(57)【要約】【課題】ＥＬＩＳＡ法での免疫分析において、一次抗体を短時間で確実に固定化でき、かつブロッキング操作を省略することのできる免疫分析容器を提供すること。【解決手段】免疫分析容器において、反応に用いる部位の表面に抗体結合分子及びタンパク質の非特異的吸着を阻害のための蛋白質由来のブロッキング剤を予め塗布した免疫分析容器であり、好ましくは抗体結合分子が、プロテインＡ、プロテインＧ、抗Ｆｃ抗体、及び抗Ｆｃ抗体Ｆａｂフラグメントから選ばれる少なくとも１つであり、ブロッキング剤がアルブミン、乳蛋白質、ゼラチン、コラーゲンから選ばれる少なくとも１つである記載の免疫分析容器。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫分析容器において、反応に用いる部位の表面に抗体結合分子及びタンパク質の非特異的吸着を阻害のための蛋白質由来のブロッキング剤を予め塗布したことを特徴とする免疫分析容器。
【請求項２】
抗体結合分子が、プロテインＡ、プロテインＧ、抗Ｆｃ抗体、及び抗Ｆｃ抗体Ｆａｂフラグメントから選ばれる少なくとも１つである請求項１記載の免疫分析容器。
【請求項３】
ブロッキング剤がアルブミン、乳蛋白質、ゼラチン、コラーゲンから選ばれる少なくとも１つである請求項１又は２記載の免疫分析容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査やバイオテクノロジー分野で使用する抗原抗体反応を利用した分析に用いる容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫分析法の用いる容器には、プレート、チューブ、ビーズなどの種類がありそれぞれに特徴を持っている。それらの測定容器の中で一度に多量の検体を処理できる点からプレート形状の容器がしばしば使用されている。特に９６や３８４ウェルプレートはそれにあわせた寸法の器具や測定装置等数多くの器具装置が既に市販されており汎用性が高くなっている。
【０００３】
免疫分析法の代表的なものとしてＥＬＩＳＡ法がある。一般的なＥＬＩＳＡ法では抗体―抗原反応を用いたサンドイッチ法が実施される。サンドイッチ法は特定の抗原と特異的に結合するように作製された抗体と、同じ抗体を検出のためのペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素で標識した抗体が用いられる。
その一般的な手順としては、まず抗体を溶液状態でプレートなどのプラスチック基材に分注し、物理化学的な吸着反応により抗体をプラスチック基材表面に固相化させる。過剰な抗体を洗浄の後、次に不必要な物理化学吸着による抗原や標識抗体などの物理化学的な吸着を抑えるため、ブロッキングと呼ばれる操作を行う。実際には、スキムミルク、牛血清アルブミンやゼラチンといった蛋白質の中から、用いた抗原、抗体の反応に影響を及ぼさない蛋白質溶液で抗体が結合している部分以外を覆うように吸着させる。このように準備されたプレートに対して抗原を含む溶液（一般的にはこれが検体と呼ばれる）を加え抗原抗体反応を起こさせる。次に酵素標識した抗体溶液を分注しプラスチック基材−抗体―抗原―標識抗体の複合体を形成せしめ、酵素活性を測定することで検体である抗原の量を測定する。この一連の操作は各ステップごとに洗浄操作が必要であり、開始から終了まで、早くて丸一日、かかれば二日間の作業となり時間と手間がかかる。
【０００４】
上記の反応において、抗原抗体反応は生化学的に安定な反応であり、抗原と抗体の組み合わせが間違いなければ必ず抗原抗体反応は生ずる。また、標識に用いた酵素の活性は酵素の保存方法を間違えず、市販品であれば有効期限内に使用すれば、活性測定は可能である。これらに対し、測定の最初のステップであるプラスチック基材と抗体との反応は物理化学吸着という確実性に乏しい現象を用いて行っており、その反応の条件により吸着量は左右される。実際、用いるプラスチック基材の表面性状や反応時の温度，時間により同じ抗体を結合させてもその吸着量は異なることが知られている。したがって一次固相化反応は時間をかける方が好ましいが、抗体は蛋白質であるのでその変性を防ぐために長時間行う場合は４℃条件下で、すなわち冷蔵庫に入れて反応させることが望ましい。
【０００５】
こうした固定化は可能であるが、反応としては不確かである物理化学吸着を用いることなく使用するためにプラスチック基材表面に官能基を導入しそれを用いて抗体分子を固定化する方法もある。例えば特許文献１はカルボキシル基を導入する方法であり、この基材を用いれば共有結合により一次固相化が確実に行うことができるが、一連の操作に要する時間はほとんど変化がない。また、特許文献２ではプロテインＡ分子膜を作製し、抗体固相化する方法が記載さているが、ＬＢ膜作製方法が取り入れられており量産化が難しく汎用性に乏しい。
【０００６】
次にＥＬＩＳＡ法においてブロッキング剤として用いられるものは、スキムミルク、ウシ血清アルブミン、ゼラチンなどが一般的である。ブロッキング剤の必要とされる効果は、抗原抗体反応以外の非特異な吸着反応を抑えることである。これを満足するには何も蛋白質にこだわる必要はなく、実際に化学合成物質からなるブロッキング剤も市販されている。
