(57)【要約】【課題】動物細胞の分化能を制御するための系の提供【解決手段】動物細胞の培養または増殖に際して２種以上のサイトカインを組み合わせて用いる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上が組み合わさったサイトカインを有効成分とし、かつ
骨髄間質細胞を包含する多能性幹細胞の３以上の分化の方向性の決定と方向性の決定された各細胞における分化の程度が制御できる、
ことを特徴とする哺乳動物細胞の分化を制御するためのサイトカインのセット。
【請求項２】
多能性幹細胞が骨髄間質細胞であり、分化の方向性が３以上である請求項１記載のサイトカインのセット。
【請求項３】
前記分化の方向性が、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、内皮細胞および脂肪細胞に向かうことからなる群より選ばれる請求項１または２記載のサイトカインのセット。
【請求項４】
前記各分化の程度が、血清の存在下でもたらされる分化のいずれか一つに比べ少なくとも１０％促進または抑制される請求項１〜３のいずれかに記載のサイトカインのセット。
【請求項５】
２種以上が組み合わさったサイトカインが、骨形成因子−２（ＢＭＰ−２）骨形成因子−４（ＢＭＰ−４）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、グロース・ディファレンシェーション・ファクター（ＧＤＦ−５）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β２）からなる群より選ばれる請求項１〜４のいずれかに記載のサイトカインのセット。
【請求項６】
組み合わさったサイトカインが、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２とＯＳＭ、ＢＭＰ−２とＴＧＦ−β２、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−４とＯＳＭ、ＯＳＭ−ＢＭＰ−４、ＯＳＭとＴＧＦ−β２、ＯＳＭとＧＤＦ−５、ＯＳＭとＧＤＦ−５とＢＭＰ−４、ＯＳＭとＧＤＦ−５とＴＧＦ−β２とＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２とＯＳＭとＧＤＦ−５とＢＭＰ−４およびＢＭＰ−２とＯＳＭとＧＤＦ−５とＴＧＦ−β２とＢＭＰ−４からなる群より選ばれる請求項５記載のサイトカインのセット。
【請求項７】
骨髄間質細胞が、ＢＭＰ−２による刺激により少なくとも平滑筋細胞、拍動する心筋細胞および内皮細胞に分化しうる多能性成体幹細胞である請求項１〜５のいずれかに記載のサイトカインのセット。
【請求項８】
骨髄間質細胞が温度感受性ＳＶ−４０Ｔ細胞遺伝子を担持するトランスジェニックマウス由来である請求項１〜６のいずれかに記載のサイトカインのセット。
【請求項９】
骨髄間質細胞の分化が、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、エクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）およびイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）からなる群から選ばれる環境下で誘導される請求項１〜８のいずれかに記載のサイトカインのセット。
【請求項１０】
ｅｘ  ｖｉｖｏ  または  ｉｎ  ｖｉｖｏ  での骨髄間質細胞の分化が再生医療における細胞移殖に際して利用されるものである請求項１〜７のいずれかに記載のサイトカインのセット。
【請求項１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  での骨髄間質細胞の分化が、該細胞を分化しうる能力を有する作用剤をスクリーニングするのに利用されるものである請求項８記載のサイトカインのセット。
【請求項１２】
（Ａ）  温度感受性ＳＶ−４０Ｔ抗原遺伝子を担持するトランスジェニックマウス由来の多能性の骨髄間質細胞を用意し、
（Ｂ）  該細胞を、分化しうる能力を有することが期待される候補作用剤の存在下で該細胞を増殖しうる培地で培養し、
（Ｃ）  培養細胞の分化の方向性または分化の程度を決定し、そして
（Ｄ）  こうして決定された分化の方向性または分化の程度についての結果を該作用剤の不存在下での該細胞の培養結果と比べ、両結果の差異を該作用剤が骨髄間質細胞の分化能に及ぼす作用の指標とすることを特徴とする脊椎動物細胞の分化能を有する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
比較作用剤として、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＯＳＭ、ＧＤＦ−５およびＴＧＦ−β２からなる群から選ばれる少なくとも２種が利用される請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
無血清培地で培養が行われる請求項１３記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は動物細胞の維持、増殖、さらには分化誘導、殊に再生医療の技術分野で用いることのできる手段、より具体的には、サイトカインの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
交通事故やケガで、あるいは病気で心臓、肺、腎臓、血管、消化管、さらには神経等の組織や臓器を欠損させてしまった場合、他人の臓器に頼らず、本人の細胞を利用し、心臓や血管などの欠損組織等に分化する機能を保持した幹細胞や機能細胞を用いて、もとの臓器に再生させる再生医療技術の開発が望まれている。
【０００３】
