(57)【要約】　　　（修正有）【課題】生物の内因活性化に関与する新たなＥＰＨ様受容体タンパク質チロシンキナーゼの発見とその利用方法を提供する。【解決手段】ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから得られた新規な受容体タンパク質チロシンキナーゼのＥＰＨサブファミリーの４つのメンバーを開示する。受容体タンパク質をコードする核酸配列、組換えプラスミド及び発現用の宿主細胞、該タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、並びにそのような受容体および抗体の産生法及び使用法も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　少なくともＥＰＨ様受容体タンパク質チロシンキナーゼの細胞外ドメインの一部を有するポリペプチドをコードする分離された核酸であって、
（ａ）配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６のいずれかに記載の核酸；
（ｂ）配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６のいずれかの核酸のコード領域の相補鎖と、１Ｍ Ｎａ+中に６０℃、その後０.２×SSC中にて６０℃で洗浄する条件下でハイブリダイズする核酸；
（ｃ）遺伝コードの縮重がなければ、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６のいずれかの核酸のコード領域の相補鎖と、１Ｍ Ｎａ+中に６０℃、その後０.２×SSC中にて６０℃で洗浄する条件下でハイブリダイズする前記（ｂ）の核酸；
からなる群から選択される前記核酸。
【請求項２】
　真核又は原核宿主細胞において請求項１に記載の核酸により発現したポリペプチド産物。
【請求項３】
　ヒト由来のものである請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
　配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１７のいずれかに示されているアミノ酸配列の一部又は全てを有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
　ＥＰＨ様受容体の細胞外ドメインを含むフラグメントをコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
　ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
　Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞中での発現に好ましい１つ以上のコドンを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
　哺乳動物細胞中での発現に好ましい１つ以上のコドンを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項９】
　配列番号１３に記載のアミノ酸１〜５４７、及び、場合によって、アミノ酸末端メチオニル残基をコードする核酸。
【請求項１０】
　配列番号１５に記載のアミノ酸２１〜５４７、及び、場合によって、アミノ末端メチオニル残基をコードする核酸。
【請求項１１】
　配列番号１７に記載のアミノ酸２３〜５５３、及び、場合によって、アミノ末端メチオニル残基をコードする核酸。
【請求項１２】
　異種受容体細胞質ドメインに融合した配列番号１３のアミノ酸１−５４７、配列番号１５のアミノ酸２１−５４７もしくは配列番号１７のアミノ酸２３−５５３のいずれかを含むキメラタンパク質をコードする核酸。
【請求項１３】
　請求項１の核酸を含むプラスミド又はウイルスＤＮＡベクター。
【請求項１４】
　請求項１３のプラスミドで安定に形質転換又はトランスフェクトされた原核又は真核宿主細胞。
【請求項１５】
　請求項１４の宿主細胞を培養して該宿主細胞にＥＰＨ様受容体タンパク質チロシンキナーゼを発現させることを含む、ＥＰＨ様受容体タンパク質チロシンキナーゼを産生する方法。
【請求項１６】
　配列番号１３、配列番号１５若しくは配列番号１７のいずれかに示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はそのフラグメントであって、少なくとも細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを含む分離されたポリペプチドまたはフラグメント。
【請求項１７】
　配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する、精製・分離されたヒトＥＰＨ様受容体。
【請求項１８】
　配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する、精製・分離されたヒトＥＰＨ様受容体。
【請求項１９】
　配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する、精製・分離されたヒトＥＰＨ様受容体。
【請求項２０】
　ヒト由来のものである、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
　形質転換またはトランスフォームされた原核又は真核細胞から産生された請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
　請求項１６のポリペプチドを特異的に結合する抗体又はそのフラグメント。
【請求項２３】
　モノクローナル抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
　医薬上許容し得るアジュバント、担体、可溶化剤又は希釈剤と混合した請求項１６のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２５】
　医薬上許容し得るアジュバント、担体、可溶化剤又は希釈剤と混合した請求項２２の抗体を含む医薬組成物。
【請求項２６】
　有効量の請求項１６のポリペプチドを投与することを含む、非ヒト動物体内のＥＰＨ様受容体タンパク質チロシンキナーゼの内因性活性化を調節する方法。
【請求項２７】
　アンチセンスオリゴヌクレオチドを請求項１の核酸とハイブリダイズすることを含む、ＥＰＨ様受容体タンパク質チロシンキナーゼの合成を調節する方法。
【請求項２８】
　請求項１６の受容体ポリペプチドに結合するリガンドを同定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの分子を、受容体／リガンド複合体を形成させるに十分な時間受容体ポリペプチドに露出する段階；
（ｂ）複合体を形成していない分子を除去する段階；及び
（ｃ）受容体ポリペプチドに結合した分子の存在を検出する段階；
からなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）、特に新規なＥＰＨ様受容体ＰＴＫとそのフラグメント及び類似体、並びに該ＰＴＫをコードする核酸に係わる。本発明はまた、上記のような受容体を製造及び使用する方法にも係わる。
【背景技術】
【０００２】
　受容体ＰＴＫ類は、構造に関連してファミリーを構成する、細胞外シグナルへの細胞の応答を媒介するタンパク質である（Ｕｌｌｒｉｃｈ等，　Ｃｅｌｌ　６１，　ｐｐ．２０３−２１２，　１９９０）。この受容体は三つの主要な機能性ドメイン、即ち触媒活性をもたらす配列を含む細胞内領域と、単一疎水性膜透過（ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインと、その構造がリガンド結合特異性を決定するグリコシル化細胞外領域とによって特徴付けられる。シグナル変換は、上記受容体と類縁の（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体の細胞外ドメインに成長または分化因子が結合することによって開始される。リガンドの結合は受容体の自己リン酸化を誘導し得る受容体のダイマー化を容易にする。可溶性タンパク質リガンドと膜関連タンパク質リガンドとの両方が上記のように機能することが判明している。この過程は、様々な細胞質基質のリン酸化を含み、細胞の生物学的応答を最終到達点とする一連の相互作用の最初の段階である。最も良く解明された、チロシンキナーゼ受容体活性化に対する応答は細胞の成長である。しかし、ｉｎ　ｖｉｖｏでの幾つかの成長因子の役割についての分析は、分化または細胞の生存はチロシンキナーゼ受容体とリガンドとの相互作用によっても媒介され得ることを示唆している。
【０００３】
　受容体ＰＴＫは、配列相同性と共有構造モチーフとの両方に基づいて十分に定義されたファミリーに分類されている。触媒活性をもたらす細胞内ドメインの部分のアミノ酸配列は総てのチロシンキナーゼ間で良く保存され、受容体サブファミリー内では更に密接に整合している。アミノ酸配列の上記部分の比較は、ファミリーのメンバー同士、またはファミリーのメンバーとチロシンキナーゼ全般との関連性（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）を示す系統樹の作成に用いられている（Ｈａｎｋｓ及びＱｕｉｎｎ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　２００，　ｐｐ．３８−６２，　１９９１）。上記配列保存はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて新規なチロシンキナーゼを単離するのにも用いられている（Ｗｉｌｋｓ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６，　ｐｐ．１６０３−１６０７，　１９８９）。ＰＴＫの高度に保存された触媒ドメインに基づくオリゴヌクレオチドは、鋳型中に存在する関連配列の増幅にＰＣＲプライマーとして用い得る。それらの断片は従って、対応する完全長受容体クローンをｃＤＮＡライブラリーから単離するためのプローブとして用い得る。ファージ発現ライブラリー中でのＰＴＫ　ｃＤＮＡクローンの同定には抗ホスホチロシン抗体も用いられている（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ及びＰａｓｑｕａｌｅ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　２００，　ｐｐ．５５７−５６４，　１９９１）。このような方策は何人かの研究者によって、増加し続けるタンパク質チロシンキナーゼ受容体の同定に用いられている。
