(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規なクラス２サイトカイン受容体（ＳＪ２３６８）及びその遺伝子を同定することにより、炎症性疾患や悪性腫瘍の予防並びに治療に有用な医薬及びそのスクリーニング方法。【解決手段】テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ（ＴＬＨ）をコードする遺伝子ＰＬＯＤ２、及び、種々の生分解速度を有するコラーゲン物質を調製するための方法および組成物を提供する。又、線維症経過におけるアリシン架橋に対するヒドロキシアリシン架橋の比を低下させるための方法、および、その組成物とそのスクリーニング方法、線維症経過を診断および／または監視するための方法を提供する。【選択図】　図６
2004033188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋したコラーゲン分子を含むコラーゲンマトリックスを得る方法において、該コラーゲンマトリックスの蛋白分解的減成に対する耐性が、コラーゲンマトリックスにおけるヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との比を制御することにより制御されるところの方法。
【請求項２】
コラーゲンマトリックスにおけるヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との比が、コラーゲンテロペプチドのリシルヒドロキシル化レベルを制御することにより制御される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
コラーゲンテロペプチドのリシルヒドロキシル化レベルがテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性のレベルを制御することにより制御される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性のレベルが、ＰＬＯＤ２遺伝子の発現を制御することによって、またはＰＬＯＤ２発現産物のテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性を制御することによって制御される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との高められた比を示す組織からコラーゲンを得ること、および蛋白分解的減成に対して高められた耐性を有するコラーゲンマトリックスを調製するために該コラーゲンを使用することを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
アリシン架橋を主として示す組織からコラーゲンを得ること、およびコラーゲンマトリックスを調製するために該コラーゲンを使用することを含み、蛋白分解的減成に対して高められた耐性を有するコラーゲンマトリックスが、ヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との高められた比を示す組織から得られたコラーゲンを添加混合することにより得られるところの、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ヒドロキシリシン残基とリシン残基との高められた比を有するテロペプチドを有するコラーゲンを産生する細胞を培養すること、およびヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との高められた比故に蛋白分解的減成に対して高められた耐性を有するコラーゲンマトリックスを調製するために、該産生されたコラーゲンを使用することを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
該コラーゲン産生細胞が、構成的に発現されるＰＬＯＤ２遺伝子組換え体を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該コラーゲン産生細胞が、ＰＬＯＤ２遺伝子の発現を刺激する組成物の存在下で培養される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
ヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との低められた比を示す組織からコラーゲンを得ること、および蛋白分解的減成に対して低められた耐性を有するコラーゲンマトリックスを調製するために該コラーゲンを使用することを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ヒドロキシアリシン架橋を主として示す組織からコラーゲンを得ること、およびコラーゲンマトリックスを調製するために該コラーゲンを使用することを含み、蛋白分解的減成に対して低められた耐性を有するコラーゲンマトリックスが、ヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との低められた比を示す組織から得られたコラーゲンを添加混合することにより得られるところの、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ヒドロキシリシン残基とリシン残基との低められた比を有するテロペプチドを有するコラーゲンを産生する細胞を培養すること、およびヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との低められた比故に蛋白分解的減成に対して低められた耐性を有するコラーゲンマトリックスを調製するために、該産生されたコラーゲンを使用することを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
該コラーゲン産生細胞が、ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性または産生を抑制する組成物の存在下で培養される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該組成物が、リシルオキシダーゼのレベルに影響を及ぼさない、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
コラーゲンのテロペプチドのリシルヒドロキシル化レベルを低めることができ、それによって、ヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との低められた比を有するコラーゲンマトリックスが得られるところの化合物または組成物を、哺乳類の線維症の症状を治療するための薬剤調製物を製造するために使用する方法。
【請求項１６】
該化合物または組成物が、ＰＬＯＤ２遺伝子によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性または産生を抑制することができ、しかしリシルオキシダーゼの活性または産生を抑制することができない、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該化合物または組成物が、共基質２−オキソグルタレートの結合のために予定され、それによって２−オキソグルタレートを置き換えるところの該テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性部位の１以上のサブ部位に結合する化合物を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該化合物または組成物が、該テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性部位において結合したＦｅ２＋をキレート化し、それによって、該Ｆｅ２＋の酸素原子受容機能を抑制しおよび／または２−オキソグルタレートに対して該Ｆｅ２＋を抑制する化合物を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
該化合物または組成物が、該テロペプチドリシルヒドロキシラーゼを共触媒的に不活性化するアントラサイクリンまたはクマル酸類似体を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
該化合物または組成物が、該テロペプチドリシルヒドロキシラーゼを共触媒的に不活性化する、ヒドロキシル化性位置において非生理的リシン誘導体を含むペプチドまたはペプチド様物質を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
該化合物または組成物が、該テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性部位のための天然基質と競合するヒドロキシル化性ペプチドまたはペプチド様物質を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
該化合物または組成物が、該テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性部位のための天然基質と競合する非ヒドロキシル化性ペプチドまたはペプチド様物質を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
該化合物または組成物が、該テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性部位に結合し、それによってアスコルベートを置き換える非還元性アスコルベートである化合物を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
該化合物または組成物が、該テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの非結合反応を促進することができ、その結果、該テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの不活性な自己酸化形態のレベルを高めることができる、非ヒドロキシル化性配列を有するペプチドまたはペプチド様物質を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
該化合物または組成物が、化合物ライブラリーをスクリーニングすること（コンビナトリアル化学）によって見出される化合物を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２６】
該化合物または組成物が、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性を選択的に抑制する抗体またはアプタマーを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２７】
該抗体またはアプタマーが、該テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性部位とまたはその近くで反応する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該抗体またはアプタマーがテロペプチドと反応し、それによって、該酵素の反応を立体的妨害によって抑制する、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
該化合物または組成物が、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ遺伝子の転写を選択的に抑制する化合物を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項３０】
該化合物がミノキシジルまたはミノキシジル類似体である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該化合物または組成物が、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ遺伝子から誘導されるｍＲＮＡの翻訳を抑制するためにアンチセンスＲＮＡを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項３２】
該化合物または組成物が、テロペプチドに対して活性を示さないが内因性テロペプチドリシルヒドロキシラーゼと、その天然基質（コラーゲンテロペプチド）に関して競合する、変異したテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードする組換え遺伝子を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項３３】
