(57)【要約】【課題】  アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製するための方法を提供することによって、より迅速かつ正確な試験および分析の方法を提供すること。【解決手段】  本発明は、アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製するための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子をサンプルに添加して、混合物を形成する工程であって、ここで、この磁性粒子は、混合物中に含まれるタンパク質含有物質に非特異的に結合し得、そしてここで、この混合物は、約０．２Ｍ以下の塩濃度を有する、工程；（ｂ）タンパク質含有物質が磁性粒子と非特異的に結合する場合に、このタンパク質含有物質を混合物から沈澱させて、沈澱物および上清を形成する工程；（ｃ）上清を処分する工程；ならびに（ｄ）沈澱物を単離して、調製されたサンプルを生成する工程、を包含する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製するための方法であって、以下：
（ａ）ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子をサンプルに添加して、混合物を形成する工程であって、ここで、該磁性粒子は、該混合物中に含まれるタンパク質含有物質に非特異的に結合し得、そしてここで、該混合物は、約０．２Ｍ以下の塩濃度を有する、工程；
（ｂ）該タンパク質含有物質が該磁性粒子と非特異的に結合する場合に、該タンパク質含有物質を該混合物から沈澱させて、沈澱物および上清を形成する工程；
（ｃ）該上清を処分する工程；ならびに
（ｄ）該沈澱物を単離して、調製されたサンプルを生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記沈澱させる工程が、磁場を適用する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、以下：
（ｅ）前記調製されたサンプルを溶液に溶解して、結合していないタンパク質含有物質および磁性粒子の混合物を形成する工程；
（ｆ）該混合物に磁場を適用して、該磁性粒子を除去する工程；
（ｇ）該タンパク質含有物質を収集して、単離された調製されたサンプルを形成する工程、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液が、緩衝溶液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液が、溶解溶液である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記混合物が、約０．１２５Ｍ以下の塩濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物が、約０．０１〜０．１０Ｍの範囲の塩濃度を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記塩が、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、およびＫＣｌからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合物が、界面活性剤をさらに含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤が、約１〜１０ｍＭの濃度で存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記界面活性剤が、陽イオン性界面活性剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記陽イオン性界面活性剤が、第四級アンモニウム塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第四級アンモニウム塩が、セチルトリメチルアンモニウムブロミドおよびオクタデシルトリメチルアンモニウム塩からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記磁性粒子が、鉄、酸化鉄、窒化鉄、炭化鉄、ニッケルおよびコバルト、ならびにこれらの混合物および合金からなる群より選択される材料からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記磁性粒子が、常磁性粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記磁性粒子が、磁性ラテックス粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記磁性粒子が、約０．１〜１００μｍの範囲の平均直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記磁性粒子が、約１〜５０μｍの範囲内の平均直径を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記磁性粒子が、約１〜５μｍの範囲内の平均直径を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質含有物質が、細胞、免疫グロブリン、タンパク質および酵素からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記調製されたサンプルが、ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に適切である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記磁性粒子が、被覆されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記調製されたサンプルが、ＰＣＲにおける使用に適切である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記調製されたサンプルが、イムノアッセイにおける使用に適切である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプルが、組織サンプル、全血サンプル、白血球サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、培養細胞サンプル、糞便サンプル、または尿サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
アッセイにおいて使用するための血液サンプルを調製するための方法であって、以下：
（ａ）ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子を血液サンプルに添加して、混合物を形成する工程であって、ここで、該磁性粒子は、該混合物中に含まれる細胞に非特異的に結合し得、そしてここで、該混合物は、約０．２Ｍ以下の塩濃度を有する、工程；
（ｂ）該細胞が該磁性粒子に非特異的に結合する場合に、該混合物から該細胞を沈澱させて、沈澱物および上清を形成する工程；
（ｃ）該上清を処分する工程；ならびに
（ｄ）該沈澱物を単離して、調製された血液サンプルを生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記溶液が、緩衝溶液である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶液が、溶解溶液である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記混合物が、約０．１２５Ｍ以下の塩濃度を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合物が、約０．０１〜０．１０Ｍの範囲内の塩濃度を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記混合物が、界面活性剤をさらに含有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記界面活性剤が、約１〜１０ｍＭの濃度で存在する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記界面活性剤が、陽イオン性界面活性剤である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記陽イオン性界面活性剤が、第四級アンモニウム塩である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第四級アンモニウム塩が、セチルトリメチルアンモニウムブロミドおよびオクタデシルトリメチルアンモニウム塩からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記磁性粒子が、常磁性粒子または磁性ラテックス粒子である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記調製された血液サンプルが、ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に適切である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記磁性粒子が、被覆されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記調製された血液サンプルが、ＰＣＲにおける使用に適切である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記調製された血液サンプルが、イムノアッセイにおける使用に適切である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記沈澱させる工程が、磁場の適用をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
