(57)【要約】【課題】　桿状ビリオンのコートタンパクは、らせん状に構築されており、伸長可能な粒子の内部にＲＮＡをらせん状に巻くようにしてＲＮＡ桿状ウイルス粒子をキャプシド化するように、遺伝子操作を行ったＲＮＡウイルス配列のサイズ範囲を拡張するために、桿状のコートにキャプシド化された組換えＲＮＡ配列を提供すること。【解決手段】　感染性ウイルス配列と、異種の構築起点およびコートタンパク遺伝子とを含むハイブリッドＲＮＡウイルス配列。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞に感染しそして該宿主細胞において複製し得るハイブリッドＲＮＡであって、第１のウイルス由来のＲＮＡセグメント、および該第１のウイルスとは異種の構築起点およびコートタンパク遺伝子をコードする異なるウイルス由来のＲＮＡ配列を、該ハイブリッドＲＮＡのＲＮＡ複製または感染性を妨害せずにこのような配列を容認し得る該ハイブリッドＲＮＡの領域に含む、ハイブリッドＲＮＡであって、ここで、該異なるウイルスは、該第１のウイルスよりも大きい、ハイブリッドＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（産業上の利用分野）
　本発明は、植物細胞を形質転換させたり、系統的に植物に感染させたりするための遺伝子工学に、ＲＮＡ植物ウイルスを使用することに関する。特に本発明は、異種のコートタンパクにウイルス配列をパッケージングすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
（従来の技術）
　ＲＮＡウイルス、特に（＋）鎖メッセンジャーセンスＲＮＡウイルスが植物の遺伝子操作に有用であることは認識されている。例えば、特許文献１および特許文献２を参照されたい（これらは参照文献としてここに採用する）。
【０００３】
　しかしながら、植物の遺伝子工学に対してＲＮＡウイルスを使用することを包含する従来の方法における問題点は、外来遺伝子のＲＮＡコピーを挿入するのに適当な部位を提供する多くの植物ウイルスが、自然な感染状態では、球状または二十面体のキャプシドにキャプシド化されるという事実であった。該キャプシドは、これらのウイルスによって保持され得る遺伝子物質の量に対して幾何学的な制約を課している。
【０００４】
　このように有用なウイルスの例は、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）やササゲクロロテックモットルウイルス（ＣＣＭＶ）のようなトリコルナビリダエ（Ｔｒｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）の三分節ウイルスである。これらのウイルスは二十面体キャプシドにパッケージングされる。ＢＭＶ　ＲＮＡ３部分は異種ＲＮＡの担体として広く研究されている。しかしながら、このＲＮＡ部分の機能的要素の構造を観察すると、天然のＢＭＶ　ＲＮＡ１の　３．２〜３．３ｋｂというサイズは、二十面体のＢＭＶコートによって保持され得る最大サイズにほぼ近い。
【０００５】
　ＢＭＶ　ＲＮＡ３のサイズは約２．１ｋｂであるので、パッケージングし得るＲＮＡ３誘導体に、天然のＢＭＶ　ＲＮＡ３配列の一部を欠失させることなく付加し得る外来配列の大きさは、せいぜい約１ｋｂ程度である。広く研究されているＢＭＶ　ＲＮＡ３の場合には、複製および遺伝子発現に対してシスである必要のない配列を同定することにより、このような欠失を有する変異体を構築し得る可能性が開かれるが、同量の元のウイルスＲＮＡを欠失させる必要がなく異種ＲＮＡ配列を付加し得ることは、より複雑なウイルス誘導体を作製する際に自由度と柔軟性とを増大させるのに非常に望ましい。ＢＭＶ　および等しい大きさの他のいくつかのウイルスに対しても、ウイルスのＲＮＡをパッケージングするのにＲＮＡサイズの上限と下限とが存在する可能性がある（非特許文献１）。
【０００６】
　このように、サイズに上限または下限の制約がなく、いくつかのＲＮＡを自由にパッケージングし得るコートタンパク中に組換えＲＮＡウイルス配列をキャプシド化することは望ましい。
【０００７】
　二十面体ウイルスとは対照的に、広範囲な植物ウイルスの部類は、硬質の桿状または可撓性のある桿状の形であるビリオンにまで拡張された。タバコモザイクウイルスは広く研究されている一例である。例えば、以下の文献を参照されたい：
非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５。
【０００８】
　このような桿状ビリオンのコートタンパクは、ＲＮＡ遺伝子によってコードされている。構築起点配列もパッケージングを開始するのに必要である。
【０００９】
　ＴＭＶササゲ株（Ｃｃ）の構築起点とコートタンパク遺伝子とを含むｃＤＮＡクローンは、非特許文献６によって単離されている。この特定のＴＭＶ株では、構築起点配列はコートタンパク遺伝子内にある；しかし、他の株では、構築起点とコートタンパク遺伝子とは別個である。
【特許文献１】欧州特許出願第８５３００９７９．３号
【特許文献２】欧州特許出願第８６３０１５８６．３号
【非特許文献１】Ａｈｌｑｕｉｓｔら（１９８４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７２：３６９−３８３
