(57)【要約】　　【課題】　ＢＲＣＡ１遺伝子中の生殖細胞系突然変異、ならびに乳癌および卵巣癌に対する病気素因の診断。　　【解決手段】　ヒト乳癌および卵巣癌に対する病気素因遺伝子(ＢＲＣＡ１)を単離し、かつ、検出するのに用いる方法および材料の使用。【選択図】図６
2004135687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヌクレオチド１２０ないしヌクレオチド５７０８の配列番号：１記載のヌクレオチド配列、その相補体あるいは対応するＲＮＡまたは、 （ｉｉ） ヌクレオチド１２０ないしヌクレオチド５７０８の配列番号：１記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体、その相補体あるいは対応するＲＮＡを含み、かつ（ａ）　配列番号：２記載のアミノ酸配列を含むBRCA１ポリペプチドをコードする核酸；および（ｂ）　４５℃を越える温度および２００ｍM未満の塩濃度の緊縮ハイブリダイゼーション条件下、ヌクレオチド１２０ないしヌクレオチド５７０８の配列番号：１記載のヌクレオチド配列を含むBRCA1核酸にハイブリダイズする核酸であって、BRCA1、その対立遺伝子変異体または天然に産出されるその突然変異体をコードする該核酸よりなる群から選択される単離核酸。
【請求項２】
作動可能にBRCA1遺伝子調節配列に連結される請求項１記載の単離核酸。
【請求項３】
（ｉ）請求項１記載のヌクレオチド１２０ないしヌクレオチド５７０８の配列番号：１記載のヌクレオチド配列またはその対立遺伝子変異体または天然に産出されるその突然変異形態より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸または（ｉｉ）該核酸に対応するRNAの試料中の存在を測定するハイブリダイゼーションプローブであって、請求項１記載の核酸のヌクレオチド配列の部分を含む単離したＤＮＡを含み、ここに、該プローブの配列は、４５℃を越える温度および２００ｍM未満の塩濃度の緊縮ハイブリダイゼーション条件下、該核酸またはRNAのBRCA1ポリペプチドコード配列の部分である標的配列に特異的にハイブリダイズでき、該部分は少なくとも１５個のヌクレオチドを含む該ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項４】
請求項３記載のハイブリダイゼーションプローブに適した核酸プローブであって、該核酸プローブのヌクレオチド配列がヌクレオチド３６３１ないし３９３０位の配列番号：１記載のDNA配列を含む該核酸プローブ。
【請求項５】
請求項１記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項６】
（ａ）　（ｉ）請求項１記載の単離核酸または請求項３記載のプローブおよび、（ｉｉ）該ベクターの宿主細胞中で作動可能なレプリコンを含む複製クローニングベクター；および（ｂ）該BRCA１ポリペプチドまたはその突然変異形態が、該ベクターの宿主細胞中のコード配列の発現を指示できるプロモーター配列に作動可能に連結される請求項１記載の単離核酸を含む発現ベクターよりなる群から選択されるベクター。
【請求項７】
請求項５または６記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項８】
請求項２記載の突然変異BRCA1ヌクレオチド配列の同定方法であって、予想される突然変異BRCA１対立遺伝子のヌクレオチド配列をヌクレオチド１２０ないしヌクレオチド５７０８の配列番号：１記載のコード配列および／またはその対立遺伝子変異体を含有するBRCA1のヌクレオチド配列と比較することを含む該方法。
【請求項９】
表９に記載のプライマーの対を用いる増幅により調製されるＤＮＡ断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細には、本発明は、そのいくつかの突然変異対立遺伝子が、癌、特に乳癌および卵巣癌に感受性を引き起こすヒト乳癌および卵巣癌病気素因遺伝子(ＢＲＣＡ１)を単離し、検出するのに用いる方法および材料に関する。より詳細には、本発明は、ＢＲＣＡ１遺伝子における生殖細胞系突然変異、ならびに乳癌および卵巣癌に対する病気素因の診断におけるその使用に関する。本発明は、さらに、ヒト乳癌および卵巣癌におけるＢＲＣＡ１遺伝子における体細胞突然変異、ならびにヒト乳癌および卵巣癌の診断および予診におけるその使用に関する。加えて、本発明は、他のヒト癌におけるＢＲＣＡ１遺伝子の体細胞突然変異、ならびにヒト癌の診断および予診におけるその使用に関する。また、本発明は、遺伝子療法、蛋白質置換療法および蛋白質ミメティックスを包含する、ＢＲＣＡ１遺伝子中に突然変異を有するヒト癌の療法にも関する。本発明は、さらに、癌療法用薬剤のスクリーニングにも関する。最後に、本発明は、乳癌および卵巣癌の病気素因の診断に有用な、突然変異についてのＢＲＣＡ１遺伝子のスクリーニングに関する。
　本発明の背景、および特に、実施に関するさらなる詳細を提供する場合を明らかにするために本明細書中で用いる刊行物および他の材料は、出典明示して本明細書の一部とみなし、簡便のために、以下の明細書中の著者および日付けによって示し、添付する参照リスト中に各々グループ化する。
【背景技術】
【０００２】
　トランスフォーム状態の優性で正の多くの調節遺伝子(オンコジーン)、ならびに劣性で負の多くの調節遺伝子(腫瘍サプレッサー遺伝子)を包含する癌の遺伝学は複雑である。百を超えるオンコジーンが特徴付けられている。１ダースに満たない腫瘍サプレッサー遺伝子しか同定されていないが、その数は５０を超えて増加すると予想される(Ｋnudson,1993)。
【０００３】
　そのように多数の遺伝子の関与は、細胞で作動して正常組織の完全性を維持する増殖制御機構の複雑さを強調している。この複雑性は他の方法で明白である。現在まで、単一の遺伝子がすべての、または大部分のヒト癌の成長に関与していることが示されたことはない。最も普遍的なオンコジーン突然変異はＨ-ｒａｓ遺伝子に存在し、全ての充実性腫瘍の１０-１５％に見出されている(Ａndersonら，1992)。最も頻繁に突然変異する腫瘍サプレッサー遺伝子は、全腫瘍のほぼ５０％でホモ接合的に欠損したＴＰ５３遺伝子、および検査した腫瘍細胞系統の４６％でホモ接合的に欠損したＣＤＫＮ２である(Ｋambら，1994)。すべてのトランスフォーム細胞に共通する標的なしには、癌細胞を破壊または復帰させる一方で害されていない正常組織を残し得る「魔法の弾丸」の夢はありそうにない。特異的に標的化した抗癌剤の新たな創薬の望みは、細胞分裂の制御において一般的な役割を演じている腫瘍サプレッサー遺伝子またはオンコジーンを同定する能力に支えられ得る。
【０００４】
　クローン化され特徴付けられた腫瘍サプレッサー遺伝子は、１）網膜芽細胞腫(ＲＢ１)；２）Ｗilms腫瘍(ＷＴ１)；３）Ｌi-Ｆraumeni症候群(ＴＰ５３)；４）家族性腺腫性茸腫症(ＡＰＣ)；５）神経線維腫症１型(ＮＦ１)；６）神経線維腫症２型(ＮＦ２)；７）von Ｈippel-Ｌindau病(ＶＨＬ)；８）多発性内分泌腺腫症２Ａ型(ＭＥＮ２Ａ)；および９）メラノーマ(ＣＤＫＮ２)に対する感受性に影響する。
【０００５】
　遺伝子的にマッピングされているが未だ単離されていない腫瘍サプレッサー遺伝子座には：多発性内分泌腺腫症１型(ＭＥＮ１)；リンチ癌家族性症候群２型(ＬＣＦＳ２)；神経芽細胞腫(ＮＢ)；基底細胞母斑症候群(ＢＣＮＳ)；Ｂeckwith-Ｗiedemann症候群(ＢＷＳ)；腎細胞腫(ＲＣＣ)；結節性硬化症１型(ＴＳＣ１)；および結節性硬化症２型(ＴＳＣ２)に関する遺伝子が包含される。今日までに特徴付けられている腫瘍サプレッサー遺伝子は、ＤＮＡ結合蛋白質(ＷＴ１)、補助転写因子(ＲＢ１)、ＧＴＰアーゼ活性化蛋白質またはＧＡＰ(ＮＦ１)、細胞骨格因子(ＮＦ２)、膜結合受容体キナーゼ(ＭＥＮ２Ａ)、細胞サイクル調節因子(ＣＤＫＮ２)および公知の蛋白質に明白な同一性をなんら有しない他のもの(ＡＰＣおよびＶＨＬ)を包含する、種々のタイプの蛋白質と同類の産物をコードする。
【０００６】
　多くの場合、遺伝的研究を通して元来同定された腫瘍サプレッサー遺伝子は、ある種の散発性腫瘍においては欠失または突然変異していることが示されている。この結果は、染色体異常の領域が、癌への遺伝的病気素因および散発性癌の両方に関与する重要な腫瘍サプレッサー遺伝子の位置を知り得ることを示している。
【０００７】
　今日までに特徴付けられた数種の腫瘍サプレッサー遺伝子の顕著な特徴の１つは、特定の腫瘍型においてそれが高率で欠失しているということである。該欠失には、しばしば、単一対立遺伝子の欠失、いわゆるヘテロ接合体の欠失(ＬＯＨ)が含まれるが、また、両方の対立遺伝子のホモ接合体欠失も含まれ得る。ＬＯＨに関しては、予め存在する突然変異のためか、二次的散発性突然変異のためかのいずれかによって、残りの対立遺伝子が非機能性になると予想される。
【０００８】
　乳癌は、女性に影響する最も重要な疾病の１つである。最近の比率では、米国女性は、９５歳までに乳癌を発症する１/８の危険度を有する(Ａmerican Ｃancer Ｓociety，1992)。後期ステージの乳癌の治療は、しばしば、無駄で、かつ醜く、疾病の医療管理において早期の検出を高い優先としている。乳癌よりもより頻繁ではないが、卵巣癌はしばしば迅速に死に至り、米国女性における癌致死率の第４番目の最も普遍的原因である。乳癌発症率の疾病-規定比率に寄与する遺伝的因子は全ケースの約５％と概算されるが、約２５％のケースが４０歳前に診断されている(Ｃlausら,1991)。乳癌は５０歳付近の年齢-特異的発症率曲線の変曲に基づき、２種のタイプ、すなわち、低齢発症および高齢発症に分けられる。１つの遺伝子、すなわちＢＲＣＡ１の突然変異が家族性乳癌の約４５％の原因と考えられるが、乳癌および卵巣癌の両方を有する家族の少なくとも８０％の原因と考えられる(Ｅastonら,1993)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
　ＢＲＣＡ１遺伝子が１９９０年に最初にマッピングされてから、それを単離する激しい努力がなされてきている(Ｈallら,1990；Ｎarodら,1991)。第２の遺伝子座、ＢＲＣＡ２は最近、染色体１３ｑにマッピングされ(Ｗoosterら，1994)、ＢＲＣＡ１とほぼ同等な低齢-発症乳癌の比率と考えられるようであるが、卵巣癌の低い危険性に寄与している。低齢-発症乳癌に対する残りの感受性は、家族性癌の未だマッピングされていない遺伝子と、ＴＰ５３のごとき珍しい生殖細胞系突然変異との間に分けられる(Ｍalkinら，1990)。また、血管拡張性失調症遺伝子のヘテロ接合体キャリアーが、乳癌につき高危険性であることも示唆されている(Ｓwiftら，1976；Ｓwiftら，1991)。高齢-発症乳癌はしばしば家族性であるが、血縁における危険度は低齢-発症乳癌ほど高くない(Ｃannon-Ａlbrightら，1994；Ｍettlinら，1990)。しかしながら、遺伝的感受性によるかかるケースのパーセンテージは知られていない。
【００１０】
　乳癌は、部分的に、家族性疾病であると長い間認識されている(Ａnderson,1972)。膨大な数の研究者が遺伝的受継の証拠を検査し、データは主要な感受性遺伝子座または遺伝子座群の優性遺伝とほとんど一致すると結論している(ＢishopおよびＧardner，1980；Ｇoら，1983；ＷilliamsおよびＡnderson，1984；Ｂishopら，1988；Ｎewmanら，1988；Ｃlausら，1991)。最近の結果は、少なくとも３つの遺伝子座が存在し、これらが乳癌ならびに他の癌に対する感受性を運んでいることを証明している。これらの遺伝子座は染色体１７ｐ上のＴＰ５３遺伝子座
(Ｍalkinら，1990)、ＢＲＣＡ１として知られている１７ｑ-連鎖感受性遺伝子座(Ｈallら，1990)、および未マッピングの残りのものに寄与する１または２以上の遺伝子座である。Ｈallら(1990)は、低齢発症を有する家系において遺伝した乳癌感受性が染色体１７ｑ２１に連鎖していることを示したが；より適当な遺伝的モデルを使用したこのグループによるつづく研究は、低齢発症乳癌への限定を部分的に論駁された(Ｍargaritteら，1992)。
【００１１】
　１７ｑ-連鎖乳癌病気素因遺伝子(ＢＲＣＡ１)をクローン化する大部分の戦略は正確な遺伝的位置決定研究を要する。ＢＲＣＡ１の機能的な役割に関する最もシンプルなモデルは、癌となる病気素因であるＢＲＣＡ１の対立遺伝子が野生型対立遺伝子に対して劣性であり；すなわち、少なくとも１つの野生型ＢＲＣＡ１対立遺伝子を含む細胞は癌にかからないことを支持している。しかしながら、１つの野生型ＢＲＣＡ１対立遺伝子および１つの病気素因対立遺伝子を含有する細胞は、ランダム突然変異によってか、または細胞分裂の間の染色体欠失(非染色体分離)によるかのいずれかで野生型対立遺伝子の欠失にしばしば遭遇し得る。かかる突然変異細胞の子孫はすべて、ＢＲＣＡ１の野生型機能を欠いており、腫瘍に発展し得る。このモデルによれば、ＢＲＣＡ１の病気素因対立遺伝子は劣性で、癌に対する感受性を優性で受け継いでいても：１つの病気素因対立遺伝子(および１つの野生型対立遺伝子)を有する女性は癌を発症する危険性を有する。なぜならば、彼女の乳房上皮細胞が、自然発生的に野生型ＢＲＣＡ１対立遺伝子を欠失し得るからである。このモデルは、網膜芽細胞腫遺伝子および神経芽細胞腫遺伝子を包含するクラスの遺伝子、腫瘍サプレッサーまたは抗オンコジーンとして知られている癌感受性対立遺伝子の群に適用する。推論により、このモデルは、最近示されているごとく(Ｓmithら，1992)、ＢＲＣＡ１機能を説明することもできる。
【００１２】
　第２の可能性は、ＢＲＣＡ１病気素因対立遺伝子が実際に優性であり；すなわち、ＢＲＣＡ１の野生型対立遺伝子は病気素因対立遺伝子の腫瘍形成役割を克服し得ないということである。したがって、野生型と突然変異対立遺伝子との両方を運ぶ細胞は、悪性腫瘍細胞を生じる前にＢＲＣＡ１の野生型コピーを欠失しているとは限らない。その代わりに、病気素因個人における乳房細胞は、癌に通じるある種の他の確率的変化(群)が起きているであろう。
【００１３】
　ＢＲＣＡ１病気素因対立遺伝子が劣性である場合、該ＢＲＣＡ１遺伝子は正常な乳房組織で発現するが、乳癌で機能的に発現しないと予想される。それとは反対に、ＢＲＣＡ１病気素因対立遺伝子が優性である場合、野生型ＢＲＣＡ１遺伝子は正常な乳房組織で発現し得るか、またはし得ない。しかしながら、該病気素因対立遺伝子は、乳癌細胞で発現するようである。
【００１４】
　ＢＲＣＡ１の１７ｑ連鎖は、乳癌と卵巣癌の両方を有する５人の家系のうちの３人で独立して確認された(Ｎarodら，1991)。これらの研究は、連鎖したマーカーｐＣＭＭ８６(D17S74)のいずれか側に対して１５センチモルガン(ｃＭ)、または約１５Ｍｂｐの非常に広範な領域の中に該遺伝子が位置決定されると主張している。しかしながら、ｐＣＭＭＳ６を取り囲むマーカーを用いた遺伝的研究によって該領域をさらに画定する試行は首尾よくいかないことが証明された。つづく研究は、該遺伝子がかなり接近していて(Ｅastonら，1993)、元来の分析が欠陥であったことを示している(Ｍargaritteら，1992)。Ｈallら(1992)は、最近、ＢＲＣＡ１遺伝子を、基部側のＭｆｄｌ５(D17S250)および末端側のヒトＧＩＰ遺伝子と境を接する約８ｃＭ(約８Ｍｂｐ)の間隔に位置決定した。公的に入手可能なデータに基づくＢＲＣＡ１対立遺伝子についてのわずかに狭い間隔は、１９９２年３月の「染色体１７研究会」(Ｆain，1992)で合意に達した。これらの領域のサイズおよびそれと関連する不確実性は、ＢＲＣＡ１遺伝子を単離する物理的マッピングおよび／またはクローニング戦略の設計および器具を過剰に困難としている。
【００１５】
　乳癌感受性対立遺伝子の同定により、感受性個人を早期に検出することができ、癌に通じる初期工程を理解する我々の能力を大きく増すであろう。感受性対立遺伝子は腫瘍が進展する間にしばしば変化するため、これらの遺伝子のクローニングも、より良好な診断および予診産物の開発、ならびにより良好な癌療法においても重要となり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
　本発明は、一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細には、本発明は、癌、特に乳癌および卵巣癌に対する感受性を生じるある種の対立遺伝子である、ヒト乳癌病気素因遺伝子(ＢＲＣＡ１)を単離し、かつ検出するのに用いる方法および材料に関する。より詳細には、本発明は、ＢＲＣＡ１遺伝子における生殖細胞系突然変異、ならびに乳癌および卵巣癌の病気素因の診断におけるその使用に関する。本発明は、さらに、ヒト乳癌におけるＢＲＣＡ１遺伝子の体細胞突然変異、ならびにヒト乳癌および卵巣癌の診断および予診におけるその使用に関する。加えて、本発明は、他のヒト癌におけるＢＲＣＡ１遺伝子の体細胞突然変異、ならびにヒト癌の診断および予診におけるその使用に関する。本発明は、また、遺伝子療法、蛋白質置換療法および蛋白質ミメティックスを包含する、ＢＲＣＡ１遺伝子に突然変異を有するヒト癌の療法に関する。本発明は、さらに、癌療法用の薬剤のスクリーニングに関する。最後に、本発明は、突然変異についてのＢＲＣＡ１遺伝子のスクリーニングに関し、それは乳癌および卵巣癌の病気素因を診断するのに有用である。
【発明の効果】
【００１７】
　本発明は、個人のＢＲＣＡ１対立遺伝子をテストするのに用いる物質および方法ならびに該対立遺伝子の正常または病気素因性質の解釈を供する。正常の危険より高い個人はそのライフスタイルを適当に修飾するであろう。ＢＲＣＡ１の場合、最も有意な非−遺伝的危険因子は若年の全妊娠期間の保護効果である。従って、危険な婦人は早くに子供を作ることを考えるか、若年の全期間妊娠のホルモン効果を刺激するように設計した療法を考えることができよう。高い危険の婦人もまた早期検出に努力し、乳房の自己診断を学び実践する絶好の動機付けとなろう。かかる婦人は、一般の集団よりも早い年齢で始めて、規則的な乳房Ｘ線像を取るよう動機付けされるであろう。卵巣スクリーニングも、より高い頻度でなされるであろう。ＢＲＣＡ１遺伝子座の配列分析に基づく診断方法も腫瘍検出および分類に適用できるであろう。配列分析を用いて前駆体病巣を診断できるであろう。該方法の進歩およびＢＲＣＡ１および他の原因的遺伝子座についての情報の蓄積と共に、癌を良性および悪性に分けることが可能となろう。
【００１８】
　乳癌を持つ婦人は、もしそれが病気素因でないというよりも、もしそれが病気素因であり、従ってさらに癌を有するであろうときは、異なる外科方法に従うであろう。ペプチドまたは小さい分子（合理的薬剤デザイン）いずれかを用いる他の療法が開発されるであろう。ペプチドはミッシング遺伝子産物それ自体またはミッシング遺伝子産物の一部であろう。別法として、治療剤は有害な遺伝子機能を模倣するもう１つの分子、受け継いだ遺伝子座の有害効果を妨げることが求められるペプチドまたは非ペプチド分子であろう。また、療法は正常なＢＲＣＡ１対立遺伝子を個人に導入して、有害対立遺伝子の効果を妨げるであろう蛋白質を作製することを通じる、遺伝子ベースであり得る。これらの遺伝子療法は多くの形態を取ることができ、腫瘍が形成されるのを妨げる、一旦生じた癌を治癒する、または癌が転移するのを停止させることに向けられるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
　本発明は、一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細には、本発明は、癌、特に乳癌および卵巣癌に対して感受性を生じるある種の対立遺伝子である、ヒト乳癌病気素因遺伝子(ＢＲＣＡ１)を単離し、かつ検出するのに用いる方法および材料に関する。より詳細には、本発明は、ＢＲＣＡ１遺伝子における生殖細胞系突然変異、ならびに乳癌および卵巣癌の病気素因の診断におけるその使用に関する。本発明は、さらに、ヒト乳癌におけるＢＲＣＡ１遺伝子における体細胞突然変異、ならびにヒト乳癌および卵巣癌の診断および予診におけるその使用に関する。加えて、本発明は、他のヒト癌におけるＢＲＣＡ１遺伝子中の体細胞突然変異、ならびにヒト癌の診断および予診におけるその使用に関する。また、本発明は、遺伝子療法、蛋白質置換療法および蛋白質ミメティックスを包含する、ＢＲＣＡ１遺伝子中に突然変異を有するヒト癌の療法に関する。本発明は、さらに、癌治療用の薬剤のスクリーニングに関する。最後に、本発明は、突然変異についてのＢＲＣＡ１遺伝子のスクリーニングに関し、それは乳癌および卵巣癌の病気素因を診断するのに有用である。
【００２０】
　本発明は、好ましくは少なくとも８塩基長〜約１００ｋｂ長の、ＢＲＣＡ１遺伝子座または突然変異ＢＲＣＡ１遺伝子座の全体または一部分よりなる単離ポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドはアンチセンス・ポリヌクレオチドとし得る。本発明は、また、かかる単離ポリヌクレオチドよりなる組換え構築物、例えば、形質転換宿主細胞における発現に適した組換え構築物を提供する。
【００２１】
　また、本発明により、分析物中のＢＲＣＡ１遺伝子座またはその発現産物の一部分を含むポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。かかる方法は、さらに、ＢＲＣＡ１遺伝子座の一部分を増幅する工程を含んでよく、さらに、ＢＲＣＡ１遺伝子座の該一部分を増幅するためのプライマーである１セットのポリヌクレオチドを提供する工程を含んでよい。該方法は、癌に対する病気素因の診断、または癌の診断もしくは予診のいずれかに有用である。
【００２２】
　本発明は、また、ＢＲＣＡ１遺伝子座によってコードされる少なくとも５個のアミノ酸残基よりなる単離ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体も提供する。
【００２３】
　本発明は、また、ＢＲＣＡ１遺伝子座の一部分よりなるポリヌクレオチドを分析物中で検出するためのキットを提供し、該キットは適当な容器中に密閉したＢＲＣＡ１遺伝子座の一部分に相補的なポリヌクレオチドおよびそれを使用するための指示書を含む。
【００２４】
　本発明は、さらに、重合性ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを調製し、ＢＲＣＡ１遺伝子座の少なくとも８つの隣接したヌクレオチドよりなる配列を得る方法；ならびに、重合性アミノ酸を含むポリペプチドを調製して、ＢＲＣＡ１遺伝子座内にコードされる少なくとも５個のアミノ酸を含む配列を得る方法を提供する。
【００２５】
　本発明は、さらに、突然変異を同定するためにＢＲＣＡ１遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。かかる方法は、さらに、ＢＲＣＡ１遺伝子座の一部分を増幅する工程をさらに含み得、かつ、ＢＲＣＡ１遺伝子座の該一部分を増幅するためのプライマーである１セットのポリヌクレオチドを提供する工程を含み得る。該方法は、癌に対する病気素因の診断または癌の診断もしくは予診のいずれかで使用する突然変異の同定に有用である。
【００２６】
　本発明は、さらに、ＢＲＣＡ１遺伝子中の突然変異を同定するための予想ＢＲＣＡ１突然変異対立遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【００２７】
　加えて、本発明は、ＢＲＣＡ１遺伝子産物機能を回復するのに適当な薬剤を同定するために、癌療法用の薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００２８】
　最後に、本発明は、癌細胞に指向する遺伝子-ベースの療法の作成に必要な手段を提供する。これらの療法剤は、ＢＲＣＡ１蛋白質の機能が再構成されるように適当なベクターに設置するか、または、より直接的な方法で標的細胞にデリバリーするかのＢＲＣＡ１遺伝子座の全体または一部分を含むポリヌクレオチドの形態を採り得る。療法剤は、また、ＢＲＣＡ１の部分的または全体的な蛋白質配列のいずれかに基づいたポリペプチドの形態も採り得る。これらは、イン・ビボ(in vivo)でＢＲＣＡ１の活性を機能的に置換し得る。
【００２９】
　個人が乳癌および卵巣癌に対する病気素因を作るＢＲＣＡ１遺伝子は、ＢＲＣＡ１蛋白質をコードする遺伝子であり、この蛋白質が、公知の蛋白質またはＤＮＡ配列となんら意味深い相同性を有しないことが判明したことは本発明の知見である。この遺伝子は、本明細書中でＢＲＣＡ１と命名する。生殖細胞系におけるＢＲＣＡ１遺伝子座中の突然変異が、乳癌および卵巣癌に対する病気素因の指標になるということは本発明の知見である。最後に、ＢＲＣＡ１遺伝子座における体細胞突然変異も、乳癌、卵巣癌および他の癌と関連しており、このことが、これらの癌の指標、またはこれらの癌の病気素因を表していることが本発明の知見である。ＢＲＣＡ１遺伝子座の突然変異事象には、コード配列および非-コード配列内における欠失、挿入および点突然変異が含まれ得る。
【００３０】
　ヒトゲノムのヒト染色体１７の長腕上の領域から開始する１７ｑは、約８Ｍｂｐと概算されるサイズ、遺伝子座を含む領域、ＢＲＣＡ１を有し、乳癌および卵巣癌を含む癌に対して感受性を引き起こすことが突き止められている。
【００３１】
　ＢＲＣＡ１遺伝子座を含む領域は、種々の遺伝的技術を用いて同定した。遺伝子マッピング技術は、遺伝子マーカーでの組換えによりＢＲＣＡ１領域を最初に画定した。多重ケースの乳癌(およびある家系では卵巣癌ケース)を有する大きく広がった家族(「家系」)の研究に基づいて、ＢＲＣＡ１遺伝子ならびにＢＲＣＡ１遺伝子座中の他の予想感受性対立遺伝子を含む染色体領域の正確な位置を示した。２つの分裂中止点が、遺伝子マーカーと該疾病との間の組換体として、およびＢＲＣＡ１遺伝子座の基部側の１つの組換体として発現されるＢＲＣＡ１遺伝子座の末端側に発見された。したがって、ＢＲＣＡ１遺伝子座を含む領域はこれらのマーカーと物理的に境を接する。
【００３２】
　本発明により提供される遺伝子マーカーの使用は、ヒト酵母人工染色体(ＹＡＣ)またはヒト細菌人工染色体(ＢＡＣ)ライブラリーからの領域をカバーするクローンの同定を許容する。また、この領域からのより簡便に操作したコスミド、Ｐ１およびＢＡＣクローンの同定および調製、ならびにサブセットのクローンからのコンチグ(contig)の構築も許容する。これらのコスミド、Ｐ１、ＹＡＣおよびＢＡＣは、ＢＲＣＡ１遺伝子座のクローニングの基礎を提供し、例えば、乳癌および／または卵巣癌の診断および治療に有効な試薬を開発する基礎を提供する。ＢＲＣＡ１遺伝子および他の可能性のある感受性遺伝子はこの領域から単離した。単離は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする領域において、コスミド、Ｐ１およびＢＡＣからの全体または部分的ｃＤＮＡインサートと共に、ソフトウェア・トラッピング(連続的または非連続的ゲノムＤＮＡ配列から、コードエキソンを含んでいそうな配列を同定するコンピュータ的方法)、ハイブリッド選抜技術および直接的スクリーニングを用いて行った。これらの方法を用いて、乳房および他の組織中に発現される遺伝子座の配列を得た。これらの候補遺伝子座を分析して、癌感受性を供する配列を同定した。本発明者らは、ＢＲＣＡ１として知られている１７ｑ-連鎖癌感受性の原因となる家系において、ＢＲＣＡ１遺伝子座のコード配列中に突然変異が存在することを発見した。この遺伝子がこの領域中に存在することは知られていなかった。本発明は、特定の癌の早期検出を容易にして患者の生存に活力を与えるのみならず、感受性の個人が癌を発症する前に彼らを検出することもできる。
【００３３】
母集団-源
　広くよく記録されているユタ州の家系は、ヒト遺伝学研究の良好な入手源を提供する点において特に重要である。各大きな家系は、独立して、ＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子がその家族中で分離しているか否かを決定する能力を提供する。ＢＲＣＡ１遺伝子座の位置決定および単離に関する組換え情報性は、感受性対立遺伝子の存在を確認するのに十分に大きな家系からのみ得ることができた。大きな兄弟姉妹は乳癌を研究する上で特に重要である。なぜならば、ＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子の浸透度が年齢および性別の両方によって減じられ、情報的兄弟姉妹を発見することを困難としているためである。さらに、大きな兄弟姉妹はその接近した血縁のハロタイプからの影響によって、死亡した個人のハロタイプを構築するのに必須である。
【００３４】
　他の母集団も有益な情報を提供し得るが、かかる研究には一般的により大きな努力を要し、家族は通常遥かに小さく、それ故、あまり情報を得ることができない。ユタ州の年齢を調整した乳癌発症率は２０％で、平均米国の比率よりも低い。ユタ州における低い発症率は、恐らく、大部分は、最初の妊娠の低年齢によるもので、遺伝的病気素因を運ぶユタ州の家系にそのケースが見出される確率は上昇する。
【００３５】
遺伝子マッピング
　情報的な家族の組が与えられれば、疾病を染色体の領域に連鎖するために遺伝マーカーは必須である。かかるマーカーには、制限断片長多形(ＲＥＬＰ)(Ｂotsteinら,1980)、変動する数の縦列反復を有するマーカー(ＶＮＴＲ)(Ｊeffreysら，1985；Ｎakamuraら，1987)、および短縦列反復(ＳＴＲ)、特にＣｐＡの反復(ＷeberおよびＭay，1989；Ｌittら，1989)に基づく豊富なクラスのＤＮＡ多形が含まれる。遺伝子地図を作製するためには、潜在的な遺伝子マーカーを選抜し、研究する家系構成員から抽出したＤＮＡを用いてそれらを試験する。
【００３６】
　疾病と関連する遺伝子座を探索するのに有用な遺伝子マーカーは、特異的染色体を稠密にカバーするか、染色体の特異的領域の詳細な分析による特にこの問題に基づいて選抜し得る。疾病と連鎖する遺伝マーカーを選抜する好ましい方法には、家系の情報性の程度を評価して所与の程度の多形の遺伝子マーカーの間の理想的な距離を決定し、ついで、最大の効率で理想的に離れた公知の遺伝子地図からマーカーを選抜することが含まれる。家系の情報性は、該マーカーが無関係な個人においてヘテロ接合体である確率によって測定する。また、ＰＣＲを用いた標的核酸配列の増幅によって検出したＳＴＲマーカーを用いることが最も効率的であり；かかるマーカーは非常に情報性が高く、アッセイし易く(ＷeberおよびＭay,1989)、複合戦略を用いて同時にアッセイし得(ＳkolnickおよびＷallace，1988)、要する実験数を顕著に低減し得る。
【００３７】
　連鎖性が確立されたら、疾病遺伝子座に隣接するマーカー、すなわち、該疾病遺伝子座に近い１または２以上のマーカー、および該疾病遺伝子座に対し基部側の１または２以上のマーカーを見付ける必要がある。可能ならば、公知の遺伝子地図から候補マーカーを選抜し得る。知られているものがない場合には、実施例で示すＳＴＲ技術によって新たなマーカーを同定し得る。
【００３８】
　遺伝子マッピングは通常は反復的工程である。本発明においては、ＢＲＣＡ１遺伝子座の周りの隣接遺伝子マーカーを画定し、ついで、これらの隣接マーカーをＢＲＣＡ１遺伝子座に首尾よく近い他のマーカーに置き換えることによってそれを開始する。最初の工程、組換え事象では、広範な家系によって画定して、特異的な遺伝子マーカーから離れているか近いかとして、ＢＲＣＡ１遺伝子座を特異的に位置決定することを補助する(Ｇoldgarら，1994)。
【００３９】
　本発明が開示されるまでは、ＢＲＣＡ１を囲む領域はよくマッピングされておらず、マーカーもほとんどなかった。したがって、物理的にマッピングされたＹＡＣからサブクローン化したコスミド上の短い反復配列を分析して、新たな遺伝子マーカーを開発した。このアプローチを用いて、本発明の１つのマーカー、４２Ｄ６が発見され、これは、ＢＲＣＡ１領域用の末端側隣接マーカーとしてｐＣＭＭ８６で置換した。４２Ｄ６はｐＣＭＭ８６からほぼ１４ｃＭに存在するため、それ故、ＢＲＣＡ１領域はほぼ１４センチモルガン分減少された(Ｅastonら，1993)。かくして、本発明は、ＢＲＣＡ１領域のより接近して連鎖した末端側隣接マーカーを見出すことによって開始した。ついで、ＢＲＣＡ１は、遺伝子マーカーＭfdl５に対して末端側に存在することを発見した。したがって、ＢＲＣＡ１は、Ｍfdl５および４２Ｄ６と境を接する６Ｍｂｐ〜１０Ｍｂｐの領域に存在することが示された。つづいて、マーカーＭfdl９lはＭfdl５から末端側であって、ＢＲＣＡ１から基部側にあることを発見した。かくして、Ｍdfl５を、最も基部側の遺伝子マーカーとしてＭfdl９lで置換した。同様にして、遺伝子マーカーＭfdl８８は、ＢＲＣＡ１遺伝子座を含む領域をほぼ１.５Ｍｂまで狭める、遺伝子マーカー４２Ｄ６を置換し得ることを発見した。ついで、当該分野で知られており、かつ本明細書に記載した技術を用いて、マーカーＭfdl9lを基部側マーカーとしてのtdj1474で置換し、Ｍfdl88を末端側マーカーとしてのＵ５Ｒで置き換えて、ＢＲＣＡ１遺伝子座を単離し、特徴付けを得るに十分に小さい領域までＢＲＣＡ１領域を狭めた(図３参照)。
【００４０】
物理的マッピング
　３つの異なる方法を用いて該領域を物理的にマッピングした。第一のものは、ｔｄｊ１４７４およびＵ５Ｒによって隣接して挟まれた領域をクローン化するための酵母人工染色体(ＹＡＣ)の使用であった。第二のものは、ＢＲＣＡ１遺伝子座を含む領域をカバーするＰ１、ＢＡＣおよびコスミドクローンのセットの作製であった。
【００４１】
　酵母人工染色体(ＹＡＣ)
　ＢＲＣＡ１遺伝子座を含む十分に小さな領域を同定したら、該領域をカバーする重複ＹＡＣのセットを同定することによって、該領域中のＤＮＡの物理的単離を続行した。有用なＹＡＣは、各々、広範に分布し、ほぼ５０,０００のＹＡＣを含むＳt.LouisおよびＣＥＰＨ　ＹＡＣライブラリーのごとき公知のライブラリーから単離し得る。ＹＡＣをこれらの公的にアクセス可能なライブラリーから単離し、Ｍichigan Ｇenome Ｃenterを含む多数の供給源から得ることができる。明らかに、これらのＹＡＣにアクセスしたものは、本発明を開示することなしに、本発明者らが選択した特異的ＹＡＣの価値を理解しなかったであろう。なぜならば、彼らは、ＢＲＣＡ１遺伝子座を含む最小の領域の中にどのＹＡＣが存在し、どのＹＡＣがその外側に存在するかということを理解しなかったであろうからである。
【００４２】
　コスミド、Ｐ１およびＢＡＣクローン
　本発明においては、コスミド、Ｐ１およびＢＡＣクローンにより続行してこの領域をカバーすることが有利である。ＹＡＣインサートと比較してより小さなサイズのこれらのインサートは、特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてそれをより有用としている。さらに、酵母細胞よりもむしろ細菌細胞中にクローン化ＤＮＡを有していれば、目的のＤＮＡを操作し得る簡便性が大きく上昇し、ハイブリダイゼーション・アッセイのノイズに対する信号の比が改善される。ＹＡＣのコスミドサブクローンについては、該ＤＮＡを制限酵素Ｓau３Ａで部分消化し、ｐＷＥ１５コスミドベクター(Ｓtratagene社，カタログ番号1251201)のＢamＨＩ部位にクローン化する。ヒト配列を含むコスミドは、実施例に詳記するごとく、ヒト反復ＤＮＡ(例えば、Ｇibco/ＢＲＬ社、ヒトＣ０ｔ-１ ＤＮＡ、カタログ番号5279Ａ)とのハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、ついで、種々の技術によってフィンガープリンティングする。
【００４３】
　Ｐ１およびＢＡＣクローンは、前記のごとく単離した、ＹＡＣ、コスミドまたはＰ１およびＢＡＣ由来の特異配列標識部位(ＳＴＳ)で全ヒトゲノムから構築したライブラリーをスクリーニングすることによって得る。
【００４４】
　これらのＰ１、ＢＡＣおよびコスミドクローンは、散在反復配列(ＩＲＳ)ＰＣＲおよび／または制限酵素消化につづくゲル電気泳動、および得られたＤＮＡフラグメントの比較(フィンガープリント)(Ｍaniatisら,1982)によって比較し得る。該クローンは、また、ＳＴＳの存在によっても特徴付け得る。該フィンガープリントを用いて、該領域をカバーするが冗長すぎないクローンの重複隣接セット(本明細書においては、「最小限タイル路(minimum tiling path)という」)を画定する。かかる最小限タイル路は、つづく実験の基礎を形成し、ＢＲＣＡ１遺伝子座由来となり得るｃＤＮＡを同定する。
【００４５】
　Ｐ１およびＢＡＣクローンでのギャップの適用範囲
　ゲノミッククローンを有する同定コスミド間のＢＲＣＡ１コンチグ(contig)中のいずれのギャップもカバーするために、Ｐ１用のコスミドよりもほぼ２倍大きく、ＢＡＣについてはなおより大きなゲノミックＤＮＡのインサートを含むＢＡＣベクターとＰ１中のクローン(Ｓternberg，1990；Ｓternbergら,1990；Ｐierceら，1992；Ｓhizuyaら，1992)とを用いた。Ｐ１クローンは、スクリーニング用に本発明らによって提供されるＰＣＲプライマーを用いてＧenome Ｓciences社によって単離した。ＢＡＣは、Ｄr.Ｍel Ｓimon's laboratoryにおけるハイブリダイゼーション技術によって得た。Ｐ１クローンを用いる戦略により、ＹＡＣ由来でないクローンの独立セットでゲノム領域をカバーすることも許容される。これは、検出されていないＹＡＣ中の他の欠失の可能性に対して保護する。Ｐ１クローン由来のこれらの新たな配列は、以下に記載するごとく、候補遺伝子をさらにスクリーニングするための材料を提供する。
【００４６】
遺伝子単離
　単離しようと試行する遺伝子座のコード配列の候補となりそうな配列の存在につきゲノミッククローンを試験する多くの技術が存在し、これには、限定するものではないが：
ａ．ズー・ブロット(zoo blot)
ｂ．ＨＴＦ・アイランド(island)の同定
ｃ．エキソントラッピング
ｄ．コスミドまたはＹＡＣへのｃＤＮＡのハイブリダイゼーション
ｅ．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
が含まれる。
　(ａ)ズー・ブロット　第一の技術はコスミドをサザンブロットにハイブリダイズさせて進化の過程で保存され、従って、ヒトに対し種々の程度の関係を有する種(サル、ウシ、ニワトリ、ブタ、マウスおよびラットのごとき)からのＤＮＡと陽性のハイブリダイゼーション信号を与えるＤＮＡ配列を同定する。種々の種からのかかるＤＮＡを含むサザンブロットは市販されている(Ｃlonetech社，カタログ番号7753-1)。
　(ｂ)ＨＴＦアイランドの同定　第二の技術には、ヌクレオチドＣおよびＧに富む領域を見出すことが含まれ、この領域はしばしばコード配列の付近またはその中に生じる。かかる配列は、これらの領域において頻繁に切断されるＣｐＧ二量体を含む部位に特異的な制限酵素として、ＨＴＦ(ＨpaＩ小フラグメント)またはＣｐＧアイランドと呼称される(Ｌindsayら，1987)。
　(ｃ)エキソントラッピング　第三の技術は、スプライス結合部を含有し、したがって遺伝子のコード配列を含んでいそうなゲノミックＤＮＡ中の配列を同定する方法、エキソントラッピングである。エキソン増幅(Ｂucklerら，1991)を用いて、前記したＤＮＡクローンからエキソンを選抜し、増幅する。エキソン増幅は、機能性５'および／または３'スプライス部位によって隣接して挟まれたＲＮＡ配列の選抜に基づいている。さらなる研究用の処理可能な数の候補遺伝子を同定するために、エキソン増幅の産物を用いて乳癌ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。エキソントラッピングは、コンピュータプログラムを用いた配列決定ＤＮＡの小セグメントで、またはソフトウェア捕捉によっても行い得る。
　(ｄ)コスミド、Ｐ１、ＢＡＣまたはＹＡＣに対してハイブリダイズする
ｃＤＮＡ　第四の技術は、コスミド、Ｐ１、ＢＡＣまたはＹＡＣに対するｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを利用し、転写された配列がクローン化ゲノムＤＮＡ中に同定され、かつ、それから回収されるのを可能とする選択的富化技術の修飾法である(Ｋandpalら，1990)。本目的に修飾した選択的富化技術には、ＹＡＣ中に存在するＢＲＣＡ１の領域からのＤＮＡをカラムマトリックスに結合させ、ついで該結合ＤＮＡとハイブリダイズする適当なライブラリーからｃＤＮＡを選抜し、つづいて該結合ＤＮＡを増幅させて精製することが含まれ、クローン化ゲノムＤＮＡによって代表される領域中のｃＤＮＡが非常に増大される。
　(ｅ)ｃＤＮＡの同定　第五の技術は、ＢＲＣＡ１遺伝子座に対応するｃＤＮＡを同定することである。前記した技術のいずれかを用いて選抜した、予想コード配列を含むハイブリダイゼーション・プローブを用いて、乳房組織ｃＤＮＡライブラリー、卵巣ｃＤＮＡライブラリーおよびいずれかの他の必要なライブラリーを包含する種々のライブラリーをスクリーニングする。
【００４７】
　また、主題のｃＤＮＡの直接的選抜の他の変形を用いても、ＢＲＣＡ１の候補遺伝子を見い出した(Ｌovettら，1991；Ｆutreal，1993)。この方法は、コスミド、Ｐ１またはＢＡＣ ＤＮＡをプローブとして用いる。プローブＤＮＡは、ＨaeIIIのごとき平滑切断制限酵素で消化する。ついで、二本鎖アダプターを該ＤＮＡに連結し、これはビオチン化プライマーを用いる続くＰＣＲ増幅反応においてプライマーの結合部位として作用する。標的ｃＤＮＡは、第一鎖のランダム起点合成またはオリゴ(ｄＴ)起点合成のいずれかの合成につづく第二鎖合成によって、組織試料、例えば、乳房組織由来のｍＲＮＡから作製する。ｃＤＮＡ末端を平滑にし、二本鎖アダプターに連結する。これらのアダプターは、ＰＣＲ用の増幅部位として作用する。標的およびプローブ配列を変性させ、ヒトＣ０ｔ-１ ＤＮＡと混合して反復配列を遮断する。溶液ハイブリダイゼーションを高Ｃ０ｔ-１/２値として、稀な標的ｃＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションを保証する。ついで、アニーリングした材料をアビジンビーズ上に捕捉し、高ストリンジェンシーで洗浄し、保持されたｃＤＮＡを溶出し、ＰＣＲによって増幅する。選抜したｃＤＮＡは、分析用のプラスミドベクターにクローニングする前に増大のさらなるラウンドに付す。
【００４８】
候補性についてのｃＤＮＡの試験
　ｃＤＮＡが、異常ＢＲＣＡ１遺伝子産物または異常なレベルのＢＲＣＡ１遺伝子産物を生成する羅患された家系構成員から抽出したＤＮＡ中に配列を見出すことによって得られるＢＲＣＡ１遺伝子座であることを立証する。かかるＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子は、広範な家系中で該疾病に関し共-分離しているであろう。それは、また、乳癌および卵巣癌を有する非-家系個人、ついで一般集団中の個人において、より高頻度で存在するであろう。最後に、腫瘍は、他の例においては生殖細胞系で突然変異する遺伝子座でしばしば体細胞突然変異するため、本発明者らは、腫瘍組織から抽出したＤＮＡ中のＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子と同一または同様である配列に突然変異誘発した正常な生殖細胞系ＢＲＣＡ１対立遺伝子を見出すことが期待される。腫瘍組織からのＢＲＣＡ１配列を同一個人の生殖細胞系からのＢＲＣＡ１対立遺伝子と比較するか、癌ケースからの生殖細胞系ＢＲＣＡ１対立遺伝子を非羅患個人からのものと比較するかのいずれにせよ、遺伝子産物の正常機能を明らかに破壊するに十分に重大である突然変異を見出すことが鍵となる。これらの突然変異は多種の形態を採り得る。最も重大な形態はフレームシフト突然変異または広範な欠失であり、これらは、遺伝子に、異常蛋白質をコードさせるか、または重大に変化した蛋白質を発現させるであろう。より重大でない破壊的突然変異には、小規模な枠内欠失および非保存性塩基対置換が含まれ、これらは、システイン残基へのまたはシステイン残基からの変化、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸への変化またはその反対、疎水性アミノ酸から親水性アミノ酸への変化またはその反対、あるいは、蛋白質の二次、三次または四次の構造に影響するであろう他の突然変異のごとき、産生蛋白質に重大な影響を及ぼすであろう。サイレント突然変異または保存性アミノ酸置換を生じるものは、一般的に蛋白質機能を破壊するとは予想されない。
【００４９】
　本発明の診断および予診によれば、野生型ＢＲＣＡ１遺伝子座の変化が検出される。加えて、該方法は、野生型ＢＲＣＡ１遺伝子座を検出し、ＢＲＣＡ１遺伝子座に癌の素因の欠失を確認することによって行い得る。「野生型遺伝子の変化」とは、コード領域および非コード領域における欠失、挿入および点突然変異を含むすべての形態の突然変異が包含される。欠失は、遺伝子全体のものであるか、または遺伝子の一部分のみのものであり得る。点突然変異は終止コドン、フレームシフト突然変異またはアミノ酸置換を生じ得る。体細胞突然変異は、特定の組織、例えば、腫瘍組織でのみ発生するものであり、生殖細胞系において遺伝されない。生殖細胞系突然変異は体のいずれの組織においても見出すことができ、遺伝される。単一の対立遺伝子のみが体細胞的に突然変異した場合、初期新生生物状態が示される。しかしながら、両方の対立遺伝子が体細胞的に突然変異した場合、後期の新生生物状態が示される。かくして、ＢＲＣＡ１突然変異の知見は、診断および予診の情報を両方提供する。欠失していないＢＲＣＡ１対立遺伝子(例えば、姉妹染色体からＢＲＣＡ１欠失を運ぶ染色体の姉妹染色体で見出された)は、挿入、小さな欠失および点突然変異のごとき他の突然変異につきスクリーニングし得る。腫瘍組織において見出された多くの突然変異はＢＲＣＡ１遺伝子産物の発現を低下に通じるものであろうと考えられる。しかしながら、非-機能的遺伝子産物に通じる突然変異も、癌にかかった状態に通じるであろう。点突然変異事象は、遺伝子のプロモーターでのごとき、調節領域中で起こり得、ｍＲＮＡの発現の欠失または減少に通じる。点突然変異も、また、適当なＲＮＡプロセシングを破壊し得、ＢＲＣＡ１遺伝子産物の発現の欠失、あるいは、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率の低下に通じる。
【００５０】
　有用な診断技術には、限定するものではないが、さらに以下で詳細に論じる蛍光イン・サイチュ(in situ)ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)、直接ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、一本鎖構造解析(ＳＳＣＡ)、ＲＮアーゼ保護アッセイ、対立遺伝子-特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)、ドットブロット分析およびＰＣＲ-ＳＳＣＰが包含される。
【００５１】
　乳癌および卵巣癌および本明細書で同定した他の癌のごとき癌の素因は、ＢＲＣＡ１遺伝子の突然変異についてヒトのいずれかの組織を試験することによって確認し得る。例えば、生殖細胞系ＢＲＣＡ１突然変異を遺伝した個人は、癌を発症し易い傾向であろう。これは、該個人の体のいずれかの組織からのＤＮＡを試験することによって決定し得る。最も単純には、採血しその血液の細胞からＤＮＡを抽出する。加えて、ＢＲＣＡ１遺伝子の突然変異について、胎児細胞、胎盤細胞または羊膜細胞を試験することによっても出生前診断を行い得る。点突然変異または欠失のいずれによるにせよ、野生型ＢＲＣＡ１対立遺伝子の変化は、本明細書で論じるいずれかの手段によって検出し得る。
【００５２】