【０００４】
　現在、５１の異なるＰＴＫ受容体遺伝子が公表されており、これらは１４のサブファミリーに分類されている。それらのサブファミリーの一つにＥＰＨ様受容体が有る。このサブファミリーの原型メンバーであるＥＰＨはＨｉｒａｉ等によって、ウイルスオンコジーンｖ−ｆｐｓに由来するプローブへの低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを用いて単離された（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８，　ｐｐ．１７１７−１７２０，　１９８７）。ＥＰＨ様受容体は、ＮＩＨ　３Ｔ３細胞における遺伝子の過発現が軟寒天及びヌードマウスの腫瘍においてフォーカス形成を惹起することを示す研究に一部基づき、細胞の成長に関連付けられている（Ｍａｒｕ等，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５，　ｐｐ．１９９−２０４，　１９９０）。ＥＰＨサブファミリーの他のメンバーで同定済みのものには、
ＥＣＫ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ等，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１０，　ｐｐ．６３１６−６３２４，　１９９０）、
Ｅｌｋ（Ｌｈｏｔａｋ等，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１１，　ｐｐ．２４９６−２５０２，　１９９１）、
Ｃｅｋ４、５、６、７、８、９及び１０（Ｐａｓｑｕａｌｅ，　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　２，　ｐｐ．５２３−５３４，　１９９１；　Ｓａｊｊａｄｉ等，　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ　３，　ｐｐ．７６９−７７８，　１９９１；　Ｓａｊｊａｄｉ及びＰａｓｑｕａｌｅ，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８，　ｐｐ．１８０７−１８１３，　１９９３）、
ＨＥＫ２（Ｂｏｈｍｅ等，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８，　ｐｐ．２８５７−２８６２，　１９９３）、
Ｅｅｋ、Ｅｒｋ（Ｃｈａｎ及びＷａｔｔ，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　６，　ｐｐ．１０５７−１０６１，　１９９１）、
Ｅｈｋ１、Ｅｈｋ２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ等，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８，　ｐｐ．３２７７−３２８８，　１９９３）
が含まれる。これらの受容体のうちの幾つかに関して相同体が、他の種において同定されている（Ｗｉｃｋｓ等，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９，　ｐｐ．１６１１−１６１５，　１９９２；　Ｇｉｌａｒｄｉ−Ｈｅｂｅｎｓｔｒｅｉｔ等，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　７，　ｐｐ．２４９９−２５０６，　１９９２）。幾つかのファミリーメンバーの発現パターン及び発生特性は、当該受容体とそのリガンドが様々な組織の増殖、分化及び維持に重要であることを示唆している（Ｎｉｅｔｏ等，　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１６，　ｐｐ．１１３７−１１５０，　１９９２）。構造的にはＥＰＨサブファミリーメンバーは、その細胞外ドメインに存在するＩｇ様ループ、システインに富む領域、及び二つのフィブロネクチン型反復部分によって特徴付けられる。触媒ドメインのアミノ酸配列は細胞質ＰＴＫのＳＲＣサブファミリーに対して、いずれの受容体ＰＴＫに対してよりも密接に関連する。受容体ＰＴＫの触媒ドメインの中で、ＥＰＨサブファミリーものはアミノ酸配列において上皮成長因子受容体サブファミリーのものに最も類似する。
【０００５】
　本発明は、ＥＰＨサブファミリーに属する新規な受容体を同定することを目的とする。先に示したＰＣＲ法を用いて、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから５種のヒトＥＰＨ様受容体を同定した。これらの受容体を、ＨＥＫ４、ＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８及びＨＥＫ１１と呼称する。これらの受容体と、これまでに同定されているＥＰＨ様受容体との関連性は次のとおりである。
【０００６】
　ＨＥＫ４はＣｅｋ４（ニワトリ）及びＭｅｋ４（マウス）のヒト相同体であり、以前にヒトリンパ球腫瘍細胞系から単離されたＨＥＫ（Ｂｏｙｄ等，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６７，　ｐｐ．３２６２−３２６７，　１９９２；　Ｗｉｃｋｓ等，　１９９２）と同一である。
【０００７】
　ＨＥＫ５は、ニワトリ由来の完全長ＥＰＨ様受容体クローンであるＣｅｋ５のヒト相同体である。ＨＥＫ５配列の一部は、約６０アミノ酸をコードするヒトクローンＥＲＫとして以前に開示された（Ｃｈａｎ及びＷａｔｔ，　１９９１）。
【０００８】
　ＨＥＫ７は、ニワトリから単離されたＣｅｋ７のヒト相同体である。
【０００９】
　ＨＥＫ８は、ニワトリ由来の完全長クローンＣｅｋ８及びマウス由来の完全長クローンＳｅｋのヒト相同体である（Ｎｉｅｔｏ等，　１９９２；　Ｓａｊｊａｄｉ等，　１９９１）。
【００１０】
　ＨＥＫ１１は既知の非ヒト相同体を有しない。新しいメンバーＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８及びＨＥＫ１１が追加され、かつＥＰＨ様受容体をコードするＰＣＲ断片が報告されて（Ｌａｉ及びＬｅｍｋｅ，　Ｎｅｕｒｏｎ　６，　ｐｐ．６９１−７０４，　１９９１）、ＥＰＨ様受容体を表わす配列は全部で１２種公表されたことになり、その結果このサブファミリーはＰＴＫの既知のサブファミリーのうちで最大となった。
【００１１】
　本発明は、可溶性のＥＰＨ様受容体、及びＥＰＨ様受容体に対する抗体を生成させることも目的とする。前記可溶性受容体及び抗体は、ＥＰＨ受容体活性化の調節に有用である。
【００１２】
　発明の概要
　本発明は、新規なＥＰＨ様受容体タンパク質チロシンキナーゼを提供する。本発明は特に、ＥＰＨ様受容体ＰＴＫのサブファミリーの、まとめてＨＥＫ（ヒトｅｐｈ様キナーゼ）と呼称する４種の新メンバーをコードする核酸を単離して提供する。本発明は、ストリンジェントな条件下にＥＰＨ様受容体核酸とハイブリダイズする核酸も包含する。本発明は、受容体ポリペプチド産生のための発現ベクター及び宿主細胞、並びに受容体産生方法も提供する。
【００１３】
　本発明はＥＰＨ様受容体のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドも、そのフラグメント及び類似体と共に提供する。本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体も包含する。本発明はまた、ＥＰＨ様受容体の内在活性を調節する方法、及び受容体リガンドを同定する方法も包含する。
【００１４】
　発明の詳細な説明
　本発明は、新規なＥＰＨ様受容体タンパク質チロシンキナーゼに係わる。本発明は特に、ＥＰＨ様受容体ＰＴＫのサブファミリーの４種の新メンバーをコードする単離核酸に係わる。前記４種のメンバーを以後ＨＥＫ（ヒトｅｐｈキナーゼ）と呼称する。受容体ＰＴＫ及びＥＰＨ様受容体ＰＴＫの保存領域に対するオリゴヌクレオチドプローブを用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー中で、ＨＥＫ受容体をコードする核酸を同定した。３種のＨＥＫ受容体の推定アミノ酸配列はこれまでに同定されている、ニワトリから単離されたＥＰＨ様受容体Ｃｅｋ５、Ｃｅｋ７及びＣｅｋ８と触媒ドメインにおいて大幅な相同性を有し、従ってこれらの受容体をＨＥＫ５、ＨＥＫ７及びＨＥＫ８と呼称する。第四のＨＥＫ受容体の推定アミノ酸配列は、これまでに同定されているいずれのＥＰＨ様受容体の相同体でもないことが判明した。この受容体はＨＥＫ１１と呼称する。「ＨＥＫ」という語は、ＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８及びＨＥＫ１１、並びに本発明の範囲内に有るこれらの受容体の類似体、変異体及び突然変異体を包含すると理解される。
【００１５】
　本発明は、
（ａ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号１６のうちのいずれかに示した核酸とその相補的鎖、
（ｂ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号１６のうちのいずれかに示した核酸のコーディング領域にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸、及び
