(57)【要約】【課題】ＳＭＰ３０遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物、該動物を用いた抗体およびそれ等の作製方法を提供する。【解決手段】染色体ＳＭＰ３０遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列を、欠失させるか、他の配列に置換するか、または当該遺伝子内に他の配列を挿入することにより、機能が欠損した変異型ＳＭＰ３０遺伝子を作製する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セネッセンスマーカープロテイン３０（ＳＭＰ３０）の機能が欠損したＳＭＰ３０欠損動物。
【請求項２】
染色体ＳＭＰ３０遺伝子に他の配列を挿入することにより、機能が欠損した変異型ＳＭＰ３０遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＳＭＰ３０欠損動物。
【請求項３】
染色体ＳＭＰ３０遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列を欠失させるか、あるいは他の配列に置換することにより、機能が欠損した変異型ＳＭＰ３０遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＳＭＰ３０欠損動物。
【請求項４】
前記ＳＭＰ３０の機能の欠損が、染色体ＳＭＰ３０遺伝子の転写と翻訳を含むＳＭＰ３０発現の過程またはＳＭＰ３０のプロセッシングの過程に関わる遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、あるいは他の配列に置換することによるものであることを特徴とする、請求項１に記載のＳＭＰ３０欠損動物。
【請求項５】
染色体ＳＭＰ３０遺伝子へ薬剤耐性遺伝子を挿入することにより、機能が欠損した変異型ＳＭＰ３０を含むことを特徴とする、請求項２のＳＭＰ３０欠損動物。
【請求項６】
前記薬剤耐性遺伝子が、染色体ＳＭＰ３０遺伝子のエキソンに挿入されたネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする、請求項５のＳＭＰ３０欠損動物。
【請求項７】
前記ＳＭＰ３０欠損動物が、非ヒト動物またはその子孫であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載のＳＭＰ３０欠損動物。
【請求項８】
前記非ヒト動物が哺乳類であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載のＳＭＰ３０欠損動物。
【請求項９】
前記非ヒト動物がげっ歯類であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載のＳＭＰ３０欠損動物。
【請求項１０】
前記非ヒト動物がマウスであることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載のＳＭＰ３０欠損動物。
【請求項１１】
ＳＭＰ３０の機能が欠損したＳＭＰ３０欠損動物を免疫して得られた抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、ヒトＳＭＰ３０またはその一部に反応を示す、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
染色体ＳＭＰ３０遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、あるいは他の配列で置換することにより、機能が欠損した変異型ＳＭＰ３０遺伝子を作製することを特徴とする、ＳＭＰ３０欠損動物の作製方法。
【請求項１４】
染色体ＳＭＰ３０遺伝子の発現の過程またはＳＭＰ３０のプロセッシングの過程に関わる遺伝子産物をコードする、染色体上遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、あるいは他の配列で置換することによる、ＳＭＰ３０欠損動物の作製方法。
【請求項１５】
ＳＭＰ３０の機能が欠損した動物を免疫して抗体を作製することを特徴とする、抗体の作製方法。
【請求項１６】
前記抗体が、ヒトＳＭＰ３０またはその一部に反応を示す、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１５に記載の抗体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＳＭＰ３０（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ３０）の機能が欠損した新規な系統の動物とその作出法、及び本発明による動物を用いて作製した抗体とその作出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
