(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ヒト由来のＤＮＡＸ　Ｖｉｃ−１（ＤＶｉｃ−１）およびＤＮＡＸ鼠径部創傷発現ＣＣケモカイン（ＤＧＷＣＣ）と命名された、以前には知られていなかったケモカインモチーフを含む分子の存在を示すこと。【解決手段】ＣＣケモカインファミリー蛋白質のアミノ酸配列をもとにＰＣＲプライマーを作製し上記ヒト由来ＤＮＡＸ　Ｖｉｃ−１の候補配列を選択する。上記配列を使用して組換え蛋白質を発現させ抗体反応等で更にしぼりこみ、更に組換蛋白質を精製し、上記ヒトＤＮＡＸ　Ｖｉｃ−１蛋白質を同定した。天然型ヒトＤＮＡＸ　Ｖｉｃ−１、それの組換え蛋白質及び融合蛋白質。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６に示すポリペプチドのＰｈｅ１〜Ｇｌｙ８８を含む、実質的に純粋なＤＧＷＣＣポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７】
ポリペプチドが発現される条件下で、請求項６に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、ポリペプチドを組換え的に産生するプロセス。
【請求項８】
ケモカインモチーフおよび配列番号６に示すポリペプチドのＰｈｅ１〜Ｇｌｙ８８の少なくとも１２連続残基を含む、抗原性ポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
ポリペプチドが発現される条件下で、請求項１２に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、ポリペプチドを組換え的に産生するプロセス。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、前記培養物から単離される、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
請求項８に記載のポリペプチドを含む、キット。
【請求項１６】
配列番号１０に示すポリペプチドのＭｅｔ１〜Ｍｅｔ９６を含む、実質的に純粋なＤＧＷＣＣポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１６に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。
【請求項１９】
請求項１６に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２２】
ポリペプチドが発現される条件下で、請求項２１に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、ポリペプチドを組換え的に産生するプロセス。
【請求項２３】
ケモカインモチーフおよび配列番号１０に示すポリペプチドのＭｅｔ１〜Ｍｅｔ９６の少なくとも１２連続残基を含む、抗原性ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。
【請求項２５】
請求項２３に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２８】
ポリペプチドが発現される条件下で、請求項２７に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、ポリペプチドを組換え的に産生するプロセス。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、前記培養物から単離される、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
請求項２３に記載のポリペプチドを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本出願は、１９９６年１１月２７日に提出された米国特許仮出願第６０／０３１，８０５号；ならびに１９９６年１２月５日に提出された通常の米国特許出願第０８／７６１，０７１号；ならびにＭｏｒａｌｅｓらにより１９９７年１０月２４日に提出された米国の特許出願優先権を主張する；これらは参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
　（発明の分野）
　本発明は、哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物の免疫系の細胞）の発達、分化、運搬、および生理機能の制御に機能するタンパク質に関連する組成物を意図する。特に、種々の細胞型（造血細胞を含む）の発達、分化、および機能を制御または証明するタンパク質を提供する。
【背景技術】
【０００３】
　（発明の背景）
　哺乳動物の循環系の循環する成分は、種々の細胞型（赤血球系の赤血球および白血球ならびに骨髄細胞系列を含む）を含む。例えば、非特許文献１〜３を参照のこと。
【０００４】
　しばらくの間、哺乳動物の免疫応答は「免疫ネットワーク」と呼ばれる細胞間で相互作用する複合体の系に基づくことが知られていた。最近の研究により、新しい見識がこの系の内部機構に提供された。多くの応答が、実際に、リンパ球、マクロファージ、顆粒球、ならびに他の細胞のネットワーク様相互作用の周囲を回転することが明らかであるが、免疫研究者達は今日、溶解性タンパク質（リンホカイン、サイトカイン、もしくはモノカインとして知られる）がこれらの細胞性相互作用を制御する重大な役割を担うという見解を一般に支持している。従って、細胞を調節する因子の作用の単離、特徴付けならびに機構について多くの興味があり、それらの理解は多数の医療的異常（例えば、免疫系および他の疾患）の診断および治療に有意な進歩を導くはずである。
【０００５】
　リンホカインは、広範な用途の細胞間活性を明らかに媒介する。それらは多能性の造血幹細胞の複雑な免疫系を構成する多様な細胞系列を含む膨大な数の前駆体への増殖、成長、および分化を補助することが示される。これらの細胞成分間の相互作用は健常な免疫応答に必要である。リンホカインを他の薬剤と組合せて投与した場合、これらの異なる細胞系列はしばしば異なる様式で応答する。
【０００６】
　ケモカインは多数ならびに多様なタンパク質のスーパーファミリーである。このスーパーファミリーは、ケモカインモチーフ中の最初の二つのシステインが隣接するか（Ｃ−Ｃ分枝と称する）、または介在性の残基による空間形成のいずれかにより二つの典型的な枝に分割される（“Ｃ−Ｘ−Ｃ“）。ごく最近に同定されたケモカインの分枝は、対応するモチーフ中の二つのシステインが欠失し、ならびにリンホタクチンとして公知のケモカインによって表される。別の最近同定された枝は二つのシステインの間に３個の介在性の残基を有する（例えば、ＣＸ３Ｃケモカイン）。非特許文献４および５を参照のこと。
【０００７】
　多くの因子が、前駆細胞の分化プロセスに影響するか、または生理機能もしくは特定の細胞型の移動の特性を制御することが同定されている。これらの観察は、免疫機能での機能がこれまで無認識であった他の因子が存在することを示す。これらの因子は生物学的な活性を提供し、それらの効果の範囲は既知の分化、もしくは活性因子とは異なり得る。インビボで細胞生理機能を調節する調節因子の構造的、生物学的、および生理学的な特性に関する知識の不在は、このような因子の効果の調節を妨げる。従って、関連する細胞の発達もしくは生理機能の調製が必要とされる医療的な状態は、処理が困難なままである。
【非特許文献１】Ｒａｐａｐｏｒｔ（１９８７）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　（第２版）　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ
【非特許文献２】Ｊａｎｄｌ（１９８７）Ｂｌｏｏｄ：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，　Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ　および　Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．
【非特許文献３】Ｐａｕｌ（編）（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版）Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．
【非特許文献４】ＳＣＨＡＬＬおよびＢａｃｏｎ（１９９４）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　６：８６５−８７３
【非特許文献５】ＢａｃｏｎおよびＳｃｈａｌｌ（１９９６）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ　＆　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．　１０９：９７−１０９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　（発明の要旨）
　本発明は、ＤＮＡＸ　Ｖｉｃ−１（ＤＶｉｃ−１）およびＤＮＡＸ鼠径部創傷発現ＣＣケモカイン（ＤＧＷＣＣ）と本明細書により命名された、以前には知られていなかったケモカインモチーフを含む分子の存在を示す。以下に記載のケモカインタンパク質配列の配列解析に基づき、ＤＶｉｃ−１およびＤＧＷＣＣがＣＣケモカインファミリーに属することは明らかである。
【０００９】
　好ましい実施態様において、本発明は以下より選択された物質の組成物を提供する：配列番号２の少なくとも約１２アミノ酸の長さにわたって、少なくとも約８５％の配列同一性を示す実質的に純粋または組換えのＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチド；配列番号２の天然配列ＤＶｉｃ−１；ＤＶｉｃ−１配列を含む融合タンパク質；配列番号６もしくは８の少なくとも約１２アミノ酸の長さにわたって、少なくとも約８５％の配列同一性を示す、実質的に純粋な組換えＤＧＷＣＣタンパク質またはペプチド；配列番号６もしくは８の、天然配列ＤＧＷＣＣ；およびＤＧＷＣＣ配列を含む融合タンパク質。実質的に純粋または単離されたタンパク質の実施態様では、本発明は以下の対応する部分に配列同一性を示すセグメントを含むタンパク質を提供する：ホモロジーが少なくとも約９０％の同一性があり、その部分が少なくとも約９アミノ酸であるＤＶｉｃ−１；ホモロジーが少なくとも約８０％の同一性であり、その部分が少なくとも約１７アミノ酸であるＤＶｉｃ−１；もしくはホモロジーが少なくとも約７０％の同一性であり、そしてその部分が少なくとも約２５アミノ酸であるＤＶｉｃ−１；または：ホモロジーが少なくとも約９０％の同一性であり、そしてその部分が少なくとも約９アミノ酸であるＤＧＷＣＣ；ホモロジーが少なくとも８０％の同一性であり、そしてその部分が少なくとも約１７アミノ酸であるＤＧＷＣＣ；もしくはホモロジーが少なくとも約７０％の同一性であり、そしてその部位が少なくとも約２５アミノ酸であるＤＧＷＣＣ。他のポリペプチドの実施態様は以下のものを含む：ＤＶｉｃ−１が配列番号２の成熟配列を含む実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドがヒトを含む霊長類に由来する実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドが配列番号２の少なくともひとつのポリペプチドセグメントを含む実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドが同一性を示す部分を多く示す実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドが、ＤＶｉｃ−１の天然の対立遺伝子改変体である実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドが少なくとも約３０アミノ酸長を有する実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドが霊長類ＤＶｉｃ−１に特異的な、少なくとも二つの非重複エピトープを示す実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドがＤＶｉｃ−１に特異的な、少なくとも二つの非重複エピトープを示す実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドがＤＶｉｃ−１に対して少なくとも約２０アミノ酸長にわたって少なくとも約９０％の配列同一性を示す実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドがグリコシル化されている実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドが、合成ポリペプチドである実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドが、固体基板に付着している実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドが他の化学成分に結合している実施態様；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドが、天然配列からの置換の５倍またはそれより少ない置換物である実施態様；またはＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドが天然の配列に由来する欠失改変体もしくは挿入改変体である実施態様；ＤＧＷＣＣが配列番号６もしくは配列番号８の成熟配列を含む実施態様；またはＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドが霊長類もしくは齧歯類を含む哺乳動物に由来する実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質、もしくはペプチドが配列番号６もしくは８の少なくとも一つのポリペプチドセグメントを含む実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドが同一性を示す部分を多数示す実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質、もしくはペプチドがＤＧＷＣＣの天然の対立遺伝子改変体である実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドが少なくとも３０アミノ酸長を有する実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドが霊長類のＤＧＷＣＣに特異的な少なくとも二つの非重複エピトープを示す実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドがＤＧＷＣＣに対して少なくとも約２０アミノ酸長にわたって少なくとも約９０％の配列同一性を示す実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドがＤＧＷＣＣに特異的な、少なくとも二つの非重複抗原決定基を示す実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドがＤＧＷＣＣに対して少なくとも約２０アミノ酸長にわたって少なくとも約９０％の配列同一性を示す実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドがグリコシル化されている実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドが合成ポリペプチドである実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドが固体基板に付着している実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドが他の化学成分と結合している実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドが天然配列に由来する５倍またはそれより少ない置換体である実施態様；ＤＧＷＣＣタンパク質もしくはペプチドがまたは天然の配列に由来する欠失改変体もしくは挿入改変体である実施態様。ポリプチドの他の調製物が提供され、これは以下のものを含む組成物を含む：無菌のＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチド；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはペプチドおよびキャリア（このキャリアは：水、生理食塩水、および／または緩衝液を含む水性化合物であるが；および／または経口的、直腸、経鼻、局所的、もしくは非経口的な投与のために処方される）；無菌のＤＷＧＣＣタンパク質もしくはペプチド；ＤＷＧＣＣタンパク質もしくはペプチドおよびキャリア（このキャリアは：水、生理食塩水、ならびに／もしくは緩衝液を含む水性化合物であるか；および／または経口的、直腸、経鼻、局所的、もしくは非経口的な投与のために処方される）を含む。
【００１０】
　他のポリペプチド形態は以下のものを含む融合タンパク質を含む：配列番号２もしくは１２の成熟タンパク質配列；配列番号６もしくは８の成熟タンパク質配列；ＦＬＡＧ，Ｈｉｓ６を含む；もしくはＩｇ配列；もしくは他のケモカインタンパク質の配列を含む検出または精製用のタグ。キットはこのようなタンパク質もしくはペプチド、および以下のものを含み提供される：ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはポリペプチドを含むコンパートメント；ＤＶｉｃ−１タンパク質もしくはポリペプチドを含むコンパートメント；もしくはキット中の試薬の使用もしくは廃棄のための説明書。
【００１１】
　結合化合物および結合組成物の結合が提供され、例えば、抗体に由来する抗原結合部分を含み、特異的に天然の：ＤＶｉｃ−１タンパク質、（このタンパク質が霊長類のタンパク質であるか；結合化合物がＦｖ、Ｆａｂ、もしくはＦａｂ２フラグメントであるか；結合化合物が他の化学的成分と結合しているか；または抗体が；配列番号２もしくは１２を含む成熟ポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されているか；成熟したＤＶｉｃ−１に対して惹起されているか；精製されたＤＶｉｃ−１に対して惹起されているか；免疫選択されているか；ポリクローナル抗体であるか；変性されたＤＶｉｃ−１に結合するか；抗原に対して少なくとも３０ｍＭのＫｄを示すか；ビーズもしくはプラスチック膜を含む固体基板に付着しているか；無菌組成物中にあるか；または検出可能に標識（放射性もしくは蛍光標識を含む）されている）；ＤＧＷＣＣタンパク質（このタンパク質が霊長類もしくは齧歯類のタンパク質であるか；結合化合物がＦｖ、Ｆａｂ、もしくはＦａｂ２フラグメントであるか；結合化合物が他の化学的成分と結合しているか；または抗体が：配列番号６もしくは８を含む天然のポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されているか；成熟したＤＧＷＣＣに対して惹起されているか；精製されたＤＷＧＣＣに対して惹起されているか；免疫選択されているか；ポリクローナル抗体であるか；変性されたＤＷＧＣＣに結合するか；抗原に対して少なくとも３０ｍＭのＫｄを示すか；ビーズもしくはプラスチック膜を含む固体基板に付着しているか；無菌組成物中にあるか；もしくは検出可能に標識（放射性もしくは蛍光標識を含む）されている。
【００１２】
　結合組成物を有するキットの実施態様はこのような結合化合物および以下を含む：結合化合物を含むコンパートメント；および／もしくはキット中の試薬の使用もしくは廃棄のための説明書。代表的に、キットは定性的もしくは定量的な分析に行うことが可能である。種々の他の組成物が提供され、例えば、以下を含む：上記のような無菌の結合化合物；もしくは上記のような結合化合物およびキャリア（このキャリアは：水、生理食塩水、ならびに／もしくは緩衝液を含む水性化合物であるか；および／または経口的、直腸、経鼻、局所的、もしくは非経口的な投与のために処方されている）。
【００１３】
　核酸が提供され、これには記載されたようなタンパク質もしくはペプチドもしくは融合タンパク質をコードする単離されたまたは組換えの核酸が含まれる。ここで、ＤＶｉｃ−１タンパク質がヒトを含む霊長類に由来するか；配列番号１〜４または１１〜１２の多数の抗原性ペプチドをコードするか；またはＤＶｉｃ−１核酸は：配列番号１〜４もしくは１１〜１２の任意の抗原性ペプチド配列をコードし；天然のｃＤＮＡがコードするそのセグメントをコードする天然のｃＤＮＡに少なくとも約８０％の同一性を示すか；発現ベクターであるか；さらに複製起点を含むか；天然の供給源に由来するか；同定可能なレベルを含むか；合成ヌクレオチド配列を含むか；６ｋｂ未満、好ましくは３ｋｂ未満であるか；ヒトを含む霊長類に由来するか；天然の全長コード配列を含むか；ＤＶｉｃ−１タンパク質をコードするハイブリダイゼーションプローブであるか；もしくはＰＣＲプライマーであり；ＰＣＲ産物；もしくは変異誘発プライマーであるか；ＤＧＷＣＣタンパク質がヒトもしくはマウスを含む霊長類もしくは齧歯類に由来するか；あるいはＤＧＷＣＣ核酸が：配列番号６もしくは８の抗原性ペプチド配列をコードするか；配列番号６もしくは８の抗原性ペプチド配列の多数をコードするか；そのセグメントをコードする天然のｃＤＮＡに対して少なくとも約８０％の同一性を示すか；発現ベクターであるか；さらに複製起点を含むか；天然の供給源に由来するか；検出可能な標識を含むか；合成ヌクレオチド配列を含むか；６ｋｂ未満、好ましくは３ｋｂ未満であるか；ヒトもしくはマウスを含む霊長類もしくは齧歯類に由来するか；天然の全長コード配列を含むか；ＤＧＷＣＣタンパク質をコードする遺伝子のハイブリダイゼーションプローブであるか；またはＰＣＲプライマーであるか；ＰＣＲ産物、もしくは変異誘発プライマーである。
【００１４】
　上記のような組換え核酸を含む細胞もしくは組織も提供され、これには以下のものが含まれる：原核生物細胞；真核生物細胞；細菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞；哺乳動物細胞；マウス細胞；霊長類細胞；もしくはヒト細胞。核酸を含むキットが提供され、これは例えば、核酸、および以下を含む：核酸を含むコンパートメント；ＤＶｉｃ−１またはＤＧＣＷＣＣタンパク質もしくはポリペプチドを更に含むコンパートメント；および／もしくはキット中の試薬の使用もしくは廃棄のための説明書）。代表的には、キットは定性的もしくは定量的な分析を行うことが可能である。
【００１５】
　このような核酸は以下のものを含む：３０℃および２Ｍ未満の塩、４５℃および／または５００ｍＭの塩、あるいは５５℃および／または１５０ｍＭの塩の洗浄条件下で、配列番号１にハイブリダイズする核酸；ＤＶｉｃ−１に対して、少なくとも約３０ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約８５％の同一性を示すか、少なくとも９０％および／またはストレッチが少なくとも５５ヌクレオチドであるか、あるいは少なくとも９５％および／またはストレッチがＤＶｉｃ−１に対して少なくとも７５ヌクレオチドである核酸；３０℃および２Ｍ未満の塩、４５℃および／または５００ｍＭの塩、または５５℃および／または１５０ｍＭの塩の洗浄条件下で、配列暗号５または７にハイブリダイズする核酸；ＤＧＷＣＣに対して、少なくとも約３０ヌクレオチドにわたって少なくとも約８０％の同一性を示すか、少なくとも９０％および／またはストレッチが少なくとも５５ヌクレオチドであるか、あるいは少なくとも９５％および／またはストレッチが少なくとも７５ヌクレオチドである核酸。
【００１６】
