(57)【要約】【課題】アルツハイマー型痴呆症の発症に関係するアミロイドβの産生を効率的に測定するための材料、および該材料を利用しアミロイドβ産生に影響を与える物質のスクリーニング方法の提供。【解決手段】アミロイドβ前駆蛋白　改変蛋白、および当該改変蛋白および検出可能な分泌型蛋白からなる融合蛋白、および、これらを安定発現した試験細胞、ならびに、該試験細胞を用いたアミロイドβ産生に影響を与える物質のスクリーニング方法。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
βセクレテース切断部位を含み、該βセクレテースによる切断に影響を与えず、かつαセクレテース切断を生じないようなアミノ酸変異がなされている、アミロイドβ前駆蛋白質（ＡＰＰ）　改変蛋白。
【請求項２】
請求項１に記載のＡＰＰ改変蛋白をコードする核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載のＡＰＰ改変蛋白を発現している試験細胞。
【請求項４】
検出可能な分泌蛋白、及び請求項１に記載のＡＰＰ　改変蛋白からなる融合蛋白。
【請求項５】
請求項４に記載の融合蛋白をコードする核酸分子。
【請求項６】
請求項４に記載の融合蛋白を発現している試験細胞。
【請求項７】
被験物質がβセクレテース活性に影響を与えるか否かを試験するための方法であって、請求項３および６に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、該βセクレテースにより切断されて細胞外に分泌された検出可能な分泌型蛋白を測定することを特徴とする方法。
【請求項８】
被験物質が、アミロイドβ産生に影響を与えるか否かを試験するための方法であって、請求項３および６に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、βセクレテースにより切断されて、細胞外に分泌された検出可能な分泌蛋白を測定することを特徴とする方法。
【請求項９】
アルツハイマー型痴呆症治療薬又は予防薬の有効成分となる物質をスクリーニングするための方法であって、請求項３および６に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、βセクレテースにより切断されて細胞外に分泌された検出可能な分泌蛋白を測定することを特徴とする方法。
【請求項１０】
被験物質の存在下で培養した細胞の生死判定を行うことにより、被験物質の細胞毒性を調べる工程を有する請求項７乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
スウェーデン型家族性アルツハイマー病ＡＰＰ変異が導入されている請求項１に記載の改変蛋白。
【請求項１２】
スウェーデン型家族性アルツハイマー病ＡＰＰ変異が導入されている請求項４に記載の融合蛋白。
【請求項１３】
配列番号２〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の改変蛋白。
【請求項１４】
配列番号７〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の改変蛋白。
【請求項１５】
配列番号１２〜１６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する請求項４に記載の融合蛋白。
【請求項１６】
配列番号１７〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する請求項４に記載の融合蛋白。
【請求項１７】
以下のアミノ酸配列
2004000060.tif 000062
を有する請求項１に記載の改変蛋白。
【請求項１８】
以下のアミノ酸配列
2004000060.tif 000063
を有する請求項１に記載の改変蛋白。
【請求項１９】
請求項１７又は１８のいずれかに記載の改変蛋白、及び検出可能な分泌蛋白からなる融合蛋白。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のいずれかに記載の蛋白をコードする核酸分子。
【請求項２１】
請求項１１〜１９のいずれかに記載の蛋白を発現している試験細胞。
【請求項２２】
被験物質がβセクレテース活性に影響を与えるか否かを試験するための方法であって、請求項２１に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、該βセクレテースにより切断されて細胞外に分泌された検出可能な分泌型蛋白を測定することを特徴とする方法。
【請求項２３】
被験物質が、アミロイドβ産生に影響を与えるか否かを試験するための方法であって、請求項２１に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、βセクレテースにより切断されて、細胞外に分泌された検出可能な分泌蛋白を測定することを特徴とする方法。
【請求項２４】
アルツハイマー型痴呆症治療薬又は予防薬の有効成分となる物質をスクリーニングするための方法であって、請求項２１に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、βセクレテースにより切断されて細胞外に分泌された検出可能な分泌蛋白を測定することを特徴とする方法。
【請求項２５】
被験物質の存在下で培養した細胞の生死判定を行うことにより、被験物質の細胞毒性を調べる工程を有する請求項２２乃至２４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルツハイマー病誘因の一つと考えられているアミロイドβの測定方法およびアミロイドβの産生に影響を与える物質のスクリーニング方法の提供に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー型痴呆症は、進行性の神経変性疾患であり、記銘力障害を中心とする認知機能障害と病理学的変化（老人斑、神経原線維変化および神経細胞死）がその特徴とされている。
【０００３】
一方、アミロイドβは、約４０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドで、本疾患の病理学的特徴である老人斑の主要な構成成分であり、アミロイドβの脳内蓄積は本疾患の初期における病理変化として周知である。
【０００４】
また、アミロイドβは、それ自体神経細胞に対して毒性を示すこと、及びその前駆体であるアミロイドβ前駆蛋白質（ａｍｉｌｏｉｄ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ：　ＡＰＰ）に遺伝的に変異を有する家系が存在し高頻度にアルツハイマー型痴呆症が発症すること、およびその変異遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにおいては脳内に大量のアミロイドβの蓄積が認められることなどから、本疾患の発症原因の一つであると考えられている。
【０００５】
ＡＰＰは、構造上Ｉ型膜蛋白質として分類され、生体内においては、Ｋｕｎｉｔｚ−Ｔｙｐｅｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ　ｄｏｍａｉｎの有無により数種の分子種が存在する。神経系においては、６９５アミノ酸残基よりなるＡＰＰ６９５が主要分子であるが、その生理作用については不明の部分が多い。
【０００６】
ところで、ＡＰＰは、多くは図１に示すようにアミロイドβ中央部（Ｎ末端から１６番目）、すなわち、ＡＰＰ６９５の６１２位リジン残基のＣ末端側においてαセクレテースによりプロセッシングを受ける。この場合、アミロイドβの産生は起こらず、Ｎ末端側のｓＡＰＰαとＣ末端側の８３残基のフラグメント（Ｃ８３）が生じる。Ｃ８３は、さらに、γセクレテースによりＰ３ペプチドを生じるが、Ｐ３ペプチドはアミロイドβと性質が異なり凝集性を示さず、易分解性であることが示されている（非アミロイドβ産生系）。
【０００７】
一方、ＡＰＰのマイナープロセッシング系として、アミロイドβを生ずるアミロイドジェニックな系が存在する。このプロセッシングは、ＡＰＰ６９５の５９６位メチオニン残基　Ｃ末端側において、βセクレテースの作用により生じる系であり、ｓＡＰＰβおよびＣ末端側の９９残基のフラグメント（Ｃ９９）が生じる。Ｃ９９は、さらにγセクレテースによる切断を受け、アルツハイマー病の原因とされるアミロイドβを産生する。また、この経路は、ＡＰＰのプロセッシング全体の１０％以下と考えられている（アミロイドβ産生系）。
【０００８】
ここでいうαセクレテースとは、ＡＰＰにおけるαセクレテース切断部位に作用し、ペプチド結合を切断せしめる酵素、βセクレテースとは、ＡＰＰにおけるβセクレテース切断部位に作用し、ペプチド結合を切断せしめる酵素をいう。
【０００９】
また、上記ＡＰＰプロセッシングの初期段階において、αおよびβセクレテースは競合的に働くとされている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１７，　１５７−１８０，　２００１）。
