(57)【要約】      （修正有）【課題】グルココルチコイド製剤への感受性判定に用いる核酸プローブおよびプライマーの提供。【解決手段】グルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子における、ＧＲタンパク質の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンがフェニルアラニンをコードするコドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、上記タンパク質において、第６５１番目のセリン残基のフェニルアラニン残基への変異を有してなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質において、第６５１番目のセリン残基のフェニルアラニン残基への変異を有してなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンのフェニルアラニン残基をコードするコドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、第１９５２番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
グルココルチコイド受容体遺伝子における、グルココルチコイド受容体タンパク質の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンがフェニルアラニン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項７】
グルココルチコイド製剤への感受性の判定に用いるための、請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
グルココルチコイド受容体遺伝子における、グルココルチコイド受容体タンパク質の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンがフェニルアラニン残基をコードするコドンとなる変異を検出するためのプライマーペアであって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。
【請求項９】
グルココルチコイド製剤への感受性の判定に用いるための、請求項８に記載のプライマーペア。
【請求項１０】
グルココルチコイド受容体遺伝子の変異を検出することにより、グルココルチコイド製剤への感受性を判定する方法であって、
請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項８または９に記載のプライマーペアを用いて、グルココルチコイド受容体遺伝子における、グルココルチコイド受容体タンパク質の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンがフェニルアラニン残基をコードするコドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項８または９に記載のプライマーペアを含んでなる、グルココルチコイド製剤への感受性の判定用キット。
【請求項１２】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質において、第６５１番目のセリン残基のフェニルアラニン残基への変異を有してなるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、グルココルチコイド製剤への感受性の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
グルココルチコイド受容体（ＧＲ）は、グルココルチコイドにより活性化される転写因子であり、様々な遺伝子の発現を調節する。ヒトＧＲα（ｈＧＲα）は、エクソン９αを含む計９個のエクソンによりコードされる（Ｅｎｃｉｏ  Ｉ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒａ−Ｗａｄｌｅｉｇｈ  Ｓ．Ｄ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６，  ７１８２−７１８８，  １９９１）。ＧＲβは、エクソン９αに代えてエクソン９βを有する選択的スプライシング型であり、グルココルチコイド耐性のヒト多発性骨髄腫細胞において同定されており、機能を持たないｈＧＲαである（Ｍｏａｌｌｉ  Ｐ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３，  ３８７７−３８７９，  １９９３）。７７７個のアミノ酸を有するｈＧＲαは、ＤＮＡ結合ドメイン（第４２１〜４８６番アミノ酸）、リガンド結合ドメイン（第５２８〜７２０番アミノ酸）、ホモ二量体化ドメイン（第４５６〜７７７番アミノ酸）、Ｈｓｐ９０結合ドメイン（第５６８〜６５３番アミノ酸）、核内移行ドメイン（第４７９〜５０６番アミノ酸および第５２６〜７７７番アミノ酸）、トランス活性化ドメイン（第７７〜２６２番アミノ酸、第４０４〜４９１番アミノ酸および第５２６〜５５６番アミノ酸）等の多くの機能性ドメインを有する（Ｓａｖｏｒｙ  Ｊ．Ｇ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９，  １０２５−１０３７，  １９９９；  Ｖｏｔｔｅｒｏ  Ａ．  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｕｓｏｓ  Ｇ．Ｐ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  １０，  ３３３−３３８，  １９９９）。サイトゾル中では、ＧＲは熱ショックタンパク質その他のタンパク質に会合しており（Ｐｒａｔｔ  Ｗ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｔｏｆｔ  Ｄ．Ｏ．，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  １８，  ３０６−３６０，  １９９７）、グルココルチコイドの結合によりＧＲの核内移行が起きる（Ｗｅｂｓｔｅｒ  Ｊ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｃｉｄｌｏｗｓｋｉ  Ｊ．Ａ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  １０，  ３９６−４０２，  １９９９）。
【０００３】
