(57)【要約】【課題】生体試料中には微量しか含まれていないような低分子量のタンパク質の分析が可能となる方法の開発が求められていた。【解決手段】生体試料由来の検査液に含まれる分子量５千〜６万ダルトンのタンパク質の電気泳動法による分析方法であって、（１）外部と連続しながら接する小空間を粒子内部に有し、かつ、当該小空間における外表面以外の粒子における他外表面は当該小空間における外表面に比べて高い親水性を有する粒子に、一次試料である前記検査液を接触させる第一工程、（２）前記第一工程により得られた粒子に極性溶媒を接触させ、二次試料を形成させる第二工程、及び（３）前記第二工程により形成された二次試料を電気泳動分離し、分離された前記タンパク質を検出する第三工程を有することを特徴とする分析方法及びその利用等。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料由来の検査液に含まれる分子量５千〜６万ダルトンのタンパク質の電気泳動法による分析方法であって、
（１）外部と連続しながら接する小空間を粒子内部に有し、かつ、当該小空間における外表面以外の粒子における他外表面は当該小空間における外表面に比べて高い親水性を有する粒子に、一次試料である前記検査液を接触させる第一工程、
（２）前記第一工程により得られた粒子に極性溶媒を接触させ、二次試料を形成させる第二工程、及び
（３）前記第二工程により形成された二次試料を電気泳動分離し、分離された前記タンパク質を検出する第三工程
を有することを特徴とする分析方法。
【請求項２】
第三工程において二次試料を電気泳動分離する方法が、一次元電気泳動法又は二次元電気泳動法であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
第三工程において二次試料を電気泳動分離する方法が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法であることを特徴とする請求項１又は２記載の分析方法。
【請求項４】
生体試料由来の検査液に含まれる分子量５千〜６万ダルトンのタンパク質の取得方法であって、請求項１記載の方法により検出された前記タンパク質を回収する工程を有することを特徴とする取得方法。
【請求項５】
生体試料由来の検査液に含まれる分子量５千〜６万ダルトンのタンパク質の同定方法であって、
（１）請求項１記載の方法により検出された前記タンパク質又は当該タンパク質がペプチド分解により断片化されたペプチドを回収する工程、及び
（２）前工程により回収された前記タンパク質又は断片化されたペプチドを質量分析する工程
を有することを特徴とする同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料由来の検査液に含まれる低分子量タンパク質の電気泳動法による分析方法及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学、バイオサイエンスの分野において、例えば、血液等の生体試料中に微量に含まれるタンパク質の分析は、疾病マーカーとなるタンパク質に基づく検査・検診や新規バイオマーカーとなるタンパク質の探索研究等において重要である。これらの有用なタンパク質には、当該生体試料中には微量しか含まれていないような低分子量のタンパク質も含まれている。
例えば、生体試料が血液である場合、当該生体試料中には多くのタンパク質が含まれており、具体的には、アルブミン、α２マクログロブリン、トランスフェリン等の高分子量タンパク質が全タンパク質の８０  ％以上を占める。それゆえに、何らかの前処理を行わず、当該生体試料をそのまま電気泳動分離し、分離されたタンパク質を検出すると、上記のような高分子量タンパク質が過剰に検出され、微量に含まれる低分子量タンパク質を検出することができなかった（例えば、非特許文献１参照）。
上記のような前処理の方法としては、例えば、アルブミンがチバクロンブルー色素に特異的に吸着することを利用し、前記生体試料中から最も多く含まれるアルブミンを除去する方法が知られている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  、１、１５０３〜１５０６  （２００１）
【０００４】
【非特許文献２】
Ｍｅｔｃａｌｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  、１９９  、４６５〜４７２（１９８１）貢
