(57)【要約】【課題】新規避妊手段としての使用が予想される、タンパク質、核酸配列および抗体を提供すること。【解決手段】本発明は、精巣特異的キナーゼのファミリー（ｔｓｓｋファミリー）、当該キナーゼをコードする核酸配列および当該キナーゼに対する抗体に関する。本発明は更に、特異的インヒビターを単離するための標的またはｔｓｓｋキナーゼ活性のアンタゴニストとしてのこのキナーゼの使用を目的とする。そのインヒビターは、避妊薬としての使用を有すると予想される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１０からなる群から選択される核酸配列を含む精製ポリヌクレオチド。
【請求項２】
組換えヒトｔｓｓｋ遺伝子構成物であって、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される核酸配列に作動可能なように連結させた非天然プロモーターを含む当該構成物。
【請求項３】
請求項２の構成物を含むトランスジェニック細胞。
【請求項４】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１０、配列番号４のアミノ酸配列とは１つまたは２つの保存的アミノ酸置換残基が異なるアミノ酸配列、および配列番号６のアミノ酸配列とは１つまたは２つの保存的アミノ酸置換残基が異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。
【請求項５】
当該アミノ酸配列が、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列と同一である、請求項４の精製ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号５のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項７】
配列番号６のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項８】
可能性あるヒト治療剤をスクリーニングする方法であって、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号４、配列番号５、配列番号６の生理活性フラグメントからなる群から選択されるｔｓｓｋポリペプチドを、候補化合物と接触させること、および当該候補化合物が選択的に当該ポリペプチドに結合するかどうかを決定することを含む当該方法。
【請求項９】
当該ｔｓｓｋポリペプチドを固体表面上に固定化し、当該候補を標識する、請求項８の方法。
【請求項１０】
ｔｓｓｋキナーゼ活性のアンタゴニストを同定する方法であって、
インビトロキナーゼアッセイ組成物であって、ホスフェートの標識源、ｔｓｓｋ基質、および配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選択されるｔｓｓｋキナーゼを含む当該組成物を提供すること、
当該組成物を候補阻害化合物と接触させること、および
当該ｔｓｓｋキナーゼの活性を減少する化合物を同定すること、
を含む当該方法。
【請求項１１】
ホスフェートの当該標識源が［γ３２Ｐ］ＡＴＰである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
当該ｔｓｓｋ基質が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１０の方法。
【請求項１３】
２またはそれより多いｔｓｓｋキナーゼが、キナーゼアッセイ組成物中に存在する、請求項１０の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
米国政府の権利
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈにより認可された許可番号ＨＤ０６２７４、ＨＤ２２７３２、ＨＤ３８０８２、およびＣＡ０６９２７の下、米国政府の支持により行われた。米国政府は、本発明に関し一定の権利を有する。
【０００２】
優先権の主張
本願は、２０００年１１月９日出願の米国仮出願番号６０／２４６，９３９および２００１年１月３０日出願の米国仮出願番号６０／２６４，９２１に基づく、３５ＵＳＣ§１９９（ｅ）による優先権を主張する。それらの開示は本明細書に引用により加える。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、精子特異的キナーゼ（ｔｓｓｋ）遺伝子のファミリー、それらそれぞれをコードしたタンパク質およびそれらのタンパク質に対する抗体を目的とする。本発明はまた、ｔｓｓｋキナーゼ活性のインヒビターの同定のための標的としてのｔｓｓｋキナーゼの使用を含む。
【０００４】
【従来の技術】
本発明の背景
精子形成、機能精子細胞が精巣中で生成される過程には、成長中の生殖細胞（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ）とそれらの支持セルトリ細胞（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌ）との特異的相互作用ならびにアンドロゲン生成Ｌｅｙｄｉｇ細胞によるホルモン調節が含まれる。精子形成の一般的な組立は、実質的にすべての哺乳類で同一であり、３つの明確な相に分けられる：１）最初の相は、精原細胞が有糸分裂し、脆弱な精母細胞を生ずる増殖相または精原相であり、２）ハプロイド精細胞を生ずる減数分裂相、および３）精子への、各円形精細胞（ｒｏｕｎｄ　ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）分化による精子完成。最初の２つの相を調節する分子機構は、比較的十分に解析されているが、分子ベースの精子完成は殆ど知られていない。
【０００５】
哺乳類の精子完成、精子完成の減数分裂後相は、ハプロイド精細胞で生ずる劇的な形態的変化により特徴付けられる。いくつかのこれらの変化には、先体形成およびその内容物の形成、クロマチンの濃縮および再構築、当該細胞のエロンゲーションおよび種特異的再形成、ならびに鞭毛のアセンブリが含まれる。これらのイベントは、この発生期間に生ずる遺伝子転写およびタンパク質翻訳の両方の変化から生ずる。ハプロイド精細胞中で翻訳された幾つかのタンパク質は、精巣から離れた後、形態的成熟精子中に残留する。この点を考慮すると、精子形成の間に合成されるタンパク質は、精細胞分化および／または受精の間の精子機能に必要となり得る。
【０００６】
本発明は、この高度に分化した細胞の機能を調節する、哺乳類精子中のシグナリングイベントに関する。より特に、本発明は、精子受精能の獲得を修飾するシグナルトランスダクションに関する。射精後、精子は活発に動くことができるが、受精能力に欠いている。それらは、受精能獲得と呼ばれる時間−依存過程で、雌の生殖器官中で受精能を獲得する。受精能獲得は、セリン／スレオニンおよびチロシン残基の両方の幾つかのタンパク質のタンパク質リン酸化が付随すると説明され、タンパク質チロシンリン酸化がｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路（これら２つのシグナリング経路間のクロストークを含む）により調節される下流であることが説明される。ＰＫＡを除き、受精能獲得の調節に含まれる他のキナーゼもまた知られていない。
【０００７】
更なるタンパク質キナーゼが精子形成中に含まれることが示されたが、それらの幾つかのみが生殖細胞中または精巣中で排他的に発現する（Ｊｉｎｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３，　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１３，　４１４６−５６；　Ｎａｙａｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　Ｍｅｃｈ　Ｄｅｖ　７４，　１７１−４；　Ｓｈａｌｏｍ＆　Ｄｏｎ，　１９９９，　Ｍｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ　Ｄｅｖ　５２，　３９２−４０５；　Ｔｏｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　２４９，　１０７−１２；　Ｔｏｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７４，　１２１７１−６；　Ｔｓｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１７，　８２３−３３；　Ｗａｌｄｅｒｉ　＆　Ｃｏｗａｎ，　１９９３，　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１３，　７６２５−３５）。精巣特異的キナーゼの例は、近年、述べられているマウス遺伝子、ｔｓｓｋ１、２および３（Ｂｉｅｌｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４，　Ｇｅｎｅ　１３９，　２３５−９；　Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１３９，　１８５１−９；　Ｚｕｅｒｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ｍｅｃｈ　Ｄｅｖ　９３，　１７５−７）である。ｔｓｓｋキナーゼファミリーの機能は知られていない。しかし、このファミリーのメンバーは、精子完成の間、減数分裂後に発現するため、それらは、生殖細胞分化で、またはその後の精子機能で役割を担うと仮定される。そのため、このキナーゼファミリーの機能を阻害する化合物は避妊薬として利用可能であると予想される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
各種の避妊法の利用にかかわらず、世界的に、そして米国では、５０％を超える妊娠が望まれないものである。そのため、女性および男性の異なる要求に、より適合する避妊の不可欠な必要性があり、異なった人種、文化および宗教上の価値観を考慮した不可欠な必要性がある。コンドームの使用または精管切除を除き、男性の避妊法の利用は非常に制限される。
【０００９】
殆どの生理的な過程のプロテインキナーゼの重要性は、特定薬物によるｔｓｓｋキナーゼファミリーの活性阻害により受精を阻害可能であることを示唆する。本発明のある態様により、ｔｓｓｋキナーゼファミリーを新規薬物の開発の標的として使用する。特に、精子特異的ｔｓｓｋ遺伝子産物は、ｔｓｓｋキナーゼ活性の特異的インヒビターのスクリーニングに使用し、これらのインヒビターは、単独で、または意図しない妊娠を阻止する他の避妊薬と共に使用する。有利なことに、ｔｓｓｋキナーゼファミリーのメンバーの特有配列は、その活性に対する特異的インヒビターを発見する見込みを支持する。最終的に、精子形成後の精子中にこれらのキナーゼは残留し、精子の生理機能の役割を担うならば、設計された特異的ｔｓｓｋキナーゼインヒビターは、受精を阻止するため、男性および女性の両方に使用することができる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の要約
本発明は、ヒト精子特異的ｔｓｓｋキナーゼ遺伝子ファミリーおよびその相当するタンパク質を目的とする。より特に、本発明は、ヒトｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２およびｔｓｓｋ３キナーゼ、ならびに当該キナーゼの使用であってｔｓｓｋキナーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための当該使用を目的とする。本発明は、ヒトｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２およびｔｓｓｋ３に対し生ずる抗体および診断ツールとしてのこれらの抗体の使用をも包含する。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトｔｓｓｋ１、ヒトｔｓｓｋ２およびヒトｔｓｓｋ３のアミノ酸配列間の比較を示したものである。図１に示すように、当該３つのタンパク質間のアミノ酸配列はカルボキシ末端近辺が相違している。
【００１２】
本発明の詳細な説明
定義
