(57)【要約】【課題】複数の分離カラムの分離能及び質量分析装置の検出感度に悪影響を及ぼすことなく迅速に検出可能な液体クロマトグラフ質量分析装置を実現する。【解決手段】分離カラム５に連続して試料が供給され分離カラム５から紫外可視検出器６を通過した成分がトラップカラム８に供給され保持される。トラップカラム９にはポンプ１１により溶出液１２が供給され、供給初期の一定時間だけバルブ１３を介してボトル１４に溶出液が破棄された後カラム９が保持していた成分が高速分離カラム１５を介して質量分析装置１６に供給される。一定時間経過後十方バルブ７の流路が切り替えられカラム９に分離カラム５からの試料が供給されカラム８には溶出液１２が供給され、供給初期の一定時間だけバルブ１３を介してボトル１４に溶出液が破棄され、その後カラム８が保持していた成分が高速分離カラム１５を介して質量分析装置１６に供給される。【選択図】      図１
2004271272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
送液手段と、試料注入手段と、複数の分離カラムと、質量分析手段とを有する液体クロマトグラフ質量分析装置において、
第１分離カラムにより分離された試料成分を保持する複数のトラップカラムと、
複数のトラップカラムのうちの１つのトラップカラムを上記第１分離カラムに接続したとき、他の１つのトラップカラムは送液手段に接続し、一定時間毎に上記１つのトラップカラムの第１分離カラムへの接続と送液手段への接続とを切り替えると共に、上記他の１つのトラップカラムの送液手段への接続と第１分離カラムへの接続とを切り替える第１切り替えバルブと、
トラップカラムが送液手段に接続された一定の初期時間だけ、送液手段に接続されたトラップカラムを廃液手段に接続した後、上記送液手段に接続されたトラップカラムを、第１分離カラムより短時間で試料成分を分離でき、質量分析手段に接続された第２分離カラムに接続する第２切り替えバルブと、
を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項２】
請求項１記載の液体クロマトグラフ質量分析装置において、第１分離カラムと複数のトラップカラムとの間には、試料のクロマトグラムを検出する検出手段が配置されていることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項３】
請求項１記載の液体クロマトグラフ質量分析装置において、上記第２分離カラムは、高速分離可能なモノリスカラムであることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項４】
送液手段と、試料注入手段と、複数の分離カラムと、質量分析手段とを有する液体クロマトグラフ質量分析装置において、
第１分離カラムより短時間で試料成分を分離でき、第１分離カラムにより分離された試料成分をさらに分離する複数の第２分離カラムと、
複数の第２分離カラムのうちの１つの第２分離カラムを上記第１分離カラムに接続したとき、他の１つの第２分離カラムは送液手段に接続し、一定時間毎に上記１つの第２分離カラムの第１分離カラムへの接続と送液手段への接続とを切り替えると共に、上記他の１つの第２分離カラムの送液手段への接続と第１分離カラムへの接続とを切り替える第１切り替えバルブと、
第２分離カラムが送液手段に接続された一定の初期時間だけ、送液手段に接続された第２分離カラムを廃液手段に接続した後、上記送液手段に接続された第２分離カラムを、質量分析手段に接続する第２切り替えバルブと、
を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフ質量分析装置に係わり、特に、複数の分離カラムを有する多次元液体クロマトグラフ質量分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
複数の成分を含む溶液試料の分析に、液体クロマトグラフ質量分析装置が使用されている。
【０００３】
この液体クロマトグラフ質量分析装置は、試料を分離カラム内に通過させ、カラムと成分間に生じる相互作用が成分毎に異なることを利用して試料中の成分を互いに分離する液体クロマトグラフと、分離された成分を順次イオン化し、生成したイオンを検出する質量分析装置とを備えている。
【０００４】
ここで、試料中の成分の種類が多い場合は、各成分を更に分離するために、複数の分離カラムを直列に接続した多次元液体クロマトグラフを用いた多次元液体クロマトグラフ質量分析装置が使用される。
【０００５】
多次元液体クロマトグラフ質量分析装置の例としては、特許文献１や、非特許文献１に記載されている。
【０００６】
