(57)【要約】【課題】簡単な構成で試料の画像を取得し、蛍光の相関解析を行なうことができる生体分子解析装置を提供すること。【解決手段】生体分子の動的挙動を解析する生体分子解析装置であって、測定可能な状態に保持された生体分子を含む生物学的試料の少なくとも一つの観察領域に対応する画像を取得する画像取得手段（１１）と、この画像取得手段で取得した試料画像中の所望の点位置に測定点を配置する配置手段（１２）と、この配置手段で配置された測定点から被測定物質の動的情報に由来する信号を測定する測定手段（１０２）と、この測定手段で測定した結果を解析する解析手段（１０５）と、を具備し、前記画像取得手段および前記配置手段の少なくとも一方は少なくとも一つの可変焦点光学素子（１１，１２）からなる。【選択図】    図１
2004361086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子の動的挙動を解析する生体分子解析装置であって、
測定可能な状態に保持された生体分子を含む生物学的試料の少なくとも一つの観察領域に対応する画像を取得する画像取得手段と、
この画像取得手段で取得した試料画像中の所望の点位置に測定点を配置する配置手段と、
この配置手段で配置された測定点から被測定物質の動的情報に由来する信号を測定する測定手段と、
この測定手段で測定した結果を解析する解析手段と、を具備し、
前記画像取得手段および前記配置手段の少なくとも一方は少なくとも一つの可変焦点光学素子からなることを特徴とする生体分子解析装置。
【請求項２】
前記画像取得手段で取得する画像は３次元領域を含む画像であり、
前記配置手段は、測定点を３次元上の任意の位置に配置することを特徴とする請求項１に記載の生体分子解析装置。
【請求項３】
前記少なくとも一つの可変焦点光学素子は、それぞれ２次元方向の走査およびＺ軸フォーカス移動の少なくとも一方を行なう請求項１に記載の生体分子解析装置。
【請求項４】
前記少なくとも一つの可変焦点光学素子は、可変焦点レンズおよび可変焦点ミラーの少なくとも一方を含む請求項１または３に記載の生体分子解析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料内の１箇所以上の特定部位の統計的な性質や各部位間の相互作用などを求める生体分子解析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、試料内の特定部位を高い分解能で観察したり測定したりする装置として、共焦点光学系を用いた顕微鏡が利用されてきている。共焦点光学顕微鏡に関しては、例えば文献”Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”  Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ（ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ  （Ｌｏｎｄｏｎ）に解説がある。また、主に生物試料を対象とした解説として、文献”Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”  Ｊ．Ｂ．Ｐａｗｌｅｙ（ｅｄ．）  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）などがある。
【０００３】
１９９０年代に入り、蛍光を用いた単一分子の検出・イメージングに関する研究が急増している。例えば単一分子の検出法として、文献Ｐ．Ｍ．Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔｃ．  ＡＣＣ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．  （１９９６），  Ｖｏｌ．２９，  ｐ６０７−６１３、また蛍光相関分光法（ＦＣＳ）などが挙げられる。蛍光相関分光法では、共焦点顕微鏡の視野中の所定の１個の焦点において蛍光標識したタンパク質や担体粒子の溶液中でのブラウン運動に基づく蛍光強度のゆらぎを解析して自己相関関数を求め、対象とする微粒子の数や大きさなどを推測する。この技術については、例えば、金城政孝「蛋白質  核酸  酵素」（１９９９）  Ｖｏｌ．４４，  Ｎｏ．９，  ｐ１４３１−１４３７に論じられている。
【０００４】
また従来は、試料の顕微鏡画像をレーザー光のような点光源によって取得するために、互いに回動方向を直角に設定してなる２個のガルバノミラー走査機構により２次元走査していた。Ｚ軸方向のフォーカス移動については、試料ステージをモーターなどの駆動機構を用いてＺ軸方向へ微小量移動させたり、あるいは光路の途中に固定レンズと可動レンズとからなるフォーカス位置調整機構を挿入し、この可動レンズを光軸方向へ微小量移動させたりすることにより、フォーカス位置を変化させていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
一方、上記の技術に関して、いくつか特許出願がなされている。特開２００１−１９４３０３号公報の技術は、測定したい蛍光分子の密度が希薄であるような試料溶液に適用される蛍光相関分光法であって、シリンドリカル・レンズを用いて、２次元的に走査して試料の撮像領域内全体に励起光が照射されるようにして試料全体を励起する。そして、２次元光検出器上の蛍光強度値を集めて１つの全体的な揺らぎ情報を得ている。