　さらに、細胞もしくは組織培養細胞の生理的機能もしくは発達を調節する方法が提供され、この方法はＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣのアゴニストもしくはアンタゴニストへの細胞の曝露を含む。本発明はまた、化合物、化合物への特異的な結合を検出する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：ＤＶｉｃ−１ケモカインに特異的に結合する抗原結合部位；ＤＶｉｃ−１ケモカインもしくはそのフラグメントをコードする発現ベクター；記載される抗原結合部位により特異的に認識される実質的に純粋なタンパク質；実質的に純粋なＤＶｉｃ−１ケモカインもしくはそのペプチド、またはＤＶｉｃ−１ケモカイン配列の３０アミノ酸配列部分を含む融合タンパク質；ＤＧＷＣＣケモカインに特異的に結合する抗原結合部位；ＤＧＷＣＣケモカインもしくはそのフラグメントをコードする発現ベクター；記載される抗原結合部位により特異的に認識される実質的に純粋なタンパク質；および実質的に純粋なＤＧＷＣＣケモカインもしくはそのペプチド、あるいはＤＧＷＣＣケモカイン配列の３０アミノ酸配列部分を含む融合タンパク質からなる群から選択される組成物に化合物を接触させる工程；および組成物への化合物の結合を検出する工程。
【００１７】
　（詳細な説明）
　（Ｉ．一般）
　本発明はサイトカインもしくはケモカインの構造特性またはモチーフ特徴を示すタンパク質をコードする霊長類のＤＮＡ配列を提供する。ケモカインファミリーの総説については、例えば、Ｌｏｄｉら、（１９９４）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３：１７６２−１７６７；Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ　および　Ｃｌｏｒｅ（１９９１）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　４：２６３−２６９；Ｍｉｌｌｅｒ　および　Ｋｒａｎｇｅｒ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：２９５０−２９５４；ＭａｔｓｕｓｈｉｍａおよびＯｐｐｅｎｈｅｉｍ（１９８９）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　１：２−１３；ＳｔｏｅｃｋｌｅおよびＢａｋｅｒ（１９９０）　Ｎｅｗ　Ｂｏｉｌ．　２：３１３−３２３；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、（１９９１）　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　９：６１７−６４８；Ｓｃｈａｌｌ（１９９１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　３：１６５−１８３；ならびにＴｈｅ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ。
【００１８】
　本明細書中に記載される新規のサイトカインは、ＤＮＡＸ　Ｖｉｃ−１（ＤＶｉｃ−１）およびＤＮＡＸ鼠蹊部創傷で発現されたＣＣケモカイン（ＤＧＷＣＣ）と命名された。配列番号３および４は、ＨＨＦＦＱ２５Ｒヒト胎児心臓ライブラリーおよびＨＯＥＤＨ１１Ｒヒト造骨細胞ライブラリーより、それぞれ入手した二つのＥＳＴを定義する。これらは高い相同性を示し、そしておそらくは類似する転写産物由来のＥＳＴである。これら二つのＥＳＴのケモカインモチーフは比較され、ついでコンセンサス配列が誘導され、ついでヒトＤＶｉｃ−１（配列番号１）をコードすることが確かめられた。シグナル配列は、アラニン（Ａｌａ）と（Ｉｌｅ）との間で示されるが、これは細胞株が異なると変化し得る。ヒトＤＶｉｃ−１転写産物の代替的なより長い転写物もまた開示され、これはケモカインモチーフの特徴を示さないアミノ末端の伸長を有する（配列番号１１および１２）。
ヒトＤＧＷＣＣのポリペプチドおよび核酸配列は配列番号５および６として開示される。ヒトＤＧＸＣＣケモカイン核酸配列のコード配列は配列番号５のおよそ１番目のヌクレオチドから始まり、およそ３３６ヌクレオチドで終了する。特徴的なＣＣモチーフは配列番号６の９〜１０アミノ酸残基で見られ得る。シグナル配列が示されるが、関連する遺伝子に基づいて、僅かに異なるプロセシングが異なる細胞型で生じ得る。マウスＤＧＷＣＣケモカイン（ｍＤＶｉｃ−１と以前に命名された；ＵＳＳＮ／０８／７６１，０７１を参照のこと）の核酸配列および対応するアミノ酸配列は配列番号７および８として開示される。ポリＡシグナルはヌクレオチド３８４〜３８９由来であり、そして終止コドンの一部を含む。Ｐシグナルはアラニン（Ａｌａ（−１））とロイシン１（Ｌｅｕ１）との間の切断を予測するが；実際の切断は残基の隣もしくはその近傍であり得る。
【００１９】
　以下の記載は例示的な目的のために、霊長類の実施態様（例えば、ヒト）に関するが、他の物（例えば、齧歯類を含む天然の哺乳動物供給源に由来する）に関連する実施態様は同様に適用可能である。これらの供給源は、種々の脊椎動物（代表的には温血動物（例えば、トリおよび哺乳動物、特に家畜、齧歯類、霊長類）を含むはずである。他のケモカインとの比較は表１に提供される。
【００２０】
　（表１：タンパク質配列のアライメント）
ヒトＭＣＰ−１（配列番号９）はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｓ７１５１３である；ヒトＭＩＰ−３ａ（配列番号１０）はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７７０３５である；ヒトＤＶｉｃ−１（配列番号２）をともなう。核酸配列の類似したアライメントは、同一性および差異の領域を示す。
【００２１】
【表１】
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　本発明のケモカインタンパク質は、それらの物理化学的ならびに生物学的な特性により部分的に規定される。本明細書中で記載されるケモカイン（例えば、ＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣ）の生物学的特性は、それらのアミノ酸配列ならびに成熟したサイズにより、部分的に規定される。それらはまた、少なくとも生物学的な特性のいくつかを他の類似するケモカインと共有するはずである。当業者は、いくつかの配列の改変が分子の生物学的活性を有意に変化させずに寛容性であり得ることを容易に認識し得る（例えば、保存的な置換もしくはレセプター相互作用または重要な３次元構造の特徴に重要な残基から離れた位置）。逆に、非保存的置換は選択された機能を削除するために適応され得る。
【００２２】
　これらのケモカインは、特異的な組織の型（例えば、皮膚組織）に存在し、そしてレセプターとのタンパク質の相互作用は、細胞の生理的機能、もしくは発達の様々な局面を媒介するのに重要である。ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣをコードするメッセージを発現する細胞型は、細胞分化ならびに発達における重要なシグナルが、それらにより媒介されることを示唆する。例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（第三版）Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ；Ｂｒｏｗｄｅｒら、（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（第三版）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．；Ｒｕｓｓｏら、（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；ならびにＷｉｌｋｉｎｓ（１９９３）Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（第二版）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。さらに、ＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣ発現または応答性は、例えば、特定の細胞の分集団を規定するためのマーカーとして貢献するはずである。
【００２３】
　新規のケモカインは研究ならびに配列データベースの注意深い解析から発見された。利用可能なデータベースにおける配列の不在は、そのメッセージは滅多に発現させず、および／または非常に低いレベルであることを強く示唆する。これは非常に制限された細胞発現、および／またはほとんどの細胞型では非常に低いレベルであることを反映し得る。
【００２４】
　ノーザンブロット解析は、標準的な方法を用いて実施され得る（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第二版）第１〜３巻、ＣＳＨ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８７および捕捉）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｏｉｏｌｏｇｙ　Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎ，ＮＹを参照のこと。
【００２５】
　（ＩＩ．定義）
　用語「結合組成物」は、抗体−抗原相互作用におけるように、ＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣケモカインと特異的ならびに選択的に結合する分子をいう。しかし、レセプタータンパク質のような他の組成物もまた、特異的ならびに／または選択的にＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣケモカインと結合し、他の分子を排除する。代表的に、結合は天然の生理的機能に関連したタンパク質−タンパク質相互作用において共有結合もしくは非共有結合のいずれかであり、そしてキャリア化合物もしくは二量体化のパートナーを含む多タンパク質複合体のメンバーを含み得る。分子はポリマー、もしくは化学的試薬であり得る。相互作用が類似の特異性（例えば、特異的親和性）を示す限り、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインが必ず凸形状の分子（例えば、リガンド−レセプター相互作用のリガンドまたはレセプターが）であるかどうかについて関わりがないことが必然的に示される。機能的アナログは構造的に改変されたリガンドであり得、または、例えば、適切なリガンド結合決定基と相互作用する分子形状を有する完全に無関係な分子であり得る。リガンドはレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストとして貢献し得る。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら（編）（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ　＆　Ｇｉｌｍａｎ’ｓ；Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版）Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
【００２６】
　用語「結合因子：ケモカインタンパク質複合体」は、本明細書中で使用される場合、結合因子ならびにケモカインタンパク質（例えば、ＤＶｉｃ−１ならびにＤＷＧＣＣ）の複合体に関する結合因子のケモカインタンパク質への特異的な結合により形成される。結合因子の特異的もしくは選択的な結合は、結合因子が、多くの他のタンパク質において共有されないＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質上の部位を認識する特異的結合部位（例えば、抗原結合部位）を有することを意味する。例えば、ＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質に対して惹起され、そしてケモカインタンパク質上のエピトープを認識する抗体は、特異的ならびに選択的な結合による結合因子：ＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質複合体を形成し得る。代表的には、結合因子：ＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質複合体の形成は、他のタンパク質ならびに生物製剤の混合物中のＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質の測定を可能にする。同様に、用語「抗体：ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質複合体」は、結合因子が例えば、抗体由来の抗原結合部分である態様をいう。抗体はモノクローナル、ポリクローナル、もしくは抗体の結合フラグメント（例えば、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ）２フラグメント）であり得る。抗体は、交差反応性試験の目的のために、好ましくはポリクローナル抗体である。
【００２７】
　「相同的な」核酸配列は、比較された場合、有意な類似性もしくは同一性を示す。核酸におけるホモロジーのための標準は、配列比較および／または系統学的な関連性による、当該分野で一般に使用されるホモロジーの基準であるか、もしくはハイブリダイゼーションの条件に基づくかのいずれかである。ハイブリダイゼーションの条件は以下でより詳細に記載される。
【００２８】
　「単離された」核酸は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくは混合されたポリマーの核酸であり、天然の配列に自然に付随する他の生物学的成分（例えば、元の種に由来するタンパク質ならびに隣接するゲノム配列）から実質的に分離される。用語「核酸配列」は、その天然に存在する環境から取り出されている核酸配列を含み、そして組換え体もしくはクローン化されたＤＮＡ単離物、および化学的に合成されたアナログ、または異種の系で生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、単離された形態の分子を含む。単離された核酸は通常均質な核酸分子を含むが、いくつかの実施態様では不均質な少数の配列を有する核酸を含む。この不均質性は代表的にはポリマーの末端、または所望の生物学的機能もしくは活性に重要ではない部分で見られる。
【００２９】
　本明細書中で使用される、用語「ＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質」は、タンパク質の文脈で使用される場合、配列番号２に示される、特にケモカインモチーフ部分からの、アミノ酸配列を有するタンパク質、またはこのようなタンパク質（好ましくは天然の実施態様）に独特の、および／もしくは特徴的な有意なフラグメントを含む。ヒトおよびマウスＤＧＷＣＣ、ならびに配列番号６および８についても同様である。本発明はまた、このようなケモカインと似た構造を示すポリペプチド（例えば、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカイン特異的結合成分と相互作用するもの）を包含する。これらの結合成分、例えば抗体は、代表的にＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインのいずれかと高い親和性（例えば、少なくとも約１００ｎＭ、通常約３０ｎＭより良好であり、好ましくは約１０ｎＭより良好であり、そして更に好ましくは約３ｎＭより良好である）で結合する。
【００３０】
　本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」もしくは「タンパク質」は、例えばＤＧＷＣＣケモカインのケモカインモチーフ部分の有意なフラグメントまたはセグメントを含み、そして以下のようなアミノ酸残基のストレッチを包含する：少なくとも約８アミノ酸、一般には少なくとも１０アミノ酸、更に一般的には少なくとも１２アミノ酸、しばしば少なくとも１４アミノ酸、更に頻繁には少なくとも１６アミノ酸、代表的には少なくとも１８アミノ酸、更に代表的には少なくとも２０アミノ酸、通常少なくとも２２アミノ酸、更に通常は少なくとも２４アミノ酸、好ましくは少なくとも２６アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２８アミノ酸、ならびに、特に好ましい実施態様では少なくとも約３０、もしくは更に多いアミノ酸（例えば、３５，４０，４５，５０，６０，７０，８０など）。セグメントは適切な長さのアミノ末端およびカルボキシ末端を有し得る（例えば、例えば残基１，２，３などで始まり、そして例えば残基９５，９４，９３，９２などで終わる）。本発明は複数の上記セグメントを含むタンパク質を包含する。
【００３１】
　「組換え」核酸は、その産生方法、もしくはその構造のいずれかにより定義される。その産生方法（例えばプロセスにより作られる産物）に関しては、このプロセスは、例えば、ヌクレオチド配列、代表的には選択もしくは産生においてヒトの介入を含む組換え核酸の技術の使用である。あるいは、組換え核酸は、天然では互いに連続していない二つのフラグメントの融合体を含む配列を生成することにより作製される核酸であり得るが、天然の産物を（例えば、天然に生じた変異体）を排除することが意図される。従って、例えば、任意の天然には存在しないベクターで細胞を形質転換することにより作られた産物は、任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを使用して誘導される配列を含む核酸と同様に包含される。このようなことは、代表的には配列認識部位を導入もしくは除去すると同時に、コドンを、同じもしくは保存されたアミノ酸をコードする重複コドンに置き換えるために頻繁に行われる。あるいは、通常で利用可能な天然の形態では見られない所望の組合せの機能を含む単一の遺伝的実体を生成するために、所望の機能の核酸セグメントを共に結合させることにより実施される。制限酵素認識部位はしばしばこのような人為的操作の標的であるが、他の部位特異的標的（例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列、もしくは他の有用な特徴）が設計により取り込まれ得る。類似する概念は、組換え（例えば融合）ポリペプチドについて意図される。特に含まれるのは、遺伝コードの重複性により、これらの抗原のフラグメントに類似するポリペプチドをコードする合成核酸、および種々の異なる種改変体に由来する配列の融合体を含む。
【００３２】
　「溶解度」は、スベードベリー単位で測定される沈降に反映される。スベードベリー単位は、特定の条件下での分子の沈降速度の測定単位である。沈降速度の決定は分析的な超遠心分離により古典的に実施されたが、代表的には今日では標準的な超遠心分離により実施される。Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ（１９８２）Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第二版）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；ならびにＣａｎｔｅｒおよび　Ｓｃｈｉｍｍｅｌ（１９８０）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１−３部，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡを参照のこと。大雑把な決定として、おそらく可溶性ポリペプチドを含むサンプルを、標準的フルサイズの超遠心分離機で、約５０Ｋ　ｒｐｍで約１０分間で回転させ、そして可溶性分子は上清中に残留する。可溶性の粒子もしくはポリペプチドは代表的には約３０Ｓ未満であり、さらに代表的には約１５Ｓ未満であり、通常は約１０Ｓ未満であり、さらに通常では約６Ｓ未満であり、そして特定の実施態様では、好ましくは約４Ｓ未満であり、そしてさらに好ましくは約３Ｓ未満である。ポリペプチドもしくはフラグメントの溶解度は環境およびポリペプチドに依存する。多くのパラメーター（温度、電解質の環境、サイズ、およびポリペプチドの分子的特徴、ならびに溶媒の性質を含む）はポリペプチドの溶解度に影響する。代表的には、ポリペプチドが用いられる温度は約４℃から約６５℃の範囲である。通常、使用時での温度は約１８℃を超え、さらに通常では約２２℃を超える。診断上の目的のために、温度は通常、ほぼ室温以上であるが、アッセイでの成分の変性温度より低い。治療上の目的のために、温度は通常、体温、代表的にはヒトについては約３７℃であるが、特定の状況下では、インサイチュもしくはインビトロでは温度は上昇もしくは下降し得る。
【００３３】
　ポリペプチドのサイズおよび構造は一般には、実質的に安定な状態にあり、大抵は変性状態にない。ポリペプチドは四次構造において他のポリペプチドと会合して、例えば溶解度を与え得るか、または脂質もしくは界面活性剤と、天然の脂質二重層相互作用に近い様式で会合し得る。
【００３４】
　溶媒は通常、生物学的活性の保存のために使用されるタイプの、生物学的に適合性の緩衝液であり、そして通常、生理的な溶媒に近い。通常、溶媒は中性のｐＨ、代表的には約５と１０との間、そして好ましくは約７．５を有する。いくつかの場合には、代表的には穏やかな非変性性界面活性剤（例えば、ＣＨＳ（コレステリルヘミサクシネート）もしくはＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピル−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）が、またはタンパク質の構造的もしくは生理的な特性の有意な破壊を避けるために十分に低濃度で界面活性剤が添加される。
【００３５】
　タンパク質の文脈での「実質的に純粋」は、代表的にはタンパク質が、元の供給源生物体に由来する他の混入タンパク質、核酸、および他の生物学的製剤から単離されることを意味する。純度、もしくは「単離」は標準的な方法によりアッセイされ得、そして通常は少なくとも約５０％の純度、、さらに通常では少なくとも約６０％の純度、一般には少なくとも約７０％の純度、さらに一般には少なくとも約８０％の純度、しばしば少なくとも約８５％の純度、さらに頻繁には少なくとも約９０％の純度、好ましくは少なくとも約９５％の純度、さらに好ましくは少なくとも約９８％の純度、および最も好ましい実施態様では少なくとも９９％の純度である。類似の概念は、例えば、抗体または核酸に適用される。
【００３６】
　核酸配列比較の文脈での「実質的類似性」とは、比較した場合にセグメントまたはそれらの相補的鎖のいずれかが、適切なヌクレオチド挿入もしくは欠失を有して、最適に整列させた場合に、少なくとも約５０％のヌクレオチド、一般的には少なくとも５６％、さらに一般的には少なくとも５９％、通常は少なくとも６２％、さらに通常では少なくとも６５％、しばしば少なくとも６８％、さらに頻繁には少なくとも７１％、代表的には少なくとも７４％、さらに代表的には少なくとも７７％、大抵は少なくとも８０％、さらに大抵では少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５から９８％以上、そして特定の実施態様では約９９％以上の高い程度のヌクレオチドが同一であることを意味する。あるいは、実質的類似性は、セグメントが、選択的なハイブリダイゼーションの条件下で、代表的には配列番号１、５、または７から誘導される配列を使用する鎖またはその相補体に対してハイブリダイズする場合に存在する。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約３０ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約５５％の類似性が、好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約６５％の類似性が、さらに好ましくは約２０ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約７５％の類似性が、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の類似性が存在する場合に生じる。Ｋａｎｅｈｉｓａ（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：２０３−２１３を参照のこと。記載のように、類似性比較の長さはより長いストレッチにわたり得、そしていくつかの実施態様では少なくとも約１７ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、さらに通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、さらに代表的には少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、そしてさらに好ましくは少なくとも７５から１００以上のヌクレオチド（例えば、１５０，２００など）のストレッチにわたる。
