(57)【要約】【課題】細胞間のタンパク質の移動をつかさどるポリペプチドと、これをコードするポリヌクレオチドと、さらに、産業に利用可能な上記ポリペプチド・ポリヌクレオチドの利用方法とを提供する。【解決手段】アミノ酸の１文字表記で、ＶＭＩＤＰＤＶＰＧＰＳＤＰＦＬＫＥＨＬＨＷで示される２１アミノ酸残基全てか、または、当該アミノ酸配列中の１０残基以上の配列を含んでいるポリペプチドは、細胞間のタンパク質の移動をつかさどる。このアミノ酸配列では、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されていてもよい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列全てか、または、当該アミノ酸配列中の１０残基以上の配列を含んでおり、細胞間のタンパク質の移動をつかさどるポリペプチド。
【請求項２】
上記１０残基以上の配列には、第１７番目のグルタミン酸が含まれていることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
上記１０残基以上の配列には、さらに、第４番目のアスパラギン酸、第５番目のプロリン、第６番目のアスパラギン酸、第８番目のプロリン、第１０番目のプロリン、第１１番目のセリン、第１３番目のプロリン、第２０番目のヒスチジンのうち、少なくとも一つが含まれていることを特徴とする請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
シロイヌナズナ由来である請求項１、２または３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
さらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列全てか、または、当該アミノ酸配列中の１０残基以上の配列のうち、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる請求項１ないし４の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
上記置換または欠失するアミノ酸が、第１７番目のグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１ないし６の何れか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
細胞間移動させたいタンパク質に、請求項１ないし６の何れか１項に記載のポリペプチドを融合させたことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項７または８に記載のポリヌクレオチドと、細胞間移動させたいタンパク質の遺伝子と、プロモーター配列とを含む組換え発現ベクターを得る工程と、
得られた組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、配列番号１に示されるアミノ酸配列全てか、または、当該アミノ酸配列中の１０残基以上の配列をシグナルペプチドとして含んでいる融合タンパク質を発現する工程とを含んでいることを特徴とするタンパク質の細胞間移動方法。
【請求項１２】
上記宿主細胞が動物細胞または植物細胞であり、かつ、宿主となる生物の組織を形成している細胞であるとともに、
上記細胞間移動させたいタンパク質が、宿主となる生物に対して薬理効果を有するタンパク質であることを特徴とする請求項１１に記載のタンパク質の細胞間移動方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞間のタンパク質の移動をつかさどるポリペプチドと、これをコードするポリヌクレオチドとこれらの利用方法とに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＴＦＬ１遺伝子はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の遺伝子であり、花序分裂組織の維持に関わるだけでなく、最近では、成長相の制御全般に関わる遺伝子であるとみられている（例えば、非特許文献１参照）。このＴＦＬ１遺伝子・タンパク質の機能については未だ不明な点が多いが、最近、本発明者らは、ＴＦＬ１タンパク質が、栄養成長期から生殖成長期に移行する時期、すなわち、花序茎頂において細胞間移動していることを明らかにした。
【０００３】
また、ＴＦＬ１タンパク質は、哺乳動物から同定されたホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＥＢＰ）と相同性を有している。ＰＥＢＰの生化学的な機能は不明であるが、ヒトやラットにおいては、海馬で産生されるＨＣＮＰ（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）という神経ペプチドの前駆体であることが報告されており（非特許文献２参照）、さらには、ＰＥＢＰがＲａｆキナーゼのインヒビター活性があることも報告されている（非特許文献３参照）。
【０００４】
さらに、ＴＦＬ１遺伝子と高い相同性を有する遺伝子として、シロイヌナズナ由来のＦＴ遺伝子が知られている（例えば、非特許文献４，５参照）。このＦＴ遺伝子は、花成を抑制するＴＦＬ１遺伝子とは反対に、花成を促進する機能を有しており、ＴＦＬ１遺伝子とＦＴ遺伝子とは、花成の制御において拮抗的に作用している可能性が示唆されている。
【０００５】
上記ＴＦＬ１タンパク質と相同性を有するタンパク質は、上記ＦＴ遺伝子にコードされるＦＴタンパク質以外にも、イネ、アブラナ、タバコ、トマトなど、各種の植物から多数見出されている。本発明では、このようなＴＦＬ１タンパク質に類似するタンパク質をＴＦＬ１ファミリータンパク質と称し、同様に、ＴＦＬ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子をＴＦＬ１ファミリー遺伝子と称する。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ，  Ｏ．Ｊ．，  Ａｍａｙａ，  Ｉ．，  Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５，１６０９−１６１５（１９９８）
【０００７】
【非特許文献２】
Ｔｏｈｄｏｈ，  Ｎ．，  Ｔｏｊｏ，  Ｓ．，  Ａｇｕｉ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．：Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ３０，  ３８１−３８４（１９９５）
【０００８】
【非特許文献３】
Ｙｅｕｎｇ，  Ｋ．，  Ｓｅｉｔｚ，  Ｔ．，  Ｌｉ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  ：Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，  １７３−１７７（１９９９）
【０００９】
【非特許文献４】
Ｋｏｂａｔａｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｋａｙａ，  Ｈ．，  Ｇｏｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，  １９６０−１９６２（１９９９）
