(57)【要約】【解決手段】１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有するタンパク質、本タンパク質を用いたインヒビターのスクリーニング方法に関する。【効果】本発明のスクリーニング方法によって得られる本発明発タンパク質のインヒビターは糖尿病等の治療薬となりうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示す配列のうち２位のセリン残基から６８１位のアラニン残基までのアミノ酸配列を含有する、１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有するタンパク質、またはそのアミノ酸配列のうち１つまたは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／または付加している変異アミノ酸配列を含有し、かつ該タンパク質と同等の１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有する変異タンパク質。
【請求項２】
配列番号２に示す配列において２６９位がメチオニンである、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号２に示す配列のうち２位のセリン残基から７位のアラニン残基までのアミノ酸配列、および５６０位のロイシン残基から６８１位のアラニン残基までのアミノ酸配列を含有する、請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
Ｎ末端にメチオニン残基を有する、請求項１から３までのいずれか記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【請求項６】
配列番号１における６位のアデニンから２０４８位のグアニンまでの塩基配列を含有する請求項５記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７５６の下に寄託されているエシエリシア・コリ／ＳＭＩＮＴ２０１０３２４に含有されている、請求項６記載のＤＮＡ分子。
【請求項８】
請求項５から７までのいずれか記載のＤＮＡ分子を含有する宿主細胞。
【請求項９】
受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７５６の下に寄託されているエシエリシア・コリ／ＳＭＩＮＴ２０１０３２４である請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１から４までのいずれか記載のタンパク質を用いることを特徴とする、１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体のインヒビターをスクリーニングする方法。
【請求項１１】
請求項１から４までのいずれか記載のタンパク質を用いることを特徴とする、グルコース、フルクトースおよびマンノースから選択される少なくとも一つの過剰取り込みに起因する疾患の予防、進展阻止または治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
グルコース、フルクトースおよびマンノースから選択される少なくとも一つの過剰取り込みに起因する疾患が糖尿病、糖尿病性合併症、肥満症、高インスリン血症、糖代謝異常、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、脂質代謝異常、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、うっ血性心不全、浮腫性疾患、代謝性アシドーシス、シンドロームＸ、高尿酸血症、痛風および／または腎炎である、請求項１１記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有するタンパク質、それをコードするＤＮＡ分子、本タンパク質を用いた本タンパク質のインヒビターのスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病ではマンノースの血中濃度が上昇することが知られており（非特許文献１）、血中マンノース濃度は代謝性疾患における血糖値や中性脂肪と正の相関を示し、ＨＤＬコレステロールとは負の相関を示すことが明らかになっている（非特許文献２）。フルクトースもまた、糖尿病においてその血中濃度が上昇することが報告されている（非特許文献３）。また、フルクトースは細胞内での代謝経路においてＡＴＰを多量に消費し、脂質生成を促進し、かつ乳酸を形成することから、所謂フルクトース毒性をもたらすことが知られている（非特許文献４）。マンノースやフルクトースは、糖尿病ラットの腎糸球体に蓄積することが知られており、糖尿病性腎症との関連も指摘されている（非特許文献５）。さらに、糖尿病性合併症の一因とされるタンパク質の糖化反応において、マンノースおよびフルクトースはグルコースの５倍以上のタンパク質糖化能を持つことが示されている（非特許文献６）。それ故、生体内でグルコースの過剰取り込みを抑制しつつ、フルクトースやマンノースの過剰取り込みをも阻害すれば、糖尿病を始めとしたグルコース、フルクトースおよびマンノースから選択される少なくとも一つの過剰取り込みに起因する疾患の予防または進展阻止等に好適であることが期待される。
【０００３】
フルクトースやマンノースが生体で利用される際には、輸送担体と呼ばれる膜タンパク質を介して細胞膜から細胞に取り込まれる。腎臓等には、１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体が機能的に存在していることが報告されている（非特許文献７および８）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｅｌｊａ　Ｐｉｔｋａｎｅｎ，　Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，　１９９６年７月，第２５１巻，第１号，　ｐ．９１−１０３
【非特許文献２】
Ｏ．　Ｍ．　Ｐｉｔｋａｎｅｎ、外２名，　Ｓｃａｎｄ　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９９年１２月，第５９巻，第８号，ｐ．６０７−６１２
【非特許文献３】
Ｔａｋａｈｉｒｏ　Ｋａｗａｓａｋｉ、外２名，Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ，　２００２年２月，第２５巻，第２号，　ｐ．３５３−３５７
【非特許文献４】
Ｒ．　Ｇｉｔｚｅｌｍａｎｎ、外２名，Ｔｈｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｓｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ，（米国），　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，　１９９５年，　ｐ．９０５−９３４
