(57)【要約】【課題】  従来よりタンパク質の合成効率を向上できる無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法を提供する。【解決手段】  グリセロール等の多価アルコールを含有する抽出用液を用いてカイコ組織からの抽出を行う、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、ならびに該抽出用液を有するカイコ組織抽出用キットを提供する。本発明の調製方法により調製されたカイコ組織の抽出液を用いて無細胞系にてタンパク質合成を行うと、多価アルコールを含有しない抽出溶液を用いて調製された抽出液を用いた場合と比較して、格段にタンパク質合成量が向上される。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価アルコールを含有する抽出用液を用いてカイコ組織からの抽出を行う、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法。
【請求項２】
多価アルコールが、グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ポリエリスリトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、キシロース、マルトースおよびイノシトールのうちから選ばれる少なくともいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抽出後に遠心分離して得られた上清と、該遠心分離後の沈殿からさらに上記抽出用液を用いて抽出を行った後に遠心分離して得られた上清とを混合して、抽出液を調製することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
多価アルコールを含有する抽出用液を有するカイコ組織用抽出キット。
【請求項５】
多価アルコールが、グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ポリエリスリトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、キシロース、マルトースおよびイノシトールのうちから選ばれる少なくともいずれかである、請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、ならびにカイコ組織用抽出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成としては、たとえば、小麦胚芽の抽出液や大腸菌の抽出液を用いる方法が知られている。
【０００５】
しかし、小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成では、抽出液の抽出操作が一般に極めて煩雑であるという欠点がある。
小麦胚芽の抽出液の調製方法の一例として、たとえば、特許文献１には、以下のような手順が記載されている。小麦種子をミルに添加し、破砕した後、篩で粗胚芽画分を得、四塩化炭素とシクロヘキサン混液（四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．５：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を浮上する画分から回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去する。この胚芽画分に混在する種皮などの不純物を静電気帯電体を用いて吸着除去する。次に、この試料から小麦胚乳成分を完全に除去するため、非イオン性界面活性剤であるＮＰ４０の０．５％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄を繰り返す。蒸留水の存在下に再度１回の超音波洗浄を行い、小麦胚芽を純化する。
このように小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成では、抽出液の調製が煩雑であり、多大な時間と労力を要するという不具合がある。
【０００６】
また大腸菌の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成では、大腸菌が原核生物であるため、タンパク質への糖鎖修飾を行うことができず、糖タンパク質を合成することができないという欠点がある。上記糖鎖修飾によりタンパク質に付加される糖鎖は、物質間や細胞間の認識や接着に関与するシグナルやリガンドとして、タンパク質自身の機能調節因子として、またはタンパク質の保護や安定化因子として機能しているものと考えられる。そのため、糖鎖修飾を受けるタンパク質について生体内の機能を解析するためには、糖鎖修飾を受けたタンパク質（糖タンパク質）を取得することが必要であり、タンパク質への翻訳の後に糖鎖修飾も行えるような無細胞系のタンパク質合成が望まれている。
また、無細胞系でのタンパク質の合成効率を可及的に向上させ得ることも望まれていることであり、そのような無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、抽出用液の開発も望まれている。
【特許文献１】特開２０００−２３６８９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、従来よりタンパク質の合成効率を向上できる無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）多価アルコールを含有する抽出用液を用いてカイコ組織からの抽出を行う、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法。
（２）多価アルコールが、グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ポリエリスリトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、キシロース、マルトースおよびイノシトールのうちから選ばれる少なくともいずれかである、上記（１）に記載の方法。
（３）抽出後に遠心分離して得られた上清と、該遠心分離後の沈殿からさらに上記抽出用液を用いて抽出を行った後に遠心分離して得られた上清とを混合して、抽出液を調製することを特徴とする、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）多価アルコールを含有する抽出用液を有するカイコ組織用抽出キット。
（５）多価アルコールが、グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ポリエリスリトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、キシロース、マルトースおよびイノシトールのうちから選ばれる少なくともいずれかである、上記（４）に記載のキット。
【０００９】
なお本明細書において「カイコ」は、カイコガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経るものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むものとする。
カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態では、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通常、４回脱皮して５齢期で成熟する（この成熟した状態のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる）。カイコの幼虫は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。
【００１０】
本明細書における「絹糸腺」は、カイコ幼虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けられる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロインを分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリシンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質となる。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出され、固体化して絹糸となる。
【００１１】
本明細書における「脂肪体」は、カイコ幼虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らかい扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物質を含んでいる。
【００１２】
本明細書における「胚」は、カイコの卵の状態の組織を指すものとする。
【００１３】