また、分離カラムを直列に接続するものではないが、試料濃縮カラムと、反応カラムと、分離カラムを直列に接続する液体クロマトグラフが特許文献２に記載されている。
【０００７】
この特許文献２に記載された技術は、試料水を、濃縮カラムに供給して濃縮する一方、溶離液を成分イオン分離カラムに供給し、濃縮及び分離が完了した時点で、流路切換バルブを切換え、脱離用溶液を濃縮カラム、反応カラムを介して成分イオン分離カラムに供給する技術である。
【０００８】
特許文献２記載の技術のように構成することにより、濃縮と分離とを孤立して行い、最適な濃縮法と最適な分離条件の選定を可能とするものである。
【０００９】
【特許文献１】
特開平３−１７５３５５号公報
【特許文献２】
特開昭６２−２５５８６５号公報
【非特許文献１】
アナリィティカルケミストリ６９巻（１９９７年）第１５１８頁から第１５２４頁（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９，（１９９７）ＰＰ１５１８−１５２４）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
多次元液体クロマトグラフ質量分析装置では、分離の原理が異なる複数のカラムを用いる。
【００１１】
その理由は、第１のカラムによる分離に要求される溶出液と、第２のカラムによる分離に要求される溶出液の種類が異なるからである。
【００１２】
つまり、例えば、第１の分離カラムに陽イオン交換カラムを用いた場合、溶出液には適当な濃度の電解質溶液を用いるが、この電解質溶液は質量分析装置に導入する溶液としては望ましくない。
【００１３】
電解質溶液を質量分析装置に導入すると、イオン化効率の低下すなわち検出感度の低下や、イオン導入路の汚染や詰まりなど質量分析装置に悪影響を与える。そのため、このような電解質溶液を質量分析装置には導入することが出来ない。
【００１４】
そこで、特許文献２に記載された技術を応用して、電解質溶液を第１の分離カラムに供給して試料を分離し適切な貯留用カラムに貯留した後、流路切換バルブを切換え、電解質溶液以外の質量分析装置に導入可能な溶液を、貯留カラムから第２の分離カラムに供給して、分離した試料を質量分析装置に供給することが考えられる。
【００１５】
しかしながら、この場合、貯留カラムから第２の分離カラムへの溶液供給中、つまり、第２の分離カラムによる試料液の分離期間中は、第１のカラムによる試料分離が停止されるため、試料の連続供給ができず、分析に長時間必要となってしまう。
【００１６】
また、従来技術における多次元液体クロマトグラフ質量分析装置においては、複数の分離カラムのそれぞれの分離カラムで分離するためには一定の時間が必要であるため、第１のカラムと直列に接続された第２のカラムによる分離が終了するまで、第１のカラムによる分離を停止しなければならず、溶出液を連続的に第１のカラムから第２のカラムに導入することができなかった。
【００１７】
そのため、従来技術における多次元液体クロマトグラフ質量分析装置においては、第１の分離カラムからの溶出成分のうち目的成分を含む溶出成分のみを分取した後に、第２のカラムに導入する必要があった。
【００１８】
この場合、特定成分は測定できるが、試料溶液中に含まれる全成分を測定することはできない。
【００１９】
試料溶液中の全成分を分析するためには、第１の分離カラムからの溶出液を複数のサンプルループやトラップカラムなどに一旦分取し、分取された溶出液を逐次第２の分離カラムに導入する必要がある。
【００２０】
この場合、分取しない場合と比較して、第２の分離カラムでの分離に要する時間は、第１の分離カラムからの溶出液から分取するサンプル数の増加数に対応して、第２の分離カラムでの分離に要する時間が長くなる。
【００２１】
すなわち、分析全体に要する時間が通常の液体クロマトグラフ質量分析装置を用いた場合と比較して大幅に長くなってしまう。
【００２２】
分析対象物が生体試料であれば短時間に分析する必要があるため、第１の分離カラムからの溶出液を一旦分取する方法は、生体試料の分析には用いることはできない。
【００２３】
また、生体試料以外の分析対象物であっても、分析に長時間が必要となることは望ましいことではない。
【００２４】
本発明の目的は、複数の分離カラムを有する多次元液体クロマトグラフ質量分析装置であって、それぞれの分離カラムの分離能および質量分析装置の検出感度に悪影響を及ぼすことなく迅速に検出可能な液体クロマトグラフ質量分析装置を実現することである。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は次のように構成される。
