(57)【要約】【課題】本発明は、入手が容易な非軟骨細胞から効率よく軟骨様細胞を製造することができる軟骨様細胞の製造方法、実験用や医療用に利用することができる軟骨様細胞、および軟骨様細胞誘導用組成物を提供する。【解決手段】非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程を含み、好ましくは、該非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程が、非軟骨細胞に、Ｓｏｘ９遺伝子と、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかとを発現させることを含む軟骨様細胞の製造方法、および、該製造方法により製造された軟骨様細胞。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程を含むことを特徴とする軟骨様細胞の製造方法。
【請求項２】
軟骨様細胞が、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子、およびＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子のうち少なくとも１つが、非軟骨細胞よりも高発現する細胞である請求項１に記載の軟骨様細胞の製造方法。
【請求項３】
非軟骨細胞が、非幹細胞である請求項１および２のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法。
【請求項４】
非軟骨細胞が、間葉系細胞である請求項１から３のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法。
【請求項５】
非軟骨細胞が、線維芽細胞、脂肪細胞および筋肉細胞のいずれかである請求項１から４のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法。
【請求項６】
非軟骨細胞が、皮膚由来の細胞、皮下脂肪由来の細胞および筋肉由来の細胞のいずれかである請求項１から５のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法。
【請求項７】
非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程が、非軟骨細胞に、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子とを発現させることを含む請求項１から６のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法。
【請求項８】
発現が遺伝子導入により行われる請求項７に記載の軟骨様細胞の製造方法。
【請求項９】
遺伝子導入がベクターにより行われる請求項８に記載の軟骨様細胞の製造方法。
【請求項１０】
Ｓｏｘ５遺伝子の転写活性を高活性化する組成物およびＳｏｘ６遺伝子の転写活性を高活性化する組成物の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子の転写活性を高活性化する組成物とを添加する請求項７に記載の軟骨様細胞の製造方法。
【請求項１１】
非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程の少なくとも一部が、３次元培養およびペレット培養のいずれかにより行われる請求項１から１０のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法。
【請求項１２】
非軟骨細胞に由来し、軟骨細胞様形質を有することを特徴とする軟骨様細胞。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法により製造される請求項１２に記載の軟骨様細胞。
【請求項１４】
軟骨を欠損した患部組織の、欠損部位の補填に用いられる請求項１２および１３のいずれかに記載の軟骨様細胞。
【請求項１５】
美容に用いられる請求項１２および１３のいずれかに記載の軟骨様細胞。
【請求項１６】
Ｓｏｘ９遺伝子、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子を発現するベクターからなることを特徴とする軟骨様細胞誘導用組成物。
【請求項１７】
Ｓｏｘ９遺伝子、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかの転写活性を高活性化することを特徴とする軟骨様細胞誘導用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、実験用や医療用に利用することができる軟骨様細胞、該軟骨様細胞の製造方法、および、該軟骨様細胞の製造に用いられる軟骨様細胞誘導用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
再生医療は、従来の医療では対応しきれなかった不可逆的な臓器損傷を、幹細胞の旺盛な増殖・分化能を用いて克服しようとする新しい医療である。軟骨は再生能力が低く、変形性関節症や先天的軟骨欠損などの疾患は再生医療の大きなターゲットである。
軟骨形成に影響を与える因子のリストは、最近の研究で爆発的に増えている。軟骨の基質を構成する様々な蛋白や、細胞周期を制御する因子、シグナル伝達因子などの変異が、軟骨形成に大きな影響を与えることが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
このように、現在、軟骨形成に影響を与える因子は数多く知られているが、これらの知見の多くは、これらの因子をノックアウトすると軟骨分化が起こらないというような、分化・増殖のいわゆる必要条件の決定にとどまっており、この因子があれば軟骨細胞に分化するというような、いわゆる十分条件を決定していない。軟骨の再生医療を実現するためには、軟骨の分化・増殖を思いのままに制御する技術が必要であり、従来の基礎研究の知見では、この目的には不十分である。
