(57)【要約】【課題】核酸を吸着した多孔質体フィルターを高温条件下に置く必要がなく、核酸をより迅速に溶出する方法を提供する。【解決手段】多孔質体からなるフィルターに吸着された核酸を活性酸素処理することによって溶出させる核酸溶出方法。【選択図】　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（１）粘度増加剤を含まない溶液中で細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（２）細胞抽出液を多孔質体からなるフィルターで濾過して、細胞抽出液中の核酸をフィルターに吸着させる工程；
（３）該フィルターに吸着された核酸を断片化して溶出する工程；
を含む、多孔質体からなるフィルターを用いて細胞を含む試料から細胞の核酸を調製する方法。
【請求項２】
多孔質体からなるフィルターが不織布である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
活性酸素を用いて核酸を断片化する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
還元糖に二価の金属イオンを添加して発生させた活性酸素を用いる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
活性酸素が過酸化水素である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
過酸化水素に二価の金属イオンを添加して発生させた活性酸素を用いる、請求項３記載の方法。
【請求項７】
酵素を用いて核酸を断片化する、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を吸着した多孔質体フィルターから核酸を迅速に溶出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フィルターを用いて細胞から核酸を精製する方法が開示されている。ＷＯ００／２１９７３号で開示されている方法では、
（１）まず、細胞を含む試料をフィルターにかけて細胞をフィルターに吸着させ、
（２）次にフィルターに吸着された細胞を溶解し、
（３）フィルターで濾過し、
（４）フィルターに吸着された核酸を洗浄し、そして
（５）最後に、核酸をフィルターから溶出する。
【０００３】
該発明のフィルターに吸着された核酸を溶出する方法としては、４０℃から１２５℃の温度に加温して溶出する方法が記載されており、溶出バッファーのｐＨは５から１１の範囲で、塩濃度は高くても低くても良いことが記述されている。
【０００４】
また、米国特許第５１８７０８３号および米国特許第５２３４８２４号では、血液細胞を界面活性剤で溶解してからポアサイズが０．２μｍから０．８μｍのフィルターにかけてＤＮＡを精製するという方法を開示している。米国特許第５２３４８２４号でクレームしている方法は、血球から純粋なＤＮＡを迅速に調製する方法であって次の工程を含む。（１）高剪断力がかからないように２分から４０分かけて界面活性剤と粘度増強剤を含む溶液でゆるやかに細胞を溶解させて細胞のＤＮＡを含む溶解液を調製する。この時、ＤＮＡはフィルターにトラップされるように十分大きな分子量を持っている必要がある。次に、（２）この抽出液を０．２μｍから０．８μｍの孔径を持ったフィルターで濾過してＤＮＡをフィルターにトラップする。それから（３）フィルターを純水中で約１００℃５分から１５分間加熱してＤＮＡを抽出する。溶出液は、１００ｍＭ以下のマグネシウムまたはカルシウムを含んでいてもよい。
【０００５】
本発明者は、特願２００１−２０８５１４号で多孔質体からなるフィルターを用いて、細胞から核酸を抽出、精製する簡便な方法を開示した。該発明は、
（１）粘度増加剤を含まない溶液中で細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（２）細胞抽出液を多孔質体からなるフィルターで濾過して、細胞抽出液中の核酸をフィルターに吸着させる工程；
（３）フィルターを洗浄する工程；および
（４）マグネシウムとカルシウムのいずれの２価カチオンも含まない溶液中でフィルターから核酸を溶出する工程；
からなる、多孔質体からなるフィルターを用いて細胞を含む試料から細胞の核酸を調製する方法を含んでいる。多孔質体からなるフィルターに吸着された核酸は高塩濃度のバッファーで溶出されず、また核酸の吸着はフィルターの表面荷電が正でも負でも同じように起こる。該発明で開示された溶出法の一例は、ＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８；１ｍＭ　ＥＤＴＡ）にフィルターを浸して８０℃で６０分間保温するというものであり、溶出されてくる核酸のサイズは数ｋｂから数１０ｋｂであった。
【０００６】
また本発明者は、特願２００１−３２２４９４号で多孔質体に吸着させた核酸を溶出させる方法を開示した。該発明は、
（１）粘度増加剤を含まない溶液中で細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（２）細胞抽出液を多孔質体からなるフィルターで濾過して、細胞抽出液中の核酸をフィルターに吸着させる工程；