本発明の説明および請求において、以下の専門用語は、以下で示す定義に従い使用する。
【００１３】
本明細書で使用するとき、「核酸」、「ＤＮＡ」および同様の語句にはまた、核酸類似体が含まれ、すなわち、ホスホジエステルバックボーン以外を有する類似体が含まれる。例えば、当分野に既知であり、バックボーンにおけるホスホジエステル結合に代わるペプチド結合を有するいわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００１４】
語句「ペプチド」には、３またはそれより多いアミノ酸が含まれ、ここで、当該アミノ酸は天然に生じたアミノ酸でもよいし、合成された（非天然で生じた）アミノ酸であってもよい。ペプチド擬似物（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｉｍｅｔｉｃ）には、１つまたはそれより多い以下の修飾を有するペプチドが含まれる：
１．１つまたはそれより多いペプチジル−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−連結（結合）が、−−ＣＨ２−カルバメート連結（−−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−−）、ホスホネート連結、−ＣＨ２−スルホンアミド（−ＣＨ２−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−−）連結、尿素（−−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−−）連結、−−ＣＨ２−第二級アミン連結のような非ペプチジル連結により置換されるか、またはアルキル化ペプチジル連結（−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−）（ここで、ＲはＣ１−Ｃ４アルキルである）で置換されたペプチド、
２．Ｎ−末端が、−−ＮＲＲ１基、−−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、−−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、−−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基（ここで、ＲおよびＲ１は、水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであるが、両方とも水素となることはない）へ誘導化されるペプチド、
３．Ｃ末端が、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（ここで、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルコキシからなる群から選択される）、および−−ＮＲ３Ｒ４（Ｒ３およびＲ４は、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択される）へ誘導化されるペプチド。
【００１５】
天然に生ずる、ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のようなＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによる推奨の略語である：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦであり、ロイシンはＬｅｕまたはＬであり、イソロイシンはＩｌｅまたはＩであり、メチオニンはＭｅｔまたはＭであり、ノルロイシンはＮｌｅであり、バリンはＶａｌまたはＶであり、セリンはＳｅｒまたはＳであり、プロリンはＰｒｏまたはＰであり、スレオニンはＴｈｒまたはＴであり、アラニンはＡｌａまたはＡであり、チロシンはＴｙｒまたはＹであり、ヒスチジンはＨｉｓまたはＨであり、グルタミンはＧｌｎまたはＱであり、アスパラギンはＡｓｎまたはＮであり、ロイシンはＬｙｓまたはＫであり、アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤであり、グルタミン酸はＧｌｕまたはＥであり、システインはＣｙｓまたはＣであり、トリプトファンはＴｒｐまたはＷであり、アルギニンはＡｒｇまたはＲであり、グリシンはＧｌｙまたはＧであり、そしてＸは任意のアミノ酸である。他の天然に生ずるアミノ酸は、例えば４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシンなどにより含まれる。
【００１６】
合成または非天然に生ずるアミノ酸とは、天然にはインビボでは生じないが、それにも拘わらず、本明細書に記載のペプチド構造体中に組み込まれ得るアミノ酸をいう。得られた「合成ペプチド」には、２０の天然に生ずるアミノ酸であって、当該ペプチドの１つ、２つまたはそれより多い位置で遺伝学的にコードされる当該アミノ酸以外のアミノ酸を含む。例えば、ナフチルアラニンは、合成を促進するためトリプトファンに置換され得る。ペプチドに置換され得る他の合成アミノ酸には、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、Ｌ−α−ヒドロキシルシル（ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｙｌ）およびＤ−α−メチルアラニルのようなα−アミノ酸、Ｌ−α−メチルアラニル、β−アミノ酸、およびイソキノリルが含まれる。Ｄアミノ酸および非天然に生ずる合成アミノ酸はまた、ペプチド中に組み込まれ得る。他の誘導体には、２０の遺伝学的にコードされたアミノ酸（または任意のＬもしくはＤアミノ酸）の天然に生ずる側鎖の、他の側鎖による置換が含まれる。
【００１７】
本明細書で記載するとき、語句「保存的アミノ酸置換残基（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」は、以下の５つの群のうちの１つにおける置換として本明細書では定義する：
Ｉ．　小脂肪族、非極性または僅かに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．　極性、陰性荷電残基およびそのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．　極性、陽性荷電残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．　巨大な脂肪族、非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ；
Ｖ．　巨大な芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００１８】
本明細書で使用するとき、語句「精製した」およびそのような語句は、天然または自然の環境で分子または化合物に通常付随する汚染物が実質的に含まれていない形態の分子または化合物の単離に関する。
【００１９】
本明細書で使用するとき、ｔｓｓｋポリペプチドの「生物学的に活性なフラグメント」または「生理活性フラグメント」なる語句は、天然リガンドに特異的に結合し得る全長タンパク質の天然または合成タンパク質を包含する。
【００２０】
語句「作動可能なように連結させた」は、近接した配置をいい、当該成分が通常の機能を果たすように配置されることをいう。例えば、コーディング配列に作動可能なように連結させた調節配列またはプロモーターは、コーディング配列の発現をし得る。
【００２１】
本明細書で使用するとき、語句「非天然プロモーター」は、コーディング配列に作動可能なように連結させた任意のプロモーターをいい、当該コーディング配列およびプロモーターは、天然には結合していない（すなわち、組換えプロモーター／コーディング配列構成物）。
【００２２】
本明細書で使用するとき、トランスジェニック細胞は、核酸配列を含む任意の細胞であって、ここで導入された当該核酸配列がコードする遺伝子を発現し得る形式で当該細胞中に当該核酸配列は導入されている。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明
本発明は、ヒトおよびマウスの生殖細胞において排他的に発現するキナーゼのファミリー（ｔｓｓｋキナーゼファミリー）を目的とする。ヒトｔｓｓｋ遺伝子のマウス相同体は、従前に述べられており、雄生殖細胞で減数分裂後に発現が見られた（Ｂｉｅｌｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４，　Ｇｅｎｅ　１３９，　２３５−９；　Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１３９，　１８５１−９）。ツー・イースト・ハイブリッド技術（ｔｗｏ　ｙｅａｓｔ　ｈｙｂｒｉｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および免疫共沈降を用い、Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）は、マウスｔｓｓｋ１および２が、ｔｓｓｋ基質を代表する５４Ｋｄａのタンパク質に結合し、そのタンパク質をリン酸化することを発見した。このｔｓｓｋ基質をｔｓｋｓと称する。ｔｓｋｓタンパク質はまた、精巣特異的であり、その発生的発現（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、生殖細胞で減数分裂後発現することを示唆する。ｔｓｓｋ基質のマウスｃＤＮＡ配列は従前に報告されており（Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）、ＥＳＴデータベースの探索に使用された。ヒトＥＳＴ相同体ＡＬ０４１３３９が発見され、ヒト精巣ｍａｒａｔｈｏｎ　ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｉｎｃ．）を用いる５’および３’ＲＡＣＥにより全長クローンを得るためセンスおよびアンチセンスプライマーの作成に使用した。ヒトｔｓｋｓの全長ヌクレオチド配列を配列番号７として提供し、推定タンパク質配列を配列番号８として提供する。
【００２４】
ｔｓｓｋキナーゼの発生的発現パターン、および生理学的過程のキナーゼ群の一般的関連性により、このファミリーの精巣特異的キナーゼは、精子形成で役割を担っていると考えられる。ｔｓｓｋキナーゼファミリーおよび推定基質の１つが精子形成中に同時に発現するという発見は、避妊標的（ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ　ｔａｒｇｅｔｓ）としてこれらのタンパク質を使用できる可能性がある。従って、本発明の１つの態様は、ヒトｔｓｓｋ相同体の単離および避妊薬の単離おけるその使用を目的とする。
【００２５】
精子は転写的および翻訳的には不活性であるため、分子レベルで候補精子タンパク質キナーゼをクローニングおよび特性解析するには、雄生殖細胞から単離したＲＮＡの使用が必要である。雄生殖細胞系で発現するＲＮＡ転写物は、最終的には精子機能に重要となり得るが、その転写物が精巣精子形成の間に機能することもあり得る。この方法を用い、特有ｃＤＮＡを、ｓｅｒ／ｔｈｒタンパク質キナーゼサブファミリーの推定タンパク質キナーゼをコードするマウス雄生殖細胞からクローニングした。当該キナーゼ（ｔｓｓｋ３ｂ）はマウス雄生殖細胞で減数分裂後に特異的に発現する。本発明の１つの実施態様により、特有精巣特異的マウスｔｓｓｋ遺伝子を提供する。ｔｓｓｋ３ｂの核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９および配列番号１０として提供する。
【００２６】
ｔｓｓｋ３ｂのヒト相同体をもまたクローニングし（ヒトｔｓｓｋ３と称する）、その相同体はタンパク質レベルで推定マウスタンパク質と９８％相同性がある。ヒトｔｓｓｋ３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および配列番号６として提供する。最近、類似のマウスタンパク質キナーゼが述べられており、精巣特異的セリンキナーゼ３（マウスｔｓｓｋ３）（Ｚｕｅｒｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ｍｅｃｈ　Ｄｅｖ　９３，　１７５−７）、精巣特異的タンパク質キナーゼの小ファミリーのメンバー（Ｂｉｅｌｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４，　Ｇｅｎｅ　１３９，　２３５−９；　Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１３９，　１８５１−９）として同定された。この相同性にも拘わらず、ヒトｔｓｓｋ３およびマウスｔｓｓｋ３ｂの両方のｃＤＮＡであって、クローニングし本出願で記載した当該ｃＤＮＡは、マウスｔｓｓｋ３とは幾つかのアミノ酸が相違している。
