(57)【要約】【課題】  間葉系幹細胞を検出、分離・識別するためのマーカー及び該マーカーを用いた間葉系幹細胞の検出、分離・識別方法を提供するものである。【解決手段】  配列表に示される遺伝子は、間葉系幹細胞で特異的に発現する。該遺伝子を間葉系幹細胞検出用のマーカーとして用いることよりなる。更に、本発明は、該間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ、及び該間葉系幹細胞遺伝子マーカーの検出に際して、被検細胞の該遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマーを含み、また、本発明の間葉系幹細胞マーカー遺伝子が発現するポリペプチドからなる間葉系幹細胞検出用ポリペプチドマーカー、該ポリペプチドマーカーを検出するための、該ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体、更には、間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ、ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体を用いた間葉系幹細胞の識別、分離方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１、２、４、６、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１９、又は４６に示される塩基配列を有する遺伝子であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項２】
遺伝子INTEGRIN, ALPHA 6 (ITGA6), MRNA（NM 000210）；遺伝子SOLUTE CARRIER FAMILY 20 (PHOSPHATE TRANSPORTER)、MEMBER 1（NM 005415）；遺伝子RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE M2 POLYPEPTIDE (RRM2), MRNA（NM 001034）；遺伝子FOLLISTATIN (FST), TRANSCRIPT VARIANT FST317, MRNA（NM 006350）；遺伝子SPROUTY (DROSOPHILA) HOMOLOG 2 (SPRY2), MRNA（NM 005842）；遺伝子RAB3B, MEMBER RAS ONCOGENE FAMILY (RAB3B), MRNA（NM 002867）；遺伝子SOLUTE CARRIER FAMILY 2 (FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER)（NM 006516）；遺伝子INTERLEUKIN 13 RECEPTOR, ALPHA 2 (IL13RA2), MRNA（NM 000640）；遺伝子SERINE/THREONINE KINASE 12 (STK12), MRNA（NM 004217）；遺伝子MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 5 (CE)（NM 006739）；遺伝子THYROID HORMONE RECEPTOR INTERACTOR 13 (TRIP13), MRNA（NM 004237）；遺伝子KINESIN-LIKE 6 (MITOTIC CENTROMERE-ASSOCIATED KINESIN) (K)（NM 006845）；遺伝子CYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 3 (CDK2-ASSOCIATED DUAL（NM 005192）；遺伝子CHROMOSOME CONDENSATION PROTEIN G (HCAP-G),MRNA（NM 022346）；遺伝子CDC28 PROTEIN KINASE 1 (CKS1), MRNA（NM 001826）；遺伝子PROTEIN REGULATOR OF CYTOKINESIS 1 (PRC1), MRNA（NM 003981）；遺伝子CELL DIVISION CYCLE 2, G1 TO S AND G2 TO M (CDC2), MRNA（NM 001786）；遺伝子CDC20 (CELL DIVISION CYCLE 20, S. CEREVISIAE, HOMOLOG) (CD)（NM 001255）；遺伝子LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS（NM 014791）；遺伝子MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M)（NM 005916）；遺伝子CYCLIN A2 (CCNA2), MRNA（NM 001237）；遺伝子THYMIDINE KINASE 1, SOLUBLE (TK1), MRNA（NM 003258）；又は遺伝子cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4) (CDKN2A), mRNA（NM 000077）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項３】
遺伝子EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1（NM 018894）；遺伝子Human insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5) mRNA（AU132011）；遺伝子Homo sapiens clone 24775 mRNA sequence（AA402981）；proteoglycan 1, secretory granule（AV734015）；遺伝子insulin-like growth factor binding protein 5（AA374325）；遺伝子solute carrier family 21 (organic anion transporter), member 3（AF085224）；遺伝transglutaminase 2 (C polypeptide, protein-glutamine-gamma-glutamyl  transferase)（AL552373）；遺伝子coagulation factor II (thrombin) receptor（M62424）；遺伝子plasminogen activator, urokinase（NM 002658）；遺伝子tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (Sorsby fundus dystrophy, pseudoinflammatory)（W96324）；遺伝子matrix Gla protein（BF668572）；遺伝子B-cell CLL/lymphoma 1（Z23022）；遺伝子CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II antigen-associated)（BG333618）；遺伝子adducin 3 (gamma)（AL135243）；遺伝子solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 4（NM 004696）；遺伝子protein S (alpha)（NM 000313）；遺伝子phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate 5-phosphatase homolog; phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatase type IV（AF187891）；遺伝子progesterone membrane binding protein（BE858855）；遺伝子brain-derived neurotrophic factor（X60201）；又は遺伝子apolipoprotein E（BF967316）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項４】
遺伝子HOMO SAPIENS WNT INHIBITORY FACTOR-1 (WIF-1), MRNA（NM 007191）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ11175 (FLJ11175), MRNA（NM 018349）；遺伝子HOMO SAPIENS RHO GDP DISSOCIATION INHIBITOR (GDI) BETA (ARHGDIB), MRNA（NM 001175）；遺伝子HOMO SAPIENS POTASSIUM INTERMEDIATE/SMALL CONDUCTANCE CALCIUM-ACTIVATE（NM 021614）；遺伝子HOMO SAPIENS NUCLEAR FACTOR (ERYTHROID-DERIVED 2)-LIKE 3 (NFE2L3), MRNA（NM 004289）；遺伝子HOMO SAPIENS GS3955 PROTEIN (GS3955), MRNA（NM 021643）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA 3' END SIMILAR TO SIMILAR TO GLYCOPROTEIN MUC18（AA302605）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ21841 (FLJ21841), MRNA（NM 024609）；遺伝子HOMO SAPIENS ZINC FINGER PROTEIN 185 (LIM DOMAIN) (ZNF185), MRNA（NM 007150）；遺伝子SC1=PUTATIVE TRANS-ACTING FACTOR INVOLVED IN CELL CYCLE CONTROL [HUMAN, MRNA, 24]（S53374）；遺伝子HOMO SAPIENS NADH DEHYDROGENASE (UBIQUINONE) 1 ALPHA SUBCOMPLEX, 8 (19K)（NM 014222）；遺伝子HOMO SAPIENS HOMOLOG OF YEAST MCM10; HYPOTHETICAL PROTEIN PRO2249 (PRO2)（NM 018518）；遺伝子HOMO SAPIENS COLLAGEN, TYPE VII, ALPHA 1 (EPIDERMOLYSIS BULLOSA, DYSTRO（NM 000094）；遺伝子HOMO SAPIENS AUTOCRINE MOTILITY FACTOR RECEPTOR (AMFR), MRNA（NM 001144）；遺伝子HOMO SAPIENS CLONE 24421 MRNA SEQUENCE /CDS=UNKNOWN /GB=AF070641 /GI=3283914 /UG=（AF070641）；遺伝子HOMO SAPIENS MRNA;遺伝子CDNA DKFZP586E1621 (FROM CLONE DKFZP586E1621) /CDS=UNKNOWN /GB（AL080235）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項５】
遺伝子HOMO SAPIENS RESERVED (KCNK12), MRNA（NM 022055）；遺伝子HOMO SAPIENS UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME E2C (UBE2C), MRNA（NM 007019）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA FLJ10517 FIS, CLONE NT2RP2000812 /CDS=(61,918) /GB=AK001379 /G（AK001379）；遺伝子HOMO SAPIENS CARTILAGE LINKING PROTEIN 1 (CRTL1), MRNA（NM 001884）；遺伝子HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434F2322 (FROM CLONE DKFZP434F2322) /CDS=UNKNOWN /GB（AL133105）；遺伝子HOMO SAPIENS, CLONE MGC:9549 IMAGE:3857382, MRNA, COMPLETE CDS /CDS=(92,1285) /G（BC012453）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP586J1119 (DKFZP586J1119), MRNA（NM 032270）；遺伝子HOMO SAPIENS GLIA MATURATION FACTOR, GAMMA (GMFG), MRNA（NM 004877）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA: FLJ23095 FIS, CLONE LNG07413 /CDS=UNKNOWN /GB=AK026748 /GI=10（AK026748）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP762E1312 (DKFZP762E1312), MRNA（NM 018410）；遺伝子HOMO SAPIENS IROQUOIS-CLASS HOMEODOMAIN PROTEIN (IRX-2A), MRNA（NM 005853）；又は遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10540 (FLJ10540), MRNA（NM 018131）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項６】
遺伝子HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434C1915 (FROM CLONE DKFZP434C1915); PARTIAL CDS /C（AL137698）；遺伝子HOMO SAPIENS MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M)（NM 005916）；遺伝子HOMO SAPIENS DYNEIN, CYTOPLASMIC, INTERMEDIATE POLYPEPTIDE 1 (DNCI1), M（NM 004411）；遺伝子HUMAN MRNA FOR PROTEIN GENE PRODUCT (PGP) 9.5.（X04741）；遺伝子HOMO SAPIENS RAD51-INTERACTING PROTEIN (PIR51), MRNA（NM 006479）；遺伝子HOMO SAPIENS BACULOVIRAL IAP REPEAT-CONTAINING 5 (SURVIVIN) (BIRC5), MR（NM 001168）；遺伝子HOMO SAPIENS UDP-N-ACETYL-ALPHA-D-GALACTOSAMINE:POLYPEPTIDE N-ACETYLGAL（NM 004482）；遺伝子HOMO SAPIENS CYCLIN B1 (CCNB1), MRNA（NM 031966）；遺伝子HOMO SAPIENS FLAP STRUCTURE-SPECIFIC ENDONUCLEASE 1 (FEN1), MRNA（NM 004111）；遺伝子HOMO SAPIENS SERINE/THREONINE KINASE 15 (STK15), MRNA（NM 003600）；遺伝子HOMO SAPIENS MAD2 (MITOTIC ARREST DEFICIENT, YEAST, HOMOLOG)-LIKE 1 (MA)（NM 002358）；遺伝子HOMO SAPIENS NUCLEOLAR PROTEIN ANKT (ANKT), MRNA（NM 018454）；遺伝子HOMO SAPIENS HSPC150 PROTEIN SIMILAR TO UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME (H)（NM 014176）；遺伝子HOMO SAPIENS CYTOCHROME P450 RETINOID METABOLIZING PROTEIN (P450RAI-2),（NM 019885）；遺伝子HOMO SAPIENS NIMA (NEVER IN MITOSIS GENE A)-RELATED KINASE 2 (NEK2), MR（NM 002497）；遺伝子HOMO SAPIENS BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 4 (BMP4), MRNA（NM 001202）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA FLJ10674 FIS, CLONE NT2RP2006436 /CDS=UNKNOWN /GB=AK001536 /GI（AK001536）；又は遺伝子HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN A (17KD) (CENPA), MRNA（NM 001809）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項７】
遺伝子HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP564P116 (FROM CLONE DKFZP564P116) /CDS=UNKNOWN /GB=A（AL049338）；遺伝子HOMO SAPIENS TTK PROTEIN KINASE (TTK), MRNA（NM 003318）；遺伝子HOMO SAPIENS KARYOPHERIN ALPHA 2 (RAG COHORT 1, IMPORTIN ALPHA 1) (KPNA（NM 002266）；遺伝子HOMO SAPIENS POLYMERASE (DNA DIRECTED), THETA (POLQ), MRNA（NM 006596）；遺伝子HOMO SAPIENS ETS VARIANT GENE 5 (ETS-RELATED MOLECULE) (ETV5), MRNA（NM 004454）；遺伝子HOMO SAPIENS TRANSFORMING, ACIDIC COILED-COIL CONTAINING PROTEIN 3 (TAC)（NM 006342）；遺伝子HOMO SAPIENS KINESIN-LIKE 1 (KNSL1), MRNA（NM 004523）；遺伝子HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN E (312KD) (CENPE), MRNA（NM 001813）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA, 3' END /CLONE=IMAGE:1651289 /CLONE END=3' /GB=AI12（AI123815）；遺伝子HOMO SAPIENS DISTAL-LESS HOMEO BOX 5 (DLX5), MRNA（NM 005221）；遺伝子HOMO SAPIENS V-MYB AVIAN MYELOBLASTOSIS VIRAL ONCOGENE HOMOLOG-LIKE 2 （NM 002466）；又は遺伝子HOMO SAPIENS SERUM DEPRIVATION RESPONSE (PHOSPHATIDYLSERINE-BINDING PRO（NM 004657）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項８】
遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10604 (FLJ10604), MRNA（NM 018154）；遺伝子HOMO SAPIENS RIBONUCLEASE HI, LARGE SUBUNIT (RNASEHI), MRNA（NM 006397）；遺伝子HOMO SAPIENS ANILLIN (DROSOPHILA SCRAPS HOMOLOG), ACTIN BINDING PROTEIN（NM 018685）；遺伝子HOMO SAPIENS H4 HISTONE FAMILY, MEMBER G (H4FG), MRNA（NM 003542）；遺伝子HOMO SAPIENS G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR 37 (ENDOTHELIN RECEPTOR TYPE B-（NM 005302）HOMO SAPIENS UBIQUITIN CARRIER PROTEIN (E2-EPF), MRNA（NM 014501）；遺伝子HOMO SAPIENS, SIMILAR TO TUMOR DIFFERENTIALLY EXPRESSED 1, CLONE IMAGE:3639252, （BC007375）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC2577 (MGC2577), MRNA（NM 031299）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ13912 (FLJ13912), MRNA（NM 022770）；遺伝子HOMO SAPIENS ANNEXIN A3 (ANXA3), MRNA（NM 005139）；遺伝子HOMO SAPIENS STATHMIN 1/ONCOPROTEIN 18 (STMN1), MRNA（NM 005563）HOMO SAPIENS, SIMILAR TO RIBOSOMAL PROTEIN L39, CLONE MGC:20168 IMAGE:4555759, M（BC012328）；遺伝子HOMO SAPIENS POLO (DROSOPHIA)-LIKE KINASE (PLK), MRNA（NM 005030）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項９】
遺伝子HOMO SAPIENS PROTEASOME (PROSOME, MACROPAIN) 26S SUBUNIT, ATPASE, 5 (PS)（NM 002805）；遺伝子HOMO SAPIENS EUKARYOTIC TRANSLATION INITIATION FACTOR 4 GAMMA, 2 (EIF4G)（NM 001418）；遺伝子HOMO SAPIENS DIHYDROPYRIMIDINASE-LIKE 3 (DPYSL3), MRNA）（NM 001387）；遺伝子
HOMO SAPIENS ADAPTOR-RELATED PROTEIN COMPLEX 1, SIGMA 2 SUBUNIT (AP1S2)（NM 003916）；遺伝子HOMO SAPIENS PLECTIN 1, INTERMEDIATE FILAMENT BINDING PROTEIN, 500KD (P)（NM 000445）；遺伝子HOMO SAPIENS HETEROGENEOUS NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEIN U (SCAFFOLD ATTAC（NM 031844）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC5306 (MGC5306), MRNA（NM 024116）；遺伝子HOMO SAPIENS MHC CLASS I POLYPEPTIDE-RELATED SEQUENCE A (MICA), MRNA（NM 000247）；遺伝子HOMO SAPIENS PROTEIN ASSOCIATED WITH PRK1 (AWP1), MRNA（NM 019006）；遺伝子HOMO SAPIENS PROGESTERONE RECEPTOR MEMBRANE COMPONENT 2 (PGRMC2), MRNA（NM 006320）；遺伝子HOMO SAPIENS POLYGLUTAMINE BINDING PROTEIN 1 (PQBP1), MRNA（NM 005710）；遺伝子HOMO SAPIENS S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 1 (AMD1), MRNA（NM 001634）； HOMO SAPIENS INTERFERON-INDUCED, HEPATITIS C-ASSOCIATED MICROTUBULAR AG（NM 006417）；遺伝子HOMO SAPIENS PROTEIN KINASE, AMP-ACTIVATED, GAMMA 1 NON-CATALYTIC SUBUN（NM 002733）；HOMO SAPIENS PROCOLLAGEN-PROLINE, 2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE (PROLINE（NM 004199）；遺伝子HOMO SAPIENS ENDOTHELIAL DIFFERENTIATION, LYSOPHOSPHATIDIC ACID G-PROTE（NM 012152）；又は遺伝子HOMO SAPIENS KIAA0127 GENE PRODUCT (KIAA0127), MRNA（NM 014755）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか記載の間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有する間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる請求項１０記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ。
【請求項１３】
配列表の配列番号１、２、４、６、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１９、又は４６に示される塩基配列を有する遺伝子のグループ、及び請求項２〜９のいずれか記載の遺伝子のグループの２以上の遺伝子を検出するプローブを固定化させたことを特徴とする請求項１２記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ。
【請求項１４】
配列表の配列番号３、５、８、１３、１６又は１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする間葉系幹細胞検出用ポリペプチドマーカー。
【請求項１５】
請求項１４記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１６】
抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１５記載の抗体。
【請求項１８】
被検細胞における請求項１〜９のいずれか記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現を検出することを特徴とする間葉系幹細胞の識別方法。
【請求項１９】
間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現の検出を、ノーザンブロッティング法を用いて行うことを特徴とする請求項１８記載の間葉系幹細胞の識別方法。
【請求項２０】
間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現の検出を、請求項１０又は１１記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブを用いて行うことを特徴とする請求項１８記載の間葉系幹細胞の識別方法。
【請求項２１】
間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現の検出を、請求項１２又は１３記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行うことを特徴とする請求項１８記載の間葉系幹細胞の識別方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現の検出が、定量的又は半定量的ＰＣＲの使用を含んでいることを特徴とする間葉系幹細胞の識別方法。
【請求項２３】
定量的又は半定量的ＰＣＲの使用が、ＲＴ−ＰＣＲ法であることを特徴とする請求項２２記載の間葉系幹細胞の識別方法。
【請求項２４】
配列表の配列番号２０に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２１に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２２に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２３に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２４に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２５に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２６に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２７に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２８に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２９に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３０に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３１に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３２に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３３に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３４に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３５に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３６に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３７に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３８に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３９に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号４０に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４１に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号４２に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４３に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、又は、配列表の配列番号４４に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４５に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマーとからなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子増幅のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー。
【請求項２５】
配列表の配列番号４７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号４９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、又は配列表の配列番号６９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマとからなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子増幅のためのリアルタイムＰＣＲ用プライマー。
【請求項２６】
配列表の配列番号７１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１００に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１１１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１１３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、又は配列表の配列番号１１５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマとからなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子増幅のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー。
【請求項２７】
被検細胞における遺伝子を、請求項２４〜２６のいずれか記載のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも１対以上のプライマーを用いて増幅し、増幅した遺伝子を請求項１０又は１１記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブを用いて検出することを特徴とする請求項１８記載の間葉系幹細胞の識別方法。
【請求項２８】
請求項１５〜１７のいずれか記載の抗体を用いて、被検細胞における間葉系幹細胞マーカーポリペプチドの発現を検出することを特徴とする間葉系幹細胞の識別方法。
【請求項２９】
被検細胞における、配列表の配列番号１、１１及び１９からなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子のグループの１遺伝子以上の発現と、配列表の配列番号２、４、６、７、９、１０、１２、１４、１５、及び１７からなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子のグループの１遺伝子以上の発現とを組み合わせて、評価することを特徴とする間葉系幹細胞の識別方法。
【請求項３０】
請求項１０又は１１記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ及び／又は請求項１５〜１７のいずれか記載の抗体を用いて、被検細胞における間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子及び／又は間葉系幹細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出し、識別した間葉系幹細胞を分離することを特徴とする間葉系幹細胞の識別分離方法。
【請求項３１】
請求項１５〜１７のいずれか記載の抗体を用いた蛍光抗体法により被検細胞中における間葉系幹細胞を標識化し、該標識化した間葉系幹細胞を分離することを特徴とする請求項３０記載の間葉系幹細胞の識別分離方法。
【請求項３２】
請求項１０又は１１記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ、該プローブを固定した請求項１２又は１３記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ、及び請求項１５〜１７のいずれか記載の抗体の少なくても一つ以上を装備してなる間葉系幹細胞の識別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の検出、分離・識別に関し、特に、間葉系幹細胞を検出、分離・識別するのに用いる間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー及び間葉系幹細胞検出用ポリペプチドマーカー、及び、該マーカーを用いた間葉系幹細胞の検出、識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、哺乳類の骨髄等に存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に分化する多能性の幹細胞として知られている。間葉系幹細胞は、その分化多能性の故に、骨、軟骨、腱、筋肉、脂肪、歯周組織など、多くの組織の再生医療のための移植材料として注目されている（遺伝子医学、Ｖｏｌ．４、Ｎｏ．２（２０００）ｐ５８−６１）。最近、間葉系幹細胞研究の現状と展望についての総説が発行され、間葉系幹細胞の採取や培養に関する報告がなされている（実験医学、Ｖｏｌ．１９、Ｎｏ．３（２月号）２００１、ｐ３５０−３５６）。更に、脂肪組織にも間葉系幹細胞が存在することが報告された（Tissue Engineering, P.A. Zuk et al., Multilineage cells from human adipose tissue : implications for cell-based therapies. 7 : 211-228, 2001）。
【０００３】
近年、間葉系幹細胞の培養、分化等に関しいくつかの特許出願が公開されている。例えば、特表平１１−５０６６１０号公報には、無血清環境下でヒト間葉前駆細胞の生存を維持する組成物及び方法について、特表平１０−５１２７５６号公報には、間葉系幹細胞の分化を誘導するために、プロスタグランジン、アスコルビン酸、コラーゲン細胞外基質等からなる骨誘導因子、分化付随因子、軟骨誘導因子等の生物活性因子と接触させることよりなる方法について、特開２０００−２１７５７６号公報には、プロラクチン又はその同効物の共存下で多能性間葉系幹細胞を培養し、間葉系幹細胞を脂肪細胞へ分化させる方法について、それぞれ発明が開示されている。
【０００４】
本発明者は、先に、基底膜細胞外基質の存在下において、または繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等の含有培地で間葉系幹細胞を培養することによって、間葉系幹細胞が著しく速く増殖させ、かつ、その分化能を維持できることを見い出して、従来の培養方法と比較して顕著に多くの間葉系幹細胞を得る培養方法を開示した（特開２００３−５２３６０号公報）。また、間葉系幹細胞の採取に際して、採取母体に安全で、且つ採取が容易な分離採取を行うために、口腔組織から間葉系幹細胞を分離採取する方法を開示した（特開２００３−５２３６５号公報）。
【０００５】
近年、再生医療の進展とともに、間葉系幹細胞は、その分化多能性の故に、骨、軟骨、腱、筋肉、脂肪、歯周組織など、多くの組織の再生医療のための移植材料として注目されている。間葉系幹細胞を、組織の再生医療に利用するためには、まず、この幹細胞を生体組織から採取し、それを増殖し、更にそれを分化増殖して、組織の調製を行うことが必要となる。間葉系幹細胞は骨髄や骨膜に存在するが、組織再生医療への実用化のためには、まず、これらの組織から間葉系幹細胞を安全且つ容易に採取する方法を開発するが必要である。そして、間葉系幹細胞を組織再生医療へと実用化するためには、間葉系幹細胞を十分な量確保する技術を開発することが必要である。そのためには、採取した間葉系幹細胞を分化能力を維持したまま培養増殖させる技術を開発することが重要である。
【０００６】
本発明者は、上記の通り、間葉系幹細胞の採取に際して、採取母体に安全で、且つ採取が容易な分離採取を行うための方法を開発した。更に本発明者は、基底膜細胞外基質の存在下において、あるいは繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等の含有培地で間葉系幹細胞を培養することによって、間葉系幹細胞をその分化能を維持したまま爆発的に増殖させる方法を開発した。しかしながら、培養増殖した間葉系幹細胞を再生医療へと実用化するためには、培養した細胞が間葉系幹細胞であることを確認する必要があり、該間葉系幹細胞を検出、識別する方法を開発することが必要である。従来、間葉系幹細胞において、該細胞を特徴づけるマーカー遺伝子の特定はなされてきていなかった。したがって、間葉系幹細胞を特徴づけるマーカー遺伝子を特定し、間葉系幹細胞を検出、分離・識別する方法を開発することは、間葉系幹細胞を再生医療へと実用化するために、解決されなければならない重要な課題である。
