(57)【要約】【解決課題】上記フリーフロー電気泳動法の抱える諸問題を解決すべくなされたもので、流れの特性を流れ自体の内部性状に変更を加えて電気泳動槽内での円滑な流れを確保することにより、安定な分取、容易な気泡除去、電気泳動槽への負荷の軽減を実現するフリーフロー電気泳動法を提供することにある。【解決手段】２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽に緩衝液と試料溶液とを連続的に注入しながら試料の分離と分取を行うフリーフロー電気泳動法において、緩衝液に液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物とを共に混合させた液を用いる。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽に緩衝液と試料溶液とを連続的に注入しながら試料の分離と分取を行うフリーフロー電気泳動法において、緩衝液に液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物とを共に混合させた液を用いることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項２】
２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽に両性担体を含んだ緩衝液と陽極側部液と陰極側部液と陽極電極液と陰極電極液と試料溶液とを連続的に注入しながら試料の等電点分離と分取を行うフリーフロー等電点電気泳動法において、緩衝液と陽極側部液と陰極側部液に、液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物とを共に混合させた液を用いることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項３】
請求項１または２記載のフリーフロー電気泳動法において、陽極電極液と陰極電極液に液の粘性を下げる水溶性有機化合物を混合させた液を用いることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のフリーフロー電気泳動法において、液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物が共にアルコール類であることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項５】
請求項４記載のフリーフロー電気泳動法において、液の粘性を高める水溶性有機化合物がグリセリンであり、液の粘性を下げる水溶性有機化合物がエチルアルコールであることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項６】
請求項５記載のフリーフロー電気泳動法において、グリセリンの濃度が０．５〜５  ｖ／ｖ  ％であることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項７】
請求項５記載のフリーフロー電気泳動法において、エチルアルコールの濃度が５〜２０ｖ／ｖ  ％であることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項８】
請求項２乃至７のいずれかに記載のフリーフロー電気泳動法において、試料溶液または緩衝液に等電点を有する色素を含んだ液を用いることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項９】
請求項８記載のフリーフロー電気泳動法において、等電点を有する色素がｐＨによって変色する特性を有する色素であることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項１０】
請求項８または９記載のフリーフロー電気泳動法において、等電点を有する色素がメチルレッドであることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項１１】
請求項１０記載のフリーフロー等電点電気泳動法において、メチルレッドの濃度が０．００５〜０．０５  ｗ／ｖ  ％であることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項１２】
請求項２乃至１１のいずれかに記載のフリーフロー電気泳動法において、陽極電極液に陽極側部液と同じ液を、陰極電極液に陰極側部液と同じ液を用いることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれかに記載のフリーフロー電気泳動法において、電界の印加方法が定電流設定であることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれかに記載のフリーフロー電気泳動法において、２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽の間隔が１５０μｍ以下であることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項１５】
請求項１４記載のフリーフロー電気泳動法において、２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽の間隔が１０μｍ〜５０μｍであることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動槽に緩衝液と試料溶液とを連続的に流しながら試料溶液中に含まれる溶質の分離と分取を行うフリーフロー電気泳動法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
フリーフロー電気泳動とは、２つの平板の間に形成された電気泳動槽に試料と緩衝液を連続的に注入しながら電気泳動による分離及び分取を行う電気泳動法である。分離操作は予め緩衝液注入口から一定流速で支持液としての緩衝液を流して複数の流出口への液の流れを作り、試料注入口から試料を注入する。電気泳動槽内部は狭い空間特有の物理的現象によって強い層流が実現されているため、異なる液体を電気泳動槽に連続的に流すと各液体は拡散しにくく、ほぼ直線的に流出口に向かって流れ出る。電気泳動槽の両端に形成した１対の電極間に電圧を印加すると、試料に含まれる物質は電気泳動の原理によって正負いずれかの電極側に泳動しながら該当する流出口に流出する。物質によって泳動の方向及び速度が異なるため、試料に含まれる物質は分離しながら流出口に流出する。従って、複数の流出口の中から特定の分取口より液を取り出すことにより試料の分取が行える。例えば、特許文献１参照。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００１−９１４９７号公報（段落０００４、図１等）
【０００４】
この場合、分取用流路の流路抵抗にばらつきがあると電気泳動槽での流れに影響がでて、ひいては精密な分離ができなくなるという問題があった。また、電気泳動槽中での流れは、２つの平板間中央では流速が最大で平板表面では流速がゼロとなる所謂層状流速プロフィルを取るため、サンプルの分離バンドが三カ月状のブロードな形状となる。また、電気浸透流により陰極付近で流れが同極に引き付けられるという現象が生ずる。さらに、電流が流れることによりジュール熱が発生し、それにより温度が不均一になり不均一な流れとなるという問題もあった。また、使用状態によっては、電極室で発生した気泡が電気泳動槽に進入するという問題もあった。
【０００５】
特許文献１は、分取用流路の不均一な流路抵抗より電気泳動槽での流れに影響がでて不精密な分離としてしまうという問題に対して、電気泳動槽の下流部に配置される複数の分取流路の断面積および長さを等しくすることによって、分取流路の流路抵抗を均一なものとし分離部での均一な流れに影響が出るのを防止している（請求項１、段落、００１２）。特許文献１は、マイクロファブリケーション技術の進展に伴ってフリーフロー電気泳動槽を小型化する技術に関し、装置の小型化、試薬の微量化を可能とするものである。