【０００４】
また、骨髄間葉系幹細胞では、ＴＧＦβ３およびＢＭＰ−２を発現させると、肥大軟骨および骨芽細胞への分化を抑えて、軟骨様細胞に分化誘導できることが知られている（非特許文献２参照）。しかし、このような、間葉系幹細胞などの幹細胞では、臨床応用に足るだけの量を確保するのが困難であるという難点がある。
【０００５】
一方、Ｓｏｘという転写因子は、前述の軟骨形成に影響を与える数多くの因子のなかのひとつである。Ｓｏｘ９遺伝子は軟骨やその前駆細胞で発現されており、また精巣、腎臓およびすい臓でも発現されている。Ｓｏｘ９遺伝子の変異は、軟骨異形成症及び精巣の異常を起こす。Ｓｏｘ９遺伝子のない細胞は、軟骨特有の遺伝子を発現することができない。Ｓｏｘ５および６遺伝子の変異も軟骨異形成症を起こし、Ｓｏｘ５遺伝子とＳｏｘ６遺伝子の複合変異では、さらに重篤な軟骨の異常がおきることが知られている（非特許文献３参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｋａｒａｐｌｉｓ  ＡＣ．  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｉｎ：  Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ  ＪＰ，  Ｒａｉｓｚ  ＬＧ，  Ｒｏｄａｎ  ＧＡ，  ｅｄｓ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００２：３３−５８．
【非特許文献２】
Ｓｅｋｉｙａ  Ｉ，  Ｖｕｏｒｉｓｔｏ  ＪＴ，  Ｌａｒｓｏｎ  ＢＬ，  Ｐｒｏｃｋｏｐ  ＤＪ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００２  Ａｐｒ  ２；９９（７）：４３９７−４０２．
【非特許文献３】
ｄｅＣｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ，  Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，  Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｋ．    Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．    Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：７２１−７２７，  ２００１．
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、入手が容易な非軟骨細胞から効率よく軟骨様細胞を製造することができる軟骨様細胞の製造方法、実験用や医療用等に利用することができる軟骨様細胞、および軟骨様細胞誘導用組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、無数の軟骨関連遺伝子の中からＳｏｘ遺伝子に着目し、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子を様々に組み合わせて、自然の状態では軟骨分化能を全く持たないヒト皮膚線維芽細胞に遺伝子導入し、軟骨特有の遺伝子発現および基質蛋白産生で軟骨再生を判定した。その結果、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子をそれぞれ単独で発現させても効果を示さなかったが、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子とを発現させると、他に特殊な因子等を用いることなく軟骨特有の形質を皮膚線維芽細胞に付与することができた。
【０００９】
本発明は、この新しい知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。
＜１＞  非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程を含むことを特徴とする軟骨様細胞の製造方法である。
＜２＞  軟骨様細胞が、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子、およびＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子のうち少なくとも１つが、非軟骨細胞よりも高発現する細胞である前記＜１＞に記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜３＞  非軟骨細胞が、非幹細胞である前記＜１＞および＜２＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜４＞  非軟骨細胞が、間葉系細胞である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜５＞  非軟骨細胞が、線維芽細胞、脂肪細胞および筋肉細胞のいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜６＞  非軟骨細胞が、皮膚由来の細胞、皮下脂肪由来の細胞および筋肉由来の細胞のいずれかである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜７＞  非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程が、非軟骨細胞に、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子とを発現させることを含む前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜８＞  