(57)【要約】【課題】従来の細胞外電位測定デバイスでは被験体細胞を保持する窪みの内に被験体細胞が確実に固定されているかどうかを容易に判断することが困難であった。【解決手段】基板１の一面側にダイアフラム２を設け、このダイアフラム２のいずれかの面に第一の窪み３を設け、この第一の窪み３に貫通孔４を設け、この貫通孔４の前記第一の窪み３と反対側の開口部に第二の窪み６を設け、この第二の窪み６の一部に検出電極５ａ、５ｂを設けることにより、培養液のイオン濃度を効率よく測定することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる第一の窪みを設け、この第一の窪みに貫通孔を設け、この貫通孔の前記第一の窪みと反対側の開口部に少なくとも一つ以上の曲面からなる第二の窪みを設け、この第二の窪みの一部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイス。
【請求項２】
第一の窪みに貫通孔を少なくとも２つ以上設け、これらの貫通孔の前記第一の窪みと反対側の開口部に第二の窪みを設けた請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項３】
第二の窪みに少なくとも２つの検出電極を設けた請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項４】
第二の窪みに検出電極を設けた請求項２に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項５】
貫通孔の形状が矩形あるいはＵ字形もしくはこれらの組み合わせである請求項１〜４のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項６】
基板がシリコンである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項７】
基板がＳＯＩ基板である請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項８】
第一の窪みの開口部の寸法が１０〜１００μｍであり、貫通孔の最小開口径もしくは幅が１〜１０μｍであり、第二の窪みの開口部の寸法が５〜１０μｍである請求項１〜７のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項９】
基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる第一の窪みを設け、この第一の窪みに貫通孔を設け、この貫通孔の前記第一の窪みと反対側の開口部に第二の窪みを設け、この第二の窪みの一部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、基板の他面側からエッチングによって前記ダイアフラムを形成する工程と、このダイアフラムを構成するいずれかの面の上に１枚のフォトマスクを用いてレジストマスクを形成する工程と、ドライエッチングによって第一の窪み、貫通孔、第二の窪みの順に形成する工程と、この第二の窪みに薄膜形成技術により検出電極を形成する工程からなる細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１０】
レジストマスクのエッチングホールの形状を所望とする貫通孔の形状とほぼ同じになるようにした請求項９に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１１】
エッチングを促進するガスのみを用いて第一の窪みを形成し、エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いて貫通孔を形成し、エッチングを促進するガスのみを用いて第二の窪みを形成する請求項９に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１２】
基板を異なる方向に少なくとも２回以上傾けてそれぞれエッチングを行うことにより、第一の窪みに少なくとも２つ以上の貫通孔および第二の窪みを形成する請求項９に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１３】
基板がシリコンよりなる細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、エッチングを促進するガスがＳＦ６、ＣＦ４、ＸｅＦ２のうちいずれか一つを含むガスを用い、エッチングを抑制するガスがＣ４Ｆ８、ＣＨＦ３のいずれかまたはこれらを含むガスを用いる請求項１１に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞外電位あるいは細胞の活動に発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法であり、例えば化学物質によって細胞が発する反応を検出する薬品スクリーニングに用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞の電気的活動を指標にして薬品をスクリーニングすることはパッチクランプ法、蛍光色素または発光指示薬を用いる方法により行われている。
【０００３】
