(57)【要約】【課題】バイオミネラルの形成を特異的タンパク質により制御して、人工的にバイオミネラルを作製する方法を提供すること。【課題を解決するための手段】磁性細菌から得られた特異的タンパク質を利用して、磁性細菌の磁気微粒子に対してＳＤＳ、尿素、酸処理をすることによって、磁気微粒子表面から金属イオンと相互間力を有するタンパク質の単離・同定した。また、このタンパク質のアミノ酸配列やかかるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を決定し、金属イオンと結合能を有し、磁気微粒子の結晶構造を制御するタンパク質であることを見出した。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオミネラルから界面活性剤、タンパク質変性剤処理によって得られ、バイオミネラルに対して直接相互作用を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）または、（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ金属イオンと相互間力を有するタンパク質
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３の記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ金属イオンと相互間力を有するタンパク質。
【請求項５】
請求項３又は４記載のＤＮＡの一部からなることを特徴とするプロモーター。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、金属イオンと相互間力を有するタンパク質
【請求項８】
請求項６又は７記載のタンパク質の一部からなり、かつ金属イオンと相互間力を有するペプチド
【請求項９】
請求項６若しくは７記載のタンパク質又は請求項８記載のペプチドと、機能性タンパク質又は機能性ペプチドとを結合させた融合タンパク質または融合ペプチド
【請求項１０】
請求項６〜９記載のタンパク質、若しくはペプチドを用いて、金属結晶の形態、組成、構造を制御させた物
【請求項１１】
請求項６若しくは７記載のタンパク質、請求項８記載のペプチド、又は請求項９のいずれか記載の融合タンパク質若しくは融合ペプチドを発現することができる発現系を含んでいる宿主細胞
【請求項１２】
宿主細胞が、宿主磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）であることを特徴とする請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１３】
宿主磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）が、ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５８，ＡＴＣＣ７００２６４）、ＭＳ−１（ＩＦＯ１５２７２，ＡＴＣＣ３１６３２，ＤＳＭ３８５６）、ＭＳＲ−１（ＩＦＯ１５２７２，ＤＳＭ６３６１）、ＲＳ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３２８３）、又はＭＧＴ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６１７）であることを特徴とする請求項１２記載の宿主細胞
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載の宿主磁性細菌から得られる磁気微粒子
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、磁気微粒子表面特異的なタンパク質Ｍｍｓ６、それをコードするＤＮＡ、及びそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】磁性細菌が生成する磁性細菌粒子は、菌体内ではマグネトソーム（ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅ）と呼ばれる粒径５０〜１００ｎｍの磁気微粒子が１０〜２０個チェーン状に連なった構造をしており、厚さ約２〜４ｎｍの有機膜で覆われている。また、磁性細菌によって合成される磁性細菌粒子の形態は、八面体形、六角柱、弾丸状などの形状があり、これらの形態は種特異的であることが観察されている（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５２，  ４６４−７３，  １９９９）。この事実は、磁性細菌において種特異的な結晶の形態制御機構の存在を強く示唆しており、その制御機構は磁性細菌粒子膜上の膜タンパク質が関与していると考えられている（Ａｄｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１，  １２５−１８１，  １９９０）。また、小胞内でマグネタイトを形成するためには、マグネトソーム特異的なタンパク質が鉄イオンの蓄積や結晶核形成、鉱物の還元、ｐＨのコントロールなどの特異的な機能を担っていることが考えられている（Ａｄｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１，  １２５−１８１，  １９９０、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７０，  ８３４−８４１，  １９８８）。
