(57)【要約】【課題】少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞を、容易かつ確実に取り外すことができる細胞取り外し方法、および、かかる細胞取り外し方法を用いた細胞回収方法を提供すること。【解決手段】本発明の細胞取り外し方法は、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体１の表面に付着した細胞２を、担体１から取り外すのに際し、細胞２が付着した担体１を、キレート剤を含む処理液４００により、少なくとも１回処理するものであり、特に、細胞の回収に好適に用いられる。この細胞取り外し方法では、処理液４００による処理に先立って、細胞２が付着した担体１を、洗浄液３００により少なくとも１回洗浄するのが好ましく、また、処理液４００による処理後の担体１を、第２の処理液５００により、少なくとも１回処理するのが好ましい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞を、前記担体から取り外すのに際し、
前記細胞が付着した前記担体を、キレート剤を含む処理液により、少なくとも１回処理することを特徴とする細胞取り外し方法。
【請求項２】
前記キレート剤は、ポリアミノカルボン酸類である請求項１に記載の細胞取り外し方法。
【請求項３】
前記ポリアミノカルボン酸類は、エチレンジアミン四酢酸である請求項２に記載の細胞取り外し方法。
【請求項４】
前記処理液の前記キレート剤の濃度は、０．００２〜２ｗｔ％である請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項５】
１回の前記処理液による処理時間は、１〜１５分である請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項６】
前記処理液による処理時の前記処理液の温度は、４〜４０℃である請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項７】
前記処理液による処理時に、前記細胞が付着した前記担体に対して振動または衝撃を与える操作を行う請求項１ないし６のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項８】
前記処理液による処理回数は、１〜５回である請求項１ないし７のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項９】
前記処理液は、酵素を実質的に含まないものである請求項１ないし８のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項１０】
前記処理液による処理に先立って、前記細胞が付着した前記担体を、少なくとも１回洗浄する請求項１ないし９のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項１１】
前記洗浄に用いる洗浄液は、等張液である請求項１０に記載の細胞取り外し方法。
【請求項１２】
前記処理液による処理後の前記担体を、前記処理液の条件と異なる条件の第２の処理液により、少なくとも１回処理する請求項１ないし１１のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項１３】
前記第２の処理液は、前記処理液による処理後の前記担体を洗浄するための洗浄液である請求項１２に記載の細胞取り外し方法。
【請求項１４】
前記洗浄液は、等張液である請求項１３に記載の細胞取り外し方法。
【請求項１５】
前記細胞は、前記担体の表面に付着した状態で増殖したものである請求項１ないし１４のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項１６】
前記担体は、粒状のものである請求項１ないし１５のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項１７】
粒状の前記担体の平均粒径は、５０〜５００μｍである請求項１６に記載の細胞取り外し方法。
【請求項１８】
前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものである請求項１ないし１７のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１８のいずれかに記載の細胞取り外し方法により、前記担体から取り外された前記細胞を回収することを特徴とする細胞回収方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞取り外し方法および細胞回収方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
リン酸カルシウム系化合物は、細胞親和性に優れているため、再生医療や組織培養の分野において広く用いられており、リン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面では、細胞が効率よく増殖することが知られている。
【０００３】
そして、担体の表面で増殖した細胞は、必要に応じて、担体から取り外されることが行われる。
【０００４】
ここで、ポリスチレン製等の担体から細胞を取り外す際には、一般に、トリプシンが用いられる（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
ところが、リン酸カルシウム系化合物は、細胞親和性が高いがために、リン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面で増殖した細胞は、担体に強固に付着しており、トリプシンを用いても担体から取り外すことが極めて困難である。
【０００６】
【特許文献１】