【００１０】
【非特許文献５】
Ｋａｒｄａｉｌｓｋｙ，  Ｉ．，  Ｓｈｕｋｌａ，  Ｖ．，  Ａｈｎ，  Ｊ．−Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，１９６２−１９６５（１９９９）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、植物において、タンパク質が細胞間を移動するメカニズムの詳細については現在のところほとんど知られていない。
【００１２】
例えば、現在までに、細胞間を移動するタンパク質の遺伝子として、例えば植物では、上記ＴＦＬ１遺伝子以外に、シロイヌナズナのＳＨＯＲＴ  ＲＯＯＴ遺伝子、ＣＡＰＲＩＣＥ遺伝子、ＬＥＡＦＹ遺伝子、トウモロコシのＫｎｏｔｔｅｄ１遺伝子等が知られている。ところが、これら遺伝子にコードされるタンパク質がどのように細胞間移動するかについてはほとんど解明されていない。
【００１３】
もちろん、上記ＴＦＬ１タンパク質の細胞間移動が、花成制御機構や、植物の形態変化制御の機構にどのように関与しているかについても明らかではない。
【００１４】
ＴＦＬ１ファミリータンパク質において、細胞間移動のメカニズムが解明されれば、これらファミリータンパク質の機能の解明に役立てることができる。さらには、前述したように、ＴＦＬ１ファミリータンパク質は、哺乳動物由来のＰＥＢＰと相同性を有していることから、ＴＦＬ１タンパク質の細胞間移動のメカニズムが明らかになれば、哺乳動物におけるＰＥＢＰの機能解明に応用することが可能となり得る。
【００１５】
加えて、細胞間移動のメカニズムを応用すれば、植物だけでなく動物においても任意のタンパク質を細胞間移動させることが可能となり、例えば、医療分野への応用の道も拓かれる。そのため、ＴＦＬ１ファミリータンパク質の機能解明だけでなく、産業上も様々な分野に応用することが期待できる。
【００１６】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ＴＦＬ１タンパク質から見出された、細胞間のタンパク質の移動をつかさどるポリペプチドと、これをコードするポリヌクレオチドと、さらに、産業に利用可能な上記ポリペプチド・ポリヌクレオチドの利用方法とを提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、ＴＦＬ１タンパク質から、細胞間のタンパク質の移動をつかさどるポリペプチドを初めて見出すことに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列全てか、または、当該アミノ酸配列中の１０残基以上の配列を含んでおり、細胞間のタンパク質の移動をつかさどるポリペプチドである。このポリペプチドとしては、シロイヌナズナ由来のＴＦＬ１タンパク質に含まれるものを挙げることができる。
【００１９】
上記ポリペプチドにおいては、上記１０残基以上の配列には、第１７番目のグルタミン酸が含まれていることが好ましく、さらに、第４番目のアスパラギン酸、第５番目のプロリン、第６番目のアスパラギン酸、第８番目のプロリン、第１０番目のプロリン、第１１番目のセリン、第１３番目のプロリン、第２０番目のヒスチジンのうち、少なくとも一つが含まれていることがより好ましい。
【００２０】
上記ポリペプチドにおいては、さらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列全てか、または、当該アミノ酸配列中の１０残基以上の配列のうち、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができ、より好ましくは、上記置換または欠失するアミノ酸が、第１７番目のグルタミン酸以外のアミノ酸であるポリペプチドを挙げることができる。
【００２１】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドとしては、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２２】
本発明にかかる上記ポリヌクレオチド・ポリペプチドの利用方法としては、例えば、細胞間移動させたいタンパク質に、上記ポリペプチドを融合させた融合タンパク質、上記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、これらポリヌクレオチド・ポリペプチドを利用したタンパク質の細胞間移動方法等を挙げることができる。
【００２３】
上記細胞間移動方法の一例としては、例えば、上記ポリヌクレオチドと、細胞間移動させたいタンパク質の遺伝子と、プロモーター配列とを含む組換え発現ベクターを得る工程と、得られた組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、配列番号１に示されるアミノ酸配列全てか、または、当該アミノ酸配列中の１０残基以上の配列をシグナルペプチドとして含んでいる融合タンパク質を発現する工程とを含んでいる方法を挙げることができる。
【００２４】
上記細胞間移動方法では、宿主細胞が動物細胞または植物細胞であり、かつ、宿主となる生物の組織を形成している細胞であるとともに、上記細胞間移動させたいタンパク質が、宿主となる生物に対して薬理効果を有するタンパク質であることがより好ましい。
【００２５】
上記構成または方法によれば、タンパク質の細胞間の移動をつかさどる上記ポリペプチドは、最大で２１残基のアミノ酸配列からなっている。そのため、このポリペプチドを利用することで、ＴＦＬ１ファミリータンパク質の機能の解明に役立てることができるだけでなく、任意のタンパク質を細胞間移動させることも可能となり、農業分野だけでなく医療分野等への応用の可能性も見出すことができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
（１）本発明にかかるポリペプチドの配列、構造
本発明者は、ＴＦＬ１タンパク質の分子解剖を進めた結果、配列番号１に示される２１残基（アミノ酸の１文字表記で、ＶＭＩＤＰＤＶＰＧＰＳＤＰＦＬＫＥＨＬＨＷの配列）のアミノ酸配列が、ＴＦＬ１タンパク質と同じ細胞間移動を示すことを見出した。すなわち、本発明者は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＴＦＬ１タンパク質の細胞間移動をつかさどるポリペプチドであることを見出した。この２１残基のアミノ酸配列は、ＴＦＬ１タンパク質における第２エキソン領域に相当する。
【００２８】
本発明にかかるポリペプチドは、細胞やタンパク質の種類に関わらず細胞間のタンパク質移動をつかさどる機能を有していればよく、その長さは特に限定されるものではない。すなわち、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号１に示す２１残基のアミノ酸配列そのものであってもよいが、このアミノ酸配列中に含まれる、少なくとも１０残基以上の配列であってもよい。このように、本発明にかかるポリペプチドは、タンパク質を細胞間移動させる機能を有していれば、配列番号１に示す２１残基全てが揃った配列である必要は無く、配列番号１中の１０残基以上の配列を含んでいるポリペプチドであればよい。
