(57)【要約】【課題】コリネ型細菌にメタノールの利用能力を付与し、メタノールを発酵原料としてアミノ酸等の発酵生産物を産生する能力を有する新規細菌を提供する。【解決手段】目的物質を産生する能力を有するコリネ型細菌を培地に培養し、培地又は細菌細胞内に目的物質を生成、蓄積させ、培地又は細菌細胞から目的物質を採取する、コリネ型細菌を利用した目的物質の製造法において、前記細菌として、メタノール脱水素酵素遺伝子が導入され、ヘキシュロースフォスフェートシンターゼ及びホスホヘキシュロイソメラーゼの活性が増強され、かつメタノールの利用能力を付与又は増強されたコリネ型細菌を用い、前記培地としてメタノールを炭素源として含む培地を用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質を産生する能力を有するコリネ型細菌を培地に培養し、培地又は同細菌細胞内に目的物質を生成、蓄積させ、培地又は細菌細胞から目的物質を採取する、コリネ型細菌を利用した目的物質の製造法において、前記コリネ型細菌はメタノール脱水素酵素遺伝子、ヘキシュロースフォスフェートシンターゼ遺伝子及びホスホヘキシュロイソメラーゼ遺伝子が導入され、かつメタノールの利用能力を付与されるように改変されたコリネ型細菌であり、前記培地はメタノールを炭素源として含むことを特徴とする、目的物質の製造法。
【請求項２】
前記細菌が、さらにメタノール脱水素酵素の活性促進因子をコードする遺伝子が導入されたコリネ型細菌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
目的物質がＬ−アミノ酸である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記細菌がコリネバクテリウム属細菌である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである請求項５記載の方法。
【請求項７】
メタノール脱水素酵素遺伝子、ヘキシュロースフォスフェートシンターゼ遺伝子及びホスホヘキシュロイソメラーゼ遺伝子が導入され、かつメタノールの利用能力を付与されるように改変されたコリネ型細菌。
【請求項８】
さらにメタノール脱水素酵素の活性促進因子をコードする遺伝子が導入された請求項７記載のコリネ型細菌。
【請求項９】
コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である請求項８記載のコリネ型細菌。
【請求項１０】
コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである請求項９記載のコリネ型細菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、メタノール利用能力は本来有していないか、又はメタノール利用能力が低い微生物に、メタノール利用能力を付与又は増強する技術、および、当該技術によって得られた微生物を用いて、メタノールを利用して目的物質を製造する方法に関するものである。
【０００２】
本発明により生産される物質とは、Ｌ−アミノ酸、核酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質など、従来より微生物により生産されてきたものである。
【０００３】
【従来の技術】
現在まで、微生物による有用生産物の製造において、その発酵原料として利用されるのは、農産物に由来する糖質がほとんどである。しかしながら、今後農産物に由来する糖価格は上昇の傾向にあるため、その代替発酵原料として安価な良質原料が求められている。
【０００４】
メタノールは水に溶解しやすく、安価で高純度である。また天然ガスの主成分であるメタンから比較的容易に製造でき、物質生産の原料として魅力的である。メタノールを微生物の発酵原料として用いれば、主原料費を削減できるだけでなく、生産物の発酵液からの精製や、廃液処理プロセスを簡略化でき、トータルの製造コストを低減できる。
【０００５】
メタノールを原料にして微生物を用いて物質生産、特にアミノ酸を製造するプロセスに関しては、既にアクロモバクター属およびシュードモナス属の微生物を用いる方法（特許文献１）、プロタミノバクター属またはメタノモナス属の微生物を用いる方法（特許文献２）、メチロバチルス属の微生物を用いる方法（特許文献３）、メチロトロフィックバチルスを用いる方法（特許文献４、５）などが知られている。しかしながら、いずれの菌株も、まだ実用菌としての高いアミノ酸の生産性を獲得するに至っていない。
【０００６】
一方、グルコースからアミノ酸を製造する方法としては、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、あるいはエシェリヒア属の微生物を用いる方法が主流となっている（非特許文献１）。これらのアミノ酸生産菌は、その発見から実用菌の育種に至る長い歴史の過程で、アミノ酸の生産効率を最大にすべく、様々な変異が導入され、育種されてきた貴重な菌株である。しかしながら、これらの工業化されている菌株は、メタノールを利用できない微生物である。
【０００７】
【特許文献１】
特公昭４５−２５２７３号公報
【特許文献２】
特開昭５０−２５７９０号公報
【特許文献３】
特開平４−９１７９３号公報
【特許文献４】
特開平３−５０５２８４号公報
【特許文献５】
米国特許第６０８３７２８号
【非特許文献１】
「アミノ酸発酵」相田浩  他編（学会出版センター）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、本来、糖類の利用はできるが、メタノールは利用できないコリネ型細菌に、メタノールの利用能力を付与又は増強し、メタノールを発酵原料としてアミノ酸をはじめとする発酵生産物を産生する能力を有する新規コリネ型細菌、及び、同細菌を用いてメタノールから目的物質を製造する方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、コリネ型細菌にメタノール脱水素酵素遺伝子を導入し、さらにヘキシュロースフォスフェートシンターゼ遺伝子及びホスホヘキシュロイソメラーゼ遺伝子をも導入し、それらを発現させることにより、同細菌にメタノール利用能力を付与することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１０】
（１）目的物質を産生する能力を有するコリネ型細菌を培地に培養し、培地又は同細菌細胞内に目的物質を生成、蓄積させ、培地又は細菌細胞から目的物質を採取する、コリネ型細菌を利用した目的物質の製造法において、前記コリネ型細菌はメタノール脱水素酵素遺伝子、ヘキシュロースフォスフェートシンターゼ遺伝子及びホスホヘキシュロイソメラーゼ遺伝子が導入され、かつメタノールの利用能力を付与されるように改変されたコリネ型細菌であり、前記培地はメタノールを炭素源として含むことを特徴とする、目的物質の製造法。
（２）前記細菌が、さらにメタノール脱水素酵素の活性促進因子をコードする遺伝子が導入されたコリネ型細菌である、（１）の方法。
（３）目的物質がＬ−アミノ酸である（１）または（２）の方法。
（４）Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである（３）の方法。
（５）前記細菌がコリネ型細菌である（４）の方法。
（６）前記コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである（５）の方法。
（７）メタノール脱水素酵素遺伝子、ヘキシュロースフォスフェートシンターゼ遺伝子及びホスホヘキシュロイソメラーゼ遺伝子が導入され、かつメタノールの利用能力を付与されるように改変されたコリネ型細菌。
（８）さらにメタノール脱水素酵素の活性促進因子をコードする遺伝子が導入された（７）のコリネ型細菌。
（９）コリネ型細菌がコリネバクテリウム属である（７）のコリネ型細菌。
（１０）コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである（９）のコリネ型細菌。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のコリネ型細菌は、メタノール脱水素酵素遺伝子が導入され、更にヘキシュロースフォスフェートシンターゼ遺伝子及びホスホヘキシュロイソメラーゼ遺伝子が導入され、かつメタノールの利用能力を付与されるように改変されたコリネ型細菌である。
【００１２】
メタノールを利用できる微生物は、メタノールの酸化酵素（例えばメタノール脱水素酵素）を有し、そして、その酸化により生成するフォルムアルデヒドを、精巧な代謝調節により、異化および同化している。これはフォルムアルデヒドが、生体にとって極めて毒性が強いため、細胞はそれを速やかに炭素源やエネルギー源として利用するか、もしくは解毒して処理する必要があるためである。翻って、メタノールを利用できない微生物に、メタノール利用能力を付与することを考えると、当然ながら、メタノール酸化酵素の導入は必須であるが、その活性発現の為に生じたフォルムアルデヒドを適切に処理するための具体的方策が乏しく、任意の微生物へのメタノール利用能付与は不可能と考えられていた。
