(57)【要約】【課題】的確な肝細胞癌の検査を実現すること【解決手段】染色体１番ｑ腕領域のコピー数の増幅を検出し、この検出したコピー数の増幅に基づいて、肝細胞癌のサイズの増大度を検査するようにして、肝細胞癌のサイズの増大化に関与する特有の染色体領域である染色体１番ｑ腕領域の異常の有無を、この領域のコピー数の増幅に基づいて解析することができ、この解析に基づいて肝細胞癌の増大度をより客観的かつ的確に検査するようにした方法。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体１番ｑ腕領域のコピー数の増幅を検出し、この検出したコピー数の増幅に基づいて、肝細胞癌のサイズの増大度を検査することを特徴とする染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法。
【請求項２】
染色体８番ｑ腕領域のコピー数の増幅を検出し、この検出したコピー数の増幅に基づいて、肝細胞癌の未分化度を検査することを特徴とする染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法。
【請求項３】
染色体１番ｑ腕領域および染色体６番ｐ腕領域のコピー数の増幅を検出し、これらの検出したコピー数の増幅に基づいて、肝細胞癌の病期を検査することを特徴とする染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法。
【請求項４】
染色体１番ｑ腕、染色体６番ｐ腕および染色体８番ｑ腕の３箇所の染色体領域におけるコピー数の増幅の数すなわち染色体異常指数を検出し、この検出した染色体異常指数に基づいて肝細胞癌を検査することを特徴とする染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、癌の染色体異常解析に基づく検査方法に係り、特に、肝細胞癌の患者から癌組織あるいは癌細胞を採取し、その癌細胞が有する染色体異常すなわち増幅領域または欠失領域を解析した結果に基づいて、癌の病期や悪性度を検査する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高齢化社会が急速に進行する中で、日本人にとって、癌、すなわち悪性新生物や悪性腫瘍による死亡率が最も高く、１９９６年の統計においては第一位の死亡原因となっている。中でも、肝臓および肝内胆管癌による死亡率は、胃癌、気管・気管支癌および肺癌に次いで第三位となっている（社団法人日本肝臓学会編肝がん白書参照）。
【０００３】
さらに、原発性肝癌は、癌細胞が由来する細胞の種類によって、肝細胞癌、肝内胆管癌、その他の癌に大別されるが、その中でも肝細胞癌の頻度が最も高く、約９５％と大半を占めている。
【０００４】
この肝細胞癌は、死亡年齢が若いことが特徴であり、正確な診断とそれに基づく的確な治療が強く求められている。
【０００５】
このような肝癌をはじめとして、一般に癌の診断は、現在のところ組織形態学的検査に基づいて行われており、病理担当医師の経験的ないしは主観的判断に依るところが大きいといえる。
【０００６】
しかし、近年の研究により、遺伝子、あるいは遺伝子がコードされる染色体の増幅や欠失が癌の発生や悪性形質発現に大きく関与することが明かにされてきている。
【０００７】
したがって、癌の表現形質の決定において最も基底をなす染色体の異常に基づいた情報を医療現場に提供することが可能になれば、より客観的かつ的確な癌の検査を実現し得るものと期待される。
【０００８】
これまでにも、例えば、網膜芽細胞腫や、家族性大腸ポリポーシス症、あるいはＬｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群などに代表される家族遺伝性の癌については、それぞれＲｂ遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子が原因遺伝子として特定されており、遺伝子検査によってその発症リスクを知ることも可能となっている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、癌の大半を占める非家族性の散発性癌については、その原因となる染色体領域あるいは遺伝子が複雑多岐にわたり、特定の原因遺伝子を特定することは困難である。
