(57)【要約】標的核酸を分析する方法が供給される。核酸に付着した蛍光標識は、標的核酸の少なくとも一本鎖に組み込まれ、かつ、前記方法は、増幅産物の前記標識鎖が、その相補鎖から解離することによって生じる蛍光放射の変化をモニタ−することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸サンプルにおける少なくとも一つの標的核酸の配列変動を特定する方法であって、
ａ）増幅産物を生成するために核酸増幅反応混合物における標的核酸を増幅する工程であって、ここに、前記増幅反応混合物は、
ａａ）ポリメラ−ゼ、
ａｂ）デオキシヌクレオシド三リン酸またはその機能的アナログ、
ａｃ）少なくとも第一プライマーと第二プライマーを含み、
ここに、第一プライマーは、標的核酸にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
第二プライマーは、標的核酸の相補鎖にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
少なくとも一方のプライマーが、サンプル中に存在する可能性のある他の全ての蛍光体にたいしてＦＲＥＴ−供与体−受容体関係に無い蛍光性化合物によって標識され、この標識プライマーは、
ｉ）第一プライマー、
ｉｉ）第二プライマー、
ｉｉｉ）および、表示用プライマーから成り、この表示用プライマーは、
−　第一および第二プライマーが使用された場合にのみ増幅されるＤＮＡ断片にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、
−　ポリメラ−ゼによって合成を始める
のに十分なほどの相補性を有し、
ｂ）増幅産物を単一鎖に変性し、その後単一鎖を元に戻して二本鎖産物を形成する工程、
ｃ）増幅された標的配列を含む増幅混合物を、二本鎖ＤＮＡ変性勾配に暴露して、同時に蛍光放射の変化をモニタ−する工程、
を含む方法。
【請求項２】
核酸サンプルにおける標的核酸を分析する方法であって、
ａ）増幅産物を生成するために核酸増幅反応混合物における標的核酸を増幅する工程であって、ここに、前記増幅反応混合物は、
ａａ）ポリメラ−ゼ、
ａｂ）デオキシヌクレオシド三リン酸またはその機能的アナログ、
ａｃ）少なくとも第一プライマーと第二プライマーを含む複数のプライマーを含み、
ここに、第一プライマーは、標的核酸にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
第二プライマーは、標的核酸の相補鎖にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
少なくとも一方のプライマーが蛍光性化合物によって標識されることを特徴とし、この標識プライマーは、
ｉ）第一プライマー、
ｉｉ）第二プライマー、
ｉｉｉ）および、表示用プライマーから成るグル−プから選択され、この表示用プライマーは、
−　第一および第二プライマーが使用された場合にのみ増幅されるＤＮＡ断片にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、
−　ポリメラ−ゼによって合成を始める
のに十分なほどの相補性を有し、
ここに、標識プライマーは増幅産物の一本鎖に組み込まれ、
ｂ）増幅産物の標識鎖が、その相補鎖から解離することによって生じる蛍光放射の変化をモニタ−する工程であって、ここに、この蛍光放射の変化は、蛍光共鳴エネルギ−転移関係によるものではない、
諸工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
反応混合物であって、
ポリメラ−ゼ、
デオキシヌクレオシド三リン酸またはその機能的アナログ、
少なくとも第一プライマーと第二プライマーを含む複数のプライマーを含む複数のプライマーを含み、
ここに、第一プライマーは、標的核酸にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
第二プライマーは、標的核酸の相補鎖にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
少なくとも一方のプライマーが蛍光性化合物によって標識されることを特徴とし、この標識プライマーは、
第一プライマー、
第二プライマー、および、
表示用プライマーから成るグル−プから選択され、この表示用プライマーは、
−　第一および第二プライマーが使用された場合にのみ増幅されるＤＮＡ断片にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、
−　ポリメラ−ゼによって合成を始める
のに十分なほどの相補性を有し、
ここに、標識プライマーは増幅産物の一本鎖に組み込まれ、かつ、蛍光体は、標的核酸増幅時にサンプル中に存在する可能性のある他の全ての蛍光体にたいしてＦＲＥＴ−供与体−受容体関係を持たない、
ことを特徴とする反応混合物。
【請求項４】
核酸サンプル中の標的核酸の配列変動を特定する方法であって、標的核酸は第一鎖と、全体としてそれと相補的な第二鎖とを含み、第一鎖が蛍光化合物で標識されることを特徴とする方法であって、
標的核酸を一本鎖に変性する工程、
前記一本鎖を元に戻し二本鎖産物を形成するためにサンプルを冷却する工程であって、ここに、冷却速度は少なくとも０．１℃／秒であり、
サンプルを熱勾配に暴露し、同時に、増幅産物の標識鎖が、その相補鎖から解離することによって生じる蛍光放射の変化をモニタ−する工程であって、ここに、熱勾配内の温度転移は少なくとも０．０５℃／秒であり、
の諸工程を含む方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドと、それに結合する蛍光標識とを含む表示用プライマーを含む標的核酸分析用キットであって、前記オリゴヌクレオチドは、第一プライマーと第二プライマーを用いて増幅された標的核酸の増幅遺伝子座にたいしてハイブリダイズするように構成され、第一プライマーは第一セグメントと第二セグメントとを有し、第一セグメントは、標的核酸にたいして、それとハイブリダイズするのに十分な相補性を有し、第二セグメントは、表示用プライマーにたいし、それとハイブリダイズするのに十分な相同性を有し、ここに、前記オリゴヌクレオチドは、増幅されない標的核酸にたいしてはハイブリダイズしないように構成されることを特徴とするキット。
【請求項６】
標的核酸分析用キットであって、
標的核酸の遺伝子座を増幅するように構成される、少なくとも第一プライマーと第二プライマーを含む複数のプライマーを含み、
前記第一プライマーは、標的核酸配列にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、鋳型依存性合成を始めるのに十分な相補性を有し、
前記第二プライマーであって、標的核酸の相補鎖にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、鋳型依存性合成を始めるのに十分な相補性を有し、
少なくとも一方のプライマーは蛍光化合物によって標識されることを特徴とし、この標識プライマーは、
ｉ）第一プライマー、
ｉｉ）第二プライマー、
ｉｉｉ）および、表示用プライマー
から成るグル−プから選ばれ、ここに、この表示用プライマーは、
−　第一および第二プライマーが使用された場合にのみ増幅されるＤＮＡ断片にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、
−　ポリメラ−ゼによって合成を始める
のに十分なほどの相補性を有し、
ここに、蛍光化合物は、他の全ての蛍光体にたいしてＦＲＥＴ−供与体−受容体関係を持たず、かつ、標識プライマーは、増幅遺伝子座の一本鎖の中に組み込まれるように構成される、
ことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
予想外の配列変動を検出するために従来用いられている方法では、多くＰＣＲ後にゲル電気泳動を行うことが必要である。このような方法としては、単一鎖構成多型法（Ｏｒｉｔａ，　Ｏ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８６：２７６６−２７７０，　１９８９）、ヘテロ二重鎖移動分析法（Ｎａｔａｒａｊ，　Ａ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，　２０：１１７７−１１８５，　１９９９）、変性勾配ゲル電気泳動法（Ａｂｒａｍｓ，　Ｅ．Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　７：４６３−４７５，　１９９０）、温度勾配ゲル電気泳動法（Ｗａｒｔｅｌｌ，　Ｒ．Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．　Ａ．，　８０６：１６９−１８５，　１９９８）、および、酵素切断法（Ｈａｗｋｉｎｓ，　Ｇ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，　２０：１１７１−１１７６，　１９９９）が挙げられる。ＤＮＡの塩基配列を決定することによって新規突然変異を特定する場合も、周回配列決定およびゲル電気泳動を含めた多段工程を要する。変性による高性能液体クロマトグラフィ−（Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｉ　Ｇ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｅｓｔｉｎｇ，　５：９−１６，　２００１）は比較的最近の方法ではあるが、これも、ＰＣＲ後にサンプリングと注入を要する。
【０００２】
最近、突然変異特定走査・検出法として均一蛍光法が報告されている。ＳＹＢＲグリ−ンＩは、二重鎖ＤＮＡ結合性染料であり、リアルタイムＰＣＲにおいて、産物形成のモニタ−（Ｗｉｔｔｗｅｒ，　Ｃ．Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　２２：１３０−１３８，　１９９７）、および、融解温度のモニタ−（Ｒｉｒｉｅ，　Ｋ．Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２４５：１５４−１６０，　１９９７）に頻繁に用いられている。ＰＣＲ産物の精製およびＳＹＢＲグリ−ンＩの添加後、融解曲線分析によって最大１６７ｂｐの産物において一塩基多型が検出されている（Ｌｉｐｓｋｙ，　Ｒ．Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　４７：６３５−６４４，　２００１）。しかしながら、高濃度のＳＹＢＲグリ−ンＩが使用された場合、これがＰＣＲを阻害するので（Ｗｉｔｔｗｅｒ，　Ｃ．Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２５：４３０−４４２，　２００１）、染料は増幅後に添加されている。また、ＰＣＲ産物の精製が必要とされたことから、リアルタイム分析の可能性はさらに制限された。別の報告で、ＳＹＢＲグリ−ンＩと併せてＧＣクランプ法を用いることによって、最大２１２ｂｐの産物でスニップが検出されたことが報じられている（Ｅｌｅｎｉｔｏｂａ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，　Ｋ．Ｓ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌ．　１５９：８４５−８５３，　２００１、および、米国特許第６，３４６，３８６号）。しかしながら、ＰＣＲ後、融解度分析を実行する前に、溶液を尿素で１２Ｍに調節しなければならない。いずれの場合もＰＣＲ後にサンプル添加が必要であった。サンプル操作が加われば、それがどのようなものであっても、ＰＣＲ産物が後続反応に持ち越される、持ち越し汚染の危険度を増加させる。