発現が遺伝子導入により行われる前記＜７＞に記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜９＞  遺伝子導入がベクターにより行われる前記＜８＞に記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜１０＞  Ｓｏｘ５遺伝子の転写活性を高活性化する組成物およびＳｏｘ６遺伝子の転写活性を高活性化する組成物の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子の転写活性を高活性化する組成物とを添加する前記＜７＞に記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜１１＞  非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程の少なくとも一部が、３次元培養およびペレット培養のいずれかにより行われる前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜１２＞  非軟骨細胞に由来し、軟骨細胞様形質を有することを特徴とする軟骨様細胞である。
＜１３＞  前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法により製造される前記＜１２＞に記載の軟骨様細胞である。
＜１４＞  軟骨を欠損した患部組織の、欠損部位の補填に用いられる前記＜１２＞および＜１３＞のいずれかに記載の軟骨様細胞である。
＜１５＞  美容に用いられる前記＜１２＞および＜１３＞のいずれかに記載の軟骨様細胞である。
＜１６＞  Ｓｏｘ９遺伝子、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子を発現するベクターからなることを特徴とする軟骨様細胞誘導用組成物である。
＜１７＞  Ｓｏｘ９遺伝子、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかの転写活性を高活性化することを特徴とする軟骨様細胞誘導用組成物である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の軟骨様細胞の製造方法は、非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程を含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の工程を含む。
前記「軟骨様細胞」とは、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子、およびＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子のうち少なくとも１つが、非軟骨細胞よりも高発現する細胞をいう。前記ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、前記ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、前記ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、前記Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、前記Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子、および前記Ｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子は、軟骨細胞で特徴的に発現する遺伝子であり、正常軟骨細胞のマーカーとして知られている。
【００１１】
ここで、「非軟骨細胞よりも高発現する」とは、軟骨様細胞が、少なくとも１時的に、前記軟骨細胞に特徴的に発現する遺伝子を発現し、軟骨細胞特異的なタンパク質を産生することを意味する。
また、前記軟骨細胞は軟骨に特徴的なタンパク質である軟骨基質を産生するため、トルイジンブルーによる染色で紫色に染まることが経験的に知られており、前記軟骨様細胞は、トルイジンブルーによる染色で紫色に染まる。
【００１２】
前記非軟骨細胞は、軟骨細胞以外の細胞であれば特に制限はなく、目的に合わせて適宜選択することができる。前記非軟骨細胞としては、軟骨細胞以外の間葉系細胞が好ましく、幹細胞である必要は無い。前記非軟骨細胞としては、例えば、皮膚線維芽細胞のような線維芽細胞、脂肪細胞および筋肉細胞などが挙げられ、由来する組織も、皮膚の他、胎盤、皮下脂肪および筋肉などが挙げられる。特に、皮膚由来の細胞は、軟骨芽細胞のような軟骨系の細胞と異なり、生体から得る場合でも、侵襲が軽微であるという利点がある。また、皮膚由来の細胞は、間葉系幹細胞などのように、臨床応用に足るだけの量を確保することが困難である細胞とは異なり、量的にも豊富であるという利点がある。また、間葉系幹細胞を用いた場合よりも、肥大軟骨や骨芽細胞への分化をさらに低く抑えられるという利点もある。このように広い範囲の細胞から材料を選択することができるということは、軟骨系の細胞や、間葉系幹細胞からしか軟骨様細胞を分化させることができない方法に比べて、目的に適合した材料を安定に入手する観点から極めて有利である。
【００１３】
また、軟骨は血管の少ない組織であるため、該軟骨様細胞を治療目的等に用いる場合であっても、「非軟骨細胞」は、必ずしも同一人から採取する必要は無く、目的に応じて、適宜選択することができる。
【００１４】
非軟骨細胞の軟骨様細胞への誘導は、非軟骨細胞に、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子とを発現させることにより行うことができる。すなわち、（１）Ｓｏｘ９遺伝子とＳｏｘ５遺伝子との組合せ、（２）Ｓｏｘ９遺伝子とＳｏｘ６遺伝子との組合せ、または、（３）Ｓｏｘ９遺伝子とＳｏｘ５遺伝子とＳｏｘ６遺伝子との組合せを、ひとつの細胞内で発現させることにより行うことができる。