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、動物種によってアルブミンとチバクロンブルー色素との親和性が違うため、動物種によっては効果が少なく、さらに、チバクロンブルー色素を利用した方法では主としてアルブミンが除去されるだけであり、他のα２マクログロブリン、トランスフェリン等の高分子量タンパク質を除去することはできなかった。その結果、当該前処理が施された生体試料を電気泳動分離し、分離されたタンパク質を検出しても、未だ高分子量タンパク質が過剰に検出され、微量に含まれる低分子量タンパク質を検出することができなかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、生体試料由来の検査液に含まれる低分子量タンパク質の電気泳動法による分析方法について種々検討した結果、一次試料から特定な前処理により高分子量タンパク質が除去された二次試料を形成させ、当該二次試料を電気泳動分離し、分離された分子量５千〜６万ダルトンのタンパク質を検出することにより、前記生体試料中には微量しか含まれていないような低分子量のタンパク質の電気泳動法による分析方法が可能となることを見出し、本発明に至った。
【０００７】
即ち、本発明は、
１．生体試料（以下、本生体試料と記すこともある。）由来の検査液（以下、本検査液と記すこともある。）に含まれる分子量５千〜６万ダルトンのタンパク質（以下、本低分子量タンパク質と記すこともある。）の電気泳動法による分析方法であって、
（１）外部と連続しながら接する小空間を粒子内部に有し、かつ、当該小空間における外表面以外の粒子における他外表面は当該小空間における外表面に比べて高い親水性を有する粒子（以下、本粒子と記すこともある。）に、一次試料である前記検査液を接触させる第一工程、
（２）前記第一工程により得られた粒子に極性溶媒を接触させ、二次試料を形成させる第二工程、及び
（３）前記第二工程により形成された二次試料を電気泳動分離し、分離された前記タンパク質を検出する第三工程
を有することを特徴とする分析方法（以下、本発明分析方法と記すこともある。）；
２．第三工程において二次試料を電気泳動分離する方法が、一次元電気泳動法又は二次元電気泳動法であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
３．第三工程において二次試料を電気泳動分離する方法が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法であることを特徴とする前項１又は２記載の分析方法；
４．生体試料由来の検査液に含まれる分子量５千〜６万ダルトンのタンパク質の取得方法であって、前項１記載の方法により検出された前記タンパク質を回収する工程を有することを特徴とする取得方法（以下、本発明取得方法と記すこともある。）；
５．生体試料由来の検査液に含まれる分子量５千〜６万ダルトンのタンパク質の同定方法であって、
（１）前項１記載の方法により検出された前記タンパク質又は当該タンパク質がペプチド分解により断片化されたペプチドを回収する工程、及び
（２）前工程により回収された前記タンパク質又は断片化されたペプチドを質量分析する工程
を有することを特徴とする同定方法（以下、本発明同定方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明分析方法は、生体試料由来の検査液に含まれる分子量５千〜６万ダルトンのタンパク質の電気泳動法による分析方法であって、（１）外部と連続しながら接する小空間を粒子内部に有し、かつ、当該小空間における外表面以外の粒子における他外表面は当該小空間における外表面に比べて高い親水性を有する粒子に、一次試料である前記検査液を接触させる第一工程、（２）前記第一工程により得られた粒子に極性溶媒を接触させ、二次試料を形成させる第二工程、及び（３）前記第二工程により形成された二次試料を電気泳動分離し、分離された前記タンパク質を検出する第三工程
を有することを特徴とする。
【０００９】
本発明分析方法における「生体試料」（即ち、本生体試料）としては、例えば、各種の生体細胞若しくはそれを含む組織（ここでの組織とは、血液、血漿、血清、リンパ液等の体液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは体分泌物（尿、乳汁等）等のあらゆる生体試料をあげることができる。代表的な本生体試料としては、血液、血漿、血清、リンパ液等の体液があげられる。
本発明分析方法における「生体試料由来の検査液」（即ち、本検査液）は、上記の生体試料が液体状態であればそのまま若しくはその希釈液を検査液として用いてもよく、また、上記の生体試料（肝組織、筋組織、脳組織、心組織等）が非液体状態であれば、例えば、ホモゲナイズ、濾過及び／又は遠心分離すること等により液体状態に調製された生体試料（一般的には、「組織抽出液」と呼ばれることもある。）若しくはその希釈液を検査液として用いてもよい。
生体試料の希釈液は、後述の極性溶媒を含んでいてもよく、当該極性溶媒を含んだ酸性、塩基性又は中性の水溶液若しくは水性緩衝液であってもよい。
【００１０】