特公平７−４０９２９号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞を、容易かつ確実に取り外すことができる細胞取り外し方法、および、かかる細胞取り外し方法を用いた細胞回収方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（１９）の本発明により達成される。
【０００９】
（１）  少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞を、前記担体から取り外すのに際し、
前記細胞が付着した前記担体を、キレート剤を含む処理液により、少なくとも１回処理することを特徴とする細胞取り外し方法。
【００１０】
本発明によれば、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞を、容易かつ確実に取り外すことができる。
【００１１】
（２）  前記キレート剤は、ポリアミノカルボン酸類である上記（１）に記載の細胞取り外し方法。
【００１２】
これにより、リン酸カルシウム系化合物からカルシウムがより効率よく除去される。その結果、細胞を担体からより確実に取り外すことができる。
【００１３】
（３）  前記ポリアミノカルボン酸類は、エチレンジアミン四酢酸である上記（２）に記載の細胞取り外し方法。
【００１４】
エチレンジアミン四酢酸は、カルシウムイオンの捕捉能が高く、細胞へ与えるダメージが小さいという点で優れている。
【００１５】
（４）  前記処理液の前記キレート剤の濃度は、０．００２〜２ｗｔ％である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
これにより、担体から細胞を効率よく取り外すことができる。
【００１６】
（５）  １回の前記処理液による処理時間は、１〜１５分である上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
これにより、１回の処理で、多くの細胞を回収することができる。
【００１７】
（６）  前記処理液による処理時の前記処理液の温度は、４〜４０℃である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
これにより、担体から細胞を効率よく取り外すことができる。
【００１８】
（７）  前記処理液による処理時に、前記細胞が付着した前記担体に対して振動または衝撃を与える操作を行う上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
これにより、担体の表面により強固に付着する細胞も取り外すことができる。
【００１９】
（８）  前記処理液による処理回数は、１〜５回である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
このような処理回数で、十分な数の細胞を回収することができる。
【００２０】
（９）  前記処理液は、酵素を実質的に含まないものである上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【００２１】
酵素を実質的に含まない処理液を用いることにより、細胞の生存数が低減するのをより確実に防止することができる。
【００２２】
（１０）  前記処理液による処理に先立って、前記細胞が付着した前記担体を、少なくとも１回洗浄する上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
これにより、キレート剤による処理効果をより向上させることができる。
【００２３】
（１１）  前記洗浄に用いる洗浄液は、等張液である上記（１０）に記載の細胞取り外し方法。
これにより、浸透圧の違いによる細胞の破壊を防止することができる。
【００２４】
（１２）  前記処理液による処理後の前記担体を、前記処理液の条件と異なる条件の第２の処理液により、少なくとも１回処理する上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【００２５】
（１３）  前記第２の処理液は、前記処理液による処理後の前記担体を洗浄するための洗浄液である上記（１２）に記載の細胞取り外し方法。
これにより、細胞の回収率をより向上させることができる。
【００２６】
（１４）  前記洗浄液は、等張液である上記（１３）に記載の細胞取り外し方法。
これにより、浸透圧の違いによる細胞の破壊を防止することができる。
【００２７】
（１５）  前記細胞は、前記担体の表面に付着した状態で増殖したものである上記（１）ないし（１４）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【００２８】
かかる細胞は、担体の表面により強固に付着しているが、本発明は、かかる細胞を担体から取り外す場合への適用に適する。
【００２９】
（１６）  前記担体は、粒状のものである上記（１）ないし（１５）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【００３０】
これにより、担体の表面積を増大させることができ、担体を細胞培養に用いる場合には、より効率のよい細胞培養が可能となる。
【００３１】
（１７）  粒状の前記担体の平均粒径は、５０〜５００μｍである上記（１６）に記載の細胞取り外し方法。
【００３２】
これにより、担体の表面積を十分に確保することができるとともに、担体を細胞培養に用いる場合には、担体を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００３３】
（１８）  前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものである上記（１）ないし（１７）のいずれかに記載の細胞取り外し方法。
【００３４】