【非特許文献５】
王　力寧、他３名，日本腎臓学会誌，１９９０年，第３２巻，第４号，ｐ．４０１−４０８
【非特許文献６】
Ｈ．　Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｂｕｎｎ、外１名，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８１年７月，第２１３巻，ｐ．２２２−２２４
【非特許文献７】
Ｔｏｓｈｉｋａｚｕ　Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ、外５名，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，　１９９６年８月，第１２９１号，第１号，　ｐ．８９−９５
【非特許文献８】
Ｔ．　Ｂｌａｓｃｏ、外５名，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，２０００年１１月，第１７８巻，第２号，ｐ．１２７−１３５
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子のクローニングに成功した。そして、ＣＯＳ−７細胞にて本遺伝子を発現させ、本タンパク質が１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノースを取り込み、かつグルコースを取り込む活性を有することを見出し、本発明を完成した。
本発明タンパク質の１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を阻害する薬剤は、糖尿病を始めとした、グルコース、フルクトースおよびマンノースから選択される少なくとも一つの過剰取り込みに起因する疾患の予防または進展阻止等に好適であることが期待される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヒト１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体と推定されるタンパク質、それをコードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含有する宿主細胞、そのタンパク質のインヒビターのスクリーニング方法を提供する。
【０００７】
即ち、本発明は、
（１）配列番号２に示す配列のうち２位のセリン残基から６８１位のアラニン残基までのアミノ酸配列を含有する、１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有するタンパク質、またはそのアミノ酸配列のうち１つまたは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／または付加している変異アミノ酸配列を含有し、かつ該タンパク質と同等の１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有する変異タンパク質；
具体的には、配列番号２に示す配列において２６９位がメチオニンである本発明のタンパク質；配列番号２に示す配列のうち２位のセリン残基から７位のアラニン残基までのアミノ酸配列、および５６０位のロイシン残基から６８１位のアラニン残基までのアミノ酸配列を含有する、本発明のタンパク質；および、Ｎ末端にメチオニン残基を有する本発明のタンパク質；
【０００８】
（２）上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ分子；具体的には、配列番号１における６位のアデニンから２０４８位のグアニンまでの塩基配列を含有するＤＮＡ分子；および受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７５６の下に寄託されているエシエリシア・コリ／ＳＭＩＮＴ２０１０３２４に含有されているＤＮＡ分子；
（３）本発明のＤＮＡ分子を含有する宿主細胞；具体的には受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７５６の下に寄託されているエシエリシア・コリ／ＳＭＩＮＴ２０１０３２４である宿主細胞；
（４）本発明のタンパク質を用いることを特徴とする、１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体のインヒビターをスクリーニングする方法、および本発明のタンパク質を用いることを特徴とする、グルコース、フルクトースおよびマンノースから選択される少なくとも一つの過剰取り込みに起因する疾患の予防、進展阻止または治療薬をスクリーニングする方法；に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
１）１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有するタンパク質およびそれをコードするＤＮＡ分子
本発明は第１の態様として、配列番号２に示す配列のうち２位のセリン残基から６８１位のアラニン残基までのアミノ酸配列を含有する、１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有するタンパク質およびそれをコードするＤＮＡ分子に関する。このＤＮＡ分子を本明細書ではＳＭＩＮＴ２０１０３２４と呼称する。
配列番号２に示すアミノ酸配列のうち８位から５５９位までの配列（２６９位を除く）は、ＮＣＢＩのタンパク質配列データベースにおいてＣＡＣ００５７４．１として開示されている。しかし、この配列はヒト第１染色体の連結クローンの一部から作成された配列であり、クローンの全長を表すものでなく、実際にタンパク質として調製されたものではない。
【００１０】
本明細書中、「１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性」とは、Ｎａ＋の輸送と１，５−アンヒドログルシトール、フルクトース、マンノースまたはグルコースの輸送を共役させることによりＮａ＋の勾配を利用して濃度勾配に逆らった１，５−アンヒドログルシトール、フルクトース、マンノースまたはグルコースの輸送を行う単糖類共輸送担体活性を意味する。かかる活性はＳｉｌｖｅｒｍａｎ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｅｃｔｉｏｎ８：　Ｒｅｎａｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．２　（Ｗｉｎｄｈａｇｅｒ　ＥＥ，ｅｄ），　ｐｐ．２０１７−２０３８　（１９９２）．，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｏｘｆｏｒｄ；　Ｈｅｄｉｇｅｒ　ＭＡ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｒｅｖ．，　Ｖｏｌ．７４，　ｐｐ．９９３−１０２６（１９９４）；　Ｌｏｏ　Ｄ．Ｄ．Ｆ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．９５，　ｐｐ．７７８９−７７９４　（１９９８）に記載の手法によって、当業者であれば容易に判定することができる。単糖類共輸送担体活性の具体的な測定方法は実施例８および９に記載している。また、「ナトリウム／グルコース共輸送担体活性」とは、Ｎａ＋の輸送とグルコースの輸送を共役させることによりＮａ＋の勾配を利用して濃度勾配に逆らったグルコースの輸送を行う活性を意味する。
