(57)【要約】【課題】試料液の蒸発や結露（再液化）による液面変動がなく、時間の遅れがほとんどないリアルタイム測定が可能で、試料容器の装着が容易である遺伝子増幅反応モニターを提供する。【解決手段】遺伝子増幅の程度をリアルタイムでモニターする装置において、遺伝子増幅反応用容器を複数装着し回転するものであって、該遺伝子増幅反応用容器はすべて回転軸に直角な面上に固定され、少なくとも１対の光学系が設けられたもの。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子増幅の程度をリアルタイムでモニターする装置において、遺伝子増幅反応用容器を複数装着し回転するものであって、該遺伝子増幅反応用容器はすべて回転軸に直角な面上に固定され、少なくとも１対の光学系が設けられていることを特徴とする遺伝子増幅反応モニター。
【請求項２】
該遺伝子増幅法は、ＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法などの一定温度下で行なわれる方法である請求項１記載の遺伝子増幅反応モニター。
【請求項３】
該遺伝子増幅反応をモニターする方法は、ピロリン酸マグネシウムによる濁りの程度を測定するものである請求項１又は２記載の遺伝子増幅反応モニター。
【請求項４】
該遺伝子増幅反応用容器は、市販の８連ストリップ型ＰＣＲチューブである請求項１乃至３記載の遺伝子増幅反応モニター。
【請求項５】
該光学系は複数対設け、且つそれぞれの光源の波長が異なるものである請求項１乃至４記載の遺伝子増幅反応モニター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、遺伝子増幅反応モニターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、ＤＮＡ診断法として、ＰＣＲ法やＬＣＲ法等の特定のＤＮＡ断片が増幅されるか否かによって種々の判定を行なうことができるようになってきている。特に、ＰＣＲ法はＤＮＡ増幅法のほとんどといっても過言ではないほど普及している。
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　）法は、２種のプライマーによって規定された特定断片を鋳型として、酵素的にこの特定断片を、温度を上げ下げすることによって増幅する方法である。９０℃以上になるとＤＮＡの二重螺旋が分解し、低温（６０〜７５℃）になると再度合成されるという性質を応用したものであるり、通常は９４℃、４５℃、７２℃、９４℃のサイクルを繰り返すだけでＤＮＡ合成の連鎖反応が起こる。
【０００３】
よって、通常は所定時間、反応を行ない増幅したか否かを判定するものである。しかし、これではリアルタイムで増幅状況が分からないばかりか、反応の速さも判別できない。
そこで、ＰＣＲ法であってもリアルタイムでＤＮＡの増幅状況をモニターすることが要望されている。リアルタイムでモニターするということは、時間と増幅程度との関係を示すグラフが描けるということである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＰＣＲ法は前記した通り、何回も温度を上下しなければならず、それも所定温度まで上げて、また所定温度まで下げる等非常に手間である。完全自動化は可能であるが、制御が難しく、制御できなくなったり、所定温度になるまでの時間が長くなったりする。このような状態で、リアルタイムモニターは非常に難しい。
【０００５】
また、ＤＮＡは増幅しても無色であるため検出できない。よって、光の照射によって蛍光を発する蛍光インターカレータ分子を遺伝子に組み込み、それを光学系で検出することによって、ＤＮＡの増幅状態がモニターできるものである。
この時、容器内の水溶液（試料液）は、高温（１００℃近い）によって蒸発し、上部の蓋付近で結露することが考えられる。試料液は非常に微量であるため、蒸発すると液面が変化する。勿論、上部で結露したものが直ちに戻ればよいが、上方で結露して落下しないと（微量であるため、毛管現象や表面張力で通常は落下しない）液面が下がり、光学系が適切に測定できなくなる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
以上のような状況に鑑み、本発明者は鋭意研究の結果本発明遺伝子増幅反応モニターを完成したものであり、その特徴とするところは、遺伝子増幅の程度をリアルタイムでモニターする装置において、遺伝子増幅反応用容器を複数装着し回転するものであって、該遺伝子増幅反応用容器はすべて回転軸に直角な面上に固定され、少なくとも１対の光学系が設けられた点にある。
【０００７】
モニターとは、監視装置であり、具体的には種々の測定により遺伝子増幅反応の度合いを調べる装置である。
【０００８】
遺伝子増幅の程度とは、遺伝子の増幅がどの程度進んでいるかということであり、これは光学系によって検知できるよう工夫されている。例えば、ＰＣＲ法であれば、蛍光インターカレータ分子が付加されているため蛍光の強度で検知でき、後述するＬＡＭＰ法であれば白濁の程度で検知可能である。
【０００９】
遺伝子増幅反応用容器とは、遺伝子増幅反応が起こっている容器であり、通常は使用しやすいように世界的に規格を定めて、サイズを一定にしている。材質も透明プラスチック製である。現在最も多用されているものは、８連ストリップ型ＰＣＲチューブである。勿論、本発明ではこれに限らず、どのような容器を用いてもよい。
【００１０】
本モニターは、容器を回転させることが第１の特徴である。回転させることによって、遠心力が生じ、外側方向に容器全体が押圧され、内容物である蒸発後再液化した液等もすべて外側方向に大きな力がかかる。容器は、底部を外側に向けるように回転装置に固定されるため、外側方向に力がかかるということは、通常の状態では下方に向かって力がかかっていることとなる。
回転速度は自由であり、容器の内径、内容物の粘度等によって決めればよいが、通常５０〜３００ｒｐｍ程度で十分である。
【００１１】
この容器を回転させることによって、次のような効果が生じるのである。
１　回転による遠心力により、液面が常に保たれる。
２　１対の光学系でも、回転している容器内のすべての試料を、時間の遅れがほとんどなく、リアルタイム測定が可能となる。
３　異なる波長の光による測定も容易である。
【００１２】
少なくとも１対の光学系が設けられている。