　ＤＮＡ配列変動を検出するのに用い得る幾つかの方法が存在する。手動配列決定または自動化蛍光配列決定のいずれかの直接ＤＮＡ配列決定は、配列変動を検出し得る。ＢＲＣＡ１ほど大きな遺伝子については、非常に激しい労働であるが、最適条件下では遺伝子のコード配列における突然変異をめったに見失わない。別のアプローチは、一本鎖構造多形性アッセイ(ＳＳＣＡ)(Ｏritaら，1989)である。この方法は、特にＤＮＡフラグメントが２００ｂｐよりも大きな場合、すべての配列変化を検出しないが、最適化して大部分のＤＮＡ配列変動を検出することができる。検出感度が低下することは不利であるが、ＳＳＣＡで可能な処理量の増加は、それを、研究ベースの突然変異検出用の直接配列決定の魅力的な、可能な別法としている。ＳＳＣＡゲル上でシフトした移動度を有するフラグメントをついで配列決定して、正確なＤＮＡ配列変動の性質を決定する。２つの相補的ＤＮＡ鎖の間の誤対合の検出に基づく他のアプローチには、締付変性電気泳動法(clamped denaturing denaturing gel elctrophoresis)(ＣＤＧＥ)(Ｓheffieldら，1991)、ヘテロ二重らせん分析(heteroduplex analysis)(ＨＡ)(Ｗhiteら，1992)および化学的誤対合切断(chemical mismatch cleavage)(ＣＭＣ)(Ｇrompeら，1989)が含まれる。前記した方法はいずれも大きな欠失、二本鎖形成または挿入を検出せず、あるいは、蛋白質の転写または翻訳に影響する調節的突然変異を検出しないであろう。蛋白質先端切断アッセイまたは非対称アッセイのごときこれらのクラスの突然変異を検出し得る他の方法は、特異的な型の突然変異のみを検出し、ミスセンス突然変異は検出しないであろう。ＤＮＡ配列変動を検出する最近利用し得る方法の概説は、Ｇrompe(1993)による最近の概説において見出すことができる。突然変異が判明したら、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)ハイブリダイゼーションのごとき対立遺伝子特異的検出アプローチを利用して、同突然変異につき、膨大な数の他の試料を迅速にスクリーニングすることができる。
【００５３】
　組織中の野生型ＢＲＣＡ１遺伝子の変化を検出するためには、周囲の正常組織から遊離した組織を単離することが有用である。腫瘍細胞の組織調製物を増やす方法は当該分野で知られている。例えば、該組織は、パラフィンまたはクライオスタット切片から単離し得る。癌細胞も、フローサイトメトリーによって正常細胞から分離し得る。これらの技術、ならびに、正常細胞から腫瘍細胞を分離する他の技術は当該分野でよく知られている。腫瘍組織が正常組織で非常に汚染されている場合、突然変異の検出はより困難である。
【００５４】
　ＤＮＡ配列中の多形性を検出する迅速な予備分析は、１または２以上の制限酵素、好ましくは多数の制限酵素で切断したＤＮＡの一連のサザンブロット法で見ることによって行い得る。各ブロットは一連の正常個人および一連の癌ケース、腫瘍またはその両方を含む。(ＢＲＣＡ１遺伝子座付近か、またはそれを包含する配列で釣り上げた場合に対照とは長さが異なる)ハイブリダイズしたフラグメントを示すサザンブロットは、可能性のある突然変異を示す。非常に大きな制限断片を生成する制限酵素を用いる場合には、パルスフィールド電気泳動(ＰＦＧＥ)を用いる。
【００５５】
　点突然変異の検出は、当該分野でよく知られている技術を用いて、ＢＲＣＡ１対立遺伝子(群)を分子クローン化し、該対立遺伝子(群)を配列決定することによってなし得る。別法として、該遺伝子配列は、公知技術を用いて、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製物から直接増幅し得る。ついで、増幅した配列のＤＮＡ配列を決定し得る。
【００５６】
　感受性対立遺伝子の存在を確認するためのより完全で、いまだ間接的である試験のよく知られた６種の方法が存在する：１）一本鎖形成構造分析(ＳＳＣＡ)(Ｏritaら，1989)；２）変性勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)(Ｗartellら,1990；Ｓheffieldら，1989)；３)ＲＡアーゼ保護アッセイ(Ｆinkelsteinら，1990；Ｋinszlerら，1991)；４）対立遺伝子-特異的オリゴヌクレオチド(ＡＯＳ)(Ｃonnerら，1983)；５）イー・コリ(Ｅ.coli)mutＳ蛋白質のごときヌクレオチド誤対合を認識する蛋白質の使用(Ｍodrich，1991)；ならびに６）対立遺伝子-特異的ＰＣＲ(ＲanoおよびＫidd，1989)。対立遺伝子-特異的ＰＣＲには、その３'末端で特定のＢＲＣＡ１突然変異にハイブリダイズするプライマーを使用する。特定のＢＲＣＡ１突然変異が存在しない場合、増幅産物は認められない。欧州特許公開第0332435号およびＮewtonら，1989に開示された増幅耐性突然変異系(Ａmplification Ｒefractory Ｍutation Ｓystem，ＡＲＭＳ)も用い得る。
【００５７】
　遺伝子の挿入および欠失は、クローニング、配列決定および増幅によっても検出し得る。加えて、遺伝子または周辺マーカー遺伝子の制限酵素断片長多形(ＲＦＬＰ)プローブを用いても、対立遺伝子の変化または多形フラグメント中の挿入を記録し得る。かかる方法は、影響された個人において見出されたＢＲＣＡ１突然変異の存在につき、該個人の親類をスクリーニングするのに特に有用である。当該分野で公知である挿入および欠失を検出する他の技術を用い得る。
【００５８】
　最初の３種の方法(ＳＳＣＡ、ＤＧＧＥおよびＲＡアーゼ保護アッセイ)においては、新たな電気泳動バンドが出現する。ＳＳＣＡは、異なって移動するバンドを検出する。なぜならば、配列の変化が一本鎖、すなわち分子内塩基対合において差を生じるからである。ＲＡアーゼ保護には、突然変異ポリヌクレオチドの２または３以上のより小さなフラグメントへの切断が含まれる。ＤＧＧＥは、変性勾配ゲルを用いて、野生型配列と比較した突然変異配列の移動速度における差を検出する。対立遺伝子-特異的オリゴヌクレオチドアッセイにおいては、特異的な配列を検出するようにオリゴヌクレオチドが設計されており、ハイブリダイゼーション信号の存在または不存在を検出することによって該アッセイを行う。
ｍｕｔＳアッセイにおいては、突然変異と野生型配列との間のヘテロ二重らせん中にヌクレオチド誤対合を含む配列にのみ該蛋白質が結合する。
【００５９】
　本発明による誤対合とは、２本の鎖が１００％相補性でない場合のハイブリダイズした核酸二重らせんである。全相補性の欠失は、欠失、挿入、逆位または置換に起因し得る。誤対合検出を用いて、遺伝子中またはそのｍＲＮＡ産物中の点突然変異を検出し得る。これらの技術は配列決定よりも感度が低いが、それらは、膨大な数の腫瘍試料で行うのにより単純である。誤対合切断技術の一例は、ＲＡアーゼ保護法である。本発明の実施においては、該方法は、ヒト野生型ＢＲＣＡ１遺伝子コード配列に相補的な標識リボプローブの使用が含まれる。該リボプローブと腫瘍組織から単離したｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとは共にアニーリング(ハイブリダイズ)し、つづいて、二重らせんＲＮＡ構造中のある種の誤対合を検出し得る酵素ＲＮアーゼＡで消化する。誤対合をＲＡアーゼＡによって検出する場合、それは誤対合の部位で切断する。かくして、アニーリングしたＲＮＡ調製物を電気泳動ゲルマトリックス上で分離する場合に、もし誤対合をＲＮアーゼＡによって検出し切断したら、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡの完全長二重らせんＲＮＡよりも小さいＲＮＡ産物が示されるであろう。該リボプローブは、完全長のＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡまたは遺伝子である必要はないが、そのいずれかのセグメントとし得る。リボプローブがＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡまたは遺伝子のセグメントのみを含む場合、多数のこれらのプローブを用いて、誤対合につき全ｍＲＮＡ配列をスクリーニングすることが望ましいであろう。
【００６０】
　同様にして、ＤＮＡプローブを用いて、酵素的または化学的切断を介して、誤対合を検出し得る(例えば、Ｃottonら，1988；Ｓhenkら，1975；Ｎovackら,1986参照)。別法として、対合二重らせんに対する誤対合二重らせんの電気泳動移動度のシフトによって、誤対合を検出し得る(例えば、Ｃariello，1988参照)。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれを用いるにせよ、突然変異を含有し得る細胞性ｍＲＮＡまたはＤＮＡは、ハイブリダイゼーション前にＰＣＲ(後記参照)を用いて増幅し得る。ＢＲＣＡ１遺伝子のＤＮＡにおける変化は、特に、欠失および挿入のごとき、変化が全体の再配列の場合、サザン・ハイブリダイゼーションを用いても検出し得る。
【００６１】
　ＰＣＲを使用することによって増幅したＢＲＣＡ１遺伝子のＤＮＡ配列は、対立遺伝子-特異的プローブを用いてもスクリーニングし得る。これらのプローブは核酸オリゴマーで、その各々は、公知の突然変異を隠し持つＢＲＣＡ１遺伝子配列の領域を含んでいる。例えば、１つのオリゴマーは、ＢＲＣＡ１遺伝子配列の一部分に対応する、約３０ヌクレオチド長とし得る。かかる一式の対立遺伝子-特異的プローブを用いることにより、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニングして、ＢＲＣＡ１遺伝子中に予め同定した突然変異の存在を同定し得る。増幅したＢＲＣＡ１配列と対立遺伝子-特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロンフィルター上で行い得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下の特定のプローブに対するハイブリダイゼーションは、対立遺伝子-特異的プローブ中のごとく腫瘍組織中に同突然変異が存在することを示している。　候補遺伝子座中の突然変異についての最も明確な試験は、対照集団からのゲノムＢＲＣＡ１配列と癌患者からのものとを直接比較することである。別法として、例えばＰＣＲによって、増幅した後にｍＲＮＡを配列決定し、それによって候補遺伝子のエキソン構造を決定する必要を削除することもできる。
【００６２】
　ＢＲＣＡ１のコード領域の外側に落ちる癌患者からの突然変異は、ＢＲＣＡ１遺伝子の付近またはその中のイントロンおよび調節配列のごとき、非コード領域を検査することによって検出し得る。非コード領域中の突然変異が重要であるという初期の示唆は、対照個人と比較しての癌患者における異常なサイズの、または豊富なｍＲＮＡ分子を明らかにするノザンブロット実験から出て来得る。
【００６３】
　ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡ発現の変化は、当該分野で公知のいずれかの技術によって検出し得る。これらには、ノザンブロット分析、ＰＣＲ増幅およびＲＡアーゼ保護が含まれる。ｍＲＮＡ発現の低下は、野生型ＢＲＣＡ１遺伝子の変化を示している。野生型ＢＲＣＡ１遺伝子の変化は、野生型ＢＲＣＡ１蛋白質の変化についてスクリーニングすることによっても検出し得る。例えば、ＢＲＣＡ１と免疫反応性であるモノクローナル抗体を用いて組織をスクリーニングし得る。同起源抗原を欠くことは、ＢＲＣＡ１突然変異を示しているであろう。突然変異対立遺伝子の産物に特異的な抗体を用いて突然変異ＢＲＣＡ１遺伝子産物を検出することもできる。かかる免疫学的アッセイは、当該分野で公知のいずれかの簡便な形式で行い得る。これらには、ウェスタンブロット、免疫組織化学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。変化したＢＲＣＡ１蛋白質を検出するいずれかの手段を用いて、野生型ＢＲＣＡ１遺伝子の変化を検出し得る。蛋白質結合性測定のごとき機能アッセイを用い得る。加えて、ＢＲＣＡ１生化学的機能を検出するアッセイを用いることができる。突然変異ＢＲＣＡ１遺伝子産物の発見は、野生型ＢＲＣＡ１遺伝子の変化を示している。
【００６４】
　突然変異ＢＲＣＡ１遺伝子または遺伝子産物は、血清、便、尿および唾液のごとき、他のヒト身体試料中にも検出し得る。組織中の突然変異ＢＲＣＡ１遺伝子または遺伝子産物を検出するための前記に論じた同技術は、他の身体試料にも適用し得る。癌細胞は腫瘍から脱皮し、かかる身体試料中に出現する。加えて、ＢＲＣＡ１遺伝子産物それ自体は、細胞外空間に分泌され得、癌細胞が不存在でもこれらの身体試料中に発見し得る。かかる身体試料をスクリーニングすることによって、単純で早期の診断を多くのタイプの癌について達成し得る。加えて、突然変異ＢＲＣＡ１遺伝子または遺伝子産物についてかかる身体試料を試験することによって、化学療法または放射線療法の進展をより容易にモニターし得る。
【００６５】
　本発明の診断方法は、ＢＲＣＡ１が腫瘍発生において役割を有するいずれの腫瘍にも適用し得る。本発明の診断方法は臨床医に有用で、彼は、治療の適当な過程で決定し得る。
【００６６】
　本発明のプライマー対は、ＰＣＲを用いた特定のＢＲＣＡ１対立遺伝子のヌクレオチド配列の決定に有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの対は、染色体１７ｑ２１上のＢＲＣＡ１遺伝子の中か、または周辺の配列にアニーリングして、ＢＲＣＡ１遺伝子自体の増幅ＤＮＡ合成を開始し得る。完全セットのこれらのプライマーにより、ＢＲＣＡ１遺伝子コード配列の全ヌクレオチド、すなわち、エキソンの合成が許容される。プライマーセットは、好ましくは、イントロンおよびエキソン配列の両方の合成を許容する。対立遺伝子-特異的プライマーも用い得る。かかるプライマーは特定のＢＲＣＡ１突然変異対立遺伝子にのみアニーリングし、したがって、鋳型としての突然変異対立遺伝子存在下で産物を増幅するのみであろう。
【００６７】
　増幅した配列のつづくクローニングを促進するために、プライマーはその５'末端に付加した制限酵素部位配列を有し得る。かくして、プライマーの全ヌクレオチドは、制限酵素部位を形成するに必要な幾つかのヌクレオチド以外は、ＢＲＣＡ１配列またはＢＲＣＡ１付近の配列に由来する。該プライマーそれ自体は、当該分野でよく知られている技術を用いて合成し得る。一般的に、該プライマーは、市販されているオリゴヌクレオチド合成器を用いて作製し得る。ＢＲＣＡ１オープンリーディングフレームの配列を配列番号：１に示す。特定のプライマーの設計は、当業者の十分に範囲内である。
【００６８】
　本発明により提供される核酸プローブは、多くの目的に有用である。それは、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション、およびすでに前記で論じた点突然変異を検出するＲＡアーゼ保護法に用い得る。該プローブを用いてＰＣＲ増幅産物を検出し得る。それを用いて、他の技術を用いたＢＲＣＡ１遺伝子またはｍＲＮＡとの誤対合を検出することもできる。
【００６９】
　野生型ＢＲＣＡ１遺伝子を有する個人はＢＲＣＡ１対立遺伝子から生じた癌を有さないことが発見された。しかしながら、ＢＲＣＡ１蛋白質の機能を妨害する突然変異は癌の病理に関与している。したがって、機能を欠失したか、または変化した機能を有する蛋白質を産生する変化(または突然変異)したＢＲＣＡ１遺伝子の存在は、癌の危険性の増加に直接関係する。ＢＲＣＡ１遺伝子突然変異を検出するためには、生物試料を調製し、分析するＢＲＣＡ１対立遺伝子の配列と野生型ＢＲＣＡ１対立遺伝子の配列との間の相違を分析する。突然変異ＢＲＣＡ１対立遺伝子は、前記したいずれかの技術によって最初同定し得る。ついで、突然変異対立遺伝子を配列決定して、特定の突然変異対立遺伝子の特異的な突然変異を同定する。別法として、突然変異ＢＲＣＡ１対立遺伝子は、慣用的な技術を用いて、突然変異(変化)したＢＲＣＡ１蛋白質を同定することによって最初に同定し得る。ついで、該突然変異対立遺伝子を配列決定して、各対立遺伝子の特異的突然変異を同定する。突然変異、特にＢＲＣＡ１蛋白質の変化した機能に通じるものを、ついで、本発明の診断方法および予診方法に用いる。
【００７０】
定義
　本発明は、以下の定義を用いる：
　「ポリヌクレオチドの増幅」には、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、連結増幅(またはリガーゼ鎖反応(ligase chain reaction，ＬＣＲ))およびＱ-ベータレプリカーゼの使用に基づく増幅法のごとき方法を用いる。これらの方法は、よく知られており、当該分野で広く実施されている(例えば、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号、ならびに(ＰＣＲについては)Ｉnnisら，1990；および(ＬＣＲについては)Ｗuら，1989a参照)。ＰＣＲを行う試薬およびハードウェアは市販されている。ＢＲＣＡ１領域からの配列を増幅するのに有用なプライマーは、好ましくは、ＢＲＣＡ１領域中の配列、またはその中の標的領域に隣接する領域中の配列に相補的であって、それに特異的にハイブリダイズする。増幅によって作製したＢＲＣＡ１配列は直接配列決定し得る。別法として、あまり望ましくはないが、増幅した配列(群)は配列分析に先んじてクローン化し得る。酵素的に増幅したゲノムセグメントの直接クローン化および配列分析は、Ｓcharf，1986によって記載されている。
【００７１】
　「分析ポリヌクレオチド」および「分析鎖」とは、標的配列を含むと予想され、生物試料を包含する種々のタイプの試料中に存在し得る一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドをいう。
【００７２】
　「抗体」；本発明は、また、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体およびその断片、ならびにその免疫学的な結合同等物を提供し、これらは、ＢＲＣＡ１ポリペプチドおよびその断片、またはＢＲＣＡ１領域からの、特にＢＲＣＡ１遺伝子座またはその一部分からのポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る。「抗体」なる語は、均一な分子基、または複数の異なる分子基より構成される血清産物のごとき混合物をいうのに用法用いる。ポリペプチドは、ペプチド合成器中で合成的に調製し、(例えば、鍵穴吸着性ヘモシアニンのような)キャリアー分子にカップリングさせ、ウサギに数カ月にわたって注射し得る。ウサギ血清は、ＢＲＣＡ１ポリペプチドまたは断片に対する免疫反応性につき試験する。モノクローナル抗体は、蛋白質ポリペプチド、融合蛋白質またはそれらの断片でマウスを注射することにより作製し得る。モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡによってスクリーンし、ＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはその断片との特異的免疫反応性について試験するであろう(ＨarlowおよびＬane，1988参照)。これらの抗体は、アッセイならびに医薬に有用であろう。
【００７３】
　十分な量の所望のポリペプチドを得たら、種々の目的にそれを用いることができる。典型的な用途は、結合について特異的な抗体の産生である。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであって、当該分野でよく知られているイン・ビトロ(in vitro)またはイン・ビボ(in vivo)技術によって作製し得る。ポリクローナル抗体の作製には、適当な標的免疫系、典型的にはマウスまたはウサギを選択する。実質的に純粋な抗原は、動物に適した方法によってか、または免疫学者によく知られている他の指標によって決定した様式で免疫系に提示する。注射の典型的な部位は、筋肉内、腹膜内または皮膚内的なフットパッドである。勿論、他の種をマウスまたはウサギと代替し得る。ついで、当該分野で公知の技術を用いてポリクローナル抗体を精製し、所望の特異性に調整する。
【００７４】
　免疫学的応答性は、通常、免疫アッセイでアッセイする。通常、かかる免疫アッセイには、例えば、抗原と同細胞かつ同様式によって作製した抗原源のある種の精製が含まれる。種々の免疫アッセイ法が当該分野でよく知られている(例えば、ＨarlowおよびＬane，1988またはＧoding，1986参照)。
　１０−８Ｍ−１、もしくは好ましくは１０−９〜１０−１０Ｍ−１またより強い親和性を有するモノクローナル抗体は、典型的に、例えば、ＨarlowおよびＬane，1988またはＧoding，1986に記載されている標準的な方法によって作製するであろう。簡単には、適当な動物を選抜し、所望の免疫化プロトコールに従う。適当な時間の後に、かかる動物の脾臓を切除し、適当な選抜条件下にて個々の脾臓細胞を不死化メラノーマ細胞に融合する。その後に、該細胞をクローン化的に分離し、各クローンの上清を、抗原の所望の領域に特異的な適当な抗体のそれらの産生について試験する。
【００７５】
　他の適当な技術には、抗原ポリペプチドへか、または別法としてファージまたは同様なベクター中の抗体の選抜したライブラリーへのリンパ球のイン・ビトロ(in vitro)暴露が含まれる(Ｈuseら，1989参照)。本発明のポリペプチドおよび抗体は、修飾しても、しないでも用い得る。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、共有的または非共有的のいずれかで、検出可能なシグナルを供する物質を結合することによって標識されるであろう。広範な標識およびコンジュゲート技術が知られており、科学文献および特許文献の両方において広範に報告されている。適当な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光剤、化学発光剤、磁性粒子他が含まれる。かかる標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；4,275,149号および第4,366,241号が含まれる。また、組換え免疫グロブリンを作製することもできる(米国特許第4,816,567号参照)。
【００７６】
　「結合パートナー」とは、例えば、抗原および抗原-特異的抗体または酵素およびそのインヒビターのような、高い特異性でリガンド分子と結合する能力を有する分子をいう。一般的に、該特異的結合パートナーは、単離条件下にて、十分な親和性で結合して、分析物コピー／(ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの場合には)相補鎖二重らせんを固定化しなければならない。特異的結合パートナーは当該分野で公知であって、例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、膨大な公知の受容体-リガンドカップリング物および相補的ポリヌクレオチド鎖が包含される。相補的ポリヌクレオチド結合パートナーの場合においては、該パートナーは、通常、少なくとも約１５塩基長、少なくとも４０塩基長とし得る。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。
【００７７】
　「生物試料」とは、個人からの分析物ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むと予想される組織または流体の試料をいい、限定するものではないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器、腸および尿生殖器、涙、唾液、赤血球、腫瘍、器官、組織およびイン・ビトロ(in vitro)細胞培養構成物の試料が含まれる。
【００７８】
　本明細書で用いるごとき、新生生物の文脈で用いる「診断」または「予診」なる語は、処理の前、間およびその後の１）新生生物として病巣の分類、２）新生生物の程度の測定、または３）疾病進展のモニターを示すのに用いる。
【００７９】
　「コードする」；ポリペプチドを「コードする」というポリヌクレオチドは、その天然状態または当業者によく知られている方法によって操作されている場合、それは、ｍＲＮＡおよび/または該ポリペプチドもしくはその断片に転写および／または翻訳され得る。アンチセンス鎖は、かかる核酸、および、それから予想し得る配列コードの相補物である。
【００８０】
　「単離した」または「実質的に純粋な」；「単離した」または「実質的に純粋な」核酸(例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー)とは、天然のヒト配列または蛋白質(例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のヒトゲノム配列および蛋白質)を自然に付随する他の細胞成分から実質的に単離されたものである。該語には、核酸配列および蛋白質の自然に発生する環境から除去したそれらを包含し、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物、および化学合成したアナログまたは外来系によって生物学的に合成したアナログが含まれる。
【００８１】
　「ＢＲＣＡ１対立遺伝子」とは、ＢＲＣＡ１遺伝子座の正常対立遺伝子、ならびに素因個人に、例えば、乳房、卵巣、結腸直腸および前立腺癌を含む、多くの部位の癌を発症させる変形を運んでいる対立遺伝子をいう。かかる素因対立遺伝子は、「ＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子」とも呼称する。
【００８２】
　「ＢＲＣＡ１座」、「ＢＲＣＡ１遺伝子」、「ＢＲＣＡ１核酸」または「ＢＲＣＡ１ポリヌクレオチド」とは、各々、ポリヌクレオチドをいい、それら全部はＢＲＣＡ１領域中に存在し、それらは、個人に乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌および前立腺癌を発症する素因の特定の対立遺伝子を正常組織に発現するようである。ＢＲＣＡ１における突然変異は、他のタイプの腫瘍の発生および／または進行に関与し得る。遺伝子座は、素因個人に癌を発症させる突然変異によって部分的に示される。これらの突然変異は下記するＢＲＣＡ１領域内に入る。ＢＲＣＡ１座は、コード配列、介在配列および転写および／または翻訳を制御する調節因子を含むよう意図される。ＢＲＣＡ１座は、該ＤＮＡ配列の全ての対立遺伝子変形を含むよう意図される。
【００８３】
　核酸に適用する場合、これらの語は、ＢＲＣＡ１ポリペプチド、断片、同等物または変形をコードする核酸をいい、例えば、蛋白質融合物または欠失物が包含される。本発明の核酸は、天然ＢＲＣＡ１-コード遺伝子、または天然ＢＲＣＡ１-コード遺伝子またはその一部分と実質的に相同性を有するものに由来するか、またはそれに実質的に同じものかのかのいずれかの配列を有するであろう。配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するＢＲＣＡ１ポリペプチドのコード配列を配列番号：１に示す。
【００８４】
　本発明のポリヌクレオチド組成物には、当業者によって容易に理解されるであろう、センス鎖またはアンチセンス鎖の両方の、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、および混合ポリマーが含まれ、化学的または生化学的に修飾され得、あるいは非-天然または誘導化ヌクレオチド塩基を含み得る。かかる修飾物には、例えば、標識物、メチル化物、１または２以上の天然に発生するヌクレオチドのアナログでの置換物、(例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート他のような)非帯電リンケージのごときヌクレオチド間修飾物、(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート他のような)荷電リンケージ、(例えば、ポリペプチドのような)ペンダント型基、(アクリジン、プソラレン他のような)インターカレター、キレート剤、アルキル化剤および(例えば、アルファアノマー核酸他のような)修飾リンケージが含まれる。また、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定した配列に結合する能力のポリヌクレオチドをミメティックスする合成分子も包含される。かかる分子は、当該分野で知られており、例えば、その中で分子骨格中のリン酸結合の代わりにペプチド結合を用いるものが含まれる。
【００８５】
　本発明は、ＢＲＣＡ１領域の全体または一部分を含む組換え核酸を提供する。該組換え構築物は、宿主細胞中で自律的に複製し得る。別法として、該組換え構築物は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに一体化するようになり得る。かかる組換えポリヌクレオチドは、その起源または操作による、１）天然では結合するポリヌクレオチドの全体または一部分と結合せず；２）天然では結合するもの以外のポリペプチドに結合し；または３）天然には生じない、ゲノム、ｃＤＮＡ、半-合成または合成起源のポリヌクレオチドを含む。
【００８６】
　したがって、天然には生じない他の配列を含む組換え核酸が本発明によって提供される。野生型配列を用いることができるが、それは、しばしば、例えば、欠失、置換または挿入によって改変されているであろう。
【００８７】
　種々のタイプのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、本発明の核酸の天然起源としてスクリーンし得、あるいはかかる核酸は、ゲノムＤＮＡまたは他の天然起源に存在する配列の増幅によって(例えば、ＰＣＲによって)提供し得る。ｃＤＮＡライブラリーの選択は、通常、所望の蛋白質のｍＲＮＡに富む組織起源に対応する。ファージライブラリーが通常好ましいが、他のタイプのライブラリーを用いることもできる。ライブラリーのクローンをプレートに拡げ、スクリーニング用基質に移し、変性し、所望の配列の存在につき釣上げる。
【００８８】
　本発明で用いるＤＮＡ配列は、通常、少なくとも約５コドン(１５ヌクレオチド)、より通常は少なくとも７-１５コドン、最も好ましくは、少なくとも約３５コドンを含む。また、１または２以上のイントロンが存在し得る。このヌクレオチド数は、通常、ＢＲＣＡ１-コード配列と特異的にハイブリダイズするであろう首尾よいプローブに要するおよそ最小限の長さである。
【００８９】
　核酸操作用の技術は、一般的に、例えば、Ｓambrookら，1989またはＡusbelら，1992に記載されている。制限酵素他のごときかかる技術に適用する試薬は当該分野で広く知られており、Ｎew Ｅngland ＢioＬabs社、Ｂoehringer Ｍannheim社、Ａmersham社、Ｐromega Ｂiotec社、Ｕ.Ｓ.Ｂiochemicals社、Ｎew Ｅngland Ｎuclear社および他の多くの供給源のごとき業者から市販されている。本発明の融合蛋白質を作製するのに用いる組換え核酸配列は、天然または合成配列由来とし得る。適当なプローブを用いて、種々のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー(ＧenＢank，Ｎational Ｉnstitute of Ｈealth参照)から多くの天然遺伝子配列を得ることができる。
【００９０】
　「ＢＲＣＡ１領域」とは、マーカーｔｄｊ１４７４およびＵ５Ｒによって結合されるヒト染色体１７ｑ２１の部分をいう。この領域には、ＢＲＣＡ１遺伝子を含むＢＲＣＡ１座が含まれる。
【００９１】
　本明細書で用いるごとく、「ＢＲＣＡ１座」、「ＢＲＣＡ対立遺伝子」および「ＢＲＣＡ領域」は、すべて、遺伝子座、対立遺伝子または領域を含む二本鎖ＤＮＡ、ならびに遺伝子座、対立遺伝子または領域を含むいずれかの一本鎖ＤＮＡをいう。
【００９２】
　本明細書で用いるごとく、ＢＲＣＡ１座または領域もしくは対立遺伝子の「部分」とは、少なくとも約８ヌクレオチド、または好ましくは約１５ヌクレオチド、またはより好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの最小限サイズを有すると規定され、および少なくとも約４０ヌクレオチドの最小限サイズを有し得る。
【００９３】
　「ＢＲＣＡ１蛋白質」または「ＢＲＣＡ１ポリペプチド」とは、ＢＲＣＡ１座によってコードされる蛋白質またはポリペプチド、その変形または断片をいう。　
【００９４】
　「ポリペプチド」なる語は、アミノ酸ポリマーまたはその相当物をいい、特異的な長さの生成物をいうのではなく；したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白質がポリペプチドの定義の中に含まれる。この語は、また、例えば、グルコシル化、アセチル化、リン酸化他のポリペプチドの修飾物をいうのではなく、または排除する。該定義の中に含まれるのは、天然および非天然に生じる(例えば、非天然アミノ酸他を包含する)１または２以上のアナログのアミノ酸を含むポリペプチド、置換結合を有するポリペプチド、ならびに当該分野で公知の他の修飾物が含まれる。通常、かかるポリペプチドは、天然のＢＲＣＡ１配列に少なくとも約５０％相同で、好ましくは約９０％を超えて、より好ましくは少なくとも約９５％相同性である。また、高または低ストリンジェンシー条件下にてＢＲＣＡ１-コード核酸にハイブリダイズし、ＢＲＣＡ１蛋白質(群)に対する抗血清によって回収される酷似したポリペプチドまたは蛋白質も包含される。
【００９５】
　相同性につき比較するポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも約１６アミノ酸、通常、少なくとも約２０残基、より通常は少なくとも約２４残基で、典型的には、少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基を超えるであろう。
【００９６】
　「作動可能に連結した」とは、かく記載した成分が、その意図した様式の機能を許容する関係にある並列(juxtaposition)をいう。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合には、該プロモーターは該配列に作動可能に連結されている。
【００９７】
　「プローブ」；適当なストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下にて、標的配列のポリペプチドと安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって検出し得る、特定の癌の素因または大部分の癌に関連するＢＲＣＡ１対立遺伝子に関連するポリヌクレオチド多形性をいう。プローブが標的配列に対して完全に相補的であると予想される場合には、ストリンジェント条件を用いるであろう。例えば、変形が、プローブは完全に相補的でない結果を有すると予想される場合のような幾つかの誤対合が予想される場合、ハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーを低下させ得る。非特異的／偶然の結合を排除する、すなわち、ノイズを最小限化する条件を選択する。かかる示唆は天然ＤＮＡ多形性ならびに突然変異を同定し、これらの示唆はさらに分析して、ＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子の検出を立証する必要がある。
【００９８】
　ＢＲＣＡ１対立遺伝子のプローブは、ＢＲＣＡ１領域またはそのｃＤＮＡの配列由来とし得る。該プローブは、ＢＲＣＡ１領域の全体または一部分に広がり、かつＢＲＣＡ１領域への特異的なハイブリダイゼーションを許容するいずれの適当な長さともし得る。標的配列が該プローブと同一の配列を含む場合、該プローブは、例えば、約８-３０塩基対の範囲に短くし得る。なぜならば、該ハイブリッドは、ストリンジェント条件下でさえ比較的安定であろうからである。プローブとある程度の誤対合が予想される場合、すなわち、該プローブが種々の領域にハイブリダイズすることが予想される場合、必要な特異性で標的配列にハイブリダイズするより長いプローブを用い得る。
【００９９】
　プローブには、標識またはレポーター分子に結合する単離ポリヌクレオチドが含まれ、それを用いて、標準的な方法によって配列類似を有する他のポリヌクレオチド配列を単離し得るであろう。プローブの調製および標識の技術としては、例えば、Ｓambrookら,1989またはＡusbelら，1992を参照せよ。他の同様なポリヌクレオチドは、相同ポリヌクレオチドを用いることによって選抜し得る。別法として、これらまたは同様のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子コード中の重複を用いることによって合成または選抜し得る。例えば、サイレント変化(それによって種々の制限部位を作製する)または特定の系を最適化することによって、種々のコドン置換を導入し得る。突然変異を導入して、ポリペプチドの特性(恐らくは、リガンド-結合親和性、鎖間親和性の変化またはポリペプチド分解または代謝回転速度の変化)を修飾することができる。
【０１００】
　本発明の合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを含むプローブは、天然に発生するか、または組換えの一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド、あるいは化学合成由来とし得る。プローブは、ニック・トランスレーション、クレノー酵素フィル-イン(fill-in)反応または当該分野で公知の他の方法によっても標識し得る。
【０１０１】
　ＢＲＣＡ１をコードするポリヌクレオチド配列からの、少なくとも約８ヌクレオチド、通常少なくとも約１５ヌクレオチドで、約６ｋｂより短い、通常約１.０ｋｂより短いヌクレオチドを有するポリヌクレオチド配列の一部分が、プローブとして好ましい。また、該プローブを用いて、ＢＲＣＡ１をコードするｍＲＮＡが細胞または組織中に存在するか否かを決定することもできる。
【０１０２】
　ＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはその断片について本発明によって提供される
「蛋白質修飾物または断片」は、一次構造配列に実質的に相同性であるが、例えば、イン・ビボ(in vivo)またはイン・ビトロ(in vitro)の化学的および生化学的修飾または異常なアミノ酸を取り込んだものが含まれる。かかる修飾には、当業者によって容易に理解されるであろう、例えば、アセチル化、カルボキシ化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、(例えば、放射線核種での)標識、ならびに種々の酵素的修飾が含まれる。かかる目的に有用なポリペプチドを標識する種々の方法およびその置換または標識は、当該分野でよく知られており、３２Ｐのごとき放射性同位体が含まれ、これは、標識リガンドの特異的結合対メンバーとして作用し得る標識抗リガンド(例えば、抗体)、蛍光団、化学発色剤、酵素および抗リガンドに結合する。標識の選択は、要する感度、プライマーとコンジュゲート容易性、安定性要件および入手可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識する方法は当該分野でよく知られている(例えば、Ｓambrookら，1989またはＡusbelら，1992参照)。
【０１０３】
　実質的に完全長のポリペプチドに加えて、本発明は、偽ポリペプチドの生物学的に活性な断片を提供する。重要な生物学的活性には、ＢＲＣＡ１ポリペプチドのリガンド-結合性、免疫学的活性および他の生物学的活性特性が含まれる。免疫学的活性には、標的免疫系の免疫源機能、ならびに結合用の免疫学的エピトープを分け持っていること、ＢＲＣＡ１蛋白質のエピトープにつき競合または置換抗原のいずれかとして作用することの両方が含まれる。本明細書で用いる「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基をいう。エピトープは、エピトープにユニークな空間立体配置に３個のアミノ酸を含み得る。一般的に、エピトープは、少なくとも５個のかかるアミノ酸、およびより通常は少なくとも８-１０個のかかるアミノ酸よりなる。かかるアミノ酸の空間立体配置を決定する方法は当該分野で知られている。
【０１０４】
　免疫学的目的には、直列反復ポリペプチド・セグメントを免疫原として用い、それによって抗原蛋白質を高度に産生し得る。別法として、かかるポリペプチドは、特異的結合につき高効率の競合物としても作用するであろう。ＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体の作製を以下に記載する。
【０１０５】
　また、本発明は、ＢＲＣＡ１ポリペプチドおよび断片を含む、融合ポリペプチドも提供する。ホモポリペプチドは、２または３以上のＢＲＣＡ１ポリペプチド配列の間の、またはＢＲＣＡ１の配列と関連蛋白質との間の融合とし得る。同様に、誘導蛋白質の特性または活性の組合せを示すであろうヘテロ融合物を構築し得る。例えば、リガンド-結合または他のドメインは、異なる新たな融合ポリペプチドまたは断片の間で「交換」し得る。かかるホモまたはヘテロ融合ポリペプチドは、例えば、変化した強さまたは特異性の結合を示し得る。融合パートナーには、免疫グロブリン、細菌β-ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β-ラクタマーゼ、α-アミラーゼ、アルコール・デヒドロゲナーゼおよび酵母アルファ接合因子が含まれる(例えば、Ｇodowskiら，1988参照)。
【０１０６】
　融合蛋白質は、典型的には、以下に記載するごとき、いずれかの組換え核酸法によって作製し得、あるいは化学合成法とし得る。ポリペプチドを合成する技術は、例えば、Ｍerrifield，1963に記載されている。
【０１０７】
　「蛋白質精製」とは、ＢＲＣＡ１をコードする組換え核酸で形質転換した細胞からのごとき、他の生物材料からＢＲＣＡ１ポリペプチドを単離するための種々の方法、ならびに当該分野でよく知られている方法をいう。例えば、かかるポリペプチドは、例えば、本発明によって提供される抗体を用いる免疫アフィニティー・クロマトグラフィーによって精製し得る。蛋白質精製の種々の方法は当該分野でよく知られており、Ｄeutscher，1990およびＳcopes，1982に記載されたものが含まれる。
【０１０８】
　「単離した」、「実質的に純粋な」および「実質的に均一な」なる語は、天然状態では蛋白質またはポリペプチドを付随する成分からそれらを分離することを記載するために相互変換可能に用いる。少なくとも約６０〜７５％の試料が単一のポリペプチド配列を示す場合、単量体蛋白質は実質的に純粋である。実質的に純粋な蛋白質は、典型的には、約６０％〜９０％Ｗ／Ｗの蛋白質試料、より通常には約９５％、好ましくは約９９％純粋を超える蛋白質試料を含むであろう。蛋白質純度または均一性は、蛋白質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動につづく該ゲルの染色の際の単一ポリペプチドバンドの視覚化のごとき、当該分野でよく知られている多くの手段によって示し得る。特定の目的には、ＨＰＬＣまたは精製に利用する当該分野でよく知られた他の手段を用いることによって高解像度を供し得る。
【０１０９】
　ＢＲＣＡ１蛋白質は、その天然状態でそれに付随する天然の汚染物からそれを分離した場合、天然で関連する成分を実質的に含まない。かくして、化学的に合成したか、またはそれが天然に起源する細胞とは異なる細胞系で合成したポリペプチドは、その天然に付随する成分を実質的に含まないであろう。蛋白質は、当該分野でよく知られた蛋白質精製技術を用いて単離することによって、天然に付随する成分を実質的に含まないものとすることもできる。
【０１１０】
　単離および操作した遺伝子配列の発現産物として生成するポリペプチドは、ホモ細胞型で発現される場合でさえ、本明細書で用いる「単離ポリペプチド」である。ヘテロ細胞によって発現される合成作製形態または分子は、本来、単離分子である。
【０１１１】
　「組換え核酸」とは、天然に生じるものではない、または、配列の２の他の分離したセグメントの人工的組合せによって作製した核酸である。この人工的な組合せは、しばしば、いずれかの化学合成手段によってか、または核酸の単離セグメントの人工操作によって、例えば、遺伝子工学技術によってなされる。かかるものは、通常、同一または保存アミノ酸をコードする余分なコドンでコドンを置換して行うが、典型的には、配列認識部位を導入するか、または除去する。別法として、それを行って、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合し、所望の組合せの機能を生成する。
【０１１２】
　「調節配列」とは、通常、遺伝子座のコード領域の１００ｋｂ以内の配列をいうが、それはコード領域からさらに離れていることもあり、それは、(遺伝子の転写、およびｍＲＮＡの翻訳、スプライシング、安定性などを含む)遺伝子の発現に影響する。
【０１１３】
　「実質的に相同または同様な」；他の核酸(またはその相補鎖)と(適当なヌクレオチド挿入または欠失を有して)最適に並べた場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５-９８％のヌクレオチド塩基のヌクレオチド配列同一性が存在する場合、核酸またはその断片はもう１つのものに「実質的に相同性である」(「または実質的に同様である」)。
【０１１４】
　別法として、鎖またはその相補鎖に対して選択的なハイブリダイゼーション条件下で、他の核酸(またはその相補鎖)に、核酸またはその断片がハイブリダイズする場合、実質的な相補性または(同一性)が存在する。特異性の全体的な欠乏よりも実質的により選択的なハイブリダイゼーションが起こる場合に、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％のストレッチにわたって少なくとも約５５％相同性が存在する場合に生じるであろう(Ｋanehisa，1984参照)。記載した相同性比較の長さは、より長いストレッチとすることもでき、特定の具体例においては、しばしば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６またはそれを超えるヌクレオチドのストレッチにわたるであろう。
【０１１５】
　核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるであろう、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基誤対合の数に加えて、塩濃度、温度、または有機溶媒のごとき条件によって影響されるでろう。ストリンジェントな温度条件には、一般的に、３０℃を超える、典型的には３７℃を超える、好ましくは４５℃を超える温度が含まれるであろう。ストインジェントな塩条件には、通常、１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満であろう。しかしながら、指標の組合せはいずれの単一の指標の測定よりも遥かにより重要である(例えば、ＷetmurおよびＤavidson，1968参照)。プローブ配列は、また、特定の条件下にて二重らせんＤＮＡに特異的にハイブリダイズして、三重らせんまたは他のより高次のＤＮＡ複合体を形成し得る。かかるプローブの調製および適当なハイブリダイゼーション条件は当該分野でよく知られている。
【０１１６】
　「実質的相同性」または「実質的同一性」なる語は、ポリペプチドをいう場合、問題のポリペプチドまたは蛋白質が自然に発生する全体蛋白質またはその一部分と少なくとも約３０％同一性、通常少なくとも約７０％同一性、好ましくは少なくとも約９５％同一性を表すことを示す。
【０１１７】