（３）フィルターを洗浄する工程；および
（４）該フィルターに吸着された核酸をアルカリ処理して溶出する工程；
からなる、多孔質体からなるフィルターを用いて細胞を含む試料から細胞の核酸を調製する方法を含んでいる。該発明で開示された溶出法は、４０℃から１００℃の温度範囲でアルカリ処理するというものである。
【０００７】
一方、活性酸素は、「活性酸素」（「蛋白質核酸酵素」　臨時増刊、Ｖｏｌ．３３、ＮＯ．１６）や「抗酸化物質のすべて」（先端医学社）に詳しく記載されている。これによると狭義の活性酸素とは、３Ｏ２の１電子還元種であるスーパーオキシド（Ｏ２・−）、２電子還元種である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、電子励起状態の酸素分子種である１重項酸素（１Ｏ２）、及びヒドロキシラジカル（ＨＯ・）であり、広義には、金属―酸素錯体（金属オキソ酸も含む）を主として、これら活性種と生体分子との反応に由来するペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）、アルコキシラジカル（ＬＯ・）、ヒドロキシペルオキシド（ＬＯＯＨ）、一酸化窒素（ＮＯ）なども活性酸素の範疇に含まれる。活性酸素を用いて核酸を溶出させることに関しては全く報告されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、核酸を吸着した多孔質体フィルターを高温条件下に置く必要がなく、また核酸をより迅速に溶出する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく種々検討した結果、意外なことに、活性酸素等を用いてフィルター上の核酸を断片化して溶出させることが可能であり、溶出した核酸を用いてＰＣＲ等の解析も可能であることを見出し、本発明を完成させるに到った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の工程：
（イ）粘度増加剤を含まない溶液中で細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（ロ）細胞抽出液を多孔質体からなるフィルターで濾過して、細胞抽出液中の核酸をフィルターに吸着させる工程；
（ハ）該フィルターに吸着された核酸を断片化して溶出する工程；
を含む、多孔質体からなるフィルターを用いて細胞を含む試料から細胞の核酸を調製する方法。
（２）多孔質体からなるフィルターが不織布である、（１）記載の方法。
（３）活性酸素を用いて核酸を断片化する、（１）記載の方法。
（４）還元糖に二価の金属イオンを添加して発生させた活性酸素を用いる、（３）記載の方法。
（５）活性酸素が過酸化水素である、（３）記載の方法。
（６）過酸化水素に二価の遷移金属イオンを添加して発生させた活性酸素を用いる、（３）記載の方法。
（７）酵素を用いて核酸を断片化する、（１）記載の方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、以下の工程：
（１）粘度増加剤を含まない溶液中で細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（２）細胞抽出液を多孔質体からなるフィルターで濾過して、細胞抽出液中の核酸をフィルターに吸着させる工程；
（３）該フィルターに吸着された核酸を断片化して溶出する工程；
を含む、多孔質体からなるフィルターを用いて細胞を含む試料から細胞の核酸を調製する方法である。
【００１２】
本発明において多孔質体からなるフィルターとは、一方の面から他方の面に連通する多数の微細な孔を有し、核酸を選択的に分離除去できる平均孔径を有する通気性のフィルターを意味する。多孔質体からなるフィルターの孔の形状やその連通状態、フィルターの厚さ、材質、形状、寸法等は特に問わず、多孔質体からなるフィルターはフィルム、シート、膜、板、塊状、繊維状、粒状等の任意の形態であることができる。多孔質体からなるフィルターは有機材料および無機材料のいずれからなっていてもよく、また天然材料、合成材料または半合成材料からなっていてもよい。多孔質体からなるフィルターの例としては天然、合成、半合成、再生の有機または無機繊維からなる多孔質体；　有機または無機発泡体（例えばスポンジ、フォームなど）；　孔成分の溶出、焼結、延伸、穿孔などにより孔形成された有機、無機多孔質体；　有機または無機の微粒子や細片を充填または結合した多孔質体などを挙げることができる。例えば、繊維からなる多孔質体フィルターの場合は、繊維は有機または無機の短繊維、スライバー、長繊維のいずれからなっていてもよく、しかもフィルターの形態は、単なる繊維の塊でもよく、また不織布または織布よりなる繊維布層の１層または複数層でもよい。しかし織布および不織布の方が、一般に単位重量あたりの表面積が大きく、更に液の流れる方向におけるフィルターの厚みを薄くすることができる。このため圧力損失が小さく、大きな溶液処理速度を出せるようになるので、織布および不織布の方が好ましい。更に、製造の容易さの点から不織布が最も好ましく用いられる。ここで、不織布とは、編繊によらずに繊維あるいは糸の集合体が、化学的、熱的、または機械的に結合された布状のものをいう。なお、繊維と繊維とが互いに接触して摩擦により、或いは互いにもつれあうことなどにより一定の形状を保っている場合、これも機械的に結合されたことに含める。織布とは、縦糸と横糸とが交錯してできた布地を意味する。