【００３７】
　ハイブリダイゼーションの文脈における相同性または実質的類似性に言及する際の「ストリンジェントな条件」とは、塩、温度、有機溶媒、および他のパラメーター（代表的には、ハイブリダイゼーション反応において制御されるもの）の、ストリンジェントな組み合わせ条件である。パラメーターの組合せは、単一の任意のパラメーターの測定単位よりもさらに重要である。例えば、ＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｄｓｏｎ（１９６８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９−３７０を参照のこと。ストリンジェントな条件下で標的核酸に結合する核酸プローブは、上記標的核酸に特異的である。このようなプローブは、代表的には１１ヌクレオチド長より長く、そしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的に結合するために、プローブの配列により特定される領域にわたって標的核酸に対して十分に同一または相補的である。
【００３８】
　他の哺乳動物種に由来するＤＧＷＣＣケモカインは、近縁種の種間（Ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーションによりクローン化および単離され得る。例えば、以下を参照のこと。類似性は遠縁種間では相対的に低いかもしれず、従って比較的近縁な種のハイブリダイゼーションが望ましい。あるいは、より低い種特異性を示す抗体調製物の調製は、発現クローニングのアプローチに有用であり得る。
【００３９】
　句「抗体に特異的に結合する」または「特異的に免疫応答性である」は、タンパク質またはペプチドを言及する場合、タンパク質および他の生物学的成分の異種集団の存在下でのタンパク質の存在の決定因である結合反応をいう。従って、示されたイムノアッセイの条件下では、特定の抗体は特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質とは有意には結合しない。このような条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質についてのその特異性について選択された抗体を要求し得る。例えば、配列番号２、または６もしくは８に示されるアミノ酸配列を有するＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質免疫原に対して惹起された抗体は、ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質については特異的に免疫反応性だが、他のタンパク質に対してはそうでない抗体を入手するために選択され得る。抗体は、例えば、多型性およびスプライシング、もしくは発生的な改変体も認識して種特異的であり得る。
【００４０】
　（ＩＩＩ．核酸）
　ＤＧＷＣＣケモカインは、構造的および機能的に関連するタンパク質の例である。これらの可溶性ケモカインタンパク質は、異なる細胞型間にシグナルを伝達するのに役立つ。開示されるように、好ましい実施態様は、異なる個体もしくは他の種（例えば、鳥類および哺乳動物のような温血動物）に由来する遺伝子を単離するための標準的な手順において有用である。交差ハイブリダイゼーションは、個体、株、または種からの、タンパク質をコードする関連遺伝子の単離を可能にする。多数の異なるアプローチは、本明細書中で提供される情報に基づいて、適切な核酸クローンを首尾良く単離するために利用可能である。サザンブロットハイブリダイゼーションの研究は、特定のハイブリダイゼーション条件下で、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、およびウサギのゲノム中の相同遺伝子の存在を定性的に決定し得る。
【００４１】
　相補的な配列はプローブもしくはプライマーとしても使用される。もっともらしいアミノ末端の同定に基づけば、他のペプチドは、例えば、係留されたベクターもしくはポリＡ相補的ＰＣＲ技術とを結びつけて、または他のペプチドの相補的ＤＮＡと結びつけて特に有用であるはずである。
【００４２】
　ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードする遺伝子の核酸操作の技術（例えば、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現ベクターへのサブクローニング、プローブの標識化、ＤＮＡハイブリダイゼーションなど）は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１〜３巻，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹに記載され、これは本明細書中で参考として援用される。このマニュアルは以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」と言及される。
【００４３】
　ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードするＤＮＡ配列の単離の様々な方法がある。例えば、本明細書で開示される配列と同一もしくは相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡは単離される。全長のプローブが使用され得、またはオリゴヌクレオチドプローブが、開示された配列との比較により生成され得る。このようなプローブをハイブリダイゼーションアッセイで直接使用して、ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードするＤＮＡを単離し得るか、またはプローブはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードするＤＮＡの単離のための、ＰＣＲのような増幅技術での使用のために設計され得る。逆翻訳コンピュータープログラムは、同じタンパク質をコードする代わりの核酸配列もまた提供し得る。
【００４４】
　ｃＤＮＡライブラリーを調製するために、ｍＲＮＡは、ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質を発現する細胞から単離される。ｃＤＮＡはｍＲＮＡから調製され、組換えベクター中に連結される。ベクターは、増殖、スクリーニング、およびクローニングのために組換え宿主にトランスフェクトされる。ｃＤＮＡライブラリーを作製およびスクリーニングするための方法は周知である。ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）Ｇｅｎｅ２５：２６３−２６９ならびにＳａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと。
【００４５】
　ゲノムライブラリーのために、ＤＮＡは、組織から抽出され、そして機械的に剪断されるか、もしくは酵素消化されるのかのいずれかにより約１２〜２０ｋｂのフラグメントを生じ得る。次に、フラグメントは勾配遠心分離により分離され、そしてバクテリオファージλベクター中にクローン化される。これらのベクターおよびファージは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの記載のように、インビトロでパッケージングされる。組換えファージは、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９６：１８０−１８２中の記載のように、プラークハイブリダイゼーションにより解析される。コロニーハイブリダイゼーションは、例えば、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら（１９７５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７２：３９６１−３９６５に一般的に記載されるように実施される。
【００４６】
　ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーションアッセイにおいて本明細書中で記載される核酸プローブにハイブリダイズする能力により、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーのいずれかにおいて同定され得る。対応するＤＮＡ領域は、当業者に周知の標準的な方法により単離される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと。
【００４７】
　標的配列を増幅する種々の方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）はまた、ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡから、およびゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからこのような核酸配列を直接増幅するために使用される。ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードする単離された配列は、ＰＣＲ増幅のテンプレートとしてもまた使用され得る。
【００４８】
　代表的には、ＰＣＲ技術では、増幅されるＤＮＡ領域の二つの５’領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが合成される。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応が二つのプライマーを使用して実施される。Ｉｎｎｉｓら（編）（１９９０）ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと。プライマーは、全長のＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードする全領域を増幅するための、または所望により、さらに小さなＤＮＡセグメントを増幅するように選択され得る。一度このような領域がＰＣＲ増幅されると、それらは配列決定され得、そして標準的な技術を使用して得られた配列からオリゴヌクレオチドプローブが調製され得る。次いで、これらのプローブは、ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードするＤＮＡの単離に使用され得る。
【００４９】
　プローブとして使用するオリゴヌクレオチドは、通常、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２２（２０）：１８５９−１８６２により最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って、またはＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８に記載されたように自動合成機を使用して、化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、例えば、未変性のアクリルアミドゲル電気泳動により、またはＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅｇｎｉｅｒ（１９８３）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９により記載されるようにアニオン交換ＨＰＬＣにより実行される。合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏｌｄａｖｅ編（１９８０年）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５：４９９−５６０，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋでの、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの化学的分解法を用いて検証され得る。
【００５０】
　ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードする単離された核酸が同定された。ヌクレオチド配列および対応するオープンリーディングフレームは配列番号１または５または７に提供される。
これらのＤＶｉｃ−１およびＤＧＷＣＣケモカインは、ケモカインの部分に限定された類似性を示す。例えば、ＭａｔｓｕｓｈｉｍａおよびＯｐｐｅｎｈｅｉｍ（１９８９）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　１：２−１３；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：６１７−６４８；Ｓｃｈａｌｌ（１９９１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　３：１６５−１８３；ならびにＧｒｏｎｅｎｂｏｒｎおよびＣｌｏｒｅ（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　４：２６３−２６９を参照のこと。比較の他の特徴は、ＤＧＷＣＣケモカインとケモカインファミリーとの間で明白である。例えば、Ｌｏｄｉら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３：１７６２−１７６６を参照のこと。詳細には、ｂ−シート残基およびａ−ヘリックス残基は、例えばＲＡＳＭＯＬプログラム（ＳａｙｌｅおよびＭｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ（１９９５）ＴＩＢＳ　２０：３７４−３７６；またはＧｒｏｎｅｎｂｅｒｇら、（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　４：２６３−２６９を参照のこと）を使用して決定され得、そして他の構造的な特徴はＬｏｄｉら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３：１７６２−１７６７で定義されている。これらの二次的特徴および三次的特徴は、適切なシステイン残基の間隔とともに、Ｃ，ＣＣ，ＣＸＣ，およびＣＸ３Ｃの構造的特徴をさらに定義するのを助ける。
【００５１】
　本発明は、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードする単離されたＤＮＡまたはフラグメントを提供する。加えて、本発明は、適切な条件下（例えば、高いストリンジェンシー）で本明細書に記載されるＤＮＡ配列とハイブリダイズし得る、タンパク質もしくはポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡもしくは組換えＤＮＡを提供する。上記生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、インタクトなリガンドまたはフラグメントであり得、そしてとりわけ天然の実施態様では、配列番号２または６または８に開示されるようなアミノ酸配列を有する。好ましい実施態様は、単離物由来の、例えば、グリコシル化されていない場合のサイズが約１１，０００から１２，５００ダルトンの全長の天然の配列、または少なくとも約６，０００ダルトン、さらに好ましくは少なくとも約８，０００ダルトンのフラグメントである。グリコシル化形態では、タンパク質は１２，５００ダルトンを超え得る。更に、本発明は、ＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質に相同であるタンパク質をコードするか、または、ＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードするｃＤＮＡをプローブとして使用することにより単離された、単離されたＤＮＡもしくは組換えＤＮＡまたはそのフラグメントの使用を意図する。単離されたＤＮＡは、５’および３’に隣接する調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ−Ａ付加シグナルなど）をそれぞれ有し得る。これらの配列を有する発現ベクターを作製するための方法、または例えば、タンパク質産物を発現および精製するための方法もまた含まれる。
【００５２】
　（ＩＶ．ＤＶｉｃ−１、ＤＧＷＣＣケモカインの作製）
　ＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣケモカインをコードするＤＮＡまたはそのフラグメントは、化学的合成、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、または広範な種々の細胞株もしくは組織サンプルから調製されたゲノムライブラリーのスクリーニングにより入手され得る。このようなことを行うための方法、または発現ベクターを作製するための方法は、本明細書中に記載される。
【００５３】
　これらのＤＮＡは、全長タンパク質またはフラグメントの合成のために、広範な種々の宿主細胞で発現され得る。次いで、これらの全長タンパク質もしくはフラグメントは、例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の産生のために；結合の研究のために；改変した分子の構築および発現のために；ならびに構造／機能の研究のために使用され得る。各ＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣケモカインまたはそのフラグメントは、適切な発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞中で発現され得る。これらの分子は、組換え宿主由来のもの以外は、タンパク質または細胞の混入物を含まないように実質的に精製され得、それゆえ薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤と組み合わされた場合、薬学的組成物中で特に有用である。抗原（例えば、ＤＧＷＣＣケモカイン）またはその部分は、他のタンパク質との融合物として、またはエピトープタグを有して発現され得る。
【００５４】
　発現ベクターは、代表的には、適切な宿主細胞において認識される適切な遺伝的制御エレメントに作動可能に連結された所望の抗原遺伝子もしくはそのフラグメントを含む自己複製性ＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物である。発現をもたらすために必要とされる特定の型の制御エレメントは、使用される最終的な宿主細胞に依存する。一般には、遺伝制御エレメントは、原核生物のプロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系を含み得、そして代表的には転写プロモーター、転写開始を制御する任意のオペレーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を終結させる配列を含む。発現ベクターはまた、通常、ベクターが宿主細胞から独立的に複製することを可能にする複製起点を含む。
【００５５】
　本発明のベクターは、ＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣケモカイン、または代表的には、例えば、生物学的に活性なポリペプチドすなわちタンパク質をコードするフラグメントを含む。ＤＮＡはウイルスのプロモーターの制御下にあり得、そして選択マーカーをコードし得る。本発明は、原核生物もしくは真核生物宿主においてＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードする真核生物ｃＤＮＡを発現し得るような発現ベクターの使用を更に意図し、ここで、このベクターは宿主と適合性であり、そしてタンパク質をコードする真核生物ｃＤＮＡは、ベクターを含む宿主の増殖により目的のｃＤＮＡが発現されるようにベクター中に挿入される。通常、発現ベクターは、それらの宿主細胞における安定な複製のために、もしくは増幅して細胞当たりの所望の遺伝子の全コピーを大いに増加させるために設計される。発現ベクターの宿主細胞中での複製を要求することは、必ずしも必要ではない（例えば、宿主細胞により認識される複製起点を含まないベクターを使用して、種々の宿主においてタンパク質もしくはそのフラグメントの一過性の発現をもたらすことは可能である）。ＤＶｉｃ−１もしくはＤＧＷＣＣケモカイン遺伝子またはそのフラグメントの、宿主ＤＮＡ中への組換えによる組み込みを生じるベクターの使用、あるいは内在性の遺伝子の発現を制御するプロモーターの取り込みもまた可能である。
【００５６】
　本明細書で使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主のゲノム中へのＤＮＡフラグメントの組込みを可能にする他のビヒクルが意図される。発現ベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現をもたらす遺伝的制御エレメントを含む特殊化されたベクターである。プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態であるが、同等の機能を果たす多くの他の形態のベクターは、本明細書中の使用に適する。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、（１９８５および補遺）Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｄｒｉｑｕｅｚら（編）、（１９８８）　Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ　Ｓｕｒｖｅｙ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｅｓ　Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
【００５７】
　適切な宿主細胞は、原核生物、下等真核生物、および高等真核生物を含む。原核生物はグラム陰性生物およびグラム陽性生物の両方（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含む。下等真核生物は、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ）、ならびにＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの種を含む。高等真核生物は、非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞および鳥類）、ならびに哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、ならびに齧歯類）の両方の動物細胞に由来する、樹立された組織培養細胞株を含む。
