(57)【要約】    【課題】γ−ＣＧから効率的にシステインを得ることができる方法、延いては酵母エキスからシステイン高含有食品素材の優れた製造法を提供すること。    【解決手段】γ−グルタミルシステインを含有する酵母菌体から酵母エキスを製造し、同エキスを６０℃以下の低温に制御しながら濃縮して固形分濃度１０％以上の液体の形態の食品素材を調製し、該食品素材を７０〜１３０℃に保持すること（特定条件下での２段加熱）を特徴とするシステイン高含有食品素材の製造法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミルシステインを含有する酵母菌体から酵母エキスを調製し、同エキスを６０℃以下の低温に制御しながら濃縮して固形分濃度１０％以上の液体の形態の食品素材を調製し、該食品素材を７０〜１３０℃に保持することを特徴とするシステイン高含有食品素材の製造法。
【請求項２】
該食品素材中の還元糖の存在量が１％以下でかつ酸性条件下で加熱処理（７０〜１３０℃に保持）することを特徴とする請求項１記載のシステイン高含有食品素材の製造法。
【請求項３】
該低温制御濃縮方法が真空濃縮であることを特徴とする請求項１または２記載のシステイン高含有食品素材の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−グルタミルシステインを含有する酵母菌体から酵母エキスを調製し、同エキスを６０℃以下の低温に制御しながら濃縮して固形分濃度１０％以上の液体の形態の食品素材を調製し、該素材を７０〜１３０℃に保持すること（特定条件下での２段加熱）を特徴とするシステイン高含有食品素材の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
システイン及びその酸化型ジスルフィドであるシスチンは食品の風味改善目的で使用されている。特開平１０−１３６８８３号公報には、システイン及びシスチンを含有する電解液に食品を浸漬し、食品の褐変を抑制する方法が開示されている。この発明によると、シスチンが還元極においてシステインに還元され、このシステインにより酵素的酸化によるキノン類の生成を経た褐色色素の生成が抑制されると開示されている。即ち、シスチンを用いてこのような食品の変色を抑制する為には還元によりシステインを生成させるという煩雑な操作が必要となる。また、特許第３２４６０６４号公報には、魚節の製造の際にシステインを利用する技術が開示されている。この発明によると、原料魚から節を製造する際に含硫化合物を添加して製造した魚節は、風味が強化されかつ風味劣化が抑制されると記載されており、シスチンよりもシステインの方が重量あたりの効果が高いと記載されている。また、国際公開ＷＯ９３／０８２７４号公報には、動植物蛋白質に含まれる酸化型システイン残基を還元して得られるシステイン残基をパン生地の改良に用いる技術が開示されている。このように、システインはその酸化型であるシスチンよりも使用範囲が広く、使用効果が高い。
【０００３】
このように広い用途を有するシステインの製法としては、蛋白分解法や半合成法などが知られているが、現在主に用いられている方法は蛋白分解法と半合成法である。しかしながら、システインを上記の目的で用いる場合、これを高含有量で含有する食品素材の強い要望があるが、システインを高含有量で含有する食品素材は従来ほとんど知られていなかった。
【０００４】
しかるところ、最近、国際公開ＷＯ００／３０４７４号公報（特許文献１）にて、γ−グルタミルシステイン（以下、γ−ＧＣと表記することがある）を含む食品素材を酵素処理又は特定条件下での加熱処理に付することによりシステイン及びその酸化型ジスルフィドであるシスチンを高含有する食品素材が得られることが明らかとなった。しかしながら、特許文献１には、γ−ＧＣからシステイン（Cysteine。以下、Ｃｙｓと表記することがある）及び酸化型ジスルフィドであるシスチン（Cystine）の合計生成率は記載されているが、γ−ＧＣからシステイン単独の生成率は記載されていない。前述したように、システインはシスチンよりもその用途が広く、その効果も高いことがわかっており、システインを効率的に製造する方法は産業上有益である。また、酵素処理によりシステイン及び酸化型ジスルフィドであるシスチンを製造するためには酵素が必要であり、加熱処理によりシステイン及びその酸化型ジスルフィドであるシスチンを製造するよりもコスト高になる。
