(57)【要約】【課題】ヒトＫＵＺポリペプチドおよびポリヌクレオチド並びに前記ポリペプチドの組換え法による生産方法を提供する。【解決手段】配列番号２のヒトＫＵＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８０％同一であり、かつヒトＫＵＺポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。【効果】ヒトＫＵＺポリペプチドおよびポリヌクレオチドは炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患を含む機能障害または疾病の治療と、このような症状の診断アッセイに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のヒトＫＵＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８０％同一であり、かつヒトＫＵＺポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記のポリヌクレオチドが、配列番号２のヒトＫＵＺポリペプチドをコードする配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記のポリヌクレオチドが、その全長において配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１のポリヌクレオチドである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２のヒトＫＵＺポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失または置換されており、かつヒトＫＵＺポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在するとき配列番号２のポリペプチドと少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むヒトＫＵＺポリペプチドを産生することができる発現系を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項８】
請求項７に記載の発現系を含有する宿主細胞。
【請求項９】
ヒトＫＵＺポリペプチドを産生させるのに十分な条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養し、この培養物から前記ポリペプチドを回収することを含んでなる、ヒトＫＵＺポリペプチドの産生方法。
【請求項１０】
宿主細胞が適当な培養条件下でヒトＫＵＺポリペプチドを産生するように、請求項７に記載の発現系を用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることを含んでなる、ヒトＫＵＺポリペプチドを産生する細胞の作製方法。
【請求項１１】
全長において配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含んでなるヒトＫＵＺポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１１に記載のヒトＫＵＺポリペプチドに免疫特異的な抗体。
【請求項１４】
請求項１１に記載のヒトＫＵＺポリペプチドの活性増加または発現増加を必要としている患者を治療するための医薬組成物であって、治療に有効な量の、前記ポリペプチド活性のｉｎ　ｖｉｖｏ　生産をもたらす形の、配列番号２のヒトＫＵＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド、
を含んでなる医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載のヒトＫＵＺポリペプチドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療するための医薬組成物であって、治療に有効な量の、
（ａ）　前記ポリペプチドに対するアンタゴニスト、および／または
（ｂ）　前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制する核酸分子、および／または
（ｃ）　前記ポリペプチドのリガンド、基質または受容体に関して前記ポリペプチドと競合するポリペプチド、
を含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１１に記載のヒトＫＵＺポリペプチドの発現または活性と関連した被験者の疾病またはその罹病性の検出方法であって、
（ａ）　前記被験者のゲノム中にヒトＫＵＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異があるかどうかを調べる、および／または
（ｂ）　前記被験者から得られたサンプル中のヒトＫＵＺポリペプチド発現の存在または量を分析する、
ことを含んでなる方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載のヒトＫＵＺポリペプチドを阻害（拮抗）または活性化する化合物の同定方法であって、
（ａ）　ヒトＫＵＺポリペプチドを発現している細胞（もしくはヒトＫＵＺポリペプチドを発現している細胞膜）またはヒトＫＵＺポリペプチドに応答する細胞と候補化合物とを接触させ、そして
（ｂ）　その結合、または機能的応答の刺激もしくは抑制を観察するか、または候補化合物と接触させた細胞（または細胞膜）の能力を、接触させなかった同一の細胞と、ヒトＫＵＺポリペプチド活性に関して比較する、
ことを含んでなる方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法により同定されたアンタゴニスト。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法により作製された組換え宿主細胞、またはヒトＫＵＺポリペプチドを発現しているその膜。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、前記のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、並びにその生産方法に関する。より詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはＡＤＡＭファミリーに関係しており、以後ヒトＫＵＺと記す。本発明はまた、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用を阻害または活性化することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ショウジョウバエＫＵＺ遺伝子のヒト相同体として知られるタンパク質はメタロプロテアーゼのＡＤＡＭファミリーのメンバーである。このプロテアーゼおよび別のファミリーメンバーであるＴＮＦ転換酵素は、プロＴＮＦをプロセシングしてＴＮＦの成熟形態にしうることが示された（Ｂｌａｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３８５：７２９、１９９７；Ｌｕｎｎら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．　４００：３３３−３３５，１９９７）。したがって、このメンバーおよび追加のファミリーメンバーが、他のサイトカイン、成長因子、または受容体のプロセシングにおいて何らかの役割を担っていることが予想されるだろう。プロセシングが生じ、かつその生化学がＡＤＡＭファミリーのメンバーを含む機構と一致する他のサイトカインや受容体には、ＣＤ２３、Ｌ−セレクチン、ＦＡＳリガンド、ＣＤ１６およびその他が含まれる（Ｈｏｏｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．　３２１，２６５−２７９，１９９７に概説されている）。存在しうる基質とＡＤＡＭファミリーメンバーとの関係は不明であり、そのためヒトＫＵＺタンパク質は１以上の細胞型においてこれらのサイトカインおよび成長因子の任意の組合わせのプロセシングに関与している可能性がある。他のファミリーメンバーであるメルトリン（ｍｅｌｔｒｉｎ）とフェルチリン（ｆｅｒｔｉｌｉｎ）は、細胞−細胞融合に関与している（Ｙａｇａｍｉ−Ｈｉｒｏｍａｓａら、Ｎａｔｕｒｅ　３７７：６５２−６５６（１９９５））。ヒトＫＵＺタンパク質のウシ相同体は基質としてミエリンを使用することが示されており（Ｈｏｗａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．　３１７：４５−５０，１９９６）、またショウジョウバエＫＵＺ遺伝子産物は神経分化に関与している（Ｒｏｏｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３：１２２７−１２３１，１９９６）。これらのプロセシング酵素の１以上を阻害することは、炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患における治療上の有用性をもちうる。
