(57)【要約】【課題】ゲノムＤＮＡに一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することで、植物における相同組換え頻度を向上させる方法を提供することを課題とする。【解決手段】植物においてＵＶＤＥを発現させることにより、一本鎖ＤＮＡ切断を誘起し、結果的に相同組換え頻度を向上させる試みを行った。具体的には、相同組換え頻度を評価するために、組換え基質が導入されたアラビドプシスにおいてアカパンカビＵＶＤＥ遺伝子を発現させたところ、アカパンカビＵＶＤＥの導入によって相同組換え頻度はコントロールと比較して最高４５倍まで上昇することが示された。この結果、植物においてＵＶＤＥを発現させる事により、相同組換え頻度を著しく上昇できることが明らかとなった。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡに一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
【請求項２】
植物細胞においてＵＶＤＥを発現させることを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
【請求項３】
ＵＶＤＥが発現している植物細胞にＵＶ−Ｂ照射を行うことを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
【請求項４】
ＵＶＤＥがアカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、もしくは枯草菌ＵＶＤＥである、請求項２または３に記載の植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法により、植物におけるジーンターゲティング効率を上昇させる方法。
【請求項６】
ゲノムＤＮＡに一本鎖ＤＮＡ切断を誘導した植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
【請求項７】
ＵＶＤＥを発現させた植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
【請求項８】
ＵＶ−Ｂが照射されたＵＶＤＥが発現している植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
【請求項９】
ＵＶＤＥがアカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、もしくは枯草菌ＵＶＤＥである、請求項７または８に記載のジーンターゲティング法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載のジーンターゲティング法により任意の遺伝子が改変された形質転換植物細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項１２】
ノックアウト植物である、請求項１１に記載の形質転換植物体。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１５】
ＵＶＤＥをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを有効成分として含有する、植物における相同組換え促進剤。
【請求項１６】
ＵＶＤＥをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを有効成分として含有する、植物におけるジーンターゲティング効率促進剤。
【請求項１７】
ＵＶＤＥがアカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、もしくは枯草菌ＵＶＤＥである、請求項１５または１６に記載の促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゲノムＤＮＡに一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することで、植物における相同組換え頻度を向上させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高等植物におけるジーンターゲティング効率が極めて低い理由として、高等植物における相同組換え頻度が極めて低いことが指摘されていた。従ってこれまでも相同組換え頻度を向上させるために相同組換えに関与する遺伝子を植物体に導入する試み等（非特許文献１および２）が行われてきたが、顕著な組換え頻度の向上は報告されていない。
【０００３】
アラビドプシスを用いたこれまでの研究において、紫外線（ＵＶ−Ｂ）の照射によって相同組換え頻度が向上する事、またＵＶ光産物の除去を行うｐｈｏｔｏｌｙａｓｅの欠損株においては組換え頻度向上程度がさらに高くなる事が報告されていた（非特許文献３および４）。従って高等植物のＵＶ光産物の除去にはヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、組換え修復（ＨＲ）の関与する事が示唆されていた。
【０００４】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Ｈａｎｉｎ  Ｍ，  Ｍｅｎｇｉｓｔｅ  Ｔ，  Ｂｏｇｕｃｋｉ  Ａ，  Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  Ｊ．  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＭＩＭ  ｇｅｎｅ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２０００  Ｏｃｔ；２４（２）：１８３−９．