【００５８】
　原核生物宿主ベクター系は、各種の、多くの異なる種のための広範な種々のベクターを含む。本明細書で使用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉおよびそのベクターは、他の原核生物で使用される等価なベクターを含むように包括的に使用される。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２もしくはその誘導体である。ＤＧＷＣＣケモカインもしくはＤＧＷＣＣケモカインのフラグメントを発現するために使用され得るベクターは以下のプロモーターを含むベクターのようなベクターを含むがこれらに限定されない：ｌａｃプロモーター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；ＩＰＰプロモーター（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰもしくはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）；またはｐｔａｃのようなハイブリッドプロモーター（ｐＤＲ５４０）。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　およびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ　Ｓｕｒｖｅｙ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｅｓ　１０：２０５−２３６　Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ中の、Ｂｒｏｓｉｕｓら、（１９８８）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ　Ｉｐｐ−　ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ」を参照のこと。
【００５９】
　下等真核生物（例えば、酵母およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）は、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカイン配列を含有するベクターで形質転換され得る。本発明の目的のために、最も一般的な下等真核生物宿主は、パン酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。多くの他の株および種類もまた利用可能であるが、これは、下等真核生物を代表するために一般に使用される。酵母ベクターは、代表的に複製起点（組込み型を除いて）、選択遺伝子、プロモーター、所望のタンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ、ならびに翻訳終止、ポリアデニル化、および転写終結のための配列からなる。酵母に関して適切な発現ベクターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび種々の他の糖分解酵素遺伝子プロモーターのような構成性プロモーターまたは、アルコールデヒドロゲナーゼ２プロモーターまたはメタロチオネインプロモーターのような誘発性プロモーターを含有する。適切なベクターは、以下のタイプの誘導体を含有する：低いコピー数で自己複製すること（ＹＲｐ−系列のような）、高いコピー数で自己複製すること（ＹＥｐ−系列のような）；組込み型（ＹＩｐ−系列のような）、またはミニ染色体（ＹＣｐ−系列のような）。
【００６０】
　高等真核生物組織培養細胞は、代表的には、機能的に活性なＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質の発現のために好ましい宿主細胞である。原則として、多くの高等真核生物組織培養細胞株は、無脊椎動物供給源由来または脊椎動物供給源由来にかかわらず、例えば昆虫バキュロウイルス発現系を使用し得る。しかしながら、哺乳類細胞は、同時翻訳および翻訳後の両方で適切なプロセシングを達成するために好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は日常的である。有用な細胞株はＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ベビーラット腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥細胞株、そしてサル（ＣＯＳ）細胞系を包含する。そのような細胞株のための発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（例えば、ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終止部位を含有する。これらのベクターはまた、選択遺伝子または増幅遺伝子を含有し得る。適切な発現ベクターは、例えばアデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルス由来のような起源に由来するプロモーターを保有するプラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表的な例は、ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ、Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　５：１１３６−１１４２を参照のこと；ｐＭＣ１ｎｅｏ　Ｐｏｌｙ−Ａ、Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ　５１：５０３−５１２を参照のこと；およびｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０のようなバキュロウイルスを包含する。
【００６１】
　ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインは、生物学的応答を惹起するためにグリコシル化される必要はないようである。しかしながら、特定のまたは定義されたグリコシル化パターンを提供する系においてＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインポリペプチドを発現することは、時折望ましい。この場合、有用なパターンは、発現系により自然に提供されるパターンである。しかしながら、このパターンは、ポリペプチド（例えば、非グリコシル化型の）を、異種発現系に導入された適切なグリコシル化タンパク質に曝露することにより、修正可能となる。例えば、ＤＧＷＣＣケモカイン遺伝子は、哺乳類または他のグリコシル化酵素をコードする１つ以上の遺伝子と同時形質転換され得る。過度のグリコシル化は、ＤＧＷＣＣケモカインイン生物学的活性に有害となり得、当業者は最適な生物学的活性を与えるグリコシル化の程度を最適化するために日常的な試験を実施し得ることがさらに理解される。
【００６２】
　ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカイン、またはそのフラグメントは、細胞膜に連結されたホスファチジルイノシトール（ＰＩ）であるように操作され得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素（例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ）での処理により膜から除去され得る。これは、抗体を生物学的に活性な形態で放出し、そしてタンパク質化学の標準的な手順による精製を可能にする。例えば、Ｌｏｗ　（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　９８８：　４２７−４５４；Ｔｓｅら　（１９８５）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：　１００３−１００８；およびＢｒｕｎｎｅｒ　ら（１９９１）　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１１４：　１２７５−１２８３を参照のこと。
【００６３】
　今やＤＶｉｃ−１およびＤＧＷＣＣケモカインが特徴付けられており、そのフラグメントまたは誘導体はペプチドを合成するための従来のプロセスにより調製され得る。これらとしては、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ　（１９８４）　Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，　ＩＬ；　ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ　（１９８４）　Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ＮＹ；　およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ　（１９８４）　Ｔｈｅ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ＮＹに記載のようなプロセスが挙げられる。例えば、アジド処理、酸塩化物プロセス、酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、もしくはシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾールプロセス、酸化−還元プロセス、またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）／付加剤プロセスが使用され得る。固相および液相合成の両方が、前記のプロセスに適用可能である。また、化学的連結、例えばＤａｗｓｏｎら、（１９９４）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６６：７７６−７７９、ペプチド結合により長鎖合成ペプチドを連結する方法、を参照のこと。
【００６４】
　調製されたタンパク質およびそのフラグメントは、単離され得、ペプチド分離、例えば、抽出、沈澱、電気泳動、および種々の型のクロマトグラフィなどにより反応混合物から精製され得る。本発明のＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインは、その所望の用途に依存して種々の精製の程度で得られ得る。精製は、公知のタンパク質精製法の使用または本明細書に記載の抗体または結合パートナー（例えば、免疫吸着アフィニティ−クロマトグラフィ−における）の使用により達成され得る。この免疫吸着アフィニティ−クロマトグラフィは、まず、固体支持体に抗体を連結させ、次いで、連結した抗体を、適切な起源細胞の溶解した溶解物、リガンドを発現する他の細胞の溶解物、または組換えＤＮＡ技術の結果としてのＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインを産生する細胞の溶解物もしくは上清と接触させることにより実施される。以下を参照のこと。
【００６５】
　複数の細胞株が、他の細胞と比べて高レベルでＤＧＷＣＣケモカインを発現する細胞についてスクリーニングされ得る。天然ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインは、天然起源から単離し得るか、または適切な発現ベクターを使用する形質転換細胞からの発現により得る。発現したタンパク質の精製は、標準的手順により達成されるか、または細胞溶解物もしくは上清から高い効率での効果的精製のための設計された手段と併用され得る。エピトープまたは他のタグ（例えば、ＦＬＡＧまたはＨｉｓ６セグメント）は、このような精製の特徴にために使用され得る。
【００６６】
　（Ｖ．抗体）
　抗体は、それらの天然に存在する（全長）形態およびそれらの組換え形態の両方において、個々の、多型性の、対立遺伝子の、株の、または種改変体、そしてそのフラグメントを包含する種々のＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインに対して惹起され得る。さらに抗体は、それらの活性形態または不活性形態のどちらかのＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインに対して惹起され得る。抗イディオタイプ抗体もまた、使用され得る。抗体は、種、個々のまたは多型性の改変体に対する種々の結合特異性を示し得る。
【００６７】
　（Ａ．抗体産生）
　多数の免疫原が、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質と特異的に反応性の抗体を産生するために使用され得る。組換えタンパク質は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生のために好ましい免疫原である。天然に存在するタンパク質はまた、純粋形態または不純形態のどちらかで使用され得る。本明細書に記載のＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質配列を使用して生成される合成ペプチドもまた、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインに対する抗体の産生のための免疫原として使用され得る。組換えタンパク質は、本明細書に記載されるような真核生物または原核生物細胞において発現され得、そして記載されるように精製され得る。天然に折り畳まれたまたは変性した物質は、抗体産生のために、適切なように、使用され得る。モノクローナルまたはポリクローナル抗体のどちらかが、タンパク質を測定するための免疫アッセイにおける、引き続く使用のために生成され得る。
【００６８】
　ポリクローナル抗体産生の方法は、当業者に公知である。代表的には、免疫原（好ましくは精製タンパク質）を、アジュバントと混合し、そして動物をこの混合物で免疫する。免疫原調製物に対する動物の免疫応答を、試験出血を採取し、そして目的のＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質への反応性の力価を決定することによりモニターする。免疫原に対する抗体の適度に高い力価が得られる場合、通常、反復免疫化後、血液を哺乳類から採集し、そして抗血清を調製する。所望される場合、タンパク質に対して反応性の抗体について富化するために抗血清のさらなる分画を、実施し得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ；またはＣｏｌｉｇａｎを参照のこと。
【００６９】
　モノクローナル抗体は当業者に周知の種々の技術により得られ得る。代表的には、所望の抗原で免疫化された動物由来の脾臓細胞を、通常にはミエローマ細胞との融合により、不死化する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（１９７６）　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　６：５１１−５１９　（参考として本明細書中に援用される）を参考のこと）。不死化の代替的方法は、エプスタインバールウイルス、オンコジーン、もしくはレトロウイルスでの形質転換、または当業者に公知の他の方法を包含する。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、抗原についての所望の特異性および親和性の抗体の産生に関してスクリーニングもする。このような細胞により生じるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含有する種々の技術により高め得る。あるいは、当業者は、例えば、Ｈｕｓｅら、（１９８９）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１により概説される一般的プロトコールに従って、ヒトＢ細胞由来ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離し得る。
【００７０】
　ＤＧＷＣＣケモカインの所定のフラグメントに対する抗体、（結合フラグメントおよび単鎖バージョンを包含する）は、上記のようなキャリヤータンパク質とのフラグメントの結合体での動物の免疫化により惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常のまたは欠陥のＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインへの結合に関してスクリーニングされ得るか、または、例えば、レセプターを通して仲介されるアゴニストもしくはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約１ｍＭ、より通常には少なくとも約３００μＭ以上で、代表的には少なくとも灼く１０μＭで、代表的には少なくとも約３０μＭで、好ましくは、少なくとも約１０μＭで、そしてより好ましくは少なくとも約３μＭまたはそれより良い、ＫＤで結合する。
【００７１】
　いくつかの場合において、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなど）からモノクローナル抗体を調製することが所望される。そのようなモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ，　ＣＡ、および本明細書中で引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ　（１９８８）　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ＣＳＨ　Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ　（１９８６）　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ＮＹ；および特に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（１９７５）　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：　４９５−４９７（これは、モノクローナル抗体を産生する一つの方法を記載する）において見出され得る。簡潔に要約すると、この方法は、動物に免疫原を注入することを包含する。次いで、動物は屠殺され、そして細胞はその脾臓から採取され、次いでその細胞は骨髄腫細胞に融合される。この結果は、インビトロで再生され得るハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」である。次いで、ハイブリドーマの集団をスクリーニングして、各々が免疫原に対する単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離する。この様式において、得られる個々の抗体種は、免疫原物質上で認識される特異的部位に応答して作製される免疫動物由来の不死化およびクローン化されたＢ単細胞の生産物である。
【００７２】
　他の適切な技術は、ファージもしくは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択を包含する。例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）「λファージにおける免疫グロブリンレパートリーのラージコンビナトリアルライブラリーの作製」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１：およびＷａｒｄら（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：５４４−５４６を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む改変を伴ってまたは伴わずに使用され得る。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する基質を共有結合的にまたは非共有結合的に結合することにより標識される。広範に多様な標識および結合技術が公知であり、そして科学文献および特許文献の両方で多数報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。組換え免疫グロブリンもまた産生され得る。Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＱｕｅｅｎら　（１９８９）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６：　１００２９−１００３３を参照のこと。
【００７３】
　本発明の抗体は、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質の単離におけるアフィニティークロマトグラフィーに有用である。カラムは、抗体を固相支持体（例えば、アガロース、ＳＥＰＨＡＤＥＸなどのような粒子）に連結させて調製され得、ここで、細胞溶解物または上清は、カラムを通過され得、カラムを洗浄し、続いて温和な変性剤の濃度を増加させることによって、精製ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質が遊離される。同様に、ケモカインへ結合する抗体は、レセプター結合を中和し得、レセプターアンタゴニストとして役立ち得る。それらはまた、ウエスタンブロット検出試薬またはＥＬＩＳＡ試薬として有用であり得る。
【００７４】
　抗体はまた、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。通常、このような手順に使用される抗体は、抗体の結合により抗原の存在の容易な検出を可能にする部分で標識される。
【００７５】
　ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインに対する抗体は、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインを発現する細胞集団の同定に使用し得る。例えば、ＤＧＷＣＣケモカインを発現する細胞の発現産物をアッセイすることにより、疾患、例えば免疫易無防備状態
の診断が可能となる。
【００７６】
　個々のＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインに対して惹起される抗体はまた、抗イディオ型の抗体を惹起するために有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種々の免疫学的状態を検出または診断するにおいて有用である。
【００７７】
　（Ｂ．免疫アッセイ）
　特定のタンパク質は、種々の免疫アッセイ方法により測定し得る。一般に、免疫学的および免疫アッセイ手段の総説に関して、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ（編）（１９９１）Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（第７編）を参照のこと。さらに、本発明の免疫アッセイは、Ｍａｇｇｉｏ（編）（１９８０）　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，　Ｆｌｏｒｉｄａ；　Ｔｉｊａｎ　（１９８５）　「Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」，　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｂ．　Ｖ．，　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；　ならびに、　Ｈａｒｌｏｗ　および　Ｌａｎｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　（前出），において広く概説される多くの構成で実施し得る。それぞれは、本明細書中に参考として援用される。また、Ｃｈａｎ（編）（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｏｒｌａｎｄｏ，　ＦＬ；　ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ（編）（１９９１）　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮＹ；　およびＮｇｏ（編）（１９８８）　Ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮＹ．を参照のこと。