【０００３】
別の均一蛍光法として、リアルタイムハイブリダイゼ−ション・プロ−ブを用いる方法がある（Ｗｉｔｔｗｅｒ，　Ｃ．Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　２２：１３０−１３８，　１９９７）。これらのプロ−ブは、融解温度シフトに基づいてプロ−ブの下にあるどんな変異でも検出することが可能である。多数の単一標識ハイブリダイゼ−ション・プロ−ブをアンプリコンに沿って横並びさせて、Ｔｍ多重化法によりｐ５３突然変異を走査・検出する（Ｍｉｌｌｗａｒｄ，　Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．，　印刷中、２００２）。
【０００４】
ＰＣＲプライマーについては、それらがＰＣＲ産物に組み込まれる際に蛍光変化を助長するようにさせる多くの設計法がある。そのような設計法としては、二重鎖変位プライマー法（Ｌｉ，　Ｑ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　３０：ｅ５，　２００２）や、スコルピオン・プライマー法（Ｗｈｉｔｅｃｏｍｂｅ，　Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１７：８０４−８０７，　１９９９）が挙げられるが、ただしこれに限定されない。前者の方法では、蛍光は、始めは相補鎖オリゴヌクレオチド上のアクセプタ−蛍光搬送体によって消光されているが、相補鎖がＰＣＲで解離すると、この蛍光信号を放出させる。後者の方法では、スコルピオン・プライマーはル−プ状尾部を持ち、これがＰＣＲ前では標識を消光分子に近接させる。しかし、変性し、ＰＣＲ産物に取り込まれると信号を放出させる。これらの設計法の多くは、主に増幅を検出することを目的とする。対立遺伝子特異的増幅によって遺伝子型分析を実行したケ−スもいくつかはあった。上記参照例のいずれにおいても、融解分析の使用や、融解温度によって配列変動を区別する方法の使用を教示するものはなかった。
【０００５】
融解温度の差に基づいて様々の分析対象を区別するために、５’末端残基に蛍光標識したＰＣＲプライマーを用いる方法については既に論じられている（米国特許申請公刊第２００１００００１７５号、Ｋｕｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．）。しかしながら、Ｋｕｒａｎｅの教示によれば、配列変動の僅かな違いを区別するのは不可能である、なぜなら、融解曲線分析の結果は、標的核酸濃度にきわめて高度に依存するからである。従って、本発明以前には、上記の標識プライマー、または、その他の形の標識プライマーが、融解分析によって増幅産物における僅かな配列変動やヘテロ二重鎖の検出するのに使用が可能であることを示したものは全く存在していなかった。
【０００６】
（発明の概要）
一つの態様において、本発明は、広範囲の配列において、変異をスキャンし配列の小変動を同定するための、簡単で感度の高いリアルタイムＰＣＲ法を目的とする。５’末端標識ＰＣＲプライマーを用いることによって、ＰＣＲ産物における一塩基多型およびその他の配列小変動を、増幅産物の融解曲線分析によって検出することが可能である。これらの融解曲線はヘテロ二重鎖の出現時期を明らかにするが、また、この融解曲線を用いることによって、ＰＣＲ後に添加したり、操作したりすることを全く要せずに、リアルタイム変異走査を実行することが可能である。さらに、多くの場合、異なるヘテロ接合体のみならず、異なるホモ接合体同士を互いに区別することが可能である。即ち、本発明の手法を用いることにより、遺伝子型判別がしばしば可能である。最後に、ハプロタイプの分析のみならず、生物体のタイプ分けも、本発明の方法を用いることによって可能である。
【０００７】
一つの実施態様において、本発明は、ＰＣＲとアンプリコン融解分析を要するのみで、中間処理を全く要することの無い、配列変動走査法を供給する。ＰＣＲプライマーの内少なくとも一つは蛍光標識されるが、その標識は、アンプリコンが融解すると蛍光に変化が生じるようなやり方で行われる。ヘテロ二重鎖は、融解曲線導関数プロットにおける、低温「肩」の出現およびピ−クの平坦化として検出される。ヘテロ二重鎖の検出は、変性後融解前の急冷（＞２℃／秒）、陽イオン低濃度、および、融解中の急速加熱（０．１−０．５℃／秒）によって増加する。別の実施態様では、二本の未標識プライマーが、前記未標識プライマーの内の一方に付加された普遍的尾部にたいして相同的な配列を有するもう一本の表示用標識プライマーと共に用いられる。
【０００８】
様々な実施態様において、本発明の方法は、例えば、ＨＴＲ２Ａ（Ｔ１０２Ｃ）、ベ−タ・グロビン（Ｈｂ　Ｓ，　ＣおよびＥ）、アポＥ（２／２，　２／３，　２／４，　３／３，　３／４および４／４）、および、ＣＦＴＲ（Ｆ５０８ｄｅｌ，　Ｆ５０８Ｃ，　Ｉ５０７ｄｅｌ，　Ｉ５０６Ｖ）において多型を検出するのに用いられる。ほとんどの場合、異なるホモ接合体同士は融解温度（Ｔｍ）によって区別が可能であり、ヘテロ接合体は、低温「肩」と、よりなだらかな転移に基づいてホモ接合体から区別することが可能であり、また、異なるヘテロ接合体同士は、蛍光融解曲線の形に基づいて他のヘテロ接合体と区別することが可能である。アンプリコンのサイズは４４と３０３ｂｐの間を変動した。５％未満（２４３ｂｐ長のアンプリコンにおける単一塩基の違いに相当する）のＤＮＡ変動の存在が検出された。
【０００９】
（詳細な説明）
従来から、均一リアルタイム変異走査法は不安定で捉えどころが無いとされている。二本鎖ＤＮＡ特異的染料は理想的候補と考えられる。特に、ＳＹＢＲグリ−ンＩは融解分析に広く使用されており、かつ、ＰＣＲ中に大きな蛍光変化を示す（Ｗｉｔｔｗｅｒ，　Ｃ．Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　（リアルタイムＰＣＲ）、　ｉｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：　　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（診断用分子微生物学−原理と応用），　Ｄ．　Ｐｅｒｓｉｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．，　ｅｄｓ．，　ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ，　２００２）。しかしながら、融解曲線収得の間に温度を上げると、ＳＹＢＲグリ−ンＩは、低温で融解するヘテロ二重鎖から遊離して、より高温で融解するホモ二重鎖と再結合する。融解中に臭化エチジウムが再分配することが報告されている（Ａｋｔｉｐｉｓ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１４：３２６−３３１，　１９７５）。ＳＹＢＲグリ−ンＩは、ＰＣＲと適合的な濃度においては制限条件ではないから、ヘテロ二重鎖転移時において蛍光にネットの変化は無い（図１）。融解分析による溶液中のヘテロ二重鎖検出に関わるもう一つの問題点は、低融解点のヘテロ二重鎖が、それぞれの完全相補鎖と再結合するかもしれないということである。ＰＣＲ終了時、ＰＣＲ産物は高濃度になるので、この再結合は急速に起こるかもしれないから、この場合も、ヘテロ二重鎖の転移時において蛍光にネットの変化は生じない。ＤＮＡ染料は、Ｔｍを高温度側に変位させ、融解転移の幅を広げる傾向がある（Ｄｏｕｔｈａｒｔ，　Ｒ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２：２１４−２２０，　１９７３）。高いＴｍを有する分析対象は変性させるのが難しく、転移が幅広いと、融解曲線の解像度を低下させるかもしれない。
【００１０】
しかしながら、本発明にかかる標識プライマーを用いるならば、変異の走査に遊離二本鎖ＤＮＡ染料を使用することに伴う問題点は回避される。染料の再分布、Ｔｍの増加や、融解転移の広がりは全く無い。ヘテロ二重鎖が問題であれば、再結合の可能性は、溶液が再結合の起こりやすい温度に維持される時間を制限することによって減少するかもしれない。再結合は、温度がヘテロ二重鎖のＴｍと、ホモ二重鎖のＴｍとの間にある場合に特に起こりやすいようである。この時間は、融解前の急冷と、融解中の急速加熱によって制限が可能である。さらに急速加熱は、融解工程中、初期のプライマー結合を減らすことから、それによって、ヘテロ二重鎖のネットの減少が起こりにくくなる。さらに核酸のアニ−リング速度は、陽イオン濃度が低ければ低いほど低下する。前記理論的予測は実際に得られた結果と一致する。急冷（図２）、急速加熱（図３）、および、Ｍｇ＋＋低濃度（図４）では、より顕著なヘテロ二重鎖のピ−クが存在する。急速加熱の実際的限界としては、サンプル中の温度の均一性維持の困難、蛍光測定値収得数の減少、および、融解転移の拡大が挙げられる。
【００１１】
デ−タは、蛍光対温度プロット、または、蛍光の一次導関数対温度プロットのいずれかとして提示されてもよい。この二つのプロットは相互に交換が可能であるが、それぞれ、観察者の注意を、デ−タの別の態様に向けさせる。融解度ピ−ク（Ｔｍ）は、導関数プロットにおいてもっとも良く観察される。一方、転移の拡大や、低融解点転移の出現は、蛍光対温度プロット上で観察する方がより容易に見て取れる。
【００１２】
アンプリコン融解とともに蛍光を変化させる標識プライマーは、未知の変異の走査と、特異的遺伝子型分析の両方に有効である可能性を持つ。これらの用途においてはドメイン融解を考慮に入れることが重要である。変性勾配ゲル電気泳動と異なり、情報に富むドメインが第一融解ドメインであるとは必ずしも限らないが、しかし、標識プライマーを含むドメインではある。多型が標識プライマーの融解ドメイン内に無い場合は、ただ多型検出の感度が低下するだけである。このことの極端な例を図１４に示す。同図において、ａｐｏＥ遺伝子座における標識プライマーから遥かに遠い多型は全く検出されない。明らかにミスマッチ部分は、標識プライマーを含むドメインよりも先に融解する。この制限を修正するには少なくとも二つの方法がある。未標識プライマーにはＧＣクランプを添加して、アンプリコンの残余部を強制的に一つのドメインとして融解させることが可能である（Ａｂｒａｍｓ，　Ｅ．Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　７：４６３−４７５，　１９９０；　１１）。また、別法として、二つのプライマーを、好ましくはスペクトラム的に別々の放射を行う異なる染料で標識することも可能である。色多重化法（Ｗｉｔｔｗｅｒ，　Ｃ．Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２５：４３０−４４２，　２００１）を用いて、両標識の融解を追跡して、アンプリコンの両側をモニタ−することも可能である。この制限を修正するための他の方法も本発明の範囲内にある。
