(57)【要約】      （修正有）【課題】卵アレルギー患者が摂取してもアレルギー症状を引き起こし難い、低アレルゲン化卵白およびその製造方法を提供する。【解決手段】本発明の低アレルゲン化卵白は、ＥＬＩＳＡ法によって測定された未変性オボムコイドの含有割合が、鶏卵の生卵白の２０／１０００以下である。該低アレルゲン化卵白の製造方法は、固形分濃度が０．２〜３％で、かつｐＨ１０〜１１．５に調整した卵白水溶液を、８０℃以上で加熱処理する方法である。上記卵白水溶液は卵白を噴霧乾燥又は凍結乾燥して得られた乾燥卵白を水で希釈して得てもよい。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＬＩＳＡ法によって測定された未変性オボムコイドの含有割合が、鶏卵の生卵白の２０／１０００以下である、低アレルゲン化卵白。
【請求項２】
請求項１において、
前記未変性オボムコイドの含有割合が、ＥＬＩＳＡ法によって測定される抗オボムコイド・ポリクローナル抗体と反応する未変性オボムコイドの含有割合である、低アレルゲン化卵白。
【請求項３】
請求項１または２において、
鶏卵の生卵白と比較して、変性オボムコイドの含有割合が増加している、低アレルゲン化卵白。
【請求項４】
固形分濃度が０．２〜３％で、かつｐＨを１０〜１１．５に調整した卵白水溶液を、８０℃以上で加熱処理すること、を含む、低アレルゲン化卵白の製造方法。
【請求項５】
請求項４において、
前記卵白水溶液は、卵白を噴霧乾燥または凍結乾燥して得られた乾燥卵白を水で希釈して固形分濃度を０．２〜３％とした後、ｐＨを１０〜１１．５に調整して得られる、低アレルゲン化卵白の製造方法。
【請求項６】
請求項４において、
前記卵白水溶液は、卵白にアルカリ性のｐＨ調整剤を添加した後、噴霧乾燥または凍結乾燥して、前記ｐＨ調整剤と乾燥卵白との混合物を作製し、前記混合物を水で希釈して固形分濃度を０．２〜３％に調整することにより得られ、
前記ｐＨ調整剤を、前記卵白水溶液のｐＨが１０〜１１．５となるように添加する、低アレルゲン化卵白の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低アレルゲン化卵白およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
鶏卵は、含有するアミノ酸の組成からも明らかであるように、生体にとって利用効率が高く、非常に良質な蛋白質を含む。しかしながら、その卵白には、例えばオボアルブミンやオボムコイドのような、比較的アレルゲン性の高い蛋白質が６０％以上も含まれている。このため、これらの高アレルゲン性の蛋白質を卵白から確実に除去する方法の開発が求められている。現在までに、卵白中に含まれる高アレルゲン性の蛋白質を低アレルゲン化する処理として、例えば、グルコシダーゼ処理による方法（例えば、特許文献１参照）や、加熱凝固および細砕による洗浄法（例えば、特許文献２参照）が創出されている。
【０００３】
卵白中に含まれるアレルゲン性が高い蛋白質の中でも、オボアルブミンは、比較的容易に加熱凝固しやすく、加熱処理によってアレルゲン性が低下しやすい。これに対して、オボムコイドは、加熱による変性が起こりにくく、卵白を単独で十分に加熱しても、アレルゲンを完全に除去するのは困難である。具体的には、オボムコイドは、１００℃で６０分間加熱処理を行なっても、抗体との反応性は失活しない。
【０００４】
【特許文献１】
特開平７−９９９３６号公報
【特許文献２】
特開平７−２３６４５４号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
すなわち、鶏卵を調理または加工する時に加わる熱によって、オボムコイドのアレルゲン性を低下させることは困難である。このため、食物アレルギー患者（特に卵アレルギー患者）にとって、卵白は未だに利用し難い食品である。すなわち、卵アレルギー患者は、日常生活において、卵白を含まない食品を選択して摂食しなければならない。しかしながら、卵白は、加工食品をはじめとする多くの食品に使用されている。このため、卵アレルギー患者が摂食できる食品の範囲は限られてしまう。
【０００６】
さらに、卵白は食品のみならず、化粧品の原料としても使用される。このため、摂食からだけでなく、皮膚等から卵白の成分が吸収されることによっても、アレルギー反応が生じる。このため、食品のみならず、化粧品や薬品の原料として用いられる卵白についても、低アレルゲン化されていることが望ましい。
【０００７】
特に、近年では、アレルギー患者の数は増加しており、低アレルゲン化された卵白の開発がより強く求められるようになってきている。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、卵アレルギー患者が摂取してもアレルギー症状を引き起こし難い、低アレルゲン化卵白およびその製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の低アレルゲン化卵白は、ＥＬＩＳＡ法によって測定された未変性オボムコイドの含有割合が、鶏卵の生卵白の２０／１０００以下である。
【００１０】
「ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法」とは、酵素免疫測定法ともいい、一般に、抗原または抗体に共有結合で酵素を標識して、抗体または抗原の存在を、酵素反応を利用して検出する方法である。
