(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規なポリペプチド及びそれらのポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。【解決手段】本発明は、新規なポリペプチド及びそれらのポリペプチドをコードする核酸分子に係る。また、ここで、それらの核酸配列を含むベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドに結合する抗体、及び本発明のポリペプチドを製造する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）に示したアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列がＦｉｇ２３（配列番号：５８）に示したヌクレオチド配列を含む、請求項１の核酸配列。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列がＦｉｇ２３（配列番号：５８）に示した配列の全長コード化配列を含む、請求項１又は請求項２の核酸。
【請求項４】
登録番号ＡＴＣＣ２０９６１６で寄託したＤＮＡの全長コード化配列を含む単離された核酸。
【請求項５】
請求項１から４の何れか１項の核酸を含んでなるベクター。
【請求項６】
前記核酸がベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列に作用可能に連結している、請求項５のベクター。
【請求項７】
請求項５又は請求項６のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞がＣＨＯ細胞、大腸菌又は酵母細胞である、請求項７の宿主細胞。
【請求項９】
ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項７又は請求項８の宿主細胞を培養すること、並びに前記ポリペプチドを細胞培地から回収することを含んでなる、前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）に示したアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有する単離された天然配列ポリペプチド。
【請求項１１】
登録番号ＡＴＣＣ２０９６１６で寄託したヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
異種アミノ酸配列と融合した請求項１０又は請求項１１に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項１３】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタッグ配列である、請求項１２のキメラ分子。
【請求項１４】
前記異種アミノ酸配列がイムノグロブリンのＦｃ領域である、請求項１２のキメラ分子。
【請求項１５】
請求項１０又は請求項１１に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項１６】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５の抗体。
【請求項１８】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１７の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、新規なＤＮＡの同定及び単離、及び該ＤＮＡによりコードされる新規なポリペプチドの組換え生産に関する。
【０００２】
（発明の背景）
細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。新規な未変性分泌タンパク質を同定する努力が産業界及び学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　９３；７１０８−７１１３（１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。
【０００３】
膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用する。具体例には、繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。新規な未変性レセプタータンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために、哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。
ここで我々は、新規の分泌及び膜貫通ポリペプチド、及びこれらポリペプチドをコードする新規な核酸の同定及び特徴づけを記述する。
【０００４】
ＰＲＯ３６３
細胞表面タンパク質ＨＣＡＲは、アデノウイルスのサブグループＣ及びコクサッキーウイルスのサクグループＢに対するレセプターとして作用する膜結合タンパク質である。よって、ＨＣＡＲは細胞へのウイルス感染を媒介する手段を提供するものであり、細胞表面上にＨＣＡＲレセプターが存在すると、ウイルス粒子に対する結合部位が提供され、それによってウイルス感染が促進される。
膜結合タンパク質、特にウイルスに対する細胞表面レセプターを提供するものの生理学的重要性に鑑みて、新規で未変性の膜結合レセプタータンパク質を同定するための努力が、産業界及び学術界の双方により現在なされている。これらの多くの努力は、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ３６３と命名した、Ａ３３及びガン胎児抗原を含む様々な腫瘍抗原及び細胞表面タンパク質ＨＣＡＲに対して相同性を有する新規な膜結合ポリペプチドをここに記載するもので、このポリペプチドは新規な細胞表面ウイルスレセプター又は腫瘍抗原でありうる。
【０００５】
（発明の概要）
ＰＲＯ３６３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３６３」と命名した、細胞表面レセプタータンパク質ＨＣＡＲと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３６３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２４（配列番号５９）のアミノ酸残基１〜３７３を持つＰＲＯ３６３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２４（配列番号５９）のアミノ酸残基１〜Ｘ（ここで、Ｘはアミノ酸２１６〜アミノ酸２２５の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ３６３細胞外ドメインポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３６３をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６１６として１９９８年２月５日に寄託されたＤＮＡ４５４１９−１２５２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３６３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３６３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２４（配列番号５９）の残基１〜３７３を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ３６３ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関しており、該細胞外ドメインは、Ｆｉｇ２４（配列番号５９）に示される配列のアミノ酸１〜Ｘ（ここで、Ｘはアミノ酸２１６〜２２５の任意のアミノ酸である）を含みうる。場合によっては、ＰＲＯ３６３ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６１６として１９９８年２月５日に寄託されたＤＮＡ４５４１９−１２５２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０００６】
更なる実施態様
本発明の他の実施態様では、本発明は上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含んでなるベクターを提供する。そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母である。上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものを製造する方法が更に提供され、これは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例としては、免疫グロブリンのＦｃ領域又はエピトープタグ配列に融合した上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものが含まれる。
他の実施態様では、本発明は上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。
また他の実施態様では、本発明はゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列を単離するのに有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、これらプローブは上述したあるいは後記するヌクレオチド配列の任意のものから取り出されうる。
【０００７】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（例えば、ＰＲＯ／数字）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。ここで使用される「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ここに記載されるＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
【０００８】
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、天然配列ＰＲＯ３６３ポリペプチドは、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）のアミノ酸１〜３７３を含有する成熟又は全長天然配列ＰＲＯ３６３ポリペプチドである。
【０００９】
ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、最初に同定された膜貫通ドメインのいずれかの末端から約５を越えないアミノ酸を含みうる。
【００１０】
「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ−又はＣ−末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、またさらに好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。
【００１１】
ＰＲＯアミノ酸配列に対してここで同定されている「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。好ましいソフトウェアアラインメントプログラムはＢＬＡＳＴである。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここで使用される％同一性は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２６６：　４６０−４８０　（１９９６）；　ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）を用いて計算される。殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＢＬＡＳＴ−２で使用される動的値であるＨＳＰ　Ｓ及びＨＳＰ　Ｓ２パラメータは、対象とする配列の組成及び配列が検索されるデータベースの組成によりプログラム自身によって確立される。しかしながら、感度をあげるように値を調節してもよい。％配列同一性は、整列させた領域内の残基の総数で一致する同一の残基を除した商によって決定される。
【００１２】
ここで同定されるＰＲＯコード化配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＰＲＯ配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここで使用される同一性の値は、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションを各々１及び０．１２５に設定し、初期値に設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールによって計算される。
【００１３】
「陽性（ポジティブ）」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基（例えば、保存的置換の結果として）を含む。陽性の％値は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス内でポジティブな値が付けられた残基を上記の整列領域内の残基の総数で除した商によって決定される。
【００１４】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜約２０の残基）を有する。
【００１５】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００１６】
「単離された」ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子は、同定され、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＰＲＯポリペプチド核酸分子を含む。
【００１７】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００１８】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００１９】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に抗−ＰＲＯポリペプチドモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、及び多エピトープ特異性を持つ抗−ＰＲＯ抗体組成物を包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯの形態を意味する。
【００２０】
ここで使用される「治療」又は「治療する」とは、治癒的療法、予防的療法及び防止的療法を称する。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患が防止されているもののなかで疾患に罹りやすいものを含む。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、ここでの哺乳動物はヒトである。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）を含む。
【００２１】
「アゴニスト」なる用語は、本発明の天然ＰＲＯポリペプチド（ここで、天然ＰＲＯポリペプチドは、プロ−ＰＲＯポリペプチド、プレ−ＰＲＯポリペプチド、プレプロ−ＰＲＯポリペプチド、又は成熟ＰＲＯポリペプチドを意味する）のペプチド又は非ペプチド類似物及びそのような天然ＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体を意味し、それらは天然ＰＲＯポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持している。好ましくは、本発明のアゴニストは、天然ＰＲＯポリペプチドの定量的結合認識特性及びレセプター活性化特性を保持している。
「アンタゴニスト」は、本発明の天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を阻害する分子を指し、ここで、天然ＰＲＯポリペプチドは、プロ−ＰＲＯポリペプチド、プレ−ＰＲＯポリペプチド、プレプロ−ＰＲＯポリペプチド、又は成熟ＰＲＯポリペプチドを意味する。好ましくは、ここでのアンタゴニストは、本発明の天然ＰＲＯポリペプチドの結合パートナーへの結合を阻害する。ＰＲＯポリペプチド「アンタゴニスト」は、ＰＲＯアンタゴニストエフェクター機能を防止又は妨害する分子（例えば、ＰＲＯポリペプチドによるＰＲＯポリペプチドレセプターの結合及び／又は活性化を防止又は妨害する分子）である。このような分子は、例えば、アンタゴニスト分子有無における天然ＰＲＯポリペプチドの結合を監視することにより、それらがＰＲＯポリペプチドレセプター活性化を競合的に阻害する能力をスクリーニングすることができる。また本発明のアンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチド遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドも含み、そのアンチセンスポリヌクレオチドは、ＰＲＯポリペプチドの転写又は翻訳を阻止し、それによりその発現及び生物学的活性を阻害する。
【００２２】
