(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ＴＧＦ−β受容体複合体との間で相互に作用し、ＴＧＦ−βのシグナル伝達において負の調節を行うような核酸とそれがコードするポリペプチド等を提供する。【解決手段】４６４；４６５；４６７；４６４及び４６５；４６４及び４６７；並びに４６５及び４６７からなる群から選択された場所に位置する非セリンアミノ酸を含有する変異であって、該変異は、Ｓｅｒ４６４Ａ；Ｓｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６４Ａ及びＳｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６４Ａ及びＳｅｒ４６７Ａ；並びにＳｅｒ４６５Ａ及びＳｅｒ４６７Ａからなる群から選択された変異であることができる前記変異を含有すること以外は、Ｓｍａｄ２のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのヒトホモログを含む単離されたポリペプチドなどに関する。【選択図】　図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４６４；４６５；４６７；４６４及び４６５；４６４及び４６７；並びに４６５及び４６７からなる群から選択された場所に位置する非セリンアミノ酸を含有する変異であって、該変異は、Ｓｅｒ４６４Ａ；Ｓｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６４Ａ及びＳｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６４Ａ及びＳｅｒ４６７Ａ；並びにＳｅｒ４６５Ａ及びＳｅｒ４６７Ａからなる群から選択された変異であることができる前記変異を含有すること以外は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのヒトホモログを含む単離されたＳｍａｄ２ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項３】
作動的にプロモーターに連結されている請求項２に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項３の発現ベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトされたホストセル。
【請求項５】
配列番号：３のアミノ酸配列を含む、単離されたＳｍａｄ４結合ポリペプチドであって、該ポリペプチドはＳｍａｄ２でないが、配列番号：２の最もＣ−末端の４つのアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の５つのアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の６つのアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の７つのアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の８つのアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の９つのアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の１０個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の１１個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の１２個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の１３個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の１４個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の１５個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の１６個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の１７個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の１８個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ−末端の１９個のアミノ酸及び配列番号：２の最もＣ−末端の２０個のアミノ酸からなる群から選択される１種のポリペプチドを含んでもよく、また、配列番号：４のアミノ酸配列を含んでもよい前記ポリペプチド。
【請求項６】
単離されたポリペプチドが、Ｓｅｒ４６４、Ｓｅｒ４６５、Ｓｅｒ４６７、Ｓｅｒ４６４／Ｓｅｒ４６５、Ｓｅｒ４６４／Ｓｅｒ４６７並びにＳｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７からなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸においてリン酸化されている、請求項５に記載の単離されたＣ結合ポリペプチド。
【請求項７】
単離されたポリペプチドがＴβＲ−Ｉ、ＴβＲ−ＩＩ、アクチビンタイプＩレセプター、アクチビンタイプＩＩレセプター又はＳｍａｄ４ではないことを条件とし、かつ、Ｓｍａｄ２のアミノ酸２２７−２４４に結合する抗体を除き、請求項１、５又は６のいずれかに記載のポリペプチドを選択的に結合し、抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよく、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント及びＳｍａｄ２ポリペプチドについて選択的なＣＤＲ３領域を含むフラグメントからなる群から選択される１種の抗体フラグメントであってもよい、単離されたポリペプチド。
【請求項８】
ほ乳類細胞におけるＴＧＦ−βシグナルトランスダクションを減少させるために効果的な量の内因性Ｓｍａｄ２のリン酸化阻害剤と、ほ乳類細胞を接触させる工程を含み、該リン酸化阻害剤が請求項１に記載のポリペプチドである、ほ乳類細胞におけるＴＧＦ−βシグナルトランスダクションを阻害するための方法。
【請求項９】
対象のＴＧＦ−βシグナルトランスダクション活性を減少させるために効果的な量で、ＴＧＦ−βレセプターに選択的に結合する薬剤を、そのような治療が必要な対象に投与する工程を含み、該薬剤が請求項１に記載の単離されたポリペプチドである、対象のＴＧＦ−βシグナルトランスダクション活性を減少させるための方法。
【請求項１０】
Ｓｍａｄ２／ＴＧＦ−βレセプター相互作用と関連する疾病の診断又は治療における有用な薬理学的薬剤のためのリード化合物を同定するための方法であって、
請求項１に記載のＳｍａｄ２ポリペプチド、ＴＧＦ−βレセプター、及び候補薬理学的薬剤（ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｇｅｎｔ）を含む混合物を形成すること、
候補薬理学的薬剤の不在下で、Ｓｍａｄ２ポリペプチドによるＴＧＦ−βレセプターの基準量の特異的結合を起こす条件で混合物をインキュベートする工程、及び
試験におけるＳｍａｄ２ポリペプチドによるＴＧＦ−βレセプターの特異的結合量を検出する工程であって、試験におけるＳｍａｄ２ポリペプチドの特異的結合量がＳｍａｄ２ポリペプチドの特異的結合の基準量に対して減少すると、候補薬理学的薬剤がＳｍａｄ２／ＴＧＦ−β相互作用を阻害する薬理学的薬剤のためのリード化合物（ｌｅａｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）であることを示し、また、試験におけるＳｍａｄ２ポリペプチドの特異的結合量がＳｍａｄ２ポリペプチドの特異的結合の基準量に対して増加すると、候補薬理学的薬剤が、Ｓｍａｄ２／ＴＧＦ−β相互作用を増強する薬理学的薬剤のためのリード化合物であることを示す、該工程、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
ＴＧＦ−β仲介Ｓｍａｄ２シグナルトランスダクションと関連する疾病の診断又は治療において有用な薬理学的薬剤のためのリード化合物を同定するための方法であって、
請求項１に記載の野生型Ｓｍａｄ２ポリペプチド、ＴＧＦ−βレセプター、及び変異型Ｓｍａｄ２ポリペプチドを含む候補薬理学的薬剤を含有する混合物を形成する工程であって、該変異型Ｓｍａｄ２ポリペプチドはＳｅｒ４６４Ａ；Ｓｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６４Ａ及びＳｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６４Ａ及びＳｅｒ４６７Ａ；並びにＳｅｒ４６５Ａ及びＳｅｒ４６７Ａからなる群から選択される１又は２以上の変異を有する単離された請求項１に記載の単離されたポリペプチド又はそのＴＧＦ−βレセプター結合フラグメントであってもよい上記工程、
候補薬理学的薬剤の不在下で、野生型Ｓｍａｄ２ポリペプチドのＴＧＦ−β仲介リン酸化の基準量が起こる条件下で混合物をインキュベートする工程、及び
野生型Ｓｍａｄ２ポリペプチドのＴＧＦ−β仲介リン酸化の試験における量を検出する工程であって、
野生型Ｓｍａｄ２ポリペプチドのリン酸化の基準量に対する野生型Ｓｍａｄ２ポリペプチドのリン酸化の試験における量の減少が、候補薬理学的薬剤はＴＧＦ−β仲介Ｓｍａｄ２シグナルトランスダクション活性を阻害する薬理学的薬剤のためのリード化合物であることを示す該工程、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
配列番号：５のＣ−末端アミノ酸配列を有する少なくとも１つの経路制限Ｓｍａｄポリペプチド又はそのフラグメントに選択的に結合する単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドはＴβＲ−Ｉ、ＴβＲ−ＩＩ、アクチビンタイプＩレセプター、アクチビンタイプＩＩレセプター又はＳｍａｄ４ではないことを条件とし、かつ、Ｓｍａｄ２のアミノ酸２２７−２４４に結合する抗体を除いて、経路制限Ｓｍａｄポリペプチド又はそのフラグメントが配列番号：５の第二セリン残基、第三セリン残基並びに第二セリン残基及び第三セリン残基からなる群から選択されてもよい少なくとも１つのセリン残基においてリン酸化されており、該経路制限Ｓｍａｄポリペプチドは、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５及びＳｍａｄ９からなる群から選択されてもよく、該単離されたポリペプチドはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント及び経路制限Ｓｍａｄポリペプチドに選択的なＣＤＲ３領域を含むフラグメントからなる群から選択される１種の抗体フラグメント；モノクローナル抗体又は経路制限Ｓｍａｄポリペプチドの１つに選択的に結合する抗体であってもよい、前記単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、及びＳｍａｄ９からなる群から選択されてもよい、経路制限ＳｍａｄポリペプチドのＣ−末端セリン残基のリン酸化を調節する薬理学的薬剤のためのリード化合物を同定するための方法であって、
配列番号：５の第二セリン残基、配列番号：５の第三セリン残基並びに配列番号：５の第二及び第三セリン残基からなる群から選択されてもよい、少なくとも１つのＣ−末端セリン残基を有する経路制限Ｓｍａｄポリペプチド、少なくとも１つのＣ−末端セリン残基をリン酸化することができるＴＧＦ−βスーパーファミリーレセプター又はレセプター複合体、及び候補薬理学的薬剤を含む混合物を形成する工程であって、該工程は経路制限Ｓｍａｄポリペプチド及びＴＧＦ−βレセプター又はレセプター複合体を含む細胞を候補薬理学的薬剤と接触させる工程を含んでもよく、さらにＴＧＦ−βスーパーファミリーレセプター又はレセプター複合体を活性化するリガンドを添加する工程を含んでもよく、該候補薬理学的薬剤がＴＧＦβではない上記工程、
候補薬理学的薬剤の不在下で、ＴＧＢ−βスーパーファミリーレセプター又はレセプター複合体による少なくとも１つのＣ−末端セリン残基のリン酸化の基準量が起こる条件下で混合物をインキュベートする工程、及び
ＴＧＦ−βスーパーファミリーレセプター又はレセプター複合体による少なくとも１つのＣ−末端セリン残基の試験におけるリン酸化量を検出する工程であって、試験におけるリン酸化量がリン酸化の基準量に対して減少すると、候補薬理学的薬剤が経路制限Ｓｍａｄポリペプチドの少なくとも１つのＣ−末端セリン残基のリン酸化を減少させる薬理学的薬剤のためのリード化合物であることを示し、また、試験におけるリン酸化の量がリン酸化の基準量に対して増加すると、候補薬理学的薬剤が経路制限ＳｍａｄポリペプチドのＣ−末端セリン残基のリン酸化を増加させる薬理学的薬剤のためのリード化合物であることを示す、該工程、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
細胞内での異型Ｓｍａｄタンパク複合体形成を減少するための方法であって、リン酸化された経路制限Ｓｍａｄポリペプチドに選択的に結合する抗体又はその抗体をコードする核酸を供給する工程であって、該経路制限Ｓｍａｄポリペプチドは、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、及びＳｍａｄ９からなる群から選択されてもよく、また該抗体は、配列番号：５の第二セリン残基、配列番号：５の第三セリン残基並びに配列番号：５の第二及び第三セリン残基からなる群から選択される少なくとも１つのリン酸化されたＣ−末端セリン残基を有する経路制限Ｓｍａｄポリペプチドに選択的に結合するものであってもよい上記工程、及び
細胞内での異型Ｓｍａｄタンパク複合体の形成を十分に減少させる量の抗体又はその抗体をコードする核酸と細胞を接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
配列番号：２の最もＣ末端の４個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の５個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の６個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の７個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の８個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の９個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の１０個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の１１個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の１２個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の１３個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の１４個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の１５個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の１６個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の１７個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の１８個のアミノ酸、配列番号：２の最もＣ末端の１９個のアミノ酸、並びに配列番号：２の最もＣ末端の２０個のアミノ酸及び配列番号：５からなる群より選択した１種のポリペプチドエピトープと選択的に結合する抗体であって、
ポリペプチドエピトープが、配列番号：２のＳｅｒ４６４、Ｓｅｒ４６５、Ｓｅｒ４６７、Ｓｅｒ４６４／４６５、Ｓｅｒ４６４／４６７及びＳｅｒ４６５／４６７並びに配列番号：５のＳｅｒ１、Ｓｅｒ２、Ｓｅｒ４、Ｓｅｒ１／２、Ｓｅｒ１／４及びＳｅｒ２／４からなる群より選択した１又は２以上のアミノ酸において任意にリン酸化され、かつ、ポリペプチドエピトープが、配列番号：２の４６４；４６５；４６７；４６４と４６５、４６４と４６７及び４６５と４６７並びに配列番号：５の１；２；４；１と２；１と４及び２と４からなる群より選択した場所に位置する１の非セリンアミノ酸を含む変異を任意に含む、前記抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＴＧＦ−β受容体複合体との間で相互に作用し、ＴＧＦ−βのシグナル伝達において負の調節を行うような核酸とそれがコードするポリペプチドに関するものである。本発明はまた、その核酸とポリペプチドに結合する物質にも関係する。本発明はさらに、疾患の治療および／あるいは診断においてそのような核酸とポリペプチドを利用する方法にも関係する。
【０００２】
発明の背景
哺乳類の胚形成および成熟した組織のホメオスタシスにおいてトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）は細胞内コミュニケーションに中心的な役割を果している（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　８：１−９，１９９３）。この多面的な因子の細胞における効果は、２つの遠縁に当たるＩ型とＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体であるＴβＲ−ＩおよびＴβＲ−ＩＩがそれぞれ、リガンドとの間でヘテロオリゴマーを形成することによって引き出される（ＬｉｎとＬｏｄｉｓｈ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　１１：９７２−９７８，　１９９３；　Ｄｅｒｙｎｃｋ，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．，　１９：　５４８−５５３，　１９９４；　ＭａｓｓａｇｕｅとＷｅｉｓ−Ｇａｒｃｉａ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｒｖ．　２７：　４１−６４，　１９９６；　ｔｅｎ　Ｄｉｊｋｅ、Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　８：１３９−１４５，１９９６）。この受容体は２つともシグナル伝達には必要とされるが、作用には順序がある；ＴβＲ−Ｉは、構成的に活性化されているＴβＲ−ＩＩキナーゼの基質なのである（Ｗｒａｎａら、Ｎａｔｕｒｅ，　３７０：３４１−３４７，１９９４；　Ｗｉｅｓｅｒら、ＥＭＢＯ　Ｊ，１４：２１９９−２２０８，１９９５）。ＴＧＦ−βは似たような方法でシグナルを伝達するアクチビンや骨形成タンパク（ＢＭＰｓ）を含む、構造的に関連したタンパクの大きなファミリーの一部を形成している。それらはそれぞれ別のＩ型とＩＩ型という２つのセリン／スレオニンキナーゼ受容体複合体を持っている（Ｌｉｎ　とｌｏｄｉｓｈ、１９９３；　Ｄｅｒｙｎｃｋ，　１９９４；　ＭａｓｓａｇｕｅとＷｅｉｓ−Ｇａｒｃｉａ、１９９６；　ｔｅｎ　Ｄｉｊｋｅら、１９９６）。
【０００３】
ショウジョウバエとネマトーダ（シーエレガンス）を用いたＴＧＦ−β様のシグナル伝達経路に関する遺伝的な研究によってＭａｄ（マザー・アゲインストｄｐｐ）（Ｓｅｋｅｌｓｋｙら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３９：１３４７−１３５８，１９９５）およびｓｍａ（Ｓａｖａｇｅら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９３：７９０−７９４，１９９６）遺伝子が同定された。このような生物の中で、この関連遺伝子の産物はセリン／スレオニン受容体を介して作用しているＴＧＦ−β様リガンドの下流で必須の機能を果している（Ｗｉｅｒｓｄｏｒｆら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　１２２：２１５３−２１６３，　１９９６；　Ｎｅｗｆｅｌｄら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　１２２：２０９９−２１０８，　１９９６；　Ｈｏｏｄｌｅｓｓら、Ｃｅｌｌ，　８５：４８９−５００，　１９９６）。脊椎動物でＭａｄおよびｓｍａに相当する遺伝子はそれぞれＳｍａｄ（Ｄｅｒｙｎｃｋら、Ｃｅｌｌ，８７：１７３，１９９６）およびＭＡＤＲ（ＷｒａｎａとＡｔｔｉｓａｎｏ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．，１２：４９３−４９６，　１９９６）遺伝子と命名された。Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ４／ＤＰＣ４における遺伝的変異は特定の腫瘍で見い出されているので、Ｓｍａｄは腫瘍抑制遺伝子として機能しているのかも知れない（Ｈａｈｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２７１：３５０−３５３，　１９９６；　Ｒｉｇｇｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，　１３：３４７−３４９，　１９９６；　Ｅｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ，　８６：５４３−５５２，　１９９６）。ＳｍａｄタンパクはＭＨ１ドメインおよびＭＨ２ドメインと名付けられたよく似た２つの領域を持ち、変異の多いプロリン−リッチ配列につながっている（Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ，　８５：９４７−９５０，　１９９６；　ＤｅｒｙｎｃｋとＺｈａｎｇ、Ｃｕｒｒ．　Ｂｉｏｌ．，　６：１２２６−１２２９，　１９９６）。Ｓｍａｄ２のＣ末端部分を非相同ＤＮＡ結合ドメインと融合した場合、転写活性をもつことが判った（Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ，　３８１：６２０−６２３，　１９９６；　Ｍｅｅｒｓｓｅｍａｎら、Ｍｅｃｈ．　Ｄｅｖ．，　６１：１２７−１４０，　１９９７）。Ｓｍａｄ２タンパク全体をＤＮＡ結合ドメインと融合した場合、転写活性は隠されてしまうが、リガンドによる刺激で転写活性は現れてくる（Ｌｉｅら、１９９６）。
