(57)【要約】【課題】新規コンドロイチン合成酵素、及びその遺伝子を提供する。【解決手段】本発明に係るｃＣｈＳｙタンパク質は、コンドロイチン硫酸の生合成過程において、糖鎖とコアタンパク質との結合領域に最初のＧａｌＮＡｃを転移するＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性と、糖鎖延長段階における二糖繰り返し領域を合成するＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性およびＧｌｃＵＡＴ−ＩＩ活性とを有していると考えられる新規コンドロイチン合成酵素である。また、本発明に係る遺伝子は上記ｃＣｈＳｙタンパク質をコードする遺伝子である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるコンドロイチン合成酵素。
【請求項２】
線虫由来である請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち、４〜２１８４番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１または２記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるコンドロイチン合成酵素。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項８】
請求項４または５のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規コンドロイチン合成酵素及びその遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチン硫酸は、動物一般の細胞表面に分布する硫酸化グリコサミノグリカンの一種である。その構造は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）がβ１−３、β１−４結合で結合している二糖が繰り返した構造（（−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＵＡβ１−）ｎ）であり、コアタンパク質のセリン残基に結合領域（ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ）を介して結合し、プロテオグリカンとして機能している。なお、Ｇａｌはガラクトースを、Ｘｙｌはキシロースを示す。
【０００３】
このコンドロイチン硫酸の生合成は、まず、上記結合領域の末端のＧｌｃＵＡ残基にＧａｌＮＡｃがＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素−Ｉ（ＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ）によりβ１−４結合で転移されることから始まる。その後、β１−３結合でＧｌｃＵＡが、そしてβ１−４結合でＧａｌＮＡｃが交互に転移され、二糖繰り返し領域が合成される。これらの糖転移活性のうち、前者はグルクロン酸転移酵素−ＩＩ（ＧｌｃＵＡＴ−ＩＩ）活性、後者はＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素−ＩＩ（ＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ）活性という。そして最後に、硫酸基転移酵素によって構成糖が硫酸化されてコンドロイチン硫酸となる。
【０００４】
上記のようなコンドロイチン硫酸の糖鎖合成に関与する酵素として、ヒトではｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ　Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（以下、「ｈＣｈＧｎ」と称する）とｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（以下、「ｈＣｈＳｙ」と称する）とが本発明者らによって見出されている。ｈＣｈＧｎは、上記のＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性とＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性とを有しており、ＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性を持つことから上記結合領域に最初のＧａｌＮＡｃを転移する酵素である。ｈＣｈＳｙは、上記のＧｌｃＵＡＴ−ＩＩ及びＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性を併せ持ち、上記二糖繰り返し領域を合成する酵素である（Ｋｉｔａｇａｗａ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　３８７２１−３８７２６、及び　Ｕｙａｍａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７７，　８８４１−８８４６）。
【０００５】