【００１３】
変異走査法は、その変異検出感度によって判断されうる（Ｎａｔａｒａｊ，　Ａ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，　２０：１１７７−１１８５，　１９９９）。検出感度は、アンプリコンのサイズ、および、アンプリコン内部の安定性分布に依存する。本法においては、標識末端よりも１７５ｂｐ遠ざかった変異は検出されなかった。アンプリコン末端近くの多型から生じたヘテロ二重鎖は、大部分のアンプリコンよりも前に「呼吸する」、すなわち融解する傾向がある。本発明においては、これら末端多型は、ＧＣクランプを導入することによって、または、アンプリコンの両端を標識することによって検出が可能である。内部ドメインが両端部よりも前に融解する場合も検出が失敗することがあるだろう。しかしながら、両端部がカバ−されていれば、最大３００、恐らくは最大５００、可能性として最大８００ｂｐまでの大抵のアンプリコン内部におけるヘテロ接合体配列変動は全て検出が可能である。
【００１４】
以上総合すると、本発明の一つの実施態様は、核酸サンプルにおける一つの標的核酸を分析する方法であって、
ａ）増幅産物を生成するために核酸増幅反応混合物における標的核酸を増幅する工程であって、ここに、前記増幅反応混合物は、
ａａ）ポリメラ−ゼ、
ａｂ）デオキシヌクレオシド三リン酸またはその機能的アナログ、
ａｃ）少なくとも第一プライマーと第二プライマーとを含む複数のプライマーを含み、
ここに、前記第一プライマーは、標的核酸にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
前記第二プライマーは、標的核酸の相補鎖にたいして、それとハイブリダイズし、かつ、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
少なくとも一方のプライマーが蛍光性化合物によって標識され、ここに、その標識プライマーは、
ｉ）第一プライマー、
ｉｉ）第二プライマー、
ｉｉｉ）および、表示用プライマーから成るグル−プから選択されることを特徴とし、この表示プライマーは、
第一および第二プライマーが使用された場合にのみ増幅されるＤＮＡにたいして、それとハイブリダイズし、かつ、ポリメラ−ゼによって合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
ここに、前記標識プライマーは、増幅産物の一鎖の中に組み込まれ、および、
ｂ）増幅産物の標識鎖が、その相補鎖から解離することによって生じる蛍光放射の変化をモニタ−する工程、
の諸工程を含むことを特徴とする方法を目的とするものである。
【００１５】
第一の例示の実施態様は、一つの標的核酸の配列を分析する方法であって、
ａ）増幅産物を生成するために核酸増幅反応混合物における標的核酸を増幅する工程であって、ここに、前記増幅反応混合物は、
ａａ）ポリメラ−ゼ、
ａｂ）デオキシヌクレオシド三リン酸またはその機能的アナログ、
ａｃ）第一プライマーと第二プライマーを含む一対の増幅プライマーを含み、
ここに、前記第一プライマーは、前記標的核酸にたいして、それとハイブリダイズし、さらに、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
前記第二プライマーは、前記標的核酸の相補鎖にたいして、それとハイブリダイズし、さらに、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
いずれか一方の、または、両方の増幅プライマーが、サンプル中に存在する可能性のある、他のいずれの蛍光体にたいしてもＦＲＥＴ−供与体−受容体関係に無い蛍光体によって標識され、
ｂ）前記増幅産物を変性して単一鎖とし、その後、前記単一鎖を元に戻して二本鎖産物を形成する工程、および、
ｃ）増幅標的産物を含む前記増幅混合物にたいして二本鎖ＤＮＡ変性勾配法を実行し、同時に蛍光放射をモニタ−する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１６】
この最初の例示の実施態様にたいして要約すると、従来のＰＣＲ増幅プライマーも、いずれか一方、または、両方のプライマーが、同じか、または、異なる蛍光化合物で標識されている限り、使用が可能である。
【００１７】
一つの特異な実施態様では、２対以上の増幅プライマーを用いる多重化法によって２個以上の標的核酸が増幅される。この方法では、一対の増幅プライマーを含むプライマーのうち、一つのプライマー、または、両方のプライマーが標識される。この場合、例えば、各プライマーは、他のプライマーペアと比べて区別可能な蛍光放射スペクトラムを有する異なる蛍光化合物によって標識される。これによって、分析対象となる各標的核酸配列について蛍光信号の区別が可能となる。
【００１８】
第二の例示の実施態様は、標的核酸配列を分析する方法であって、
ａ）増幅産物を生成するために核酸増幅反応混合物における前期標的核酸を増幅する工程であって、ここに、前記増幅反応混合物は、
ａａ）ポリメラ−ゼ、
ａｂ）デオキシヌクレオシド三リン酸またはその機能的アナログ、
ａｃ）第一プライマーと第二プライマーとを含む一対のプライマーを含み、
ここに、前記第一プライマーは、前記標的核酸にたいして、それとハイブリダイズし、さらに、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
前記第二プライマーは、前記標的核酸の相補鎖にたいして、それとハイブリダイズし、さらに、ＤＮＡポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
ａｄ）サンプル中に存在する可能性のある、他のいずれの蛍光体においてもＦＲＥＴ−供与体−受容体の関係に無い蛍光体によって標識される表示用プライマーであって、該表示用プライマーは、前記一対の増幅プライマーによって増幅されるＤＮＡ断片とハイブリダイズし、さらに、ポリメラ−ゼによって合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
ｂ）前記増幅産物を変性して単一鎖とし、その後、前記単一鎖を元に戻して、二本鎖産物を形成する工程、および、
ｃ）増幅標的産物を含む前記増幅混合物にたいして二本鎖ＤＮＡ変性勾配法を実行し、同時に蛍光放射をモニタ−する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【００１９】
この第二の例示の実施態様にたいして要約すると、従来の二本のＰＣＲ増幅プライマーが、増幅標的配列とハイブリダイズすることが可能な、第三の標識プライマーとの併用される。この第二の基本的実施態様の場合、さらに、二対以上の未標識増幅プライマーによる多重化法においては２個以上の標的核酸の増幅が可能である。
【００２０】
一つの特異的実施態様では、標識プライマーの配列が、標的ＤＮＡにたいして、完全に、または、少なくなくとも一部不完全ではあるが適合するように選択されているために、標識プライマーが標的配列にハイブリダイズすることが可能である。多重化法では、少なくとも一つの共通領域を共有する異なる遺伝子を増幅する場合、そのようなプライマーを設計することが可能である。この場合、表示用配列は、まさにその領域とハイブリダイズするように適当に選択することが可能である。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施態様では、表示用配列を、使用される増幅プライマーを介して、アンプリコンの中に導入することも可能である。この場合、増幅プライマーの各対の少なくとも一方のプライマーは、少なくとも第一および第二セグメントを含む。ここに、第一セグメントは、標的核酸にたいして、それとハイブリダイズするほどに十分な相補性を有し、また、第二セグメントは、表示用プライマーの表示用配列と十分に相同であり、かつ、第二セグメントは、第一セグメントに比べて、プライマーの５’末端にたいしてより近位に位置する。このような状況下では、一種類の標識増幅プライマーしか必要とされない。
【００２２】
本願の文脈では、「相同的」という用語は、各プライマーが、標準的条件において、標準的ＰＣＲ反応混合物内部で、その相同配列の相補鎖にたいしてハイブリダイズし、かつ、ＰＣＲ増幅に使用するのが相応しいほどにポリメラ−ゼによってＤＮＡ合成を始めることを意味するものとする。さらに、「ポリメラ−ゼ」という用語は、核酸増幅に使用が可能な全てのポリメラ−ゼを意味し、例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラ−ゼを意味する。
【００２３】
表示用汎用プライマーを使用することができることとは、多くの標的において配列変化の有無を走査するのに、蛍光標識された、ただ一個のオリゴヌクレオチドしか合成される必要がないことを意味する。各標的からの１個のプライマーは、表示用配列を含むように修正される。ＰＣＲを多数回繰り返すと、この標識プライマーは最終的アンプリコンに組み込まれる。反応には、２個ではなく、３個のオリゴヌクレオチドが必要となるが、しかし、互いに独立に実行される別々のアッセイにおいてさえ、全ての標的にたいして同じ蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用が可能である。一つの例示の実施態様では、汎用プライマーは、標的配列にたいして十分な相同性を持たないために、その汎用プライマーは標的配列にたいしてハイブリダイズして、合成を始めることができない。
【００２４】
アッセイの種類や、実際に使用される蛍光化合物のタイプによって、蛍光放射は、標識プライマーを取り込んだ増幅産物が解離、すなわち融解した場合に、増加するかもしれないし、減少するかもしれない。本発明によれば、標識プライマーは、蛍光放射の修飾が、主に、その蛍光化合物の付着する二本鎖核酸の解離すなわち融解によって引き起こされるように選択される。
【００２５】
本発明の方法では、蛍光は、変性勾配の関数としてモニタ−される。しかしながら、勾配の種類とは無関係に、実際にモニタ−されるのは、二本鎖増幅産物の二本鎖の解離によってもたらされる蛍光の変化であり、これは、そのＰＣＲ産物の中に蛍光標識が取り込まれた地点から観察される。
【００２６】
変性勾配は熱勾配であってもよい。言い換えれば、本発明は、例えば、適当に標識したプライマーを用いたＰＣＲ増幅中に、または、増幅にひきつづき、温度依存性蛍光をモニタ−することを特徴とする方法を目的とする。別法として、変性勾配は変性剤の勾配であってもよい。このモニタリングは、増幅過程とは別に、例えば、ＤＮＡ変性分析・蛍光モニタリング装置によって、または、例えば、変性勾配ゲル電気泳動装置のような従来技術で既知のその他の装置によって実行されてもよい。しかしながら、温度依存性蛍光のモニタリングが、均一定量フォ−マットの一部を構成している場合には、ＰＣＲ増幅と温度依存性蛍光のモニタ−とは、反応チャンバ−を中途で開放せずに、同じ反応チャンバ−で実行されることが多くの場合望ましい。
