(57)【要約】【課題】ＳＡＭの精製を明らかに単純化する、細菌を用いるＳＡＭの発酵産生法。【解決手段】ＳＡＭ合成酵素を有する出発株から入手可能であり、かつ出発株と比較してＳＡＭ合成酵素の強化された活性を有する細菌株を培地中で培養し、その際、細菌株はＳＡＭを培地中へ分泌し、かつＳＡＭを培地から分離する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の発酵産生法において、出発株から入手可能であり、出発株と比較してＳＡＭ合成酵素の強化された活性を有する細菌株を、培地中で培養し、その際には、細菌株がＳＡＭを培地中へ分泌し、かつＳＡＭを培地から分離することを特徴とする、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の発酵産生法。
【請求項２】
細菌株として、腸内細菌科、特に好ましくはエシェリキア属からの株を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＳＡＭ合成酵素として、配列SEQ ID NO: 1を含むタンパク質又は４０％を上回る、好ましくは６０％を上回る、特に好ましくは８０％を上回るSEQ ID NO: 1への配列類似性を有する機能的変異体を使用する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
細菌株を最少塩培地中で培養する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
炭素源としてグルコース又はグリセリンを使用する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
窒素源として尿素、アンモニア又はその塩又は硝酸塩を使用する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
細菌株のインキュベーションを、好気的培養条件下で、１６〜１５０ｈの期間に亘り、それぞれの細菌株に最適な成長温度の範囲内で行う、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
最少塩培地にＬ−メチオニンを添加し、その際には、０．０５〜２５ｇ／ｌの濃度での添加が好ましく、かつ１〜５ｇ／ｌの濃度での添加が特に好ましい、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
最少塩培地にＤ，Ｌ−メチオニンを添加し、その際には、０．０５〜２５ｇ／ｌの濃度での添加が好ましく、かつ１〜５ｇ／ｌの濃度での添加が特に好ましい、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
培地からのＳＡＭの取得を、培地を遠心分離し、引き続きＳＡＭをクロマトグラフィーにより精製するか、錯化するか、例えば十字流ろ過のようにろ過するか、又は沈殿させることにより行う、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素を過剰産生する細菌株の使用下でのＳ−アデノシルメチオニンの発酵製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）は、物質代謝における最も重要なメチル基供与体であり、かつ薬学分野において、うつ病、肝臓疾患及び関節炎の治療の際に使用される。記載されたＳＡＭ製造法には、前駆物質であるＬ−メチオニンの存在での酵母の培養（Schlenk F.及びDePalma R.E., J. Biol. Chem. 1037-1050 (1957), Shiozaki S.他, Agric. Biol. Chem. 53, 3269-3274 (1989)）及び細胞溶解産物から抽出した後に形成されたＳＡＭのクロマトグラフィーによる精製(US4562149)が包含される。この方法の欠点は、とりわけ、形成されたＳＡＭの費用のかかる精製である、それというのも、細胞はまず最初に破壊され、かつＳＡＭは、他の全ての細胞構成要素、例えばアミノ酸、糖、脂質、ヌクレオチド、タンパク質、補因子並びに他の高分子量化合物及び低分子量化合物から分離されなければならないからである。この理由から、ＳＡＭの発酵産生法の開発は、培養上清中への形成されたＳＡＭの選択的分泌、ひいては精製法の単純化が可能となる場合に、現存の方法に対して明らかな利点を有するであろう。培養上清中には、ごく僅かな物質のみが存在するに過ぎず、そのためにＳＡＭの分泌が既に第一の精製工程であり、かつさらなる精製が明らかに軽減されるであろう。
【０００３】
GB1436509には、酵母、例えばカンジダ−トロピカリスによるＳＡＭの細胞外産生法が記載されている。この方法の欠点は、使用された産生株が、ＧＲＡＳ−状態（一般的に安全であると認識される；generally recognized as safe）を有するのではなくて、一部ではそれどころか病原性生物として評価されうる異例な菌類であることによる。そのうえ、これらの生物は、遺伝的手法で入手困難であり、かつその物質代謝は、広範囲に及び公知ではない。そのため、代謝工学により改善するための２つの必須条件が欠けている。それに反して細菌は遺伝的に容易に入手可能であり、物質代謝が多くの種について十分研究されており、かつＧＲＡＳ−状態を有する多くの非病原性種が存在する。故に、ＳＡＭが細菌により産生される方法が極めて望ましいであろう。しかしながら、これまで、細菌中のＳＡＭの細胞外産生は公知ではない。