【非特許文献２】Ｇｈｅｒｂｉ  Ｈ，  Ｇａｌｌｅｇｏ  ＭＥ，  Ｊａｌｕｔ  Ｎ，  Ｌｕｃｈｔ  ＪＭ，  Ｈｏｈｎ  Ｂ，  Ｗｈｉｔｅ  ＣＩ．  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｉｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｒａｄ５０．  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  ２００１  Ａｐｒ；２（４）：２８７−９１．
【非特許文献３】Ｒｉｅｓ  Ｇ，  Ｈｅｌｌｅｒ  Ｗ，  Ｐｕｃｈｔａ  Ｈ，  Ｓａｎｄｅｒｍａｎｎ  Ｈ，  Ｓｅｉｄｌｉｔｚ  ＨＫ，  Ｈｏｈｎ  Ｂ．  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ＵＶ−Ｂ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０００  Ｊｕｌ  ６；４０６（６７９１）：９８−１０１．
【非特許文献４】Ｒｉｅｓ  Ｇ，  Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  Ｇ，  Ｆｒｏｈｎｍｅｙｅｒ  Ｈ，  Ｈｏｈｎ  Ｂ．  ＵＶ−ｄａｍａｇｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０００  Ｎｏｖ  ２１；９７（２４）：１３４２５−９．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、高等植物における相同組換え頻度を向上させる方法を提供することにある。より具体的には、ゲノムＤＮＡに一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することで、高等植物における相同組換え頻度を向上させる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＵＶ光産物を認識して一本鎖ＤＮＡ切断を行うＵＶ  Ｄａｍａｇｅ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＵＶＤＥ）をアカパンカビや分裂酵母より発見し、この酵素をＮＥＲ欠損株のヒトＸＰＡ細胞株に導入したところ、ＸＰＡの紫外線感受性が回復することを見いだした。このことから、本来ＮＥＲで修復される損傷が、ＵＶＤＥによる一本鎖ＤＮＡ切断とそれに続く複製による２本鎖ＤＮＡ切断を経て相同組換えにより修復されている可能性が示された。
【０００７】
そこで、本発明者らはＵＶＤＥを高等植物において発現させることにより、一本鎖ＤＮＡ切断を誘起し、結果的に相同組換え頻度を向上させる試みを行った。具体的には、相同組換え頻度を評価するために、組換え基質が導入されたアラビドプシスにおいてアカパンカビＵＶＤＥ遺伝子を導入したところ、アカパンカビＵＶＤＥの発現によって染色体内相同組換え頻度はコントロールと比較して最高４５倍まで上昇することが示された。この結果、高等植物においてＵＶＤＥを発現させる事により、相同組換え頻度を著しく上昇できることが明らかとなった。
【０００８】
即ち、本発明は、ゲノムＤＮＡに一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することで、植物における相同組換え頻度を向上させる方法に関し、以下の〔１〕〜〔１７〕を提供するものである。
〔１〕  ゲノムＤＮＡに一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
〔２〕  植物細胞においてＵＶＤＥを発現させることを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
〔３〕  ＵＶＤＥが発現している植物細胞にＵＶ−Ｂ照射を行うことを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
〔４〕  ＵＶＤＥがアカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、もしくは枯草菌ＵＶＤＥである、〔２〕または〔３〕に記載の植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
〔５〕  〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法により、植物におけるジーンターゲティング効率を上昇させる方法。
〔６〕  ゲノムＤＮＡに一本鎖ＤＮＡ切断を誘導した植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
〔７〕  ＵＶＤＥを発現させた植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
〔８〕  ＵＶ−Ｂが照射されたＵＶＤＥが発現している植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
〔９〕  ＵＶＤＥがアカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、もしくは枯草菌ＵＶＤＥである、〔７〕または〔８〕に記載のジーンターゲティング法。
〔１０〕  〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載のジーンターゲティング法により任意の遺伝子が改変された形質転換植物細胞。
〔１１〕  〔１０〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔１２〕  ノックアウト植物である、〔１１〕に記載の形質転換植物体。