【００２７】
予想されるマウスｔｓｓｋ１および２アミノ酸配列（Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７により述べられているような）を遺伝子バンクの探索目的に用い、マウスｔｓｓｋ１とｔｓｓｋ２の両方のゲノム配列を得た。次いで、これらのゲノムマウス遺伝子のコーディング領域の３’末端および５’末端を用い、センスおよびアンチセンスプライマーをそれぞれ作成し、ＰＣＲ技術を用いヒト相同体を単離した（実施例２参照）。増幅ｃＤＮＡフラグメントを、ＴＯＰＯ　ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いクローニングし、配列決定した。増幅ヒトｔｓｓｋ１遺伝子はおおよそ１．３ｋｂの大きさであり、単離ヒトｔｓｓｋ２遺伝子は、１．２ｋｂの大きさであった。ヒトｔｓｓｋ１の核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号４として提供する。ヒトｔｓｓｋ２の核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２および配列番号５として提供する。
【００２８】
本発明の１つの実施態様により、精製ポリペプチドを、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号３とは１つもしくはそれより多い保存的アミノ酸置換残基が異なるアミノ酸配列を含むように提供する。より好ましくは、精製ポリペプチドは、配列番号１または配列番号３とは５未満の保存的アミノ酸置換残基が異なるか、より好ましくは２またはそれ未満の保存的アミノ酸置換残基が異なるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
１つの好ましい実施態様では、精製ポリペプチドは、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含む。これらのポリペプチドは、組換えで産生したポリペプチドの精製を補助する付加アミノ酸配列を含み得る。１つの実施態様では、精製ポリペプチドは、配列番号４、配列番号５および配列番号６ならびにペプチドタグ（当該ペプチドタグは、ｔｓｓｋペプチド配列と連結する）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。その融合タンパク質および適当なペプチドタグの発現に適当な発現ベクターは当業者に既知であり、商業的に利用可能である。１つの実施態様では、当該タグには、Ｈｉｓタグが含まれる（実施例４参照）。他の実施態様では、精製ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列またはペプチドタグに連結した配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
他の実施態様では、本発明は、ｔｓｓｋポリペプチドの一部を含む精製ポリペプチドを目的とする。より好ましくは、ｔｓｓｋポリペプチド部分は、天然のリガンドに特異的に結合し得る配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号９からなる群から選択される全長ポリペプチドの天然または合成部分からなる。１つの実施態様では、ヒトｔｓｓｋフラグメントは、ｔｓｋｓへの結合能を保持する。
【００３１】
本発明はまた、ヒトｔｓｓｋをコードする核酸配列を含む。１つの実施態様では、核酸配列を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０またはそのフラグメントの配列を含むように提供する。他の実施態様では、精製核酸配列を、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択し、提供する。
【００３２】
本発明はまた、ストリンジェントまたは高ストリンジェント条件下（本明細書で記載のように）、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０により表されるヌクレオチド配列またはその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）のすべてまたは一部にハイブリダイズするアミノ酸を含む。ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズ部分は典型的には少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０または５０）のヌクレオチドである。本明細書で記載の型のハイブリダイズ核酸を、例えばクローニングプローブ、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）、またはヒトｔｓｓｋ遺伝子の発現を検出するための診断プローブとして使用し得る。
【００３３】
核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性は、融解温度またはＴｍとして表され、それは、核酸二重鎖がその成分である一本鎖ＤＮＡに解離する温度である。この融解温度は、必要なストリンジェント条件の定義に用いる。典型的に１％のミスマッチでＴｍは１℃下がり、これによりハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度が推定される（例えば、２つの配列が９５％を超える同一性を有するならば、最終洗浄温度はＴｍから５℃減少する）。実施では、Ｔｍの変化は、１％ミスマッチあたり０．５℃から１．５℃であり得る。
【００３４】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３の核酸配列、およびその配列（または相補配列）に、ストリンジェントまたは高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列を目的とする。本発明では、、高ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を−５℃Ｔｍ以上で実施することと定義される。ストリンジェント条件は、６８℃、５×ＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　溶液／１．０％　ＳＤＳでハイブリダイズし、６８℃、０．２×ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳで洗浄することを含むように定義される。適度のストリンジェント条件には、６８℃、５×ＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　溶液／１．０％　ＳＤＳおよび４２℃、３×ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳで洗浄することを含む。その条件についての更なるガイダンスは当分野では容易に利用可能であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８９，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（ｅｄｓ．）　１９９５，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎ．Ｙ．）　ａｔ　Ｕｎｉｔ　２．１０。
【００３５】
本発明はまた、組換えヒトｔｓｓｋ遺伝子構成物を目的とする。１つの実施態様では、組換え遺伝子構成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、および配列番号１０からなる群から選択される核酸配列に作動可能なように連結した非天然プロモーターを含む。１つの実施態様では、組換え遺伝子構成物は、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される核酸配列に作動可能なように連結した非天然プロモーターを含む。非天然プロモーターは、好ましくは、事前に決定した宿主細胞で発現し得る強力な構造プロモーターである。これらの組換え遺伝子構成物は、宿主細胞中に導入され、ｔｓｓｋ遺伝子産物を合成するトランスジェニック細胞系を作成し得る。宿主細胞は、多種多様の真核および原核生物から選択し得、２つの好ましい宿主細胞はＥ．　ｃｏｌｉと酵母細胞である。
【００３６】
１つの実施態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号１０からなる群から選択された核酸配列は、適当な調節配列に遺伝子配列を作動可能なように連結する方法で真核または原核発現ベクター中に挿入し、ヒトｔｓｓｋは適当な真核または原核細胞宿主細胞中で発現する。適当な真核宿主細胞およびベクターは当業者に既知である。バキュロウイルスシステムもまたトランスジェニック細胞の作成および本発明のｔｓｓｋ遺伝子の合成に適当である。本発明の１つの態様は、ヒトｔｓｓｋおよびヒトｔｓｓｋコーディング配列のフラグメントを発現する組換え遺伝子を含むトランスジェニック細胞系を目的とする。本明細書で使用するとき、トランスジェニック細胞は、外因的に導入する核酸配列を含む任意の細胞である。より好ましくは、導入核酸は、トランスジェニック細胞中で有意に安定（すなわち、細胞ゲノム中へ組み込まれるか、または高コピーのプラスミド中に存在する）であり、子孫細胞へ伝えられる。１つの実施態様では、トランスジェニック細胞は、ヒト細胞であり、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、および配列番号１０からなる群から選択される核酸配列を含む。より好ましくは、核酸配列は、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群から選択される。本発明はまた、非ヒトトランスジェニック生物を含み、ここで、当該トランスジェニック生物の１つまたはそれより多い細胞は、ヒトｔｓｓｋを発現する組換え遺伝子を含む。
【００３７】
本発明はまた、ヒトｔｓｓｋを作成する方法を含む。当該方法は、ヒトｔｓｓｋをコードする配列を含む核酸配列を宿主細胞中に導入し、そして導入ヒトｔｓｓｋ遺伝子を発現し得る条件下で宿主細胞を培養するステップを含む。１つの実施態様では、当該プロモーターは、条件付き（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）または誘導性プロモーターであり、他に、当該プロモーターは組織特異的または一過性制限的（ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）プロモーター（すなわち、作動可能なように連結した遺伝子は、特定組織でまたは特定時間でのみ発現する）であり得る。合成ｔｓｓｋは、標準技術を用い精製され、ハイスループットスクリーニングに用いられｔｓｓｋ活性のインヒビターを同定し得る。他に、１つの実施態様では、組換え的に作成したｔｓｓｋポリペプチドまたはそのフラグメントを用い、ｔｓｓｋポリペプチドに対する抗体を作成する。組換え的に作成したｔｓｓｋをまた用い、結晶構造を得る。その構造を結晶学的分析し、ｔｓｓｋ機能を阻害する特定薬物を設計し得る。
【００３８】
好ましくは、精子特異的キナーゼをコードする核酸配列を、事前に選択した宿主細胞中で発現する適当な調節配列に作動可能なように当該遺伝子配列を連結する方法で適当な発現ベクター中に挿入する。適当な宿主細胞、ベクターおよびＤＮＡ構成物を細胞中に導入する方法は当業者に既知である。特に、精子特異的キナーゼをコードする核酸配列を、細胞または細胞群に、インビトロまたはインビボで、リポソーム、ウイルスに基づくベクターまたはマイクロインジェクションを用い、付加し得る。
【００３９】