このような背景の下、例えば心臓に関しては、心臓の発生・分化に重要な遺伝子が多数単離され、また胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多分化能を有する細胞を用い、心筋細胞の発生・分化の解析が行われている。さらに、骨髄細胞を含めた幹細胞が種々の細胞へ分化する多分化能（または多能性）を有することが示唆されている。そして、このような骨髄由来細胞がマウスの生体においても傷害心筋の再生に寄与し、心機能の改善が認められるとの報告もなされている。
【０００４】
より具体的には、ＥＳ細胞の発生・分化の解析に関して、未分化なネズミＥＳ細胞を、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−βスパーファミリーの構成員、すなわちＴＧＦ−βおよびＢＭＰ２）でプライムして形成される胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）は著しく増大した拍動領域を有する心筋への分化を促進することが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
他方、骨髄由来の細胞に関して、温度感受性ＳＶ−４０Ｔ抗原遺伝子のトランスジェニックマウスから樹立され、そして筋形成性、骨形成性および脂肪形成性分化を示す骨髄間質細胞株（ＴＢＲ細胞株）のあるものは、骨格筋に分化し、そしてその分化はオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）により刺激されるが、別のＴＢＲ細胞株の平滑筋への分化はＯＳＭにより阻害されることが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。なお、ＴＢＲ細胞株の一般的な作製方法および具体的な株についての詳細も公表されている（例えば、特許文献１、ならびに非特許文献３および４参照。）。非特許文献３および４には、ＴＢＲ細胞株はＴ抗原の不活化や増殖条件に応じて表現型変化を示し、脂肪前駆細胞が脂肪細胞および骨形成性細胞に誘導され、いくつかの脂肪前駆細胞および内皮細胞株は筋細胞および脂肪細胞に誘導される、ことも記載されている。このような性質からＴＢＲ細胞は多能性間葉系幹細胞由来であることが示唆されている。また、間葉系幹細胞から、骨細胞、軟骨細胞、腱細胞、靭帯細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、間質細胞等へ誘導できることも知られている（非特許文献５参照。）。
【０００６】
さらに、心筋細胞への分化能を有する骨髄由来の細胞が５−アザシチジン等のＤＮＡの脱メチル化剤の投与により、確率的（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）に心筋細胞、脂肪細胞および骨格筋細胞の系列に分化することが公表されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００７】
また、特許文献２には、ＦＧＦ−８、ＥＴ１、Ｍｉｄｋｉｎｅ、ＢＭＰ４の４種類のうち少なくとも一種のサイトカインと５−アザシチジンとを組み合わせて添加することで骨髄由来の細胞に心筋特異的な遺伝子の発現を促進できることも記載されている。またさらに、特許文献２には、心筋細胞への分化能を有するマウス骨髄細胞を予め５−アザシチジンで処理した後、マウスに移殖すると心筋細胞および血管細胞において移殖細胞に由来する細胞が見られることも示唆している。
【０００８】
【特許文献１】
特開平５−２９２９５８号公報
【０００９】
【特許文献２】
国際公開第０１／４８１５１号パンフレット、特に４頁２−１１行、５３頁−５５頁
【００１０】
【非特許文献１】
Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２００２；１６：１５５８−１５６６、要約部
【００１１】
【非特許文献２】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．−Ａｎｉｍａｌ  ３７：６９８−７０４（２００１）、要約部
【００１２】
【非特許文献３】
Ｊ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １６４：５５−６４（１９９５）
【００１３】
【非特許文献４】
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１８、４２４−４２９（１９９５）
【００１４】
【非特許文献５】
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４、１４３−１４７（１９９９）
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べたとおり、当該技術分野では、ＥＳ細胞だけでなく、ある一定の骨髄由来の細胞（造血幹細胞を除く。）が多分化能を有し、特定の分化形質を発現し、機能的な細胞、さらには組織や器官になることが知られており、そして特定の形質ないしは機能または分化の方向性が変化しうることも示唆されている。なお、特許文献２にも、サイトカインの使用により分化の方向性（新しい分化形質の発現性）を変化できることが記載されているが、記載の方法では、原則として、５−アザシチジン（生体内でリン酸化されて核酸に取込まれ、ＤＮＡ合成を阻害する作用を有する。）との併用が必要である。
【００１６】