【００１３】
しかし、本発明者らは、本来、メタノールを利用できない微生物、とりわけコリネ型細菌であってもメタノール酸化能を有する酵素を菌体に存在させ、更に、ヘキシュロースフォスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びホスホヘキシュロイソメラーゼをコードする遺伝子を同時に、菌体内へ導入し、それら遺伝子を発現させることにより、メタノール利用能力を付与しうる事を見出した。
【００１４】
本発明に用いるコリネ型細菌として具体的には、本発明の細菌に特徴的な上記性質を付与し得るコリネ型細菌であれば特に制限されない。コリネ型細菌としては、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ４１，  ２５５  （１９８１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含み、具体的には以下のものが例示される。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００１５】
具体的には、発酵生産物がＬ−スレオニンの場合は、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ＡＪ１２３１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１７２）（米国特許第５，１８８，９４９号参照）等であり、Ｌ−リジンの場合は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＪ１２４３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２９４）（米国特許第５，３０４，４７６号）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＪ３９９０（ＡＴＣＣ３１２６９）（米国特許第４，０６６，５０１号参照）、及び後述するＡＪ１１０１３５株等であり、Ｌ−グルタミン酸の場合は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２８２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１７２）（特開平５−２６８１１号、フランス特許出願公開第２，７０１，４８９号）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２４７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２９２２）（米国特許第５，２７２，０６７号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１３０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１８９）（ＪＰ  ９５／０１５８６号国際公開パンフレット参照）等であり、Ｌ−ロイシンの場合はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＪ３７１８（ＦＥＲＭ  Ｐ−２５１６）（米国特許第３，９７０，５１９号参照）等であり、Ｌ−イソロイシンの場合はブレビバクテリウム・フラバム  ＡＪ１２１４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９）（米国特許第４，６５６，１３５号参照）等であり、Ｌ−バリンの場合は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＪ１２３４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１７６３）（米国特許第５，１８８，９４８号参照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場合は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＪ１２６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１６０）（フランス特許出願公開第  ２，６８６，８９８号参照）等である。
【００１６】
本発明者らは、鋭意研究した結果、メタノール利用能を賦与する基本的な条件として、メタノール脱水素酵素活性を菌体内で十分に発揮させること、そして同酵素反応により生成するホルムアルデヒドを同化する機能をも同時に発揮するということに想到した。また、ホルムアルデヒドの有効な同化には、リブロースモノ燐酸経路の鍵酵素であるヘキシュロースホスフェートシンターゼ（ＨＰＳ）とホスホヘキシュロイソメラーゼ（ＰＨＩ）の酵素活性増強が有効であると、本発明者らは考えた。そして、メタノール脱水素酵素遺伝子をコリネ型細菌に導入し、さらに、ＨＰＳ及びＰＨＩの活性を発現する遺伝子も併せて導入することによって、本来メタノールを利用できないコリネ型細菌にメタノール利用能を付与しうることを見い出した。
【００１７】
本発明に用いるメタノール脱水素酵素（ＭＤＨ，  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、メタノールを酸化しホルムアルデヒドに転換できる酵素活性をもつ酵素である。本発明に用い得るＭＤＨとしては、例えば、主にグラム陰性の微生物で見られるＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）−依存型のＭＤＨが挙げられる。具体的にはメチロバクテリウム・イクストーケンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）ＡＭ１株（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１１９巻：９７−１０６（１９９２年））のＭＤＨ等が挙げられる。あるいは、グラム陽性の微生物で見られるＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）−依存型のＭＤＨ、具体的にはバチルス・メタノリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７４巻：５３４６−５３５３（１９９２年））のＭＤＨやバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＳＭ２３３４株に由来するアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ２５２巻：６６１−６６６（１９８８年））などが挙げられる。更には、牛の肝臓中（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  １００巻：３４−４６  （１９６６年））やヒトの肝臓中（Ａｒｃｈ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ７２巻：６０４−６０７（１９９８年））のＡＤＨが挙げられる。また、本来はメタノールに作用しないアルコール脱水素酵素の基質特異性を改変し、メタノールに対しても有意に作用する変異型のアルコール脱水素酵素を、その遺伝子に変異を導入する事で、新規に創製しても用いることができる。しかし、本発明に好適に用いることのできるＭＤＨとして具体的には、例えばメタノール資化性バチルスであるバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＮＣＩＭＢ  Ｎｏ．１２５２４に由来するＭＤＨが挙げられる。
【００１８】
ＭＤＨをコードする遺伝子（ｍｄｈ）は、ＭＤＨを産生する微生物から、通常の遺伝子のクローニング法として同様にして取得することができる。例えば、バチルス・ブレビスＳ１株（ＮＣＩＭＢ  １２５２４）染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）によって、ＭＤＨ遺伝子を取得することができる。遺伝子のクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１．２１（１９８９）に記載されている。尚、ＭＤＨ遺伝子が同遺伝子を導入したコリネ型細菌で機能していることは、細菌の溶菌液のＭＤＨ活性を測定することにより確認することができる。ＭＤＨ活性は、例えば、メタノールからホルムアルデヒドへの酸化に伴う、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の還元化を、波長３４０ｎｍ光の吸光度を測定する方法によって測定することができる。
【００１９】
