(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＮＡインターフェアレンス（ＲＮＡｉ）によってサイクリンＢ遺伝子の発現を配列特異的に抑制することのできる二本鎖ＲＮＡ、及び細胞周期の異常に起因する種々の疾患の予防及び／又は治療のための医薬の提供。【解決手段】サイクリンＢ遺伝子配列においてＲＮＡｉによる破壊（分解）の標的となる部位を特定し、特定の塩基配列の一部分と相同な塩基配列を含む二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列の塩基番号３３１〜３４９で表される塩基配列と相同な塩基配列を含む、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
長さが３０塩基以下である請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオレチドを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチドを有効成分として含有する細胞周期の異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項５】
細胞周期の異常に起因する疾患が、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患、及び発生異常や染色体異常に基づく疾患から成る群から選択される疾患である、請求項４記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＲＮＡインターフェアレンス（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）によって細胞周期に関与するサイクリンＢ遺伝子の発現を抑制することのできる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチド、該オリゴヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびに細胞周期の異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞周期は、ＤＮＡ複製を行うＳ期、分裂を行うＭ期とそれぞれの準備期であるＧ１，  Ｇ２  期から成る。サイクリンＢは、細胞周期の進行に関与するタンパク質であるサイクリンのうちのひとつである。サイクリンにはこれまでＡからＨの８タイプが知られているが、Ｇ１／Ｓ期に関わるものはＧ１サイクリン（Ｇ１ｃｙｃｌｉｎ）、Ｇ２／Ｍ期に関わるものは分裂サイクリン（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｙｃｌｉｎ）と呼ばれ、それぞれ特異的なサイクリン依存性プロテインキナーゼ（ｃｄｋ）と結合して活性化し、細胞周期を進行させる働きをもつ。近年の研究で、哺乳類細胞では、サイクリンＤ・ｃｄｋ４／６，サイクリンＥ・ｃｄｋ２，サイクリンＡ・ｃｄｋ２，サイクリンＢ・ｃｄｃ２が順に活性化し、これらのサイクリン・ｃｄｋ複合体が細胞周期の進行の中心的役割を担うことが明らかにされた。細胞周期の進行の調節は、これらのサイクリン・ｃｄｋ複合体活性を様々な因子が調節することによって行われている。また、遺伝情報の不具合を検出し、分裂期（Ｍ期）  前に細胞周期を停止するＧ２／Ｍ  チェックポイントは、サイクリンＢ・ｃｄｃ２活性の上昇を抑制することによってなされている。腫瘍の発生は、このサイクリンＢの発現過剰によって惹起される細胞周期の異常が原因と考えられる。ヒトのサイクリンＢをコードする遺伝子の配列は既に公表されているが（ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０３１９６６）、その発現を抑制する制御配列については特定されていない。
【０００３】
一方、多細胞生物の個体又は培養細胞において、特定の遺伝子発現を抑制する方法として、ＲＮＡインターフェアレンス（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）法が知られている。ＲＮＡｉとは、細胞に導入されたＲＮＡが、それと同じ塩基配列を持った遺伝子の発現を抑制する現象をいい、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）を破壊することで発現を抑制するため、遺伝子の機能解析に有効な方法として着目されている。抑制効果は一本鎖ＲＮＡより二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の方が大きく、ＲＮＡｉ効果はプロモーター部分やイントロン部分にはなく、エキソン部分で有効であることが確認されている。ＲＮＡｉは１９８６年に線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）で発見され（Ｆｉｒｅ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１，  ８０６−８１１，  １９９８）、その後ショウジョウバエ（Ｋａｎｎｅｒｄｅｌｌ，  Ｊ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ９５，  １０１７−１０２６，  １９９８）、ゼブラフィッシュ（Ｗａｒｇｅｌｉｕｓ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２６３，  １５６−１６１，  １９９９）、シロイヌナズナ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，  Ｐ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９５，  １３９５９−１３９６４，  １９９８）、トリパノソーマ（Ｎｇｏ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９５，  １４６８７−１４６９２，  １９９８）、ヒドラ（Ｌｏｈｍａｎｎ，  Ｊ．  