再生医療では、上記の文献で主として検討されている心臓の再成のみならず、上述したとおり、肺、腎臓、血管、消化管、さらには神経等の組織や臓器を再成できる技術の開発が望まれるであろう。したがって、本発明の目的は、必要に応じて、各種の機能的な細胞、さらには組織や器官を誘導するのに寄与しうる手段を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述したような多分化能を有する細胞は、５−アザシチジンのようなＤＮＡの脱メチル化剤を使用することなく、一定のセットでサイトカインを使用することにより分化の方向性および分化の程度を変えること、換言すれば、分化の方向性および分化の程度を制御できることを見出した。したがって、本発明はかような知見に基づき完成されたものであり、
２種以上が組み合わさったサイトカインを有効成分とし、かつ
多能性幹細胞、例えば骨髄間質細胞の３以上の分化の方向性の決定と方向性の決定された各細胞における分化の程度が制御できる、
ことを特徴とする哺乳動物細胞の分化を制御するためのサイトカインのセット、を提供する。
【００１８】
また、かようなサイトカインのセットを、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、エクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）およびイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）からなる群から選ばれる環境下で使用できる。このような使用の態様の具体的なものとしては、前記の成分ともなりうるサイトカインやその他の同等な作用を有する作用剤をスクリーニングするための方法、また、直接もしくは間接的な再生医療、例えば、多分化能を有する細胞を生体に移殖する際に、これらの細胞と組み合わせて前記サイトカインのセットを投与するか、あるいはレシピエント本人から採取した細胞を予め前記サイトカインのセットで処理し、所望の分化形質を発現させるか、さらには、特定の機能の細胞もしくは組織まで分化させた後、生体に移殖する方法を挙げることができる。該スクリーニング方法としての好ましい態様としては、
（Ａ）  多能性幹細胞、特に温度感受性ＳＶ−４０Ｔ抗原遺伝子を担持するトランスジエニックマウス由来の多能性の骨髄間質細胞を用意し、
（Ｂ）  該細胞を、分化しうる能力を有することが期待される作用剤の存在下で該細胞を増殖しうる培地で培養し、
（Ｃ）  培養細胞の分化の方向性または分化の程度を決定し、そして
（Ｄ）  こうして決定された分化の方向性または分化の程度についての結果を該作用剤の不存在下での該細胞の培養結果と比べ、両結果の差異を該作用剤が骨髄間質細胞の分化能に及ぼす作用の指標とすることを特徴とする脊椎動物細胞の分化能を有する薬剤のスクリーニング方法が提供される。
【００１９】
さらに好ましい態様としては、上記のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＯＳＭ、ＧＤＦ−５およびＴＧＦ−β２から選ばれるサイトカインが比較作用剤として使用される段階を含む。
【００２０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２１】
本発明に従う、サイトカインのセットにより分化の方向性等が制御できる多能性幹細胞は、本発明の目的に沿うものであれば、ＥＳ細胞を初めとし、該サイトカインのセットにより、生来の細胞から、３以上の新しい分化形質が発現し、機能的な組織や器官になりうる細胞であれば、骨髄、脳、肝臓、その他の臓器から単離できた細胞、さらには該細胞の初代培養細胞、継代培養細胞、不死化細胞のいずれであってもよい。しかし、好ましくは骨髄由来の造血幹細胞を除く、幹細胞が挙げられる。また、単離または樹立された細胞株であって、予備的に骨髄間質細胞とか、間葉系幹細胞と称されているものであっても、本発明の目的に沿う限り（例えば、その後、本発明に従うサイトカインのセットを用いることにり、多能性幹細胞の特性を発揮する限り）、本発明にいう多能性幹細胞に包含される。したがって、上記の非特許文献３〜４に記載の多能性を示す細胞がより具体的なものとして挙げられる。これらに記載の細胞と同等の特性をもっていれば、細胞の起源を問うことなく使用でき、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト等の哺乳動物由来の細胞であることができる。限定されるものでないが、本発明の作用、効果を確認する上で、都合のよい多能性幹細胞としては、前述の非特許文献３または４に記載されているような、温度感受性ＳＶ−４０Ｔ抗原遺伝子のトランスジェニックマウスから樹立されたＴＢＲ株（または系）と称されているものが挙げられる。なお、これらの非特許文献３および４は、共著者として、本発明者の一人である帯刀益夫博士が含まれているとおり、上記のＴＢＲ株の特定の株、例えばＴＢＲ−５２等は、仙台市青葉区星陵町４−１  東北大学  加齢医学研究所から、試験、研究の目的に使用することを前提に、制限なく分譲される。
【００２２】
本発明に従えば、２種以上が組み合わさったサイトカインを有効成分として使用する。サイトカインの語は、当該技術分野で普通に用いられている意味、内容を表すものとして使用している。後述する具体例を見れば明らかになるであろう。本発明では、２種以上のサイトカインが組み合わさって使用されるが、この使用は、同時または、時間、場所、等を異にして個別に使用するものであってよい。また、組み合わせて（またはセットで）使用するが、このような使用が一度なされれば、その後は、いずれか一種のみを使用する場合も、本発明のサイトカインのセットの使用に包含される。例えば、多能性幹細胞の分化の方向性を決定し、そして方向性の程度を制御するのに２種以上のサイトカインを用いた後、最終的な目的に沿うよう、分化した特定の細胞を得る目的で、一種のサイトカインで選択的に増殖分化する場合であっても、これらの全段階は、本発明に従うサイトカインのセットの使用に相当するものと、理解されている。３以上の分化の方向性とは、多能性幹細胞を増殖させた場合に、新たな３種以上の特性（分化形質）が発現されるか、または機能的な細胞もしくは組織や器官を指向する性質を意味し、端的にいえば、いずれかの機能細胞、例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞等に至る性向である。したがって、各分化の程度とは、例えば、平滑筋細胞または骨格筋細胞が対照、例えば、単離された状態にあるサイトカインを添加することなく、血清の存在下での各分化細胞の出現率に比べた場合の出現率の多寡を意味する。