【００１０】
また、癌の種類、すなわち発生臓器、組織または細胞の違いによって染色体異常のパターンは異なり、その上、臓器や組織あるいは細胞がある種の異常を有していたとしても、それが癌化の原因となるかはこれらの臓器等によって全く異なる。
【００１１】
このため、癌の発生、進展の分子メカニズムに関しては未だに不明な点か多く、これまでにおいても、肝細胞癌の染色体の増幅や欠失異常を解析した研究報告はあるものの、肝細胞癌の臨床的進展度を評価し得る結果を得るには至っていない。
【００１２】
したがって、癌の種類ごとに多症例かつ詳細な分子レベルの解析、そして肝細胞癌をはじめとする散発性癌の染色体異常とその臨床情報との関連解析による新たな検査指標の開発が急務とされている。
【００１３】
なお、近年、新たなゲノム解析方法として、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ−Ａ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８，  ８１８−８２１，  １９９２）らによって、ＣＧＨ法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法、比較ゲノムハイブリダイゼーション法）と称される方法が報告された。
【００１４】
このＣＧＨ法によれば、癌細胞の染色体増幅・欠失異常領域を一度の実験操作で、かつ、特異的ＤＮＡプローブやＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを必要とすることなく、全染色体にわたってスクリーニングすることが可能である。
【００１５】
本発明者は、このＣＧＨ法を用いれば、多数の肝細胞癌臨床摘出検体について全染色体にわたる異常領域解析を行うことができ、さらには、その結果と各症例の臨床病態情報との相関関係を調べることによって、肝細胞癌の染色体異常に基づく検査方法への展開が可能であると考えた。
【００１６】
このような観点に基づき、本発明者は更に具体的に研究を進め、６７症例の肝細胞癌患者から提供を受けた癌組織検体を独自にＣＧＨ法によって実際に解析した。
【００１７】
この結果、肝細胞癌の大きさ、細胞分化度、肉眼的ステージといった癌の病期、悪性度の指標に統計的有意な相関性を有する新たな染色体領域を見いだすことに成功した。
【００１８】
そこで、これらの染色体異常を検出することによる肝細胞癌の検査方法を発明するに至った。
【００１９】
本発明は、このような点に鑑みてなされたもので、肝細胞癌に特徴的な病期の進行に関与する染色体領域を見出し、その染色体領域における異常の有無を簡便かつ迅速に解析し、この解析に基づいた肝細胞癌の診断を行うことによって、これまでになされてきた組織形態学的検査に代替あるいは少なくとも補足することができ、より客観的かつ的確な肝細胞癌の検査を実現することができる肝細胞癌の検査方法を提供することを目的とするものである。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため本発明の請求項１に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法の特徴は、染色体１番ｑ腕領域のコピー数の増幅を検出し、この検出したコピー数の増幅に基づいて、肝細胞癌のサイズの増大度を検査する点にある。
【００２１】
そして、この請求項１に係る発明によれば、肝細胞癌のサイズの増大化に関与する特有の染色体領域である染色体１番ｑ腕領域の異常の有無を、この領域のコピー数の増幅に基づいて解析することができ、この解析に基づいて肝細胞癌の増大度をより客観的かつ的確に検査することができる。
【００２２】
請求項２に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法の特徴は、染色体８番ｑ腕領域のコピー数の増幅を検出し、この検出したコピー数の増幅に基づいて、肝細胞癌の未分化度を検査する点にある。
【００２３】
そして、この請求項２に係る発明によれば、肝細胞癌の細胞分化の低分化型への進行に関与する特有の染色体領域である染色体８番ｑ腕領域の異常の有無を、この領域のコピー数の増幅に基づいて解析することができ、この解析に基づいて肝細胞癌の未分化度をより客観的かつ的確に検査することができる。