コンドロイチン硫酸は、コラーゲンとともに細胞外マトリックスの主成分となっている。また、コンドロイチン硫酸は、ヘパラン硫酸と同様に、脊椎動物等における脳の神経ネットワークの形成に重要な役割を果たすことが最近の研究から明らかになってきている（Ｏｈｈｉｒａ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　３７４，　２４−３４、及び　Ｓｕｇａｈａｒａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｙａｍａｄａ，　Ｓ．　（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．　Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１２，　３２１−３４９）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このようなコンドロイチン硫酸を取得する方法としては、例えば、クジラの軟骨等から調製する方法が知られていた。しかしながら、クジラの軟骨等から調製できるコンドロイチン硫酸の量は限られている。また、近年、クジラは動物愛護の観点から捕鯨は制限されており、クジラの調達自体が困難となっている。
【０００７】
その他の方法として、例えば、ヒト由来のコンドロイチン合成酵素遺伝子を組み込んだプラスミドをバクテリア等に組み込むことによって、培養系でコンドロイチン糖鎖を合成し、ひいてはコンドロイチン硫酸を生産する方法が考えられる。しかし、ヒトのコンドロイチン合成酵素は上記のようにｈＣｈＳｙとｈＣｈＧｎと２種類存在するため、これらの酵素遺伝子を同時に組み込む必要があり、煩雑な操作が必要になる。しかも、２つの酵素活性を適切に調節してコンドロイチン硫酸を生産させるのは困難である。
【０００８】
このように、コンドロイチン硫酸を効率良く大量生産する方法は未だ見出されておらず、例えば、前記結合領域に最初のＧａｌＮａｃを転移する活性と、二糖繰り返し領域を合成する活性とを併せ持つ新たなコンドロイチン合成酵素が得られれば、この酵素はコンドロイチン硫酸の大量生産に利用できるほか、種々の産業上の利用が期待できる。
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、新規のコンドロイチン合成酵素、及びその遺伝子を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ；　Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）由来のゲノムデータベースを用いて、ヒトコンドロイチン合成酵素であるｈＣｈＳｙ遺伝子（アクセッションＮｏ．ＡＢ０２３２０７）、またはｈＣｈＧｎ遺伝子（アクセッションＮｏ．ＡＸ０９２３４０）と相同性のある配列を検索したところ、ｈＣｈＳｙ遺伝子と相同性のあるＤＮＡ配列を見出した。さらに、この配列を用いて全長遺伝子をクローニングし、そのタンパク質を発現させ機能解析を行ったところ、このタンパク質が現にコンドロイチン合成酵素であり、しかも前記結合領域に最初のＧａｌＮＡｃを転移する活性と、二糖繰り返し領域を合成する活性とを併せ持つタンパク質であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であり、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるコンドロイチン合成酵素。
【００１２】
上記（ａ）のタンパク質は、本発明者らが今回新たにコンドロイチン合成酵素として単離・同定したものであり、後述のように、膜貫通領域（ＴＭ）と、ＧａｌＮＡｃＴドメイン（Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素と相同性が高い領域）と、ＧｌｃＵＡＴドメイン（グルクロン酸転移酵素と相同性が高い領域）とが含まれているものである。また、後述の実施例に示すように、構造解析の結果、このタンパク質と、従来線虫のゲノムデータベースで公開されていたＤＮＡ配列から推定されるタンパク質（アクセッションＮｏ．Ｔ２５２３３）とはアミノ酸配列が異なっていることがわかった。
【００１３】
機能解析の結果、本発明の上記タンパク質は、コンドロイチン硫酸の生合成過程の初期段階において、前記結合領域に最初のＧａｌＮＡｃを転移するＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性と、糖鎖延長段階における二糖繰り返し領域を合成するＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性とを有することが実験的に確認された。さらに、構造解析の結果等からＧｌｃＵＡＴ−ＩＩ活性をも有すると推測される。
【００１４】
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１に示される遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
【００１５】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（線虫、キイロショウジョウバエ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、線虫は現在、実験動物・モデル動物として広く用いられており、本発明に係る遺伝子やタンパク質を用いた糖鎖工学の技術開発や糖鎖機能の研究だけでなく、さらには、本発明に係る遺伝子やタンパク質のホモログの関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などに有用である。