【００２７】
従来技術において（米国特許第６，１７４，６７０号参照、なお、引用することによって本引例を本明細書に含めることとする）、融解分析は、融解中に温度依存性蛍光をモニタ−することによって実行可能であることが知られている。通常、融解曲線分析はできるだけゆっくりと行われる。これは、正確で、再現性の高いデ−タを得るためであり、融解点を正確に求めるためである。なお、融解点は、温度対蛍光プロットにおいて一次導関数の最大値と定義される。しかしながら、選択された時間パラメ−タが比較的短い場合、いくつかの利点が見られるだろう。例えば、冷却相での温度転移は少なくとも０．１℃／秒、好ましくは少なくとも１℃／秒であり、もっとも好ましくは少なくとも５℃／秒である。また例えば、融解相での温度転移は少なくとも０．０５℃／秒、好ましくは少なくとも０．２℃／秒、もっとも好ましくは少なくとも０．４℃／秒である。用途に応じて、短い冷却相と短い融解相とは結合してもよい。
【００２８】
例えば、蛍光信号発信はヌクレオベ−ス消光によって実現してもよい（ｖｏｎＡｈｓｅｎ　Ｎ．，　Ｌａｂｅｌｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｓｃａｎｎｉｎｇ：　　ｍａｋｉｎｇ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｕｓｅｏｆ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ　ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　（変異走査のための標識プライマー：ヌクレオベ−ス消光作用の診断への利用）Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　４９：３５５−６，　２００３）。この方法では、隣接ヌクレオベ−スの作用が蛍光放射に影響を及ぼす。ヌクレオベ−ス消光の例では、ＰＣＲアンプリコンがハイブリダイズして標識を内部に取り込むと、蛍光信号は増加する。同様に、例えば、蛍光信号は、ＰＣＲアンプリコンが融解すると減少する。しかしながら、使用する蛍光染料の種類や、隣接塩基の種類に応じて、ハイブリダイゼ−ション時に有意な信号の減少や、融解時には対応する増加が観察されることも可能である。融解中に蛍光増加を示す染料もあれば、融解時に蛍光減少を示す染料もあることを了解するならば、プライマー標識には広範な蛍光染料の使用が可能なわけである。フルオレセン、オレゴングリ−ン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｃｙ５、および、テキサスレッドは、全て良好な信号を与える。
【００２９】
オリゴヌクレオチドに付着する染料のほとんどは、そのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると蛍光を変化させ、かつ、二本鎖が融解すると逆方向に蛍光を変化させる。特に、ＳｉｍｐｌｅＰｒｏｂｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（Ｉｄａｈｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｂｉｏｃｈｅｍ）によるプライマーのＧ残基に結合したオレゴングリ−ンは、アンプリコン融解時に、見事な蛍光の減少を生じ、一方、プライマーのＣ残基に結合したＢＯＤＩＰＹ−ＦＬは融解時に見事な蛍光の増加を生じる。蛍光標識に関して唯一要求されることは、その結合する核酸が、相補鎖に、または、不完全相補鎖にハイブリダイズする時に、その蛍光強度が変化するということだけである。
【００３０】
従って、本発明の一つの特別な実施態様では、蛍光化合物を有するヌクレオチドはＧ残基である。使用する蛍光化合物に依って、これは多くの場合、融解時に蛍光信号の減少をもたらす。さらに特別な例として、このＧ残基はオレゴングリ−ンで標識されてもよい。ただし、本開示の範囲内において他の蛍光染料を用いてもよい。
【００３１】
また別の特別な実施態様では、蛍光化合物を有するヌクレオチド残基はＣ残基である。さらに詳しく言うと、このＣ残基は蛍光化合物としてＢＯＰＩＤＹ−ＦＬを有してもよい。ただし、本開示の範囲内において他の蛍光染料を用いてもよい。
【００３２】
一般に、染料をＧ残基に結合させた場合、その核酸が単一鎖構成を取ると、蛍光は消光する。二本鎖を形成すると、この作用は一部取り除かれるが、二本鎖が解離して蛍光を減少の方に傾けると、再び回復する。逆に、Ｃ残基に結合した染料は、通常、融解時に蛍光を増加させる。これは、Ｃ残基が、相補的Ｇにたいして隣接しなくなるからだと考えられる。しかしながら、融解時に蛍光が増加するか減少するかは、その他に、特異的な蛍光染料や、蛍光染料をオリゴヌクレオチドに結合させるリンカ−分子にも依存する。例えば、融解時に観察される蛍光変化の量や、その方向までもが、蛍光をプライマーに結合させるリンカ−分子に依存する。フルオレセンを、５’末端リン酸基に（または、直接ヌクレオベ−スに）たいし、Ａ、ＴまたはＧへのイソチオシアネ−ト結合を介して結合させた場合、その方向は通常（−）方向であり、変化量は小である。カルボキシフルオレセン結合の場合も、その方向は（−）方向であるが、変化量はかなり大きくなる。結合がＣ残基を通じて行われ、フルオレセンがイソチオシアネ−ト結合を介して結合する場合、方向は（＋）方向である。しかしながら、カルボキシフルオレセン結合の場合、方向は逆になり、僅かに（−）方向になる。また別の例では、蛍光標識を、その蛍光変化を融解時に減少するように変位させる塩基アナログ、例えばニトリインド−ルを介して結合させる。また、標識されるプライマーは、それぞれの蛍光化合物によってその５’末端において標識すると有利である。なぜなら、オリゴヌクレオチドの５’末端標識は、従来技術で既知の各種の方法によって、簡単で安価に実行が可能だからである。その他の構成も本発明の範囲内にあることを理解しなければならない。例えば、米国特許申請公刊第２００３００２２１７７号　Ｗｉｔｔｗａｒ　ｅｔ　ａｌ．　を参照されたい。本引例を引用することによって本明細書に含めることとする。実例を下記の表１に掲げる。
【００３３】
【表１】
2004033216.tif 000002
＜表の説明：
１．ｎは５−ニトロインド−ル塩基アナログ、ｐは３−ニトロインド−ル塩基アナログ、Ｆは５’末端に存在しない蛍光搬送体、Ｘは５’ＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＡＧＧＴ３’（配列番号１）（本文中に記載された、標的とは独立のプライマー尾部）、Ｙは５’ＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴ３’（配列番号２）（ＣＦＴＲ遺伝子座用のプライマーの内の一つ）、をそれぞれ表す。
２．ＤＮＡ断片は、後述する他の実施例と同様にして増幅し、融解曲線分析を行った。いくつかの場合において、標識オリゴヌクレオチドにたいして相補的な未標識鎖を合成し、過量に混合し、融解に先だってアニ−ルさせた（「合成」と表示）。合成二本鎖のほとんどは平滑末端を持つ。しかし、蛍光搬送体を塩基アナログに結合させる場合は、相補鎖は、その塩基アナログに隣接する一般的塩基までペアを組めるようにした（または、注記５に記載した例では蛍光搬送体の隣まで）。二本鎖の解離によって生じる蛍光の変化率（％）は下記のようにして求めた。即ち、融解転移前後の、直線性基礎値を、融解転移の中点（Ｔｍ）に外挿した。これらの基線とＴｍの交点は、その転移に固有な最大および最小蛍光値を定義する。最小蛍光値にたいする変化率（％）は、蛍光が融解と共に増加する場合には、（最大値−最小値）／最小値ｘ１００として、蛍光が融解と共に減少する場合には、（最小値−最大値）／最小値ｘ１００として計算した。
３．構造
2004033216.tif 000003
４．構造
2004033216.tif 000004
５．この場合、蛍光搬送体は５’末端には無く、５’塩基アナログとＧの間にある。与えられる相補鎖はこのＧまでしかペアを組まないから、蛍光搬送体と塩基アナログのオ−バ−ハングが生じることになる。＞
【００３４】
前述の実施態様では、蛍光は、蛍光共鳴エネルギ−転移（ＦＲＥＴ）関係にある染料同士の間の距離を変化させることなく、増加または減少する。本発明の文脈では、「ＦＲＥＴ−供与体−受容体関係」という用語は、供与体化合物と受容体化合物との間に、受容体化合物から観察可能な蛍光放射を生じさせるような、蛍光共鳴エネルギ−転移があることを意味する。本発明によれば、蛍光放射の変化は、ＦＲＥＴ関係にある染料同士の間の距離を変えることによってではなく、ヌクレオベ−ス消光作用によって引き起こされる。しかしながら、融解中に変化しないＦＲＥＴ関係は本発明の範囲内に含まれる。例えば、互いにＦＲＥＴペアを構成する供与体と受容体の複合体である、ＢｉｇＤｙｅｓ　（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｐｓｙｓｔｅｍｓ）　のような複合ＦＲＥＴ染料によって標識されたプライマーは、蛍光信号の変化が、ＦＲＥＴ関係の変化ではなく、主にＰＣＲ産物の融解によってもたらされるものである限り、本発明の範囲内に含まれる。同様に、向き合う鎖に発信体と消光体を有する二本鎖変位プライマーも、発信染料を有するプライマーが、ＦＲＥＴ関係の変化を巻き込むことなく、ＰＣＲ産物の融解信号を生成する主要媒体として作動する限り、本発明の範囲内に含まれる。
【００３５】
また別の実施態様では、蛍光化合物は、二本鎖核酸に結合する染料である。この二本鎖核酸結合性染料が、アンプリコンの複数の鎖の内の一つに組み込まれている限り（例えば、核酸増幅に使用される複数のプライマーの内の一つに結合する蛍光標識として）、生成される蛍光信号は融解ドメインに関連するだろう。この場合でも、他の標識法も本発明の範囲内にあることは理解される。
【００３６】
本発明のさらに別の態様は、未標識プライマーを適当に設計することによって人工的ＧＣクランプを導入することである。従って、本発明はさらに、一本のプライマーだけが標識され、さらに、未標識プライマーが、３−３０個のＧ残基またはＣ残基、好ましくは５−２０個のＧ残基またはＣ残基から成る５’尾部を有し、かつ、その尾部が標的核酸にたいして相補的では無いことを特徴とする、一つの例示の実施態様を目的とする。
【００３７】