【００１０】
現在、アミロイドβの産生を抑制することによりアルツハイマー病を予防、治療する試みがなされているが、その標的分子候補の一つとしてβセクレテースが検討されている。βセクレテースは、すでにＢＡＣＥ１として同定されている。またＢＡＣＥ１ノックアウトマウスの知見よりＢＡＣＥ１が欠損しても正常なフェノタイプを示すことが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　４，　２３１，　２００１　および　Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　４，　２３３，　２００１）。従って、βセクレテース活性を阻害することによるアミロイドβ産生抑制はアルツハイマー病の予防薬、治療薬に結びつくものとして期待されている。他方、βセクレテース活性を上げる物質は、アルツハイマー病の発症機構の解明、疾患モデルの作製、およびアミロイド仮説の証明に役立つものと思われる。
【００１１】
実際、野生型ＡＰＰのＣ末端部分を、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のＣ末端側に融合した蛋白を細胞内に発現させ、βセクレテース阻害活性を有する化合物を、培養上清中に分泌されたＳＥＡＰ活性を測定することによりスクリーニングする方法などが検討されている（シーアイエス　ダイアグノステイック株式会社）。
【００１２】
しかしながら、前述のようにαおよびβセクレテースは競合的に働き、しかもαセクレテースによるプロセッシングが全体の９０％を占めていることから、アミロイドβ産生効率は極めて低いものと考えられる。従って、前述の融合蛋白を用いたスクリーニング系では、アミロイドβ産生に影響を与える物質を、効率的にスクリーニングし得るとは言い難い。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルツハイマー型痴呆症の発症に関係するアミロイドβの産生を効率的に測定するための材料及び方法、並びにアミロイドβの産生に影響を与える物質を効率的にスクリーニングするための方法を提供することを主な目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アミロイドβの産生を効率的に測定するための材料又は方法について、鋭意研究した結果、ＡＰＰのαセクレテース切断部位をアミノ酸置換することにより、βセクレテース切断に影響を与えることなく、該αセクレテース切断を消失せしめ得ることを見出した。更に、当該ＡＰＰ改変蛋白を、検出可能な分泌蛋白に融合させて、細胞内に安定発現させることにより、アミロイドβ産生に影響を与える物質を効率的にスクリーニングする方法を見出し、これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００１５】
即ち、本発明は、次の事項を含むものである。
【００１６】
項１．βセクレテース切断部位を含み、該βセクレテースによる切断に影響を与えず、かつαセクレテース切断を生じないようなアミノ酸変異がなされている、アミロイドβ前駆蛋白質（ＡＰＰ）　改変蛋白。
【００１７】
項２．項１に記載のＡＰＰ改変蛋白をコードする核酸分子。
【００１８】
項３．項１に記載のＡＰＰ改変蛋白を発現している試験細胞。
【００１９】
項４．検出可能な分泌蛋白、及び項１に記載のＡＰＰ　改変蛋白からなる融合蛋白。
【００２０】
項５．項４に記載の融合蛋白をコードする核酸分子。
【００２１】
項６．項４に記載の融合蛋白を発現している試験細胞。
【００２２】
項７．被験物質がβセクレテース活性に影響を与えるか否かを試験するための方法であって、項３および６に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、該βセクレテースにより切断されて細胞外に分泌された検出可能な分泌型蛋白を測定することを特徴とする方法。
【００２３】
項８．被験物質が、アミロイドβ産生に影響を与えるか否かを試験するための方法であって、項３および６に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、βセクレテースにより切断されて、細胞外に分泌された検出可能な分泌蛋白を測定することを特徴とする方法。
【００２４】
項９．アルツハイマー型痴呆症治療薬又は予防薬の有効成分となる物質をスクリーニングするための方法であって、項３および６に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、βセクレテースにより切断されて細胞外に分泌された検出可能な分泌蛋白を測定することを特徴とする方法。
【００２５】
項１０．被験物質の存在下で培養した細胞の生死判定を行うことにより、被験物質の細胞毒性を調べる工程を有する細胞毒性を示すか否かを試験する工程を含む項７乃至９のいずれかに記載の方法。
【００２６】
本願発明には、更には、以下の発明が包含される。
【００２７】
項１１．スウェーデン型家族性アルツハイマー病ＡＰＰ変異が導入されている、項１に記載の改変蛋白。
【００２８】
項１２．スウェーデン型家族性アルツハイマー病ＡＰＰ変異が導入されている、項４に記載の融合蛋白。
【００２９】
項１３．配列番号２〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する項１に記載の改変蛋白。
【００３０】
項１４．配列番号７〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する項１に記載の改変蛋白。
【００３１】
項１５．配列番号１２〜１６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する項４に記載の融合蛋白。
【００３２】
項１６．配列番号１７〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する項４に記載の融合蛋白。
【００３３】
項１７．以下のアミノ酸配列
2004000060.tif 000002
を有する項１に記載の改変蛋白。
【００３４】
項１８．以下のアミノ酸配列
2004000060.tif 000003
を有する項１に記載の改変蛋白。
【００３５】
項１９．項１７又は１８のいずれかに記載の改変蛋白、及び検出可能な分泌蛋白からなる融合蛋白。
【００３６】
項２０．項１１〜１９のいずれかに記載の蛋白をコードする核酸分子。
【００３７】
項２１．項１１〜１９のいずれかに記載の蛋白を発現している試験細胞。
【００３８】
項２２．被験物質がβセクレテース活性に影響を与えるか否かを試験するための方法であって、項２１に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、該βセクレテースにより切断されて細胞外に分泌された検出可能な分泌型蛋白を測定することを特徴とする方法。
【００３９】
項２３．被験物質が、アミロイドβ産生に影響を与えるか否かを試験するための方法であって、項２１に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、βセクレテースにより切断されて、細胞外に分泌された検出可能な分泌蛋白を測定することを特徴とする方法。
【００４０】
項２４．アルツハイマー型痴呆症治療薬又は予防薬の有効成分となる物質をスクリーニングするための方法であって、項２１に記載の細胞を被験物質の存在下で培養し、βセクレテースにより切断されて細胞外に分泌された検出可能な分泌蛋白を測定することを特徴とする方法。
【００４１】
項２５．被験物質の存在下で培養した細胞の生死判定を行うことにより、被験物質の細胞毒性を調べる工程を有する項２２乃至２４のいずれかに記載の方法。
【００４２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、詳細に説明する。
【００４３】
アミロイドβ前駆蛋白質（ＡＰＰ）改変蛋白
本発明におけるアミロイドβ前駆蛋白質（ＡＰＰ）改変蛋白とは、ＡＰＰにおけるβセクレテース切断部位を含み、かつ、αセクレテース切断部位が、上記βセクレテースによる切断に障害を与えないアミノ酸変異によって改変されていることを特徴とする蛋白である。
【００４４】
ここで、βセクレテース切断部位とは、例えば、ＡＰＰ６９５においては、ＡＰＰ６９５の５９６位メチオニン残基と５９７位アスパラギン酸残基の間を指す（図１参照）。また、αセクレテース切断部位とは、ＡＰＰ６９５においては、６１２位リジン残基と６１３位のロイシン残基との間を指す。
【００４５】
ＡＰＰ６９５のアミノ酸配列を図２及び配列表の配列番号１に示す。以下、本明細書におけるアミノ酸、蛋白質、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００４６】