【００１３】
本発明において、細胞とは、特に限定するものではないが、例えばヒト細胞、特にヒト末梢血白血球、酵母などの真核性単細胞生物、真菌、細菌、ウィルスなどを意味する。
【００１４】
本発明において、細胞を含む試料とは血液、尿、髄液、喀痰、体液、細胞浮遊液、細胞培養液など細胞を含むものならどのようなものであってもよい。また、それらの試料に何らかの処理をほどこした処理液であっても良い。処理の方法としては、例えば、喀痰のような粘性の高い試料を喀痰処理剤により溶解するなどの方法が考えられる。
【００１５】
本発明において、細胞抽出液とは細胞を破壊して得られる細胞の構成成分をすべて含む混合物のことで、細胞を含む試料に細胞溶解液を作用させて作製することができる。細胞溶解液とは細胞を破壊して核酸を抽出するために用いられる溶液のことで、界面活性剤、酵素、ＥＤＴＡなどを含むが、これらをすべて含む必要はない。界面活性剤としては、ノニオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）、イオン性界面活性剤、例えばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＮＬＳ（Ｎ−ラウロイル硫酸ナトリウム）などが使用できる。酵素としては、蛋白質分解酵素、例えばＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫなどを用いるが、細胞種によってはリゾチーム、リゾスタフィン（スタフィロコッカス属）、β１，３−グルカナーゼ、マンナーゼ、キチナーゼ（真菌類）なども用いられる。ＲＮＡを除いた方が好ましい場合には、ＲＮａｓｅＡのようなＲＮＡ分解酵素を加えれば良い。また、酵素は含まなくとも良い。動物細胞では低張液に接触させるだけで細胞を破裂させることも可能である。ＥＤＴＡはＤＮＡ分解酵素を阻害するために用い、通常２５ｍＭの濃度で使用する。また細胞抽出液は、細胞を含む試料に超音波をかける、あるいは、ホモジナイザーで破砕するなど物理的な力を加えて作製することも可能である。
【００１６】
本発明の核酸吸着フィルターを作製する場合、細胞抽出液を多孔質体からなるフィルターで濾過して、細胞抽出液中の核酸をフィルターに吸着させる工程の後に、フィルターを洗浄する工程を加えた方が好ましい。洗浄は、フィルターに付着した蛋白質、脂質などの物質を洗い流すために行う。洗浄液には、ＳＤＳやトリトンＸ−１００などの界面活性剤、０．５Ｍ以上のＮａＣｌなどの塩溶液などを使用するが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、付着した物質の種類に応じて選択すればよい。また場合によっては、洗浄工程を省略することも可能である。
【００１７】
本発明において、粘度増加剤とは溶液の剪断力によってＤＮＡが切断されないように溶液に添加される、溶液の粘度を高く保つための試薬であって、例えばポリビニルアルコール、アガロース、ゼラチン、ポリビニルピロリジンなどがある。
【００１８】
本発明において使用する活性酸素は、狭義の活性酸素である３Ｏ２の１電子還元種であるスーパーオキシド（Ｏ２・−）、２電子還元種である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、電子励起状態の酸素分子種である１重項酸素（１Ｏ２）、及びヒドロキシラジカル（ＨＯ・）、及び広義の活性酸素である、金属−酸素錯体（金属オキソ酸も含む）を主として、これら活性種と生体分子との反応に由来するペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）、アルコキシラジカル（ＬＯ・）、ヒドロキシペルオキシド（ＬＯＯＨ）、一酸化窒素（ＮＯ）などが挙げられ、特に限定されるものではない。
【００１９】
活性酸素を発生させる方法としては様々な方法が報告されており、例えば次の様な方法で容易に活性酸素を発生させる事ができる。過酸化水素水は、これ自身が活性酸素であるが、過酸化水素水にＣａ２＋やＦｅ２＋などの二価の金属イオンを添加すると過酸化水素は酸化剤として働きヒドロキシラジカル（ＨＯ・）を発生する。Ｄ−リボース等の還元糖に金属イオンＣｕ２＋を添加すると活性酸素が発生して、細胞障害性や核酸の損傷を引き起こす事も報告されている。抗腫瘍性の抗生物質のブレオマイシンを、鉄（ＩＩ）と酸素、あるいは、鉄（ＩＩＩ）と過酸化水素と共存させると活性酸素錯体種が発生し、ＤＮＡ切断を引き起こすことが知られている。
【００２０】