このパッチクランプ法はマイクロピペットの先端部分に付けた細胞膜の微小部分（パッチと呼ぶ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法であり、この方法は一個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
また、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する蛍光色素または発光指示薬により、細胞内のイオンの移動をモニタすることで細胞の電気的活動を測定する方法もある。
【０００５】
しかし、パッチクランプ法はマイクロピペットの作成および操作に特殊な技術を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要することから大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。
【０００６】
また、蛍光色素などを利用する方法は大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングすることができる。しかしながら細胞を染色する工程が必要になるとともに、用いる色素の影響により測定時に検出されるバックグラウンド・レベルが高くなってしまったり、時間とともにこの色素が脱色するためにＳ／Ｎ比が悪くなるという欠点がある。
【０００７】
これに代わる方法として、細胞の保持手段を有した基板およびこれに設けられた電極によって細胞外電位を測定するデバイスも発明者らのグループにより提案されている（例えば、特許文献１参照）。この方法はパッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、しかも蛍光色素を用いる方法のように簡易に高速で大量の試料を測定できるものであり、基板上に設けられた細胞の保持手段を有する少なくとも一つのウエルと、このウエルに電気信号を検出するセンサー手段とを有する細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定するものである。
【０００８】
上記特許文献１で開示される細胞外電位測定デバイスの動作について図面を用いて詳細に説明する。
【０００９】
図１９は上記特許文献１で開示される細胞外電位測定デバイスのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル４０内に培養液４８が入れられ、被験体細胞４７は基板４２に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板４２に形成された窪み４１および開口部を介してこの窪み４１に連絡する貫通孔４４を備えた構成となっている。
【００１０】
さらに、貫通孔４４の中にはセンサー手段である測定電極４５が配置されており、この測定電極４５は配線を経て信号検出部に連結されている。
【００１１】
そして、測定の際には被験体細胞４７を貫通孔４４側から吸引ポンプなどの手段により、この被験体細胞４７が窪み４１部分に密着保持される。このようにして被験体細胞４７の活動により発生する電気信号はウエル４０中の培養液４８側に漏れることなく、貫通孔４４側に設けた測定電極４５によって検出される。
【００１２】
ここで、被験体細胞４７を保持する窪み４１の大きさは１０〜３０μｍ程度であり、貫通孔４４側の大きさが１〜５μｍと２段階にする必要がある。この形状を正確に実現するためには２種類のマスクを用いる必要があり、第一のマスクによりドライエッチングを行って窪み４１を形成した後、第二のマスクによってドライエッチングを行って貫通孔４４を形成する必要があった。
【００１３】
【非特許文献１】
「細胞の分子生物学、第三版」、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社
【特許文献１】
ＷＯ０２／０５５６５３号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような細胞外電位測定デバイスにおいて問題となるのは、被験体細胞４７を窪み４１内に保持するためにウエル４０側から加圧もしくは貫通孔４４の下側を減圧にすることが行われる。このとき、同時に貫通孔４４の窪み４１側に培養液４８が圧力差によって導入されることにより測定電極４５と接触することが必要である。この上下の圧力差を適当な値とすることで、培養液４８は貫通孔４４の出口側でメニスカス形状を形成することにより安定することができる。
【００１５】
しかしながら、図１９に示すような直線的な貫通孔４４の出口側の形状ではメニスカス形状を形成することができる適当な圧力差の値は狭い範囲でしかなかった。
【００１６】
すなわち、最適な圧力差からわずかでも外れると、メニスカス形状が破壊されて培養液４８の容量を一定にすることができないという問題があった。また被験体細胞４７が窪み４１の中に保持され、さらに貫通孔４４を覆うように細胞膜が密着しているかどうかを調べる手段がなかった。
【００１７】