【００２９】
また、本発明にかかるポリペプチドには、上記配列番号１に示すアミノ酸配列以外の配列が含まれていてもよい。例えば、上記２１残基のアミノ酸配列と、他の機能を有する配列とをタンデムにつなげたポリペプチドであってもよい。
【００３０】
なお、本発明における「ポリペプチド」という語は、「タンパク質」ほど分子量が大きくないペプチド全般を指すものと定義する。一般に、アミノ酸が複数ペプチド結合しており分子量５，０００以下のものをポリペプチドと称するが、本発明にかかる「ポリペプチド」もこのような一般的な意味にしたがうものとする。もちろん、アミノ酸が１０個程度以下ペプチド結合してなるオリゴペプチドも、本発明における「ポリペプチド」に含まれる。
【００３１】
また、本発明にかかるポリペプチドは、ＴＦＬ１タンパク質のホモログであるＴＦＬ１ファミリータンパク質においても９０％以上保存されている。したがって、本発明にかかるポリペプチドは、シロイヌナズナ由来であってもよいが、それ以外の植物由来であってもよい。
【００３２】
ＴＦＬ１ファミリータンパク質は、大きく、ＴＦＬ１グループとＦＴグループとに分けることができる。何れのグループに属するタンパク質も、多くの植物で見つかっており、全体に高度に保存されている。
【００３３】
ＴＦＬ１グループのタンパク質としては、具体的には、例えば、シロイヌナズナのＡＴＣタンパク質；アブラナのＢＮＴＦＬ１タンパク質、キャベツのＢＯＴＦＬ１タンパク質、カブのＢＲＴＦＬ１タンパク質（何れもアブラナ科植物）；キンギョソウのＣＥＮタンパク質；タバコのＣＥＴ１タンパク質、ＣＥＴ２タンパク質、ＣＥＴ４タンパク質、ＣＥＴ５タンパク質；トマトのＳＰタンパク質；イネのＦＤＲ１タンパク質、ＦＤＲ２タンパク質；ブドウ（Ｖｉｔｉｓ）のＴＦＬ１相同タンパク質；ドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ）のＴＦＬ１相同タンパク質、またはインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）のＴＦＬ１相同タンパク質；等が挙げられる。
【００３４】
ＦＴグループのタンパク質としては、シロイヌナズナのＦＴタンパク質、ＴＳＦタンパク質、ＭＦＴタンパク質；温州ミカンのＣｉＦＴタンパク質；イネのＨｄ３ａタンパク質、ＲＦＴ１タンパク質、ＡＬ６６２９４６タンパク質、ＡＰ００３０７９タンパク質、Ａｐ００２８８２タンパク質；等が挙げられる。なお、ＡＬ６６２９４６タンパク質、ＡＰ００３０７９タンパク質およびＡｐ００２８８２タンパク質のナンバーはイネ由来ＥＳＴの登録ナンバーである。
【００３５】
なお、上記各タンパク質（およびそれをコードする遺伝子）の詳細については、次に示す各文献に記載されている。
〔シロイヌナズナのＡＴＣタンパク質〕Ｍｉｍｉｄａ，  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．：Ｇｅｎｅ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ．  ６，
３２７−３３６（２００１）
〔アブラナのＢＮＴＦＬ１タンパク質、キャベツのＢＯＴＦＬ１タンパク質、カブのＢＲＴＦＬ１タンパク質〕Ｍｉｍｉｄａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １４２，  １５５−１６２（１９９９）
〔キンギョソウのＣＥＮタンパク質：Ｂｒａｄｌｅｙ，  ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．〕Ｎａｔｕｒｅ  ３７９（６５６８），  ７９１−７９７（１９９６）、ＭＥＤＬＩＮＥ：９６１７２８５３
〔タバコのＣＥＴ１タンパク質、ＣＥＴ２タンパク質、ＣＥＴ４タンパク質、ＣＥＴ５タンパク質〕Ａｍａｙａ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１（８），  １４０５−１４１８（１９９９）、ＭＥＤＬＩＮＥ：９９３８０００４
〔トマトのＳＰタンパク質〕Ｐｎｕｅｌｉ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５（１１），  １９７９−１９８９（１９９９）、ＭＥＤＬＩＮＥ：９８２３７６８
〔ドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ）のＴＦＬ１相同タンパク質〕Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｃ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２５（３），  １５１７−１５２８（２００１）、ＭＥＤＬＩＮＥ：２１１４０３３４
〔シロイヌナズナのＦＴタンパク質、ＴＳＦタンパク質、ＭＦＴタンパク質〕Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６（５４４６），  １９６０−１９６２（１９９９）、ＭＥＤＬＩＮＥ：２００５０９５８、またはＫａｒｄａｉｌｓｋｙ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６（５４４６），  １９６２−１９６５（１９９９）、ＭＥＤＬＩＮＥ：２００５０９５９
図１に示すように、これらＴＦＬ１ファミリータンパク質においては、本発明にかかるポリペプチドがよく保存されていることが分かる。また、図１の最下に図中ｃｏｎｓｅｎｓｕｓで示すように、これらＴＦＬ１ファミリータンパク質に含まれるポリペプチドでは、第１４番目のアミノ酸残基を除いて、各アミノ酸残基が高い相同性を示すことがわかる。この結果からも明らかなように、本発明にかかるポリペプチドでは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第３番目のアミノ酸残基はイソロイシン（Ｉ）ではなくスレオニン（Ｔ）であってもよく、第１６番目のアミノ酸残基はリシン（Ｋ）ではなくアルギニン（Ｒ）であってもよい。
【００３６】
このように、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号１に示されるポリペプチド（シロイヌナズナのＴＦＬ１タンパク質由来）に限定されるものではなく、シロイヌナズナのＦＴタンパク質由来であってもよいし、他の植物のＴＦＬ１ファミリータンパク質由来であってもよい。
【００３７】
