(57)【要約】【課題】　少なくとも一つの所定の塩基（例えば、アデニン、グアニン、６−メルカプトグアニン、８−オキソ−グアニン、及び８−オキソ−アデニン）を含む核酸の検出方法を提供する。【解決手段】　（ａ）核酸を、酸化還元反応で所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と；（ｂ）酸化還元反応を検出する段階と；（ｃ）所定の塩基での検出された酸化還元反応から核酸の存在若しくは不存在を決める段階とからなる、少なくとも一つの所定の塩基（例えば、アデニン、グアニン、６−メルカプトグアニン、８−オキソ−グアニン、及び８−オキソ−アデニン）を含む核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の検出方法。その方法は、ＤＮＡ配列決定、診断分析、及び定量分析を含む多様な応用の中で使用される。【選択図】　　　図２
2004117371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　超小型電子基板と、
　該基板上の導電性酸化還元検出電極と、
　該検出電極と隣接し、非導電性層にて固定化された特異結合対の第一の要素であって、サンプル中に存在する特異結合対の第二の要素と反応可能である前記第一の要素とからなり、
　前記検出電極に電位を印加すると生じる酸化還元反応が検出可能である、結合対の要素の電気化学的検出に有用である超小型電子装置。
【請求項２】
　前記超小型電子基板はサンプル容器を有し、該容器は該導電性酸化還元検出電極と該固定化された第一の要素とを有する、請求項１に記載の超小型電子装置。
【請求項３】
　前記超小型電子基板は、複数の導電性酸化還元検出電極と、複数の固定化第一の要素とを有する前記容器を具有する、請求項２に記載の超小型電子装置。
【請求項４】
　導電性金属を有する導電性基準電極をさらに有する、請求項３に記載の超小型電子装置。
【請求項５】
　導電性金属を有する導電性補助電極をさらに有する、請求項３又は４に記載の超小型電子装置。
【請求項６】
　前記酸化還元反応は各導電性酸化還元検出電極からの電気的接続を介して検出可能である、請求項５に記載の超小型電子装置。
【請求項７】
　特異結合対の複数の第一の要素内の何れかの要素は、複数の第一の要素内の何れかの他の要素と同じ、又は異なる、請求項６に記載の超小型電子装置。
【請求項８】
　特異結合対の複数の第一の要素内の各要素は複数の第一の要素内の他の要素とは異なる、請求項７に記載の超小型電子基板。
【請求項９】
　該第一の要素は核酸及びタンパク質からなる群から選択された、請求項６に記載の超小型電子装置。
【請求項１０】
　特異結合対の該第一の要素はオリゴヌクレオチド捕捉プローブを含み、該オリゴヌクレオチド捕捉プローブは長さで４乃至１００のヌクレオチドである、請求項９に記載の超小型電子装置。
【請求項１１】
　酸化還元反応検出器をさらに有する、請求項６に記載の超小型電子装置。
【請求項１２】
　該基板はシリコンである、請求項６に記載の超小型電子装置。
【請求項１３】
　該基板はガラスである、請求項６に記載の超小型電子基板。
【請求項１４】
　該超小型電子装置は一つ以上のサンプル容器を具備する、請求項６に記載の超小型電子装置。
【請求項１５】
　何れかのサンプル容器内の特異結合対の複数の第一の要素は、他の何れかのサンプル容器内の複数の第一の要素と同じ、又は異なる、請求項１４に記載の超小型電子装置。
【請求項１６】
　各サンプル容器内の特異結合対の複数の第一の要素は他のサンプル容器内の複数の第一の要素と同じである、請求項１５に記載の超小型電子装置。
【請求項１７】
　特定のサンプル容器内の複数の第一の要素のうちの何れかの要素は該特定のサンプル容器中の他の何れかの要素と同じ、又は異なる、請求項１４に記載の超小型電子装置。
【請求項１８】
　特定のサンプル容器内の複数の第一の要素のうちの各要素は、該特定のサンプル容器内の他の何れかの要素とは異なる、請求項１７に記載の超小型電子装置。
【請求項１９】
　各サンプル容器は超小型基板と、導電性酸化還元検出電極と、特異結合対の固定化第一の要素とを有する、請求項１４に記載の超小型電子装置。
【請求項２０】
　該第一の要素は核酸及びタンパク質からなる群から選択された、請求項１４に記載の超小型電子装置。
【請求項２１】
　特異結合対の該第一の要素はオリゴヌクレオチド捕捉プローブを有し、該オリゴヌクレオチド捕捉プローブは長さで４ないし１００のヌクレオチドである、請求項１４に記載の超小型電子装置。
【請求項２２】
　酸化還元反応検出器をさらに有する、請求項１４に記載の超小型電子装置。
【請求項２３】
　該基板はシリコンである、請求項１４に記載の超小型電子装置。
【請求項２４】
　該基板はガラスである、請求項１４に記載の超小型電子装置。
【請求項２５】
　各導電性酸化還元検出電極はポテンシオスタットと電気的に接続されており、サンプル容器はサンプルと、電解質溶液とを有し、各検出電極は溶液と電気化学的に接触しており、電位が電極に印加された条件にて、電極と酸化還元電極に関与可能である電気化学的媒体物を含む、請求項１６に記載の超小型電子装置。
【請求項２６】
　該酸化還元反応を検出する酸化還元反応検出器をさらに有し、サンプルが特異結合対の第二の要素を含む際には、サンプルは特異結合対の第二の要素を含まないときよりも、電流が一層検出可能である、請求項２５に記載の超小型電子装置。
【請求項２７】
　超小型電子装置は複数のサンプル容器と、各該サンプル容器は電解質溶液を含み、その溶液は電気化学的に接触した該導電性酸化還元検出電極を有し、溶液は電気化学的媒介物を有する、請求項２５に記載の超小型電子装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は核酸のハイブリッド形成及び配列決定に関し、特に核酸のハイブリッド形成を定性的及び定量的に検出する方法並びに核酸の塩基配列決定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　ＤＮＡの突然発生の試料中の個々のＤＮＡ配列の検出は、遺伝子の同定、ＤＮＡのプロファイリング、及びＤＮＡ配列決定の新規なアプローチの基礎を提供する。ＤＮＡハイブリッド形成検出に対する一つのアプローチは、突然発生の試料中の配列への表面結合オリゴマーのハイブリッド形成を示す分析的応答を使用して分析されうる表面結合ＤＮＡ配列の使用を含む。これらの分析方法は一般に、表面結合二重鎖中の単一塩基の不正対合に対し敏感でない、目的ＤＮＡ鎖上の共有結合により結合されたラベルから発生するレーザ誘導蛍光を含む。例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇ他へのアメリカ特許第５，１４３，８５４号及び５，４０５，７８３号；Ｆｏｄｏｒ他のＮａｔｕｒｅ　３６４巻の５５頁（１９９３年）；ＢａｉｎｓのＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０７巻の３５６頁（１９９５年）；及びＮｏｂｌｅのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６７（５）巻の２０１Ａ頁（１９９５年）はこの応用のための外面又は”チップス（切れ端）”を示す。Ｈａｌｌ他のＢｉｏｃｈｅｍ．　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃ．　Ｂｉｏ．　Ｉｎｔｅｒ．　３２（１）　巻の２１頁（１９９４年）により提案された代わりの方法において、ＤＮＡハイブリッド形成は二重鎖ＤＮＡに対する比較として一本鎖ＤＮＡの酸化還元挙動の観測を含む電気化学的方法により検出された。この技術もまたＤＮＡ試料中の単一塩基不正対合に対し敏感でない。単一塩基不正対合を検出するための技術は、Ｎａｇａｉ　他へのアメリカ特許第５，１９４，３７２号中に示されるような酵素による又は化学的な解裂検討を含む。しかし、これらの技術は、それらがより多い時間及び分離技術を必要とするかぎりにおいて有益ではない。
【０００３】
　Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ他へのアメリカ特許第５，３１２，５２７号は二重鎖核酸が酸化還元活性錯体に接触される、目的核酸を検出するためのボルタンメトリー配列選択的センサを記載する。その錯体は二重鎖ＤＮＡに対し非特異的に結合する。その錯体自身ボルタンメトリー信号を提供する酸化還元活性化合物であるため、その錯体は分析法において機能しない。
【０００４】
　Ｈｉｌｌ他へのアメリカ特許第４，８４０，８９３号は配位子とアンチ配位子の間の競争的結合行動が順次電気化学的に検出される、核酸のための電気化学的分析を記載する。
【０００５】
　従って、素早くて敏感であり、素早くオンライン適用されうる単一塩基対の不正対合を検出する方法を含む、ＤＮＡハイブリッド形成を検出する方法に対する技術的必要性が残されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
　一般に、本発明は、少なくとも一つの所定の塩基（例えば、アデニン、グアニン、６−メルカプトグアニン、８−オキソ−グアニン、及び８−オキソ−アデニン）を含む核酸の検出方法を提供する。その方法は、（ａ）核酸を、酸化還元反応で所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と；（ｂ）酸化還元反応を検出する段階と；（ｃ）所定の塩基での検出された酸化還元反応から核酸の存在若しくは不存在を決める段階とからなる。その方法の特定の実施例及び望まれる特定の目的に依存して、その発明は核酸がハイブリッド形成核酸を形成するために補足的な核酸と接触する段階を更に含む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
　第一の様相として、本発明はＤＮＡハイブリッド形成を検出する方法を提供する。その方法は、（ａ）ハイブリッド形成ＤＮＡを形成するためにＤＮＡ試料をオリゴヌクレオチドプローブと接触する段階と、（ｂ）該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも一つの所定の塩基を有し、ハイブリッド形成ＤＮＡを、酸化還元反応で該オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と、（ｃ）酸化還元反応を検出する段階と、（ｄ）所定の塩基での検出された酸化還元反応からハイブリッド形成ＤＮＡの存在又は不存在を決定する段階とを含む。以下詳細に検討されるように、酸化還元反応を検出する段階は、一般に所定の塩基からの電子の流れを測定することにより実施される。
【０００８】
　第二の様相に従い、本発明はＤＮＡハイブリッド形成を検出する別の方法を提供する。その方法は、（ａ）ハイブリッド形成ＤＮＡを形成するためにＤＮＡ試料をオリゴヌクレオチドプローブと接触する段階と、（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも一つの所定の塩基を有し、ハイブリッド形成ＤＮＡを、酸化還元反応で該オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と、（ｃ）酸化還元反応を検出する段階と、（ｄ）検出された酸化還元反応の反応速度を測定する段階と、（ｅ）測定された反応速度を一本鎖ＤＮＡとの遷移金属錯体の酸化還元反応の速度と比較する段階と、（ｆ）測定された反応速度が一本鎖ＤＮＡとの遷移金属錯体の酸化還元反応の速度と実質的に同じであるか否かを決める段階を含む。
【０００９】
　第三の様相に従い、本発明はＤＮＡハイブリッド形成を検出するための装置を提供する。その装置は、（ａ）複数のＤＮＡ試料容器と、（ｂ）該複数のＤＮＡ試料容器を運ぶための試料取扱手段と、（ｃ）ＤＮＡ試料容器のそれぞれにオリゴヌクレオチドプローブを配達するためのオリゴヌクレオチドプローブ配達手段と、（ｄ）該複数のＤＮＡ試料容器のそれぞれに遷移金属錯体を配達するための遷移金属錯体配達手段と、（ｅ）酸化還元反応を検出するための酸化還元反応検出器とを含む。
【００１０】
　第四の様相に従い、本発明はＤＮＡハイブリッド形成を検出するための第二の装置を提供する。その装置は、（ａ）ＤＮＡ試料容器と、（ｂ）ＤＮＡ試料容器に複数のオリゴヌクレオチドプローブを配達するためのオリゴヌクレオチドプローブ配達手段と、（ｃ）ＤＮＡ試料容器に遷移金属錯体を配達するための遷移金属錯体配達手段と、（ｄ）酸化還元反応を検出するための酸化還元反応検出器とを含む。
【００１１】
　第五の様相に従い、本発明はＤＮＡの配列決定法を提供する。その方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドプローブは独特の酸化電位を有する所定の合成の塩基を含み、ハイブリッド形成ＤＮＡを形成するためにＤＮＡ試料を該オリゴヌクレオチドプローブと接触する段階と、（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブは所定数の所定の合成塩基を有し、ハイブリッド形成ＤＮＡを、酸化還元反応で該オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の合成の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と、（ｃ）酸化還元反応を検出する段階と、（ｄ）検出された酸化還元反応の反応速度を測定する段階と、（ｅ）所定の合成塩基と対にされた塩基を同定する段階とを含む。
【００１２】
　本発明の前述及び別の様相は以下に設けられた詳細な記載中に詳細に説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
　ここで使用される”核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）”の語はＤＮＡとＲＮＡの両方を含む何れかの核酸のことを言う。本発明の核酸は典型的にはポリヌクレイン酸、つまり、３’，５’ホスホジエステル結合により共有結合により結合された個々のヌクレオチドの高分子である。
【００１４】
　ここで使用される”相補核酸（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）はハイブリッド形成核酸を作るために別の核酸と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを含む、何れかの核酸のことを言う。
【００１５】
　”〜の存在若しくは不存在を決める”の表現は検出行動（例えば、ＤＮＡハイブリッド形成、ＲＮＡハイブリッド形成、目的核酸の検出等）の存在若しくは不存在を定性的に決定すること、及び定量的に決定することを含むことが意図される。
【００１６】