本明細書における「無細胞系タンパク質合成」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成（翻訳系）、ならびに、外来鋳型ＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成（転写／翻訳系）のいずれであってもよい。ここで、本発明の合成方法によって無細胞系で合成される「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペプチドから高分子量のいずれをも包含するものとする。また本明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されてなる糖タンパク質も含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来よりタンパク質の合成効率を向上できる無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、ならびにそのためのカイコ組織抽出用キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、多価アルコールを含有する抽出用液を用いてカイコ組織からの抽出を行うことを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法である。かかる抽出用液を用いて調製されたカイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液を用いて無細胞系タンパク質合成反応を行うことで、多価アルコールを含有しない抽出用液を用いて調製されたカイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液を用いて無細胞系タンパク質合成反応を行った場合と比較して、格段にタンパク質合成量が向上される。これは、その詳細は不明ではあるが、タンパク質合成に関与する成分が効率的に抽出され且つ安定化されること、ならびに多価アルコールを含有することで抽出液自体の粘性が低下するためタンパク質合成反応が進行しやすくなるなどの理由によるものと考えられる。
【００１６】
本発明の方法に用いる抽出用液に含有される多価アルコールとしては、同一分子内に水酸基を２個以上有するアルコールであれば特に制限はないが、タンパク質合成効率及び取扱い性の観点から、同一分子内に水酸基を２個〜５０個有するものを用いるのが好ましく、同一分子内に水酸基を２個〜３０個有するものを用いるのがより好ましい。
本発明の方法に使用できる多価アルコールとしては、たとえば、グリセロール、ジグリセロール、ポリグリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、エリスリトール、ポリエリスリトール、キシリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、リボース、イノシトール、スクロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、ソルビトール、トレハロース、キシロースなどが挙げられるが、タンパク質合成効率の観点からは、グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ポリエリスリトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、キシロース、マルトースおよびイノシトールのうちから選ばれる少なくともいずれかが好ましい。
【００１７】
上記多価アルコールのうち、ポリエリスリトール以外のものについては、従来公知の種々の方法で製造することができるし、また市販のものを適宜使用すればよい。またポリエリスリトールは、本出願人らの一人が独自に開発したエリスリトールの２量体〜６量体である。後述する製造例１に、４量体のポリエリスリトールの製造方法を例示する。４量体以外のポリエリスリトールについては、当業者であれば製造例１の記載に基づき適宜製造することが可能である。
【００１８】
本発明に用いる抽出用液中における多価アルコールの濃度（混合物の場合には、それら全体の濃度）は、タンパク質合成効率の観点から、１（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％であるのが好ましく、２（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％であるのがより好ましい。
【００１９】
本発明の方法に用いる抽出用液は、上述のように多価アルコールを含有しているならば、その他の成分については特に制限はないが、プロテアーゼインヒビターをさらに含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、カイコ組織由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果としてカイコ組織由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。
【００２０】
上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、カイコ組織より抽出した後の抽出液にはセリンプロテアーゼ活性が強いと推定されることから、セリンプロテアーゼに対して特異性の高いＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、一種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
【００２１】
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００２２】
また本発明に用いる抽出用液は、上記多価アルコールおよびプロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）および緩衝剤をさらに含有するのが好ましい。
【００２３】
上記カリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２４】
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを超えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２５】
上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２６】
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２７】
上記ＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出用液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２８】
上記緩衝剤は、抽出用液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こるｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、当該抽出用液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６〜８に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出用液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を超えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが特に好ましい。
【００２９】
当該抽出液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、調製後の抽出液において抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを超えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３０】
すなわち、本発明に用いる抽出用液は、２（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％の上記多価アルコールを含有するとともに、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭ〜２００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。
【００３１】
本発明における抽出対象であるカイコ組織は、カイコの一生のうちのどの状態（卵、幼虫（１齢期〜５齢期）、蛹、成虫）のいずれの組織であってよい。またカイコ組織は、単一の状態における単一の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺のみ）に限らず、単一の状態における複数の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺および脂肪体）であってもよく、複数の状態における単一の組織（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ幼虫における後部絹糸腺）であってもよいものとする。無論、複数の状態における複数の組織であってもよい。
なおカイコ組織は、カイコ組織の全体（たとえば、後部絹糸腺全体）である必要はない。
【００３２】