【００２４】
請求項３に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法の特徴は、染色体１番ｑ腕領域および染色体６番ｐ腕領域のコピー数の増幅を検出し、これらの検出したコピー数の増幅に基づいて、肝細胞癌の病期を検査する点にある。
【００２５】
そして、この請求項３に係る発明によれば、肝細胞癌の病期の進行度（悪性度）に関与する染色体領域である染色体１番ｑ腕領域および染色体６番ｐ腕領域における異常の有無を、これらの領域のコピー数の増幅に基づいて解析することができ、この解析に基づいて肝細胞癌の病期の進行度をより客観的かつ的確に検査することができる。
【００２６】
請求項４に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法の特徴は、染色体１番ｑ腕、染色体６番ｐ腕および染色体８番ｑ腕の３箇所の染色体領域におけるコピー数の増幅の数すなわち染色体異常指数を検出し、この検出した染色体異常指数に基づいて肝細胞癌を検査する点にある。
【００２７】
そして、この請求項４に係る発明によれば、肝細胞癌の悪性度と相関関係を有する染色体異常指数すなわち染色体１番ｑ腕、染色体６番ｐ腕および染色体８番ｑ腕の３箇所の染色体領域のうちのコピー数の増幅の異常を有する領域の数に基づいて、肝細胞癌の悪性度をより客観的かつ的確に検査することができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法の実施形態について、図１を参照して説明する。
【００２９】
以下の第１乃至第４実施形態に示すように、本発明に係る肝細胞癌の検査方法は、特定の染色体領域におけるコピー数の異常を検出し、この検査したコピー数の異常に基づいて肝細胞癌の検査を行うものである。
【００３０】
まず、第１実施形態について説明すると、本第１実施形態においては、染色体１番ｑ腕領域のコピー数の増幅を検出し、この検出したコピー数の増幅に基づいて、肝細胞癌のサイズの増大度を検査する。
【００３１】
このような方法を採るのは、本発明者が、以下に示すようにＣＧＨ法を用いた肝細胞癌の解析を行った結果、染色体１番ｑ腕領域が、肝細胞癌のサイズの増大化の進行に関与する特有の染色体領域であるということが判明したことによるものである。
【００３２】
すなわち、ＣＧＨ法は、解析したい癌細胞、癌組織から抽出したゲノムＤＮＡ、または、癌化しているかどうか調べたい細胞と、対照としての正常細胞ゲノムＤＮＡとを、それぞれ異なる蛍光色素等で標識し、それらを正常細胞のメタフェーズ染色体展開標本に対して競合ハイブリダイズさせることによって、癌細胞での染色体増幅領域欠失領域を一度の実験で全染色体にわたってスクリーニングすることが可能な手法である。
【００３３】
このＣＧＨ法を行うにあたっては、まず、試験ＤＮＡとして、例えば、被験者の手術摘出組織や肝臓組織生検試料から調整したＤＮＡと、対照ＤＮＡとして、例えば、正常細胞ＤＮＡまたは正常細胞を不死化した細胞株ＤＮＡとを用意する。なお、試験ＤＮＡの調整にあたっては、組織切片標本を作製、観察して、正常細胞を除き、癌細胞のみを選択して使用するマイクロダイセクションを行えば、さらに高感度な解析になり得る。また、対照ＤＮＡは、その由来臓器は問わない。
【００３４】
そして、これら試験ＤＮＡおよび対照ＤＮＡに対してニックトランスレーション標識法や、ランダムプライマー標識法などの方法を用いて標識を施すことによって、プローブＤＮＡを合成する。なお、標識としては、蛍光物質や放射性同位元素などを用いることができる。
【００３５】
次に、このように合成したプローブＤＮＡを、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせる。このターゲットＤＮＡは、例えば、スライドガラス上に固定された正常メタフェーズ染色体展開標本や、染色体上の位置が同定されたＤＮＡクローン、あるいは、ＢＡＣやＰ１をベクターとするゲノムＤＮＡクローン等であってもよい。また、スライドガラス上に限らず、メンブレンや繊維状担体や微粒子に固定したＤＮＡをターゲットとしてハイブリダイゼーション反応を生じさせることもできる。
【００３６】