【０００５】
このような状況のもと、γ−ＧＣより加熱処理によりシステインを効率的に製造する改良方法が強く望まれていた。
【０００６】
γ−ＧＣを加熱処理するプロセスは、特許文献１の他に、特許第２８３０４１５号公報（特許文献２）、特許第２９０３６５９号公報（特許文献３）等でも公開されている。特許文献２では、γ−ＧＣに糖類を添加して加熱することにより良好なローストミート様の香りや風味がするフレーバー組成物が得られると開示されおり、そして特許文献３ではグルタミルシステイン等の含硫化合物を一定量含有する酵母エキスに糖類を添加し、脂肪非存在下で加熱することによりローストミートフレーバー様風味を有する調味料が得られると開示されている。しかしながら、これら２つの特許文献２および３でもやはり、γ−ＧＣから効率的にシステインが得られるとの知見は開示されていない。
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／３０４７４号公報
【特許文献２】特許第２８３０４１５号公報
【特許文献３】特許第２９０３６５９号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ０１／９０３１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前項記載の従来技術の背景下に、本発明の目的は、γ−ＣＧから効率的にシステインを得ることができる方法、延いては酵母エキスからシステイン高含有食品素材の優れた製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ところで、特許文献１では、γ−ＧＣを加熱することにより、前述のように、システイン及びその酸化型ジスルフィドであるシスチンの総量が高収率で得られると開示されている。
【０００９】
さて、本発明者は、γ−ＧＣの加熱による反応が分子内反応により進行することを実験により確認した（後掲実験例１参照）。その為、加熱分解によりγ−ＧＣから遊離するシステイン及びその酸化型ジスルフィドの収率は、γ−ＧＣの濃度によらない為、γ−ＧＣを含有する水溶液を濃縮する必要はない。一方、酵母エキスには含硫化合物が豊富に含まれており、γ−ＧＣと相互作用する（後掲実験例２参照）。その為、酵母エキス等の含硫化合物が含まれている食品素材の溶液中でγ−ＧＣを加熱分解する場合は、２分子以上の反応に特徴的な分子間反応が生じることが想定される。よって、γ−ＧＣを酵母エキス等の食品素材の溶液中で加熱分解するプロセスは、分子間反応と分子内反応が競合する反応機構を示す。このような、分子間反応と分子内反応が競合する場合には、反応溶液の反応物質（reactant）濃度を低くすることにより分子間反応を抑制できる。一方、分子内反応自体は基質濃度に依存しない為、反応溶液の反応物質濃度を低くしても反応速度に影響しない。その為、反応溶液中の反応物質濃度を低くすることにより、分子間反応が抑制される為に、相対的に分子内反応の効率が上昇する。
【００１０】
このような、分子間反応と分子内反応が競合するような反応例として、ペプチドの環化反応をあげることができる。環状ペプチドを合成する場合は、分子内環化（分子内反応）を優先させる為、高希釈化又は溶液中に反応物の溶液を滴下しながら反応させることにより、反応溶液中の反応物質濃度を低くし、環状ペプチドを高収率で合成する。
【００１１】
このような理論的背景の下、γ−ＧＣを酵母エキスなどの食品素材溶液中で加熱分解する場合は、食品素材溶液の固形分濃度が低い条件下で反応を行なうことがγ−ＧＣからシステイン及びその酸化型ジスルフィドであるシスチンの生成率を高めることに資する。特許文献１においても、γ−ＧＣを４．５％含有する酵母エキス粉末を固形分濃度が２％水溶液になるように溶解して加熱分解したところ、システインおよびその酸化型ジスルフィドであるシスチンを総量で２％含有する酵母エキス粉末が得られたと記載されている（同文献実施例１参照）。この時のγ−ＧＣからシステイン及びその酸化型ジスルフィドであるシスチンの生成率は９０％以上であり、前述の理論通り極めて高い生成率を示している。
【００１２】