【００１６】
本発明に係る抗体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について図１ないし図３に基づいて説明すれば、以下の通りである。尚、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１８】
本発明は、新規なコンドロイチン合成酵素とこれをコードする遺伝子とを見出すとともに、これら遺伝子及びタンパク質の機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明の遺伝子、タンパク質の配列、構造について説明し、次いでこれら遺伝子、タンパク質の機能、利用方法等について説明することとする。
【００１９】
（１）本発明に係る遺伝子及びタンパク質の配列、構造
以下の説明では、本発明者らが単離・同定した線虫由来のコンドロイチン合成酵素を「ｃＣｈＳｙタンパク質」と称し、これをコードする遺伝子を「ｃＣｈＳｙ遺伝子」と称して説明する。
【００２０】
線虫には、コンドロイチン硫酸は存在しないが、コンドロイチンは存在している。そこで、本発明者らは当初線虫にもヒトと同じように２種類のコンドロイチン合成酵素があると考えた。しかし、線虫のゲノムデータベースを用いて、前記ｈＣｈＳｙ遺伝子、またはｈＣｈＧｎ遺伝子と相同性を有するＤＮＡ配列を検索したところ、ｈＣｈＳｙ遺伝子と相同性を有するＤＮＡ配列のみ見出された。このことから、線虫のコンドロイチン合成酵素は、１つのタンパク質でコンドロイチン合成に必要なすべての活性を有するのではないかと推測された。このことを確かめるために、上記ｈＣｈＳｙ遺伝子と相同性を有するＤＮＡ配列から線虫由来のｃＣｈＳｙ遺伝子を実際にクローニングし、当該遺伝子にコードされるｃＣｈＳｙタンパク質の詳細な構造解析、並びに機能解析を行った。
【００２１】
上記ｃＣｈＳｙ遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号１に示すように、２２０５塩基対（約２．２ｋｂｐ）のサイズを有しており、４番目〜６番目の塩基配列が開始コドン（ＡＴＧ）であり、２１８５番目〜２１８７番目の塩基配列が終止コドン（ＴＡＧ）である。従って、上記ｃＣｈＳｙ遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列のうち、４番目〜２１８４番目の塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有しており、このＯＲＦは、２１８１塩基対（約２．１８ｋｂｐ）のサイズを有している。
【００２２】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。
【００２３】
さらに、本発明の「遺伝子」は、上記ｃＣｈＳｙ遺伝子のほか、前述のように（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、または、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるコンドロイチン合成酵素をコードする遺伝子であってもよいし、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２４】
一方、本発明に係るタンパク質すなわち新規コンドロイチン合成酵素は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しており、７２６のアミノ酸残基からなっているｃＣｈＳｙタンパク質が例示される。
【００２５】
構造解析の結果、上記ｃＣｈＳｙタンパク質は、従来線虫のゲノムデータベースで公開されていたＤＮＡ配列から推定されるタンパク質（アクセッションＮｏ．Ｔ２５２３３）とはＮ末端領域が異なっていることがわかった。より詳細には図１に示すように、２つのタンパク質は、Ｎ末端領域、およびｃＣｈＳｙタンパク質における９３〜１１３番目の配列領域が異なっていた。なお、同図において、上段が今回クローニングしたｃＣｈＳｙタンパク質の配列、下段が従来線虫のゲノムデータベースで公開されていたタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２６】
図２には、上記ｃＣｈＳｙタンパク質とｈＣｈＳｙタンパク質との相同性を比較した結果を示す。上段がｈＣｈＳｙタンパク質、下段がｃＣｈＳｙタンパク質である。２つのタンパク質間の相同性は、約３９％あり、今回クローニングしたｃＣｈＳｙタンパク質の方が、従来線虫のゲノムデータベースで公開されていた配列がコードするタンパク質に比べて、よりｈＣｈＳｙタンパク質と相同性が高いことがわかった。
【００２７】
