(57)【要約】【課題】表面プラズモン共鳴シグナルを検出可能なセンサーカップを用いて細胞表層に発現させた目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を簡便かつ正確に検出する方法を提供する。【解決手段】目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する方法であって、下記の工程：（ａ）金属薄膜を底面に有し表面プラズモン共鳴シグナルを検出可能なセンサーカップの該金属薄膜表面にタンパク質又は低分子化合物を固定化する工程；及び（ｂ）細胞表面に目的タンパク質を発現させた細胞の懸濁液を上記センサーカップに加え、固定化された上記タンパク質又は低分子化合物と上記目的タンパク質との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する工程を含む方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する方法であって、下記の工程：
（ａ）金属薄膜を底面に有し表面プラズモン共鳴シグナルを検出可能なセンサーカップの該金属薄膜表面にタンパク質又は低分子化合物を固定化する工程；及び
（ｂ）細胞表面に目的タンパク質を発現させた細胞の懸濁液を上記センサーカップに加え、固定化された上記タンパク質又は低分子化合物と上記目的タンパク質との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
アルカンチオールで修飾した該金属薄膜上にタンパク質又は低分子化合物を固定化する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該アルカンチオールに含まれる炭素数が８個以上である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アルカンチオールで修飾した該金属薄膜上に上記タンパク質又は低分子化合物とともに血清アルブミンを固定化する請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
血清アルブミンがウシ血清アルブミンである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞が酵母である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
目的タンパク質がアグルチニン又はその一部との融合タンパク質として酵母の細胞表面に発現している請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記融合タンパク質がα−アグルチニンのＣ末端３２０アミノ酸の配列を含む融合タンパク質である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出するためのセンサーカップであって、上記の他のタンパク質又は低分子化合物をその表面に固定化した金属薄膜を底面に有しており、細胞表面に目的タンパク質を発現させた細胞の懸濁液をセンサーカップ内部に導入して検出を行うためのセンサーカップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞表層に発現した目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を検出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年様々な生物のゲノム解析が進展した結果、今後の生物学はゲノムがコードするタンパク質の機能、及びタンパク質間の相互作用の解析が中心になると考えられており、「プロテオーム解析」を呼ばれる領域が形成されている。
【０００３】
この「プロテオーム解析」においてタンパク質間相互作用は、機能発現や疾患のメカニズム解析等の観点から非常に重要であり、種々の解析法が提案されている。例えば「酵母２ハイブリッド法」はその代表であり、包括的なタンパク質間相互作用解析が可能である。しかし酵母２ハイブリッド法は、原理的に核内でのタンパク質間相互作用を検出する手法であり、核内に移行できないタンパク質には適用できない。またタンパク質間相互作用をＤＮＡの転写活性により間接的に検出する為、偽陽性や偽陰性の発生頻度が高いという問題点も有している。
【０００４】
またタンパク質間の相互作用をＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）により検出する手法も開発されている。しかし、目的タンパク質を単離、精製する必要がある上に、蛍光性色素での標識等が必要であるという問題点があり、包括的なタンパク質間相互作用には適していなかった。
【０００５】
この様な問題に対して、タンパク質間相互作用を無標識で検出可能な表面プラズモン共鳴法が近年注目されている。「表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：以下、ＳＰＲと略称することがある）」とは、金属薄膜が被着されたガラス中を光が進み界面で全反射するとき、界面で生じるエバネッセント波と金属薄膜において生じる表面プラズモン波の波数が一致して起こる共鳴であり、この共鳴が起こると反射光の強度が減少する。表面プラズモン波は金属薄膜表面上で生じるので、その極く近傍の媒質に濃度変化や質量変化があれば、表面プラズモン波が変化し、それに応じて反射光の強度を減少させる入射角が変化する。この原理に従い、反射光の強度を減少させる入射角の変化を共鳴シグナルとして求めることができる〔１０−４度の変化を１ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔ）と呼ぶ〕。表面プラズモン共鳴を応用して蛋白質の相互作用などを測定するためのＳＰＲバイオセンサーについては、例えば、「蛋白質  核酸  酵素、Ｖｏｌ．３７、（１９９２）」の５３〜６０頁及び８１〜８７頁に詳述されている。