さらに別の問題として、前述のように２種類のマスクを用いて行うと第一のマスクによるドライエッチングを行った後、第二のマスクを用いてドライエッチングを行う際にマスクのアライメントずれが生じ、さらに２枚のマスクを用意してフォトリソグラフィをそれぞれ別々に行うことから製造的にも手間がかかり、コスト高を招くことがあった。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の請求項１に記載の発明は、基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる第一の窪みを設け、この第一の窪みに貫通孔を設け、この貫通孔の前記第一の窪みと反対側の開口部に少なくとも一つ以上の曲面からなる第二の窪みを設け、この第二の窪みの一部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスであり、貫通孔内の培養液は第二の窪み内で表面張力によって維持されるので、培養液が不用意に外部に飛び出すことが無く、測定が安定する細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１９】
本発明の請求項２に記載の発明は、第一の窪みに貫通孔を少なくとも２つ以上設け、これらの貫通孔の前記第一の窪みと反対側の開口部に第二の窪みを設けた請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、被験体細胞が第一の窪み内の複数の貫通孔のうちいずれかを細胞膜によって覆うと、その貫通孔からの信号によって細胞外電位を測定することができる。つまり、複数の貫通孔にすることで被験体細胞が第一の窪み内に保持された場合において、より確実に貫通孔を覆うようになるのでより確実な細胞外電位の測定が可能になる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２０】
本発明の請求項３に記載の発明は、第二の窪みに少なくとも２つの検出電極を設けた請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、同じ貫通孔および第二の窪みに複数の検出電極が設けられているので、この検出電極間の抵抗値を測定することで、貫通孔内の培養液のイオン濃度変化を測定することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２１】
本発明の請求項４に記載の発明は、第二の窪みに検出電極を設けた請求項２に記載の細胞外電位測定デバイスであり、同じ第一の窪み内に２つ以上の貫通孔および第二の窪みおよび検出電極が設けられているので、検出電極間の抵抗値を測定することで、被験体細胞が貫通孔を覆っているかどうかを判断することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２２】
つまり、細胞膜がいずれの貫通孔も覆っていない場合は、培養液によって貫通孔どうしは導通しているため抵抗値は低いが、いずれかあるいは両方の貫通孔が細胞膜によって覆われている場合には、貫通孔どうしの抵抗値は大きなものとなる。これによって、被験体細胞の保持時に貫通孔を確実に細胞膜が覆っているかどうかが判断できる。
【００２３】
本発明の請求項５に記載の発明は、貫通孔の形状が矩形あるいはＵ字形もしくはこれらの組み合わせである請求項１〜４のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、貫通孔が矩形となることで、円形状に比べて狭い幅の貫通孔とすることができる。
【００２４】
このことにより、被験体細胞が貫通孔内に不用意に引き込まれることなく、第一の窪み内にとどまりながら貫通孔を細胞膜が覆うことができるようになることから測定が確実にできる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２５】
また、被験体細胞の形状が楕円球状に変形しやすい場合は、貫通孔を矩形にすることで第一の窪みの形状を楕円球状に容易にすることができる。
【００２６】
さらに、矩形の長さは円形の貫通孔に比べて長くなるので、同一の貫通孔に２つ以上の検出電極を形成することが容易であるという製造上の利点も有する。
【００２７】
さらに、貫通孔がＵ字形の場合では、上記と同様の効果が得られる上外形が丸くなっているために第一の窪みをより球形にしたい場合において、容易に実現できるという製造上の利点を有する。つまり、矩形の場合は、矩形の貫通孔を中心とする第一の窪みは楕円球形状になるが、Ｕ字の場合は貫通孔の開口部を中心に集めることができるので、第一の窪みがより球に近い形になるのである。
【００２８】
本発明の請求項６に記載の発明は、基板がシリコンである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、ダイアフラム、窪み、貫通孔をドライエッチングにより高精度に形成した細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２９】
本発明の請求項７に記載の発明は、基板がＳＯＩ基板である請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、より高精度で生産性に優れた細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００３０】