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ，２１４，  ２１１−２１４，１９９９）、プラナリア（Ｓａｎｃｈｅｚ  Ａｌｖａｒａｄｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９６，  ５０４９−５０５４，  １９９９）などの他の生物種でも認められた。ＲＮＡｉは発見された当初、哺乳動物細胞においては約３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡを細胞内に導入すると、細胞が本来持っている免疫機能によりアポトーシスを起こして細胞が死んでしまうため、哺乳動物細胞での利用は困難であると思われてきた。しかし、近年ではマウス初期胚や哺乳動物培養細胞でもＲＮＡｉが起こり得ることが示され、ＲＮＡｉの誘導機構そのものは哺乳動物細胞にも存在することがわかってきた（非特許文献１参照）。その後、さらに短い（２１〜２３ｂｐ）ｄｓＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）が哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡｉを誘導できることが示された（非特許文献２参照）。ＲＮＡｉによる遺伝子サイレンシング（ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）の原理は、細胞へ導入されたｓｉＲＮＡがマルチ・タンパク質複合体と結合してＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成し、このｓｉＲＮＡ−タンパク質複合体がｓｉＲＮＡと相同性を持つｍＲＮＡに結合し、ＲＩＳＣヌクレアーゼ活性によりｓｉＲＮＡ−ｍＲＮＡの結合部位が切断された結果、標的遺伝子の発現が抑制されるというものである。
【０００４】
アンチセンス法も同じく遺伝子の発現を抑制する方法であり、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）又はＤＮＡを細胞内に導入し、ｍＲＮＡと結合させることによってその転写、及び翻訳を阻害することを原理としている。アンチセンス法では標的遺伝子のｍＲＮＡのある領域に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドがハイブリッド結合することによって遺伝子発現が抑制されるので、元のｍＲＮＡの一本鎖は保存されており、またハイブリッド結合が何らかの理由によりはずれるとその抑制が解除される。これに対し、ＲＮＡｉ法は、標的遺伝子のｍＲＮＡの相同部分を分解（切断）することによって遺伝子発現を配列特異的に抑制するので元のｍＲＮＡは一本鎖ではなくなり、抑制の度合いが高い。しかもＲＮＡｉ法では短い配列（ｄｓＲＮＡでは通常２１〜２３塩基）で制御ができるのでアンチセンス法よりはるかに容易に分子設計できるという点で有利である。しかしながら、標的遺伝子の発現を有意に破壊できる二本鎖ＲＮＡの選択は、これを事前に予測する確立された方法がなく、ＲＮＡｉ法による遺伝子発現抑制技術において大きな障害となっている。例えば、スタートコドンから７５塩基以上下流の最初のＡＡを見つけ、ＡＡに続く配列でＧＣ含量が５０％前後である配列を探索・選択し、その配列が目的遺伝子に対して特異的であることを確認し、実際に目的遺伝子の発現を抑制するかを実験的に確かめてみるという手法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆａｓｍａｃ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｉｒｎａ２．ｈｔｍｌ）など、二本鎖ＲＮＡの選択について幾つかの試みが提案されている。しかしながら、目的とする標的遺伝子により事情が相違し、結局は、試行錯誤による選択によっているのが現状である。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｕｉ−Ｔｅｉ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４７９，  ７９−８２，  ２０００
【非特許文献２】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１，  ４９４−４９８，  ２００１
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、細胞内に導入することによって細胞周期に関与するサイクリンＢ遺伝子の発現を配列特異的に抑制することのできる二本鎖ＲＮＡを提供することにある。本発明のさらなる課題は、細胞周期の異常に起因する種々の疾患のための医薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべき鋭意研究を重ねた結果、サイクリンＢの遺伝子配列においてＲＮＡｉによる破壊（分解）の標的となる部位を特定し、この部位の塩基配列と相同な塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、これを細胞に導入したところ、サイクリンＢが発現しないことを確認できた。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）配列番号１に記載の塩基配列の塩基番号３３１〜３４９で表される塩基配列と相同な塩基配列を含む二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
（２）長さが３０塩基以下である上記（１）の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
（３）上記（１）の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチドを含む発現ベクター。
（４）上記（１）の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチドを有効成分として含有する細胞周期の異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬。