【０００６】
従ってＳＰＲバイオセンサーを用いることにより、目的タンパク質について蛍光色素等で標識することなく結合定数等を定量的に解析できる。もっとも、従来のタンパク質間相互作用検出法と同様に、ＳＰＲにより特定のタンパク質間相互作用を検出するためには被験物質である目的タンパク質をアフィニティークロマトグラフィー等の煩雑な手法により精製する必要があるという問題点があった。また、細胞膜又は細胞壁中に発現したタンパク質と他のタンパク質との相互作用を検出するための簡便な手法は従来提供されていないが、その理由は膜タンパク質の単離及び精製が容易ではないことにある。特開２００１−２０８７５５号公報には「細胞膜をリン脂質の存在下に金属薄膜表面に固定化し、該細胞膜と相互作用する物質を選択することを特徴とする表面プラズモン共鳴による生理活性物質のスクリーニング方法」が開示されているが、この方法においても、膜タンパク質を一旦単離して精製した後に金属薄膜表面へ固定化する必要があった。
【０００７】
この様な問題を解決するための手段として、表層に目的タンパク質を発現した細胞を直接用い、他のタンパク質との相互作用を検出することは非常に有効である。目的タンパク質が膜タンパク質である場合には、そのタンパク質を単離及び精製することなく、簡便な遠心分離により細胞表層に目的タンパク質を発現させた細胞を容易に分離した後、直接他のタンパク質との相互作用を検出できる。目的タンパク質が膜タンパク質でない場合でも、他の膜タンパク質との融合タンパク質として発現させることによりアフィニテイークロマトグラフィー等の煩雑な手法により精製することなく、同様に簡便な遠心分離により細胞表層に目的タンパク質を発現させた細胞を分離して、直接他のタンパク質との相互作用検出を検出できる。従って、細胞表層に発現された目的タンパク質と他のタンパク質との相互作用をＳＰＲにより直接検出する手法は、煩雑なタンパク質精製や色素標識等を必要としない簡便な方法として極めて有用である。
【０００８】
例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ社のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏ．ｊｐ）及びＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，ｖｏｌ２８，７７−８４（１９９７）には、黄色ブトウ球菌表面に発現したプロテインＡと金属薄膜上に固定化されたＩｇＧとの相互作用検出法が開示されている。しかし、このプロテインＡは本来黄色ブトウ球菌表面に発現するタンパク質であり、他の目的タンパク質を同様に黄色ブトウ球菌表面に発現させることができないという問題がある。また、原核生物である黄色ブトウ球菌では糖修飾等の翻訳後修飾ができないという欠点もあった。さらに、ガラスにコートされた金属薄膜の表面にリガンドを固定化し、これに接するように被測定物質収容用フローセルが配備されたセンサーチップを使用する方法では被測定物質を変更するためにはフローセルを含む流路を全て一旦洗浄する必要がある。また黄色ブトウ球菌より大きな酵母や動物細胞や植物細胞を用いると、一旦固定化されたリガンドと相互作用しても流圧により細胞がリガンドから解離してしまう懸念があった。
【０００９】
この様な問題は、センサーカップを用いる非フロー方式により解決することができる。センサーカップとは、誘電体ブロックが光ビームの入射面、出射面及び金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されているカップ状の表面プラズモン共鳴検出用の測定チップであり、このセンサーカップを用いる表面プラズモン共鳴に関する技術はＷＯ９５／２２７５４及び特開２００２−２９６１７２号公報に開示されている。被測定物質（細胞）毎にセンサーカップを用意することで煩雑な流路洗浄の必要がなくなり、また相互作用評価を静置させて行うことで流圧の問題も回避可能である。
【００１０】
もっとも、従来の測定チップを用いる場合は、誘電体ブロックとプリズム状誘電体ブロックとの間の空隙により屈折率が不連続になることを防止するため、両誘電体ブロックを屈折率マッチング液を介して一体化する必要があるが、その作業は非常に煩雑であり、従来の測定チップを用いた測定は操作性が悪いという問題がある。また、屈折率マッチング液を使用することから、環境に与える悪影響も懸念されている。
【００１１】
これらの問題に対し、特開２００２−２９６１７２号公報には、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる薄膜層と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件となり、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなる、全反射減衰を利用した測定装置に用いられる測定チップであって、前記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面及び前記薄膜層が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記薄膜層が一体化されてなることを特徴とする技術が開示されている。
【００１２】
また、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜からなる薄膜層と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件となり、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられる測定チップにおいて、前記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面及び前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されてなることを特徴とする技術が開示されている。
