(57)【要約】【課題】リガンドに結合し得る可能性のある蛋白質との比較により、相互作用特異性の有無を調べると共に、重大な副作用を引き起こす可能性のあるような非特異的な相互作用のないことについても調べられる計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質・リガンド相互作用の解析方法とすることである。【解決手段】インターネットを介して蛋白質の立体構造データベースに接続されたコンピュータを設け、リガンドおよび仮想リガンドの前記計算プログラムに必要な立体構造情報を分子結合エネルギー計算プログラムのファイルに格納し、また受容体蛋白質群の立体構造データを前記分子結合エネルギー計算プログラムの指定ファイル内に格納し、これら立体構造データからシミュレートされた受容体蛋白質−リガンド複合体の結合エネルギー値を対応するリガンドと受容体蛋白質との関係から蛋白質−リガンド相互作用を評価する解析方法とする。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子結合エネルギー計算プログラムが構築され、かつインターネットを介して蛋白質の立体構造データベースに接続されたコンピュータを設け、低分子化合物である一つのリガンドの前記計算プログラムに必要な立体構造情報と、このリガンドに対し分子構造が類似する複数の仮想リガンドであって前記データベースから選択されるリガンド群の立体構造情報とを前記分子結合エネルギー計算プログラムの指定ファイル内に格納し、また前記一つのリガンドが対応する受容体蛋白質と結合した受容体蛋白質−リガンド複合体群の立体構造データを前記データベースから検索すると共に、検索された各立体構造データからリガンド部分を除いた受容体蛋白質群の立体構造データを前記分子結合エネルギー計算プログラムの指定ファイル内に格納し、これら格納された受容体蛋白質群および前記リガンド群の立体構造データから１つずつ組み合わされたデータに基づいてシミュレートされた受容体蛋白質−リガンド複合体の結合エネルギー値を全てのデータの組み合わせについて算出し、この結合エネルギー値と、対応するリガンドと受容体蛋白質との関係を評価することによって前記リガンドの各種受容体蛋白質に対する相互作用を解析することからなる計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質−リガンド相互作用の解析方法。
【請求項２】
分子結合エネルギー計算プログラムが、ギブス自由エネルギーを算出する計算プログラムである請求項１に記載の計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質−リガンド相互作用の解析方法。
【請求項３】
リガンドに対する分子構造の類似が、結晶構造を有するリガンドにおける重心が同じ座標にあることである請求項１または２に記載の計算機上の仮想プロテインアレイ蛋白質−リガンド相互作用の解析方法。
【請求項４】
コンピュータが、インターネットを介して解析方法の利用者と接続されており、仮想リガンドのデータベースからの選択を電子メールを介した利用者が行ない、かつリガンドの各種受容体蛋白質に対する相互作用の解析結果を電子メールを介して利用者が受け取れるようにした請求項１〜３に記載の計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質−リガンド相互作用の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、創薬開発、抗原抗体相互作用の解析、疾患マーカーの探索などの特定蛋白質の作用を利用する技術分野において、蛋白質の特異的相互作用をコンピュータを用いて解析する計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質−リガンド相互作用の解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のマイクロアレイ技術は生物科学の解明のために非常に重要なツールの一つであり、一度に数千の遺伝子の解析結果を研究者に供給することができるＤＮＡアレイ技術の驚異的な進歩は特に注目されている。ＤＮＡアレイの膨大なデータから統計学的な手法により抽出される生物学的意義を含む重要な情報群は、医学生物学分野に重要なインパクトをもたらしてきた。