〔１３〕  〔１１〕または〔１２〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１４〕  〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１５〕  ＵＶＤＥをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを有効成分として含有する、植物における相同組換え促進剤。
〔１６〕  ＵＶＤＥをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを有効成分として含有する、植物におけるジーンターゲティング効率促進剤。
〔１７〕  ＵＶＤＥがアカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、もしくは枯草菌ＵＶＤＥである、〔１５〕または〔１６〕に記載の促進剤。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ＵＶ  Ｄａｍａｇｅ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＵＶＤＥ）を植物において発現させることにより、一本鎖ＤＮＡ切断を誘起し、結果的に相同組換え頻度を上昇できることを見出した。これにより、植物におけるジーンターゲティング効率を上昇させることが可能となった。本発明は、この知見に基づくものである。
【００１０】
本発明は、ゲノムＤＮＡに一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法を提供する。このような方法は、植物におけるジーンターゲティング効率を上昇させる方法として利用できる。
【００１１】
本発明における植物としては、好ましくは高等植物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１２】
本発明において、一本鎖ＤＮＡ切断の誘導方法は、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、ＵＶＤＥを植物細胞に発現させることで実施できる。
【００１３】
本発明におけるＵＶＤＥ（ＵＶ  Ｄａｍａｇｅ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）とは、紫外線で生じるシクロブタン型二量体、６−４光産物、Ｄｅｗａｒ型光産物など全てのメジャーなＤＮＡ損傷の５’側の３−ＯＨを残すようにニックを入れる酵素を指す。本発明におけるＵＶＤＥはまた塩基が無くなった部位（ＡＰサイト）を認識して切るＡＰエンドヌクレアーゼの活性（Ｓｈｉｎ−ｉｃｈｉｒｏ  Ｋａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７，  ３０９６−３１０３，  １９９９）も有する。
【００１４】
本発明におけるＵＶＤＥとしては、例えば、アカパンカビＵＶＤＥ（アクセッション番号  Ｄ１１３９２、ＢＡＡ７４５３９）、分裂酵母ＵＶＤＥ（アクセッション番号  Ｄ７８５７１、ＢＡＡ１１４１５）、枯草菌ＵＶＤＥ（アクセッション番号  Ｚ４９７８２、ＣＡＡ８９８６５．１）が挙げられる。また、これらの配列は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（Ｖｏｌ．  ２４，  １２６７−１２７１，  １９９６）にも開示されている。
【００１５】
本発明においては、アカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、または枯草菌ＵＶＤＥと同等な機能を有する蛋白質もまた利用することができる。
【００１６】
アカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、または枯草菌ＵＶＤＥと同等な機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡの単離方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：  １３５０−１３５４，  １９８５、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：  ４８７−４９１，  １９８８）を利用して行うことができる。即ち、当業者であれば、アカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、または枯草菌ＵＶＤＥをコードするＤＮＡの塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、他の所望の生物からアカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、または枯草菌ＵＶＤＥと高い相同性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを単離し、その配列を決定することができる。上記プライマーは、アカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、または枯草菌ＵＶＤＥのＣ末側に存在する高度に保存されている領域（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（Ｖｏｌ．  ２４，  １２６７−１２７１，  １９９６）を参照）をコードするＤＮＡ配列を基に設計することが好ましい。
【００１７】