さらに、以下：
（ｅ）前記調製された血液サンプルを溶液中に溶解させて、結合していない血液細胞および磁性粒子の混合物を形成する工程；
（ｆ）該混合物に磁場を適用して、該磁性粒子を除去する工程；
（ｇ）該血液細胞を収集して、単離された調製された血液サンプルを形成する工程、
を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４５】
アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製する際に有用なキットであって、以下：
（ａ）ポリアルキレングリコール；
（ｂ）該サンプル中に含まれるタンパク質含有物質に非特異的に結合し得る、磁性粒子；
（ｃ）約０．２Ｍ以下の濃度を有する塩；および
（ｄ）該サンプルを調製するための指示書、
を備える、キット。
【請求項４６】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
緩衝溶液をさらに備える、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
溶解溶液をさらに備える、請求項４５に記載のキット。
【請求項４９】
前記塩が、約０．１２５Ｍ以下の濃度を有する、請求項４５に記載のキット。
【請求項５０】
前記塩が、約０．０１〜０．１０Ｍの範囲内の濃度を有する、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記塩が、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、およびＫＣｌからなる群より選択される、請求項４５に記載のキット。
【請求項５２】
界面活性剤をさらに備える、請求項４５に記載のキット。
【請求項５３】
前記界面活性剤が、陽イオン性界面活性剤である、請求項４５に記載のキット。
【請求項５４】
前記陽イオン性界面活性剤が、第四級アンモニウム塩である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記第四級アンモニウム塩が、セチルトリメチルアンモニウムブロミドおよびオクタデシルトリメチルアンモニウム塩からなる群より選択される、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前記磁性粒子が、鉄、酸化鉄、窒化鉄、炭化鉄、ニッケルおよびコバルト、ならびにこれらの混合物および合金からなる群より選択される材料からなる、請求項４５に記載のキット。
【請求項５７】
前記磁性粒子が、常磁性粒子である、請求項４５に記載のキット。
【請求項５８】
前記磁性粒子が、磁性ラテックス粒子である、請求項４５に記載のキット。
【請求項５９】
前記磁性粒子が、約０．１〜１００μｍの範囲内の平均直径を有する、請求項４５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイおよびイムノアッセイのようなアッセイにおいて引き続き使用するためにサンプルを調製するための、ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子、ならびに約０．２Ｍ以下の塩濃度の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特異的結合分子に結合した磁性粒子は、特異的結合のプロセスによって、低分子、高分子、ウイルス、細菌および細胞を液体から分離するために使用されている。固定された特異的結合剤なしでの磁性粒子もまた、非特異的吸着のプロセスによって、核酸およびウイルスを分離するために使用されている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜２参照）。磁性粒子は、重力下で沈降する利点を有するが、磁場の適用は、既に迅速なこのプロセスを促進するよう働く。従って、代表的な数時間の長さにわたる遠心分離手順とは異なり、１〜２分間で分離が起こり得る。不運なことに、生物学的サンプルにおいて使用する場合、所望でない高分子および低分子による非特異的結合部位の競合に起因して、非特異的吸着は非常に弱く、そして不確かである。
【０００３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリアルキレングリコールは、タンパク質およびウイルスを生物学的サンプルから分離するために、広範に使用されている（例えば、非特許文献３参照）。ＰＥＧは、水を結合し、そして溶液中にタンパク質を保持する水を排除することによって、タンパク質を沈澱させる。沈澱するタンパク質の型は、ＰＥＧ濃度によって決定される。低濃度（例えば、１〜２モル濃度の塩と合わせて４％ｗ／ｖ）において、ウイルスおよびバクテリオファージが沈澱する。これは、これらの微生物の分離および濃縮のための標準的な方法である。このプロセスはまた、通常、沈澱物を沈降させるために、４℃でのインキュベーションおよび引き続く遠心分離を必要とする（例えば、非特許文献４参照）。
【０００４】
磁性粒子とＰＥＧとの組み合わせは、共通ではないが、タンパク質の増強された分離が示唆されている（例えば、非特許文献５参照）。この組み合わせはまた、バクテリオファージおよびウイルス非特異的結合について記載されており、そして代表的に、高い塩濃度（例えば、２．５Ｍの塩化ナトリウム）を使用する（例えば、特許文献２参照）。この組み合わせはまた、プラスミドＤＮＡのような材料の、ゲノムＤＮＡおよび細胞細片を含有する溶液からの回収のための、核酸沈澱試薬（例えば、水性塩化ナトリウム中のポリエチレングリコール）として記載されている（例えば、特許文献３参照）。沈澱したバクテリオファージ、ウイルスおよびプラスミドＤＮＡは、非特異的な機構で磁性粒子に容易に吸着し、従って、より迅速かつ好都合な磁気分離を可能にして、標準的な遠心分離技術にとって代わることが明らかである。上述の分離は、調製の目的ではなされているが、分析の目的ではなされていない。
【特許文献１】欧州特許第０２８１３９０号明細書
【特許文献２】米国特許第５６８１９４６号明細書
【特許文献３】米国特許第５６６５５５４号明細書
【非特許文献１】Ｂｉｔｔｏｎら，「Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ｂｙ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ」Ｗａｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：５４９（１９７４）
【非特許文献２】Ｗａｒｒｅｎ，「Ｎｅｗ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｊａｐ．Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｃｏｎｆ，Ｈａｍｍｏｎ（Ｅｄ．）．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ  ｐ．１５２−１５４（１９７２）
【非特許文献３】Ｆｒｉｅｄら，Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２：２３８（１９７１）
【非特許文献４】Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：７３４（１９７１）
【非特許文献５】Ｍｕｎｒｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３：２９７（１９８１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当該分野の進歩にもかかわらず、改善された分析方法に対する必要性が続いている。具体的には、より迅速かつ正確な試験および分析の方法を提供することが、必要とされている。本発明は、アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製するための方法を提供することによって、これらの必要性に取り組む。本発明は、分析アプローチ適用において特に有用性を見出す、ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子の特定の試薬の組み合わせの使用（例えば、イムノアッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて分析されるべきサンプルの調製）を包含する。以前の核酸分離およびタンパク質分離において使用されたポリアルキレングリコール溶液とは異なり、本発明は、低いイオン強度の緩衝液を使用する。驚くべきことに、塩の最小化および省略の両方が、より良好なアッセイ結果を与えることが見出された。例えば、高い塩濃度において、沈澱物は磁性粒子に接着しなかった。さらに、低下した塩濃度は、種々のアッセイにおいて使用され得る万能サンプルを提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製するための方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子をサンプルに添加して、混合物を形成する工程であって、ここで、この磁性粒子は、混合物中に含まれるタンパク質含有物質に非特異的に結合し得、そしてここで、この混合物は、約０．２Ｍ以下の塩濃度を有する、工程；