【０００３】
また、ＤＮＡアレイに続いてプロテインアレイも注目され、蛋白質間相互作用の解析、抗原抗体相互作用の解析、蛋白質／核酸の相互作用の解析、蛋白質複合体におけるサブユニットの解析、変異体蛋白質の解析、ファージライブラリやペプチドライブラリによる標的蛋白質発現のスクリーニング、定量的測定、疾患マーカーの探索、蛋白質発現プロファイルの解析、臨床検査への応用、創薬開発におけるリード化合物のスクリーニングなどに利用されている。
【０００４】
一方で新薬のためのリード化合物のスクリーニングについての低コスト化が必要とされてきているため、計算機によるリード化合物同定のアプローチが応用されてきた。
【０００５】
低分子のバーチャルスクリーニングにおいて、ドッキングスタディは重要な鍵を握り、１９９０年代に入ってから、Ｘ線結晶立体構造解析により立体構造が判明した蛋白質に関して、酵素阻害薬の分子設計が実際に機能することがいくつかの例で示された。
【０００６】
特に医薬品開発にとっては、リガンド探索の補助的手段として、計算機シミュレーションが用いられることが多いために、従来型の低分子−蛋白質間のドッキング評価ソフトは、ある受容体蛋白質に対して、多数の低分子リガンドを評価し、スクリーニングすることによって、リガンド探索を実施する目的で作成されているものが多い。
【０００７】
生体高分子の分子ドッキングのアルゴリズムには、解決しなければならない深刻な問題点として、標的タンパクとリガンドの柔軟性、水分子の扱い方、分子力場の精度がある。
【０００８】
そして、不完全ながらもバーチャルスクリーニングやストラクチャーベースドデザインは、その物質的、時間的なコストパフォーマンスから幅広く用いられ、例えば、ある特定の標的蛋白質に対して、相互作用力の強い化合物をバーチャル化合物ライブラリから探索するシステムが成功例として挙げられる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、実際の生体内では、薬剤は膨大な数の生体分子、タンパク、核酸、脂質、糖質、そして水分子と相互作用を試されるわけであるから、ドラッグと標的ではない分子との非特異的な相互作用は重大な副作用を引き起こす可能性を孕むが、従来型のバーチャルスクリーニングではその予測が困難である。
【００１０】
そこで、この発明の課題は、プロテインアレイの概念を計算機による分子ドッキングシミュレーションの技術と組み合わせて、例えば仮想プロテインアレイシステムと呼べるものを構築し、好ましくはＷＥＢ上で閲覧できるアプリケーションで構築し、計算機を利用した仮想上のプロテインアレイを構築することによって、実際上のプロテインアレイが持つ上述の問題点を解決することである。
【００１１】
そして、リガンドとしての低分子化合物と、特定の受容体蛋白質との相互作用だけではなく、リガンドに結合し得る可能性のある多種類の蛋白質と比較することにより、相互作用特異性の有無を調べると共に、重大な副作用を引き起こす可能性のあるような非特異的な相互作用の有無についても調べられる計算機シミュレーションすなわち、計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質−リガンド相互作用の解析方法とすることである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、この発明においては、分子結合エネルギー計算プログラムが構築され、かつインターネットを介して蛋白質の立体構造データベースに接続されたコンピュータを設け、低分子化合物である一つのリガンドの前記計算プログラムに必要な立体構造情報と、このリガンドに対し分子構造が類似する複数の仮想リガンドであって前記データベースから選択されるリガンド群の立体構造情報とを前記分子結合エネルギー計算プログラムの指定ファイル内に格納し