【０００６】
また、フリーフロー電気泳動法について、上記層流速度プロフィルによる三カ月現象、電気浸透流による偏流、温度不均一により不均一な流れ等の問題を、作動モードを等電点電気泳動法（ＩＥＦ）および等速電気泳動法（ＩＴＰ）を採用するとともに、サンプルを流れに直角に導入することにより三カ月の状流れ現象を低減し、出口近傍の乱流・デッド体積を適当な液を逆に流すこと等によって解決することを提案されている。例えば、非特許文献１参照。なお、非特許文献１は、電気泳動槽としては長さ５００ｍｍ、幅１００ｍｍ、深さ０．４ｍｍの市販されていたフリーフロー電気泳動装置を用いて、フリーフロー等電点電気泳動を行う手法であり、特許文献１のようなマイクロファブリケーション技術によるフリーフロー電気泳動法に直ちに当てはまるものではない。
【０００７】
【非特許文献】
“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９９６，１７，１９０６−１９１０”（１９０７〜１９０８頁の３．結果および論議の３．１および３．２参照）
【０００８】
上記フリーフロー等電点電気泳動法はフリーフロー電気泳動法の手法の一つであり、タンパク質の分離を行う際に用いられ、電気泳動槽内にｐＨ勾配を生じさせてタンパク質の等電点の違いで等電点収束させ分離・分取する手法である。非特許文献１にもあるように、電気泳動槽に流す緩衝液に両性担体を含んだ液を用い、電圧印加により電極間の溶液にｐＨ勾配を作って、等電点を有する試料を等電点分離する方法である電気泳動槽中央に流す緩衝液とは別に電極の構成されている部分には陽極電極液と陰極電極液が用いられ、また、電気泳動糟に中央に流す緩衝液と両端の両電極液の間に陽極側部液と陰極側部液が用いられる（非特許文献１の１９０６頁の右欄下から第２段落参照）。
【０００９】
【発明の解決しようとする課題】
発明者らは、フリーフロー電気泳動法について、上記層流速度プロフィルによる三カ月現象、電気浸透流による偏流、温度不均一により不均一な流れ、気泡の混入等の問題について、原点に立ち返って改めて検討をした結果、流れ自体の特性を流れ内部の性状を変更することによって解決できないかとの発想に到達した。上記問題解決のこのような発想は全く新たな発想であり、従来技術には示唆も動機付けもなかった。
【００１０】
即ち、本発明は、流れの特性を流れ自体の内部性状に着目し、それを積極的に変更することによって、フリーフロー電気泳動法における上記層流速度プロフィルによる三カ月現象、電気浸透流による偏流、温度不均一により不均一な流れ等の問題を解決できないかとの着想の基になされたものである。
【００１１】
即ち、本発明は、上記フリーフロー電気泳動法の抱える諸問題を解決すべくなされたもので、流れの特性を流れ自体の内部性状に変更を加えて電気泳動槽内での円滑な流れを確保することにより、安定な分取、容易な気泡除去、電気泳動槽への負荷の軽減を実現するフリーフロー電気泳動法を提供することにある。
また、本発明は、電気泳動糟内の等電点収束状態を確認することで再現性の良いフリーフロー等電点電気泳動法を提供することにある。
本発明は、特に、１５０μｍ以下の電気泳動槽に対して好適なフリーフロー等電点電気泳動法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明に係るフリーフロー電気泳動法は、２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽に緩衝液と試料溶液とを連続的に注入しながら試料の分離と分取を行うフリーフロー電気泳動法において、緩衝液に液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物とを共に混合させた液を用いることを特徴とする。
【００１３】
「液の粘性を高める水溶性有機化合物」の添加は、媒質の拡散の防止や電気浸透流の抑制効果がある。一方、「液の粘性を下げる水溶性有機化合物」の添加は液の表面張力を下げることによる気泡の除去効率の向上、流出口における流出量の安定性向上、及び電気泳動槽への負荷軽減の効果がある。両物質の添加は粘性という点では相反する効果を有する物を添加するが、フリーフロー電気泳動を行う上では双方の効果がともに生かされ効果的に発揮され、安定な分取、容易な気泡除去、電気泳動槽への負荷の軽減が可能となる。
【００１４】
したがって本発明は、緩衝液に液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物とを共に混合させた液を用いることで、円滑な流れを確保し、安定な分取、容易な気泡除去、電気泳動槽への負荷の軽減が可能なフリーフロー等電点電気泳動法を提供することができる。
【００１５】
【発明の実施の態様】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）電気泳動槽
電気泳動槽としては、フリーフロー電気泳動装置に設けられるものであれば本発明のフリーフロー電気泳動法を適用できる。
例えば、電気泳動槽の間隔は安定層流が実現できる間隔であれば任意の間隔とすることができる。１５０μｍ以下であれば、レイノルズ数が小さくなるために安定な層流が実現できることや、電気泳動槽の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できる等の効果が得られる。なお、電気泳動槽の間隔を狭くすることによってその効果は大きくなり、電気泳動糟の容積も小さくなるために緩衝液や試料の微量化ができる。電気泳動槽の最適な間隔は１０μｍ〜５０μｍの範囲である。この範囲とすると、電気泳動槽の抵抗、電気泳動槽への水圧の負荷をより適切に制御でき、高電圧印加時に流れる電流もより適切に制御できる。
【００１６】
（２）緩衝液と電極液
電気泳動層に流される緩衝液の種類は特に限定されず、通常電気泳動に用いられる緩衝液を任意に選択できる。例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ホウ酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−グリシン緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−酢酸緩衝液を挙げることができる。また、電極部にも電極液を流すが、電極液は電気泳動槽に流す緩衝液と同一の緩衝液を用いることもできる。
（３）緩衝液の粘性を高める水溶性有機化合物と緩衝液の粘性を下げる水溶性有機化合物
緩衝液の粘性を高める水溶性有機化合物と緩衝液の粘性を下げる水溶性有機化合物の量は、本発明の目的である安定な分取、容易な気泡除去、電気泳動槽への負荷の軽減を可能とする範囲内で、緩衝液の種類、電気泳動槽の形状等、分離する試料種類等も考慮に入れて適宜決定する。例えば、緩衝液の粘性を高める水溶性有機化合物の添加量は０．５〜５ｖ／ｖ％の範囲とし、緩衝液の粘性を下げる水溶性有機化合物の添加量は５〜２０ｖ／ｖ％の範囲として、その混合比は１：１０と設定できる。該濃度は、タンパク等の生物試料の活性を保ちつつ該化合物（例えば、エチルアルコール）の添加の効果を十分に発揮できる濃度に該当する範囲である。
【００１７】
▲１▼緩衝液の粘性を高める水溶性有機化合物
「液の粘性を高める水溶性有機化合物」は、媒質の拡散の防止や電気浸透流の抑制をする効果を有する。「液の粘性を高める水溶性有機化合物」としては、「液の粘性を高める水溶性有機化合物」としては、グリセリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン等を用いることができる。グリセリンは溶解性が高いため調整がし易いメリットがある。いずれの水溶性有機化合物を用いた場合にも、０．０１〜５  ｖ／ｖ  ％の濃度範囲であることが望ましい。