本発明分析方法における第一工程において用いられる「粒子」（即ち、本粒子）とは、外部と連続しながら接する小空間を粒子内部に有し、かつ、当該小空間における外表面以外の粒子における他外表面は当該小空間における外表面に比べて高い親水性を有する粒子である。ここで「外部と連続しながら接する小空間を粒子内部に有」する粒子とは、例えば、一般的には、多孔質粒子と呼ばれることもあるものであって、その粒子径は約０．５〜５００μｍ（好ましくは約２０〜２００μｍ）の範囲である球状（即ち、ビーズの形態）のものが好ましい。当該粒子の比表面積は、例えば、約２００〜８００ｍ２／ｇの範囲であることが好ましい。
また「小空間における外表面以外の粒子における他外表面は当該小空間における外表面に比べて高い親水性を有する粒子」とは、例えば、粒子内部に存在する小空間における外表面以外の粒子における最外表面（即ち、粒子外部に接する最外表面）には主として親水性の基を有し、かつ、粒子内部に存在する小空間における外表面（即ち、粒子内部に存在する外表面）には主として疎水性基又はイオン交換性の基を有する粒子であって、前記の粒子外部に接する最外表面がジオール基等の親水性の基を持った構造のものが好ましい。尚、本粒子の選定は適宜予備実験により決められるが、一般的には、極性の比較的低いの本低分子量タンパク質に対しては粒子内部に存在する外表面に疎水性の基を有する粒子が、極性の比較的高い本低分子量タンパク質に対しては粒子内部に存在する外表面にイオン交換基を有する粒子が好ましく用いられる。
【００１１】
本粒子は、１種以上の疎水性モノマーと１種以上の親水性モノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマー（ａ  ｗａｔｅｒ−ｗｅｔｔａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ）の製造方法と準じた方法により製造することができる。
尚、ここで「水湿潤性ポリマー」とは、水によって部分的又は全面的に溶媒和されるポリマーを表わしている。また「モノマー」とは、１つ以上の重合可能な官能基を含んだ重合前の分子、及びポリマーの反復構造単位を表わす。「ポリマー」は２種以上の異なったモノマーを含んでもよく、この場合は「コポリマー」とも呼ばれる。コポリマーが含んでいるあるモノマーの「モル％」とは、コポリマーを構成している種々の（２種以上の）モノマーの総モル数に対する当該モノマーのモル分率（％で表示）を意味している。
疎水性モノマーは疎水性部分を含んでよい。好ましい疎水性部分としては、フェニル基、フェニレン基又は炭素原子数２〜１８個のアルキル基をあげることができるが、これらに限定されない。より具体的には、例えば、ジビニルベンゼン、スチレン等がより好ましい疎水性モノマーとしてあげられる。
親水性モノマーは親水性部分を含んでよい。好ましい親水性部分としては、飽和、不飽和又は芳香族の複素環式基（具体的には、例えば、ピロリドニル基、ピリジル基等）をあげることができる。他の好ましい親水性部分としては、エーテル基をあげることができる。より具体的には、例えば、Ｎ−ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルビリジン、エチレンオキシド等がより好ましい親水性モノマーとしてあげられる。
例えば、本粒子がポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーからなる多孔質ポリマーの場合には、例えば、米国特許第４，３８２，１２４号等に記載されるような通常のラジカル重合方法を使用して、ジビニルベンゼンとＮ−ビニルピロリドンとを共重合させることによって製造すればよい。
尚、得られるコポリマーの組成は、上記２種のモノマーの最初の化学量論により決定されるが、モノマー間の反応性の差のために出発物質の比率とは実質的に同じとならない場合もある。本粒子がポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーからなる多孔質ポリマーの場合、例えば、５〜３０モル％程度（好ましくは１０〜２５モル％程度、より好ましくは１５〜２０モル％程度）のＮ−ビニルピロリドンを含むという組成において本低分子量タンパク質の好ましい回収率が得られる。
【００１２】
本発明分析方法における第一工程において、本粒子に一次試料である本検査液を接触させるには、本粒子と本検査液との密な接触を可能にするいかなる方法（例えば、バッチプロセス又はクロマトグラフィープロセス）で本粒子に本検査液を接触させてもよい。例えば、本検査液を本粒子が充填されたカラム、ディスク又はプラグに強制的に通してもよいし、或いは本検査液を本粒子と共に、例えば、バッチ攪拌反応器において攪拌してもよい。本検査液はさらに、マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）の本粒子含有ウェル（ｐｏｌｙｍｅｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｗｅｌｌ）に加えてもよい。本粒子は、例えば、ビーズの形態やペレットの形態をとってもよい。本検査液は、本低分子量タンパク質が本粒子上に吸着するのに充分な時間に渡って本粒子と接触させる。当該時間は、通常、本低分子量タンパク質が本粒子の外表面と本検査液との間で平衡になるのに必要な時間である。本粒子上への本低分子量タンパク質の吸着又は分配は、部分的であっても全体的であってもよい。