【非特許文献２】Ｍ．Ｈ．Ｖ．Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ（１９８１）、“トバモウイルス”、「植物ウイルスの感染および比較診断に関するハンドブック」、Ｅ．Ｋｕｒｓｔａｋ（編）、ｐｐ．５４１−５６４；
【非特許文献３】Ｐ．Ｊ．Ｇ．Ｂｕｔｌｅｒ（１９８４）、「タバコモザイクウイルスの構造と構築に関する最近の描像」、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２５３−２７９；
【非特許文献４】Ｄ．Ｌ．Ｂｅｃｋら（１９８５）、「ＴＭＶの全長ｃＤＮＡクローンの合成」、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、７５：１３３４（要約）；
【非特許文献５】Ｗ．Ｏ．Ｄａｗｓｏｎら（１９８６）、「タバコモザイクウイルスの完全ゲノムのｃＤＮＡクローニングおよび感染性の転写物の生産」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：１８３２−１８３６
【非特許文献６】Ｔ．Ｍｅｓｈｉら（１９８１）、「ＴＭＶ（ササゲ株）ＲＮＡのクローン化されたｃＤＮＡコピーの、構築起点、コートタンパクシストロン、および３’非コード領域を含むヌクレオチド配列」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８４：２０−２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
　桿状ビリオンのコートタンパクは、らせん状に構築されており、伸長可能な粒子の内部にＲＮＡをらせん状に巻くようにしてＲＮＡ桿状ウイルス粒子をキャプシド化する。このように、遺伝子操作を行ったＲＮＡウイルス配列のサイズ範囲を拡張するために、桿状のコートにキャプシド化された組換えＲＮＡ配列を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
　一般的に、例えば所望の宿主が、感染させるのが望ましいウイルスの配列の天然のコートタンパクに対して免疫性を確立する場合には、異種のコートタンパクキャプシドにウイルス配列をパッケージングすることが望ましい。しかし、本発明の以前には、１つより多くのＲＮＡウイルスに由来する機能（例えば、宿主特異性、感染性など）を組み合わせたハイブリッドウイルスは構築されていなかった。
【００１２】
　生育可能な組換え体は、ＲＮＡ配列に７０％の相同性のあるポリオウイルス１型と３型との間のｃＤＮＡレベルで構築された（Ｇ．Ｓｔａｎｗａｙら（１９８６）、「ｃＤＮＡを用いたポリオウイルスのタイプ間の組換え体の構築」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：１１８７）。この組換え体は、０．７４ｋｂの５’非翻訳配列と、３型由来の最初の１１個のポリタンパクコドンとを、１型由来の配列の残部とともに保存していた。報告されている第２の組換え体は、３型由来のＶＰ１キャプシドタンパク遺伝子の一部を１型の構造物に挿入したものを含んでいたが、この組換え体は生育可能ではなかった。このことは相同性を有さない機能領域を組み合わせることに問題があることを示している。
【００１３】
　広範囲のピコルナウイルスゲノム間における組換えの別の例は、ポリオウイルス１型とコクサッキーＢ３ウイルスとの間の組換えによる構築である（Ｂ．Ｌ．Ｓｅｍｌｅｒ　ら（１９８６）、「ポリオウイルスおよび温度感受性のコクサッキーウイルスのｃＤＮＡクローンに由来のキメラプラスミド」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：１７７７）。この場合には、コクサッキーＢ３の５’非コード領域の０．４ｋｂ　部分が、７０％の相同性を有する部分と置き換えることによって、ポリオウイルスの構造物に挿入された。得られた組換えウイルスは生育可能ではあったが、温度感受性の複製表現型を示した。
【００１４】
　組換えウイルスを生産するためのこれらの報告されている試みのいずれおいても、置き換えた部分に対して７０％より少ない相同性を有する置換部分を持つ生育可能なハイブリッドウイルスは生産されなかった。そして、いずれの場合も、２またはそれ以上の異なるウイルスに由来する別個の機能を再び成功裏に組み合わせたものはなかった。２つの異なるウイルス型由来のハイブリッドＲＮＡ植物ウイルスに関する人為的な構築も報告されていない。
【００１５】
　桿状ウイルスのキャプシド化されていない誘導体は、組換えＲＮＡ中に外来遺伝子を運ぶためのベクターとして最近使用されており（Ｔａｋａｍａｔｓｕ、Ｎ．ら「ＴＭＶ−ＲＮＡに媒介された外来遺伝子のタバコ植物における発現」（印刷中））、そして組換えＲＮＡ配列は桿状コートにインビトロでキャプシド化されている（Ｓｌｅａｔ、Ｄ．Ｅ．ら、「タバコモザイクウイルスＲＮＡの構築起点の配列によって導かれる組換えＲＮＡ分子の偽ウイルス粒子へのパッケージング（印刷中））。しかし、感染性ウイルス配列にとって外来であるキャプシドに組換えウイルスＲＮＡをインビボでパッケージングすることは、これまで報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
