(57)【要約】【課題】植物体内より分離した微生物を直接、あるいは当該微生物を固定化した資材を土壌へ混和することにより、土壌中の硝酸態窒素を脱窒し、その蓄積量を低減化させる。【解決手段】シュードモナス・フルオレッセンスＦＰＴ−９６０１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４７８）、ＴＳＢ−２５菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９３）、ＦＰＴ−Ｂ１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９０）、ＦＰＴ−Ｙ１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９１）から選ばれた菌株を使用することを特徴とする土壌中の硝酸態窒素の低減化方法であり、これら微生物を固定化した資材を土壌へ混和することにより、土壌中の硝酸態窒素を脱窒し、その蓄積量を低減化させることができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス・フルオレッセンスＦＰＴ−９６０１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４７８）、ＴＳＢ−２５菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９３）、ＦＰＴ−Ｂ１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９０）及びＦＰＴ−Ｙ１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９１）から選ばれた菌株を使用することを特徴とする土壌中の硝酸態窒素の低減化方法。
【請求項２】
シュードモナス・フルオレッセンス菌株の菌体濃度が１０４ｃｆｕ／ｇ以上である請求項１記載の土壌中の硝酸態窒素の低減化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、稲作土壌、畑作土壌、放牧場等に蓄積した硝酸態窒素を低減化させる方法に関する。さらに詳しくは、植物体内より分離した微生物を直接、あるいは当該微生物を固定化した資材を土壌へ混和することにより、土壌中の硝酸態窒素を脱窒し、その蓄積量を低減化させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、環境保全が重要視されており、その一つとして土壌中に存在する硝酸態窒素を低減化する方法が種々検討されている。硝酸態窒素は、類縁物質である亜硝酸態窒素と共に水質汚濁物質に指定されており、これらに汚染された水を人畜が摂取すると中毒症状を起こすことが知られている。
また、農業活動において硝酸態窒素は重要な肥料成分の一つであり、その使用を制限することは困難であるが、水稲などの露地栽培環境下では、降雨、灌水により容易に地下水系などに溶脱することで問題となる。更に、野菜などの施設栽培環境下でも、土壌中に蓄積された硝酸態窒素が、水害などにより施設内が冠水すると高濃度で流亡する危険性がある。
【０００３】
環境中の硝酸態窒素の低減化方法としては、▲１▼イオン交換法、▲２▼逆浸透膜法、▲３▼電気透析法、▲４▼生物的脱窒法等があるが、▲１▼、▲２▼及び▲３▼は工場のように廃水が集中管理できるような場合には適しているが、上記のような土壌中の硝酸態窒素の除去法としては現実的ではない。
また、▲４▼の生物的脱窒法として、一般的な脱窒細菌として知られているシュードモナス・デニトリフィカンスを利用する方法がある。この菌を使用する方法では、一般に炭素源としてメタノールが使用されるが、メタノールは水溶性であるため、溶解した硝酸態窒素を含むメタノールの余剰分が環境中に流亡し、二次汚染を引き起こすことがある。
しかし、これらはいずれも主に水系に流亡、存在する硝酸態窒素の低減化方法である。
【０００４】
土壌中の硝酸態窒素の低減化方法としては、土壌中に元来存在する脱窒活性などの硝酸態窒素低減化活性を有する微生物群に、栄養源等を与えて利用する方法が知られている。（特許文献１参照）
この様な土着の微生物活性に依存した硝酸態窒素の低減化方法は、適用される環境条件により効果の安定性とその再現性が乏しいのが現実である。
また発酵産物と共に複数種の微生物を土壌に投入する方法が知られている。（特許文献２参照）
更に、土壌より分離したペニシリウム属、アスペルギルス属、ペシロミセス属、ストレプトマイセス属またはキサントモナス属の菌株を土壌へ再投入する方法が知られている。（特許文献３参照）
この様に、外部から土壌中へ微生物を導入する場合は、導入微生物の定着と活性発現は、環境条件による影響を受けることは言うまでもないが、未だ充分な微生物の定着性と硝酸態窒素の低減化効果を発揮するまでには至っていないのが現状である。
【０００５】
ところで本発明者らは、農作物の根内において相利共生する特定の２菌株を利用した耐病性苗の育成技術を確立し、「育苗培土及びその製造方法並びに耐病性苗の育成方法」として先に出願を行った。（特許文献４参照）
更に、この様な菌株を使用する技術である「植物成長調整剤」と「挿し木苗及び挿し木苗への菌株の接種方法」に関する技術を確立した。（特許文献５及び６参照）