　「実質的に同一の機能」とは、野生型ＢＲＣＡ１核酸または野生型ＢＲＣＡ１ポリペプチドに関しての、修飾核酸または修飾蛋白質の機能をいう。修飾ポリペプチドは野生型ＢＲＣＡ１ポリペプチドに実質的に相同性であって、同一の機能を実質的に有するであろう。修飾ポリペプチドは、変化したアミノ酸配列を有し、および／または修飾アミノ酸を含み得る。機能の同一性に加えて、修飾ポリペプチドは、より長い半減期のごとき他の有用な特性を有し得る。修飾ポリペプチドの機能(活性)の同一性は、実質的に野生型ＢＲＣＡ１ポリペプチドの活性と同一とし得る。別法として、修飾ポリペプチドの機能(活性)の同一性は、野生型ＢＲＣＡ１ポリペプチドの活性よりも高いものとし得る。修飾ポリペプチドは、慣用的な技術を用いて合成し、あるいは、修飾した核酸によってコードされ、慣用的な技術を用いて作製される。修飾核酸は慣用的な技術によって調製する。野生型ＢＲＣＡ１遺伝子機能と実質的に同様の機能を有する核酸は、前記した修飾蛋白質を産生する。
【０１１８】
　ポリペプチドの相同性は、典型的に、配列分析ソフトウェアを用いて測定する(例えば、Ｓequence Ａnalysis Ｓoftware Ｐackage of the Ｇenetics Ｃomputer Ｇroup，Ｕniversity of Ｗisconsin Ｂiotechnology Ｃenter，910 Ｕniversity Ａvenue，Ｍadison，Ｗisconsin 53705参照)。蛋白質分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の修飾を指定した相同性の測定を用いて、同様配列を対合する。保存性置換には、典型的に、以下の群の中の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【０１１９】
　ポリペプチド「断片」、「一部分」または「セグメント」とは、少なくとも約５〜７個の隣接したアミノ酸、しばしば、少なくとも約７〜９個の隣接したアミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３の隣接したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０〜３０またはそれを超えて隣接したアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチである。
【０１２０】
　本発明のポリペプチドは、可溶性である場合、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、カラム充填材(例えば、Ｓepharose beads)、磁性ビーズ、ガラスウール、プラスチック、金属、ポリマーゲル、細胞または他の基体のような固相支持体にカップリングし得る。かかる支持体は、例えば、ビーズ、ウェル、計深棒または膜のような形態を採り得る。
【０１２１】
　「標的領域」とは、増幅および／または検出する核酸の領域をいう。「標的配列」なる語は、所望の条件下にて、それとプローブまたはプライマーとが安定なハイブリッドを形成するであろう配列をいう。
【０１２２】
　本発明の実施は、特に指摘しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学および免疫学の慣用的な技術を用いる(例えば、Ｍaniatisら，1982；Ｓambrookら，1989；Ａusubelら，1992；Ｇlover，1985；Ａnand，1992；ＧuthrieおよびＦink，1991参照)。ヒト染色体１７ｑのマッピングを含むヒト遺伝子マッピングの技術および材料の一般的な議論は、例えば、ＷhiteおよびＬalouel，1988に記載されている。
【０１２３】
組換えまたは化学的に合成した核酸；ベクター、形質転換、宿主細胞の調製
　本発明の大量のポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞中の複製によって産生し得る。所望の断片をコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片は、原核生物または真核生物細胞に導入し、複製する能力を有する、組換えポリヌクレオチド構築物、通常ＤＮＡ構築物に導入する。通常、ポリヌクレオチド構築物は、酵母または細菌のごとき単細胞宿主における複製に適しているであろうが、(ゲノム内に一体化されるか、またはされないで)培養した哺乳動物または植物あるいは他の真核生物細胞系統への導入を意図することもできる。本発明の方法によって作製した核酸の精製は、例えば、Ｓambrookら，1989またはＡusubelら，1992に記載されている。
【０１２４】
　本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＢeaucageおよびＣarruthers，1981によって記載されているホスホルアミダイト法、またはＭatteucciおよびＣaruthers，1981によるトリエステル法による化学合成によって作製し得、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成器で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下にてそれらの鎖を一緒にアニーリングさせることによって、あるいは、適当なプライマー配列と一緒にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することによって、化学合成の一本鎖から得ることができる。
【０１２５】
　原核生物または真核生物宿主へ導入するために調製するポリヌクレオチド構築物は、所望のポリヌクレオチドをコードする目的のポリヌクレオチド断片を包含する宿主によって認識される複製系を含み得、好ましくは該ポリヌクレオチドコードセグメントに作動可能に連結した転写および翻訳の開始の調節配列も含むであろう。発現ベクターには、例えば、複製開始点または自律複製配列(ＡＲＳ)、ならびに、リボソーム-結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列およびｍＲＮＡ安定化配列のごとき、発現制御配列、プロモーター、エンハンサーおよび必須のプロセシング情報部位が含まれ得る。分泌シグナルには、適当には、天然ＢＲＣＡ１蛋白質からか、または他の受容体、あるいは同一または関連する種の分泌ポリペプチドからかのいずれかからのもので、蛋白質を細胞膜貫通および／または緊提させるもので、従って、その機能トポロジーを達成する、あるいは細胞から分泌されるものが含まれ得る。かかるベクターは、当該分野でよく知られ、例えば、Ｓambrookら，1989またはＡusbelら，1992中で論じられている標準的な組換え技術によって調製し得る。
【０１２６】
　適当なプロモーターおよび他の必須のベクター配列は、宿主で機能するように選択され、適当には、ＢＲＣＡ１遺伝子と天然で関連するものが含まれ得る。細胞系統および発現ベクターの作動し得る組合せの例は、Ｓambrookら，1989またはＡusubelら，1992に記載されており；また、例えば、Ｍetzgerら，1988を参照せよ。多くの有用なベクターが当該分野で公知であり、Ｓtratagene社、Ｎew Ｅngland Ｂiolabs社、Ｐromega Ｂiotech社他のごとき業者から入手し得る。
ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖酵素プロモーターのごときプロモーターを原核生物宿主に用い得る。有用な酵母プロモーターには、メタロチオネイン、３-ホスホグリセレート・キナーゼ、または、エノラーゼもしくはグリセルアルデヒド-３-ホスフェート・デヒドロゲナーゼのごとき他の解糖酵素、マルトースおよびガラクトース利用に寄与する酵素他のプロモーター領域が含まれる。酵母発現の使用に適したベクターおよびプロモーターは、さらに、Ｈitzemanら，EP 73,675A号に記載されている。適当な非天然哺乳動物プロモーターには、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター(Ｆiersら，1978)またはマウスモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、II型アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスまたはポリオーマ由来のプロモーターが含まれ得る。加えて、該構築物は、複数コピーの遺伝子を作製し得るように、増幅性遺伝子(例えば、ＤＨＦＲ)に連結し得る。適当なエンハンサーおよび他の発現制御配列に関しては、例えば、Ｅnhancers and Ｅukaryotic Ｇene Ｅxpression，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress社，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，Ｎew Ｙork(1983)を参照せよ。
【０１２７】
　かかる発現ベクターは自律的に複製し得るが、それらは、当該分野でよく知られている方法によって、宿主細胞のゲノムに挿入することによって複製することもできる。
【０１２８】
　発現およびクローニングベクターは、ベクターで形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必須な蛋白質をコードする遺伝子である選択マーカーを含むようである。この遺伝子が存在することにより、該インサートを発現する宿主細胞のみの増殖が保証される。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート他への抵抗性を付与する；ｂ）栄養要求性欠損を補う、またはｃ）複合培地から入手できない重要な栄養を供給する(例えば、悍菌(Ｂacilli)にはＤ-アラニン・ラセマーゼをコードする遺伝子)蛋白質をコードしている。適当な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、種々の宿主に対する適当なマーカーは当該分野でよく知られている。
【０１２９】
　目的の核酸を含むベクターはイン・ビトロ(in vitro)で転写し得、よく知られた方法(例えば、インジェクション(Ｋuboら，1988))によって、得られたＲＮＡを宿主細胞に導入し得、あるいは、該ベクターは細胞宿主のタイプに依存して変動する当該分野でよく知られている方法(エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ-デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル衝撃；リポフェクション感染(ベクターがレトロウイルスゲノムのごとき感染性因子である)；ならびに他の方法)によって宿主細胞に直接導入し得る(一般的に、Ｓambrookら，1989およびＡusubelら，1992参照)。とりわけ前記したものを包含する当該分野で公知のいずれかの方法による宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、本明細書中で「形質転換」という。前記の核酸を導入した細胞は、かかる細胞の子孫も含むことを意味する。
【０１３０】
　本発明の大量の核酸およびポリヌクレオチドは、ＢＲＣＡ１核酸またはその一部分を原核生物または真核生物宿主細胞に和合性のベクターまたは他の発現ビヒクルで発現させることによって調製し得る。最も通常用いる原核生物宿主はエシェリキア・コリ(Ｅscherichia coli)であるが、バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)またはシュードモナス(Ｐseudomonas)のごとき他の原核生物も用い得る。
【０１３１】
　哺乳類宿主細胞、あるいは、酵母、糸状菌、植物、昆虫、または両生類もしくは鳥類のごとき他の真核生物宿主細胞も、また、本発明の蛋白質の産生に有用となり得る。培養における哺乳動物細胞の増殖は、それ自体よく知られている(ＪakobyおよびＰastan，1979参照)。通常用いられる哺乳動物宿主細胞系統の例はＶＥＲＯおよびＨeＬa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ならびにＷＩ３８、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞系統であるが、他の細胞系統も、例えば、より高い発現、望ましいグリコシル化パターン、または他の特徴を供するに適当となり得ることは当業者によって理解されるであろう。
【０１３２】
　ベクター構築物の様式に依存するマーカーを用いることによって、クローンを選抜し得る。マーカーは、同一または異なるＤＮＡ分子上とし得るが、好ましくは同一ＤＮＡ分子上である。原核生物宿主においては、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する抵抗性によって、形質転換体を選抜し得る。温度感受性に基づく特定の産物の産生も、適当なマーカーとして作用し得る。
【０１３３】
　本発明のポリヌクレオチドで形質転換した原核生物または真核生物細胞は、本発明の核酸およびポリペプチドの産生のみならず、例えば、ＢＲＣＡ１ポリペプチドの特性の研究においても有用であろう。
　アンチセンス・ポリヌクレオチド配列は、当業者によって理解されるであろうごとく、ＢＲＣＡ１座の発現を防ぐか、または減じるのに有用である。例えば、ＢＲＣＡ１座またはＢＲＣＡ１領域からの他の配列(特に、ＢＲＣＡ１座に隣接するもの)の全体もしくは一部分を含有するポリヌクレオシドベクターは、アンチセンス方向でプロモーターの制御下に置き、細胞に導入することができる。細胞内におけるかかるアンチセンス構築物の発現は、ＢＲＣＡ１転写および／または翻訳および／または複製を妨害するであろう。
【０１３４】
　本明細書で開示したＢＲＣＡ１遺伝子配列に基づくプローブおよびプライマーを用いて、他の種における相同性ＢＲＣＡ１遺伝子配列および蛋白質を同定する。これらのＢＲＣＡ１遺伝子配列および蛋白質は、それを単離した種についての、本明細書に記載した診断／予測、治療および薬剤スクリーニング方法に用いる。
【０１３５】
使用方法：核酸診断および診断キット
　個人が癌になる素因であるＢＲＣＡ１対立遺伝子の存在を検出するためには、血液のごとき生物試料を調製し、ＢＲＣＡ１の感受性対立遺伝子の存在または不存在について分析する。新生生物の存在を検出するためには、前駆体病斑の悪性腫瘍に向けての進展、または、予測指標として、病斑の生物試料を調製し、ＢＲＣＡ１の突然変異対立遺伝子の存在または不存在について分析する。これらの試験の結果および解釈情報は、試験した個人に対するコミュニケーションのためにヘルスケア・プロバイダーに戻す。かかる診断は、診断研究所によって行うか、別法として、診断キットを製造し、ヘルスケア・プロバイダーまたは自己-診断用にプライベートな個人に対して販売し得る。
【０１３６】
　最初に、スクリーニング法は適当なＢＲＣＡ１配列の増幅が含まれる。本発明のもう１つの好ましい具体例において、該スクリーニング方法は、非-ＰＣＲベースの戦略を含む。かかるスクリーニング法には、当該分野でよく知られている２-段階標識増幅方法論が含まれる。ＰＣＲおよび非-ＰＣＲの両方のベースのスクリーニング戦略は、高レベルの感度で標的配列を検出し得る。
【０１３７】
　今日用いられている最もポピュラーな方法は、標的増幅である。ここにおいては、標的核酸配列をポリメラーゼで増幅する。ポリメラーゼ作動増幅を用いる１つの特に好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)である。ポリメラーゼ連鎖反応および他のポリメラーゼ-作動増幅アッセイにより、ポリメラーゼ-作動増幅サイクルの使用を通して、コピー数にして百万倍を超える増加を達成し得る。増幅したら、得られた核酸は配列決定し得るか、またはＤＮＡプローブ用の基質として用い得る。
【０１３８】
　プローブを用いて標的配列の存在を検出する(例えば、癌感受性についてのスクリーニングにおいて)場合、所望により、血液または血清のごとき分析すべき生物試料を処理して核酸を抽出し得る。試料核酸を種々の方法で調製して、標的配列の検出；例えば、変性、制限消化、電気泳動またはドット・ブロットを容易ならしめることができる。分析核酸の標的化領域は、通常、少なくとも部分的に一本鎖であって、プローブの標的配列とハイブリッドを形成しなければならない。配列が天然に一本鎖である場合、変性は必要ないであろう。しかしながら、配列が二本鎖である場合、該配列は恐らく変性させる必要がある。変性は、当該分野で公知の種々の技術によって行い得る。
【０１３９】
　分析核酸およびプローブは、分析物中の予想標的化配列とプローブ中の標的配列との安定なハイブリッド形成を促進する条件下にてインキュベートする。分析物に結合させるのに用いるプローブの領域は、ヒト染色体１７ｑの標的化領域に完全に相補的とし得る。したがって、誤った陽性を防ぐためには、高ストリンジェンシー条件が望ましい。しかしながら、高ストリンジェンシー条件は、ゲノム中にユニークである染色体領域にプローブが相補的である場合にのみ使用する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの間および洗浄工程の間の多数の因子によって決定され、これには、温度、イオン強度、塩基組成、プローブ長およびホルムアミド濃度が含まれる。これらの因子は、例えば、Ｍaniatisら，1982およびＳambrookら，1989に概説されている。特定の環境下においては、三重らせん、四重らせん他のごときより高次のハイブリッドを形成させて、標的配列を検出する手段を提供することが望ましいこともあり得る。
【０１４０】
　いずれにせよ、得られたハイブリッドの検出は、通常、標的プローブを用いることによってなされる。別法として、該プローブは非標識であってもよいが直接または間接的に標識したリガンドとの特異的な結合によって検出し得る。適当な標識、ならびにプローブおよびリガンドを標識する方法は当該分野で公知であって、これには、例えば、公知の方法(例えば、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたはキナージング(kinasing))、ビオチン、蛍光基、化学発光基(例えば、ジオキセタン、特に励起(triggered)ジオキセタン)、酵素、抗体他によって取り込み得る放射能標識が含まれる。この基本スキームの変形は当該分野で公知であって、外来物質から検出すべきハイブリッドの分離を容易ならしめる変形、および／または標識基からの信号を増幅する変形が含まれる。多くのこれらの変形は、例えば、ＭatthewsおよびＫricka，1988；Ｌandegrenら，1988；Ｍittlin，1989；米国特許第4,868,105号およびＥＰＯ公開第225,807号に概説されている。
【０１４１】
　前記したごとく、非-ＰＣＲ-ベースのスクリーニングアッセイも本発明で意図される。例示的な非-ＰＣＲに基づく方法を実施例１１に供する。この方法は、核酸プローブ(または、ホスホン酸メチル骨格を正常なホスホジエステルと置換えたごときアナログ)を低レベルのＤＮＡ標的にハイブリダイズする。このプローブは、共有結合がハイブリダイゼーションの特異性を妨害しないように、当該プローブに共有結合した酵素を有し得る。この酵素-プローブ-コンジュゲート-標的核酸複合体は、ついで、遊離プローブ酵素コンジュゲートから単離し得、酵素検出用に基質を添加する。酵素活性は、感度にして１０３-１０６の増加が得られる発色または発光出力における変化で観察認される。オリゴデオキシヌクレオチド-アルカリホスファターゼ・コンジュゲートの調製およびハイブリダイゼーション・プローブとしてのそれらの使用に関する一例としては、Ｊablonskiら，1986を参照せよ。
【０１４２】
　二段階標識増幅方法論は、当該分野で公知である。これらのアッセイは、(ジゴキシゲニン、ビオチン他のごとき)小リガンドが、ＢＲＣＡ１に特異的に結合し得る核酸プローブに結合するという原理で行う。例示的なプローブを本明細書の表９および１０に供し、これにはさらに、配列番号：１のヌクレオチド位３６３１〜３９３０に対応する核酸プローブが含まれる。対立遺伝子特異的プローブもまた、この例の範囲内にあることが意図されており、例示的な対立遺伝子特異的プローブには、本願明細書の表１２および１３中に要約した素因突然変異を包含するプローブが含まれる。
【０１４３】
　一例において、核酸プローブに結合する小プローブは、抗体-酵素コンジュゲートによって特異的に認識される。この例の１つの具体例において、ジゴキシゲニンが核酸プローブに結合する。ハイブリダイゼーションは、化学発光基質になる抗体-アルカリホスファターゼ・コンジュゲートによって検出する。この具体例による核酸プローブを標識する方法については、Ｍartinら，1990を参照せよ。第二の実施例においては、第一リガンドに特異的にコンプレックスを形成し得る第二リガンド-酵素コンジュゲートによって小リガンドを認識する。この例のよく知られた具体例は、ビオチン-アビジン型の相互作用である。核酸プローブを標識する方法およびビオチン-アビジンに基づくアッセイにおけるそれらの使用については、Ｒigbyら，1977およびＮguyenら，1992を参照せよ。
【０１４４】
　本発明の核酸プローブアッセイがＢＲＣＡ１を検出し得る核酸プローブのカクテルを用いるであろうことも、本発明の範囲内で意図されている。かくして、細胞試料中のＢＲＣＡ１の存在を検出する一例において、ＢＲＣＡ１に相補的な２以上のプローブを用い、特に、多くの異なるプローブを、別法として、２、３または５この異なる核酸プローブ配列を用いる。もう１つの例において、患者におけるＢＲＣＡ１遺伝子配列中の突然変異の存在を検出するためには、ＢＲＣＡ１に相補的な２以上のプローブを用い、ここに、カクテルは、ＢＲＣＡ１中に変化を有する患者の集団において同定された対立遺伝子-特異的突然変異に結合し得るプローブを含む。この具体例においては、いずれの数のプローブを用いることができるが、好ましくは、個人が乳癌になる素因として同定された主遺伝子突然変異に対応するプローブを含むであろう。本発明の範囲内に意図される幾つかの候補プローブには、表１２および１３に同定した対立遺伝子-特異的突然変異を含むプローブ、ならびに、配列番号：１の５'および３'の両方の突然変異サイトに対応するＢＲＣＡ１領域を有するプローブが含まれる。
【０１４５】
使用方法：ペプチド診断および診断キット
　病斑の新生生物状態は、野生型ＢＣＡ１ポリペプチドの変化に基づいても検出し得る。かかる変化は、慣用的な技術による配列分析によって決定し得る。より好ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、ＢＲＣＡ１ペプチド中の相違、または不存在を検出する。該抗体は、「抗体」なる標題下で前に論じ、実施例１２および１３にさらに示すごとく調製し得る。抗体を生起させて精製する他の技術は当該分野でよく知られており、いずれのかかる技術を用いても、本発明に請求する調製物をなし得る。本発明の好ましい具体例において、抗体は、溶液からＢＲＣＡ１蛋白質を免疫沈降し、かつ、ポリアクリルアミドゲルのウェスタンまたはイムノブロット上でＢＲＣＡ１蛋白質と反応するであろう。もう１つの好ましい具体例において、抗体は、免疫細胞化学的技術を用いて、パラフィンまたは凍結組織切片中のＢＲＣＡ１蛋白質を検出するであろう。
【０１４６】
　ＢＲＣＡ１またはその突然変異を検出する方法に関する好ましい具体例には、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いたサンドウィッチアッセイを含む、酵素結合免疫ソルベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、イムノラジオ分析アッセイ(ＩＲＭＡ)およびイムノ酵素アッセイ(ＩＥＭＡ)が含まれる。例示的なサンドウィッチアッセイは、(出典明示して本明細書の一部とみなし、実施例１４で例示する)米国特許第4,376,110号および第4,486,530号においてＤavidらによって記載されている。
【０１４７】
使用方法：薬剤スクリーニング
　本発明は、いずれかの種々の薬剤スクリーニング技術においてＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはその結合フラグメントを使用することによって、化合物をスクリーニングするのに特に有用である。
【０１４８】
　かかる試験において使用するＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中で遊離させ得、固体支持体に固定化し得、あるいは細胞表面上に支持し得る。薬剤スクリーニングの１つの方法は、好ましくは競合結合アッセイにおいて、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換えポリヌクレオチドで安定して形質転換した真核生物または原核宿主生物細胞を使用する。生存能力を有するか、または固定形態のいずれかのかかる細胞は、標準結合アッセイに用いることができる。例えば、ＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはフラグメントと試験すべき剤との間の複合体の形成について測定し得、または、ＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはフラグメントと既知リガンドとの間の複合体の形成が試験すべき剤によって妨害される程度を検査し得る。
【０１４９】
　かくして、本発明は、薬剤とＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはフラグメントとを接触させ、当該分野でよく知られている方法によって、(ｉ)該剤とＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはフラグメントとの間の複合体の存在につき、または(ｉｉ)ＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはそのフラグメントとリガンドとの間の複合体の存在につきアッセイすることを特徴とする薬剤のスクリーニング方法を提供する。かかる競合結合アッセイにおいて、ＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはフラグメントは、典型的に標識されている。遊離ＢＲＣＡ１ポリペプチドまたはフラグメントは、蛋白質：蛋白質複合体に存在するものから単離し、遊離(すなわち、非コンプレックス形成)標識の量は、各々、ＢＲＣＡ１に対して試験すべき剤の結合の測定値、またはＢＲＣＡ１：リガンド結合で妨害された値である。
【０１５０】
　薬剤スクリーニングのもう１つの技術は、ＢＲＣＡ１ポリペプチドに対して適当な結合アフィニティーを有する化合物の高処理量スクリーニングを提供し、これは、Ｇeysen，1984年9月13日に公開されたＰＣＴ国際公開ＷＯ84/03564号に詳記されている。簡単に説明すると、多数の異なる小ペプチド試験化合物を、プラスチックピンまたはある種の他の表面のごとき固体支持体上で合成する。ペプチド試験化合物をＢＲＣＡ１ポリペプチドと反応させ、洗浄する。結合したＢＲＣＡ１ポリペプチドを、ついで、当該分野でよく知られている方法によって検出する。
【０１５１】
　精製したＢＲＣＡ１は、前記した薬剤スクリーニング技術において使用するために、プレート上に直接コートし得る。しかしながら、該ポリペプチドに対する非-中和抗体を用いて抗体を捕捉し、該固相上にＢＲＣＡ１ポリペプチドを固定化し得る。
【０１５２】
　また、本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用も意図しており、その中では、ＢＲＣＡ１ポリペプチドに特異的に結合し得る中和抗体を、ＢＲＣＡポリペプチドまたはそのフラグメントに対する結合について、試験化合物と競合させる。このようにして、抗体を用いて、１または２以上のＢＲＣＡ１ポリペプチドの抗原決定基を有するいずれのペプチドの存在も検出し得る。
【０１５３】
　薬剤スクリーニングのさらなる技術には、非機能性ＢＲＣＡ１遺伝子を有する(前記したごとき)宿主真核生物細胞系統または細胞の使用が含まれる。これらの宿主細胞系統または細胞は、ＢＲＣＡ１ポリペプチドレベルで欠失している。宿主細胞系統または細胞は、薬剤化合物存在下で増殖する。宿主細胞の増殖速度を測定して、該化合物がＢＲＣＡ１欠失細胞の増殖を調節し得るか否かを判断する。
【０１５４】
使用方法：合理的薬剤デザイン
　合理的薬剤デザインの目標は、例えば、より活性な、または安定な形態のポリペプチド、またはイン・ビボ(in vivo)でポリペプチドの機能を向上する、または妨害する薬剤を製造するために、目的の生物学的に活性なポリペプチド、または、当該薬剤が相互作用する小分子(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター)の構造アナログを設計することである(例えば、Ｈodgson，1991参照)。１つのアプローチにおいて、最初に目的の蛋白質(例えば、ＢＲＣＡ１ポリペプチド)または、例えば、ＢＲＣＡ１-受容体もしくはリガンドコンプレックスの三次元構造を、X-線結晶学、コンピュータ・モデリング、または最も典型的には、組合せたアプローチによって決定する。あまり頻繁ではないが、相同蛋白質の構造に基づくモデリングによって、ポリペプチドの構造に関する有用な情報を得ることができる。合理的薬剤デザインの一例は、ＨＩＶプロテアーゼ・インヒビターの開発である(Ｅricksonら，1990)。加えて、ペプチド(例えば、ＢＲＣＡ１ポリペプチド)をアラニン・スキャンによって分析する(Ｗells，1991)。この技術においては、アミノ酸残基をＡlaに置換し、ペプチド活性に対するその影響を測定する。ペプチドの各アミノ酸残基をこのようにして分析して、ペプチドの重要な領域を決定する。
【０１５５】
　また、機能アッセイによって選抜した標的-特異的抗体を単離し、ついで、その結晶構造を解明することもできる。原則として、このアプローチにより、続く薬剤デザインに基づき得るファーマコア(pharmacore)が得られる。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体(抗-ｉｄｓ)を生起することによって、蛋白質結晶学を全く回避することができる。鏡像の鏡像のごとく、抗-ｉｄｓの結合サイトは、元の受容体のアナログであると予想される。ついで、抗-ｉｄｓを用いて、ペプチドの化学的または生物学的に作成したバンクのバンクからペプチドを同定し、単離し得る。ついで、選抜したペプチドは、ファーマコアとして作用するであろう。
【０１５６】
　かくして、例えば、改善されたＢＲＣＡ１ポリペプチド活性または安定性を有するか、または、例えば、ＢＲＣＡ１ポリペプチド活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニスト他として作用する薬剤をデザインすることができる。クローン化ＢＲＣＡ１配列の有効性によって、十分な量のＢＲＣＡ１ポリペプチドを利用して、ｘ線結晶学のごとき分析実験を行い得る。加えて、本明細書に供するＢＲＣＡ１蛋白質配列の知見は、ｘ-線結晶学の代わりに、またはそれに加えて、コンピュータモデリング技術を利用するものに導くであろう。
【０１５７】
使用方法：遺伝子療法
　本発明により、野生型ＢＲＣＡ１機能を突然変異ＢＲＣＡ対立遺伝子を運ぶ細胞に供する方法が提供される。かかる機能の提供は、受容細胞の新生生物増殖を抑制するにちがいない。野生型ＢＲＣＡ１遺伝子またはその遺伝子の一部分は、遺伝子が染色体外に残るようベクターで細胞に導入し得る。かかる状態においては、遺伝子は、染色体外位置から細胞によって発現されるであろう。遺伝子フラグメントを突然変異ＢＲＣＡ１対立遺伝子を運ぶ細胞に導入し発現させた場合、該遺伝子フラグメントは、細胞の非-新生生物増殖に要するＢＲＣＡ１蛋白質の一部分をコードしているにちがいない。
【０１５８】
　より好ましくは、野生型ＢＲＣＡ１遺伝子またはその一部分を、細胞に存在する内因性突然変異ＢＲＣＡ１遺伝子とそれが組換わるように、突然変異細胞に導入する状況である。かかる組換えには、二重組換え事象が必要であり、これはＢＲＣＡ１遺伝子突然変異の訂正を生じる。組換えおよび染色体外維持の両方の遺伝子を導入するベクターは当該分野で公知であり、いずれかの適当なベクターを用い得る。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈およびウイルス形質導入のごとき細胞にＤＮＡを導入する方法は当該分野で公知であり、方法の選択は日常従事者の能力の範囲内にある。野生型ＢＲＣＡ１遺伝子で形質転換した細胞をモデル系として使用し、癌の緩解およびかかる緩解を促進する薬剤処理を研究し得る。
【０１５９】
　一般的に前に論じたごとく、ＢＲＣＡ１遺伝子またはフラグメントは、適用し得る場合には、癌細胞中のかかる遺伝子の発現産物の量を増加させるために、遺伝子療法に用いることができる。かかる遺伝子療法は、癌性および前-癌性細胞の両方における使用に特に適しており、この療法においては、正常細胞に比して、ＢＲＣＡ１ポリペプチドのレベルがなくなるかまたは減じられる。また、「正常」レベルで突然変異遺伝子が発現しているが、該遺伝子産物は完全に機能的でない腫瘍細胞中でさえ、所与のＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを増加させるにも有用となり得る。
【０１６０】
　遺伝子療法は、(例えば、Ｆriedman，1991によって記載されたごとき)一般的に許容された方法によって行われるであろう。患者の腫瘍からの細胞は、まず、前記した診断方法によって分析して、腫瘍細胞におけるＢＲＣＡ１ポリペプチドの産生を確認するであろう。発現制御因子につなげたＢＲＣＡ１遺伝子のコピーを含み、腫瘍細胞の内側で複製能力を有するウイルスまたはプラスミドベクター(以下のさらなる詳細参照)を調製する。米国特許第5,252,479号およびＰＣＴ国際公開ＷＯ93/07282号に開示のごとき、適当なベクターは公知である。ついで、腫瘍部位に局所的にか、または(他のサイトに転移し得るいずれかの腫瘍細胞に達するために)全身的にかのいずれかでベクターを患者に注射する。トランスフェクト遺伝子が各標的化腫瘍細胞のゲノムに恒久的に取り込まれた場合、該処理を定期的に反復し得る。
【０１６１】
　当該分野で公知である遺伝子移入系は、本発明の遺伝子療法の実施に有用となり得る。これらには、ウイルスおよび非ウイルス移入法が含まれる。ＳＶ４０(Ｍadzakら，1992)、アデノウイルス(Ｂerkner，1992；Ｂerknerら，1988；ＧorzigliaおよびＫapikian，1992；Ｑuantinら，1992；Ｒosenfeldら，1992；Ｗilkinsonら，1992；Ｓtratford-Ｐerricaudetら，1990)、ワクシニアウイルス(Ｍoss，1992)、アデノ関連ウイルス(Ｍuzyczka，1992；Ｏhiら，1992)を含むパポーバウイルス科、ＨＳＶおよびＥＢＶ(Ｍargolskee，1992；Ｊohnsonら，1992；Ｆinkら，1992；ＢreakfieldおよびＧeller，1987；Ｆreeseら，1990)を含むヘルペスウイルス科、ならびにニワトリ(ＢrandyopadhyayおよびＴemin，1984；Ｐetropoulosら，1992)、ネズミ(Ｍiller，1992；Ｍilerら，1985；Ｓorgeら，1984；ＭannおよびＢaltimore，1985；Ｍillerら，1988)およびヒト起源(Ｓhimadaら，1991；Ｈelsethら，1990；Ｐageら，1990；ＢuchschacherおよびＰanganiban，1992)のレトロウイルスを包含する、多数のウイルスが遺伝子移入ベクターとして用いられている。大部分のヒト遺伝子療法プロトコールは、不活化ネズミレトロウイルスに基づいている。
【０１６２】
　当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈(Ｇrahamおよびvan der Ｅb，1973；Ｐellicerら，1980)のごとき化学的技術；例えば、マイクロインジェクション(Ａndersonら，1980；Ｇodonら，1980；Ｂrinsterら，1981；ＣonstantiniおよびＬacy，1981)のごとき機械的方法；リポソームを介した膜融合-介在移入(Ｆelgnerら，1987；ＷangおよびＨaung，1989；Ｋanedaら，1989；Ｓtewartら，1992；Ｎabelら，1990；Ｌimら，1992);ならびに直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体-媒介ＤＮＡ移入(Ｗolffら，1990；Ｗuら，1991；Ｚenkeら，1990；Ｗuら，1989b；Ｗolffら，1991；Ｗagnerら，1990；Ｗagnerら，1991；Ｃottenら，1990；Ｃurielら，1991a；Ｃurielら，1991b)が含まれる。ウイルス-媒介遺伝子移入は、リポソームデリバリーを用いる直接イン・ビボ(in vivo)遺伝子移入と組み合わせることにより、周囲の非分割細胞にではなく、腫瘍細胞にウイルスベクターを指向することができる。別法として、レトロウイルスベクター産生細胞系統を腫瘍に注射し得る(Ｃulverら，1992)。ついで、産生細胞の注射は、ベクター粒子の連続供給源を提供する。この技術は、手術不可能な脳腫瘍を有するヒトにおいて使用することが認可されている。
【０１６３】
　生物および物理学的遺伝子移入法を組み合わせたアプローチにおいては、いずれかのサイズのプラスミドＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン-コンジュゲート抗体と組み合わせ、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合する。ついで、三分子コンプレックスを用いて細胞を感染する。アデノウイルスベクターは、カップル化ＤＮＡが損傷される前に、エンドソームの効率的な結合、内在化および消化を許容する。
【０１６４】
　リポソーム／ＤＮＡコンプレックスは、直接イン・ビボ遺伝子移入を媒介し得ることが示された。標準的なリポソーム調製物において遺伝子移入プロセスは非特異的であるが、例えば、直接イン・サイチュ(in situ)投与後に、局在化イン・ビボ(in vivo)取り込みおよび発現が腫瘍沈着において報告されている(Ｎabel，1992)。ＤＮＡを、乳房組織および卵巣組織(例えば、乳房または卵巣の上皮細胞)にＤＮＡを直接標的化する遺伝子移入技術が好ましい。受容体-媒介遺伝子移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドにＤＮＡ(通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態)をコンジュゲートすることによってなす。リガンドは、標的細胞／組織型の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。１つの適当な受容体／リガンド対には、エストロゲン受容体およびそのリガンド、エストロゲン(およびエストロゲン・アナログ)が含まれ得る。これらのリガンド-ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血液に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮＡ-蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊の問題を克服するため、アデノウイルスとの同時感染を関与させて、エンドソーム機能を崩壊し得る。
【０１６５】
　該療法には、単独または結合して行い得る二工程が含まれる。第一工程においては、ＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子を運ぶ思春期前女性を、彼女達の乳管上皮前駆細胞の幾つかまたは全部が機能正常ＢＲＣＡ１対立遺伝子の少なくとも１つのさらなるコピーを受けるように、遺伝子デリバリービヒクルで処理する。この工程においては、処理した個人は、正常な対立遺伝子が存在することによって感受性対立遺伝子の作用を押しとどめる程度まで低下した乳癌の危険性を有する。予防的な療法の第二工程においては、予め処理した若年女性、特に、提起した遺伝子療法治療を受けた女性をホルモン療法に付して、全期間妊娠の乳房に対する影響を最小限とする。
【０１６６】
使用方法：ペプチド療法
　ＢＲＣＡ１活性を有するペプチドを、突然変異または欠失したＢＲＣＡ１対立遺伝子を運ぶ細胞に提供し得る。ＢＲＣＡ１蛋白質の配列を開示する(配列番号：２)。蛋白質は、例えば、公知の発現ベクターを用いて、細菌中でｃＤＮＡ配列を発現させることによって産生し得る。別法として、ＢＲＣＡ１ポリペプチドは、ＢＲＣＡ１産生-哺乳動物細胞から抽出することもできる。加えて、合成化学の技術を用いて、ＢＲＣＡ１蛋白質を合成することもできる。いずれのかかる技術も、ＢＲＣＡ１蛋白質を含む本発明の調製物を提供し得る。該調製物は、実質的に他のヒト蛋白質を含んでいない。このことは、微生物またはイン・ビトロ(in vitro)の合成によって最も容易になされる。
【０１６７】
　活性ＢＲＣＡ１分子は、マイクロインジェクションによってか、または例えば、リポソームを使用することによって細胞に導入し得る。別法として、能動的または拡散によって、ある種の活性分子が細胞によって取り込まれ得る。ＢＲＣＡ１遺伝子産物の細胞外適用は、腫瘍増殖に十分に影響し得る。ＢＲＣＡ１活性を有する分子の適用は、新生生物状態の部分的逆転に通じるにちがいばい。ＢＲＣＡ１活性を有する他の分子(例えば、ペプチド、薬剤または有機化合物)を用いてもかかる逆転に影響し得る。実質的に同様の機能を有する修飾ペプチドも、ペプチド療法に用いられる。
【０１６８】
使用方法：形質転換宿主
　同様にして、突然変異ＢＲＣＡ１対立遺伝子を運ぶ細胞および動物をモデル系として用いて、治療剤としての潜在性を有する物質について実験および試験し得る。細胞は、典型的には、培養上皮細胞である。これらは、体細胞または生殖系列のいずれかのＢＲＣＡ１突然変異を有する個人から単離し得る。別法として、該細胞系統を設計して、前記したごとく、ＢＲＣＡ１対立遺伝子中に突然変異を運ばせ得る。試験物質を該細胞に適用した後、該細胞の新生生物的に形質転換した表現型を測定する。アンカレッジ・インディペンデント増殖、ヌードマウスにおける腫瘍形成性、細胞の非侵入性、および増殖因子依存性を包含する、新生生物的に形質転換した細胞のいずれの特色も評価し得る。これらの各特色のアッセイは、当該分野で知られている。
【０１６９】
　治療剤を試験する動物は、全体動物の突然変異誘発後または生殖系統細胞または接合体の処理後に選択し得る。かかる処理には、通常は、第二動物種からの突然変異ＢＲＣＡ１対立遺伝子の挿入、ならびに、破壊した相同遺伝子の挿入が含まれる。別法として、動物の内在性ＢＲＣＡ１遺伝子(群)は、挿入または欠失突然変異または従来技術を用いた他の遺伝的変化によって破壊し得る(Ｃapecchi，1989；ＶalanciusおよびＳmithies，1991；Ｈastyら，1991；Ｓhinkaiら，1992；Ｍombaertsら，1992；Ｐhilpottら，1992；Ｓnouwaertら，1992；Ｄonehowerら，1992)。試験物質を動物に投与した後に、腫瘍の増殖を評価しなければならない。試験物質が腫瘍の増殖を防ぐか、または抑制した場合には、該試験物質は、本明細書にて同定した癌の治療の候補治療剤である。これらの動物モデルは、潜在的な治療製品に極めて重要な試験ビヒクルを提供する。
【０１７０】
　本発明を以下の実施例に参照することにより記載するが、これは説明目的で供するものであって、いかなる場合においても本発明を限定するものではない。当該分野でよく知られている標準技術、または以下に特別に記載する技術を利用した。
【実施例】
【０１７１】
　　　　　　　　　　　　　　　　実施例１
　１７ｑ−連鎖乳癌感受性遺伝子座を有するような確認家系および実験家系
　　広範な癌に罹り易い家系は、多くのケースの乳癌を持つ広範な家系および実験に利用できる血縁者の大きな一組を供する、はっきりとした集団から確認した。これらの大家系に存在する非常に多数の減数分裂は、ＢＲＣＡ１遺伝子座が分離しつつあるの否かを検出する能力を供し、調査すべき小領域内に起こる情報的組換え体についての機会を減少させた。これは、ＢＲＣＡ１領域への連鎖を確立する機会を大いに改良し、ＢＲＣＡ１領域の取り扱い易いサイズへの縮小を容易とし、ＢＲＣＡ１遺伝子座自体の同定を可能とする。
【０１７２】
　各家系を、すべての利用可能な関連血縁者を通じて、各発端者または癌ケースのすべての情報的一親等血縁者まで拡大した。これらの家系については、さらなる乳癌ケース、および該家系で現れた注目する他の部位（例えば、卵巣）に癌を持つ個人を、腫瘍登録関連ファイルを通じて捜し当てた。ユタ州癌登録で確認されなかった家系で報告されているすべての乳癌を調査した。医学記録または死亡証明書を、すべての癌の確認のために入手した。ＤＮＡを抽出した血液試料を供することによって、各鍵となる個人およびすべての情報的個人を参加させた。また、我々は、故人ケースの遺伝子型がその血縁者の遺伝子型から推定できるように、故人ケースの配偶者および血縁者からサンプリングした。
【０１７３】
　推定できる遺伝子型を持つ３以上の癌ケースを有する１０の家系を、増殖性乳病および乳癌の研究用の関連データベータから元々は確認された２９家系の組からの１７ｑマーカーに対する連鎖実験のために選択した（Skolnickら、1990）。これらの家系の選択の基準は、乳癌を持つ２人の姉妹または母親および彼女の娘の存在であった。さらに、１９８０年以来我々の乳癌連鎖研究の一部として研究してきた２の家系（Ｋ１００１、Ｋ９０１８）、乳癌および／または卵巣癌のクラスターの存在についての関連データベースから確認した６の家系（Ｋ２０１９、Ｋ２０７３、Ｋ２０７９、Ｋ２０８０、Ｋ２０３９、Ｋ２０８２）および早期開始乳癌を持つ自己推定家系（Ｋ２０３５）を含めた。これらの家系を調査し、前記したように我々の臨床で拡大させた。表１は、引き続いての実施例の主題であるこれらの１９家系の特徴を示す。表１では、各家系につき、我々のデータベースにおける個人の合計数、タイプ分けした個人の数、および乳房／卵巣癌の診断時の最小、メジアンおよび最大年齢を報告する。乳癌の診断時のメジアン年齢が増加する順に家系を分類する。卵巣および乳癌双方と診断された４人の婦人は両方のカテゴリーに数える。
【０１７４】
【表１】
2004135687.tif 000003
【０１７５】
　　　　　　　　　　　　　　　　実施例２
　染色体１７ｑに連鎖した家系の選択およびインターバルＭｆｄ１５−Ｍｆｄ１８８へのＢＲＣＡ１の位置決め
　これらの１９の家系で収集した各試料につき、標準的な実験プロトコルを用いて、血液（２のケースでは、パラフィン包埋組織ブロック）からＤＮＡを抽出した。この実験における遺伝子型決定は、短い縦列反復（ＳＴＲ）マーカーに制限した。というのは、一般に、これらは高ヘテロ接合性を有し、ＰＣＲ法は非常に少量のＤＮＡを使用しつつ、迅速な回転を供するからである。この努力を助力するために、ＣＡ陽性クローン用の染色体特異的コスミドライブラリーをスクリーニングすることによって、染色体１７上の４つのかかるＳＴＲマーカーを開発した。これらのマーカーのうち３つが長腕：（４６Ｅ６．Eastonら、1993)；（４２Ｄ６、Eastonら、1993)；２６Ｃ２（Ｄ１７Ｓ５１４、Oliphantら、1991）に位置決定され、他方、外のもの１２Ｇ６（Ｄ１７Ｓ５１３、Oliphantら、1991)は、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子座近くの短腕に位置決定された。これらのうち２つの４２Ｄ６および４６Ｅ６を、全世界の研究者による乳癌家族のタイプ分けのためにBreast Cancer Linkage Consortiumに提出した。我々の研究所で開発したのではないマーカーについてのオリゴヌクレオチド配列は、発表された報告から、あるいはBreast　Cancer　Linkage　Consortiumの一部として、あるいは他の研究者から入手した。