、また前記一つのリガンドが対応する受容体蛋白質と結合した受容体蛋白質−リガンド複合体群の立体構造データを前記データベースから検索すると共に、検索された各立体構造データからリガンド部分を除いた受容体蛋白質群の立体構造データを前記分子結合エネルギー計算プログラムの指定ファイル内に格納し、これら格納された受容体蛋白質群および前記リガンド群の立体構造データから１つずつ組み合わされたデータに基づいてシミュレートされた受容体蛋白質−リガンド複合体の結合エネルギー値を全てのデータの組み合わせについて算出し、この結合エネルギー値と、対応するリガンドと受容体蛋白質との関係を評価することによって前記リガンドの各種受容体蛋白質に対する相互作用を解析することからなる計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質−リガンド相互作用の解析方法としたのである。
【００１３】
上記したように構成されるこの発明の解析方法によると、解析対象の任意低分子化合物である一つのリガンドに対し、複数の受容体蛋白質と同時にドッキングシミュレーションがなされ、その分子結合エネルギー値を評価することによって、任意低分子化合物であるリガンドの相互作用のプロファイルを行うことができる。
【００１４】
その際に、低分子化合物であるリガンドの生理活性作用を、ひとつの受容体蛋白質（レセプター）との相互作用のみで結論つけるだけでなく、複数の受容体蛋白質間との相互作用を分子結合エネルギー値の分布を評価することにより解析することができる。
【００１５】
そして、前述の分子結合エネルギー計算プログラムは、ギブス自由エネルギーを算出する計算プログラムを採用することが、計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質−リガンド相互作用の解析を確実に行なうために好ましい。
【００１６】
また、リガンドに対し分子構造が類似する複数の仮想リガンドを特定の基準に基づいて選出するためには、結晶構造を有するリガンドにおける重心が同じ座標にあることを類似判断の基準とすることが好ましい。
【００１７】
また、実際に計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質−リガンド相互作用の解析を簡便に利用できるようにするためには、コンピュータが、インターネットを介して解析方法の利用者と接続されており、仮想リガンドのデータベースからの選択を電子メールを介した利用者が行ない、かつリガンドの各種受容体蛋白質に対する相互作用の解析結果を電子メールを介して利用者が受け取れるようにすることが好ましい。
【００１８】
このように特定の低分子化合物であるリガンドと複数の蛋白質群との相互作用を比較評価できる本願の発明に係る解析方法では、低分子化合物であるリガンドの持つ蛋白質群への特異性、親和性を総合的に評価することで新たな視点から、低分子化合物であるリガンドの特性を探索し、前述の問題点を解決できる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
この発明の計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質−リガンド相互作用の解析方法の実施形態を図１および図２に基づいて説明する。
【００２０】
図１に示すように、実施形態の解析方法は主要な３つのパート（ＷＥＢインターフェース、蛋白質の立体構造データベース、分子結合エネルギー計算プログラム）からなり、データベースやドッキングエンジンの変更にも柔軟に対応できるようにした。
【００２１】
［ＷＥＢインターフェース］：
このシステムはビジュアルテクノロジーのＶＴα（６６７Ｍｈｚの２ＣＰＵ、　１０２４ＭＢのメモリ）を用いてレッドハットＬＩＮＵＸ７．１をＯＳとして解析された。また、デル４４００　ペンティアム４（２ＧＨｚ）、５１２ＭＢのメモリ）を用いてレッドハットＬＩＮＵＸ７．２をＯＳとして動作している。自作機のペンティアム４（１．７ＧＨｚ）、２５６ＭＢのメモリ）を用いてレッドハットＬＩＮＵＸ７．２をＯＳとして動作する。