システインはシスチンに比較して、前述のように用途が広くその使用効果も高いことから、同文献記載の条件下でのシステインの生成率（システインへの変換率）を確認することが必要である。そこで、本発明者らは、同文献記載の実施例１に準じ、γ−ＧＣを含有する酵母エキス粉末を固形分濃度２％の水溶液に調製し、同様の条件で加熱処理を行いシステインへの変換率（すなわち、加熱処理した水溶液中のシステインのモル数を加熱処理前の水溶液中のγ−ＣＧのモル数で除した商）を求めたところ、γ−ＧＣからシステインへの変換率は約４０％であった。
【００１３】
本発明者らは、γ−ＧＣからシステインへの変換率を高めるために鋭意検討を行なった結果、γ−ＧＣを含有する酵母エキスを６０℃以下の低温に制御しながら濃縮して固形分濃度１０％以上の濃縮物となし、好ましくは酸性条件下、より好ましくはｐＨ３．５〜６、かつ好ましくは還元糖の存在量が１％以下の水溶液状態で前記濃縮温度より高温の７０〜１３０℃に保持する加熱処理に付することによりγ−ＧＣからシステインへの変換率を７０％にも高めることができることを見出し、このような知見に基いて本発明を完成するに到った。この結果は、分子内反応と分子間反応が競合するγ−ＧＣの水溶液中での分解反応からは推定される結果とは異なる予想外のものである。
【００１４】
すなわち、本発明は、酵母菌体を処理して得られる酵母エキスを６０℃以下の低温に制御しながら濃縮し、固形分濃度１０％以上の濃縮物となし、これを好ましくは酸性条件下、より好ましくはｐＨ３．５〜６でかつ好ましくは還元糖の低存在量、具体的には、好ましくは１％以下、より好ましくは０．５％以下、の条件下で前記濃縮温度より高温の７０〜１３０℃、好ましくは７０〜１００℃、より好ましくは７５〜１００℃に保持すること（加熱処理）により、γ−ＧＣを含有する酵母エキスからシステインを高含有する食品素材を効率的に製造する方法に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
先ず、（１）本発明に用いる酵母について説明する。これは、γ−ＧＣを含有する酵母であれば、特に制限されない。γ―ＧＣの含有量も特に限定されないが、γ―ＧＣの含有量が低すぎる酵母を用いる場合には、システインの濃度が高い目的製品である食品素材を得ようとすると、製品に酵母臭が感ぜられるようになるため好ましくない。システィンを高濃度含有し、しかも、酵母臭の発現のない食品素材を得るためには、γ―ＧＣ含有量が１％以上（乾燥菌体重量に対するγ−ＧＣ重量％）の酵母を用いることが好ましい。このような酵母は、国際公開ＷＯ００／３０４７４号公報（前掲特許文献１）に記載されているＨ４△ＧＳＨ２株、国際公開ＷＯ０１／９０３１０号公報（特許文献４）に記載のＮα２株、Ｎα３株などを挙げることができる。後述するように、γ−ＧＣは分解反応時に酵母エキス中のＳＨ基を有する化合物と相互作用してシステインの生成率が低下する為、菌体中のグルタチオン含量が低下した酵母、好ましくは乾燥酵母菌体あたり０．５％以下、より好ましくは０．１％以下、さらに好ましくは菌体の生育とのバランスからグルタチオンを微量しか含有していない菌株を用いることが好ましい。このような菌株として、例えば、３８７位のグリシン残基がアルパラギン酸残基に変異したグルタチオン合成酵素を有するサッカロマイセス・セレビシエ、５４位のプロリン残基がロイシン残基に変異したグルタチオン合成酵素を有するサッカロマイセス・セレビシエ、３７０位のアルギニン残基以降が欠失したグルタチオン合成酵素を有するサッカロマイセス・セレビシエなどをあげることができる。
【００１７】
なお、γ−ＧＣは、酵母菌体中の可溶性区分に存在し、かつ、該可溶性区分は酵母菌体のほぼ１／３を占めることから、酵母中のγ-ＧＣ含有量の上限は３０重量％を超えないものと推定される。
【００１８】
酵母は、前記のように、γ−ＧＣを含有するものであれば特に制限されないが、具体的にはサッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス・ポンベなどのシゾサッカロマイセス属、キャンディダ・ユティリスなどのキャンディダ属等に属する酵母を挙げることができる。因みに、後掲実施例１においては、国際公開ＷＯ０１／９０３１０号公報（前掲特許文献４）に記載の手法を利用して取得したグルタチオン合成酵素活性が弱化した２倍体酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）Ｎ３株を用いた。