本発明の請求項８に記載の発明は、第一の窪みの開口部の寸法が１０〜１００μｍであり、貫通孔の最小開口径もしくは幅が１〜１０μｍであり、第二の窪みの開口部の寸法が５〜１０μｍである請求項１〜７のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、このような形状は数〜数十μｍの被験体細胞が効率的に第一の窪み内に保持することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００３１】
本発明の請求項９に記載の発明は、基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる第一の窪みを設け、この第一の窪みに貫通孔を設け、この貫通孔の前記第一の窪みと反対側の開口部に第二の窪みを設け、この第二の窪みの一部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、基板の他面側からエッチングによって前記ダイアフラムを形成する工程と、このダイアフラムを構成するいずれかの面の上に１枚のフォトマスクを用いてレジストマスクを形成する工程と、ドライエッチングによって前記第一の窪み、貫通孔、第二の窪みの順に形成する工程と、この第二の窪みに薄膜形成技術により検出電極を形成する工程からなる細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、１枚のフォトマスクによってレジストマスクを形成することから、第一の窪み内の正確な位置に貫通孔および第二の窪みを形成できる。
【００３２】
本発明の請求項１０に記載の発明は、レジストマスクのエッチングホールの形状を所望とする貫通孔の形状とほぼ同じになるようにした請求項９に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、第一の窪みおよび貫通孔の大きさは被験体細胞の大きさによって決められるものであるがフォトマスクで形成するエッチングホールは必要とする貫通孔の大きさにしておくことにより、第一の窪みの大きさは貫通孔の大きさ以上であれば自由に決めることができるので、第一の窪み、貫通孔および第二の窪みの形状をより容易に形成することができる。
【００３３】
本発明の請求項１１に記載の発明は、エッチングを促進するガスのみを用いて第一の窪みを形成し、エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いて貫通孔を形成し、エッチングを促進するガスのみを用いて第二の窪みを形成する請求項９に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、第一の窪みおよび貫通孔および第二の窪みの形状を容易に形成することができる。
【００３４】
本発明の請求項１２に記載の発明は、基板を異なる方向に少なくとも２回以上傾けてそれぞれエッチングを行うことにより、第一の窪みに少なくとも２つ以上の貫通孔および第二の窪みを形成する請求項９に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、これにより貫通孔および第二の窪みを第一の窪み内に複数設けることができる。
【００３５】
本発明の請求項１３に記載の発明は、基板がシリコンよりなる細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、エッチングを促進するガスがＳＦ６、ＣＦ４、ＸｅＦ２のうちいずれか一つを含むガスを用い、エッチングを抑制するガスがＣ４Ｆ８、ＣＨＦ３のいずれかまたはこれらを含むガスを用いる請求項１１に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、所望とする形状を効率良く得ることができる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法について実施の形態および図面を用いて説明する。
【００３７】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１および図１〜図１８により請求項１〜１３に記載の発明について説明する。
【００３８】
図１は本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスを示す斜視図であり、図２は同断面図であり、図３は貫通孔の周辺部の拡大図であり、図４は本発明の細胞外電位測定デバイスの動作を説明するための要部拡大断面図である。また図５〜図１０は細胞外電位測定デバイスの製造工程を説明するための断面図であり、図１１は別の細胞外電位測定デバイスの構成を示す断面図であり、図１２は図１１の貫通孔周辺部の拡大断面図である。さらに、図１７、図１８は他の細胞外電位測定デバイスの構成例を示す斜視図である。また図１３〜図１６は図１１に示す細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための断面図である。
【００３９】
次に、本発明の細胞外電位測定デバイスの構成について説明する。
【００４０】
図１〜図３において、基板１はシリコンで形成されており、基板１の一面側にはダイアフラム２が形成されている。このダイアフラム２の材質は基板１と同じシリコンであり、厚みは約２５μｍである。３は第一の窪みであり、半球形の曲面で構成されており、開口部の大きさは約２０μｍである。第一の窪み３には貫通孔４がダイアフラム２を貫通するごとく形成されている。この貫通孔４は第一の窪み３の最深部に位置する箇所に設けられており、この貫通孔４は円もしくは楕円形状をしており、円または楕円の長径が約５μｍである。