【０１７６】
　すべての遺伝子型決定フィルムは、対立遺伝子の一貫したコード付けを維持するのに使用される標準的なレーンマーカーで、盲検によりスコアを取った。ここに示す４つの家系における鍵となる試料は、すべての関連マーカーにつき二連でタイプ分けした。すべての１９の家系は、２の多形ＣＡ反復マーカー：４２Ｄ６（Ｄ１７Ｓ５８８）、我々の研究所で単離されたＣＡ反復、およびＭｄｆ１５（Ｄ１７Ｓ２５０）、J. Weber (Weberら、1990)によって供されたＣＡ反復につき、タイプ分けをした。いくつかの入手源からのプローブを用いて、染色体１７上、特に染色体１７コスミド上に遺伝マーカーを創製し、Los Alamos National Laboratories (van Dillaら、1986)による分類された染色体からラムダファージライブラリーを作製した。
【０１７７】
　これらの２つのマーカー（４２Ｄ６、Ｍｆｄ１５）およびこれらの２のマーカーの間に概略位置決定された第３のマーカーＭｆｄ１８８（Ｄ１７Ｓ５７９、Hallら、1992）を持つ各家系についてのＬＯＤスコアは、組換え分率の２つの値０.００１および０.１につき計算した。（ＬＯＤスコアの計算については、Oh,1985参照）。尤度は、Clausら，1991によって導かれたモデルで計算したが、これは、０.００３の見積もった遺伝子頻度、約０.８０の遺伝子キャリアにおける一生の危険、および非遺伝子キャリアにおける乳癌についての集団ベースの年齢特異的危険を推定するものである。ＬＯＤスコア計算で用いる３つのマーカーについての対立遺伝子頻度は、ＣＥＰＨパネル（WhiteおよびLalouel、1988)における非血縁個人の我々自身の研究所でのタイプ分けから計算した。表２は、３つのマーカー４２Ｄ６、Ｍｆｄ１８８、およびＭｆｄ１５を持つ各家系の対での連鎖分析の結果を示す。
【０１７８】
【表２】
2004135687.tif 000004
【０１７９】
　ＣＡＳＨモデル（Clausら、1991)下、少なくとも１つの遺伝子座につきＬＯＤスコア＞１.０の１７ｑの連鎖についての基準を用いると、１９の家系のうち４つが１７ｑに連鎖しているようであった（Ｋ１９０１、Ｋ１９２５、Ｋ２０３５、Ｋ２０８２）。多数のさらなる家系は、いくらかの連鎖の証拠を示したが、この時点では連鎖カテゴリーに明確に帰属させることはできなかった。これらは、家系Ｋ１９１１、Ｋ２０７３、Ｋ２０３９およびＫ２０８０を含むものであった。１７ｑ−連鎖家系のうち３つはこの領域で情報的組換え体を有し、これらを後記にて詳述する。
【０１８０】
　家系２０８２は、いくつかのグループによって現在報告されている最大の１７ｑ連鎖乳癌家族である。該家系は２０ケースの乳癌、および１０ケースの卵巣癌を持つ。２のケースは、卵巣癌および乳癌を持つ。この家族について１７ｑへの連鎖の証拠は圧倒的である：散在的であるような乳癌の３ケースの存在に拘わらず、連鎖したハプロタイプを持つＬＯＤスコアは６.０を超える。すなわち、これらのケースは、Ｍｆｄ１５および４２Ｄ６の間に連鎖したハプロタイプの一部を共には有しない。これらの３つの散在ケースは、年齢４６、４７および５４歳にて乳癌を持つと診断された。より小さい家系では、このタイプの散在的癌は、連鎖の分析および鍵となる組換え体の正しい同定を大いに混乱させる。２０８２家系における鍵となる組換え体は、その母親および伯母が各々５８歳および６６歳の年齢で卵巣癌となった４５歳で卵巣癌を発病した婦人である。彼女は、Ｍｆｄ１５における非連鎖対立遺伝子を受け継ぎつつ、Ｍｆｄ１８８および４２Ｄ６双方についてのハプロタイプの連鎖した一部を受け継いだ；この組換え事象により、はＢＲＣＡ１はＭｆｄ１５に対して末端側に位置決定された。
【０１８１】
　Ｋ１９０１は、早期開始乳癌家系の典型的なものである。該家系は１０ケースの乳癌を持ち、４３.５齢のメジアン断時年齢を持つ；４ケースは４０歳前に診断された。マーカー４２Ｄ６でのこの家系についてのＬＯＤスコアは１.５であり、その結果、０.９６の１７ｑ−連鎖の事後確率である。この家系でハプロタイプを調査すると、真性な男性キャリアおよび４５歳で乳癌を持つと診断された彼の罹患娘において組換えハプロタイプが同定された。マーカーＭｆｄ１５についてのそれらの連鎖対立遺伝子は、（彼女の子供から完全には推定できなかった１のケースを除き）該家系におけるすべての他のケースで見いだされるものとは異なる。２つのハプロタイプはＭｆｄ１８８および４２Ｄ６につき同一である。従って、家系１９０１からのデータによってもＢＲＣＡ１遺伝子座はＭｆｄ１５に対して末端側に位置決定される。
【０１８２】
　家系２０３５は、病気の表現型において、Ｋ１９０１と同様である。この家系における乳癌の８ケースについてのメジアン診断年齢は３７歳である。１のケースは６０歳で卵巣癌も有していた。この家族における乳癌ケースは、共に８０歳代におけるその死亡まで共に乳癌に罹らなかった２人の姉妹から受け継いだものにある。各分家は４ケースの乳癌を持ち、顕著な早期開始を有する各分家には少なくとも１のケースがあった。この家系はＭｆｄ１５につき２.３４のＬＯＤスコアを有する。２の分家において乳癌を分離しているハプロタイプはＭｆｄ１５において同一の対立遺伝子を共に有するが、末端側遺伝子座Ｍｆｄ１８８およびＮＭ２３（４２Ｄ６に対して丁度末端側に位置する集団（consortium）の一部としてタイプ分けされたマーカー）については異なる。２のハプロタイプはマーカー４２Ｄ６については一致するにも拘わらず、対立遺伝子は、血統によって同一（共通の先祖に由来する）というよりも、状態によって同一に共有されたものである（同一の対立遺伝子であるが、異なる先祖に由来する）。というのは、共有された対立遺伝子はこの遺伝子座で観察された第２の最も普通の対立遺伝子だからである。対照的に、Ｍｆｄ１５で共有された連鎖対立遺伝子は０.０４の頻度を有する。これは、我々のデータベースでは鍵となる組換え体である。というのは、それは、ＢＲＣＡ１がハプロタイプの基部側で分離する唯一の組換えであり、かくして、ＢＲＣＡ１領域と境界を接する末端を供するからである。この事象については、鍵となる組換えではないことには、家系の両分家において乳癌につき分離する稀なＭｆｄ１５対立遺伝子も共に有する家系に嫁いだ妻に第２の突然変異体ＢＲＣＡ１遺伝子が存在することを要する。この事象は１０００分の１未満の確率を有する。従って、この家系からの証拠により、Ｍｆｄ１８８に対してＢＲＣＡ１遺伝子座は基部側に位置決定された。
【０１８３】
　　　　　　　　　　　　　　　　実施例３
　微細構造地図の作成およびさらなるＳＴＲ多形を用いるＭｆｄ１９１−Ｍｆｄ１８８に対するおよびＢＲＣＡ１領域の精密決定
　我々の組換え体の特徴付けを改良し、フランキングマーカーを明確とするためには、染色体１７ｑ上のこの比較的小さな領域の密な地図が必要であった。染色体１７の研究により、遺伝的および物理的マッピング実験（Fain,1992)の組合せに基づき、この領域のコンセンサス地図を作成した（図１）。この地図は、高度に多形のＳＴＲ多形、および多数の多形的発現遺伝子を共に含有する。この地図はこの順序についての証拠につき詳細を与えず、また隣接遺伝子座の順序における逆転についての局所的支持のいずれの測定も与えなかったので、我々は、それを、新しいマーカーの開発で使用すべき源およびＢＲＣＡ１を含有する小領域の我々の詳細な遺伝地図および物理的地図の作成を得るための粗いガイドとして総括した。我々のアプローチは、他の研究者によって提供された現行ＳＴＲマーカー、およびＣＥＰＨ関連家族からのＤＮＡを用いて同定された減数分裂の（遺伝的）分裂中止点のパネルおよびこの領域につき構築された体細胞細胞ハイブリッド（物理的分裂中止点）のパネル双方に関し我々の研究所から新しく開発されたすべてのマーカーを分析することであった。これらのマーカーは、Ｍｆｄ１５、Ｍｆｄ１９１（James Weberによって提供)、ＴＨＲＡ１（Futrealら、1992a)、およびDonald Black博士によって提供された３つの多形、ＮＭ２３（Hallら、1992）、ＳＣＧ４０（Ｄ１７Ｓ１８１）、および６Ｃ１（Ｄ１７Ｓ２９３）に対して基部側にマップされる、我々の研究所で開発された２６Ｃ２を含むものであった。
【０１８４】
　マーカーの遺伝子位置決定
　注目する領域内の新しいマーカーを遺伝子的に位置決定するために、我々は、ＣＥＰＨ文献パネルにおける、および我々の大きい乳癌家系（Ｋ２０８２）における、領域内の多数の鍵となる減数分裂分裂中止点を同定した。もしこの領域において小さな遺伝子距離があれば、それらは、この目的で使用できる比較的小さい組の組換え体であるに過ぎないらしく、また、それらは、組にグループ分けできるマーカーのようである。各組内におけるマーカーの順序は物理的マッピングによってのみ決定できる。しかしながら、新しいマーカーを位置決定するのに必要な遺伝子型決定の数は最小化される。これらの分裂中止点は表３および４に示す。このアプローチを用い、我々は、マーカーＴＨＲＡ１、６Ｃ１、ＳＣＧ４０およびＭｆｄ１９１を遺伝子的に順序付けることができた。表３および４から分かるように、ＴＨＲＡ１およびＭｆｄ１９１は共に、ＢＲＣＡ１遺伝子座を含有すると我々が従前に確認したＭｆｄ１５−Ｍｆｄ１８８領域の内側をマップする。表３および４において、Ｍ／Ｐは、母親または親の組換え体を示す。「１」は、遺伝された対立遺伝子は祖父起源であって、他方、「０」は祖母起源であり、「−」は該遺伝子座がタイプ分けされていないかまたは非情報的であることを示す。
【０１８５】
【表３】
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【０１８６】
【表４】
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【０１８７】
　我々の組換え体家族におけるマーカーＭｆｄ１５、Ｍｆｄ１８８、Ｍｆｄ１９１およびＴＨＲＡ１の分析
　Ｍｆｄ１５、Ｍｆｄ１８８、Ｍｆｄ１９１およびＴＨＲＡ１を我々の組換え体家族においてタイプ分けし、ＢＲＣＡ１遺伝子座を位置決定するためのさらなる情報につき調べた。家系１９０１において、Ｍｆｄ１５組換え体はＴＨＲＡ１についての組換え体であるが、Ｍｆｄ１９１については非情報的であり、かくして、ＢＲＣＡ１をＴＨＲＡ１に対して末端側に位置決定する。Ｋ２０８２において、Ｍｆｄ１５に関する組換え体はＭｆｄ１９１に関する組換え体でもあり、かくして、ＢＲＣＡ１遺伝子座をＭｆｄ１９１に対して末端側に位置決定する（Goldgarら、1994)。家系Ｋ２０３５におけるＴＨＲＡ１およびＭｆｄ１９１の調査からは、さらなる位置決定情報は得られなかった。というのは、２の分家は両マーカーにつき一致したからである。しかしながら、ＳＣＧ４０および６Ｃ１は共にＭｆｄ１８８と同一のパターンを呈し、かくして、この家族におけるＭｆｄ１８８組換え体によって提供された位置決定情報における我々の信頼性を増大させる。ＢＲＣＡ１遺伝子座、または少なくともその一部は、従って、基部側のＭｆｄ１９１および末端側のＭｆｄ１８８と境界を接するインターバル内にある。
【０１８８】
　　　　　　　　　　　　　　　　実施例４
　注目する領域における遺伝子的および物理的源の開発
　Ｍｆｄ１９１−Ｍｆｄ１８８領域における高度に多形の遺伝子座の数を増加させるために、我々は、該領域に物理的にマップされるコスミドおよびＹＡＣから、我々の研究所で多数のＳＴＲマーカーを開発した。これらのマーカーにより我々は該領域をさらに精密決定できた。
　ＳＴＲ、はこれらの遺伝子座を含有し、次いでこれを用いて、コスミドＰ１またはＢＡＣにおいてサブクローンを同定するＹＡＣを同定するための所望の領域にあることが知られている遺伝子から同定した。次いで、これらのサブクローンを、（ＣＡ）ｎオリゴヌクレオチド（Pharmacia)を用いてＣＡ縦列反復の存在につきスクリーニングした。強力なシグナルを持つクローンを優先的に選択した。というのは、それらは、非常に多数の反復および／または（ＣＡ）ｎパターンに対するほとんど完全な正確さを有するＣＡ−反復を表すようだからである。これらの特徴は、共に、多形の確率を高めることが知られている（Weber, 1990）。これらのクローンをベクターから直接的に配列決定して、該反復の位置を決定した。我々は、（ＧＴ）１０ＴのごときＣＡ−反復の末端に相補的な可能なプライマーの組のうち１つを用いることによって、ＣＡ−反復の一方側のユニークな配列を得た。このユニーク配列に基づき、プライマーを、他の方向において反復を逆に横切る配列を作成し、ＣＡ−反復に隣接する第２のプライマーの設計用のユニーク配列を得た。次いで、ＳＴＲを、無関係個人の小群についての多形につきスクリーニングし、ハイブリッドパネルに対してテストして、それの物理的位置を確認した。これらの基準を満たす新しいマーカーを、ユタ州およびＣＥＰＨ家族からの４０の無関係個人の組においてタイプ分けして、実験集団に適する対立遺伝子頻度を得た。本研究で報告する他のマーカーの多くを、ＣＥＰＨ無関係個人の小群でテストして、同様に適する対立遺伝子頻度を得た。
【０１８９】
　前記手法を用い、合計８の多形ＳＴＲがこれらのＹＡＣＳから見い出された。このようにして同一の遺伝子座のうち、４つが、共に多形であってＢＲＣＡ１領域に対して位置決定された。４つのマーカーは染色体１７に位置決定されず、使用したＹＡＣのキメラ的性質を反映する。該領域にあった４つのマーカーをＡＡ１、ＥＤ２、４−７およびＹＭ２９と命名した。ＡＡ１およびＥＤ２はＲＮＵ２遺伝子につき陽性のＹＡＣから開発し、４−７はＥＰＢ３　ＹＡＣから、ＹＭ２９はハイブリッドパネルによって該領域に位置決定されたコスミドから開発した。乳癌家系で分析した対立遺伝子の数、ヘテロ接合性およびこれらの４つのおよびすべての他のＳＴＲ多形の源の記載を表５に後記する。
【０１９０】
【表５】
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【０１９１】
　物理的に該領域にマップされた４つのＳＴＲ多形（４−７、ＥＤ２、ＡＡ１、ＹＭ２９）を減数分裂で分析し、分裂中止点パネルを表３および４に示した。表６および７は、これらの４つのマーカーの位置決定についての関連するＣＥＰＨデータおよび家系２０８２データを含む。表において、Ｍ／Ｐは母系または父系組換え体を示す。「１」は、引き継がれた対立遺伝子が祖父系起源のものであることを示し、他方、「０」は祖母系起源を示し、「−」は該遺伝子座がタイプ分けされていないか、または非情報的であることを示す。
【０１９２】
【表６】
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【０１９３】
【表７】
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【０１９４】
　ＣＥＰＨ１３３３−０４から、我々は、ＡＡ１およびＹＭ２９がＭｆｄ１９１に対して末端側に位置するに違いないと見る。１３２９２より、ＡＡ１およびＥＤ２は共に４−７、ＹＭ２９およびＭｆｄ１８８に対して基部側であると推定できる。Ｋ２０８２で見い出された組換え体はいくつかのさらなる順序付けの情報を提供する。３つの独立した観察（個人番号２２、４０および６３）には、ＡＡ１、ＥＤ２、４−７、およびＹＭ２９、およびＭｆ１８８はＭｆｄ１９１に対して末端側に位置決定され、他方、ＩＤ１２５により、４−７、ＹＭ２９、およびＭｆｄ１８８はＳＧＣ４０に対して基部側に位置決定される。マーカーＡＡ１／ＥＤ２および４−７／ＹＭ２９／Ｍｆｄ１８８の２つのクラスター内における相対的順序付けについての遺伝的情報は遺伝子組み換え分析からは得られなかった。インタースティシャル・ヒトＤＮＡの小片が失われているらしい「ホール」を含有することが知られているハイブリッドに関する遺伝子座の順序付けは疑わしいが、ハイブリッドパターンは４−７がＹＭ２９およびＭｆｄ１８８の上方に存在することを示す。
【０１９５】
　　　　　　　　　　　　　　　　実施例５
　マーカーＡＡ１、４−７、ＥＤ２およびＹＭ２９での乳癌家系の遺伝的分析
　前記にて議論した鍵となる組換え体を含有する３つの家系以外に、家系２０３９は、新しく開発されたＳＴＲマーカーの分析を通じて、当該領域に連鎖し、有用な組換え体を含有することが示された。
【０１９６】
　表８は、各遺伝子座における特異的マーカー対立遺伝子およびその各頻度によって家系のハプロタイプ（コドン形で示す）を明らかにする。表８では、対立遺伝子は頻度が低下する順序でリストし；各遺伝子座についての対立遺伝子１−５の頻度を表５に示す。ＨをコードするハプロタイプはＢＲＣＡ１関連ハプロタイプであり、Ｐは部分的Ｈハプロタイプを示し、Ｒは観測可能な組換えハプロタイプを示す。表８で明らかなごとく、すべての家系がすべてのマーカーにつきタイプ分けされたのではなく、特に家系Ｋ２０８２において、家系のうちすべての個人が同一組のマーカーにつきタイプ分けされたのではない。１の例外があるが、罹患したまたは危険な家系構成員から受け継がれたハプロタイプのみを示し；該家系と結婚した配偶者からのハプロタイプは記載しない。かくして、与えられた兄弟姉妹では、ハプロタイプＸおよびＹの様子は、罹患した／危険な個人からの両ハプロタイプが観察され、いずれも乳癌関連ハプロタイプではなかった。
【０１９７】
【表８】
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【０１９８】
　家系Ｋ１９０１において、新しいマーカーは乳癌感受性を持つ観察可能な組換え体を示さず、これは、この家系における組換え事象がＴＨＲＡ１およびＥＤ２間で最も起こるらしいことを示す。かくして、この家系で４つの新しいマーカーを調べたことに基づいて、新しいＢＲＣＡ１位置決定情報は得られなかった。家系２０８２において、鍵となる組換え体個人はＥＤ２、４−７、ＡＡ１、およびＹＭ２９につき連鎖した対立遺伝子を引き継ぎ、これはｔｄｊ１４７４についての組換え体であり、これは、組換え事象がｔｄｊ１４７４およびＥＤ２／ＡＡ１の間でこの個人で起こったことを示す。
【０１９９】
　表８に示す家系Ｋ２０３５、Ｈ１、Ｈ２およびＲ２には注目する３つのハプロタイプがある。Ｈ１は４ケースおよび個人１７からの１の真性な男性キャリア承継者に存在し、他方、Ｈ２は２ケースおよび個人１０の承継者における２の真性な男性キャリアに存在する。Ｒ２はＭｆｄ１５およびＳＣＧ４０の間のおよびそれを含めた遺伝子座につきＨ２と同一であるが、ＳＣＧ４０と４２Ｄ６との間で組換え体を有する。我々は、ＢＲＣＡ１が４２Ｄ６に対して基部側にあることを確立したので、このＨ２／Ｒ２差異はさらなる位置決め情報を付加しない。Ｈ１およびＲ２はＭｆｄ１５、ＴＨＲＡ１、ＡＡ１およびＥＤ２において同一の対立遺伝子を共に有するが、ＥＤ２に対して末端側と推定される遺伝子座、すなわち４−７、Ｍｆｄ１８８、ＳＣＧ４０および６Ｃ１につき異なる。２のハプロタイプはマーカーＹＭ２９（４−７およびＭｆｄ１８８の間に物理的にマップされるマーカー）にて第５番目の対立遺伝子につき一致するにも拘わらず、該対立遺伝子は血統により同一に保有されているというよりも状態により同一に保有されているようである。というのは、この対立遺伝子はこの遺伝子座で最も普通の対立遺伝子であり、ＣＥＰＨ親における推定頻度は０.４２だからである。対照的に、Ｍｆｄ１５およびＥＤ２遺伝子座で共に保有された連鎖対立遺伝子は各々０.０４および０.０９の頻度を有する。また、それらは、Ｍｆｄ１９１において（頻度＝０.５２）、ＴＨＲＡ１、およびＡＡ１（頻度＝０.２８）においてより普通の対立遺伝子を保有する。これは該組における鍵となる組換え体である。というのは、それは乳癌がハプロタイプの基部の部分に関して分離している唯一の組換え体であり、かくして、末端側境界を決めるからである。従って、この家系からの証拠により、ＢＲＣＡ１遺伝子座は４−７の基部側に位置決定される。
【０２００】
　ＢＲＣＡ１をｔｄｊ１４７４の末端側に位置決めする家系２０８２における組換え事象は、直接的に推定できる記載した４つの事象のうちの１つだけである；すなわち、罹患母親の遺伝子型は彼女の配偶者および子孫から推定でき、組換えハプロタイプは彼女の罹患娘で観察できる。この家族において、ＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子を担う罹患個人に有利な可能性は極めて高い；データの唯一の可能な解釈は、ＢＲＣＡ１がＭｆｄ１９１の末端側にあるというものであり、あるいは表明された組換え体が４４歳の卵巣癌の散在ケースであるというものである。直接的に観察可能なまたは推定された組換え体というよりも、家系２０３３の解釈は、該家系の異なったかつ時々は遠い関連分家で分離する、区別される１７ｑ−ハプロタイプの観察に依存する。これらのハプロタイプの一部はいくつかのマーカーにつき共通する対立遺伝子を有し、他方、それらは、他のマーカーにおいて、共有された領域にＢＲＣＡ１遺伝子座を位置決めする。この位置決めの信頼性は、いくつかの因子；各ハプロタイプを担う個人間の関係、共有された対立遺伝子の頻度、ハプロタイプがＢＲＣＡ１遺伝子座に関して分離することが示された確実性、およびハプロタイプを決定する領域におけるマーカーの密度に依存する。家系２０３５の場合では、２つの分家が密接に関係しており、各分家は各ハプロタイプを担う多数の早期開始ケースを有する。共有された対立遺伝子のうち２つは共通である（Ｍｆｄ１９１、ＴＨＲＡ１）一方、Ｍｆｄ１５、ＡＡ１、およびＥＤ２における共有された対立遺伝子の推定頻度は各々０.０４、０.２８および０.０９である。従って、これらの対立遺伝子は、状態によって同一である（同一対立遺伝子であるが一般的集団に由来）というよりも、血統によって同一である（共通の先祖に由来）。
【０２０１】
　　　　　　　　　　　　　　　　実施例６
　精密な物理的マッピング研究は、ｔｄｊ１４７４およびＵ５Ｒが挟み隣接する領域にＢＲＣＡ１を位置付ける。
　１９９０年における染色体１７ｑへの最初の位置決定（Hallら、1990)以来、効果的な位置クローニング戦略の手段を可能として当該遺伝子を単離するのに十分な位小さな領域にＢＲＣＡ１遺伝子を位置決めするのに多大の努力がなされてきた。世界的に収集した２１４家族よりなる共同性Breast Cancer Linkage Consortiumデータベースにおいて、多点連鎖分析（multipoint linkage analysis）（Eastonら、1993)によって、まずＢＲＣＡ１遺伝子座がインターバルＭｆｄ１５（Ｄ１７Ｓ２５０）−４２Ｄ６（Ｄ１７Ｓ５８８）に位置決定された。引き続いての精密な位置決めは、特定の家族における個人の組換え事象に基づくものであった。領域ＴＨＲＡ１−Ｄ１７Ｓ１８３はBowcockら、1993によって明確化され；領域ＴＨＲＡ１−Ｄ１７Ｓ２８はSimardら、1993によって明確化された。
【０２０２】
　我々は、さらに、ＢＲＣＡ１遺伝子座はマーカーＭｆｄ１９１（Ｄ１７Ｓ７７６）に対して末端側に存在しなければならないことを示した（Goldgarら、1994)。このマーカーはＴＨＲＡ１およびＲＡＲＡに対して末端側に存在することが知られている。ＢＲＣＡ１遺伝子座についての最小の公表されている領域は、かくして、Ｄ１７Ｓ７７６とＤ１７Ｓ７８との間にある。この領域は、約１５０万塩基のＤＮＡを依然含有し、該領域におけるすべての遺伝子の単離およびテストを非常に困難な仕事としている。我々は、従って、該領域の物理的な地図を構築し、該領域に位置する多形ＳＴＲマーカーの組を単離し、情報的家族の組におけるこれらの新しいマーカーを分析する仕事を行って、取り扱えるインターバルへのＢＲＣＡ１遺伝子の位置決めの精度を上げた。
【０２０３】
　４つの家族が、位置クローニング戦略の適用のための十分に小さな領域へのＢＲＣＡ１の位置決めについての重要な情報的遺伝的証拠を提供する。２つの家族（Ｋ２０８２、Ｋ１９０１）は、ＢＲＣＡ１についての基部側境界に関するデータを提供し、他の２つ（Ｋ２０３５、Ｋ１８１３）は末端側境界を定める。これらの家族を後記にて詳述する。ＰＣＲによってアッセイできる合計１５の短鎖縦列反復マーカーを用いて、研究した家族におけるこの位置決定の精度を上げた。これらのマーカーはＤＳ１７Ｓ７６５４、ＤＳ１７Ｓ９７５、ｔｇｊ１４７４およびｔｇｊ１２３９を含む。これらのマーカー用のプライマー配列は配列番号３に、ＤＳ１７Ｓ７５４については配列番号４に、ＤＳ１７Ｓ９７５については配列番号５および配列番号６に、ｔｇｊ１４７４については配列番号７および配列番号８に、ｔｇｊ１２３９については配列番号９および配列番号１０に供する。
【０２０４】
　家系２０８２
　家系２０８２は現在までに研究された最大のＢＲＣＡ１−連鎖乳癌／卵巣癌家族である。それは、８.６のＬＯＤスコアを有し、１７ｑ連鎖についての明白な証拠を提供する。この家族は従前に記載されており、ＢＲＣＡ１をＭＦＤ１９１（Ｄ１７Ｓ７７６）の末端側に位置決めする臨界的組換え体を含有することが示されている。この組換え体は、その母親が６３歳で卵巣癌を有した４５歳で卵巣癌と診断された婦人で起こった。罹患した母親は他界し；しかしながら、彼女の子供から、彼女はＭｆｄ１５およびＭｆｄ１８８の間の領域において家族の３０の他のケースに存在する連鎖ハプロタイプを有すると推定できた。彼女の罹患した娘は遺伝子座ＥＤ２，４−７およびＭｆｄ１８８において連鎖対立遺伝子を受け継いだが、Ｍｆｄ１５およびＭｆｄ１９１における非−ＢＲＣＡ１染色体上の対立遺伝子を受け継いだ。この組換え分裂中止点をさらに位置付けするために、我々は物理的マッピング源に由来する以下のマーカーにつき、その家族の鍵となる構成員をテストした：ｔｄｊ１４７４、ｔｄｊ１２３９、ＣＦ４、Ｄ１７Ｓ８５５。マーカーｔｄｊ１４７４およびＣＦ４については、罹患娘は連鎖対立遺伝子を受け継がなかった。しかしながら、ＳＴＲ遺伝子座ｔｄｊ１２３９については、該母親は情報的であって、彼女の娘はＢＲＣＡ１関連対立遺伝子を受け継いだと推定できた。Ｄ１７Ｓ８５５はこの家族では情報的でなかった。この分析に基づき、順序は１７ｑ動原体−Ｍｆｄ１９１−１７ＨＳＤ−ＣＦ４−ｔｄｊ１４７４−ｔｄｊ１２３９−Ｄ１７Ｓ８５５−ＥＤ２−４−７−Ｍｆｄ１８８−１７ｑテロメアである。従って、前記した組換え体はＢＲＣＡ１をｔｄｊ１４７４に対して末端側に位置付け、分裂中止点はｔｄｊ１４７５とｔｄｊ１２３９との間のインターバルに位置付けた。ｔｄｊ１４７４に対して末端側に位置付けられるＢＲＣＡ１のもの以外のこの家族におけるデータについての唯一の別の説明は、組換え体個人に存在する卵巣癌はＢＲＣＡ１遺伝子とは独立した理由によって引き起こされるというものである。５０歳前に診断される卵巣癌が稀だとしたら、この別の解釈は全くありそうにもない。
【０２０５】
　家系１９０１
　家系１９０１は、７ケースが５０歳前に乳癌と診断され、そのうち４ケースが４０歳前に診断された早期開始乳癌家族である。さらに、５０歳および７０歳の間に乳癌と診断された３ケースがあった。乳癌の１ケースは、６１歳における卵巣癌も有していた。この家族は、現在、Ｄ１７Ｓ８５５につき１.５のＬＯＤスコアを有する。この連鎖証拠および少なくとも１つの卵巣眼ケースの存在が与えられれば、この家族は０.９９を超えるＢＲＤＡ１による事後確率を有する。この家族では、組換えは、それから他のケースの大部分に遺伝した卵巣癌ケースの兄弟である個人が該家族における他のケースと共分離するハプロタイプの一部を共に有するという事実に由来する。しかしながら、彼はこの部分的ハプロタイプを彼の娘に渡し、彼女は４４歳で乳癌を発病した。もしこのケースがＢＲＤＡ１遺伝子によるものならば、この兄弟および彼の姉妹の間で共有されたハプロタイプの一部のみがＢＲＤＡ１遺伝子を含有できる。この種の情報の解釈の困難性は、共有されていないマーカー、従って、組換え体を確認することはできるが、一致するマーカーは、それらが非組換え体であるゆえに、あるいはそれらの親がホモ接合体であったゆえに共有されているであろうということである。親の遺伝子型データがなければ、これらの別解釈を区別できない。Ｋ１９０１におけるハプロタイプに鑑みると、彼はＭｆｄ１５（Ｄ１７Ｓ２５０）、ＴＨＲＡ１、ＣＦ４（Ｓ１７Ｓ１３２０）、およびｔｄｊ１４７４（１７Ｓ１３２１）において連鎖対立遺伝子を共に有していないことが示される。彼はＭｆｄ１９１（Ｄ１７Ｓ７７６）、ＥＤ２（Ｓ１７Ｓ１３２７）、ｔｄｊ１２３９（Ｄ１７Ｓ１３２８）およびＭｆｄ１８８（Ｄ１７Ｓ５７９）において連鎖対立遺伝子を共に有している。Ｍｆｄ１９１で共有された対立遺伝子は比較的稀（０.０７）であるにも拘わらず、我々は、該親は、それらがいずれか側の近くに位置付けされるマーカーにて組換え体であるのでホモ接合体であり、この領域における二重組換え事象は極端にありそうにもないと推定する。かくして、この家族における証拠はｔｄｊ１４７４に対してＢＲＣＡ１遺伝子座を末端側に位置決定する。しかしながら、この分裂中止点のより低い限界は親の遺伝子型情報なくしては決定するのが不可能である。この家族で鍵となる組換え分裂中止点は家系２０８２における結果を確認させることは当惑させるものである。前と同じように、この家族における位置決め情報は、もし乳癌がＢＲＣＡ１遺伝子によるものならば意味のあるものにすぎない。しかしながら、診断における彼女の比較的早期年齢（４４）はこれを非常にありそうなものとする。というのは、一般的集団では４５歳前の乳癌の危険は低いからである（ほぼ１％）。
【０２０６】
　家系２０３５
　この家族は、臨界的組換え事象についての情報が直接的には観察されないが、観察から、当該家族の２の分家における早期開始乳癌に関し共分離する２つのハプロタイプが１７ｑＢＲＣＡ１領域の基部側部分に位置決めされたマーカーにつき同一であるが、より末端側の遺伝子座では異なるようであると推定される点でＫ１９０１と同様である。これらの２のハプロタイプの各々は早期開始のまたは両側乳癌の少なくとも４ケースで起こる。この家族におけるＥＤ２での総じてのＬＯＤスコアは２.２であり、該家族に乳癌のケースがあり（これは、８０％のＢＲＣＡ１連鎖の事前確率を示す）、この家族がＢＲＣＡ１に連鎖しているという得られた事後確率は０.９９８である。ハプロタイプは、マーカーＭｆｄ１５、ＴＨＲＡ１、Ｍｆｄ１９１、ＥＤ２、ＡＡ１、Ｄ１７Ｓ８５８およびＤ１７Ｓ９０２につき同一である。Ｍｆｄ１５およびＥＤ２における共通の対立遺伝子は共にかなり稀であり、これは、このハプロタイプは子孫によって同一に共有されていることを示す。しかしながら、該ハプロタイプはＣＡ３７５、４−７、およびＭｆｄ１８８、ならびにいくつかのより末端側マーカーにつき一致しない。これは、ＢＲＣＡ１遺伝子座がマーカーＣＡ３７５上方に存在するにちがいないことを示す。このマーカーはＤ１７Ｓ７８よりも５０ｋｂ下方に位置し、従って、それはＳｉｍａｒｄら（１９９３）に報告されているように、一義的には、この従前の低い境界のさらなる確認として働く。
【０２０７】
　家系１８１３
　家系１８１３は、その母親が４５歳で乳癌と診断され６１歳で卵巣癌診断された４０歳前に乳癌と診断された４ケースを持つ小さな家族である。この状況は、該４ケースは３人の異なる父親を有し、それのうち１人のみが遺伝子型が決定されているという事実によって幾分複雑化している。しかしながら、ＢＲＣＡ１領域における多数の異なるマーカーならびにゲノムにおける他の場所の高度に多形のマーカーをタイプ分けすることによって、該家族におけるすべての子供の父親が誰であるかは、かなりの確実性をもって決定された。この家族は、１７ｑマーカーに関し０.６０の最大多点ＬＯＤスコアを生じ、もし少なくとも１ケースの卵巣癌があれば、その結果、０.９３のＢＲＣＡ１連鎖家族であるという事後確率となる。この家族は、３４歳で乳癌を発病した個人１８において直接的に観察可能な組換え事象を含有する（Ｓｉｍａｒｄら，Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１１９３−１１９９（１９９３）における図５参照）。関連１７ｑ遺伝子座における罹患母親の遺伝子型は、彼女の遺伝子型、彼女の罹患姉妹の遺伝子型、および３人の他の非罹患兄弟姉妹の遺伝子型から推定できる。個人１８は以下の遺伝子座：Ｍｆｄ１５、ＴＨＲＡ１、Ｄ１７Ｓ８００、Ｄ１７Ｓ８５５、ＡＡ１、およびＤ１７Ｓ９３１につきＢＲＣＡ１連鎖対立遺伝子を受け継ぐ。しかしながら、Ｄ１７Ｓ９３１の下方のマーカー、すなわち、Ｕ５Ｒ、ｖｒｓ３１、Ｄ１７Ｓ８５８およびＤ１７Ｓ５７９については、彼女は病気を担わない染色体上に位置する対立遺伝子を受け継いだ。この家族からの証拠は、従って、ＢＲＣＡ１遺伝子座をマーカーＵＳ５に対して基部側に位置付ける。彼女の診断の早期年齢（３４）のため、組換え個人の癌はこの家族における乳癌／卵巣癌の他のケースの原因となる遺伝子によるものではないということは極めてありそうにもなく：この家族における不確実性は、この家族における乳癌は第２の、まだマップされていない、乳癌感受性遺伝子座よりむしろＢＲＣＡ１によるものであるという我々の幾分少ない証拠に由来する。
【０２０８】
　ＢＲＣＡ１を含有する領域のサイズ
　前記で詳述した遺伝データに基くと、ＢＲＣＡ１遺伝子座は、共に我々の研究所で単離されたマーカーｔｄｊ４７４およびＵ５Ｒ間のインターバルに存在するにちがいない。図２および３に示す物理的地図に基づき、我々はこれらの２つの遺伝子座の間の物理的距離を見積もろうと試みることができる。それは、この領域にわたる約８０ｋｂの平均インサートサイズの約１４　Ｐ１クローンとするる。しかしながら、いくつかの未知の程度のこれらのすべてのＰ１重複のため、該物理的領域は８０ｋｂの１４倍よりも、どもうかなり小さいらしい。該領域をカバーするクローンの制限地図に基づき、我々はＢＲＣＡ１を含有する領域のサイズはほぼ６５０ｂｐであると見積もる。
【０２０９】
　　　　　　　　　　　　　　　　実施例７
　Ｃｏｎｔｉｇ領域のゲノム分析によるＢＲＣＡ１遺伝子座についての候補ｃＤＮＡクローンの同定
　可能な領域の完全なスクリーニング
　候補ｃＤＮＡを同定する最初の方法は、かなり労力が必要だが、公知の技術を用いた。該方法は、該ｃｏｎｔｉｇにおけるコスミドならびにＰ１およびＢＡＣクローンをスクリーニングして推定暗号配列を同定することよりなるものであった。次いで、推定暗号配列を含有するクローンをｃＤＮＡライブラリーのフィルター上のプロープとして使用して将来の分析用の候補ｃＤＮＡクローンを同定した。該クローンを２つの方法のうちいずれかによって推定暗号配列につきスクリーニングした。
【０２１０】
　ズー（ｚｏｏ）ブロット
　推定暗号配列を同定するための第１の方法は、いくつかの種にわたって進化を通じて保存された配列についてコスミドおよびＰ１クローンをスクリーニングすることによるものであった。この技術を「ズーブロット分析」といい、Ｍｏｎａｃｏ，１９８６によって記載されている。特に、ウシ、ニワトリ、ブタ、マウスおよびラットからのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤＩＩＩで消化した（酵素当たりＤＮＡ８μｇ）。消化したＤＮＡを２０ボルトにて１６時間０.７％ゲル上で一晩分離し（１４ｃｍゲル）、標準的なサザーンブロット技術を用いてＤＮＡをナイロン膜に移した。例えば、６５℃にて、０.１×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳおよび０.２Ｍ　トリス、ｐＨ８.０中で３０分間処理し、次いで、４２℃にて、５×ＳＳＣ、１０％ＰＥＧ８０００、２０ｍＭ　ＮａＰＯ４、ｐＨ６.８、１００μｇ／ｍｌ　サケ精子ＤＮＡ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５０％ホルムアミド、０.１％ＳＤＳおよび２μｇ／ｍｌ　Ｃ０ｔ−１ＤＮＡ中でブロックした。
【０２１１】
　分析すべきコスミドおよびＰ１クローンを制限酵素で消化して、ヒトＤＮＡをベクターＤＮＡから遊離させた。該ＤＮＡを２０ボルトにて１６時間１４ｃｍの０.５％アガロースゲル泳動にて一晩分離した。ヒトＤＮＡバンドをゲルから切り出し、０.５×トリス酢酸緩衝液中、１００ボルトにて、ゲルウェッジから少なくとも２時間で電気溶出させた（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２）。次いで、溶出したＮｏｔ　Ｉ消化ＤＮＡ（〜１５ｋｂないし２５ｋｂ）をＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して小さな断片（〜０.５ｋｂないし５.０ｋｂ）が得られ、次いで、これは放射性ヌクレオチドでのＤＮＡの標識の次工程にため容易に溶融した。該ＤＮＡ断片を、ヘキサマーランダムプライミング標識方法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｎ，カタログ番号１００４７６０）によって標識した。標識したＤＮＡをスペルミン沈殿させて（１００μｌ　ＴＥ、５μｌ　０.１Ｍスペルミン、および５μｌ　１０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ添加）、取り込まれなかった放射性ヌクレオチドを除去した。次いで、標識したＤＮＡを６５℃の１００μｌ　ＴＥ、０.５Ｍ　ＮａＣｌに５分間で再懸濁し、次いで、製造業者の指示のごとくに（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号５２７９ＳＡ）、ヒトＣ０ｔ−１ＤＮＡで２−４時間でブロックした。該Ｃ０ｔ−１ブロックトプローブをブロッキング溶液中、４２℃で、ズーブロットフィルター上でインキュベートした。該フィルターを室温にて２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で３０分間洗浄し、次いで、５５℃にて同一緩衝液中で３０分間洗浄した。次いで、該フィルターを、−７０℃にて、増感剤を含むＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フィルムに１ないし３日間暴露した。かくして、ズーブロットを当該インサートからのＥｃｏ−Ｒ１断片のプールと、または各断片と個々にハイブリダイズさせた。
【０２１２】
　ＨＴＦアイランド（ｉｓｌａｎｄ）分析
　ｃＤＮＡライブラリーについてのプローブとして使用するためのコスミドを同定する第２の方法はＨＴＦアイランド分析であった。パルス場地図はＨＴＦアイランドを明らかとできるので、これらのＨＴＦアイランド領域にマップされるコスミドを優先的に分析した。ＨＴＦアイランドはＤＮＡのセグメントであって、これは非常に高頻度の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有し（Ｔｏｎｏｌｉｏら、１９９０）、その認識配列がＣｐＧジヌクレオチドを含む酵素の制限部位のクラスターリングによって明らかにされる。ＨＴＦ−アイランド分析で有用であることが知られている酵素はＡｓｃＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＥａｇＩ、ＳｃａＩＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＳｍａＩおよびＭｌｕＩである（Ａｎａｎｄ，１９９２）。酵素ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＥａｇＩ、ＳａｃＩＩおよびＳａｌＩを用いてパルス場地図を作成し、２つのＨＴＦアイランドが見い出された。これらのアイランドは当該領域の末端に位置し、１つはＧＰ２Ｂ遺伝子座の末端側であり、他のものは同遺伝子座よりも基部側であり、共にＢＲＣＡ１領域の外部にある。これらの２つの位置をカバーするＴＡＣに由来するコスミドを分析して、これらの制限部位、かくしてＨＴＦアイランドを含有するものを同定した。
【０２１３】
　ｃＤＮＡスクリーニング
　ＨＴＦアイランドを含有するか、あるいはヒト以外の他の種のＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを示すクローンは暗号配列を含有するようである。これらのクローンからのヒトＤＮＡを全インサートとしてまたはＥｃｏＲＩ断片として単離し、前記したごとくに標識した。標識したＤＮＡを用いて、ｃＤＮＡフィルターが６５℃で０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳのよりストリンジェントな洗液を３０分間２回受けた以外は、ズーブロットと同一条件下で種々のｃＤＮＡライブラリーのフィルターをスクリーニングした。
　我々の実験で現在まで使用したｃＤＮＡライブラリーのほとんどは（正常乳房組織、妊娠８カ月で乳房悪性の婦人からの乳房組織からのライブラリー）Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から調製した。８カ月妊婦の乳房組織から作成したｃＤＮＡライブラリーはラムダｇｔ−１０ベクター中にてＣｌｏｎｅｔｅｃｈ（カタログ番号ＨＬ１０３７ａ）から入手でき、これを、Ｃ６００Ｈｆｌ細菌宿主細胞中で増殖させる。正常乳房組織および悪性乳房組織試料を３７歳の白人女性から単離し、１グラムの各組織をｍＲＮＡプロセッシングおよびｃＤＮＡライブラリー構築のためにＣｌｏｎｅｔｅｃｈに送った。後者の２のライブラリーは、ランダムおよびオリゴ−ｄＴプライミング双方を用いて作成し、最終産物のサイズを選択し、これを次いでラムダＺａｐＩＩベクターにクローン化し、製造業者によって記載されているごとくに細菌のＸＬ１−ブルー株で増殖させた。さらなる組織−特異的ｃＤＮＡライブラリーは、ヒト胎児脳（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号９３６２０６）、ヒト精巣（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，カタログＨＬ３０２４）、ヒト胸腺（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，カタログＨＬ１１２７ｎ）、ヒト脳（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，カタログＨＬ１１８１０）、ヒト胎盤（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，カタログ１０７５ｂ）、およびヒト骨格筋（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，カタログＨＬ１１２４ｂ）を含む。
【０２１４】
　該ｃＤＮＡライブラリーをＮＺＣＹＭプレート上でその宿主細胞と共に平板培養し、フィルターリフトをＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）におけるごとくに各プレートから二連にて作成する。候補ゲノムクローンからのインサート（ヒト）ＤＮＡを精製し、高比活性まで放射能標識した。次いで、放射能ＤＮＡを該ｃＤＮＡフィルターにハイブリダイズさせて、候補コスミドクローン内に位置する遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定した。この方法によって同定されたｃＤＮＡを拾い、再度平板培養し、標識クローンインサートまたはそに由来するＥｃｏＲＩ断片ＤＮＡで再度スクリーニングして、それらの陽性状態を確認した。第２ラウンドのスクリーニング後に陽性であったクローンを次いで増殖させ、サザーンブロット分析および配列決定のためにそれらのＤＮＡを精製した。製造業者からのプロトコルに記載されてごとくに、ラムダファージベクターからのプラスミドのイン・ビボ切出を通じて、クローンをプラスミドとして精製するか、あるいはクローンを制限断片としてラムダファージから単離し、プラスミドベクターにサブクローン化した。
【０２１５】
　サザーンブロット分析を二連で行い、１つは、元のゲノムインサートＤＮＡをプローブとして用いて、ｃＤＮＡインサーがハイブリダイズする配列を含有することを確認した。第２のブロットを最大ｃＤＮＡインサートからのｃＤＮＡインサートＤＮＡとハイブリダイズさせて、いずれのクローンが同一遺伝子を表すかを確認した。ゲノムクローンとハイブリダイズし、かつユニークであるすべてのｃＤＮＡを配列決定し、ＤＮＡ分析を行って、該配列が公知またはユニークな遺伝子を表すか否かを判断した。ユニークであるらしいすべてのｃＤＮＡクローンをさらに候補ＢＲＣＡ１遺伝子座として分析した。具体的には、該クローンをノーザーンブロットにハイブリダイズさせて、乳房特異的発現および正常−乳房腫瘍ＲＮＡにおける異なる発現を探す。また、それらをＢＲＣＡ１領域におけるクローンについてＰＣＲによって分析してそれらの位置を確認した。遺伝子座の広がりをマップするために、全長ｃＤＮＡを単離し、ＹＡＣならびに元の同一クローンの回りのおよびそれを含むクローンに対するＰＣＲプローブとしてそれらの配列を使用する。次いで、イントロン−エキソン境界をさらに配列分析により明確とした。
【０２１６】
　我々は、当該領域におけるコスミドＢＡＣおよびＰ１クローンからのズーブロット陽性ＥｃｏＲＩ断片で、正常乳房、妊娠８ケ月の乳房および胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。潜在的ＢＲＣＡ１　ｃＤＮＡクローンを３つのライブラリー間で同定した。クローンを拾い、再度平板培養し、元のプローブで再度スクリーニングして、それらが陽性であることを確認した。
【０２１７】
　ハイブリッド−選択ｃＤＮＡの分析
　直接選択から得られたｃＤＮＡ断片を、プローブＤＮＡに対するサザーンブロットハイブリダイゼーションによってチェックして、それらがｃｏｎｔｉｇに由来することを確認した。このテストをパスしたものをその全体について配列決定した。次いで、このようにした得られたＤＮＡ配列のセットを相互に対してチェックして、重複する独立したクローンを見いだした。例えば、クローン６９４−６５、１２４０−１および１２４０−３３が独立して得られ、引き続いて、ＥＳＴ：４８９：１と命名された同一の近接ｃＤＮＡ配列に由来することが示された。
【０２１８】
　候補クローンの分析
　前記からの候補遺伝子の１以上を配列決定し、当該情報を各発現された遺伝子の同定および分類に使用した。ＤＮＡ配列を、ヌクレオチド配列比較によって、およびすべてのフレームにおける翻訳、続いての公知のアミノ酸配列との比較によって、公知の遺伝子と比較した。これは、局所および遠隔配列データバンク（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）双方に対する配列比較のため、クライアント／サーバーソフトウェアパッケージ（例えば、ＢＬＡＳＴＮ　１.３.１３ＭＰ）のＧｅｎｅｔｉｃ　Ｄａｔａ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　（ＧＤＥ）バージョン２.２ソフトウェアおよびＢａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　（Ｂｌａｓｔ）シリーズを用い、Ｓｕｎ　ＳＰＡＲＣワークステーションで作動させて達成された。コスミドおよびＰ１で同定されたｃＤＮＡクローンのクレクションから再度構築した配列が得られた。新しい配列を表すすべて候補遺伝子をさらに分析して、推定ＢＲＣＡ１遺伝子座につきそれらの候補をテストした。
【０２１９】
　突然変異スクリーニング
　罹患血統における突然変異をスクリーニングするために、２の異なるアプローチを行った。まず、ＢＲＣＡ１の感受性対立遺伝子を担うことが知られている家族構成員から単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲによる候補遺伝子配列の増幅用鋳型として使用した。もしＰＣＲプライマーがイントロン／エキソン境界に隣接しまたはそれと重複すると、増幅した断片はｃＤＮＡ配列から予測されるものよりも大きいか、あるいは増幅混合物には存在しないであろう。かかる増幅実験および設計したプライマーを用いたＰ１、ＢＡＣまたはコスミドクローンの配列決定を組み合わせることによって、イントロン／エキソン構造を確立し、最終的には該血統からのゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列を得ることができる。
