(57)【要約】【課題】  アルツハイマー病を治療できる物質のスクリーニングに使用できるモデルを提供する。【解決手段】  アルツハイマー病の遺伝学的な素質と関連する突然変異型ヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の対立遺伝子をエンコードする核酸配列を有する組換ポリヌクレオチドを含む、ヒト以外の形質転換宿主である。【選択図】            なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の遺伝学的な素質と関連する突然変異型ヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の対立遺伝子をエンコードする核酸配列を有する組換ポリヌクレオチドを含む、ヒト以外の形質転換宿主。
【請求項２】
動物である、請求項１に記載の形質転換宿主。
【請求項３】
マウスである、請求項２に記載の形質転換宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病に関するモデルに関する。特に、本発明は、薬剤をスクリーニングするおよび薬剤の効果を評価するためのモデルシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、一般的に老人痴呆として知られている進行性の病気である。広義にいうと、この病気は、２つのカテゴリー、つまり後年に始まるものと初期に始まるものとに分かれる。後年に始まるものは、老年（６５＋数年）で起こり、正常なものより早い速度でかつより重度に脳の自然の萎縮が起こることによって生じるものである。初期に始まるアルツハイマー病は、かなりより頻繁に起こるが、老年期前、つまり３５から６０才の間で、非常に発達する広範囲な脳の萎縮による病理学的に同様な痴呆を示す。このタイプのアルツハイマー病の一形態としては血族で起こりやすいものがあることが知られており、このため、これは家族性アルツハイマー病(familial Alzheimer's disease)（ＦＡＤ）として知られている。
【０００３】
両方のタイプのアルツハイマー病において、病理学的には同様であるが、より若い年齢で始まる場合のほうが、異常性がより重度でかつより広範囲になる傾向がある。この病気は、２タイプの脳の病変、つまり、老人斑および神経細線維のもつれ(neurofibrillary tangle)によって特徴づけられる。
【０００４】
老人斑は、中枢の細胞外のアミロイドの沈着による１５０μｍまでの直径の破壊された神経網の領域である。神経細線維のもつれ(neurofibrillary tangle)は、それぞれが対でねじれている２本のフィラメントからなるアミロイドタンパク質の細胞内の沈着物である。
【０００５】
老人斑のアミロイドフィラメントの主要なタンパク質のサブユニットである、β−アミロイドタンパク質は、相対的な分子量が約４，５００の非常に凝集した小さいポリペプチドである。このタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質(amyloid precursor protein)（ＡＰＰ）と呼ばれるかなりより大きな前駆体タンパク質の切断生成物である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、様々な形態のアルツハイマー病（ＡＤ）に対する効果的な治療は知られていない。しかしながら、それに対する治療が利用でき、アルツハイマー病に関する痴呆とよく似た進行性の知能の衰退が生じる様々な他の形態の痴呆は存在する。
【０００７】
したがって、ＡＤに関する診断テストによって、アルツハイマー病を排除できるため、これらの他の症状の診断および治療に有用な道具が得られる。また、適当な治療が利用できる際にも有用である。
【０００８】
ＡＤの病因に含まれる基礎的な生化学的な事項をさらに定義するために用いられるアルツハイマー病の実験モデルの開発も重要である。このようなモデルは、一つの適用として、アルツハイマー病の変性の過程を変える物質(agent)を評価するために用いることができると考えられる。例えば、アルツハイマー病のモデルシステムを、ＡＤの病因を誘発する若しくは促進する環境因子のスクリーニングに用いられる。一方、実験モデルは、ＡＤの進行を阻害し、防止し、または転換する物質のスクリーニングに用いることができる。ＡＤを防止し、はばみ、若しくは転換するのに効果的である薬剤の開発に用いることもできると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、アルツハイマー病の遺伝学的な素質と関連する突然変異型ヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の対立遺伝子をエンコードする核酸配列を有する組換ポリヌクレオチドを含む、ヒト以外の形質転換宿主を提供するものである。この際、本発明の形質転換宿主は、動物、より好ましくはマウスであることが好ましく、また、ヒトのアミロイド前駆体タンパク質７７０（ＡＰＰ７７０）の７１７番目のアミノ酸残基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片をエンコードするＤＮＡ配列を有する形質転換宿主であることが特に好ましい。
【００１０】
なお、本発明は、モデルシステムがＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片をエンコードするＤＮＡ配列からなる、アルツハイマー病のモデルシステムを提供するものである。
【００１１】
第一の実施態様においては、本発明は、ＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片をエンコードする単離されたＤＮＡ配列を提供するものである。
【００１２】
第二の実施態様においては、本発明は、ＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片をエンコードするヒトのＤＮＡ配列の少なくとも１つの組込まれたコピーを有するヒト以外の形質転換動物を提供するものである。
【００１３】
第三の実施態様においては、本発明は、ヒト以外の内因性のＡＰＰ対立遺伝子の少なくとも１つがバリンをエンコードしない７１７番目のコドンを含むすべての若しくは一部のヒトのＡＰＰ遺伝子によって完全に若しくは部分的に置き代ったものである、ヒト以外の形質転換動物を提供するものである。
【００１４】
第四の実施態様においては、本発明は、細胞がＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片を発現する、異種のＤＮＡ配列で形質転換した若しくはトランスフェクションした、またはヒト以外の形質転換動物由来の、細胞、具体的には哺乳類動物の細胞および好ましくは神経、神経膠、または星状細胞の系統(lineage) の哺乳類動物の細胞を提供するものである。標準的なプロトコルによると、培養されたヒトの細胞は、初代培養物若しくは不死化した細胞株のいずれにしても、培養されたヒトの細胞が突然変異ＡＰＰポリペプチドを発現するように、突然変異ＡＰＰ対立遺伝子で、一時的あるいは安定してトランスフェクションされる。
【００１５】
第五の実施態様においては、本発明は、ＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片をエンコードするＤＮＡ配列を含むヒト以外の形質転換動物および形質転換された細胞の製造方法を提供するものである。
【００１６】
第六の実施態様においては、本発明は、他のヒトのタンパク質を含まない、ＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片の製造方法を提供するものである。
【００１７】
第七の実施態様においては、本発明は、ＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有し、他のヒトのタンパク質を含まない、ヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片を提供するものである。
【００１８】
第八の実施態様においては、本発明は、対立遺伝子の７１７番目のコドンがバリンをエンコードしないことを決定することによってこのような疾病に特徴的なＡＰＰ対立遺伝子を検出するものである、アルツハイマー病、特に初期に始まるＡＤの遺伝学的な素因に連結した(linked)（つまり、コセグレゲートした(cosegregate)）ＡＰＰ対立遺伝子の検出方法を提供するものである。好ましくは、７１７番目のコドンがイソロイシン、グリシン、若しくはフェニルアラニンのいずれかをエンコードすることが決定される際に、疾病に特徴的なＡＰＰ対立遺伝子が検出される。したがって、アルツハイマー病に関連した遺伝学的な変化の存在を定める方法が得られる。この診断方法を用いて、遺伝学的なスクリーニングを目的として、発病する前に、この病気の発達を予想するまたはヒト以外の実験動物若しくは細胞において特異的な突然変異を検出することができる。
【００１９】
第九の実施態様においては、本発明は、特にヒト以外の動物の細胞に存在する、他のヒトのタンパク質を含まないヒトの変異ＡＰＰポリペプチドを提供するものである。本発明は、また、７１７番目の位置（ＡＰＰ７７０に関して定義される際の）でのアミノ酸の置換を含む本発明の特別な実施態様に関して上記したようなこのようなポリペプチドをエンコードする単離された核酸およびこのような核酸の使用及び適用に関するものである。
【００２０】
本発明の一概念によると、ＡＰＰに関してコードする遺伝子配列における遺伝学的な変化を同定することからなる、被験者から除去した核酸または他のサンプルにおける、アルツハイマー病に対する遺伝子の存在を検出する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、アルツハイマー病の遺伝学的な素質と関連する突然変異型ヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の対立遺伝子をエンコードする核酸配列を有する組換ポリヌクレオチドを含む、ヒト以外の形質転換宿主に関するものである。したがって、本発明の形質転換宿主は、薬剤をスクリーニングするおよび薬剤の効果を評価するためのモデルシステムとして使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
特に脳の領域におけるβ−アミロイドタンパク質（Ａ４）の蓄積は、アルツハイマー病の主要な病理学的な特徴の一つである。このβ−アミロイドタンパク質は、内部の切断生成物(internal cleavage product)として、より大きなアミロイド前駆体タンパク質(amyloid precursor protein)（ＡＰＰ）の一つまたはそれ以上のイソ型由来である約４ｋＤのタンパク質（３９から４２アミノ酸）である。それぞれ、５６３、６９５、７１４、７５１、及び７７０個のアミノ酸を含む、少なくとも５つのＡＰＰの独特なイソ型がある（ウィラック(Wirak)ら、（１９９１年）、サイエンス(Science)、２５３：３２３）。これらのＡＰＰのイソ型は、ヒトの第２１染色体上に位置する、ＡＰＰ遺伝子と称される、単一の遺伝子の一次転写産物をスプライシングすることによっても生じる。ほとんどのＡＰＰのイソ型は配糖化された貫膜タンパク質であり（ゴールドガバー(Goldgaber)ら、（１９８７年）、サイエンス(Science)、２３５：８７７）、４つのイソ型、ＡＡ５６３、ＡＰＰ７１４、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０がクニッツタイプ(Kunitz type)のセリンプロテアーゼインヒビターと相同性のあるプロテアーゼインヒビタードメインを有することが知られている。β−アミロイド（Ａ４）セグメントは、約半分のトランスメンブレンドメインおよびＡＰＰのイソ型の細胞外ドメインの最初の約２８アミノ酸からなる。
【００２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏのＡＰＰのタンパク質分解プロセッシング(proteolytic processing)は正常な生理学的なプロセスである。カルボキシル末端を切り取った形態のＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０は、脳および脳脊髄液に存在し（パルマート(Palmert)ら、（１９８９年）、プロック  ナショル  アカデ  サイ  ユーエスエー(Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A.)、８６：６３３８；ワイデマン(Weidemann)ら、（１９８９年）、セル(Cell)、５７：１１５）、ＡＰＰのイソ型のＡ４ペプチドドメイン内の構成性切断部位(constitutive cleavage site)でのＡＰＰのイソ型の切断によって生じる（エッシュ(Esch)ら、（１９９０年）、サイエンス(Science)、２４８：１１２２）。構成性切断部位(constitutive cleavage site)での正常なタンパク質分解による切断によって、イソ型によってはプロテアーゼインヒビタードメインを含む大きい（約１００ｋＤ）の可溶性のＮ−末端断片、およびほとんどのＡ４ドメインを含む９〜１０ｋＤの膜に結合したＣ−末端断片が得られる。