【０００３】磁気微粒子膜上のタンパク質について、これまでに、Ｇｏｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７０，  ８３４−８４１，  １９８８）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる細胞膜と磁気微粒子膜、細胞質のタンパク質プロフィールの比較から、１５，３３ｋＤａの磁気微粒子膜特異的なタンパク質をＭＳ−１株において観察した。Ｏｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  １７１，  ９９−１０２，  １９９６）は、ＭＳ−１株において同じ手法で低分子量のタンパク質を分画するためにＴｒｉｃｉｎｅ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、１２，２２，２８ｋＤａのタンパク質が磁気微粒子膜特異的であることを示した。本発明者らもＡＭＢ−１株において、２４．８，３５．６，６６．０ｋＤａの特異的なタンパク質を同定した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６８，  ９３２−９３７，  ２０００）。これらの磁性細菌粒子膜特異的なタンパク質のうち、２２ｋＤａタンパク質の遺伝子ｍａｍ２２（Ｇｅｎｅ  １７１，  ９９−１０２，  １９９６）および３５．６ｋＤａタンパク質の遺伝子ｍｐｓＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６８，  ９３２−９３７，  ２０００）はクローニングされ、モチーフ解析から機能は推定されているが、機能解析は行われておらず、他のタンパク質についてもその後の報告はない。また本発明者らにより分離された磁性細菌生成関連遺伝子ｍａｇＡが、鉄輸送タンパク質をコードしており、細胞膜および磁性細菌粒子膜上に局在することが報告（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  ２８３９２−２８３９６，  １９９５、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１８，  ２３−２７，  １９９５）されている。
【０００４】いくつかの細菌は、光合成や硝化作用、メタンの酸化、窒素固定のような特化した代謝のための細胞内膜構造を保持しているが、物質を内包するような膜構造系を細胞内に保持する細菌が観察された報告はない。前述の代謝に関連した膜構造は細胞膜に由来することが観察されているが、その形成メカニズムについては報告がなく、磁性細菌粒子膜がどこから由来したものかは不明である。最近、本発明者は、磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＡＭＢ−１（ＡＴＣＣ７００２６４）の磁性細菌粒子膜において特異的に発現する５つのタンパク質、１２．０、１６．０、２４．８、３５．６（ＭｐｓＡ）及び６６．２ｋＤａのタンパク質を報告し（Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ８４−８６，  ４４１−４４６，  ２０００）、また磁性細菌粒子膜において最も多く発現している１６．０ｋＤａのタンパク質が２次元電気泳動によって２つのスポットに分離することを報告しているが、その詳細についてはわかっていなかった。
【０００５】他方、特開平５−２０９８８４号公報には、磁性細菌から抽出した磁性細菌粒子に、ピリジルジチオアルキル脂肪酸Ｎ−スクシンイミジルエステルを用い、蛍光標識を行った抗体または抗原を固定化し、それらに対する抗原または抗体を用いて抗原抗体反応を行い、凝集を生じさせたのち、これを磁気的に分離濃縮し、蛍光濃度を測定することにより極めて微量の抗原、抗体を精度よく検出できる方法が開示されている。また、特開平６−２６１７４５号公報には、活性汚泥を用いる汚水、下水等の処理に有用で、しかも均一な形状、大きさのマグネタイト超微粒子の合成に有用な硫酸還元能を有する磁気細菌が、特開平７−２４１１９２号公報には、磁性細菌のマグネトソーム及び遺伝子を含有するリポソームや、かかるリポソームに磁場を印加することにより、該リポソームを細胞へ誘導し、該細胞と接触させる工程を有する細胞への遺伝子の導入方法が開示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＡＭＢ−１由来の磁気微粒子膜特異的タンパク質Ｍｍｓ６、それをコードするＤＮＡ、及びそれらを利用したバイオミネラル制御因子等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、磁性細菌の磁気微粒子に対してＳＤＳ、尿素、酸処理をすることによって、磁気微粒子表面から金属イオンと相互間力を有するタンパク質の単離・同定した。