(57)【要約】【課題】培養生成物中のコルディセピンの含有量を向上させる。【解決手段】液体培地にコルディセピンを産生する冬虫夏草菌を接種し、これを下記（１）式で表される培地の表面積と体積との比Ｋ値が０．０６以上である条件で静置培養することにより、得られる培養生成物中のコルディセピン含有量を従来と比べて顕著に増大させることができる。Ｋ＝〔培地表面積（ｃｍ２）／培地体積（ｍｌ）〕      （１）前記Ｋ値が０．１０以上であることが好ましい。特に前記Ｋ値が０．２０以上であることが好ましい。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地にコルディセピンを産生する冬虫夏草菌を接種し、これを下記（１）式で表される培地の表面積と体積との比Ｋ値が０．０６以上である条件で静置培養することを特徴とする冬虫夏草の培養方法。
Ｋ＝〔培地表面積（ｃｍ２）／培地体積（ｍｌ）〕      （１）
【請求項２】
前記Ｋ値が０．１０以上である請求項１に記載の冬虫夏草の培養方法。
【請求項３】
前記Ｋ値が０．２０以上である請求項１に記載の冬虫夏草の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた抗腫瘍効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有する薬用茸の一種である冬虫夏草用の培地に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
冬虫夏草は、薬用茸の一種で、昆虫などを宿主とし、菌糸が増殖して宿主を死に至らしめた後、該宿主の体内で菌糸が充満すると子実体を形成するコルディセプス（ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属の茸の一種であり、冬季には宿主の体内にあり、夏季になると宿主の虫体から穿ち出る子嚢菌に属する茸である。
冬虫夏草は、自然状態では地中または地上に菌糸または胞子として存在する菌であり、寄生する昆虫の幼虫期、蛹期及び成虫期全般にわたって体内に侵入して発生する。
冬虫夏草は、優れた抗腫瘍効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有するものとして知られている。冬虫夏草の有効成分はコルディセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）であり、その含有量は、子実体の乾燥体において０．０２〜０．６重量％程度である。
【０００３】
近年、冬虫夏草の菌糸体を人工的に培養する方法としていくつか提案されており、例えば、冬虫夏草の虫体菌糸又は座胞子をセミなどの節足動物の昆虫類の成虫、蛹、幼虫などに定着させて固体培養する方法、米胚を利用した培養液の製造方法などが知られている。しかしながら、成虫、蛹、幼虫などに定着させる固体培養や、米胚を利用した液体培養などの従来の培養方法では、培養方法が複雑であった。また、その収量は、たとえば、さなぎ固体培養による培養生成産物中のコルディセピン含有量は約０．１〜０．５重量％、米胚液体培養の場合は約０．０４重量％といずれも高くなかった（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特開昭６３−２０９５７９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を向上させることができる冬虫夏草の培養方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の冬虫夏草の培養方法は、液体培地にコルディセピンを産生する冬虫夏草菌を接種し、これを下記（１）式で表される培地の表面積と体積の比Ｋ値が０．０６以上である条件で静置培養することを特徴とするものである。なお、本発明における「培地の表面積」とは、液体培地を容器にいれた場合に大気と接する上面部分の面積をいう。
Ｋ＝〔培地表面積（ｃｍ２）／培地体積（ｍｌ）〕      （１）
【０００７】
Ｋ値が０．０６以上の条件で培養することにより、得られる培養生成物中のコルディセピン含有量を従来と比べて顕著に増大させることができる。Ｋ値が０．１以上であれば、Ｋ値が０．０６の場合と比べて、得られる培養生成物中のコルディセピン含有量をより増加させることができ、好ましい。さらにＫ値が０．２以上では、０．０６の場合と比べて、得られる培養生成物中のコルディセピン含有量をより一層増加させることができ、特に好ましい。Ｋ値が０．０６未満では、培養生成物中のコルディセピン含量を増大させる効果が少ない。
なお、静置培養することにより、振とう培養するよりも菌体の成長が良好になり、また、得られる培養生成物中に含まれるコルディセピン量が増大する。
【０００８】
本発明に用いられる冬虫夏草は、コルディセピンを産生する菌であり、コルディセピンを体外に排出および／または体内に含有する菌である。例えば、コルディセプス属に属するもので、コルディセプス・ミリタリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）等の培養に好ましく用いられ、特にコルディセプス・ミリタリス（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５７、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５８）が好ましく用いられるが、これに限定されるものではない。
【０００９】