発生工学的技術の発展と分子生物学の知識の蓄積に伴い、遺伝子を人為的に操作し、動物個体へ導入して、種々の遺伝子改変動物の作製が可能となっている（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２１４巻、１２４４〜１２４６頁、１９８１年）。これらはいわゆる遺伝子組換え（トランスジェニック）動物と呼ばれ、医学・生物学領域で様々な応用が期待され、特に、遺伝子操作により特定の蛋白質を欠損させた動物モデルは、クローニングされた遺伝子の、生体内での生理学的機能や、疾患との関連性の解析において、最も強力な手段のひとつとされている。
【０００３】
例えばマウスではＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ；胚性幹細胞）において、遺伝子の相同的組換えを利用する手法により、遺伝子および遺伝子産物欠損マウス（いわゆるノックアウトマウス）の作製が可能である（Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．    Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．    Ｓｃｉ．    ＵＳＡ、第８６巻、８９２７〜８９３１頁、１９８９年）。
【０００４】
一般に、特定の遺伝子産物を欠損させる方法としては、目的とする蛋白質をコードする遺伝子を破壊することが行われる。具体的には破壊する標的遺伝子のクローニングを行い、その遺伝子内部に挿入するターゲッテイングベクターを作製する。このベクターはマウスＥＳ細胞に導入され、相同的組換えが行われる。組換えが生じたＥＳ細胞を受精卵の８細胞期胚に吸着させ、あらかじめ偽妊娠させておいた仮親の卵管に移植し、出生させる。その後出生したマウスの尾部よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ    Ｒｅａｃｔｉｏｎ）あるいはサザンハイブリダイゼーションにより標的遺伝子の組換えを確認する。このマウスをさらに退交配し、純系のノックアウトマウス系として確立する。ノックアウトマウスの作製方法の詳細は、Ｃｕｒｒｅｎｔ    Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ    ＆  Ｓｏｎｓ，    Ｉｎｃ．）や、実験医学別冊  バイオマニュアルシリーズ  ８「ジーンターゲッテイング；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」（相沢慎一著：羊土社）に記載されている。
【０００５】
破壊される遺伝子は必ずしも目的とする蛋白質をコードする遺伝子に限定されない。ある特定遺伝子について、その転写から翻訳にいたる一連の過程のいずれか、あるいは、その遺伝子産物（蛋白質）が正常に機能するために、翻訳後のプロセッシングが必要であるなら、その過程のいずれかを阻害するような遺伝子の改変も、当該蛋白質の欠損となる。この場合どの過程が阻害されるかによって、当該蛋白質がまったく産生されなかったり、あるいは産生されても機能しない等の様々な表現型を示す。
【０００６】
こうして作製されたノックアウトマウスには通常生殖細胞を含めた全ての細胞に外来遺伝子により破壊された遺伝子が組み込まれており、メンデルの法則に従って正確に子孫に伝達される。即ち１匹のノックアウトマウスは、１つの新しい系統として樹立することができ、繁殖能力が損なわれない限り、交配を繰り返すことによって同じ遺伝的資質を持った実験動物として供給し続けることが可能である。また導入する遺伝子の上流にプロモーターやエンハンサーなどの遺伝子制御領域をつなぐことにより組織特異的に発現を制御することも可能である。
【０００７】
一方、ＳＭＰ３０は加齢に伴い減少するラット肝細胞内の蛋白質として１９９２年に報告され（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ    Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第１１１６巻、１２２〜１２８、１９９２年）、そのアミノ酸配列やｃＤＮＡ配列もヒト（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ    Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第１２６３巻、２４９〜２５２、１９９５年）、ラット（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ    Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第１１３２巻、２９７〜３０５、１９９２年）、マウス（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ、  第１３０８巻、４９〜５７、１９９６年）や、ラビット、ウシ、ニワトリ、ヒキガエル（ｔｏａｄ）（Ｍｉｓａｗａら、Ｉｎｔ    Ｊ  Ｍｏｌ    Ｍｅｄ、第６巻、１９１〜１９６、２０００年）  においてすでに決定されている。またマウスについてはジェノミックＤＮＡ配列と構造も報告された（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ、  第１３０８巻、４９〜５７、１９９６年）。Ｆｕｊｉｔａ・Ｍａｒｕｙａｍａら以外の研究グループも遅れて同一の物質のクローニングを行いｒｅｇｕｃａｌｃｉｎと称しているが、以下、ＳＭＰ３０という名称で統一する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