【００２４】
病原性のβ−アミロイド（Ａ４）タンパク質の生成は、Ａ４ドメイン内の構成性部位での正常な切断は起こらず、むしろＡ４ドメインに隣接する２か所の特異的な部位で切断が起こる等の、ＡＰＰの異常な若しくは代わりのタンパク質分解プロセッシング(proteolytic processing)の結果であると考えられる。これらの異常な切断部位の１つはトランスメンブレンドメイン中にあり、他の異常な切断部位は細胞外のドメインの最初の２８アミノ酸のＮ−末端辺りに位置する（図３を参照）。このような異常なタンパク質分解による切断によって、タンパク質分解による分解および除去に対して耐性のある高密度のアミロイド形成性の凝集物(dense amyloidogenic aggregate)を形成しやすいβ−アミロイドＡ４ポリペプチドが生じる。このようにして得られたβ−アミロイドの凝集物は、アルツハイマー病の神経病理学的な証しである多くのアミロイド斑および脳血管のアミロイドの形成に含まれると考えられる。しかしながら、正確な異常な切断部位は必ずしも明らかではない；ＡＤに罹っている患者の脳から単離されたβ−アミロイド分子はＮ−およびＣ−末端の異質性を示す。したがって、異常な切断経路は、配列に特異的なタンパク質分解後のエキソペプチダーゼ活性化（末端の異質性を生じる）を含む、または配列に特異的でない。
【００２５】
ＡＰＰ遺伝子はヒトの第２１染色体上に位置することが知られている。家族性アルツハイマー病によって分離する遺伝子座は、ＡＰＰ遺伝子の近くの第２１染色体上に位置する（ハイスロップ(Hyslop)ら、（１９８７年）、サイエンス(Science)、２３５：８８５）。ＡＰＰ遺伝子とＡＤ遺伝子座との間の組換えはすでに報告されている（シェレンバーグ(Schellenberg)ら、（１９８８年）、サイエンス(Science)、２４１：１５０７）。これらのデータによって、ＦＡＤを引き起こす突然変異の部位としてＡＰＰ遺伝子が除外されるように思われる（ファン  ブロウクホーヴェン(Van Broekhoven)ら、（１９８７年）、ネイチャー(Nature)、３２９：１５３；タンジ(Tanzi)ら、（１９８７年）、ネイチャー(Nature)、３２９：１５６）。
【００２６】
組換えＤＮＡ技術によって、可能な突然変異の位置を決めるための様々な遺伝子の分析技術が得られる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction)（ベル、（１９８９年）、イムノロジー  ツデイ(Immunology Today)、１０：３５１）は、イントロンのプライマーを用いた特異的な配列を増幅するのに使用でき、さらに、これは直接配列決定(direct sequencing)によって分析できる。
【００２７】
ダッチタイプのアミロイド症（「エッチシーエッチダブルエー−ディ」（“ＨＣＨＷＡ−Ｄ”）による遺伝性の脳出血の分野において作業をしている研究者たち（レヴィ(Levy)ら、（１９９０年）、サイエンス(Science)、２４８：１１２２４）は、これによってこれらの患者の脳血管中にβ−アミロイドの蓄積が起こると考えられるＡＰＰにおける６１８番目の残基（ＡＰＰ６９５のナンバリングシステム(numbering system)を用いる）でのＧｌｕからＧｌｎへの置換を発見した。本発明者らは、一塩基置換、つまり２１４９番目の塩基対でのＣからＴへのトランジションが家族性アルツハイマー病のケースによってはＡＰＰ遺伝子配列の一部で発見されることを確認した。この塩基対のトランジションによって、β−アミロイドタンパク質のＣ−末端付近の、アミノ酸の置換、つまり７１７番目のアミノ酸（ＡＰＰ770）でのバリンからイソロイシンへの置換が起こる（ヨシカイ(Yoshikai)）ら、（１９９０年）、ジーン(Gene)、８７：２５７を参照）。これによって、アルツハイマー病のケースによってはＡＰＰ遺伝子内の突然変異、特にバリン以外のアミノ酸をエンコードする等の７１７番目のコドンを変える突然変異によって生じることが指摘される。
【００２８】
さらに、一塩基置換、つまり２１５０番目の塩基対付近のＴからＧへのトランジションが、家族性アルツハイマー病の他のケースにおいてＡＰＰ遺伝子配列の一部で発見された。この塩基対のトランジションによって、７１７番目のアミノ酸で、異なるアミノ酸の置換、つまりバリンからグリシンへの置換が生じ、これによってアルツハイマー病のケースによっては特に７１７番目のコドンでの、ＡＰＰ遺伝子における突然変異によって生じるという論拠が有力になる。
【００２９】
７１７番目のコドン（ＡＰＰ６９５では６４２番目の残基）でのバリンからイソロイソンへの置換が生じるＡＰＰ遺伝子座における突然変異によって、家族によってはＡＤが生じることは現在明らかである（ゴウティ(Goate)ら、（１９９１年）、ネイチャー(Nature)、３４９：７０４）。７１７番目のコドンでバリンがグリシンに置換される第二のＡＰＰ対立遺伝子の変異体も現在確認され、ＡＰＰ遺伝子の７１７番目のコドンでの対立遺伝子の変異体、好ましくはバリン以外のアミノ酸をエンコードするもの、さらに好ましくはイソロイシン、グリシン、若しくはフェニルアラニンをエンコードするものが病原性のおよび／または疾病に特徴的な対立遺伝子であることが示されるくらい、ＡＤの表現型によく連接している(link)（チャーティアー−ハーリン(Chartier-Harlin)ら、（１９９１年）、ネイチャー(Nature)、３５３：８４４）。
【００３０】
ＡＰＰのβ−アミロイド（Ａ４）領域のいずれの側でのタンパク質分解も、７１７番目のコドンでの特異的な突然変異によって促進または量的に変化し、β−アミロイドの沈着および凝集の割合が増す。このような７１７番目のコドンでの突然変異は、主要なタンパク質分解経路（構成性部位(constitutive site)での切断）に対するより悪い基質若しくは（異常な切断部位での）競合する、代わりの切断経路に対するより良好な基質を提供することによってβ−アミロイドの形成を増加する。
【００３１】
定義
多くの言葉および表現はこの明細書を通して使用され、さらに、明細書の理解を容易にするために、以下の定義を用いる：
ここで用いられるように、「エキソン」は成熟したＲＮＡ生成物中で発現する分断遺伝子のセグメントを意味する。
【００３２】
ここで用いられるように、「イントロン」は成熟したＲＮＡ生成物中で発現しない分断遺伝子のセグメントを意味する。イントロンは、核の一次転写産物の一部であるが、スプライシングによってｍＲＮＡを生産し、さらに、細胞質へ運ばれる。
【００３３】
ここで用いられるように、「アミロイドタンパク質前駆体に対してコードする遺伝子配列」という句は、ヨシカイ(Yoshikai)ら、（１９９０年）、ジーン(Gene)、８７：２５７およびカング(Kang)ら、上記引用文(loc. cit.)で詳細に記載されているようなＤＮＡおよびｃＤＮＡを意味するものとし、さらに、プロモーターＤＮＡ配列はサルバウム(Salbaum)ら、（１９８８年）、イーエムビーオー（ＥＭＢＯ）、７（９）：２８０７で詳細の記載されているようなものを意味するものとする。
【００３４】
ここで用いられるように、「標識」または「標識された」という言葉は、検出可能なマーカーの導入（例えば、放射性同位元素で標識した(radiolabeled)ヌクレオチドの導入による、または末端を放射性同位元素で標識した(radiolabeled)リン酸塩で末端標識することによる）を意味する。ＤＮＡ若しくはＲＮＡは、具体的には、放射性同位元素で標識した(radiolabeled)ヌクレオチド（Ｈ３、Ｃ１４、Ｓ３５、Ｐ３２）、または標識されたアビジン（例えば、蛍光マーカー若しくは酵素活性を有するアビジン）によって検出できるビオチン化(biotinylated)ヌクレオチド、または標識された特異的な抗体によって検出できるジゴキシゲニン化(digoxygeninylated)ヌクレオチドを導入することによって標識される。
【００３５】
ここで用いられるように、「イソ型」、「ＡＰＰ」、および「ＡＰＰのイソ型」は、ＡＰＰ遺伝子の少なくとも１つのエキソンによってエンコードされるポリペプチドを意味する（キタグチ(Kitaguchi)ら、（１９８８年）、ネイチャー(Nature)、３３１：５３０；プロンテ(Pronte)ら、同書(ibid)、ページ５２５；アールイー  タンジ(R.E. Tanzi)、同書(ibid)、ページ５２８；デ  ソウベイジ(de Sauvage)およびオクテイブ(Octave)、（１９８９年）、サイエンス(Science)、２４５：６５１；ゴールド(Golde)ら、（１９９０年）、ニューロン(Neuron)、４：２５３）。ＡＰＰのイソ型は、アルツハイマー病の一形態に関連のあるまたはＡＤの病気の表現型に関連のないＡＰＰの対立遺伝子（若しくはこれのエキソン）によってエンコードされる。
【００３６】
「β−アミロイド遺伝子」という言葉は、β−アミロイドはＡＰＰ遺伝子の生成物の翻訳後切断によって生じたタンパク質生成物であるため、ここではＡＰＰ遺伝子の同義語として用いられる。
【００３７】
ここで用いられるように、「断片」は、ポリペプチドが以下のアミノ酸のコア配列（アミノ−からカルボキシル−末端の方向で並べられている）を含む、少なくとも約９個のアミノ酸、具体的には５０から７５、またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドを意味する：
-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-X-Ile-Thr-Leu  ［配列番号：６］
ただし、Ｘはバリン以外の２０個の既知のアミノ酸のいずれかであり、さらに特にＸはイソロイシン、グリシン、若しくはフェニルアラニンである。断片は、末端を切り取ったＡＰＰのイソ型、修飾されたＡＰＰのイソ型（アミノ酸の置換、欠損、またはコア配列の外側での添加による等）、または他の変異ポリペプチド配列であるが、ＡＤに疾病しているまたは疾病していないにかかわらず、ヒト個人中に存在する自然に生じたＡＰＰのイソ型またはβ−アミロイドのポリペプチドではない。必要であれば、この断片は、１から２０から、具体的には５０から１００、ただし２５０から５００またはそれ以上までの数である、いずれかの末端で添加アミノ酸(additional amino acid)に融合される。
【００３８】
ここで用いられるように、「ＡＰＰ７５１」および「ＡＰＰ７７０」は、ヒトのＡＰＰ遺伝子によってエンコードされたそれぞれ７５１および７７０個のアミノ酸残基長のポリペプチドを意味する（プロンテ(Pronte)ら、上記引用文(loc. cit.)；キタグチ(Kitaguchi)ら、上記引用文(loc. cit.)；タンジ(Tanzi)ら、上記引用文(loc. cit.)）。
【００３９】
ここで用いられるように、「７１７番目のコドン」は、ＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸の位置、またはＡＰＰ７７０の７１７番目の位置に相当するＡＰＰのイソ型若しくは断片中のアミノ酸の位置をエンコードするコドン（つまり、トリヌクレオチド配列）を意味する。例えば、以下に限定されないが、１００個のＮ−末端のアミノ酸を除去することによってＡＰＰ７７０の末端を切り取ることによって生じた６７０残基長の断片は、７１７番目のコドンに相当する６１７番目のアミノ酸の位置を有する。事実、ここで用いられるように、７１７番目のコドンは、ＡＰＰ７５１［配列番号：２］の６９８番目のアミノ酸残基およびＡＰＰ６９５［配列番号：１］の６４２番目のアミノ酸残基をエンコードするコドンを意味する。
【００４０】
ここで用いられるように、「ヒトのＡＰＰのイソ型または断片」は、ヒト個人において自然に生じたヒトのＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、若しくはＡＰＰ６９５タンパク質における配列と一致する少なくとも９個の保存アミノ酸(conservative amino acid)の配列を含むＡＰＰのイソ型または断片であり、かつ一致した配列がヒト以外の種において自然に生じたＡＰＰタンパク質中には存在しないものであることを意味する。
【００４１】