グルココルチコイド療法は、多くの炎症性疾患およびいくつかのタイプの癌において有効である。しかし、少数の患者は臨床的有効量のグルココルチコイドに対して応答せず、この状態はグルココルチコイド耐性と呼ばれる（Ｌｏｋｅ  Ｔ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｒｅｐ．  ２，  １４４−１５０，  ２００２）。ＧＲ遺伝子におけるいくつかの家族性変異は、コルチコステロイド耐性または造血系腫瘍と関連することが示されているが、これらの変異は比較的頻度が小さく、耐性の一般的な原因とは考えられていない（ＤｅＲｉｊｋ  Ｒ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．
８１，  １０３−１２２，  ２００２）。
【０００４】
近年、ＧＲ遺伝子における複数の一塩基多型（ＳＮＰ）が同定されており、そのうちのいくつかは比較的頻度が高い。例えば、Ｃｙｓ６４３Ａｒｇ置換またはＣ末端部の遺伝子配列へのアデニンの挿入により、グルココルチコイド受容体の機能が消失することが報告されている（非特許文献１：Ｎａｇａｎｏ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  １８１，  １０９−１１４，  ２００２）。また、Ｉｌｅ５５９Ａｓｎ、Ｉｌｅ７４７ＭｅｔおよびＡｒｇ４７７Ｈｉｓのアミノ酸置換を起こすそれぞれの一塩基多型により、グルココルチコイド受容体の機能が低下し、または消失することが報告されている（非特許文献２：Ｋｉｎｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８６，  ５６００−５６０８，  ２００２；非特許文献３：Ｖｏｔｔｅｒｏ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８７，  ２６５８−２６６７，  ２００２；非特許文献４：Ｒｕｉｚ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ５５，  ３６３−３７１，  ２００１）。さらに、Ｂｃｌ  Ｉ制限断片長多型は、ステロイド剤への感受性に関連することが報告されている（非特許文献５：Ｐａｎａｒｅｌｌｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８３，  １８４６−１８５２，  １９９８）。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｎａｇａｎｏ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  １８１，  １０９−１１４，  ２００２
【非特許文献２】
Ｋｉｎｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８６，  ５６００−５６０８，  ２００２
【非特許文献３】
Ｖｏｔｔｅｒｏ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８７，  ２６５８−２６６７，  ２００２
【非特許文献４】
Ｒｕｉｚ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ５５，  ３６３−３７１，  ２００１
【非特許文献５】
Ｐａｎａｒｅｌｌｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８３，  １８４６−１８５２，  １９９８
【０００６】
【発明の概要】
本発明者らは、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子において、ＧＲタンパク質の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンがフェニルアラニン残基をコードするコドンとなり、ＧＲの機能が低減する遺伝子変異を見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００７】
上記の変異を有するヒトにおいては、ＧＲタンパク質の発現量が減少し、その機能である転写活性化能も同様に低下するため、ＧＲに作用するグルココルチコイド製剤の効果が発揮されにくい。
【０００８】
従って、本発明は、グルココルチコイド製剤への感受性の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび変異型タンパク質ならびに核酸分子の提供を目的とする。
【０００９】
そして、本発明による変異型ポリヌクレオチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質において、第６５１番目のセリン残基のフェニルアラニン残基への変異を有してなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１０】
さらに、本発明による変異型タンパク質は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質において、第６５１番目のセリン残基のフェニルアラニン残基への変異を有してなるタンパク質である。
【００１１】
さらに、本発明による核酸分子は、グルココルチコイド受容体遺伝子における、グルココルチコイド受容体タンパク質の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンがフェニルアラニン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子である。
【００１２】
【発明の具体的説明】
本発明により検出されるグルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子中の変異は、ＧＲタンパク質の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンがフェニルアラニン残基をコードするコドンとなるもの（本発明において「Ｓ６５１Ｆ変異」という）である。このような変異としては、例えば、翻訳開始コドンから数えて第１９５２番目（配列番号１中の第１９５２番目）のシトシン（Ｃ）残基のチミン（Ｔ）残基への変異（本発明において「１９５２Ｃ＞Ｔ」という）が挙げられる。Ｓ６５１Ｆ変異により、ＧＲタンパク質の発現量が減少し、その機能である転写活性化能も同様に低下するため、ＧＲに作用するグルココルチコイド製剤の効果が発揮されにくい。従って、Ｓ６５１Ｆ変異を検出することにより、グルココルチコイド製剤への感受性の判定が可能となる。特に、このような製剤の投与前に、ＧＲ遺伝子上のＳ６５１Ｆ変異を検出することにより、該製剤が奏効しにくいヒトを見出すことが可能となる。
【００１３】