【０００４】
Ｓ−アデノシルメチオニンの合成は、特に、大腸菌（Escherichia coli；E. coli）中で集中的に調査されていた(Greene, R.C., Biosynthesis of Methionine in: Neidhardt F.C., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and molecular biology, 第2版, ASM Press, Washington DC (1996), 542-560頁及びそこに含まれている参考文献)。ＳＡＭの合成は、Ｌ−メチオニンの費用がかかり、高度に制御された合成に引き続いて、Ｌ−メチオニン及びＡＴＰから１工程で行われる。その際、３つ全てのリン酸基は、ＡＴＰから、無機リン酸及びピロリン酸を生じながら遊離する。この反応は、大腸菌中で遺伝子metKによりコードされる酵素：Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素（EC 2.5.1.6、メチオニン−アデノシルトランスフェラーゼ、ＳＡＭ合成酵素）により触媒される。この酵素は、生化学的にかつ遺伝的に詳細にキャラクタリゼーションされ、かつ極めて厳密な最終産物阻害（フィードバック制御）を示す。すなわち、酵素の活性は、過剰量のＳＡＭの存在で強く阻害されている（Markham他, J. Biol. Chem., 9082-9092 (1980)）。このフィードバック制御は、エネルギーを消費するＳＡＭの不必要な合成並びに細胞中の高すぎる、ことによると細胞には有害なＳＡＭレベルを防止するが、しかしＳＡＭの発酵による過剰産生も邪魔している。他の生物（サッカロミケス−セレビジェ(Saccharomyces cerevisiae)、メタノコッカス−ジャナシイ(Methanococcus janaschii)、ラット）のＳＡＭ合成酵素は同様に調査され、これらは同様にＳＡＭによる阻害性を示すが、しかしながらこの阻害性は大腸菌のＳＡＭ合成酵素の場合ほど顕著ではない（Park他, Bioorgan. Med. Chem., 2179-2185 (1996); Lu and Markham, J. Biol. Chem., 16624-16631 (2002); Oden及びClarke, Biochemistry, 2978-2986 (1983)。
【０００５】
他の生物（例えば酵母）とは違って、細菌中にはＳＡＭのための輸送系が存在せず、かつ細菌は故に、この物質を培地から吸収できないので、ＳＡＭ合成酵素は必須酵素である。大腸菌のＳＡＭ合成酵素は、過剰産生されることができ、このことは細胞中の酵素量の増加をもたらした（Markham他, J. Biol. Chem., 9082-9092 (1980)）。しかしながら、過剰産生が細胞中のＳＡＭ量の増加ももたらすことは公知ではない。このことは見込まれうることでもない、それというのも、細胞中のＳＡＭの蓄積は上述のＳＡＭ合成酵素のフィードバック制御により防止されるからである。ＳＡＭの細胞内産生は、すなわち、ＳＡＭ合成酵素の活性の制御により制限されている。
【０００６】
それに反して、ラット肝からのＳＡＭ合成酵素の過剰産生により、大腸菌中の細胞内ＳＡＭレベルは、明らかに高められることができた（Alvarez他, Biochem. J., 557-561 (1994); EP0647712A1）。これは可能である、それというのも、このＳＡＭ合成酵素は、大腸菌からの同種酵素のように厳密なフィードバック制御の影響下にはなく、かつこうして細菌中の制御が回避されるからである。しかしながら、ここでも、ＳＡＭの細胞外蓄積が観察されなかった。
【特許文献１】US4562149
【特許文献２】GB1436509
【特許文献３】EP0647712A1
【特許文献４】JP2000139471A
【特許文献５】DE-A-10247437
【特許文献６】DE-A-10249642
【非特許文献１】Schlenk F.及びDePalma R.E., J. Biol. Chem. 1037-1050 (1957)
【非特許文献２】Shiozaki S.他, Agric. Biol. Chem. 53, 3269-3274 (1989)
【非特許文献３】Greene, R.C., Biosynthesis of Methionine in: Neidhardt F.C., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and molecular biology, 第2版, ASM Press, Washington DC (1996)
【非特許文献４】Markham他, J. Biol. Chem., 9082-9092 (1980)
【非特許文献５】Park他, Bioorgan. Med. Chem., 2179-2185 (1996)
【非特許文献６】Lu and Markham, J. Biol. Chem., 16624-16631 (2002)
【非特許文献７】Oden及びClarke, Biochemistry, 2978-2986 (1983)
【非特許文献８】Alvarez他, Biochem. J., 557-561 (1994)