（ｃ）（ｂ）の核酸であるが、遺伝暗号の縮重のために配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号１６のうちのいずれかに示した核酸のコーディング領域にハイブリダイズする核酸
の中から選択された単離核酸を包含する。本発明の核酸は好ましくは、既知のヒトまたは非ヒトＥＰＨ様受容体の間で観察される核酸同等性に基づくヌクレオチド不整率（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が約５％以下となることを可能にする条件下にＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８またはＨＥＫ１１コーディング領域にハイブリダイズする。上記のような条件とは、例えば１Ｍ　Ｎａ＋中６０℃でハイブリダイゼーションを行ない、その後０．２×ＳＳＣ中６０℃で洗浄するといったものである。同様の不整率レベルでの塩基対合を可能にする他のハイブリダイゼーション条件も、当業者には確認可能である。
【００１６】
　好ましい一例において、単離核酸はＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８またはＨＥＫ１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。核酸にはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。本発明の核酸は、細胞外リガンド結合ドメインと、トランスメンブランドメインと、細胞質ドメインとを有する完全長受容体ポリペプチドをコードし得、または可溶分泌形態で産生される細胞外ドメインなどのフラグメントをコードし得る。可溶性ＨＥＫ受容体を産生する核酸構築物を実施例３に説明する。本核酸によってコードされるポリペプチド及びフラグメントはＥＰＨ様受容体タンパク質チロシンキナーゼの、リガンド結合能などの生物活性を少なくとも一つ有する。
【００１７】
　本発明は、キメラタンパク質をコードする核酸も包含し、その際キメラタンパク質はＨＥＫ受容体のアミノ酸配列の一部を、異種タンパク質由来のアミノ酸配列に連結された状態で含む。このようなキメラタンパク質の一例に、異種受容体細胞質ドメインと融合したＨＥＫ受容体細胞外ドメインが有る。実施例５に、ＨＥＫ８細胞外ドメインをｔｒｋＢ細胞質ドメインと共に含むキメラ受容体、及びＨＥＫ１１細胞外ドメインをｔｒｋＢ細胞質ドメインと共に含む第二のキメラ受容体の構築及び発現を説明する。ＨＥＫ受容体を、抗体識別部位として機能するＩｇドメインなど、他の機能性タンパク質ドメインと融合させることも可能である。
【００１８】
　本発明の核酸は、受容体ＰＴＫを発現する異種核酸と連結し得る。前記のような異種核酸には、転写、翻訳、増幅、分泌等のための遺伝因子を提供する生物機能性プラスミドまたはウイルスベクターが含まれる。本発明のＥＰＨ様受容体の産生に適した発現ベクターの一例に、実施例３に述べたｐＤＳＲαが有る。哺乳動物、酵母、昆虫または細菌細胞における本発明のＥＰＨ様受容体の発現には他のベクターも適当であると理解される。加えて本発明は、本発明のＥＰＨ様受容体ＰＴＫをコードする核酸をｉｎ　ｖｉｖｏで発現させることも包含する。例えば、選択した組織において機能するベクターを用いれば、トランスジェニック動物におけるＥＰＨ様受容体の組織特異的発現を容易に実現することができる。
【００１９】
　本発明のＥＰＨ様受容体ＰＴＫを発現させるための宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞やＮＩＨ　３Ｔ３細胞といった、確立された哺乳動物細胞とすることが好ましいが、哺乳動物遺伝子の発現に適した他の細胞系が容易に入手可能であり、それらを用いてもよい。このような宿主細胞を、ＥＰＨ様受容体の発現に適した核酸構築物で形質転換またはトランスフェクトする。形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を用いて、診断または治療用途に適した量の受容体を産生させ、またＥＰＨ様受容体を脳、腎臓及び肝臓などの選択した成体組織において、または胚組織もしくは急速に分裂する組織において特異的に（ｔａｒｇｅｔｅｄ）発現させることができる。
【００２０】
　本発明は、ＥＰＨ様受容体の生物学的特性（例えばリガンド結合、シグナル伝達）を少なくとも一つ有する、精製及び単離されたポリペプチドを提供する。単離ポリペプチドは好ましくは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号１６のうちのいずれかに示したアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドは、細胞外ドメインと、トランスメンブランドメインと、細胞質ドメインとを有する完全長ポリペプチドか、またはそのフラグメント、例えば細胞外ドメインもしくはその一部のみを有するフラグメントであり得る。受容体ポリペプチドが、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１６に示したアミノ酸配列の類似体または天然変異体であってもよいことは理解されよう。上記類似体は、当分野で利用可能な方法を用いるアミノ酸置換、欠失及び／または挿入によって生成させる。
【００２１】
　本発明のポリペプチドは好ましくは外来ＤＮＡ配列の発現産物であり、即ちＥＰＨ様受容体は好ましくは組み換え手段によって産生される。本発明は、ＥＰＨ様受容体を発現するベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を培養することを含むＥＰＨ様受容体産生方法も包含する。ＥＰＨ様受容体、特にそのフラグメントは化学合成によって調製することも可能である。上記のように調製したポリペプチドは、用いる宿主細胞に応じてグリコシル化されたりされなかったりし得、あるいはまたアミノ末端にメチオニン残基を有し得る。上記のように調製したポリペプチドは、当分野で通常用いられる方法で同定し、かつ細胞培養から回収する。
【００２２】
　本発明のＥＰＨ様受容体は、該受容体に対する抗体の産生に用いられる。ＨＥＫ受容体に対する抗体については実施例４に述べてある。本発明のポリペプチドを識別する抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得、また結合フラグメントまたはキメラ抗体であり得る。このような抗体は、診断アッセイにおけるＥＰＨ様受容体の検出、前記受容体の精製、及びＥＰＨ様受容体活性の調節に有用である。
【００２３】
　本出願の米国特許同時係属出願第０８／１４５，６１６号に述べたように、ＥＰＨ様受容体に関するリガンドで唯一既知であるのが、ＥＣＫ受容体に結合して該受容体のリン酸化を誘導するタンパク質である。このＥＣＫ受容体リガンドは以前にＢ６１として同定された（Ｈｏｌｚｍａｎ等，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１０，　ｐｐ．５８３０−５８３８，　１９９０）。ＥＣＫ受容体を利用できることはリガンドの同定に重要であったが、これはＢ６１が以前は、既知ではあったがＥＣＫ受容体リガンドと看做されていなかったからである。従って、リガンド結合ドメインを有するＥＰＨ様受容体はリガンドの同定及び精製に有用である。本発明のポリペプチドは、ＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８及びＨＥＫ１１受容体に関するリガンドの同定及び精製に用い得る。潜在的リガンドを検出する結合アッセイは溶液中で、または本出願の米国特許同時係属出願第０８／１４５，６１６号に開示したような方法を用いる固体支持体上への受容体の固定化によって行ない得る。このようなアッセイでは、単離したＨＥＫ受容体のリガンド結合ドメインを用い得る。あるいは他の場合には、Ｉｇドメインと融合させたＨＥＫリガンド結合ドメインを、細胞表面上でＨＥＫリガンドの存在を検出するのに用い得る。
【００２４】
　可溶性のＥＰＨ様受容体を用いて細胞関連受容体の活性化を、典型的には未結合リガンドに関して細胞関連受容体と競合させることにより調節（即ち促進または低減）することができる。ＥＰＨ様受容体活性化を調節することによって、受容体保有細胞の増殖及び／または分化を変更し得る。例えば、観察される本発明の受容体の組織分布（表５参照）から、可溶性ＨＥＫ７受容体は主に脳細胞の増殖及び／分化に影響すると考えられ、一方可溶性ＨＥＫ５受容体は主に脳及び膵臓の細胞に影響し得るが、ＨＥＫ５受容体が他の組織に及ぼす作用も無視することはできない。
【００２５】
　ＥＰＨ様受容体に対する抗体は、当分野で通常のアッセイ法であるイムノアッセイを用いて前記受容体を異なる種類の細胞中に検出するための有用な試薬である。この抗体はまた、受容体活性化を調節する有用な治療薬でもある。この抗体は受容体に結合してリガンドの結合を直接または間接にブロックし、それによって受容体活性化の拮抗物質として機能する。あるいは他の場合には、この抗体は受容体に結合することでリガンドの結合を容易にすることにより作用物質として機能し得、比較的低いリガンド濃度の下で受容体の活性化を実現し得る。加えて、本発明の抗体は、受容体活性化を誘導することによってそれ自体がリガンドとして機能し得る。ＥＰＨ様受容体に対する抗体は、ＥＰＨ様受容体保有細胞に関して富化された細胞集団の選択に有用であるようにも企図されている。前記のような細胞集団は、或る種の細胞を喪失した患者を治療しなければならない場合の細胞治療法において有用であり得る。
【００２６】
　本発明の単離核酸は、ＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８、ＨＥＫ１１及び関連受容体をコードするＤＮＡ及び／またはＲＮＡを検出及び定量するハイブリダイゼーションアッセイに用い得る。このようなアッセイは、様々な種類の細胞の上記受容体を発現させる潜在能力の測定、及び実際のＨＥＫ受容体発現レベルの測定において重要である。加えて、上記核酸はＨＥＫ受容体遺伝子中の、転座、転位（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）、重複等といった異常の検出にも有用である。