【００２３】
かような分化の方向性は、具体的には、多能性幹細胞が平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、内皮細胞または脂肪細胞、等の各分化形質を発現したか、もしくは各分化細胞に至ることを意図しているが、これらに限定されるものでない。本発明に従う、２以上のサイトカインのセットを使用すれば、上記各分化細胞の少なくとも３種に多能性幹細胞を指向させることができ、そして指向させて得られる各分化細胞の、分化形質の発現の程度もしくは出現の程度を制御できる。これらの程度は、多官能性幹細胞を前記サイトカインが添加されていないが、血清が補足されていること以外、他の培養組成は本質的に同一の培地で培養したときに観察される各分化形質の発現の程度もしくは各分化細胞の出現の程度に比べ、検出できる程度に促進（もしくは増加）または抑制（もしくは減少）していることを意味する。この程度は、前記の血清の存在下でもたらされる分化形質の発現または分化細胞の出現に比べ、少なくとも１０％促進または抑制されていることが好ましい。こうして本発明によれば、いずれか特定の分化細胞の出現率または存在の割合を選択的に高めることができる。上記の分化形質の発現の程度および分化細胞の出現の程度を検出する例は、後述の実施例に特定のものを挙げるが、当該技術分野に周知の如何なる技法に従ってもよい。
【００２４】
本発明では、多能性幹細胞を上記のように誘導できる２種以上のサイトカインの組み合わせ（またはセット）を構成するサイトカインは、本発明の目的に沿う、例えば、直前に記載したような、いずれか特定の分化細胞の出現率または存在の割合を選択的に高めることのできる、ものであれば如何なるサイトカインを使用し、それらを如何に組み合わせたものであってもよい。しかし、このようなサイトカインの例として、限定されるものでないが、骨形成因子−２（ＢＭＰ−２）、骨形成因子−４（ＢＭＰ−４）、オンコスチンＭ（ＯＳＭ）、グロース・ディファレンシェーション・ファクター（ＧＤＦ−５）およびトランスフォーミン増殖因子（ＴＧＦ−β２）、等を挙げることができる。また、このようなサイトカインの組み合わせの例としては、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２とＯＳＭ、ＢＭＰ−２とＴＧＦ−β２、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−４とＯＳＭ、ＯＳＭ−ＢＭＰ−４、ＯＳＭとＴＧＦ−β２、ＯＳＭとＧＤＦ−５、ＯＳＭとＧＤＦ−５とＢＭＰ−４、ＯＳＭとＧＤＦ−５とＴＧＦ−β２とＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２とＯＳＭとＧＤＦ−５とＢＭＰ−４およびＢＭＰ−２とＯＳＭとＧＤＦ−５とＴＧＦ−β２とＢＭＰ−４を挙げることができる。例えば、ある多能性幹細胞（後述する実施例参照）は、ＢＭＰ−２とＯＳＭとの組み合わせ使用により、高い出現率での自律拍動する心筋細胞への分化能および高い出現率での内皮細胞への分化能を有することが確認できる、したがって、目的に応じて、かような多能性をもつ幹細胞にＢＭＰ−２またはＯＳＭを適用するか、あるいはＢＭＰ−２およびＯＳＭを適用することができる。
【００２５】
上記の２種以上のサイトカインの組み合わせ使用により多能性幹細胞にいずれかの分化形質を発現させるか、またはいずれかの分化細胞を出現させる環境（または条件）は、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、エクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）またはイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）であることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  および  ｅｘ  ｖｉｖｏ  で使用される細胞の増殖条件は、当該技術分野で哺乳動物細胞を培養するのに通常用いられる条件をそのまま、あるいは改良したものであることができる。例えば、培地としては、基本的には、必須栄養源が添加してあり、アミノ酸では、動物（哺乳類）が合成できない必須アミノ酸のＬ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミンを基本として加えてあり、場合によっては生育を良くする目的で、非必須アミノ酸のＬ−グリシン、Ｌ−セリンも添加したものであれば、どのような培地でも利用できる。培養温度、等のその他の条件は、温度条件など、そのほかに、ＣＯ２インキュベーター中の気相のＣＯ２と共同して培地のｐＨを安定化させるために添加するバッファー剤として、細胞が炭酸水素イオンを必要とすることから、一般的には炭酸水素系の重炭酸ナトリウム溶液を加えるか、さらにＨＥＰＥＳなど添加して、ＣＯ２インキュベーターから外に取り出してもｐＨが安定に保てるように工夫してよい。また、適宜、雑菌の汚染を防ぐために、抗生物質を加えてもよい。本発明に従えば、培地から必要に応じて、血清その他の作用剤を除去し、サイトカインが添加される。他方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  では、生理学的または使用するサイトカインに悪影響を及ぼさない媒体中にサイトカインを含有せしめた形態が採用できる。かような媒体の例としては、限定されるものでないが、無菌水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水であることができる。また、これらの媒体には生体に悪影響を及ぼさない範囲でサイトカインを、例えば生体内にそのまま適用した場合、生体内で酵素分解を受け自己組織の再生が妨げられることがない、除放媒体と組み合わせて生体内で安定化するのがよい。その媒体として、以下のものを単独でまたは組み合わせて使用してよい。