【００１１】
また、本願において、変性していないオボムコイドを「未変性オボムコイド」とし、本発明の低アレルゲン化卵白の製造方法により変性したオボムコイドを「変性オボムコイド」とする。また、本願において、単に「オボムコイド」という場合、未変性のオボムコイドをいうものとする。
【００１２】
本発明の低アレルゲン化卵白によれば、卵アレルギー患者が摂取してもアレルギー症状を引き起こし難く、かつ安全性が高い。ここで、「未変性オボムコイドの含有割合」は、希釈されていない卵白中における未変性オボムコイドの含有割合をいう。
【００１３】
上記本発明の低アレルゲン化卵白においては、前記未変性オボムコイドの含有割合が、ＥＬＩＳＡ法によって測定される抗オボムコイド・ポリクローナル抗体と反応する未変性オボムコイドの含有割合であることができる。
【００１４】
ここで、上記本発明の低アレルゲン化卵白においては、鶏卵の生卵白と比較して、変性オボムコイドの含有割合が増加している。
【００１５】
また、本発明の低アレルゲン化卵白の製造方法は、固形分濃度が０．２〜３％で、かつｐＨを１０〜１１．５に調整した卵白水溶液を、８０℃以上で加熱処理すること、を含む。なお、本願において、固形分濃度の単位「％」は、「％（ｗ／ｖ）」のことをいうものとする。
【００１６】
本発明の低アレルゲン化卵白の製造方法によれば、簡便な方法にてかつ短時間で低アレルゲン化処理を完了することができる。また、ｐＨの調整に要するアルカリ性のｐＨ調整剤が少量ですむため、生産コストを低減することができる。
【００１７】
ここで、上記製造方法において、前記卵白水溶液は、卵白を噴霧乾燥または凍結乾燥して得られた乾燥卵白を水で希釈して固形分濃度を０．２〜３％とした後、ｐＨを１０〜１１．５に調整して得ることができる。また、ここで、上記製造方法において、前記卵白水溶液は、卵白にアルカリ性のｐＨ調整剤を添加した後、噴霧乾燥または凍結乾燥して、前記ｐＨ調整剤と乾燥卵白との混合物を作製し、前記混合物を水で希釈して固形分濃度を０．２〜３％に調整することにより得られ、前記ｐＨ調整剤を、前記卵白水溶液のｐＨが１０〜１１．５となるように添加することができる。
【００１８】
なお、本願において、「乾燥卵白」とは、噴霧乾燥または凍結乾燥によって乾燥させた卵白をいう。
【００１９】
鶏卵を割卵し、卵黄を分離して得られる生卵白中には炭酸ガスが溶存している。この生卵白をそのまま噴霧乾燥または凍結乾燥すると、溶存していた炭酸ガスを除去することができる。この乾燥卵白を、固形分濃度が０．２〜３％となるように水で希釈して得られた卵白水溶液は、ｐＨが９．５〜１０とアルカリ性の特性を有する。これは、噴霧乾燥または凍結乾燥の段階で炭酸ガスが除去されるため、乾燥卵白がアルカリ性に傾くことに起因する。したがって、前記乾燥卵白を用いることにより、前記卵白水溶液のｐＨの調整に要するアルカリ性のｐＨ調整剤の量をより少なくすることができる。よって、生産コストのさらなる低減を図ることができる。
【００２０】
本発明の低アレルゲン化卵白は、食品原料，化粧品材料，ならびに薬品材料として適用可能である。また、卵白を含む食材を加熱調理する際に、本発明の低アレルゲン化卵白の製造方法を適用することにより、本発明の低アレルゲン化卵白を含む食品を製造することができる。
【００２１】
例えば、卵白を含む食材を加熱調理して食品を製造する場合、加熱対象となる食材中に、アルカリ性のｐＨ調整剤を添加してｐＨを１０〜１１．５に調整して加熱調理する。これにより、加熱調理中に、食材中の卵白に含まれる未変性オボムコイドが変性する。すなわち、この場合、加熱調理中に卵白中の未変性オボムコイドの含有割合を低減することができる。その結果、本発明の低アレルゲン化卵白を含む食品を得ることができる。この場合、卵白を調味料として用いる場合も含まれる。なお、アルカリ性のｐＨ調整剤を添加しなくても、卵白を含む食材がｐＨ１０〜１１．５であれば、アルカリ性のｐＨ調整剤を使用しなくてもよい。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２３】
本実施の形態の低アレルゲン化卵白の製造方法は、固形分濃度が０．２〜３％で、かつｐＨを１０〜１１．５に調整した卵白水溶液を、８０℃以上で加熱処理することにより、低アレルゲン化卵白を得ること、を含む。この方法によれば、卵白中のオボムコイドを変性させることにより、卵白のアレルゲン性を低下させることができる。したがって、この方法によって得られた低アレルゲン化卵白は、鶏卵の生卵白と比較して、変性オボムコイドの含有割合が増加している。
【００２４】
［低アレルゲン化卵白の製造方法］
本発明の低アレルゲン化卵白を得るためには、まず、原料の卵白を用意する。卵白は、鶏卵等を割卵し、卵黄を分離して得られる生卵白のほか、生卵白を噴霧乾燥または凍結乾燥して得られた乾燥卵白、冷凍卵白を解凍したもの、あるいはリゾチームを除去した卵白であってもよい。
【００２５】
まず、卵白に水を加えて希釈し、卵白水溶液を作製する。生卵白は通常、固形分濃度が約１０％である。よって、本願においては、生卵白の固形分濃度を約１０％として、固形分濃度を換算した。
【００２６】
ここで、卵白水溶液中における固形分濃度は、０．２〜３％であることが望ましく、１〜３％であることがより望ましい。この卵白水溶液において、固形分濃度が３％を超えると、加熱処理を行なった場合、卵白水溶液中で凝固が起こりやすく、これにより、ＥＬＩＳＡ法を用いた評価が難しくなることが懸念される。また、長時間の加熱処理によって、卵白水溶液中において変色や異臭が発生しやすくなる。