【００１９】
次に、（２）上のように準備した酵母から酵母エキスを製造する方法を説明する。
【００２０】
上記のようにして得られる種酵母を好適な条件で培養して得られた酵母培養物は、γ−ＧＣを含有する酵母菌体を含有する。培養物からそのまま酵母エキスを製造することもできるが、酵母培養物からγ−ＧＣを含有する酵母菌体を一旦分離し、この菌体から酵母エキスを製造することもできることは言うまでもない。酵母エキスの製法は、その条件はγ−ＧＣ又はＣｙｓを著しく分解しない限り特に制限されず、常法によることができる。１例として、酵母菌体を６０〜８０℃の熱水で保持することにより内容物を抽出し、抽出残渣（菌体残渣）を取り除くことにより製造する方法を挙げることができる。このような熱水抽出法で酵母エキスを製造した場合、酵母エキスの固形分濃度は通常数％程度である。また、熱水抽出により酵母エキスを製造した場合、菌体残渣が取り除かれる為酵母エキスに含まれる固形分あたりのγ−ＧＣ含有量は数倍に上昇する。例えば、１重量％のγ−ＧＣを含有する酵母菌体から熱水抽出により内容物を抽出した場合、酵母エキスに含まれる固形分あたりのγ−ＧＣ含有量は約４〜８重量％程度に上昇する。なお、抽出効率は劣るが、酵母菌体や酵母培養物から酵母エキスを製造する際、抽出温度を６０℃以下の低温に保持する方法も本発明の実施態様から排除されるものではない。この場合、次工程である濃縮工程にそのまま連続するため、抽出物である酵母エキスが固形分濃度１０％以上になるまで６０℃以下に連続保持することになる。
【００２１】
（３）上のようにして得られた酵母エキスの本発明の方法による濃縮方法は、次の通りである。
【００２２】
すなわち、上記のようにして製造した酵母エキスは固形分濃度が通常数％の低濃度であるので、γ−ＧＣをＣｙｓへ変換する加熱処理前に濃縮する必要がある。濃縮方法は、γ−ＧＣ及びＣｙｓを著しく分解しない限り特に制限されないが、低温濃縮であることが好ましい。高温条件下での濃縮は、γ−ＧＣ及びＣｙｓが酵母エキス中の含硫化合物と相互作用し、Ｃｙｓの生成率が低下する為好ましくない。
【００２３】
かくして、本発明においては、酵母エキスを６０℃以下の低温に制御しながら濃縮して固形分濃度１０％以上の液体の形態の食品素材を調製する。低温濃縮法としては、具体的には、真空濃縮、冷凍濃縮などが挙げられる。また、濃縮は、低溶存酸素共存下、例えば溶存酸素量３ｐｐｍ以下、好ましくは２ｐｐｍ以下、より好ましくは１ｐｐｍ以下で行うことが好ましい。溶存酸素共存下での濃縮は、γ−ＧＣ及びＣｙｓのＳＨ基が酸化を受け、Ｃｙｓの生成率が低下する為好ましくない。このような条件下での低温濃縮によれば、酵母エキスの固形分濃度は例えば６〜１５時間で固形分濃度１０％以上になる。この場合、例えば、酵母エキスを固体状となるまで濃縮することも可能であるが、固体状とした場合、次工程である濃縮後の加熱反応は、固体状としたものを水等によって液体状に戻す必要がある。従って、濃縮後の酵母エキスは、液体状であることが工程管理上からも望ましい。
【００２４】
次に、（４）上のようにして得られた液体形態の食品素材を加熱処理してシステイン高含有食品素材とする方法を説明する。
【００２５】
濃縮後の酵母エキスの加熱反応（加熱分解）は固形分濃度１０％以上の液体の形態の食品素材（水溶液）中で行なうことが好ましい。固形分濃度１０％未満の水溶液中で加熱分解を行なった場合、γ−ＧＣの分解反応が1次反応に従わず、Ｃｙｓへの分解以外の副反応が生じ、Ｃｙｓの生成率が低下するため好ましくない。また、加熱温度は７０〜１３０℃の間で行なうことが、Ｃｙｓの効率的生成にとって好ましい。７０℃未満で加熱反応を行なった場合、γ−ＧＣからＣｙｓへの分解反応に時間がかかり、その間にγ−ＧＣ及びＣｙｓのＳＨ基が溶液中の溶存酸素によって酸化を受けるため好ましくない。一方、１３０℃より高温で分解反応を行なう場合、γ−ＧＣ及びＣｙｓのＳＨ基が酸化を受けＣｙｓの生成率が低下するため、同様に好ましくない。このような条件下での加熱処理によれば、該食品素材は、例えば３０分から１２０分でＣｙｓを固形分濃度に占める割合で２％もの高含有率で含有するＣｙｓ高含有食品素材となる。
【００２６】
