(57)【要約】【課題】細胞培養の際添加する生理活性物質、及び細胞が産生する生理活性物質の容器壁面への吸着を低減し、添加した生理活性物質が細胞に与える効果を高める若しくは細胞産生物質を効率良く回収する事が出来る細胞培養容器を提供する事。【解決手段】容器の培養液が接触する内面に水との接触角が１０度以下の親水性の層を有し、該容器の内面の細胞が接触する部分に細胞培養に適した培養床を有し、好ましくは該親水性の層がポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリオキシＣ２−Ｃ４アルキレン基含有メタクリレート重合体又はこれを含む共重合体、ポリビニルピロリドン、リン脂質・高分子複合体、及び２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体又はこれを含む共重合体、から選ばれる少なくとも１つの材料からなる細胞培養容器。【選択図】  図３
2004290111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器の培養液が接触する内面に水との接触角が１０度以下の親水性の層を有し、該容器の内面の細胞が接触する部分に細胞培養に適した培養床を有する事を特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
親水性の層がポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリオキシＣ２−Ｃ４アルキレン基含有メタクリレート重合体又はこれを含む共重合体、ポリビニルピロリドン、リン脂質・高分子複合体、及び２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体又はこれを含む共重合体、から選ばれる少なくとも１つの材料からなる請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項３】
請求項１又は２記載の細胞培養容器の製造方法であって、容器内面に親水性材料を塗布し乾燥する工程、細胞培養に適した表面を有するプラスチックフィルムを該容器形状に合わせて成形する工程、及び該容器と該プラスチックフィルムを組み合わせる工程からなる細胞培養容器の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は生化学実験・臨床検査・薬剤の開発研究において使用する細胞培養容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
接着系細胞の培養に使用される容器類は形状としてはシャーレ、フラスコ及びマルチウェルプレートで、材質はポリスチレン等のプラスチック表面に酸素プラズマもしくは放射線の照射により極性基を導入し、細胞の接着−伸展に適した表面に改質したものが一般的に用いられている。
しかし、その様に細胞培養に適した表面は蛋白質に対しても強い吸着性を示し、その様な蛋白質の吸着が培養する細胞の種類及び実験の目的によっては大きな問題となる場合がある。
例えば、サイトカインが細胞に与える影響を評価しようとする場合、培養系に添加したサイトカインが容器壁面に非特異吸着してしまえば、加えたサイトカインの濃度と細胞に与える影響の大きさとの相関を議論する事は出来ない。
更に、高価な試薬を容器への非特異吸着による損失分を考慮して常に過剰量加える必要があり非経済的でもある。
また、細胞から産生される生理活性物質を回収する場合についても同様で、産生された生理活性物質が容器壁面に非特異吸着してしまえば、正確な産生量を測定する事が出来ず、回収率も低下する。
【０００３】
通常培養に用いる培地には血清等が添加されており比較的蛋白質濃度が高い状態であるため、共存している蛋白の中で吸着しやすいアルブミン等が最初に吸着し、容器表面を覆ってしまい、それがマスキングの役割を示すのでその後添加する生理活性物質は吸着しないという意見もある。
しかし、一旦吸着してしまった蛋白質は変性し、変性した蛋白質は二次的な吸着を誘引するので実質的にはマスキングの効果は低く、共雑する蛋白質の濃度、水溶液のｐＨ、温度等によってその効果にばらつきが発生するので好ましくない。
吸着して欲しくない蛋白質の量が微量であるほど吸着の影響は大きく、本発明者の検討では蛋白質の濃度が数μｇ／ｍＬ付近で存在する蛋白質の最大３０％以上が吸着により失われてしまう。
前述のような吸着の影響は、特に評価結果の精度と再現性が要求される薬効評価等のセルベースアッセイには結果に重大な影響を与える可能性が考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、細胞培養の際添加する生理活性物質、及び細胞が産生する生理活性物質の容器壁面への吸着を低減し、添加した生理活性物質が細胞に与える効果を高める若しくは細胞産生物質を効率良く回収する事が出来る細胞培養容器を提供する事である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
即ち本発明は、
（１）容器の培養液が接触する内面に水との接触角が１０度以下の親水性の層を有し、該容器の内面の細胞が接触する部分に細胞培養に適した培養床を有する事を特徴とする細胞培養容器、
（２）親水性の層がポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリオキシＣ２−Ｃ４アルキレン基含有メタクリレート重合体又はこれを含む共重合体、ポリビニルピロリドン、リン脂質・高分子複合体、及び２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体又はこれを含む共重合体、から選ばれる少なくとも１つの材料からなる（１）記載の細胞培養容器、