【００２７】
乾燥卵白から卵白水溶液を調製する場合も、生卵白から卵白水溶液を調製する場合と同様の固形分濃度に調整される。したがって、乾燥卵白に水を添加して卵白水溶液を調製する場合は、生卵白から卵白水溶液を調製する場合よりも、希釈に必要な水の量が多くなる。
【００２８】
次いで、この卵白水溶液のｐＨを調整する。ここで、卵白水溶液のｐＨは、１０〜１１．５であることが望ましく、１１〜１１．５であることがより望ましい。ｐＨが１０未満であると、オボムコイドのアレルゲン性を十分低下させることができない。一方、ｐＨが１１．５を超えると、加熱の際に臭いが生じる場合がある。
【００２９】
ｐＨの調整は、アルカリ性のｐＨ調整剤を添加することによって行なう。ここで、安全性の観点から、食品で許容されるアルカリ性のｐＨ調整剤を使用することが望ましい。使用可能なアルカリ性のｐＨ調整剤は特に限定されないが、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸三ナトリウム等のアルカリ性のｐＨ調整剤を用いることができる。また、アルカリ性のｐＨ調整剤は、水溶液の形態で添加してもよいし、あるいはそのまま卵白水溶液に添加してもよい。あるいは、卵白にアルカリ性のｐＨ調整剤を添加した後、噴霧乾燥または凍結乾燥して、このｐＨ調整剤と乾燥卵白との混合物を作製し、次いで、前記混合物を水で希釈した後、ｐＨを１０〜１１．５（より望ましくは１１〜１１．５）に調整することにより、卵白水溶液を作製してもよい。
【００３０】
次いで、ｐＨを１０〜１１．５に調整された卵白水溶液を、８０℃以上にて加熱する。加熱温度が８０℃未満であると、オボムコイドを十分変性させることができないため、卵白のアレルゲン性を十分低下させることができない。また、加熱時間は３〜３０分間が望ましく、３〜１０分間がより望ましい。加熱時間が３分間未満であると、オボムコイドを十分変性させることができないため、卵白のアレルゲン性を十分低下させることができない。一方、３０分間を超えて加熱すると、卵白の風味が損なわれるおそれがある。
【００３１】
また、必要となる加熱時間は、ｐＨがある程度の影響を及ぼす。例えば、卵白水溶液のｐＨが１１．０〜１１．５の間にある場合、加熱時間は３〜５分間がより望ましく、ｐＨが１０〜１１．０の間にある場合、加熱時間は５〜１０分間がより望ましい。
【００３２】
以上の工程により、低アレルゲン化卵白の水溶液が得られる。
【００３３】
なお、得られた低アレルゲン化卵白の水溶液中に、若干の凝集物が析出することがある。この場合、必要に応じて、遠心分離法等を用いて、製品から凝集物を除去することが望ましい。
【００３４】
また、必要に応じて、得られた低アレルゲン化卵白の水溶液のｐＨを、７〜８に調整する。この卵白水溶液を化粧品や食品等の原料に用いる場合、該卵白水溶液のｐＨを中性に近い値に調整するのが望ましい。ｐＨの調整は、安全性の観点から、食品で許容される酸性のｐＨ調整剤を使用することが望ましい。使用可能な酸性のｐＨ調整剤は特に限定されないが、クエン酸、酢酸等の酸性のｐＨ調整剤を用いることができる。また、酸性のｐＨ調整剤は、水溶液の形態で添加してもよいし、あるいはそのまま卵白水溶液に添加してもよい。なお、この低アレルゲン化卵白の水溶液のｐＨを７〜８に調整した後でも、卵白のアレルゲン性は低下したままであるため、卵白加工品としての産業上の利用分野も広い。
【００３５】
さらに、得られた低アレルゲン化卵白水溶液は、噴霧乾燥または凍結乾燥などによって、粉末状の低アレルゲン化卵白を得ることができる。これにより、低アレルゲン化卵白とそれ以外の成分とを分離することができ、かつ、長期保存性を高めることができる。
【００３６】
［低アレルゲン化卵白］
本実施の形態の低アレルゲン化卵白において、未変性オボムコイドの含有割合は、鶏卵の生卵白に含まれる未変性オボムコイドと、抗オボムコイド・ポリクローナル抗体との結合性を基準にして算出することができる。
【００３７】
具体的には、上記製造方法によって得られた本実施の形態の低アレルゲン化卵白は、ＥＬＩＳＡ法によって測定された、抗オボムコイド・ポリクローナル抗体と反応する未変性オボムコイドの含有割合が、鶏卵の生卵白の２０／１０００以下である。
【００３８】
ここで、卵白中において、抗オボムコイド・ポリクローナル抗体と反応する未変性オボムコイドの含有割合は、抗オボムコイド・ポリクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法によって測定される。以下、ＥＬＩＳＡ法を用いた、卵白水溶液中の未変性オボムコイドの含有割合の測定方法について説明する。
【００３９】
まず、卵白を水で希釈して、所定濃度の卵白水溶液を作製する。次いで、この卵白水溶液に含まれる未変性オボムコイド（抗原）を、例えばポリスチレン製プレートのウエル表面に吸着させて、未変性オボムコイド（抗原）をコーティングする（固相化）。次に、未変性オボムコイドが吸着されていない各ウエルの固相部分に他の抗原や非特異的な抗体が吸着しないように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む緩衝液でブロックする（ブロッキング）。次いで、抗オボムコイド・ポリクローナル抗体（捕捉用抗体）を前記固相化した未変性オボムコイド（抗原）と反応させ、さらにその後、例えばアルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（酵素標識２次抗体）を各ウエルに添加してインキュベートする。その後、未反応抗体などを除去し、標識に使った酵素の触媒作用によって発色する基質を反応させ（発色）、吸光度を測定する。