（ｂ）タンパク質含有物質が磁性粒子と非特異的に結合する場合に、このタンパク質含有物質を混合物から沈澱させて、沈澱物および上清を形成する工程；
（ｃ）上清を処分する工程；ならびに
（ｄ）沈澱物を単離して、調製されたサンプルを生成する工程、
を包含する。
【０００７】
１つの実施形態において、上記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。
【０００８】
１つの実施形態において、上記沈澱させる工程は、磁場を適用する工程をさらに包含する。
【０００９】
１つの実施形態において、本発明の方法は、さらに、以下：
（ｅ）上記調製されたサンプルを溶液に溶解して、結合していないタンパク質含有物質および磁性粒子の混合物を形成する工程；
（ｆ）この混合物に磁場を適用して、磁性粒子を除去する工程；
（ｇ）タンパク質含有物質を収集して、単離された調製されたサンプルを形成する工程、
を包含する。
【００１０】
１つの実施形態において、上記溶液は、緩衝溶液である。
【００１１】
１つの実施形態において、上記溶液は、溶解溶液である。
【００１２】
１つの実施形態において、上記混合物は、約０．１２５Ｍ以下の塩濃度を有する。
【００１３】
１つの実施形態において、上記混合物は、約０．０１〜０．１０Ｍの範囲の塩濃度を有する。
【００１４】
１つの実施形態において、上記塩は、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、およびＫＣｌからなる群より選択される。
【００１５】
１つの実施形態において、上記混合物は、界面活性剤をさらに含有する。
【００１６】
１つの実施形態において、上記界面活性剤は、約１〜１０ｍＭの濃度で存在する。
【００１７】
１つの実施形態において、上記界面活性剤は、陽イオン性界面活性剤である。
【００１８】
１つの実施形態において、上記陽イオン性界面活性剤は、第四級アンモニウム塩である。
【００１９】
１つの実施形態において、上記第四級アンモニウム塩は、セチルトリメチルアンモニウムブロミドおよびオクタデシルトリメチルアンモニウム塩からなる群より選択される。
【００２０】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、鉄、酸化鉄、窒化鉄、炭化鉄、ニッケルおよびコバルト、ならびにこれらの混合物および合金からなる群より選択される材料からなる。
【００２１】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、常磁性粒子である。
【００２２】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、磁性ラテックス粒子である。
【００２３】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、約０．１〜１００μｍの範囲の平均直径を有する。
【００２４】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、約１〜５０μｍの範囲内の平均直径を有する。
【００２５】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、約１〜５μｍの範囲内の平均直径を有する。
【００２６】
１つの実施形態において、上記タンパク質含有物質は、細胞、免疫グロブリン、タンパク質および酵素からなる群より選択される。
【００２７】
１つの実施形態において、上記調製されたサンプルは、ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に適切である。
【００２８】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、被覆されている。
【００２９】
１つの実施形態において、上記調製されたサンプルは、ＰＣＲにおける使用に適切である。
【００３０】
１つの実施形態において、上記調製されたサンプルは、イムノアッセイにおける使用に適切である。
【００３１】
１つの実施形態において、上記サンプルは、組織サンプル、全血サンプル、白血球サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、培養細胞サンプル、糞便サンプル、または尿サンプルである。
【００３２】
別の局面において、本発明は、アッセイにおいて使用するための血液サンプルを調製するための方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子を血液サンプルに添加して、混合物を形成する工程であって、ここで、この磁性粒子は、混合物中に含まれる細胞に非特異的に結合し得、そしてここで、この混合物は、約０．２Ｍ以下の塩濃度を有する、工程；
（ｂ）細胞が磁性粒子に非特異的に結合する場合に、混合物から細胞を沈澱させて、沈澱物および上清を形成する工程；
（ｃ）上清を処分する工程；ならびに
（ｄ）沈澱物を単離して、調製された血液サンプルを生成する工程、
を包含する。
【００３３】
１つの実施形態において、上記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。
【００３４】
１つの実施形態において、上記溶液は、緩衝溶液である。
【００３５】
１つの実施形態において、上記溶液は、溶解溶液である。
【００３６】
１つの実施形態において、上記混合物は、約０．１２５Ｍ以下の塩濃度を有する。
【００３７】
１つの実施形態において、上記混合物は、約０．０１〜０．１０Ｍの範囲内の塩濃度を有する。
【００３８】
１つの実施形態において、上記混合物は、界面活性剤をさらに含有する。
【００３９】
１つの実施形態において、上記界面活性剤は、約１〜１０ｍＭの濃度で存在する。
【００４０】
１つの実施形態において、上記界面活性剤は、陽イオン性界面活性剤である。
【００４１】
１つの実施形態において、上記陽イオン性界面活性剤は、第四級アンモニウム塩である。
【００４２】
１つの実施形態において、上記第四級アンモニウム塩は、セチルトリメチルアンモニウムブロミドおよびオクタデシルトリメチルアンモニウム塩からなる群より選択される。
【００４３】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、常磁性粒子または磁性ラテックス粒子である。
【００４４】
１つの実施形態において、上記調製された血液サンプルは、ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に適切である。
【００４５】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、被覆されている。
【００４６】
１つの実施形態において、上記調製された血液サンプルは、ＰＣＲにおける使用に適切である。
【００４７】
１つの実施形態において、上記調製された血液サンプルは、イムノアッセイにおける使用に適切である。
【００４８】
１つの実施形態において、上記沈澱させる工程は、磁場の適用をさらに包含する。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明の方法は、さらに、以下：
（ｅ）上記調製された血液サンプルを溶液中に溶解させて、結合していない血液細胞および磁性粒子の混合物を形成する工程；
（ｆ）混合物に磁場を適用して、磁性粒子を除去する工程；
（ｇ）血液細胞を収集して、単離された調製された血液サンプルを形成する工程、
を包含する。
【００５０】
別の局面において、本発明は、アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製する際に有用なキットを提供し、このキットは、以下：
（ａ）ポリアルキレングリコール；
（ｂ）サンプル中に含まれるタンパク質含有物質に非特異的に結合し得る、磁性粒子；
（ｃ）約０．２Ｍ以下の濃度を有する塩；および
（ｄ）サンプルを調製するための指示書、
を備える。
【００５１】
１つの実施形態において、上記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明のキットは、緩衝溶液をさらに備える。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明のキットは、溶解溶液をさらに備える。
【００５４】
１つの実施形態において、上記塩は、約０．１２５Ｍ以下の濃度を有する。
【００５５】
１つの実施形態において、上記塩が、約０．０１〜０．１０Ｍの範囲内の濃度を有する。
【００５６】
１つの実施形態において、上記塩は、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、およびＫＣｌからなる群より選択される。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明のキットは、界面活性剤をさらに備える。
【００５８】
１つの実施形態において、上記界面活性剤は、陽イオン性界面活性剤である。
【００５９】
１つの実施形態において、上記陽イオン性界面活性剤は、第四級アンモニウム塩である。
【００６０】
１つの実施形態において、上記第四級アンモニウム塩は、セチルトリメチルアンモニウムブロミドおよびオクタデシルトリメチルアンモニウム塩からなる群より選択される。