ハイドロキシアパタイトは、生体材料として用いられるものであり、細胞が極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞に対するダメージを与える可能性が特に低い。このため、担体を細胞培養に用いる場合には、より効率のよい細胞培養が可能となる。
【００３５】
（１９）  上記（１）ないし（１８）のいずれかに記載の細胞取り外し方法により、前記担体から取り外された前記細胞を回収することを特徴とする細胞回収方法。
【００３６】
本発明は、各種の目的で使用可能であるが、特に、細胞を回収する目的への適用が好適である。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の細胞取り外し方法および細胞回収方法を添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００３８】
本発明において、表面に付着した細胞を取り除くべき担体は、その少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものである。
【００３９】
リン酸カルシウム系化合物は、細胞との親和性（細胞親和性）が高いため、かかる担体は、その表面に細胞を付着させた状態で増殖させる細胞培養担体として好適に使用される。
【００４０】
まず、このような担体について説明する。
図１は、本発明で用いられる担体の一例を示す断面図である。
【００４１】
図１に示す担体１は、マイクロキャリヤー培養に用いられるものであり、粒状（好ましくは、ほぼ球状）をなしている。担体１には、ブロック状（塊状）、ペレット状、シート状等の各種形状のものを使用することもできるが、粒状のものを用いることにより、その表面積を増大させることができ、より効率のよい細胞培養が可能となる。
【００４２】
図１に示すように、担体１は、主として樹脂材料で構成された基材１１と、基材１１の表面を覆うように形成され、リン酸カルシウム系化合物層１２とを有している。これにより、担体１の形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）等の調整が容易となる。なお、担体１は、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されるものであってもよい。
【００４３】
基材１１を樹脂材料で構成する場合、この樹脂材料としては、各種熱硬化性樹脂、各種熱可塑性樹脂を用いることができ、具体的には、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタン等、熱硬化性樹脂としては、例えば、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４４】
リン酸カルシウム系化合物層１２を構成するリン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＣａＨＰＯ４等のうちの１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００４５】
これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）を主成分とするものが最適である。ハイドロキシアパタイトは、生体材料として用いられるものであり、細胞が極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞に対するダメージを与える可能性が特に低い。
【００４６】
なお、これらのリン酸カルシウム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式合成法などによって合成することができる。この場合、リン酸カルシウム系化合物中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００４７】
また、リン酸カルシウム系化合物層１２は、図１に示すように、基材１１の表面付近に、リン酸カルシウム系化合物で構成された粒子１３（以下、単に「粒子１３」と言う。）の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましい。これにより、リン酸カルシウム系化合物層１２と基材１１との密着性を優れたものとすることができる。このため、リン酸カルシウム系化合物層１２の基材１１の表面からの剥離を好適に防止すること、すなわち、担体１の強度を優れたものとすることができる。
【００４８】
この場合、リン酸カルシウム系化合物層１２は、例えば、基材１１の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子（以下、単に「多孔質粒子」と言う。）を衝突させることにより形成することができる。かかる方法によれば、容易かつ確実に、リン酸カルシウム系化合物層１２を形成することができる。
【００４９】
この基材１１と多孔質粒子との衝突は、例えば、市販のハイブリダイゼーション装置を用いて、乾式で行うことができる。このときの条件は、例えば、基材１１と多孔質粒子との混合比が、重量比で４００：１〜５０：１程度、装置内の温度が、基材１１の主材料として用いた樹脂材料の軟化温度以下（通常、８０℃以下）とされる。
【００５０】
このような担体１は、その密度（比重）が水の密度に近いのものであるのが好ましい。具体的には、担体１の密度は、０．８〜１．４ｇ／ｃｍ３程度であるのが好ましく、０．９〜１．２ｇ／ｃｍ３程度であるのがより好ましい。これにより、担体１を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００５１】
また、担体１の平均粒径は、５０〜５００μｍ程度であるのが好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがより好ましい。これにより、担体１の表面積を十分に確保することができるとともに、担体１を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００５２】