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ等，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　（１９９５）を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；又は（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｎＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファーと７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いることを意味する。その他の例は、４２℃の５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６／８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用いて、４２℃で０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで洗浄することである。更にその他の実施例は、５５℃で１０％のデキストラン硫酸、２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び５０％ホルムアルデヒドを用いてハイブリッド形成を行い、続いて５５℃でＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣから構成される高緊縮性洗浄液を用いることである。
「中程度の緊縮性条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，　上掲に記載されており、上記より低い緊縮性の洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００２３】
「サザン分析」又は「サザンブロット」は、ＤＮＡ又はＤＮＡ含有組成物の制限エンドヌクレアーゼ消化におけるＤＮＡ配列の存在が、知られた標識オリゴヌクレオチド又はＤＮＡ断片へのハイブリッド形成により確認される方法である。サザン分析は、典型的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）のｓｅｃｔｉｏｎｓ　９．３７−９．５２に記載されているように、アガロースゲル上のＤＮＡ消化物の電気泳動分離、電気泳動後のＤＮＡの変性、及び放射性標識、ビオチニル化、又は酵素標識プローブでの分析のためのＤＮＡのニトロセルロース、ナイロン、又は他の適した膜支持体上への移行を含む。
「ノーザン分析」又は「ノーザンブロット」は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ又はその断片、又はＲＮＡ断片などの公知のプローブにハイブリッド形成するＲＮＡ配列を同定するために用いられる方法である。プローブは、３２Ｐ等の放射性同位体、又はビオチニル化、又は酵素で標識される。分析されるＲＮＡは、通常はアガロース又はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離され、ニトロセルロース、ナイロン、又は他の適した膜に移され、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のｓｅｃｔｉｏｎｓ　７．３９−７．５２に記載されたもののような当該分野で知られた標準的技術を用いてプローブとハイブリッド形成する。
【００２４】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００２５】
「発現ベクター」という用語は、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸が適切な宿主細胞におけるその発現に影響を与えうるコントロール配列に作用可能に結合したベクターを定義するのに用いられる。ベクターは通常複製部位を有する（但し、これは染色体組込みが起こる場合は必要ない）。また発現ベクターは、形質転換細胞においてフェノタイプ選択を提供できるマーカー配列も含む。例えば、大腸菌は典型的に、大腸菌種から誘導されるプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される（Ｂｏｌｉｖａｒ等，　Ｇｅｎｅ　２：　９５　［１９７７］）。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、よってクローニング又は発現のいずれの目的でも、形質転換細胞を同定する容易な手段を提供する。また発現ベクターは、最適には転写及び翻訳の制御に有用な配列、例えば、プロモーター及びシャイン−ダルガーノ配列（原核生物について）又はプロモーター及びエンハンサー（哺乳動物について）を含む。プロモーターは、そうである必要はないが誘発性であり；哺乳動物宿主のためのＣＭＶプロモーターなどの強力な構成プロモーターさえもが宿主細胞毒性無しにＬＨＲを製造することがわかった。発現ベクターは、任意の発現制御、複製可能配列又は選択遺伝子を含む必要はないと考えられるが、それらが無いことにより、ハイブリッド形質転換体の同定及び高レベルのハイブリッド免疫グロブリン発現の達成が妨害される可能性がある。
【００２６】
「リポ多糖」又は「ＬＰＳ」は、ここで「エンドトキシン」の同義語として用いられる。リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性菌、例えば大腸菌の外膜の特徴的成分である。それらは多糖部分と脂質Ａと呼ばれる脂肪部分とからなる。一細菌種から他に変化する多糖は、Ｏ−特異的鎖（３〜８糖の繰り返し単位から構成される）及び２部コアからなる。脂質Ａは実際に、リン酸及び種々の数の脂肪酸で修飾された２つのグルコサミン糖を常に含む。さらなる情報については、例えば、Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ及びＢｒａｄｅ，　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｕｇｕｓｔ　１９９２，　５４−６１を参照のこと。
【００２７】
「敗血性ショック」は、ここでは最も広い意味で用いられ、Ｂｏｎｅ，　Ａｎｎ．　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ．　１１４，　３３２−３３３　（１９９１）に記載された全ての定義を含む。特に、敗血性ショックは、感染に対する全身性反応で始まる、敗血症と呼ばれる症候群である。この症候群は低血圧及び器官不全をもたらし、それは敗血性ショックと呼ばれる。敗血性ショックは、グラム陽性生物及び真菌、並びにエンドトキシン含有グラム陰性生物によって開始されうる。従って、この定義は「エンドトキシンショック」に限定されない。
【００２８】
「遺伝子増幅」及び「遺伝子複製」なる語句は交換可能に用いられ、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞系で生成されるプロセスを意味する。複製された領域（増幅されたＤＮＡの伸展）は、しばしば「単位複製配列」と呼ばれる。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
【００２９】
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００３０】
ここで用いられる「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学治療薬の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，　Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，　ＮＪ）、及びドキセタキセル（タキソテア、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ　Ｒｏｒｅｒ，　Ａｎｔｏｎｙ，　Ｆｒａｎｃｅ）、トキソテア、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４，６７５，１８７号参照）、メルファラン及び関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬もこの定義に含まれる。
「成長阻害薬」は、ここで用いられる場合、インビトロ又はインビボで、細胞、特にここに定義される遺伝子を過剰発現している癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害薬は、Ｓ期においてそのような遺伝子を過剰発現している細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害薬の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻止する薬剤、例えば、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル及びＡｒａ−Ｃである。さらなる情報は、Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，　Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ，編集，　Ｃｈａｐｔｅｒ　１，　Ｍｕｒａｋａｍｉによる表題「Ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，　ｏｎｃｏｇｅｎｓ，　ａｎｄ　ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｄｒｕｇｓ」（ＷＢ　Ｓａｕｎｄｅｒｓ：　Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，　１９９５）、特に１３頁に見出される。
「ドキソルビシン」は、アントラサイクリン抗生物質である。
【００３１】
用語「サイトカイン」は、一の細胞集団により放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質のための一般的用語である。このようなサイトカインの例は、リンカイン、モノカイン、及び伝統的ポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；リラキシン；プロリラキシン；等である。ここで用いられるように、用語サイトカインは天然供給源から又は組換え細胞培地からのタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的等価物を含む。
【００３２】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常は２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンの異種四量体糖タンパク質である。各軽鎖は重鎖にジスルフィド結合で結合しているが、ジスルフィド鎖の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また、各重鎖及び軽鎖は規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を持ち、それに続いて多数の定常ドメインがある。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）及び他端に定常ドメインを持ち；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと並び、軽鎖可変ドメインは重鎖可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖の可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。
用語「可変」は、可変ドメインの或る部分が抗体中で大きく異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に用いられるという事実を意味する。しかしながら、可変性、抗体の可変ドメイン全体に渡って均一に分布してはいない。それは、軽鎖及び重鎖の可変領域の両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存される部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々４つの領域を含んでおり、大きくはβ−シート配置をとり、３つのＣＤＲに接続し、それはβ−シート構造を接続する、或る場合にはその一部を構成するループを形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域の直近に保持され、他の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成の寄与している（Ｋａｂａｔ等，　ＮＩＨ　Ｐｕｂｌ．　Ｎｏ．９１−３２４２，　Ｖｏｌ．　Ｉ，　６４７−６６９頁　（１９９１））。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接含まれないが、抗体の抗体依存性細胞毒性への参加といった種々のエフェクター機能を示す。
【００３３】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉｓｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ等，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．　８（１０）：　１０５７−１０６２　［１９９５］）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬに量体の表面に抗原結合部位を決定する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００３４】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　ｖｏｌ．　１１３，　Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ｐｐ．　２６９−３１５　（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
【００３５】
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ　４０４，０９７；　ＷＯ　９３／１１１６１；　及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０：　６４４４−６４４８　（１９９３）により十分に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法（Ｌｏｗｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ）で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３６】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
【００３７】
ＩＩ．　本発明の組成物と方法
全長ＰＲＯ３６３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３６３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３６３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３６３ポリペプチドが細胞表面タンパク質ＨＣＡＲと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３６３ポリペプチドが新たなＨＣＡＲ相同体であると考えられている。
【００３８】
ＰＲＯポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯと比較してＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。
【００３９】
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００４０】
2004000009.tif 000002
【００４１】
ＰＲＯポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン，　ｍｅｔ，　ａｌａ，　ｖａｌ，　ｌｅｕ，　ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ，　ｓｅｒ，　ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ，　ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ，　ｇｌｎ，　ｈｉｓ，　ｌｙｓ，　ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ，　ｐｒｏ；　及び