加齢に伴い各臓器では多様な病変を発症する。内的あるいは外的刺激により臓器を構成する細胞は障害を受ける。その際に重要な細胞内事象は細胞内カルシウムの上昇である。細胞内カルシウムは種々の細胞機能に必須なイオンではあるが過剰な上昇は細胞膜障害を始めとして細胞機能を著しく低下させる。従って細胞機能の維持において細胞内カルシウムの恒常性維持は必須である。
【０００９】
ＳＭＰ３０は新しいタイプのカルシウム結合蛋白質であり、細胞膜カルシウムポンプを活性化することにより細胞内カルシウムの恒常性を保つ生物機能を持っていることが知られている。しかしながら、ヒトを含めた生物種におけるＳＭＰ３０の働きの詳細・機序は十分に解明されておらず、特に疾患との関連、各種病態への関与等、解明すべき点が数多く残されている。また一般に生物学的解析においては、抗体の作製が必須であるが、ＳＭＰ３０においてはいまだ反応性の高い抗体、特にモノクローナル抗体が得られていない。これはＳＭＰ３０が異種動物間で非常に高い相同性を示していることが原因と考えられる。これらの問題を解決する上で、ＳＭＰ３０が欠損した動物モデルの提供が必須である。
【００１０】
従って、本発明の目的は、ＳＭＰ３０が欠損した非ヒト動物を提供することである。また、当該動物を用いて、反応性の高い抗体を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、相同組換えを利用してＳＭＰ３０が欠損している動物を人為的に作出することに成功した。
【００１２】
即ち、本発明の、ＳＭＰ３０欠損動物の第１の態様は、ＳＭＰ３０の機能が欠損したＳＭＰ３０欠損動物である。
【００１３】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物の第２の態様は、前記ＳＭＰ３０の機能の欠損が、染色体ＳＭＰ３０遺伝子における他の配列の挿入によるものであることを特徴とする、ＳＭＰ３０欠損動物である。
【００１４】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物の第３の態様は、前記ＳＭＰ３０の機能の欠損が、染色体ＳＭＰ３０遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列を欠失させるか、あるいは他の配列に置換することによるものであることを特徴とする、ＳＭＰ３０欠損動物である。
【００１５】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物の第４の態様は、前記ＳＭＰ３０の機能の欠損が、染色体ＳＭＰ３０遺伝子の転写と翻訳を含むＳＭＰ３０発現の過程またはＳＭＰ３０のプロセッシングの過程に関わる遺伝子産物をコードする他の遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、あるいは他の配列に置換することによるものであることを特徴とする、ＳＭＰ３０欠損動物である。
【００１６】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物の第５の態様は、前記ＳＭＰ３０の欠損が、染色体ＳＭＰ３０遺伝子の一部における薬剤耐性遺伝子の挿入によるものであることを特徴とする、ＳＭＰ３０欠損動物である。
【００１７】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物の第６の態様は、前記薬剤耐性遺伝子が、染色体ＳＭＰ３０遺伝子のエキソンに挿入されたネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする、ＳＭＰ３０欠損動物である。
【００１８】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物の第７の態様は、ＳＭＰ３０欠損動物が、非ヒト動物またはその子孫であることを特徴とする、ＳＭＰ３０欠損動物である。
【００１９】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物の第８の態様は、前記非ヒト動物が哺乳類であることを特徴とする、ＳＭＰ３０欠損動物である。
【００２０】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物の第９の態様は、前記非ヒト動物がげっ歯類であることを特徴とする、ＳＭＰ３０欠損動物である。
【００２１】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物の第１０の態様は、前記非ヒト動物がマウスであることを特徴とする、ＳＭＰ３０欠損動物である。
【００２２】
本発明の抗体の第１の態様は、ＳＭＰ３０の機能が欠損したＳＭＰ３０欠損動物を免疫して得られた抗体である。