１つの実施態様により、組成物は、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列またはその抗原性フラグメントを有するペプチドを含むように提供する。１つの実施態様では、抗原性フラグメントは、配列番号６の配列番号４の配列からなる。当該組成物は、医薬的に許容される担体または添加物と組合され、哺乳類種に投与され免疫応答が誘導され得る。
【００４０】
本発明の他の実施態様は、ヒトｔｓｓｋまたはそのフラグメントに対し生ずる単離抗体を目的とする。ヒトｔｓｓｋに対する抗体は、当分野に既知の方法を用い作成され得る。１つの実施態様では、抗体は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８および配列番号９からなる群から選択されるポリペプチドに特異的結合するように提供する。１つの実施態様では、抗体は、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択されるポリペプチドに結合するように提供する。１つの好ましい実施態様では、当該抗体はモノクローナル抗体である。当該抗体は、修飾を伴うかまたは伴わずに使用され得、共有結合または非共有結合でレポーター分子と結合することにより標識し得る。更に、当該抗体は標準的担体で製剤化され得、所望により標識されて治療または診断組成物を製造し得る。
【００４１】
本発明はまた、ヒトｔｓｓｋの存在を検出する方法を提供する。当該方法は、サンプルを、ヒトｔｓｓｋに特異的に結合する標識抗体と接触させ、非結合および非特異的結合物質を除去し、そして標識抗体の存在を検出するステップを含む。１つの実施態様では、標識化合物は、直接的または間接的（すなわち、標識した二次抗体）に標識する抗体を含む。特に、本発明のｔｓｓｋ抗体は、ｔｓｓｋの発現およびその細胞での位置の確認、またはヒト可溶性ｔｓｓｋまたはインヒビターで処置する患者をモニターするアッセイに使用し得る。
【００４２】
本発明の１つの態様では、ｔｓｓｋキナーゼファミリーを、新規薬物の開発のための標的として使用する。ハイスループットスクリーニングと結合したコンビナトリアル化学方法を用いる、小分子ライブラリー作成の分野での進展により、理想的な細胞透過インヒビターの探索を促進する。更に、結晶学的方法を用い構造に基づく設計により、リガンド設計を探索し得るリガンド−タンパク質相互作用部位を詳細に特性解析する能力が改善される。
【００４３】
１つの実施態様では、本発明は、薬剤、小分子、またはｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３またはその生理活性フラグメントを含むポリペプチドと相互作用するタンパク質をスクリーニングする方法を提供する。本明細書で使用するとき、ｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３の「生物学的作用フラグメント」または「生理活性フラグメント」なる語句は、ｔｓｋｓを含むそれぞれの天然ｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３ポリペプチドの天然リガンドのうちの少なくとも１つに特異的に結合可能な天然ペプチドの天然または合成部分を含む。本発明は、結合するかまたはｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３の活性を修飾し、そのため、受精能の治療または診断マーカーとして有用となる、小分子、化合物、組換えタンパク質、ペプチド、核酸、抗体などをスクリーニングするためのインビボおよびインビトロの両方のアッセイを含む。
【００４４】
本発明の１つの実施態様では、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号９からなる群から選択されるｔｓｓｋポリペプチドを用い、生理学的条件下、ｔｓｓｋに結合するリガンドを単離する。当該方法は、ｔｓｓｋポリペプチドを生理学的条件下で化合物混合物と接触させ、非結合および非特異的結合物質を除去し、ｔｓｓｋポリペプチドへの結合を維持する化合物を単離するステップを含む。典型的に、ｔｓｓｋポリペプチドは、標準技術を用い固体支持体に結合し、化合物のスクリーニングを迅速にし得る。当該固体支持体は、生体化合物の固定化に使用し、以下に限らないが、ポリスチレン、アガロース、シリカまたはニトロセルロースを含む任意の表面から選択され得る。１つの実施態様では、固体表面は、官能性シリカまたはアガロースビーズを含む。その化合物のスクリーニングは、医薬製剤のライブラリーおよび従事者に既知の標準技術を用い行い得る。
【００４５】
次いで、ｔｓｓｋポリペプチドに結合するリガンドは更に、実施例７に記載のようなインビトロキナーゼアッセイの使用を介するアゴニストおよびアンタゴニスト活性を分析し得る。ｔｓｓｋキナーゼ活性のインヒビターは、精子の成熟／受精能獲得を阻止する薬剤として使用する可能性を有する。そのインヒビターは、医薬組成物として製剤化し、対象に投与し精子形成を阻止し、避妊の手段を提供し得る。
【００４６】
１つの実施態様により、ヒトｔｓｓｋキナーゼ活性の特異的インヒビターは、ホスホリレーションイベントを検出し得るインビトロキナーゼアッセイの使用を介し同定する。１つの実施態様では、ｔｓｓｋキナーゼ活性のインヒビターを同定する方法には、１つまたはそれより多い阻害の可能性のある化合物の存在下、１つまたはそれより多いヒトｔｓｓｋポリペプチドとホスフェートの標識源とを合わせることを含む。実施例４に記載のように、ｔｓｓｋタンパク質は、自己リン酸化する性質を有する。そのため、候補阻害化合物の存在下および非存在下で生ずる自己リン酸化の速度を比較することにより、特異的阻害化合物を同定し得る。１つの好ましい実施態様では、ｔｓｓｋ基質を提供し、当該アッセイは、候補阻害化合物の存在下および非存在下での当該基質のリン酸化の速度の測定に基づく。好ましくは、多数の化合物が、ハイスループット技術を用いスクリーニングし、ｔｓｓｋ特異的阻害化合物を同定する。
【００４７】
１つの実施態様により、ｔｓｓｋキナーゼ活性の特異的インヒビターは、インビトロキナーゼアッセイ組成物を提供することにより同定し、ここで当該組成物は、ホスフェートの標識源、ｔｓｓｋ基質、および配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号９からなる群から選択されるｔｓｓｋキナーゼを含む。ｔｓｓｋ基質リン酸化の速度は、任意の阻害化合物の非存在下の調節条件下で測定し、次いで、同一条件を用い、１つまたはそれより多い阻害の可能性のある化合物の存在下でアッセイを行うときｔｓｓｋ基質のリン酸化の速度を測定する。ｔｓｓｋキナーゼの活性を減少する当該化合物を同定し、阻害効果がｔｓｓｋキナーゼに特異的かどうか決定するため試験した。
【００４８】
１つの実施態様では、ヒトｔｓｓｋインヒビターを同定する方法には、ホスフェートの標識源、ｔｓｓｋ基質、および配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選択されるｔｓｓｋキナーゼを提供し、その組成物を１つまたはそれより多い阻害可能性のある化合物と接触させ、リン酸化の速度を測定するステップを含む。１つの好ましい実施態様では、ホスフェートの標識源は［γ３２Ｐ］ＡＴＰであり、ｔｓｓｋ基質は配列番号８のアミノ酸配列を含む。当該キナーゼアッセイは、３つ全てのキナーゼに対するインヒビターの活性を確認するため存在する２つまたはそれより多いヒトｔｓｓｋキナーゼにより構成され得る。
【００４９】
【実施例】
実施例１
新規マウス精巣特異的セリン／スレオニンキナーゼの単離
タンパク質キナーゼ中に存在する保存領域に相当するディジェネレイトオリゴヌクレオチドを用いる逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、精巣特異的セリン／スレオニンキナーゼの新規メンバーを単離した。このＰＣＲフラグメントは、雄生殖細胞においてノーザンブロット分析により１０２０ｂｐ転写物を認識した。プローブとしてこのフラグメントを用い、全長ｃＤＮＡを、マウス混合生殖細胞ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。このｃＤＮＡは、２６８アミノ酸のタンパク質をコードする８０４塩基のオープンリーディングフレームを有する。組織発現分析により、このタンパク質キナーゼは、マウス精巣生殖細胞中で発生的に発現し、脳、卵巣、腎臓、肝臓または初期胚細胞には存在しないことが示された。
【００５０】
この新規推定セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（配列番号９）は、ほぼｔｓｓｋ３（Ｚｕｅｒｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ｍｅｃｈ　Ｄｅｖ　９３，　１７５−７）と同じであり、最近では、マウス精巣特異的プロテインキナーゼと述べられているが、コーディング領域のシフトおよび２２アミノ酸（１０９から１３１残基）の変化を生ずる幾つかの塩基欠失の点が異なる。この新規タンパク質キナーゼのヒト相同体（配列番号６）を実質的にクローニングし、精巣中での排他的発現が見られた。ヒトおよびマウスｃＤＮＡクローンの両方を用いる蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により、ｌｐ３４−３５および４Ｅ、それぞれのクロモソーム上のシンテニー局在性（ｓｙｎｔｅｎｉｃ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が示された。ｔｓｓｋ３との相同性により、この新規タンパク質キナーゼはｔｓｓｋ３ｂと名づける。
【００５１】
材料および方法
精子形成細胞群の単離
精製した、パキテン期精母細胞、円形精細胞および濃縮精細胞（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ　ｓｐｅｒｍａｔｉｄｓ）の群を、コラゲナーゼおよびトリプシン−ＤＮａｓｅＩ（Ｂｅｌｌｖｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９７７；　Ｒｏｍｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，　１９７６）での連続解離により、成体マウス（ＣＤ−１；　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒｓ）の被膜剥離精巣から作成した。当該細胞を、エンリッチなＫｒｅｂｓ　Ｒｉｎｇｅｒ　Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＫＲＢ）（Ｂｅｌｌｖｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９７７；　Ｒｏｍｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，　１９７６）の２−４％ＢＳＡ勾配における単位重量の沈降速度により、個別の群に分離した。パキテン期精母細胞および円形精細胞群は少なくとも純度８５％であったが、濃縮精細胞群は〜４０−５０％の純度であった（無核化残留体（ａｎｕｃｌｅａｔｅｄ　ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｂｏｄｉｅｓ）および幾つかの円形精細胞が本来的に混ざっている）。
【００５２】
ＲＮＡ単離およびノーザンブロット分析