（６）芳香族：ｔｒｐ，　ｔｙｒ，　ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒ等，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３：　４３３１（１９８６）；　Ｚｏｌｌｅｒ等，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１０：　６４８７　（１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等，　Ｇｅｎｅ，　３４：　３１５　（１９８５）］、制限的選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等，　Ｐｈｉｌｏｓ．　Ｔｒａｎｓ．　Ｒ．　Ｓｏｃ．　Ｌｏｎｄｏｎ　ＳｅｒＡ，　３１７：　４１５　（１９８６）］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯポリペプチド変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，　（Ｗ．Ｈ．　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．，　Ｎ．Ｙ．）；　Ｃｈｏｔｈｉａ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１５０：　１　（１９７６）］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
【００４２】
ＰＲＯポリペプチドの修飾
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯポリペプチドを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−ＰＲＯポリペプチド抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　Ｗ．Ｈ．　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．，　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，　ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００４３】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯポリペプチドに見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は天然配列ＰＲＯポリペプチドに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加及び／又はグリコシル化部位に結合した糖残基の比率及び／又は組成の変更を意味する。
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変更を伴う。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯポリペプチド（Ｏ−結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【００４４】
ＰＲＯポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ　８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ，　ＣＲＣ　Ｃｒｉｔ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　ｐｐ．　２５９−３０６　（１９８１）に記載されている。
ＰＲＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ等，　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．，　２５９：５２（１９８７）により、及びＥｄｇｅ等，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１１８：１３１（１９８１）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ等，　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１３８：３５０　（１９８７）に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
【００４５】
また、本発明のＰＲＯポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯポリペプチドを容易に精製できるようにする。もう一つの実施態様において、キメラ分子はＰＲＯポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。キメラ分子の二価の形態には、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。
種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ　ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ等，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　８：２１５９−２１６５　（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ等，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　５：３６１０−３６１６　（１９８５）］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ等，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　３（６）：５４７−５５３　（１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Ｈｏｐｐ等，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　６：１２０４−１２１０　（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２５５：１９２−１９４　（１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ等，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６６：１５１６３−１５１６６　（１９９１）］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８７：６３９３−６３９７　（１９９０）］を含む。
【００４６】
ＰＲＯポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、所望のＰＲＯポリペプチド核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ等，　Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｗ．Ｈ．　Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ．，　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，　ＣＡ　（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　８５：２１４９−２１５４　（１９６３）参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。所望のＰＲＯポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯポリペプチドを生産してもよい。
【００４７】
Ａ．ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡは、所望のＰＲＯポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯポリペプチドＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯポリペプチドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された（ＰＲＯポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の）プローブによってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，上掲；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ等，　ＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９５）］。
【００４８】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通して決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００４９】
Ｂ．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯポリペプチド生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋ等，　上掲に見出すことができる。
【００５０】
形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗ等，　Ｇｅｎｅ，　２３：３１５　（１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ　８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　５２：４５６−４５７　（１９７８）のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎ等，　Ｊ．　Ｂａｃｔ．，　１３０：９４６　（１９７７）及びＨｓｉａｏ等，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７６：３８２９　（１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ等，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　１８５：５２７−５３７　（１９９０）及びＭａｎｓｏｕｒ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　３３６：３４８−３５２　（１９８８）を参照のこと。
【００５１】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、Ｅ．　ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）　、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・ブチリス（Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・リチェニフォルミス（Ｂ．　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ　２６６，７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。これらの例は例示であり限定ではない。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質加水分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｔｒ３　ｐｈｏＡ　Ｅ１５　（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９　ｄｅｇＰ　ｏｍｐＴｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ　５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｔｒ３　ｐｈｏＡ　Ｅ１５　（ａｌｇＦ−ｌａｃ）１６９　ｄｅｇＰ　ｏｍｐＴ　ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００５２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｒｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ，　Ｎａｔｕｒｅ，　２９０：　１４０　［１９８１］；　１９８５年５月２日発行のＥＰ　１３９，３８３）；クルベロミセスホスツ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｈｏｓｔｓ）（米国特許第４，９４３，５２９号；　Ｆｌｅｅｒ等，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　９：　９６８−９７５　（１９９１））、例えばケーラクチス（Ｋ．　ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ，　ＣＢＳ６８３，　ＣＢＳ４５７４；　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ等，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　７３７　［１９８３］）、ケーフラギリス（Ｋ．　ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ　１２，４２４）、ケーブルガリクス（Ｋ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ　１６，０４５）、ケーウィケラミイ（Ｋ．　ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ　２４，１７８）、ケーワルチイ（Ｋ．　ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ　５６，５００）、ケードロソフィラルム（Ｋ．　ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ　３６，９０６；　Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇ等，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　８：　１３５　（１９９０））、ケーテモトレランス（Ｋ．　ｔｈｅｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びケーマルキシアナス（Ｋ．　ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ　４０２，２２６）；ピッチャパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ　１８３，０７０；　Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ等，　Ｊ．　Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　２８：　２６５−２７８　［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマレーシア（ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ　２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｃａｓｅ等，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７６：　５２５９−５２６３　［１９７９］）；シュワニオマイセス（ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日発行のＥＰ　３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日発行のＷＯ　９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ等，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１１２：　２８４−２８９　［１９８３］；　Ｔｉｌｂｕｒｎ等，　Ｇｅｎｅ，　２６：　２０５−２２１　［１９８３］；　Ｙｅｌｔｏｎ等，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８１：　１４７０−１４７４　［１９８４］）及びアスペルギルス・ニガー（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　４：　４７５−４７９　［１９８５］）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、Ｃ．　Ａｎｔｈｏｎｙ，　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆ　Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，　２６９　（１９８２）に記載されている。
【００５３】
