(57)【要約】【課題】ＤＮＡ断片の全体ＤＮＡ上での位置を推定するために費やされる時間を大幅に短縮することができるＤＮＡ断片位置推定装置を提供する。【解決手段】蛍光染色されかつ、端部Ｐ１に微粒子αが結合されたＤＮＡ断片Ｐを流路３に流すとともに、捕捉用のレーザ光を照射してＤＮＡ断片Ｐを伸張させる。そして、蛍光励起用のレーザ光をレーザ走査機構９によって、ＤＮＡ断片Ｐの端部Ｐ１からＰ２まで走査させて照射し、ＤＮＡ断片の蛍光強度分布を取得する。取得した蛍光強度分布からＤＮＡ断片の局所的なＧＣ含有率の分布を算出し、このＧＣ含有率の分布を予めデータベースとして記憶されている全体ＤＮＡの各位置における局所的なＧＣ含有率と比較することにより、ＤＮＡ断片Ｐの全体ＤＮＡ上での位置を推定する。【選択図】      図１
2004275109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡに属するＤＮＡ断片の前記ＤＮＡにおける位置を推定するＤＮＡ断片位置推定装置であって、
前記ＤＮＡの所定の塩基配列の局所的な含有率の分布を予め記憶する記憶手段と、
蛍光染色されたＤＮＡ断片を伸張させる伸張手段と、
伸張された前記ＤＮＡ断片を蛍光励起させるための励起用のレーザ光を出力し、出力した励起用のレーザ光を前記ＤＮＡ断片の長尺方向に走査させるレーザ照射手段と、
前記励起用のレーザ光が照射されることにより蛍光した前記ＤＮＡ断片の蛍光強度を検出し、検出した蛍光強度の時系列的推移から前記ＤＮＡ断片の蛍光強度分布を取得するする取得手段と、
前記取得手段が取得した蛍光強度分布に基づいて、ＤＮＡ断片の前記所定の塩基配列の局所的な含有率を算出する後処理手段と、
前記記憶手段が記憶するＤＮＡの所定の塩基配列の局所的な含有率の分布と、前記後処理手段が算出した前記ＤＮＡ断片の所定の塩基配列の局所的な含有率の分布とを比較することにより、前記ＤＮＡ断片の前記ＤＮＡ上における位置を推定する位置推定手段とを備えることを特徴とするＤＮＡ断片位置推定装置。
【請求項２】
前記局所的な含有率は、ＤＮＡの全長に対しておよそ１／８０から１／４０の長さを有する領域における含有率であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ位置推定装置。
【請求項３】
前記ＤＮＡ断片は、その一端にレーザ光によって捕捉される微粒子が結合され、
前記伸張手段は、流体によって前記ＤＮＡ断片を所定速度で流すための流路と、前記ＤＮＡ断片を捕捉するための捕捉用のレーザ光を出力する捕捉用レーザ光源とを備えることを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ断片位置推定装置。
【請求項４】
前記流路は、マイクロチャネル流路であることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ断片位置推定装置。
【請求項５】
前記流路は下流側にＤＮＡを回収するための回収槽をさらに備え、
前記位置推定手段が推定した前記ＤＮＡ断片の位置を基に、当該ＤＮＡ断片が前記ＤＮＡの関心部位に位置するものであるか否かを判断する判断手段と、
前記判断手段が前記ＤＮＡ断片が関心部位に位置するものであると判断した場合、当該ＤＮＡ断片を前記回収槽に導く回収手段とを備えることを特徴とする請求項３又は４記載のＤＮＡ断片位置推定装置。
【請求項６】
前記所定の塩基配列は、グアニンとシトシン又はチミンとアデニンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ断片位置推定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ断片のＤＮＡ上での位置を推定するＤＮＡ断片位置推定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
各個人の遺伝的形質を下に、その人が招来罹る可能性の高い疾患を事前に調べ、それに対処することを目的とする遺伝子診断や、各個人の遺伝的形質などを判断基準にして患者ごとに薬や治療法を決定していくテーラーメード医療が現実になりつつある。これらの治療を行うためには、全体ＤＮＡの関心部位における塩基配列を高精度で特定することが求められている。そのためには、全体ＤＮＡの関心部位におけるＤＮＡを抽出することが必要であり、これを実現するには、ＤＮＡ断片の全体ＤＮＡ上での位置を推定する技術が要求される。
【０００３】
ＤＮＡ断片の全体ＤＮＡ上での位置を推定する技術として、ファイバーＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｉｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）と呼ばれる手法が知られている（非特許文献１，２）。この手法では、まず、ＤＮＡ断片のライブラリーを作成する。そして、このライブラリーからＤＮＡ断片を取り出して蛍光分子を結合させ、このＤＮＡ断片を、全体ＤＮＡ上にふりかける。すると、ＤＮＡ断片は、全体ＤＮＡと塩基配列が等しい箇所で結合（ハイブリタイズ）される。ハイブリタイズされた全体ＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察すると、切断ＤＮＡ断片が蛍光発光するため、ＤＮＡ断片の全体ＤＮＡ上での位置を推定することができる。