ＡＰＰには、ＡＰＰ６９５以外に、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０等の複数の分子種が存在するが、これらのαセクレテース及びβセクレテースの切断部位は同じであるため、ＡＰＰ６９５を用いて説明している。但し、本発明のＡＰＰ改変蛋白に用いるＡＰＰが、ＡＰＰ６９５に限定されるわけではない。
【００４７】
本発明のＡＰＰ改変蛋白においては、上記特徴を有するために必要な領域を含有し、かつβセクレテースによる切断に支障がなければ、特に、Ｎ末端側のアミノ酸配列の長さに限定はない。また、Ｃ末端領域に関しても、βセクレテース部分の開裂後に生じるγセクレテースにより生じるアミロイドβの産生に支障がなければ、必ずしもＣ末端部分全てのアミノ酸配列を必要とするわけではない。
【００４８】
ＡＰＰ６９５の場合、上記特徴を有するために必要な領域として、ＡＰＰ６９５の５９３−６４８位を例示することができる。
【００４９】
この必要な領域について説明すると、まずβセクレテ−ス認識サイト５９６−５９７を含んでいる必要がある。また、βセクレテ−スが、基質として認識するのにＮ端側の４残基程度が必要であるとの報告（Ｎｅｕｒｏｎ，１４，６６１−６７０（１９９５））があるため、少なくともＮ端側は、５９３残基から必須となる。さらに、αセクレテ−スサイトである６１２−６１３が必要である。更に、産生されるアミロイドβにて産生量を確認するためのアミロイドβ部分（５９７−６３８）を含めると５９３−６３８残基が必要となる。また更に、ＡＰＰは、Ｉ型膜蛋白であるので、正常に膜に固定され、膜に固定された上でプロセッシングを受けるために、膜貫通領域６２５−６４８が必要である。従って、これらを含む５９３−６４８位が例示される。
【００５０】
このような領域を含む蛋白としては、例えば、ＡＰＰ６９５のアミノ酸配列５８１−６９５位を含むＣ末端側領域を有するものなどが例示できる。
【００５１】
本発明において、「βセクレテースによる切断に影響を与えず」とは、αセクレテース切断を生じさせないようなアミノ酸変異によって、βセクレテースによる切断が消失又は低下しないことを意味する。
【００５２】
本発明の改変蛋白において、αセクレテース切断を生じないようなアミノ酸変異とは、例えば、αセクレテース切断部位におけるアミノ酸の欠失、置換、付加などによってアミノ酸が変異されたものを意味する。該アミノ酸変異は、βセクレテースによる切断に影響を与えず、かつαセクレテース切断を生じないようなものである限り、特に制限されることはない。
【００５３】
このうち、アミロイドβのＮ末端アミノ酸から１７位のロイシン残基をグルタミン酸、プロリン、アラニン又はリジンに置換するアミノ酸で変異したもの、および、１６位リジン残基をトリプトファンに置換するアミノ酸に変異したものが、特に好ましい。
【００５４】
具体的には、配列番号２〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するＡＰＰ改変蛋白などが例示できる。
【００５５】
さらに、βセクレテースの攻撃をより容易にするために、一般に知られている遺伝性アルツハイマー病におけるＡＰＰアミノ酸変異配列を導入することもできる。遺伝性アルツハイマー病におけるＡＰＰアミノ酸変異配列としては、例えば、スウェーデン型家族性アルツハイマー病ＡＰＰ変異配列を例示できる。
【００５６】
このような蛋白として、具体的には、配列番号７〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する改変蛋白などが挙げられる。
【００５７】
本発明のＡＰＰ改変蛋白は、ＡＰＰ蛋白をコードする遺伝子を該改変蛋白のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に改変し、適当な発現ベクターへ導入した後、宿主細胞内において発現させることにより得ることができる。また、各ステップにおける目的遺伝子の取得に際し、適宜、サブクローニング操作等を行ってもよい。例えば、適当なクローニングベクターに目的遺伝子を挿入した後、常法により目的遺伝子の選別を行い、該遺伝子自体の量を増やすことなどができる。
【００５８】
なお、ＡＰＰ改変部分のアミノ酸に対応するＤＮＡ分子に関しては、該アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である限り、いずれの組み合わせも可能である。コドンの選択は、常法に従って行うことができる。例えば、利用する宿主のコドンの使用頻度などを考慮し決定することができる。
【００５９】
また、目的ＤＮＡ分子配列の取得に際しては、たとえばＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅法により変換増幅することができる。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、上記核酸分子の変換ＤＮＡの配列情報に基づいて適宜設定でき、常法に従って合成できる。
【００６０】
また、増幅させたＤＮＡ断片の単離、精製は、常法に従って行うことができ、例えばゲル電気泳動法、分子ふるい操作などによって得ることができる。
【００６１】
また、上記で得られる本発明の核酸分子或いはＤＮＡ断片は、例えばジデオキシ法やマキサム−ギルバート法などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００６２】
該蛋白の製造は、上記ＤＮＡ分子により提供されるＤＮＡ分子の配列情報に基づいて、常法の遺伝子組換技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．，　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ．　１９８９　　　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．　　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．　１９９８．など参照）に従って調製することができる。
【００６３】
該蛋白の製造は、より詳細には、該所望の蛋白をコードするＤＮＡ分子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することによって行われる。
【００６４】
宿主細胞としては、原核生物由来細胞、真核生物由来細胞などを用いることができる。
【００６５】
原核生物由来細胞としては、例えば、大腸菌や枯草菌などに由来する細胞を用いることができる。大腸菌としては、とりわけエシェリシア．コリ（　Ｅｓｃｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２株に含まれるものが好適である。また、枯草菌としては、とりわけバシラスズブチリス　マーバーグ１６８株に含まれるものが好適である。
【００６６】
原核生物を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中にＤＮＡ分子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シャイン‐アンド‐ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３　などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種ベクターを用いることができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＩ−Ｐ２　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　社）、ｐＥＴ２１、　ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　社）　等を例示できる。
【００６７】
プロモーターについても特に限定はなく、エシェリシア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン（ｔｒｐ）　プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲ　プロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
【００６８】
真核生物由来細胞としては、例えば、哺乳動物由来細胞、具体的には、サルの細胞であるＣＯＳ細胞　（Ｃｅｌｌ，　２３：　１７５　（１９８１））やチャイニーズハムスター卵巣細胞およびそのジヒロド葉酸レダクターゼ欠損株　（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，　１０８：　９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　７７：　４２１６　（１９８０））、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，　４：５４９（１９６９））、およびＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１３３：１２３（１９８４））などを用いることができる。また、サッカロミセス属酵母細胞なども好適に用いることができる。