（ａ）なお、液体の形態の食品素材の、前項（４）で説明した加熱処理の際の還元糖の存在量については、次の通りである。
【００２７】
γ−ＧＣの加熱分解中には還元糖は存在しないことが好ましい。具体的には、先に説明したように、好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．５％以下である。還元糖が存在すると、これがγ−ＧＣ及びＣｙｓと反応し、Ｃｙｓ以外の物質に変換されてしまうからである。還元糖の存在量はＣｙｓへの変換率に影響するため極力存在しないことが好ましい。このような還元糖の存在量が上記の範囲内にある食品素材は、酵母の培養時に残糖が可及的少量となるように糖を酵母に資化させた酵母培養物から調製することができる。また、残糖が多い場合は、酵母培養物からそのまま酵母エキスを製造しないで酵母培養物から酵母菌体を一旦分離し、また必要に応じて一旦分離した酵母菌体を水洗するなどしてから酵母エキスを作成することで調製することができる。γ−ＧＣからＣｙｓへの加熱反応（加熱分解）時に還元糖が存在する場合は、モル当量などから考えて、還元糖の存在量は好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．５％以下であり、かつ酸性条件下、好ましくはｐＨ３．５〜６でγ−ＧＣからＣｙｓへの変換反応を行なうことが好ましい。
【００２８】
（ｂ）また、加熱反応時のｐＨについては次の通りである。
【００２９】
加熱によるγ−ＧＣからＣｙｓへの変換工程は後述実験例１に記載のように、γ−ＧＣのカルボニル基の酸素原子の部位にプロトネーションが生じる結果、この部位を起点とした脱離反応が生じることにより起きる。その為、酸性条件下で行なうことが好ましい。例えば、十分なプロトネーションが生じるｐＨ３．５〜６とすることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実験例および実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００３１】
実験例１：γ−ＧＣからシステインの遊離反応は分子内反応によることの確認
まず、ＭＯＰＡＣ（Cambridge Soft ChemOffice Ultra, CS MOPAC）を用いたγ−ＧＣの構造最適化計算を行なったところ、γ−ＧＣの分子構造は通常のα結合をしたジペプチドでみられるような伸びた構造ではなく、γ−グルタミル基がシステイン(Ｃｙｓ)のアミノ基（グルタミン酸とシステインのアミド結合部分）に接近するように曲がった構造をとることが予測された。また、γ−ＧＣの分極電荷を計算したところ、γ位のカルボニル基の酵素原子の部位に負の電荷を有していた。その為、酸性条件下では、γ−ＧＣのこの部位がプロトネーションを起こしやすく、この部位を起点とした脱離反応が起き、Ｃｙｓが遊離すると予測される。γ−ＧＣの持つこのような分子構造から、γ−ＧＣからのＣｙｓの遊離反応（γ−ＧＣのＣｙｓへの分解反応）は分子内反応にて進行すると推測される。
【００３２】
次に、γ−ＧＣからＣｙｓの遊離反応が分子内反応によって進行し、基質濃度に依存しない事を確認する為、反応速度論による解析を行なった。γ−ＧＣを約１０ｍＭ及び約１００ｍＭ含有する２種の水溶液を調製し、各々を５０、６０、７０および８０℃に加熱し、０〜２４時間後のγ−ＧＣ量を測定した。この結果より分解速度定数を求め、アレニウスプロットを作成した。
【００３３】
結果を図１Ａ〜図１Ｄに示す。この結果から、加熱温度が高いほど分解速度は速いことがわかる。このことから、γ−ＧＣからのＣｙｓの遊離反応は基質濃度依存的ではなく、温度依存的に進行することが示された。
【００３４】
上記の結果より、γ−ＧＣからのＣｙｓの遊離反応は分子内反応により起こり、γ−ＧＣの基質濃度に依存しない事が確認された。
【００３５】
実験例２：γ−ＧＣと酸化型含硫化合物の相互作用
γ−ＧＣは食品素材中の他の含硫化合物と相互作用する。そこで、酸化型ジスルフィドである酸化型グルタチオン含有溶液中でのγ−ＧＣの分解反応を調べた。その結果、酸化型含硫化合物が共存するような食品素材中では、γ−ＧＣはその還元力の高さから酸化型含硫化合物を還元し、次にγ−ＧＣを含む化合物の分解反応が進行することが予測される。その反応は後掲図２に示す反応機構により分解することが推測された。
【００３６】