体組織、特定年齢のマウスの精巣、および成体マウスの単離精子形成細胞由来のトータルＲＮＡを、５Ｍ　グアニジウムイソチオシアネート、２５ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、０．５％Ｓａｒｋｏｓｙｌ、および０．１Ｍ　２−メルカプトエタノール（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔａｌ．，　１９７９）中で細胞をホモジナイズすることにより単離した。ライゼートを、５．７Ｍ　ＣｓＣｌ、０．１Ｍ　ＥＤＴＡのクッション上で、１１４，０００×ｇ、２０℃で一夜、遠心分離した。ペレットを再懸濁し、フェノール：クロロホルムで抽出し、当該ＲＮＡをエタノールで沈殿した。当該ＲＮＡの完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、１％アガロースゲルにおけるリボゾームＲＮＡのエチジウムブロミド染色により証明した。等量のＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルで電気泳動した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８９）。ＲＮＡをニトロセルロースペーパーに移し、８０℃で２時間ベイク（ｂａｋｅ）し、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ　Ｔｏｒｕｌａ　ＲＮＡ、５×ＳＳＰＥ中で最低１時間、４２℃で事前ハイブリダイズ（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）した。適当なＤＮＡプローブをＰＣＲで作成し、ランダムプライム法で３２ｐ−ｄＣＴＰで標識し、１０％デキストランサルフェートを伴う５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ　ＴｏｒｕｌａＲＮＡ、５×ＳＳＰＥ中のブロット（１×１０６　ｃｐｍ／ｍｌ）と共にインキュベーションし、４２℃で一夜ハイブリダイズした。ブロットを２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで洗浄した（何れも室温で２×１０分間）。洗浄後、当該フィルターを風乾させ、増強スクリーンと共に−７０℃でフィルムに感光させた。ヒト組織のノーザンブロットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得、ハイブリダイゼーションは、上記のとおり行った。
【００５３】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩを用い、製造者指示書に従い行い、その後、ＰｒｏｍｅｇａのＴａｑポリメラーゼを使用した。ＰＣＲ条件は以下の通りである：９５℃２分間を１サイクル；　９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃１分間を３５サイクル；　当該サイクルは７２℃７分間の１サイクルで終了し、次いで４℃に冷蔵した。次いで、当該ＤＮＡ産物を２％アガロースゲルで分析した。以下のディジェネレイトプライマーを用い、チロシンキナーゼの保存領域の標的とした：逆転写ステップの場合、３つのランダムヌクレオチド（ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡ（Ａ／Ｔ）ＡＧＧＡＣＣＡ（Ｃ／Ｇ）ＡＣ（Ａ／Ｇ）ＴＣ：配列番号１１）後にサブクローニングする５’ＥｃｏＲＩ共通部位を付加したチロシンキナーゼのサブファミリーに共通のコーディングサブ領域ＩＸに相当するディジェネレイトアンチセンス２０−ｍｅｒ；　（２）ＰＣＲステップには、同じプライマーを、チロシンキナーゼのサブファミリーと共通のサブ領域ＶＩｂに相当するディジェネレイトセンス２０−ｍｅｒと共に用い、またＥｃｏＲＩの共通部位をまた４つのランダムヌクレオチド（ＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣ（Ａ／Ｃ）Ｇ（Ａ／Ｃ／Ｔ／Ｇ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／Ｔ）Ｔ；　配列番号２）の後に導入した。ＰＣＲ反応が終了し当該産物を分析した後、ｃＤＮＡを、製造者指示書に従いＴＯＰＯ　ＴＡクローニングベクター（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、ＥｃｏＲＩサブクローニング共通部位は使用しなかった。３５の陽性クローンのＭｉｎｉｐｒｅｐにより、Ｑｉａｇｅｎキットを用い作成し、次いで、Ｔ７プライマーを用い配列決定した。
【００５４】
マウスｔｓｓｋ３ｂのクローニング
ｔｓｓｋ３ｂをクローニングするため、ＲＴ−ＰＣＲにより得られた特有配列を用い、この新規キナーゼに対する特定プライマーを設計した。プライマーＡ２（アンチセンス：ＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴＡＴＣＡＴＧＧＧ；　配列番号１３）およびＳ２（センス：　ＴＧＴＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧ：配列番号１４）を用い、１６９塩基のＰＣＲフラグメントを得た。その後、このＰＣＲフラグメントを、ランダムプライム法により、３２ｐ−ｄＣＴＰで放射標識し、プローブとして用い、従前に述べられているようにオリゴ−ｄＴプライム化混合化生殖細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【００５５】
ヒトｔｓｓｋ３ｂ相同体のクローニング
ヒトＥＳＴデータベースのサーチ目的に予測マウスｔｓｓｋ３ｂアミノ酸配列を用い、登録ＡＩ５５３９３８をＢＬＡＳＴ　ｓｅａｒｃｈから得た。このＥＳＴ配列を用い、アンチセンスプライマーＡ３（ＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＡＴＣＧＴ；配列番号１５）を得た。このプライマーおよびアダプター（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ；　配列番号１６）を、鋳型としてヒト精巣ｍａｒａｔｈｏｎ　ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｉｎｃ）を用いる５’ＲＡＣＥに使用した。当該ＰＣＲ反応ミックスを最初に１０分間９４℃で加熱し、次いで当該ミックスを以下の条件で４０サイクルのＰＣＲを行った：９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分間。これらのサイクルの後、当該ミックスを７２℃１０分間インキュベーションした。ＡｍｐＴａｑ　Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を、ＰＣＲ用の通常のＴａｑポリメラーゼの代わりに用いた。増幅ｃＤＮＡフラグメントをクローニングし、ＴＯＰＯ　ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い配列決定した。以下の５’ＲＡＣＥを得るｃＤＮＡ配列の５’末端を用い、センスプライマーＳ３（ＧＣＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴＧＴＴＣＴＡＡＣＧＣＴＧ；配列番号１７）を設計した；　アンチセンスプライマーＡ４（ＴＣＴＣＣＣＣＣＴＡＣＴＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡＧＣ；配列番号１８）は、ＡＩ５５３９３８の３’末端に基づいている。次いで、これら２つのプライマーを用い、上記の条件で、同じライブラリーから全長ヒトｔｓｓｋ３ｂ相同体を増幅した。増幅１．０５８ｋｂフラグメントを切り取り、クローニングし、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｖｉｒｇｉｎｉａの配列決定施設を用い配列決定した。ｃＤＮＡライブラリー増幅ｔｓｓｋ３ｂヒト相同体のＣ末端１４００ｂｐフラグメントをヒト組織のノーザンブロットに使用した。
【００５６】
ＤＮＡ配列決定およびコンピューター分析
すべての配列決定を、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＦＳ　ｄｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙおよび適当なプライマーで、３７３Ａ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）を用い行った。あいまいなところは反対鎖を配列決定することにより解決した。ＤＮＡおよびタンパク質配列分析は、Ｍａｃ　Ｖｅｃｔｏｒ　ＭＴ（Ｋｏｄａｋ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，　ＣＴ）およびＳｅｑｕｅｎｃｅｒＴＭ（Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｅｓ　Ｃｏｒｐ．，　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，　ＭＩ）ソフトウェアプログラムを用い行った。
【００５７】
蛍光性ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびクロモソームマッピング
蛍光性ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および免疫蛍光の検出は、従前に述べられているように行った（Ｂｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５，　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ，　７０：　２６３−２６７）。１ｋｂ、マウスｃＤＮＡ、および相当する１ｋｂヒト相同体を、１μｇ　ＤＮＡ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）それぞれ２０μＭ、１μＭ　ｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ　Ｂ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１０μＭ　ビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、２ｕｎｉｔｓ　ＤＮＡポリメラーゼＩ／ＤＮａｓｅＩ（ＧＩＢＣＯ，　ＢＲＬ）およびＨ２Ｏを含み総容量５０μｌの反応物中のニックトランスレーションによりビオチニル化した。プローブを変性させ、ヒト末梢リンパ球およびマウス胚線維芽細胞、それぞれのメタフェーズスプレッド（ｍｅｔａｐｈａｓｅ　ｓｐｒｅａｄｓ）にハイブリダイズした。ハイブリダイズプローブを、フルオレセイン標識アビジン、ならびに抗アビジン抗体（Ｏｎｃｏｒ）およびフルオレセイン標識アビジンの第二層の付加により増幅したシグナルで検出した。クロモソーム調製物はＤＡＰＩで対比染色し、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピューターワークステーションで操作する冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，　Ｔｕｃｓｏｎ，　ＡＺ）を装着したＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｐｈｏｔ　ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡で観察した。ＤＡＰＩ染色およびＦＩＴＣシグナルのデジタル化イメージを得、擬色化し、Ｏｎｃｏｒ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．６ソフトウェアを用いマージした。
【００５８】
結果
マウス雄生殖細胞由来のプロテインキナーゼのクローニング
哺乳類精子受精能獲得は、幾つかのタンパク質のタンパク質チロシンリン酸化の増加により生ずる。成熟精子は、タンパク質の合成ができず、これらの細胞中でのＲＮＡの存在が議論されているため、最終的に機能を低下させる目的でＲＴ−ＰＣＲによるプロテインキナーゼを同定するべく、ＲＮＡを最初にマウス混合生殖細胞群から単離した。チロシンキナーゼのサブファミリー中のディジェネレイトプライマーターゲッティング保存領域を用い、ＴＡクローニング後、上記方法で述べられるように得られた２７の配列を分析し、ＧｅｎｅＢａｎｋの配列と比較した。殆どの配列がチロシンキナーゼサブファミリーの既知メンバーとマッチするが、得られた配列の幾つかは、ｓｅｒ／ｔｈｒプロテインキナーゼのサブファミリーのメンバーとマッチした。
【００５９】
