＯＨ基が生成する。
【００２７】
上記のようにして得られた測定チップにおいて、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００２８】
本発明の測定チップの表面上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００２９】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原２６、８６、５５、１１１  、１５７  などに対する抗体等を使用することができる。
【００３０】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００３１】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００３２】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００３３】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。
【００３４】
上記のようにして生理活性物質を固定化した測定チップは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００３５】
即ち、本発明によれば、生理活性物質が固定化された本発明の測定チップを用いて、これに被験物質を接触させることにより、該測定チップに固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定する方法が提供される。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
【００３６】
本発明では、測定チップの表面に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術により検出する。
【００３７】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００３８】
次に、本発明の測定チップを備えた表面プラズモン共鳴測定装置について説明する。
表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。
【００３９】
本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置は、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。
【００４０】
また、前記の通り、前記誘電体ブロックは、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。さらには前記金属膜が疎水性高分子化合物でコーティングされている。
【００４１】
本発明では、具体的には、特開２００１−３３０５６０号公報記載の図１〜図３２で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置、特開２００２−２９６１７７号公報記載の図１〜図１５で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置を好ましく用いることができる。特開２００１−３３０５６０号公報および特開２００２−２９６１７７号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
【００４２】
例えば、特開２００１−３３０５６０号公報記載の表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる複数の測定ユニットと、これら複数の測定ユニットを支持した支持体と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段と、前記複数の測定ユニットの各誘電体ブロックに関して順次前記全反射条件および種々の入射角が得られるように、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、各測定ユニットを順次前記光学系および光検出手段に対して所定位置に配置する駆動手段とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置が挙げられる。
【００４３】
なお、上記の測定装置においては、例えば前記光学系および光検出手段が静止状態に保たれるものとされ、前記駆動手段が、前記支持体を移動させるものとされる。
【００４４】
その場合、前記支持体は、回動軸を中心とする円周上に前記複数の測定ユニットを支持するターンテーブルであり、また前記駆動手段は、このターンテーブルを間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、この支持体を前記複数の測定ユニットの並び方向に間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。
【００４５】
一方、上記とは反対に、前記支持体が静止状態に保たれるものであり、前記駆動手段が、前記光学系および光検出手段を移動させるものであっても構わない。
【００４６】
その場合、前記支持体は、円周上に前記複数の測定ユニットを支持するものであり、前記駆動手段は、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。
【００４７】
他方、前記駆動手段が、その回動軸を支承するころがり軸受けを有するものである場合、この駆動手段は、該回動軸を一方向に回動させて前記複数の測定ユニットに対する一連の測定が終了したならば、この回動量と同量だけ該回動軸を他方向に戻してから、次回の一連の測定のためにこの回動軸を前記一方向に回動させるように構成されることが望ましい。
【００４８】
また上記の測定装置においては、前記複数の測定ユニットが連結部材により１列に連結されてユニット連結体を構成し、前記支持体が、このユニット連結体を支持するように構成されていることが望ましい。