【００１１】
本発明のタンパク質およびそれをコードするＤＮＡ分子は通常の遺伝子工学的手法によって調製することができる。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｔ．，　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）などの基本書に従って目的のＤＮＡをクローニングし、通常の手法によりそのＤＮＡ分子から目的のタンパク質を発現させる。目的のＤＮＡをクローニングするには、例えばヒト由来細胞のｃＤＮＡライブラリーに対してＳＭＩＮＴ２０１０３２４のｃＤＮＡ部分配列を基に作製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法や同様に作製した特異的プライマーを用いてＰＣＲ法に従い実施することができる。
【００１２】
本発明は別の態様として、本発明のタンパク質の変異タンパク質、即ち本発明タンパク質のアミノ酸配列のうち１つまたは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／または付加している変異アミノ酸配列を含有し、かつ該タンパク質と同等の１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有する変異タンパク質をも提供する。かかる変異体は、クローニングされた上記ＤＮＡ分子を基にして、置換、欠失、付加などの改変（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｔ．　１５章、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を行うことによって調製することができる。かかる変異体の１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性は上記の手法により容易に判定することができる。「同等の１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性」とは、実施例６記載の試験に基づくナトリウム存在下でのメチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの取り込み量が、ナトリウム非存在下でのメチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの取り込み量の２倍以上であることを意味する。
【００１３】
本発明は具体的には、配列番号２に示す配列において２６９位がメチオニンである本発明のタンパク質；配列番号２に示す配列のうち２位のセリン残基から７位のアラニン残基までのアミノ酸配列、および５６０位のロイシン残基から６８１位のアラニン残基までのアミノ酸配列を含有する本発明のタンパク質；およびＮ末端にメチオニン残基を有する本発明のタンパク質が含まれる。これらのタンパク質では、指定したアミノ酸残基またはアミノ酸配列以外の配列部分に上記の変異を有することができる。
さらに具体的には、今回クローニングされたＳＭＩＮＴ２０１０３２４ＤＮＡ分子を含有する大腸菌は、茨城県つくば市東１丁目１番３号、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（微生物の表示：エシエリシア・コリ／ＳＭＩＮＴ２０１０３２４；受託日：平成１４年３月１２日；受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７５６）。
【００１４】
２）本発明のＤＮＡ分子を含有する宿主細胞
本発明の宿主細胞には大腸菌などの原核細胞、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの真核細胞が含まれる。具体的には、昆虫細胞としてＳｆ９細胞、動物細胞としてＣＯＳ−７細胞、メサンギウム細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃａｃｏ−２細胞などが挙げられる。本発明の宿主細胞には受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７５６の下、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されているエシエリシア・コリ／ＳＭＩＮＴ２０１０３２４が含まれる。
【００１５】
３）本発明のタンパク質を用いることを特徴とするインヒビターのスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は例えば、以下の方法により行うことができる。
まず、１，５−アンヒドログルシトール／フルクトース／マンノース輸送担体活性を有する本発明タンパク質をコードするＤＮＡ分子を適当な発現ベクターに組込み、それを適当な宿主細胞に導入し、適当な条件下にて培養して本発明タンパク質を発現させる。
スクリーニングを実施するために本発明タンパク質を発現させるのに使用できる適当な発現ベクターとしては、宿主細胞が動物細胞の場合はｐＣＩｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ、ｐＭＥ１８Ｓを例示することができ、大腸菌の場合はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＧＥＭＥＸ−１を例示することができ、また昆虫細胞ではｐＢａｃＰＡＲＫ８−ＧＵＳ（トランスファー用ベクター）／ＢａｃＰＡＫ６（ウイルスＤＮＡ）などを例示することができる。また、適当な宿主細胞としては、例えばＣＯＳ−７細胞などの動物細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、または大腸菌などの原核細胞などが挙げられる。適当な培養培地は、１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭ（動物細胞）、ＬＢ培地（大腸菌）などが例示される。
【００１６】