本発明に用いるｍｄｈ遺伝子の具体例として、バチルス  ブレビスＳ１株のｍｄｈ遺伝子が挙げられる。バチルス  メタノリカスＣ１株のｍｄｈ遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｍ６５００４（エントリーネームＢＡＣＭＤＨ）として登録されている。
【００２０】
尚、メタノール脱水素の活性を活性化する因子（Ａｍｄ：Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の存在が報告されている。例えば、バチルス・メタノリカスＣ１株のメタノール脱水素酵素の活性化因子（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４４巻：４２６−４３３（１９９７年））やバチルス・スブチリス１６８株のｙｑｋＧ遺伝子産物（特開２０００−６９９７６号）である。これらの使用はＭＤＨの活性増強に有効な手段である。これらのＭＤＨ活性促進因子をコードするＤＮＡ（ａｍｄ遺伝子）をＭＤＨ遺伝子を保持するコリネ型細菌に導入することによって、同細菌細胞内のＭＤＨ活性を高めることができる。Ａｍｄをコードする遺伝子（ａｍｄ）、例えばｙｑｋＧ遺伝子は、バチルス・ズブチリス、例えばバチルス  ズブチリス１６８株の染色体ＤＮＡから、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号１１及び１２に示す塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲにより取得することができる。
【００２１】
本発明に用いるｙｑｋＧ遺伝子の具体例として、バチルス  ズブチリス１６８株のＹｑｋＧ遺伝子が挙げられる。同遺伝子の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を、配列番号１５及び１６に示す。
【００２２】
次に、ＨＰＳ及びＰＨＩの活性を発現させる方法を説明する。
ＨＰＳ及びＰＨＩ活性の発現は、ＨＰＳをコードする遺伝子（ｈｐｓ）及びＰＨＩをコードする遺伝子（ｐｈｉ）を、目的のコリネ型細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これを目的のコリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のｈｐｓ及びｐｈｉ遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素活性が増強される。
【００２３】
ｈｐｓ及びｐｈｉ遺伝子は、ＭＤＨ遺伝子と同様に、ＨＰＳ又はＰＨＩを産生する微生物から、通常の遺伝子のクローニング法として同様にして取得することができる。
ＨＰＳを産生する微生物としては、メチロモナス  カプサラタス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）  （Ｊ．Ｒ．  Ｑｕａｙｌｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １８８，  ｐ．３１４，  １９９０）、メチロモナス  Ｍ１５株（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １８８，  ｐ．３１９，  １９９０）、メチロモナス  アミノファシエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｍｉｎｏｆａｃｉｅｎｓ）７７ａ株（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  ５２３，  ｐ．２３６，  １９７８）、マイコバクテリウム  ガストリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｓｔｒｉ）ＭＢ１９  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １８８，  ｐ．３９３，  １９９０）、アセトバクター  メタノリカス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）ＭＢ５８  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １８８，  ｐ．４０１，  １９９０）等が知られている。また、ＰＨＩを産生する微生物としては、メチロモナス  アミノファシエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｍｉｎｏｆａｃｉｅｎｓ）７７ａ株  （Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，４１（７），ｐ１１３３，  １９７７年）、グラム陽性の通性メタノール資化菌であるマイコバクテリウム  ガストリ（特開平１１−１２７８６９号）等が知られている。また、バチルス・スブチリスにおいて、ｈｐｓ、ｐｈｉの両遺伝子が報告されている（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８１巻：７１５４−７１６０（１９９９年））。さらに、メタノール資化性バチルスであるバチルス・ブレビスＳ１株は、染色体ＤＮＡ上にｈｐｓ遺伝子とｐｈｉ遺伝子がタンデムに存在していることが報告されている（平成１２年度  日本生物工学会大会  講演要旨集第１１３頁、及びＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２１４巻、ｐ１８９−１９３，  ２００２年）。同株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによって、ｈｐｓ及びｐｈｉ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することができる。
【００２４】
本発明に用いるｈｐｓ遺伝子及びｐｈｉ遺伝子の具体例として、バチルス  ズブチリス１６８株のｈｐｓ遺伝子及びｐｈｉ遺伝子や、バチルス  ブレビスＳ１株のｈｐｓ遺伝子及びｐｈｉ遺伝子が挙げられる。バチルス  ブレビスＳ１株のｈｐｓ遺伝及びｐｈｉ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１７に示す。また、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号１８及び１９に示す。
【００２５】
バチルス・メタノリカスＰＢ１株（ＮＣＩＭＢ１３１１３）、バチルス・ブレビスＳ１株（ＮＣＩＭＢ１２５２４）は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｓ．，  Ｔｏｒｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ  １３５，  Ａｂｂｅｙ  Ｒｏａｄ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ９  ８ＤＧ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。
【００２６】
ＨＰＳ活性は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８８，３９７−４０１  （１９９０年）に記載の方法にて測定することができる。また、ＰＨＩ活性は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ    ｖｏｌ．１８１，  ｐ．７１５４−７１６０  （１９９９年）に記載の方法によって測定することができる。
【００２７】
ＨＰＳ及びＰＨＩ活性の増幅は、目的のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上にｈｐｓ及びｐｈｉ遺伝子を多コピー存在させることによっても達成できる。目的のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上にｈｐｓ及びｐｈｉ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ｈｐｓ及びｐｈｉ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のｈｐｓ及びｐｈｉ遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＨＰＳ及びＰＨＩ活性が増幅される。
【００２８】
ＨＰＳ及びＰＨＩ活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、ｈｐｓ又はｐｈｉ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平１−２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｖｅｇプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ｈｐｓ又はｐｈｉ遺伝子の発現が強化されることによってＨＰＳ又はＰＨＩ活性が増幅される。発現調節配列の増強は、ＨＰＳ又はＰＨＩのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００２９】