こうしたことは、ＡＤＡＭファミリーに治療標的としての確立され実証された歴史があることを示している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
明らかに、炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患を含むがこれらに限らない、機能障害または疾病を予防し、改善し、治療する上で何らかの役割を果たすＡＤＡＭファミリーの新たなメンバーを同定して特性付ける必要性が存在している。本発明はこのようなメンバーを提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一つの態様において、ヒトＫＵＺポリペプチドおよび組換え物質、並びにその生産方法に関する。本発明のもう一つの態様はヒトＫＵＺポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関する。こうした使用には、とりわけ、炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患の治療が含まれる。他の態様では、本発明は、本発明により提供される物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法、並びに同定された化合物を用いてヒトＫＵＺの平衡異常と関連した状態を治療することに関する。本発明のさらに他の態様は、不適当なヒトＫＵＺ活性またはヒトＫＵＺレベルと関連した疾病を検出するための診断アッセイに関する。
【０００５】
定義
下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理解しやすくするためのものである。
「ヒトＫＵＺ」とは、特に、一般的には配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのアレリック変異体を意味する。
「ヒトＫＵＺ活性もしくはヒトＫＵＺポリペプチド活性」または「ヒトＫＵＺもしくはヒトＫＵＺポリペプチドの生物学的活性」とは、類似の活性、向上した活性、または望ましくない副作用が低下したこれらの活性を含めて、ヒトＫＵＺの代謝的または生理的機能を意味する。さらに、前記ヒトＫＵＺの抗原的および免疫原的活性も含まれる。
「ヒトＫＵＺ遺伝子」とは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのアレリック変異体および／またはそれらの相補体を意味する。
【０００６】
本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それはそのもとの環境から変化しているか移動しており、またはその両方である。例えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単離された」ものである。
【０００７】
「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、またはより典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が行われてきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【０００８】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソスター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質という）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタイプの修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、分枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成法によって製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ　−　ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｔ．Ｅ．　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，　Ｗ．Ｈ．　Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９９３；　ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ　ＣＯＶＡＬＥＮＴ　ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ，　Ｂ．Ｃ．　Ｊｏｈｎｓｏｎ　編，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８３中のＷｏｌｄ，　Ｆ．，　Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓａｎｄ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，　ｐｇｓ．　１−１２；　Ｓｅｉｆｔｅｒ　ら，　“Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”，　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　（１９９０）　１８２：６２６−６４６；および　Ｒａｔｔａｎ　ら，　“Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ａｇｉｎｇ”，Ａｎｎ　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓ���ｉ　（１９９２）　６６３：４８−６２を参照のこと。
【０００９】
本明細書中で用いる「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配列によりコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および末端切断（トランケーション）を生じさせることができる。典型的なポリペプチドの変異体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるような相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体はアレリック変異体のように天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法または直接合成により調製することができる。
【００１０】
「同一性」はヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最大級の整合（一致）が得られるように配列を並べる。「同一性」それ自体は当技術分野で認識された意味をもち、発表された技法を使って計算することができる。例えば、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，　Ｌｅｓｋ，　Ａ．Ｍ．　編，　ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８８；　ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：　ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ　ＡＮＤ　ＧＥＮＯＭＥＰＲＯＪＥＣＴＳ，　Ｓｍｉｔｈ，　Ｄ．Ｗ．　編，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９９３；　ＣＯＭＰＵＴＥＲ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＯＦ　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＡＴＡ，　ＰＡＲＴ　Ｉ，　Ｇｒｉｆｆｉｎ，　Ａ．Ｍ．　ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｎ，　Ｈ．Ｇ．　編，　ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，　１９９４；　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，　ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，　Ｇ．，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８７；　および　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＰＲＩＭＥＲ，　Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，　Ｊ．編，　Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９９１を参照のこと。