【００４０】
ここで、抗原である未変性オボムコイドの含有割合が大きいほど、未変性オボムコイド（抗原）と抗オボムコイド・ポリクローナル抗体（捕捉用抗体）との結合体が多く生じる。また、前記結合体の含有割合が大きいほど、酵素標識２次抗体と前記結合体との結合体が多く生じる。
【００４１】
すなわち、未変性オボムコイド（抗原）の含有割合が大きいほど、酵素標識２次抗体による発色の度合いが大きくなり、その結果、吸光値が大きくなる。
【００４２】
一方、変性オボムコイドは、抗体と結合しないため、洗浄により除去される。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例と比較例とを示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、卵白水溶液中の固形分濃度を除き、実施例中、「％」は、特に明示されていない限り「％（ｗ／ｖ）」を示す。
【００４４】
［低アレルゲン化卵白水溶液の作製］
（実施例１）
鶏卵卵白の凍結乾燥粉末を水に再溶解させて、固形分濃度が１％の卵白水溶液を作製した。次いで、炭酸ナトリウム水溶液を添加して、炭酸ナトリウムの濃度がそれぞれ０．１Ｍおよび０．２５Ｍである２種類の卵白水溶液（１），（２）を作製した。ここで、卵白水溶液（１）のｐＨが１１．３であり、卵白水溶液（２）のｐＨが１１．４であることを確認した。
【００４５】
この卵白水溶液（１），（２）をそれぞれ、１００℃で０，３，５，１０分間加熱した後、直ちに水冷して、各低アレルゲン化卵白水溶液（以下、「処理済卵白水溶液」とする）を得た。
【００４６】
（実施例２）
鶏卵生卵白に所定量の炭酸ナトリウム（結晶）を添加して、泡立てないように静かに攪拌することにより、炭酸ナトリウムの濃度が０．１Ｍおよび０．２Ｍである２種類の炭酸ナトリウム含有生卵白（３’），（４’）を作製した。この生卵白（３’），（４’）をそれぞれ凍結乾燥して、炭酸ナトリウムと乾燥卵白との混合物（３”），（４”）を得た。この混合物（３”），（４”）をそれぞれ、固形分濃度が１％となるように水に再溶解させて、２種類の卵白水溶液（３），（４）を作製した。ここで、卵白水溶液（３）のｐＨが１０．５であり、卵白水溶液（４）のｐＨが１１．４であることを確認した。
【００４７】
この卵白水溶液（３），（４）をそれぞれ、１００℃で０，３，５，１０分間加熱した後、直ちに水冷して、各低アレルゲン化卵白水溶液（処理済卵白水溶液）を得た。
【００４８】
（実施例３）
鶏卵生卵白に所定量の炭酸ナトリウム（結晶）を添加して、泡立てないように静かに攪拌することにより、炭酸ナトリウムの濃度が０．１Ｍおよび０．２Ｍである２種類の炭酸ナトリウム含有生卵白（５’），（６’）を作製した。この生卵白（５’），（６’）をそれぞれ、固形分濃度が１％となるように水で１０倍に希釈して、２種類の卵白水溶液（５），（６）を作製した。ここで、卵白水溶液（５）のｐＨが１０．１であり、卵白水溶液（６）のｐＨが１０．３であることを確認した。
【００４９】
この卵白水溶液（５），（６）をそれぞれ、１００℃で０，３，５，１０分間加熱した後、直ちに水冷して、各低アレルゲン化卵白水溶液（処理済卵白水溶液）を得た。
【００５０】
［アレルゲン性の評価］
（実施例４）
（１）抗オボムコイド・ポリクローナル抗体の作製
本実施例の抗オボムコイド・ポリクローナル抗体は、以下のようにして作製した。なお、本実施例では、（株）日本チャールズ・リバーから購入した５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。
【００５１】
まず、０．８ｍｇの精製オボムコイドを１ｍｌの生理的食塩水に溶解させ、この溶液と等量のフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）を加えてよく攪拌し、腹腔内免疫用溶液を調製した。次いで、精製オボムコイドが１匹あたり４０μｇの投与量となるように、この腹腔内免疫用溶液をマウスに腹腔内免疫した。その２週間後に、今度はＣＦＡの代わりに、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）で等濃度に調整した免疫用オボムコイド溶液（１匹あたり４０μｇのオボムコイドに相当する量）をマウスに腹腔内投与した。さらに、２週間後に、等量の精製オボムコイドをＩＦＡと共に腹腔内に追加免疫した。さらに１週間後、マウスの頚動脈より全採血し、定法にしたがって血清を調製し、マウス抗オボムコイド・ポリクローナル抗体を得た。
【００５２】
上記実施例１〜３で得られた各処理済卵白水溶液と、抗オボムコイド・ポリクローナル抗体との結合性評価を、以下に示すＥＬＩＳＡ法に基づいて行った。
【００５３】
（２）卵白水溶液中の未変性オボムコイドの含有割合の測定
次に、ＥＬＩＳＡ法を用いて、卵白水溶液中の未変性オボムコイドの含有割合を測定した。
【００５４】