次いで、先に調製した本発明のタンパク質発現細胞（例えば、ＳＭＩＮＴ２０１０３２４を発現させたＣＯＳ−７細胞など）を用いて、例えば、以下のような操作を行う。まず、塩化ナトリウムを含む取り込み用緩衝液には、非放射ラベル体と１４Ｃラベル体のメチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを最終濃度が１ｍＭとなるように混和して添加する。試験化合物はジメチルスルフォキシドに溶解した後、蒸留水にて適宜希釈して１ｍＭメチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含む取り込み用緩衝液に添加し、測定用緩衝液とする。対照群用には試験化合物を含まない測定用緩衝液を、基礎取り込み測定用には、取り込み用緩衝液において塩化ナトリウムに替えて塩化コリンを含む基礎取り込み測定用緩衝液を調製する。培養した細胞の培地を除去し、前処置用緩衝液（メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含まない基礎取り込み用緩衝液）を加え、３７℃で１０分間静置する。同一操作をもう１度繰り返した後、前処置用緩衝液を除去し、各測定用緩衝液および基礎取り込み用緩衝液を加え３７℃で静置する。１時間後に測定用緩衝液を除去し、洗浄用緩衝液（１０ｍＭ非ラベル体メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含む基礎取り込み用緩衝液）で２回洗浄する。０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで細胞を溶解し、その液をピコプレートに移した。マイクロシンチ４０を加えて混和し、マイクロシンチレーションカウンター　トップカウントにて放射活性を計測する。対照群の取り込み量から基礎取り込み量を差し引いた値を１００％として、試験化合物の各濃度におけるメチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの取り込み量を算出する。試験化合物におけるメチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み量が極めて低い、或いは実質的ゼロの場合、加えた試験化合物は効果的なインヒビターとして判断される。
上記スクリーニング方法は、当業者の常識の範囲において適宜変更を加えることができる。
【００１７】
本発明はさらに、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする、グルコース、フルクトースおよびマンノースから選択される少なくとも一つの過剰取り込みに起因する疾患の予防、進展阻止または治療薬をスクリーニングする方法に関する。「グルコース、フルクトースおよびマンノースから選択される少なくとも一つの過剰取り込みに起因する疾患」とは糖、脂質および核酸の代謝異常に基づく疾患であり、糖尿病、糖尿病性合併症、肥満症、高インスリン血症、糖代謝異常、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、脂質代謝異常、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、うっ血性心不全、浮腫性疾患、代謝性アシドーシス、シンドロームＸ、高尿酸血症、痛風および／または腎炎等の疾患が例示される。
【００１８】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００１９】
実施例１
オリゴキャップ法によるｃＤＮＡライブラリーの作製
（１）ｍＲＮＡ抽出と購入
ヒト小腸（Ｓｍａｌｌ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織より全ＲＮＡとして抽出されたｍＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ　＃６４０３９−１）を購入し、小腸（Ｓｍａｌｌ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）由来のライブラリーＳＭＩＮＴとした。
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製
それぞれのＲＮＡよりオリゴキャプ法［Ｍ．　Ｍａｒｕｙａｍａ　ａｎｄ　Ｓ．　Ｓｕｇａｎｏ，　Ｇｅｎｅ，　１３８：　１７１−１７４　（１９９４）］を改良した方法（ＷＯ　０１／０４２８６）によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐリンカー（配列番号３）およびＯｌｉｇｏ　ｄＴプライマー（配列番号４）を用いて、ＷＯ　０１／０４２８６に記載したようにＢＡＰ（細菌アルカリホスファターゼ）処理、ＴＡＰ（タバコ酸性ピロホスファターゼ：Ｔｏｂａｃｃｏ　Ａｃｉｄ　Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。次いで、５’（配列番号５）と３’（配列番号６）のＰＣＲプライマーを用いＰＣＲ　（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡに変換し、ＳｆｉＩ切断した。次いで、通常は２ｋｂ以上（場合によっては３ｋｂ以上）に分画したｃＤＮＡ断片をＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（図１）（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＢ００９８６４，発現ベクター）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００２０】
オリゴキャップ法を改良した方法で作製した高全長率ｃＤＮＡライブラリー（既知ｍＲＮＡのタンパク質コード領域を指標にして算出した各ｃＤＮＡライブラリーの５’端の全長率は平均９０％）は、真核細胞での発現が可能な発現ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を用いて作製した。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３にはクローニング部位の上流にＳＲαプロモーターとＳＶ４０　ｓｍａｌｌ　ｔイントロンが組み込まれており、またその下流にはＳＶ４０ポリＡ付加シグナル配列が挿入されている。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３のクローン化部位は非対称性のＤｒａＩＩＩサイトとなっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩ部位を付加しているので、クローン化したｃＤＮＡ断片はＳＲαプロモーターの下流に一方向性に挿入される。したがって、全長ｃＤＮＡを含むクローンでは、得られたプラスミドをそのままＣＯＳ細胞などに導入することにより、一過的に遺伝子を発現させることが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物である蛋白質として、あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析することが可能となっている。
【００２１】
実施例２
ｃＤＮＡクローン末端配列解析と全長塩基配列解析クローンの選択