グリコシル化ＰＲＯポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株　（ＣＯＳ−７，　ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ等，　Ｊ．　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ．，　３６：５９　（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，　Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７７：４２１６　（１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，　Ｍａｔｈｅｒ，　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｐｒｏｄ．，　２３：２４３−２５１　（１９８０））ヒト肺細胞　（Ｗ１３８，　ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７５）；　ヒト肝細胞　（Ｈｅｐ　Ｇ２，　ＨＢ　８０６５）；　及びマウス乳房腫瘍細胞　（ＭＭＴ　０６０５６２，　ＡＴＴＣ　ＣＣＬ５１）を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００５４】
Ｃ．複製可能なベクターの選択及び使用
所望のＰＲＯポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
対象とするＰＲＯポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯポリペプチドＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２，１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ　９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００５５】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリのための遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯポリペプチド核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ　等により，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７７：４２１６　（１９８０）に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｓｇｍａｎ等，　Ｇｅｎｅ，　７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等，　Ｇｅｎｅ，　１０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Ｊｏｎｅｓ，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　８５：１２　（１９７７）］。
【００５６】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯポリペプチド核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　２７５：６１５　（１９７８）；　Ｇｏｅｄｄｅｌ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　２８１：５４４　（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　８：４０５７　（１９８０）；　ＥＰ　３６，７７６］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒ　等，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８０：２１−２５　（１９８３）］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎ　等，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２５５：２０７３　（１９８０）］又は他の糖分解酵素［Ｈｅｓｓ　等，　Ｊ．　Ａｄｖ．　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ．，　７：１４９　（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１７：４９００（１９７８）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ　７３，６５７に更に記載されている。
【００５７】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ　２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯポリペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　２９３：６２０−６２５　（１９８１）；　Ｍａｎｔｅｉ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　２８１：４０−４６　（１９７９）；　ＥＰ　１１７，０６０；　及びＥＰ　１１７，０５８に記載されている。
【００５８】
Ｄ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５　（１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯポリペプチドＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００５９】
Ｅ．ポリペプチドの精製
ＰＲＯポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン−Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，　Ｍｅｔｈｏｄｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　１８２　（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産されるＰＲＯポリペプチドの性質に依存する。
【００６０】
ＰＲＯポリペプチドの用途
本発明のＰＲＯポリペプチドをコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＰＲＯポリペプチドコード化核酸も、ここに記載される組換え技術によるＰＲＯポリペプチドの調製に有用であろう。
全長天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸又はその一部は、全長ＰＲＯポリペプチド遺伝子の単離又はＰＲＯポリペプチド核酸配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＰＲＯポリペプチドの天然発生変異体又は他の種からのＰＲＯポリペプチドをコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、ここに開示した任意のＤＮＡ分子の核酸配列から、又は天然配列ＰＲＯコード化ＤＮＡのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯポリペプチド遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰＲＯポリペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【００６１】
本出願で開示するＥＳＴｓはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＰＲＯ配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸配列は、そのＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【００６２】
ＰＲＯポリペプチドのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合、ＰＲＯポリペプチドは、そのリガンドを同定するアッセイに用いることができる。同様にして、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲＯポリペプチド又はＰＲＯポリペプチドのリガンドの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【００６３】
また、ＰＲＯポリペプチド又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えばマウス又はラット）とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、対象とするＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりＰＲＯポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＰＲＯポリペプチド導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＰＲＯポリペプチドコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【００６４】
あるいは、ＰＲＯポリペプチドの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＰＲＯポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＰＲＯポリペプチド「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ（５’と３’末端の両方）を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはＴｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ，　Ｃｅｌｌ，　５１：５０３（１９８７）を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に（例えばエレクトロポレーションによって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Ｌｉ等，　Ｃｅｌｌ，　６９：９１５（１９９２）参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，　Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｅ．　Ｊ．　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，　ｅｄ．　（ＩＲＬ，　Ｏｘｆｏｒｄ，　１９８７），　ｐｐ．　１１３−１５２参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【００６５】
ＰＲＯポリペプチドのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
ＰＲＯポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＰＲＯポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン（ｒｈＩＦＮ）、インターロイキン−２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Ｊｏｈｎｓｏｎ等，　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．，　２：　７９５−７９９　（１９９６）；　Ｙａｓｕｄａ，　Ｂｉｏｍｅｄ．　Ｔｈｅｒ．，　２７：　１２２１−１２２３　（１９９３）；　Ｈｏｒａ等，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　８：　７５５−７５８　（１９９０）；　Ｃｌｅｌａｎｄ，　「Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｏｌｙａｃｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ　Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｓｉｇｎ：　Ｔｈｅ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　ａｎｄ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｐｏｗｅｌｌ　及び　Ｎｅｗｍａｎ編，　（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９９５），　ｐ．　４３９−４６２；　ＷＯ　９７／０３６９２，　ＷＯ　９６／４００７２，　ＷＯ　９６／０７３９９；　及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【００６６】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Ｌｅｗｉｓ，　「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｅｒ」：　Ｍ．　Ｃｈａｓｉｎ及び　Ｒ．　Ｌａｎｇｅｒ　（編），　Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　ａｓ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９９０），　ｐｐ．　１−４１。
例えば約８５ｋｇの最大体重を持つ哺乳動物に約８０ｇ／ｋｇ／日の用量を与える製剤について、最大用量は１日当たり約６．８ｍｇのＰＲＯポリペプチドであろう。この用量レベルに達するためには、最大の可能なタンパク質負荷（１５−２０％ｗ／ｗＰＲＯポリペプチド）及び最小の起こりうる初期破裂（＜２０％）を持つ持続放出製剤が必要である。１−２週間に渡るマイクロカプセルからのＰＲＯポリペプチドの連続（ゼロ−オーダー）放出も望ましい。さらに、放出されるカプセル化タンパク質は、所望の放出時間に渡ってその一体性及び安定性を維持しなければならない。
【００６７】
本発明のＰＲＯ３６３ポリペプチドは、細胞表面ＨＣＡＲタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３６３ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。特に、ＰＲＯポリペプチドから誘導される細胞外ドメインは、ウイルス感染の影響を低下させるためにインビボで治療的に使用できる。
【００６８】
本発明の化合物は、製薬的に有用な組成物を調製するための周知の方法に従って処方でき、それによりＰＲＯポリペプチドが製薬的に許容可能な担体媒体との混合物に混合される。好適な担体媒体及びその処方は、他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含むが、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　１６ｔｈ　ｅｄ．，　１９８０，　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，　Ｏｓｌｏ等編集に記載されており、その開示は参考としてここに取り入れる。
【００６９】
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬剤濃度は、特に意図される用途に応じて変化する。例えば、静脈深部の血栓症又は末梢血管疾患の治療においては、「ボーラス」投与が典型的には好ましく、それに続く投与は、およそ一定な血液レベル、好ましくは約３μｇ／ｍｌのオーダーに維持するように与えられる。
しかしながら、吸入能力は一般に利用できない救急医療ケア設備に関連する用途では、横たわる疾患（例えば塞栓症、亀裂骨折）の一般的な緊急性のために、幾分多めの初期投与量、例えば静脈内ボーラスを与えるのが一般的に望ましい。
【００７０】
抗−ＰＲＯポリペプチド抗体
本発明は、さらに抗−ＰＲＯポリペプチド抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
Ａ．ポリクローナル抗体
抗−ＰＲＯポリペプチド抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００７１】
Ｂ．モノクローナル抗体