通常、ブロッキング操作も一次抗体固相化と同様、物理化学適な吸着反応であるので時間をかけて反応させることが必要である。
【０００７】
従って一次固相化およびブロッキング操作にかかる時間を短縮できれば非常に有用な手段となる。このアイデアを具現化するために特許文献３において、表面上に官能基、親水基の高分子がグラフトされている免疫分析容器が記載されている。非常に有効な技術であるが、サンドイッチ法に限定すれば、抗体を基材上の官能基に結合させるという方法は、場合によっては抗体の抗原認識部位を結合に使用してしまい抗体の抗原結合能を１００％活用できない可能性がある。
【０００８】
【特許文献１】特開昭６２−１２３３５９号公報
【特許文献２】特開平５−２７３２１２号号公報
【特許文献３】特開２００１−２７２４０６号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、創薬やバイオテクノロジー分野などに用いられるＥＬＩＳＡ用プラスチック基材の表面性状に関するもので、一次抗体を短時間で確実に固定化でき、かつ、ブロッキング操作が必要無い免疫分析容器を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）免疫分析容器において、反応に用いる部位の表面に抗体結合分子及びタンパク質の非特異的吸着を阻害のための蛋白質由来のブロッキング剤を予め塗布したことを特徴とする免疫分析容器、
（２）抗体結合分子が、プロテインＡ、プロテインＧ、抗Ｆｃ抗体、及び抗Ｆｃ抗体Ｆａｂフラグメントから選ばれる少なくとも１つである（１）記載の免疫分析容器、
（３）ブロッキング剤がアルブミン、乳蛋白質、ゼラチン、コラーゲンから選ばれる少なくとも１つである（１）又は（２）記載の免疫分析容器、
である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＥＬＩＳＡ法において唯一不確かな反応である一次抗体の固相化を確実に実施し、かつ、一次抗体の固相化後のブロッキング操作が不必要な系にすることについて考案されたものである。
本発明では、一次抗体と確実に結合する分子群を予めプラスチック基材表面に固定化し、さらにブロッキング処理をすることによって、一次抗体の固相化を確実なものとするとともに、一次抗体の固相化後のブロッキング操作を不要にすることを可能にした。
【００１２】
本発明に使用する一次抗体と特異的に結合する分子としては、プロテインＡ、プロテインＧ等が挙げられる。どちらも微生物由来の抗体結合蛋白質であり、抗体のアフィニティー精製に使用されている等、抗体との特異的な結合は広く知られている。その他には、抗体を抗原として作製された抗体、特に抗体のＦｃ領域と特異的に結合するように作製された抗体や該抗体のＦａｂ部分などは抗体と特異的に結合し、かつ、抗体の抗原認識部位（エピトープ）をフリーの状態で残すことから抗体の固定化として好ましい。
以上述べた、一次抗体と特異的に結合する分子群を固相化することにより、必要とされる一次抗体を選択的に固定化することが可能である。かつプロテインＡ、プロテインＧ、もしくは抗体を選択的に認識する抗体と一次抗体との反応は、抗原抗体反応に匹敵する生化学的に安定な反応であるため効率良く目的の抗体を固相化することが可能となる。
【００１３】
ブロッキング処理に関しては従来技術のところでも述べたように、蛋白質分子を用いることは簡便で実績もあるが、基本的に蛋白分子を用いたブロッキング剤は長期の保存に欠ける、という点で用事調整するのが一般的である。しかしながら凍結保存すれば蛋白質はその性質を長期に渡り保存することが可能である。特に凍結乾燥後、冷凍保存すればその機能を十分に保持することが可能である。
【００１４】
本発明の免疫分析容器の製造方法としては、（１）抗体結合分子を物理化学吸着により、吸着させた後ブロッキング剤を塗布する。（２）表面に官能基を構築させてから抗体結合分子を共有結合させた後、ブロッキング剤を塗布する。（３）ブロッキング剤を塗布してから化学反応で抗体結合分子を固定化する、等の方法が考えられる。
【００１５】
本発明の免疫分析容器においては、抗体結合分子とブロッキング剤が表面に共存していれば、どのような方法を用いてもかまわない。また、容器へ導入する抗体結合分子の濃度は低すぎるとシグナル／ノイズ比が低くなるため、抗体結合分子の導入量に関しては１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上であることが好ましい。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】
（実施例１）
９６ウェルプレート成形品（住友ベークライト製）に５００μｇ／ｍＬ濃度のプロテインＡ／リン酸緩衝液を１００μＬ分注し、４℃で一晩反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、０．５％ウシ血清アルブミン／リン酸緩衝液を３００μＬ分注しさらに一晩反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後ＥＬＩＳＡ法にて性能を評価した。
