(57)【要約】【課題】複数個の細胞が中空部内で一列に整列保持できる中空繊維の提供。【解決手段】固定する細胞の大きさに応じて中空部の径を設計した中空繊維を使用し、その中空繊維に細胞を１細胞づつ整列させることにより、効率よく細胞を整列保持することができる。さらには、中空繊維に排出手段を具備することにより、整列した細胞を１個づつ固定及び排出が可能となる。よって、従来、熟練を要し、処理にかなりの時間を要するとされてきたマイクロインジェクションを、連続的に且つ確実に実施することが可能となる。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数個の細胞を中空部内で一列に整列保持するための中空繊維。
【請求項２】
細胞が浮遊細胞である請求項１記載の中空繊維。
【請求項３】
中空繊維の内径が２００μｍ以下である請求項１又は２記載の中空繊維。
【請求項４】
中空繊維の光透過係数が７０％以上である請求項１〜３のいずれかに記載の中空繊維。
【請求項５】
中空繊維の先端部が鋭角に加工されている請求項１〜４のいずれかに記載の中空繊維。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の中空繊維に、細胞の排出手段を具備した中空繊維。
【請求項７】
排出手段がシリンジである請求項６記載の中空繊維。
【請求項８】
以下の工程を含むマイクロインジェクション法。
（１）　　　　請求項６又は７記載の中空繊維の中空部に、細胞を一列に整列保持する工程。
（２）　　　　中空繊維の先端部に細胞を固定する工程。
（３）　　　　固定した細胞に物質を導入する工程。
（４）　　　　物質を導入後、細胞を排出し、さらに新たな細胞を固定する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数個の細胞が中空部内で一列に整列保持できる中空繊維に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、動物の卵や培養細胞の核、細胞質などに核や種々の細胞を注入する方法として、マイクロインジェクション法が用いられており、遺伝子操作動物の作成、遺伝子、タンパク質、抗体等の導入による遺伝子機能解析などに用いられている。
【０００３】
マイクロインジェクション法は、個々の細胞にマイクロピペットを用いて確実に遺伝子等の物質導入を行う手法である。マイクロインジェクション法は、細胞へ物質を導入する最も確実な方法であるが、血液細胞のように液体中に浮遊する細胞を用いる場合は操作毎に１個づつ細胞を固定する必要があるため時間を要し、処理能力が低いという問題点があった。さらには、高い成功率で物質導入を達成するためには、かなりの熟練を要するという問題点もあった。
【０００４】
その欠点を解決する手段として、細胞を固定する支持体などについて、いくつかの検討がなされている。例えば、貫通穴を有する基板に吸引等を利用して細胞を固定する方法（特開平１１−１１２９７６号、特開２０００−２３６５７号公報参照）が挙げられる。この方法は、多数の細胞を一度に固定できるため有用である。しかし、固定する細胞の形状、大きさ等を均一と仮定しているため、実際の刺入操作の際に、細胞に針が刺さらないか、細胞が破壊される問題があった。また、双眼顕微鏡下では細胞が平面にしか見えないため、刺入操作を実施したと思っていても、実際は刺入操作が完了していない問題があった。
【０００５】
また固定する細胞がプラスチック等に付着する性質を持つ場合、マイクロピペット等の先端への固定操作は比較的容易に達成されるが、血液細胞などの浮遊細胞では非常に困難である。そのような細胞の固定方法としては、上述の吸引固定やプレート上への固定が例示できるが、吸引固定の場合は吸引されているだけなので、固定が非常に不安定である。さらには１個づつ吸引固定するには、相当の時間と労力を費やす。また、プレート上への固定は、大掛かりな装置が必要となり簡易的ではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記課題を解決した細胞保持用の中空繊維を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、固定する細胞の大きさに応じて中空部の径を設計した中空繊維を使用し、その中空繊維に細胞を１細胞づつ整列させることにより、効率よく細胞を整列保持できることを見いだし、本発明に至った。