また、このタンパク質のアミノ酸配列やかかるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を決定し、金属イオンと結合能を有し、磁気微粒子の結晶構造を制御するタンパク質であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ金属イオンと相互間力を有するタンパク質（請求項２）や、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ（請求項３）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ金属イオンと相互間力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項４）や、請求項３又は４記載のＤＮＡの一部からなることを特徴とする転写活性を有するプロモーター（請求項５）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項６）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ金属イオンと相互間力を有するタンパク質（請求項７）や、請求項６又は７記載のタンパク質の一部からなり、かつ金属イオンと相互間力を有するペプチド（請求項８）に関する。
【０００９】また本発明は、請求項６若しくは７記載のタンパク質又は請求項８記載のペプチドと、機能性タンパク質又は機能性ペプチドとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド（請求項９）、かつ金属イオンと相互間力を有することを特徴とする組換えタンパク質又はペプチドに関する。また、請求項請求項６〜９記載のタンパク質、若しくはペプチドを用いて、バイオミネラルの構造を制御させた物（請求項１０）に関する。
【００１０】また本発明は、請求項６若しくは７記載のタンパク質、請求項８記載のペプチド、又は請求項９のいずれか記載の融合タンパク質若しくは融合ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１１）や、宿主細胞が、宿主磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）であることを特徴とする請求項１１記載の宿主細胞（請求項１２）や、宿主磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）が、ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５８，ＡＴＣＣ７００２６４）、ＭＳ−１（ＩＦＯ１５２７２，ＡＴＣＣ３１６３２，ＤＳＭ３８５６）、ＭＳＲ−１（ＩＦＯ１５２７２，ＤＳＭ６３６１）、ＲＳ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３２８３）、又はＭＧＴ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６１７）であることを特徴とする請求項１２記載の宿主細胞（請求項１３）や、請求項１２又は１３記載の宿主磁性細胞から得られる磁気微粒子（請求項１４）に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の対象となるタンパク質としては、図１や配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる磁気微粒子膜特異的なタンパク質Ｍｍｓ６や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ金属イオンと相互間力を有するタンパク質等を挙げることができる。なお、図１中、イタリックはＮ末端アミノ酸シークエンスで得られた部分配列を示し、下線部は（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）の特徴的な繰り返し配列を示している。また、本発明のペプチドとしては、本発明のタンパク質の一部からなり、かつ金属イオンと相互間力を有するペプチドを挙げることができる。上記本発明の対象となるタンパク質及びペプチドを総称して、以下「本件タンパク質・ペプチド」ということがある。なお、本件タンパク質・ペプチドは、例えば磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＡＭＢ−１の細胞破砕液を三画分（細胞膜、磁気微粒子膜及び細胞膜）に分画し、各タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを比較する方法や、本件タンパク質・ペプチドのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。なお、上記磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＡＭＢ−１は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市）に、１９９２年１１月１２日受託番号「ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５８」として寄託されている。
【００１２】本発明の対象となるＤＮＡとして、具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる磁気微粒子膜特異的なタンパク質Ｍｍｓ６をコードするＤＮＡや、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ金属イオンと相互間力を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡを挙げることができる。参考までに、本発明のｍｍｓ６及びその周辺領域の塩基配列を図２に示す。図２に示されているように、配列番号１に示される塩基配列の一部には、転写活性を有するプロモーターも有している。これらはそのＤＮＡ配列情報等に基づき、公知の方法により調製することができる。
