(57)【要約】　　　（修正有）【課題】メラノトロピックホルモンレセプターの特性を有する新規ポリペプチドをコードする新規ＤＮＡ断片、とくにメラノサイト刺激ホルモンレセプター（ＭＳＨレセプター）をコードするＤＮＡ断片と、ＭＳＨレセプターであるポリペプチドの提供。【解決手段】診断および治療目的の薬物、細胞系、ベクターおよびＤＮＡの工作のみならず、診断および治療目的のモノクローナル抗体の製造のための、メラノトロピックホルモンレセプターＤＮＡおよびポリペプチドの用途および工作も開示。また、そのＤＮＡ断片、ポリペプチドおよび抗体を用いる、悪性メラノーマ、皮膚ガン、白斑、発熱状態、炎症状態、侵害状態、緊張状態、記憶障害状態、皮膚黒ずみの減少または増加、色素沈着状態、てんかんおよび神経損傷の治療および診断の方法の開示。さらに前記レセプターと相互作用する物質の選択方法の開示。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片、または
１）配列番号１５に示すＤＮＡ配列と少なくとも５５％の相同性を有し、かつ／または
２）アミノ酸配列が配列番号１６に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードし、かつ／または
３）配列番号１５に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用であり、かつ
４）ＭＳＨレセプターによっても結合される抗体に結合するポリペプチドをコードし、かつ／または
５）ＭＳＨレセプターであるポリペプチドまたはＭＳＨレセプターと同じ結合能力を有するポリペプチドをコードする、
該ＤＮＡ断片の類似体もしくは部分配列。
【請求項２】
配列番号１６に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
【請求項３】
請求項１または２記載のＤＮＡ断片の部分配列であるＤＮＡ断片であって、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２１ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも２７ヌクレオチドおよび最も好ましくは少なくとも５１ヌクレオチドを含んでなるＤＮＡ断片。
【請求項４】
配列番号１５に示すＤＮＡ配列に少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、および最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を示すＤＮＡ断片であって、
１）ＭＳＨレセプターによっても結合される抗体に結合するポリペプチドをコードし、かつ／または
２）ＭＳＨレセプターであるポリペプチドまたはＭＳＨレセプターと同じ結合能力を有するポリペプチドをコードする、
ＤＮＡ断片。
【請求項５】
配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片、または
１）配列番号７に示すＤＮＡ配列に少なくとも７０％の相同性を示し、かつ／または
２）アミノ酸配列が配列番号８に示すアミノ酸配列に少なくとも５０％の相同性を有するポリペプチドをコードし、かつ
３）Ｇ−タンパク質結合レセプターの一部または全部のポリペプチド、好ましくはＰＯＭＣ由来ペプチドに対するレセプターの一部または全部のポリペプチドをコードする、
該ＤＮＡ断片の類似体もしくは部分配列。
【請求項６】
ＭＳＨレセプターのポリペプチドの一部または全部をコードする請求項５記載の類似体または部分配列。
【請求項７】
配列番号８に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする請求項５または６記載のＤＮＡ断片。
【請求項８】
配列番号７に示すＤＮＡ配列に少なくとも８０％の相同性および好ましくは少なくとも９５％の相同性を示すＤＮＡ断片であって、Ｇ−タンパク質結合レセプターの一部または全部のポリペプチド、好ましくはＰＯＭＣ由来ペプチドに対するレセプターの一部または全部のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
【請求項９】
配列番号１５に示すＤＮＡ配列またはそれに対応する部分配列と、少なくともひとつのヌクレオチドが置換、付加、挿入、削除および／または再配列されている点で異なる修飾ＤＮＡ断片またはその部分配列であるＤＮＡ断片であって、
１）ＭＳＨレセプターによっても結合される抗体に結合するポリペプチドをコードし、かつ／または
２）ＭＳＨレセプターであるポリペプチドまたはＭＳＨレセプターと同じ結合能力を有するポリペプチドをコードする、
ＤＮＡ断片。
【請求項１０】
配列番号７に示すＤＮＡ配列またはそれに対応する部分配列と、少なくともひとつのヌクレオチドが置換、付加、挿入、削除および／または再配列されている点で異なる修飾ＤＮＡ断片またはその部分配列であるＤＮＡ断片であって、Ｇ−タンパク質結合レセプターの一部または全部、好ましくはＰＯＭＣ由来ペプチドに対するレセプターの一部または全部をコードするＤＮＡ断片。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のＤＮＡ断片と異なるまたは同一の第２ＤＮＡ断片のひとつまたは複数、好ましくはジフテリアトキシンをコードするＤＮＡ断片、スタフィロコッカスタンパクをコードするＤＮＡ断片およびリシントキシンをコードするＤＮＡ断片よりなる群から選ばれる第２ＤＮＡ断片のひとつまたは複数とともに、請求項１から１０のいずれかに記載のＤＮＡ断片をフレームにおいて含んでなる融合ＤＮＡ断片であるＤＮＡ断片であって、ＭＳＨまたはその類似体に結合し得る融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片。
【請求項１２】
配列番号１６に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または
１）ＭＳＨレセプターであるかまたはＭＳＨもしくはその類似体と結合することができ、かつ／またはＭＳＨレセプターによっても結合される抗体と結合し、かつ
２）配列番号１５に示すＤＮＡ断片と少なくとも５５％の相同性を有するＤＮＡ断片によってコードされる、
該ポリペプチドの類似体もしくは部分配列。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリペプチドの部分配列であるポリペプチドであって、少なくとも７アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１５アミノ酸および最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸を含んでなるポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または
１）Ｇ−タンパク質結合レセプターの一部または全部、好ましくはＰＯＭＣ由来ペプチドに対するレセプターの一部または全部であり、かつ
２）配列番号８に示すアミノ酸配列に少なくとも５０％の相同性を示す、
該ポリペプチドの類似体もしくは部分配列。
【請求項１５】
ＭＳＨレセプターの一部または全部である請求項１４記載の類似体または部分配列。
【請求項１６】
請求項１２記載のポリペプチドの類似体または部分配列であって、配列番号１５に示すＤＮＡ配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％および最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を示すＤＮＡ断片にコードされる類似体または部分配列。
【請求項１７】
配列番号８に示すポリペプチドに少なくとも５５％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％および最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を示すポリペプチドまたはその部分配列もしくは類似体であって、該ポリペプチドがＧ−タンパク質結合レセプターの一部または全部、好ましくはＰＯＭＣ由来ペプチドに対するレセプターの一部または全部であるポリペプチドまたはその部分配列もしくは類似体。
【請求項１８】
グリコシル化され、かつ／または炭水化物もしくは脂質部分と連結され、かつ／またはパルミトイル・アンカーもしくはその一部を含有し、かつ／または検出可能な標識を備えており、かつ／または固体支持体に連結している請求項１２から１７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１２から１７のいずれかに記載のポリペプチドと異なっていても同一でもよい第２ポリペプチドと融合された請求項１２から１７のいずれかに記載のポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドであるポリペプチドあって、融合ポリペプチドが好ましくはＭＳＨまたはその類似体に結合する能力を維持しているポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１２から１７のいずれかに記載のポリペプチドと異なっていても同一でもよい第２ポリペプチドと融合された請求項１２から１７のいずれかに記載のポリペプチドの部分配列を含んでなる融合ポリペプチドであるポリペプチドあって、融合ポリペプチドが好ましくはＭＳＨまたはその類似体に結合する能力を維持しているポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１２から１７のいずれかに記載のポリペプチドと異なっていても同一でもよい第２ポリペプチドと融合された請求項１２から１７のいずれかに記載のポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドであるポリペプチドあって、第２ポリペプチドが好ましくはジフテリアトキシン、スタフィロコッカスタンパクまたはリシントキシンをコードするポリペプチド。
【請求項２２】
実質的に純粋な形態の請求項１２から１７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１２から２１のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
【請求項２４】
宿主生物または細胞系中で複製することができる、請求項１から１１および２３のいずれかに記載のＤＮＡ断片を担う複製可能な発現ベクター。
【請求項２５】
寄託番号ＤＳＭ８４４０の下、ドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツエルクルツレン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングに寄託されているｐＥ−ＭＣ−２である請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
請求項１から１１および２３のいずれかに記載のＤＮＡ断片または請求項２４もしくは２５記載のベクターを担い、かつ複製することのできる細胞。
【請求項２７】
細菌、酵母および原生動物よりなる群から選ばれるか、またはカビ、昆虫、植物および哺乳動物よりなる群から選ばれる多細胞生物由来の細胞である請求項２６記載の細胞であって、好ましくはバチルス、エシェリキアおよびサルモネラ属よりなる群から選ばれる細菌である細胞。
【請求項２８】
ヒトなどの哺乳動物におけるチロシナーゼ陽性アルビニズムなどのＭＳＨレセプターの欠乏またはＭＳＨレセプター機能障害によって起こる状態の治療用医薬組成物の製造のための、請求項１から１１のいずれかに記載のＤＮＡ断片の使用。
【請求項２９】
ヒトなどの哺乳動物において皮膚のメラニン含有量を増加させる方法であって、好ましくは日光に当たるのを減らすことをともなってまたはともなわずに皮膚の黒ずみを増加するために、またはサンバーンを避けるために、ＭＳＨレセプターを介して作用する請求項１２から２１のいずれかに記載のポリペプチドに結合し得る物質を投与することを含んでなる方法。
【請求項３０】
組織サンプル、細胞培養物または細胞懸濁液などの生物学的サンプル中のＭＳＨレセプターを検出する方法であって、任意に標識された、ＭＳＨレセプターと結合する、天然のＭＳＨと異なる物質でサンプルを処理して、結合した物質の存在を検出または視覚化する方法。
【請求項３１】
検出可能な標識を任意に備えた抗体であって、請求項１２から２１のいずれかに記載のポリペプチドと反応し、好ましくはモノクローナル抗体である抗体。
【請求項３２】
ＭＳＨレセプターｍＲＮＡの検出および／または定量方法であって、細胞、組織サンプル、細胞培養物または細胞懸濁液などの生物学的サンプルからＲＮＡを抽出すること、ならびに標識された請求項１から１１のいずれかに記載のＤＮＡ断片、または標識された請求項１から１１のいずれかに記載のＤＮＡ断片から構築されたＲＮＡ断片への、該ＲＮＡのハイブリダイゼーションを測定することを含んでなる方法。
【請求項３３】
ＭＳＨレセプターｍＲＮＡの検出および／または定量方法であって、細胞または組織からＲＮＡを抽出すること、ならびにつづいてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いるために、請求項１から１１のいずれかに記載のＤＮＡ断片にもとづいて合成されるＰＣＲプライマー（類）を用いて、前記ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することを含んでなる方法。
【請求項３４】
メラノーマおよび皮膚ガンなどのＭＳＨレセプターを発現する疾病状態の診断のための請求項３０、３２および３３のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項３５】
ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションなどの技術を用いて他の類似のＤＮＡ断片を単離するための請求項１から１１のいずれかに記載のＤＮＡ断片の使用。
【請求項３６】
ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションなどの技術に用いるためのＤＮＡプローブを設計するための請求項１２から２１のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項３７】
ＭＳＨレセプターに結合しうる物質の設計に用いるためにＭＳＨレセプターまたはＭＳＨ結合能力を有するその類似体の三次構造を推定するための、請求項１２から２１のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項３８】
前記物質が、抗体もしくはその一部、またはＭＳＨレセプターもしくはメラノトロピックホルモンレセプターポリペプチドに親和性を有する天然または合成起源の分子である請求項２９または３０記載の方法。
【請求項３９】
配列番号８に示す配列を含んでなる全長Ｇ−タンパク質結合レセプターをコードするポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号７に示すＤＮＡ配列を含んでなる全長Ｇ−タンパク質結合レセプターをコードするＤＮＡ断片。
【請求項４１】
配列番号７に示すＤＮＡ配列にハイブリダイズする全長Ｇ−タンパク質結合レセプターをコードするＤＮＡ断片であって、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳからなる溶液中で６５℃にて２０分間洗浄した場合にハイブリダイズし続ける全長Ｇ−タンパク質結合レセプターをコードするＤＮＡ断片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトメラノサイト刺激ホルモンレセプター（ＭＳＨレセプター）をコードするＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）またはその類似体もしくは部分配列に関する。該ＤＮＡ断片は３１７アミノ酸のポリペプチドをコードする９５１ｂｐのオープンリーディングフレームを含有する。該ＤＮＡ断片も、その類似体、部分配列または修飾体も、本発明の重要な１側面を構成する。該ＤＮＡ断片は真核細胞系においてすでに発現され、その発現されたタンパク質は、天然のＭＳＨレセプターと同一の性質を有することが分かっている。本発明は、また、ヒトＭＳＨレセプターのサブタイプをコードするＤＮＡ断片（本出願中では、ＭＣ−２と呼ぶ）であって、３２５アミノ酸のポリペプチドをコードする９７５ｂｐのオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片にも関し、該ＤＮＡ断片も、その類似体、部分配列または修飾体も、本発明の重要な１側面を構成する。このＤＮＡ断片も真核細胞系においてすでに発現され、その発現されたタンパク質は、ＭＳＨレセプターサブタイプと同一の性質を有することが分かっている。
【０００２】
本発明は、また、本発明のＤＮＡ断片によってコードされたポリペプチドならびに該ポリペプチドの類似体および部分配列にも関する。さらに、本発明は前記ＤＮＡ断片、その類似体および部分配列の用途、ならびに本発明のＤＮＡ断片によってコードされる本発明のポリペプチドの用途にも関する。とくにＭＳＨレセプター活性を有する本発明のポリペプチドの用途は興味深い。本発明のポリペプチドまたはその類似体もしくは部分配列の抗体産生のための用途は、本発明のまた別の側面を構成する。またさらに、本発明は、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、メラノーマ、皮膚ガン、発熱状態、炎症状態および侵害（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ）状態、緊張（ｃａｔａｔｏｎｉｃ）状態ならびに記憶障害状態などのＭＳＨレセプターの発現する疾病状態の診断および治療に用いるための診断および治療方法および診断および治療剤に関する。本発明は、ＭＳＨレセプターの検出および定量のための方法にも関する。さらに本発明は、ＭＳＨレセプターの活性を妨害する（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ）ことのできる物質をテストするための方法、およびＭＳＨレセプターの発現する疾病状態の治療方法を提供する。本特許出願は、ヒトおよび／または動物における、皮膚および／または毛髪および／または毛皮の色のコントロールまたは診断および／または測定および／または産生コントロールのための、ＭＳＨレセプターをコードする断片またはＭＳＨレセプターの非疾病状態での用途にも関する。さらに、本特許出願は、コンピュータモデリング方法の利用による、および／またはクリスタログラフィックアプローチおよび／またはＮＭＲ（核磁気共鳴）による構造解析の応用によるＭＳＨレセプターの三次構造の解明、ならびにＭＳＨレセプターおよび／またはそのサブタイプ（ＭＣ−２）に対して結合親和性を有する医薬（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）の設計のための、前記レセプター構造の知識の用途にも関する。
【０００３】
本発明は、ＭＳＨレセプターもしくはその類似体をコードするＤＮＡ断片ならびにこれらの適用、そしてこれに関係してＭＳＨレセプターおよび／またはその生物学的機能に属する産生物を同定する方法を含んでおり、バイオテクノロジー、薬物学、医学および獣医学の実践にとって有用になるであろう重要な貢献を行うものである。ＤＮＡ断片、その類似体および部分配列、ならびにこれらの応用を用いる背景として、ＭＳＨレセプターおよびヒトや動物におけるその生物学的機能に関する最も重要な事実のいくつかを以下に要約する。
【０００４】
【従来の技術】
ＭＳＨレセプターに関する情報（以下にレビューする）は存在したものの、ＭＳＨレセプター遺伝子の構造もＭＳＨレセプターの一次アミノ酸配列も、本特許出願の優先日以前には知られていなかった。以下に述べることから明らかなように、ＭＳＨレセプターは、抗炎症および抗発熱機能のようないくつもの異なる機能を有し、メラノーマおよび皮膚ガンなどのいくつもの疾病に関与する大変重要なレセプターであり、さらにこのレセプターはヒトおよび動物における皮膚、毛髪および毛皮の色のコントロールにおいて重要な役割を有している。
【０００５】
ＭＳＨレセプターとその生物学的機能
ＭＳＨレセプターは、機能的および構造的に類似性を示すレセプターの大きなクラスに属する。これらのレセプターは、グアニンヌクレオチド制御タンパク（Ｇ−タンパク）と呼ばれる共役タンパク（ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（たとえばＧｓ、Ｇｉ、Ｇｋなどのいくつかのタイプが知られている）をへて、それらの細胞効果を伝える。ＭＳＨレセプターは、α−ＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）に対する認識部位として働く細胞膜結合タンパクである。ＭＳＨという語は、いくつかのペプチドに関するが、それらのうちα−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨが言及されるであろう。α−ＭＳＨが一般に最も大きい活性を示す。これらのホルモンは一般にメラノトロピックホルモン（ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｃ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ）と呼ばれ、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）もいくつかの関連ペプチドもこれに属し、ヒトおよび動物中に存在する。本特許出願においては、ＭＳＨレセプターに結合親和性を有するペプチドを集合的にＭＳＨペプチドまたはＭＳＨレセプターリガンドと呼ぶであろう。ＭＳＨレセプターリガンドがＭＳＨレセプターに結合すると、続いてレセプターの活性化がおこり、これによりそのレセプターが位置している細胞の活性が変化する。ＭＳＨレセプターは、メラノサイトに存在することが知られている。メラノサイトは色素細胞であり、ヒトにおいて皮膚にさまざまな量のダークな色素沈着（ｄａｒｋｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を行い、紫外線照射からの皮膚の防御においてひとつの役割を有している。動物においても、メラノサイトは皮膚の色素沈着においてひとつの役割を有している。動物およびヒトのどちらにおいても、皮膚の色の変化は少なくとも部分的にはメラノサイトによって媒介されており、これらの変化はまた、ＭＳＨレセプターに結合するペプチドホルモンによるＭＳＨレセプターの活性化の程度によって部分的に制御されてもいる（ノードランド（Ｎｏｒｄｌｕｎｄ）１９９１；レビン（Ｌｅｖｉｎｅ）１９９１）。
【０００６】
ＭＳＨレセプターは、メラノサイト以外の細胞タイプにも存在しうる（タトロ（Ｔａｔｒｏ）１９８７）。そのようなばあいには、ＭＳＨレセプターは他のタイプの重要な生理学的役割を果たしうる。α−ＭＳＨは、視床下部、扁桃核小体（ｃｏｒｐｕｓ　ａｍｙｇｄａｌｏｉｄｅｕｍ）、大脳皮質などの脳の一定の領域において産生されることが知られている。さらに、α−ＭＳＨの前駆分子であるプロオピオメラノコルチン（ｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）は、表皮中だけでなく、胸腺および脾臓のリンパ球、好中球、胎盤、子宮においても見つかっている（ノーランド１９９１）。ＭＳＨレセプター上に作用することによって、α−ＭＳＨは（ｉ）ＣＮＳ中のニューロトランスミッター効果の媒介、（ｉｉ）内分泌制御（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）への関与、（ｉｉｉ）免疫−炎症応答の調整、さらに（ｉｖ）皮膚の色素沈着制御（前述のように（ノーランド１９９１、レビン１９９１）における役割を有するであろう証拠がある。ＭＳＨレセプターは、抗侵害（ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ）効果の誘発、グルーミング行動の混乱、伸展反射とあくび反射の変化および緊張状態（ｃａｔａｔｏｎｉｃ　ｓｔａｔｅｓ）など、神経化学プロセスにおいてさまざまな機能を果たす（ハーシュ（Ｈｉｒｓｈ）およびオードノー（Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅ）１９８６）。さらに、ＭＳＨレセプターが視覚および言語学習の促進における機能を有することが示唆されている（ベイスら（Ｖｅｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．）１９７８、ワードら（Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）１９７９、ハンドルマン（Ｈａｎｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９８３）。内分泌機能におけるＭＳＨレセプターの役割が示唆されている。たとえば、α−ＭＳＨが副腎皮質からのコルチゾールの分泌に影響を与え、成長ホルモン、黄体形成ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンの血漿レベルを上昇させうることが報告されている（ライドら（Ｒｅｉｄ　ｅｔ　ａｌ．）１９８４）。
【０００７】
ＭＳＨレセプターは、α−ＭＳＨにより誘導される抗炎症作用だけでなく（ラインズら（Ｒｈｅｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．）１９８９）、α−ＭＳＨにより起こる強力な抗発熱作用も媒介するようである（クラークら（Ｃｌａｒｋ　ｅｔ　ａｌ．）１９８５）。中枢のＭＳＨレセプターも、ＭＳＨペプチドが抗てんかん効果を有するため、抗けいれん効果の媒介に関与している（デ　ビード（Ｄｅ　Ｗｉｅｄ）１９９３）。さらに、ＭＳＨレセプターは、末梢神経傷害の後の神経新生および筋肉の再神経支配の加速・促進効果を媒介する、ＭＳＨペプチドの成長因子効果の媒介を行うものと考えられる（ストランドら（Ｓｔｒａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．）１９９３）。
【０００８】
メラノーマ細胞上のＭＳＨレセプター
メラノーマ細胞系は、不滅化した（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）メラノサイトに由来する。メラノサイトは、臨床的には悪性メラノーマの出発点である（以下にレビューする）。ＭＳＨレセプターは、異なる細胞系における発生率が７０％を超えると報告されているように、多くのメラノーマ細胞系上に存在する（タトロら１９９０ａ）。実験的メラノーマでは、メラノーマの分化、腫瘍形成性および転移強度は、ＭＳＨに影響される（カメヤマら（Ｋａｍｅｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．）１９９０）。さらに、α−ＭＳＨの免疫反応性が、ヒトメラノーマ転移において存在することが証明されており（ガーネンら（Ｇｈａｎｅｍ　ｅｔ　ａｌ．）１９８９）、局所的に形成されたメラノトロピック活性（ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）がメラノーマの発病において、ひとつの役割を果たしている可能性が示唆される。
【０００９】
メラノーマ細胞系上にＭＳＨレセプターが存在することにより、哺乳動物における主要な既知循環メラノトロピンである内因性α−ＭＳＨが、インビボにおいてメラノーマ細胞活性を調整しているであろうことが示唆される。メラノーマ腫瘍に特異的な結合部位があることの証明は、これらがインビボで細胞応答システムに連結していることを示すものではないが、培養メラノーマ細胞における結合と生物学的応答の密接な関係を考えると、これはきわめてありそうなことのように思われる（タトロら１９９０ｂ）。証拠により、α−ＭＳＨがメラノーマ細胞の増殖および転移コロニーを形成する能力を調整しうることが示唆されている（ラーナーら（Ｌｅｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）１９８９；アデル−マレックら（Ａｂｄｅｌ−Ｍａｌｅｋ　ｅｔ　ａｌ．）１９８６）。
【００１０】
哺乳動物メラノサイトおよびメラノーマ細胞において、α−ＭＳＨがＭＳＨレセプターを介してアデニル酸シクラーゼの活性化に関与する細胞内経路に作用することは、よく認識されている（タトロら（Ｔａｔｒｏ　ｅｔ　ａｌ．）１９９０ｂ）。これによってサイクリックＡＭＰの産生が増加し、これがつぎにメラニン生合成における主要酵素であるチロシナーゼを誘導する。しかしながら、メラノトロピンはＭＳＨレセプターに結合後、細胞内カルシウムを増加させることを示す証拠がある（マック　ネイルら（Ｍａｃ　Ｎｅｉｌ　ｅｔ　ａｌ．）１９９０）。この効果は、ＭＳＨ／ＭＳＨレセプター複合体がホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を活性化し、つぎにこれが作用してイノシト−ル　１，４，５−トリホスフェートを産生し、さらにこれが細胞内カルシウムの流動の引き金を引くという事実によるものと考えることができる。この考えは、レセプターに媒介されるＰＬＣの活性化は、Ｇ−タンパクに連結したできごとであり、レセプターは同時的に、たとえば無差別なやり方で、いくつかの既知のＧ−タンパク連結代謝経路を通して作用することが示されている（トライフォートら（Ｔｒａｉｆｆｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ．）１９９２およびグーデルマンら（Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９９２）という事実によるものである。ホスホリパーゼＣの活性化も、プロテインキナーゼＣの活性化因子であるジアシルグリセロールの産生を引き起こす。実際、最近になってＭＳＨがプロテインキナーゼＣを活性化することができるということが示された（バッフェイら（Ｂｕｆｆｅｙ　ｅｔ　ａｌ．）１９９２）。前記のセカンドメッセンジャーシステムを介しても共役している２つの他のＧ−タンパク共役レセプター、すなわちα１ｂ−アドレナリンレセプターおよびセロトニンレセプターは、プロトオンコジェニック（ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）であることが示されている（アレンら（Ａｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９９１；ユリウスら（Ｊｕｌｉｕｓ　ｅｔ　ａｌ．）１９８９）。このことは、さらにＭＳＨレセプターがメラノーマにおける発病の役割を有しうることを示唆する。さらに、メラノトロピンは、成長関連オンコジーンｃ−ｆｏｓの発現を誘導することが示されていることで（ハートら（Ｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ．）１９８９）、さらにこの考えが支持されている。サカーノフら（Ｓｕｋｈａｎｏｖ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９１）にも記されている。