【０００４】
アフリカツメガエルにおける機能的な分析では、Ｓｍａｄはその種類によって異なった反応を示している。Ｓｍａｄ１はＢＭＰ様の反応で、腹側中胚葉を誘導するが、Ｓｍａｄ２はアクチビン／ＴＧＦ−β様の反応で背側中胚葉を誘導する（Ｇｒａｆｆら、Ｃｅｌｌ，　８５：４７９−４８７，　１９９６；　ＢａｋｅｒとＨａｒｌａｎｄ、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．，　１０：１８８０−１８８９，　１９９６；　Ｔｈｏｍｓｅｎ、ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　１２２：２３５９−２３６６，　１９９６）。リガンドの刺激によってＳｍａｄはそのセリン残基とスレオニン残基がリン酸化される；ＢＰＭはＳｍａｄ１のリン酸化を刺激し、ＴＧＦ−βはＳｍａｄ２とＳｍａｄ３のリン酸化を誘導する（Ｈｏｏｄｌｅｓｓら、１９９６；　Ｌｉｕら、１９９６；　Ｅｐｐｅｒｔら、１９９６；　Ｌｅｃｈｌｅｉｄｅｒら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７１：１７６１７−１７６２０，　１９９６；　Ｙｉｎｇｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９３：８９４０−８９４４，　１９９６；　Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，　３８２：１６８−１７２，　１９９６；　Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら、Ｃｅｌｌ，　８７：１２１５−１２２４，　１９９６；　Ｎａｋａｏら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７２：２８９６−２９００，　１９９６）。
【０００５】
Ｓｍａｄ４はＴＧＦ−β、アクチビンおよびＢＭＰのシグナル伝達における共通成分である（Ｌａｇｎａら、Ｎａｔｕｒｅ，　３８３：８３２−８３６，　１９９６；　Ｚｈａｎｇら、Ｃｕｒｒ，　Ｂｉｏｌ．，　７：２７０−２７６，　１９９７；　ｄｅ　Ｗｉｎｔｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，　１４：１８９１−１９００，　１９９７）。今のところ、Ｓｍａｄ４のリン酸化はトランスフェクトした細胞をアクチビンで刺激した後にのみ起きると報告されている（Ｌａｇｎａら、１９９６）。ＴＧＦ−βあるいはアクチビンで刺激した場合、Ｓｍａｄ４はＳｍａｄ２あるいはＳｍａｄ３と相互作用し、ＢＭＰで刺激した場合は、Ｓｍａｄ４とＳｍａｄ１のヘテロ複合体が認められた（Ｌａｇｎａら、１９９６）。リガンドによる刺激を受けるとＳｍａｄ複合体は細胞質から核へ移行する（Ｈｏｏｄｌｅｓｓら、１９９６；　Ｌｉｕら、１９９６；　ＢａｋｅｒとＨａｒｌａｎｄ、１９９６；　Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら、１９９６）。それらは核でＤＮＡ結合タンパクと共に遺伝子の転写を調節している可能性がある（Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ，　３８３：６９１−６９６，　１９９６）。
【０００６】
発明の要約
本発明は単離したＳｍａｄ２ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドに結合する、抗体を含めた試薬を提供する。本発明はまた、前述のポリペプチドをコードしている単離した核酸分子、そのような分子の独特の断片、前述のものを含む発現ベクター、およびそのような分子をトランスフェクトした細胞を提供する。前述のものはＴＧＦ−βのシグナル伝達によって特徴付けられた状態の診断や治療に用いることができる。本発明はまた、そのような状態を診断したり、治療したりするのに有用な薬物を同定するための方法を提供する。ここでは、生体内でリン酸化されたＳｍａｄ２のアミノ酸残基の同定を報告する。
【０００７】
本発明の１つの特徴に従って、単離したＳｍａｄ２のポリペプチドを提供する。そのポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列、あるいはヒトにおけるそのホモログを持つが、アミノ酸４６４、４６５および４６７の１又は２以上の非セリンアミノ酸を含む突然変異を含むようなポリペプチドは除く。ある態様では、単離したＳｍａｄ２ポリペプチドは、４６４；４６５；４６７；４６４番目；および４６５；４６４番目；および４６７；４６５番目および４６７番目；および４６４、４６５番目および４６７番目で構成されるグループから選択される１つ以上の部位における突然変異を含んでいる。好ましくは単離したＳｍａｄ２ポリペプチドは、たとえばＳｅｒ４６４Ａ；Ｓｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６４ＡおよびＳｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６４ＡおよびＳｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６５ＡおよびＳｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６４Ａ、Ｓｅｒ４６５ＡおよびＳｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６５Ｄ；Ｓｅｒ４６７Ｄ；およびＳｅｒ４６５ＤおよびＳｅｒ４６７Ｄで構成されるグループから選択されるようなセリン残基からアラニン残基（たとえばＳｅｒ４６５Ａ）あるいはアスパラギン酸残基（たとえばＳｅｒ４６５Ｄ）への突然変異を含んでいる。
【０００８】
ほかの態様では、前述の単離したポリペプチドは前述の活性を保持した前述の断片あるいは変異型で構成されている。
【０００９】
本発明のほかの特徴に従って、前述のポリペプチドをコードしている核酸分子を提供する。
核酸は、天然のおよび／あるいは非天然のヌクレオチドで構成され、天然のおよび／あるいは非天然のヌクレオシド結合でつながっている。
【００１０】
本発明のさらにほかの特徴に従って、本発明は上述した核酸分子を含む発現ベクター、および発現ベクターでトランスフォームあるいはトランスフェクトした宿主細胞を含んでいる。
【００１１】
本発明のほかの特徴に従って、単離されたＳｍａｄ４結合ポリペプチドを提供する。それは、単離されたポリペプチドが野生型Ｓｍａｄ２ではないという条件で、Ｓｍａｄ４タンパクあるいはその断片に選択的に結合する配列番号：３のアミノ酸配列を有する。ある態様では、単離されたＳｍａｄ４結合ポリペプチドは配列番号：２のＣ末端の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９あるいは２０個のアミノ酸で構成されている。好ましくは単離したＳｍａｄ４結合ポリペプチドは配列番号：４のアミノ酸配列で構成される。そのほかの好ましい態様では、前述の単離したＳｍａｄ４結合ポリペプチドは、Ｓｅｒ４６４、Ｓｅｒ４６５、Ｓｅｒ４６７、Ｓｅｒ４６４／Ｓｅｒ４６５、Ｓｅｒ４６４／Ｓｅｒ４６７、Ｓｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７、およびＳｅｒ４６４／Ｓｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７で構成されるグループから選択する１つか複数のアミノ酸においてリン酸化される。
【００１２】
本発明のほかの特徴に従って、本発明は、前述の単離されたポリペプチドのいずれかと結合する単離されたポリペプチドを含むが、それはＴβＲ−Ｉ、ＴβＲ−ＩＩあるいはＳｍａｄ４ではない。好ましい態様では、単離した結合ポリペプチドは抗体および抗体の断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｄ、および本発明のポリペプチドに選択的に結合するＣＤＲ３領域を含む抗体断片）を含んでいる。特に好ましい抗体としてはモノクロナール抗体が挙げられる。
本発明のほかの特徴に従って、少なくとも１つの経路限定Ｓｍａｄ、あるいはその断片で配列番号：５のアミノ酸配列のＣ末端を持つようなものに選択的に結合する単離したポリペプチドを提供する。経路限定Ｓｍａｄポリペプチドあるいはその断片は配列番号：５の少なくとも１つのセリン残基がリン酸化されており、単離したポリペプチドはＴβＲ−Ｉ、ＴβＲ−ＩＩあるいはＳｍａｄ４ではない。ある態様では、経路限定Ｓｍａｄポリペプチドは、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９で構成されるグループから選択される。他の態様では、上記のセリン残基のうち少なくとも１つは、配列番号：５の２番目のセリン残基、配列番号：５の３番目のセリン残基、および配列番号：５の２番目と３番目のセリン残基から成るグループから選択される。好ましい態様では、単離した結合ポリペプチドは抗体および抗体の断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｄ、および経路限定Ｓｍａｄポリペプチドに選択的に結合するＣＤＲ３領域を含む抗体断片）を含んでいる。とりわけ好ましい抗体はモノクローナル抗体である。ある態様では抗体あるいは抗体断片は、経路限定Ｓｍａｄポリペプチドの１つに選択的に結合する。
【００１３】
本発明のほかの特徴に従って、哺乳類細胞におけるＴＧＦ−βのシグナル伝達を阻害する方法を提供する。その方法は、哺乳類細胞におけるＴＧＦ−βのシグナル伝達を減弱させる効果のある、内因性Ｓｍａｄ２のリン酸化阻害剤と哺乳類細胞を接触させる工程を含んでいる。前述の方法のある態様では、阻害剤は、４６４、４６５および４６７番目の１つか複数の残基に突然変異を持つ前述のＳｍａｄ２ポリペプチドのようなＳｍａｄ２ポリペプチドの顕性不活性型である。
【００１４】
本発明のほかの特徴では、４６４、４６５および４６７番目の１つか複数の残基に突然変異があるようなＳｍａｄ２ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体で構成される構成物を提供する。
本発明のさらなる特徴は、対象においてＴＧＦ−βのシグナル伝達活性を減少させる方法を含んでいる。ＴＧＦ−β受容体に選択的に結合し、ＴＧＦ−βのシグナル伝達を阻害する物質を、対象においてＳｍａｄ２ＴＧＦ−βのシグナル伝達活性を減じるのに効果的な量で、そのような治療を必要としている対象に投与する。好ましい物質は、４６４、４６５および４６７番目セリン残基の１つか複数に突然変異があるようなＳｍａｄ２ポリペプチドで、特にアラニンあるいはアスパラギン酸に置換したものが好ましい。
【００１５】
本発明のほかの特徴に従って、Ｓｍａｄ２／ＴＧＦ−β受容体相互作用に関連した疾患の診断や治療に有用な薬物に関するリード化合物を同定する方法を提供する。この方法には、４６４、４６５および４６７番目のセリンの１つか複数で突然変異のあるＳｍａｄ２ポリペプチド、ＴＧＦ−β受容体および候補薬理学的薬剤の混合物を形成することが含まれている。候補薬理学的薬剤の非存在下で、Ｓｍａｄ２ポリペプチドによるＴＧＦ−β受容体への特異的な結合の基準量が起こる条件で混合物をインキュベートする。Ｓｍａｄ２ポリペプチドによるＴＧＦ−β受容体への特異的な結合に関する試験量はそれから決定する。候補薬理学的薬剤の存在下で前述の活性の減少を検出できるということは、候補薬理学的薬剤がＳｍａｄ２／ＴＧＦ−β受容体相互作用を断つような薬物のリード化合物であることを示している。候補薬理学的薬剤の存在下で前述の活性の増加が検出されるということは、候補薬理学的薬剤がＳｍａｄ２／ＴＧＦ−β受容体相互作用を増強するような薬物のリード化合物であることを示している。好ましくは、Ｓｍａｄ２ポリペプチドは、Ｓｅｒ４６４Ａ；Ｓｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６４ＡおよびＳｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６４ＡおよびＳｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６５ＡおよびＳｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６４Ａ、Ｓｅｒ４６５ＡおよびＳｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６５Ｄ；Ｓｅｒ４６７Ｄ；およびＳｅｒ４６５ＤおよびＳｅｒ４６７Ｄで構成されるグループから選択する突然変異を含んでいる。
【００１６】
本発明の別の特徴に従って、ＴＧＦ−βが介在するＳｍａｄ２のシグナル伝達活性に関連した疾患の診断や治療に有用な薬物のリード化合物を同定する方法を提供する。その方法には、野生型のＳｍａｄ２ポリペプチド、ＴＧＦ−β受容体、および、好ましくは４６４、４６５および４６７番目のセリンの１つか複数で突然変異を持っている変異型Ｓｍａｄ２ポリペプチドで構成される候補薬理学的薬剤の混合物を形成することが含まれている。候補薬理学的薬剤の非存在下で、ＴＧＦ−βによる野生型Ｓｍａｄ２ポリペプチドのリン酸化の基準量が起こる条件で、混合物をインキュベートする。ＴＧＦ−βによる野生型Ｓｍａｄ２ポリペプチドのリン酸化に関する試験量はそれから決定する。試験量の場合の方が基準量の時よりもＴＧＦ−βによる野生型Ｓｍａｄ２ポリペプチドのリン酸化を減らすということは、候補薬理学的薬剤がＴＧＦ−βによる野生型Ｓｍａｄ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を阻害するような薬物のリード化合物であることを示している。好ましくは、変異型Ｓｍａｄ２は、Ｓｅｒ４６４Ａ；Ｓｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６４ＡおよびＳｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６４ＡおよびＳｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６５ＡおよびＳｅｒ４６７Ａ；Ｓｅｒ４６４Ａ、Ｓｅｒ４６５ＡおよびＳｅｒ４６５Ａ；Ｓｅｒ４６５Ｄ；Ｓｅｒ４６７Ｄ；Ｓｅｒ４６５ＤおよびＳｅｒ４６７Ｄ；あるいはそれらのＴＧＦ−β受容体結合断片で構成されているグループから選択された突然変異を含む。
【００１７】
本発明のもう１つの特徴に従って、リン酸化されたＣ末端セリン残基を持つ、経路限定Ｓｍａｄポリペプチドの生物試料における量を定める方法を提供する。この方法には、配列番号：５で示されているアミノ酸配列の少なくとも１つのリン酸化されたセリン残基と選択的に結合するような単離ポリペプチドと生物試料を接触させること、単離ポリペプチドと経路限定Ｓｍａｄポリペプチドとの結合を測定すること、およびリン酸化されたＣ末端セリン残基を持つ経路限定Ｓｍａｄポリペプチドの生物試料中における量を測定しつつ対照との結合を比較することが含まれている。生物試料とは、試験管内の抽出物のような生物抽出物、あるいは試験管内もしくは生体内における組織化学的分析のための組織試料である。ある態様では、経路限定ＳｍａｄポリペプチドはＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９で構成されているグループから選択する。好ましい態様では、単離した結合ポリペプチドは、モノクローナル抗体を含む抗体および抗体断片を含んでいる。ある好ましい態様では、抗体あるいは抗体断片は、配列番号：５の２番目のセリン残基、配列番号：５の３番目のセリン残基、および配列番号：５の２番目と３番目のセリン残基で構成されているグループから選択された、少なくとも１つがリン酸化されたＣ末端セリン残基を持つ経路限定Ｓｍａｄポリペプチドに選択的に結合する。
【００１８】
本発明のもう１つの特徴に従って、経路限定ＳｍａｄポリペプチドのＣ末端セリン残基のリン酸化を調節するような薬物のリード化合物を同定するための方法を提供する。その方法には、少なくとも１つのＣ末端セリン残基を持つ経路限定Ｓｍａｄポリペプチド、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体あるいは受容体複合体で少なくとも１つのＣ末端セリン残基をリン酸化できるもの、および候補薬理学的薬剤で構成される混合物を形成することが含まれる。候補薬理学的薬剤の非存在下で、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体あるいは受容体複合体による少なくとも１つのＣ末端セリン残基のリン酸化基準量が生じる条件で、混合物をインキュベートする。ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体あるいは受容体複合体による少なくとも１つのＣ末端セリン残基のリン酸化に関する試験量はそのあと検出する。リン酸化の基準量に比べてリン酸化の試験量が減少するということは、候補薬理学的薬剤が、経路限定Ｓｍａｄポリペプチドの少なくとも１つのＣ末端セリン残基のリン酸化を減らすような薬物のリード化合物であることを示している。リン酸化の基準量に比べてリン酸化の試験量が増加するということは、候補薬理学的薬剤が、経路限定Ｓｍａｄポリペプチドの少なくとも１つのＣ末端セリン残基のリン酸化を増強するような薬物のリード化合物であることを示している。ある態様では、経路限定ＳｍａｄポリペプチドはＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９で構成されているグループから選択する。ほかの態様では、少なくとも１つのセリン残基は、配列番号：５の２番目のセリン残基、配列番号：５の３番目のセリン残基、および配列番号：５の２番目と３番目のセリン残基で構成されているグループから選択する。さらに他の態様では、経路限定Ｓｍａｄポリペプチド、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体あるいは受容体複合体および候補薬理学的薬剤で構成される混合物を形成する工程は、経路限定Ｓｍａｄポリペプチド、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体あるいは受容体複合体を持っている細胞と候補薬理学的薬剤を接触させることを含んでいる。前述の方法の特に好ましい態様では、混合物を形成する工程はさらにＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体あるいは受容体複合体を活性化するリガンドを加えることを含む。
【００１９】
本発明のもう１つの特徴に従って、細胞内での異型Ｓｍａｄタンパク複合体の形成を減らす方法を提供する。その方法には、リン酸化された経路限定Ｓｍａｄポリペプチドと選択的に結合する抗体あるいは抗体をコードする核酸を提供すること、および細胞内での異型Ｓｍａｄタンパク複合体の形成を減らすのに十分な量の抗体あるいは抗体をコードする核酸と細胞を接触させることが含まれている。ある態様では、経路限定Ｓｍａｄポリペプチドは、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９で構成されているグループから選択する。他の態様では、抗体は、配列番号：５の２番目のセリン残基、配列番号：５の３番目のセリン残基、および配列番号：５の２番目と３番目のセリン残基で構成されているグループから選択された少なくとも１つのリン酸化Ｃ末端セリン残基を有する、経路限定Ｓｍａｄポリペプチドと選択的に結合する。
【００２０】
薬剤調製における前述の化合物の利用も提供する。
本発明のこれら、およびそのほかの特徴は本発明の詳細な説明と共にさらに詳しく記述する。
【００２１】
発明の詳細な説明
我々は、Ｓｍａｄ２タンパクのＣ末端における２つのセリン残基、すなわちＳｅｒ４６５およびＳｅｒ４６７のＴＧＦ−βによるリン酸化を同定したことをここに示す。Ｓｅｒ４６５がリン酸化されるためにはＳｅｒ４６７のリン酸化が必要であった。Ｓｍａｄ２におけるＳｅｒ４６５および／あるいはＳｅｒ４６７をアラニン残基へ突然変異することによってＴＧＦ−βのシグナル伝達はドミナントネガティブ阻害を受け、生体内ではリン酸化される部位ではないＳｅｒ４６４における突然変異も同様であった。このようなＳｍａｄ２の変異型は、野生型Ｓｍａｄ２が一過性にしか作用しないこととは対照的に、活性化されたＴＧＦ−β受容体複合体と安定的な相互作用を行うことが判明した。Ｓｍａｄ２の４個のＣ末端アミノ酸残基を有し、Ｓｅｒ４６５およびＳｅｒ４６７がリン酸化されているペプチドは、試験管内で、リン酸化されていないペプチドよりも高い親和性でグルタチオンＳトランスフェラーゼ−Ｓｍａｄ４融合タンパクに結合した。さらに長いＣ末端ペプチド（１４個のアミノ酸残基）を用いた場合、ＧＳＴ−Ｓｍａｄ４への結合は強く増強され、この場合はリン酸化しなくても結合が認められた。