このような担体１の表面に付着した状態で、増殖した細胞は、例えば、継代培養（培養系のスケールアップ）等を行うのに際し、担体１から取り外して回収することが行われるが、このような処理に、本発明の細胞取り外し方法が好適に適用される。
【００５３】
以下では、図１に示す担体１の表面に付着した細胞を、担体１から取り外し、回収する方法について、すなわち、本発明の細胞取り外し方法を細胞回収方法に適用した場合について説明する。
【００５４】
図２は、本発明の細胞取り外し方法を細胞回収方法に適用した場合の実施形態を模式的に示す工程図である。
【００５５】
図２に示す細胞回収方法は、細胞が付着した担体を洗浄する洗浄工程と、洗浄後の細胞が付着した担体をキレート剤（キレート試薬）を含む処理液により処理する第１の処理工程と、この処理液による処理後の担体を第２の処理液により処理する第２の処理工程とを有している。これらの一連の工程（操作）は、例えば、試験管等の容器内で行われる。以下、各工程について順次説明する。
【００５６】
［１］  洗浄工程
本工程［１］に先立って培養液から分離された担体１、すなわち、細胞２が付着した担体１（以下、「細胞付着担体３」と言う。）を洗浄液３００により洗浄する。
【００５７】
具体的には、細胞付着担体３を容器１００内に収納するとともに洗浄液３００を供給する（図２中（ａ）参照）。そして、洗浄液３００を穏やかに攪拌等することにより、洗浄液３００中に細胞付着担体３を懸濁させる（図２中（ｂ）参照）。次いで、静置することにより、細胞付着担体３を容器１００内に沈降させ、上清の洗浄液３００を除去して廃棄する（図２中（ｃ）参照）。
これにより、細胞付着担体３の表面に残存する培養液を除去する。
【００５８】
通常、培養液中には、キレート剤の阻害物質（例えば、各種陽イオン等）が含まれているが、細胞付着担体３の表面に残存する培養液を極力除去しておくことにより、次工程２におけるキレート剤による処理効果をより向上させることができる。
【００５９】
本工程［１］で用いる洗浄液３００としては、各種のものが使用可能であるが、本実施形態のように細胞２の回収を目的とする場合には、等張液（細胞内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）が好適である。これにより、浸透圧の違いによる細胞２の破壊を防止することができる。
【００６０】
この等張液には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ液（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）、Ｌｏｃｋｅ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｔｙｒｏｄｅ液、Ｅａｒｌｅ液、Ｋｒｅｂｓ液、生理食塩水等を用いることができる。
【００６１】
なお、本工程［１］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、細胞付着担体３の表面に残存する培養液をより確実に除去することができる。
【００６２】
また、この場合、用いる洗浄液３００は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【００６３】
また、本工程［１］における洗浄の方法には、例えば、フィルター上に細胞付着担体３を載置して、細胞付着担体３に洗浄液３００を供給する（例えばピペット等を用いて吹き掛ける）方法等を用いることもできる。
【００６４】
［２］  第１の処理工程
次に、洗浄後の細胞付着担体３を、キレート剤を含む処理液４００により処理する。
【００６５】
具体的には、容器１００内にキレート剤を含む処理液４００を供給する（図２中（ｄ）参照）。そして、処理液４００を攪拌等することにより、処理液４００中に細胞付着担体３を懸濁させる（図２中（ｅ）参照）。次いで、静置することにより、細胞付着担体３を容器１００内に沈降させ、上清の処理液４００を回収する（図２中（ｉ）参照）。
【００６６】
これにより、担体１から細胞２が取り外され、処理液４００中に浮遊する細胞２を回収する。
【００６７】
本発明者は、前述したような従来の問題点に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、細胞付着担体３を、キレート剤を含む処理液４００により処理すると、細胞２を担体１から容易かつ確実に取り外すことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００６８】
これは、担体１の表面付近を構成するリン酸カルシウム系化合物から、その構成元素の一つであるカルシウムをイオンとしてキレート剤が捕捉して引き抜くことにより、担体１の表面のリン酸カルシウム系化合物が分解され、細胞２の足場が消失することが主な要因であると推察される。
【００６９】
このようなキレート剤としては、カルシウムイオン（２価の陽イオン）を捕捉し得るものであれば、特に限定されないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）のようなポリアミノカルボン酸類、クエン酸のようなオキシカルボン酸類、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）のようなホスホン酸類等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７０】
これらの中でも、キレート剤としては、ポリアミノカルボン酸類が好ましい。キレート剤としてポリアミノカルボン酸類を用いることにより、リン酸カルシウム系化合物からカルシウムがより効率よく除去される。その結果、細胞２を担体１からより確実に取り外すことができる。