核酸は、他の核酸配列と結合する(placed into a functional relationship)際には「操作して連結される(operably linked)」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす際にはコーディング配列に操作して連結される(operably linked)。転写調節配列(transcription regulatory sequence)に関しては、「操作して連結される(operably linked)」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接している、さらに必要であれば２つのタンパク質のコーディング領域(coding region)を結合する際には、隣接しかつ読み枠内にあることを意味する。
【００４２】
「に相当する」という言葉は、配列が基準配列のすべて若しくは一部と相同性のある（すなわち、厳密に展開して関連しないが、一致する）という意味で、ここでは使用する。一方、「に相補する」という言葉は、相補的配列が基準配列のすべて若しくは一部と相同性のあるという意味で、ここでは使用する。例えば、ヌクレオチド配列“ＴＡＴＡＣ”は、基準配列“ＴＡＴＡＣ”に相当し、基準配列“ＧＴＡＴＡ”に相補する。
【００４３】
「転写促進(transcriptional enhancement)」という言葉は、機能的なプロモーターを有する連結された配列の転写速度が増加するような機能的な性質という意味でここでは使用する。
【００４４】
「物質(agent)」という言葉は、化学的な化合物、化学的な化合物の混合物、生物学的な高分子、または細菌、植物、菌類、若しくは動物（特に哺乳動物）細胞若しくは組織等の生物材料から作製された抽出物という意味でここでは使用する。物質(agent)は、以下に記載されているスクリーニングアッセイに含まれる強力な生物学的な活性によって評価される。
【００４５】
ここで用いられるように、「突然変異体」という言葉は、ＡＤを発達させる遺伝的な素因に対して特徴的であるミスセンス突然変異を有するＡＰＰ対立遺伝子を意味する；詳しくは、７１７番目のコドンがバリンでない１９個のアミノ酸の一つ（すなわち、グリシン、メチオニン、アラニン、セリン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トリプトファン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、リシン、およびグルタミン）、好ましくはイソロイシン、グリシン、フェニルアラニンをエンコードする等の、ＡＰＰ遺伝子の７１７番目のコドン（ＡＰＰ７７０におけるアミノ酸配列について）での突然変異。このように、突然変異ＡＰＰ７７０のポリペプチドは、バリンではない７１７番目の位置のアミノ酸残基を有するＡＰＰ７７０のポリペプチドである。他の突然変異ＡＰＰのイソ型は、７１７番目のコドンに相当する（つまり、７１７番目のコドンによってエンコードされる）アミノ酸残基の位置がバリンでないアミノ酸からなる。同様にして、突然変異ＡＰＰの対立遺伝子または変異体ＡＰＰの７１７番目のコドンの対立遺伝子は、７１７番目のコドン（上記の、「７１７番目のコドン」の定義において記載したように翻訳を誘導したヒトのＡＰＰ７７０について）にバリン以外のアミノ酸、好ましくはイソロイシン、グリシン、若しくはフェニルアラニンをエンコードするＡＰＰの対立遺伝子である。したがって、７１７番目のコドンにバリンをエンコードするＡＰＰの対立遺伝子は、「野生型」のＡＰＰの対立遺伝子である。
【００４６】
ヌクレオチドの置換、欠損、および添加が本発明のポリヌクレオチドに含まれることは当業者に明らかである。しかしながら、このようなヌクレオチドの置換、欠損、および添加は、実質的に、ポリヌクレオチドが特異的なハイブリッドの形成を生じるのに十分厳しいハイブリッド形成条件下で図５および６に示されるポリヌクレオチド配列の一つにハイブリッドを形成できなくなるようなものではあってはならない。
【００４７】
「特異的なハイブリッド形成」は、例えば、変異体ＡＰＰの対立遺伝子またはこの制限断片に相当するバンドはサザンブロット上で同定できるが、野生型のＡＰＰの対立遺伝子（すなわち、７１７番目のコドンにバリンをエンコードするもの）は同定されない若しくはシグナル強度を基にすると変異体ＡＰＰの対立遺伝子と識別できる等、プローブが特異的なターゲットに対して選択的にハイブリッドを形成する、プローブであるポリヌクレオチド（例えば、置換、欠損、および／または添加を含む本発明のポリヌクレオチド）および特異的なターゲットであるポリヌクレオチド（例えば、配列を有するポリヌクレオチド）との間のハイブリッド形成としてここでは定義される。特異的なハイブリッド形成によって１塩基のミスマッチ(mismatch)の検出が可能なハイブリッド形成用のプローブは、既知の方法にしたがって設計され、これらは、マニアティス(Maniatis)ら、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、２版、（１９８９年）、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク(Cold Spring Harbor, N.Y.)およびバーガー(Berger)およびキンメル(Kimmel)、メソッズ  イン  エンザイモロジー、１５２巻、ガイド  ツー  モレキュラー  クローニング  テクニックス(Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques)、（１９８７年）、アカデミック  プレス，インク(Academic Press, Inc.)、サン  ジエゴ、シーエー(San Diego, CA)；ギブス(Gibbs)ら、（１９８９年）、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ(Nucleic Acids Res.)、１７：２４３７；コウク(Kowk)ら、（１９９０年）、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ(Nucleic Acids Res.)、１８：９９９；ミヤダ(Miyada)ら、（１９８７年）、メソッズ  エンザイモル(Methods Enzymol.)、１５４：９４に記載されており、それぞれを参考としてここに記載した。オリゴヌクレオチドのＴｍは、標準的な条件下（１Ｍ  ＮａＣｌ）で［４℃×（Ｇ＋Ｃ）＋２℃×（Ａ＋Ｔ）］の計算によって求められる。ＰＣＲの条件は標準的な条件とは異なるが、このＴｍはオリゴヌクレオチドの予想される相対的な安定性の規準として用いられる。対立遺伝子に特異的なプライマーは、具体的には、１３〜１５ヌクレオチド長、場合によっては１６〜２１ヌクレオチド長、若しくはそれ以上である；１４ヌクレオチド長のプライマー等の、短いプライマーを使用する際には、４４から５０℃等の低いアニーリング温度を用い、必要であれば、配列の塩基組成によってはこれより少し高い若しくは低くなる。
【００４８】
ここで、７１７番目のコドンが突然変異したＡＰＰ対立遺伝子の検出について説明する。
【００４９】
本発明の実施態様においては、方法は、これによって共通のバリン(consensus Val)が例えば、他の疎水性の残基に変化する、７１７番目のアミノ酸での遺伝学的な変化を同定することを含むものである。上記は、通常、被験者から取った試料について行う。疎水性の残基としては、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＩｌｅおよびＧｌｙが挙げられ、初めの３つは脂肪族の側鎖を有する。Ｐｈｅもまた、適当な疎水性の残基を有する。上記したように、好ましい残基としては、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、およびＰｈｅが挙げられる（マレル(Murrell)ら、（１９９１年）、サイエンス(Science)、２５４：９７）。
【００５０】
上記したこれらの突然変異が同じコドンで起こるという事実は一致しているが、このことは統計上の分野ではありえないように思われる。これらのデータを説明できる可能性が２つある。第一には、７１７番目のコドンでのバリン残基の置換によって、ＡＰＰの代謝における変化によるβ−アミロイドの蓄積が増加することである。第二には、この位置周辺の配列の変異によって、ＡＰＰのｍＲＮＡの翻訳量が増加し、これによってＡＤがダウン症候群によって引き起こされると考えられている経路と類似した経路によってＡＤが生じる（タンジ(Tanzi)およびハイマン(Hyman)、（１９９１年）、ネイチャー(Nature)、３５０：５６４およびランブル(Rumble)ら、（１９８９年）、エヌ  イングル  ジェー  メド(N. Engl. J. Med.)、３２０：１４４６）。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリッド形成法の研究によって、ＡＰＰ７１７の突然変異体がＡＰＰの発現を変えないことが示された（ハリソン(Harrison)ら、（１９９１年）、ニューロレプ(Neurorep.)、２：１５２）。
【００５１】
Ｖ７１７Ｉ（ＡＰＰ７１７  Ｖａｌ−＞Ｉｌｅ）、Ｖ７１７Ｇ（ＡＰＰ７１７  Ｖａｌ−＞Ｇｌｙ）およびＶ７１７Ｆ（ＡＰＰ７１７  Ｖａｌ−＞Ｐｈｅ）の突然変異体は、推定のステムループ構造を不安定化し(destabilise)、２１３１および２１５６番目の塩基対の間の可能な鉄応答性の要素(iron-responsive element)を破壊する（タンジ(Tanzi)およびハイマン(Hyman)、上記引用文(loc. cit.)）。この構造をも破壊する他の可能性のある突然変異体が様々あり、そのうち多くがタンパク質レベルでサイレント(silent)である；しかしながら、これらの突然変異は、同様のアミノ酸への変化を含むことを特に意味し、サイレントな(silent)変化または他のアミノ酸への変化はここで記載されたものより以前では報告されていない。１０の他の哺乳動物種からの配列データを調べる（ジョーンストーン(Johnstone)ら、（１９９１年）、モル  ブレイン  レス(Mol. Brain Res.)、１０：２９９）ことによって、７１７番目のコドンでのバリン残基はこれら全てにおいて保存されているが、ヒトの配列から仮定された推定のステムループ構造（タンジ(Tanzi)およびハイマン(Hyman)、上記引用文(loc. cit.)）は畜牛及び羊では起こらないと考えられる；さらに、ブタ及びマウスでは鉄応答性の要素(iron-responsive element)に対する共通配列は存在しない。最後に、このようなステムループ構造は、ｍＲＮＡの安定性を変化させることによって遺伝子の翻訳を調節する(modulate)と考えられる（クラウスナー(Klausner)およびハーフォード(Harford)、（１９８９年）、サイエンス(Science)、２４６：８７０）；しかしながら、ハリソン(Harrison)やその同僚（ハリソン(Harrison)ら、上記引用文(loc. cit.)）は、ＡＰＰのｍＲＮＡがＶ７１７Ｉの突然変異体を有する人の脳においてあまり変化していないことを、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリッド形成法によって示した。これらの理由によって、同定された特異的な突然変異によって起こるＡＰＰの翻訳速度の変化は病原性への鍵ではないと考えられる。
【００５２】
上記した特異的な突然変異が様々な変化（Ｖａｌ−＞Ｉｌｅ、Ｖａｌ−＞Ｇｌｙ、およびＶａｌ−＞Ｐｈｅ）を含むという事実によって、側鎖の疎水性若しくは側鎖の大きさが決定的な論点ではないことが指摘される。７１７番目のコドンでバリン以外のアミノ酸をエンコードするＡＰＰの対立遺伝子のすべての例はＦＡＤとコセグレゲートする(cosegregate)；これによって、野生型のＡＰＰ７７０若しくはＡＰＰ７５１の７１７番目の位置であるバリンは非病原性のＡＰＰのタンパク質分解のプロセッシング(proteolytic processing)の（つまり、構成性切断経路(constitutive cleavage pathway)による）臨界アミノ酸残基であることが示唆される。
【００５３】
ＡＰＰ分子に対する主要な代謝経路としては、β−アミロイド断片内の切断が挙げられる（エッシュ(Esch)ら、上記引用文(loc. cit.)）。β−アミロイドを得るためには、ＡＰＰをこの配列の外で切断する第二の経路が存在しなければならない。このような切断は、膜内に埋め込まれたβ−アミロイド断片を含むＡＰＰ分子のスタブ(stub)を切り離すと考えられる。恐らく、第二の経路によって生じたβ−アミロイドを含む断片はペプチダーゼの作用によって分解される；報告された突然変異体は、これらの含むペプチドが上記ペプチダーゼの作用に対してより耐性があるため、病原性がある。したがって、分解特性の変化（通常、減少）を生じるＡＰＰ遺伝子の遺伝学的な変化は、本発明の適用において特に重要である。アルツハイマー病に応答する遺伝学的な突然変異体を検出し、同定するために使用される組換えＤＮＡ技術が利用できる方法論は様々なものがある。これらとしては、ダイレクトプロービング(direct probing)、ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction)（ＰＣＲ）方法論、制限断片長多型(restriction fragment length polymorphism)（ＲＦＬＰ）分析および１本鎖立体配座解析(single strand conformational analysis)