【００２３】
本発明の抗体の第２の態様は、前記抗体が、ヒトＳＭＰ３０またはその一部に反応を示す、モノクローナル抗体であることを特徴とする、抗体である。
【００２４】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物作製方法の第１の態様は、染色体ＳＭＰ３０遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、あるいは他の配列で置換することによる、ＳＭＰ３０欠損動物の作製方法である。
【００２５】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物作製方法の第２の態様は、染色体ＳＭＰ３０遺伝子の発現の過程またはＳＭＰ３０のプロセッシングの過程に関わる遺伝子産物をコードする、染色体上の他の遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、あるいは他の配列で置換することによる、ＳＭＰ３０欠損動物の作製方法である。
【００２６】
本発明の抗体作製方法の第１の態様は、ＳＭＰ３０の機能が欠損した動物を免疫して抗体を作製することを特徴とする、抗体の作製方法である。
【００２７】
本発明の抗体作製方法の第２の態様は、前記抗体が、ヒトＳＭＰ３０またはその一部に反応を示す、モノクローナル抗体であることを特徴とする、抗体の作製方法である。
【００２８】
【発明の実施の形態】
ＳＭＰ３０遺伝子については、前述のように、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ニワトリ、カエル等からそのｃＤＮＡがクローニングされ、ｃＤＮＡ配列及びコード蛋白質（ＳＭＰ３０）のアミノ酸配列が報告されている（前述Ｆｕｊｉｔａら、またはＭｉｓａｗａらの論文）。またマウスでは染色体上のＳＭＰ３０遺伝子の構造も報告されている（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  第１３０８巻、４９〜５７、１９９６年）。これらのＳＭＰ３０はすべて２９９アミノ酸からなり、約７０％〜９２％の高い相同性を示し、特にマウスとヒトでは８９％、マウスとラットでは９４％と高値であった（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  第１３０８巻、４９〜５７、１９９６年）。
【００２９】
本発明における、ＳＭＰ３０またはそれをコードするＳＭＰ３０遺伝子は、既報のヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ニワトリ等のＳＭＰ３０のアミノ酸配列、ＳＭＰ３０遺伝子のｃＤＮＡ配列またはジェノミックＤＮＡ配列と相同性を有するものであれば、既報の配列以外のものや、これらの動物由来以外のものも含まれる。このようなＳＭＰ３０またはそれをコードするＳＭＰ３０遺伝子としては、例えば（１）既報の、ＮＣＢＩアクセス番号Ｑ６４３７４（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）に記載されたマウスのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）を有する蛋白質またはそれをコードする遺伝子、（２）既報の、ＮＣＢＩアクセス番号Ｑ６４３７４（ＥＭＢＬ）に記載されたマウスのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）において、１もしくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸を有する蛋白質またはそれをコードする遺伝子、が挙げられる。
【００３０】
ここでアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換は、通常１〜約９０個、好ましくは１〜約６０個、より好ましくは１〜約３０個、さらに好ましくは１〜約１５個である。
【００３１】
また本発明におけるＳＭＰ３０は、既報の、ＮＣＢＩアクセス番号Ｑ６４３７４（ＥＭＢＬ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）に記載されたマウスのアミノ酸配列と通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の相同性を有する。
【００３２】
また本発明におけるＳＭＰ３０遺伝子ｃＤＮＡは、ＮＣＢＩアクセス番号Ｕ２８９３７（ＤＤＢＪ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）に記載されたｃＤＮＡ配列と通常６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の塩基配列上の相同性を有する。
【００３３】
