(57)【要約】【課題】ＧＰＣＲをそのコンフォメーションを維持させたまま調製する簡便な方法を提供すること。【課題を解決するための手段】ＧＰＣＲを磁性細菌中で磁気微粒子膜に特異的な膜蛋白質またはそのフラグメントとの融合蛋白質として発現させることにより、ＧＰＣＲが磁気微粒子膜上に天然のコンフォメーションを維持したまま提示される。本発明は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＣＲ）を製造する方法であって、前記ＧＰＣＲをコードする遺伝子を発現可能な様式で含む磁性細菌を増殖させ、該磁性細菌から磁気微粒子を単離し、そして、磁気微粒子膜上に発現されている前記ＧＰＣＲを得る、の各工程を含む方法を提供する。また、本発明の方法により得られるＧＰＣＲ含有磁気微粒子、ならびにこの磁気微粒子を用いることによりＧＰＣＲ結合物質を検出またはスクリーニングする方法も開示される。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＣＲ）を製造する方法であって、
前記ＧＰＣＲをコードする遺伝子を発現可能な様式で含む磁性細菌を増殖させ、該磁性細菌から磁気微粒子を単離し、そして
磁気微粒子膜上に発現されている前記ＧＰＣＲを得る、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
前記ＧＰＣＲが、アンカー蛋白質との融合蛋白質として発現されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アンカー蛋白質が、天然の磁気微粒子膜蛋白質またはそのフラグメントである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
磁気微粒子と、これを覆う磁気微粒子膜とから構成され、前記磁気微粒子膜上にＧＰＣＲが発現されていることを特徴とするＧＰＣＲ含有磁気微粒子。
【請求項５】
磁気微粒子膜上に発現されているＧＰＣＲを有する磁気微粒子を製造する方法であって、前記ＧＰＣＲをコードする遺伝子を発現可能な様式で含む磁性細菌を増殖させ、そして該磁性細菌から磁気微粒子を単離することを特徴とする方法。
【請求項６】
試料中において、ＧＰＣＲと結合する物質を検出する方法であって、
磁気微粒子とこれを覆う磁気微粒子膜とから構成され、かつ前記磁気微粒子膜上に前記ＧＰＣＲが発現されているＧＰＣＲ含有磁気微粒子を前記試料と接触させ、そして
前記ＧＰＣＲ含有磁気微粒子に結合した物質の存在または量を測定する、
の各工程を含む方法。
【請求項７】
ＧＰＣＲと結合する物質をスクリーニングする方法であって、
磁気微粒子とこれを覆う磁気微粒子膜とから構成され、かつ前記磁気微粒子膜上に前記ＧＰＣＲが発現されているＧＰＣＲ含有磁気微粒子を試験物質と接触させ、そして、
前記試験物質が前記ＧＰＣＲ含有磁気微粒子に結合するか否かを判定する、
の各工程を含む方法。
【請求項８】
ＧＰＣＲに結合する物質をスクリーニングする方法であって、
磁気微粒子とこれを覆う磁気微粒子膜とから構成され、かつ前記磁気微粒子膜上に前記ＧＰＣＲが発現されているＧＰＣＲ含有磁気微粒子を、複数の試験物質を含む試料と接触させ、そして
前記ＧＰＣＲ含有磁気微粒子に結合した試験物質を同定する、
の各工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、磁気微粒子を利用する膜蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）は、ヒトゲノムによりコードされる全蛋白質の１−２％を占めるといわれており、シグナル伝達に関与している可能性が高いことから、薬剤発見の主要な標的として注目されている。ＧＰＣＲは、典型的には７回貫通膜ドメインを有する膜蛋白質であり、細胞膜のリン脂質中に埋め込まれている構造を有するため、細胞膜からＧＰＣＲを単離するためには、ＧＰＣＲを界面活性剤により可溶化し、精製し、次に脂質二重膜上で再構成させる必要がある。しかし、多くの場合、この精製工程の間にＧＰＣＲの天然のコンフォメーションが失われるという問題点があった。したがって、組換えＧＰＣＲをその天然のコンフォメーションを維持させたまま脂質二重膜上に提示させることができる簡便な方法が求められている。
【０００３】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
