(57)【要約】【課題】マメ科植物とそれに感染する根粒菌との共生効率を制御する方法、及び、根粒菌との共生効率が野生型と比較して低下するマメ科植物共生変異体を提供する。【解決手段】本発明のマメ科植物と根粒菌との共生効率の制御方法は、マメ科植物の根に感染して根粒を形成し、窒素固定を行う菌根菌と、該菌根菌が感染したマメ科植物との間の共生効率を制御する方法である。本発明においては、植物などの突然変異の誘発に使用されるＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）を使用した突然変異誘発によって、マメ科植物に変異を誘発させる。そして、この変異が誘発されたマメ科植物に根粒菌を接種すれば、根粒菌との共生効率を野生型と比べて低下する方向に制御することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マメ科植物に対してＥＭＳを用いて突然変異を誘発させた後に、該マメ科植物に根粒菌を接種することによって、該マメ科植物への該根粒菌の感染を抑制することを特徴とするマメ科植物と根粒菌との共生効率の制御方法。
【請求項２】
上記マメ科植物は、ミヤコグサであることを特徴とする請求項１記載の共生効率の制御方法。
【請求項３】
上記共生効率の制御方法において、突然変異が誘発されたマメ科植物は、野生型のマメ科植物と比較して感染糸の形成が抑制されることを特徴とする請求項１または２記載の共生効率の制御方法。
【請求項４】
ＥＭＳを用いて突然変異が誘発され、根粒菌との共生効率が野生型植物と比較して低下することを特徴とするマメ科植物共生変異体。
【請求項５】
上記マメ科植物共生変異体は、ミヤコグサであることを特徴とする請求項４記載のマメ科植物共生変異体。
【請求項６】
上記マメ科植物共生変異体は、野生型植物と比較して感染糸の形成が抑制されていることを特徴とする請求項４または５記載のマメ科植物共生変異体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マメ科植物に突然変異を誘発させることによって、該マメ科植物とそれに感染する根粒菌との共生効率を制御する方法、及び、根粒菌との共生効率が野生型と比較して低下するマメ科植物共生変異体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの陸上植物の根には糸状菌（菌根菌）が共生している。菌根は、その形態から外生菌根と内生菌根とに分けられ、内生菌根の中でも最も普遍的に見られるものは、ＶＡ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ−Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ）菌根菌の共生したものである。ＶＡ菌根菌は、主に土壌中のリンなどの養分を吸収し、それを植物に供給している。ＶＡ菌根菌は土壌病害や乾燥ストレスに対する抵抗を高める他、宿主特異性をほとんど示さないため、異種間植物に同時感染することができ、植物同士をつなぎ合わせることができる。
【０００３】
ところで、上述のような細菌と植物との共生関係のもう一つの例として、マメ科植物と根粒菌との共生を挙げることができる。根粒菌は、マメ科植物の根に感染して根粒を形成し、窒素固定を行うという、農業分野において非常に有用な性質を有している。このことから、根粒菌とマメ科植物との共生関係については、多くの研究者に注目されている。
【０００４】
マメ科植物の根粒共生システムにおける宿主側（すなわち、マメ科植物）の遺伝子の単離は、近年ミヤコグサやタルウマゴヤシなどのモデル植物を活用することによって、ようやく緒についたばかりである。本願発明者等も、日本に自生するマメ科植物ミヤコグサに着目し、これについて突然変異の誘発を行い、根粒菌共生系に異常をきたした変異体の単離を試みている。その結果、３３系統の共生変異体を単離することに成功し、遺伝解析によって現在までに１３の遺伝子座を同定している（非特許文献１参照）。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，  第１５巻、１７〜２６頁、２００２年
【０００６】
【非特許文献２】
植物微生物研究会  第１１回研究交流会宮崎大会講演要旨集  第２６頁（２００１年１０月１１日〜１３日）
【０００７】
【非特許文献３】
Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｌｅｇｕｍｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ          ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｒｏｐ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ａｎｄ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｂｏｏｋ、第７９頁（２００２年６月２日〜６日）
【０００８】
【非特許文献４】
日本植物学会第６６回大会  研究発表記録  第１６３頁
（２００２年９月２０日〜２３日）
【０００９】
【非特許文献５】
植物微生物研究会  第１２回研究交流会講演要旨集  第４２頁
（２００２年１０月１１日〜１３日）
【００１０】
【非特許文献６】
第２５回日本分子生物学会年会  プログラム・講演要旨集  第３９６頁（２００２年１２月１１日〜１４日）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上記ミヤコグサの共生変異体の一例として、特許文献２〜６に記載のｃｒｉｎｋｌｅ変異体（Ｌｊｓｙｍ７９変異体あるいはｓｙｍ７９変異体とも称する）を挙げることができる。このｃｒｉｎｋｌｅ変異体においては感染糸の形成に異常が見られ、それゆえ不完全な根粒を形成するということが、本願発明者等によって確認されている。
【００１２】