【００６１】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、鉄、酸化鉄、窒化鉄、炭化鉄、ニッケルおよびコバルト、ならびにこれらの混合物および合金からなる群より選択される材料からなる。
【００６２】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、常磁性粒子である。
【００６３】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、磁性ラテックス粒子である。
【００６４】
１つの実施形態において、上記磁性粒子は、約０．１〜１００μｍの範囲内の平均直径を有する。
【００６５】
アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製するための方法が、記載される。この方法は、ポリエチレングリコールおよび磁性粒子を使用し、そして最低塩濃度で実施される。この方法は、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ｂＤＮＡアッセイ、イムノアッセイおよびＰＣＲ）において使用するための血液サンプルのようなサンプルを調製するために有用である。非常に高感度のアッセイを可能にする、最適なプロセス条件もまた、記載される。
【００６６】
（発明の開示）
本発明の１つの局面は、アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子をサンプルに添加して、混合物を形成する工程であって、この磁性粒子は、この混合物中に含まれるタンパク質含有物質に非特異的に結合し得、そしてこの混合物は、約０．２Ｍ以下の塩濃度を有する工程；（ｂ）このタンパク質含有物質が磁性粒子に非特異的に結合する場合に、タンパク質含有物質をこの混合物から沈澱させて、沈澱物および上清を形成する工程；（ｃ）この上清を処分する工程；ならびに（ｄ）沈澱物を単離して、調製されたサンプルを生成する工程。
【００６７】
本発明の一つの局面は、アッセイにおいて使用するための血液サンプルを調製するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子を血液サンプルに添加して、混合物を形成する工程であって、この磁性粒子は、この混合物中に含まれる細胞に非特異的に結合し得、そしてこの混合物は、約０．２Ｍ以下の塩濃度を有する、工程；（ｂ）この細胞が磁性粒子に非特異的に結合する場合に、この細胞を混合物から沈澱させて、沈澱物および上清を形成する工程；（ｃ）この上清を処分する工程；ならびに（ｄ）沈澱物を単離して、調製された血液サンプルを生成する工程。
【００６８】
本発明の別の局面は、アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製する際に有用なキットに関し、このキットは、以下を備える：（ａ）ポリアルキレングリコール；（ｂ）サンプル中に含まれるタンパク質含有物質に非特異的に結合し得る、磁性粒子；（ｃ）約０．２Ｍ以下の濃度を有する塩；および（ｄ）サンプルを調製するための指示書。
【発明の効果】
【００６９】
本発明は、アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製するための方法を提供することによって、より迅速かつ正確な試験および分析の方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、種々のアッセイにおいて使用するためのサンプルの調製において有用な、方法およびキットを包含する。ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子を、低い塩濃度（約０．２Ｍ以下の塩濃度）の条件下で血液サンプルに添加することによって、サンプル溶液中に含まれる細胞の非特異的結合、および引き続く結合した細胞の沈澱が提供される。上清は処分され、そして沈澱物が単離され、そしてアッセイにおいて即座に使用されるか、または引き続く使用のために、適切な貯蔵条件下で貯蔵されるかのいずれかである。
【００７１】
この調製方法の利点の１つは、サンプルを調製するための迅速な手段を提供することである。本明細書中に記載される方法を使用することによって、サンプルは、１時間以上かかり得る通常の遠心分離技術と比較して、ほんの数分で調製され得、そして費用のかかる遠心分離設備の必要性を排除する。別の利点は、磁気分離技術が、より容易に自動化されることである。
【００７２】
本発明の詳細な実施形態を記載する前に、本発明を記載する際に使用される定義を記載することが有用である。記載される定義は、本特許において使用される場合にその用語に適用されるのみであり、そして他の箇所（例えば、科学文献または他の特許もしくは出願（本発明者らによる他の出願または同一人に譲渡された出願を含む））で使用されるものと同じ用語には適用可能ではないかもしれない。好ましい実施形態および実施例の以下の説明は、説明および例示の目的で提供される。従って、これらは、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定すると判断されるべきではない。さらに、実施例が提供される場合、これらは、例示のみを意図され、限定を意図されない。例えば、実施例が特定の特徴を「含む」といわれる場合、これは、その実施例がその特徴を有し得るが、このような実施例は、その特徴を含むものに限定されないことを示唆することが意図される。
【００７３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈により明らかに他のように示されない限り、例えば、「物質」との言及は、２種以上のこのような物質の混合物を包含し、「界面活性剤」との言及は、２種以上のこのような界面活性剤の混合物を包含する、などであることが、注意されなければならない。
【００７４】
本発明を記載および特許請求する際に、以下の専門用語が、以下の定義に従って使用される。
【００７５】
「アッセイ」とは、インビトロの所定の分析物（目的の物質）の存在（定性）または濃度（定量）を測定するために、生物学的サンプル（代表的には、血液）に対して実施される、インビトロの試験を意味するように、本明細書中で使用される。
【００７６】
「細胞」とは、代表的に血液において見出される細胞、およびウイルスまたは細菌生物に感染した患者において見出される細胞を意味するように、本明細書中で使用される。これらの細胞としては、例として、赤血球；白血球（多形核白血球（好中球、好酸球および好塩基球）および単核白血球（単級およびリンパ球）を含む）；血小板；免疫細胞または系統拘束細胞；癌細胞；ウイルス細胞およびレトロウイルス細胞；バクテリオファージおよび他の細菌細胞；他の病原性細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
「ハイブリダイゼーションアッセイ」とは、所定のポリヌクレオチド分析物の存在または濃度を測定するためにハイブリダイゼーション反応を使用するアッセイを意味するように、本明細書中で使用される。例示的なポリヌクレオチド分析物としては、核酸；遺伝子；染色体；プラスミド；細菌、酵母、ウイルス、ビリオン、糸状菌、真菌、植物、動物、ヒトのゲノムおよびそれらのフラグメントなどが挙げられる。用語「核酸」は、ＤＮＡ（一本鎖ｓｓＤＮＡ、二本鎖ｄｓＤＮＡ、および分枝鎖ｂＤＮＡが挙げられる）、ＲＮＡ（ｔ−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡが挙げられる）、ミトコンドリアＤＮＡおよびミトコンドリアＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡおよび葉緑体ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにこれらの混合物を包含する。ハイブリダイゼーションアッセイとしては、例として、ｂＤＮＡアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応および逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、核酸配列に基づく増幅、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、配列決定、ライゲーションアッセイ、プライマー伸長などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
「イムノアッセイ」は、所定の分析物（例えば、抗原）の存在または濃度を測定するために、免疫学的反応を使用するアッセイを意味するように、本明細書中で使用される。イムノアッセイとしては、例として、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、競合イムノアッセイ、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
「非特異的（に）結合」とは、サンプル溶液中に含まれる細胞への、磁性粒子の非共有結合をいうように、本明細書中で使用される。
【００８０】
「タンパク質含有物質」とは、細胞、免疫グロブリン、タンパク質、酵素などをいうように、本明細書中で使用される。
【００８１】