【００１３】
以上のように、従来、細胞表層に発現したタンパク質と他のタンパク質との相互作用のＳＰＲによる検出は、その細胞が本来有している膜タンパク質に限定されており、外来の目的タンパク質を遺伝子工学的手法により発現させ、他のタンパク質との相互作用を検出した例はこれまで報告なかった。また、従来報告されている系は黄色ブドウ球菌を用いた系に限定されており、酵母を利用した報告例はなかった。さらに、フロー系ではなく、センサーカップを用いてＳＰＲにより細胞表層に発現した目的タンパク質のタンパク質間相互作用を検出した報告例もない。
【特許文献１】特開２００１−２０８７５５号公報
【特許文献２】ＷＯ９５／２２７５４
【特許文献３】特開２００２−２９６１７２号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、ＳＰＲセンサーカップを用い、細胞表層に発現させた目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を簡便かつ正確に検出する方法を提供することにある。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、表面プラズモン共鳴シグナルが検出可能な金属薄膜を底面に有するセンサーカップにタンパク質又は低分子化合物を固定化した後、目的タンパク質を細胞表層に発現させた酵母などの細胞の懸濁液を該センサーカップに加えることにより、目的タンパク質と固定化されたタンパク質又は低分子化合物との相互作用を簡便かつ正確に検出できることを見い出した。また、細胞表面に存在する可能性がある目的タンパク質以外のタンパク質との非特異的相互作用を血清アルブミンにより抑制可能であり、さらに精度の高い検出が可能になることを見い出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【００１５】
すなわち、本発明により、目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する方法であって、下記の工程：
（ａ）金属薄膜を底面に有し表面プラズモン共鳴シグナルを検出可能なセンサーカップの該金属薄膜表面にタンパク質又は低分子化合物を固定化する工程；及び
（ｂ）細胞表面に目的タンパク質を発現させた細胞の懸濁液を上記センサーカップに加え、固定化された上記タンパク質又は低分子化合物と上記目的タンパク質との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する工程
を含む方法が提供される。
【００１６】
上記発明の好ましい態様によれば、アルカンチオールで修飾した該金属薄膜上にタンパク質又は低分子化合物を固定化する上記の方法；該アルカンチオールに含まれる炭素数が８個以上である上記の方法；アルカンチオールで修飾した該金属薄膜上に上記タンパク質又は低分子化合物とともに血清アルブミンを固定化する上記の方法；血清アルブミンがウシ血清アルブミンである上記の方法；細胞が酵母である上記の方法；目的タンパク質がアグルチニン又はその一部との融合タンパク質として酵母の細胞表面に発現している上記の方法；上記融合タンパク質がα−アグルチニンのＣ末端３２０アミノ酸の配列を含む融合タンパク質である上記の方法が提供される。
【００１７】
また、別の観点からは、目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出するためのセンサーカップであって、上記の他のタンパク質又は低分子化合物をその表面に固定化した金属薄膜を底面に有しており、細胞表面に目的タンパク質を発現させた細胞の懸濁液をセンサーカップ内部に導入して検出を行うためのセンサーカップが本発明により提供される。
【００１８】
この発明の好ましい態様によれば、アルカンチオールで修飾した該金属薄膜上にタンパク質又は低分子化合物を固定化した上記のセンサーカップ；該アルカンチオールに含まれる炭素数が８個以上である上記のセンサーカップ；アルカンチオールで修飾した該金属薄膜上に上記タンパク質又は低分子化合物とともに血清アルブミンが固定化された上記のセンサーカップ；血清アルブミンがウシ血清アルブミンである上記のセンサーカップ；細胞が酵母である上記のセンサーカップ；目的タンパク質がアグルチニン又はその一部との融合タンパク質として酵母の細胞表面に発現したタンパク質である上記のセンサーカップ；上記融合タンパク質がα−アグルチニンのＣ末端３２０アミノ酸の配列を含む融合タンパク質である上記のセンサーカカップが提供される。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、細胞表層に発現したタンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する方法であって、下記の工程：（ａ）金属薄膜を底面に有し表面プラズモン共鳴シグナルを検出可能なセンサーカップにタンパク質又は低分子化合物を固定化する工程；及び（ｂ）細胞表面に目的タンパク質を発現させた細胞の懸濁液を上記センサーカップに加え、固定化された上記タンパク質又は低分子化合物と上記目的タンパク質との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する工程を含むことを特徴としている。
【００２０】
表面プラズモン共鳴シグナルを検出可能なセンサーカップの種類は底面に金属薄膜が備えられたものであれば特に限定されず、当業者は適宜のものを選択可能であるが、例えば、特開２００２−２９６１７２号公報に開示されているセンサーカップなどを本発明の方法に好適に利用できる。
【００２１】