【００２２】
ＷＥＢインターフェースは、ＨＴＭＬやＰｅｒｌなどのスクリプト言語で構築できる。まず、利用者は、ＷＥＢ上にて希望する低分子化合物からなるリガンドのファイルの読み込みまたは選択を行う。この低分子化合物であるリガンドは、あらかじめ管理者が用意した低分子化合物群からの選択、または利用者が任意で選択する。分子結合エネルギー計算プログラムで使用したドッキングエンジンが要求するファイル形式に依存する。
【００２３】
選択及び送信されたリガンド情報、仮想プロテインアレイシステム情報は、ＣＧＩ（Ｃｏｍｍｏｎ　Ｇａｔｅｗａｙ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）により、サーバ（管理者）側でドッキング解析が実施される。ドッキングの結果は、事前に登録してもらった電子メールアドレスに知らせる。
【００２４】
この結果を表示したＵＲＬを電子メールにて知らせることにより、ユーザーはＷＥＢブラウザを通して、希望した低分子化合物と選択した受容体との相互作用プロファイルの結果を知ることができる。ユーザーはＷＥＢ上で、相互作用プロファイルとグラフ、蛋白質データベースに蓄積されている蛋白質情報を閲覧することができる。
【００２５】
［分子結合エネルギー計算プログラム］；
ドッキングエンジンとして、分子ドッキング評価ソフトを選択する必要がある。独自に作成した分子ドッキング評価ソフトを使用することもできるが、既存の低分子化合物／蛋白質間の分子ドッキング評価ソフトを採用してもよい。代表的な市販または周知の分子ドッキング評価ソフトを挙げれば、以下の通りである。（１）Ａｕｔｏｄｏｃｋ、（２）Ａｆｆｉｎｉｔｙ、（３）ＤＯＣＫ、（４）ＦｌｅｘＸ、（５）ＦＬＯＧ、（６）Ｇｌｉｄｅ、（７）ＧＯＬＤ、（８）ＩＣＭ−ＤＯＣＫ、（９）ＭＯＥ−ｄｏｃｋ、（１０）ＰＲＯ−ＳＥＬＥＣＴなどであり、使用時には許可が必要な場合もある。
【００２６】
因みに、分子結合エネルギー値として示されるギブス自由エネルギーに関して説明すると、ある相に含まれる成分１ｍｏｌあたりの化学ポテンシャルは、成分１ｍｏｌあたりのギブス自由エネルギーＧ＝Ｇ（Ｔ，Ｐ）と等しい。また、ある相に含まれる成分１ｍｏｌあたりのエントロピーをＳ、体積をＶとすると、成分１ｍｏｌあたりのギブス自由エネルギーＧの全微分は、ｄＧ＝−ＳｄＴ＋ＶｄＰのように表される。
【００２７】
［蛋白質の立体構造データベース］；
インターネット上の蛋白質の立体構造データベースであるＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）（以下、ＰＤＢと略記する）には、低分子と結合状態の立体構造（複合体）がＰＤＢに登録されており、このような複合体を選択できる。
【００２８】
そして、必要に応じて各々の蛋白立体構造から低分子化合物であるリガンドを取り除いたものをデータベースに格納する。その場合、選択された分子ドッキング評価ソフトが要求するファイル形式に従って拡張する必要があるのは勿論である。
【００２９】
受容体のエントリー数を増加させていくことで、データベースの拡張は可能である。そのために蛋白質の活性部位の情報が掲載されているサイト、例えばｅＦｓｉｔｅ　（ｈｔｔｐ：／／ｅｆ−ｓｉｔｅ．ｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｓａｋａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｅＦ−ｓｉｔｅ／）などを参照することができる。
【００３０】
【実施例】
分子結合エネルギー計算プログラムのドッキングエンジンにはＡｕｔｏｄｏｃｋ３．０を選択した。Ａｕｔｏｄｏｃｋ３．０はスクリプス研究所のＭｏｒｒｉｓ．　Ｇ．　Ｍらによって構築された分子ドッキングソフトであり、３つのプログラムから構成され　ＡＤＤＩＮ　ＥＮＲｆｕ　（Ｍｏｒｒｉｓ　１９９８）、ＡｕｔｏＧｒｉｄ，　ＡｕｔｏＴｏｒｓ，　Ａｕｔｏｄｏｃｋ３．０が主要コンポーネントとなっているものである。
【００３１】