【００４１】
また貫通孔４の第一の窪み３の反対側の開口部には第二の窪み６が形成されており、ダイアフラム２の下面側において図３の貫通孔４の周辺部の拡大図に示すように、金を主体とする検出電極５ａ、５ｂが第二の窪み６の開口部に近接して形成されている。
【００４２】
次に、図面を用いて本発明の細胞外電位測定デバイスの動作について説明する。
【００４３】
まず、培養液の物理化学的変化を検出する手順に付いて説明する。
【００４４】
図４はダイアフラム２において第一の窪み３、貫通孔４、第二の窪み６、検出電極５ａ、５ｂが形成された箇所の拡大断面図である。図４に示すように、ダイアフラム２の上部を培養液７で満たすと、第一の窪み３、貫通孔４は培養液７によって順に満たされる。
【００４５】
そこで、ダイアフラム２の上部空間を加圧、もしくはダイアフラム２の下部空間を減圧にすると培養液７は貫通孔４から外方へ飛び出すが、加圧あるいは減圧を適度な値にすると第二の窪み６の先端においては開口部より培養液７がメニスカス形状を形成して定常状態となる。
【００４６】
これにより、培養液７は検出電極５ａおよび５ｂに安定的に接触することになる。検出電極５ａと５ｂは図３でも明らかなように、電気的には絶縁された箇所に形成されている。しかしながら、培養液７が第二の窪み６からメニスカス形状によって検出電極５ａ、５ｂに接触することにより、電解質である培養液７を介して、両者の電気的接続が行われるのである。ここで検出電極５ａ、５ｂ間の抵抗値は培養液７のイオン濃度と関係している。
【００４７】
つまり、培養液７のイオン濃度の変化は検出電極５ａ、５ｂ間の抵抗値の変化によって検出することができるのである。さらに、この抵抗値を測定すれば培養液７が第二の窪み６において適当なメニスカスを形成しているかどうかがわかる。その理由はメニスカスが不十分であれば検出電極５ａ、５ｂへの接触も不十分となり、抵抗値が大きな値を示すからである。
【００４８】
ここで、第二の窪み６が設けられていることにより貫通孔４の出口側は直線的な形状ではなく、垂直な部分と第二の窪み６の曲面で構成される段差を持った形状である。
【００４９】
このような構造とすることによって培養液７は貫通孔４を通過した後、第二の窪み６内でメニスカスを形成しやすくなる。これは第二の窪み６が曲面であるために培養液７の表面張力が増大し、上下に多少の圧力差の変動が発生しても、圧力均衡が保たれるためである。
【００５０】
つまり、一度メニスカス形状が形成されると多少の圧力変動が発生しても、第二の窪み６を設けることにより培養液７のメニスカス形状が安定するという特有の効果を発揮することができる。この現象は流体力学用の有限要素法解析によって確認した。このメニスカス形状が安定であるということは貫通孔４、第二の窪み６内の培養液７の容量が安定することになり、より安定した測定が可能である。
【００５１】
さらに、検出電極５ａ、５ｂは第二の窪み６内にまで形成されているので、培養液７のメニスカス形状によって培養液７との接続が容易に安定して行われるという利点も有する。
【００５２】
次に、被験体細胞の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する手順について説明する。
【００５３】
図４に示すように、被験体細胞８を培養液７と共に投入し、ダイアフラム２の上部空間を加圧もしくはダイアフラム２の下部空間を減圧すると、被験体細胞８および培養液７は共に第一の窪み３の内へ引き込まれる。
【００５４】
ここで、第一の窪み３は曲面で構成されているので、被験体細胞８を保持するためにより効率的な形状となっている。
【００５５】
さらに、被験体細胞８が第一の窪み３の内に保持された後に培養液７が第二の窪み６の開口部で適当なメニスカスを形成するように上下の圧力を調整する。このときには前述のように検出電極５ａ、５ｂ間の抵抗値を測定しながら圧力調整を行うことができる。
【００５６】
また、被験体細胞８を第一の窪み３の内で貫通孔４の開口部を塞ぐように保持した後は被検体細胞８への刺激となりうる行為を施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激などがある。
【００５７】
そして、前記被験体細胞８がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、被験体細胞８は細胞膜が保有するイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この反応は被験体細胞８が培養液７と接している箇所において起こり、貫通孔４の内および第二の窪み６の培養液７と被験体細胞８の間でもイオン交換が行われる。
【００５８】
この結果として、貫通孔４の内および第二の窪み６の内の培養液７のイオン濃度は変化するので、検出電極５ａ、５ｂによってその変化を検出することができるようになる。
【００５９】