【００６９】
真核生物由来細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとするＤＮＡ分子上流のプロモーター、ＲＮＡのスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列を保有するものが挙げられ、更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ　（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１：　８５４　（１９８１））等が例示できる。上記以外にも既知の各種市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用される、かかるベクターとしては、例えばｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　社）　、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　社）、ｐＥＦ１／Ｖ５−Ｈｉｓ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃ　ＨＴ　（ＧｉｂｃｉＢＲＬ　社）、ｐＡｃＧＨＬＴ　（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ　社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，　ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ，　ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ　（以上　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【００７０】
また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０　由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインのプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーター、アデノウイルスプロモーター、エロンゲーションファクターのプロモーターなどを例示できる。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどを好適に利用できる。
【００７１】
発現ベクターの宿主細胞への導入法及びこれによる形質転換法は、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。具体的には、エレクトロポレーション、リポソーム法、リン酸カルシュウム法、ＤＥＡＥデキストラン法などを用いることができる。
【００７２】
宿主細胞を培養し、産生される蛋白を適宜分離精製することによって、本発明の蛋白を取得することができる。
【００７３】
かくして取得した当該蛋白は、そのもの自体を、β−セクレテースに対して、影響を与える化合物のスクリーニングに使用することができる。
【００７４】
また、真核生物由来細胞を用いて当該蛋白を産生した場合には、細胞全体あるいは単離蛋白のいずれを用いても良い。
【００７５】
被験化合物および該蛋白（又は蛋白発現細胞）を、β−セクレテースの共存下反応することにより、上述β−セクレテースに対して影響を与える化合物を効果的にスクリーニングすることもできる。
【００７６】
蛋白の検出方法は、たとえばＡＰＰのアミノ酸配列を認識する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法、或いはＥＬＩＳＡ法などで行うことができる。
【００７７】
融合蛋白
本発明の融合蛋白とは、上述した本発明のＡＰＰ改変蛋白のＮ末端側部分に、検出可能な分泌蛋白等を融合した蛋白をいう。
【００７８】
検出可能な分泌蛋白等とは、そのアミノ酸配列中に細胞内各組織への局在配列を含まない蛋白であり、細胞内構成成分とは異なり、通常の細胞内における生合成により細胞外に遊離され、その機能を発揮する蛋白およびアミノ酸配列を指し、当該分泌蛋白等のＣ端側領域において、βセクレテースにより切断を受け、細胞外に分泌され得る蛋白等をいう。
【００７９】
好ましくは、当該分泌蛋白等は、酵素のように基質を用いて簡便に検出できるもの、あるいは、そのもの自体が特徴的な物性を有し、機器および試薬などを用いて、胞外又は培養上清中に分泌された量を定量的に測定できるもの、あるいは、細胞外にて生理活性作用を発揮する蛋白・ペプチドである。また、培養上清中の該生理活性蛋白に起因する生物活性を測定できるもの、あるいは、一般的に、分泌蛋白の抗体を利用し、培養上清中の該分泌蛋白の量を、例えば、ＥＬＩＳＡ法あるいはウエスタンブロッティング法などにより測定できるものも用い得る。
【００８０】
具体的には、分泌型アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、ルシフェレース等を挙げることができ、例えば、培養上清中に当該酵素の基質を添加することにより、酵素活性量として定量することが可能である。
【００８１】
他に例示すれば、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）、エクオリン等の検出可能な蛋白、イムノグロブリン、成長ホルモン等の測定系の確立されている蛋白、ヒスチジンタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、フラッグタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、グルタチオンＳトランスフェレース（ＧＳＰ）タグ、Ｔ７タグ、Ｖ５エピトープタグ、Ｘ−ｐｒｅｓｓタグ、ＢＥ１１タグ等の抗体により検出可能なアミノ酸配列等を例示することができる。
【００８２】
さらに例示すれば、サイトカインに属する生理活性蛋白群、例えばインターロイキン２を挙げることができ、細胞外に遊離した該蛋白を培養液中の生物活性を測定することにより、あるいは市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定することにより、検出することが可能である。
【００８３】
また、これらの分泌蛋白等は、分泌型蛋白として産生され、分泌されることが望ましく、本来の分泌蛋白としてのシグナルペプチドを有することが望ましいが、ＡＰＰその他の分泌蛋白のシグナルペプチドを利用して、分泌させることも可能である。
【００８４】
また、これらの分泌蛋白等は、検出される酵素活性、免疫反応性、生物活性等に大きな影響のない限りにおいて、その配列の一部を改変、欠失、挿入することが可能である。
【００８５】
一方、分泌蛋白等に融合せしめる蛋白は、上述の本発明のＡＰＰ改変蛋白であって、ＡＰＰにおけるβセクレテース切断部位を含み、βセクレテースによる切断に影響を与えず、かつαセクレテース切断を生じないようなアミノ酸変異がなされた蛋白である。
【００８６】
該アミノ酸変異は、βセクレテースによる切断に影響を与えず、かつαセクレテース切断を生じないようなものである限り、特に制限されることはないが、中でも、アミロイドβのＮ末端アミノ酸から１７位のロイシン残基をグルタミン酸、プロリン、アラニン又はリジンに置換するアミノ酸で変異したもの、および、１６位リジン残基をトリプトファンに置換するアミノ酸に変異したものが、特に好ましい。
【００８７】
本発明の融合蛋白として、具体的には、配列番号１２〜１６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白などを例示することができる。
【００８８】
さらに、本発明の融合蛋白には、βセクレテースの攻撃をより容易にするために、一般に知られている遺伝性アルツハイマー病におけるＡＰＰアミノ酸変異配列を導入することもできる。遺伝性アルツハイマー病におけるＡＰＰアミノ酸変異配列としては、例えば、スウェーデン型家族性アルツハイマー病ＡＰＰ変異配列を例示できる。
【００８９】
このような融合蛋白として、具体的には、配列番号１７〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白などを挙げることができる。
【００９０】
また、該ＡＰＰ改変蛋白は、βセクレテースの攻撃を受け、切断された後、該分泌蛋白が細胞外に分泌され、かつ分泌された該蛋白が本来の特性を保持しうるアミノ酸領域を有していることが好ましい。そのようなアミノ酸領域としては、例えば、βセクレテースの切断部位からＮ端側のアミノ酸４残基までの領域から、膜貫通領域（ＡＰＰ６９５の　６２５−６４８番目のアミノ酸領域）までを含む領域、すなわちＡＰＰ６９５の５９３−６４８位等が挙げられる。さらに、この領域を含む改変蛋白として、ＡＰＰ６９５の５８１−６９５位のＣ端領域を例示することができる。
