(57)【要約】【課題】耐熱性、耐ｐＨ性が強く優れた性能を有するが、生産性の面で問題のあったサーモアスカス  オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ    ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）カタラーゼを大量に生産できるようにする。【解決手段】遺伝子工学的手法を用いて、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ    ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのゲノムＤＮＡから単離したカタラーゼ遺伝子のクローニング、培養菌体から単離したｍＲＮＡを基に作成したｃＤＮＡのクローニング、及び塩基配列の決定を行い、さらに該遺伝子を導入した形質転換体を用いてＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ    ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓカタラーゼを生産する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーモアスカス  オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ    ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）のゲノム遺伝子であって配列１の塩基配列を有するカタラーゼ遺伝子。
【請求項２】
サーモアスカス  オーランティアカスのｃＤＮＡであって配列２の塩基配列を有するカタラーゼｃＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１及び請求項２に記載の遺伝子の発現産物であって、配列３のアミノ酸配列を有するカタラーゼ。
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載の遺伝子を導入することによる、請求項３に示すサーモアスカス  オーランティアカスのカタラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はサーモアスカス  オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ    ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、以下Ｔ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）のカタラーゼ遺伝子及びこの遺伝子の発現産物であるカタラーゼに関する。更に詳しくは、Ｔ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓから新規に単離したカタラーゼ遺伝子を用いてカタラーゼを大量に生産させ、繊維染色分野での過酸化水素の分解、食品分野及び半導体分野での過酸化水素含有廃水中の過酸化水素の分解等に利用するものである。
【０００２】
【従来の技術】
カタラーゼは過酸化水素の分解を触媒する酵素であり、従来から繊維染色、食品加工、半導体分野等で使用される過酸化水素の分解除去に使用されている。
従来、微生物由来のカタラーゼとして、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等に属する微生物のカタラーゼが知られているが、糸状菌由来のカタラーゼは安定性等、優れた性質を有しているものが多い。中でもＴ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのカタラーゼは、耐熱性、耐ｐＨ性が強い等優れた性能を有している（特許文献１参照）。本酵素はＴ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓの液体培養及び固体培養で生産されるが、その生産性は低い。
【０００３】
これまでアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス  ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ノイロスポラ  クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）等の糸状菌のカタラーゼ遺伝子がクローニングされているが、より優れたカタラーゼをコードしているＴ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのカタラーゼ遺伝子はクローニングされておらず、本遺伝子を利用した本カタラーゼの大量発現は困難であった。
【０００４】
【特許文献１】
特開平５−１５３９７５号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
発明者らが解決しようとする課題は、Ｔ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのカタラーゼ遺伝子を単離し塩基配列を決定し、過酸化水素の分解除去が必要なさまざまな産業分野で利用可能な高性能カタラーゼを生産するために本遺伝子を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決するためになされたものである。本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｔ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのゲノムＤＮＡから単離したカタラーゼ遺伝子のクローニング、及びカタラーゼを生産するＴ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓの培養菌体から単離したｍＲＮＡを基に作製したカタラーゼｃＤＮＡのクローニング、更にこれらの塩基配列の決定に成功した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（１）から（４）に示すＴ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓの配列１の塩基配列を有するカタラーゼ遺伝子、配列２の塩基配列を有するｃＤＮＡ、配列３のアミノ酸配列を有するカタラーゼ、及び前記遺伝子を導入することによるＴ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのカタラーゼの製造方法に関する。
（１）Ｔ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのゲノム遺伝子であって配列１の塩基配列を有するカタラーゼ遺伝子。
（２）Ｔ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのｃＤＮＡであって配列２の塩基配列を有するカタラーゼｃＤＮＡ。
（３）（１）及び（２）に記載の遺伝子の発現産物であって、配列３のアミノ酸配列を有するカタラーゼ。
（４）（１）又は（２）に記載の遺伝子を導入することによる（３）に示すＴ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのカタラーゼの製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
Ｔ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのゲノムＤＮＡは本菌の液体培養菌体から公知の方法で抽出する。これまでに報告されている糸状菌のカタラーゼの保存領域からプライマーを作製し、このプライマーを用いてゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を行い、カタラーゼ遺伝子の部分断片を得る。得られた断片または断片の塩基配列を基に合成したものをプライマーとして、ゲノムＤＮＡの各種制限酵素による消化断片を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅した断片を公知の方法によりクローニングする。得られたカタラーゼ遺伝子断片の塩基配列の解析により、開始コドン、停止コドンを含むカタラーゼゲノム遺伝子の塩基配列を決定する。
また、Ｔ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのカタラーゼｃＤＮＡの単離は以下のように行う。カタラーゼを生産している菌体よりＲＮＡを抽出し、先に決定したカタラーゼ遺伝子塩基配列の５’−および３’−末端部配列を基にプライマーを合成し、逆転写酵素等を用いるＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを合成・増幅する。これを大腸菌ベクターに繋ぎ、大腸菌にクローニングした後、塩基配列を決定する。