従って本発明は、特徴の１つにＳｍａｄ２ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする遺伝子、前述の機能的修飾と変異、前述の有用な断片、およびそれらに関連した治療を含んでいる。本発明はまた、経路限定Ｓｍａｄタンパク（Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９を含む）がＣ末端に共通の保存配列（配列番号：５）を有するという認識を含み、従って本発明は経路限定Ｓｍａｄタンパクのすべてに関係している。
【００２２】
本発明は、記載済みのＳｍａｄ２ポリペプチドの変異型（たとえばＮａｋａｏら、１９９６；配列番号：２）のような単離したポリペプチドを提供する。特にＳｍａｄポリペプチドの突然変異型（たとえばマウスのタンパクは配列番号：２で表される）とその断片を提供する。そのようなポリペプチドは、たとえば、単独ではＴＧＦ−βのシグナル伝達を修飾するために、あるいは融合タンパクとして抗体、たとえば免疫検定の構成成分として利用する、を作成するために有用である。
【００２３】
本発明のペプチドは単離したペプチドである。ここで用いる場合、ペプチドに関して“単離したペプチド”という用語は、ペプチドが実質的に純粋で、意図した用途に対して、実用的で適切な範囲で、自然界や生体内システムでは共に見い出されるようなそのほかの物質は本質的に存在しないということを意味している。とりわけ、たとえば薬剤調製や配列決定に役立つようにペプチドは十分に純度が高く、宿主細胞の生物学的構成物資を含まない。本発明における単離したペプチドは、製剤では薬学的に許容できる担体と混合する可能性があるので、ペプチドは調製物の小さな重量比しか構成しないかもしれない。それでもなお、ペプチドは実質的に純度が高く、生体系において関連する物質から実質的に分離されたものである。
【００２４】
ここで用いられる場合、Ｓｍａｄ２ポリペプチドはＳｍａｄ２の本来のアミノ酸配列（たとえば配列番号：２）に１つか複数の修飾を加えたポリペプチド、たとえば、“野生型”Ｓｍａｄ２に突然変異させた“変異型”　を含んでいる。Ｓｍａｄ２突然変異型を創るような修飾によって、Ｓｍａｄ２ポリペプチドに関して、１）ＴＧＦ−β受容体によるリン酸化のようなＳｍａｄ２ポリペプチドの活性を減少させる、あるいは除く；２）ＴβＲ−Ｉへの結合、あるいは発現システムにおけるタンパクの安定性、あるいはタンパク−タンパク結合における安定性のようなＳｍａｄ２ポリペプチドの特性を増強する；あるいは３）抗原エピトープの付加、あるいは検出部位の付加のようなＳｍａｄ２ポリペプチドに新規の活性や特性を与える、ようなことができる。Ｓｍａｄ２ポリペプチドに対する修飾は一般的には、Ｓｍａｄ２ポリペプチドをコードしている核酸に対して行い、欠失、点突然変異、切断、アミノ酸置換、およびアミノ酸あるいは非アミノ酸分子の付加が含まれる。あるいは、ポリペプチドを直接修飾することもできる。たとえば、開裂、架橋分子の付加、ビオチンなどの検出分子の付加、脂肪酸の付加などによってである。修飾には全部あるいは一部のＳｍａｄ２アミノ酸配列で構成される融合タンパクも含まれる。ＴＧＦ−β受容体への結合あるいは相互作用活性のような特徴的な活性を保持しているＳｍａｄ２の断片、野生型Ｓｍａｄ２活性の阻害およびＴＧＦ−βによるシグナル伝達および遺伝子発現を減らすような能力。どの断片がそのような活性を保持しているのかは、当業者であれば、非野生型のＳｍａｄ２の断片を調製し、ＰＣＲ，制限エンドヌクレア−ゼ切断、あるいは部位特定突然変異誘発のような標準的な方法を用い、次にここで述べているように非野生型Ｓｍａｄ２の活性について断片を調べることによって、容易に判定することができる。
【００２５】
Ｓｍａｄ２ポリペプチドにはここでは“Ｓｍａｄ４結合ポリペプチド”と呼ぶポリペプチドも含まれる。そのようなＳｍａｄ２ポリペプチドはＳｍａｄ４に結合するようなＳｍａｄ２の部分を含んでいる。例として以下に示すように、Ｓｍａｄ４結合ポリペプチドは４個のアミノ酸ほどの短いものから野生型Ｓｍａｄ２あるいはそれより大きいものまである。Ｓｍａｄ２のＣ末端がＳｍａｄ２とＳｍａｄ４との結合に関与していることが判ったので、Ｓｍａｄ４結合ポリペプチドの好ましい例はＳｍａｄ２のＣ末端を含んでいる。例には、配列番号：３、　配列番号：４、および配列番号：５が含まれる。配列番号：３とＳｍａｄ２のＣ末端アミノ酸を加えたようなそのほかのＳｍａｄ４結合ポリペプチドも考えられる。当該分野の普通の技術者には明らかであるように、Ｓｍａｄ４結合ポリペプチドにはＳｍａｄではないアミノ酸配列も含まれる。
【００２６】
Ｓｍａｄ４結合ポリペプチドはリン酸化された場合に活性が増すことが判っている。従って、以下に例として示すようにリン酸化されたＳｍａｄ４結合ポリペプチドを作成し、用いるのが好ましい。当業者であれば良く知られた方法と材料を用いることによってそのようなポリペプチドを作成することができる。
【００２７】
一般に、突然変異型には、その生理学的活性に関連するポリペプチドの特徴を変えるために特別に修飾されているＳｍａｄ２ポリペプチドのような、経路限定Ｓｍａｄポリペプチドが含まれている。たとえば、以下に示すように、Ｓｅｒ４６５とＳｅｒ４６７はＳｍａｄ２において生体内でリン酸化される部位であることが実験的証明によって明らかになっている。ある種のＳｍａｄ２の活性ではＳｅｒ４６４が重要であることも明らかにされている。従って、これらのセリン残基の１つか複数において突然変異が起きることによって野生型Ｓｍａｄ２とは異なった活性を持つＳｍａｄ２ポリペプチドを創ることになるのである。そのような突然変異は、とりわけ生体内や試験管内でのＴＧＦ−βのシグナル伝達の調節に有用である。ここのどこかで触れたように、Ｓｍａｄ２突然変異型は様々な治療や実験用途としてＴＧＦ−βの活性を調節するために用いることができる。そのほかの用途は当業者には明らかである。
【００２８】
以下の実験で示すように、Ｓｍａｄ２における前述のセリンについてアラニン残基あるいはアスパラギン酸残基に置換することによって、ＴＧＦ−β受容体との相互作用、ＴＧＦ−βによる遺伝子発現の減少、野生型Ｓｍａｄ２のリン酸化の減少などに関して様々な程度の活性を持ったＳｍａｄ２突然変異型を生じる。そのほかの突然変異についても当該分野の標準的な技術を使い、同じ設備を用いて行えることは当業者には明らかである。そのような突然変異は点突然変異に限らず、さらに大きな欠失や切断も含まれる。
【００２９】
一般に、変異型は、生理学的活性に関係のないポリペプチドの特徴を変えるために特別に修飾されたＳｍａｄ２ポリペプチドを含んでいる。たとえば、望まないジスルフィド結合を避けるためにシステイン残基を置換したり、削除したりすることができる。同様に、発現システムでＳｍａｄ２ポリペプチドの発現を増強するためにプロテアーゼによるタンパク分解を排除することによってある種のアミノ酸を変えることもできる（たとえば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母の発現システムにおける二塩基アミノ酸残基）。さらに、活性の変化を伴わないような突然変異を組み入れて、検出を容易にしたり、安定性を高めたり、あるいは裁量によってほかの特性を持たせることもできる。
【００３０】
Ｓｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定Ｓｍａｄポリペプチドをコードしている核酸の突然変異は、コード配列のアミノ酸リーディングフレームを保存することか好ましく、変異型ポリペプチドの発現に有害でありうるヘアピンあるいはループなどの二次的構造を作るハイブリッド形成をしそうな核酸領域を創らないことが好ましい。
【００３１】
突然変異はアミノ酸置換を選択することによって、あるいはポリペプチドをコードする核酸部位を選択して無作為突然変異誘発によって行うことができる。Ｓｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定Ｓｍａｄポリペプチド変異型を発現させ、１つか複数の活性を調べて、どの突然変異が望ましい特性を持った変異ポリペプチドに当たるのかを決める。変異型（あるいは変異のないＳｍａｄ２ポリペプチド）に対してさらに突然変異をつくることもできる。それはポリペプチドのアミノ酸配列に関してはサイレントで、特別な宿主内で翻訳するような好ましいコドンを提供するというものである。たとえば大腸菌において、核酸の翻訳に好ましいコドン、は当業者に公知である。ポリペプチドの発現を増強するためにＳｍａｄ２遺伝子の非コード配列あるいはｃＤＮＡクローンにさらに突然変異を創ることもできる。Ｓｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定Ｓｍａｄポリペプチド変異型の活性は、ここで示すようにＳｍａｄポリペプチド変異型をコードしている遺伝子を細菌あるいは哺乳類の発現ベクターでクローニングし、ベクターを然るべき宿主細胞に導入し、Ｓｍａｄポリペプチド変異型を発現させ、Ｓｍａｄポリペプチドの機能的能力を測定することによって、調べることができる。たとえば、Ｓｍａｄ２ポリペプチド変異型は、例に示すようにＴＧＦ−βのシグナル伝達活性の阻害について、あるいはここで示されているように、Ｓｍａｄ２のリン酸化の阻害あるいはＳｍａｄ４への結合について調べることができる。他のポリペプチド変異型の調製は、当業者には公知であろうが、抗体結合のような他の活性の試験に有利である。
【００３２】
技能を持った熟練者はまた、前述のポリペプチドの機能的に同等な変異型、すなわち、Ｓｍａｄ２の機能的能力を保持している変異型を得るために、Ｓｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定Ｓｍａｄポリペプチドに保存的アミノ酸置換を行うこともできることを理解している。ここで用いる“保存的アミノ酸置換”は、アミノ酸を置換したタンパクの相対的電荷あるいは大きさの特徴を変えないようなアミノ酸置換をいう。変異型は、そのような方法を集めた文献に見られるように、当業者に公知のポリペプチド配列を変える方法によって作成することができる。文献はたとえば、分子クローニング：実験室マニュアルＪ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編集　第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク、１９８９、あるいは分子生物学におけるカレントプロトコールＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、ジョンウイリー＆サン社、ニューヨークである。Ｓｍａｄ２ポリペプチドの模範的な機能同等性変異型には、配列番号：２、３および４の保存的アミノ酸置換がある。アミノ酸の保存的置換は、以下のグループ内での置換を含んでいる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００３３】
Ｓｍａｄ２ポリペプチドの機能的同等変異型を作成するために、Ｓｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定Ｓｍａｄポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換はＳｍａｄ２ポリペプチド（たとえば配列番号：２、３および４）をコードしている核酸を変えることによって行う。良く知られたいろいろな方法によってそのような置換を行うことができる。たとえば、アミノ酸置換は、ＰＣＲによる突然変異、Ｋｕｎｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８２：４８８−４９２，　１９８５）に従った部位特定突然変異誘発、あるいはＳｍａｄ２ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成によって行うことができる。Ｓｍａｄ４結合ポリペプチドのような、経路限定Ｓｍａｄポリペプチド（たとえばＳｍａｄ２ポリペプチド）の特定の小さな断片にアミノ酸置換を行う場合は、置換は直接的にペプチドを合成することによって行うことができる。Ｓｍａｄ２ポリペプチドの機能的同等性変異型の活性は、変造Ｓｍａｄ２ポリペプチドをコードする遺伝子を細菌あるいは哺乳類の発現ベクターでクローニングし、ベクターを然るべき宿主細胞に導入し、変造Ｓｍａｄポリペプチド変異型を発現させ、ここで示すようにＳｍａｄ２ポリペプチドの機能的能力を測定することによって、調べることができる。化学的に合成したペプチドは、たとえばＳｍａｄ４への結合等の機能について、直接調べることができる。
【００３４】
本発明におけるＳｍａｄ２核酸のホモログや対立遺伝子は従来の技術によって同定することができる。従って、本発明の１つの特徴は、Ｓｍａｄ２ポリペプチドをコードし、かつストリンジェントな条件下で配列番号：１あるいは配列番号：１４のコード領域で構成されている核酸分子とハイブリダイズする核酸配列である。ここで用いられている“ストリンジェントな条件”という用語は、当該技術ではありふれたパラメーターのことをいう。核酸のハイブリダイゼーションのパラメーターはそのような方法を集めた文献、たとえば、分子クローニング：実験室マニュアルＪ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編集　第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク、１９８９、あるいは分子生物学におけるカレントプロトコールＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、ジョンウイリー＆サン社、ニューヨークの中に見られる。さらに厳密に言えば、ここで使うストリンジェントな条件とはたとえば、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％ファイコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行うことをいう。ＳＳＣは、０．１５Ｍ　塩化ナトリウム／０．１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７；ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウム；ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡを移した膜を室温にて２ｘＳＳＣで洗浄し、次に６５℃にて０．１ｘＳＳＣ／０．１ｘＳＤＳで洗浄する。
【００３５】
似たような程度のストリンジェントな条件が得られるほかの条件や試薬もある。技能のある熟練者はそのような条件に精通しているので、ここでは触れない。しかしながら、技能のある熟練者であれば、本発明のＳｍａｄ２核酸のホモログや対立遺伝子を明らかに同定できるような方法で条件を操作できることは言うまでもない。技能のある熟練者はまた、そのような分子の発現について細胞やライブラリーをスクリーニングし、日常的に単離し、単離した該当する核酸分子の配列を決めるような方法に精通している。
【００３６】
一般に、ホモログや対立遺伝子は、配列番号：１および配列番号：２（あるいは配列番号：１４および配列番号：１５）に対してそれぞれ少なくとも４０％のヌクレオチド同一性および／あるいは５０％のアミノ酸同一性を共有しており、少なくとも５０％のヌクレオチド同一性および／あるいは６５％のアミノ酸同一性を共有している場合もあり、少なくとも６０％のヌクレオチド同一性および／あるいは７５％のアミノ酸同一性を共有している場合もある。本発明には前述の核酸のワトソン−クリック相補性も含まれる。
【００３７】
Ｓｍａｄ２核酸のスクリーニングにおいて、前述の条件を放射性のプローブと共に用いることによってサザンブロットを行ってもよい。最終的にＤＮＡが移された膜を洗浄したのち、膜をＸ線フィルムに重ね、放射性のシグナルを検出することができる。
【００３８】
本発明はまた、天然の素材に存在するコドンの代わりになるコドンを含む同義性核酸も含んでいる。たとえば、セリン残基は、ＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴおよびＡＧＣのコドンにコードされている。６つのコドンはそれぞれセリン残基をコードするという目的において同等である。従って、Ｓｍａｄ２ポリペプチドを創っていくのにセリンを取りこむために、生体内であれ、試験管内であれ、セリンをコードする核酸トリプレットのいずれをタンパク合成装置に用いてもよいことは当業者には明らかであろう。同様に、他のアミノ酸残基をコードする核酸配列トリプレットは以下のものを含むが、それに限定するものではない：ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＴ（プロリンのコドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンのコドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡＣＴ（スレオニンのコドン）；ＡＡＣおよびＡＡＴ（アスパラギンのコドン）；およびＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＴ（イソロイシンのコドン）。その他のアミノ酸残基も同様に複数のヌクレオチド配列でコードできる。従って、本発明は、遺伝子コードの同義性により、コドン配列において生物学的に単離された核酸とは異なる同義性核酸を含んでいる。
【００３９】
１つの態様では、本発明の核酸は“天然の”デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、あるいはそれらの組合せで構成されてもよい。すなわち、天然ヌクレオチドの５’末端と別の天然ヌクレオチドの３’末端がホスホジエステル・ヌクレオシド結合を介して天然のシステムのように共有結合することができる。このような核酸は、手動であるいは自動シンセサイザーにより、よく知られている方法によって作成できる。それらはベクターによって組換え的に作成されてもよい。
【００４０】
しかしながら、好ましい例では、本発明の核酸は、“修飾された”オリゴヌクレオチドを含むことができる。すなわち、核酸は、それらの転写や翻訳を妨げないが、その安定性や標的性を高め、さもなければその治療効果を高めるような多くの方法によって修飾される可能性がある。
【００４１】
ここで使われている“修飾されたオリゴヌクレオチド”という用語は、（１）合成インターヌクレオシド結合によって少なくとも２つのヌクレオチドが共有結合している（すなわち、あるヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端のあいだのホスホジエステル結合以外の結合）および／あるいは（２）通常核酸と会合しないような化学基がオリゴヌクレオチドと共有結合しているようなオリゴヌクレオチドのことを言う。好ましい合成インターヌクレオシド結合は、ホスホオロチオエート、アルキルホスホン酸エステル、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホオノチオエート、ホスホアミド酸エステル、カルバミン酸エステル、炭酸塩、リン酸塩、トリエステル、酢酸アミド塩、カルボキシメチルエステル、およびペプチドである。
【００４２】
“修飾されたオリゴヌクレオチド”という用語は、電子対を共有して修飾された塩基および／あるいは糖を伴ったオリゴヌクレオチドも含む。たとえば、修飾されたオリゴヌクレオチドは、３’部位で水酸基以外の、５’部位でリン酸基以外の低分子量の有機基と電子対を共有して結合した糖骨格を持つオリゴヌクレオチドを含んでいる。従って修飾されたオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含んでもよい。さらに修飾されたオリゴヌクレオチドは、リボースの代わりにアラビノースのような糖を含む可能性がある。従って、本発明は、Ｓｍａｄ２ポリペプチドをコードする修飾された核酸を薬学的に許容された担体と共に含む医薬品を考慮している。
【００４３】
本発明のＳｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定Ｓｍａｄポリペプチド（ＴＧＦ−β受容体結合およびＳｍａｄ４結合ポリペプチドを含む）をコードしている核酸は、薬剤構成物の一部として投与されてもよい。そのような薬剤構成物は、当該技術で公知の、生理学的および／あるいは薬学的に許容される標準的担体を組み合わせた核酸を含む可能性がある。構成物は、無菌であり、患者への投与にとってふさわしい重量あるいは容量単位で治療上効果的な量を含むべきである。“薬学的に許容できる”という用語は、活性成分の生物活性を妨害しない、毒性のない素材ということを意味する。　“生理学的に許容できる”という用語は、細胞、細胞培養、組織あるいは生命体などの生物システムと両立する、毒性のない素材をいう。担体の特徴は、投与経路に依存している。生理学的および薬学的に許容できる担体は、希釈剤、増量剤、塩、緩衝液、安定剤、溶解剤、および当該技術で公知のそのほかの物質である。
【００４４】