別の単離方法としては、アカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、または枯草菌ＵＶＤＥをコードするＤＮＡの塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによって単離する方法が挙げられる。該ＤＮＡを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用れば、より相同性の高いＤＮＡの単離を期待することができる。単離したＤＮＡの配列の決定は、公知の方法で行うことができる。
【００１８】
別の単離方法としては、紫外線損傷の修復欠損の大腸菌や酵母に検索をしたい生物のｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙを発現させ、紫外線抵抗性になった細胞からその生物種のＵＶＤＥを単離する方法が挙げられる。本発明者らは、この方法により、アカパンカビ、分裂酵母のＵＶＤＥ遺伝子を単離した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．  ２４，  １２６７−１２７１，  １９９６）。
【００１９】
上記ＰＣＲやハイブリダイゼーション等の方法によって単離されるＤＮＡにコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、アカパンカビＵＶＤＥ、分裂酵母ＵＶＤＥ、または枯草菌ＵＶＤＥのアミノ酸配列と、配列全体で少なくとも３６％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を示す。
【００２０】
上記ＰＣＲやハイブリダイゼーション等の方法によって単離されるＤＮＡが、ＵＶＤＥをコードするＤＮＡであるかは、該ＤＮＡからコードされる蛋白質の作用により、紫外線を当てたプラズミドにニックが入り、スーパーコイル型からリラックス型に変わるか否かで判定できる（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（Ｖｏｌ．  ２４，  １２６７−１２７１，  １９９６）。具体的には、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４，  ２３９３−２３９９，  １９９５に記載のように、紫外線損傷、例えば５’末端を３２Ｐで標識した５０ヌクレオチドほどの合成ＤＮＡの中央にシクロブタン型ピリミジン二量体を入れた基質とその相補鎖をアニールして二本鎖ＤＮＡを準備し、測るべき蛋白質を作用させて損傷の部位で切られたかどうかをアクリルアミドゲル上で電気泳動して調べることにより、どこでどのように切られたかの情報を得ることができる。
【００２１】
また、上記ＰＣＲやハイブリダイゼーション等の方法によって単離されるＤＮＡが、ＵＶＤＥをコードするＤＮＡであるかは、配列の相同性からも判定することができる。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴｎ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴｘ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，  １９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，  １９９０、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，  １９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ  ＝  １００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ  ＝  １２とする。また、ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ  ＝  ５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ  ＝  ３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２，  １９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００２２】
植物細胞におけるＵＶＤＥの発現は、上記本発明のＵＶＤＥをコードするＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入することで実施できる。このように、本発明のＵＶＤＥをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターは、植物における相同組換え促進剤としての用途を有する。また、後述するように、本発明のＵＶＤＥをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターは、植物におけるジーンターゲティング効率促進剤としての用途も有する。
【００２３】
植物細胞へのベクターの導入方法としては、当業者に周知の方法、例えばｉｎ  ｐｌａｎｔａ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、組織培養系を用いたアグロバクテリウム法などを用いる事ができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明において、植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入ＤＮＡを発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここで言う「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、カルス、葉の切片や花序における細胞などが含まれる。
【００２５】