【００２７】
　ＥＰＨ様受容体を用いる治療法では典型的には、可溶形態の受容体を医薬組成物中に存在させて用いる。前記医薬組成物は、医薬に許容可能なキャリヤ、稀釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、安定剤、及び／または当分野で良く知られている他の物質を含有し得る。このような成分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　１８ｔｈ　ｅｄ．，　Ａ．　Ｒ．　Ｇｅｎｎａｒｏ　ｅｄ．，　１９９０にも記載されている。可溶性ＥＰＨ様受容体組成物の投与は、治療する状態に応じた様々な経路で可能であるが、典型的には静脈内または皮下投与を行なう。ＥＰＨ様受容体に対する抗体を含有する医薬組成物は好ましくはマウス−ヒトキメラ抗体、もしくはマウスにおいて生成させた抗体に対する患者の免疫応答が誘起される恐れを最小限に留めるべくＣＤＲグラフト抗体を含有する。抗ＥＰＨ抗体組成物のその他の成分は、可溶性受容体に関して述べたものに類似する。
【００２８】
　医薬組成物中の可溶性ＥＰＨ様受容体または抗ＥＰＨ抗体の量は、治療する状態の特性及び重篤度に依存する。所与の患者に関するこの量は当業者によって決定され得る。本発明の医薬組成物は、可溶性受容体または抗ＥＰＨ抗体を体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇから約１００ｍｇの量で含有するように企図されている。
【００２９】
　本発明は、ＥＰＨ様受容体ＰＴＫの活性化を調節する方法も提供する。この方法の実施では、治療有効量の可溶性ＥＰＨ様受容体または抗ＥＰＨ抗体を投与する。「治療有効量」という語はＥＰＨ様受容体の活性化を促進または低減する量を意味し、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇから約１００ｍｇの可溶性受容体または抗ＥＰＨ抗体量のことである。この治療は通常、受容体保有細胞の増殖及び／または分化の状態に一部関連すると考えられる、可溶性受容体または抗ＥＰＨ抗体によって治療可能な状態を有する患者に適する。表４に示したＨＥＫ受容体の組織分布に基づき、本発明の医薬組成物での治療は特に脳、心臓、筋肉、肺または膵臓に関する障害向きであると指摘することができる。しかし、幾つかのＨＥＫ受容体はきわめて様々な組織に現われ、従って受容体活性化調節作用はここに記した組織に限定されるとはかぎらないと理解される。
【００３０】
　本発明を以下の実施例によって更に詳述するが、これらの実施例を、本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。以下の実施例で用いた組み換えＤＮＡ法の全容は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，　“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，”　２ｎｄ　ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９に記載されている。
【実施例１】
【００３１】
　ＨＥＫ受容体ｃＤＮＡのクローニング及び配列決定
　本発明者は、受容体ＰＴＫのＥＰＨサブファミリーの５種のメンバーに関するクローンをヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから単離した。キナーゼドメイン中の保存アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドを設計した。プライマーＩは、多くのファミリーのＰＴＫ間に良く保存されているアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ（配列番号１）に基づいて設計した。プライマーIIは配列Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（配列番号２）に基づいて設計したが、この配列はＥＰＨサブファミリーのメンバー間では不変であるものの他のＰＴＫ中には、配列Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ以外はまれにしか見出されない。上記二つのタンパク質配列の逆翻訳に対応する、完全縮重オリゴヌクレオチドを合成し、これらを、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー由来の破壊ファージを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして用いた。上記ＰＣＲ反応の生成物をプラスミドベクターｐＵＣ１９中へクローン化し、挿入部分のヌクレオチド配列を決定した。配列決定した３５のＰＣＲ挿入部分のうちの２７が、ＰＴＫ遺伝子の一部として識別可能であった。それらの部分の、以前に公表された配列との対応を表１にまとめる。
【００３２】
【表１】
2004135670.tif 000002
【００３３】
　六つのＰＣＲ挿入部分からＳＲＣの一部と同一であるアミノ酸配列が推定されるが、これらの挿入部分は二つの異なるヌクレオチド配列を含む。一つの挿入部分はヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のβ受容体をコードすると考えられる。残りの１８のＰＣＲ挿入部分は６種の異なるヌクレオチド配列から成り、これらは総てＥＰＨサブファミリーのメンバーのフラグメントであると考えられる。１種の配列からは、ラットＥｌｋ（Ｌｈｏｔａｋ等，　１９９１）の対応領域と同一であるアミノ酸配列が推定され、このアミノ酸配列は前記領域のヒト相同体であると考えられる。二つの挿入部分からはＰＣＲ断片ｔｙｒｏ−４（Ｌａｉ及びＬｅｍｋｅ，　１９９１）の翻訳と整合するアミノ酸配列が推定されるが、これらの挿入部分は明らかにヌクレオチドレベルにおいて相違しており、一方他の二つの挿入部分はｔｙｒｏ−１及びｔｙｒｏ−５に対応する。第６のＰＣＲ挿入部分は、これまでに報告されていないＥＰＨ関連配列を有する。５個のクローンは、それらに関する完全長配列が未だ報告されていない潜在的ＥＰＨサブファミリーメンバーの一部を有するので、それぞれ放射性標識してヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングでプローブとして用いた。５個のプローブそれぞれに対応する幾つかのクローンを単離した。５種の受容体それぞれに関して、推定コーディング領域の最大部分を有するクローンのヌクレオチド配列を決定した。
【００３４】
　完全なコーディング領域を有するただ１個のｃＤＮＡクローンをＨＥＫ４に関してのみ単離した。ＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ１０及びＨＥＫ１１の、これらの受容体のアミノ末端をコードする部分はいずれのクローン中にも見出されなかった。完全なコーディング配列を得るべく、ｃＤＮＡ末端急速増幅（ＲＡＣＥ）技術を用いた。場合によっては、コーディング領域の失われた部分の獲得に２ラウンド以上のＲＡＣＥが必要であった。この操作を用いて、完全なコーディング配列が、完全なリーダー配列を欠くＨＥＫ７以外の総てのクローンに関して得られた。ＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８及びＨＥＫ１１のＤＮＡ配列を図１〜図４にそれぞれ示し、かつ配列番号１０（ＨＥＫ５）、配列番号１２（ＨＥＫ７）、配列番号１４（ＨＥＫ８）及び配列番号１６（ＨＥＫ１１）に示す。アミノ酸配列は、配列番号１１（ＨＥＫ５）、配列番号１３（ＨＥＫ７）、配列番号１５（ＨＥＫ８）及び配列番号１７（ＨＥＫ１１）に示す。
【実施例２】
【００３５】
　ＨＥＫ受容体配列の分析
　ＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８及びＨＥＫ１１は新規なヒトＥＰＨサブファミリーメンバーであるが、これらのうちのＨＥＫ１１以外の総てに関しては他の種から相同体が単離されている。本発明者はヒトＥＰＨ受容体サブファミリーメンバーを、Ｗｉｃｋｓ等，　１９９２の命名法に従いＨＥＫ（ｈｕｍａｎ　ＥＰＨ−ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅｓ）と呼称する。本発明者はこれらの受容体に関する名称及び番号を、ニワトリ（Ｃｅｋ）及びマウス（Ｍｅｋ）のファミリーの以前に発見されたメンバー（Ｓａｊｊａｄｉ等，　１９９１；　Ｓａｊｊａｄｉ及びＰａｓｑｕａｌｅ，　１９９３；　Ｐａｓｑｕａｌｅ，　１９９１）に対応させて選択した。起源種を第１文字によって示す慣例を拡張して、本発明者はＨＥＫ受容体のラット相同体をＲｅｋ（ｒａｔ　ＥＰＨ−ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅｓ）と呼称する。
【００３６】
　ＨＥＫ４は、ニワトリ受容体Ｃｅｋ４（触媒ドメインのアミノ酸同等率９１％）及びマウス受容体Ｍｅｋ４（触媒ドメインのアミノ酸同等率９６％）のヒト相同体である。ＨＥＫ５のアミノ酸配列はニワトリ受容体Ｃｅｋ５（Ｐａｓｑｕａｌｅ等，　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１２，　ｐｐ．３９５６−３９６７，　１９９２；　Ｐａｓｑｕａｌｅ，　１９９１）に非常に密接に関連する（触媒ドメインのアミノ酸同等率９６％）。ＨＥＫ７はおそらく、最近報告されたＣｅｋ７（Ｓａｊｊａｄｉ及びＰａｓｑｕａｌｅ，　１９９３）のヒト相同体である。ＨＥＫ８も、Ｓｅｋ（Ｇｉｌａｒｄｉ−ｈｅｂｅｎｓｔｒｅｉｔ等，　１９９２）及びＣｅｋ８（Ｓａｊｊａｄｉ及びＰａｓｑｕａｌｅ，　１９９３）（触媒ドメインのアミノ酸同等率９５％）に非常に密接に関連する。Ｃｅｋ６及びＣｅｋ９のヒト相同体は未だ報告されておらず、一方Ｃｅｋ１０のヒト相同体はつい最近公表された。本発明のヒト受容体のうちの一つは、他の種の受容体のうちに密接に関連するものが無く、明らかにＥＰＨサブファミリーの新規なメンバーである。本発明者はこの受容体を、Ｃｅｋ９及びＣｅｋ１０のヒト相同体がＨＥＫ９及びＨＥＫ１０とそれぞれ呼称されることを前提としてＨＥＫ１１と命名した。既知のＥＰＨサブファミリーメンバーを表２にまとめる。