【０００７】
【特許文献１】特表平１０−５１２７５６号公報。
【特許文献１】特表平１１−５０６６１０号公報。
【特許文献１】特開２０００−２１７５７６号公報。
【特許文献１】特開２００３−５２３６０号公報。
【特許文献１】特開２００３−５２３６５号公報。
【非特許文献１】遺伝子医学  Ｖｏｌ．４、Ｎｏ．２（２０００）ｐ５８−６１。
【非特許文献２】実験医学  Ｖｏｌ．１９、Ｎｏ．３（２月号）２００１、ｐ３５０−３５６。
【非特許文献３】Tissue Engineering, P.A. Zuk et al., Multilineage cells from human adipose tissue : implications for cell-based therapies. 7 : 211-228, 2001  。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、間葉系幹細胞を検出、識別するのに用いる間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー及び間葉系幹細胞検出用ポリペプチドマーカー、該遺伝子マーカーを検出するためのＰＣＲ増幅用プライマー、及び、該マーカー及びプライマーを用いた間葉系幹細胞の検出、識別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、間葉系幹細胞検出用のマーカーとなる遺伝子を見い出すべく、間葉系幹細胞における種々の遺伝子の発現の比較を行い、マーカーとなる遺伝子について探索を行った結果、配列表に示される１３の遺伝子に関して間葉系幹細胞と繊維芽細胞との間の発現量に差がみられ、間葉系幹細胞で特異的に発現しており、該遺伝子が間葉系幹細胞検出用のマーカーとなることを見い出し、本発明を完成するに至った。本発明は、該間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ、及び該間葉系幹細胞遺伝子マーカーの検出に際して、被検細胞の該遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマーを含むものである。また、本発明は、本発明の間葉系幹細胞マーカー遺伝子が発現するポリペプチドからなる間葉系幹細胞検出用ポリペプチドマーカー、該ポリペプチドマーカーを検出するための、該ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体を含むものである。更に、本発明は、該間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ、ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体を使用した間葉系幹細胞の識別方法及び分離方法を含むものである。
【００１０】
本発明の発明を完成するに至った経緯について説明すると、各種の幹細胞の中でも間葉系幹細胞は、骨、軟骨、腱、脂肪、骨格筋、心筋、血管、神経など多くの組織に分化する能力を持つものであり、再生用細胞としての期待も大きい。しかし、これまで間葉系幹細胞を特徴づけるマーカー遺伝子の特定はされていなかった。そこで、本発明者は間葉系幹細胞を特徴づけるマーカー遺伝子を特定すべく、鋭意探索を行った。すなわち、本発明者は先に開発した、骨髄由来の間葉系幹細胞をＦＧＦ等の存在下で培養することによって、その分化能を維持したまま爆発的に増殖する方法を用いて、間葉系幹細胞を増殖し、この方法によって得た間葉系幹細胞とヒト繊維芽細胞をＦＧＦ存在下で培養して、培養細胞からｍＲＮＡを抽出して、そのｍＲＮＡを鋳型とし、ＤＮＡチップ（インサイト社）をプローブとして、ＤＮＡマイクロアレイ法によりヒト由来間葉系幹細胞と繊維芽細胞に発現する遺伝子の比較を行った。
【００１１】
９４００遺伝子中６３遺伝子が間葉系幹細胞において有意に発現が高く、１４１遺伝子が有意に低かった。このうち発現量の差が３倍以上であったのは８７遺伝子（間葉系幹細胞で高かった遺伝子が２９遺伝子、低かった遺伝子が５８遺伝子）であった。３個体由来の間葉系幹細胞と３個体由来の繊維芽細胞から全ＲＮＡを抽出し、これらを鋳型に用いて、上記８７遺伝子について半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によりその発現量を調べた。その結果、発現量に差が見られない遺伝子がほとんどであった。また、異なる個体の間葉系幹細胞、あるいは繊維芽細胞の間でも発現量に差があり個体差によって発現が異なると考えられるものも多くあった。
【００１２】
ＲＴ−ＰＣＲによって間葉系幹細胞で発現が高いことが確認された遺伝子は３遺伝子（tissue factor pathway inhibitor 2, major histocompatibility complex class2 DR beta 3, serine (or cysteine) proteinase inhibitor）、低いことが確認された遺伝子は１０種類（matrix metalloprotease 1, collagenase type XV alpha, CUG triplet repeat RNA binding protein, dermatopontin, protein tyrosine kinase 7, isocitrate dehydrogenase 2, Sam68-like phosphotyrosine protein, C-type lectin superfamily member 2, adrenomedullin, apolopoprotein D）であった。これら１３遺伝子の発現量を測定することにより、判別困難であった間葉系幹細胞の同定を短時間に、かつ安価に行うことが可能となった。更に、本発明において、遺伝子の探索を行った結果、間葉系幹細胞、あるいは繊維芽細胞の間で発現量に差がある多くの遺伝子を確認した。これらの遺伝子は間葉系幹細胞検出用の遺伝子マーカーとなるものであり、遺伝子検出用プローブを構築して、マイクロアレイ又はＤＮＡチップ等として、間葉系幹細胞の検出に用いることができるものである。
【００１３】
すなわち具体的には本発明は、配列表の配列番号１、２、４、６、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１９、又は４６に示される塩基配列を有する遺伝子であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー（請求項１）や、遺伝子INTEGRIN, ALPHA 6 (ITGA6), MRNA（NM 000210）；遺伝子SOLUTE CARRIER FAMILY 20 (PHOSPHATE TRANSPORTER)、MEMBER 1（NM 005415）；遺伝子RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE M2 POLYPEPTIDE (RRM2), MRNA（NM 001034）；遺伝子FOLLISTATIN (FST), TRANSCRIPT VARIANT FST317, MRNA（NM 006350）；遺伝子SPROUTY (DROSOPHILA) HOMOLOG 2 (SPRY2), MRNA（NM 005842）；遺伝子RAB3B, MEMBER RAS ONCOGENE FAMILY (RAB3B), MRNA（NM 002867）；遺伝子SOLUTE CARRIER FAMILY 2 (FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER)（NM 006516）；遺伝子INTERLEUKIN 13 RECEPTOR, ALPHA 2 (IL13RA2), MRNA（NM 000640）；遺伝子SERINE/THREONINE KINASE 12 (STK12), MRNA（NM 004217）；遺伝子MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 5 (CE)（NM 006739）；遺伝子THYROID HORMONE RECEPTOR INTERACTOR 13 (TRIP13), MRNA（NM 004237）；遺伝子KINESIN-LIKE 6 (MITOTIC CENTROMERE-ASSOCIATED KINESIN) (K)（NM 006845）；遺伝子CYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 3 (CDK2-ASSOCIATED DUAL（NM 005192）；遺伝子CHROMOSOME CONDENSATION PROTEIN G (HCAP-G),MRNA（NM 022346）；遺伝子CDC28 PROTEIN KINASE 1 (CKS1), MRNA（NM 001826）；遺伝子PROTEIN REGULATOR OF CYTOKINESIS 1 (PRC1), MRNA（NM 003981）；遺伝子CELL DIVISION CYCLE 2, G1 TO S AND G2 TO M (CDC2), MRNA（NM 001786）；遺伝子CDC20 (CELL DIVISION CYCLE 20, S. CEREVISIAE, HOMOLOG) (CD)（NM 001255）；遺伝子LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS（NM 014791）；遺伝子MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M)（NM 005916）；遺伝子CYCLIN A2 (CCNA2), MRNA（NM 001237）；遺伝子THYMIDINE KINASE 1, SOLUBLE (TK1), MRNA（NM 003258）；又は遺伝子cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4) (CDKN2A), mRNA（NM 000077）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー（請求項２）や、遺伝子EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1（NM 018894）；遺伝子Human insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5) mRNA（AU132011）；遺伝子Homo sapiens clone 24775 mRNA sequence（AA402981）；proteoglycan 1, secretory granule（AV734015）；遺伝子insulin-like growth factor binding protein 5（AA374325）；遺伝子solute carrier family 21 (organic anion transporter), member 3（AF085224）；遺伝transglutaminase 2 (C polypeptide, protein-glutamine-gamma-glutamyl  transferase)（AL552373）；遺伝子coagulation factor II (thrombin) receptor（M62424）；遺伝子plasminogen activator, urokinase（NM 002658）；遺伝子tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (Sorsby fundus dystrophy, pseudoinflammatory)（W96324）；遺伝子matrix Gla protein（BF668572）；遺伝子B-cell CLL/lymphoma 1（Z23022）；遺伝子CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II antigen-associated)（BG333618）；遺伝子adducin 3 (gamma)（AL135243）；遺伝子solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 4（NM 004696）；遺伝子protein S (alpha)（NM 000313）；遺伝子phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate 5-phosphatase homolog; phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatase type IV（AF187891）；遺伝子progesterone membrane binding protein（BE858855）；遺伝子brain-derived neurotrophic factor（X60201）；又は遺伝子apolipoprotein E（BF967316）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー（請求項３）や、遺伝子HOMO SAPIENS WNT INHIBITORY FACTOR-1 (WIF-1), MRNA（NM 007191）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ11175 (FLJ11175), MRNA（NM 018349）；遺伝子HOMO SAPIENS RHO GDP DISSOCIATION INHIBITOR (GDI) BETA (ARHGDIB), MRNA（NM 001175）；遺伝子HOMO SAPIENS POTASSIUM INTERMEDIATE/SMALL CONDUCTANCE CALCIUM-ACTIVATE（NM 021614）；遺伝子HOMO SAPIENS NUCLEAR FACTOR (ERYTHROID-DERIVED 2)-LIKE 3 (NFE2L3), MRNA（NM 004289）；遺伝子HOMO SAPIENS GS3955 PROTEIN (GS3955), MRNA（NM 021643）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA 3' END SIMILAR TO SIMILAR TO GLYCOPROTEIN MUC18（AA302605）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ21841 (FLJ21841), MRNA（NM 024609）；遺伝子HOMO SAPIENS ZINC FINGER PROTEIN 185 (LIM DOMAIN) (ZNF185), MRNA（NM 007150）；遺伝子SC1=PUTATIVE TRANS-ACTING FACTOR INVOLVED IN CELL CYCLE CONTROL [HUMAN, MRNA, 24]（S53374）；遺伝子HOMO SAPIENS NADH DEHYDROGENASE (UBIQUINONE) 1 ALPHA SUBCOMPLEX, 8 (19K)（NM 014222）；遺伝子HOMO SAPIENS HOMOLOG OF YEAST MCM10; HYPOTHETICAL PROTEIN PRO2249 (PRO2)（NM 018518）；遺伝子HOMO SAPIENS COLLAGEN, TYPE VII, ALPHA 1 (EPIDERMOLYSIS BULLOSA, DYSTRO（NM 000094）；遺伝子HOMO SAPIENS AUTOCRINE MOTILITY FACTOR RECEPTOR (AMFR), MRNA（NM 001144）；遺伝子HOMO SAPIENS CLONE 24421 MRNA SEQUENCE /CDS=UNKNOWN /GB=AF070641 /GI=3283914 /UG=（AF070641）；遺伝子HOMO SAPIENS MRNA;遺伝子CDNA DKFZP586E1621 (FROM CLONE DKFZP586E1621) /CDS=UNKNOWN /GB（AL080235）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー（請求項４）や、遺伝子HOMO SAPIENS RESERVED (KCNK12), MRNA（NM 022055）；遺伝子HOMO SAPIENS UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME E2C (UBE2C), MRNA（NM 007019）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA FLJ10517 FIS, CLONE NT2RP2000812 /CDS=(61,918) /GB=AK001379 /G（AK001379）；遺伝子HOMO SAPIENS CARTILAGE LINKING PROTEIN 1 (CRTL1), MRNA（NM 001884）；遺伝子HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434F2322 (FROM CLONE DKFZP434F2322) /CDS=UNKNOWN /GB（AL133105）；遺伝子HOMO SAPIENS, CLONE MGC:9549 IMAGE:3857382, MRNA, COMPLETE CDS /CDS=(92,1285) /G（BC012453）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP586J1119 (DKFZP586J1119), MRNA（NM 032270）；遺伝子HOMO SAPIENS GLIA MATURATION FACTOR, GAMMA (GMFG), MRNA（NM 004877）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA: FLJ23095 FIS, CLONE LNG07413 /CDS=UNKNOWN /GB=AK026748 /GI=10（AK026748）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP762E1312 (DKFZP762E1312), MRNA（NM 018410）；遺伝子HOMO SAPIENS IROQUOIS-CLASS HOMEODOMAIN PROTEIN (IRX-2A), MRNA（NM 005853）；又は遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10540 (FLJ10540), MRNA（NM 018131）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー（請求項５）や、遺伝子HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434C1915 (FROM CLONE DKFZP434C1915); PARTIAL CDS /C（AL137698）；遺伝子HOMO SAPIENS MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M)（NM 005916）；遺伝子HOMO SAPIENS DYNEIN, CYTOPLASMIC, INTERMEDIATE POLYPEPTIDE 1 (DNCI1), M（NM 004411）；遺伝子HUMAN MRNA FOR PROTEIN GENE PRODUCT (PGP) 9.5.