(57)【要約】【課題】      本発明は、金属を配位している金属酵素において、その配位金属を他に置換することによって酵素特性の改変を行うものである。【解決手段】    金属を配位している金属酵素において、野生型で配位している金属の全部および一部が少なくとも１種以上の他の金属に置換されていることを特徴とする、置換前の酵素と比較して酵素特性に違いがある酵素、および、金属を配位している金属酵素において、野生型で配位している金属の全部および一部を少なくとも１種以上の他の金属に置換することを特徴とする、置換前の酵素と比較して酵素特性に違いが生じる酵素を作製する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属を配位している金属酵素において、野生型で配位している金属の全部および一部が少なくとも１種以上の他の金属に置換されていることを特徴とする、置換前の酵素と比較して酵素特性の向上が認められる酵素
【請求項２】
野生型で配位している金属がアルカリ土類金属である、請求項１に記載の酵素
【請求項３】
野生型で配位している金属が、マグネシウム、カルシウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ストロンチウム、モリブデン、銀、カドミウム、バリウムからなる群より選ばれるいずれか１種以上の金属に置換されていることを特徴とする請求項１または２に記載の酵素
【請求項４】
野生型で配位している金属と他の金属がヘテロに配位していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素
【請求項５】
安定性、基質に対するＫｍ値、比活性、基質特異性、至適ｐＨ、至適温度からなる群より選ばれる、少なくとも一つの酵素特性において、置換前の酵素と比較して酵素特性の向上があることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の酵素
【請求項６】
野生型で配位している金属がマグネシウムに置換されている、置換前の酵素と比較して比活性の向上が認められる、請求項５記載の酵素
【請求項７】
野生型で配位している金属がマンガンに置換されている、置換前の酵素と比較して比活性の向上が認められる、請求項５記載の酵素
【請求項８】
野生型で配位している金属が鉄に置換されている、置換前の酵素と比較して基質に対するＫｍ値の低下が認められる、請求項５記載の酵素
【請求項９】
野生型で配位している金属がカドミウムに置換されている、置換前の酵素と比較して安定性の向上が認められる、請求項５記載の酵素
【請求項１０】
野生型で配位している金属が銅に置換されている、置換前の酵素と比較して安定性の向上が認められる、請求項５記載の酵素
【請求項１１】
野生型で配位している金属が亜鉛に置換されている、置換前の酵素と比較して安定性の向上が認められる、請求項５記載の酵素
【請求項１２】
野生型で配位している金属がバリウムに置換されている、置換前の酵素と比較して安定性の向上が認められる、請求項５記載の酵素
【請求項１３】
金属酵素が酸化還元酵素である、請求項１〜１２のいずれかに記載の酵素
【請求項１４】
金属酵素が脱水素酵素である、請求項１〜１２のいずれかに記載の酵素
【請求項１５】
金属酵素がピロロキノリンキノン（以下ピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載）を補酵素とする脱水素酵素である請求項１４に記載の酵素
【請求項１６】
金属酵素がピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（以下グルコース脱水素酵素をＧＤＨとも記載）である請求項１５に記載の酵素
【請求項１７】
請求項１６記載のグルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット
【請求項１８】
請求項１６記載のグルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー
【請求項１９】
金属酵素が加水分解酵素である、請求項１〜１２のいずれかに記載の酵素
【請求項２０】
金属酵素がクレアチニンアミドヒドロラーゼである請求項１９に記載の酵素
【請求項２１】
請求項２０記載のクレアチニンアミドヒドロラーゼを含むクレアチニンアッセイキット
【請求項２２】
金属酵素において、野生型で配位している金属の全部および一部を少なくとも１種以上の他の金属に置換することを特徴とする、置換前の酵素と比較して酵素特性の向上が認められる酵素を作製する方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属を配位している金属酵素において、その配位金属を他に置換することによって酵素特性の改変を行うものである。  
【背景技術】
【０００２】
酵素は、古くから食品業界や化学業界等、数多くの産業において生体触媒として利用されてきた。そして、自然界から得られる天然型の酵素は、その産業上の求めにより、安定性や基質特異性等が向上するよう人為的な改変が加えられてきた。産業用途上不十分な特性を改変する努力は、酵素の種類に限定されるものではない。酵素特性改変の手段としては、例えば、タンパク質レベルでの改変手段として、タンパク質を構成する特定のアミノ酸を他の化合物で修飾する方法がある。また、遺伝子レベルでの改変手段としては、酵素をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列を改変することにより、アミノ酸の置換、付加、欠失を行う方法がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これらの手法を用いて改変を実施しても、その産業上の要請に応えられない場合があった。例えば、カルシウムを配位している金属酵素であるピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性グルコース脱水素酵素（以下ＰＱＱＧＤＨとも記載）は、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成するという反応を触媒する点、及び反応系の溶存酸素の影響を受けず、補酵素添加を必要としない酵素特性を有する点より、血糖の生化学診断薬はもちろん血糖センサー等幅広い用途が期待されてきた。しかしながら、産業用途上使用するには、安定性が不十分であったり、基質特異性が広く他の糖も基質なるので測定精度が不十分であったりと、酵素特性の改変が必要とされた。そこで、これまで上記手段を用いて種々の特性改良が実施されてきたが、酵素特性の改変効果は限定的なものであり、産業用途上の要求性を必ずしも満足させるものではなかった（例えば、特許文献１〜４参照。）。アミノ酸を改変の標的として特性の改変を試みることに効果の限界があると推測される。