本発明に用いられるｍｄｈ、ｈｐｓ、ｐｈｉ及びａｍｄ遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるＭＤＨ、ＨＰＳ、ＰＨＩ又はＡｍｄタンパク質の機能が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から２０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３０】
上記のようなＭＤＨタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｍ６５００４  （ｅｎｔｒｙ  ｎａｍｅ  ｏｆ  ＢＡＣＭＤＨ）として登録されている塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＤＨと同様の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３１】
また、Ａｍｄタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号１５の塩基番号の塩基番号１〜５５５からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｍｄと同様の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３２】
また、ＨＰＳと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号１７の塩基番号５０８〜１１４０からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＰＳと同様の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３３】
また、上記のようなＰＨＩタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号１７の塩基番号１１４９〜１７００からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＩと同様の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３４】
前記「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３５】
上記のようにして得られる各種遺伝子をコリネ型細菌に導入するには、例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．，Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０）  ）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Ｄｕｎｃａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｆ．Ｅ．，Ｇｅｎｅ，１，１５３（１９７７））を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｏｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．，Ｇｅｎｅｔ．，１６８．１１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｏ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７４，３９８（１９７８）；Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  １９２９（１９７８））も応用できる。更には、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３，  １９７  （１９９７））も利用できる。これらの方法は、宿主として用いる細胞に応じて適宜選択すればよい。
【００３６】
本発明に用いるコリネ型細菌は、目的物質に応じて、目的物質の生合成に関与する酵素の活性が増強されていてもよい。また、目的物質の産生に不利な酵素の活性が低下又は消失していてもよい。
【００３７】
ｍｄｈ、ｈｐｓ、ｐｈｉ及び必要に応じてａｍｄ遺伝子をコリネ型細菌に導入する場合、導入の順序は特に制限されない。また、本発明のコリネ型細菌は、目的物質を産生する能力を有するコリネ型細菌にこれらの遺伝子を導入することによって取得することもできるし、これらの遺伝子を導入したコリネ型細菌に目的物質を産生する能力を付与することによって取得してもよい。
【００３８】
本発明のコリネ型細菌は、目的物質の生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを遺伝子組換え技術により導入、増強することによって、育種されたものであってもよい。例えば、Ｌ−リジン生産菌においては、導入される遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ等、Ｌ−リジンの生合成経路上の酵素をコードする遺伝子である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、又はアスパルトキナーゼ及びジヒドロジピコリン酸合成酵素のようにＬ−アスパラギン酸、又はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受ける酵素遺伝子の場合には、かかる阻害が解除された酵素をコードする変異型遺伝子を用いることが望ましい。脱感作型アスパルトキナーゼをコードする変異型ｌｙｓＣ遺伝子（ｌｙｓＣ＊）としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株より変異処理により誘導されたＬ−リジン生産菌ＡＪ３４６３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９８７）が保持する遺伝子が挙げられる（ＷＯ９４／２５６０５国際公開パンフレット）。
【００３９】
また、本発明のコリネ型細菌は、目的物質の生合成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素、又は目的物質を培地から細胞内に取り込む酵素の活性が低下または欠損していてもよい。例えば、目的物質がＬ−リジンの場合には、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（ＷＯ  ９５／２３８６４参照）。また、Ｌ−リジンを細胞内に取り込む酵素としては、リジンパーミアーゼ（ｌｙｓＩ遺伝子産物）が挙げられる。
【００４０】
目的酵素の活性が低下または欠損したコリネ型細細菌は、例えば、染色体上の目的酵素遺伝子が遺伝子組換え技術により破壊された遺伝子破壊株、及び、染色体上の目的酵素遺伝子の発現調節配列又はコード領域に変異が生じたことにより、活性を有する目的酵素質が産生されないようになった変異株が挙げられる。
【００４１】
前記変異株は、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理することによって、取得することができる。
【００４２】
次に、染色体上の目的酵素遺伝子を遺伝子組換え技術により破壊する方法の一例として、ｌｙｓＩ遺伝子の破壊について説明する。ｌｙｓＩ遺伝子の一部を欠失し、活性を有するリジンパーミアーゼを産生しないように改変したｌｙｓＩ遺伝子（欠失型ｌｙｓＩ遺伝子）を含むＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換し、欠失型ｌｙｓＩ遺伝子と染色体上のｌｙｓＩ遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上のｌｙｓＩ遺伝子を破壊することができる。このような相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製制御領域を含むプラスミドを用いる方法などがある。
【００４３】
欠失型ｌｙｓＩ遺伝子を、宿主染色体上のｌｙｓＩ遺伝子と置換するには以下のようにすればよい。すなわち、変異型ｌｙｓＩ遺伝子とカナマイシン等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型属細菌を形質転換し、形質転換株を薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。
【００４４】
