(57)【要約】【課題】Ｃ型慢性肝炎、肝硬変、あるいは肝癌の予防・治療剤のスクリーニングに有用であるモデル動物を提供する。【解決手段】ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子が挿入された動物、または、その子孫、およびこれを用いて、慢性肝炎、肝硬変、あるいは肝発癌病態を呈するモデル動物を作製する。この提供されるモデル動物を用い、慢性肝炎、肝硬変、肝癌とヒトＣ型肝炎と同様の病態進展を起こさせることによって、肝硬変から肝癌への発症機序を解明する材料として有用であるとともに、より病態に即した治療剤および、治療法の開発に有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子の全部または一部を動物の分化全能性を有する細胞に導入し、該遺伝子が発現された形質転換動物。
【請求項２】
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子がＣ型肝炎ウイルスＴＨ株である請求項１記載の形質転換動物。
【請求項３】
動物の分化全能性を有する細胞がＥＳ細胞である請求項１記載の形質転換動物。
【請求項４】
動物の分化全能性を有する細胞が生殖系列の細胞である請求項１記載の形質転換動物。
【請求項５】
生殖系列の細胞が、受精卵である請求項４記載の形質転換動物。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子の全部または一部が、組織特異発現をする発現プロモーター配列の制御下に導入されたものであることを特徴とする請求項１記載の形質転換動物。
【請求項７】
組織特異的発現をするプロモーター配列が、肝臓特異的に発現するプロモーターであること特徴とする請求項６記載の形質転換動物。
【請求項８】
組織特異的発現をするプロモーター配列が、ヒト血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）遺伝子プロモーター配列であること特徴とする請求項６記載の形質転換動物。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子の全部または一部が、Ｃ型肝炎ウイルス株のコアタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項６から８のいずれか１項に記載の形質転換動物。
【請求項１０】
形質転換動物が齧歯類動物であることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の形質転換動物。
【請求項１１】
齧歯類動物がマウスであることを特徴とする請求項１０記載の形質転換動物。
【請求項１２】
慢性肝炎、肝硬変または肝癌を誘発する処置を施した請求項１から１１のいずれか１項記載の形質転換動物。
【請求項１３】
慢性肝炎、肝硬変または肝癌を誘発する処置を薬物投与、外科的手術若しくは免疫学的手法により行なうことを特徴とする請求項１２記載の形質転換動物。
【請求項１４】
薬物が四塩化炭素、ジエチルニトロサミン、ジメチルニトロサミン、コンカナバリンＡ、リポポリサッカロイド、プロピオニバクター　アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｕｎｅｓ）、抗Ｆａｓ抗体であることを特徴とする請求項１３記載の形質転換動物。
【請求項１５】
請求項１０から１４のいずれか１項記載の形質転換動物を用いたヒトＣ型肝炎、肝硬変、および、肝癌の治療剤の開発および、治療方法確立のためのスクリーニング方法。
【請求項１６】
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子の全部または一部を肝臓特異的に発現するプロモーターの制御下に、動物の分化全能性を有する細胞に導入し、該細胞を仮親中で個体発生させることを含む形質転換動物の作出方法。
【請求項１７】
肝臓特異的発現をするプロモーターが、ヒト血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）遺伝子プロモーターであること特徴とする請求項１６記載の形質転換動物の作出方法。
【請求項１８】
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子の全部または一部がＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１６記載の形質転換動物の作出方法。
【請求項１９】
請求項１から１１のいずれか１項記載の形質転換動物に、薬物投与、外科的手術または免疫学的手法を用いて慢性肝炎、肝硬変あるいは肝癌を誘発させることを特徴とする病態モデル動物の作出方法。
【請求項２０】
薬物が慢性肝炎、肝硬変あるいは肝癌を誘発するものである、請求項１９記載の病態モデル動物の作出方法。
【請求項２１】