【０００６】
また、特開平０８−４３７３９号公報、特開２０００−９８２４５号公報では、走査型光学顕微鏡において、多重染色された試料からの蛍光をそれぞれグレーティング、プリズムにより分光し、複数の光検出器により成分波長毎に検出を行なう。この方法では、一度に励起された試料の撮像領域内全体から蛍光色素毎の信号を取り出すことはできるが、試料の撮像領域内の選択された複数の微小な特定部位から発せられる蛍光信号をそれぞれ区別して取り出すことはできない。
【０００７】
従来行なわれている蛍光相関分光法では、視野内に存在する蛍光分子からの蛍光強度のゆらぎを観測し、これに基づいて時系列信号を得て、自己相関関数を求める。この場合、視野内に存在する蛍光分子が１種類のみであれば、得られた蛍光強度のゆらぎをそのまま解析することにより、蛍光分子の並進拡散速度などの情報を得ることができる。また、これら蛍光分子が移動したり、運動速度を変えたりしても、これらの変化を統計的に捉えることができる。発光波長の異なる２種類以上の蛍光分子が試料内に存在する場合は、波長分離を行なうことにより、それぞれの蛍光分子の自己相関や相互相関を求めることができる。しかし、同一視野内に限定されてしまう。
【０００８】
実際の生体細胞などを観測しようとする場合、細胞内外、細胞核内外での所望の分子の挙動をリアルタイムで観察することや、細胞内のシグナル伝達や物質輸送、細胞分裂などの事象について経時的な変化や局在情報を得ることが必要とされる。従来の蛍光相関分光法では、分子の集団としての状態変化や、挙動については捉えることができるが、細胞内外の所望の部位の状態変化などについて、ダイナミックに測定することは不可能であった。
【０００９】
また、顕微鏡の試料ステージをモーターなどの駆動機構を用いてＺ軸方向へ移動させるためには、モーターを試料ステージ近傍に固定しなければならず、ステージ周辺の装置が大掛かりになり、試料操作などの作業の妨害になることがあった。また、試料ステージの反復動作を連続して行なうと、モーターのバックラッシュなどのために、実際のフォーカス位置と計算上のフォーカス位置とにずれが生じるなどの問題点があった。
【００１０】
また、レンズを加えて可動するフォーカス位置調整機構を用いた場合は、光学系が複雑になり、レンズ移動機構の調整を精度良く行なわないとレンズ移動により光軸がずれたり、レンズが傾くことによって光軸が曲がったりするなどの問題があった。
【００１１】
すなわち従来では、レーザー光を簡単な機構により簡単に、３次元的に移動あるいは走査することができなかった。
【００１２】
本発明の目的は、簡単な構成で試料の画像を取得し、蛍光の相関解析を行なうことができる生体分子解析装置を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
課題を解決し目的を達成するために、本発明の生体分子解析装置は以下の如く構成されている。
【００１４】
（１）本発明の生体分子解析装置は、生体分子の動的挙動を解析する生体分子解析装置であって、測定可能な状態に保持された生体分子を含む生物学的試料の少なくとも一つの観察領域に対応する画像を取得する画像取得手段と、この画像取得手段で取得した試料画像中の所望の点位置に測定点を配置する配置手段と、この配置手段で配置された測定点から被測定物質の動的情報に由来する信号を測定する測定手段と、この測定手段で測定した結果を解析する解析手段と、を具備し、前記画像取得手段および前記配置手段の少なくとも一方は少なくとも一つの可変焦点光学素子からなる。
【００１５】
（２）本発明の生体分子解析装置は上記（１）に記載の装置であり、かつ前記画像取得手段で取得する画像は３次元領域を含む画像であり、前記配置手段は、測定点を３次元上の任意の位置に配置する。
【００１６】
（３）本発明の生体分子解析装置は上記（１）に記載の装置であり、かつ前記少なくとも一つの可変焦点光学素子は、それぞれ２次元方向の走査およびＺ軸フォーカス移動の少なくとも一方を行なう。
【００１７】
（４）本発明の生体分子解析装置は上記（１）または（３）に記載の装置であり、かつ前記少なくとも一つの可変焦点光学素子は、可変焦点レンズおよび可変焦点ミラーの少なくとも一方を含む。
【００１８】
【発明の実施の形態】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る生体分子解析装置の照明光学系、走査光学系、及び検出光学系の基本構成を示す図であり、図２はその一部拡大図である。図１，図２において同一な部分には同符号を付してある。本第１の実施の形態では、図１、図２に示すように光路の途中に、具体的には対物レンズ５の手前側光源よりに（コリメート光の途中）可変焦点レンズ１１を設置している。
【００１９】
レーザー光源１から出射したレーザー光は、第１レンズ２により合焦（フォーカス）される。合焦位置には、照明光用ピンホール３が配置されている。また、第２レンズ４のフォーカス位置に照明光用ピンホール３の位置を合わせている。第２レンズ４は、対物レンズ５までコリメート光（平行光）を導く。また、対物レンズ５の焦点位置に試料面を合わせている。
【００２０】