さらには、その中空繊維に、中空繊維内で整列した細胞の排出手段を具備することにより、細胞を１細胞づつ、且つ連続的に送り出すことができることを見いだし、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、複数個の細胞を中空部内で一列に整列保持するための中空繊維、である。整列保持する細胞は、浮遊細胞であることが好ましい。また、中空繊維の内径が１００μｍ以下であり、中空繊維の光透過係数が７０％以上であることが好ましい。本発明の中空繊維の実施形態に応じて、中空繊維の先端部が鋭角に加工されている場合もある。
上記の中空繊維には、細胞の排出手段を具備していることが好ましい。排出手段としては、簡便性を考慮しシリンジが好ましい。
さらには、細胞の排出手段を具備した中空繊維は、マイクロインジェクション法に使用される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、中空繊維は中空管状体をいい、キャピラリーと同義で使用される。中空繊維の材質としては合成繊維、半合成繊維、再生繊維、無機繊維のごとき化学繊維、及び天然繊維等が挙げられる。
【００１０】
合成繊維の代表例としては、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系の各種繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリエステル系の各種繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系の各種繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系の各種繊維、ポリビニルアルコール系の各種繊維、ポリ塩化ビニリデン系の各種繊維、ポリ塩化ビニル系繊維、ポリウレタン系の各種繊維、フェノール系繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系の各種繊維などが挙げられる。また、衣料用以外の、例えば、ポリメチルメタクリレートやポリスチレン、ポリカーボネートなどの透明非晶質高分子を主材料とした光学繊維なども用いることができる。
【００１１】
半合成繊維の代表例としては、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、キチン、キトサン等を原料としたセルロース系誘導体各種繊維、プロミックスと呼称される蛋白質系の各種繊維などが挙げられる。
再生繊維の代表例としては、ビスコース法や銅−アンモニア法、或いは有機溶剤法によるセルロース系の各種再生繊維（レーヨン、キュプラ、ポリノジック等）などが挙げられる。
【００１２】
無機繊維の代表例としては、ガラス繊維、炭素繊維などが挙げられる。
【００１３】
天然繊維の代表例としては、綿、亜麻、苧麻、黄麻などの植物繊維、羊毛、絹などの動物繊維、石綿などの鉱物繊維などが挙げられる。
【００１４】
中空繊維の内径は、物質が導入される細胞の大きさにより適宜選択される。中空部に細胞を１個づつ一列に整列させる必要がある。細胞の大きさの不均一性を考慮すれば、内径は、ヒトを含めたほ乳動物において小型の血液細胞（直径約１５μｍ）から最大の卵細胞（直径約２００μｍ）に対応すべく１０〜２００μｍ程度に設計することが好ましい。
【００１５】
また中空繊維の外径は、特に限定されるものではないが、内径が小さいため、内外径比（内径／外径）が大きいと中空繊維が肉薄となり、中空繊維の物理的強度が低下し、操作性が悪くなる。よって、中空繊維の内外径比（内径／外径）は０．８以下が好ましい。
【００１６】
中空繊維は、透明材料から作成することにより、中空部内の細胞を外部から観察することができる。この場合、中空繊維の材料は、光透過率にて７０％以上の材料からなるものが好ましい。具体的には、ガラス繊維、透明非晶質合成繊維（ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリカーボネート）等である。
【００１７】
上述の中空繊維の製造方法としては、溶融紡糸法、溶液紡糸法などによって作成することができる。これらの方法は、使用する材料により適宜選択される。またポリメチルメタクリレート、ポリカーボネートなどの透明非晶性材料に関しては、任意の外径、内径を有するパイプを成型し、パイプの一部を加熱するし、延伸することによって中空繊維を製造することができる。このとき、加熱温度、延伸速度などを調整することによって、内径、外径を制御した中空繊維を作成することが可能である。
【００１８】
本発明において、中空繊維内に整列させる細胞の種類は特に限定されない。本発明の中空繊維は細胞の大きさに対応して内径が設計されるため、ほ乳動物のほぼ全ての細胞を中空繊維の長手方向に１個づつ整列させることができる。
【００１９】