続いて、洗浄操作によって、非特異的な結合をターゲットから除いた後、このターゲットの蛍光強度を、例えば、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー、またはフローサイトメーター等によって測定する。このとき、ターゲットに結合したプローブＤＮＡを電気化学的方法によって定量してもよい。
【００３７】
最後に、試験ＤＮＡと対照ＤＮＡの結合量の比を、標識物質の量、あるいは強度として定量し、試験ＤＮＡが対照ＤＮＡに対してコピー数が増幅あるいは欠失している染色体領域を検出することによって、試験ＤＮＡの染色体異常の情報を得る。
【００３８】
より具体的には、本発明者は、以下の（１）乃至（７）に示す各条件の下で、前記の手順に従ってＣＧＨ法を用いた肝細胞癌の解析を行った。
（１）組織・細胞からのゲノムＤＮＡの調整
合計６７症例の肝細胞癌組織を、手術摘出後にすみやかに液体窒素によって凍結し、使用時まで−８０℃の温度下で冷凍庫内に保存した。各癌組織は、自動核酸抽出装置（ＮＡ−３０００、クラボウ）を用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出精製した。そして、得られたｇＤＮＡは、精製水に溶解し、蛍光ＤＮＡ定量装置（Ｈｏｅｆｅｒ  ＤｙＮＡＱｕａｎｔ２０００、アマシャムバイオサイエンス）により０．１〜１．０μｇ／μｌの濃度となるよう調整して以降の実験に用いた。対照となる正常細胞ｇＤＮＡは、健常人ボランティアの白血球より採取し、核酸抽出試薬キット（セパジーン、三光純薬）に添付プロトコールに従って抽出精製した。
（２）蛍光標識ＤＮＡプローブの合成
試験ＤＮＡとして、１症例の癌組織から得たＤＮＡを、対照ＤＮＡとして、健常人リンパ球から得たＤＮＡを用いた。これらＤＮＡ各１．０μｇを鋳型としてニックトランスレーション法により蛍光標識プローブを合成した。
【００３９】
すなわち、試験ＤＮＡからは、ＤＮａｓｅｌ、ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｌ、ｄＮＴＰ、ｄＴＴＰ、蛍光標識ｄＵＴＰおよび緩衝液からなるＣＧＨニックトランスレーションキット（Ｖｙｓｉｓ  Ｉｎｃ．）を用い、添付のプロトコールに基づいて緑色蛍光色素ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（Ｖｙｓｉｓ  Ｉｎｃ．）で標識された試験ＤＮＡプローブを合成した。一方、対照ＤＮＡからは、赤色蛍光色素ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（Ｖｙｓｉｓ  Ｉｎｃ．）で標識された対照ＤＮＡプローブを合成した。そして、得られたＤＮＡプローブの鎖長をアガロース電気泳動により確認したところ３００〜３，０００ｂｐであった。なお、蛍光物質を扱う時にはできるだけ遮光下で行うこととした。
（３）ハイブリダイゼーション溶液の作製
試験ＤＮＡプローブ溶液２０μｌと対照ＤＮＡプローブ溶液１０μｌ、さらにｃｏｔ−１  ＤＮＡ（インビトロジェン）１０μｌ（１０μｇ）、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液４μｌ、および、１００％エタノール１００μｌをマイクロチューブ内で混合し、−８０℃で２時間冷却した後、１７，０００Ｇで２０分間遠心処理した。そして、上清を除去した後、７０％エタノールを５００μｌ加えて転倒混和し、再度１７，０００Ｇで５分間遠心処理した。そして、上清を除去して得られたＤＮＡプローブ混合物の沈殿を、１０μｌのハイブリダイゼーションマスター（５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、２Ｘ（ＳＳＣ：標準クエン酸緩衝液）、ｐＨ７）に充分溶解してハイブリダイゼーション溶液とした。
（４）ターゲットスライドの調整
プローブをハイブリダイズさせるためのターゲットスライドには、分裂期ヒト正常男性リンパ球の染色体をスライドガラス上に展開・固定してなるメタフェーズ染色体標本（ＣＧＨメタフェーズターゲットスライド／Ｖｙｓｉｓ  Ｉｎｃ．）を用い、あらかじめ染色体が固定化されたエリアをダイアモンドペンを用いてマーキングしておいた。ターゲットスライドは、プローブをハイブリダイズさせる直前に７０℃に加温したＤＮＡ変性溶液（７０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、ｐＨ７．２）に２分３０秒間浸漬し、ただちに４℃に冷却した７０％エタノール、８５％エタノール、１００％エタノールに各２分間ずつ順に浸漬した後、ヘアードライヤーの冷風により乾燥させることで単鎖化・脱水した。