具体的には、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号３〜２５に示す各アミノ酸配列全てか、またはその一部（ただし、１０残基以上）であってもよい。なお、配列番号３に示すアミノ酸配列はシロイヌナズナのＡＴＣタンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号４に示すアミノ酸配列はアブラナのＢＮＴＦＬ１タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号５に示すアミノ酸配列はキャベツのＢＯＴＦＬ１タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号６に示すアミノ酸配列はカブのＢＲＴＦＬ１タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号７に示すアミノ酸配列はキンギョソウのＣＥＮタンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号８に示すアミノ酸配列はタバコのＣＥＴ１タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号９に示すアミノ酸配列はＣＥＴ２タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号１０に示すアミノ酸配列はＣＥＴ４タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号１１に示すアミノ酸配列はＣＥＴ５タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号１２に示すアミノ酸配列はトマトのＳＰタンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号１３に示すアミノ酸配列はイネのＦＤＲ１タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号１４に示すアミノ酸配列はＦＤＲ２タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号１５に示すアミノ酸配列はブドウ（Ｖｉｔｉｓ）のＴＦＬ１相同タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号１６に示すアミノ酸配列はドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ）のＴＦＬ１相同タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号１７に示すアミノ酸配列はインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）のＴＦＬ１相同タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号１８に示すアミノ酸配列はシロイヌナズナのＦＴタンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号１９に示すアミノ酸配列はシロイヌナズナのＴＳＦタンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号２０に示すアミノ酸配列はシロイヌナズナのＭＦＴタンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号２１に示すアミノ酸配列は温州ミカンのＣｉＦＴタンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号２２に示すアミノ酸配列はイネのＨｄ３ａ（Ｏｓ）タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号２３に示すアミノ酸配列はイネのＲＦＴ１タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号２４に示すアミノ酸配列はイネのＡＬ６６２９４６タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号２５に示すアミノ酸配列はイネのＡＰ００３０７９タンパク質に含まれるポリペプチドであり、配列番号２６に示すアミノ酸配列はイネのＡｐ００２８８２タンパク質に含まれるポリペプチドである。
【００３８】
さらに言い換えれば、本発明にかかるポリペプチドは、細胞間のタンパク質の移動をつかさどる機能を有していれば、配列番号１に示されるアミノ酸配列に限定されるものではない。それゆえ、配列番号３〜２５に示すポリペプチド（図１に示す各ポリペプチド）のように、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列全てか、またはその一部（ただし、１０残基以上）の配列のうち、１個またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなっていてもよい。
【００３９】
ここで、上記「１個またはそれ以上のアミノ酸」とは、特に限定されるものではないが、一般に、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）を意味する。
【００４０】
本発明にかかるポリペプチドでは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、細胞間のタンパク質の移動に重要なアミノ酸残基については、現在のところ明らかではないが、図１に示す各ＴＦＬ１ファミリータンパク質においてよく保存されているアミノ酸残基が重要であると推測される。
【００４１】
したがって、本発明にかかるポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部（ただし１０残基以上）である場合には、この一部の配列中に、第４番目のアスパラギン酸（Ｄ）、第５番目のプロリン（Ｐ）、第６番目のアスパラギン酸（Ｄ）、第８番目のプロリン（Ｐ）、第１０番目のプロリン（Ｐ）、第１１番目のセリン（Ｓ）、第１３番目のプロリン（Ｐ）、第１７番目のグルタミン酸（Ｅ）、第２０番目のヒスチジン（Ｈ）のうち、少なくとも一つが含まれていることが好ましい。
【００４２】
これらアミノ酸残基は、図１から明らかなように、ＴＦＬ１ファミリータンパク質においてアミノ酸置換が少なく非常によく保存されている領域であることが分かる。したがって、本発明にかかるポリペプチドには、上記９つのアミノ酸残基のうち少なくとも一つが含まれていることが好ましい。
【００４３】
これら９つのアミノ酸残基のうち、特に重要なアミノ酸残基の一つとしては、第１７番目のグルタミン酸を挙げることができる。後述する実施例に示すように、本発明にかかるポリペプチドでは、第１７番目のグルタミン酸（Ｅ）をリシン（Ｋ）に置換することで細胞間移動が生じなくなくなる。したがって、本発明にかかるポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部（ただし１０残基以上）である場合には、この一部の配列中に、第１７番目のグルタミン酸が含まれていることがより好ましい。
【００４４】
このように、本発明にかかるポリペプチドでは、配列番号１に示されるアミノ酸配列全てか、またはその一部（ただし、１０残基以上）の配列のうち、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなっていてもよいが、少なくとも上記置換または欠失するアミノ酸は、第１７番目のグルタミン酸以外のアミノ酸であることが非常に好ましい。
【００４５】
（２）本発明にかかるポリヌクレオチド
本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかる上記ポリペプチドを遺伝情報としてコードするオリゴヌクレオチドであればよい。すなわち、配列番号１（あるいは配列番号３〜２６の何れか）に示すアミノ酸配列全てか、またはその一部（ただし、１０残基以上）の配列をコードするオリゴヌクレオチドが本発明にかかるポリヌクレオチドに相当する。