前記発現には、ひとつの細胞内において前記２つまたは３つの遺伝子が発現する限りは、前記２つまたは３つの遺伝子を同時に発現させる場合の他、例えば先にＳｏｘ９遺伝子を発現させ、続いてＳｏｘ６遺伝子を発現させるというように、時間差がある場合であっても含まれる。
【００１５】
非軟骨細胞においては、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子は殆ど発現していないため、これらの遺伝子を発現させるためには、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子を遺伝子導入するか、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の転写活性を高活性化する組成物を添加するか、またはその両方を組に合わせることにより行うことができる。
【００１６】
遺伝子導入は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、人工ウイルス等により行うことができ、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられる。
前記非ウイルスベクターとしては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオン性脂質等を用いたリポフェクション法などが挙げられる。
これらの中でも、導入効率および安全性を併せ持つ観点から、アデノウイルスベクターを用いることが好ましい。また、Ｓｏｘ５、６、９の遺伝子は、それぞれ別のベクターに組替えられていてもよいし、１つのベクターに２種以上が組替えられていてもよい。
【００１７】
一方、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の転写活性を高活性化する組成物を添加する方法としては、Ｓｏｘ５遺伝子の転写活性を高活性化する組成物およびＳｏｘ６遺伝子の転写活性を高活性化する組成物の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子の転写活性を高活性化する組成物とを単体または複合体として添加することが挙げられる。
【００１８】
非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程は、平面培養により行われてもよいが、該工程の少なくとも一部が、３次元培養およびペレット培養のいずれかにより行われることが、分化誘導が大きい観点から好ましい。特に、３次元培養によると、分化誘導の立ち上がりが早い点で有利である。
【００１９】
３次元培養は、コラーゲン、フィブリンおよびヒアルロン酸などの足場素材のゲルの上に、遺伝子導入前または後の細胞を乗せることにより行う。３Ｄコラーゲン細胞培養システム（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ，アメリカ合衆国）等の市販の３次元培養キットを用いることもできる。
ペレット培養は、平面培養した細胞を剥がして培養液中で軽く遠心して培養することにより、自然に丸くペレット状になって培養することができる。
【００２０】
本発明の軟骨様細胞の第一の態様は、非軟骨細胞に由来し、軟骨細胞様形質を有すること以外は特に制限はない。
該軟骨様形質とは、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子およびＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子のうち少なくとも１つが、少なくとも一度、非軟骨細胞よりも高発現する時期を有することである。また、前記軟骨様細胞は、トルイジンブルーによる染色で紫色に染まる性質を有する。
【００２１】
軟骨様細胞が由来する非軟骨細胞は、軟骨細胞以外の細胞から、目的に合わせて適宜選択することができる。非軟骨細胞は、前記軟骨様細胞の製造方法において述べたのと同様に、皮膚由来の細胞であることが好ましい。
本発明の軟骨様細胞は、前記軟骨様細胞の製造方法により製造されたことが好ましい。本発明の軟骨様細胞は、軟骨作動性薬物の評価やスクリーニング等の実験用として用いることができる。また、ヒトおよび動物の変形性関節症や、先天性軟骨欠損などの治療用として軟骨を欠損した患部組織の、欠損部位の補填に用いることができる。また、美容整形等の美容用の素材としても用いることができる。
【００２２】
本発明の軟骨様細胞誘導用組成物の第一の態様は、Ｓｏｘ９遺伝子、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子を発現するベクターからなることを特徴とする。前述したように、これらのベクターは、単体で、または複合体として、軟骨様細胞の製造に用いることができる。
本発明の軟骨様細胞誘導用組成物の第二の態様は、Ｓｏｘ９遺伝子、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかの転写活性を高活性化することを特徴とする組成物である。該軟骨様細胞誘導用組成物は、非軟骨細胞に単独で、または複合体として適量添加することにより、軟骨様細胞の製造に用いることができる。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）
Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現によるヒト皮膚線維芽細胞の軟骨分化誘導を軟骨特異的遺伝子の発現量で調べた。
ヒト皮膚線維芽細胞（ＤＦＢ）は、米国Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入した。ＤＦＢは高グルコースＤＭＥＭ培地に５０ユニット／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％の牛胎児血清を加えた培地で維持培養した。