【０００４】
また、亜鉛を配位している金属酵素であるクレアチニンアミドヒドロラーゼは、筋疾患や腎疾患の指標であるクレアチニン等の測定に用いられている。これまでにシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＰＳ−７株やアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＴＥ３５８１株等の産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子が分離され、遺伝子工学的技術による該酵素の大量供給及びクレアチニン測定への利用が知られている（例えば、特許文献５〜６参照。）。シュードモナス・プチダの産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼは、ＥＤＴＡによるキレート処理で調製したアポ型酵素に、野生型酵素に配位している亜鉛と異なる種類の金属を添加することで、野生型酵素で配位している金属を添加するよりも高い比活性が得られることが示されている（非特異特許文献１。）。しかしながらこの場合、アポ型酵素の活性化に寄与しているものの、添加した金属がアポ型酵素に配位しているか否かの知見はなく、更に反応系に添加された過剰の遊離した金属が、分析に必要な他の成分、例えば発色色素の非特異的反応が生じるといった、悪影響を及ぼす懸念があった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−３４６５８７号公報
【特許文献２】特開２０００−３５０５８８号公報
【特許文献３】特開２０００−３１２５８８号公報
【特許文献４】特開２００１−１９７８８８号公報
【特許文献５】特開平３−１９６９０号公報
【特許文献６】特開平９−１５４５７４号公報
【特許文献１】Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６，ｐ１１０９−１１１７（１９７９）
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、我々は金属を配位している金属酵素が特定の金属を配位しており、その金属が酵素の反応や安定化に必須である点に着目し、金属を配位している金属酵素の配位金属を他の金属に置換することにより特性改変を実施できるのではないかと考えた。種々検討を実施した結果、金属を配位している金属酵素の配位金属を他の種々の金属に各々置換することで、安定性や基質親和性あるいは比活性の向上が図れることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
金属を配位している金属酵素において、野生型で配位している金属の全部および一部が少なくとも１種以上の他の金属に置換されていることを特徴とする、置換前の酵素と比較して酵素特性の向上が認められる酵素
項２．
野生型で配位している金属がアルカリ土類金属である、項１に記載の酵素
項３．
野生型で配位している金属が、マグネシウム、カルシウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ストロンチウム、モリブデン、銀、カドミウム、バリウムからなる群より選ばれるいずれか１種以上の金属に置換されていることを特徴とする請求項１または２に記載の酵素
項４．
野生型で配位している金属と他の金属がヘテロに配位していることを特徴とする、項１〜３のいずれかに記載の酵素
項５．
安定性、基質に対するＫｍ値、比活性、基質特異性、至適ｐＨ、至適温度からなる群より選ばれる、少なくとも一つの酵素特性において、置換前の酵素と比較して酵素特性の向上があることを特徴とする項１〜４のいずれかに記載の酵素
項６．
野生型で配位している金属がマグネシウムに置換されている、置換前の酵素と比較して比活性の向上が認められる、項５記載の酵素
項７．
野生型で配位している金属がマンガンに置換されている、置換前の酵素と比較して比活性の向上が認められる、項５記載の酵素
項８．
野生型で配位している金属が鉄に置換されている、置換前の酵素と比較して基質に対するＫｍ値の低下が認められる、項５記載の酵素
項９．
野生型で配位している金属がカドミウムに置換されている、置換前の酵素と比較して安定性の向上が認められる、項５記載の酵素
項１０．
野生型で配位している金属が銅に置換されている、置換前の酵素と比較して安定性の向上が認められる、項５記載の酵素
項１１．
野生型で配位している金属が亜鉛に置換されている、置換前の酵素と比較して安定性の向上が認められる、項５記載の酵素
項１２．
野生型で配位している金属がバリウムに置換されている、置換前の酵素と比較して安定性の向上が認められる、項５記載の酵素
項１３．
金属酵素が酸化還元酵素である、項１〜１２のいずれかに記載の酵素
項１４．
金属酵素が脱水素酵素である、項１〜１２のいずれかに記載の酵素
項１５．
金属酵素がピロロキノリンキノン（以下ピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載）を補酵素とする脱水素酵素である項１４に記載の酵素
項１６．
金属酵素がピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（以下グルコース脱水素酵素をＧＤＨとも記載）である項１５に記載の酵素
項１７．
項１６記載のグルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット
項１８．
請求項１６記載のグルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー
項１９．
金属酵素が加水分解酵素である、項１〜１２のいずれかに記載の酵素
項２０．
金属酵素がクレアチニンアミドヒドロラーゼである項１９に記載の酵素
項２１．
項２０記載のクレアチニンアミドヒドロラーゼを含むクレアチニンアッセイキット
項２２．
金属酵素において、野生型で配位している金属の全部および一部を少なくとも１種以上の他の金属に置換することを特徴とする、置換前の酵素と比較して酵素特性の向上が認められる酵素を作製する方法
【０００８】