【００４９】
また上記の測定装置においては、前記支持体に支持されている複数の測定ユニットの各試料保持機構に、自動的に所定の試料を供給する手段が設けられることが望ましい。
【００５０】
さらに上記の測定装置においては、前記測定ユニットの誘電体ブロックが前記支持体に固定され、測定ユニットの薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが上記誘電体ブロックに対して交換可能に形成されていることが望ましい。
【００５１】
そして、このような測定チップを適用する場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、前記誘電体ブロックと組み合う状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。
【００５２】
あるいは、測定ユニットの誘電体ブロック、薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが前記支持体に対して交換可能に形成されてもよい。
【００５３】
測定チップをそのような構成とする場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、支持体に支持される状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。
【００５４】
他方、前記光学系は、光ビームを誘電体ブロックに対して収束光あるいは発散光の状態で入射させるように構成され、そして前記光検出手段は、全反射した光ビームに存在する、全反射減衰による暗線の位置を検出するように構成されることが望ましい。
【００５５】
また上記光学系は、光ビームを前記界面にデフォーカス状態で入射させるものとして構成されることが望ましい。そのようにする場合、光ビームの上記界面における、前記支持体の移動方向のビーム径は、この支持体の機械的位置決め精度の１０倍以上とされることが望ましい。
【００５６】
さらに上記の測定装置において、測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光源は前記支持体より上の位置から下方に向けて前記光ビームを射出するように配設され、前記光学系は、前記下方に向けて射出された前記光ビームを上方に反射して、前記界面に向けて進行させる反射部材を備えていることが望ましい。
【００５７】
また、上記の測定装置において、前記測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光学系は、前記光ビームを前記界面の下側から該界面に入射させるように構成され、前記光検出手段は前記支持体よりも上の位置で光検出面を下方に向けて配設されるとともに、前記界面で全反射した光ビームを上方に反射して、前記光検出手段に向けて進行させる反射部材が設けられることが望ましい。
【００５８】
他方、上記の測定装置においては、前記支持体に支持される前および／または支持された後の前記測定ユニットを、予め定められた設定温度に維持する温度調節手段が設けられることが望ましい。
【００５９】
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された測定ユニットの試料保持機構に貯えられた試料を、前記全反射減衰の状態を検出する前に撹拌する手段が設けられることが望ましい。
【００６０】
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された複数の測定ユニットの少なくとも１つに、前記試料の光学特性と関連した光学特性を有する基準液を供給する基準液供給手段が設けられるとともに、前記光検出手段によって得られた、試料に関する前記全反射減衰の状態を示すデータを、前記基準液に関する前記全反射減衰の状態を示すデータに基づいて補正する補正手段が設けられることが望ましい。
【００６１】
そのようにする場合、試料が被検体を溶媒に溶解させてなるものであるならば、前記基準液供給手段は、基準液として前記溶媒を供給するものであることが望ましい。
【００６２】
さらに、上記の測定装置は、測定ユニットの各々に付与された、個体識別情報を示すマークと、測定に使用される測定ユニットから前記マークを読み取る読取手段と、測定ユニットに供給される試料に関する試料情報を入力する入力手段と、測定結果を表示する表示手段と、この表示手段、前記入力手段および前記読取手段に接続されて、各測定ユニット毎の前記個体識別情報と前記試料情報とを対応付けて記憶するとともに、ある測定ユニットに保持された試料について求められた測定結果を、その測定ユニットに関して記憶されている前記個体識別情報および前記試料情報と対応付けて前記表示手段に表示させる制御手段とを備えることが望ましい。
【００６３】
上記した測定装置を用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する場合、前記測定ユニットの１つにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出した後、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、別の測定ユニットにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出し、その後前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、前記１つの測定ユニットにおける試料に関して、再度全反射減衰の状態を検出することにより測定を行うことができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６４】
【実施例】
以下の実験は、特開２００１−３３０５６０号公報の図２２に記載の装置（以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ）（本明細書において図１として示す）、及び同公報の図２３に記載の誘電体ブロック（以下、本発明の誘電体ブロックと呼ぶ）（本明細書において図２として示す）を用いて行った。