各ｃＤＮＡライブラリーより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’末端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ＫｉｔまたはＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００，　ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析した。得られたデータについてはデータベース化を行った。
解析されたｃＤＮＡクローンの５’末端配列については、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅのｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓの表記があるデータを対象にしたＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、登録されているヒトｍＲＮＡ配列と同一なものは除いた。次にクラスタリングを行い、相同性９０％以上かつコンセンサス配列が５０塩基対以上の場合、同一グループと見なし、グループを形成させた。グループ内の、より５’−側に長いクローンを選択し、選択されたクローンについては必要に応じ３’末端配列を５’末端配列と同様の方法で解析取得した。取得された末端配列のデータを解析し、５’末端と３’末端の配列でコンティグを作るクローンは除いた。更に再度前記と同様にＢＬＡＳＴによる相同性検索によりヒトのｍＲＮＡ配列（特許化または特許出願された配列を含む）に同一なものは除いた。こうして選択したクローンより全長塩基配列解析を行うクローンを得た。
【００２２】
実施例３
全長塩基配列解析
全長塩基配列解析に選抜されたクローンについて各々全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列は、主にカスタム合成ＤＮＡプライマーを用いたダイデオキシターミネーター法によるプライマーウォーキング法によって決定した。すなわち、カスタム合成ＤＮＡプライマーを用い、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のＤＮＡシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応後、同社製のシーケンサーを用いてＤＮＡ塩基配列を解析した。一部のクローンについては、Ｌｉｃｏｒ社製ＤＮＡシーケンサーも利用した。
また、一部のクローンについてはカスタムプライマーを用いずｃＤＮＡが含まれるプラスミドをランダムに切断するショットガン法を用いて同様にＤＮＡシーケンサーでＤＮＡ塩基配列を決定した。全長塩基配列は上記方法により決定された部分塩基配列を完全にオーバーラップさせ最終的に確定した。
次に、決定された全長塩基配列から、蛋白質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。
【００２３】
今回クローニングされた目的のＳＭＩＮＴコード化ＤＮＡ配列（ＳＭＩＮＴ２０１０３２４）を含有する大腸菌は、茨城県つくば市東１丁目１番３号、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託されている（微生物の表示：エシエリシア・コリ／ＳＭＩＮＴ２０１０３２４；受託日：平成１４年３月１２日；受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７５６）。
ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。
【００２４】
実施例４
ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の配列の解析
ＤＮＡタンパク質配列データベースの検索により、ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の塩基配列は、ヒトＳＧＬＴ１（Ｍａｔｔｈｉａｓ　Ａ．　Ｈｅｄｉｇｅｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．　８６，　ｐｐ．５７４８−５７５２　（１９８９））やヒトＳＧＬＴ２（Ｗｅｌｌｓ　Ｒ．Ｇ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２６３，　ｐｐ．Ｆ４５９−Ｆ４６５（１９９２））との同一性が高く、またＳＭＩＮＴ２０１０３２４の推定アミノ酸配列は、ヒトＳＧＬＴ１と５４％の同一性が、ヒトＳＧＬＴ２と５３％の同一性があることが判明した。ＳＭＩＮＴ２０１０３２４とヒトＳＧＬＴ１およびヒトＳＧＬＴ２とのマルチプルアライメントを図２に示す。マルチプルアライメントはクラスタルＷを用いて実施した。
ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の推定アミノ酸配列に基づく、ハイドロフォビシティープロットを図３に示す。このハイドロフォビシティープロットは、ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法を用いて決定した（Ｋｙｔｅ　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．１５７，　ｐｐ．１０５−１３２　（１９８２））。ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の親水性および疎水性部位は、既知のヒトナトリウム／グルコース共輸送担体と類似している。従って、ＳＭＩＮＴ２０１０３２４はヒトナトリウム／グルコース共輸送担体と同様の２次構造を持った輸送担体であることが予想される。
【００２５】
実施例５
ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の一過性発現細胞の調製
実施例１にて調製したＳＭＩＮＴ２０１０３２４／ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ発現プラスミドを電気穿孔法によりＣＯＳ−７細胞（ＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫ　ＲＣＢ０５３９）に導入した。電気穿孔法はＥＣ１００エレクトロポレーター（Ｅ−Ｃ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を用いた。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ　Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）　８００μｌに対しＣＯＳ−７細胞３．２　ｘ　１０６個とＳＭＩＮＴ２０１０３２４／ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ発現プラスミド２０μｇを含む０．