なお、金属を配位している金属酵素において、その配位金属を他の金属に置換したという報告には次のようなものがある。ＰＱＱ依存性メタノール脱水素酵素において配位カルシウムをストロンチウムに置換した例（例えば、非特許文献１参照）、及びＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素において配位カルシウムをバリウムに置換した例（例えば、非特許文献２参照）、あるいはＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素において配位カルシウムをマグネシウム、マンガン、亜鉛等に置換した例（例えば、非特許文献３参照）。しかしながら、これらはいずれも酵素の反応機構を解明する目的で実施されたに過ぎない。金属置換により酵素特性を改変し、金属置換酵素を産業用途上使用しようという目的で実施された例はない。また、過去の例では、いずれも置換目的の金属に均一（ホモ）になることを意図して金属置換が実施されており、本発明に記載するように置換目的の金属が置換後に野生型で配位している金属とヘテロになるように置換されたという報告はない。
さらに、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を使用した例では、いずれも酵素特性の低下が認められており、本発明に記載するような酵素特性の向上は認められていない。本発明者は、この違いは上記の金属配位状態の違いに起因すると考察する。
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９４，３００，１７５−１８２
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００，３９，  ９３８４−９３９２
【非特許文献３】Ｂｉｏｓｃｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，５９，１５４８−１５５５，１９９５
【発明の効果】
【００１０】
上述したように、本発明において実施例から明らかなように、金属を配位している金属酵素において、その配位金属を他に置換することによって酵素特性の改変を行うものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の改変金属酵素の基になる、金属を配位している金属酵素とは、特に限定されるものではないが、好ましくはアルカリ土類金属を配位している金属酵素である。
別の観点から好ましくは酸化還元酵素である。さらに好ましくは脱水素酵素であり、中でも好ましくはピロロキノリンキノンを補酵素とする脱水素酵素であり、特に好ましくはピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素である。
更に別の観点から好ましくは加水分解酵素である。さらに好ましくはクレアチニンアミドヒドロラーゼである。
【００１２】
本発明の野生型で配位している金属及び野生型金属酵素とは、自然界で存在している時に金属を配位している酵素に含まれている金属及びその状態の酵素を指す
【００１３】
本願発明でいう「酵素特性」とは、特に限定されないが、実用上考慮すべき特性として、安定性、Ｋｍ値、比活性、基質特異性、至適ｐＨ、至適温度からなる群より選ばれる、少なくとも一つが、代表的なものとして挙げられる。
本願発明でいう「酵素特性の向上」とは、本願発明を実施した場合に、適当な方法で特性を評価した結果が、本願発明を実施していない場合と比べて優位なことをいう。
特性評価の方法については、当業者における常識の範囲内であり、かつ、両者の差が明らかになる条件であれば任意に設定してよいし、目的に応じて、さらに好ましい条件を選択することもできる。
【００１４】
本発明における安定性とは、一定状態における保存後の酵素活性の残存割合で評価される。例えば、本願発明を実施した場合の活性残存率が、本願発明を実施していない場合と比べて高い場合、安定性が向上したと判断される。通常、安定性は低下するより向上するほうが、使用形態（キットやセンサーなど）を考えた場合、好ましい。
本願発明においては、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ＢＳＡを含むＰＩＰＥＳ―ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）中で３５℃、７日間保存を行うことが好ましい。なお、保存における、酵素の濃度は、特に限定されないが、酵素の使用目的に応じて、その酵素が本来の性能を保持できる範囲に設定されていればよい。
【００１５】
本発明におけるある物質に対するＫｍ値（ミカエリス定数）は、酵素の基質となりうる物質との親和性に関連する指標の１つであり、公知の方法で測定することができる。
【００１６】
本発明における比活性とは、単位重量の酵素分子あたりの活性であり、より詳しくは精製酵素１ｍｇあたりの酵素活性の単位である。
【００１７】
本発明における基質特異性とは、酵素の基質に対する選択性の幅のことである。「酵素の基質特異性に違いがある」とは、少なくとも２つ以上の基質に対する反応性の相対比が、比較対象の基質間で異なることをいう。反応性は、活性測定を行ったときの測定感度等種々の公知の方法で評価することができる。
【００１８】
本発明の金属置換酵素の製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。まず、金属酵素をコードする遺伝子を遺伝子発現用ベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリシア・コリィ（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリシア・コリィＣ６００、エシェリシア・コリィＪＭ１０９、エシェリシア・コリィＤＨ５アルファなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリシア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００１９】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の組換えタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。なお、本発明においては、置換目的の金属を組換えタンパク質の生成量以上に添加した条件下で培養することが必要である。あるいは野生型で配位している金属が微生物の生育にとって必須ではない金属である場合は、野生型で配位している金属を含まず、かつ置換目的の金属を過剰に添加した条件下で培養してもよい。すなわち、組換えタンパク質発現時に置換目的の金属を野生型で配位している金属の代りに取り込ませる。