また、図３に示すように、ｃＣｈＳｙタンパク質は、膜貫通領域（ＴＭ：６番目のアミノ酸残基から２７番目のアミノ酸残基まで）と、ヒトのグルクロン酸転移酵素と高い相同性を示す領域である推定β１，３ＧｌｃＵＡＴドメイン（７１番目〜３２０番目）と、ヒトのＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と高い相同性を示す領域であるβ１，４ＧａｌＮＡｃＴドメイン（４５０番目〜７２０番目）とを有している。なかでも、１５９番目〜１６１番目の配列（ＤＤＤ）は、β１，３ＧｌｃＵＡＴに対応するＤＸＤモチーフ（ＵＤＰ−糖の結合モチーフ）であり、５７１番目〜５７３番目の配列（ＤＶＤ）は、β１，４ＧａｌＮＡｃＴに対応するＤＸＤモチーフである。さらにアスタリスクで示すように、ｃＣｈＳｙタンパク質は、４つの潜在的なＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ領域を有している（２６８番目〜２７０番目のアミノ酸残基、３３８番目〜３４０番目のアミノ酸残基、４３３番目〜４３５番目のアミノ酸残基、４６７番目〜４６９番目のアミノ酸残基）。これらのことから、ｃＣｈＳｙタンパク質は、ＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性、ＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性、およびＧｌｃＵＡ−ＩＩ活性を有していると推測される。
【００２８】
ところで、本発明に係るタンパク質には、前記（ｂ）のタンパク質、即ち、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるコンドロイチン合成酵素も含まれるが、ここで、「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記ｃＣｈＳｙタンパク質（さらには同タンパク質を含む前記（ａ）のタンパク質）の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００２９】
上記変異タンパク質には、野生型の活性に異常を持つ変異タンパク質（機能欠失型の変異タンパク質と称する）が含まれていても良い。このような機能欠失型の変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、上記機能欠失型の変異タンパク質をコードする遺伝子が含まれても良い。このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
【００３０】
本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡやＦｌａｇ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。また、公知の各種修飾を受けていてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。
【００３１】
（２）新規コンドロイチン合成酵素の機能とその利用方法
上記ｃＣｈＳｙタンパク質は、コンドロイチン硫酸の生合成過程の初期段階において、前記結合領域に最初のＧａｌＮＡｃを転移するＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性と、糖鎖延長段階における二糖繰り返し領域を合成するＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性とを有するタンパク質であることが実験的に示されている（後述の実施例参照）。また、ＧｌｃＵＡＴ−ＩＩ活性も備えていると考えられる。なぜなら、ｃＣｈＳｙタンパク質は、ｈＣｈＳｙタンパク質と高い相同性を有する推定グルクロン酸転移酵素ドメインを有しており、また、ｃＣｈＳｙ遺伝子以外、ｈＣｈＳｙ遺伝子と相同性を有する遺伝子は線虫に見出されていないためである。
【００３２】
従って、上記ｃＣｈＳｙ遺伝子、ｃＣｈＳｙタンパク質は、生理活性を有する硫酸化グリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸）の糖鎖骨格の構造の人工合成に利用することができる。例えば、コンドロイチンはこれまではクジラの軟骨などから調製されたコンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化することによって調製されていたが、ｃＣｈＳｙ遺伝子を組み込んだプラスミド等の発現ベクターをバクテリア等の宿主細胞に導入することにより、培養系でコンドロイチンを安定かつ容易に、大量生産することが可能となる。ヒト由来のｈＣｈＳｙ、ｈＣｈＧｎタンパク質の２つの酵素が関与する合成反応を、ｃＣｈＳｙタンパク質は単独で行うことができるからである。
【００３３】
さらに、特異性の異なる種々の硫酸化転移酵素と本発明のコンドロイチン合成酵素とを組み合わせて発現させることによって、生理活性を有する種々のコンドロイチン硫酸やその異性体であるデルマタン硫酸の合成に利用できる。
【００３４】
また、線虫は、現在では糖鎖工学や発生学、神経生物学等の分子レベルの基礎研究において中心的な実験材料・モデル生物となっている。従って、本発明のコンドロイチン合成酵素は、このような線虫を用いた基礎糖鎖生物学の研究用試薬や検査用試薬として利用可能である。例えば、ＤＮＡチップ等への利用が挙げられる。
【００３５】
また、本発明に係る遺伝子、タンパク質は、コンドロイチン合成酵素の異常に起因する疾患や、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカンが関係する疾患の病態解析、並びにその病気への治療薬、治療法、診断薬、及び診断法等の開発に利用可能である。
【００３６】
以下では、本発明に係る遺伝子、タンパク質等の具体的な利用方法について説明する。
【００３７】