まず、測定対象である実施例１〜３の各処理済卵白水溶液を、予め０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ：７．２）にて希釈し、測定サンプルを作製した。ここで、実施例１，２で得られた各処理済卵白水溶液（凍結乾燥処理をしたサンプル）は、１００倍に希釈し、実施例３で得られた各処理済卵白水溶液は、１０００倍に希釈することにより、各サンプルにおける固形分濃度がいずれも約０．０１％になるように調製した。また、各サンプルのｐＨは７〜８であった。
【００５５】
次いで、９６ウエルのポリスチレン製プレート（製品名マキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ），ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製）の各ウエルに１００μｌずつ各測定サンプルを入れ、プレート上面をシールして４℃で一晩静置した（固相化）。その後、各ウエル中の測定サンプルを廃棄した後、０．２％アジ化ナトリウム含有０．０５％ツイーン２０−ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液）を用いて各ウエル内を３回洗浄した。さらに、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを各ウエルに２００μｌずつ入れて、室温で１時間静置した（ブロッキング）。その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液を用いてウエル内を４回洗浄した。次いで、本実施例で得られたマウス抗オボムコイド・ポリクローナル抗体を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で７，０００，０００倍に希釈して得られた抗体溶液を、各ウエルに１００μｌずつ入れ、３７℃で２時間インキュベーションした。次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液を用いてウエル内を６回洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液でアルカリフォスファターゼ−ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を５，０００倍に希釈したものを、各ウエルに１００μｌずつ入れて、３７℃で２時間インキュベーションした。この後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液を用いてウエル内を６回洗浄した。次いで、０．１％フェニルリン酸二ナトリウム含有ジエタノールアミン緩衝液を、各ウエルに１００μｌずつ入れて遮光して室温で３０分間反応させた後、各ウエルに５ＮＮａＯＨ水溶液を２５μｌずつ入れて反応を停止させた。
【００５６】
次に、各ウエルについて、マイクロプレートリーダ（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社製）を用いて、吸光度の測定を行なった。この測定においては、４０５ｎｍと４９０ｎｍの２波長の吸光度を測定し、ＯＤ４０５（４０５ｎｍにおける吸光度）の値からＯＤ４９０（４９０ｎｍにおける吸光度）の値を差し引いた値を、ΔＯＤ４０５とした。このΔＯＤ４０５を、未変性オボムコイドのユニット数算出に用いた。
【００５７】
｛標準曲線｝
本実施例では、測定された卵白水溶液のΔＯＤ４０５から、卵白の水溶液に含まれる未変性オボムコイドの含有割合（ユニット数）を求めるために、標準曲線を用いた。以下、標準曲線の作製方法について説明する。
【００５８】
まず、精製オボムコイド（未変性）を０．０１，０．００５，……ｍｇ／ｍｌと順次希釈して、精製オボムコイドの濃度が異なる複数の水溶液を作製した。次いで、これら複数の水溶液について、前述したＥＬＩＳＡ法によって、ΔＯＤ４０５をそれぞれ求めた。ここで得られた各水溶液のΔＯＤ４０５と、各水溶液中の未変性オボムコイドの濃度とをプロットすることにより、プレ標準曲線（図示せず）を作製した。すなわち、このプレ標準曲線は、ΔＯＤ４０５の値に対する未変性オボムコイドの濃度を示すものである。
【００５９】
次いで、鶏卵の生卵白を、水で１０００倍に希釈して得られた生卵白水溶液（Ａ）（固形分濃度は約０．０１％）について、前述したＥＬＩＳＡ法によってΔＯＤ４０５を求めた結果、得られたΔＯＤ４０５は１．１２０であった。
【００６０】
さらに、ここで得られた生卵白水溶液（Ａ）のΔＯＤ４０５（ΔＯＤ４０５＝１．１２０）から、前記プレ標準曲線を用いて、生卵白水溶液（Ａ）中の未変性オボムコイドの濃度を求めた。
【００６１】
次いで、得られた生卵白水溶液（Ａ）中の未変性オボムコイドの濃度を１０００ユニットとして、上記プレ標準曲線から標準曲線（図１参照）を作成した。すなわち、前記プレ標準曲線において、生卵白水溶液（Ａ）の未変性オボムコイドの濃度を１０００として換算して、「未変性オボムコイドの濃度」を、「未変性オボムコイドのユニット数」へと単位を変換することにより、図１に示す標準曲線を作製した。この標準曲線は、卵白水溶液のΔＯＤ４０５と、水溶液中の未変性オボムコイドのユニット数との関係を示している。
【００６２】
したがって、測定対象となる処理済卵白水溶液のΔＯＤ４０５を求め、このΔＯＤ４０５から、図１に示す標準曲線を参照することにより、測定対象となる処理済卵白水溶液に含まれる未変性オボムコイドのユニット数を求めることができる。
【００６３】