【非特許文献９】Fuerste他, Gene, 119-131 (1986)
【非特許文献１０】Pharmacol. Ther., 265-280 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ＳＡＭの精製を明らかに単純化する、細菌を用いるＳＡＭの発酵産生法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この課題は、ＳＡＭ合成酵素を有する出発株(Ausgangsstamm)から入手可能であり、かつ出発株と比較してＳＡＭ合成酵素の強化された活性を有する細菌株が、培地中で培養され、その際、細菌株はＳＡＭを培地中へ分泌し、かつＳＡＭは培地から分離されることにより特徴付けられる方法により解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
細菌、とりわけ大腸菌中のＳＡＭ合成酵素が、前記のように厳密なフィードバック制御の影響下にあるという事実を考慮すれば、活性が上昇する際に、ＳＡＭ産生の増加が観察されうることは意外である。特に、過剰産生されたＳＡＭが培養上清中へ分泌されることは、全く予期されていない。上記のように、発酵製造されたＳＡＭが、細菌により培養上清中へ放出される例は存在しない。特に、細菌中でＳＡＭのための輸送系は公知ではなく、かつＳＡＭは、培地から吸収されることもできない。外に向けての受動的な拡散は、ＳＡＭのように大きく、そのうえ帯電した分子の場合には極端にありえない。故に、ＳＡＭの細胞外豊富化は、当業者には完全に意外である。
【００１０】
本発明による方法の利点は、上昇したＳＡＭ産生及び培養上清からの軽減された後処理からもたらされる。この方法は、通常はＳＡＭの細胞内蓄積を防止する厳密な産物阻害を受けているＳＡＭ合成酵素によっても上昇したＳＡＭ産生を可能にし、それにより産生したＳＡＭが培養上清中へ分泌され、ひいてはＳＡＭ合成酵素はもはや阻害されない。
【００１１】
さらにまた、意外にも、技術水準とは違って、本発明による方法においてＬ−メチオニンの代わりに、前駆物質としてＤ，Ｌ−メチオニンも使用されることができることが確認された。後者は、著しく費用がかからず、それゆえ製造費用の場合の徹底的な節約を可能にする。
【００１２】
それゆえ、本発明は、ＳＡＭ合成酵素を有する出発株から入手可能であり、かつ出発株と比較してＳＡＭ合成酵素の強化された活性を有する細菌株が、Ｄ，Ｌ−メチオニンを含有する培地中で培養され、その際、細菌株はＳＡＭを培地中へ分泌し、かつＳＡＭは培地から分離されることにより特徴付けられる方法にも関する。
【００１３】
好ましくは、本発明による方法において、ＳＡＭ合成酵素として配列SEQ ID NO: 1を含むタンパク質又は４０％を上回るSEQ ID NO: 1への配列類似性を有する機能的変異体が使用される。
【００１４】
６０％を上回るSEQ ID NO: 1への配列類似性が好ましく、８０％を上回るSEQ ID NO: 1への配列類似性が特に好ましい。
【００１５】
本発明において、言及された全ての相同の値は、アルゴリズムBESTFIT(GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wisconsin)を用いて得られた結果に基づいている。本発明は、前記のＳＡＭ合成酵素にも関する。
【００１６】
好ましくは、本発明による方法において、前記のＳＡＭ合成酵素のための遺伝子（以下にmetK遺伝子とも呼ぶ）が使用される。これは、配列SEQ ID NO:2を有する遺伝子又はこの遺伝子の機能的変異体である。
【００１７】
機能的変異体は、本発明の意味で、ヌクレオチドの欠失、挿入又は置換により、SEQ ID NO: 2 に示された配列から誘導されるＤＮＡ塩基配列であると理解されるべきであり、その際、遺伝子によりコードされたＳＡＭ合成酵素の酵素活性は得られたままである。
【００１８】
強化された活性は、本発明の意味で、好ましくは、本発明により使用される細菌株中のＳＡＭ合成酵素の活性が、それぞれの出発株と比較して、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍上昇していることであると理解されるべきである。
【００１９】
本発明による方法において使用され、かつ出発株に対して高められたＳＡＭ合成酵素活性を有する細菌株は、分子生物学の標準技術を用いて、出発株、通例野生型株から生み出されることができる。
【００２０】
多数の出発株中で、ＳＡＭ合成酵素遺伝子が同定されることができた。本発明による方法において使用される細菌株は、それゆえ、好ましくは原核生物の出発株から製造されうるものであり、これらの株は、発酵により培養可能であり、かつＳＡＭを培地中へ分泌することを可能にする組換え法で入手可能である。好ましくは、腸内細菌科、特に好ましくはエシェリキア属からの細菌株が重要であり、殊に好ましくは大腸菌種の株が重要である。その際、特に外来遺伝子(Fremdgene)を含まない大腸菌株の使用が好ましい。
【００２１】
出発株と比較して強化されたＳＡＭ合成酵素の活性は、原則的に、多様なバッチ(Ansaetze)により達成されることができる。
【００２２】