上記カイコ組織としては、カイコ幼虫の後部絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれかであることが望ましい。本発明の方法により調製された抽出液中にカイコ幼虫由来の後部絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれか由来の抽出物が含有されているか否かは、たとえばアルドラーゼについてのアイソザイム解析を行うことによって判別することができる（Nagaokaら(1995)、Insect Biochem Mol Biol. 25, 819-825）。
【００３３】
カイコ幼虫の後部絹糸腺から本発明の方法にて調製を行うと、短時間で大量のタンパク質が合成可能な特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を得ることができ、好ましい。
【００３４】
またカイコ幼虫の脂肪体から本発明の方法にて調製を行うと、脂肪体が柔らかい組織であるために、すり潰す作業が短時間で済み、結果として容易に抽出液を調製でき、好ましい。
なお、５齢期の脂肪体については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて脂肪体由来のタンパク質であるＳＰ−１、ＳＰ−２などを検出することによっても、本発明の方法で調製された抽出液中に含有されているか否かを判別することができる。
【００３５】
カイコの胚から本発明の方法にて調製を行うと、胚が１つの個体であるために他の組織とは異なり摘出する作業を要さず、結果として容易に抽出液を調製でき、好ましい。
なおカイコの胚については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて胚由来のタンパク質である３０Ｋ、ＥＳＰ、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ（Ｈ）、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ（Ｌ）などを検出することによっても、本発明の方法で調製された抽出液中に含有されているか否かを判別することができる。
【００３６】
カイコ幼虫の後部絹糸腺または脂肪体の場合、カイコ幼虫の１齢期〜５齢期のものであれば、特に制限なく本発明の方法にて調製できるが、当該後部絹糸腺または脂肪体は、５齢期のカイコ幼虫由来であるのが好ましい。これは、５齢期のカイコ幼虫においては、後部絹糸腺および脂肪体が１齢期〜５齢期のうちで最も成熟しており、これを用いることで他の齢期のものと比べて短時間で大量のタンパク質が合成可能な無細胞系タンパク質合成用抽出液が得られるためである。
中でも特に、絹糸の主成分である絹フィブロインを活発につくり、高いタンパク質合成能を有しているという観点から、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、中でも５齢期の３日〜７日のカイコ幼虫の後部絹糸腺から抽出を行うことが好ましい。
【００３７】
所望の量の上記抽出物を含有する抽出液を得るためには、通常、複数体のカイコより抽出する必要がある。抽出に供するカイコの数は、使用するカイコの状態や個体差によっても異なるが、カイコ幼虫については、繭の形成期に近づくにつれて組織の成熟に伴って、同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済む。特に絹糸腺は、５齢期のカイコ幼虫において日を追うごとに著しく成熟するため、たとえば、５齢期の１日で３０匹程度のカイコ幼虫からと同程度の量を５齢期の７日では６匹〜７匹程度のカイコ幼虫から得ることができる。
【００３８】
本発明の無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法においては、多価アルコールを含有する抽出用液を用いてカイコ組織より抽出を行うならば、その他の手順には特に制限されるものではないが、たとえば、以下の手順により行うことができる。
まず、常法にしたがって、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。
次に摘出した組織を、液体窒素で凍結させた後、予め液体窒素で冷却させた乳鉢を用いてすり潰す。これに抽出用液を添加し、一旦抽出用液も凍結させた後、シャーベット状になるまで（具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで）、薬さじで攪拌しながら溶解する。その後、再度液体窒素で完全に凍結させた後、シャーベット状になるまで（具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで）薬さじで攪拌しながら溶解するという操作を行うことで、カイコ組織からの抽出を行う。
かかる抽出操作は、摘出したカイコ組織を、たとえば液体窒素で凍結させた後、−８０℃で凍結させた乳鉢中ですり潰し、これに抽出用液を添加して抽出を行うようにしてもよいが、上記のような抽出操作を行うことで、多価アルコールを含有しており粘性の低い抽出用液を用いているためタンパク質合成反応が進行しやすくなる、ならびにタンパク質合成に関与する成分が効率的に抽出され且つ安定化されるという利点がある。
【００３９】
次に、上記抽出処理で得られた液状物を遠心分離にかける。該遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１００００×ｇ〜５００００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行う。本発明の調製方法においては、該遠心分離を１回行った後の上清をそのまま抽出液としてもよいが、好ましくは、当該上清（第一の上清）と、上記遠心分離（１回目の遠心分離）後の沈殿からさらに上記抽出用液を用いて抽出を行った後に遠心分離（２回目の遠心分離）して得られた上清（第二の上清）とを混合して、抽出液として調製することが好ましい。上記２回目の遠心分離は、上述した１回目の遠心分離と同様の条件で行えばよい。このように第一の上清と第二の上清とを混合して抽出液を調製することで、第一の上清、第二の上清を単独で抽出液とする場合と比較して、タンパク質合成効率が向上するという利点がある。これは、タンパク質合成反応に関与する成分が第一の上清だけでなく第二の上清にも多量に存在しているため、両者を混合し抽出液とすることで、単独の場合では得られない成分を補い合うことができるためであると考えられる。
また、上記第一の上清をさらに遠心分離して（上記と同様の条件であればよい）得られた上清（第三の上清）を、上記第二の上清と混合するようにすると、上記効果はさらに増強され、より好ましい。これは、１回の遠心分離では除去しきれなかった第一の上清に含まれる不純物を除去できることによるものと考えられる。なお、上記第一〜第三の上清を混合して、抽出液を調製するようにしてもよい。
【００４０】
この場合、調製される混合物（抽出液）における第一の上清および／または第三の上清（両方混合する場合には、その総量）と第二の上清との混合割合に特に制限はないが、タンパク質の合成効率の観点からは、体積比で１０：９０〜９０：１０であるのが好ましく、２０：８０〜８０：２０であるのがより好ましい。
【００４１】
上記第一の上清〜第三の上清、ならびに上記混合物を精製する目的で、これらにゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取して抽出液として調製するようにしてもよいが、タンパク質の合成効率の観点からは、当該ゲル濾過および画分の分取を経ずに抽出液として調製するのが好ましい。これは、上記ゲル濾過および画分の分取を経ることによって、反応に必要な成分まで減少してしまうためであると考えられる。
【００４２】
なお、上記ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取する場合には、具体的には以下の手順にて行えばよい。
たとえば脱塩カラム  ＰＤ−１０（アマシャム  バイオサイエンス社製）によりゲル濾過を行い、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行う。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液に、グリセロールをさらに添加したものであることが好ましい。グリセロールは、通常、５（ｖ／ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％（好ましくは、２０（ｖ／ｖ）％）となるように添加すればよい。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
次に、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が最も高い画分付近を分取する。
【００４３】
本発明は、また、上述した多価アルコールを含有する抽出用液を有するカイコ組織用抽出キットをも提供する。当該カイコ組織用抽出キットにおける抽出用液中の好適な多価アルコールの種類、濃度、その他の好適な組成については、上述したとおりである。かかるカイコ組織用抽出キットは、抽出用液を収容した適宜の容器と、その他の適当な要素で構成されていればよく、特には制限されるものではない。上記抽出用液以外の他の構成要素にも特に制限はないが、たとえば、カイコ組織の摘出に用いるハサミ、ピンセット、メスなど、また、その他カイコ用解剖台、組織洗浄液などを有していてよい。