尚、本粒子は、本検査液との接触の前に本粒子を水混和性の有機溶媒で処理し、次いで水または水性緩衝液で処理してから、本検査液を本粒子と接触させてもよいし、また、本検査液との接触の前に本粒子が湿潤されていない状態（即ち、本粒子が乾燥した状態）で、本検査液を本粒子と接触させてもよい。
【００１３】
本粒子に本検査液を接触させるために、本粒子を充填したカラムに本検査液を供する場合には、端部が開放された容器中に本粒子を充填して固相抽出カートリッジを形成させる。当該容器は、例えば、本検査液が一方の端部から容器に入り、容器中で本粒子と接触し、そして他方の端部から容器を出ていくよう、両端が開放された円柱形容器又はカラムであってよい。本粒子を容器中に充填することができる。尚、前記固相抽出カートリッジは、本粒子を当該カートリッジ中に保持するために、そして本検査液が当該カートリッジ中に流入するときに、当該カートリッジへの本検査液の出入りを可能にしつつ不溶固体物質を本検査液から除去するために、本粒子に隣接した当該カートリッジの一端又は両端に多孔質保持手段（例えば、フィルターエレメント又はフリット）をさらに含んでもよい。このようなフィルターは、例えば、溶融ガラス又は多孔質ポリマー（例えば多孔質高密度ポリエチレン）から造り上げることができる。
固相抽出カートリッジは、単一サンプルの処理にて使用してから廃棄するという一回使用カートリッジであっても、或いは複数のサンプルを処理するのに使用できるようなカートリッジであってもよい。
前記容器中の本粒子の量は、容器の体積によって限定され、約０．００１ｇ〜約５０ｇの範囲であることが好ましいが、より好ましくは約０．０２５ｇ〜約１ｇである。本粒子の量は、吸着させようとする本低分子量タンパク質の量、本粒子の有効表面積、及び、本低分子量タンパク質と本粒子との間の相互作用の強さに応じて適宜決定すればよい。
【００１４】
本粒子に本検査液を接触させるために本粒子を充填したカラムに本検査液を供する場合において、当該カラムとして端部が開放された容器中に本粒子を充填して形成された固相抽出カートリッジを使用する場合には、本検査液を固相抽出カートリッジの上部に加え、当該カートリッジに自然流の状態で流し、吸着させようとする本検査液を本粒子と接触させる。本検査液は、重力に従って当該カートリッジを流れることができる。当該カートリッジの両端間に圧力差をつけることによって流量の増大を達成することができる。このような圧力差は、当該カートリッジの下端に減圧源を取り付けることによって、当該カートリッジの上端に正圧を加えることによって（例えば、当該カートリッジの上部に加圧ガス（例えば、空気や窒素）を加えることにより）、或いは本粒子より上の当該カートリッジ内の空気をピストン又はプランジャーで圧縮することによって造り出すことができる。当該カートリッジを通る本検査液の流量は、カートリッジ両端の圧力差を調節することによって変えることができる。
【００１５】
本検査液の通液速度、通液時間は本低分子量タンパク質の種類、前記カラムの種類等により異なり、最適条件は適宜予備実験により決められるが、一般的には、約０．５〜２ｍｌ／分で約０．５〜１０分間通液することにより、本検査液に含まれる本低分子量タンパク質を本粒子内に吸着させることができる。尚、適切な溶液流量（溶液の線速度で表示）としては、例えば、最高約１４ｍｍ／秒程度をあげることができるが、好ましくは、約０．７〜３．５ｍｍ／秒程度があげられる。このようにして、本検査液に含まれる高分子量タンパク質を除去しながら、本検査液に含まれる本低分子量タンパク質のみを本粒子内に吸着させる。
【００１６】
このようなカラムとしては、例えば、Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ（商品名）（ウォーターズ製）、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ  Ｌ−１１８０（商品名）（化学品検査協会製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＰＴ  Ｃ８−５（商品名）（野村化学製）、  Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＰＣＡＥ１（商品名）（島津製作所製）、ＴＳＫ  ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ  ＰＷ（商品名）（東ソー製）等を挙げることができる。
【００１７】
本発明分析方法における第二工程において、前記第一工程により得られた粒子に極性溶媒を接触させ、二次試料を形成させるには、当該粒子と極性溶媒との密な接触を可能にするいかなる方法（例えば、バッチプロセス又はクロマトグラフィープロセス）で当該粒子に極性溶媒を接触させてもよい。