【００１８】
▲２▼緩衝液の粘性を下げる水溶性有機化合物
「液の粘性を下げる水溶性有機化合物」の添加は液の表面張力を下げることによる気泡の除去効率の向上、流出口における流出量の安定性向上、及び電気泳動槽への負荷軽減の効果がある。「液の粘性を下げる水溶性有機化合物」としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコールやイソプロピルアルコール等の表面張力の小さいアルコールが望ましい。たんぱく質等の生体試料の活性を保つという点において、エチルアルコールが最適である。また、タンパクの活性を保ちつつエチルアルコールの添加の効果を十分に発揮できる濃度は５〜２０ｖ／ｖ  ％の範囲である。
【００１９】
▲３▼組み合わせ
液の粘性を高める作用を持つ水溶性有機化合物と液の粘性を下げる作用を持つ水溶性有機化合物の組み合わせは、両者を共にアルコール類とすることが好ましい。共に溶解性が高いため互いの作用が有効に作用しやすい。このような組み合わせで特に好ましい組み合わせは、液の粘性を高める作用を持つ水溶性有機化合物がグリセリン、液の粘性を下げる作用を持つ水溶性有機化合物がエチルアルコールである。
【００２０】
以下に、本発明の好ましい態様を挙げる。特に矛盾がない限りそれらの任意の組み合わせも本発明の好ましい態様である。なお、以下に好ましい態様をまとめてあげるため、上述した内容の一部重複も含まれる。
（１）フリーフロー電気泳動法が２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽に両性担体を含んだ緩衝液と陽極側部液と陰極側部液と陽極電極液と陰極電極液と試料溶液とを連続的に注入しながら試料の等電点分離と分取を行うフリーフロー等電点電気泳動法であって、緩衝液と陽極側部液と陰極側部液に、液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物とを共に混合させた液を用いることを特徴とする。
【００２１】
本態様はフリーフロー等電点電気泳動法であり、本発明のフリーフロー電気泳動法がフリーフロー等電点電気泳動法についても有効に適用できることを示すものである。両性担体を含んだ緩衝液と陽極側部液と陰極側部液と陽極電極液と陰極電極液と試料溶液は通常電気泳動に用いられる緩衝液を任意に選択できる。例えば、以下のものが挙げられる。
【００２２】
▲１▼両性担体を含んだ緩衝液
両性担体は市販されているものを用いる。メーカー、ｐＨの範囲、及び濃度は特に限定されない。ｐＨ範囲の狭いものを用いれば、電気泳動糟内で生じるｐＨグラジェントの範囲も狭くなるため、分解能は向上する。また、ｐＨ範囲の異なる数種の両性担体を用いて等電点電気泳動を行うことも可能である。例えば、陽極側に酸性域、中央に中性域、陰極側にアルカリ域の両性担体を流して等電点電気泳動を行うことで等電点収束を短時間で実現することが可能になる。
なお、両性担体の分子量はできるだけ小さい方が望ましい。泳動速度は分子量が小さいほど速いため、分子量が小さいほど等電点収束が短い時間で実現できる。また、分取液を質量分析計で測定する場合、両性担体の分子量が小さければ分離して得た試料と両性担体とを区別できる場合が多い。分取液を質量分析計にて解析する場合、フリーフロー電気泳動に用いる望ましい両性担体の分子量は４００以下である。
【００２３】
▲２▼電気泳動糟の中央に流す緩衝液
０．５ｖ／ｖ％の両性担体（ａｍｐｈｏｌｉｎｅ  ｐＨ  ３．５−１０．０、アマシャムバイオサイエンス製）と１ｖ／ｖ％のグリセリンと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液
▲３▼陰極電極が構成されている部分に流す陰極電極液
１０ｍ  ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液
▲４▼陽極電極が構成されている部分に流す陽極電極液
１０ｍ  ｍｏｌ／ｌのリン酸と１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液
【００２４】
▲５▼電気泳動糟に中央に流す緩衝液と陰極電極液との間に流す陰極側部液
１０ｍ  ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムと１ｖ／ｖ％のグリセリンと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液
▲６▼電気泳動糟に中央に流す緩衝液と陽極電極液との間に流す陽極側部液
１０ｍ  ｍｏｌ／ｌのリン酸と１ｖ／ｖ％のグリセリンと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液
なお、陰極電極側部液および陽極側部液はフリーフロー等電点電気泳動を円滑に行なうために流す液であり、特に液体積に対して界面の面積が与える影響の強い場での分離の場合には該両電極側部液は有効に作用するものである。
▲７▼試料溶液：蛋白質、膜蛋白質、細胞、オルガネラ、ペプチド、ウィルスなどを含んだ水溶液
例えば、１０ｍｇ／ｍｌのチトクロムＣと１０ｍｇ／ｍｌのミオグロビンを含んだ水溶液
【００２５】
両物質の添加は粘性という点では相反する効果を有するものの添加であるが、フリーフロー等電点電気泳動を行う上では双方の効果が効果的に現れ、安定な分取、容易な気泡除去、電気泳動槽への負荷の軽減が可能となり、両物質の添加によって等電点収束を短時間で実現することが可能となる。
したがって本発明は、緩衝液と陽極側部液と陰極側部液に、液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物とを共に混合させた液を用いることで、安定な分取、容易な気泡除去、電気泳動槽への負荷の軽減、高速な等電点収束が可能なフリーフロー等電点電気泳動法を提供することができる。
【００２６】
本態様は、第２の実施例が対応する。
【００２７】
（２）フリーフロー電気泳動法において、陽極電極液と陰極電極液のそれぞれに液の粘性を下げる水溶性有機化合物を混合させた液を用いる。
【００２８】
フリーフロー等電点電気泳動では数ｋＶの高電圧を印加するために電極部にて電気分解による多量の気泡が発生する。発生した気泡が電極近傍に止まると安定した電界の印加が妨げられ、安定な分離が実現できなくなる。また、発生した気泡が泳動槽内にはいると流れが乱れ安定した分離ができなくなる。陽極電極液と陰極電極液に液の粘性を下げる水溶性有機化合物を混合させた液を用いることによって、電極で発生した気泡を容易に除去することが可能となる。
【００２９】
したがって、陽極電極液と陰極電極液に液の粘性を下げる水溶性有機化合物を混合させた液を用いることにより、電極で発生する気泡を容易に除去でき安定した分離が可能なフリーフロー等電点電気泳動法を提供できる。
【００３０】
本態様に関する実施例は、実施例２が対応し、「液の粘性を下げる水溶性有機化合物」とは、実施例２では「エチルアルコール」が該当する。
なお、本発明は実施例２に示すように、当然、各種変更が可能である。
【００３１】
（３）液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物が共にアルコール類である。
上記したように、液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物を共にアルコール類とすると、本発明の作用効果に加え、共に溶解性が高いために互いの作用が有効的に発揮できる。
この態様に関する実施例は、実施例１と実施例２が対応し、「液の粘性を高める水溶性有機化合物」は、実施例１と実施例２では「グリセリン」が該当し、「液の粘性を下げる水溶性有機化合物」は「エチルアルコール」が該当する。
【００３２】
（４）液の粘性を高める水溶性有機化合物がグリセリンであり、液の粘性を下げる水溶性有機化合物がエチルアルコールである。