【００４４】
上記のように本発明の方法にて得られた抽出液を用いてタンパク質合成反応を行うことによって、如何なるタンパク質、例えば生細胞で細胞毒となるタンパク質であっても、短時間にて合成することが可能となる。また、真核生物であるカイコの組織由来の抽出物を用いているため、糖タンパク質を無細胞系で合成することも可能であり、特に制限されることなく多くの種類のタンパク質を合成することができる。なお上記タンパク質合成反応は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成反応（翻訳系合成反応）、外来鋳型ＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成反応（転写／翻訳系合成反応）のいずれであってもよい。
さらに、このような抽出液は、後述するように従来の小麦胚芽からの抽出液の調製と比較して、無細胞系タンパク質合成に供することのできる抽出液を、格段に容易に調製することができ、効率的な無細胞系タンパク質合成を実現できる。
【００４５】
本発明の方法で得られた抽出液中におけるカイコ組織由来の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを超えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
【００４６】
なお上記範囲の量のカイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
【００４７】
本発明の方法で得られる抽出液を用いて、上記翻訳系合成反応、転写／翻訳系合成反応を行うために調製する反応液（それぞれ、「翻訳系用反応液」、「転写／翻訳系用反応液」と呼ぶ。）の組成に特に制限はなく、それぞれ従来公知の組成を適宜選択すればよい。
翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液のいずれの場合であっても、本発明の方法で得られた抽出液を１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するように調製されたものであるのが好ましい。すなわち、反応液の全体において、カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
以下、（１）翻訳系用反応液、（２）転写／翻訳系用反応液について、それぞれ説明する。
【００４８】
（１）翻訳系用反応液
翻訳系用反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分として、外来ｍＲＮＡ、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。かかる翻訳系用反応液を使用して翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００４９】
上記翻訳系用反応液に用いる外来ｍＲＮＡとは、カイコ組織に由来しないｍＲＮＡを指し、カイコ組織に由来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。なお、翻訳系用反応液に含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡであるかカイコ組織に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、翻訳系用反応液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判別することができる。
【００５０】
なお翻訳系用反応液に用いる外来ｍＲＮＡは、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
【００５１】
翻訳系用反応液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５２】
翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５３】
翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５４】
翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５５】
翻訳系用反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５６】
翻訳系用反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５７】
翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５８】
翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５９】
翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６０】
翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在するカイコ由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６１】
翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６２】
翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６３】
また翻訳系用反応液は、さらに上記多価アルコールを添加されたものであるのがより好ましい。多価アルコールを添加すると、翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。多価アルコールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００６４】
さらに、翻訳系用反応液は、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼなどを不活化させることにより、本発明のタンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、１０ｍＭを超えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６５】
すなわち、本発明の方法で得られた抽出液を使用した翻訳系用反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％の多価アルコール、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００６６】
上記翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（翻訳系合成反応）は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を超えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００６７】
（２）転写／翻訳系用反応液
転写／翻訳系用反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分として、外来鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも含有するのが好ましい。かかる転写／翻訳系用反応液を使用して転写／翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００６８】
上記転写／翻訳系用反応液に用いる外来鋳型ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡなどの環状ＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ産物などの直鎖状ＤＮＡであってもよい。上記外来鋳型ＤＮＡは、カイコ組織に由来しない鋳型ＤＮＡを指し、目的タンパク質をコードする塩基配列と、その５'上流側に位置するプロモーター配列とを少なくとも有する。本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、カイコ組織に由来しない鋳型ＤＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、生細胞で細胞毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、また糖タンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよい。また本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡにおけるプロモーター配列としては、特に制限されるものではないが、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。