【００３７】
【表２】
2004135670.tif 000003
【００３８】
　四つの新規な受容体クローン、並びに従来公知のＥＰＨサブファミリーメンバーであるＥＣＫ（配列番号１８）、ＥＰＨ（配列番号１９）、ＨＥＫ２（配列番号２０）及びＨＥＫ４（配列番号２１）の推定アミノ酸配列を、図５に示したように整列させた。四つのクローンは互いに、また公知のＥＰＨサブファミリーメンバーに密接に関連した。四つの新規な受容体のうちのいずれの細胞外ドメイン配列も、ＥＰＨサブファミリーメンバーの特長を成すＩｇループ、フィブロネクチンIII型反復部分、及びシステインに富む領域を有する。２０システイン残基の位置は総てのサブファミリーメンバー間に保存されている。また、ＥＰＨサブファミリー特異的プライマー（Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ；　配列番号２；　図５のアミノ酸７５７〜７６４）のベースとして用いた触媒領域部分も完全に保存されている。表３に、ヒトＥＰＨサブファミリーメンバー対間の配列同等率（％）をまとめる。表中下方部分に触媒ドメインのアミノ酸同等率（％）を示し、上半部には細胞外領域のアミノ酸同等率（％）を示す。ＥＰＨ様受容体のアミノ酸配列は、触媒領域ではきわめて良く保存されている（アミノ酸同等率６０〜８９％）が、細胞外領域では同じ受容体サブファミリーのメンバーに関して予測されるほど高率では保存されていない（アミノ酸同等率３８〜６５％）。
【００３９】
【表３】
2004135670.tif 000004
　示されている数は％で表されている。
【００４０】
　アミノ酸配列のペア毎の比較を用い、分子ファミリーの進化関係を示す系統樹を構築し得る。図６は、ＥＰＨサブファミリーのメンバー間の関係を要約した系統樹である。各グループの異種間相同体（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｓ）からの単一のファミリーメンバーのみが示されており、可能な限り、ヒト標本を用いた（異種間相同体の要約については表２を参照されたい）。枝の長さは、メンバー間のダイバージェンスの程度を表す。ＥＰＨサブファミリーは、既に進化的に他の受容体ＰＴＫよりも細胞質ＰＴＫに近い枝上に存在していることが示されている（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ及びＨｕｎｔｅｒ，１９９３）。興味深いことには、該系統樹を上ってゆくにつれ、受容体はより近縁となり、発現が脳に局在化するようになる。
【実施例３】
【００４１】
　ＨＥＫ受容体細胞外ドメインの構築及び発現
　受容体のトランスメンブラン及び細胞質ドメインをコードするＤＮＡ配列を欠失させ、細胞外ドメインの３′末端に翻訳停止コドンを導入して、可溶性細胞外形態のＨＥＫ受容体タンパク質を構築した。図１に示されているように、ＨＥＫ５細胞外ドメイン構築物は、５２４位のリシンの後に導入された停止コドンを有していた。図２に示されているように５４７位のグルタミンの後に停止コドンを導入してＨＥＫ７細胞外ドメインを構築した。図３に示されているように５４７位のトレオニンの後に停止コドンを導入してＨＥＫ８細胞外ドメインを構築した。
【００４２】
　細胞外ドメインコード領域に対するプライマー５′及び３′を用い、ＰＣＲにより、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからＨＥＫ細胞外ドメインを増幅した。
【００４３】
　ＨＥＫ５の場合、プライマー：
５′ＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＣＧ（配列番号：２２）；及び
５′ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡ（配列番号：２３）
を用いて、細胞外ドメインを増幅し、プラスミドｐＤＳＲαにクローニングするための制限部位を得た。さらに、以下のプライマー：
５′ＧＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧ（配列番号：２４）；及び
５′ＣＧＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＡＴＣ（配列番号：２５）
を用いて、翻訳開始部位、発現用ｅｌｋ受容体シグナルペプチド、及びｐＤＳＲαにクローニングするための制限部位を得た。
【００４４】
　得られた構築物は、ｅｌｋシグナル配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：２６）をコードするＤＮＡとＨＥＫ５受容体の最初のコドンとの融合体であった。
【００４５】
　得られたＨＥＫ５細胞外ドメインをＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化した後でｐＤＳＲαにクローン化し、発現させるためにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。
【００４６】
　細胞外ドメインコード領域に対するプライマー５′及び３′を用い、ＰＣＲにより、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからＨＥＫ８細胞外ドメインを増幅した。ＨＥＫ８の場合、プライマー：
５′ＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＣＧＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＴ；及び
５′ＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＣＣＡＴＣＴＣ
を用いて細胞外ドメインを増幅し、プラスミドｐＤＳＲαにクローニングするための制限部位を得た。
【００４７】
　得られたＨＥＫ８細胞外ドメインをＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化した後ｐＤＳＲαにクローン化し、発現させるためにＣＨＯ細胞に移した。
【００４８】
　細胞外ドメインコード領域に対するプライマー５′及び３′を用い、ＰＣＲにより、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからＨＥＫ７細胞外ドメインを増幅した。ＨＥＫ７の場合、プライマー：
５′ＴＴＣＧＣＣＣＴＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴＣＴＴＣＧＧＧＡＴＴＴＧＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣ及び
５′ＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴ
を用いて細胞外ドメインを増幅した。さらに、以下のプライマー：
５′ＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＣＧＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＣＴＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴ；及び
５′ＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴ
を用い、翻訳開始部位、ＨＥＫ８受容体シグナルペプチド配列及びプラスミドｐＤＳＲαにクローニングするための制限部位を得た。
【００４９】
　得られた構築物は、ＨＥＫ８シグナル配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐをコードする（ｉｎｃｏｄｉｎｇ）ＤＮＡとＨＥＫ７受容体の最初のコドンとの融合体であった。
【００５０】
　得られたＨＥＫ７細胞外ドメインをＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化した後でｐＤＳＲαにクローン化し、発現させるためにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。
【実施例４】
【００５１】
　ＨＥＫ受容体に対する抗体
　抗原として細菌融合タンパク質を用い、細胞外ドメインを認識するＨＥＫ受容体タンパク質に対する抗体を産生させた。抗原として合成ペプチドを用い、細胞質ドメインを認識する抗体も産生させた。
【００５２】
　用いた方法は既に記載されたものであった（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８８）。細胞外ドメイン抗体を得るために、ｃＤＮＡをｐＡＴＨベクターに挿入した（該構築物によりコードされる各受容体の領域については表４を参照）。これらの構築物を細菌中で発現させ、得られたＴｒｐＥ−融合タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。細胞質ドメインの抗ペプチド抗体を得るために、ペプチドを合成し（その配列については表４を参照）、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に共有結合させた。融合タンパク質及び結合したペプチドをウサギ中で抗原として用い、抗血清を産生させ、記載のように（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，１９８８）特性決定した。ＳｕｌｆｏＬｉｎｋキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を用いて抗ペプチド抗体をアフィニティー精製した。
【００５３】
【表４】
2004135670.tif 000005
【実施例５】