（X04741）；遺伝子HOMO SAPIENS RAD51-INTERACTING PROTEIN (PIR51), MRNA（NM 006479）；遺伝子HOMO SAPIENS BACULOVIRAL IAP REPEAT-CONTAINING 5 (SURVIVIN) (BIRC5), MR（NM 001168）；遺伝子HOMO SAPIENS UDP-N-ACETYL-ALPHA-D-GALACTOSAMINE:POLYPEPTIDE N-ACETYLGAL（NM 004482）；遺伝子HOMO SAPIENS CYCLIN B1 (CCNB1), MRNA（NM 031966）；遺伝子HOMO SAPIENS FLAP STRUCTURE-SPECIFIC ENDONUCLEASE 1 (FEN1), MRNA（NM 004111）；遺伝子HOMO SAPIENS SERINE/THREONINE KINASE 15 (STK15), MRNA（NM 003600）；遺伝子HOMO SAPIENS MAD2 (MITOTIC ARREST DEFICIENT, YEAST, HOMOLOG)-LIKE 1 (MA)（NM 002358）；遺伝子HOMO SAPIENS NUCLEOLAR PROTEIN ANKT (ANKT), MRNA（NM 018454）；遺伝子HOMO SAPIENS HSPC150 PROTEIN SIMILAR TO UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME (H)（NM 014176）；遺伝子HOMO SAPIENS CYTOCHROME P450 RETINOID METABOLIZING PROTEIN (P450RAI-2),（NM 019885）；遺伝子HOMO SAPIENS NIMA (NEVER IN MITOSIS GENE A)-RELATED KINASE 2 (NEK2), MR（NM 002497）；遺伝子HOMO SAPIENS BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 4 (BMP4), MRNA（NM 001202）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA FLJ10674 FIS, CLONE NT2RP2006436 /CDS=UNKNOWN /GB=AK001536 /GI（AK001536）；又は遺伝子HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN A (17KD) (CENPA), MRNA（NM 001809）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー（請求項６）や、遺伝子HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP564P116 (FROM CLONE DKFZP564P116) /CDS=UNKNOWN /GB=A（AL049338）；遺伝子HOMO SAPIENS TTK PROTEIN KINASE (TTK), MRNA（NM 003318）；遺伝子HOMO SAPIENS KARYOPHERIN ALPHA 2 (RAG COHORT 1, IMPORTIN ALPHA 1) (KPNA（NM 002266）；遺伝子HOMO SAPIENS POLYMERASE (DNA DIRECTED), THETA (POLQ), MRNA（NM 006596）；遺伝子HOMO SAPIENS ETS VARIANT GENE 5 (ETS-RELATED MOLECULE) (ETV5), MRNA（NM 004454）；遺伝子HOMO SAPIENS TRANSFORMING, ACIDIC COILED-COIL CONTAINING PROTEIN 3 (TAC)（NM 006342）；遺伝子HOMO SAPIENS KINESIN-LIKE 1 (KNSL1), MRNA（NM 004523）；遺伝子HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN E (312KD) (CENPE), MRNA（NM 001813）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA, 3' END /CLONE=IMAGE:1651289 /CLONE END=3' /GB=AI12（AI123815）；遺伝子HOMO SAPIENS DISTAL-LESS HOMEO BOX 5 (DLX5), MRNA（NM 005221）；遺伝子HOMO SAPIENS V-MYB AVIAN MYELOBLASTOSIS VIRAL ONCOGENE HOMOLOG-LIKE 2 （NM 002466）；又は遺伝子HOMO SAPIENS SERUM DEPRIVATION RESPONSE (PHOSPHATIDYLSERINE-BINDING PRO（NM 004657）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー（請求項７）や、遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10604 (FLJ10604), MRNA（NM 018154）；遺伝子HOMO SAPIENS RIBONUCLEASE HI, LARGE SUBUNIT (RNASEHI), MRNA（NM 006397）；遺伝子HOMO SAPIENS ANILLIN (DROSOPHILA SCRAPS HOMOLOG), ACTIN BINDING PROTEIN（NM 018685）；遺伝子HOMO SAPIENS H4 HISTONE FAMILY, MEMBER G (H4FG), MRNA（NM 003542）；遺伝子HOMO SAPIENS G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR 37 (ENDOTHELIN RECEPTOR TYPE B-（NM 005302）HOMO SAPIENS UBIQUITIN CARRIER PROTEIN (E2-EPF), MRNA（NM 014501）；遺伝子HOMO SAPIENS, SIMILAR TO TUMOR DIFFERENTIALLY EXPRESSED 1, CLONE IMAGE:3639252, （BC007375）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC2577 (MGC2577), MRNA（NM 031299）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ13912 (FLJ13912), MRNA（NM 022770）；遺伝子HOMO SAPIENS ANNEXIN A3 (ANXA3), MRNA（NM 005139）；遺伝子HOMO SAPIENS STATHMIN 1/ONCOPROTEIN 18 (STMN1), MRNA（NM 005563）HOMO SAPIENS, SIMILAR TO RIBOSOMAL PROTEIN L39, CLONE MGC:20168 IMAGE:4555759, M（BC012328）；遺伝子HOMO SAPIENS POLO (DROSOPHIA)-LIKE KINASE (PLK), MRNA（NM 005030）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー（請求項８）や、遺伝子HOMO SAPIENS PROTEASOME (PROSOME, MACROPAIN) 26S SUBUNIT, ATPASE, 5 (PS)（NM 002805）；遺伝子HOMO SAPIENS EUKARYOTIC TRANSLATION INITIATION FACTOR 4 GAMMA, 2 (EIF4G)（NM 001418）；遺伝子HOMO SAPIENS DIHYDROPYRIMIDINASE-LIKE 3 (DPYSL3), MRNA）（NM 001387）；遺伝子HOMO SAPIENS ADAPTOR-RELATED PROTEIN COMPLEX 1, SIGMA 2 SUBUNIT (AP1S2)（NM 003916）；遺伝子HOMO SAPIENS PLECTIN 1, INTERMEDIATE FILAMENT BINDING PROTEIN, 500KD (P)（NM 000445）；遺伝子HOMO SAPIENS HETEROGENEOUS NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEIN U (SCAFFOLD ATTAC（NM
031844）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC5306 (MGC5306), MRNA（NM 024116）；遺伝子HOMO SAPIENS MHC CLASS I POLYPEPTIDE-RELATED SEQUENCE A (MICA), MRNA（NM 000247）；遺伝子HOMO SAPIENS PROTEIN ASSOCIATED WITH PRK1 (AWP1), MRNA（NM 019006）；遺伝子HOMO SAPIENS PROGESTERONE RECEPTOR MEMBRANE COMPONENT 2 (PGRMC2), MRNA（NM 006320）；遺伝子HOMO SAPIENS POLYGLUTAMINE BINDING PROTEIN 1 (PQBP1), MRNA（NM 005710）；遺伝子HOMO SAPIENS S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 1 (AMD1), MRNA（NM 001634）； HOMO SAPIENS INTERFERON-INDUCED, HEPATITIS C-ASSOCIATED MICROTUBULAR AG（NM 006417）；遺伝子HOMO SAPIENS PROTEIN KINASE, AMP-ACTIVATED, GAMMA 1 NON-CATALYTIC SUBUN（NM 002733）；HOMO SAPIENS PROCOLLAGEN-PROLINE, 2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE (PROLINE（NM 004199）；遺伝子HOMO SAPIENS ENDOTHELIAL DIFFERENTIATION, LYSOPHOSPHATIDIC ACID G-PROTE（NM 012152）；又は遺伝子HOMO SAPIENS KIAA0127 GENE PRODUCT (KIAA0127), MRNA（NM 014755）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー（請求項９）からなる。
【００１４】
また、本発明は、請求項１〜９のいずれか記載の間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有する間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ（請求項１０）や、請求項１〜９のいずれか記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる請求項１０記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ（請求項１１）や、請求項１０又は１１記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ（請求項１２）や、配列表の配列番号１、２、４、６、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１９、又は４６に示される塩基配列を有する遺伝子のグループ、及び請求項２〜９のいずれか記載の遺伝子のグループの２以上の遺伝子を検出するプローブを固定化させたことを特徴とする請求項１２記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ（請求項１３）や、配列表の配列番号３、５、８、１３、１６又は１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする間葉系幹細胞検出用ポリペプチドマーカー（請求項１４）や、請求項１４記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体（請求項１５）や、抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１５記載の抗体（請求項１６）や、抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１５記載の抗体（請求項１７）からなる。
【００１５】
更に、本発明は、被検細胞における請求項１〜９のいずれか記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現を検出することを特徴とする間葉系幹細胞の識別方法（請求項１８）や、間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現の検出を、ノーザンブロッティング法を用いて行うことを特徴とする請求項１８記載の間葉系幹細胞の識別方法（請求項１９）や、間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現の検出を、請求項１０又は１１記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブを用いて行うことを特徴とする請求項１８記載の間葉系幹細胞の識別方法（請求項２０）や、間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現の検出を、請求項１２又は１３記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行うことを特徴とする請求項１８記載の間葉系幹細胞の識別方法（請求項２１）や、請求項１８〜２１のいずれか記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現の検出が、定量的又は半定量的ＰＣＲの使用を含んでいることを特徴とする間葉系幹細胞の識別方法（請求項２２）や、定量的又は半定量的ＰＣＲの使用が、ＲＴ−ＰＣＲ法であることを特徴とする請求項２２記載の間葉系幹細胞の識別方法（請求項２３）や、配列表の配列番号２０に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２１に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２２に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２３に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２４に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２５に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２６に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２７に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２８に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２９に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３０に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３１に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３２に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３３に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３４に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３５に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３６に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３７に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３８に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３９に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号４０に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４１に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号４２に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４３に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、又は、配列表の配列番号４４に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４５に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマーとからなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子増幅のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（請求項２４）や、配列表の配列番号４７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号４９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、又は配列表の配列番号６９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマとからなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子増幅のためのリアルタイムＰＣＲ用プライマー。（請求項２５）や、配列表の配列番号７１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１００に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１１１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１１３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、又は配列表の配列番号１１５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマとからなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子増幅のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（請求項２６）や、被検細胞における遺伝子を、請求項２４〜２６のいずれか記載のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも１対以上のプライマーを用いて増幅し、増幅した遺伝子を請求項１０又は１１記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブを用いて検出することを特徴とする請求項１８記載の間葉系幹細胞の識別方法（請求項２７）や、請求項１５〜１７のいずれか記載の抗体を用いて、被検細胞における間葉系幹細胞マーカーポリペプチドの発現を検出することを特徴とする間葉系幹細胞の識別方法（請求項２８）や、被検細胞における、配列表の配列番号１、１１及び１９からなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子のグループの１遺伝子以上の発現と、配列表の配列番号２、４、６、７、９、１０、１２、１４、１５、及び１７からなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子のグループの１遺伝子以上の発現とを組み合わせて、評価することを特徴とする間葉系幹細胞の識別方法（請求項２９）や、請求項１０又は１１記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ及び／又は請求項１５〜１７のいずれか記載の抗体を用いて、被検細胞における間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子及び／又は間葉系幹細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出し、識別した間葉系幹細胞を分離することを特徴とする間葉系幹細胞の識別分離方法（請求項３０）や、請求項１５〜１７のいずれか記載の抗体を用いた蛍光抗体法により被検細胞中における間葉系幹細胞を標識化し、該標識化した間葉系幹細胞を分離することを特徴とする請求項３０記載の間葉系幹細胞の識別分離方法（請求項３１）や、請求項１０又は１１記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ、該プローブを固定した請求項１２又は１３記載の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ、及び請求項１５〜１７のいずれか記載の抗体の少なくても一つ以上を装備してなる間葉系幹細胞の識別用キット（請求項３２）からなる。