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するｌｙｓＩ遺伝子配列との組換えを起こし、染色体ｌｙｓＩ遺伝子と欠失型ｌｙｓＩ遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では正常なｌｙｓＩ遺伝子が優性であるので、形質転換株は活性のあるリジンパーミアーゼを発現する。また、例えばシュークラーゼ遺伝子を組換えＤＮＡに搭載しておくと、組換え株はシュークラーゼを発現し、シュークロースを炭素源とする培地で生育することができないため、同遺伝子をマーカーとして用いることができる。
【００４５】
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型ｌｙｓＩ遺伝子のみを残すために、２個のｌｙｓＩ遺伝子の組換えにより１コピーのｌｙｓＩ遺伝子を、ベクター部分（マーカー遺伝子を含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる（２回目の組換え）。その際、正常なｌｙｓＩ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型ｌｙｓＩ遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型ｌｙｓＩ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なｌｙｓＩ遺伝子が切り出される場合がある。したがって、遺伝子の構造を確認することによって、欠失型ｌｙｓＩが染色体上に残った株を選択すればよい。
【００４６】
前述した目的物質の生合成に関与する酵素遺伝子も、上記の遺伝子破壊と同様にして、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上の遺伝子と置換することによって、コリネ型細菌に導入することができる。
【００４７】
上記のようにして取得される本発明のコリネ型細菌を培地に培養し、培地又は細菌細胞内に目的物質を生成、蓄積させ、培地又は細菌細胞から目的物質を採取することによって、メタノールを用いて目的物質を製造することができる。
【００４８】
本発明の方法を適用することができる目的物質としては、例えば、メタノールの代謝によって生成する物質、及び、メタノールの代謝によって生成するエネルギーを利用して産生する物質が挙げられる。具体的には、例えばアミノ酸、例えばグルタミン酸、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン等、ビタミン類、例えばビタミンＣ、更には高分子物質、例えば各種の酵素等が挙げられる。
【００４９】
本発明において「目的物質を産生する能力」とは、本発明のコリネ型細菌を好適な条件で培地に培養したときに、培地又は同細菌細胞内に、そこから採取できる程度の目的物質を生成、蓄積する能力をいう。
【００５０】
本発明の方法において培養に用いる培地及び培養条件は、使用する細菌の種類に応じて適宜設定することができるが、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。
【００５１】
炭素源としては、メタノールを用いる。メタノールとともに、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトールなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を、併用してもよい。
【００５２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００５３】
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、Ｌ−ホモセリン、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
【００５４】
培養は、用いるコリネ型細菌の生育に好適な条件で行われる。通常は、好気的条件下で１６〜９６時間実施するのがよく、培養温度は２０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８．５に制御する。ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。また、宿主として好熱性細菌を用いる場合には、培養温度は４２℃〜６０℃で培養することができる。
【００５５】
培養終了後の培地液からの代謝産物の採取は、本願発明において特別な方法が必要とされることはない。すなわち、従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。尚、炭素源として、農産物に由来する糖質を用いる場合に比べて、メタノールを使用した場合は、目的物質の精製や、廃液処理プロセスを簡略化できる場合がある。
【００５６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【実施例１】メタノール脱水素酵素遺伝子のクローニング
メタノール資化性の高温耐性バチルスであるバチルス・ブレビスＳ１株（ＮＣＩＭＢ  １２５２４）（ＮＣＩＭＢより入手）より、常法に従って染色体ＤＮＡを調製した。そしてこのＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりＭＤＨ遺伝子をクローニングした（特開２０００−６９９７６号参照）。
【００５７】
用いたＤＮＡプライマーは、ＭＤＨ−ＢＭ−１（配列番号１）及びＭＤＨ−ＢＭ−２（配列番号２）であった。これは、既に公知のバチルス  メタノリカスＣ１株のＭＤＨ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋに、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｍ６５００４（エントリーネームＢＡＣＭＤＨ）として登録されている）を参考に作製されたものである。またＰＣＲ反応は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造（株）製）を用い、９４℃、９０秒の熱処理の後、９８℃−１０秒、５５℃−３０秒、７２℃−４分を２５サイクル行い、その後７２℃で１０分間保温するというものであった。この反応により目的の大きさのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を精製後、両末端を平滑化した後、ｐＨＳＧ３９９由来（宝酒造社製）の複製起点とｐＨＭ１５１９（下記参照）由来の複製起点を持つシャトルベクターｐＢＣ４（このプラスミドの作製方法は下記参照）のＳｍａＩ部位にクローニングした。このライゲーション反応液を用いて、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造製）を、製造元のプロトコールに従い形質転換し、クロラムフェニコール耐性のコロニーを数個選択した。これらのコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、その構造を解析した後、プラスミドに組み込まれたｍｄｈ遺伝子の向きが、ベクターのｌａｃプロモーターの向きと逆方向のものをｐＢＣ−ｍ−２として、以後の実験に使用した。
【００５８】
尚、ｐＢＣ４は、次のようにして作製されたものである。既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ４８，  ２９０１−２９０３  （１９８４））由来の複製起点を持つプラスミドｐＨＫ４（特開平５−７４９１号公報参照）を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化して、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造）を用い平滑末端化した後、ＢａｍＨＩリンカー（宝酒造）を用いて、ｐＨＳＧ３９９（宝酒造）のＢａｍＨＩ部位にライゲーションにより挿入した。このライゲーション反応液を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造製）を、製造元のプロトコールに従い形質転換し、クロラムフェニコール耐性のコロニーを数個選択した。そうして得られたコロニーからプラスミドを調製することで、ｐＢＣ４を取得した。
【００５９】
【実施例２】バチルス・ズブチリスに由来するＭＤＨ活性促進因子（Ａｍｄ）をコードする遺伝子のクローニング
メタノール資化性バチルスに由来するＮＡＤ依存型メタノール脱水素酵素には、その酵素を活性化する因子があることが知られている。その一つがバチルス・ズブチリスにあることが、特開２０００−６９９７６号公報に記載されている。この因子は、Ａｍｄ（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）と命名されている。