（５）ハイブリダイゼーション
マイクロチューブで調整したプローブ溶液を７０℃のウォーターバス中で５分間インキュベートすることによってＤＮＡを単鎖化した。そして、あらかじめ３７℃に加温したスライドウォーマー上で単鎖化ターゲットスライドの染色体展開エリアに単鎖化プローブ溶液を１０μｌ滴下し、そこにあらかじめ３７℃に加温しておいたカバーガラス（サイズ１８ｍｍ×１８ｍｍ）を気泡を生じないよう静かにかぶせた。プローブ溶液がカバーガラス下で均一に広がった後、カバーガラスの周囲をペーパーボンドで囲んでプローブ溶液を封入した。そして、スライドウォーマー上で３７℃、２０分間インキュベートすることによってペーパーボンドを固化した後、湿らせた濾紙を入れてあらかじめ加湿したプラスチック製ケースに移し、そのまま３７℃のインキュベーター中で遮光下、ハイブリダイゼーション反応を行った。
（６）洗浄
７２時間のハイブリダイゼーションの後、特異的にハイブリダイズしていない余分なプローブを除くため、洗浄操作を行った。ペーパーボンドを注意深く除去し、あらかじめ４５℃ウォーターバス中で加温した洗浄液Ｉ（５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、ｐＨ７．２）を満たした染色瓶中に５分間浸漬してカバーガラスを自然剥離させた。続いて、洗浄液Ｉを満たした別の２本の染色瓶中に各５分間浸漬した。次に、４５℃に加温した洗浄液ＩＩ（２ｘＳＳＣ、ｐＨ７．２）に５分浸漬した後、室温下、洗浄液ＩＩＩ（非イオン性界面活性剤Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０を０．１％含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）、洗浄液ＩＩに各５分間浸漬した。その後、洗浄液ＩＶ（精製水）に１分間浸漬して塩類を除いた後、スライドガラスに付着した余分な水滴をペーパータオルで除去し、遮光下自然乾燥させた。その後、ターゲットスライドの染色体エリアに染色体対比染色のため試薬ＤＡＰＩ、蛍光安定化のための褪色防止剤を含む封入液ＤＡＰＩ−Ｉ  Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｖｙｓｉｓ  Ｉｎｃ．）を８μｌ滴下してカバーガラスをかぶせた。カバーガラスの周囲にマニキュアを塗布することで固定封入し、蛍光顕微鏡による解析に供した。
（７）顕微鏡画像解析
蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ２／Ｚｅｉｓｓ）、顕微鏡カメラ（３０万画素冷却ＣＣＤカメラＣ５９８５／浜松ホトニクス）、解析用コンピュータ（ＯｐｔｉｐｌｅｘＧＸ１／Ｄｅｌｌコンピュータ）およびＣＧＨ解析ソフトウェア（Ｉｓｉｓ  ｖｅｒ．９９／ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ）からなるＣＧＨ解析システムにより行った。洗浄処理が終わったターゲットスライドをＣＧＨ解析システムにセットし、１症例の解析につき１０個のメタフェーズ染色体（１個あたり１細胞由来、常染色体２２対、性染色体ＸおよびＹから構成される）を選択し、１００倍の対物レンズにて対比染色由来の青色蛍光、試験ＤＮＡ由来の緑色蛍光および対照ＤＮＡ由来の赤色蛍光像を取得した。
【００４０】
ＣＧＨ解析ソフトウェアのアルゴリズムに従って、各染色体の長軸に沿って緑色および赤色の蛍光強度を測定計算した。１症例につき６個〜１０個のメタフェーズ染色体の蛍光強度比を解析して、その平均値を算出した。そして、各染色体に沿って蛍光強度比が緑色あるいは赤色の閾値範囲を越える染色体領域をコピー数異常領域として抽出した。すなわち、緑色蛍光強度／赤色蛍光強度の値が０．８より小さい領域を欠失領域として、１．２より大きい領域を増幅領域として抽出した。なお、全染色体の同定は染色体のサイズ、ｐ腕およびｑ腕の長さ、ＤＡＰＩ染色によって観察される染色体バンドパターンに基づいて行った。
【００４１】