【００７８】
　例えば、ＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質の測定のための免疫アッセイは、当業者に公知の種々の方法により実施され得る。要するに、タンパク質を測定するための免疫アッセイは競合的または非競合的結合アッセイのどちらかであり得る。競合結合アッセイにおいて、分析すべきサンプルは、固体表面に結合した捕獲剤の特異的結合部位に関して標識された分析物と競合する。好ましくは、捕獲剤は、上述のように産生したＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質と特異的に反応する抗体である。捕獲剤へ結合した標識化分析物の濃度は、サンプル中に存在する遊離分析物の量に反比例する。
【００７９】
　競合結合免疫アッセイにおいて、サンプル中に存在するＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質は、特異的な結合剤、例えば、ＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質と特異的に反応する抗体と結合することについて、標識化タンパク質と競合する。結合剤は、結合していない標識化タンパク質からの結合した標識タンパク質の分離を成立させるように固体表面に結合され得る。あるいは、競合結合アッセイは、液相で実施され得、そして当該分野で公知の種々の技術が、結合していない標識タンパク質から結合した標識化タンパク質を分離するために使用され得る。分離後、結合した標識タンパク質の量が決定される。サンプル中に存在するタンパク質の量は、標識したタンパク質結合の量に反比例する。
【００８０】
　代わりに、分離工程が必要でない均一免疫アッセイが、実施され得る。これらの免疫アッセイにおいて、タンパク質における標識は、その特異的結合剤へのタンパク質への結合により変わる。標識化したタンパク質におけるこの変化は、従って、標識により励起されたシグナルの減少または増加を生じ、その結果免疫アッセイの終わりでの標識の測定がタンパク質の検出または定量を可能にする。
【００８１】
　ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質はまた、様々な非競合的イムノアッセイ法により決定され得る。例えば、ツーサイト固相サンドイッチイムノアッセイが使用され得る。このタイプのアッセイにおいて、タンパク質結合剤、例えば抗体は、固相支持体に結合される。抗体でもあり得、そして異なる部位でタンパク質を結合する第二のタンパク質結合剤は、標識される。タンパク質の両側での結合が生じた後、非結合標識結合剤は除去され、そして固相へ結合した標識結合剤の量が測定される。結合した標識結合剤の量は、サンプル中のタンパク質量に直接比例する。
【００８２】
　ウエスタンブロット分析は、例えば、サンプル中のＤＧＷＣＣケモカインタンパク質の存在を決定するために使用され得る。電気泳動が、例えば、タンパク質を含むと予期される組織サンプルにおいて実施される。タンパク質を分離するための電気泳動、および適切な固相支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター）へのタンパク質の移動に続いて、固体支持体はタンパク質と反応する抗体とインキュベートされる。この抗体は標識され得、または、代わりに一次抗体に結合する二次標識抗体との引き続きのインキュベーションにより検出され得る。
【００８３】
　上記のイムノアッセイ形式は、標識したアッセイ成分を使用する。この標識は、当該分野に周知の方法に従うアッセイの所望の成分へ直接的または非直接的に結合され得る。多種多様の標識物および方法が使用され得る。伝統的には、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐを取り込んだ放射活性標識体が使用された。非放射活性標識は、標識された抗体、蛍光体、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドの特異的結合対メンバーとして作用し得る抗体と結合するリガンドを含む。標識の選択は、所望の感度、化合物との結合の容易さ、安定性の要求度、および利用可能な機器に依存する。使用され得る種々の標識システムまたはシグナル産生システムの概要については、参考として本明細書中に援用される米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
【００８４】
　特定のタンパク質と反応する抗体はまた、種々のイムノアッセイ法により測定され得る。イムノアッセイ技術による抗体の測定に適用可能である免疫学的手順およびイムノアッセイ法の再検討に関して、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ（編）　Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（第７編）（前出）；Ｍａｇｇｉｏ（編）Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　前出；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、前出を参照のこと。
手短に言うと、例えば、ＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質と反応する抗血清を測定するためのイムノアッセイは、競合的のまたは非競合的結合アッセイのどちらかであり得る。競合的結合アッセイにおいて、サンプル分析物は、固体表面に結合した捕獲剤上の特異的な結合部位において標識された分析物と競合する。好ましくは、捕獲剤は、上述のように産生された、精製された組換えＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質である。単離されたまたは部分的に精製された自然に存在するタンパク質を含有するＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質の他の供給源がまた、使用され得る。非競合アッセイは、サンプル分析物が、２つの分析物特異的結合試薬の間に結合される、サンドイッチアッセイを含む。結合剤の１つは、捕獲剤として使用され、そして、固体表面に結合される。第２の結合剤は標識され、そして、視覚的または機械的手段により得られた複合体を測定または検出するために使用される。多数の捕獲剤と標識された結合剤との組合せが、使用され得る。種々の異なるイムノアッセイ形式、分離技術、および標識体はまた、ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質の測定に関する、上述のこれらと同様に使用され得る。
【００８５】
　（ＶＩ．精製ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカイン）
　ヒトＤＶｉｃ−１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号１および２に提供される。ヒトＤＧＷＣＣヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号５および６に提供され；マウスＤＧＷＣＣヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号７および８に提供される。
精製タンパク質または定義されたペプチドは、上記のように、標準的な方法により抗体を作製するために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質は免疫系に提示され、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生じ得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ　（１９９１）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，　ＮＹ；　ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ　（１９８９）　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮＹを参照のこと、これらは参考として本明細書中に引用される。あるいは、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインレセプターは、特異的結合試薬として使用され得、そして、例えば、ＤＧＷＣＣケモカインリガンドの精製のために、その結合の特異性が利用され得る。
【００８６】
　特異的結合組成物は、ＤＧＷＣＣケモカインを発現する細胞株から作製される発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。スクリーニングのための多くの方法は、例えば、表面に発現されるリガンドの標準的な染色、またはパニングが利用可能である。細胞内発現のスクリーニングはまた、種々の染色または免疫蛍光手順により行われ得る。結合組成物は、リガンドを発現する細胞をアフィニティ精製するために、または選別するために使用され得た。
【００８７】
　ペプチドセグメントはまた、同種遺伝子との比較に加えて、ライブラリーをスクリーニングするための適切なオリゴヌクレオチドを産生するために使用され得る。遺伝子コードが、スクリーニングのためのプローブとして有用な適切なオリゴヌクレオチドを選択するために使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドは、自然の対立遺伝子の多型変異体を含むライブラリーから所望のクローンを選択することにおいて有用である。
【００８８】
　ペプチド配列はこのようなセグメントを認識する抗体を産生するペプチドの調製を可能にし、このような配列をコードするオリゴヌクレオチドの調製を可能にする。この配列はまた、合成的調製を可能にする、例えば、Ｄａｗｓｏｎら、（１９９４）　Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：７７６−７７９を参照のこと。ＤＶｉｃ−１およびＤＧＷＣＣケモカインは分泌タンパク質であり得るので、この遺伝子は、通常、プロセシングおよび分泌に際して除去されるＮ−末端シグナル配列を有する。しかしながら、正確なプロセシングポイントは異なる細胞型において変わり得、そして、異なる長さの形態が、しばしば検出される。例えば、シグナル切断ポイントの予測は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９７）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．　１０：１−８の方法により実施され得る。最も密接に関係する報告された配列との比較における構造的特徴の分析は、別のサイトカイン、特に、ＣＣおよびＣＸＣケモカインとして公知であるタンパク質種との類似性を明らかにした。
【００８９】
　（ＶＩＩ．物理学的変異体）
　本発明はまた、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインのアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列類似性を有するタンパク質またはペプチドを含む。天然の変異体は、個々の変異体、多型性の変異体、対立遺伝子変異体、株変異体または種変異体を含む。
【００９０】
　アミノ酸配列類似性または配列同一性は、必要であれば、必要なギャップを導入して、残基のマッチを最適化することにより決定される。これは、保存的置換をマッチとして考慮する場合は、変化する。保存的置換は、代表的には以下の群内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。相同なアミノ酸配列は、タンパク質配列における、天然の多型変異、対立遺伝子変異、および種間変異を含む。代表的な相同タンパク質またはペプチドは、ＤＧＷＣＣケモカインのアミノ酸配列と５０〜１００％の類似性（ギャップが導入され得る場合）から７５〜１００％の類似性（保存的置換が含まれる場合）を有する。類似性の測定は、少なくとも約５０％、一般的には少なくとも６０％、より一般的には少なくとも６５％、通常は少なくとも７０％、より通常には少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも８０％であり、そして特に好ましい実施態様では、少なくとも８５％以上である。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら（１９７０）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　４８：　４４３−４５３；　Ｓａｎｋｏｆｆら　（１９８３）　Ｔｉｍｅ　Ｗａｒｐｓ，　Ｓｔｒｉｎｇ　Ｅｄｉｔｓ，　ａｎｄ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：　Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　第１章，　Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，　Ｒｅａｄｉｎｇ，　ＭＡ；　およびＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，　ＣＡのソフトウェアパッケージ；　およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩもまた参照のこと。
【００９１】
　哺乳動物ＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質をコードする核酸は、ストリンジェントな条件下で、代表的には配列番号１の核酸配列にハイブリダイズする。例えば、ＤＶｉｃ−１ケモカインタンパク質をコードする核酸は、通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１の核酸にハイブリダイズする。一般には、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、プローブ配列に対する融解点温度（Ｔｍ）よりも約１０℃低いように選択される。Ｔｍは、５０％の標的配列が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨの下で）温度である。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７で塩濃度が約０．２モルであり、そして温度が少なくとも約５０℃である条件である。とりわけ、相補鎖の塩基組成およびサイズ、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の存在、および塩基ミスマッチの程度を含む他の因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに有意に影響を及ぼし得る。好ましい実施態様には、５０％ホルムアミドおよび２００ｍＭ　ＮａＣｌ中で、４２℃で、開示された配列に結合する核酸が含まれる。
【００９２】
　単離されたＤＧＷＣＣケモカインＤＮＡは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、およびヌクレオチドストレッチの短い逆位により容易に改変され得る。これらの改変により、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカイン抗原、それらの誘導体、または高度に類似した生理学的活性、免疫原活性もしくは抗原活性を有するタンパク質をコードする新規のＤＮＡ配列が得られる。
改変された配列は、変異抗原を生成するため、または発現を増強するために使用され得る。増強された発現は、遺伝子の増幅、転写の増大、翻訳の増大、および他の機構を含み得る。このような変異ＤＧＷＣＣケモカイン誘導体は、タンパク質またはそのフラグメントの予め決定された（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）変異または部位特異的変異を含む。「変異ＤＧＷＣＣケモカイン」は、他に上述のようにヒトＤＧＷＣＣケモカインの相同性定義に該当するが、欠失、置換、または挿入のいずれかにより、天然に見出されるＤＧＷＣＣケモカインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特に、「部位特異的変異ＤＧＷＣＣケモカイン」は、一般に、配列番号６または８の配列を有するタンパク質と有意な類似性を有し、（例えば、天然の実施態様）、そして種々の生物学的活性（例えば、これらの配列との抗原性または免疫原性）を共有するタンパク質を含み、そして好ましい実施態様では、開示された配列の大部分または全てを含有するタンパク質を含む。これはまた、異なる個体由来の多型変異体にも適用される。同様の概念は、異なるＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質、特に種々の温血動物（例えば、哺乳動物および鳥類）に見出されるＤＧＷＣＣケモカインタンパク質に適用される。前に述べたように、記載は、一般に他のＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質を含むことを意図しており、特に議論されたマウスまたはヒトの実施態様に限定されないことを強調する。
【００９３】
　部位特異的変異部位は予め決定されているが、変異体は部位特異的である必要はない。例えば、ＤＧＷＣＣケモカインの変異誘発は、アミノ酸の挿入または欠失を作製することにより行われ得る。置換、欠失、挿入、または任意の組み合わせが生成されて、最終構築物に到達し得る。挿入は、アミノ末端融合物またはカルボキシ末端融合物、（例えば、エピトープタグ）を含む。ランダムな変異誘発は、標的コドンにて行われ得、次いで、発現された変異体は、所望の活性についてスクリーニングされ得る。公知の配列を有するＤＮＡ中の予め決定された部位での置換変異の作製方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術による）。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８７および補遺）もまた、参照のこと。ＤＮＡ中の変異は、通常、コード配列を読み取り枠の外にするべきではなく、そして好ましくは、ハイブリダイズしてループまたはヘアピンのような２次的なｍＲＮＡの構造を生成し得る相補的な領域を作らない。
【００９４】
　本発明はまた、組換えタンパク質（例えば、これらのタンパク質由来のセグメントを使用する異種融合タンパク質）を提供する。異種融合タンパク質は、本来、同じ方式では通常融合されないタンパク質またはセグメントの融合物である。従って、免疫グロブリンとＤＧＷＣＣケモカインポリペプチドとの融合産物は、代表的なペプチド結合で融合される配列を有し、代表的には単一の翻訳産物として作られ、そしてそれぞれの供給源のペプチドに由来する特性を示す、連続したタンパク質分子である。同様の概念が異種核酸配列に適用される。
【００９５】
　さらに、新たな構築物が他のタンパク質由来の類似の機能的ドメインの組み合わせから作製され得る。例えば、タンパク質結合セグメントまたは他のセグメントが、異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメントの間で「交換」され得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら　（１９８９）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３：　１３３０−１３３６；　およびＯ’Ｄｏｗｄら　（１９８８）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６３：　１５９８５−１５９９２を参照のこと。従って、特異性の新たな組み合わせを示す新たなキメラポリペプチドは、タンパク質結合特異性および他の機能的ドメインの機能的結合により得られる。
ＶＩＩＩ。結合剤：ケモカインタンパク質複合体
　配列番号２または８のアミノ酸配列からなる免疫原のような規定された免疫原に対して作成された抗体へ特異的または選択的に結合するか、または特異的免疫反応するＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質は、イムノアッセイで代表的に決定される。イムノアッセイは、配列番号２、６、または８のタンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は、他のケモカインに対して低交差反応性を有するように選択され、そして、任意のこのような交差反応性はイムノアッセイの使用前の免疫吸着により除去される。
【００９６】
　イムノアッセイにおける使用のための抗血清を産生するために、配列番号２または６または８のタンパク質は、本明細書中に記載されるように単離される。例えば、組換えタンパク質は哺乳類動物細胞株で産生され得る。ＢＡＬＢ／ｃのようなマウスの純系株は、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントのような標準的なアジュバント、および標準的なマウス免疫化プロトコル（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出を参照のこと）を使用して、配列番号２または４または８のタンパク質で免疫化される。あるいは、本明細書中で開示される配列由来およびキャリアタンパク質に結合された合成ペプチド（好ましくは、全長に近い）が免疫原として使用され得る。ポリクローナル血清は採集され、そして、イムノアッセイ（例えば固体支持体に固定化された免疫原の固相イムノアッセイ）において免疫原タンパク質に対して力価測定される。１０４またはそれよりも大きな力価をもつポリクローナル抗血清が選択され、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ　５７０〜５７３頁（前出）に記載されるような競合的結合イムノアッセイを使用して、Ｃ、ＣＣ、ＣＸ３Ｃ、およびＣＸＣケモカインに対するこれらの交差反応性が試験された。好ましくは、２つのケモカインが、この決定において、ヒトＤＧＷＣＣケモカインとの組合せで使用される。
【００９７】
　競合的結合形式におけるイムノアッセイは、交差反応性決定に使用され得る。例えば配列番号２または配列番号６および／または配列番号８のタンパク質は、固体支持体へ固定化され得る。アッセイに添加されたタンパク質は、固定化された抗原に対する抗血清の結合と競合する。固定化されたタンパク質に対する抗血清の結合と競合する上記タンパク質の能力は、配列番号２または配列番号６および／または配列番号８のタンパク質と比較される。上記タンパク質のパーセント交差反応性は、標準的計算法を使用して計算される。上に列挙された個々のタンパク質と１０％未満の交差反応性をもつこれらの抗血清は選択され、そしてプールされる。次いで、交差反応性抗体は、上の列挙されたタンパク質との免疫吸着によりプールされた抗血清から除去される。
【００９８】