４　ｃｍキュベット内で４００　Ｖ、１２６０μＦの条件下に行った。遺伝子導入後、細胞を遠心分離により回収し細胞１キュベット分に対し３．２　ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ　Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウェルプレートの１ウェルあたり１２５μＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下一晩培養した後、１０％ウシ胎仔血清（三光純薬）、１００　ｕｎｉｔｓ　／　ｍＬペニシリンＧナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ　／　ｍＬ硫酸ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１ウェルあたり１２５μＬずつ加えた。翌日まで培養しメチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み活性の測定に供した。
【００２６】
実施例６
ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の一過性発現細胞におけるナトリウム依存性のメチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み活性試験
「取り込み用緩衝液」は、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ　２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む緩衝液ｐＨ７．４に、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（α−ＭＧ）の非放射ラベル体（Ｓｉｇｍａ）と１４Ｃラベル体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）の総和の最終濃度が１ｍＭとなるように混和し、調製した。基礎取り込み測定用には塩化ナトリウムに替えて１４０ｍＭの塩化コリンを含む「基礎取り込み測定用緩衝液」を調製した。実施例５にて培養した細胞培養物から培地を除去し、前処置用緩衝液（α−ＭＧを含まない基礎取り込み測定用緩衝液）を１穴あたり１８０μＬ加え、３７℃で１０分間静置した。同一操作をもう１度繰り返した後、前処置用緩衝液を除去し、測定用緩衝液および基礎取り込み用緩衝液を１穴当たり７５μＬずつ加え３７℃で静置した。１時間後に測定用緩衝液を除去し、１穴当たり１８０μＬの洗浄用緩衝液（１０ｍＭ非放射ラベル体α−ＭＧを含む基礎取り込み用緩衝液）で２回洗浄した。１穴当たり７５μＬの０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで細胞を溶解し、その液をピコプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）に移した。１５０μＬのマイクロシンチ４０（Ｐａｃｋａｒｄ）を加えて混和し、マイクロシンチレーションカウンター　トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ）にて放射活性を計測した。
【００２７】
得られた結果を図４に示す。
図４は、ＳＭＩＮＴ２０１０３２４が、ナトリウム依存性のメチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み活性を有していることを示している。
【００２８】
実施例７
ＳＭＩＮＴ２０１０３２４遺伝子のヒト組織における分布パターン
１）ｃＤＮＡの合成
ヒト肝臓、結腸、精巣、膵臓、肺、小腸、胃、胎盤、筋肉由来のトータルＲＮＡ（ｔＲＮＡ）はサワディーテクノロジー社から購入し、気管、脳、腎臓、心臓のｔＲＮＡはＣＬＯＮＴＥＣＨ社から購入した。ｔＲＮＡ濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎ　ＲＮＡ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｇｅｎｔ　ａｎｄ　ｋｉｔ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）を用いて測定し、ｃＤＮＡの合成（逆転写反応）を行った。１６．５μｌ反応液を用い、１．５μｇ　ｔＲＮＡ、１．５μｌの５００　ｎｇ／μｌ　ｒａｎｄｏｍ　ｈｅｘａｍｅｒ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んでいる。反応液を７０℃で５分の反応を行い、室温に５分間保持した。６μｌの５ｘ　ＢＲＬ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３．２５μｌの蒸留水（ニッポンジーン）、１．５μｌの１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．７５μｌのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および２μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んでいる１３．５μｌ反応液を上記反応液に加えた。また同時にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の代わりに蒸留水（ニッポンジーン）を加えた反応液も同様に上記溶液に加えた。全ての混合液は室温１０分放置後、４２℃で１時間反応を行った。そしてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を失活させるために９５℃１０分反応を行い、直ちに氷中に移した。次に１．５μｌのＲＮａｓｅ　Ｈを加え、３７℃３０分反応を行った。
反応終了後１７０μｌの蒸留水を加えた。合成されたｃＤＮＡは２００μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出し、さらに２００μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１を用いて抽出した。エタノール沈殿を行い、１００μｌの蒸留水（ニッポンジーン）に希釈した。
【００２９】
２）リアルタイム定量　ＰＣＲを用いたＳＭＩＮＴ２０１０３２４遺伝子発現量の測定