　”ハイブリッド形成ＤＮＡ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ＤＮＡ）”及び”ハイブリッド形成核酸（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）の語は二重鎖のＤＮＡ若しくは核酸を形成するためにハイブリッド形成される一本鎖ＤＮＡ、又は三重ヘリックスＤＮＡ若しくは核酸を形成するためにハイブリッド形成される二重鎖ＤＮＡ若しくは核酸のことを言う。
【００１７】
　本発明の方法及び装置は時折ここでＤＮＡに関して説明されるが、これは明確化を目的とするものであり、そして現発明の方法と装置はＲＮＡのような他の核酸に適用されうることが理解されるべきである。
【００１８】
　　Ａ．核酸増幅方法
　本発明の工程はハイブリッド形成ＤＮＡを生産するためにオリゴヌクレオチドプローブへＤＮＡ試料を接触することを含むので、プローブと接触する前にＤＮＡを増幅するための一定の適用が望ましい。選択された、若しくは目的の核酸配列の増幅は適当な手段により実施されうる。一般には、Ｄ．　Ｋｗｏｈ及びＴ．　ＫｗｏｈのＡｍ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｌａｂ．　８巻の１４−２５頁（１９９０年）を参照のこと。適当な増幅技術の例は、限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＮＡに対する、逆転写酵素連鎖反応を含む）、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写酵素増幅（Ｄ，Ｋｗｏｈ他のＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６巻の１１７３−１１７７頁（１９８９年）を参照）、自己支持配列複製（若しくは”３ＳＲ”）（Ｊ．　Ｇｕａｔｅｌｌｉ他のＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７巻の１８７４−１８７８頁（１９９０年）を参照）、Ｑβレプリカーゼシステム（Ｐ．　Ｌｉｚａｒｄｉ他のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６巻の１１９７−１２０２頁（１９８８年）を参照）、核酸配列ベース増幅（若しくは”ＮＡＳＢＡ”）（Ｒ．　ＬｅｗｉｓのＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ　１２（９）巻の１頁（１９９２年）、修復連鎖反応（若しくは”ＲＣＲ”）（Ｒ．　Ｌｅｗｉｓの上記のものを参照）、及びブーメランＤＮＡ増幅（若しくは”ＢＤＡ”）（Ｒ．　Ｌｅｗｉｓの上記のものを参照）を含む。適用生成物中に取り込まれる塩基は天然又は改良された塩基（増幅の前若しくは音に改良された）であり、続く電気化学的検出段階を最適にするために選択される。
【００１９】
　ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はまた公知の技術とともに実施される。例えば、アメリカ特許第４，６８３，１９５号；４，６８３，２０２号；４，８００，１５９号；及び４，９６５，１８８号を参照のこと（ここに挙げられた全てのアメリカ特許の例の開示内容は例として組み込まれるべきものである。）。一般に、ＰＣＲは、初めに、各核酸の鎖に対して相補的である各プライマーの伸長生成物が合成されるように、ハイブリッド形成条件下で検出されるべき特異的な配列の各鎖に対する一つのオリゴヌレオチドプライマーと核酸試料（例えば、熱安定なＤＮＡポリメラーゼの存在下）を処理し、ここでプライマーは、各プライマーから合成された伸長生成物がその補体から分離される時に他のプライマーの伸長生成物の合成のためのテンプレートといて働くことができるように、ハイブリッド形成する特異的な配列の各鎖に対して十分に相補的であり、そしてその後、配列若しくは検出されるべき配列が存在する場合にそれらのテンプレートからプライマー伸長生成物を分離するための変性条件下で試料を処理することを含む。これらの段階は望みの程度の増幅が得られるまで周期的に繰り返される。増幅された配列の検出は、反応生成物に対しハイブリッド形成することのでき、検出可能なラベルを保持するオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ）を反応生成物に加え、その後公知の技術に従いそのラベルを検出することにより実施される。増幅されるべき核酸がＲＮＡである場合、増幅は公知の技術に従う逆転写によりＤＮＡへ初期転換することにより実施される。
【００２０】
　鎖置換増幅（ＳＤＡ）は公知の技術に従い実施される。一般には、Ｇ．　Ｗａｌｋｅｒ他のＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９巻の３９２−３９６頁（１９９２年）；Ｇ．　Ｗａｌｋｅｒ他のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｓｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２０巻の１６９１−１６９６頁（１９９２年）を参照のこと。例えば、ＳＤＡは単一の増幅プライマー又は一対の増幅プライマーを用いて実施され、後者と共に指数増幅が達成される。一般に、ＳＤＡ増幅プライマーは、５’から３’の方向において、フランキング配列（重要でないＤＮＡ配列）、反応において使用される制限酵素のための制限部位、及び増幅及び／又は検出される目的配列に対しハイブリッド形成するオリゴヌレオチド配列（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ）からなる。認識部位への制限酵素の結合を促進するために配され、制限部位がニッキングされた後ＤＮＡポリメラーゼのプライミング部位を提供するフランキング配列は好ましくは１５から２０ヌクレオチドの長さであり；制限部位はＳＤＡ反応中で機能的であり（即ち、非パリンドロミック認識部位の使用を通して満足される状態で、プライマーの鎖中に結合されたホスホロチオネート結合は続くニッキングを制限しない。）；オリゴヌクレオチドプローブは好ましくは約１３から１５ヌクレオチドの長さである。
【００２１】
　リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）もまた公知の技術に従い実施される。例えば、Ｒ．　ＷｅｉｓｓのＳｃｉｅｎｃｅ　２５４巻の１２９２頁（１９９１年）を参照のこと。一般に、一方の対は検出されるべき配列の一方の鎖に結合し、他方の対は検出されるべき配列の他方の鎖に結合する：オリゴヌクレオチドプローブの二つの対を用いて実施される。それぞれの対は共にそれが対応する鎖と完全に重なる。反応は初めに、検出されるべき配列の鎖を変性（例えば、分離）し、その後それぞれの対のオリゴヌクレオチドプローブが共に結合されるように鎖を熱安定なリガーゼの存在下で二対のオリゴヌクレオチドプローブと反応し、それから反応生成物を分離し、その後でその配列が望みの程度に増幅されるまでその工程を周期的に繰り返す。検出はＰＣＲに関して上記したのと同様の方法でその後実施される。
【００２２】
　　Ｂ．オリゴヌクレオチドプローブ
　上記のように、本発明の製造方法はＤＮＡのハイブリッド形成の検出に有用である。製造方法の第一段階はハイブリッド形成ＤＮＡを形成するためにＤＮＡ試料をオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む。本発明の方法において有用なオリゴヌクレオチドプローブは約４若しくは６の塩基と約８０若しくは１００の塩基若しくはそれ以上までとの間からなり、より好ましくは約８と約１５塩基との間からなる何れかのプローブでありうる。オリゴヌクレオチドプローブは、この分野で良く知られる技術に従い広く多様な塩基配列の何れかを有して調製される。オリゴヌクレオチドプローブの調製に適当な塩基は、アデノシン、シトシン、グアニン、ウラシル、及びチミン等の天然に産するヌクレオチド塩基；並びに８−オキソ−グアニン、６−メルカプトグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチル−２−チオリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプスードウリジン、β，Ｄ−ガラクトシルケオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプスードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β，Ｄ−マンノシルケオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン，Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシアセチック　アシッド　メチルエステル、ウリジン−５−オキシアセチック　アシッド、ウィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プスードウリジン、ケオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、２−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ウィブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、及び３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン等の天然に存在しない又は”合成”のヌクレオチド塩基から選択される。オリゴヌクレチドのバックボーンは、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ＲＮＡはＤＮＡより好ましくないが）、カルボサイクル等の改良糖、及びフルオロ及びメトキシ等の２’置換を含む糖を含んで使用される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つ、若しくは全てのヌクレオチド間結合ホスフェート残基が、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート及びホスホラミデート等（例えば、一つおきのヌクレオチド間結合ホスフェート残基が記載されたように改良される）の改��されたホスフェートであるオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはＰ．　Ｎｉｅｌｓｅｎ他のＳｃｉｅｎｃｅ　２５４　巻の１４９７−１５００頁（１９９１年）に記載されたように”ペプチド核酸”である。オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも一部が少なくともＤＮＡ試料の配列の公知の一部の結合することのできる配列を保持することのみが必要である。それは、異なる塩基配列を有する数多くのオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ試料を結合する幾つかの応用（例えば、二若しくはそれ以上の目的核酸が試料中に有る場合、又は単一の目的核酸が”サンドイッチ”分析中で二若しくはそれ以上のプローブにハイブリッド形成される場合）において望ましい。
【００２３】
　　Ｃ．ハイブリッド形成の方法論
　ＤＮＡ（若しくは核酸）試料は当業者に知られた適当な方法でオリゴヌクレオチドプローブと接触される。例えば、ＤＮＡ試料は溶液中に溶解され、ハイブリッド形成を許す条件の下、ＤＮＡ試料を含む溶液中にオリゴヌクレオチドプローブを溶解することによりオリゴヌクレオチドプローブと接触される。適当な条件は当業者にとって公知であり（例えば、Ｆａｌｋｏｗ他へのアメリカ特許第４，３５８，５３５号及び同様の物を記載する他のアメリカ特許例を参照のこと）、高い塩濃度条件を含む。他に、ＤＮＡ試料は固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブと共に溶液中に溶解され、ＤＮＡ試料はその上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブを有する固体支持体をＤＮＡ試料を含む溶液中に浸すことによりオリゴヌクレオチドプローブと接触される。
【００２４】
　　Ｄ．酸化剤及び酸化還元反応
　ハイブリッド形成段階は酸化段階に進むとき、ハイブリッド形成の後、ハイブリッド形成ＤＮＡ（若しくは核酸）は酸化還元反応でオリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基の酸化をすることのできる適当な酸化剤と反応される。所定の塩基は、選択された酸化剤との反応で酸化を受けるオリゴヌクレオチドプローブ中の天然に産するか又は合成のヌクレオチド塩基でありうる。所定の塩基は、所定の塩基が対にされないときに比べて対にされるときに独特の酸化速度を示す。所定の塩基は、４種の天然発生の塩基のそれぞれと対にされるとき、独特の酸化速度を示す。一般に、５’−モノヌクレオチド（例えば、５’−デオキシリボヌクレオチド又は５’−リボヌクレオチド）の塩基は触媒反応を使用して検出可能な１０４Ｍ−１ｓ−１以上の速度定数を示す。適当な所定の塩基の例は、限定はされないが、グアニン、アデノシン、８−オキソ−グアニン、及び８−オキソ−アデノシン、８−ブロモ−グアニン、グアノシン、キサントシン、ウィオシン、プスードウリジン、６−メルカプトグアニン、８−メルカプトグアニン、２−チオキサンチン、６−チオキサンチン、６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−カルボキシメチル−メルカプトプリン、２−メルカプトプリン、６−メトキシプリン、２−アセチルアミノ−６−ヒドロキシプリン、６−メチルチオ−２−ヒドロキシプリン、２−ジメチルアミノ−６−ヒドロキシプリン、２−ヒドロキシプリン、２−アミノプリン、６−アミノ−２−ジメチルアリル−プリン、２−チオアデニン、８−ヒドロキシアデニン、８−メトキシアデニンを含む。典型的には、所定の塩基は、グアニン、アデノシン、６−メルカプトグアニン、８−オキソ−グアニン、及び８−オキソ−アデニンからなる群より選択され、グアニンは現在好ましい天然に産する所定の塩基であり、６−メルカプトグアニンが現在好ましい合成による所定の塩基である。
【００２５】