本発明において特に好適に用いられる活性酸素としては、Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅやＤ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ等の還元糖にＣｕ２＋やＦｅ２＋等の二価の金属イオンを添加して得られるヒドロキシラジカル、過酸化水素にＣｕ２＋やＦｅ２＋等の二価の金属イオンを添加して得られるヒドロキシラジカル等が挙げられる。二価の金属イオンを添加して活性酸素を発生させる場合、活性酸素反応液中にＥＤＴＡ等の金属キレート剤を添加することにより、活性酸素の発生を停止させ、核酸が過度に損傷をうけることを防ぐことができるため、特に好適に使用され得る。活性酸素を用いた核酸の処理時間は３０分以内、好ましくは１０分以内、より好ましくは１〜５分である。
【００２１】
フィルターに吸着した核酸を溶出させる場合の好適な条件は、吸着した核酸量や種類にも依存するが、例えば、Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅに二価の金属イオンとしてＦｅ２＋を添加してヒドロキシラジカルを発生させる場合、Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅの濃度は１ｍＭから１Ｍ、好ましくは１０ｍＭから５００ｍＭ、更に好ましくは５０ｍＭから２００ｍＭである。また、Ｆｅ２＋の濃度は。０．００１ｍＭから１０ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭから１０ｍＭ、更に好ましくは０．０５ｍＭから５ｍＭである。反応温度は３０から６５℃、好ましくは４０から６０℃、更に好ましくは４５から５５℃である。
【００２２】
本発明において、フィルターに吸着した核酸を断片化する方法として、活性酸素を用いる方法の他、核酸の特定の配列を認識して切断する制限酵素、任意配列を切断するＤＮａｓｅ等の核酸分解酵素を使って断片化してもよい。また、吸着フィルターに紫外線を照射して核酸を断片化するなどの方法も考えられる。本発明において好適に使用される制限酵素としては、ＨａｅＩＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ等が挙げられるがこれらに限定されない。認識する核酸の長さは制限酵素によって異なるが、例えば６塩基認識の制限酵素よりも４塩基認識の制限酵素の方が断片化によって生じる核酸断片がより短くなってフィルターからの溶出効率が高まり、より好ましい。酵素を用いる場合、酵素の量（濃度、比率等）は、核酸の量及び酵素の種類に依存する。
【００２３】
以下、本発明を更に詳しく説明する。特願２００１−２０８５１４号で開示されているように、多孔質からなるフィルターに吸着された核酸を溶出するためには、ＴＥバッファー中で８０℃、６０分加熱する必要がある。特願２００１−３２２４９４号でも、核酸が吸着したフィルターを４０℃から１００℃の高温条件下に置かなければならない。溶出時の温度制御が不要で、かつ、より短時間に溶出する核酸の方法を確立できれば、核酸調製法としては極めて簡便かつ迅速な方法が完成することになる。
【００２４】
本発明では、フィルターに吸着された核酸を活性酸素処理して溶出させた場合、ＴＥバッファー中での溶出やアルカリによる溶出より簡便で短時間で吸着ＤＮＡを溶出することができ、極めて有用であった。活性酸素により核酸残基のリン酸エステル結合が切断されて核酸の断片化が起こることはよく知られており、フィルターに吸着した核酸が断片化されてフィルターから容易に溶出されたと考えられる。金属イオンを添加した過酸化水素を用いた場合、金属イオンを添加しない場合と比較すると、添加時の方がフィルターに吸着したゲノムを短時間に断片化し、溶出させることが出来た。また、過酸化水素水の濃度を高めるとゲノムＤＮＡの断片化に要する時間が短縮され。溶出に必要な時間が短縮した。
【００２５】
活性酸素を核酸に作用させた場合、核酸残基のリン酸エステル結合が切断されるだけでなく、特に核酸の塩基部分への損傷が生じることも知られているが、活性酸素処理を短時間で行う、あるいは、溶出した核酸溶液から活性酸素を迅速に取り除くことで核酸に対する損傷を最小限に抑えることができる。活性酸素を取り除く方法として、例えば、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＴＭ（Ｍａｒｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）等の核酸精製カラムを使って核酸溶出液中の活性酸素を除く方法、限外濾過膜を使って核酸だけを精製して濃縮する方法、また、一般にエタノール沈殿法と呼ばれる塩の存在化で適量のアルコールを添加して核酸を沈殿させて核酸を精製させる方法がある。金属イオンの存在化で活性酸素を産生させる場合には、金属イオンを含む活性酸素反応液に金属イオンのキレート剤を添加することで活性酸素の発生を止める方法もある。また、一般的にラジカルスカベンジャーと呼ばれる活性酸素消去剤を添加して活性酸素による核酸の切断と損傷を抑えることも可能である。例えば、スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）は、スーパーオキシドを消去する事が知られており、アスコルビン酸やグルタチオンはヒドロキシラジカル、スーパーオキシドを消去する事がよく知られている。
【００２６】