あるいは、抗−ＰＲＯポリペプチド抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６：４９５　（１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には対象とするＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　（１９８６）　ｐｐ．　５９−１０３］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００７２】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Ｋｏｚｂｏｒ，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ等，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　（１９８７）　ｐｐ．　５１−６３］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０７：２２０　（１９８０）によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００７３】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Ｇｏｄｉｎｇ，　上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００７４】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等，　上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【００７５】
Ｃ．ヒト化抗体
本発明の抗−ＰＲＯポリペプチド抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Ｊｏｎｅｓ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　３２１：５２２−５２５　（１９８６）；　Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　３３２：３２３−３２９　（１９８８）；　及びＰｒｅｓｔａ，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐ．　Ｓｔｒｕｃｔ．　Ｂｉｏｌ．，　２：５９３−５９６　（１９９２）］。
【００７６】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）及び共同研究者［Ｊｏｎｅｓ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　３２１：５２２−５２５　（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　３３２：３２３−３２７　（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３９：１５３４−１５３６　（１９８８）］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２２７：３８１　（１９９１）；Ｍａｒｋｓ等，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２２２：５８１　（１９９１）］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Ｃｏｌｅ等及びＢｏｅｒｎｅｒ等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Ｃｏｌｅ等，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，　Ａｌａｎ　Ｒ．　Ｌｉｓｓ．　ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ等，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１４７（１）：８６−９５（１９９１）　］。
【００７７】
Ｄ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＰＲＯポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ，　Ｎａｔｕｒｅ，　３０５：５３７−５３９　（１９８３）］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ　９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，１０：３６５５−３６５９　（１９９１）に開示されている。
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ等，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【００７８】
Ｅ．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ　９１／００３６０；　ＷＯ　９２／２００３７３；　ＥＰ　０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
【００７９】
抗−ＰＲＯポリペプチド抗体の用途
本発明の抗−ＰＲＯポリペプチド抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗−ＰＲＯポリペプチド抗体は、ＰＲＯポリペプチドの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Ｚｏｌａ，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｉｎｃ．　（１９８７）　ｐｐ．　１４７−１５８］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。Ｈｕｎｔｅｒ等　Ｎａｔｕｒｅ，　１４４：９４５　（１９６２）；Ｄａｖｉｄ等，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１３：　１０１４　（１９７４）；Ｐａｉｎ等，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈ．，　４０：２１９　（１９８１）　；及びＮｙｇｒｅｎ，　Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，　３０：４０７　（１９８２）に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部位に抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。
また、抗−ＰＲＯポリペプチド抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯポリペプチドのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＰＲＯポリペプチドに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾過紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するＰＲＯポリペプチドを含有する試料と接触させた後、固定された抗体に結合したＰＲＯポリペプチド以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＰＲＯポリペプチドを抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【００８０】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
（実施例）
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランドである。
【００８１】
実施例１：新規なポリペプチド及びそれをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ公的データベースからの約９５０の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要ならば、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ、ＧｅｎＢａｎｋ）及び独自に開発したデータベース（例えば、ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ）を含む。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ及びＧｉｓｈ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２６６：　４６０−４８０　（１９９６））を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Ｂｌａｓｔスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ　Ｇｒｅｅｎ，　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，　Ｓｅａｔｔｌｅ，　ＷＡ；　ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、ｐｈｒａｐを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を、しばしば（全てではない）ＢＬＡＳＴ及びｐｈｒａｐの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及びＰＲＯポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離スルプローブとして用いるために使用した。正方向（．ｆ）及び逆方向（．ｒ）ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ（．ｐ）配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，　ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２５３：　１２７８−１２８０　（１９９１）参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
【００８２】
実施例２：アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリの調製
ｍＲＮＡを対象とするヒト組織からＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，　ＣＡからの試薬及びプロトコールを用いて単離した（Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　２）。このＲＮＡを、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　ＭＤ　（Ｓｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬及びプロトコールを用いるベクターｐＲＫ５ＤにおけるオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡの生成に使用した。この方法において、日本産ｃＤＮＡは１０００ｂｐを越えるサイズ分類し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄを、ｓｐ６転写開始部位、それに続くＳｆｉＩ制限酵素部位、さらにＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリの調製
一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を好ましく表現するために二次ｃＤＮＡライブラリを作成した。Ｓｐ６ＲＮＡを（上記の）一次ライブラリから生成し、このＲＮＡを、ベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０におけるＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　（上で参照したＳｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬及びプロ値コールを用いたランダムプライムしたｃＤＮＡライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡを５００−１０００ｂｐにサイズ分類し、平滑末端でＮｏｔＩアダプターに結合させ、ＳｆｉＩ部位で切断し、そしてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）に次いでアルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターにクローニングされたｃＤＮＡは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
【００８３】
３．形質転換及び検出
上記２パラグラフに記載したライブラリからのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２０ｍｌ）を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔した。次いで、ＳＯＣ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１ｍｌ）を添加し、この号物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む２０標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした（３７℃）。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばＣｓＣｌ−勾配を用いてＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡは、次いで以下の酵母プロトコールにのせた。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：（１）酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターでの形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母コロニーから直接的な挿入物のＰＣＲ増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのＤＮＡの精製。
用いた酵母菌株はＨＤ５６−５Ａ（ＡＴＣＣ−９０７８５）であった。この株は以下の遺伝子型：ＭＡＴアルファ、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ＭＡＬ＋、ＳＵＣ＋、ＧＡＬ＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができるが、。このような変異体は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたｓｅｃ７１が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ、ＳＳＡ１ｐ−４ｐ）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
【００８４】
形質転換は、Ｇｉｅｔｚ等，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｒｅｓ．，　２０：　１４２５　（１９９２）に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロス（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロスは、Ｋａｉｓｅｒ等，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ，　ｐ．　２０７　（１９９４）に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なＹＥＰＤブロス（５００ｍｌ）中におよそ２ｘ１０６細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．１）に希釈し、１ｘ１０７細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．４−０．５）まで再成長させた。
次いで細胞を収穫し、５，０００ｒｐｍで５分間のＳｏｒｖａｌ　ＧＳ３　ローターのＧＳ３ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして５０ｍｌのファルコン管内で、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＧＳ−６ＫＲ遠心機において３，５００ｒｐｍで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（１０ｍｌ，　１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，　１ｍＭのＥＤＴＡ　ｐＨ７．５，　１００ｍＭのＬｉ２ＯＯＣＣＨ３）で続けて洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ（２．５ｍｌ）中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞（１００μｌ）を新鮮な変性一本鎖サケ精子ＤＮＡ（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ　Ｌａｂｓ，　Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，　ＭＤ）及び形質転換ＤＮＡ（１μｇ　ｖｏｌ．　＜　１０μｌ）と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで４０％ＰＥＧ／ＴＥ（６００μｌ，　４０％のポリエチレングリコール−４０００，　１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，　１ｍＭのＥＤＴＡ，　１００ｍＭのＬｉ２ＯＯＣＣＨ３，　ｐＨ　７．５）を添加した。この混合物を緩く撹拌し、３０℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした。次いで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で１２，０００ｒｐｍで５−１０秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ（５００μｌ，　１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，　１ｍＭのＥＤＴＡ　ｐＨ　７．５）への再懸濁に次いで遠心分離した。