なお本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば鋳型ＤＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各外来鋳型ＤＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。なお、抽出液において、含有される鋳型ＤＮＡが外来鋳型ＤＮＡであるかカイコ組織に由来する鋳型ＤＮＡであるかは、抽出液中より、フェノール−クロロホルム抽出を行ってその鋳型ＤＮＡを抽出し、その塩基配列を解析することによって判別することができる。
【００６９】
また、本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、上記目的タンパク質をコードする塩基配列の３'下流側に転写を終結させる機能を有するターミネーター配列、および／または、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点からポリＡ配列を有しているのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。
【００７０】
外来鋳型ＤＮＡは、転写／翻訳系用反応液中において、０．１μｇ／ｍＬ〜８０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来鋳型ＤＮＡが０．１μｇ／ｍＬ未満または８０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００７１】
転写／翻訳系用反応液に用いるＲＮＡポリメラーゼは、外来鋳型ＤＮＡが有するプロモーター配列に応じて適宜選択することができる。たとえば、外来鋳型ＤＮＡがＴ７プロモーター配列を有している場合は、その配列を認識するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。また、外来鋳型ＤＮＡが、ＳＰ６またはＴ３プロモーター配列を有している場合は、それぞれ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
【００７２】
ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡ合成の速度およびタンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中に０．０１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが０．０１Ｕ／μＬ未満であると、ｍＲＮＡの合成量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためであり、またＲＮＡポリメラーゼが１００Ｕ／μＬを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００７３】
転写／翻訳系用反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７４】
転写／翻訳系用反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００７５】
転写／翻訳系用反応液中におけるシチジン５'−三リン酸（以下、「ＣＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＣＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７６】
転写／翻訳系用反応液中におけるウリジン５'−三リン酸（以下、「ＵＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＵＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７７】
転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７８】
転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７９】
転写／翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜５００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００８０】
転写／翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。ｔＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００８１】
転写／翻訳系用反応液は、さらに、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビター、スペルミジンおよび緩衝剤を含有するのが好ましい。
【００８２】
転写／翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８３】
転写／翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８４】
転写／翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜２０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１００ｍＭを超えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００８５】
転写／翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在するカイコ由来のＲＮａｓｅによって、転写／翻訳系合成反応の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で添加されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００８６】
上記スペルミジンは、転写における伸張反応を促進する目的で添加されるものであり、転写／翻訳系用反応液中において０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。スペルミジンが０．０１ｍＭ未満であると、ｍＲＮＡの合成速度が低下し生成するｍＲＮＡの量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下するというような傾向にあるためであり、またスペルミジンが１００ｍＭを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００８７】
転写／翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、５ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８８】
また転写／翻訳系用反応液は、さらに上記多価アルコールを添加されたものであるのがより好ましい。多価アルコールを添加すると、転写／翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。多価アルコールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００８９】
すなわち、本発明の方法で得られた抽出液を使用した転写／翻訳系用反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、さらに０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＣＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜５００μＭのアミノ酸成分、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡを含有するのが好ましい。さらには、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜２０ｍＭのＤＴＴ、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭのスペルミジン、５ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％の多価アルコールを含有するように実現されるのが好ましい。
【００９０】
上記転写／翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（転写／翻訳系合成反応）についても、上記翻訳系合成反応の場合と同様、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行えばよい。転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写工程の反応温度が１０℃未満であると、転写の速度が低下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。また翻訳工程の温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。翻訳工程の反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また翻訳工程の反応温度が４０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。