　項目１：感染性ウイルス配列と、異種の構築起点およびコートタンパク遺伝子とを含むハイブリッドＲＮＡウイルス配列。
【００１７】
　項目２：前記コートタンパク遺伝子に加えて、機能性タンパクをコードする異種配列を含む第１項に記載の配列。
【００１８】
　項目３：機能性ＲＮＡの異種配列を含む項目１に記載の配列。
【００１９】
　項目４：前記構築起点およびコートタンパク遺伝子が少なくとも１つの桿状ビリオンに由来する項目に記載の配列。
【００２０】
　項目５：前記構築起点およびコートタンパク遺伝子がタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に由来する項目１に記載の配列。
【００２１】
　項目６：項目１に記載のＲＮＡ配列に相補的なｃＤＮＡを含むプラスミド。
【００２２】
　項目７：ハイブリッド桿状ＲＮＡビリオン。
【００２３】
　項目８：ハイブリッド二十面体ＲＮＡビリオン。
【００２４】
　項目９：機能性ＲＮＡの異種配列を含むハイブリッドＲＮＡビリオン。
【００２５】
　項目１０：機能性異種ＲＮＡで植物をトランスフェクトさせる方法であって、該方法は以下の工程を包含する：
　（ａ）該植物を感染させ得る、第１のビリオンに由来するＲＮＡウイルス配列を、該機能性異種ＲＮＡと、
第２のビリオンに由来する構築起点およびコートタンパクとを含むように修飾することであり、ここで該第１および第２のビリオンは形状が異なる；
　（ｂ）１またはそれ以上の複製遺伝子をシスまたはトランスに与えて、該修飾されたＲＮＡウイルス配列の複製を確実にすること；
　（ｃ）該植物を（ａ）および（ｂ）の要素と接触させて、感染を起こさせること；および
　（ｄ）該植物によって該感染を系統的に広げること。
【００２６】
　（発明の要旨）
　ＲＮＡウイルスは、植物およびその他の高等生物の遺伝子工学において、除草剤、病害および害虫に対する抵抗性のような有益な性質を与えるための有用なベクターとなる。しかし、現存する系は望まれるような適応性がない。ＲＮＡウイルス配列のキャプシド化は、該ウイルスの宿主系によるかなりの、そして確実な分布拡大に必要であると思われる。例えば、コートのないＲＮＡウイルスは、単細胞およびプロトプラストに感染し得る。そして、ある単一成分のＲＮＡウイルスの場合、最初に接種された部位から離れた部位に不規則に広がり得る。しかし、特に多くの多成分植物ＲＮＡウイルスについては、単一の感染部位またはトランスフェクション部位からの植物を介する効率的な伝達に、ウイルスコート内へのキャプシド化を必要とする。本発明は、感染性ウイルス配列を異種コートタンパクキャプシド内にパッケージングされたハイブリッドウイルス作製法を提供する。インビトロまたはインビボでキャプシド化し得るハイブリッドウイルスＲＮＡ配列と同様に、キャプシド化ハイブリッドビリオンも提供される。
【００２７】
　本発明のハイブリッドＲＮＡウイルス配列は、感染性ウイルス配列と、異種の構築起点およびコートタンパク遺伝子とを含む。
【００２８】
　本発明のプラスミドは上記のＲＮＡ配列に相補的なｃＤＮＡを含む。
【００２９】
　機能性異種ＲＮＡで植物をトランスフェクトさせる本発明の方法は、以下の工程を包含する：
　（ａ）該植物を感染させ得る、第１のビリオンに由来するＲＮＡウイルス配列を、該機能性異種ＲＮＡと、第２のビリオンに由来する構築起点およびコートタンパクとを含むように修飾することであり、ここで該第１および第２のビリオンは形状が異なる；
　（ｂ）１またはそれ以上の複製遺伝子をシスまたはトランスに与えて、該修飾されたＲＮＡウイルス配列の複製を確実にすること；
　（ｃ）該植物を、およびの要素と接触させて、感染を起こさせること；および
　（ｄ）該植物によって該感染を系統的に広げること。
【００３０】
　ここで用いる“ハイブリッドＲＮＡウイルス”という用語は、生存可能な生体を形づくるために、２つまたはそれ以上の異なるウイルス由来の機能性配列を組み合わせた組換え体ウイルスを意味する。詳細には、本発明のハイブリッドＲＮＡウイルスは、あるＲＮＡウイルス由来の感染性ウイルス配列、および別のウイルス（またはその他のウイルス）由来の構築起点およびコートタンパク遺伝子を有するＲＮＡ配列である。“ハイブリッドＲＮＡビリオン”という用語は、キャプシド化された形のこのようなウイルスを意味する。
【００３１】
　多くの有用なＲＮＡウイルスは、付加し得る遺伝子の大きさを制限する正二十面体のコート内にキャプシド化される。それによって、桿状コートタンパクキャプシド内にＲＮＡウイルス配列をキャプシド化する方法が提供される。これらのコートタンパクキャプシドは、少なくともタバコモザイクウイルスの６．４ｋｂの大きさまでの、大きなサイズのＲＮＡ断片を収容するように拡張し得る。所望の大きさのＲＮＡ断片は、粒子が通常の物理的操作によって実質的に破砕されるほど大きくない限りは、桿状粒子内にキャプシド化され得る。
【００３２】
　組換え体ウイルスＲＮＡ配列は、通常はある型のコートタンパクにキャプシド化されているウイルス由来の本来のウイルス配列を、異なる型にキャプシド化したものとして提供される。好ましくは、正二十面体キャプシドに通常キャプシド化されるか、そうでなければ桿状キャプシドに通常キャプシド化されない感染性ウイルスを、桿状キャプシド生成のために遺伝子および構築起点と組み合わせる。このようにして、桿状キャプシド内に本来のウイルス配列をキャプシド化し得る。好ましくは、本来のウイルス配列を修飾して所望の外来遺伝子を含有させる。