（５）細胞周期の異常に起因する疾患が、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患、及び発生異常や染色体異常に基づく疾患から成る群から選択される疾患である、上記（４）の医薬。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
１．二本鎖ＲＮＡオリゴヌレオチド
本発明の「二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド」（以下、単に二本鎖ＲＮＡという場合もある）はサイクリンＢの遺伝子配列に存在するＲＮＡｉによる破壊（分解）の標的部位の塩基配列と相同な塩基配列を有し、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖からなる。標的部位の塩基配列と相同な配列を有する鎖はセンスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖のいずれであってもよいが、通常はセンスＲＮＡ鎖であり、アンチセンスＲＮＡ鎖はセンスＲＮＡ鎖に対して相補である。
ここで、「相同」とはＴ（チミン）がＵ（ウラシル）となる以外は完全に同一であることをいう。
【００１０】
本発明において、サイクリンＢ遺伝子配列中のＲＮＡｉによる破壊（分解）の標的部位の決定は、登録されているサイクリンＢ遺伝子の配列情報に基づいて候補となる２０〜２５塩基の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチド（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）を幾つか設計し、これらのｓｉＲＮＡのサイクリンＢ遺伝子発現抑制を調べることによって行う。具体的には、サイクリンＢをコードする遺伝子が存在する転写翻訳系に該ｓｉＲＮＡを添加してサイクリンＢの発現抑制を調べるか、又はサイクリンＢをコードする遺伝子に対応するｍＲＮＡが存在する系に該ｓｉＲＮＡを添加して、サイクリンＢの発現抑制を調べる。サイクリンＢ遺伝子の塩基配列は既に知られており、例えばヒトサイクリンＢは、ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０３１９６６の配列情報が利用できる。
【００１１】
ｓｉＲＮＡの設計は、標的遺伝子により異なるが、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｍａｃ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｉｒｎａ３．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｂｉｏｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ／ａｐｐ−ｓｉｒｎａ．ｓｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｐｉｂｐｃ．ｇｗｄｇ．ｄｅ／ａｂｔｅｉｌｕｎｇｅｎ／１００／１０５／ｓｉｒｎａ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｄｅｓｉｇｎ．ｈｔｍｌに記載のプロトコル等を参照して行うことができる。
【００１２】
これまでに報告されるｓｉＲＮＡの一般的な設計方法は、スタートコドンから７５塩基以上下流の最初のＡＡを見つけ、ＡＡに続く配列でＧＣ含量が５０％前後である配列を探索・選択し、その配列が目的遺伝子に対して特異的であることを確認し、実際に目的遺伝子の発現を抑制するかを実験的に確かめるという工程からなる。
また、目的遺伝子に対して特異的であることの確認は、可能性のある標的部位の塩基配列、即ち選択したｓｉＲＮＡ塩基配列をデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）と比較し、他のどの遺伝子とも顕著な相同性を有しないことを確かめることによって行う。相同性検索は、例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｈｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を用いることができる。
【００１３】
しかしながら、上記の一般的な方法に従うと、本発明の対象であるサイクリンＢ遺伝子にあっては、ＡＡに続く起点として、配列番号１に示す塩基配列における２７８，２８５，２９７，３０５，３２７位の塩基など、数多くの塩基を起点する配列が候補となる。従って、実際にはこれらの候補から細胞内にタンパク質が発現されていないかに関して細胞生物学的な実験を行って絞り込むという試行錯誤を繰り返す必要がある。
【００１４】
また、完全なｓｉＲＮＡ実験のために適当なネガティブコントロールｓｉＲＮＡも含めることが好ましい。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡとしては、設定したｓｉＲＮＡと同じ塩基組成を有するが、ゲノムに対して顕著な配列相同性がないオリゴヌクレオチドが用いられる。典型的にはｓｉＲＮＡの塩基配列をランダムに並び換え、相同性検索をして他のどの遺伝子に対しても相同性がないことを確認することによって設計する。
【００１５】
上記のようにして設計された本発明の二本鎖ＲＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列の塩基番号３３１〜３４９で表される塩基配列（５’−ＧＴＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧ−３’）と相同な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の二本鎖ＲＮＡは、上記の１９塩基からなる配列を少なくとも含んでいればこれに任意の塩基が付加されていてもよい。しかしながら、創薬の簡便性又は生体内に投与した場合の安定性の観点から、長さが３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、さらに好ましくは２３塩基以下であることが好ましい。