　次いで、免疫吸着しそしてプールされた抗血清は、二次タンパク質と免疫原タンパク質（例えば、配列番号６または８のＤＧＷＣＣケモカインモチーフ）と比較するために、上記のような競合的結合イムノアッセイにおいて使用される。この比較を実施するために、２つのタンパク質は、広範囲の濃度でそれぞれアッセイされ、そして、固定化されたタンパク質への抗血清の結合の５０％を抑制するために必要とされる各タンパク質の量が、決定される。所望の二次タンパク質の量が、タンパク質（例えば、所望の配列番号６または８のタンパク質）の量の２倍未満である場合、次いで、二次タンパク質は、免疫原に対して産生された抗体に特異的に結合するといわれる。
【００９９】
　ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質は、密接に関連した遺伝子を含む種を越えた、同種タンパク質の群の種形成であることが理解される。ＤＧＷＣＣケモカインタンパク質のような特定の遺伝子産物について、その用語は、本明細書中で開示されるアミノ酸配列のみならず、また多型変異体、対立遺伝子変異体、または非対立遺伝子変異体である別のタンパク質を表す。用語「ＤＧＷＣＣ」は、従来の技術（例えば、点変異のような組換え技術、またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードする短いＤＮＡセクションを切除することにより、または新しいアミノ酸を置換することによりまたは新しいアミノ酸の付加）を使用する計画的変異により導入される非天的変異体を含むことが理解される。このような主要でない変異体は、本来の分子の免疫学的同一性および／またはその生物学的活性を実質的に維持するべきである。従って、これらの変異体は、設計自然に存在するＤＧＷＣＣケモカインタンパク質（例えば、配列番号６または８に示されるＤＧＷＣＣケモカインタンパク質）と特定的に免疫反応するタンパク質を含む。変化したタンパク質の生物学的特徴は、適切な細胞系でのタンパク質の発現および適切な生物学的活性（例えば走化作用効果）を測定することにより、決定され得る。少数であるとみなされる特定のタンパク質修飾は、全体としてＤＧＷＣＣケモカインタンパク質に関して上述のような、同様の化学的特徴を有するアミノ酸の保存的置換を含む。配列番号６または８のタンパク質に最適なタンパク質を並べることにより、そして免疫同一性を決定するために本明細書中に記載される通常の免疫アッセイの使用により、またはリンパ球化学走性アッセイの使用により、研究者は、本発明のタンパク質組成物を決定し得る。
【０１００】
　（ＩＸ．機能的変異体）
　ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインに対する物理学的応答のブロックは、そのレセプターへのタンパク質の結合の阻害（例えば、競合から阻害により）から生じ得る。従って、本発明のインビトロアッセイは、単離タンパク質、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインを結合した組換え膜を発現する細胞由来の膜、これらのタンパク質のレセプター結合セグメントを含む溶解性フラグメント、または固相基質に結合したフラグメントをしばしば使用する。これらのアッセイはまた、結合セグメント変異体およびその修飾体またはタンパク質変異体および修飾体（例えば、タンパク質類似体）のどちらかの効果の診断上の決定を可能にする。本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図する（例えば、抗原またはレセプターフラグメントに対する中和抗体が、タンパク質の結合のために試験化合物と競合する場合）。この様式で、抗体は、タンパク質の１つ以上の抗原性結合部位を共有するポリペプチドの存在を検出するために使用され得、そしてまた、他にレセプターと相互作用し得るタンパク質の結合部位を占領にするために使用され得る。
【０１０１】
　例えば、ＤＧＷＣＣケモカイン抗原の「誘導体」は、アミノ酸配列変異体、グリコシル化改変体、および他の化学成分との共有結合体または凝集結合体を含有する。共有結合誘導体は、当該分野で周知の手段により、ＤＧＷＣＣケモカインアミノ酸側鎖中または、Ｎ−末端またはＣ−末端に見られる群の機能性の結合により調製され得る。これらの誘導体は、カルボキシル末端のまたはカルボキシル側鎖を有する残基の脂肪族エステルまたはアミド、水酸基を有する残基のＯ−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基を有する残基（例えば、リジンまたはアルギニン）のＮ−アシル誘導体を含有し得るがこれらに限定されない。アシル基はアルキル部分（例えば、Ｃ３〜Ｃ１８の通常のアルキル）を含む残基から選択され、それにより、アルカノイルアロイル種を形成する。免疫原性部分がハプテンである場合、キャリアタンパク質への共有結合は、重要であり得る。
【０１０２】
　特に、グリコシル化改変（例えば、その合成およびプロセシングの間、またはさらなるプロセシングの工程でのポリペプチドのグリコシル化パターンの改変によりなされる）が包含される。これを達成する特に好ましい手段は、通常そのようなプロセシングを提供する細胞に由来するグリコシル化酵素（例えば、哺乳動物グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝すことによる。脱グリコシル化酵素もまた、意図される。他の小さな改変を有する同様の一次アミノ酸配列のバージョンもまた包含され、これはリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニン）または、リボシル基もしくは架橋剤を含む他の成分を包含する。
【０１０３】
　誘導体の主要な群は、ＤＧＷＣＣケモカインまたはそのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合体である。これらの誘導体は、Ｎ末端またはＣ末端融合物のような組換え培養物中で、または反応性側鎖基を介するのタンパク質の架橋結合に有用な当該分野で公知の薬剤の使用により合成され得る。架橋結合剤を用いる好ましいタンパク質誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭化水素部分、およびシステイン残基である。
【０１０４】
　ＤＧＷＣＣケモカインと他の相同性タンパク質または異種タンパク質との融合ポリペプチドもまた、提供される。多くの増殖因子およびサイトカインがホモ２量体であり、そして反復構築物（ｒｅｐｅａｔ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、タンパク質分解的切断に対する感受性の減少を包含する種々の利点を有し得る。さらに、多くのレセプターはシグナルの伝達のためにリガンド２量体化が必要であり、そして種々の２量体タンパク質またはドメイン反復が所望され得る。異種ポリペプチドは、異なる表面マーカー間での融合物であり得、例えば、レセプター結合特異性を示すハイブリッドタンパク質が得られる。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組み合わせを示す異種融合物が構築され得る。代表的な例は、融合タンパク質の存在または位置を容易に測定し得るための、レポーターポリペプチド（例えば、ルシフェラーゼ）とリガンドのセグメントまたはドメイン（例えば、レセプター結合セグメント）との融合物である。例えば、Ｄｕｌｌら、米国特許第４，８５９，６０９号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーには、細菌ｂ−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母のα接合因子を包含する。例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら　（１９８８）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：８１２−８１６を参照のこと。
【０１０５】
　そのようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、または他の部分（特に、リン酸基と類似の分子形を有する部分）の付加もしくは除去により化学的に改変されたアミノ酸残基を有し得る。いくつかの実施態様では、改変は有用な標識試薬であるか、または精製の標的（例えばアフィニティーリガンド）として作用する。
【０１０６】
　本発明はまた、アミノ酸配列またはグリコシル化での変更以外のＤＧＷＣＣケモカインの誘導体の使用を意図する。そのような誘導体は、化学部分との共有結合または凝集会合を包含し得る。これらの誘導体は、一般に３つのクラスに分類される：（１）塩、（２）側鎖および末端残基の共有結合改変、および（３）例えば、細胞膜との吸着複合体。そのような共有結合誘導体または凝集誘導体は、免疫原として、イムノアッセイにおける試薬として、あるいは精製法（例えば、リガンドまたは他の結合リガンドのアフィニティー精製のための）において有用である。例えば、ＤＧＷＣＣケモカイン抗原は、抗ＤＧＷＣＣケモカイン抗体またはそのレセプターのアッセイあるいは精製に使用するために、当該分野で周知の方法による臭化シアン活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥのような固体支持体への共有結合により、固定化され得るか、あるいは、グルタルアルデヒド架橋結合を有して、あるいは有さないで、ポリオレフィン表面に吸着され得る。ＤＧＷＣＣケモカインはまた、検出可能な基で標識され得る。例えば、クロラミンＴ手順により放射性ヨウ素化され、希土類キレートに共有結合され、または診断的アッセイで使用するために別の蛍光部分と結合される。ＤＧＷＣＣケモカインの精製は、固定化抗体またはレセプターにより行われ得る。
【０１０７】
　単離されたＤＧＷＣＣケモカイン遺伝子により、ＤＧＷＣＣケモカインに対応する発現を欠く細胞（例えば、対応するタンパク質を欠きそしてネガティブバックグラウンド活性を示す種の型または細胞）の形質転換が可能になる。形質転換された遺伝子の発現により、規定されたまたは単一の種改変体を用いて、抗原性が純粋な細胞株の単離が可能となる。このアプローチにより、ＤＧＷＣＣレセプタータンパク質の生理学的影響のより感度の高い検出および区別が可能になる。細胞成分フラグメント（例えば、細胞質フラグメントまたは膜フラグメント）は単離され得、そして使用され得る。ＤＧＷＣＣを例として用いる記載は、一般にＤＶｉｃ−１にも代替適応可能である。
【０１０８】
　（Ｘ．使用）
　本発明は、本明細書中の他所に、または以下の診断用のキットの記載において記載されるような診断的適用における（例えば、発達異常についての一般的な記載において）使用を見出す試薬を提供する。
【０１０９】
　ＤＧＷＣＣケモカインヌクレオチド、例えば、ＤＧＷＣＣケモカインＤＮＡまたはＲＮＡ、は法医学アッセイの成分として用いられ得る。例えば、提供されたヌクレオチド配列は、例えば３２Ｐまたはビオチンを用いて標識され得、そして標準的な制限フラグメントポリモルフィリンをプローブするために用いられ得る。これはそれぞれの、または例えば供給源の種を区別するのに助けとなる測定可能な特徴を提供する。このようなプローブは、遺伝子指紋法のような周知の法医学技術において用いられ得る。さらに、ＤＧＷＣＣケモカイン配列から作製されたヌクレオチドプローブは、染色体異常を検出するためのインサイチュアッセイに用いられ得る。例えば、ＤＧＷＣＣケモカイン遺伝子をコードするヒト染色体の再構成は、他の公知の染色体マーカーと結合したＤＧＷＣＣケモカインプローブを用いて、周知のインサイチュ技術を介して検出され得る。
【０１１０】
　抗体、およびＤＧＷＣＣケモカインタンパク質もしくは核酸に特異的な抗体、または他の結合薬剤は、対応するＤＧＷＣＣケモカイン分子を精製するために用いられ得る。以下の実施例に記載されるように、ＤＧＷＣＣケモカイン成分の抗体精製は、可能、および実行可能の両方である。抗体および他の結合薬剤はまた、本明細書中に記載される周知のテクニックを用いて、組織サンプル、または細胞集団中に、ＤＧＷＣＣケモカイン成分が存在するかどうかを決定するための診断方法に用いられ得る。結合剤がＤＧＷＣＣケモカインに結合する能力は、ＤＧＷＣＣケモカインの誤った調節に関連した障害を診断する手段を提供する。抗体、および他のＤＧＷＣＣケモカインに結合する薬剤はまた、組織学的な標識として有用であり得る。以下の実施例に記載されるように、ＤＧＷＣＣケモカインの発現は、特異的な組織型に限定されている。抗体、または核酸のようなプローブを、ＤＧＷＣＣケモカインに指向させることにより、インサイチュ、またはインビトロで組織型および細胞型を区別するためのプローブの使用が可能となる。
【０１１１】
　本発明はまた、顕著な治療的価値を有する試薬を提供する。ＤＧＷＣＣケモカインヌクレオチド（天然に存在するかまたは組換え）、そのフラグメント、およびそれらに対する抗体は、ＤＧＷＣＣケモカインに対する結合親和性を有するとして同定された化合物とともに、異常な生理機能または発達（異常な増殖、たとえばガン状態、または変性状態を含む）に関連する状態の処置において有用である。異常増殖、再生、変性、および萎縮は、本明細書中に提供される組成物を使用する適切な治療的処置により調節され得る。例えば、ＤＧＷＣＣケモカインによる異常な発現または異常なシグナリングに関連する疾患または障害は、このタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストの標的である。このタンパク質は、神経細胞、または造血細胞（例えば、免疫応答に影響を与えるリンパ球）の制御または発達に役割を果たすようである。
【０１１２】
　他の異常発達状態は、ノーザンブロット分析によってＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣ　ｍＲＮＡを有すると示される細胞タイプにおいて公知である。Ｂｅｒｋｏｗ（編）　Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ，　Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ．，　Ｒａｈｗａｙ，　ＮＪ；およびＴｈｏｒｎら　Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，　ＮＹを参照のこと。発達的または機能的異常（例えば、神経系または免疫系の異常）は、本明細書中に提供される組成物を使用する予防または処置に感受性であり得る、顕著な医学的異常および状態を引き起こす。
【０１１３】
　特定のケモカインは、ウイルス複製機構にもまた、関連付けられている。例えば、Ｃｏｈｅｎ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２：８０９−８１０；Ｆｅｎｇら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２：８７２−８７７；およびＣｏｃｃｈｉら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：１８１１−１８１６。ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインは、同様の文脈で有用であり得る。
【０１１４】
　組換えＤＶｉｃ−１、もしくは組換えＤＧＷＣＣケモカイン、またはケモカイン抗体は精製され得、次いで患者に投与され得る。これらの試薬は治療的使用のためにさらなる有効成分または不活性成分（例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、免疫原性アジュバント）中で）と、生理学的に無毒の安定化剤および賦形剤とともに組み合わされ得る。これらの組み合わせは、濾過滅菌され、そして凍結乾燥により投薬バイアル中に、または安定化水性調製物中の貯蔵物として投薬形態にされ得る。本発明はまた、抗体またはその結合フラグメント（補体結合でない形態を含む）の使用を意図する。
【０１１５】
　抗体もしくはレセプターまたはそれらのフラグメントを使用する薬物スクリーニングによって、ＤＶｉｃ−１ケモカイン、またはＤＧＷＣＣケモカインに対する結合親和性を有する化合物（会合成分の単離を含む）が同定され得る。次いで、その化合物が固有の刺激活性を有し、それゆえ、タンパク質の活性をブロックするという点で、ブロッカーまたはアンタゴニストであるかどうか決定するために、次の生物学的アッセイが利用され得る。同様に、固有の刺激活性を有する化合物はレセプターを活性化し得、従って、それが、例えば、ＤＧＷＣＣケモカインの活性を刺激するとうい点で、アゴニストである。本発明はさらに、アンタゴニストとしてのＤＧＷＣＣケモカインに対する抗体の治療的使用を意図する。このアプローチは、他のＤＧＷＣＣケモカイン種変異体について特に有用であるはずである。
【０１１６】
　効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる因子に依存する。この因子は、投与手段、標的部位、患者の生理状態、および投与される他の医薬（ｍｅｄｉｃａｎｔ）を包含する。従って、処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために力価滴定されるべきである。代表的には、インビトロで使用される投薬量は、これら試薬のインサイチュでの投与に有用な量における有用な手引きを提供し得る。特定の障害の処置に効果的な用量の動物実験は、ヒトでの投薬量のさらなる予測的な指標を提供する。以下には、種々の考察が記載されている、例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）　（１９９０）　Ｇｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　（第８版）　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ：　および（１９９０）　Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　（第１７版）　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ。投与法は、それらの中および以下で考察されている。例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与、経皮拡散など。薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理食塩水、緩衝液、および例えば、Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ，　Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪに記載された他の化合物を包含する。投薬量の範囲は通常、適切なキャリアを有して、１ｍＭ濃度より低い量であり、代表的には約１０μＭ濃度未満、通常約１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｐＭ（ｐｉｃｏｍｏｌａｒ）未満、そして最も好ましくは約１ｆＭ（ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ）未満の範囲であると期待される。徐放性処方物または徐放性装置が、持続投与にしばしば利用される。
【０１１７】
　ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカイン、そのフラグメント、およびそれまたはそのフラグメントに対する抗体、アンタゴニスト、およびアゴニストは、処置される宿主に直接投与され得るか、または、化合物のサイズに依存して、それらを投与前に卵白アルブミンまたは血清アルブミンのようなキャリアタンパク質に結合させることが所望され得る。治療的処方物は、任意の従来の投与処方物中で投与され得る。活性な成分を単独で投与することは可能であるが、治療的処方物として呈することが望ましい。処方物は、上記で定義したように、その１以上の受容可能なキャリアとともに、代表的には少なくとも１つの活性な成分を含有する。それぞれのキャリアは、他の成分に適合性であり、そして患者に対して有害でないという意味で薬学的におよび生理学的に受容可能であるべきである。処方物は、経口投与、直腸投与、鼻投与、または非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、および皮内投与を包含する）に適切な処方物を包含する。処方物は、便宜的に単位剤形で提示され得、そして薬学分野で周知の任意の方法により調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）　ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，　第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ；および（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　第１７版（１９９０）、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，　Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ；　Ａｖｉｓら（編）（１９９３）　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｏｓａｇｅ　Ｆｏｒｍｓ：　Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；　Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｏｓａｇｅ　Ｆｏｒｍｓ：　Ｔａｂｌｅｔｓ　Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；　およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編）　（１９９０）　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｏｓａｇｅ　Ｆｏｒｍｓ：　Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄｅｋｋｅｒ，　ＮＹを参照のこと。本発明の治療は、他の治療剤と併用されるかまたは関連して使用され得る。
【０１１８】
　本発明の、ＤＶｉｃ−１、またはＤＧＷＣＣケモカインの天然に存在する形態および組換えの形態の両方は、このタンパク質に対する結合活性について化合物をスクリーニングし得る、キットおよびアッセイ法に特に有用である。自動化アッセイのいくつかの方法は、短期間に多数の化合物のスクリーニングを可能にするように近年開発されている。例えば、Ｆｏｄｏｒら　（１９９１）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：　７６７−７７３、および他の化学物質多様性ライブラリーの記載（これには多数の化合物による結合親和性の試験方法が記載されている）を、参照のこと。適切なアッセイの開発は、本発明で提供される大量の精製可溶化ＤＧＷＣＣケモカインの利用可能性により、非常に容易になり得る。
【０１１９】
　例えば、アンタゴニストは、一旦タンパク質が構造的に定義されれば、通常見出され得る。潜在的なタンパク質アナログの試験は、精製したレセプターを使用する高度に自動化されたアッセイ法の開発により、今や可能である。特に、新たなアゴニストおよび新たなアンタゴニストは、本明細書中に記載のスクリーニング技術を使用することにより見い出される。特に重要なものに、多型ＤＧＷＣＣケモカインレセプター（例えば、ＤＧＷＣＣケモカインの種改変体のアンタゴニストとして、提供し得る化合物）に対する結合親和性を、組み合わせていることが見出された。
【０１２０】