【０２２０】
　もし候補遺伝子のイントロン／エキソン構造が複雑であると、かなりより迅速である第２のアプーチは、血統リンパ球ｃＤＮＡから増幅した断片の配列決定を含む。血統血液から抽出したリンパ球ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを、設計したプライマーのセットを用いるＰＣＲ増幅の基質として用いた。もし候補遺伝子がリンパ球で有意な程度発現されたならば、かかる実験は通常増幅された断片を生じ、これはイントロン／エキソン結合の知識なくして直接的に配列決定できる。
【０２２１】
　かかる配列決定反応の産物をゲル電気泳動によって分析して、失欠または挿入のごとき突然変異、あるいはアミノ酸変化または他の有害効果を引き起こす塩基対置換いずれかを含有する配列における位置を決定した。
【０２２２】
　乳房で発現されるＢＲＣＡ１領域内のいずれの配列もＢＲＣＡ１についての候補遺伝子であると考えられる。所与の候補遺伝子がＢＲＣＡ１に対応するという強力な証拠は、血統家族が候補の欠陥対立遺伝子を含有するという証拠に由来する。
【０２２３】
　　　　　　　　　　　　　　　　実施例８
　ＢＲＣＡ１の同定
　ＢＲＣＡ１の同定
　いくつかの戦略を用い、Ｄ１７Ｓ１３２１およびＤ１７Ｓ１３２４間の１７ｑ２１の６００ｋｂ領域につき、転写体の詳細なマップを開発した。候補を発現する配列は：１）乳房、胎児脳、またはリンパ球ｃＤＮＡライブラリーの直接的スクリーニング、２）乳房、リンパ球または卵巣ｃＤＮＡのハイブリッド選択、または３）ゲノムＤＮＡのランダム配列決定およびＸＰＯＵＮＤ（ＴｈｏｍａｓおよびＳｋｏｌｎｉｃｋ，１９９４）によるコーディングエキソンの産生、から得られたＤＮＡ配列として定義された。多くの場合におけるこれらの発現された配列を、いくつかの独立して同定された配列からなるｃｏｎｔｉｇに組み立てた。候補遺伝子はこれらの候補発現配列のうちの１を超えるものからなってよい。この領域内の６５の候補発現配列を、ハイブリッド選択によって、ｃＤＮＡライブラリーの直接的スクリーニングによって、およびＰ１サブクローンのランダム配列決定によって同定した。転写体サイズ、ＤＮＡ配列、データベース比較、発現パターン、ゲノム構造、および最も重要には、１７ｑ−連鎖乳房および卵巣癌感受性を分離する家系からの個人におけるＤＮＡ配列分析によって発現配列を特徴付けた。
【０２２４】
　発現配列、１１４１：１（６４９ｂｐ）、６９４：５（２１３ｂｐ）および７５４：２（１０７９ｂｐ）の３つの独立ｃｏｎｔｉｇを単離し、結局、ＢＲＣＡ１の一部を表すことが示された。これらのｃｏｎｔｉｇについてのＥＳＴをノーザン分析用のハイブリダイゼーションプローブとして用いた場合、ほぼ７.８ｋｂの単一転写体が正常乳房ｍＲＮＡで観察され、これは、それらが単一遺伝子の異なる部分をコードすることを示唆する。乳房、胎児脳、胸腺、精巣、リンパ球および胎盤ｃＤＮＡのスクリーニングおよび乳房ｍＲＮＡでのＰＣＲ実験は、１１４１：１、６９４：５および７５４：２ｃｏｎｔｉｇを連鎖させた。胸腺、精巣および乳房ｍＲＮＡでの５’ＲＡＣＥ実験はｃｏｎｔｉｇを推定５’末端まで延長し、複合全長配列が得られた。ＰＣＲおよびＰ１の直接配列決定および当該領域におけるＢＡＣを用いて、イントロンの位置を突き止め、スプライスドナーおよびアクセプター部位の決定を可能とした。これらの３つの発現配列を単一の転写転移単位に併合し、これは最終分析でＢＴＣＡ１であることが判明した。この転写単位は６００ｋｂ領域の中心におけるＤ１７Ｓ８５５に隣接して位置決定された（図４）。
【０２２５】
　ｃＤＮＡクローンから得られた配列、ハイブリッド選択配列、および増幅されたＰＣＲ産物の組合せにより、複合全長ＢＴＣＡ１　ｃＤＮＡの構築が可能となった（配列番号：１）。ＢＲＣＡ１　ｃＤＮＡの配列（停止コドンまで）もまたＧｅｎＢａｎｋに寄託し、受託番号Ｕ−１４６８０が与えられた。この寄託配列を参照して一体化させる。３’方向に最も遠くに伸びるｃＤＮＡクローンは、ポリアデニル化シグナルに先行されるポリ（Ａ）トラクトを含有する。ｃＤＮＡの概念的翻訳により、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，１９８７）に似た配列に囲まれ隣接された潜在的開始コドンと共に２０８キロダルトン（アミノ酸配列、配列番号２）の単一の長いオープンリーディングフレームが明らかとされた。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１）およびＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｙｌら、１９９０）のサーチは、亜鉛−フィンガードメインに対してかなりの相同性を持つアミノ末端に近い配列を同定した（図５）。この配列は、コンセンサスＣ３ＨＣ４亜鉛−フィンガーモチーフに存在するシステインおよびヒスチジン残基を含有し、データベースにおける亜鉛−フィンガー蛋白質に関する多数の他の残基を共に有する。ＢＲＣＡ１遺伝子はゲノムＤＮＡの１００ｋｂを超えて配置された２３コーディングエキソンからなる（図６）。ＢＲＣＡ１　ｃＤＮＡの断片をプローブとして用いるノーザンブロットは、最も豊富には乳房、胸腺および精巣に存在し、また卵巣にも存在する約７.８ｋｂの単一転写体を同定した（図７）。４つの別にスプライスされた産物が独立したｃＤＮＡクローンで検出され；これらのうちの３つが乳房、２つが卵巣ｍＲＮＡで観察された（図６）。組織ｃＤＮＡからのＰＣＲ概観により、この遺伝子からの転写体の５’末端近くにかなりのヘテロ接合性があるという考えがさらに支持され；該ヘテロ結合性についての分子的ベースは、最初のスプライスドナー部位の異なる選択を含み、検出された変化はすべて同定された開始コドンよりも５’側の領域における転写体を改変する。我々は、この５’非翻訳領域で６つの潜在的別のスプライスドナーを検出し、最長の失欠は１，１５５ｂｐである。乳房および卵巣におけるＢＲＣＡ１蛋白質の支配的形態はエキソン４を欠く。ＢＲＣＡ１エキソン４のヌクレオチド配列を配列番号１１に示し、予測されるアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【０２２６】
　ＢＲＣＡ１ゲノムＤＮＡのさらなる５’配列を配列番号１３に示す。１位のＧは精巣における潜在的開始部位を表す。１４０位のＡは体細胞組織における潜在的開始部位を表す。図８に示す５’配列の６つの別のスプライス形態がある。３５６位のＧは公認された最初のスプライスドナー部位を表す。４４４位のＧは２のクローンにおける最初のスプライスドナー部位を表す（精巣１および精巣２）。８８９位におけるＧは胸腺３における最初のスプライスドナー部位を表す。第４のスプライスドナー部位は１２３０位におけるＧである。１５１３位におけるＴは前記スプライスドナーのすべてについてのスプライスアクセプター部位を表す。第５の別のスプライス形態は５９１位における最初のアクセプター部位と共に３４９位における最初のスプライスドナー部位ならぴに８８９位における第２のスプライスドナー部位および１５１３位における第２のアクセプター部位を有する。６つの別の形態がこの５’領域においてスプライスされない。１５３２位におけるＡは公認された開始部位であり、これは配列番号１の１２０位に出現する。ＢＲＣＡ１について決定された部分的ゲノムＤＮＡ配列は図１２−１９および配列番号１４−３４に示す。下方のケース文字（図１２−１９）はイントロン配列を表し、他方、上方のケース文字はエキソン配列を表す。図１２−１９においてイントロン内の不明確なインターバルはｖｖｖｖｖｖｖｖで示す。イントロン／エキソン結合は表９および１０に示す。エキソン８および１４の５’末端で見い出されたＣＡＧはいくつかのｃＤＮＡで見い出されたが、他のものでは見い出されなかった。公知の多形部位は、図１２−１９において肉太活字で示し、下線を施す。
【０２２７】
【表９】
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【０２２８】
【表１０】
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【０２２９】
　発散した系統発生的バックグラウンドの生物からのゲノムＤＮＡを亜鉛−フィンガー領域を欠くＢＲＣＡ１配列でプローブする低ストリンジェンシィブロットにより、ヒト、サル、ヒツジおよびブタで強力にハイブリダイズする断片が明らかにされ、齧歯類では非常に弱いハイブリダイゼーションシグナルが明らかとされた。この結果は、亜鉛−フィンガードメトンは別として、ＢＲＣＡ１は進化を通じて中レベルにてのみ保存されていることを示す。
【０２３０】
　１７ｑ−連鎖家系における生殖細胞系ＢＲＣＡ１の突然変異
　ＢＲＣＡ１候補遺伝子についての最も厳格なテストは、乳癌および卵巣癌に対する１７ｑ−連鎖感受性を分離する家系からのキャリア個人における潜在的に破壊的な突然変異について調べることである。かかる個人は野生型配列とは異なるＢＲＣＡ１対立遺伝子を含有しなければならない。この分析で使用したＤＮＡ試料の組は８の異なるＢＲＣＡ１家系を表す個人からのＤＮＡよりなるものであった（表１１）。
【０２３１】
【表１１】
2004135687.tif 000013
【０２３２】
　これらの家系における可能性（ＬＯＤ）スコアの対数値は１７ｑ２１におけるマーカーの組につき９.４９ないし−０.４４の範囲である。４の家族は連鎖につき納得のいくＬＯＤスコアを有し、４は低い正または負のＬＯＤスコアを有する。後者の家系は含めた。何故ならば、それらは少なくとも３人の罹患構成員につき染色体１７ｑ２１にて共有するハプロタイプを示すからである。さらに、該組におけるすべての家系は乳癌開始の早期年齢を示し、家系の４つは卵巣癌の少なくとも１ケースを含み、両者はＢＲＣＡ１家系の特徴である。１の家系２０８２はほとんど同等の乳癌および卵巣癌の度合いを有し、これは集団における卵巣癌が相対的に稀であることを仮定すれば異常な出現である。２つを除きすべての家系はユタ州で確認された。Ｋ２０３５は中西部からのものである。Ｋ２０９９は南米からのアフリカン−アメリカン−家系である。
【０２３３】
　ＢＲＣＡ１における病気素因たる突然変異についての最初のスクリーニングにおいて、各家系における病気素因たるハプロタイプを担う１の個人からのＤＮＡをテストした。２３のコーディングエキソンおよび関連スプライス結合をゲノムＤＮＡ試料から、またはリンパ球ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡから増幅した。増幅したＤＮＡ配列をＤＮＡ配列を野生型配列と比較すると、８の家系試料のうち４つが配列変異体を含有することが判明した（表１２）。
【０２３４】
【表１２】
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【０２３５】
　すべての４つの配列変異体はヘテロ接合であり、各々は家系のうち１つでのみ出現する。家系２０８２はエキソン１１にナンセンス突然変異を含有する（図９）。家系１９１０はエキソン２０に単一のヌクレオチド挿入を含有する（図１０）。家系２０９９はエキソン２１にミスセンス突然変異を含有し、その結果、Ｍｅｔ→Ａｒｇ置換となる。フレームシフトおよびナンセンス突然変異はＢＲＣＡ１産物の機能にとって破壊的となるようである。家系１９１０におけるフレームシフト対立遺伝子によってコードされたペプチドは、野生型Ｃ−末端から１０８残基で始まる改変されたアミノ酸配列を含有する。家系１９０１におけるフレームシフト対立遺伝子によってコードされたペプチドは、野生型Ｎ−末端から２４番目の残基で始まるアミノ酸配列を含有する。家系２０８２における突然変異対立遺伝子はＣ−末端から５５１残基失う蛋白質をコードする。家系２０９９で観察されたミスセンス置換は、それが小さな疎水性アミノ酸（Ｍｅｔ）を大きな荷電残基（Ａｒｇ）によって置き換えるので、潜在的に破壊的である。また、１１の共通の多形も同定され、これは暗号配列に８つ、およびイントロンに３つである。
【０２３６】
　家系２０３５で研究した個人は明らかにＢＲＣＡ１で調節突然変異を含有する。彼女のｃＤＮＡでは、多形部位（塩基３６６７においてＡ→Ｇ）はヘテロ接合を出現し、他方、彼女のゲノムＤＮＡはこの部位においてヘテロ接合性を明らかとした（図１１）。この観察についての可能な説明は、彼女の突然変異したＢＲＣＡ１対立遺伝子からのｍＲＮＡは、その産生または安定性に影響する突然変異のため存在しないということである。この可能性をさらにＢＲＣＡ１暗号領域における５つの多形部位を調べることによって調べ、これはＢＲＣＡ１転写体における３.５ｋｂもの多くによって分離されている。彼女のゲノムＤＮＡが多形につきヘテロ接合性を表す場合において、ｃＤＮＡはヘテロ接合性である。他の家系からのおよび家系２０３５における非ハプロタイプキャリアにえける個人において、これらの多形部位はｃＤＮＡにおけるヘテロ接合性として観察され、これは、ｃＤＮＡからの増幅が１の対立遺伝子に有利に片寄らなかったことを示す。この分析は、家系２０３５におけるＢＲＣＡ１突然変異は転写を妨げ、またはＢＲＣＡ１転写体の不安定性または異常なスプライシングを引き起こすことを示す。
【０２３７】
ＢＲＣＡ１ハプロタイプを持つＢＲＣＡ１突然変異の共分離および集団頻度分析
　蛋白質機能を潜在的に破壊する以外、２つの基準が候補病気素因突然変異としての資格を有する配列変異体で満たされなければならない。変異体は、１）病気素因ＢＲＣＡ１ハプロタイプを担う家系からの個人において存在し、家系の他の構成員では存在せず、２）一般的集団では稀であるということに合致しなければならない。
【０２３８】
　各突然変異をＢＲＣＡ１に関する共分離につきテストした。家系１９１０におけるフレームシフト突然変異については、２の他のハプロタイプキャリアおよび１の非−キャリアを配列決定した（図１０）。キャリアのみがフレームシフト突然変異を呈した。家系２０８２におけるＣからＴへの変化は新しいＡｖｒＩＩ制限部位を創製した。家系における他のキャリアおよび非−キャリアを制限部位の存在についてテストした（図９）。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を、家系２０９９における配列変異体の存在を検出するために設計した。該家系からのいくつかの個人、病気素因対立遺伝子に関連するハプロタイプを担うことが知られているいくらか、および関連ハプロタイプを担わないことが知られている他のものを、該家系で従前に検出されている突然変異につき、ＡＳＯによってスクリーニングした。各家系において、対応する突然変異対立遺伝子がＢＲＣＡ１−関連ハプロタイプを担う個人で検出され、非キャリアでは検出されなかった。家系２０３５からの個人で観察された潜在的調節突然変異の場合において、該家系におけるキャリアからのｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを、多形部位におけるヘテロ接合性につき比較した。いずれの場合においても、ｃＤＮＡ試料における区別された対立遺伝子は、ＢＲＣＡ１病気素因対立遺伝子を担う染色体上に存在することが示された（図１１）。
【０２３９】
　突然変異は集団における単に共通の多形であるという可能性を排除するために、各突然変異についてのＡＳＯを用いて、正常ＤＮＡ試料の組をスクリーニングした。白人における遺伝子頻度見積もりはユタ州集団からのランダム試料に基づくものであった。アフリカン−アメリカンにおける遺伝子頻度見積もりは、彼女の連鎖研究で用いたアフリカン−アメリカンおよび２０人の新しく生まれたユタ州のアフリカン−アメリカンに由来するＭ．Ｐｅｒａｃｅｋ−Ｖａｎｃｅによって提供された３９試料に基づくものであった。４の潜在的病気素因突然変異のいずれも適当な対照集団で見いだされず、これは、それらが一般的な集団で稀であることを示す。かくして、ＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子についての２の重要な要件は候補病気素因突然変異によって満たされた：１）病気を持つ突然変異対立遺伝子の共分離、および２）対照における突然変異対立遺伝子の不存在（これは、一般的集団における低遺伝子頻度を示す）
【０２４０】
　ＢＲＣＡ１突然変異の表現型発現
　ＢＲＣＡ１蛋白質に対する該突然変異の効果はＢＲＣＡ１家系における観察された表現型発現における差異と相関した。ほとんどのＢＲＣＡ１家系は、乳癌についてのものと比較して（Ｅａｓｔｏｎら、１９９３）、中程度に増大した卵巣癌危険を有し、より小さなサブセットは卵巣癌の高い危険を有する。ＢＲＣＡ１突然変異が検出された４つの家系のうち３つが前者のカテゴリーに入り、他方、４番目（Ｋ２０８２）が高い卵巣癌危険群に入る。Ｋ２０８２で見い出されたＢＲＣＡ１ナンセンス突然変異は検出された他の突然変異よりもアミノ末端に近く位置するので、それは異なる表現型を有すると予測される。事実、家系Ｋ２０８２突然変異は高い卵巣癌可能性を有し、他の家系よりも乳癌ケースのより遅い平均診断年齢を有する（Ｇｏｌｄｇａｒら、１９９４）。開始年齢におけるこの差異は、より小さく、より高度に浸透性の（penetrant)家族における確実性の偏りによりものであるか、またはそれはＢＲＣＡ１突然変異の挙動における組織−特異的差異を反映しているものであろう。公知のＢＲＣＡ１突然変異を分離する他の３つの家系は、平均して、乳癌毎１０ケースにつき１の卵巣癌を有するが、その２０代後半または３０代前半において診断された乳癌ケースの高集団を有する。フレームシフト突然変異を有する家系１９１０は注目するに値する。何故ならば、４人の罹患固人のうち３人が両側乳癌を有し、各ケースにおいて、第２の腫瘍が最初の出現から１人以内に診断されたからである。潜在的調節ＢＲＣＡ１突然変異を分離する家系２０３５は劇的な表現型を有することが予測されよう。この家系における乳癌ケースの８０％が５０歳前に起こる。この数字は当該セットにおけるいずれとも同程度に高く、これは高い浸透性のＢＲＣＡ１突然変異対立遺伝子を示唆する（表１１）。
【０２４１】
　前記突然変異は明らかに有害で、非常に若い年齢の婦人において乳癌を引き起こすが、突然変異を持つ４の家系の各々は、悪性を発病することなく８０歳まで生きた少なくとも１人の突然変異担持婦人を含む。ＢＲＣＡ１突然変異の効果を軽減し得る他の遺伝的または環境的因子を続いて突き止めるのは、該研究で最高に重要であろう。
【０２４２】
　８の推定ＢＲＣＡ１−連鎖家系のうち４つにおいて、潜在的病気素因突然変異は見いだされなかった。これらの４つのうち３つは０.５５未満のＢＲＣＡ１−連鎖マーカーについてのＬＯＤスコアを有する。かくして、これらの家系は、実際は、ＢＲＣＡ１病気素因対立遺伝子を分離しないようである。あるいは、これらの４の家系における突然変異は、例えば、転写体のレベルに影響し、従って、検出を遠ざけるＢＲＣＡ１の領域に存在するらしい。
【０２４３】
　癌におけるＢＲＣＡ１の役割
　現在同定されているほとんどの腫瘍サプレッサー遺伝子は、存在しない、非機能的または機能が低下した蛋白質産物を生じる。ＴＰ５３突然変異の大部分はミスセンスであり；これらのうちいくつかは、野生型産物の機能に干渉する異常ｐ５３分子を生産することが示されている（Shaulianら、1992;Srivastavaら,1993)。同様の優性な陰性の作用メカニズムが、切形分子を生産するいくつかの腺腫ポリーブ症コリ（ｃｏｌｉ）（ＡＰＣ）対立遺伝子につき（Ｓｕら、１９９３）、および蛋白質のＤＮＡ結合を改変するＷｉｌｍｓの腫瘍遺伝子（ＷＴ１）における点突然変異につき（Ｌｉｔｔｌｅら、１９９３）提案されている。ＢＲＣＡ１暗号配列で観察された突然変異の性質は優性陰性蛋白質または非機能的蛋白質の生産に一致する。家系２０３５で推定された調節突然変異は優性陰性ではありえない；むしろ、この突然変異は影響された対立遺伝子からのＢＲＣＡ１発現の低下または完全な喪失を引き起こすようである。
【０２４４】
　ＢＲＣＡ１蛋白質は、多数のＤＮＡ結合蛋白質で見い出された、核酸への亜鉛−依存性結合と深く結び付いたものと類似の、Ｃ３ＨＣ４亜鉛−フィンガードメインを含有する。ＢＲＣＡ１の最初の１８０アミノ酸は酸性残基よりも５個多い塩基性残基を含有する。対照的に、分子の残りは非常に酸性で、７０個の酸性残基が正味に過剰である。過剰の負電荷はＣ−末端近くに特に集中している。かくして、１の可能性は、ＢＲＣＡ１がＮ−末端ＤＮＡ結合ドメインおよびＣ−末端トランス活性化「酸性ブロブ（ｂｌｏｂ）」ドメインと共に転写因子をコードするということである。興味深いことには、もう１つの家族性腫瘍サプレッサー遺伝子、ＷＴ１、も亜鉛−フィンガーモチーフを含有する（Ｈａｂｅｒら、１９９０）。ＷＴ１における多くの癌病気素因突然変異は亜鉛−フィンガードメインを改変する（Ｌｉｔｔｌｅら、１９９３；Ｈａｂｅｒら、１９９０；Ｌｉｔｔｌｅら、１９９２）。ＷＴ１は、転写因子、およびＷＴ１のＤＮＡ結合特性を改変する亜鉛−フィンガードメインの一部をコードするエキソンの別のスプライシングをコードする（Ｂｉｃｋｍｏｒｅら、１９９２）。ＷＴ１　ｍＲＮＡの別にスプライスされたいくつかの形態は転写リプレッサーとして作用する分子を創製する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、１９９４）。いくつかのＢＲＣＡ１スプライシング変異体は亜鉛−フィンガーモチーフを改変し、ＷＴ１で起こるのに類似の調節メカニズムがＢＲＣＡ１に適用できるという可能性を生じる。
【０２４５】
　　　　　　　　　　　　　　　　実施例９
　ＢＲＣＡ１突然変異についての腫瘍の分析
　最もＢＲＣＡ１突然変異を含有するらしい腫瘍についての分析に焦点を当てるため、初代乳癌および卵巣癌をＢＲＣＡ１領域におけるＬＯＨにつきタイプ分けした。３つの高度に多形の単純縦列反復マーカーを用いてＬＯＨ：Ｄ１７Ｓ１３２３およびＤ１７Ｓ８５５（これは、ＢＲＣＡ１の遺伝子内である）、およびＤ１７Ｓ１３２７（これは、ＢＲＣＡ１に対してほぼ１００ｋｂ末端側にある）をアクセスした。情報的ケース（すなわち、生殖細胞系がヘテロ接合性である）における合計したＬＯＨ頻度は乳癌につき３２／７２（４４％）、卵巣癌につき１２／２１（５７％）であり、当該領域におけるＬＯＨの従前の測定に一致する（Ｆｕｔｒｅａｌら、１９９２ｂ；Ｊａｃｏｂｓら、１９９３；Ｓａｔｏら、１９９０；Ｅｃｃｌｅｓら、１９９０；Ｃｒｏｐｐら、１９９４）。かくして、分析により、混血人種の３２の乳房腫瘍および１２の卵巣腫瘍のパネルおよびＢＲＣＡ突然変異につき調べるべき開始年齢が定義された。一本鎖コンフォメーション分析（ＳＳＣＡ）および直接配列決定の組合せによって、該遺伝子の完全な５，５８９ｂｐ暗号領域およびイントロン／エキソン境界配列をこの腫瘍セットでスクリーニングした。
【０２４６】
　合計６の突然変異（そのうち２つが同一）が見い出され、１つが卵巣腫瘍におけるもの、４つが乳房腫瘍におけるもの、１つが男性の非罹患ハプロタイプキャリアにおけるものであった（表１３）。１の突然変異Ｇｌｕ１５４１Ｔｅｒは、３２３個のアミノ酸を失った切形蛋白質を生じるであろう停止コドンをカルボキシル末端に導入した。加えて、２のミスセンス突然変異が同定された。これらはＡｌａ１７０８ＧｌｕおよびＭｅｔ１７７５Ａｒｇであって、荷電残基による小さな疎水性残基の置換を含む。患者１７７６４および１９９６４は同一家族からのものである。患者ＯＶ２４において、ヌクレオチド２５７５は失欠され、患者１７７６４および１９９６４においてヌクレオチド２９９３−２９９６は失欠されている。
【０２４７】
【表１３】
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【０２４８】
　いくつかの系の証拠は、すべての５の突然変異はＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子を表すことを示唆する。
　（ｉ）すべての突然変異は生殖細胞系に存在する；
　（ii）すべては、適当な対照集団に不存在で、それらは共通の多形ではないことを示唆する；
　（iii）ＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子を分離する家系に属する患者からの腫瘍にも当てはまるが（Ｓｍｉｔｈら、１９９２；Ｋｅｌｓｅｌｌら、１９９３）（もし突然変異が中性多形を表すと、それらはケースの５０％でのみ保持されるべきである）、各突然変異対立遺伝子は腫瘍で保有される；
　（iv）突然変異を持つ４つの乳癌ケースにおける開始年齢は２４歳と４２歳の間で変化し、ＢＲＣＡ１を持つ個人における乳癌の早期開始年齢と合致する；同様に、卵巣癌ケースは４４歳で診断され、これはすべての卵巣癌の最も若い１３％に入る；および最後に、
　（ｖ）腫瘍の組はこの基準に関して選択されなかったにも拘わらず、５ケースのうち３つは、過去にさかのぼるとそれらの医学記録で見いだされる乳癌および卵巣癌の陽性家族歴史を有する。
【０２４９】
　ＢＴ１０６は２４歳で乳癌と診断された。彼女の母親は卵巣癌を有し、彼女の父親は黒色腫を有し、彼女の父方祖母もまた乳癌を有した。患者ＭＣ４４（アフリカン−アメリカン）は４２歳で両側乳癌を有した。この患者は３４歳で乳癌で死亡した姉妹、リンパ腫で死亡したもう１人の姉妹、および肺癌で死亡した兄弟を有した。彼女の突然変異（Ｍｅｔ１７７５Ａｒｇ）は以前家系２０９９（ＢＲＣＡ１感受性対立遺伝子を分離し、アフリカン−アメリカンおよび白人対照では不存在であるアフリカン−アメリカン）で検出されている。我々の知識では、患者ＭＣ４４は家系２０９９に関連しない。稀な突然変異対立遺伝子の検出（ＢＲＣＡ１家系で１回および明らかに無関係の早期開始乳癌ケースで１回）は、Ｍｅｔ１７７５Ａｒｇ変化はアフリカン−アメリカンで共通の病気素因であろうことを示唆する。総合すると、これらの観察は腫瘍におけるすべての４つのＢＲＣＡ１突然変異は感受性対立遺伝子を表し；体細胞突然変異は分析した試料で検出されなかった。
【０２５０】
　体細胞ＢＲＣＡ１突然変異の数の少なさは、１７ｑについてのＬＯＨの頻度および癌進行における腫瘍サプレッサーとしての感受性遺伝子の通常の役割を仮定すれば、予測されるものではなかった。この結果については３つの可能な説明がある：（ｉ）我々のスクリーニング手法によると暗号配列においていくつかのＢＲＣＡ１突然変異が失われていた；（ii）ＢＲＣＡ１体細胞突然変異は主としてコーディングエキソンの外側にある；および（iii）１７ｑにおけるＬＯＨ事象はＢＲＣＡ１体細胞突然変異を反映しない。
【０２５１】
　もし体細胞ＢＲＣＡ１突然変異が乳癌および卵巣癌で真に稀であれば、これはＢＲＣＡ１の生物学について強力な密接関係を有するであろう。体細胞ＢＲＣＡ１突然変異の明らかな欠如は、一般的な集団における腫瘍と比較して、遺伝的に病気素因のＢＲＣＡ１キャリアにおる腫瘍の発生においていくつかの基本的差異があるであろうことを含蓄する。例えば、ＢＲＣＡ１における突然変異は乳癌および卵巣発病における特定の早期段階において腫瘍形成に対してのみ効果を有し得る。この確率は閉経期前乳癌におけるＢＲＣＡ１についての主要機能と一致する。乳癌および卵巣癌におけるＢＲＣＡ１の役割についてのかかるモデルは、生殖ホルモンとＢＲＣＡ１機能との間の相互作用を予測させる。しかしながら、家族性−散発性の乳癌および卵巣癌の臨床的もしくは病理学的差異（開始年齢以外）は記載されていない（Lynchら、1990)。他方、乳癌の家族履歴を持つ患者からの乳癌における増大したＴＰ５３突然変異および微小付随体の不安定性の最近の知見（Ｇｌｅｂｏｖら、１９９４）は病気素因個人で遺伝的に生気する腫瘍のいくつらかの差異を反映するであろう。今や、この現象におけるＢＲＣＡ１の関与は直接的に扱える。あるいは、体細胞ＢＲＣＡ１突然変異の欠如は、ＢＲＣＡ１と同一の腫瘍抑制経路で機能するが、総合すると散発性腫瘍における突然変異についてのより都合よい標的を表す多数の遺伝子の存在に由来するであろう。遺伝経路における単一要素の突然変異は一般に該経路を破壊するのに十分であるので、ＢＲＣＡ１は他の要素の突然変異速度の合計よりもかなり低い速度で突然変異するであろう。
【０２５２】
　　　　　　　　　　　　　　　実施例１０
　ＢＲＣＡ１遺伝子の分析
　ＢＲＣＡ１遺伝子の構造および機能は以下の方法によって測定される。
　生物学的研究
　ＢＲＣＡ１　ｃＤＮＡを含有する哺乳動物発現ベクターを構築し、該遺伝子中に損傷を持つ適当な乳癌細胞にトランスフェクトする。野生型ＢＲＣＡ１　ｃＤＮＡならびに改変したＢＲＣＡ１　ｃＤＮＡを用いる。該改変したＢＲＣＡ１　ｃＤＮＡは改変したＢＲＣＡ１対立遺伝子から得ることができるか、あるいは後記するごとくに産生できる。培養における表現型復帰（例えば、細胞形態、倍加時間、足場依存性増殖）および動物における表現型復帰（例えば、腫瘍形成性）を調べる。研究では当該遺伝子の野生型および突然変異体形（セクションＢ）を共に使用する。
【０２５３】
　分子遺伝学研究
　イン・ビトロ突然変異誘発を行って、（個人コドンにおける単一塩基対置換およびクラスター電荷→アラニン走査突然変異誘発によって）失欠突然変異体およびミスセンス突然変異体を構築する。該突然変異体を生物学的、生物化学的および生物物理学的研究で用いる。
【０２５４】
　メカニズム研究
　ＢＲＣＡ１蛋白質が公知および未公知ＤＮＡ配列に結合する能力を調べる。プロモーターをトランス活性化するその能力は、哺乳動物細胞における一時的レポーター発現系によって分析する。粒子−捕獲および酵母の２−ハイブリッド系のごとき通常の手法を用いていずれの機能的パートナーも見つけ同定する。該パートナーの性質および機能を特徴付ける。これらのパートナーは薬物発見用の標的である。
【０２５５】
　構造研究
　組換え蛋白質をイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、昆虫および／または哺乳動物細胞で産生させ、結晶学およびＮＭＲ実験で使用する。蛋白質の分子作成も使用する。これらの研究は構造から導かれる薬物設計を容易とする。
【０２５６】
　　　　　　　　　　　　　　　実施例１１
　試料中におけるＢＲＣＡ１の存在を検出するための２工程アッセイ
　Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓら（１９８５）によって開示されている方法に従って患者試料を加工し、１％アガロースゲルを通して分離し、サザーンブロット分析用にナイロン膜に移す。ＧＳ　Ｇｅｎｅリンカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、膜を１５０ｍＪでＵＶ架橋させる。配列番号１のヌクレオチド３６３１−３９３０位に対応するＢＲＣＡ１プローブをｐＴＺ１８Ｕにサブクローンする。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で感染させたイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＶ１１９０にファゲミド（ｐｈａｇｅｍｉｄｅ）を形質転換する。一本鎖ＤＮＡを標準的な手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）により単離する。
【０２５７】
　０．５Ｍ　ＮａＰＯ４中の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中、６５℃にて、ブロットを１４−３０分間プレハイブリダイズさせる。該方法はＮｇｕｙｅｎら、１９９２に記載されているものに従う。該ブロットを、２５−５０ｍｇ／ｍｌ一本鎖プローブＤＮＡを含む７％ＳＤＳ、０．５Ｍ　ＮａＰＯ４中、６５℃で一晩ハイブリダイズさせる。ポスト−ハイブリダイゼーション洗液は６５℃における５％ＳＤＳ、４０ｍＭ　ＮａＰＯ４中の２回の３０分間洗液であり、続いて６５℃における２回の３０分間の１％ＳＤＳ、４０ｍＭ　ＮａＰＯ４洗液よりなる。
【０２５８】
　次いで、該ブロットを室温にてリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６.８）で５分間すすぎ、室温にてＰＢＳ中の０.２％カゼインと共に３０−６０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で５分間すすぐ。次いで、該ブロットを、６Ｍ尿素、０.３Ｍ　
【０２５９】
　ＮａＣｌおよび５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）よりなるハイブリダイゼーション緩衝液と共に、４５℃にて、震盪する水浴中で５−１０分間プレインキュベートする。緩衝液を除去し、５０−７５μｌ／ｃｍ２の新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液＋共有結合架橋したオリゴヌクレオチド−アルカリ性フォスファターゼの、ユニバートルプライマー部位（ＵＰ−ＡＰ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と相補的なヌクレオチド配列とのコンジュゲートの２.５　ｎＭで置き換える。該ブロットを４５℃で２０−３０分間ハイブリダイズさせ、ポストハイブリダイゼーション洗液を、４５℃にて、２回の６Ｍ尿素中１０分間洗液、１×標準クエン加生理食塩水（ＳＳＣ）、０.１％ＳＤＳおよび１×ＳＳＣ、０.１％トリトンＸ−１００中の１回洗液としてインキョベートする。該ブロットを室温で１×ＳＳＣと共に１０分間すすぐ。
【０２６０】
　０.１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０.０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ１０.０からなる基質緩衝液中で震盪しつつ、ブロットを室温で１０分間インキョベートする。基質緩衝液および０.２ｍＭ　ＡＭＰＰＤ（３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン、二ナトリウム塩、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共に個々のブロットをヒートシール可能なバッグに入れる。震盪しつつの室温での２０分のインキュベーション後、過剰のＡＭＰＰＤ溶液を除去する。該ブロットをＸ−線に一晩暴露する。陽性バンドはＢＲＣＡ１の存在を示す。
【０２６１】
　　　　　　　　　　　　　　　実施例１２
　ＢＲＣＡ１に対するポリクローナル抗体の作製
　ＢＲＣＡ１暗号配列のセグメントをイー・コリ中の融合蛋白質として発現させた。過剰に生産された蛋白質をゲル溶出によって精製し、これを用いて、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８によって記載されているものと同様の手法を用い、ウサギおよびマウスを免疫化した。この手法は種々の他の蛋白質に対してＡｂｓを生じることが示されている（例えば、Ｋｒａｅｍｅｒら、１９９３）。
【０２６２】
　略言すれば、ＢＲＣＡ１暗号配列のストレッチをプラスミドＰＥＴ５Ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中の融合蛋白質としてクローン化した。ＢＲＣＡ１を組み込んだ配列は配列番号２の＃１３６１−１５５４に対応するアミノ酸を含む。ＩＰＴＧでの誘導の後、予測される分子量を持つ融合蛋白質の過剰生産を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって確認した。融合蛋白質は電気溶出によってゲルから精製した。ＢＲＣＡ１融合産物としての蛋白質の同定は、Ｎ−末端における蛋白質配列決定によって確認した。次いで、該精製した蛋白質をウキザにおける免疫原として使用した。ウサギをフロイントの完全なアジュバント中の１００μｇ蛋白質で免疫化し、３週間隔で２回（最初、フロイントの不完全アジュバント中の免疫原１００μｇで、続いてＰＢＳ中の免疫原１００μｇ）追加免疫した。しかる後、血清を含有する抗体を２週間収集する。
【０２６３】
　この手法を反復して、ＢＲＣＡ１遺伝子の突然変異体形に対する抗体を得る。野生型ＢＲＣＡ１に対する抗体と組み合わせて、これらの抗体を用いて種々の組織および生物学的流体中の突然変異体形の存在および相対的レベルを検出する。
【０２６４】
　　　　　　　　　　　　　　　実施例１３
　ＢＲＣＡ１に特異的なモノクローナル抗体の作製
　以下のプロトコルに従ってモノクローナル抗体を作製する。よく知られているごとく、グルタルアルデヒドまたはＥＤＣを用い、キーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートした無傷ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ１ペプチド（野生型または突然変異体）からなる免疫原でマウスを免疫化する。
【０２６５】
　該免疫原をアジュバントと混合する。各マウスに免疫原１０ないし１００μｇの４回の注射を摂取させ、第４回目の注射の後、血液試料をマウスから採取して、該血清が免疫原に対する抗体を含有するか否かを判断する。血清力価をＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって測定する。免疫原に対する抗体の存在を示す血清を持つマウスをハイブリドーマ作製のために選択する。
【０２６６】
　免疫マウスから脾臓を摘出し、単細胞懸濁液を調製する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８参照）。細胞融合は実質的にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５によって記載されているごとくに行う。略言すれば、ＨａｒｌｏｗｅおよびＬａｎｅ、１９８８によって記載されているようにポリエチレングリコールを用い、Ｐ３.６５.３骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を免疫脾臓細胞と融合させる。細胞を９６ウェル組織培養プレート中、２×１０５細胞／ウェルの密度で平板培養する。個々のウェルを増殖につき調べ、増殖したウェルの上清を、野生型または突然変異体ＢＲＣＡ１標的蛋白質を用い、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって、ＢＲＣＡ１特異的抗体の存在につきテストする。陽性ウェル中の細胞を増殖させ、サブクローンしてモノクローナル抗体を確立し確認する。
【０２６７】
　所望の特異性を持つクローンを増殖させ、マウスまたは中空繊維中で腹水として増殖させて、特徴付けおよびアッセイ開発のために十分量の抗体を得る。
【０２６８】
　　　　　　　　　　　　　　　実施例１４
　ＢＲＣＡ１についてのサンドイッチアッセイ
　モノクローナル抗体をプレート、チューブ、ビーズ、または粒子のごとき固体表面に結合させる。好ましくは、抗体を９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル表面に結合させる。ＢＲＣＡ１ペプチド／蛋白質（野生型または突然変異体）を含有する１００μｌ試料（例えば、血清、尿、組織サイトゾル）を固相抗体に結合させる。試料を室温で２時間インキュベートする。次いで、試料流体をデカントし、該固相を緩衝液で洗浄した、未結合物質を除去する。１００μｌの第２モノクローナル抗体（ＢＲＣＡ１ペプチド／蛋白質上の異なる抗原決定基に対するもの）を該固相に添加する。この抗体を検出器分子（例えば、１２５Ｉ、酵素、蛍光体、または発色団）で標識し、第２抗体と共に固相を室温で２時間インキュベートする。第２抗体をデカントし、固相を緩衝液で洗浄して未結合物質を除去する。
【０２６９】
　結合した標識の量（これは、試料に存在するＢＲＣＡ１ペプチド／蛋白質の量に比例する）を定量する。野生型ＢＲＣＡ１につき特異的なモノクローナル抗体ならびにＢＲＣＡ１で同定された突然変異体の各々に特異的なモノクローナル抗体を用い、別々のアッセイを行う。
【０２７０】
　本発明の方法および組成物は種々の具体例の形態で具体化でき、そのうちの少しのみを本明細書で開示したことは認識されるであろう。本発明の精神を逸脱することなく他の具体例が存在することは当業者に明らかである。かくして、記載した具体化は例示的であって、制限的なものであると解釈されるべきではない。
【０２７１】
　　　　　　　　　　　　　　文献のリスト
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　Ｓｎｏｕｗａｅｒｔ，Ｊ．Ｎ．ら（１９９２）．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：１０８３
　Ｓｏｒｇｅら（１９８４）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．４：１７３０−１７３７
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　Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら（１９９０）．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１０３−１０７
　Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら（１９９２）．　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ　２：１５１−１６２
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　Ｓｕ，Ｌ．Ｋ．ら（１９９３）．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：２７２８−３１
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　Ｔｏｎｏｌｉｏ，Ｄ．ら（１９９０）．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ
　Ｖａｌａｎｃｉｕｓ，Ｖ．＆　Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｏ．（１９９１）．　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１１：１４０２
　ｖａｎ　Ｄｉｌｌａら（１９８６）．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
４：５３７−５５２
　Ｗａｇｎｅｒら（１９９０）．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：３４１０−３４１４
　Ｗａｇｎｅｒら（１９９１）．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８８：４２５５−４２５９
　ＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８９）．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：９５０８−９５１４
　Ｗａｒｔｅｌｌ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９０）．　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１８：２６９９−２７０５
　Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｌ．（１９９０）．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　７：５２４−５３０
　ＷｅｂｅｒおよびＭａｙ（１９８９）．　Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．　４４：３８８−３９６
　Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１８：４６４０
　Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９１）．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２０２：３９０−４１１
　Ｗｅｔｍｕｒ　＆　Ｄａｖｉｄｓｏｎ（１９６８）．　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　３１：３４９−３７０
　Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ｂ．羅（１９９２）．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１２：３０１−３０６
　ＷｈｉｔｅおよびＬａｌｏｕｅｌ（１９８８）．　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．　２２：２５９−２７９
　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら（１９９２）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２０：２２３３−２２３９
　ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９８４）：　Ｇｅｎｅｔ．　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．　１：７−２０
　Ｗｏｌｆｆら（１９９０）．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６５−１４６８　Ｗｏｌｆｆら（１９９１）．　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１１：４７４−４８５
　Ｗｏｏｓｔｅｒ，Ｒ．ら（１９９４）．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６５：２０８８　Ｗｕら（１９８９ａ）．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４：５６０−５６９
　Ｗｕら（１９８９ｂ）．　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ　２６４：１６９８５−１６９８７
　Ｗｕら（１９９１）．　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６６：１４３３８−１４３４２
　Ｚｅｎｋｅら（１９９０１）．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：３６５５−３６５９
【０２７２】
　特許および特許出願のリスト
　米国特許第３，８１７，８３７号
　米国特許第３，８５０，７５２号
　米国特許第３，９３９，３５０号
　米国特許第３，９９６，３４５号
　米国特許第４，２７５，１４９号
　米国特許第４，２７７，４３７号
　米国特許第４，３６６，２４１号
　米国特許第４，３７６，１１０号
　米国特許第４，４８６，５３０号
　米国特許第４，６８３，１９５号
　米国特許第４，６８３，２０２号
　米国特許第４，８１６，５６７号
　米国特許第４，８６８，１０５号
　米国特許第５，２５２，４７９号
　欧州公開第２２５，８０７号
　欧州特許出願公開第０３３２４３５号
　Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ，ＰＣＴ出願公開ＷＯ　８４／０３５６４、１９８４年９月１３日公開
　Ｈｉｔｚｅｍａｎら、ＥＰ７３，６７５Ａ
　ＰＣＴ出願公開ＷＯ　９３／０７２８２
【０２７３】
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT: Skolnick, Mark H.