なお、ここでは検出電極は５ａ、５ｂの２つの電極を形成したが、検出電極は一つでも測定は可能である。その方法はダイアフラム２の上部を満たす培養液７と同電位の参照電極（図示せず）と第二の窪み６の近傍に設けた単体の検出電極との間の電圧を測定することにより、貫通孔４の内および第二の窪み６の内のイオン濃度の変化を測定することができるので被験体細胞８の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定することができる。
【００６０】
なお、イオン濃度の変化は抵抗値だけではなく、電流値、電荷量、電位などの別の物理量を測定することでも測定可能である。
【００６１】
また、別の例として図１１、図１２に示すように、貫通孔９ａ、９ｂは第一の窪み３の内の最深部より上部に設けられ、ダイアフラム２の厚み方向に対して４５°の角度で傾けて構成している。このような構成にすることによって貫通孔９ａ、９ｂとして第一の窪み３の内に複数個設けることが可能であり、さらにこの貫通孔９ａ、９ｂのそれぞれに第二の窪み１０ａ、１０ｂを構成することができる。
【００６２】
この場合、図１２に示すように金を主体とする検出電極１１ａ、１１ｂをそれぞれの第二の窪み１０ａ、１０ｂに設けることによって、前記第二の窪み１０ａ、１０ｂが一つの場合と同様にダイアフラム２の上部を培養液７で満たすと、第一の窪み３、貫通孔９ａ、９ｂが満たされ、上下の圧力差によって培養液７が第二の窪み１０ａ、１０ｂの先端でメニスカス形状を形成し、検出電極１１ａ、１１ｂにそれぞれ接触する。こうして検出電極１１ａ、１１ｂ間の抵抗値を測定することにより、第二の窪み１０ａ、１０ｂの先端で適当なメニスカスが形成されているかどうかがわかり、貫通孔９ａ、９ｂおよび第二の窪み１０ａ、１０ｂの内のイオン濃度の変化もわかる。
【００６３】
そして、被験体細胞８（図示せず）を培養液７と共に投入した場合は貫通孔９ａ、９ｂを被験体細胞８の細胞膜が覆うように保持されているかどうかが判断できる。例えば、貫通孔９ａのみを細胞膜が塞ぎ、貫通孔９ｂは塞がれていない場合は検出電極１１ａとダイアフラム２の上部の培養液７からとる参照電極（図示せず）間の抵抗値は高く、検出電極１１ｂと参照電極間は低くなることで判断できる。
【００６４】
なお、貫通孔９ａ、９ｂおよび第二の窪み１０ａ、１０ｂは離れて形成されているので検出電極１１ａ、１１ｂを容易に形成できるという製造上の利点も有する。
【００６５】
上記の状態で被験体細胞８に外部より刺激を与えると被験体細胞８の活動が起こり、貫通孔９ａ、９ｂの内および第二の窪み１０ａ、１０ｂのイオン濃度が変化するので被験体細胞８の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化が測定できる。
【００６６】
また、第一の窪み３の大きさは被験体細胞８が容易に最深部まで到達できるように被検体細胞８に応じて適当な大きさ、形状のものを選択することによって容易に対応することができる。
【００６７】
次に、本実施の形態１では貫通孔４、９ａ、９ｂの大きさは丸形状あるいは楕円形状としたが、矩形あるいはＵ字形状とすることもできる。
【００６８】
図１７、図１８はそれぞれ貫通孔１５、１７を矩形、Ｕ字形状にした細胞外電位測定デバイスの斜視図である。図１７に示すように貫通孔１５が矩形の場合は第一の窪み１６の形状はカマボコ状に丸みを持った形状となり、図１８に示すように貫通孔１７がＵ字形状の場合には第一の窪み１８の形状はほぼ半球状になる。
【００６９】
前記のような形状とすることで、第一の窪み１６がカマボコ状の場合には被験体細胞８の固定形状が細長くなるような場合（例えば、モノアラガイ由来の神経節細胞）に最適であり、第一の窪み１８の形状を半球にして貫通孔１７の形状をＵ字形状にした場合には、例えば被験体細胞８が変形しやすく、丸形状にした貫通孔４では通り抜けてしまうような場合において有効である。つまり、貫通孔１７をＵ字にすると、貫通孔１７の内を満たす培養液７の容量をさほど減らすことなく開口部の最小幅部分を小さくできることから、不用意に被験体細胞８が貫通孔１７の内に進入して破壊されることが少なくなる。
【００７０】
なお、第一の窪み３、１６、１８、貫通孔４、１５、１７の大きさは測定する被験体細胞８の大きさ、形状、性質によって決められるものであるが、窪み３、１６、１８の大きさを１０〜１００μｍとし、貫通孔４、１５、１７の大きさを１〜１０μｍにすることによって５〜１００μｍ程度の大きさの被験体細胞８を測定することができる。
【００７１】
次に、本発明の細胞外電位測定デバイスの製造方法について図５〜図１０を用いて説明する。
【００７２】
図５〜図１０は図２に示すところの細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための工程断面図である。
【００７３】
この細胞外電位測定デバイスの製造方法は図５に示すようにシリコンからなる基板１を用意し、基板１の他面にレジストマスク１２を形成した後、図６のように下面から所定の深さだけエッチングすることによって、基板１の上部にダイアフラム２を形成する。その後前記レジストマスク１２は除去する。
【００７４】
次に、図７に示すようにダイアフラム２の外表面にレジストマスク１３を形成する。このときのレジストマスク１３のエッチングホールの形状は必要とする貫通孔４の形状とほぼ同じになるよう設計しておく。
【００７５】
その後、図８に示すようにドライエッチングによってダイアフラム２側からエッチングを行う。このとき、エッチングガスとしてはエッチングを促進するガスのみを用いる。