【発明の効果】
【００１６】
近年、再生医療の進展とともに、間葉系幹細胞が多くの組織の再生医療のための移植材料として注目されている。間葉系幹細胞を、組織の再生医療に利用するためには、間葉系幹細胞を十分な量確保する技術を開発することが必要であるとともに、培養した細胞が間葉系幹細胞であることを確認する必要があり、該間葉系幹細胞を検出、識別する方法が重要となる。また、抗体などを用いて多種類の細胞の集団から間葉系幹細胞を分離することにも役立つ。本発明により、間葉系幹細胞を特徴づけるマーカー遺伝子を特定したことによって、容易且つ確実に間葉系幹細胞を検出、識別することが可能となり、間葉系幹細胞を再生医療へと実用化するため大きく貢献することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、間葉系幹細胞で特異的に発現する、間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子又は間葉系幹細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出して、間葉系幹細胞の識別を行うことよりなる。本発明において、間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカーとなる遺伝子は、配列表の配列番号１、２、４、６、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７又は１９に示される塩基配列を有する遺伝子である。
また、本発明において、間葉系幹細胞検出用のポリペプチドマーカーとなるポリペプチドは、配列表の配列番号３、５、８、１３、１６又は１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１８】
配列表の配列番号１に示される遺伝子は［serine (or cysteine) proteinase inhibitor］の遺伝子であり、配列表の配列番号２に示される遺伝子は［adrenomedullin］の遺伝子であり、配列表の配列番号４に示される遺伝子は［apolopoprotein D］の遺伝子であり、配列表の配列番号６に示される遺伝子は［collagenase type XV alpha 1］の遺伝子であり、配列表の配列番号７に示される遺伝子は［CUG triplet repeat RNA binding protein2］の遺伝子であり、配列表の配列番号９に示される遺伝子は［dermatopontin］の遺伝子であり、配列表の配列番号１０に示される遺伝子は［isocitrate dehydrogenase 2］の遺伝子であり、配列表の配列番号１１に示される遺伝子は［major histocompatibility complex class2, DR beta 3］の遺伝子であり、配列表の配列番号１２に示される遺伝子は［protein tyrosine kinase 7］の遺伝子であり、配列表の配列番号１４に示される遺伝子は［Sam68-like phosphotyrosine protein］の遺伝子であり、配列表の配列番号１５に示される遺伝子は［C-type lectin superfamily member 2］の遺伝子であり、配列表の配列番号１７に示される遺伝子は［matrix metalloprotease 1］の遺伝子であり、及び、配列表の配列番号１９に示される遺伝子は［tissue factor pathway inhibitor 2］の遺伝子であり、配列表の配列番号４６に示される遺伝子は［major histocompatibility complex DR alpha］の遺伝子である。
【００１９】
本発明の間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子のＤＮＡ配列情報は、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、それぞれアクセッションナンバー：ＡＩ１３３６１３（配列番号１）、ＮＭ＿００１１２４（配列番号２）、ＮＭ＿００１６４７（配列番号４）、Ｌ０１６９７（配列番号６）、Ｕ６９５４６（配列番号７）、ＡＷ０１６４５１（配列番号９）、ＡＬ５４５９５３（配列番号１０）、ＢＦ７３２８２２（配列番号１１）、ＡＬ１５７４８６（配列番号１２）、ＡＡ１１２００１（配列番号１４）、ＸＭ＿００６６２６（配列番号１５）、ＮＭ＿００２４２１（配列番号１７）、ＡＬ５５０３５７（配列番号１９）、及びＢＦ７９５９２９(配列番号４６)によりアプローチすることができる。
【００２０】
更に本発明において確認された、繊維芽細胞に比較して、間葉系幹細胞で多量に発現している遺伝子としては、以下のものが挙げられる：
遺伝子INTEGRIN, ALPHA 6 (ITGA6), MRNA（NM 000210）；遺伝子SOLUTE CARRIER FAMILY 20 (PHOSPHATE TRANSPORTER)、MEMBER 1（NM 005415）；遺伝子RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE M2 POLYPEPTIDE (RRM2), MRNA（NM 001034）；遺伝子FOLLISTATIN (FST), TRANSCRIPT VARIANT FST317, MRNA（NM 006350）；遺伝子SPROUTY (DROSOPHILA) HOMOLOG 2 (SPRY2), MRNA（NM 005842）；遺伝子RAB3B, MEMBER RAS ONCOGENE FAMILY (RAB3B), MRNA（NM 002867）；遺伝子SOLUTE CARRIER FAMILY 2 (FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER)（NM 006516）；遺伝子INTERLEUKIN 13 RECEPTOR, ALPHA 2 (IL13RA2), MRNA（NM 000640）；遺伝子SERINE/THREONINE KINASE 12 (STK12), MRNA（NM 004217）；遺伝子MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 5 (CE)（NM 006739）；遺伝子THYROID HORMONE RECEPTOR INTERACTOR 13 (TRIP13), MRNA（NM 004237）；遺伝子KINESIN-LIKE 6 (MITOTIC CENTROMERE-ASSOCIATED KINESIN) (K)（NM 006845）；遺伝子CYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 3 (CDK2-ASSOCIATED DUAL（NM 005192）；遺伝子CHROMOSOME CONDENSATION PROTEIN G (HCAP-G),MRNA（NM 022346）；遺伝子CDC28 PROTEIN KINASE 1 (CKS1), MRNA（NM 001826）；遺伝子PROTEIN REGULATOR OF CYTOKINESIS 1 (PRC1), MRNA（NM 003981）；遺伝子CELL DIVISION CYCLE 2, G1 TO S AND G2 TO M (CDC2), MRNA（NM 001786）；遺伝子CDC20 (CELL DIVISION CYCLE 20, S. CEREVISIAE, HOMOLOG) (CD)（NM 001255）；遺伝子LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS（NM 014791）；遺伝子MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M)（NM 005916）；遺伝子CYCLIN A2 (CCNA2), MRNA（NM 001237）；遺伝子THYMIDINE KINASE 1, SOLUBLE (TK1), MRNA（NM 003258）；又は遺伝子cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4) (CDKN2A), mRNA（NM 000077）。
【００２１】
遺伝子EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1（NM 018894）；遺伝子Human insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5) mRNA（AU132011）；遺伝子Homo sapiens clone 24775 mRNA sequence（AA402981）；proteoglycan 1, secretory granule（AV734015）；遺伝子insulin-like growth factor binding protein 5（AA374325）；遺伝子solute carrier family 21 (organic anion transporter), member 3（AF085224）；遺伝transglutaminase 2 (C polypeptide, protein-glutamine-gamma-glutamyl  transferase)（AL552373）；遺伝子coagulation factor II (thrombin) receptor（M62424）；遺伝子plasminogen activator, urokinase（NM 002658）；遺伝子tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (Sorsby fundus dystrophy, pseudoinflammatory)（W96324）；遺伝子matrix Gla protein（BF668572）；遺伝子B-cell CLL/lymphoma 1（Z23022）；遺伝子CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II antigen-associated)（BG333618）；遺伝子adducin 3 (gamma)（AL135243）；遺伝子solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 4（NM 004696）；遺伝子protein S (alpha)（NM 000313）；遺伝子phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate 5-phosphatase homolog; phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatase type IV（AF187891）；遺伝子progesterone membrane binding protein（BE858855）；遺伝子brain-derived neurotrophic factor（X60201）；又は遺伝子apolipoprotein E（BF967316）。
【００２２】
遺伝子HOMO SAPIENS WNT INHIBITORY FACTOR-1 (WIF-1), MRNA（NM 007191）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ11175 (FLJ11175), MRNA（NM 018349）；遺伝子HOMO SAPIENS RHO GDP DISSOCIATION INHIBITOR (GDI) BETA (ARHGDIB), MRNA（NM 001175）；遺伝子HOMO SAPIENS POTASSIUM INTERMEDIATE/SMALL CONDUCTANCE CALCIUM-ACTIVATE（NM 021614）；遺伝子HOMO SAPIENS NUCLEAR FACTOR (ERYTHROID-DERIVED 2)-LIKE 3 (NFE2L3), MRNA（NM 004289）；遺伝子HOMO SAPIENS GS3955 PROTEIN (GS3955), MRNA（NM 021643）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA 3' END SIMILAR TO SIMILAR TO GLYCOPROTEIN MUC18（AA302605）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ21841 (FLJ21841), MRNA（NM 024609）；遺伝子HOMO SAPIENS ZINC FINGER PROTEIN 185 (LIM DOMAIN) (ZNF185), MRNA（NM 007150）；遺伝子SC1=PUTATIVE TRANS-ACTING FACTOR INVOLVED IN CELL CYCLE CONTROL [HUMAN, MRNA, 24]（S53374）；遺伝子HOMO SAPIENS NADH DEHYDROGENASE (UBIQUINONE) 1 ALPHA SUBCOMPLEX, 8 (19K)（NM 014222）；遺伝子HOMO SAPIENS HOMOLOG OF YEAST MCM10; HYPOTHETICAL PROTEIN PRO2249 (PRO2)（NM 018518）；遺伝子HOMO SAPIENS COLLAGEN, TYPE VII, ALPHA 1 (EPIDERMOLYSIS BULLOSA, DYSTRO（NM 000094）；遺伝子HOMO SAPIENS AUTOCRINE MOTILITY FACTOR RECEPTOR (AMFR), MRNA（NM 001144）；遺伝子HOMO SAPIENS CLONE 24421 MRNA SEQUENCE /CDS=UNKNOWN /GB=AF070641 /GI=3283914 /UG=（AF070641）；遺伝子HOMO SAPIENS MRNA;遺伝子CDNA DKFZP586E1621 (FROM CLONE DKFZP586E1621) /CDS=UNKNOWN /GB（AL080235）。
【００２３】
遺伝子HOMO SAPIENS RESERVED (KCNK12), MRNA（NM 022055）；遺伝子HOMO SAPIENS UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME E2C (UBE2C), MRNA（NM 007019）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA FLJ10517 FIS, CLONE NT2RP2000812 /CDS=(61,918) /GB=AK001379 /G（AK001379）；遺伝子HOMO SAPIENS CARTILAGE LINKING PROTEIN 1 (CRTL1), MRNA（NM 001884）；遺伝子HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434F2322 (FROM CLONE DKFZP434F2322) /CDS=UNKNOWN /GB（AL133105）；遺伝子HOMO SAPIENS, CLONE MGC:9549 IMAGE:3857382, MRNA, COMPLETE CDS /CDS=(92,1285) /G（BC012453）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP586J1119 (DKFZP586J1119), MRNA（NM 032270）；遺伝子HOMO SAPIENS GLIA MATURATION FACTOR, GAMMA (GMFG), MRNA（NM 004877）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA: FLJ23095 FIS, CLONE LNG07413 /CDS=UNKNOWN /GB=AK026748 /GI=10（AK026748）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP762E1312 (DKFZP762E1312), MRNA（NM 018410）；遺伝子HOMO SAPIENS IROQUOIS-CLASS HOMEODOMAIN PROTEIN (IRX-2A), MRNA（NM 005853）；又は遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10540 (FLJ10540), MRNA（NM 018131）。
【００２４】
遺伝子HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434C1915 (FROM CLONE DKFZP434C1915); PARTIAL CDS /C（AL137698）；遺伝子HOMO SAPIENS MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M)（NM 005916）；遺伝子HOMO SAPIENS DYNEIN, CYTOPLASMIC, INTERMEDIATE POLYPEPTIDE 1 (DNCI1), M（NM 004411）；遺伝子HUMAN MRNA FOR PROTEIN GENE PRODUCT (PGP) 9.5.（X04741）；遺伝子HOMO SAPIENS RAD51-INTERACTING PROTEIN (PIR51), MRNA（NM 006479）；遺伝子HOMO SAPIENS BACULOVIRAL IAP REPEAT-CONTAINING 5 (SURVIVIN) (BIRC5), MR（NM 001168）；遺伝子HOMO SAPIENS UDP-N-ACETYL-ALPHA-D-GALACTOSAMINE:POLYPEPTIDE N-ACETYLGAL（NM 004482）；遺伝子HOMO SAPIENS CYCLIN B1 (CCNB1), MRNA（NM 031966）；遺伝子HOMO SAPIENS FLAP STRUCTURE-SPECIFIC ENDONUCLEASE 1 (FEN1), MRNA（NM 004111）；遺伝子HOMO SAPIENS SERINE/THREONINE KINASE 15 (STK15), MRNA（NM 003600）；遺伝子HOMO SAPIENS MAD2 (MITOTIC ARREST DEFICIENT, YEAST, HOMOLOG)-LIKE 1 (MA)（NM 002358）；遺伝子HOMO SAPIENS NUCLEOLAR PROTEIN ANKT (ANKT), MRNA（NM 018454）；遺伝子HOMO SAPIENS HSPC150 PROTEIN SIMILAR TO UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME (H)（NM 014176）；遺伝子HOMO SAPIENS CYTOCHROME P450 RETINOID METABOLIZING PROTEIN (P450RAI-2),（NM 019885）；遺伝子HOMO SAPIENS NIMA (NEVER IN MITOSIS GENE A)-RELATED KINASE 2 (NEK2), MR（NM 002497）；遺伝子HOMO SAPIENS BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 4 (BMP4), MRNA（NM 001202）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA FLJ10674 FIS, CLONE NT2RP2006436 /CDS=UNKNOWN /GB=AK001536 /GI（AK001536）；又は遺伝子HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN A (17KD) (CENPA), MRNA（NM 001809）。