ＰＣＲに言及しているのではあるが、従来技術で知られるその他の増幅法も、本発明の範囲内で使用可能であることを理解しなければならない。そのような方法としては、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、鎖変位増幅（ＳＤＡ）、核酸配列依拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ロ−リングサ−クル増幅（ＲＣＡ）等が挙げられるが、ただしそれらに限定されるものではない。これらの方法は必ずしも均一法として実施されるものではないけれども、融解度分析に先立って、その他の工程、例えば、制限酵素切断、鎖特異的末端標識、鎖特異的捕捉・固定化等と併用することも可能である。さらに、話は増幅および増幅後分析に言及しているが、本開示にかかる融解温度分析は、他の手段によって得られた核酸、例えば、制限酵素切断断片にたいして実行することも可能である。この制限酵素切断断片は、本申請書に記載される方法に従って、それ自体末端標識されてもよく、あるいは、標識参照鎖を混ぜて、融解温度分析に供してもよい。
【００３８】
本発明のさらにもう一つの態様は、上で開示した方法の内の一つを実行するための反応混合物に関する。さらに具体的に言うと、本発明による反応混合物は、
ポリメラ−ゼ、
デオキシヌクレオシド三リン酸またはその機能的アナログ、
少なくとも第一プライマーと第二プライマーとを含む複数のプライマーを含み、
ここに、前記第一プライマーは、標的核酸にたいして、それとハイブリダイズし、さらに、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
前記第二プライマーは、標的核酸の相補鎖にたいして、それとハイブリダイズし、さらに、ポリメラ−ゼによって鋳型依存性の合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
少なくとも一方のプライマーが蛍光性化合物によって標識され、この標識プライマーは、
ｉ）第一プライマー、
ｉｉ）第二プライマー、
ｉｉｉ）および、表示用プライマー
から成るグル−プから選ばれるものであり、
ここに、前記表示プライマーは、第一および第二プライマーが使用された場合にのみ増幅されるＤＮＡにたいし、それとハイブリダイズし、ポリメラ−ゼによって合成を始めるのに十分なほどの相補性を有し、
ここに、前記標識プライマーは増幅産物の一鎖の中に組み込まれ、かつ、蛍光体は、標的核酸の増幅時にサンプル中に存在するかも知れない他の蛍光体にたいして全くＦＲＥＴ−供与体−受容体関係を持たない。
【００３９】
さらに、本発明は、前述の反応混合物を調製するためのキットを目的とする。このキットは、次の化合物の内のいくつか、または、全てを含んでいてもよい。
ポリメラ−ゼ、
デオキシヌクレオチドまたはそのアナログ、
バッファ−、
標識プライマー、および／または、
一本以上の未標識プライマー。
【００４０】
本発明は、あらゆる種類の配列変動の分析にも使用が可能であり、従って、様々な技術分野に応用が可能である。
【００４１】
先ず第１の主要な態様として、本発明は、少なくとも１個以上の標的核酸配列について、単一塩基多型の検出を含めた（ただしそれに限定されない）多型の有無チェックのため上に開示された方法の使用に関する。適当な実験条件下では、融解曲線の形と位置は極めて再現性が良い。従って、従来未知の多型の有無の検出のために配列を分析することが可能であり、これによって、新規の配列変動を検出することになるかもしれない。
【００４２】
本発明の第二の態様は、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶまたはＨＰＶのような感染病パラメ−タの遺伝子型決定を含めた、微生物やウィルスの遺伝子型の決定のために、上に開示された方法や組成の使用に関するが、ただしそれらに限定されるものではない。従来分野で既知であるが、異なる系統の感染媒体同士の間にごく僅かにしか配列差が存在しないにも拘わらず、異なる病態を引き起こすことが時々ある。従って、この新規の発明は、早期、かつ、急速な遺伝子型確定のための感度の高いツ−ルを供給する。このツ−ルは、感染症にたいする適当な医学処置の選択をやり易くし、かつ、早める。
【００４３】
本発明のさらに別の態様は、対立遺伝子状態の決定のために上に開示された方法や組成の使用に関する。例えば、ホモ接合体配列の変動を区別することができれば、それは好都合である。融解曲線分析によってＡｐｏＥ　２／２，　３／３および４／４は簡単に区別される。Ｈｂ　ＡＡとＨｂ　ＳＳを区別するのはそれよりも難しいが、こうしたホモ接合体の変動でも区別することが可能である。なお、ＡｐｏＥホモ接合体は全てＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ置換によって異なり、一方、ＨｂＡＡとＨｂ　ＳＳはＡ／Ｔ：Ｔ／Ａ置換によって異なる。しかし、本発明によれば、野生型と同じＴｍを持つホモ接合体変種を検出する一つのやり方は、野生型をその未知のＤＮＡと混合することである。もしもホモの変種が存在するのであれば、得られるヘテロ二重鎖は、独特の低温度肩と平坦化ピ−クを呈することになる。分析対象が全濃度の５％未満の量として存在するＤＮＡ変種を検出することが可能なのであるから（例えば、図１３Ｂ参照）、本法は、ＤＮＡ濃度の変動にたいしても耐性が高い。
【００４４】
異なるヘテロ接合体は、多くの場合、各ヘテロ接合体が異なる二本のホモ二重鎖と、異なる二本のヘテロ二重鎖を生ずるため、区別できる。各二本鎖は固有の融解温度を持つから、４本全ての二本鎖を合わせると、観察される融解曲線が得られる。例えば、ベ−タ・グロビンＳＣヘテロ接合体は、他のヘテロ接合体よりも、長い低温度肩を持つ（図８および９）。これは、ＳＣヘテロ二重鎖が、他のヘテロ接合体では単一のミスマッチであるのにたいして、２箇所の隣接位置においてミスマッチがあるからである。様々な形の融解曲線が、存在するホモ接合体・ヘテロ接合体の、安定性および／または動的融解速度によって求められる。定常な実験条件下では、融解曲線は簡単に求められ、かつ、再現性も高い。
【００４５】
本発明はさらに、ＤＮＡ標本における標的遺伝子の対立遺伝子状態を確定する方法をも目的とする。本開示の方法によれば、ホモ接合状態とヘテロ接合状態とを簡単に区別することが可能であり、さらに、複数のホモ接合体を区別することも可能である。本申請書に開示される方法によって複数のホモ接合体を区別することが可能である一方で、増幅反応自体の前または後で、未知のＤＮＡ標本と、既知のホモ接合体ＤＮＡとを混合することも本発明の範囲内に含まれる。これは、より簡単なホモ接合体の確定を提供するかもしれない。
【００４６】
本発明のさらに別の実施態様では、核酸サンプルにおける標的核酸の配列変種を同定するための方法であって、前記標的配列は、第一鎖と、全体としてそれと相補的な第二鎖とを含み、ここに、第一鎖が蛍光化合物によって標識されることを特徴とする方法が提供される。この方法は、
増幅産物を変性して単一鎖とする工程、
それによって前記単一鎖を元に戻して二本鎖産物を形成するためにサンプルを冷却する工程であって、ここに冷却速度は少なくとも０．１℃／秒、好ましくは少なくとも０．２℃／秒、もっとも好ましくは少なくとも０．４℃／秒であり、
サンプルを熱勾配にかけ、同時に、増幅産物の標識鎖が、その相補鎖から解離することから生じる蛍光放射変化をモニタ−する工程であって、ここに、温度勾配内部における温度転移は、少なくとも０．０５℃／秒、好ましくは少なくとも０．２℃／秒、もっとも好ましくは少なくとも０．４℃／秒である、
の諸工程を含む。
【００４７】
この実施態様においては、配列変動は増幅無しでも検出が可能であることが理解される。別態様として、この方法を増幅後に使用してもよい。
【００４８】
（実施例）
ＰＣＲプロトコ−ル
標識オリゴヌクレオチドおよび未標識オリゴヌクレオチドは、ＩＴ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｏｐｅｒｏｎ，　またはＳｙｎｔｈｅｇｅｎから入手した。純度は、既述したように（Ｗｉｔｔｗａｒ，　Ｃ．Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２５：４３０−４４２，　２００１）吸光度によって評価した。ＰＣＲは、別様に指示しない限り、あらかじめ２０℃／秒の転移にプログラム設定し、Ｒｏｃｈｅ　ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにおいて１０μｌ容量で実行した。増幅混合物は、別様に指示しない限り、鋳型としての５０ｎｇのＤＮＡ、各２００μＭのｄＮＴＰ、０．４ＵのＫｌｅｎＴａｑ１ポリメラ−ゼ（ＡＢ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ社，　セントルイス、ミズ−リ州）、８８ｎｇのＴａｑＳｔａｒｔ抗体（ＣｌｏｎＴｅｃｈ社）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリスｐＨ８．３、５００μｇ／ｍｌの牛血清アルブミン、および、０．５μＭプライマーを含む。標識プライマーの代わりに、インディケ−タ−としてＳＹＢＲグリ−ンＩを用いた場合は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）のストック液の１：３０，０００最終希釈液を用いた。通常、融解分析は、サイクル反応の直後にＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて行った。場合によっては、毛細管サンプルを、煮沸浴に３秒間置き、氷水で３秒間冷却し、さらに、アルミニウム円筒中にてサンプルを０．３℃／秒で加熱し、熱電対から温度を１６ビットデ−タとして、また、毛細管先端の表面照射によって蛍光を１６ビットデ−タとして取得して、高解像度融解曲線を得た。
【００４９】
標識プライマーまたはＳＹＢＲグリ−ンＩによる嚢胞性線維症膜横断コンダクタンス制御（ＣＦＴＲ）遺伝子座の遺伝子型分析
ＣＦＴＲ遺伝子の４４塩基対から成る断片を、プライマーＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴ（配列番号３）およびＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡ（配列番号４）によって増幅した。前方向プライマーは、オレゴングリ−ンＳｉｍｐｌｅＰｒｏｂｅ　（Ｉｄａｈｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）として５’標識するか、または、ＳＹＢＲグリ−ンＩをこの反応に含めた。これらのプライマーは、Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｉ５０７ｄｅｌ、Ｆ５０８Ｃ変異を含む突然変異ホットスポットを挟んでいる。ＰＣＲを、８５℃と５８℃の間で（０秒間保持）４０サイクル実行した。最終の融解サイクルは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて９５℃へ加熱、５５℃へ冷却、次に上昇勾配０．２℃／秒にて連続的に蛍光を採光して行った。
【００５０】
冷却速度、加熱速度、および、Ｍｇ＋＋濃度のヘテロ二重鎖分析に及ぼす作用の分析