しかしながら、上記ｃｒｉｎｋｌｅ変異体については、未だその原因遺伝子は特定されておらず、その性質についても未解明の部分が多く存在するのが現状である。また、上記ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の有用な利用方法についても見出されていない。
【００１３】
そこで、本発明はマメ科植物に上述のような突然変異の誘発を利用することによって、該マメ科植物とそれに感染する根粒菌との共生効率を制御する方法、及び、根粒菌との共生効率が野生型と比較して低下するマメ科植物共生変異体を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上述のｃｒｉｎｋｌｅ変異体について、さらなる機能解析を行った結果、上記ｃｒｉｎｋｌｅ変異体は感染糸の成長に影響を及ぼすとともに、根毛、毛状突起、種子などの形成を変化させるということを見出した。そして、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のこのような性質を利用すれば、根粒菌との共生効率を制御させることができると考えられたことから、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明のマメ科植物と根粒菌との共生効率の制御方法は、マメ科植物に対してＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）を用いて突然変異を誘発させた後に、該マメ科植物に根粒菌を接種することによって、該マメ科植物への該根粒菌の感染を抑制することを特徴とするものである。
【００１６】
この共生効率の制御方法は、マメ科植物の根に感染して根粒を形成し、窒素固定を行う菌根菌と、該菌根菌が感染したマメ科植物との間の共生効率を制御する方法である。本発明においては、植物などの突然変異の誘発に使用されるＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）を使用した突然変異誘発によって、マメ科植物に変異を誘発させる。
【００１７】
この変異が誘発されたマメ科植物は、後述の実施例にも示すように、野生型植物と比較して感染糸の形成が抑制されるなどといった、根粒菌の感染を阻害するような表現型を示す。そして、この変異が誘発されたマメ科植物に根粒菌を接種すれば、根粒菌との共生効率を野生型と比べて低下する方向に制御することができる。
【００１８】
これによれば、未だ解明されていない部分の多いマメ科植物と根粒菌との共生機構の解明に利用できる。
【００１９】
また、本発明の共生効率の制御方法は、突然変異が誘発されたマメ科植物は、野生型のマメ科植物と比較して感染糸の形成が抑制されることを特徴とするものでもある。
【００２０】
本発明のマメ科植物共生変異体は、ＥＭＳを用いて突然変異が誘発され、根粒菌との共生効率が野生型植物と比較して低下することを特徴とするものである。
【００２１】
上記マメ科植物共生変異体は、後述の実施例にも示すように、野生型植物と比較して感染糸の形成が抑制されるなどといった、根粒菌の感染を阻害するような表現型を示す。すなわち、本発明のマメ科植物共生変異体は、野生型植物と比較して感染糸の形成が抑制されていることを特徴とするものでもある。
【００２２】
それゆえ、上記マメ科植物共生変異体は、未だ解明されていない部分の多いマメ科植物と根粒菌との共生機構の解明に利用することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２４】
本発明に係るマメ科植物と根粒菌との共生効率の制御方法は、マメ科植物に対してＥＭＳを用いて突然変異を誘発させた後に、該マメ科植物に根粒菌を接種することによって、該マメ科植物への該根粒菌の感染を抑制することを特徴としている。
【００２５】
また、本発明に係るマメ科植物共生変異体は、ＥＭＳを用いて突然変異が誘発され、根粒菌との共生効率が野生型植物と比較して低下することを特徴としている。
【００２６】
本実施の形態では、上記マメ科植物としてマメ科モデル植物の一種であるミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ    ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、上記根粒菌としてＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉを用いた方法について説明する。
【００２７】
先ず、マメ科植物としてミヤコグサを用いたマメ科植物共生変異体（ｃｒｉｎｋｌｅ変異体）を作製する。このマメ科植物共生変異体は、従来公知の突然変異誘発法であるＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）を用いた突然変異誘発法によって作製される。Ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のより具体的な作製方法については、実施例に示す通りである。
【００２８】
このようにして作製されたｃｒｉｎｋｌｅ変異体には、根粒菌としてＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉが接種されと、野生型に根粒菌が接種された場合と比較して、生育に遅れが生ずる。なお、このｃｒｉｎｋｌｅ変異体に、栄養源として硝酸態窒素などの窒素が供給されれば、この生育の遅れは見られなくなることから、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体では、窒素固定能が低下していると考えられる。このような窒素固定能の低下によって、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体には、毛状突起（トライコーム）、さや、根毛などに発達の異常が確認される。
【００２９】
ところで、根粒菌のような窒素固定細菌は、植物由来の感染糸を経由して植物に感染し、根粒を形成する。しかしながら、上記ｃｒｉｎｋｌｅ変異体においては、この感染糸の形成が野生型植物と比較して抑制される。これによって、本発明のマメ科植物共生変異体は、根粒菌との共生効率が野生型植物と比較して低下すると考えられる。そして、上記マメ科植物変異体においては、根粒の形成は不完全なものとなる。