リアルタイム定量ＰＣＲのプライマーとして、フォワード：５’−ＴＧＴ　ＣＡＣ　ＡＧＴ　ＣＣＣ　ＣＡＡ　ＣＡＣ　ＣＡ−３’（配列番号７）およびリバース：５’−ＣＣＧ　ＡＡＧ　ＣＡＴ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　ＡＧＣ　Ａ−３’（配列番号８）、プローブとして５’−ＴＧＴ　ＣＡＣ　ＣＴＣ　ＣＣＡ　ＣＧＧ　ＣＣＣ　Ｇ−３’（配列番号９）を用いた。プローブは蛍光色素ＦＡＭで５’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで３’末端をラベルした。上記で作成された２．５　ｎｇ　ｃＤＮＡ、１ｘ　Ｔａｑｍａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５００　ｎＭフォワード、リバースプライマー、２００　ｎＭプローブを含む２５μｌ反応液を調製した。ＰＣＲ条件は次の通りである：５０℃２分、１サイクル、９５℃１０分、１サイクル、９５℃１５秒、６０℃１分、４０サイクル。遺伝子発現量の測定はＧｅｎｅＡｍｐ　５５００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＭｉｃｒｏＡｍｐ　ｏｐｔｉｃａｌ　９６−　ｗｅｌｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｐｌａｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＭｉｃｒｏＡｍｐ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｃａｐ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中にて行った。シグナルは製造元の手引きに従って検出した（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ　Ａ．　Ｈｅｉｄ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６，　９８６−９９４．　１９９６）。連続的に１：１０の割合で希釈したプラスミドＤＮＡ（実施例３記載のエシエリシア・コリ／ＳＭＩＮＴ２０１０３２４宿主細胞から抽出）（３．５ｘ　１０６、３．５ｘ　１０５、３．５ｘ　１０４、３．５ｘ　１０３、３．５ｘ　１０２、３．５ｘ　１０１　ｍｏｌｅｃｕｌｅ／ｗｅｌｌ）を標準曲線として解析を行った。
得られた結果を図５に示す。
図５は、ＳＭＩＮＴ２０１０３２４が小腸と腎臓に多く発現していることを示している。これより、ＳＭＩＮＴ２０１０３２４は小腸での糖吸収や腎臓での糖の再吸収に重要な役割を果たしていることが予想される。
【００３０】
実施例８
ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の一過性発現細胞における取り込み基質特異性の確認
１）ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の一過性発現細胞の調製
実施例１にて調製したＳＭＩＮＴ２０１０３２４／ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ発現プラスミドをリポフェクション法によりＣＯＳ−７細胞（ＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫ　ＲＣＢ０５３９）に導入した。リポフェクション試薬はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ　ＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。リポフェクション前日に、ＣＯＳ−７細胞を１ｍＬあたり６×１０５個となるようＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、これを９６穴プレートの１穴あたり５０μＬずつ分注した。リポフェクションは以下に従い行った。１穴あたり０．１μｇのプラスミドを１０μＬのＤ−ＭＥＭで希釈し、０．５μＬのＰＬＵＳ試薬を加えて穏やかに混和し、１５分間静置したものをプラスミド希釈液とした。１穴あたり０．５μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬を１０μＬのＤ−ＭＥＭ培地で希釈し、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ希釈液とした。プラスミド希釈液にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ希釈液を等量加えて混和し、１５分間静置した後、１穴あたり２０μＬずつ細胞培養液に添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下５時間培養した。その後１６．７％ウシ胎仔血清（三光純薬）を含むＤ−ＭＥＭ培地を１穴あたり１００μＬずつ添加した。２日間培養し、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み阻害活性の測定に供した。
【００３１】
２）メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み阻害活性の測定
取り込み用緩衝液は１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ２−［２−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む緩衝液ｐＨ７．４に、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（α−ＭＧ）の非放射ラベル体（Ｓｉｇｍａ）と１４Ｃラベル体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のα−ＭＧを最終濃度が１ｍＭとなるように混和し添加した。基礎取り込み測定用には塩化ナトリウムに替えて１４０ｍＭの塩化コリンを含む基礎取り込み測定用緩衝液を調製した。グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、および１，５−アンヒドログルシトールに対する基質特異性を測定するため、これらの糖類をそれぞれ蒸留水に溶解した後、蒸留水で適宜希釈して取り込み用緩衝液に添加し、測定用緩衝液とした。ＳＭＩＮＴ２０１０３２４一過性発現細胞の培地を除去し、前処置用緩衝液（α−ＭＧを含まない基礎取り込み用緩衝液）を１穴あたり２００μＬ加え、３７℃で１０分間静置した。同一操作をもう１度繰り返した後、前処理用緩衝液を除去し、測定用緩衝液、取り込み用緩衝液または基礎取り込み用緩衝液を１穴当たり７５μＬずつ加え３７℃で静置した。１時間後に測定用緩衝液を除去し、１穴当たり１５０μＬの洗浄用緩衝液（１０ｍＭ非放射ラベル体α−ＭＧを含む基礎取り込み用緩衝液）で２回洗浄した。１穴当たり７５μＬの０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで細胞を溶解し、その液をピコプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）に移した。１５０μＬのマイクロシンチ４０（Ｐａｃｋａｒｄ）を加えて混和し、マイクロシンチレーションカウンター　トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ）にて放射活性を計測した。対照群の取り込みから基礎取り込み量を差し引いた値を１００％として、上記糖類の各濃度におけるα−ＭＧの取り込み量を算出した。その結果をを図６に示す。図６は、ＳＭＩＮＴ２０１０３２４によるα−ＭＧの取り込みがグルコース、１，５−アンヒドログルシトール、フルクトースおよびマンノースによって阻害され、またガラクトースによって阻害されないことを示している。このことは、ＳＭＩＮＴ２０１０３２４がグルコース、１，５−アンヒドログルシトール、フルクトースおよびマンノースを取り込み基質としていることを示唆している。