【００１１】
悪性メラノーマ
悪性メラノーマ（メラノカルチノーマ）は、メラノサイト由来の悪性腫瘍である。悪性腫瘍全体の約１％が悪性メラノーマである。悪性メラノーマの発生率は急速に増加している。ここ数十年の間、男女とも同じように、発生率は１０年ごとにほぼ倍増している。悪性メラノーマは、皮膚のあらゆる部位にできうる。できやすい部位はある。足、その次に頭と首である。できにくい部位は、生殖器官、会陰、肛門周辺部および粘膜である。この腫瘍では、隣接した皮膚や周辺リンパ節への転移の発生率が高い。血行性転移も起こりうる。
【００１２】
悪性メラノーマができる主な要因は日光に当ることである。主に影響をうけやすい人は、日光により容易に損傷を受けうる色白の肌をもつ人である。さまざまな治療法にもかかわらず、メラノーマでの５年生存率は、間隔の離れた転移のあるばあいにはわずか５％、周辺転移のあるばあいには４３％である（ローゼスら（Ｒｏｓｅｓ　ｅｔ　ａｌ．）１９９１）。実際にある臨床的に受け入れられている治療法は、病変部の外科的切除以外は非特異的で、外肢灌流（ｌｉｍｂ　ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、化学療法、免疫療法、放射線療法およびホルモン療法（ホーら（Ｈｏ　ｅｔ　ａｌ．）１９９０）などである。成功が非常に限られているにもかかわらず、ヨードキノリン（ランブレヒトら（Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ　ｅｔａｌ．）１９８４）、ヨードチオウラシル（コデーレら（Ｃｏｄｅｒｒｅ　ｅｔ　ａｌ．）１９８６）およびＮ−（２−ジエチルアミノエチル）−４−ヨードベンズアミド（ミケロットら（Ｍｉｃｈｅｌｏｔ　ｅｔ　ａｌ．）１９９１）などの放射性薬物が、メラノーマの診断および治療に用いられている。メラノーマの診断および治療の別のアプローチは、メラノーマ結合抗原に対する放射性標識をしたモノクローナル抗体を用いることである（アーリーら（Ｅａｒｙ　ｅｔ　ａｌ．）１９８９；ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）１９９１）。これには、真のメラノーマ結合抗原がなくてはならないという問題がある。また、メラノーマ腫瘍の成長段階によって異なる抗原が発現され、体の異なる部位の腫瘍では異なる抗原を発現しうる。このため、すべての非常に高度に特異性を有するモノクローナル抗体を、混合して用いることが必要であろう。そのような混合物の組合せは、患者によって、また同じ患者であっても腫瘍の前記段階のちがいによって、さまざまに異なるであろう。これをすべて行うのは非常に困難である。以前に行われた研究によって、ヒト患者の約８０％のメラノーマ転移において、ＭＳＨレセプターの検出が可能であることが示されている（タトロら１９９２参照）。
【００１３】
メラノーマ細胞上のＭＳＨレセプターは、この疾病の治療に有効な新規な医薬の重要なターゲットであると考えられてきた。ジフテリア毒素とα−ＭＳＨの融合タンパク質が構築され、ジフテリア毒素を標的に送達することにより、インビトロでＭＳＨレセプターを有する細胞に選択的に毒性を有することが示された（マーフィーら（Ｍｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ．）１９８６；ウェンら（Ｗｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９９１；タトロら１９９２）。別のアプローチでは、細胞障害性Ｔ細胞のＣＤ３レセプターに対する抗体とＭＳＨを結合した。この複合体は、インビトロにおいてメラノーマ細胞の細胞溶解を媒介することが示された。そのＭＳＨ部分がメラノーマ細胞のＭＳＨレセプターに結合する一方で、抗体がＣＤ３を有する細胞障害性Ｔ細胞を捕らえ、これによりメラノーマ細胞の溶解が媒介される（リウら（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．）１９８８）。
【００１４】
ＭＳＨレセプターと皮膚の黒ずみおよび毛髪および毛皮の色のコントロール
内因性、外因性のメラノトロピンは、インビボにおいてヒトの皮膚の色素沈着を促進することが示唆されている（レビン（Ｌｅｖｉｎｅ）１９９１；ミュリガンら（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９８２；ラーナーら１９６１）。ＭＳＨおよびその他のメラノトロピンがメラニン形成を刺激する作用機構は、よく研究されている。メラノトロピンがメラノサイト上のＭＳＨレセプターに結合し、その結果アデニル酸シクラーゼの活性化が起こる。増加したｃＡＭＰによって、チロシンをドーパ、ドーパをドーパキノンに変換するチロシナーゼ酵素が活性化され、これによりメラニンが形成される。こうして形成されたメラニンは、部分的にメラノサイトから分泌され、皮膚のケラチノサイトに取り込まれ、これにより皮膚の色をより黒くする。さらに、こうして形成された色素はヒトおよび動物における毛髪および毛皮の色を構成するであろう。種々の色が毛髪、毛皮および皮膚におけるメラニン色素の存在のレベルに依存して生じるであろう。
【００１５】
ＭＳＨレセプターと抗発熱および抗炎症作用
α−ＭＳＨは、同定されている最も強力な抗発熱剤のひとつである（クラークら１９８５）。さらに、ホルボールエステルもしくは接触性のアレルゲンのような化学物質や刺激原に対する求心性および遠心性、両方の炎症応答がα−ＭＳＨの局所的な適用によりブロックされる。これらの抗発熱および抗炎症効果は、ホルモンのカルボキシル末端領域に存すると思われ、ＭＳＨレセプターに対する作用を通して媒介されるという考えを支持する。
【００１６】
ＭＳＨレセプターと白斑
白斑では、皮膚の色素形成のない領域が特徴である。そのような皮膚の色の喪失は、色素細胞の喪失および／または機能障害による。皮膚の色素細胞上のＭＳＨレセプターの局在のため、白斑においてＭＳＨレセプターは何らかの役割を有すると考えられる。白斑の原因のひとつはＭＳＨレセプタータンパクおよび／またはポリペプチドに対する宿主の自己免疫応答でありうる。そのため、ＭＳＨレセプターは、白斑状態の治癒（ｃｕｒｅ）および／または改善の興味深い標的を構成する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
先に要約したように、ＭＳＨレセプターはさまざまな細胞のいくつもの生物学的機能において活性を有し、また関与するので、ＭＳＨレセプター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片に関する本発明が重要であることは明らかである。このようなＤＮＡ断片の配列を明らかにしようとかなりの努力がなされたにもかかわらず、本発明以前にそれを成し遂げた者はいなかった。
【００１８】
配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片は、ヒトｃＤＮＡライブラリーに由来し、それ以前には知られていなかった配列番号２に示す３１７アミノ酸のポリペプチドをコードする９５１ｂｐのオープンリーディングフレームを含有することがわかった。このポリペプチドは、ＭＳＨレセプターの完全なポリペプチドを構成する。注意深く構築されたプライマーにもとづいたｃＤＮＡの分子クローニングおよびヌクレオチド配列決定の詳しい説明は、実施例１に示す。ＭＳＨレセプターのｃＤＮＡは、そのメッセンジャーＲＮＡがメラノーマ細胞中にのみ見つかり、脳、胸腺、副甲状腺、耳下腺、唾液腺、副腎、精巣、肝臓、肺、心臓、脾臓、骨格筋、腸および結腸などのその他に調べた組織には見つからなかったという事実にもとづいて、かなり稀なクローンに表われる。実施例１を参照のこと。
【００１９】
前記のポリペプチドの膜貫通セグメント（それぞれ、配列番号１中のヌクレオチド２８６から３５１、３９４から４６５、５１７から５８８、６４０から７１１、７３３から８０４、８９８から９７２および９９７から１０６８に対応する）は、ハイドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）分析によって決定された（カイトら（Ｋｙｔｅ　ｅｔ　ａｌ．）１９８２）。
【００２０】
グリコシル化部位は配列番号２中のアミノ酸残基１５および２９に見られ、リン酸化部位である可能性のある部位は配列番号２中のアミノ酸残基４２〜４５、１５１〜１５４および３０６〜３０８に見られ、パルミチル化部位である可能性のある部位は配列番号２中のアミノ酸残基３１６に見られる。
【００２１】
ここで用いられるアミノ酸の省略形は、以下のとおり：
【００２２】
【表１】
2004000137.tif 000002
【００２３】
ここに示したヌクレオチドの表記の各々は、一般に用いられている省略形で示される。すなわち、
Ａは、デオキシアデニンを表す。
【００２４】
Ｔは、デオキシチミジンを表す。
【００２５】
Ｇは、デオキシグアニンを表す。
【００２６】
Ｃは、デオキシシトシンを表す。
【００２７】
Ｎは、デオキシイノシンを表す。
【００２８】
以下に記載するＤＮＡ断片Ｇ−８（配列番号７に示すヌクレオチド配列）をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、別の新たなＤＮＡ断片をヒトゲノムライブラリーから単離した。このＤＮＡ断片を、本出願中の配列番号１５として示している。この断片は、これもまたＭＳＨレセプターおよび／またはＭＳＨレセプターサブタイプでもあるそれ以前には知られていなかったポリペプチドをコードしていることが示されているので、本発明のまた別の興味深い側面を構成する。その断片によりコードされているポリペプチドは、本明細書中の配列番号１６として示している。このポリペプチドは、α−ＭＳＨレセプターおよび／またはβ−ＭＳＨレセプターおよび／またはγ−ＭＳＨレセプターおよび／またはＡＣＴＨレセプターなどのメラノトロピックホルモンレセプターであると信じられており、ここでは、互換可能なようにＭＣ−２およびＭＣ−２レセプターと呼ぶ。ＭＣ−２レセプターは、とくに中枢神経系に、また腸、肺、心臓、肝臓、脾臓、平滑および骨格筋組織ならびに免疫系などの末梢器官にもあることが知られる。
【００２９】
配列番号１５のヌクレオチド配列を有する新規なＤＮＡ断片は、１６５０ヌクレオチドを含んでなり、ここに記載されるように配列決定された。ヌクレオチド１から６１５は５’非翻訳領域を形成し、ヌクレオチド１５９１から１６５０は３’非翻訳領域を形成している。ヌクレオチド６１６から１５９０のコード断片は、配列番号１６に示す３２５アミノ酸のポリペプチドをコードしている。このＤＮＡ断片は、実施例６に記載されるようにヒトゲノムライブラリーから単離された。
【００３０】
このように、本発明の１側面は、
配列番号１５に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片、または
１）配列番号１５に示すＤＮＡ配列と少なくとも５５％の相同性を有し、かつ／または
２）アミノ酸配列が配列番号１６に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％相同であるポリペプチドをコードし、かつ／または
３）ＭＳＨレセプターによっても結合される抗体に結合するポリペプチドをコードし、かつ／または
４）ＭＳＨレセプターであるかまたはＭＳＨレセプターと同じ結合能力を有するポリペプチドをコードする
該ＤＮＡ断片の類似体もしくは部分配列に関する。
【００３１】
本発明のひとつの特徴的な側面は、配列番号１５に示すヌクレオチド配列を有し、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片に関するが、少なくとも１５ヌクレオチドを含んでなるその類似体または部分配列は、また別の本発明の重要な側面である。本発明は、配列番号１５に示す前記のヌクレオチド配列のコード部分にも、非コード部分にも関する。配列番号１５に示すＤＮＡ配列からえられる同じ長さのＤＮＡ断片と少なくとも５５％の相同性、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９５％を示すＤＮＡ断片も、そのような断片および部分配列が、エピトープとしての活性を有するため、それに対する抗体応答を引き起こすことができるポリペプチドをコードしうるので、本発明の興味深い側面である。そのような抗体は、以下に明らかにするように、ＭＳＨレセプターを構成するポリペプチドにも結合することができ、そのためＭＳＨレセプターの関連する疾病および状態の診断および治療において重要である。さらに、そのような断片および部分配列は、以下に明らかにするように他の用途の中で他のＤＮＡ断片の同定においてプローブとして用いることができる。この点で、配列番号１または配列番号１５に示すＤＮＡ断片の非コード部分の断片および／または部分配列は、このＤＮＡ断片のコード部分の断片および／または部分配列と同等に重要である。
【００３２】
ヌクレオチド配列に関してこのコンテクストにおいて用いられるとき、「部分配列」という語は、本発明のＤＮＡ断片に由来し、かつ基準１）〜４）のうち少なくともひとつにそれが適合していることにより証明されるような特徴的ヌクレオチド配列を保有しているヌクレオチド配列を表す。典型的には、その部分配列は配列番号１５に示すヌクレオチド配列の一部であり、その部分配列は、配列番号１５に示すヌクレオチド配列から取られるひと続きの範囲のヌクレオチドであるか、配列番号１５に示すヌクレオチド配列の１または複数の別個のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列が組合わせられたものであるかのいずれかである。
【００３３】
このコンテクストにおいて「特徴的ヌクレオチド配列」は、本発明のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を表すことを意図し、これは以下の基準のひとつまたは複数にしたがってＤＮＡ断片を同定するということに注意することが重要である：−　それは、ＭＳＨレセプターの結合特性を有するペプチドをコードする、かつ／または
−　それは、それが由来するオリジナルＤＮＡ断片によりコードされるポリペプチドとも（高度な特異性を有して）結合する抗体によって（高度な特異性を有して）結合されるペプチドをコードする（結合は、たとえば実施例１０に記載のようにして評価する）、かつ／または
−　それは、それが由来するオリジナルＤＮＡ断片を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用であろう。
【００３４】
たとえばレセプターなどの化合物「Ｘ」がポリペプチド、抗体またはその他の物質「Ｙ」と「結合」するとき、本出願においては、生理学的条件下（たとえば３７℃のリンゲル溶液中、またはたとえば本質的に実施例３に記載されるような結合緩衝液および条件を用いて）で「Ｙ」を他の物質と区別する「Ｘ」の能力によって評価されるような「Ｘ」の「Ｙ」への実質的に特異的な結合として定義される。「Ｘ」は「Ｙ」と既知の親和力で結合することが好ましい。好ましくは、複合体「ＸＹ」の解離定数（
【００３５】
【数１】
2004000137.tif 000003
【００３６】
として定義される（式中、ＡＸ、ＡＹおよびＡＸＹは、
【外１】
2004000137.tif 000004
【００３７】
における「Ｘ」、「Ｙ」および「ＸＹ」の活量（ａｃｔｉｖｉｔｙ）を表す）は、１０μＭより小さく、より好ましくは１μＭより小さく、さらに好ましくは１００ｎＭより小さい。最も好ましくは複合体「ＸＹ」の解離定数は１０ｎＭより小さい。そのうえ、さらなる意味づけにおいては、「Ｘ」が「Ｙ」に結合すると言われ、後者が既知の高親和性で化合物「Ｚ」とも結合するとき（「Ｙ」は、テスト手段と考えられうる程度に高い親和性で「Ｚ」と結合することが証明されている）、形成された複合体「ＸＹ」の解離定数は、「ＹＺ」の解離定数の１００，０００倍以下、好ましくは１０，０００倍以下、より好ましくは１，０００倍以下、最も好ましくは１００倍以下である。
【００３８】
そのような結合特性を測定するひとつのやり方は、実施例３の方法を用いることである。実施例３では、メラノトロピックホルモンのパネルが、１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨとＭＳＨレセプターであることが疑われているものとの結合を阻害する能力についてテストされている。
【００３９】
前記に従って、あるＤＮＡ断片と配列番号１５に示すＤＮＡ断片またはその部分配列のひとつとの間の相同性が３０％程度に小さくても、いくつかのばあいには、その相同性によって第１のＤＮＡ断片中に特徴的ＤＮＡ配列があることが保証されるうる。したがって、本発明は配列番号１５中のＤＮＡ配列の特徴的ＤＮＡ配列を保有しているＤＮＡ断片に関する。該特徴的ＤＮＡ配列は配列番号１および１５に示すＤＮＡ配列のいずれかとの相同性が３０％程度に小さい。このようなことは、その特徴的配列がポリペプチドの機能的に重要な部分の一部であり、そのためその他のポリペプチドとはほとんど類似性のないばあいに最もありそうなことである。しかしながら、相同性の程度は、特徴的配列が分子の機能的に重要性の少ない部分をコードしているばあいは、少なくとも４０％であることが好ましい。相同性の程度は、いくつかのばあいには、９５％程度に非常に高くなりうる。これは、特徴的ＤＮＡ断片がポリペプチドの膜内部分をコードしており、そのアミノ酸配列が他の膜貫通ポリペプチドの配列とよく似ているようなばあいであろう。
【００４０】
本明細書および特許請求の範囲において、「部分配列」という語は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２１ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも２７ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも５１ヌクレオチドの大きさを有するヌクレオチド配列を示す。小さい断片が、ここに記載されるようにエピトープ、ＤＮＡもしくはＲＮＡとのハイブリダイゼーション用またはＰＣＲ技術におけるＤＮＡ−プローブとして有用であり、抗体産生を引き起こす能力のあるエピトープを含んでなるペプチドをコードしていることで有用であることはよく知られている。
【００４１】
本発明のＤＮＡ断片に関して「類似体」という語は、配列番号１５に示す本発明のＤＮＡ断片によりコードされるポリペプチドと同一または実質的に同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を表すことを意図している。
【００４２】
同じアミノ酸がさまざまなコドンによりコードされ、そのコドンの使い方は、とりわけそのヌクレオチド配列を発現する、問題の生物の好みに関係するということはよく知られている。したがって、本発明のＤＮＡ断片のひとつまたは複数のヌクレオチドまたはコドンは、発現の際に問題のＤＮＡ断片によりコードされるポリペプチドと同一または実質的に同一のポリペプチドを生じる他のヌクレオチドまたはコドンと交換しうる。
【００４３】
したがって、配列番号１６のアミノ酸１から３２５を含んでなるポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、本発明の非常に重要な実施態様である。
【００４４】
また、このコンテクストにおいて用いられる「類似体」という語は、ＭＳＨレセプターを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列としての、類似のヌクレオチドの組合せ（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）または配列のＤＮＡ断片またはＤＮＡ配列を表す。ここで、リガンド結合特性および／または生物学的機能および／または免疫原性についてＭＳＨレセプターと比べて劣るようになるような効果をもたないマイナーな変更、あるいは興味深く有用で新規な結合特性または生物学的機能または免疫原性などを類似体に与えるようなマイナーな変更は許容される。類似のＤＮＡ断片またはＤＮＡ配列は、動物またはヒトに由来するものでも、または部分的もしくは完全に前記のような合成起源でもよい。類似体は、組換えＤＮＡ技術を用いてえられたものでもよい。
【００４５】
さらに、「類似体」および「部分配列」という語では、ひとつまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入（イントロンを含む）、付加、削除および再配置などの配列中の変形であって、ＤＮＡ断片またはその部分配列によりコードされるポリペプチドに実質的な影響を与えないものを許容することが意図されている。「置換」という語では、完全なヌクレオチド配列中のひとつまたは複数のヌクレオチドの、ひとつまたは複数の異なるヌクレオチドでの置き換えを意味することを意図している。「付加」は、完全なヌクレオチド配列のいずれかの端でのひとつまたは複数のヌクレオチドの追加を意味すると理解される。「挿入］は、完全なヌクレオチド配列中へのひとつまたは複数のヌクレオチドの導入を意味することを意図している。「削除」は、完全なヌクレオチド配列から、配列のいずれかの端または配列中のいずれかの適当なポイントで、ひとつまたは複数のヌクレオチドを取り去ることを意味することを意図している。「再配列」は、ふたつまたはそれより多くのヌクレオチド残基を相互に交換することを意味することを意図している。
【００４６】
「ポリペプチドに実質的な影響を与えない」という語を使うときは、ＤＮＡ断片がその類似体／部分配列が由来するＤＮＡ断片によりコードされるＭＳＨレセプターポリペプチドと比べてその免疫原性および／またはＭＳＨ結合特性が維持されているポリペプチドをコードしている、と理解される。
【００４７】
「断片」、「配列」、「部分配列」および「類似体」という語は、本発明にしたがって断片、配列、部分配列および類似体に関して本明細書および特許請求の範囲中で用いているように、もちろん自然環境中でのこれらの現象ではなく、むしろたとえば単離、精製、インビトロまたは組換え形態におけるこれらの現象を含むと理解される。
【００４８】
「相同性」および「相同な」という語では、ＤＮＡ断片に関しては、問題のヌクレオチド間の相同性を意味することを意図している。それらの間の相同性は、対（ｍａｔｃｈ）においてＤＮＡ断片のヌクレオチドの同一性および位置に関して証明されなくてはならない。ここに記載されるポリペプチドおよびその断片に関しては、それらの語は、問題のアミノ酸間の相同性を意味することを意図している。それらの間の相同性は、対においてポリペプチドのアミノ酸の同一性および位置に関して証明されなくてはならない。
【００４９】
「ＭＳＨレセプターの結合能力」は、このコンテクストにおいて、レセプターとさまざまな可能なリガンドとの間の結合を、ここで述べるように１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨ（１２５Ｉ−（Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７）−ＭＳＨ）の結合を阻害する能力に関して測定するテストにより評価したＭＳＨレセプターの結合特性として表される。
【００５０】
「ＭＳＨレセプターと同じ結合能力」は、ここでは、ＭＳＨのＭＳＨレセプターとの結合による効果を引き出すことはできないにしろ、他の化合物よりも高い親和性によって、物質が１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨと結合することを示す結合特性（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｆｉｌｅ）として定義される。
【００５１】
「ＭＳＨの類似体」または「メラノトロピックホルモンの類似体」に言及するときは、前記のようなＭＳＨレセプターに対する結合能力を示す物質を意味することを意図している。したがって、ＭＳＨの類似体およびメラノトロピックホルモンの類似体の例としては、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨ、γ−ＭＳＨおよびＮＤＰ−ＭＳＨがあげられる。
【００５２】
「メラノトロピックホルモン」という語は、ＭＳＨまたはＡＣＴＨの生物学的活性と同じ活性を典型的に有する天然ペプチドである、プロオピオメラノコルチン（ｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ（ＰＯＭＣ））由来の天然ペプチドと、合成ペプチドである、天然メラノトロピックホルモンにより誘導されうる生物学的効果の少なくともひとつを誘導する能力を有する合成ペプチド、の両方を意味する。したがって、メラノトロピックホルモンの例としては、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨ、γ−ＭＳＨ、ＡＣＴＨおよびＮＤＰ−ＭＳＨがあげられる。
【００５３】
「メラノトロピックホルモンレセプター」という語では、メラノトロピックホルモンにより活性化することができ、一般にメラノトロピックホルモン応答と呼ばれる、セカンドメッセンジャー応答（もしくはいずれかの他の典型的レセプター応答）または生物学的効果を誘導することのできるレセプターを意味することを意図している。メラノトロピックホルモンによる、メラノサイトにおけるメラニン形成の刺激および副腎におけるコルチコステロイド合成の刺激は、メラノトロピックホルモン応答の典型的な例である。メラノトロピックホルモンレセプターの例としては、ＭＳＨレセプター、ＡＣＴＨレセプターおよびＭＣ−２があげられる。
【００５４】
本発明は、配列番号３および配列番号４として示すプライマーならびに以下に定義するそれらの類似体の構築にもとづいている。前記より明らかなように、ＭＳＨレセプターの機能を調べるために大きな興味がもたれおよび多くの努力がなされていたため、ＭＳＨレセプターをコードするＤＮＡの単離に興味がもたれていたことは明らかである。これらのプライマーを設計する際には、本発明を可能なものとした実施例１に詳しく記載したように、本発明の発明者は、きわめて注意深く仕事を行った。
【００５５】
したがって、プライマーとして用いられる本発明の前記ＤＮＡ断片は、本発明の興味深いまた別の側面を構成し、ＭＳＨレセプターと同種の機能および／または結合能力を有するポリペプチドをコードする他のＤＮＡ断片の検出および単離などの種々の重要な有用性を有する。とくに、これらのプライマーは、他のＧ−タンパク共役あるいは結合レセプターの検出において用いることができる。したがって本発明は、配列番号３のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片（セグメント３から）またはその類似体（ここで、ヌクレオチド１３および／または１５および／または２３は任意にＣにより置換される）、および配列番号４のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片（セグメント６から）またはその類似体（ここで、ヌクレオチド１９および／または２９および／または３２は任意にＣにより置換され、ヌクレオチド２０および／または３１は任意にＧにより置換される）にも関する。
【００５６】
他の外来ＤＮＡ断片との近縁度（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）の検査など、本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列またはそれから転写されたＲＮＡ断片を検査するために、ハイブリダイゼーションは有用な方法である。ハイブリダイゼーションは、つぎのようにして行うことができる：本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列を、使用可能ないずれかの標識原理（放射活性システム、発色反応システム、光にもとづくシステムまたはこれらの変形）で標識し、プローブを構成する。検査すべき外来ＤＮＡ／ＲＮＡをマトリックスに連結させる。マトリックスを適切に処理してＤＮＡ／ＲＮＡをマトリックスに連結させる。そのマトリックスに前記ＤＮＡ／ＲＮＡが連結するようにマトリックスを適切な処置に付す。そのマトリックスと問題の外来ＤＮＡ／ＲＮＡに適する一定の組成の予備ハイブリダイゼーション溶液に一定の温度で一定時間さらす。つぎにマトリックスを標識された変性ＤＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション溶液中におく。ハイブリダイゼーションは、適当な温度および時間で行う。つぎにマトリックスを、そのマトリックスと問題の外来ＤＮＡ／ＲＮＡに適する一定の組成の溶液で一定の温度にて一定時間洗浄する。つぎにマトリックスをＤＮＡプローブの標識の性質にもとづいた適当な検出システムに付す。ついでその結果を分析する。外来ＤＮＡ／ＲＮＡとＤＮＡプローブとのいかなるハイブリダイゼーションも、２つの種の類似性の指標であり、その外来ＤＮＡ／ＲＮＡが本発明の一部であるかどうかの検査に用いることができる。前記のハイブリダイゼーションの手順において、本発明のポリペプチドまたはその類似体もしくは部分配列に対応するＲＮＡプローブも、ＤＮＡプローブの代わりに用いることができる。ＤＮＡ配列間の類似性を決定する他のアプローチとしては、通常のＤＮＡ配列決定分析により、本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列と比較しようとするＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を従来のＤＮＡ配列決定分析法で決定し、本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列との相同性の程度を比較することによるアプローチがあげられる。
【００５７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーは、クローン化されたＭＳＨレセプターのヌクレオチド配列にもとづいて、または他の既知の類似の配列にもとづいて合成することができる。これらのプライマーは、ついでＭＳＨレセプターの配列またはその類似体の配列の全体または一部を増幅するのに用いることができる。本発明の一部を構成する配列番号３および配列番号４に示すプライマーは、この側面において用いることができる。一種の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるポリメラーゼ連鎖反応酵素は、増幅において一般に１万分の１の頻度で間違ったヌクレオチドを取り込む（ティンダルら（Ｔｉｎｄａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．）１９８８）。増幅の繰り返す性質ゆえに、これで新たに変えられた配列は増幅されたＭＳＨレセプターにしばしば起因すると考えられる。
【００５８】