【００３３】
　異種コートタンパク遺伝子および構築起点を結合させるのに適した本来のウイルスＲＮＡ配列は、ＲＮＡウイルス配列由来か、またはＲＮＡウイルス配列に相当する配列である。このようなウイルスの例は、当該技術分野で公知であるＢＭＶ、一般にトリコルナビリダエ（Ｔｒｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、およびその他の多くのような正鎖ウイルスである。さらに有用なウイルス配列は、逆転写されたウイルスまたはトラスポゾンＲＮＡ、ウイロイドおよびサテライトウイルス由来の、または相当する配列である。
【００３４】
　このようなウイルス配列は最小限として、宿主内に於ける複製能力および宿主への感染能力を有しているべきである。このような機能の決定因子は、シスで必要とされ得るか、またはその他の場合ではトランスで供給され得る。トランスにおける複製に充分である条件の一例は、ＢＭＶ　ＲＮＡ３を宿主内で複製させるための、ＢＭＶ　ＲＮＡ１　および２によりコードされるタンパクの存在の必要性である。これに対して、ある複製シグナルは、ＲＮＡ１および２で感染させた細胞において誘導される機構によってＲＮＡ３誘導体を複製させるように、シスで（すなわちＲＮＡ３誘導体に直接に結合して）存在させるべきである。
【００３５】
　このような本来のウイルス配列は、外来または異種遺伝子を付加するための適当な部位を有することも望ましい。遺伝子および配列に関する“外来”および“異種”という用語は、天然に存在する本来のウイルスにコードされない遺伝子または配列を意味する。このような外来遺伝子または配列は、本来のウイルス配列に必要な機能、すなわち、複製能力および宿主への感染能力を妨害しないいずれの部位にも挿入し得る。宿主内での発現に関して、“異種”遺伝子は、該遺伝子が配置される宿主内の位置に天然には存在しない遺伝子である。
【００３６】
　同様に、異種コートタンパク遺伝子および構築起点の配置される位置は、本来のウイルス配列のこのような必要な機能を妨害しない位置が望ましい。
【００３７】
　可撓性のある、または硬質の桿状ＲＮＡウイルス由来のコートタンパク配列は本発明において特に有用であり、該配列と構築起点とを組み合わせると、コートタンパク配列を制御し得る。一般に、当該技術分野で認められているように、構築起点はそれらのコートタンパク遺伝子に特異的である。それゆえ、コートタンパク遺伝子および構築起点は同じ生体由来であることが好ましい。遺伝子内に構築起点を有するコートタンパク遺伝子、例えば、ＴＭＶ　ササゲ（Ｃｃ）株遺伝子が特に好ましい。
【００３８】
　本来のウイルスＲＮＡに付加される外来ＲＮＡ配列は、機能性ＲＮＡであり得るか、または機能性ＲＮＡをコードし得る。そして、宿主生物の遺伝子型および表現型をトランスフェクションまたは形質転換し得る。機能性ＲＮＡは、特定の、そしてＲＮＡ断片によってもたらされることが知られているいずれの機能をも提供する。このような機能は、宿主細胞によって翻訳されると、有用あるいは所望の特性を有するペプチドまたはタンパクを合成する配列をコードするメッセンジャーＲＮＡとして作用するようなコード機能を包含するが、これに限定されない。このようなタンパクをここでは“機能性タンパク”と呼ぶ。ＲＮＡ断片は、例えば、リボゾームＲＮＡのように構造的でもあり得る；例えば、核内低分子ＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡのように制御的であるか、または触媒的であり得る。アンチセンスＲＮＡは、標的細胞内における相補的ＲＮＡの機能を阻害するのに有用である。
【００３９】
　当業者によって認められるように、もし挿入されたＲＮＡ配列が形質転換細胞によって直接翻訳される遺伝子からなるメッセンジャー−センスＲＮＡ型であるならば、遺伝子はイントロンのような非翻訳配列に妨害されない。一方、挿入遺伝子は自然に存在する遺伝子である必要はないが、修飾された１つ以上のコード断片合成物であり得るか、または１つ以上のタンパクをコードする。ＲＮＡはまた、修飾されたＲＮＡ分子の全長またはその他の特徴を調節するために、挿入および欠失を組み合わせることにより修飾され得る。
【００４０】
　挿入された外来ＲＮＡ配列は、非ウイルスまたはウイルス起源であり得る。そして、本来はＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかに相当し得る。これらの配列は、受容細胞の翻訳機構によって直接翻訳され得るか、またはそれらの機能性、構造性、あるいは制御的機能について認識され、利用される型であるのならば、その起源は原核生物または真核生物であり得る。
【００４１】
　上述のように、外来ＲＮＡ配列の“発現”は、機能性ＲＮＡまたは機能性タンパクの生産を包含し得る。この発現は、いずれの有用なレベルでもあり得る。そして、当業者により認められるように、所望の生産物および用いる宿主に依存する適当な制御因子が必要であり得る。このような制御因子を提供することは、当業者にとり通常の問題である。