上述したが、液の粘性を高める水溶性有機化合物をグリセリンとし、液の粘性を下げる水溶性有機化合物をエチルアルコールとすることで、本発明の作用効果に加え次の作用効果がある。グリセリンは溶解性が高いため調整がし易いメリットがあり、エチルアルコールは試料として用いるタンパク質の活性を保つという点において最適である。
本態様に関する実施例は、実施例１と実施例２とが対応する。
【００３３】
（５）グリセリンの濃度が０．５〜５  ｖ／ｖ  ％である。
グリセリンの濃度が０．５〜２  ｖ／ｖ  ％の範囲を下回ると試料がわずかに拡散する傾向がみられ、またこの範囲を超えると粘性が高くなり気泡の除去効率が軽減し電気泳動槽にかかる負荷が増大する傾向がある。また、フリーフロー等電点電気泳動法においては、条件等によっては、この範囲を下回ると試料の等電点収束は効果的に行なわれない可能性もでてき、またこの範囲を超えると等電点収束に時間を要する。従って、本態様は、最適なグリセリン濃度を提供する。本態様に関する実施例は、実施例１と実施例２とが対応する。
【００３４】
（６）エチルアルコールの濃度が５〜２０ｖ／ｖ  ％である。
試料として用いるタンパクの活性を保ちつつエチルアルコールの添加の効果を十分に発揮できる濃度は５〜２０ｖ／ｖ  ％の範囲である。従って本発明は、最適なエチルアルコール濃度を提供することができる。本態様に関する実施例は、実施例１と実施例２とが対応する。
【００３５】
（７）フリーフロー等電点電気泳動法において、試料溶液または緩衝液に等電点を有する色素を含んだ液を用いる。
一般に行われている等電点電気泳動は、担体としてゲルを用い静置した状態で１０時間以上の時間を要して等電点収束を実現しているが、フリーフロー電気泳動の場合無担体であり且つ液の流れのある状態にて数分から数１０分で等電点収束させるため、流れの状態、電気泳動糟表面の状態、試料の塩濃度等の様々な要因で条件が乱れる。このため、再現性良くフリーフロー等電点電気泳動を行うためには、電気泳動糟内の等電点収束状態を確認しながら電気泳動を行うことが望ましい。
成分不明なタンパク質の分離を行う場合、試料の濃度やそれに含まれる塩濃度も不明なため、電気泳動時の電気泳動糟の電気的抵抗が異なる。このため、等電点電気泳動が理想的に生じる電界の印加条件が試料によって異なる。試料溶液に等電点を有する色素を加えると、色素の挙動によって電気泳動糟内の状態を把握することが可能となる。色素の泳動方向によって電気泳動が実現できているか否かを判断でき、さらに色素が細く収束しているか否かによって等電点収束の条件に至っているか否かの判断が可能となる。
当該色素は試料溶液あるいは緩衝液のいずれかに含有させても同じ効果が得られる。緩衝液中に含ませると、試料溶液に色素を含有させる必要はなくなる。緩衝液中に含ませる場合、色素の濃度は試料溶液中に含ませる濃度よりも薄い方が望ましい。
【００３６】
等電点収束の条件に至っていない場合、色素の流れは電気泳動糟を横切りやや広がり気味に流れるのが確認できる。この状態は電気泳動がゾーン電気泳動であることを示しており、等電点収束の条件が確立できていないことを示唆するつまり、色素の流れが見えることで電気泳動ができていることが確認でき、その色素の流れが収束することで等電点電気泳動条件が確立できていることを確認でき、収束した流れが流出する位置を調整することで回収液の等電点の補正ができる。つまり、等電点を有する色素はフリーフロ−等電点電気泳動のマーカーとなり、その混合によってデータの再現性を得ることが可能な安定したフリーフロー等電点電気泳動を実現することが可能な方法を提供できる。
【００３７】
本態様に関する実施例は、実施例３が対応し、「等電点を有する色素」は、第３の実施例では「メチルレッド」が該当する。
【００３８】
（８）フリーフロー等電点電気泳動法において、等電点を有する色素がｐＨによって変色する特性を有する色素である。
等電点とｐＨによって変色する特性を共に有する色素を用いることで、上記（７）の作用に加え、電気泳動糟内のｐＨの状態を確認することができる。
【００３９】
等電点を有しｐＨによって変色する特性を併せ持った色素としては、メチルレッドや、チトクロムＣやミオグロビンを挙げられる。ただし、チトクロムＣやミオグロビンは同じマーカーとしての機能は果たすが、チトクロムＣやミオグロビンは有色タンパクであるためその後の分析にもタンパクとしての振る舞いをすることになる。メチルレッドは色素であるため、タンパク染色等の実験では染色されず区別ができる。また、蛍光標識したタンパク質も同様にマーカーとして機能する。蛍光標識タンパクは微量で確認できるのがメリットではあるが、確認できるのは収束状態と流出口位置だけで液のｐＨの確認はできない。また、蛍光で観察することになるためそのための光源やカメラ等の装置構成が必要となる。
本態様に関する実施例は、実施例３が対応し、「ｐＨによって変色する特性を有する色素」は、第３の実施例では「メチルレッド」が該当する。
【００４０】
（９）フリーフロー等電点電気泳動法において、等電点を有する色素がメチルレッドであることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
成分不明なタンパク質の分離を行う場合、試料の濃度やそれに含まれる塩濃度も不明なため、電気泳動時の電気泳動糟の電気的抵抗が異なる。このため、等電点電気泳動が理想的に生じる電界の印加条件が試料によって異なる。例えば、メチルレッドは酸性域で赤色となるｐＨ指示薬で、且つ３．７５の等電点を有する。このため、サンプルにメチルレッドを加えると、そのメチルレッドの挙動によって電気泳動糟内の状態を把握することが可能となる。試料溶液中ではメチルレッドは淡い黄色の色を呈する。電気泳動槽にて泳動すると、緩衝液にｐＨ勾配が生じ、メチルレッドが陽極側に泳動することで赤いラインとして流れが確認できるようになる。
【００４１】
更に、等電点収束の条件に至ると、赤いラインは細く収束し、直線的に流出口に向かう流れが生じる。等電点収束の条件に至っていない場合、赤いラインは電気泳動糟を横切り陽極側にやや広がり気味に流れるのが確認できる。この状態は電気泳動がゾーン電気泳動であることを示しており、等電点収束の条件が確立できていないことを示唆する。つまり、メチルレッドの赤いラインが見えることで電気泳動ができていることとｐＨの状態が確認でき、その赤いラインが収束することで等電点電気泳動条件が確立できていることを確認でき、収束したラインが流出する位置を調整することで回収液の等電点の補正ができる。つまり、メチルレッドはフリーフロ−等電点電気泳動のマーカーとなり、その混合によってデータの再現性を得ることが可能な安定したフリーフロー等電点電気泳動を実現することが可能な方法を提供できる。
本態様に関する実施例は、実施例３が対応する。
【００４２】
（１０）フリーフロー等電点電気泳動法において、メチルレッドの濃度が０．００５〜０．０５  ｗ／ｖ  ％である。
メチルレッドの濃度は０．００５〜０．０５  ｗ／ｖ  ％の範囲とすることが好ましい。０．００５以上で色が確認がより容易となり、０．０５以内であると適正な濃度と収束が確保できる。マーカーとしての最適な濃度は０．０１〜０．０３  ｗ／ｖ  ％の範囲である。従って本態様は、メチルレッドの最適な濃度を提供することができる。本態様に関する実施例は、実施例３が対応する。
【００４３】
（１１）フリーフロー等電点電気泳動法において、陽極電極液に陽極側部液と同じ液を、陰極電極液に陰極側部液と同じ液を用いる。
陰極電極液に陰極側部液と同じ液を、陽極電極液に陰極側部液と同じ液を用いることにより、用いる溶液の種類を少なくすることが可能となり、装置の省スペース化、簡略化が実現できる。本態様に関する実施例は、実施例３が対応する。
【００４４】
（１２）フリーフロー電気泳動法において、電界の印加方法が定電流設定である。