センサーカップの一例は、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる薄膜層と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件となり、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなる、全反射減衰を利用した測定装置に用いられる測定チップである。このセンサーカップは、誘電体ブロックが光ビームの入射面、出射面および前記薄膜層が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記薄膜層が一体化されてなることを特徴としている。
【００２２】
別のセンサーカップは、表面プラズモン共鳴測定装置を対象として構成されたものであり、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜からなる薄膜層と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件となり、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられる測定チップにおいて、前記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されてなることを特徴とするものである。
【００２３】
図１には、上記の第１の実施形態による表面プラズモン共鳴測定チップ（以下、単に測定チップという）１０を用いる表面プラズモン共鳴測定装置の全体形状を示した。図２はこの装置の要部の側面形状を示し、図３は測定チップ１０の斜視形状を示している。図１に示す通り、この表面プラズモン共鳴測定装置は、複数の測定チップ１０を支持するターンテーブル２０と、測定用の光ビーム（レーザビーム）３０を発生させる半導体レーザ等のレーザ光源３１と、入射光学系を構成する集光レンズ３２と、光検出器４０と、上記ターンテーブル２０を間欠的に回動させる支持体駆動手段５０と、この支持体駆動手段５０の駆動を制御するとともに、上記光検出器４０の出力信号Ｓを受けて後述の処理を行なうコントローラ６０と、試料自動供給機構７０とを有している。
【００２４】
上記測定チップ１０は、図２および図３に示す通り、例えば直方体状に形成された透明誘電体ブロック１１と、この誘電体ブロック１１の上面に形成された例えば金、銀、銅、アルミニウム等からなる金属膜１２と、この金属膜１２の上に側方が閉じられた空間を画成する筒状部材からなる試料保持枠１３とから構成されている。誘電体ブロック１１は、上記金属膜１２が形成される面（後述の界面１１ａを構成する面）と、光ビーム３０が入射する面１１ｂと、光ビーム３０が出射する面１１ｃとを全てを含む１つのブロックとして形成されている。試料保持枠１３の中には、後述のようにして例えば液体の試料１５が貯えられる。
【００２５】
光ビーム３０は、上述の通り収束光状態で誘電体ブロック１１に入射するので、上記界面１１ａに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なおこの入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そこで、光ビーム３０は界面１１ａで全反射し、この反射した光ビーム３０には、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。ここで、上記集光レンズ３２等の光学系は、光ビーム３０を界面１１ａにデフォーカス状態で入射させるように構成されてもよい。そのようにすれば、表面プラズモン共鳴の状態検出（例えば前記暗線の位置測定）の誤差が平均化されて、測定精度が高められる。
【００２６】
上述のように、光ビーム３０が全反射するとき、界面１１ａから金属膜１２側にエバネッセント波がしみ出す。そして、光ビーム３０が界面１１ａに対してある特定の入射角θＳＰで入射した場合は、このエバネッセント波が金属膜１２の表面に励起する表面プラズモンと共鳴するので、この光については反射光強度Ｉが鋭く低下する。なお図４には、この全反射減衰現象が生じた際の入射角θと反射光強度Ｉとの関係を概略的に示した。そこで、光検出器４０が出力する光量検出信号Ｓから各受光素子毎の検出光量を調べ、暗線を検出した受光素子の位置に基づいて上記入射角（全反射減衰角）θＳＰを求め、予め求めておいた反射光強度Ｉと入射角θとの関係曲線に基づけば、試料１５中の特定物質を定量分析することができる。コントローラ６０の信号処理部６１は、以上の原理に基づいて試料１５中の特定物質を定量分析し、その分析結果が表示部６２に表示される。
【００２７】
センサーカップの底面の金属薄膜の表面には、ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ）と呼ばれる単分子膜を形成することができ、この単分子膜に相互作用を検出するためのタンパク質又は低分子化合物を固定化することができる。通常、ＳＡＭを形成するための化合物としては、非特異的相互作用を抑制する目的からデキストランやポリエチレングリコールの様な親水性化合物及びポリマーがしばしば利用される。例えば金属表面にリンカーを介し、親水性のハイドロゲルを固定化することで物理吸着を抑制する方法が知られている（特許第２８１５１２０号、米国特許第５４３６１６１号明細書、特開平８−１９３９４８号公報を参照）。この様な親水性のＳＡＭは、溶液中に存在するタンパク質間の相互作用を検出する場合には適しているが、本発明者らの検討の結果、細胞表層に発現した目的タンパク質との相互作用を検出する目的でタンパク質又は低分子化合物を金属薄膜上に固定化する場合のＳＡＭとしては、必ずしも適していないことが判明した。
【００２８】