【００７１】
特に、キレート剤としては、ＥＤＴＡが好適である。ＥＤＴＡは、カルシウムイオンの捕捉能が高く、細胞２へ与えるダメージが小さいという点で優れている。
【００７２】
処理液４００のキレート剤の濃度は、特に限定されないが、０．００２〜２ｗｔ％程度であるのが好ましく、０．０１〜１ｗｔ％程度であるのがより好ましい。キレート剤の濃度が低く過ぎると、キレート剤の種類等によっては、担体１から細胞２を効率よく取り外すことができない場合があり、一方、キレート剤の濃度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、細胞２へのダメージ（悪影響）が生じるおそれがある。
【００７３】
また、キレート剤を溶解する溶媒としては、例えば、前記洗浄液３００で挙げたものと同様のものを用いることができる。
【００７４】
特に、本実施形態では、この処理液４００中に浮遊する細胞２を回収して、再度使用するので、溶媒中には、細胞２の成育に必要な各種添加物を添加するようにしてもよい。これにより、細胞２の生存数が低減するのを効果的に防止することができる。
【００７５】
このような添加物としては、例えば、グルコース、各種ビタミン類、グルタミン等のようなアミノ酸類、ＮａＣｌ、ＫＣｌのような電解質等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７６】
また、処理液４００は、例えば、トリプシン、ペプシン、パパインのような酵素（消化酵素）を実質的に含まないものであるのが好ましい。これらの酵素は、細胞膜の破壊（溶解）等の悪影響を細胞に与える作用を有している。このため、これらの酵素を実質的に含まない処理液４００を用いることにより、細胞２の生存数が低減するのをより確実に防止することができる。
【００７７】
１回の処理液４００による処理時間は、１〜１５分程度であるのが好ましく、３〜５分程度であるのがより好ましい。１回の処理時間が短過ぎると、１回の処理で回収される細胞数が少なくなり、処理回数を増加させざるを得ず、その結果、回収される液量が不要に増大し好ましくない。一方、１回の処理時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、細胞２へダメージを与えるおそれがある。
【００７８】
処理液４００による処理時の処理液の温度は、４〜４０℃程度であるのが好ましく、２５〜３７℃程度であるのがより好ましい。処理時の処理液４００の温度が低く過ぎると、キレート剤の種類等によっては、担体１から細胞２を効率よく取り外すことができない場合があり、一方、処理時の処理液４００の温度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、細胞２へダメージ（悪影響）を与えるおそれがある。
【００７９】
また、本工程［２］では、細胞付着担体３に対して振動または衝撃を与える操作を行うのが好ましい。これにより、担体１の表面により強固に付着する細胞２も取り外すことができる。
【００８０】
この操作としては、例えば、処理液４００とともに細胞付着担体３をピペット２００で吸引し、排出する操作を繰り返すピペッティング操作（図２中（ｆ）〜（ｈ）参照）や、ピペットを用いて上清の処理液４００を吸引し、担体１に吹き掛ける操作、振盪器により担体１に振動を与える方法等により行うことができる。特に、図示のようなピペッティング操作によれば、細胞２へダメージを与えることを防止しつつ、短時間で操作を行うことができるという利点がある。
【００８１】
このような処理液４００による処理回数は、１〜５回程度であるのが好ましく、２〜３回程度であるのがより好ましい。このような処理回数で、十分な数の細胞２を回収することができる。処理液４００による処理回数を前記上限値を超えて多くしても、それ以上の細胞２の回収率の増大は見込めず、回収する液量が増大するだけで好ましくない。
【００８２】
［３］  第２の処理工程
次に、細胞２が取り外された担体１を、洗浄液（第２の処理液）５００により洗浄（処理）する。
【００８３】
具体的には、容器１００内に洗浄液５００を供給する（図２中（ｊ）参照）。そして、洗浄液５００を攪拌等することにより、洗浄液５００中に担体１を懸濁させる（図２中（ｋ）参照）。次いで、静置することにより、担体１を容器１００内に沈降させ、上清の洗浄液５００を回収する（図２中（ｌ）参照）。
【００８４】
これにより、担体１から取り外されたが、担体１の表面や容器１００の内面に吸着して、前記処理液４００中には回収されなかった細胞２を回収することができ、その結果、細胞２の回収率をより向上させることができる。
【００８５】
本工程［３］で用いる洗浄液５００としては、前記工程［１］と同様のものを用いる。すなわち、この洗浄液５００としては、等張液が好適である。これにより、浸透圧の違いによる細胞２の破壊を防止することができる。
【００８６】
なお、本工程［３］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、担体１の表面や容器１００の内面に吸着して残存する細胞２をより確実に回収することができる。
【００８７】
また、この場合、用いる洗浄液５００は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【００８８】
また、第２の処理液は、このような洗浄液５００に限定されるものではなく、前記処理液４００の条件と異なる条件のもの、例えば、処理液４００に対してキレート剤の濃度、種類、組成等の条件が異なるものが使用可能である。
【００８９】
以上、本発明の細胞取り外し方法および細胞回収方法について説明したが、本発明は、これらに限定されるものではなく、必要に応じて任意の工程が追加されてもよく、また、前記実施形態における工程［１］および［３］の一方または双方を省略することもできる。
【００９０】