整列の方法としては、中空繊維に適当な排出手段を具備することにより実施される。中空繊維に具備する排出手段としては、例えばシリンジが使用される。シリンジの先端に本発明の中空繊維を接続し、シリンジ内を細胞培養液で満たし、シリンジのピストン部分を加圧する。加圧により、細胞は中空繊維内に導入され、一列に整列保持される。また、排出手段は、加圧度合を調整することにより、細胞の固定、排出も可能とする。
【００２０】
次に上述の中空繊維及び排出手段をマイクロインジェクション法に適用する際の好ましい実施形態を、図面を使用して説明する。しかし、本発明の中空繊維の用途はマイクロインジェクションに限定されない。
【００２１】
マイクロインジェクション法では、顕微鏡下で細胞の位置を確認しながら細胞に物質導入を行う。よって、上述の光透過率の高い中空繊維を使用することが好ましい。また、中空繊維の先端を鋭角に加工することによって、中空繊維から排出された細胞を脱落させずに保持することができる。中空繊維の先端は、研磨することなどにより平滑にすることが好ましい（図１参照）。
【００２２】
次に中空繊維は、中空繊維内の細胞を排出する手段に接続される。細胞を排出する手段としては、排出速度を調整するために一定圧力に保てる装置などが好ましい。より簡便に実施するには、図２に示すように、中空繊維１１にシリンジ１２を接続し、ピストン１３を加圧することにより、細胞を中空繊維内に導入し、整列保持する。シリンジへの中空繊維の固定は、一般的な接着剤等で固定する（１４は連結部を示す）。その際、接着剤は中空繊維の材質に悪影響を与えないものを選択する。中空繊維として、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネートなどを用いる場合には、ウレタン、エポキシなどの接着剤を用いることが好ましい。
【００２３】
次に図２の装置を使用したマイクロインジェクション法を、図３に従い説明する。シリンジ２１内に満たされている細胞２２は、シリンジのピストン２３を加圧することにより、中空繊維２４内で一列に整列固定される。排出速度、即ち加圧度を調整することにより、中空繊維の先端に露出した細胞２５を固定する。固定された細胞２５は、顕微鏡で観察しながら、マイクロインジェクション装置２６を使用し、注入する目的物質２７を細胞２５に導入する。導入操作終了後、細胞２５を排出し、次の細胞を同様の方法で固定し、物質導入を繰り返す。
【００２４】
上述の方法のように、本発明の中空繊維を使用することにより、従来、熟練を要し、処理にかなりの時間を要するとされてきた細胞への物質導入を、連続的に且つ確実に実施することが可能となる。さらには、本発明の中空繊維は、プラスチック、ガラス等に付着しない浮遊細胞への物質導入に非常に好ましい。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例を使用し、本発明をより詳細に説明する。
＜実施例１＞
外径１０ｍｍ、内径３ｍｍのポリメチルメタクリレート製パイプを用い、パイプの一部を１８０℃で加熱し、一定速度にてパイプを送りながら下部を延伸することによって、外径２７０μｍ、内径１９μｍの中空繊維を作成した。
次に、容量１ｍｌのシリンジの先端部（針は除く）に上記の中空繊維（５０ｍｍ長に切断。片端は鋭角に切断した。）をポリウレタン接着剤（日本ポリウレタン工業　コロネート４４０３　ニッポラン４２７６）で接続・固定した（図４参照）。硬化後、水を流すことによって流路ができていることを確認した。
シリンジの溶液溜め部分に、リンパ球細胞培養液を導入し、ピストンで圧力をかけることにより、細胞の放出を試みた。結果、細胞は１細胞づつ放出され、圧力を調整することにより、中空繊維の先端部で保持されることが顕微鏡下で確認できた。
【００２６】
【発明の効果】
中空繊維に細胞を１細胞づつ整列させることにより、効率よく細胞を整列保持できる。さらには、中空繊維に排出手段を具備することにより、整列した細胞を１個づつ固定及び排出が可能となる。よって、従来、熟練を要し、処理にかなりの時間を要するとされてきたマイクロインジェクションを、連続的に且つ確実に実施することが可能となる。
【００２７】
【図面の簡単な説明】
【図１】中空繊維内で整列保持された細胞を示す模式図である。
【図２】排出手段を具備した中空繊維を示す模式図である。
【図３】図２の中空繊維をマイクロインジェクションに応用した例を示す図である。
【００２８】
【符号の説明】
１　中空繊維
２　細胞
１１　中空繊維
１２　シリンジ
１３　ピストン
１４　連結部
２１　シリンジ
２２　細胞
２３　ピストン
２４　中空繊維
２５　露出した細胞
２６　マイクロインジェクション装置
２７　目的物質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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