分子ドッキング評価ソフトにはＡｕｔｏｄｏｃｋ３．０のプログラム群をスクリプト処理により構築した。総合的なギブス自由エネルギーは３つの因子、トーションのエントロピー、Ａｕｔｏｄｏｃｋ３．０で得られたエネルギー最低値と低分子の内部エネルギーの合計である。
【００３２】
ドッキングの際に用いる探索手法は、ＳＡ（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ　Ａｎｎｅａｌｉｎｇ），　ＧＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ），　ＬＧＡ　（Ｌａｍａｒｃｋｉａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ），　ＳＷ（Ｓｏｌｉｓ　ａｎｄ　ｗｅｔｓ２）を用いることが可能であるが、実施例では全てＬＧＡで実施した。
【００３３】
それぞれのドッキング実験は１０回、イールディングは１０ドックコンフォメーション、ドッキングのパラメータは以下の通り；集団サイズは１０、ランダムスタート位置とコンフォメーションは、トランスレーションにおいては２Åの最大変異、ローテーションは５０度、エリティズムは１、変異レイトは０．０２、クロスオーバーレイトは０．８、ローカルサーチレイトは０．０６、シミュレーションは最大１．５百万エネルギー進化、最大２７０００世代で実施した。
【００３４】
Ａｕｔｏｄｏｃｋ３．０で要求される受容体のファイル形式に従い、次の拡張を行った。データベースで検索された受容体に対して、極性水素原子（ｐｏｌａｒ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ａｔｏｍｓ）を幾何学的に付加した。電荷付加はｋｏｌｌｍａｎ　ｕｎｉｔｅｄ−ａｔｏｍ　ｃｈａｒｇｅｓを付加した。溶媒和エネルギー付加したＰＢＤ拡張ファイルをデータベース化した。
【００３５】
従来Ａｕｔｏｄｏｃｋ３．０でドッキングする際には、リガンドのデータ、受容体のデータに基づいてコマンド“ｍｋｇｐｆ３”で生成される、グリッドパラメーターファイル（ｇｐｆ）群が必要である。
【００３６】
実施例では、計算の高速化を目指すため、ドッキング毎にグリッドパラメーターファイル（ｇｐｆ）群を作成するのではなく、仮想リガンドを用いてあらかじめ各受容体固有のグリッドパラメーターファイル（ｇｐｆ）群を作成し、ＰＤＢ拡張ファイルとともに格納した。
【００３７】
仮想リガンドは、多種のリガンドに対応できるように、Ａｕｔｏｄｏｃｋ３．０で使用可能な原子種すべてを含み、かつ結晶構造のネイティブリガンドと同じ座標の重心を設定した。
【００３８】
図３に実施例のＷＥＢインターフェースにおける入力初期画面を示した。同図に示す画面のように、ファイルモードと選択モードのいずれかから低分子化合物情報の入力が可能である。
【００３９】
参照ファイルの読み込み（上部）ではユーザーが作成した任意の低分子化合物であるリガンドの情報ファイルを読み込みエントリーすることができる。任意の低分子化合物の情報ファイルは、リガンドに幾何学的な水素付加、ガスタイガーマルシニ法による電荷付加を行った。
【００４０】
そして、ルートポジションをアサインし、Ａｕｔｏｔｏｒｓによるトーション数を決定した。すでに用意された低分子化合物であるリガンドの選択では、ＷＥＢ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｐａｒｔに既に格納されている低分子化合物の情報ファイル群の中から、選択した。
【００４１】
図４は各受容体の既知アノテーション情報の閲覧画面であり、既知情報のアノテーション付加として、それぞれの生物学的な受容体情報を格納する。具体的には、出願人のＩＤ（ＫＬＩＭＥＲＳ−ＩＤ）、機能分類、ＰＤＢ，　ＰＲＯＳＩＴＥ、　ＰＩＲ、　探索中心座標などであり、これらの情報は、受容体の生物学的な情報をユーザーが情報を得るためのものである。
【００４２】
図５は、相互作用プロファイルの結果画面である。ユーザーはメールでＵＲＬを受け取り、そのＵＲＬに接続することで結果を閲覧することができる。
【００４３】