本発明の方法において、金属薄膜上にタンパク質又は低分子化合物を固定化する場合に用いるＳＡＭとしては、例えばアルカンチオール類により形成されるＳＡＭが好適である。アルカンチオール類によりＳＡＭを製造する技術は公知であり、例えば、末端をチオール化したＤＮＡを金属膜に固定化してＳＰＲを用いるＤＮＡセンサーを作製する場合には、６−ヒドロキシ−１−ヘプタンチオールを添加することによって、非特異的吸着が起こらず、高感度で目的ＤＮＡを検出できることが報告されている（米国特許第５９４２３９７号、及びＪ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９９７，  １１９，  ８９１６−８９２０を参照）。また、チオール化したビオチンと１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールとを同時混合し、ストレプトビジンとの反応を非特異結合を抑制して検出できることが報告されている（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９９９，  １２１，  ６４６９−６４７８）。しかしながら、披験物質として細胞を用いる場合、特にセンサーカップ式ＳＰＲにおいてアルカンチオール類が好ましいＳＡＭを与えることは従来知られていなかった。
【００２９】
アルカンチオールの種類は直鎖又は分岐のアルキル基を有するチオールであれば特に限定されないが、炭素数４以上のアルカンチオールが好ましく、炭素数６個以上、好ましくは８個以上のアルカンチオールが特に好ましい。例えばブタン−１−チオール、オクタン−１−チオール、ウンデカン−１−チオール、ドデカン−１−チオールなどを用いることができる。炭素数の上限は特に限定されないが、例えば３０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下である。また、これらのアルキル基は置換基を有していてもよく、このような例として、例えば１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールなどを用いることができる。
【００３０】
また、本発明の方法でアルカンチオールで形成させたＳＡＭを用いる場合、非特異的相互作用を抑制するために血清アルブミン、好ましくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を測定系内に存在させることが好ましい。生理活性物質の物理吸着による非特異結合を軽減する方法として、プラスチックプレートを用いる免疫化学分析ではウシ血清アルブミンなどによりいわゆるブロッキングが行われているが、細胞を用いる場合、特にセンサーカップ式ＳＰＲで細胞を測定系に導入する場合に血清アルブミンが非特異的相互作用を顕著に抑制できることは従来知られていない。血清アルブミンは、アルカンチオールにより金属薄膜上にＳＡＭを形成し、タンパク質又は化合物を固定化した後に物理吸着により固定化してもよく、あるいはアルカンチオールにより金属薄膜上にＳＡＭを形成した後、タンパク質又は化合物を固定化する際に同時に吸着させてもよい。
【００３１】
金属薄膜上に固定化したタンパク質又は化合物に対して、細胞表層に目的タンパク質を発現させた細胞を相互作用させる場合、センサーカップ内に細胞浮遊液を導入して一定時間毎にピペッテイングにより撹拌してもよく、あるいは細胞を添加した後、静置させて相互作用を検出してもよい。細胞をセンサーカップ内に添加した後、静置させて相互作用を検出することが好ましい。
【００３２】
細胞表層に目的タンパク質を発現させた細胞の種類は特に限定されないが、例えば、糖タンパク質やリン酸化タンパク質を発現可能な酵母、動物細胞、又は植物細胞が好ましい。これらのうち、培養の容易さ及び安全性などの観点から酵母を用いることが最も好ましい。酵母の細胞表層に目的タンパク質を細胞壁又は細胞膜タンパク質との融合タンパク質として発現させる技術は既に報告されている。例えば、植田等はグルコアミラーゼをα−アグルチニンとの融合タンパク質として酵母表層に発現させ、デンプンを唯一の炭素源として生育させ、エタノールを生産することに成功している（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６３，  １３３２−１３３６  （１９９７））。細胞表層に目的タンパク質を発現させるためには、これらの公知技術を適宜採用することができる。
【００３３】
酵母を用いる場合、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列、プロモーター配列、分泌シグナル配列、並びに細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターを酵母に導入して発現させることにより、目的タンパク質と細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質又はその一部とを含む融合タンパク質を酵母表層に発現させることができる。
【００３４】
プロモーターの種類は、酵母での発現に通常利用されるプロモーターであれば特に限定されないが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモター（Ｓａｗａｉ−Ｈａｔａｎａｋａ，  Ｈ．，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５９，  １２２１−１２２８  （１９９５））、及びガラクトキナーゼ（Ｇａｌａｃｔｏｋｉｎａｓｅ）のプロモーター（ＧＡＬ１）（Ｄａｖｉｓ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ４，  １４４０−１４４８  （１９８４））、キャンデイダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のイソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ）のプロモーター（ＵＰＲ−ＩＣＬ）（Ｋａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ４４，  ７５９−７６５  （１９９６））などが利用される。
【００３５】