【００２４】
ヒトＳｏｘ５、６、９の全長ｃＤＮＡは、ヒト気管軟骨ｃＤＮＡ（米国クロンテック社より購入）を鋳型にしてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）により増幅し、哺乳類の発現ベクター（ｐＥＧＦＰＣ１、ｐＥＧＦＰＣ２またはｐＳｈｕｔｔｌｅ、米国クロンテック社）に組み込んだ（図１）。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーの配列およびＰＣＲ増幅の条件は以下の通りである。
Ｓｏｘ５（ｐＥＧＦＰＣ２）：センス  ＡＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＧＡＣＣＡ（配列番号１）、アンチセンス  ＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴ（配列番号２）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６２℃、４０秒、伸長７２℃、２分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＴＡクローニングした後、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯのＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅで切り出して、ｐＥＧＦＰＣ２のＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅにサブクローンした。
Ｓｏｘ６（ｐＥＧＦＰＣ１）：センス  ＧＴＴＡＧＡＴＣＴ（ＢｇｌＩＩ ｓｉｔｅ）ＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴ（配列番号３）、アンチセンス  ＴＧＴＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡ（配列番号４）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６５℃、４０秒、伸長７２℃、３分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにＴＡクローニングした後、ＢｇｌＩＩとｐＣＲ２．１ＴＯＰＯのＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅで切り出して、ｐＥＧＦＰＣ１のＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅにサブクローンした。
Ｓｏｘ９（ｐＥＧＦＰＣ１）：センス  ＧＴＴＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩ ｓｉｔｅ）ＣＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣ（配列番号５）、アンチセンス  ＡＣＴＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩ ｓｉｔｅ）ＡＴＴＴＧＧＧＴＡＣＧＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴ（配列番号６）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６０℃、４０秒、伸長７２℃、２分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにＴＡクローニングした後、ＸｈｏＩ／ＨＩｎｄＩＩＩで切り出して、ｐＥＧＦＰＣ１のＸｈｏＩ／ＨＩｎｄＩＩＩにサブクローンした。
Ｓｏｘ５（ｐＳｈｕｔｔｌｅ）：センスＧＴＴＧＧＧＣＣＣ（ＡｐａＩ ｓｉｔｅ）ＡＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＧＡＣＣＡ（配列番号７）、アンチセンスＡＣＴＧＧＴＡＣＣ（ＫｐｎＩ ｓｉｔｅ）ＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴ（配列番号８）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６２℃、４０秒、伸長７２℃、２分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにＴＡクローニングした後、ＡｐａＩ／ＫｐｎＩで切り出して、ｐＳｈｕｔｔｌｅのＡｐａＩ／ＫｐｎＩにサブクローンした。
Ｓｏｘ６（ｐＳｈｕｔｔｌｅ）：センス  ＧＴＴＧＣＴＡＧＣ（ＮｈｅＩ ｓｉｔｅ）ＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴ（配列番号９）、アンチセンス  ＡＣＴＧＧＴＡＣＣ（ＫｐｎＩ ｓｉｔｅ）ＴＧＴＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡ（配列番号１０）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６５℃、４０秒、伸長７２℃、３分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにＴＡクローニングした後、ＮｈｅＩ／ＫｐｎＩで切り出して、ｐＳｈｕｔｔｌｅのＮｈｅＩ／ＫｐｎＩにサブクローンした。
Ｓｏｘ９（ｐＳｈｕｔｔｌｅ）：センス  ＧＴＴＧＣＴＡＧＣ（ＮｈｅＩ ｓｉｔｅ）ＣＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣ（配列番号１１）、アンチセンス  ＡＣＴＧＧＴＡＣＣ（ＫｐｎＩ ｓｉｔｅ）ＡＴＴＴＧＧＧＴＡＣＧＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴ（配列番号１２）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６０℃、４０秒、伸長７２℃、２分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにＴＡクローニングした後、ＮｈｅＩ／ＫｐｎＩで切り出して、ｐＳｈｕｔｔｌｅのＮｈｅＩ／ＫｐｎＩにサブクローンした。