「サンプル」とは、アッセイ方法によって分析されるべきであり、従って、本発明の方法において使用されるために適切な、生物学的サンプルをいうように、本明細書中で使用される。サンプルは、代表的に、「個体」から得られ、従って、標本は、固体の組織サンプル（例えば、生検から得られた組織のサンプル）、流体サンプル（例えば、血液または尿のサンプル）、または医療社会において通常使用される他の任意の患者標本（例えば、培養された細胞サンプルまたは糞便サンプル）であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、流体サンプルは、リンパ液、細胞の溶解物、乳汁、血漿、唾液、精液、血清、髄液、涙、全血、全血の画分、損傷サンプル、皮膚の外側部分、および呼吸性分泌物、腸管分泌物、および尿生殖器管の分泌物のような体液であり得る。好ましくは、サンプルは、組織サンプル、全血サンプル、白血球サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、培養細胞サンプル、糞便サンプル、または尿サンプルである。
【００８２】
（サンプル調製方法）
本発明の１つの実施形態は、アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製するための方法であり、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子をサンプルに添加して、混合物を形成する工程であって、この磁性得粒子は、混合物中に含まれるタンパク質含有物質に非特異的に結合し得、そしてこの混合物は、約０．２Ｍ以下の塩濃度を有する、工程；
（ｂ）タンパク質含有物質が磁性粒子に非特異的に結合する場合に、タンパク質含有物質を混合物から沈澱させて、沈澱物および上清を形成する工程；
（ｃ）上清を処分する工程；ならびに
（ｄ）沈澱物を単離して、調製されたサンプルを生成する工程。
【００８３】
多数のポリアルキレングリコールが、本発明の方法において使用され得、そして例として、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコール、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり、これは、エチレングリコールの縮合生成物であり、そして一般式ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｘ−Ｈを有する。ＰＥＧは、多数の市販の供給源から容易に入手可能であり、そして代表的に、様々な分子量のＰＥＧポリマーの混合物として販売されている。約３００〜３０，０００の範囲の平均分子量を有するＰＥＧが、本発明の方法における使用に特によく適しており、より具体的には、２０００〜１５，０００であり、特に、約８０００の分子量が、特に好ましい。
【００８４】
本発明の方法における使用および本発明のキットのために適切な、多数の磁性粒子が存在し、そして常磁性粒子および磁性ラテックスビーズが挙げられる。
【００８５】
磁性粒子または磁性ビーズは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＥ）、Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，ＭＡ）、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ）、およびＢｉｏＱｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．（Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＮＨ）のような供給源から市販されている。例示的な材料としては、鉄、酸化鉄、窒化鉄、炭化鉄、ニッケルおよびコバルト、ならびにこれらの混合物および合金が挙げられる。
【００８６】
磁性ラテックスビーズは、Ｓｅｒａｄｙｎｅのような供給源から市販されている。
【００８７】
磁性粒子は、代表的に、約０．１〜１００μｍの直径、好ましくは、約１〜５０μｍ、より好ましくは、約１〜５μｍの平均直径を有する。磁性粒子の形状は、通常、球形であるが、他の構成（不規則、棒状など）の粒子もまた、使用され得る。
【００８８】
塩濃度は、好ましくは、約０．２Ｍ以下であるが、約０．１２５Ｍ以下の塩濃度を利用することもまた、望ましくあり得る。代表的に、この方法は、約０．０１〜０．１０Ｍの範囲内の塩濃度を有することによって、受容可能なパラメータにおいて機能する。代表的な塩としては、例として、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、ＫＣｌなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
沈澱させる工程は、タンパク質含有物質−磁性粒子の複合体が沈降するにつれて、重力のみによってなされ得る。反応容器の底部に磁場を適用することによって、このプロセスの速度を促進することが、望ましくあり得る。従って、沈澱物は、磁性粒子複合体が重力によってかまたは沈降段階の間のいくつかの時点での磁場の適用によって沈降することを可能にすることによって、単離され得る。別の実施形態において、単離される沈澱物の量を最大にするために、上清が処分されながら、磁場が適用される。
【００９０】
次いで、調製されたサンプルは、アッセイにおいて即座に使用され得るか、または適切な貯蔵条件下で、引き続く使用のために貯蔵され得る。
【００９１】
調製されたサンプルが、引き続く使用のために貯蔵されるべきである場合、さらなる加工は必要とされない。上清が処分され、そして沈澱物が単離されて、調製されたサンプルを生成した後に、このサンプルは凍結される。代表的な貯蔵条件は、＋４〜−８０℃の範囲内の温度である。好ましい貯蔵条件は、−２０〜−８０℃の範囲内の温度で、６ヶ月以上である。
【００９２】
調製されたサンプルが、アッセイにおいて即座に使用されるべきである場合には、代表的に、タンパク質含有物質を磁性粒子から分離するために、このサンプルをさらに加工することが望ましくあり得る。従って、本発明の方法の別の実施形態は、以下の工程をさらに包含する：
（ｅ）調製されたサンプルを溶液中に溶解して、結合していないタンパク質含有物質と磁性粒子との混合物を形成する工程；
（ｆ）磁場をこの混合物に適用して、磁性粒子を除去する工程；
（ｇ）タンパク質含有物質を収集して、単離された調製されたサンプルを形成する工程。
【００９３】
この溶解する工程において使用される溶液は、標準的な緩衝溶液または溶解溶液のいずれかであり得る。溶液の型の選択は、タンパク質含有物質の任意の細胞性物質の一体性を維持することが望ましいか否か（例えば、イムノアッセイにおいて使用するため）、あるいは細胞がそこに含まれる任意のＤＮＡまたはＲＮＡを放出することを妨げることが望ましいか否か（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用するため）に依存する。
【００９４】
この方法はまた、界面活性剤の添加を包含し得、この界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、イオン性などであり得る。陽イオン性界面活性剤が好ましく、そして例示的な陽イオン性界面活性剤としては、例として、第四級アンモニウム塩（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドおよびオクタデシルトリメチルアンモニウム塩）が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤は、約１〜１０ｍＭの範囲の濃度で存在し得る。
【００９５】
ウイルスは、サンプル中の種々のタンパク質と会合することが公知であるので、沈澱工程において界面活性剤を含むことは、結合したタンパク質からのウイルス（およびその結果、核酸）のより効率的な解放を容易にし、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおいてこれらを接近可能にする。ｂＤＮＡアッセイに単独で界面活性剤を含めることは、コントロールより高いシグナルを発生させなかった。このとは、この界面活性剤が、ハイブリダイゼーション反応を加速させていないことを示唆する（ＰｏｎｔｉｕｓおよびＢｅｒｇ，１９９１）。さらに、１６〜１８時間のハイブリダイゼーション反応が、ｂＤＮＡアッセイプロトコルにおいて使用され、従って、任意の潜在的なハイブリダイゼーション加速を排除する。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態において、このサンプルは、血液サンプルであり、そしてアッセイにおいて使用するための血液サンプルの調製のための方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ポリアルキレングリコールおよび磁性粒子を血液サンプルに添加して、混合物を形成する工程であって、この磁性粒子は、混合物中に含まれる細胞に非特異的に結合し得、そしてこの混合物は、約０．２Ｍ以下の塩濃度を有する、工程；
（ｂ）細胞が磁性粒子に非特異的に結合する場合に、この混合物から細胞を沈澱させて、沈澱物および上清を形成する工程；
（ｃ）上清を処分する工程；ならびに
（ｄ）沈澱物を単離して、調製された血液サンプルを生成する工程。
【００９７】
この調製された血液サンプルは、貯蔵され得るか、または上記のように、アッセイにおいて即座に使用するために、さらに処理され得る。
【００９８】
（イムノアッセイ）
本発明は、イムノアッセイのためのサンプル調製方法として、特に有用性を見出す。これらの例において、分析物は、代表的に、タンパク質である。タンパク質を検出し得る、当該分野において公知の任意のイムノアッセイが、使用され得る。
【００９９】