本発明において、「グルココルチコイド製剤」とは、グルココルチコイドを有効成分として含む医薬組成物を意味する。グルココルチコイド製剤は、炎症抑制、白血病細胞死等の薬理作用を有し、抗炎症剤や抗ガン剤として用いられる。該製剤の作用機序は、まず、細胞質にあるＧＲに結合し、次いで、グルココルチコイド製剤が結合したＧＲが遺伝子の上流領域または他の転写因子タンパク質に結合するというものである。これにより、遺伝子群の転写活性化または転写の抑制が起こり、薬理作用がもたらされる。
【００１４】
本発明において、「グルココルチコイド製剤に対して耐性である」とは、被検者においてグルココルチコイド製剤の薬理効果が見られない、もしくは抑制された状態をいう。本発明において「抑制」とは、完全な抑制に限定されず、対照（例えば、健常人）と比較して抑制されていれば、上記「抑制」の意味に解される。例えば、ある被検者についてグルココルチコイド製剤に対して耐性であると判定された場合には、該被検者へのグルココルチコイド製剤の投与による治療効果は見られない、もしくは低いものと予想することができる。本発明によって得られた被検者についてのグルココルチコイド製剤の有効性に関する情報によって、該被検者に対する治療方針等を適宜決定することが可能である。
【００１５】
変異型ポリヌクレオチドおよび変異型タンパク質
Ｓ６５１Ｆ変異を検出するためには、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質において、第６５１番目のセリン残基のフェニルアラニン残基への変異を有してなるタンパク質、ならびにこれをコードするポリヌクレオチドを標的とすることができる。すなわち、このような変異型タンパク質または変異型ポリヌクレオチドの存在を確認することにより、Ｓ６５１Ｆ変異を検出することができる。
【００１６】
Ｓ６５１Ｆ変異を検出する際には、ゲノム中の上記変異型ポリヌクレオチドを標的とすることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、ヒトＧＲ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンのフェニルアラニン残基をコードするコドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドとされる。ヒトＧＲ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を発現しうる限り、特に限定されないが、好ましくは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列中のチミン（Ｔ）残基がウラシル（Ｕ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるｍＲＮＡを生体内において生産しうるヌクレオチド配列とされ、例えば、ＮＣＢＩデータベースに登録番号ＡＣ００４７８２として登録されているゲノム配列中のＧＲ遺伝子配列が挙げられる。ＧＲ遺伝子の両末端部位は当業者にとって明らかであるが、好ましくはＧＲ遺伝子の全エクソンを含むものとする。
【００１７】
また、Ｓ６５１Ｆ変異を検出する際に、ゲノムにおける上記変異型ポリヌクレオチドの転写産物であるｍＲＮＡに対して生成させたｃＤＮＡを標的とすることもできる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、第１９５２番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００１８】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
【００１９】
本発明による変異型タンパク質および変異型ポリヌクレオチドは、既述の通り、Ｓ６５１Ｆ変異を検出する際の標的として有用であるが、さらには、該変異を有するグルココルチコイド受容体を活性化する化合物をスクリーニングするためにも有用である。
【００２０】
核酸分子およびこれを用いた薬物感受性予知／検出方法
本発明による核酸分子は、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出しうるものであり、該核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる。
【００２１】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子が通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。また、あるヌクレオチド分子にハイブリダイズする核酸分子は、特異的なハイブリダイズが可能であれば、そのヌクレオチド分子に対して完全に相補的である必要はないが、好ましくは、そのヌクレオチド分子に相補的なヌクレオチド分子の全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００２２】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２３】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、検出の標的をゲノムとする場合には、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２４】
本発明による核酸分子は、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。該核酸プローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成機等を用いて合成オリゴヌクレオチドとして作製してもよいし、あるいは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製してもよい。
【００２５】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１５ヌクレオチド以上とすることが好ましく、また、１００ヌクレオチド以下、より好ましくは５０ヌクレオチド以下とすることが好ましい。
【００２６】
さらに、本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、該核酸分子を適宜標識することが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）が挙げられる。
【００２７】
また、本発明による核酸分子は、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００２８】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１５〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは１７〜３０ヌクレオチドとする。