【００５４】
　ＨＥＫ／ＴｒｋＢキメラ受容体
１．ラットｔｒｋＢ細胞質ドメインをコードするｐＳＪＡ１の作製
　全てのキメラ受容体は、ラットｔｒｋＢの細胞内部分とＨＥＫ受容体の１つのトランスメンブラン領域及び細胞外ドメインとから構成される。各個別の構築を簡略化するために、ＲｔｒｋＢ／ＡｆｌII（又はｐＳＪＡ１）と称される中間又は親プラスミドを作製した。先ず、ＰＣＲ支援突然変異誘発により、コードペプチド配列を変えずに、ＡｆｌII部位（ＣＴＴＡＡＧ）を、ラットｔｒｋＢ ｃＤＮＡ〔Ｍｉｄｄｌｅｍａｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，１４３−１５３（１９９１）〕の２０２１位（２０２１位のシトシン（Ｃ２０２１）〜２０２６位のグアニン（Ｇ２０２６，ＣＴＣＡＡＧ）に導入した。簡潔に言えば、ラットｔｒｋＢ ｃＤＮＡ配列に基づいてＰＣＲプライマーを合成した。プライマーＩは該ｃＤＮＡのＣ２００３〜Ｇ２０３４を含んでいた。該プライマーは２つの突然変異、即ち、２０２３位でのシトシンからチミン（Ｔ）への置換（Ｃ２０２３Ｔ）及びＴ２０１３とＧ２０１４の間へのアデニン（Ａ）の挿入を含んでいた。これらの突然変異により、Ｃ２０２１位にＡｆｌII部位が、またＡｆｌII部位に隣接する追加のＸｈｏＩ部位が形成された。プライマーIIは、ＡｐａＩ部位を有するｃＤＮＡのＴ２１４１〜Ａ２１６５を逆方向で含んでいた。これらのプライマー及びラットｔｒｋＢ ｃＤＮＡ鋳型により産生されたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ及びＡｐａＩ酵素で消化し、発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３（ＩｎＶｉｔｒｏＧｅｎ）のＸｈｏＩ及びＡｐａＩ部位にサブクローン化して、ｐＳＪＡ１−ｂを作製した。次いで、ｐＳＪＡ１−ｂをＡｐａＩで線状とし（ｌｉｎｅａｒｉｚｅ）、ＢａｎIIで消化したラットｔｒｋＢ ｃＤＮＡフラグメント（Ｇ２１５１〜Ｇ４６９７）と連結して、ラットｔｒｋＢタンパク質（Ｌ４４２〜Ｇ７９０）の全細胞内ドメイン及びｃＤＮＡの１６２７ヌクレオチド３′末端の非コード領域の１５７１残基（Ａ３１３１〜Ｇ４６９７）をコードする配列を含む大きなフラグメント（Ｃ２０２１〜Ｇ４６９７）を再構成した。
２．ＨＥＫ８／ラットｔｒｋＢ（ｐＳＪＡ５）キメラの作製。
【００５５】
　上記と同様な方法でＨＥＫ８／ラットｔｒｋＢキメラを作製した。先ず、ＳａｌＩ／ＢｓａＩ ｃＤＮＡフラグメントをプラスミドＴＫ１０／ＦＬ１３から分離した。該フラグメントは、ＨＥＫ８ ｃＤＮＡの始めからＴ１６８９までのヌクレオチド配列を含んでいた（図３）。次いで、ＨＥＫ８ ｃＤＮＡ配列に基づいて一対のオリゴヌクレオチドを合成した。第１のオリゴヌクレオチドの配列は、ＨＥＫ８ ｃＤＮＡのＧ１６９０〜Ｃ１７４０と同じであり、その３′末端に追加のＣ残基が加えられていた。第２のオリゴヌクレオチドは、ＨＥＫ８ ｃＤＮＡと逆方向であり、ＨＥＫ８ ｃＤＮＡ配列のＣ１６９４〜Ｃ１７４０、及びその５′末端に追加の５個の残基モチーフ、ＴＴＡＡＧを含んでいた。これらの２つのオリゴヌクレオチドをキナーゼ化し、等モル比でアニーリングして、ＨＥＫ８ ｃＤＮＡのＧ１６９０〜Ｃ１７４０配列及びそれぞれその５′及び３′末端にＢｓａＩ及びＡｆｌII付着端を有する二本鎖ＤＮＡフラグメントを形成した。該フラグメントをＳａｌＩ／ＢｓａＩ ｃＤＮＡフラグメントと共にＸｈｏＩ／ＡｆｌII線状ｐＳＪＡ１に連結して、ＨＥＫ８／ＲｔｒｋＢ（ｐＳＪＡ５）キメラ構築物を作製した。
３．ＨＥＫ１１／ラットｔｒｋＢ（ｐＳＪＡ６）キメラの作製
　ＨＥＫ１１／ラットｔｒｋＢキメラを作製するために、先ず、プラスミドＴＫ１９Ｔ３から、ＨＥＫ１１ ｃＤＮＡ（図４）のヌクレオチドＣｌ〜Ｔ１６７４の配列を含むＳａｌＩ／ＡｃｃＩフラグメントを分離した。次いで、ＨＥＫ１１ ｃＤＮＡ配列に基づいて、一対のオリゴヌクレオチドを合成した。第１のオリゴヌクレオチドは、ＨＥＫ１１ ｃＤＮＡのヌクレオチドＡ１６６６〜Ｔ１６９１と同じ配列を有し、ＡｃｃＩ部位を含んでいた。第２のオリゴヌクレオチドは、ＨＥＫ１１ ｃＤＮＡと逆方向であり、ＨＥＫ１１ ｃＤＮＡ配列のＧ１８９５〜Ｔ１９１９を含んでいた。該オリゴヌクレオチドの５′末端に、追加の１０個の残基モチーフ、ＣＣＣＧＣＴＴＡＡＧを加えて、ＡｆｌII部位を導入した。これは、ＨＥＫ１１受容体のトランスメンブラン領域及び外部ドメインと、同じ読み取りフレーム中のｐＳＪＡ１にクローン化されたラットｔｒｋＢ ｃＤＮＡの細胞内ドメインとの連結に用いられる。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、また鋳型としてＨＥＫ１１ ｃＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲフラグメントをＡｃｃＩ及びＡｆｌII酵素で消化し、ＳａｌＩ／ＡｃｃＩ ｃＤＮＡフラグメント及びＸｈｏＩ／ＡｆｌII線状ｐＳＪＡ１と連結して、ＨＥＫ１１／ラットｔｒｋＢ（ｐＳＪＡ６）キメラ構築物を作製した。
【実施例６】
【００５６】
　ＨＥＫ受容体の組織分布
　ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより、ラット組織及びヒトにおけるＨＥＫ４、ＨＥＫ５、ＨＥＫ７，ＨＥＫ８及びＨＥＫ１１受容体のｍＲＮＡ発現分布を調べた。
【００５７】
　Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２，１５６−１５９（１９８７）〕の方法を用い、ラットの全ＲＮＡを組織から調製した。該ＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロース電気泳動により分離し、２０×ＳＳＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２）を用いてＨｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に転移した。膜を真空下に８０℃で３０分間脱水し、次いで、ＵＶ透照装置（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ，Ｎｅｗ Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）上で３分間架橋させた。膜を５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．２％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性ニシン精子ＤＮＡ（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２）中４２℃で２時間予備ハイブリダイズした。ヒト組織のノーザーンブロットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。少なくとも１×１０９ｃｐｍ／μｇの比活性までのヘキサヌクレオチドランダムプライミングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用い、受容体の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡのフラグメントを３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識してプローブを作製した。１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓを用いた以外は予備ハイブリダイゼーション緩衝液と類似の緩衝液中、４２℃で２４〜３６時間、１〜５ｎｇ／ｍｌの濃度でプローブを膜にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、それぞれ２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５分間室温で２回、次いで、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中１５分間５５℃で２回膜を洗浄した。Ｄｕｐｏｎｔ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ補力スクリーン（ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎ）を有するＫｏｄａｋ ＸＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用い、ブロットを１〜２週間露出した。結果を図７〜図１１に示す。
【００５８】
　ＨＥＫ４の相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）は既にマウス、ニワトリ及びラットから同定されている。成熟マウスでは、発現は主として脳と精巣で検出される（Ｓａｊｊａｄｉら，１９９１）。わずかに異なるパターンが成熟ニワトリ組織に検出されたが、主たる発現源は、脳、肝臓及び腎臓であった。低レベルの発現が肺及び心臓で検出可能であった〔Ｍａｒｃｅｌｌｅ ＆ Ｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ７，２４７９−２４８７（１９９２）〕。Ｒｅｋ４遺伝子（ｔｙｒｏ−４）のフラグメントを分離し、成熟ラットにおける組織発現の検出に用いた（Ｓａｊｊａｄｉら，１９９１）。Ｒｅｋ４ ｍＲＮＡを発現した唯一の組織は脳であった。しかし、肺や精巣由来ＲＮＡは調べなかった。ＨＥＫ４に関するこれまでの実験では、細胞系でのｍＲＮＡの発現を調べたに過ぎないが、それは１つの前Ｂ細胞系及び２つのＴ細胞系で検出された（Ｗｉｃｋｓら，１９９２）。ｉｎ ｖｉｖｏでの発現に関する上記の重要性はまだ解明されていない。該実験において、本出願人は、ヒト組織中でのＨＥＫ４の発現だけでなくラット組織中でのＲｅｋ４の発現をも調べた。ＨＥＫ４ ｍＲＮＡは約７ｋｂのサイズの単一転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に相当する（図７Ａ）。ＨＥＫ４ ｍＲＮＡは胎盤中で最も多量に発現されたが、心臓、脳、肺及び肝臓にも低レベルの発現が存在する。長期露出すると、微量のｍＲＮＡが腎臓及び膵臓で検出された。ラットでの発現はマウス及びニワトリで検出されたものと類似であった。Ｒｅｋ４は本明細書で特性決定したファミリーメンバーのいずれの最低レベルでも発現した。ラットの肺で約７ｋｂの転写体が検出され、脳ではより低い量が検出された（図７Ｂ）。さらに、４ｋｂの転写体がラットの精巣で発現した。該転写体は全ＲＮＡを用いても僅かしか検出されなかったので、他のラット組織は、検出レベル以下のＲＥＫ４量しか含んでいないものもあると思われる。