【００１８】
例えば、前記第一工程において本粒子に一次試料である本検査液を接触させるために本粒子を充填したカラムに一次試料である本検査液を供した場合には、極性溶媒を当該カラムに通液すればよい。そして当該カラムとして、端部が開放された容器中に本粒子を充填して形成された固相抽出カートリッジを使用した場合には、極性溶媒を固相抽出カートリッジの上部に加え、当該カートリッジに自然流の状態で流し、本粒子に極性溶媒を接触させる。極性溶媒は、重力に従って当該カートリッジを流れることができる。当該カートリッジの両端間に圧力差をつけることによって流量の増大を達成することができる。このような圧力差は、当該カートリッジの下端に減圧源を取り付けることによって、当該カートリッジの上端に正圧を加えることによって（例えば、当該カートリッジの上部に加圧ガス（例えば、空気や窒素）を加えることにより）、或いは本粒子より上の当該カートリッジ内の空気をピストン又はプランジャーで圧縮することによって造り出すことができる。当該カートリッジを通る極性溶媒の流量は、カートリッジ両端の圧力差を調節することによって変えることができる。
【００１９】
極性溶媒の通液速度、通液時間は一次試料の種類、当該カラムの種類等により異なり、最適条件は適宜予備実験により決められるが、一般的には、約０．１〜２ｍｌ／分、好ましくは約０．１ｍｌ／分〜１ｍｌ／分、より好ましくは約０．２〜０．５ｍｌ／分で約０．５〜１５分間、好ましくは約５〜１０分間通液することにより、当該カラムを通過した極性溶媒を回収して二次試料を形成させることができる。尚、適切な溶液流量（溶液の線速度で表示）としては、例えば、最高約１４ｍｍ／秒程度をあげることができるが、好ましくは、約０．７〜３．５ｍｍ／秒程度があげられる。このようにして、本粒子内に吸着させた本低分子量タンパク質が当該粒子から脱着又は溶離されるよう当該粒子を極性溶媒で洗浄し、これによって本低分子量タンパク質を含んだ二次試料が形成される。
【００２０】
本発明分析方法における第二工程において用いられる極性溶媒としては、第一工程において用いられた本粒子との組み合わせに適する極性溶媒であれば特に限定されないが、無機塩類を含まない極性溶媒が好ましく用いられる。
極性溶媒としては、例えば、極性の水混和性有機溶媒若しくは水／有機溶媒混合液、又は、それら液体若しくは水に有機酸を含有させた混合液等をあげることができる。極性の水混和性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール及びイソプロパノール等のアルコール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン等があげられ、また、水／有機溶媒混合液で用いられる有機溶媒としては、例えば、上記の極性の水混和性有機溶媒の他、無極性若しくは適度に極性の水不混和性溶媒（例えば、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、クロロホルム又は酢酸エチル）があげられる。さらにこれら溶媒の混合液であってもよい。尚、極性の水混和性有機溶媒を利用することにより、ＭｃＤｏｎａｌｄ  ａｎｄ  Ｂｏｕｖｉｅｒ，ｓｕｐｒａ，（１９９５）；Ｓｎｙｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９７４）等に記載される情報を利用すれば、過度の実験を行わなくても適切な溶媒を決定することができるので、例えば、アセトニトリル又はメタノール等を特に好ましいものとしてあげることができる。一般的には、当該極性の水混和性有機溶媒の含有量は約５０〜１００重量％であり、好ましくは５０〜８０重量％、より好ましくは約５０〜６０重量％である。
【００２１】
極性溶媒としては、極性の水混和性有機溶媒若しくは水／有機溶媒混合液、又は、水に含有される有機酸としては、例えば、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸等をあげることができる。好ましくは、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸等があげられる。含有される有機酸の量としては、約０．０５〜２重量％をあげることができる。好ましくは約０．１〜１重量％、より好ましくは０．１〜０．２重量％があげられる。
【００２２】
本発明分析方法における第三工程において用いられる電気泳動としては、タンパク質を分離し得るいかなる電気泳動法であってもよく、特に限定されない。尚、必要に応じて二次試料に含まれる有機溶媒や有機酸を除去する場合には、例えば、乾燥することにより容易になすことができる。そして電気泳動に供する前に、乾燥された二次試料を適当な溶媒に再溶解すればよい。
【００２３】