薬物が四塩化炭素、ジエチルニトロサミン、ジメチルニトロサミン、コンカナバリンＡ、リポポリサッカロイド、プロピオニバクター　アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｕｎｅｓ）、抗Ｆａｓ抗体であることを特徴とする請求項２０記載の病態モデル動物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用いて、ヒトのＣ型肝炎の病態に極めて類似した、慢性肝炎、肝硬変、肝癌を誘発する病態モデル作製法とこれを用いた、ヒトＣ型肝炎、肝硬変および、肝癌の治療剤の開発、および治療方法確立のためのスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＣＶは持続感染して慢性肝炎から肝硬変を発症し、長期間を経て肝癌にいたることが知られている。ＨＣＶ感染の治療としてインターフェロンが使われているが、その効果は部分的であり、新たな治療法の開発が望まれている。しかし、ＨＣＶ感染症の良い実験動物モデルが無いために、発癌機構の解析と新たな治療剤および、治療法の開発の妨げとなっている。
【０００３】
ＨＣＶ感染症においてウイルス感染と慢性炎症の両者が肝発癌に深く関与していると考えられており、ＨＣＶ遺伝子産物を過剰発現させたトランスジェニックマウスが数種類作製された。しかしながら、ヒトの病態とは異なり、慢性肝炎、肝硬変といった病態を呈することがなかった（Ｔ　Ｋａｗａｍｕｒａら　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２５　１０１４　１９９７、Ｋ　Ｍｏｒｉｙａら　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ　４　１０６５　１９９８、Ｃ　Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉら　Ｈｅｐａｔｏｌｇｙ　２５　７１９１９９７など）。また、発癌に関しては起こらないか、発癌したとしてもかなりの低頻度であり（Ｋ　Ｍｏｒｉｙａら　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ　４　１０６５　１９９８など）、また、用いた　ＨＣＶ株の違いにより、トランスジェニック動物の病態に違いが認められた（例えば、Ｋ　Ｍｏｒｉｙａら　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ　４　１０６５　１９９８　と　Ｋ　Ｍｏｒｉｙａら　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ　４　１０６５　１９９８の比較）。従来技術では、Ｃ型肝炎由来の肝癌発症機序の解析および、肝癌治療剤の開発および、治療法確立のためのスクリーニングは困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ＨＣＶに起因する肝炎、発癌を極めてヒトの病態に類似した状態で再現する動物モデルおよび、Ｃ型肝炎および、肝癌の治療剤の開発および、治療方法確立のためのスクリーニング方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従来技術の問題点を解決すべく、本発明者らは、今まで動物に導入されたことのない　ＨＣＶ　ＴＨ株由来遺伝子（Ｗａｋｉｔａら　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２６５　１４２０５　１９９４）を用いたが、従来と同様に肝炎、肝硬変、肝癌などの発症は認められなかった。ＨＣＶ感染症においてウイルス感染と慢性炎症の両者が肝発癌に深く関与していると考えられている。したがって、ＨＣＶ遺伝子由来のタンパク質が胎児期から存在するため、免疫寛容が成立して肝炎が発症せず、癌化も起こらなかったものと考えられる。そこで、肝炎を慢性的に誘発することにより、肝癌を発症させることができる可能性を考えて検討を行った。こうすることにより、先に述べた、　ＨＣＶ遺伝子の存在と慢性肝炎をモデル動物で共存させることでヒトの病態に即したモデル動物になりうることを見出した。
【０００６】
そこで本発明者らは、ＨＣＶ感染と慢性肝障害による高頻度肝臓腫瘍発生動物モデルを作製し、Ｃ型肝炎および、肝癌の治療剤開発および、治療方法確立のためのスクリーニング系として有用であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、ＨＣＶのウイルスゲノム遺伝子由来のｃＤＮＡを組み込み、ＨＣＶのウイルスタンパク質を肝臓特異的に発現するトランスジェニック動物または、その子孫において、肝障害を誘発して慢性肝炎あるいは、肝硬変を誘発して、高頻度に肝癌を発症させることを特徴とするＣ型肝炎および、肝癌治療剤開発および、治療法確立のためのスクリーニング系を提供するものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）　ＨＣＶ遺伝子の全部または一部を動物の分化全能性を有する細胞に導入し、該遺伝子が発現された形質転換動物。
（２）　ＨＣＶ遺伝子がＨＣＶ　ＴＨ株である請求項１記載の形質転換動物。