【００２９】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料から上記Ｓ６５１Ｆ変異を検出する上で好ましいものである。
【００３０】
核酸増幅法は、通常、プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出するためのプライマーペアであって、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるプライマーペアが提供される。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００３１】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異の有無を検出することができ、これにより、グルココルチコイド製剤への感受性を判定することができる。
【００３２】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができ、より具体的には、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域を増幅するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＳ６５１Ｆ変異を検出する工程を含んでなる、グルココルチコイド製剤への感受性判定方法が提供される。
【００３３】
この方法による薬物感受性判定に当たっては、例えば、被験者から末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪などの試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【００３４】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００３５】
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりＳ６５１Ｆ変異を検出する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマー：
フォワード：５’−ＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１９）；
リバース：５’−ＡＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＡＧＣ−３’（配列番号２０）、
を用いて核酸増幅法を行ない、これらのプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
【００３６】
また、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異において、この変異により特定の制限酵素による認識配列が失われるかまたは生成する場合には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて上記の変異を検出することができる。このような方法は、例えば、上述の核酸増幅法において前記制限酵素認識配列を包含する領域を増幅するようなプライマーペアを用い、得られた増幅断片をこの制限酵素で消化した後、得られる断片の数およびそれらの鎖長を調べることにより実施することができる。このような方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、適切な制限酵素、プライマー、増幅反応条件、制限酵素反応条件等を適宜設定することができる。
【００３７】
さらに、上述のような核酸増幅法によって得られた増幅断片につき、その増幅断片中に何らかの変異が存在するか否かを簡便な方法により調べ、変異を有すると判断されたサンプルについてのみ、Ｓ６５１Ｆ変異の検出を行なうこともできる。
【００３８】
上記の簡便法としては、例えば、一本鎖高次構造多型（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を利用した方法（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法：Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ａｌｕ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９９１  Ａｕｇ  １；  ６（８）：  １３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ−ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．  １９９５  Ａｐｒ  １；  ４（５）：  ２７５−２８２）が挙げられる。この方法では、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させ、次いで、この一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、そのゲル上での移動度を、変異を有しない対照サンプルの移動度と比較する。この方法において増幅するＤＮＡ断片の鎖長は２００〜４００ｂｐとすることが好ましい。
【００３９】
上記の簡便法としては、また、変性剤濃度勾配ゲル法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）を用いることもできる。この方法では、増幅したＤＮＡをＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離し、そのゲル上での移動度を、変異を有しない対照サンプルの移動度と比較する。このような方法は当技術分野において公知であり、当業者であれば適切に実施することができる。
【００４０】
本発明による薬物感受性判定法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、プライマーの一方を変異部位に対合できるように設計し、他方を変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に変異が存在する場合には増幅産物が得られ、変異が存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより変異の有無を判定することができる。
【００４１】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等による変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、グルココルチコイド製剤への感受性判定方法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異の存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００４２】