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を決定する方法は多数存在していると同時に、「同一性」なる用語は当業者には公知である　（Ｃａｒｉｌｌｏ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｌｉｐｔｏｎ，　Ｄ．，　ＳＩＡＭ　Ｊ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ　（１９８８）　４８：１０７３）　。２つの配列間の同一性または類似性を決定するために汎用される方法としては、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｈｕｇｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，　Ｍａｒｔｉｎ　Ｊ．　Ｂｉｓｈｏｐ　編，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，　１９９４　およびＣａｒｉｌｌｏ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｌｉｐｔｏｎ，　Ｄ．，　ＳＩＡＭ　Ｊ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ　（１９８８）　４８：１０７３　に記載される方法があるが、これらに限らない。同一性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムに集成されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好適なコンピュータプログラム法としては、ＧＣＳ　プログラムパッケージ　（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，　Ｊ．ら，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９８４）　１２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ　（Ａｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．ら，　Ｊ　Ｍｏｌｅｃ　Ｂｉｏｌ　（１９９０）　２１５：４０３）があるが、これらに限らない。
【００１１】
一例として、配列番号１の基準ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号１の基準ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチドにつき最高で５つの点突然変異を含みうることを除けば、基準配列と同一であることを意図している。言い換えると、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、基準配列中の５％までのヌクレオチドを欠失させるか、他のヌクレオチドで置換するか、または基準配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数を基準配列に挿入すればよい。基準配列のこれらの突然変異は、基準ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして配置することができる。
【００１２】
同様に、配列番号２の基準アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペプチド配列が配列番号２の基準アミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸につき最高で５つのアミノ酸変更を含みうることを除けば、基準配列と同一であることを意図している。言い換えると、基準アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、基準配列中の５％までのアミノ酸残基を欠失させるか、他のアミノ酸で置換するか、または基準配列中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸数を基準配列に挿入すればよい。基準配列のこれらの変更は、基準アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基準配列中のアミノ酸残基の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして配置することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチド
一つの態様において、本発明はヒトＫＵＺポリペプチド（またはヒトＫＵＺタンパク質）に関する。このヒトＫＵＺポリペプチドには、配列番号２のポリペプチドだけでなく、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、その全長において配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。さらに、少なくとも９７〜９９％同一であるものが非常に好適である。また、その全長において配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドもヒトＫＵＺポリペプチドに含まれる。さらに、少なくとも９７〜９９％同一であるものが非常に好適である。ヒトＫＵＺポリペプチドはヒトＫＵＺの少なくとも１つの生物学的活性を示すことが好ましい。
【００１４】
ヒトＫＵＺポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などがある。
【００１５】
また、ヒトＫＵＺポリペプチドの断片も本発明に含まれる。こうした断片は全体的に前記ヒトＫＵＺポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ヒトＫＵＺポリペプチドと同様に、断片は「フリースタンディング」（それ自体で独立）していても、より大きいポリペプチド内に含まれていてもよく、つまりその大きいポリペプチドの一部または一領域、最も好ましくは一つの連続領域、を断片が構成していてもよい。本発明のポリペプチド断片の代表的な例として、およその見当でアミノ酸番号１−２０、２１−４０、４１−６０、６１−８０、８１−１００、および１０１からヒトＫＵＺポリペプチドの末端までの断片が挙げられる。ここで、「およそ」とは、上記の範囲の一端または両端で数個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が増えたり減ったりした範囲を含むものである。
【００１６】
好適な断片としては、例えば、アミノ末端を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキシル末端を含むものとの二連の残基の欠失を除いた、ヒトＫＵＺポリペプチドのアミノ酸配列を有するトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）ポリペプチドが含まれる。また、αヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシート形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適である。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、その活性が向上した断片、または望ましくない活性が減少した断片を含めて、ヒトＫＵＺ活性を媒介するものである。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片も含まれる。
【００１７】
これらのポリペプチド断片はどれも、抗原活性を含めたヒトＫＵＺの生物学的活性を保持することが好ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、すなわち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されているものである。典型的なこうした置換は、Ａｌａ，　Ｖａｌ，　Ｌｅｕ　と　Ｉｌｅの間；Ｓｅｒ　とＴｈｒ　の間；酸性残基　ＡｓｐとＧｌｕ　の間；Ａｓｎ　とＧｌｎ　の間；塩基性残基　ＬｙｓとＡｒｇ　の間；または芳香族残基　ＰｈｅとＴｙｒ　の間で起こる。特に、数個、５〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失または付加されている変異型が好適である。
【００１８】
本発明のヒトＫＵＺポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより製造されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドの製造のための手段は当業界でよく理解されている。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチド
本発明のもう一つの態様はヒトＫＵＺポリヌクレオチドに関する。ヒトＫＵＺポリヌクレオチドには、ヒトＫＵＺポリペプチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレオチド、並びにこれらと密接に関連したポリヌクレオチドが含まれる。さらに特定すると、本発明のヒトＫＵＺポリヌクレオチドとしては、配列番号２のヒトＫＵＺポリペプチドをコードする配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１の特定配列を有するポリヌクレオチドがある。さらに、ヒトＫＵＺポリヌクレオチドには、配列番号２のヒトＫＵＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオチド配列と全長において少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。これに関連して、少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが好適であり、特に少なくとも９５％同一であるものが好適である。さらに、少なくとも９７％同一であるものがより好ましく、少なくとも９８〜９９％同一であるものがより一層好ましく、少なくとも９９％同一であるものが最も好ましい。また、増幅反応に使用できる条件下、またはプローブやマーカーとして使用できる条件下でハイブリダイズするのに十分な、配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列との同一性を有するヌクレオチド配列もヒトＫＵＺポリヌクレオチドに含まれる。本発明はまた、このようなヒトＫＵＺポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
本発明のヒトＫＵＺは、ヒトＫＵＺをコードする表１のｃＤＮＡ（配列番号１）の配列決定の結果により示されるように、ＡＤＡＭファミリーの他のタンパク質と構造的に関連している。配列番号１のｃＤＮＡ配列は配列番号２の７４８個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド番号１１３−２３５６）を含んでいる。表２のアミノ酸配列（配列番号２）は７４８個のアミノ酸残基においてＢ．ｔａｕｒｕｓメタロプロテアーゼ（Ｈｏｗａｒｄ，Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．　３１７，４５−５０，（１９９６））と約９７％の同一性を有し、また５８９個のアミノ酸残基においてディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）・メタロプロテアーゼについての部分ヒトクローン（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｚ４８　５７９）と９９％の同一性を有する（ＢＬＡＳＴ使用）。さらに、ヒトＫＵＺ（配列番号２）は５８９個のアミノ酸残基においてショウジョウバエＫＵＺ遺伝子と４９％の同一性を有する（Ｒｏｏｋｅ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３，１２２７−１２３１，１９９６）。また、ヒトＫＵＺ（配列番号２）は８０５個のアミノ酸残基においてＴＮＦ−α転換酵素と２５％の同一性を有する（Ｂｌａｃｋ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，　３８５：７２９−７３３，１９９７；Ｍｏｓｓ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３８５：７３３−７３６，１９９　７）。表１のヌクレオチド配列（配列番号１）は２２５５個のヌクレオチド残基においてＢ．ｔａｕｒｕｓメタロプロテアーゼ（Ｈｏｗａｒｄ，Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．　３１７，４５−５０，（１９９６））と約９４％の同一性を有し、また２１１６個のヌクレオチド残基においてディスインテグリン・メタロプロテアーゼについての部分ヒトクローン（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｚ４８５７９）と１００％の同一性を有する（ＢＬＡＳＴ使用）。したがって、本発明のヒトＫＵＺポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それらの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／特性をもつことが予測され、それらの有用性は当業者には自明である。
【００２１】
ヒトＫＵＺのヌクレオチド配列（配列番号１）
【表１】
2004000198.tif 000002
2004000198.tif 000003
【００２２】
ヒトＫＵＺのアミノ酸配列（配列番号２）
【表２】
2004000198.tif 000004
【００２３】
ヒトＫＵＺをコードする本発明の一つのポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニングにより、ヒト滑膜繊維芽細胞、ヒト破骨細胞腫、ヒト活性化単球、ヒトＴ細胞、ヒト結腸癌の細胞中のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーから、エクスプレスド・シークエンス・タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ：　ＥＳＴ）分析　（Ａｄａｍｓ，　Ｍ．Ｄ．　ら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）　２５２：１６５１−１６５６；　Ａｄａｍｓ，　Ｍ．Ｄ．　ら，　Ｎａｔｕｒｅ　（１９９２）　３５５：６３２−６３４；　Ａｄａｍｓ，　Ｍ．Ｄ．ら，　Ｎａｔｕｒｅ　（１９９５）　３７７　Ｓｕｐｐ：３−１７４）　を用いて得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得ることができ、商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成することもできる。
【００２４】
配列番号２のヒトＫＵＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、表１中に含まれるポリペプチドコード配列（配列番号１のヌクレオチド番号１１３−２３５６）と同一であっても、遺伝子コードの重複性（縮重）のため、やはり配列番号２のポリペプチドをコードする配列であってもよい。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドをヒトＫＵＺポリペプチドの組換え生産のために用いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列またはその断片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするもの）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列またはその断片が含まれる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例として、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｉｎｃ．）により提供されかつＧｅｎｔｚ　ら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　（１９８９）　８６：８２１−８２４に記載されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド、またはＨＡタグである。また、このポリヌクレオチドは５’および３’非コード配列、例えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。
【００２６】
さらに好適な具体例は、数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されている、表２のヒトＫＵＺポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）を含むヒトＫＵＺ変異型をコードするポリヌクレオチドである。
【００２７】
本発明はさらに、前記の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」とは、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性があるときだけハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。
【００２８】