【００２６】
ポリ乳酸（多孔体）、コラーゲン、コラーゲンスポンジ、ベーター三リン酸カルシウム、多孔質ハイドロキシアパタイト、ポリ乳酸マイクロスフェア、ポリ乳酸コーティングゼラチンスポンジ、乳酸−エチレングリコール共重合体、アガロース、ポリビニルアルコール、アルギン酸、アガロース／ヘパリン、アミロペクチン、フィブリンゲル、コラーゲンミニペレット、エチレン−酢酸ビニル共重合体、乳酸−グリコール酸共重合体、キトサン、乳酸／グリコール酸−エチレングリコール共重合体、チタンインブラントなどを添加してもよい。
【００２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  および  ｅｘ  ｖｉｖｏ  で使用する場合の各サイトカインの使用量は、後述する実施例における使用量を参照して、必要があれば、さらに小実験を行って最適量を決定すればよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ  で使用する場合は通常０．１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの用量であることができる。こうして、本発明に従う２種以上のサイトカインを含んでなるセットは、少なくとも、心臓、毛細血管、動脈及び静脈などの血管系の臓器、胃、食道、結腸、直腸、小腸、大腸などの消化器系の臓器、手足の筋肉、気管、子宮、膣や脂肪組織などの再生医療に利用できる。
【００２８】
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  で該セットを用いる場合は、殊に、簡便に使用、操作のできる本発明者の一部によって提供された、上記のＴＢＲ間質細胞株を利用して、多態様幹細胞の分化の方向性を決定でき、さらに方向性の決定された各分化の程度を制御できる作用剤のスクリーニング系を構築できる。かようなスクリーニング系において、本発明に従うサイトカインのセットは、比較試料として使用できる。例えば、スクリーニングにかけるべき作用剤の候補物質（例えば、ＴＢＲ株を分化誘導しうることが期待できる候補作用剤）の存在下で多態性幹細胞を培養する代わりに、上記のサイトカインの一種または二種以上の存在下での培養結果を、該候補物質の作用を評価する上での標準（もしくは基準）とすることにより、多態性幹細胞を所期の分化方向へ分化誘導するのに役立つ作用剤が効率よくスクリーニングできる。なお、かようなスクリーニング系で使用できる培養条件は上述したものに基づくことができる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を具体例により、さらに詳述するが、本発明は、これらに限定されるものでない。
実施例１：細胞株ＴＢＲ５２が多能性を有することの確認
（１）  本実施例では細胞株ＴＢＲ５２（上述の非特許文献３および４参照。）を使用し、培地は下記の表１に示される組成を有するα−ＭＥＭ培地を使用した。
【００３０】
【表１】
2004290006.tif 000002
【００３１】
（２）  ＴＢＲ５２の分化能
以下に記載するウェスタンブロッティング法（ＷＢ）、免疫染色法および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法などの同定方法の組み合わせによって同定した。
（２−１）  平滑筋細胞については、３５ｍｍプラスチックディッシュに培養した細胞集団のなかに顕微鏡学的に単核で紡錘形（ｓｐｉｎｄｌｅ  ｓｈａｐｅ）を示す細胞を観察し、その培養細胞集団から抽出した蛋白質混合物から平滑筋細胞に特異的に発現するミオシン軽鎖キナーゼ（ｓｍ−ＭＬＣＫ）を検出するために、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって蛋白質を分離し、分離したゲル上の蛋白質をメンブレンに転写し（ＷＢ法）、メンブレン上のｓｍ−ＭＬＣＫに特異的に反応する一次抗体（Ｓｉｇｍａ  製、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−Ｍｙｏｓｉｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ，ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ，  ｃｌｏｎｅ  Ｋ３６，  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｍ７９０５）とそれを検出するためのホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した二次抗体（ＩＣＮ製、Ｇｏａｔ，  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２，  ＩｇＧ、カタログＮｏ．５５５５３）を使用することによって同定した。