転写／翻訳系合成反応では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な２０℃〜３０℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００９１】
上記翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液を使用して合成できるタンパク質に特に制限はない。合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【００９２】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００９３】
実施例１
５齢期の６日に達したカイコ幼虫をサンプリングした。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順に従って後部絹糸腺について抽出を行った。
抽出は、まず、５齢期の６日に達したカイコ幼虫より摘出した後部絹糸腺を、液体窒素で凍結させた後、予め液体窒素で冷却された乳鉢を用いてすり潰した。これに下記組成の抽出用液を添加し、一旦抽出液も凍結させた後、シャーベット状になるまで薬さじで攪拌しながら溶解した。その後、液体窒素で完全に凍結させた後、シャーベット状になるまで再度薬さじで攪拌しながら溶解するという操作を行うことで、カイコ組織からの抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ              ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ            酢酸カリウム
・２ｍＭ                酢酸マグネシウム
・１９．３（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・１ｍＭ                ＤＴＴ
・０．５ｍＭ            ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清（第一の上清）のみを単離し、再び３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行い、上清（第三の上清）を単離した。一方、上記１回目の遠心分離後の沈殿に、上記組成の抽出用液を添加し、上述したのと同様の抽出操作を行った後、３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行い、上清（第二の上清）を単離した。こうして得られた６．２５μｌの第二の上清と６．２５μｌの第三の上清とを混合し、抽出液を調製した。
【００９４】
実施例２
上記実施例１で得られた１２．５μｌの第三の上清をそのまま抽出液として調製した以外は、実施例１と同様にして行った。
【００９５】
実施例３
上記実施例１で得られた１２．５μｌの第二の上清をそのまま抽出液として調製した以外は、実施例１と同様にして行った。
【００９６】
実験例１
：実施例１〜３の各抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例１〜３で得られた各抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製した。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  抽出液
・４０μｇ／ｍＬ    外来ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・１．０ｍＭ        酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ        ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・０．５ｍＭ        ＡＴＰ
・０．５ｍＭ        ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ      ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・４０μＭ          アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。
各々調製した反応液を用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタンパク質（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応液量は２５μＬとした。反応温度は２５℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。
合成されたルシフェラーゼは、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲ  ＡＢ−２１００、アトー社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図１は、実験例１の結果を示すグラフである。図１において、縦軸はルシフェラーゼ発光積算量を示し、横軸は反応時間（時間）を示す。
【００９７】
実施例４
実施例１で調製した第二の上清と第三の上清との混合物を、さらにＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅ（アマシャム  バイオサイエンス社製）に、抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上記混合物を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分を分取し、これを抽出液とした以外は、実施例１と同様にした。
【００９８】
実施例５
実施例２で得られた第三の上清を、さらにＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅ（アマシャム  バイオサイエンス社製）に、抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上記混合物を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分を分取し、これを抽出液とした以外は、実施例２と同様にした。
【００９９】
実施例６
実施例３で得られた第二の上清を、さらにＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅ（アマシャム  バイオサイエンス社製）に、抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上記混合物を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取し、これを抽出液とした以外は、実施例３と同様にした。
【０１００】
実験例２
：実施例４〜６の各抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例４〜６で得られた各抽出液を用いて、実験例１と同様にして、無細胞系タンパク質合成反応を行った。
図２は、実施例４〜６についての実験例２の結果を示すグラフである。図２において、縦軸はルシフェラーゼ発光積算量を示し、横軸は反応時間（時間）を示す。
【０１０１】
実施例７
５齢期の６日に達したカイコ幼虫をサンプリングした。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順に従って後部絹糸腺について抽出を行った。
抽出は、まず、５齢期の６日に達したカイコ幼虫より摘出した後部絹糸腺３．０ｇを液体窒素で凍結した後、予め液体窒素で冷却させた乳鉢を用いてすり潰し、下記の組成の抽出用液を用いて抽出用液を添加した。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・１０（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・１ｍＭ            ＤＴＴ
・０．５ｍＭ        ＰＭＳＦ
抽出用液の添加後、液体窒素にて凍結、解凍した後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。この遠心分離後、上清のみを単離し、抽出液とした。
【０１０２】
実施例８
グリセロールを２０（ｖ／ｖ）％含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１０３】
実施例９
グリセロールに換えて、２０（ｖ／ｖ）％のジグリセロールを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１０４】
実施例１０
グリセロールに換えて、１０（ｖ／ｖ）％のエチレングリコールを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１０５】
製造例１
：ポリエリスリトール（４量体）の製造
メソ−エリスリトール１００．０ｇと水酸化ナトリウム１．０ｇとを二酸化炭素雰囲気下、２４０℃、３０ｍｍＨｇ〜４０ｍｍＨｇで２時間反応させた。得られた褐色液体に水１５０ｍｌを加え、希塩酸で中和し、活性炭で脱色し、カチオン交換樹脂（三菱化学（株）製、ダイアイオンＳＫ−１１２）およびアニオン交換樹脂（三菱化学（社）製、ダイアイオンＷＡ３０）にて処理し、水を留去して無色粘性の液体６９．３ｇ（含水率：５％）を得た。