ＷＯ９７／３５９６４
【特許文献２】
特開平８−２２８７８２
【特許文献３】
特開平１１−２８５３８７
【特許文献４】
特開２００２−１７６９８９
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＧＰＣＲをそのコンフォメーションを維持させたまま調製する簡便な方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、磁性細菌中でＧＰＣＲを磁気微粒子膜に特異的な膜蛋白質またはそのフラグメントとの融合蛋白質として発現させることにより、ＧＰＣＲが磁気微粒子膜上に天然のコンフォメーションを維持したまま提示されることを見いだし、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち本発明は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＣＲ）を製造する方法を提供する。該方法は、ＧＰＣＲをコードする遺伝子を発現可能な様式で含む磁性細菌を増殖させ、磁性細菌から磁気微粒子を単離し、そして磁気微粒子膜上に発現されているＧＰＣＲを得ることを特徴とする。好ましくは、ＧＰＣＲは、アンカー蛋白質との融合蛋白質として発現されているものである。特に好ましくは、アンカー蛋白質は、天然の磁気微粒子膜蛋白質またはそのフラグメントである。磁気微粒子膜蛋白質のシグナルペプチドを用いてもよい。
【０００７】
別の観点においては、本発明は、磁気微粒子と、これを覆う磁気微粒子膜とから構成され、磁気微粒子膜上にＧＰＣＲが発現されていることを特徴とするＧＰＣＲ含有磁気微粒子を提供する。本発明はまた、ＧＰＣＲをコードする遺伝子を発現可能な様式で含む磁性細菌を増殖させ、そして該磁性細菌から磁気微粒子を単離することにより、磁気微粒子膜上に発現されているＧＰＣＲを有する磁気微粒子を製造する方法を提供する。
【０００８】
さらに別の観点においては、本発明は、磁気微粒子とこれを覆う磁気微粒子膜とから構成され、かつ磁気微粒子膜上にＧＰＣＲが発現されているＧＰＣＲ含有磁気微粒子を試料と接触させ、そして、ＧＰＣＲ含有磁気微粒子に結合した物質の存在または量を測定することにより、試料中においてＧＰＣＲと結合する物質を検出する方法を提供する。
【０００９】
さらに別の観点においては、本発明は、磁気微粒子とこれを覆う磁気微粒子膜とから構成され、かつ磁気微粒子膜上にＧＰＣＲが発現されているＧＰＣＲ含有磁気微粒子を試験物質と接触させ、そして、試験物質がＧＰＣＲ含有磁気微粒子に結合するか否かを判定することにより、ＧＰＣＲと結合する物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法においては、好ましくは、ＧＰＣＲ含有磁気微粒子を複数の試験物質を含む試料と接触させ、そして、ＧＰＣＲ含有磁気微粒子に結合した試験物質を同定する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の方法においては、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＣＲ）をコードする遺伝子を発現可能な様式で含む磁性細菌を増殖させ、磁性細菌から磁気微粒子を単離することにより、磁気微粒子膜上に発現されているＧＰＣＲを得ることができる。
【００１１】
本発明において用いる磁気微粒子は、磁性細菌の菌体内において産生される粒径約５０−１５０ｎｍのマグネタイトからなる微粒子である。磁性細菌としては、例えば、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  種の微生物（例えば、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５８），  ＭＳ−１  （ＩＦＯ  １５２７２，      ＡＴＣＣ３１６３２，  ＤＳＭ３８５６），  ＳＲ−１  （ＩＦＯ    １５２７２  ＤＳＭ  ６３６１）、およびＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  種の微生物（例えば、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．  