レーザー光源１から照射されたレーザー光は、第１レンズ２と照明光用ピンホール３を介してダイクロイックミラー７を透過し、第２レンズ４を介して、Ｘ軸走査スキャナ６１とＹ軸走査スキャナ６２に達する。Ｘ軸走査スキャナ６１とＹ軸走査スキャナ６２は、互いに走査方向が直交している。レーザー光は、Ｘ軸走査スキャナ６１とＹ軸走査スキャナ６２により、それぞれＸ軸走査及びＹ軸走査され、可変焦点レンズ１１と対物レンズ５を介して試料Ｓ面内で２次元走査される。
【００２１】
試料Ｓ内の蛍光分子からの蛍光信号は、照射されたレーザー光と同じ光路を通って、第２レンズ４と照明光用ピンホール３の間に配置されたダイクロイックミラー７で反射される。この反射光は、第２レンズ４の焦点位置に配置された受光用ピンホール８を通過して、受光用レンズ９に導かれる。ダイクロイックミラー７は、照射されたレーザー光（励起光）を透過し、蛍光分子から発せられた蛍光を反射させるスペクトル特性を持っている。受光用レンズ９の焦点位置に受光用ピンホール８が位置している。蛍光は、受光用レンズ９を通って光検出器（受光器）１０に到達する。光検出器１０としては、画像取得用のＣＣＤカメラなどの２次元光検出器を用いる。蛍光の強度ゆらぎの測定には、ＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード）、あるいは光電子増倍管などを用いる。
【００２２】
可変焦点レンズ１１は、２枚の対向して配置された透明のガラス基板と、両ガラス基板に取り付けられた電極、及び両ガラス基板の間に満たされた液晶により構成されている。この液晶に印加する電圧を調整して液晶分子に一定方向の傾きを持たせ、液晶を通過した光に波面変調または位相変調をかけて、レンズ機能を持たせて焦点位置を変化させる。焦点位置の変更は、電圧の加減により行なうので、スムーズに実施することができる。
【００２３】
また、特開平５−１００２０１号公報に開示されているように、共通電極と輪帯状電極の間に液晶を配置して、輪帯状電極に印加する電圧を制御して液晶に屈折率分布を形成し、焦点距離が自由に変えられるように構成した可変焦点レンズを用いても良い。あるいは、特開平５−３０３０１１号公報に開示されているように、合成樹脂フィルムから成る透明な膜の中にシリコンオイルのような透明な液体を満たし、この容量を変化させることによって透明膜の形状を変化させて、焦点距離を変えることができる構成とした可変焦点レンズを用いても良い。
【００２４】
図３は、可変焦点ミラーの構成を示す図である。レーザー光の光軸方向のフォーカス移動のために、図３に示すような可変焦点ミラーを用いても良い。可変焦点ミラー１２は、変形膜１２１、例えばポリイミドなどのフィルム（厚さ１〜５μｍ程度）に電極を配置し、この変形膜１２１の表面にアルミニウムなどの金属薄膜を貼り付けて構成する。そして、対向電極１２２に電流を印加することにより静電引力を発生させ、フィルム面の曲率を変化させて凹面形状とし、レンズ効果を持たせる。
【００２５】
また、対向電極１２２に印加する電圧を変化させることにより、凹面の曲率が変化し、焦点位置を光軸上で変化させることができる。この場合、可変焦点ミラー１２は図４に示すように、光源とするレーザーからの平行光束を鏡面反射させると同時に、反射光を収束光とする。この反射光（収束光）を対物レンズ５に通すことで、レーザー光のフォーカス位置を試料Ｓ内のＺ軸方向（深さ方向）へ任意に変化させることができる。このように可変焦点ミラー１２を用いることで、可変焦点機構をスムーズに実現した上で入射光の吸収損失を極力少なくすることができ、光を有効に利用することができる。
【００２６】
可変焦点ミラーの他の構成として、例えば単結晶シリコンの薄膜と下方の電極膜との間に電圧を印加し、静電引力により単結晶シリコンの薄膜の形状を湾曲させて凹面状の放物面とすることができる。単結晶シリコンの薄膜にアルミニウムなどの金属膜を貼り付けることにより、鏡面を形成することができる。これに関してはオプトロニクス誌Ｎｏ．７，１９９９，ｐ．１６１〜１６６に詳しく記載されている。
【００２７】
図５は、本発明の第１の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図である。
【００２８】
２次元の顕微鏡画像を得るために、レーザー光源１ａの２次元走査が必要となる。例えば、２個のガルバノミラーを互いに走査方向が直交するように配設してＸＹスキャナー６ａ（Ｘ軸走査スキャナとＹ軸走査スキャナからなる）とし、レーザー光をＸ軸走査及びＹ軸走査する。これを第１の走査系とする。
【００２９】
レーザー光源１ａから照射されたレーザー光は、ダイクロイックミラー７１で反射され、ＸＹスキャナー６ａによりＸ軸走査及びＹ軸走査され、ダイクロイックミラー７３で反射され、可変焦点レンズ１１と対物レンズ５を介して試料Ｓ面内すなわち細胞内で２次元走査される。試料Ｓからの反射光、蛍光は、照射光と同じ光路を通り、ダイクロイックミラー７１を介して光検出器１０１で受光される。光検出器１０１に入射した光強度信号は電気信号に変換され、信号処理装置１０３で波形整形され、画像処理装置１０６に導かれる。画像処理装置１０６は画像信号を生成し、ＴＶモニター１０７上に試料Ｓの２次元画像を生成する。
【００３０】