（ＳＳＣＡ）が挙げられる。
【００５４】
ダイレクトプロービング(direct probing)を用いた点突然変異(point mutation)の検出は、合成でまたはニックトランスレーションによって調製されるオリゴヌクレオチドのプローブを使用する。このＤＮＡプローブは、例えば、放射性同位元素標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識および例えばサザンブロッティングによるハイブリッド形成方法で肉眼観察できるもの等を用いて適当に標識される。標識されたプローブは、ニトロセルロース若しくはナイロン６６の基質に結合したＤＮＡのサンプルと反応する。標識されたＤＮＡプローブに相補的であるＤＮＡ配列を有する領域は、再アニーリング反応の結果、それ自身標識される。さらに、このように標識されたフィルターの領域を、例えば、ラジオオートグラフィーによって肉眼観察する。
【００５５】
また、リガーゼ連鎖反応(ligase chain reaction)（ＬＣＲ）等の、プロービング技術(probing technique)は、ミスマッチプローブ、すなわち突然変異の点(point)以外はターゲットと完全に相補性を有するプローブを用いる。さらに、ターゲット配列を、以下の２つのオリゴヌクレオチドを識別できる条件下で、完全に相補性を有するオリゴヌクレオチドおよびミスマッチ(mismatch)を含むオリゴヌクレオチドの両方とハイブリッド形成させる。反応条件を操作することによって、完全に相補性を有する場合のみハイブリッド形成を得ることが可能である。ミスマッチ(mismatch)が存在する際には、非常にハイブリッド形成が減少する。
【００５６】
ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction)（ＰＣＲ）は、かなり効率よく特異的なＤＮＡ配列を増幅させる技術である。熱に安定な酵素であるＴａｑＩポリメラーゼを用いて行われた変性、プライマーのアニーリングおよび拡張(extension)を繰り返し行うことによって、目的とするＤＮＡ配列の濃度が指数的に増加する。
【００５７】
ＡＤのアミロイドタンパク質の前駆体をエンコードするヌクレオチド配列が分かること（カング(Kang)ら、上記引用文(loc. cit.)およびヨシカイ(Yoshikai)、上記）により、有用なＤＮＡに隣接する配列に相補的である合成のオリゴヌクレオチドが調製できる。それぞれのオリゴヌクレオチドは２本鎖の一つに相補的である。さらに、ＤＮＡを高温（例えば、９５℃）で変性させ、次に、過剰な高いモル濃度のオリゴヌクレオチドの存在下で再アニーリングする。それぞれが互いに向いている３’方向の、オリゴヌクレオチドを、ターゲット配列の反対の鎖とハイブリッド形成させ、さらに、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で核酸の鋳型に沿って酵素拡張(enzymatic extenssion)を開始する。次に、末端生成物を他のサイクルのために再変性する。この３段階のサイクル(three-step cycle)を数回繰り返した後、百万倍以上によるＤＮＡセグメントの増幅が得られる。さらに、このようにして得られたＤＮＡを、遺伝的な変化の位置を決定するために直接配列決定を行う。または、変化したＤＮＡにのみ結合するオリゴヌクレオチドを調製することも可能であり、これによって突然変異が存在する際にＰＣＲによってのみＤＮＡが増殖する。ＰＣＲ後、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成（ジヘラ(Dihella)ら、（１９８８年）、ランセット(Lancet)、１：４９７）を用いて、ＡＤの点突然変異を検出する。または、特異的な対立遺伝子の増幅と呼ばれるＰＣＲ（ＰＡＳＡ）を用いることもできる；上記は、１塩基対が異なる対立遺伝子間を迅速にかつ正確に識別するために分画増幅(differential amplification)を用いる。
【００５８】
さらに他の方法においては、ＰＣＲの後に、このようにして得られた生成物をさらに分析する制限エンドヌクレアーゼによる消化を行う。エキソン１７の配列決定の結果で見られるように、２１４９番目の塩基対でのＣからＴこのへの置換によって、ＢｃｌＩの制限部位が生じる。この制限エンドヌクレアーゼの認識部位が生じることによって、ＲＦＬＰ分析を用いたＡＤの突然変異の検出または７１７番目のコドンを含むＰＣＲによる生成物における多形性のＢｃｌＩ部位の存在若しくは欠損の検出が容易になる。
【００５９】
ＲＦＬＰ分析のために、例えば、ＡＤに罹っていると思われる被験者のおよび正常な被験者の血液からＤＮＡを得、制限エンドヌクレアーゼのＢｃｌＩで消化し、さらに、アガローズゲル電気泳動を用いて大きさによって分離する。次に、標識されたプローブを用いてハイブリッド形成することによって、エンドヌクレアーゼで消化された生成物を検出するために、サザンブロット(Southern blot)技術を用いることができる。サザンブロット(Southern blot)により得られたパターンをさらに比較できる。このような方法を用いて、ＢｃｌＩ部位等の、７１７番目のコドンでの制限部位を作製するまたは除去するアルツハイマー病の突然変異にまたがるＤＮＡを、検出されたバンドの数をはかり、この数をバリンをエンコードする７１７番目のコドンの対立遺伝子を有する規準となる対立遺伝子のものと比較することによって、検出する。
【００６０】
相応じて、２１５０番目の塩基対でのＴからＧのへの置換によって、ＳｆａＮＩの制限部位（ＧＣＡＴＣ）が生じ、これは、必要な変更を加えて(mutatis mutandis)上記の方法と同様にして利用される。７１７番目のコドンがバリン以外のアミノ酸をエンコードする、７１７番目のコドン内でのヌクレオチドの置換によってさらに制限部位が同様にして生じることは、遺伝コードおよび制限エンドヌクレアーゼによって認識されたヌクレオチド配列のリストを参考することによって容易に算定できる（プロメガ  プロトコルズ  アンド  アプリケーションズ  ガイド(Promega Protocols and Applications Guide)、（１９９１年）、プロメガ  コーポレーション(Promega Corporation)、マディソン、ウィスコンシン(Madison Wisconsin)）。
【００６１】
１本鎖立体配座解析(single strand conformational analysis)（ＳＳＣＡ）（オリタ(Orita)ら、（１９８９年）、ジェノミックス(Genomics)、５：８７４およびオリタ(Orita)ら、（１９９０年）、ジェノミックス(Genomics)、６：２７１）は、少なくともある例においては好ましい配列の変化を迅速に検出する方法を提供している。
【００６２】
特異的な対立遺伝子のＰＣＲ増幅（ＰＡＳＡ）は、１塩基の突然変異あるいは多形性を素早く検出する方法である（ニュートン(Newton)ら、（１９８９年）、ヌクレイック  アシッズ  レス(Nucleic Acids Res.)、１７：２５０３；ニコルズ(Nichols)ら、（１９８９年）、ジェノミックス(Genomics)、５：５３５；オカヤマ(Okayama)ら、（１９８９年）、ジェー  ラボ  クリン  メディ(J. Lab. Clin. Med.)、１１４：１０５；サーカー(Sarkar)ら、（１９９０年）、アナル  バイオケム(Anal. Biochem.)、１８６：６４；ソマー(Sommer)ら、（１９８９年）、マヨ  クリン  プロック(Mayo Clin. Proc.)、６４：１３６１；ウ(Wu)ら、（１９８９年）、プロック  ナショル  アカデ  サイ  ユーエスエー(Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A.)、８６：２７５７；およびダットン(Dutton)ら、（１９９１年）、バイオテクニックス(Biotechniques)、１１：７００））。ＰＡＳＡ（対立遺伝子の特異的増幅として知られている）は、対立遺伝子に特異的である等の２本のオリゴヌクレオチドのプライマーによる増幅を含む。対立遺伝子に特異的なプライマーの３’末端の若しくは付近の塩基とのミスマッチ(mismatch)により他の対立遺伝子はあまり増幅しないが、目的とする対立遺伝子が効果的に増幅する。このようにして、ＰＡＳＡまたはＰＡＭＳＡの関連した方法を用いて、１つ若しくはそれ以上の７１７番目のコドンが変異したＡＰＰの対立遺伝子を特異的に増幅できる、このような増幅が個体より得られた遺伝材料（若しくはＲＮＡ）上でなされる際には、個体における１つ若しくはそれ以上の７１７番目のコドンが変異したＡＰＰの対立遺伝子の存在の検出方法として機能できる。
【００６３】
同様にして、リガーゼ連鎖反応(ligase chain reaction)（ＬＣＲ）として知られている方法は、鎌状赤血球貧血を引き起こすヘモグロビンの対立遺伝子における１塩基置換を良好に検出するために用いられる（バラニー(Barany)ら、（１９９１年）、プロック  ナショル  アカデ  サイ  ユーエスエー(Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A.)、８８：１８９；ワイス(Weiss、（１９９１年）、サイエンス(Science))、２５４：１２９２）。ＬＣＲのプローブを一緒に用いる、または多数の異なる突然変異体を同時にスクリーニングするために複合したものを用い(multiplex)てもよい。したがって、７１７番目のコドンが変異したＡＰＰの対立遺伝子のスクリーニングの一方法としては、バリンはエンコードしないがアミノ酸をエンコードする７１７番目のコドンを有するＡＰＰの対立遺伝子を検出する少なくとも２つの、好ましくはすべてのＬＣＲのプローブを複合して用いるものがある。普遍遺伝コードによって、すべてのバリン以外をエンコードしたアミノ酸の同義配列(degenerate sequence)が得られるため、特に７１７番目のコドンが変異した対立遺伝子を検出するためのＬＣＲのプローブの設計は簡単であり、ＬＣＲのプローブ等の複合して用いられたプール(pool)を目的とする特殊な使用に対して従業者の裁量で選択できる。
【００６４】
上記の技術またはこれらの変形のいずれかを用いて診断を行うにあたって、様々な個体を調べることは好ましい。上記としては、疾病していない親、疾病している親、疾病している兄弟、疾病していない兄弟が挙げられ、さらにはより遠い血族の人々をも恐らく挙げられる。
【００６５】
モデル動物および細胞株
家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の原因としてのβ−アミロイド遺伝子の７１７番目のコドンにおける特異的なと突然変異を同定することによって、遺伝子操作を用いて、例えば、薬剤をスクリーニングするおよび薬剤の効果を評価するためのモデルシステムとして使用する突然変異ＦＡＤ遺伝子（若しくはこの一部）を含む形質転換モデルシステムおよび／または全細胞システムを開発することができる。さらに、このようなモデルシステムによって、ＡＰＰおよびβ−アミロイドの代謝の基礎的な生化学を定義する道具が得られ、これによって合理的な薬剤の設計の基礎が得られる。
【００６６】
細胞システムの一タイプは自然由来のものである。このタイプでは、例えば、エプスタイン−バールウィルス(Epstein-Barr virus)を用いてリンパ芽球様細胞株(lyphoblastoid cell line)中に永久に形質転換できる必要な細胞を提供するために、疾病した被験者からの血液サンプルを得なければならない。
【００６７】
確立されたら、このような細胞株を浮遊培養で連続して生育させ、ＡＰＰの発現およびプロセッシングを研究するための様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験に用いる。
【００６８】
ＦＡＤの突然変異体は優性であるため、細胞株の構築方法としては、（安定にまたは一時的のいずれかで）確立された選択細胞株中に突然変異遺伝子、若しくは７１７番目のコドンを含むこれらの一部を遺伝子操作することも挙げられる。シソディア(Sisodia)（（１９９０年）、サイエンス(Science)、２４８：４９２）は、トランスフェクションよる哺乳動物細胞への正常なＡＰＰ遺伝子の挿入を記載している。オルタースドルフ(Ortersdorf)ら（（１９９０年）、ジェー  バイオル  ケム(J. Biol. Chem.)、２６５：４４９２）は、不死化された真核生物の細胞株へのＡＰＰの挿入について記載している。
【００６９】
バキュロウィルスの発現システムは、真核生物の細胞における異種遺伝子を高いレベルで発現させるのに有用である。クノプス(Knops)ら、（１９９１年）、ジェー  バイオル  ケム(J. Biol. Chem.)、２６６（１１）：７２８５は、このようなシステムを用いたＡＰＰの発現について記載している。