前述の４４ｂｐアンプリコンを用いて、冷却および加熱速度、および、Ｍｇ＋＋濃度の作用を、ヘテロ接合体Ｆ５０８ｄｅｌ　ＤＮＡを用いて調べた。増幅後、冷却速度の効果（８５℃から６１℃転移時にアニ−ルするアンプリコン）を、０．２℃／秒で融解し、２０、５、２、１、０．５、０．１または０．０５℃／秒で冷却して調べた。加熱速度（アンプリコン融解）については、２０℃／秒で冷却し、０．０５、０．１、０．２または０．４℃／秒で融解して調べた。陽イオン（Ｍｇ＋＋濃度）の作用は、４４ｂｐのアンプリコンの濃度において、ＭｇＣｌ２の濃度を１，２，３，４または５ｍＭとし、他の全ての濃度は一定となるように（アンプリコン、バッファ−等）調節して調べた。冷却速度は２０℃／秒とし、加熱速度は０．１℃／秒とした。
【００５１】
ＨＴＲ２Ａスニップ
各プライマーセットは、ＨＴＲ２Ａ遺伝子（Ｌｉｐｓｋｙ，　Ｒ．Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　４７：６３５−６４４，　２００１）のエキソン１内部の共通の多型（Ｔ１０２Ｃ）を挟んだ。１１５塩基対の断片を下記の前方向プライマーＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＴＡＣＡＧＴＡＡＴＧ（配列番号５）および逆方向プライマーＴＧＡＧＡＧＧＣＡＣＣＣＴＴＣＡＣＡＧ（配列番号６）にて増幅した。さらに、１５２塩基対と３０４塩基対の断片を、前方向プライマーＧＣＴＣＡＡＣＴＡＣＧＡＡＣＴＣＣＣＴ（配列番号７）と、逆方向プライマーＴＧＡＧＡＧＧＣＡＣＣＣＴＴＣＡＣＡＧ（配列番号８）およびＡＧＧＡＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＣＡＴＴＣ（配列番号９）にて、それぞれ、増幅した。前方向プライマーは、オレゴングリ−ンのＳｉｍｐｌｅ−Ｐｒｏｂｅ（Ｉｄａｈｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）として５’標識した。多型は、１１５ｂｐ産物の標識末端から数えて３０ｂｐ、１５２ｂｐと３０４ｂｐ産物の標識末端から６７ｂｐ離れていた。１１５ｂｐと１５２ｂｐ増幅は、９５℃と６０℃の間で２秒間保持、および、７４℃で１０秒間保持からなるサイクルを４０回サイクル行った。３０４塩基対増幅は、９５℃と７０℃の間で、７０℃で２０秒間保持からなるサイクルを４０サイクルさせた。全てのアンプリコンについて、最終融解曲線は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて９５℃へ加熱、５５℃へ冷却、次に上昇速度０．２℃／秒にて９５℃まで連続的に蛍光を採光して得た。
【００５２】
ベ−タ・グロビン突然変異（Ｈｂ　Ｓ，　ＣおよびＥ）
ＰＣＲは、ＫｌｅｎＴａｑを含む５０ｍＭトリスの代わりに、Ｔａｑポリメラ−ゼ（Ｒｏｃｈｅ社）を含む１００ｍＭ　２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパネジオ−ル、ｐＨ８．８にて行った。ベ−タ・グロビン遺伝子の１１３塩基対の断片を、プライマーＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴ（配列番号１０）およびＣＣＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＣＣＴＴＧ（配列番号１１）にて増幅した。第一プライマーは、オレゴングリ−ンＳｉｍｐｌｅ−Ｐｒｏｂｅ　（Ｉｄａｈｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）として５’標識した。これらのプライマーは、３個の単一塩基多型、ＨｂＣ　（Ｇ１６Ａ），　ＨｂＳ　（Ａ１７Ｔ）およびＨｂＥ　（Ｇ７６Ａ）を挟んでいた。
【００５３】
９５℃１０秒間の初回変性の後、サンプルを下記のプロトコ−ルに従って４５サイクルさせた。すなわち、９５℃で保持無し、５１℃で６秒保持、上昇速度１℃／秒で７２℃まで、７２℃では保持無しである。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ融解曲線は、９５℃へ加熱、６０℃へ冷却、次に、０．２℃／秒の上昇速度にて９５℃まで連続的に蛍光を採光した。いくつかの例では高解像度融解曲線を得た。
【００５４】
表示用プライマーシステム
ＣＦＴＲ遺伝子座における比較的長いアンプリコンには表示用プライマーシステムを用いた。前述の配列変動に加えて、多型１５０６Ｖについても調べた。この表示用プライマーシステムでは、遺伝子座特異的標識プライマーの代わりに、５’尾部を備える未標識プライマーを用いた。この５’尾部は、同じ反応に含まれるが遺伝子座特異的ではない、第三の標識表示用プライマーと相同である。遺伝子座特異的プライマーの一つに、相同な未標識５’尾部を単に付加することによって、様々な遺伝子座をこの同じ標識プライマーによって調べることも可能である（Ｎｕｏｖｏ，　Ｇ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．　４７：２７３−２７９，　１９９９）。２４３塩基対断片を、プライマーＡＧＡＡＴＡＴＡＣＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＡＧ（配列番号１２）（０．５μＭ）とＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＡＧＧＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡ（配列番号１３）（０．０５μＭ）によって増幅した。下線を施した配列は、表示用プライマー（オレゴングリ−ン）ＧＧＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＡＧＧＴ（配列番号１４）（０．５μＭ）にたいして相同な、標的と無関係な尾部である。ＰＣＲは９５℃と６５℃（２０秒）間の転移を１サイクルとして５０サイクルさせて、高解像度融解曲線を得た。
【００５５】
ヘテロ二重鎖検出感度試験（Ｉ５０６Ｖ）
ヘテロ二重鎖検出感度は、ヘテロ接合体Ｉ５０６Ｖ　ＤＮＡを野生型ＤＮＡに希釈して調べた。ヘテロ接合体Ｉ５０６Ｖ　ＤＮＡを、下記の割合（野生型：ヘテロ型）となるように野生型ＤＮＡと混合した。割合は、０：１、１：１、４：１、９：１、１９：１、４９：１および９９：１である。この２４３ｂｐ断片を増幅し、前述のように融解させた。
【００５６】
ＡｐｏＥ配列変動
アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の１８１塩基対断片を、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２と、プライマーＧＣＧＣＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣ（配列番号１５）およびＣＧＡＣＧＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣ（配列番号１６）によって増幅した。下線を施した配列は、増幅混合物に０．２５μＭで含まれる表示用プライマー（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ）−ＣＣＣＧＡＣＧＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡ（配列番号１７）の使用を可能とする、標的とは無関係の尾部である。これらのプライマーは、２個の共通多型、すなわち、ｅ３遺伝子型をｅ４遺伝子型に変えたＴからＣへの塩基変換、および、ｅ３遺伝子型をｅ２遺伝子型に変えたＣからＴへの塩基変換を挟んでいた。９８℃で１分の初回の変性後、サンプルを、９８℃（２秒）と７０℃間において７０と７８℃間の上昇速度を２℃／秒にした転移を１サイクルとして５０サイクルさせた。高解像度融解曲線を得た。
【００５７】
それぞれ異なる蛍光搬送体を備えた２個の標識プライマーによる多数対立遺伝子検出
アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の１８１塩基対断片を、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２と共に、プライマー（テキサスレッド）−ＧＣＧＣＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣ（配列番号１８）および（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ）−ＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣ（配列番号１９）によって増幅した。これらのプライマーは、２個の共通多型、すなわち、ｅ３遺伝子型をｅ４遺伝子型に変えたＴからＣへの塩基変換、および、ｅ３遺伝子型をｅ２遺伝子型に変えたＣからＴへの塩基変換を挟んでいた。９８℃で１分の初回の変性後、サンプルを、９８℃（２秒）と７０℃間において７０℃と７８℃間の上昇速度を２℃／秒にした転移を１サイクルとして５０サイクルさせた。高解像度融解デ−タを分析する。
【００５８】
一方は標識プライマー、他方の未標識プライマーにはＧＣクランプを用いて行った多数対立遺伝子検出
アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の１８１塩基対断片を、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２と共に、プライマー（ＧＣ）ｎ−ＧＣＧＣＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣ（配列番号２０）および（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ）−ＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣ（配列番号２１）によって増幅した。ここに、ｎは３−３０の中から選ばれる。アンプリコンの未標識末端を１回の転移で融解させるには、同末端を十分に安定化させるだけで十分である。これらのプライマーは、２個の共通多型、すなわち、ｅ３遺伝子型をｅ４遺伝子型に変えたＴからＣへの塩基変換、および、ｅ３遺伝子型をｅ２遺伝子型に変えたＣからＴへの塩基変換を挟んでいた。９８℃で１分の初回の変性後、サンプルを、９８℃（２秒）と７０℃（１０秒）間において７０と７８℃間の上昇速度を２℃／秒にした転移を１サイクルとして５０サイクルさせた。高解像度融解デ−タを分析した。
【００５９】
標識プライマーによるハプロタイプ分析
ハプロタイプを定義する配列変動が全て一本の標識プライマーの融解ドメインに含まれているならば、様々のハプロタイプを区別することは可能である。ハプロタイプの分類が望まれるならば、一つの実施態様では、ＧＣクランプを単一標識プライマーと併用して、ハプロタイプ領域を横断する一つのドメインを創成する。各ハプロタイプは特有の配列であるから、それらのホモ二重鎖融解曲線に基づいて区別が可能である。一つのサンプルの中に２個の異なるハプロタイプが存在するのであれば、２個のホモ二重鎖産物と、２個のヘテロ二重鎖産物が融解曲線を定義することになる。例えば、ＨＬＡ遺伝子座の増幅は、通常、ヘテロ接合体産物の増幅をもたらす。異なる遺伝子型は異なる融解曲線を呈するものであるから、ＨＬＡ遺伝子型分析も可能となる。