一方、第１の走査系と同じく、例えば、２個のガルバノミラーを互いに走査方向が直交するように配設してＸＹスキャナー６ｂ（Ｘ軸走査スキャナとＹ軸走査スキャナからなる）とし、レーザー光をＸ軸走査及びＹ軸走査する。これを第２の走査系とする。この第２の走査系でレーザー光を走査し、蛍光分子からの蛍光信号を光検出器１０２で受光し、コンピュータ１０５で相関分光解析を行なう。
【００３１】
励起光としてのレーザーは、波長４８８ｎｍのアルゴンレーザー、６３３ｎｍのＨｅ・Ｎｅレーザーを用いる。細胞内の所望の箇所を標識する蛍光色素は、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）、サイファイヴ（Ｃｙ５）を用いる。ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）は波長４８８ｎｍのアルゴンレーザーで励起する。サイファイヴ（Ｃｙ５）は６３３ｎｍのＨｅ・Ｎｅレーザーで励起する。
【００３２】
レーザー光源１ｂから照射されたレーザー光（励起光）は、ダイクロイックミラー７２で反射され、さらにミラー７４で反射され、ＸＹスキャナー６ｂによりＸ軸走査及びＹ軸走査され、レンズ７５とダイクロイックミラー７３を介し、可変焦点レンズ１１と対物レンズ５を介して試料Ｓ面内で２次元走査される。
【００３３】
試料Ｓ内の所望の箇所の蛍光色素分子からの蛍光は励起光と同じ光路を通り、それぞれの色素の発光波長に合わせて調整されたダイクロイックミラー７２により、入射光路から分離されて光検出器１０２で受光される。光検出器１０２に入射した光強度信号は電気信号に変換され、信号処理装置１０３で波形整形され、ｏｎ−ｏｆｆの２値化パルスに変換されて、コンピューター１０５に導かれる。コンピューター１０５に入力された２値化パルス信号は、相関演算が行なわれ、自己相関関数が求められる。さらに、得られた自己相関関数から、蛍光分子の並進拡散速度や測定領域中の蛍光分子の数の変化などが求められる。
【００３４】
光検出器１０２に入射する光強度信号が比較的大きい場合は、光検出器１０２から出力される電気信号は時系列信号となる。この場合は、電気信号を信号処理装置１０３でＡ／Ｄ変換しデジタル信号に変換した後、波形整形を行ない、先と同様に２値化パルス信号に変換する。この２値化パルス信号をコンピューター１０５に導くことによって相関演算が行なわれ、自己相関関数が求められる。
【００３５】
第１の走査系と第２の走査系のＸ軸走査スキャナ及びＹ軸走査スキャナは、互いに直交する方向に走査されるように配置されており、コンピューター１０５によって制御されるＸＹスキャナー駆動装置１１１，１１２により走査運動が正確に制御される。ＸＹスキャナー駆動装置１１１，１１２には走査位置検出機構が装備されており、リアルタイムで走査位置が精度良く検知され、コンピューター１０５にフィードバック制御される。これにより、走査位置と画像が一致するようになる。
【００３６】
また、可変焦点機構によるＺ軸フォーカス移動は、可変焦点レンズ駆動装置１１３により行なわれる。可変焦点レンズ駆動装置１１３はコンピューター１０５に接続されており、コンピューター１０５から駆動制御信号が送られ、この制御信号に基づいて、可変焦点レンズ１１の液晶分子の配向状態を調整し、Ｚ軸フォーカス移動を行なう。このようにして２次元走査に連動してＺ軸フォーカス移動が行なわれ、３次元画像をＴＶモニター１０７上に生成させる。また、画像取得と同時にレーザー光の照射位置も、細胞Ｓ内外の所望の位置に３次元的に移動させることができる。
【００３７】
前述したガルバノミラーなどで行なう２個の独立したＸ軸走査スキャナ及びＹ軸走査スキャナの走査角度は、ＸＹスキャナ角度検出装置１１４によって検出される。その検出信号は画像処理装置１０６に導かれて、画像処理装置１０６から出力される画像信号と組み合わされ、ＴＶモニター１０７の画面上の試料Ｓの顕微鏡画像の位置と一致される。
【００３８】
２次元の顕微鏡画像上でのスキャンニングポイントの指定は、以下のように行なう。観察者は、ＴＶモニター１０７上の観察画像を見ながら所望のポイントの指定をコンピュータ１０５の指定手段（キーボード、マウスポインタ等）を用いて行う。すると、コンピュータ１０５は、画面上に指定された１または２以上の点でＸＹスキャナー６ｂのスキャンを停止するようにＸＹスキャナー駆動装置１１２を調整する。また、Ｚ軸上のポイントについても、ＸＹスキャナー６ｂと連動して駆動された可変焦点レンズ１１によるＺ軸方向の画像に基づく指定が行われ、これにより、試料Ｓの３次元上の任意の位置に測定点が配置される。このときのＸＹスキャナー６ｂの走査角度は、ＸＹスキャナ角度検出装置１１４によって精度よく検出される。
【００３９】
また、ガルバノミラーで走査するのでなく、可変焦点レンズまたは可変焦点ミラーで走査系を構成することにより、試料内の３次元方向について、所望の細胞や分子の蛍光相関解析を行なうこともできる。
【００４０】
本第１の実施の形態では、可変焦点レンズを用いて、２次元画像を取得するためのＸＹスキャナー（例えばガルバノミラーを用いる）、及び蛍光の相関解析を行なうためのＸＹ走査光学系（例えばガルバノミラーを用いる。図１ではＸＹスキャナーと表記）のＺ軸上に位置する同じ試料の内外の部位における３次元画像を得られると共に、蛍光の相関解析を行なうことができる。すなわち第１の実施の形態では、画像取得のための光学系と蛍光の相関解析を行なうための光学系とについて、同時にＺ軸フォーカス移動を行なうことができる。ＸＹスキャナーの角度は、ＸＹスキャナー角度検出装置で検出し、所望の部位にスキャン位置を確実に一致させることができる。