活性酸素処理にて溶出したゲノムＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＴＭカラムにて精製し、ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用することも可能であり、ハイブリダイゼーションに使用するプローブを活性酸素溶出と同一の条件で処理しても、ハイブリダイゼーションは可能であった。
【００２７】
【実施例】
以下に本発明について例を示すが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
実施例１　過酸化水素水による核酸溶出
血液は健常人から採血し、抗凝固剤としてヘパリンナトリウム（清水製薬）を血液１ｍｌあたり１０単位添加した。血液中の白血球数は、ＬｅｕｃｏＣＯＵＮＴ　Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメーター（ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ、　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。血液０．２５ｍｌ中の白血球数は、約１．１５ｘ１０６個であった。この血液を０．２５ｍｌずつエッペンドルフチューブに分注して、−８０℃で凍結保存した。不織布は旭メディカル（株）の製品Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ−３コートを使用した。ここでＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ−３コートとは、ＨＭ−３（２−ヒドロキシエチルメタアクリレート（以下ＨＥＭＡと略称する）とＮ，Ｎ−ジメチルエチルメタアクリレート（以下ＤＭと略称する）からなる共重合体、ＨＥＭＡ：ＤＭ＝９７：３）をエタノールに溶解した溶液でＡ０４０Ｃ０１をコーティングしたもので、本不織布は旭メディカル（株）Ｓｅｐａｃｅｌｌ（登録商標）のメインフィルターとして使用されている。
【００２８】
不織布を直径１２ｍｍの円盤状に切断して、それを４枚重ねてフィルターホルダー（ＳＷＩＮＮＥＸ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にセットし、フィルターホルダーの上流には１０ｍｌの注射筒、下流には吸引ポンプを設置してフィルターホルダーに接続した。最初に３ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８；１００ｍＭ　ＮａＣｌ；２５ｍＭ　ＥＤＴＡ；０．５％　ＳＤＳ）で不織布を洗浄した。
【００２９】
０．２５ｍｌの凍結保存血に、３７℃に加温した２ｘ　Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８；２００ｍＭ　ＮａＣｌ；５０ｍＭ　ＥＤＴＡ；１％ＳＤＳ）を０．２５ｍｌ加え、更にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、　Ｒｏｃｈｅ）を０．０５μｇ加えて、これを３７℃の水浴で時々加温しながらｖｏｒｔｅｘで撹拌して完全に溶解した。室温で５分放置後、この血液抽出液を不織布にかけて直ちに吸引濾過し血球から得られたゲノムＤＮＡを不織布上に吸着させた。それから、吸引しながら８ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを流してフィルターを洗浄した。
【００３０】
次に、３ｍｌの１Ｍ　ＮａＣｌを含むＰＢＳ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍｌの精製水を流して不織布を洗浄した。そこに３％の過酸化水素水と０．１ｍＭのＣｕＣｌ２からなる活性酸素液１ｍｌを添加してシリンジをゆっくり押し、液を不織布全体に浸らせた。室温に１、２、３、５分間室温に置いた後、シリンジを押して活性酸素液を全て押し出し、さらに１ｍｌのＴＥバッファーで不織布に吸着したゲノムＤＮＡを溶出させた。ゲノムＤＮＡはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）にて速やかに精製し、溶出したゲノムＤＮＡ溶液中に含まれる過酸化水素と金属イオンを除いた。
【００３１】
精製したゲノムＤＮＡの量は、ＯＤ２６０ｎｍを測定して定量を行った。また、この精製ＤＮＡを０．７％　アガロース電気泳動にかけて、その断片化の程度を確認した。その結果を図１に示す。短時間の過酸化水素処理にてフィルターに吸着したゲノムＤＮＡが溶出される事が示された。
【００３２】