（１）送液手段と、試料注入手段と、複数の分離カラムと、質量分析手段とを有する液体クロマトグラフ質量分析装置において、第１分離カラムにより分離された試料成分を保持する複数のトラップカラムを備え、第１切り替えバルブは、複数のトラップカラムのうちの１つのトラップカラムを第１分離カラムに接続されたとき、他の１つのトラップカラムを送液手段に接続し、一定時間毎に１つのトラップカラムの第１分離カラムへの接続と送液手段への接続とを切り替えると共に、他の１つのトラップカラムの送液手段への接続と第１分離カラムへの接続とを切り替える。
また、第２切り替えバルブは、トラップカラムが送液手段に接続された一定の初期時間だけ、このトラップカラムを廃液手段に接続し、その後、このトラップカラムを第２分離カラムに接続する。
第２分離カラムは質量分析手段に接続され、第１分離カラムより短時間で試料成分を分離できる。
【００２６】
（２）好ましくは、上記（１）において、第１分離カラムと複数のトラップカラムとの間には、試料のクロマトグラムを検出する検出手段が配置されている。
【００２７】
（３）また、好ましくは、上記（１）において、第２分離カラムは、高速分離可能なモノリスカラムである。
【００２８】
（４）送液手段と、試料注入手段と、複数の分離カラムと、質量分析手段とを有する液体クロマトグラフ質量分析装置において、第１分離カラムより短時間で試料成分を分離でき、第１分離カラムにより分離された試料成分をさらに分離する複数の第２分離カラムを備える。
第１切り替えバルブは、複数の第２分離カラムのうちの１つを第１分離カラムに接続したとき、他の１つのを送液手段に接続する。また、第１切り替えバルブは、一定時間毎に１つの第２分離カラムの第１分離カラムへの接続と送液手段への接続とを切り替えると共に、他の１つの第２分離カラムの送液手段への接続と第１分離カラムへの接続とを切り替える。
また、第２切り替えバルブは、第２分離カラムが送液手段に接続された一定の初期時間だけ、この第２分離カラムを廃液手段に接続した後、質量分析手段に接続する。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を添付図面を参照して説明する。
図１は、本発明の第１の実施形態である液体クロマトグラフ質量分析装置の概略構成図である。
【００３０】
図１において、ポンプ１は、溶出液２および溶出液３を、その組成比を変化させながら一定流量で、試料注入装置４に送液を行う。試料注入装置４は、ポンプ１からの溶出液とともに試料を流路に注入する。
【００３１】
注入された試料中の成分は、分離カラム５に送られ、この分離カラム５との相互作用の小さい順に溶出される。分離カラム５により溶出された各成分は紫外可視検出器６で検出された後、十方バルブ７に送られる。
【００３２】
十方バルブ７は、２つのトラップカラム８及び９に接続され、一定時間毎に、分離カラム５により溶出された成分がトラップカラム８に供給されるか、トラップカラム９に供給されるかの流路が切り替えられる。
【００３３】
図２は、十方バルブ７の流路を示す図である。
十方バルブ７は、図２の（Ａ）及び（Ｂ）に示す２通りに流路を切り替えることが可能である。
【００３４】
十方バルブ７が図２の（Ａ）に示す流路の状態である場合は、分離カラム５に連続して溶出液と共に試料が供給され、分離カラム５から紫外可視検出器６を通過した成分が、トラップカラム８に保持され、保持されない溶出液の大半はトラップカラム８から廃液ボトル１０に送られる。
また、トラップカラム９は、図１に示すポンプ１１と切り替えバルブ１３に流路を介して接続されている。
【００３５】
図２の（Ａ）に示す接続状態に切り替えられてから、一定時間経過後、十方バルブ７の流路は、図２の（Ｂ）に示す状態に切り替えられ、トラップカラム８は、ポンプ１１と切り替えバルブ１３に流路を介して接続される。そして、トラップカラム８に保持された成分および溶出液は、ポンプ１１から一定流量で送液された溶出液１２より溶出される。
【００３６】
ここで、トラップカラム８に溶出液１２が供給されると、トラップカラム８内に存在する溶出液２及び溶出液３が、はじめにトラップカラム８から溶出される。
【００３７】
溶出液２および溶出液３は、質量分析装置１６に供給する溶液としては適切ではないので、トラップカラム８から溶出された溶出液２及び溶出液３は流路切り替えバルブ１３を介して廃液ボトル１４に送られる。
【００３８】
溶出液２および溶出液３がトラップカラム８から溶出された後、トラップカラム８に保持された成分が溶出する前に、流路切り替えバルブ１３を、廃液ボトル１４から高速分離カラム１５に切り替えることで、トラップカラム８から溶出された成分は高速分離カラム１５に送られる。
【００３９】