【００６０】
高度に多型に富む配列の遺伝子型分析
感染病を同定する場合、増幅配列は高度に多型に富むことがよくある。例えば、リボソ−ムＲＮＡをコ−ドするＤＮＡは極めて変動に富むので、細菌の遺伝子型分析に使用が可能である。同様に、多くのウィルスも極めて多型に富む。例えば、ヒト・パピロ−マウィルス（ＨＰＶ）にはたくさんのタイプがあり、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）には異なる遺伝子型があり、また、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）には異なる系統がある。これら様々なタイプや系統を確定することは、感染の予後診断や治療にとって重要である。プライマー用の共通配列領域を見つけるのが難しいことがある。
【００６１】
一つの実施態様では、先ず、区別しなければならないグル−プを表す、入手可能な全ての配列を並べる。対立遺伝子特異的増幅によって、各カテゴリーが異なるプライマー色に対応するそのようなカテゴリーに前記グル−プが分割されるように、プライマーを選択し、標識する。標的をＰＣＲで増幅し、高解像度融解曲線を入手する。例示の実施態様では、一般にヘテロ接合体は見られないものであるから、ゆっくりした温度転移を用いることも可能である。一つの例示の実施態様では、融解曲線分析を、別に急冷相を実行することなく、増幅の終了時に実施した。
【００６２】
デ−タ分析
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒおよび高解像度融解デ−タは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ付属のソフトウェア、または、ＬａｂＶｉｅｗに書き込まれている特注ソフトウェアを用いて分析した。図１−４に示すデ−タは、標準的なＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアによって分析した。図５−１４に示すデ−タは、下記の特性を持つ特注ソフトウェアを使用した。蛍光対温度プロットは、先ず、各サンプルについて融解転移前後のベースラインを定義して、０と１００の間に標準化した。それぞれのプロットを得るために、パ−セント標準化した蛍光強度を、前記２本のベースラインの間の、サンプルの蛍光強度パ−セントとして計算した。いくつかの例で、Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタ−法が、二次多項式と、１度間隔内に全ての点を含むデ−タウィンド−とともに用いられた（Ｗｉｔｔｗｅｒ，　Ｃ．Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　（リアルタイムＰＣＲ）、　ｉｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：　　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（診断用分子微生物学−原理と応用），　Ｄ．　Ｐｅｒｓｉｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．，　ｅｄｓ．，　ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ，　２００２）。融解曲線の導関数プロットは、各点におけるＳａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ多項式から求めた。
【００６３】
結果
最適なヘテロ二重鎖形成、および、標識プライマーとの融解に対する初期条件を、ＣＦＴＲ遺伝子の４４ｂｐ断片を用いて調べた。このような短いアンプリコンでは、ヘテロ二重鎖は融解すると、融解曲線導関数プロット上において明瞭なピ−クとして出現する（図１Ａ−Ｂ）。予期した通り、３ｂｐを欠損したヘテロ接合体（Ｆ５０８ｄｅｌおよびＩ５０７ｄｅｌ）は、単一塩基変化（Ｆ５０８Ｃ）よりも不安定なヘテロ二重鎖ピ−クをもたらす。Ｆ５０８Ｃ主要ピ−クは、実際に、野生型よりも高い温度で融解する。これは、ＴからＧへの変換がより安定化をもたらすことを反映している（Ｇｒｕｎｄｒｙ，　Ｃ．Ｎ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｅｓｔｉｎｇ，　３：３６５−３７０，　１９９９）。Ｆ５０８ｄｅｌとＩ５０７ｄｅｌのヘテロ接合体ピ−クはややずれている。ＳＹＢＲグリ−ンＩを、未標識プライマーによるＰＣＲに含めても、同じ条件下で明瞭なヘテロ接合体ピ−クは観察されなかった。
【００６４】
ヘテロ二重鎖が融解前の冷却速度に依存することは、急速な冷却が、特に比較的小さいアンプリコンの場合、著明なヘテロ二重鎖形成に重要であることを示している（図２Ａ−Ｂ）。４４ｂｐアンプリコンの場合、ヘテロ二重鎖は、冷却速度が０．１℃以下では観察されない。ヘテロ二重鎖形成は、５℃／秒を越える速度では平坦になるようである。しかし、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを５℃／秒と２０℃／秒で冷却するようにプログラム設定した場合、サンプルの温度転移速度にほとんど差は無かった。これは、ヘテロ二重鎖形成は、５℃／秒を越える速度でもなお増加し続けているかもしれないことを示唆する。実際、ヘテロ二重鎖形成の最大量は、毛管サンプルを煮沸水の中に入れ、直後に氷水の中で急冷した場合に見られた（デ−タ図示せず）。
【００６５】
より小さいアンプリコンでは、ヘテロ二重鎖は、より高い温度転移速度における融解中に、より著明となる（図３Ａ−Ｂ）。見かけのＴｍもまた、融解過程が平衡からずれるにつれて、転移速度が高くなればなるほど高温側に変位する（Ｇｕｎｄｙ，　Ｃ．Ｎ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｅｓｔｉｎｇ，３：３６５−３７０，　１９９９）。高い転移速度はまた、温度間隔あたり収得が可能な蛍光デ−タの数を制限することがある。
【００６６】
比較的最近の研究によって、より大きなアンプリコンは、より小さなアンプリコンに比べて、加熱速度や冷却速度にたいする依存度が低いことが示されている。例えば、１００ｂｐのアンプリコンでは、加熱速度や冷却速度の効果は小さく、２００ｂｐのアンプリコンでも、使用する加熱・冷却速度に依らず、結果はほぼ同様であるようだ。さらに、融解曲線分析に先立つ融解と再アニ−リングは、全ての用途において必要とされるわけではないということが理解される。本明細書で使用する場合、融解と再アニ−リングは、多くの場合増幅の伸長相の後で、複数の鎖を混ぜ合わせるヘテロ二重鎖の検出のために用いられる。ある種の用途では、特に、各種微生物やウィルスの場合のようにホモ二重鎖しか存在しない場合には、融解や再アニ−リングは必要とされない。また、短い縦列反復配列（ＳＴＲ）や、種々の数の縦列反復配列（ＶＮＴＲ）を含む標的配列を相手にする場合には、この融解・再アニ−リング工程を省略するのが好ましい。例えば、伸長反応後、ＶＮＴＲが変性した場合、ヘテロ二重鎖が生成されるばかりでなく、各種反復セグメントが適正な順序で再アニ−ルせず、極めて複雑な融解曲線をもたらすことがある。しかしながら、ＶＮＴＲ標的配列が、後に融解・再アニ−リングを要することなく増幅されるならば、存在するホモ二重鎖は、比較的簡単なやり方で融解し、存在する対立遺伝子の数を示す。
【００６７】
ヘテロ二重鎖の相対的パ−セントは、イオン強度が減少するにつれて増大する。最大効果はＭｇ＋＋において観察されるが（図４Ａ−Ｂ）、Ｋ＋やＴｒｉｓ＋でもこの効果を示す（デ−タ図示せず）。予期した通り、イオン強度はＴｍに影響を及ぼす。
【００６８】
アンプリコンのサイズが、ヘテロ二重鎖検出および遺伝子型分析に及ぼす効果を図５Ａ−Ｃに示す。ＨＴＲ２Ａ遺伝子における一つのＳＮＰに関する三つ全ての遺伝子型を分析した。すなわち、三つの異なるアンプリコンサイズを持つ、ホモ接合体Ｔ、ホモ接合体Ｃ、および、ヘテロ接合体である。ホモ接合体Ｃ遺伝子型は、ホモ接合体Ｔ遺伝子型よりも常により安定であり、このため、適当な対照が存在するならば、この二つのホモ接合体の区別は可能である。ヘテロ接合体転移は必ずホモ接合体よりも幅広いので、ヘテロ接合体曲線は、高温において、より不安定なホモ接合体曲線を横切ることになる。遺伝子型の間の違いは、アンプリコンサイズが増大するにつれて減少するけれども、３０４ｂｐのアンプリコンサイズでは、全ての遺伝子型が明瞭に区別された。
【００６９】
融解曲線の質や、異なる遺伝子型の区別能力は、使用される装置類の温度解像度、蛍光解像度および正確さに依存する。図６は、ベ−タ・グロビンの三つの遺伝子型、野生型（ＡＡ）、ＡＳおよびＳＣそれぞれについて、異なる二つのＤＮＡサンプルから得られた標準化融解曲線を示す。１１３ｂｐのアンプリコンを、０．２℃／秒の速度で一度に４個を融解させた。全ての遺伝子型を区別することが可能であったけれども、各トレ−スにかなりのノイズのあることが明らかである。図７Ａは、同じサンプルをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにおいて１回に１個走らせた場合を示す。より多くのデ−タ点が得られているが、曲線の外見上の品質はほぼ同じである。アナログ−デジタル変換の限界が明らかである。なぜなら、１２ビット温度変換器では、解像度を１℃当たり８−９区分に制限するからである。温度・蛍光を１６ビット変換すればはるかに良好な解像度を得ることが可能である（図８）。高解像度装置はまた、サンプル内でのより高い温度均一性を保証する。なぜなら、円柱状のキャピラリーが完全にアルミニウム製のシリンダーに囲まれるからである。本装置では、一時にただ１個のサンプルを操作しているだけであるが、０．３℃／秒融解曲線では３分未満の時間が必要であり、１℃当たり５０−１００個のデ−タが取得され得る。
【００７０】
６個の、もっとも一般的なベ−タ・グロビン遺伝子型に関する標準化融解曲線を図９に示す。４個のヘテロ接合体（ＡＣ、ＡＥ、ＡＳおよびＳＣ）全て明瞭にホモ接合体と区別され、かつ、ヘテロ接合体も全て互いに異なるように見える。このヘテロ接合体が区別可能であることを示すさらに別の証拠が図１０に示される。同図においては、単純なヘテロ接合体（ＡＣ、ＡＥおよびＡＳ）それぞれについて２個のＤＮＡサンプルを、２ＡＡ（野生型）サンプルと共に示す。一つの遺伝子型内では、トレ−スは緊密に重複する。
【００７１】