【００５９】
　成熟組織におけるＨＥＫ５の発現はニワトリ及びラットで既に実験されている。ニワトリにおける実験では、脳及び肝臓でＣｅｋ５タンパク質が同定されたが、より低量のタンパク質が腸でも検出された。ラットでは、ｔｙｒｏ−５フラグメントが成熟した脳でのみｍＲＮＡを発現させたことが検出されたが、腸は検査しなかった（Ｌａｉ及びＬｅｍｋｅ、１９９１）。本出願人による実験の結果は、ＨＥＫ５ ｍＲＮＡがＨＥＫ４よりはるかに高レベルで発現し、数種のサイズの転写体として検出されたことを示している。最も多量のｍＲＮＡは約４．０及び４．４ｋｂのものであり、９．５ｋｂ以上の高分子量転写体は少量であった（図８Ａ）。ＨＥＫ５ ｍＲＮＡは胎盤で最も多量に発現したが、脳、膵臓、腎臓、筋肉及び肺でも高レベルで発現した。ブロットをさらに長時間露出すると、心臓及び肝臓でも転写体の存在が認められた。ＨＥＫ５のラット相同体（Ｒｅｋ５）はいくらか類似した発現パターンを示した。Ｒｅｋ５は腸で最も多量に発現し、次いで、脳、腎臓、肺、胸腺、胃及び卵巣で発現した（図８Ｂ）。精巣、筋肉、心臓又は肝臓では発現が検出されなかった。本出願人は、このファミリーの分析中に、ラットＥｒｋフラグメント（Ｃｈａｎ ＆ Ｗａｔｔ，１９９１）もＲｅｋ５受容体の一部をコードするとの結論を下した。数種のラット組織中でＥｒｋ発現を調べたが、肺においてのみ発現が検出された。該レポートと本出願人及び他の人々（Ｌａｉ ＆ Ｌｅｍｋｅ，１９９１）が知見したものとの不一致がどうして起こるかは不明である。
【００６０】
　ＨＥＫ８の相同体がニワトリ、マウス及びラットから同定されている。成熟ニワトリでは、脳において単一のＣｅｋ８転写体の高レベルの発現が検出され、腎臓、肺、筋肉及び胸腺でも発現が検出された。 ＨＥＫ８のマウスの相同体、Ｓｅｋの発現は、成熟脳中で単一転写体として多量に発現したことが検出され、低レベルの発現が心臓、肺及び腎臓に認められた。Ｒｅｋ８（ｔｙｒｏ−１）のフラグメントを用いてラット組織における発現を調べたが、脳においてのみ発現が検出された（Ｌａｉ ＆ Ｌｅｍｋｅ，１９９１）。本出願人は、Ｈｅｋ８ ｍＲＮＡがＨＥＫ５と同レベルで発現することを見いだした。多重転写体も認められたが、最も多量であったのは、７ｋｂと５ｋｂのものであった。最高レベルのｍＲＮＡの発現が脳に認められたが、心臓、肺、筋肉、腎臓、胎盤及び膵臓を含む他の組織にも実質的レベルの発現が検出された。肝臓での発現は他の組織に比べるとはるかに低レベルであった。ヒト及びマウスの発現パターンにおける唯一の違いは、ニワトリにおいてＣｅｋ８の場合にも見られる、ヒト筋肉における発現であった。ラット組織中では、Ｒｅｋ８は脳で最も高レベルで発現し、次いで、肺、心臓及び精巣であった（図１０Ｂ）。ＨＥＫ８とは対照的に、Ｒｅｋ８の発現は、ＨＥＫ８が容易に検出可能であった二つの組織、即ち、筋肉及び腎臓では低いようであった。さらに、Ｒｅｋ８は、長期露出してさえ認められなかったので、５．０ｋｂ転写体として発現しなかった。
【００６１】
　本出願人は、このファミリーの分析中に、ＨＥＫ７はＣｅｋ７のヒトの相同体であると推定した。成熟ニワトリで認められた唯一の発現は脳で検出された８．５ｋｂ転写体であった（Ｓａｊｊａｄｉ ＆ Ｐａｓｑｕａｌｅ，１９３）。本明細書に記載の５つのＥＰＨサブファミリーメンバーの中で、ＨＥＫ７がその発現パターンが最も制限されていた。ヒトｍＲＮＡの分析により、脳にだけ有意な発現が認められ、胎盤でははるかに低レベルの発現しか見られなかった（図９Ａ）。長期露出しても、検査した他のいずれの組織にも発現が認められなかった。２つの顕著な転写体が脳で検出され、最高レベルで発現したのは、６ｋｂのサイズのものであり、他は９ｋｂの長さのものであった。しかし胎盤では、９ｋｂの転写体のみが検出された。Ｒｅｋ７ ｍＲＮＡはＨＥＫ７と類似のパターンで発現し、最高レベルの発現は脳で検出され、卵巣でははるかに低レベルの発現しか認められなかった（図９Ｂ）。該転写体は、ＨＥＫ７と類似サイズのものであり、６ｋｂ転写体は脳でのみ検出された。
【００６２】
　ＨＥＫ１１は数種の転写体として発現し、長さが７．５、６．０及び３．０ｋｂの多量のｍＲＮＡ、及び４．４及び２．４ｋｂの少量の転写体が発現した（図１１Ａ）。５つのｍＲＮＡは全て脳で最も高いレベルで発現し、次いで心臓であった。胎盤、肺及び腎臓は５種の転写体中４種を有意な量で発現したが、筋肉では低レベルの発現しか検出されなかった。膵臓では検出可能な量のＨＥＫ１１ ｍＲＮＡはほとんど検出されず、肝臓では検出可能なＨＥＫ１１転写体は全く認められなかった。Ｒｅｋ１１は類似の発現パターンを有し、脳で４種の転写体（１０、７．５，３．５及び３．０ｋｂ）が検出された（図１１Ｂ）。
【００６３】
　検査した全ての組織における５つの受容体それぞれのｍＲＮＡ発現の相対レベルを表５に要約する。
【００６４】
【表５】
2004135670.tif 000006
【００６５】
　ＨＥＫ４、５、８及び１１の転写体は、ヒト組織中ではかなり広範囲に分布していたが、ＨＥＫ７は脳特異的であった。ラットとヒト組織の発現パターンは、ラットブロットが全ＲＮＡを用いたためにポリＡ＋よりも感度が低かったことを考えれば、ほぼ似通ったものであった。Ｓａｊｊａｄｉ及びＰａｓｑｕａｌｅによりＣｅｋ ｍＲＮＡについて検出されたように（Ｓａｊｊａｄｉ ＆ Ｐａｓｑｕａｌｅ，１９９３）、しばしば単一受容体に対して数種の異なるサイズの転写体が検出された。転写体のサイズ分布は、組織及び種特異的のようである。これまでの研究により、より小型のＭｅｋ４転写体は潜在的に分泌性の（ｓｅｃｒｅｔｅｄ）受容体をコードすることが示されている（Ｓａｊｊａｄｉら，１９９１）。
【００６６】
　以下の章では、実施例１に記載の実験の実施に用いられた材料及び方法を説明する。
【００６７】
　ＨＥＫ受容体ｃＤＮＡの分離、クローニング及び配列決定
　鋳型としてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからの破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）ファージを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＥＰＨサブファミリー受容体の触媒ドメインの一部を含むフラグメントを作製した。ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の１０μｌアリコートを７０℃で５分間処理して、ファージ粒子を破壊し、次いで、湿潤氷上で冷却した。破壊ファージを、総容量１００μｌ中の１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液１０μｌ、２ｍＭの各ｄＮＴＰ８μｌ、各プライマー １００ピコモル及びＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）１．５μｌに加えた。該反応を３５サイクル実施したが、各サイクルは、９６℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間から構成した。最後に７２℃で５分間インキュベートして、完全な延長が得られるようにした。用いたプライマーはＥＰＨサブファミリーメンバー間で強固に保持されているアミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）混合物であった。
５′ＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＹＣＧＮＧＡＹＹＴＮＧＣＮＧＣ′（配列番号：２７）；
５′ＡＧＧＧＧＡＴＣＣＲＷＡＲＳＷＣＣＡＮＡＣＲＴＣ′（配列番号：２８）。
【００６８】
　ＰＣＲ反応産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、配列分析するためにＭ１３ｍｐ１９〔Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）〕にクローン化した。ＥＰＨ受容体サブファミリーメンバーのフラグメントであると同定された５つのクローンをランダムプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、各クローンを、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー由来プラークを含むＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎニトロセルロースフィルター（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）のスクリーニングに用いた。単クローンを得るために、陽性スクリーニングプラークから作製したファージストックを平板培養し、同一プローブで再スクリーニングした。ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を補ったｉｎ ｖｉｖｏ切り出し法（ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により、ｃＤＮＡ挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに転移した。Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３Ａ自動ＤＮＡ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてヌクレオチド配列を決定した。