【００３０】
このように、本発明に係るマメ科植物共生変異体は、野生型植物と比較して感染糸の形成が抑制されるという表現型を示し、これによって、根粒菌との共生効率が野生型植物と比較して低下していると考えられる。なお、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のより具体的な表現型については、後述の実施例にて説明する。
【００３１】
そして、本発明に係るマメ科植物と根粒菌との共生効率の制御方法は、上述のマメ科植物共生変異体の性質を利用して、該マメ科植物共生変異体に接種された根粒菌の感染を抑制することによって行われると言うこともできる。これによって、上記共生効率の制御方法は、マメ科植物と根粒菌との共生効率を低下する方向に制御することができる。
【００３２】
以上のように、本実施の形態では、上記マメ科植物としてミヤコグサを用いたが、本発明はこれに限定されることなく、それ以外のマメ科植物（例えば、エンドウ、インゲンマメ、アルファルファ、ダイズなど）についても適用することが可能である。
【００３３】
また、上記根粒菌についても、上述のＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉに限定されることなく、それ以外の根粒菌を使用することができる。しかしながら、上記根粒菌は比較的高い宿主特異性を示すことから、宿主である上述のマメ科植物に適したものを用いることが好ましい。このような根粒菌として、具体的には、エンドウにはＲ．  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、インゲンマメにはＲ．  ｐｈａｓｅｏｌｉ、アルファルファにはＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、ダイズにはＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍなどを挙げることができる。
【００３４】
なお、本発明においては、突然変異誘発剤であるＥＭＳを用いてマメ科植物を変異させるという手法を用いている。しかし、このようにして得られたｃｒｉｎｋｌｅ変異体の原因遺伝子がクローニングされれば、当該原因遺伝子を用いて、従来公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）によって、マメ科植物共生変異体を作製することが可能となる。
【００３５】
すなわち、上記原因遺伝子を過剰発現するように適当なプロモーターとともにベクターに挿入した後、宿主となるマメ科植物（例えば、ミヤコグサ、エンドウ、インゲンマメ、アルファルファ、ダイズなど）に発現可能に導入すれば、さらにマメ科植物と根粒菌との共生効率をプラス方向に制御することも可能となる。
【００３６】
このように、上記ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の原因遺伝子が特定されれば、マメ科植物と根粒菌との共生効率の制御をより自在に操作できる可能性があると言える。そして、例えばマメ科植物と根粒菌との共生効率を向上させれば、当該マメ科植物から採取される作物の収量を増加させたり、肥料の使用を減らしても従来と同じ生育効率を得ることもできると考えられる。マメ科植物には、エンドウ、インゲンマメ、アルファルファ、ダイズなどといった農業分野において非常に有用なものが多数含まれるため、この共生効率の制御方法は利用価値が高いと考えられる。
【００３７】
【実施例】
本発明の実施例について、図面を用いて以下に説明する。なお、本発明は、この記載に限定されるものではない。本実施例では、上述のｃｒｉｎｋｌｅ変異体の作製方法およびその表現型の調査結果について述べる。
【００３８】
〔実験方法〕
１．植物材料
ｃｒｉｎｋｌｅ変異体は、従来文献（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １５，  １７−２６頁、（２００２年））の記載に基づいて、モデルマメ科植物ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ    ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）Ｇｉｆｕ  Ｂ−１２９を用いて、ＥＭＳによる突然変異誘発法によって作製し、表現型解析の前に野生型Ｇｉｆｕと２回戻し交配をした。野生型Ｇｉｆｕ及びｃｒｉｎｋｌｅの種は、ともに表面に傷がつけられ、濃硫酸に１０分間浸された後、流水下で３回洗浄され、１０％（ｖ／ｖ）ＮａＣｌＯで１０分間表面が殺菌された。処理された種は、滅菌水で３回洗浄され、室温の下、滅菌水中に２〜３時間浸された。種は、ペトリ皿中の０．８％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔ寒天上で発芽させられ、培養棚で１６時間の明状態／２６℃、８時間の暗状態／２３℃のサイクルで、相対湿度６０％の状態で生育された。ａｌｂ１−１変異体（Ｌｊｓｙｍ７４−１；Ｉｍａｉｚｕｍｉ−Ａｎｒａｋｕ  Ｈ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３８，８７１−８８１頁、（１９９７年）参照）は、根粒形成や組織学的構造についてｃｒｉｎｋｌｅ変異体と比較するために使用された。
【００３９】
２．菌株