【００１３】また、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、磁気微粒子表面に特異的なタンパク質Ｍｍｓ６のＤＮＡと同効な目的とする金属イオンと相互間力を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１４】本発明の融合タンパク質や融合ペプチドとしては、本件タンパク質・ペプチドと、機能性タンパク質又はペプチドとが結合しているものであればどのようなものでもよく、機能性タンパク質としては、例えば、抗原、抗体、プロテインＡ等の免疫関連タンパク質や、レクチン、アビジン、ビオチン等の結合能を有する結合性タンパク質や、補酵素、加水分解酵素、酸化還元酵素、異性化酵素、転移酵素、脱離酵素、制限酵素等の酵素や、各種受容体や、ＧＦＰ等のマーカタンパク質などが挙げられ、機能性ペプチドとしては、上記機能性タンパク質の一部からなるペプチドや、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどを例示することができるがこれらに限定されるものではなく、１又は２以上の機能性タンパク質や機能性ペプチドが融合した融合機能性タンパク質であってもよい。かかる融合タンパク質や融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本件タンパク質・ペプチドの精製や、本件タンパク質・ペプチドの検出や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１５】本発明はまた、上記本件タンパク質・ペプチドや、融合タンパク質又は融合ペプチドを発現することができる発現系を含んでいる宿主細胞に関する。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  １９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング  （ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、磁性細菌、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができるが、磁気を利用して容易に収集できることから磁性細菌を用いることが好ましい。なお、磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）としては、ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５８）、ＭＳ−１（ＩＦＯ１５２７２，ＡＴＣＣ３１６３２，ＤＳＭ３８５６）、ＭＳＲ−１（ＩＦＯ１５２７２，ＤＳＭ６３６１）、ＲＳ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３２８３）、ＭＧＴ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６１７）等の磁性細菌を具体的に例示することができるがこれらに限定されるものではない。
【００１６】また、発現系としては、上記本件タンパク質・ペプチドや、融合タンパク質又は融合ペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージ                    の遺伝的要素に由来するものを挙げることができるが、本発明の高転写活性を有する前記プロモーター、ＨＴ３プロモーター（特開平１１−２４３９６３号公報）、ｍａｇＡプロモーター（特開平８−２２８７８２号公報）、ｍｐｓプロモーター（ＷＯ９７／３５９６４号公報）等の磁性細菌由来のプロモーターを有する組換えプラスミドベクターが好ましい。また、これら発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００１７】上記発現系を含んでいる宿主磁性細菌等の宿主細胞や、かかる細胞を培養して得られる上記本件タンパク質・ペプチド又は融合タンパク質・ペプチドや、上記宿主磁性細菌から得られる本件タンパク質・ペプチド又は融合タンパク質・ペプチドが磁気微粒子膜上に発現している磁気微粒子は、後述するように本発明の磁気微粒子の構造の制御ができる。
【００１８】上記本件タンパク質・ペプチド又は融合タンパク質・ペプチドが磁気微粒子膜上に発現している磁気微粒子（マグネトソーム）は、宿主磁性細菌内で、主としてタンパク質からなる被覆膜で覆われた状態で存在し、生理活性物質のキャリアとして用いることができ、かかる磁気微粒子は上記宿主磁性細菌を用いて製造することができる。かかる製造方法としては、例えば、本来的に有機膜に結合して生成する膜タンパク質Ｍｍｓ６の全部又は一部（少なくとも膜結合部分）をコードするＤＮＡ、又はそのＤＮＡに機能性タンパク質・ペプチドをコードするＤＮＡとを融合させたＤＮＡ配列と、前記高転写活性を有するプロモーター配列とを含む組換えプラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養することにより、本件タンパク質・ペプチド又は融合タンパク質・ペプチドが磁気微粒子膜上に発現している磁気微粒子を細菌内で生成させる方法を挙げることができる。本件タンパク質・ペプチド又は融合タンパク質・ペプチドが磁気微粒子膜上に発現している磁気微粒子は、培養により増殖させた上記磁性細菌を公知の方法により破砕又は溶解し、磁石を利用して容易に収集することができる。