ＲＳ−１  （ＦＥＲＭ  Ｐ−１３２８３））等が挙げられる。これらの磁性細菌から得られる磁気微粒子は、リン脂質を主成分とする有機膜で被覆されており、この膜には種々の膜蛋白質が存在する。ＡＭＢ−１株の磁気微粒子膜上に存在する膜蛋白質としては、ＭａｇＡ蛋白質、ＭｐｓＡ蛋白質、Ｍｍｓ１６蛋白質等が同定されている（特開平８−２２８７８２，ＷＯ９７／３５９６４、特開２００２−１７６９８９等）。また、これらの膜蛋白質を利用して、ルシフェラーゼ（Ｎａｋａｍｕｒａ，      Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１８，  ２３−７  （１９９５））やプロテインＡ（Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ．，  ７２，  ３５１８−２２  （２０００））等の有用蛋白質を発現させる方法が開発されている。
【００１２】
本発明の方法においては、好ましくは、ＧＰＣＲを磁気微粒子上でアンカー蛋白質との融合蛋白質として発現させる。アンカー蛋白質とは、磁気微粒子膜上に結合して発現される蛋白質またはその一部であって、これに融合させた他の蛋白質を膜にアンカリングさせる役割を果たす。本発明においてＧＰＣＲとの融合蛋白質を生成するためには、例えば、ＡＭＢ−１株の磁気微粒子膜上で発現される膜蛋白質をアンカー蛋白質として用いることができ、例えば、上述したＭａｇＡ蛋白質、ＭｐｓＡ蛋白質、Ｍｍｓ１６蛋白質等を用いることができる。さらに、これらの膜蛋白質のフラグメントであって、磁気微粒子膜への局在化を指示する機能を有するフラグメントも、本発明においてＧＰＣＲとの融合蛋白質を生成するために用いることができる。本発明にしたがえば、磁性細菌から磁気微粒子を回収することにより、ＧＰＣＲを磁気微粒子膜上に提示された形で、天然のコンフォメーションを維持したまま単離することが可能である。
【００１３】
ＧＰＣＲとしては、これまでに単離または同定されているいずれのＧＰＣＲを用いてもよい。さらに、ゲノム配列情報またはｃＤＮＡ配列情報からＧＰＣＲであることが予測されるが、対応する蛋白質が単離されていないかまたはその存在が確認されていないものについても、本発明にしたがって組換え融合蛋白質として発現させて、その機能を解析することができる。
【００１４】
融合蛋白質を生成するためには、これらの磁気微粒子膜上で発現される膜蛋白質をコードするＤＮＡ配列と、ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ配列とを、磁性細菌中で機能しうるプロモータの下流にインフレームとなるように連結し、これを磁性細菌中で複製可能なベクター中に挿入する。ベクターとしては、例えば、特開平８−２２８７８２に記載されるｐＲＫ４１５、特開平１１−２８５３８７に記載されるｐＭＳ−Ｔ１またはその誘導体を用いることができる。得られた発現ベクターを用いて、接合伝達、エレクトロポレーション等の公知の方法により磁性細菌を形質転換する。得られた形質転換体を適切な条件下で培養すると、菌体内に磁気微粒子が産生され、磁気微粒子を被覆している有機膜上で融合蛋白質が発現する。磁性細菌の菌体を破壊または溶解した後、磁気を利用して磁気微粒子を回収することにより、目的とするＧＰＣＲ蛋白質と膜蛋白質との融合蛋白質を容易に得ることができる。
【００１５】
本発明にしたがって得られるＧＰＣＲ融合蛋白質は、ＧＰＣＲが磁気微粒子膜中に埋め込まれた形で発現されるため、ＧＰＣＲがその天然のコンフォメーションまたはそれに近いコンフォメーションをとることが可能である。したがって、本発明により製造されるＧＰＣＲは、リガンドとの結合等の機能の解析に用いるのに有用である。
【００１６】
別の観点においては、本発明は、磁気微粒子膜上にＧＰＣＲが発現されていることを特徴とするＧＰＣＲ含有磁気微粒子を提供する。ＧＰＣＲ含有磁気微粒子は、磁気微粒子と、これを覆う磁気微粒子膜とから構成される。本発明のＧＰＣＲ含有磁気微粒子は、ＧＰＣＲをコードする遺伝子を発現可能な様式で含む磁性細菌を増殖させ、そして該磁性細菌から磁気微粒子を単離することにより得ることができる。
【００１７】