配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列またはその断片と同一であるか実質的に同一である本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＫＵＺポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、また、ヒトＫＵＺ遺伝子との配列類似性が高い他の遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者には公知である。一般的に、これらのヌクレオチド配列は対象物のヌクレオチド配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一である。プローブはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含み、好ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは３０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するものである。
【００２９】
一実施態様において、ヒトＫＵＺポリペプチド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体を含む）をコードするポリヌクレオチドを得ることは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、前記のポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する各工程を含んでなる。かくして、もう一つの態様では、本発明のヒトＫＵＺポリヌクレオチドはさらに、配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列を含むものである。ヒトＫＵＺポリペプチドも、前記のハイブリダイゼーション条件により得られたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを含む。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者に公知である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は上で定義したとおりであるか、または、５０％　ホルムアミド、５×ＳＳＣ　（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　１５ｍＭ　クエン酸三ナトリウム）　、５０ｍＭリン酸ナトリウム　（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％　デキストラン硫酸および２０μｇ／ｍｌの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で４２℃で一夜インキュベートし、次いでフィルターを　０．１×ＳＳＣ　中約６５℃で洗浄する条件である。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、動物およびヒトの疾病に対する治療薬および診断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利用することができる。
【００３１】
ベクター、宿主細胞、発現
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、このベクターにより遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの生産に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いてこの種のタンパク質を生産するための無細胞翻訳系も使用することができる。
【００３２】
組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部を組み入れるために、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、Ｄａｖｉｓ　ら，　ＢＡＳＩＣ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ　（１９８６）　およびＳａｍｂｒｏｏｋ　ら，　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．　（１９８９）　などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または感染により行うことができる。
【００３３】
適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ　１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ　２９３、Ｂｏｗｅｓ　メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。
【００３４】
多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、特に、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものがある。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現するのに適した系またはベクターはどれも使用することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　（前掲）　に記載されるような、日常的に用いられる公知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入することができる。
【００３５】
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
【００３６】
スクリーニングアッセイで使用するためヒトＫＵＺポリペプチドを発現させようとする場合、そのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適である。この場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する。ヒトＫＵＺポリペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製するために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する必要がある。
【００３７】
組換え細胞培養物からヒトＫＵＺポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性されるときは、タンパク質を再生させるための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーションを復元することが可能である。
【００３８】
診断アッセイ
本発明はまた、診断薬としてのヒトＫＵＺポリヌクレオチドの使用に関する。機能障害と関連したヒトＫＵＺ遺伝子の変異型の検出は、ヒトＫＵＺの過少発現、過剰発現または変化した発現により生ずる疾病またはその罹病性の診断に追加しうる、またはその診断を下しうる診断用ツールを提供するだろう。ヒトＫＵＺ遺伝子に変異がある個体を、さまざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すことができる。
【００３９】
診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ることができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用しても、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識ヒトＫＵＺヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで同定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とはＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異により区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用いるもしくは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定によっても検出できる（例えば、Ｍｙｅｒｓ　ら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２３０：１２４２　を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確認できる（Ｃｏｔｔｏｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ（１９８５）　８５：４３９７−４４０１を参照のこと）。別の実施態様では、例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを行うため、ヒトＫＵＺヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用いられている（例えば、Ｍ．　Ｃｈｅｅ　ら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．２７４，　ｐｐ．６１０−６１３　（１９９６）　を参照のこと）。