次いで、細胞をＴＥ（１ｍｌ）中に希釈し、アリコート（２００μｌ）を１５０ｍｍ成長プレート（ＶＷＲ）に予め調製した選択培地に拡げた。
【００８５】
あるいは、複数の少量反応ではなく、形質転換を１回の大規模反応で実施したが、試薬の量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Ｋａｉｓｅｒ等，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ，　ｐ．　２０８−２１０　（１９９４）に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（ＳＣＤ−Ｕｒａ）であった。形質転換体は３０℃で２−３日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Ｂｉｅｌｙ等，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１７２：　１７６−１７９　（１９８８）に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料（反応性　Ｒｅｄ−１２０，　Ｓｉｇｍａ）に結合させた。結合したデンプンをＳＣＤ−Ｕｒａ寒天プレートに最終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）で導入し、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝した（最終濃度５０−１００ｍＭ）。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地（１５０ｍｍプレート）に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝ＳＣＤ−Ｕｒａ寒天への赤色団分の直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
【００８６】
４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、９６ウェルプレートにおいて無菌水（３０μｌ）に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート（５μｌ）を、０．５μｌのＫｌｅｎｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ）；　４．０μｌの１０ｍＭ　ｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）；　２．５μｌのＫｅｎｔａｑバッファー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；　０．２５μｌの正方向オリゴ１；０．２５μｌの逆方向オリゴ２；１２．５μｌの蒸留水を含有する２５μｌ容量におけるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
５’−　ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＡＡＡＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴ　−３’
（配列番号：３２４）であった。
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＡＴＴ−３’
（配列番号：３２５）であった。
次いで、ＰＣＲは以下の通り実施した：
2004000009.tif 000003
下線を施した領域は、各々ＡＤＨプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０からの３０７ｂｐ領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのＰＣＲ反応の全生成物は３４３ｂｐであった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
ＰＣＲに続いて、反応のアリコート（５μｌ）を、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されたように１％アガロースゲル中でトリス−ボレーと−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝系を用いたアガローススゲル電気泳動により試験した。４００ｂｐより大きな単一で強いＰＣＲ産物をもたらすクローンを、９６　Ｑｉａｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　清浄化カラム（Ｑｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ．，　Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，　ＣＡ）での精製の後にＤＮＡ配列によりさらに分析した。
【００８７】
実施例１０：ヒトＰＲＯ３６３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４２８２８と命名される。ＤＮＡ４２８２８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３６３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー（４２８２８．ｆ１）　５’−ＣＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡＡＣＧＡＡＧＣ−３’　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号：６０）
逆方向ＰＣＲプライマー（４２８２８．ｒ１）　５’−ＡＣＴＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧＣ−３’　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号：６１）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４２８２８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（４２８２８．ｐ１）
５’−ＧＴＡＴＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＡＧＧＣ−３’　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号：６２）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３６３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３６３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３１８（ＤＮＡ４５４１９−１２５２）と命名される］（配列番号：５８）及びＰＲＯ３６３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３１８（ＤＮＡ４５４１９−１２５２）の全核酸配列をＦｉｇ２３（配列番号：５８）に示す。クローンＵＮＱ３１８（ＤＮＡ４５４１９−１２５２）は、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１９０−１９２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１３０９−１３１１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ２３）。予測されるポリペプチド前駆体は３７３アミノ酸長である（Ｆｉｇ２４）。Ｆｉｇ２４に示した全長ＰＲＯ３６３タンパク質は、約４１，２８１ダルトンの分子量及び約８．３３のｐＩを有する。Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）に示したアミノ酸配列のアミノ酸２２１〜２５４に膜貫通ドメインが存在する。またＰＲＯ３６３ポリペプチドは、約アミノ酸１５〜５６及び約アミノ酸８７〜１１６に少なくとも２つのミエリン
Ｐ０タンパク質ドメインを有する。クローンＵＮＱ３１８（ＤＮＡ４５４１９−１２５２）は、１９９８年２月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６１６が付与されている。
全長ＰＲＯ３６３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが細胞表面タンパク質ＨＣＡＲと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ３６３が新規なＨＣＡＲ相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ　３５．４５　ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　３５）は、ＰＲＯ３６３アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＨＳ４６ＫＤＡ＿１，　ＨＳＵ９０７１６＿１，　ＭＭＣＡＲＨ＿１，　ＭＭＣＡＲＨＯＭ＿１，　Ａ３３＿ＨＵＭＡＮ，　Ｐ＿Ｗ１４１４６，　Ｐ＿Ｗ１４１５８，　Ａ４２６３２，及びＢ４２６３２との間の有意な相同性を明らかにした。
【００８８】
実施例９９：ハイブリッド形成プローブとしてのＰＲＯポリペプチドコード化核酸の使用
以下の方法は、ＰＲＯをコードする核酸配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
ここに開示する対象とするＰＲＯポリペプチドのコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種ＤＮＡ類（ＰＲＯポリペプチドの天然発生変異体をコードするものなど）のスクリーニングのためのプローブとして又はそれからプローブを調製する塩基として用いられる。
いずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識ＰＲＯポリペプチドコード化核酸誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
次いで、全長天然配列ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【００８９】
実施例１００：大腸菌におけるＰＲＯポリペプチドの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による所望のＰＲＯポリペプチドの非グリコシル化形態の調製を例示する。
所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Ｂｏｌｉｖａｒ等，　Ｇｅｎｅ，　２：９５　（１９７７）参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、特定のＰＲＯポリペプチドコード領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，　上掲に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化ＰＲＯポリペプチドを金属キレート化カラムを用いてポリペプチドを緊密に結合させる条件下で精製した。
【００９０】
ＥＰ特許出願番号９９９１２３２１．９では、以下の手法を用いて、ＰＲＯポリペプチドを大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態で発現させた。ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ−Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（Ｗ３１１０　ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）　ｌｏｎ　ｇａｌＥ　ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）　ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ　ｈｙｃａｓｅ　ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させた。
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、亜硫酸によりブロックされたシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされた。溶液をＢｅｃｋｍａｎ　Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅ中で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのＱｉａｇｅｎ　Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷した。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，　Ｕｔｒｏｌ　ｇｒａｄｅ）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸収により見積もった。
試料を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールデｌイング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再折りたたみされたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ　Ｒ１／Ｈ逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたＰＲＯタンパク質を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５　Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８に調製した。
【００９１】
実施例１０１：哺乳動物細胞におけるＰＲＯポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるＰＲＯポリペプチドの調製を例示する。
発現ベクターとしてｐＲＫ５（１９８９年３月１５日発行のＥＰ　３０７，２４７参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯコード化ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，　上掲に記載されたような結合方法を用いてＰＲＯポリペプチドＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＰＲＯと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドＤＮＡを約１μｇのＶＡ　ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ等，　Ｃｅｌｌ，　３１：５４３　（１９８２））］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ　ＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０分間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術において、ＰＲＯポリペプチドは、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃ等，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　１２：７５７５　（１９８１）に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯポリペプチドを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯポリペプチドをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯポリペプチドを含む培地を濃縮して、選択した方法にとって精製することができる。