【００７０】
本発明の方法をさらに使用すると、突然変異遺伝子を有する形質転換動物の作製に使用できる突然変異遺伝子（すなわち、７１７番目のコドンが変異したＡＰＰの遺伝子）を除去できる。例えば、ヒトの７１７番目のコドンが変異したＡＰＰの対立遺伝子全体を、クローニングベクター（例えば、λシャロン３５、コスミド、若しくは酵母の人工染色体）中に、一部または全体として、クローニングし、単離する。ヒトの７１７番目のコドンが変異したＡＰＰの遺伝子を、一部または全体、マウス等の、ヒト以外の宿主動物に転移する。転移の結果、このようにして得られたヒト以外の形質転換動物は、好ましくは１つまたはそれ以上の７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドを発現する。最も好ましくは、本発明のヒト以外の形質転換動物は、ニューロンに特異的な様式で１つまたはそれ以上の７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドを発現する（ウィラック(Wirak)ら、（１９９１年）、イーエムビーオー（ＥＭＢＯ）、１０：２８９）。最初の主要なＡＰＰの転写開始部位の付近および上流にある４．５キロベースの配列を含むヒトの全ＡＰＰ遺伝子（７１７番目のコドンが突然変異したものをエンコードする）を実質的に転移することによって上記が達成される。
【００７１】
または、７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドをエンコードするミニ遺伝子を設計してもよい。このようなミニ遺伝子は、ポリアデニル化シグナル(pokyadenylation signal)配列の下流および上流のプロモーター（および好ましくはエンハンサー）に連結した、好ましくは全長の、７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチド、ＡＰＰ遺伝子のエキソンの組み合わせ、若しくはこれらの組み合わせをエンコードするｃＤＮＡ配列を含む。このようなミニ遺伝子の構築物は、適当な形質転換宿主（例えば、マウス若しくはラット）中に導入されると、エンコードされた７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチド、最も好ましくはＡＰＰ７７０の７１７番目のコドンまたはＡＰＰのイソ型若しくは断片の相当する位置にイソロイシン、グリシン、若しくはフェニルアラニンのいずれかを含む７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドを発現する。
【００７２】
形質転換動物を作製する一方法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの胚の幹(embryonic stem)（ＥＳ）細胞株において相同的組換によって目的とする遺伝子に突然変異を行った後、宿主の未分化胚芽細胞(blastocyst)中に修飾されたＥＳ細胞株をマイクロインジェクションし、さらに養い母中で培養するものがある（フローマン(Frohman)およびマーティン(Martin)、（１９８９年）、セル(Cell)、５６：１４５を参照）。または、１細胞の胚への突然変異遺伝子若しくはこれの一部のマイクロインジェクション後に養い母において培養する技術を使用してもよい。形質転換動物、特に野生型のＡＰＰのイソ型若しくは断片を発現する形質転換動物の様々な使用が、ウィラック(Wirak)ら、（１９９１年）、イーエムビーオー（ＥＭＢＯ）、１０（２）：２８９；シリング(Schilling)ら、（１９９１年）、ジーン(Gene)、９８（２）：２２５；クオン(Quon)ら、（１９９１年）、ネイチャー(Nature)、３５２：２３９；ウィラック(Wirak)ら、（１９９１年）、サイエンス(Science)、２５３：３２３；およびカワバタ(Kawabata)ら、（１９９１年）、ネイチャー(Nature)、３５４：４７６において開示されている。さらなる形質転換動物の作製方法は既知である。
【００７３】
または、部位特異的突然変異誘発および／または遺伝子変換を用いて、突然変異された対立遺伝子がヒトのＡＰＰ遺伝子の（ＡＰＰ７７０の）７１７番目のコドン（この位置はヒトのＡＰＰ遺伝子若しくはＡＰＰ７７０タンパク質に対するマウスのＡＰＰ遺伝子若しくはＡＰＰタンパク質の相同性のマッチング(homology matching)によって容易に同定される）に相当するマウスのＡＰＰ遺伝子におけるコドンの位置にバリンをエンコードしない等の、内因性の若しくはトランスフェクションされた、マウス（または他のヒト以外の動物）のＡＰＰ遺伝子の対立遺伝子を突然変異できる。好ましくは、このような突然変異されたマウスの対立遺伝子は、相当するコドンの位置でイソロイシン若しくはグリシン若しくはフェニルアラニンをエンコードしている。
【００７４】
治療
家族性ＡＤの明白な徴候をまだ示さない個人においてβ−アミロイドタンパク質に対してコードする遺伝子配列中の遺伝子の突然変異を検出することによって、本発明の方法を用いて、病気の発達を防止する、遺伝子の移植の形態を有する、遺伝子治療を用いることが可能である。
【００７５】
変異ＡＰＰタンパク質の製造のモジュレーションに対するさらなる実施態様としては、変異ＡＰＰ配列、または実施態様によっては野生型のＡＰＰ配列のすべて若しくは一部に相補的である特異的なアンチセンスなポリヌクレオチドを用いる方法が挙げられる。このように相補的なアンチセンスなポリヌクレオチドとしては、関連したターゲット配列、すなわち７１７番目のコドンが変異したＡＰＰ配列に対する特異的なハイブリッド形成がポリヌクレオチドの性質として維持されればよく、具体的には、ヌクレオチドの置換、添加、欠損、または転位が挙げられる。したがって、アンチセンスなポリヌクレオチドは、野生型のＡＰＰ（つまり、７１７番目のコドンがバリンをエンコードする）と比較した場合、変異ＡＰＰ（つまり、７１７番目のコドンがバリンをエンコードしない）配列に選択的に結合しなければならない。このアンチセンスなポリヌクレオチドは変異対立遺伝子（若しくは必要であれば野生型の対立遺伝子）のヌクレオチド配列を意味し、同義性配列(degenerate sequence)を意味するものではないことは明らかである。
【００７６】
相補的なアンチセンスなポリヌクレオチドとしては、変異ＡＰＰのＭＲＮＡ種に特異的にハイブリッド形成でき、ｍＲＮＡ種の転写および／またはエンコードされたポリペプチドの翻訳を防止できる可溶性のアンチセンスなＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチドが挙げられる（チング(Ching)ら、（１９８９年）、プロック  ナショル  アカデ  サイ  ユーエスエー(Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A.)、８６：１０００６；ブローダー(Broder)ら、（１９９０年）、アン  イント  メディ(Ann. Int. Med.)、１１３：６０４；ロロイ(Loreau)ら、（１９９０年）、エフイービーエス  レターズ(FEBS Letters)、２７４：５３〜５６；ホルセンベルグ(Holcenberg)ら、ＷＯ９１／１１５３５；米国特許番号：７，５３０，１６５号（「ニュー  ヒューマン  クリプト  ジーン(New human CRIPTO gene)」−ダーウェント  パブリケーションズ  エルティディ、ロクデイル  ハウス、１２８  テオバルズ  ロード、ロンドン(Derwent Publications Ltd., Rochdale House, 128 Theobalds Road, London)、英国）より出版；ＷＯ９１／０９８６５；ＷＯ９１／０４７５３；ＷＯ９０／１３６４１；およびＥＰ３８６５６３号、それぞれここでは参考として挙げられている）。したがって、このアンチセンスなポリヌクレオチドは変異ＡＰＰのポリヌクレオチドの製造を阻害する。アンチセンスなポリヌクレオチドが転写を選択的に阻害するおよび／または変異（若しくは野生型の）ポリペプチドに相当するｍＲＮＡの翻訳がＴリンパ球の活性化を阻害することができる。
【００７７】
アンチセンスなポリヌクレオチドは、好ましくは発現カセットが細胞タイプの特異的な発現を促進する配列を含むものである、形質転換された神経性の、神経膠の、若しくは星状細胞等の、トランスフェクションされた細胞または形質転換細胞若しくは動物において異種の発現カセットより生産される（ウィラック(Wirak)ら、上記引用文(loc. cit.)）。または、アンチセンスなポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養液若しくは循環系若しくはｉｎ  ｖｉｖｏの間質液のいずれかにおける、外部環境に投与される可溶性のオリゴヌクレオチドからなる。外部環境に存在する可溶性のアンチセンスなポリヌクレオチドは、細胞質に接近して特異的なｍＲＮＡ種の翻訳を阻害することが知られている。実施態様によっては、アンチセンスなポリヌクレオチドはメチルホスホネート(methylphosphonate)部分からなる。アンチセンスなポリヌクレオチドに関する一般的な方法については、アンチセンス  ＲＮＡ  アンド  ＤＮＡ(Antisense RNA and DNA)、（１９８８年）、ディエー  メルトン(D.A. Melton)、出版、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、コールド  スプリング  ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨークを参照。
【００７８】
変異ＡＰＰの抗原およびモノクローナル抗体
本発明の他の概念においては、ＡＰＰに対してコードする遺伝子配列中の遺伝子の変化を検出することによって、同じ源の変化したβ−アミロイドタンパク質のサンプルが得られる。このタンパク質は、アルツハイマー病に罹っていると診断された被験者の脳組織由来であり、または、より好ましくは、このタンパク質は組換ＤＮＡ方法によって製造されるまたは固体の支持体における直接化学合成(direct chemical synthesis)によって合成される。このようなポリペプチドは、７１７番目のコドンを含むＡＰＰの変異対立遺伝子のアミノ酸配列を含むものである。上記配列の例を以下に示す：
(a)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Gly-Ile-Thr-Leu- [配列番号:7]
(b)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Met-Ile-Thr-Leu- [配列番号:8]
(c)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Ala-Ile-Thr-Leu- [配列番号:9]
(d)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Ser-Ile-Thr-Leu- [配列番号:10]
(e)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Ile-Ile-Thr-Leu- [配列番号:11]
(f)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Leu-Ile-Thr-Leu- [配列番号:12]
(g)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Thr-Ile-Thr-Leu- [配列番号:13]
(h)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Pro-Ile-Thr-Leu- [配列番号:14]
(i)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-His-Ile-Thr-Leu- [配列番号:15]
(j)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Cys-Ile-Thr-Leu- [配列番号:16]
(k)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Tyr-Ile-Thr-Leu- [配列番号:17]
(l)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Phe-Ile-Thr-Leu- [配列番号:18]
(m)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Glu-Ile-Thr-Leu- [配列番号:19]
(n)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Trp-Ile-Thr-Leu- [配列番号:20]