冬虫夏草用培地は、冬虫夏草を培養するものであれば特に限定されるものではないが、好ましくは、（Ａ）グルコース、スクロース、糖蜜、マルトース、米及び／又はとうもろこしから選ばれた少なくとも１種、（Ｂ）ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれた少なくとも１種及び／又は（Ｄ）ビオチン、ビタミンＢ類を含有してなる液体培地等である。
【００１０】
（Ａ）成分は、冬虫夏草用培地の炭素源として含有するものであり、グルコース、スクロース、糖蜜、マルトース、米及び／又はとうもろこしのいずれか１種又は２種以上である。米、とうもろこしは、適宜粉砕して用いることが好ましい。例えば、粒径２００〜３００μｍ程度とするが、これに限定されるものではない。米、とうもろこしは、安価で容易に入手できる材料であるので、低コストで培地を提供することができる。
【００１１】
（Ａ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は、好ましくは１〜６重量％である。なお、（Ａ）成分として、グルコース、スクロース、糖蜜、マルトースのいずれか１種を用いる場合はさらに好ましい含有量は１〜３重量％であるが、米および／またはとうもろこしのみを（Ａ）成分として用いる場合には、他の（Ａ）成分と比較して糖質の含有量が低いので、３〜５重量％であることが好ましい。（Ａ）成分の含有量が１重量％未満では、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向がある。
なお、本発明において重量％とは、水１００重量部に対して、成分ｘ重量部を含有することを意味する。
【００１２】
（Ｂ）成分は、冬虫夏草用培地の窒素源として含有するものであり、ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれるいずれか１種又は２種以上である。イーストまたはモルトはその抽出物を使用してもよい。ミルクとしては、粉乳、脱脂粉乳が挙げられる。
（Ｂ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は、好ましくは１〜７重量％であり、特に好ましくは４〜７重量％である。（Ｂ）成分の含有量が１重量％未満、また、７重量％を超えた場合は、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向がある。
【００１３】
（Ｃ）成分は、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれるいずれか１種又は２種以上である。
アスパラギン、アスパラギン酸、グリシンは、アミノ酸の１種である。アスパラギンとしてはＬ体、Ｄ体どちらも使用できるが、Ｌ体が好ましい。アスパラギン酸においても、Ｌ体、Ｄ体どちらも使用できる。Ｌ−アスパラギン（和光純薬製のもの等）を用いた場合には、低コストに製造できるので工業的に好ましい。
ＤＮＡとしては、例えば、魚等から抽出したＤＮＡが使用でき、鮭精液由来のＤＮＡ等が挙げられる。
【００１４】
（Ｃ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は好ましくは０．１〜０．５重量％であり、特に好ましくは、０．３〜０．４重量％である。（Ｃ）成分の含有量が０．１重量％未満の場合は、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向があり、かつコルディセピン含有量の増加効果が少ないので好ましくない。また、（Ｃ）成分の含有量が０．５重量％を超えた場合は、菌体の成長及びコルディセピン含有量の増加効果の極限を超えるため好ましくない。
【００１５】
（Ｄ）成分は、ビタミンとして冬虫夏草用培地に含有させるものであり、ビオチン、ビタミンＢ類のいずれか１種又は２種以上である。
ビオチンはビタミンの一種である。
ビタミンＢ類は、ビタミンＢであれば特に限定されず、好ましくは、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等であり、これらは単独のものでも、又は二種以上の混合物であってもよい。
【００１６】
（Ｄ）成分の含有量は、特に限定されないが、微量であることがよく、例えば冬虫夏草用培地１００ｍｌに対して２〜１０μｇ程度である。（Ｄ）成分の含有量が２μｇ未満の場合は、得られる培養生成物中のコルディセピン含有量の増加効果が少ないので好ましくない。また、（Ｄ）成分の含有量が１０μｇを大きく超えた場合は、菌体の成長およびコルディセピン含有量の増加効果の極限を超えるので好ましくない。
【００１７】
冬虫夏草用培地のｐＨは、２〜９であることがことが好ましく、特に好ましくは、５〜７である。ｐＨの調製は、調製が行えるならばどのようにしてもよく、例えば、塩酸や水酸化ナトリウムを使用する調製方法が挙げられる。
【００１８】
本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）〜（Ｄ）成分以外はほとんど水であるが、この水としては、特に限定されず、水道水、井戸水、蒸留水等が挙げられる。
さらに、（Ａ）〜（Ｄ）成分、水以外にも、コルディセピンの含有量を向上させるために他の成分を含有させてもよい。
他の成分としては、例えば（Ｂ）成分以外の窒素源としてはおから、それ以外には例えばマグネシウム、カルシウム等のミネラルが挙げられる。
【００１９】