また、エピトープタグＰＲＯポリペプチドは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯポリペプチドはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ−ｈｉｓタグＰＲＯポリペプチド挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ−ｈｉｓタグＰＲＯポリペプチドを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【００９２】
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それは対応するタンパク質の可溶化形態及び／又はポリ−Ｈｉｓタグ形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）として発現された。
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｕｎｉｔ　３．１６，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ　（１９９７）に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Ｌｕｃａｓ等，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　ｒｅｓ．　２４：　９，　１７７４−１７７９　（１９９６）に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ），　Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）及びＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のＬｕｃａｓ等に記載されているように成長させた。約３ｘ１０−７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．２μｍ透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍｌスピナーに分けた。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地を満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートした。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０５細胞／ｍＬで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行の米国特許第５，１２２，４６９号に記載された生産培地を使用した。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　３６５　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｇｒａｄｅ　Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）の３０ｍＬとした。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷した。
【００９３】
ポリ−Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，　ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール、ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５　Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，　ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸，　ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μｌの１Ｍトリスバッファー，　ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によりＮ−末端アミノ酸配列決定した。
以下のＰＲＯポリペプチドはＣＨＯ細胞において成功裏に一過性形質移入された：ＰＲＯ３６３。
以下のＰＲＯポリペプチドはＣＯＳ細胞において成功裏に一過性形質移入された：ＰＲＯ３６３。
以下のＰＲＯポリペプチドはＣＨＯ細胞において成功裏に一過性形質移入された：ＰＲＯ３６３。
【００９４】
実施例１０２：酵母菌でのＰＲＯポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯポリペプチドの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯポリペプチドの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯポリペプチドの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯポリペプチドは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【００９５】
実施例１０３：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯポリペプチドの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯポリペプチドの組換え発現を記載する。
所望のＰＲＯポリペプチドを、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯポリペプチド又はＰＲＯポリペプチドの所定部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商品名）ウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１７１１）中にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４から５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ等，　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｏｘｆｏｒｄ：　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９４）に記載されているように実施した。
次に、発現されたポリ−ｈｉｓタグＰＲＯポリペプチドは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Ｒｕｐｅｒｔ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　３６２：１７５−１７９　（１９９３）に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）に複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯポリペプチドを含む画分をプールして負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯポリペプチドの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【００９６】
ＰＲＯ３６３は、バキュロウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞で成功裏に発現された。発現は、実際には０．５−２Ｌスケールで実施したが、より大きな（例えば８Ｌ）での調製に容易にスケールアップできる。タンパク質は、対応するタンパク質の可溶化形態及び／又はポリ−Ｈｉｓタグ形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）として発現された。
バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞での発現のために、ＰＣＲ増幅に続いて、対応するコード化配列をバキュロウイルス発現ベクター（ＩｇＧ融合物に対するｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ及びポリＨｉｓタグに対するＰＨ．Ｈｉｓ）にサブクローニングし、そのベクター及びＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ（登録商標）バキュロウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１０５スポドプテラグルヒペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１７１１）にリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を用いて同時形質移入した。ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ及びＰＨ．Ｈｉｓ．ｃは、市販のバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の修飾物であり、Ｈｉｓ又はＦｃタグ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加したＨｉｎｋのＴＮＭ−ＦＭ培地で成長させた。細胞は、２８℃で５日間インキュベートした。上清を回収し、続いて１０％ＦＢＳを添加したＨｉｎｋのＴＮＭ−ＦＨ培地におけるＳｆ９細胞感染による約１０の感染効率（ＭＯＩ）での最初のウイルス増幅に用いた。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおける作成物の発現を、１ｍｌの上清の２５ｍＬのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）又はＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。
第１の増幅上清をＥＳＦ−９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＬＬＣ）で成長させたＳｆ９細胞のスピナー培地（５００ｍｌ）の約０．１のＭＯＩでの感染に使用した。細胞は２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収して濾過した。バッチ結合及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを、スピナー培地の発現が確認されるまで、必要に応じて繰り返した。
形質移入細胞からの条件培地（０．５〜３Ｌ）を、遠心分離により細胞を除去し０．２２ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ−Ｈｉｓタグ作成物については、タンパク質作成物をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，　ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッファー，　ｐＨ６．８中で２５ｍｌのＧ２５　Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，　ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸，　ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５ｍＬの１Ｍトリスバッファー，　ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動で試験し、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によりＮ−末端アミノ酸配列決定した。
ＰＲＯ３６３はバキュロウイルス感染Ｈｉ５昆虫細胞において成功裏に発現された。発現は、実際には０．５−２Ｌスケールで実施したが、より大きな（例えば８Ｌ）での調製に容易にスケールアップできる。
【００９７】
バキュロウイルス感染Ｈｉ５細胞における発現について、ＰＲＯポリペプチドコード化ＤＮＡは、Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等の適当な系で増幅されても、又はバキュロウイルス発現ベクターの含まれるエピトープタグの上流（５’−）に融合させてもよい。このようなエピトープタグは、ポリ−Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域等）を含む。種々のプラスミドを用いることができ、ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）等の市販のプラスミドから誘導されたプラスミドを含む。簡単には、ＰＲＯポリペプチド又はＰＲＯポリペプチドの所望の部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅する。５’プライマーは隣接する（選択された）制限酵素部位を導入してもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化して発現ベクターにサブクローニングされる。例えば、ｐＶＬ１３９３の誘導体はヒトＩｇＧ（ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ）のＦｃ領域又はＮＡＭＥ配列の８ヒスチジン（ｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ）タグ下流（３’−）を含むことができる。Ｈｉ５細胞は、２７℃、ＣＯ２無し、ペン／ストレプト無しの条件下で５０％の集密度まで成長させた。１５０ｍｍプレート各々について、３０μｇのＰＲＯポリペプチドを含むｐＩＥベースベクターを１ｍｌのＥｘ−細胞培地（媒質：Ｅｘ−細胞４０１＋１／１００のＬ−Ｇｌｕ　ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　＃１４４０１−７８Ｐ（注：この媒質は軽感受性））と混合し、別の管において、１００μｌのセルフェクチン（ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　＃１０３６２−０１０）（ボルテックスで混合））を１ｍｌのＥｘ−細胞培地と混合した。２つの溶液を混合し、室温で１５分間インキュベーションした。８ｍｌのＥｘ−細胞培地を２ｍｌのＤＮＡ／セルフェクチン混合物に添加し、Ｅｘ−細胞培地で１回洗浄したＨｉ５細胞上に層形成させた。次いでプレートを暗中室温でインキュベートした。次いでＤＮＡ／セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をＥｘ−細胞で１回洗浄して過剰のセルフェクチンを除去した。３０ｍｌの新鮮なＥｘ−細胞培地を添加し、細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収して、バキュロウイルス感染ベクターでのＰＲＯポリペプチドの発現を、１ｍｌの上清の２５ｍＬのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）又はＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。
形質移入細胞からの条件培地（０．５〜３Ｌ）を、遠心分離により細胞を除去し０．２２ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ−Ｈｉｓタグ作成物については、タンパク質作成物をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，　ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッファー，　ｐＨ６．８中で２５ｍｌのＧ２５　Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，　ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸，　ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５ｍＬの１Ｍトリスバッファー，　ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。ＰＲＯポリペプチドの均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定及び所望又は必要に応じて他の分析手法により評価できる。
【００９８】