この生卵白水溶液（Ａ）の未変性オボムコイドの濃度を１，０００ユニットとした場合における、各処理済卵白水溶液に含まれる未変性オボムコイドのユニット数を、表１に示した。
【００６４】
【表１】
2004261154.tif 000002
【００６５】
生卵白水溶液（Ａ）中の固形分希釈濃度の度合いが、測定対象の卵白水溶液中の固形分希釈濃度の度合いと等しい場合、生卵白水溶液（Ａ）中の未変性オボムコイドのユニット数と、測定対象の卵白水溶液中の未変性オボムコイドのユニット数との比は、鶏卵の生卵白における未変性オボムコイドの含有割合と、測定対象の卵白水溶液における未変性オボムコイドの含有割合との比に等しい。
【００６６】
例えば、鶏卵の生卵白を、水で１０００倍に希釈して得られた生卵白水溶液（Ａ）中の未変性オボムコイドのユニット数を１０００としたとき、測定対象の卵白を、生卵白水溶液（Ａ）と同程度の固形分濃度に希釈して得られた卵白水溶液中の未変性オボムコイドのユニット数は、２０以下であることが望ましい。この場合、上記方法によって製造された低アレルゲン化卵白は、ＥＬＩＳＡ法によって測定された、抗オボムコイド・ポリクローナル抗体と反応する未変性オボムコイドの含有割合が、鶏卵の生卵白の２０／１０００以下である。
【００６７】
表１によれば、生卵白を凍結乾燥して得られた乾燥卵白を水に溶解させ、さらにアルカリ性のｐＨ調整剤（炭酸ナトリウム）を添加して得られた処理済卵白水溶液（実施例１）、生卵白にアルカリ性のｐＨ調整剤（炭酸ナトリウム）を添加して凍結乾燥させた後水で希釈し、次いで加熱処理を行なうことにより得られた処理済卵白水溶液（実施例２）、および生卵白にアルカリ性のｐＨ調整剤（炭酸ナトリウム）を添加した後水で希釈し、次いで加熱処理を行なうことにより得られた処理済卵白水溶液（実施例３）とも、加熱開始５分後には、未変性オボムコイドのユニット数は、２０ユニット未満になった。
【００６８】
すなわち、図１に示す標準曲線より算出した結果、実施例１〜３の処理済卵白水溶液のうち、５分間加熱したものについては、等濃度の生卵白水溶液（未処理の生卵白水溶液）と比較して、抗オボムコイド・ポリクローナル抗体と反応する未変性オボムコイドの含有割合が２０／１０００以下であった。これにより、各処理済卵白水溶液について、卵白中のオボムコイド由来のアレルゲン性を低減することができた。
【００６９】
以上により、実施例１〜３の低アレルゲン化卵白の製造方法によれば、ｐＨが１０〜１１．５に調整された卵白水溶液に対する加熱処理によって、短時間で卵白中のオボムコイドが変性することにより、卵白のアレルゲン性を低下させることができた。
【００７０】
さらに、実施例１〜３で得られた処理済卵白水溶液に対して、酸性のｐＨ調整剤を用いて中和処理したが、アレルゲン性の低下は確認されなかった。
【００７１】
［ヒト患者血清を用いた抗体との反応性の評価］
（実施例５）
実施例２で得られた処理済卵白水溶液（３），（４）（ともに、１００℃で５分間加熱処理済）を用いて、３人の卵アレルギー患者由来の血清（患者Ａ，Ｂ，Ｃ）中の抗体との反応性を調べた。本実施例において、卵白水溶液とヒト患者血清を用いた抗体との反応性は、前述した実施例４におけるマウス抗オボムコイド抗体との反応性評価と同様に、ＥＬＩＳＡ法にて評価を行なった。
【００７２】
測定するサンプル（未処理の卵白水溶液および加熱した処理済卵白水溶液（３），（４））を、あらかじめ０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）にて１００倍に希釈して、いずれのサンプルにおいても、固形分濃度が約０．０１％（ｗ／ｖ）になるように調製した。なお、このときの各サンプルのｐＨは、７〜８であった。
【００７３】
なお、本実施例において、未処理の卵白水溶液は、凍結乾燥卵白Ｐ−３９（キユーピー（株）製）を水で１％（ｗ／ｖ）に溶解させて調製した。また、処理済卵白水溶液（３），（４）の固形分濃度は、実施例２において前述したように、１％である。
【００７４】
次いで、９６ウエルのポリスチレン製プレート（製品名マキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ），ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製）の各ウエルに、１００μｌずつ各測定サンプルを固形分濃度が０．０１％になるように希釈して入れ、プレート上面をシールして４℃で一晩静置した（固相化）。その後、各ウエル中の測定サンプルを廃棄した後、０．２％アジ化ナトリウム含有０．０５％ツイーン２０−ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液）を用いて各ウエル内を３回洗浄した。さらに、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを各ウエルに２００μｌずつ入れて、室温で１時間静置した（ブロッキング）。その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液を用いてウエル内を４回洗浄した。次いで、本実施例のヒト患者血清をそれぞれ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で１，０００倍に希釈して得られた抗体溶液を、各ウエルに１００μｌずつ入れ、３７℃で２時間インキュベーションした。