該化合物または組成物が、ヒドロキシル化性ペプチドまたは、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼによって通常触媒される反応に関してコラーゲンテロペプチドと競合するペプチドをコードする配列である、請求項１６記載の方法。
【請求項３４】
該哺乳類がヒトである、請求項１５記載の方法。
【請求項３５】
哺乳類の線維症経過の発症または状態を診断および／または監視する方法において、該哺乳類からサンプルを採取し、該サンプルを分析してＰＬＯＤ２遺伝子の発現レベルを決定し、該発現レベルを標品と比較することを含む方法。
【請求項３６】
ＰＬＯＤ２遺伝子由来のｍＲＮＡのレベルを決定するために、ノーザンブロット法または定量的もしくは半定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）によってサンプルが分析される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼのレベルを決定するために、ＰＬＯＤ２特異的抗体またはアプタマーを使用してサンプルが分析される、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの酵素活性レベルを決定するために、ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼに適する基質である少なくとも１つのヒドロキシル化性リシンを含むペプチドまたはポリペプチドを使用してサンプルが分析される、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
化合物または組成物をスクリーニングしてテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性に対するそれらの効果を決定するためのアッセイにおいて、試験されるべき化合物または組成物を、酵素的に機能する条件下で、ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ酵素およびこの酵素に適する基質と接触させること、および該基質のリシルヒドロキシル化レベルを、試験されるべき化合物または組成物の不存在下での該基質のリシルヒドロキシル化レベルと比較して決定することを含むアッセイ。
【請求項４０】
基質が、式Ｑ−Ｌ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｄ−Ｅ−Ｋ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｖ−Ｐのペプチド、または他の、内部リシンを含みかつＮ−末端セリンまたはスレオニンを有しないペプチド、特にビオチン標識された基質であるビオチン−Ｑ−Ｌ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｄ−Ｅ−Ｋ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｖ−Ｐである、請求項３９記載のアッセイ。
【請求項４１】
試験されるべき化合物または組成物を、ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ酵素およびこの酵素に適する基質と接触させた後に、反応混合物から該基質を分離すること、該基質を、Ｈｙｌのヒドロキシル基を酸化してアルデヒド部分にすることができる過ヨウ素酸塩または他の酸化剤、およびヒドラジド染料と順次反応させること、および基質からの蛍光を測定することをさらに含む、請求項４０記載のアッセイ。
【請求項４２】
化合物または組成物をスクリーニングしてテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ発現に対するそれらの効果を決定するためのアッセイにおいて、試験されるべき化合物または組成物の存在下で、ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ酵素を発現する細胞を成長させること、およびＰＬＯＤ２発現のレベルを、試験されるべき化合物または組成物の不存在下でのＰＬＯＤ２発現レベルと比較して決定することを含むアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素分解（特にプロテイナーゼによる）に対する安定性を増加または減少させるためにコラーゲン物質を改変することの一般的分野に関する。更に、本発明は、線維症の症状の内科療法の分野、および線維症経過の診断および／または監視の分野に関する。更に、本発明は、線維症の症状の治療に潜在的に有用である物質のためのスクリーニング試験の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
原線維コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＸＩ型）は、分子のアミノ末端およびカルボキシ末端の両方にテロペプチド（各々、Ｎ−テロペプチドおよびＣ−テロペプチド）がフランキングしている３重螺旋ドメインから成る。コラーゲンの生合成は多工程プロセスであり、その結果、３重螺旋およびテロペプチドの両方が改変される。コラーゲンの生合成における工程の１つは、３重螺旋およびテロペプチドにおける特定のリシン残基のリシルヒドロキシラーゼ酵素（ＥＣ１．１４．１１．４）によるヒドロキシル化である。
【０００３】
細胞外コラーゲン分子は自発的に凝集して細線維になる。架橋によって分子の更なる安定化が生じる。架橋は、テロペプチドの特定のリシン（Ｌｙｓ）またはヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）残基が、リシルオキシダーゼ酵素（ＥＣ１．４．３．１３）によって、各々アルデヒドアリシンおよびヒドロキシアリシンに転化されることにより開始される［Ｈ．Ｍ．　ｋａｇａｎ，　１９９４，　Ｐａｔｈ．　Ｒｅｓ．　Ｐｒａｃｔ．，　１９０：９１０−９１９］。アルデヒドは次いで、３重螺旋中のＬｙｓまたはＨｙｌ残基と反応して、特徴的な２官能性架橋を生じる。これらの架橋はついには成熟して、３または４官能性架橋になる［Ｄ．Ｒ．　Ｅｙｒｅ，　１９８７，　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１４４：　１１５−１３９；　Ａ．Ｊ．　Ｂａｉｌｅｙ　ら，　１９９８，　Ｍｅｃｈ．　Ａｇｅｉｎｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍ，　１０６：　１−５６］。
【０００４】
架橋の生成に関係した２つの経路が記載されている。１方はテロペプチドからのアリシンに基づき、他方はテロペプチドからのヒドロキシアリシンに基づく。各経路は、化学的にはっきり異なる架橋を生じる。ヒドロキシアリシン架橋の例は、ヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）およびリシルピリジノリン（ＬＰ）である。これらの架橋の前駆体は、各々、ジヒドロキシリシノノルロシン（ＤＨＬＮＬ）およびヒドロキシリシノノルロイシン（ＨＬＮＬ）として還元された形態で知られる２官能性架橋である。
【０００５】
プロテイナーゼを含む環境におけるコラーゲン分子の安定性が、中でも架橋のレベルに依存することは周知である。プロテイナーゼに対するコラーゲン分子の安定性は、架橋の量を増加させることにより高めら得る。架橋は、酵素的に媒介される架橋および非酵素的に媒介される架橋であり得る。酵素的に媒介される架橋は、リシルオキシダーゼによって生じる。非酵素的方法での架橋の導入は、コラーゲンを種々の化学物質、例えばアルデヒド、エポキシド、イソシアネート、アシルアジド、カルボジイミド、還元糖（いわゆるメイラード反応）によって処理するか、種々の物理的方法、例えば照射（例えば、短波のＵＶ照射）によるか、または脱水熱処理によって達成され得る。リシルオキシダーゼ、化学物質または物理的方法によってコラーゲン架橋を高めることによりコラーゲンの生分解時間を制御することに関して数多くの文献および特許がある。コラーゲン物質の減成時間の制御は、特に薬物放出および組織エンジニアリングの分野において非常に重要である。組織エンジニアリングの出発点は、足場の設計および足場に接種されるべき細胞の種類の考察である。足場は、種々の傷の治療状況においても使用され得る。インプラントの長期にわたる物理的妨害を避けるために、足場の生分解が必要である。減成速度は、適用に応じ、そして組織生成と調和しなければならない。コラーゲンは、足場の製造の基礎としてしばしば使用される。多数の適用において、非架橋コラーゲンは、再造形されて耐性置換体になり得る前にメタロプロテイナーゼによって減成されやすい故に、使用され得ない。そのような場合には、プロテイナーゼに対してより高い耐性を示すコラーゲンの足場が必要である。したがって、コラーゲンの減成速度を制御するための種々の方法、例えば上記した化学的および物理的方法が開発されている。
【０００６】
化学的および物理的方法の欠点は、分子内の架橋の位置が制御され得ないことである。架橋は、分子全体にわたって生じる。さらに、上記架橋は、分子内または分子間であり得る。別の欠点は、ほとんどの化学的および物理的方法がコラーゲン分子を部分的に変性することである。変性されたコラーゲンは、蛋白分解的減成を非常に受けやすい。他の欠点は、いくつかの架橋が何らかの毒性を示し、免疫原生を有し、生体力学特性に悪影響を及ぼし、細胞／マトリックス相互作用に悪影響を及ぼすこと、あるいは、その処理が望ましくない副作用、例えばマトリックスの石灰化を高めることである。
【０００７】
これらの問題は、リシルオキシダーゼを使用して克服され得る。生成したアルデヒドは、３重螺旋内の非常に特定の位置に位置するアミノ酸と反応する。さらに、架橋は通常、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で生じるので、架橋は毒性または免疫原生を示さず、リシルオキシダーゼによる処理はコラーゲン分子の変性を生じない。
【０００８】
いくつかの場合、蛋白分解性環境においてリシルオキシダーゼによって架橋されたコラーゲン分子の耐久性が十分高くなく、その結果、短すぎる生分解時間を生じる。他の場合、リシルオキシダーゼによって架橋されたコラーゲンは、長すぎる生分解時間を示す。後者は、例えば線維症の場合である。線維症の症状では、コラーゲン分子の望ましくない蓄積が見られ、これはプロテイナーゼによる減成が困難である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
自然に生じる架橋の生成に基づくコラーゲン物質の生分解時間を制御するための手段が要求されている。ここで、本発明者らは、ヒドロキシアリシン架橋によって架橋されたコラーゲンが、アリシンによって架橋されたコラーゲンよりも、蛋白分解酵素に対する耐性が高くかつ減成しにくいことを示す。両方の架橋はともにインビボで生じ、リシルオキシダーゼによって生じる。本発明者らの方法は、テロペプチドのリシルヒドロキシル化レベルを制御することによりコラーゲンの生分解時間を制御することにおいてユニークである。これは、テロペプチドに存在するリシン残基をヒドロキシル化する酵素であるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼのレベルを制御することにより達成される。
【００１０】
本発明は、線維症におけるコラーゲン蓄積の不可逆性を部分的に説明するところの、ヒドロキシアリシン架橋の量が線維症組織において高められるという観察にも関する。
【００１１】
ここで、本発明者らは、遺伝子ＰＬＯＤ２が、テロペプチドのリシルヒドロキシル化レベルを調整することを可能にするテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードすることをも示す。ＰＬＯＤ２によってコードされる酵素がテロペプチド中のＬｙｓまたはコラーゲンの３重螺旋中のＬｙｓをヒドロキシル化するかどうかは、以前には知られていなかった。
【００１２】
本発明は、広い適用性を有する。組織エンジニアリングまたは薬物デリバリーにおいて使用されるコラーゲン物質の製造に使用され得るが、線維症経過を抑制する目的の内科療法の分野においても使用され得る。線維症組織では、テロペプチド−リシル−架橋経路においてテロペプチド−ヒドロキシリシル−架橋経路へ向かう切り替えが見られる。ＰＬＯＤ２によってコードされる酵素の合成（転写、翻訳）の抑制および／またはＰＬＯＤ２によってコードされる蛋白質の酵素活性の抑制は、プロテイナーゼによる減成がより容易であるところの、アリシン架橋によって主に架橋されるコラーゲン網を生じる。本発明は、遺伝子ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードし、そしてこの酵素が線維症において重要な役割を果たすという新規な発見に基づく線維症経過の検出のための新規物質および方法にも関する。