この図２の（Ｂ）に示す状態においては、トラップカラム９は、紫外線検出器６を介して分離カラム５に接続されると共に廃液ボトル１０に廃液を供給する流路に接続され、図２の（Ａ）に示す状態から時間的に連続して分離カラム５に供給された試料が紫外可視検出器６を介してトラップカラム９に送られ、成分が保持されて溶出液の大半は廃液ボトル１４に送られている。
【００４０】
トラップカラム８から高速分離カラム１５に送られた成分は、高速分離カラム１５との相互作用の小さい順に更に分離されて溶出される。溶出された成分は質量分析装置１６に送られ、質量分析装置１６により成分の質量数情報が得られる。
【００４１】
高速分離カラム１５は、分離カラム５の成分分離より短時間で成分分離が可能であるため、トラップカラム８、９、それぞれの成分トラップ時間以下の時間で成分分離を終了している。
【００４２】
そして、図２の（Ｂ）に示す接続状態に切り替えられてから、一定時間経過後、十方バルブ７の流路は、図２の（Ａ）に示す状態に切り替えられる。
【００４３】
このように、十方バルブ７は、一定時間毎に、図２の（Ａ）に示す接続状態と（Ｂ）に示す接続状態とを切り替える。
【００４４】
なお、ポンプ１、１１、十方バルブ７、流路切り替えバルブ１３の動作は、動作制御部（図示せず）により制御される。
【００４５】
図１に示した第１の実施形態において、分離カラム５に陽イオン交換カラムを用い、高速分離カラム１５にモノリスカラムを各々用いて、ペプチド混合物試料を測定した時に得られた分析結果の一例を図３に示す。
【００４６】
ここで、モノリスカラムとは、充填剤として従来多く用いられていた球状粒子ではなく、円柱状ロッドを用いたものであり、従来の球状粒子を充填したカラムと比較して短い時間で成分の分離が可能である。
【００４７】
球状粒子を充填したＯＤＳカラムと、シリカの円柱状ロッドを担体に使用したモノリスカラムを各々用いて、同一成分を分析したときのクロマトグラムの例を図４に示す。
【００４８】
図４の（Ａ）はＯＤＳカラムを用いた例であり、図４の（Ｂ）はモノリスカラムを用いた例である。ＯＤＳカラムでは、成分を分離するのに約２５分必要としているが、モノリスカラムでは５分以内という短時間で全成分の分離が可能である。
【００４９】
また、図３の（Ａ）は、紫外可視検出器６で検出されたＵＶクロマトグラムである。このＵＶクロマトグラムでは、陽イオン交換カラムにより分離された各ペプチド成分のピークが検出されている。
【００５０】
図３の（Ｂ）は、保持時間１８分から２０分の間の２分間に溶出された成分がトラップカラム８に送られ、更にモノリスカラム１５で分離された後、質量分析装置１６で検出された全イオンクロマトグラムである。
【００５１】
図３の（Ａ）に示すＵＶクロマトグラムでは、保持時間１８分から２０分の間に単一のピークとして検出された成分が、モノリスカラムでの分離により、３つの成分▲１▼、▲２▼及び▲３▼に分離されている。
【００５２】
これは、陽イオン交換カラムとモノリスカラムとでは分離のメカニズムが異なるためであり、陽イオン交換カラムでは分離不十分な成分間の分離を、モノリスカラムで分離可能としている。
【００５３】
また、高速分離カラム１５にモノリスカラムを用いているため、２分という短い時間でも全成分の分離が可能であった。
【００５４】
図３の（Ｃ）は、図３の（Ｂ）に示した全イオンクロマトグラムで検出されたピーク▲２▼の質量スペクトルである。
【００５５】
陽イオン交換カラムで分離を行うために溶出液２および溶出液３をバッファ溶液として用いるが、バッファ溶液をそのまま質量分析装置１６に導入すると成分の検出感度が低下してしまう。
【００５６】
そこで、本発明の第１の実施形態においては、トラップカラム８、９を用いてバッファ溶液である溶出液２及び溶出液３を、バッファ溶液を含まない溶出液１２を用いて洗い流すため、質量分析装置１６にバッファ溶液を導入することがない。
【００５７】
その結果、質量分析装置１６により各成分を高感度に検出することが可能となった。本発明の第１の実施形態による分析結果では、分離カラムを一つしか使用しない通常の液体クロマトグラフ質量分析装置の分析と同じ分析時間で多次元液体クロマトグラフ質量分析装置での分析が行え、従来の多次元液体クロマトグラフ質量分析装置に比べて非常に短い時間で分析を行うことが可能となった。
【００５８】
また、第２の分離カラムとして高速分離可能なモノリスカラム１５を用いているので、分離カラム５で分離に要する時間、つまり、トラップカラムで成分をトラップするに必要な時間より短時間でモノリスカラム１５により分離が終了可能であるため、第１の分離カラム５に連続して試料を供給することができる。
【００５９】