前記の本発明の重要な側面を構成するＤＮＡ断片は、ゲノミックＤＮＡから直接に、またはｍＲＮＡを単離し、逆転写酵素を用いてこれを対応するＤＮＡ配列に変換してｃＤＮＡをつくることによりえることができる。ＤＮＡ断片をゲノミックＤＮＡからえるときには、実施例１に記載するようにゲノミック配列を直接スクリーニングすることによりえられる。ＭＳＨレセプター配列の知識、または精製されたＭＳＨレセプターのアミノ酸配列決定によりえられた配列の情報にもとづいて設計されたＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによって、そのようなスクリーニングを行うことができる。ＤＮＡが相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）起源のときには、ＭＳＨレセプターまたはその一部を含む細胞からのｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作ることによりえることができる。ハイブリダイゼーションは、ＭＳＨレセプター配列の知識、または精製されたＭＳＨレセプターのアミノ酸配列決定によりえられた配列の情報にもとづいて設計されたＤＮＡプローブによって行うことができる。
【００５９】
本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列は、細胞系における発現クローニング（シーら（Ｘｉｅ　ｅｔ　ａｌ．）１９９２）または卵細胞（ｏｏｃｙｔｅ）における発現クローニング（ユリウスら１９８８；マスら（Ｍａｓｕ　ｅｔ　ａｌ．）１９８７）のような他の方法（ライトら（Ｗｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．）１９９２）を用いてもえることができる。
【００６０】
本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列は、たとえば哺乳動物などの他の動物からもえることができる。このようにしてえられるＤＮＡは、配列番号１５に示すものときわめて類似するか、またはよく知られている種間の変化による構造上の相違を有しているであろう。
【００６１】
本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列は、それをベクターと融合し、その複合体を適当な微生物または哺乳動物細胞系の中に挿入することにより複製が可能である。そうするかわりに、ＤＮＡ断片を化学合成を用いて製造することもできる。
【００６２】
前記のように、配列番号１５に示す本発明のＤＮＡ断片によりコードされるポリペプチドは、それぞれＭＳＨレセプターおよびＭＳＨレセプター／ＭＳＨレセプターサブタイプをコードしているコード領域を含むことが示されている。
【００６３】
したがって、本発明の別の最も重要な側面は、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
１）ＭＳＨレセプターであるかまたはＭＳＨもしくはその類似体と結合することができ、かつ／または
２）配列番号１５に示すＤＮＡ断片と少なくとも５５％相同なＤＮＡ断片によってコードされ、かつ／または
３）ＭＳＨレセプターによっても結合される抗体を結合する
前記ポリペプチドの類似体もしくは部分配列に関する。
【００６４】
「ＭＳＨレセプター」という語を用いることによってＭＳＨと結合することのできるポリペプチドを意味し、「その類似体」という語によって、ＭＳＨと結合することのできる、ＭＳＨレセプターと同じ結合能力を有するいかなるポリペプチドをも意味する。したがって、哺乳動物などの異なる動物など、とくにヒトにおいて、異なるソースからえられた、たとえば炭水化物部分またはリン酸化および／または組織分布において異なっているポリペプチドも含まれる。このコンテクストにおいて、ＭＳＨレセプターという語も前記の本発明のポリペプチドの両方を指す。
【００６５】
類似体という語は、ＭＳＨレセプターとも結合する抗体と結合することができるポリペプチドをも含む。そのような類似体は、ＭＳＨレセプターに対しても生じるあるいはＭＳＨレセプターによっても引き起こすことが可能な免疫応答を、引き起こすあるいは刺激することができるであろう。これらおよび他の類似体は、類似体に関して先に定義した本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列によってコードされる。類似体は、特徴的な側面において、ここで検討されるような合成起源のものであってよい。
【００６６】
ポリペプチドに関する「類似体」という語は、このコンテクストにおいて、配列番号２または配列番号１６に示す特徴的なアミノ酸配列（または本発明の別のポリペプチド）と類似のアミノ酸の組合せまたは配列の、タンパク質またはポリペプチドを表すためにも使われている。ここで、リガンド結合特性および／または生物学的機能および／または免疫原性について不利な効果をもたないマイナーな変更、あるいは興味深い有用で新規な結合特性または生物学的機能または免疫原性などを類似体に与えうるようなマイナーな変更は許容される。類似のポリペプチドまたはタンパク質は、動物またはヒトに由来しても、または部分的もしくは完全に合成起源でもよい。類似体は、組換えＤＮＡ技術を用いてえられたものでもよい。
【００６７】
同じ動物のゲノム中に、同じまたは類似の遺伝子が２つまたはそれより多くのコピーに存在しうることが広く認識されている。遺伝子突然変異は、常にＤＮＡ配列の分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）を誘導する傾向にあるので、同じおよび／または類似の遺伝子によりコードされたタンパク質の構造は、進化の過程では分岐する傾向にある。したがって、このコンテクストにおいて、配列番号１および配列番号１５に示すＤＮＡが実際に存在するため、ＭＳＨレセプターはゲノム中に少なくとも２つのコピーで存在することが明らかである。したがって、配列番号１および１５は、メラノトロピックホルモンに対する２つのタンパク質の結合特性は異なるがともにＭＳＨレセプター特性を有するタンパク質をコードしている。したがって、動物、たとえばホモサピエンスのゲノム中にはさらに多くのＭＳＨレセプターのコピーが存在することが予測される。そのようなタンパク質とここに記載されるＭＳＨレセプターとの間のアミノ酸の組合せの類似性のため、これらのタンパクは本願において、ＭＳＨレセプターの類似体であると考える。したがって、そのようなタンパク質も本発明の一部である。
【００６８】
このコンテクストにおいて「ＭＳＨレセプター由来の特徴的アミノ酸配列」という語は、配列番号２に示すポリペプチドまたは配列番号１６に示すアミノ酸配列の（直線または空間的構造の点から見て）実質的にひと続きの範囲（ｓｔｒｅｔｃｈ）を構成し、かつＭＳＨレセプターをコードするアミノ酸を含んでなるアミノ酸配列を意味することを意図している。その二次的または三次的構造は、興味深く有用な特性を有するであろうし、エピトープを構成しうる。
【００６９】
このコンテクストにおいて、「エピトープ」という語は、免疫能のある細胞を刺激または相互作用することができ、ＭＳＨレセプターを構成するポリペプチドとも結合する抗体の産生を刺激することができる、本発明のあらゆるポリペプチドまたはその類似体を指す。とくに、診断および治療に関して望ましい特性を示すエピトープは、本発明の重要な側面を構成する。
【００７０】
このコンテクストにおいて、「エピトープ」という語は、ＭＳＨレセプターを構成するポリペプチドによっても結合される既存のまたは新規な物質と相互作用するまたは結合することができる、本発明のあらゆるポリペプチドまたは特徴的アミノ酸配列またはそれらの類似体をも指す。該物質は、有機分子、小ペプチドもしくは大ポリペプチド、またはそれらのいずれかの誘導体でありうる。そのようなアプローチは、薬剤物のスクリーニングプログラムにおいて用途を見つけることができる。
【００７１】
「レセプターサブタイプ」という語では、比較される別のレセプターとは、それぞれのレセプターに対するリガンド親和性は異なるかもしれないが、その別のレセプターと同一の、ひとつのリガンドおよび／または複数のリガンドと結合することができるレセプターを意味することを意図している。
【００７２】
したがって、ＭＣ−２を「ＭＳＨレセプターサブタイプ」と呼ぶときは、ＭＣ−２はＭＳＨレセプターであることが示されるが、種々のリガンド／物質との結合のパターンは、たとえば配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＭＳＨレセプターなどの他のＭＳＨレセプターとは異なることを表す。
【００７３】
ポリペプチドに関して「部分配列」という語は、配列番号１６に示すポリペプチド配列の一部を含んでなるポリペプチド配列、または任意にＭＳＨ結合能力を保有しうる本発明の他のポリペプチド配列を意味する。ここで説明されるように修飾が行われることによって類似化されたポリペプチド部分配列も含まれる。興味深いエピトープを構成する、または先に定義したような本発明のヌクレオチドの部分配列によりコードされるポリペプチドも含まれる。
【００７４】
「ＭＳＨレセプターの誘導体」は、ＭＳＨレセプターの類似体、部分配列またはサブタイプのいずれをも意味する。
【００７５】
本発明の最も重要な側面において、本発明は配列番号１５に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片によってコードされるポリペプチド、好ましくは配列番号１６に示すポリペプチドに関する。
【００７６】
本発明のポリペプチドは、配列番号１６に示す配列の一部であるアミノ酸配列を有する同じ長さのポリペプチドと少なくとも５５％の相同性、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性の程度を示すポリペプチドを含んでなる。
【００７７】
本発明はまた、配列番号１６の５アミノ酸から３２４アミノ酸を含んでなる部分配列、およびそのようなポリペプチドのあらゆる類似体に関する。その部分配列は、好ましくは少なくとも７アミノ酸、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１５アミノ酸および最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸を含んでなる。ポリペプチドは、他のいかなる部分（ｍｏｉｅｔｙ）と連結していてもよい。
【００７８】
本発明はまた、ＭＳＨレセプターと同じ結合能力を有している、または本発明のポリペプチドに対して作られたもしくはこれと反応する抗体によって認識される、実質的に純粋なポリペプチドにも関する。さらに、本発明は、あらゆる実質的に純粋な形態の本発明のポリペプチドに関する。
【００７９】
さらに、本発明はグリコシル化されている、または炭水化物もしくは脂質部分と連結している、ここで定義されたポリペプチドに関する。パルミトイル・アンカーまたはその一部を含有するポリペプチドも、脂溶性の形態の本発明のあらゆるポリペプチドも、興味深い側面を構成する。そのような形態のポリペプチドは、ここに記載する本発明の興味深い側面において、レセプターの機能障害を有する動物、とくにヒトにおける治療において有用であろう。
【００８０】
本発明の脂溶性の形態のポリペプチドは、ポリペプチドが受け入れ側（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）の細胞膜に取り込まれるように、リポソーム、ミセルおよびリン脂質などの成分を含んでなる形態であってよい。脂溶性の形態はポリペプチドの安定性を保証し、好ましくはある形態において、薬物学的に許容可能であって、その脂溶性の形態を動物、とくにヒトに投与することができることが重要である。脂溶性の形態は、界面活性剤、鉱物油もしくは植物油のような油、または水などの成分を含んでなる形態であってよく、前記の成分のひとつまたは複数の懸濁液であってよい。
【００８１】
このコンテクストにおいて、「実質的に純粋な」という語は、問題のポリペプチドが実質的に他の成分、たとえば他のポリペプチドまたは炭水化物などを含まないことを意味すると理解される。そのような他の成分は、ポリペプチドの製造および／または回収により生じるか、またはそうでなくてもそのポリペプチドとともに見つけられるかもしれない。本発明のポリペプチドの高い純度は、ポリペプチドがたとえば抗体の産生のためなどに用いられるときに、有利である。また、高い純度のため、実質的に純粋なポリペプチドは、ほとんどの目的のために従来の低い純度のポリペプチドよりも少ない量で用いることができる。本発明のポリペプチドの精製は、当業者に知られている方法で行うことができる。
【００８２】
配列番号１６に示すアミノ酸配列を有し、ＭＳＨレセプターである本発明のポリペプチドは、他のＧ−タンパク共役レセプターとの類似性を有する。それらの最も共通の特徴は、他のすべてのＧ−タンパク共役レセプターと同様に、細胞膜を７回貫くということである。異なるＧ−タンパク共役レセプターの膜貫通セグメントの間の相同性の観察にもとづいて、細胞外ループおよび膜貫通セグメントは、たとえばＭＳＨもしくはＭＳＨの類似体の結合またはレセプターに対しリガンドとして働く合成有機分子の結合などの、リガンド結合に関与しているとの仮説がたてられている。細胞内ループは、Ｇ−タンパクと共役する役割を与えられており、他の細胞内作用に関与している可能性がある。このコンテクストにおいて、リガンドとの結合および／またはＧ−タンパクとの共役に関与すると考えられる前記の膜貫通セグメントとさらに細胞外および細胞内ループは、言及したレセプター中のセグメントおよびループのうちひとつまたは２つまたはそれより多くまたはすべてである。
【００８３】
Ｇ−タンパク共役レセプターおよびいくつかの関連タンパク質（たとえばバクテリオロドプシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）やオプシン（ｏｐｓｉｎｓ））の３次元（３Ｄ）構造を解き明かそうとする熱心な努力が世界中の数々の研究所で進められている。いったんこれらのタンパク質のうちのひとつの３Ｄ構造が解き明かされれば、その他のＧ−タンパク共役レセプターの３Ｄ構造は、それらの一次アミノ酸構造が分かっていれば、コンピュータ計算の方法で容易に解き明かされるであろうと期待される。これは、すべてのＧ−タンパク共役レセプターが類似した総体（ｇｒｏｓｓ）３Ｄ構造を示しているようであるという事実のためである（サンカラ−ラマクリシュメン（Ｓａｎｋａｒａ−Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ）およびビシュベシュワラ（Ｖｉｓｈｖｅｓｈｗａｒａ）１９８９；フィンドレイ（Ｆｉｎｄｌａｙ）およびエリオポーラス（Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ）１９９０；ハイベルト　エム・エフら（Ｈｉｂｅｒｔ　Ｍ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．）１９９１）。
【００８４】
したがって、ＭＳＨレセプターの細胞外ループを構成すると考えられているアミノ酸１から３９、１００から１１６、１８２から１８８および２６９から２７６は、とくに重要であると考えられている。これらの領域は、ドラッグデザインのためまたはたとえば標的を絞ったドラッグデリバリーなどにおける臨床的用途のため意図された抗体のための、エピトープ標的としてとくに重要であろう。
【００８５】
ＭＳＨレセプターの細胞内ループを構成すると考えられているアミノ酸６３から７５、１４２から１５７、２１３から２４３および３０１から３１７は、とくに重要であると考えられる。これらの領域は、ＭＳＨレセプターのＧ−タンパクに対する共役のメカニズムを明らかにするうえで、とくに重要であろう。これらの領域は、レセプターとＧ−タンパクとの相互作用を調整することを目的とする薬物の標的として働くであろう。変更された特性を示す新たなＭＳＨレセプター類似体を作り出すために、たとえば削除、部位特異的突然変異、余分なアミノ酸の挿入またはそれらの組合せなどによって、アミノ酸配列を変更することも、とくに望まれるであろう。そのような変更されたレセプターは、レセプターのＧ−タンパクとの共役における分子メカニズムのさらなる理解のために望まれるしれない。さらに、細胞内セグメントをコードするＤＮＡ配列、とくに塩基対６３６から７２６、またその他のセグメントも、これらの領域は他のＧ−タンパク共役レセプターをコードする断片との相同性が少ないと考えられるので、本発明のこの特別な部分に関するまた別の側面である。したがって配列のそのような領域は、以下に詳しく記載するように、ハイブリダイゼーション研究においてＭＳＨレセプターＤＮＡまたはｍＲＮＡに対して選択的であるＤＮＡプローブを作る働きをすることができる。
【００８６】
また、ＭＳＨレセプターの膜貫通セグメントを構成すると考えられているアミノ酸４０から６２、７６から９９、１１７から１４０、１５８から１８１、１８９から２１２、２４４から２６８および２７７から３００は、とくに重要であると考えられる。変更された特性を示すＭＳＨレセプター類似体を作り出すためにひとつまたはいくつかの特定のアミノ酸を変更することがここで望まれるであろう。そのような変更されたレセプターは、ＭＳＨおよびＭＳＨ類似体のレセプターへの結合における分子メカニズムの理解のために、さらに望まれるしれない。さらに、膜貫通セグメントをコードするＤＮＡ配列は、これらの領域がＭＳＨレセプターの天然の変異体である他のＧ−タンパク共役レセプターをコードする断片との相同性がきわめて高いと考えられるので、本発明のこの特別な部分に関するまた別の側面である。そのようなレセプターをコードする断片は、ＭＳＨレセプターの種変異体をコードする他の種に存在するであろう。そのようなレセプターをコードする断片は、動物にもヒトにも存在しうるものであり、ＭＳＨレセプターのサブタイプであるか、またはメラノトロピックホルモンレセプターファミリーの同じクラスに属する可能性のある密接に関係するレセプタータイプである、相同なレセプターをコードする。膜貫通セグメント由来のＤＮＡ配列を利用する相同性スクリーニング方法を用いることによって、これらの相同なレセプターをコードする断片のＤＮＡ配列をえることが可能であろう。
【００８７】
配列番号１６の配列は配列番号２の配列と異なるため、以下のＭＣ−２レセプターの断片はとくに重要であると考えられる：ＭＣ−２レセプターの細胞外ループを構成すると考えられる配列番号１６のアミノ酸１から３７、９８から１１４、１８０から１８６および２６６から２７３である。これらの領域は、ドラッグデザインのためのまたはたとえば標的を絞ったドラッグデリバリーなどにおける臨床的用途のため意図された抗体のための標的としてとくに重要であろう。
【００８８】
本発明の他の実施態様において、ＭＣ−２レセプターの細胞内ループを構成すると考えられている配列番号１６のアミノ酸６２から７３、１３９から１５５、２１２から２３９および２９８から３２５は、とくに重要である。これらの領域は、ＭＣ−２レセプターのＧ−タンパクに対する共役のメカニズムを明らかにするためにとくに重要であろう。これらの領域は、レセプターとＧ−タンパクとの相互作用を調整することを目的とする薬剤の標的として働きうる。変更された特性を示す新たなＭＣ−２レセプター類似体を作り出すために、たとえば削除、部位特異的突然変異、余分なアミノ酸の挿入またはそれらの組合せなどによって、アミノ酸配列を変更することも、とくに望まれるであろう。そのような変更されたレセプターは、レセプターのＧ−タンパクとの共役における分子メカニズムの理解のためにさらに望まれるしれない。さらに、細胞内セグメントをコードするＤＮＡ配列、とくに配列番号１５の塩基対６３３から７１７、またその他のセグメントも、これらの領域は他のＧ−タンパク共役レセプターをコードする断片との相同性が少ないと考えられるので、本発明のこの特別な部分に関するまた別の側面である。したがって、配列のそのような領域は、以下に詳しく記載するように、ハイブリダイゼーション研究においてＭＣ−２レセプターＤＮＡまたはｍＲＮＡに対して選択的であるＤＮＡプローブを作る働きをしうる。
【００８９】
また別の本発明の実施態様において、ＭＣ−２レセプターの膜貫通セグメントを構成すると考えられている配列番号１６のアミノ酸３８から６１、７４から９７、１１５から１３８、１５６から１７９、１８７から２１１、２４０から２６５および２７４から２９７は、とくに重要であると考えられる。変更された特性を示すＭＣ−２レセプター類似体を作り出すためにひとつまたはいくつかの特定のアミノ酸を変更することがここで望まれるであろう。そのような変更されたレセプターは、レセプターへのＭＳＨまたはＭＳＨ類似体の結合における分子メカニズムの理解のために、さらに望まれるしれない。さらに、膜貫通セグメントをコードするＤＮＡ配列は、これらの領域がＭＣ−２レセプターの天然の変異体である他のＧ−タンパク共役レセプターをコードする断片との相同性がきわめて高いと考えられるので、本発明のこの特別な部分に関するまた別の側面である。そのようなレセプターをコードする断片は、ＭＣ−２レセプターの種変異体をコードする他の種に存在するであろう。そのようなレセプターをコードする断片は、ＭＣ−２レセプターのサブタイプである、またはメラノトロピックホルモンレセプターファミリーの同じクラスに属する可能性のある密接に関係するレセプターである、相同なレセプターをコードする動物にもヒトにも存在しうる。膜貫通セグメント由来のＤＮＡ配列を利用する相同性スクリーニング方法を用いることによって、これらの相同なレセプターをコードする断片のＤＮＡ配列をえることが可能であろう。
【００９０】
前記の特定のアミノ酸配列は、本発明の部分配列の顕著な例である。本発明のまた別の重要な部分配列は、前記の部分配列の修飾物である部分配列である。それらの部分配列は、そのもとの特別な配列についても、前記のポリペプチドのための基準１）から３）のいずれかひとつを満たすものである。また、そのようないずれのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も本発明のこの側面に含まれる。
【００９１】
プライマーを用いて、３つのＤＮＡ断片が単離され配列決定された。これらのＤＮＡ断片は、配列番号５に示すＧ−６、配列番号７に示すＧ−８、配列番号９に示すＧ−１０と呼ばれ、配列番号１に示すＤＮＡ配列と相同性を共有する。
【００９２】
したがって、配列番号５、配列番号７または配列番号９に示すヌクレオチド配列のいずれかに、少なくとも４０％の相同性を示すか、または配列番号１３および／または配列番号１４に示すヌクレオチド配列をプライマーとして用いることにより単離することができるか、または配列番号５、配列番号７または配列番号９に示すヌクレオチド配列のいずれかを有する、ＤＮＡ断片またはその部分配列もしくは類似体にも関する。相同性は、ある側面において、配列番号５、配列番号７または配列番号９に示すＤＮＡ配列のいずれかに対して、それぞれ少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、またさらに好ましくは少なくとも８０％および最も好ましくは少なくとも９５％である。
【００９３】
配列番号５、配列番号７および配列番号９に示すＤＮＡ配列によりそれぞれコードされる配列番号６、８または１０に示すポリペプチドのいずれかに対して少なくとも４０％の相同性を示すポリペプチド配列またはその部分配列もしくは類似体は、さらに別の実施態様を構成する。相同性は、ある側面において、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示すポリペプチドのいずれか、それぞれに対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、またさらに好ましくは少なくとも８０％および最も好ましくは少なくとも９５％である。
【００９４】
本発明のあらゆるＤＮＡ断片は、本発明の特徴的な実施態様において、標識されてまたは非標識で、完全長のコード断片を単離するために、および／またはＲＮＡを検出もしくは定量するために用いられるＤＮＡプローブの調製のために用いられうる。これらのいずれのＤＮＡ断片の情報も、ＰＣＲプライマーの作製のためおよびポリペプチドの作製のためにも用いることができる。
【００９５】
前述し、実施例にも記載するように、Ｇ−８断片が新たなＭＳＨレセプターサブタイプ、ＭＣ−２を単離するのに用いられている。したがって、他の２つの断片Ｇ−６およびＧ−１０を用いて、同種の実験を行うことが考えられる。
【００９６】
ＤＮＡ断片Ｇ−６およびＧ−１０は、２つの潜在的Ｇ−タンパク共役レセプターを表し、それらをコードする完全長コード断片を、たとえば実施例１に記載するのと同じ方法を用いて単離するのに用いることができる。
【００９７】
とくに、Ｇ−６およびＧ−１０が配列番号３および配列番号４に示すプライマーと実質的に相同であるため、Ｇ−６およびＧ−１０のうちのひとつまたは両方がＭＳＨレセプターと類似の起源を共有するペプチドのためのレセプター、すなわちたとえばＡＣＴＨレセプター、ｍｅｔ−エンケファリンレセプターおよびβ−エンドルフィンレセプターなどのＰＯＭＣ（プロオピオメラノコルチン）レセプターをコードするコード断片を表すと考えられる。とくに、Ｇ−６およびＧ−１０はκオピオイドレセプターとは非類似であるため、これらのうちのひとつまたは両方がμ、δおよびσオピオイドレセプターであると考えられる。
【００９８】
しかしながら、Ｇ−６およびＧ−１０は、各々細胞内セグメント５において始まっている独自な配列特徴、すなわちアミノ酸「Ｌ−Ｙ−Ｖ／Ｉ−Ｈ−Ｍ」を有している。Ｇ−６およびＧ−１０のうちのひとつまたは両方が新しいクラスのペプチドホルモンレセプター、たとえばコルチコトロピン放出ホルモンレセプター、成長ホルモン放出ホルモンレセプター、ゴナドトロピン放出ホルモンレセプター、サイロトロピン放出ホルモンレセプター、黄体形成ホルモン放出ホルモンレセプター、卵胞刺激ホルモン放出ホルモンレセプター、絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンレセプターおよび／またはグルカゴンレセプターなどのためのレセプターをコードするＤＮＡ配列の部分を表すことが考えられる。
【００９９】
しかしながら、Ｇ−６およびＧ−１０もまた、短い細胞外ループを有する。このことは、これらの断片によってコードされるレセプターが、小ペプチドホルモンタイプのＧ−タンパク共役レセプターを構成することを示す。したがって、Ｇ−６およびＧ−１０のうちのひとつまたは両方がニューロペプチドＹレセプタ−、腫瘍壊死因子レセプター、コロニー刺激因子レセプター、インターロイキン１レセプター、ニューロテンレセプター、心房性ナトリウム利尿因子レセプター、カリジン（ｋａｌｌｉｄｉｎ）レセプター、バルボガストリン（ｂｕｌｂｏｇａｓｔｒｉｎ）レセプター、モチリン（ｍｏｔｉｌｉｎ）レセプター、膵臓ポリペプチドレセプター、嗅受容器サブタイプ、精子フェロモンレセプターサブタイプ、インシュリン様成長因子レセプター、味受容器サブタイプ、ガストドシン（ｇｕｓｔｕｄｕｃｉｎ）共役レセプターサブタイプ、インヒビン（ｉｎｈｉｂｉｎ）レセプターサブタイプおよび／またはキョートロピンレセプターを表しているかもしれない。
【０１００】
Ｇ−６およびＧ−１０は、他の既知のＧ−タンパク共役レセプターをコードするヌクレオチド断片とは非類似であり、後者にはアミンに対するよく特徴付けされたレセプターが実質量含まれており、これらのことは、前記に反して、Ｇ−６およびＧ−１０のうちのひとつまたは両方が、脂質に対するレセプター、すなわちより詳しくはプロスタグランジンＥ１レセプター、プロスタグランジンＥ２レセプター、プロスタグランジンＦ２ａレセプターなどのプロスタノイドに対するレセプター、またはたとえばＰＧＩ２レセプターなどのプロスタサイクリンに対するレセプター、および／またはたとえばロイコトリエンＤ４レセプターおよび／またはロイコトリエンＣ４レセプターなどのロイコトリエンに対するレセプターなど、ならびに／またはたとえばホスファチジン酸レセプターおよび／またはトロンボキサンＡ２レセプターおよび／または血小板活性化因子レセプターなどの非脂質に対するレセプターに対する遺伝子をコードしていることを示しているのかもしれない。
【０１０１】
またそれに反して、Ｇ−タンパク共役レセプターであるＧ−６およびＧ−１０の一般的な特徴付けによると、Ｇ−６およびＧ−１０のうちのひとつまたは両方が、サブスタンスＰレセプター、サブスタンスＫレセプター、エンドセリンレセプター、アンジオテンシンレセプター、ケモアトラクタント（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）ペプチドレセプター、ボンベシンレセプター、オキシトシンレセプター、バソプレッシンレセプター、抗利尿ホルモンレセプター、ガストリンレセプター、コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）レセプター、カナビノイド（ｃａｎａｂｉｎｏｉｄ）レセプター、卵胞刺激ホルモンレセプター、黄体形成ホルモンレセプター、成長ホルモンレセプター、サイロトロピンレセプター、カルシトニンレセプター、カルシトニン遺伝子関連ペプチドレセプターおよび／または副甲状腺ホルモンレセプターのサブタイプに対する遺伝子をコードしていると考えられる。
【０１０２】
本発明のＤＮＡ断片の知識（または類似体もしくはＲＮＡ断片の知識）にもとづき、記載された本発明のＤＮＡ断片は、核酸分解酵素に対する抵抗性を改善するため、または細胞膜通過輸送性を改善するためにひとつまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含有して作ることができる。
【０１０３】
組換えＤＮＡ技術を用いて、適当なポリペプチドを製造することができる。さらに詳しくは、ポリペプチドは、本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列を担っている生物を、該ＤＮＡ断片が発現されるような条件の下で培養または育て、続いてその発現されたポリペプチドを前記生物から回収することからなる方法により製造することができる。
【０１０４】
そのようなポリペプチドの製造のために用いることのできる生物は、たとえば動物のような高等な生物、またはたとえば微生物のような下等な生物である。用いる生物のタイプにかかわらず、本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列（前記）は、直接か、または適当なベクターの助けを借りるかのいずれかにより生物に導入されるべきである。そうする代わりに、本発明のＤＮＡ断片を直接か、または発現ベクターの助けを借りるかのいずれかにより導入することにより、ポリペプチドを哺乳動物細胞系において製造することもできる。
【０１０５】
本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列は、適当な安定な発現べクターにおいてクローン化したのち、適当な細胞系に入れることもできる。つぎに、用いているベクターおよび細胞系に適する条件を用いて、所望のポリペプチドを発現している細胞を選択する。ついで、選択された細胞をさらに増殖させ、所望のポリペプチドの非常に重要な、連続的ソースを形成する。
【０１０６】
本発明のポリペプチドは、本発明のＤＮＡ断片に相補的なＲＮＡのインビトロでの翻訳によって作ることもできる。これは、フリーの形態で、またはひとつまたは複数のタンパク質の融合において、全分子または分子の一部分もしくは複数の部分に対して行うことが可能である。用いることのできる方法は記載されている（サムロックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）１９８９；スピリンら（Ｓｐｉｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９８８）。本発明のポリペプチドは、融合されたまたは融合されていない形態で、機能的なタンパク質としてインビトロでも発現されることが可能である（ゾズーヤら（Ｚｏｚｕｌｙａ　ｅｔ　ａｌ．）１９９０）。