【００４６】
具体的な一例としては、配列番号２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号２に示すポリヌクレオチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードしている６３塩基のオリゴヌクレオチドであり、配列番号１に示すアミノ酸配列から、遺伝暗号に基づいて塩基配列を逆算した人工的な配列である。そのため、配列番号２においては、生物名の項目（＜２１３＞）を「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と記載しており、配列中には、４種類の塩基のうち２種類以上の塩基であってもよい部位（ｎ、ｈ、ｙまたはｒ）が含まれる。
【００４７】
もちろん、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記配列番号２に示される塩基配列以外の塩基配列を有していてもよいことは言うまでもない。また、上記配列番号２に示す塩基配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列から逆算したものであるが、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号３〜２６の何れかのアミノ酸配列や、これらアミノ酸配列の一部を置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列から逆算されたものであってもよい。さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドには、上記配列番号２に示す塩基配列の一部を改変した改変ポリヌクレオチドも含まれる。
【００４８】
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡであっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい。さらに、本発明における「ポリヌクレオチド」は、上記配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列が含まれていてもよい。
【００４９】
（３）本発明にかかるポリペプチドの生産方法
本発明にかかるポリペプチドの生産方法は特に限定されるものではなく、遺伝子工学的手法であってもよいし、化学的手法であってもよい。
【００５０】
遺伝子工学的手法の場合、例えば、次のような方法が挙げられる。まず、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードする遺伝子とを含む組換え発現ベクターを作製する。そして、この組み換え発現ベクターを公知の方法により大腸菌や酵母等の微生物または動物細胞等のホストに導入（形質転換）し、ポリペプチドと他のタンパク質との融合タンパク質を発現させる。そして、得られた融合タンパク質をホストから抽出して、任意の酵素等を用いてポリペプチドのみを切断して精製する。
【００５１】
また、上記他のタンパク質として、細胞間移動させたいタンパク質を選択すれば、ポリペプチドのみを切断する必要は無く、融合タンパク質としてそのまま用いればよい。なお、この遺伝子工学的手法で用いられる具体的な技術や材料等については、後述する「（４）本発明の利用」の項にて、融合タンパク質の生産方法を例に挙げて説明する。
【００５２】
化学的手法の場合、例えば、公知の化学的なペプチド合成方法によって本発明にかかるポリペプチドを合成することができる。公知の化学的なペプチド合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等の方法を挙げることができるが特に限定されるものではない。また、本発明にかかるポリペプチドの合成は、固相合成法および液相合成法の何れであってもよい。
【００５３】
化学的手法の一例について具体的に説明すると、例えば、まず、配列番号１に示されるアミノ酸配列を構成するアミノ酸を縮合させる。このとき、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより合成することができる。このときの縮合方法や保護基の脱離方法については、公知のいずれの手法を用いてもよい。反応後は公知の精製方法を用いて得られたポリペプチドを精製すればよい。上記精製方法としては、例えば、溶媒抽出法、蒸留法、カラムクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法、再結晶法等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。これらの方法は単独で用いてもよいし適宜組み合わせて用いてもよい。
【００５４】
また、本発明にかかるポリペプチドでは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）であればよいが、これに限定されるものではなく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）やエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここで、エステルにおけるＲとしては、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基、炭素数７〜１２のアラルキル基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００５５】
さらに、本発明にかかるポリペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているものや、糖鎖が結合した糖ペプチドなどの複合ペプチド等が含まれてもよい。精製後のポリペプチドの配列は、エドマン分解法等の公知の手法を用いて確認することができる。通常は、自動アミノ酸分析装置により配列決定および確認を行えばよい。
【００５６】
また、本発明にかかるポリヌクレオチド（本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の生産方法も特に限定されるものではなく、上記ポリペプチドと同様に、遺伝子工学的手法または化学的手法を用いることができる。
【００５７】
遺伝子工学的手法の場合、ＴＦＬ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子を、公知のプラスミド等に組み込んで大腸菌等のホストを用いて増殖させ、適当な制限酵素によって、本発明にかかるポリヌクレオチドのみを切り出せばよい。また、化学的手法の場合、配列番号２に示される塩基配列を化学合成すればよい。化学的手法の場合、例えば配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基がｎ、ｈ、ｙまたはｒ等のユニバーサルコードであれば、化学合成する段階で任意の塩基を選択すればよい。
【００５８】
（４）本発明の利用
本発明にかかるポリペプチドは、細胞間においてタンパク質の移動をつかさどるため、本発明の利用方法の一つとしては、細胞間移動させたいタンパク質に、本発明にかかるポリペプチドを融合させて融合タンパク質とする方法が挙げられる。