なお、金属酵素の種類によっては、組換えタンパク質発現後に、野生型で配位している金属を他の金属に置換可能なもの、あるいは特定の処理を施さなければ金属を配位しないものもあるが、そのような酵素に関しては培養の手段を選ばない。その他、炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコ−ス，シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩や、特定のアミノ酸、特定のビタミンなども必要に応じて使用される。本発明培養温度は菌が発育し、改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリシア・コリィの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、組換えタンパク質が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し組換えタンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００２０】
培養物中の組換えタンパク質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って組換えタンパク質が培養液中に存在する場合は、濾過，遠心分離などにより、組換えタンパク質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。組換えタンパク質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して組換えタンパク質を可溶化し、水溶液として分離採取する。この様にして得られた組換えタンパク質含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製された金属置換酵素を得ることができる。なお、上述の通り、金属酵素が組換えタンパク質発現後に、野生型で配位している金属を他の金属に置換可能なもの、あるいは特定の処理を施さなければ金属を配位しないものである場合は、本精製後にそれぞれの酵素に適した処理を実施することで、目的とする金属置換酵素を得ることが出来る。
【００２１】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う金属置換されたピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うグルコース脱水素酵素を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のグルコース脱水素酵素に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うグルコース脱水素酵素は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のグルコース脱水素酵素はホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時に該金属とピロロキノリンキノンを添加し、ホロ化することもできる。
【００２２】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う金属置換されたピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素を用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のグルコース脱水素酵素はホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ピロロキノリンキノンを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のグルコース脱水素酵素をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよび配位金属、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のグルコース脱水素酵素を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。  
【００２３】
クレアチニンアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う金属置換されたクレアチニンアミドヒドロラーゼを含むクレアチニンアッセイキットを特徴とする。
本発明のクレアチニンアッセイキットは、上記の金属置換されたクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、および過酸化水素検出試薬を含む。過酸化水素検出試薬とは、サルコシンオキシダーゼにより生成する過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で、生成色素として測定する試薬であり、酸化系発色試薬及び必要に応じて４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンなどのカップラーを含む。本発明の過酸化水素測定試薬は、各種の市販のものなどを用いることができるが、特に限定されるものではない。更に上記のクレアチニンアッセイキットは、金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖類、有機酸などを安定化剤として使用することもできる。また通常、試薬性能に悪影響を及ぼさない範囲で防腐剤や界面活性剤を添加し、適当な緩衝液と共に使用される。緩衝液の種類、濃度およびｐＨは、各試薬成分の保存および酵素反応など目的に応じて一種もしくは複数が選択されるが、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応時のｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用されることが好ましい。
本発明により、従来のクレアチニンアッセイキットに比べて正確性に優れ、および／または経済的に有利な試薬を供給することが可能となる。例えば、本発明の金属置換され、安定性の向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼを用いることで、クレアチニンアミドヒドロラーゼの劣化に伴う試薬寿命を延長させることができ、同時に測定の正確性と精密性の向上が期待できる。また例えば、本発明の金属置換され、比活性が向上若しくクレアチニンに対するＫｍ値が低下したクレアチニンアミドヒドロラーゼを用いることで、クレアチニンアッセイキット中への必要酵素添加量、ひいては試薬に掛かるコストを低減させることができ、安価な試薬の供給が可能となる。更にはキットに添加されたクレアチニンアミドヒドロラーゼが原因で引き起こされる、クレアチニンアッセイキットの濁りや試薬ブランク上昇のリスクを低減させることも期待できる。