根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ    ｌｏｔｉ、ＭＡＦＦ３０３０９９）は、日本の農林水産省の農業生物資源研究所から入手した。ＥＧＦＰを発現するＭ．ｌｏｔｉ  ＢＮ０２変異体は、大阪大学の佐伯博士から入手した。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を恒常的に発現し、ｐＤＧ４９９（ｎｏｄＢ：ｌａｃＺ）レポーター遺伝子を輸送するＭＡＦＦ３０３０９９の誘導体ＭＬ００１は、東北大学の南沢博士より提供された。細菌は、ＴＹ培地中で、２８℃２時間、培養された。なお、Ｍ．ｌｏｔｉ  ＭＡＦＦ３０３０９９は、１５μｇ／ｍｌのホスホマイシンを含むＴＹ培地で、ＧＦＰ遺伝子を保有するＭ．ｌｏｔｉは、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＴＹ培地で、ｌａｃＺ遺伝子を保有するＭ．ｌｏｔｉは、１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＴＹ培地で培養された。
【００４０】
３．根毛変形解析
根毛変形に関する解析法は、従来文献（Ｂｏｎｆａｎｔｅ  Ｐ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １３，  １１０９−１１２０頁、（２０００年））の記載に基づいて実施された。殺菌された種子は湿ったフィルター紙上で２日間吸収された。発芽した種子は、その後、１／４の濃度のＢｒｏｕｇｈｔｏｎ    ａｎｄ  Ｄｉｌｗｏｒｔｈの寒天培地上に移された。プレートは、まっすぐな根の成長を促進するために、縦に配置された。種子は２日間生育された後、Ｍ．ｌｏｔｉ  ＭＡＦＦが細胞密度１０８個／ｍｌで接種された。３日経過後、根は収穫され、２０％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムで数分間清浄化された。清浄化されたサンプルは、水で３回洗浄された後、光学顕微鏡（ＢＸ５０、オリンパス光学社製）で観察された。
【００４１】
４．感染糸の調査
感染糸を可視化するために、根には、ｅＧＦＰまたはｌａｃＺレポーター遺伝子を発現するＭ．ｌｏｔｉ株が接種された。生育後７日目の野生型およびｃｒｉｎｋｌｅ変異体の種子は、「ピロー・システム」（以下に示す）へ移行された。２日後、植物にはＭ．ｌｏｔｉ株が細胞密度１０８個／ｍｌで接種された。１つの遺伝子型につき少なくとも１０個の苗木が、接種後異なる日に検査された。β−ガラクトシダーゼ活性を測定するために、全ての根が固定液（１％（ｖ／ｖ）グルタルジアルデヒド  ｉｎ  １×リン酸塩（ＰＢＳ）バッファー、ｐＨ７．５）に３分間真空浸透され、さらに１時間ＰＢＳバッファーでインキュベートされた。固定されたサンプルは、引き続いてＰＢＳバッファーで２度洗浄され、０．２×ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、２．５ｍＭ  Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］、０．８ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド（ナカライテスク社製）を含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液を使用して、β−ガラクトシダーゼ活性測定用に染色された。染色は、３分間の真空浸透の後、１昼夜の室温でのインキュベートによって実施された。染色されたサンプルは、ＰＢＳによって３度洗浄され、２０％（ｖ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウム溶液で清浄化された。感染糸はオリンパスのＢＸ５０顕微鏡を使用して、ＬａｃＺの場合は明視野の照度で、ＧＦＰの場合は蛍光装置を取り付けて観察された。
【００４２】
感染糸の共焦点の顕微鏡観察では、根にはＧＦＰを発現するＭ．ｌｏｔｉを感染させた。接種から１０日〜１５日経過後、根は切り取られ、細胞壁を染色するために１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム溶液に３０分間浸された（Ｇａｇｅ  Ｄ．Ｊ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８，  ７１５９−７１６６頁、（１９９６年）参照）。その後、組織は滅菌水で洗浄された。共焦点顕微鏡観察は、上記のＧａｇｅらの文献に記載のオリンパス光学社製の共焦点レーザ走査顕微鏡ＦＶ５００で実施された。
【００４３】
５．根粒の観察
生育７日目の苗木は、「ピロー・システム」に移行された。この「ピロー・システム」は、従来文献（Ｓｚｃｚｙｇｌｏｗｓｋｉ  Ｋ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １１，  ６８４−６９７頁、（１９９８年））に記載のものにいくつかの変更を加えたものである。ポリプロピレンのティーパック（１２０ｍｍ×９５ｍｍ）が、ピローバッグとして使用された。一つのピロー・システムは、１２〜１５のティーバッグからなり、プラスチックトレイ（３０×１０×１０ｃｍ）上に並んで配置された。ティーパック内には、バーミキュライトとパーライトとが重量比６：１で混合して含まれており、このティーパックは、１０μＭ  ＫＮＯ３を含むＢｒｏｕｇｈｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｌｗｏｒｔｈの栄養液に１５分間浸された。この低濃度の硝酸塩は、接種されたＬ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ植物の根粒形成には影響を及ぼさなかった（データ示さず）。苗木は一例に５個づつ、個々のピローの間に配置された。２日後、根には細胞密度１０８個／ｍｌでＧＦＰを発現するＭ．ｌｏｔｉが接種された。変異体の表現形は、毎週の観察された。根粒形成が起こった根は全て、蛍光装置（ＭＺＦＬＩＩＩ、ライカミクロシステム社製）が取り付けられた実体顕微鏡で観察された。
【００４４】
６．根粒の組織観察