（２−２）  骨格筋細胞については、３５ｍｍプラスチックディッシュに培養した細胞集団のなかに顕微鏡学的に多核で筋管（ｍｙｏｔｕｂｅ）状、かつ横紋筋型構造を示す細胞を観察して確認し、上述と同様の方法によって培養細胞集団から抽出した蛋白質混合物から骨格筋細胞に特異的に発現する速筋型骨格筋ミオシン重鎖ＩＩ（ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｙｏｓｉｎ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  ＩＩ，  ｆａｓｔ）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって蛋白質を分離し、当該ミオシン重鎖ＩＩに特異的に反応する一次抗体  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｙｏｓｉｎ（ｆａｓｔ）（Ｓｉｇｍａ  製、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，ｃｌｏｎｅ  ＭＹ３２，Ｍ４２７６）とそれを検出するためのホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗マウスの二次抗体（ＩＣＮ製、Ｇｏａｔ，  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２，ＩｇＧ、Ｎｏ．５５５５３）を使用することによって同定した。培養ディッシュ中の細胞核の観察は培養液の除去後、濃度１μｇ／ｍｌに調製した染色液ヨウ化プロピジウム（Ｐｌ）を添加し、染色液との反応処理を室温で５分間行い、染色液を除去しリン酸バッファ緩衝液（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。ＰＢＳによる洗浄処理は各々５分間、３回行った。
【００３２】
また、速筋型骨格筋ミオシン重鎖ＩＩ蛋白の発現の確認は常法に従い免疫染色によって行った。具体的には、３５ｍｍプラスチックディッシュ内の２５ｍｍ  Ｐｏｌｙ−Ｌ  Ｉｙｓｉｎｅ  コートカバーグラス（４９２５−０４０、旭テクノグラス、東京）上に培養した細胞集団をリン酸バッファー液（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、２．５％パラフォルムアルデヒドを１．５ｍｌ用い、４℃下で１５分間固定した。ＰＢＳによって５分間、３回洗浄した後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１．５ｍｌのＰＢＳを用い、室温下で３分間の穿孔処置を行った。ＰＢＳを用い、５分間３回洗浄した後、５％スキムミルクを含むＰＢＳ（以下５％スキンミルク−ＰＢＳと記す）１．５ｍｌを添加し、４℃下で３０分間処理した。上述の速筋型骨格筋ミオシン重鎖ＩＩに特異的に反応する抗体  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｙｏｓｉｎ（ｆａｓｔ）（Ｓｉｇｍａ  製、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１，ｃｌｏｎｅ  ＭＹ３２，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｍ４２７６）を５％スキムミルク−ＰＢＳで１：５０に希釈し、これを一次抗体として用いた。先の３０分間処理で用いた５％スキンミルク−ＰＢＳ１．５ｍｌをこの一次抗体１．５ｍｌに置換し、４℃下で約１４時間反応させた。その後、ＰＢＳを用い、５分間３回洗浄した。二次抗体としては５％スキムミルク−ＰＢＳを用いて、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）標識の抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ  製、Ｇｏａｔ，  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−Ｆａｂ、Ｆ８７１１）を１：２００に希釈した。この二次抗体１．５ｍｌを用い、４℃下で３０分間反応させ、次いでＰＢＳを用いて５分間３回洗浄した後、反転し  ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｈ−１０００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、  ＵＳＡ）をはさみスライドグラス上にマウントした。倒立蛍光顕微鏡を用いて速筋型骨格筋ミオシン重鎖ＩＩの蛋白の発現を確認した。
（２−３）  心筋細胞については、３５ｍｍプラスチックディッシュに培養した細胞集団のなかに顕微鏡学的に単核で棍棒状（ｒｏｄ  ｓｈａｐｅ）の形態を有し、自律的に周期的な収縮（拍動）をする細胞を観察し、ＷＢ法を用い上述と同様の手順で従い、心筋特異的なコネキシン４３蛋白質の発現を確認した。ただし、一次抗体として抗コネキシン  ４３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  製、製品  Ｎｏ．ＭＡＢ３０６８）を使用し、二次抗体としては抗マウスの二次抗体（ＩＣＮ製、Ｇｏａｔ、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２，１ｇＧ  Ｎｏ．５５５５３）を使用した。さらにＲＴ−ＰＣＲ法によってＮｋｘ２．５遺伝子、αミオシン重鎖遺伝子の発現を確認することで同定した。
【００３３】