なお、本発明においては、冬虫夏草が産生したコルディセピンは菌体内のみならず培養液中に大量に存在する。したがって、菌体から複雑な工程を経て分離せずとも大量のコルディセピンを培養液から効率的に精製分離することができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例をあげて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】
実施例においては、下記の菌株を、種菌培養として下記前々培養および前培養して使用した。
【００２２】
（使用菌株）
菌株としては、コルディセプス・ミリタリス（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５７）を保存菌株用培地（スラント培地：ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン  ２μｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）で保存したものを用いた。
【００２３】
（前々培養）
平板寒天培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン２μｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）をシャーレに２０ｍｌ充填した。このシャーレ培地に、前記保存した菌株を約１５ｍｍ＊１５ｍｍ切り出して接種し、これを２１℃下２週間培養した。
【００２４】
（前培養）
液体培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン２μｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１２１℃下２０分間滅菌処理した。処理後、液温度が室温まで下がったとき、この液体培地に、前々培養したシャーレ培地から切り出した約１ｃｍ角のコロニ−三つを接種した。これを回転振盪機を用いて８０ｒｐｍで、２１℃下１０日間培養し、分生子を顕微鏡で確認後、各本培養に使用した。
【００２５】
（本培養）
グルコース３重量部、ペプトン４重量部、アスパラギン０．１重量部、ＭｇＳＯ４０．０５重量部、ビオチン２μ重量部、水１００重量部からなる液体培地を、１２１℃下２０分間滅菌処理した。この液体培地に該培地１００ｍｌあたり前記前培養で得られた菌体含有培地１ｍｌを接種し、これを下記（１）式で表される培地の表面積と体積の比Ｋ値が下記表１に示した実施例１〜２０（Ｋ値：０．０６〜２．２５）の値のそれぞれの条件下、２３℃で４０日静置培養した。得られた培養物中の総コルディセピン量を求め、その結果を表１および図１のグラフに示した。
Ｋ＝〔培地表面積（ｃｍ２）／培地体積（ｍｌ）〕      （１）
なお、得られた生成物の総コルディセピン量は下記のようにして求めた。
【００２６】
（培養生成物中の総コルディセピン量の測定）
各培養液１００ｍｌをろ紙（５Ｂ：アドバンテック東洋社製）を用いてろ過した。得られた菌体を５日間凍結乾燥した後、精密天秤で測定しその重量（以下、菌体重量とする）を測定した。
また、ろ過した培養液を凍結乾燥し、その重量（以下、培養液乾燥重量とする）を測定した。
【００２７】
凍結乾燥した菌体１ｇを水（蒸留水）を用いて１０分間超音波（サンフレックス、ＤＧ−１、５０Ｗ、４３ＫＨｚ）処理した。この処理液をろ紙（５Ｂ：アドバンテック東洋社製）を用いてろ過してコルディセピン含有量分析用試料とした。
この試料を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ（ＬＣ−１０：株式会社島津製作所製））を用いて分析し、コルディセピンの含有量を測定した（以下、菌体コルディセピン含有量とする）。
【００２８】
ＨＰＬＣの条件は、カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（ＯＤＳ）  ２５０Ｌ＊４．６φｍｍ（ジーエルサイエンス株式会社製）を用い、移動相は５０ｍＭリン酸カリウム：アセトニトリル（Ｖ／Ｖ＝９５：５）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出波長２６０ｎｍで行った。
前記ろ過培養液の凍結乾燥物についても、同様にしてコルディセピン含有量を測定した（以下、培養液コルディセピン含有量とする）。
【００２９】
これらの値から、次式に基づいて総コルディセピン量を求めた。
2004267005.tif 000002
【００３０】
【表１】
2004267005.tif 000003
【００３１】
表１及び図１に示した結果から、総コルディセピン量は、Ｋ値が０．０６以上で従来の倍以上の量であったが、特に０．１０以上で急激に総コルディセピン量が増大した。Ｋ値が０．２以上では、０．０６の場合と比較しても５．５倍以上のコルディセピンが得られた。
なお、菌体重量は、Ｋ値が０．０６〜２．２５の範囲で行った本実施例においては、約１．８ｇ〜２．３ｇ程度の範囲内でほぼ横並びであり、総コルディセピン量程顕著な差は認められなかった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、顕著にコルディセピンの産生量を増加させることが可能な冬虫夏草の培養方法を提供することができる。また、本発明においては、コルディセピンが菌体自体の中にとどまらず、培養液中に大量に含まれるため、コルディセピンを容易に分離精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｋ値と総コルディセピン量との関係を表したグラフである。
【図１】
2004267005.tif 000004