【００６５】
図１に示す表面プラズモン共鳴測定装置は、測定ユニットを支持する支持体として、互いに平行に配された２本のガイドロッド４００，４００に摺動自在に係合し、それらに沿って図中の矢印Ｙ方向に直線移動自在とされたスライドブロック４０１が用いられている。そしてこのスライドブロック４０１には、上記ガイドロッド４００，４００と平行に配された精密ねじ４０２が螺合され、この精密ねじ４０２はそれとともに支持体駆動手段を構成するパルスモータ４０３によって正逆回転されるようになっている。
【００６６】
なおこのパルスモータ４０３の駆動は、モータコントローラ４０４によって制御される。すなわちモータコントローラ４０４には、スライドブロック４０１内に組み込まれてガイドロッド４００，４００の長手方向における該スライドブロック４０１の位置を検出するリニアエンコーダ（図示せず）の出力信号Ｓ４０が入力され、モータコントローラ４０４はこの信号Ｓ４０に基づいてパルスモータ４０３の駆動を制御する。
【００６７】
またガイドロッド４００，４００の側下方には、それに沿って移動するスライドブロック４０１をそれぞれ左右から挟む形で、レーザ光源３１および集光レンズ３２と、光検出器４０とが配設されている。集光レンズ３２は光ビーム３０を集光する。また、光検出器４０が設置されている。
【００６８】
ここで本実施形態においては、一例として８個の測定ユニット１０を連結固定してなるスティック状のユニット連結体４１０が用いられ、測定ユニット１０は８個一列に並べた状態でスライドブロック４０１にセットされるようになっている。
【００６９】
図２は、このユニット連結体４１０の構造を詳しく示すものである。ここに示される通りユニット連結体４１０は、測定ユニット１０が８個、連結部材４１１により連結されてなるものである。
【００７０】
この測定ユニット１０は、誘電体ブロック１１と試料保持枠１３とを例えば透明樹脂等から一体成形してなるものであり、ターンテーブルに対して交換可能な測定チップを構成している。交換可能とするためには、例えばターンテーブルに形成された貫通孔に、測定ユニット１０を嵌合保持させる等すればよい。なお本例では、金属膜１２の上にセンシング物質１４が固定されている。
【００７１】
実施例１：測定チップの作製
（１）比較例：ＳＡＭ化合物（７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール）で被覆処理した測定チップの作製（ＳＡＭ：自己組織化膜）
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ  ＩＮＣ．）で３０分間処理した後、１ｍＭの７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（同仁化学）のエタノール溶液を金属膜に接触するように添加し、２５℃で１８時間表面処理を行った。その後、エタノールで５回、エタノール／水混合溶媒で１回、水で５回洗浄を行った。このサンプルをＳＡＭ処理チップと呼ぶ。
【００７２】
（２）ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）膜の作成
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ  ＩＮＣ．）で３０分間処理した後、０．５ｍｇ／ｍｌのポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液５μｌを金属膜に接触するように添加し、５℃で１５分間静置した。
【００７３】
（３）ポリメチルメタクリレート膜をＮａＯＨで処理した測定チップの作成
前記（２）で得られたサンプルに１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液をＰＭＭＡ膜に接触するように添加し、６０℃５時間静置した後、水で３回洗浄した。このサンプルをＰＭＭＡ／ＮａＯＨ処理チップと呼ぶ。
【００７４】
（４）ポリスチレン（ＰＳ）膜の作成
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ  ＩＮＣ．）で３０分間処理した後、０．５ｍｇ／ｍｌのポリスチレンのメチルエチルケトン溶液５μｌを金属膜に接触するように添加し、５℃で１５分間静置した。
（５）ポリスチレン膜をオゾン処理した測定チップの作成
前記（２）で得られたサンプルをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ  ＩＮＣ．）で３０分間処理した。このサンプルをＰＳ／オゾン処理チップと呼ぶ。
【００７５】
実施例２：測定チップの性能評価：
（１）蛋白質の非特異吸着の測定
測定チップ表面に対する非特異的な蛋白質の吸着はノイズの原因となる為、極力少ないほうが好ましい。以下方法により各バイオセンサー用チップに対するＢＳＡ（シグマ製）、アビジン（ナカライテスク製）の非特異吸着性を評価した。
【００７６】
ＳＡＭ処理チップ（実施例１−（１）の方法で作製）、ＰＭＭＡ／ＮａＯＨ処理チップ（実施例１−（３）の方法で作製）、ＰＳ／オゾン処理チップ（実施例１−（５）の方法で作製）に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、２０分間静置した。さらに水で洗浄後、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ、ｐＨ８．５）を各測定チップに添加し、２０分間静置後、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ビアコア社製、ｐＨ７．４）で洗浄した。