【００４０】
診断アッセイは、前記の方法によりヒトＫＵＺ遺伝子の変異を検出することで、炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患への罹りやすさを診断または判定する方法を提供する。
【００４１】
さらに、被験者から得られたサンプルからヒトＫＵＺポリペプチドまたはヒトＫＵＺｍＲＮＡのレベルの異常な低下または増加を測定する方法により、炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患の診断を下すことができる。発現の低下または増加は、当技術分野で公知のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロット、その他のハイブリダイゼーション法によりＲＮＡレベルで測定することができる。宿主から得られたサンプル中のヒトＫＵＺポリペプチドのようなタンパク質のレベルを測定するためのアッセイ法は当業者によく知られている。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。
【００４２】
かくして、もう一つの態様において、本発明は、疾病、特に、炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患またはこのような疾病への罹りやすさを診断するためのキットに関し、このキットは、
（ａ）　ヒトＫＵＺポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列）もしくはその断片、
（ｂ）　（ａ）　のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（ｃ）　ヒトＫＵＺポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）もしくはその断片、または
（ｄ）　ヒトＫＵＺポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対する抗体、
を含んでなる。このようなキットにおいて、（ａ）　、（ｂ）　、（ｃ）　または　（ｄ）が実質的な構成成分であることが理解されよう。
【００４３】
染色体アッセイ
本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有用である。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズすることができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させる上で重要な第一段階である。ひとたび配列が正確な染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種のデータは、例えば、Ｖ．　ＭｃＫｕｓｉｃｋ，　Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎ　（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＷｅｌｃｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　からオンラインで入手可能）　中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）により同定する。
【００４４】
患者と正常個体とのｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異も調べることができる。患者の一部または全部に変異が観察されるが、どの正常個体にも観察されない場合は、その変異が疾病の原因である可能性がある。
【００４５】
抗体
本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細胞は、ヒトＫＵＺポリペプチドに免疫特異的な抗体を産生するための免疫原としても使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における他の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い親和性を有することを意味する。
【００４６】
ヒトＫＵＺポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることができる。例を挙げると、ハイブリドーマ技法　（Ｋｏｈｌｅｒ，　Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．，　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）　２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法　（Ｋｏｚｂｏｒら，　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　（１９８３）　４：７２）　およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら，　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，　ｐｐ．７７−９６，　Ａｌａｎ　Ｒ．　Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　１９８５）　などがある。
【００４７】
本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８　号）を適応させることができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができる。
前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。
ヒトＫＵＺポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患の治療に使用できる可能性がある。
【００４８】
ワクチン
本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関し、この方法は、特に炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患から前記動物を防御するための抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに十分なヒトＫＵＺポリペプチドまたはその断片を哺乳動物に接種することを含んでなる。本発明のさらに別の態様は、哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生させるような免疫学的応答を引き出すために、ｉｎ　ｖｉｖｏ　でヒトＫＵＺポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介してヒトＫＵＺポリペプチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関する。
【００４９】
本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物においてヒトＫＵＺポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製剤（組成物）に関し、この組成物はヒトＫＵＺポリペプチドまたはヒトＫＵＺ遺伝子を含有する。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。ヒトＫＵＺポリペプチドは胃の中で分解されうるので、非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内等への注射を含む）に投与することが好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量容器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供することができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や当技術分野で公知の他のアジュバント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性で変化し、ルーチンな実験操作により簡単に決定できる。
【００５０】
スクリーニングアッセイ
本発明のヒトＫＵＺポリペプチドは、このポリペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）またはその活性を阻害する化合物（アンタゴニスト、または阻害剤ともいう）のスクリーニング法において使用することができる。こうして、本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産物の混合物からアゴニストまたはアンタゴニストを評価し同定するためにも用いられる。これらのアゴニストまたはアンタゴニストは、本発明のポリペプチドの、場合によって、天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、酵素などであってよく、また、本発明のポリペプチドの構造的または機能的な模擬物であってもよい（Ｃｏｌｉｇａｎ　ら，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１（２）：　Ｃｈａｐｔｅｒ　５　（１９９１）を参照のこと）。