【００２５】
遺伝子HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP564P116 (FROM CLONE DKFZP564P116) /CDS=UNKNOWN /GB=A（AL049338）；遺伝子HOMO SAPIENS TTK PROTEIN KINASE (TTK), MRNA（NM 003318）；遺伝子HOMO SAPIENS KARYOPHERIN ALPHA 2 (RAG COHORT 1, IMPORTIN ALPHA 1) (KPNA（NM 002266）；遺伝子HOMO SAPIENS POLYMERASE (DNA DIRECTED), THETA (POLQ), MRNA（NM 006596）；遺伝子HOMO SAPIENS ETS VARIANT GENE 5 (ETS-RELATED MOLECULE) (ETV5), MRNA（NM 004454）；遺伝子HOMO SAPIENS TRANSFORMING, ACIDIC COILED-COIL CONTAINING PROTEIN 3 (TAC)（NM 006342）；遺伝子HOMO SAPIENS KINESIN-LIKE 1 (KNSL1), MRNA（NM 004523）；遺伝子HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN E (312KD) (CENPE), MRNA（NM 001813）；遺伝子HOMO SAPIENS CDNA, 3' END /CLONE=IMAGE:1651289 /CLONE END=3' /GB=AI12（AI123815）；遺伝子HOMO SAPIENS DISTAL-LESS HOMEO BOX 5 (DLX5), MRNA（NM 005221）；遺伝子HOMO SAPIENS V-MYB AVIAN MYELOBLASTOSIS VIRAL ONCOGENE HOMOLOG-LIKE 2 （NM 002466）；又は遺伝子HOMO SAPIENS SERUM DEPRIVATION RESPONSE (PHOSPHATIDYLSERINE-BINDING PRO（NM 004657）。
【００２６】
遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10604 (FLJ10604), MRNA（NM 018154）；遺伝子HOMO SAPIENS RIBONUCLEASE HI, LARGE SUBUNIT (RNASEHI), MRNA（NM 006397）；遺伝子HOMO SAPIENS ANILLIN (DROSOPHILA SCRAPS HOMOLOG), ACTIN BINDING PROTEIN（NM 018685）；遺伝子HOMO SAPIENS H4 HISTONE FAMILY, MEMBER G (H4FG), MRNA（NM 003542）；遺伝子HOMO SAPIENS G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR 37 (ENDOTHELIN RECEPTOR TYPE B-（NM 005302）HOMO SAPIENS UBIQUITIN CARRIER PROTEIN (E2-EPF), MRNA（NM 014501）；遺伝子HOMO SAPIENS, SIMILAR TO TUMOR DIFFERENTIALLY EXPRESSED 1, CLONE IMAGE:3639252, （BC007375）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC2577 (MGC2577), MRNA（NM 031299）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ13912 (FLJ13912), MRNA（NM 022770）；遺伝子HOMO SAPIENS ANNEXIN A3 (ANXA3), MRNA（NM 005139）；遺伝子HOMO SAPIENS STATHMIN 1/ONCOPROTEIN 18 (STMN1), MRNA（NM 005563）HOMO SAPIENS, SIMILAR TO RIBOSOMAL PROTEIN L39, CLONE MGC:20168 IMAGE:4555759, M（BC012328）；遺伝子HOMO SAPIENS POLO (DROSOPHIA)-LIKE KINASE (PLK), MRNA（NM 005030）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【００２７】
また、本発明において確認された、繊維芽細胞に比較して、間葉系幹細胞で発現していないか或いは極めて少量発現している遺伝子としては、以下のものが挙げられる：
遺伝子HOMO SAPIENS PROTEASOME (PROSOME, MACROPAIN) 26S SUBUNIT, ATPASE, 5 (PS)（NM 002805）；遺伝子HOMO SAPIENS EUKARYOTIC TRANSLATION INITIATION FACTOR 4 GAMMA, 2 (EIF4G)（NM 001418）；遺伝子HOMO SAPIENS DIHYDROPYRIMIDINASE-LIKE 3 (DPYSL3), MRNA）（NM 001387）；遺伝子HOMO SAPIENS ADAPTOR-RELATED PROTEIN COMPLEX 1, SIGMA 2 SUBUNIT (AP1S2)（NM 003916）；遺伝子HOMO SAPIENS PLECTIN 1, INTERMEDIATE FILAMENT BINDING PROTEIN, 500KD (P)（NM 000445）；遺伝子HOMO SAPIENS HETEROGENEOUS NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEIN U (SCAFFOLD ATTAC（NM 031844）；遺伝子HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC5306 (MGC5306), MRNA（NM 024116）；遺伝子HOMO SAPIENS MHC CLASS I POLYPEPTIDE-RELATED SEQUENCE A (MICA), MRNA（NM 000247）；遺伝子HOMO SAPIENS PROTEIN ASSOCIATED WITH PRK1 (AWP1), MRNA（NM 019006）；遺伝子HOMO SAPIENS PROGESTERONE RECEPTOR MEMBRANE COMPONENT 2 (PGRMC2), MRNA（NM 006320）；遺伝子HOMO SAPIENS POLYGLUTAMINE BINDING PROTEIN 1 (PQBP1), MRNA（NM 005710）；遺伝子HOMO SAPIENS S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 1 (AMD1), MRNA（NM 001634）； HOMO SAPIENS INTERFERON-INDUCED, HEPATITIS C-ASSOCIATED MICROTUBULAR AG（NM 006417）；遺伝子HOMO SAPIENS PROTEIN KINASE, AMP-ACTIVATED, GAMMA 1 NON-CATALYTIC SUBUN（NM 002733）；HOMO SAPIENS PROCOLLAGEN-PROLINE, 2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE (PROLINE（NM 004199）；遺伝子HOMO SAPIENS ENDOTHELIAL DIFFERENTIATION, LYSOPHOSPHATIDIC ACID G-PROTE（NM 012152）；又は遺伝子HOMO SAPIENS KIAA0127 GENE PRODUCT (KIAA0127), MRNA（NM 014755）であることを特徴とする間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカー。
【００２８】
本発明において、本発明の間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現を検出するには公知の遺伝子の発現の検出方法を用いることができる。例えば、本発明の間葉系幹細胞マーカー遺伝子の発現を検出するために、ノーザンブロッティング法を用いることができる。また、本発明の遺伝子マーカーにより、間葉系幹細胞を検出、識別するために、本発明の間葉系幹細胞遺伝子マーカーのＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するプローブを用いることができる。該プローブを用いて間葉系幹細胞を検出するには、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、配列表に示した遺伝子マーカーのＤＮＡ配列から適宜の長さのＤＮＡプローブを作製し、適宜蛍光標識等の標識を付与しておき、これを被検体とハイブリダイズすることにより、間葉系幹細胞の検出を行う。該ＤＮＡプローブとしては、配列表に示した本発明の遺伝子マーカーの塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブを用いることができる。また、該プローブを、少なくとも１つ以上を固定化させたマーカー遺伝子検出用のマイクロアレイ又はＤＮＡチップの形で用いることもできる。
【００２９】
なお、上記ＤＮＡプローブの作製に際して、本発明の塩基配列において、「間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３０】
更に、本発明においては、本発明の間葉系幹細胞検出用ポリペプチドマーカーの検出に際して、該タンパク質のポリペプチドによって誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いることができる。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を挙げることができる。該抗体の作製は、本発明のポリペプチドマーカーを抗原として、常法により作製することができる。本発明の抗体を用いて、被検細胞における間葉系幹細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的測定法を用いて実施することができる。該免疫学的測定法としては、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的測定法を挙げることができる。
【００３１】
本発明においては、本発明の間葉系幹細胞検出用プローブ及び／又は本発明の間葉系幹細胞検出用抗体を用いて、被検細胞における間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子及び／又は間葉系幹細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出し、識別して間葉系幹細胞を分離し、取得することができる。被検細胞における間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子の検出に際しては、被検細胞の遺伝子を増幅するために、定量的又は半定量的ＰＣＲを用いることができる。該ＰＣＲとしてはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を用いることができる。該ＰＣＲを行うに際しては、本発明の間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子を増幅するためのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーからなるプライマーを用いる。
【００３２】
本発明の間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子を増幅するためのプライマーを列挙すると：配列表の配列番号２０に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２１に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２２に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２３に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２４に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２５に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２６に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２７に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号２８に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号２９に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３０に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３１に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３２に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３３に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３４に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３５に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３６に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３７に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号３８に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号３９に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号４０に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４１に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号４２に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４３に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、又は、配列表の配列番号４４に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４５に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマーを挙げることができる。
【００３３】
更に、本発明の間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子を増幅するためのプライマーを列挙すると：配列表の配列番号４７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号４８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号４９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号５８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号５９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号６７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号６８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、又は配列表の配列番号６９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマとからなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子増幅のためのリアルタイムＰＣＲ用プライマーを挙げることができる。
【００３４】
更に、本発明の間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子を増幅するためのプライマーを列挙すると：配列表の配列番号７１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号７８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号７９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号８８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号８９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号９８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号９９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１００に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０７に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１０８に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１０９に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１０に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１１１に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１２に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列表の配列番号１１３に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１４に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、又は配列表の配列番号１１５に示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表の配列番号１１６に示される塩基配列を有するアンチセンスプライマとからなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子増幅のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを挙げることができる。
