(57)【要約】【課題】インビトロで体性幹細胞の分化を誘導する新規な方法を提供すること。【解決手段】体性幹細胞の体細胞への分化を誘導する方法であって、体性幹細胞を、分化誘導すべき組織および臓器由来の細胞と共培養、あるいは組織および臓器由来細胞の培養上清の存在下で培養することを特徴とする方法。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体性幹細胞の体細胞への分化を誘導する方法であって、体性幹細胞を、分化誘導すべき組織および臓器由来の細胞と共培養することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により製造される体細胞。
【請求項３】
体性幹細胞の体細胞への分化を誘導する方法であって、体性幹細胞を、分化誘導すべき組織および臓器由来の細胞の培養上清の存在下で培養することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法により製造される体細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、体性幹細胞の体細胞への分化を誘導する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
幹細胞は、種々の細胞に分化する能力を保持している未分化細胞であり、遺伝子治療、臓器移植、骨髄移植等における応用が期待されている。幹細胞には胚性幹細胞と体性幹細胞（組織幹細胞）がある。このうち胚性幹細胞は個体のすべての組織および臓器の細胞に分化する能力をもつことが明らかとなり、再生医療に応用できる細胞として期待されている。しかしながら、胚性幹細胞のソースである受精卵の入手が困難であり、受精卵の取扱いおよびクローン技術などに関する倫理上の問題が胚性幹細胞の臨床応用に対する障害となる。これに比べて、患者自身から単離することができる体性幹細胞はこのような問題はない。近年の生物医学の発展は、この体性幹細胞が胚性幹細胞に匹敵するほどの能力をもつことを明らかにしており、再生医療に用いることができる細胞としてその可能性が期待されている。
【０００３】
体性幹細胞とは、生体組織および臓器中に存在し、特定の種類の細胞に分化しうる能力をもつ細胞である。胚性幹細胞と同じく、その分化誘導のメカニズムや分化しうる細胞の範囲についてはまだ不明な点が多い。体性幹細胞から血球、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、脂肪細胞などの体細胞への分化を誘導するためには、体性幹細胞の培養系に種々の細胞増殖因子や分化誘導剤を加えて培養させる方法が用いられている。例えば、未分化骨髄間葉系幹細胞を５−アザシチジンの存在下で培養すると心筋細胞に分化し、ＴＧＦ−β３の存在下で培養すると軟骨細胞に分化することが知られている。また、インビボ系では、間葉幹細胞を心筋組織に移植すると心筋細胞様の細胞に分化することが見いだされている。
【０００４】
しかし、いずれの方法も再現性および信頼性が十分ではない。したがって、当該技術分野においては、体性幹細胞の分化を誘導する新規な方法の開発が求められている。
【０００５】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。いずれも、本発明の属する分野における一般的技術水準を示す文献であり、本発明を教示も示唆もしていない。
【特許文献１】
ＷＯ９９／０３９７３
【特許文献２】
特開２０００−２１７５７６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、インビトロで体性幹細胞の分化を誘導する新規な方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、体性幹細胞の体細胞への分化を誘導する方法であって、体性幹細胞を、分化誘導すべき胎生期、新生児あるいは子供、成人などのあらゆる生体の組織および臓器由来の細胞と共培養することを特徴とする方法を提供する。本発明はまた、体性幹細胞の体細胞への分化を誘導する方法であって、体性幹細胞を、分化誘導の目的となる組織および臓器由来の細胞の培養上清の存在下で培養することを特徴とする方法を提供する。