(57)【要約】【課題】コンジュゲートしうる分子種に制限がなく、しかも精製が容易でプロダクツ損失が少ない新規なＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートの製造方法を提供する。【解決手段】固相担体上においてＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントを活性水素含有基で修飾し、これに二官能性リンカーを介して活性水素含有基をもつ機能性有機化合物を縮合させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体上においてＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントを活性水素含有基で修飾し、これに二官能性リンカーを介して活性水素含有基をもつ機能性有機化合物を縮合させることを特徴とするＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートの製造方法。
【請求項２】
活性水素含有基が、アミノ基、カルボキシル基、チオール基及びヒドロキシル基の中から選ばれた少なくとも１種である請求項１記載のＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートの製造方法。
【請求項３】
二官能性リンカーが、イソシアナト基、チオイソシアナト基、マレイミド基、カルボン酸活性エステル基、カルボキシル基、チオール基、ハロゲノアセチル基及びアミノ基の中から選ばれた少なくとも１種の基２個を有する化合物である請求項１又は２記載のＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートの製造方法。
【請求項４】
機能性有機化合物が、タンパク質、ペプチド、酵素、糖類、脂質及び蛍光色素の中から選ばれた少なくとも１種である請求項１、２又は３記載のＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固相担体上でＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントと任意の機能性有機化合物とをリンカーを介して縮合させることにより、精製工程を少なくし、効率よくＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、アンチセンス・アンチジーン法やリボザイム法により得られる遺伝子医薬が注目されているが、これらの遺伝子医薬については、膜透過性、ヌクレアーゼ耐性、特異性及び親和性について、いろいろな問題点がある。
そして、これらの問題点の多くは、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格、糖部分、塩基部分に機能性ペプチドをコンジュゲートすることにより解決しうると考えられている。
【０００３】
ところで、このペブチドをコンジュゲートする方法としては、液相中でγ‐マレインイミドブチルオキシサクシンイミドをリンカーとして用いる方法（非特許文献１参照）、液相中でヨードアセトキシサクシンイミドをリンカーとして用いる方法（非特許文献２参照）、緩衝液中でリンカーとＤＮＡを結合させ、液相中でペプチドとコンジュゲートする方法（非特許文献３参照）などが知られているが、液相法は得られた生成物をクロマトグラフィーを用いて精製しなければならないため、操作が煩雑になるのを免れない。
【０００４】
他方、固相法として、固相上で、まずペプチド合成を行い、次いでＤＮＡ−ＲＮＡを合成し、最後にアンモニア処理する方法が提案されているが（非特許文献４参照）、この方法ではペプチド中に組み込むことができるアミノ酸が制限されるという欠点がある。
【０００５】
【非特許文献１】
「バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）」，（米国），第５巻，１９９４年，ｐ．３７３−３７８
【非特許文献２】
「バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）」，（米国），第５巻，１９９４年，ｐ．４６８−４７４
【非特許文献３】
「ザ・ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），第６５巻，第１６号，２０００年，ｐ．４９００−４９０８
【非特許文献４】
「テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，）」，（英国），第３５巻，第１７号，１９９４年，ｐ．２７３３−２７３６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、従来方法のもつ欠点を克服し、コンジュゲートしうる分子種に制限がなく、しかも精製が容易でプロダクツ損失が少ない新規なＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートの製造方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートを製造する方法について鋭意研究を重ねた結果、固相担体上においてＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントを修飾し、それに二官能性リンカーを介して機能性有機化合物を縮合させることにより、縮合させる分子種の制限なしに、しかも純度の高いＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートを得ることができることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、固相担体上においてＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントを活性水素含有基で修飾し、これに二官能性リンカーを介して活性水素含有基をもつ機能性有機化合物を縮合させることを特徴とするＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートの製造方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明方法においては、固相担体上で処理することが必要であるが、この固相担体としては、例えば多孔性ガラス、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）、ポリエチレングリコール−ポリスチレンなどが用いられる。
【００１０】
この固相担体上で、例えば汎用されているシアノエチルアミダイト法のプロトコルに従い、ＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントを自動合成したのち、得られたフラグメントの５´‐末端又は中間の位置の水酸基を活性水素含有基で化学修飾する。この活性水素含有基としては、例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基及びヒドロキシル基を挙げることができる。この際、フラグメント合成で用いた塩基部とリン酸部の保護基は結合させたままで後続の反応に供することができる。
【００１１】