【００３２】
実施例９
ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の一過性発現細胞におけるナトリウム依存性のマンノース取り込み活性試験
１）ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の一過性発現細胞の調製
実施例１にて調製したＳＭＩＮＴ２０１０３２４／ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ発現プラスミドをリポフェクション法によりＣＯＳ−７細胞（ＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫ　ＲＣＢ０５３９）に導入した。リポフェクション試薬はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ　ＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。リポフェクション前日に、ＣＯＳ−７細胞を１ｍＬあたり６×１０５個となるようＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、これを９６穴プレートの１穴あたり５０μＬずつ分注した。リポフェクションは以下に従い行った。１穴あたり０．５μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬を１０μＬのＤ−ＭＥＭで希釈し、「ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ希釈液」とした。１穴あたり０．１μｇのプラスミドを１０μＬのＤ−ＭＥＭで希釈し、０．５μＬのＰＬＵＳ試薬を加えて穏やかに混和後、１５分間静置し、「プラスミド希釈液」とした。プラスミド希釈液にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ希釈液を等量加えて混和して１５分間静置した後、１穴あたり２０μＬずつ細胞培養液に添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下５時間培養した。その後１６．７％ウシ胎仔血清（三光純薬）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤ−ＭＥＭ培地を１穴あたり１００μＬずつ添加した。２日間培養し、マンノース取り込み活性の測定に供した。
【００３３】
２）マンノース取り込み活性の測定
「取り込み用緩衝液」は１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ２−［２−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．１ｍＭサイトカラシンＢ（和光純薬）を含む緩衝液ｐＨ７．４に、マンノースの非放射ラベル体（和光純薬）と１４Ｃラベル体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のマンノースを最終濃度が１ｍＭとなるように混和して添加した。基礎取り込み測定用には塩化ナトリウムに替えて１４０ｍＭの塩化コリンを含む「基礎取り込み用緩衝液」を調製した。ＳＭＩＮＴ２０１０３２４一過性発現細胞の培地を除去し、前処置用緩衝液（マンノースならびにサイトカラシンＢを含まない基礎取り込み用緩衝液）を１穴あたり１８０μＬ加え、３７℃で１０分間静置した。同一操作をもう１度繰り返した後、前処置用緩衝液を除去し、取り込み用緩衝液および基礎取り込み用緩衝液を１穴当たり７５μＬずつ加え３７℃で静置した。１時間後に取り込み用緩衝液および基礎取り込み用緩衝液を除去し、１穴当たり１８０μＬの洗浄用緩衝液（１ｍＭ非放射ラベル体マンノースを含む基礎取り込み用緩衝液）で２回洗浄した。１穴当たり７５μＬの０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで細胞を溶解し、その液をピコプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）に移した。１５０μＬのマイクロシンチ４０（Ｐａｃｋａｒｄ）を加えて混和し、マイクロシンチレーションカウンター　トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ）にて放射活性を計測した。その結果は図７の通りである。図７により、ＳＭＩＮＴ２０１０３２４がナトリウム依存性にマンノースを取り込むことが示された。
【００３４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬの制限断片地図である。
【図２】ＳＭＩＮＴ２０１０３２４とヒトＳＧＬＴ１およびヒトＳＧＬＴ２とのマルチプルアライメントである。図中、（−）は欠落（間隙）を、（＊）は保存アミノ酸残基を、（：）はＰａｍ２５０マトリックス上においてスコアー＞０．５を示すアミノ酸グループを、そしてを（．）はＰａｍ２５０マトリックス上においてスコアー＝＜０．５を示すアミノ酸グループをそれぞれ示す。
【図３】ＳＭＩＮＴ２０１０３２４の推定アミノ酸配列に基づくハイドロフォビシティープロットである。
【図４】ＳＭＩＮＴ２０１０３２４ＤＮＡ分子をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞におけるナトリウム依存性メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み活性を示すグラフである。
【図５】ＳＭＩＮＴ２０１０３２４遺伝子のヒト組織における分布パターンを示すグラフである。
【図６】ＳＭＩＮＴ２０１０３２４ＤＭＡ分子をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞における取り込み基質確認試験の結果を示すグラフである。
【図７】ＳＭＩＮＴ２０１０３２４ＤＮＡ分子をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞におけるナトリウム依存性マンノース取り込み活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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