【００７６】
基板１がシリコンの場合、このエッチングを促進するガスにはＳＦ６、ＣＦ４、ＸｅＦ２などを用いることができる。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、横方向へのエッチングも促進する作用があるからである。実験ではＸｅＦ２を用いて効果を確認している。これによって、エッチング形状は図８に示すように開口部を中心とする半球形となり、第一の窪み３が形成される。またレジストマスク１３はほとんどエッチングされないので、図８のように最初の形状を保っている。
【００７７】
次に、図９に示すように基板１の一面側に貫通孔４を形成する。この貫通孔４を形成する際にはエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスによるドライエッチングを行い、ダイアフラム２を貫通する前にエッチングを終了する。
【００７８】
この工程では、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスの時間比を変えることで実現できる。
【００７９】
また、この貫通孔４の形状は矩形あるいはＵ字状もしくはこれらの組み合わせを用いることができる。
【００８０】
次に、図１０に示すように再びエッチングを促進するガスのみを用いてエッチングを行うと、先の貫通孔４をエッチングする際にエッチングを抑制するガスによって第一の窪み３および貫通孔４の壁面には保護膜（図示せず）が形成されているので、エッチングを促進するガスのみを用いてエッチングすると貫通孔４のダイアフラム２の他面側のみがエッチングされて第二の窪み６が形成される。
【００８１】
なお、前記保護膜の厚みが不十分な場合には、第一の窪み３、貫通孔４もエッチングされてしまうので、必要であれば貫通孔４を形成した後、壁面に保護膜を厚く形成する工程を行うことも可能であり、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスの時間比を変えることで実現できる。
【００８２】
このようにして、曲面で構成される第一の窪み３、第二の窪み６およびこれらを接続する貫通孔４が形成される。
【００８３】
その後、図２に示すように第二の窪み６の近傍に検出電極５ａ、５ｂを通常の薄膜形成手段によって形成する。このとき第二の窪み６は貫通孔４の大きさより大きいので、検出電極５ａ、５ｂを形成する際でも要求される解像度を低くすることができるので、より簡単な製造方法とすることができる。
【００８４】
なお、基板１としてシリコンを用いたが、シリコンの中に酸化シリコンが埋め込まれた基板を用いることもできる。このような基板はＳＯＩ基板と呼ばれ、上部のダイアフラム２の厚みを高精度にしたり、貫通孔４をエッチングによって形成する際、酸化シリコン層がエッチングストップ層となるのでより簡単な製造方法とすることができる。
【００８５】
次に、図１１に示す構成を有する細胞外電位デバイスの製造方法について図１３〜図１６を用いて説明する。
【００８６】
まず、第一の窪み３を形成するまでの工程は図５〜図８に示した前記製造工程と同じ方法で形成することができる。
【００８７】
次に、図１３に示すように基板１をイオンの進行方向に対して４５°に傾けてドライエッチングを行う。このときのエッチングガスとしてはエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを交互に用いる。エッチングを促進するガスとしてはＸｅＦ２、ＣＦ４、ＳＦ６などがある。またエッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ３、Ｃ４Ｆ８などがある。これらのガスを混合してエッチングすることで、エッチングされた壁面にＣＦ２のポリマーである保護膜を形成するので、ドライエッチングによる貫通孔９ａの形成をレジストマスク１３の下方のみに進行させることが可能となる。
【００８８】
ここで、エッチングが下方のみに進行する仕組みを少し詳しく説明する。
【００８９】
まず、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができる。この工程ではエッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に、外部コイルによる誘導結合法によって生成されたプラズマ中で高周波を基板１に加えることで、基板１にマイナスのバイアス電圧が発生することによりプラズマ中のプラスイオンであるＳＦ５＋やＣＦ３＋が基板１に向かって衝突するのでドライエッチングは垂直下方方向に進むことになり、ドライエッチングを抑制させる際には基板１に高周波を加えなければ基板１にはバイアス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となるＣＦ＋が偏向を受けなくなり、基板１のドライエッチング穴の壁面へ均一な保護膜の形成ができることになる。実験ではエッチングを促進するガスとしてＳＦ６、抑制するガスとしてＣ４Ｆ８を用いて確認している。
【００９０】
これによって、エッチングは垂直下方のみに進行し、レジストマスク１３は前述のように最初の形状を保っているので、結果として図１４のようにダイアフラム２の厚み方向に対して４５°に傾いて貫通孔９ａを形成することができる。