次に、このようにして固相担体に担持されたままの化学修飾させたＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントに二官能性リンカーを反応させ、フラグメントとリンカーとを結合させる。ここで用いる二官能性リンカーは、上記の活性水素含有基と反応して安定な結合を形成しうる官能基２個を有する化合物である。
【００１２】
このような官能基としては、例えば、アミノ基と反応するものとして、イソシアナト基、チオイソシアナト基、カルボン酸活性エステル基、カルボキシル基などが、チオール基と反応するものとして、マレイミド基、チオール基やヨードアセチル基、ブロモアセチル基、クロロアセチル基のようなハロゲノアセチル基などが、またカルボキシル基と反応するものとして、イソシアナト基、アミノ基などがある。
【００１３】
したがって、二官能性リンカーとしては、例えば以下の（イ）ないし（チ）に示す化合物がある。
（イ）Ｓ‐（２‐ピリジルジチオ）システアミン
【化１】
2004275140.tif 000002
（ロ）Ｎ‐スクシンイミジル＝３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピナート
【化２】
2004275140.tif 000003
（ハ）ヨードアセトキシスクシンイミド
【化３】
2004275140.tif 000004
（ニ）ジチオイソシアナトアルカン
ＳＮＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＣＳ
（ホ）ジイソシアナトアルカン
ＯＮＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＣＯ
（ただしｎは１〜１０の整数）
（ヘ）２‐（２‐ピリジルジチオ）エチルイソシアネート
【化４】
2004275140.tif 000005
（ト）Ｎ‐（４‐マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド
【化５】
2004275140.tif 000006
（チ）Ｎ‐４‐マレイミド酪酸
【化６】
2004275140.tif 000007
【００１４】
このＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントと二官能性リンカーとの反応は、前記の固相担体上で化学修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントに、上記の二官能性リンカーを、例えばアセトニトリルやジメチルホルムアミドのような溶液に溶かして加え、１０〜４０℃において２〜１０時間かきまぜる。この際の溶液中の二官能性リンカーの濃度としては、０．１〜１モル／リットルが好ましい。反応終了後、上記の溶剤でよく洗浄して不純物を除去する。
【００１５】
次に、このようにして得たＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントと二官能性リンカーとの縮合生成物を固相担体上に担持したまま、これに活性水素含有基、例えば水酸基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基などをもつ機能性有機化合物を有機溶剤、例えばアセトニトリルやジメチルホルムアミドなどに溶解して加え、１０〜４０℃において２〜１０時間かきまぜることによって反応させる。反応終了後、同じ溶剤で洗浄し、不純物を除くと固相担体に結合したＤＮＡ又はＲＮＡコンジュゲートが得られる。
次いで、アルカリで処理し固相担体から脱離させ、クロマトグラフなどにより精製すれば、所望のＤＮＡ−ＲＮＡコンジュゲートが２０〜５０％の収率で得られる。
【００１６】
この際用いるアルカリとしては、濃アンモニア水又は０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液が好ましい。
また、前記の機能性有機化合物の例には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、酵素、糖類、脂質、ホルモン、蛍光色素、合成高分子などがある。
【００１７】
以下に、各種の二官能性リンカーを用いて、ＤＮＡとペプチドとをコンジュゲートさせる方法を例として本発明方法の反応式を示す。
【化７】
2004275140.tif 000008
（式中のＸ及びＸ´は、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ又は−ＯＨである）
【００１８】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
ＤＮＡ自動合成機（クルアケム社製、製品名「ＰＳ２５０」）を用い、常法に従いＣＰＧ担体上でオリゴヌクレオチドの５´末端をアミノ基で化学修飾した。
次いで、ヘキサメチレンジイソシアナートをアセトニトリルに溶かして調製した０．５モル濃度溶液を加え、２０℃において５時間反応させたのち、アミノ酸側鎖を保護したフリーのＮ末端アミノ基をもつペプチドフラグメントを反応させることにより、オリゴヌクレオチドの５´末端にヘキサメチレンジイソシアナートを介してペプチドを結合させた。
次に、この反応生成物に２８％濃度のアンモニア水を加え、５５℃において５時間かきまぜることにより、固相担体からの生成コンジュゲートの切り出しと同時にペプチドからの保護基の脱離を行った。
このようにして、式
【化８】
2004275140.tif 000009
で表わされるＤＮＡフラグメントとペプチドとのコンジュゲートが収率２５％で得られた。
【００２０】
実施例２
実施例１と同様にしてＣＰＧ上においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）Ｒｅｖタンパク質由来のぺプチドを合成し、その５´末端のＤＭＴを脱保護し、アミノ化試薬を反応させてアミノ基を導入した。
次いで、ヘキサメチレンジイソシアネートを加えて室温で１２時間反応させたのち、核外輸送シグナルペプチド（Ｆ１−ＮＥＳペプチド）を加え、４５℃において２４時間反応させ、最後にアンモニア水を加えて５５℃において４時間反応させるとことによりＣＰＧから切り出した。
このようにして、ＤＮＡ−ＮＥＳペプチドコンジュゲートを得た。
【００２１】
実施例３
Ｆｍｏｃ固相合成法により、アミノ基を５´末端にオリゴヌクレオチドを製造した。
次いで、Ｎ‐（４‐マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドを加えて、オリゴヌクレオチドのアミノ基と結合させた。
次に同様にＦｍｏｃ固相合成法によりＮ末端にシスチン残基をもつペプチドを製造し、シスチン残基のチオール基とオリゴヌクレオチドのマレイミド基を反応させることにより、ＤＮＡ−ペプチドコンジュゲートを収率３５％で得た。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントに多種多様の機能性有機化合物の分子を、簡単かつ高効率でコンジュゲートさせることができるため、ＤＮＡやＲＮＡ分子に種々の機能を付与することができ、例えば、分解酵素に対して耐性を付与するＤＮＡ又はＲＮＡ分子、細胞内への取り込みを促進させるＤＮＡ又はＲＮＡ分子、反応性を向上させるＤＮＡ又はＲＮＡ触媒分子などを導入する手段として有望である。