【０００９】
上記のように単離、解析された本カタラーゼ遺伝子は２３５４ｂｐからなり、カタラーゼｃＤＮＡは２２４１ｂｐからなっていた。これらの結果より、本遺伝子は２つのイントロンを含み、７４６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが判明した。本遺伝子は、最も相同性の高いアスペルギルス  フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のカタラーゼＡ遺伝子と７３％の相同性を示した。
【００１０】
本カタラーゼ遺伝子及び本ｃＤＮＡは、これを同種及び異種宿主に導入して高発現せしめ、カタラーゼを製造することが可能である。
宿主としては各種真核微生物が利用可能である。異種発現の宿主としてアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス  ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス  アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．ａｗａｍｏｒｉ）トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ  リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ．ｒｅｅｓｅｉ）、リゾプス  ニヴェウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）等を例示できるが、宿主−ベクター系が確立されているものであればよく、これらに限定されるものではない。同種発現宿主として、Ｔ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓも利用可能である。
【００１１】
上記により単離したカタラーゼ遺伝子は宿主における公知の高発現プロモーターを利用し発現させることが可能である。プロモーターとしては宿主のグルコアミラーゼ遺伝子、タカアミラーゼ遺伝子、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン酸脱水素酵素遺伝子等のプロモーターが使用できるがこれらに限定されるものではない。本カタラーゼ遺伝子は上記プロモーターの下流に挿入され、プラズミドに組み込まれて公知の方法により宿主に導入される。この形質転換体を培養することによりカタラーゼの高発現が達成される。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：カタラーゼ遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定
Ｔ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのゲノムＤＮＡは液体培養した菌体から公知の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）により調製した。ＰＣＲ用のプライマーとして、糸状菌カタラーゼのアミノ酸配列アラインメントをもとに２箇所の保存領域から公知の方法により下記のプライマーを作製した（プライマー１、２）。このプライマーを用いてゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、アスペルギルス  フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のカタラーゼＡ遺伝子と高い相同性を示す２８２ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ＤＮＡ断片の塩基配列を基に合成したプライマー（プライマー３、４）を用い、ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ消化断片を鋳型としてサークルＰＣＲを行い、それぞれ２．６ｋｂ及び２．４ｋｂの増幅断片を得た。これを大腸菌にクローン化し、更にサブクローン化し、塩基配列を決定した。これらの断片にはカタラーゼ遺伝子の開始コドンを含む５’末端側の大部分は含まれていたが、３’末端側の一部が含まれていなかった。３’末端側をコードする断片を得るため、２．４ｋｂＰｓｔＩ断片の下流のＤＮＡ断片の取得を目的に、以下のようにカセットＰＣＲを行った。即ち、ゲノムＤＮＡのＸｂａＩ消化断片とＸｂａＩカセットオリゴマーとのライゲートを鋳型として用い、プライマーとしてＰｓｔＩ断片の３’−末端付近の塩基配列を基に作製した２種のネストプライマー（プライマー５、６）とＸｂａ  Ｉカセットプライマー（プライマー７、８）を用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、約１．０ｋｂの増幅断片を得た。この断片をクローン化して塩基配列を解析し、上記断片では欠けていたカタラーゼのＣ末端部分をコードする遺伝子部分の塩基配列を決定した。これらの断片を結合することによりカタラーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を得た。これらの結果に基づき、２３５４ｂｐからなるカタラーゼ遺伝子の全塩基配列が決定された。本配列はアスペルギルス  フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のカタラーゼＡ遺伝子と７３％の相同性を示した。
プライマー１    ５’−ＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＹＧＡＹＣＡＹＧＡＲＣＧ−３’（２２ｍｅｒ）
プライマー２    ５’−ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＹＴＧＲＡＴＲＡＡＲＡＡ−３’    （２１ｍｅｒ）
プライマー３    ５’−ＧＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＡＴＴＣＧＣＧＧＴＴＡＡＧ−３’（３０ｍｅｒ）
プライマー４    ５’−ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴＴＣＣＧＡＡＧ−３’（３０ｍｅｒ）
プライマー５    ５’−ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＴＧＴＣＡ−３’（３０ｍｅｒ）
プライマー６    ５’−ＧＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴ−３’（３０ｍｅｒ）
プライマー７    ５’−ＧＴＡＣＡＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧ−３’  （３０ｍｅｒ）
プライマー８    ５’−ＧＡＡＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’（３０ｍｅｒ）
【００１３】
実施例２：カタラーゼｃＤＮＡのクローニング及び塩基配列の決定
カタラーゼを生産しているＴ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓの菌体から公知の方法によりｍＲＮＡを抽出した。
１ｓｔ  ｃＤＮＡの合成はアマシャム製のｃＤＮＡ合成キットを用い、そのマニュアルに従って行った。目的ｃＤＮＡの増幅、単離は次のように行った。先に決定したゲノム遺伝子の５’−および３’−末端の塩基配列を基にプライマーを合成した。それぞれのプライマーには制限酵素認識配列のタグが付けてある。１ｓｔ  ｃＤＮＡ  ｍｉｘｔｕｒｅを鋳型にしてＰＣＲを行い、特異的増幅断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫにつなぎ大腸菌にクローニングした。この断片の塩基配列を決定し、カタラーゼｃＤＮＡであることを確認した。本ｃＤＮＡ  は、配列２に示した、開始コドン及び停止コドンを含む２２４１ｂｐの塩基配列から成り、７４６アミノ酸残基からなるカタラーゼのアミノ酸配列（配列３）が判明した。
【００１４】
【発明の効果】
本発明によりＴ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのカタラーゼを大量に生産することが可能になり、過酸化水素の分解が必要な様々な産業分野への適用を可能にするものである。
【００１５】
【配列表】
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