ＳＡＭ合成酵素のための遺伝子は、それによりコードされた酵素が出発酵素よりも高い活性を有するように変更されることができる。これは、例えばＳＡＭ合成酵素のための遺伝子の非特異的又は意図的な突然変異生成により行われてよい。非特異的突然変異は、例えば化学薬剤（例えば１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸及びこれに類するもの）により、及び／又は物理的方法により、及び／又は特定の条件下で実施されるＰＣＲ反応により、及び／又はミューテーター株（例えばXL1-Red、Stratagene、アムステルダム、NL）中のＤＮＡの増幅により、生み出されることができる。ＤＮＡフラグメント内部の特異的な位置での突然変異の導入方法は公知である。出発酵素と比較して上昇した活性を有するＳＡＭ合成酵素の製造のための別の可能性は、多様な前記方法の組合せにある。
【００２３】
出発株と比較して強化されたＳＡＭ合成酵素の活性を達成するための別の可能性は、この酵素のためにコードする遺伝子の過剰発現である。過剰発現は、本発明の意味で、好ましくは、ＳＡＭ合成酵素遺伝子が、ＳＡＭ合成酵素遺伝子が取得されているそれぞれの出発株と比較して、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍増えて発現されることであると理解されるべきである。
【００２４】
株中のmetK遺伝子の過剰発現を達成するために、細菌株中のmetK遺伝子のコピー数は、高められることができ、及び／又はmetK遺伝子の発現は、好ましくは適しているプロモーターにより上昇されうる。
【００２５】
metK遺伝子のコピー数の増大は、出発株細胞中で、当業者に公知の方法を用いて達成されることができる。こうして、例えば、metK遺伝子は、細胞１個当たりの複数回のコピー数を有するプラスミドベクター（例えば大腸菌についてはpUC19、pBR322、pACYC184）中へクローニングされ、かつ株中へ導入されることができる。選択的に、metK遺伝子は、細胞の染色体中へ複数回組み込まれることができる。組込み方法として、溶原性バクテリオファージを有する公知の系、インテグラティブプラスミド又は相同組み換えを経ての組込みが利用されることができる。
【００２６】
プロモーターを制御しながらプラスミドベクター中へのmetK遺伝子のクローニングによりコピー数を高めることが好ましい。pBR322誘導体、例えばpJF118ut（pJF118EH、Fuerste他 Gene, 119-131 (1986)から導かれる）中へのmetK遺伝子のクローニングにより大腸菌中のコピー数を高めることが特に好ましい。
【００２７】
プラスミドによりコードされたmetK遺伝子の発現のための制御領域として、metK遺伝子の自然のプロモーター−及びオペレーター領域が利用されることができるが、しかしながら、metK遺伝子の強化された発現は、特に他のプロモーターを用いて行われてもよい。持続的であるか又は制御されているＳＡＭ合成酵素遺伝子の誘導性発現を可能にする相応するプロモーター系、例えば大腸菌中でgapA遺伝子の構成性GAPDHプロモーター又は誘導性lac-、tac-、trc-、lambda-、ara-又はtet-プロモーターは当業者に公知である。そのような構成物は、本来公知の方法でプラスミド又は染色体上で使用されることができる。
【００２８】
metK遺伝子のクローニングのための特に好ましい一実施態様において、既に強化された発現のためのプロモーター、例えば大腸菌の誘導性tac-プロモーター系を有するプラスミドが使用される。
【００２９】
さらに、強化された発現は、翻訳開始シグナル、例えばリボソーム結合部位又は遺伝子の開始コドンが、最適化された配列中でそれぞれの構成物上に存在しているか、又は“コドン使用法(codon usage)”によりまれなコドンがより頻繁に現れるコドンに対して交換されるか、又はｍＲＮＡ安定化配列が最適化されることにより達成されることができる。
【００３０】
好ましくは、本発明による方法において使用される細菌株は、metK遺伝子並びに調節シグナルの挙げられた修飾を有するプラスミドを含んでいる。
【００３１】
プラスミドベクター中へのmetK遺伝子のクローニングは、例えば、完全なmetK遺伝子を対象としている、特異的なプライマーの使用下でのポリメラーゼ連鎖反応、及び引き続いてベクター−ＤＮＡフラグメントとのライゲーションを用いるmetK遺伝子の特異的増幅により行われる。
【００３２】
ＳＡＭの本発明による発酵産生のための細菌株の有効性は、付加的な措置により強化されることができる。Ｌ−メチオニン又はＤ，Ｌ−メチオニンの添加の代わりに、本発明による方法において使用された株の内在性メチオニン合成は強化されることができる。例えば、この目的には、メチオニン−及びＳＡＭ−物質代謝の遺伝子のリプレッサーのためにコードする遺伝子metJがもはや発現されない株(JP2000139471A)又は改善されたメチオニン合成を示す株が使用されることができる、それというのも、これらは改善されたホモセリン−トランススクシニラーゼ(Transsuccinylase)を有するからである(JP2000139471A、DE-A-10247437、DE-A-10249642)。
【００３３】
普通の形質転換法（例えばエレクトロポレーション、ＣａＣｌ２法）により、metK含有プラスミドは出発株中へ導入され、かつ例えば抗生物質耐性を用いてプラスミドを有しているクローン上で選択される。
【００３４】