【００４２】
　天然のＴＭＶ　ＲＮＡは、長さ約６．４ｋｂである。しかし、本発明の桿状キャプシドは、必要に応じて長く、または短くし得る。ＢＭＶの正二十面体キャプシドがキャプシド化し得る最大の大きさは約３．２ｋｂであると考えられているので、桿状コートを使用すると、前もって正二十面体にキャプシド化されたウイルスのみが接近しうる宿主において、系統的拡散のためのキャプシド化によってコンピテントに作製され得る、遺伝子操作されたウイルス配列の大きさの範囲をかなり拡張することが確認され得る。
【００４３】
　後に述べるように、外来ＲＮＡ配列の挿入は、対応するｃＤＮＡに含有されるすべての配列の逆転写により行うことが好ましい。または、本来はＤＮＡ由来の外来配列の場合、本来のＤＮＡ配列が用いられ得る。適当なベクターのいずれもが、このような遺伝子工学を実施するための基礎を提供するために用いられ得る。これらはすべて当業者に明らかである。好適なプラスミドは実施例で検討する。所望のＤＮＡ配列またはＤＮＡ断片の組み合わせを構築するための方法は、当該技術分野でよく知られている。これらの方法は、適当な制限酵素、結合方法およびオリゴヌクレオチドの変換を用いており、所望の機能を有する断片を組み合わせて構築するために役立つ。これらの操作性を確認するためのこのような構築物を調べる技術もよく知られているが、ここでは詳細を議論しない。
【００４４】
　同様に、遺伝子工学を実施および／またはインビトロでＤＮＡ配列が転写されたＲＮＡを得るにあたり、本発明のＤＮＡ配列を有するベクターのために、当該分野で公知の細菌宿主のいずれもが用いられ得る。例えば、欧州特許出願番号第８５３００９７９．３号に記載の方法により、インビトロにおける転写されたＲＮＡの生産を行い得る。
【００４５】
　当業者に明らかなように、適当な宿主特異性および複製機能を与えることによって本発明のＲＮＡ配列でいずれの植物も感染され得る。その他の真核生物もまた、単細胞および組織培養物のように適当な構築物で感染させ得る。本発明は、与えられた宿主の種類、またはＲＮＡウイルスの型のいずれにも制限されない。異種の保護コート、またはキャプシド化を提供する一般的効用、特にウイルス配列の大きさを拡張させるという効用は、付加されたＲＮＡ配列によって改良され得るようなウイルスの使用を包含するいずれの過程においても、改良として当業者に認められる。
【００４６】
　“系統的感染”という用語は、本来の接種部位の細胞以上を包含するように宿主生物系を通して広がる感染を意味する。宿主生物全体が感染する必要はない；感染の目的により、単一の器官または器官の一部で十分である。
【００４７】
　宿主生物に適用される“トランスフェクションされた”という用語は、該生物内部で複製されるような方法で生物細胞内へ本発明のウイルス配列を導入することを意味する。トランスフェクションさせるために、生物を系統的に感染させる必要はないが、系統的に感染させることが好ましい。
【００４８】
　宿主生物の感染を開始する方法は、当該技術分野で公知であり、適当な方法のいずれも使用し得る。植物への感染の好適な方法は、ウイルスが複製するか、または植物に感染するように、ウイルスまたはウイルスＲＮＡを含有する溶液を傷つけた植物に接触させることである。
【発明の効果】
【００４９】
　桿状ビリオンのコートタンパクが、らせん状に構築されており、伸長可能な粒子の内部にＲＮＡをらせん状に巻くようにしてＲＮＡ桿状ウイルス粒子をキャプシド化するように、遺伝子操作を行ったＲＮＡウイルス配列のサイズ範囲を拡張するために、桿状のコートにキャプシド化された組換えＲＮＡ配列が、本発明によって提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
　（発明の好適な実施態様）
　本発明の好ましい実施態様においては、正二十面体ウイルス、好ましくは三分節系ウイルス、そしてより好ましくは　ＢＭＶ、のＲＮＡ断片は、円筒状キャプシド中にパッケージングされる。好ましくは　ＴＭＶの、そしてより好ましくは　ＴＭＶササゲ株（Ｃｃ）のコートタンパクの円筒状キャプシド中にパッケージングされる。好ましくは、そのパッケージングされた配列はまた、異種遺伝子を含むように修飾される。
【００５１】
　ＢＭＶ　のゲノムは、それぞれ３．２、２．９および２．１ｋｂのメッセンジャーセンスＲＮＡ１、２、および３に分けられる。これらのＲＮＡのｃＤＮＡコピーは、一般的な転写ベクターであるｐＰＭ１中にクローン化された。このｐＰＭ１は、１９８４年３月７日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド、にＮｏ．４０１７として寄託された。ＲＮＡの１、２および３をそれぞれ含むクローンは、ｐＢ１ＰＭ１８、ｐＢ２ＰＭ２５　およびｐＢ３ＰＭ１と命名され、そして、それぞれＮｏ．４０１７１、４０１７０および４０１６９　として上記と同日にＡＴＣＣに寄託された。細胞が、ＢＭＶ　ＲＮＡ３に感染するためには、ＢＭＶ　ＲＮＡ１および２によってコードされたタンパクが存在しなければならない。好ましい実施態様においては、これら３つのＢＭＶ　ＲＮＡは、桿状ウイルスのコートタンパク内に、別々にキャプシド化されている。
【００５２】