磁気微粒子膜においてＧＰＣＲが所望のコンフォメーションで発現されているか否かは、当該技術分野において知られる種々の方法を用いることにより容易に確認することができる。例えば、当該ＧＰＣＲに対する抗体を用いて抗原抗体反応により検出するか、または当該ＧＰＣＲのリガンドとして知られている物質が結合するか否かを検出する、等の方法を用いることができる。例えば、以下に記載される実施例においては、ＧＰＣＲのモデルとしてＤ１ドーパミンレセプター（Ｄ１Ｒ）を用い、これを磁気微粒子膜特異的蛋白質であるＭｍｓ１６に融合させて、磁性細菌の磁気微粒子膜上で発現させた。次に、抗Ｄ１ドーパミンレセプター抗体の結合を測定することにより、あるいはＤ１Ｒに対する天然のリガンドまたは公知のアゴニスト／アンタゴニストの結合を測定することにより、Ｄ１Ｒが所望のコンフォメーションで発現しているか否か、あるいは、Ｄ１Ｒがリガンド等と結合する能力を保持しているか否かを確認することができる（図１）。
【００１８】
本発明にしたがえば、ＧＰＣＲ蛋白質が磁性細菌の磁気微粒子膜上に固定化された形で発現されるため、このＧＰＣＲ含有磁気微粒子を用いて、ＧＰＣＲの機能解析、リガンドの同定および定量、アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング等を容易に行うことができる。
【００１９】
例えば、本発明のＧＰＣＲ含有磁気微粒子を試料と接触させ、そして、ＧＰＣＲ含有磁気微粒子に結合した物質の存在または量を測定することにより、試料中において、ＧＰＣＲと結合する物質を検出することができる。この方法は、ＧＰＣＲのリガンドのアッセイに有用である。この方法は、磁石を用いて磁気微粒子を回収することにより、磁気微粒子上のＧＰＣＲと結合した物質を未結合物質から容易に分離することができるという利点を有する。さらに、本発明のＧＰＣＲ含有磁気微粒子は、有用物質のスクリーニングにおいて用いるのに有用である。すなわち、本発明のＧＰＣＲ含有磁気微粒子を試験物質を含む溶液と接触させ、そして、試験物質がＧＰＣＲ含有磁気微粒子に結合するか否かを判定することにより、ＧＰＣＲに結合しうる物質を同定することができる。この方法は、ＧＰＣＲのアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニングに有用である。この方法はまた、ＧＰＣＲのリガンドが不明である場合に、リガンドを同定してＧＰＣＲの機能を解析するのに有用である。本発明の方法は、配列情報からＧＰＣＲであることが予測されるが、対応する蛋白質が単離されていないかまたはその存在が確認されていない未知の蛋白質についても実施することができるため、ゲノム配列情報またはｃＤＮＡ配列情報から機能が推定されている蛋白質について、その実際の機能を解析するのに特に有用である。
【００２０】
さらに、本発明のＧＰＣＲ含有磁気微粒子を用いて、複数の試験物質を含む試料からＧＰＣＲに結合する物質のみを単離することができる。例えば、ＧＰＣＲ含有磁気微粒子を複数の試験物質を含む試料と接触させ、磁石を用いて磁気微粒子を回収することにより、磁気微粒子上のＧＰＣＲと結合した物質を容易に分離することができる。これらの物質を単離して分析することにより、ＧＰＣＲの機能の解明に有用な情報を得ることができる。また、この方法を用いて、アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニングを容易に行うことができる。
【００２１】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２２】
【実施例】
実施例１．Ｍｍｓ１６−Ｄ１Ｒ融合蛋白質のＥ．ｃｏｌｉでの発現
ＡＭＢ−１株中で複製可能なシャトルベクターを構築した。特開平１１−２８５３８７に記載されるｐＭＳ−Ｔ１およびｐＵＣ１８からなるｐＭＣ１８（Ａｍｐｒ）をＳｃａＩおよびＸｂａＩで消化した。同様にｐＡＣＹＣ１８４（日本ジーン）をＳｃａＩおよびＸｂａＩで消化した後、ｐＭＳ−Ｔ１およびＴｅｔｒが含まれるように連結し、ｐＵＭＧｔを作製した。アンカー蛋白質としては、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＢＭ−１のＭｍｓ１６を用いた。Ｍｍｓ１６遺伝子の配列は特開２００２−１７６９８９に開示されている。この配列情報を基に、ＡＢＭ−１ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲにより、Ｍｍｓ１６プロモータおよびＭｍｓ１６コーディング領域をコードするＤＮＡを取得した。また、Ｄ１ドーパミンレセプター遺伝子は、公知の配列情報に基づいて、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲにより取得した。これらのＰＣＲ産物を用いて、上述のプラスミドｐＵＭＧｔに、Ｍｍｓ１６のプロモータ配列、およびその下流にＤ１Ｒコーディング配列を挿入して、Ｄ１Ｒ発現プラスミドｐＵＭＤ１ｔを構築した。同様に、プラスミドｐＵＭＧｔにＭｍｓ１６プロモータ配列、およびその下流にＭｍｓ１６コーディング配列とＤ１Ｒコーディング配列とをインフレームとなるよう挿入して、Ｍｍｓ１６−Ｄ１Ｒ発現プラスミドｐＵＭ１６Ｄ１ｔを構築した（図２）。