【００２５】
この発現ベクターとＡｄｅｎｏＸ発現システム（米国クロンテック社）を使って、キットのマニュアルに従い、それぞれの蛋白を発現するアデノウイルスを作製した。アデノウイルスはＨＥＫ２９３細胞を用いて増幅し、アデノウイルス精製キット（米国クロンテック社）を用いて精製した。力価は、ＡｄｅｎｏＸ迅速力価測定キット（米国クロンテック社）を用いて測定した。
【００２６】
ヒト皮膚線維芽細胞は、コンフルエントになるまで１０ｃｍ培養皿で増殖させた後に、組換えアデノウイルスを一細胞当たり約５０ウイルスの割合で感染させた（ＭＯＩ５０）。感染２日後に細胞をトリプシン処理して培養皿からはがし、５０万個の細胞を１５ｃｃ遠心管の中にいれ、軽く（１００ｇ５分程度）遠心をかけてから、培養した。培養には、血清抜きの高グルコースＤＭＥＭ培地、あるいは高グルコースＤＭＥＭに１００ｎＭのデキサメザン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、４０μｇ／ｍｌのプロリン、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸、１ｘＩＴＳ＋１（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を加えたものにさらに、３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２（山之内製薬）と１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＥ、ＵＳＡ）を添加した完全軟骨産生培地を使った。
【００２７】
底に沈んだ皮膚細胞は、ペレット状に自然に丸まった。培養液は３〜４日毎に交換した。この細胞ペレットは、３日、１週，２週，３週間後に回収して、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（１００ｎｇから１μｇ）を鋳型とし、ランダムヘキサマーをプライマーとして、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（ＡＢＩ社）を用いて、添付のプロトコールに従い、逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡのうち、１μｌを鋳型として、２次のＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲアンプリコン配列を含む標的遺伝子の全長ならびに部分長のｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、ｐＣＲ−ＴＯＰＯｚｅｒｏＩＩベクターまたはｐＣＲ−ＴＯＰＯＩＩベクター（インビトロジェン社）にクローニングし、リニアライズした後に標準の鋳型として用いた。
【００２８】
２次のＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲ反応はＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（キアゲン社）を用いて、使用説明書に従い行った。２次のＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲ増幅ならびに、リアルタイム蛍光検出はＡＢＩ７７００配列検出システム（ＡＢＩ社）を用いて行った。すべての反応は、４つ同じものを行った。ここの全ＲＮＡ中の標的遺伝子のコピー数は標準曲線を参照することにより計算し、ヒトＧＡＰＤＨを内在性コントロールとしてヒト全ＲＮＡ（ＡＢＩ社）を用いて補正した。
【００２９】
個々のプライマーの標的遺伝子の翻訳領域中の位置は表１のとおりである。Ｓｏｘ５およびＳｏｘ６のプライマーセットは、長いアイソフォームのアミノ末端領域にデザインした。
【表１】
2004267052.tif 000002
【００３０】
測定結果を図２（ａ）から（ｆ）に表す。（ａ）から（ｆ）は、それぞれ、正常軟骨細胞のマーカーであるＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、Ａｇｇｒｅｃａｎ、Ｍａｔｒｉｌｉｎ３、および、Ｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１の遺伝子の発現を、全ＲＮＡ中の標的遺伝子のコピー数を縦軸として表す。
Ｓｏｘ５、６および９遺伝子を発現するアデノウイルスを共に感染させると、測定したすべての正常軟骨細胞のマーカー遺伝子の発現が、無血清ＤＭＥＭ培地で培養したＤＦＢに誘導された（図２（ａ）から（ｆ）のＳｏｘ５／６／９）。しかし、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子を発現するアデノウイルスをそれぞれ単独で感染させたときには、これらのマーカー遺伝子の発現は低かった（図２（ａ）から（ｆ）のＳｏｘ９、但し、Ｓｏｘ５、６を単独で感染させた結果についてはマーカー遺伝子の発現が殆ど認められなかったため図示しなかった）。図２（ａ）から（ｆ）のＬａｃＺはＬａｃＺ遺伝子を発現するネガティブコントロールのアデノウイルスを感染させた結果である。
【００３１】
さらに、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子のうちの２つを組み合わせて感染させた結果は、Ｓｏｘ９遺伝子とＳｏｘ５遺伝子との組合せ、Ｓｏｘ９遺伝子とＳｏｘ６遺伝子との組合せでは、マーカー遺伝子の発現が誘導されたのに対し（図２（ａ）から（ｆ）のＳｏｘ５／９およびＳｏｘ６／９）、Ｓｏｘ５遺伝子とＳｏｘ６遺伝子との組合せでは、マーカー遺伝子の発現は低かった（図２（ａ）から（ｆ）のＳｏｘ５／６）。