Ｂ−Ｒａｆｋｉｎａｓｅのようなサブファミリーの既知メンバー間で、精子完成に関与するｓｅｒ／ｔｈｒプロテインキナーゼの新規ファミリーに対し相同性を有する配列を検出した（Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１３９，　１８５１−９）。この新規のｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼをクローニングするため、この配列に相当する１６９塩基対の特異的ＰＣＲフラグメントを放射標識し、マウス混合生殖細胞ｃＤＮＡライブラリーを上記の方法で述べたようにスクリーニングした。１．０２ｋｂ　ｃＤＮＡ挿入物を含むクローンを得（配列番号１０）、Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．の命名法によりｔｓｓｋ−３ｂと名付けた。配列決定分析により、２６６アミノ酸推定ｓｅｒ／ｔｈｒプロテインキナーゼをコードする８０４ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームが示された。開始メチオニンに隣接するヌクレオチドは、Ｋｏｚａｋ共通配列に十分に適合する。３’−非翻訳領域は、ポリ（Ａ）テールの上流のポリアデニル化シグナルの２１のヌクレオチドを示す。当該配列は、ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼに相当する予測保存ドメインのすべてを含む。
【００６０】
マウスｔｓｓｋ３の発現パターン
マウスｔｓｓｋ３ｂの発現パターンを、ｔｓｓｋ３ｂの全長転写産物に相当するｔｓｓｋ−３ｂ特異的プローブを用いる異なるマウス組織由来のトータルＲＮＡのノーザンブロット分析により調査した。このプローブは、上記方法で記載したように作成した混合マウス生殖細胞群中で排他的におおよそ１ｋｂの単一転写産物を認識した。高感光で、生殖細胞の１．３５ｋｂ転写産物の排他的識別も可能であり、この転写物は、マウス生殖細胞ライブラリーをスクリーニングし、他のｔｓｓｋ３ｂのスプライシングが示されるときには観察されなかった。更なる、精巣中のｔｓｓｋ−３ｂの発現パターンの分析のため、成体精巣の精製生殖細胞から得たＲＮＡによるノーザンブロットを実施した。ｔｓｓｋ−３ｂｍＲＮＡは、円形および濃縮精細胞で減数分裂後に発現するが、減数分裂パキテン期精母細胞では発現しなかった。マウス試験では、胚発生のｄ１１−１２で分化し、始原生殖細胞が生じる。最初の精子形成の波は、誕生後数日で始まり、精原細胞は、思春期前に初期精細胞に分化する。成熟精子への分化は、テストステロン依存であり、思春期後生ずる。
【００６１】
ｔｓｓｋ−３ｂが減数分裂後に発現するかどうか更に調査するため、トータル精巣ＲＮＡを、出生後の異なる年齢（１、３、７、１０、１５、２０、２４、３０および成体）のマウスから調製し、ノーザンブロット分析により分析した。ｔｓｓｋ−３ｂの転写は、誕生後、２０と２４日の間に始まり、このｍＲＮＡの減数分裂後発現を確認した。
【００６２】
これらの結果により、ｔｓｓｋ３ｂの発現パターンは、マウスｔｓｓｋ１およびｔｓｓｋ２（Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１３９，　１８５１−９）のものと類似することが示され、これにより、ｔｓｓｋ３　ｍＲＮＡ発現は発生的に調節され、その発現は、精子完成の開始あたりで減数分裂後に刺激されることが示唆される。
【００６３】
ｔｓｓｋ３ｂの発現パターンを更に分析するため、我々は、卵母細胞、中期ＩＩ停止卵子でおよび移植前胚発生の異なる段階で特定プライマーを用いＲＴ−ＰＣＲを行った。これらの任意の段階では、正確な大きさのｔｓｓｋ３ｂＰＣＲ産物が混合生殖細胞トータルＲＮＡから増幅し得る条件下、ＰＣＲ産物が観察されなかった。
【００６４】
ｔｓｓｋ３Ｂのヒト相同体のクローニングおよび発現
マウスｔｓｓｋ３配列を用い、生殖細胞腫瘍由来のヒトＥＳＴをデータベースのＢＬＡＳＴ　ｓｅａｒｃｈにより同定し、３’および５’ＲＡＣＥと共に使用し、上記方法に記載のような適当なライゲーションしたヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から全長ヒト相同体（配列番号３）をクローニングした。
【００６５】
ヒト組織でのｔｓｓｋ３の発現パターンを調査するため、組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ヒトｔｓｓｋ３　ｃＤＮＡのＣ末端４００ｂｐフラグメントによりプローブとした。１ｋｂおよび１．３５ｋｂＲＮＡ転写産物は当該精巣中で排他的に発現した。マウスの場合と同様に、１．３５ｋｂフラグメントは、他のスプライスした転写物を示し得る。マウスｔｓｓｋ３ｂとこれら新規のｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼのヒト相同体ｔｓｓｋ３の両方は、互いに最も高い相同性（９８％）を有しており、そしてマウスｔｓｓｋ３（９２％）、マウスｔｓｓｋ１およびマウスｔｓｓｋ２（５６％）とづづき、これは、このキナーゼが新規ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼの同じサブファミリーに属することを示唆する。記載したように、ｔｓｓｋ３およびｔｓｓｋ３ｂは非常に高い相同性（９２％）を有し、これら２つの配列間の相違は、２２アミノ酸（残基１０９から１３１）の範囲に限定される。この範囲をヌクレオチドレベルで分析すると、３つの塩基対欠失が、コーディング領域にシフトを生じ上記の２２アミノ酸に変化を生じたマウスｔｓｓｋ３配列で観察された。この時点でのこれらのフレームシフトの起点は不明であり、２種類のｔｓｓｋ３がマウス精巣に存在する可能性がある。より可能性があるのは、これら２つの配列の１つは、当該配列中の僅かな誤りを有し得ることである。ｔｓｓｋ３ｂヒト相同体は、マウスｃＤＮＡクローンから独立して得られ、そのマウス相同体とはアミノ酸レベルで１００％の相同性を有するため、出願人は、マウス３ｂとヒトｔｓｓｋ３配列の両方の正確さについて確信する。
【００６６】
ヒトおよびマウスｔｓｓｋ３のクロモソームマッピング
ｔｓｓｋ３ｂのクロモソームの位置もまた、全長ヒトｃＤＮＡプローブを用いる蛍光性ｉｎｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）でマッピングした。蛍光シグナルは、スコアした２０のメタフェーズスプレッドすべてのクロモソーム１で検出された。観察された合計１０９シグナルのうち、４９（４５％）が１ｐにあった。すべてのクロモソーム特異的シグナルは１ｐ３４．１−３４．３に局在した。シグナルの分布は以下のようであった：１染色分体（６細胞）、２染色分体（１４細胞）および３染色分体（５細胞）。マウスｔｓｓｋ３ｂｃＤＮＡ相同体はクロモソーム４のシンテニー領域、バンドＥに位置していた。
【００６７】
実施例２
ｔｓｓｋキナーゼファミリーのヒト相同体の全長ｃＤＮＡおよびｔｓｓｋ基質由来の部分的ｃＤＮＡ配列のクローニング
遺伝子銀行のサーチ目的で、予想されるマウスｔｓｓｋ１および２アミノ酸配列を用い、マウスｔｓｓｋ１およびｔｓｓｋ２の両方のゲノム配列を得た。クロモソーム５および２２にそれぞれ位置するこれらの遺伝子にはイントロンはない。コーディング領域の３’末端および５’末端に相当する配列を用い、それぞれセンスおよびアンチセンスプライマーを設計した。両方のヒトキナーゼ相同体の全長配列を最終的に得るため、鋳型としてヒト精巣ｍａｒａｔｈｏｎ　ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｉｎｃ．）を使用し、アンチセンスプライマーを５’ＲＡＣＥに用い、センスプライマーを３’ＲＡＣＥに用いた。増幅ｃＤＮＡフラグメントをＴＯＰＯ　ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いクローニングし、配列決定した。全長ヒトｔｓｓｋキナーゼｃＤＮＡを増幅するため、５’ＲＡＣＥ後に得られた５’末端のｃＤＮＡ配列を用い、５’センスプライマーを設計した。３’ＲＡＣＥ後に得られた３’末端のｃＤＮＡ配列を用い、アンチセンスプライマーを設計した。次いで、これらの２対のプライマーを用い、同じライブラリーからヒトｔｓｓｋ１および２を増幅した。増幅配列１．３ｋｂ（ｔｓｓｋ１）および１．２ｋｂ（ｔｓｓｋ２）をサブクローニングし、配列決定した。ｔｓｓｋキナーゼファミリーの３つのメンバーの翻訳ヒト相同体をそれぞれ配列番号１−３として提供する。
【００６８】
発現の特異性を分析するため、幾つかのヒト組織を描く市販用のブロットを、ヒトｔｓｓｋ１および２の全長ｃＤＮＡ由来ランダムプライム化標識ラベルを用い、行った。加えて、部分的な８００塩基対配列由来のランダムプライム標識化プローブを用い、ｔｓｓｋ基質の組織分布を決定した。ノーザンブロットは、商業用の利用可能なヒト組織ブロット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用い行った。
【００６９】
ノーザンブロットにより、ｔｓｓｋ１、２およびｔｓｓｋ基質は精巣特異的ｍＲＮＡである。これら同一のブロットを、ｔｓｓｋプローブにストリップし、βアクチン配列で再プローブ化した（各レーンに等量のＲＮＡを負荷し確認した）。発現の特異性を更に分析するために、同一プローブを用い、７６種のヒト組織由来の商業用の利用可能なｍＲＮＡアレイを使用するドットブロットを行った（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｃａｔ＃７７７５−１のＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＭＴＥＴＭ）Ａｒｒａｙを用いる）。それぞれのプローブ化ＭＴＥで得られたシグナルのみが、精巣ＲＮＡを含むグリッド中にある。この実験により、これらのメッセージはヒトでは精巣特異的であることが確認された。加えて、Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）は、ｔｓｓｋ１および２がマウス生殖細胞中で発現し、これらのメッセージは他の１１組織中には存在しなかったことを示した。
【００７０】
実施例３
免疫局在性およびイムノブロッティング実験
ｔｓｓｋ１、２および３キナーゼおよびその基質が精巣中に存在するかどうか決定するため、および／または組換えタンパク質に対する成熟精子特異的抗体を作成する。他に、各ｃＤＮＡの予想アミノ酸配列から設計する特異的ペプチドに対する抗ペプチド抗体を作成する。作成された各抗体の特異性を、組換え体ｔｓｓｋ１、２および３について試験する。各タンパク質の特定アミノ酸配列に対し設計した抗ペプチド抗体は特異的となると予想される。
【００７１】
ｔｓｓｋキナーゼおよびｔｓｓｋ基質に対し作成した抗体を用い、他の組織中のこれらキナーゼの存在を分析する。この目的のため、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、胎盤、骨格筋および脾臓のような種々の組織のＣｌｏｎｔｅｃｈタンパク質ＭｅｄｌｅｙｓＴＭを、抗ｔｓｓｋおよび抗ｔｓｓｋ基質抗体を使用するウェスタンブロットで試験する。ｔｓｓｋ１、２および３をコードするｍＲＮＡが精巣にのみ存在するため、同様のタンパク質分布が予測される。ｔｓｓｋキナーゼのヒト相同体は、マウス対応物と比較すると８０％を超える相同性を有するため、ヒト組換えｔｓｓｋキナーゼに対する抗血清はマウス相同体を同様に認識すると予測される。そのため、ヒトｔｓｓｋキナーゼに対し作成した抗体もまた、マウス組織中で試験する。
【００７２】
精製組換えタンパク質に対するポリクローナル抗体を作成するため。ラットおよびウサギを抗体産生に用いる。この目的のために、Ｍａｎｄａｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）により述べられるようなプロトコールに従う。抗体力価はＥＬＩＳＡによりモニターし、抗体の特異性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング分析でチェックする。
【００７３】
精子調製
免疫局在性およびイムノブロッティング実験を行うため、ヒト精子を健常なドナーから回収し、従来述べられている（Ｎａａｂｙ−Ｈａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）ようなＰｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　Ｕｐｓａｌａ，　Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心分離を用い精製する。次いで、精子を最終濃度２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌで再懸濁する。