次に、この活性酸素液で溶出し精製したゲノムＤＮＡがＰＣＲの鋳型と成り得るかを確認した。プライマーには、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ）Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ａｍｐｌｉｍｅｒ　Ｓｅｔを使用した。不織布からの溶出液を蒸留水で１０倍に希釈して、その５μｌをＰＣＲ反応液（最終濃度１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．３；５０ｍＭ　ＫＣｌ；１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２；０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ；０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ　ｄＣＴＰ；０．２ｍＭ　ｄＴＴＰ；１．２５Ｕ　ＡｍｐｌｉＴａｑ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｇ３ＰＤＨ　３’−プライマー　０．５μＭ；Ｇ３ＰＤＨ　５’−プライマー　０．５μＭ）に加えて５０μｌとした。これをＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）で９４℃　５分　１サイクル；９４℃　３０秒、６０℃　１分、７２℃　１．５分、３０サイクル；７２℃　７分　反応させた。ＰＣＲ終了後、反応液１０μｌに１０ｘ　Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒを１．５μｌ加えてよく混和し、全量を２％　アガロース電気泳動にかけた。５０Ｖ、４５分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してイメージアナライザー（ＢｉｏＩｍａｇｅ　Ｇｅｌ　Ｐｒｉｎｔ　２０００ｉ／ＶＧＡ）で撮影した。結果を図２に示す。過酸化水素にて溶出した精製ゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲによる核酸増幅が可能である事が示された。
【００３３】
実施例２　還元糖と金属イオンによる核酸溶出
実施例１と同様の方法にて、ヒトのゲノムＤＮＡを吸着させたＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ−３コートの不織布を用意した。これをカラムフォルダーから取り出し、２４穴プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ）に移し、活性酸素液として１００ｍＭ　Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ　５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＳＩＧＭＡ）と０．１ｍＭ　ＣｕＣｌ２　を各々２５０μｌずつ添加し、攪拌しながら５０℃に置いた。１、３、５、１０、３０分後に、０．５Ｍ　ＥＤＴＡを５０μｌ添加して、活性酸素の発生を止めた。このうちの１０μｌを０．７％のアガロースゲル電気泳動にかけた。５０Ｖ、４５分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ　Ｇｅｌ　Ｐｒｉｎｔ　２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。その結果を図３に示す。二価の金属イオンを添加した還元糖にて発生させた活性酸素によって、フィルターに吸着したゲノムＤＮＡが溶出される事が示された。
【００３４】
次に、この活性酸素液で溶出し精製したゲノムＤＮＡがＰＣＲの鋳型と成り得るかを、実施例１と同じ方法にて確認した。その結果を図４に示す。二価の金属イオンを添加した還元糖にて発生させた活性酸素によってフィルターから溶出したヒトゲノム精製ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲによる核酸増幅は、短時間の活性酸素反応において可能である事が示された。
【００３５】
実施例３　制限酵素による核酸溶出
実施例１と同様の方法にて、ヒトのゲノムＤＮＡを吸着させたＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ−３コートの不織布を用意した。これをカラムフォルダーから取り出し、２４穴プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ）に移し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Ｔａｋａｒａ）　２．５μｌを含む酵素溶液５０μｌを添加し、室温あるいは３７℃にて５、１０、３０分間置いた。このうちの５０μｌをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラムにて精製し５０μｌの溶出ゲノム溶液を得た。これらのうちの１０μｌを０．７％のアガロースゲル電気泳動にかけた。５０Ｖ、４５分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ　Ｇｅｌ　Ｐｒｉｎｔ　２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。その結果を図５に示す。制限酵素によってフィルターに吸着したゲノムＤＮＡが切断されて溶出される事が示された。
【００３６】
参考例１
不織布から活性酸素にて断片化し溶出させたゲノムＤＮＡが、ハイブリダイズに使用可能かどうかを、ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（ＤＩＧ）標識ＤＮＡを使ったハイブリダイゼーション実験にて確認した。