　好ましい実施態様においては、ＢＭＶ　ＲＮＡ１、２および３は、それぞれ、適切な構築の起点を含むが、ＢＭＶ　ＲＮＡ３配列だけが加えられたコートタンパクを含む。上記いずれの配列も機能性タンパクまたは機能性ＲＮＡをコードする配列のような付加的なＲＮＡ　配列を含むように修飾され得るにもかかわらず、ＢＭＶ　ＲＮＡ３配列だけが該タンパクを含む。異種または外来の配列を挿入するためのＤＮＡ配列の修飾方法は、当該分野で既知である。一般に、ウイルスのＲＮＡ配列は、完全長のｃＤＮＡ転写物に転換され、そしてベクターにクローン化され、次いで外来ＤＮＡ断片を挿入する（該挿入物のＲＮＡ複製が中断したり感染性が妨害されないような領域中に挿入する）ことによって修飾される。
【００５３】
　パッケージングされているウイルスＲＮＡは、加えられたコートタンパク遺伝子により妨害されるのを回避するように欠失または不活性化した、それ自身のコートタンパクの遺伝子を有することが必要である。ウイルスコートタンパク遺伝子を不活性化する方法は、当該分野で既知である。例えば、Ａｈｌｑｕｉｓｔら、（１９８１）、「ブロムモザイクウイルスＲＮＡ３のヌクレオチド完全配列」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５３：２３−３８を参照されたい。遺伝子を不活性化する好適な方法は、その遺伝子またはその本質的な部分における単なる欠失である。他の方法としては、点突然変異または挿入による不活性化が包含される。
【００５４】
　異種コートタンパク遺伝子の翻訳の正確さを確実にするためには、本来のコートタンパクの翻訳の開始ＡＴＧコドンを（これが欠失していないならば）、修飾する必要もあり得る。そしてこれは、オリゴヌクレオチド置換のような、当該分野で既知の方法により達成され得る。もし、付加されたコートタンパクの配列が、それ自身の翻訳開始コドンを有するならば、本来のタンパクの開始コドンの欠失または不活性化が必要である。しかし、または、それは保持され、付加されたコートタンパク配列の翻訳を開始するのに使用され得る。但しこれは、それによって導入されるどのようなアミノ酸配列の変化も、ＲＮＡのパッケージングおよびキャプシドの形成に妨害を与えない場合においてである。
【００５５】
　桿状ビリオン粒子を生産する多くのＲＮＡウイルスが、当該分野で知られている（例えば、「植物のウイルス学」（第２版）Ｒ．Ｅ．Ｆ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ（１９８１）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、および”４ｔｈ　Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｔａｘｏｗｏｎｙ　ｏｆ　Ｖｉｒｕｓｅｓ”、（１９８２）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７：１−１９９を参照されたい。有用なコートタンパクおよび構築の起点となる配列は、単離され、そして余分な実験を行うことなく当該分野で既知の方法により、そのようなウイルスから逆転写され得る。好適な配列は、ＴＭＶ配列であり、最も好ましい配列は、ＴＭＶ　ササゲ（Ｃｃ）株のコートタンパク遺伝子のような、それ自身の構築起点が組み込まれているコートタンパクの遺伝子である。Ｍｅｓｈｉら、（前出）のｐＣｃ８Ｃ５プラスミドは、そのような配列に相当するｃＤＮＡを含んでいる。これをＭｅｓｈｉらの方法により調製し、ここで論じている実験のために用いた。この株の広範な有用性、そしてコートタンパク遺伝子の配列および構築の起点がＭｅｓｈｉら、（前出）により発表されているという事実から、このプラスミドおよび／または該配列の再構築を行うことは、当業者に容易である。
【００５６】
　標準的なクローン化技術によって、コートタンパク遺伝子および桿状ビリオンの構築起点の配列が、パッケージングされるべきウイルス配列中に連結される。好ましくは、そのウイルスの本来のコートタンパク遺伝子が除去される部位に連結される。しかし、ウイルスが複製し、そしてその宿主に感染する能力が妨害されなければ、どの部位に連結されてもよい。
【００５７】
　挿入された新しいコートタンパク遺伝子の翻訳の発現は、既知の方法によって行われ得る。以下の実施例においては、ＴＭＶコートタンパク遺伝子は、サブゲノムＢＭＶ　ＲＮＡ４の開始部位のすぐ下流に挿入され、このことにより、ＴＭＶ　コートタンパクのサブゲノムｍＲＮＡのＢＭＶ由来の合成が行われる。このＴＭＶ遺伝子は、従って“サブゲノムプロモーター”の下流に位置すると言われる。
【００５８】
　宿主植物中での発現が望まれる外来遺伝子は、ウイルスが複製する能力および該ウイルスが宿主に感染する能力を妨害しなければ、本来のウイルスのゲノム中の好都合な位置のどこにでも挿入され得る。好ましくは、外来遺伝子は、コートタンパクおよびそのサブゲノムのプロモーターのすぐ上流に挿入される。本来のウイルスのコートタンパクを通常制御するサブゲノムプロモーターのコピーはまた、そのような外来遺伝子の上流に配置され、その翻訳の発現を可能にする。
【００５９】
　ＲＮＡ転写物が、インビボ（例えば、細菌宿主中）で、またはインビトロ（当該分野で既知である）で調製され、そして、適当な植物宿主または植物組織に移植される。キャプシド化が、宿主生物中でおこるので、そのＲＮＡは、キャプシド化された形で、または溶液で使用され得る。