【００９１】
なお、ダイアフラム２を貫通する前にエッチングを終了する。
【００９２】
また、貫通孔９ａは斜めに傾けてエッチングするので貫通孔９ａの断面形状はレジストマスク１３の開口部の形状より少し歪む、これが問題な場合は斜めにしたときに円形状に見えるようにレジストマスク１３の形状を変えておく必要がある。これにともない、第一の窪み３のエッチング形状も少し変わるので、これらを総合的に鑑み、レジストマスク１３の形状を決定すると良い。
【００９３】
また、基板１を傾ける場合の可能な角度はレジストマスク１３の開口部の形状と厚みによって決定されるものであり、例えば１μｍの開口部で１μｍの厚みを持つレジストマスクの場合はエッチングの幾何的な位置からして４５°よりも小さな傾きでなければエッチングはできない。
【００９４】
次に、再びエッチングを促進するガスのみを用いてエッチングを行うと、先の貫通孔９ａをエッチングする際にエッチングを抑制するガスによって第一の窪み３および貫通孔９ａの壁面には保護膜（図示せず）が形成されているので、エッチングを促進するガスのみを用いてエッチングすると貫通孔９ａのダイアフラム２の他面側のみがエッチングされて、図１５に示すように第二の窪み１０ａが形成される。
【００９５】
その後、図１６に示すように基板１を反対の角度に傾け、再度同じようにエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いて貫通孔９ａを形成した後、エッチングを促進するガスのみを用いて第二の窪み１０ａを形成する。
【００９６】
なお、レジストマスク１３はエッチング後に除去する。
【００９７】
次に、図１１に示すように基板１の下面から通常の薄膜形成工程により、金を主体とする検出電極１１ａ、１１ｂをそれぞれの第二の窪み１０ａ、１０ｂに近接して形成する。第一の窪みの３内に形成された貫通孔１０ａ、１０ｂが一つの場合より要求されるパターンの解像度が低いので、より簡単な製造工程とすることができる。
【００９８】
このような方法によって、図１１に示すような第一の窪み３の中に２個の貫通孔９ａ、９ｂおよび２個の第二の窪み１０ａ、１０ｂを形成することが可能である。このエッチング工程において、プラズマ中のイオンの進行方向と基板１の傾斜角度は８９°以下にして形成することが生産性の観点から好ましく、より好ましくは２０〜７０°の範囲で形成することができる。
【００９９】
このように、複数の貫通孔９ａ、９ｂを設けることによって、被験体細胞８が第一の窪み３の内に保持された場合において、より確実に貫通孔９ａ、９ｂを覆うようになることから、第二の窪み１０ａ、１０ｂに検出電極１１ａ、１１ｂを形成することにより、より確実な細胞外電位の測定が可能になる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【０１００】
このとき、第一の窪み３および貫通孔９ａ、９ｂの大きさは測定する被験体細胞の大きさ、形状、性質によって決められるものであるが、第一の窪み３の大きさを１０〜１００μｍ、貫通孔９ａ、９ｂの大きさを１〜１０μｍにすることによって５〜１００μｍ程度の大きさの細胞を測定することができる。
【０１０１】
さらに、第二の窪み１０ａ、１０ｂの大きさは貫通孔９ａ、９ｂの大きさと培養液７の流体特性によって決められるものであり、効果を確認するために有限要素法による流体解析を行った結果、流体が水で５μｍの貫通孔９ａ、９ｂの場合、１０μｍの大きさを持つ第二の窪み１０ａ、１０ｂとしたところ、メニスカス形状が安定することが確認できた。
【０１０２】
【発明の効果】
以上のように本発明の細胞外電位測定デバイスの構成によれば、被験体細胞の細胞膜が隙間無く密着するので、細胞が活動する際に発する物理化学的変化を貫通孔側に設けられた検出電極によって効率よく検出することが可能となり、第一の窪みの正確な位置に容易に貫通孔を形成できるとともに培養液を一定に保つことにより安定して測定することができる細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの斜視図
【図２】同断面図
【図３】同貫通孔周辺部の拡大図
【図４】同動作を説明するための要部拡大断面図
【図５】同製造方法を示すための断面図
【図６】同断面図
【図７】同断面図
【図８】同断面図
【図９】同断面図
【図１０】同断面図
【図１１】同別の構成を有する細胞外電位測定デバイスの断面図
【図１２】同貫通孔周辺部の拡大断面図
【図１３】同製造方法を示すための断面図
【図１４】同断面図
【図１５】同断面図
【図１６】同断面図
【図１７】同他の細胞外電位測定デバイスの一例を示す斜視図
【図１８】同斜視図
【図１９】従来の細胞外電位測定デバイスの一例を示す断面図
【符号の説明】
１  基板
２  ダイアフラム
３  第一の窪み
４  貫通孔
５ａ、５ｂ  検出電極
６  第二の窪み
７  培養液
８  被験体細胞
９ａ、９ｂ  貫通孔
１０ａ、１０ｂ  第二の窪み
１１ａ、１１ｂ  検出電極
１２  レジストマスク
１３  レジストマスク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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