【００６０】
Ａｍｄをコードする遺伝子（ａｍｄ）は、既に公知になっている方法によりバチルス・ズブチリスからクローニングされた。具体的には、以下のようにして行った。
バチルス・ズブチリス  １６８株をＬＢ培地で培養し、得られた菌体より染色体ＤＮＡを通常の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ７２，  ６１９−６２９  （１９６３））により抽出した。この染色体ＤＮＡを鋳型にして、制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を、目的ＤＮＡ断片の両端にもつように導入するようなオリゴヌクレオチド（配列番号１１、１２）をＰＣＲのプライマーとして、目的遺伝子であるａｍｄを含む遺伝子ＤＮＡ断片を増幅した。増幅の条件は、変性（デナチュレーション）工程９８℃：１０秒、対合（アニーリング）工程５５℃：３０秒、伸長（イクステンション）工程７２℃：２分からなるサイクルを２５回行った。使用した酵素はＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）で、メーカーの使用指示書に従って使用した。
【００６１】
増幅されたＤＮＡ断片をフェノール・クロロフォルム処理とエタノール沈殿により精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、両末端がＥｃｏＲＩ部位になったａｍｄ断片を調製した。一方、エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム・グルタミカムのシャトルベクターであるｐＶＫ７（後述する）も、同様に制限酵素ＥｃｏＲＩにて処理し、更にアルカリホスファターゼにより末端のリン酸基を除去した後、上記のａｍｄ断片とライゲーションした。このライゲーション反応液を用いて、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造製）を、製造元のプロトコールに従い形質転換し、カナマイシン耐性のコロニーを数個選択した。
【００６２】
前記のｐＶＫ７は、以下のようにして、エシェリヒア・コリ用ベクターであるｐＨＳＧ２９９（Ｋｍｒ；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ６１，  ６３−７４，  （１９８７）参照）にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプティックプラスミドであるｐＡＭ３３０を結合することによって構築した（特開平１１−２６６８８１号、ＷＯ９９／０７８５３号国際公開パンフレット参照）。ｐＡＭ３３０は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株より調製した。ｐＨＳＧ２９９をＡｖａＩＩ（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したのち、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したｐＡＭ３３０と接続した。こうしてｐＶＫ７を取得した。ｐＶＫ７は、Ｅ．  ｃｏｌｉ及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、ｐＨＳＧ２９９由来のマルチプルクローニングサイトと、ｌａｃＺ’及びマーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を保持している。
【００６３】
これらのコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、その構造を解析した後、プラスミドに組み込まれたａｍｄ遺伝子の向きが、ベクターのｌａｃプロモーターの向きと同じものとしてｐＶＫ−ａを取得し、以後の実験に使用した。
【００６４】
【実施例３】メタノール資化性バチルスからのｈｐｓ遺伝子及びｐｈｉ遺伝子のクローニング
メタノール資化性バチルスであるバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）Ｓ１株より染色体ＤＮＡを上記と同様に調製した。これをＰＣＲの鋳型にして、目的ＤＮＡ領域の増幅を行った。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチド（配列番号１３、１４）の配列には、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ部位が増幅ＤＮＡ断片の両端に導入できるように工夫した。ＰＣＲ反応は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造（株）製）を用い、９４℃、９０秒の熱処理の後、９８℃−１０秒、５５℃−３０秒、７２℃−２分を２５サイクル行い、その後７２℃で１０分間保温するというものであった。その後、得られたＤＮＡ断片を、常法に従い精製後、制限酵素ＫｐｎＩで処理し、両末端がＫｐｎＩ切断端となった目的ＤＮＡを得た。
【００６５】
一方、エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム・グルタミカムのシャトルベクターであるｐＶＫ７を制限酵素ＫｐｎＩで処理し、次にアルカリフォスファターゼで処理後、上記のＤＮＡ断片とＴ４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）により連結した。これで、上記と同様に、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを多数得た。これらより数個のコロニーを選択し、それらのもつプラスミドを調べ、目的遺伝子である  ｈｐｓ遺伝子とｐｈｉ遺伝子の方向が、ベクター上のｌａｃプロモーターの向きと同じものを取得した。なお、このプラスミドをｐＶＫ−ｈと命名した。
【００６６】
【実施例４】ｈｐｓ，  ｐｈｉおよびａｍｄを保持するプラスミドの構築
実施例２および３で作製し、取得したプラスミドｐＶＫ−ａとｐＶＫ−ｈを、それぞれ制限酵素ＣｌａＩとＳａｃＩの２種類で処理した。ｐＶＫ−ａからはａｍｄ遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。一方、ｐＶＫ−ｈからはｈｐｓ−ｐｈｉ遺伝子を含むＤＮＡ断片を常法により調製し、ａｍｄ遺伝子断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。
【００６７】
この反応液を用いて、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体の選択にはカナマイシン耐性を指標とした。寒天プレート上に出現した数十個のコロニーのうちから、６個を任意に選び、保持しているプラスミドの構造を解析したところ、全て、意図した構造、つまりｐＶＫ７のベクター上に、ａｍｄ、ｈｐｓ、ｐｈｉの３遺伝子が搭載されたものであることが確認され、これを取得した。このプラスミドをｐＶＫ−ｈａと命名した。
【００６８】
【実施例５】メタノール利用能が賦与されたコリネバクテリウム・グルタミカムの作製とメタノール利用能の検定
実施例１及び実施例４に述べた方法により構築した２つのプラスミド、つまりｐＢＣ−ｍ−２とｐＶＫ−ｈａをエレクトロポレーション法（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを使用した。キュベットの電極間隔は０．１ｃｍのものを用いた。パルス条件は、２５μＦ，  ２００Ω，  １．８ｋＶ）により、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）に導入した。尚、得られたプラスミド導入株は、クロラムフェニコールを５μｇ／ｌとカナマイシンを２５μｇ／ｌ含むＣＭ−２Ｓ寒天プレート（培地組成は下記参照）にて選択することができた。得られたプラスミド導入株を、クロラムフェニコールを５μｇ／ｌとカナマイシンを２５μｇ／ｌ含むＣＭ−２Ｓ液体培地にて、３１．５℃で一晩振とう培養した。尚、振とう培養は、試験管を用いて３ｍｌの培養液中にて行った。
【００６９】
ＣＭ−２Ｓ培地は、以下のようにして調製した。表１に記載の成分を全て混ぜ合わせてからＫＯＨにてｐＨ７．２に調整し、その後、オートクレーブを１２０℃で２０分間行い滅菌した。寒天培地の場合は、寒天２０ｇ／Ｌを添加した。
【００７０】
【表１】
2004261150.tif 000002
【００７１】