ここで用いられる“ベクター”とは、異なった遺伝的環境間を移動させるために、あるいは宿主細胞で発現させるために、制限反応および連結反応によって望ましい配列を挿入した数多くの核酸のいかなるものもいう。ＲＮＡベクターも利用できるが、ベクターは一般的にはＤＮＡで構成されている。ベクターはプラスミド、ファージミド、およびウイルスゲノムを含むがこれに限定されるものではない。クローニングベクターは、宿主細胞の中で複製することができ、かつ１つか複数のエンドヌクレアーゼ制限部位があり、そこで決定できる方法でベクターを切断することができ、望ましいＤＮＡ配列をその中に連結し、新しい組換えベクターが宿主細胞の中で複製する能力を保持しているようなものである。プラスミドの場合、望ましい配列の複製は、宿主細菌の中でプラスミドがコピー数を増やすような多くの回数で起きるか、あるいは宿主が有糸分裂で増える前に宿主当たり１回だけ起きる。ファージの場合、複製は溶菌性ファージでは能動的に起き、溶原性ファージでは受動的に起きる可能性がある。発現ベクターは、望ましいＤＮＡ配列が制限反応と連結反応で挿入され、調節配列に結合してＲＮＡ転写物として発現する可能性のあるものである。ベクターはさらに、ベクターでトランスフォームあるいはトランスフェクトされた、あるいはされていない細胞の同定に利用するのにふさわしい標識となる配列を１つか複数含むことができる。標識には、たとえば、抗生物質あるいはそのほかの化合物の抵抗性あるいは感受性のどちらかを減少させるか、増加させるようなタンパクをコードする遺伝子、よく知られている標準的な分析で検出できるような活性を持つ酵素をコードする遺伝子（たとえばβガラクトシダーゼあるいはアルカリホスファターゼ）、および形質転換あるいは形質移入した細胞、宿主、コロニー、あるいはプラークの表現型に視覚的な影響を与える遺伝子（たとえば緑色蛍光タンパク）がある。好ましいベクターは、自発的に複製する能力があり、ＤＮＡ断片の中でそれと操作可能に結合した構造遺伝子産物を発現できるものである。
【００４５】
ここで用いる場合、コード配列と調節配列は、調節配列の影響下あるいは支配下でコード配列の発現や転写を行うようにそれらを共有結合させる場合は、“操作可能に”結合するという。コード配列が機能タンパクに翻訳されることが望ましい場合、２つのＤＮＡ配列は、５’調節配列のプロモーターの誘導によってコード配列の転写を生じるのならば、および２つのＤＮＡ配列間における結合の性質が、（１）フレームシフト突然変異を生じない、（２）コード配列の転写に向けられたプロモーター領域の能力を遮らない、あるいは（３）相当するＲＮＡ転写物のタンパクに翻訳する能力を遮らないものであるならば、“操作可能に”結合するという。従って、プロモーター領域がＤＮＡ配列の転写に影響することができ、その結果生じる転写物が望ましいタンパクあるいはポリペプチドに翻訳されるならば、そのプロモーター領域はコード配列と操作可能に結合されていよう。
【００４６】
遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は生物種や細胞のタイプで異なってよいが、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などのような転写や翻訳の開始に含まれるような５’非転写および５’非翻訳配列を必須に含む。とりわけ、５’非転写調節配列は、操作可能に結合した遺伝子を転写制御するためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むことになる。調節配列はまた、必要ならば、エンハンサー配列あるいは上流のアクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、５’リーダーあるいはシグナル配列を任意で含むことができる。然るべきベクターの選択と設計は当該分野の普通の技術者の能力と裁量の範中にある。
【００４７】
発現に関して必要な要素をすべて含んでいる発現ベクターは市販されており、当業者には公知である。分子クローニング：実験室マニュアルＪ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編集　第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク、１９８９を参照のこと。Ｓｍａｄ２ポリペプチドあるいはその断片あるいはその変異型をコードする非相同性ＤＮＡ（ＲＮＡ）を細胞に導入することによって細胞を遺伝子工学的に操作する。非相同性ＤＮＡ（ＲＮＡ）を転写要素の操作可能な制御下に置き、宿主細胞内で非相同性のＤＮＡを発現できるようにする。
【００４８】
哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ発現のための好ましいシステムは、ｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン、カールズバッド、カリフォルニアで入手できる）のようなもので、Ｇ４１８抵抗性（安定的にトランスフェクトされた細胞株の選択を促進する）を与える遺伝子やヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列のような選択的マーカーを持っている。さらに、霊長類や犬の細胞株における発現に適しているのはｐＣＥＰ４ベクター（インビトロゲン）であり、これはエプステインバーウイルス（ＥＢＶ）起源の複製機構を持ち、核外複数コピー要素としてのプラスミドの性質を助長する。もう１つの発現ベクターにはｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドがあり、試験管内で転写を効果的に刺激するエロンゲーション因子１αポリペプチドのプロモーターを含んでいる。そのプラスミドはＭｉｓｈｉｚｕｍａとＮａｇａｔａ（Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１８：５３２２，　１９９０）により記載されており、転写実験でのその利用はたとえばＤｅｍｏｕｌｉｎ（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　ｂｉｏｌ．，　１６：４７１０−４７１６，　１９９６）が公表した。さらにそのほかのベクターとしては、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔにより公表されたアデノウイルスがあり、それはＥ１とＥ３タンパクを欠いている（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　９０：６２６−６３０，　１９９２）。ＡｄｅｎｏＰ１Ａ組換え体としてのアデノウイルスの利用はＰＩＡに対する免疫のためにマウスに皮内注射したとしてＷａｒｎｉｅｒらによって公表された（Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ，　６７：３０３−３１０，　１９９６）。
【００４９】
発明はまた、いわゆる発現キットを含み、それによって熟練者が望ましい発現ベクターを作成できるのである。そのような発現キットは少なくとも各々につき前に論じ独立したコード配列部分を含んでいる。前述の配列が含まれていさえすれば、必要とされる他の成分を必要に応じて加えることができる。
本発明はまた、細胞や動物の中でのＳｍａｄ２突然変異遺伝子による“遺伝子改変”の構築を可能にし、ＴＧＦ−βのシグナル伝達の特徴を研究するための材料を提供する。
【００５０】
ここで述べるように本発明には数多くの用途があり、そのうちのいくつかについては本明細書中の別のところで触れている。まず、本発明はリン酸化を減らした、あるいはリン酸化を失くしたような非野生型活性を持つＳｍａｄ２ポリペプチドの作成と単離を可能にする。技能のある熟練者には周知の様々な方法を用いて単離したＳｍａｄ２分子を得ることができる。元々ポリペプチドを産生している細胞からクロマトグラフのような手段や免疫認識によって、ポリペプチドを精製してもよい。別の方法としては、ポリペプチドの産生を引き起こすように発現ベクターを細胞に導入してもよい。別の方法では、コードされたポリペプチドを産生させるために、ｍＲＮＡ転写物を細胞に微量注入するか、導入してもよい。網状赤血球溶解系のような無細胞抽出物におけるｍＲＮＡの翻訳を用いてポリペプチドを産生してもよい。当該分野の専門家であればＳｍａｄ２ポリペプチドを単離するための公知の方法を容易に行うこともできる。このようなものには、免疫クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ，サイズ排斥クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィおよび免疫アフィニティクロマトグラフィが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
Ｓｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定Ｓｍａｄポリペプチドにおける生体内でのリン酸化部位およびＳｍａｄ４との結合接点を明らかにすることによって熟練者は、ＴＧＦ−βシグナル伝達活性の異常により特徴付けられる疾患を診断したり、調節したりすることができる。このような方法は、ある態様では、ＴＧＦ−βシグナル伝達を亢進している疑いのある細胞に本発明のＳｍａｄポリペプチドを接触させることを含む。本発明のＳｍａｄポリペプチドは、野生型ＳｍａｄのＴＧＦ−βによるリン酸化およびＳｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定ＳｍａｄポリペプチドやＳｍａｄ４との結合のドミナントネガティブ阻害剤として作用し、従って亢進されたＴＧＦ−βのシグナル伝達を調節することができる。
本発明によって、ここで開示するようにＳｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定ＳｍａｄポリペプチドにＴβＲ−ＩやＳｍａｄ４のようなタンパクを結合することによってかかるタンパクを単離することが可能になる。この結合を同定することによって当業者は、Ｓｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定ＳｍａｄポリペプチドがＴβＲ−ＩやＳｍａｄ４のようなそのほかのタンパクに結合することを阻止することができる。タンパクへの結合は、ＳｍａｄＴβＲ−Ｉ結合部位を含むポリペプチドをタンパクが結合している（たとえば細胞）ような生物システムに結合を阻止するのに十分な量だけ入れることによって実施できる。Ｓｍａｄ２におけるＳｍａｄ４の結合部位を同定することによって当業者は、通常の組換えＤＮＡ法を用いて、Ｓｍａｄ４のようなタンパクに結合できるように修飾されたタンパクを作成できるようになる。
【００５２】
本発明はさらに、細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を減らしたり、増やしたりする方法を提供する。そのような方法は、試験管内でＴＧＦ−βシグナル伝達を変えるのに有用である。たとえば、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達を阻止したり、不足しているＴＧＦ−βシグナル伝達を増やしたりする能力について化合物を調べる場合に有用である。生体内では、そのような方法は、たとえば癌の治療など、増殖を調節するのに有用である。たとえば細胞にドミナントネガティブＳｍａｄ２を導入することによって細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を高めることは、ＴＧＦ−βシグナル伝達の推定される阻害剤効果を調べるモデルシステムを提供するために用いることができる。そのような方法はまた、ＴＧＦ−βシグナル伝達の過不足が原因の状態を治療するのに有用である。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、例に示したリポーターシステムのような、当業者に公知の様々な方法によって測定することができる。ここに開示した方法を利用することによって、ＴＧＦ−βシグナル伝達に対する影響についてＳｍａｄ２のような経路限定Ｓｍａｄポリペプチドの活性を調節する様々な因子をスクリーニングすることができる。熟練した専門家であれば、まず、ＴＧＦ−βシグナル活性のようなＳｍａｄ２活性の調節を測定し、次いでそのような調節因子を標的細胞や対象に適用し、標的細胞や対象に対する効果を評価することができる。たとえば、癌の治療に有用なＳｍａｄ２の調節因子をスクリーニングする場合、培養細胞とＳｍａｄ２調節因子を接触させ、通常の方法によって細胞増殖の増減あるいは細胞の病巣形成を測定することができる。そのほかのＴＧＦ−βシグナル伝達の下流への影響について、いろいろなタイプの細胞で似たような方法を用い、Ｓｍａｄ２活性調節因子を評価することができる。
【００５３】
本発明はまた、前に述べたようにＳｍａｄ２に由来する“ドミナントネガティブ”ポリペプチドを提供する。ドミナントネガティブポリペプチドとはタンパクの不活性型変異型であり、細胞様装置との相互作用において活性型タンパクに取って代わって、あるいは活性型タンパクと競合しているために、活性型タンパクの効果を減少させるものをいう。たとえば、リガンドに結合するが、リガンドとの結合による対応するシグナルを伝達しないドミナントネガティブ受容体は、リガンドの発現による生物学的効果を減じることができる。同様に、標的タンパクと通常は相互作用するがリン酸化はしないドミナントネガティブの触媒的に不活性なキナーゼは細胞のシグナルに応答して標的タンパクのリン酸化を減少させる。同様に、遺伝子の制御領域におけるプロモーター部位に結合するが、遺伝子の転写を増すことのないドミナントネガティブ転写因子は、転写を増やさずにプロモーター結合部位を占拠することによって通常の転写因子の効果を減らすことができる。
【００５４】
細胞におけるドミナントネガティブポリペプチドの発現の最終目的は、活性型タンパクの機能を減少させるということである。当業者であればタンパクのドミナントネガティブ変異型の可能性を評価することができ、通常の突然変異誘発法を用いて１つか複数のドミナントネガティブ変異型ポリペプチドを創ることができる。たとえば、ここに含まれる変異型Ｓｍａｄ２ポリペプチドの教示を例にとれば、当業者は、部位特異的突然変異誘発、スキャニング突然変異誘発、Ｓｍａｄ２　ｃＤＮＡの部分的遺伝子欠失あるいは削除などによりＳｍａｄ２ポリペプチドの配列（配列番号：２）を修飾することができる。米国特許第５，５８０，７２３号、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版１９８９を参照されたい。熟練した専門家は次に、選択した活性の減少および／あるいはそのような活性（たとえばＳｍａｄ２によるＴＧＦ−βシグナル活性の減弱）の保持について突然変異のあるポリペプチドを調べることができる。タンパクのドミナントネガティブ変異型を創り、調べるようなその他の方法は、当業者には明らかである。
経路限定Ｓｍａｄポリペプチド（たとえばＳｍａｄ２ポリペプチド）のドミナントネガティブ変異型には、生体内でリン酸化部位が突然変異したもの、あるいはＳｍａｄ４結合部位が突然変異されたり欠失していてＳｍａｄ２のＳｍａｄ４との相互作用が減少あるいは失われているものが含まれる。当業者は、選択した活性が減弱しているような突然変異や欠失を持ったＳｍａｄ２突然変異型や変異型を容易に作成することができる。
【００５５】
本発明はまた、本発明のＳｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定Ｓｍａｄポリペプチド、およびＳｍａｄポリペプチドとＴβＲ−ＩやＳｍａｄ４のような結合相手との複合体と結合するポリペプチドのような物質を含んでいる。そのような結合物質はたとえば、ＳｍａｄポリペプチドおよびＳｍａｄポリペプチドとその結合相手との複合体の存在／非存在を検出するためのスクリーニング分析において、およびＳｍａｄポリペプチドおよびＳｍａｄポリペプチドとその結合相手との複合体を単離するための精製プロトコールにおいて利用することができる。そのような物質はまた、Ｓｍａｄポリペプチド、あるいは、たとえばそのようなポリペプチドへの結合によるその結合相手、あるいはその結合相手あるいは両方の元々の活性を阻害するためにも利用することができる。
【００５６】
従って本発明は、たとえば本発明のＳｍａｄ２ポリペプチドに選択的に結合することができる抗体や抗体断片のようなペプチド結合物質を含んでいる。抗体は従来の方法によって作成するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を含んでいる（たとえばＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，　２５６：４９５，１９７５）。以下で例示するように、好ましい抗体にはＳｍａｄ２のリン酸化端部に選択的に結合する抗体（Ｓｍａｄ２リン酸化端部抗体）がある。そのほかの好ましい抗体としては経路限定ほかのＳｍａｄタンパク（Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ９）に特異的な、似たようなリン酸化端部抗体がある。前述のものには、経路限定Ｓｍａｄ（配列番号：５）の４個のアミノ酸Ｃ末端モチーフに対して作成された抗体、およびＳｍａｄタンパクのもっと長いリン酸化断片に対して作成され、それぞれのＳｍａｄタンパクを認識する（たとえば配列番号：４およびほかの経路限定Ｓｍａｄの相当する配列）ような抗体も含まれる。
【００５７】
ここで用いられる“抗体”は、ヒトの定常領域とヒト以外の哺乳動物種から得たＳｍａｄタンパク結合ＣＤＲ３領域を持ったヒトのモノクローナル抗体あるいはその断片で、機能的に活性のあるものを含んでいる。
【００５８】
当該分野で周知のように、エピトープと抗体との結合には、抗体分子の小さな部分、パラトープのみが関わっている（一般には、Ｃｌａｒｋ，　ＷＲ（１９８６）「現代免疫学の実験的基礎」、ウイリー＆サン社、ニューヨーク；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ（１９９１）「免疫学の本質」、第７版、ブラックウエルサイエンティフィック出版、オックスフォードを参照されたい）。たとえばｐＦｃ’領域とＦｃ領域は補体反応に影響を持つが、抗原との結合には関与していない。ｐＦｃ’領域が酵素によって切り離されたか、ｐＦｃ’領域を含まないように作成された抗体はＦ（ａｂ’）２断片と呼ばれ、元々の抗体の抗原結合部位を両方とも保持している。同様に、Ｆｃ領域を酵素によって切り離したか、Ｆｃ領域を含まないように作成された抗体はＦａｂ断片と呼ばれ、元々の抗体分子における抗原結合部位の片方を保持している。さらにＦａｂ断片は、共有結合した抗体軽鎖とＦｄと呼ばれる抗体重鎖の一部分から構成されている。Ｆｄ断片は抗体特異性の主な決定基（単一のＦｄ断片が抗体特異性を変えることなく１０個までの軽鎖と会合する可能性がある）であり、Ｆｄ断片は単独でエピトープ結合能を保持している。
【００５９】
抗体の抗原結合部分には、当該分野では周知のように、直接抗原のエピトープと相互作用する相補性決定領域（超可変部）（ＣＤＲｓ）およびパラトープの三次構造を維持しているフレームワーク領域（ＦＲｓ）がある（一般にＣｌａｒｋ、１９８６；　Ｒｏｉｔｔ、１９９１を参照されたい）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄ断片と軽鎖の両方において、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）はそれぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）で分断されている。ＣＤＲｓは、特にＣＤＲ３は、さらに詳しくは重鎖のＣＤＲ３は抗体特異性に大きく関与している。
【００６０】
良く知られているように、哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域は元々の抗体のエピトープ特異性を保持したままで、非特異的あるいは非相同特異性のある抗体の似たような領域と置き換えることができる。このことは、ヒト以外のＣＤＲｓをヒトのＦＲおよび／あるいはＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合させて機能的抗体を作成するという“ヒト化”抗体の開発と利用において最も明らかに示されている。従ってたとえば、ＰＣＴ国際公告番号ＷＯ９２／０４３８１は、マウスのＦＲ領域の少なくとも一部がヒトのＦＲ領域に置換されたヒト化マウスＲＳＶ抗体の作成と利用を教示している。元々の抗体の抗原結合能を持った断片を含むそのような抗体は“キメラ”抗体と呼ばれることが多い。
【００６１】
ヒト化モノクローナル抗体は当該分野で公知のどのような方法を用いて作成してもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、たとえば、ヒト以外の哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域を元々の抗体のエピトープ特異性を保持したままでヒト抗体の似たような領域で置換することによって構築してもよい。たとえば、ヒト以外のＣＤＲｓといくつかの任意のフレームワークをヒトのＦＲおよび／あるいはＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合して機能的な抗体を作成してもよい。米国ではプロテイン・デザイン・ラボ（マウンテンビュー、カリフォルニア）のように、特定のマウス抗体領域からヒト化抗体を商業的に合成する企業がある。
【００６２】