次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液を用いてウエル内を６回洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液でアルカリフォスファターゼ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を１，０００倍に希釈したものを、各ウエルに１００μｌずつ入れて、３７℃で２時間インキュベーションした。この後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液を用いてウエル内を６回洗浄した。次いで、０．１％フェニルリン酸二ナトリウム含有ジエタノールアミン緩衝液を、各ウエルに１００μｌずつ入れて遮光して室温で３０分間反応させた後、各ウエルに５ＮＮａＯＨ水溶液を２５μｌずつ入れて反応を停止させた。
【００７５】
次に、各ウエルについて、マイクロプレートリーダ（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社製）を用いて、吸光度の測定を行なった。この測定においては、４０５ｎｍと４９０ｎｍの２波長の吸光度を測定し、ＯＤ４０５（４０５ｎｍにおける吸光度）の値からＯＤ４９０（４９０ｎｍにおける吸光度）の値を差し引いた値を、ΔＯＤ４０５とした。このΔＯＤ４０５を、未変性オボムコイドのユニット数算出に用いた。
【００７６】
図２は、本実施例において測定した、卵アレルギー患者の血清中に含まれる抗体と、実施例２の処理済卵白水溶液との反応性を示すグラフである。
【００７７】
図２によれば、それぞれの卵白水溶液は、患者血清によってその抗体との反応性が異なるものの、実施例２で得られた低アレルゲン化処理済卵白水溶液（加熱済）は、未処理の卵白水溶液と比較して、卵アレルギー患者の血清中の抗体との反応性は顕著に（１／２〜１／１０以下に）低下したことがわかる。
【００７８】
［起泡性の評価］
（実施例６）
実施例１〜３で得られた処理済卵白水溶液の起泡性を以下の方法にて検討した。まず、各処理済卵白水溶液２ｍｌをそれぞれ１５ｍｌのポリプロピレン製チューブに入れ、ボルテックスミキサーにて連続３０秒間強く攪拌した。その後、泡立ちの状態を観察した。その結果、いずれの処理済卵白水溶液においても、起泡性について、未処理生卵白水溶液との大きな差異は認められなかった。
【００７９】
以上により、実施例１〜３で得られた処理済卵白水溶液は、固形分濃度が同等の生卵白水溶液と同じ起泡性を有することが確認された。
【００８０】
［熱凝固性の評価］
（実施例７）
実施例１〜３で得られた処理済卵白水溶液の熱凝固性を以下の方法にて検討した。すなわち、各処理済卵白水溶液１ｍｌをそれぞれ１．５ｍｌのマイクロチューブに入れ、このチューブをウォーターバスラックに固定して１００℃の湯浴にて１０分間加熱処理を行なった。その後、直ちに水冷し、卵白の状態を観察した。その結果、各処理済卵白水溶液および未処理の生卵白水溶液の両方とも、凝固は確認されなかった。また、各処理済卵白水溶液について、固形分濃度を３％に調製したものについても、同様に、凝固は確認されなかった。
【００８１】
さらに、各処理済卵白水溶液をそれぞれ０．０２Ｍクエン酸溶液等の酸性溶液でｐＨ７〜８に調整して得られた溶液について、呈味性を調べたところ、通常の卵白水溶液とほぼ変わらなかった。
【００８２】
また、実施例１〜３において、通常の固形分濃度の卵白に対してｐＨの調整を行なうと、１分間加熱しただけで通常の生卵白と同様の熱凝固性を示す。このことから、本発明で調製された処理済卵白水溶液を濃縮して得られた卵白は、生卵白同様の加熱凝固性を有すると思われる。
【００８３】
以上により、実施例１〜３で得られた処理済卵白水溶液は、固形分濃度が同等の卵白水溶液と同様の熱凝固性を有することが確認された。
【００８４】
［シャンプー原料としての利用］
（実施例８）
加熱装置付小型ミキサー内に、実施例１で得られた処理済卵白水溶液を中和後凍結乾燥して得られた乾燥卵白および香料以外の原料を入れ８０℃に加熱した後、同温度で攪拌して均一とした。次に、ゆっくり攪拌しながら冷却し、品温が５０℃以下となったところで上記残りの原料（乾燥卵白および香料）を添加した後、更に攪拌しながら常温まで冷却したところ、透明なシャンプーが得られた。
原料                                        使用量（ｇ）
ラウリル硫酸トリエタノールアミン                  ２５０
Ｎ−ココイルメチルタウリンナトリウム              １００
ラウリル酸ジエタノールアミド                        ３０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド                      ３０
１，３−ブチレングリコール                            ２
デヒドロ酢酸                                          ２
クエン酸                                              ２
香料                                                  ２
乾燥卵白                                            ５０