この方法による薬物感受性判定に当たっては、例えば、被検者から末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪などの試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）を参照することができる。
【００４３】
本発明による核酸分子をハイブリダイゼーション法による変異の検出においてプローブとして用いる場合、本発明による核酸分子を基板上に固定したＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップと被験者由来の核酸試料とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ハイブリダイゼーションの有無を検出してもよい。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子を基板上に固定してなる、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出しうるＤＮＡチップ、さらには、このＤＮＡチップを用いてＳ６５１Ｆ変異を検出する工程を含んでなる、グルココルチコイド製剤への感受性を判定する方法が提供される。本発明において基板に結合させるプローブの鎖長は特に制限されないが、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜２５ヌクレオチドとする。このようなＤＮＡチップを用いて変異を検出する技術は当技術分野において周知であり（ポストシークエンスのゲノム科学、第１巻「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、２０００年）、当業者であれば、本発明による核酸分子を用いて適切なＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップを用いてＳ６５１Ｆ変異を検出することができる。
【００４４】
ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。この方法は、Ｓ６５１Ｆ変異が一塩基多型である場合において特に好ましい。このような一塩基多型としては、例えば、１９５２Ｃ＞Ｔが挙げられる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００４５】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４６】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ａｈｍａｄｉａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ｖｏｌ．  ２８０，  ｐｐ１０３−１１０，  （２０００））においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４７】
ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異が上述のような一塩基多型である場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いてその変異を検出することもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００４８】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法（Ｌｉｖａｋ  ＫＪ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ａｎａｌ．  ｖｏｌ．１４，  ｐｐ１４３−１４９，  （１９９９））において、例えば、１９５２Ｃ＞Ｔ変異を検出する場合には、多型部位のヌクレオチドを含む領域に対して、ＣアレルおよびＴアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用プライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型（Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔ）が容易に決定される。
【００４９】
ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異の検出に用いることのできる他の方法としては、質量分析法による方法（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＴＪ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  ＬＭ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ｖｏｌ．  １８，  ｐｐ７７−８４，  （２０００））、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ｖｏｌ．  １７，  ｐｐ２９２−２９６，  （１９９９）；「遺伝子医学」ｖｏｌ．４，  Ｎｏ．１，  メディカルドゥ社発行、ｐｐ４４−５１およびｐｐ６８−７２  （２０００））が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、遺伝子の変異を検出しうる方法であれば、いかなる方法を用いることもできる。
【００５０】
本発明による薬物感受性判定法において、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異が存在すると評価されたサンプルは、グルココルチコイド製剤に対して耐性であると、すなわち、該製剤が奏効しにくいものと判断することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００５１】
以上のような薬物への感受性の判定のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００５３】
例１：グルココルチコイド受容体（ＧＲ）の機能に対するＧＲ遺伝子中の変異の影響
（１）材料および方法
（ｉ）ＧＲ遺伝子のＤＮＡ供給源および配列決定