欧州特許出願０２３９４００号は、その内容はすべてここでは参考として取り入れられているが、マウス（あるいはヒト以外のほかの哺乳類）の抗体の少なくともＣＤＲ部分がヒト化抗体に含まれるヒト化モノクローナル抗体の作成と利用について模範的な教示を提供している。手短に言えば、少なくともマウスのＣＤＲ部分を含むヒト化ＣＤＲモノクローナル抗体を作るためには以下の方法が有用である。Ｉｇ重鎖あるいは軽鎖の可変部ドメイン、ヒト抗体からのフレームワーク領域を含む可変部ドメインおよびマウス抗体のＣＤＲ領域を少なくともコードするＤＮＡ配列に操作できるように結合した適当なプロモーターを含む、複製できる第一の発現ベクターを作成する。任意で、少なくとも相補的なヒトＩｇ軽鎖あるいは重鎖の各可変部ドメインをコードするＤＮＡ配列に操作できるように適当なプロモーターを結合した、第二の複製できる発現ベクターを作成する。次に細胞株をベクターでトランスフォームする。好ましくは細胞株は、骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマ、クアドローマ細胞株のようなリンパ球起源の不死化した哺乳動物の細胞株、あるいはウイルスでトランスフォームし、不死化した正常リンパ球である。次にトランスフォームした細胞株はヒト化抗体を作るために、当業者に良く知られた条件で培養する。
【００６３】
欧州特許出願０２３９４００号に述べられているように、複製できるベクターに挿入すべき特殊な抗体ドメインを創るために、いくつかの方法が良く知られている。たとえば、ドメインをコードするＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチド合成によって作成してもよい。別の方法としては、ＣＤＲ領域を欠いている合成遺伝子であって、４つのフレームワーク領域が適当な制限部位と共に結合部で融合していて、２本鎖で合成、あるいは制限部位を利用してサブクローニングしたＣＤＲカセットを繋ぎ易くした末端と共にフレームワーク領域の結合部に連結することが可能な合成遺伝子を用いることもできる。もう１つの方法は、オリゴヌクレオチドの部位特定突然変異誘発による可変部ＣＤＲを含むドメインをコードするＤＮＡ配列を作成することである。このような方法はそれぞれ技術的によく知られている。従って技術的に、そのエピトープに対する抗体特異性を壊すことなくマウスのＣＤＲ領域を含むヒト化抗体を作ることができる。
【００６４】
好ましい態様では、発明のヒト化抗体は、沈殿モノクローナル抗体の少なくともＳｍａｄタンパク結合ＣＤＲ３領域を含んでいるヒトモノクローナル抗体である。上に書き留めたように、そのようなヒト化抗体は、沈殿モノクローナル抗体のＦＲ領域の一部あるいは全部をヒトの相同ＦＲ領域で置き換えることによって作成してもよい。さらに、Ｆｃ部分は、Ｓｍａｄリン酸化端部抗体のＣＤＲの一部あるいは全部を持っているヒトＩｇＧ抗体と同様にＩｇＡあるいはＩｇＭを作るように置き換えてもよい。特に重要なことは、Ｓｍａｄリン酸化端部タンパクに結合するＣＤＲ３領域を含み、Ｓｍａｄリン酸化端部抗体のほかのＣＤＲ領域やＦＲ領域は少なく含むようにすることである。そのようなヒト化抗体は特に臨床で役に立つ。それらはＳｍａｄタンパクを、特にそのリン酸化型を特異的に認識し、抗体そのものに対するヒトの免疫反応は起こさないからである。
従って技術的には明らかなように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ，ＦｖおよびＦｄ断片；そのＦｃおよび／あるいはＦＲおよび／あるいはＣＤＲ１および／あるいはＣＤＲ２および／あるいは軽鎖ＤＣＲ３領域がヒトあるいはヒト以外の相同性配列で置き換えられているようなキメラ抗体；そのＦＲおよび／あるいはＣＤＲ１および／あるいはＣＤＲ２および／あるいは軽鎖ＤＣＲ３領域がヒトあるいはヒト以外の相同性配列で置き換えられているようなキメラ抗体のＦ（ａｂ’）断片；そのＦＲおよび／あるいはＣＤＲ１および／あるいはＣＤＲ２および／あるいは軽鎖ＤＣＲ３領域がヒトあるいはヒト以外の相同性配列で置き換えられているようなキメラ抗体のＦａｂ断片；およびそのＦＲおよび／あるいはＣＤＲ１および／あるいはＣＤＲ２領域がヒトあるいはヒト以外の相同性配列で置き換えられているようなキメラ抗体のＦｄ断片を備えている。
【００６５】
ここで用いられている“機能的な活性のある抗体断片”は、ここで開示される抗体と同じ特異性を持っている元々の抗体のＳｍａｄ結合機能性を保持するような、本発明のＳｍａｄタンパク結合領域を含む抗体分子の断片を意味している。そのような断片はまた、技術的にはよく知られ、試験管内および生体内において通常用いられる。とりわけ良く知られている、機能的に活性を持っている抗体断片は、抗体のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄ断片を含むが、これに限定されるものではない。元々の抗体のＦｃ断片を欠いているこのような断片は、元々の抗体に比べてより迅速に血液循環から消失し、非特異的な組織結合をすることも少ない（Ｗａｈｌら，　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．，　２４：３１６−３２５，　（１９８３））。たとえば単鎖抗体は、Ｌａｄｎｅｒらへの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている方法に従って作ることができる。そのような単鎖抗体は可動性リンカー部分が結合した軽鎖および重鎖の可変部を含んでいる。単離した重鎖可変部の単一ドメインで構成される単一ドメイン抗体（“Ｆｄ”）を得る方法も報告され（たとえばＷａｒｄら，　Ｎａｔｕｒｅ，　３４１：６４４−６４６（１９８９）を参照されたい）、単離された形で、標的エピトープに対する十分な親和性を持ち、それに結合するような抗体重鎖可変部（ＶＨ単一ドメイン抗体）を同定するためのスクリーニング方法が開示されている。抗体重鎖および軽鎖の可変部の公知の配列に基づいて組換えＦｖ断片を作る方法は、技術的には知られ、Ｍｏｏｒｅらの米国特許第４，４６２，３３４に記載されている。抗体断片の利用や作成について記載しているそのほかの参考文献には、たとえばＦａｂ断片（Ｔｉｊｓｓｅｎ酵素免疫検定の実際と理論、エルゼビア、アムステルダム１９８５）、Ｆｖ断片（Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２：１１３０（１９７３）；　Ｓｈａｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５：１５９１（１９７６）；　Ｅｈｒｉｌｃｈら、米国特許第４，３５５，０２３号）および抗体分子の一部（Ａｕｄｉｌｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ米国特許第４，４７０，９２５号）がある。このように技術的にはＳｍａｄタンパクエピトープに対する抗体特異性を損なうことなく元々の抗体のいろいろな部分から抗体断片を作ることができる。
【００６６】
機能的に活性のある抗体断片はまた、“ヒト化抗体断片”も含んでいる。当業者には知られているように、そのような断片は元々のヒト化抗体を酵素で切断するという従来の方法で作成することができる。しかしながら、構造の性質上、処理していない抗体がそのような切断に適していない場合、出発物質として用いる免疫グロブリンによって記載の構造物を作成することはできる；あるいは組換え技術を使う場合、ＤＮＡ配列自体が、望ましい“断片”をコードできるようになる。最終的に望ましい無処理の免疫グロブリン断片を作成するためにそのＤＮＡ断片を発現させ、化学的あるいは生物学的な方法によって生体内や試験管内で結合することができる。
【００６７】
従って本発明はその特徴として、経路限定Ｓｍａｄポリペプチド（Ｓｍａｄ４結合ポリペプチドを含む）と特異的に結合するような多くの大きさと型のポリペプチドを含み、Ｓｍａｄポリペプチドとその結合相手との複合体を含む。このようなポリペプチドはまた抗体技術以外の方法に由来してもよい。たとえば、そのようなポリペプチド結合物質は、溶液中で、固相化した形で容易に調製することができるような縮重したペプチドライブラリーによって、あるいはファージディスプレイライブラリーとして提供することができる。組合せライブラリーも１つか複数のアミノ酸で構成されるペプチドで合成することができる。ライブラリーはさらにペプチドと非ペプチド合成部分によって合成することができる。
【００６８】
ファージディスプレイは、発明に従って有用な結合ペプチドを同定するのに特に効果的である、たとえば、経路限定Ｓｍａｄポリペプチドのリン酸化された部分と結合するようなペプチド、特に抗体結合に追加の特異性を与えるようなアミノ酸の付加がある場合もない場合も配列番号：５におけるＣ末端アミノ酸モチーフのリン酸化された部分と結合するようなペプチドを同定するのに効果的である。手短に言えば、従来の方法を用いて４から約８０のアミノ酸残基を挿入したファージライブラリー（たとえばｍ１３、ｆｄ、あるいはラムダファージを用いて）を作成する。たとえば挿入断片は完全な縮重配列でも偏った配列でもかまわない。次にＳｍａｄ２ポリペプチドたとえば、Ｃ末端において１つか複数のリン酸化されたセリンを持つような、あるいは経路限定Ｓｍａｄポリペプチドで同様にリン酸化されているようなポリペプチドに結合するような挿入断片を持っているファージを選択する。Ｓｍａｄポリペプチドに結合するファージを再選択するためにこの過程は数回繰り返してもよい。繰り返すことによって特殊な配列を持ったファージを濃縮することができる。発現したポリペプチドの配列を確認するためにＤＮＡの配列分析を行う。Ｓｍａｄポリペプチドに結合するような最短の直線配列を決める。最短直線配列の一部あるいは全部およびその上流か下流の１つか複数の縮重残基を含む挿入断片を有するような偏ったライブラリーを用いて、その方法を繰り返す。酵母ツーハイブリッドスクリーニング法もＳｍａｄポリペプチドに結合するようなポリペプチドの同定に用いてもよい。従って本発明のＳｍａｄ２ポリペプチド、そのほかの経路限定Ｓｍａｄのリン酸化されたもの、およびそれらの断片は、発明のＳｍａｄ２ポリペプチド結合相手のペプチドを同定し、選択するために、ファージディスプレイライブラリーを含むペプチドライブラリーのスクリーニングに利用することができる。記載されているように、そのような分子はスクリーニング分析、精製プロトコール、Ｓｍａｄポリペプチド機能の直接的な妨害、および当業者に周知のそのほかの目的に利用することができる。
【００６９】
Ｓｍａｄ２ポリペプチドとそれらの断片はまた、たとえばＴＧＦ−β受容体複合体やＳｍａｄ４などの元々の結合相手を単離するためにも利用できる。そのような結合相手の単離は周知の方法に従って行ってもよい。たとえば、単離したＳｍａｄ２ポリペプチドを基材（たとえばポリスチレンビーズなどのクロマトグラフ媒体、あるいはフィルター）に結合させ、ＴＧＦ−β受容体複合体が入っていると思われる溶液を基材にかける。Ｓｍａｄ２ポリペプチドに結合できるようなＴＧＦ−β受容体複合体が溶液中に存在すれば、Ｓｍａｄ２ポリペプチドを結合した基材に結合することになる。そのようにしてＴＧＦ−β受容体複合体を単離してもよい。ほかのＳｍａｄやアクチビン受容体複合体などのＳｍａｄ２の結合相手であるようなほかのタンパクも過度の実験を行わずに似たような方法によって単離してもよい。
【００７０】
本発明は、原核生物（たとえば大腸菌）あるいは真核生物（たとえばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母発現システムおよび昆虫細胞における組換えバキュロウイルス発現）の宿主細胞や細胞株にトランスフェクトすることは勿論、発現ベクターにおけるＳｍａｄ２ｃＤＮＡ配列の利用を含んでいることも認識されるだろう。とりわけ有用なのはヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類などの哺乳類細胞である。それらには多種多様な組織の型があり、一次細胞および細胞株が含まれる。特別な例には、角化細胞、末梢血リンパ球、骨髄幹細胞および胎児性幹細胞が含まれる。発現ベクターは関連する配列、上記した核酸が操作できるようにプロモーターに結合されることが必要である。
【００７１】
投与する際には、本発明の治療用組成物は薬学的に許容できるような製剤で投与する。そのような製剤には、通常薬学的に許容される濃度の塩、緩衝液試薬、保存剤、相性の良い担体、免疫補助液やサイトカインのような補助的免疫賦活剤およびそのほかの任意の治療用試薬を含んでもよい。
【００７２】
本発明の治療剤は注射や時間をかける点滴を含めてどのような従来の経路でも投与することができる。投与はたとえば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経皮である。抗体を治療に用いる場合、好ましい投与経路は肺噴霧によるものである。抗体を含んだ噴霧投与システムを作る技術は当業者に周知である。一般に、そのようなシステムでは、パラトープ結合能のような抗体の生物特性をあまり損なわないような成分を利用すべきである（たとえば、ＳｃｉａｒｒａとＣｕｔｉｅ，「レミングトンの製剤科学」の中の“噴霧”第１８版　１９９０　１６９４−１７１２ページを参照のこと、参考として取り入れられている）。当業者は、過度の実験に頼ることなく抗体噴霧を作る種々のパラメーターや条件を容易に定めることができる。本発明のアンチセンス製剤を投与する場合は、ゆっくり静脈から投与することが好ましい。
【００７３】
非経口投与の製剤は、無菌の水性溶液、水性溶液以外の溶液、懸濁液および乳状液を含む。水性溶液以外の溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射できる有機エステルがある。水性担体には、水、アルコール水溶液、生理食塩水および緩衝液媒体を含む懸濁液あるいは乳状液が含まれる。非経口溶媒には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖と塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、不揮発性の動物油が含まれる。静脈内投与の溶媒には輸液栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルブドウ糖に基づくようなもの）などが含まれる。保存剤やそのほかの添加剤ではたとえば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性気体などが含まれる。
【００７４】
本発明の製剤は効果的な量で投与する。効果的な量とは、薬剤単独で、あるいは併用で望ましい反応が得られるような薬剤の量である。癌を治療する場合、望ましい反応とは癌の進行を阻止することである。このことは、一時的に病気の進行を単に遅らせることを含んでもよいが、より好ましくは、病気の進行を永久に止めることである。これは、通常の方法でモニターすることができるし、ここで議論する発明の診断方法によってモニターすることもできる。
【００７５】
本発明は遺伝子治療も考慮している。生体外（エキソビボ）遺伝子治療を行うための方法は米国特許第５，３９９，３４６およびすべて公に利用できる文書である、特許のファイル経歴に提出されている証拠物件において概説されている。一般にそれは、欠陥遺伝子コピーを持った対象の細胞に機能のある遺伝子コピーを試験管内（インビトロ）で導入し、遺伝子工学的に処理された細胞を対象に戻すというものである。機能のある遺伝子コピーは調節因子の操作できる制御下に置き、遺伝子工学的に処理された細胞で遺伝子が発現できるようにする。適当な発現ベクターと同様に数多くのトランスフェクションやトランスデューションの技術が当業者には周知であり、そのうちのいくつかはＰＣＴ出願ＷＯ９５／００６５４に記載されている。アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよび標的リポソームようなベクターを用いた生体内（インビボ）遺伝子治療もまた本発明によって考慮されている。
【００７６】
本発明はさらに、Ｓｍａｄ２あるいはその断片のような経路限定Ｓｍａｄポリペプチドあるいはその断片によって調節される細胞機能のレベルで作用するような薬物あるいは薬物用のリード化合物を同定するための効果的な方法を提供する。とりわけ、そのような機能にはＴＧＦ−βスーパーファミリーのシグナル伝達およびＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体−Ｓｍａｄ２とＳｍａｄ２−Ｓｍａｄ４タンパク複合体の形成が含まれている。一般に、スクリーニング方法には、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体−Ｓｍａｄ結合などのＳｍａｄ活性を妨害するような化合物の分析が含まれている。そのような方法は自動的で高い処理能力の化合物スクリーニングに適している。スクリーニング方法によって検出される薬物に関する標的となる治療の指標は、標的となる細胞の機能が、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体のような細胞内での１つか複数の天然のＳｍａｄ結合標的又は本発明のＳｍａｄ２ポリペプチドあるいはその断片のような経路限定Ｓｍａｄポリペプチドを含む複合体形成の変質による調節に従うということのみにおいて限定される。標的となる指標は、受容体−リガンドの結合に続くＴＧＦ−β、ＢＭＰおよび／あるいはアクチビンのシグナル伝達によって調節される細胞のプロセスを含んでいる。
【００７７】
薬物を分析するために多種多様な方法が提供されている。それには、試験管内標識タンパク−タンパク結合アッセイ、電気泳動易動度シフトアッセイ、免疫アッセイ、ツー―あるいはスリー−ハイブリッドスクリーニングおよび発現アッセイなどの細胞を用いたアッセイなどがある。たとえば、経路限定ＳｍａｄあるいはＳｍａｄ断片の細胞内での結合に関して核酸を標的細胞にトランスフェクトした場合の効果を迅速に調べるためにはスリー−ハイブリッドスクリーニングが用いられる。トランスフェクトする核酸はたとえば、組合せペプチドライブラリーあるいはアンチセンス分子をコードすることができる。そのような分析に便利な試薬は、たとえば良く知られているＧＡＬ４である。細胞を用いた典型的なアッセイには、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインと融合したＳｍａｄ２ポリペプチドをコードする核酸およびＳｍａｄ２と相互作用するＳｍａｄ４ドメインでＶＰ１６のような転写活性ドメインと融合したものをコードする核酸を１つの細胞にトランスフェクトするようなものがある。細胞はまた、１つか複数のＧＡＬ４結合部位のような遺伝子の発現調節領域に操作できるようにつないだリポーター遺伝子を含んでいる。Ｓｍａｄ２融合ポリプチドとＳｍａｄ４融合ポリプチドが結合するとＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインとＶＰ１６転写活性ドメインはリポーター遺伝子が転写できるように接近して、リポーター遺伝子の転写の活性化が起きる。Ｓｍａｄ２ポリペプチドによる細胞機能を調節するような物質はリポーター遺伝子の発現を変えることによって検出できる。リポーター遺伝子の発現が変わるのを測定する方法は技術的に知られている。
【００７８】
核酸のトランスフェクションによって作られない場合は、上記の方法で用いた経路限定Ｓｍａｄ断片は、単離したポリペプチドとしてアッセイ混合物に加えられる。Ｓｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定Ｓｍａｄポリペプチドは、生物抽出物から単離されるかも知れないが、好ましくは組換え的に作られる。組換え的に作られたＳｍａｄポリペプチドは、ほかのポリペプチド、たとえばタンパク−タンパク結合、配列特異的核酸結合（ＧＡＬ４のような）を作るあるいは増強する能力、アッセイ条件下でＳｍａｄポリペプチドの安定性を高める能力、あるいは緑色蛍光タンパクあるいは下記の例に記載されているようなＦｌａｇエピトープのような検出部位を提供するような能力を持っているポリペプチドとｓｍａｇタンパクとの融合物を含むキメラタンパクを含んでいる。
【００７９】
アッセイ混合物は、Ｓｍａｄポリペプチドと相互作用できるようなＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体あるいはその断片のような細胞内の天然のＳｍａｄ結合標的で構成される。天然のＳｍａｄ結合標的を用いてもよい一方、Ｓｍａｄ結合標的の一部分（たとえばペプチドあるいは核酸の断片）や類似体（すなわちアッセイの目的に関して天然の結合標的のＳｍａｄ結合特性を模倣するような薬物）がＳｍａｄ断片に対してアッセイで測定できる結合親和性や結合活性を持っている限り、その一部分や類似体を利用することが好ましい場合が多い。
【００８０】
アッセイ混合物はまた、候補薬理学的薬剤を含んでいる。通常は、複数のアッセイ混合物は、様々な濃度に対する異なった反応を得るために、いろいろな物質濃度で並行して検定を行う。通常は、このような濃度の１つはネガティブコントロールとして、すなわち物質の濃度がゼロあるいは検出限界以下で働く。候補物質は通常、有機化合物であるけれども数多くの化学物質を含んでいる。好ましくは候補薬理学的薬剤は小さな有機化合物で、すなわちその分子量は５０より大きく約２５００より小さい、好ましくは約１０００より小さく、さらに好ましくは５００より小さいものである。候補物質はポリペプチドおよび／あるいは核酸と構造的に相互作用するために必要な官能基を含んでおり、通常は少なくともアミン基、カルボニル基、水酸基あるいはカルボキシル基を含み、好ましくは少なくとも官能基を２つ含み、さらに好ましくは少なくとも官能基を３つ持つ。候補物質は、１つか複数の上述の官能基で置換した環状炭素あるいは複素環構造および／あるいは芳香族あるいは多芳香族構造を含むことができる。候補物質はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上述の誘導体あるいは構造的類似体、あるいはそれらの組合せのような生体分子でもよい。物質が核酸である場合、ここで定めているような修飾核酸も考慮に入れるが、物質は通常、ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子である。