【００６０】
　当業者に理解されるように、あるウイルスは、感染および複製が最も好適に行われるための特別の条件を必要とし得る。そしてそれには、シスもしくはトランスで作用する遺伝子（その全ては植物もしくは植物組織に感染するときに存在するべきである）の存在が包含される。例えば、ＢＭＶ　ＲＮＡ３の感染には、ＢＭＶ　ＲＮＡ１および２の存在が必要である。さらに、ある宿主に対して必要な宿主特異性遺伝子を有するウイルスによる感染は、ある環境下では、通常はその宿主に影響しない第２のウイルスによる宿主の感染を可能にする。例えば、ＢＭＶ　ウイルス単独ではタバコに感染せず、そしてＴＭＶ　ウイルス単独では大麦に感染しないが、ＴＭＶ　およびＢＭＶ　ウイルスの混合物は、大麦およびタバコの両者に感染する（ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＮｉｃｈｏｌｓ（１９７７）　　　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、６７：４８４−４８９）。もし必要な遺伝子を供給する完全な本来のウイルスが使用されるならば、必要とされる遺伝子の全てを同定しマッピングする必要はない。
【００６１】
　宿主植物中で発現するように本来のウイルス遺伝子の一部分に挿入され得る適当な遺伝子としては、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）遺伝子；害虫抵抗性遺伝子（例えば、バシラスチューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の殺虫タンパク遺伝子）；病原菌抵抗性、除草剤耐性または抵抗性、改変された成長特性を有する、または新しい代謝経路の遺伝子；そして、植物または他の宿主生物中での商業的に有用なペプチドまたは薬剤の生産のための遺伝子；を包含する。一般に、その発現生成物が植物細胞内で機能的であるどのような異種遺伝子も、ここで述べるウイルス発現系内に挿入され得る。
【００６２】
　植物は、野外および温室内の条件下のいずれにおいてもトランスフェクトされ得る。修飾は、その特性に対する必要性に応じて、成長サイクル中のどのようなときにも行われ得る。例えば、害虫に対する抵抗性は、その収穫物が害虫により被害を受ける危険があるときにのみ、そして収穫物が害虫により最も影響を受けそうであるときに、付与され得る。他の特性は、二次的な性質（例えば、収穫後の飼料のタンパク含量の増加）を増強するのに用いられ得る。ＲＮＡウイルスの感染を受けるどのような植物の種類も、表現型の形質転換が可能である。ウイルスの選択および修飾の詳細は、当業者に知られかつ理解されている事柄から自由に選択される事項である。
【００６３】
　ＲＮＡウイルス由来の修飾ＲＮＡにより、表現型もしくは遺伝型を改変された細胞および生物体の他の用途は、修飾すべき広範囲のＲＮＡウイルス、および感染する広範囲の宿主細胞型が与えられれば、当業者にとって自明である。トランスフェクトした動物細胞、細菌細胞などの他の用途は、容易に想像され得る。例えば、αウイルスに感染する動物細胞（ＢＭＶ　と同種の非構造タンパクを共用し、そしてウイルス複製の多くの性質をＢＭＶ　と共用する）は、所望の遺伝子を有する修飾αウイルスにより細胞培養物中において感染し、そしてそれにより短時間のうちに所望のタンパクの大量の発現が起こる。本発明のキャプシド化されたＲＮＡウイルスは、環境条件または宿主防御による厳しい条件（コートを有していないウイルスを不活性化するような条件）に、そのウイルスをさらす必要のある場合に、特に有効である。
【００６４】
　遺伝子学的に設計されたウイルスを調製し、使用する方法が、ここに　ＢＭＶのＲＮＡを例にあげて述べられているが、当業者は、他のウイルスＲＮＡについても、既知の技術を用いてここに述べた原理を適応し得る。
【実施例】
【００６５】
　以下に、ＴＭＶコートタンパク遺伝子および構築起点のＢＭＶ　ＲＮＡ３への挿入、挿入遺伝子の発現、そして、ハイブリッドＲＮＡの桿状粒子へのインビボでのパッケージングを記載する。
【００６６】
　第１図に示されるように、プラスミドｐＢ３ＴＰ７は、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼのプロモーターに融合したプラスミドｐＢ３ＰＭ１からのＢＭＶ　ＲＮＡ３の全長のｃＤＮＡコピーを含み、生物学的に活性のあるＲＮＡ３転写物を、インビトロで生成させ得る。このプラスミドのＢＭＶコートタンパクの開始ＡＴＧコドンは、オリゴヌクレオチド特異的置換法（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８２）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：４８８−４９２）により修飾し、ＡＡＧコドンとし、プラスミドｐＢ３ＲＳ２とされた。
【００６７】