本研究において採用する８８名の被検者は、ステロイド薬の投与を受けた日本人のアレルギー患者とした。これらの被検者から採取した末梢血リンパ球を、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを用いて不朽化した。不朽化されたリンパ球から、ゲノムＤＮＡを抽出した。なお、この研究は、国立成育医療センター（日本国）および国立医薬品食品衛生研究所（日本国）の倫理審査委員会による承認を得て行なった。また、上記の全被検者からインフォームドコンセントを書面で得た。
【００５４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびコード領域の配列決定のためのプライマーは、ＮＣＢＩデータベースから得たヌクレオチド配列（Ｍ７８５０６、Ｍ７８５０７、Ｕ７８５０８、ＡＣ００４７８２）に基づいて設計した。本研究に使用した全てのプライマー（配列番号３〜２６）を、下記の表１に示す。表１に記載されたプライマーの名称において、「ＧＲＥＸ」に続く数字は増幅の対象とするエクソンの番号を示し、この数字に続く「Ｆ」および「Ｒ」はそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーを意味する。
【００５５】
【表１】
2004275101.tif 000002
【００５６】
ＰＣＲおよび配列決定は次のようにして行なった。まず、ＧＲ遺伝子を３分割して増幅するためのプライマーセットとＺ−Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社、京都、日本）を用いて、ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）からＧＲ遺伝子を増幅した。ここで、プライマーセットとしては以下のものを用いた。また、このＰＣＲの条件は、９８℃で５秒間、５５℃で５秒間および７２℃で１９０秒間の反応を３０サイクルとした。
【００５７】
（ａ）エクソン２〜３増幅用プライマー：
フォワード：ＡＴＴＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＴＡＡ（配列番号２７）、
リバース：ＡＡＴＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＴＧＴＣＡＴＴＧＴＴＡ（配列番号２８）；
（ｂ）エクソン３〜７増幅用プライマー：
フォワード：ＧＡＧＡＡＣＴＧＴＡＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＣＣＴＴ（配列番号２９）、
リバース：ＡＧＡＡＴＣＡＣＡＣＡＧＴＡＴＧＴＡＧＣＣＣ（配列番号３０）；
（ｃ）エクソン７〜９β増幅用プライマー：
フォワード：ＧＡＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＡＴＡＡＧＣＡＡＧＡ（配列番号３１）、
リバース：ＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＴＡＣＴＣＡ（配列番号３２）。
【００５８】
次に、各エクソンをそれぞれ表１に記載のプライマーセットを用いて増幅した。ＤＮＡポリメラーゼとしてはＥｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社、京都、日本）を使用した。まず、９５℃で５分の熱変性を行ない、その後、９５℃で３０秒、５５℃で１分および７２℃で２分の反応を３０サイクル行ない、さらに７２℃で７分の最終反応を１回行なった。その後、ＰＣＲ産物を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、米国）を使用するＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、米国）を用いて直接配列決定した。
【００５９】
（ｉｉ）プラスミド
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ＶＡ、米国）から入手したｐＲＳｈＧＲαは、ヒトＧＲαの完全長コード領域および構成的に活性のあるラウス肉腫ウイルスプロモーターを含んでいる（Ｖ．  Ｇｉｇｕｅｒｅ，  Ｓ．  Ｍ．  Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，  Ｒ．  Ｍ．  Ｅｖａｎｓ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｃｅｌｌ  ４６  （１９８６）  ６４５−６５２）。Ｔ５０４Ｓ変異型ＧＲおよびＳ６５１Ｆ変異型ＧＲのそれぞれをコードする発現プラスミドは、野生型ｐＲＳｈＧＲαプラスミドを鋳型とし、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ位置指定突然変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＣＡ、米国）を用いて構築した。対照として用いるエンプティーベクタープラスミドは、ｐＲＳｈＧＲαプラスミドからｈＧＲαのｃＤＮＡを除去することにより構築した。Ｒｅｎｉｌｌａ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼをコードするｐｈＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＷＩ、米国）を、同時トランスフェクションによるトランスフェクション効率の標準化に用いた。ｐｈＲＬ−ＴＫを用いることにより得られるトランスフェクション効率は一貫していた（エンプティーベクターの９２〜１０３％）。
【００６０】
（ｉｉｉ）細胞培養
ＧＲ発現プラスミドをトランスフェクトする細胞としては、内因性ＧＲレベルが非常に低いという理由で、アフリカミドリザルの腎細胞株であるＣＯＳ−７細胞を用いた。ＣＯＳ−７細胞は、厚生労働省研究資源バンク（ＪＣＲＢ）（東京、日本）から入手した。この細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、５％ＣＯ２大気下、３７℃で増殖させた。デキサメタゾン処理用には、この細胞を、チャコールデキストラン処理済のＦＢＳ（１０％）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【００６１】
（ｉｖ）ノーザンブロット分析