野生型及びｃｒｉｎｋｌｅの根粒の組織観察のために、３〜４ｍｍの長さの根の断片が、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを含む２ｍＭカコジル酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）中に、３０分間真空浸透された。４℃の新しい固定液中で一昼夜のインキュベートの後、根の断片は濃度の異なる一連のエタノール（３０％、５０％、７０％、８０％（ｖ／ｖ）：各ステップにつき２×１５分間、９０％、９５％、９９％（ｖ／ｖ）：各ステップにつき２×５分間、１００％（ｖ／ｖ）で１時間）で脱水された。浸透と包埋が、Ｈｉｓｔｏ−Ｔｅｃｈｎｉｋ    ７１００のプロトコルに基づいて実施された。１〜１．５μｍのやや薄めの部分は、超ミクロトーム（ライカウルトラカットＳ）上でガラスナイフを用いて、根が埋め込まれたサンプルから切り取られた。その断片は、１０μｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを含む溶液で染色された。
【００４５】
７．根粒のアミロプラストの蓄積
根粒におけるアミロプラストの観察は、やや薄めの部分で実施された。サンプルは、取り扱い説明書に基づいて、周期的な酸−シッフ塩基染色システム（Ｓｉｇｍａ    Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｔ．    Ｌｏｕｉｓ）で染色され、光学顕微鏡で観察された。
【００４６】
８．レグヘモグロビン転写物の生体内局在
レグヘモグロビン遺伝子の発現は、従来文献（Ｋｏｕｃｈｉ  Ｈ．  ａｎｄ  Ｈａｔａ  Ｓ．，  Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １０，  ５９−６８頁、（１９９３年））に記載されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて観察された。レグヘモグロビン遺伝子のセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ断片を準備するために、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ    根粒ＲＮＡから逆転写酵素ＰＣＲによって得られた０．３２ｋｂｐのｃＤＮＡ断片が、ｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ    ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）へ挿入されクローニングされた。ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた直線化によって、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡをそれぞれ産生するポリメラーゼＳｐ６およびＴ７には、テンプレートが供給された。逆転写酵素ＰＣＲ増幅のために、レグヘモグロビン遺伝子に特異的な２つのプライマーが合成された。プローブは、Ｓｐ６／Ｔ７  ＤＩＧ    ＲＮＡラベリングキットを用いて、ジゴキシゲニンでラベルされた。
【００４７】
組織調製のために、Ｍ．ｌｏｔｉ  ３０３０９９接種から２ヶ月経過後に採取された根粒が、４％（Ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で固定された。根粒は一連のエタノールで脱水化され、パラフィン包埋培地に包埋された。１０μｍの厚さのミクロトーム部分が、ポリＬ−Ｌｙｓでコーティングされたガラススライド上に配置された。この部分は、ジゴキシゲニンでラベルされたセンスレグヘモグロビンＲＮＡあるいはアンチセンスレグヘモグロビンＲＮＡと、５０℃で１６時間ハイブリダイズされた。そして、引き続いて洗浄が実施された。ハイブリダイゼーションシグナルは、ニトロブルーテトラゾリウム塩及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルリン酸トルイジンを含む、アンチジゴキシゲニン−アルカリン  ホスファターゼ配合体を使用して可視化された。そして、この部分は光学顕微鏡で観察された。
【００４８】
９．ニトロゲナーゼ活性
原型の植物のニトロゲナーゼ活性は、Ｈ２放出量として生体内で測定された。野生型および変異体植物は、バーミキュライトとパーライトとを重量比６：１で含むポットで生育された。Ｍ．ｌｏｔｉ  ＭＡＦＦ３０３０９９の接種から３〜５週間経過後に、ニトロゲナーゼ活性が、ポットに蒸気を通してインラインＨ２検出器によって決定された。Ｈ２検出器による出力は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ    Ｌａｂ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅに供給され、Ｌｏｇｇｅｒ  Ｐｒｏ    ソフトウエアを使用して解析された。見掛けのニトロゲナーゼ活性を決定するために、安定化するまでに、ガスにおけるＮ２とＯ２との混合比が８０：２０（ｖ／ｖ）に達した。ガスにおいて、Ａｒ：Ｏ２の混合比が８０：２０（ｖ／ｖ）に変換された後に観察されたピークの値は、ＴＮＡを決定するために使用された。ニトロゲナーゼ固定速度は、式：［ＴＮＡ−（見掛けのニトロゲナーゼ活性）］／３によって算出された。
【００４９】
〔結果〕
（１）窒素供給阻害によってｃｒｉｎｋｌｅの成長阻害は引き起こされる。
【００５０】
典型的な窒素欠乏の兆候が、窒素飢餓条件下でのｃｒｉｎｋｌｅ変異体の成長において観察された。根粒菌の存在下、および低濃度の硝酸塩の存在下で、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の全体としての成長は、野生型Ｇｉｆｕと比較して妨げられる。根粒菌との接種後に、野生型植物は生育の遅れを示す。１０−ｄのタイムコースにおいては、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体では発芽の顕著な低下と、側生根の大幅な減少が観察された（図１（ａ）および（ｃ）参照）。しかしながら、根の成長に関しては、野生型と変異体とで顕著な差は見られなかった（図１（ｂ）参照）。Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ    ｌｏｔｉとの感染から２ヶ月経過後のｃｒｉｎｋｌｅ変異体は、同世代の野生型植物と比較して、その大きさが約１／２となることが確認された（図２（ａ）、（ｂ）参照）。変異体の根は野生型のものと比較して、細く短かった（図２（ｃ）、（ｄ）、表１参照）。