光学系とは、光源と検知装置のセットをいう。光源は、単色光のような特定の波長をカットした光でも全光でもよい。また、可視光でなくともよい。
光学系は、複数対設けてもよい。それぞれの光学系は、波長が同じでも異なっていてもよい。
【００１３】
遺伝子増幅反応用容器はすべて回転軸に直角な面上に固定されている。これは、通常の遠心分離機では、分離液を入れる容器は水平ではなく傘型の面上で固定されている。しかし、傘型の面上では、光学系の位置採りが難しい。更に、現在最も汎用されている８連ストリップ型ＰＣＲチューブ（規格品）は、傘型の面上にはそのまま装着できず、１本づつ切り離さなければならなかった。８連ストリップ型ＰＣＲチューブがより柔軟なプラスチックで製造されれば可能であるが、光学測定用容器には不適である。
【００１４】
本発明では、遺伝子増幅反応用容器は回転軸に直角であるが、一般的には水平である。この容器は、通常蓋付きであるため水平にしても液が容器からこぼれることはない。また、容器の内径が通常非常に小さいため（内容積が、０．１ｍｌ〜２ｍｌ）毛管現象により、さかさまにしても落下しない。よって、このような容量のものでは水平にしてもほとんど液面は変わらない。
【００１５】
光学系による測定は、容器内液の色の変化である。これは、蛍光マーカーによる変化でも、不溶解物の析出による白濁でも、何でもよい。光源からの光の透過光や反射光の変化である。
【００１６】
また、本発明は、従来のＰＣＲ法にも使用できるが、ＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法などの一定温度下で行なわれる方法にはより適している。
ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、２本鎖ＤＮＡ、６つの領域を認識する４つのプライマー、鎖置換型ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、核酸基質等を同一容器に入れ、一定温度（６５℃付近）で保温することにより、検出までを１ステップの工程で行なうことができる。増幅効率が高く、ＤＮＡを１５分〜１時間程度で１０９〜１０１０倍に増幅することができるものである。（詳細は、国際公開番号ＷＯ００／２８０８２参照）
ＩＣＡＮ法は、寳酒造株式会社が開発した方法で、合成された一対のキメラプライマーが、ＤＮＡの特定部分にアニールし、そこからＤＮＡが伸長していき、両側から伸長してきた両鎖が鋳型から離れ伸長鎖同士アニールするという方法を利用するものである。
【００１７】
このＬＡＭＰ法は、増幅が進むほど不溶性の塩（ピロリン酸マグネシウム）が析出するため、白濁してくる。よって、その白濁の程度を測定すれば増幅の程度が分かるのである。これは、光源からの透過光を測定するのが簡単である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
次に本発明を図面に示す実施の形態に基づいてより詳細に説明する。
図１は、本発明遺伝子増幅反応モニター１の回転部分の１例を示す断面図である。回転円盤２が回転軸３に水平に固定されている。この回転円盤３の外周部に試料容器固定部４が多数設けられている。この例の試料容器固定部４は、現在市販されている８連ストリップ型ＰＣＲチューブ５用の形式になっている。容器５の底部側の斜線部６が試料液である。円盤が停止していても、毛管現象により、液が蓋７側に移動することはない。
【００１９】
光源８が液部６の下方に位置するよう設けられている。光源８から照射された光は受光器９に入る。この例では光学系は１対のみである。勿論、多数の試料容器は回転しているため、すべての試料が、常に（厳密には非常に頻度の多い時々という意味）測定できる。よって、多数の試料について、リアルタイム測定が可能となる。
この例は、ＬＡＭＰ法によるものであるため、温度は一定でよい。
【００２０】
図２は、図１で用いた８連ストリップ型ＰＣＲチューブ５を示すもので、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は正面図である。これは、世界的な規格によったものであり、この状態でＤＮＡを入手することが多い。材質は透明ポリエチレン等であり、柔軟性はそう高くはない。上部に蓋７が設けられ蒸発やこぼれを防止している。
【００２１】
図３は、図１の平面図である。回転円盤２の外周に多数の試料容器５がセットされている。この例では、容器として８連ストリップ型ＰＣＲチューブ５を用いているため、６組がセットされている。このような多数であっても、６回の取りつけ作業だけである。この図では、４８本ではなく、５０本の容器がセットされているが、２本は予備であり試料を入れるのではなく、例えば真っ黒な容器をセットして目印にしたりするものである。
【００２２】
【発明の効果】
以上詳細に説明した本発明には次のような大きな効果がある。
（１）　試料容器を回転させ、遠心力を常にかけているため、試料液の蒸発や結露（再液化）による液面変動がない。
（２）　試料容器を回転させているため、１対の光学系でも、すべての試料を、時間の遅れがほとんどなく、リアルタイム測定が可能となる。
（３）　光学系を複数採用し、それぞれ異なる波長にすれば、異なる波長による測定も容易である。
（４）　試料容器を１平面（通常は水平）上で固定するため、現在汎用されている８連ストリップ型ＰＣＲチューブがそのまま（１つづつ切り離さず）使用できる。よって、装着が非常に容易である。
（５）　８連ストリップ型ＰＣＲチューブが切り離さず使用できるため、試料の錯誤が激減する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明遺伝子増幅反応モニターの１例を示す側面図である。
【図２】８連ストリップ型ＰＣＲチューブの、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。
【図３】図１の平面図である。
【符号の説明】
１　本発明遺伝子増幅反応モニター
２　回転円盤
３　回転軸
４　試料容器固定部
５　８連ストリップ型ＰＣＲチューブ
６　試料液
７　蓋
８　光源
９　受光器
【図１】
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【図２】
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【図３】
2004033146.tif 000005