【００７４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング
精子および異なる組織由来の他の細胞型を遠心分離でペレットとし、リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌで洗浄し、メルカプトエタノールの入っていないサンプル緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ，　１９７０）に再懸濁し、５分間煮沸する。遠心分離後、上清を回収し、２−メルカプトエタノールを最終濃度５％となるように加え、５分間煮沸し、次いで、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥした。タンパク質濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＡＢＣキットで測定する。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐへのタンパク質の電気泳動転移および免疫検出を、従来述べられているように行う（Ｋａｌａｂ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）。ゲルを、銀またはクマジーブルーで染色するか、ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　ＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ転移させ、抗組換え抗体でプローブ化する。
【００７５】
免疫蛍光
ｔｓｓｋ１、２および３の細胞内位置を決定するため、可能性酵素に対する特異的抗体を免疫蛍光実験ならびにヒト精巣組織およびヒト精子の免疫電子顕微鏡に使用する。加えて、抗体がマウス抗原を認識するならば、その局在性を、マウス生殖細胞および精子の免疫蛍光性で探索する。
【００７６】
精子を適当な実験条件下で処置し、ＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド−０．０５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドの溶液で懸濁液で１時間固定し、３７℃のＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３７℃１０分間、透過処理する。次いで、精子をＰＢＳで洗浄し、従来述べられている（Ｖｉｓｃｏｎｔｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）ように、適当な抗体の連続希釈物（５、１０、５０および１００）と共に一夜インキュベーションする。ＰＢＳで精子を洗浄後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧと共にインキュベーションし、次いでポリリシン被覆顕微鏡スライドに付着させる。ＰＢＳによる３×洗浄の後、当該スライドをフルオロモント（ｆｌｕｏｒｏｍｏｎｔ）でマウントし、蛍光を評価する。精巣生検から得た精巣サンプルを従来記載（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）のように処理する。
【００７７】
実施例４
組換えｔｓｓｋタンパク質の発現
多くのキナーゼがＥ．　ｃｏｌｉ内で作用分子として発現する（Ｂｏｄｅｎｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４；　Ｌｅｔｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２）。Ｅ．　ｃｏｌｉだと比較的簡単であり、容易にスケールアップできるという利点がある。ＴＳＳＫ１、２、３のオープンリーディングフレームを増幅し、ｐＥＴ２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中でＨｉｓタグと融合させる。当該プラスミドをＢＬ２１ＤＥ３または他の適当な宿主株に形質転換する。組換えタンパク質産生は、培養培地に最終濃度１ｍＭとなるようＩＰＴＧを加えることにより誘導する。組換えタンパク質は、天然の条件下、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いＥ．　ｃｏｌｉライゼートから精製する。結晶形成の促進のため、高純度のタンパク質が最適である。上記のタンパク質調製物を精製するため、ＰｒｅｐＣｅｌｌ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）を使用する準備した電気泳動を用いる。キナーゼアッセイは結晶化を行う前に行う。
【００７８】
細菌中における、組換え精巣ｔｓｓｋキナーゼおよびｔｓｓｋ基質を産生させるため、ｔｓｓｋ１、２および３の、ならびにｔｓｓｋ基質のための発現構成物を作成する。これらタンパク質のそれぞれのコーディング領域を、Ｃ末端６残基のＨｉｓタグを含むｐＥＴ２８ｂ発現ベクター中にサブクローニングする。特に当該構成物は、完全ＯＲＦを用い作成する。プライマーは、５’末端にＮｄｅＩ部位および３’末端にＸｈｏＩ部位ができるように設計する。増幅産物を、ｐＥＴ２８ｂ発現ベクターのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位にライゲーションする。組換えタンパク質を発現ベクターの６ヒスチジン残基と融合させるため、発現タンパク質は、Ｎｉ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ結合樹脂親和性クロマトグラフィーを用い精製する。一旦、精製すると、キナーゼ活性はｔｓｓｋ基質で評価し、酵素が正しくホールディングされていることを確認する。
【００７９】
ＴＳＳＫ２タンパク質は、Ｅ．　ｃｏｌｉ内での発現が上手くいき、精製した。ｔｓｓｋ２を発現させるため、オープンリーディングフレームを、Ｈｉｓ−タグを有するｐＥＴ２８ｂ発現ベクター中にサブクローニングした。組換えタンパク質はＩＰＴＧでの誘導後、産生した。細菌で発現し、部分的に精製したｔｓｓｋ２を、ＢｉｏｒａｄのＰｒｅｐＣｅｌｌを使用する準備したゲル電気泳動により更に精製した。当該画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＴＳＳＫ基質を発現させ、同様に精製した。これらの精製タンパク質を用い、標準技術を用いラットポリクローナル抗体を産生した。
【００８０】
複数のキナーゼがインビボおよびインビトロで自己リン酸化するという性質を有するため、精製した細菌性の発現組換えｔｓｓｋ２を自己リン酸化についてアッセイした。当該実験は、４０μＭ　ＡＴＰ（１μＣｉの［３２Ｐ］ＡＴＰ）、１０ｍＭ　Ｍｇ２＋、ｐ−ニトロ−フェニルホスフェートおよびグリセロールホスフェートのようなホスファターゼインヒビターおよびプロテアーゼインヒビター（ロイペプチンおよびアプロチニン１０μｇ／ｍｌ）の存在下で構成し、当該アッセイは、サンプル緩衝液で停止させ、ｔｓｓｋ２は１０％ＰＡＧＥで分離した。乾燥ゲルのオートラジオグラフィーにより、組換えｔｓｓｋ２に３２Ｐが組み込まれていることが示され、これは、細菌で発現したｔｓｓｋ２は、生ずるリン酸化で正確にフォールディングされ、構造研究に使用し得ることを示唆する。
【００８１】
細菌で発現した組換えタンパク質のすべてが正確にフォールディングされているわけではないので、同様のアプローチにより、酵母でｔｓｓｋ１、２および３を発現する。酵母でｔｓｓｋキナーゼおよび基質を発現させるため、キナーゼを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，　ＣＡ）のｐＰＩＣＺαＢベクターにサブクローニングし、分泌タンパク質および細胞内タンパク質のようにＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ中で発現する。これらの構成物はまた、培養培地または抽出細胞の何れかからの組換えタンパク質の精製が容易となるＣ末端Ｈｉｓタグを有する。
【００８２】
実施例５
酵母ツー・ハイブリッド・システムにおけるｔｓｋｓとｔｓｓｋ２との相互作用
ｔｓｓｋ２とｔｓｋｓとのタンパク質−タンパク質相互作用を証明するため、ツー・ハイブリッド・システムを用いた。この実験では、ベイト遺伝子（ｔｓｓｋ２）を、最初に、ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）への融合としてレポーター株中に形質転換した。ＧＡＬ４活性化ドメイン（ＡＤ）への融合としてｔｓｋｓを発現する第二プラスミドもまたＡＨ１０９レポーター株中に導入した。ウェスタンブロットを行い、酵母中での融合タンパク質の発現の確認を行った。ｔｓｓｋ２およびｔｓｋｓの相互作用により、ヒスチジン（ＨＩＳ）遺伝子の転写が促進され、Ｈｉｓのない培地中で酵母が増殖し得ることが観察された。同様に、ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメインに融合したｐ５３を発現する第一の構成物とＧＡＬ４活性化ドメイン（ＡＤ）に融合したＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ　抗原を発現する第二の構成物とを酵母細胞に共トランスフェクトすることにより、ｐ５３およびＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原は相互作用し、Ｈｉｓ遺伝子活性化を促進することが示された。この相互作用を陽性対照として使用した。対照的に、ＴＳＳＫ２およびｐ５３とＤＮＡ−ＢＤとの融合タンパク質は、ＧＡＬ−ＡＤプラスミドを共トランスフェクトしたときは増殖を促進しなかった。ＧＡＬ−ＡＤ単独、またはＧＡＬ−ＡＤとＴＳＫＳとの融合タンパク質またはＧＡＬ−ＡＤとＳＶ４０Ｌａｒｇｅ　Ｔ　抗原との融合タンパク質の何れも、Ｈｉｓ遺伝子の転写を活性化する能力を有さなかった。この実験により、ｔｓｓｋ２および基質ｔｓｋｓは相互作用し得ることが示され、これらのタンパク質のヒト相同体が、マウス対応物と同様に挙動することを示唆する。
【００８３】
ｔｓｓｋ２とｔｓｋｓとがインビボで相互作用するかどうか調査するため、受精能獲得した精子および受精能獲得していない精子を、タンパク質−タンパク質相互作用を保護する条件下でＴｒｉｔｏｎＸ１００で抽出し、次いで、免疫沈降を特定抗体で行う。相互作用は、典型的な交差免疫沈降実験における他の抗体を用いるウェスタンブロットによりアッセイする。相互作用するタンパク質が共存するため、二重標識免疫蛍光が生じ、共存を調査する。ヒトｔｓｓｋではウサギ抗体はまだ得られていないが、ラット抗ｔｓｓｋ２およびラット抗ｔｓｋｓ抗体は従前から得られており、そのため、ヒトｔｓｓｋに対する抗体を得る任意の困難性が予想される理由はない。
【００８４】
実施例６
ｔｓｓｋ１、２、３およびｔｓｓｋ基質の結晶構造の単離
２つのストラテジーをｔｓｓｋ特異的インヒビターの理論的設計に利用する。第一に、ハイスループットスクリーニングに適するインビトロキナーゼアッセイを開発する。第二に、ｔｓｓｋキナーゼ単独の結晶構造またはその基質との複合化した結晶構造を得る。
【００８５】
Ｘ線結晶を使用する構造研究の場合、おおよそ５ｍｇの活性キナーゼを得る必要がある。この量のタンパク質は、一般的には、最初の結晶化の試みに適当な量である。最初の試みは、組換え未処理タンパク質で行う；これは、幾つかの酵素の構造研究を含む多くの場合に成功すると証明されている共通の結晶技術である。結晶スクリーニング前に、発現フラグメントを、酵素活性の適当なレベルならびに純度、均一性および溶解性についてチェックし得る。懸滴蒸発拡散法（ｈａｎｇｉｎｇ　ｄｒｏｐ　ｖａｐｏｒ　ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）と合わせて使用する、幾つかの商業用の利用可能な結晶スクリーニングキットは、結晶成長条件を探索する標準的な最初のステップを提供する。触媒的に必要な金属イオン、基質および／またはインヒビターの存在下、フラグメントの結晶スクリーニングは、アポ酵素のスクリーニングと同時に行う。
【００８６】