　酸化剤は、独特の酸化電位で所定の塩基と反応性を持つカチオン性、アニオン性、若しくはツヴィッターイオン性分子等の電荷を持つ分子である。従って、酸化剤の選択は選択された特異な所定の塩基に従い、当業者により素早く決定可能である。特に好ましい酸化剤は、触媒サイクルを完成して、金属錯体の還元された形態が再生されるような所定の塩基との金属−ＤＮＡ電子移動の可能な遷移金属錯体を含む。本発明の方法にとって適当な遷移金属錯体の例は、例えば、ルテニウム２＋（２，２’−ビピリジン）３（”Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋”），ルテニウム２＋（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）３（”Ｒｕ（Ｍｅ２−ｂｐｙ）３２＋”），ルテニウム２＋（５，６−ジメチル−１，１０−フェナントロリン）３（”Ｒｕ（Ｍｅ２−ｐｈｅｎ）３２＋”），鉄２＋（２，２’−ビピリジン）３（”Ｆｅ（ｂｐｙ）３２＋”），鉄２＋（５−クロロフェナントロリン）３（”Ｆｅ（５−Ｃｌ−ｐｈｅｎ）３２＋”），オスミウム２＋（２，２’−ビピリジン）３（”Ｏｓ（ｂｐｙ）３２＋”），オスミウム２＋（５−クロロフェナントロリン）３（”Ｏｓ（５−Ｃｌ−ｐｈｅｎ）３２＋”），ジオキソルテニウム１＋ホスフィン、及びジオキソルテニウム１＋ピリジン（”ＲｅＯ２（ｐｙ）４１＋”）と含む。酸化剤として有用なアニオン性錯体は：Ｒｕ（ｂｐｙ）（（ＳＯ３）２−ｂｐｙ）２２-及びＲｕ（ｂｐｙ）（（ＣＯ２）２−ｂｐｙ）２２-であり、酸化剤として有用なツヴィッターイオン性錯体は、（ＳＯ３）２−ｂｐｙ２-が４，４’−ジスルホナト−２，２’−ビピリジンであり、（ＣＯ２）２−ｂｐｙ２−が４，４’−ジカルボキシ−２，２’−ビピリジンである、Ｒｕ（ｂｐｙ）２（（ＳＯ３）２−ｂｐｙ）及びＲｕ（ｂｐｙ）２（（ＣＯ２）２−ｂｐｙ）である。ピリジン、ビピリジン及びフェナントロリンの適当な置換誘導体もまた前記の金属の何れかとの錯体中で使用される。適当な置換誘導体は、限定はされないが、４−アミノピリジン、４−ジメチルピリジン、４−アセチルピリジン、４−ニトロピリジン、４，４’−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、５，５’−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、６，６’−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、４，４’−ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、５，５’−ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、６，６’−ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、４，４’−ジヒドロキシル−２，２’−ビピリジン、５，５’−ジヒドロキシル−２，２’−ビピリジン、６，６’−ジヒドロキシル−２，２’−ビピリジン、４，４’，４”−トリアミノ−２，２’，２”−ターピリジン、４，４’，４”−トリエチレンジアミン−２，２’，２”−ターピリジン、４，４’，４”−トリヒドロキシ−２，２’，２”−ターピリジン、４，４’，４”−トリニトロ−２，２’，２”−ターピリジン、４，４’，４”−トリフェニル−２，２’，２”−ターピリジン、４，７−ジアミノ−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジアミノ−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジエチレンジアミン−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジエチレンジアミン−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジヒドロキシ−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジヒドロキシ−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジニトロ−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジニトロ−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジスペラミン−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジスペラミン−１，１０−フェナントロリン、及びジピリド〔３，２−ａ：２’，２’−ｃ〕フェナジンを含む。
【００２６】
　酸化剤は、所定の塩基との酸化剤の酸化還元反応を達成するために、適当な技術に従いハイブリッド形成ＤＮＡと反応される。必要とされることの全ては、酸化剤は所定の塩基の選択的な酸化を達成するのに効果的な条件の下でハイブリッド形成ＤＮＡと反応されることである。例えば、遷移金属は、酸化剤と所定の塩基との間の酸化還元反応は起こさせるのに十分な条件の下で、溶解されたハイブリッド形成ＤＮＡを含む溶液中に酸化剤を溶解することにより溶解されたハイブリッド形成ＤＮＡと反応される。他に、ＤＮＡが固体支持体上に固定された実施例においては、同じ固体支持体上に酸化剤を固定し、その固体支持体を酸化剤と所定の塩基の酸化還元反応を起こさせるのに十分な条件の下でその溶液中に浸すことにより酸化剤はハイブリッド形成ＤＮＡと反応される。その酸化還元反応は生じる溶媒はＤＮＡを溶解するのに適当な溶剤であり、好ましくは水からなる。酸化還元反応を起こさせるのに適当な条件は当業者に知られている。
【００２７】
　ハイブリッド形成ＤＮＡ又は核酸において、酸化剤はＤＮＡの小さい溝中で結合し、所定の塩基と酸化剤の間の密接な接触は二重（若しくは三重）らせんの独特の構造により妨げられる。所定の塩基残基のこの防御は、電子移動の速度を減じる溶媒を通した電子のトンネリングの必要をもたらす。溶媒の到達しやすさは所定の塩基と対にされるヌレオチド塩基の性質と共に変化する。そのトンネリング距離は式：
　　ｋ／ｋｓｓ＝ｅｘｐ（−βΔｒ）
に従い評価されえて、ここで、Δｒは一本鎖と比較した二重鎖における距離の変化であり、ｋｓｓは一本鎖ＤＮＡ試料における所定の塩基の酸化に対する速度定数である。即ち、所定の塩基と酸化剤の間のトンネング距離は各塩基対合に対して及び不対ＤＮＡに対して異なる。従って、電子移動速度定数は対となった（若しくは不正対合された）塩基の同一性を示す。電子移動に対する駆動力が再配列エネルギ（λ）より大きくないとすると、反応物の接近と結合された仕事項で補正された、駆動力に対するＲＴｌｎｋのプロットは、マーカス理論に従い、１／２の傾きを持つ直線を形成する。マーカス理論に基づくと、絶対速度定数は以下の式：
　　ｋ＝νｅｘｐ［−β（ｒ−ｒ０）］ｅｘｐ［−（ΔＧ＋λ）２／４λＲＴ］
に従い計算されえて、ここで、νは拡散律速における速度定数（１０１１Ｍ−１ｓ−１）であり、ｒは活性化された錯体中の反応物と生成物の間の距離であり、ｒ０は反応物と生成物の最も近接した距離であり、βは介在する媒体の影響である。上記のように、所定の塩基はハイブリッド形成ＤＮＡの内部に取り込まれているので、このことは電子が超えて酸化剤へとトンネリングすべき有限の距離を負わせる。即ち、ｒはｒ０と等しくない。水に対するβは約３Ａ−１である。βに対するこの比較的大きな値は、電子移動速度定数における大きな変化がトンネリング距離のとても小さな変化によってもたらされるであろうことを示す。所定の塩基と、所定の塩基と対にされた塩基との間のＤＮＡのコンフォメーションは所定の塩基と対にされた塩基に依存し、所定の塩基と対にされた塩基は電子が所定の塩基と酸化剤の間をトンネリングしなければならないトンネリング距離に影響する。トンネリング距離と所定の塩基と対にされた特定の塩基の間の相関がそのために確立される。
【００２８】
　　Ｅ．酸化還元反応の検出
　酸化還元反応の生起は当業者に知られた適当な手段に従い検出される。例えば、酸化還元反応の生起は、酸化還元反応の生起を示す電気的信号における変化を観測するための検出電極を使用して検出される。典型的には、酸化剤とハイブリッド形成ＤＮＡの間の電子移動に対して敏感な検出電極が反応ハイブリッド形成ＤＮＡ及び酸化剤を含む溶液と接して設置される。一般に、参照電極及び補助電極もまた検出電極と共にその溶液中と接して設置される（殆どの電流は補助電極を通る）。適当な検出電極は当業者によく知られ、例えばガラス状カーボン電極又はインディウム　チン　オキサイド電極を含む。同様に、適当な参照電極もまた当業者によく知られ、例えば銀／塩化銀電極を含む。
【００２９】
　酸化還元反応に伴われた電気信号の検出はハイブリッド形成ＤＮＡの存在又は不存在の決定を可能にする。ハイブリッド形成ＤＮＡの存在又は不存在の決定段階は、典型的には（ｉ）酸化還元反応の反応速度を測定する段階と、（ｉｉ）測定された反応速度を、一本鎖ＤＮＡとの遷移金属錯体の酸化還元反応速度と比較する段階と、（ｉｉｉ）測定された反応速度が一本鎖ＤＮＡとの遷移金属錯体の酸化還元反応速度と実質的に同じであるか否かを決める段階とを含む。反応速度を測定する段階は適当な手段により実施される。例えば、相対反応速度は、掃引速度、プローブ濃度、目的物濃度、媒剤、緩衝液、温度、及び／又は電気化学的方法の関数として電流を比較することにより決められる。
【００３０】
　酸化還元反応速度は当業者に知られた適当な手段に従い測定される。典型的には、酸化還元反応速度は酸化還元反応の生起に結合された電気信号の測定により測定される。例えば、酸化還元反応に結合された電気信号は、検出電極との電気的伝達における適当な装置を提供することにより測定される。適当な装置は、ハイブリッド形成ＤＮＡと酸化剤との反応の酸化還元反応速度の測定を提供するために発生される電気信号を測定することができる。電気信号はサイクリックボルタンメトリー、通常のパルスボルタンメトリー、クロノアンペロメリー、及び矩形波ボルタンメトリーを含む電気化学的方法の何れかに特異的なものであり、サイクリックボルタンメトリーは最近好まれている形態である。
【００３１】
　測定された反応速度はその後一本鎖ＤＮＡとの遷移金属錯体の知られた酸化還元反応速度と比較される。既に詳細に検討たように、ハイブリッド形成若しくは一本鎖のＤＮＡに何れにおいても、酸化剤と所定の塩基との間のトンネリング距離は、酸化剤と所定の塩基との間の反応の酸化還元反応速度に影響する。従って、ハイブリッド形成ＤＮＡは一本鎖のＤＮＡに比べ異なる酸化還元反応速度を示す。所定の塩基でのハイブリッド形成ＤＮＡの存在若しくは不存在は、測定された酸化還元反応速度が、酸化剤と一本鎖ＤＮＡ中の所定の塩基との酸化還元反応速度と同じものであるか否かを決めることにより決定されうる。更に、酸化剤と所定の塩基との間のトンネリング距離は、各可能な塩基対合が他のものから区別されるような所定の塩基とその相手との間の結合距離に従って異なる。所定の塩基とその塩基対との間の結合距離は所定の塩基と対にされる塩基に依存する。例えば、アデノシンと対にされたグアニンの酸化に対する酸化還元速度はシトシンと対にされたグアニンの酸化に対する酸化還元速度と異なり、次にそのシトシンと対にされたグアニンの酸化に対する酸化還元速度はグアニンと対にされたグアニンの酸化に対する酸化還元速度と異なり、またグアニンと対にされたグアニンの酸化に対する酸化還元速度はチミンと対にされたグアニンの酸化に対する酸化還元速度と異なる。特に、グアニンの酸化に対する酸化還元速度は、一本鎖のグアニンはアデノシンと対にされたグアニンより大きく、アデノシンと対にされたグアニンはグアニンと対にされたグアニンより大きく、グアニンと対にされたグアニンはチミンと対にされたグアニンより大きく、チミンと対にされたグアニンシトシンと対にされたグアニンより大きいという傾向に従う。従って、本発明の方法は所定の塩基又は所定の塩基に隣接する塩基対での単一塩基対の不正対合を検出に有用である。
【００３２】
　好都合なことに、多様な天然発生の塩基のそれぞれと対にされた場合の所定の塩基の酸化の酸化還元反応速度間の差異はまた、所定の塩基と対にされた塩基の同定を可能にする。所定の塩基と対にされた塩基は（ｉ）検出された酸化還元反応の反応速度を測定し、（ｉｉ）測定された反応速度を、所定の塩基と結合されたアデノシン、シトシン、グアニン、若しくはチミンを有するＤＮＡと酸化剤の４つの異なる公知の酸化還元反応速度のそれぞれと比較し、（ｉｉｉ）公知の反応速度のどれが測定された反応速度と実質的に同じであるかを決めることにより同定される。反応速度は上記の技術に従い測定される。同様に、所定の塩基と結合されたアデノシン、シトシン、グアニン、若しくはチミンを有するＤＮＡと酸化剤の４つの異なる酸化還元反応のそれぞれの反応速度はこれらの反応速度が知られているような同じ技術に従い測定される。ハイブリッド形成ＤＮＡとの酸化剤の酸化還元反応の測定された反応速度はその後、所定の塩基と結合されたアデノシン、シトシン、グアニン、若しくはチミンを有するＤＮＡと酸化剤の公知の酸化還元反応速度公知と比較される。例えば、所定の塩基と対にされた塩基は、測定された酸化還元反応速度と実質的に同じである酸化還元反応速度を有する公知の塩基対合を決めることにより決定される。
【００３３】
　　Ｆ．ＤＮＡ配列決定
　本発明は、（ａ）オリゴヌクレオチドプローブは独特の酸化電位を有する所定の合成塩基を含み、ハイブリッド形成ＤＮＡを形成するためにＤＮＡ試料を該オリゴヌクレオチドプローブと接触する段階と、（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブは所定数の所定の合成塩基を有し、ハイブリッド形成ＤＮＡを、酸化還元反応で該オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の合成塩基を酸化することのできる遷移金属錯体等の酸化剤と反応する段階と、（ｃ）酸化還元反応を検出する段階と、（ｄ）検出された酸化還元反応の反応速度を測定する段階と、（ｅ）所定の合成塩基と対にされた塩基を同定する段階とからなるＤＮＡの配列決定方法も提供する。
【００３４】
　ここまでに検討された方法に従い、ＤＮＡ試料は、当業者に知られえた技術に従い、オリゴヌクレオチドプローブと接触する段階の前に増幅される。合成塩基はここまでに記載された塩基の群、及び当業者に知られた他の合成塩基から選択される。合成塩基は４つの天然発生の塩基、即ちアデノシン、シトシン、グアニン、及びチミンの酸化電位と比較して独特の酸化電位を有する必要があることが唯一の制限である。ハイブリッド形成ＤＮＡを酸化剤と反応し、酸化還元反応を検出し、反応速度を測定するオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ試料を接触する段階は、ここまでに記載されたように実施される。所定の合成塩基と対にされた塩基を同定する段階は、（ｉ）測定された反応速度を、所定の合成塩基と結合されたアデノシン、シトシン、グアニン、若しくはチミンを有するＤＮＡと酸化剤の４つの異なる公知の酸化還元反応速度のそれぞれと比較する段階と、（ｉｉ）公知の反応速度の中で測定された反応速度と実質的に同じものを決める段階とを含む。