（３）　動物の分化全能性を有する細胞がＥＳ細胞である（１）記載の形質転換動物。
（４）　動物の分化全能性を有する細胞が生殖系列の細胞である（１）記載の形質転換動物。
（５）　生殖系列の細胞が、受精卵である（４）記載の形質転換動物。
（６）　ＨＣＶ　ＴＨ株遺伝子の全部または一部が、組織特異発現をする発現プロモーター配列の制御下に導入されたものであることを特徴とする（１）記載の形質転換動物。
（７）　組織特異的発現をするプロモーター配列が、肝臓特異的に発現するプロモーターであること特徴とする（６）記載の形質転換動物。
（８）　組織特異的発現をするプロモーター配列が、ヒト血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）遺伝子プロモーター配列であること特徴とする（６）記載の形質転換動物。
（９）　ＨＣＶ株遺伝子の全部または一部が、ＨＣＶ　ＴＨ株のコアタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（６）から（８）のいずれかに記載の形質転換動物。
（１０）　形質転換動物が齧歯類動物であることを特徴とする（１）から（９）のいずれかに記載の形質転換動物。
（１１）　齧歯類動物がマウスであることを特徴とする（１０）記載の形質転換動物。
（１２）　慢性肝炎、肝硬変または肝癌を誘発する処置を施した（１）から（１１）のいずれかに記載の形質転換動物。
（１３）　慢性肝炎、肝硬変または肝癌を誘発する処置を薬物投与、外科的手術若しくは免疫学的手法により行なうことを特徴とする（１２）記載の形質転換動物。
（１４）　薬物が四塩化炭素、ジエチルニトロサミン、ジメチルニトロサミン、コンカナバリンＡ、リポポリサッカロイド、プロピオニバクター　アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｕｎｅｓ）、抗Ｆａｓ抗体であることを特徴とする（１３）記載の形質転換動物。
（１５）　（１０）乃至（１４）のいずれかに記載の形質転換動物を用いたヒトＣ型肝炎、肝硬変、および、肝癌の治療剤の開発および、治療方法確立のためのスクリーニング方法。
（１６）　ＨＣＶ遺伝子の全部または一部を肝臓特異的に発現するプロモーターの制御下に、動物の分化全能性を有する細胞に導入し、該細胞を仮親中で個体発生させることを含む形質転換動物の作出方法。
（１７）　肝臓特異的発現をするプロモーターが、ヒト血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）遺伝子プロモーターであること特徴とする（１６）記載の形質転換動物の作出方法。
（１８）　ＨＣＶ遺伝子の全部または一部が、ＨＣＶのコアタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（１６）記載の形質転換動物の作出方法。
（１９）　（１）から（１１）のいずれかのに記載の形質転換動物に、薬物投与、外科的手術または免疫学的手法を用いて慢性肝炎、肝硬変あるいは肝癌を誘発させることを特徴とする病態モデル動物の作出方法。
（２０）　薬物が慢性肝炎、肝硬変あるいは肝癌を誘発するものである、（１９）記載の病態モデル動物の作出方法。
（２１）　薬物が四塩化炭素、ジエチルニトロサミン、ジメチルニトロサミン、コンカナバリンＡ、リポポリサッカロイド、プロピオニバクター　アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｕｎｅｓ）、抗Ｆａｓ抗体であることを特徴とする（２０）記載の病態モデル動物の作出方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．本発明のモデル動物の作出
次に本発明のモデル動物の作出方法について説明する。組織特異的に発現するプロモーターの下流にＨＣＶ遺伝子の全部または一部を導入して発現ベクターを作製する。ＨＣＶ由来遺伝子としては、ＨＣＶ　ＴＨ株遺伝子が例示されるがこれに限定されない。動物に導入されたときに該動物がＣ型慢性肝炎、肝硬変または肝癌病態を呈する遺伝子ならばいずれの遺伝子でもよい。組織特異的に発現するプロモーターとしては、肝臓特異的に発現するプロモーターが望ましいが、これには限定されない。肝臓特異的に発現するプロモーターとして例えば、ヒト血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）遺伝子プロモーター（Ｚｈａｏ　Ｘ．ら　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１１１　７３６　１９９２）が挙げられる。このようにして、前記プロモーターとＨＣＶ遺伝子を導入して作製した発現ベクターを、分化全能性を有する細胞に導入し、導入後仮親に移植する。分化全能性を有する細胞としては、受精卵、初期胚の他、多分化能を有するＥＳ細胞等の培養細胞が挙げられる。また、導入する対象とする動物の種類は、トランスジェニック動物の作出技術が確立されている動物で有れば特に制限されない。