結晶は、シッティングドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ　ｄｒｏｐ）を平衡化することにより２１℃で得られる。クリオディフラクション（ｃｒｙｏｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）実験の場合、結晶を、これらの試薬の中間濃度を有する３つの溶液を介して同様の緩衝性溶液に移す。室温および低レゾリューションでの回折実験の場合、回転陽極Ｘ線発生装置（ｒｏｔａｔｉｎｇ　ａｎｏｄｅ　Ｘ−ｒａｙ　ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）のＣｕＫαを用いる。最終的な構造は、予備的な改良、モデル改善および更なる改善後に確立する。
【００８７】
ｔｓｓｋキナーゼファミリーの場合、基質の存在下での結晶化を、分子に基づくキナーゼ活性の確立のため、試みる。最初の結晶化条件が得られると、その条件を、少なくとも３．０Åレゾリューションで回折する結晶が得られるように、最適化する。ＭＡＤ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ａｎｏｍａｌｏｕｓ　ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）およびＭＩＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｉｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）技術による構造の直接同期化を同時に行い、確実に成功させ得る。同期化構造の半自動モデル構成および改良技術を用い、迅速に構造結果が得られ得る。構造が得られると、その結果は、精子形成のｔｓｓｋキナーゼファミリーおよび／または精子機能での特有の役割を理解する観点で分析する。これらの研究の最終目的は、避妊に有用であることを証明し得る、ｔｓｓｋ１、２および／または３の特異的インヒビターの設計のため、鋳型として当該構造を使用し得る。
【００８８】
実施例７
ｔｓｓｋ特異的キナーゼアッセイの開発
ｔｓｓｋファミリー用の特異的キナーゼアッセイの設計は、別の観点から利点がある。第一に、キナーゼアッセイは、ＡＴＰのＫｍのようなこれらの酵素、二価陽イオンおよび基質の動力学的特性を解析し得る。第二に、作用酵素のみは結晶学的研究に適当であるため、キナーゼアッセイにより、組換えタンパク質のフォールディングが確認され得る。第三に、ｔｓｓｋ特異的インヒビターのハイスループットスクリーニングに適当なキナーゼアッセイに基づく研究室スケールでのインビトロキナーゼアッセイの開発に望ましい。
【００８９】
ｔｓｓｋキナーゼ活性を測定するアッセイの開発は、基質、［γ３２Ｐ］ＡＴＰ、Ｍｇ２＋および／またはＭｎ２＋およびホスファターゼインヒビターの存在のようなキナーゼアッセイの一般的特性による。しかし、第一に、ｔｓｓｋキナーゼの源を提供しなければならない。ｔｓｓｋキナーゼは、これらのタンパク質の組換え的発現および発現キナーゼの精製により生ずる。
【００９０】
哺乳類細胞抽出物のキナーゼアッセイ
それぞれのヒトｔｓｓｋキナーゼのＯＲＦをｐＣＭＶ−ＨＡエピトープタグ化哺乳類発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　ｃａｔ＃Ｋ６００３−１）中にサブクローニングする。ｔｓｓｋ基質のＯＲＦをｐＣＭＶ−Ｍｙｃ哺乳類発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　上記と同じ）にサブクローニングする。３つのＨＡ−キナーゼのそれぞれを、それぞれのヒトｔｓｓｋ用の３種のＣＯＳ細胞系中でｃＭｙｃ−ｔｓｓｋ基質で共発現させる。共発現は、それぞれの抗タグ抗体で免疫蛍光を有効に行う。ＨＡおよびＨｙｃに対する抗体はＣｌｏｎｔｅｃｈから利用可能である。抗ｃ−Ｍｙｃはマウスモノクローナルであり、抗ＨＡはウサギポリクローナルであるため、キナーゼおよび基質の両方が同じ細胞中で共発現するかどうか分析することが可能となる。
【００９１】
次いで、タンパク質を１％Ｔｒｉｔｏｎで抽出し、免疫沈降を、抗ＨＡ−タグ抗体を用い行う。他に、抗ｔｓｓｋ−キナーゼ／抗−ｔｓｓｋ基質抗体を用い、ｔｓｓｋキナーゼおよびｔｓｓｋ基質を免疫沈降し得る。典型的に当該抗体は、標的リガンドの単離を幇助するセファロースビーズのような固体支持体に結合する。プロテインＡセファロースによる沈殿後、当該ペレットを、ＡＴＰ（１０μＭ、１００μＭおよび１ｍＭ）、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋（１００μＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭ）および１μＣｉの［γ３２Ｐ］ＡＴＰの異なる濃度を用いるキナーゼ活性についてアッセイする。リン酸化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離およびオートラジオグラフィー後評価する。免疫沈降後のキナーゼ活性の評価は、１つの特定キナーゼの活性を特異的に測定し得る、しばしば使用される方法（Ｃｏｓｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５，　Ｃｅｌｌ　８１，　１１３７−４６；　Ｍｏｏｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５，　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ　５３，　６９２−９）である。Ｋｕｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）が、ｔｓｓｋ１および２の免疫沈降後のｔｓｓｋ基質のリン酸化の検出に成功したため、哺乳類システムでの共発現後のｔｓｓｋキナーゼのキナーゼ活性を測定することが可能であると予測される。
【００９２】
インビトロキナーゼアッセイ
それぞれ精製した酵素を、種々の濃度の、ＡＴＰ（１０μＭ、１００μＭおよび１ｍＭ）、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋（１００μＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭ）、１μＣｉの［γ３２Ｐ］ＡＴＰ、および種々の濃度の精製ｔｓｓｋ基質（１、１０および１００ｎｇ／アッセイ）と混合する。リン酸化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離およびオートラジオグラフィーの後に評価する。タンパク質が正確にフォールディングされているならば、基質のリン酸化は、この方法で容易に検出されると予測される。
【００９３】
実施例８
ｔｓｓｋ抗体の産生
精製ｔｓｓｋ２およびｔｓｋｓを使用し、ラットポリクローナル抗体を産生した。組換えヒトｔｓｓｋ１、２および３ならびにヒトｔｓｓｋ基質に対する抗血清を用い、組織分布およびタンパク質レベルでの細胞下局在性を決定する。当該ラット抗ｔｓｓｋおよび抗ｔｓｋｓ抗体は、組換えタンパク質を認識し、予想されるＭＷを有する精子および精巣中のタンパク質をも認識した。これは、ｔｓｓｋファミリーの少なくとも１つのメンバーおよびその基質（ｔｓｋｓ）が精子中に存在することを示唆する。次いで、これらの抗体を用い、受精能を獲得したヒト精子中のこれらのタンパク質の細胞内位置を研究した。Ｔｓｓｋ２は、ヒト精子の赤道セグメント（ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ　ｓｅｇｍｅｎｔ）に局在することが観察された。ｔｓｋｓもまた赤道セグメントに局在した。それにも拘わらず、抗ｔｓｋｓ抗体は、前頭および尾に存在するタンパク質をも認識する。これら分子の免疫局在性は、ｔｓｓｋ２およびｔｓｋｓが、ヒト精子群の少なくとも１画分に精子の類似領域中に存在することを示唆する。対照実験は、各抗体のラット免疫前血清を用い行った。ウェスタンブロットおよび免疫蛍光の両方は陰性であった。ｔｓｓｋ２に対する抗体はｔｓｓｋ２に対し産生させるが、配列に高い相同性があるためこの抗体がｔｓｓｋファミリーの他のメンバーを認識したことを否定できない。しかし、３つのｔｓｓｋイソ酵素間の識別は、ｔｓｓｋ１と２の間で相違し、ｔｓｓｋ３中には存在しないＣ末端ドメインに対する抗体を産生させることにより可能となり得る。
【００９４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトｔｓｓｋ１、ヒトｔｓｓｋ２およびヒトｔｓｓｋ３のアミノ酸配列間の比較を示したものである。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月3日(2003.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列配列番号１または配列番号２を含む精製ポリヌクレオチド。
【請求項２】
組換えヒトｔｓｓｋ遺伝子構成物であって、核酸配列配列番号１または配列番号２に作動可能なように連結させた非天然プロモーターを含む当該構成物。
【請求項３】
請求項２の構成物を含むトランスジェニック細胞。
【請求項４】
アミノ酸配列配列番号４、配列番号５、または配列番号４のアミノ酸配列とは１つまたは２つの保存的アミノ酸置換残基が異なるアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。
【請求項５】
当該アミノ酸配列が、アミノ酸配列配列番号４または配列番号５と同一である、請求項４の精製ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号４のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項７】
配列番号５のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項８】
可能性あるヒト治療剤をスクリーニングする方法であって、ｔｓｓｋポリペプチド配列番号４、配列番号５、配列番号４の生理活性フラグメント、または配列番号５の生理活性フラグメントを、候補化合物と接触させること、および当該候補化合物が選択的に当該ｔｓｓｋポリペプチドに結合するかどうかを決定することを含む当該方法。
【請求項９】
当該ｔｓｓｋポリペプチドを固体表面上に固定化し、当該候補を標識する、請求項８の方法。
【請求項１０】
ｔｓｓｋキナーゼ活性のアンタゴニストを同定する方法であって、
インビトロキナーゼアッセイ組成物であって、ホスフェートの標識源、ｔｓｓｋ基質、およびｔｓｓｋキナーゼを含む当該組成物を提供すること、
候補阻害化合物の存在下および非存在下での基質のリン酸化の速度を測定すること、および
アンタゴニスト化合物の非存在下で構成されるアッセイで観察されるキナーゼ活性と比べてｔｓｓｋキナーゼ活性が減少するアンタゴニスト化合物を同定すること、を含む当該方法。
【請求項１１】
当該ｔｓｓｋキナーゼが配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ホスフェートの当該標識源が［γ３２Ｐ］ＡＴＰである、請求項１０の方法。
【請求項１３】
当該ｔｓｓｋ基質が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１０の方法。
【請求項１４】
２またはそれより多いｔｓｓｋキナーゼが、キナーゼアッセイ組成物中に存在する、請求項１０の方法。
【請求項１５】
配列番号４、配列番号５、配列番号４の生理活性フラグメントまたは配列番号５の生理活性フラグメントを含むペプチド、および
医薬的に許容される担体、
を含む組成物。
【請求項１６】
添加物を更に含む、請求項１５の組成物。
【請求項１７】
当該アミノ酸配列が配列番号４または配列番号５である、請求項１５の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明の１つの実施態様により、精製ポリペプチドを、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号４もしくは配列番号６とは１つもしくはそれより多い保存的アミノ酸置換残基が異なるアミノ酸配列を含むように提供する。より好ましくは、精製ポリペプチドは、配列番号４または配列番号６とは５未満の保存的アミノ酸置換残基が異なるか、より好ましくは２またはそれ未満の保存的アミノ酸置換残基が異なるアミノ酸配列を含む。