分泌シグナルとしては、酵母の発現及び分泌に通常利用されるシグナル領域、例えば、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル領域や、酵母のα−ファクターのプレプロ配列（Ｗａｌｋｅｒ，  Ｇ．  Ｍ．，  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｐ２６５，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｙｄ．，  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ  （１９９８）  ）を利用できる。これらのプロモーター及び分泌シグナルは、既知の方法、例えば既知配列を基にして作成されたプライマーを用いて、前記微生物のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ法や、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５１，  ６５−７０  （１９９５）やＡｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５７，  ６９７−７０１  （２００１）に記載のプラスミドｐＧＡ１１及びｐＧＰＭ６を適当な制限酵素反応により切り出すことにより入手できる。
【００３６】
酵母の種類は特に限定されず、例えば、サッカロミセス類、ジゾサッカロミセス属、キャンデイダ属に属する酵母を用いることができるが、これらのうちサッカロミセス属に属する酵母が好ましく、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＴ８−１などが特に好ましい（Ｔａｊｉｍａ，  Ｍ．，  Ｙｅａｓｔ，  １，  ６７−７７  （１９８５））。アグルチニン遺伝子又はその断片は酵母から得られるが、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＴ８−１などから得ることが好ましい。アグルチニンはａ−アルグチニン及びα−アグルチニンのいずれであってもよく、その断片は表層に発現する酵素活性に悪影響を与えなければどの様な配列であってもよい。アグルチニン又はその一部をコードする配列としては、好ましくはサッカロミセス属由来のａ−アグルチニンのＡＧＡ２配列をコードする配列が用いられる。このＡＧＡ２は、ＧＰＩアンカーを介して細胞壁に固定化されているＡＧＡ１に２つのジスルフィド結合で結合することにより細胞表層に固定化される。また、好ましくはサッカロミセス属由来のα−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列が用いられる。このアミノ酸配列中には４個所の糖鎖結合部位がある。グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーがフォスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼ（ＰＩ−ＰＬＣ）で切断された後に、この糖鎖と細胞壁を構成する多糖類とが共有結合することにより、α−アグルチニンのＣ末端配列部分が細胞壁と結合して保持される。
【００３７】
上記ａ−アルグチニンを用いる場合は、ＡＧＡ１配列の３’末端側に目的タンパク質をコードする配列を融合させることが可能であり、その結果、目的タンパク質のＮ末端がａ−アルグチニンに融合することになる。一方、上記α−アグルチニンを用いる場合には、α−アグルチニンの５’末端側に目的タンパク質をコードする配列を融合させることが可能であり、目的タンパク質のＣ末端がα−アルグチニンに融合することになる。
【００３８】
上記の組換えベクターを導入した酵母では、上記組換えベクターはプラスミドの形態又は染色体に組み込まれた形態のどちらで存在していてもよい。また、上記の組換えベクターは、取得の簡易化の観点から大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。例えば、上記ＤＮＡの調製材料は、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（２μｍ）とＣｏｌＥ１の複製開始点（ｏｒｉ）を有しており、また、酵母選択マーカー（例えばＴＲＰ、ＵＲＡ３等）及び大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）を有することがさらに好ましい。また、目的タンパク質を発現させるために、該目的タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等のいわゆる調節配列をも含んでいることが望ましい。
【００３９】
上記の組換えベクターによる酵母の形質転換は、定法に従って行うことができ、例えば、酢酸リチウム法、電気パルス法又はプロトプラスト法等により形質転換体を得ることができる。形質転換体の培養方法も公知であり、例えば「Ｍ．  Ｄ．  Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ，  ”Ｍｅｔｈｏｄ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，  Ｇｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）」等に記載された方法を当業者は適宜行うことができる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
実施例１：  ＺＺドメインを表層発現した酵母の作成
Ａ：ＺＺドメインを表層発現可能なプラスミドの構築