（３）（１）又は（２）記載の細胞培養容器の製造方法であって、容器内面に超親水性材料を塗布し乾燥する工程、細胞培養に適した表面を有するプラスチックフィルムを該容器形状に合わせて成形する工程、及び該容器と該プラスチックフィルムを組み合わせる工程からなる細胞培養容器の製造方法、
である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明で用いる容器の形状は、目的とする細胞培養に適した形状であれば特に限定するものではないが、一般的には従来使用されているシャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート等の形状が好ましい。
容器の材料としては細胞の観察を行なう点においては透明なものが好ましく、ガラス、プラスチックが挙げられ、特に成形性の点で塩化ビニル、アクリル、ポリスチレン、ポリエステル系のプラスチックが好適である。
【０００７】
次に本発明の重要な特徴の一つである容器内面に親水性材料の層を付与する工程について述べる。
添加した蛋白質及び細胞が産生した蛋白質の吸着によるロスを低減化するという本発明の目的において、容器内面に水との接触角１０度以下の親水性材料の層を構築するという新規な方法を取り入れている
従来溶液中の蛋白質は、その物質中の疎水性部位と容器表面の疎水性部位との間に発生する疎水性相互作用により吸着する為、容器基材表面を超親水性に改質する事でその吸着を防止出来る事は本発明者も既に見出しており、国際公開第００／３９５８２号においてその技術を開示している。
親水性の指標として水との接触角が１０度以下であれば従来の容器と比較して蛋白質の吸着を有為に低減化する事が出来、その接触角は低い方が吸着制御効果が高くなり本発明の目的としては好ましい。
【０００８】
親水性材料の層を構築する方法は、特に限定するものではなくプラズマを用いた表面共有結合法、グラフト重合法等の既知の手法により親水性を有する極性基を表面に導入するか、若しくは特開２００１−５０２９５９号公報に開示されている様な非イオン性界面活性剤を表面に結合する方法を用いても良い。
【０００９】
その他技術的に最も容易な方法としては親水性材料を溶解した溶液を用いたコーティング法が挙げられる。
親水性材料を塗布し乾燥する際に重要な点は、コーティング層の厚みである。
コーティング層で基材表面が完全に覆われている状態が好ましいが、その厚みが増すと吸着防止性能は低下してゆく。その理由は、親水性材料の層が厚くなれば自由水を含みその自由水と一緒に蛋白質分子が表面に残留するためであると考えられる。
よって、コーティングの際にはコーティング溶液の溶質つまり親水性材料の濃度及びその溶媒、加えて乾燥条件を充分に検討し、コーティング層が出来るだけ薄い状態で容器表面を満遍なく覆っている状態を構築する事でより高い吸着防止性能を得る事が出来る。
【００１０】
本発明に使用する親水性材料としては、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリオキシＣ２−Ｃ４アルキレン基含有メタクリレート重合体又はこれを含む共重合体、ポリビニルピロリドン、リン脂質・高分子複合体から選ばれる少なくとも１つであることが好ましく、更に好ましくは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体又はこれを含む共重合体を用いる。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む化合物の共重合体としては特に限定するものでは無いが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・ブチルメタクリレート共重合体（「ハイドロゲルの血液適合性に及ぼす親水性基構造の影響」生体材料Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．６  石原一彦、中林宣男他参照）を好適に使用する事が出来る。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体又は共重合体においては、共重合体中の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの含有率が高いほど優れた吸着制御効果が期待できるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの含有率が高ければ共重合体は水溶性となる為、目的に応じて共重合比率を調節する必要がある。
【００１１】
次に本発明におけるもう一つの重要な特徴である容器内面の細胞が接触する部分に有する培養床について述べる。
前述の親水性材料の層は蛋白質の吸着を防止する点においては優れているが、同時に細胞の接着も妨げる為、接着系の細胞はその表面では接着−伸展する事が出来ず培養容器として用いる事が出来ない。
そこで、蛋白質の吸着を防止し尚且つ細胞を接着させるという矛盾をどの様に解決するかという点に対し鋭意検討の結果、内面の細胞を培養する部分に細胞培養に適した培養床を設けるという方法を考案した。
更に、容器内面に前述の方法で親水性の層を構築した後に、細胞培養に適した表面を有するプラスチックフィルムを組み合わせるという製造方法により製造が容易で尚且つ細胞培養に適した表面加工の自由度が大きいという点も本発明の特徴である。