(o)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Arg-Ile-Thr-Leu- [配列番号:21]
(p)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Ile-Thr-Leu- [配列番号:22]
(q)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Asn-Ile-Thr-Leu- [配列番号:23]
(r)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Lys-Ile-Thr-Leu- [配列番号:24]
(s)-Ile-Ala-Thr-Val-Ile-Gln-Ile-Thr-Leu- [配列番号:25]
さらに、このようなポリペプチド材料を用いて、例えば、コーラー(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)（（１９７５年）、ネイチャー(Nature)、２５６：４９５）の方法を用いて、抗血清およびモノクローナル抗体を調製できる。さらに、このようなモノクローナル抗体は診断テストの基礎を形成するものである。
【００７９】
このような変異ＡＰＰのポリペプチドを用いて、特異的な抗体の製造のために動物を免疫処理する。これらの抗体は、多クローン性の抗血清からなるまたはハイブリドーマ細胞によって製造されるモノクローナル抗体からなる。抗体の一般的な調製方法については、アンチボディズ：ア  ラボラトリー  マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)、（１９８８年）、イー  ハーロウ(E. Harlow)およびディ  レイン(D. Lane)、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、コールド  スプリング  ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨークを参照（これはここでは参考として挙げられている）。
【００８０】
例えば、以下に制限されないが、組換によって製造される７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドの断片を、免疫反応を生じるようにアジュバントと共にマウスに注入することができる。少なくとも１×１０７Ｍ−１の結合親和性(binding affinity)を有する組換断片を結合するマウスの免疫グロブリンを、抗血清として免疫処理されたマウスから集め、さらに、アフィニティクロマトグラフィーまたは他の方法によって精製する。さらに、脾臓細胞をマウスより集め、ミエローマ細胞に融合させ、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞のバンクを作製する。ハイブリドーマのバンクから、少なくとも１×１０６Ｍ−１の親和力を有する組換えで生産された断片を結合する免疫グロブリンを分泌するクローンをスクリーニングできる。さらに詳しくは、７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドには結合するが野生型の（すなわち、７１７番目のコドンがバリンをエンコードする）ＡＰＰのポリペプチドとの交差反応性が限られている免疫グロブリンが、野生型のＡＰＰによる予備吸着(preabsorption)または野生型と比較した場合変異体を選択的に結合する特異的なイディオタイプのハイブリドーマ細胞株のスクリーニングのいずれかによって、選択される。
【００８１】
最終的に目的とする変異ＡＰＰポリペプチドを発現できる本発明の核酸配列を、様々な異なるポリヌクレオチド（ゲノム若しくはｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチド等）から、さらには様々な異なる技術によって、形成できる。
【００８２】
前記したように、ＤＮＡ配列は、配列を発現調節配列に操作して連結した(operably link)（つまり、発現調節配列の機能を確保するために位置づけた）後、宿主において発現する。これらの発現ベクターは、具体的にはエピソームとしてあるいは宿主の染色体ＤＮＡの内在性の一部として宿主生物において複製可能である。一般的には、発現ベクターは、目的とするＤＮＡ配列を形質転換した細胞を検出および／または選択できるような、例えばテトラサイクリン耐性またはヒグロマイシン耐性等の、選択マーカーを有する（例えば、米国特許番号：４，７０４，３６２号を参照、これはここでは参考として挙げられている）。
【００８３】
７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、エンコードされたポリペプチド生成物が生産される等の、コーディング配列(coding sequence)の転写（発現配列）および翻訳を容易にする配列を含む。このようなポリペプチドの構築は既知であり、マニアティス(Maniatis)ら、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、２版、（１９８９年）、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク(Cold Spring Harbor, N.Y.)に記載されている。例えば、以下に制限されないが、このようなポリペプチドとしては、プロモーター、転写終結部位（真核生物の発現宿主においてはポリアデニル化部位(pokyadenylation site)）、リボソーム結合部位、および必要であれば、真核生物の発現宿主において使用するエンハンサー、およびさらに必要であれば、ベクターの複製に必要な配列が挙げられる。
【００８４】
大腸菌(E.coli)は、本発明のＤＮＡ配列をクローニングするために特に有用な一原核生物宿主である。使用するのに適している他の微生物宿主としては、バチルス  サブチルス(Bacillus subtilus)等のバチルス(Bacillus)、およびサルモネラ(Salmonella)等の他の腸内細菌、セラティア(Serratia)、及び様々なシュードモナス種(Pseudomonas species)が挙げられる。これらの原核生物宿主においては、発現ベクターを作製することも可能であり、具体的には、これらのベクターは宿主細胞と両立できる発現制御配列（例えば、複製起点）を含む。さらに、ラクトースのプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）のプロモーターシステム、β−ラクタマーゼのプロモーターシステム、またはλファージのプロモーターシステム等の、多くの様々な既知のプロモーターが存在する。これらのプロモーターは、具体的には、必要であればオペレーター配列と共に発現を制御し、さらに、転写及び翻訳を開始し終了させるために、リボソーム結合部位配列等を有する。
【００８５】
酵母等の、他の微生物を発現に用いてもよい。３−ホスホグリセリン酸キナーゼ若しくは他の解糖酵素を含む、プロモーター、および複製起点等の、発現制御配列、および必要であれば終結配列等を有する適当なベクターを有する、サッカロマイセス(Saccharomyces)が、好ましい宿主である。
【００８６】
微生物に加えて、哺乳動物の組織細胞培養物も、本発明のポリペプチドを発現し、生産するのに使用できる（ウィンナッカー(Winnacker)ら、「フロム  ジーン  ツー  クローンズ(From Gene to Clones)」、ブイシーエッチ  パブリッシャーズ(VCH Publishers)、ニューヨーク、ニューヨーク、（１９８７年）を参照、これはここでは参考として挙げられている）。真核生物の細胞が、ヒトのタンパク質をそのまま分泌できる多くの好ましい宿主細胞株が当該分野において開発されているため、実際に好ましく、具体的には、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ヒーラ(HeLa)細胞、ミエローマ細胞株、ジャーカット細胞(Jurkat cell)等が挙げられる。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー等の発現制御配列（クイーン(Queen)ら、（１９８６年）、イムノル  レブ(Immunol. Rev.)、８９：４９、これはここでは参考として挙げられている）、およびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位(pokyadenylation site)、及び転写終結配列等の必要なプロセッシング情報部位(processing information site)を含む。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウィルス、ウシのパピローマウィルス等由来のプロモーターである。有用なＤＮＡセグメント（例えば、変異ＡＰＰポリペプチドをエンコードするポリペプチド）を含むベクターを、細胞宿主のタイプによって変わる、既知の方法によって宿主細胞に転移することができる。例えば、塩化カルシウムによるトランスフェクションは一般的に原核生物の細胞に用いられるが、リン酸カルシウム処理若しくはエレクトロポレーションは他の細胞宿主に使用される。（通常、マニアティス(Maniatis)ら、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、コールド  スプリング  ハーバー  プレス、(Cold Spring Harbor Press)、（１９８２年）を参照、これはここでは参考として挙げられている。）
または、相同的組換を用いて、特異的な部位、例えば、宿主のＡＰＰ遺伝子座において、宿主ゲノム中にＡＰＰの変異配列を挿入してもよい。相同的組換の一つのタイプでは、１つまたはそれ以上の宿主の配列を置き換える；例えば、宿主のＡＰＰの対立遺伝子（若しくはこの一部）を変異ＡＰＰの対立遺伝子（若しくはこの一部）と置換する。このような遺伝子の置換方法に加えて、相同的組換を用いて、宿主のＡＰＰ遺伝子座以外の特異的な部位に変異ＡＰＰの対立遺伝子を標的にして(target)もよい。相同的組換を用いて、変異ＡＰＰの対立遺伝子を導入したヒト以外の形質転換動物および／または細胞を作製できる。
【００８７】
この方法自身によって、診断において使用できるテストキットを容易に形成できる。このようなキットは、第一のコンテナー(container)が適当に標識されたＤＮＡプローブを含む１つまたはそれ以上のコンテナー(container)を密に並べて区分されるキャリアー(carrier)からなる。他のコンテナー(container)は、酵素基質等の、標識されたプローブの位置を決定するのに用いる試薬を含む。さらに他のコンテナー(container)には、制限酵素（ＢｃｌＩ等）、バッファーなどが、使用のための指示に従って入っている。
【実施例】
【００８８】
以下の実施例によって詳細に説明するが、以下の実施例によって本発明は制限されるものではない。
【００８９】
（実施例１−β−アミロイド（ＡＰＰ）遺伝子におけるＶａｌ−＞Ｉｌｅの突然変異の検出）
アルツハイマー病を剖検で確認した一家族（図１を参照）おける第２１染色体の長腕に沿ったＡＤおよびマーカーの分離(segregation)を評価した。６人の疾病した人および３３人の疾病していないが疾病する危険を有する人からのＤＮＡサンプルを用いた。
【００９０】
疾病した家族員におけるＡＰＰ遺伝子を、イントロンのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction)（ＰＣＲ）の直接配列決定(direct sequencing)によって分析した（ギレンステン(Gyllensten)、ユー  イン  ピーシーアール  テクノロジー(U. in PCR Technology)、エリック，エッチエー(Erlich, H.A.)著、ストックトン  プレス(Stockton Press)、４５〜６０、１９８９年；ヨシカイ(Yoshikai)ら、（１９９０年）、ジーン(Gene)、８７：２５７）。（図２）。このプライマーを、ジーン  アセンブラー  プラス(Gene Assembler Plus)（ファルマシア  エルケービー(Pharmacia LKB)製）を用いて製造会社のプロトコルにしたがって作製した。
【００９１】
ＡＰＰ遺伝子のエキソン１７を増幅するために、ＰＣＲを以下のイントロンのプライマーを用いて行った：
[A]5'-CCTCATCCAAATGTCCCCGTCATT-3' [配列番号:26]および
[B]5'-GCCTAATTCTCTCATAGTCTTAATTCCCAC-3' [配列番号:27]