次に、標識されていないメタノールを終濃度０．２％（ｖ／ｖ）となるように添加したＭＭ−ＭＥＳ−ＲＣ培地（培地組成は下記参照）に、上記の一晩培養した後の培養液を１％（ｖ／ｖ）の割合で植菌し、３１．５℃で約４０時間振とう培養し、培地中のメタノールの濃度をガスクロマトグラフィーを用いて経時的に測定した。尚、メタノールを含む培地での培養は、Ｌ字型試験管を用いて１０ｍｌの培養液中にて行った。また、メタノール脱水素酵素を持たないためにメタノールを利用する能力を持たないことが明らかな対照として、ｐＶＫ−ｈａのみエレクトロポレーション法により導入した、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）も同じ条件で培養を行い、同様に培地中のメタノール濃度の経時的な変化を観察した。
【００７２】
ＭＭ−ＭＥＳ−ＲＣ培地は、次のようにして調製した。予め、Ｄ−リボースとカザミノ酸以外の各成分を混合して５倍濃度の溶液を作り、ＮａＯＨにてｐＨ７．０に調整し、フィルター滅菌した。また、５０％のＤ−リボースと１０％のカザミノ酸水溶液を作り、フィルター滅菌した。その後、実際に使用する際に５０％のＤ−リボースと１０％のカザミノ酸を、それぞれ終濃度５ｇ／Ｌとなるように添加し、更に上記の５倍濃度の溶液を２００ｍｌ加え、滅菌水を添加して最終的に１Ｌにフィルアップした。
【００７３】
【表２】
2004261150.tif 000003
【００７４】
その結果、ｐＶＫ−ｈａのみを導入した株での、培地中のメタノールの減少速度に対して、ｐＢＣ−ｍ−２とｐＶＫ−ｈａの両者を保持する株での、培地中のメタノールの減少速度の方が、有意に速いことが確認できた。この場合、メタノール脱水酵素を持たないためにメタノールを消費できないｐＶＫ−ｈａのみを導入した株で観察された培地中のメタノールの減少は、自然蒸発によるものと考えられた。よって、ｐＢＣ−ｍ−２とｐＶＫ−ｈａの両者を保持する株の方が、培地中のメタノールを速く減少させるという結果は、この株がメタノールを消費する能力を獲得したことを示唆している。
【００７５】
【実施例６】コリネバクテリウム・グルタミカムのＬ−リジン生産株の構築Ｌ−リジンを生産できるように改変したコリネバクテリウム・グルタミカムを以下に述べる方法で構築した。親株には、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）を用いたが、その染色体上のアスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）は、リジン生産菌（ＡＪ３４６３）でみられた脱感作型アスパルトキナーゼをコードする変異型ｌｙｓＣ遺伝子（ｌｙｓＣ＊）に置換した。また、リジンパーミアーゼ（ｌｙｓＩ）遺伝子の一部を欠失させて、不活性型ｌｙｓＩ遺伝子に改変することを行った。具体的には、次のような実験操作を行った。
【００７６】
まず初めに、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）の持つクリプティック・プラスミドｐＡＭ３３０を常法により脱落させた。
次に、ｌｙｓＣ遺伝子をｌｙｓＣ＊遺伝子に変更するためのプラスミドｐＢＳ３Ｃ＊を以下に述べる方法で構築した。ｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）を制限酵素ＡｖａＩＩにて消化し、ＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造）により両末端を平滑化し、更にアルカリフォスファターゼにより脱リン酸化し、ｓａｃＢ遺伝子（バチルス・ズブチリスのレバンシュークラーゼ遺伝子）を含むＤＮＡ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。  なお、このｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、常法により抽出したバチルス・ズブチリス１６８株の染色体を鋳型にして、プライマー３（配列番号３）とプライマー４（配列番号４）を用いてＰＣＲにて増幅（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造（株）製）を用い、９４℃、９０秒の熱処理の後、９８℃−１０秒、５５℃−３０秒、７２℃−１．５分を２５サイクル行い、その後７２℃で１０分間保温するというものであった。）し、制限酵素ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩにより消化した後、ＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造）により両末端を平滑化たものである。
【００７７】
このライゲーション反応液でエシェリヒア・コリＪＭ１０９株のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体の選択にはカナマイシン耐性を指標とした。出現したコロニーの内、設計通りにｐＨＳＧ２９９にｓａｃＢ遺伝子が導入されたことが確認されたものからプラスミドを抽出し、このプラスミドをｐＢＳ３と命名した。
【００７８】
次に、このｐＢＳ３と、ｐ３９９ＡＫ９（ＷＯ９４／２５６０５に記載。  ｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）製）に、Ｌ−リジン生産菌であるＡＪ３４６３株のｌｙｓＣ＊遺伝子を搭載したプラスミド）を、両者共に制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで消化し、それぞれｓａｃＢ遺伝子を含む領域とｌｙｓＣ＊遺伝子を含む領域をＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結して、反応液をエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９株のコンピテントセルに形質転換した。形質転換体の選択にはカナマイシン耐性を指標とした。出現したコロニーから保持するプラスミドを調製し構造を確認し、設計通りにｐＢＳ３に、ｐ３９９ＡＫ９由来のｌｙｓＣ＊遺伝子が挿入されたプラスミドを選択し、取得した。なお、これをｐＢＣ３Ｃ＊と命名した。
【００７９】
ｐＢＣ３Ｃ＊を用いて、ｐＡＭ３３０を脱落させたコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９株）のｌｙｓＣ遺伝子を以下のような手順でｌｙｓＣ＊遺伝子に置き換えた。まず、ｐＢＣ３Ｃ＊を常法によりＡＴＣＣ１３８６９株に導入し、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含むＣＭＤｅｘ培地（組成は下記参照）にて生育する株を得た。尚、ｐＢＣ３Ｃ＊には、ＡＴＣＣ１３８６９株中にて複製が可能な複製起点を持たないため、得られたカナマイシン耐性を示す株は、ＡＴＣＣ１３８６９株の染色体上のｌｙｓＣ遺伝子領域において、ｐＢＣ３＊上のｌｙｓＣ＊遺伝子と相同組換え反応により組み込まれたものである。次に、この一回組み換え株をＣＭＤｅｘ培地にて３１．５℃で一晩培養した後、ＤＸ−Ｓ１０寒天培地（組成は下記参照）に塗りつけた。この場合、ｌｙｓＣ領域での二回目の組み換えが起こり、導入したｐＢＣ３＊のｓａｃＢ遺伝子領域を含むベクター部分が脱落した株は、この寒天培地上に生育することが可能で、且つ、カナマイシン感受性になっている株として選択できる。もし、ｓａｃＢ遺伝子が染色体上に残存していれば、その遺伝子産物であるシュークラーゼ活性により、シュークロースを含むＤＸ−Ｓ１０培地では生育できない。こうして得られた候補株のｌｙｓＣ遺伝子領域の塩基配列を常法により決定し、ｌｙｓＣ＊遺伝子に置き換えられたことが確認された株を、２２５６Ｃ＊株と命名した。
【００８０】
ＣＭＤｅｘ培地は、以下のようにして調製した。表３の成分を全て混ぜ合わせてからＫＯＨにてｐＨ７．５に調整し、その後、オートクレーブを１２０℃で２０分間行い滅菌した。また、寒天培地の場合は、寒天を最終濃度で２０ｇ／Ｌとなるように添加して作製した。
【００８１】
一方、Ｄｘ−Ｓ１０寒天培地は、以下のようにして調製した。表４の成分を全て混ぜ合わせてからＫＯＨにてｐＨ７．５に調整し、その後、オートクレーブを１２０℃で２０分間行い滅菌した。その後、フィルター滅菌した５０％シュークロースを２００ｍｌ添加した。
【００８２】
【表３】
2004261150.tif 000004
【００８３】
【表４】
2004261150.tif 000005
【００８４】
一方、ｌｙｓＩ遺伝子を破壊する為に、プラスミドｐＢＳ３ＩΔを以下のように構築した。コリネバクテリウム・グルタミカムから常法により取得した染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマー５（配列番号５）とプライマー６（配列番号６）を用いてＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片と、プライマー７（配列番号７）とプライマー８（配列番号８）を用いてＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を得た。この時のＰＣＲの条件は、ＬＡ−ｔａｑ（宝酒造（株）製）を用い、９４℃、５秒の熱処理の後、９４℃−３０秒、５２℃−３０秒、７２℃−１分を２５サイクル行い、その後７２℃で１０分間保温するというものであった。次に、このようにして得られた上記の二つのＤＮＡ断片を鋳型に、プライマー９（配列番号９）とプライマー１０（配列番号１０）によるクロスオーバーＰＣＲを行い、ｌｙｓＩ遺伝子のコーディング領域の中央付近を欠失させたＤＮＡ断片（ｌｙｓＩΔ）を得た。尚、プライマー６とプライマー７の５’末端領域は、互いに相補する配列を持ち、アニーリング出来るように設計してある。またこの時のＰＣＲの条件は、ＬＡ−ｔａｑ（宝酒造（株）製）を用い、９４℃、５秒の熱処理の後、９４℃−３０秒、５２℃−３０秒、７２℃−１分を２５サイクル行い、その後７２℃で１０分間保温するというものであった。