本発明において「ＳＭＰ３０の機能が欠損した非ヒト動物」（以下、ＳＭＰ３０欠損動物と称する。）とは、染色体上に導入された変異により、ＳＭＰ３０が産生されないか、あるいは機能が欠損した変異型ＳＭＰ３０を産生する非ヒト動物を意味する。ＳＭＰ３０の欠損は、機能が欠損した変異型ＳＭＰ３０遺伝子を有することに起因するのが最も一般的であり、遺伝子工学的にも手法が確立している。本発明においても、変異型ＳＭＰ３０遺伝子を有するＳＭＰ３０欠損動物を、その実施の一例としてあげている。
【００３４】
機能が欠損した変異型ＳＭＰ３０遺伝子としては、変異のない正常遺伝子と比較して、遺伝子発現が抑制されるか、または遺伝子産物の活性が少なくとも一部失われた遺伝子が挙げられる。典型例としては、遺伝子発現が完全に抑制されるか、または遺伝子産物の活性が完全に消失した遺伝子が挙げられる。
【００３５】
本発明の動物としては、その構成細胞のすべてにおいて、変異型ＳＭＰ３０遺伝子が染色体上で、ホモの状態で存在しているもの（ホモ欠損動物）、またはヘテロの状態で存在しているもの（ヘテロ欠損動物）が挙げられる。また、その構成細胞の一部のみにおいて変異型ＳＭＰ３０遺伝子がホモまたはヘテロの状態で存在する、キメラ動物も挙げられる。
【００３６】
非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタなどの哺乳動物、ニワトリなどの鳥類、カエルなどの両生類、などが挙げられる。これらのうちマウスやラットなどのげっ歯類動物は、ライフサイクルが短く繁殖が容易であり、遺伝的欠損動物の作製技術も確立していることなどの点で有利であるため、好ましい。
【００３７】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物は、最も一般的な方法として、染色体のＳＭＰ３０遺伝子に人為的に変異を導入し、その機能を欠損させることにより作製できる。具体的には、染色体上のＳＭＰ３０遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列を欠失させるか、他の配列に置換することにより、ＳＭＰ３０遺伝子の機能を欠損させることができる。
【００３８】
欠失または他の配列を挿入・置換させる部位（ターゲット部位）は、プロモーター領域、非翻訳領域、翻訳領域などのいずれであってもよい。これらのどの部分をターゲットとするかによって、ＳＭＰ３０遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）が産生されなくなったり、転写産物を不安定化したりすることが可能である。また活性の失ったＳＭＰ３０（蛋白質）やその断片を産生させることもできる。遺伝子の機能を完全に欠損させるには、プロモーター領域または翻訳領域をターゲットとすることが好ましい。
【００３９】
前記のような染色体上のＳＭＰ３０遺伝子への変異導入は、遺伝子相同組換えにより実施できる。具体的には、例えば以下のように実施できる。
【００４０】
まず相同組換えに使用するターゲッテイングベクターを作製する。ターゲッテイングベクターには相同組換えによって置き換える、染色体由来のＳＭＰ３０遺伝子の全部または一部と、マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子の上流と下流は、ＳＭＰ３０遺伝子の、挿入しようとする部分と相同な塩基配列部位によって囲まれる。
【００４１】
前記ＳＭＰ３０遺伝子の全部または一部は、ＳＭＰ３０遺伝子を欠損させようとする動物種の染色体ＤＮＡからＳＭＰ３０遺伝子領域を単離して得られる。例えば定法によりその動物種の染色体ＤＮＡ（ジェノミックＤＮＡ）ライブラリーから、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはこれらの組み合わせにより、ＳＭＰ３０遺伝子のクローンを得ることができる。
【００４２】
ターゲッテイングベクターには、マーカー遺伝子を挿入する。これは、ベクターを細胞内に導入する際に、導入した細胞のみを選択するためのものである。このようなマーカー遺伝子としては、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子（ＤＴ−Ａ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）等、通常の薬剤耐性選択に用いる遺伝子を用いることができる。例えばネオマイシン耐性遺伝子が導入された細胞は、Ｇ４１８などのネオマイシンに耐性を示すので、細胞の培養の際にネオマイシンを加える事によって、ベクターを含む細胞のみを選択できる。
【００４３】
また、ＳＭＰ３０遺伝子にレポーター遺伝子を挿入してもよい。これはターゲッテイングベクターを導入した細胞内や、目的とするＳＭＰ３０欠損動物の細胞内でのＳＭＰ３０遺伝子の転写活性をモニターするためのものである。この場合、挿入する非相同的配列部分にＳＭＰ３０遺伝子とレポーター遺伝子の翻訳フレームが一致するように設計する。レポ−ター遺伝子は一般に用いられるものでよく、例えばｌａｃＺ（大腸菌−ガラクトシダーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ＧＵＳ（竅｜グルコニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、タウマリン遺伝子等を用いることができる。