【００１７】
本発明の二本鎖ＲＮＡを構成する少なくとも一つの鎖は１〜６塩基、好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは２〜４塩基の３’オーバーハング（代表的にはＴＴ）を有する。
【００１８】
本発明の二本鎖ＲＮＡは、上記で設計したｓｉＲＮＡの塩基配列に基づいてＲＮＡオリゴヌクレオチド（センスＲＮＡ鎖、アンチセンス鎖）を合成し、それらをアニーリングすることによって作成できる。二本鎖ＲＮＡを構成するセンスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖の合成は、例えば市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて一般的な方法で行うことができる。合成方法としては、例えば、ホスホロアミダイト法、ハイドロジェンホスフォネート法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法が挙げられる。また、合成したＲＮＡ鎖の精製も常法に従うことができ、例えば、通常の高速液体クロマトグラフィーやポリアクリルアミドゲル電気泳動、溶媒抽出、塩析等による方法を適宜採用することができる。
【００１９】
アニーリングは、合成したＲＮＡ鎖一組（センスＲＮＡ鎖、アンチセンス鎖）をそれぞれｄｓＲＮＡ用アニーリングバッファーに溶解し、等量（等ｍｏｌｅ数）混合し、二本鎖が解離する温度まで加熱し、その後徐々に冷却してインキュベートすることにより行う。アニーリングの条件としては、例えば、９０℃にて１分、続いて３７℃にて１時間が静置することが例示される。その後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈殿を行う。
【００２０】
本発明の二本鎖ＲＮＡオリゴヌレオチドは、大腸菌等を用いて組換え法によって取得することもできる。具体的には、本発明のＲＮＡ鎖の鋳型となるＤＮＡ断片を、大腸菌内でＲＮＡの転写が行われるのに適当なプロモーターの制御下におかれるように連結されたＤＮＡを作成し、このＤＮＡを含む組換えベクターで大腸菌を形質転換して培養し、ＲＮＡの転写を行わせた後に二本鎖ＲＮＡを菌体から取得する。
【００２１】
２．二本鎖ＲＮＡオリゴヌレオチド発現ベクター
本発明の二本鎖ＲＮＡオリゴヌレオチドは、適当な発現ベクターに挿入して標的細胞内で生成させることもできる。
本発現ベクターとして利用しうるベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ、Ｐ１ファージ由来人工染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡなどが挙げられるが、特に長さが短いｐＵＣ系プラスミド（例えば１〜３ｋｂｐ程度）が好ましい。
【００２２】
本ベクターには、プロモーター及び／又はその他の制御配列を機能しうる形で連結して挿入してもよい。「機能しうる形で連結して挿入する」とは、本ベクターが導入される標的細胞において、プロモーター及び／又はその他の制御配列の制御下に上記二本鎖ＲＮＡが発現されて内在性のサイクリンＢ遺伝子における標的部位のｍＲＮＡが破壊（分解）されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。本ベクターに組み込むことが可能なプロモーター及び／又は制御配列は特に限定されるものではなく、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、その他の調節エレメントなど、当技術分野で公知のプロモーター及び／又は制御配列を、導入する標的細胞に応じて適宜選択することができる。上記で用いる適当なプロモーターとは、導入された細胞内でＲＮＡの転写が行われるようなものであれば特に制限はないが、好ましくは特定条件下でのみ発現誘導をかけられるような、Ｔｅｔ誘導プロモーター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、Ｅｃｄｙｓｏｎｅ誘導プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩＰＴＧ誘導プロモーター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が挙げられる。
上記のようにして作製された発現ベクターは、標的細胞に導入されるとｓｉＲＮＡが発現され、ＲＮＡｉによるサイクリンＢ遺伝子の破壊（分解）が進行する。
【００２３】
上記の方法によって取得された二本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを標的細胞に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、ウイルス法、ＨＶＪ−リポソーム法、リポフェクション法、パーティクルガン法等が用いられる。ＲＮＡ導入効率は細胞の種類によって異なるため、細胞によって導入用（トランスフェクション）試薬、ＲＮＡの量、細胞の密度、導入時間を最適化する必要がある。
【００２４】
二本鎖ＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入した標的細胞は、通常の細胞培養と同様の条件下において培養を行う。また、二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞においては、必要に応じてこの培養中に導入したプロモーターを活性化させる。活性化の方法は、それぞれのプロモーターに適した通常行われる方法で行うことができる。培養条件は、使用した細胞に適した条件で行い、培養時間は、該細胞に導入した二本鎖ＲＮＡが充分量転写される時間行う。
【００２５】
二本鎖ＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入した標的細胞におけるサイクリンＢ遺伝子の発現解析は、抗体による免疫蛍光染色、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法等によって行うことができる。