【００３７】
ＤＮＡのＤＩＧ標識はＲｏｃｈｅ社ＰＣＲ　ＤＩＧ　Ｐｒｏｂｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＫｉｔとＰＣＲ　ＤＩＧ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｍｉｘを使い、ハイブリダイゼーションと検出にはＲｏｃｈｅ社のＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットを用いた。
【００３８】
１ｎｇ　Ｌａｍｂｄａ　ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）と配列番号１と２記載のＤＮＡプライマー（最終濃度各０．４μＭ）を含むＰＣＲ反応液（最終濃度１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含むＰＣＲバッファー；０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ；０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ　ｄＣＴＰ；０．１９ｍＭ　ｄＴＴＰ；０．０１ｍＭ　ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ；２．６Ｕ　Ｅｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＡｍｐｌｉＴａｑ）５０μｌを調製して、これをＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）で９４℃　３分　１サイクル；９４℃　３０秒、６０℃　１分、７２℃　３分、３０サイクル；７２℃　５分　反応させた。標識されたＤＮＡをＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラムにて精製し、５０μｌのＤＩＧ標識ＤＮＡプローブ水溶液を得た。
【００３９】
このＤＩＧ標識ＤＮＡプローブに１００ｍＭ　Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ　５−ｐｈｏｐｈａｔｅと０．０５ｍＭ　ＣｕＣｌ２からなる活性酸素液５０μｌを添加し、５０℃にて２、１０分間おいた。これをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラムにて再度精製し、溶液中の活性酸素を取り除き活性酸素処理済みＤＩＧ標識ＤＮＡプローブとした。次に、０．０１ｎｇから１０μｇのＬａｍｂｄａ　ＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にブロットし、アルカリ変性を行って一本鎖にした後、ＵＶクロスリンクにて膜上に固定化した。これをＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ）液中に浸し４２℃にて３時間プレハイブリダイゼーションを行った後、熱変性にて一本鎖にした先の活性酸素処理済みＤＩＧ標識ＤＮＡプローブを添加し４２℃にて１８時間保温させてハイブリダイゼーションを行った。
【００４０】
これを２ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを使って室温５分間の洗浄を２回行った後、０．１ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを使って６８℃１５分間の洗浄を２回行った。次に洗浄バッファー（最終濃度０．１Ｍ　マレイン酸；０．１５Ｍ　ＮａＣｌ；０．３％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｐＨ７．５）にて１分間平衡化を行った後、マレイン酸バッファー（最終濃度０．１Ｍ　マレイン酸；０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．５）で１０倍希釈したブロッキング溶液（Ｒｏｃｈｅ）に１時間浸した。これに３μｌのアルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ）を添加し室温にて３０分間おいた。洗浄バッファーを用いて室温にて１５分間の洗浄を２回行い、次にアルカリフォスファターゼバッファー（最終濃度０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ９．５；０．１Ｍ　ＮａＣｌ；５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）にて２分間平衡化を行い、これに１／１００容のアルカリフォスファターゼ基質溶液ＣＳＰＤ　ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を添加して２０分間３７℃にて保温した後、これをＨｙｐｅｒ　ＥＣＬフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に３０分間感光させ、現像機（Ｋｏｎｉｃａ）にて現像を行った。その結果を図６に示す。活性酸素処理したＤＩＧ標識ＤＮＡプローブにおいても、膜上に固定化したＤＮＡとのハイブリダイゼーションが可能であることが示された。