得られたものをＴＯＦ−ＭＳ分析（マイクロマス社製  ＬＣＴ質量分析計、イオン化方式：ＥＳＩ、測定イオン：正イオン）したところ、メソ−エリスリトールに由来する１０４Ｄａの繰り返し単位が観測できた。また、主なピークとして、ｍ／ｚ２２６（重合度２）から１４７４（重合度１４）までの鎖状ポリエリスリトールのピークに加えて、それらのｍ／ｚより１８Ｄａおよび３６Ｄａの小さい脱水物のピークも観察された。同装置のＬＣ（カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー（株）社製）、溶離液：（アセトニトリル／水＝８０／２０）、６０℃、流速１ｍｌ／ｍｉｎ）にて成分を分離し分子量を測定したところ、同一分子量でも直鎖状と分岐状のポリエリスリトールが観察された。なお、ＴＯＦ−ＭＳのイオン強度より算出すると、平均重合度は４であった。
【０１０６】
実施例１１
グリセロールに換えて、上記製造例１で得られたポリエリスリトールを１０（ｖ／ｖ）％含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１０７】
比較例１
グリセロールを含有しないこと以外は実施例７で用いたのと同様の抽出用液を用いて抽出を行った以外は、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１０８】
実験例３
：実施例７〜１１、比較例１の各抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例７〜１１、比較例１で得られた各抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製した。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  抽出液
・１６０μｇ／ｍＬ  外来ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・１．７５ｍＭ      酢酸マグネシウム
・２ｍＭ            ＤＴＴ
・０．７５ｍＭ      ＡＴＰ
・０．５ｍＭ        ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ      ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ          クレアチンリン酸
・５０μｇ／ｍＬ    クレアチンキナーゼ
・１００μＭ        アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター
・１００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。
各々調製した反応液を用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタンパク質（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応液量は２５μＬとした。反応温度は２５℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。
合成されたルシフェラーゼは、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図３は、実験例３の反応開始より４時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフである。図３において、縦軸は、比較例１で得られた抽出液を用いた場合の無細胞系タンパク質合成量に対する、実施例７〜１１で得られた各抽出液を用いた場合の無細胞系タンパク質合成量の割合（相対合成量：％）を表している。図３に示すように、多価アルコールを含有する抽出用液を用いて調製した抽出液を使用した反応液は、多価アルコールを含有しない抽出用液を用いて調製した抽出液を使用した反応液と比較して、タンパク質合成量が約２００％〜３５０％となる。
【０１０９】
実施例１２
グリセロールに換えて、１０（ｖ／ｖ）％のエリスリトールを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１１０】
実施例１３
グリセロールに換えて、１０（ｖ／ｖ）％のキシリトールを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１１１】
実施例１４
グリセロールに換えて、１０（ｖ／ｖ）％のソルビトールを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１１２】
実施例１５
グリセロールに換えて、１０（ｖ／ｖ）％のトレハロースを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１１３】
実施例１６
グリセロールに換えて、１０（ｖ／ｖ）％のスクロースを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１１４】
実施例１７
グリセロールに換えて、１０（ｖ／ｖ）％のラクトースを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１１５】
実施例１８
グリセロールに換えて、１０（ｖ／ｖ）％のキシロースを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１１６】
実施例１９
グリセロールに換えて、１０（ｖ／ｖ）％のマルトースを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１１７】
実施例２０
グリセロールに換えて、１０（ｖ／ｖ）％のイノシトールを含有すること以外は実施例７と同様の抽出用液を用いて、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１１８】
比較例２
グリセロールを含有しないこと以外は実施例７で用いたのと同様の抽出用液を用いて抽出を行った以外は、実施例７と同様にして抽出液を調製した。
【０１１９】
参考例１
：ベクターｐＴNＴ−Ｌｕｃの構築
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するｐＧＥＭ−Ｌｕｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、構造遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。これとは別に、ｐＴNＴ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ  Ｅｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、これらをライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドを、配列表配列番号３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、２５サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴNＴ  Ｖｅｃｔｏｒ由来の５'−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴNＴ−Ｌｕｃと命名した。
【０１２０】
参考例２
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
上記参考例１で作成したプラスミドベクターｐＴNＴ−Ｌｕｃを鋳型にして、配列表配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ｐ  Ｒｖ）と、配列表配列番号５に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ−ＡＴＧ）を用い、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃５分、３０サイクルのＰＣＲを行った。反応終了後、電気泳動でＰＣＲ産物を分離した後、Ｇｅｎ  Ｅｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて精製し、これをライゲーション反応に用いた。このようにして、プラスミドベクターｐＴNＴ−ＬｕｃからＳＰ６プロモーター配列、５'−βグロビンリーダー配列およびルシフェラーゼをコードする構造遺伝子の５’上流側マルチクローニングサイトを欠失せしめたプラスミドベクターを得た。