ＰＣＲの条件は、９４℃、１０分間で変性；さらに、６０℃で１分、７２℃で３分、９４℃で１．５分を３５サイクル；および７２℃で１０分を１サイクル。１０ｍＭトリス−塩酸  ｐＨ８．３、５０ｍＭ塩化カリウム、０．０１％ゼラチン、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ピコモルのそれぞれのＰＣＲプライマーおよび１単位のＴａｑポリメラーゼを用いて、反応を行った。全体の最終反応容積は２５μｌであった。
【００９２】
次に、第二のＰＣＲ反応を、最終濃度がプライマー［Ａ］が５０ピコモルおよびプライマー［Ｂ］が０．５ピコモルで行った。ＰＣＲ生成物を、セントリコン  １００  マイクロコンセントレーター(centricon 100 microconcentrator)（アミコン(Amicon)製）上で精製し、製造会社のプロトコルにしたがってシークエナーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）キット（バージョン  ２．０、ユナイテッド  ステーツ  バイオケミカル  コープ(United States Biochemical Corp.)；シークエナーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）は商標である）を用いた配列決定のために直接用いた。
【００９３】
エキソン１７はβ−アミロイドペプチドの一部をエンコードし、ダッチタイプのアミロイド症（「エッチシーエッチダブルエー−ディ」（“ＨＣＨＷＡ−Ｄ”））による遺伝性の脳出血を引き起こす（ＡＰＰ６９３の）突然変異の部位であるため、これを最初に配列決定した。
【００９４】
エキソン１７の配列分析によって、７１７番目のアミノ酸でバリンからイソロイシンへの変化が生じる、２１４９番目の塩基対でＣからＴへのトランジションが明らかになった（図２および図３）。
【００９５】
このＣからＴへのトランジションによって、ＰＣＲの生成物内で検出できるＢｃｌＩの制限部位が生じる（図４）。製造会社によって推奨されているように、ＢｃｌＩによる消化を５０℃で２〜４時間行い、さらに、３％アガロースで電気泳動した。
【００９６】
１００人の関連のない正常な個人および１４ケース（９家族）の家族性の後年に始まる病気のＰＣＲによるスクリーニングでは、この置換が示されなかった。家族性の初期に始まる病気の１１ケース（９家族）のスクリーニングで、関連のない家族の２人の疾病した個人においてＢｃｌＩの制限部位が明らかになった。遺伝的データによって、病気の遺伝子座がミスセンス突然変異体に連結していることが示される。また、２００個の正常な染色体において多形性が検出されなかったことによって、これが病原性のある突然変異体であるという主張が支持される。
【００９７】
バリンからイソロイシンへの置換は、β−アミロイドペプチドのＣ−末端のトランスメンブランドメインの２残基内で起こる。コンピューター分析によって、置換によってトランスメンブランがより疎水性になり、これによって膜内により強力にタンパク質を固定することが予想される。置換の位置、β−アミロイドペプチドのＣ−末端から２残基は、沈着したペプチドのオリジン(origin)に重要である。この知見は、アルツハイマー病のエッチシーエッチダブルエー−ディ（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）、つまりアミロイドの沈着がβ−アミロイドペプチド内ではなくＮ−末端により近い突然変異によって起こる病気への関連を示すものである（レヴィ(levy)ら、上記引用文(loc. cit.)）。
【００９８】
（実施例２−欠陥(defective)β−アミロイド（ＡＰＰ）遺伝子を含む細胞株の調製）
１０ｍｌの新鮮な血液を、家族性アルツハイマー病に罹っているそれぞれの個人から集めた。リンパ球をパーコルグラジエント(Percoll gradient)上で血液から精製し、エプスタイン−バールウィルス(Epstein-Barr virus)（ＥＢＶ）と混合した。次に、細胞を１０％ウシ胎児血清、抗生物質、グルタミンおよびＴリンパ球を殺すシクロスポリンＡを追加した培地中に撒いた。ＥＢＶによって感染したＢリンパ球を不死化し、患者のＢ細胞由来の永久細胞株を確立した。
【００９９】
リンパ芽球様細胞株(lyphoblastoid cell line)、ＡＣ２１は、ヨーロッピアン  コレクション  オブ  アニマル  セル  カルチャーズ(European Collection of Animal Cell Cultures)、ポートン  ダウン(Porton Down)に寄託されている。
【０１００】
（実施例３−β−アミロイド（ＡＰＰ）遺伝子におけるＶａｌ−＞Ｇｌｙの突然変異の検出）
疾病年齢が５９±４才であるＡＤを剖検で確認した、Ｆ１９と称され、図５に示された家系を、ＡＰＰ遺伝子の近くに位置する、非常に多形性であるジヌクレオチドの反復マーカー(repeat marker)ＧＴ１２の対立遺伝子（Ｄ２１Ｓ２１０）が病気とコセグレゲートする(co-segregate)ことを観察することによって確認した。連鎖分析(linkage analysis)によって、以下の表に示されるように、組換画分がゼロの際にマーカーと病気との間のピーク  ロッド  スコア(peak lod score)が３．０２であった：
シータ  0     0.01  0.05  0.1   0.2   0.3   0.4 
ロッド  3.02  2.97  2.75  2.47  1.86  1.22  0.6 
ロッド  スコア(lod score)を、リンケージ（ＬＩＮＫＡＧＥ）パッケージ(package)のムリンク（ＭＬＩＮＫ）を用いて０．００１の表現型模写率および０．００１の遺伝子頻度を有する年齢に依存している浸透度が０．０１から０．９５である病気に罹りやすい７クラスを用いて計算した（ラトロップ(Lathrop)ら、（１９８４年）、プロック  ナショル  アカデ  サイ  ユーエスエー(Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A.)、８１：３４４３）。
【０１０１】
Ｆ１９の疾病したおよび疾病していない個人のＡＰＰのエキソン１７の配列を決定した。疾病した人においては、図６に示されるように、２１５０番目の位置でＧ−＞Ｔのトランジションが存在した。
【０１０２】
エキソン１７の増幅を、以下のように修飾して、上記実施例１およびチャーティアー−ハーリン(Chartier-Harlin)ら、（１９９１年）、ニューロサイ  レッツ(Neurosci. Letts.)、１２９：１３４に記載されたようにして行った：
（ａ）増幅用のプライマー配列は以下の通りである：
ATA-ACC-TCA-TCC-AAA-TGT-CCC-C [配列番号:28]および
GTA-ACC-CAA-GCA-TCA-TGG-AAG-C [配列番号:29]；さらに
（ｂ）ＰＣＲの条件は、９４℃、１０分間した後、６０℃で１分、７２℃で１分、９４℃で１分を３５サイクル、さらに、７２℃で５分であった。
【０１０３】
５０ピコモルの第二のプライマーを用いて、１本鎖の生成物を生産し、さらに、これを精製した（チャーティアー−ハーリン(Chartier-Harlin)ら、上記引用文(loc. cit.)）。精製した生成物を以下の配列のプライマーを用いてシークエナーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）キット（２．０）（商標；ユーエスビー(USB)）を用いて配列決定した：
AAA-TGA-AAT-TCT-TCT-AAT-TGC-G [配列番号:30]
Ｔ−＞Ｃのトランジションの存在によって、配列決定反応におけるイノシン（シークエナーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）キット）を含ませることによって溶解するゲルのアーチファクトが得られた。
【０１０４】
Ｆ１９の疾病した個人のエキソン７および１６を直接配列決定(direct sequencing)すること（チャーティアー−ハーリン(Chartier-Harlin)ら、上記引用文(loc. cit.)）によって、これらは正常な配列を有することが示され、ＳＳＣＡ（オリタ(Orita)ら、上記引用文(loc. cit.)）および（オリタ(Orita)ら）によってはエキソン２、３、７、９、１２、１３若しくは１５における変化を同定できなかった。エキソン１７のＳＳＣＡによって、標準のスクリーニングの条件下で、ＡＰＰ６９３（レヴィ(levy)ら、上記引用文(loc. cit.)およびハーディ(Hardy)ら、（１９９１年）、ランセット(Lancet)、３３７：１３４２〜１３４３）およびＡＰＰ７１７  Ｖａｌ−＞Ｉｌｅの両方が検出され、修飾すると、ＡＰＰ７１７  Ｖａｌ−＞Ｇｌｙが検出される。
【０１０５】
（実施例４−変異ＡＰＰ対立遺伝子を有する形質転換動物の生産）
構築物の生産：ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ末端がＰｖｕＩＩ部位の付近にくるように、ｐＢＲ３２２のＰｖｕＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間にポリリンカーをクローニングすることによって、ベクタープリンク(vector plink)を構築した。連結によって、ｐＢＲ３２２のセグメントに関連したＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩ部位の両方を破壊した。ＳＶ４０のポリアデニル化シグナル(pokyadenylation signal)を含むｐＳＶ２ｎｅｏ（サザン(Southern)およびベルグ(Berg)、（１９８２年）、ジェー  モル  アップル  ジェネット(J. Mol. Appl. Genet.)、１：３２７）の７００ｂｐのＨｐａＩからＥｃｏＲＩまでの断片を、プリンク(plink)のＨｐａＩからＥｃｏＲＩの部位にクローニングすることによって、ｐＮｏｔＳＶを得た。ＳＶ４０の１６Ｓ／１ｇＳのスプライス部位を含むｐＬ２の２００ｂｐのＸｈｏＩからＰｓｔＩの断片（オカヤマ(Okayama)およびベルグ(Berg)、（１９８３年）、モル  セル  バイオル(Mol. Cell Biol.、３：２８０)）を単離し、クレノウで断端を平滑にし、さらに、ｐＮｏｔＳＶのＨｐａＩ部位にクローニングすることによって、ｐＳｐｌｉｃｅを得た。ＡＰＰに対するｃＤＮＡのコーディング領域(coding region)を含むｐＡＰＰ６９５の２．３ｋｂのＮｒｕＩからＳｐｅＩの断片（タンジ(Tanzi)ら、（１９８７年）、サイエンス(Science)、２３５：８８０）をｐＳｐｌｉｃｅのＮｒｕＩからＳｐｅＩの部位にクローニングすることによって、ｐｄ６９５を得た。同様のストラテジーを用いて、ＡＰＰ７５１（タンジ(Tanzi)ら、（１９８８年）、ネイチャー(Nature)、３３１：５２８）のｃＤＮＡを用いてｐｄ７５１を得た。様々なプロモーターを、単一のＮｒｕＩ部位またはＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩ部位を用いて、ｐｄ６９５およびｐｄ７５１ベクターに挿入した。
【０１０６】
ｐｓｈＡＰＰ６９５およびｐｓｈＡＰＰ７５１の生成：ＡＰＰのｃＤＮＡの１．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片をｐｕｃ１９  ｘＨａｍｙのＢａｍＨＩ部位にクローニングすることによって、構築物、ｐＡｍｙｐｒｏＢａｍを得た。ｐＡｍｙｐｒｏＢａｍの７００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩからＡｓｐ７１８の断片（サルバウム(Salbaum)ら、（１９８８年）、イーエムビーオー(EMBO)、７：２８０７に記載された７００ｂｐのＢａｍＨＩからＡｓｐ７１８の断片と同じ）をｐｄ６９５およびｐｄ７５１のＨｉｎｄＩＩＩからＡｓｐ７１８の部位にクローニングし、ｐｓｈＡＰＰ６９５およびｐｓｈＡＰＰ７５１を得た。
【０１０７】
ｐＡＰＰ６９５およびｐＡＰＰ７５１：ｐＡｍｙｐｒｏＢａｍの３．０ｋｂのＥｃｏＲＩからＸｈｏＩの断片、ＡＰＰ７５１  ｃＤＮＡの１．５ｋｂのＸｈｏＩからＳｐｅＩの断片、およびｐｄ７５１のＳｐｅＩからＥｃｏＲＩの断片の３工程の連結反応(three-way ligation)によって、ｐＡＰＰ６９５およびｐＡＰＰ７５１ベクターを得た。
【０１０８】
ｐＮＳＥ７５１（＋４７）の生成：ｐＮＳＥ６（フォース−ペッター(Forss-Petter)ら、（１９９０年）、ニューロン(Neuron)、５：１８７）のＨｉｎｄＩＩＩからＫｐｎＩの断片、ｐＮＳＥ６のＫｐｎＩからＢｓｔＹＩの断片およびｐＡＰＰ７５１の部分的なＢａｍＨＩ（ＡＴＧより−４７番目）からＨｉｎｄＩＩＩの断片の３工程の連結反応(three-way ligation)を用いて、ｐＮＳＥ７５１（＋４７）を構築した。これによって、ｐＮＳＥ７５１（＋４７）のＫｐｎＩ部位にクローニングされたＫｐｎＩ断片を得た。ＢｓｔＹ１／Ｂａｍの融合によって、両方の部位が欠損する。
【０１０９】