また、前記実施形態では、本発明の細胞取り外し方法を細胞回収方法に適用した場合、すなわち、本発明の細胞取り外し方法の目的を細胞を回収する目的として説明したが、本発明の細胞取り外し方法は、例えば、担体の再利用を目的等として使用することもできる。この場合、洗浄液、キレート剤を含む処理液および第２の処理液の条件は、いずれも、前述したものに限定されるものでないことは言うまでもない。
【００９１】
【実施例】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
【００９２】
１．担体の用意
まず、平均粒径２００μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ３のナイロン粒子（基材）５０ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．６７、平均粒径１０μｍのハイドロキシアパタイト粒子（一次粒子が凝集結合した多孔質粒子）０．２５ｇとを用意した。
【００９３】
なお、ハイドロキシアパタイト粒子は、その比表面積が４５ｍ２／ｇ、かつ、その細孔径が６００Åであった。
【００９４】
次に、これらナイロン粒子およびハイドロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置を６４００回転／分、３２〜５０℃で５分間稼動させた。これにより、表面がハイドロキシアパタイトで被覆された担体（図１参照）を得た。
【００９５】
なお、得られた担体は、平均粒径２０１μｍ（ハイドロキシアパタイト被覆層の平均厚さ１μｍ）、密度１．０３ｇ／ｃｍ３であった。
【００９６】
２．細胞の培養
前記担体を用いて、Ｖｅｒｏ細胞（１×１０５個／ｍＬ）を、１０日間培養した。培養液（培地）には、ＭＥＭ（１０％ＦＣＳ含有）を用い、３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２の環境下で培養した。
【００９７】
また、培養容器には、１００ｍＬ用スピンナーフラスコを用い、スターラーの回転数は、２０ｒｐｍとした。
【００９８】
３．細胞の回収
（実施例）
＜１＞  まず、上清の培養液を廃棄した後、Ｖｅｒｏ細胞が付着した担体を容器内に収納し、ＰＢＳ（洗浄液）２０ｍＬを供給し、３７℃、５分間攪拌した。なお、このとき、スターラーの回転数は、２０ｒｐｍとした。そして、静置した後、上清のＰＢＳを廃棄した。
【００９９】
＜２＞  次に、容器内に、０．０２ｗｔ％ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液（処理液）２０ｍＬを供給し、３７℃、５分間攪拌した。なお、このとき、スターラーの回転数は、３０ｒｐｍとした。
【０１００】
次いで、Ｖｅｒｏ細胞が付着した担体とＥＤＴＡのＰＢＳ溶液とをピペットで吸引し、排出するピペッティング操作を行った。そして、静置した後、上清の細胞が浮遊するＥＤＴＡのＰＢＳ溶液を回収した。
この工程＜２＞の操作を、３回繰り返して行った。
【０１０１】
＜３＞  次に、容器内に、ＰＢＳ（第２の処理液）２０ｍＬを供給し、３７℃、５分間攪拌した。なお、このとき、スターラーの回転数は、３０ｒｐｍとした。そして、静置した後、上清の細胞が浮遊するＰＢＳを回収して、先に回収したＥＤＴＡのＰＢＳ溶液に混合した。
【０１０２】
（比較例）
前記＜２＞において、処理液として、０．２５ｗｔ％トリプシンのＰＢＳ溶液を用いた以外は、前記実施例と同様にして、細胞の回収を行った。
【０１０３】
４．評価
実施例（本発明）および比較例の細胞回収方法により細胞の回収操作を行った後の担体を、それぞれ、クリスタルバイオレットを用いて染色し、担体の状態を顕微鏡で確認した。
【０１０４】
その結果を、図３および図４に示す。なお、図３は、実施例の細胞回収方法により細胞の回収操作を行った後の担体の状態を示す顕微鏡画像であり、図４は、比較例の細胞回収方法により細胞の回収操作を行った後の担体の状態を示す顕微鏡画像である。
【０１０５】
これらの図に示すように、実施例の細胞回収方法により細胞の回収を行った担体では、その表面に細胞の付着がほとんど認められなかった。
【０１０６】
これに対し、比較例の細胞回収方法により細胞の回収を行った担体では、担体の表面に多くの細胞が取り外されることなく残存し、また、これらの細胞を介して多くの担体が凝集してしまった。
【０１０７】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞を、容易かつ確実に取り外すことができる。
【０１０８】
また、トリプシンのような酵素を用いることなく、担体からの細胞の取り外しが可能であるため、細胞へのダメージ（悪影響）が生じるのを好適に防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いられる担体の一例を示す断面図である。
【図２】本発明の細胞取り外し方法を細胞回収方法に適用した場合の実施形態を模式的に示す工程図である。
【図３】実施例の細胞回収方法により細胞の回収操作を行った後の担体の状態を示す顕微鏡画像である。
【図４】比較例の細胞回収方法により細胞の回収操作を行った後の担体の状態を示す顕微鏡画像である。
【符号の説明】
１              担体
１１            基材
１２            リン酸カルシウム系化合物層
１３            粒子
２              細胞
３              細胞付着担体
１００          容器
２００          ピペット
３００          洗浄液
４００          処理液
５００          洗浄液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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