【実施例】
【００２４】
以下、野生型においてカルシウムを配位するピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性のグルコース脱水素酵素、及び野生型において亜鉛を配位するクレアチニンアミドヒドロラーゼにおいて、各々配位金属のカルシウム及び亜鉛を他の金属に置換した実施例により、本発明を具体的に説明する。言うまでもなく本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
＜実施例１＞ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
アシネトバクター  バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）  ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性のグルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を、発現ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のマルチクローニング部位に挿入し、発現プラスミドｐＮＰＧ１４を構築した。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００２６】
＜実施例２＞金属置換ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の取得
発現プラスミドｐＮＰＧ１４をエシェリシア・コリィＤＨ５アルファ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地上に形質転換体を得た。該形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、及び置換目的の金属イオンが１．２ｍＭ含まれる生産培地（２％  ポリペプトン、３％  酵母エキス、１％  グリセロール、０．２３％  リン酸２水素カリウム、１．２５％  リン酸水素２カリウム、ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃、２４時間振とう培養を実施し、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を発現した。具体的には、マグネシウム、マンガン、銅、亜鉛、鉄、バリウム及びコントロールとしてカルシウムを添加して検討した。培地添加量は５０ｍｌ／５００ｍｌ坂口フラスコであり、振とう数は１８０回転／分であった。
培養終了後、菌体を回収し、菌体内タンパクとしてＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素が発現したことを確認した。そこで、回収した菌体を５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でＯ．Ｄ．６６０＝１００となるように懸濁後、超音波破砕により菌体を破砕し、さらに遠心分離により上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＳＰ（アマシャム−バイオサイエンス社）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後にＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−バイオサイエンス社）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより非吸着画分を回収し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
本来ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素は、基質結合部位に補酵素ＰＱＱとカルシウムイオンを含むが、エシェリシア・コリィはＰＱＱを産生する能力がないので、上記酵素はアポ型酵素であり、このままでは基質結合部位に補酵素ＰＱＱと金属イオンを含まない。そこで、該精製酵素溶液に、３０μＭ  ＰＱＱ、及び２５０μＭ  各置換目的金属イオンを添加し、３０℃、３０分反応することで、各目的金属イオンを配位したホロ型の金属置換ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を取得した。なお、反応後に、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で緩衝化したＧ−２５脱塩カラムにて脱塩することにより、未反応のＰＱＱと金属イオンを除去した。具体的には、配位金属がマグネシウムに置換したＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素（Ｍｇ−ＧＤＨ）、配位金属がマンガンに置換したＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素（Ｍｎ−ＧＤＨ）、配位金属が銅に置換したＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素（Ｃｕ−ＧＤＨ）、配位金属が亜鉛に置換したＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素（Ｚｎ−ＧＤＨ）、配位金属が鉄に置換したＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素（Ｆｅ−ＧＤＨ）、配位金属がバリウムに置換したＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素（Ｂａ−ＧＤＨ）、及びコントロールとして野生型と同じカルシウムを配位したＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素（Ｃａ−ＧＤＨ）を取得した。