　本発明は、種々の薬剤スクリーニング技術において、組み換えタンパク質を用いるスクリーニング化合物に、特に有用である。特異的なリガンド用のスクリーニングにおいて、組換えタンパク質を用いる利点には、：（ａ）特定の供給源由来のＤＧＷＣＣケモカインの再生し得る供給源の改良；（ｂ）アッセイ中でノイズ比に対して、よりよいシグナルを与える、潜在的に非常に多量の、細胞あたりのリガンド；ならびに（ｃ）種改変体特異性（理論上、より良い生物学的特異性、および疾患特異性を与える）。
【０１２１】
　薬剤スクリーニングの一つの方法は、真核宿主細胞または原核宿主細胞（これは、ケモカインレセプターを発現する組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換される）を利用する。その他の単離物中において、レセプターを発現する細胞が単離され得る。生存形態または固定形態のいずれかである、そのような細胞は、標準的なリガンド／レセプター結合アッセイに用いられ得る。また、Ｐａｒｃｅら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：２４３−２４７；およびＯｗｉｃｋｉら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：４００７−４０１１、これに、細胞応答を検出する高感度な方法が記載されている。競合アッセイは、細胞（ＤＧＷＣＣケモカインの供給源である）が、１２５Ｉ−抗体のようなリガンドに対する、公知の結合親和性を有する標識されたレセプターまたは抗体、および結合組成物に対する結合親和性が測定される試験サンプルと接触され、インキュベートされる場合に特に有用である。次いで、結合型および遊離型標識結合組成物は、リガンド結合の程度を評価するために分離される。試験化合物結合体の量は、既知の供給源に結合した標識レセプターの量に反比例する。多くの技術のうちの任意の技術が、リガンド結合の範囲を評価するため、遊離リガンドから結合型を分離するために使用する。この分離工程は、代表的にフィルターへの付着、続いて洗浄、プラスチックへの付着の後に洗浄、または細胞膜の遠心のような手順を含む。生存細胞もまた、ＤＧＷＣＣケモカイン媒介機能（例えば、２次メッセンジャー（すなわち、Ｃａ＋＋）のレベル；細胞増殖；イノシトールリン酸プールの変化など）に対する薬物の効果についてスクリーニングするために使用され得る。いくつかの検出方法は、分離工程の省略を可能にする（例えば、近接感受性検出システム（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ））。カルシウム感受性の色素は、蛍光計測器または蛍光細胞選別装置を用いてＣａ＋＋レベルを検出するのに有用である。
【０１２２】
　別の方法は、ＤＧＷＣＣケモカインの供給源として、形質転換した真核宿主細胞、または原核宿主細胞由来の膜を利用する。これらの細胞は、例えば、膜結合型に操作されたＤＧＷＣＣケモカインの発現を指向するＤＮＡベクターで安定に形質転換されている。本質的に、膜はその細胞から調製され、そして上記の競合アッセイのようなレセプター／リガンド結合アッセイに用いられる。
【０１２３】
　さらに別のアプローチは、形質転換した真核宿主細胞、原核宿主細胞由来の可溶化された未精製の、または可溶化された精製のＤＧＷＣＣケモカインに用ることである。これは、特異性の増加、自動化能力、および高い薬剤試験処理能力という利点を有する、「分子」結合アッセイを可能にする。
【０１２４】
　薬剤スクリーニングの別の技術は、ＤＧＷＣＣケモカイン抗体への適切な結合親和性を有する化合物について高い処理能力スクリーニングを提供するアプローチを包含し、そして詳細は、１９８４年９月１３日発行の、Ｇｅｙｓｅｎの欧州特許出願８４／０３５６４に記載されている。最初に、異なる小ペプチド試験化合物の多くが、固体基板上（例えば、プラスチックピン）または他の適切な表面（Ｆｏｄｏｒら、前出を参照のこと）で合成される。次いで、ピン全てが、可溶化された未精製の、または可溶化された精製のＤＧＷＣＣケモカイン抗体と反応させ、そして洗浄する。次の工程には、結合型ＤＧＷＣＣケモカイン抗体の検出が含まれる。
【０１２５】
　合理的な薬物設計はまた、ＤＧＷＣＣケモカインおよび他のエフェクターまたはアナログの分子の形の構造的研究に基づき得る。例えばＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２０２巻および２０３巻を参照のこと。エフェクターは、リガンド結合に応答して他の機能を仲介する他のタンパク質、または通常はレセプターと相互作用する他のタンパク質であり得る。どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するかを決定する１つの手段は、物理的構造決定（例えば、Ｘ線結晶学または２次元ＮＭＲ技術）である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについての手引きを提供する。タンパク質の構造決定の詳細な記載は、例えば、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ　（１９７６）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１２６】
　精製ＤＧＷＣＣケモカインは、上述の薬物スクリーニング技術に使用するプレートに直接コーティングされ得る。しかし、これらのリガンドに対する非中和抗体は、それぞれのリガンドを固相に固定化する捕獲抗体として使用され得る。ＤＧＷＣＣを用いた実施例は、ＤＶｉｃ−１ケモカインをかわりに用いても行い得る。
【０１２７】
　（ＸＩ．キット）
　本発明はまた、ケモカイン、またはケモカインレセプターの存在を検出するための種々の診断キットおよび方法におけるＤＶｉｃ−１、またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を意図する。代表的には、キットは、規定されたＤＶｉｃまたはＤＧＷＣＣケモカインペプチドまたは遺伝子セグメント、あるいは一方または他方を認識する試薬（例えば、レセプターフラグメント、もしくは抗体）のいずれかを含む区画を有する。
【０１２８】
　例えば、ＤＧＷＣＣケモカインに対する試験化合物の結合親和性を測定するためのキットは、代表的には、試験化合物；標識化合物（例えば、　ＤＧＷＣＣケモカインに対する既知の結合親和性を有するレセプター、または抗体）；ＤＧＷＣＣケモカインの供給源（天然に存在するかまたは組換えの）；およびＤＧＷＣＣケモカインを固定化するための固相のような、遊離標識化合物から結合標識化合物を分離するための手段を含有する。一旦化合物がスクリーニングされると、　ＤＧＷＣＣケモカインに対する適切な結合親和性を有する化合物が、レセプターに対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するか否かを決定するために、当該分野で周知のように、適切な生物学的アッセイで評価され得る。組換えＤＧＷＣＣケモカインポリペプチドの利用可能性は、そのようなアッセイを較正するための充分に規定された標準をまた提供する。
【０１２９】
　サンプル中の、例えば、ＤＧＷＣＣケモカインの濃度を測定するための好ましいキットは、代表的には、標識化合物（例えば、　ＤＧＷＣＣケモカインに対する公知の結合親和性を有するレセプターまたは抗体）、　ＤＧＷＣＣケモカインの供給源（天然に存在するかまたは組換えの）、および遊離標識化合物から結合標識化合物を分離するための手段（例えば、ＤＧＷＣＣケモカインを固定化するための固相）を含有する。試薬および説明書を含む区画が、通常提供される。
【０１３０】
　ＤＧＷＣＣケモカインまたはリガンドフラグメントに特異的な、抗原結合フラグメントを包含する抗体は、ＤＧＷＣＣケモカインおよび／またはそのフラグメントのレベルの上昇の存在を検出する診断適用に有用である。このような診断的アッセイは、溶解物、生細胞、固定細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を用い得、そしてさらに血清などの中のリガンドに関連する抗原の検出を包含し得る。診断アッセイは、同質（遊離試薬と抗原−　ＤＧＷＣＣケモカイン複合体との間の分離工程を有しない）または異質（分離工程を有する）であり得る。放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素増幅イムノアッセイ技術（ＥＭＩＴ）、基質標識蛍光イムノアッセイ（ＳＬＦＩＡ）などのような種々の市販のアッセイが存在する。例えば、非標識抗体は、第２の抗体を使用することにより用いられ得、この第２の抗体は標識され、そしてＤＧＷＣＣケモカインまたはその特定のフラグメントに対する抗体を認識する。類似のアッセイがまた、文献で広範に考察されている。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ　（１９８８）　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｃｈａｎ（編）（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ；Ｐｒｉｃｅ　およびＮｅｗｍａｎ（編）（１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；　ならびに　Ｎｇｏ（編）（１９８８）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０１３１】
　抗イディオタイプ抗体は、種々の異常な状態の徴候であり得るＤＧＷＣＣケモカインに対する抗体の存在を診断するための類似の使用を有し得る。例えば、ＤＧＷＣＣケモカインの過剰産生により、種々の免疫学的、または他の医学的な反応の生成を生じ得、この反応は、異常な生理状態（例えば、細胞増殖、活性化、または分化において）の診断であり得る。
【０１３２】
　しばしば、診断アッセイのための試薬が、アッセイの感度を最適化するようにキット中に供給される。本発明のために、アッセイ、プロトコル、および標識の性質に依存して、標識抗体、非標識抗体またはレセプター、または標識ＤＧＷＣＣケモカインのいずれかが提供される。これは通常、緩衝液、安定化剤、酵素の基質のようなシグナル生成に必要な物質などのような、他の添加剤との結合体である。好ましくは、キットはまた、適切な使用および使用後の内容物の処分のための説明書を含む。代表的には、キットはそれぞれの有用な試薬のための区画を有する。望ましくは、試薬は、乾燥した凍結乾燥粉末として提供され、ここで、試薬は水性の媒体中で再構成され得、アッセイを行うために適当な濃度の試薬を提供し得る。
【０１３３】
　薬物スクリーニングアッセイおよび診断アッセイの任意の上述の成分の多くは、改変せずに使用され得、または種々の方法で改変され得る。例えば、標識は、直接または間接的に検出可能なシグナルを提供する部分に、共有結合的にまたは非共有結合的に連結することにより達成され得る。これらのアッセイの任意のアッセイにおいて、タンパク質、試験化合物、ＤＧＷＣＣケモカイン、またはそれらに対する抗体が、直接または間接のいずれかで標識され得る。直接標識の候補は、以下の標識グループを包含する：１２５Ｉのような放射性標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素（米国特許第３，６４５，０９０号）、および蛍光強度、波長移動、または蛍光偏光の変化をモニターし得る蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号）。間接標識の可能性には、１成分のビオチン化とそれに続く上記の標識グループの１つに結合したアビジンへの結合が含まれる。
【０１３４】
　遊離のリガンドから結合リガンドを分離する、あるいは、遊離の試験化合物から結合試験化合物を分離する多数の方法もまた存在する。ＤＧＷＣＣケモカインを種々のマトリクス上に固定化し、続いて洗浄し得る。適切なマトリクスには、ＥＬＩＳＡプレート、フィルター、およびビーズのようなプラスチックが挙げられる。ＤＧＷＣＣケモカインをマトリクスに固定化する方法には、プラスチックへの直接接着、捕獲抗体の使用、化学的カップリング、およびビオチン−アビジンが含まれるがこれらに限定されない。このアプローチの最後の工程は、例えば、ポリエチレングリコールのような有機溶媒、もしくは硫酸アンモニウムのような塩を用いる方法を含む、任意のいくつかの方法により、リガンド／レセプター複合体またはリガンド／抗体複合体の沈降を含む。他の適切な分離技術は、Ｒａｔｔｌｅら（１９８４）　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　３０：１４５７〜１４６１に記載のフルオレセイン抗体磁化パーティクル法および米国特許第４，６５９，６７８号に記載の二重抗体磁化パーティクル分離法を含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
　種々の標識にタンパク質またはこれらのフラグメントを連結する方法は、文献に広範に報告されており、本明細書中で詳述する必要はない。技術の多くは、カルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使用を介してのペプチド結合の形成のための活性化カルボキシル基の使用、連結のためのメルカプト基と活性化ハロゲン（例えば、クロロアセチル）または活性化オレフィン（例えば、マレイミド）との反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質はまた、これらの適用における使用が見出される。
【０１３６】
　本発明の別の診断的側面は、ＤＧＷＣＣケモカインの配列から得られるオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の使用を含む。これらの配列は、天然の供給源または異常な状態（例えば、ガンまたは発生における問題）を有すると疑われる患者からのサンプル中にＤＧＷＣＣケモカインメッセージのレベルを検出するためのプローブとして用いられ得る。ＲＮＡヌクレオチド配列およびＤＮＡヌクレオチド配列の両方の調製、配列の標識、ならびに配列の好ましいサイズについては、文献中で、十分な説明および考察がされている。通常、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約１４ヌクレオチドを有するべきであり、通常は、少なくとも約１８オリゴヌクレオチドを有するべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブは、数キロベースまでであり得る。種々の標識が用いられ得るが、最も一般的には放射性核種であり、特に３２Ｐが用いられ得る。しかし、ポリヌクレオチド中に導入するためのビオチン修飾ヌクレオチドを用いるような、他の技術もまた用いられ得る。次いで、ビオチンは、アビジンまたは抗体に対する結合部位として作用する。これは、広範な種々の標識（例えば、放射性核種、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、酵素など）を用いて標識され得る。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡタンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が用いられ得る。次に、抗体が標識され得、そして二重鎖が表面に結合されている場合、表面での二重鎖形成の際に、二重鎖に結合した抗体の存在を検出し得るように、アッセイを実施し得る。新規のアンチセンスＲＮＡに対するプローブの使用を、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイナススクリーニング、組換えプロービング、ハイブリッド放出翻訳（ｈｙｂｒｉｄ　ｒｅｌｅａｓｅｄ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（ＨＲＴ）、およびハイブリッド停止翻訳（ｈｙｂｒｉｄ　ａｒｒｅｓｔｅｄ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（ＨＡＲＴ）のような多くの従来の技術を用いて実施し得る。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を含む。
【０１３７】
　これらおよび他のマーカーの定量的または定性的存在についてもまた試験する診断キットがまた、意図される。診断または予後は、マーカーとして用いられている複数の指標の組み合わせに依存し得る。従って、キットは、マーカーの組み合わせについて試験し得る。例えば、Ｖｉａｌｌｅｔら（１９８９）　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｓ．　１：８９〜９７を参照のこと。各ケモカインの定性的または定量的発現を、タンパク質またはｍＲＮＡレベルでの標準方法により評価し得る。
【０１３８】
　（ＸＩＩ．レセプター単離）
　特異的相互作用の結合パートナーを単離した上で、そのカウンターパートナーを単離するための方法が存在する。Ｇｅａｒｉｎｇら（１９８９）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　８：３６６７〜３６７６を参照のこと。例えば、レセプターに対する結合を妨げることなく、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインを標識する手段が決定され得る。例えば、アフィニティー標識またはエピトープタグを、リガンドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかと融合し得る。発現ライブラリーを、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインの特異的結合について（例えば、細胞選別またはこのような結合成分を発現する亜集団を検出する他のスクリーニング方法によって）スクリーニングし得る。例えば、Ｈｏら（１９９３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ’ｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：１１２６７〜１１２７１を参照のこと。あるいは、パンニング法が用いられ得る。例えば、ＳｅｅｄおよびＡｒｕｆｆｏ（１９８７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４：３３６５〜３３６９を参照のこと。２ハイブリッド選択システムもまた、利用可能なケモカイン配列を用いて適切な構築物を作製するために適用され得る。例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３４０：２４５〜２４６を参照のこと。標準的なＣａ＋＋フラックス法（ｆｌｕｘ　ｍｅｔｈｏｄｓ）もまた利用され得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら編（１９９２および定期的増補　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ＮＹ）を参照のこと。
【０１３９】
　タンパク質を標識と架橋する技術は、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインの結合パートナーを単離するために適用され得る。これにより、例えば、リガンド−レセプター様の様式で、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインと特異的に相互作用するタンパク質の同定が可能となる。代表的には、ケモカインファミリーは、７つの膜貫通レセプターファミリーのレセプターに結合し、そしてＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインに対するレセプターは、類似の構造を示すようである。従って、レセプターは、リガンド結合能力を示し得る形態でこのような膜タンパク質を発現し得る系における発現によって見出される。
【０１４０】
　本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照することにより最も良く理解されるが、これは、特定の実施態様に本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１４１】
　（Ｉ．一般的方法）
　下記の多くの標準的方法を、以下に記載しまたは参照する：例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮＹ；　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　（第二版）、第１〜３巻，　ＣＳＨ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮＹ；　Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，　Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，　ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８７および補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，　ＮＹ；　Ｉｎｎｉｓら、（編）（１９９０）　ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮＹ。タンパク質精製のための方法には、硫安沈澱、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化、およびその他のような方法が含まれる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９８７および定期的増補）；　Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ　（１９９０）「タンパク質精製へのガイド」Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　第１８２巻、およびこのシリーズの他の巻；ならびにタンパク質精製製品の使用に関する製造者の印刷物（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，　ＮＪ、またはＢｉｏ−Ｒａｄ，　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，　ＣＡ．）を参照のこと。組換え技術との組合せにより、適切なセグメント（エピトープタグ）（例えば、ＦＬＡＧ配列、または例えばプロテアーゼ除去可能配列を介して融合され得る等価物）への融合が可能になる。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９８９）Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ　１２：６９〜７０；　Ｈｏｃｈｕｌｉ　（１９９０）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈ　Ｍｅｔａｌ　Ｃｈｅｌａｔｅ　Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ」Ｓｅｔｌｏｗ　（編）　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２：８７〜９８，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮＹ；およびＣｒｏｗｅら、（１９９２）ＯＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：　Ｔｈｅ　Ｈｉｇｈ　Ｌｅｖｅｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　＆　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＱＵＩＡＧＥＮ，　Ｉｎｃ．，　Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，　ＣＡを参照のこと。