これらのことから、ヒト皮膚線維芽細胞に、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子のうち、少なくとも２つの組合せであって、Ｓｏｘ５とＳｏｘ６との組合せを除くものを発現させると、軟骨細胞に特異的なマーカー遺伝子の発現が誘導され、軟骨様細胞が誘導されることが判った。
【００３２】
（実施例２）
Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現によるヒト皮膚線維芽細胞の軟骨分化誘導を軟骨基質発現で調べた。
実施例１と同じサンプルの一部を、組織学的検索に用いた。細胞塊を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で４℃にて、一晩置くことにより固定した。その後、７０％エタノールで使用時まで４℃にて保存した。標本は、ＯＣＴコンパウンドに包埋して、１０μｍ厚の凍結切片とするか、あるいは脱水の後パラフィンに包埋した後に５μｍ厚の切片とした。軟骨様基質の検出にはアルシアンブルー、トルイジンブルー、またはサフラニンＯ染色を用い、形態の観察にはヘマトキシリンエオジン染色を用いた。トルイジンブルーは、青い染色液であるが、軟骨基質においては異調染色（メタクロマジー）を呈し、紫色になる。このことを利用して軟骨気質の産生を評価した。
【００３３】
結果を図３に示す。ＬａｃＺ遺伝子を発現させたネガティブコントロールのサンプルでは全く異調染色は観られなかった。Ｓｏｘ５やＳｏｘ６を単独で発現させたものでは僅かに、Ｓｏｘ９を発現させたものではさらに少し多く異調染色が観られた。これに対し、Ｓｏｘ５、６、９を共に発現させたサンプルでは、正常の軟骨にも匹敵する強い異調染色を示す部位が広範に観られた。この結果は、アルシアンブルー染色やサフラニンＯ染色など他の軟骨基質染色でも同様であった（データは示さず）。
【００３４】
（実施例３）
３次元培養による軟骨分化促進効果を調べた。
３Ｄコラーゲン細胞培養システム（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ，アメリカ合衆国）またはＩ型アテロコラーゲン（Ｋｏｋｅｎ、東京）を用い、使用説明書に従い、コラーゲンゲル上での３次元培養を実施した。どちらの系でもほぼ同様の結果が得られた。
【００３５】
まず、実施例１で用いたのと同様の、Ｓｏｘ９のみを発現させたヒト皮膚線維芽細胞と、Ｓｏｘ５、６および９を共に発現させたヒト皮膚線維芽細胞を、感染後２日目にトリプシンで剥がし、２４ウェルプレートにいれたコラーゲンを含むＤＭＥＭ上に、２５００００個／ｃｍ２となるように播き、無血清高グルコースＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞は、３次元培養にした後、７、１４、２１日目に集めた。正常軟骨細胞のマーカーであるＣＯＬ２Ａ１およびＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ  １の発現量を実施例１と同様に測定し、軟骨分化促進効果を調べた。また、平面培養や、ペレット培養も行った。結果を図４（ａ）（ｂ）に表す。
【００３６】
Ｓｏｘ５、６および９遺伝子を共に発現させたヒト皮膚線維芽細胞をコラーゲンゲル上で３次元培養した場合（図４中ダイヤ）は、平面培養（図４中四角）やペレット培養（図４中丸）の場合に比して、一週間という早期に軟骨分化マーカーが上昇し、その発現量も高い傾向があった。ただし三週目でのＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ  １はペレット培養の方が高くなった（図４（ｂ））。Ｓｏｘ９遺伝子のみの発現では全く軟骨分化は起こらなかった（図４中三角）。
【００３７】
３次元培養後一週間のサンプルをトルイジンブルーで染色すると、Ｓｏｘ９遺伝子単独に発現させたものでは異調染色する軟骨基質が殆ど産生されなかったのに対し（図５（ａ））、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子を共に発現させたものでは、この一週間という早期に、異調染色する軟骨基質が大量に産生されたのが分かった（図５（ｂ））。
これらのことから、平面培養に比べ、ペレットおよび３次元培養は、分化誘導の観点から優れており、特に、３次元培養によれば、軟骨基質の産生をはやく立ち上げることができることが判った。
【００３８】
（実施例４）
Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現による肥大軟骨分化と骨芽細胞分化の抑制を調べた。
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は自然には肥大軟骨分化し、骨芽細胞に分化するが、ＴＧＦβ３およびＢＭＰ−２を発現させると、肥大軟骨分化および骨芽細胞への分化を抑えて、軟骨様細胞に分化誘導できることが知られている。そこで、本発明者等は、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現により、このような効果が得られるかを調べた。
【００３９】
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、米国Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入した。ｈＭＳＣはＭＳＣ増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ｈＭＳＣはコンフルエントになるまで１０ｃｍ培養皿で増殖させた後に、それぞれの遺伝子の組換えアデノウイルスベクターを一細胞当たり一遺伝子につき約５０ウイルスの割合で感染させた（ＭＯＩ５０）。すなわち、ＴＧＦβ３の組換えアデノウイルスベクター、ＢＭＰ−２の組換えアデノウイルスベクターおよびＬａｃＺの組換えアデノウイルスベクターをＭＯＩ５０ずつ感染させたもの、ＬａｃＺの組換えアデノウイルスベクターのみＭＯＩ５０で感染させたもの、Ｓｏｘ９の組換えアデノウイルスベクターのみＭＯＩ５０で感染させたもの、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ９の組換えアデノウイルスベクターをそれぞれＭＯＩ５０で感染させたものについて、培養した。