ｐＮＳＥ７５１の生成：これによってＡＰＰのコーディング領域(coding region)へのＮＳＥの開始コドンの直接融合(direct fusion)が生じる、４プライマーの２段階のＰＣＲのプロトコル(4 primer two-step PCR protocol)（ヒグチ(Higuchi)ら、（１９８８年）、ヌクレイック  アシッズ  レス(Nucleic Acids Res.)、１６：７３５１）を用いて、このベクターを得た。オリゴヌクレオチドＣ２、１０７２、１０７３、およびＡ２（下記のヌクレオチド配列を参照）を用いて、ＰＣＲ生成物を得た。制限酵素による消化によってＫｐｎＩ断片を得た。このＫｐｎＩ断片を用いて、ｐＮＳＥ７５１（＋４７）中の同様の断片を置換した。
【０１１０】
ｐＮＳＥ７５１−ハーディ(pNSE751-Hardy)およびｐＮＳＥ７５１−ダッチ(pNSE751-Dutch)の生成：４プライマーの２段階のＰＣＲのプロトコル(4 primer two-step PCR protocol)を用いて、ハーディ(Hardy)（ＡＰＰ６４２  ＡＰＰ６９５のＶａｌ−＞Ｉｌｅ）およびダッチ(Dutch)（ＡＰＰ６１８  ＡＰＰ６９５のＧｌｎ−＞Ｇｌｕ）の突然変異を導入した。反応のセットは両方とも、適当な突然変異を含む「内側のプライマー(inside primer)」を有する同様の「外側のプライマー(outside primer)」を使用した。これによって、消化後ＢｇｌＩＩからＳｐｅＩの断片が生じ、これはダッチ(Dutch)またはハーディ(Hardy)の突然変異のいずれかを含んでいた。ｐＮＳＥ７５１のＢｇｌＩＩからＳｐｅＩの断片を突然変異断片によって置換し、適当なベクターを得た。突然変異の存在をベクターの配列分析によって確認した。
【０１１１】
ｐＮＳＥ７５１−ハーディ(pNSE751-Hardy)およびｐＮＳＥ７５１−ダッチ(pNSE751-Dutch)の生成：４プライマーの２段階のＰＣＲのプロトコル(4 primer two-step PCR protocol)（ヒグチ(Higuchi)ら、（１９８８年））を用いて、ハーディＶＩ(Hardy VI)（ＡＰＰ６４２  ＶからＩ）、ハーディＶＧ(Hardy VG)（ＡＰＰ６４２  ＶからＧ）、およびダッチ(Dutch)（ＡＰＰ６１８  ＥからＱ）の突然変異を導入した。プライマー１１７／７３８、９２２、９２３、および７８５を用いて、ハーディＶＩ(Hardy VI)の突然変異体を得た；プライマー１１７／７３８、１１０５、１１０６、および７８５を用いて、ハーディＶＧ(Hardy VG)の突然変異体を得た；プライマー１１７／７３８、１０１０、１０１１、および７８５を用いて、ダッチ(Dutch)の突然変異体を得た。これらすべての突然変異において、ＰＣＲ生成物を制限酵素で消化することによって、７００ｂｐのＢｇｌＩＩからＳｐｅＩの断片を単離し、さらにｐＮＳＥ７５１の同様の部位にクローニングした。この突然変異は配列分析によって確認した。
【０１１２】
ｐＮＦＨ７５１の生成：ヒトのＮＦＨ遺伝子（リーズ(Lees)ら、（１９８８年）、イーエムビーオー(EMBO)、７（７）：１９４７）を、プローブとしてラットのＮＦＨのｃＤＮＡを用いてゲノムライブラリーから単離した（リーベルバーグ(Lieberburg)ら、（１９８９年）、プロック  ナショル  アシッズ  レス  ユーエスエー(Proc. Natl. Acids. Res. U.S.A.)、８６：２４６３）。ＳｓｔＩ断片をｐＳＫベクターにサブクローニングした。１対のＰＣＲプライマーを作製し、ＮＦＨ遺伝子の開始コドンの直ぐ上流の１５０ｂｐの増幅した断片の３’末端にＮｒｕＩ部位を置いた。５’末端は、開始コドンから１５０番目の上流にＫｐｎＩ部位を有する。ｐＮＦＨ８．８の５．５ｂのＨｉｎｄＩＩＩからＫｐｎＩ断片、ＫｐｎＩからＮｒｕＩのＰＣＲによって生じた断片、およびｐｄ７５１のＨｉｎｄＩＩＩからＮｒｕＩの断片の３工程の連結反応(three-way ligation)によって、ｐＮＦＨ７５１の最終的な構築物を得た。開始コドンでのＰＣＲによって生じた融合物周辺の配列を、配列分析によって確認した。ｐＮＦＨ７５１の同様の断片を配列を確認した突然変異ベクターの６００ｂｐのＢｇｌＩＩからＳｐｅＩの断片で置換することによって、ｐＮＦＨ７５１のダッチ(Dutch)およびハーディ(Hardy)の変異体を得た。突然変異の存在は、突然変異したオリゴマーによるハイブリッド形成によってまたは配列分析によって確認した。
【０１１３】
ｐＴｈｙ７５１の生成：以下の３工程の連結反応(three-way ligation)によって、ｐＴｈｙ７５１ベクターを得た。ヒトのゲノムライブラリーから単離したｐＴｈｙ８．２のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩの断片（チャング(Chang)ら、（１９８５年）、プロック  ナショル  アカデ  サイ  ユーエスエー(Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A.)、８２：３８１９）、合成断片ＴｈｙＡＰＰ、およびｐｄ７５１のＨｉｎｄＩＩＩからＮｒｕＩの断片。
【０１１４】
ＴｈｙＡＰＰを以下に示す：
CAGACTGAGATCCCAGAACCCTAGGTCTGACTCTAGGGTCTTGG [配列番号:31]
ｐＴｈｙＣ１００の生成：以下の３工程の連結反応(three-way ligation)によって、このｐＴｈｙＣ１００構築物を得た。ｐＴｈｙ８．２の３．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩの断片、合成断片ＴｈｙＡＰＰ２、およびｐｄ７５１またはｐＮＳＥ７５１ダッチ(Dutch)若しくはｐＮＳＥ７５１ハーディ(Hardy)のＨｉｎｄＩＩＩからＢｇｌＩＩの断片を連結し、ｐＴｈｙＣ１００を得た。
【０１１５】
ＴｈｙＡＰＰ２を以下に示す：
CAGACTGAGATCCCAGAACCGATCCTAGGTCTGACTCTAGGGTCTTGG [配列番号:32]
開始コドン周辺の領域を配列分析によって確認した。
【０１１６】
注入用のＤＮＡの調製：ＮｏｔＩによる消化およびゲル電気泳動のために有用な相当するベクターから注入用のトランスジーン(transgene)を単離した。このトランスジーン(transgene)をジーン  クリーン  キット(Gene Clean kit)（バイオ１０１(Bio101)）を用いて精製し、さらに、エルチップ(Elutip)またはヌクレオゲン  ４０００  カラム(Nucleogen 4000 column)で精製したＨＰＬＣで精製した。
【０１１７】
マイクロインジェクション：このトランスジーン(transgene)を、ＦＶＢ若しくはＢ６Ｄ２Ｆ２の１細胞胚(one-cell embryo)の最も便利な前核（一般的にはオスの前核）中に２〜２０μｇ／ｍｌ量を注入した（マニピュレイティング  ザ  マウス  エンブリオ(Manipulating the Mouse Embryo)、ビー  ホーガン(B. Hogan)、エフ  コンスタンチニ(F. Constantini)、イー  ラシー(E. Lacy)、コールド  スプリング  ハーバー(Cold Spring Harbor)、（１９８６年））。注入された胚を一晩培養した。２細胞段階に分裂した胚を、偽妊娠した(pseudo-pregnant)メスのＣＤ１マウス中に移植した。このマウスを約２１日で離乳させた(weaned)。尾の生検により得られたＤＮＡサンプルを、トランスジーン(transgene)に特異的なプローブ（一般的にはＳＶ４０  ３’のスプライス(SV40 3' splice)およびポリアデニル化シグナル(pokyadenylation signal)配列）を用いたサザンブロットによって分析した。トランスジーン(transgene)の少なくとも１コピーを有する形質転換マウスを同定した。
【０１１８】
形質転換マウスの使用：ｈＡＰＰ遺伝子またはその変異体を発現するマウスを用いて、アミロイドの沈着の病因およびアミロイドの沈着を調節する(modulate)ように設計された治療上の関与を試験できる。
【０１１９】
形質転換マウスの生化学的な分析によって、β−アミロイドに対する前駆体と考えられるＡＰＰの異化作用における可能な中間体が明らかになる。この分析は、動物においてまたは発現する細胞の一次組織培養において行うことができる。
【０１２０】
この動物を用いて、強力な治療物質を試験することができる。マウスの試験群を、一定期間適当な様式で投与される試験化合物によって処理する。試験期間が終了した際、動物を、試験化合物の可能な効果について、行動学的に、生化学的に、および組織学的に評価する。このプロトコルは、試験化合物の作用の予想されるメカニズムに依存する。ＡＤを治療するのに用いられる化合物をこの方法を用いて同定できる。
【０１２１】
[配列表]
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【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】初期に始まるＡＤが明らかに常染色体優性の無秩序(disorder)として受け継がれている第一の家系図を示すものである。この家族における疾病する平均年齢は５７±５才である。黒塗は、疾病した人を意味し、斜線は死亡した人を示す。女性は丸によって示され、男性は四角によって示される。三角はプライバシーの保護のため現在の世代について用いられる。第二世代においては、２人の疾病した兄弟の配偶者は姉妹であった。サンプルは、ハプロタイプが示されている１３人、これらの人々の１９人の子供及び配偶者、および７人のより遠い血縁の疾病していない人から用いた。染色体の長腕上の４遺伝子座における第三世代の各人の２本の第２１染色体の文字を家系図の下に示す。この連鎖データ(linkage data)によって、黒塗の染色体は疾病した父親から受け継がれていることが指摘される。
【図２】疾病した人における２１４９番目の塩基対での１塩基対変化(a single base pair change)を示す図１の家系図の正常なおよび疾病した人におけるＡＰＰ遺伝子のエキソン１７の一部のシークエンシングゲル(sequencing gel)のオートラジオグラフである。このＣからＴへのトランジションによって７１７番目のコドンでのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換が起こることが判る。
【図３】トランスメンブレンドメイン内のバリンからイソロイシンへの突然変異（ＶからＩ）および細胞外ドメインにおけるエッチシーエッチダブルエー−ディ（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）を引き起こす突然変異（ＥからＱ）を示すＡＰＰ遺伝子のエキソン１６および１７によってエンコードされるアミノ酸配列の一部を示すものである。トランスメンブレンドメインの斜線のはいった領域および細胞外ドメインの四角で囲ってあるアミノ酸は、沈着したβ−アミロイドペプチドの配列を示している。
【図４】初期に始まるＡＤ家族における疾病しないおよび疾病した人からのエキソン１７のＰＣＲ生成物のＢｃｌＩ消化物を示し、制限部位および病気のコセグレゲーション(co-segregation)を示すものである。
【図５】家族Ｆ１９の家系図、さらにはＤ２１Ｓ２１０のデータを示すものである。
【図６】Ｆ１９の疾病したおよび疾病しない人のＡＰＰのエキソン１７配列を示すものである。
【図７】ＡＰＰ６９５の配列の一部を示すものである。
【図８】ＡＰＰ６９５の配列の一部を示すものである。
【図９】ＡＰＰ６９５の配列の一部を示すものである。
【図１０】ＡＰＰ６９５の配列の一部を示すものである。
【図１１】ＡＰＰ６９５の配列の一部を示すものである。
【図１２】ＡＰＰ６９５の配列の一部を示すものである。
【図１３】ＡＰＰ６９５の配列の一部を示すものである。
【図１４】ＡＰＰ７５１の配列の一部を示すものである。
【図１５】ＡＰＰ７５１の配列の一部を示すものである。
【図１６】ＡＰＰ７５１の配列の一部を示すものである。
【図１７】ＡＰＰ７５１の配列の一部を示すものである。
【図１８】ＡＰＰ７５１の配列の一部を示すものである。
【図１９】ＡＰＰ７５１の配列の一部を示すものである。
【図２０】ＡＰＰ７５１の配列の一部を示すものである。
【図２１】ＡＰＰ７５１の配列の一部を示すものである。
【図２２】ＡＰＰ７７０の配列の一部を示すものである。
【図２３】ＡＰＰ７７０の配列の一部を示すものである。
【図２４】ＡＰＰ７７０の配列の一部を示すものである。
【図２５】ＡＰＰ７７０の配列の一部を示すものである。
【図２６】ＡＰＰ７７０の配列の一部を示すものである。
【図２７】ＡＰＰ７７０の配列の一部を示すものである。
【図２８】ＡＰＰ７７０の配列の一部を示すものである。
【図２９】ＡＰＰ７７０の配列の一部を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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