【００５９】
上記融合タンパク質の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）を好ましく用いることができる。例えば、細胞間移動させたいタンパク質（所望のタンパク質）をコードする遺伝子を取得し、この遺伝子に本発明にかかるポリヌクレオチドをつなげ、さらに任意のプロモーター配列をつなげた上で、任意のベクターに導入して組み換え発現ベクターを作製する。このとき用いられるプロモーター配列やベクターの種類は特に限定されるものではなく、上記所望のタンパク質の種類やホストの種類等に応じて、適切なプロモーター配列やベクターを選択すればよい。さらに、必要に応じてターミネーター配列を含めてもよい。
【００６０】
また、所望のタンパク質をコードする遺伝子と本発明にかかるポリヌクレオチドとをつなげた遺伝子は、ホスト細胞のゲノムＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、ホスト細胞のゲノム中には天然に存在しないが人為的操作の結果、ホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定のホスト細胞のゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加してホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００６１】
次に、作製された上記組み換え発現ベクターを、任意のホスト内に導入する。このとき用いられるホストの種類は特に限定されるものではなく、上記所望のタンパク質の種類等に応じて、適切なホストを選択すればよい。また、上記組み換え発現ベクターをホストに導入する方法（形質転換方法）についても特に限定されるものではなく、ホストの種類等に応じて選択される公知の形質転換方法を用いればよい。
【００６２】
例えば、本発明にかかるポリペプチドの一例として、シロイヌナズナのＴＦＬ１遺伝子から得られたもの（配列番号２に示すアミノ酸配列）を挙げることができるので、本発明にかかるポリペプチドを融合させる対象のタンパク質（細胞間移動させたいタンパク質、所望のタンパク質）としても植物由来のタンパク質を好適に用いることができる。そこで、上記ホストとしても植物を好適に用いることができる。
【００６３】
ホストとして好適に用いられる植物としては、具体的な種は特に限定されるものではないが、例えば、トウモロコシ、トマト、コムギ、イネ、エンドウ、タバコ、ペチュニア、アサガオ、キンギョソウ、シロイヌナズナ等、実験植物として一般的に用いられている各種植物を挙げることができるが、中でもシロイヌナズナをより好ましく用いることができる。シロイヌナズナは小型の実験植物として有用で全ゲノム配列が解析されているだけでなく、ＴＦＬ１遺伝子・タンパク質の由来でもあるため好ましい。
【００６４】
また、ホストが植物である場合に好適に用いられる形質転換方法としては、例えば、プロトプラスト／スフェロプラスト法、ＰＥＧ法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、リボソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法、パーティクルガン法等の方法を挙げることができる。特にシロイヌナズナをホストとする場合、形質転換方法としては、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法等がより好ましく用いられる。
【００６５】
さらに、上述した、本発明にかかるポリペプチドの由来の一つであるシロイヌナズナのＴＦＬ１タンパク質は、広くホモログの存在が知られており、その中には、前述したように、哺乳動物由来のＰＥＢＰも含まれる。したがって、本発明にかかるポリペプチドが適用可能なホストとしては、各種動物も挙げられる。
【００６６】
ホストとして好適に用いられる動物としては、具体的な種は特に限定されるものではないが、例えば、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞、ヒトおよびヒト由来の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００６７】
また、ホストが動物である場合に好適に用いられる形質転換方法としては、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００６８】
さらに、上記宿主が動物であっても植物であっても、ホストとなる細胞（宿主細胞）は、培養されている分離した個々の細胞であってもよいし、生物の組織を形成している細胞であってもよい。後述するように、上記所望のタンパク質として、宿主となる生物に対して薬理効果を有するタンパク質を選択すれば、当該薬理効果を有するタンパク質と本発明にかかるポリペプチドとの融合タンパク質を生体内に投与したり、これら融合タンパク質をコードする遺伝子を生体内で発現させたりすることで、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に応用することも可能になる。
【００６９】
また、上記組み換え発現ベクターがホストに導入されたか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト中で欠失している遺伝子をマーカーとして用いて、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明にかかるポリペプチドを含む組み換え発現ベクターとともに、ホストに導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。マーカーとしては、他に薬物耐性遺伝子等を用いることもできる。
【００７０】
上記融合タンパク質は、上記組み換え発現ベクターをホスト内に導入することによりホスト内で発現される。ここで、上記融合タンパク質は、所定の条件で発現が誘導されるように設計してもよい。すなわち、例えば、ある条件で機能するような誘導型のプロモーター配列を選択することで、融合タンパク質の発現を誘導することが可能となる。後述する実施例では、表皮細胞特異的に発現するプロモーターを用いて融合タンパク質を発現させている。
【００７１】
本発明で用いられる上記所望のタンパク質（細胞間移動させたいタンパク質）の具体的な種類は特に限定されるものではない。後述する実施例では、例えば、ＧＦＰタンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いている。また、後述する実施例では、ＧＦＰタンパク質１分子または２分子を移動させることが可能であった。それゆえ、本発明では、上記所望のタンパク質の分子量は特に限定されないものの、分子量５０ｋダルトン（５００，０００）以下であれば、より確実に細胞間移動が可能になる。もちろん、本発明において細胞間移動させるタンパク質の分子量の上限は上記に限定されるものではない。
【００７２】
上記任意のタンパク質は、変異の無いタンパク質であってもよいし、変異タンパク質であってもよい。ここで言う変異タンパク質とは、変異前のタンパク質を基準として、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたタンパク質を示す。また、ここで言う「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００７３】