【０００４】
【非特許文献１】
ＤＮＡ  Ｆｉｂｅｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｃｌａｓｓ  Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｉｎ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ：Ａｂｅｒｒａｎｔ  ＣＨ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｃｅｎｔｅｒ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＤＮＡファイバー蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションによる異常増殖Ｂ細胞における免疫グロブリンクラス転換の解析：濾胞中心細胞リンパ腫における変形ＣＨ遺伝子再配列）
Ｂｙ  Ｊａｎ−Ｗｉｌｌｅｍ  Ｖａａｎｄｒａｇｅｒ，Ｅｄ  Ｓｃｈｕｕｒｉｎｇ，Ｈａｎｎｅｋｅ  Ｃ．Ｋｌｕｉｎ−Ｎｅｌｅｍａｎｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｓ．Ｄｙｅｒ，Ａｎｔｏｎ  Ｋ．Ｒａａｐ，ａｎｄ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｍ．Ｋｌｕｉｎ；Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ  ９２，Ｎｏ８（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５），１９９８：ｐｐ２８７１−２８７８
【非特許文献２】
Ｄｉｒｅｃｔ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  １１ｑ１３  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ＤＮＡ  Ｆｉｂｅｒ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｉｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（マルチカラーＤＮＡファイバー蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる外套細胞リンパ腫における分散した１１ｑ１３染色体転座の直接観察）
Ｂｙ  Ｊａｎ−Ｗｉｌｌｅｍ  Ｖａａｎｄｒａｇｅｒ，Ｅｄ  Ｓｃｈｕｕｒｉｎｇ，Ｅｌｉｎｅ  Ｚｗｉｋｓｔｒａ，Ｃａｒｌａ  Ｊ．ｄｅ  Ｂｏｅｒ，Ｋａｒｉｎ  Ｋ．Ｋｌｅｉｖｅｒｄａ，Ｊｈａｎ．Ｊ．Ｍ  ｖａｎ  Ｋｒｉｅｋｅｎ，Ｈａｎｎｅｋｅ  Ｃ．Ｋｌｕｉｎ−Ｎｅｌｅｍａｎｓ，Ｇｅｒｔ−Ｊａｎ  Ｂ．ｖａｎ  Ｏｍｍｅｎ，Ａｎｔｏｎ  Ｋ．Ｒａａｐ，ａｎｄ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｍ．Ｋｌｕｉｎ；Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ  ８８，Ｎｏ  ４（Ａｕｇｕｓｔ  １５），１９９６：ｐｐ１１７７−１１８２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ファイバーＦＩＳＨ法によれば、ＤＮＡ断片のライブラリーを作成しなければならない。このライブラリーの作成は、全体ＤＮＡを制限酵素で、数万個のＤＮＡ断片に切断し、各ＤＮＡ断片をイースト菌等の微生物に組み込んで増殖させることにより行われる。かかる作業は、煩雑であることから、一つのライブラリーを作成するためには、数年の期間が費やされるのが一般的である。
【０００６】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、ライブラリーを作成することなく短時間でＤＮＡ断片の位置を推定することができるＤＮＡ断片位置推定装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明に係るＤＮＡ断片位置推定装置は、ＤＮＡに属するＤＮＡ断片の前記ＤＮＡにおける位置を推定するＤＮＡ断片位置推定装置であって、前記ＤＮＡの所定の塩基配列の局所的な含有率の分布を予め記憶する記憶手段と、蛍光染色されたＤＮＡ断片を伸張させる伸張手段と、伸張された前記ＤＮＡ断片を蛍光励起させるための励起用のレーザ光を出力し、出力した励起用のレーザ光を前記ＤＮＡ断片の長尺方向に走査させるレーザ照射手段と、前記励起用のレーザ光が照射されることにより蛍光した前記ＤＮＡ断片の蛍光強度を検出し、検出した蛍光強度の時系列的推移から前記ＤＮＡ断片の蛍光強度分布を取得するする取得手段と、前記取得手段が取得した蛍光強度分布に基づいて、ＤＮＡ断片の前記所定の塩基配列の局所的な含有率を算出する後処理手段と、前記記憶手段が記憶するＤＮＡの所定の塩基配列の局所的な含有率の分布と、前記後処理手段が算出した前記ＤＮＡ断片の所定の塩基配列の局所的な含有率の分布とを比較することにより、前記ＤＮＡ断片の前記ＤＮＡ上における位置を推定する位置推定手段とを備えることを特徴とする。