【００２３】
これらの発現プラスミドをエレクトロポレーション法により大腸菌に導入した。形質転換体を培養し、菌体を回収し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄した後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌに懸濁し、ＥＤＴＡの存在下でリゾチウムで３７℃で１時間処理してスフェロプラストを調製した。このスフェロプラストをマイクロタイタープレートの表面に１×１０８個／ウエルで吸着させ、ＢＳＡでブロッキングした後、抗体またはアンタゴニストを用いてＤ１Ｒについてアッセイした。
【００２４】
抗体によるアッセイにおいては、抗Ｄ１ドーパミンレセプター抗体（ラットＩｇＧ）を第一抗体として用い、これにアルカリホスファターゼ標識抗ラットＩｇＧを加え、次に発光基質を加えて化学発光を測定した。結果を図３に示す。
【００２５】
また、アンタゴニストによるアッセイにおいては、ＢＯＤＩＰＹ標識ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１ドーパミンレセプターのアンタゴニスト）をプレートに加え、抗ＢＯＤＩＰＹ抗体（ウサギＩｇＧ）を加えた後に、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧを加え、次に発光基質を加えて、化学発光を測定した。結果を図４に示す。
【００２６】
これらの結果から明らかなように、Ｄ１ＲおよびＭｍｓ１６とＤ１Ｒとの融合蛋白質のいずれも、大腸菌においてＭｍｓ１６のプロモータ制御下で細胞質膜上で発現され、抗体に認識されるコンフォメーションを有し、かつリガンド結合能を有していることが確認された。
【００２７】
実施例２．Ｍｍｓ１６−Ｄ１Ｒ融合蛋白質の磁気微粒子上での発現
実施例１において作成したＭｍｓ１６−Ｄ１Ｒ発現プラスミドｐＵＭ１６Ｄ１ｔを、エレクトロポレーションによりＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１に導入した。得られた形質転換体を培養し、菌体を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、フレンチプレスに３回通して破砕した。次に、文献（Ａｐｐｌ．  ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ８４−８６，  ４４１−４４６，  ２０００）に記載されるように、磁気粒子画分、細胞質画分、細胞膜画分の３画分に分離した。簡単には、フレンチプレス破砕試料から磁気を用いて磁気微粒子を回収し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄して、磁気粒子画分とした。残りの試料を１００００ｇで４℃で１０分間遠心分離し、その上清をさらに１６０，０００ｇで４℃で１時間超遠心分離して、上清を細胞質画分とした。このときの沈殿物をＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、１６０，０００ｇで４℃で１時間超遠心分離して、沈殿物を回収した。これをＰＢＳ緩衝液に再懸濁して、細胞膜画分とした。
【００２８】
それぞれの画分について、実施例１に記載の方法と同様にして、抗Ｄ１Ｒ抗体および抗Ｄ１Ｒラット抗体−ＡＰコンジュゲート化ヤギ抗ラット抗体を用いてＤ１Ｒを検出した。対照としては、発現プラスミドを導入していないＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ      ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１を用いて、上記と同様に培養し、分画した。磁気粒子上でＤ１ドーパミンレセプターが発現されていることが確認された（図５）。また、細胞膜画分においてもＤ１ドーパミンレセプターが検出されたが、細胞質画分では検出されなかった。