例えば、ＳＤＳを含む溶液に乾燥させた二次試料を再度溶解させた後、これをＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いた一次元電気泳動に供して本低分子量タンパク質を分離することができる。また、尿素若しくはチオ尿素を含む溶液に二次試料を再度溶解させた後、これを一次元目に等電点電気泳動を供し、次いで二次元目にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供するニ次元電気泳動により本低分子量タンパク質を分離することもできる。
【００２４】
本発明分析方法における第三工程において分離された本低分子量タンパク質を検出するには、タンパク質を検出し得るいかなる検出法であってもよく、特に限定されない。例えば、色素クーマシーブリリアントブルーＲ２５０により本低分子量タンパク質を染色して検出することができる。
染色された本低分子量タンパク質の検出は、その電気泳動像から目視、デンシトメーター、画像解析システム等を利用すればよい。画像解析システムとしては、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＰＤＱｕｅｓｔ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ等があげられる。
尚、電気泳動像を分析する際には、例えば、本検査液での電気泳動像と対照での電気泳動像との差異に基づき本低分子量タンパク質を検出することもできる。
【００２５】
このようにして本発明分析方法により検出された本低分子量タンパク質を回収することにより、本検査液から本低分子量タンパク質を取得するもできる。例えば、本発明分析方法における第三工程で用いられる電気泳動において、ポリアクリルアミドゲルが利用された場合には、当該ゲルから本低分子量タンパク質を容易に抽出し回収することができる。抽出する方法は特に限定されないが、例えば、トリプシンを利用して当該ゲル中で本低分子量タンパク質をペプチドに断片化し抽出する方法、電気泳動的に膜へ転写し抽出する方法等の通常の方法があげられる。
【００２６】
さらに、このようにして本発明分析方法により検出された本低分子量タンパク質又は当該タンパク質がペプチド分解により断片化されたペプチドを回収することにより、本検査液に含まれる本低分子量タンパク質を同定することもできる。本低分子量タンパク質を同定する方法は、特に限定されないが、例えば、断片化されたペプチドを、ＥＳＩイオン化法等を用いるイオントラップ型質量分析装置や四重極−飛行時間型質量分析装置にて質量分析したり、ＭＡＬＤＩイオン化法等を用いる飛行時間型質量分析装置にて質量分析すればよい。また、電気泳動的に膜へ転写し抽出した後、本低分子量タンパク質に特異的な抗体を用いて当該タンパク質をイムノアッセイすればよい。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１  （本検査液の調製）
本生体試料としてマウス血清（シグマアルドリッチジャパン製）を用いた。マウス血清１００μｌに、ヒト成長ホルモン（シグマアルドリッチジャパン製）、ミオグロビン（シグマアルドリッチジャパン製）、オボアルブミン（シグマアルドリッチジャパン製）、それぞれ１０μｇずつを添加し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（アプライドバイオシステムズジャパン製）水溶液を加え、全体を１ｍｌとすることにより、本検査液を調製した。
【００２９】
実施例２  （本粒子の製造：ポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーの製造）
５０ｇのヒドロキシプロピルメチルセルロース（ダウケミカル製）を１０００ｍｌの水に溶解して得られる溶液を３０００ｍ１のフラスコに加える。１７５ｇのジビニルベンゼン（ＤＶＢ  ＨＰ−８０，ダウケミカル製）、１０２ｇのＮ−ビニル−２−ピロリドン（インタナショナル・スペシャルティ・プロダクツ製）及び１．８５ｇのアゾビスイソブチロニトリル（Ｖａｚｏ６４，デュポンケミカル製）を２４２ｇのトルエン中に溶解して得られる溶液を上記混合物に加える。こうした得られる二相混合物を室温にて３０分間充分に攪拌して、所望のミクロンサイズの油滴を形成させる。次いで得られる懸濁液を適度に撹拌しながら７０℃に加熱し、当該温度で２０時間保持する。次いでこの懸濁液を室温に冷却し、濾過し、そしてメタノールで洗浄する。得られる濾過ケークを、減圧にて８０℃で１６時間乾燥する。ポリマー生成物の組成は元素分析によって求める。ジビニルベンゼンモノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとの出発比率を変えることにより、本実施例に記載される方法に従って約１３、１４、１６及び２２モル％のＮ−ビニルピロリドンを含む一連のポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）を製造する。