【００４１】
【発明の効果】
本発明を用いれば、核酸を吸着したフィルターから迅速に核酸を溶出することができる。従来の方法では溶出に６０分を要したが、本発明では５分以内に完了し、しかもＰＣＲなどの解析も従来と同じように可能である。
【００４２】
【配列表】
2004000078.tif 000003
2004000078.tif 000004
【００４３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】過酸化水素にて溶出した核酸の０．７％　アガロース電気泳動
０．１ｍＭ　ＣｕＣｌ２を含む３％　過酸化水素にて溶出した。
Ｌａｎｅ１　１ｋｂ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；
Ｌａｎｅ２　過酸化水素処理　室温１分；
Ｌａｎｅ３　過酸化水素処理　室温２分；
Ｌａｎｅ４　過酸化水素処理　室温３分；
Ｌａｎｅ５　過酸化水素処理　室温５分
【図２】過酸化水素溶出の核酸を鋳型にしたＰＣＲ増幅産物の２％　アガロース電気泳動
０．１ｍＭ　ＣｕＣｌ２を含む３％　過酸化水素にて溶出した核酸を鋳型としたヒトＧ３ＰＤＨ部分配列のＰＣＲによる増幅。
Ｌａｎｅ１　１００ｂｐ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；
Ｌａｎｅ２　過酸化水素処理　室温１分；
Ｌａｎｅ３　過酸化水素処理　室温２分；
Ｌａｎｅ４　過酸化水素処理　室温３分；
Ｌａｎｅ５　過酸化水素処理　室温５分
【図３】還元糖と金属イオンにて溶出した核酸の０．７％　アガロース電気泳動
１００ｍＭ　Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ　５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅと０．１ｍＭ　ＣｕＣｌ２を含む活性酸素液にて溶出させた。
Ｌａｎｅ１　１ｋｂ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；
Ｌａｎｅ２　５０℃　１分；
Ｌａｎｅ３　５０℃　３分；
Ｌａｎｅ４　５０℃　５分；
Ｌａｎｅ５　５０℃　１０分；
Ｌａｎｅ６　５０℃　３０分；
Ｌａｎｅ７　ＴＥバッファーによる溶出　９５℃　２０分（コントロール）
【図４】還元糖と金属イオンにて溶出した核酸を鋳型にしたＰＣＲ増幅産物の２％　アガロース電気泳動
１００ｍＭ　Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ　５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅと０．１ｍＭ　ＣｕＣｌ２を含む活性酸素液にて溶出させた核酸を鋳型としたヒトＧ３ＰＤＨ部分配列のＰＣＲによる増幅。
Ｌａｎｅ１　１００ｂｐ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；
Ｌａｎｅ２　５０℃　１分；
Ｌａｎｅ３　５０℃　３分；
Ｌａｎｅ４　５０℃　５分；
Ｌａｎｅ５　１００ｂｐ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ；
Ｌａｎｅ６　５０℃　１０分；
Ｌａｎｅ７　５０℃　３０分
【図５】不織布から制限酵素にて溶出した核酸の０．７％　アガロース電気泳動
Ｌａｎｅ１　１ｋｂ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；
Ｌａｎｅ２　室温　５分間；　Ｌａｎｅ３　室温　５分間（カラム精製）；
Ｌａｎｅ４　室温　１０分間；　Ｌａｎｅ５　室温　１０分間（カラム精製）；Ｌａｎｅ６　室温　３０分間；　Ｌａｎｅ７　室温　３０分間（カラム精製）；Ｌａｎｅ８　３７℃　５分間；　Ｌａｎｅ９　３７℃　５分間（カラム精製）；Ｌａｎｅ１０　３７℃　１０分間；
Ｌａｎｅ１１　３７℃　１０分間（カラム精製）；
Ｌａｎｅ１２　３７℃　３０分間；
Ｌａｎｅ１３　３７℃　３０分間（カラム精製）；
Ｌａｎｅ１４　１ｋｂ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；
【図６】活性酸素処理のハイブリダイゼーションへの影響
最終濃度５０ｍＭ　Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ　５−ｐｈｏｐｈａｔｅと２５μＭ　ＣｕＣｌ２にて処理したＤＩＧ標識ＤＮＡプローブとナイロンメンブレンに固定化したＤＮＡとのハイブリダイゼーション。コントロールとして、活性酸素未処理とＴＥバッファー中で９５℃にて２０分間処理したＤＩＧ標識ＤＮＡプローブを用いた。
【図１】
2004000078.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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