別の観点においては、本発明はまた、本発明の方法により製造される体細胞を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において用いることができる体性幹細胞としては、限定されないが、骨髄未分化間葉幹細胞、造血幹細胞、血管幹細胞、神経幹細胞、小腸幹細胞、脂肪幹細胞、皮膚幹細胞、歯周組織幹細胞、毛様体幹細胞、角膜輪部幹細胞、肝臓あるいは脾臓に存在している内臓幹細胞等が挙げられる。間葉幹細胞は、骨、軟骨、骨格筋、心筋などに分化する能力を有する。造血幹細胞は血球に、血管幹細胞は血管に、神経幹細胞は各種神経細胞に、それぞれ分化する能力を有する。さらに、これらの体性幹細胞から樹立された細胞株を用いてもよい。
【０００９】
体性幹細胞は、骨髄、末梢血、骨格筋、皮膚、脂肪、内臓（肝臓、膵臓、腎臓など）、小腸、十二指腸、大腸、毛包組織、歯周組織、平滑筋、毛様体、角膜輪部などから採取し、それぞれの細胞に適した培地中で継代培養して増殖させることにより、あるいは特定の表面抗原によって分離することにより、初代培養細胞を得ることができる。あるいは、既に樹立された細胞株を用いることもできる。
【００１０】
分化誘導すべき組織および臓器由来の細胞は、目的とする組織および臓器、例えば、骨、軟骨、骨格筋、平滑筋、心筋、血球細胞、血管内皮細胞、神経細胞、星状膠細胞、網膜細胞、色素上皮細胞、歯根膜細胞、エナメル芽細胞、セメント芽細胞、シュワン細胞、肝、膵、腎などを構成するすべての細胞、毛包組織を構成するすべての細胞、内（外）分泌腺細胞、感覚（視覚、聴覚、嗅覚）細胞、腱、靱帯細胞、肺胞細胞、上皮系細胞、組織マクロファージなどから採取し、それぞれの細胞に適した培地中で培養する。このとき、目的とする細胞以外の細胞を可能な限り除去することが好ましい。下記の実施例においては、心筋細胞から他の組織成分および線維芽細胞を除去する具体的方法が記載されている。なお、組織および臓器由来の細胞と体性幹細胞との組み合わせは同種同系に限られず、同種異系、異種異系の細胞を用いることも可能である。
【００１１】
共培養は、体性幹細胞の初代培養細胞あるいは継代培養細胞と組織および臓器由来細胞とを混合して培養することにより行うことができる。両方の細胞を浮遊系あるいは付着系で混合して培養してもよく、フィルターによって分離した状態で培養してもよく、あるいは、いずれかの細胞をフィーダーとしてフラスコに付着させて用いてもよい。このような培養条件は、用いる体性幹細胞と、組織および臓器由来細胞の性質に応じて、当業者が適宜選択することができる。
【００１２】
体性幹細胞を組織および臓器由来細胞の培養上清の存在下で培養する場合には、組織および臓器由来細胞の培養上清を採取し、必要に応じてフィルター滅菌した後、体性幹細胞の培養液に加える。
【００１３】
目的とする体細胞に分化したか否かの確認は、増殖した細胞の形態を肉眼または顕微鏡下で観察することにより行うことができる。さらに、抗体等を用いて組織特異的に発現するマーカータンパク質の存在を確認してもよく、表面抗原のタイプを判定してもよい。また、ブロッティング技術を用いて、ＲＮＡ、ＤＮＡレベルで分化特異的マーカータンパク質の検出を遺伝子およびタンパク質レベルで行ってもよい。このようなマーカータンパク質は当該技術分野においてよく知られており、例えば、心筋細胞については、アクチン、ミオシン等が挙げられる。
【００１４】
本発明の方法により製造された体細胞は、生物学的研究、薬学的研究、発生学的研究、医学的研究および臨床医学、特に再生医療の分野で広く利用することができる。臨床医学においては、悪性腫瘍、免疫系疾患、神経変性性疾患および筋疾患の治療、骨再生、軟骨、筋肉、神経、胃腸管、皮膚などの再生、肝、膵、腎臓、内分泌器官などの機能の再生、血管新生、および外傷治癒等において利用することができる。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。以下の実施例においては、骨髄細胞から心筋細胞へ分化誘導させた例が示される。
【００１６】
動物