【００１３】
本発明は、テロペプチド中のヒドロキシリシンのレベルの調整に基づいて、蛋白分解酵素を含む環境で種々の減成時間を示すコラーゲン物質の製造法を提供する。
【００１４】
本発明は、傷の治療および線維症が生じる他の経過において、アリシン誘導される架橋ではなく、ヒドロキシアリシン架橋の生成を選択的に抑制し、こうして、集合したコラーゲン網の蛋白分解的減成速度を高めるための新規方法を提供する。その方法の選択性は、アリシン架橋の生合成が弱められず、したがって非架橋コラーゲンよりも好ましい機械的特性を有するコラーゲンを生じるような選択性である。この選択性は、リシルオキシダーゼではなくテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性または産生を選択的に抑制する有効量の組成物の投与によって達成され得る。
【００１５】
本発明はさらに、線維症／瘢痕の開始および／または進行を監視するための手段としての、ＰＬＯＤ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡコピーの量を推定または決定するための方法に関する。本発明はさらに、抗体および／またはアプタマ−または他の手段によってサンプル中の、ＰＬＯＤ２でコードされる酵素の量を測定する方法、および１以上のヒドロキシル化性配列を使用してサンプル中のテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性レベルを決定する方法を提供する。上記方法は、線維症の経過を診断または監視するための手段である。
【００１６】
さらに、本発明は、酵素の活性に対する抑制特性またはＰＬＯＤ２遺伝子の転写もしくは各々のＲＮＡ鋳型の翻訳に関するアンタゴニスト特性を示す化合物をスクリーニングするために設計された試験系においてテロペプチドリシルヒドロシキラーゼ活性を測定する方法を提供する。
【００１７】
テロペプチドリシルヒドロシキラーゼの合成（転写および／または翻訳）を抑制し得る組成物および／またはその酵素の活性を抑制し得る化合物に関する本発明の更なる目的および利点は、以下の詳細な説明を考慮すると、当業者には明らかであろう。
【００１８】
実施例では、（１）アリシンによって架橋されたコラーゲンが、ヒドロキシアリシンによって架橋されたコラーゲンよりもプロテイナーゼによって減成されやすいこと、（２）ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼであることを示す、ブルック（Ｂｒｕｃｋ）症候群におけるＰＬＯＤ２遺伝子の種々の突然変異、（３）高められたＰＬＯＤ２発現レベルが、高められたヒドロキシアリシン架橋レベルを生じること、（４）ＰＬＯＤ２のｍＲＮＡレベルを測定する方法、（５）ＰＬＯＤ２の発現が、線維症を媒介する細胞である筋線維芽細胞において非常に高められること、（６）テロペプチドリシルヒドロキシラーゼに対する抑制特性を示す化合物をスクリーニングするために設計された高スループットアッセイの様式、（７）種々の減成速度を有するコラーゲン物質を製造する方法、（８）テロペプチド中の高いリシルヒドロキシル化レベルを有するコラーゲンを得るために細胞中のテロペプチドリシルヒドロキシラーゼレベルを高める方法、（９）テロペプチド中の低いリシルヒドロキシル化レベルを有するコラーゲンを得るためにテロペプチドリシルヒドロキシラーゼレベルを抑制する方法を例証する。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、架橋したコラーゲン分子を含むコラーゲンマトリックスを得る方法において、該コラーゲンマトリックスの蛋白分解的減成に対する耐性が、コラーゲンマトリックスにおけるヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との比を制御することにより制御されるところの方法を提供する。コラーゲンマトリックスにおけるヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との比は、コラーゲンテロペプチドのリシルヒドロキシル化レベルを制御することにより制御され得る。コラーゲンテロペプチドのリシルヒドロキシル化レベルは、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性のレベルを制御することにより制御され得る。テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性のレベルは、ＰＬＯＤ２遺伝子の発現を制御することによって、またはＰＬＯＤ２発現産物のテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性を制御することによって制御され得る。好ましくは、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性のレベルが、螺旋リシルヒドロキシラーゼ活性に同時に影響を及ぼすことなく制御されるが、螺旋リシルヒドロキシラーゼ活性が同時に増加しまたは減少することは許容され得る。より好ましくは、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性のレベルが、リシルオキシダーゼ活性が影響されないような方法で制御される。それによって、本発明は、架橋の全体の程度に重要な影響を及ぼすことなく、コラーゲンマトリックスにおけるヒドロキシアリシン架橋とアリシン架橋との改変された比を達成することを可能にする。
【００２０】
本発明は、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で行なわれる方法、特に、蛋白分解的減成または破壊に対する所望の耐性、すなわち所望の生分解時間、特に蛋白分解的減成に対して所望の高いまたは低い安定性、を有するコラーゲンマトリックスを製造する方法を含む。そのようなインビトロ法は、コラーゲンを産生する生きている細胞の使用を含み得るが、完全に細胞不含であってもよい。本発明はさらに、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）、すなわち生きている哺乳類、特にヒトにおいて行なわれる方法を含み、ここで、主な適用は、線維症の症状の治療にある。
【００２１】
さらに、本発明は、哺乳類の線維症経過の発症または状態を診断および／または監視する方法において、該哺乳類からサンプル（特に組織サンプル）を採取し、該サンプルを分析してＰＬＯＤ２遺伝子の発現レベルを決定し、該発現レベルを標品と比較することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、化合物または組成物をスクリーニングしてテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性に対するそれらの効果を決定するためのアッセイ（特に高スループットアッセイ）において、試験されるべき化合物または組成物を、酵素的に機能する条件下で、ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ酵素およびこの酵素に適する基質と接触させること、および該基質のリシルヒドロキシル化レベルを、試験されるべき化合物または組成物の不存在下での該基質のリシルヒドロキシル化レベルと比較して決定することを含むアッセイを提供する。そのようなアッセイは好ましくは、試験されるべき化合物または組成物を、ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ酵素およびこの酵素に適する基質と接触させた後に、反応混合物から該基質を分離すること、該基質を、Ｈｙｌのヒドロキシル基を酸化してアルデヒド部分にすることができる酸化剤、例えば過ヨウ素酸塩、およびヒドラジド染料と順次反応させること、および基質からの蛍光を測定することをさらに含む。
【００２３】
さらに、本発明は、化合物または組成物をスクリーニングしてテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ発現に対するそれらの効果を決定するためのアッセイにおいて、試験されるべき化合物または組成物の存在下で、ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ酵素を発現する細胞を成長させること、およびＰＬＯＤ２発現のレベルを、試験されるべき化合物または組成物の不存在下でのＰＬＯＤ２発現レベルと比較して決定することを含むアッセイを提供する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
定義
テロペプチドリシルヒドロキシラーゼは、コラーゲンテロペプチドのリシン残基をヒドロキシリシンに転化することができる酵素を意味する。テロペプチドリシルヒドロキシラーゼは、螺旋リシルヒドロキシラーゼに対立するものとして、テロペプチドに存在するＬｙｓに関して、コラーゲン分子の３重螺旋部分に存在するＬｙｓよりも高いアフィニティーを有する。
【００２５】
本発明では、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼは、ＰＬＯＤ２遺伝子の核酸配列またはそれに相同的な核酸配列によってコードされる生物的に活性な酵素を意味する。該酵素は、ＰＬＯＤ２の完全なｍＲＮＡ配列、そのスプライシング変異体、またはＰＬＯＤ２核酸配列の断片（しかし、テロペプチド中のリシン残基をヒドロキシル化する意味で生物活性を示すポリペプチドをなおもコードする）から誘導される。本発明はまた、ＰＬＯＤ２変異体、すなわち、ヌクレオチド配列においてまたはコードされたポリペプチドのアミノ酸配列においてすら異なるが、テロペプチドのリシン残基のヒドロキシル化において活性を示すポリペプチドをなおもコードする変異体をも包含する。いくつかのＰＬＯＤ２変異体は、その技術分野において公知である。好ましいＰＬＯＤ２変異体は、ＰＬＯＤ２アミノ酸配列との相同性が少なくとも９０％であるものである。遺伝暗号の縮重の結果、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードし、いくつかはＰＬＯＤ２のポリペプチドに対して最小の相同性を有する多数のポリヌクレオチド配列が調製され得る。すなわち、本発明は、あり得るコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより作られ得るポリヌクレオチド配列の各々および全てのありうる変異を意図する。
【００２６】
公知のＰＬＯＤ２配列のいくつかの例は、Ｍ．　Ｖａｌｔａｖａａｒａら（１９９７，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７２（１１）：６８３１−６８３４）、Ｈ．Ｎ．　Ｙｅｏｗｅｌｌ　＆　Ｌ．Ｃ．　Ｗａｌｋｅｒ　（１９９９，　Ｍａｔｒｉｘ，　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１８：１７９−１８７）、Ｈ．　Ｒｕｏｔｓａｌａｉｎｅｎら（１９９９，　Ｍａｔｒｉｘ，　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１８：３２５−３２９）、およびＨ．　Ｒｕｏｔｓａｌａｉｎｅｎら（２００１，　Ｍａｔｒｉｘ，　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　２０：１３７−１４６）に見ることができる。Ｙｅｏｗｅｌｌ　＆　Ｗａｌｋｅｒの上記文献は、ＰＬＯＤ２の２つのスプライシング変異体の存在を記載している。本特許出願では、ＰＬＯＤ２Ａが短い形状を意味し、一方、ＰＬＯＤ２Ｂが、エキソン１３Ａ（エキソン１３とエキソン１４との間に存在）を含むＰＬＯＤ２の形状を意味する。
【００２７】
言葉「テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性または産生を抑制する」は、本明細書では、広い意味で使用される。すなわち、酵素の実際の抑制そのものをカバーするだけでなく、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ遺伝子の転写の抑制、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ遺伝子由来のｍＲＮＡの翻訳の抑制、および変異したテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ、またはテロペプチドに対して活性を示さないが、内在するテロペプチドリシルヒドロキシラーゼとその天然の基質（コラーゲンテロペプチド）に関して競合するところのその断片（をコードする組換え遺伝子）による処理をもカバーする。