【００３５】
　別の実施例において、オリゴヌクレオチドプローブは第二の所定の合成塩基を更に含む。第二の所定の合成塩基は、第一の所定の合成塩基の酸化電位と異なる独特の酸化電位を有する。この実施例において、所定の塩基と酸化剤の酸化還元反応を検出する段階は、同様の第二の所定の合成塩基と酸化剤の酸化還元反応を検出する段階を更に含む。加えて、酸化還元反応速度の測定段階は、同様の酸化剤による第二の所定の塩基と酸化の酸化還元反応速度の測定を含む。更に、所定の合成塩基と対にされた塩基を同定する段階は、同様の第二の所定の合成塩基と対にされた塩基を同定する段階を更に含む。この実施例に従い、両方の所定の塩基の酸化還元反応が検出され、結局、各所定の合成塩基と対にされた塩基がここまでに記載の方法を用いて同定される。当業者にとって明らかであるように、各所定の合成塩基は他の全ての所定の合成塩基の酸化電位と異なり、そして４種の天然発生の塩基のそれぞれの酸化電位と異なる独特の酸化電位を示す場合、前記の方法は２以上の所定の合成塩基を用いて実施される。所定の塩基と対にされた各塩基がここに記載の方法に従い同定されるのみではなく、ＤＮＡは、ＤＮＡ試料中の各塩基を同定するための異なる部位に所定の合成塩基を有する十分な数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを用いて前記の方法の段階を繰り返すことにより配列決定される。言い換えると、ＤＮＡ試料は、各プローブ配列が少なくとも一の所定の合成塩基を含み、その合成塩基は各オリゴヌクレオチドプローブ中でプローブ配列に沿って異なりそして計算された部位に置かれる、十分な数のオリゴヌクレオチドプローブを提供することにより配列決定される。この方法では、酸化剤とのハイブリッドＤＮＡの酸化還元反応の繰り返しの検出、酸化還元反応速度の測定、及び所定の合成塩基と対にされた塩基の同定がＤＮＡ試料の配列の塩基対塩基の同定をもたらす。
【００３６】
　　Ｇ．装置
　本発明はまた、本発明の方法を実施するのに有用な装置を提供する。一のかかる例証としての装置が図３に模式的に示される。一般に、装置は多数のＤＮＡ試料容器１０からなる。駆動アセンブリ１１は多数のＤＮＡ試料容器を運ぶ試料取扱手段として配される。液体貯蔵器１２、供給ライン１３及びバルブ１４は各ＤＮＡ試料容器にオリゴヌクレオチドプローブを配達するためのオリゴヌクレオチドプローブ配達手段として配され、対応する液体貯蔵器１５、供給ライン１６及びバルブ１７は多数のＤＮＡ試料容器のそれぞれに遷移金属錯体を配達するための酸化剤配達手段として配される。駆動装置２１及びプローブ２２を含むプローブアセンブリ２０は酸化還元反応を検出するための酸化還元反応検出手段として配される。操作中、ＤＮＡ試料は試料容器１０中に事前堆積される。駆動アセンブリ１１はその後、試料容器１０を連続的にオリゴヌクレオチドプローブ配達手段及びそれぞれの試薬をその中に配達するための酸化剤配達手段の下方に輸送する。試薬配達後、それぞれの試料容器は駆動手段によりプローブ２２の下方の位置まで進められ、プローブ２２は酸化還元反応の検出のために駆動装置２１により試料容器中に前進される。サイクリックボルタモグラムに実施に必要な付加電極がプローブ２２とともに運ばれる。多様な構成要素の操作及びデータの収集は一般用途のコンピュータ上をランするソフトウェアプログラム等の適当なコントローラ３０を用いて実施される。
【００３７】
　前記装置多くの変化はもちろん等業者にとって明白である。多数のＤＮＡ試料容器は等業者に知られた適当な容器であり、ＤＮＡ試料を含むことのできるマイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、培養バイアル、固体支持体等を含む。試料取扱手段は、ＤＮＡ試料容器を運ぶことのできる、当業者に知られた適当に設計された試料容器の取扱手段である。
【００３８】
　各ＤＮＡ試料容器にオリゴヌクレオチドプローブを配達するための適当なオリゴヌクレオチドプローブ配達手段はこの分野で良く知られている。例えば、一の実施例に従い、オリゴヌクレオチドプローブ配達手段はその上にオリゴヌクレオチドプローブは固定される固体支持体からなる。このオリゴヌクレオチドプローブ配達手段は、ＤＮＡ試料とオリゴヌクレオチドプローブのハイブリッド形成をもたらす適当な条件下でのＤＮＡ試料とオリゴヌクレオチドプローブとの間の十分な接触を可能にする必要がある。多数のＤＮＡ試料容器のそれぞれに酸化剤を配達するための適当な酸化剤配達手段はこの分野で良く知られている。例えば、一の実施例に従い、酸化剤は酸化剤配達手段からなる固体支持体に取り付けられる。酸化還元反応を検出する酸化還元反応検出器は、一の実施例に従い所定の塩基の酸化を検出することのできる一若しくはそれ以上の電極からなる。適当な検出電極及び参照電極は本発明の方法への例と共にここまでに記載される。好ましくは、電極は酸化還元反応の酸化還元反応速度を測定する手段を用いた電気的伝達の中にある。酸化還元反応速度を測定する適当な手段はここまでに記載されたように当業者に知られている。
【００３９】
　本発明の装置の別の実施例において、ＤＮＡハイブリッド形成検出の装置は、（ａ）ＤＮＡ試料容器と；（ｂ）ＤＮＡ試料容器に複数のオリゴヌクレオチドプローブを配達するためのオリゴヌクレオチドプローブ配達手段と；（ｃ）ＤＮＡ試料容器に酸化剤を配達するための酸化剤配達手段と；（ｄ）酸化還元反応を検出するための酸化還元反応検出器とからなる。この装置は、その開示内容がここで例として完全に取り込まれる、Ｐｉｒｒｕｎｇ他へのアメリカ特許第５，１４３，８５４号及び第５，４０５，７８３号；　Ｆｏｄｏｒ他のＮａｔｕｒｅ　３６４巻の５５５頁（１９９３年）；ＢａｉｎｓのＡｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　１０７巻の３５６頁（１９９５年）；及びＮｏｂｌｅ　のＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６７（５）巻の２１頁（１９９５年）に記載される等の固定されたプローブを用いた使用に適合される。
【００４０】
　上記のように、ＤＮＡ試料容器は当業者に知られた適当な容器である。オリゴヌクレオチドプローブ配達手段は好ましくはその上に固定された多数のオリゴヌクレオチドプローブを有する固体支持体であり、それはＤＮＡ試料容器へプローブを配達することができる。例えば、一の実施例に従い、その上に固定された多数のオリゴヌクレオチドプローブを有する固体支持体は、ＤＮＡ試料の一若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成を可能にするのに十分な条件下でＤＮＡ試料容器内でＤＮＡ試料と接触される。
【００４１】
　ＤＮＡ試料容器に酸化剤を配達するための適当な酸化剤配達手段はここまでに記載される。好ましい酸化剤配達手段はその上に固定された酸化剤を有する固体支持体からなる。一の実施例に従い、酸化剤及び多数のオリゴヌクレオチドプローブは同じ固体支持体上に固定される。
【００４２】
　本発明に従う装置はＤＮＡ試料の変化の診断的な分析を行なうのに有用である。多数のオリゴヌクレオチドプローブは単一試料内での多様なＤＮＡの分析と検出を可能とし、そのため、病原やウイルス等を含むＤＮＡの変化に対する単一試料のスクリーニングに有用な道具を提供する。
【００４３】
　　Ｈ．ＲＮＡハイブリッド形成検出、ＲＮＡ配列決定及びＲＮＡ不正対合検出
　ここではまた、ＲＮＡハイブリッド形成検出法、ＲＮＡ配列決定法及びＲＮＡ不正対合検出法が開示される。かかる方法の実施に有用なＲＮＡは、限定は去れないがリボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ若しくは病原ＲＮＡ（例えば、レトロウイルス、ＨＩＶ−１他等のＲＮＡウイルスから得られたＲＮＡ）を含む。本発明の第一の様相は、従って、（ａ）ハイブリッド形成ＲＮＡを形成するためにＲＮＡ試料をオリゴヌクレオチドプローブと接触する段階と；（ｂ）該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも一つの所定の塩基を有し、ハイブリッド形成ＲＮＡを、酸化還元反応で該オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と；（ｃ）酸化還元反応を検出する段階と；（ｄ）所定の塩基での検出された酸化還元反応からハイブリッド形成ＲＮＡの存在又は不存在を決定する段階とからなるハイブリッド形成ＲＮＡを検出する方法である。
【００４４】
　さらに限定すると、ハイブリッド形成ＲＮＡを検出する方法は、（ａ）ハイブリッド形成ＲＮＡを形成するためにＲＮＡ試料をオリゴヌクレオチドプローブと接触する段階と、（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも一つの所定の塩基を有し、ハイブリッド形成ＲＮＡを、酸化還元反応で該オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と、（ｃ）酸化還元反応を検出する段階と、（ｄ）検出された酸化還元反応の反応速度を測定する段階と、（ｅ）測定された反応速度を一本鎖ＲＮＡとの遷移金属錯体の酸化還元反応の速度と比較する段階と、（ｆ）測定された反応速度が一本鎖ＲＮＡとの遷移金属錯体の酸化還元反応の速度と実質的に同じであるか否かを決める段階とからなる。
【００４５】
　ＲＮＡ配列決定の方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドプローブは独特の酸化速度を有する所定の塩基を含み、ハイブリッド形成ＲＮＡを形成するためにＲＮＡ試料を該オリゴヌクレオチドプローブと接触する段階と、（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブは所定数の所定の塩基を有し、ハイブリッド形成ＲＮＡを、酸化還元反応で該オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と、（ｃ）酸化還元反応を検出する段階と、（ｄ）検出された酸化還元反応の反応速度を測定する段階と、（ｅ）所定の合成塩基と対にされた塩基を同定する段階とからなる。　オリゴヌクレオチドプローブ、ハイブリッド形成の方法論、酸化剤、酸化還元反応の検出、及びこれらの方法の実施に有用な装置は上記セクションＡ−Ｈ中に実質的に示されており、当業者に知られた原則（例えば、ウラシルを塩基であるチミンに置き換える）に従い核酸試料としてＲＮＡを用いた使用に対し適用される。
【００４６】
　　Ｉ．目的核酸上の所定の塩基の検出
　既に特に記載された方法において、金属錯体は一本の及び二本鎖のＤＮＡ又は核酸から電気化学的電流を得るために使用される。グアニン等の所定の塩基は電気的信号を与え、この信号は二重鎖ＤＮＡに対してよりはるかに弱い。かかる方法は高い構造的感応を有効に示し、単一塩基不正対合を識別することができる。かかる方法はそのため、ＤＮＡの配列決定に対し特に有用である。しかし、かかる方法の二つの欠点は：（ａ）プローブの鎖からハイブリッドへ進む上で負の信号があること、及び（ｂ）信号の増幅が無いことである。以下の技術はこれらの問題の解決を提供する。加えて、以下の技術は診断的な分析に対し特に有用であり、核酸の定量的な検出に対し特に有用である。
【００４７】
　前記した観点において、ここでも開示されるのは、目的核酸が少なくとも一の所定の塩基を含み、同じものを含むと推定される試験試料中での目的核酸の存在と不存在を検出する方法である。上記方法と反対に、本発明においては所定の塩基はオリゴヌクレオチドプローブ上よりむしろ、目的核酸上に置かれる。
【００４８】
　その方法は目的核酸を含む試験試料上で実施される。（限定されないが）生検試料等の組織試料並びに血液、痰、尿及び精液試料等の生物学的液体、バクテリア培養、土壌試料、食物試料他を含む、目的核酸を含むと推定される何れかの試験試料が用いられる。目的核酸は、試験の特定の目的に従って、動物、植物若しくは微生物の（例えば、ウイルス、プロカリオチック及びユーカリオチックバクテリア、原生動物、菌類、プロトクチスタ他）を含む何れかの起源ものである。試料は本方法の実施の前に当業者に知られた明確な技術に従い処理又は精製され；望みであるなら、核酸は本方法が実施される前にそこで消化され、砕かれ及び／又は増幅（上記参照）される。
【００４９】
　図４に模式的に示されるように、方法は、（ａ）ハイブリッド形成核酸を形成するために目的核酸と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブに試験試料を接触する段階と；（ｂ）ハイブリッド形成核酸を、酸化還元反応で所定の塩基を酸化する遷移金属錯体に接触する段階と；（ｃ）ハイブリッド形成核酸と結合された酸化還元反応の存在若しくは不存在を検出する段階と；（ｄ）所定の塩基での検出された酸化還元反応から試験試料中の目的核酸の存在若しくは不存在を決める段階とからなる。図４に示されたように、オリゴヌクレオチドプローブは、検出段階の前に生じる分離段階を伴い（例えば、段階（ａ）と（ｂ）の間又は段階（ｂ）と（ｃ）の間）、ハイブリッド形成核酸からの試験試料の分離を促進するために固体支持体上に固定される。更に、オリゴヌクレオチドプローブは、溶液、及び（例えば、オリゴヌクレオチドプローブと結合する媒介物質により、又はビオチンがオリゴヌクレオチドプローブに結合され、アビジンが固体支持体上に固定されるビオチン−アビジン結合相互作用により）試料からハイブリッド形成核酸分離するために提供された他の手段の中で自由に提供される。
【００５０】
　好ましくは、目的核酸はオリゴヌクレオチドプローブが含むより少なくとも１０以上多い所定の塩基を含み、又はより好ましくはオリゴヌクレオチドプローブが含むより少なくとも５０若しくは１００以上多い所定の塩基を含む。目的核酸がオリゴヌクレオチドプローブより多い所定の塩基を含むとき、より大きな電流の増加が有益に得られる。
【００５１】
　加えて、オリゴヌクレオチドプローブは所定の塩基の無いこと、又は少なくとも実質的に所定の塩基の無いこと（即ち、プローブからの信号が妨害せず、又は目的核酸からの信号であると間違えられない十分に少ない所定の塩基を含む）が好ましい。目的核酸に簡単にハイブリッド形成する天然発生の塩基の配列が利用できない場合、レドックス不活性（以下で検討される）な別の塩基の利用の計画が用いられる。
【００５２】
　図４に示されるように、目的核酸は好ましくはオリゴヌクレオチドプローブより長く、少なくとも一の所定の塩基はハイブリッド形成核酸中でオリゴヌクレオチドプローブにハイブリッド形成されない（即ち、”突出”塩基である）。好ましくは少なくとも１０，５０，若しくは１００の所定の塩基が、それにより検出された電気化学的信号の実質的な増幅を提供する”突出”塩基である。
【００５３】