【０１４２】
　標準的な免疫学的技術は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，　ＮＹ；およびＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　７０、７３、７４、８４、９２、９３、１０８、１１６、１２１、１３２、１５０、１６２、および１６３巻に記載される。神経細胞の生物学的活性についてのアッセイは、例えば、Ｗｏｕｔｅｒｌｏｏｄ（１９９５編）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｍｏｄｕｌｅｓ　１０、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　およびＮｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｔｏｔｏｗａ，　ＮＪに記載される。開発系の方法論は、例えば、Ｍｅｉｓａｍｉら（編）Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ；およびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｉｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載される。
【０１４３】
　ＦＡＣＳ分析は、Ｍｅｌａｍｅｄら、（１９９０）Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　Ｓｏｒｔｉｎｇ　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ＮＹ；Ｓｈａｐｉｒｏ　（１９８８）　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｌｉｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ＮＹ；およびＲｏｂｉｎｓｏｎら、（１９９３）　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ＮＹに記載されている。
【０１４４】
　（ＩＩ．ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインクローンの単離）
　ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインをコードするクローンを、多くの異なる可能な方法により天然の供給源から単離する。本明細書中で提供される配列で、ＰＣＲプライマー、もしくはハイブリダイゼーションプローブを、ゲノムＤＮＡセグメントまたはｃＤＮＡ逆性転写物のいずれかを単離するために、選択および／または構築する。適切な細胞供給源は、列挙される組織（例えば、皮膚または上皮または創傷治癒ライブラリー）を含む。遺伝的改変体および多形性改変体または対立遺伝子改変体を、個々の集団をスクリーニングすることによって単離する。
【０１４５】
　ＰＣＲベースの検出を、好ましくはコード配列の反対の末端からのプライマーを用いて標準的方法により実施するが、隣接セグメントは、特定の目的のために選択し得る。
あるいは、ハイブリダイゼーションプローブを選択する。プローブの特定のＡＴまたはＧＣ含量を、予測される相同性およびミスマッチングに依存して選択する。適切なストリンジェンシー条件を選択して、適切な正のシグナル対バックグラウンド比を調整する。連続的な洗浄工程を用いて、より高い相同性のクローンを回収する。
【０１４６】
　さらにクローンを、抗体に基づく選択手順を用いて単離する。標準的な発現クローニング方法（例えば、膜関連発現産物のＦＡＣＳ染色を含む）を適用する。抗体を用いて、認識されるタンパク質を産生するクローンを同定する。あるいは、抗体を用いて、そのＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインタンパク質をコードする遺伝子を単離するためのタンパク質配列決定および標準的手段で、ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインを精製する。
【０１４７】
　ゲノム配列に基づく方法はまた、天然に利用可能な配列、またはそうでなければ提供される配列に対する相同性を示す配列の同定を可能にする。
【０１４８】
　（ＩＩＩ．ケモカインクローンについての霊長類対応物の単離）
　類似の方法を、別の霊長類から適切な霊長類ケモカイン遺伝子を単離するために、上記のように用いる。類似の供給源物質を、天然の遺伝子（遺伝的改変体、多形性改変体、対立遺伝子改変体、または系統改変体）を単離するために用いる。他の種改変体もまた、類似の方法を用いて単離する。さらに、遺伝子データベースを適切なモチーフについて検索し得る。
【０１４９】
　（ＩＶ．齧歯類ケモカインクローンの単離）
　適切な齧歯類供給源を、上記のように選択する（例えば、ラット、ハムスターなど）。類似の方法を用い、種改変体を単離する。しかし、類似性のレベルは、代表的には、齧歯類のケモカイン配列は、ヒトから他の霊長類までの配列と比較すると、より低い。
【０１５０】
　（Ｖ．染色体局在化）
　ｃＤＮＡを、例えば、ビオチン−１４　ｄＡＴＰでニックトランスレーションして、ラベルし、そして２種の正常動物（好ましくは雄性）由来の分裂中期に対して、５ｎｇ／μｌの最終濃度でインサイチュでハイブリダイズする。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法を、Ｃａｌｌｅｎら（１９９０）　Ａｎｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　３３：２１９〜２２１に記載される方法から、染色体をヨウ化プロピジウム（対比染色）およびＤＡＰＩ（染色体同定のため）の両方で分析する前に染色するという点において、改変し得る。分裂中期調製物の画像を、ＣＣＤカメラにより取り込み、そしてコンピューターで増幅する。適切に標識された染色体の同定を、決定する。このような分子についての標準的配置に対する局在性、または異なる配置もまた、機能に関する情報として提供し得る。
【０１５１】
　ヒトＤＶｉｃ−１は、ヒト染色体９ｐ１３に局在する。
【０１５２】
　（ＶＩ．発現；精製；特徴付け）
　上記からの適切なクローンを用いて、コード配列を適切な発現ベクターに挿入する。これは、原核生物、酵母、昆虫、または高等脊椎動物について特異的に選択されるベクターであり得る（例えば、哺乳類発現系）。標準法を、遺伝子産物を産生させるために適用するが、この遺伝子産物は、好ましくは、可溶性分泌分子として、しかし、ある例では細胞内タンパク質としてもまた生成される。細胞内タンパク質は、代表的には、タンパク質を回収するために細胞溶解を必要とする。そして不溶性封入体は、さらなる精製のための一般的な開始物質である。
【０１５３】
　ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインをコードするクローンを用いて、組み換え産生手段が使用されるが、天然の形態を、適切な供給源から精製し得る。タンパク質産物を、ある場合には、例えば、イムノアフィニティー法で結合させて、タンパク質精製の標準的方法により精製する。イムノアフィニティー法を、上記のように、タンパク質の精製工程として、またはタンパク質の分離特性を決定する検出アッセイとしてのいずれかに用いる。
【０１５４】
　好ましくは、タンパク質は培地に分泌され、そして可溶性産物を、可溶性形態で培地から精製する。代わりには、上記のように、原生動物発現系からの封入体は、有用な材料供給源である。代表的には、不溶性タンパク質を封入体から可溶化し、そして標準法を用いて再び折り畳む。精製法を、上記のように開発する。
【０１５５】
　上記の精製法による産物を特徴付けし、多くの構造的特徴を決定する。標準的な物理学的方法を適用する（例えば、アミノ酸分析およびタンパク質配列決定）。得られるタンパク質を、ＣＤ分光法および他の分光法に供する（例えば、ＮＭＲ、ＥＳＲ、質量分析など）。産物を特徴付けして、その分子形態およびサイズを決定する（例えば、ゲルクロマトグラフィーおよび類似の技術）。クロマトグラフィーの特徴を理解することにより、より穏やかで効率的精製法を導く。
【０１５６】
　グリコシル化部位の予測を、例えば、Ｈａｎｓｅｎら（１９９５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３０８：８０１〜８１３に報告されるように行い得る。
【０１５７】
　（ＶＩＩ．ケモカインに対する抗体の調製）
　例えば、上記のように、発現のためのＤＮＡ、または産生されるタンパク質で、動物を免疫して抗体を産生させる。ポリクローナル抗血清を、いくつかの場合では未精製抗原を用いて惹起するが、得られる血清は、より高いバックグラウンドレベルを示す。好ましくは、抗原を、例えば、上記に示されるようなポリクローナル血清を用いるアフィニティークロマトグラフィーを含む、標準タンパク質精製技術を用いて精製する。特異的抗体の存在を、規定された合成ペプチドフラグメントを用いて検出する。
【０１５８】
　ポリクローナル血清を、上記のように精製した精製抗原に対して、または、例えば多数のペプチドもしくは合成ペプチドを使用して惹起する。全長配列の全てを含む、一連の重複している合成ペプチドは、動物に提示された場合、そのタンパク質の最も直鎖状であるエピトープを認識する血清を産生する。このような抗血清を、タンパク質をアフィニティー精製するために用い、次に別の抗血清調製物を産生するために別の動物に完全な全長タンパク質を導入するために用いる。
【０１５９】
　類似の技術を用い、未精製抗原または好ましくは精製抗原のいずれかに対するモノクローナル抗体を誘導する。抗血清または抗体は、天然のタンパク質を認識するか、または変性抗原を認識し得る。調製物を、所望のように、免疫的に選択し、免疫的に精製し得る。
【０１６０】
　（ＶＩＩＩ．細胞分布および組織分布）
　タンパク質または遺伝子産物の分布を、例えば、上記のように産生した抗体試薬を用いる免疫組織化学を用いて、またはケモカインをコードする核酸をスクリーニングすることによって、決定する。ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法を用い、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはメッセージ含量を検出する。組織化学はまた、より高いもしくはより低いレベルのメッセージもしくはＤＮＡを発現する組織内の特異的細胞型の決定を可能にする。抗体技術は、生物学的サンプル（体液または組織サンプルを含む）のタンパク質を定量化するために有用である。イムノアッセイを、タンパク質を定量化するために開発した。ＦＡＣＳ分析もまた、細胞集団の発現を評価するために使用し得る。
【０１６１】
　マウスＤＧＷＣＣ配列を、新生仔マウスで検出した（受胎後１４．５日目から１つの配列および受胎後１９．５日目から３つの配列）。３つの配列は成体マウスに由来した。それぞれ、肝臓、胎盤、および皮膚から１つずつである。ノーザン分析では、精巣におけるシグナルは、脳におけるシグナルよりも遥かに大きく、脳におけるシグナルは、肺におけるシグナルよりも遥かに大きいことを示す。
【０１６２】
　（ＩＸ．微小走化性アッセイ）
　ＤＧＷＣＣケモカインの移動性（ｐｒｏ−ｍｉｇｒａｔｏｒｙ）活性を、微小走化性アッセイで評価する。例えば、Ｂａｃｏｎら（１９８８）Ｂｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　９５：９６６〜９７４を参照のこと。他の輸送アッセイもまた用いられる。例えば、Ｑｕｉｄｌｉｎｇ−Ｊaｒｂｒｉｎｋら（１９９５）　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２５：３２２〜３２７；　Ｋｏｃｈら（１９９４）　Ｊ．　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　９３：９２１〜９２８；　およびＡｎｔｏｎｙら（１９９３）　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５１：７２１６〜７２２３を参照のこと。
【０１６３】
　ケモカインをまた、例えば、Ｈ．　Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒに記載されるような造血アッセイにおける活性についてアッセイし得る。Ｂｅｌｌｉｄｏら（１９９５）　Ｊ．　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　９５：２８８６〜２８９５；　およびＪｉｌｋａら（１９９５）　Ｅｘｐｔｌ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　２３：５００〜５０６を参照のこと。それらを、Ｓｔｒｅｉｔｅｒら（１９９２）　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌ．　１４１：１２７９〜１２８４に記載のように血管形成活性についてアッセイする。または、炎症における役割についてアッセイし得る。例えば、Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９９６）　Ｊ．　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｒｅｓ，　６４：２６〜３１を参照のこと。
【０１６４】
　（Ｘ．直接的および間接的生物学的活性）
　頑強かつ鋭敏なアッセイを、例えば、免疫細胞、神経細胞、または幹細胞について、上記のように選択する。ケモカインを、用量応答が検出されるかどうかが見えるように用量を増加させてアッセイに添加する。例えば、増殖アッセイにおいて、プレートに細胞をプレートする。適切な培養培地を提供し、そしてケモカインを種々の量で細胞に添加する。増殖を、ケモカインの細胞に対する直接的影響または間接的影響のいずれかを検出する期間にわたってモニターする。
【０１６５】
　あるいは、活性化アッセイもしくは誘引アッセイを用いる。適切な細胞型（例えば、造血細胞、骨髄細胞（マクロファージ、好中球、多形核球など）もしくはリンパ系細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞）、神経細胞（神経、神経膠細胞、乏突起膠細胞、星状膠細胞など）、または幹細胞（例えば、他の細胞型（例えば、腸陰窩細胞）に分化する前駆細胞、および未分化細胞型）を選択する。
【０１６６】
　他のアッセイは、他のケモカインを用いて実証されているアッセイである。例えば、ＳｃｈａｌｌおよびＢａｃｏｎ（１９９４）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　６：８６５〜８７３；　およびＢａｃｏｎおよびＳｃｈａｌｌ（１９９６）　Ｉｎｔ．　Ａｒｃｈ．　Ａｌｌｅｒｇｙ　＆　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１０９：９７〜１０９を参照のこと。
【０１６７】
　（ＸＩ．構造活性関連性）
　特定残基の臨界についての情報を、標準的手順および分析を用いて決定する。例えば、所定の部位で（例えば、上記で同定された部位で）の多くの異なる改変体を産生し、そして改変体の生物学的活性を評価することによって、標準的変異誘発分析を実施する。これは、活性を改変する部位を決定する程度まで実施し得るか、または生物学的活性を保持するか、ブロックするか、もしくは調節するかのいずれかのために置換され得る残基を決定するために特定の部位に焦点を合わせるために実施し得る。
【０１６８】
　あるいは、天然の改変体の分析は、どの部位が天然の変異体を許容するかを示す。これは、個体の間の、または系統もしくは種を超えての、改変体の集団的分析から生じ得る。選択された個体からのサンプルを分析する（例えば、ＰＣＲ分析および配列決定）。これは、集団多形性の評価を可能にする。
【０１６９】
　（ＸＩＩ．アゴニスト／アンタゴニストについてのスクリーニング）
　アゴニストまたはアンタゴニストを、生物学的活性を誘導またはブロックする能力についてスクリーニングする。候補化合物（例えば、天然のＤＧＷＣＣケモカインの配列改変体）をそれらの生物学的活性についてアッセイする。あるいは、化合物を、単独または組み合わせてスクリーニングし、生物学的活性の効果を決定する。
【０１７０】
　（ＸＩＩＩ．ケモカインのレセプターの単離）
　ＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣケモカインを、抗体が用いられるのとほぼ同様に、その結合特異性を利用することにより、その結合パートナーを同定するための特異的結合試薬として使用し得る。結合試薬は、上記のように、標識（例えば蛍光もしくはその他）されるか、またはパンニング法についての基質に固定化されるかのいずれかである。代表的なケモカインレセプターは、７回膜貫通レセプター（ｓｅｖｅｎ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。
【０１７１】
　結合組成物（例えば、ケモカイン）を、結合パートナー（すなわち、レセプター）を発現する細胞株から作製された発現ライブラリーをスクリーニングするために用いる。標準的染色技術を用いて、細胞内もしくは表面で発現されたレセプターを検出または識別するか、または表面発現形質転換細胞をパンニング法によってスクリーニングする。細胞内発現のスクリーニングを、種々の染色手順または免疫蛍光手順により実施する。ＭｃＭａｈａｎら（１９９１）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１０：２８２１〜２８３２もまた参照のこと。
【０１７２】
　標準的Ｃａ＋＋フラックスプロトコルを、ＤＧＷＣＣのレセプターを同定するために使用し得る（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）（１９９２および定期的補遺）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　　Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｔ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ＮＹ）。
【０１７３】
　例えば、０日目に２チャンバーのペルマノックス（ｐｅｒｍａｎｏｘ）スライドを、チャンバーあたり１ｍｌのＰＢＳ中の１０ｎｇ／ｍｌのフィブロネクチンで、３０分間室温で予めコーティングする。ＰＢＳで１回リンスする。次いで、ＣＯＳ細胞を、１．５ｍｌの増殖培地中で、チャンバーあたり２〜３×１０５細胞でプレートする。３７℃で一晩、インキュベートする。
【０１７４】
　各サンプルについて１日目に、６６ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン、６６ｍＭのクロロキン、および４ｍｇのＤＮＡを無血清ＤＭＥ中に含む溶液０．５ｍｌを調製する。各セットについて、ポジティブコントロール（例えば、ヒトＤＧＷＣＣケモカインｃＤＮＡの）を、１および１／２００希釈で調整し、ならびにネガティブモック（ｍｏｃｋ）を調製する。細胞を無血清ＤＭＥでリンスする。ＤＮＡ溶液を添加し、５時間３７℃でインキュベートする。培地を除去し、ＤＭＥ中の１０％　ＤＭＳＯを０．５ｍｌ、２．５分間添加する。培地を除去し、ＤＭＥで１回洗浄する。１．５ｍｌの増殖培地を添加し、一晩インキュベートする。
【０１７５】
　２日目に、培地交換する。３または４日目に、細胞を固定し、染色する。細胞をハンクス緩衝化生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ）で２回リンスし、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／グルコースで５分間固定する。ＨＢＳＳで３回洗浄する。スライドを、全ての液体を除去した後に−８０℃で保存し得る。各チャンバーについて、０．５ｍｌにてインキュベーションを、以下のように実施する。３２ｍｌ／ｍｌの１Ｍ　ＮａＮ３を含むＨＢＳＳ／サポニン（０．１％）を２０分間添加した。次いで、細胞を、ＨＢＳＳ／サポニンで１回洗浄する。ケモカインまたはケモカイン／抗体複合体を細胞に添加し、３０分間インキュベートする。細胞をＨＢＳＳ／サポニンで２回洗浄する。適切な場合、１次抗体を３０分間添加する。２次抗体を添加し（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ抗マウス抗体を１／２００希釈で）、３０分間インキュベートする。ＥＬＩＳＡ溶液（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｅｌｉｔｅ　ＡＢＣ　西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液）を調製し、そして３０分間予めインキュベートする。例えば、２．５ｍｌＨＢＳＳ／サポニンあたり溶液Ａ（アビジン）を１滴および溶液Ｂ（ビオチン）を１滴使用する。細胞をＨＢＳＳ／サポニンで２回洗浄する。ＡＢＣ／ＨＲＰ溶液を添加し、３０分間インキュベートする。ＨＢＳＳで細胞を２回洗浄し、第２の洗浄を２分間行い、これにより、細胞が閉じる。次いで、Ｖｅｃｔｏｒジアミノ安息香酸（ＤＡＢ）を５〜１０分間添加する。５ｍｌのガラス蒸留水あたり、２滴の緩衝液と４滴のＤＡＢと２滴のＨ２Ｏ２を使用する。チャンバーを注意深く取り除き、スライドを水でリンスする。数分間風乾し、次いで、１滴のＣｒｙｓｔａｌ　Ｍｏｕｎｔを添加し、カバースリップをかける。８５〜９０℃で５分間焼く。
【０１７６】
　プールのポジティブ染色を評価し、続いてサブクローン化して、結合を担う単一遺伝子を単離する。
【０１７７】
　または、ケモカイン試薬を、レセプターを発現する細胞をアフィニティー精製もしくは分類するために用いる。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらまたはＡｕｓｕｂｅｌらを参照のこと。
【０１７８】
　別の戦略は、パンニングにより、膜に結合したレセプターについてスクリーニングすることである。レセプターｃＤＮＡを、上記のように構築する。リガンドは固定化し得、そして発現細胞を固定するために使用し得る。固定化を、例えば、ケモカイン融合構築物のＦＬＡＧ配列を認識する適切な抗体を使用することにより、または１次抗体に対して惹起された抗体を用いることにより達成し得る。選択および増幅の循環サイクルは、適切なクローンの濃縮、およびレセプター発現クローンの最終的な単離をもたらす。
ファージ発現ライブラリーを、ケモカインによりスクリーニングし得る。適切な標識技術（例えば、抗ＦＬＧＡ抗体）により、適切なクローンの特異的標識が可能になる。
【０１７９】
　（ＸＩＶ．免疫組織化学的局在化）
　上記の抗体を、種々の組織におけるＤＶｉｃ−１またはＤＧＷＣＣの発現を同定するために用いる。免疫組織化学的染色の方法は、例えば、Ｓｈｅｅｈａｎら（編）（１９８７）Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｔｔｌｌｅ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，　ＯＨ）に記載される。
【０１８０】
　本明細書中に引用される全ての文献は、個々の刊行物または特許出願の各々が、全ての目的についてその全体が参考として援用されることが具体的にそして個々に示されるかのような程度に、本明細書中に参考として援用される。
【０１８１】
　本発明の多くの改変および変更は、当業者に明らかであるように、その精神と範囲を逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定の実施態様は例示としてのみ提供され、そして本発明は、添付の請求の範囲の用語およびこのような請求の範囲に対する等価物の十分な範囲によってのみ制限される。
【配列表】
2004135675000001.app