ＵＶＤＥを発現させることにより相同組換え頻度が上昇するか否かは、実施例に記載のように組換え基質を用いることで評価することができるが、この方法に限定されるものではない。
【００２６】
また、ＵＶＤＥが発現している植物細胞に、ＵＶ−Ｂ照射を行うことによって、ＵＶ−Ｂ非照射時と比べ相同組換え頻度をさらに上昇させることが可能である。本発明は、このような高効率な方法も提供するものである。
【００２７】
植物にＤＮＡ導入を行うと通常外来ＤＮＡはゲノム上にランダムに組みこまれる。これに対し、相同組換えを介してゲノム上の特定の部位に外来ＤＮＡが組みこまれる場合をジーンターゲティングという。ジーンターゲティングによって特定の遺伝子の機能を破壊する事だけでなく、アミノ酸置換を誘起する変異等を遺伝子に導入する事も可能である。
【００２８】
本発明は、ゲノムＤＮＡに一本鎖ＤＮＡ切断を誘導した植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法を提供する。本発明のジーンターゲティング法により、例えば、作物から望ましくない遺伝子（アレルゲン遺伝子等）を破壊する事や特定の遺伝子の発現を向上させ作物の生産性の向上や特定の成分を増加させる事が可能になる。本発明のジーンターゲティング法は、例えば、ＵＶＤＥを発現させた植物細胞に対してジーンターゲティングベクターを導入することで実施できる。また、ＵＶＤＥが発現している植物細胞にＵＶ−Ｂ照射を行った後に、ジーンターゲティングベクターを導入することによって、ＵＶ−Ｂ非照射時と比べてさらに効率的なターゲティングを行う事も期待できる。ジーンターゲティングベクターはターゲティングを行う所望の遺伝子の配列を有し、かつジーンターゲティングを起こした細胞、個体のみを選抜するドミナントネガティブマーカーを保持しているものが望ましい。また、本発明のターゲティングベクターの骨格となるベクターは、当業者に周知のベクターを使用することができる。
【００２９】
また、本発明は、本発明のジーンターゲティング法により任意の遺伝子が改変された形質転換植物細胞、該形質転換細胞を含む形質転換植物体を提供する。該植物体としては、特定の遺伝子の機能が破壊されたノックアウト植物体や特定の遺伝子にアミノ酸置換を誘起する変異が導入された植物体が挙げられる。また、このような植物体としては、例えば、作物から望ましくない遺伝子（アレルゲン遺伝子等）が除去された植物体、作物の生産性が向上した植物体、および特定の成分が増加した植物体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明における任意の遺伝子が改変された形質転換植物細胞は、例えばＵＶＤＥをコードするＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入した後、ジーンターゲティングベクターを導入し任意の遺伝子が改変された細胞を回収することで製造できる。また、当業者は、ＵＶＤＥをコードするＤＮＡが挿入されたベクターが導入された植物細胞に、ＵＶ−Ｂ照射を行った後に、ジーンターゲティングベクターを導入し、任意の遺伝子が改変された細胞を回収することもできる。
【００３１】
ＵＶＤＥ遺伝子の発現はジーンターゲティングが実際に生じる組織細胞において行われなければならない。従って形質転換に用いる植物組織において特異的に発現するプロモーターか、あるいは恒常的に発現するプロモーターの下流にＵＶＤＥ遺伝子を接続しベクターに導入しなければならない。この際アグロバクテリウム法による形質転換の場合はｐＢＩ１２１系やｐＰＺＰ系等のバイナリーベクターを用い、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等で植物細胞へ導入する場合は通常の遺伝子操作研究に用いるｐＵＣ系等のベクターを用いる。また、プロモーターとＵＶＤＥの接続やベクターへの導入等は通常の制限酵素やＤＮＡライゲース等を用いる。
【００３２】
以下、本発明の形質転換植物細胞の製造方法を例示するが、該形質転換植物細胞の製造方法は、これに限定されるものではない。
【００３３】
ジーンターゲティングにはまず前述のようにターゲティングを行う遺伝子を保持し、且つジーンターゲティングを生じた細胞、植物体のみを効率的に選抜するマーカー遺伝子を有するジーンターゲティングベクターを構築し、これをアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ法等で植物細胞へ導入する。導入後は遺伝子の導入された細胞をポジティブ選抜マーカー遺伝子の発現等を利用して選抜すると共に、ジーンターゲティング以外の方法で遺伝子導入された細胞をネガティブ選抜マーカー遺伝子の発現を利用して排除する。ポジティブ選抜マーカーとしてはハイグロマイシン抵抗性遺伝子等の抗生物質抵抗性遺伝子を用いる事ができ、ネガティブ選抜マーカーとしてはジフテリア毒遺伝子、シトシンデアミネース遺伝子等を好適に用いる事ができる。また、ジーンターゲティングがおきた最終的な確認は植物体においてサザン法やＰＣＲ法によって行う。
【００３４】
本発明における任意の遺伝子が改変された形質転換植物体は、例えば、本発明の形質転換植物細胞から植物体を再生させることで作製できる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １００：  １５０３，  １９９２）。