【００４１】
（第２の実施の形態）
図６は、本発明の第２の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図である。図６において図５と同一な部分には同符号を付してある。
【００４２】
この場合、レーザー光の走査に可変焦点レンズと可変焦点ミラーを用いている。本第２の実施の形態では、可変焦点レンズ１１を用いた第１の走査系により細胞など試料の２次元画像を取得する。可変焦点レンズ駆動装置１１３は、可変焦点レンズ角度検出装置１１６を介してコンピューター１０５に接続されている。また、第２の走査系で可変焦点ミラー１２により２次元方向の走査を行ない、細胞内外の所望の箇所（例えば３箇所）の分子などの蛍光相関解析を行なう。可変焦点ミラー１２の駆動は、可変焦点ミラー駆動装置１１５により行なわれる。可変焦点ミラー駆動装置１１５は、可変焦点ミラー角度検出装置１１７を介してコンピューター１０５に接続されており、コンピューター１０５から駆動制御信号が送られる。
【００４３】
勿論、試料の２次元画像を取得するための走査系として可変焦点ミラーを、また細胞内外の所望の部位での蛍光相関解析を行なうための走査系として可変焦点レンズを用いても良い。さらに、試料の画像取得のための走査系と細胞内外の所望の部位での蛍光相関解析を行なうための走査系とを、全て可変焦点ミラーとしても良いし、あるいは可変焦点レンズとしても良い。
【００４４】
可変焦点レンズ１１及び可変焦点ミラー１２の走査角度とＺ軸フォーカス位置は、それぞれ可変焦点レンズ角度検出装置１１６及び可変焦点ミラー角度検出装置１１７によって検出される。それらの検出信号は画像処理装置１０６に導かれて、画像処理装置１０６から出力される画像信号と組み合わされ、ＴＶモニター１０７の画面上の試料Ｓの顕微鏡画像の位置と一致される。
【００４５】
（第３の実施の形態）
図７は、本発明の第３の実施の形態に係る生体分子解析装置の構成を示す図である。図７では、試料内の３次元方向について、複数の所望の細胞や分子の蛍光相関解析を行なうための複数の走査系と、試料の画像を取得するための走査系の構成例を示す図である。
【００４６】
図７では、四つの照明系Ｓ１１ａ，Ｓ１２ａ、Ｓ２２ａ、Ｓ３２ａ、三つの走査系Ｓ１１ｂ，Ｓ１２ｂ、Ｓ１３ｂ、及び四つの検出系Ｓ１１ｃ，Ｓ１２ｃ、Ｓ２２ｃ、Ｓ３２ｃを備えている。照明系Ｓ１１ａ，Ｓ１２ａ、Ｓ２２ａ、Ｓ３２ａは、それぞれレーザー光源１１ａ，１１ｂ、２１ｂ、３１ｂ及び第１レンズ１２ａ、１２ｂ、２２ｂ、３２ｂからなる。走査系Ｓ１１ｂ，Ｓ１２ｂ、Ｓ１３ｂは、それぞれＸＹスキャナーであるサーボ方式のガルバノスキャナー（ガルバノミラー）１６ａ，１６ｂ、１６ｃからなる。ガルバノスキャナー１６ａ，１６ｂ、１６ｃは、各々がＸ軸走査スキャナとＹ軸走査スキャナからなる。検出系Ｓ１１ｃ，Ｓ１２ｃ、Ｓ２２ｃ、Ｓ３２ｃは、それぞれ受光用レンズ１９ａ，１９ｂ、２９ｂ、３９ｂ、受光用ピンホール１８ａ，１８ｂ、２８ｂ、３８ｂ及び光検出器１１０ａ，１１０ｂ、２１０ｂ、３１０ｂからなる。
【００４７】
まず、ステージＳＴ上に測定可能な状態で保持された生物学的試料（細胞）Ｓの画像を取得するために、第１の照明系Ｓ１１ａ、第１の走査系Ｓ１１ｂ、及び第１の検出系Ｓ１１ｃを用いる。レーザー光源１１ａから照射されたレーザー光は、第１レンズ１２ａ及びダイクロイックミラー１７ａを介して、ガルバノスキャナー１６ａに達する。レーザー光は、ガルバノスキャナー１６ａでＸＹ走査され、ダイクロイックミラー２０１で反射し、ダイクロイックミラー２０２を透過して、対物レンズ５を介してステージＳＴ上の試料Ｓを照明する。
【００４８】
試料Ｓからの反射光および蛍光は、対物レンズ５を介してダイクロイックミラー２０２を透過し、ダイクロイックミラー２０１で反射して、ガルバノスキャナー１６ｂ、ダイクロイックミラー１７ａ、ミラー１９１ａ、受光用レンズ１９ａ、及び受光用ピンホール１８ａを介して光検出器１１０ａで受光される。光検出器１１０ａは、光信号の強度を測定する。光信号は、画像処理装置にてコントラスト向上、輪郭強調などの画像処理が行なわれた後、コンピューターに導かれ、ＴＶモニター上で２次元画像となる。
【００４９】
次に、試料Ｓ内の蛍光分子の自己相関関数を取得するために、例えば第２の照明系Ｓ１２ａ、第２の走査系Ｓ１２ｂ、及び第２の検出系Ｓ１２ｃを用いる。レーザー光源１１ｂから照射されたレーザー光は、第１レンズ１２ｂ、ダイクロイックミラー１７ｂ、及びミラー２０３を介して、ガルバノスキャナー１６ｂに達する。レーザー光は、ガルバノスキャナー１６ｂでＸＹ走査され、ダイクロイックミラー２０２で反射され、対物レンズ５を介してステージＳＴ上の試料Ｓを照明する。これにより、第１の実施の形態と同様にレーザー光が微小な測定領域に存在する試料Ｓ内の蛍光分子を励起し、蛍光信号（フォトンパルス）が得られる。
【００５０】
得られた蛍光信号、すなわち蛍光分子からの蛍光の強度ゆらぎは、対物レンズ５を介してダイクロイックミラー２０２で反射し、ガルバノスキャナー１６ｂ、ミラー２０３、ダイクロイックミラー１７ｂ、ミラー１９１ｂ、受光用レンズ１９ｂ、及び受光用ピンホール１８ｂを介して光検出器１１０ｂで受光される。蛍光信号は、光検出器１１０ｂで光電流パルスに変換され、信号処理装置に導かれて波形整形、２値化処理などが行なわれ、コンピューター（相関解析装置）により自己相関関数、相互相関関数などが求められる。ここで得られた自己相関関数から、蛍光分子の並進拡散運動の速度などの統計的な性質が求められる。