そこで、まずＣｙｓ、γ−ＧＣおよびグルタチオン（以下、ＧＳＨと表記することがある）の還元電位を調べたところ、Ｃｙｓ、γ−ＧＣそしてＧＳＨの順に還元力が高かった。次に、１０ｍＭのＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）またはＧＳＳＧ非添加及び１０ｍＭのγ−ＧＣを含む水溶液（ｐＨ５）を調製し、９０℃で加熱し、Ｃｙｓ、γ−ＧＣおよびＧＳＨの値を経時的に測定した。
【００３７】
これらの結果を図３（ａ）及び図３（ｂ）に示す。それらの結果から、γ−ＧＣによってＧＳＳＧが還元されてＧＳＨが生成し、ＧＳ−γ−ＧＣが生成する結果、γ−ＧＣからのＣｙｓの遊離が効率的に生じない事がわかった。即ち、酸化型ＳＨを有する食品素材中でγ−ＧＣを加熱分解するとその濃度依存的に副反応が生じ、システインの生成率が低下することが示された。
【００３８】
実験例３：γ−ＧＣ含有酵母エキス及び酵母エキス粉末の調製
以下の実験例に用いるγ−ＧＣ含有酵母エキス粉末を以下のようにして調製した。
【００３９】
（ａ）γ−ＧＣ含有酵母Ｎ３株の取得
２倍体サッカロマイセス・セレビシエ野生株から常法に従って、１倍体Ｎａ株（ＭＡＴ  ａ）を取得した。Ｎａ株と国際公開ＷＯ  ０１／９３１０号公報（前掲特許文献４）記載の１倍体酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）Ｎα３株（ＭＡＴα  ｇｓｈ２）を接合させ、２倍体酵母を取得した。この２倍体酵母を常法に従い、胞子形成させ、Ｎα３株と同じ変異型グルタチオン合成酵素遺伝子を有する１倍体酵母Ｎａ３株（ＭＡＴａ  ｇｓｈ２）を取得した。Ｎα３株とＮａ３株を接合させ取得した２倍体の中から、ホモの形で変異型グルタチオン合成酵素を有し、ＳＤ培地で培養した時対数増殖期に１重量％以上のγ−ＧＣを含有する２倍体酵母Ｎ３株を選抜した。なお、Ｎα３株の代わりにサッカロマイセス・セレビシエ  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４６（国際寄託番号  ＢＰ−８２２８）を用いることによっても取得することができる。
或いは、Ｎα３株の代わりに２倍体株であるサッカロマイセス・セレビシエ  ＡＪ１４８６１株（国際寄託番号  ＢＰ−０８５５３）を用いることによっても取得することができる。
【００４０】
（ｂ）γ−ＧＣ含有酵母菌体の調製
上記のようにして取得したＮ３株をジャーファンメーターを用いて培養した。ＹＰＤ培地を用い、３０℃でグルコースをフィードして培養した。培養物を集菌・洗浄することによりγ−ＧＣ含有酵母菌体を調製した。
【００４１】
（ｃ）γ−ＧＣ含有酵母エキス及び酵母エキス粉末の調製
上記のようにして調製したγ−ＧＣ含有酵母菌体を１０ｇ／ｄｌの濃度になるように水に懸濁し、７０℃で１０分間加熱することにより内容物を抽出した。遠心分離により、酵母菌体残渣と内容物を分離した。分離された内容物（酵母エキス。固形分濃度１．７％）を凍結乾燥により乾燥させ、ＤＭ（dry matter、固形分）に占める割合が８％のγ−ＧＣを含有する酵母エキス粉末を調製した。
【００４２】
実験例４：糖存在下でのγ−ＧＣの分解反応（１）
前掲特許文献１および２には、γ−ＧＣを酵母エキス中で糖類を添加して加熱処理することにより良好なローストビーフ風味のフレーバー組成物が得られることが開示されている。そこで、この反応中のＣｙｓ生成率を測定した。
【００４３】
すなわち、実験例３で調製した酵母エキス粉末を３０重量部、グルタミン酸を３０重量部およびキシロース（還元糖）を３重量部の割合で含む濃度８３％の水溶液を調製し（還元糖の存在量３％）、９０℃で３５分加熱処理した。その結果、Ｃｙｓは生成していなかった。これは、生成したＣｙｓが糖類と反応した為であると推測される。
【００４４】
実験例５：糖存在下でのγ−ＧＣの分解反応（２）
実験例３で作成した酵母エキス粉末を濃度３０％、ｐＨ４．５の水溶液に調製し、この溶液を１０等分して、それぞれにキシロース又はグルコースを終濃度で０％、０．２５％、０．５％、１％および３％になるように添加した。各水溶液を９０℃で２時間保持して加熱処理を行った。
【００４５】
その結果を後掲図４に示す。この結果から、酸性条件下では、キシロース濃度が１％以下であるとき効率的にＣｙｓが得られることが示された。