【００２８】
言葉「アンタゴニスト」は、本明細書で使用されるとき、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの生物学的活性の効果の量または期間を減じる分子を意味する。アンタゴニストは、蛋白質、核酸、炭水化物、抗体、アプタマー、またはテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの効果を減じるところの任意の他の分子を包含し得る。
【００２９】
線維症は、コラーゲンの過剰な沈着を特徴とし、その結果、影響を受けた組織の瘢痕を生じるところの障害または望ましくない身体的症状である。
【００３０】
アリシンによって架橋されたコラーゲンは、原線維において異なる分子充填を示し、かつヒドロキシアリシンによって架橋されたコラーゲンと比較してより容易に減成される
ブルック症候群における骨コラーゲンは、正常な骨のヒドロキシアリシン架橋に欠ける。その架橋は、アリシン架橋によって置き換えられている［Ｒ．Ａ．　Ｂａｎｋら，　１９９９，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６：　１０５４−１０５８］。アリシン架橋されたコラーゲン分子が、蛋白分解酵素による減成をより受けやすいかどうかを確証するために、脱塩されたブルック症候群の骨（アリシン架橋を含む）及び脱塩された対照の骨（ヒドロキシアリシン架橋を含む）の両方が、０．５Ｍの酢酸に溶解されたペプシンによって処理された。ペプシン処理された脱塩されたブルック症候群の骨は、（正常な骨の５％と比較して）コラーゲン分子の６５％の遊離を生じた。脱塩されたブルック症候群の骨及び脱塩された対照の骨の０．５Ｍ酢酸中での処理は、各々、コラーゲン分子の７％及び１％の可溶化を生じた。これは、６５％の遊離されたコラーゲンの値が、主としてペプシンの作用によることを示す。
【００３１】
アリシン架橋されたコラーゲン分子が蛋白分解酵素による減成をより受けやすいことの更なる証拠が、ブルック症候群の患者の尿中のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）レベルを測定することにより得られた。本発明者らは、ブルック症候群であると臨床的に診断された患者の尿を分析した（ほとんどの患者がその文献に記載されている）。実施例の１つにおいて示されたデータは、ブルック症候群におけるヒドロキシプロリンの尿中レベル（Ｈｙｐのμモル／クレアチニンのミリモル）が、年齢に関係した対照または年齢に関係した骨形成不全症患者よりも高いことを示している（図１Ａ；Ｐ＜０．００１）。これは、コラーゲン減成の増加があることを示している。同じことが、高められたヒドロキシプロリン／プロリン比から結論付けられ得る（図１Ｂ；Ｐ＜０．００１）。尿中のコラーゲン減成産物のほとんどが骨に由来するので［Ｍ．Ｓ．　Ｃａｌｖｏら，　１９９６，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，　１４：　３３３−３６８］、ブルック症候群患者は恐らく、骨コラーゲンの高められた回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）を示す。実際、ブルック症候群患者は骨粗鬆症であり、高められた骨コラーゲン減成をさらに示す。この現象は、ブルック症候群の骨におけるヒドロキシアリシン架橋の欠乏に帰する。
【００３２】
興味深いことに、ブルック症候群の骨（主としてアリシン架橋を含む）由来のペプシン処理されたコラーゲンは、ＳＤＳ電気泳動において２つのβバンド（β１，１及びβ１，２（１：２の比））を示すが、正常な骨（（主としてヒドロキシアリシン架橋を含む）由来のペプシン処理されたコラーゲンは、ＳＤＳ電気泳動において３つのβバンド（β１，１、β１，２及びβ２，２（１：１：１の比））を示す。βバンドは、２官能性架橋によって互いに連結される２つのα鎖である。コラーゲンの架橋は、２、３の特定のアミノ酸のみを含む。コラーゲン分子が正しく配列しているとき、立体的及び化学的理由のために、これらのアミノ酸のみが互いに反応し得る。従って、充填配置（ｐａｃｋｉｎｇ　ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）における変化は、架橋の量および性質に影響を及ぼし、またはその逆であるに違いない。いずれの場合も、架橋パターンが、原線維内コラーゲン分子の配列を探るためのマーカーとして使用され得る。ペプシン処理後のβバンドパターンにおける違いは、コラーゲン分子の異なる充填の結果であると本発明者らは思った。Ｊ．　Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら　［１９９６，　Ｊ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，　１０７：５８９−５９２］も、アリシンによって架橋されたコラーゲン分子が、ヒドロキシアリシン架橋を含むコラーゲン分子の充填とは異なる、原線維内での充填配置を示すことを開示している。本発明者らは、アリシン架橋されたコラーゲンの高められた減成速度が認められたことには、充填におけるこの違いが原因となって関係していると仮定する。
【００３３】
実施例の１つは、アリシン架橋に対するヒドロキシアリシン架橋の種々の比を示し、従ってプロテイナーゼに対して種々の減成速度を示すコラーゲン組成物の調製法を記載する。
【００３４】
結論として、アリシンによって架橋されたコラーゲン分子は、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の両方において、蛋白分解的減成をより受けやすい。これは、ブルック症候群患者の尿におけるコラーゲン減成産物の高い排泄、およびその結果としてその患者の骨粗鬆症状態を説明する。逆に、ヒドロキシアリシンによって架橋されたコラーゲンは、プロテイナーゼに対してより耐性であると言うことができる。この観察は、１以上のプロテイナーゼを含む環境において種々の減成時間を示すコラーゲン物質の調製のための新規な手段を提供する。コラーゲン物質の滞在時間は、テロペプチドにおけるヒドロキシリシンのレベルを増加させることにより増加され得る。注目すべきことは、ヒドロキシアリシン由来の架橋の存在が、不可逆的なコラーゲン沈着（線維症に見られるようなもの；下記を参照）の指標であることが以前から知られているにもかかわらず、蛋白分解酵素に対するコラーゲンの感受性に対する、酵素的に媒介される架橋の種類の影響は今まで研究されておらず、それを、コラーゲンマトリックスの生分解時間の増減のための手段として考慮することも決してなかったことである。この無視に関するあり得る説明は、テロペプチドのリシンのヒドロキシリシンへの転化がどのようにして制御され得るのかが今まで分からなかったということである。転化は、酵素テロペプチドリシルヒドロキシラーゼによって媒介される。テロペプチドのリシンのヒドロキシリシンへの転化を制御するために、該酵素の正体およびその作用機構を知ることが必要である。以下の段落（６．２）において、遺伝子ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードすることを示す。
【００３５】
ブルック症候群患者のＰＬＯＤ２の配列が変異を示した。これは、遺伝子ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードすることの直接の証拠を提供する
コラーゲンの３重螺旋中のＬｙｓのヒドロキシル化が、配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙに存在するＬｙｓ上で排他的に起こる。Ｘ位置のＬｙｓはヒドロキシル化されない。テロペプチド中のヒドロキシル化されたＬｙｓは、完全に異なるアミノ酸配列に埋め込まれる。それを考慮して、酵素の２つの群の存在が仮定されている。すなわち、３重螺旋配列中のＬｙｓをヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）に転化する酵素群（螺旋リシルヒドロキシラーゼ）およびテロペプチド中のＬｙｓのＨｙｌへの転化に寄与する酵素群（テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ）である。
【００３６】
テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの群が存在するに違いないことの最も直接的な証拠は、エーラー・ダンロスＶＩ型症候群（ＥＤＳ−ＶＩ）およびブルック症候群の架橋の研究から引き出された。ＥＤＳ−ＶＩは、コラーゲンの３重螺旋のヒドロキシリシン欠乏によって生化学的に特徴付けられる疾患である。ＥＤＳ−ＶＩ患者は、組織中（例えば、骨由来のコラーゲンＩ型中）のピリジノリンの正常なレベルおよび尿中のピリジノリンの正常な排泄レベルを示す［Ｂ．　Ｓｔｅｉｎｍａｎｎら，　１９９５，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．，　５７：　１５０５−１５０８；　Ａｃｉｌ　Ｙ．ら，　１９９５，　Ｊ．　Ａｍ．Ａｃａｄ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，　３３：　５２２−５２４］。ピリジノリンは、ヒドロキシアリシン経路に由来する架橋である。すなわち、ＥＤＳ−ＶＩでは、３重螺旋のＨｙｌの欠乏にもかかわらず、正常な量のＨｙｌがテロペプチドに存在する。このことから、ＥＤＳ−ＶＩにおける変異した遺伝子は、螺旋リシルヒドロキシラーゼをコードすることになる。ブルック症候群では、その反対が見られる。すなわち、骨ではコラーゲンの３重螺旋の正常なＨｙｌレベルが見られ、一方、ヒドロキシアリシン由来の架橋は実質的に存在しない［Ｒ．Ａ．　Ｂａｎｋら，　１９９９，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６：　１０５４−１０５８］。すなわち、ブルック症候群では、３重螺旋Ｈｙｌの正常なレベルにもかかわらず、テロペプチド中のＨｙｌの欠乏が観察される。定義によれば、ブルック症候群における変異した遺伝子は、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ、またはＴＬＨ活性に関与するコファクター、またはその酵素の発現／合成に関与する転写因子である。
【００３７】
今まで、３つのリシルヒドロキシラーゼ遺伝子、すなわちＰＬＯＤ１、ＰＬＯＤ２およびＰＬＯＤ３が同定されている。略号ＰＬＯＤは、プロコラーゲン−リシン、２−オキソグルタレート５−ジオキシゲナーゼ（リシルヒドロキシラーゼの系統的名称である）に由来し、一方、１、２および３は、発見の順序を示す。３つのＰＬＯＤ遺伝子の発現は、組織特異的分布を示す［Ｍ．　Ｖａｌｔａｖａａｒａら，　１９９７，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７２：　６８３１−６８３４；　Ｍ．　Ｖａｌｔａｖａａｒａら，　１９９８，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７３：　１２８８１−１２８８６；　Ｋ．　Ｐａｓｓｏｊａら，　１９９８，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９５：　１０４８２−１０４８６；　Ｈ．　Ｒｏｕｔｓａｌａｉｎｅｎら，　１９９９，　Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．，　１８：　３２５−３２９］。ＰＬＯＤ２は、組織特異的スプライシング変異体をも示す［Ｈ．Ｎ．　Ｙｅｏｗｅｌｌ　＆　Ｌ．Ｃ．　Ｗａｌｋｅｒ，　１９９９，　Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．，　１８：１７９−１８７］。さらに、ＰＬＯＤ１の組織特異的形態が存在することのＤＮＡレベルでの何らかの証拠がある［Ｈ．Ｎ．　Ｙｅｏｗｅｌｌら，　１９９４，Ｊ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，　１０２：　３８２−３８４］。ＰＬＯＤ１−３は、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現系において発現された。ｃＤＮＡによってコードされる蛋白質は、螺旋状配列ＩＫＧＩＫＧＩＫＧまたはＡＲＧＩＫＧＩＲＧＦＳＧを含む合成ペプチドに対して活性を示す。種々のコラーゲン型に対するＰＬＯＤ１〜３の発現された遺伝子産物の特異性は今まで研究されていないが、種々のリシルヒドロキシラーゼ間のアミノ酸配列相同性が比較的低い（約５０〜６０％）ことは、該酵素の基質特性または機能性における相違を示唆する。