【００８１】
候補物質は、合成あるいは天然の化合物ライブラリーを含めた多種多様な化合物ソースから得ることができる。たとえば、多種多様な有機化合物や生体分子を無作為にあるいは方向性をもって合成するために数多くの手段を利用することができる。それらには、無作為化オリゴヌクレオチド発現、合成有機組合せライブラリー、無作為ペプチドのファージディスプレイライブラリーなどがある。別の方法としては、細菌、菌類、植物および動物での抽出物における天然化合物のライブラリーも利用できるし、容易に作成される。さらに、天然の、および合成したライブラリーおよび化合物は従来の化学的、物理学的、および生化学的手段によって容易に修飾することができる。さらに、物質の構造的類似体を作成するために、周知の薬物を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような方向を持ったあるいは無作為の化学修飾の対象としてもよい。
【００８２】
そのほかの多様な試薬を混合物に含めることができる。このようなものには、タンパク−タンパクおよび／あるいはタンパク−核酸結合を促進するような、塩、緩衝液、中性タンパク（たとえばアルブミン）界面活性剤などのような試薬が含まれる。そのような試薬はまた反応成分の非特異的あるいはバックグラウンド反応を減らす可能性がある。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を改善するようなそのほかの試薬を用いてもよい。
【００８３】
前述のアッセイ材料の混合物は、候補薬理学的薬剤がなければ、Ｓｍａｄ２ポリペプチドが細胞の結合標的、その一部分あるいはその類似体に特異的に結合するような条件下でインキュベートする。成分を加える順序、インキュベーション温度、インキュベーション時間、およびアッセイのそのほかのパラメーターは容易に決めることができる。そのような実験はアッセイの基本的な組成物ではなく単にアッセイパラメーターの最適化にかかわるだけである。インキュベーション温度は通常、４℃から４０℃の間である。インキュベーション時間は、スクリーニングの迅速で高い処理能力を促進するために最小限が好ましく、通常は０．１から１０時間の間である。
【００８４】
インキュベーションののち、利用者にとって都合の良い方法で、Ｓｍａｄ２ポリペプチドと１つか複数の結合標的との間の特異的結合の有無を検出する。細胞を用いないようなアッセイでは非結合成分と結合成分を分ける分離ステップを用いることが多い。分離ステップは多様な方法で行ってもよい。好適には、成分の少なくとも１つを固体の基材に固相化し、非結合成分を容易に分離する。固体の基材は、たとえばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、計量棒、樹脂の粒子などのように多種多様な素材で、多種多様な形に作ることができる。基材は分離が容易でコストが低いことのみならず、好ましくは、まずバックグラウンド結合を最小にし、シグナルとノイズの比が最大になるようなものを選択する。
【００８５】
分離はたとえば、容器からビーズや計量棒を出すことによって、マイクロタイタープレートのような容器を空にするか希釈することによって、ビーズや粒子やクロマトカラムやフィルターを洗浄溶液や洗浄溶媒ですすぐことによって行ってもよい。分離ステップは、好ましくは、複数回すすぐ、あるいは洗浄することを含んでいる。たとえば、固体基材がマイクロタイタープレートである場合、通常、塩、緩衝液、界面活性剤、非特異的タンパクなどのような特異的な結合に関わらないようなインキュベーション混合物の成分を含む洗浄溶液でウエル（穴）を数回洗浄してもよい。固体基材が磁気ビーズの場合、ビーズを洗浄溶液で１回か複数回洗浄したのち、磁石を用いて分離してもよい。
【００８６】
ツー−あるいはスリー−ハイブリッド・スクリーニングのような細胞を用いたアッセイに関してどのような簡便な方法でも検出効果を上げる可能性はある。標的分子と相互作用するＳｍａｄ２ポリペプチドのリポーター遺伝子転写アッセイで得られた転写物は、βガラクトシダーゼ活性やルシフェラーゼ活性などのような直接的あるいは間接的に検出できる産物をコードしている。細胞を含まない結合アッセイでは普通、成分の１つに検出できる標識を含め、あるいは検出できる標識を結合する。たとえば直接検出できるもの（たとえば放射活性、発光、光学密度あるいは電子密度等）あるいは間接的に検出できるもの（ＦＬＡＧのようなエピトープタグあるいは西洋ワサビペルオキシターゼのような酵素タグなど）のような多種多様な標識を使うことができる。標識は、Ｓｍａｄの結合相手に結合してもよいし、あるいは結合相手の構造内に取りこませてもよい。
【００８７】
標識やそのほかのアッセイ成分の性質によって標識を検出するために多様な方法を用いてもよい。たとえば、標識は固体の基材に結合している間に、あるいは固体基材から分離したのちに検出してもよい。標識は、光学密度あるいは電子密度、放射活性の放出、非放射性エネルギーの移行などによって直接的に検出しても、あるいは抗体に結合して、ストレプアビジン−ビオチン結合などによって間接的に検出してもよい。標識を検出する方法は技術的によく知られている。
【００８８】
発明は、Ｓｍａｄ特異的に結合する物質、そのような物質を同定し、作成する方法、診断や治療や薬剤開発におけるそれらの利用を提供している。たとえば、Ｓｍａｄ２特異的な薬物は、特に、ＴＧＦ−βが誘導するＳｍａｄ２のリン酸化やＳｍａｄ４−Ｓｍａｄ２複合体の形成などのようなＳｍａｄ２を含む経路を不適当に利用していることが疾患や疾患予後と関連している場合に、様々な診断および治療への応用に有用である。新規のＳｍａｄ特異的結合物質は、経路限定Ｓｍａｄ特異抗体（たとえばリン酸化端部抗体）およびツーハイブリッド・スクリーニングのようなアッセイによって同定されるそのほかの細胞内結合物質、および化学ライブラリーなどのスクリーニングによって同定される非天然の細胞内結合物質を含む。
【００８９】
一般に、結合物質へのＳｍａｄ２の結合特異性は結合平衡定数によって示される。Ｓｍａｄポリペプチドに選択的に結合できる標的は、好ましくはその結合平衡定数が少なくとも１０７Ｍ−１、さらに好ましくは約１０８Ｍ−１および最も好ましくは約１０９Ｍ−１である。経路限定Ｓｍａｄ特異的な結合を測定するために、細胞を用いた、および細胞を用いない多種多様なアッセイを利用してよい。細胞を用いたアッセイには、ワン、ツーおよびスリーハイブリッド・スクリーニング法、Ｓｍａｄによる転写の阻害や増加を調べるようなアッセイなどが含まれる。細胞を含まないアッセイには、Ｓｍａｄタンパク結合アッセイや免疫アッセイなどが含まれる。Ｓｍａｄ２ポリペプチドのような経路限定Ｓｍａｄポリペプチドを結合する物質のスクリーニングに有用なそのほかのアッセイには、蛍光共鳴エネルギー移行（ＦＲＥＴ）や電気泳動易動度シフト分析（ＥＭＳＡ）がある。
【００９０】
核酸を試験管内で宿主に導入するか、生体内で導入するかによって、本発明の核酸を細胞に導入するための様々な技術を用いてもよい。そのような技術には、核酸−ＣａＰＯ４のトランスフェクション、ＤＥＡＥに会合させた核酸のトランスフェクション、当該核酸を含んでいるレトロウイルスによるトランスフェクション、リポソームによるトランスフェクションなどがある。ある種の用途では、特殊な細胞に対して核酸を的にすることが好まれる。そのような例では、本発明の核酸を細胞に運ぶために用いられる媒体（たとえばレトロウイルス、あるいはその他のウイルス；リポソーム）がそれ自体に標的分子を結合することができる。たとえば、標的細胞の膜表面タンパクに特異的な抗体のような分子、あるいは標的細胞上の受容体に対するリガンドのような分子は、核酸を運ぶ媒体に結合するか、取り込ませることができる。たとえば、本発明の核酸を運ぶためにリポソームを用いた場合、形質膜陥入に関連した表面膜タンパクに結合しているタンパクは、組み込みのためにおよび／あるいは取りこみを促進するためにリポソーム形成に取り込まれる。そのようなタンパクには、特殊な型の細胞に属するカプシドタンパクやその断片、細胞周期中に内部移行を受けるタンパクに対する抗体、細胞内局在を標的にし、かつ細胞内半減期を増やすようなタンパクがある。当業者にはよく知られているように重合体運搬システムも核酸を細胞に運ぶのに有利に用いられる。そのようなシステムによって核酸の経口投与さえできる。
【００９１】
実施例
材料と方法
細胞株
ＣＯＳ−１細胞とミンクの肺上皮（Ｍｖ１Ｌｕ）細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（ギブコ−ＢＲＬ）中で培養した。
【００９２】
コンストラクトおよび細胞へのトランスフェクション
ＴβＲ−Ｉ、ＴβＲ−ＩＩおよびＳｍａｄ２のプラスミドにおける発現は以前記載されている（ｔｅｎ　Ｄｉｊｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２６４：１０１−１０４，　１９９４；　Ｎａｋａｏら，　１９９６）。Ｓｍａｄ２の突然変異型はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）による方法で作成し、ｐｃＤＮＡ３ベクターでサブクローニングした。Ｓｍａｄ２のｃＤＮＡにおける交換した制限断片の突然変異と配列はＤＮＡの配列決定によって確認した。一過性のトランスフェクションは、Ｃａｒｃａｍｏら、Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１４：３８１０−３８２１，１９９４に記載されたＤＥＡＥ−デキストランプロトコールを用いて行った。
【００９３】
［３２Ｐ］オルトリン酸塩標識、トリプシン分解によるリン酸化ペプチドのマッピング、リン化酸アミノ酸の二次元分析および自動エドマン分解
［３２Ｐ］オルトリン酸塩標識、トリプシン分解によるリン酸化ペプチドのマッピング、リン酸化アミノ酸の二次元分析および自動エドマン分解は以前記載されたように行った（Ｓｏｕｃｈｅｌｎｙｔｓｋｙｉら、ＥＭＢＯ　Ｊ．，　１５：６２３１−６２４０，　１９９６）。要約すれば、０．５％の透析したＦＣＳ，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２，［３２Ｐ］オルトリン酸塩（１．０ｍＣｉ／ｍｌ）を含む、リン酸塩を含まない培養液中で、サブコンフルエントな細胞を標識した。ＴＧＦ−βで６０分間刺激した後で、細胞を洗浄し、溶解緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％トリトン−Ｘ１００，５ｍＭ　ＮａＦ，１０ｍＭ　Ｎａ４ｐ２Ｏ７，１ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４，１ｍＭフェニルメチルフッ化スルホン酸（ＰＭＳＦ）、１００Ｕ／ｍｌアプロチニン）にて溶解した。細胞溶解物はＳｍａｄ２に対するＳＥＤ抗血清（ＳＥＤ；　Ｎａｋａｏら、１９９６）を用いて免疫沈降を行った；免疫沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ニトロセルロース膜に移した。リン酸化されたＳｍａｄ２タンパクを膜から切りだし、その場でトリプシン（改変配列決定等級；プロメガ）にて分解した。二次元リン酸化ペプチドのマッピングは特にＢｏｙｌｅらによって記載された（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　２０１：１１０−１４９．　１９９１）ようにハンターの薄層電気泳動法（ＨＴＬＥ−７０００；ＣＢＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。一次元目の電気泳動は、ｐＨ１．９（ギ酸／氷酢酸／水；４４：１５６：１８００；ｖ／ｖ／ｖ）２０００Ｖにて２７分間行い、二次元目のクロマトグラフィはイソブチル酸／ｎ−ブタノール／ピリジン／氷酢酸／水（１２５０：３８：９６：５８：５５８；ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）で行った。感光したあと、リン酸化ペプチドをｐＨ１．９の緩衝液でクロマト板から溶出し、凍結乾燥した；試料は並行して、二次元リン酸化アミノ酸分析を行い、自動エドマン分解を行った。放射性化合物の配列決定のために、説明書にあるような通常の方法に従って、溶出したリン酸化ペプチドを、カルボジイミドカップリングを用いてセクエロン−ＡＡ膜（ミリポア）に結合させ、アプライド・バイオシステムズのシーケンサー（モデル４７７Ａ）を用いてエドマン分解を行った。各サイクルから放出されたフェニルチオヒダントイン・アミノ酸誘導体で薄層クロマトグラフ板上にスポットをつけた。各スポットの放射活性はフジＸ−バイオ−イメージャーで感光することによって定量した。
【００９４】
ＴＧＦ−β１のヨード化とアフィニティ架橋
Ｆｒｏｌｉｋら（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２５９：１０９９５−１１０００，　１９８４）に従ってクロラミンＴ法にてＴＧＦ−β１をヨード化した。架橋は以前記載された（Ｆｒａｎｚｅｎら，Ｃｅｌｌ，　７５：６８１−６９２，　１９９３）ように行った。１２５Ｉ−ＴＧＦ−βで架橋されたＴＧＦ−βとＳｍａｄ２各受容体の複合体はＳｍａｄ２抗血清（ＳＥＤ；　Ｎａｋａｏら、１９９６）で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した。ゲルを乾燥させ、フジＸ−バイオ−イメージャーで感光した。ＴβＲの発現の同等性を調べるために、細胞溶解物を抗ＴβＲ−Ｉ抗体で免疫沈降し、以前記載したように（Ｆｒａｎｚｅｎら、１９９３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、オートラジオグラフィを行った。Ｓｍａｄタンパクの発現を調べるために、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、電気的にニトロセルロース膜に移し、Ｓｍａｄ２抗血清を用いて免疫ブロットを行い、増強化学発光検出システム（アマシャム）にて検出した。
【００９５】
転写反応アッセイ
ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いてＳｍａｄ２発現プラスミドの存在下あるいは不存在下でＭｖＩＬ細胞にｐ３ＴＰ−Ｌｕｘ（Ｃａｒｃａｍｏら、Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　１５：１５７３−１５８１，　１９９５）を一過性にトランスフェクションした。トランスフェクト後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で細胞を２４時間培養した。次に０．１％ＦＢＳで５時間培養したのちＴＧＦ−β１を加えた。細胞溶解物のルシフェラーゼ活性は、２２−２４時間後にＬＫＢルミノメーター（ＬＫＢ　ブローマ）を用い、プロトコルに従って、ルシフェラーゼ・アッセイ・システム（プロメガ・ビデオテック）で測定した。
【００９６】
ペプチド合成と固相支持体への結合
ペプチドＫＫＫＳＳＭＳ（配列番号：６）およびＫＫＫＹＴＱＭＧＳＰＳＶＲＣＳＳＭＳ（配列番号：７）はアプライドバイオシステムズのペプチドシンセサイザー（モデルＡＢＩ４３０Ａ）を用い、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法によって合成した。相当するペプチドで、最もＣ末端近くの２つのセリン残基がリン酸化されているペプチドは合成の間にリン酸化Ｆ−ｍｏｃセリン残基誘導体を用いて合成した。アプライドバイオシステムズのバイオ　イオン２０装置を用いてプラズマ脱離質量分析によってペプチドを分析した。ペプチドは凍結乾燥し、乾燥状態で保管した。製品プロトコルに従って、ペプチドは第一級アミノ基を介して活性化ＣＮＢｒセファロース４Ｂ（ファルマシア）に結合させた；Ｎ末端の３つのリジンは結合効率促進の役目を果した。結合効率は結合前と後のペプチド溶液のＯＤ２８０（短いペプチドではＯＤ２１５）を測定することにより計算した。４つのペプチドの結合効率はすべてほぼ１００％であった。
ＧＳＴ融合タンパクの作成
【００９７】
ＳｍａｄのｃＤＮＡをｐＧＥＸベクター（ファルマシアＬＫＢ）中にクローニングし、融合タンパクは、原則としてＳｍｉｔｈ　とＪｏｈｎｓｏｎ，　Ｇｅｎｅ，　６３：３１−４０，　１９８８に記載されているように、調整され、吸収された。
ＧＳＴ融合タンパクとリン酸化および非リン酸化Ｓｍａｄ２ペプチドとの結合
【００９８】
リン酸化および非リン酸化Ｓｍａｄ２由来のＣ末端ペプチドを、１％トリトンを含むリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）に０．１％ＢＳＡを加えたものの中でＧＳＴ−Ｓｍａｄ融合タンパクと共に４℃で一晩インキュベートした。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで５回洗浄したのち、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した。タンパクは電気的にニトロセルロース膜に移し、抗ＧＳＴ抗体で免疫ブロットを行い、増強化学発光検出システム（アマシャム）にて検出した。
【００９９】
実施例１．Ｓｍａｄ２の生体内リン酸化部位のマッピング
ＴＧＦ−β受容体が活性化されることによりＳｍａｄ２のセリン残基およびスレオニン残基がリン酸化される（Ｅｐｐｅｒｔら、１９９６；　Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら、１９９６；　Ｎａｋａｏら，１９９６）。Ｓｍａｄ２のリン酸化された残基の位置を特定するために、トリプシンによるリン酸化ペプチドの二次元マッピングを行った。トランスフェクトしていないＭｖ１Ｌｕ細胞、Ｓｍａｄ２だけを一過性にトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞、およびＳｍａｄ２と共にＴβＲ−ＩとＴβＲ−ＩＩを一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞を［３２Ｐ］オルトリン酸塩で標識し、ＴＧＦ−β１の存在下あるいは不存在下で培養した。そののち、Ｓｍａｄ２抗血清を用いて細胞溶解物の免疫沈降を行い、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、オートラジオグラフィを行った。フジＸバイオ−イメージャーを用いてゲル板を感光し、分析した。試料を乗せたところは小さな黒い四角形で示されている。ＴＧＦ−β１の不存在下ではＳｍａｄ２はほんのわずかにリン酸化されるにすぎないが、リガンドによる刺激ののち、リン酸化は劇的に増加した（図１Ａ）。
【０１００】
図１Ａに示される実験におけるＳｍａｄ２リン酸化タンパクを膜に移し、切り出して（レーン３（Ｂ），４（Ｃ），５（Ｅ），および６（Ｆ））トリプシン分解を行った。トリプシン分解ののち、高圧電気泳動と薄層クロマトグラフィでペプチドを展開した。３２Ｐ−標識リン酸化ペプチドの二次元マッピング分析によれば、様々な濃度で約１６個のスポットが見い出された（図１Ｂ，Ｃ，Ｄ）。リガンドの刺激がない場合、ブロードな痕跡（スポット１８）および薄いスポットがわずかに認められた。豊富にリン酸化されたペプチド（スポット１８）は、ＭＨ１とＭＨ２ドメインの間のプロリン−リッチリンカー配列をほぼ完全にカバーするような大きなトリプシン分解ペプチド配列からのペプチドに対して作成した抗血清で免疫沈降した。このリン酸化ペプチドにはリン酸化セリンもリン酸化スレオニンも含まれていた。
【０１０１】
ＴＧＦ−β１の刺激によって複数のスポットが出現し、誘導された；特に、負に強く荷電した７つのリン酸化ペプチドが認められた（スポット５，６，６ｎ、１２ａ、１２ｂ，１２ｃおよび１５）。内因性のＳｍａｄ２のみのＭｖ１Ｌｕ細胞およびＳｍａｄ２が過剰発現しているＭｖ１Ｌｕ細胞のリン酸化ペプチドマップは、過剰発現Ｓｍａｄ２のマップのほうがシグナルは強いものの同一であった。ＣＯＳ−１細胞でＴβＲ−ＩおよびＴβＲ−ＩＩと共にＳｍａｄ２を過剰発現させ、リガンドとともに培養した場合、やはりＳｍａｄ２のリン酸化が刺激された（図１Ａ）．このような細胞で生体内リン酸化を受けたＳｍａｄ２のトリプシン分解リン酸化ペプチドマップは、Ｍｖ１Ｌｕ細胞のリン酸化Ｓｍａｄ２とほぼ同様のパターンを示した（図１Ｅ，Ｆ，Ｇ）。スポット１からスポット１８までのリン酸化アミノ酸の分析は、リン酸化セリンとリン酸化スレオニンの両方の残基を含んでいるスポット１１とスポット１８を除くすべてにおいてセリン残基がリン酸化されていることを示した（データは示さず）。リン酸化チロシンを含んでいるスポットはなかった。
【０１０２】
図１Ｆのスポット１５に相当するリン酸化ペプチドでリン酸化アミノ酸分析を行った。標準として用いたリン酸化セリン（Ｓｐ）、リン酸化スレオニン（Ｔｐ）およびリン酸化チロシン（Ｙｐ）の移動を示す。リン酸化ペプチドにおけるリン酸化された残基の位置を同定するために、二次元クロマトグラフィ板から抽出したペプチドのエドマン分解における放射活性の放出を測定した。３２−Ｐ標識アミノ酸の溶出位置が示され、３番目と５番目にセリン残基を含んでいるＳｍａｄ２由来のトリプシン分解ペプチドの唯一可能な配列が導かれた。リン酸化セリンだけを含んでいるスポット１５に相当するペプチドは、３サイクルと５サイクルに３２Ｐ−放射活性の放出が得られ、後のサイクルにいくぶん尾を引いたが、それはこの方法の特徴である。相当するトリプシン分解ペプチドが３番目と５番目にセリン残基を持っているＳｍａｄ２の中で唯一のものだったので（図２ＡとＢ）、これはＳｍａｄ２のＣ末端におけるＳｅｒ４６５とＳｅｒ４６７がリン酸化されたことを示している。トリプシン分解ペプチドのＣ末端はリン酸化できるもうひとつのアミノ酸すなわちＳｅｒ４６４を含んでいた。しかしながら、放射性化合物による配列決定およびリン酸化アミノ酸分析によれば、Ｓｅｒ４６４が単独あるいはＳｅｒ４６５およびＳｅｒ４６７との組合せでリン酸化される場合に予想される移動位置にあるリン酸化ペプチドにおける２番目の位置ではリン酸化セリンは示されなかった。従ってＳｍａｄ２のＳｅｒ４６４はＴＧＦ−βの刺激によってはリン酸化されないものと思われる。