本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、各種ホスト細胞中に導入して、本発明に係るコンドロイチン合成酵素又はその変異タンパク質を発現させることができる。導入された本発明に係る遺伝子又は変異遺伝子は、ホスト細胞中でベクターとして存在してもよいし、ホスト細胞のゲノムＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、ホスト細胞のゲノム中には天然に存在しないが人為的操作の結果、ホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定のホスト細胞のゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加してホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００３８】
上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけでなくターミネーター配列を含めてもよい。
【００３９】
また、上記遺伝子又は変異遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターとともにホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るコンドロイチン合成酵素のＧＦＰ融合タンパク質を発現させてもよい。
【００４０】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ　ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００４１】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００４２】
本発明に係る遺伝子やタンパク質等の薬剤化については、従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば研究用試薬の場合、本発明に係る遺伝子を形質転換キット化したり、本発明に係る新規コンドロイチン合成酵素を異種発現系で大量生産し精製したりすればよい。
【００４３】
同様に、本発明に係るコンドロイチン合成酵素に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、上記ｃＣｈＳｙタンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。具体的には、モノクローナル抗体は、例えば、センダイウイルス、ポリエチレングリコール、または、電気的パルスにより、正常なリンパ球とミエローマ細胞とを融合させ、その融合リンパ球細胞に抗体を産生させる、従来公知の細胞融合法（ハイブリドーマ細胞株作製法）によって得られる。また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術によっても作製できる。ポリクローナル抗体は、例えば、抗原感作した動物の血清免疫グロブリン画分から取得できる。
【００４４】
また、本発明に係るこれら各遺伝子の一部配列をプローブやプライマーとして用いることができる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００４５】
（３）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係る上記ｃＣｈＳｙ遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
【００４６】
例えば、上記ｃＣｈＳｙ遺伝子のｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、線虫のゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ｃＣｈＳｙ遺伝子のｃＤＮＡ配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００４７】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００４８】
また、上記プローブの配列を、上記ｃＣｈＳｙタンパク質の機能上重要と考えられる領域（例えば、前記β１，３ＧｌｃＵＡＴドメインまたはβ１，４ＧａｌＮＡｃＴドメイン）の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ｃＣｈＳｙタンパク質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００４９】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記ｃＣｈＳｙのｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いて線虫のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００５０】
本発明に係る上記ｃＣｈＳｙタンパク質等を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記ｃＣｈＳｙタンパク質又はその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
【００５１】
上記ｃＣｈＳｙタンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例の記載に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。
【００５３】
〔実施例１：線虫由来のｃＣｈＳｙ遺伝子のクローニング及び構造解析〕
線虫には、コンドロイチン硫酸は存在しないが、コンドロイチンは存在している。そこで、線虫のゲノムデータベースを用いて、ヒト由来のｈＣｈＳｙ遺伝子（アクセッションＮｏ．ＡＢ０２３２０７）、ｈＣｈＧｎ遺伝子（アクセッションＮｏ．ＡＸ０９２３４０）と相同性を有するＤＮＡ配列を検索した。その結果、線虫のゲノムからは、ｈＣｈＳｙ遺伝子と相同性を有するＤＮＡ配列のみ見出された。
【００５４】
上記ＤＮＡ配列をもとに、線虫で実際に発現する遺伝子（ｃＤＮＡ）の中から同じＤＮＡ配列を持つ遺伝子をクローニングし、その全長を決定したところ、配列番号１に示す塩基配列からなることがわかった。
【００５５】
本発明者らは、上記遺伝子を「ｃＣｈＳｙ遺伝子」と命名した。ｃＣｈＳｙ遺伝子は、配列番号２に示す７２６アミノ酸残基からなるｃＣｈＳｙタンパク質をコードしている。構造解析の結果、このｃＣｈＳｙタンパク質は、従来線虫のゲノムデータベースで公開されていた配列がコードするタンパク質（アクセッションＮｏ．Ｔ２５２３３）とは異なっていることがわかった。図１に示すように、上段が上記ｃＣｈＳｙタンパク質の配列、下段が従来線虫のゲノムデータベースで公開されていた配列がコードするタンパク質である。同図に示すように、２つのタンパク質は、Ｎ末端領域（Ｎ末端領域、およびｃＣｈＳｙタンパク質における９３番目〜１１３番目のアミノ酸配列）が異なっていた。
【００５６】
図２には、上記ｃＣｈＳｙタンパク質とｈＣｈＳｙタンパク質との相同性を調べた結果が示される。上段がｈＣｈＳｙタンパク質、下段がｃＣｈＳｙタンパク質である。図３には、ｃＣｈＳｙタンパク質の構造が模式的に示される。ｃＣｈＳｙタンパク質は、前述のように、膜貫通領域（ＴＭ）と、ヒトのグルクロン酸転移酵素と高い相同性を示す領域である推定β１，３ＧｌｃＵＡＴドメインと、ヒトのＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と高い相同性を示す領域であるβ１，４ＧａｌＮＡｃＴドメインとを有している。
【００５７】
ｈＣｈＳｙタンパク質はゴルジ体局在型のＩＩ型膜タンパク質であるため、上記ｃＣｈＳｙタンパク質もゴルジ体局在型のＩＩ型膜タンパク質と予測される。このため、ｃＣｈＳｙタンパク質は、膜貫通領域（ＴＭ）を挟んで、Ｎ末端側が細胞質内ドメイン（１番目〜５番目のアミノ酸残基）、Ｃ末端側がゴルジ体内腔ドメイン（２８番目〜７２６番目のアミノ酸残基）と考えることができる。
【００５８】
〔実施例２：ｃＣｈＳｙタンパク質の機能解析〕
上記ｃＣｈＳｙタンパク質の機能を詳細に解析するために、分泌型の可溶性変異タンパク質を作製した。
【００５９】
具体的には、まず、ｃＣｈＳｙタンパク質のＮ末端から４２番目までのアミノ酸残基を除いた配列（４３番目〜７２６番目のアミノ酸残基からなる領域）をＰＣＲによって増幅させた。その後、生じたフラグメントを細胞外分泌シグナルであるインシュリンのシグナル配列と、プロテインＡ　ＩｇＧ結合ドメインを有するベクターに組み込んだ。この発現ベクターを用いて、分泌型の可溶性変異タンパク質を、プロテインＡ　ＩｇＧドメインを融合させた酵素として、ＣＯＳ−１細胞で発現させた。培地中に分泌された変異タンパク質は、細胞内因性のグリコシル転移酵素を除くために、ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに吸着させた。その後、この変異タンパク質が吸着したビーズを酵素源として用いた。
【００６０】
次に、上記酵素源を用いて、ｃＣｈＳｙタンパク質がＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性を有するか否かを調べた。具体的には、以下の方法で行った。
【００６１】
まず、ポリマーのコンドロイチン由来の六糖（ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）３と変異タンパク質が吸着した酵素源のビーズとを、供給基質であるＵＤＰ−〔３Ｈ〕ＧａｌＮＡｃ存在下でインキュベートしたところ、前記六糖は〔３Ｈ〕ＧａｌＮＡｃ残基でラベルされた。
【００６２】
この〔３Ｈ〕ＧａｌＮＡｃ残基が、β１−４結合を通じて、六糖の末端のＧｌｃＵＡ残基に転移されているのか否かを調べるために、前記〔３Ｈ〕ラベル反応の生成物を、ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＵＡの結合を特異的に切断するコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（以下、ＣＳａｓｅＡＣＩＩと称する）で消化した。その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　Ｐｅｐｔｉｄｅカラムを用いて、ゲル濾過を行った（方法は、Ｋｉｔａｇａｗａ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　３８７２１−３８７２６記載の方法と同様）。その結果、遊離の〔３Ｈ〕ＧａｌＮＡｃ残基が検出された。
【００６３】