配列表配列番号６に示す塩基配列を有するＳｆＮＰＶ(Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus）のポリへドリン遺伝子の５’ＵＴＲのセンス鎖、アンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）によってその５’末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ  Ｐｏｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（シグマ社製）によって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５’上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＳｆＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５’ＵＴＲが順方向（５’→３’）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した。このようにして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間にＳｆＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５’ＵＴＲが順方向に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１２１】
実験例４
：カイコ組織由来の抽出物を含有する反応液を用いた無細胞系タンパク質合成
（１）インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
上記参考例２で作製したベクターを、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたベクター１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用い２０μｌスケールで３７℃４時間のインビトロ転写反応を行い、ｍＲＮＡを合成した。
転写反応終了後、１ＵのＲＱ１  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃１５分インキュベートし、鋳型を消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μｌの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ  ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした後、滅菌水で溶出した。溶出画分に酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたｍＲＮＡの定量は２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定して行った。
（２）無細胞系タンパク質合成反応
実施例１２〜２０及び比較例２で調製したカイコ抽出液ならびに上記（１）で得られたｍＲＮＡを用い、下記組成の反応液を調製し、無細胞系タンパク質合成反応を行った。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  カイコ抽出液
・１６０μｇ／ｍＬ  ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・１．７５ｍＭ      酢酸マグネシウム
・２．０ｍＭ        ＤＴＴ
・０．７５ｍＭ      ＡＴＰ
・０．５ｍＭ        ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ      ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・４０μＭ          アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター
・１００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で６時間行い、反応液量は２５μＬとした。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【０１２２】
図４は、実験例４のタンパク質合成反応開始より６時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフである。図４において、縦軸は、比較例２で得られた抽出液を用いた場合の無細胞系タンパク質合成量に対する、実施例１２〜２０で得られた各抽出液を用いた場合の無細胞系タンパク質合成量の割合（相対合成量：％）を表している。図４に示すように、多価アルコールを含有する抽出用液を用いて調製した抽出液を使用した反応液は、多価アルコールを含有しない抽出用液を用いて調製した抽出液を使用した反応液と比較して、タンパク質合成量が約２００％〜３００％となった。
【０１２３】
参考例３
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＡｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号７に示す塩基配列を有するＡｃＮＰＶ（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）のポリへドリン遺伝子の５’ＵＴＲを用いた以外は参考例２と同様にして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間に、配列表配列番号７に示す塩基配列を有するＡｃＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５’ＵＴＲが順方向（５’→３’）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＡｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１２４】
実験例５
：カイコ組織由来の抽出物を含有する反応液を用いた無細胞系タンパク質合成
（１）インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
ベクターとして参考例３で調製したｐＡｐｈｄ−Ｌｕｃを用いた以外は、実験例４（１）と同様の方法により、ｍＲＮＡを調製した。
（２）抽出液として実施例７及び比較例１で調製したカイコ抽出液を用い、ｍＲＮＡとして上記（１）で得られたｍＲＮＡを用いる以外は実験例４（２）と同様の反応液を調製し、無細胞系タンパク質合成反応を行った。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。反応液量は２５μＬとした。経時的にサンプリングを行い、実験例４（２）と同様に合成されたルシフェラーゼ量を定量した。
【０１２５】
図５は、実験例５の結果を示すグラフである。図５において、縦軸は、ルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を、横軸は反応時間（時間）を示す。図５に示すように、グリセロールを含有する抽出用液を用いて調製した抽出液を使用した反応液は、グリセロールを含有しない抽出用液を用いて調製した抽出液を使用した反応液と比較して、各時間において、タンパク質合成量が約２００％〜３５０％となった。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、従来よりタンパク質の合成効率を向上できる無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、ならびにそのためのカイコ組織抽出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】実験例１の結果を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ発光積算量を示し、横軸は反応時間（時間）を示す。
【図２】実施例４〜６についての実験例２の結果を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ発光積算量を示し、横軸は反応時間（時間）を示す。
【図３】実験例３の反応開始より４時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフである。
【図４】実験例４の反応開始より６時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフである。
【図５】実験例５の結果を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（時間）を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２８】
配列番号１：プライマー  Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ
配列番号２：プライマー  Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ
配列番号３：プライマー  Ｔ７プロモーター
配列番号４：プライマー  Ｔ７ｐ  Ｒｖ
配列番号５：プライマー  Ｌｕｃ−ＡＴＧ
配列番号６：ＳｆＮＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号７：ＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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