本発明によるＳＡＭの産生のための細菌株の培養は、好ましくは文献から公知の最少塩培地中で行われる。
【００３５】
炭素源として、原則的に、利用できる全ての糖、糖アルコール、有機酸もしくはその塩、デンプン水解物、糖蜜又は他の物質が使用されてよい。その際、好ましくはグルコース又はグリセリンが使用される。また、複数の異なる炭素源の組み合わされた飼料も可能である。窒素源として、尿素、アンモニア及びその塩、硝酸塩並びに他のＮ源が利用することができる。可能な窒素源には、複雑なアミノ酸混合物、例えば酵母抽出物、ペプトン、麦芽抽出物、ダイズペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー(Corn Steep Liquor)及びＮＺ−アミンも属する。
【００３６】
さらに、培地に細胞成長が改善される特定の成分、例えばビタミン、塩、酵母抽出物、アミノ酸及び微量元素が添加されてよい。
【００３７】
そのうえ、培地にＳＡＭ合成のための特異的な前駆物質としてのＬ−メチオニンが、０．０５〜２５ｇ／ｌの濃度で添加されてよい。１〜５ｇ／ｌの濃度でのＬ−メチオニンの添加が好ましい。
【００３８】
本発明による特に好ましい方法において、培地にＬ−メチオニンの代わりにＤ，Ｌ−メチオニンが、０．０５〜２５ｇ／ｌの濃度で添加される。１〜５ｇ／ｌの濃度でのＤ，Ｌ−メチオニンの添加が好ましい。
【００３９】
株のインキュベーションは、好ましくは好気的培養条件下で、１６〜１５０ｈの期間に亘り、かつそれぞれの株に最適な成長温度の範囲内で行われる。
【００４０】
最適な温度範囲として、１５〜５５℃が好ましい。３０〜３７℃の温度が特に好ましい。
【００４１】
株の培養は、振とうフラスコ又は発酵槽中で行われてよく、その際、体積に関する制限は与えられていない。培養は、バッチ法、フィード−バッチ法又は連続法において行われてよい。
【００４２】
培地からのＳＡＭの取得は、当業者に公知の方法、例えば細胞を分離するための培地の遠心分離及び引き続いて産物のクロマトグラフィーによる精製、錯化、ろ過、例えば十字流ろ過又は沈殿により、行われてよい。
【００４３】
本発明による方法において産生されたＳＡＭの検出及び定量は、例えばクロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）を用いて行われる。
【００４４】
次の例は、本発明をさらに説明するのに利用される。例を実施するのに使用した細菌株：大腸菌 W3110/pKP481を、DSMZ(Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、D-38142 Braunschweig)で番号DSM 15426のもとでブダペスト条約に従って寄託した。
【００４５】
使用した全ての分子生物学的方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡの単離及び精製、制限酵素によるＤＮＡの修飾、クレノウ−フラグメント及びリガーゼ、形質転換等を、当業者に公知であるか、文献に記載されたか又はそれぞれの製造者により推奨された方法で実施した。
【実施例】
【００４６】
例１：プラスミドpKP481の構成
Ａ．metK遺伝子の増幅
大腸菌からのmetK遺伝子を、Taq-ＤＮＡポリメラーゼの使用下でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、通常の、当業者に公知の実施に従って増幅した。基質として大腸菌−野生型株W3110(ATCC 27325)の染色体ＤＮＡを利用した。プライマーとして、配列
５′−ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＴ−３′(SEQ ID No: 3)を有するオリゴヌクレオチドmetK2及び配列
５′−ＧＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＡＡＴＡＴＧ−３′(SEQ ID No: 4)を有するオリゴヌクレオチドmetK4を使用した。
【００４７】
ＰＣＲの際に得られた約１．２ｋｂの長さを有するＤＮＡフラグメントを、引き続いてQIAprep Spin Miniprep Kits(Qiagen、Hilden)のＤＮＡ吸着カラムを用いて、製造者の指示に従って精製した。
Ｂ．ベクターpJF118utへのmetK遺伝子のクローニング
ＰＣＲフラグメント中へ、プライマーmetK4を介して、制限エンドヌクレアーゼEcoRIのための切断部位を導入した。精製したＰＣＲフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼEcoRIを用いて、製造者により指示された条件下で切断し、引き続いてリン酸化し、アガロースゲルを通して分離し、ついでQIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen)を用いて製造者の指示に従ってアガロースゲルから単離した。クローニングベクター及び発現ベクターpJF118EH（Fuerste他 Gene、119-131 (1986)）から誘導されたベクターpJF118utは、任意の遺伝子の制御された発現を可能にする多様な遺伝的エレメントを含む。これは、pBR-プラスミドファミリーから誘導された複製開始点を有するベクターである。クローニングした遺伝子の発現を、tac-プロモーターにより制御し、lacIq-リプレッサーにより抑制し、かつラクトース又はIPTGにより誘導することができた。