【００４４】
さらにベクターが細胞内で非相同的組換えを起こした場合に細胞が死滅するようなＤＴ−Ａカセットを加えることも可能である。これによってターゲッテイングベクターが目的の染色体領域に組み込まれた細胞を、通常より高い割合で選択することができる。
【００４５】
相同組換え用ターゲッテイングベクターは以下のように構築する。即ち、前述のようにして単離した染色体由来ＳＭＰ３０を適当な制限酵素で切断して得られた断片を、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、ＤＴ−Ａカセット等と適当な順序で連結させる。この時に必要ならば合成したリンカーＤＮＡを用いてもよい。また、単離した染色体由来ＳＭＰ３０遺伝子は、必要に応じてＰＣＲ法等により断片の一部を増幅することも可能である。相同組換え用ターゲッテイングベクターは、通常のＤＮＡ組換え技術により容易に作製することができる。
【００４６】
次に、相同組換え用ターゲッテイングベクターを、直線化して、適当な細胞へ導入する。細胞は、潜在的に全ての細胞に分化し得るものを用いる。例えばマウスの場合、受精卵や初期胚、あるいはＥＳ細胞（胚性幹細胞）のような培養細胞であるが、このうちＥＳ細胞は技術的にも確立していることから最も好ましい。導入する方法は、通常の方法、例えばエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等が用いられる。
【００４７】
ターゲッテイングベクターが取り込まれた細胞は、ベクター内のマーカー遺伝子の発現によって選択できる。例えばマーカーが薬剤耐性遺伝子であれば、適当な期間、薬剤存在下で培養することにより選択できる。選択された細胞内の相同的組換えはＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーションによって確認できる。ＤＴ−Ａカセットを挿入した場合は、通常よりも相同的組換えの割合が上昇するが、いずれにしても挿入確認の際に組換えの部位を確認する必要がある。
【００４８】
組換えによって目的ＤＮＡが挿入した細胞（例えばＥＳ細胞）を８細胞期の宿主胚に凝集法により注入し、胚盤胞期まで発生させた後、これを偽妊娠動物の子宮に移植してキメラの産仔を得る。
【００４９】
これらのキメラ動物の産仔で生殖細胞がＥＳ細胞に由来するものを野生型と退交配してＳＭＰ３０遺伝子へテロ欠損動物を得ることができる。また得られたＳＭＰ３０ヘテロ欠損動物同士を交配してホモ欠損とすることも可能である。これらの動物の遺伝子型は、その動物の体の一部（例えば尾部先端）から得た染色体ＤＮＡについて、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法等により、解析し確認できる。
【００５０】
本発明の動物は、正常な動物と同様な方法により飼育することができる
【００５１】
ＳＭＰ３０欠損動物は、ＳＭＰ３０欠損による疾病とその治療法の解明に用いることができる。
【００５２】
本発明のＳＭＰ３０欠損動物を用いることにより、あらゆる種に有効な、反応性の高い抗ＳＭＰ３０抗体を作製することが可能である。例えば、抗体の作製にはマウスやラットを用いるのが一般的であるが、前述のように、ＳＭＰ３０のアミノ酸配列はヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ等の哺乳動物のみならず、ニワトリやカエル等においても、非常に高い相同性を維持しており（Ｆｕｊｉｔａら、Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ、第１０７巻、２７１−２８０、１９９９年）（Ｍｉｓａｗａら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、第６巻、１９１〜１９６、２０００年）、抗体を作製するのは容易ではない。しかしこの問題は本発明であるＳＭＰ３０欠損動物を用いることで解決できる。例えばＳＭＰ３０欠損マウスに任意の動物種のＳＭＰ３０を免疫することによって、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれにおいても、従来のものより高い反応性を持つ抗体を作製することができる。さらにこの抗体は、ＳＭＰ３０のアミノ酸配列が異なる種においても高い相同性が維持されていることから、あらゆる種において有効である可能性が極めて高いと推定される。
【００５３】
前述の抗体は、例えば体液・組織中のＳＭＰ３０量の測定に用いられる。血液、尿、膵液、胃液、胆汁、髄液等、のあらゆる体液や組織にはＳＭＰ３０が存在しており、各種の臓器障害により量が増減する。これらは抗ＳＭＰ３０抗体を用いて測定することができる。測定方法としては、ＥＬＩＳＡやサンドイッチ法等、一般的測定方法のいずれを用いてもよい。開発された測定方法は、前述のとおり種を超えて有効であり、例えばヒトのみならず、家畜、ペット、実験動物等に用いることも可能である。
【００５４】
また前述の抗体は、定法により、病理学的組織診断において免疫組織学的に利用することが可能である。
【００５５】