【００９１】
また、当該融合蛋白は、ＡＰＰにおけるβセクレテース切断部位がβセクレテースの攻撃に影響を及ぼすような立体構造上の障害を持つものでないように、必要に応じて、ＡＰＰ改変蛋白のＮ末端領域を延長し、もしくは、適宜分泌蛋白とＡＰＰ改変蛋白の間に新たにスペーサーを入れることもできる。
【００９２】
このような融合蛋白の具体例として、配列番号１２〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白を例示することができる。
【００９３】
該融合蛋白は、前述の本発明ＡＰＰ　改変蛋白における製造方法に記載されたのと同様の方法で製造することができ、遺伝子組換手法により、前述した本発明のＡＰＰ改変蛋白をコードする遺伝子および分泌可能な蛋白をコードする遺伝子を基に作製することができる。
【００９４】
試験細胞
上述した本発明のＡＰＰ改変蛋白又は融合蛋白を安定に発現する本発明の試験細胞について以下に述べる。
【００９５】
ここで、試験細胞とは、化合物の効力や毒性などを測定するための試験に使用し、測定結果を判定するために用いられる細胞のことを意味する。
【００９６】
本発明の試験細胞は、例えば、上述と同様の遺伝子工学的手法および材料（発現ベクター）を用いることにより、作成することができる。
【００９７】
治療薬の開発を目的としたスクリーニングに使用する場合には、試験細胞の製造に使用する細胞の、細胞構成成分、遺伝子発現機構、蛋白発現機構および分泌機構が、ヒトに近いことが好ましい。従って、融合蛋白を発現する細胞の場合は、例えば、ＡＰＰ部分で切断を受けた後、分泌蛋白が細胞外に遊離される機構を備えた細胞などを用いることが好ましい。
【００９８】
また、細胞の性質としては、増殖速度が速く継代を経ても安定な細胞であることが好ましい。例えば、ヒト由来細胞または、哺乳動物由来の細胞、具体的にはＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，　１０８：　９４５（１９５８）），　Ｈｅｌａ細胞（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　１２：　２６４（１９５２）），　ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，　１０８：　（１９５８）），　Ｊｕｒｋａｔ　細胞（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１３３：　１２３（１９８４）），　２９３細胞（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．，　３６：　５９（１９７７））などを例示できる。
【００９９】
安定発現細胞株を得るための方法として、薬剤耐性遺伝子、即ち、アミノグリコシドリン酸転移酵素（Ｔｈ５ｎｅｏ）、ハイグロマイシンＢリン酸転移酵素（ｈｙｇｒ）、キサンチンーグアニンホスフォリポシル転移酵素（Ｅｃｏ−ｇｐｔ）およびジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）などを、発現ベクターに組み込んでいる発現ベクター、たとえば、ｐＳＶ２ｎｅｏ，　ｐＲＳＶｎｅｏ　あるいは、ｐＨｙｇ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、もしくはｐＳＶ２ｄｈｆｒ　などを用いることができる。これを、細胞内導入後、それぞれの選択薬剤Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ＨＡＴ培地およびメトトレキセート添加培地にて培養することにより安定発現細胞を得ることが可能である。また、高発現細胞株の選別に関しては、培養上清中の分泌蛋白か、もしくは該融合蛋白の構成成分を測定することにより達成することができる。たとえば、培養上清中の酵素活性を例示することができる。あるいは、細胞内にあっては、検出可能な分泌蛋白およびＡＰＰ　Ｃ末端部分認識抗体を用いたウエスタンブロッテイング法あるいはＥＬＩＳＡ法にて検出することも可能である。さらに、遺伝子発現レベルでは、ノーザンブロッテイングあるいはＲＴ−ＰＣＲ法などを用いて検出することができる。
【０１００】
測定方法
本発明の測定方法は、上述した試験細胞を被験物質と処理し、βセクレテース切断部位で開裂され細胞外に分泌された検出可能な分泌蛋白を測定することにより行うことができる。
【０１０１】
以下に、その測定方法に関して詳述する。すなわち、該試験細胞を、培地で懸濁した後、適当な培養プレートに幡種する。幡種細胞は、必要なら安定化するまで一定時間インキュベートを行う。また、プレートは幡種細胞数、および分泌蛋白の測定感度を勘案して任意に決定できる。好適な例として、例えば、９６穴プレートをあげることができる。
【０１０２】
その後、被験化合物を溶媒に加え、溶解せしめた後、一定濃度となるように添加する。この時、被験物質は、たとえば脂溶性化合物又は難溶性化合物であればＤＭＳＯなどの両親媒性溶媒を用いて溶解した後添加することができるが、使用溶媒が細胞に対して影響を及ぼさない濃度に設定することが望ましい。また、親水性被験物質の場合は、水溶性の溶媒、たとえば生理食塩水、培地などを用いることができる。被験物質を添加後、一定時間培養を行うが、培養時間は、被験物質が細胞内に取り込まれ十分に標的分子と反応する時間であればよく、試験系に応じて任意に設定できる。
【０１０３】
インキュベート後、培養上清を一定量分取し、該上清中に存在する分泌蛋白量をその特性に応じて測定する。例えば、該分泌蛋白が酵素であれば基質を添加することにより酵素活性量として測定することができる。また、該分泌蛋白が特徴的物性を有するものであれば、その特性に応じた測定法によればよく、たとえば特有の吸収スペクトルを有するものであれば吸光度計等を用いて測定できる。必要ならＨＰＬＣなどを用いた分離操作により、目的蛋白をモニターすることにより定量することもできる。さらに、該分泌蛋白が生理活性蛋白たとえばサイトカインのようなものであれば、培養上清中の該蛋白に起因する生物活性を測定すればよい。また、市販のＥＬＩＳＡキットなどを用いて測定定量することも可能である。
【０１０４】
また、細胞内に発現している融合蛋白の存在形態をモニターしてもよい。つまり、融合蛋白がβセクレテース切断部位において切断を受けたかどうかを直接確認することもできる。すなわち、βセクレテースにより切断を受け生成する９９残基のＣ端フラグメント（Ｃ９９）の量を測定することにより、被験候補化合物が機能的に作用したか否かを確認することができる。
【０１０５】
測定方法としては、Ｃ９９を認識する抗体を用いて、たとえば細胞を溶解後ウエスタンブロッテイングあるいはＥＬＩＳＡ法を用いて検出定量することが可能である。
【０１０６】
被験物質が、βセクレテース活性に影響を及ぼすかどうかは、上記方法において、被験物質無添加（溶媒のみ）において培地中に遊離されてくる該検出可能な分泌蛋白（コントロール値）を基準にして判定することができる。具体的には、コントロール値に対して測定値が低い場合は、アミロイドβ産生に抑制的影響を及ぼしたものと判定される。また、逆にコントロール値に比し高い値が測定された場合は、アミロイドβ産生に促進効果を有しているものと判定される。
【０１０７】
被験化合物がアミロイドβ産生に対して影響を及ぼすかどうかは、統計学的解析、すなわち、有意差検定を行うことにより判定を行う。
【０１０８】
上記方法によって、被験物質が、βセクレテース活性に対して影響を及ぼすかどうかを試験することができる。また、アルツハイマー型痴呆症治療薬又は予防薬の有効成分の候補となる物質をスクリーニングする事ができる。
【０１０９】
さらに、本発明の測定方法においては、被験物質が細胞に対して毒性を示すか否かを試験する工程を含ませてもよい。
【０１１０】
被験物質が細胞に対して毒性を示すか否かは、被験物質と試験細胞を処理し、検出可能な分泌型蛋白を測定した後、該処理細胞の生存状況を測定することにより、判定することができる。
【０１１１】
具体的には、生存細胞数の測定は、カルセインＡＭに染色された細胞数を、死細胞数の染色においては、プロピジウム‐ヨードによって染色された細胞数を測定することによって調べることができる。また、トリパンブルー染色にて染色された細胞をカウントすることにより死細胞数を測定することもできる。あるいは生細胞によって生じるテトラゾリウム塩（ＭＴＴ，　ＭＴＳ，　ＷＳＴ−１，　ＷＳＴ−８等）のホルマザンを比色測定することにより生細胞数を、あるいはアポトーシスなどの細胞死により培養上清中に流出してきた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定することにより死細胞数を測定することもできる。もちろん、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１１３】
実施例１：ＡＰＰ改変蛋白遺伝子の構築と発現