なお、上記で用いたＨＢＳ−ＥＰバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃＡｃｉｄ）０．０１ｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ０．１５ｍｏｌ／ｌ、ＥＤＴＡ  ０．００３ｍｏｌ／ｌ、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０  ０．００５重量％である。
【００７７】
次にそれらの測定チップを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、ＢＳＡ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ＨＢＳ−ＥＰバッファー）あるいはアビジン溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ＨＢＳ−ＥＰバッファー）を添加し、１０分間静置した。その後、ＨＢＳ−ＥＰバッファーで洗浄し、３分後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量を各蛋白質の非特異吸着量とした。
【００７８】
（２）蛋白質・検体化合物間の相互作用の測定
各測定用チップにニュートラルアビジン（ＰＩＥＲＣＥ製）を固定化し、Ｄ−ビオチン（ナカライテスク製）との相互作用測定を以下の方法で行った。
【００７９】
ＳＡＭ処理チップ（実施例１−（１）の方法で作製）、ＰＭＭＡ／ＮａＯＨ処理チップ（実施例１−（３）の方法で作製）、ＰＳ／オゾン処理チップ（実施例１−（５）の方法で作製）に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、２０分間静置後、ＨＢＳ−Ｎバッファー（ビアコア社製、ｐＨ７．４）で洗浄した。次に、ニュートラルアビジン溶液（１００μｇ／ｍｌ、ＨＢＳ−Ｎバッファー）を添加し、３０分静置後、ＨＢＳ−Ｎバッファーで洗浄した。以上の操作により、ニュートラルアビジンを各測定チップ表面に共有結合で固定化した。ニュートラルアビジンの添加前と洗浄後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量をニュートラルアビジンの固定化量（ＲＵ値）とした。
なお、上記で用いたＨＢＳ−Ｎバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃＡｃｉｄ）０．０１ｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ０．１５ｍｏｌ／ｌである。
【００８０】
さらに、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ、ｐＨ８．５）を各測定チップに添加後、ＨＢＳ−Ｎバッファーで洗浄することにより、ニュートラルアビジンと反応せずに残存したＣＯＯＨ基をブロックした。
【００８１】
次に、各測定チップを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、Ｄ−ビオチン（０．５μｇ／ｍｌ、ＨＢＳ−Ｎバッファー））を各測定チップに添加し、１０分間静置後、ＨＢＳ−Ｎバッファーで洗浄した。Ｄ−ビオチンの添加前と洗浄後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量をニュートラルアビジンに対するＤ−ビオチンの結合量とした。
【００８２】
（３）測定時のベースライン安定性の評価
特に低分子の検体化合物の結合を検出する場合、測定時のベースラインが不安定であると、その結合を検出することが極めて困難となる。
【００８３】
ベースラインの安定性は以下の方法で評価した。まず、各測定チップに前記（２）と同様の方法でニュートラルアビジンを固定化した。次にそれらの測定チップを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、ＨＢＳ−Ｎバッファーを添加した。そのまま３０分間静置し、その間の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量を記録した。この共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量は１０ＲＵ以下であることが好ましく、５ＲＵ以下であることがさらに好ましい。
【００８４】
（４）結果
表１に蛋白質の非特異吸着の測定結果、表２に蛋白質・検体化合物間の相互作用の測定結果、表３に測定時のベースラインの安定性を示す。
【００８５】
【表１】
2004286539.tif 000002
【００８６】
【表２】
2004286539.tif 000003
【００８７】
【表３】
2004286539.tif 000004
【００８８】
表１の結果から、本発明により、極めて蛋白質の非特異吸着の少ない表面を提供できることがわかる。表２の結果から、本発明の場合でも、従来の方法と同様に蛋白質の固定化、および検体化合物の検出が可能なことがわかる。表３の結果から、本発明により、測定時のベースラインを安定化できることがわかる。即ち、本発明により、非特異吸着を抑制し、かつ測定時のベースラインの安定性に優れた表面プラズモン共鳴測定装置用の測定チップを提供することができた。
【００８９】
【発明の効果】
本発明により、非特異吸着を抑制し、かつ測定時のベースラインの安定性に優れた表面プラズモン共鳴測定装置用の測定チップを提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、表面プラズモン共鳴測定装置を示す。
【図２】図２は、誘電体ブロックを示す。
【符号の説明】
１０  測定ユニット
１１  誘電体ブロック
１２  金属膜
１３  試料保持枠
１４  センシング物質
３１  レーザ光源
３２  集光レンズ
４０  光検出器
Ｓ４０  出力信号
４００  ガイドロッド
４０１  スライドブロック
４０２  精密ねじ
４０３  パルスモータ
４０４  モータコントローラ
４１０  ユニット連結体
４１１  連結部材
【図１】
2004286539.tif 000005
【図２】
2004286539.tif 000006