ＳＭＰ３０は、ほぼ全身の臓器に発現しているが、特に薬剤障害の主要な標的臓器である肝細胞及び腎尿細管上皮細胞には強い発現がある。ＳＭＰ欠損動物においてはこれらの標的細胞が薬物障害に対して脆弱となるので、医薬品のこれらの臓器に対する副作用を高感度で検出することが可能である。ＳＭＰ３０が欠損した動物は、医薬品開発における副作用の高感度検出モデルとして有効である。
【００５６】
動物実験において、酸化ストレスによってＳＭＰ３０の発現が低下することが知られている。またＳＭＰ３０の発現は加齢に伴い減少し、その結果血中ＳＭＰ３０蛋白質量も低下することから（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第１３０８巻、４９〜５７、１９９６年）、酸化ストレスによって細胞の老化が亢進していることが推定される。このことから、例えば血中ＳＭＰ３０蛋白質量を測定することにより、ＳＭＰ３０の発現の低下を、老化度のパラメーターとして用いることができる。
【００５７】
ＳＭＰ３０欠損動物の表皮細胞ではフィラグリンの分解が低下し、保水性が大きい遊離アミノ酸量が減少する。ＳＭＰ３０測定法やＳＭＰ３０欠損動物等を組合せて、皮膚の保水性を亢進させる医薬品や化粧品の開発が可能である。
【００５８】
肝癌細胞にＳＭＰ３０ｃＤＮＡを移入することによって癌細胞の分化が生じる。ＳＭＰ３０欠損動物及び抗ＳＭＰ３０抗体を用いて、ＳＭＰ３０抑制による癌細胞の分化・誘導の制御、即ち、癌細胞の保存的療法に応用が可能となる。
【００５９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６０】
【実施例】
実施例１  ＳＭＰ３０遺伝子欠損動物作製用ＤＮＡ断片の調製
ラットのＳＭＰ３０のｃＤＮＡであるλＳＭＰ８（ＮＣＢＩアクセス番号；Ｘ６９０２１（ＤＤＢＪ））（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ    Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第１１３２巻、２９７〜３０５、１９９２年）をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩによって制限酵素処理して得られた、ラットＳＭＰ３０ｃＤＮＡの全コーデイング領域を含む、約１ＫｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして、１２９／ＳＶ系統マウス由来のゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、λファージ）についてプラークハイブリダイゼーションにより、マウスＳＭＰ３０遺伝子（約１４Ｋｂｐ）をクローニングした（図１）。これを制限酵素ＣｌａＩで消化し、第１エクソンと第２エクソンを含む約６Ｋｂｐの断片を含む約１４ＫｂｐのＣｌａＩ断片（長腕）を得た。
【００６１】
さらにＣ５７ＢＬ／６マウス由来ジェノミックＤＮＡのｐＧＭ６ＳＭＰ３０（ＮＣＢＩアクセス番号；  Ｕ３２１７０（ＤＤＢＪ））（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  第１３０８巻、４９〜５７、１９９６年）を鋳型として、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）を第３エクソンのＣｌａＩから３’方向に、その下流約２Ｋｂｐ部位にアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）を５’方向に設定し、約２Ｋｂｐ断片（短腕）をＰＣＲ法により調製した（図１）。なお上記鋳型に用いたＤＮＡ断片の配列は決定されていないので、その対応する部分を含む領域のみＤＮＡ配列を決定し、さらにその５’端をＳａｌＩ断端となるように配列を加えて、アンチセンスプライマーを設計した。
【００６２】
次に３８０４ｂｐのｐＭＣ１ｎｅｏプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、ＸｈｏＩとＳａｌＩで消化し、Ｎｅｏ耐性遺伝子とプロモーターを含む、１０８３ｂｐの断片を得た（図２）。この断片の５’端をアダプターによりＳａｌＩ断端に改変した。
【００６３】
以上３つのＤＮＡ断片、即ち、ＳＭＰ３０の長腕と短腕、Ｎｅｏ耐性遺伝子をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋内のマルチクローニングサイトのＣｌａＩとＳａｌＩの間に長腕、ｎｅｏ、短腕の順に組み込んだ（図３Ａ、Ｂ）。
【００６４】
次に、このプラスミドから制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩにより得られる約８．５ＫｂｐのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＭＣＤＴ−Ａ（Ａ＋Ｔ／ｐａｕ）（ライフテックオリエント社製、Ｙａｇｉら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、第２１４巻、７７〜８６、１９９３年）のＮｏｔＩ／ＸｈｏＩの間に挿入した（図３Ｃ）。その結果図３Ｄに示すターゲッテイングベクターが得られた。これを通常の方法により大量に調製し、ＮｏｔＩで切断して、ＳＭＰ３０の相同組換えに用いる、直線化したＤＮＡを得た（図３Ｅ）。