【００５１】
上記の例では、蛍光分子の相関関数を取得するために、第２の照明系Ｓ１２ａ、第２の走査系Ｓ１２ｂ、及び第２の検出系Ｓ１２ｃの組み合わせを用いたが、その他、第３の照明系Ｓ２２ａ、第２の走査系Ｓ１２ｂ、及び第３の検出系Ｓ２２ｃの組み合わせと、第４の照明系Ｓ３２ａ、第３の走査系Ｓ１３ｂ、及び第４の検出系Ｓ３２ｃの組み合わせを用いることができる。すなわち、各光学系により個別に、試料内の所望の異なる部位に存在する蛍光分子からの自己相関関数または相互相関関数の取得を行なうことができる。各ガルバノスキャナー１６ａ，１６ｂ、１６ｃは互いに独立して動作し、試料内の異なる複数部位にレーザー光スポットを集光させる。あるいは、各ガルバノスキャナー１６ａ，１６ｂ、１６ｃを互いに連動させて、試料内の所望の一部位に同時にレーザー光スポットを集光させることもできる。
【００５２】
本第３の実施の形態では、第１の走査系はＸＹスキャナーにより細胞など試料の２次元画像を取得する。第２〜４の走査系は、それぞれＸＹスキャナーにより２次元方向の走査を行ない、細胞内あるいは外の所望の３箇所の分子などの蛍光相関解析を行なう。
【００５３】
第１の走査系についてはＸＹスキャナーとして可変焦点レンズを、また第２〜４の走査系についてはＸＹスキャナーとして可変焦点ミラーを用いることができる。勿論、第１の走査系のＸＹスキャナーとして可変焦点ミラーを、また第２〜４の走査系のＸＹスキャナーとして可変焦点レンズを用いても良い。さらに、第１〜４の走査系を全て可変焦点ミラーとしても良いし、あるいは全て可変焦点レンズとしても良い。
【００５４】
本第３の実施の形態では、３次元的に異なる部位に存在する３点に同時にレーザー光をフォーカスすることができ、所望の細胞や分子の蛍光相関解析を行なうことができる。このとき、同時に第１の走査系で試料の２次元画像、または３次元画像を取得する。また、所望の細胞や分子の蛍光相関解析を行なうための走査系をさらに並列的に増やすこともできる。また、試料の画像を取得するための走査系についても同様に、並列的に増やして、複数の離散的な部位の顕微鏡画像を取得して表示、記録しても良い。
【００５５】
（第４の実施の形態）
図８は、本発明の第４の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図である。図８において図５，図６と同一な部分には同符号を付してある。
【００５６】
本第４の実施の形態では、２次元の顕微鏡画像を取得するための２次元走査光学系として、例えばガルバノミラーからなるＸＹスキャナー６ａを用いる。また、蛍光の相関解析を行なうためのＸＹ走査光学系として、例えばガルバノミラーからなるＸＹスキャナー６ｂを用いる。
【００５７】
また、レーザー光のＺ軸方向のフォーカス移動のために、可変焦点ミラー１２を用いる。すなわち、可変焦点ミラー駆動装置１１５により可変焦点ミラー１２のミラー面の曲率を変化させ、レーザー光のＺ軸方向のフォーカス位置を変化させる。
【００５８】
これにより、顕微鏡画像の取得のための光学系と蛍光の相関解析を行なうための光学系とについて、同時にＺ軸方向のフォーカス移動を行なうことができる。すなわち、Ｚ軸上に位置する同じ試料の内外の部位における３次元画像を得られるとともに、蛍光の相関解析を行なうことができる。
【００５９】
可変焦点ミラー１２の構成は、上記第１の実施の形態で述べたものと同様である。ＸＹスキャナー６ａ，６ｂの角度は、ＸＹスキャナー角度検出装置１１４で検出し、ＸＹスキャナー駆動装置１１２は所望の部位にスキャン位置を確実に一致させる。
【００６０】
（第５の実施の形態）
図９は、本発明の第５の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図である。図９において図５，図６と同一な部分には同符号を付してある。
【００６１】
本第５の実施の形態では、２次元の顕微鏡画像を取得するための２次元走査と、蛍光の相関解析を行なうための２次元走査とを、同時に可変焦点レンズ１１の曲率変化、あるいは屈折率変化によって行なう。また、可変焦点レンズ１１の曲率変化、あるいは屈折率変化によってレーザー光のＺ軸方向のフォーカス位置を変化させる。この際、可変焦点レンズ１１によるレーザー光の照射角度を可変焦点レンズ角度検出装置１１６で検出し、所望の部位にレーザー光のフォーカス位置を確実に一致させる。
【００６２】
これにより、画像取得のための光学系と蛍光の相関解析を行なうための光学系とについて、同時に２次元走査とＺ軸フォーカス移動とを行なうことができる。
【００６３】
（第６の実施の形態）
図１０は、本発明の第６の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図である。図１０において図５，図６と同一な部分には同符号を付してある。
【００６４】
本第６の実施の形態では、２次元の顕微鏡画像を取得するための２次元走査光学系として、例えばガルバノミラーからなるＸＹスキャナー６ａを用いる。また、蛍光の相関解析を行なうためのＸＹ走査光学系として、可変焦点ミラー１２を用いる。