【００６９】
　５′レース（Ｒａｃｅ）
　製造業者の指示に従い、５′ＲＡＣＥキット（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてｃＤＮＡの５′末端を分離した。ウルトラフリー−ＭＣ（ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）セルロースフィルター（３０，０００分子量カットオフ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用い、過剰なプライマーを第１鎖ｃＤＮＡ合成後に除去した。増幅ＰＣＲ産物を適切な制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて精製した。精製ＰＣＲ産物を、適切な制限酵素で消化しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１９〔Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，Ｇｅｎｅ ３３，１０３−１１９（１９８５）〕に連結し、連結混合物をエレクトロポレーションにより宿主細菌に導入した。得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを作製した。ＤＮＡ配列を決定するために最大挿入断片を含むクローンを選択した。
【００７０】
　本発明を好ましい実施態様に関して説明したが、当業者にはその変更及び改変が考えられるものと理解する。従って、添付請求の範囲にはそのような均等な変更が全て含まれ、該変更も請求されている本発明の範囲内に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】ＨＥＫ５受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図１Ｂ】ＨＥＫ５受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図１Ｃ】ＨＥＫ５受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図１Ｄ】ＨＥＫ５受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図１Ｅ】ＨＥＫ５受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図２Ａ】ＨＥＫ７受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図２Ｂ】ＨＥＫ７受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図２Ｃ】ＨＥＫ７受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図２Ｄ】ＨＥＫ７受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図２Ｅ】ＨＥＫ７受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図３Ａ】ＨＥＫ８受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図３Ｂ】ＨＥＫ８受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図３Ｃ】ＨＥＫ８受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図３Ｄ】ＨＥＫ８受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図３Ｅ】ＨＥＫ８受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図４Ａ】ＨＥＫ１１受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図４Ｂ】ＨＥＫ１１受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図４Ｃ】ＨＥＫ１１受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図４Ｄ】ＨＥＫ１１受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図４Ｅ】ＨＥＫ１１受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図４Ｆ】ＨＥＫ１１受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。
【図５Ａ】ヒトＥＰＨ受容体サブファミリーのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図５Ｂ】ヒトＥＰＨ受容体サブファミリーのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図５Ｃ】ヒトＥＰＨ受容体サブファミリーのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図５Ｄ】ヒトＥＰＨ受容体サブファミリーのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図５Ｅ】ヒトＥＰＨ受容体サブファミリーのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図５Ｆ】ヒトＥＰＨ受容体サブファミリーのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図６】受容体タンパク質チロシンキナーゼのＥＰＨサブファミリーの分子の系統発生を示す説明図である。
【図７Ａ】ＨＥＫ受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図である。
【図７Ｂ】ＨＥＫ受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図である。
【図８Ａ】ＨＥＫ受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図である。
【図８Ｂ】ＨＥＫ受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図である。
【図９Ａ】ＨＥＫ受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図である。
【図９Ｂ】ＨＥＫ受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図である。
【図１０Ａ】ＨＥＫ受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図である。
【図１０Ｂ】ＨＥＫ受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図である。
【図１１Ａ】ＨＥＫ受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図である。
【図１１Ｂ】ＨＥＫ受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図である。
【図１Ａ】
2004135670.tif 000007
【図１Ｂ】
2004135670.tif 000008
【図１Ｃ】
2004135670.tif 000009
【図１Ｄ】
2004135670.tif 000010
【図１Ｅ】
2004135670.tif 000011
【図２Ａ】
2004135670.tif 000012
【図２Ｂ】
2004135670.tif 000013
【図２Ｃ】
2004135670.tif 000014
【図２Ｄ】
2004135670.tif 000015
【図２Ｅ】
2004135670.tif 000016
【図３Ａ】
2004135670.tif 000017
【図３Ｂ】
2004135670.tif 000018
【図３Ｃ】
2004135670.tif 000019
【図３Ｄ】
2004135670.tif 000020
【図３Ｅ】
2004135670.tif 000021
【図４Ａ】
2004135670.tif 000022
【図４Ｂ】
2004135670.tif 000023
【図４Ｃ】
2004135670.tif 000024
【図４Ｄ】
2004135670.tif 000025
【図４Ｅ】
2004135670.tif 000026
【図４Ｆ】
2004135670.tif 000027
【図５Ａ】
2004135670.tif 000028
【図５Ｂ】
2004135670.tif 000029
【図５Ｃ】
2004135670.tif 000030
【図５Ｄ】
2004135670.tif 000031
【図５Ｅ】
2004135670.tif 000032
【図５Ｆ】
2004135670.tif 000033
【図６】
2004135670.tif 000034
【図７Ａ】
2004135670.tif 000035
【図７Ｂ】
2004135670.tif 000036
【図８Ａ】
2004135670.tif 000037
【図８Ｂ】
2004135670.tif 000038
【図９Ａ】
2004135670.tif 000039
【図９Ｂ】
2004135670.tif 000040
【図１０Ａ】
2004135670.tif 000041
【図１０Ｂ】
2004135670.tif 000042
【図１１Ａ】
2004135670.tif 000043
【図１１Ｂ】
2004135670.tif 000044
【配列表】
2004135670000001.xml