なお、各金属置換ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素に含まれる配位金属が、カルシウムから置換目的の金属に置換されたことの確認は、最終的なホロ型酵素中に含まれる金属含量を測定することにより実施することにした。具体的には、Ｍｇ−ＧＤＨ、Ｚｎ−ＧＤＨ、Ｆｅ−ＧＤＨに含まれるカルシウム含量と各々置換目的の金属含量をＩＣＰ発光分光分析法求めることにより、目的とした金属への配位置換が出来たかどうかを判断した。
＜結果＞
金属置換ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素中の単位タンパク量あたりに含まれる金属含有比（モル比）
・  Ｍｇ−ＧＤＨ
Ｃａ：Ｍｇ＝１：１
・  Ｚｎ−ＧＤＨ
Ｃａ：Ｚｎ＝１：５
・  Ｆｅ−ＧＤＨ
Ｃａ：Ｆｅ＝１：９
いずれも置換目的の金属への配位置換を確認した。なお、野生型配位金属であるＣａとのヘテロな配位が確認されたが、これは培養での酵素生産時に培地中のＣａを配位したことに起因すると考えられる。このヘテロな金属配位が本発明の特徴であり、酵素特性向上に寄与していると考える。
【００２７】
＜実施例３＞金属置換ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の特性確認
金属置換ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の比活性、Ｋｍ値、保存安定性を確認した。以下に活性測定法、各特性確認法、及びその結果を示す。
ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素活性の測定方法
・  測定原理
ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ→  Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ）  ＋  ＮＴＢ  →  ２ＰＭＳ  ＋  ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。（ｒｅｄは還元型を示す。）
・  単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：１Ｍ（１．８ｇ  Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液，  ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ  ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加える。５Ｎ  ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．１％  ＢＳＡを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
・  遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用事調製）
０．９ｍｌ  Ｄ−グルコース溶液          （Ａ）
２５．５ｍｌ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）    （Ｂ）
２．０ｍｌ  ＰＭＳ溶液                              （Ｃ）
１．０ｍｌ  ＮＴＢ溶液                              （Ｄ）
【００２８】
【表１】
2004267203.tif 000002
【００２９】
・  ３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
・  ０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
・  ５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
体積活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト−  ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
重量活性（Ｕ／ｍｇ）＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ  ｍｇ／ｍｌ）
【００３０】
比活性の測定
単位液量あたりのタンパク含量をＢｒａｄｆｏｒｄ法プロテインアッセイキット（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて測定した。上記活性測定法により単位液量あたりの活性値を測定し、単位液量あたりの活性値を単位液量あたりのタンパク含量で割ることで、各金属置換ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の比活性を求めた。
【００３１】
Ｋｍ値の測定
上記活性測定法において、反応試薬中のグルコース濃度を２，４，８，１２，１６，２０ｍＭと変化させ、各基質濃度とその時の酵素活性値より、各金属置換ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のＫｍ値を測定した。
【００３２】
保存安定性の測定
各金属置換ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ―ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）に、酵素濃度５Ｕ／ｍｌとなるように添加し、３５℃にて７日間保存後に酵素活性を測定し、添加時の酵素濃度と比較することにより残存活性率を求めた。
＜結果＞
【００３３】
【表２】
2004267203.tif 000003
【００３４】
＜実施例４＞金属置換クレアチニンアミドヒドロラーゼの取得
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＰＳ−７株由来のクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターｐＣＮＨ５２１（特許第２５２７０３５号公報）により、エシェリシア・コリィＪＭ１０９（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地上に形質転換体を得た。該形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）５ｍｌに植菌し、３０℃、１６時間振とう培養を行った後、該培養液を１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、及び塩化マンガン５ｍＭを含むＬＢ培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）５００ｍｌに接種し、３７℃、１６時間振とう培養を実施しクレアチニンアミドヒドロラーゼを発現した。