【０１０３】
Ｓｅｒ４６５とＳｅｒ４６７がＳｍａｄ２におけるリン酸化部位であることを確認するために、これらの残基と隣接するＳｅｒ４６４を単独あるいは組み合わせてアラニン残基に突然変異させた。Ｓｍａｄ２／Ｓ４６４Ａ（Ｓ４６４Ａ），Ｓｍａｄ２／Ｓ４６５，４６７Ａ（Ｓ４６５，Ｓ４６７Ａ），およびＳｍａｄ２／Ｓ４６４，４６５，４６７Ａ（／Ｓ４６４，４６５，４６７Ａ）突然変異型についても野生型Ｓｍａｄ２（Ｗ．Ｔ．）と同様に二次元リン酸化ペプチドマッピングを行った。Ｓｍａｄ２あるいはＳｍａｄ２突然変異型をＴβＲ−ＩおよびＴβＲ−ＩＩとともにＣＯＳ−１細胞に一過性にトランスフェクトし、［３２Ｐ］オルトリン酸塩で標識した。ＴＧＦ−βで処理したのち、野生型Ｓｍａｄ２あるいはＳｍａｄ２突然変異型について免疫沈降を行い、トリプシン分解リン酸化ペプチドの二次元マッピングを行った。試料を乗せた位置は黒い四角形で示されている。矢印はトリプシン分解ペプチドを構成しているＳｅｒ４６５とＳｅｒ４６７の移動位置を示している。３２Ｐ−標識ＴＧＦ−β刺激ＣＯＳ−１細胞から得た野生型Ｓｍａｄ２および突然変異型Ｓｍａｄ２のトリプシン分解リン酸化ペプチドの二次元マッピング分析では、Ｓｅｒ４６５とＳｅｒ４６７がリン酸化されたペプチドに相当するスポット１５は、スポット１５を含むＳｍａｄ２／Ｓ４６５Ａ突然変異型のリン酸化ペプチドマップには認められないということが判った；Ｓｍａｄ２Ｓ４５４Ａ突然変異型のマップは実際、野生型Ｓｍａｄ２のマップと同一であった。さらに、Ｓｍａｄ２／Ｓ４６４，４６５，４６７Ａ三連突然変異型のリン酸化ペプチドマップもスポット１５を欠き、Ｓｍａｄ２／Ｓ４６５，４６７Ａ突然変異型のマップと同じであった。このようにＳｅｒ４６５とＳｅｒ４６７がＳｍａｄ２における生体内リン酸化部位である。
【０１０４】
図２ＤはＳｍａｄ２の模式図とＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３およびＳｍａｄ５のＣ末端配列である。保存的な残基は囲って示している。Ｃ末端モチーフＳＳ（Ｍ／Ｖ）Ｓ（配列番号：５）はＳｍａｄ１，Ｓｍａｄ２，Ｓｍａｄ３，Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９で見い出された。従ってこのようなＳｍａｄはすべて適当な活性化された受容体の直接的な基質であるという可能性がある。この可能性のとおりに、ＴＧＦ−βで刺激した細胞から得たＳｍａｄ３のリン酸化ペプチドマップではＳｍａｄ２のスポット１５と似たように移動するリン酸化ペプチドが見られた；Ｃ末端ＳＳ（Ｍ／Ｖ）Ｓモチーフを欠いているＳｍａｄ４のマップにはそのようなスポットは認められなかった。
【０１０５】
実施例２：Ｓｅｒ４６５のリン酸化にはＳｅｒ４６７がリン酸化されていることが必要である。
Ｓｅｒ４６５とＳｅｒ４６７は互いに極めて近傍に位置しているので、それらが順次リン酸化されている可能性について調べた。Ｓｅｒ４６５あるいはＳｅｒ４６７がアラニン残基あるいはアスパラギン酸残基に変換しているようなＳｍａｄ２突然変異型のＴβＲ−Ｉによるリン酸化をトランスフェクション後のＣＯＳ−１細胞で明らかにした。ＴＧＦ−β受容体を共発現させ、ＴＧＦ−βで刺激したあとで、野生型Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ２／Ｓ４６５Ａ，Ｓｍａｄ２／Ｓ４６５Ｄ，Ｓｍａｄ２／Ｓ４６７Ａ，およびＳｍａｄ２／Ｓ４６７Ｄ突然変異型に関して、トリプシン分解ペプチドの二次元マッピングを上述のように行うと，すべての場合でスポット１５は消失することが判った。矢印はＳｍａｄ２／Ｓ４６７Ａ突然変異型のマップにはない、トリプシン分解ペプチドのＣ末端の移動位置を示している。明らかにＳｍａｄ２／Ｓ４６５Ａ，Ｓｍａｄ２／Ｓ４６５Ｄ，およびＳｍａｄ２／Ｓ４６７Ｄ突然変異型で新しいスポットが１つ出現したが、それはＳｍａｄ２／Ｓ４６７Ａの突然変異型のマップには見られなかった（図３Ａ）。この新しいスポットはｐＨ１．９の電気泳動における移動距離がスポット１５に比べて短く、新しいリン酸化ペプチドはリン酸化の程度が低いと考えられ、２つの残基ではなく１つの残基でリン酸化が起きていることを示唆していた。Ｓｍａｄ２／Ｓ４６５ＡおよびＳｍａｄ２／Ｓ４６７Ｄ突然変異型のマップに現れた新しいリン酸化ペプチドのエドマン分解溶出パターンを図３Ｂに示す。各サイクルで放出された３２Ｐ−放射活性を測定した。Ｓｍａｄ２突然変異型のＣ末端アミノ酸配列は分画番号に沿って示してある。Ｓｍａｄ２／Ｓ４６５Ａ突然変異型のマップから得た新しいスポットの放射性化合物による配列決定を行うと、放射活性は５サイクル目に溶出され、Ｓｅｒ４６５の突然変異後トリプシン分解ペプチドのＣ末端Ｓｅｒ４６７でリン酸化が起きたという予想に一致した。新しいスポットがＳｍａｄ２／Ｓ４６７Ａ突然変異型のマップで見られないという事実はＳｅｒ４６５のリン酸化にはＳｅｒ４６７のリン酸化が必要であるということを示唆している。Ｓｍａｄ２／Ｓ４６７Ｄ突然変異型のマップでは新しいスポットが認められたという知見は、４６７番目に負の電荷を導入したことによってＳｅｒ４６５のリン酸化が回復できることを示唆していた。そのスポットの放射性化合物による配列決定では放射活性のピークは３サイクル目に溶出された。このことは、Ｓｍａｄ２／Ｓ４６７Ｄ突然変異型のＣ末端ペプチドでＳｅｒ４６５がリン酸化されたことを示しており、Ｓｅｒ４６７におけるリン酸化という必要条件はこの残基に負の電荷を導入することによって回避できることを示唆していた。
【０１０６】
実施例３：Ｓｅｒ４６４，Ｓｅｒ４６５および／あるいはＳｅｒ４６７における突然変異はＴＧＦ−βによるシグナル伝達を妨害する。
ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＳｅｒ４６４，Ｓｅｒ４６５およびＳｅｒ４６７の重要性を明らかにするために、このような残基を単独であるいは組み合わせてアラニン残基あるいはアスパラギン酸残基に置きかえたＳｍａｄ２突然変異型について、ＴＧＦ−βが介在する転写反応を阻害する能力を、ｐ３ＴＰ−Ｌｕｘリポータープラスミドを用いて測定した（図４）。ｐ３ＴＰ−Ｌｕｘプラスミドを単独で、あるいはＳｍａｄ２あるいはＳｍａｄ２突然変異型発現プラスミドとともにＭｖ１Ｌｕ細胞に一過性にトランスフェクトした。１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１で刺激する前（■）と後（□）でルシフェラーゼ活性を測定した。値は、サイトメガロウイルスプロモーターの転写制御下でのβ−ｇａｌリポーター遺伝子を用いたトランスフェクション効率に対して標準化した。三回独立に行った実験の代表を示す。以前の結果（Ｚｈａｎｇら、１９９６）に一致して、トランスフェクトされた野生型Ｓｍａｄ２が存在しようと不存在であろうとシグナル伝達には差異が認められなかったことは、内因性のＳｍａｄ２のレベルで十分に反応できることを示している。Ｓｅｒ４６５あるいはＳｅｒ４６７がアラニン残基に置き換わっているようなＳｍａｄを発現しているものはどれもルシフェラーゼシグナル性が減少した。リン酸基の負の電荷を模倣するためにアスパラギン酸残基を導入してもルシフェラーゼ発現の刺激は回復しなかった。明らかに、Ｓｍａｄ２／Ｓｅｒ４６４Ａもドミナントネガティブ阻害剤として作用した。しかしながら、実験のなかには、この突然変異型のＴＧＦ−βシグナル伝達における阻害効果が、Ｓｍａｄ２／Ｓ４６５ＡやＳｍａｄ２／Ｓ４６７Ａよりも小さいものもあった。このように、Ｓｍａｄ２におけるＳｅｒ４６４および特にリン酸化されやすい残基であるＳｅｒ４６５およびＳｅｒ４６７はＴＧＦ−βが誘導するｐ３ＴＰ−Ｌｕｘの転写反応に必要なものである。
【０１０７】
実施例４：野生型Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ２突然変異型とＴβＲ−Ｉとの結合ＣＯＳ−１細胞に野生型Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ２突然変異型をＴＧＦ−β受容体と共に共発現させることによってＳｍａｄ２とＴＧＦ−β受容体複合体との相互作用を調べた（図５）。野生型Ｓｍａｄ２（Ｗ．Ｔ．）あるいはＳｍａｄ２突然変異型をＴβＲ−ＩＩおよび野生型（Ｗ．Ｔ．）あるいはキナーゼを不活化した（Ｋ．Ｒ．）ＴβＲ−Ｉと組み合わせてＣＯＳ−１細胞に形質移入した。Ｃ末端においてＨＡエピトープでタグを付けたＷＴＴβＲ−ＩおよびＫＲＴβＲ−Ｉコンストラクトを用いた。受容体は１２５Ｉ−ＴＧＦ−β１とアフィニティ架橋した。細胞溶解物をＳｍａｄ２抗血清で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィで分析した。ＴβＲ−ＩとＴβＲ−ＩＩの移動位置を示す。Ｓｍａｄ２−受容体の相互作用は１２５−Ｉ−ＴＧＦ−β１で架橋してある受容体をＳｍａｄ２に対する抗体が共沈させる能力で測定する。以前の結果（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら、１９９６）のとおりに、ＴβＲ−Ｉのキナーゼが不活化されＴβＲ−ＩＩのキナーゼでリン酸化されるという条件下で野生型Ｓｍａｄ２はＴβＲ−Ｉと相互作用する；一方、Ｃ末端の３つのセリンがアラニンに変わっているようなＳｍａｄ突然変異型は活性化した野生型ＴβＲ−Ｉにも高い親和性で結合することができるということが判った。Ｓｍａｄ２の１つあるいは２つのセリン突然変異型についても同様の実験系で、ＴβＲ−ＩＩとの複合体中において野生型のＴβＲ−Ｉあるいはキナーゼ不活化のＴβＲ−Ｉ突然変異型と相互作用する能力を分析した。２つのセリン突然変異型は３つのセリン変異型と同様にＴβＲ−Ｉと相互作用した。さらに、１つのセリン変異型も野生型ＴβＲ−Ｉと相互作用することが判った。興味深いことに、Ｓｅｒ４６４は生体内のリン酸化部位ではないけれども、Ｓｍａｄ２／Ｓ４６４ＡはＳｍａｄ２／Ｓ４６５ＡおよびＳｍａｄ２／Ｓ４６７Ａ突然変異型と同じくらい効果的にＴβＲ−Ｉと相互作用した（図５）。架橋した１２５Ｉ−ＴＧＦ−β受容体複合体の免疫沈降とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィで確認されたように、ＴβＲ−ＩとＴβＲ−ＩＩは同じようなレベルで発現していた；またＳｍａｄ２も、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分画をＳｍａｄ２抗血清により免疫ブロットしたところ、同じようなレベルで発現していた（データは示さず）。これらのデータは、ＴＧＦ−βによる遺伝子発現に対する刺激におけるＳｍａｄ２およびＳｅｒ４６４，Ｓｅｒ４６５および／あるいはＳｅｒ４６７での突然変異型のドミナントネガティブ効果（図４）に一致しており、ＴβＲ−Ｉへの結合メカニズムにおいてＳｍａｄ２突然変異型と内因性Ｓｍａｄ２が競合することを示唆している。
【０１０８】
実施例５：Ｓｍａｄ２のＣ末端に由来するペプチドはリン酸化されている場合の方がリン酸化されていないものよりも高い親和性でＧＳＴ−Ｓｍａｄ４に結合する。
Ｓｍａｄ２のリン酸化されたＳｅｒ４６５およびＳｅｒ４６７がＳｍａｄ４とのヘテロマー相互作用に直接関与しているかどうかを調べるために、Ｓｍａｄ２Ｃ末端に相当するリン酸化したペプチドとリン酸化していないペプチドを作成し、ＧＳＴ−Ｓｍａｄ４融合タンパクへの結合能を調べた。Ｓｍａｄ２Ｃ末端の短いペプチドＳＳＭＳ（ＳＮｐ；配列番号：３）とそれをリン酸化したもの（ＳＰｐ）、および長いペプチドＴＱＭＧＳＰＳＶＲＣＳＳＭＳ（ＬＮｐ；配列番号：４）とそれをリン酸化したもの（ＬＰｐ）をＣＮＢｒ−セファロース（ペプチド−ビーズ）に結合し、ＧＳＴあるいはＧＳＴ−Ｓｍａｄ４融合タンパクとインキュベートした。競合させるために大過剰の（２００μＭ）リン酸化していない短い（ＳＮｐ）あるいは長い（ＬＮｐ）ペプチドあるいはそれらをリン酸化したもの（それぞれＳＰｐとＬＰｐ）を用いた（阻害）。ビーズに結合したタンパクはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロース膜に移して抗ＧＳＴ抗体で免疫ブロットした。ＧＳＴおよびＧＳＴ−Ｓｍａｄ４の移動位置を二重矢で示す。標準タンパクの分子量は、タンパク染色したＧＳＴとＧＳＴ−Ｓｍａｄ４が示されているゲルの左側に表示する。Ｓｍａｄ４はＳｍａｄ２のＣ末端の４つのアミノ酸を含有する二重にリン酸化されたペプチド（ＳＳｐＭＳｐ；配列番号：３）に結合するが、同じペプチドがリン酸化されていない場合はほとんど（まったく）結合しないことが判った（図６）。またＳｍａｄ２の１４個のＣ末端アミノ酸を含有するリン酸化された長いペプチド（ＴＱＭＧＳＰＳＶＲＣＳＳｐＭＳｐ；配列番号：４）はＳＳｐＭＳｐペプチドよりも効率よくＧＳＴ−Ｓｍａｄ４に結合することが判った。また、リン酸化された長いペプチドは同じペプチドがリン酸化されていない場合よりも効率的にＧＳＴ−Ｓｍａｄ４に結合したが、リン酸化されていない長いペプチドとの間には少なからぬ結合が認められた。このことは、Ｓｍａｄ２とＳｍａｄ４との結合はＳｍａｄ２のＳｅｒ４６５とＳｅｒ４６７のリン酸化にだけ依存しているのではなく、リン酸化部位の上流の配列も関与していることを示している。過剰に加えた短いあるいは長いリン酸化されたペプチドによって結合は阻害されるけれども、無関係なリン酸化ペプチド、リン酸化セリンあるいはＳｍａｄ２に由来するペプチドを過剰に加えても阻害しないのでその相互作用は特異的である；ＧＳＴタンパクはリン酸化されたペプチドとは結合しなかった（図６およびデータは示さず）。
【０１０９】
実施例６：Ｓｍａｄ２リン酸化端部に対する抗体の作成
ＴＧＦ−β受容体によってリン酸化されたＳｍａｄ２に対するウサギの抗血清をＳｍａｄ２のリン酸化された端部に対して作成した。キャリアータンパクとの結合を促すために、配列番号：３アミノ酸のＮ末端に３つのリジンペプチド（ＫＫＫ）を加えた。下線部のセリン（５番目と７番目のアミノ酸でＳｍａｄ２のＳｅｒ４６５とＳｅｒ４６７に相当する）がリン酸化されているでき上がったペプチド、ＫＫＫＳＳＭＳ（配列番号：６）をポリクローナル抗体作成のための標準的なプロトコールに従って、グルタールアルデヒドによってカサガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）のヘモシアニンに結合し、フロイントのアジュバントと混合してウサギを免疫するために用いた。免疫したウサギから採血し、常法に従い抗血清を調製した。リン酸化セリン特異的抗血清（Ｓｍａｄ２リン酸化端部抗体という）の特徴を以下の実施例で述べる。上記の方法でほかにもＳｍａｄ２リン酸化セリンに特異的な抗血清を作成する。それには、１４個のアミノ酸から成るペプチド（配列番号：４）、配列番号：４の４−１１番目、５−１２番目、６−１３番目および７−１４番目に相当する８個のアミノ酸から成るペプチド、配列番号：４の８−１１番目、９−１２番目および１０−１３番目に相当する４個のアミノ酸から成るペプチドを用いる。さらにほかのＳｍａｄ２リン酸化セリンに特異的な抗血清を作成するためには必要に応じてほかのペプチドを選ぶことができる。前述のペプチドにおいてセリン残基の１つか複数がリン酸化されている。
【０１１０】
実施例７：ウエスタンブロット分析によれば、Ｓｍａｄ２リン酸化端部抗体は、ＴＧＦ−βＩ型受容体によりリン酸化されたＳｍａｄ２を認識する。
ＴＧＦ−βＩ型受容体およびＩＩ型受容体およびＳｍａｄ２を発現するプラスミドを用いて、Ｓｍａｄ７発現プラスミドの存在下あるいは不存在下でＣＯＳ細胞をトランスフェクトした。細胞はＴＧＦ−βとともに、あるいはＴＧＦ−βを加えずに培養し、細胞溶解物を作成して、例６で作成したＳｍａｄ２リン酸化端部抗体を用いてウエスタンブロットを行った。実験結果を図７に示す。Ｓｍａｄ７およびＴＧＦ−βの不存在下では、Ｓｍａｄ２は弱くリン酸化され（レーン１）、リガンドを加えるとリン酸化は増加する（レーン４）。リガンド不存在下でのリン酸化は、ＣＯＳ細胞中において、受容体が、リガンドとは無関係にヘテロマー複合体を形成するために起きる。Ｓｍａｄ２Ｃ末端におけるＳｅｒ４６５とＳｅｒ４６７の受容体依存性のリン酸化を阻害するＳｍａｄ７が十分量存在する場合は、Ｓｍａｄ２におけるリン酸化に濃度依存性の減少が認められた。このように、Ｓｍａｄ２リン酸化端部抗体は、ＴＧＦ−βＩ型受容体によりリン酸化されたＳｍａｄ２を認識する。同じブロットをＳｍａｄ２特異的抗体で再ブロットした；各トランスフェクションでＳｍａｄ２は同じように発現していた。
【０１１１】
実施例８：Ｓｍａｄ２リン酸化端部抗体は、代謝的に標識し、ＴＧＦ−βで刺激した細胞の抽出物中のリン酸化されたＳｍａｄ２を認識する。
Ｓｍａｄ２リン酸化端部抗体がＴＧＦ−βの刺激に続いてリン酸化されるＳｍａｄ２と結合するかどうかを調べるために、膠芽細胞腫の細胞株Ｕ３４３ＭＧａ３５Ｌを３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインで４時間、代謝的に標識した。ＴＧＦ−βを加える場合は標識時間の最後の１時間に１０ｎｇ／ｍｌ加えた。細胞溶解物をプロテインＡセファロースビーズと共にインキュベートすることにより事前処理をした。プロテインＡセファロースビーズを除くために遠心分離を行った後、細胞抽出物をＳｍａｄ特異抗体を用いて免疫沈降に付した。抗血清‘５４３’はＳｍａｄ２を認識し、‘５４２’はＳｍａｄ３に特異的であり、‘ＤＰＣ’はＳｍａｄ４に対して作成し、‘５９７’は実施例６で作成したＳｍａｄ２リン酸化端部抗体である。抗体の特異性を示すために、対照には抗血清を作成するために用いたペプチドを含めた。抗血清と共に２時間インキュベートしたのち、免疫複合体をプロテインＡセファロースビーズを用いて回収した。ビーズは溶解緩衝液（１２５ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１ｍＭ　ＰＭＳＦ，１．５％トラシロール、および１％トリトンＸ−１００）で３回洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％ＳＤＳ，０．５％デオキシコレート、０．５％トリトンＸ−１００，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０）で３回洗浄し、および高塩緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，１％トリトンＸ−１００）で３回洗浄した。免疫複合体は８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、フジ−Ｘバイオイメージャーにて視覚化した。図８に示すように、Ｕ−３４３ＭＧａ３５Ｌは、５４３抗血清で特異的に認識されるＳｍａｄ２タンパクを明らかに発現しており（レ−ン１，２，９および１０）、またＳｍａｄ４はＤＰＣ抗体によって沈降していた（レーン５，６，１３，１４）。Ｓｍａｄ３はこの細胞では検出されなかった。ＴＧＦ−β不存在下では、Ｓｍａｄ２リン酸化端部抗血清（５９７）は、どのＳｍａｄタンパクも検出しなかった（レーン７，８）。１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１で細胞を１時間処理すると、Ｓｍａｄ２リン酸化端部抗体は明らかに、特異的にリン酸化されたＳｍａｄ２を認識した（レーン１１，１２）。これらのデータは、Ｓｍａｄ２リン酸化端部抗血清が、代謝的に標識した細胞の抽出物に存在する、ＴＧＦ−βによって誘導されたＳｍａｄ２のリン酸化を検出するのにうまく利用できることを示している。
【０１１２】
実施例９：経路限定Ｓｍａｄ１，Ｓｍａｄ３，Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９を認識するリン酸化端部抗体の作成
ＴＧＦ−βによってリン酸化されたＳｍａｄ１，Ｓｍａｄ３，Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９を認識するウサギ抗血清を、これらのＳｍａｄタンパクのリン酸化端部に当たるペプチドに対して作成した。キャリアータンパクとの結合を促進するために、配列番号：８（ＳＳＶＳ）のアミノ酸のＮ末端に３つのリジンペプチド（ＫＫＫ）を加えた。でき上がったペプチド、たとえばＫＫＫＳＳＶＳ（配列番号：９）は１つか複数のセリンがリン酸化されているが、これをグルタールアルデヒドによってカサガイのヘモシアニンに結合した。Ｓｍａｄ特異的抗体を作成するために必要に応じてさらに長いペプチドも用いた。たとえば、追加のペプチドは、Ｓｍａｄ１，Ｓｍａｄ３，Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９のＣ末端に由来するさらに長いペプチドにＫＫＫリンカーを加えたものである。たとえば、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３を含むアミノ酸１４個から成る配列番号：４の類似体、あるいは配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３の７−１４番目に相当する８個のアミノ酸から成る中間の長さのペプチドである。Ｃ末端の端から２つのアミノ酸を欠くようなＳｍａｄＣ末端ペプチドを含めて、さらにほかのペプチドも、経路限定Ｓｍａｄタンパクに対する抗体を作成するために使う（たとえば、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３の９−１２番目に相当する４個から成るペプチド、あるいは配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３の５−１２番目に相当する８個から成るペプチド）。前述のペプチドはすべてＣ末端セリン残基の１つか複数がリン酸化されている。