【００２９】
さらに、磁気粒子画分を用いて、Ｄ１ドーパミンレセプターのアンタゴニストであるＳＣＨ２３３９０の結合を調べた。磁気粒子１００μｇを結合バッファー（５０      ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ５  ｍＭ  ＫＣｌ，  １．５  ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ４ｍＭ  ＭｇＣｌ２，      １２０  ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し、これに［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０を加え、２１℃で１時間インキュベートした。ガラスフィルターを用いて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄した後、シンチレーションカウンターを用いて３      Ｈを計数したところ、磁気粒子上のＤ１ドーパミンレセプターがＳＣＨ２３３９０に結合する能力を有することが確認された（図６）。
【００３０】
実施例３．Ｄ１Ｒ提示磁気微粒子を用いるドーパミンの競合結合アッセイ
ドーパミン競合アッセイの原理を図７に示す。実施例２に記載の方法にしたがって、野生型またはＭｍｓ１６−Ｄ１Ｒ発現プラスミドｐＵＭ１６Ｄ１ｔで形質転換したＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ      ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１から磁気微粒子を調製した。各５０μｇの磁気微粒子を１００μｌの結合バッファーに懸濁し、種々の濃度のドーパミンおよび最終濃度１×１０−７ＭのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識２３３９０を加えて、室温で１時間インキュベートした。磁気を用いて磁気粒子を回収し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄した後、５２０ｎｍで蛍光強度を測定した。結果を図８に示す。図から明らかなように、ドーパミン濃度が高くなるにしたがって磁気微粒子の蛍光強度が低下し、磁気微粒子表面上に提示されたＤ１ドーパミンレセプターがドーパミンに結合する機能を有することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｍｍｓ１６−Ｄ１Ｒ融合蛋白質の磁気微粒子上での発現およびＤ１Ｒのアッセイの概略を示す。
【図２】図２は、Ｄ１ドーパミンレセプターをコードする遺伝子を発現させるための発現プラスミドの構造を示す。
【図３】図３は、組換え大腸菌のスフェロプラスト上で発現されているＤ１ドーパミンレセプターを抗Ｄ１Ｒ抗体を用いて検出した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、組換え大腸菌のスフェロプラスト上で発現されているＤ１ドーパミンレセプターに対するＳＣＨ２３３９０の結合活性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１の磁気粒子上で発現されているＤ１ドーパミンレセプターを抗Ｄ１Ｒ抗体を用いて検出した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１の磁気粒子上で発現されているＤ１ドーパミンレセプターを［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０を用いて検出した結果を示すグラフである。
【図７】図７は、ドーパミン競合アッセイの原理を示す。
【図８】図８は、ドーパミン競合アッセイの結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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