一般に、イムノアッセイは、サンプル中の物質を同定し、そして好ましくは定量するために、分子上のエピトープとその相同的な抗体との間での特異的結合を利用する技術を包含する。従って、タンパク質マーカーを測定するために使用されるイムノアッセイは、タンパク質マーカーと、このタンパク質マーカーに指向する対応する抗体との間の、特異的な結合を利用する。タンパク質マーカーを検出するための１つの方法は、サンプルをスライド上に配置する工程、適切に標識された抗体を添加する工程、結合していない標識抗体を洗浄する工程、および適切なデバイス（例えば、顕微鏡）を用いて、結合したタンパク質の存在について、サンプルを観察する工程を包含する。
【０１００】
別の型のイムノアッセイは、特定のタンパク質マーカーを固定するために、特定のタンパク質マーカーに指向する、固体に結合した抗体が、患者標本と接触されることを含む。結合していないタンパク質が洗浄された後に、第二の標識された抗体（このタンパク質マーカーの異なるエピトープに指向する）が、固定されたタンパク質と接触される。この標識された抗体が、検出および定量される。特異的イムノアッセイは、当業者に周知である。例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような酵素イムノアッセイは、検出可能な標識として、酵素を使用する。
【０１０１】
タンパク質分析物に特異的な抗体は、市販されているか、または当該分野において公知の方法（例えば、抗体のモノクローナル産生またはポリクローナル産生）を使用して生成され得る。例えば、タンパク質が宿主（例えば、ウサギまたはマウス）に注射され、そしてその脾臓が、数週間後に取り出される。エチレングリコールの存在下で、この宿主由来の脾臓細胞は、ヒポキサンチン−グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠く骨髄腫細胞に添加される。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミンを含有する培地中で、融合した細胞のみが生存する。なぜなら、融合していない脾臓細胞は、インビトロで増殖せず、そして融合していない骨髄腫細胞は、ＨＧＰＲＴなしでは、この培地中で新たなヌクレオチドを作製し得ないからである。次いで、融合した細胞は、所望の抗体の産生について試験され得、そして引き続いて、分離および培養され得る。その結果は、タンパク質に指向する抗体の供給である。アッセイ設計に依存して、抗体は、使用前に標識され得る。
【０１０２】
（ハイブリダイゼーションアッセイ）
本発明はまた、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、分枝鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイおよび逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ）のためのサンプル調製方法として、有用性を見出す。このようなアッセイは、当該分野において周知であり、そして代表的に、市販のキットを使用して実施される。例えば、ＨＣＶ  ＲＮＡの存在を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ試験は、Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＣＶ  Ｍｏｎｉｔｏｒ試験（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）であり、一方でＨＣＶ  ＲＮＡについてのｂＤＮＡ試験は、Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ  ＨＣＶ−ＲＮＡ  ２．０試験（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）である。
【０１０３】
核酸ハイブリダイゼーションは、核酸またはポリヌクレオチドの特定の配列を同定するための、周知の方法である。一般に、ハイブリダイゼーションは、相補的な核酸鎖間の対合に基づく。目的の核酸分析物を含有するサンプル溶液にプローブを曝露することによって、既知の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドが、核酸分析物の標的配列を同定するためのプローブとして使用され得る。核酸分析物がプローブにハイブリダイズする場合、その分析物は、必然的に、標的配列を含有する。この方法の種々の局面は、詳細に研究されている。本質的に、ハイブリダイゼーションアッセイの全てのバリエーションは、相補的な塩基配列が対合し、そして二本鎖分子を形成することを可能にし、そして本発明の方法は、全ての型のハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得ることが理解される。これらのアッセイのうちのいくつかの詳細が、以下に提供される。
【０１０４】
（サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ）
サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ｕｒｄｅａらに対する米国特許第５，１２４，２４６号、同第５，７１０，２６４号、および同第５，８４９，４８１号を参照のこと。簡単にいえば、患者の標本のようなサンプルが、ハイブリダイズする条件下で、オリゴヌクレオチドプローブと接触して配置される。次いで、このオリゴヌクレオチドプレローブは、そのサンプル中に存在する目的の任意のｍＲＮＡとハイブリダイズする。プローブは、代表的に、基材上に固定され、その結果、相補的ｍＲＮＡを捕捉または固定し得る。サンプルは、オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションが完了することを確実にするために十分な時間にわたって、基材に結合したオリゴヌクレオチドプローブと接触したままである。当業者は、必要な「インキュベーション」時間を決定し得るが、約０．２５時間〜約３．０時間が、代表的である。十分なインキュベーション時間が経過した後に、サンプルは適切な洗浄溶液で洗浄され、これによって、ハイブリダイズしていない物質が除去される。洗浄技術は周知であり、そして／または当業者によって容易に決定され得る。代表的に、緩衝溶液およびおそらく界面活性剤を含有する洗浄流体が使用される。緩衝溶液は、ハイブリダイズしていない物質を除去するために適した、当該分野において公知の任意の従来の溶液であり得、そして通常、１種以上のアルカリ金属の塩（例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせ）を含有する。界面活性剤は、結合していないオリゴヌクレオチドプローブを洗浄するために適した任意の界面活性剤であり得、例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）、Ｉｇｅｐａｌ  Ｃａ（登録商標）、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、およびＬｕｂｒｏｌ（登録商標）の商品名で販売されている、非イオン性のポリオキシエチレン系界面活性剤である。これらの全ては、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のような市販の供給源から市販されている。１回以上の洗浄が、約２１〜６０℃の範囲内の温度でなされる。最適には、この洗浄工程は、室温で実施される。
【０１０５】
（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応）
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）ハイブリダイゼーションアッセイは、サンプル中に存在する任意のｍＲＮＡに基づいてｃＤＮＡを作製する工程、引き続く測定を包含する。このような技術は、当該分野において周知である。一般に、過剰の４種のデオキシヌクレオチド三リン酸分子（すなわち、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、およびデオキシグアノシン三リン酸）、およびプライマー（すなわち、オリゴｄＴプライマー）が、サンプルに添加される。ｍＲＮＡ鎖からの分離（例えば、塩基性培地中での変性による）の後に、得られるオリゴヌクレオチドは、元のｍＲＮＡ配列に相補的な一本鎖ＤＮＡである。次いで、ＤＮＡポリメラーゼが、過剰の４種のデオキシヌクレオチド三リン酸分子およびプライマーの存在下で添加されて、二本鎖ＤＮＡを作製し得る。さらなる詳細は、Ｇｅｒａｒｄら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１）：６１−７７（１９９７）およびＡｎｄｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５（３）：５７０−５７７（１９９７）に提供されている。その後、二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡに変性され得、ここで、２つの鎖のうちの一方は、本質的に、元のｍＲＮＡに対応するＤＮＡである。しかし、このＤＮＡは、分解にさほど感受性ではなく、従って、サンプル中のｍＲＮＡの量を決定する際のｍＲＮＡについてのより安定な代理として使用され得る。ＤＮＡを検出するための種々の方法が公知であり、そしてサンプル中に最初に含まれた対応するｍＲＮＡを検出およびその量を決定するために使用され得る。明らかであるように、本明細書中に記載される、ｍＲＮＡを検出および測定するための方法の多くは、ＤＮＡの検出および測定に適合され得る。