初代培養心筋細胞を用意するために、新生児スプラグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ））ラットを用いた。培養骨髄細胞を用意するためには、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現しているトランスジェニックラットを日本ＳＬＣより購入して用いた。
【００１７】
培養骨髄細胞の用意
培養骨髄細胞は、４−５週齢のメスＧＦＰトランスジェニックラットの大腿骨及び脛骨より、既に発表されている方法（Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｒｅｓ．１９８８；２５４，３１７−３３０等）を基に改変したの方法で用意した。以下に要約する。まずエーテルにより動物を麻酔し、窒息死させた。７０パーセントアルコールで十分消毒後、毛を剃り、脛骨遠位部の皮膚を切開して大腿骨頭周囲まで皮膚を開き、筋組織を可視下においた。次に、大腿骨と脛骨から筋組織を剥ぎ落とした。股関節部と足関節部をはずすことによって大腿骨と脛骨を単離した。
【００１８】
両骨端部をできるだけ遠位で切り落とすことによって骨髄両末端を露わにし、２０−２１ゲージの針を装着したシリンジを用いて、骨髄液を１ｍｌのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）でクライオジェニックチューブ内に回収した。クライオジェニックチューブ内でＰＢＳに混ざった骨髄液をよく撹拌した後、あらかじめ５ｍｌのＭＳＣ培地（α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）、１５％ウシ血清、１％カナマイシン）を入れた遠心管に回収し、１０００回転、室温で５分間遠心して上清を除去、４ｘ１０−６細胞／ｍｌになるようにＴ２５フラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に撒いて３７℃５％ＣＯ２条件下に培養した。培養後２−３日毎にＭＳＣ培地で培地交換し、骨髄細胞を増殖させた。
【００１９】
培養心筋細胞の用意
培養心筋細胞は、新生児ＳＤラットの心室筋より、すでに発表されている方法（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１９９９；１００，３０５−３１１等）で用意した。まず、氷上のＰＢＳ入り６ｃｍ皿４枚と、スターラーで適度に撹拌し３７℃に固定したＰＤＭ（１０％パンクレアチン（ＳＩＧＭＡ）、８％ＮａＣｌ、２％ＫＣｌ、０．０５％ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１％ＮａＨＣＯ３、２％デキストロース）８ｍｌ入り三角フラスコを用意した。新生児ＳＤラットの前胸部を露わにして剣状突起下に直鋏を入れ、胸骨を一気に切開後に拍動する左心室を確認、そのまま左心室を切離して氷上のＰＢＳ入り皿に回収した。培養に使う全ての左心室を一枚目の皿に回収後に、一つ一つピンセットで順に４枚の皿に移していくことによって切離した検体を洗浄した。４枚目の皿に全て回収の後は、そのＰＢＳを吸引除去し、代わりにＰＤＭ２ｍｌで皿を満たして、曲鋏とピンセットを使って左心室を細かく切り刻んだ。３７℃のＰＤＭ８ｍｌ入り三角フラスコにこの細かくなった検体を全量を流しこみ、１５分間スターラーで撹拌した。最初の１５分撹拌後は上清を除去吸引し、新しいＰＤＭ１０ｃｃに浮かして同様に１５分撹拌した。２回目からは上清を遠心管に回収して１０００回転５分３７℃で遠心後に上清を除去、沈殿を３ｍｌハート培地（Ｈｅａｒｔ　Ｍｅｄｉｕｍ：１０％ハンクスバランス塩溶液（日本製薬）、１％ビタミン、２％アミノ酸、１％非必須アミノ酸、１％Ｌ−グルタミン、１％グリシン、２％ヒポキサンチン（以上ＧＩＢＣＯ社）、０．１６５％ＮａＨＣＯ３、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社）、１０％ウシ血清）に回収して３７℃のインキュべーターに保存した。上清を除いた三角フラスコ内の沈殿は新しいＰＤＭ１０ｍｌに浮かせ、この一通りの操作を９回繰り返した。３ｍｌハート培地に浮かせた沈殿は全て同じ遠心管に保存し、９回分の回収の後検体全量（４５ｍ１）をよくパイぺットで撹拌し、１０ｃｍ培養皿（ＣＯＲＮＩＮＧ社）４枚に撤いて４５分間３７℃で培養した（プレプレーティング）。プレプレーティングによって線維芽細胞の９０％以上が培養皿に接着する。プレプレーティング後上清を回収し適量のハート培地に浮かせ、４ｍｌフラスコ（ＬＡＢ−ＴＥＫ社）に細胞を撒き、３７度５％ＣＯ２条件下に培養した。培養後毎日ハート培地で培地交換した。