ヒト型ＡＰＰ遺伝子（図２）のＮ末端のシグナルペプタイド直後にエピトープ　タグ　ＢＥ１１を付加し、ベクターに組み込んだＢＥ１１−ｈＡＰＰ６９５を出発物質とした。　ＡＰＰ６９５のαセクレテース切断部位のＮ末側アミノ酸（アミロイドβ１６位リジン）、もしくは、Ｃ末側アミノ酸（アミロイドβ１７位ロイシン）にサイトダイレクテッドムータゲネシス法（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ，　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、１６位にはトリプトファンを、１７位には、アラニン、グルタミン酸、リジン、プロリン、グルタミン、スレオニン残基を導入した。これらの変異型ＡＰＰと野生型ＡＰＰをそれぞれｐＣＩｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み入れたコンストラクトを構築し、リポソーム法（ＤＯＴＡＰ，　ベーリング−マンハイム）にてＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、一過性に発現させた。トランスフェクト後４８時間で細胞と培養上清を回収し、８％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッテイングにて発現蛋白とそのプロセッシングを解析した。　また、ＢＥ１１に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ　ＢＥ１１）を用い細胞膜付随全長型ＡＰＰの発現を確認し、その発現レベルを標準化した後、培養上清（Ｍｅｄｉｕｍ）中に分泌されたαセクレテース切断産物（ｓＡＰＰα）とβセクレテース切断産物（ｓＡＰＰβ）をそれぞれに対する特異的抗体をもちいて検出、定量した。結果を図３及び表１に示す。
【０１１４】
図３において、Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｔは、アミノ酸１文字表記で、それぞれ、アラニン、グルタミン酸、リジン、プロリン、グルタミン、スレオニンを意味する。また、左端のＷは野生型（Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）を、右端のｍは、ｍｏｃｋでベクターのみを意味する。
【０１１５】
【表１】
2004000060.tif 000004
【０１１６】
また、表１において、↓は各セクレテース切断産物の量の減少、→は各セクレテース切断産物の量が不変、↑はセクレテース切断産物の量の増加、０は、各セクレテース切断産物が全く検出されないことを示す。
【０１１７】
図３又は表１の結果に示されるように、１７位をアラニンで置換した場合、αセクレテース切断産物の量が減少した。１６位をトリプトファンで置換した場合、αセクレテース切断産物の量が大幅に減少した。また、１７位をグルタミン酸又はプロリンで置換した場合には、αセクレテース切断産物が全く検出されなかった。
【０１１８】
一方、これらの変異によって、βセクレテースによる切断は全く影響を受けなかった。
【０１１９】
また、１７位をリジンに置換したところ、αセクレテース切断産物の量が減少し、βセクレテース切断産物の量がやや増加した。
【０１２０】
以上の結果に示されるように、これらの変異を導入した本発明のタンパク質は、アミロイドβの産生に影響を与える物質を効率的にスクリーニングするために有効に使用し得ることが確認できた。
【０１２１】
以下、アミロイドβ１７位をグルタミン酸で置換して変異したＡＰＰ改変蛋白を用いて、融合蛋白の構築を行った。
【０１２２】
実施例２：融合蛋白遺伝子の構築および試験細胞の樹立
（１）融合蛋白遺伝子の構築
まず、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードしているｃＤＮＡ（ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　６０４９−１））を、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで処理することにより、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を得た。ただし、これは、ＳＥＡＰのコーデイング領域の、最後の１０個のアミノ酸に相当する部位は除かれている。
【０１２３】
次いで、ヒトＡＰＰ改変蛋白ｃＤＮＡ断片すなわち、Ｃ末端領域（ＡＰＰ　Ｎ末端より数えて５８１から６９５アミノ酸）　を用いてＰＣＲ法をにより単離した。なお、プライマーは以下のものを用いた。
センスプライマー：　ＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＴＣ　（ＸｂａＩを含む）
アンチセンスプライマー：　ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡ　（ＮｏｔＩを含む）。
また、テンプレートＤＮＡは、前述本発明ヒトＡＰＰ改変蛋白遺伝子を用いた。
【０１２４】
ＰＣＲ反応条件は以下の通りである。
【０１２５】
反応溶液　２５　μｌ（　１０　ｍＭ　ＫＣｌ，　１０　ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４，　２　ｍＭ　ＭｇＳＯ４，　０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，　４００　μＭ　ＮＴＰ，　０．５　μＭ　Ｐｒｉｍｅｒ（各センス、アンチセンス），　１０　ｎｇ　テンプレートＤＮＡ，　０．０１％　ＢＳＡ，　０．２５ユニット　Ｖｅｎｔｒ’ｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ，　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　２５４Ｌ）を含む２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ８．０）。
【０１２６】
増幅条件は、（９４℃ｘ３０秒、５５℃ｘ１分、７２℃ｘ２分）　ｘ　２５サイクルで行い、増幅されたＰＣＲ断片のクローニングには、ｐＴ７　ｂｌｕｅ−３　（Ｎｏｖａｇｅｎ　Ｉｎｃ．，　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　７００２９−３）を使用し、トランスフォーメーションには、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ　（Ｔｏｙｏｂｏ，　　Ｃａｔ．Ｎｏ．　ＤＮＡ−９０１）　を用いた。該操作により、ｐＴ７　ｂｌｕｅ−３／ｃＡＰＰＥを得た。
【０１２７】
また、スウエーデン型変異を挿入するために、以下の操作を行った。すなわち、まずＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトを持つＤＮＡアダプターを作製した。なお、オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【０１２８】
センス：　ＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧ
アンチセンス：　ＡＡＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＣＴＴＣＡＧＡ
これを、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏ　ＲＩで前もって消化しておいたｐＴ７　ｂｌｕｅ−３／ｃＡＰＰＥに挿入し、サブクローニングを常法に従って行い、ｐＴ７　ｂｌｕｅ−３／ＡＰＰＥを得た。
【０１２９】
次いで、ｐＴ７　ｂｌｕｅ−３／ＡＰＰＥを、常法に従いＸｂａＩおよびＮｏｔＩにて処理を行い、得たＸｂａＩ−ＮｏｔＩ断片を融合蛋白の製造材料とした。ＳＥＡＰに関しては、　ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ　をＥｃｏ　ＲＩおよびＸｂａＩにて処理を行い、ＳＥＡＰ　Ｅｃｏ　ＲＩ−Ｘｂａ　ＩＤＮＡ断片を得た。
上記２種類のＤＮＡ断片を、前もってＥｃｏ　ＲＩおよびＮｏｔ　Ｉにて処理しておいた発現ベクター　ｐＥＦ１／Ｖ５−Ｈｉｓ　に対して、ライゲーションを行い融合蛋白発現遺伝子の構築を完成した。
（２）融合蛋白安定発現試験細胞株の樹立