Goldgar, David E.
Miki, Yoshio
Swenson, Jeff
Kamb, Alexander
Harshman, Keith D.
Shattuck-Eidens, Donna M.
Tavtigian, Sean V.
Wiseman, Roger W.
Futreal, P. Andrew
(ii) TITLE OF INVENTION: 17q-Linked Breast and Ovarian Cancer
Susceptibility Gene
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 85 
(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:
(A) ADDRESSEE: Venable, Baetjer, Howard & Civiletti, LLP
(B) STREET: 1201 New York Avenue, N.W., Suite 1000
(C) CITY: Washington
(D) STATE: DC
(E) COUNTRY: USA
(F) ZIP: 20005
(v) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) CURRENT APPLICATION DATA: 
(A) APPLICATION NUMBER: 
(B) FILING DATE: 
(C) CLASSIFICATION: 
(vii) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: US 
(B) FILING DATE: 07-JUN-1995
(vii) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: US 08/409,305
(B) FILING DATE: 24-MAR-1995
(vii) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: US 08/348,824
(B) FILING DATE: 29-NOV-1994
(vii) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: US 08/308,104
(B) FILING DATE: 16-SEP-1994
(vii) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: US 08/300,266
(B) FILING DATE: 02-SEP-1994
(vii) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: US 08/289,221
(B) FILING DATE: 12-AUG-1994
(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
(A) NAME: Ihnen, Jeffrey L.
(B) REGISTRATION NUMBER: 28,957
(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 24884-109347
(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:
(A) TELEPHONE: 202-962-4810
(B) TELEFAX: 202-962-8300
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 5914 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 120..5708
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:
agctcgctga gacttcctgg accccgcacc aggctgtggg gtttctcaga taactgggcc     60
CCTGCGCTCA GGAGGCCTTC ACCCTCTGCT CTGGGTAAAG TTCATTGGAA CAGAAAGAA     119
ATG GAT TTA TCT GCT CTT CGC GTT GAA GAA GTA CAA AAT GTC ATT AAT      167
Met Asp Leu Ser Ala Leu Arg Val Glu Glu Val Gln Asn Val Ile Asn  
1               5                  10                  15      
GCT ATG CAG AAA ATC TTA GAG TGT CCC ATC TGT CTG GAG TTG ATC AAG      215
Ala Met Gln Lys Ile Leu Glu Cys Pro Ile Cys Leu Glu Leu Ile Lys  
20                  25                  30          
GAA CCT GTC TCC ACA AAG TGT GAC CAC ATA TTT TGC AAA TTT TGC ATG      263
Glu Pro Val Ser Thr Lys Cys Asp His Ile Phe Cys Lys Phe Cys Met  
35                  40                  45              
CTG AAA CTT CTC AAC CAG AAG AAA GGG CCT TCA CAG TGT CCT TTA TGT      311
Leu Lys Leu Leu Asn Gln Lys Lys Gly Pro Ser Gln Cys Pro Leu Cys  
50                  55                  60                  
AAG AAT GAT ATA ACC AAA AGG AGC CTA CAA GAA AGT ACG AGA TTT AGT      359
Lys Asn Asp Ile Thr Lys Arg Ser Leu Gln Glu Ser Thr Arg Phe Ser  
65                  70                  75                  80  
CAA CTT GTT GAA GAG CTA TTG AAA ATC ATT TGT GCT TTT CAG CTT GAC      407
Gln Leu Val Glu Glu Leu Leu Lys Ile Ile Cys Ala Phe Gln Leu Asp  
85                  90                  95      
ACA GGT TTG GAG TAT GCA AAC AGC TAT AAT TTT GCA AAA AAG GAA AAT      455
Thr Gly Leu Glu Tyr Ala Asn Ser Tyr Asn Phe Ala Lys Lys Glu Asn  
100                 105                 110          
AAC TCT CCT GAA CAT CTA AAA GAT GAA GTT TCT ATC ATC CAA AGT ATG      503
Asn Ser Pro Glu His Leu Lys Asp Glu Val Ser Ile Ile Gln Ser Met  
115                 120                 125              
GGC TAC AGA AAC CGT GCC AAA AGA CTT CTA CAG AGT GAA CCC GAA AAT      551
Gly Tyr Arg Asn Arg Ala Lys Arg Leu Leu Gln Ser Glu Pro Glu Asn  
130                 135                 140                  
CCT TCC TTG CAG GAA ACC AGT CTC AGT GTC CAA CTC TCT AAC CTT GGA      599
Pro Ser Leu Gln Glu Thr Ser Leu Ser Val Gln Leu Ser Asn Leu Gly  
145                 150                 155                 160  
ACT GTG AGA ACT CTG AGG ACA AAG CAG CGG ATA CAA CCT CAA AAG ACG      647
Thr Val Arg Thr Leu Arg Thr Lys Gln Arg Ile Gln Pro Gln Lys Thr  
165                 170                 175      
TCT GTC TAC ATT GAA TTG GGA TCT GAT TCT TCT GAA GAT ACC GTT AAT      695
Ser Val Tyr Ile Glu Leu Gly Ser Asp Ser Ser Glu Asp Thr Val Asn  
180                 185                 190          
AAG GCA ACT TAT TGC AGT GTG GGA GAT CAA GAA TTG TTA CAA ATC ACC      743
Lys Ala Thr Tyr Cys Ser Val Gly Asp Gln Glu Leu Leu Gln Ile Thr  
195                 200                 205              
CCT CAA GGA ACC AGG GAT GAA ATC AGT TTG GAT TCT GCA AAA AAG GCT      791
Pro Gln Gly Thr Arg Asp Glu Ile Ser Leu Asp Ser Ala Lys Lys Ala  
210                 215                 220                  
GCT TGT GAA TTT TCT GAG ACG GAT GTA ACA AAT ACT GAA CAT CAT CAA      839
Ala Cys Glu Phe Ser Glu Thr Asp Val Thr Asn Thr Glu His His Gln  
225                 230                 235                 240  
CCC AGT AAT AAT GAT TTG AAC ACC ACT GAG AAG CGT GCA GCT GAG AGG      887
Pro Ser Asn Asn Asp Leu Asn Thr Thr Glu Lys Arg Ala Ala Glu Arg  
245                 250                 255      
CAT CCA GAA AAG TAT CAG GGT AGT TCT GTT TCA AAC TTG CAT GTG GAG      935
His Pro Glu Lys Tyr Gln Gly Ser Ser Val Ser Asn Leu His Val Glu  
260                 265                 270          
CCA TGT GGC ACA AAT ACT CAT GCC AGC TCA TTA CAG CAT GAG AAC AGC      983
Pro Cys Gly Thr Asn Thr His Ala Ser Ser Leu Gln His Glu Asn Ser  
275                 280                 285              
AGT TTA TTA CTC ACT AAA GAC AGA ATG AAT GTA GAA AAG GCT GAA TTC     1031
Ser Leu Leu Leu Thr Lys Asp Arg Met Asn Val Glu Lys Ala Glu Phe  
290                 295                 300                  
TGT AAT AAA AGC AAA CAG CCT GGC TTA GCA AGG AGC CAA CAT AAC AGA     1079
Cys Asn Lys Ser Lys Gln Pro Gly Leu Ala Arg Ser Gln His Asn Arg  
305                 310                 315                 320  
TGG GCT GGA AGT AAG GAA ACA TGT AAT GAT AGG CGG ACT CCC AGC ACA     1127
Trp Ala Gly Ser Lys Glu Thr Cys Asn Asp Arg Arg Thr Pro Ser Thr  
325                 330                 335      
GAA AAA AAG GTA GAT CTG AAT GCT GAT CCC CTG TGT GAG AGA AAA GAA     1175
Glu Lys Lys Val Asp Leu Asn Ala Asp Pro Leu Cys Glu Arg Lys Glu  
340                 345                 350          
TGG AAT AAG CAG AAA CTG CCA TGC TCA GAG AAT CCT AGA GAT ACT GAA     1223
Trp Asn Lys Gln Lys Leu Pro Cys Ser Glu Asn Pro Arg Asp Thr Glu  
355                 360                 365              
GAT GTT CCT TGG ATA ACA CTA AAT AGC AGC ATT CAG AAA GTT AAT GAG     1271
Asp Val Pro Trp Ile Thr Leu Asn Ser Ser Ile Gln Lys Val Asn Glu  
370                 375                 380                  
TGG TTT TCC AGA AGT GAT GAA CTG TTA GGT TCT GAT GAC TCA CAT GAT     1319
Trp Phe Ser Arg Ser Asp Glu Leu Leu Gly Ser Asp Asp Ser His Asp  
385                 390                 395                 400  
GGG GAG TCT GAA TCA AAT GCC AAA GTA GCT GAT GTA TTG GAC GTT CTA     1367
Gly Glu Ser Glu Ser Asn Ala Lys Val Ala Asp Val Leu Asp Val Leu  
405                 410                 415      
AAT GAG GTA GAT GAA TAT TCT GGT TCT TCA GAG AAA ATA GAC TTA CTG     1415
Asn Glu Val Asp Glu Tyr Ser Gly Ser Ser Glu Lys Ile Asp Leu Leu  
420                 425                 430          
GCC AGT GAT CCT CAT GAG GCT TTA ATA TGT AAA AGT GAA AGA GTT CAC     1463
Ala Ser Asp Pro His Glu Ala Leu Ile Cys Lys Ser Glu Arg Val His  
435                 440                 445              
TCC AAA TCA GTA GAG AGT AAT ATT GAA GAC AAA ATA TTT GGG AAA ACC     1511
Ser Lys Ser Val Glu Ser Asn Ile Glu Asp Lys Ile Phe Gly Lys Thr  
450                 455                 460                  
TAT CGG AAG AAG GCA AGC CTC CCC AAC TTA AGC CAT GTA ACT GAA AAT     1559
Tyr Arg Lys Lys Ala Ser Leu Pro Asn Leu Ser His Val Thr Glu Asn  
465                 470                 475                 480  
CTA ATT ATA GGA GCA TTT GTT ACT GAG CCA CAG ATA ATA CAA GAG CGT     1607
Leu Ile Ile Gly Ala Phe Val Thr Glu Pro Gln Ile Ile Gln Glu Arg  
485                 490                 495      
CCC CTC ACA AAT AAA TTA AAG CGT AAA AGG AGA CCT ACA TCA GGC CTT     1655
Pro Leu Thr Asn Lys Leu Lys Arg Lys Arg Arg Pro Thr Ser Gly Leu  
500                 505                 510          
CAT CCT GAG GAT TTT ATC AAG AAA GCA GAT TTG GCA GTT CAA AAG ACT     1703
His Pro Glu Asp Phe Ile Lys Lys Ala Asp Leu Ala Val Gln Lys Thr  
515                 520                 525              
CCT GAA ATG ATA AAT CAG GGA ACT AAC CAA ACG GAG CAG AAT GGT CAA     1751
Pro Glu Met Ile Asn Gln Gly Thr Asn Gln Thr Glu Gln Asn Gly Gln  
530                 535                 540                  
GTG ATG AAT ATT ACT AAT AGT GGT CAT GAG AAT AAA ACA AAA GGT GAT     1799
Val Met Asn Ile Thr Asn Ser Gly His Glu Asn Lys Thr Lys Gly Asp  
545                 550                 555                 560  
TCT ATT CAG AAT GAG AAA AAT CCT AAC CCA ATA GAA TCA CTC GAA AAA     1847
Ser Ile Gln Asn Glu Lys Asn Pro Asn Pro Ile Glu Ser Leu Glu Lys  
565                 570                 575      
GAA TCT GCT TTC AAA ACG AAA GCT GAA CCT ATA AGC AGC AGT ATA AGC     1895
Glu Ser Ala Phe Lys Thr Lys Ala Glu Pro Ile Ser Ser Ser Ile Ser  
580                 585                 590          
AAT ATG GAA CTC GAA TTA AAT ATC CAC AAT TCA AAA GCA CCT AAA AAG     1943
Asn Met Glu Leu Glu Leu Asn Ile His Asn Ser Lys Ala Pro Lys Lys  
595                 600                 605              
AAT AGG CTG AGG AGG AAG TCT TCT ACC AGG CAT ATT CAT GCG CTT GAA     1991
Asn Arg Leu Arg Arg Lys Ser Ser Thr Arg His Ile His Ala Leu Glu  
610                 615                 620                  
CTA GTA GTC AGT AGA AAT CTA AGC CCA CCT AAT TGT ACT GAA TTG CAA     2039
Leu Val Val Ser Arg Asn Leu Ser Pro Pro Asn Cys Thr Glu Leu Gln  
625                 630                 635                 640  
ATT GAT AGT TGT TCT AGC AGT GAA GAG ATA AAG AAA AAA AAG TAC AAC     2087
Ile Asp Ser Cys Ser Ser Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys Lys Tyr Asn  
645                 650                 655      
CAA ATG CCA GTC AGG CAC AGC AGA AAC CTA CAA CTC ATG GAA GGT AAA     2135
Gln Met Pro Val Arg His Ser Arg Asn Leu Gln Leu Met Glu Gly Lys  
660                 665                 670          
GAA CCT GCA ACT GGA GCC AAG AAG AGT AAC AAG CCA AAT GAA CAG ACA     2183
Glu Pro Ala Thr Gly Ala Lys Lys Ser Asn Lys Pro Asn Glu Gln Thr  
675                 680                 685              
AGT AAA AGA CAT GAC AGC GAT ACT TTC CCA GAG CTG AAG TTA ACA AAT     2231
Ser Lys Arg His Asp Ser Asp Thr Phe Pro Glu Leu Lys Leu Thr Asn  
690                 695                 700                  
GCA CCT GGT TCT TTT ACT AAG TGT TCA AAT ACC AGT GAA CTT AAA GAA     2279
Ala Pro Gly Ser Phe Thr Lys Cys Ser Asn Thr Ser Glu Leu Lys Glu  
705                 710                 715                 720  
TTT GTC AAT CCT AGC CTT CCA AGA GAA GAA AAA GAA GAG AAA CTA GAA     2327
Phe Val Asn Pro Ser Leu Pro Arg Glu Glu Lys Glu Glu Lys Leu Glu  
725                 730                 735      
ACA GTT AAA GTG TCT AAT AAT GCT GAA GAC CCC AAA GAT CTC ATG TTA     2375
Thr Val Lys Val Ser Asn Asn Ala Glu Asp Pro Lys Asp Leu Met Leu  
740                 745                 750          
AGT GGA GAA AGG GTT TTG CAA ACT GAA AGA TCT GTA GAG AGT AGC AGT     2423
Ser Gly Glu Arg Val Leu Gln Thr Glu Arg Ser Val Glu Ser Ser Ser  
755                 760                 765              
ATT TCA TTG GTA CCT GGT ACT GAT TAT GGC ACT CAG GAA AGT ATC TCG     2471
Ile Ser Leu Val Pro Gly Thr Asp Tyr Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ser  
770                 775                 780                  
TTA CTG GAA GTT AGC ACT CTA GGG AAG GCA AAA ACA GAA CCA AAT AAA     2519
Leu Leu Glu Val Ser Thr Leu Gly Lys Ala Lys Thr Glu Pro Asn Lys  
785                 790                 795                 800  
TGT GTG AGT CAG TGT GCA GCA TTT GAA AAC CCC AAG GGA CTA ATT CAT     2567
Cys Val Ser Gln Cys Ala Ala Phe Glu Asn Pro Lys Gly Leu Ile His  
805                 810                 815      
GGT TGT TCC AAA GAT AAT AGA AAT GAC ACA GAA GGC TTT AAG TAT CCA     2615
Gly Cys Ser Lys Asp Asn Arg Asn Asp Thr Glu Gly Phe Lys Tyr Pro  
820                 825                 830          
TTG GGA CAT GAA GTT AAC CAC AGT CGG GAA ACA AGC ATA GAA ATG GAA     2663
Leu Gly His Glu Val Asn His Ser Arg Glu Thr Ser Ile Glu Met Glu  
835                 840                 845              
GAA AGT GAA CTT GAT GCT CAG TAT TTG CAG AAT ACA TTC AAG GTT TCA     2711
Glu Ser Glu Leu Asp Ala Gln Tyr Leu Gln Asn Thr Phe Lys Val Ser  
850                 855                 860                  
AAG CGC CAG TCA TTT GCT CCG TTT TCA AAT CCA GGA AAT GCA GAA GAG     2759
Lys Arg Gln Ser Phe Ala Pro Phe Ser Asn Pro Gly Asn Ala Glu Glu  
865                 870                 875                 880  
GAA TGT GCA ACA TTC TCT GCC CAC TCT GGG TCC TTA AAG AAA CAA AGT     2807
Glu Cys Ala Thr Phe Ser Ala His Ser Gly Ser Leu Lys Lys Gln Ser  
885                 890                 895      
CCA AAA GTC ACT TTT GAA TGT GAA CAA AAG GAA GAA AAT CAA GGA AAG     2855
Pro Lys Val Thr Phe Glu Cys Glu Gln Lys Glu Glu Asn Gln Gly Lys  
900                 905                 910          
AAT GAG TCT AAT ATC AAG CCT GTA CAG ACA GTT AAT ATC ACT GCA GGC     2903
Asn Glu Ser Asn Ile Lys Pro Val Gln Thr Val Asn Ile Thr Ala Gly  
915                 920                 925              
TTT CCT GTG GTT GGT CAG AAA GAT AAG CCA GTT GAT AAT GCC AAA TGT     2951
Phe Pro Val Val Gly Gln Lys Asp Lys Pro Val Asp Asn Ala Lys Cys  
930                 935                 940                  
AGT ATC AAA GGA GGC TCT AGG TTT TGT CTA TCA TCT CAG TTC AGA GGC     2999
Ser Ile Lys Gly Gly Ser Arg Phe Cys Leu Ser Ser Gln Phe Arg Gly  
945                 950                 955                 960  
AAC GAA ACT GGA CTC ATT ACT CCA AAT AAA CAT GGA CTT TTA CAA AAC     3047
Asn Glu Thr Gly Leu Ile Thr Pro Asn Lys His Gly Leu Leu Gln Asn  
965                 970                 975      
CCA TAT CGT ATA CCA CCA CTT TTT CCC ATC AAG TCA TTT GTT AAA ACT     3095
Pro Tyr Arg Ile Pro Pro Leu Phe Pro Ile Lys Ser Phe Val Lys Thr  
980                 985                 990          
AAA TGT AAG AAA AAT CTG CTA GAG GAA AAC TTT GAG GAA CAT TCA ATG     3143
Lys Cys Lys Lys Asn Leu Leu Glu Glu Asn Phe Glu Glu His Ser Met  
995                 1000                1005             
TCA CCT GAA AGA GAA ATG GGA AAT GAG AAC ATT CCA AGT ACA GTG AGC     3191
Ser Pro Glu Arg Glu Met Gly Asn Glu Asn Ile Pro Ser Thr Val Ser  
1010                1015                1020                 
ACA ATT AGC CGT AAT AAC ATT AGA GAA AAT GTT TTT AAA GAA GCC AGC     3239
Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ile Arg Glu Asn Val Phe Lys Glu Ala Ser  
1025                1030                1035                1040 
TCA AGC AAT ATT AAT GAA GTA GGT TCC AGT ACT AAT GAA GTG GGC TCC     3287
Ser Ser Asn Ile Asn Glu Val Gly Ser Ser Thr Asn Glu Val Gly Ser  
1045                1050                1055     
AGT ATT AAT GAA ATA GGT TCC AGT GAT GAA AAC ATT CAA GCA GAA CTA     3335
Ser Ile Asn Glu Ile Gly Ser Ser Asp Glu Asn Ile Gln Ala Glu Leu  
1060                1065                1070         
GGT AGA AAC AGA GGG CCA AAA TTG AAT GCT ATG CTT AGA TTA GGG GTT     3383
Gly Arg Asn Arg Gly Pro Lys Leu Asn Ala Met Leu Arg Leu Gly Val  
1075                1080                1085             
TTG CAA CCT GAG GTC TAT AAA CAA AGT CTT CCT GGA AGT AAT TGT AAG     3431
Leu Gln Pro Glu Val Tyr Lys Gln Ser Leu Pro Gly Ser Asn Cys Lys  
1090                1095                1100                 
CAT CCT GAA ATA AAA AAG CAA GAA TAT GAA GAA GTA GTT CAG ACT GTT     3479
His Pro Glu Ile Lys Lys Gln Glu Tyr Glu Glu Val Val Gln Thr Val  
1105                1110                1115                1120 
AAT ACA GAT TTC TCT CCA TAT CTG ATT TCA GAT AAC TTA GAA CAG CCT     3527
Asn Thr Asp Phe Ser Pro Tyr Leu Ile Ser Asp Asn Leu Glu Gln Pro  
1125                1130                1135     
ATG GGA AGT AGT CAT GCA TCT CAG GTT TGT TCT GAG ACA CCT GAT GAC     3575
Met Gly Ser Ser His Ala Ser Gln Val Cys Ser Glu Thr Pro Asp Asp  
1140                1145                1150         
CTG TTA GAT GAT GGT GAA ATA AAG GAA GAT ACT AGT TTT GCT GAA AAT     3623
Leu Leu Asp Asp Gly Glu Ile Lys Glu Asp Thr Ser Phe Ala Glu Asn  
1155                1160                1165             
GAC ATT AAG GAA AGT TCT GCT GTT TTT AGC AAA AGC GTC CAG AAA GGA     3671
Asp Ile Lys Glu Ser Ser Ala Val Phe Ser Lys Ser Val Gln Lys Gly  
1170                1175                1180                 
GAG CTT AGC AGG AGT CCT AGC CCT TTC ACC CAT ACA CAT TTG GCT CAG     3719
Glu Leu Ser Arg Ser Pro Ser Pro Phe Thr His Thr His Leu Ala Gln  
1185                1190                1195                1200 
GGT TAC CGA AGA GGG GCC AAG AAA TTA GAG TCC TCA GAA GAG AAC TTA     3767
Gly Tyr Arg Arg Gly Ala Lys Lys Leu Glu Ser Ser Glu Glu Asn Leu  
1205                1210                1215     
TCT AGT GAG GAT GAA GAG CTT CCC TGC TTC CAA CAC TTG TTA TTT GGT     3815
Ser Ser Glu Asp Glu Glu Leu Pro Cys Phe Gln His Leu Leu Phe Gly  
1220                1225                1230         
AAA GTA AAC AAT ATA CCT TCT CAG TCT ACT AGG CAT AGC ACC GTT GCT     3863
Lys Val Asn Asn Ile Pro Ser Gln Ser Thr Arg His Ser Thr Val Ala  
1235                1240                1245             
ACC GAG TGT CTG TCT AAG AAC ACA GAG GAG AAT TTA TTA TCA TTG AAG     3911
Thr Glu Cys Leu Ser Lys Asn Thr Glu Glu Asn Leu Leu Ser Leu Lys  
1250                1255                1260                 
AAT AGC TTA AAT GAC TGC AGT AAC CAG GTA ATA TTG GCA AAG GCA TCT     3959
Asn Ser Leu Asn Asp Cys Ser Asn Gln Val Ile Leu Ala Lys Ala Ser  
1265                1270                1275                1280 
CAG GAA CAT CAC CTT AGT GAG GAA ACA AAA TGT TCT GCT AGC TTG TTT     4007
Gln Glu His His Leu Ser Glu Glu Thr Lys Cys Ser Ala Ser Leu Phe  
1285                1290                1295     
TCT TCA CAG TGC AGT GAA TTG GAA GAC TTG ACT GCA AAT ACA AAC ACC     4055
Ser Ser Gln Cys Ser Glu Leu Glu Asp Leu Thr Ala Asn Thr Asn Thr  
1300                1305                1310         
CAG GAT CCT TTC TTG ATT GGT TCT TCC AAA CAA ATG AGG CAT CAG TCT     4103
Gln Asp Pro Phe Leu Ile Gly Ser Ser Lys Gln Met Arg His Gln Ser  
1315                1320                1325             
GAA AGC CAG GGA GTT GGT CTG AGT GAC AAG GAA TTG GTT TCA GAT GAT     4151
Glu Ser Gln Gly Val Gly Leu Ser Asp Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp  
1330                1335                1340                 
GAA GAA AGA GGA ACG GGC TTG GAA GAA AAT AAT CAA GAA GAG CAA AGC     4199
Glu Glu Arg Gly Thr Gly Leu Glu Glu Asn Asn Gln Glu Glu Gln Ser  
1345                1350                1355                1360 
ATG GAT TCA AAC TTA GGT GAA GCA GCA TCT GGG TGT GAG AGT GAA ACA     4247
Met Asp Ser Asn Leu Gly Glu Ala Ala Ser Gly Cys Glu Ser Glu Thr  
1365                1370                1375     
AGC GTC TCT GAA GAC TGC TCA GGG CTA TCC TCT CAG AGT GAC ATT TTA     4295
Ser Val Ser Glu Asp Cys Ser Gly Leu Ser Ser Gln Ser Asp Ile Leu  
1380                1385                1390         
ACC ACT CAG CAG AGG GAT ACC ATG CAA CAT AAC CTG ATA AAG CTC CAG     4343
Thr Thr Gln Gln Arg Asp Thr Met Gln His Asn Leu Ile Lys Leu Gln  
1395                1400                1405             
CAG GAA ATG GCT GAA CTA GAA GCT GTG TTA GAA CAG CAT GGG AGC CAG     4391
Gln Glu Met Ala Glu Leu Glu Ala Val Leu Glu Gln His Gly Ser Gln  
1410                1415                1420                 
CCT TCT AAC AGC TAC CCT TCC ATC ATA AGT GAC TCT TCT GCC CTT GAG     4439
Pro Ser Asn Ser Tyr Pro Ser Ile Ile Ser Asp Ser Ser Ala Leu Glu  
1425                1430                1435                1440 
GAC CTG CGA AAT CCA GAA CAA AGC ACA TCA GAA AAA GCA GTA TTA ACT     4487
Asp Leu Arg Asn Pro Glu Gln Ser Thr Ser Glu Lys Ala Val Leu Thr  
1445                1450                1455     
TCA CAG AAA AGT AGT GAA TAC CCT ATA AGC CAG AAT CCA GAA GGC CTT     4535
Ser Gln Lys Ser Ser Glu Tyr Pro Ile Ser Gln Asn Pro Glu Gly Leu  
1460                1465                1470         
TCT GCT GAC AAG TTT GAG GTG TCT GCA GAT AGT TCT ACC AGT AAA AAT     4583
Ser Ala Asp Lys Phe Glu Val Ser Ala Asp Ser Ser Thr Ser Lys Asn  
1475                1480                1485             
AAA GAA CCA GGA GTG GAA AGG TCA TCC CCT TCT AAA TGC CCA TCA TTA     4631
Lys Glu Pro Gly Val Glu Arg Ser Ser Pro Ser Lys Cys Pro Ser Leu  
1490                1495                1500                 
GAT GAT AGG TGG TAC ATG CAC AGT TGC TCT GGG AGT CTT CAG AAT AGA     4679
Asp Asp Arg Trp Tyr Met His Ser Cys Ser Gly Ser Leu Gln Asn Arg  
1505                1510                1515                1520 
AAC TAC CCA TCT CAA GAG GAG CTC ATT AAG GTT GTT GAT GTG GAG GAG     4727
Asn Tyr Pro Ser Gln Glu Glu Leu Ile Lys Val Val Asp Val Glu Glu  
1525                1530                1535     
CAA CAG CTG GAA GAG TCT GGG CCA CAC GAT TTG ACG GAA ACA TCT TAC     4775
Gln Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro His Asp Leu Thr Glu Thr Ser Tyr  
1540                1545                1550         
TTG CCA AGG CAA GAT CTA GAG GGA ACC CCT TAC CTG GAA TCT GGA ATC     4823
Leu Pro Arg Gln Asp Leu Glu Gly Thr Pro Tyr Leu Glu Ser Gly Ile  
1555                1560                1565             
AGC CTC TTC TCT GAT GAC CCT GAA TCT GAT CCT TCT GAA GAC AGA GCC     4871
Ser Leu Phe Ser Asp Asp Pro Glu Ser Asp Pro Ser Glu Asp Arg Ala  
1570                1575                1580                 
CCA GAG TCA GCT CGT GTT GGC AAC ATA CCA TCT TCA ACC TCT GCA TTG     4919
Pro Glu Ser Ala Arg Val Gly Asn Ile Pro Ser Ser Thr Ser Ala Leu  
1585                1590                1595                1600 
AAA GTT CCC CAA TTG AAA GTT GCA GAA TCT GCC CAG AGT CCA GCT GCT     4967
Lys Val Pro Gln Leu Lys Val Ala Glu Ser Ala Gln Ser Pro Ala Ala  
1605                1610                1615     
GCT CAT ACT ACT GAT ACT GCT GGG TAT AAT GCA ATG GAA GAA AGT GTG     5015
Ala His Thr Thr Asp Thr Ala Gly Tyr Asn Ala Met Glu Glu Ser Val  
1620                1625                1630         
AGC AGG GAG AAG CCA GAA TTG ACA GCT TCA ACA GAA AGG GTC AAC AAA     5063
Ser Arg Glu Lys Pro Glu Leu Thr Ala Ser Thr Glu Arg Val Asn Lys  
1635                1640                1645             
AGA ATG TCC ATG GTG GTG TCT GGC CTG ACC CCA GAA GAA TTT ATG CTC     5111
Arg Met Ser Met Val Val Ser Gly Leu Thr Pro Glu Glu Phe Met Leu  
1650                1655                1660                 
GTG TAC AAG TTT GCC AGA AAA CAC CAC ATC ACT TTA ACT AAT CTA ATT     5159
Val Tyr Lys Phe Ala Arg Lys His His Ile Thr Leu Thr Asn Leu Ile  
1665                1670                1675                1680 
ACT GAA GAG ACT ACT CAT GTT GTT ATG AAA ACA GAT GCT GAG TTT GTG     5207
Thr Glu Glu Thr Thr His Val Val Met Lys Thr Asp Ala Glu Phe Val  
1685                1690                1695     
TGT GAA CGG ACA CTG AAA TAT TTT CTA GGA ATT GCG GGA GGA AAA TGG     5255
Cys Glu Arg Thr Leu Lys Tyr Phe Leu Gly Ile Ala Gly Gly Lys Trp  
1700                1705                1710         
GTA GTT AGC TAT TTC TGG GTG ACC CAG TCT ATT AAA GAA AGA AAA ATG     5303
Val Val Ser Tyr Phe Trp Val Thr Gln Ser Ile Lys Glu Arg Lys Met  
1715                1720                1725             
CTG AAT GAG CAT GAT TTT GAA GTC AGA GGA GAT GTG GTC AAT GGA AGA     5351
Leu Asn Glu His Asp Phe Glu Val Arg Gly Asp Val Val Asn Gly Arg  
1730                1735                1740                 
AAC CAC CAA GGT CCA AAG CGA GCA AGA GAA TCC CAG GAC AGA AAG ATC     5399
Asn His Gln Gly Pro Lys Arg Ala Arg Glu Ser Gln Asp Arg Lys Ile  
1745                1750                1755                1760 
TTC AGG GGG CTA GAA ATC TGT TGC TAT GGG CCC TTC ACC AAC ATG CCC     5447
Phe Arg Gly Leu Glu Ile Cys Cys Tyr Gly Pro Phe Thr Asn Met Pro  
1765                1770                1775     
ACA GAT CAA CTG GAA TGG ATG GTA CAG CTG TGT GGT GCT TCT GTG GTG     5495
Thr Asp Gln Leu Glu Trp Met Val Gln Leu Cys Gly Ala Ser Val Val  
1780                1785                1790         
AAG GAG CTT TCA TCA TTC ACC CTT GGC ACA GGT GTC CAC CCA ATT GTG     5543
Lys Glu Leu Ser Ser Phe Thr Leu Gly Thr Gly Val His Pro Ile Val  
1795                1800                1805             
GTT GTG CAG CCA GAT GCC TGG ACA GAG GAC AAT GGC TTC CAT GCA ATT     5591
Val Val Gln Pro Asp Ala Trp Thr Glu Asp Asn Gly Phe His Ala Ile  
1810                1815                1820                 
GGG CAG ATG TGT GAG GCA CCT GTG GTG ACC CGA GAG TGG GTG TTG GAC     5639
Gly Gln Met Cys Glu Ala Pro Val Val Thr Arg Glu Trp Val Leu Asp  
1825                1830                1835                1840 
AGT GTA GCA CTC TAC CAG TGC CAG GAG CTG GAC ACC TAC CTG ATA CCC     5687
Ser Val Ala Leu Tyr Gln Cys Gln Glu Leu Asp Thr Tyr Leu Ile Pro  
1845                1850                1855     
CAG ATC CCC CAC AGC CAC TAC TGA CTGCAGCCAG CCACAGGTAC AGAGCCACAG    5741
Gln Ile Pro His Ser His Tyr  *                                   
1860                                                 
GACCCCAAGA ATGAGCTTAC AAAGTGGCCT TTCCAGGCCC TGGGAGCTCC TCTCACTCTT   5801
CAGTCCTTCT ACTGTCCTGG CTACTAAATA TTTTATGTAC ATCAGCCTGA AAAGGACTTC   5861
TGGCTATGCA AGGGTCCCTT AAAGATTTTC TGCTTGAAGT CTCCCTTGGA AAT          5914
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1863 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:
Met Asp Leu Ser Ala Leu Arg Val Glu Glu Val Gln Asn Val Ile Asn 
1               5                  10                  15     
Ala Met Gln Lys Ile Leu Glu Cys Pro Ile Cys Leu Glu Leu Ile Lys 
20                  25                  30         
Glu Pro Val Ser Thr Lys Cys Asp His Ile Phe Cys Lys Phe Cys Met 
35                  40                  45             
Leu Lys Leu Leu Asn Gln Lys Lys Gly Pro Ser Gln Cys Pro Leu Cys 
50                  55                  60                 
Lys Asn Asp Ile Thr Lys Arg Ser Leu Gln Glu Ser Thr Arg Phe Ser 
65                  70                  75                  80 
Gln Leu Val Glu Glu Leu Leu Lys Ile Ile Cys Ala Phe Gln Leu Asp 
85                  90                  95     
Thr Gly Leu Glu Tyr Ala Asn Ser Tyr Asn Phe Ala Lys Lys Glu Asn 
100                 105                 110         
Asn Ser Pro Glu His Leu Lys Asp Glu Val Ser Ile Ile Gln Ser Met 
115                 120                 125             
Gly Tyr Arg Asn Arg Ala Lys Arg Leu Leu Gln Ser Glu Pro Glu Asn 
130                 135                 140                 
Pro Ser Leu Gln Glu Thr Ser Leu Ser Val Gln Leu Ser Asn Leu Gly 
145                 150                 155                 160 
Thr Val Arg Thr Leu Arg Thr Lys Gln Arg Ile Gln Pro Gln Lys Thr 
165                 170                 175     
Ser Val Tyr Ile Glu Leu Gly Ser Asp Ser Ser Glu Asp Thr Val Asn 
180                 185                 190         
Lys Ala Thr Tyr Cys Ser Val Gly Asp Gln Glu Leu Leu Gln Ile Thr 
195                 200                 205             
Pro Gln Gly Thr Arg Asp Glu Ile Ser Leu Asp Ser Ala Lys Lys Ala 
210                 215                 220                 
Ala Cys Glu Phe Ser Glu Thr Asp Val Thr Asn Thr Glu His His Gln 
225                 230                 235                 240 
Pro Ser Asn Asn Asp Leu Asn Thr Thr Glu Lys Arg Ala Ala Glu Arg 
245                 250                 255     
His Pro Glu Lys Tyr Gln Gly Ser Ser Val Ser Asn Leu His Val Glu 
260                 265                 270         
Pro Cys Gly Thr Asn Thr His Ala Ser Ser Leu Gln His Glu Asn Ser 
275                 280                 285             
Ser Leu Leu Leu Thr Lys Asp Arg Met Asn Val Glu Lys Ala Glu Phe 
290                 295                 300                 
Cys Asn Lys Ser Lys Gln Pro Gly Leu Ala Arg Ser Gln His Asn Arg 
305                 310                 315                 320 
Trp Ala Gly Ser Lys Glu Thr Cys Asn Asp Arg Arg Thr Pro Ser Thr 
325                 330                 335     
Glu Lys Lys Val Asp Leu Asn Ala Asp Pro Leu Cys Glu Arg Lys Glu 
340                 345                 350         
Trp Asn Lys Gln Lys Leu Pro Cys Ser Glu Asn Pro Arg Asp Thr Glu 
355                 360                 365             
Asp Val Pro Trp Ile Thr Leu Asn Ser Ser Ile Gln Lys Val Asn Glu 
370                 375                 380                 
Trp Phe Ser Arg Ser Asp Glu Leu Leu Gly Ser Asp Asp Ser His Asp 
385                 390                 395                 400 
Gly Glu Ser Glu Ser Asn Ala Lys Val Ala Asp Val Leu Asp Val Leu 
405                 410                 415     
Asn Glu Val Asp Glu Tyr Ser Gly Ser Ser Glu Lys Ile Asp Leu Leu 
420                 425                 430         
Ala Ser Asp Pro His Glu Ala Leu Ile Cys Lys Ser Glu Arg Val His 
435                 440                 445             
Ser Lys Ser Val Glu Ser Asn Ile Glu Asp Lys Ile Phe Gly Lys Thr 
450                 455                 460                 
Tyr Arg Lys Lys Ala Ser Leu Pro Asn Leu Ser His Val Thr Glu Asn 
465                 470                 475                 480 
Leu Ile Ile Gly Ala Phe Val Thr Glu Pro Gln Ile Ile Gln Glu Arg 
485                 490                 495     
Pro Leu Thr Asn Lys Leu Lys Arg Lys Arg Arg Pro Thr Ser Gly Leu 
500                 505                 510         
His Pro Glu Asp Phe Ile Lys Lys Ala Asp Leu Ala Val Gln Lys Thr 
515                 520                 525             
Pro Glu Met Ile Asn Gln Gly Thr Asn Gln Thr Glu Gln Asn Gly Gln 
530                 535                 540                 
Val Met Asn Ile Thr Asn Ser Gly His Glu Asn Lys Thr Lys Gly Asp 
545                 550                 555                 560 
Ser Ile Gln Asn Glu Lys Asn Pro Asn Pro Ile Glu Ser Leu Glu Lys 
565                 570                 575     
Glu Ser Ala Phe Lys Thr Lys Ala Glu Pro Ile Ser Ser Ser Ile Ser 
580                 585                 590         
Asn Met Glu Leu Glu Leu Asn Ile His Asn Ser Lys Ala Pro Lys Lys 
595                 600                 605             
Asn Arg Leu Arg Arg Lys Ser Ser Thr Arg His Ile His Ala Leu Glu 
610                 615                 620                 