【０１０７】
前記に一致して、本発明は、本発明のＭＳＨレセプターポリペプチドまたはここで定義する融合ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ挿入物を含むベクターに関する。ひとつのとくに重要な実施態様において、本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列またはここで定義される本発明の融合ＤＮＡ断片は、宿主生物または細胞系中で複製されることが可能な複製可能発現ベクターによって運搬されうる。
【０１０８】
ベクターは、とくにプラスミド、ファージ、コスミド、ミニクロモソームまたはウイルスであってよい。本発明の興味深い実施態様において、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞ゲノムに統合されるベクターであってよい。
【０１０９】
本発明の重要な側面として、本発明のＤＮＡ断片を担っており、これを発現することの可能な生物も含まれる。ここではそのようなプラスミドベクターが構築されており、これをｐＥ−１１Ｄと呼ぶ。このベクターは、本発明のまた別の側面を構成する。
【０１１０】
また、本発明は、本発明のＤＮＡ断片を担っており、これを複製することの可能な生物にも関する。そのようなｐＢ−１１Ｄと称するプラスミドベクターが構築され、本発明の一部を構成する。このベクターは、ブダペスト条約の手続および条件にしたがい、ドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に１９９２年８月２４日にＤＳＭ７２１４の番号の下、寄託された。
【０１１１】
さらに、また別の、本発明のＤＮＡを複製することができる、ｐＢ−ＭＣ−２と称するプラスミドベクターが構築されている。したがって、ｐＢ−ＭＣ−２は本発明の別の非常に重要な側面を構成する。ｐＢ−ＭＣ−２の構築は、実施例６に詳しく記載する。
【０１１２】
さらに、また別の、これも本発明の非常に重要な実施態様であるｐＥ−ＭＣ−２と称するプラスミドベクターが構築されている。ｐＥ−ＭＣ−２プラスミドベクターは、本発明のＭＣ−２レセプターを発現することができる。ｐＥ−ＭＣ−２の構築は実施例７に詳しく記載し、ＭＣ−２レセプターの発現のためのｐＥ−ＭＣ−２の使用は、実施例８に例をあげて説明する。このベクターは、ブダペスト条約の手続および条件にしたがい、ドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオルガニスメンに１９９３年８月９日にＤＳＭ８４４０の番号の下、寄託された。
【０１１３】
本発明のペプチドの製造という、本発明のこの側面において用いることのできる生物には、細菌、酵母、原生動物などの微生物である細胞、もしくはかび、昆虫、植物、哺乳動物などの多細胞生物由来の細胞が含まれ、あるいはそれは細胞系であってもよい。もしその生物が細菌であるばあい、その細菌は、好ましくはたとえばバチルス・サブチリス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス属、たとえば大腸菌などのエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはサルモネラ属である。
【０１１４】
もし、高等生物が用いられるばあい、ポリペプチドの製造にはトランスジェニックの技術を用いうる。適当な動物の例としては、ヒツジ、ウシ、ブタなどがあげられる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、その動物が生来発現しているポリペプチド、たとえば牛乳タンパクなどのポリペプチドとともに発現される。ついで、結果として生じる融合タンパク質は、本発明のポリペプチドをえるために、翻訳後修飾に付すことができる。
【０１１５】
本発明の別の側面において、ＭＳＨレセプターをコードするＤＮＡから自然にＭＳＨレセプターを発現することが見つけられた適当な細胞タイプから、ＭＳＨレセプターをえることができる。そのような細胞は、たとえばＷＭ　２６６−４細胞として実施例３に示すようなメラノーマ細胞系であってもよいが、それらは本発明のＤＮＡ断片を発現する細胞を含むいかなる組織からもえることができる。
【０１１６】
ＭＳＨ結合特性を有する本発明のポリペプチドを産生することができる、安定な細胞系が確立された。その細胞系のＣＯＳ−７細胞は、別の本発明の重要な側面を構成する。その細胞系は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片を含有しており、以下に記載する結合特性と実質的に同一の結合特性を有するポリペプチドを安定に産生する。この安定な細胞系の作製については、実施例５において詳しく記載する。
【０１１７】
したがって、本発明はＮＤＰ−ＭＳＨに任意に高親和性にて結合する本発明のポリペプチドを産生する安定な細胞系にも関する。そのような細胞系の確立は、実施例５に記載の技術にしたがって、または当業者の知る他の方法により行うことができる。
【０１１８】
本発明の特定の側面において、本発明のＤＮＡ断片は、融合ポリペプチドを製造する目的をもって、本発明のポリペプチドまたはその類似体もしくは部分配列をコードする本発明のＤＮＡ断片またはその類似体に対してフレームにおいて融合された、本発明のポリペプチドとは異なるまたは同一のひとつまたは複数のポリペプチドをコードしている、ひとつまたは複数の第２のヌクレオチド配列を含んでなってもよい。そのようなポリペプチドは、本発明のまた別の興味深い側面を構成する。組換えＤＮＡ技術を用いるときは、融合されたＤＮＡ配列を適当なベクターまたはゲノムに挿入することができる。そうする代わりに、ヌクレオチド配列のひとつを、すでに他のヌクレオチド（類）を含有しているベクターまたはゲノムに挿入する。融合ポリペプチドは、また、ヌクレオチド配列を別々に挿入して発現を行わせることにより作ることもできる。真核細胞または原核細胞起源でありうる宿主生物は、融合配列が発現されるのを保証する条件下で育てられる。つぎに融合ポリペプチドを精製し、適当な方法を用いて本発明のポリペプチドをその融合のパートナーから分離する。融合ポリペプチドは、本発明の特定の実施態様においても、ＭＳＨまたはその類似体と結合する能力を依然として有している。
【０１１９】
本発明のポリペプチドが融合する第２ポリペプチドは、本発明の特定の実施態様において、ジフテリアトキシン、スタフィロコッカスタンパク、リシントキシン、シュウドモナスエンドトキシン、アブリンまたはかびのリボソーム不活性化タンパク（ＲＩＰ）をコードするＤＮＡ断片であってよい。本発明の他の実施態様において、第２ＤＮＡ断片はメラノトロピックホルモンレセプター、ＭＳＨレセプターまたはＡＣＴＨレセプターであってよい。
【０１２０】
本発明の他のポリペプチドだけでなく、本発明の融合ポリペプチドも修飾されてよい。たとえば、グリコシル化されても、炭水化物もしくは脂質部分と連結していても、固体支持体と結合したパルミトイル・アンカーまたはその一部を含んでいても、および検出可能な標識を備えていてもよい。
【０１２１】
本発明はまた、実質的に純粋な形態の本発明のポリペプチドおよびそのポリペプチドを製造する方法にも関する。本発明のポリペプチドの製造方法は、以下の工程を含んでなる：
（ａ）本発明のＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入すること、
（ｂ）工程（ａ）で作ったベクターで、適当な宿主生物を形質転換すること、
（ｃ）ポリペプチドの発現に適した条件下で工程（ｂ）で作った宿主生物を培養すること、
（ｄ）ポリペプチドを採取すること、および
（ｅ）任意にそのポリペプチドを翻訳後修飾に付すこと。
【０１２２】
本発明のポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡ断片またはその類似体もしくは部分配列は、発現のためにベクターまたは生物に挿入される前または後に修飾しうる。ポリペプチド産生物もまた修飾に付されうる。修飾はＤＮＡおよびポリペプチド中それぞれに、ひとつまたは複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加、挿入、削除または再配列を含んでいてよい。「置換」という語では、本発明のＤＮＡ断片またはポリペプチド中のひとつまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を置き換えることを意味することを意図している。「付加」という語は、本発明のＤＮＡ断片／ポリペプチドまたはそれらの一部の、いずれかの端での、ひとつまたは複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の追加を意味する。挿入では、本発明のＤＮＡ断片もしくはポリペプチドまたはそれらの一部への、ひとつまたは複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の導入を意味することを意図している。削除では、本発明のＤＮＡ断片もしくはポリペプチドまたはそれらの一部からの、ひとつまたは複数のヌクレオチドおよびアミノ酸を取り去ることを意味することを意図している。再配列は、ＤＮＡまたはポリペプチド配列、それぞれにおいて、ひとつまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸が交換されていることを意味することを意図している。しかしながら、ＤＮＡ断片は、生物への挿入の前または後に、突然変異生成によって修飾されてもよい。本発明のＤＮＡまたはタンパク質の配列は、そのいかなる生理学的、生化学的もしくは生物学的特性も、またはそのような特性（ひとつおよび／またはすべて）の一部、またはそのような特性（ひとつおよび／またはすべて）のすべてを失うことのないような方法で修飾されてよい。
【０１２３】
前記のように製造されたポリペプチドを、熱処理、化学処理（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）または酵素処理（ペプチダーゼ、プロテイナーゼおよびタンパク修飾酵素）などの翻訳後修飾に付してもよい。ポリペプチドは生物中で産生されるとき、それの自然の産生環境に比べて異なるやり方で加工（ｐｒｏｃｅｓｓ）されてよい。問題の宿主生物によって行われる加工する特徴の除去または変更は、有利であるかもしれないし、有利でないかもしれない。
【０１２４】
本発明のポリペプチドを細菌などの原核生物中で製造するとき、この方法で作られたペプチドは、しばしば微生物の内側で不溶性の非機能性の含有体として見つけられるという事実のため、有用な翻訳後修飾は、固有（ｎａｔｉｖｅ）の機能的な形態のペプチドをえるためにペプチドを再び折りたたんでいる（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）であろう。そのような含有体のそのようなペプチドのリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）は、伝統的には、ポリペプチドを変性し、その後徐々に連続的に再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）することにより再び折りたたまれる。
【０１２５】
「切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」ポリペプチドという語は、結局は結果としてたとえば溶解性などのポリペプチドの特性が変化するような、ひとつまたは複数のアミノ酸の削除されたポリペプチドを指す。さらなる意味において、「切断された」ポリペプチドという語は、すべて１つのポリペプチド由来の、または該ポリペプチドをコードするひとつ（または複数）のコード断片から発現された、ポリペプチドの混合物を指す。
【０１２６】
生物または細胞系におけるポリペプチドの本発明にしたがった発現に続いて、ポリペプチドはそのまま用いることもできるし、またはまず生物または細胞系から精製することもできる。もしポリペプチドが分泌産生物として発現されるばあい、それは直接精製することができる。もしポリペプチドが連合産生物（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ）として発現されるばあい、精製の前に宿主の部分的または完全な破壊が必要であろう。ポリペプチドの精製のために用いられる方法の例としては、（ｉ）抗体を用いた免疫沈降またはアフィニティークロマトグラフィー、（ｉｉ）適当なリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィー、（ｉｉｉ）ゲル濾過、イオン交換もしくは高速液体クロマトグラフィーまたは前記のいずれかの誘導手順などのその他のクロマトグラフィー手順、（ｉｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動および等電点電気泳動のような電気泳動手順、（ｖ）その他あらゆる特定の溶解化および／または精製技術、があげられる。
【０１２７】
また、本発明のポリペプチドの調製は、ポリペプチド配列の個々のアミノ酸を連続的に連結するのに用いられる、よく知られた液相または固相ペプチド合成方法によって行ってもよい。そうする代わりに、ポリペプチドは個々のアミノ酸の連結によりポリペプチド配列の断片を作り、これをそのあとで、結果として所望のポリペプチドができるように連結することによっても合成することができる。したがって、これらの方法は、本発明のまた別の興味深い側面を構成する。
【０１２８】
非常に重要で、したがって本発明の重要な側面を構成するのは、ＭＳＨレセプターによって発揮される活性を調整する種々の方法である。先に詳しく記載したこの活性は、ＭＳＨレセプターに関連した種々の疾病状態およびその他の種々の生物学的機能に対して重要なかかわりを有しうる。したがって、ＭＳＨレセプターの種々の分子との結合を妨害したり刺激したりするための方法は、本発明の重要な側面である。
【０１２９】
本発明のそのような側面のひとつは、リガンドを、通常はＧ−タンパクと相互作用するレセプターのエピトープ、とくに細胞外ループおよび／または膜貫通配列および／または細胞質ループおよび／またはＣ−末端配列のうちのひとつまたは複数、と結合させることによって、Ｇ−タンパクとレセプターとの間の共役を阻害または刺激する方法を用いることを含んでなる、前記のＭＳＨレセプターのそのグアニンヌクレオチド結合タンパクへの連結を妨害または刺激する方法に関する。したがって、ひとつの側面においてこの方法は、配列番号１６に示すアミノ酸配列またはその、細胞外ループおよび／または膜貫通配列および／または細胞質ループおよび／またはＣ−末端配列またはそれらの組合せのうちのひとつまたは複数をコードするいずれかの部分配列を含んでなる部分配列、を有するポリペプチドと結合することが前もって分かっている物質を動物とくにヒトに投与することを含んでなる。
【０１３０】
このコンテクストにおいて「リガンド」は、天然または合成の、不可逆でもよいが好ましくは可逆的な方法でＭＳＨレセプターに結合するであろう物質を指す。
【０１３１】
本発明の別の、ＭＳＨもしくは類似ペプチドまたはＧ−タンパクの前記のＭＳＨレセプターへの結合を妨害するまたは刺激するための方法は、アゴニスト、アンタゴニスト、ブロッカーまたはＭＳＨと類似の構造を有するＭＳＨ誘導体などの物質を用いてＭＳＨレセプターの結合部位を占領するように、配列番号１６に示すアミノ酸配列またはその、細胞外ループおよび／または膜貫通配列および／または細胞質ループおよび／またはＣ−末端配列またはそれらの組合せのうちのひとつまたは複数をコードするいずれかの部分配列を含んでなるその類似体もしくは部分配列、を有するポリペプチドと結合することが前もって分かっている物質を動物とくにヒトに投与すること、任意にそれによってセカンドメッセンジャー要素の生成を妨害または刺激することを含んでなる。その物質は、レセプターまたはその一部に結合しうるペプチド、有機化合物または抗体などの合成リガンドであってよい。抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体であってもよい。
【０１３２】
ＭＳＨレセプターの結合親和性を減少または増加させる方法は、本発明の興味深い側面であり、アロステリック調節の使用によりえることができる。さらに、本発明のＭＳＨレセプターのそのグアニンヌクレオチド結合タンパクへの共役を妨害するひとつの方法は、ＭＳＨレセプターの産生を減少させることである。これは、アンチセンスオリゴ療法によってえられる。この療法では、本発明のポリペプチドまたはその類似体に対応するｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ断片が、ヒト細胞におけるポリペプチドの翻訳を阻止するのに、さらにはＭＳＨレセプターポリペプチドの合成の阻害するのに有効であろう。
【０１３３】
ＭＳＨレセプターの産生を増加させる方法は、レセプター・アップレギュレイションであろう。また、セカンドメッセンジャー要素の生成を減少または増加させるおよび／またはＭＳＨレセプターの産生を増加させるおよび／または任意にＭＳＨのＭＳＨレセプターへの結合親和性を増加または減少させる方法は、本発明の一部である。その方法は、配列番号１６に示すアミノ酸配列またはその、細胞外ループおよび／または膜貫通配列および／または細胞質ループおよび／またはＣ−末端配列またはそれらの組合せのうちのひとつまたは複数をコードするいずれかの部分配列を含んでなるその類似体もしくは部分配列、を有するポリペプチドと結合する物質と結合するまたはするようになることが前もって分かっている物質である医薬を動物とくにヒトに投与することを含んでなる。
【０１３４】
先に示したような物質は、以下に記載する、ＭＳＨレセプターによって発揮される効果を妨害または刺激することができる物質の同定のための方法を用いることにより選択することができるであろう。
【０１３５】
ＭＳＨレセプターの内在化（ホルモンと結合できないようにする）のための方法は、本発明の別の側面を構成する。その方法は、配列番号１６に示すアミノ酸配列またはその、細胞外ループおよび／または膜貫通配列および／または細胞質ループおよび／またはＣ−末端配列またはそれらの組合せのうちのひとつまたは複数をコードするいずれかの部分配列を含んでなるその部分配列、を有するポリペプチドと結合することが前もって分かっている物質、たとえばある物質またはＭＳＨの修飾された形態であって、ホルモンによって活性化される正常なプロセスを始めることができるまたはできないのどちらであっても、レセプターの内在化を起すような物質を用いることを含んでなる。この方法もＭＳＨレセプターにより発揮される効果を調整するのに用いうる。
【０１３６】
放射性リガンド結合技術ならびに発現されたＭＳＨレセプタータンパクおよびペプチドを用いることにより、ＭＳＨレセプターに対する物質（リガンド）の結合親和性を測定することができる。そのような測定は、ＭＳＨレセプターに対する潜在的な活性を有する新規な薬物（合成または天然）のスクリーニングにおいて、典型的に行われる。薬物理学の見地から、そのような薬物は、ＭＳＨレセプターでアゴニスト、部分アゴニストとしてまたはアンタゴニストとして作用しうる。そのような物質のすべてのタイプを本発明の方法を用いてテストすることができる。ＭＳＨレセプター（またはＭＳＨレセプター誘導体）を有する生物または細胞を破壊することを目的として、ＭＳＨレセプター（またはその誘導体）に作用する物質／リガンドを有毒剤（毒物、放射性核種）と連結させることもできる。
【０１３７】
本発明の非常に重要な側面は、哺乳動物細胞などの細胞中、とくにヒト細胞中で、セカンドメッセンジャー要素の生成などのＭＳＨレセプターによって発揮される効果を妨害または刺激するために用いうる物質を同定する方法に関する。ＭＳＨのＭＳＨレセプターへの結合を阻害するのは、これを行うためのひとつの方法である。したがって、ＭＳＨレセプターへ結合することができる物質を同定するための方法は、本発明の非常に重要な側面である。この方法には、問題の物質の、ＭＳＨのＭＳＨレセプターへの結合と競合する能力を評価する種々の方法が含まれる。その物質は、ＭＳＨレセプター上のＭＳＨ結合部位をブロックすることによりこの結合を妨げうる。その結果ＭＳＨのＭＳＨレセプターへの結合によって発揮される効果をブロックすることになる。他の実施態様において、その物質は、任意に（ＭＳＨにくらべて）増加したＭＳＨレセプターに対する結合能力を有し、さらにＭＳＨレセプターにより発揮される効果を活性化することができる物質であってよい。
【０１３８】
本発明のこの側面のひとつの実施態様は、実施例３に記載のようにしてえられるＭＳＨレセプタータンパクまたはその類似体を、テスト物質とともに放射性標識されたＭＳＨまたはＭＳＨ類似体と、インキュベートすることである。テスト物質の結合活性によって、ＭＳＨレセプターと結合を形成する標識されたＭＳＨまたはＭＳＨ類似体の量は変化するであろう。ＭＳＨレセプターに対して高い結合親和性を有するテスト物質は、結合親和性の低いテスト物質よりも低い濃度で、標識されたＭＳＨまたはＭＳＨ類似体の結合を排斥するであろう。標識されたＭＳＨまたはＭＳＨ類似体の、結合しているものと遊離のものとの分離は、濾過、遠心、スーパーフロー（ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）またはクロマトグラフィーなどの技術によって行う。レセプター上に保持されている、またはレセプターから分離された溶液中に存在するどちらかの放射活性の測定は、標準核計測（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を用いて行う。本発明のこの実施態様の別の変形において、レセプターに結合している、またはレセプターから分離されて溶液中に存在しているＭＳＨまたはＭＳＨ類似体の量は、ＭＳＨまたはＭＳＨ類似体を検出しうる他のいずれかの適当な検出システムを用いて検出する。そのような検出システムの例としては、ラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫溶媒測定法）などの免疫測定法、免疫蛍光測定法、紫外線吸収スペクトル法または蛍光放射スペクトル法などがあげられる。
【０１３９】
本発明のこの側面の別の実施態様において、ＭＳＨレセプターへのテスト物質の結合量は、テスト物質のＭＳＨレセプターへの結合によって起きたＧ−タンパクとのＭＳＨレセプターの相互作用の程度における変化を測定することにより間接的にかつ／またはおよそ見積もられる。そのようなテストシステムの変形において、テスト物質の効果は単独で調べられる。そのような測定法の別の変形において、テスト物質のＭＳＨまたはＭＳＨ類似体に対して競合する能力は、テスト物質とＭＳＨまたはＭＳＨ類似体を同時に添加することにより調べられる。テスト物質、ＭＳＨまたはＭＳＨ類似体により引き起こされるＭＳＨレセプターによるＧ−タンパクの活性化の程度は、たとえば以前に記載された方法（アクトリーズ（Ａｋｔｏｒｉｅｓ）およびヤコブズ（Ｊａｋｏｂｓ）１９８１；べーコンら（Ｖａｃｈｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９８６）を用いて系のＧＴＰアーゼ活性を測定することにより、または他の適当な方法を用いることにより直接的に測定することができる。そうする代わりに、ひとつ（または複数）のリガンドとＭＳＨレセプターとの１次的相互作用に続いて変化しうる他の生化学的、または生理学的パラメーターを測定することで、系の活性化の程度を間接的に測定することができよう。このコンテクストにおいて測定可能な実体としての例としては、アデニレートシクラーゼ活性、ｃＡＭＰレベル、皮膚の色素沈着、チロシナーゼ活性および［３５Ｓ］メチオニン取り込みがあげられる（バーチルら（Ｂｕｒｃｈｉｌｌ
ｅｔ　ａｌ．）１９９０）。
【０１４０】
本発明のまた別の実施態様において、これはリガンドが大きな分子であるばあい、たとえば抗体であるようなばあいにとくに有用なのであるが、レセプターへのリガンドの結合の検出は他のアプローチを用いることによって行いうる。この実施態様のひとつの変形では、リガンドを実質的に純粋なＭＳＨレセプターまたはその類似体の標品とともにインキュベートする。後者は適当な分子に付加されており、そのことにより、ＭＳＨレセプターの結合しているものと遊離のものとを分離したのち、たとえば核計測、色彩、蛍光または酵素活性などによってＭＳＨレセプターリガンド複合体の検出が可能となる。ＭＳＨレセプターの結合しているリガンドと遊離のリガンドとの分離は、たとえば、リガンドに対して作られた第２抗体を添加し、それによりリガンド−レセプター複合体を沈降させることによって行うことができる。本発明の他の変形では、実質的に純粋なＭＳＨレセプターの標品を固体支持体に付着させる。つぎにリガンドを固体レセプター（ｓｏｌｉｄｉｆｉｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とインキュベートして、そののち従来のＥＬＩＳＡを用いることによりまたはいずれかの類似の適当なアプローチを用いることによって、レセプターに結合したリガンドの量の検出を行うことができる。
【０１４１】
ここに記載するリガンドは、検出可能な標識を備えていてもよいと理解されるであろう。リガンド自身は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体などの大きな分子でありうるし、また、天然もしくは合成起源のＭＳＨレセプターに結合することのできる物質であろう。
【０１４２】
前記の、および類似のアプローチを用いて、レセプターリガンドによるＭＳＨレセプター（またはその誘導体）の結合をブロックすることのできる物質を同定することができる。このコンテクストにおいて、「ＭＳＨレセプター（またはその誘導体）をブロックする」という語は、ＭＳＨレセプター（またはその誘導体）が物質によって占領され、レセプターリガンドがＭＳＨレセプター（またはその誘導体）と結合できなくなるかまたはＭＳＨレセプターリガンドはＭＳＨレセプターと結合はできるがＭＳＨレセプターを活性化できなくなることを意味する。
【０１４３】
ＭＳＨレセプターに結合する物質の同定のための前記の方法に類似の方法は、他のメラノトロピックホルモンレセプターと結合する物質の同定にも用いることができると理解されるであろう。配列番号５および９に示すヌクレオチド配列を有する、配列番号６および１０に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、その他のメラノトロピックホルモンレセプターに由来しうるので、これらのメラノトロピックホルモンレセプターの結合特性は非常に重要でありうる。したがって、メラノトロピックホルモンレセプターに結合しうる物質の同定のための前記のような方法は、本発明の重要な側面である。
【０１４４】
もちろん、配列番号５、７および９に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片は、本発明の他のＤＮＡ断片と同じように修飾することができることに注目することも重要である。したがって、配列番号１および１５に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片の修飾に関する本明細書中のすべての開示は、配列番号５、７および９に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片の修飾に、同様にまたは必要な変更を加えて当てはめられる。また、配列番号５、７および９に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片は、配列番号１および１５に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片について本明細書中に記載したのと同様にして、用いることもできる。同じように、配列番号６、８および１０に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列番号１および１５に示すポリペプチドと同様にして修飾することができる。したがって、配列番号６、８および１０に示す配列を有するポリペプチドの修飾に関する本明細書中のすべての開示は、配列番号１および１５に示すポリペプチドの修飾に、同様にまたは必要な変更を加えて当てはめられる。また、本発明の側面として、配列番号６、８および１０に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列番号１および１５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドについて本明細書中に記載したのと同様にして用いることができる。
【０１４５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのような結合実験の結果にもとづいて、ＭＳＨレセプターと同定されている。一連のＰＯＭＣ（プロオピオメラノコルチン）由来のペプチドは、ＭＳＨレセプターのコード断片でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞への１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨの結合の阻害において、異なるポテンシーを示した。そのポテンシーの順番は、ＮＤＰ−ＭＳＨ（Ｋｉ＝２３±０．５ｐＭ）＞α−ＭＳＨ（Ｋｉ＝９２±１９ｐＭ）＞ＡＣＴＨ（１〜３９）（Ｋｉ＝１７０±３７ｐＭ）＞β−ＭＳＨ（Ｋｉ＝４４９±７４ｐＭ）＞γ−ＭＳＨ（Ｋｉ＝１０１０±２００ｐＭ）であった。ＡＣＴＨ（４〜１０）は、非常に低い結合親和性（Ｋｉ＝２２，４００±７２００ｐＭ）を示したが、一方非メラノトロピックＰＯＭＣペプチドβ−エンドルフィンは、発現されたＭＳＨレセプターに対して親和性を示さなかった。
【０１４６】
さらに、加えてＭＣ−２と呼ばれる配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが、そのような結合実験の結果にもとづいて、ＭＳＨレセプターおよび／またはＭＳＨレセプターサブタイプと同定されている。一連のＰＯＭＣ由来のペプチドは、ＭＣ−２レセプターのコード断片でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞への１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨの結合の阻害において、異なるポテンシーを示した：ＮＤＰ−ＭＳＨ（Ｋｉ＝５．１８±０．５４ｎＭ）＞α−ＭＳＨ（Ｋｉ＝９２８±３１４ｎＭ）＝ＡＣＴＨ（１〜３９）（Ｋｉ＝９２９±３８９ｎＭ）＞β−ＭＳＨ（Ｋｉ＝１．７５±０．６７μＭ）＞γ−ＭＳＨ（Ｋｉ＝３．４５±０．８８μＭ）。非メラノトロピックＰＯＭＣペプチドβ−エンドルフィンは、発現されたＭＣ−２レセプターに対して親和性を示さなかった。
【０１４７】
前記の結合実験は、動物のシステム全体、ヒトの臨床試験、組織標本、微生物および／または細胞、とくに前記レセプタータンパクまたはその類似体を発現している細胞系を用いて行うことができる。またそれは、本発明の精製されたタンパク質を用いても行うことができる。精製されたタンパク質は、可溶性の形態で、または適当なマトリックスに付着された固相で用いることができる。
【０１４８】