【００６５】
また、レーザー光のＺ軸方向のフォーカス移動についても可変焦点ミラー１２を用いる。レーザー光のＺ軸方向のフォーカス位置を変化させるための可変焦点ミラー１２のミラー面の曲率の変化、及びＸＹ走査を行なうための形状変化は、可変焦点ミラー駆動装置１１５にて行なう。
【００６６】
これにより、顕微鏡画像の取得のための光学系と蛍光の相関解析を行なうための光学系とについて、それぞれ独自に動作を行なわせることができる。すなわち、試料の観察部位と蛍光の相関解析を行なう部位とを、別々に選択することができる。また、ＸＹスキャナー６ａ及び可変焦点ミラー１２の角度は、それぞれＸＹスキャナー角度検出装置１１４及び可変焦点ミラー角度検出装置１１７で検出し、所望の部位にスキャン位置を確実に一致させることができる。
【００６７】
（第７の実施の形態）
図１１は、本発明の第７の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図である。図１１において図５，図６と同一な部分には同符号を付してある。
【００６８】
本第７の実施の形態では、２次元の顕微鏡画像を取得するための２次元走査を可変焦点ミラー１２ａの走査で行ない、蛍光の相関解析を行なうための２次元走査を可変焦点ミラー１２ｂのミラー面の曲率変化によって行なう。また、レーザー光のＺ軸方向のフォーカス移動は、２次元画像を取得するための光学系と蛍光の相関解析を行なうための光学系とで、別々に可変焦点ミラー１２ａ，１２ｂのミラー面の曲率を変化させて実施する。この際、可変焦点ミラー１２ａ，１２ｂによるレーザー光の照射角度を可変焦点ミラー角度検出装置１１７ａ，１１７ｂで検出し、所望の指定位置とレーザー光のフォーカス位置とを確実に一致させる。
【００６９】
これにより、画像取得のための光学系と蛍光の相関解析を行なうための光学系とについて、同時に異なる位置で２次元走査とＺ軸フォーカス移動とを行なうことができる。結果として、試料の３次元画像を取得するとともに、画像を取得した位置と異なる位置、または同じ位置における蛍光の相関解析を行なうことができる。
【００７０】
（第８の実施の形態）
図１２は、本発明の第８の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図である。図１２において図５，図６と同一な部分には同符号を付してある。
【００７１】
本第８の実施の形態では、２次元の顕微鏡画像を取得するための２次元走査を、例えばガルバノミラーからなるＸＹスキャナー６ａで実施する。画像を取得するための光学系において、レーザー光のＺ軸方向のフォーカス移動を可変焦点レンズ１１の屈折率変化、あるいは形状の曲率変化で行なう。可変焦点レンズ１１の屈折率変化、あるいは形状の曲率変化は、可変焦点レンズ駆動装置１１３で実施する。可変焦点レンズ駆動装置１１３は可変焦点レンズ角度検出装置１１６を介してコンピューター１０５に接続されており、レーザー光のＺ軸方向のフォーカス移動の大きさ、方向、タイミングなどを制御する。
【００７２】
一方、蛍光の相関解析を行なうための２次元走査を、例えばガルバノミラーからなるＸＹスキャナー６ｂを用いて行なう。蛍光の相関解析を行なうための光学系において、レーザー光のＺ軸方向のフォーカス移動については、可変焦点ミラー１２のミラー面の曲率変化によって行なう。可変焦点ミラー１２は可変焦点ミラー駆動装置１１５により、その形状変化を実現する。可変焦点ミラー駆動装置１１５はコンピューター１０５に接続されており、可変焦点ミラー１２のミラー面の曲率変化を制御する。
【００７３】
以上により、可変焦点ミラー１２のミラー面の曲率変化、レーザー光のＺ軸方向のフォーカス移動を、２次元画像を取得するための光学系と蛍光の相関解析を行なうための光学系とで別々に、または同時に行なうことができる。この際、２種類のＸＹスキャナーについて、それらの回動角度をＸＹスキャナー角度検出装置１１４で検出し、所望の指定位置とレーザー光の走査角度とを確実に一致させる。
【００７４】
これにより、画像取得のための光学系と蛍光の相関解析を行なうための光学系とについて、同時に異なる位置で２次元走査とＺ軸フォーカス移動とを行なうことができる。その結果として、試料の３次元画像を取得すると共に、画像を取得した位置と異なる位置、または同じ位置における蛍光の相関解析を行なうことができる。なお、画像を取得するための光学系と蛍光の相関解析を行なうための光学系とを、それぞれ複数配置しても良い。
【００７５】
上記実施の形態によれば、生体細胞、生体分子の蛍光相関解析装置を含む画像取得装置において、レーザー光の２次元走査、およびレーザー光によるＺ軸（深さ方向）フォーカス移動を、可変焦点レンズあるいは可変焦点ミラーにより行ない、３次元的に離散する複数の分子、あるいは細胞の蛍光相関解析を行なう。また、可変焦点光学系を用いてレーザー光を３次元的に走査して、所望の部位の３次元画像を取得する。
【００７６】
このように、可変焦点光学系を離散的に存在する所望の複数の生体細胞、生体分子の蛍光相関解析装置に適用することにより、簡便な機構でレーザー光のＺ軸フォーカス移動、または３次元的なフォーカスポイントの移動を行なうことができる。また、本機構を画像取得の走査系にも用いることで、細胞内外の所望の部位の３次元画像を記録、観察することができると共に、細胞内外に３次元的に分布する複数の所望の分子の蛍光相関解析も行なうことができる。