　例えば、何れのグアニン残基も含まないオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、Ａ，Ｔ，及びＣのみ）が用いられる。この鎖の存在下のＲｕ（ｐｂｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムはオリゴマーの無いそれととても似ている。この鎖はその後、目的核酸がオリゴヌクレオチドプローブより長いとすると、重なり塩基対領域と突出領域の何れか又は両方にグアニンを含む（図４には目的核酸の鎖に隣接する”Ｇ”により示される）目的の鎖とハイブリッド形成される。多数のグアニンが検出されるため、信号はハイブリッド形成された数に比べ増幅される。ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡが目的の鎖である場合、大きな信号増幅を与える多数の突出グアニンが出会う。例えば、リボソームＲＮＡは特定の生体に対し１０００個と同じ程度の多くのグアニンを含み、従ってハイブリッド形成結果毎におよそ１０００倍の増幅を提供する。例えば、一の好ましい実施例において、目的の鎖上の所定の塩基に対する分析は、媒介物質の存在下で掃引されたときに低度の背景信号を与える、電極表面の近くに向けられた固体表面上の（好ましくはレドックス活動しない）プローブの鎖の固定を含む。固体表面はその後、所定の塩基を含む目的の鎖の溶液と接触される。ハイブリッド形成が生じるとすると、目的の鎖はこのとき、電極のすぐ近くにあり、電流の増加が検出される。
【００５４】
　核酸の定量。本発明は核酸の定量検出に特に良く適合する。このセクションに記載された場合では、酸化剤（例えば、Ｒｕ（ｐｂｙ）３２＋）によるハイブリッドの酸化に対する速度定数はディジタルシミュレーションによりサイクリックボルタモグラム（若しくは他の電気信号）から決めることができる。殆どの条件下で、この反応は二次の速度論に従い、即ち速度＝ｋ［Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋］［ＤＮＡ］であり、ここでｋは特定のプローブ−目的物ハイブリッドに対して特異的な速度定数であり、［Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋］は酸化剤の濃度であり、そして［ＤＮＡ］はハイリッド（ＤＮＡ−ＲＮＡハイブッドでありうる）の濃度である。ｋ及び［Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋］が公知とすると、ハイブリッドの量を決めることができる。実際、目的ＤＮＡ及びＲＮＡを含む異なる量の標準溶液を用いて得られた電流増加に対する較正曲線が構成され、ハイブリッドの量を直接に得るために電流増加が使用された。この量はその後直接に目的物質の量と比較される。例えば、Ｍ．　Ｈｏｌｏｄｎｉｙ　他のＪ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９巻の３５１０−３５１６頁（１９９５年）；Ｊ．　Ｍｅｌｌｏｒｓ他のＳｃｉｅｎｃｅ　２７２巻の１１６７−１１７０頁（１９９６年）参照のこと。
【００５５】
　オリゴヌクレオチドプローブ、ハイブリッド形成の方法論、酸化剤及び酸化還元反応の方法、酸化還元反応の検出、並びにこれらの方法の実施に有用な装置は上記セクションＡ−Ｈに示される通りである。
【００５６】
　　Ｊ．レドックス不活性な代用塩基
　上記セクションＨに記載された方法の一つの不利な点は、オリゴヌクレオチドプローブが好ましくは実質的な数の所定の塩基（例えば、グアニン）を含まないことである。この問題に対する解決は、プローブの鎖の中でグアニンと置換し（即ち、グアニンのように、他の塩基が核酸二重鎖の中で示すよりも高い結合親和性を持つ塩基）、適当な反応条件下で酸化剤により酸化されることのない代用塩基を使用することである。グアニンが所定の塩基である場合のかかる代用塩基の例はイノシン及び７−デアザ−グアニンである。
【００５７】
　その結果、目的核酸は少なくとも一の所定の塩基を含み、プローブ若しくは捕獲核酸は代用のレドックス不活性な塩基を含むとき、目的核酸の検出方法は、（ａ）ハイブリッド形成核酸を形成するために目的核酸と特異的に結合する相補核酸に目的核酸を接触する段階と；（ｂ）ハイブリッド形成核酸を、酸化還元反応で所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体に接触する段階と；（ｃ）酸化還元反応を検出する段階と；（ｄ）所定の塩基での検出された酸化還元反応からその核酸の存在若しくは不存在を決める段階とからなる。目的核酸中の所定の塩基はグアニンであり目的核酸はシトシン（相補核酸中でグアニンと普通に結合する）を含む場合、相補核酸はハイブリッド形成核酸中でシトシンと結合する代用塩基を含む。代用塩基はイノシン及び７−デアザ−グアニンからなる群から選択される。反応段階は典型的には、代用塩基を酸化すること無く所定の塩基の選択的な酸化を達成するのに十分な条件の下で核酸と遷移金属錯体を反応することからなる。
【００５８】
　オリゴヌクレオチドプローブ、ハイブリッド形成の方法論、酸化剤及び酸化還元反応の方法、酸化還元反応の検出、並びにこれらの方法の実施に有用な装置は上記セクションＡ−Ｉに示される通りである。
【００５９】
　　Ｋ．ターミナルトランスフェラーゼを用いた所定塩基の高分子化
　上記セクションＨに記載された方法の別の実施例は所定塩基の付加的なものを提供するためにターミナルトランスフェラーゼを用いて目的核酸を伸長することを含む。図７に示されるように、かかる方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドプローブはターミナルトランスフェラーゼによる伸長のために遮断される終端を有し、ハイブリッド形成核酸を形成するために目的核酸と特異的に結合する該オリゴヌクレオチドプローブに試験試料を接触する段階と；（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブを、所定の塩基からなる目的核酸の伸長生成物を生成するためにターミナルトランスフェラーゼの存在下で所定の塩基を含む溶液に接触する段階と；（ｃ）オリゴヌクレオチドプローブを、酸化還元反応で所定の塩基を酸化する遷移金属錯体に接触する段階と；（ｄ）酸化還元反応の存在若しくは不存在を検出する段階と；（ｅ）所定の塩基での検出された酸化還元反応から試験試料中の目的核酸の存在若しくは不存在を決める段階とからなる。試験試料は好ましくは検出段階の前でオリゴヌクレオチドプローブから分離され、より好ましくは上記段階（ａ）と（ｂ）の間でプローブから分離される。分離は固定されたプローブの使用により実施され、又はそのプローブは上記セクションＨで記載されたように溶液中に自由に備えられる。
【００６０】
　オリゴヌクレオチドプローブ、ハイブリッド形成の方法論、酸化剤及び酸化還元反応の方法、酸化還元反応の検出、並びにこれらの方法の実施に有用な装置は上記セクションＡ−Ｉに示される通りである。
【００６１】
　　Ｌ．サンドイッチ分析
　上記セクションＨの方法の別の実施例は、図８に模式的に示される所謂”サンドイッチ”分析である。サンドイッチ分析において、目的核酸は捕獲プローブ、目的核酸、及び信号プローブからなる３つの（又はそれ以上の）部分のハイブリッドの一部である。
【００６２】
　同じものを含むと推定される試験試料中の目的核酸の存在若しくは不存在を検出する方法は、（ａ）捕獲プローブは目的核酸に特異的に結合するものであり、オリゴヌクレオチド捕獲プローブを提供する段階と；（ｂ）試験試料を、ハイブリッド形成核酸を形成するために捕獲プローブに接触する段階と；（ｃ）信号プローブは目的核酸に特異的に結合するものであり、ハイブリッド形成核酸サンドイッチを生成するために信号プローブは少なくとも一の所定の塩基を含むものであり、オリゴヌクレオチド信号プローブをハイブリッド形成核酸に接触する段階と；（ｄ）ハイブリッド形成核酸サンドイッチを、酸化還元反応で所定の塩基を酸化する遷移金属錯体に接触する段階と；（ｅ）ハイブリッド形成核酸と結合された酸化還元反応の存在若しくは不存在を検出する段階と；（ｆ）所定の塩基での検出された酸化還元反応から試験試料中の目的核酸の存在若しくは不存在を決める段階とからなる。分離段階は上記段階（ｂ）と段階（ｃ）との間にあり、又は上記段階（ｃ）と段階（ｄ）の間にあり、試験試料は好ましくは捕獲プローブから分離される。分析形式（例えば、突然発生又は同種発生）に従い、オリゴヌクレオチド捕獲プローブは固体支持体（例えば、高分子ビーズ、板、若しくはマイクロタイタープレートウェルの内部表面）、又は上記のように試験試料からハイブリッド形成核酸を分離するために提供された代わりの手段の上に固定される。
【００６３】
　多数の”サンドイッチ”分析形式が知られている。分析形式の選択は重大ではなく、適当な形式が本発明の実施するために用いられる。例えば、Ｒａｎｋｉ他へのアメリカ特許第４，４８６，５３９号に記載されるように、オリゴヌクレオチド捕獲プローブは固体支持体上に固定される。Ｋｕｒｎ他へのアメリカ特許第４，８６８，１０４号に記載されるように、オリゴヌクレオチドプローブは高分子形成ユニット含み、その高分子化によりハイブリッド形成核酸のサンドイッチは分離される。Ｍ．Ｓ．　Ｕｒｄｅａ　のＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ．　３９巻の７２５−７２６頁（１９９３年）に記載されるように、信号プローブは直線状又は分枝形状である。固定されたポリヌクレオチドにオリゴヌクレオチド捕獲プローブを結合するメディエイタポリヌクレオチドが、Ｓｔａｂｉｎｓｋｙへのアメリカ特許第４，７５１，１７７号に記載されるように、用いられる。Ｒ．　Ｇｏｏｄｓｏｎの欧州特許出願第０　　２３８　　３３２号：Ｗ．　Ｈａｒｒｉｓｏｎ　の欧州特許出願第０　　１３９　　４８９号、及びＮ．　Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ　の欧州特許出願第０　　１９２　　１６８号に記載されるように、オリゴヌクレオチドプローブは特異的な結合対（例えば、ビオチン）の一部分、及び固体支持体上に固定された（例えば、アビジン）、結合対の他の部分との第二の結合相互作用により試験試料から分離されたハイブリッド形成核酸のサンドイッチに連結される。
【００６４】
　オリゴヌクレオチドプローブ、ハイブリッド形成の方法論、酸化剤及び酸化還元反応の方法、酸化還元反応の検出、並びにこれらの方法の実施に有用な装置は上記セクションＡ−Ｋに示される通りである。
【００６５】
　　Ｍ．背景のグアニン信号存在下での所定の塩基の検出
　オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基の存在はグアニンの酸化から生成される背景信号の存在下であっても検出される。不正対合の検出は、４つの自然の塩基（Ａ，Ｔ／Ｕ，Ｃ及びＧ）の存在下でオリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基を検出する能力に依存するからである。そのため、所定の塩基は他の４つの塩基より素早く酸化されうるものでなければならない。
【００６６】
　本発明は背景のグアニンの信号の存在下での所定の塩基の電気化学的検出のために有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供する。そのオリゴヌクレオチドプローブは上記のセクションＢで示された何れかのオリゴヌクレオチドプローブからなり、そのオリゴヌクレオチドプローブ中の少なくとも一つのプリン塩基は式Ｉ：
【００６７】
【化１】
2004117371.tif 000003
のプリン置換基である。オリゴヌクレオチドプローブは意図されたその結合の相手に従い、望みのように前記式の多数の塩基（例えば、１、２若しくは３から５，１０，若しくは１５まで又はそれ以上）を含みうる。かかるオリゴヌクレオチドプローブの特定例、及びその調製に有用なヌクレオチドは、式ＩＩ：
【００６８】
【化２】
2004117371.tif 000004
ここで：
Ｒ１はＨＯ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−，ヌクレオチド、若しくはオリゴヌクレオチドであり；
Ｒ２は−Ｈ，ヌクレオチド、若しくはオリゴヌクレオチドであり；
Ｒ３は−Ｈ，−ＯＨ，ハロ（例えば、フロロ、クロロ）、アルコキシ（例えば、メトキシ又はエトキシ等のＣ１−Ｃ４アルコキシ）、アミノ、若しくはアジド；
Ｒ４は−Ｏ−又は−ＣＨ２−、である
の化合物である。
【００６９】
　上記式Ｉ及び式ＩＩと関連して記載されるようなオリゴヌクレオチドプローブは公知の技術に従い作られ、当業者にとって容易に明白となるように以降に置かれた例の開示の中で改良される。
【００７０】
　式ＩＩの化合物の一の好ましい実施例において、Ｒ１はＨＯ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。式Ｉの化合物の別の好ましい実施例において、ＲはＨである。Ｒ１がヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドであるとき、ホスホジエステル結合は３’末端まである。Ｒ２がヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドであるとき、ホスホジエステル結合は５’末端まである。
【００７１】
　式Ｉの化合物は、上記のセクションＡ−Ｍで記載された本発明の方法において利用されるオリゴヌクレオチドプローブ中の塩基として有利に含まれる。オリゴヌクレオチドプローブはもちろん多数の塩基を含むが、オリゴヌクレオチドプローブが背景のグアニンの存在下で所定の塩基の検出のために使用されるべきものであるとき、少なくとも一の式Ｉの塩基を含む必要がある。オリゴヌクレオチドプローブは長さが５，１０，５０若しくは１００に近い塩基対である。式ＩＩの化合物の特定例は６−メルカプトグアノシン５’−モノホスフェート（６−Ｓ−ＧＭＰ）である。
【００７２】
　　Ｎ．電極構造