また、上記融合タンパク質には、本発明にかかるポリペプチド以外にも付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００７４】
上述した例では、ホストとして動物または植物を用いた場合であるが、本発明にかかるポリペプチドを利用する場合には、ホスト、ベクター、プロモーター配列として細菌や酵母等を用いることも可能である。
【００７５】
このように、本発明の利用方法には、本発明にかかるポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが含まれる。さらには、この組み換え発現ベクターを含む融合タンパク質生産キット等も本発明に含めることができる。
【００７６】
例えば、本発明にかかるポリヌクレオチドとプロモーター配列とを含む組み換え発現ベクターと、これに対応するホスト（宿主細胞）と、遺伝子組み替えおよび上記ホストの形質転換に必要な試薬類をまとめてキット化しておく。これによって、細胞間移動させたいタンパク質の遺伝子を取得することができれば、この融合タンパク質生産キットを用いることで、任意のタンパク質を融合タンパク質としてホスト内で発現させることが可能となる。
【００７７】
（５）本発明の有用性
前述したように、細胞間を移動するタンパク質としては、植物では、上記ＴＦＬ１タンパク質以外に、シロイヌナズナのＳＨＯＲＴ  ＲＯＯＴタンパク質、ＣＡＰＲＩＣＥタンパク質、ＬＥＡＦＹタンパク質、トウモロコシのＫｎｏｔｔｅｄ１タンパク質等が知られている。しかしながら、これらタンパク質においては、細胞間移動をつかさどるドメイン等についてはほとんど知られておらず、例えば、Ｋｎｏｔｔｅｄ１タンパク質については、広い領域が必要とされている程度であった。
【００７８】
しかしながら、本発明では、ＴＦＬ１タンパク質から、初めて細胞間でタンパク質の移動をつかさどる配列、言い換えれば、タンパク質の移動のシグナルとなる配列（シグナルペプチド）を見出すことに成功した。したがって、本発明にかかるポリペプチドやこれをコードするポリヌクレオチドを利用すれば、任意のタンパク質を細胞間移動させることが可能になると考えられ、これを利用した産業への応用も見出すことができる。
【００７９】
本発明の産業への応用としては、例えば、接ぎ木法による農作物の栽培が挙げられる。具体的には、耐病原性タンパク質をコードする遺伝子と、本発明にかかるポリヌクレオチドとをつなげ、接ぎ木の台木となる植物に遺伝子導入する。これによって、耐病原性タンパク質と本発明にかかるポリペプチドとの融合タンパク質が台木細胞内で発現する。この融合タンパク質は、本発明にかかるポリペプチドによって台木細胞から接ぎ木細胞に移動しやすくなり、接ぎ木法で栽培される農作物に対して、耐病原性を効果的に付与することが可能となる。
【００８０】
特に、接ぎ木法による農作物栽培は、果樹のほぼ１００％、野菜類では、ナスなどで約１０％を占める。そのため、本発明を接ぎ木法に応用する際の有用性は非常に大きなものとなる。
【００８１】
また、タンパク質の細胞間移動は、全ての細胞で起きるわけではなく、組織特異性が見られるが、本発明者によるＦＴタンパク質を用いた研究によれば、組織特異性が低下する結果も得られている。したがって、本発明を用いれば、タンパク質の移動において組織特異性を無くしたり、逆に移動できる組織を任意に決定したりできる可能性もある。
【００８２】
また、前述したように、ＴＦＬ１ファミリータンパク質は、ＴＦＬ１ファミリータンパク質は動物にもホモログが存在すると考えられるので、本発明は植物以外の動物等への利用も可能であると考えられる。したがって、本発明の適用範囲は非常に広くなることがと考えられるため、本発明はより一層優れた有用性を有する。
【００８３】
したがって、本発明の産業への応用分野は、植物に限定されるものではなく、ヒトも含む動物も含まれる。例えば、本発明では、上記のように組織特異性を高めることが可能であると考えられるため、本発明にかかるポリペプチドを、例えばヒトの特定組織に対して特異性を高めたものとすれば、ＤＤＳへの応用が可能となる。
【００８４】
より具体的には、前述したように、任意の薬理効果を有するタンパク質と本発明にかかるポリペプチドとを融合させた融合タンパク質を生産して、ホストとなる動物（例えば、ヒト）に薬理学的に投与するか、遺伝子治療技術を利用して融合タンパク質をコードする遺伝子を導入して生体内で発現させる。生体内に入った融合タンパク質では、ポリペプチドの組織特異性が高まっているので、特定の組織に到達した時点で、周囲の細胞から標的となる細胞に移動することが可能となる。標的となる細胞が何らかの異常を示すものとなっていれば、この異常を示す細胞に、薬理効果を有する融合タンパク質を集中的に移動させることが可能となるので、部位特異的な治療が可能となる。
【００８５】
ここで、本発明をＤＤＳに応用する場合には、他のＤＤＳ技術と併用してもよい。例えば、生体内に投与した融合タンパク質を、他のＤＤＳ技術を用いて、患部となる組織近傍まで誘導し、さらに、患部となる組織では、本発明により、異常を示す細胞に対して融合タンパク質を集中的に細胞間移動させることが可能となる。
【００８６】
このように、本発明は、植物だけでなく動物においても応用することが可能であり、ヒトに対する投薬技術や医療技術等への応用も十分に期待されるものとなっている。
【００８７】
【実施例】
以下の実施例、および図２、図３に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８８】
〔実施例１：本発明にかかるポリペプチドの同定〕
ＴＦＬ１タンパク質の各エキソン領域をそれぞれＧＦＰタンパク質に融合させた融合タンパク質を作製し、これを植物に導入して、ＧＦＰ融合タンパク質の挙動を観察した。
【００８９】
まず、ＧＦＰ遺伝子の３’末端（タンパク質ではＣ末端に相当）とＴＦＬ１遺伝子のそれぞれのエキソン領域とを、リンカーをもちいてつなげた。このとき、ＧＦＰ遺伝子としては、Ｓ６５Ｔと呼ばれる改変型遺伝子を用い、停止コドンをＧＧＴに変えたものを用いた。リンカーとしては、グリシン（Ｇ）、グリシン（Ｇ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）の順でアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを用いた。
【００９０】
ＧＦＰ・エキソンをつなげたコンストラクト（ＧＦＰ−エキソン遺伝子と奏する）をプロモーター配列につなげ、これをＴｉプラスミドに組み込んだ。このとき用いたプロモーター配列としては、表皮細胞に特異的に発現する配列ＡＴＭＬ１遺伝子のプロモーター（文献Ｌｕ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８，  ２１５５−２１６８（１９９６）、およびＳｅｓｓｉｏｎｓ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２０，  ２５９−２６３（１９９９）参照）を選択した。これによって、ＧＦＰ−エキソン融合タンパク質を細胞表皮で特異的発現させることが可能となり、細胞表皮での融合タンパク質の細胞間移動を観察しやすくすることができる。