プロテインＡの抗体（Ｆｃ部位）認識に関わるαへリックスの繰り返し部分をコードする塩基配列を、ｐＥＺＺ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，  ＵＳＡ）を鋳型ＤＮＡとし、以下の２種類のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、増幅産物を制限酵素Ｓａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉ  で切断した。これをにＡｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５５，  ４７１−４７５  （２００１）記載のプラスミドｐＣＡＳ１を制限酵素Ｓａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉ  で切断したベクターに挿入することにより、ＺＺドメインを表層発現可能なプラスミドを構築し、ｐＣＺＺと命名した。
５’−ｇｃｔｇｃｇｃａａｃａｃｇａｔｇｃｃｇｃｇｇｇｇｇａｃａａｃａａ−３’
５’−ｃｃｇｇｇｔａｃｃｇａｇｃｔｃｇａａｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｔｔｔ−３’
【００４１】
Ｂ：ｐＣＺＺを含む酵母の調製
前記Ａにより得られたプラスミドＤＮＡ、ｐＣＺＺを酢酸リチウム法により酵母ＭＴ８−１に形質転換し、酵母ＭＴ８−１／ｐＣＺＺを調製した。得られた酵母ＭＴ８−１／ｐＣＺＺを０．６７％Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％グルコース、２％カザミノ酸を含むＳＤ培地で１８時間培養した後、得られた酵母を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）により分離し、更にリン酸バッファー（ｐＨ  ７．４）で２回洗浄した。
【００４２】
Ｃ：アルカンチオールでの金薄膜の修飾
以下の操作では、特開２００２−２９６１７２号公報に開示されている技術に基づいて作成したセンサーカップ（測定チップ）を用いた。ドデカンチオール２．４μＬをエタノール１０ｍＬに溶解し、金蒸着直後のセンサーカップに各７０μＬずつ添加した後、２４時間冷蔵庫で保管した。センサーカップ内からエタノール溶液をピペットで全量吸い取った後、水１００μＬでカップを１０回洗浄し、冷蔵庫に保管した。また、対照として、１１−ヒドロキシ−ウンデカンチオールを金薄膜に固定化し、エピクロルヒドリン水溶液を加え２５℃４時間反応させた後、デキストラン（Ｔ−１００）水溶液を加えて２５℃２０時間反応させることによりデキストランＴ５００による修飾を行った。
【００４３】
Ｄ：ウサギＩｇＧの金薄膜上への固定化
前記Ｃにより得られたドデカンチオールで修飾した金薄膜を底面に持つセンサーカップ内を１００ＭμＬのＰＢＳで満たした後、センサーカップ内より７０μＬを除去しアセテートバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ社）７０μＬを添加する操作を３回繰り返した。このセンサーカップ内より５０μＬを除去しウサギＩｇＧ（２５μｇ／ｍＬ）を含むアセテートバッファー  ５０μＬを加え、室温で３０分反応（固定化）させた。次にカップ内より７０μＬを除去しＰＢＳ（７０μＬ）を添加する操作を５回繰り返した後、ベースラインを安定化させ、固定化開始時のシグナル値との差を固定化量とした。
【００４４】
またデキストランＴ５００の修飾した金薄膜上へのウサギＩｇＧの固定化は、以下のとおり行った。センサーカップを１００μＬのＰＢＳで満たしベースラインを安定化させた後、カップ内より７０μＬを除去し蒸留水７０μＬを加える操作を３回繰り返した。カップ内より７０μＬを除去後、０．４ｍＭ  ＥＤＣ及び０．２ｍＭ  ＮＨＳの混合水溶液を添加し、室温で１０分間反応させカルボキシル基の活性エステル化を行った。カップ内より７０μＬを除去しアセテートバッファー（７０μＬ）を添加する操作を３回繰り返した後、カップ内より５０μＬを除去しウサギＩｇＧ（２５μｇ／ｍＬ）を含むアセテートバッファー  ５０μＬを加え、室温で３０分反応（固定化）させた。さらにカップ内より７０μＬを除去しＰＢＳ  ７０μＬを加える操作を３回繰り返した後、１Ｍ  エタノールアミン  ７０μＬを加え、室温で１０分間ブロッキングした。最後にカップ内より７０μＬを除去しＰＢＳ（７０μＬ）を添加する操作を５回繰り返した後ベースラインを安定化させ、固定化開始時のシグナル値との差を固定化量とした。
【００４５】
Ｅ：ウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用におけるＳＡＭの影響
前記Ｄにより得られたウサギＩｇＧを固定化したセンサーカップを完全にＰＢＳ（１００μＬ）で置換しベースラインを安定化させた後、カップ内より５０μＬを除去し、ＺＺドメインを表層発現した酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＺＺ、６００ｎｍの吸光度＝１．０）のＰＢＳ溶液を添加し、室温で１０分間反応させた（添加後のカップ内の酵母濃度  ６００ｎｍの吸光度＝０．５）。カップ内より７０μＬを除去しＰＢＳ（７０μＬ）を添加する操作を５回繰り返した後ベースラインを安定化させ、開始時のシグナル値との差を相互作用量とした。また対照としてＺＺドメインを表層発現していない酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＡＳ）についても同様の操作を行った。その結果、デキストランＴ５００で修飾したセンサーカップを用いた場合は、相互作用シグナルは検出されなかった。一方、アルカンチオールで修飾したセンサーカップを用いた場合、ＭＴ８−１／ｐＣＺＺでは５０ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）が、ＭＴ８−１／ｐＣＡＳでは２０ＲＵのシグナルが検出された。
【００４６】
Ｆ：ウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用の酵母濃度依存性