【００３５】
本発明において、間葉系幹細胞の識別を行うには、被検細胞における遺伝子を、上記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも１対以上のプライマーを用いて増幅し、増幅した遺伝子を本発明の間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブを用いて検出する。
【００３６】
本発明の間葉系幹細胞検出用マーカー遺伝子は、間葉系幹細胞において特異的に高く発現する遺伝子と、特異的に低く発現する遺伝子とがあり、それらの遺伝子の発現を組み合わせて検出することにより、間葉系幹細胞の検出精度を高めることができる。因みに、間葉系幹細胞において特異的に高く発現する遺伝子としては、配列表の配列番号１、１１及び１９からなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子を挙げることができ、特異的に低く発現する遺伝子としては、配列表の配列番号２、４、６、７、９、１０、１２、１４、１５、１７、及び４６からなる間葉系幹細胞マーカー遺伝子を挙げることができる。更に、本発明で確認された間葉系幹細胞マーカー遺伝子を挙げることができる。したがって、それぞれの遺伝子のグループの１遺伝子以上の発現を組み合わせることにより、より検出精度の高い間葉系幹細胞の識別を行うことができる。
【００３７】
本発明の抗体を用いて蛍光抗体法を用いて、被検細胞における間葉系幹細胞マーカーポリペプチドの発現を検出し、間葉系幹細胞を識別、分離するには、公知の方法により間葉系幹細胞を標識化し、分離することができる。該標識化方法としては、例えば、蛍光抗体法を挙げることができる。蛍光抗体法により未分化造血細胞を標識化するには、本発明の間葉系幹細胞検出用ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体を蛍光標識し、これを抗原を発現している間葉系幹細胞に結合させて、間葉系幹細胞を標識化する（直接蛍光抗体法）か、或いは、抗原を発現している間葉系幹細胞に、未標識の本発明の特異抗体を結合させた後に、標識化した二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）を結合させて間葉系幹細胞を標識化し（間接蛍光抗体法）、該標識化した間葉系幹細胞を分離、採取する。
【００３８】
本発明の間葉系幹細胞の検出、識別に用いる間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用プローブ、該プローブを固定した間葉系幹細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ、及び本発明の間葉系幹細胞検出用の抗体は、それらをを装備した間葉系幹細胞の識別用キットとして製品化しておくことができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１［材料と方法］
（細胞）
ヒト由来間葉系幹細胞（human mesenchymal stem cell）、およびヒト繊維芽細胞（human fibroblast）はDalbecco's modified Eagle's medium（low glucose）（Sigma社製）に１０％ fetal calf serum、１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを加えた培地を用いて３７℃にて培養した。
【００４１】
（ＤＮＡマイクロアレイ）
１０ｃｍディッシュ１枚の各細胞からTRIZOL reagent（Invitrogen社製）を用いて全ＲＮＡを抽出後、micro poly (A) purist（Ambion社製）を用いてｍＲＮＡを精製し、DNA microarray（Incyte Genomics社：Kurabo Life Array analysis servis；Lot. No. KL01081）を行った。なお、ＤＮＡマイクロアレイ解析は、Kurabo社に委託した。
【００４２】
（半定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
各細胞からTRIZOL reagent（Invitrogen社製）を用いて全ＲＮＡを抽出後、各全ＲＮＡ１μｇを鋳型として、SuperScript first-strand synthesis system for RT-PCR（Invitrogen社製）を用いて、４２℃、５０分間の逆転写反応を行ってｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型としてAdvantage 2 PCR enzyme system（Clontech社製）を用いて各遺伝子を増幅した。９４℃３０秒間で変性、６８℃１分間でアニールを３０サイクル行った。増幅に用いた各遺伝子のプライマー配列を表１にまとめた。増幅した遺伝子を１％アガロースゲルを用いた電気泳動にて分離し、エチジウムブロマイド染色によって検出した。
【００４３】
【表１】
2004290189.tif 000002
【００４４】
実施例２［検出結果］
（ＤＮＡマイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイの結果、９４００遺伝子中、６３遺伝子が繊維芽細胞と比較して間葉系幹細胞において有意に発現が高く、１４１遺伝子が低いことが明らかになった。また、それ以外の遺伝子では有意な差は認められなかった。このうち、３倍以上の差が認められた８７遺伝子中、間葉系幹細胞の方が発現が高かった遺伝子が２９遺伝子、低かった遺伝子が５８遺伝子であった。
【００４５】
（半定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
３個体由来の間葉系幹細胞と３個体由来の繊維芽細胞から全ＲＮＡを抽出し、これらを鋳型に用いて、上記８７遺伝子について半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によりその発現量を調べた。その結果、発現量に差が見られない遺伝子がほとんどであった。また、異なる個体の間葉系幹細胞、あるいは繊維芽細胞の間でも発現量に差があり、個体差によって発現が異なると考えられるものも多くあった（図１）。
【００４６】
ＲＴ−ＰＣＲによって間葉系幹細胞で発現が高いことが確認された遺伝子は、serine (or cysteine) proteinase inhibitor（配列表の配列番号１）、major histocompatibility complex class2 DR beta 3（配列番号１１）、及びtissue factor pathway inhibitor 2（配列番号１９）の３遺伝子であった（図２）。
【００４７】
また、低いことが確認された遺伝子は、adrenomedullin（配列番号２）、apolipoprotein D（配列番号４）、collagenase type XV alpha 1（配列番号６）、CUG triplet repeat RNA binding protein（配列番号７）、dermatopontin protein（配列番号９）、isocitrate dehydrogenase 2（配列番号１０）、tyrosine kinase 7（配列番号１２）、Sam68-like phosphotyrosine protein（配列番号１４）、C-type lectin superfamily member 2（配列番号１５)、及びmatrix metalloprotease 1（配列番号１７）の１０遺伝子（図３）であった。さらに、これら１３遺伝子について、７個体由来の間葉系幹細胞と４個体由来の繊維芽細胞から抽出した全ＲＮＡを鋳型とした半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、その発現量の確認を行った（図４）。
【００４８】
実施例３［間葉系幹細胞における各遺伝子の発現の測定  Ｉ］
実施例１と同様にして、本発明の遺伝子マーカーのヒト由来間葉系幹細胞及びヒト繊維芽細胞における発現を測定した。用いたＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲのプライマーとリアルタイムＰＣＲ用のプローブを表２に示す。
【００４９】
【表２】
2004290189.tif 000003
【００５０】
間葉系幹細胞とヒト繊維芽細胞とにおけるｍＲＮＡレベルの相対的な遺伝子の発現の状況を図５に示す。また、間葉系幹細胞と骨芽細胞とにおけるデフアレンシャルな遺伝子の発現の状況を、表３（real  time  ＰＣＲ）及び図６、７，８に示す。
【００５１】
【表３】
2004290189.tif 000004
【００５２】
実施例４［間葉系幹細胞における各遺伝子の発現の測定  II］
実施例１と同様にして、本発明の各遺伝子マーカーのヒト由来間葉系幹細胞及びヒト繊維芽細胞における発現を測定した。用いたＲＴ−ＰＣＲのセンス及びアンチセンスプライマーは、配列表の配列番号７１〜１１６に示す。間葉系幹細胞とヒト繊維芽細胞とにおける遺伝子の発現の状況を図９及び図１０に示す。また、間葉系幹細胞／繊維芽細胞の発現の割合を、表４に示す。
【００５３】
【表４】
2004290189.tif 000005
【００５４】
実施例５［間葉系幹細胞における各遺伝子の発現の測定  III］
実施例１と同様にして、本発明の各遺伝子マーカーのヒト由来間葉系幹細胞及びヒト繊維芽細胞における発現を測定した。間葉系幹細胞／繊維芽細胞の発現の割合を、表５に示す。
【００５５】
（表５）  
（間葉系幹細胞／繊維芽細胞）      （遺伝子名）
8.9   EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1
8.4   Human insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5) mRNA
7.7   Homo sapiens clone 24775 mRNA sequence
7     "proteoglycan 1, secretory granule"
6.8   insulin-like growth factor binding protein 5
6.7   "solute carrier family 21 (organic anion transporter), member 3"
6.5   "transglutaminase 2 (C polypeptide,proteinglutamine-gamma-glutamyl        transferase)"
5.8   coagulation factor II (thrombin) receptor
5.6   "plasminogen activator, urokinase"
5.5   "tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (Sorsby fundus dystrophy,       pseudoinflammatory)"
5.1   matrix Gla protein
4.6   B-cell CLL/lymphoma 1
4.6   "CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II antigen-associated)"
4.2   adducin 3 (gamma)
4.2   "solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 4"
3.4   protein S (alpha)
3.3   "phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate 5-phosphatase homolog; phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatase type IV"
3.2   progesterone membrane binding protein
3.2   brain-derived neurotrophic factor
3     apolipoprotein E
38.5  "GI|6005949|REF|NM 007191.1| HOMO SAPIENS WNT INHIBITORY FACTOR-1         (WIF-1), MRNA"
12.7  "GI|8922916|REF|NM 018349.1| HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ      11175 (FLJ11175), MRNA"
11.2  "GI|10835001|REF|NM 001175.1| HOMO SAPIENS RHO GDP DISSOCIATION IN        HIBITOR (GDI) BETA (ARHGDIB), MRNA"
10.3  "GI|11055973|REF|NM 021614.1| HOMO SAPIENS POTASSIUM INTERMEDIATE/        SMALL CONDUCTANCE CALCIUM-ACTIVATE"
8.7   "GI|5731346|REF|NM 004289.3| HOMO SAPIENS NUCLEAR FACTOR (ERYTHROID-DERIVED 2)-LIKE 3 (NFE2L3), MRNA"
7.6   "GI|11056053|REF|NM 021643.1| HOMO SAPIENS GS3955 PROTEIN (GS3955), MRNA"
7.5   "EST10324 ADIPOSE TISSUE, WHITE I HOMO SAPIENS CDNA 3' END SIMILAR TO SIMILAR TO GLYCOPROTEIN MUC18,"
6.6   "GI|13375818|REF|NM 024609.1| HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FL      J21841 (FLJ21841), MRNA"
6.5   "GI|6005971|REF|NM 007150.1| HOMO SAPIENS ZINC FINGER PROTEIN 185 (LIM DOMAIN) (ZNF185), MRNA"
6.5   "GNL|UG|HS S2334464 SC1=PUTATIVE TRANS-ACTING FACTOR INVOLVED IN C      ELL CYCLE CONTROL [HUMAN, MRNA, 24"
6.4   "GI|7657368|REF|NM 014222.1| HOMO SAPIENS NADH DEHYDROGENASE (UBIQ    UINONE) 1 ALPHA SUBCOMPLEX, 8 (19K"
6.3   "GI|8924142|REF|NM 018518.1| HOMO SAPIENS HOMOLOG OF YEAST MCM10;       HYPOTHETICAL PROTEIN PRO2249 (PRO2"
6.2   "GI|4502960|REF|NM 000094.1| HOMO SAPIENS COLLAGEN, TYPE VII, ALPHA 1 (EPIDERMOLYSIS BULLOSA, DYSTRO"
6.2   "GI|4502074|REF|NM 001144.1| HOMO SAPIENS AUTOCRINE MOTILITY FACTOR RECEPTOR (AMFR), MRNA"
6.2   GNL|UG|HS S1090551 HOMO SAPIENS CLONE 24421 MRNA SEQUENCE /CDS=UNKNOWN /GB=AF070641 /GI=3283914 /UG=
6.2   GNL|UG|HS S1570341 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP586E1621 (FROM CLONE DKFZP586E1621) /CDS=UNKNOWN /GB
6.1   "GI|11545760|REF|NM 022055.1| HOMO SAPIENS RESERVED (KCNK12), MRNA"
6.0   "GI|5902145|REF|NM 007019.1| HOMO SAPIENS UBIQUITIN-CONJUGATING EN      ZYME E2C (UBE2C), MRNA"
5.9   "GNL|UG|HS S1970614 HOMO SAPIENS CDNA FLJ10517 FIS, CLONE NT2RP200      0812 /CDS=(61,918) /GB=AK001379 /G"
5.8   "GI|4503052|REF|NM 001884.1| HOMO SAPIENS CARTILAGE LINKING PROTEIN 1 (CRTL1), MRNA"
5.8   GNL|UG|HS S1972520 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434F2322 (FROM CLONE DKFZP434F2322) /CDS=UNKNOWN /GB
5.7   "GNL|UG|HS S3837475 HOMO SAPIENS, CLONE MGC:9549 IMAGE:3857382, MR      NA, COMPLETE CDS /CDS=(92,1285) /G"
5.4   "GI|14150008|REF|NM 032270.1| HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DK      FZP586J1119 (DKFZP586J1119), MRNA"
5.4   "GI|4758439|REF|NM 004877.1| HOMO SAPIENS GLIA MATURATION FACTOR,       GAMMA (GMFG), MRNA"
5.4   "GNL|UG|HS S2654530 HOMO SAPIENS CDNA: FLJ23095 FIS, CLONE LNG07413 /CDS=UNKNOWN /GB=AK026748 /GI=10"
5.3   "GI|8922180|REF|NM 018410.1| HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKF      ZP762E1312 (DKFZP762E1312), MRNA"
5.3   "GI|5031806|REF|NM 005853.1| HOMO SAPIENS IROQUOIS-CLASS HOMEODOMAIN PROTEIN (IRX-2A), MRNA"
5.2   "GI|8922501|REF|NM 018131.1| HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ      10540 (FLJ10540), MRNA"
5.1   "GNL|UG|HS S1972896 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434C1915 (FROM CL      ONE DKFZP434C1915); PARTIAL CDS /C"
5.1   "GI|14149622|REF|NM 005916.1| HOMO SAPIENS MINICHROMOSOME MAINTENA      NCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M"
5.0   "GI|4758177|REF|NM 004411.1| HOMO SAPIENS DYNEIN, CYTOPLASMIC, INT      ERMEDIATE POLYPEPTIDE 1 (DNCI1), M"