【００４６】
実験例６：酵母エキス濃縮条件（溶存酸素濃度）
実験例３で作成したγ−ＧＣを含む酵母エキス粉末を濃度３．４％の水溶液（ｐＨ４．５）に調製し、これを５０℃で１０時間加熱した。水溶液中の溶存酸素濃度によるγ−ＧＣ（生成したＣｙｓも合算する）の残存率を調べた。
【００４７】
結果を後掲図５に示す。それらの結果から、溶存酸素濃度１ｐｐｍ（脱気及び窒素封入により制御した）では、γ−ＧＣは９０％程度も残存しているが、溶存酸素濃度６ｐｐｍでは、４０％程度に低下した。６ｐｐｍは常圧下での溶存酸素濃度であるため、酸化型ＳＨを作成しないためにも真空条件下で低温加熱処理することの有効性が示された。
【００４８】
次に、実験例３（ｃ）で調製した酵母菌体抽出液（遠心分離により酵母菌体残渣と分離した内容物）を１２０ｍｍＨｇの減圧下で、抽出液を５０〜７０℃の範囲で加熱することにより、固形分濃度が６０％になるまで濃縮した。濃縮途中に、酵母菌体抽出液に含まれるγ−ＧＣ及びシステイン含有量を経時的に測定した。その結果、γ−ＧＣ及びシステインの総量は８５％以上残存していた。
【００４９】
実験例７：固形分濃度によるγ−ＧＣの分解反応の違い
実験例３（ｃ）で調製した酵母菌体抽出液（固形分濃度１．７％）を１２０ｍｍＨｇの減圧下で温度を５０℃に制御しながら固形分濃度が２〜６０％（すなわち、３％、５％、８％、１０％、２０％および３０％）になるまで真空濃縮した。塩酸を添加することによりｐＨを４．５に調整した各水溶液を５０℃、６０℃、７０℃、８０℃および９０℃で加熱し、水溶液中のγ−ＧＣ含有量を経時的に測定することにより、各濃度におけるγ−ＧＣの分解反応を反応速度論により解析した。
【００５０】
結果を後掲図６Ａ〜６Ｆに示す。各図において、（ａ）はある固形分濃度におけるγ−ＧＣの分解経時変化を示し、（ｂ）は対応するアレニウスプロットを示す。それらの結果から、固形分濃度１０％以上で加熱処理したときはγ−ＧＣの分解反応は分子間反応より分子内反応が優先し、温度依存的な一次反応にて進行することがわかった。よって、酸化型ＳＨを有する食品素材中では、濃度１０％以上で加熱処理することが分子間反応を抑制し、分子内反応を進行させＣｙｓの生成効率を高めることに効果的であることが示された。
【００５１】
実験例８：γ−ＧＣからのＣｙｓの生成率
実験例３（ｃ）で調製した酵母菌体抽出液（固形分濃度１．７％）を１２０ｍｍＨｇの減圧下で温度を５０℃に制御しながら固形分濃度が１０〜６０％（１０％、２０％、３０％、４０％、５０％および６０％）になるまで真空濃縮し、塩酸を添加することによりｐＨを４．５になるように調整した。各水溶液を９０℃で加熱し、Ｃｙｓの生成率を経時的に測定した。その結果、各々の固形分濃度におけるＣｙｓの最高生成率（加熱後の水溶液に含まれるＣｙｓのモル数の最高値を濃縮前の溶液に含まれるγ−ＧＣのモル数で除した商）は順に７２．５％、７７．６％、７８．７％、７８．１％、７７．５％および７４％であった。
【００５２】
実験例９：γ−ＧＣからのＣｙｓ生成率
実験例３（ｃ）で調製した酵母菌体抽出液（固形分濃度１．７％）を１２０ｍｍＨｇの減圧下で温度を５０℃に制御しながら固形分濃度が１０〜６０％（１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％）になるまで真空濃縮し、塩酸を添加することによりｐＨを３．０又は水酸化ナトリウム溶液を添加することによりｐＨを６．０に調整した。各水溶液を９０℃で加熱し、Ｃｙｓの生成率を経時的に測定した。その結果、ｐＨ３．０での各々の固形分濃度におけるＣｙｓの最高生成率は順に７５．８％、７９．３％、８０．２％、８０．１％、７６．２％、７５．２％であった。また、ｐＨ６．０での各々の固形分濃度におけるＣｙｓの最高生成率は順に７１．８％、７２．８％、７５．８％、７６．３％、７４．２％、７２．２％であった。
【００５３】
実験例１０
（ａ）γ−ＧＣ含有酵母菌体の調製
まず、ＡＪ１４８６１株（国際寄託番号  ＢＰ−０８５５３）をＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液をパントテン酸カルシウム０．４ｍｇ／ｄｌ含む培地Ａに植菌し、３０℃で振とう培養した。対数増殖期に培地を採取し、遠心分離によって菌体を回収した。回収した菌体を菌体濃度（乾燥酵母重量）が１２０ｍｇ／ｄｌになるように、パントテン酸カルシウムを含まない培地Ｂに摂取し、３０℃で一日振とう培養した（菌体内γ−ＧＣ含有量は経時的に増加し、乾燥酵母菌体あたり約４．０％）。培養物を集菌・洗浄することによりγ−ＧＣ含有酵母菌体を調製した。