ＣＯＳ−７細胞（１．６×１０６細胞）を、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、野生型ＧＲまたは変異型ＧＲの発現プラスミド３．５μｇとｐｈＲＬ−ＴＫプラスミド０．５μｇとで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。５μｇの各全ＲＮＡサンプルを電気泳動し、ナイロン膜（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ，  ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，  ＭＡ、米国）に転写し、文献（Ｂｒｏｗｎ  Ｔ．  ａｎｄ  Ｍａｃｋｅｙ  Ｋ．，  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｙ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  ｓｌｏｔ  ｂｌｏｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，  ｓｕｐｐｌｅ．  ３７，  ｕｎｉｔ  ４．９，  １９９７）の記載に従って、３２Ｐ標識したｈＧＲαまたはサル由来グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ｈＧＲαのｃＤＮＡは、ｐＲＳｈＧＲαプラスミドをＫｐｎ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで消化することにより作製した。サルＧＡＰＤＨのｃＤＮＡは、サルＧＡＰＤＨ特異的プライマーペアと鋳型としてのＣＯＳ−７細胞からの全ＲＮＡを用いる逆転写ＰＣＲにより作製した。ハイブリダイゼーションシグナルは、Ｂｉｏｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＢＡＳ−１５００（富士写真フイルム、東京、日本）を用いて分析した。
【００６２】
（ｖ）ウェスタンブロット分析
同時トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞（１．６×１０６細胞）を上述のように作製し、その細胞ペレットをタンパク質サンプル緩衝液中で煮沸した。全細胞タンパク質を、６％ＳＤＳ−ポロアクリルアミドゲル（Ｔｅｆｕｃｏ社、東京、日本）上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ＣＡ、米国）上に転写した。この膜を、５％脱脂乳でブロッキングし、一次抗体としてポリクローナルウサギ抗ヒトＧＲ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ＣＡ、米国）とともにインキュベートし、次いで、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国）とともにインキュベートした。ＧＲタンパク質を、ＷｅｓｔＦｅｍｔｏ最大感度基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ＩＬ、米国）を用いて、その説明書に従って可視化した。これらのシグナルは、密度分析により評価した。
【００６３】
（ｖｉ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＣＯＳ−７細胞（１．４×１０５細胞）を、野生型ＧＲ発現プラスミドｐＲＳｈＧＲαまたは変異型ＧＲ発現プラスミド０．３μｇと、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物（ｐＨＨ−Ｌｕｃ）（ＡＴＣＣ、ＶＡ、米国、その配列はＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＦ０９３６８６に登録されている）０．６μｇおよび内部対照としてのｐｈＲＬ−ＴＫプラスミド０．６μｇとで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、これらの細胞をビークル（メタノール）または様々な濃度のデキサメタゾンで処理し、さらに２４時間培養した。これらの細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰｉｃａＧｅｎｅ  Ｄｕａｌ  ＳｅａＰａｎｓｙ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社、東京、日本）を用いて細胞溶解物を調製した。その後、ルシフェラーゼ活性を、ＶＩＣＴＯＲ２  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ社、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）を用いて測定した。全てのトランスフェクション効率は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に従って標準化した。
【００６４】
（ｖｉｉ）免疫細胞学的分析
ＣＯＳ−７細胞（１．６×１０６細胞）を、野生型ＧＲまたは変異型ＧＲの発現プラスミド４μｇでトランスフェクトし、４８時間培養した。これらの細胞を、ビークルまたは１００ｎＭデキサメタゾンで９０分間処理した。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで、室温下にて１５分間固定化し、０．５％トリトンＸ−１００で１５分間透過化処理した。固定化された細胞を、１０％ヤギ血清を含有するＰＢＳとのインキュベーションによりブロッキングし、同時に、１００ｎｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で、室温下にて３０分間処理し、次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄した。これらの細胞を、１０％ヤギ血清を含有するＰＢＳで希釈したウサギポリクローナル抗ＧＲ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）とともに、４℃で一晩インキュベートした。これらの細胞を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで５回洗浄し、１０％ヤギ血清を含有するＰＢＳで希釈した、Ａｌｅｘ５９４に結合させた抗ウサギＩｇＧ抗体（ＦＵＮＡＫＯＳＨＩ社、東京、日本）とともに、室温下にて１時間インキュベートした。免疫反応したＧＲおよびＤＡＰＩで染色した核を、蛍光顕微鏡下で可視化した。
【００６５】
（ｖｉｉｉ）統計学的解析
ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析およびレポーターアッセイの結果を、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウエア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、ＮＣ、米国）を用いるＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、さらにはフィッシャーのＰＬＳＤ法により、統計学的有意差について評価した。
【００６６】
（２）結果