６０　ｍｍ　カルチャーディッシュ上にて培養を行っておいたチャイニーズ−ハムスター−オバリー細胞（ＣＨＯ−Ｋ１，　ＡＴＣＣ　ＣＣＬ６１）に対してトランスフェクション試薬ＰｏｌｙｆｅｃｔＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｃａｔ．Ｎｏ．　３０１１０５）　を用いて該発現ベクタ−のトランスフェクションを行った。なお、該細胞の培養には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　Ｄ８０６２）に牛胎仔血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　１２１０３−７８９，　Ｌｏｔ．　Ｎｏ．　９Ｋ２０８７）を終濃度１０％となるように添加した培地を使用した。４８時間後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ　（５００　μｇ／ｍｌ）　を含む前述培地に処理細胞を懸濁した後、９６穴マイクロプレートに　１，　１０，　１００　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割合で幡種した。２週間後、陽性クローンを含むｗｅｌｌのスクリーニングを行った。すなわち、アルカリフォスファターゼ基質（Ｂｌｕｅ　ＰｈｏｓＴＭ，　ＫＰＬ，　Ｃａｔ．Ｎｏ．　５０−８８−００）を用いて培養上清中のアルカリフォスファターゼ活性の測定を行った。このアルカリフォスファターゼ活性を指標として、安定した発現を示すクローンを選別した。
【０１３０】
図４に示されるように、得られたクローン（ＣＨＯ／ｓｗ）は細胞の増殖に伴い（図４−Ｂ）、時間経過とともに、培養上清中のアルカリフォスファターゼ活性（Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ）が上昇していることがわかる（図４−Ａ）。
【０１３１】
以上のようにして樹立した融合蛋白発現細胞（ＣＨＯ／ｓｗ）は、増殖・培養時間に伴い、培養上清中にβセクレテース切断産物としてアルカリフォスファターゼを分泌した。また、分泌されたアルカリフォスファターゼの活性は、同様に分泌されたアミロイドβの産生量と相関することが明らかとなった。従って、分泌アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより、アミロイドβの産生を検出することが可能である目的の細胞株を作製することに成功した。
【０１３２】
さらに、培養上清中のアミロイドβをＥＬＩＳＡにより測定したところ、アミロイドβ産生量は、アルカリフォスファターゼ活性と相関することが確認された（図４−ＣおよびＤ）。アルカリフォスファターゼ活性、およびＭＴＴによる細胞増殖は、後述の方法により行った。アミロイドβ１−４０および１−４２測定は、市販のキット（免疫生物研究所、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．１７７１４　及び１７７１２）を用いた。
【０１３３】
（３）融合蛋白に導入された遺伝子の確認
更に、実際に、遺伝子導入が行われているかどうかの確認を行った。まず、１００　ｍｍ　Ｄｉｓｈ上でコンフルエント状態に培養した遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＤｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（１００　ｍＭ　ＮａＣｌ，　２５　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．５％　ＳＤＳ，　０．１　ｍｇ／ｍｌ　プロテインキナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ）を含む１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ８．０）　５００　μｌ　に懸濁し、５０℃で一夜インキュベートした。続いて、細胞溶解物をフェノール−クロロフォルム（１：１）で抽出し、水槽を同量のイソプロパノールを添加し、１，７００　ｘ　ｇで２分間遠心分離することによりＤＮＡを回収した。次いで、ＤＮＡはＴＥ緩衝液（１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ８．０）　０．５　ｍｇ／ｍｌに懸濁し、６０℃で完全に溶解させた。ＰＣＲは、前述調製ＤＮＡをテンプレート（２．５　μｇ）とし、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，　Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＲ００１Ａ）、および後述各プライマー０．５　μＭを用いて行った。条件は、（９４℃　ｘ　３０秒、６０℃　ｘ１分、７２℃　ｘ　２分）ｘ　３０サイクルにて行った。
【０１３４】
融合蛋白に対するプライマーは以下の通りである。
【０１３５】
センス：ＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＴＣ
アンチセンス：ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡ
また、βアクチンに対するプライマーは以下の通りである。
【０１３６】
センス：ＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣ
アンチセンス：ＡＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＡ
図５−Ａに示したように、本融合蛋白発現細胞株（図中Ｓで示す）は、目的の融合蛋白（ＳＥＡＰ−ＡＰＰｓｗ）の遺伝子が導入されていることが明らかとなった。対照として、遺伝子導入していないＣＨＯ細胞株（図中Ｈで示す）およびスウェーデン型変異を付加していない融合蛋白（ＳＥＡＰ−ＡＰＰｗｔ）遺伝子を導入した細胞株（図中Ｗで示す）を用いた。Ｗにおいても融合蛋白遺伝子の導入が確認された。ここで、対照の遺伝子としては、β−Ａｃｔｉｎを用いた。
【０１３７】
また、取得クローンが実際に目的融合蛋白が発現しているかどうかについて、ウエスタンブロッテイングを用いて確認した。
【０１３８】
まず、１００　ｍｍ　Ｄｉｓｈ上でコンフルエントの状態に培養したＣＨＯ−Ｋ１細胞を細胞溶解バッファー　（１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　０．１％　ＳＤＳ，　１％　ＮＰ−４０，　０．５％　Ｃｈａｐｓ，　１０　ｍｇ／ｍｌ　アプロチニン，　１０　ｍｇ／ｍｌ　リュウペプチンを含む５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ８．０）１　ｍｌに懸濁し、氷上で３０分間間欠的にボルテックス操作を行った。細胞溶解物は、１４，０００ｒｐｍで１０分、４℃遠心分離を行い、上清をウエスタンブロッテイング用サンプルとした。次いで、細胞抽出液　および培養上清１６　μｌを、サンプル調製バッファー（１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０％　ＳＤＳ，　２５％　グリセロール，　０．１％　ＢＰＢ，　１％　２−メルカプトエタノールを含む０．６２４　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ６．８）４　μｌに対して混合し、１３％　ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０　ｘ１０　ｃｍ　スラブゲル）にて、電気泳動を行った。泳動後、蛋白はセミドライブロッター（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ　ＳＤ，　Ｂｉｏ　Ｒａｄ，　Ｃａｔ．Ｎｏ．１７０−３９４０）を用い、ニトロセルロース膜（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−ＥＣＬ，　アマシャムファルマシア　バイオテック，Ｃａｔ．　Ｎｏ．　ＲＰＮ３０３２Ｄ）に対してトランスファーを行った。次いで、ニトロセルロース膜を、Ｂｌｏｔｔｏ−Ｂ　ｂｕｆｆｅｒ（１％　ＢＳＡ，　１％　ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ，　０．０５％　ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）中で、１時間室温でブロッキング操作を行い、ＡＰＰ認識抗体溶液で処理（２時間、室温）を行った。ニトロセルロース膜は洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で十分洗浄した後、二次抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−２０３０）および　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−２００５））に対して、１時間室温で処理を行った。検出は、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｓｕｐｅｒ　Ｓｉｇｎａｌ’ｑ，　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ．，　Ｃａｔ．Ｎｏ．３４０８０）を用いた。なお、一次抗体は、以下のものを使用した。
【０１３９】