【００４０】
また、ヒト皮膚線維芽細胞（ＤＦＢ）についても、ＬａｃＺの組換えアデノウイルスベクターのみＭＯＩ５０で感染させたもの、Ｓｏｘ９の組換えアデノウイルスベクターのみＭＯＩ５０で感染させたもの、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ９の組換えアデノウイルスベクターをそれぞれＭＯＩ５０で感染させたものについて、培養した。
感染２日後に細胞をトリプシン処理して培養皿から剥がし、５０万個の細胞を１５ｃｃ遠心管の中に入れ、軽く遠心をかけてから、培養した。
【００４１】
培養には、高グルコースＤＭＥＭに、１００ｎＭのデキサメザン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、４０μｇ／ｍｌのプロリン、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸、１ｘＩＴＳ＋１（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を加えたものにさらに、３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２（山之内製薬）と１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＥ、ＵＳＡ）を添加した完全軟骨産生培地を使った。底に沈んだ皮膚細胞は、ペレット状に自然に丸まった。培養液は３−４日毎に交換した。結果は図６に表す。
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いた従来の方法では、ペレット培養して何も加えない状態で、既に骨芽細胞マーカーであるＢＳＰと肥大軟骨のマーカーであるＣＯＬ１０Ａ１の発現が観られる（白丸）。また、ペレット培養してＴＧＦβ３やＢＭＰを加えて軟骨分化を誘導しても、まだ、ＢＳＰとＣＯＬ１０Ａ１の上昇が観られる（黒四角）。この上昇はＳｏｘ９を加えただけでは変化がない（白三角）が、Ｓｏｘ５、６、９を同時に加えると抑制される（黒ダイヤ）。
【００４２】
ヒト皮膚線維芽細胞（ＤＦＢ）においては、何も加えない状態では特に肥大軟骨および骨芽細胞マーカーは上昇しないが（白四角）、Ｓｏｘ９を加えるとＣＯＬ１０Ａ１が上昇する場合がある（図６（ｂ）の黒丸）。しかし、この上昇はＳｏｘ５、６、９を共に発現させることで抑制される（図６（ｂ）の黒三角）。なお、図６（ａ）においては、ヒト皮膚線維芽細胞（ＤＦＢ）に、ＬａｃＺ（白四角）、Ｓｏｘ９単独（黒丸）、Ｓｏｘ５、６、９を共に（黒三角）発現させた場合は、すべてベースライン上に重なっている。
【００４３】
このように、Ｓｏｘ５、６、９を共に発現させると、軟骨様細胞への分化が進むのみならず、軟骨様細胞にとって好ましくない、肥大軟骨および骨芽細胞への分化を抑制できる。この抑制効果は、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いた実験においても、従来のＴＧＦβ３およびＢＭＰ−２の発現を用いた方法よりも優れており、皮膚線維芽細胞を用いた実験においては、殆どこの分化は起こらなかった。したがって、本発明の方法が、肥大軟骨分化および骨芽細胞分化の少ない優れた方法であることが判った。
【００４４】
（実施例５）
皮膚線維芽細胞の増殖実験を行った。
皮膚線維芽細胞は、実施例１と同様の条件で培養した場合、一ヶ月で約１００倍増え、その後も２−３ヶ月までは問題なく増殖した。この結果によれば、もし１，０００，０００個の細胞からスタートしたとすると、一ヶ月で１００，０００，０００個、２ヶ月で１０，０００，０００，０００個となり、この最後の数字は、細胞が直径１０μｍの球だと仮定して１０ｃｍ３に相当し、皮膚線維芽細胞が十分量の軟骨様細胞の素材となり得ることを示している。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、入手が容易な非軟骨細胞から効率よく軟骨様細胞を製造することができる軟骨様細胞の製造方法、実験用や医療用に利用することができる軟骨様細胞、および軟骨様細胞誘導用組成物を提供することができる。
【００４６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ベクターの構築を表す図である。
【図２】図２は、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現によるヒト皮膚線維芽細胞の軟骨分化誘導を、軟骨特異的遺伝子の発現量で表した図である。
【図３】図３は、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現によるヒト皮膚線維芽細胞の軟骨分化誘導を、軟骨基質の染色で表した写真である。
【図４】図４は、３次元培養による軟骨分化促進効果を軟骨特異的遺伝子の発現量で表した図である。
【図５】図５は、３次元培養による軟骨分化を軟骨基質の染色で表した写真である。
【図６】図６は、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現による肥大軟骨分化と骨芽細胞分化の抑制を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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