一次抗体として抗ヒトアルブミン抗体（ＤＡＣＯ社製、Ａ０００１）のリン酸緩衝液溶液を（０．２μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウェルで分注し、１時間静置してプロテインＡと反応させた。反応後、ウェル内の溶液を捨て０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたリン酸緩衝液からなる洗浄液で３回洗浄した。次にＨｅｐＧ２細胞の培養上清（細胞の分泌したヒトアルブミンを含む）を１００μＬ／ウェル加え室温で１時間静置し、抗原抗体反応をさせた。反応後、先に記載したのと同じ洗浄液で３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗ヒトアルブミン抗体（ＤＡＣＯ社製、Ｐ０３５６）リン酸緩衝液溶液を（０．２μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置して抗原抗体反応させた。反応後、洗浄液で３回洗浄した。一次抗体−抗原−標識二次抗体で固定化されたペルオキシダーゼを発色反応に用いて吸光度を測定した。発色反応にはＴＭＢＺ反応キット（住友ベークライト製、スミロンＭＬ−１１２０Ｔ）を用いた。
【００１７】
（実施例２）
９６ウェルプレート成形品（住友ベークライト製）に５００μｇ／ｍＬ濃度のプロテインＡ／リン酸緩衝液を１００μＬ分注し、４℃で一晩反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、スキムミルク／リン酸緩衝液を３００μＬ分注しさらに４時間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後ＥＬＩＳＡ法にて性能を評価した。
一次抗体として抗ヒトアルブミン抗体（ＤＡＣＯ社製、Ａ０００１）のリン酸緩衝液溶液を（０．２μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウェルで分注し、１時間静置してプロテインＡと反応させた。反応後、ウェル内の溶液を捨て０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたリン酸緩衝液からなる洗浄液で３回洗浄した。次にＨｅｐＧ２細胞の培養上清（細胞の分泌したヒトアルブミンを含む）を１００μＬ／ウェル加え室温で１時間静置し、抗原抗体反応をさせた。反応後、先に記載したのと同じ洗浄液で３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗ヒトアルブミン抗体（ＤＡＣＯ社製、Ｐ０３５６）リン酸緩衝液溶液を（０．２μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置して抗原抗体反応させた。反応後、洗浄液で３回洗浄した。一次抗体−抗原−標識二次抗体で固定化されたペルオキシダーゼを発色反応に用いて吸光度を測定した。発色反応にはＴＭＢＺ反応キット（住友ベークライト製、スミロンＭＬ−１１２０Ｔ）を用いた。
【００１８】
（比較例１）
ＥＬＩＳＡ測定用９６ウェルプレート（住友ベークライト製、ＭＳ−８８９６Ｆ）に一次抗体として抗ヒトアルブミン抗体（ＤＡＣＯ社製、Ａ０００１）のリン酸緩衝液溶液を（０．２μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウェルで分注し、１時間静置して固相化した。反応後、ウェル内の溶液を捨て０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたリン酸緩衝液からなる洗浄液で３回洗浄した。次に５％スキムミルク溶液を３００μＬ／ウェル加え４℃（冷蔵庫）で一晩ブロッキング処理し、ブロッキング後、洗浄液で３回洗浄した。ＨｅｐＧ２細胞の培養上清（細胞の分泌したヒトアルブミンを含む）を１００μＬ／ウェル加え１時間、室温で抗原抗体反応をさせた。反応後、３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗ヒトアルブミン抗体（ＤＡＣＯ社製、Ｐ０３５６）リン酸緩衝液溶液を（０．２μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置して抗原抗体反応させた。反応後、洗浄液で３回洗浄した。一次抗体−抗原−標識二次抗体で固定化されたペルオキシダーゼを発色反応に用いて吸光度を測定した。発色反応にはＴＭＢＺ反応キット（住友ベークライト製、スミロンＭＬ−１１２０Ｔ）を用いた。
（結果）
結果を下表に示す。
【００１９】
【表１】
2004361295.tif 000002
【００２０】
結果より、実施例において測定にかかる時間が著しく短縮されるだけでなく、コントロール値の改善が見られシグナル／ノイズ比が向上していることが判る。これは比較例では抗原抗体反応だけでなく抗原や標識二次抗体の物理化学吸着が発生していることを示し、本発明においては、そのような物理化学吸着を確実にコントロールできていることを示している。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、ＥＬＩＳＡ法での免疫分析において、ブロッキング操作が必要ないため測定時間が著しく短縮され、かつ物理化学吸着を確実にコントロールしてシグナル／ノイズ比を向上する免疫分析容器が得られる。