【０００８】
この構成によれば、蛍光染色されたＤＮＡ断片は、レーザ光の１次元的な照射を容易とするために伸張されて線状にされた後、蛍光励起用のレーザ光により長手方向に１次元的に走査されて蛍光発光する。そして、蛍光強度の時系列的な推移から、ＤＮＡ断片の蛍光強度分布が取得され、この蛍光強度分布を基に、ＤＮＡ断片の所定の塩基配列の局所的な含有率の分布が算出される。算出されたＤＮＡ断片の所定の塩基配列の局所的な含有率の分布は、予めデータベースとして記憶されているそのＤＮＡ断片が属するＤＮＡの所定の塩基配列の局所的な含有率の分布と比較され、ＤＮＡ断片の位置が推定される。そのため、従来技術で示したファイバーＦＩＳＨ法のように、ＤＮＡライブラリーを作成しなくとも、ＤＮＡ断片の位置を推定することができる。その結果、ＤＮＡ断片の位置推定に費やされる時間を大幅に短縮することができる。
【０００９】
また、前記局所的な含有率は、ＤＮＡの全長に対して略１／８０から１／４０の長さを有する領域における含有率であることが好ましい。
【００１０】
この構成によれば、全長に対しておよそ１／８０から１／４０の長さの領域における所定の塩基配列の含有率を局所的な含有率として算出しているため、ＤＮＡの位置毎に所定の塩基配列の局所的な含有率が異なる値となって現われることとなり、ＤＮＡ断片の位置をより正確に検出することができる。
【００１１】
また、前記ＤＮＡ断片は、その一端にレーザ光によって捕捉される微粒子が結合され、前記伸張手段は、流体によって前記ＤＮＡ断片を所定速度で流すための流路と、前記ＤＮＡ断片を捕捉するための捕捉用のレーザ光を出力する捕捉用レーザ光源とを備えることが好ましい。
【００１２】
この構成によれば、ＤＮＡ断片は、捕捉用のレーザ光によって捕捉され、流体からの作用により伸張されるため、ＤＮＡ断片を線状に伸張させる際のＤＮＡ断片への損傷が抑制されることとなり、より正確な蛍光強度分布を取得することができる。その結果、ＤＮＡ断片の位置をより精度よく検出することができる。
【００１３】
また、前記流路は、マイクロチャネル流路であることが好ましい。この構成によれば、流路にＤＮＡ断片を例えば１個ずつ流すことが可能となり、複数のＤＮＡ断片に対する蛍光分布の測定を連続的に行うことができ、蛍光分布の測定を効率よく行うことができる。
【００１４】
また、前記流路は下流側にＤＮＡを回収するための回収槽をさらに備え、前記位置推定手段が推定した前記ＤＮＡ断片の位置を基に、当該ＤＮＡ断片が関心部位に位置するものであるか否かを判断する判断手段と、前記判断手段がＤＮＡ断片が関心部位に位置するものであると判断した場合、当該ＤＮＡ断片を前記回収槽に導く回収手段とを備えることが好ましい。
【００１５】
この構成によれば、位置を測定した結果、ＤＮＡ断片が、関心部位に位置するものである場合、このＤＮＡ断片をＤＮＡ回収槽へと導くことによりＤＮＡ断片を回収することが可能となるため、関心部位に位置するＤＮＡ断片を容易に収集することができる。
【００１６】
また、前記ＤＮＡ断片は、グアニンとシトシンとを蛍光発光させる蛍光物質により蛍光染色される、又は、チミンとアデニンとを蛍光発光させる蛍光物質により蛍光染色されることが好ましい。
【００１７】
この構成によれば、グアニンとシトシンとの含有量または、チミンとアデニンとの含有量に応じた強度を有する蛍光強度分布が得られるため、測定の結果得られた蛍光強度分布にＤＮＡ断片の塩基配列が現われることとなる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の実施の形態を示したＤＮＡ断片位置推定装置の全体構成を示した模式図である。本ＤＮＡ断片位置推定装置は、ＤＮＡ断片を捕捉するための捕捉用レーザ光を出力するレーザ発生装置１と、ＤＮＡ断片を蛍光発光させるための蛍光励起用レーザ光を出力するレーザ発生装置２と、ＤＮＡ断片Ｐを流すための流路３と、捕捉用レーザ光及び蛍光励起用レーザ光を集光し、ＤＮＡ断片Ｐを照射する集光レンズ４と、本ＤＮＡ断片位置推定装置全体を統括制御する制御装置５とを備えている。レーザ発生装置１と集光レンズ４との間には、レーザ光の下流側に向けて、ビームエキスパンダ６、２波長性ミラー７が順番に配設されている。レーザ発生装置２と集光レンズ４との間には、レーザ光の下流側に向けて、ビームエキスパンダ８、レーザ走査機構９及び２波長性ミラー７が順番に配設されている。ビームエキスパンダ８とレーザ走査機構９との間には、２波長性ミラー１０が配設されている。２波長性ミラー１０の図中上側には、集光レンズ１１を介して検出器１２が配設されている。