【００９１】
得られたＧＦＰ−エキソン−ＴｉプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８（以下、アグロバクテリウムＣ５８と称する）に移した。ホストとしてシロイヌナズナ（Ｃｏｌｕｍｂｉａの系統）を用い、減圧浸潤法により上記アグロバクテリウムＣ５８をシロイヌナズナに感染させて、ＧＦＰ−エキソン遺伝子をシロイヌナズナに導入した。トランスジェニック植物を選抜するための薬剤としてはカナマイシンを用いた。得られたトランスジェニック・シロイヌナズナの細胞表皮におけるＧＦＰの発現（蛍光）を観察した。
【００９２】
ＧＦＰの発現の観察においては、形質転換第二世代を用いて、花序を５０μｍの厚さに切り、１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。ＧＦＰタンパク質の蛍光の画像を得るために、励起のためにアルゴンイオンレーザー（４８８ｎｍ）を用いた。このとき２種類のバンドパスフィルター（ＨＱ  ５１５／５３０）を用いた。また、ＰＩは４８８ｎｍで励起させたロングパスフィルター（Ｅ６００ＬＰ）を用いて観察した。このようにして光学切片像を撮影し、緑色の蛍光であるＧＦＰタンパク質の発現像と赤色の蛍光であるＰＩの像とを合成した。
【００９３】
その結果、エキソン２との融合タンパク質では細胞間移動が見られた（図示せず）。エキソン２のアミノ酸配列を確認したところ、配列番号１に示す２１アミノ酸残基からなっており、本発明にかかるポリペプチド（以下、説明の便宜上、シグナルペプチドと称する）とした。
【００９４】
〔実施例２：ＧＦＰ−シグナル融合タンパク質の発現〕
実施例１で得られたシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、説明の便宜上、シグナル遺伝子と称する）とＧＦＰ遺伝子とを、実施例１と同様の方法によりつなげて、ＧＦＰ−シグナル−Ｔｉプラスミドを作製した。
【００９５】
このとき、シグナル遺伝子は停止コドンで終了するように改変した。また、ＧＦＰ−シグナル−Ｔｉプラスミドとしては、▲１▼ＧＦＰ遺伝子の下流に上記シグナル遺伝子をつなげたコンストラクト（以下、１ＧＦＰと称する）と、ＧＦＰ遺伝子の配列を直列（タンデム）に連結したものに上記シグナル遺伝子をつなげたコンストラクト（以下、２ＧＦＰと称する）とを作製した。
【００９６】
これら２種類のコンストラクトを、前記実施例１と同様にしてシロイヌナズナに導入し、得られたトランスジェニック・シロイヌナズナの細胞表皮におけるＧＦＰの発現を観察した。その結果、図２に示すように、ＧＦＰ−シグナル融合タンパク質では、表皮細胞から内部への移動が見られた。
【００９７】
〔比較例１：ＧＦＰ−ＴＦＬ１融合タンパク質の発現〕
ＧＦＰ遺伝子の下流にＴＦＬ１遺伝子をつなげたＧＦＰ−ＴＦＬ１−Ｔｉプラスミドを作製した。これ以外は、前記実施例１と同一の方法でシロイヌナズナに上記プラスミドを導入し、得られたトランスジェニック・シロイヌナズナの細胞表皮において、ＧＦＰの発現を観察した。その結果、ＧＦＰ−ＴＦＬ１融合タンパク質では表皮細胞から内部への移動が見られた。
【００９８】
〔比較例２：ＧＦＰ−ＴＦＬ１（シグナル機能喪失）融合タンパク質の発現〕
ＧＦＰ遺伝子の下流に、シグナルペプチドに相当する領域を除いたＴＦＬ１遺伝子をつなげて、ＧＦＰ−ＴＦＬ１（シグナル機能喪失）−Ｔｉプラスミドを作製した。これ以外は、前記実施例１と同一の方法でシロイヌナズナに上記プラスミドを導入し、得られたトランスジェニック・シロイヌナズナの細胞表皮において、ＧＦＰの発現を観察した。その結果、ＧＦＰ−ＴＦＬ１（シグナル機能喪失）融合タンパク質では表皮細胞から内部への移動が見られなかった。
【００９９】
このように、上記実施例１、２および比較例１、２の比較により、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＴＦＬ１遺伝子のエキソン２に対応するポリペプチド）が、細胞間においてタンパク質の移動をつかさどることが分かる。
【０１００】
〔実施例３：シグナルペプチドの一部改変〕
ＧＦＰ遺伝子の下流に、シグナルペプチドの第１７番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）をリシン（Ｋ）に置換したＴＦＬ１遺伝子をつなげて、ＧＦＰ−ＴＦＬ１（シグナル改変）−Ｔｉプラスミドを作製した。これ以外は、前記実施例１と同一の方法でシロイヌナズナに上記プラスミドを導入し、得られたトランスジェニック・シロイヌナズナの細胞表皮において、ＧＦＰの発現を観察した。その結果、図３に示すように、ＧＦＰ−ＴＦＬ１融合タンパク質の細胞間移動が起こらなくなることがわかった。
【０１０１】
この結果から、配列番号１に示すポリペプチドにおいては、タンパク質を細胞間移動させる機能を発現させるためには、少なくとも第１７番目のグルタミン酸が重要であることが分かる。また、本発明にかかるポリペプチドは、ＧＦＰタンパク質のＣ末端であってもＮ末端であってもどちらの末端に付加しても細胞間移動の機能を発揮することができる。
【０１０２】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかるポリペプチドは、タンパク質の細胞間移動をつかさどるシグナルペプチドとして、ＴＦＬ１ファミリータンパク質から、初めて見出されたものである。そのため、本発明にかかるポリペプチドを利用することによって、任意のタンパク質を細胞間移動させることができると考えられる。そのため、本発明を利用すれば、ＴＦＬ１ファミリータンパク質の機能解明だけでなく、植物において任意のタンパク質を細胞間移動させることが可能となる。しかも、ＴＦＬ１ファミリータンパク質は動物にもホモログが存在すると考えられるので、本発明は、単なる研究用試薬以外にも、植物・動物にも用いることが可能な各種薬剤としての応用が期待できる。
【０１０３】
それゆえ、本発明にかかるポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびその利用方法は、植物を利用した各種バイオ産業や種苗産業に応用可能であるだけでなく、動物を利用したバイオ産業や医薬品産業等についても応用の可能性が見出されるという効果を奏する。
【０１０４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかるポリペプチドが、ＴＦＬ１ファミリータンパク質において保存されている状態を示すアミノ酸配列の対比図である。
【図２】（ａ）は、タンデムにつながれた２つのＧＦＰ遺伝子の下流に、本発明にかかるポリヌクレオチドを連結した、ＧＦＰ−ポリペプチド融合タンパク質の発現と細胞間移動とを示す図である。
【図３】１つのＧＦＰ遺伝子の下流に、ＴＦＬ１遺伝子の全長をつなぐとともに、本発明にかかるポリペプチドにおける第１７番目のアスパラギン酸をリシンに置換したＴＦＬ１遺伝子をつないだ、ＧＦＰ−ＴＦＬ１融合タンパク質の発現と細胞間移動が起こらない状態とを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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