【００１９】本発明のマグネットリポソームとしては、前記本件タンパク質・ペプチド又は融合タンパク質・ペプチドが磁気微粒子膜上に発現している磁気微粒子（マグネトソーム）を含有したものであればどのようなものでもよく、かかるマグネットリポソームをドラックキャリアーとして医薬に用いることができる。例えば、癌や免疫疾患などの疾患に対する治療剤、抑制剤等の薬剤としての遺伝子と、上記磁気微粒子を封入したマグネットリポソームを癌や免疫疾患等の患者に注入し、これを外部磁場によって患部に誘導・固定・放出制御することで、癌や免疫疾患などの疾患を治療できる。また、分散性に優れた磁気微粒子を用いることにより、上記薬剤の封入率が高くなることから、本発明のマグネットリポソームの作製にかかる分散性に優れた磁気微粒子を用いることが好ましい。
【００２０】
【実施例】以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（菌株と培養方法）
ｍｍｓ６遺伝子のクローニング及びＭｍｓ６タンパク質の発現には大腸菌ＤＨ５αを使用した。この大腸菌ＤＨ５αはアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬｕｒｉａ培地を用いて、３７℃で培養した。磁性細菌Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．ＡＭＢ−１（ＡＴＣＣ７００２６４）はＭＳＧＭ培地（ｐＨ６．７５）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １４０，  ７２０−７２９，  １９７９）を用いて、２６℃、嫌気条件で培養した（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３５，  ６５１−６５５，  １９９１）。
【００２１】実施例２（本発明のＭｍｓ６タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及びシークエンス解析）
文献（Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ８４−８６，  ４４１−４４６，  ２０００）記載の方法で、磁性細菌細胞破砕液を細胞膜、磁気微粒子膜、及び細胞質の三画分に分画し、それらの画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、それぞれのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを比較することによって磁性細菌粒子膜特異的な新規タンパク質Ｍｍｓ６（分子量６ｋＤａ）を同定し、かかるタンパク質を二次元電気泳動により分離した。分離後、電気泳動ゲルをクーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０で染色した。次に、タンパク質のＮ末端のアミノ酸シークエンスを決定するために、かかるスポットのタンパク質をそれぞれゲルから切り取り、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）メンブランにブロットした。メンブランにブロットしたタンパク質に対して、ｇａｓ−ｐｈａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＰＳＱ−１０、Ｓｈｉｍａｄｚｕ，  Ｋｙｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）を用いてエドマン分解法により解析し、Ｎ末端のアミノ酸シークエンス（５８残基）を決定した結果、完全に一致することがわかった。
【００２２】上記アミノ酸シークエンス、ＭａｇＡのコドン頻度（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  ２８３９２−２８３９６，  １９９５）に基づき、Ｍｍｓ６をコードする塩基配列をＤＮＡに変換し、ＡＭＢ−１及びＭＳ−１のゲノム配列を元に検索を行った。ｍｍｓ６の遺伝子配列をジーンウォーキングによるシークエンスにより行った。Ｓ１プライマー（配列番号３）ＣＡＧＧＣＣＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴ、Ｓ２プライマー（配列番号４）ＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＴＴＧＧＣＧＣＣとＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｏｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてアンカーＰＣＲを行った。ＡＭＢ−１から抽出したゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩでそれぞれ消化し、断片末端に各制限酵素カセットをライゲーションした。ライゲーション産物に対し、カセットプライマーＣ１及び既知領域のプライマーＳ１を用いてＰＣＲを行った。さらに、非特異的な増幅産物のクローニングを押さえるために、カセットプライマーＣ２及びプライマーＳ２を用いてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、クローニング後、シークエンスを行い配列の決定を行った。その結果、タンパク質Ｍｍｓ６をコードするＯＲＦを含む、１，０００ｂｐのシークエンスが決定された。また、開始コドンより上流の領域には１０個のプロモーター様配列と、リボソーム結合部位が存在し、下流域にはターミネーター配列が見られた。