このようにして製造される各ポリマー５０ｍｇを、ポリマー層の入口と出口とにポリエチレンフリットを要する１ｃｃのＳｅｐ−Ｐａｋ  ＶａｃＲカートリッジ容器（ウォーターズ・コーポレーション製）中に充填することにより、固相抽出カートリッジを形成させる。
【００３０】
実施例３  （本粒子の調製）
本粒子３０ｍｇが１ｍｌのシリンジに充填されたカラムとして、市販のＯａｓｉｓ  ＨＬＢ（商品名）（ウォーターズ製）を用いた。当該カラムに、０．１％  トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル（関東化学製）水溶液を通液することにより、本粒子を洗浄した。次いで、１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む水溶液を通液することにより、本粒子を平衡化した。
【００３１】
実施例４  （本発明分析方法における第一工程）
実施例１で調製された本検査液１ｍｌを、実施例３で平衡化された本粒子がシリンジに充填されたカラムに室温にて流速１ｍｌ／ｍｉｎで通液した。
次いで、このようにして得られたカラムに、１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む水溶液を通液することにより、本粒子を洗浄した。
【００３２】
実施例５  （本発明分析方法における第ニ工程）
実施例４で洗浄された本粒子がシリンジに充填されたカラムに、１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル水溶液を通液し、当該カラムから排出された溶出液を二次試料として回収した。
【００３３】
実施例６  （本発明分析方法における第三工程）
回収された溶出液（即ち、二次試料）をＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮乾燥機（Ｓｅｒｖａｎｔ社製）にて乾燥することにより、トリフルオロ酢酸及びアセトニトリルを除去しながら、乾固した二次試料を得た。
次いで、このようにして得られた二次試料を水１ｍｌに再溶解された電気泳動用試料と、実施例１で調製された本検査液とを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いた一次元電気泳動（トリス−グリシン緩衝液中、２００Ｖの定電圧で４０分間の電気泳動）に供して本低分子量タンパク質を分離した。尚、当該ゲルとしては、１５〜２５％の密度勾配を有するＳＤＳポリアクリルアミドゲル（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ製）が使用された。電気泳動を終了した後、当該ゲルをクーマシーブリリアントブルー染色キットＱｕｉｃｋ  ＣＢＢ（商品名）（和光純薬工業製）に３０分間浸した後、水で洗浄した。
このようにして得られた結果を図１に示した。図中の左レーン（レーン▲１▼：比較のための電気泳動像／実施例１で調製された本検査液）では、高分子量タンパク質である血清アルブミン（６６ｋＤａ）のみ検出されており、本低分子量タンパク質であるミオグロビン（１６ｋＤａ）、ヒト成長ホルモン（２３ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）を検出することができなかった。これに対して図中の右レーン（レーン▲２▼：本発明のための電気泳動像／実施例１〜６で調製された電気泳動用試料）では、本低分子量タンパク質であるミオグロビン、ヒト成長ホルモン、オボアルブミンのバンドが検出できた。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により、生体試料中には微量しか含まれていないような低分子量のタンパク質の電気泳動法による分析方法が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いた一次元電気泳動に供してタンパク質を分離した後、当該ゲルをクーマシーブリリアントブルー染色キットで染色することで検出した結果である電子泳動像を示す図（写真）である。図中の左レーン（レーン▲１▼：比較のための電気泳動像／実施例１で調製された本検査液）では、高分子量タンパク質である血清アルブミン（６６ｋＤａ）のみ検出されており、本低分子量タンパク質であるミオグロビン（１６ｋＤａ）、ヒト成長ホルモン（２３ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）を検出することができなかった。これに対して図中の右レーン（レーン▲２▼：本発明のための電気泳動像／実施例１〜６で調製された電気泳動用試料）では、本低分子量タンパク質であるミオグロビン、ヒト成長ホルモン、オボアルブミンのバンドが検出できた。
【図１】
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