【００１９】
レーザ発生装置１、２は、それぞれレーザ光源とレーザ光源を駆動するための駆動回路とを備えている（図略）。レーザ光源としては、例えばレーザダイオードが用いられる。駆動回路は、制御装置５の制御の基、駆動電流をレーザ光源に供給し、レーザ光源からレーザ光を出力させる。
【００２０】
ビームエキスパンダ６，８は、それぞれレーザ発生装置１，２から出力されたレーザ光を、ビーム径を増大させてレーザ走査機構９，２波長性ミラー７へ導く。
【００２１】
レーザ走査機構９は、例えばポリゴンミラーと、ポリゴンミラーを所定速度で回転させるためのモータなどから構成され、レーザ発生装置２から出力されたレーザ光をＤＮＡ断片Ｐの長手方向に１次元的に走査して、ＤＮＡ断片Ｐを照射する。なお、本レーザ走査機構９においては、ポリゴンミラーに代えてガルバノミラーを用いても良い。
【００２２】
２波長性ミラー７は、ビームエキスパンダ６からのレーザ光を反射させて集光レンズ４側に導く。また２波長性ミラー７は、レーザ走査機構９からのレーザ光を透過させて集光レンズ４側に導く。さらに、２波長性ミラー７は、ＤＮＡ断片Ｐからの蛍光を透過し、ビーム径を増大させてレーザ走査機構９側に導く。
【００２３】
２波長性ミラー１０は、ビームエキスパンダ８からのレーザ光を透過してレーザ走査機構９側に導き、レーザ走査機構９からのＤＮＡ断片Ｐの蛍光を反射して、集光レンズ１１側に導く。
【００２４】
検出器１２は、例えば光電子増倍管あるいはアバランシェフォトダイオードで構成され、ＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度を検出する。
【００２５】
図２は、本ＤＮＡ断片位置推定装置の流路３付近の構成を示した図である。流路３は、平板状の流路基台３０上に形成されている。流路３の最上流位置には、複数のＤＮＡ断片Ｐが貯溜可能な貯溜槽３４が配設されている。集光レンズ４の図中下側には、ＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度を測定するための測定ステージ３８が設けられている。測定ステージ３８の近傍には、測定中のＤＮＡ断片Ｐを撮影するためのＣＣＤカメラ（図略）が配設されている。測定ステージ３８の下流側に位置する分岐点３７において、流路３は流路３１，３２に２分岐されている。流路３１の最下流位置には、測定の結果、回収する必要があると判断されたＤＮＡ断片Ｐを貯溜する回収槽３５が配設され、また、流路３２の最下流位置には、測定の結果、回収する必要がないと判断されたＤＮＡ断片Ｐを貯溜する廃棄槽３６が配設されている。
【００２６】
流路基台３０は、貯溜槽３４側が回収槽３５及び廃棄槽３６側よりも高くなるように多少の傾斜を有した状態で設置されており、流路３の液体は、回収槽３５及び廃棄槽３６側に向けて流れるようになっている（矢印Ａで示す方向）。なお、流路３を流れる流体としては、例えば水が用いられる。
【００２７】
なお、貯溜槽３４に貯溜される複数ＤＮＡ断片Ｐには、予め、グアニン及びシトシンの局所的な含有量に応じた強度でＤＮＡ断片を蛍光させることができる、例えば７−ＡＤＤ（７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｏｎｏｍｉｃｉｎｅ  Ｄ）等の物質によって蛍光染色されているとともに、端部Ｐ１にはレーザ光によって捕捉される微粒子αが結合されている。なお、グアニン及びシトシンを蛍光させる代わりに、チミン及びアデニンを蛍光させてもよい。この場合、例えばヘキスト３３２５８を用いて、ＤＮＡ断片Ｐを蛍光染色すればよい。
【００２８】
流路３、３１、３２は、例えば２個のＤＮＡ断片Ｐが幅方向に並んで移動することができないような幅寸法を有するマイクロチャネル流路である。このため、貯溜槽３４から流路３に向けて一度に大量のＤＮＡ断片Ｐが流出することが防止され、ＤＮＡ断片Ｐを連続的に測定することが可能となり、ＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度の測定を高効率で行うことができる。
【００２９】
分岐点３７近傍には、電極６１，６２が配設されている。電極６１，６２は、制御装置５の制御の基、電極６１から電極６２の方向に電界Ｅ１を発生させる、又は電極６２から電極６１の方向に電界Ｅ２を発生させる。ＤＮＡ断片Ｐは、負の電荷を有しているため、電界Ｅ１からのクーロン力を受けた場合は、流路３１側に導かれ、電界Ｅ２からのクーロン力を受けた場合は、流路３２側に導かれる。
【００３０】
測定ステージ３８において、流路３内を所定速度で流れるＤＮＡ断片Ｐは、その一端に結合された微粒子αにレーザ光が照射されることにより捕捉される。そして、流路３内を所定速度で流れる流体によって、下流側に向けて伸張される。これによって、ＤＮＡ断片Ｐは線状となり、蛍光励起用のレーザ光による一次元走査が可能な形状となる。
【００３１】