薬物は、本発明のポリペプチドの非常に特定の部分に作用するように設計することができる。薬物は、細胞外ループもしくは膜貫通セグメントのいずれかの領域のみ、またはそれらの範囲内に対して作用することができる。どちらのばあいにも、ＭＳＨレセプターまたはその誘導体への天然のリガンドの結合に影響を与えうるであろう。特定的な薬物は、細胞内ループの領域に対しても作ることができる。そのような薬物は、ＭＳＨレセプターまたはその誘導体とＧ−タンパクのような細胞内システムとの共役に影響を与えうるであろう。そのような薬物はまた、Ｇ−タンパクに影響を与えて、それらがＭＳＨレセプターまたはその誘導体と共役できないようにすることもできるであろう。
【０１４９】
本発明によって、ＭＳＨレセプターの関与する疾病状態のさまざまな治療法が提供される。これらの疾病には、メラノーマ、皮膚ガン、発熱状態、炎症状態、侵害状態、緊張状態、記憶障害状態、減少または増加した皮膚の黒ずみおよび／または色素沈着状態、てんかんなどのＭＳＨレセプターを発現する疫病状態が含まれる。本発明は、神経修復、筋肉再神経支配および／またはニューロン成長を増進させる方法も含む。
【０１５０】
中枢神経系に局在するため、ＭＣ−２レセプターはとくに、疼痛、発熱、緊張および記憶障害状態などの状態の治療に用いられる薬物の標的である。さらに、ＭＣ−２レセプターは末梢神経にも局在するため、それは抗炎症薬の興味深い標的である。ＭＣ−２レセプターは、疾病および／または毒物の影響および／または加齢および／またはニューロン損傷に伴うもしくはそれを引き起こす他の条件により損傷を受けたニューロンの成長および／または再生および／または修復を増進する薬物の興味深い標的でもある。さらに、筋肉の再神経支配を改善する能力があるため、ＭＣ−２レセプターは、筋肉の再神経支配障害を改善する能力を有するため、筋肉の再神経支配障害の状態の治療薬の興味深い標的でもある。さらに、中枢神経系に局在するため、ＭＣ−２レセプターは、てんかんの治療に用いられる薬剤の重要な標的でもある。
【０１５１】
したがって、本発明は、ＭＳＨレセプターに結合する物質の形で医薬を投与することを含んでなる、表面にＭＳＨレセプターを含有する細胞をその医薬でターゲティングする方法に関する。本発明の特定の実施態様では、その医薬は、抗体もしくはその一部などの物質に付着されるか、またはＭＳＨレセプターに親和性を有する天然もしくは合成起源の分子でありうる。その医薬は、放射性核種または毒物または他のあらゆる天然または合成起源の分子であってよい。医薬を結合させる物質として、モノクローナル抗体などの抗体を用いることは、本発明の重要な側面を含む。診断または治療の目的で、毒素または放射能をその抗体に付与することができるであろう。そのようなアプローチは、そのようなＭＳＨレセプター抗体の高い結合活性と特異性が期待されるため、ＭＳＨ毒物コンジュゲートよりも優れていることが期待される。さらに、ＭＳＨ毒物コンジュゲートは、それらの潜在的ホルモン活性のために不適当な効果を誘導するかもしれない。ＭＳＨレセプターがメラノーマ細胞に最も共通で最も特異的な成分であるため、ＭＳＨレセプターに対するモノクローナル抗体と結びつけられた毒素または放射線を用いることは、非常に魅力的なアプローチであることが示されるであろう。
【０１５２】
本発明のまた別の実施態様では、その物質は、レセプターまたはそのエピトープに結合し、任意に本出願に記載の方法論を用いることにより見いだされうる、天然もしくは合成起源の化合物、またはそのペプチドもしくは誘導体である。そのような物質は、とくにＭＳＨとの何らかの構造的類似性を有するまたはまったく構造的類似性のない合成および／または天然の化合物であってよい。そのような化合物は典型的には、適当に結合された側鎖を有する、ひとつまたは２つまたはそれより多くの芳香および／または非芳香環および／またはヘテロ環で構成されていてもよく、さらに複数の環構造を相互に連結する鎖を有していてもよい。そのような物質は、それらの構造においてかなりさまざまであり、そのような物質には、ＭＳＨレセプターの同一エピトープに結合するかまたは異なるエピトープに結合するかのどちらかであるという事実にもとづくいくつかの異なるクラスが存在する。これらの物質のいくつかは、ＭＳＨペプチドと、ＭＳＨレセプター上の同一の結合エピトープを部分的または完全に共有しているが、一方他の物質はＭＳＨレセプターの他のおよび／または部分的に他のエピトープに結合する。これらの物質のいくつかはＭＳＨの作用を模倣する能力を有し、レセプターに結合すると細胞および／または器官および／または組織中にＭＳＨがＭＳＨレセプターに結合するときと同じ効果を起こす。他の物質は反対に、ＭＳＨレセプターに結合することによりＭＳＨのレセプターに対する作用を妨げる能力を有する。
【０１５３】
本発明の非常に重要な側面では、その脂溶性の形態のＭＳＨレセプターを動物に投与することによって、動物、とくにヒトの治療に用いうる。
【０１５４】
また、本発明の非常に重要な側面では、ＭＳＨレセプター欠乏またはＭＳＨレセプター機能障害によって動物、とくにヒトにおいて起こる状態を、活性形のＭＳＨレセプターをコードするＤＮＡ断片を導入することにより治療しうる。そのような本発明によって治療しうるひとつの状態は、チロシナーゼ陽性アルビニズムである。
【０１５５】
前に述べたように、内因性および外因性のメラノトロピンは、インビボでヒトの皮膚色素沈着を促進することが示唆されている（レビン（Ｌｅｖｉｎｅ）１９９１；ミュリガンら（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９８２；ラーナーら（Ｌｅｒｅｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）１９６１）。日光に当たることなく黒ずみを起こす治療は、まずく黒ずみ容易にサンバーンを起こしてしまう人には有用であろう。皮膚中でのメラニンの増加は、これらの人々を紫外線から防御し、したがって皮膚ガンの危険性を低くする。
【０１５６】
ＭＳＨおよび他のメラノトロピンの使用は、有害な過剰日光射照を受けることなく皮膚を黒くすることのできる、効果的で安全な手段であろう。さらに、結果として増加した皮膚色素沈着は、のちの日光暴露の効用に対する保護を提供するかもしれない。チロシナーゼ陽性アルビニズムを有する患者では、メラニンを形成する分子機構は存在するが、機能が完全でない（キングら（Ｋｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）１９８８）。おそらく、これらの患者においてメラノトロピンは、ＭＳＨレセプターに作用することでチロシナーゼを刺激し、その結果色素沈着を増大することができるであろう。これにより、これらの人々に彼らの外観の改善および社会的受け入れの改善だけでなく紫外線からの防御を提供しうる。
【０１５７】
このコンテクストにおいて、メラノトロピンはＭＳＨレセプターのエピトープと結合し、それによって、たとえばＭＳＨと同種の皮膚黒ずみ効果またはいかなる他のＭＳＨの効果と類似する望ましい効果を誘導する物質であることが意図される。そのような物質は、本出願に記載した方法論を用いて見いだすことができ、とくに、ＭＳＨと何らかの構造上の類似性を有するかまたはＭＳＨとはまったく構造上の類似性のない合成物質であってよい。
【０１５８】
また、本発明は、ＭＳＨレセプターにより活性である物質を用いることを含んでなる、動物、とくにヒトにおいて皮膚中のメラニン含有量を増加させる方法に関する。それによって、日光に当たることなくまたはより少ない日光暴露で、皮膚の黒ずみをえることができるため、サンバーンを避けることが可能であろうし、これは既に記載したように最も望ましいことである。
【０１５９】
本発明のＭＳＨレセプターの検出は、本発明の種々の診断の側面において重要であり、組織中で通常見られるより高いＭＳＨレセプターの組織含有量を伴う種々の疾病状態の診断を容易にし、メラノーマや皮膚ガンなどのいくつかの疾病の予測を改善しうる。本発明のとりわけ重要な側面は、メラノーマまたは皮膚ガンなどのＭＳＨレセプター発現疾病において、さらなる治療のための予測および／または手引きを評価するにあたり、ＭＳＨレセプターの検出を用いることである。
【０１６０】
したがって、本発明は、ＭＳＨレセプターに結合する能力のある診断剤でＭＳＨレセプターを表面に含有する細胞を標的にすることを含んでなる、メラノーマまたは皮膚ガンなどのＭＳＨレセプター発現疾病状態の診断の方法に関する。ここで、診断剤はレセプターへの結合ののち、検出することができる。診断剤は、ＭＳＨレセプターに結合する物質と結合させて投与されてもよい。
【０１６１】
診断剤は、放射性物質であるかまたは放射性物質に連結されていてもよい。他の実施態様では、診断剤は、着色もしくは発色物質であるかまたは着色もしくは発色剤に連結されていてもよい。
【０１６２】
本発明の診断方法のひとつは、生物学的サンプルをＭＳＨレセプターに結合する物質で処理し、結合した物質の存在を検出または視覚化して、前記サンプル中のＭＳＨレセプターを検出することである。本発明のとくに興味深い実施態様では、その物質は抗体またはその一部である。抗体はＭＳＨレセプターの可能な異なる形態の間の違いを識別しうる抗体であってよい。抗体は放射性核種で標識されているか、ビオチン化されているか、または標識されずにあとで免疫染色によって検出されうる。本発明のこの部分に関して重要な方法は、ＥＬＩＳＡタイプの方法またはラジオイムノアッセイタイプの方法による、結合された抗体の検出および／または測定である。
【０１６３】
ここで用いられる「サンプル」または「生物学的サンプル」という語は、細胞、部分細胞画分（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）、細胞画分、組織サンプル、細胞培養物、または細胞懸濁液として定義される。
【０１６４】
前記と関連して、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその類似体もしくは部分配列に反応性のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体にも関する。抗体に関する本発明の種々の側面の詳細は、本発明の部分を構成しここに記載する。
【０１６５】
このコンテクストにおいて、抗体という語は抗体分子全体またはそのあらゆる断片と理解される。抗体は、産生の途中におよび／またはあとで断片化することができる。抗体は始めに断片化された形で作り、そのまま用いることも異なる断片とあわせて用いることもできる。
【０１６６】
本発明のポリペプチドへの抗体の調製のために用いる動物は、好ましくはウサギ、サル、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ブタ、ウマおよびモルモットよりなる群より選ばれる。抗体産生細胞は、脾臓細胞または末梢血リンパ球でありうる。
【０１６７】
抗体またはその断片は、単一特異性の（ポリクローナルな）種類であってよい。単一特異性抗体は、適当な動物に本発明のポリペプチドの実質的に純粋な標品を注射することによって調製しうる。これのあと初回の採血の前に、１回または適当な間隔の複数回のブースター注射をすることができる。それぞれの免疫化から約５から７日後に、動物の採血を行う。抗体は、任意に標準抗体精製技術を用いることにより、血清から単離しうる（サムロックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ
ａｌ．）１９８９）。
【０１６８】
配列番号２の配列を用いて、それぞれ配列番号２のアミノ酸４から１９および２５から３５と同一のアミノ酸配列を有する２つのペプチドを化学的に合成することにより、ポリクローナル抗体を調製した。
【０１６９】
これらの２つのペプチドを、（別々に）チログロブリンと連結し、フロイントのアジュバント中別々にウサギに注射した。４回のブースター注射ののち、両方のコンジュゲートとも、ウサギに、ＭＳＨレセプター含有細胞に対して高度に反応性である血清の形成を誘導したことがわかった。抗ＭＳＨウサギ血清の製造の詳細は、実施例１０に示す。
【０１７０】
モノクローナル抗体またはその断片は、ＭＳＨレセプターの必須の成分、すなわちエピトープに対して作られうる。ハイブリドーマ細胞系をもちいることにより、またはそのクローンもしくはサブクローンによりまたは該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系からの遺伝情報を担っている細胞によって、通常の技術（ケーラーら（Ｋｏｅｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）１９７５）を用いてモノクローナル抗体を製造しうる。該モノクローナル抗体を産生する細胞を適当な細胞系と融合させ、えられた該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞をクローニングすることにより、モノクローナル抗体を製造することができる。そうする代わりに、該モノクローナル抗体を産生する非融合細胞系を不滅化することによって製造しうる。モノクローナル抗体は、最終的に細胞成長培地から採取される。モノクローナル抗体を作るのに用いるハイブリドーマ細胞は、インビトロでまたは動物の体腔で増殖させうる。モノクローナル抗体またはその断片は、組換えＤＮＡ技術を用いて作ることもできる（ヒューズら（Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ．）１９８９）。
【０１７１】
モノクローナル抗体は、適当な動物をＭＳＨレセプタータンパクの未精製の標品で免疫することによっても作りうる。えられたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマクローンを、たとえば実施例３に記載のアプローチを用いて、そのＭＳＨまたはその類似体のＭＳＨレセプター対する結合をブロックする能力についてスクリーニングすることができる。
【０１７２】
抗体のイデオタイプ（抗原結合）構造は、抗原性があり、したがってそのイデオタイプ構造に対して作られる特異的な抗体を生じさせることが可能である。イデオタイプ構造に対して作られる抗体は、抗イデオタイプ抗体と呼ばれる。そのような抗体は、もとの抗原の構造を模倣しうるので、もとの抗原のように機能しうる。そのような抗体は、本発明のもとのポリペプチドの機能、利用可能性および特性の一部または全部のために、もとの抗原（ＭＳＨレセプタータンパク、ポリペプチドまたはそれらの類似体）と置き換わりうる。
【０１７３】
好ましくは、ほとんどのばあいにモノクローナル抗体またはその断片が用いられるであろうが、ポリクローナル抗体またはその断片も用いうる。ＭＳＨレセプター抗体の典型的用途は以下のとおりである：
タンパク質の精製用：抗体は、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降技術を用いて、生物学的サンプルからえられたＭＳＨレセプターまたはその誘導体を精製するのに用いることができる。
【０１７４】
診断および治療用：ＭＳＨレセプターまたはその誘導体に対するモノクローナル抗体は、動物およびヒトにおける疾病状態の診断および治療に用いることができる。診断および治療用抗体は、一般にメラノーマとして記載される皮膚ガンのような、皮膚の障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）のために有用でありうる。ＭＳＨレセプターがメラノーマ組織に一貫して見いだされるという知見はこの考えを支持する。診断剤は本発明のポリペプチドに対する特異性を有する抗体でありうる。抗体は、他のタンパク質または固体支持体と連結することができ、および／または凝集反応テストもしくは発色テストに用いることができる。そのような抗体は、標準組織化学または免疫化学技術を用いて、生物学的サンプル中のＭＳＨレセプターまたはその誘導体を定量するのに用いることもできる。
【０１７５】
毒物療法用：特異的なモノクローナル抗体は、リシンまたはジフテリアトキシンのような異なる毒物と連結することができる。標的とされた細胞毒性を有するハイブリッドタンパクを組み立てるため、一般に、植物毒のリシンのＡ鎖またはジフテリアトキシンのＡ鎖がモノクローナル抗体に結合される。また、用いられる毒物は、代わりにシュードモナスエンドトキシン、アブリンまたはカビの（ｆｕｎｇａｌ）リボソーム不活性化タンパク（ＲＩＰ）から選びうる。このコンテクストにおいて、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体と毒物部分との間のハイブリッドは、生物中のＭＳＨレセプターを有する細胞を殺すことを達成するために用いることができる。さらに、このコンテクストにおいて、毒物はＭＳＨレセプターのある細胞を殺すおよび／または損傷を与えるという目的にとって適当なあらゆる毒物を意味することを意図している。毒物の毒性効果は、毒物が抗体とコンジュゲートしたままで発揮されうる。しかしながら、いったん抗体−毒物コンジュゲートがＭＳＨレセプター含有細胞につけば、毒物が処理される（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）ことの方がありそうなことである。そのようなプロセシングは、たとえば抗体−毒物複合体の内在化、抗体からの毒物の開裂および細胞内の毒物作用部位への毒物の輸送に関しうる。そのプロセシングは、ＭＳＨレセプター含有細胞の天然の機構により行われ、抗体−毒物複合体の注意深く工作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）された特性により、複合体に最も好ましいプロセシング経路を与えることにより、その毒性が最大限に発揮されるであろう。
【０１７６】
抗体−毒物複合体の臨床効力を改善するために、完全な抗体全体の代わりに、たとえばＦ（ａｂ´）２またはＦａｂ´断片を用いることによって、モノクローナル抗体をそのサイズを減ずるように設計することができる。分子のサイズの縮小は、抗体−毒物複合体が血液から腫瘍細胞の部位へ拡散する能力を増加するであろう。さらに、抗体とのコンジュゲーションのために小さくされた（ｓｍａｌｌ　ｓｉｚｅｄ）毒物、たとえばカビのＲＩＰなどを選ぶことで、同じ効果がえられるであろう。さらに、Ｆ（ａｂ´）２またはＦａｂ´断片を毒物コンジュゲーションに用いることによって行われるように、Ｆｃ断片を取り除くことで抗体−毒物コンジュゲートがＦｃレセプター含有細胞に結合する可能性を取り除き、毒物複合体のＭＳＨレセプター含有細胞以外の他の細胞への非特異的結合を最小にするであろう。したがって、こうすることにより抗体−毒物複合体の選択性は増加し、より多くの用量を投与することが可能となるであろうため細胞毒性効果が増加する。抗体−毒物コンジュゲートが投与された患者における体液性免疫応答が誘導される問題は、事前におよび／または付随的に、免疫応答を抑制する薬物を投与することによって最小に押さえられうる。そのような薬物は、たとえばシクロホスファミド、プレドニゾン、アザチオプリンおよび／またはシクロスポリンから選びうる。さらに、同じ目的のための別のアプローチは、ＣＤ４抗原に対して作られたモノクローナル抗体を投与することである。さらに、同じ目的のための別のアプローチは、抗体−毒物複合体をその免疫原性を最小にするように注意深く工作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）することである。そのような工作は、ＭＳＨレセプターに対して高い親和性で結合する能力を保ちつつ、かつその所望の毒性効果を保ちながら複合体中の最も免疫原性のあるエピトープを取り除くことによって可能である。さらに、工作は患者へ投与されたのちの複合体の安定性を増加するという目的も有しているであろう。安定性の増加は、よい治療効果をえるために必須である。
【０１７７】
抗体−毒物複合体の臨床効率の増加は、複合体の毒性を高めるであろう別の薬剤（ａｇｅｎｔ）を患者に付随的に投与することによっても与えられうる。その別の薬剤は、たとえばシクロホスファミド、ダウノルビシンおよび／またはインターフェロンであってよい。さらに、毒性の増加は、毒性の関与するメカニズムが異なっている２および／またはいくつかの毒物が含まれている抗体−毒物複合体を同時に用いることによって与えられうる。その代わりに、また別のメラノーマタンパクに対して作られた別の抗体−毒物複合体を、本発明の抗ＭＳＨレセプター抗体−毒物複合体と同時に投与することによって、臨床効率を増加させるであろう。抗体−毒物複合体の臨床効率を増加させるまた別の方法は、ＭＳＨレセプター抗体−毒物複合体に、さらにＲＩＴのため細胞毒性を誘導する適当な放射性核種を結合させることによって与えられる。メラノーマの治療のためのＲＩＴのアプローチについて、以下にさらに記載する。
【０１７８】
放射線診断および放射線療法用：ＭＳＨレセプターまたはその誘導体に対するモノクローナル抗体は、動物およびヒトにおける疾病状態の診断および治療に用いることができる。診断および治療用抗体は、一般にメラノーマと呼ばれる皮膚ガンのような疾病に対して有益であろう。ＭＳＨレセプターが一貫してメラノーマ組織上に見いだされるという知見は、この考えを支持する。
【０１７９】
特異的なモノクローナル抗体は、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕおよび６７Ｇａのような異なる放射性核種に結合させることもできる。そのような放射性標識された抗体は、診断（ラジオイムノシンチグラフィー）または治療（ラジオイムノセラピー）のために用いることができる。
【０１８０】
このコンテクストにおいて、放射性核種は、ＭＳＨレセプターを含有する細胞および／または細胞群（ｃｅｌｌ　ｃｌｕｓｔｅｒ）を検出する目的のために適当な、あらゆる放射性核種を意味することを意図している。抗ＭＳＨレセプター抗体への放射性核種の連結は、いくつかの技術によって行うことができる。１２３Ｉ、１２５Ｉおよび／または１３１Ｉでは、充分に確立されたクロラミン−Ｔ法、ヨードゲン法、ラクトパーオキシダーゼ法および／またはヒドロキシパーオキシダーゼ法により結合を行うことができる。さらに、その代わりにボルトン−ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）試薬を用いて、放射ヨード標識を行うことができる。たとえば１１１Ｉｎおよび／または９０Ｙおよび／または６７Ｃｕでの放射性標識は、二価のキレート剤を抗体に連結させたのち、その複合体に放射性核種を加えることにより行いうる。複合体のキレート能力のため、放射性核種は複合体に付着する。適当なキレート剤は、たとえばイソチオシアネートベンジルＥＤＴＡ（ＣＩＴＣ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）から選ぶことができ、無水物または環状無水物を混合することによって連結される（ナイトビッチ（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）１９９０）。しかしながら、そのような複合体はいくらか不安定なキレート化、さらに製造の間には抗体の分子間および分子内架橋を提供するかもしれないので、たとえばＧＹＫ−ＤＴＰＡまたはＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡなどの他のキレート剤を代わりに用いてよい（ナトビッチ（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）１９９０）。９９ｍＴｃの抗体への放射性標識は、抗体上のジスルフィド結合を還元し、それによって９９ｍＴｃの安定な付着のための部位を提供するような、直接標識技術によって行いうる。この末端のためのひとつの方法は、ジスルフィド結合を還元することができるスズを用い、かつスズでの還元により９９ｍＴｃを提供する［９９ｍＴｃ］過テクネチウム酸塩（ｐｅｒｔｅｃｈｎｅｔａｔｅ）を加えることである（ナトビッチ（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）１９９０）。このコンテクストにおいてスズは、たとえば酒石酸第一スズ（ｓｔａｎｎｏｕｓ　ｔａｒｔｒａｔｅ）の形態または目的に適した他の形態で提供されうる。スズの代わりとして、たとえばジチオトライトールおよび／または２−メルカプトエタノールなどの他の適当な還元剤を用いてもよい。さらに、［９９ｍＴｃ］過テクネチウム酸塩の代わりに、９９ｍＴｃ源として［９９ｍＴｃ］−グルカルテート（ｇｌｕｃａｒｔａｔｅ）および／または［９９ｍＴｃ］−ホスホン酸塩（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）を用いてもよい。さらに抗ＭＳＨ抗体の９９ｍＴｃ標識のための別のアプローチは、前記のようにキレート剤を用いることである。９９ｍＴｃキレート化の目的のための有望な概念は、そのタンパク質は９９ｍＴｃの強いキレート化を与えるため、メタロチオネインを抗ＭＳＨレセプター抗体に連結することである。さらに別に用いることのできるキレート剤は、ジアミドデメルカプチド（ｄｉａｍｉｄｅｄｅｍｅｒｃａｐｔｉｄｅ）キレート剤である（フリッツバーグら（Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．）１９８６）。
【０１８１】
ラジオイムノシンチグラフィー手順は、標識された抗体は、正常または病気の、細胞上のＭＳＨレセプター（またはその誘導体）を認識し、抗体はＭＳＨレセプター（またはその誘導体）のない細胞には結合しないという事実にもとづいている。シンチグラフィック検査の最終的な質は、検査される標本にあるＭＳＨレセプター（またはその誘導体）の絶対量およびバックグラウンドの活性に依存する。非腫瘍に対する腫瘍のシグナル比が１．５／１またはそれより高いときは、この技術を用いて腫瘍を検出することが可能である。画像化は、初めは全般的に平面シンチグラフィック検査として行われる。解剖学的標識が点光源で示され、別々に記録され、そののちコンピュータの助けが加えられる。シングル・フォトン・エミッシヨン・コンピューテッド・トモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）を行うことができ、検査の対象の周囲３６０°回転のガンマカメラによるデータがえられる。つぎに数学的計算処理によって、横断面、前頭断面、矢状断面または斜断面が再構築される。ＳＰＥＣＴは感度が改善されたようで、必要とされる腫瘍／非腫瘍シグナル比は低い。このコンテクストにおいて、前記のアプローチは、ＭＳＨレセプター（またはその誘導体）が発現される皮膚ガンおよび他の疾病状態の診断に用いられることができ、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体によりアプローチを行うことができる。
【０１８２】
病気の細胞を特異的なモノクローナル抗体に結合した有毒剤によって殺すためのラジオイムノセラピー（ＲＩＴ）は、有望な概念である。ＲＩＴは有効に行われるためには、腫瘍／非腫瘍シグナル比の他にも要件がある。放射能の量は、周囲の正常細胞に高い放射線量を与えることなく、腫瘍を根絶するのに充分なものでなくてはならない。さらに、標識された抗体の腫瘍中の分布は均一で、すべての腫瘍細胞への照射を可能にするものでなくてはならない。腫瘍中のモノクローナル抗体の生物学的半減期は、放射性核種が最大の放射線効果を充分に発揮しうるように、長くなくてはならない。このコンテクストにおいて、前記のアプローチは、ＭＳＨレセプター（またはその誘導体）が発現されている皮膚ガンおよび他の疾病状態の治療において用いられることができ、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体によってアプローチを行うことができる。
【０１８３】
リガンド結合ブロッカーとして：レセプターリガンドによるＭＳＨレセプター（またはその誘導体）への結合の妨げは、本発明のポリペプチドに対し特異性を有する抗体によって適切に行われうる。このコンテクストにおいて、「ＭＳＨレセプター（またはその誘導体）のブロッキング」という語は、ＭＳＨレセプター（またはその誘導体）が抗体で占領されてレセプターリガンドがＭＳＨレセプター（またはその誘導体）を活性化できないことを意味する。
【０１８４】
前記に従い、本発明は、検出可能な標識を備える本発明のポリペプチドに結合することができる抗体、および検出可能な標識を備える本発明のポリペプチドに関する。そのポリペプチドまたは抗体は、いくつかの実施態様においては、固体支持体に連結されていてもよい。支持体は、プレート、ストリップ、ビーズ、粒子、フィルムおよび紙からなる群より選ばれてよく、固体支持体は、ラテックス、ポリスチレン、塩化ポリビニル（ｐｏｌｙ　ｖｉｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ポリオレフィン、ナイロン、２フッ化ポリビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）、セルロース、シリコンまたはシリカでできていてよい。
【０１８５】
ＭＳＨレセプターの検出および／または定量のためのほかの方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出を含んでなり、そのような方法は好ましくは先で詳しく記載したハイブリダイゼーションの原理にもとづいている。したがって、そのようなひとつの側面において、本発明は、部分細胞画分、細胞、組織サンプル、細胞培養物または細胞懸濁液などの生物学的サンプルからＲＮＡを抽出し、かつ本発明の標識されたＤＮＡ断片、または本発明のＤＮＡ断片から構築することのできる標識されたＲＮＡ断片との該ＲＮＡのハイブリダイゼーションを測定することを含んでなるＭＳＨレセプターのｍＲＮＡの検出および／または定量のための方法に関する。また、ノーザンブロットまたはドットブロットなどのＲＮＡ測定方法も用いうる。ハイブリダイゼーションは、ｉｎ　ｓｉｔｕで行われてよく、または標識されたアンチセンスｍＲＮＡプローブを用いてよい。別の実施態様において、ＭＳＨレセプターｍＲＮＡの検出および／または定量は、細胞または組織からＲＮＡを抽出し、それをつぎにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いるためにｃＤＮＡに変換することによって行われる。ＰＣＲプライマー（類）は、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号４に示すＤＮＡ断片または本発明の他のいずれかのＤＮＡ断片のような本発明のＤＮＡ断片にもとづいて合成しうる。検出および／または定量のためのこの方法は、メラノーマ、皮膚ガン、発熱状態、炎症状態、侵害状態、緊張状態、記憶障害状態、減少もしくは増加した皮膚黒ずみの状態および／または色素沈着状態などのＭＳＨレセプター発現疾病状態を診断するための診断方法として用いうる。
【０１８６】
本発明の別の特定の実施態様では、ＭＳＨレセプターＲＮＡおよび／またはＤＮＡの検出のためのこの方法は、所望の毛皮および／または皮膚の色の動物をえるために、動物の飼育における生産コントロールとして用いられる。そのような毛皮および／または皮膚色コントロールが望まれる動物は、たとえば哺乳動物および爬虫類から選ばれてよく、とくにたとえば、ヘビ、アリゲーター、クロコダイル、ミンク、キツネ、ハムスターまたはチンチラであってもよい。
【０１８７】