ここで、標的細胞としては、哺乳動物由来の培養細胞が好適に用いられる。具体的には、ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）、ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣｌ−１）、アフリカミドリザルＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、イヌＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−３４）、マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９６５１）、ラットＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）等が挙げられる。
【００２６】
３．細胞周期の異常に起因する疾患の予防及び／又は治療用医薬
本発明の二本鎖ＲＮＡは、サイクリンＢの発現を抑制するものであるため、細胞周期の異常に起因すると考えられている疾患、例えば癌、自己免疫疾患、神経変性疾患、発生異常や染色体異常に基づく疾患等の予防及び／又は治療の医薬として有効である。癌としては、例えば胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮癌、脳腫瘍、骨肉種、又は骨髄腫瘍等が、自己免疫疾患としては、例えば慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、甲状腺炎、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、ベーチェット病、バセドー病等が、神経変性疾患としては、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病等が挙げられる。また、発生異常や染色体異常に基づく疾患としては、例えば遺伝子病、配偶子病、胎芽病、胎児病流産、Ｄｏｗｎ症候群、Ｔｕｒｎｅｒ症候群等が挙げられる。上記の疾患はあくまで例示でありこれらに限定されるものではない。本発明の医薬は、上記疾患の発症を予防することを目的として、あるいは上記疾患を発症した患者に対しては症状の悪化の防止又は症状の軽減などを目的として投与することができる。
【００２７】
本発明の二本鎖ＲＮＡを医薬として用いる場合、細胞への取り込みの促進や標的細胞への指向性を高める目的で、ウイルス性又は非ウイルス性の遺伝子導入用ベクターに担持させた形態とする。ウイルス性ベクターとしては、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター等が挙げられる。また、非ウイルス性ベクターとしては、リポソーム、人工脂質ベシクル、デンドリマーなどの高分子化合物等が挙げられる。この場合、市販の導入用試薬（リポフェクチン、リポフェクトアミン、ＤＭＲＩＥ−Ｃ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ、ＤＯＴＡＰ（ＢｉｏＴｅｘ社製）、Ｔｆｘ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等が利用できる。また、本発明の医薬は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することもできる。
【００２８】
遺伝子治療の形態としては、標的細胞を体外に取り出して遺伝子導入を行う体外法（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）、体内に遺伝子を導入する体内法（ｉｎ  ｖｉｖｏ法）があるが、本発明の医薬はいずれの治療形態にも適用される。体外法では患者由来の細胞を一旦体外で培養し、本発明の二本鎖ＲＮＡの導入処理をした後に患者に投与すればよいし、体内法では上記の遺伝子導入ベクターを直接患者体内（皮膚、筋肉、肝臓、肺など）へ投与すればよい。
【００２９】
本発明の医薬の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、特に癌治療を目的とする場合は、癌原病巣に対して又は癌種に対応した予想転移部位に対して局所注射等の局所投与を行うことが好ましい。
【００３０】
本発明の医薬の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日あたり二本鎖ＲＮＡの重量にして約  ０．１〜１００  ｍｇの範囲が適当である。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）ｓｉＲＮＡの調製
ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０３１９６６に開示されるヒトサイクリンＢ遺伝子の塩基配列（配列番号１）からＲＮＡｉの標的配列を想定し、下記表１に示すｓｉＲＮＡの候補となるＲＮＡオリゴヌレクチド（Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１−１〜Ｂ１−８）のセンスＲＮＡ鎖（センスｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ鎖（アンチセンスｓｉＲＮＡ）をそれぞれ自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（株式会社日本バイオサービス社製）にて合成した。合成したオリゴヌレクオチドは通常の方法に従って逆相高速液体クロマトグラフィーにて単離精製し、ＲＮＡサンプルを得た。センスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖をそれぞれ含む各ＲＮＡサンプルを５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）に希釈し、時々氷につけながらボルテックスミキサーを使い、浮遊物がなくなるまで十分に溶解した。各ＲＮＡサンプルを３０μｌと、５×アニーリングバッファー（５００ｍＭ酢酸カルシウム、１５０ｍＭ    ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ＰＨ７．４、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム）１５μｌを混合した（全量７５μｌ）。溶液を９０℃で１分間加熱し、スピンダウン後に３７℃で６０分間静置した。二本鎖のＲＮＡオリゴヌクレオチドが得られた（最終濃度は２０μＭ（２０ｐｍｏｌ／μｌ））。