図３は、本ＤＮＡ断片位置推定装置における制御装置５の機能を説明するためのブロック構成図である。制御装置５は、ＣＰＵ（中央処理装置）５１、ＲＯＭ（リードオンリーメモリ）５２、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）５３、表示装置５４及び操作部５５を備えている。
【００３２】
ＲＡＭ５３は、ＣＰＵ５１の作業領域として用いられ種々のデータを一時的に記憶する。表示装置５４は、ＣＲＴ（陰極線管）あるいは液晶パネルから構成され、測定ステージ３８に配設されたＣＣＤカメラによって撮影された測定中のＤＮＡ断片Ｐの画像を表示する。操作部５５は、キーボード及びマウスを含み、ユーザからの操作指令を受付ＣＰＵ５１に出力する。
【００３３】
さらに、制御装置５には、帯電回路６３、レーザ発生装置１，２が接続されており、これらの装置を制御する。帯電回路６３は、ＣＰＵ５１が例えばハイレベルの電圧信号を出力した場合、電極６１をプラスに帯電させ、電極６２をマイナスに帯電させることにより、電極６１から電極６２に向かう電界Ｅ１を発生させる。これにより、流路３を流れるＤＮＡ断片Ｐは、回収槽３５へ導かれる。一方、ＣＰＵ５１が例えばローレベルの電圧信号を出力した場合、電極６１をマイナスに帯電させ、電極６２をプラスに帯電させることにより、電極６２から電極６１に向かう電界Ｅ２を発生させる。これにより、流路３を流れるＤＮＡ断片Ｐは、廃棄槽３６側に導かれる。
【００３４】
ＲＯＭ５２は、データベース記憶部５２１及び関心部位記憶部５２２とを備えている。データベース記憶部５２１は、全体ＤＮＡの各位置における局所的なグアニンとシトシンとの含有率（局所的なＧＣ含有率の分布）を記憶している。ここで、全体ＤＮＡとは、例えばヒトの細胞に存在する１本の染色体が該当する。データベース記憶部５２１は、ヒトの全ての染色体についての局所的なＧＣ含有率の分布を記憶してもよいし、全ての染色体のうちののいずれか１本又は複数本の染色体についての局所的なＧＣ含有率の分布を記憶してもよい。さらに、ヒトの以外の生物又は植物の染色体についての局所的なＧＣ含有率の分布を記憶してもよい。
【００３５】
全体ＤＮＡの各位置における局所的なＧＣ含有率の分布は、以下のようにして求められる。まず、制限酵素を用いて全体ＤＮＡをＤＮＡ断片に分割する。制限酵素は、所定の塩基配列を検出して、その位置においてＤＮＡを分割する物質である。そして、分割された各ＤＮＡ断片に対して、局所的なＧＣ含有率の分布を算出する。
【００３６】
局所的なＧＣ含有率Ｒｇｃは、ある塩基数Ｌ［ｂｐ］の長さのＤＮＡ上に出現するグアニン及びシトシンの数をそれぞれＮｇ及びＮｃとすると、式（１）のように定義される。
【００３７】
Ｒｇｃ＝（Ｎｇ＋Ｎｃ）／Ｌ・・・式（１）
Ｎｇ及びＮｃの値は、一般的にＤＮＡ上の位置で異なるため、これを考慮すると、ＤＮＡ上の位置ｉにおける、局所的なＧＣ含有率Ｒｇｃ（ｉ）は式（２）のように表される。
【００３８】
Ｒｇｃ（ｉ）＝（Ｎｇ（ｉ）＋Ｎｃ（ｉ））／Ｌ・・・式（２）
また、塩基配列が既知のＤＮＡにおいて、局所的なＧＣ含有率Ｒｇｃ（ｉ）は、式（３）の演算を行うことにより算出することができる。
【００３９】
【数１】
2004275109.tif 000003
【００４０】
δｃ（ｋ）、δｇ（ｋ）はｋ番目の塩基がＣあるいはＧであればそれぞれ１になる関数である。すなわち、式（４）のように表される関数である。
【００４１】
【数２】
2004275109.tif 000004
【００４２】
ここで、Ｕ（ｋ）はｋ番目の位置に存在する塩基を表す。また、Ｌを平滑化窓長と呼ぶこととする。平滑化窓長Ｌの大きさは、全長が４０ｋｂｐの全体ＤＮＡがある場合、例えば１０００ｂｐや５００ｂｐ程度の大きさである。平滑化窓長Ｌは、任意の配列を持つＤＮＡを考えた場合、その値が変化すると局所的なＧＣ含有率Ｒｇｃ（ｉ）は異なる値になる。そのため、平滑化窓長Ｌは、局所的なＧＣ含有率Ｒｇｃ（ｉ）を考える際、重要なパラメータとなる。
【００４３】
一方、塩基配列が既知でないＤＮＡにおける局所的なＧＣ含有率Ｒｇｃ（ｉ）は、式（５）の演算を行うことにより算出される。
【００４４】
【数３】
2004275109.tif 000005
【００４５】
ここで、Ｘｇｃ（ｉ）はＤＮＡ断片の位置ｉにおける蛍光強度を表している。〈Ｘｇｃ〉は、全長がＫ［ｂｐ］であるＤＮＡ断片の蛍光強度の平均を表している。０．５は、Ｘｇｃ（ｉ）の平均値を０．５にするための係数である。
【００４６】
このようにして、各ＤＮＡ断片の局所的なＧＣ含有率の分布を求めた後、各ＤＮＡ断片に対して、端部同士の局所的なＧＣ含有率の分布がほぼ一致するＤＮＡ断片同士を、隣接するＤＮＡ断片として、ＤＮＡ断片をつなぎ合わせていき、全体ＤＮＡの局所的なＧＣ含有率の分布を求める。そして、この局所的なＧＣ含有率の分布をデータベースとしてデータベース記憶部５２１に記憶させる。
【００４７】