このような手順および条件に従って合計６７症例の肝細胞癌についてＣＧＨ解析を行い、得られた全染色体上の染色体異常領域データを集計し、各種臨床病態情報との相関関係の解析を行った。
【００４２】
その結果を、図１および表１ならびに表２に示す。
【００４３】
まず、図１は、肝細胞癌の全染色体異常領域のスクリーニング結果を示すものである。
【００４４】
図１において、染色体図の右側のラインは各症例の増幅領域を、左側のラインは欠失領域を表している。ラインの重複が多い領域が高頻度異常領域を表している。
【００４５】
また、以下の表１は、肝細胞癌において高頻度（異常頻度２０％以上）に異常が認められた染色体領域を示すものである。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
表１に示すように、染色体領域１番ｑ腕（表１において１ｑ）、６番ｐ腕（６ｐ）、７番ｐ腕（７ｐ）、８番ｑ腕（８ｑ）の増幅、１番ｐ腕（１ｐ）、４番ｑ腕（４ｑ）、１３番ｑ腕（１３ｑ）、１６番ｐ腕（１６ｐ）、１６番ｑ腕（１６ｑ）および１７番ｐ腕（１７ｐ）の欠失が、肝細胞癌で特有な高頻度異常領域であることが判明した。
【００４８】
さらに、表２は、肝細胞癌組織のサイズ増大と染色体異常との相関性を示すものである。
【００４９】
【表２】
2004290141.tif 000004
【００５０】
表２に示すように、肝細胞癌において染色体異常の有無が各症例の腫瘍サイズ（癌組織の最大径を腫瘍サイズとして評価）の増大化に相関するかをマン・ホイットニ検定によって検討した。統計解析の結果、染色体１番ｑ腕領域に増幅異常を有する症例ほど有意に腫瘍サイズが大きくなることが判明した。
【００５１】
この解析結果から、染色体１番ｑ腕領域が、肝細胞癌のサイズの増大化の進行に関与する特有の染色体領域であることがわかる。
【００５２】
従って、本第１実施形態においては、肝細胞癌のサイズの増大化の進行に関与する特有の染色体領域である染色体１番ｑ腕領域の異常の有無を、この領域のコピー数の増幅に基づいて解析することができ、この解析に基づいて、肝細胞癌の増大度をより客観的かつ的確に検査することができる。
【００５３】
なお、染色体のコピー数異常を検出することができれば、その検出方法は問わないが、例えば、前述したＣＧＨ法を用いれば、簡便かつ迅速に異常を検出することが可能である。
【００５４】
また、ＣＧＨ法に限らず、調べたい細胞あるいは組織のスライド標本が作製できれば、例えばＩＳＨ（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を用いることもできる。このＩＳＨ法は、特定の染色体領域に対する標識プローブＤＮＡを作製し、被験者から採取した細胞、組織、あるいはそれらのメタフェーズ染色体を固定したスライドガラス標本に対してハイブリダイゼーション反応させる方法である。プローブＤＮＡは、ターゲットとなる染色体領域のＤＮＡに特異的に結合するため、蛍光標識プローブを用いた場合には、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナを用いて、その蛍光シグナルを計測することで、コピー数を調べることができる。正常な細胞では、１細胞あたり２コピーのシグナルが観察されるが、増幅異常があれば３コピー以上のシグナルが、欠失異常であれば１コピー以下のシグナルとして観察される。
このＩＳＨ法を用いることによっても、肝細胞癌の染色体異常を簡便かつ迅速に検出し、得られた情報に基づいて肝細胞癌の検査を迅速かつ適正に行うことができる。
【００５５】
次に、本発明に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法の第２実施形態について説明すると、本第２実施形態においては、染色体８番ｑ腕領域のコピー数の増幅を検出し、この検出したコピー数の増幅に基づいて、肝細胞癌の未分化度を検査する。
【００５６】
このような方法を採るのは、本発明者が前述したＣＧＨ法を用いた肝細胞癌の解析を行った結果、染色体８番ｑ腕領域が、肝細胞癌の未分化度の進行に関与する特有の染色体領域であるということが判明したことによるものである。
【００５７】
すなわち、本発明者は、前述の第１実施形態において説明したＣＧＨ法の手順および前記（１）乃至（７）の各条件に従いながら、肝細胞癌の細胞分化度と染色体異常との相関性を解析するための実験を行ったところ、以下の、表３に示す結果を得た。