培養終了後、菌体を回収し、回収した菌体を５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍｌに懸濁後、超音波破砕により菌体を破砕し、さらに遠心分離により上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液
にポリエチレンイミンを用いて用いて除核酸処理を施した後、硫酸アンモニウムを用いた塩析分画を行った。塩析沈殿物を２０ｍｌの５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、６０℃、３０分間熱処理後、遠心分離により不溶物を除去した。遠心上清を５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した後、同緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−バイオサイエンス社）イオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、０．１〜０．３Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配溶出により、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性画分を得た。このクレアチニンアミドヒドロラーゼ画分を限外濾過により濃縮した後、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ−２５にてゲル濾過し、Ｍｎにより置換された精製酵素標品（Ｍｎ−ＣＮＨ）を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを得た。
比較の為に、亜鉛を配位した野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼ（Ｚｎ−ＣＮＨ）は、形質転換体培養時に、クレアチニンアミドヒドロラーゼ生産培地に１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を用い、それ以外は上記と同様の方法により取得した。 
尚、クレアチニンアミドヒドロラーゼの活性測定は、下記試薬を使用し、下記測定条件で行った。
試薬
試薬Ａ：０．１Ｍクレアチン溶液（１．４９ｇのクレアチニン（メルク社製）を５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、１００ｍｌとする）
試薬Ｂ：０．５Ｎ  ＮａＯＨ水溶液
試薬Ｃ：１．０％ピクリン酸水溶液
測定条件
試験管に試薬Ａ０．９ｍｌを採り、３７℃で約５分間予備加温した後、０．１ｍｌの酵素溶液を加えて反応を開始させる。３７℃で正確に１０分間反応させた後、直ちに反応液０．１ｍｌを採り、試薬Ｂ１．９ｍｌ中へ加える。これに試薬Ｃ１．０ｍｌを加え、２５℃で２０分間放置後、５２０ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤテスト）。盲検は氷令した試薬Ａに酵素溶液をを添加後直ちに反応液の０．１ｍｌを採り、試薬Ｂ１．９ｍｌ中へ加え、２５℃で２０分間放置後、５２０ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤブランク）。
計算
下記の計算により酵素活性を算出する。
体積活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト−  ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×１０×ｄｆ｝／（４．６５×１．０×１０×Ｖｓ）
重量活性（Ｕ／ｍｇ）＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．０ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（０．１ｍｌ）
４．６５：Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ−ｐｉｃｒａｔｅのミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
１０：反応液量（１．０ｍｌ）／採取液量（０．１ｍｌ）、反応時間（１０分間）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ  ｍｇ／ｍｌ）
取得した野生型及び金属置換クレアチニンアミドヒドロラーゼに含まれる配位金属は、原子吸光分析により測定した。その結果を表３に示す。
【００３５】
【表３】
2004267203.tif 000004
【００３６】
表３より、野生型のクレアチニンアミドヒドロラーゼが、一分子に２個の亜鉛イオンが配位しているのに対し、Ｍｎ置換クレアチニンアミドヒドロラーゼは、一分子にマンガンと亜鉛が１個ずつヘテロに配位していることが確認された。
【００３７】
＜実施例５＞金属置換クレアチニンアミドヒドロラーゼの特性確認
比活性の測定
単位液量あたりのタンパク含量を２８０ｎｍにおける吸光度により測定した。上記活性測定法により単位液量あたりの活性値を測定し、単位液量あたりの活性値を単位液量あたりのタンパク含量で割ることで、野生型及び金属置換クレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を求めた。その結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
2004267203.tif 000005
【００３９】
表４より、亜鉛が配位した野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼに比べて、本発明の金属置換クレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性が大幅に向上していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の改変した金属酵素は、比活性やＫｍ値、保存安定性などの向上により、臨床検査や食品分析など幅広い用途分野に利用することが出来、産業界に寄与することが大である。
【配列表】
2004267203000001.app