【００３５】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作製する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ  ＳＫ：  Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ  （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ  Ｅｄｓ）  ｐｐ．６６−７４，  １９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １００：  １５０３，  １９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：  ９５７，  １９９１）、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（例えば、単子葉植物の超迅速形質転換法（特許第３１４１０８４号））など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００３６】
一旦、任意の遺伝子が改変された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、任意の遺伝子が改変された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）ｐＰＫＭ  ＮｃＵＶＤＥの構築
アカパンカビ（Ｎ．  ｃｒａｓｓａ）由来のＵＶ  ｄａｍａｇｅ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ遺伝子（ＮｃＵＶＤＥ）（Ｙａｊｉｍａ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ，  １９９５  Ｍａｙ  １５，  １４（１０），  ２３９３−２３９９．）の過剰発現ベクターを作製するために、ｐＣＹ４Ｂ−ＵＶＤＥ  （Ｏｋａｎｏ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０００，  ２７５，  ３２６３５−３２６４１．）  を鋳型としてプライマーＮｃＵＶＤＥ／Ｎｈｅ  （５’−ＣＴＣＡｇＣＴＡｇＣｇＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴｇＣＣＴＴＣＣＣｇＴＡ−３’（配列番号：１）、下線部分はクローニングのためにデザインしたＮｈｅ  Ｉサイトを示した）及びＮｃＵＶＤＥ／ＳｎａＢ  Ｉ（５’−ＴＣＣＴＡＣｇＴＡＡＴＣＡＣＣＣｇＴＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：２）、下線部分はクローニングのためにデザインしたＳｎａＢ  Ｉサイトを示した）を用いてＰＣＲを行い、２ｋｂの完全なＮｃＵＶＤＥのコード領域を含む遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  （ＴＯＹＯＢＯ）を用い、次の条件で行った。
（５０  ｐｇ  ｏｆ  ｐＣＹ４Ｂ−ＵＶＤＥＰ  ＤＮＡ，  １５  ｐｍｏｌ  ｏｆ  ＮｃＵＶＤＥ／Ｎｈｅ，  １５  ｐｍｏｌ  ｏｆ  ＮｃＵＶＤＥ／ＳｎａＢ  Ｉ，  ５  ｍｉｃｒｏＬ  ｏｆ  １０Ｘ  Ｂｕｆｆｅｒ，  ５  ｍｉｃｒｏＬ  ｏｆ  ４  ｄＮＴＰｓ，  ２  ｍｉｃｒｏＬ  ｏｆ  ２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  ５  ｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｉｎ  ５０  ｍｉｃｒｏＬ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ．  ９５℃，  ２ｍｉｎ；  ３０  ｃｙｃｌｅｓ  ｏｆ  （９５℃，  １５ｓｅｃ；  ６０℃，  １５ｓｅｃ；  ７２℃，  ２ｍｉｎ）；  ７２℃，  ７ｍｉｎ）。増幅したＰＣＲ  断片はＮｈｅ  Ｉ及びＳｎａＢ  Ｉ処理し、Ｎｈｅ  Ｉ及びＳｎａＢ  Ｉ処理したｐＭＣＳ５ベクターにクローン化した（ｐＭＣＳ  ＮｃＵＶＤＥ）。塩基配列の確認を行った後、ｐＭＣＳ  ＮｃＵＶＤＥからＮｈｅ  Ｉ及びＨｐａ  Ｉ処理により切り出した２ｋｂ  ＮｃＵＶＤＥ遺伝子断片をＸｂａ  Ｉ及びＳｍａ  Ｉ処理したｐＰＫＭベクター（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，  １９９４  Ｓｅｐ，  ２５（６），  ９８９−９９４．）にクローン化し、ＮｃＵＶＤＥ過剰発現のためのバイナリーベクターとした（ｐＰＫＭ  ＮｃＵＶＤＥ、図１）。
【００３８】
（２）アラビドプシスの形質転換
得られたｐＰＫＭ  ＮｃＵＶＤＥをエレクトロポレーション法によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５  へ導入した。ｐＰＫＭ  ＮｃＵＶＤＥを保持するＡ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５を用いて、Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法  （Ｃｌｏｕｇｈ，  Ｓ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，  Ａ．Ｆ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ，  １９９８，  １６，  ７３５−７４３．）  により、ＧＵＳ  組換え基質１４０６系統及び１４１５系統（Ｇｈｅｒｂｉ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  ｒｅｐ．，  ２００１，  ２，  ２８７−２９１．）が既に導入されているＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  を形質転換した。１４０６系統はＧＵ−ＵＳの形でＧＵＳが分断され、１４１５系統はＵ’Ｇ’−ＵＳの形でＧＵＳが分断されている（図２）。得られた形質転換種子は２５ｍｇ／Ｌの濃度のカナマイシンを含む０．８％  寒天を固化剤としたＭＳ培地  （Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，  Ｆ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ，  １９６２，  １５，  ４７３−４９７．）  上に播種し、カナマイシンを含む培地上で生育してきた植物体を、ＮｃＵＶＤＥ過剰発現植物体の候補として実験に用いた。生育条件は２２℃、２４時間明所とした。