【０１０６】
（転写媒介増幅）
転写媒介増幅（ＴＭＡ）アッセイは、逆転写酵素がサンプルに添加されて標的ｍＲＮＡのｃＤＮＡを作製する点で、ＲＴ−ＰＣＲアッセイに類似している。しかし、ＴＭＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼが添加されて、ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＲＮＡアンプリコンを合成する。新たに合成されたアンプリコンの各々は、ＴＭＡプロセスに再び入り、そして新たな回の複製のためのテンプレートとして働く。従って、ＴＭＡプロセスは、ｍＲＮＡの効果的な増幅を生じる。次いで、ＲＮＡアンプリコンに相補的な標識プローブによって、ＲＮＡアンプリコンが検出され、そして測定される。ＴＭＡに基づく類似のアッセイは、文献に記載されている。例えば、Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５（３）：６７６−６７８（１９９７）を参照のこと。
【０１０７】
（核酸配列に基づく増幅）
核酸配列に基づく増幅（すなわち、ＮＡＳＢＡ（登録商標））は、相同増幅プロセスである。この方法は、３種の酵素（逆転写酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）および２種のプライマーの、単一の反応容器（サンプル由来のｍＲＮＡを含む）への添加を包含する。第一のプライマーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるｍＲＮＡおよび５’末端配列上の配列に相補的な、３’配列を含む。組み合わせて、これらの試薬は、ｍＲＮＡの複数のコピーの合成を生じ、これらのコピーは、次いで、適切な標識プローブの添加によって測定され得る。この型のアッセイは、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｄａｖｅｙら、ＥＰ  ０３２９８２２に記載されている。
【０１０８】
（ＲＮＡｓｅ保護アッセイ）
ＲＮＡｓｅ保護アッセイにおいて、標識されたオリゴヌクレオチドプローブがサンプルに添加されて、この標識されたプローブと任意の相補的ｍＲＮＡとの間でのハイブリダイゼーションを生じる。次いで、このサンプルは、ＲＮａｓｅで処理されて、全ての残りの一本鎖ｍＲＮＡを分解する。ハイブリダイズしたプローブの部分は、消化から保護される。ハイブリダイズしていないフラグメントは、より大きい、ハイブリダイズした複合体（これは、標識を保有する）から、例えば、電気泳動によって分離され得る。次いで、この標識が測定され得る。プローブが、ｍＲＮＡに対してモル過剰で（例えば、２倍のモル過剰で）添加される場合、得られるシグナルは、サンプル中のｍＲＮＡの量に比例する。
【０１０９】
（分枝鎖ＤＮＡアッセイ）
分枝鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）は、Ｕｒｄｅａら，Ｇｅｎｅ  ６１：２５３−２６４（１９８７）に詳細に記載されている。他の例示的なｂＤＮＡアッセイは、Ｕｒｄｅａらに対する米国特許第４，８６８，１０５号；Ｕｒｄｅａらに対する米国特許第５，１２４，２４６号；Ｕｒｄｅａらに対する米国特許第５，１３２，２０４号；Ｕｒｄｅａらに対する米国特許第５，６３５，３５２号；およびＣｏｌｌｉｎｓらに対する米国特許第５，６８１，７０２号に記載されている。実施例３は、１つのこのようなプロトコルを説明する。
【０１１０】
（キット）
本発明の別の実施形態は、アッセイにおいて使用するためのサンプルを調製する際に有用なキットであり、このキットは、以下を備える：
（ａ）ポリアルキレングリコール；
（ｂ）サンプル中に含まれるタンパク質含有物質に非特異的に結合し得る、磁性粒子；
（ｃ）約０．２Ｍ以下の濃度を有する塩；および
（ｄ）サンプルを調製するための指示書。
【０１１１】
アッセイの実施において有用な他の道具もまた、このキットに含まれ得、これらの道具としては、試験管、磁石、移動ピペットなどが挙げられる。キットは、試薬、核酸プローブ、標識された分析物、および標準物質を備え得る。キットは、１つのアッセイのために十分な材料を含み得るか、または複数のアッセイのために十分な材料を含み得る。例えば、１０回、２５回、５０回、またはそれより多くのアッセイのための材料が、単一のキットにおいて提供され得る。このキットはまた、本明細書中に記載されるアッセイのいずれかにおける、これらの試薬の１つ以上の使用のための指示書を含み得る。
【実施例】
【０１１２】
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術の範囲内である薬学的処方物、医化学などの従来の技術を使用する。このような技術は、文献に完全に説明されている。種々の型の薬学的処方物の調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版（１９９５）（上記で引用された）およびＡｎｓｅｌら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，第６版（Ｍｅｄｉａ，ＰＡ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）に記載されている。
【０１１３】
以下の実施例は、本発明の化合物をどのように作製および使用するかの完全な開示および記載を当業者に提供するために記載されており、そして本発明者らが自分の発明であるとみなす範囲を限定することは、意図されない。数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にする努力がなされたが、いくらかの誤差および偏差が、考慮されるべきである。他に示されない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、そして圧力はほぼ大気圧である。全ての成分を、他に示されない限り、販売者から購入した。
【０１１４】
（略号）
ｂＤＮＡ  分枝鎖ＤＮＡ
ＢＧＧ  ウシγグロブリン
ＤＳ  硫酸デキストラン
ＨＢＶ  Ｂ型肝炎ウイルス
ＨＣＶ  Ｃ型肝炎ウイルス
ＨＩＶ  ヒト免疫不全ウイルス
Ｍｅｑ  百万当量
ＭＬＰ  磁性ラテックス粒子
ＰＢＭＣ  末梢血単核細胞
ＰＢＳ  リン酸緩衝化生理食塩水
ＰＢＳ／Ｔｘ−１００  １×ダルベッコ溶液、０．１％  Ｔｘ−１００
ＰＥＧ  ポリエチレングリコール
ＰＭＰ  常磁性粒子
ＳＡ  ストレプトアビジン
（実施例１）
（ＰＥＧ沈澱したタンパク質の、低塩媒体中での磁性粒子への増加した吸着）
（Ａ．ＢＧＧ分離−ＰＥＧ／ＮａＣｌ）
熱凝集させたＢＧＧのＰＢＳ溶液を、６０℃で２０分間ＢＧＧを加熱することによって調製した。この溶液は、０．３６２の初期光学濃度（２８０ｎｍ）を有し、そして０．１５ｍｌの１７．２％  ＰＥＧ（体積／体積）および３Ｍ  ＮａＣｌを０．５ｍｌのタンパク質溶液に添加すると、非常に懸濁した。次いで、この懸濁した混合物を氷上で３０分間冷却し、そして２０００ｒｐｍで２０分間遠心して、沈澱したタンパク質を沈降させた。このプロセスにより、溶液が完全に清澄化し、そしてその光学濃度は０．０３に低下した。このことは、この溶液からの大部分のＢＧＧの除去を示した。
【０１１５】
（Ｂ．ＢＧＧ分離−ＰＥＧ／ＮａＣｌおよびＰＭＰ）
ＰＥＧ／ＮａＣｌの添加後に１ｍｇのＰＭＰを添加し、次いで磁気分離したことを除いて、ＢＧＧ分離実験を繰り返した。観察された濁り度の低下はほんのわずかであり、そして光学濃度に有意な変化はなかった。
【０１１６】
（Ｃ．ＢＧＧ分離−ＰＥＧおよびＰＭＰ）
ＮａＣｌをＰＥＧ溶液から省いたことを除いて、ＢＧＧ分離実験を繰り返した。最初に同程度の濁り度が現れ、そして１ｍｇのＰＭＰを添加すると、磁気分離により、溶液が完全に清澄化した。このことは、塩の非存在下では、沈澱したタンパク質がより効率的にＰＭＰに吸着したことを示した。
【０１１７】
類似の実験を、熱凝集したＢＧＧの代わりに２０の異なるヒト血清を使用して行った。これらの血清のすべてにおいて、ＰＥＧにより誘導される濁り度の清澄化は、ＮａＣｌの非存在下において、より効率的であった。清澄化は、ＰＭＰまたはＭＬＰ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）を使用して達成された。
【０１１８】
引き続く実験である、ＨＣＶおよびＨＩＶについてのｂＤＮＡアッセイは、１Ｍ  ＮａＣｌと比較して、０．０１〜０．１０ＭのＮａＣｌを含むＰＥＧ／ＰＭＰ混合物を用いると、感度が３〜５倍高いことを示した。
【０１１９】
（実施例２）
（Ａ．Ｂ型肝炎のｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ：ＭｇＣｌ２および硫酸デキストランを含むＰＥＧ／ＰＭＰおよび含まないＰＥＧ／ＰＭＰを使用するウイルス濃縮の評価、ＰＢＳ／Ｔｘ−１００および溶解溶液を用いる解放）
（ｉ．捕捉および解放のプロトコル）
５００μｌの血清サンプルを、１５０μｌのＰＥＧ／ＰＭＰ溶液（１ｍｇ  ＰＭＰ、１７．２％  ＰＥＧ（体積／体積））と混合した。この混合物をボルテックスし、そして沈澱物を分離した。１００μｌの上清を除去し、そして非結合を決定するために保持した。解放されたウイルスをプレートに移したときに、１０μｌの上清をこのプレートに移した。残りの上清を除去し、そして処分した。
【０１２０】