本発明のさらなる実施態様において、ＭＳＨレセプターをコードする断片またはその部分配列は、たとえば前記のようなクローニングまたはＰＣＲを用いることによって、動物において分析される。こうしてえられたＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡは、ＭＳＨレセプターの特定の変異体を検出する目的で、既知の方法論を用いて配列分析に付される。そのようなＭＳＨレセプターの変異体の検出は、たとえば所望の皮膚および／または毛皮の色をえるための動物の飼育における生産コントロールにおいて求められる。そのような毛皮および／または皮膚色コントロールが望まれる動物は、たとえば哺乳動物および爬虫類から選ばれてよく、とくにたとえば、ヘビ、アリゲーター、クロコダイル、ミンク、キツネ、ハムスターまたはチンチラであってもよい。
【０１８８】
本発明のさらなる実施態様において、動物の所望の皮膚および／または毛皮の色は、ＭＳＨレセプターの所望の変異体を動物中に導入すること、たとえばＭＳＨレセプターの変異体を適当に産生するトランスジェニック動物の作製すること、によってえられる。その代わりとして、所望のＭＳＨレセプターの変異体は、動物においてｉｎ　ｓｉｔｕでＭＳＨレセプターをコードする断片の突然変異を行うことによりえられる。ＭＳＨレセプターの変異体の導入が望まれる動物は、たとえば哺乳動物および爬虫類から選ばれてよく、とくにたとえば、ヘビ、アリゲーター、クロコダイル、ミンク、キツネ、ハムスターまたはチンチラであってもよい。
【０１８９】
本明細書において、ＭＳＨレセプターの変異体は配列番号１、配列番号２、配列番号１５または配列番号１６の相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）および／または類似体を意味することを意図している。
【０１９０】
ＭＳＨレセプター（Ｇ−タンパク共役レセプターファミリーの一員）の三次構造についての原子レベルでの詳しい構造の情報が欠けていることが、分子レベルでのレセプター機能を理解する努力を妨げ続けている。本発明のポリペプチドは、タンパク質の精製法、および／または組換えＤＮＡ技術および／または合成化学のアプローチを用いて大量に生産することができる。したがって本発明のポリペプチドを結晶化することができる。結晶化、三次元における分子の規則的な充填は、溶液中のタンパク分子間の引力および分散力または反発力の正しいバランスをえることにかかっている。ＭＳＨレセプターまたはその誘導体のような膜構成タンパク（ｉｎｔｅｇｒａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を可溶化するためには、天然のリン脂質環境を界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）によって置き換えることが必要である。その結果えられるタンパク質周辺の界面活性剤の殻は、規則的な結晶の形成を妨げる最も重要な要因であると考えられる。界面活性剤を除くことによって、タンパク質の沈殿が起こり、結晶学的研究には役に立たなくなってしまう。
【０１９１】
ＭＳＨレセプターの結晶化におけるおもな問題は、７つの膜貫通部分のあるＭＳＨレセプターの膜部分で安定または半安定複合体を形成する理想的な界面活性剤を見つけることである。また、レセプターの全体構造がそれほど影響されないこと、それが本出願で記載したような、たとえば放射性リガンド結合などの機能分析を用いて確認することができることも必要条件である。結晶化に有用ないくつかの種類の界面活性剤が現在知られており適用しうる。これらの界面活性剤のそれぞれについて、ＭＳＨレセプターの溶解度に対する個々の状態図をえて、結晶化に最適な条件を見つけるためにこれらの状態図を詳しく分析することはよいアプローチである。そのようなアプローチを用いて、タンパク単位に結晶の成長のための分子間接触を整えさせるための緩衝液または界面活性剤と塩との混合物を見いだし、改良することが可能である。このコンテクストにおいて、塩とは、結晶格子に並べるための個々のＭＳＨレセプター分子の相互作用を支持しうる１価および／または２価のイオンを意図している。さらに、結晶化は、そのかわりにまたはそれに加えて、レセプターに結合して分子間接触の可能な表面を増加させるＭＳＨまたはＭＳＨ類似体を添加することによって行われうる。さらにＭＳＨレセプターの溶解度は、温度勾配を用いて分析されうる。結晶化を示す核の最初の凝集は、たとえばレーザー光散乱との組合せで分析することができる。結晶をえるため、たとえばミクロ−バッチ応用だけでなくシッティング・アンド・ハンギング・ドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｈａｎｇｉｎｇ　ｄｒｏｐ）などのアプローチは有用であろう。よりすぐれた結晶は微小重力（ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ）状態をもちいてえられるであろう。最終的なアプローチとして、重原子群（ｈｅａｖｙ　ａｔｏｍ　ｃｌｕｓｔｅｒ）も適用することができる。
【０１９２】
結晶凝集は、たとえば１オングストローム波長または１オングストロームより大きいもしくは小さいような適当な波長での、たとえばシンクロトロン照射に付して放射回折に対するデータを集めることによって、分析しうる。結晶学における相の問題解決のための不規則散乱（ａｎｏｍａｌｏｕｓ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）の適用が行いうる。さらに、たとえば−１０℃および４℃などの適当な温度に結晶を冷却すること、または非常に放射感受性であるＭＳＨレセプター結晶を瞬間冷凍することを行ってもよい。ＭＳＨレセプターの三次元構造のＸ線回折パターンからの解析は、よく知られた計算技術を用いて行いうる。
【０１９３】
まだ、結晶を形成したＧ−タンパク共役レセプター（ＭＳＨレセプターは、そのファミリーに属する）はないが、２つの他の膜部分タンパク、光合成反応中心（アレンら（Ａｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９８７）およびバクテリオロドプシン（ヘンダーソンら（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９９０）、が研究に成功している。同種の技術を単独または組合せで、本発明のポリペプチドの結晶化および／または原子構造決定に適用しうる。さらに、タンパク質の三次元構造の解明を目的とする他の技術も急速に発展している。そのような技術のひとつは、現代の多次元ＮＭＲ技術と同様の二次元ＮＭＲ（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）１９８９）であり、すでにはるかに進歩している。そのような技術をＭＳＨレセプター三次構造の解明に用いるために、充分な量の純粋なＭＳＨタンパク質を有し、そしてレセプターの既知の一次アミノ酸配列とともに適切な計算法に適用される適切な２次元または多次元ＮＭＲデータをえることが必要である。さらに、タンパク質の三次構造を解明することを目的として、コンピュータにおける計算法も開発されている。これらの方法は一般に集合的に分子モデリングと呼ばれる。いったんＧ−タンパク共役レセプターファミリーの一員の三次構造が解明されれば、一次アミノ酸配列が分かっていることを条件に、前記の方法のひとつ、２つまたはそれより多くを用いることにより他のＧ−タンパク共役レセプターの三次構造は急速に解明されることが予想される。これは、これらのレセプターの三次構造における高い類似性が予想されるためである。トリプシンに対する相同性にもとづくレニンの三次構造の解明（ラドュング（Ｒａｄｕｎｇ）１９８８）などの、他の種類のタンパク質の三次構造の解明は、すでに達成され成功しており、ＭＳＨレセプターの三次構造をえるために類似のアプローチを用いることができよう。そのようなアプローチにおいて、ＭＳＨレセプタータンパク質の基本骨格を別のＧ−タンパク共役レセプターの基本骨格と、２つのタンパク質のアミノ酸配列（部分配列）の最も相同な部分を用いて、突き合わせる。一般的に、レセプターの膜貫通セグメントのみが、この一致部分にあると考えられる。ＭＳＨレセプターを別のＧ−タンパク共役レセプターの基本骨格と突き合わせたあと、最終的なファンデルワールス重複が除外されるまで、たとえばアミノ酸側鎖の位置付けだけでなく膜貫通セグメントの回転および傾斜などを含む、ＭＳＨレセプターの膜貫通セグメントの注意深い位置付けにより、ＭＳＨレセプターの構造の精密な推論が行われる。さらに、同じおよび／または隣接した膜貫通セグメントの異なるアミノ酸の間に、たとえば水素結合などの適当な結合を形成するアミノ酸側鎖の位置付けを見いだすことにより、さらなる構造の精密な推論が行われる。最終的に、よく知られている計算技術によって、系のエネルギーを最小にすることによって、さらなる構造の精密な推論が行われる。系のエネルギーは、通常たとえばアンバーフォースフィールド（Ａｍｂｅｒ　ｆｏｒｃｅ　ｆｉｅｌｄ）などによる大まかな方法を用いることによって計算され、またさらに正確な量子力学計算の方法が適用されてもよい。そのような計算は、たとえばハイパーケム（Ｈｙｐｅｒｃｈｅｍ）、シビル（Ｓｙｂｙｌ）などの商業的に利用しうるコンピュータプログラムをもちいて容易に行われる。
【０１９４】
いったんＧ−タンパク共役レセプターのうちのひとつの原子構造が分かれば、ＭＳＨレセプターを含むこの非常に重要なレセプターファミリーの他の構成員に対して同じことを行うのは比較的容易であると理解される。
【０１９５】
原子構造の知識は、一方では細かい詳細におけるレセプターの機能を理解するのを助け、他方では計算によるおよび／または他の適当な方法による特定の薬物の開発の改善を容易にする。適用することのできる方法のなかでは、コンピュータにおける、エピトープの３次元グラフィック分析、リガンドのＭＳＨレセプターの潜在エピトープへのドッキングおよび物質の新たな（ｄｅ　ｎｏｖｏ）設計がある。
【０１９６】
したがって、本発明は、ＭＳＨレセプターに結合することができる物質の設計に用いるため、ＭＳＨ結合能力を有するＭＳＨレセプターまたはその類似体の三次構造を推定するための、本発明のポリペプチド配列の用途にも関する。
【０１９７】
ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションなどの技術を用いることにより、前記で開示したＤＮＡ断片を、他の類似のＤＮＡ断片、すなわち本発明のＤＮＡ断片を見いだし、単離するために用いることができると理解される。また、そのような発見および単離に用いるためのＤＮＡプローブを設計するために本発明のポリペプチドを用いることも可能である。したがって、このアプローチをもちいて、オリゴヌクレオチドプライマーは、普遍的な遺伝コードを用いて本発明のポリペプチド配列から推定される。そのようなプライマーは、実施例１および４に記載のように、ＰＣＲを行い、他の類似のＤＮＡ断片を発見および単離するために用いることができる。したがって、そのような本発明のＤＮＡ断片およびポリペプチドの用途も、本発明の重要な側面を構成する。
【０１９８】
【実施例】
実施例１
ＭＳＨレセプターｃＤＮＡ分子クローニングおよびヌクレオチド配列決定
【０１９９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの設計
早期にクローン化されたＧ−タンパク共役レセプターの膜に及んでいるセグメント３と６における配列の相同性を注意深く調べることにより、プライマーを設計した。プライマーの設計は、いずれのひとつのレセプターまたはレセプターのいずれのひとつのクラスにもかたよっていなかった。プライマーは変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）され（セグメント３からのプライマーでは重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が８、セグメント６からのプライマーでは重複が３２）、そうでなければ高度に変性するようになる場所にはデオキシイノシンとよばれる不活性ヌクレオチドを入れた。プライマーは、注文にもとづきシンビコム（Ｓｙｍｂｉｃｏｍ）ＡＢ（ツビステベーゲン（Ｔｖｉｓｔｅｖａｅｇｅｎ）４８、ウメア（Ｕｍｅａ）、スエーデン）によって化学合成した。プライマーは、クローニングを容易なものにするために、５’−末端でＥｃｏＲＩ（セグメント３）およびＢａｍＨＩ（セグメント６）リンカーを用いて合成した。
【０２００】
プライマー配列を配列番号３および配列番号４に示す。
【０２０１】
ヒトゲノムＤＮＡ上でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
１μｇのヒトゲノムＤＮＡ（クローンテック・ラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）４０３０　ファビアン・ウエイ、パロ・アルト　カリフォルニア　９４３０３　アメリカ合衆国、より購入）を前記のプライマーを用いてＰＣＲに付した。ＰＣＲは、最終容量５０μｌで行った。それには、１μｇのヒトゲノムＤＮＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．３、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．００１％ゼラチン、２００μＭの各デオキシヌクレオチド、１μＭの各プライマーおよび１ユニットの酵素ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（酵素は、パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）、７６１　メイン・アベニュー、ノエウオーク、コネチカット　０６８５９、アメリカ合衆国、よりえた）が含まれていた。
【０２０２】
用いたＰＣＲの熱プロファイルは、サーマル・サイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）（ハイバイド（Ｈｙｂａｉｄ）、１１１−１１３ウォルデグレイブ・ロード、テッッジントン、ミッドレセックス、ＴＷ１１　８ＬＬ、英国）を用いて、全２５サイクルに対して９３℃６０秒、５５℃４０秒および７２℃６０秒であった。
【０２０３】
反応の１０％を、標準の方法（サムロックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）１９８９）を用いて、アガロースゲル電気泳動により分析した（図１を参照）。３つの生成物が、およそ７０５ｂｐ、５０１ｂｐおよび３７２ｂｐに確認された。７０５および５０１ｂｐの生成物は、のちに２つの既にクローニングされたレセプターのＤＮＡであることが確認されたが、３７２ｂｐの生成物は、新規なＧ−タンパク共役レセプターであることが確認され、これだけについてさらに処理を進めた。
【０２０４】
３７２ｂｐ産生物の配列決定
標準の技術（サムロックら１９８９）を用いて、３７２ｂｐ生成物をｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）ベクター（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．）、マジソン、ウィスコンシン、アメリカ合衆国）中にクローン化し、ＧＥ４と名付けた、えられたプラスミドのひとつについて、チェーン・ターミネーション法（サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）１９７７）を用いて配列決定を行った。それは、配列番号１１に示す配列を含有することがわかった。
【０２０５】
ＧＥ４ｍＲＮＡの組織分布
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、標準プロトコール（サムロックら１９８９）に記載されるようなオリゴｄＴ精製計画を用いて、以下の組織から調製した：脳、胸腺、副甲状腺、耳下腺、唾液腺、副腎、睾丸、肝臓、肺、心臓、脾臓、骨格筋、腸、結腸およびＷＭ２６６−４ヒトメラノーマ細胞（ＡＴＣＣ♯ＣＲＬ１６７６）。１０μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、記載のように（サムロックら１９８９）０．８％アガロース−ホルムアルデヒドゲルによる電気泳動に付した。つぎに、そのＲＮＡをジェネスクリーン・メンブレン（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ニュー・イングランド・ヌクレアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、アメリカ合衆国）上にブロットし、ＵＶ線で膜へ架橋させた。つぎにその膜を１０ｍｌの予備ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌ変性ウシ胸腺ＤＮＡ）を含有する密閉プラスチックバッグ中に４２℃にて４時間置いた。つぎに予備ハイブリダイゼーション溶液を１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（１０ｍｌ予備ハイブリダイゼーション溶液＋３２Ｐ標識されたＧＥ４ＤＮＡプローブ）で置き換えた。ＧＥ４ＤＮＡは、市販のマルチプライムキット（ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ　ｋｉｔ）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アイレスブリー、バッキンガムシアー、ＨＰ２０　１ＢＲ、英国）を用いて３２Ｐで標識した。膜は、ハイブリダイゼーション溶液中に４２℃にて１２時間置いた。つぎに膜を０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液中で６０℃にて３０分洗浄し、風乾して、１６時間オートラジオグラフィーフィルムにさらした。図２を参照のこと。ヒトメラノーマＷＭ２６６−４細胞のレーン＃１６のみに陽性のシグナルが見られる。
【０２０６】
ＷＭ２６６−４細胞からのｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクーニング
ＷＭ２６６−４細胞は、ＡＴＣＣ、ベセスダ、メリーランド、アメリカ合衆国からえた。ＡＴＣＣに指示されたように培地中で細胞を増殖させた。ファストトラックｍＲＮＡアイソレーションキット（ｆａｓｔ　ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ）（インビトロゲン社（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　ｃｏｒｐ．）、３９８５　ソレント・バレー・ブルバード、♯Ｂ、サンジエゴ、カリフォルニア９２１２１、アメリカ合衆国）を用いて、これらの細胞からポリ（Ａ）＋ＲＮＡをえた。つぎに５μｇのこのＲＮＡを用いて、ラムダｇｔ１１ベクター中に、用いたキットの製造者により記載された材料および条件（アマシャム、アイレスブリー、バッキンガムシアー、ＨＰ２０　１ＢＲ、英国）を用いてランダムに始められたｃＤＮＡライブラリーを作った。
【０２０７】
その非増幅ライブラリーから、およそ７×１０５プラーク形成ユニットを寒天−ＬＢプレート上にまき（サムロックら１９８９）、８時間増殖させ、つぎにハイボンド−Ｃフィルターディスク（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ　ｆｌｔｅｒ　ｄｉｓｃｓ）（アマシャム、アイレスブリー、バッキンガムシアー、ＨＰ２０　１ＢＲ、英国）へ移した。つぎにフィルターディスク上のＤＮＡを、記載のように（サムロックら１９８９）変性させ固定した。フィルターディスクを、つぎに予備ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、および０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ睾丸ＤＮＡ）を含有する密閉バッグ（４フィルター／バッグ）中に６０℃にて６時間置いた。つぎにそのフィルターをハイブリダイゼーション溶液（予備ハイブリダイゼーション溶液＋３２Ｐ標識されたＧＥ４　ＤＮＡプローブ）中に、６０℃にて１２時間置いた。ＧＥ４　ＤＮＡは、市販のマルチプライムキット（アマシャム、アイレスブリー、バッキンガムシアー、ＨＰ２０　１ＢＲ、英国）を用いて３２Ｐで標識した。つぎにフィルターを０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液中で６５℃にて２０分洗浄し、風乾して、２４時間オートラジオグラフィーフィルムにさらした。陽性のプラークを採取し、さらに２回スクリーニングを繰り返したのちに、１１Ｄと名付けられた陽性プラークを単離した。
【０２０８】
１１ＤｃＤＮＡのサブクローニングおよび配列決定
１１Ｄクローンのため、大きいスケールのラムダＤＮＡ調製を記載のように（サムロックら１９８９）行った。挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素にて切り取った。これにより、一部の３´−非翻訳配列を有するすべてのコーディングおよび５´−非翻訳配列が取り出された。そのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、記載されている標準の方法（サムロックら１９８９）を用いて、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）ベクター（プロメガ社、マジソン、ウィスコンシン、アメリカ合衆国）の　ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でクローン化した。その結果えられたプラスミドＤＮＡ（図３参照のこと；ｐＢ−１１Ｄ）を、つぎにコンピテントＤＨ５アルファ大腸菌（ビーアールエル（ＢＲＬ）、８４００　ヘルゲーマン・コート、ガイサーバーグ、メリーランド　２０８７７、アメリカ合衆国）中にトランスフェクトした。細菌のコロニーを、アンピシリンを含有する寒天プレート上で増殖させた。個々のコロニーをアンピシリン含有５ｍｌ　ＬＢ培地（サムロックら１９８９）中に採取し、一晩増殖させた。プラスミドは記載のように（サムロックら１９８９）調製した。調製されたプラスミドＤＮＡを、正しい位置に１１ＤｃＤＮＡが存在するかどうかについて点検した。つぎに正しい位置に１１ＤｃＤＮＡを有して構築されたプラスミドを、さらに５００ｍｌ培養で増幅した。そのような大きいスケール標品からのプラスミドＤＮＡを、キアゲンキット（Ｑｉａｇｅｎ　Ｋｉｔｓ）（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ．）、１１７１２　モールパーク・ストリート、スタジオシティー、カリフォルニア　９１６０４、アメリカ合衆国）で調製した。コーディング配列全体および５´−非翻訳領域ならびに３´−非翻訳領域の小部分において、双方のＤＮＡ鎖を重複断片を作ることにより配列決定した。配列決定の方法は、チェーン・ターミネーション法であった（サンガーら１９７７）。クローン化された１１ＤｃＤＮＡは、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有することがわかり、７つの疎水性セグメント（それぞれ配列番号１のヌクレオチド２８６〜３５１、３９４〜４６５、５１７〜５８８、６４０〜７１１、７３３〜８０４、８９８〜９７２および９９７〜１０６８に対応する）を含むことが示された。
【０２０９】
実施例２
１１ＤｃＤＮＡの発現ベクター中へのクローニング
発現ベクターｐｃＤＮＡＩ（インビトロゲン社，３９８５　ソレント・バレー・ブルバード、♯Ｂ、サンジエゴ、カリフォルニア　９２１２１、アメリカ合衆国）は、４．２ｋｂのマルチファンクションの真核細胞発現ベクターである。これは、ヒトＣＭＶプロモーターおよび高レベル発現のためのエンハンサーを有する。
【０２１０】
１１ＤｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）ベクター（５．１．６に前記）からＥｃｏＲＩおよびＮｓｉＩ酵素で切り取り、ｐｃＤＮＡＩベクターの同じ部位につなげた。その結果えられたプラスミドＤＮＡ（図４参照；ｐＥ−１１Ｄ）を、つぎにコンピテントＭＣ１０６１／Ｐ３　大腸菌中にトランスフェクトした。細菌のコロニーを、アンピシリンを含有する寒天プレート上で増殖させた。個々のコロニーを５ｍｌ　ＬＢ−アンピシリン培地（サムロックら１９８９）中に採取し、一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡは、記載のように（サムロックら１９８９）調製した。調製されたプラスミドＤＮＡを、正しい位置に１１ＤｃＤＮＡが存在するかどうかについて点検した。つぎに正しい位置に１１ＤｃＤＮＡを有して構築されたプラスミドを、さらに５００ｍｌ培養で増幅した。そのような大きいスケール標品からのプラスミドＤＮＡを、キアゲンキット（キアゲン社、１１７１２　モールパーク・ストリート、スタジオ・シティー、カリフォルニア　９１６０４、アメリカ合衆国）で調製した。
【０２１１】
実施例３
１１ＤｃＤＮＡの発現およびその同一性の確立
ＷＭ２６６−４ヒトメラノーマ細胞（ＭＳＨレセプターｃＤＮＡがこの細胞からクローン化された）を、ＡＴＣＣにより記載された条件で増殖させた。これらの細胞を、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞について以下に記載するような放射性リガンド結合に付した。ＷＭ−２６６−４細胞は、１２５Ｉ標識されたＮＤＰ−ＭＳＨに特異的な様式で結合することが示された（図５）。
【０２１２】
ＣＯＳ−７細胞を８％ウシ胎児血清および非必須アミノ酸を含有するダルベッコ変形イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ）（ギブコ／ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、８４００　ヘルゲーマン・コート、ガイサーバーグ、　メリーランド　２０８７７、アメリカ合衆国）中で増殖させた。８０％コンフルエントな培養物を、無血清培地中、１μｇのｐＥ−１１ＤプラスミドＤＮＡおよび４０μｇリポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（ビーアールエル、８４００　ヘルゲーマン・コート、ガイサーバーグ、メリーランド　２０８７７、アメリカ合衆国）でトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後、血清含有培地に置き換えて、細胞を２０時間培養した。つぎに細胞をばらばらにしてはがし、遠心し、血清含有培地中に再懸濁し、４８穴プレート上にまいて、２４時間増殖させた。つぎにその細胞を０．３ｍｌの結合バッファー（アールズ塩（Ｅａｒｌｅ’ｓ　ｓａｌｔｓ）含有最小必要培地、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．０、０．２％ウシ血清アルブミン、１ｍＭ　１，１０−フェナンスロリン、１リットルあたり０．５ｍｇのロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ）および１リットルあたり２００ｍｇのバシトラシン）で洗浄し、２４，０００ｃｐｍの１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨおよび適当な濃度の非標識ペプチドを含有する０．３ｍｌの結合緩衝液で３７℃にて２時間インキュベートした。ＮＤＰ−ＭＳＨは、１２５ヨードで標識し（詳細は以下を参照のこと）、比放射能をモル濃度あたり８．６×１０４ｃｐｍにした。つぎにプレートを氷上に置き、細胞を０．３ｍｌの氷冷結合緩衝液で洗浄し、０．３ｍｌの０．１Ｎ　ＮａＯＨでプレートから分離した。放射能を計測し、データを放射性リガンド結合分析に適した、反復、非線型カーブ用プログラムによって分析した（図６参照のこと）。一連のＰＯＭＣ（プローオピオメラノコルチン）由来ペプチド（サクソン・バイオケミカルズ社（Ｓａｘｏｎ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＧｍｂＨ）、ハノーバー、ドイツ国より購入）は、１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨのｐＥ−１１ＤでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞への結合阻害において、差異のあるポテンシーを示した。テストされる各ペプチドのいくつかの（たとえば１１〜１２）濃度をテストし、細胞に結合していることがわかった計数のデータを、非線型回帰分析を用い、前に記載された方法（ベルグストレム（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｅｍ）およびヴィックベルグ（Ｗｉｋｂｅｒｇ）１９８６）を用いて４パラメーターのロジスティック関数にあてはめることにより、結合親和性（Ｋｉ）のポテンシーおよびレシプロカル（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）を決定した。そのＫｉの値をつぎに、前に記載された（チェン（Ｃｈｅｎｇ）およびプルソフ（Ｐｒｕｓｏｆｆ）１９７３）ようにチェンとプルソフの等式を用いることにより概算したみかけのＩＣ−５０から計算した。その分析からわかったポテンシーの順序およびＫｉの値は、ＮＤＰ−ＭＳＨ（Ｋｉ＝２３±０．５ｐＭ）＞α−ＭＳＨ（Ｋｉ＝９２±１９ｐＭ）＞ＡＣＴＨ（１〜３９）（Ｋｉ＝１７０±３７ｐＭ）＞β−ＭＳＨ（Ｋｉ＝４４９±７４ｐＭ）＞γ−ＭＳＨ（Ｋｉ＝１０１０±２０��ｐＭ）であった。ＡＣＴＨ（４〜１０）は、非常に低い結合親和性（Ｋｉ＝２２，４００±７２００ｐＭ）を示したが、非メラノトロピンのＰＯＭＣペプチドβ−エンドルフィンは、発現されたＭＳＨレセプターに対して親和性を示さなかった。これらの結果は、クローン化された本発明のＤＮＡがＭＳＨレセプターｃＤＮＡであることを明らかに示している。
【０２１３】
ＮＤＰ−ＭＳＨのヨード化
ヨードビーズ（Ｉｏｄｏｂｅａｄｓ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード、イリノイ、アメリカ合衆国）を用い、１００ｍＭ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）中１０分間で、４μｇのペプチドＮＤＰ−ＭＳＨを、１ｍＣｉの１２５−ヨードでヨード化した。つぎにヨードビーズを除いた溶液を、１５％アセトニトリル／０．０５Ｍ酢酸アンモニウム　ｐＨ５．８で予備平衡化されたＣ−１８逆相クロマトグラフィーカートリッジに付した。カートリッジを５ｍｌの予備平衡化緩衝液で洗浄し、つぎに蠕動ポンプを用いて流速１ｍｌ／分で溶出した。溶出勾配は、１５％から３５％のアセトニトリルを含有する０．０５Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．８であった。各１ｍｌの画分を集め、各画分から２．５μｌをガンマカウンターで計測することにより放射能を測定した。画分２５から２９をためて、真空乾燥し、１ｍｌ水中に再溶解した。その放射能を計測し、比放射能を計算した。
【０２１４】
実施例４
クローン化されたＭＳＨレセプターｃＤＮＡ関連ＤＮＡ配列の同定