【００６５】
実施例２  ＥＳ細胞を用いたＳＭＰ３０遺伝子の相同組換え
マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）（ＴＴ２細胞株、ＸＹ染色体）を定法により培養し、エレクトロポレーション法により上記のＮｏｔＩ処理により直線化したターゲッテイングベクターをＥＳ細胞に導入した。エレクトロポレーション実施後Ｇ４１８を含有する培地中で選別的に培養し、５０２個のネオマイシン耐性クローン（ターゲッテイングベクターが導入されたＥＳ細胞）を取得した。
【００６６】
これら５０２個のクローンについて、サザンハイブリダイゼーション法により、相同組換えの有無を確認した。即ち、抽出した細胞ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩにより切断し、電気泳動の後メンブレンに移したＤＮＡ断片について３２Ｐ標識Ｆプローブでハイブリダイゼーションを行った。野生型（ＷＴ）では７．５Ｋｂｐのバンドが検出されるのに対して相同組換えが生じた細胞（ＫＯ）では７Ｋｂｐであった（図４）。これは第３エクソン内に挿入されたＮｅｏ耐性遺伝子内にＥｃｏＲＩ切断部位が存在するためである。またこのときに使用したＦプローブは、マウスＳＭＰ３０遺伝子の第３エクソンと第４エクソン間から抽出した０．５２Ｋｂｐの断片である（図１）。５０２個のネオマイシン耐性クローンを解析した結果、３個（＃４１、＃６０、＃１６９）の相同組換えを生じた細胞を検出した。
【００６７】
実施例３  ＳＭＰ３０欠損マウスの樹立
妊娠マウスから８細胞期胚を採取するために雌雄のＩＣＲマウスを交配させ、プラグを確認し、妊娠したと思われる雌マウスの子宮から杯盤胞を摘出し、８細胞期胚を得て、ＳＭＰ３０遺伝子の相同組換えが生じたＥＳ細胞（＃４１）を凝集法により胚表面に吸着させた。その後さらに１日培養して杯盤胞に発生したものを仮親の子宮に移植した。出生したキメラマウスの遺伝子型をサザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により確認した。具体的には前述のクローンの確認と同様、マウス肝臓から抽出したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、７Ｋｂｐの断片を確認した。またＰＣＲ法による解析では、図４に示すように、野生型マウスではＴＳ３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５）とＴＡ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６）を一組のプライマーとして２８０ｂｐのバンドが、欠損マウスではＮＥＯ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）とＴＡ４の組み合わせによる３２３ｂｐのバンド及びＴＳ３とＴＡ４の組み合わせによる１３６３ｂｐのバンドが認められた。
【００６８】
ＳＭＰ３０遺伝子において相同組換えが生じたマウスと生じていないマウスそれぞれの肝臓におけるＳＭＰ３０遺伝子の発現をウエスタンブロット法により解析した。ラットＳＭＰ３０を家兎に免疫して作製したポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行うと、野生型マウスではＳＭＰ３０の分子量に該当する約３０ＫＤａの部位にバンドが認められたが、欠損マウスでは認められなかった。この結果から、ＳＭＰ３０遺伝子の相同組換えにより、ＳＭＰ３０欠損マウスが樹立したことを確認した。
【００６９】
【発明の効果】
本発明のＳＭＰ３０の機能が欠損した動物は、ＳＭＰ３０の生物学的機能の解析、疾病との関連、治療方法の探索に有用である。ＳＭＰ３０は加齢に伴い全身の臓器で減少することから、加齢に伴う疾患の発生機序の解明にも有用である。また肝細胞等が脆弱なため、新薬の副作用スクリーニングとして使用できる。さらにＳＭＰ３０欠損動物を用いて製作した抗ＳＭＰ３０抗体は、野生型を用いた場合より反応性が高く、種を超えて有効であり、ＳＭＰ３０の測定法の開発その他に広く応用できる。
【００７０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１２９／ＳｖマウスよりクローニングしたＳＭＰ３０遺伝子の概略図である。
【図２】図２は、ターゲッテイングベクター作製に使用した、プロモーターを含むｎｅｏ耐性遺伝子の概略図である。
【図３】図３は、ターゲッテイングベクター作製の概念図である。
【図４】図４は、相同組換えを検出するＰＣＲシステムの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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