図４は、データベース記憶部５２１が記憶する全体ＤＮＡ（ヒト２１番染色体）の局所的なＧＣ含有率の分布をグラフ化して示したものである。縦軸は、局所的なＧＣ含有率を示し、横軸は全体ＤＮＡの位置を表している。図４に示すグラフでは、多数のピークが観測されるが、これは、ＣｐＧアイランドと呼ばれ、ＧＣ含有量が高い領域を表している。ヒトゲノムにおいては、５６％の遺伝子がその近傍にＣｐＧアイランドを持つことが分かっている。そのため、ＣｐＧアイランドのパターンは、ＤＮＡ断片とのマッチングを行う際に重要となる。
【００４８】
関心部位記憶部５２２は、全体ＤＮＡにおいて、例えば重要な遺伝子が存在するような位置である関心部位が、全体ＤＮＡのどの位置に存在しているかを示す位置情報を記憶している。ここで、データベース記憶部５２１が複数の染色体についてのＧＣ含有率の分布を記憶している場合は、関心部位記憶部５２２は、各染色体についての関心部位を記憶すればよい。なお、関心部位は、１本の染色体について１箇所しか存在しない場合もあるし複数箇所存在する場合もある。
【００４９】
ＲＯＭ５２は、本ＤＮＡ断片位置推定装置を制御するための制御プログラムを記憶する。ＣＰＵ５１は、ＲＯＭ５２が記憶する制御プログラムを実行することにより、蛍光強度分布取得部５１１、後処理部５１２、類似度算出部５１３、位置推定部５１４及び回収判断部５１５として機能する。
【００５０】
蛍光強度分布取得部５１１は、検出器１２が検出したＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度を時系列的に並べて、ＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度分布を取得する。蛍光強度分布取得部５１１は、例えばＤＮＡ断片Ｐのレーザ光の走査時間とレーザ光の走査速度との関係から、ＤＮＡ断片Ｐの各位置に対する蛍光強度を特定し、ＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度分布を取得する。
【００５１】
後処理部５１２は、蛍光強度分布取得部５１１が取得したＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度分布を上記式（５）に代入することにより、ＤＮＡ断片Ｐの局所的なＧＣ含有率の分布を算出する。
【００５２】
類似度算出部５１３、後処理部５１２が算出したＤＮＡ断片Ｐの局所的なＧＣ含有率の分布Ｒｇｃ（ｉ）を、式（６）のＲｇｃ（ｉ）に代入することにより、全体ＤＮＡの各位置に対するＤＮＡ断片の類似度を算出する。
【００５３】
【数４】
2004275109.tif 000006
【００５４】
ここで、Ｎ［ｂｐ］は、ＤＮＡ断片Ｐの全長を表し、Ｎ＞＞Ｌである。Ｒｇｃａｌｌ（ｉ）は全体ＤＮＡの位置ｉにおける局所的なＧＣ含有率を示している。Ｘｇｃ（ｉ）はＤＮＡ断片Ｐの位置ｉにおける蛍光強度を示している。＜Ｘｇｃ（ｉ）〉は、ＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度分布Ｘｇｃ（ｉ）の平均値を示している。〈Ｒｇｃａｌｌ（τ）〉は、Ｒｇｃａｌｌ（ｉ）のｉ＝τからτ＋Ｎまでの局所的なＧＣの含有率の平均を示している。そして、全長がＱ［ｂｐ］の全体ＤＮＡにおける注目位置を示す変数τを１からＱまでずらしていき、各τに対して式（７）の演算を行うことにより、全長ＤＮＡの各位置におけるＤＮＡ断片Ｐの類似度を計算する。
【００５５】
なお、式（７）は、規格化相互相関関数の形になっており、ＤＮＡ断片Ｐが全体ＤＮＡと一致した位置においては、１の値をとり、それ以外の場合は、−１＜＝Ｃ＜１の値をとる。
【００５６】
位置推定部５１４は、類似度算出部５１３が算出した全体ＤＮＡの各位置における類似度を所定の閾値と比較し、類似度がこの閾値よりも大きな位置を、そのＤＮＡ断片Ｐの位置候補として推定する。なお、閾値よりも類似度Ｃが大きな位置が１箇所の場合は、ＤＮＡ断片Ｐの位置は一意に推定されることとなる。
【００５７】
回収判断部５１５は、関心部位記憶部５２２を参照することにより、位置推定部５１４が推定したＤＮＡ断片Ｐの位置が、関心部位に該当するか否かを判断し、関心部位に該当する場合、帯電回路６３に対してハイレベルの電圧信号を出力することによりＤＮＡ断片Ｐを回収槽３５に導く。一方、位置推定部５１４が推定したＤＮＡ断片Ｐの位置が関心部位に該当しない場合、帯電回路６３に対してローレベルの電圧信号を出力することによりＤＮＡ断片Ｐを廃棄槽３６に導く。なお、位置推定部５１４がＤＮＡ断片Ｐの位置として複数の位置を推定した場合は、いずれか１つ又は２以上の位置が関心部位に該当すれば、回収判断部５１５は、ＤＮＡ断片Ｐを回収槽３５に導くものとする。
【００５８】
次に、図１及び図２を参照しながら、本ＤＮＡ位置推定装置の動作について説明する。ＤＮＡ断片Ｐが、流体からの作用を受けて、測定ステージ３８まで流されると、ＤＮＡ断片Ｐはレーザ発生装置１から出力される捕捉用のレーザ光が照射されることにより捕捉される。詳細には、ＤＮＡ断片Ｐの端部Ｐ１に結合された微粒子αにレーザ光が照射されることによりＤＮＡ断片Ｐは捕捉される。端部Ｐ１が捕捉されたＤＮＡ断片Ｐは他方の端部Ｐ２が流体からの作用を受けて、流路３の下流側に向けて伸張される。次いで、レーザ発生装置２から蛍光励起用のレーザ光が出力される。レーザ走査機構９は、このレーザ光をＤＮＡ断片Ｐを端部Ｐ１から端部Ｐ２まで走査する。走査されたレーザ光を受光したＤＮＡ断片Ｐは、グアニンとシトシンの含有率に応じた強度で蛍光する。ＤＮＡ断片Ｐの蛍光は、集光レンズ４、２波長性ミラー１０によって検出器１２へと導かれ、蛍光強度が検出される。