２つのＰＣＲプライマーを、クローン化されたＭＳＨレセプターｃＤＮＡの配列にもとづいて設計した。それらのヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１３および配列番号１４に示す。
【０２１５】
これらのプライマーを用いて、熱プロファイルを除いて実施例２の記載とまったく同様の方法でヒトゲノムＤＮＡ上でＰＣＲを行った。熱プロファイルは、９４℃３０秒、４５℃２０秒、７２℃２０秒を５サイクル、そしてつぎに９４℃３０秒、６０℃２０秒、７２℃２０秒を２５サイクルであった。反応の１０％を、標準の方法（サムロックら１９８９）をもちいてアガロースゲル電気泳動により分析した。えられた生成物をｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）ベクター中へクローン化し、配列決定を完成した。それらは、それぞれ配列番号５、配列番号７および配列番号９に示すヌクレオチド配列を有することが示された。
【０２１６】
実施例５
１１ＤｃＤＮＡの安定な発現ベクター中へのクローニング
１１ＤｃＤＮＡのクローニング
発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロゲン社、３９８５　ソレント・バレー・ブルバード、♯Ｂ、サンジエゴ、カリフォルニア　９２１２１、アメリカ合衆国）は、４．５ｋｂのマルチファンクションの真核細胞発現ベクターである。これは、ＣＭＶプロモーターおよび高レベル発現のためのエンハンサーならびに安定にトランスフェクタントを選択するためのネオマイシン遺伝子を有している。
【０２１７】
１１ＤｃＤＮＡを、実施例２に記載したようにｐｃＤＮＡＩベクターから、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素を用いて切り取り、ｐＲＣ／ＣＭＶベクターの同じ部位につなげた。その結果えられたプラスミドＤＮＡを、つぎにコンピテントＩＮＶαＦ´大腸菌中へトランスフェクトした。細菌コロニーをアンピシリン含有寒天上で増殖させた。個々のコロニーを５ｍｌ　ＬＢ−アンピシリン培地（サムロックら１９８９）中に採取し、一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、記載のように（サムロックら１９８９）調製した。調製されたプラスミドＤＮＡを、正しい位置に１１ＤｃＤＮＡが存在するかどうかについて点検した。つぎに正しい位置に１１ＤｃＤＮＡを有して構築されたプラスミドを、さらに５００ｍｌ培養で増幅した。そのような大きいスケールの標品からのプラスミドＤＮＡを、キアゲンキット（キアゲン社、１１７１２　モールパーク・ストリート、スタジオ・シティー、カリフォルニア　９１６０４、アメリカ合衆国）で調製した。
【０２１８】
１１ＤｃＤＮＡの安定な発現
ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣより入手可能）を８％ウシ胎児血清および非必須アミノ酸を含有するダルベッコ変形イーグル培地（ギブコ／ビーアールエル、８４００　ヘルゲーマン・コート、ガイサーバーグ、メリーランド　２０８７７、アメリカ合衆国）中で増殖させ、トランスフェクションの５時間後、血清含有培地を無血清培地に置き換えて、細胞を４８時間培養した。この時点で、ネオマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）含有培地（選択培地）中で細胞を増殖させることにより、安定にｐＲＣ／ＣＭＶ−１１Ｄプラスミドを有している細胞の選択を始めた。４日ごとに選択培地を交換して、選択手順を２週間続けた。生き残った細胞を集め、選択培地中に維持した。これらの細胞は、安定な細胞系を構成する。
【０２１９】
結合特性を調べるために、細胞を培養フラスコからばらばらにしてはがし、遠心し、選択培地中に再懸濁し、４８穴プレート上にまいて、２４時間増殖させた。つぎにその細胞を０．３ｍｌの結合緩衝液（アールズ塩含有最小必要培地、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．０、０．２％ウシ血清アルブミン、１ｍＭ　１，１０−フェナンスロリン、１リットルあたり０．５ｍｇのロイペプチンおよび１リットルあたり２００ｍｇのバシトラシン）で洗浄し、２４，０００ｃｐｍの１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨおよび適当な濃度の非標識ペプチドを含有する０．３ｍｌの結合緩衝液で３７℃にて２時間インキュベートした。ＮＤＰ−ＭＳＨは、実施例３で説明したように１２５ヨードで標識し、比放射能をモル濃度あたり８．６×１０４ｃｐｍにした。つぎにプレートを氷上に置き、細胞を０．３ｍｌの氷冷結合緩衝液で洗浄し、０．３ｍｌの０．１Ｎ　ＮａＯＨでプレートから分離した。放射能を計測し、データを放射性リガンド結合分析に適した、反復、非線型曲線用プローグラムによって分析した。一連のＰＯＭＣ（プロ−オピオメラノコルチン）由来ペプチド（サクソン・バイオケミカルズ社、ハノーバー、ドイツ国）は、１２３Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨの安定細胞系への結合阻害に差異のあるポテンシーを示した。その分析からわかったポテンシーの順序は、ＮＤＰ−ＭＳＨ＞　α−ＭＳＨ＞ＡＣＴＨ（１〜３９）＞β−ＭＳＨ＞　γ−ＭＳＨであった。ＡＣＴＨ（４〜１０）は、非常に低い結合親和性を示したが、非メラノトロピンのＰＯＭＣペプチドβ−エンドルフィンは、発現されたＭＳＨレセプターに対して親和性を示さなかった。これらの結果は、クローン化されたＭＳＨレセプターｃＤＮＡが、安定な細胞系において産生され、発現されていることを明らかに示している。
【０２２０】
実施例６
Ｇ８ＤＮＡの完全長クローンの分子クローニングおよびヌクレオチド配列決定
ヒト胎盤ゲノムのライブラリーのスクーニング
ヒトゲノムＤＮＡライブラリーをストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、アメリカ合衆国から購入した。このライブラリーから、およそ７×１０５プラーク形成ユニットを寒天−ＬＢプレート上にまき（サムロックら１９８９）、８時間増殖させ、つぎにハイボンド−Ｎフィルターディスク（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ　ｆｉｌｔｅｒ　ｄｉｓｃｓ）（アマシャム、アイレスブリー、バッキンガムシアー、ＨＰ２０　１ＢＲ、英国）へ移した。つぎにフィルターディスク上のＤＮＡを変性させ、記載のように（サムロックら１９８９）固定した。フィルターディスクを、つぎに予備ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１０ｍＭ　リン酸ナトリウムｐＨ７．０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、および０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ睾丸ＤＮＡ）を含有する密閉バッグ（４フィルター／バッグ）中に６０℃にて６時間置いた。つぎにそのフィルターをハイブリダイゼーション溶液（予備ハイブリダイゼーション溶液＋３２Ｐ−標識されたＧ−８ＤＮＡプローブ、配列番号７中に示す）中に、６０℃にて１２時間置いた。Ｇ−８ＤＮＡは、市販のマルチプライムキット（アマシャム、アイレスブリー、バッキンガムシアー、ＨＰ２０　１ＢＲ、英国）を用いて３２Ｐで標識した。つぎにフィルターを０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液中で６５℃にて２０分洗浄し、風乾して、２４時間オートラジオグラフィーフィルムにさらした。陽性のプラークを採取し、さらに２回スクリーニングを繰り返したのちに、ＭＣ−２と名付けられた遺伝子を含有する陽性プラークを単離した。
【０２２１】
完全長ＭＣ−２ＤＮＡのサブクローニングおよび配列決定
ＭＣ−２クローンのため、大きいスケールのラムダＤＮＡ調製を記載のように（サムロックら１９８９）行った。挿入物は、ＳａｃＩ酵素にて切り取った。これにより、すべてのコーディングと５´−非翻訳末端および３´−非翻訳末端の一部を含む２．４ｋｂ断片が取り出された。そのＳａｃＩ断片を、記載されている標準の方法（サムロックら１９８９）を用いて、ｐＧＥＭ５Ｚｆ（＋）ベクター（プロメガ社、マジソン、ウィスコンシン、アメリカ合衆国）のＳａｃＩ部位中にクローン化した。その結果えられたプラスミドＤＮＡｐＢ−ＭＣ−２（図７）を、つぎにコンピテントＤＨ５アルファ大腸菌（ビーアールエル、８４００　ヘルゲーマン・コート、ガイサーバーグ、メリーランド　２０８７７、アメリカ合衆国）中にトランスフェクトした。細菌のコロニーを、アンピシリンを含有する寒天プレート上で増殖させた。個々のコロニーをアンピシリン含有５ｍｌ　ＬＢ培地（サムロックら１９８９）中に採取し、一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡは記載のように（サムロックら１９８９）調製した。調製されたプラスミドＤＮＡを、正しい位置にＭＣ−２ＤＮＡが存在するかどうかについて点検した。つぎに正しい位置にＭＣ−２ＤＮＡを有して構築されたプラスミドを、さらに５００ｍｌ培養で増幅した。そのような大きいスケール標品からのプラスミドＤＮＡを、キアゲンキット（キアゲン社、１１７１２　モールパーク・ストリート、スタジオ・シティー、カリフォルニア　９１６０４、アメリカ合衆国）で調製した。コーディング配列全体および５’−非翻訳領域ならびに３’−非翻訳領域の小部分において、双方のＤＮＡ鎖を重複断片を作ることおよびプライマーウォーキングにより配列決定した。配列決定の方法は、チェーン・ターミネーション法であった（サンガーら１９７７）。クローン化されたＭＣ−２ＤＮＡは、配列番号１５に示す配列を有することがわかった。
【０２２２】
実施例７
ＭＣ−２ＤＮＡの発現ベクター中へのクローニング
発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロゲン社、３９８５　ソレント・バレー・ブルバード、♯Ｂ、サンジエゴ、カリフォルニア　９２１２１、アメリカ合衆国）は、４．５ｋｂでマルチファンクションの真核細胞発現ベクターである。これは、ヒトＣＭＶプロモーターおよび高レベル発現のためのエンハンサーを有する。
【０２２３】
ＭＣ−２ＤＮＡ（配列番号１０のヌクレオチド番号５２０からヌクレオチド番号１６２０まで）を、ｐＲＣ／ＣＭＶベクターのＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩの間の部位につなげた。その結果えられたプラスミドＤＮＡｐＥ−ＭＣ−２（図８）を、つぎにコンピテントＩＮＶαＦ´大腸菌中にトランスフェクトした。細菌のコロニーを、アンピシリンを含有する寒天プレート上で増殖させた。個々のコロニーを５ｍｌ　ＬＢ−アンピシリン培地（サムロックら１９８９）中に採取し、一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡは、記載のように（サムロックら１９８９）調製した。調製されたプラスミドＤＮＡを、正しい位置にＭＣ−２ＤＮＡが存在するかどうかについて点検した。つぎに正しい位置にＭＣ−２ＤＮＡを有して構築されたプラスミドを、さらに５００ｍｌ培養で増幅した。そのような大きいスケール調製品からのプラスミドＤＮＡを、キアゲンキット（キアゲン社、１１７１２　モールパーク・ストリート、スタジオ・シティー、カリフォルニア　９１６０４、アメリカ合衆国）で調製した。
【０２２４】
実施例８
ＭＣ−２ＤＮＡの発現およびその同一性の確立
ＣＯＳ−７細胞を８％ウシ胎児血清および非必須アミノ酸を含有するダルベッコ変形イーグル培地（ギブコ／ビーアールエル、８４００　ヘルゲーマン・コート、ガイサーバーグ、メリーランド　２０８７７、アメリカ合衆国）中で増殖させた。８０％コンフルエントな培養物を、無血清培地中、１μｇのｐＥ−ＭＣ−２プラスミドＤＮＡおよび４０μｇリポフェクチン（ビーアールエル、８４００ヘルゲーマン・コート、ガイサーバーグ、メリーランド　２０８７７、アメリカ合衆国）でトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後、血清含有培地に置き換えて、細胞を２０時間培養した。つぎに細胞をばらばらにしてはがし、遠心し、血清含有培地中に再懸濁し、４８穴プレート上にまいて、２４時間増殖させた。つぎにその細胞を０．３ｍｌの結合緩衝液（アールズ塩含有最小必要培地、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．０、０．２％ウシ血清アルブミン、１ｍＭ　１，１０−フェナンスロリン、１リットルあたり０．５ｍｇのロイペプチンおよび１リットルあたり２００ｍｇのバシトラシン）で洗浄し、２４，０００ｃｐｍの１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨおよび適当な濃度の非標識ペプチドを含有する０．３ｍｌの結合緩衝液で３７℃にて２時間インキュベートした。ＮＤＰ−ＭＳＨは、１２５ヨードで標識し（詳細は以下を参照のこと）、比放射能をモル濃度あたり８．６×１０４ｃｐｍにした。つぎにプレートを氷上に置き、細胞を０．３ｍｌの氷冷結合緩衝液で洗浄し、０．３ｍｌの０．１Ｎ　ＮａＯＨでプレートから分離した。放射能を計測し、データを放射性リガンド結合分析に適した、反復、非線型曲線用プログラムによって分析した（図９参照のこと）。一連のＰＯＭＣ（プローオピオメラノコルチン）由来ペプチド（サクソン・バイオケミカルズ社、ハノーバー、ドイツ国より購入）は、１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨのｐＥ−ＭＣ−２でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞への結合阻害において、差異のあるポテンシーを示した。テストされる各ペプチドのいくつかの（たとえば１０〜１２）濃度をテストし、細胞に結合していることがわかった計数のデータを、非線型回帰分析を用い、前に記載された方法（ベルグストレムおよびヴィックベルグ１９８６）を用いて４パラメーターロジスティック関数にあてはめることにより、結合親和性（Ｋｉ）のポテンシーおよびレシプロカルを決定した。そのＫｉの値をつぎに、前に記載された（チェンおよびプルソフ１９７３）ようにチェンとプルソフの等式を用いることにより概算したみかけのＩＣ−５０から計算した。その分析からわかったポテンシーの順序およびＫｉの値は、ＮＤＰ−ＭＳＨ（Ｋｉ＝５．１８±０．５４ｎＭ）＞α−ＭＳＨ（Ｋｉ＝９２８±３１４ｎＭ）＝ＡＣＴＨ（１〜３９）（Ｋｉ＝９２９±３８９ｎＭ）＞β−ＭＳＨ（Ｋｉ＝１．７５±０．６７μＭ）＞γ−ＭＳＨ（Ｋｉ＝３．４５±０．８８μＭ）であった。非メラノトロピンのＰＯＭＣペプチドβ−エンドルフィンは、発現されたＭＳＨレセプターに対して親和性を示さなかった。これらの結果は、クローン化された本発明のＭＣ−２ＤＮＡがメラノトロピックレセプターファミリーの新たな一員であることを明らかに示している。
【０２２５】
ＮＤＰ−ＭＳＨのヨード化：ヨードビーズ（ピアース、ロックフォード、イリノイ、アメリカ合衆国）を用い、１００ｍＭ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）中１０分間で、４ｍｇのペプチドＮＤＰ−ＭＳＨを、１μＣｉの１２５ヨードでヨード化した。つぎにヨードビーズを除いた溶液を、１５％アセトニトリル／０．０５Ｍ　酢酸アンモニウム　ｐＨ５．８で予備平衡化されたＣ−１８逆相クロマトグラフィー・カートリッジに付した。カートリッジを５ｍｌの予備平衡化緩衝液で洗浄し、つぎに蠕動ポンプを用いて流速１ｍｌ／分で溶出した。溶出勾配は、０．０５Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．８を含有する１５％から３５％のアセトニトリルであった。画分の１ｍｌを集め、各画分から２．５μｌをガンマカウンターで計測することにより放射能を測定した。画分２５から２９をためて、真空乾燥し、１ｍｌ水中に再溶解した。その放射能を計測し、比放射能を計算した。
【０２２６】
実施例９
ＰＣＲ分析によるＭＣ−２ＲＮＡ検出
ヒト脳組織（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（アメリカ合衆国）より購入）およびＷＭ２６６−４メラノーマ細胞（インビトロゲン社、アメリカ合衆国からのファストトラックキットにより作製）からのＲＮＡをスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ）ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（ビーアールエル、アメリカ合衆国）を用いて逆転写した。ＲＮＡ調製物中のゲノムＤＮＡ汚染の可能性を除くために、逆転写の前と後のサンプルについてＰＣＲを行った。５μｇのＲＮＡを逆転写に用い、つぎにそのすべてを鋳型として最初のＰＣＲに用いた。この最初のＰＣＲは、ＭＣ−２ＤＮＡの５’−および３’−非翻訳領域に特異的なプライマー（以下に１および２番として記載する）を用いて行った。この最初のＰＣＲ反応の１０パーセントをつぎに、クローンＭＣ−２のコーディング領域に特異的なプライマー（以下に３および４番として記載する）を用いた２回目のＰＣＲ反応に付した。
【０２２７】
プライマー１：５´−ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＧＴＡＧＧＣＴＧ
（配列番号１７）
プライマー２：５´−ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧ
（配列番号１８）
プライマー３：５´−ＣＴＧＣＡＴＴＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴ
（配列番号１９）
プライマー４：５´−ＡＡＧＣＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣ
（配列番号２０）
【０２２８】
ＰＣＲは、両方ともジーンアンプリフィケーションキット（Ｇｅｎｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ）（パーキン・エルマー・シータス、アメリカ合衆国）を用いて行った。用いたＰＣＲ熱プロファイルは、９３℃６０秒、５５℃４０秒および７２℃６０秒を全部で４０サイクルである。反応の５０％をアガロースゲル電気泳動により分析した。生成物は、期待された３８０ｂｐ位置に見られる（図１０）。
【０２２９】
実施例１０
配列番号２のポリペプチド配列を有するＭＳＨレセプターに対するポリクローナル抗体の作製
配列番号２のポリペプチドにもとづいた、以下の２つのペプチドを合成した：ペプチドＭ１−Ｙ、配列番号２のアミノ酸４から１９：
Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ
Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ
ペプチドＭ２−Ｙ、配列番号２のアミノ酸２５から３５：
Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ
Ａｒｇ　Ｃｙｓ
ペプチドは、マルチプルペプチドシステム（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｓｔｅｍ、アメリカ合衆国）により商業的に合成された。ＭＢＳ方法を用いることにより、合成ペプチドをサイログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（ＴＨＹ）にコンジュゲートさせた。この方法は、システイン含有ペプチドの遊離のスルフィドリル基を二価性の架橋剤ＭＢＳによりキャリアータンパクに連結させる。
【０２３０】
ウサギの免疫化
各ＴＨＹ−ペプチド（０．５ｍｇ）コンジュゲートを、別々にフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）（１：１）中に懸濁し、別々にＳＷＬラビットに注射した。３週間後、不完全アジュバント中０．５ｍｇのコンジュゲートを用いて追加のブースター注射をウサギに行った。そののち４週間の間隔をあけて、合計で４回ブースター注射を行うまで同じ手順でブースター注射を行った。最後の注射の後１２から１４日後に血清を採取した。免疫化前に、正常ウサギ血清（免疫前血清）の標本を各ウサギから採取した。すべての血清は、使用前の−８０℃での貯蔵のため等分した。
【０２３１】
抗体スクリーニング
それぞれＭＳＨレセプターを発現するまたは発現しない培養細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでコートされたスライドに２４時間接着させ、つぎにそのスライドをＰＢＳ中で穏やかに洗浄した。（ＭＳＨレセプター発現細胞としては、実施例３に記載した方法を用いてｐＥ−１１ＤでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を用いた。コントロールとしては、ＭＳＨレセプターを発現していない非トランスフェクトＣＯＳ−７細胞を用いた）。スライドに接着された細胞を４％パラホルムアルデヒド中２２℃にて１０分間固定し、そののちスライドをＰＢＳ中で２回洗浄した。つぎに細胞をＰＢＳ中０．２％トリトンＸ−１００の中で２２℃にて４分間インキュベートすることによって、浸透化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）したのち、再びスライドをＰＢＳ中で穏やかに５分の間隔をあけて３回洗浄した。つぎにスライドを１０％ウシ胎児血清中２２℃にて３０分間予備インキュベートし、そののち１０％ウシ胎児血清中、希釈（１：１００）免疫前血清または希釈（１：１００）抗血清のいずれかで２２℃にて６０分間インキュベートした。この手順ののち、スライドをＰＢＳ中で穏やかに５分の間隔をあけて３回洗浄した。つぎにスライドをＴＲＩＴＣ標識された抗ウサギ２次抗体（希釈１：４０）で２２℃にて６０分間インキュベートしたのち、再びスライドをＰＢＳ中で穏やかに５分の間隔をあけて３回洗浄した。つぎに、適切な波長のための適当なフィルターを用いて蛍光顕微鏡下で細胞を観察した。
【０２３２】
結果：
ＭＳＨレセプター発現細胞は、免疫前血清でテストされたとき、極めて少量の蛍光しか示さなかった（反応は、＋として分類される）。
【０２３３】
ＭＳＨレセプター発現細胞は、ペプチドＭ１−Ｙに対して作製された抗血清でテストされたとき、およびペプチドＭ２−Ｙに対して作製された抗血清でテストされたときの両方で、高い蛍光を示した（両方のケースで、反応は＋＋＋＋として分類される）。
【０２３４】
ＭＳＨレセプターを発現していないコントロール細胞は、ペプチドＭ１−ＹまたはペプチドＭ２−ｙに対して作製された抗血清でテストされたとき、極めて少量の蛍光しか示さなかった（反応は、両方のばあいにおいて＋として分類される）。
【０２３５】
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−　Ｍｕｒｐｈｙ，　ＪＲ，　Ｗ　Ｂｉｓｈａｉ，　Ｍ　Ｂｏｒｏｗｓｋｉ，　Ａ　Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，　Ｊ　Ｂｏｙｄ　＆　Ｓ　Ｎａｇｌｅ：　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　，　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，　ａｎｄ　ｍｅｌａｎｏｍａ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ　ｔｏｘｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　ａｌｐｈａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　１９８６，　８３，　８２５８８２６２．
−　Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，　ＪＪ：α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ．　Ａ　ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｗｉｔｈ　ｐｉｇｍｅｎｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ．　ＪＡＭＡ．　１９９１，　２６６，　２７５３−２７５４．
−　Ｒｅｉｄ，　ＲＬ，　Ｎ　Ｌｉｎｇ　＆　ＳＳＣ　Ｙｅｎ：　Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆα−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ａｎｄ　ｉｎ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ−ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　Ｍｅｔａｂ．　１９８４，　５８，　７７３−７７７．
−　Ｒｈｅｉｎｓ，　ＬＡ，　ＡＬ　Ｃｏｔｌｅｕｒ，　ＲＳ　Ｋｌｅｉｅｒ，　ＷＢ　Ｈｏｐｐｅｎｊａｎｓ，　ＤＮ　Ｓａｕｄｅｒ　＆　ＪＪ　Ｎｏｒｄｌｕｎｄ：　Ａｌｐｈａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｃｏｎｔａｃｔ　ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ　ｉｎ　Ｃ５７／ＢＬ６　ｍｉｃｅ．　ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　１９８９，　３，　２２８２−２２８４．
−　Ｒｏｓｅｓ，　ＤＦ，　ＮＳ　Ｋａｒｐ，　Ｒ　Ｏｒａｔｚ，　Ｎ　Ｄｕｂｉｎ，　ＭＮ　Ｈａｒｒｉｓ，　Ｊ　Ｓｐｅｙｅｒ，　Ａ　Ｂｏｙｄ，　ＦＭ　Ｇｏｌｏｍｂ，　Ｊ　Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ，　Ｍ　Ｄｕｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｗｉｔｈ　ｒｅｇｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｄｉｓｔａｎｔ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍｅｌａｎｏｍａ．　Ｓｕｒｇ．　Ｇｙｎｅｃｏｌ．　Ｏｂｓｔｅｔ．　１９９１，　１７２，　２６２−２６８．
−　Ｓａｎｋａｒａ−Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，　Ｒ　＆　Ｓ　Ｖｉｓｈｖｅｓｈｗａｒａ：　Ａ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｂｏｎｄｅｄ　ｃｈａｉｎ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ　ｂｙ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ　ａｐｐｒｏａｃｈ．　Ｊ　Ｂｉｏｍｏｌ　Ｓｔｒｕｃｔ　Ｄｙｎ．　１９８９，　７，　１８７−２０５．
−　Ｔａｔｒｏ，　ＪＢ，　Ｍ　Ａｔｋｉｎｓ，　ＪＷ　Ｍｉｅｒ，　Ｓ　Ｈａｒｄａｒｓｏｎ，　Ｈ　Ｗｏｌｆｅ，　Ｔ　Ｓｍｉｔｈ，　ＭＬ　Ｅｎｔｗｉｓｔｌｅ　＆　Ｓ　Ｒｅｉｃｈｌｉｎ：　Ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ．　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ．　１９９０ａ，　８５，　１８２５−１８３２．
−　Ｔａｔｒｏ，　ＪＢ，　Ｚ　Ｗｅｎ，　ＭＬ　Ｅｎｔｗｉｓｔｌｅ，　ＭＢ　Ａｔｋｉｎｓ，　ＴＪ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｓ　Ｒｅｉｃｈｌｉｎ　＆　ＪＲ　Ｍｕｒｐｈｙ：　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｌｐｈａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｔｏｘｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９９２，　５２，　２５４５−２５４８．
−　Ｖｅｉｔｈ，　ＪＬ，　ＣＡ　Ｓａｎｄｍａｎ，　ＪＭ　Ｇｅｏｒｇｅ　＆　ＶＣ　Ｓｔｅｖｅｎｓ：　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＭＳＨ／ＡＣＴＨ　４−１０　ｏｎ　ｍｅｍｏｒｙ，　ａｔｔｅｎｔｉｏｎ，　ａｎｄ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｗｏｍｅｎ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．
Ｂｅｈａｖ．　１９７８，　２０，　４３−５０．
−　Ｗａｒｄ，　ＭＭ，　ＣＡ　Ｓａｎｄｍａｎ，　ＪＭ　Ｇｅｏｒｇｅ　＆　Ｈ　Ｓｈｕｌｍａｎ：　ＭＳＨ／ＡＣＴＨ　４−１０　ｉｎ　ｍｅｎ　ａｎｄ　ｗｏｍｅｎ：　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｕｐｏｎ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　ａｔｔｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｍｏｒｙ　ｔａｓｋ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｂｅｈａｖ．　１９７９，　２２，　６６９−６７３．
−　Ｗｅｎ，　ＺＬ，　Ｘ　Ｔａｏ，　Ｆ　Ｌａｋｋｉｓ，　Ｔ　Ｋｉｙｏｋａｗａ　＆　ＪＲ　Ｍｕｒｐｈｙ：　Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ　ｔｏｘｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　ａｌｐｈａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｔｏｘｉｎ．　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｉｎ−ｆｒａｍｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｒ３８７　ｔｏ　Ｈｉｓ４８５　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｈｉｇｈｌｙ　ｐｏｔｅｎｔ　ｆｕｓｉｏｎ　ｔｏｘｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　１９９１，　２６６，　１２２８９−１２２９３．