　上記の方法に従う核酸中の所定の塩基の電気化学的検出に有用な電極は、（ａ）その上に作用表面を有する導電性基板と；（ｂ）作用表面に接続された高分子層とからなる。高分子層は核酸に結合するものであり（例えば、疎水性相互作用又は何れか他の適当な結合技術）遷移金属錯体に対し浸透性である（即ち、遷移金属錯体は高分子と結合された核酸へ移動できる）。導電性の基板は金属基板又は半導体基板を含む非金属基板である（例えば、金、ガラス状カーボン、インジウムのドープされた酸化スズ、他）。導電性基板は、その端に形成された作用表面を有する伸長プローブ、又はその一の側面に形成された作用表面を有するフラットシート等のいずれかの物理形態をとる。高分子層は、作用表面への高分子層のクランプ、電極上への高分子溶液の蒸着、又は電解高分子化による等、何れかの適当な手段により作用電極に接続される。例となる高分子は、限定はされないが、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、及びポリ（ビニルピリジン）を含む。高分子層の厚みは重要ではないが、１００オングストローム（Ａ）から１，１０、若しくは１００μｍでも可能である。その電極はセクションＡ−Ｍに記載された全ての方法で実質的に使用されうる。その結果、一般に、本発明は核酸を検出する方法を提供し、該核酸は少なくとも一の所定の塩基を含み、その方法は、（ａ）電極はその上に形成された作用表面と該作用表面に接続された上記の高分子層を有する導電性基板からなり、該核酸を含む試料を該電極に接触する段階と；（ｂ）該核酸を、酸化還元反応で所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と；（ｃ）該電極を通る電流の流れを測定することにより酸化還元反応を検出する段階と；（ｄ）所定の塩基での検出された酸化還元反応から該核酸の存在又は不存在を決定する段階とからなる。
【００７３】
　　Ｏ．超小型電子装置
　上記技術の利点はそれらが超小型電子装置を用いて実施されることである。上記の方法における核酸種の電気化学的検出に有用な超小型電子装置は、第一及び第二の反対の面を有する超小型電子基板と；該第一の面上の導電性電極と；該導電性電極に隣接して該第一の面上に固定されたオリゴヌクレオチド捕獲プローブとからなる。捕獲プローブは、プローブで、又はそのプローブにハイブリッド形成された目的核酸で生じる酸化還元反応が隣接電極で検出されるように、隣接電極に十分近く配置される。
【００７４】
　図９及び図１０に示される実施例において、超小型電子装置２０は第一の反対の面に多数の分離電極２１と、各分離電極に隣接して固定された多数の分離オリゴヌクレオチド捕獲プローブとを有する。他と異なり、それぞれ結合された電極を伴う、多数の分離オリゴヌクレオチドプローブを備えることにより、異なるハイブリッド形成結果の変化を検出できる単一の、小型装置が提供される。装置が電線を引かれ、又は別なやり方で効果的にここに記載の方法の検出及び決定段階を実施するのに必要な電子装置と結合されるように、各電極は実質的に適当な接点２３に実質的に接続される。
【００７５】
　核酸は公知の技術により超小型電子装置の基板上の適当な位置に固定される。例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇ　他へのアメリカ特許第５，４０５，７８３号を参照。超小型電子装置の基板は半導体（例えばシリコン）又は簡便な超小型電子技術を用いて処理されうる半導体ではない物質（例えば、ガラス）である。電極は金属又は多結晶シリコン等の非金属導電性物質である。電極は堆積物エッチング等の簡便な超小型電子処理技術を使用して形成されうる。適当な超小型電子構造の変化及び組立技術は当業者に良く知られている。例えば、Ｓ．　Ｍ．　ＳｚｅのＶＬＳＩ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８３年）；Ｓ．　Ｋ．　ＧｈａｎｄｈｉのＶＬＳＩ　Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　（１９８３年）を参照。
【００７６】
　以下の例は本発明を説明するために提供され、それを限定すると解されるべきではない。これらの例において、ｃｍ２／ｓは秒毎の平方センチメートルを意味し、Ｍはモル濃度を意味し、Ｍ−１ｓ−１は秒毎のモル毎を意味し、ｅＶはエレクトロンボルトを意味し、Ｖはボルトを意味し、ｎｍはナノメートルを意味し、ＧＭＰはグアニン５’−モノホスフェートを意味し、ＩＴＯはスズでドープされた酸化インジウム電極を意味する。サイクリックボルタモグラムは公知の技術に従い、ＥＧ＋Ｇ　Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔのモデル２７３Ａを用いて取得された。ＩＴＯ作用電極は、米国、ミネソタ州５５０８２−１２３４、スティルウォーターの北４７番通り１３９６０のデルタ　テクノロジー．Ｌｔｄ．から入手可能な、部品番号ＣＨ−５０１Ｎ−１５１４のＩＴＯコートされたソーダライムガラスシートから製作される。ナイロン膜は米国、イリノイ州６０００５のアーリントン　ハイトのクリアーブルック　ドライブ２６３６のアマシャム　Ｃｏｒｐ．からカタログ番号ＲＰＮ　１２１０ＢのハイボンドＮ＋（ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ＋）ナイロン膜として入手できる。
【実施例１】
【００７７】
　Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムの測定
　一回のボルタンメトリースイープの間に観測される金属錯体の酸化された形によるＤＮＡの酸化の多数回のターンオーバーにより生成された接触強化を用いた、ウシサイモスＤＮＡを伴う及び伴わないＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムが図１に示される。図１では、均一な線は７００ｍＭのＮａＣｌ／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中、２５ｍＶ／ｓでの５０μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のスキャンを表し、点線は５０μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋と３．０ｍＭの（ヌクレオチド）ウシサイモスＤＮＡのボルタモグラムを表す。ＤＮＡの拡散係数（即ち、２．０×１０−７ｃｍ２／ｓ）は金属錯体のそれ（８．０×１０−６ｃｍ２／ｓ）に比べすっと小さいため、ＤＮＡ結合レドックス対のボルタンメトリーは結合された及び結合されない形態に関する方形図によって分析されるべきである。この現象は一般に結合形態に対して劇的に減少した電流をもたらすが；しかし、十分に高いイオン強度（〔Ｎａ＋＝０．８Ｍ〕）では、金属錯体の結合は電流応答に影響するためには弱すぎる。この場合、電流は単純なＥＣ’の機構によって分析される。
【００７８】
　Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋→Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋（Ｅ）
　Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋＋ＤＮＡ→Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＋ＤＮＡｏｘ（Ｃ’）
【実施例２】
【００７９】
　サイクリックボルタモグラムの分析
　サイクリクボルタモグラムは、ＤＩＧＳＩＭＴＭデータ分析パッケージを使用し、背景を差引されたものと、完全な電流−電位曲線をフィットすることにより分析された。入力パラメータは、全て分離実験において決められた金属錯体に対するＥ１／２及び金属錯体に対する拡散係数であった。そのため、フィッティングから得られた唯一のパラメータは式２に対する二次の速度定数ｋ＝９．０×１０３Ｍ−１ｓ−１であった。この同じ速度定数は広い範囲の掃引速度で決められた。
【００８０】
　Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋によるＤＮＡの酸化に対する速度定数は二つの分離実験で確認された。第一番目に、矩形波ボルタモグラムは、ＣＯＯＬＴＭアルゴリズムとフィッティングすることにより式２に対する擬一次のｋｏｂｓを得るために使用された。ＣＯＯＬＴＭアルゴリズムはＤＩＧＳＩＭＴＭと大きく異なるフィッティングアプローチを使用するが、しかし、ＤＮＡに対するｋｏｂｓのプロットは線形であり、ＤＩＧＳＩＭＴＭを用いたサイクリックボルタモグラムのフィッティングから得られた速度定数と一致する、二次の速度定数ｋ＝８．２×１０３Ｍ−１ｓ−１を与えた。第二番目に、Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋の標準試料が用意され、流れの止められたラピッドスキャン中で直接にＤＮＡと反応された。３５０及び６００ｎｍの間の時間依存スペクトルの全体分析は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋が中間体を伴うこと無く１２×１０３Ｍ−１ｓ−１の速度定数できれいにＲｕ（ｂｐｙ）３２＋へ転換されることを示した。こうして、Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋によるＤＮＡ酸化の速度定数は、劇的に異なるフィッティングプロトコルを用いる二つの独立な電気化学的測定により、そして完全可視スペクトルのフィッティングを用いる非電気化学的ストップドフロー技術により明確に確立された。
【実施例３】
【００８１】
　　サイクリックボルタモグラムの分析
　電子移動に対する駆動力が再配列エネルギ（λ）よりも有意に小さいとすると、駆動力に対するＲＴ　ｌｎ　ｋ　のプロットは（反応物の接近と結合された仕事項に対し補正された場合）　、１／２の傾きをもつ直線を形成する。異なるレドックス電位を持つ多数のＭｅｔａｌ（ｂｐｙ）３３＋誘導体によるＤＮＡの酸化に対する速度定数は、以下の表１に示される。
【００８２】
　マーカス理論は電子移動速度の駆動力依存を述べ、絶対速度定数は以下の式：
　ｋ＝νｅｘｐ［−β（ｒ−ｒo）］ｅｘｐ［−（ΔＧ＋λ）２／４λＲＴ］
によって分析されえて、ここで、νは拡散律速における速度定数（１０１１Ｍ−１ｓ−１）であり、ｒは活性化された錯体中の反応物と生成物の間の距離であり、ｒ０は反応物と生成物の最も近接した距離であり、βは介在する媒体の影響を示す。二重らせんの内部へのグアニンドナーの取込みは、電子が超えて結合金属錯体へトンネリングすべき有限の距離、即ちｒ≠ｒ０、を負わせる。しかし、グアニン５’−モノホスフェート（ＧＭＰ）が電子受容体として用いられるとすると、金属錯体を伴うグアニンの直接拡散が可能である（ｒ＝ｒ０）。Ｆｅ（ｂｐｙ）３３＋及びＧＭＰに対し、ストップドフローにより測定された速度定数は２．６×１０３Ｍ−１ｓ−１である。関連の反応に対して知られたλの値は１−１．５ｅＶの範囲内にあり、１．１±０．１Ｖのグアニン＋／０連結に対するΔＧを与える。
　表１．Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋によるＤＮＡオリゴマー中のグアニンの酸化に対する速度定数
【００８３】
【表１】
2004117371.tif 000005
ａ　速度定数を決めるために使用されるＤＮＡ濃度はグアニンヌクレオチドのモルに基づく。
ｂ　溶媒を通るトンネリングの確立された距離。β（Ｈ２Ｏ）＝３Å１及びｋＳＳ＝１．８×１０５Ｍ−１Ｓ−１で、ｋ／ｋＳＳ＝ｅｘｐ［−βΔｒ］に従い計算された距離。
ｃ　速度定数はグアニン濃度に相関するので、ＧＧ不正対合に対して観測された速度は一つのグアニンを含む他のオリゴマーに関して規格化された。
【００８４】
　図２に、一本鎖である５’−ＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡ（Ｃ）及びそれの相補鎖へハイブリッド形成されたものの存在下でのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムがある。図２では、掃引速度は２５ｍＶ／ｓであり、（Ａ）は２５μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋＋１００μＭの（グアニンヌクレオチド中の）二重鎖完全ハイブリッド形成ＤＮＡ（５’−ＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡ）・（３’−ＴＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴ）を表し、（Ｂ）はＧＡ不正対合（５’−ＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡ）・（３’−ＴＴＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴ）を表し、（Ｃ）は一のグアニンヌクレオチド（５’−ＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡ）を含む一本鎖のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋を表す。ＧＭＰの場合、一本鎖に対するｒ＝ｒ０、及び１．８×１０５Ｍ−１ｓ−１の速度定数はΔＧ（グアニン＋／０）＝１．１Ｖ及びλ＝１．３ｅＶを与え、ＧＭＰ酸化からの値と一致する。一本鎖に対する劇的な増加がある一方、ハブリッド形成に関する電流において４倍の減少をもたらし、ほんの僅かの増加が完全にハイブリッド形成された二重鎖に対しこの掃引速度で観測された。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋等の金属錯体は小さな溝中でＤＮＡに結合することが知られており、従って二重鎖の酸化に対する１５０倍遅い速度定数（１．２×１０３Ｍ−１ｓ−１）がグアニン残基と表面結合錯体の間の距離から得られる。金属錯体小さな溝中でドッキングされるとき、グアニンと金属錯体は密接した接触には至らず、電子はグアニン残基と金属錯体を分離する溶媒を通ってトンネリングする必要がある。水を通るトンネリングは非極性の媒体を通るよりもはるかに非効率的であり、水に対するβの値は約３Å−１であると確立されている。そのためトンネリング距離は：
　　ｋ／ｋｓｓ＝ｅｘｐ（−βΔｒ）
に従い計算されえて、ここで、Δｒは一本鎖と比較した二重鎖における距離の変化である。この分析から、完全にハイブリッド化された二重鎖に対するΔｒは１．７Åである。
【００８５】
　水に対する大きな値は、電子移動速度定数における大きな差が、ＤＮＡ構造における小さな摂動を順に反映しうる、トンネリング距離におけるとても小さな変化によりもたらされることを示す。また図２に示されるのは、ＧＣ塩基対がＧＡ不正対合により置換されている同じ二重鎖の存在下のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のボルタモグラムである。ＧＡ不正対合の取込みは標準二重鎖と比較してなまの電流における二倍の増加をもたらし、それは速度定数における１６倍の変化に解釈される（ｋＧＡ＝１．９×１０４Ｍ−１ｓ−１）。一本鎖、完全なハイブリッド形成二重鎖、及び３のＧＸ不正対合の全てに対する速度データは表１に表示される。また一本鎖と比較した計算されたトンネング距離Δｒが示される。推定されるように、Ｇ−プリン不正対合におけるグアニン残基は、二つの塩基がまだ不安定な対中の二つの水素結合により連結されているＧＴ不正対合におけるより金属錯体に対してより近づきやすい。しかし、ＧＴ不正対合はまだ速度定数において簡単に検出できる４倍の変化を引き起こす。そのため、酸化速度定数は傾向Ｇ（一本鎖）＞ＧＡ＞ＧＧ＞ＧＴ＞ＧＣに従う。これらの不正整合のそれぞれを別のものから区別する能力は、所定の塩基に隣接する塩基対での単一塩基対の不正対合に対してさえ敏感なハイブリッド形成の不正対合感応検出のための基礎を提供する。