【００４８】
metK遺伝子のクローニングのために、ベクターpJF118utを、制限酵素EcoRI及びPstIで、製造者により指示された条件下で切断した。PstI−切断部位の３′−突出末端を、クレノウ酵素を用いて、当業者に公知の方法で分解した。プラスミドを、引き続いてアルカリホスファターゼでの処理により５′−末端で脱リン酸化し、ついでＰＣＲフラグメントのようにQIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を用いて精製した。切断し、かつ脱リン酸化したベクターとのＰＣＲフラグメントのライゲーションを、製造者の指示に従いT4−ＤＮＡリガーゼの使用下に行った。ライゲーションバッチでの株DH5αの大腸菌細胞の形質転換を、エレクトロポレーションを用いて当業者に公知の方法で実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−アンピシリン−寒天平板（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、テトラサイクリン２０ｍｇ／ｌ）上に塗抹し、３７℃で一晩に亘りインキュベートした。
【００４９】
所望の形質転換体を、プラスミド単離後、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen、Hilden)を用いて制限分析により同定し、かつエラーのなさを、配列分析により確認した。
【００５０】
このようにして得られたプラスミドpKP481（図１）中には、tac-プロモーターの制御下でのmetK遺伝子がある。
例２：Ｓ−アデノシルメチオニンの生産者の製造
例1に記載されたプラスミドpKP481を、ＣａＣｌ２法を用いて大腸菌株W3110(ATCC 27325)へ形質転換し、かつテトラサイクリン２０ｍｇ／ｌを有するＬＢ−寒天平板上で淘汰後、プラスミドを形質転換体の１つから再単離し、制限エンドヌクレアーゼで開裂し、かつ調査した。この株は、W3110/pKP481と呼ばれ、かつＳＡＭの産生に適している。
例３：Ｓ−アデノシルメチオニンの発酵産生
Ａ．ＳＡＭの産生
ＳＡＭを発酵産生するために、株W3110/pKP481を使用した。比較として、同一の条件下で培養したプラスミドなしの野生型株W3110(ATCC 27325)を利用した。
【００５１】
培養のために、次の培地を使用した：培地１ ｌについて：ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０．０１４７ｇ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ ０．１５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ ２．５ｍｇ、ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ ０．７ｍｇ、ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ ０．２５ｍｇ、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ １．６ｍｇ、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．３ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １２．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ、ＮａＣｌ ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．００２ｇ、Ｎａ３−シトレート×２Ｈ２Ｏ １ｇ、グルコース１５ｇ、トリプトン１ｇ、酵母抽出物０．５ｇ。W3110/pKP481の培養の際に、培地に、テトラサイクリ２０μｇ／ｍｌを添加した。記載された場合には（表参照）、培地は、そのうえ、Ｌ−メチオニン０．５ｇ／ｌ又はＤ，Ｌ−メチオニン１ｇ／ｌの添加を含んでいた。
【００５２】
産生培養のための予備培養として、まず最初に、１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の培地１０ｍｌにそれぞれの株を接種し、かつ３７℃及び１６０rpmで１６ｈに亘り振とう器上でインキュベートした。このようにして調製した細胞を、最終的に、３００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の同じ培地５０ｍｌに０．１のＯＤ６００（６００ｎｍでの吸収）で接種した。産生培養物のインキュベーションを、３７℃及び１６０ｒｐｍで４８ｈに亘り振とう器上で行った。ＳＡＭ合成酵素遺伝子の発現を、イソプロピル−β−チオガラクトシド０．１ｍＭ（ＩＰＴＧ）の添加により０．６のＯＤ６００で誘導した。２４ｈ及び４８ｈ後、試料を取り出し、かつ細胞を、遠心分離により培地から分離した。
Ｂ．産生したＳＡＭの定量