【００１２】
細胞培養に適した培養床として使用する材料は表面の加工性、成形性、透明性の点からプラスチックフィルムが好ましく、プラスチックフィルムの材料としては培養に使用する薬品に対する耐性を有すること、組織や細胞を培養する時に毒性を示さないことなどの要件を備えていれば特に制限はない。
このようなプラスチックとしては、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＴＰＸ樹脂などがあげられる。また、培養する細胞の種類に応じて該フィルム表面に、プラズマ処理、コロナ処理、γ線処理等の処理を施しても良い。
プラスチックフィルムの厚さは特に限定するものではないが０．０５〜１．０ｍｍの範囲のものが取り扱い性に優れる。
【００１３】
プラスチックフィルムを容器と組み合わせる為に成形する際、その形状は容器内面に組み込む事が可能な形状であるという事が必須条件となるが、その条件さえ満たされていれば目的に応じた任意の形状とする事が出来る。
成形の方法についても特に限定は無く、射出成形若しくはプラスチックフィルムのシートを任意の形状に切り抜く等の方法が挙げられる。
以上説明の如く作製した容器底面に培養床を設置する事で本発明の細胞培養容器が完成する。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。
（実施例）
ポリスチレン製２４穴マルチウェルプレート（住友ベークライト製  ＳＵＭＩＬＯＮ  ＭＳ−８０２４Ｒ）に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体の０．５ｗｔ／ｖｏｌ％エタノール溶液を分注し、５分間静置した後に真空ポンプに接続した吸引用ノズルで６０秒間吸引後、７０℃で４Ｈｒ真空乾燥させた。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体は、「リン脂質類似構造を有するハイドロゲル膜からの薬物放出  高分子論文集，４６，５９１−５９５（１９８９）」の内容に従い２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレート比＝３／７の共重合体を合成し使用した。
コート後の表面接触角を測定した結果、水との接触角は０度の超親水性であった。
次に厚み０．１ｍｍのポリエチレンテレフタレートのシートを直径１３ｍｍφの円形に切り出し、酸素プラズマに３分間暴露した後前記親水化処理したプレートのウェル底面に敷いた。
その状態で紫外線で殺菌した後に実施例として試験に供した。
【００１５】
（比較例）
細胞培養用２４穴マルチウェルプレート（ＭＳ−８０２４０）を比較例とした。表面の水との接触角は６５度であった。
【００１６】
（細胞産生物回収量の比較）
実施例及び比較例を用いて細胞培養を行い、産生物の回収量を比較した。
ＨｅｐＧ２細胞を５×１０５個／ｍＬの濃度で２ｍＬ／ウェルづつ播種し３日間培養後の細胞生存率を測定した結果、比較例及び実施例共に８０％で生存率が同等である事を確認した。培養にはＦＢＳを１０％添加したダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を使用した。
【００１７】
その後実施例及び比較例で培養した細胞の培養上清中に含まれるアルブミン濃度を比較した。
アルブミンの測定にはＥＬＩＳＡ法を使用した。
坑ヒトアルブミン抗体（ウサギ）（ＤＡＫＯ社製Ａ００８）をリン酸バッファーで２００倍に希釈した溶液を１００μＬ／ウェルでプレートに分注し、４℃一晩静置し固相化した後０．０５％ｔｗｅｅｎ２０添加リン酸バッファーで３回洗浄した。
次にスキムミルク３％リン酸バッファー溶液を３００μＬ／ウェルで分注し、室温で２時間静置した後０．０５％ｔｗｅｅｎ２０添加リン酸バッファーで３回洗浄した。
次に実施例及び比較例の培養上清を５０μＬ／ウェルで分注し室温で１時間インキュベートし、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０添加リン酸バッファーで３回洗浄した。
ペルオキシターゼ標識ウサギ抗ヒトアルブミン抗体（ＤＡＫＯ社製Ｐ０１２８）をリン酸バッファーで８０００倍に希釈、１００μＬ／ウェルで分注後室温で１時間インキュベートし、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０添加リン酸バッファーで３回洗浄した。
ＴＭＢＺ基質液を使用して発色、プレートリーダーで吸光度を測定した。
結果は表１に示す通りで、比較例に比べ実施例の吸光度が高くＨｅｐＧ２細胞の産生したアルブミンを有効に回収出来ている事が示された。
【００１８】
【表１】
2004290111.tif 000003
【００１９】
【発明の効果】
本発明の細胞培養容器は生理活性物質の吸着が無く、接着系細胞を使用した実験を感度及び精度良く行なう事が出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】内面に親水性材料の層を有する容器を示した概略図である。
【図２】細胞培養に適した表面を有するプラスチックフィルムを示した概略図である。
【図３】親水性材料の層を有する容器、及び細胞培養に適した表面を有するプラスチックフィルムを組み合わせた本発明の細胞培養容器を示した概略図である。
【図１】
2004290111.tif 000004
【図２】
2004290111.tif 000005
【図３】
2004290111.tif 000006