【０１１３】
ポリクローナル抗体を作成する常法に従って、キャリアータンパクと結合したペプチドはフロイントアジュバントと混合してウサギの免疫に用いる。リン酸化セリン特異的な抗血清の特徴を以下の例で述べる。経路限定Ｓｍａｄタンパクのリン酸化型と非リン酸化型に対するポリクローナル抗体の特異性を、免疫沈降とウエスタンブロットを含む当業者にはよく知られた方法で調べることができる。経路限定Ｓｍａｄタンパクのリン酸化型に対する抗血清で、経路限定Ｓｍａｄタンパクの非リン酸化型と交叉反応するものは、必要に応じ、アフィニティ精製することにより、経路限定Ｓｍａｄタンパクのリン酸化型のみを認識するポリクローナル抗体を得ることができる。別の方法としては、以下の実施例１２で述べるように経路限定Ｓｍａｄタンパクのリン酸化型に対するモノクローナル抗体を作成することもできる。常法に従って、経路限定Ｓｍａｄタンパクのリン酸化型を選択的に認識する抗体の発現についてモノクローナル抗体を産生している各ハイブリドーマクローンを調べることができる。
実施例１０：ウエスタンブロット分析によれば、経路限定Ｓｍａｄリン酸化端部抗体は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型受容体によりリン酸化した、経路限定Ｓｍａｄを認識する。
【０１１４】
実施例７で述べたように、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体および経路限定Ｓｍａｄを発現するプラスミド（Ｓｍａｄ１，Ｓｍａｄ３，Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９）をいろいろな量でＳｍａｄ７を発現するプラスミドの存在下あるいは不存在下でＣＯＳ細胞にトランスフェクトする。リン酸化Ｓｍａｄ１，Ｓｍａｄ５あるいはＳｍａｄ９を認識する抗体を調べるために、ＢＭＰＩ型およびＩＩ型受容体およびＳｍａｄ１，Ｓｍａｄ５あるいはＳｍａｄ９発現プラスミドを細胞にトランスフェクトする。リン酸化Ｓｍａｄ３を認識する抗体を調べるために、ＴＧＦ−βあるいはアクチビンのＩ型およびＩＩ型受容体およびＳｍａｄ３発現プラスミドを細胞にトランスフェクトする。次にトランスフェクトした受容体によってＴＧＦ−β、アクチビンあるいはＢＭＰ分子の存在下および不存在下で細胞を調べ、常法に従い細胞溶解物を作成し、経路限定Ｓｍａｄリン酸化端部抗血清を用いてウエスタンブロットを行う。ＴＧＦ−β、アクチビンあるいはＢＭＰ分子の存在下では経路特異的なＳｍａｄはリン酸化され、リン酸化端部抗体で認識される。個々のリン酸化されたＳｍａｄタンパクに対して選択的な抗体は抗体作成に用いた各種ペプチド（およびリン酸化されていないペプチド）を利用する阻害実験によって同定することができる。たとえば、Ｓｍａｄ１リン酸化ペプチドに対して作成した抗体で、過剰なＳｍａｄ１リン酸化ペプチドの存在下で対応抗原に結合せず、リン酸化されていないＳｍａｄ１ペプチド、あるいはＳｍａｄ３，Ｓｍａｄ５および／あるいはＳｍａｄ９リン酸化ペプチドの存在下で対応抗原に結合するようなものは、Ｓｍａｄ１のリン酸化されたＣ末端に選択的に結合する抗体である。従って経路限定Ｓｍａｄリン酸化端部抗体は、ＴＧＦ−βＩ型の受容体が介在してリン酸化された経路特異的なＳｍａｄを認識する。
【０１１５】
実施例１１：経路特異的なＳｍａｄリン酸化端部抗体は、代謝的に標識し、かつＴＧＦ−βで刺激した細胞の抽出物中における、リン酸化された経路特異的Ｓｍａｄを認識する。
経路限定Ｓｍａｄを過剰発現している細胞株（たとえば天然に過剰発現している、あるいは発現プラスミドでトランスフェクトした）を３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインで４時間、代謝的に標識する。ＴＧＦ−β１を１０ｎｇ／ｍｌ加え又は加えずに標識時間の最後の１時間細胞をインキュベートする。常法に従って細胞を溶解する。細胞溶解物はプロテインＡセファロースビーズと共にインキュベートすることにより事前処理する。ビーズを除くために遠心分離した後、経路特異的Ｓｍａｄリン酸化端部抗血清を用いて細胞抽出物を免疫沈降する。抗血清の特異性を示すために、コントロールには抗血清作成に用いた経路特異的ペプチドも含める。２時間インキュベートした後、プロテインＡセファロースビーズで免疫複合体を回収する。ビーズは溶解緩衝液（１２５ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１ｍＭ　ＰＭＳＦ，１．５％トラシロール、および１％トリトンＸ−１００）で３回洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％ＳＤＳ，０．５％デオキシコレート、０．５％トリトンＸ−１００，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０）で３回洗浄し、および高塩緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，１％トリトンＸ−１００）で３回洗浄する。免疫複合体は８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分画し、フジ−Ｘバイオイメージャーにて視覚化する。１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１で１時間細胞を処理した場合、経路特異的なＳｍａｄリン酸化端部抗体は、リン酸化された経路特異的Ｓｍａｄタンパクを明らかに特異的に認識する。従って、抗体は代謝的に標識した細胞抽出物に存在する経路特異的Ｓｍａｄタンパクのそれぞれを効果的に免疫沈降する。
【０１１６】
実施例１２：モノクローナル抗体の作成
１．マウスの免疫
Ｃ末端に１つか複数のリン酸化セリン残基を持つ経路限定Ｓｍａｄペプチドをダルベッコのリン酸緩衝液生理食塩水に懸濁し、等量の完全フロイントアジュバント（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）で乳状液にしたものを、マウス（たとえばＢＡＬｂ／ｃメス；ジャクソン研究所、バーハーバー，ＭＥ）に皮下注射あるいは腹腔内注射することにより免疫する。ダルベッコのリン酸緩衝液生理食塩水にリン酸化Ｓｍａｄペプチドを懸濁し、等量の不完全フロイントアジュバント（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）で乳状液にしたものを、最初の免疫に続いて１４日間の間隔で腹腔内に２度注射することにより、追加免疫を行う。
【０１１７】
２．抗体産生に関するマウスのスクリーニング
常法に従い、免疫沈降あるいはウエスタンブロットによって、リン酸化Ｓｍａｄペプチドに対する抗体の存在を調べる。たとえば、三回目および最終免疫ののち１０日目に、眼窩出血によって各マウスから少量の血液を採取し、凝固させる。免疫したマウスから得た血清試料を１：１０００に希釈して（５０μｌ）標識したＳｍａｄペプチド（３２Ｐリン酸化、ビオチン結合、Ｆｌａｇ抗体タグなどで標識できる）に加え、ウエル（穴）で混合し、４℃にて６０分反応させる。プロテインＡセファロースを反応物に加え、４℃で３０分反応させる。結合した抗体を遠心分離で回収する。沈殿物を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料緩衝液を加え、免疫複合体を壊すために煮沸する。次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィ（放射性標識の場合）あるいは化学発光のような検出方法で分析する。別の方法としては、洗浄した沈殿物の放射活性をシンチレーションカウンターで測定する。モノクローナル抗体を創るための細胞融合のために、リン酸化Ｓｍａｄペプチドに強く結合したマウスの血清を選択する。
【０１１８】
３．ハイブリドーマの作成
常法によってハイブリドーマ細胞株を作成する；一例を以下に示す。要約すれば、リン酸化Ｓｍａｄペプチドに対して最大の抗体価を持ったマウスを選択し、最終免疫から４週間放置する。次いでダルベッコリン酸緩衝液生理食塩水に溶かしたリン酸化Ｓｍａｄペプチドを腹腔内注射することにより、免疫効果を高める。４日後、頚椎脱臼によりマウスを安楽死させ、脾臓を摘出し、その細胞懸濁液を作り、ダルベッコリン酸緩衝液生理食塩水で洗浄する。脾細胞の数を数え、免疫グロブリンの軽鎖も重鎖も分泌できない（Ｋｅａｒｎｅｙら、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　１２３：１５４８，１９７９）ＳＰ２／０骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ８００６，ロックビル、ＭＤ）と２：１（脾細胞：骨髄腫細胞）の比率で混合し、ケラーとミルステイン（Ｎａｔｕｒｅ，　２５６：４９５，　１９７５）によって開発された方法に従って、ＨＡＴ選択培地中で８枚の９６穴（ウエル）組織培養プレートを用いてポリエチレングリコール１４５０（ＡＴＣＣ，ロックビル、ＭＤ）によって融合する。
【０１１９】
融合後１０日から２１日の間にハイブリドーマの細胞塊が見えるようになり、上述のような免疫沈降でスクリーニングを行う。別の方法としては、どのハイブリドーマがリン酸化Ｓｍａｄペプチドに結合する抗体を産生しているかを測定するために、ＥＬＩＳＡ法あるいはほかの免疫結合アッセイを使うことができる。陽性反応を示したハイブリドーマ細胞塊はすべて２４穴（ウエル）培養プレートで増殖させ、モノクローナル細胞株を作るために限界希釈法によってサブクローニングする。この時点でどのハイブリドーマが抗Ｓｍａｄタンパク抗体を産生しているのかを同定するために更にスクリーニングを行う。陽性クローンを同定するために、上述の方法、たとえばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収アッセイ）でハイブリドーマの培養から回収した培養液（上清）をスクリーニングする。
【０１２０】
ＩＳＯストリップ（ベーリンガー・マンハイム，インディアナポリス、ＩＮ）のような型決定キットを用いて、モノクローナル抗体を任意で調べて抗体のサブクラスを決める。少量のハイブリドーマ上清（たとえば５μｌ）をＰＢＳで希釈して抗マウスＩｇ抗体を結合した青いラテックスビーズの入った試験管に加える。アイソタイプ検定用の細片（ストリップ）を各試験管に入れる、ビーズ／抗体溶液は毛管現象で細片を上り、別々のアイソタイプに特異的な抗体を含む抗体結合ラインまで達する。ハイブリドーマ上清で検出される各アイソタイプは細片のある領域で青いラインとして現れる。
【０１２１】
実施例１３：抗Ｓｍａｄモノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の分離と配列決定
抗体はハイブリドーマから単離し、周知の方法で精製する。配列を決定するために精製抗体の重鎖と軽鎖を分離するには少なくとも２つの方法を用いてもよい。最初の方法は、半調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い、次いでポリビニルジフルオライド（ＰＶＤＦ）上に電気的にブロットするというものである。要約すれば、精製抗体は、２−メルカプトエタノールで還元したのち、ＳＤＳの中でスラブゲル電気泳動を行う。分画した重鎖と軽鎖をマツダイラの電気ブロット法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２６１：１００３５，１９８７）を用いてＩＭＭＯＢＩＬＯＮ膜（ミリポア、ベッドフォード、ＭＡのＰＶＤＦ膜）のような膜上に移す。クマシーブリリアントブルー染色で同定した重鎖と軽鎖に相当するバンドを膜から切りだし、Ｎ末端配列決定を行う。
【０１２２】
２番目のもっと複雑な方法では大量の重鎖と軽鎖が液体で得られる。この方法では、精製抗体を０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に対して４℃にて透析し、次いで、Ｍｏｒｅｈｅａｄら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３：２５００，１９８４）によって記載されたようなＮａＳＯ３Ｎａ２Ｓ２Ｏ０における酸化的亜硫酸分解を行う。亜硫酸分解に続いて、抗体調製試料を１Ｍ　酢酸に対して透析し、凍結乾燥し、１Ｍ　酢酸で再構築し、１Ｍ　酢酸でセファデックスＧ７５によってゲル濾過する。この段階のあとで軽鎖と重鎖の純度を分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べることができる。次いで配列決定のために濃縮する。
【０１２３】
Ｎ末端のアミノ酸配列決定はアプライドバイオシステムズ　モデル４７７Ａタンパク−ペプチドシーケンサーのような市販のアミノ酸シーケンサーを用いて行ってもよい。単離した鎖の分析はシーケンサーの取り扱い説明書に従って行う。
【０１２４】
実施例１４：オリゴヌクレオチドプライマーの設計とＳｍａｄリン酸化端部モノクロナール抗体の核酸のクローニング
１．オリゴヌクレオチドの作成
前述のアミノ酸配列の分析から得た情報に基づいてＰＣＲで用いるための同義性オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。そのほかの非同義性プライマーは、完全な重鎖と軽鎖をコードしているｃＤＮＡをＰＣＲで増幅して得られるヌクレオチド配列情報に基づいて設計してもよい。
オリゴヌクレオチドプライマーは、アプライドバイオシステムズのモデル３８０Ｂシンセサイザーのような市販のシーケンサーを用いて常法で合成する。
別の方法としては、ＩｇＧ１　Ｆｄ重鎖断片と軽鎖のＰＣＲによる増幅は、（Ｋａｎｇら、方法、酵素学における方法の比較　２巻、Ｒ．Ａ．　ＬｅｒｎｅｒとＤ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ編、アカデミック出版，ＮＹ　１１１−１１８ページ、１９９１）に記載されたように、重鎖と軽鎖の可変部遺伝子ファミリー、およびＩｇＧ１のｋあるいはｌに対する３’定常部プライマーを用いて行ってもよい。プライマーは、様々なほかの組換え用途のために、Ｆｄと軽鎖ライブラリーのファージディスプレイベクターへの配列連結反応を行えるように制限酵素部位を含んでもよい。
【０１２５】
２．重鎖と軽鎖のＰＣＲによる増幅とＤＮＡの配列決定
周知の方法によって、細胞質全ＲＮＡをハイブリドーマから単離する。最初のｃＤＮＡ鎖は、逆転写酵素を用いて細胞質全ＲＮＡから直接合成する。次いでポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）による増幅は標準的なプロトコールに従って熱サイクル装置あるいは似たような装置を用いて行う。増幅ののち、ＰＣＲ混合物は臭化エチジウムを加えたアガロースゲルで電気泳動する。当該ＰＣＲ断片をゲルから切りだし、たとえば電気溶出などによって精製する。ゲルで精製したＰＣＲ断片は適当な制限酵素で切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのようなクローニングベクターに連結する。コンペテントな細菌細胞を連結混合物でトランスフォームし、増殖させ、ＤＮＡを得るために溶解する。キアゲン・プラスミド・マキシプレップキット（キアゲン、チャッツワース、ＣＡ）のようなＤＮＡ精製の周知の技術でプラスミドＤＮＡを精製する。次いで自動ＤＮＡシーケンサーで配列を決定する。重鎖Ｆｄ断片および軽鎖について得られた配列は、市販されているソフトウエア・パッケージやＧｅｎｂａｎｋデータベースを用いて照合することができる。
【０１２６】
均等物
ここで述べている発明における特別な実施例には多くの均等物があることは、当業者には単に普通の実験によって認識され、確認できるだろう。そのような均等物は、以下の請求項に含めるつもりである。
ここで公表した参考文献はすべてそのまま全部参考として取り入れる。
配列一覧を示したあとに請求項を続ける。
【０１２７】
配列の簡単な説明
配列番号：１は、マウスＳｍａｄ２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である（受け入れ番号Ｕ６０５３０）。
配列番号：２は、マウスＳｍａｄ２タンパクのアミノ酸配列である（受け入れ番号Ｕ６０５３０）。
配列番号：３は、Ｓｍａｄ４に結合しているＳｍａｄ２Ｃ末端の４アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号：４は、Ｓｍａｄ４に結合しているＳｍａｄ２Ｃ末端の１４アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号：５は、経路限定ＳｍａｄにおけるＣ末端モチーフのアミノ酸配列である。
配列番号：６は、リン酸化Ｓｍａｄ２に対するポリクローナル抗体を作成するために用いたペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：７は、抗体作成に用いた別のリン酸化Ｓｍａｄ２ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：８は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９タンパクのＣ末端のアミノ酸配列である。
配列番号：９は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９に対する抗体を作成するために用いたリン酸化ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：１０は、Ｓｍａｄ１タンパクＣ末端の１４アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、Ｓｍａｄ３タンパクＣ末端の１４アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号：１２は、Ｓｍａｄ５タンパクＣ末端の１４アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号：１３は、Ｓｍａｄ９タンパクＣ末端の１４アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号：１４は、ヒトＳｍａｄ２のｍＲＮＡのヌクレオチド配列である（受託番号ＡＦ０２７９６４）。
配列番号：１５は、ヒトＳｍａｄ２タンパクのアミノ酸配列である（受託番号ＡＦ０２７９６４）。
【０１２８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＴβＲによるＳｍａｄ２のリン酸化を示すフォスフォイメージャーからのデジタルイメージを含む。
【図１Ｂ】ＴβＲによるＳｍａｄ２のリン酸化を示すフォスフォイメージャーからのデジタルイメージを含む。
【図１Ｃ】ＴβＲによるＳｍａｄ２のリン酸化を示すフォスフォイメージャーからのデジタルイメージを含む。
【図１Ｄ】ＴβＲによるＳｍａｄ２のリン酸化を示すフォスフォイメージャーからのデジタルイメージを含む。
【図１Ｅ】ＴβＲによるＳｍａｄ２のリン酸化を示すフォスフォイメージャーからのデジタルイメージを含む。
【図１Ｆ】ＴβＲによるＳｍａｄ２のリン酸化を示すフォスフォイメージャーからのデジタルイメージを含む。
【図１Ｇ】ＴβＲによるＳｍａｄ２のリン酸化を示すフォスフォイメージャーからのデジタルイメージを含む。
【図２Ａ】Ｓｍａｄ２の生体内での主なリン酸化部位としてのＳｅｒ４６５とＳｅｒ４６７の同定を示す。
【図２Ｂ】Ｓｍａｄ２の生体内での主なリン酸化部位としてのＳｅｒ４６５とＳｅｒ４６７の同定を示す。
【図２Ｃ】Ｓｍａｄ２の生体内での主なリン酸化部位としてのＳｅｒ４６５とＳｅｒ４６７の同定を示す。
【図２Ｄ】Ｓｍａｄ２の生体内での主なリン酸化部位としてのＳｅｒ４６５とＳｅｒ４６７の同定を示す。
【図３Ａ】Ｓｅｒ４６５のリン酸化にはＳｅｒ４５７がリン酸化されることが必要なことを明らかにしている。
【図３Ｂ】Ｓｅｒ４６５のリン酸化にはＳｅｒ４５７がリン酸化されることが必要なことを明らかにしている。
【図４】４６４、４６５および／あるいは４６７番目のセリン残基がアラニンあるいはアスパラギン酸残基で置換されたＳｍａｄ２変異型のＴＧＦ−βによる転写反応に対する顕性不活性効果を示す。
【図５】野生型および変異型Ｓｍａｄ２とＴβＲ−Ｉとの会合を示す。
【図６】Ｓｍａｄ２のＣ末端に由来するリン酸化されたペプチドがＳｍａｄ４に結合することを示す。
【図７】Ｓｍａｄ２のリン酸化断片に対する抗体がリン酸化されたＳｍａｄ２に特異的であることを示すフォスフォイメージャーからのデジタルイメージを含む。
【図８】Ｓｍａｄ２のリン酸化断片に対する抗体がＴＧＦ−βで刺激された細胞内のリン酸化Ｓｍａｄ２を認識することを示すフォスフォイメージャーからのデジタルイメージを含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2004000142.tif 000027
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2004000142.tif 000032
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2004000142.tif 000036
【図３Ａ】
2004000142.tif 000037
【図３Ｂ】
2004000142.tif 000038
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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