培地Ｂの組成は、下記第１表に示す通りであり、培地Ａの組成は培地Ｂにパントテン酸カルシウムを０．４ｍｇ／ｄｌ含む組成である。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
（ｂ）γ−ＧＣ含有酵母エキスの調製
上記のようにして調製したγ−ＧＣ含有酵母菌体を１０ｇ／ｄｌの濃度になるように水に懸濁し、７０℃で１０分間加熱することにより内容物を抽出した。遠心分離により、酵母菌体残渣と内容物を分離した。このようにして、γ−ＧＣを含有する酵母菌体抽出液を調製した（固形分濃度約２．２％、固形分に占めるγ−ＧＣの割合が約１４％）。
（ｃ）γ−ＧＣからＣｙｓへの変換率
上記のようにして調製した酵母菌体抽出液を１２０ｍｍＨｇの減圧下で５０℃に制御しながら固形分濃度が３０％になるまで真空濃縮し、塩酸を添加することによりｐＨを４．５に調整した。水溶液を９０℃で加熱し、Ｃｙｓの生成率を経時的に測定した。その結果、Ｃｙｓの最高生成率は８２．１％であった。この結果は、実験例３（ｃ）に記載の結果と相俟って、Ｃｙｓの生成率には菌株や培養条件による影響のないことが理解される。
【００５６】
実施例１：システイン高含有食品素材の調製
（ａ）液体のシステイン高含有食品素材の調製
実験例３記載の方法で調製したγ−ＧＣ含有酵母菌体を１０ｇ／ｄｌになるように水に懸濁し、７０℃で１０分間加熱することにより内容物を抽出した。遠心分離により、酵母菌体残渣と内容物を分離した。このようにしてγ−ＧＣを含有する内容物１０Ｌを調製した（エキス中の固形分濃度は約１．７％であり、γ−ＧＣは固形分に対し約８％含有されていた）。内容物を１２０ｍｍＨｇの減圧下で温度を５０℃に制御して濃縮、約１０時間後に固形分濃度約３０％まで濃縮した。塩酸を添加しｐＨを４．５に調整した濃縮液を９０℃で約１時間保持し、液体のシステイン高含有食品素材を調製した。すなわち、固形分に占める割合が３．１％のＣｙｓを含有する食品素材を得た。この時のγ−ＧＣからＣｙｓへの変換率は約８０％であった。
【００５７】
（ｂ）粉末のシステイン高含有食品素材の調製
上記で得られた液体のシステイン高含有食品素材を凍結乾燥することにより、固形分に占める割合が３．１％の粉末状のＣｙｓ高含有食品素材を得た。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によれば、γ−ＣＧから効率的にシステインを得ることができ、延いては酵母エキスからシステイン高含有食品素材を容易に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】γ−ＧＣ（濃度１０ｍＭ）の分解反応を示す（実験例１）。
【図１Ｂ】γ−ＧＣ（濃度１０ｍＭ）の分解反応（Ｃｙｓの生成）を示す（実験例１）。
【図１Ｃ】γ−ＧＣ（濃度１００ｍＭ）の分解反応を示す（実験例１）。
【図１Ｄ】γ−ＧＣ（濃度１００ｍＭ）の分解反応（Ｃｙｓの生成）を示す（実験例１）。
【図２】γ−ＧＣと酸化型含硫化合物の相互作用のメカニズムを示す（実験例２）。
【図３】Ｃｙｓ、γ−ＧＣおよびＧＳＨのＧＳＳＧ共存下および非共存下の加熱反応を示す（実験例２）。
【図４】糖存在下でのγ−ＧＣの分解反応（Ｃｙｓ変換率）を示す（実験例５）。
【図５】溶存酸素濃度とγ−ＧＣの残存率の関係を示す（実験例６）。
【図６Ａ】ＤＭ３％におけるγ−ＧＣの分解反応を示す（実験例７）。
【図６Ｂ】ＤＭ５％におけるγ−ＧＣの分解反応を示す（実験例７）。
【図６Ｃ】ＤＭ８％におけるγ−ＧＣの分解反応を示す（実験例７）。
【図６Ｄ】ＤＭ１０％におけるγ−ＧＣの分解反応を示す（実験例７）。
【図６Ｅ】ＤＭ２０％におけるγ−ＧＣの分解反応を示す（実験例７）。
【図６Ｆ】ＤＭ３０％におけるγ−ＧＣの分解反応を示す（実験例７）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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