定電流設定とすることで短時間で等電点収束条件を実現することが可能となる。従って本発明は短時間にてフリーフロー電気泳動が可能な方法を提供することができる。本態様に関する実施例は、実施例２と実施例３とが対応する。
【００４５】
（１３）フリーフロー電気泳動法において、２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽の間隔が１５０μｍ以下である。
２枚の平板の間隔を１５０μｍ以下の電気泳動槽とした場合、本発明の効果に加えて、レイノルズ数が小さくなるために非常に安定な層流が実現できることや、電気泳動糟の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できることなどの利点がある。また、電気泳動糟の容積が小さいため、用いる緩衝液や試料を微量化できる利点がある。
【００４６】
しかしながら、体積に対して与える界面の面積の影響が強い場での分離となるため、従来技術をそのまま利用してもフリーフロー等電点電気泳動は実現できない。本発明では、上記（１）〜（６）記載の条件を採用することによって、効果的な電気泳動を実現した。したがって本態様は、電気泳動槽の間隔を１５０μｍ以下の電気泳動槽とし、高速分離・分取、サンプルの微量化、緩衝液や電極液の微量化、装置の小型化が可能なフリーフロー電気泳動法を提供することができる。
この発明に関する実施例は、実施例２と実施例３とが対応し、本実施例では電気泳動槽の間隔は３０μｍとした。
【００４７】
（１４）フリーフロー電気泳動法において、２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽の間隔が１０μｍ〜５０μｍである。
電気泳動糟の間隔は、１５０μｍ以下であればレイノルズ数が小さくなるために安定な層流が実現できることや、電気泳動糟の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できる等の効果が得られる。なお、電気泳動糟の間隔を狭くすることによってその効果は大きくなり、電気泳動糟の容積も小さくなるために緩衝液や試料の微量化ができる。
【００４８】
本態様の通り、電気泳動糟の間隔を１０μｍ〜５０μｍとすると、高電圧印加時に流れる電流を抑え気泡発生や熱の発生を抑制することができ、また、電気泳動糟の抵抗、電気泳動糟への水圧の負荷を適切に保持できる。
なお、電気泳動槽の間隔を１０μｍ〜５０μｍに保持するにあたり、電気泳動槽の流れの幅と流れの長さのサイズは小さい方が望ましく、それぞれ１０ｃｍ以下とすることが望ましい。
【００４９】
【実施例】
以下に、本発明のフリーフロー電気泳動法で用いたのフリーフロー電気泳動装置を示す。
図１はこの発明の実施例に用いるフリーフロー電気泳動素子１の上面図であり、図２は図１の線ＩＩ−ＩＩに沿う断面図でる。フリーフロー電気泳動素子１は、以下に示すマイクロファブリケーション技術にて作成した。フリーフロー電気泳動素子１は、電気泳動槽構成基板２と注入口構成基板３との組み合わせで構成される。電気泳動槽構成基板２の上面図を図３に、注入口構成基板３の裏面図を図４に示す。このフリーフロー電気泳動素子１は、幅広の溝からなる電気泳動槽８と細長い溝からなる２つの電極室９と、電気泳動槽８と電極室９とを区切る隔壁１０を構成した電気泳動槽構成基板２と、複数の緩衝液注入口４ａ〜４ｕと複数の試料注入口５ａ〜５ｅと複数の流出口６ａ〜６ｕと１対の電極７ａ，ｂを構成した注入口構成基板３とを張り合わせて構成される。電極７は注入口構成基板３の電気泳動槽構成基板２と対向する面上に薄膜で構成される。隔壁１０は対向する注入口構成基板３との間に空隙を有して構成される。複数の緩衝液注入口４と複数の流出口６は同数且つ同間隔で構成される。
【００５０】
電気泳動槽構成基板２及び注入口構成基板３の素材はホウケイ酸ガラス、電極７は白金薄膜からなる。電気泳動糟８と電極室９は公知のウェットエッチング法にて深さ３０μｍに加工した。隔壁１０は対向する注入口構成基板３との間に１μｍの空隙ができるように加工した。緩衝液注入口４と試料注入口５と流出口６は超音波加工によって加工した。電極７はスパッタリング法によって成膜した。電気泳動槽構成基板２及び注入口構成基板３の接合は、図示しないアモルファスシリコン薄膜を介して陽極接合法によって接合した。フリーフロー電気泳動素子１は電極７ａを電圧印加電源の陰極に、電極７ｂを電圧印加電源の陽極に接続した。
【００５１】
また、この発明の実施例に用いたフリーフロー電気泳動素子１は、安定な層流状態でフリーフロー電気泳動を行うことが可能なフリーフロー電気泳動素子であれば、その構成は特に限定されるものではない。
【００５２】
次に、フリーフロー電気泳動素子１を用いたフリーフロー電気泳動法を示す。
【実施例１】
（該当クレーム１，４，５，６，７）
【００５３】
緩衝液として１ｖ／ｖ％のグリセリンと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ３ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−３ｍＭ塩酸緩衝液を、試料溶液としてキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーを混合した水溶液を用い、フリーフロー電気泳動素子１にてフリーフロー電気泳動を行った。緩衝液は、液注入口４ａ〜４ｕからポンプで注入した。試料溶液は試料注入口５ｂからポンプで注入した。フリーフロー電気泳動は、緩衝液と試料溶液を注入しながら電極７に電圧を印加して行った。分取液は流出口６ａ〜６ｕからの流出液を回収して得た。数ｋＶの電圧を印加しフリーフロー電気泳動を行うと、試料溶液中のキシレンシアノールＦＦは流出口６ｏにブロモフェノールブルーは流出口６ｓ及び６ｔに分離して流出した。なお、緩衝液と試料溶液の注入を開始した際、電気泳動糟内にわずかな気泡が入ったがその気泡は流れに伴って容易に流出した。また、分取液の回収も安定して行うことができた。更にフリーフロー泳動素子１にかかる負荷はほとんどなく、繰り返し使うことが可能であった。
【００５４】
次に、実施例１の結果を説明し、さらに考察を加える。
本実施例では、緩衝液に濃度１  ｖ／ｖ  ％のグリセリンと濃度１０  ｖ／ｖ  ％のエチルアルコールを含んだ液を用いてフリーフロー電気泳動を行ったが、グリセリンの添加は液の粘性を上げることによる拡散の防止や電気浸透流の抑制効果があり、一方、アルコールの添加は、液の粘性や表面張力を下げることによる気泡の除去効率の向上、流出口における流出量の安定性向上、及び電気泳動槽への負荷軽減の効果がある。両物質の添加は粘性という点では相反する効果を有するものの添加になるが、その割合を本実施例の割合とすることで双方の効果が効果的に現れ、安定な分取、容易な気泡除去、電気泳動槽への負荷の軽減が可能となった。
【００５５】
なお、本実施例１において、緩衝液の種類は限定されず通常電気泳動に用いられる緩衝液に変更できる。また、本実施例では緩衝液注入口４の全てに同一の緩衝液を注入しているが、電極側の緩衝液注入口４ａと４ｕには専用の電極液を用いることもできる。また、電極側の緩衝液注入口４ａと４ｕに注入する緩衝液に混合するエチルアルコールの濃度を高くすることで、電極で発生する気泡の除去効率を更に向上させることも可能である。
【００５６】
グリセリンの濃度は１ｖ／ｖ％に限定されず、０．５〜５  ｖ／ｖ  ％の範囲で変更できる。この範囲を下回ると試料がわずかに拡散するようになるり、またこの範囲を超えると粘性が高くなり過ぎて気泡の除去効率が軽減し電気泳動槽にかかる負荷が大きくなる。また、グリセリンは他の液の粘性を高める作用を持つ水溶性有機化合物に変更することが可能である。例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやポリビニルアルコールやポリビニルピロリドンとすることができる。グリセリンは溶解性が高いため調整がし易いメリットがある。いずれの水溶性有機化合物を用いた場合も適用できる濃度があり、その濃度は０．０１〜５  ｖ／ｖ  ％であることが望ましい。