好ましくはマウス、ラット、ハムスターなどの齧歯類であり、それらの中でも特に近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが好ましいが、技術的には全ての動物種を対象とすることが可能である。実施例ではマウスを用いているが、これに限定されることなく、ラット、ウサギ、ブタ、メダカ、ゼブラフィッシュなどでもよい。例えばＰｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：７３８０−７３８４，　１９８０の方法等に従って、上記導入遺伝子を哺乳動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞および生殖細胞染色体中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって本発明のモデル動物を作出することができる。個体へと発生させる全能性細胞は、目的のタンパク質の発現の程度が好ましい全能性細胞を選択しておくことが望ましい。
【００１０】
導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Ｆｏｕｎｄｅｒ）として、交配によりＨＣＶ遺伝子を染色体の一部に安定的に発現可能に組み込んだトランスジェニック動物を効率よく作出することができる。そして、トランスジェニック動物は病態モデル動物として使用することができる
作出したトランスジェニック動物の肝臓に炎症および障害を発生させることにより、このトランスジェニック動物の肝臓に慢性肝炎、肝硬変、腫瘍を発生させる。炎症および、肝障害をおこす方法は、薬物を用いる方法、外科手術的手法を用いた方法、免疫学的手法を用いた方法があるが、これに限定されない。
【００１１】
薬物を用いる方法としては、四塩化炭素０．３−２　ｍｇ／ｍｌを定期的に経口あるいは、腹腔内投与、ジエチルニトロサミン１−２０　ｍｇ／ｍｌを定期的に経口あるいは、腹腔内投与、ジメチルニトロサミン１−２０　ｍｇ／ｍｌを定期的に経口あるいは、腹腔内投与、コンカナバリンＡ　０．１ｍｇ／ｂｏｄｙを定期的に静脈投与、リポポリサッカロイド、プロピオニバクター　アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｕｎｅｓ）　１−１０ｍｇ／ｂｏｄｙを静脈投与して７日後にリポポリサッカロイド１−１０μｇ／ｂｏｄｙを静脈投与することを定期的に行なうことＤ−ガラクトミン１−１０ｍｇ／ｂｏｄｙを静脈投与して数日後にリポポリサッカロイド１０−３０μｇ／ｋｇを静脈内あるいは腹腔内投与することを定期的に行なうこと、抗Ｆａｓ抗体（クローンＪｏ２）などを１−５０ｍｇ／ｂｏｄｙでなどを静脈内あるいは腹腔内投与するなどがあるが、これに限定されない。
外科手術的手法を用いる方法としては、肝切除などがあるが、これに限定されない。
免疫学的手法を用いる方法としては、養子免疫、抗原を用いた免疫、ＤＮＡを
用いた免疫方法などがあるが、これに限定されない。
【００１２】
２．本発明の病態モデル動物の使用
本発明の病態モデル動物を、Ｃ型肝炎、肝硬変および肝癌の治療剤のスクリーニング又は治療法の開発のために用いることができる。
本発明の病態モデル動物に被験物質を投与し、Ｃ型肝炎、肝硬変および肝癌が治癒するかあるいは退行するかを指標に被験物質が治療剤として使用し得るかどうか判断できる。また、病態モデル動物中のＨＣＶ関連遺伝子の発現量を測定し、被験物質を投与しない場合のＨＣＶ関連遺伝子の発現量と比較することにより、ＨＣＶ関連遺伝子の発現量を減少させる物質、すなわちＨＣＶに関連する疾患の治療剤をスクリーニングすることが可能である。
【００１３】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
〔実施例１〕
（１）　トランスジェニックマウスの作製
発現ベクターの構築のため、ＳＡＰプロモーターの下流にＨＣＶ　ＴＨ株のコア領域遺伝子ｃＤＮＡの５７３塩基対長を挿入した（図１）。ＨＣＶ　ＴＨ株のコア領域遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列と予想されるアミノ酸配列を図２に示す（それぞれ、配列番号１および配列番号２）。この発現ベクターを精製してマウスの受精卵にマイクロインジェクションした。生まれたマウスの体細胞遺伝子への、トランスジーンの組み込みを以下の方法でスクリーニングした。マウスの耳介切片をプロテネースＫ溶液中で５５度１時間加熱した。得られたＤＮＡ溶液をＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは２９４Ｓ−２０（５’−ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ−３’）（配列番号３）と６０４Ｒ−１８（５’−ＴＴＧＣＣＡＴＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＡ−３’）（配列番号４）である。得られたＰＣＲ産物を電気泳動して、目的の大きさ（３１１ｂｐ）のＤＮＡの有無によりトランスジーンの組み込みを判定した。３匹の陽性マウスを同定した。この３匹をＳＣ１１、ＳＣ１２、ＳＣ１４と命名した。