Leu Val Val Ser Arg Asn Leu Ser Pro Pro Asn Cys Thr Glu Leu Gln 
625                 630                 635                 640 
Ile Asp Ser Cys Ser Ser Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys Lys Tyr Asn 
645                 650                 655     
Gln Met Pro Val Arg His Ser Arg Asn Leu Gln Leu Met Glu Gly Lys 
660                 665                 670         
Glu Pro Ala Thr Gly Ala Lys Lys Ser Asn Lys Pro Asn Glu Gln Thr 
675                 680                 685             
Ser Lys Arg His Asp Ser Asp Thr Phe Pro Glu Leu Lys Leu Thr Asn 
690                 695                 700                 
Ala Pro Gly Ser Phe Thr Lys Cys Ser Asn Thr Ser Glu Leu Lys Glu 
705                 710                 715                 720 
Phe Val Asn Pro Ser Leu Pro Arg Glu Glu Lys Glu Glu Lys Leu Glu 
725                 730                 735     
Thr Val Lys Val Ser Asn Asn Ala Glu Asp Pro Lys Asp Leu Met Leu 
740                 745                 750         
Ser Gly Glu Arg Val Leu Gln Thr Glu Arg Ser Val Glu Ser Ser Ser 
755                 760                 765             
Ile Ser Leu Val Pro Gly Thr Asp Tyr Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ser 
770                 775                 780                 
Leu Leu Glu Val Ser Thr Leu Gly Lys Ala Lys Thr Glu Pro Asn Lys 
785                 790                 795                 800 
Cys Val Ser Gln Cys Ala Ala Phe Glu Asn Pro Lys Gly Leu Ile His 
805                 810                 815     
Gly Cys Ser Lys Asp Asn Arg Asn Asp Thr Glu Gly Phe Lys Tyr Pro 
820                 825                 830         
Leu Gly His Glu Val Asn His Ser Arg Glu Thr Ser Ile Glu Met Glu 
835                 840                 845             
Glu Ser Glu Leu Asp Ala Gln Tyr Leu Gln Asn Thr Phe Lys Val Ser 
850                 855                 860                 
Lys Arg Gln Ser Phe Ala Pro Phe Ser Asn Pro Gly Asn Ala Glu Glu 
865                 870                 875                 880 
Glu Cys Ala Thr Phe Ser Ala His Ser Gly Ser Leu Lys Lys Gln Ser 
885                 890                 895     
Pro Lys Val Thr Phe Glu Cys Glu Gln Lys Glu Glu Asn Gln Gly Lys 
900                 905                 910         
Asn Glu Ser Asn Ile Lys Pro Val Gln Thr Val Asn Ile Thr Ala Gly 
915                 920                 925             
Phe Pro Val Val Gly Gln Lys Asp Lys Pro Val Asp Asn Ala Lys Cys 
930                 935                 940                 
Ser Ile Lys Gly Gly Ser Arg Phe Cys Leu Ser Ser Gln Phe Arg Gly 
945                 950                 955                 960 
Asn Glu Thr Gly Leu Ile Thr Pro Asn Lys His Gly Leu Leu Gln Asn 
965                 970                 975     
Pro Tyr Arg Ile Pro Pro Leu Phe Pro Ile Lys Ser Phe Val Lys Thr 
980                 985                 990         
Lys Cys Lys Lys Asn Leu Leu Glu Glu Asn Phe Glu Glu His Ser Met 
995                 1000                1005            
Ser Pro Glu Arg Glu Met Gly Asn Glu Asn Ile Pro Ser Thr Val Ser 
1010                1015                1020                
Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ile Arg Glu Asn Val Phe Lys Glu Ala Ser 
1025                1030                1035                1040
Ser Ser Asn Ile Asn Glu Val Gly Ser Ser Thr Asn Glu Val Gly Ser 
1045                1050                1055    
Ser Ile Asn Glu Ile Gly Ser Ser Asp Glu Asn Ile Gln Ala Glu Leu 
1060                1065                1070        
Gly Arg Asn Arg Gly Pro Lys Leu Asn Ala Met Leu Arg Leu Gly Val 
1075                1080                1085            
Leu Gln Pro Glu Val Tyr Lys Gln Ser Leu Pro Gly Ser Asn Cys Lys 
1090                1095                1100                
His Pro Glu Ile Lys Lys Gln Glu Tyr Glu Glu Val Val Gln Thr Val 
1105                1110                1115                1120
Asn Thr Asp Phe Ser Pro Tyr Leu Ile Ser Asp Asn Leu Glu Gln Pro 
1125                1130                1135    
Met Gly Ser Ser His Ala Ser Gln Val Cys Ser Glu Thr Pro Asp Asp 
1140                1145                1150        
Leu Leu Asp Asp Gly Glu Ile Lys Glu Asp Thr Ser Phe Ala Glu Asn 
1155                1160                1165            
Asp Ile Lys Glu Ser Ser Ala Val Phe Ser Lys Ser Val Gln Lys Gly 
1170                1175                1180                
Glu Leu Ser Arg Ser Pro Ser Pro Phe Thr His Thr His Leu Ala Gln 
1185                1190                1195                1200
Gly Tyr Arg Arg Gly Ala Lys Lys Leu Glu Ser Ser Glu Glu Asn Leu 
1205                1210                1215    
Ser Ser Glu Asp Glu Glu Leu Pro Cys Phe Gln His Leu Leu Phe Gly 
1220                1225                1230        
Lys Val Asn Asn Ile Pro Ser Gln Ser Thr Arg His Ser Thr Val Ala 
1235                1240                1245            
Thr Glu Cys Leu Ser Lys Asn Thr Glu Glu Asn Leu Leu Ser Leu Lys 
1250                1255                1260                
Asn Ser Leu Asn Asp Cys Ser Asn Gln Val Ile Leu Ala Lys Ala Ser 
1265                1270                1275                1280
Gln Glu His His Leu Ser Glu Glu Thr Lys Cys Ser Ala Ser Leu Phe 
1285                1290                1295    
Ser Ser Gln Cys Ser Glu Leu Glu Asp Leu Thr Ala Asn Thr Asn Thr 
1300                1305                1310        
Gln Asp Pro Phe Leu Ile Gly Ser Ser Lys Gln Met Arg His Gln Ser 
1315                1320                1325            
Glu Ser Gln Gly Val Gly Leu Ser Asp Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp 
1330                1335                1340                
Glu Glu Arg Gly Thr Gly Leu Glu Glu Asn Asn Gln Glu Glu Gln Ser 
1345                1350                1355                1360
Met Asp Ser Asn Leu Gly Glu Ala Ala Ser Gly Cys Glu Ser Glu Thr 
1365                1370                1375    
Ser Val Ser Glu Asp Cys Ser Gly Leu Ser Ser Gln Ser Asp Ile Leu 
1380                1385                1390        
Thr Thr Gln Gln Arg Asp Thr Met Gln His Asn Leu Ile Lys Leu Gln 
1395                1400                1405            
Gln Glu Met Ala Glu Leu Glu Ala Val Leu Glu Gln His Gly Ser Gln 
1410                1415                1420                
Pro Ser Asn Ser Tyr Pro Ser Ile Ile Ser Asp Ser Ser Ala Leu Glu 
1425                1430                1435                1440
Asp Leu Arg Asn Pro Glu Gln Ser Thr Ser Glu Lys Ala Val Leu Thr 
1445                1450                1455    
Ser Gln Lys Ser Ser Glu Tyr Pro Ile Ser Gln Asn Pro Glu Gly Leu 
1460                1465                1470        
Ser Ala Asp Lys Phe Glu Val Ser Ala Asp Ser Ser Thr Ser Lys Asn 
1475                1480                1485            
Lys Glu Pro Gly Val Glu Arg Ser Ser Pro Ser Lys Cys Pro Ser Leu 
1490                1495                1500                
Asp Asp Arg Trp Tyr Met His Ser Cys Ser Gly Ser Leu Gln Asn Arg 
1505                1510                1515                1520
Asn Tyr Pro Ser Gln Glu Glu Leu Ile Lys Val Val Asp Val Glu Glu 
1525                1530                1535    
Gln Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro His Asp Leu Thr Glu Thr Ser Tyr 
1540                1545                1550        
Leu Pro Arg Gln Asp Leu Glu Gly Thr Pro Tyr Leu Glu Ser Gly Ile 
1555                1560                1565            
Ser Leu Phe Ser Asp Asp Pro Glu Ser Asp Pro Ser Glu Asp Arg Ala 
1570                1575                1580                
Pro Glu Ser Ala Arg Val Gly Asn Ile Pro Ser Ser Thr Ser Ala Leu 
1585                1590                1595                1600
Lys Val Pro Gln Leu Lys Val Ala Glu Ser Ala Gln Ser Pro Ala Ala 
1605                1610                1615    
Ala His Thr Thr Asp Thr Ala Gly Tyr Asn Ala Met Glu Glu Ser Val 
1620                1625                1630        
Ser Arg Glu Lys Pro Glu Leu Thr Ala Ser Thr Glu Arg Val Asn Lys 
1635                1640                1645            
Arg Met Ser Met Val Val Ser Gly Leu Thr Pro Glu Glu Phe Met Leu 
1650                1655                1660                
Val Tyr Lys Phe Ala Arg Lys His His Ile Thr Leu Thr Asn Leu Ile 
1665                1670                1675                1680
Thr Glu Glu Thr Thr His Val Val Met Lys Thr Asp Ala Glu Phe Val 
1685                1690                1695    
Cys Glu Arg Thr Leu Lys Tyr Phe Leu Gly Ile Ala Gly Gly Lys Trp 
1700                1705                1710        
Val Val Ser Tyr Phe Trp Val Thr Gln Ser Ile Lys Glu Arg Lys Met 
1715                1720                1725            
Leu Asn Glu His Asp Phe Glu Val Arg Gly Asp Val Val Asn Gly Arg 
1730                1735                1740                
Asn His Gln Gly Pro Lys Arg Ala Arg Glu Ser Gln Asp Arg Lys Ile 
1745                1750                1755                1760
Phe Arg Gly Leu Glu Ile Cys Cys Tyr Gly Pro Phe Thr Asn Met Pro 
1765                1770                1775    
Thr Asp Gln Leu Glu Trp Met Val Gln Leu Cys Gly Ala Ser Val Val 
1780                1785                1790        
Lys Glu Leu Ser Ser Phe Thr Leu Gly Thr Gly Val His Pro Ile Val 
1795                1800                1805            
Val Val Gln Pro Asp Ala Trp Thr Glu Asp Asn Gly Phe His Ala Ile 
1810                1815                1820                
Gly Gln Met Cys Glu Ala Pro Val Val Thr Arg Glu Trp Val Leu Asp 
1825                1830                1835                1840
Ser Val Ala Leu Tyr Gln Cys Gln Glu Leu Asp Thr Tyr Leu Ile Pro 
1845                1850                1855    
Gln Ile Pro His Ser His Tyr  *  
1860                
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: s754 A
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:
CTAGCCTGGG CAACAAACGA                                                 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: s754 B
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:
GCAGGAAGCA GGAATGGAAC                                                 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: s975 A
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:
TAGGAGATGG ATTATTGGTG                                                 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: s975 B
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:
AGGCAACTTT GCAATGAGTG                                                 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: tdj1474 A
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:
CAGAGTGAGA CCTTGTCTCA AA                                              22
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 23 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: tdj1474 B
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:
TTCTGCAAAC ACCTTAAACT CAG                                             23
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: tdj1239 A
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:
AACCTGGAAG GCAGAGGTTG                                                 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: tdj1239 B
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:
TCTGTACCTG CTAAGCAGTG G                                               21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 111 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 2..111
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11:
G GKC TTA CTC TGT TGT CCC AGC TGG AGT ACA GWG TGC GAT CAT GAG         46
Xaa Leu Leu Cys Cys Pro Ser Trp Ser Thr Xaa Cys Asp His Glu  
1865                1870                1875                 
GCT TAC TGT TGC TTG ACT CCT AGG CTC AAG CGA TCC TAT CAC CTC AGT       94
Ala Tyr Cys Cys Leu Thr Pro Arg Leu Lys Arg Ser Tyr His Leu Ser  
1880                1885                1890                1895 
CTC CAA GTA GCT GGA  CT                                              111
Leu Gln Val Ala Gly     
1900    
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 36 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:
Xaa Leu Leu Cys Cys Pro Ser Trp Ser Thr Xaa Cys Asp His Glu Ala 
1               5                  10                  15     
Tyr Cys Cys Leu Thr Pro Arg Leu Lys Arg Ser Tyr His Leu Ser Leu 
20                  25                  30         
Gln Val Ala Gly 
35     
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1534 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13:
GAGGCTAGAG GGCAGGCACT TTATGGCAAA CTCAGGTAGA ATTCTTCCTC TTCCGTCTCT     60
TTCCTTTTAC GTCATCGGGG AGACTGGGTG GCAATCGCAG CCCGAGAGAC GCATGGCTCT    120
TTCTGCCCTC CATCCTCTGA TGTACCTTGA TTTCGTATTC TGAGAGGCTG CTGCTTAGCG    180
GTAGCCCCTT GGTTTCCGTG GCAACGGAAA AGCGCGGGAA TTACAGATAA ATTAAAACTG    240
CGACTGCGCG GCGTGAGCTC GCTGAGACTT CCTGGACCCC GCACCAGGCT GTGGGGTTTC    300
TCAGATAACT GGGCCCCTGC GCTCAGGAGG CCTTCACCCT CTGCTCTGGG TAAAGGTAGT    360
AGAGTCCCGG GAAAGGGACA GGGGGCCCAA GTGATGCTCT GGGGTACTGG CGTGGGAGAG    420
TGGATTTCCG AAGCTGACAG ATGGGTATTC TTTGACGGGG GGTAGGGGCG GAACCTGAGA    480
GGCGTAAGGC GTTGTGAACC CTGGGGAGGG GGGCAGTTTG TAGGTCGCGA GGGAAGCGCT    540
GAGGATCAGG AAGGGGGCAC TGAGTGTCCG TGGGGGAATC CTCGTGATAG GAACTGGAAT    600
ATGCCTTGAG GGGGACACTA TGTCTTTAAA AACGTCGGCT GGTCATGAGG TCAGGAGTTC    660
CAGACCAGCC TGACCAACGT GGTGAAACTC CGTCTCTACT AAAAATACNA AAATTAGCCG    720
GGCGTGGTGC CGCTCCAGCT ACTCAGGAGG CTGAGGCAGG AGAATCGCTA GAACCCGGGA    780
GGCGGAGGTT GCAGTGAGCC GAGATCGCGC CATTGCACTC CAGCCTGGGC GACAGAGCGA    840
GACTGTCTCA AAACAAAACA AAACAAAACA AAACAAAAAA CACCGGCTGG TATGTATGAG    900
AGGATGGGAC CTTGTGGAAG AAGAGGTGCC AGGAATATGT CTGGGAAGGG GAGGAGACAG    960
GATTTTGTGG GAGGGAGAAC TTAAGAACTG GATCCATTTG CGCCATTGAG AAAGCGCAAG   1020
AGGGAAGTAG AGGAGCGTCA GTAGTAACAG ATGCTGCCGG CAGGGATGTG CTTGAGGAGG   1080
ATCCAGAGAT GAGAGCAGGT CACTGGGAAA GGTTAGGGGC GGGGAGGCCT TGATTGGTGT   1140
TGGTTTGGTC GTTGTTGATT TTGGTTTTAT GCAAGAAAAA GAAAACAACC AGAAACATTG   1200
GAGAAAGCTA AGGCTACCAC CACCTACCCG GTCAGTCACT CCTCTGTAGC TTTCTCTTTC   1260
TTGGAGAAAG GAAAAGACCC AAGGGGTTGG CAGCGATATG TGAAAAAATT CAGAATTTAT   1320
GTTGTCTAAT TACAAAAAGC AACTTCTAGA ATCTTTAAAA ATAAAGGACG TTGTCATTAG   1380
TTCTTCTGGT TTGTATTATT CTAAAACCTT CCAAATCTTC AAATTTACTT TATTTTAAAA   1440
TGATAAAATG AAGTTGTCAT TTTATAAACC TTTTAAAAAG ATATATATAT ATGTTTTTCT   1500
AATGTGTTAA AGTTCATTGG AACAGAAAGA AATG                               1534
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1924 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:
GAGGCTAGAG GGCAGGCACT TTATGGCAAA CTCAGGTAGA ATTCTTCCTC TTCCGTCTCT     60
TTCCTTTTAC GTCATCGGGG AGACTGGGTG GCAATCGCAG CCCGAGAGAC GCATGGCTCT    120
TTCTGCCCTC CATCCTCTGA TGTACCTTGA TTTCGTATTC TGAGAGGCTG CTGCTTAGCG    180
GTAGCCCCTT GGTTTCCGTG GCAACGGAAA AGCGCGGGAA TTACAGATAA ATTAAAACTG    240
CGACTGCGCG GCGTGAGCTC GCTGAGACTT CCTGGACCCC GCACCAGGCT GTGGGGTTTC    300
TCAGATAACT GGGCCCCTGC GCTCAGGAGG CCTTCACCCT CTGCTCTGGG TAAAGGTAGT    360
AGAGTCCCGG GAAAGGGACA GGGGGCCCAA GTGATGCTCT GGGGTACTGG CGTGGGAGAG    420
TGGATTTCCG AAGCTGACAG ATGGGTATTC TTTGACGGGG GGTAGGGGCG GAACCTGAGA    480
GGCGTAAGGC GTTGTGAACC CTGGGGAGGG GGGCAGTTTG TAGGTCGCGA GGGAAGCGCT    540
GAGGATCAGG AAGGGGGCAC TGAGTGTCCG TGGGGGAATC CTCGTGATAG GAACTGGAAT    600
ATGCCTTGAG GGGGACACTA TGTCTTTAAA AACGTCGGCT GGTCATGAGG TCAGGAGTTC    660
CAGACCAGCC TGACCAACGT GGTGAAACTC CGTCTCTACT AAAAATACNA AAATTAGCCG    720
GGCGTGGTGC CGCTCCAGCT ACTCAGGAGG CTGAGGCAGG AGAATCGCTA GAACCCGGGA    780
GGCGGAGGTT GCAGTGAGCC GAGATCGCGC CATTGCACTC CAGCCTGGGC GACAGAGCGA    840
GACTGTCTCA AAACAAAACA AAACAAAACA AAACAAAAAA CACCGGCTGG TATGTATGAG    900
AGGATGGGAC CTTGTGGAAG AAGAGGTGCC AGGAATATGT CTGGGAAGGG GAGGAGACAG    960
GATTTTGTGG GAGGGAGAAC TTAAGAACTG GATCCATTTG CGCCATTGAG AAAGCGCAAG   1020
AGGGAAGTAG AGGAGCGTCA GTAGTAACAG ATGCTGCCGG CAGGGATGTG CTTGAGGAGG   1080
ATCCAGAGAT GAGAGCAGGT CACTGGGAAA GGTTAGGGGC GGGGAGGCCT TGATTGGTGT   1140
TGGTTTGGTC GTTGTTGATT TTGGTTTTAT GCAAGAAAAA GAAAACAACC AGAAACATTG   1200
GAGAAAGCTA AGGCTACCAC CACCTACCCG GTCAGTCACT CCTCTGTAGC TTTCTCTTTC   1260
TTGGAGAAAG GAAAAGACCC AAGGGGTTGG CAGCGATATG TGAAAAAATT CAGAATTTAT   1320
GTTGTCTAAT TACAAAAAGC AACTTCTAGA ATCTTTAAAA ATAAAGGACG TTGTCATTAG   1380
TTCTTCTGGT TTGTATTATT CTAAAACCTT CCAAATCTTC AAATTTACTT TATTTTAAAA   1440
TGATAAAATG AAGTTGTCAT TTTATAAACC TTTTAAAAAG ATATATATAT ATGTTTTTCT   1500
AATGTGTTAA AGTTCATTGG AACAGAAAGA AATGGATTTA TCTGCTCTTC GCGTTGAAGA   1560
AGTACAAAAT GTCATTAATG CTATGCAGAA AATCTTAGAG TGTCCCATCT GGTAAGTCAG   1620
CACAAGAGTG TATTAATTTG GGATTCCTAT GATTATCTCC TATGCAAATG AACAGAATTG   1680
ACCTTACATA CTAGGGAAGA AAAGACATGT CTAGTAAGAT TAGGCTATTG TAATTGCTGA   1740
TTTTCTTAAC TGAAGAACTT TAAAAATATA GAAAATGATT CCTTGTTCTC CATCCACTCT   1800
GCCTCTCCCA CTCCTCTCCT TTTCAACACA ATCCTGTGGT CCGGGAAAGA CAGGGCTCTG   1860
TCTTGATTGG TTCTGCACTG GGCAGGATCT GTTAGATACT GCATTTGCTT TCTCCAGCTC   1920
TAAA                                                                1924
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 631 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:
AAATGCTGAT GATAGTATAG AGTATTGAAG GGATCAATAT AATTCTGTTT TGATATCTGA     60
AAGCTCACTG AAGGTAAGGA TCGTATTCTC TGCTGTATTC TCAGTTCCTG ACACAGCAGA    120
CATTTAATAA ATATTGAACG AACTTGAGGC CTTATGTTGA CTCAGTCATA ACAGCTCAAA    180
GTTGAACTTA TTCACTAAGA ATAGCTTTAT TTTTAAATAA ATTATTGAGC CTCATTTATT    240
TTCTTTTTCT CCCCCCCCTA CCCTGCTAGT CTGGAGTTGA TCAAGGAACC TGTCTCCACA    300
AAGTGTGACC ACATATTTTG CAAGTAAGTT TGAATGTGTT ATGTGGCTCC ATTATTAGCT    360
TTTGTTTTTG TCCTTCATAA CCCAGGAAAC ACCTAACTTT ATAGAAGCTT TACTTTCTTC    420
AATTAAGTGA GAACGAAAAT CCAACTCCAT TTCATTCTTT CTCAGAGAGT ATATAGTTAT    480
CAAAAGTTGG TTGTAATCAT AGTTCCTGGT AAAGTTTTGA CATATATTAT CTTTTTTTTT    540
TTTTGAGACA AGTCTCGCTC TGTCGCCCAG GCTGGAGTGC AGTGGCATGA GGCTTGCTCA    600
CTGCACCTCC GCCCCCGAGT TCAGCGACTC T                                   631
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 481 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:
TGAGATCTAG ACCACATGGT CAAAGAGATA GAATGTGAGC AATAAATGAA CCTTAAATTT     60
TTCAACAGCT ACTTTTTTTT TTTTTTTTTG AGACAGGGKC TTACTCTGTT GTCCCAGCTG    120
GAGTACAGWG TGCGATCATG AGGCTTACTG TTGCTTGACT CCTAGGCTCA AGCGATCCTA    180
TCACCTCAGT CTCCAAGTAG CTGGACTGTA AGTGCACACC ACCATATCCA GCTAAATTTT    240
GTGTTTTCTG TAGAGACGGG GTTTCGCCAT GTTTCCCAGG CTGGTCTTGA ACTTTGGGCT    300
TAACCCGTCT GCCCACCTAG GCATCCCAAA GTGCTAGGAT TACAGGTGTG AGTCATCATG    360
CCTGGCCAGT ATTTTAGTTA GCTCTGTCTT TTCAAGTCAT ATACAAGTTC ATTTTCTTTT    420
AAGTTTAGTT AACAACCTTA TATCATGTAT TCTTTTCTAG CATAAAGAAA GATTCGAGGC    480
C                                                                    481
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 522 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:
TGTGATCATA ACAGTAAGCC ATATGCATGT AAGTTCAGTT TTCATAGATC ATTGCTTATG     60
TAGTTTAGGT TTTTGCTTAT GCAGCATCCA AAAACAATTA GGAAACTATT GCTTGTAATT    120
CACCTGCCAT TACTTTTTAA ATGGCTCTTA AGGGCAGTTG TGAGATTATC TTTTCATGGC    180
TATTTGCCTT TTGAGTATTC TTTCTACAAA AGGAAGTAAA TTAAATTGTT CTTTCTTTCT    240
TTATAATTTA TAGATTTTGC ATGCTGAAAC TTCTCAACCA GAAGAAAGGG CCTTCACAGT    300
GTCCTTTATG TAAGAATGAT ATAACCAAAA GGTATATAAT TTGGTAATGA TGCTAGGTTG    360
GAAGCAACCA CAGTAGGAAA AAGTAGAAAT TATTTAATAA CATAGCGTTC CTATAAAACC    420
ATTCATCAGA AAAATTTATA AAAGAGTTTT TAGCACACAG TAAATTATTT CCAAAGTTAT    480
TTTCCTGAAA GTTTTATGGG CATCTGCCTT ATACAGGTAT TG                       522
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 465 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:
GGTAGGCTTA AATGAATGAC AAAAAGTTAC TAAATCACTG CCATCACACG GTTTATACAG     60
ATGTCAATGA TGTATTGATT ATAGAGGTTT TCTACTGTTG CTGCATCTTA TTTTTATTTG    120
TTTACATGTC TTTTCTTATT TTAGTGTCCT TAAAAGGTTG ATAATCACTT GCTGAGTGTG    180
TTTCTCAAAC AATTTAATTT CAGGAGCCTA CAAGAAAGTA CGAGATTTAG TCAACTTGTT    240
GAAGAGCTAT TGAAAATCAT TTGTGCTTTT CAGCTTGACA CAGGTTTGGA GTGTAAGTGT    300
TGAATATCCC AAGAATGACA CTCAAGTGCT GTCCATGAAA ACTCAGGAAG TTTGCACAAT    360
TACTTTCTAT GACGTGGTGA TAAGACCTTT TAGTCTAGGT TAATTTTAGT TCTGTATCTG    420
TAATCTATTT TAAAAAATTA CTCCCACTGG TCTCACACCT TATTT                    465
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 513 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19:
AAAAAATCAC AGGTAACCTT AATGCATTGT CTTAACACAA CAAAGAGCAT ACATAGGGTT     60
TCTCTTGGTT TCTTTGATTA TAATTCATAC ATTTTTCTCT AACTGCAAAC ATAATGTTTT    120
CCCTTGTATT TTACAGATGC AAACAGCTAT AATTTTGCAA AAAAGGAAAA TAACTCTCCT    180
GAACATCTAA AAGATGAAGT TTCTATCATC CAAAGTATGG GCTACAGAAA CCGTGCCAAA    240
AGACTTCTAC AGAGTGAACC CGAAAATCCT TCCTTGGTAA AACCATTTGT TTTCTTCTTC    300
TTCTTCTTCT TCTTTTCTTT TTTTTTTCTT TTTTTTTTTG AGATGGAGTC TTGCTCTGTG    360
GCCCAGGCTA GAAGCAGTCC TCCTGCCTTA GCCNCCTTAG TAGCTGGGAT TACAGGCACG    420
CGCACCATGC CAGGCTAATT TTTGTATTTT TAGTAGAGAC GGGGTTTCAT CATGTTGGCC    480
AGGCTGGTCT CGAACTCCTA ACCTCAGGTG ATC                                 513
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 6769 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20:
ATGATGGAGA TCTTAAAAAG TAATCATTCT GGGGCTGGGC GTAGTAGCTT GCACCTGTAA     60
TCCCAGCACT TCGGGAGGCT GAGGCAGGCA GATAATTTGA GGTCAGGAGT TTGAGACCAG    120
CCTGGCCAAC ATGGTGAAAC CCATCTCTAC TAAAAATACA AAAATTAGCT GGGTGTGGTG    180
GCACGTACCT GTAATCCCAG CTACTCGGGA GGCGGAGGCA CAAGAATTGC TTGAACCTAG    240
GACGCGGAGG TTGCAGCGAG CCAAGATCGC GCCACTGCAC TCCAGCCTGG GCCGTAGAGT    300
GAGACTCTGT CTCAAAAAAG AAAAAAAAGT AATTGTTCTA GCTGGGCGCA GTGGCTCTTG    360
CCTGTAATCC CAGCACTTTG GGAGGCCAAG GCGGGTGGAT CTCGAGTCCT AGAGTTCAAG    420
ACCAGCCTAG GCAATGTGGT GAAACCCCAT CGCTACAAAA AATACAAAAA TTAGCCAGGC    480
ATGGTGGCGT GCGCATGTAG TCCCAGCTCC TTGGGAGGCT GAGGTGGGAG GATCACTTGA    540
ACCCAGGAGA CAGAGGTTGC AGTGAACCGA GATCACGCCA CCACGCTCCA GCCTGGGCAA    600
CAGAACAAGA CTCTGTCTAA AAAAATACAA ATAAAATAAA AGTAGTTCTC ACAGTACCAG    660
CATTCATTTT TCAAAAGATA TAGAGCTAAA AAGGAAGGAA AAAAAAAGTA ATGTTGGGCT    720
TTTAAATACT CGTTCCTATA CTAAATGTTC TTAGGAGTGC TGGGGTTTTA TTGTCATCAT    780
TTATCCTTTT TAAAAATGTT ATTGGCCAGG CACGGTGGCT CATGGCTGTA ATCCCAGCAC    840
TTTGGGAGGC CGAGGCAGGC AGATCACCTG AGGTCAGGAG TGTGAGACCA GCCTGGCCAA    900
CATGGCGAAA CCTGTCTCTA CTAAAAATAC AAAAATTAAC TAGGCGTGGT GGTGTACGCC    960
TGTAGTCCCA GCTACTCGGG AGGCTGAGGC AGGAGAATCA ACTGAACCAG GGAGGTGGAG   1020
GTTGCAGTGT GCCGAGATCA CGCCACTGCA CTCTAGCCTG GCAACAGAGC AAGATTCTGT   1080
CTCAAAAAAA AAAAACATAT ATACACATAT ATCCCAAAGT GCTGGGATTA CATATATATA   1140
TATATATATA TATTATATAT ATATATATAT ATATATGTGA TATATATGTG ATATATATAT   1200
AACATATATA TATGTAATAT ATATGTGATA TATATATAAT ATATATATGT AATATATATG   1260
TGATATATAT ATATACACAC ACACACACAT ATATATGTAT GTGTGTGTAC ACACACACAC   1320
ACAAATTAGC CAGGCATAGT TGCACACGCT TGGTAGACCC AGCTACTCAG GAGGCTGAGG   1380
GAGGAGAATC TCTTGAACTT AGGAGGCGGA GGTTGCAGTG AGCTGAGATT GCGCCACTGC   1440
ACTCCAGCCT GGGTGACAGA GCAGGACTCT GTACACCCCC CAAAACAAAA AAAAAAGTTA   1500
TCAGATGTGA TTGGAATGTA TATCAAGTAT CAGCTTCAAA ATATGCTATA TTAATACTTC   1560
AAAAATTACA CAAATAATAC ATAATCAGGT TTGAAAAATT TAAGACAACM SAARAAAAAA   1620
WYCMAATCAC AMATATCCCA CACATTTTAT TATTMCTMCT MCWATTATTT TGWAGAGMCT   1680
GGGTCTCACY CYKTTGCTWA TGCTGGTCTT TGAACYCCYK GCCYCAARCA RTCCTSCTCC   1740
ABCCTCCCAA RGTGCTGGGG ATWATAGGCA TGARCTAACC GCACCCAGCC CCAGACATTT   1800
TAGTGTGTAA ATTCCTGGGC ATTTTTTCAA GGCATCATAC ATGTTAGCTG ACTGATGATG   1860
GTCAATTTAT TTTGTCCATG GTGTCAAGTT TCTCTTCAGG AGGAAAAGCA CAGAACTGGC   1920
CAACAATTGC TTGACTGTTC TTTACCATAC TGTTTAGCAG GAAACCAGTC TCAGTGTCCA   1980
ACTCTCTAAC CTTGGAACTG TGAGAACTCT GAGGACAAAG CAGCGGATAC AACCTCAAAA   2040
GACGTCTGTC TACATTGAAT TGGGTAAGGG TCTCAGGTTT TTTAAGTATT TAATAATAAT   2100
TGCTGGATTC CTTATCTTAT AGTTTTGCCA AAAATCTTGG TCATAATTTG TATTTGTGGT   2160
AGGCAGCTTT GGGAAGTGAA TTTTATGAGC CCTATGGTGA GTTATAAAAA ATGTAAAAGA   2220
CGCAGTTCCC ACCTTGAAGA ATCTTACTTT AAAAAGGGAG CAAAAGAGGC CAGGCATGGT   2280
GGCTCACACC TGTAATCCCA GCACTTTGGG AGGCCAAAGT GGGTGGATCA CCTGAGGTCG   2340
GGAGTTCGAG ACCAGCCTAG CCAACATGGA GAAACTCTGT CTGTACCAAA AAATAAAAAA   2400
TTAGCCAGGT GTGGTGGCAC ATAACTGTAA TCCCAGCTAC TCGGGAGGCT GAGGCAGGAG   2460
AATCACTTGA ACCCGGGAGG TGGAGGTTGC GGTGAACCGA GATCGCACCA TTGCACTCCA   2520
GCCTGGGCAA AAATAGCGAA ACTCCATCTA AAAAAAAAAA AGAGAGCAAA AGAAAGAMTM   2580
TCTGGTTTTA AMTMTGTGTA AATATGTTTT TGGAAAGATG GAGAGTAGCA ATAAGAAAAA   2640
ACATGATGGA TTGCTACAGT ATTTAGTTCC AAGATAAATT GTACTAGATG AGGAAGCCTT   2700
TTAAGAAGAG CTGAATTGCC AGGCGCAGTG GCTCACGCCT GTAATCCCAG CACTTTGGGA   2760
GGCCGAGGTG GGCGGATCAC CTGAGGTCGG GAGTTCAAGA CCAGCCTGAC CAACATGGAG   2820
AAACCCCATC TCTACTAAAA AAAAAAAAAA AAAAATTAGC CGGGGTGGTG GCTTATGCCT   2880
GTAATCCCAG CTACTCAGGA GGCTGAGGCA GGAGAATCGC TTGAACCCAG GAAGCAGAGG   2940
TTGCAGTGAG CCAAGATCGC ACCATTGCAC TCCAGCCTAG GCAACAAGAG TGAAACTCCA   3000
TCTCAAAAAA AAAAAAAAAG AGCTGAATCT TGGCTGGGCA GGATGGCTCG TGCCTGTAAT   3060
CCTAACGCTT TGGAAGACCG AGGCAGAAGG ATTGGTTGAG TCCACGAGTT TAAGACCAGC   3120
CTGGCCAACA TAGGGGAACC CTGTCTCTAT TTTTAAAATA ATAATACATT TTTGGCCGGT   3180
GCGGTGGCTC ATGCCTGTAA TCCCAATACT TTGGGAGGCT GAGGCAGGTA GATCACCTGA   3240
GGTCAGAGTT CGAGACCAGC CTGGATAACC TGGTGAAACC CCTCTTTACT AAAAATACAA   3300
AAAAAAAAAA AAATTAGCTG GGTGTGGTAG CACATGCTTG TAATCCCAGC TACTTGGGAG   3360
GCTGAGGCAG GAGAATCGCT TGAACCAGGG AGGCGGAGGT TACAATGAGC CAACACTACA   3420
CCACTGCACT CCAGCCTGGG CAATAGAGTG AGACTGCATC TCAAAAAAAT AATAATTTTT   3480
AAAAATAATA AATTTTTTTA AGCTTATAAA AAGAAAAGTT GAGGCCAGCA TAGTAGCTCA   3540
CATCTGTAAT CTCAGCAGTG GCAGAGGATT GCTTGAAGCC AGGAGTTTGA GACCAGCCTG   3600
GGCAACATAG CAAGACCTCA TCTCTACAAA AAAATTTCTT TTTTAAATTA GCTGGGTGTG   3660
GTGGTGTGCA TCTGTAGTCC CAGCTACTCA GGAGGCAGAG GTGAGTGGAT ACATTGAACC   3720
CAGGAGTTTG AGGCTGTAGT GAGCTATGAT CATGCCACTG CACTCCAACC TGGGTGACAG   3780
AGCAAGACCT CCAAAAAAAA AAAAAAAAGA GCTGCTGAGC TCAGAATTCA AACTGGGCTC   3840
TCAAATTGGA TTTTCTTTTA GAATATATTT ATAATTAAAA AGGATAGCCA TCTTTTGAGC   3900
TCCCAGGCAC CACCATCTAT TTATCATAAC ACTTACTGTT TTCCCCCCTT ATGATCATAA   3960
ATTCCTAGAC AACAGGCATT GTAAAAATAG TTATAGTAGT TGATATTTAG GAGCACTTAA   4020
CTATATTCCA GGCACTATTG TGCTTTTCTT GTATAACTCA TTAGATGCTT GTCAGACCTC   4080
TGAGATTGTT CCTATTATAC TTATTTTACA GATGAGAAAA TTAAGGCACA GAGAAGTTAT   4140
GAAATTTTTC CAAGGTATTA AACCTAGTAA GTGGCTGAGC CATGATTCAA ACCTAGGAAG   4200
TTAGATGTCA GAGCCTGTGC TTTTTTTTTG TTTTTGTTTT TGTTTTCAGT AGAAACGGGG   4260
GTCTCACTTT GTTGGCCAGG CTGGTCTTGA ACTCCTAACC TCAAATAATC CACCCATCTC   4320
GGCCTCCTCA AGTGCTGGGA TTACAGGTGA GAGCCACTGT GCCTGGCGAA GCCCATGCCT   4380
TTAACCACTT CTCTGTATTA CATACTAGCT TAACTAGCAT TGTACCTGCC ACAGTAGATG   4440
CTCAGTAAAT ATTTCTAGTT GAATATCTGT TTTTCAACAA GTACATTTTT TTAACCCTTT   4500
TAATTAAGAA AACTTTTATT GATTTATTTT TTGGGGGGAA ATTTTTTAGG ATCTGATTCT   4560
TCTGAAGATA CCGTTAATAA GGCAACTTAT TGCAGGTGAG TCAAAGAGAA CCTTTGTCTA   4620
TGAAGCTGGT ATTTTCCTAT TTAGTTAATA TTAAGGATTG ATGTTTCTCT CTTTTTAAAA   4680
ATATTTTAAC TTTTATTTTA GGTTCAGGGA TGTATGTGCA GTTTGTTATA TAGGTAAACA   4740
CACGACTTGG GATTTGGTGT ATAGATTTTT TTCATCATCC GGGTACTAAG CATACCCCAC   4800
AGTTTTTTGT TTGCTTTCTT TCTGAATTTC TCCCTCTTCC CACCTTCCTC CCTCAAGTAG   4860
GCTGGTGTTT CTCCAGACTA GAATCATGGT ATTGGAAGAA ACCTTAGAGA TCATCTAGTT   4920
TAGTTCTCTC ATTTTATAGT GGAGGAAATA CCCTTTTTGT TTGTTGGATT TAGTTATTAG   4980
CACTGTCCAA AGGAATTTAG GATAACAGTA GAACTCTGCA CATGCTTGCT TCTAGCAGAT   5040
TGTTCTCTAA GTTCCTCATA TACAGTAATA TTGACACAGC AGTAATTGTG ACTGATGAAA   5100
ATGTTCAAGG ACTTCATTTT CAACTCTTTC TTTCCTCTGT TCCTTATTTC CACATATCTC   5160
TCAAGCTTTG TCTGTATGTT ATATAATAAA CTACAAGCAA CCCCAACTAT GTTACCTACC   5220
TTCCTTAGGA ATTATTGCTT GACCCAGGTT TTTTTTTTTT TTTTTTTGGA GACGGGGTCT   5280
TGCCCTGTTG CCAGGATGGA GTGTAGTGGC GCCATCTCGG CTCACTGCAA TCTCCAACTC   5340
CCTGGTTCAA GCGATTCTCC TGTCTCAATC TCACGAGTAG CTGGGACTAC AGGTATACAC   5400
CACCACGCCC GGTTAATTGA CCATTCCATT TCTTTCTTTC TCTCTTTTTT TTTTTTTTTT   5460
TTGAGACAGA GTCTTGCTCT GTTGCCCAGG CTGGAGTACA GAGGTGTGAT CTCACCTCTC   5520
CGCAACGTCT GCCTCCCAGG TTGAAGCCAT ACTCCTGCCT CAGCCTCTCT AGTAGCTGGG   5580
ACTACAGGCG CGCGCCACCA CACCCGGCTA ATTTTTGTAT TTTTAGTAGA GATGGGGTTT   5640
CACCATGTTG GCCAGGCTGG TCTTGAACTC ATGACCTCAA GTGGTCCACC CGCCTCAGCC   5700
TCCCAAAGTG CTGGAATTAC AGGCTTGAGC CACCGTGCCC AGCAACCATT TCATTTCAAC   5760
TAGAAGTTTC TAAAGGAGAG AGCAGCTTTC ACTAACTAAA TAAGATTGGT CAGCTTTCTG   5820
TAATCGAAAG AGCTAAAATG TTTGATCTTG GTCATTTGAC AGTTCTGCAT ACATGTAACT   5880
AGTGTTTCTT ATTAGGACTC TGTCTTTTCC CTATAGTGTG GGAGATCAAG AATTGTTACA   5940
AATCACCCCT CAAGGAACCA GGGATGAAAT CAGTTTGGAT TCTGCAAAAA AGGGTAATGG   6000
CAAAGTTTGC CAACTTAACA GGCACTGAAA AGAGAGTGGG TAGATACAGT ACTGTAATTA   6060
GATTATTCTG AAGACCATTT GGGACCTTTA CAACCCACAA AATCTCTTGG CAGAGTTAGA   6120
GTATCATTCT CTGTCAAATG TCGTGGTATG GTCTGATAGA TTTAAATGGT ACTAGACTAA   6180
TGTACCTATA ATAAGACCTT CTTGTAACTG ATTGTTGCCC TTTCGCTTTT TTTTTTGTTT   6240
GTTTGTTTGT TTTTTTTTGA GATGGGGTCT CACTCTGTTG CCCAGGCTGG AGTGCAGTGA   6300
TGCAATCTTG GCTCACTGCA ACCTCCACCT CCAAAGGCTC AAGCTATCCT CCCACTTCAG   6360
CCTCCTGAGT AGCTGGGACT ACAGGCGCAT GCCACCACAC CCGGTTAATT TTTTGTGGTT   6420
TTATAGAGAT GGGGTTTCAC CATGTTACCG AGGCTGGTCT CAAACTCCTG GACTCAAGCA   6480
GTCTGCCCAC TTCAGCCTCC CAAAGTGCTG CAGTTACAGG CTTGAGCCAC TGTGCCTGGC   6540
CTGCCCTTTA CTTTTAATTG GTGTATTTGT GTTTCATCTT TTACCTACTG GTTTTTAAAT   6600
ATAGGGAGTG GTAAGTCTGT AGATAGAACA GAGTATTAAG TAGACTTAAT GGCCAGTAAT   6660
CTTTAGAGTA CATCAGAACC AGTTTTCTGA TGGCCAATCT GCTTTTAATT CACTCTTAGA   6720
CGTTAGAGAA ATAGGTGTGG TTTCTGCATA GGGAAAATTC TGAAATTAA               6769
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 4249 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21:
GATCCTAAGT GGAAATAATC TAGGTAAATA GGAATTAAAT GAAAGAGTAT GAGCTACATC     60
TTCAGTATAC TTGGTAGTTT ATGAGGTTAG TTTCTCTAAT ATAGCCAGTT GGTTGATTTC    120
CACCTCCAAG GTGTATGAAG TATGTATTTT TTTAATGACA ATTCAGTTTT TGAGTACCTT    180
GTTATTTTTG TATATTTTCA GCTGCTTGTG AATTTTCTGA GACGGATGTA ACAAATACTG    240
AACATCATCA ACCCAGTAAT AATGATTTGA ACACCACTGA GAAGCGTGCA GCTGAGAGGC    300
ATCCAGAAAA GTATCAGGGT AGTTCTGTTT CAAACTTGCA TGTGGAGCCA TGTGGCACAA    360
ATACTCATGC CAGCTCATTA CAGCATGAGA ACAGCAGTTT ATTACTCACT AAAGACAGAA    420
TGAATGTAGA AAAGGCTGAA TTCTGTAATA AAAGCAAACA GCCTGGCTTA GCAAGGAGCC    480
AACATAACAG ATGGGCTGGA AGTAAGGAAA CATGTAATGA TAGGCGGACT CCCAGCACAG    540
AAAAAAAGGT AGATCTGAAT GCTGATCCCC TGTGTGAGAG AAAAGAATGG AATAAGCAGA    600
AACTGCCATG CTCAGAGAAT CCTAGAGATA CTGAAGATGT TCCTTGGATA ACACTAAATA    660
GCAGCATTCA GAAAGTTAAT GAGTGGTTTT CCAGAAGTGA TGAACTGTTA GGTTCTGATG    720
ACTCACATGA TGGGGAGTCT GAATCAAATG CCAAAGTAGC TGATGTATTG GACGTTCTAA    780
ATGAGGTAGA TGAATATTCT GGTTCTTCAG AGAAAATAGA CTTACTGGCC AGTGATCCTC    840