抗ヒトＡＰＰ抗体（Ｃ末端部分認識抗体，　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，　Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−８７１７）、抗ｓＡＰＰα抗体（自社作製）、抗ｓＡＰＰβ抗体（　免疫生物研究所　）。
【０１４０】
結果を図５−Ｂに示した。細胞溶解物のウエスタンブロッティングの結果（図５−Ｂ左写真）より、矢印で示すように目的の位置にＡＰＰの発現が確認された。上部のバンドは内因性ＡＰＰ、下部のバンドは融合蛋白を示し、スウェーデン型変異を付加した融合蛋白発現細胞株（Ｓ）およびスウェーデン型変異を付加していない融合蛋白遺伝子導入細胞株（Ｗ）において融合蛋白の発現が確認された。
【０１４１】
また、培養上清のウエスタンブロッティングの結果より、α切断産物は、いずれの培養上清においても検出されなかった（図５−Ｂ中央写真）。
【０１４２】
一方、β切断産物に関しては、融合蛋白発現細胞株（Ｓ）においてのみ検出された（図５−Ｂ右写真）。以上の結果より、本融合蛋白発現細胞株は、蛋白レベルにおいて目的融合蛋白を発現し、我々の意図したように、β切断を優先的に受けて融合蛋白を細胞外に分泌していることが確認された。
【０１４３】
さらに、ＡＰＰの切断により生ずるＣ末端領域について確認を行った。上記のように調製したウエスタンブロッテイングサンプル（細胞溶解物の上清）をアセトンにより濃縮した。すなわち、ウエスタンブロッテイングサンプル１６７μｌに８倍量の冷アセトンを添加し、攪拌後、−２０℃にて一夜放置し、１４，０００　ｒｐｍで１０分、４℃遠心分離を行い、抗ヒトＡＰＰ　Ｃ末端抗体（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，　Ｃａｔ．Ｎ．Ａ−８７１７）を一次抗体として検出した。
【０１４４】
図５−Ｃに示したように、融合蛋白発現細胞株（Ｓ）は、β切断を優先的に受けて、細胞内にその切断産物であるＣ端９９残基フラグメント（Ｃ９９）の増加が観察された。また、同時に観察されたα切断産物であるＣ８３は、ホスト細胞においても同様に観察されることから、内因性ＡＰＰのプロセッシングにより生じた分子であることが推定された。
【０１４５】
以上より、我々の作製した安定細胞株は、目的融合蛋白遺伝子が導入され、目的融合蛋白を発現し、目的としたプロセッシングを受けて、目的融合蛋白を分泌していることが確認された。また、スウェーデン型変異を入れた方がβセクレテースの基質特異性が高く、βアミロイドの産生は５〜１０倍増加することが明らかとなった。
【０１４６】
実施例３：試験細胞を用いた化合物のスクリーニング
（１）アミロイドβ産生に対する影響の測定
９６穴マイクロプレートに対して、実施例２で取得した細胞、すなわち融合蛋白（ＳＥＡＰ−ＡＰＰｓｗ）の遺伝子が導入されている安定細胞株を　５，０００　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割合で蒔き、予め、ＤＭＳＯに溶解しておいた被験物質を終濃度、５　μｇ／ｍｌ　となるように添加し、一夜（１８−２４時間）、５％　ＣＯ２　の下インキュベーター中にてインキュベートさせた。その後、培養上清５０　μｌを、アルカリフォスファターゼ活性測定用のマイクロプレートに移し、アルカリフォスファターゼ基質（Ｂｌｕｅ　ＰｈｏｓＴＭ，ＫＰＬ，　Ｃａｔ．Ｎｏ．　５０−８８−００）　５０　μを添加し、１時間反応させた後、反応停止液（Ｂｌｕｅ　ＰｈｏｓＴＭ，　ＫＰＬ，　Ｃａｔ．Ｎｏ．５０−８９−０１）　１００　μｌ　を加え、マイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ’ｑ　Ｍｕｌｔｉｓｏｆｔ）を用いて、６５０　ｎｍの吸収を測定した（図６左上図及び右上図）。
【０１４７】
被験物質無添加における吸収に対して有意に差のつく被験物質を、アミロイドβ産生に対して影響を与える候補物質とした。
【０１４８】
（２）被験物質の細胞に対する毒性の判定
上記試験細胞のマイクロプレートに対して、ＭＴＴ溶液　５０μｌ（１　ｍｇ／ｍｌ　培養液）　ずつ、各ウエルに添加し、４時間、５％　ＣＯ２インキュベーター中にて反応させた。反応後、上清を捨て、ＤＭＳＯ　１００μｌを格ウエルに添加し、攪拌した後、マイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ’ｑ　Ｍｕｌｔｉｓｏｆｔ）にて、５７５　ｎｍにて吸収を測定した（図６左下図及び右下図）。被験物質無添加における吸収と同程度の吸収を持つ被験物質を細胞毒性なしとした。
【０１４９】
図６に実施例３および４で行った結果を示した。図６左側の上下の図は、実際のマイクロプレートの写真で、上図がアルカリフォスファターゼの結果を、下図がＭＴＴによる細胞毒性の結果を示している。プレートの１列目は、細胞を入れないブランクを、１２列目は細胞を入れた時の被験物質無添加のコントロールを示す。２〜１１列目が、被験物質を添加したときの例となっている。一方、右側の上下の図は、吸光度より求めたコントロールに対する％値を数値で表したものであって、左側の２〜１１列目に相当するものを示している。
【０１５０】
この結果より、６Ｄ、１０Ｇ、１１Ｂにおいてアルカリフォスファターゼ活性の低下が観察された。また、５Ｇ、８Ｃ、８Ｄ、１０Ｇ、１１Ｂにおいて細胞毒性が認められた。これらの結果を総合した結果、アミロイドβ産生に対して影響を与え、かつ、細胞毒性の少ない化合物として、６Ｄの化合物が選別された。
【０１５１】
【発明の効果】
本発明によれば、アミロイドβ産生を効率的にモニターできる材料が提供される。また、該材料を利用した融合蛋白を細胞に発現させることにより、アミロイドβ産生に影響を与える物質を効率的にスクリーニングすることが可能になる。また、アルツハイマー治療薬あるいは予防薬のスクリーニングも有効に行うことが可能となり、治療薬の開発という面からも有用である。さらに、該スクリーニング系から見出された物質は、アルツハイマー病のモデル動物の作製または作用機序の解明にも有用である。
【０１５２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＡＰＰの構造の模式図とＡＰＰのプロセッシングを示した図である。
【図２】図２は、ＡＰＰ６９５のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３は、ＡＰＰにおけるαセクレテース切断部位（１７位）のアミノ酸置換におけるβセクレテース切断に与える影響を示したウエスタンブロッティングの図である。
Ａは、細胞溶解後、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。エピトークタグＢＥ１１に対するモノクローナル抗体でＡＰＰ全長を検出した。
Ｂは、培養上清をＡと同様に電気泳動を行った後、ウエスタンブロッテイングを行った結果を示す図である。αセクレテースおよびβセクレテース切断部位に挟まれた部分のアミノ酸を認識するモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｓＡＰＰα）を用いて検出を行った。
Ｃは、培養上清を、Ｂと同様に電気泳動を行った後、ウエスタンブロッテイングを行った結果を示す図である。ＡＰＰ　Ｎ末端側５９６位までを認識する抗体（Ａｎｔｉ−ｓＡＰＰβ）を用いて検出を行った。
Ｄは、抗体認識部分を模式図で示した図である。
【図４】図４におけるＡは、ＳＥＡＰ−ＡＰＰｓｗ安定発現ＣＨＯ　Ｋ１細胞株（ＣＨＯ／ＳＷ）の培養上清中のアルカリホスファターゼ活性を示す図である。
図４におけるＢは、ＳＥＡＰ−ＡＰＰｓｗ安定発現ＣＨＯ　Ｋ１細胞株（ＣＨＯ／ＳＷ）のＭＴＴアッセイによる細胞の増殖を示す図である。
図４におけるＣ及びＤは、培養上清中のアミロイドβの産生量を示す図である。
【図５】図５のＡは、選択されたクローンにおいて、本発明の融合蛋白をコードする遺伝子が細胞内に導入されているかどうかをＰＣＲで確認した図である。
図５のＢは、選択されたクローンにおいて、融合蛋白が実際に合成され、また、目的の部分のみで切断されて培養上清中に分泌されているかどうかをウエスタンブロッテイングで確認した図である。
図５のＣは、選択されたクローンにおいて、融合蛋白が実際に合成され、また目的の部分で切断されているかどうかを調べるために、細胞内Ｃ９９をウエスタンブロッテイングで確認した図である。
【図６】図６は、本発明のスクリーニング結果の一例を示す図である。
図６の左上図は、培養上清中のアルカリホスファターゼ活性を６５０　ｎｍで比色測定した結果を示している。
図６の左下図は、ＭＴＴアッセイにおける細胞数の測定結果を示す図である。
図６の右上図は、アルカリフォスファターゼ活性を、被験物質無添加の場合を１００として、数値化した結果を示す図である。
図６の右下図は、ＭＴＴアッセイにおける細胞数を、被験物質無添加の場合を１００として、数値化した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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