【００５８】
【表３】
2004290141.tif 000005
【００５９】
表３の結果に基づいて、肝細胞癌において染色体異常の有無が低分化型への進行に相関するか否かをカイ二乗検定に基づいて統計学的に解析したところ、染色体８番ｑ腕に増幅異常を有する症例ほど有意に未分化度が高くなることが判明した。
【００６０】
この解析結果から、染色体８番ｑ腕領域が、肝細胞癌の低分化型への進行に関与する特有の染色体領域であることがわかる。
【００６１】
ここで、通常、細胞は、未分化な状態から低分化、中分化、高分化な状態に分化することで成長し、高分化な細胞は、成熟した正常な機能を発揮する。逆に癌細胞においては、正常から逆行して未分化に戻るほど一般に悪性度が高くなる。
【００６２】
従って、本第２実施形態においては、肝細胞癌の細胞分化の低分化型への進行に関与する特有の染色体領域である染色体８番ｑ腕領域の異常の有無を、この領域のコピー数の増幅に基づいて解析することができ、この解析に基づいて肝細胞癌の悪性度の指標となる未分化度をより客観的かつ的確に検査することができる。
【００６３】
なお、染色体のコピー数異常の検出方法は問わないが、ＣＧＨ法やＩＳＨ法を用いれば、簡便かつ迅速に異常を検出し得ることについては、第１実施形態における検査方法と同様である。
【００６４】
次に、本発明に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法の第３実施形態について説明すると、本第３実施形態においては、染色体１番ｑ腕領域および染色体６番ｐ腕領域のコピー数の増幅を検出し、これらの検出したコピー数の増幅に基づいて、肝細胞癌の病期を検査する。
【００６５】
このような方法を採るのは、本発明者が前述したＣＧＨ法を用いた肝細胞癌の解析を行った結果、染色体１番ｑ腕領域および染色体６番ｐ腕領域が、肝細胞癌の病期の進行度（悪性度）に関与する特有の染色体領域であるということが判明したことによるものである。
【００６６】
すなわち、本発明者は、前述の第１実施形態において説明したＣＧＨ法の手順および前記（１）乃至（７）の各条件に従いながら、肝細胞癌の臨床ステージ進行と染色体異常との相関性を解析するための実験を行ったところ、以下の表４に示す結果を得た。なお、表４におけるステージ１〜４の分類は、ＴＮＭ方式（原発性肝癌取扱い規約、日本肝癌研究会編）に従ったものである。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
表４の結果に基づいて、肝細胞癌において染色体異常の有無が臨床ステージの進行に相関するかをマン・ホイットニ検定に基づいて統計学的に解析したところ、染色体１番ｑ腕と６番ｐ腕領域に増幅異常を有する症例ほど有意にステージが進行していることが判明した。
【００６９】
この解析結果から、染色体１番ｑ腕領域と染色体６番ｐ腕領域とが、肝細胞癌の病期の進行度（悪性度）に関与する染色体領域であることがわかる。
【００７０】
従って、本第３実施形態においては、肝細胞癌の病期の進行度に関与する特有の染色体領域である染色体１番ｑ腕領域および染色体６番ｐ腕領域における異常の有無を、これらの領域のコピー数の増幅に基づいて解析することができ、この解析に基づいて肝細胞癌の病期の進行度をより客観的かつ的確に検査することができる。
【００７１】
なお、染色体のコピー数異常の検出方法は問わないが、ＣＧＨ法やＩＳＨ法を用いれば、簡便かつ迅速に異常を検出し得ることについては、第１実施形態における検査方法と同様である。
【００７２】
次に、本発明に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法の第４実施形態について説明すると、本第４実施形態においては、染色体１番ｑ腕、染色体６番ｐ腕および染色体８番ｑ腕の３箇所の染色体領域におけるコピー数の増幅の数すなわち染色体異常指数を検出し、この検出した染色体異常指数に基づいて肝細胞癌を検査する。
【００７３】
このような方法を採るのは、本発明者が前述したＣＧＨ法を用いた肝細胞癌の解析を行った結果、染色体１番ｑ腕、染色体６番ｐ腕および染色体８番ｑ腕が、肝細胞癌の悪性度に関与する特有の染色体領域であるということが判明したことによるものである。