【００５１】
ヒトＫＵＺポリペプチドは多くの病理を含めて多数の生物学的機能に関与している。したがって、一方ではヒトＫＵＺポリペプチドを刺激し、他方ではヒトＫＵＺポリペプチドの機能を阻害し得る化合物および薬物を見つけ出すことが望まれる。一般的に、アゴニストは炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患のような症状の治療および予防目的で用いられる。アンタゴニストは炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患のような症状のさまざまな治療および予防目的で使用しうる。
【００５２】
一般に、こうしたスクリーニング法はヒトＫＵＺポリペプチドを発現する適当な細胞、またはヒトＫＵＺポリペプチドに応答する適当な細胞を用いるものである。この種の細胞には哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ由来の細胞または大腸菌細胞が含まれる。次いで、ヒトＫＵＺポリペプチドを発現する細胞（もしくは発現されたポリペプチドを含む細胞膜）またはヒトＫＵＺポリペプチドに応答する細胞を試験化合物と接触させて、その結合または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。候補化合物と接触させた細胞の能力を、接触させなかった同一細胞とヒトＫＵＺ活性に関して比較する。
酵素活性または活性の阻害は、プロテアーゼについての標準的な技術のいずれかを使用して測定可能で、例えば、こうした技術として、タンパク質の配列をベースとした蛍光消滅基質、ビオチン化および放射性標識ペプチドを使用するシンチレーション近接アッセイ、産物タンパク質に対するウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡがある。
【００５３】
これらのアッセイでは候補化合物の結合を簡単に試験することができ、そこでは候補化合物と直接または間接に結合された標識により、または標識した競合物質との競合を用いるアッセイにより、ヒトＫＵＺポリペプチドを担持する細胞への付着が検出される。さらに、これらのアッセイでは、ヒトＫＵＺポリペプチドを担持する細胞に適した検出系を用いて、候補化合物がヒトＫＵＺポリペプチドの活性化により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを試験することができる。一般的に、活性化の阻害剤は既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして候補化合物の存在がアゴニストによる活性化に与える影響が調べられる。
【００５４】
さらに、これらのアッセイは、候補化合物とヒトＫＵＺポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混合物をつくり、この混合物中のヒトＫＵＺ活性を測定し、そしてこの混合物のヒトＫＵＺ活性を標準と比較する各ステップを単に含むだけでよい。
【００５５】
また、ヒトＫＵＺのｃＤＮＡ、タンパク質またはこのタンパク質に対する抗体を用いて、細胞内でのヒトＫＵＺｍＲＮＡまたはタンパク質の生産に及ぼす添加化合物の作用を検出するためのアッセイを組み立てることができる。例えば、当技術分野で公知の標準方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、ヒトＫＵＺタンパク質の分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのＥＬＩＳＡを構築することができ、これは適切に操作された細胞または組織からのヒトＫＵＺの生産を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストともいう）の探索に用いることができる。
【００５６】
膜結合受容体または可溶性受容体が存在するのであれば、当技術分野で公知の標準的な受容体結合法によりこの種の受容体を同定するためにヒトＫＵＺタンパク質を用いることができる。こうした受容体結合法には、限定するものではないが、リガンド結合および架橋アッセイがあり、このアッセイでは、ヒトＫＵＺを放射性アイソトープ（例：１２５Ｉ）で標識するか、化学的に修飾（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適したペプチド配列に融合させ、そして推定上の受容体源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液など）とインキュベートする。その他の方法としては、表面プラズモン共鳴および分光学のような生物物理的方法がある。受容体の精製およびクローニングに用いることに加えて、これらの結合アッセイは、もし存在するのであれば、ヒトＫＵＺのその受容体への結合と競合するヒトＫＵＺのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために用いることもできる。スクリーニングアッセイを行うための標準的な方法は当技術分野でよく理解されている。
【００５７】
ヒトＫＵＺポリペプチドの潜在的なアンタゴニストの例としては、抗体、ある場合には、ヒトＫＵＺポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素などと密接な関係があるオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの断片）、または本発明のポリペプチドと結合するが応答を誘導しない（それゆえポリペプチドの活性を妨げる）小分子などがある。
【００５８】
かくして、他の態様において、本発明は、ヒトＫＵＺポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはヒトＫＵＺポリペプチドの生産を低下または増加させる化合物を同定するためのスクリーニングキットに関し、このキットは、
（ａ）　ヒトＫＵＺポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）
（ｂ）　ヒトＫＵＺポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）を発現する組換え細胞、
（ｃ）　ヒトＫＵＺポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）を発現する細胞膜、または
（ｄ）　ヒトＫＵＺポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対する抗体、
を含んでなる。このようなキットにおいて、（ａ）　、（ｂ）　、（ｃ）　または　（ｄ）が実質的な構成成分であることが理解されよう。
【００５９】
予防および治療法
本発明は、ヒトＫＵＺポリペプチド活性の過剰量と不足量のどちらにも関係した炎症、神経変性、アレルギー性疾患、または基質サイトカインもしくは受容体の脱調節を伴う他の疾患などの異常な状態の治療法を提供する。
ヒトＫＵＺポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可能である。一つのアプローチは、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの結合をブロックすることにより、または第２のシグナルを抑制することで異常な状態を軽減することにより、ヒトＫＵＺポリペプチドの機能を阻害するのに有効な量で、前記の阻害剤化合物（アンタゴニスト）を製剤学上許容される担体とともに患者に投与することを含んでなる。もう一つのアプローチでは、リガンド、基質、酵素、受容体などと結合する能力がまだある可溶性形態のヒトＫＵＺポリペプチドを、内因性のヒトＫＵＺポリペプチドとの競合状態で投与する。このような競合剤の典型的な例はヒトＫＵＺポリペプチドの断片である。
【００６０】
さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性ヒトＫＵＺポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、体内で生成されるか別個に投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする。例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，　ＣＲＣＰｒｅｓｓ，　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，　ＦＬ　（１９８８）中のＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ　（１９９１）　５６：５６０　を参照のこと。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給することもできる。例えば、Ｌｅｅ　ら，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　（１９７９）　６：３０７３；　Ｃｏｏｎｅｙ　ら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）　２４１：４５６；　Ｄｅｒｖａｎら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）　２５１：１３６０　を参照のこと。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することもできるし、関連オリゴマーをｉｎ　ｖｉｖｏ　で発現させることもできる。
【００６１】
ヒトＫＵＺおよびその活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療上有効な量のヒトＫＵＺポリペプチドを活性化する化合物（すなわち、前記のアゴニスト）を製剤学上許容される担体とともに患者に投与して、異常な状態を緩和することを含んでなる。別法として、患者の関連細胞においてヒトＫＵＺを内因的に産生させるために遺伝子治療を用いることができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細胞に導入する。その結果、パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性のウイルス粒子を産生するようになる。ｉｎ　ｖｉｖｏ　での細胞処理およびｉｎ　ｖｉｖｏ　でのポリペプチド発現のために、これらの産生細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論に関しては、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｔ　Ｓｔｒａｃｈａｎａｎｄ　Ａ　Ｐ　Ｒｅａｄ，　ＢＩＯＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｔｄ　（１９９６）　中のＣｈａｐｔｅｒ　２０，　ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびその中の引用文献）　を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量のヒトＫＵＺポリペプチドを適当な製剤学上の担体とともに投与することである。
【００６２】
製剤および投与
可溶性形態のヒトＫＵＺポリペプチドのようなペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストペプチド、または小分子は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤化することができる。このような製剤は治療上有効な量のポリペプチドまたは化合物と、製剤学上許容される担体または賦形剤を含有する。この種の担体としては、食塩水、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せがあるが、これらに限らない。製剤は投与様式に適合させるべきであり、これは当技術分野の技量の範囲内である。本発明はさらに、前記の本発明組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含んでなる医薬用パックおよびキットに関する。
本発明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用しても、他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に使用してもよい。
【００６３】
医薬組成物を全身投与するときの好ましい形態は、注入（注射）、典型的には静注である。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として適切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能である。これらの化合物は軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよい。
【００６４】
必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり０．１　〜１００　μｇ　の範囲である。利用可能な化合物が多種多様であり、それぞれの投与経路の効率も異なるため、必要とされる投与量は広範に変動することを予想すべきである。例えば、経口投与は静注による投与よりも高い投与量を必要とすることが予想される。こうした投与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【００６５】
治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞を、ｅｘ　ｖｉｖｏ　でポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的に操作する。その後、この細胞を患者に導入する。
【００６６】
【実施例】
他に詳述した場合を除いて、当業者には公知で一般的な技術を使用して、以下の実施例を行なった。これらの実施例は本発明を例示するものであるが、限定するものではない。
【００６７】
実施例１
ウシ・ディスインテグリン・メタロプロテアーゼ遺伝子のコード領域の５’末端を使用してＨＧＳデータベースを検索した。ＥＳＴ１７５９３４７（プロジェクトＩＤ　：ＨＳＹＡＧ８９）がヒト胸腺間質細胞のｃＤＮＡライブラリーから同定され、このＥＳＴの全挿入物を配列決定したところ、該挿入物が公表されたヒトＫＵＺ遺伝子（Ｈｏｗａｒｄ　Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．　３１７（Ｐｔ　１），４５−５０，１９９６）の欠失５’末端を含有することを確認した。また、公表された部分ヒトＫＵＺ遺伝子中のヌクレオチド１６０位に存在するがウシ相同体内には存在しない１５３個のヌクレオチド残基からなる内部挿入物は、ＨＳＹＡＧ８９には存在していない。したがって、ＨＳＹＡＧ８９はショウジョウバエＫＵＺ遺伝子に関連するウシ・ディスインテグリン・メタロプロテアーゼのヒト対応物である。
次にＡｐａ　Ｉ、Ｎｏｔ　Ｉ二重消化物を用いてノーザンブロットを行い、コード領域の３．５　ｋｂ断片を得、これをゲル電気泳動により単離し放射性標識した。この断片を使用して多組織ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上でコード配列を検出した。これらのブロットはヒトＫＵＺをコードするｍＲＮＡの広範な発現を示し、心臓、脳、膵臓および胸腺で最高の発現を示した。存在しうる基質は、２９３細胞または同等の細胞において該基質を共発現させ、その細胞上清中の産物タンパク質断片を検出することにより同定できる。
【００６８】
実施例２
全長ｃＤＮＡを得るための方法はいくつかあるが、そのうちの２つを以下に説明する。
１）ｃＤＮＡ末端の高速増幅（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ：ＲＡＣＥ）法は５’末端を得るために利用することができる。Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５，８９９８−９００２（１９８８）を参照のこと。簡単に述べると、特定のオリゴヌクレオチドをｍＲＮＡにアニーリングし、これによりｃＤＮＡ鎖の合成を開始させる。ＲＮアーゼＨを用いてｍＲＮＡを破壊した後、ｃＤＮＡの３’末端にポリＣアンカー配列を付加し、得られた断片をネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）組のアンチセンスプライマーおよびアンカー配列プライマーを用いて増幅する。増幅断片は適当なベクターにクローニングして、制限分析および配列解析にかける。
２）ポリメラーゼ連鎖反応は、２組のプライマーを用いるネステッドＰＣＲを連続して行なうことで、ヒトｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡの５’末端を増幅するために使用することができる。１組のアンチセンスプライマーは部分ｃＤＮＡの５’末端に特異的であり、もう１組のプライマーはベクター特異的配列にアニーリングする。増幅産物は適当なベクターにクローニングして、制限分析および配列解析にかける。
【００６９】
本明細書中に引用された、特許および特許出願明細書を含めた全ての刊行物は、あたかも各刊行物が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体を参考としてここに組み入れるものとする。
【００７０】
【配列表】
2004000198.tif 000005
2004000198.tif 000006
2004000198.tif 000007
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