【００２３】実施例３（塩基配列、アミノ酸配列の解析）
上記実施例により決定されたＭｍｓ６タンパク質のＤＮＡやアミノ酸配列の解析をＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（ＤＮＡＳＴＡＲ  ＩＮＣ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＵＳＡ）を用いて行った。さらに、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ  ＤＮＡ  ｄａｔａｂａｓｅｓ．を用いてホモロジー解析も行った。その結果、機能が明らかにされているタンパク質とのホモ路ジーは存在しなかった。しかしながら、タンパク質の中に（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）の特徴的な繰り返し配列が見いだされた。このような疎水性アミノ酸の繰り返し配列は絹フィブロインやコラーゲン等の構造タンパク質によく見られ、またバイオミネラルと深い関わりを持っていることが言われている。
【００２４】実施例４（Ｍｍｓ１６タンパク質の発現および単離）
Ｍｍｓ６−ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）融合タンパク質を大腸菌内で高発現させるために、目的遺伝子のＯＲＦを増幅するＰＣＲプライマーをデザインした。ＮｄｅＩサイトをデザインしたフォワードプライマー（配列番号５）（５′−ＧＧＧＧＧＡＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＧＧＴＡＡＧ−３′）と、ＢａｍＨＩサイトをデザインしたリバースプライマー（配列番号６）（５′−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＧＴＣＧＣＧＣＡＧＴＴＣＧＡＣ  −  ３′）とを用いてＰＣＲ反応を行った。増幅されたＭｍｓ６をコードするＰＣＲ断片をＴＡクローニングし、その後、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化し、Ｍｍｓ６をコードする断片をｐＥＴ１５ｂにクローニングすることにより融合タンパク質発現ベクター、ｐＥＴ１５ｂ−ｍｍｓ６を得た。
【００２５】上記プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｍｍｓ６を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、大腸菌内でＭｍｓ６−Ｈｉｓ融合タンパク質を１ｍＭのＩＰＴＧを添加した培地で発現させた。培養後大腸菌を遠心回収し、緩衝液Ａ１（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．０、４Ｍ  ｕｒｅａ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０％エタノール）に再懸濁することにより溶菌した。フィルター濾過により可溶化されなかった菌体抽出物を除き、タンパク質溶液を得た。これに、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを加え、激しく攪拌し、Ｎｉ−ＮＴＡビーズに融合タンパク質を回収した。回収後、緩衝液Ａ２（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ６．３、４Ｍ  ｕｒｅａ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０％エタノール）でＮｉ−ＮＴＡビーズの洗浄をおこなった。緩衝液Ａ３（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ４．５、８Ｍ  ｕｒｅａ、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４）でＮｉ−ＮＴＡビーズのから、融合タンパク質の溶出を行った。溶出液に対して、等量の再構成緩衝液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ（還元型）、  １ｍＭ  ｇｌｕｔａｔｉｏｎｅ（還元型）、０．８ｍＭ  ｇｌｕｔａｔｉｏｎｅ（酸化型）、１０％  グリセロール、ｐＨ８．０）を加えた。これを４Ｍ、２Ｍのｕｒｅａを含む透析緩衝液中（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  グリセロール、ｐＨ８．０）で透析を行った。透析後、ｕｒｅａを含まない透析緩衝液にて透析を行った。最後に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液にて透析しグリセロールの除去を行った。得られたタンパク質に対して、トロンビン処理をすることによりＨｉｓタグの除去を行い、タンパク質を得た。