【００７４】
すなわち、本発明者は、前述の第１実施形態において説明したＣＧＨ法の手順および前記（１）乃至（７）の各条件に従いながら、肝細胞癌の病期の進行度（悪性度）と染色体異常との相関性を解析するための実験を行ったところ、以下の表５に示す結果を得た。
【００７５】
【表５】
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【００７６】
表５の結果に基づいて、染色体領域１番ｑ腕、６番ｐ腕および８番ｑ腕の３箇所のうち、いくつの領域で増幅異常を有するかを染色体異常指数と定義した（０＋〜３＋）。そして、この染色体指数と、肝細胞癌の悪性度の指標として、腫瘍サイズ、未分化度、ステージの進行度との相関をスピアマンの順位相関検定に基づいて解析した結果、染色体指数の増大と肝細胞癌の悪性度の増加との間に統計学的に有意な相関関係があることが判明した。
【００７７】
従って、本第４実施形態においては、肝細胞癌の悪性度と相関関係を有する染色体異常指数すなわち染色体１番ｑ腕、染色体６番ｐ腕および染色体８番ｑ腕の３箇所の染色体領域のうちのコピー数の増幅の異常を有する領域の数に基づいて、肝細胞癌の悪性度をより客観的かつ的確に検査することができる。
【００７８】
以上のように、第１乃至第４実施形態における染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法によれば、肝細胞癌の進展度を染色体異常に基づいて検査することができるため、従来の組織形態学的検査に比べて、より客観的な情報を得ることが可能であり、ひいては肝細胞癌の的確な診断に大きく寄与するものと考えられる。
【００７９】
より具体的には、本発明を用いて肝細胞癌患者を診断した場合に、ステージの進行度が高いと判定されたならば、それは遠隔転移の可能性や再発の可能性が高いことを予測させ、そのような患者に対しては十分な抗癌剤による補助療法を開始すべきであると判断することが可能となる。
【００８０】
一方、ステージの進行がまだ低いと判定されたならば、副作用の少ない最小限の治療を行えばよい。
【００８１】
このように、本発明を、医療の現場に導入することによって、従来法に比べてより的確な肝臓癌の診断が可能となり、その結果Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅの向上や、医療費の削減になど、医学的にも社会的にも多くの恩恵を与えることになると期待される。
【００８２】
なお、本発明は前記各実施形態のものに限定されるものではなく、必要に応じて種々変更することが可能である。
【００８３】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の請求項１に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法によれば、肝細胞癌の増大度をより客観的かつ的確に検査することができ、ひいては肝細胞癌の適正かつ迅速な治療に寄与することができる。
【００８４】
請求項２に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法によれば、肝細胞癌の分化度をより客観的かつ的確に検査することができ、ひいては肝細胞癌の適正かつ迅速な治療に寄与することができる。
【００８５】
請求項３に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法によれば、肝細胞癌の病期の進行度をより客観的かつ的確に検査することができ、ひいては肝細胞癌の適正かつ迅速な治療に寄与することができる。
【００８６】
請求項４に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法によれば、染色体異常指数に基づいて、肝細胞癌の悪性度をより客観的かつ的確に検査することができ、ひいては肝細胞癌のより適正かつ迅速な治療に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る染色体異常に基づく肝細胞癌の検査方法の実施形態において、肝細胞癌の全染色体異常領域のスクリーニング結果を示す図
【符号の説明】
１，２，．．．，２２  染色体
【図１】
2004290141.tif 000008