また、前記〔３Ｈ〕ラベルした反応生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ　Ｐｅｐｔｉｄｅカラム（１．０×３０ｃｍ）にアプライして、０．４ｍｌずつフラクションとして回収した。その後、放射能活性を指標に解析した。その結果、図４に示すように、アローヘッドの位置に〔３Ｈ〕ラベルされたコンドロイチンの七糖が検出された。
【００６４】
これらの結果から、ＧａｌＮＡｃ残基は、β１−４結合で六糖の末端に存在するＧｌｃＵＡ残基に転移されていることが示された。
【００６５】
続いて、ｃＣｈＳｙタンパク質がＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性を有するか否かを調べた。具体的には、１００ｎｍｏｌの結合領域擬似体であるＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌが、酵素源のビーズ存在下で、〔３Ｈ〕ＧａｌＮＡｃ残基によりラベルされるか否かを調べた。ここで用いた、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌのアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎ）は、疎水性アミノ酸を擬似すると考えられている。そして、その反応生成物を１００ｍＩＵのＣＳａｓｅＡＣＩＩで消化した。その後、その消化物をＮｏｖａ−ＰａｋＣ１８カラムにアプライして疎水性ＨＰＬＣを行い、２ｍｌずつフラクションとして回収した。その後、放射能活性を指標に解析した（方法は、Ｕｙａｍａ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７７，　８８４１−８８４６記載の方法と同様）。
【００６６】
ＣＳａｓｅＡＣＩＩでの消化物を疎水性ＨＰＬＣにかけた場合（●）、並びに、ＣＳａｓｅＡＣＩＩで消化していない反応物を疎水性ＨＰＬＣにかけた場合（▲）の結果を図５に示す。図５のアローヘッドに示す位置（●の位置）にフリーの〔３Ｈ〕ＧａｌＮＡｃ残基が検出された。この結果から、ｃＣｈＳｙタンパク質はＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性を有していることがわかった。
【００６７】
従って、ｃＣｈＳｙタンパク質は、ＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性だけでなくＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性も有していることが示された。
【００６８】
一方、１ｎｍｏｌのコンドロイチンの七糖であるＧａｌＮＡｃ−（ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）３を受容体基質として用いた場合、ＧｌｃＵＡＴ−ＩＩ活性は検出されなかった。しかし、ｃＣｈＳｙ遺伝子は、ｈＣｈＳｙ遺伝子と高い相同性を有する推定グルクロン酸転移酵素（ＧｌｃＵＡ−Ｔ）ドメインを有しており、また、ｃＣｈＳｙ遺伝子以外、ｈＣｈＳｙ遺伝子と相同性を有する遺伝子は線虫のゲノムから見出されていないため、ｃＣｈＳｙタンパク質はＧｌｃＵＡＴ−ＩＩ活性をも有していると考えられる。
【００６９】
【発明の効果】
本発明に係る新規コンドロイチン合成酵素は、以上のように、コンドロイチン硫酸の合成に必要なＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ、ＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性を有しており、さらに、ＧｌｃＵＡＴ−ＩＩ活性をも有していると考えられる。それゆえ、硫酸化グリコサミノグリカンの糖鎖骨格の構造の人工合成に利用できるほか、種々の硫酸化転移酵素と組み合わせることにより、種々のコンドロイチン硫酸やその異性体であるデルマタン硫酸の合成に利用できる。また、上記コンドロイチン合成酵素は線虫から単離されたので、線虫を用いた基礎糖鎖生物学の研究用試薬や検査用試薬としても利用可能である。
【００７０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のｃＣｈＳｙタンパク質のアミノ酸配列と従来の線虫のゲノムデータベースで公開されていたＤＮＡ配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列とを比較した図である。
【図２】上記ｃＣｈＳｙタンパク質のアミノ酸配列とヒト由来のｈＣｈＳｙタンパク質のアミノ酸配列とを比較した図である。
【図３】上記ｃＣｈＳｙタンパク質の構造を模式的に示した説明図である。
【図４】上記ｃＣｈＳｙタンパク質がＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性を有するか否かを調べたゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図５】上記ｃＣｈＳｙタンパク質がＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性を有するか否かを調べた疎水性ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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