精製水                                          １０００
得られたシャンプーを用いて、洗髪テストをしたところ、くし通りがよく、しっとり感のあるまとまりやすい髪に仕上げることができた。
【００８５】
［ヘアクリーム原料としての利用］
（実施例９）
実施例２で得られた処理済卵白水溶液を中和後凍結乾燥して得られた乾燥卵白および香料以外の水相の原料を８０℃で加熱溶解させて、予め水相部を調整した。次に、加熱装置付小型ミキサー内に油相の原料を入れ８０℃で加熱溶解させて、油相部を調整した後、同温度で前記油相部を攪拌しながら、前記水相部を徐々に前記油相部に添加して転相乳化を行なった。次に、ゆっくり攪拌しながら冷却し、品温が５０℃以下となったところで、上記水相の残りの原料（乾燥卵白および香料）を添加した後、更に攪拌しながら常温に冷却したところ、延びの良いヘアクリームが得られた。
原料                                        使用量（ｇ）
油相
ポリオキシエチレンソルビタン                      ２０
モノパルミテート                                  １５
ポリオキシエチレンセチルエーテル                  １５
モノステアリン酸グリセリン                          ８
ステアリン酸                                      ２０
ベヘニルアルコール                                １０
流動パラフィン（♯７０）                        ３００
水相
１，３−ブチレングリコール                        ２０
トリエタノールアミン                                ４
メチルパラベン                                      １
ブチルパラベン                                      １
香料                                                １
乾燥卵白                                          ２０
精製水                                        １０００
得られたヘアクリームを用いて、整髪テストをしたところ、潤いのある使用感が得られ、ベトつきなく整髪をすることができた。
【００８６】
［食品原料としての利用］
（実施例１０）
ショートニング２２ｇとグラニュー糖２０ｇとを混合し、水１２ｇおよびバニラフレーバー微量を加えて攪拌した後、薄力粉３６ｇと、実施例３で得られた処理済卵白水溶液を中和後乾燥して得られた乾燥卵白１０ｇとを加えて練らないように混ぜ合わせた。得られた生地を冷蔵庫で３０分間静置した後、円筒状に成形し、冷蔵庫で凍らせた。
【００８７】
次いで、凍った生地を約７ｍｍ幅ずつ等分に切り分けた後、オーブンにて１７０℃で１５分間焼成した後、粗熱を取ってからデシケータ内で完全に冷まして、クッキーを得た。
【００８８】
得られたクッキーを試食してみたところ、歯ごたえが良く、美味であった。
【００８９】
【発明の効果】
本発明の低アレルゲン化卵白は、ＥＬＩＳＡ法によって測定された未変性オボムコイドの含有割合が、鶏卵の生卵白の２０／１０００以下である。これにより、卵アレルギー患者、特に軽度の卵アレルギー患者に対しても、よりアレルギー反応を引き起こしにくい卵白を提供することができる。また、中華料理等に用いられるピータンのｐＨが１１〜１２であることを考慮すると、安全性が高い卵白として期待される。さらに、加熱凝固性および起泡性については、通常の生卵白と同様の特性を有することから、本発明の低アレルゲン化卵白を、応用性の広い食品原料，化粧品材料（例えば、ヘアクリーム原料やシャンプー原料），ならびに薬品材料として利用することができる。
【００９０】
また、本発明の低アレルゲン化卵白の製造方法は、固形分濃度が０．２〜３％で、かつｐＨを１０〜１１．５に調整した卵白水溶液を、８０℃以上で加熱処理すること、を含む。これにより、簡便な方法にてかつ短時間で低アレルゲン化処理を完了することができる。また、添加するアルカリ性のｐＨ調整剤が少量ですむため、生産コストを低減することができる。
【００９１】
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々の形態に変形可能である。
【００９２】
例えば、上記実施形態では、鶏卵中の卵白の低アレルゲン化に関する例を示したが、オボムコイドを含有するものであれば、他の鳥類の卵についても同様に、本発明を適用することができる。これにより、鶏卵の場合と同様に、低アレルゲン化卵白を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例において、未変性オボムコイドのユニット数とΔＯＤ４０５との関係を示す標準曲線の一例である。
【図２】本発明の一実施例において、卵アレルギー患者の血清を用いた抗体との反応性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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