培養上清中に含まれているＳＡＭを、ＨＰＬＣを用いて定量した。その際、Develosil RP-Aqueous C 30-カラム、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ（Phenomenex, A-schaffenburg, Dで商業的に入手可能である）を使用し、かつ適用された培養上清１０μＬを、Ｈ２Ｏ １ ｌ上の８５％濃度Ｈ３ＰＯ４ ３ｍｌからなる移動相を有する定組成溶離を用いて０．５ｍｌ／minの流量で室温で分離し、かつダイオードアレー検出器を用いて２６０ｎｍの波長で定量した。第１表は、それぞれの培養上清中のＳＡＭの達成された含量を示す。
【００５３】
【表１】
2004267209.tif 000002
例４：プラスミドpMSRLSSkの構成
Ａ．RLSS遺伝子の増幅
ラット肝からのＳＡＭ合成酵素のための遺伝子（RLSS; Mato他, Pharmacol. Ther., 265-280 (1997)）を、Taq-ＤＮＡポリメラーゼの使用下でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、通常の、当業者に公知の実施により増幅した。基質として、ラット(Rattus norve-gicus)からのｃＤＮＡを利用した。プライマーとして、配列
５′−ＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣ−３′(SEQ ID No: 5) を有するオリゴヌクレオチドRLSS1及び配列
５′−ＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＣＴＡＡＡＡＣＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＣＣＴＣＣＣＡ−３′(SEQ ID No: 6)を有するオリゴヌクレオチドRLSS2を使用した。約１．２ｋｂの長さを有するＰＣＲの際に得られたＤＮＡフラグメントを、引き続いてQIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen、Hilden)のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造者の指示に従って精製し、引き続いてリン酸化した。
Ｂ．ベクター中へのRLSS遺伝子のクローニング
本発明によるプラスミドの構成のためのベースプラスミドとして、pACYC184から誘導されたプラスミドpACYC184-LHを使用した、これは番号DSM 10172のもとでDeutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturn in Braunschweigで寄託されている。このプラスミド中へ、GAPDHプロモーターの配列を挿入した：GAPDHプロモーターを、ポリメラーゼ連鎖反応により当業者に公知の規則に従って増幅し、その際、プライマーとして、配列５′−ＧＴＣＧＡＣＧＣＧＴＧＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＧＣＧＴＡＡＴＧＣ−３′(SEQ ID No. 7)を有するオリゴヌクレオチドGAPDHfw及び配列５′−ＧＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧ−３′(SEQ ID NO. 8)を有するオリゴヌクレオチドGAPDHrevII及び基質として大腸菌株W3110(ATCC 27325)からの染色体ＤＮＡを利用した。産物を、電気泳動により単離し、QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen)を用いて精製し、かつ制限酵素MluI及びPacIで製造者の指示に従って処理した。この上に、同じ酵素で処理したベクターpACYC184-LH中へT4-リガーゼを用いて挿入し、それによりプラスミドpKP228が生じた。
【００５４】
プラスミドpKP228中へ、合成的な多重クローニング部位を、次の手順により導入した：pKP228を、酵素BglIIで切断し、末端をクレノウ酵素で製造者の指示に従って補充し(aufgefuellt)、かつアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。こうして調製されたベクター中へ、次の配列を有する合成的に製造された二本鎖ＤＮＡフラグメントを挿入した: ５′−ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＣＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧ−３′(SEQ ID No: 9)。生じたプラスミドpKP504は、GAPDHプロモーターの後方に多重クローニング部位を有する。
【００５５】
pKP504を、PvuIIで切断し、脱リン酸化し、かつ製造者の指示に従って、ラット肝からのＳＡＭ合成酵素のための遺伝子（遺伝子配列はSEQ ID No: 10参照、タンパク質配列はSEQ ID No. 11参照）を含有するリン酸化ＰＣＲ産物と、T4-ＤＮＡリガーゼの使用下にライゲーションした。ライゲーションバッチでの株DH5αの大腸菌細胞の形質転換を、エレクトロポレーションを用いて当業者に公知の方法で実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−アンピシリン−寒天平板（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、テトラサイクリン２０ｍｇ／ｌ）上に塗抹し、かつ３７℃で一晩に亘りインキュベートした。