【００３８】
ＰＬＯＤ１は、コラーゲンの３重螺旋のヒドロキシリシン欠乏によって生化学的に特徴付けられる疾患であるエーラー・ダンロスＶＩ型症候群（ＥＤＳ−ＶＩ）において変異される遺伝子である［Ｊ．　Ｂｒｉｎｃｋｍａｎｎら，　１９９８，　Ａｒｃｈ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．　Ｒｅｓ．，　２９０：　１８１−１８６；　Ｈ．Ｎ．　Ｙｅｏｗｅｌｌ　＆　Ｌ．Ｃ．　Ｗａｌｋｅｒ，　２０００，　Ｍｏｌｅｃ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｍｅｔａｂ．，　７１：　２１２−２２４］。ＥＤＳ−ＶＩでは、テロペプチドの正常なヒドロキシル化が見られる。すなわち、ＰＬＯＤ１遺伝子は、３重螺旋リシルヒドロキシラーゼを恐らくコードする。
【００３９】
今まで、ＰＬＯＤ２またはＰＬＯＤ３に関連させた疾患はなかった。Ｒ．Ａ．　Ｂａｎｋら［１９９９，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６：　１０５４−１０５８］による文献には、欠陥（すなわち、骨コラーゲンのテロペプチドにＨｙｌが存在しないこと）が染色体１７ｐ１２に関連するところのクルド人系のブルック症候群ファミリーが示されている。これは、候補遺伝子としてのＰＬＯＤ２およびＰＬＯＤ３を排除するものである。なぜならば、それらは各々、染色体３および７上に位置するからである。ＰＬＯＤ２およびＰＬＯＤ３によってコードされるリシルヒドロキシラーゼの基質特異性は知られていない。両方の酵素に対して行われた唯一の基質研究は、螺旋配列ＩＫＧＩＫＧＩＫＧまたはＡＲＧＩＫＧＩＲＧＦＳＧを示すペプチドとのインキュベーションである。両方の酵素は、これらの螺旋配列をヒドロキシル化することができた［Ｍ．　Ｖａｌｔａｖａａｒａら，　１９９７，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７２：　６８３１−６８３４；　Ｍ．　Ｖａｌｔａｖａａｒａら，　１９９８，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７３：　１２８８１−１２８８６；　Ｋ．　Ｐａｓｓｏｊａら，　１９９８，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９５：　１０４８２−１０４８６］。これらのデータから、ＰＬＯＤ２およびＰＬＯＤ３は、螺旋リシルヒドロキシラーゼをコードすると結論付けられる。さらに、ＰＬＯＤ２は、ヒドロキシアリシン架橋が極めて低いレベルで存在するところの皮膚において発現される［Ｈ．Ｎ．　Ｙｅｏｗｅｌｌ　＆　Ｌ．Ｃ．　Ｗａｌｋｅｒ，　１９９９，　Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１８：１７９−１８７；　Ｃ．　Ｗａｎｇら，　２０００，　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１９：　７１−７７］。これも、ＰＬＯＤ２が螺旋リシルヒドロキシラーゼをコードすることを示唆するであろう。
【００４０】
骨芽細胞（の前駆体）に関する研究は、Ｉ型コラーゲンのテロペプチドにおける１６日（鉱化段階）でのＬｙｓヒドロキシル化の高まりが、ＰＬＯＤ２ｍＲＮＡのより高い発現と一致するというデータを提供した［Ｋ．　Ｕｚａｗａら，　１９９９，　Ｊ．　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．　Ｒｅｓ．，　１４：　１２７２−１２８０］。これらのデータに基づいて、著者らは、ＰＬＯＤ２遺伝子がテロペプチドリシルヒドロキシル化に関与し得ると仮定した。しかし、そのデータは、説得力がない。上記著者らによって示されるように（図３、第２列、初期分化段階＝８日でのｍＲＮＡレベル）、ピリジノリン架橋の形成には２、３日が必要であり、この期間のＰＬＯＤ２発現が低いからである。その結論はしたがって、その分野の他の研究者らによってその後無視された。事実、本発明者らは、骨芽細胞（の前駆体）におけるＰＬＯＤ２レベルを同様に測定したが、鉱化段階を包含する骨芽細胞の分化の間にＰＬＯＤ２レベルの増加は見られなかった（図７）。これは、Ｕｚａｗａらが使用したノーザンブロット法よりもはるかに信頼性を有するリアルタイムＰＣＲ法によって行われた。
【００４１】
本発明者らは、罹患した２人の子供を持ち、健康な子供はいない（子供の１人は、Ｅ．　Ｊ．　Ｂｒｅｓｌａｕ−Ｓｉｄｅｒｉｕｓら，　１９９８，　Ｊ．　Ｐｅｄｉａｔｒ．　Ｏｒｔｈｏｐ．　Ｂ，　７：３５−３８のケース８である）クルド人の別の血族のブルック症候群ファミリー（ファミリーＰＭ）を今研究した。この家系では、染色体１７の本発明者らが発表したマーカーを用いると、連鎖の不在が認められた。ハプロタイプ分析は、罹患した子供が異なる母系の染色体を受け継いだことを示した。ＰＬＯＤ２によってコードされるリシルヒドロキシラーゼは、遺伝子地図９８によれば、染色体３上の間隔Ｄ３Ｓ１５５０およびＤ３Ｓ１３０６（各々、性平均１５９．８ｃＭおよび１６４．２５ｃＭ）の間に位置する。ハプロタイプ分析は、ＤＮＡマーカーＤ０３Ｓ１７６４（性平均１５２．６２ｃＭ）、Ｄ０３Ｓ１５１２（性平均１５８．３８ｃＭ）、Ｄ０３Ｓ１７４４（１６１．０４ｃＭ）、Ｄ０３Ｓ３６１８（１６３．１８ｃＭ）およびＤ０３Ｓ１５９４（１６８．９４ｃＭ）を用いて、両親および２人の罹患者について行われた。罹患者は、Ｄ０３Ｓ１５１２、Ｄ０３Ｓ１７４４、Ｄ０３Ｓ３６１８およびＤ０３Ｓ１５９４に関してホモ接合性であり、ハプロタイプ分析は、罹患した子供が、その染色体領域の２つの同一のコピーを受け継いだことを示した（すなわち家系によるホモ接合性）（図２Ｂ）。すなわち、このブルック症候群ファミリーおよびＰＬＯＤ２が位置する染色体領域には良好な連鎖が認められた。結論として、このブルック症候群ファミリーは、驚いたことに、ＰＬＯＤ２によってコードされるリシルヒドロキシラーゼがテロペプチドリシルヒドロキシラーゼであることの遺伝学的証拠を提供した。第２のブルック症候群ファミリー（ファミリーＤＲ）も、染色体３に対して連鎖を示す（図２Ａ）。
【００４２】
文献に発表されたＰＬＯＤ２の一次構造は、主としてｃＤＮＡ配列に基づく。これは、イントロン／エキソン境界が知られていないことを意味する。ＰＬＯＤ１およびＰＬＯＤ３は１９のエキソンを有する。これら２つの遺伝子のイントロン／エキソン境界は同一である。ＰＬＯＤ２はＰＬＯＤ１およびＰＬＯＤ３との相同性が高いので、エキソン／イントロン境界がＰＬＯＤ１およびＰＬＯＤ３のそれと一致することも予想される。これは、現人類の染色体３のクローンＲＰ１１−７５８Ｉ１４（ＧｅｎＢａｎｋコードＡＣ０５３５３９）およびＲＰ１１−２７４Ｈ２（ＧｅｎＢａｎｋコードＡＣ０１８３６９）の配列を分析することにより確認された。さらに、エキソン１３Ａとして示される余分のエキソン（ＰＬＯＤ１およびＰＬＯＤ３には見られない）は、ＰＬＯＤ２の一体としての一部分（ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｌ　ｐａｒｔ）である。ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードすることの直接の証拠を提供するために、ＴａＫａＲａ　Ｌａ　Ｔａｑポリメラーゼを使用し、各エキソンの５’および３’側にフランキングしたイントロンにプライマーを位置させて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってエキソン１〜エキソン１９ならびにエキソン１３Ａを個々に増幅した。これは、ブルック症候群患者、罹患していない両親、および健康な対照集団から得られた市販のゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　１６９１１１２）からのゲノムＤＮＡ（標準的方法によって精製）を用いて行われた。予想された大きさ（１％アガロースゲル上で測定）の増幅されたエキソンを、Ｑｉａｇｅｎ　ＰＣＲ精製キットによって遊離ｄＮＴＰおよびポリメラーゼから分離した。精製されたエキソンを、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用するサイクルシークエンスＰＣＲにおいて、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を用いて染色し、そして、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（商標）３１０装置を試用する毛管電気泳動によって分析した。個々のエキソンの増幅に関する使用したプライマーおよびＰＣＲ条件の詳細については、実施例の１つを参照。ファミリーＰＭの２人のブルック症候群患者の配列分析は、配列ＧＧＹＥＮＶＰＴにおいてＧｌｙ６→Ｖａｌの変異を生じるヌクレオチドミスセンス変異を示した。この変異は、両方の対立遺伝子上に見られた。両親は、このミスセンス変異の保因者であった（図３を参照）。ファミリーＤＲの１人のブルック患者では、配列ＧＧＹＥＮＶＰＴにおいてＴｈｒ→Ｉｌｅ変異を生じるヌクレオチドミスセンス変異であった．その患者は、その変異に対してホモ接合性であったが、両親および健康な妹は、この変異に対してヘテロ接合性であった（図４参照）。ファミリーＰＭおよびＤＲに見られた２つの異なる点変異は、異なるＰＬＯＤ間および異なる種属間で１００％アミノ酸相同性を示す配列に位置していた。これは、一般的にはリシルヒドロキシラーゼの機能および特にはＰＬＯＤ２の機能におけるこの領域の重要な役割を示唆する。
【００４３】
結論として、この段落では、別の方面で示された証拠を鑑みて多いに驚いたことに、ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードすることを示した。これは、テロペプチド中のヒドロキシリシンのレベルを調節することが今可能であるので、プロテイナーゼに対して種々の耐性時間を示すコラーゲン組成物の調製における新規な手段を提供することにより、その分野の要求を満足させる。
【００４４】
テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの発現を調節することによりアリシン架橋に対してヒドロキシアリシン架橋を増減する方法
本発明は、コラーゲンテロペプチドのリシルヒドロキシル化レベルを低下させる化合物または組成物の有効量を哺乳類に投与し、それによって、アリシン架橋に対するヒドロキアリシン架橋の低下された比を有するコラーゲンマトリックスを生じることにより、該哺乳類の線維症の症状を治療する方法を提供する。投与の正確な方法、投与されるべき用量および治療プロトコルに関して、本発明は特に制限されない。これらの因子は、投与されるべき活性物質または組成物、治療されるべき組織、治療されるべき患者、線維症の程度などの因子に多いに依存する。例えば、線維症が皮膚または他の容易に接近しやすい組織に生じた場合は、局所または皮下投与が好ましい投与経路であろう。肺組織の線維症の場合は、吸入による投与が好ましい投与経路であろう。線維症が内部組織、例えば肝臓に生じた場合は、例えば静脈内注射または輸液による全身投与が必要であり得る。活性剤は、特定の部位または組織を目標にするための手段に結合され得る。当業者は、投与経路、投与されるべき活性物質または組成物、ならびに用量および治療プロトコルに関する最良の治療法を個々のケースで決定することができる。
【００４５】
低められたヒドロキシリシンレベルを有するコラーゲン物質の調製のためにテロペプチドリシンのヒドロキシリシンへの転化を抑制する方法は、寄与するテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ遺伝子の転写を抑制することである。テロペプチドリシルヒドロキシラーゼのプロモーター領域を抑制することができる化合物は、アリシン架橋に対するヒドロキシアリシン架橋の量を調節するために潜在的に魅力的な化合物である。研究に値する化合物は、例えば、ミノキシジルおよびミノキシジル類似体である。これらは、ＰＬＯＤ１遺伝子の転写を抑制することが知られている化合物である［Ｓ．　Ｍｕｒａｄら，　１９９４，　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．，　３０８：　４２−２７］。
【００４６】
テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの合成を抑制するための更なる方法は、アンチセンスＲＮＡ（ＤＮＡアンチセンス鎖、すなわち蛋白質をコードしない鎖、の転写産物）によってｍＲＮＡ翻訳を抑制することである。細胞のトランスフェクションは、裸のアンチセンスＲＮＡ、すなわちＰＬＯＤ２ＤＮＡアンチセンス鎖（の一部）を含む担体またはベクター中に乳化されたまたはそれに結合されたアンチセンスＲＮＡを用いて行なわれ得る。