（ｉ）ＧＲ遺伝子中に見出された２種の遺伝子変異
８８人の日本人被検者についてＧＲ遺伝子のコード領域を配列決定した結果、アミノ酸置換を伴う２つのヘテロ接合性一塩基変異が見出された。一つは第１５１０ヌクレオチドにおけるアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）への置換であり、これは第５０４アミノ酸におけるトレオニン（Ｔｈｒ）からセリン（Ｓｅｒ）へのアミノ酸置換を伴う（１５１０Ａ＞Ｔ；Ｔ５０４Ｓ）。もう一つは第１９５２ヌクレオチドにおけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換であり、これは第６５１アミノ酸におけるセリン（Ｓｅｒ）からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）へのアミノ酸置換を伴う（１９５２Ｃ＞Ｔ；Ｓ６５１Ｆ）。なお、ヌクレオチドおよびアミノ酸の位置を示す上記の数字は、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＣ００４７８２に登録されている配列に従うものである。
【００６７】
（ｉｉ）トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞における変異型ＧＲ  ｍＲＮＡの発現
変異型ＧＲ  ｍＲＮＡの発現レベルを調べるために行なったノーザンブロット分析の結果を図１に示す。図１において、上方のパネルは、ｈＧＲαｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを示し、下方のパネルは、ＲＮＡの定量の際の補正に用いるための、内因性ＧＡＰＤＨとＧＡＰＤＨｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを示す。この分析から、野生型ＧＲのｍＲＮＡ発現レベルを１００とした場合のＴ５０４Ｓ変異体およびＳ６５１Ｆ変異体のｍＲＮＡ発現レベルは、それぞれ１１３．７±１２．２および８５．９±５．５と推定され、これらの２種の変異体の間に有意差は認められなかった。
【００６８】
（ｉｉｉ）全細胞溶解物における変異型ＧＲタンパク質の発現レベル
変異型ＧＲタンパク質の発現レベルを定量するために行なったウェスタンブロット分析の結果を図２に示す。この分析から、野生型ＧＲのタンパク質発現レベルを１００とした場合のＴ５０４Ｓ変異体およびＳ６５１Ｆ変異体のタンパク質発現レベルは、それぞれ９０．２±１５．１および６５．６±４．３と推定された。野生型ＧＲとＴ５０４Ｓ変異型ＧＲとの間では、タンパク質発現レベルにおける有意差は認められなかった。他方で、Ｓ６５１Ｆ変異型ＧＲのタンパク質発現レベルは、野生型ＧＲと比較して有意に減少していた（Ｐ＜０．０５）。上述のノーザンブロット分析において有意差が見られなかったことを考慮すると、Ｓ６５１Ｆ変異型ＧＲのタンパク質発現レベルの減少は、タンパク質の不安定性またはＣＯＳ−７細胞における不十分な翻訳に起因するものと考えられる。
【００６９】
（ｉｖ）変異型ＧＲの細胞内局在
変異型ＧＲの細胞内局在を調べるために行なった免疫細胞学的分析から、次のようなことが明らかとなった。まず、野生型ＧＲでトランスフェクトした細胞をビークルで処理した場合には、発現したＧＲタンパク質は細胞質中に存在していた。他方で、同細胞を１００ｎＭデキサメタゾンで処理した場合には、ほとんどのＧＲタンパク質は核の中に存在していた。Ｔ５０４Ｓ変異体およびＳ６５１Ｆ変異体のタンパク質の局在パターンは、野生型のものとほとんど同様であった。
【００７０】
（ｖ）変異型ＧＲの転写活性
変異型ＧＲの転写活性を調べるために行なったレポーターアッセイの結果を図３に示す。図３において、ルシフェラーゼ活性は、１００ｎＭデキサメタゾンで処理した野生型ＧＲの測定値に対する百分率（％）として示す。各プロットにおける棒は標準偏差（ｎ＝３）を表し、「＊＊」はフィッシャーのＰＬＳＤ法においてＰ＜０．００１であることを表す。エンプティーベクタープラスミドのみでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞では、デキサメタゾン処理の有無にかかわらず、ルシフェラーゼ活性は見られなかった。野生型ＧＲでトランスフェクトした細胞では、デキサメタゾンの用量に比例してルシフェラーゼ活性が増加した。Ｔ５０４Ｓ変異体でトランスフェクトした細胞では、野生型と同様のルシフェラーゼ活性が見られた。これに対し、Ｓ６５１Ｆ変異体でトランスフェクトした細胞では、野生型と比較してルシフェラーゼ活性が有意に低く、１００ｎＭデキサメタゾンで処理した場合には、野生型の６５％のルシフェラーゼ活性となった。変異型ＧＲの転写活性は、それらのタンパク質発現レベル（図２）と良好な相関を示した。
【００７１】
（３）考察
上述の実験結果によれば、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異により、ｍＲＮＡの発現レベルは変化しないにもかかわらず、タンパク質発現レベルおよび転写活性はともに野生型の６５％にまで減少することがわかる（図１〜３）。これにより、タンパク質発現レベルの減少はタンパク質の不安定性または不十分な翻訳に起因することが示される。また、転写活性とタンパク質発現レベルとの良好な相関から、転写活性の減少はタンパク質発現レベルの低下に起因するものと考えられる。このことは、Ｓ６５１Ｆ変異型ＧＲがデキサメタゾンに応答して核内に移行することを示す免疫細胞学的データにより支持される。第６５１アミノ酸残基はＨｓｐ９０結合ドメイン中に位置する。Ｈｓｐ９０はＧＲタンパク質を安定化させるため、この位置におけるセリンのフェニルアラニンへの置換がその変異型ＧＲに対するＨｓｐ９０の結合特性に影響を与え、この変異型ＧＲタンパク質の安定性を害している可能性がある。
【００７２】
一方で、Ｔ５０４Ｓ変異体は、野生型と同様のｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルおよび転写活性を示す。
【００７３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】野生型、Ｔ５０４Ｓ変異型およびＳ６５１Ｆ変異型それぞれのＧＲ転写産物のノーザンブロット分析の結果を示す電気泳動写真である。
【図２】野生型、Ｔ５０４Ｓ変異型およびＳ６５１Ｆ変異型それぞれのＧＲタンパク質のウェスタンブロット分析の結果を示す電気泳動写真である。
【図３】野生型、Ｔ５０４Ｓ変異型およびＳ６５１Ｆ変異型それぞれのＧＲの転写活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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