図６に示すように、リガンド、受容体の複合体ファイルを３５種類選択し、この３５種類の複合体と解析後の３５種類の相互作用プロファイルを示した。便宜上、リガンドのファイル名を小文字で、受容体のファイル名を大文字で示した。
【００４４】
図６（Ａ）には、３５組のリガンドをすべて分子結合エネルギー計算プログラムで実行したときの分子結合エネルギーであるΔＧ結合値（ギブス自由エネルギー：Ｊ／ｍｏｌ）を示した。
【００４５】
また、元の結晶構造の組み合わせの受容体が、３５個の受容体群の中で占める順位を調べて、順位の分布を示したものが図５の表である。
【００４６】
図５の表の結果からも明らかなように、３５個のリガンド中、１６個が５位以内、９個が６〜１０位、７個が１１〜２０位という結果になった。他の３個（１ｆｋｇ１ｓｌｔ，　２ｍｃｐ）は２６〜３５位に分布した。
【００４７】
１ｆｋｇ，　１ｓｌｔ，　２ｍｃｐは、受容体側（１ＦＫＧ，　１ＳＬＴ，２ＭＣＰ）の特異性が不良であり、各アッセイにおける平均順位は３５個中３１．６位、３１．８位、２９．３位となり、平均的に下位にランクされたことが判明した。この結果から、受容体側のものによっては、多くのリガンドに対して相互作用が弱い受容体が存在することが示唆された。
【００４８】
しかしながら、各アッセイにおける平均順位が低い受容体でも、元の結晶構造との組み合わせが１位の受容体も存在した。６ＡＢＰがそうである。６ＡＢＰは各アッセイにおける平均順位が２６．１位とかなり低いが、元の結晶構造との組み合わせが１位となった。
【００４９】
また逆に、各アッセイの平均順位が上位にくる受容体もあった。１ＡＣＭ　ＡＤＤＩＮ　ＥＮＲｆｕ　，３ＣＰＡ，３ＴＰＩ，４ＣＴＳであり、各アッセイの平均順位は５．５位、９．８位、９．０位、８．２位となった。元の結晶構造との組み合わせは、２位、１位、１位、５位となった。
【００５０】
上記の結果から本システムにおいて、受容体の種類によっては、相対的に多種のリガンド群に強く相互作用する受容体、相対的にリガンド群のほとんどに弱くしか相互作用しない受容体、の存在を確認した。そのなかでも、あるリガンド（元の結晶構造の組み合わせ）に特異的相互作用を発揮する受容体の存在も確認できた。
【００５１】
【発明の効果】
この発明は、以上説明したように、解析対象の任意低分子化合物である一つのリガンドに対し、複数の受容体蛋白質と同時にドッキングシミュレーションがなされ、その分子結合エネルギー値を評価することによって、任意低分子化合物であるリガンドの相互作用のプロファイルを行うことができる。
【００５２】
その際に、低分子化合物であるリガンドの生理活性作用を、ひとつの受容体蛋白質（レセプター）との相互作用のみで結論づけるだけでなく、複数の受容体蛋白質間との相互作用を分子結合エネルギー値の分布を評価することによってより正確に解析することができる。
【００５３】
したがって、リガンドに結合し得る可能性のある多種類の蛋白質と比較することにより、相互作用特異性の有無ばかりでなく、重大な副作用を引き起こす可能性のあるような非特異的な相互作用のないことについても調べることのできる計算機上の仮想プロテインアレイによる蛋白質・リガンド相互作用の解析方法であるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施形態の解析方法の工程図
【図２】実施形態の解析方法を示す要部の工程の説明図
【図３】実施例のＷＥＢインターフェースにおける入力初期画面
【図４】実施例の各受容体の既知アノテーション情報のＷＥＢインターフェースにおける閲覧画面
【図５】実施例の相互作用プロファイルの結果示すＷＥＢインターフェースにおける閲覧画面
【図６】（Ａ）分子結合エネルギー計算プログラムの実行で得られた分子結合エネルギーΔＧ値を示す表
（Ｂ）使用した受容体蛋白質の一覧表
（Ｃ）使用したリガンドの一覧表
（Ｄ）着色表記した相互作用プロファイル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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