【００５６】
所望の形質転換体を、プラスミド単離後、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen、Hilden)を用いて制限分析により同定し、かつエラーのなさを、配列分析により確認した。
【００５７】
このようにして得られたプラスミドpMSRLSSk中には、大腸菌からのgapA遺伝子の構成性GAPDHプロモーターの制御下でのRLSS遺伝子（ラット肝からのＳＡＭ合成酵素のためにコードする）がある。
例５：Ｓ−アデノシルメチオニンの第２の生産者の製造
例４に記載されたプラスミドpMSRLSSkを、ＣａＣｌ２法を用いて大腸菌株W3110(ATCC 27325)へ形質転換し、かつテトラサイクリン２０ｍｇ／ｌを有するＬＢ−寒天平板上での淘汰後、プラスミドを形質転換体の１つから再単離し、制限エンドヌクレアーゼで開裂し、かつ調査した。この株を、W3110/pMSRLSSkと呼び、かつＳＡＭの産生に適している。株を、DSMZ(Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、D-38142 Braunschweig)で、番号DSM 16133のもとでブダペスト条約に従って寄託した。
例６：Ｓ−アデノシルメチオニンの発酵産生
Ａ．ＳＡＭの産生
ＳＡＭの発酵産生のために、株W3110/pMSRLSSkを使用した。比較として、同一の条件下で培養したプラスミドなしの野生型株W3110(ATCC 27325)を利用した。
【００５８】
培養のために、次の培地を使用した：培地１ ｌについて：ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０．０１４７ｇ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ ０．１５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ ２．５ｍｇ、ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ ０．７ｍｇ、ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ ０．２５ｍｇ、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ １．６ｍｇ、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．３ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １２．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ、ＮａＣｌ ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．００２ｇ、Ｎａ３−シトレート×２Ｈ２Ｏ １ｇ、グルコース１５ｇ、トリプトン１ｇ、酵母抽出物０．５ｇ。W3110/pMSRLSSkの培養の際に、培地にテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを添加した。記載された場合には（第２表参照）、培地は、そのうえＬ−メチオニン０．５ｇ／ｌ又はＤ，Ｌ−メチオニン１ｇ／ｌの添加を含んでいた。
【００５９】
産生培養のための予備培養として、まず最初に、１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の培地１０ｍｌにそれぞれの株を接種し、かつ３７℃及び１６０rpmで１６ｈに亘り振とう器上でインキュベートした。このようにして調製した細胞を、最終的に、３００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の同じ培地５０ｍｌに０．１のＯＤ６００（６００ｎｍでの吸収）で接種した。産生培養物のインキュベーションを、３７℃及び１６０rpmで４８ｈに亘り振とう器上で行った。２４ｈ及び４８ｈ後、試料を取り出し、かつ細胞を、遠心分離により培地から分離した。
Ｂ．産生したＳＡＭの定量
培養上清中に含まれているＳＡＭを、ＨＰＬＣを用いて定量した。その際、Develosil RP-Aqueous C 30-カラム、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ（Phenomenex、A-schaffenburg、Dで商業的に入手可能である）を使用し、かつ適用された培養上清１０μＬを、Ｈ２Ｏ １ ｌ上の８５％濃度のＨ３ＰＯ４ ３ｍｌからなる移動相を有する定組成溶離を用いて０．５ｍｌ／minの流量で室温で分離し、かつダイオードアレー検出器を用いて２６０ｎｍの波長で定量した。第２表は、それぞれの培養上清中のＳＡＭの達成された含量を示す。
【００６０】
【表２】
2004267209.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の例１の方法に従って得られたプラスミドpKP481。
【図１】
2004267209.tif 000004