5.0   HUMAN MRNA FOR PROTEIN GENE PRODUCT (PGP) 9.5.
5.0   "GI|5453903|REF|NM 006479.1| HOMO SAPIENS RAD51-INTERACTING PROTEIN (PIR51), MRNA"
4.9   "GI|4502144|REF|NM 001168.1| HOMO SAPIENS BACULOVIRAL IAP REPEAT-C      ONTAINING 5 (SURVIVIN) (BIRC5), MR"
4.9   "GI|9945386|REF|NM 004482.2| HOMO SAPIENS UDP-N-ACETYL-ALPHA-D-G      ALACTOSAMINE:POLYPEPTIDE N-ACETYLGAL"
4.9   "GI|14327895|REF|NM 031966.1| HOMO SAPIENS CYCLIN B1 (CCNB1), MRNA"
4.8   "GI|6325465|REF|NM 004111.3| HOMO SAPIENS FLAP STRUCTURE-SPECIFIC       ENDONUCLEASE 1 (FEN1), MRNA"
4.8   "GI|4507274|REF|NM 003600.1| HOMO SAPIENS SERINE/THREONINE KINASE 15 (STK15), MRNA"
4.8   "GI|6466452|REF|NM 002358.2| HOMO SAPIENS MAD2 (MITOTIC ARREST DEF      ICIENT, YEAST, HOMOLOG)-LIKE 1 (MA"
4.7   "GI|15421859|REF|NM 018454.2| HOMO SAPIENS NUCLEOLAR PROTEIN ANKT       (ANKT), MRNA"
4.7   "GI|7661807|REF|NM 014176.1| HOMO SAPIENS HSPC150 PROTEIN SIMILAR TO UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME (H"
4.7   "GI|9845284|REF|NM 019885.1| HOMO SAPIENS CYTOCHROME P450 RETINOID       METABOLIZING PROTEIN (P450RAI-2),"
4.7   "GI|4505372|REF|NM 002497.1| HOMO SAPIENS NIMA (NEVER IN MITOSIS GENE A)-RELATED KINASE 2 (NEK2), MR"
4.7   "GI|4502422|REF|NM 001202.1| HOMO SAPIENS BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 4 (BMP4), MRNA"
4.7   "GNL|UG|HS S1970775 HOMO SAPIENS CDNA FLJ10674 FIS, CLONE NT2RP200      6436 /CDS=UNKNOWN /GB=AK001536 /GI"
4.7   "GI|4585861|REF|NM 001809.2| HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN A (17 KD) (CENPA), MRNA"
4.6   GNL|UG|HS S1368141 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP564P116 (FROM CLONE DKFZP564P116) /CDS=UNKNOWN /GB=A
4.6   "GI|4507718|REF|NM 003318.1| HOMO SAPIENS TTK PROTEIN KINASE (TTK), MRNA"
4.6   "GI|4504896|REF|NM 002266.1| HOMO SAPIENS KARYOPHERIN ALPHA 2 (RAGCOHORT 1, IMPORTIN ALPHA 1) (KPNA"
4.6   "GI|5729983|REF|NM 006596.1| HOMO SAPIENS POLYMERASE (DNA DIRECTED), THETA (POLQ), MRNA"
4.5   "GI|4758315|REF|NM 004454.1| HOMO SAPIENS ETS VARIANT GENE 5 (ETS-RELATED MOLECULE) (ETV5), MRNA"
4.5   "HOMO SAPIENS TRANSFORMING, ACIDIC COILED-COIL CONTAINING PROTEIN 3 (TAC"
4.5   "HOMO SAPIENS KINESIN-LIKE 1 (KNSL1), MRNA"
4.5   "HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN E (312KD) (CENPE), MRNA"
4.5         " HOMO SAPIENS CDNA, 3' END /CLONE=IMAGE:1651289 /CLONE END=3' /GB=AI12"
4.4   "HOMO SAPIENS DISTAL-LESS HOMEO BOX 5 (DLX5), MRNA"
4.4   "HOMO SAPIENS V-MYB AVIAN MYELOBLASTOSIS VIRAL ONCOGENE HOMOLOG-LIKE 2"
4.4   "HOMO SAPIENS SERUM DEPRIVATION RESPONSE (PHOSPHATIDYLSERINE  -BINDING PRO"
4.4   "HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10604 (FLJ10604), MRNA"
4.4   "HOMO SAPIENS RIBONUCLEASE HI, LARGE SUBUNIT (RNASEHI), MRNA
4.4   "HOMO SAPIENS ANILLIN (DROSOPHILA SCRAPS HOMOLOG), ACTIN BINDING PROTEIN"
4.4   " HOMO SAPIENS H4 HISTONE FAMILY, MEMBER G (H4FG), MRNA"
4.3   "HOMO SAPIENS G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR 37 (ENDOTHELIN RECEPTOR T      YPE B-"
4.3   "HOMO SAPIENS UBIQUITIN CARRIER PROTEIN (E2-EPF), MRNA"
4.3   " HOMO SAPIENS, SIMILAR TO TUMOR DIFFERENTIALLY EXPRESSED 1, CLONE         IMAGE:3639252, "
4.2   "HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC2577 (MGC2577), MRNA"
4.2   "HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ13912 (FLJ13912), MRNA"
4.2   "HOMO SAPIENS ANNEXIN A3 (ANXA3), MRNA"
4.2   "HOMO SAPIENS STATHMIN 1/ONCOPROTEIN 18 (STMN1), MRNA"
4.2   "GNL|UG|HS S3837587 HOMO SAPIENS, SIMILAR TO RIBOSOMAL PROTEIN L39, CLONE MGC:20168 IMAGE:4555759, M"
4.2   "HOMO SAPIENS POLO (DROSOPHIA)-LIKE KINASE (PLK), MRNA"
【００５６】
実施例６［間葉系幹細胞における各遺伝子の発現の測定  VI］
実施例１と同様にして、本発明の各遺伝子マーカーのヒト由来間葉系幹細胞及びヒト繊維芽細胞における発現を測定した。間葉系幹細胞／繊維芽細胞の発現の割合を、表５に示す。表中の−は、間葉系幹細胞において遺伝子が発現していないか、或いは極めて少量の発現であることを示す。
【００５７】
（表６）
（間葉系幹細胞／繊維芽細胞）      （遺伝子名）
-53.576     "HOMO SAPIENS PROTEASOME (PROSOME, MACROPAIN) 26S SUBUNIT, A          TPASE, 5 (PS"
-45.692     "HOMO SAPIENS EUKARYOTIC TRANSLATION INITIATION FACTOR 4 GAM          MA, 2 (EIF4G"
-27.6354  "HOMO SAPIENS DIHYDROPYRIMIDINASE-LIKE 3 (DPYSL3), MRNA"
-20.5446  "HOMO SAPIENS ADAPTOR-RELATED PROTEIN COMPLEX 1, SIGMA 2 SUBUN              IT (AP1S2)"
-19.5809    "HOMO SAPIENS PLECTIN 1, INTERMEDIATE FILAMENT BINDING PROTE            IN, 500KD P"
-16.9025    "HOMO SAPIENS HETEROGENEOUS NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEIN U (SCA            FFOLD ATTAC"
-14.97          "HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC5306 (MGC5306), MRNA"
-14.6106    "HOMO SAPIENS MHC CLASS I POLYPEPTIDE-RELATED SEQUENCE A (MI          CA), MRNA"
-13.8886    "HOMO SAPIENS PROTEIN ASSOCIATED WITH PRK1 (AWP1), MRNA"
-13.6578    "HOMO SAPIENS PROGESTERONE RECEPTOR MEMBRANE COMPONENT 2 (PG            RMC2), MRNA"
-11.4783    "HOMO SAPIENS POLYGLUTAMINE BINDING PROTEIN 1 (PQBP1), MRNA"
-10.2392          "HOMO SAPIENS S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 1 (AM          D1), MRNA"
-9.9506     "HOMO SAPIENS INTERFERON-INDUCED, HEPATITIS C-ASSOCIATED MIC          ROTUBULAR AG"
-9.2594     "HOMO SAPIENS PROTEIN KINASE, AMP-ACTIVATED, GAMMA 1 NON-CAT          ALYTIC SUBUN"
-7.518      "HOMO SAPIENS PROCOLLAGEN-PROLINE, 2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGEN        ASE (PROLINE"
-6.0365     "HOMO SAPIENS ENDOTHELIAL DIFFERENTIATION, LYSOPHOSPHATIDIC           ACID G-PROTE"
-5.4442     "HOMO SAPIENS KIAA0127 GENE PRODUCT (KIAA0127), MRNA"
【００５８】
実施例７［間葉系幹細胞におけるmajor histocompatibility complex ＤＲの発現の測定］
間葉系幹細胞におけるmajor histocompatibility complex ＤＲの発現を、フローサイトメトリーを用いて測定した。結果を、図１１に示す。
【００５９】
実施例８［間葉系幹細胞の分化誘導における各遺伝子の発現の変化］
実施例１と同様にＲＴ−ＰＣＲを用い、間葉系幹細胞の分化誘導における各遺伝子の発現の変化を測定した。間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導における各遺伝子の発現の状況を図１２に示す。各マーカー遺伝子について、骨分化誘導４日〜２８日での遺伝子発現の変化を図１３〜１６に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の実施例において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒト間葉系幹細胞或いはヒト繊維芽細胞の間で、個体によるばらつきが大きい遺伝子を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＭＳＣで発現が高かった遺伝子を示す図である。
【図３】本発明の実施例において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＭＳＣで発現が低かった遺伝子を示す図である。
【図４】間葉系幹細胞で発現が高い／低いことが確認された１３遺伝子について、７個体由来の間葉系幹細胞と４個体由来の繊維芽細胞から抽出した全ＲＮＡを鋳型とした半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、その発現量の確認を行った結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、間葉系幹細胞とヒト繊維芽細胞とにおけるｍＲＮＡレベルの相対的な遺伝子の発現の状況を示す写真である。
【図６】本発明の実施例において、間葉系幹細胞と骨芽細胞とにおける各マーカー遺伝子のデフアレンシャルな遺伝子の発現の状況を示す図である。
【図７】本発明の実施例において、間葉系幹細胞と骨芽細胞とにおける各マーカー遺伝子のデフアレンシャルな遺伝子の発現の状況を示す図である。
【図８】本発明の実施例において、間葉系幹細胞と骨芽細胞とにおける各マーカー遺伝子のデフアレンシャルな遺伝子の発現の状況を示す図である。
【図９】本発明の実施例において、各マーカー遺伝子について、間葉系幹細胞とヒト繊維芽細胞とにおける遺伝子の発現の状況を示す図である。
【図１０】本発明の実施例において、各マーカー遺伝子について、間葉系幹細胞とヒト繊維芽細胞とにおける遺伝子の発現の状況を示す図である。
【図１１】本発明の実施例において、間葉系幹細胞におけるmajor histocompatibility complex ＤＲの発現を、フローサイトメトリーを用いて測定した結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例において、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導における各遺伝子の発現の状況を測定した結果を示す図である。
【図１３】本発明の実施例において、各マーカー遺伝子について、骨分化誘導４日〜２８日での遺伝子発現の変化を示す図である。
【図１４】本発明の実施例において、各マーカー遺伝子について、骨分化誘導４日〜２８日での遺伝子発現の変化を示す図である。
【図１５】本発明の実施例において、各マーカー遺伝子について、骨分化誘導４日〜２８日での遺伝子発現の変化を示す図である。
【図１６】本発明の実施例において、各マーカー遺伝子について、骨分化誘導４日〜２８日での遺伝子発現の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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