【００３３】
【表１】
2004261026.tif 000002
2004261026.tif 000003
【００３４】
（実施例２）  ｓｉＲＮＡによるサイクリンＢ発現解析試験
（１）方法
トランスフェクションする１日前にヒトＨｅｌａ細胞を３．５ｃｍプレートに播いた。細胞量は２０〜５０％コンフルエントになるようにした。細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で洗浄した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を８００μｌ加えた。
実施例１で調製した２０μＭのｓｉＲＮＡ（Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１−１〜Ｂ１−８）各１０μｌにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１７０μｌを加え、ｓｉＲＮＡ溶液を調製した。ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１６μｌで希釈し、室温で５分から１０分間静置し、トランスフェクション試薬を調製した。このトランスフェクション試薬に上記ｓｉＲＮＡ溶液を加え、穏やかに混合し、室温で１５〜２０分間静置した。得られたｓｉＲＮＡ−ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＩＮＥ混合液を上記培養細胞に加え（全量１ｍｌ）、軽く混合し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養後、血清を３００μｌ加え、０、１、３日目にサイクリンＢ抗体による蛍光染色にて細胞内における目的遺伝子の発現を観察した。また、抗体による蛍光染色の対染色としてＤＡＰＩによる核染色も同時に行った。
【００３５】
（２）結果
図１は、ｓｉＲＮＡ導入細胞（ｓｉＲＮＡ＋）、ｓｉＲＮＡ非導入細胞（ｓｉＲＮＡ−）について、サイクリンＢ抗体による蛍光染色及びＤＡＰによる核染色を行った結果を示す。
ＣｙｃｌｉｎＢ１−５（配列番号１に記載の塩基配列の塩基番号３３１〜３４９で表される塩基配列を標的部位とするｓｉＲＮＡ）導入細胞は、１日目でサイクリンＢ抗体による蛍光染色が観察されなかった。また、同導入細胞におけるＤＡＰＩによる核染色によれば、蛍光染色が観察されない部位にも細胞が確かに存在していることがわかる。
従って、ＣｙｃｌｉｎＢ１−５導入細胞ではサイクリンＢの発現が抑制されていることが確認された。これに対し、ｓｉＲＮＡ非導入細胞（ｓｉＲＮＡ−）、ＣｙｃｌｉｎＢ１−７（配列番号１に記載の塩基配列の塩基番号４３１〜４４９で表される塩基配列を標的部位とするｓｉＲＮＡ）導入細胞は、サイクリンＢ抗体による蛍光染色が観察され、サイクリンＢの発現が認められた。従って、ＣｙｃｌｉｎＢ１−５はサイクリンＢ発現の抑制効果があるが、ＣｙｃｌｉｎＢ１−７はその抑制効果がないといえる。また、ＣｙｃｌｉｎＢ１−１，  １−２，  １−３，  １−４，  １−６，  １−８導入細胞についてもＣｙｃｌｉｎＢ１−７導入細胞同様にサイクリンＢの発現が認められ、サイクリンＢの発現抑制効果がないことを確認した。
【００３６】
図２は、時系列（０日目、１日目、３日目）における細胞数の増加状況を示す。図２で、コントロール（ｓｉＲＮＡ非導入細胞）は、時間が経過しても２Ｎ（Ｇ１）（以下Ｇ１期と呼ぶ）における細胞数が増加し、４Ｎ（Ｇ２／Ｍ）（以下Ｇ２／Ｍ期と呼ぶ）において減少した。これに対して、ｓｉＲＮＡ（Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１−５）導入細胞細胞は、０日目ではコントロールと同じ細胞数の増減（増減形態が同じ）になっているが、１日目、３日目になるにつれて、コントロールとは逆に、Ｇ１期における細胞数が減少し、逆にＧ２／Ｍ期における細胞数が増加した。これは、１日目、３日目ではＧ２／Ｍ期の本来の処理が行われず、細胞が蓄積している状態、つまり細胞周期が停止状態になっていると考えられる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、ＲＮＡインターフェアレンス（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）によって細胞周期に関与するサイクリンＢ遺伝子の発現を抑制することのできる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチドが提供される。本発明の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチドは、サイクリンＢの発現を有意に抑制できるので、細胞周期の異常に起因する疾患、代表的には癌の予防及び／又は治療のための医薬として有用である。
【００３８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｓｉＲＮＡ処理細胞（ｓｉＲＮＡ＋）、ｓｉＲＮＡ未処理細胞（ｓｉＲＮＡ−）について、サイクリンＢ抗体による蛍光染色及びＤＡＰによる核染色を行った結果を示す。
【図２】時系列（０日目、１日目、３日目）における細胞数の増加状況を示す。
【図１】
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【図２】
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