【００５７】
エチルアルコールの濃度は１０ｖ／ｖ％に限定されず、他の液の粘性を下げる作用を持つ水溶性有機化合物に変更することが可能である。例えば、メチルアルコールやイソプロピルアルコール等の表面張力の小さいアルコールが望ましい。試料として用いるタンパク質の活性を保つという点において、エチルアルコールが最適である。また、タンパクの活性を保ちつつエチルアルコールの添加の効果を十分に発揮できる濃度は５〜２０ｖ／ｖ  ％の範囲である。
【００５８】
液の粘性を高める作用を持つ水溶性有機化合物と液の粘性を下げる作用を持つ水溶性有機化合物の組み合わせは、液の粘性を高める作用を持つ水溶性有機化合物がグリセリン、液の粘性を下げる作用を持つ水溶性有機化合物がエチルアルコールを選択することが望ましい。両者は共にアルコール類であり、共に溶解性が高いため互いの作用が有効に作用しやすい。
なお、試料注入口の場所は限定されない。
【００５９】
【実施例２】
（該当クレーム２，３，４，５，６，７，１３，１４，１５）
以下に本発明のフリーフロー等電点電気泳動法の実施例を示す。実施例２でも、図１と図２とに示す上述のフリーフロー電気泳動素子１を用いてフリーフロー等電点電気泳動法を行った。
フリーフロー等速電気泳動とはタンパク質の分離を行う際に用いられる手法であるが、電気泳動槽に流す緩衝液に両性担体を含んだ液を用い、電気泳動槽内にｐＨ勾配を生じさせてタンパク質の等電点の違いで分離・分取する手法である。この手法では、電気泳動糟に中央に流す緩衝液とは別に電極の構成されている部分には陽極電極液と陰極電極液が用いられ、また、電気泳動糟に中央に流す緩衝液と両端の両電極液の間に陽極側部液と陰極側部液が用いられる。
【００６０】
電気泳動糟の中央に流す緩衝液として０．５ｖ／ｖ％の両性担体（ａｍｐｈｏｌｉｎｅ  ｐＨ  ３．５−１０．０、アマシャムバイオサイエンス製）と１ｖ／ｖ％のグリセリンと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液を、陰極電極が構成されている部分に流す陰極電極液として１０ｍ  ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液を、陽極電極が構成されている部分に流す陽極電極液として１０ｍ  ｍｏｌ／ｌのリン酸と１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液を、電気泳動糟に中央に流す緩衝液と陰極電極液との間に流す陰極側部液として１０ｍ  ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムと１ｖ／ｖ％のグリセリンと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液を、電気泳動糟に中央に流す緩衝液と陽極電極液との間に流す陽極側部液として１０ｍ  ｍｏｌ／ｌのリン酸と１ｖ／ｖ％のグリセリンと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液を、試料溶液として１０ｍｇ／ｍｌのチトクロムＣと１０ｍｇ／ｍｌのミオグロビンを含んだ水溶液を用い、フリーフロー電気泳動素子１にてフリーフロー等電点電気泳動を行った。
【００６１】
中央の緩衝液注入口４ｆ〜ｐに緩衝液を、４ａに陰極電極液を、４ｕに陽極電極液を、４ｂ〜ｅに陰極側部液を、４ｑ−ｔに陽極側部液をポンプで流した。試料溶液は試料注入口５ｂからポンプで注入した。フリーフロー等電点電気泳動は、緩衝液と陰極電極液と陽極電極液と陰極側部液と陽極側部液と試料溶液を注入しながら電極７に電界を印加して行った。分取液は流出口６ｂ〜６ｔからの流出液を回収して得た。流出口６ａ及び６ｕからの流出液は回収せずドレインに排出した。電界の印加方法は定電流設定とし、値を１ｍＡとした。電圧の値は３ｋＶから徐々に上がり初め８．５ｋＶで安定した。電気泳動糟内の流速は試料溶液の線流速が３ｍｍ／ｓｅｃ以下になるようにポンプ調整した。
【００６２】
電界の印加により緩衝液の流れるエリアにはｐＨ勾配が生じ、分取液には表１に示すｐＨ勾配が生じた。試料溶液中に含まれるチトクロムＣとミオグロビンは、有色タンパク質であるため電気泳動糟上面を観察することで両タンパクの分離状態を確認した。両タンパクは電気泳動糟に入ると同時に分離し、後に収束しながら流出口に排出した。分取液のｐＨと両タンパクの流出場所を表１に示した。チトクロムＣの等電点９．６に対し分取液のｐＨは９．４、ミオグロビンの等電点７．０に対し分取液のｐＨは６．４とその値はほぼ一致した。試料溶液の注入口を試料注入口５ｃまたは試料注入口５ｄとした場合においても両タンパクは同じ流出口に収束し流出したことから、この泳動が等電点電気泳動であることが確認できた。
【表１】
2004286665.tif 000003
【００６３】
次に、実施例２の結果を説明し、さらに考察を加える。
フリーフロー電気泳動素子１は、上記構成にて記載したように、緩衝液注入口４と流出口６とが同数且つ同間隔に構成されている。上述したように、狭い空間に液を連続的に流した場合、流れが強い層流となるため液体同士が拡散しにくい状態が生じる。それぞれの緩衝液注入口４から異なる緩衝液を流した場合、それと対向する流出口６に拡散することなく流れ出る。従って、本構成とすることで、複数種の液を流しながら泳動分離を行うことが可能なフリーフロー電気泳動素子となる。また、電気泳動糟の間隔が３０μｍと狭いために高電圧が印加可能であり、数秒で試料の分離が可能になる。また、電気泳動糟の容積が小さいため、用いる緩衝液や試料を微量化できる利点がある。
【００６４】
しかしながら、本実施例に用いた間隔の狭い電気泳動糟では、体積に対し界面の面積の影響が強い場での分離となるため、従来技術をそのまま利用してもフリーフロー等電点電気泳動は実現できない。本実施例では、緩衝液と両極側部液にそれぞれ濃度１  ｖ／ｖ  ％のグリセリンと濃度１０  ｖ／ｖ  ％のエチルアルコールを含んだ液を用い、両電極液にそれぞれ濃度１０  ｖ／ｖ  ％のエチルアルコールを含んだ液を用いることで等電点電気泳動を実現した。グリセリンの添加は液の粘性を上げることによる拡散の防止や電気浸透流の抑制効果がある。一方、アルコールの添加は、液の粘性や表面張力を下げることによる気泡の除去効率の向上、流出口における流出量の安定性向上、及び電気泳動槽への負荷軽減の効果がある。両物質の添加は粘性という点では相反する効果を有するものの添加になるが、その割合を本実施例の割合とすることで双方の効果が効果的に現れ等電点電気泳動が可能となった。
【００６５】
また、電極液へのアルコールの添加により電極液の粘性が下がり、電極における電気分解反応によって生じる気泡を効率的に除去できるため、安定に電圧が印加できる条件を保つことが可能となる。
したがって実施例２では、電気泳動槽の間隔を３０μｍの電気泳動槽とし、緩衝液と両極側部液にそれぞれ濃度１  ｖ／ｖ  ％のグリセリンと濃度１０  ｖ／ｖ  ％のエチルアルコールを含んだ液を用い、両電極液にそれぞれ濃度１０  ｖ／ｖ  ％のエチルアルコールを含んだ液を用いることで、間隔の狭い電気泳動槽にてフリーフロー等電点電気泳動を可能とする方法を提供することができた。
【００６６】
なお、実施例２は、当然、各種変更が可能である。
例えば、電気泳動糟の間隔は３０μｍに限定されず、安定層流が実現できる間隔であれば任意の間隔とすることができる。１５０μｍ以下であれば、レイノルズ数が小さくなるために安定な層流が実現できることや、電気泳動糟の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できる等の効果が得られる。なお、電気泳動糟の間隔を狭くすることによってその効果は大きくなり、電気泳動糟の容積も小さくなるために緩衝液や試料の微量化ができる。電気泳動糟の最適な間隔は２０μｍ〜５０μｍの範囲である。この範囲とすることによって、気泡の発生や熱の発生等も問題とならず、電気泳動糟の抵抗をより適切に維持でき、電気泳動糟への水圧の負荷も適切に維持できる。