【００５１】
以下に示す表１は、野生型植物とｃｒｉｎｋｌｅ変異体との成長および根粒形成の様子を比較した結果である。表１の野生型植物およびｃｒｉｎｋｌｅ変異体は、ピロー・システムによって生育され、Ｍ．ｌｏｔｉの感染から２ヶ月経過後に収穫されたものであり、数値は（平均値）±（標準偏差）で示す。また、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体における白い根粒、ピンク色の根粒は、それぞれ、タイプ１、タイプ２の根粒に相当する。
【００５２】
【表１】
2004261078.tif 000002
【００５３】
また、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の地上部は黄化し、本葉が矮化し、茎には色素の沈着が観察された。表１に示すように、感染後２ヶ月の変異体の芽の成長は、野生型の約６６％と顕著に減少した。窒素源の豊富な存在下（１０ｍＭＫＮＯ３）では、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の成長は野生型と同等であった（データ示さず）。このことから、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の異常な成長は、単に窒素供給が制限された結果であるということが示唆される。
【００５４】
（２）Ｃｒｉｎｋｌｅ変異体は、毛状突起（トライコーム）、さや、根毛の発達を変化させる。
【００５５】
３つの非共生の表現型が、変異体植物において観察された。ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の注目すべき特徴は、異常なトライコームの発達である。顕微鏡で観察した場合、野生型Ｇｉｆｕのトライコームはまっすぐであった（図３（ａ）参照）。一方、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のトライコームは、波状にうねっていた（図３（ｂ）参照）。この表現型は、がく、花柄、花軸、茎、及び各若葉の背軸側の中央脈において確認された。ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の成熟したさやは、野生型と比較して約４３％短かった（図３（ｃ）、（ｄ）、表２参照）。このようにｃｒｉｎｋｌｅ変異体は１つのさやにおいて、野生型と比較して少しの種しかつくらない。外見的に縮んでいて、細く小さい成長しない胚が、野生型に比べさやにおいて多く見られた（図３（ｅ）、（ｆ）、表２参照）。
【００５６】
以下に示し表２は、野生型植物とｃｒｉｎｋｌｅ変異体の種と、さやの長さを比較したものである。表２に示す結果は、成熟したさや各３０個における（平均値）±（標準偏差）である。
【００５７】
【表２】
2004261078.tif 000003
【００５８】
Ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の種の大きさは、５０個の平均で０．７４ｍｇであり、野生型の種の平均値０．９８ｍｇと比べてやや小さかった。ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のその他の共生以外に関する特徴は、根毛の基部が大きくなっているということである。根粒菌の存在下で野生型の根は、細くまっすぐな根毛を発達させる。一方、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体は、基部において膨張した根毛を形成した（図示せず）。変異体の根毛では、増大した部分が根毛細胞の約１／２を覆っていた。Ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のこれらの共生以外に関する表現型は、硝酸塩の高濃度（１０ｍＭ）存在下では影響されなかった。
【００５９】
（３）感染糸発達はｃｒｉｎｋｌｅ変異体において阻止される。
【００６０】
根毛形成の解析では、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体において、Ｍ．ｌｏｔｉ感染に対して根毛の反応が野生型と比較して遅れるということを確認した（図示せず）。Ｍ．ｌｏｔｉ感染後１〜５日経過後に、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体において根毛形成は、主として末端の膨張部に生じていた。より長期間の感染では、データは示さないが野生型と同じように、根毛歪み、「羊飼いの杖」、先端の屈曲、そして分枝も観察された。接種されていないコントロール植物においては根毛の反応は全く見られなかった（図示せず）。
【００６１】
野生型および変異体植物において細菌感染を可視化するために、ｌａｃＺや緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を運搬するＭ．ｌｏｔｉ  ＭＡＦＦ３０３０９９の類似体が使用された。ＧＦＰを発現するＭ．ｌｏｔｉの感染から５日後および１０日後には、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のほとんどの根毛に感染が見られなかった（図１（ｄ）参照）。野生型における接種後２週間の継続的な感染では、感染糸は皮層に侵入し、細い網状組織のように分岐する（図示せず）。発達中の根粒原基における感染糸の網状組織は、Ｍ．ｌｏｔｉの感染後１週間以内に観察される。ｃｒｉｎｋｌｅ変異体においては、根毛の感染糸の開始と伸長に関しては野生型と同様である。しかしながら、感染糸の慎重派、侵入を阻止されることで、根毛細胞の基部におけるバルーン形状構造においてほぼ終了する（図示せず）。
【００６２】