【００５９】
次に、ＣＰＵ５１が行う処理について説明する。図５は、ＣＰＵ５１が行う処理を示したフローチャートである。まず、ステップＳ１において、蛍光強度分布取得部５１１は、検出器１２から出力されたＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度を受信し、この蛍光強度を時系列的に並べることにより、ＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度分布を取得する。
【００６０】
ステップＳ２において、後処理部５１２は、蛍光強度分布取得部５１１が取得した蛍光強度分布Ｘｇｃ（ｉ）に対してノイズ除去処理及び平滑化処理を施した後、上記式（５）のＸｇｃ（ｉ）に代入することにより、ＤＮＡ断片Ｐの局所的なＧＣ含有率の分布Ｒｇｃ（ｉ）を算出する。
【００６１】
ステップＳ３において、類似度算出部５１３は、注目位置を示す変数τに０を代入することによりτを初期化する。ステップＳ４において、類似度算出部５１３は、ＤＮＡ断片Ｐの局所的なＧＣ含有率の分布Ｒｇｃ（ｉ）を式（６）に代入することにより、全体ＤＮＡの注目位置τにおけるＤＮＡ断片Ｐの類似度を算出する。
【００６２】
ステップＳ５において、類似度算出部５１３は、τに１を加算し、τの値を更新する。ステップＳ６において、類似度算出部５１３は、注目位置τの値が全体ＤＮＡの全長Ｑよりも大きいか否かを判断し、τ＜＝Ｑの場合（ステップＳ６でＮＯ）、ステップＳ４に戻り、次の注目位置における類似度を計算する。一方、τ＞Ｑの場合（ステップＳ６でＹＥＳ）、すなわち、全体ＤＮＡの全ての位置における類似度の計算が終了している場合、ステップＳ７に進む。
【００６３】
ステップＳ７において、位置推定部５１４は、全体ＤＮＡの各位置における類似度Ｃ（τ）を閾値Ｔと比較し、類似度がＣ（τ）＞Ｔを満たす位置をＤＮＡ断片Ｐの位置候補として推定する。
【００６４】
図６は、ヒト２１番染色体を全体ＤＮＡとしたときのあるＤＮＡ断片Ｐの類似度の計算結果をグラフ化して示したものである。縦軸は類似度Ｃ（τ）を表し、横軸は位置を示している。ここで閾値Ｔを例えばＴ＝０．９に設定すると、図６に示すように、６０００ｋｂｐ付近で類似度Ｃ（τ）が、閾値Ｔよりも大きい位置Ｍが存在することが分かる。この場合、位置推定部５１４は、位置ＭをＤＮＡ断片Ｐの全体ＤＮＡ上での位置として推定する。
【００６５】
ステップＳ８において、回収判断部５１５は、ステップＳ７で推定されたＤＮＡ断片Ｐの位置が、全体ＤＮＡの関心部位に位置するものであるか否かを、関心部位記憶部５２２を参照することにより判断し、ＤＮＡ断片Ｐが関心部位に位置するものである場合（ステップＳ８でＹＥＳ）、帯電回路６３にハイレベルの電圧信号を出力し、ＤＮＡ断片Ｐを回収槽３５に導く（ステップＳ９）。一方、ＤＮＡ断片Ｐが関心部位に位置しないものである場合（ステップＳ８でＮＯ）、回収判断部５１５は、帯電回路６３にローレベルの電圧信号を出力し、ＤＮＡ断片Ｐを廃棄槽３６に導く（ステップＳ１０）。以上で処理を終了する。
【００６６】
次に、塩基配列が既知であるλＤＮＡに関して、ＤＮＡ配列から算出された局所的なＧＣ含有率の分布と本ＤＮＡ断片位置推定装置によって得られたλＤＮＡの蛍光強度の分布との対比結果について説明する。λＤＮＡは、ＹＯＹＯ１と７−ＡＤＤとを用いて染色した。ＹＯＹＯ１は、塩基配列によらずＤＮＡ全体を均一に染色することができる物質であり、７−ＡＤＤは、ＧＣを特異的に染色することができる物質である。ＹＯＹＯ１を波長４８８ｎｍのレーザ光で励起して中心波長５４０ｎｍの蛍光強度を検出し、７−ＡＤＤを波長５３２ｎｍのレーザ光で励起して中心波長６３０ｎｍの蛍光強度を検出した。図７は、λＤＮＡの蛍光強度分布を示しており、（ａ）はＹＯＹＯ１を励起したときの蛍光強度分布を示し、（ｂ）は７−ＡＤＤを励起したときの蛍光強度分布を示している。図７（ａ）に示すように、ＹＯＹＯ１の蛍光強度分布はほぼ一様であるが、７−ＡＤＤの蛍光強度分布はばらつきがあることが観測される。（ａ）に示す傾きは照明光の強度むらに起因して生じるものである。そのため、（ａ）に示すＹＯＹＯ１の強度分布を一次関数で近似し、（ｂ）に示す傾向強度分布からこの一次関数を差し引くことにより７−ＡＤＤの強度分布を規格化する。
【００６７】