【００３９】
（３）ＧＵＳ  アッセイ
（２）で得られたカナマイシン耐性植物体の自殖種子（Ｔ２種子）をカナマイシンを含むＭＳ寒天培地上に播種し、次世代植物体（Ｔ２植物体）を選抜した。発芽後１週間程度で本葉が展開してきた植物体を耐性個体としカナマイシンを含まないＭＳ培地上に移植しさらに２週間生育させた。この植物体約２０個体を用いてＧＵＳ  アッセイを行い、組換えの起こった細胞数を青色のスポットとして数えた。ＧＵＳアッセイはＳｗｏｂｏｄａらの方法  （Ｓｗｏｂｏｄａ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １９９４，  １３，  ４８４−４８９．）に従い行った。約２０個体の植物体を５０  ｍＬのＧＵＳ染色液（１００  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  （ｐＨ  ７．０），  ０．７  ｍＭ  Ｘ−Ｇｌｕｃ，  ａｎｄ  ２０％  ｍｅｔｈａｎｏｌ）  に浸積し、３７℃で４８時間反応させた。反応終了後ＧＵＳ染色液を捨て去り、メタノールを用いてクロロフィルを取り除き、植物体上の青色スポットを実体顕微鏡を用いて数えた。コントロールとして形質転換に用いた１４０６及び１４１５植物体についても同様の実験を行った。
【００４０】
［実施例１］
組換え修復活性を評価するために、組換え基質が導入されたアラビドプシスにおいてＮｃＵＶＤＥ遺伝子を発現させた。ここで、組換え基質とは、レポーター遺伝子ＧＵＳ遺伝子を一部重複させて分断したものであり、一部重複した部分を利用して相同組換えが起これば機能的なＧＵＳ遺伝子が作られ、組換えが生じた細胞はＧＵＳ基質を与える事により青く染まる（図２）。
【００４１】
ＮｃＵＶＤＥ過剰発現バイナリーベクターｐＰＫＭ  ＮｃＵＶＤＥを作製し、ＧＵＳ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｌｉｎｅｓ  １４０６，  １４１５を形質転換した結果、７系統の１４０６−ＮｃＵＶＤＥ過剰発現植物体の候補（１４０６／ＵＶＤＥ−２，  ３，  ４，  ５，  ６，  ８，  １０）と１８系統の１４１５−ＮｃＵＶＤＥ過剰発現植物体の候補（１４１５／ＵＶＤＥ−１〜１０，  １２〜１９）を得た。これらのＴ２世代の植物体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析を行い、ＮｃＵＶＤＥの発現を確認した。これらの植物体の内１４０６／ＵＶＤＥ−２，  ３，  ４，  ５，１０を用いてＧＵＳアッセイを行い、相同組換えの頻度を青色のスポットとして数えたところ、顕著な相同組換え頻度の上昇が認められた（表１）。
【００４２】
【表１】
2004275012.tif 000002
【００４３】
特に１４０６／ＵＶＤＥ−１０ではコントロールと比べ４５倍の組換え頻度の上昇が認められた。このことからＮｃＵＶＤＥはアラビドプシスゲノムＤＮＡ上に存在するＵＶ光産物（ＣＰＤ及び６−４  光産物）またはＡＰサイトを認識し１本鎖ＤＮＡ切断を形成し、さらにＤＮＡ複製過程において２本鎖ＤＮＡ切断が生じ、結果的に相同組換えによる２本鎖ＤＮＡ切断修復機能を上昇させたと考えられる。また、上記の植物体にＵＶ−Ｂ照射を行いより多くの光産物を生じさせることによって、定常状態よりも多くの１本鎖ＤＮＡ切断を誘発することが可能であると考えられ、ＵＶ−Ｂ非照射時と比べ相同組換え頻度をさらに上昇できると考えられる。
【００４４】
従って高等植物においてＮｃＵＶＤＥを発現させる事により、組換え修復に対する依存度を著しく高める事が可能であると判明した。この知見は高等植物においてジーンターゲティングを行う際直ちに適用可能であると考えられる（図３）。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、植物細胞において、標的とする改変対象遺伝子のみを高効率で置換できるようになった。この手法を活用することにより、アレルゲン遺伝子の特異的不活性化、耐病性や除草剤耐性の付与、高必須アミノ酸含量を高めた蛋白質の生産等が、種々の作物において可能になると考えられる。また本発明は、遺伝子組換え作物において標的とする既知の植物遺伝子以外は改変しないため、消費者により受け入れられやすく、かつ安全性の高い組換え作物を供給可能となり、植物バイオテクノロジーの発展に寄与できると期待される。
【００４６】
【配列表】
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2004275012.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＰＫＭ  ＮｃＵＶＤＥの構築を示す図である。
【図２】ＧＵＳ遺伝子組換え基質を示す図である。
【図３】ＵＶＤＥ酵素の作用機作と、同酵素の植物細胞における過剰発現の効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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