βガラクトシダーゼ活性に関しては、ｌａｃＺレポータータンパク質を運搬するＭ．ｌｏｔｉの感染から８日後に根で調査された。野生型においては、細菌の侵入が、未成熟の根粒の内部組織におおいて、青いしみの存在によって明らかとなった（０．２〜０．６２ｍｍ）。根粒の形態形成に無関係な感染は、皮層細胞の分裂の段階を超えて進むのではなく、根の表皮において抑えられる。Ｃｒｉｎｋｌｅにおける根の調査によって、未成熟な根粒は野生型よりも小さく（０．０６〜０．２５ｍｍ）、感染が抑えられることに関連しているということが明らかとなった（図示せず）。ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の根における感染糸のほとんどは、突起の表層のみに侵入し、根粒において感染の進行を停止させる。
【００６３】
ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の感染糸が阻止される特定の細胞層を確認するために、共焦点顕微鏡によって根の観察が行われた。野生型において連続的な感染が、発達中の根粒における感染糸ネットワークの形成によって観察された。ｃｒｉｎｋｌｅ変異体では、異なる感染糸が根毛において注目された。しかしながら、感染糸は、根粒皮層細胞へ侵入せず、表皮で侵入がストップされた。
【００６４】
（４）Ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の根粒の２つの形態
Ｍ．ｌｏｔｉの感染によって誘導される野生型の根粒は、窒素固定段階では、球状でピンク色をしている。図４（ａ）には、Ｍ．ｌｏｔｉの感染から２ヶ月後の根粒が形成された野生型植物の根の様子を示す。根粒の原基は、感染後数日以内に出現し、感染後１週間で完全発達した根粒が観察される。ｃｒｉｎｋｌｅ変異体においては、感染糸の発育不全は、結果として多くの小さな突起および白い根粒を形成させる（タイプ１）。そのうちのいくつかは、変異体の根において、拡大し、いびつな形状となり、淡いピンク色の根粒となる（タイプ２）（図４（ｂ）参照）。根粒菌の感染後２ヶ月では、野生型植物は、主として感染したピンク色の根粒（０．６〜１．６ｍｍ）からなる（表１、図４（ａ）、（ｃ）参照）。Ｃｒｉｎｋｌｅ変異体では、根粒の多くが感染していないタイプ１の根粒（０．５〜０．７ｍｍ）であり、一部が感染したタイプ２の根粒（１〜１．８ｍｍ）（表１、図４（ｂ）、（ｄ）参照）である。
【００６５】
根粒の詳細な構造を観察するために組織学的な調査が実施された。野生型においては、感染から２週間で、皮層へ侵入する太い感染糸が表皮において確認された（図示せず）。この管状の感染糸においては、いくつかの植物性の細菌が、植物由来と考えられる感染糸の壁に囲い込まれている。感染細胞の多くは、根粒の内部組織において明らかとなっている。変異体の突起部では、細菌はカールした根毛に侵入し、感染糸を伸ばすことができる。しかし、根粒の原始細胞における感染糸の侵入は観察されなかった（図示せず）。それに加えて、ｃｒｉｎｋｌｅの突起における根の表皮細胞のいくつかは、感染部位の近くに茶色がかった色素沈着を形成した（図示せず）。このような色素細胞は接種された野生型植物ではほとんど見られない。
【００６６】
感染か１ヶ月後、野生型の成熟した根粒は、中央部に突出した液胞を有する細菌が感染した細胞を含んだ。対照的に、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のタイプ１の根粒においては、感染した細胞は観察されなかった（図示せず）。その代わりに、細菌の塊が根粒の外側の皮層や中央組織で確認された。これらは、感染糸から放出されない細菌であり、細胞間の空間において凝集したままであった。自己蛍光の壁が、外側の皮層において細菌を取り囲むように観察された（図示せず）。ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のタイプ２の根粒の調査では、中央組織に散在する細菌に感染した細胞も確認された（図示せず）。ａｌｂ−１変異体では、根粒の中央組織の広い部分を占める肥大した感染糸の形成によって、異常な感染が特徴付けられた（図示せず）。
【００６７】
野生型の根粒の周期的な酸−シッフ染色で、感染していない内部の皮層細胞でわずかのアミロプラストが確認された。これは、輸送された光合成産物が代謝されたことを示唆している（図５（ａ）参照）。ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の非感染の根粒（タイプ１）、及び、感染した根粒（タイプ２）ともに、アミロプラストの大量の蓄積が観察された（図５（ｂ）参照）。図５（ａ）および（ｂ）において、矢印で示す黒い箇所が染色されたアミロプラストである。また、図５（ａ）および（ｂ）において、ｉｃが感染細胞、ｕｃが非感染細胞である。
【００６８】
ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の根粒では、発達していない維管束も観察された。野生型では、根粒の外周で網状組織を形成する根粒の基部で維管束は二股に分かれる（Ｉｍａｉｚｕｍｉ−Ａｎｒａｋｕ  Ｈ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３８，  ８７１−８８１頁、（１９９７年）参照））。ｃｒｉｎｋｌｅ変異体では、維管束は分岐するが、それ以上は分かれない。このように、短く不規則な維管束はｃｒｉｎｋｌｅ変異体の基部の部分で発達した（データ示さず）。この分化していない維管束の表現型は、上述のａｌｂ−１変異体と類似していた。
【００６９】
（５）ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の根粒におけるレグヘモグロビン転写の局在化とニトロゲナーゼ活性
野生型およびｃｒｉｎｋｌｅ変異体の完全に成熟した根粒におけるレグヘモグロビンｍＲＮＡの細胞内局在は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって調査された。野生型の根粒において、感染から２ヶ月で中央組織の感染細胞において転写が検出された（図５（ｃ）参照）。ハイブリダイゼーションシグナルは、ジゴキシゲニンでラベルされたセンスＲＮＡ転写物がプローブとして使用された場合、観察されなかった（データ示さず）。