【００２０】
共培養
初代培養後培養フラスコ内８０−９０％まで増殖した骨髄細胞と、培養後３−４日目の心筋細胞を用いて以下のように４ｍｌフラスコ（ＬＡＢ−ＴＥＫ社）で共培養した。
すなわち、
１番：心筋細胞を、ＭＳＣ培地で培養する
２番：心筋細胞と骨髄細胞を、ＭＳＣ培地で培養する
３番：骨髄細胞を、心筋細胞のコンディション培地で培養する
４番：骨髄細胞を、ＭＳＣ培地で培養する
ここで、心筋細胞のコンディション培地とは、それまで１−２日心筋細胞を培養していた培地を１８ゲージの針を装着したシリンジで回収し、０．２２μｍのフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を通したものを指す。
共培養後２−３日毎に培地交換し、１０日目に以下のように免疫染色を施行した。
【００２１】
蛍光免疫二重染色
蛍光免疫二重染色は以下のとおり行った。共培養後１０日目の検体を、まず４％パラホルムアルデヒドで４℃で３０分間固定した。０．００５％サポニン（ＳＩＧＭＡ）／ＰＢＳで洗浄後、２０％ブロックエース（第日本製薬）／０．００５％サポニン／ＰＢＳで３０分間ブロッキングし、一次抗体（ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ社）、抗βアクチン抗体ＨＨＦ３５（Ｅｎｚｏ社））を加えて４℃で一晩おいた。０．００５％サポニン／ＰＢＳで洗浄後、二次抗体（ロバ抗ウサギポリクローナルＦＩＴＣ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）、ヒツジ抗マウスＩｇＧテキサスレッドポリクローナル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社））と核染色のためのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社）を加えて室温で９０分間おいた。０．００５％サポニン／ＰＢＳで洗浄後、Ｆｌｕｏｒｏ　Ｓａｖｅ　Ｅｅａｇｅｎｔ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）と０．１２μｍのカバーグラス（マツナミ社）で封入した。封入後、ＯＬＹＭＰＵＳ　ＡＸ８０ＴＲ顕微鏡で観察した。
【００２２】
結果を図１−３に示す。心筋細胞確認であるアクチン（ａ）はＩＧ励起で赤色に、細胞確認のための核染色（ｂ）はＵ励起で青色に、骨髄細胞由来確認であるＧＦＰ（ｃ）はＩＢ励起で緑色に観察される。図１は骨髄細胞と心筋細胞とをＭＳＣ培地で共培養したときに得られた細胞を示す。ＧＦＰを発現する骨髄由来細胞のいくつかがアクチンを発現していること、すなわち心筋細胞に分化していることがわかる。図２は骨髄細胞を心筋細胞のコンディション培地で培養したときに得られた細胞を表す。ＧＦＰを発現する骨髄由来細胞が心筋細胞に分化していることがわかる。図３は心筋細胞をＭＳＣ培地で培養した対照実験である。これらの心筋細胞はアクチンを発現しているが、ＧＦＰは発現していない。
【００２３】
以上の結果から、骨髄細胞を心筋細胞と共培養するか、または骨髄細胞を心筋細胞のコンディション培地で培養すると、骨髄細胞が心筋細胞に分化したことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、骨髄細胞と心筋細胞とをＭＳＣ培地で共培養したときに得られた細胞を示す写真図面である。
【図２】図２は骨髄細胞を心筋細胞のコンディション培地で培養したときに得られた細胞を示す写真図面である。
【図３】図３は心筋細胞をＭＳＣ培地で培養したときに得られた細胞を示す写真図面である。
【図１】
2004135625.tif 000002
【図２】
2004135625.tif 000003
【図３】
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