【００７７】
また上記実施の形態によれば、ガルバノミラーのようなＸＹ走査系を用いなくて済むので、装置が簡素化されると共に、機械的な磨耗などのおそれがなく、安定した動作が可能になり、振動にも強くなる。また、画像取得のための光学系と蛍光の相関解析を行なうための光学系とを空間的に異なる配置とすることができ、試料の所望の位置での３次元画像を同時または時間差をもって取得できると共に、画像を取得した位置とは異なる位置または同じ位置における蛍光の相関解析を行なうことができる。
【００７８】
よって、本発明によれば、生きたままの自然状態に必須な３次元領域中での試料から、各種生体分子の動的挙動を安定した精度で解析でき、例えば多数のタンパク質により構成されたタンパク質複合体（クロマチン構造変換因子など）の解析を行なうことができる。これにより、遺伝子発現を制御するネットワーク機構の解明、アポトーシスの分子機構の解明、ゲノム複製制御のメカニズムの解明、染色体構造変化等をリアルタイムで観察、記録することなどが可能になる。これらの生命現象の解明を通して、新たな医薬品の創生、ガン化メカニズムの解明、プロテオーム解析などに幅広く応用できる。また、細胞のような生体試料中の各種オルガネラ成分や各種イオンチャンネルの動態も解析できる。さらに、神経伝達物質やホルモン受容体の動態解析にも適用できる。
【００７９】
なお、本発明は上記各実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。
【００８０】
【発明の効果】
本発明によれば、簡単な構成で試料の画像を取得し、蛍光の相関解析を行なうことができる生体分子解析装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る生体分子解析装置の照明光学系、走査光学系、及び検出光学系の基本構成を示す図。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係る生体分子解析装置の照明光学系、走査光学系、及び検出光学系の一部拡大図。
【図３】本発明の第１の実施の形態に係る可変焦点ミラーの構成を示す図。
【図４】本発明の第１の実施の形態に係る可変焦点ミラーの作用を示す図。
【図５】本発明の第１の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図。
【図６】図６は、本発明の第２の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図。
【図７】本発明の第３の実施の形態に係る生体分子解析装置の構成を示す図。
【図８】本発明の第４の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図。
【図９】本発明の第５の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図。
【図１０】本発明の第６の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図。
【図１１】本発明の第７の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図。
【図１２】本発明の第８の実施の形態に係るＺ軸方向可変焦点機構を備えた生体分子解析装置の構成を示すブロック図。
【符号の説明】
１，１ａ，１ｂ…レーザー光源  ２…第１レンズ  ３…照明光用ピンホール  ４…第２レンズ  ５…対物レンズ  ６１…Ｘ軸走査スキャナ  ６２…Ｙ軸走査スキャナ  ６ａ，６ｂ…ＸＹスキャナー
７…ダイクロイックミラー  ８…受光用ピンホール  ９…受光用レンズ  １０…光検出器  １１…可変焦点レンズ  １２…可変焦点ミラー  ７１…ダイクロイックミラー  ７２…ダイクロイックミラー  ７３…ダイクロイックミラー  ７４…ミラー  ７５…レンズ  １０１，１０２…光検出器  １０３…信号処理装置  １０５…コンピューター  １０６…画像処理装置  １０７…ＴＶモニター  １１１，１１２…ＸＹスキャナー駆動装置  １１３…可変焦点レンズ駆動装置  １１４…ＸＹスキャナ角度検出装置  １１５…可変焦点ミラー駆動装置  １１６…可変焦点レンズ角度検出装置  １１７…可変焦点ミラー角度検出装置  １２１…変形膜  １２２…対向電極  ２０１，２０２…ダイクロイックミラー  ２０３，２０４，２０５…ミラー  Ｓ…試料
【図１】
2004361086.tif 000003
【図２】
2004361086.tif 000004
【図３】
2004361086.tif 000005
【図４】
2004361086.tif 000006
【図５】
2004361086.tif 000007
【図６】
2004361086.tif 000008
【図７】
2004361086.tif 000009
【図８】
2004361086.tif 000010
【図９】
2004361086.tif 000011
【図１０】
2004361086.tif 000012
【図１１】
2004361086.tif 000013
【図１２】
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