【００４７】
テロペプチドＬｙｓのＨｙｌへの転化を抑制する別の方法は、酵素テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ自体の活性を抑制することである。プロリルヒドロキシラーゼおよびリシルヒドロキシラーゼは非常に類似した触媒特性（例えば、それらは同じ共基質を共有する）を有する。さらに、プロリルおよびリシルヒドロキシラーゼの抑制パターンも同様に非常に類似しているが、いくつかの細部において相違があり、これは、上記ヒドロキシラーゼの触媒部位間に重要な相違があることを示唆している。例えば、脂肪族および芳香族の２−オキソグルタレート類似体（下記を参照）のＫｉ値は、ＰＬＯＤ１によってコードされるリシルヒドロキシラーゼに対しての方が、プロリル３−ヒドロキシラーゼおよびプロリル４−ヒドロキシラーゼに対するよりも明らかに高い。プロリル３−ヒドロキシラーゼ、プロリル４−ヒドロキシラーゼ、およびＰＬＯＤ１によってコードされる螺旋リシルヒドロキシラーゼの抑制に関して以前に得られたデータは、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの抑制剤の、知見に基づく設計のために使用され得る。その仮定は、ＰＬＯＤ２によってコードされる酵素によって行なわれるヒドロキシル化反応の後、ＰＬＯＤ１のように、２−オキソ−［１−１４Ｃ］グルタレートのデカルボキシル化を測定することができるという観察によって強化される［Ｖａｌｔａｖａａｒａら，　１９９７，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７２：　６８３１−６８３４］。
【００４８】
ＰＬＯＤ１によってコードされる酵素のそれに匹敵するＰＬＯＤ２によってコードされる酵素の反応機構は、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ抑制剤の設計に関する窓を当業者のために提供する。従うことは、ＰＬＯＤ１によってコードされる蛋白質に関する以前の知見に基づくＰＬＯＤ２によってコードされる蛋白質の反応機構の記載、およびそれに続く、この反応機構がどのように抑制され得るかの記載である。これは、ＰＬＯＤ１によってコードされる酵素の抑制に関して過去において記載された、技術に密接に平行した実験としての十分なガイダンスを当業者に提供すべきである。リシルヒドロキシラーゼは、第一鉄イオン（Ｆｅ２＋）、２−オキソグルタレート、分子酸素（Ｏ２）およびアスコルベートを必要とする反応においてリシンに作用する。２−オキソグルタレートは、Ｏ２の１つの原子がスクシネートに組み入れられることを伴うヒドロキシル化の間に化学量論的に脱カルボキシル化され、一方、他方の原子は酵素結合した第一鉄イオンと錯体を形成する。後者は、反応性の高い鉄−酸素錯体、フェリルイオンを生じる。フェリルイオンの酸素原子は次いで、リシン残基上に形成されるヒドロキシ基に組み込まれ、それによってフェリルイオンを、酵素結合した第一鉄イオンに転化する。ヒドロキシル化性基質の不存在下では、リシルヒドロキシラーゼは、全ての共基質の存在下で２−オキソグルタレートの脱カルボキシル化反応を触媒することができる［Ｇ．　Ｔｓｃｈａｎｋら，　１９９４，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　３００：　７５−７９］。このいわゆる非結合反応では、フェリルイオンがＦｅ３＋およびＯＨ−に転化され、Ｆｅ３＋イオンは活性部位に結合されたままであり、Ｆｅ３＋がアスコルベートによってＦｅ２＋に還元されるまで、酵素を新しい触媒サイクルに関して利用できなくする。インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのリシルヒドロキシラーゼ反応におけるアスコルベートの主な役割は、非結合反応後に酵素を再活性化させることである［Ｒ．　Ｍｙｌｌｙｌａら，　１９８４，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２５９：　５４０３−５４０５］。アスコルベートは、そのようなものとして、酵素の鉄成分を、それが偶発的に酸化されたならば、還元された状態に戻すという管理的役割を果たす。非結合反応（および従って鉄の酸化）は、非ヒドロキシル化性配列を含むペプチドによって高められ得る［Ｄ．Ｆ．　Ｃｏｕｎｔｓら，　１９７８，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７５：　２１４５−２１４９；　Ｎ．Ｖ．　Ｒａｏ　＆　Ｅ．　Ａｄａｍｓ，　１９７８，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２５３：　６３２７−６３３０］。
【００４９】
テロペプチドリシンをヒドロキシリシンに転化する酵素反応は、リシルオキシダーゼを抑制することなくテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性を抑制する化合物の設計のために使用され得る。そのような可能性のある抑制剤の例は以下の通りである。
・２−オキソグルタレートの結合のために予定された酵素の活性部位のサブサイトに結合する化合物（例えば、２−オキソグルタレートの脂肪族および芳香族の構造的類似物）。上記化合物によるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性の抑制は、２−オキソグルタレートに関して競合する。
・テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性部位において結合したＦｅ２＋をキレート化する化合物。上記化合物によるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性の抑制は、Ｆｅ２＋の酸素原子受容機能に関しておよび／またはＦｅ２＋の２−オキソグルタレートへの結合に関して競合する。
・アントラサイクリンまたはクマル酸類似体によるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの共触媒的不活性化。
・ヒドロキシル化性位置において非生理学的リシン誘導体を含むペプチドによるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの共触媒的不活性化。
・テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの天然基質（テロペプチド）に関して競合するヒドロキシル化性ペプチドまたはペプチド様物質。選択されたペプチドまたはペプチド様物質は、リシルオキシダーゼの天然基質に関する競合がはるかに少ない。
・テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの天然基質（テロペプチド）に関して競合する非ヒドロキシル化性ペプチドまたはペプチド様物質。選択されたペプチドまたはペプチド様物質は、リシルオキシダーゼの天然基質に関する競合がはるかに少ない。
・テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ上のペプチド基質結合部位に関してコラーゲンと競合する化合物。ありうる例は、螺旋リシルヒドロキシラーゼを抑制することが示された、マラチオンおよびその酸化された誘導体マラオキソンなどの有機ホスフェート様化合物である［Ａ．　Ｓａｍｉｍｉ　＆　Ｊ．Ａ　Ｌａｓｔ，　２００１，　Ｔｏｘｉｃｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　１７６：　１８１−１８６］。
【００５０】
リシルヒドロキシラーゼの非結合反応は、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性を抑制する化合物の設計のために使用され得る。ありうる化合物は以下の通りである。
・酵素の活性部位に結合するが、フェリル酸素の特異的な代替受容体として作用することができない非還元性アスコルベート類似体。そのような化合物がアスコルベート（またはフェリルイオンを還元することができるアスコルベート類似体）の代わりに活性部位に存在すると、自己酸化による酵素の不活性化を生じる。上記非還元性アスコルベート類似体によるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性の抑制は、アスコルベートに関して競合する。
・テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの非結合反応を促進することができる、非ヒドロキシル化性配列を有するペプチドまたはペプチド様物質。上記抑制剤は、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの自己酸化（非活性）レベルの高められたレベルを生じる。
【００５１】
ペプチドまたは他の化合物によるプロリルヒドロキシラーゼおよび螺旋リシルヒドロキシラーゼの抑制に関して、多くの研究が発表されている。従うものは、リシルオキシダーゼに影響を及ぼさない、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼのための抑制剤の設計において出発点として使用され得る２、３の選択された研究例である。ペプチドによる共触媒的不活性化の例は、Ｖ．　Ｇｕｎｚｌｅｒら，　１９８８，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６３：　１９４９８−１９５０４；　Ｋ．　Ｋａｒｖｏｎｅｎら，　１９９０，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６５：　８１４５−８４１９である。クマル酸およびアントラサイクリンによる共触媒的不活性化の例は、Ｖ．　Ｇｕｎｚｌｅｒら，　１９８７，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　２４２：　１６３−１６９；　Ｖ．　Ｇｕｎｚｌｅｒら，　１９８８，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　２５１：　３６５−３７２である。２−オキソグルタレートおよびアスコルベートの抑制競合類似体の例は、Ｋ．　Ｍａｊｉｍａａら，　１９８４，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１３８：　２３９−２４５；　Ｋ．　Ｍａｊｉｍａａら，　１９８５，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　２２９：　１２７−１３３；　Ｋ．　Ｍａｊｉｍａａら，　１９８６，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６１：　７８１９−７８２３である。リシルヒドロキシル化性ペプチドの立体配置要件の例は、Ｐ．　Ｊｉａｎｇ　＆　Ｖ．Ｓ．　Ａｎａｎｔｈａｎａｒａｙａｎａｎ，　１９９１，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６６：　２２９６０−２２９６７である。
【００５２】
テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの抑制剤の、知見に基づく設計とは別に、リシルオキシダーゼではなくテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性を抑制する化合物を見出すために、化合物のライブラリーを用いた研究が行なわれ得る。
【００５３】
テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの触媒特性の抑制の更なる例は、抗体の使用である。酵素に対する抗体であり、かつ活性部位をブロックしまたはそうでなければテロペプチドリシルヒドロキシラーゼによるヒドロキシル化を抑制することができる抗体は、酵素反応の有力な抑制剤である。これらの抗体、好ましくはモノクローナル抗体は、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼのアミノ酸の範囲、特にＦｅ２＋または２−オキソグルタレートの酵素への結合に寄与する残基の周りの配列を含む合成ペプチドまたはペプチド様物質によってマウスを免疫化することにより生じさせることができる。抑制する抗体の発生のための有望な候補のペプチドまたはペプチド様物質は、恐らく（しかし、必ずしもではない）、酵素のカルボキシ末端の最後の６０残基（すなわち、ＰＬＯＤ１によってコードされるリシルヒドロキシラーゼの触媒特性において役割を果たすことが知られている保存された残基を含む領域）から誘導されるべきである。モノクローナル抗体は、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性をブッロクするための能力においてファージ展示ライブラリー（ｐｈａｇｅ　ｄｉｓｐｌａｙ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）をスクリーニングすることによっても生じさせることができる。活性部位には関与しないが、酵素の基質結合のために重要な部分に対して関与する抗体も、酵素反応の有力な抑制剤である。さらに、コラーゲンテロペプチドに関する抗体も、立体的妨害によってテロペプチドリシルヒドロキシラーゼのヒドロキシル化反応を抑制することが予想される。モノクローナルまたはポリクローナル抗体のほかに、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）が使用され得る。そのような細胞内抗体は、関与する細胞内で発現される、操作された遺伝子によってコードされる［Ｉ．Ｊ．　Ｒｏｎｄｏｎ　＆　Ｗ．Ａ．　Ｍａｒａｓｃｏ，　１９９７，　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　５１：　２５７−２８３］。
【００５４】
あるいは、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼによって触媒される反応を抑制するために、アプタマーを使用することができる。アプタマーは、高いアフィニティーおよび特異性を伴って標的分子に結合する、選択された核酸結合物質である（ラテン語　媒ａｐｔｕｓ媒は「フィットすること」を意味する）。テロペプチドリシルヒドロキシラーゼに結合する核酸アプタマーは、インビトロでの選択および増幅の反復法によってオリゴヌクレオチドの非常に大きなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法であるＳＥＬＥＸ法によって容易に選択され得る［Ｓ．Ｄ．　Ｊａｙａｓｅｎａ，　１９９９，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．，　４５：　１６２８−１６５０］。ライブラリーは典型的には、２つの固定された配列領域がフランキングした１０１４〜１０１５のランダムＤＮＡ配列を含む。標的分子に結合する配列（標的分子は、固体支持体に固定されている）は、簡単な洗浄工程によって、結合していない配列から分離される。標的に結合した配列の集団を、２つの固定された配列領域に対するプライマーを使用してＰＣＲにより増幅する。濃縮されたライブラリーが、次の選択／増幅サイクルに使用され得る。高アフィニティーのバインダーの濃縮効率は、各回での選択のストリンジェンシーによって支配される。濃縮されたライブラリーは、各メンバーの配列情報を得るために、クローン化され、配列決定される。生成したアプタマーは、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性を測定するために設計されたアッセイによって、標的酵素を抑制する能力に関してスクリーニングされなければならない。
【００５５】
テロペプチドリシンのヒドロキシリシンへの転化を抑制するためのさらに別の方法は、テロペプチドを結合することができるが、テロペプチドのリシンをヒドロキシリシンに転化することができないテロペプチドリシルヒドロキシラーゼを含む構築物の放出である。そのような外因性のテロペプチドリシルヒドロキシラーゼは、その天然の基質（テロペプチド）に関して内因性のテロペプチドリシルヒドロキシラーゼと競合する。上記構築物のために、部位特異的突然変異誘発によって変異されたテロペプチドリシルヒドロキシラーゼを使用することができる。部位特異的突然変異誘発のための候補残基は、ブルック症候群において見出された変異残基である。部位特異的突然変異誘発のための他の候補残基は、螺旋リシルヒドロキシラーゼの全活性に必要であり　［Ａ．　Ｐｉｒｓｋａｎｅｎら，　１９９６，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２７１：　９３９８−９４０２］、かつＰＬＯＤ２によってコードされるリシルヒドロキシラゼにおいて保存される残基である。特に興味深いのは、Ｆｅ２＋の、リシルヒドロキシラーゼの触媒部位への結合に必要な３つのリガンド（ＰＬＯＤ１によってコードされる螺旋リシルヒドロキシラーゼに関しては、Ｈｉｓ−６３８、Ａｓｐ−６４０およびＨｉｓ−６９０である。番号付けは、処理されたポリペプチドにおける第一残基で始まる）、または２−オキソグルタレートの酵素への結合に寄与する残基（これは、ＰＬＯＤ１によってコードされる螺旋リシルヒドロキシラーゼに関しては、Ａｒｇ−７００である）である［Ｋ．　Ｐａｓｓｏｊａら，　１９９８，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　４３４：　１４５−１４８］。同じ残基がＰＬＯＤ２において保存される。やはり可能性のある興味深い残基は、グリコシル化されたＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列である。ＰＬＯＤ１によってコードされるグリコシル化されたリシルヒドロキシラーゼは、その脱グリコシル化された同等物よりも高い活性を有する［Ｒ．　Ｍｙｌｌｙｌａら，　１９８８，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　２５３：　４８９−４９６］。すなわち、最大のリシルヒドロキシラーゼ活性を得るために、アスパラギン結合したオリゴ糖が必要であると思われる。ＰＬＯＤ２によってコードされるリシルヒドロキシラーゼのアスパラギン結合したオリゴ糖のための２つのありうる結合部位は、ＰＬＯＤ１によってコードされる螺旋リシルヒドロキシラーゼ配列における相同的位置を有する。ありうる興味深い他の残基は、リシルヒドロキシラーゼ２のシステインである。これらの例は、限定するものとして解釈されるべきでない。
【００５６】
テロペプチドリシンのヒドロキシリシンへの転化を抑制するための本発明の更なる実施態様は、ヒドロキシル化性Ｌｙｓを含むペプチドの有効量を投与することである。酵素基質として作用するペプチドは、コラーゲンテロペプチドをヒドロキシル化するために利用できる酵素のレベルを低下させる。そのようなペプチドを細胞内に放出するための方法は、そのようなペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド構築物の放出である。
【００５７】
ヒドロキシアリシン架橋の病理学的レベルは、コラーゲン分子の望ましくない蓄積を生じる（線維症）
皮膚の異常な創傷治癒、例えば過形成性瘢痕では、多量のヒドロキシアリシン誘導架橋（例えばＤＨＬＮＬ）が見られる［Ａ．Ｊ．　Ｂａｉｌｅｙ　＆　Ｎ．Ｄ．　Ｌｉｇｈｔ，　１９８５，　Ｃｉｂａ　Ｆｏｕｎｄ．　Ｓｙｍｐ．，　１１４：８０−９６］。角膜支質の創傷後に産生されるコラーゲンにおいても、ＤＨＬＮＬの優勢が見られる。その結果生じる瘢痕は、アリシン架橋を失って、ヒドロキシアリシン誘導架橋の著しく増加されたレベルを示す［Ｄ．Ｊ．　Ｃａｎｎｏｎ　＆　Ｓ．　Ｃｉｎｔｒｏｎ，　１９７５，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　４１２：　１８−２５］。異常な瘢痕における高められたヒドロキシアリシン誘導された架橋に関する草分け的研究が後に確認され、その後、他の（主に線維症の）疾患における高められたヒドロキシアリシン誘導架橋に関して報告された。他の疾患は、例えば、種々の肺疾患（呼吸窮迫症候群、後発性肺線維症、過敏性肺炎、呼吸細気管支炎、珪肺症およびブレオマイシン誘発性肺線維症）、慢性アドリアマイシン腎症（非免疫性糸球体硬化症および介在性線維症を生じる実験モデル）、心筋層の梗塞瘢痕、関節拘縮、管腔狭窄（ｎａｒｒｏｗｉｎｇ）、脂肪皮膚硬化症、輪状大動脈拡張症、デュピュイトラン病の線維症病変、リポイド蛋白症患者の皮膚、糖尿病、クロモブラストミコーシス感染による皮膚の線維症、骨格筋損傷、腱肥大および種々の肝臓疾患、例えば槽のエキノコックス症（密で不可逆な線維症）、肝細胞癌、アルコール性肝硬変またはウイルス性肝炎またはアンソン住血吸虫によって誘発される硬変肝である。線維症組織中の高められたヒドロキシアリシン架橋レベルに関するこの膨大な量のデータから、線維症病変の特徴の１つは、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼのアップレギュレーションであると結論付けることができる。
【００５８】
最近、ヒドロキシアリシン架橋の相対的な（および絶対的な）量が、肺および肝臓の線維症におけるコラーゲンの蓄積のための十分な生物マーカーであることが示唆されている［Ｌ．Ａ．　ｌａｓｔら，　１９９０，　Ａｍ．　Ｒｅｖ．　Ｒｅｓｐｉｒ．　Ｄｉｓ．，　１４１：　３０７−３１３；Ｓ．　Ｒｉｃａｒｄ−Ｂｌｕｍら，　１９９５，　Ｐａｒａｓｉｔｅ，　２：　１１３−１１８］。同じことが他の線維症組織（例えば、皮膚および腎臓）において見られるので、「器官線維症は、アリシン架橋の割合が、ヒドロキシアリシン誘導架橋に有利であるように減少するところの架橋の変化を最終的に伴うユニークな経過であると考えられる」ことが実際に述べられた［Ｊ．　Ｂｒｉｎｃｋｍａｎｎら，　１９９６，　Ｊ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，　１０７：　５８９−５９２］。すなわち、ヒドロキシアリシン架橋は、線維症の病因に関係する。事実問題として、ヒドロキシアリシン架橋のレベルは、線維症の不可逆性の評価における重要な基準であり得た。この記述の有効性は、急性（自己限定性）および進行性の形態の線維症において見られる架橋パターンによって強められる。皮膚の損傷に応じて産生されるコラーゲンは、初期において、ヒドロキシアリシンから誘導される架橋であるＤＨＬＮＬによって安定化される。創傷治癒の初期段階では、両方の形態の線維症のコラーゲンが、主要な架橋として、ＤＨＬＮＬを有するが、２、３ヶ月後には、ほぼ等しい割合のＨＬＮＬが存在する。その後、急性および進行性の線維症は異なる経路をとる。皮膚線維症の進行性の形態である過形成性瘢痕では、２つの架橋の１：１比が保持される。これに対して、自己限定性の形態の線維症における架橋パターンは、徐々に正常に戻る。すなわち、ヒドロキシアリシン誘導架橋が消失し、そしてアリシン誘導架橋によって置き換えられる。さらに、古い過形成性瘢痕のＨＬＮＬは、ヒドロキシアリシンから誘導され、したがって、アマドリ転位を受けることによって安定化される。正常な瘢痕のＨＬＮＬは、ほとんど全体がアリシンから誘導されている点において、正常な真皮に似ている［Ａ．Ｊ．　Ｂａｉｌｅｙ　＆　Ｎ．Ｄ．　Ｌｉｇｈｔ，　１９８５，　Ｃｉｂａ　Ｆｏｕｎｄ．　Ｓｙｍｐ．，　１１４：　８０−９６］。
【００５９】
この段落で言及されるデータは、ヒドロキシアリシン誘導架橋によって架橋されたコラーゲンが、アリシン誘導架橋によって架橋されたコラーゲンよりも減成しにくいという本発明者らの記述の更なる証拠を提供する。データは、架橋の種類がコラーゲン異化作用の速度を調節するための機構を提供することを示す。ヒドロキシアリシン架橋を有するコラーゲンは、アリシン残基によって架橋されたコラーゲンよりも蛋白分解的減成を受けにくい。明らかに、テロペプチドヒドロキシリシンの代わりにテロペプチドリシンを含むコラーゲンの産生は、線維症の症状の治療に有益であろう。テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの抑制（ヒドロキシアリシン架橋を失ってアリシン架橋の形成を高めること）は、アリシン誘導架橋に対するヒドロキシアリシン誘導架橋の量を減少させ、コラーゲンを蛋白分解的減成をより受けやすいものにすることにより、線維症反応を妨害するための魅力的な方法である。次の段落では、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードするＰＬＯＤ２が実際に線維症細胞において非常に発現されることを示す。
【００６０】
線維症細胞は、高レベルのＰＬＯＤ２ｍＲＮＡを含む