なお、電気泳動槽の間隔を１０μｍ〜５０μｍに保持するにあたり、電気泳動槽の流れの幅と流れの長さのサイズは小さい方が望ましく、それぞれ１０ｃｍ以下とすることが望ましい。１０ｃｍを超えるサイズとすると電気泳動槽を構成する基板の反りなどの影響が出て電気泳動槽の間隔を１０μｍ〜５０μｍに保持するのが困難となる。
【００６７】
グリセリンの濃度は１ｖ／ｖ％に限定されず、０．５〜５  ｖ／ｖ  ％の範囲で変更できる。この範囲を下回ると試料の等電点収束は困難であり、またこの範囲を超えると等電点収束に時間を要する。また、グリセリンは他の液の粘性を高める作用を持つ水溶性有機化合物に変更することが可能である。例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやポリビニルアルコールやポリビニルピロリドンとすることができる。グリセリンは溶解性が高いため調整がし易く、等電点収束条件が得られやすいメリットがある。いずれの水溶性有機化合物を用いた場合も適用できる濃度があり、その濃度は０．０１〜５  ｖ／ｖ  ％であることが望ましい。
【００６８】
両性担体は市販されているものを用いる。メーカー、ｐＨの範囲、及び濃度は特に限定されない。ｐＨ範囲の狭いものを用いれば、電気泳動糟内で生じるｐＨグラジェントの範囲も狭くなるため、分解能は向上する。また、ｐＨ範囲の異なる数種の両性担体を用いて等電点電気泳動を行うことも可能である。例えば、陽極側に酸性域、中央に中性域、陰極側にアルカリ域の両性担体を流して等電点電気泳動を行うことで等電点収束を短時間で実現することが可能になる。
なお、両性担体の分子量はできるだけ小さい方が望ましい。泳動速度は分子量が小さいほど速いため、分子量が小さいほど等電点収束が短い時間で実現できる。また、分取液を質量分析計で測定する場合、両性担体の分子量が小さければ分離して得た試料と両性担体とを区別できる場合が多い。分取液を質量分析計にて解析する場合、フリーフロー電気泳動に用いる望ましい両性担体の分子量は４００以下である。
【００６９】
エチルアルコールの濃度は１０ｖ／ｖ％に限定されず、他の液の粘性を下げる作用を持つ水溶性有機化合物に変更することが可能である。例えば、メチルアルコールやイソプロピルアルコール等の表面張力の小さいアルコールが望ましい。試料として用いるタンパク質の活性を保つという点において、エチルアルコールが最適である。また、タンパクの活性を保ちつつエチルアルコールの添加の効果を十分に発揮できる濃度は５〜２０ｖ／ｖ  ％の範囲である。
【００７０】
液の粘性を高める作用を持つ水溶性有機化合物と液の粘性を下げる作用を持つ水溶性有機化合物の組み合わせは、液の粘性を高める作用を持つ水溶性有機化合物がグリセリン、液の粘性を下げる作用を持つ水溶性有機化合物がエチルアルコールを選択することが望ましい。両者は共にアルコール類であり、共に溶解性が高いため互いの作用が有効に作用しやすい。
【００７１】
両電極液及び両電極側部液の濃度は１０ｍ  ｍｏｌ／ｌに限定されず変更が可能であが、５〜２０ｍ  ｍｏｌ／ｌの範囲が望ましい。この範囲とすることによって、高電圧の印加の下、電極液の電気抵抗を維持でき緩衝液に印加される電圧を適切なものとし、良好な等電点収束を可能とする。両電極液及び両電極側部液の組成はリン酸水溶液と水酸化ナトリウム水溶液に限定されず、他の電解質溶液の組み合わせとすることが可能である。なお、両電極液の濃度は、両電極側部液の濃度と同濃度かそれ以上にすることが望ましい。
【００７２】
電界の印加の方法は、本方法では定電流設定にて行っているがこの方法に限定されず、定電圧設定や定電力設定とすることもできる。等電点収束を短時間で実現させるためには定電流設定が望ましい。
【００７３】
電極側部液の注入場所は本実施例では、４ｂ〜ｅに陰極側部液を、４ｑ−ｔに陽極側部液を流しているが、その場所は特に限定されず、中央の緩衝液と両端電極部の電極液の間であれば変更可能であり適当な幅を持って流すことができるが、緩衝液と両電極側部液の流れの幅は、陰極側部液：緩衝液：陽極側部液の幅の比が１：１〜８：１の範囲であることが望ましい。また、良好な等電点収束を得るための最適な幅の比は、１：２〜４：１である。試料注入口の場所は緩衝液が流れている場所であれば限定されない。
【００７４】
【実施例３】（該当クレーム８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５）
以下に本発明のフリーフロー電気泳動法の第３の実施例を示す。実施例２同様、上述のフリーフロー電気泳動素子１を用いたフリーフロー等電点電気泳動法である。
本実施例では、緩衝液、陰極側部液、陽極側部液は実施例１と同じ物を用い、陰極電極液に陰極側部液と同じ液を、陽極電極液に陰極側部液と同じ液を用いた。試料溶液には、濃度不明な数種のタンパク質混合物とメチルレッドを緩衝液に溶かした液を用いた。試料溶液はタンパク質混合物の希釈率を変えたものを２種作り、メチルレッドの濃度は２種とも０．０２ｗ／ｖ％とした。液の流し方、流速、回収方法は１実施例１と同様の条件にてフリーフロー等電点電気泳動を行った。試料溶液は試料注入口５ｃからポンプで注入した。電界の印加方法は定電流設定とし、メチルレッドが流出口６ｐに収束して流出する値となるよう調整した。試料溶液１は電流１．２ｍＡで、試料溶液２は電流１ｍＡでメチルレッドが流出口６ｐに収束して流出した。回収液のｐＨと、回収液に含まれるタンパク質の等電点を等電点ゲル電気泳動によって分析した結果を、表２に示す。各回収液のｐＨと流出タンパクの等電点はほぼ一致した。また、試料１と試料２の結果も対応した。
【表２】
2004286665.tif 000004
【００７５】
次に、実施例３の結果を説明し、さらに考察を加える。
本実施例では、陰極電極液に陰極側部液と同じ液を、陽極電極液に陰極側部液と同じ液を用いたが、分取液には第１実施例と同様にｐＨ勾配が生じ、等電点電気泳動が実現できた。また、電極での電気分解反応によって生じる気泡の除去も問題なく行うことができ、安定に電圧が印加できる条件を保つことができた。本条件より、用いる溶液の種類を少なくすることが可能となり、装置の省スペース化、簡略化が実現できた。
【００７６】
本実施例では、成分不明なタンパク質の分離を行った。成分が不明な場合、試料の濃度やそれに含まれる塩濃度も不明なため、電気泳動時の電気泳動糟の電気的抵抗が異なる。このため、等電点電気泳動が理想的に生じる電界の印加条件が試料によって異なる。メチルレッドは酸性域で赤色となるｐＨ指示薬で、且つ３．７５の等電点を有する。このため、試料溶液にメチルレッドを加えると、そのメチルレッドの挙動によって電気泳動糟内の状態を把握することが可能となる。０．０２ｗ／ｖ％のメチルレッドの濃度とすると、試料溶液中ではメチルレッドは淡い黄色の色を呈する。電気電気泳動糟にて泳動すると、緩衝液にｐＨ勾配が生じ、メチルレッドが陽極側に泳動することで赤いラインとして流れが確認できるようになる。
【００７７】
更に、等電点収束の条件に至ると、赤いラインは細く収束し、直線的に流出口に向かう流れが生じる。等電点収束の条件に至っていない場合、赤いラインは電気泳動糟を横切り陽極側にやや広がり気味に流れるのが確認できる。この状態は電気泳動がゾーン電気泳動であることを示しており、等電点収束の条件が確立できていないことを示唆する。つまり、メチルレッドの赤いラインが見えることで電気泳動ができていることとｐＨの状態が確認でき、その赤いラインが収束することで等電点電気泳動条件が確立できていることを確認でき、収束したラインが流出する位置を調整することで回収液の等電点の補正ができる。本実施例では２種の試料を用いたが、メチルレッドの収束位置を調整することで表２に示すように２回の実験データが対応できる物となった。つまり、メチルレッドはフリーフロ−等電点電気泳動のマーカーとなり、その混合によってデータの再現性を得ることが可能な安定したフリーフロー等電点電気泳動を実現することが可能な方法を提供できる。