【特許文献１】
特開２００１−３００５０９号公報
【特許文献２】
特開２００１−８５５０号公報
【特許文献３】
特開２０００−２５３８６８号公報
【特許文献４】
特開平９−３０８３７２号公報
【特許文献５】
特開平１０−２８７５２０号公報
【特許文献６】
特願２００１−３２２９２２号
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、前述の農作物の栽培に関する別の観点より、土壌中の硝酸態窒素を低減化させる方法について検討を進めた結果、特許文献４、５及び６で使用するような菌株が、前述のような土壌中の硝酸態窒素の低減化に極めて有効に作用することを見出し、係る知見に基づき本発明を完成させたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明はシュードモナス・フルオレッセンスＦＰＴ−９６０１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４７８）、ＴＳＢ−２５菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９３）、ＦＰＴ−Ｂ１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９０）及びＦＰＴ−Ｙ１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９１）から選ばれた菌株を使用することを特徴とする土壌中の硝酸態窒素の低減化方法に関する。
尚、本発明に於いては、特許文献４、５及び６で使用する菌株の技術（以下、「本願の先行技術」と云う）で使用した菌株を使用するものであるが、これら本願の先行技術と本発明とは以下の点において区別できる。
【０００８】
本願の先行技術の一部では、シュードモナス属細菌を固定化した培土に関して記載しているが、これは当該効果の発現を安定化するため、一定以上の固定化菌密度を維持した培土で植物を育苗し、固定化した微生物を効率的に被育苗植物体内部に移行させることを目的としている。
従って、これら微生物固定化培土をさらに土壌等と混和し増量して使用することは、菌密度を希釈によって減少させることになり、使用方法としては明らかに適切でない。
【０００９】
また、本願の先行技術では、微生物の固定化に使用する担体には特に肥料成分を添加することはなく、従って培土中の窒素源は極めて低く、培土担体中においてシュードモナス属細菌が脱窒効果を発現することを知ることはできない。
また、これまで周知のシュードモナス・フルオレッセンス菌株には、脱窒能を有するものと有しないものとが存在することが知られているが、本発明では脱窒能を有するシュードモナス・フルオレッセンス菌株の中で、特に本発明の菌株が硝酸態窒素の低減化効果を顕著に発現することを見出したものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明で使用するシュードモナス・フルオレッセンスは、独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センターに、シュードモナス・フルオレッセンスＦＰＴ−９６０１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４７８）、ＴＳＢ−２５菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９３）、ＦＰＴ−Ｂ１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９０）及びＦＰＴ−Ｙ１菌株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９１）として寄託されている菌株であり、これらの菌株は植物体内より分離されたものである。これら菌株は、２，４−ジアセチルフロログルシノール産生能を特徴的に有しており、本発明ではこれら菌株を混和した土壌中でその定着性が高いことを確認した。そして本発明の目的とする土壌中の硝酸態窒素を効果的に低減化させるという効果を発現する。
【００１１】
ところで土壌中の窒素は、土壌微生物が窒素をアンモニア態として固定化する一方で、同じく微生物の代謝により硝酸態、亜硝酸態へと変換される。
硝酸態窒素は植物に吸収されたり、微生物によって脱窒されるが、脱窒とは硝酸態窒素が窒素ガスとして大気に放出されることをいう。
本発明では植物体内より分離されたこれら菌株を土壌に混和し、土壌中の脱窒微生物の菌数と脱窒活性を自然環境下よりも高めることで効率的な脱窒を行い、硝酸態窒素量の低減化を実現する。
【００１２】
本発明で使用する菌株の培養方法は、例えばポテト・デキストロース液体培地（一例として、ポテトエキス４ｇ／Ｌ水、グルコース２０ｇ／Ｌ水、ｐＨ＝７．０）、ブイヨン培地等を、そのままあるいは１／１０〜１／１００濃度に希釈し、これを使用して培養を行う。培地を希釈して用いる理由は、自然界からの分離菌は、栄養源濃度の高い培地で培養すると、元来有していた性質を消失するためである。