実施例１０４：ＰＲＯポリペプチドに結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯポリペプチド、ＰＲＯポリペプチドを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯポリペプチドを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＰＲＯポリペプチド免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｈ，　Ｈａｍｉｌｔｏｎ，　ＭＴ）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗−ＰＲＯポリペプチド抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、ＰＲＯポリペプチド静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯポリペプチドに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＰＲＯポリペプチドに対するモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗−ＰＲＯポリペプチドモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【００９９】
実施例１０５：キメラＰＲＯポリペプチド
ＰＲＯポリペプチドは、タンパク質精製を促進するための一又は複数の付加的ポリペプチドドメインを持つキメラタンパク質として発現させてもよい。このような精製促進ドメインは、これらに限られないが、固定化金属での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール等の金属キレート形成ペプチド、固定化免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ（商品名）伸展／親和性精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ．，　Ｓｅａｔｔｌｅ，　Ｗａｓｈ．）で利用されるドメインを含む。精製ドメイン及びＰＲＯポリペプチド配列の間に因子ＸＡ又はエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　Ｃａｌｉｆ．）等の切断可能なリンカー配列を含むことは、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの発現促進に有用であろう。
【０１００】
実施例１０６：特異的抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロＰＲＯポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレＰＲＯポリペプチドは、対象とするＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗−ＰＲＯポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，　Ｎ．Ｊ．）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化セファロース（商品名）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯポリペプチドは、細胞が成長する培地中に油様な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、ＰＲＯポリペプチドが回収される。
【０１０１】
実施例１０７：薬剤スクリーニング
本発明は、ＰＲＯポリペプチド又はその結合断片を種々の薬剤スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に位置しても、細胞内に局在化していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＰＲＯポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ＰＲＯポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験する事もできる
即ち本発明は、ＰＲＯポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＰＲＯポリペプチド又は断片に接触させ、（Ｉ）試薬とＰＲＯポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は（ｉｉ）ＰＲＯポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、フリーのＰＲＯポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、フリー又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯポリペプチドに結合する又はＰＲＯポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に発行されたＷＯ　８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＰＲＯポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合可能な中和抗体が、ＰＲＯポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯポリペプチドで、一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１０２】
実施例１０８：合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＰＲＯポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例は、ＰＲＯポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬剤の創作に使用できる（参考、Ｈｏｄｇｓｏｎ，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　９：　１９−２１　（１９９１））。
１つの方法において、ＰＲＯポリペプチド、又はＰＲＯ−インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定する。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯポリペプチド様分子の設計又は行こうなインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Ｂｒａｘｔｏｎ及びＷｅｌｌｓ，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３１：　７７９６−７８０１　（１９９２）に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はＡｔｈａｕｄａ等，　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１１３：　７４２−７４６　（１９９３）に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体（抗−ｉｄｓ）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗−ｉｄｓの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗−ｉｄｓは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のＰＲＯポリペプチドがＸ線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列の知識は、ｘ線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる知識を提供する。
【０１０３】
実施例１１６：ラット卵形嚢支持細胞の増殖
有毛細胞先祖（聴毛細胞再生に関連）である内耳支持細胞に対して潜在的にマイトジェンとして作用するＰＲＯポリペプチドを同定する努力において、種々のＰＲＯポリペプチドが以下のアッセイで試験された。
ラット卵形嚢内皮細胞系（ＵＥＣ−４細胞）を、３３℃における２００μｌの血清含有培地中、３０００細胞／ウェルの密度で分けた。一晩の後、３７℃において培地を無血清培地に変え、ＰＲＯポリペプチドを種々の希釈で添加した。２４時間のインキュベーションの後、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に２４時間かけて添加した。次いで細胞をＴｏｍｔｅｃ細胞回収器を用いて回収した。内皮細胞をポリリシン基質上で成長させたので、細胞回収の前にトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で３０分間培養ウェルに添加して細胞を離れさせた。マトリクス９６００ガスカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｄｏｗｎｅｒｓ　Ｇｒｏｖｅ，　ＩＬ）でｃｐｍ／ウェルを数えた。各実験群からの３つの培養ウェルからデータを集め、平均±ＳＥＭで表した。対照群（ＴＧＦ−α処理）との比較として、統計的分析に両側不対ｔ−試験を用いた。
対照の値より少なくとも３０％高い平均ｃｐｍ数をこのアッセイでのポジティブと考える。以下のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ３６３。
【０１０４】
実施例１１７：インサイツハイブリッド形成
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定ｍＲＮＡ合成及び染色体マッピングにおける追跡に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Ｌｕ及びＧｉｌｌｅｔｔ，　Ｃｅｌｌ　Ｖｉｓｉｏｎ　１：　１６９−１７６　（１９９４）のプロトコールの最適な変形に従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ−標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のＬｕ及びＧｉｌｌｅｔｔに記載されたようにインサイツハイブリッド形成する。［３３−Ｐ］ＵＴＰ−標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをＫｏｄａｋ　ＮＴＢ２核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
３３Ｐ−リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＢＦ　１００２，　ＳＡ＜２０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ−ＵＴＰを含む管に以下の成分を添加した：
２．０μｌの５ｘ転写バッファー
１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ：　１０μ；　１０ｍＭのＧＴＰ，　ＣＴＰ＆ＡＴＰ＋１０μｌのＨ２Ｏ）
１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌのＲｎａｓｉｎ
１．０μｌのＤＮＡテンプレート（１μｇ）
１．０μｌのＨ２Ｏ
１．０μｌのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ産物についてＴ３＝ＡＳ，　Ｔ７＝Ｓ，通常）
管を３７℃で１時間インキュベートし、１．０μｌのＲＱ１　ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１紙にピペットした。残りの溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いてスピンさせた（６分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（３分間）。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ　ＩＩで数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ　ＭｒｋＩＩＩを３μｌの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃に３分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、１８０−２５０ボルトで４５分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。
【０１０５】
３３Ｐ−ハイブリッド形成
Ａ．凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（２５ｍｌ　２０ｘＳＳＣ　＋　９７５ｍｌ　ＳＱ　Ｈ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（２５０ｍｌの予備加熱ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌストック１２．５μｌ）、切片を０．５ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中、各２分間脱水した。
Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理
スライドを脱パラフィンし、ＳＱ　Ｈ２Ｏ中に配置し、２ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅバッファー中１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く０．５ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
Ｃ．プレハイブリッド化
スライドをＢｏｘバッファー（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を５０μｌのハイブリッド形成バッファー（３．７５ｇデキストラン硫酸＋６ｍｌＳＱ　Ｈ２Ｏ）で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、１８．７５ｍｌのホルムアミド、３．７５ｍｌの２０ｘＳＳＣ及び９ｍｌのＳＱ　Ｈ２Ｏを添加し、組織を良くボルテックスし、４２℃で１−４時間インキュベートした。
Ｄ．ハイブリッド形成
スライド当たり１．０ｘ１０６ｃｐｍのプローブ及び１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μｌのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、５０μｌの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド５０μｌに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
Ｅ．洗浄
洗浄は、２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（２５０ｍｌＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ｘ１０分間、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
Ｆ．オリゴヌクレオチド
インサイツ分析を、ここに開示した種々のＤＮＡ配列について実施した。この分析に用いたオリゴヌクレオチドは、ここに開示した核酸配列から誘導し、一般的に約４０〜５５ヌクレオチド長の範囲であった。
【０１０６】
材料の寄託
次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，１２３０１　パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド、米国（ＡＴＣＣ）に寄託した：
材料　　　　　　　　　ＡＴＣＣ寄託番号　　　寄託日
ＤＮＡ４５４１９−１２５２　　　　ＡＴＣＣ　２０９６１６　　　１９９８年２月５日
【０１０７】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則（特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む）に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ２３】天然配列ＰＲＯ３６３ｃＤＮＡの核酸配列（配列番号：５８）を示す。配列番号：５８は、ここで「ＵＮＱ３１８」及び／又は「ＤＮＡ４５４１９−１２５２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２４】Ｆｉｇ２３に示した配列番号：５８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５９）を示す。
【図２３】
2004000009.tif 000004
【図２４】
2004000009.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月1日(2003.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】天然配列ＰＲＯ３６３ｃＤＮＡの核酸配列（配列番号：５８）を示す。配列番号：５８は、ここで「ＵＮＱ３１８」及び／又は「ＤＮＡ４５４１９−１２５２」と命名されるクローンである。
【図２】図１に示した配列番号：５８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５９）を示す。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2004000009.tif 000006
【図２】
2004000009.tif 000007