１５０μｌの溶解溶液またはＰＢＳ／Ｔｘ−１００を、この沈澱物に添加し、ボルテックスし、そして６３℃で３０分間インキュベートした。ＰＭＰを分離した。１０μｌの解放されたウイルスを、プレートに移した。
【０１２１】
（ｉｉ．定量）
次いで、ｂＤＮＡアッセイを、製造業者のプロトコルに従って実施した。使用したＨＢＶキットは、ＭＭ１１２２５（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）であった。陽性の血清の投入は、３７５Ｍｅｑ／サンプルであった。緩衝液Ａは、ＰＢＳ／Ｔｘ−１００であった。緩衝液Ｂは、溶解溶液であった。
【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
【表２】
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（Ｂ．Ｂ型肝炎の、濃縮工程を含むｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ：ＰＥＧ／ＰＭＰ沈澱試薬における硫酸デキストランの４つの濃度の評価、およびＰＢＳ／Ｔｒｉｓ／Ｔｘ−１００解放剤のｐＨの影響）
使用したＰＢＳ／Ｔｒｉｓ組成物は、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩、および０．０２％  ＮａＮ３であった。
【０１２４】
【表３】
2004286749.tif 000004
【０１２５】
【表４】
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（実施例３）
（Ｃ型肝炎のｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ）
（Ａ．ＮＨ２−ＭＬＰ、ＮＨ２−ＰＭＰおよびＢＧＧ−ＰＭＰ／ＰＥＧでの沈澱プロトコルを用いるＨＣＶの捕捉）
以下の３つの固相（５０ｍｇ／ｍｌストック）を使用した：ＮＨ２−ＭＬＰ（ビス−アミンをＣＯＯＨ  ＭＬＰ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）にカップリングさせることによって調製した）、ＢＧＧ−ＰＭＰおよびＮＨ２−ＰＭＰ。
【０１２６】
【表５】
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ＰＥＧを添加すると、溶液からのタンパク質の沈澱とともに、血清は濁った。沈澱物（固相）を除去した。５０μｌのニートおよび５０μｌの１０倍希釈物（２５μｌ＋２２５μｌ陰性血清）を、ｂＤＮＡプレートに移した。上清の残りを除去し、そして処分した。
【０１２７】
固体の相転移なしのサンプルについて、１２５μｌのサンプルおよび３７５μｌの溶解溶液を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れ、そして５３℃で１時間インキュベートした。次いで、１５０μｌをプレートに移した。
【０１２８】
５００μｌの溶解試薬を固相に添加し、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、そしてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微細物除去器（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で５３℃で６０分間インキュベートした。次いで、固相を分離した。１５０μｌのニートおよび１５０μｌの１０倍希釈物（５０μｌ＋４００μｌ溶解溶液）を、ｂＤＮＡプレートに移した。次いで、ｂＤＮＡアッセイを、製造業者のプロトコルに従って実施した。使用したＨＣＶキットは、ＨＣＶ  ２．０  ｂＤＮＡキットＭＭ８３３（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）であった。
【０１２９】
【表６】
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【０１３０】
【表７】
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（Ｂ．抗エンベロープおよび抗コアＰＭＰまたはＰＥＧ／ＰＭＰ沈澱を用いるＨＣＶの捕捉）
【０１３１】
【表８】
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ＰＥＧを添加すると、溶液からのタンパク質の沈澱とともに、血清は濁った。沈澱物（固相）を除去した。５０μｌのニートおよび５０μｌの１０倍希釈物（２５μｌ＋２２５μｌ陰性血清）を、ｂＤＮＡプレートに移した。次いで、ｂＤＮＡアッセイを、製造業者のプロトコルに従って実施した。
【０１３２】
【表９】
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（実施例４）
（細胞アッセイ）
上に記載されたものと同じ手順を、培養細胞（Ｊｕｒｋａｔ）および白血球に適用し、そして捕捉された細胞の数を、顕微鏡によって計数した。両方の型の細胞が、９０％を超える収率で捕捉された。
【０１３３】
（Ａ．１ｍｌの全血からのＰＢＭＣの精製：材料／方法）
材料：１ｍｌの全血；３００μｌのＰＭＰ／ＰＥＧ（３．３３ｍｇ  ＰＭＰ／８．７５％  ＰＥＧ）；Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、１０×ＰＢＳおよび１×ＰＢＳ；ならびに氷上の全血。
【０１３４】
５ｍｌの全血を、４５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁させ、そして約３０秒間反転させた。５ｍｌの１０×ＰＢＳを添加した。この混合物を、１０００ｇで１０分間遠心し、そして上清を吸引により除去した。この洗浄を、５０ｍｌの１×ＰＢＳを用いて繰り返し、次いで、５ｍｌの１×ＰＢＳに再懸濁させて、細胞懸濁物を得た。１ｍｌの細胞懸濁物を１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管（氷上に保持）に入れることによって、コントロールのアリコートを作製した。１ｍｌの細胞懸濁物を、３００μｌのＰＭＰ／ＰＥＧ試薬に添加し、そしてこの混合物を５回反転させた。次いで、この混合物を磁石の上に配置し、そして５分間分離した。上清を取り出し、そして１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れた。コントロールのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管およびサンプルのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管を、２０００ｇで１０分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心器で遠心した。液体を吸引し、そしてペレットを１００μｌのＰＢＳに再懸濁させた。
【０１３５】
（Ｂ．方法の評価：生存可能な細胞の計数）
１０μｌのトリパンブルー（４％）を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れた。１０μｌの再懸濁させた細胞を添加した。生存可能な細胞の数を、血球計（４グリッドまたは２００個の細胞）で計数した。コントロール（ＰＢＳ中１：１００に希釈）、１０（×１００）細胞／４グリッド×１．０ｅ４は、２，５００，０００細胞／ｍｌの生存可能細胞計数を有した。ＰＭＰ／ＰＥＧ上清中では、生存可能な細胞は計数されなかった。従って、本発明のＰＭＰ／ＰＥＧ処理は、サンプルから全ての細胞を除去することに成功した。
【０１３６】
（実施例４）
（ＰＭＰ／ＰＥＧを用いた、低張度で溶解したＰＢＭＣからの、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の検出）
ＧＡＰＤＨ（細胞において見出されるハウスキーピング遺伝子）についてのｂＤＮＡアッセイを使用して、ＰＭＰ／ＰＥＧサンプル濃度の直線性をモニタリングした。１ｍｌの低張度で調製された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（５．５ｅ４細胞／ｍｌ）または全血（ＷＢ）を、以下に示される割合で１×ＰＢＳに希釈し、そして記載されるように、ＰＭＰ／ＰＥＧ方法によって濃縮した。得られた濃縮サンプルを、ＧＡＰＤＨについてｂＤＮＡアッセイにおいて分析した。以下に示されるように、信号／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比は、ＰＢＭＣおよび全血の両方を用いて試験された最低希釈まで、直線的に低下する。このことは、全血、培養された細胞などを用いるこのサンプル調製方法の、広範な適用可能性を支持する。
【０１３７】
【表１０】
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本発明を、その好ましい特定の実施形態、上記の説明、および実施例（これらは、本発明の範囲を説明することを意図されるが限定することは意図されない）と組み合わせて記載したが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変化がなされ得、そして均等物が代わりとなり得ることが、当業者によって理解されるべきである。他の局面、利点および改変は、本発明が属する分野の当業者に明らかである。
【０１３８】
従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲を参照して、決定されるべきである。