第２の分離カラムが成分を分離するに要する時間が第１の分離カラムが成分を分離するに要する時間と同程度であれば、トラップカラム８又は９に滞留するバッファ溶液を廃棄するに必要な時間等だけ、第２の分離カラムによる分離終了時間が遅れ、その時間分だけ、第１の分離カラムへの試料供給を停止しなければならず、第１の分離カラム５に連続して試料を供給することができない。
【００６０】
以上のように、本発明の第１の実施形態によれば、複数の分離カラムの分離能および質量分析装置の検出感度に悪影響を及ぼすことなく迅速に検出可能な液体クロマトグラフ質量分析装置を実現することができる。
【００６１】
本願発明者による実験では、従来技術における多次元液体クロマトグラフ質量分析装置では、分析に必要な時間が約１０時間であったところ、本発明の第１の実施形態によれば、約３０分〜１時間程度で分析を行うことができた。
【００６２】
なお、モノリスカラムに代表される高速分離カラムとは、第１の分離カラムより短時間で成分の分離が可能な分離カラムである。
【００６３】
図５は、本発明の第２の実施形態である液体クロマトグラフ質量分析装置の概略構成図である。この第２の実施形態においては、第１の実施形態におけるトラップカラム８、９に替えて高速分離カラム１７、１８が配置され、分離カラム１５が省略されている点が第１の実施形態と相違し、他の部分は同様な構成となっている。
【００６４】
図５において、十方バルブ７は、一定時間毎に流路が切り替えられ、各成分は２つの高速分離カラム１７、１８のいずれかに送られる。ここで、十方バルブ７の流路を図６に示す。
【００６５】
十方バルブ７は、図６中の（Ａ）および（Ｂ）の２通りに流路を切り替えることが可能である。十方バルブ７が図６の（Ａ）に示す流路の状態の場合、紫外可視検出器６を通過した成分は高速分離カラム１７に保持され、保持されない溶出液の大半は高速分離カラム１７から溶出され、廃液ボトル１０に送られる。
【００６６】
一定時間経過後、十方バルブ７の流路は、図６の（Ｂ）に示す状態に切り替えらる。
【００６７】
ここで、高速分離カラム１７内に存在する溶出液２及び溶出液３は溶出液１２より高速分離カラム１７から溶出され、流路切り替えバルブ１３を介して廃液ボトル１４に送られる。
【００６８】
その後、切り替えバルブ１３が廃液ボトル１４から質量分析装置１６側に切り替えられ、高速分離カラム１７に保持されていた各成分はポンプ１１より一定流量で送液された溶出液１２により高速分離カラム１７との相互作用の小さい順に分離され、溶出されて質量分析装置１６に送られ、各成分の質量数情報が得られる。
【００６９】
このとき同時に、紫外可視検出器６から送られてきた成分は高速分離カラム１８に保持され溶出液の大半は廃液ボトル１４に送られている。
【００７０】
本発明の第２の実施形態においても、第１の実施形態と同様な効果を得ることができる。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によれば、複数の分離カラムを有する多次元液体クロマトグラフ質量分析装置であって、それぞれの分離カラムの分離能および質量分析装置の検出感度に悪影響を及ぼすことなく迅速に検出可能な液体クロマトグラフ質量分析装置を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施形態である液体クロマトグラフ質量分析装置の概略構成図である。
【図２】本発明の第１の実施形態における十方バルブの流路切り替え図である。
【図３】本発明の第１の実施形態により得られるクロマトグラム及びマススペクトルの例を示すグラフである。
【図４】ＯＤＳカラムを用いた場合と、モノリスカラムを用いた場合とのクロマトグラムを比較するグラフである。
【図５】本発明の第２の実施形態である液体クロマトグラフ質量分析装置の概略構成図である。
【図６】本発明の第２の実施形態における十方バルブの流路切り替え図である。
【符号の説明】
１、１１    ポンプ
２、３      溶出液
４          試料注入装置
５          分離カラム
６          紫外可視検出器
７          十方バルブ
８、９      トラップカラム
１０、１４  廃液ボトル
１２        溶出液
１３        流路切り替えバルブ
１５        高速分離カラム
１６        質量分析装置
１７、１８  高速分離カラム
【図１】
2004271272.tif 000003
【図２】
2004271272.tif 000004
【図３】
2004271272.tif 000005
【図４】
2004271272.tif 000006
【図５】
2004271272.tif 000007
【図６】
2004271272.tif 000008