図８は、本ＤＮＡ位置推定装置によって測定されたλＤＮＡの蛍光強度分布と、λＤＮＡの塩基配列に基づいて算出されたλＤＮＡの局所的なＧＣ含有率の分布とを示したグラフであり、曲線Ｇ１は測定されたλＤＮＡの蛍光強度分布を示し、曲線Ｇ２は局所的なＧＣ含有率の分布を示している。図８に示すように、５〜２０ｋｂｐの範囲において、曲線Ｇ１及びＧ２は形状がほぼ一致していることが分かる。一方、２０〜２５ｋｂｐの部分では、曲線Ｇ１及びＧ２は形状があまり一致していない。これは２０〜２５ｋｂｐの範囲においてλＤＮＡが十分に伸張されていなかったためである。このことからＤＮＡを伸張させることが不可欠であることが分かる。また、十分に伸張して測定されたＤＮＡの蛍光強度分布は、対応する位置におけるＤＮＡの局所的なＧＣ含有率の分布とよく一致していることが分かる。
【００６８】
したがって、全体ＤＮＡの局所的なＧＣ含有率を予めデータベースとして記憶しておき、このデータベースと測定によって得られたＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度分布から算出された局所的なＧＣ含有率の分布とを比較することによりＤＮＡ断片Ｐの全体ＤＮＡ上での位置を正確に推定できることが分かる。
【００６９】
以上説明したように、本ＤＮＡ位置推定装置によれば、全体ＤＮＡの各位置における局所的なＧＣ含有率の分布をデータベースとして記憶しておき、このデータベースと測定によって得られたＤＮＡ断片Ｐの蛍光強度分布から算出された局所的なＧＣ含有率の分布とを比較することによりＤＮＡ断片Ｐの位置を推定することができるため、従来のようにＤＮＡライブラリー作成することなく、ＤＮＡ断片Ｐの位置を推定することができる。その結果、ＤＮＡ断片Ｐの位置を推定するために費やされる時間を大幅に短縮することができる。
【００７０】
さらに、ＤＮＡは捕捉用のレーザ光によって捕捉され、流体の作用によって伸張させているため、損傷が抑制されることとなり、より正確な蛍光分布を取得することができる。その結果、ＤＮＡ断片Ｐの位置を精度よく推定することができる。
【００７１】
さらに、回収判断部５１５は、ＤＮＡ断片Ｐが関心部位に位置するものであるか否かを判断し、関心部位に位置するものである場合、そのＤＮＡ断片Ｐを回収槽３５に導くため、重要な遺伝子が存在するような関心部位に位置するＤＮＡ断片Ｐを容易に収集することができる。
【００７２】
さらに、ＤＮＡ断片Ｐをグアニンとシトシンとを蛍光発光させるような物質（例えば７−ＡＤＤ）を用いて蛍光染色させているため、ＤＮＡ断片Ｐは、グアニンとシトシンとの含有率に応じた強度で蛍光される。その結果、蛍光強度分布にＤＮＡ断片Ｐの塩基配列が現れることとなる。
【００７３】
なお、上述した制御装置５として、パーソナルコンピュータを用いても良い。この場合、パーソナルコンピュータを本ＤＮＡ断片位置推定装置の処理部として機能させるための制御プログラムをパーソナルコンピュータのハードディスクに記憶させ、この制御プログラムをＣＰＵに実行させればよい。さらに、この場合、この制御プログラムをＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体に記録させて、この記録媒体の販売等を行っても良い。
【００７４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、ＤＮＡ断片のＤＮＡ上での位置を短時間で推定することがでる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態を示したＤＮＡ断片位置推定装置の全体構成を示した模式図である。
【図２】ＤＮＡ断片位置推定装置の流路付近の詳細な構成を示した図である。
【図３】本ＤＮＡ断片位置推定装置における制御装置５の機能を説明するためのブロック構成図である。
【図４】データベース記憶部が記憶する全体ＤＮＡ（ヒト２１番染色体）の各位置に対する局所的なＧＣ含有率をグラフ化して示したものである。
【図５】ＣＰＵが行う処理を示したフローチャートである。
【図６】ヒト２１番染色体を全体ＤＮＡとしたときのあるＤＮＡ断片Ｐの類似度の計算結果をグラフ化して示したものである。
【図７】λＤＮＡの蛍光強度分布を示しており、（ａ）はＹＯＹＯ１を励起したときの蛍光強度分布を示し、（ｂ）は７−ＡＤＤを励起したときの蛍光強度分布を示している。
【図８】ＤＮＡ位置推定装置によって測定されたλＤＮＡの蛍光強度分布と、λＤＮＡの塩基配列に基づいて算出されたλＤＮＡの局所的なＧＣ含有率の分布とを示したグラフである。
【符号の説明】
１  ２  レーザ発生装置
３  流路
４  集光レンズ
５  制御装置
６  ８  ビームエキスパンダ
７  １０  ２波長性ミラー
９  レーザ走査機構
１１  集光レンズ
１２  検出器
３０  流路基台
３１  ３２  流路
３４  貯溜槽
３５  回収槽
３６  廃棄槽
３７  分岐点
３８  測定ステージ
５１１  蛍光強度分布取得部
５１２  後処理部
５１３  類似度算出部
５１４  位置推定部
５１５  回収判断部
５２１  データベース記憶部
５２２  関心部位記憶部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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