【００８５】
上記の方法により得られたＤＮＡ断片（ｌｙｓＩΔ）とプラスミドｐＢＳ３（実施例６の上記に記載）の両者を制限酵素ＸｂａＩにて消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより連結して、反応液でエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９株のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体の選択にはカナマイシン耐性を指標とした。出現したコロニーからプラスミドを回収して構造を確認した結果、設計通りにｐＢＳ３にｌｙｓＩ遺伝子の一部を欠失したＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを取得し、ｐＢＳ３ＩΔと命名した。
【００８６】
次に、ｐＢＣ３ＩΔを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム２２５６Ｃ＊株のｌｙｓＩ遺伝子を以下のような手順で不活性化させた。まず、ｐＢＣ３ＩΔを常法により２２５６Ｃ＊株に導入し、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含むＣＭＤｅｘ培地にて生育する株を得た。尚、ｐＢＣ３ＩΔには、２２５６Ｃ＊株中にて複製が可能な複製起点を持たないため、得られたカナマイシン耐性を示す株は、２２５６Ｃ＊株のｌｙｓＩ遺伝子領域において、ｐＢＣ３ＩΔ上のｌｙｓＩΔ領域との間での相同組換えにより組み込まれたものである。この一回組み換え株をＣＭＤｅｘ培地にて３１．５℃で一晩培養した後、ＤＸ−Ｓ１０寒天培地に塗りつけた。このとき、本株中で染色体上のｌｙｓＩ遺伝子とｌｙｓＩΔ領域の間で２回目の相同組換え反応が起こり、導入したｐＢＣ３ＩΔのｓａｃＢ遺伝子領域を含むベクター部分が脱落した株は、この寒天培地上に生育することが可能で、且つ、カナマイシン感受性になる。というのは、もしｓａｃＢ遺伝子が染色体上に残存していれば、その遺伝子産物であるスクラーゼ活性により、スクロースを含むＤＸ−Ｓ１０培地では生育できないためである。従って、ＤＸ−Ｓ１０寒天培地で生育でき、カナマイシン感受性である株を２回組み換え株として選択した。得られた２回組み換え株のｌｙｓＩ遺伝子内部領域をプライマー９（配列番号９）とプライマー１０（配列番号１０）を用いてＰＣＲにより増幅し、野生型のｌｙｓＩ遺伝子よりも短いことが確認された株をｌｙｓＩ欠損株とした。
【００８７】
以上の操作により、ｌｙｓＣ遺伝子がｌｙｓＣ＊遺伝子に置き換えられ、ｌｙｓＩ遺伝子が欠失した株が取得でき、そのうちの一株を２２５６ＣＩ株（ＡＪ１１０１３５株）と命名した。なお、この株は、実施例８に記載したように、糖質を炭素源として生育し、培地中にＬ−リジンを生産することができた。
【００８８】
【実施例７】コリネバクテリウム・グルタミカムのＬ−リジン生産株へのｍｄｈ，  ａｍｄ，  ｈｐｓ，  ｐｈｉの導入
Ｌ−リジンを生産できるように改変したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１１０１３５株に、実施例１及び実施例２で構築したｐＢＣ−ｍ−２とｐＶＫ−ｈａを常法により導入し、両者を共存させた。この２つのプラスミドを保持するＡＪ１１０１３５は、ｍｄｈ，  ａｍｄ，  ｈｐｓ，  ｐｈｉの全ての遺伝子が導入されたことになる。また、このプラスミドを保持する株をＭＣＬ１０１株と命名した。尚、この株を通常培養する際には、ＣＭ−２Ｓ培地に抗生物質カナマイシンを２５μｇ／Ｌとクロラムフェニコールを１０μｇ／Ｌ含む培地で、３１．５℃にて振とう培養した。
【００８９】
【実施例８】ｍｄｈ，ａｍｄ，  ｈｐｓ，  ｐｈｉが導入されたリジン生産菌、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＣＬ１０１株のメタノール利用能の検定
実施例７で構築したＭＣＬ１０１株は、培地中のメタノールを炭素源として利用できるかどうかを検討した。ＭＣＬ１０１株を、カナマイシンを２５μｇ／Ｌとクロラムフェニコールを１０μｇ／Ｌ含むＣＭ−２Ｓ培地にて、３１．５℃で一晩振とう培養した。この培養液を、カナマイシンを２５μｇ／Ｌとクロラムフェニコールを１０μｇ／Ｌ含む１３Ｃ標識されたメタノールを終濃度０．２％（ｖ／ｖ）となるように添加したＭＭ−ＭＥＳ−ＲＣ培地と、標識されていないメタノールを終濃度０．２％（ｖ／ｖ）となるように添加したＭＭ−ＭＥＳ−ＲＣ培地に、１％（ｖ／ｖ）の割合で植菌し、３１．５℃で、それぞれ５０時間振とう培養した。培養後、生育の度合いを表す両培養液の６６０ｎｍの吸光度を測定したところ、共に約１．７に達しており、両者間で菌の生育に大きな差異は観察されなかった。また、培養を終了した両培養液のメタノール濃度をガスクロマトグラフィーにより測定したところ、どちらもほぼ等量のメタノールを消費したことが確かめられた。その後、両培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍで１５分間）し、培養上清を調製し、これを凍結乾燥した。
【００９０】
両培養液の上清より得られたそれぞれの凍結乾燥粉末から６０ｍｇをとり、それぞれ、重水５００μｌに溶解した。この両溶液中のＬ−リジン量を定量したところ、共に約１．３ｍｇであり、この両溶液中のＬ−リジン量はほぼ同一であることが解った。次に、この溶液を１３Ｃ−ＮＭＲ（核磁気共鳴分析装置）にかけ、産生されたＬ−リジン分子を構成する炭素原子中の１３Ｃの割合について解析した。その結果、１３Ｃ標識メタノールを添加した培養にて産生されたＬ−リジンの各炭素原子のシグナルは、非標識のメタノールを添加した培養により産生されたＬ−リジンのそれに比べて、約３．３〜９．９倍の強度であった。このことは、構築したＭＣＬ１０１株は、培地に添加した１３Ｃメタノールを菌体内に取りこみ、これをＬ−リジンの生成にまで利用する能力を新たに獲得したことを示しており、このことは、メタノールを利用する能力が付与されたコリネ型細菌を構築、取得することができたことを示すものである。
【００９１】
〔配列番号の説明〕
配列番号１、２：ｍｄｈクローニング用のプライマー配列
配列番号３、４：ｓａｃＢ遺伝子クローニング用のプライマー
配列番号５〜１０：中央領域を欠損したｌｙｓＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を構築するためのプライマー
配列番号１１、１２：ｙｑｋＧ（ａｍｄ）クローニング用のプライマー
配列番号１３、１４：ｈｐｓ−ｐｈｉクローニング用のプライマー
配列番号１５：バチルス・ズブチリス１６８株のｙｑｋＧ（ａｍｄ）の塩基配列
配列番号１６：バチルス・ズブチリス１６８株のｙｑｋＧ（ａｍｄ）のアミノ酸配列
配列番号１７：バチルス・ブレビスＳ１株のｈｐｓ−ｐｈｉ（Ｓ１）の塩基配列
配列番号１８：バチルス・ブレビスＳ１株のＨＰＳのアミノ酸配列
配列番号１９：バチルス・ブレビスＳ１株のＰＨＩのアミノ酸配列
【００９２】
【発明の効果】
本発明によれば、本来、メタノールを利用できないコリネ型細菌に、メタノールを利用できる能力を付与でき、コリネ型細菌が利用する炭素源やエネルギー源として、安価なメタノールが利用できる微生物を提供することができる。さらに、得られた微生物を利用することにより、メタノールを添加した培地にてメタノールから種々の発酵生産物を製造することができる。
【００９３】
【配列表】
2004261150.tif 000006
2004261150.tif 000007
2004261150.tif 000008
2004261150.tif 000009
2004261150.tif 000010
2004261150.tif 000011
2004261150.tif 000012
2004261150.tif 000013
2004261150.tif 000014
2004261150.tif 000015
2004261150.tif 000016
2004261150.tif 000017
2004261150.tif 000018
2004261150.tif 000019
2004261150.tif 000020