いくつかのＡＡおよびＡＣサンプルを融解させた場合、一つの異常ＡＣサンプルが、ＡＡグル−プとＡＣグル−プの間を通過した（図１１）。このＡＣサンプルは、以前に、ハイブリダイゼ−ションプロ−ブ融解曲線分析によってタイプ分けされたものであった（Ｈｅｒｍａｎｎ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．，　４６：４２５−４２８，　２０００）。その領域の配列を決定することによって、ＡＣ個体に見られたＧ１６Ａヘテロ接合体が確認されたが、同時に、配列決定によって、標識プライマーＴＧＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＣＴＧＡＣＴＣＣＴの下部にある、さらに別のヘテロ接合体位置が判明した。外見的には、部分的に対立遺伝子特異的増幅が起こり、これがＡＡアンプリコンの過剰生産を招き、ヘテロ二重鎖の減少を引き起こし、そのため、融解曲線をＡＡグル−プとＡＣグル−プの間に位置させることになった。この二つのホモ接合体（ＡＡとＳＳ）は、ＡからＴへの塩基変化から予期されたように識別は難しいが、Ｓｉｍｐｌｅ−Ｐｒｏｂｅ物質が無くとも、５’末端のＴ残基に結合したオレゴングリ−ンを用いることによって区別が可能である（結果は図示せず）。
【００７２】
図１２は、表示用プライマーを用いた場合の、２４３ｂｐＣＦＴＲアンプリコン内部における各種遺伝子型の、融解曲線導関数プロットを示す。４本のヘテロ二重鎖全てにおいて低温肩が示されており、ホモ接合体サンプルと区別することが明らかに可能である。野生型ＤＮＡに希釈されたＩ５０６Ｖ　ＤＮＡの検出感度を、図１３Ａ−Ｂの融解曲線導関数プロットで調べた。図１３Ａの四角で囲まれた領域を図１３Ｂで拡大した。９：１サンプル（Ｉ５０６Ｖ　ＤＮＡが５％）は、それよりも高い希釈度サンプルとは明らかに区別された。
【００７３】
６個の一般的なａｐｏＥ遺伝子型の標準化融解曲線を図１４に示す。これは、２個の単一塩基多型を挟む１８１ｂｐのアンプリコンを融解することによって得たものである。ホモ接合体は全て、塩基変化の安定性から予想される順序でＴｍに基づいて互いに区別することが可能である。しかしながら、３／４ヘテロ接合体は、３／３ホモ接合体と同じであり、また、２／３ヘテロ接合体は２／４ヘテロ接合体とほぼ同じである。すなわち、ａｐｏＥ４ハプロタイプは、Ｅ４がヘテロ接合体である場合、ａｐｏＥ３ハプロタイプと外見上近似する。
【００７４】
両方のプライマーを標識する時、一つはＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで、他方はテキサスレッドで標識すると、ａｐｏＥアンプリコン内部の両方の多型を検出することが可能である。温度依存性色補償を施した後（Ｗｉｔｔｗｅｒ，　Ｃ．Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２５：４３０−４４２，　２００１）で、ｅ３／ｅ４多型はテキサスレッドのチャンネルで検出され、ｅ３／ｅ２多型はＢＯＤＩＰＹ−ＦＬチャンネルで検出される。各標識プライマーは、その融解ドメイン内部の全ての多型を検出する。
【００７５】
もしもＧＣクランプを反対のプライマーに付加するならば、ａｐｏＥアンプリコンにおける両方の多型は、一つの標識プライマーによって検出が可能である。ＧＣクランプを用いない場合、ヘテロ接合体ではｅ３／ｅ４多型は見落とされる。ｅ３／ｅ４ヘテロ二重鎖は、標識プライマーを含めた他のアンプリコンよりも先に融解する（図１４）。ＧＣクランプの長さが増すにつれて、ｅ３／ｅ４遺伝子座は安定化されて、全アンプリコンが一つのドメインとして融解するようになる。ＧＣクランプがさらに長くなると、ＧＣクランプは、アンプリコンの残余部の後で融解するようになる。この場合でも、両方の多型の検出は可能である。
【００７６】
ハプロタイプ分析に対しては、各ハプロタイプは、特有のホモ二重鎖融解曲線を生ずるので、ハプロタイプの各二重結合は、２本のホモ二重鎖産物と、２本のヘテロ二重鎖産物とを生ずることになる。異なるヘテロ接合体の増幅は、異なる融解曲線を生ずることになるから（図１０）、ハプロタイプ分析による遺伝子型分析が可能である。区別され得る遺伝子型の数は、融解曲線デ−タの解像度に依存する。
【００７７】
高度に多型に富む配列は、遺伝子型分析することが困難である。標識プライマーを用いてこのような配列のタイプ分けをするための一つの設計案を図１５に示す。異なる放射周波数を持つ様々の染料で標識したプライマーを用いて対立遺伝子特異的増幅を用いて、グル−プをカテゴリー目に分別する。配列変動の程度に応じて、ほとんど変動が無い場合は、アンプリコンが長くなるように、広範な変動がある場合は、アンプリコンが短くなるように選択することができる。各色内において、産物を、その融解温度に基づいて分類する。多種多様な配列の区別が可能であり、これによって、複雑な遺伝子型分析作業のために、単純で、リアルタイムの技術が供給される。
【００７８】
これまでに、いくつかの好ましい実施態様を参照しながら本発明を詳細に説明してきたわけであるが、頭書の本発明の特質の中に記述され、定義されているような本発明の視野と精神の範囲内でなお変種・修正が存在する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ−Ｂは、嚢胞性線維症膜横断コンダクタンス調節遺伝子（ＣＦＴＲ）を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて、標識プライマー（図１Ａ）、またはＳＹＢＲグリ−ンＩ（図１Ｂ）を用いて行った遺伝子型分析を示す。
【図２】図２Ａは、ヘテロ二重鎖形成が、急速冷却の場合に、より多くなることを示す。ＣＦＴＲ遺伝子座におけるヘテロ接合体Ｆ５０８ｄｅｌ　ＤＮＡを、一方のプライマーを標識してＰＣＲ増幅した。サンプルを変性し、様々の速度で冷却し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて融解中のヘテロ二重鎖を観察した。図２Ｂは、ヘテロ二重鎖形成に及ぼす冷却速度の作用を模式図に表す。
【図３】図３Ａは、加熱が急速になるほど、ヘテロ二重鎖の観察が多くなることを示す。ヘテロ接合体Ｆ５０８ｄｅｌ　ＤＮＡを、一方のプライマーを標識してＰＣＲ増幅した。サンプルを変性し、冷却し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて融解中のヘテロ接合体を様々の加熱速度にて観察した。図３Ｂは、ヘテロ二重鎖形成に及ぼす加熱速度の効果を模式図に表す。
【図４】図４Ａは、様々のＭｇ＋＋濃度におけるヘテロ二重鎖形成を示す。ヘテロ接合体Ｆ５０８ｄｅｌ　ＤＮＡを、一方のプライマーを標識してＰＣＲ増幅した。Ｍｇ＋＋濃度は増幅後に調節し、ヘテロ二重鎖は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて融解中に観察した。図４Ｂは、ヘテロ二重鎖形成に及ぼすマグネシウム濃度の作用を模式図に表す。
【図５】図５Ａ−Ｃは、３個の異なる長さのアンプリコン、すなわち、１１５ｂｐ（図５Ａ）、１５２ｂｐ（図５Ｂ）、３０４ｂｐ（図５Ｃ）を用いて、一方のプライマーを標識して行ったＨＴＲ２ＡのＴ１０２Ｃ多型の遺伝子型分析を示す。各産物について、可能な三つの遺伝子型の全てが示されている。分析にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒが用いられた。
【図６】図６は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて標識プライマーを用いて行ったベ−タ・グロビン突然変異の遺伝子型分析を示す。野生型、ヘテロ接合体鎌状細胞（ＡＳ）、および、ヘテロ接合体ＳＣは二度試験した。一度に４サンプルを試験し、複数の試験によって得られたデ−タを組み合わせた。
【図７】図７Ａは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて標識プライマーを用いて行ったベ−タ・グロビン突然変異の遺伝子型分析を示す。野生型、ヘテロ接合体鎌状細胞（ＡＳ）、および、ヘテロ接合体ＳＣは二度試験した。一度に１サンプルを試験し、複数の試験によって得られたデ−タを組み合わせた。図７Ｂは、図７Ａの８４と８５℃の間の野生型トレ−スの内の一つの拡大図を示す。１２ビットアナログ−デジタル変換では温度解像度が限定されることを示す。
【図８】図８は、１６ビットの高解像度装置使用、標識プライマーによるベ−タ・グロビン突然変異の遺伝子型分析を示す。野生型、ヘテロ接合体鎌状細胞（ＡＳ）、および、ヘテロ接合体ＳＣは二度試験した。一度に１サンプルを試験し、複数の試験によって得られたデ−タを組み合わせた。
【図９】図９は、１６ビットの高解像度装置使用、標識プライマーによる、６個のもっとも一般的なベ−タ・グロビン遺伝子型の分析を示す。野生型トレ−スとＳＳトレ−スはほぼ同様であるが、ヘテロ接合体（ＡＣ、ＡＥ、ＡＳおよびＳＣ）は全て、蛍光対温度プロットにおいて特有の経路を辿っている。
【図１０】図１０は、高解像度融解による、野生型と、ベ−タ・グロビンヘテロ接合体の差を示す。野生型、ＡＣ、ＡＥ、および、ＡＳ遺伝子型は、２つずつ示されている。
【図１１】図１１は、ＡＣの異常なヘテロ接合体が同定されたことを示す。５個の異なるＡＣサンプル（通例の隣接ハイブリダイゼ−ション・プロ−ブにてタイプ分けした）、および、４個の異なる野生型サンプルを高解像度融解によって分析した。そのトレ−スが野生型とＡＣグル−プの間を通る一つのＡＣサンプルを除いては、野生型とＡＣグル−プは明瞭に区別された。この異常サンプルの配列決定をしたところ、プライマー配列の一つの中に、もう一つのヘテロ接合体塩基を持つＡＣ遺伝子型であることが判明した。
【図１２】図１２は、標識表示プライマーによる遺伝子型分析を示す。ＣＦＴＲ遺伝子の２４３ｂｐ断片を、３個のプライマーの存在下に増幅した。すなわち、標識表示プライマー、その表示用プライマー（インディケ−タ−）と相同な５’尾部を持つ未標識プライマー、および、もう一つの逆方向プライマーである。ＰＣＲを多数サイクル行うと、インディケ−タ−の配列はＰＣＲの最終産物中に組み込まれる。野生型ＤＮＡ、２個の３塩基欠失突然変異（５０８ｄｅｌと５０７ｄｅｌ）、および、２個の単一塩基多型（５０８Ｃと５０６Ｖ）のトレ−スを示す。
【図１３】図１３Ａは、２４３ｂｐＣＦＴＲ断片と標識表示プライマーを用いて野生型ＤＮＡにおいてＩ５０６Ｖ　ＤＮＡを検出する際の検出感度を示す。対立遺伝子の相対濃度は、５０％（ヘテロ接合体ＤＮＡ）から０．５％（９９：１）まで変動した。図１３Ｂは、図１３Ａの８０と８１℃の間の拡大図を示す。より広まっていない対立遺伝子５％を含むサンプルは、それよりも高い希釈度と明瞭に区別される。
【図１４】図１４は、標識表示プライマーと１８１ｂｐアンプリコンによるａｐｏＥ遺伝子型分析を示す。ホモ接合体同士（２／２、３／３および４／４）は全て明瞭に区別されたが、３／４ヘテロ接合体は３／３ホモ接合体とほぼ同様に見え、２／４ヘテロ接合体は２／３ヘテロ接合体とよく近似している。
【図１５】図１５は、高度に多型に富む配列をタイプ分けするためのスキームを示す。対立遺伝子特異的増幅を用いて、可能な全ての遺伝子型を、標識プライマーを用いて別々の色に分別する。次に、高解像度融解分析によって、各遺伝子型のＴｍと融解曲線に基づいて、各色グル−プを特異的遺伝子型に分ける。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【外国語明細書】
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