【００１４】
（２）　組み込み遺伝子の確認
組み込まれたＨＣＶ遺伝子をさらに詳しく確認するためにサザンブロット解析をおこなった。ＰＣＲで陽性だった３種類のマウスの肝臓からゲノムＤＮＡを抽出し、アガロースゲルに電気泳動した。泳動終了後、ナイロン膜にＤＮＡを転写した。ＨＣＶ　ｃＤＮＡをプローブに用いて、トランスジーンを検出した（図３）。ＳＣ１１、ＳＣ１２、ＳＣ１４の組み込みコピー数を約１６、２５、８コピーと推定できた。ＰＣＲおよびサザンブロット解析により、ＳＣ１１、ＳＣ１２、ＳＣ１４にはインジェクションしたトランスジーンが体細胞遺伝子に組み込まれていることが確認された。
【００１５】
（３）　ＨＣＶタンパク質の発現の確認
発現ベクターの構築に用いたＳＡＰプロモーターは肝臓特異的に発現することが知られている。（ｒｅｆ）ＳＣ１１、ＳＣ１２、ＳＣ１４の肝臓のライセートを作製してアクリルアミドゲルに電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗コアモノクローナル抗体でコアタンパク質を検出した（図４）。トランスジェニックマウスの肝臓に目的の大きさのコアタンパク質の発現を確認した。さらに、マウスの各種臓器から同様にライセートを作製して、コアタンパク質はトランスジェニックマウスの肝臓特異的に発現していることを確認した。
【００１６】
（４）　トランスジェニックマウスの自然経過での肝腫瘍発生
トランスジェニックマウスとコントロールマウスを１８ヶ月から２４ヶ月齢まで飼育して肝臓における腫瘍発生を観察した。表１に示すようにトランスジェニックマウスにおいてわずかに腫瘍が発生した。
【００１７】
【表１】
2004000179.tif 000002
【００１８】
（５）　四塩化炭素による肝炎の誘発
１０％または２０％の四塩化炭素溶液を１　ｍｌ／ｋｇの量でトランスジェニックマウスおよびコントロールマウスに週１回または２回投与して誘導される肝炎の程度を観察した。繰り返し投与に対して肝炎を繰り返して発生した。血清中のＡＬＴ値を測定した。図５に示すようにトランスジェニックマウスとコントロールマウスで肝炎の程度に差は見られなかった。
【００１９】
（６）　四塩化炭素による肝炎によるトランスジェニックマウスの肝腫瘍発生
図６に示すスケジュールにしたがって、当初４週間週２回２０％四塩化炭素を投与し、その後３６週間にわたる週１回の投与の後にマウスを開腹して腫瘍の発生を観察した。表２に示すように投与開始後３２週では腫瘍は認めなかった。投与開始後４０週でトランスジェニックマウス９匹中５匹に腫瘍が発生した（図７）。またコントロールマウス５匹では腫瘍発生は認められなかった。
【００２０】
【表２】
2004000179.tif 000003
【００２１】
【発明の効果】
本発明において、ＨＣＶトランスジェニックマウスに繰り返し肝炎を誘導することにより高頻度に肝臓に腫瘍を発生させる病態モデルを作製できた。したがって、この病態モデルは、Ｃ型肝炎および、Ｃ型由来肝癌治療剤開発および、治療法確立のためのスクリーニング法として有用である。
【００２２】
【配列表】
2004000179.tif 000004
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2004000179.tif 000007
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【００２３】
【配列表フリーテキスト】
2004000179.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトのＳＡＰプロモーターとＨＣＶコア領域遺伝子を連結させた導入用遺伝子断片を示した図である。
【図２】導入したＨＣＶコア領域遺伝子のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示した図である。
【図３】トランスジェニックマウスの耳介切片から抽出したＤＮＡのサザンブロットの結果を示す写真である。
【図４】トランスジェニックマウスの肝臓から抽出したタンパク質と抗ＨＣＶコア抗体とのウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図５】トランスジェニックマウスに四塩化炭素を投与した時の、マウス血中トランスアミラーゼの変動を示す図である。
【図６】トランスジェニックマウスに四塩化炭素を長期投与した時のスケジュールを示す図である。
【図７】トランスジェニックマウスに四塩化炭素を長期投与終了後の肝臓組織の病理写真である。
【図１】
2004000179.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
2004000179.tif 000014
【図５】
2004000179.tif 000015
【図６】
2004000179.tif 000016
【図７】
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