前記Ｅにより、ＳＡＭとしてアルカンチオールを用いた場合にウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用が検出されたが、これが両者の相互作用によるものが確認するために酵母濃度依存性を検討した。実験は前記Ｅと同様に行い、添加後のカップ内の６００ｎｍの吸光度が０．０５，、０．５、５となる酵母を用い連続的に行った。  その結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
2004271188.tif 000002
【００４８】
ＺＺでは６００ｎｍの吸光度＝０．０５，  ０．５、５に対して各々５、５０、２４０  ＲＵのシグナルが検出され、ＭＴ８−１／ｐＣＡＳでは同じく０、２０、１９０  ＲＵのシグナルが検出された。同じ６００ｎｍの吸光度におけるシグナルの差は５、３０、５０と酵母濃度依存的に増加していることから、これらの差がＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用によるものと推定された。
【００４９】
Ｇ：ウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用におけるＢＳＡの効果
ＳＡＭとしてアルカンチオールを用いた場合においてウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用が酵母濃度依存的に検出されたが、対照酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＡＳ）でもウサギＩｇＧとの相互作用が検出されたことから、ＢＳＡによる非特異的相互作用の抑制について検討した。実験は前記Ｅと同様の方法で行ない、ウサギＩｇＧ固定化時にＢＳＡを共存させた場合と一旦ウサギＩｇＧを固定化後ＢＳＡを改めて固定化した場合の両方について検討した。
【００５０】
ウサギＩｇＧの固定化量について結果を表２に示した。ＢＳＡを共存させた場合には、ウサギＩｇＧとＢＳＡとを合わせた固定化量には大きな影響はみられなかった。一方、固定化後ＢＳＡを改めて固定化した場合、ウサギＩｇＧ固定化量の４割のＢＳＡが固定化されることがわかった。
【００５１】
【表２】
2004271188.tif 000003
【００５２】
次に、ＢＳＡを共存させ固定化したウサギＩｇＧと酵母（添加後のカップ内の酵母濃度  ６００ｎｍの吸光度＝０．５）との相互作用を検討した。その結果を表３に示した。２５μｇ／ｍＬのＢＳＡをＩｇＧ固定化の際に共存させた場合、対照酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＡＳ）との相互作用は検出されなかったが、ＺＺドメインを表層発現した酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＺＺ）との相互作用は検出可能であることがわかった。また、一旦ウサギＩｇＧを固定化後にＢＳＡを改めて固定化した場合も同様の結果が得られた。この様にＢＳＡを用いることで非特異的相互作用を抑制可能であることがわかった。
【００５３】
【表３】
2004271188.tif 000004
【００５４】
さらに２５μｇ／ｍＬのＢＳＡを共存させ固定化したウサギＩｇＧと酵母との相互作用の濃度依存性について検討した結果を表４に示す。カップ内の６００ｎｍの吸光度０．２５〜２．５の範囲でＺＺドメインを表層発現した酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＺＺ）との相互作用シグナルは、濃度依存的に増加することがわかった。一方、対照酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＡＳ）との相互作用シグナルは吸光度０．５までは検出されないが、吸光度２．５では若干検出された。この結果から、非特異的相互作用を排除するためには、少なくとも吸光度０．５以下で測定する必要があることがわかった。
【００５５】
【表４】
2004271188.tif 000005
【００５６】
Ｈ：ウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用における攪拌の影響
前記Ｇにより、アルブミンでブロッキングした場合に非特的相互作用が抑制されることがわかったが、次に攪拌の影響について検討した。実験は前記Ｆと同様の方法で行った。相互作用検討時間を３分と１０分、１０分については攪拌の有無について比較検討した。その結果、相互作用検討時間は３分より１０分の方が相互作用シグナルが顕著に検出された。また同じ１０分でも１分おきに攪拌した場合は、殆ど相互作用が検出されないことがわかった。これは、タンパク質に対し酵母が非常に大きい為、流圧により一旦相互作用しても解離してしまうためと推定された。従ってフロー方式では、酵母の様に大きな細胞を用いる場合、この様な細胞の解離が懸念される。
【００５７】
【表５】
2004271188.tif 000006
【００５８】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、目的タンパク質の煩雑な単離及び精製工程や、目的タンパク質の色素標識などの工程を必要とせず、目的タンパク質を細胞表層に発現させた細胞を直接用いてタンパク質間相互作用を正確に検出可能である。
【００５９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を行うための表面プラズモン共鳴測定チップを用いる表面プラズモン共鳴測定装置の一例について全体図を示した図である。
【図２】図１の表面プラズモン共鳴測定装置の要部を示す一部破断側面図である。
【図３】表面プラズモン共鳴測定チップの一例を示した斜視図である。
【図４】表面プラズモン共鳴測定装置における光ビーム入射角と、光検出器による検出光強度との概略関係を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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