【００７８】
なお、実施例３は、当然、各種変更が可能である。
例えば、メチルレッドの濃度は０．０２ｗ／ｖ％に限定されず、０．００５〜０．０５  ｗ／ｖ  ％の範囲で変更することができる。この範囲とすることによって色がより明確に確認でき、濃度が濃すぎて収束がしにくくなるということも無い。マーカーとしての最適な濃度は０．０１〜０．０３  ｗ／ｖ  ％の範囲である。また、メチルレッドは他の等電点を有する色素に変更することもできるが、ｐＨによって変色する特性を併せ持った色素が望ましい。チトクロムＣやミオグロビンでも同じマーカーとしての機能は果たすが、チトクロムＣやミオグロビンは有色タンパクであるためその後の分析にもタンパクとしての振る舞いをすることになる。メチルレッドは色素であるため、タンパク染色等の実験では染色されず区別ができる。また、蛍光標識したタンパク質も同様にマーカーとして機能する。蛍光標識タンパクは微量で確認できるのがメリットではあるが、確認できるのは収束状態と流出口位置だけで液のｐＨの確認はできない。また、蛍光で観察することになるためそのための光源やカメラ等の装置構成が必要となる。
【００７９】
また、本実施例では試料溶液中にメチルレッドを含有させたが、試料溶液ではなく緩衝液中に含有させても同じ効果が得られる。緩衝液中に含ませると、試料溶液にメチルレッドを含有させる必要はなくなる。緩衝液中に含ませる場合、メチルレッドの濃度は試料溶液中に含ませる濃度よりも薄い方が望ましい。
【００８０】
【発明の効果】
【課題を解決するための手段】
請求項１に係るフリーフロー電気泳動法は、電気泳動槽に流す緩衝液に液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物とを共に混合させた液を用いるので、「液の粘性を高める水溶性有機化合物」の添加による媒質の拡散の防止や電気浸透流の抑制効果と、「液の粘性を下げる水溶性有機化合物」の添加による液の表面張力を低減による気泡の除去効率の向上、流出口における流出量の安定性向上、及び電気泳動槽への負荷軽減の効果がともに得られ、安定な分取、容易な気泡除去、電気泳動槽への負荷の軽減が可能となる。
【００８１】
請求項２に係るフリーフロー電気泳動法は、フリーフロー等電点電気泳動法であって、緩衝液と陽極側部液と陰極側部液に、液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物とを共に混合させた液を用いているので、等電点電気泳動法においても安定な分取、容易な気泡除去、電気泳動槽への負荷の軽減が可能となる。
【００８２】
請求項３に係るフリーフロー等電点電気泳動法において、陽極電極液と陰極電極液のそれぞれに液の粘性を下げる水溶性有機化合物を混合させた液を用いるので、電極で発生する気泡を容易に除去でき安定した分離が可能なフリーフロー等電点電気泳動法を提供できる。
【００８３】
請求項４に係るフリーフロー電気泳動法において、液の粘性を高める水溶性有機化合物と液の粘性を下げる水溶性有機化合物を共にアルコール類としたので、請求項１のフリーフロー電気泳動法の作用効果に加え、共に溶解性が高いために互いの作用が有効的に発揮できる。
【００８４】
請求項５に係るフリーフロー電気泳動法において、、液の粘性を高める水溶性有機化合物をグリセリン、液の粘性を下げる水溶性有機化合物をエチルアルコール類としたので、上記効果に加え、グリセリンは溶解性が高いため調製を容易とし、エチルアルコールは試料として用いるタンパク質の活性を効果的に保持する。
【００８５】
請求項６に係るフリーフロー電気泳動法において、グリセリンの濃度を０．５〜５  ｖ／ｖ  ％とするので、試料の拡散、適当な粘性の確保、気泡の除去をより確実に実現する。
【００８６】
請求項７に係るフリーフロー電気泳動法において、エチルアルコールの濃度を５〜２０ｖ／ｖ  ％としたので、試料として用いるタンパクの活性を保ちつつエチルアルコールの添加の効果を十分に発揮できる。
【００８７】
請求項８フリーフロー等電点電気泳動法において、試料溶液または緩衝液に等電点を有する色素を含んだ液を用いることによって、色素の挙動により電気泳動糟内の状態を把握し色素の泳動方向によって電気泳動が実現できているか否かを判断でき、さらに色素が細く収束しているか否かによって等電点収束の条件に至っているか否かの判断が可能となる。
【００８８】
請求項９に係るフリーフロー等電点電気泳動法において、等電点を有する色素をｐＨによって変色する特性を有する色素としたので、請求項８の効果に加え、等電点とｐＨによって変色する特性を共に有する色素を用いることで、請求項８の効果に加え、電気泳動糟内のｐＨの状態を確認することができる。
【００８９】
請求項１０フリーフロー等電点電気泳動法において、等電点を有する色素をメチルレッドとしたので、メチルレッドは酸性域で赤色となるｐＨ指示薬で、且つ３．７５の等電点を有すため、例えば、試料溶液にメチルレッドを加えると、試料溶液中ではメチルレッドは淡い黄色の色を呈し、電気泳動槽にて泳動すると、緩衝液にｐＨ勾配が生じ、メチルレッドが陽極側に泳動することで赤いラインとして流れが確認できるようになる。
【００９０】
請求項１１に係るフリーフロー等電点電気泳動法において、メチルレッドの濃度を０．００５〜０．０５  ｗ／ｖ  ％としたので、色の確認がより容易で、かつ適正な濃度と収束が確保できる。
【００９１】
請求項１２に係るフリーフロー等電点電気泳動法において、陽極電極液に陽極側部液と同じ液を、陰極電極液に陰極側部液と同じ液を用いるているので、用いる溶液の種類を少なくすることが可能となり、装置の省スペース化、簡略化が実現できる。
【００９２】
請求項１３に係るフリーフロー等電点電気泳動法において、電界の印加方法を定電流設定としたので、短時間で等電点収束条件を実現することが可能となる。従って本発明は短時間にてフリーフロー等電点電気泳動が可能な方法を提供することができる。
【００９３】
請求項１４に係るフリーフロー等電点電気泳動法において、２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽の間隔を１５０μｍ以下としたので、上記効果に加えて、レイノルズ数が小さくなるために非常に安定な層流が実現できることや、電気泳動糟の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現でき、また、電気泳動糟の容積が小さいため、用いる緩衝液や試料を微量化できる。
【００９４】
請求項１５に係るフリーフロー等電点電気泳動法において、２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽の間隔を１０μｍ〜５０μｍとしたので、高速分離・分取、試料溶液の微量化、緩衝液や電極液の微量化、装置の小型化がより確実に実現される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例に用いるフリーフロー電気泳動素子１の上面図である。
【図２】図１の線ＩＩ−ＩＩに沿う断面図でる。
【図３】電気泳動槽構成基板２の上面図を示す。
【図４】注入口構成基板３の裏面図を示す。
【符号の説明】
１・・・フリーフロー電気泳動素子、２・・・電気泳動槽構成基板、３・・・注入口構成基板、４ａ〜４ｕ・・・緩衝液注入口、５ａ〜５ｅ・・・試料注入口、６ａ〜６ｕ・・・流出口、７ａ、７ｂ・・・電極、８・・・電気泳動槽、９・・・電極室、１０・・・隔壁、
【図１】
2004286665.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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