【実施例４】
【００８６】
　プローブ鎖中の酸化を回避する改良塩基：グアニンに対するイノシンの置換
　サイクリックボルタモグラムはインジウム　チン　オキサイド　　（ＩＴＯ）作用電極（面積＝０．３２ｃｍ２），Ｐｔ−ワイヤ対極、及びＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を使用して取得された。図５で、０．７０ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＮａ−ホスフェート緩衝液（ｐＨ７）中に溶解された２５μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋及び７５μＭのオリゴヌクレオチドを含む試料が２５ｍＶ／ｓでスキャンされた。図５において、（Ａ）はオリゴヌクレオチド未添加であり、（Ｂ）は７５μＭのｄ〔５’−ＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＴＡＴＴＴ〕を伴い、（Ｃ）はＢとｄ〔５’−ＧＧＧＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧ〕とからの７５μＭのオリゴマーのハイブリッドを伴う。作用電極はスズでドープされた酸化インジウムであり、参照電極はＡｇ／ＡｇＣｌであり、対極はＰｔワイヤである。Ｃからのハイブリッドの二次構造は図中に示される。図６で、７００ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＮａ−ホスフェート緩衝剤（ｐＨ＝６．８、〔Ｎａ＋＝７８０ｍＭ〕）を含む緩衝水溶液中に溶解された５０μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋及び０．３ｍＭの５’−ＧＭＰ若しくは５’−ＩＭＰの何れかを含む試料が２．５ｍＶ／ｓで０．０Ｖから１．４Ｖまでスキャンされた。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋の不存在下でのモノヌクレオチドのスキャンは明確な酸化電流を示さなかった。新たにきれいにされたＩＴＯ電極が各実験のために使用され、緩衝液のみの背景スキャンが引き続きのスキャンから差し引かれた。二次のグアニン酸化速度定数がＤＩＧＳＩＭＴＭソフトパッケージを使用して二段階機構にサイクリックボルタンメトリーのデータをフィッティングすることにより決められた。酸化速度以外の全てのパラメータは同じ電極での金属錯体単独のボルタモグラムから決められた。５’−ＧＭＰはＳｉｇｍａから購入され、５’−ＩＭＰはＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから購入され、両方とも更なる精製無しに使用された。オリゴヌクレオチドはＵＮＣ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　において調製され、モノヌクレオチドを除去するために３０００−分子量のカットオフフィルターを通された。純粋さは逆相ＨＰＬＣにより評価された。濃度は、Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．　のＣＲＣ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ；　Ｖｏｌ．１，　１９７５年、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　ボカラトン、フロリダ州に記載されるように、２６０ｎｍでの光吸収から決められた。図５のハイブリッドは９０°Ｃ５分間の相補鎖の加熱及び２時間にわたる２５０°Ｃまでのゆっくりした冷却により調製された。
【００８７】
　これらのデータは、イノシンがレドックス不活性なプローブ鎖を提供するためにプローブ中でグアニンの代わりに置換されるうることを示す。
【実施例５】
【００８８】
　プローブ鎖中の酸化を回避する改良塩基：７−デアザ−グアニン
　この例は、レドックス不活性なプローブ鎖を提供するためにグアニンの代用である改良塩基として７−デアザ−グアニンが使用される以外は、上記例４と実質的に同じ方法で実施される。
【００８９】
　７−デアザ−グアニンは僅か１０３Ｍ−１ｓ−１の速度で酸化され、それはグアニンより２乗オーダーの大きさで遅く、レドックス不活性なプローブ鎖を提供するために十分遅い。
【実施例６】
【００９０】
　ＩＴＯ電極に取り付けられたナイロン膜に結合されたウシサイモスＤＮＡを使用する検出
　ナイロンフィルムは、電気化学セル中に適合し、溶液に晒されるＩＴＯ電極の一部を覆うように直径およそ６ｍｍの円形形状に切断された。
【００９１】
　金属錯体のサイクリックボルタモグラムのみを得る実験のために、ＩＴＯ電極は緩衝液で初めに調整される。ナイロンのディスク（ＤＮＡ無し）はその後電気化学セルに挿入され、２００μＬの２００μＭの金属錯体溶液がセル内にピペット注入される。Ｏｓ（ｂｐｙ）３２＋の実験に対し、電気化学分析の前に、６分間の平衡時間が用いられた。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋の実験に対し、電気化学分析の前に、１５分間の平衡時間が用いられた。サイクリックボルタモグラムは２５ｍＭ／ｓの掃引速度でＰＡＲ　２７３Ａポテンシオスタットを使用して取得された。
【００９２】
　ＤＮＡの実験に対し、ＤＮＡ吸収ナイロンのディスクが適当な緩衝液中でＩＴＯ電極の調整をした後、電気化学セル中に挿入される。適当な緩衝液中の２００μＬの２００μＭの金属錯体溶液がセル内にピペット注入され、適当な平衡時間（Ｏｓ（ｂｐｙ）３２＋に対し６分間及びＲｕ（ｂｐｙ）３２＋に対し１５分間）の後２５ｍＭ／ｓの掃引速度でサイクリックボルタモグラムが取られる。このナイロンディスクはおよそ５分間、５．８ｍＭのウシサイモスＤＮＡが水に溶解された溶液中に浸漬される。浸漬時間の変化は５分間から１８時間の範囲で調査された。ＤＮＡは素早く（数分以内）ナイロンフィルムと結合し、従って短い浸漬時間が典型的には用いられる。低濃度の塩の条件下では、５０ｍＭのＮａ−ホスフェート緩衝液（ｐＨ＝６．８，〔Ｎａ＋〕＝８０ｍＭ）が用いられる。高濃度の塩の条件下では、５０ｍＭのＮａ−ホスフェート緩衝剤及び７００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝６．８，〔Ｎａ＋〕＝７８０ｍＭ）の溶液が用いられる。
【００９３】
　ナイロン−ＩＴＯ電極でのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムが図１１に示される。点線は、ナイロン膜が電極に取り付けられる前にウシサイモスＤＮＡ中に浸漬されたときのボルタモグラムを示す。溶液中観測されたものと対応する、ＤＮＡラベルされた膜に対する大きな接触電流がある。その実験はＲｕ（ｂｐｙ）３２＋がナイロンフィルム中で自由に拡散すること及びＤＮＡの拡散は接触電流を実現するために必要でないことを示す。図１１はまた、媒介物質と固定されたＤＮＡの間の増加された相互作用のため、より大きな接触電流がより低い塩の濃度で観測されることを示す。
【００９４】
　図１２Ａは媒介物質としてＯｓ（ｂｐｙ）３２＋を使用する同じ実験を示す。オスミウム錯体はグアニンを酸化せず、従ってグアニン存在下で観測された電流増加はＤＮＡ結合形成による媒介物質の前濃縮から生じなければならない。実際、Ｏｓ（ｂｐｙ）３２＋に対する電流はナイロン電極でのＤＮＡ存在下のほうが、ＤＮＡ不存在下より低い。実験は、ＤＮＡがナイロン電極に結合された時のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋に対する増加した電流はもっぱら所有の接触反応のためであり、３価の結合形成の違いにはよらない。塩濃度の効果は図１２Ｂに示され、接触反応に対して観測される大きな塩の効果に比べ小さい。
【００９５】
　ＩＴＯ電極に取付けられたナイロン膜へのＤＮＡの結合により、ＤＮＡは拡散してないが媒介物質はそうである実施例においてさえもＤＮＡは検出されることを示した。この発見は、プローブ−目的物ハイブリッドが媒介物質の拡散層中にあるように固定されたプローブが電極に十分近い場合のＤＮＡの検出を可能にする。
【実施例７】
【００９６】
　ＩＴＯ電極に取り付けられたナイロン膜に結合されたＲＮＡの検出
　実験は、ベーカースイースト（Ｂａｋｅｒｓ　Ｙｅａｓｔ）（Ｓｉｇｍａから入手）からのｔＲＮＡがウシサイモスＤＮＡの代わりに使用される以外は、例６に記載されたように実施される。ナイロンフィルムのディスクは例６に記載されたようにｔＲＮＡの溶液に浸漬された。
【００９７】
　Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋存在下のサイクリックボルタンメトリーは図１３に示される。ＤＮＡを伴う場合のように、接触電流は両方の緩衝液で観測され、低濃度の塩でより大きい。ｔＲＮＡはＤＮＡと同じくカチオンと結合せず、そのため塩効果はあまり劇的でないので、高い及び低い塩濃度の間の電流において観測された違いは例６のＤＮＡを伴い観測されたもののように劇的ではない。
【００９８】
　図１３における結果は、ＲＮＡはＤＮＡに対するものと同じ方法において検出されうることを示し、これはＲＮＡ及びＤＮＡの両方がグアニンを含むため生じる。糖−ホスフェートバックボーンの化学的構成は接触電流に影響しない。この観測に基づき、ＰＮＡの、炭素環、ホスホロチオエート、若しくは他の置換リボース結合等の他の改良されたバックボーンを含む一本鎖又は二重鎖と同じく、一本鎖及び二重鎖のＤＮＡ及びＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの検出が可能である。
【実施例８】
【００９９】
　ＲＮＡの検出
　ＲＮＡの定量検出のために、ＤＮＡ（若しくはＲＮＡ，ＰＮＡ，若しくは他の代わりのバックボーン）プローブが固体支持体上に固定される。プローブはプローブ鎖中のグアニンの代わりのイノシン又は７−デアザ−グアニンの置換によりレドックス不活性となるように改良される。固定されたプローブはその後、目的ＲＮＡ（例えば、ＨＩＶ又はヘパタイチスＣからのもの）の溶液と接触される。固体表面はその後、ＲＮＡの鎖とハブリッド形成されたレドックス不活性な、固定されたプローブを含む。固体表面はそれからＲｕ（ｂｐｙ）３２＋の溶液と接触され、媒介物質のサイクリックボルタモグラムが測定される。接触電流はハイブリッド形成結果を示し、電流の大きさは鎖中の知られたグアニンの数を基に結合されたＲＮＡの鎖を定量するために用いられる。
【０１００】
　ＲＮＡの不正対合検出のために、ＤＮＡ（若しくはＲＮＡ，ＰＮＡ，若しくは他の代わりのもの）プローブが固体支持体上に固定される。プローブ鎖中の所定の塩基は他の塩基に比べより容易に酸化される。表面は目的ＲＮＡの溶液と接触され、その後Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋若しくは他の媒介物質の溶液と接触される。ハイブリッド形成の結果（完全な対合、対形成しない、若しくは不正対合）はその後ＤＮＡに対するのと同じ方法で所定の塩基で決められる。
【実施例９】
【０１０１】
　塩基の所定配列の検出
　方法は例３記載のように実施される。図１４中に４つ置かれたサイクリックボルタモグラムは、５’−Ｇによる電流が５’−ＧＧＧに対するものよりはるかに小さい５’−ＧＧに対するものに比べ、はるかに小さいことを示す。この電流におけるとても大きな増加はＧＧ及びＧＧＧ配列を含む一本鎖と二重鎖の両方に対して観測される。図１５に示されるように、同じ鎖に対するＧの追加による電流の増加は、Ｇが点々と配置されるとするとずっと小さいため、電流の増加は単純にＧの数の増加によるものではない。ＧＧＧの５’−Ｇは単一のＧよりはるかに容易に酸化されるので、ＧではなくＧＧＧを酸化することのできる（より低いレドックス電位を持つ）媒介物質を選択することが可能である。
【０１０２】
　Ｒｕ（４，４’−ジメチル−ビピリジン）３２＋のサイクリックボルタモグラムが単一のＧオリゴヌクレオチド及びＧＧＧオリゴヌクレオチドの存在下での繰り返しスキャンと共に図１６に示される。示されるように、接触電流はＧＧＧオリゴヌクレオチドの存在下でのみ観測される。この例は、より簡単に酸化された配列が背景グアニンの存在下で検出されうるような媒介物質の電位を調節する能力を示す。同じ計画はグアニンより容易に酸化されるようにするために誘導された単一の合成塩基を検出することに適用されうる。
【０１０３】
　例は、媒介物質の電位を低くし、更により容易に酸化されうる塩基又は塩基配列の識別が可能であることを示す。
【実施例１０】
【０１０４】
　背景天然グアニン存在下での所定のグアニン誘導体の検出
　６−メルカプトグアノシン５’−モノホスフェート（６−Ｓ−ＧＭＰ）の二ナトリウム塩
【０１０５】
【化３】
2004117371.tif 000006
が購入により入手可能な６−メルカプトグアノシン（Ｓｉｇｍａから）のリン酸化により調製される。リン酸化は、Ｍ．　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ他のＢｕｌｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｊｐｎ　４２巻の３５０５頁（１９６９年）の製法に従いＰＯＣｌ３を使用して行なわれる。６−Ｓ−ＧＭＰの二ナトリウム塩はボルタンメトリー分析の前にＨＰＬＣにより精製される。サイクリックボルタモグラムは、イノシン−５’−モノホスフェートの例のように高いイオン強度で実施される。作用電極は６−Ｓ−ＧＭＰの直接酸化を防ぐために表面に取り付けられたハイボンドＮ＋ナイロン膜を有するＩＴＯである。対極はＰｔワイヤである。参照電極はＡｇ／ＡｇＣｌである。掃引速度は２５ｍＶ／ｓである。
【０１０６】
　サイクリックボルタモグラムの結果は図１７中に４つ図示され、曲線ＡはＲｕ（４，４’−Ｍｅ２−ｂｐｙ）３２＋単独（４，４’−Ｍｅ２−ｂｐｙ＝４，４’−ジメチル−ビピリジン）を示す。５’−ＧＭＰの添加に従い、Ｒｕ（Ｍｅ２ｂｐｙ）３２＋波の増大は観測されないが；しかし６−メルカプトグアノシン５’−モノホスフェート（６−Ｓ−ＧＭＰ）の添加は劇的な電流増加を導く（曲線Ｂ）。５’−ＧＭＰ存在下のピーク電流は曲線Ａのそれと同一である。データは、背景天然グアニン存在下での６−メルカプトグアノシン塩基の検出が可能であることを示す。