【００７０】
以下に示す表３は、野生型植物、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体、ａｌｂ−１変異体におけるニトロゲナーゼ活性を示す。ニトロゲナーゼ活性はｃｒｉｎｋｌｅ変異体の根粒の窒素固定能を評価することによって決定された。
【００７１】
【表３】
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【００７２】
表３に示すように、Ｍ．ｌｏｔｉ感染から３週間後の、ｃｒｉｎｋｌｅの根粒におけるニトロゲナーゼのトータル活性（ＴＮＡ）は、野生型およびａｌｂ−１と比較して、相対的に低かった。感染から４週間後の、ｃｒｉｎｋｌｅにおけるＴＮＡは、野生型の根粒の約半分であった。変異体におけるＴＮＡは、より長期のインキュベーション後（感染から８週間後）には、野生型の６３％のレベルまで増加した。Ｃｒｉｎｋｌｅ変異体においては、検出されたニトロゲナーゼ活性は、根粒菌の感染から数週間経過後のタイプ２の根粒の出芽に相当すると推測される。
【００７３】
【発明の効果】
以上のように、本発明のマメ科植物と根粒菌との共生効率の制御方法は、マメ科植物に対してＥＭＳを用いて突然変異を誘発させた後に、該マメ科植物に根粒菌を接種することによって、該マメ科植物への該根粒菌の感染を抑制することを特徴としている。
【００７４】
上記の方法によれば、マメ科植物において根粒菌との共生効率を、野生型と比べて低下する方向に制御することができる。そして、未だ解明されていない部分の多いマメ科植物と根粒菌との共生機構の解明に利用できる。
【００７５】
また、本発明のマメ科植物共生変異体は、ＥＭＳを用いて突然変異が誘発され、根粒菌との共生効率が野生型植物と比較して低下することを特徴とするものである。
【００７６】
上記マメ科植物共生変異体は、野生型植物と比較して感染糸の形成が抑制されるなどといった、根粒菌の感染を阻害するような表現型を示し、未だ解明されていない部分の多いマメ科植物と根粒菌との共生機構の解明に利用することができる。
【００７７】
マメ科植物には農作物として非常に有用なものが多いため、本発明の利用価値は高いと言える。また、本発明を応用すれば、マメ科植物と根粒菌との共生効率をプラス方向に制御することも可能となり、マメ科植物の効率的な栽培に貢献できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）〜（ｄ）は、Ｍ．ｌｏｔｉ感染からの野生型、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の成長を示すグラフである。（ａ）は新芽の長さ（ｍｍ）の変化を、（ｂ）は根の長さ（ｍｍ）を、（ｃ）は側生根の数を、（ｄ）は感染糸の数をそれぞれ示す。なお、（ａ）〜（ｄ）において、●は野生型を、■はｃｒｉｎｋｌｅ変異体をそれぞれ示し、各グラフにおいて横軸はＭ．ｌｏｔｉ感染後の日数を示している。
【図２】（ａ）〜（ｄ）は、Ｍ．ｌｏｔｉ感染後８週間の野生型及びｃｒｉｎｋｌｅ変異体の成長・根粒形成の様子を示す図である。（ａ）は、野生型植物の成長の様子を示す。（ｂ）は、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の成長の様子を示す。（ｃ）は、野生型植物の根の部分をより詳細に示す。（ｄ）は、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の根の部分をより詳細に示す。なお、（ｄ）に示す縦線の長さが実際には５ｃｍであり、各図はこれと同一の縮尺となっている。
【図３】（ａ）は、野生型植物のがく部分の毛状突起を示す図である。（ｂ）は、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のがく部分の毛状突起を示す図である。（ｃ）は、野生型植物のさやを示す図である。（ｄ）は、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体のさやを示す図である。（ｅ）は、野生型植物の胚の部分を示す図である。（ｆ）は、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の胚の部分を示す図である。なお、各図に示す横線の長さが、それぞれ実際の長さである。
【図４】（ａ）および（ｂ）は、Ｍ．ｌｏｔｉの感染から２ヶ月後の根粒が形成された根の様子を光学顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（ａ）が野生型植物の場合、（ｂ）がｃｒｉｎｋｌｅ変異体の場合である。（ｃ）は、（ａ）に示す野生型植物について、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現の様子を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。（ｄ）は、（ｂ）に示すｃｒｉｎｋｌｅ変異体について、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現の様子を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図５】（ａ）は、多くの感染細胞を有する野生型植物の成熟した根粒の中央部の顕微鏡による観察の結果を示す図である。（ｂ）は、いくつかの感染細胞と大量のアミロプラストを有するｃｒｉｎｋｌｅ変異体のタイプ２の根粒の顕微鏡による観察の結果を示す図である。（ｃ）は、野生型植物の感染細胞の縦断面のレグヘモグロビン発現の様子を示す図である。（ｄ）は、ｃｒｉｎｋｌｅ変異体の感染細胞の縦断面のれグヘモグロビン発現の様子を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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