その手順はＲＴ−ＰＣＲキット（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  製、商品  Ｎｏ．１１９０４−０１８）に添付のマニュアルに従った。培養ディツシュ中の培養液を除去しディツシュ底に付着した細胞をＰＢＳで３回洗浄した。この洗浄した細胞中の総ＲＮＡを、ＲＮＡ抽出試薬  Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン製）を用いたチオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロフォルム法によって回収した。次いで回収した２．５μｇのトータルＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲキット添付のマニュアルに従い、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）法によってｃＤＮＡを作成し、ＤＥＰＣ水で１０倍に調整した。このｃＤＮＡ  １μｌを鋳型として１０倍ＰＣＲ緩衝液１μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣ１２  １μｌ、８ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ、フォーワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）（１０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ、リバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）（１０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アプライドバイオシステムズジャパン、東京）０．１μｌ、及びＤＥＰＣ水５．４μｌの全量１０μｌの反応液を調製し遺伝子の増幅反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは  ＧｅｎＡｍｐ  ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズジャパン、東京）を用い、９５℃５分の後サイクル数は３０回で各々の条件でおこなった。その後、２％アガロースゲルに標準マーカーと共に電気泳動し、ＰＣＲ産物をＵＶ光下にて確認した。遺伝子の増幅反応に用いた各々のプライマーの塩基配列は下記のとおりである。
【００３４】
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（２−４）  内皮細胞については、３５ｍｍプラスチックディッシュに培養した細胞集団のなかに顕微鏡学的に敷石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）状の形態を示す細胞を観察し、１，１′−ジオクタデシルー３，３，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート標識アセチル化低密度リポプロテイン（ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ：製品Ｎｏ．Ｌ−３４８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  製、ＵＳＡ）の取り込み能を確認することにより同定した。具体的には培養ディッシュ中の培養液を細胞に傷を付けないように吸い取って捨て、無血清培地で１０μｇ／ｍｌに調製したＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬを添加し４時間、３３℃で培養した。ＰＢＳにて５分間３回洗浄することによって取り込まなかったＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬを除き、３％フォルムアルデヒド溶液を添加し、２０分間室温に放置して固定した。蒸留水で洗浄した後、ローダミンフィルターを用い、蛍光顕微鏡で観察した。
（２−５）  脂肪細胞については、培養した細胞集団のなかに顕微鏡学的に脂肪球を持った細胞を観察し、オイルレッド染色法によって同定した。培養ディッシュ中の培養液を除去しディッシュ底に付着した細胞をＰＢＳで８分間づつ８回洗浄した後、３％のホルマリン溶液を用いて、１０分間室温に静置して固定し、次いで８０％のイソプロパノールによって１分間置換し、３７℃で１０分間、オイルレッドで染色した。さらに６０％イソプロパノールを使って１分間分別した後、３分間づつ２回洗浄し、最後に核染色のためにマイヤのヘマトキシリン溶液（和光製）によって、１０分間処理し、２分間流水で洗浄した後に、顕微鏡学的に赤く染まった脂肪細胞を確認した。また、この脂肪細胞は成熟すると明確な脂肪球を持った細胞に発育するので、染色しなくても脂肪細胞として容易に判定できた。
実施例２〜６：サイトカインによる分化の制御
試験すべきサイトカインは、下記の表−２に示される組成を有するＲＩＴＣ８０−７培地に添加して、各サイトカインの添加効果を確認した。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
ＲＩＴＣ８０−７培地を用い、ＴＢＲ５２を９０ｍｍプラスチックディッシュで細胞同士がくっ付き合う直前のサブコンフルエント状態（８０％程度のコンフルエント）まで培養した。培養液を除去した後に、１ｍｌのＥＤＴＡ・トリプシン溶液（０．０２ｇＥＤＴＡ・３Ｎａ／１００ｍｌのＰＢＳ溶液、０．００２ｇトリプシン／１００ｍｌのＰＢＳ溶液）を添加し細胞を洗浄した。この洗浄操作は細胞が剥がれる前にすばやく２回行うが、トリプシン溶液を添加し、万辺なく細胞表面に広がった直後にトリプシン溶液をパスツールピペットですばやく吸い取り除去した。次いで顕微鏡で細胞が完全に剥がれているのを確認後、表−１で示したα−ＭＥＭ培地を添加し、細胞濃度を３×１０の５乗／ｍｌに調製した。この細胞浮遊液１．５ｍｌを３５ｍｍプラスチックディッシュに添加した。この時、３５ｍｍプラスチックディッシュには、２５ｍｍ  Ｐｏｌｙ−Ｌ  ｌｙｓｉｎｅ  コートカバーグラス（４９２５−０４０、旭テクノグラス、東京）を前もって敷いておいた。α−ＭＥＭ培地の添加２４時間後に新しいα−ＭＥＭ培地に交換した。培地交換は２日または３日毎に３０日間行った。
【００３７】