ATGAGGCTTT AATATGTAAA AGTGAAAGAG TTCACTCCAA ATCAGTAGAG AGTAATATTG    900
AAGGCCAAAT ATTTGGGAAA ACCTATCGGA AGAAGGCAAG CCTCCCCAAC TTAAGCCATG    960
TAACTGAAAA TCTAATTATA GGAGCATTTG TTACTGAGCC ACAGATAATA CAAGAGCGTC   1020
CCCTCACAAA TAAATTAAAG CGTAAAAGGA GACCTACATC AGGCCTTCAT CCTGAGGATT   1080
TTATCAAGAA AGCAGATTTG GCAGTTCAAA AGACTCCTGA AATGATAAAT CAGGGAACTA   1140
ACCAAACGGA GCAGAATGGT CAAGTGATGA ATATTACTAA TAGTGGTCAT GAGAATAAAA   1200
CAAAAGGTGA TTCTATTCAG AATGAGAAAA ATCCTAACCC AATAGAATCA CTCGAAAAAG   1260
AATCTGCTTT CAAAACGAAA GCTGAACCTA TAAGCAGCAG TATAAGCAAT ATGGAACTCG   1320
AATTAAATAT CCACAATTCA AAAGCACCTA AAAAGAATAG GCTGAGGAGG AAGTCTTCTA   1380
CCAGGCATAT TCATGCGCTT GAACTAGTAG TCAGTAGAAA TCTAAGCCCA CCTAATTGTA   1440
CTGAATTGCA AATTGATAGT TGTTCTAGCA GTGAAGAGAT AAAGAAAAAA AAGTACAACC   1500
AAATGCCAGT CAGGCACAGC AGAAACCTAC AACTCATGGA AGGTAAAGAA CCTGCAACTG   1560
GAGCCAAGAA GAGTAACAAG CCAAATGAAC AGACAAGTAA AAGACATGAC AGCGATACTT   1620
TCCCAGAGCT GAAGTTAACA AATGCACCTG GTTCTTTTAC TAAGTGTTCA AATACCAGTG   1680
AACTTAAAGA ATTTGTCAAT CCTAGCCTTC CAAGAGAAGA AAAAGAAGAG AACTAGAAAC   1740
AGTTAAAGTG TCTAATAATG CTGAAGACCC CAAAGATCTC ATGTTAAGTG GAGAAAGGGT   1800
TTTGCAAACT GAAAGATCTG TAGAGAGTAG CAGTATTTCA TTGGTACCTG GTACTGATTA   1860
TGGCACTCAG GAAAGTATCT CGTTACTGGA AGTTAGCACT CTAGGGAAGG CAAAAACAGA   1920
ACCAAATAAA TGTGTGAGTC AGTGTGCAGC ATTTGAAAAC CCCAAGGGAC TAATTCATGG   1980
TTGTTCCAAA GATAATAGAA ATGACACAGA AGGCTTTAAG TATCCATTGG GACATGAAGT   2040
TAACCACAGT CGGGAAACAA GCATAGAAAT GGAAGAAAGT GAACTTGATG CTCAGTATTT   2100
GCAGAATACA TTCAAGGTTT CAAAGCGCCA GTCATTTGCT CCGTTTTCAA ATCCAGGAAA   2160
TGCAGAAGAG GAATGTGCAA CATTCTCTGC CCACTCTGGG TCCTTAAAGA AACAAAGTCC   2220
AAAAGTCACT TTTGAATGTG AACAAAAGGA AGAAAATCAA GGAAAGAATG AGTCTAATAT   2280
CAAGCCTGTA CAGACAGTTA ATATCACTGC AGGCTTTCCT GTGGTTGGTC AGAAAGATAA   2340
GCCAGTTGAT AATGCCAAAT GTAGTATCAA AGGAGGCTCT AGGTTTTGTC TATCATCTCA   2400
GTTCAGAGGC AACGAAACTG GACTCATTAC TCCAAATAAA CATGGACTTT TACAAAACCC   2460
ATATCGTATA CCACCACTTT TTCCCATCAA GTCATTTGTT AAAACTAAAT GTAAGAAAAA   2520
TCTGCTAGAG GAAAACTTTG AGGAACATTC AATGTCACCT GAAAGAGAAA TGGGAAATGA   2580
GAACATTCCA AGTACAGTGA GCACAATTAG CCGTAATAAC ATTAGAGAAA ATGTTTTTAA   2640
AGAAGCCAGC TCAAGCAATA TTAATGAAGT AGGTTCCAGT ACTAATGAAG TGGGCTCCAG   2700
TATTAATGAA ATAGGTTCCA GTGATGAAAA CATTCAAGCA GAACTAGGTA GAAACAGAGG   2760
GCCAAAATTG AATGCTATGC TTAGATTAGG GGTTTTGCAA CCTGAGGTCT ATAAACAAAG   2820
TCTTCCTGGA AGTAATTGTA AGCATCCTGA AATAAAAAAG CAAGAATATG AAGAAGTAGT   2880
TCAGACTGTT AATACAGATT TCTCTCCATA TCTGATTTCA GATAACTTAG AACAGCCTAT   2940
GGGAAGTAGT CATGCATCTC AGGTTTGTTC TGAGACACCT GATGACCTGT TAGATGATGG   3000
TGAAATAAAG GAAGATACTA GTTTTGCTGA AAATGACATT AAGGAAAGTT CTGCTGTTTT   3060
TAGCAAAAGC GTCCAGAAAG GAGAGCTTAG CAGGAGTCCT AGCCCTTTCA CCCATACACA   3120
TTTGGCTCAG GGTTACCGAA GAGGGGCCAA GAAATTAGAG TCCTCAGAAG AGAACTTATC   3180
TAGTGAGGAT GAAGAGCTTC CCTGCTTCCA ACACTTGTTA TTTGGTAAAG TAAACAATAT   3240
ACCTTCTCAG TCTACTAGGC ATAGCACCGT TGCTACCGAG TGTCTGTCTA AGAACACAGA   3300
GGAGAATTTA TTATCATTGA AGAATAGCTT AAATGACTGC AGTAACCAGG TAATATTGGC   3360
AAAGGCATCT CAGGAACATC ACCTTAGTGA GGAAACAAAA TGTTCTGCTA GCTTGTTTTC   3420
TTCACAGTGC AGTGAATTGG AAGACTTGAC TGCAAATACA AACACCCAGG ATCCTTTCTT   3480
GATTGGTTCT TCCAAACAAA TGAGGCATCA GTCTGAAAGC CAGGGAGTTG GTCTGAGTGA   3540
CAAGGAATTG GTTTCAGATG ATGAAGAAAG AGGAACGGGC TTGGAAGAAA ATAATCAAGA   3600
AGAGCAAAGC ATGGATTCAA ACTTAGGTAT TGGAACCAGG TTTTTGTGTT TGCCCCAGTC   3660
TATTTATAGA AGTGAGCTAA ATGTTTATGC TTTTGGGGAG CACATTTTAC AAATTTCCAA   3720
GTATAGTTAA AGGAACTGCT TCTTAAACTT GAAACATGTT CCTCCTAAGG TGCTTTTCAT   3780
AGAAAAAAGT CCTTCACACA GCTAGGACGT CATCTTTGAC TGAATGAGCT TTAACATCCT   3840
AATTACTGGT GGACTTACTT CTGGTTTCAT TTTATAAAGC AAATCCCGGT GTCCCAAAGC   3900
AAGGAATTTA ATCATTTTGT GTGACATGAA AGTAAATCCA GTCCTGCCAA TGAGAAGAAA   3960
AAGACACAGC AAGTTGCAGC GTTTATAGTC TGCTTTTACA TCTGAACCTC TGTTTTTGTT   4020
ATTTAAGGTG AAGCAGCATC TGGGTGTGAG AGTGAAACAA GCGTCTCTGA AGACTGCTCA   4080
GGGCTATCCT CTCAGAGTGA CATTTTAACC ACTCAGGTAA AAAGCGTGTG TGTGTGTGCA   4140
CATGCGTGTG TGTGGTGTCC TTTGCATTCA GTAGTATGTA TCCCACATTC TTAGGTTTGC   4200
TGACATCATC TCTTTGAATT AATGGCACAA TTGTTTGTGG TTCATTGTC               4249
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 710 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:
NGNGAATGTA ATCCTAATAT TTCNCNCCNA CTTAAAAGAA TACCACTCCA ANGGCATCNC     60
AATACATCAA TCAATTGGGG AATTGGGATT TTCCCTCNCT AACATCANTG GAATAATTTC    120
ATGGCATTAA TTGCATGAAT GTGGTTAGAT TAAAAGGTGT TCATGCTAGA ACTTGTAGTT    180
CCATACTAGG TGATTTCAAT TCCTGTGCTA AAATTAATTT GTATGATATA TTNTCATTTA    240
ATGGAAAGCT TCTCAAAGTA TTTCATTTTC TTGGTACCAT TTATCGTTTT TGAAGCAGAG    300
GGATACCATG CAACATAACC TGATAAAGCT CCAGCAGGAA ATGGCTGAAC TAGAAGCTGT    360
GTTAGAACAG CATGGGAGCC AGCCTTCTAA CAGCTACCCT TCCATCATAA GTGACTCTTC    420
TCCCTTGAG GACCTGCGAA ATCCAGAACA AAGCACATCA GAAAAAGGTG TGTATTGTTG     480
GCCAAACACT GATATCTTAA GCAAAATTCT TTCCTTCCCC TTTATCTCCT TCTGAAGAGT    540
AAGGACCTAG CTCCAACATT TTATGATCCT TGCTCAGCAC ATGGGTAATT ATGGAGCCTT    600
GGTTCTTGTC CCTGCTCACA ACTAATATAC CAGTCAGAGG GACCCAAGGC AGTCATTCAT    660
GTTGTCATCT GAGATACCTA CAACAAGTAG ATGCTATGGG GAGCCCATGG               710
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 473 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23:
CCATTGGTGC TAGCATCTGT CTGTTGCATT GCTTGTGTTT ATAAAATTCT GCCTGATATA     60
CTTGTTAAAA ACCAATTTGT GTATCATAGA TTGATGCTTT TGAAAAAAAT CAGTATTCTA    120
ACCTGAATTA TCACTATCAG AACAAAGCAG TAAAGTAGAT TTGTTTTCTC ATTCCATTTA    180
AAGCAGTATT AACTTCACAG AAAAGTAGTG AATACCCTAT AAGCCAGAAT CCAGAAGGCC    240
TTTCTGCTGA CAAGTTTGAG GTGTCTGCAG ATAGTTCTAC CAGTAAAAAT AAAGAACCAG    300
GAGTGGAAAG GTAAGAAACA TCAATGTAAA GATGCTGTGG TATCTGACAT CTTTATTTAT    360
ATTGAACTCT GATTGTTAAT TTTTTTCACC ATACTTTCTC CAGTTTTTTT GCATACAGGC    420
ATTTATACAC TTTTATTGCT CTAGGATACT TCTTTTGTTT AATCCTATAT AGG           473
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 421 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24:
GGATAAGNTC AAGAGATATT TTGATAGGTG ATGCAGTGAT NAATTGNGAA AATTTNCTGC     60
CTGCTTTTAA TCTTCCCCCG TTCTTTCTTC CTNCCTCCCT CCCTTCCTNC CTCCCGTCCT    120
TNCCTTTCCT TTCCCTCCCT TCCNCCTTCT TTCCNTCTNT CTTTCCTTTC TTTCCTGTCT    180
ACCTTTCTTT CCTTCCTCCC TTCCTTTTCT TTTCTTTCTT TCCTTTCCTT TTCTTTCCTT    240
TCTTTCCTTT CCTTTCTTTC TTGACAGAGT CTTGCTCTGT CACTCAGGCT GGAGTGCAGT    300
GGCGTGATCT CGNCTCACTG CAACCTCTGT CTCCCAGGTT CAAGCAATTT TCCTGCCTCA    360
GCCTCCCGAG TAGCTGAGAT TACAGGCGCC AGCCACCACA CCCAGCTACT GACCTGCTTT    420
T                                                                    421
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 997 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25:
AAACAGCTGG GAGATATGGT GCCTCAGACC AACCCCATGT TATATGTCAA CCCTGACATA     60
TTGGCAGGCA ACATGAATCC AGACTTCTAG GCTGTCATGC GGGCTCTTTT TTGCCAGTCA    120
TTTCTGATCT CTCTGACATG AGCTGTTTCA TTTATGCTTT GGCTGCCCAG CAAGTATGAT    180
TTGTCCTTTC ACAATTGGTG GCGATGGTTT TCTCCTTCCA TTTATCTTTC TAGGTCATCC    240
CCTTCTAAAT GCCCATCATT AGATGATAGG TGGTACATGC ACAGTTGCTC TGGGAGTCTT    300
CAGAATAGAA ACTACCCATC TCAAGAGGAG CTCATTAAGG TTGTTGATGT GGAGGAGCAA    360
CAGCTGGAAG AGTCTGGGCC ACACGATTTG ACGGAAACAT CTTACTTGCC AAGGCAAGAT    420
CTAGGTAATA TTTCATCTGC TGTATTGGAA CAAACACTYT GATTTTACTC TGAATCCTAC    480
ATAAAGATAT TCTGGTTAAC CAACTTTTAG ATGTACTAGT CTATCATGGA CACTTTTGTT    540
ATACTTAATT AAGCCCACTT TAGAAAAATA GCTCAAGTGT TAATCAAGGT TTACTTGAAA    600
ATTATTGAAA CTGTTAATCC ATCTATATTT TAATTAATGG TTTAACTAAT GATTTTGAGG    660
ATGWGGGAGT CKTGGTGTAC TCTAMATGTA TTATTTCAGG CCAGGCATAG TGGCTCACGC    720
CTGGTAATCC CAGTAYYCMR GAGCCCGAGG CAGGTGGAGC CAGCTGAGGT CAGGAGTTCA    780
AGACCTGTCT TGGCCAACAT GGGNGAAACC CTGTCTTCTT CTTAAAAAAN ACAAAAAAAA    840
TTAACTGGGT TGTGCTTAGG TGNATGCCCC GNATCCTAGT TNTTCTTGNG GGTTGAGGGA    900
GGAGATCACN TTGGACCCCG GAGGGGNGGG TGGGGGNGAG CAGGNCAAAA CACNGACCCA    960
GCTGGGGTGG AAGGGAAGCC CACTCNAAAA AANNTTN                             997
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 639 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:
TTTTTAGGAA ACAAGCTACT TTGGATTTCC ACCAACACCT GTATTCATGT ACCCATTTTT     60
CTCTTAACCT AACTTTATTG GTCTTTTTAA TTCTTAACAG AGACCAGAAC TTTGTAATTC    120
AACATTCATC GTTGTGTAAA TTAAACTTCT CCCATTCCTT TCAGAGGGAA CCCCTTACCT    180
GGAATCTGGA ATCAGCCTCT TCTCTGATGA CCCTGAATCT GATCCTTCTG AAGACAGAGC    240
CCCAGAGTCA GCTCGTGTTG GCAACATACC ATCTTCAACC TCTGCATTGA AAGTTCCCCA    300
ATTGAAAGTT GCAGAATCTG CCCAGAGTCC AGCTGCTGCT CATACTACTG ATACTGCTGG    360
GTATAATGCA ATGGAAGAAA GTGTGAGCAG GGAGAAGCCA GAATTGACAG CTTCAACAGA    420
AAGGGTCAAC AAAAGAATGT CCATGGTGGT GTCTGGCCTG ACCCCAGAAG AATTTGTGAG    480
TGTATCCATA TGTATCTCCC TAATGACTAA GACTTAACAA CATTCTGGAA AGAGTTTTAT    540
GTAGGTATTG TCAATTAATA ACCTAGAGGA AGAAATCTAG AAAACAATCA CAGTTCTGTG    600
TAATTTAATT TCGATTACTA ATTTCTGAAA ATTTAGAAY                           639
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 922 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27:
NCCCNNCCCC CNAATCTGAA ATGGGGGTAA CCCCCCCCCA ACCGANACNT GGGTNGCNTA     60
GAGANTTTAA TGGCCCNTTC TGAGGNACAN AAGCTTAAGC CAGGNGACGT GGANCNATGN    120
GTTGTTTNTT GTTTGGTTAC CTCCAGCCTG GGTGACAGAG CAAGACTCTG TCTAAAAAAA    180
AAAAAAAAAA AAATCGACTT TAAATAGTTC CAGGACACGT GTAGAACGTG CAGGATTGCT    240
ACGTAGGTAA ACATATGCCA TGGTGGGATA ACTAGTATTC TGAGCTGTGT GCTAGAGGTA    300
ACTCATGATA ATGGAATATT TGATTTAATT TCAGATGCTC GTGTACAAGT TTGCCAGAAA    360
ACACCACATC ACTTTAACTA ATCTAATTAC TGAAGAGACT ACTCATGTTG TTATGAAAAC    420
AGGTATACCA AGAACCTTTA CAGAATACCT TGCATCTGCT GCATAAAACC ACATGAGGCG    480
AGGCACGGTG GCGCATGCCT GTAATCGCAG CACTTTGGGA GGCCGAGGCG GGCAGATCAC    540
GAGATTAGGA GATCGAGACC ATCCTGGCCA GCATGGTGAA ACCCCGTCTC TACTANNAAA    600
TGGNAAAATT ANCTGGGTGT GGTCGCGTGC NCCTGTAGTC CCAGCTACTC GTGAGGCTGA    660
GGCAGGAGAA TCACTTGAAC CGGGGAAATG GAGGTTTCAG TGAGCAGAGA TCATNCCCCT    720
NCATTCCAGC CTGGCGACAG AGCAAGGCTC CGTCNCCNAA AAAATAAAAA AAAACGTGAA    780
CAAATAAGAA TATTTGTTGA GCATAGCATG GATGATAGTC TTCTAATAGT CAATCAATTA    840
CTTTATGAAA GACAAATAAT AGTTTTGCTG CTTCCTTACC TCCTTTTGTT TTGGGTTAAG    900
ATTTGGAGTG TGGGCCAGGC AC                                             922
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 867 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28:
GATCTATAGC TAGCCTTGGC GTCTAGAAGA TGGGTGTTGA GAAGAGGGAG TGGAAAGATA     60
TTTCCTCTGG TCTTAACTTC ATATCAGCCT CCCCTAGACT TCCAAATATC CATACCTGCT    120
GGTTATAATT AGTGGTGTTT TCAGCCTCTG ATTCTGTCAC CAGGGGTTTT AGAATCATAA    180
ATCCAGATTG ATCTTGGGAG TGTAAAAAAC TGAGGCTCTT TAGCTTCTTA GGACAGCACT    240
TCCTGATTTT GTTTTCAACT TCTAATCCTT TGAGTGTTTT TCATTCTGCA GATGCTGAGT    300
TTGTGTGTGA ACGGACACTG AAATATTTTC TAGGAATTGC GGGAGGAAAA TGGGTAGTTA    360
GCTATTTCTG TAAGTATAAT ACTATTTCTC CCCTCCTCCC TTTAACACCT CAGAATTGCA    420
TTTTTACACC TAACATTTAA CACCTAAGGT TTTTGCTGAT GCTGAGTCTG AGTTACCAAA    480
AGGTCTTTAA ATTGTAATAC TAAACTACTT TTATCTTTAA TATCACTTTG TTCAAGATAA    540
GCTGGTGATG CTGGGAAAAT GGGTCTCTTT TATAACTAAT AGGACCTAAT CTGCTCCTAG    600
CAATGTTAGC ATATGAGCTA GGGATTTATT TAATAGTCGG CAGGAATCCA TGTGCARCAG    660
NCAAACTTAT AATGTTTAAA TTAAACATCA ACTCTGTCTC CAGAAGGAAA CTGCTGCTAC    720
AAGCCTTATT AAAGGGCTGT GGCTTTAGAG GGAAGGACCT CTCCTCTGTC ATTCTTCCTG    780
TGCTCTTTTG TGAATCGCTG ACCTCTCTAT CTCCGTGAAA AGAGCACGTT CTTCTGCTGT    840
ATGTAACCTG TCTTTTCTAT GATCTCT                                        867
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 561 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29:
NAAAAACGGG GNNGGGANTG GGCCTTAAAN CCAAAGGGCN AACTCCCCAA CCATTNAAAA     60
ANTGACNGGG GATTATTAAA ANCGGCGGGA AACATTTCAC NGCCCAACTA ATATTGTTAA    120
ATTAAAACCA CCACCNCTGC NCCAAGGAGG GAAACTGCTG CTACAAGCCT TATTAAAGGG    180
CTGTGGCTTT AGAGGGAAGG ACCTCTCCTC TGTCATTCTT CCTGTGCTCT TTTGTGAATC    240
GCTGACCTCT CTATGTCCGT GAAAAGAGCA CGTTCTTCGT CTGTATGTAA CCTGTCTTTT    300
CTATGATCTC TTTAGGGGTG ACCCAGTCTA TTAAAGAAAG AAAAATGCTG AATGAGGTAA    360
GTACTTGATG TTACAAACTA ACCAGAGATA TTCATTCAGT CATATAGTTA AAAATGTATT    420
TGCTTCCTTC CATCAATGCA CCACTTTCCT TAACAATGCA CAAATTTTCC ATGATAATGA    480
GGATCATCAA GAATTATGCA GGCCTGCACT GTGGCTCATA CCTATAATCC CAGCGCTTTG    540
GGAGGCTGAG GCGCTTGGAT C                                              561
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 567 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30:
AATTTTTTGT ATTTTTAGTA GAGATGAGGT TCACCATGTT GGTCTAGATC TGGTGTCGAA     60
CGTCCTGACC TCAAGTGATC TGCCAGCCTC AGTCTCCCAA AGTGCTAGGA TTACAGGGGT    120
GAGCCACTGC GCCTGGCCTG AATGCCTAAA ATATGACGTG TCTGCTCCAC TTCCATTGAA    180
GGAAGCTTCT CTTTCTCTTA TCCTGATGGG TTGTGTTTGG TTTCTTTCAG CATGATTTTG    240
AAGTCAGAGG AGATGTGGTC AATGGAAGAA ACCACCAAGG TCCAAAGCGA GCAAGAGAAT    300
CCCAGGACAG AAAGGTAAAG CTCCCTCCCT CAAGTTGACA AAAATCTCAC CCCACCACTC    360
TGTATTCCAC TCCCCTTTGC AGAGATGGGC CGCTTCATTT TGTAAGACTT ATTACATACA    420
TACACAGTGC TAGATACTTT CACACAGGTT CTTTTTTCAC TCTTCCATCC CAACCACATA    480
AATAAGTATT GTCTCTACTT TATGAATGAT AAAACTAAGA GATTTAGAGA GGCTGTGTAA    540
TTTGGATTCC CGTCTCGGGT TCAGATC                                        567
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 633 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31:
TTGGCCTGAT TGGTGACAAA AGTGAGATGC TCAGTCCTTG AATGACAAAG AATGCCTGTA     60
GAGTTGCAGG TCCAACTACA TATGCACTTC AAGAAGATCT TCTGAAATCT AGTAGTGTTC    120
TGGACATTGG ACTGCTTGTC CCTGGGAAGT AGCAGCAGAA ATGATCGGTG GTGAACAGAA    180
GAAAAAGAAA AGCTCTTCCT TTTTGAAAGT CTGTTTTTTG AATAAAAGCC AATATTCTTT    240
TATAACTAGA TTTTCCTTCT CTCCATTCCC CTGTCCCTCT CTCTTCCTCT CTTCTTCCAG    300
ATCTTCAGGG GGCTAGAAAT CTGTTGCTAT GGGCCCTTCA CCAACATGCC CACAGGTAAG    360
AGCCTGGGAG AACCCCAGAG TTCCAGCACC AGCCTTTGTC TTACATAGTG GAGTATTATA    420
AGCAAGGTCC CACGATGGGG GTTCCTCAGA TTGCTGAAAT GTTCTAGAGG CTATTCTATT    480
TCTCTACCAC TCTCCAAACA AAACAGCACC TAAATGTTAT CCTATGGCAA AAAAAAACTA    540
TACCTTGTCC CCCTTCTCAA GAGCATGAAG GTGGTTAATA GTTAGGATTC AGTATGTTAT    600
GTGTTCAGAT GGCGTTGAGC TGCTGTTAGT GCC                                 633
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 470 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32:
TTTGAGAGAC TATCAAACCT TATACCAAGT GGCCTTATGG AGACTGATAA CCAGAGTACA     60
TGGCATATCA GTGGCAAATT GACTTAAAAT CCATACCCCT ACTATTTTAA GACCATTGTC    120
CTTTGGAGCA GAGAGACAGA CTCTCCCATT GAGAGGTCTT GCTATAAGCC TTCATCCGGA    180
GAGTGTAGGG TAGAGGGCCT GGGTTAAGTA TGCAGATTAC TGCAGTGATT TTACATGTAA    240
ATGTCCATTT TAGATCAACT GGAATGGATG GTACAGCTGT GTGGTGCTTC TGTGGTGAAG    300
GAGCTTTCAT CATTCACCCT TGGCACAGTA AGTATTGGGT GCCCTGTCAG TGTGGGAGGA    360
CACAATATTC TCTCCTGTGA GCAAGACTGG CACCTGTCAG TCCCTATGGA TGCCCCTACT    420
GTAGCCTCAG AAGTCTTCTC TGCCCACATA CCTGTGCCAA AAGACTCCAT               470
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 517 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33:
GGTGGTACGT GTCTGTAGTT CCAGCTACTT GGGAGGCTGA GATGGAAGGA TTGCTTGAGC     60
CCAGGAGGCA GAGGTGGNAN NTTACGCTGA GATCACACCA CTGCACTCCA GCCTGGGTGA    120
CAGAGCAAGA CCCTGTCTCA AAAACAAACA AAAAAAATGA TGAAGTGACA GTTCCAGTAG    180
TCCTACTTTG ACACTTTGAA TGCTCTTTCC TTCCTGGGGA TCCAGGGTGT CCACCCAATT    240
GTGGTTGTGC AGCCAGATGC CTGGACAGAG GACAATGGCT TCCATGGTAA GGTGCCTCGC    300
ATGTACCTGT GCTATTAGTG GGGTCCTTGT GCATGGGTTT GGTTTATCAC TCATTACCTG    360
GTGCTTGAGT AGCACAGTTC TTGGCACATT TTTAAATATT TGTTGAATGA ATGGCTAAAA    420
TGTCTTTTTG ATGTTTTTAT TGTTATTTGT TTTATATTGT AAAAGTAATA CATGAACTGT    480
TTCCATGGGG TGGGAGTAAG ATATGAATGT TCATCAC                             517
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 434 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34:
CAGTAATCCT NAGAACTCAT ACGACCGGGC CCCTGGAGTC GNTGNTTNGA GCCTAGTCCN     60
GGAGAATGAA TTGACACTAA TCTCTGCTTG TGTTCTCTGT CTCCAGCAAT TGGGCAGATG    120
TGTGAGGCAC CTGTGGTGAC CCGAGAGTGG GTGTTGGACA GTGTAGCACT CTACCAGTGC    180
CAGGAGCTGG ACACCTACCT GATACCCCAG ATCCCCCACA GCCACTACTG ACTGCAGCCA    240
GCCACAGGTA CAGAGCCACA GGACCCCAAG AATGAGCTTA CAAAGTGGCC TTTCCAGGCC    300
CTGGGAGCTC CTCTCACTCT TCAGTCCTTC TACTGTCCTG GCTACTAAAT ATTTTATGTA    360
CATCAGCCTG AAAAGGACTT CTGGCTATGC AAGGGTCCCT TAAAGATTTT CTGCTTGAAG    420
TCTCCCTTGG AAAT                                                      434
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35:
GATAAATTAA AACTGCGACT GCGCGGCGTG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36:
GTAGTAGAGT CCCGGGAAAG GGACAGGGGG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37:
ATATATATAT GTTTTTCTAA TGTGTTAAAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:38:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:38:
GTAAGTCAGC ACAAGAGTGT ATTAATTTGG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39:
TTTCTTTTTC TCCCCCCCCT ACCCTGCTAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40:
GTAAGTTTGA ATGTGTTATG TGGCTCCATT                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41:
AGCTACTTTT TTTTTTTTTT TTTGAGACAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42:
GTAAGTGCAC ACCACCATAT CCAGCTAAAT                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43:
AATTGTTCTT TCTTTCTTTA TAATTTATAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44:
GTATATAATT TGGTAATGAT GCTAGGTTGG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45:
GAGTGTGTTT CTCAAACAAT TTAATTTCAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:46:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:46:
GTAAGTGTTG AATATCCCAA GAATGACACT                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:47:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47:
AAACATAATG TTTTCCCTTG TATTTTACAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:48:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:48:
GTAAAACCAT TTGTTTTCTT CTTCTTCTTC                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:49:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:49:
TGCTTGACTG TTCTTTACCA TACTGTTTAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:50:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:50:
GTAAGGGTCT CAGGTTTTTT AAGTATTTAA                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:51:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:51:
TGATTTATTT TTTGGGGGGA AATTTTTTAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:52:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:52:
GTGAGTCAAA GAGAACCTTT GTCTATGAAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:53:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:53:
TCTTATTAGG ACTCTGTCTT TTCCCTATAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:54:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:54:
GTAATGGCAA AGTTTGCCAA CTTAACAGGC                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:55:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:55:
GAGTACCTTG TTATTTTTGT ATATTTTCAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:56:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:56:
GTATTGGAAC CAGGTTTTTG TGTTTGCCCC                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:57:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:57:
ACATCTGAAC CTCTGTTTTT GTTATTTAAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:58:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:58:
AGGTAAAAAG CGTGTGTGTG TGTGCACATG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:59:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:59:
CATTTTCTTG GTACCATTTA TCGTTTTTGA                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:60:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:60:
GTGTGTATTG TTGGCCAAAC ACTGATATCT                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:61:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:61:
AGTAGATTTG TTTTCTCATT CCATTTAAAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:62:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:62:
GTAAGAAACA TCAATGTAAA GATGCTGTGG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:63:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:63:
ATGGTTTTCT CCTTCCATTT ATCTTTCTAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:64:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:64:
GTAATATTTC ATCTGCTGTA TTGGAACAAA                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:65:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:65:
TGTAAATTAA ACTTCTCCCA TTCCTTTCAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:66:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:66:
GTGAGTGTAT CCATATGTAT CTCCCTAATG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:67:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:67:
ATGATAATGG AATATTTGAT TTAATTTCAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:68:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:68:
GTATACCAAG AACCTTTACA GAATACCTTG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:69:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:69:
CTAATCCTTT GAGTGTTTTT CATTCTGCAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:70:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:70:
GTAAGTATAA TACTATTTCT CCCCTCCTCC                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:71:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:71:
TGTAACCTGT CTTTTCTATG ATCTCTTTAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:72:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:72:
GTAAGTACTT GATGTTACAA ACTAACCAGA                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:73:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:73:
TCCTGATGGG TTGTGTTTGG TTTCTTTCAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:74:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:74:
GTAAAGCTCC CTCCCTCAAG TTGACAAAAA                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:75:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:75:
CTGTCCCTCT CTCTTCCTCT CTTCTTCCAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:76:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:76:
GTAAGAGCCT GGGAGAACCC CAGAGTTCCA                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:77:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:77:
AGTGATTTTA CATGTAAATG TCCATTTTAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:78:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:78:
GTAAGTATTG GGTGCCCTGT CAGTGTGGGA                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:79:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:79:
TTGAATGCTC TTTCCTTCCT GGGGATCCAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:80:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:80:
GTAAGGTGCC TCGCATGTAC CTGTGCTATT                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:81:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:81:
CTAATCTCTG CTTGTGTTCT CTGTCTCCAG                                      30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:82:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: 
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapiens
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:82:
Cys Pro Ile Cys Leu Glu Leu Ile Lys Glu Pro Val Ser Thr Lys Cys 
1               5                   10                  15      
Asp His Ile Phe Cys Lys Phe Cys Met Leu Lys Leu Leu Asn Gln Lys 
20                  25                  30          
Lys Gly Pro Ser Gln Cys Pro Leu Cys Lys 
35                  40          
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:83:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 45 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: 
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:83:
Cys Pro Ile Cys Leu Glu Leu Leu Lys Glu Pro Val Ser Ala Asp Cys 
1               5                   10                  15      
Asn His Ser Phe Cys Arg Ala Cys Ile Thr Leu Asn Tyr Glu Ser Asn 
20                  25                  30          
Arg Asn Thr Asp Gly Lys Gly Asn Cys Pro Val Cys Arg 
35                  40                  45  
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:84:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 41 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: 
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:84:
Cys Pro Ile Cys Leu Asp Met Leu Lys Asn Thr Met Thr Thr Lys Glu 
1               5                   10                  15      
Cys Leu His Arg Phe Cys Ser Asp Cys Ile Val Thr Ala Leu Arg Ser 
20                  25                  30          
Gly Asn Lys Glu Cys Pro Thr Cys Arg 
35                  40      
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:85:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: 
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:85:
Cys Pro Val Cys Leu Gln Tyr Phe Ala Glu Pro Met Met Leu Asp Cys 
1               5                   10                  15      
Gly His Asn Ile Cys Cys Ala Cys Leu Ala Arg Cys Trp Gly Thr Ala 
20                  25                  30          
Cys Thr Asn Val Ser Cys Pro Gln Cys Arg 
35                  40          
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】「染色体１７研究会」によって決定されたＢＲＣＡ１近辺の遺伝子座の順序を示す図である。図１はＦain，1992から再現した。
【図２】Ｍfd15-Ｍfd188領域部分を画定するＹＡＣの模式的地図である。
【図３】ＢＲＣＡ１領域中のＳＴＳ、Ｐ１およびＢＡＣの模式的地図である。
【図４】ヒト染色体１７の模式的地図である。ＢＲＣＡ１を含む直接関係する領域は、２つの以前に同定された遺伝子、ＣＡ１２５およびＲＮＵ２の相対的な位置を示すために拡大されており、ＢＲＣＡ１はマーカーD17S855にわたって広がっている。
【図５】Ｓmith-Ｗaterman配列に最もよく記録される３つの他の亜鉛-フィンガードメインを有するＢＲＣＡ１亜鉛-フィンガードメインの配列を示している。ＲＰＴ１は、マウスにおいてＩＬ-２受容体の負の調節因子であるようである蛋白質をコードしている。ＲＩＮ１は、亜鉛-フィンガーに関連する環(RING)-フィンガーモチーフを含むＤＮＡ-結合蛋白質をコードしている。ＲＦＰ１は、ＲＥＴオンコジーン産物のＮ-末端ドメインである予想転写因子をコードしている。下線部分は、亜鉛イオン結合ポケットを形成するシステインおよび１つのヒスチジンの位置を示すＣ３ＨＣ４共通亜鉛-フィンガー配列を含む。
【図６】別のスプライシングによって生成したイントロンの位置、およびＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡの変形を示すＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡの図である。イントロン位置は「黒塗り三角」によって示し、エキソンはｃＤＮＡを表す線の下側に番号付けしている。最上段のｃＤＮＡは、ＢＲＣＡ１のペプチド配列を作製するのに用いる組成である。ｃＤＮＡクローンまたはハイブリッド選抜クローンとして同定した別の形態を下側に示す。
【図７】ＢＲＣＡ１の組織発現パターンを示している。ブロットはＣlontech社から得、それは示した組織からのＲＮＡを含む。ハイブリダイゼーション条件は製造業者によって推奨されたもので、ＢＲＣＡ１のヌクレオチド位３６３１〜３９３０よりなるプローブを使用している。乳房および卵巣の両方がヘテロ接合体組織であり、関連する上皮細胞のパーセンテージが変動し得ることは注記しておく。分子量マーカーはｋｂである。
【図８】別のスプライシングによって生成したイントロンの位置およびＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡの変形を示すＢＲＣＡ１の５'非翻訳領域＋翻訳領域の開始点の図である。イントロンの位置を破線で示す。６つの別のスプライシング形態を示す。
【図９】Ｋindred2082におけるナンセンス突然変異を示している。Ｐとは、元来スクリーニングした個人を示し、ｂおよびｃはハロタイプキャリアーで、ａ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇはＢＲＣＡ１ハロタイプを運んでいない。ＣからＴへの突然変異は終止コドンを生じ、制限酵素ＡｖｒIIの部位を生成する。ＰＣＲ増幅産物はこの酵素で切断される。キャリアーは、該部位についてヘテロ接合体であり、それ故、３つのバンドを示す。非-キャリアーは切断されないまま残る。
【図１０】ＢＲＣＡ１家系における突然変異および共分離分析を示している。キャリアー個人は家系図中の「黒塗り丸」および「黒塗り四角」として示す。Ｋindred1910におけるフレームシフト突然変異。最初の３レーンは対照、非キャリアー試料である。１-３で標識したレーンはキャリアー個人からの配列を含む。レーン４には、ＢＲＣＡ１突然変異を運んでいない家系構成員からのＤＮＡが含まれる。菱形を用いて家系の同定を防いでいる。さらなるＣから生じたフレームシフトは１、２および３で標識したレーンで明らかである。
【図１１】ＢＲＣＡ１家系における突然変異および共分離分析を示している。キャリアー個人は、家系図中の「黒塗り丸」および「黒塗り四角」として示す。推論する調節突然変異がＫindred2035にある。２の異なる多形(ＰＭ１およびＰＭ７)のキャリアーおよび非キャリアーのＡＳＯ分析を生殖細胞系におけるヘテロ接合性について検査し、リンパ球ｍＲＮＡのヘテロ接合性と比較した。各パネルの最上段の２列はゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を含み、下の２列はｃＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を含んでいる。「Ａ」および「Ｇ」はＡＳＯによって検出した２つの対立遺伝子である。暗いスポットは、特定の対立遺伝子が試料中に存在することを示している。ＰＭ７の最初の３レーンは、一般集団の３種の遺伝子型を表している。
【図１２】ＢＲＣＡ１のゲノム配列を示している。より下のケースの文字はイントロン配列を示す一方、より上のケースの文字はエキソン配列を示す。イントロン内の不明瞭な間隔は、ｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖで示した。知られている多形部位は下線および肉付太字タイプとして示す。
【図１３】ＢＲＣＡ１のゲノム配列を示している。より下のケースの文字はイントロン配列を示す一方、より上のケースの文字はエキソン配列を示す。イントロン内の不明瞭な間隔は、ｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖで示した。知られている多形部位は下線および肉付太字タイプとして示す。
【図１４】ＢＲＣＡ１のゲノム配列を示している。より下のケースの文字はイントロン配列を示す一方、より上のケースの文字はエキソン配列を示す。イントロン内の不明瞭な間隔は、ｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖで示した。知られている多形部位は下線および肉付太字タイプとして示す。
【図１５】ＢＲＣＡ１のゲノム配列を示している。より下のケースの文字はイントロン配列を示す一方、より上のケースの文字はエキソン配列を示す。イントロン内の不明瞭な間隔は、ｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖで示した。知られている多形部位は下線および肉付太字タイプとして示す。
【図１６】ＢＲＣＡ１のゲノム配列を示している。より下のケースの文字はイントロン配列を示す一方、より上のケースの文字はエキソン配列を示す。イントロン内の不明瞭な間隔は、ｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖで示した。知られている多形部位は下線および肉付太字タイプとして示す。
【図１７】ＢＲＣＡ１のゲノム配列を示している。より下のケースの文字はイントロン配列を示す一方、より上のケースの文字はエキソン配列を示す。イントロン内の不明瞭な間隔は、ｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖで示した。知られている多形部位は下線および肉付太字タイプとして示す。
【図１８】ＢＲＣＡ１のゲノム配列を示している。より下のケースの文字はイントロン配列を示す一方、より上のケースの文字はエキソン配列を示す。イントロン内の不明瞭な間隔は、ｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖで示した。知られている多形部位は下線および肉付太字タイプとして示す。
【図１９】ＢＲＣＡ１のゲノム配列を示している。より下のケースの文字はイントロン配列を示す一方、より上のケースの文字はエキソン配列を示す。イントロン内の不明瞭な間隔は、ｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖｖで示した。知られている多形部位は下線および肉付太字タイプとして示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月12日(2004.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４５℃を超える温度および２００ｍＭ未満の塩濃度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、ヒト染色体１７ｑ２１上の遺伝子マーカーＤ１７Ｓ８５５に広がり、Ｎ−末端アミノ酸がメチオニンであって、Ｃ−末端アミノ酸がチロシンである合計１８６３個のアミノ酸をコードする遺伝子と規定されるＢＲＣＡ１遺伝子から由来するＢＲＣＡ１のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズする単離核酸。
【請求項２】
配列番号：１のヌクレオチド位置３６３１ないし３９３０の配列を含むプローブにハイブリダイズする請求項１記載の単離核酸。
【請求項３】
４５℃を超える温度および２００ｍＭ未満の塩濃度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、配列番号：３５、３８、４１、４２、４７、５７、６２、６６、６７、７２および８１よりなる群から選択されるヌクレオチド配列よりなるプローブにハイブリダイズする請求項１記載の単離核酸。
【請求項４】
配列番号：３５、３８、４１、４２、４７、５７、６２、６６、６７、７２および８１よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１または３記載の単離核酸。
【請求項５】
ＢＲＣＡ１、その対立遺伝子変異体または天然に発生するＢＲＣＡ１をコードする請求項１、３または４記載の単離核酸。
【請求項６】
該ＢＲＣＡ１変異体がカルボキシ末端にて切形されたＢＲＣＡ１蛋白質である請求項５記載の単離核酸。
【請求項７】
組織試料中の請求項６に規定されたＢＲＣＡ１突然変異体をコードする突然変異体ＢＲＣＡ１ヌクレオチド配列を同定するための方法であって、
　(ａ）該組織試料中のＢＲＣＡ１遺伝子のコード配列の少なくとも一部分を増幅し、次いで、
　（ｂ）ＢＲＣＡ１遺伝子が、フレームシフト突然変異または早期停止コドンにより引き起こされた短いアミノ酸配列をコードするかを決定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項８】
ヒトから由来する組織試料中の乳癌および卵巣癌についての病気素因を決定する方法であって、該組織試料中の請求項１記載のＢＲＣＡ１遺伝子における生殖細胞系の変化が存在するかを決定し、ここに、該変化は、変化した遺伝子にカルボキシ末端で切形された蛋白質をコードさせ、該変化の存在は、癌に対する該病気素因を示すことを含むことを特徴とする該方法。
【請求項９】
該ＢＲＣＡ１遺伝子が、配列番号：１のヌクレオチド位置３６３１ないし３９３０の配列を含むプローブにハイブリダイズすることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該変化が、フレームシフト突然変異または早期停止コドンよりなる群から選択されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
該変化が、蛋白質先端切断アッセイにより検出できることを特徴とする請求項８または１０記載の方法。
【請求項１２】
該決定工程が、
　（ａ）ＢＲＣＡ１遺伝子のコード配列の少なくとも一部分を増幅させ、
　（ｂ）増幅したＤＮＡの配列を決定し、次いで、
　（ｃ）増幅したＤＮＡによりコードされるアミノ酸残基の合計数または増幅したＤＮＡによりコードされるポリペプチドのサイズを決定し、
　ここに、該ＢＲＣＡ１遺伝子が切形した蛋白質をコードするという結果は、癌に対する該病気素因を示すことを特徴とする請求項８、１０または１１記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2004135687000001.app