【００２６】実施例５（鉄イオン結合能）
本発明のＭｍｓ６がバイオミネラルの形成に関与していることが考えられるので、バイオミネラルの構成物質である鉄イオンとの結合能を調べた。評価方法はＣｈｅｎらの方法を用いて行った。その際に用いる鉄は放射性同位体のＦｅを用いて行った。単離したＭｍｓ６タンパクをメンブランにスポットし、次にメンブランを金属イオン結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０）中に３０分間浸した。次に放射性標識されたＦｅを８．１６μｇ／ｍｌの濃度で含む金属イオン結合緩衝液中にメンブランを浸した。その後金属イオン結合緩衝液で洗浄し、Ｘフィルムに感光した。ポジティブコントロールとして、Ｅｑｕｉｎｅ  ｓｐｌｅｅｎ  ａｐｏｆｅｒｒｉｔｉｎを用い、ネガティブコントロールとして、ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎを用いた。
【００２７】上記の結果、Ｍｍｓ６において鉄イオンの結合活性が見られた。また、Ｍｍｓ６にＨｉｓタグが融合した融合タンパク質に対しても鉄イオンの結合活性が見られた。このことから、観察された鉄イオン結合能はｈｉｓタグによるモノではなく、Ｍｍｓ６分子中の配列によるものであると考えられた。またネガティブコントロールのｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎにはほとんど鉄イオンの結合は観察されず、Ｍｍｓ６と明確な差異が認められた。また変性ゲルで分離後のＭｍｓ６に対しても同様に鉄イオン結合が認められたことから、Ｍｍｓ６は鉄イオン結合能を有するタンパク質であることが示された。
【００２８】実施例６（Ｍｍｓ６によるバイオミネラルの構造制御）
実施例５の結果から、鉄イオン結合結果の考察をふまえ、マグネタイトの構造制御ついて検討してみた。マグネタイトの生成は共沈法に基づいて行った。３３ｍＭ  ＦｅＳＯ４、３３ｍＭ  ＦｅＣｌ２溶液に対して、生成されたＭｍｓ６を加え、アルゴンガスをもちいてバブリングを行いながら、０．１Ｎ  ＮａＯＨを滴下した。溶液中のｐＨが７．０付近になるまで滴下した。生成された、粒子は、蒸留水で数回洗浄後、電子顕微鏡により観察を行った。その結果、Ｍｍｓ６存在下で作成したマグネタイトは粒径が５〜３０ｎｍであり、均一な球状の粒子が多く観察された。一方Ｍｍｓ６を用いずにマグネタイト形成を行ったところ、１〜１００ｎｍの不定形の粒子であった。また、生成されたマグネタイトに対して電子線回折による分析を行ったところ、共にマグネタイトの回折像と一致し、マグネタイトの形成が示された。これらのことから、人工マグネタイトの形成時にＭｍｓ６を用いることにより、バイオミネラルと同じように形態が一定の粒子作成が可能であることが示された。
【００２９】実施例７（合成ペプチドによるバイオミネラルの構造制御）
実施例６の結果から考察し、Ｍｍｓ６の特徴を有したマグネタイトの構造制御ついて検討した。マグネタイトの生成法は、実施例７に示した共沈法に準じた。実験に利用したペプチド配列は、以下の通りである。
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
また利用できるペプチドは、上記ペプチドの他にＮ末端側からグリシンとロイシンの繰り返し配列を持ち、その後に数残基から１０残基前後の酸性アミノ酸を含有するものすべて適応可能である。生成された粒子を電子顕微鏡により観察したところ、合成ペプチド存在下で作成したマグネタイトにおいて、Ｍｍｓ６を用いた場合同様に、形態が一定の粒子が形成できていることが確認された。これらのことから、人工マグネタイトの形成時にＭｍｓ６を基にした合成ペプチドを用いることにより、バイオミネラルと同じように形態が一定の粒子作成が可能であることが示された。
【００３０】
【発明の効果】本発明の磁気微粒子膜特異的タンパク質Ｍｍｓ６あるいはその遺伝子に外来遺伝子を結合させ、発現精製したタンパクを用いることにより、金属イオンの構造を制御することができる方法を発明した。
【００３１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ゲノムシークエンスから得られた本発明の磁気微粒子膜特異的タンパク質ｍｍｓ６遺伝子及び周辺領域の塩基配列を示す図である。
【図２】大腸菌内で発現した本発明Ｍｍｓ６−ヒスチジンタグ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）及びウエスタンブロット（Ｂ）の結果を示す図である。
【図３】大腸菌内で発現した本発明Ｍｍｓ６及びＭｍｓ６−ヒスチジンタグ融合タンパク質の鉄結合能を調べた結果を示す図である。
【図４】電子顕微鏡により、人工的に生成した磁気微粒子の観察を行った。大腸菌内で発現した本発明Ｍｍｓ６タンパク質用いて生成した磁気微粒子（Ａ）及びＭｍｓ６非存在下で生成した磁気微粒子（Ｂ）の結果を示す図である。
【図５】電子線回折により、人工的に生成した磁気微粒子の観察を行った。電子線回析パターン（Ａ）、エネルギー分散Ｘ線スペクトル。大腸菌内で発現した本発明Ｍｍｓ６タンパク質用いて生成した磁気微粒子（ａ）及びＭｍｓ６非存在下で生成した磁気微粒子（ｂ）の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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