細胞の分化能に及ぼすサイトカイン類の添加の効果について、細胞培養にはα−ＭＥＭ培地を用い、α−ＭＥＭ培地の添加２４時間後に新しいα−ＭＥＭ培地に交換した。培地交換を２日または３日毎に３０日間行った。サイトカイン類の添加は培地交換の都度に行い、その量は下記の表−３に示すとおりであった。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
また、細胞分化の判定は以下に記述する基準によって行った。すなわち平滑筋については、顕微鏡学的に単核で紡錘形（ｓｐｉｎｄｌｅ  ｓｈａｐｅ）を示す細胞を観察し、単面積当たりに占める面積を目視で測定し、その平均値を％で表した。更にその培養細胞集団から抽出した蛋白質混合物から平滑筋細胞に特異的に発現するミオシン軽鎖キナーゼ蛋白の発現を上述のＷＢ法で判定した。骨格筋については、顕微鏡学的に多核で筋骨（ｍｙｏｔｕｂｅ）状、かつ横紋筋型構造を示す細胞を観察し、単面積当たりに占める面積を目視で測定し、その平均値を％で表した。更に培養細胞集団から抽出した蛋白質混合物から骨格筋細胞に特異的に発現する速筋型骨格筋ミオシン重鎖ＩＩ（ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｙｏｓｉｎ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  ＩＩ，  ｆａｓｔ）蛋白の発現を上述のＷＢ法で判定した。これらのＷＢ法の結果を示す図に代わる写真を図１として示す。心筋細胞については、顕微鏡学的に単核で棍棒状（ｒｏｄ  ｓｈａｐｅ）の形態を有し、自律的に周期的な収縮（拍動）をする細胞を観察し、単位面積当たりの自律的、周期的に拍動する細長い混紡状の細胞数を計数し、その平均値を求めた。内皮細胞については、顕微鏡学的に敷石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）状の形態を示す細胞を観察し、単面積当たりに占める面積を目視で測定し、その平均値を％で表した。脂肪細胞については、脂肪球を形成している単位当たりの細胞数を測定し、その平均値を求めた。結果を表−４および表−５にまとめて示す。
【００４０】
【表４】
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【００４１】
【表５】
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【００４２】
表−４および表−５から明らかなとおり、実施例２において培地にＢＭＰ−２を加えると、心筋細胞への分化は添加しない比較例の約１０倍まで促進された。また骨格筋細胞への分化は顕微鏡学的な形態観察では心筋細胞に覆われるなど明確な判定が出来なかったが、ＷＢ法の分析結果から、明らかに促進された。平滑筋及び内皮細胞への分化はＢＭＰ２を添加しても大きな影響を受けなかった。脂肪細胞への分化は細胞数では比較例とほとんど差がないが、ＢＭＰ２を添加することによって、小さい脂肪球をもった未熟な細胞が観察され脂肪細胞への分化が抑制されていた。
【００４３】
実施例３において、培地にＯＳＭを添加すると、心筋細胞への分化が比較例の１／２までに抑制された。また、骨格筋及び脂肪細胞への分化はほとんど完全に抑制され、顕微鏡学的な形態的観察からも多核で筋管（ｍｙｏｔｕｂｅ）状の骨格筋及び脂肪球を含む脂肪細胞は確認されなかった。骨格筋細胞の分化に対するこの抑制効果はＷＢ法による速筋型骨格筋ミオシン重鎖ＩＩ蛋白の発現の解析からも確認できた。脂肪細胞への分化もＯＳＭの添加によって抑制された。しかし、平滑筋と内皮細胞への分化に対してはほとんど影響しなかった。
【００４４】
実施例４において、培地にＧＤＦ５を添加すると、心筋細胞及び脂肪細胞への分化がわずかに促進した。しかしながら、ＧＤＦ５の添加は骨格筋細胞に特異的な速筋型骨格筋ミオシン重鎖ＩＩ蛋白の発現を抑制した。平滑筋及び内皮細胞への分化は、ＧＤＦ５の添加によって影響されなかった。
【００４５】
また、実施例５において、培地にＴＧＦ−β２を添加すると、平滑筋、心筋及び脂肪細胞への分化は抑制されたが、内皮細胞への分化は影響されなかった。骨格筋細胞への分化は、顕微鏡による形態学的観察から、全く骨格筋細胞の形態を表す細胞を観察することが出来なかったが、骨格筋細胞に特異的な速筋型骨格筋ミオシン重鎖ＩＩ蛋白の発現がＷＢ法では促進的であった。しかし、この蛋白発現に対しては現時点、明確な説明ができないが、骨格筋細胞への分化の過程で起こる形態学的な細胞融合と骨格筋分化の初期誘導期の関係を明らかにする鍵になるかもしれない。
【００４６】
さらに実施例６において、ＢＭＰ４を培地に添加すると、無添加の比較例から明らかなように、脂肪細胞への分化が１０倍以上の比率で促進されたが、平滑筋及び骨格筋細胞への分化はＷＢ法による解析によって抑制されることが分かった。また心筋細胞の特徴である自律的な拍動細胞数も少なく心筋細胞への分化は抑制された。内皮細胞への分化に対するＢＭＰ４の添加はほとんど影響しなかった。
【００４７】
これらの結果は多分化能を有する幹細胞に、各種サイトカインを与えることによって、ある特定の細胞へと分化の方向を優位に増幅させたり、低減させることが可能であることを示し、さらに添加するサイトカインを組み合わせることによって、不要な細胞を抑制し、目的とする細胞のみを優位に増幅させることが可能であることを示している。
【００４８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例におけるＷＢ法の結果（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって蛋白質を分離し、分離したゲル上の蛋白質をメンプレンに転写した）を示す図に代わる写真である。
【図１】
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