【実施例１１】
【０１０７】
　目的鎖上の所定塩基とのＤＮＡハイブリッド形成の検出
　ナイロン膜（ハイボンドＮ＋，アマシャム、４８０−６００μｇ／ｃｍ２）が、直径およそ６ｍｍの円形状に切断される。そのナイロンディスクは水中のポリシチジリック　アシッド（Ｓｉｇｍａから入手可能）の濃縮溶液中に置かれ、１時間の間浸漬される。ディスクはその後ポリシチジリック　アシッド（ｐｏｌｙ〔Ｃ〕）溶液から移動され、パラフィルム上に置かれて乾燥される。ディスクは乾燥するに従い、追加の１５μｌのｐｏｌｙ〔Ｃ〕溶液がそのフィルムに３つの５μｌアリコットにより添加される。ディスクは完全に乾燥される。乾燥されたナイロンディスクはその後、浸漬工程の間に強く結合されないｐｏｌｙ〔Ｃ〕を除去するために低濃度の塩の緩衝液（５０ｍＭのＮａ−ホスフェート、ｐＨ＝６．８，〔Ｎａ＋〕＝８０ｍＭ）中、洗浄される。
【０１０８】
　対照実験として、ｐｏｌｙ〔Ｃ〕のしみ込まされたディスクが、添加の核酸にはさらされないが、他の全てのハイブリッド形成段階を受ける偽ハイブリッド形成製法に通される。そのディスクは４００μｌのミリＱ水中に置かれ、１時間４８°Ｃで加熱され、室温まで冷却される。ディスクはその水から移され、電気化学分析の前に低濃度の塩の緩衝液で洗浄される。このように調製されたディスクは図１８及び１９の両方の背景スキャン（Ａ）を表す。
【０１０９】
　ｐｏｌｙ〔Ｃ〕のしみ込まされたディスクが４００μｌのポリグアニリック　アシッド（Ｓｉｇｍａから入手可能）の水溶液中に置かれ、１時間４８°Ｃで加熱され、室温まで冷却される。ディスクはその後そのポリグアニリック　アシッド（ｐｏｌｙ〔Ｇ〕）溶液から移され、電気化学分析の前に低濃度の塩の緩衝液で洗浄される。水中のウシサイモスＤＮＡ（Ｓｉｇｍａから入手可能）が１０分の間９０°Ｃまで加熱されることにより変性（融解）される。ｐｏｌｙ〔Ｃ〕のしみ込まされたディスクが変性ウシサイモスＤＮＡ溶液中に置かれ、１時間４８°Ｃで加熱され、室温まで冷却される。ディスクはその後そのウシサイモスＤＮＡ溶液から移され、電気化学分析の前に低濃度の塩の緩衝液で洗浄される。対照として、ｐｏｌｙ〔Ｃ〕のしみ込まされていないディスクもまた同じ製法を受けた。ナイロンフィルム中への吸収による（ハイブリッド形成によるものではない）ウシサイモスＤＮＡ溶液の結合及び検出は対照膜中で観測される。
【０１１０】
　低濃度の塩の緩衝液によるＩＴＯ電極の調整の後、上記のように処理されたナイロンディスクは電気化学セル中に挿入される。２００μｌの２００μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋溶液がそのセル内にピペット注入され、１５分間の平衡時間の後サイクリックボルタモグラムがとられる。掃引速度は２５ｍＶ／ｓｅｃである。
【０１１１】
　サイクリックボルタモグラムは図１８に報告される。プローブ配列ｐｏｌｙ〔Ｃ〕はハイボンドＮ＋ナイロン膜上に固定され、ハイブッド形成プロトコルが緩衝液中で実施される（”偽ハイブリッド形成”）。膜はＩＴＯ作用電極に取り付けられ、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムが得られる（Ａ）。膜はｐｏｌｙ〔Ｇ〕の溶液中に浸され、ハイブリッド形成は同じプロトコルに従い実施される。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムはその後測定され（Ｂ）、そして大きな電流増加がハイブリッド形成されたｐｏｌｙ〔Ｇ〕目的物の接触酸化のために得られる。図１９に示されるように、分析は明確な配列に対し特異的である。図１９は、ハイブリッド形成製法が緩衝液中（Ａ）又は一本鎖のウシサイモスＤＮＡの溶液中（Ｂ）で実施される場合のｐｏｌｙ〔Ｃ〕膜に対するボルタンメトリーを比較する。図１９は目的配列が存在しないとすると、電流増加は得られないことを示す。
【実施例１２】
【０１１２】
　ナイロン改良されたガラス状カーボン電極でのＤＮＡ検出
　図２０はナイロンフィルム上のＤＮＡの固定の前（Ａ）及び後（Ｂ）に取り付けられた該ナイロンフィルムを持つガラス状カーボン電極のサイクリックボルタモグラム（又は”ＣＶ”）を示す。
【０１１３】
　ナイロン膜（ゼータ−プローブ、バイオ−ラッド、８０−１００μｇ／ｃｍ２）は直径およそ５ｍｍで円形状に切断された。形作られたナイロンディスクはガラス状カーボン電極表面を覆い、樹脂スリーブにより位置を保持される。金属錯体のＣＶのみが得られた実験のために、ガラス状カーボン電極は初めに低濃度の塩の、５０ｍＭのＮａ−ホスフェート緩衝液（ｐＨ＝６．８，〔Ｎａ＋〕＝８０ｍＭ）で調整された。ナイロンディスク（ＤＮＡ無し）はその後電極に取り付けられ、４００μｌの２００μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋溶液が電気化学セルの中にピペット注入された。１５分間の平衡時間が電気化学分析の前に用いられた。サイクリックボルタモグラムは２５ｍＶ／ｓｅｃの掃引速度を用いＰＡＲ　２７３Ａポテンシオスタットを使用して取得された。典型的なＤＮＡ実験において、ガラス状カーボン電極は低濃度塩のＮａ−ホスフェート緩衝液中で最初に調整される。ナイロンディスクは水に溶解された５．８ｍＭのウシサイモスＤＮＡの溶液中におよそ５分間浸漬された。ディスクはその後その溶液から移され、適当な位置に保持するようにスリーブを使用してガラス状カーボン電極に配置された。４００μｌの２００μＭの（Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋溶液が電気化学セル内にピペット注入され、１５分間の平衡時間の後２５ｍＶ／ｓｅｃの掃引速度によりサイクリックボルタモグラムがとられた。
【０１１４】
　以上の記載は本発明の説明であり、それを限定するものとして解すべきものではない。本発明は、そこに含まれるべき請求の範囲の同等物と共に、以下の請求の範囲により範囲が明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ウシサイモスＤＮＡと伴う及び伴わないＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図２】一本鎖（Ｃ）及び相補鎖にハイブリッド形成されたもの（Ａ＆Ｂ）として５’−ＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡの存在下のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図３】本発明の方法を実施するために有用な一の例証となる装置の模式図である。
【図４】所定の塩基が目的核酸上に置かれたＤＮＡの定量的な検出のために特に有益な検出方法の模式図である。
【図５】ｐＨ７の、０．７ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中、２５ｍＶ／ｓの掃引速度でのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋（２５μＭ）のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図６】イノシン及びグアニンの構造が図中に示される、（Ａ）Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋（２５μＭ），（Ｂ）イノシン５’−モノフォスフェート（０．３ｍＭ）を伴うＲｕ（ｂｐｙ）３２＋（２５μＭ）、及び（Ｃ）グアノシン５’−モノフォスフェート（０．３ｍＭ）を伴うＲｕ（ｂｐｙ）３２＋（２５μＭ）のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図７】所定の塩基が末端トランスフェラーゼの伸長生成物上にある図４の発明の代替の実施例を模式図である。
【図８】サンドイッチ分析形式で実施された図４の発明の代替となる実施例の模式図である。
【図９】本発明の方法を実施するのに有用な超小型電位装置の上面図による模式図である。
【図１０】図９に示された装置の一部の側面図である。
【図１１】緩衝液浸漬ナイロンでのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋（２００μＭ）、高濃度の塩（７００ｍＭの添加ＮａＣｌ）緩衝液中のＤＮＡ吸収ナイロンでのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋（２００μＭ）、及び低濃度の塩（即ち、ＮａＣｌ未添加）緩衝液中のＤＮＡ吸収ナイロンでのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋（２００μＭ）の、ナイロン改良されたＩＴＯ電極を使用したサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図１２Ａ】緩衝液中又はＤＮＡ中に浸漬されたナイロン改良ＩＴＯ電極を使用したＯｓ（ｂｐｙ）３２＋（２００μＭ）のサイクリックボルタモグラムである、７００ｍＭの添加されたＮａＣｌを伴うサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図１２Ｂ】緩衝液中又はＤＮＡ中に浸漬されたナイロン改良ＩＴＯ電極を使用したＯｓ（ｂｐｙ）３２＋（２００μＭ）のサイクリックボルタモグラムである、ＮａＣｌ未添加のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図１３】緩衝液浸漬ナイロンでのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋（２００μＭ）、高濃度の塩（７００ｍＭの添加ＮａＣｌ）緩衝液中のｔＲＮＡ吸収ナイロンでのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋（２００μＭ）、及び低濃度の塩（即ち、ＮａＣｌ未添加）緩衝液中のｔＲＮＡ吸収ナイロンでのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋（２００μＭ）のサイクリックボルタモグラムを示す、ナイロン改良されたＩＴＯ電極でのサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図１４】掃引速度が２５ｍＶ／ｓである、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋（２５μＭ）単独及びｎ＝１（Ｇ），２（ＧＧ），又は３（ＧＧＧ）である５’−ＡＡＡＴＡＴＡＧｎ　ＴＡＴＡＡＡＡ（鎖中１００μＭ）を伴うもののサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図１５】掃引速度が２５ｍＶ／ｓである、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋（２５μＭ）単独及びｎ＝１，２，又は３である５’−ＡＡＡＴＡＴ（ＡＧＴ）ｎＡＴＡＡＡＡ（鎖中１００μＭ）を伴うもののサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図１６】掃引速度が２５ｍＶ／ｓである、２５μＭのルテニウム（４，４’−ジメチルビピリジン）３２＋（又は”Ｒｕ（４，４’−Ｍｅ２　−ｂｐｙ）３２＋”）単独（一様）並びに５’−ＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡ（ドット）及び５’−ＡＡＡＴＡＴＡＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡ（ダッシュ）を伴うもの（鎖中１００μＭ）のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図１７】曲線（Ａ）が単独のＲｕ（４，４’−Ｍｅ２　−ｂｐｙ）３２＋を表し、曲線（Ｂ）が０．７０ｍＭの６−メルカプトグアノシン　５’−モノホスフェートの存在下でのＲｕ（４，４’−Ｍｅ２　−ｂｐｙ）３２＋を表す、掃引速度が２５ｍＶ／ｓでの、０．７ＭのＮａＣｌを伴う５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中の０．２ｍＭのＲｕ（４，４’−Ｍｅ２　−ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図１８】膜はポリ〔Ｃ〕にしみ込まされ、緩衝液中（Ａ）及びポリ〔Ｇ〕の濃縮溶液中（Ｂ）でハイブリッド形成プロトコルを受ける、ハイボンドＮ＋ナイロン膜が取り付けられたＩＴＯ作用電極での２００μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図１９】膜はポリ〔Ｃ〕にしみ込まされ、緩衝液中〔Ａ〕及び変性ウシサイモスＤＮＡの濃縮溶液中でハイブリッド形成プロトコルを受ける、ハイボンドＮ＋ナイロン膜が取り付けられたＩＴＯ作用電極での２００μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図２０】ＤＮＡ無しのナイロン改良されたガラス状電極（Ａ）又はそのナイロンフィルムへのＤＮＡの吸収の後（Ｂ）での、２００μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のサイクリックボルタモグラム（掃引速度＝２５ｍＶ／ｓ）を示すグラフである。
【図１】
2004117371.tif 000007
【図２】
2004117371.tif 000008
【図３】
2004117371.tif 000009
【図４】
2004117371.tif 000010
【図５】
2004117371.tif 000011
【図６】
2004117371.tif 000012
【図７】
2004117371.tif 000013
【図８】
2004117371.tif 000014
【図９】
2004117371.tif 000015
【図１０】
2004117371.tif 000016
【図１１】
2004117371.tif 000017
【図１２Ａ】
2004117371.tif 000018
【図１２Ｂ】
2004117371.tif 000019
【図１３】
2004117371.tif 000020
【図１４】
2004117371.tif 000021
【図１５】
2004117371.tif 000022
【図１６】
2004117371.tif 000023
【図１７】
2004117371.tif 000024
【図１８】
2004117371.tif 000025
【図１９】
2004117371.tif 000026
【図２０】
2004117371.tif 000027