−　Ｌｅｖｉｎｅ，　Ｎ，　Ｓｈｅｆｔｅｌ，　ＳＮ，　Ｅｙｔａｎ，　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｋｉｎ　ｔａｎｎｉｎｇ　ｂｙ　ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｏｔｅｎｔ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎ．　ＪＡＭＡ　１９９１，　２６６，　２７３０−２７３６．
−　Ｈｉｂｅｒｔ，　ＭＦ，　Ｋａｌｌｍｅｙｅｒ，　ＳＴ，　Ｂｒｕｉｎｖｅｌｓ，　Ａ　ａｎｄ　Ｈｏｆｌａｃｋ，　Ｊ：　Ｔｈｒｅｅｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ　Ｇ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　１９９１，　４０，　８−１５．
−　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ　Ｆ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　−　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ．　１９８９．
−　Ｗｒｉｇｈｔ，　ＭＳ，　Ｇａｕｔｖｉｋ，　ＶＴ，　Ｇａｕｔｖｉｋ，　ＫＭ：　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．　Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　１９９２，　１２６，　９７−１０４．
−　Ｘｉｅ，　Ｇ−Ｘ，　Ｍｉｙａｊｉｍａ，　Ａ，　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，　Ａ：　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｖｅｎ−ｈｅｌｉｘ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ　ｗｉｔｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｆｏｒ　ｏｐｉｏｉｄ　ｌｉｇａｎｄｓ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　１９９２，　８９，　４１２４４１２８．
−　Ｊｕｌｉｕｓ，　Ｄ，　ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔ，　ＡＢ，　Ａｘｅｌ，　Ｒ，　Ｊｅｓｓｅｌ，　ＴＭ：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ　１ｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９８８，　２４１，　５５８−５６４．
−　Ｍａｓｕ，　Ｙ，　Ｎａｋａｙａｍａ，　Ｋ，　Ｔａｍａｋｉ，　Ｈ，　Ｈａｒａｄａ，　Ｙ，　Ｋｕｎｏ，　Ｍ，　Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，　Ｓ：　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ−Ｋ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｏｏｃｙｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ．　Ｎａｔｕｒｅ　１９８７，　３２９，　８３６−８３８．
−　Ｔｉｎｄａｌｌ，　ＫＲ　ａｎｄ　Ｋｕｎｋｅｌ，　ＴＡ：　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　Ｔｈｅｒｍｕｄ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＤＮＡ　ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９８８，　２７，　６００８−６０１３．
−　Ｔａｔｒｏ，　ＪＢ　ａｎｄ　Ｒｅｉｃｈｌｉｎ，　Ｓ：　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ａｌｐｈａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｒｅ　ｗｉｄｅｌｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　ｒｏｄｅｎｔｓ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　１９８７，　１２１，　１９００−１９０７
−　Ｔａｔｒｏ，　ＪＢ，　Ｅｎｔｗｉｓｔｌｅ，　Ｍ　Ｌ，　Ｌｅｓｔｅｒ，　Ｂ　Ｒ　ａｎｄ　Ｒｅｉｃｈｌｉｎ，　Ｓ：　Ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｏｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｔｕｍｏｕｒｓ　ｉｎ　ｓｉｔｕ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１９９０ｂ　５０，　１２３７−１２４２
−　Ｌｅｒｎｅｒ，　Ａ　Ｂ，　Ｍｏｅｌｌｍａｎｎ，　Ｇ，　Ｖａｒｇａ，　Ｊ　Ｍ，　Ｈａｌａｂａｎ，　Ｒ　ａｎｄ　Ｐａｗｅｌｅｋ，　Ｊ：　Ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｏｎ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ．　Ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，　１９８９，　６，　１８７−１９７
−　Ａｂｄｅｌ−Ｍａｌｅｋ，　Ｚ，　Ｈａｄｌｅｙ，　Ｍ　Ｅ，　Ｂｒｅｇｍａｎ，　Ｍ　Ｄ，　Ｍｅｙｓｋｅｎｓ，　Ｆ　Ｌ　ａｎｄ　Ｈｒｕｂｙ，　Ｖ　Ｊ：　Ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎｓ　ｏｎ　ｍｏｕｓｅ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．　Ｊ．　Ｎａｔｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．，　１９８６，　７６，　８５７−８６３．
−　Ｈａｒｔ，　Ｉ　Ｒ，　Ｒａｏ，　Ｊ　ａｎｄ　Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｒ　Ｅ：　ｃＡＭＰ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃ−ｆｏｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ　ｏｒｉｇｉｎ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９８９，　１５０，　４０８−４１３
−　Ｍａｃ　Ｎｅｉｌ，　Ｓ，　Ｄｏｂｓｏｎ，　Ｊ，　Ｂｌｅｅｈｅｎ，　Ｓ　Ｓ　ａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｙ，　Ｊ　Ａ：　ＭＳＨ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｉｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ．　Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，　１９９０，　１２３，　８２８
−　Ｂｕｆｆｅｙ，　Ｊ，　Ｔｈｏｄｙ，　Ａ　Ｊ，　Ｂｌｅｅｈｅｎ，　Ｓ　Ｓ　ａｎｄ　Ｍａｃ　Ｎｅｉｌ，　Ｓ：　ａｌｐｈａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｍｕｒｉｎｅ　Ｂ１６　ｍｅｌａｎｏｍａ．　Ｊ．　ｏｆ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　１９９２，　１３３，　３３３−３４０
−　Ａｌｌｅｎ，　Ｌ　Ｆ，　Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，　Ｒ　Ｊ，　Ｃａｒｏｎ，　Ｍ　Ｇ　ａｎｄ　Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ，　Ｓ：　Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｇｅｎｅｓ　ａｓ　ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅｓ：　Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｌｐｈａ　１ｂ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　１９９１，　８８，　１１３５４−１１３５８
−　Ｊｕｌｉｕｓ，　Ｄ，　Ｌｉｖｅｌｌｉ，　Ｔ　Ｊ，　Ｊｅｓｓｅｌ，　Ｔ　Ｍ　ａｎｄ　Ａｘｅｌ，　Ｒ：　Ｅｃｔｏｐｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ　１ｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９８９，　２４４，　１０５７−１０６２
−　Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，　Ｒ　Ｍ，　Ｐａｃｋｅｒ，　Ｓ　ａｎｄ　Ｗｏｌｆ，　Ａ　Ｐ，　ｅｔ　ａｌ．：　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｃｕｌａｒ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｗｉｔｈ　４−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）−７−（１２３Ｉ）−ｉｏｄｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ．　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．，　１９８４，　２５，　８００−８０４
−　Ｃｏｄｅｒｒｅ，　Ｊ　Ａ，　Ｐａｃｋｅｒ，　Ｓ　ａｎｄ　Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ，　Ｒ　Ｇ，　ｅｔ　ａｌ．：　Ｉｏｄｏｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ　ａｓ　ａ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ　ａｇｅｎｔ．　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．，　１９８６，　２７，　１１５７−１１６４
−　Ｍｉｃｈｅｌｏｔ，　Ｊ　Ｍ，　Ｍｏｒｅａｕ，　Ｍ　Ｃ，　Ｌａｂａｒｒｅ，　Ｐ　Ｇ，　ｅｔ　ａｌ．：　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｗ　ｉｏｄｉｎｅ−１２５　ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ａｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｔｒａｃｅｒｓ　ｆｏｒ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍｅｌａｎｏｍａ．　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．，　１９９１，　３２，　１５７３−１５８０
−　Ｅａｒｙ，　Ｊ　Ｆ，　Ｓｃｈｒｏｆｆ，　Ｒ　Ｗ，　Ａｂｒａｍｓ，　Ｐ　Ｇ，　ｅｔ　ａｌ．：　Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｏｆ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｗｉｔｈ　ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ−ｌａｂｅｌｌｅｄ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．，　１９８９，　３０，　２５−３２
−　Ｌａｒｓｏｎ，　Ｓ　Ｍ：　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｔｕｍｏｒｓ　ｂｙ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ　ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．，　１９９１，　３２，　２８７−２９１
−　Ｍｕｌｌｉｇａｎ，　Ｔ　Ｍ　ａｎｄ　Ｓｏｗｅｒｓ，　Ｊ　Ｒ：　Ｈｙｐｅｒｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ，　ｖｉｔｉｌｉｇｏ　ａｎｄ　Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ．　Ｃｕｔｉｓ，　１９８２，　２６，　３１７−３２２
−　Ｌｅｒｎｅｒ，　Ａ　Ｂ　ａｎｄ　ＭｃＧｕｉｒｅ，　Ｊ　Ｓ：　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｌｐｈａ−　ａｎｄ　ｂｅｔａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｋｉｎ　ｃｏｌｏｕｒ　ｏｆ　ｍａｎ．　Ｎａｔｕｒｅ，　１９６１，　１８９，　１７６−１７９
−　Ｋｉｎｇ，　Ｒ　Ａ　ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｓ，　Ｃ　Ｇ　：　Ａｌｂｉｎｉｓｍ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．　Ｃｌｉｎ．，　１９８８，　６，　２１７−２２８
−　Ｋｙｔｅ，　Ｊ　ａｎｄ　Ｄｏｌｉｔｔｌｅ，　Ｆ　Ｆ　：　Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１９８２，　１５７，　１０５−１３２
−　Ｋｏｅｈｌｅｒ，　Ｇ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ：　Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｆｕｓｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．　Ｎａｔｕｒｅ，　１９８５，　２５６，　４９５−４９７
−　Ｈｕｓｅ，　Ｗ　Ｄ，　Ｓａｓｔｒｙ，　Ｌ，　Ｉｖｅｒｓｏｎ，　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．：　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｌａｒｇｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｉｎ　ｐｈａｇｅ　ｌａｍｂｄａ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９８９，　２４６，　１２７５−１２８１
−　Ｓｐｉｒｉｎ，　Ａ　Ｓ，　Ｂａｒａｎｏｖ，　Ｖ　Ｉ，　Ｒｙａｂｏｖａ，　Ｌ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．：　Ａ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ｈｉｇｈ　ｙｉｅｌｄ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９８８，　２４２，　１１６２−１１６４
−　Ｚｏｚｕｌｙａ，　Ｓ　Ａ，　Ｇｕｒｅｖｉｃｈ，　Ｖ　Ｖ，　Ｚｖｙａｇａ，　Ｔ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．：　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｖｉｓｕａｌ　ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ．　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　１９９０，　３，　４５３−４５８
−　Ａｌｌｅｎ，　Ｊ　Ｐ，　Ｆｅｈｅｒ，　Ｇ，　Ｙｅａｔｅｓ，　Ｔ　Ｏ，　ｅｔ　ａｌ．：　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｃｅｎｔｅｒ　ｆｒｏｍ　Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ　Ｒ−２６：　ｔｈｅ　ｃｏｆａｃｔｏｒｓ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　１９８７，　８４，　５７３０−５７３４
−　Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，　Ｒ，　Ｂａｌｄｗｉｎ，　Ｊ　Ｍ，　Ｃｅｓｋａ，　Ｔ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．：　Ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｃｒｙｏ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．
Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１９９０，　２１３，　８９９−９２９
−　Ｓａｎｇｅｒ，　Ｆ，　Ｎｉｃｋｌｅｎ，　Ｓ　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ，　Ａ　Ｒ：　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　１９７７，　７４，　５４６３−５４６７
−　Ｋｏｚａｋ，　Ｍ：　Ａｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：　Ａｎ　ｕｐｄａｔｅ．　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　１９８９，　１０８，　２２９
−　Ｋｅｎｎｅｌｙ，　Ｐ　Ｊ　ａｎｄ　Ｋｒｅｂｓ，　Ｅ　Ｇ．　Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｓ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　１９９１，　２６６，　１５５５５−１５５５８
−　Ｓｉｅｇｒｉｓｔ，　Ｗ，　ｅｔ　ａｌ．：　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ａｌｐｈａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｏｎ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１９８９，　４９，　６３５２−６３５８
−　Ｓｕｎａｈａｒａ，　Ｒ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｈｕｍａｎ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　Ｄ１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ａｎ　ｉｎｔｒｏｎｌｅｓｓ　ｇｅｎｅ　ｏｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　５．　Ｎａｔｕｒｅ，　１９９０，　３４７，　８０−８３
−　Ａｋｔｏｒｉｅｓ，　Ｋ　＆　ＫＨ　Ｊａｋｏｂｓ：　Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ　ａｎｄ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ　ａ　ＧＴＰａｓｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ｖｉａ　ａｌｐｈａａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒｓ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ．　１９８１，　１３０，　２３５−２３８．
−　Ｖａｃｈｏｎ，　Ｌ，　Ｔ　Ｃｏｓｔａ　＆　Ａ　Ｈｅｒｔｚ：　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｂａｓａｌ　ａｎｄ　ｏｐｉｏｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｌｏｗ　Ｋｍ　ＧＴＰａｓｅ　ｔｏ　ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎａｌｏｇｓ．　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　１９８６，　４７，　１３６１−１３６９．
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−　Ｒａｄｕｎｚ，　ＨＥ　：　Ｖｏｍ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｚｕｍ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ−Ｍｏｄｅｒｎｅ　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｗｉｒｋｓｔｏｆｆ−Ｆｉｎｄｕｎｇ．　Ｐｈａｒ．　Ｕｎｓｅｒ　Ｚｅｉｔ．　１９８８，　１７，　１６１−１７６．
−　Ｂｕｒｃｈｉｌｌ，　ＳＡ，　ＪＭ　Ｍａｒｋｓ　＆　ＡＪ　Ｔｈｏｄｙ：　Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｋｉｎ　ｔｙｐｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｌｐｈａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ．　Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．　１９９０，　９５，　５５８−６１．
−　Ｔｒａｉｆｆｏｒｔ，　Ｅ　ａｎｄ　Ｒｕａｔ，　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｌｏｎｅｄ　ｒａｔ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　Ｈ２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍｅｄｉａｔｉｎｇ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ　ｃＡＭＰ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　１９９２，　８９，　２６４９−２６５３．
−　Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ，　Ｔ，　Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，　Ｍ　ａｎｄ　Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，　Ｌ：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｄｕａｌ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｏ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ　ｂｒｅａｋｄｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃａ２＋　ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　１９９２，　２６７，　４４７９−４４８８．
−　Ｄｅ　Ｗｉｅｄ，　Ｄ：　Ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎｓ　ａｓ　ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．　Ｉｎ：　Ｔｈｅ　ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　（Ｅｄ．　Ｈ　Ｖａｕｄｒｙ　ａｎｄ　ＡＮ　Ｅｂｅｒｌｅ）：　Ａｎｎ．　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．　１９９３，　６８０，　２０−２８．
−　Ｓｔｒａｎｄ，　ＦＬ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎｓ　ａｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ．　Ｉｎ：　Ｔｈｅ　ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　（Ｅｄ．　Ｈ　Ｖａｕｄｒｙ　ａｎｄ　ＡＮ　Ｅｂｅｒｌｅ）：　Ａｎｎ．　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．　１９９３，　６８０，　２９−５０．
−　Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，　ＤＪ：　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ，　ｐｒｏｂｌｅｍｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｉｓｅｓ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　Ｂｉｏｌ．　ｖｏｌ　１７，　１，　４９−５５，　１９９０．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｒａｄｉａｔ．　Ａｐｐｌ．　Ｉｎｓｔｒｕｍ．　Ｐａｒｔ　Ｂ．
−　Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ，　ＡＥ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｅ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｉｔｈｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ　９９ｍ　ｗｉｔｈ　ａ　ｄｉａｍｉｄｅ　ｄｉｔｈｉｏｌａｔｅ　ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　１９８８，　８５，　４０２５−４０２９．
【０２３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アガロースゲル電気泳動分析。レーン１−分子量マーカー。レーン２−実施例１に記載のＰＣＲ反応。３つのＤＮＡ産生物が７０５ｂｐ、５０１ｂｐおよび３７２ｂｐに見られる。３７２ｂｐ位置のバンドは、のちにヒトＭＳＨレセプターをコードする完全長の断片をクローン化するのに用いられた。
【図２】ＧＥ４　ｍＲＮＡの組織分布の、ノーザンブロット分析。異なる組織、すなわち脳（レーン２）、胸腺（レーン３）、副甲状腺（レーン４）、耳下腺（レーン５）、唾液腺（レーン６）、副腎（レーン７）、睾丸（レーン８）、肝臓（レーン９）、肺（レーン１０）、心臓（レーン１１）、脾臓（レーン１２）、骨格筋（レーン１３）、腸（レーン１４）、結腸（レーン１５）およびＷＭ２６６−４ヒトメラノーマ細胞（レーン１６）からの１０μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを電気泳動で分離し、膜上にブロットした。つぎに、それを３２Ｐ−標識されたＧＥ４プローブとハイブリダイゼーションした。見られるように、陽性のバンドは、ＷＭ２６６−４ヒトメラノーマ細胞に対応するレーン１６にのみ見られた。ＧＥ４ＤＮＡは、のちにＭＳＨレセプターコードをコードする断片の一部に見い出された。詳細は、実施例１を参照のこと。
【図３】ｐＢ−１１Ｄのプラスミド地図である。
【図４】ｐＥ−１１Ｄのプラスミド地図である。
【図５】ＷＭ２６６−４ヒトメラノーマ細胞に結合している１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨである。
【図６】図６、ＭＳＨレセプターｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣから入手可能）への１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨの結合を阻害するメラノトロピンの相対ポテンシー。
【外２】
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実験手順は、実施例２および３に記載する。各点は、４回測定の平均値を示す。非特異的結合は、全結合の８パーセントより少なかった。
【図７】図７、ｐＢ−ＭＣ−２のプラスミド地図である。
【図８】図８、ｐＥ−ＭＣ−２のプラスミド地図である。
【図９】図９、ｐＥ−ＭＣ−２のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣから入手可能）への１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨの結合を阻害するメラノトロピンの相対ポテンシー。
【外３】
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実験手順は、実施例７および８に記載する。各点は、４回測定の平均値を示す。非特異的結合は、全結合の８パーセントより少なかった。
【図１０】図１０、ヒト脳およびメラノーマ細胞ｍＲＮＡから作られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動分析。レーン１−分子量マーカー、レーン２−逆転写なしのヒト脳ｍＲＮＡ、レーン３−逆転写後のヒト脳ｍＲＮＡ、レーン４−逆転写なしのヒトメラノーマ細胞ｍＲＮＡ、レーン５−逆転写後のヒトメラノーマ細胞ｍＲＮＡ。期待された３８０ｂｐの位置の特定の産物は、逆転写後のヒト脳サンプルのみに見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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