　プラスミドｐＣｃ８Ｃ５は、タバコモザイクウイルスのササゲ（Ｃｃ）株のＲＮＡのｃＤＮＡコピー（Ｍｅｓｈｉら、前出）を部分的に含む。標準的な方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．ＣＳＨ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ）により、ＢＭＶ　コート遺伝子の内部のｐＢ３ＲＳ２の約０．５ｋｂのＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片（ＴＭＶ　Ｃｃの全コートタンパクを含む）が、ｐＣｃ８Ｃ５遺伝子の約０．６ｋｂ　ＭｂｏＩＩ−ＸｂａＩ断片に置き換えられた。上記断片はそのＲＮＡのキャプシド化の起点を表わすと考えられる配列（Ｍｅｓｈｉら、前出）を含む。そのＳａｌＩおよびＭｂｏＩＩ制限断片の末端は、両者とも連結の前にＴ４　ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端に修復された。得られたプラスミドは、ＰＢ３／ＴＭＶ　と命名される。
【００６８】
　そのプラスミドに含まれる完全なＢＭＶ　ＲＮＡ３およびＴＭＶ配列を含み、ＥｃｏＲＩで線状とされたＰＢ３／ＴＭＶ　からの転写物は、ＢＭＶ　ＲＮＡ１およびＲＮＡ２のｃＤＮＡクローンの転写物（感染し得る能力を有する）（Ｆｒｅｎｃｈら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３１：１２９４−１２９７）と共に、大麦のプロトプラストに接種された。このｐＢ３／ＴＭＶ　ＲＮＡは、そのような感染により複製され、正常なＢＭＶ　ＲＮＡ３サブゲノムの開始部位で開始されるｍＲＮＡ（その点とＢＭＶ　ＲＮＡ配列の３’末端間のすべての配列を含み、ＴＭＶ　Ｃｃ配列の挿入物をも含む）に期待される大きさのサブゲノムＲＮＡを生じた。
【００６９】
　ＲＮＡのサンプルは、ＢＭＶ　ＲＮＡ　１および２の野性型ｃＤＮＡコピーの転写物と、付加していない転写物（−）とを接種したプロトプラストから得られた。または上記野性型ｃＤＮＡコピーの転写物と、野性型ＢＭＶ　ＲＮＡ３　ｃＤＮＡまたはｐＢ３／ＴＭＶ　の転写物とを接種し、プロトプラストから得られた。種々に接種を行い、そして光照射下２４℃で２０時間インキュベートしたプロトプラストのサンプルから抽出した後、１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで分離した、３Ｈ−ウリジン標識ＲＮＡのフルオログラフにより、すべてのこれらのＲＮＡの存在が示された。
【００７０】
　ＢＭＶ　ＲＮＡ１、ＲＮＡ２およびｐＢ３／ＴＭＶの転写物に感染した大麦プロトプラストの凍結／融解細胞破砕物を、抗ＴＭＶビリオン抗体を用いて血清学特異的な電子顕微鏡（Ｋ．Ｓ．ＤｅｒｒｉｃｋおよびＲ．Ｈ．Ｂｒｌａｎｓｋｙ（１９７６）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ６６：８１５−８２０）で調べると、繰り返し実験を行った場合にも、桿状粒子が常に観察された。これらの粒子は、正常なＴＭＶビリオン粒子に極めて特徴的ないくつかの特徴を有しており、直径が約２０ｎｍであり、中央にウラニルアセテートで染色される溝がある。その粒子は、主として、長さが約１１０ｎｍであり、他方ＴＭＶ　ＣｃビリオンＲＮＡに感染したプロトプラストを同じ方法で観察したときの最も長い粒子は、長さ約３１０ｎｍであった。ＴＭＶ　ＲＮＡが６．４ｋｂの長さであり（Ｇｏｅｌｅｔら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：４８８−４９２）、粒子の長さに対するＲＮＡの比が一定である（Ｂｕｔｌｅｒ、前出）と仮定すると、これらの結果から、ｐＢ３／ＴＭＶで感染したプロトプラストからの主な粒子は約２．３ｋｂのＲＮＡを含み、そしてｐＢ３／ＴＭＶ　ＲＮＡの長さは約２．２ｋｂであることがわかる。より短い粒子を含む小さい画分もまた、ｐＢ３／ＴＭＶ由来の調製物中に認められ、そして、より大きい画分と長さが３１０ｎｍより短い粒子を含む幅広い分布が認められる画分もまた、ＴＭＶ　Ｃｃ感染調製物中に認められた。そのような小さい粒子は、大きな粒子の破損またはサブゲノムＲＮＡのキャプシド化から起こり得る。
【００７１】
　前述の実施例は、例示のために示され、本発明を限定するものではない。
（発明の要約）
　本発明の組換えＲＮＡウイルスは、異種の、好ましくは桿状コートタンパクのキャプシド内に、遺伝子操作されたウイルス配列をキャプシド化させることによって与えられる。二十面体ウイルスは、それが保持するＲＮＡの量に制約があるが、桿状ウイルスは拡大が可能なので、本発明によれば組換えウイルスＲＮＡ成分のサイズを増加（または減少）
させ得る。このような組換えウイルスの作製および使用の方法はまた、特に植物におけるトランスフェクションに関して、遺伝型および表現型の変化をもたらすことを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、ｐＢ３／ＴＭＶの構築を示すウイルスｃＤＮＡ領域概略図を示しており、該ｃＤＮＡ領域はＢＭＶ　ＲＮＡ３を有するプラスミドｐＢ３ＴＰ７、ＡＴＧからＡＧＧまでを修飾されたコートタンパクの開始コドンを有するｐＢ３ＲＳ２、ＢＭＶ　ＲＮＡ３コートタンパクの代わりにＴＭＶコートタンパクおよび構築起点を有するｐＢ３／ＴＭＶ、およびＴＭＶコートタンパクおよび構築起点を有するｐＣｃ８Ｃ５を示す。
【図１】
2004000260.tif 000002