培養後の菌体は、培養後の培養液の状態あるいはこれを乾燥した乾燥菌体の状態で使用してもよいが、安定した効果と持続性を維持するために、培養菌体をバーミキュライト、ゼオライト、シリカ、珪藻土等の担体に固定化して使用することが望ましい。更には、バーミキュライトあるいはピートモスに壌土あるいは腐植土を混合したような育苗培土のような農業資材に固定化してもよい。
【００１３】
培養した菌体を上記のような固定化資材に固定化するに際しては、培養液を適度に希釈して菌体濃度が１０４〜１０６ｃｆｕ／ｇ程度の濃度となるように調製することが望ましい。
例えば、バーミキュライトに本発明で使用する菌体を固定化する場合には、先ず上記培養後の菌株を１／１０ポテトデキストロース液体培地１Ｌで１４日間程度培養する。次いで、この培養後の菌体を滅菌水で１０倍希釈して１ＯＬとした後、１５０℃で１時間の乾熱滅菌をしたバーミキュライト５０Ｌと混合することで、１０６ｃｆｕ／ｇの菌体濃度を有する固定化資材を得ることができる。
菌体固定化資材の土壌への混合使用量は、速やかに脱窒を行うためには、土壌との混合後、菌体が１００ｃｆｕ／ｇ土壌（１ｇの土壌当たり生菌数にして１００個）以上存在するように使用することが望ましい。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。また、％は特に断らない限り全て質量％を示す。
【００１５】
（実施例１）
シュードモナス・フルオレッセンスＦＰＴ−９６０１菌株、ＴＳＢ−２５菌株、ＦＰＴ−Ｂ１菌株及びＦＰＴ−Ｙ１菌株を使用し、土壌中の硝酸態窒素の低減化試験を行った。
赤土とバーミキュライトを１８：８（容量比）で混合し、これを１６０℃の温度条件下で１時間保持し、乾熱殺菌を行った。それぞれの菌株は１／１０濃度のポテトデキストロース液体培地を用い、２３℃の温度条件下で１４日間静置培養を行った。
赤土とバーミキュライトとの混合資材と各菌株培養液を５：１（容量比）で混合、撹拌し、菌体固定化資材を調製した。
兵庫県加古郡のＮ池より掘り出した沖積土を使用し、この土壌を乾燥し水分含量３０％の土壌とした。
【００１６】
菌体固定化資材と乾燥土壌を混合し、これを隔離環境下で保持した状態で硝酸態窒素の減少量を測定した。
各菌体固定化資材の２Ｌを上記乾燥沖積土の８Ｌと混合した。また、対照資材として兵庫県姫路市の土壌から分離したシュードモナス・フルオレッセンス菌株を上記と同様に培養し固定化した資材（対照資材Ａ）、シュードモナス・フルオレッセンスのタイプカルチャー株（ＩＦ０−１４１６０）を同様に培養固定化した資材（対照資材Ｂ）、および菌株培養液を添加する代わりに同量の殺菌水を添加して調製した無菌対照資材を使用した。尚、対照の菌株は常法により脱窒能を有することを別途確認した。
それぞれの菌体固定化資材と乾燥土壌の混合物に、２０００ｍｇの硝酸イオンを含む硝酸カリウム水溶液１Ｌを混合し、これを１５Ｌ容のコンテナ容器に入れ、蓋をして２５℃の条件下で安置した。混合後、Ｏ日目、５日目、１０日目、２０日目に各資材の混合物の３カ所からそれぞれ２０ｇの土壌を採取した。
採取した土壌を２００ｍｌの蒸留水で３時間撹拌し、これをＮｏ．２濾紙で濾過し濾液を分取した。分取した濾液を適度に水で希釈し、イオンクロマトグラフィーを用いて濾液中の硝酸イオン濃度を測定した。測定値から土壌１００ｇ当たりの硝酸イオン量算出し、結果を表１に示した。
【００１７】
【表１】
2004267096.tif 000002
【００１８】
（実施例２）
実施例１で調製した各菌体固定化資材及び対照資材を使用し、兵庫県姫路市のトマト栽培土壌に混合し、土壌中の硝酸イオン濃度の変化を測定した。
トマト苗定植時に、各菌体固定化資材及び対照資材の各５０Ｌを、トマト栽培作土（畝内）の周辺土壌の２０００Ｌとそれぞれ混和した。混和後、Ｏ日目と１２０日目（栽培終了時）に各混合土壌の５カ所から土壌２０ｇを採取し、実施例１と同様の方法で土壌１００ｇ当たりの硝酸イオン量を測定した。結果を表２に示した。
【００１９】
【表２】
2004267096.tif 000003
【００２０】
（実施例３）
焼成赤玉土（細粒、大阪鋼灰（株）製）を乳鉢で磨砕後、１００ｍｌ（約１１０ｇ）を計り取り、菌体濃度を１０２〜１０６ｃｆｕ／ｍｌに調整したＦＰＴ−９６０１菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４７８）、ＴＳＢ−２５菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９３）、ＦＰＴ−Ｂ１菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９０）及びＦＰＴ−Ｙ１菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９１）を各１０ｍｌ混合した。
更に、これに１０００ｍｇ／Ｌの硝酸イオンを含む硝酸カリウム水溶液をそれぞれ３０ｍｌ添加し、２５℃で１０日間保持した。硝酸イオン含有水溶液の添加時と１０日後に、各試験区から土をそれぞれ２０ｇ採取し、実施例１と同様の方法で硝酸イオン量を測定し、土壌１００ｇ当たりの硝酸イオン量を求めた。結果を表３に示した。
【００２１】
【表３】
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