明らかに、線維症組織における線維芽細胞（いわゆる筋線維芽細胞）は正常な線維芽細胞と基本的に異なる。筋線維芽細胞は、高められたヒドロキシリシンレベルのテロペプチドを有するコラーゲンを合成する。そのようなコラーゲンは、ヒドロキシアリシン架橋によって組織のコラーゲン網に不可逆的に組み入れられるようになることが予定されている。ＤＨＬＮＬの成熟産物であるＨＰが線維症の結果の永久的マーカーとして役立ち得るという事実は、そのように架橋されたコラーゲン分子が、低いか無視できるほどの減成速度を示すことを示す。本発明者らは、先の段落において、テロペプチドリシンのヒドロキシル化が、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼによって制御され、およびＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードすると結論付けた。したがって、ＰＬＯＤ２は、筋線維芽細胞において過発現されるに違いない。本発明者らは、正常な線維芽細胞および筋線維芽細胞におけるＰＬＯＤ２のｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲ法によって測定することにより、これを確認した。テロペプチドリシルヒドロキシラーゼが線維症の重要な酵素であるという本発明者らの結論を強化するために、ＰＬＯＤ１、ＰＬＯＤ３およびコラーゲンＩ型（ＣＯＬ１Ａ１）のｍＲＮＡレベルをも測定した。図５は、筋線維芽細胞のＰＬＯＤ２ｍＲＮＡレベルが、線維芽細胞と比較して平均して４０倍増加したことを示す。これに対して、ＰＬＯＤ１およびＣＯＬ１Ａ１のｍＲＮＡレベルでは、ほんの４倍の増加が観察された。ＰＬＯＤ３レベルは、ほとんどのケースで高められなかった。データは、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼが線維症組織において非常にアップレギュレーションされることを示す。
【００６１】
線維症経過を診断または監視するための手段としての、ＰＬＯＤ２ｍＲＮＡ、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ蛋白質レベルまたはテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性レベルの測定
本発明は、哺乳類の線維症経過の発症または状態を診断および／または監視するための方法を提供する。この方法は、該哺乳類からサンプルを採取すること、該サンプルを分析してＰＬＯＤ２遺伝子の発現レベルを決定すること、および該発現レベルを標品と比較することを含む。適するサンプルは、組織サンプル、特に線維症経過の危険がある、または線維症経過を伴う組織からのものである。適する標品は、正常な組織、すなわち線維症経過に罹患していない組織におけるＰＬＯＤ２遺伝子の発現レベルを表す。
【００６２】
遺伝子ＰＬＯＤ２の転写活性の検出は、ＰＬＯＤ２由来のｍＲＮＡのレベル（例えば、ノーザンブロト分析、競合的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ分析によって）、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの蛋白質レベル（例えば、ウエスタンブロット分析によって、またはＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによって）、またはテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの機能的酵素活性のレベル（例えば、ヒドロキシル化性ペプチドによって）をアッセイすることにより達成され得る。
【００６３】
第一の方法では、ＰＬＯＤ２コード領域の転写活性を、ハイブリダイゼーションアッセイによって評価することができる。例えば、ＲＮＡは、単離され、そして、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼがコードする配列またはその特定部分に相同なプローブを使用するノーザンブロットによって分析され得る。ｍＲＮＡレベルの推定は、ＰＣＲに基づく方法、例えば逆転写酵素によるｍＲＮＡのｃＤＮＡへの転化、および続く例えば競合的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを使用することによっても達成され得る。ＰＬＯＤ２レベルを測定するためのリアルタイムＰＣＲの説明は、実施例の１つに示されている。
【００６４】
第二の方法では、酵素産物の発現（翻訳活性を反映する）は、免疫学的に、例えばウエスタンブロット法、免疫沈降法、イムノアッセイ（酵素結合イムノアッセイなど）によって評価され得る。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、またはキメラの性質を有し得る。抗体は、天然のまたは変性された酵素またはその断片（例えば合成されたペプチド）で動物を免疫感作することにより得ることができる。あるいは、抗体は、ファージ展示法によって高められ得る。酵素産物は、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列に基づいてアプタマーによって評価することもできる［Ｓ．Ｄ．　Ｊａｙａｓｅｎａ，　１９９９，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．，　４５：　１６２８−１６５０］。
【００６５】
第三の方法では、酵素産物の発現は、酵素の酵素活性を反映する方法によって評価され得る。そのような方法を、次の章で説明する。
【００６６】
テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性を測定するための高スループットアッセイ
本発明は、化合物または組成物をスクリーニングしてテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性に対するその影響を決定するアッセイを提供する。そのアッセイは、試験されるべき化合物または組成物をＰＬＯＤ２でコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ酵素およびこの酵素に適する基質と、酵素的に機能する条件下で接触させること、および基質のリシルヒドロキシル化のレベルを、試験されるべき化合物または組成物の不存在下での基質のリシルヒドロキシル化のレベルと比較して決定することを含む。
【００６７】
以下の記載は、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性を測定するための高スループットアッセイを潜在的にもたらし得る方法を説明する。そのようなアッセイは、アンタゴニスト特性を決定するために化合物をスクリーニングするために、または線維症経過を診断もしくは監視するための手段として、使用され得る。
【００６８】
少なくとも１つのヒドロキシル化性Ｌｙｓを含むテロペプチド様配列を含むビオチン化されたペプチドが、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼとのインキュベーションに付される。得られる混合物は、過ヨウ素塩または他の適する酸化剤によって処理される。Ｈｙｌの２−アミノアルコールは、急速な過ヨウ素塩酸化を受けてアルデヒドを生じることが示されている［Ｄ．Ｄ．　ｖａｎ　Ｓｌｙｋｅら，　１９４１，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　１４１：　６８１−７０５］。同じことが、Ｎ末端ＳｅｒまたはＮ末端Ｔｈｒを有するペプチドの場合に起こる。ペプチドにＮ末端ＳｅｒまたはＴｈｒがないペプチドを設計することにより、Ｈｙｌを含むペプチドのみが、過ヨウ素塩の処理によってアルデヒドを形成するであろう。アルデヒドは次いで、標識する基、例えばヒドラゾン（Ｒ’ＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−ペプチド）を形成するためのヒドラジド（Ｒ’ＣＯＮＨＮＨ２）の形態の基と反応させる。Ｒ’は、何らかの種々の有用な基、例えばルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ　Ｙｅｌｌｏｗ）、テキサスレッドまたはカスケードブルーであり得る。ビオチン化されたペプチドは、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの強い相互作用に基づく固定化によって残りの反応混合物から分離され得る。他の選択は、例えば、反復Ｈｉｓ配列を含むペプチドとＮｉ２＋担体との組合わせ、またはＳＡＭＡ−ペプチドとマレイミド担体との組み合わせの使用である。Ｈｙｌに結合した標識の蛍光の測定は、ペプチドのＬｙｓのテロペプチドリシルヒドロキシラーゼによるＨｙｌへの転化についての情報を提供する。熱量測定または放射能測定に適する標識も使用され得る。
【００６９】
強調されるべきことは、過ヨウ素塩によるＨｙｌの酸化が、ホルムアルデヒドの化学量論的放出を生じることである。４−アミノ−３−ペンテン−２−オン（フルオラルＰ）は、検出可能なホルムアルデヒドの２０００倍のアルデヒド濃度が存在しても、ホルムアルデヒドと選択的に反応して蛍光性ジヒドロピリジン生成物を形成することが報告されている［Ｈ．　Ｔｓｕｃｈｉｙａら，　１９９４，　Ａｎａｌｙｓｔ，　１１９：　１４１３−１４１６］。すなわち、ホルムアルデヒドの放出の測定は、ペプチドのＬｙｓがテロペプチドリシルヒドロキシラーゼによってＨｙｌに転化されるかどうかの情報を提供するための別の方法である。
【００７０】
さらに別の様式では、ＬｙｓまたはＨｙｌがペプチドに存在するかどうかを測定するためのエネルギー転移基質が調製され得る。この種の基質では、フォスターエネルギー供与体−受容体対を形成する２つの色素産生の基がペプチドの両端に置かれる。供与体の蛍光放射が受容体の吸収スペクトルと重複して、供与体の蛍光を消去させ、一方、基質はそのままである。介在するペプチド領域がプロテイナーゼによって切断されるとき、距離に強く依存する消去の軽減が、この活性を追跡するための手段を提供する。具体的には、エネルギー転移基質（少なくとも１つのヒドロキシル化性Ｌｙｓを含むテロペプチド様配列を含みかつ蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）および消去剤を含むペプチド）がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼに付され、次いで、トリプシンまたはリシルエンドペプチダーゼによって消化される。後者は、ＬｙｓのＣ末端でペプチド結合を切断する。トリプシンは、ＬｙｓおよびＡｒｇのＣ末端側にあるペプチド結合を切断する。Ｌｙｓ残基のヒドロキシル化は、トリプシンまたはリシルエンドペプチダーゼによる消化の受けやすさを低下させる［Ｍ．Ｓ．　Ｍｏｌｏｎｙら，　１９９８，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２５８：　１３６−１３７］。この様式では、ＬｙｓがＨｙｌに転化されると、所与の時間に蛍光の低下した増加が見られる。
【００７１】
他の高スループット様式は、ヒドロキシル化されていないペプチドを認識するがヒドロキシル化ペプチドを認識しない、またはその逆の抗体またはアプタマーに基づき得る。
【００７２】
【実施例】
実施例１
正常な骨およびブルック症候群の骨のペプシン消化が、蛋白質分解酵素によるコラーゲン減成における相違およびコラーゲン充填における相違を示す
ブルック症候群の骨および正常な骨を、０．５ＭのＥＤＴＡ、０．０５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を用いて４℃で２週間にわたって脱塩した。脱塩されたブルック症候群の骨および正常な骨を、０．５Ｍの酢酸（ＨＡｃ）または０．５ＭのＨＡｃ中のペプシン（酵素：基質比１：１０、ｗ／ｗ）と共に４℃で２４時間インキュベートした。溶解したコラーゲン（上清に存在）を不溶のコラーゲンマトリックス（溶解していないコラーゲンを含む）から遠心分離によって分離した。両者は、テフロン（登録商標）でシールされたガラス管中で６ＭのＨＣｌによって加水分解された（１１０℃、２０〜２４時間）。コラーゲン特異的アミノ酸ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の量は、逆相高性能液体クロマトグラフィーによって測定された［Ｒ．Ａ．　Ｂａｎｋら，　１９９７，　Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．，　１６：　２３３−２４３］。溶解したコラーゲンの量は、式Ｈｙｐｓｕｐ／（Ｈｙｐｒｅｓ＋Ｈｙｐｓｕｐ）ｘ１００％（式中、Ｈｙｐｓｕｐは上清中のＨｙｐの量であり、Ｈｙｐｒｅｓは残留組織中のＨｙｐの量である）を使用して総コラーゲンのパーセントとして表される。
０．５Ｍの酢酸中のコラーゲン溶解度は、ブルック症候群の骨および正常な骨に関して各々、７％および１％であった。ペプシンによる処理により、ブルック症候群の骨からはコラーゲンの６５％が放出され、正常な骨からはコラーゲンの５％だけが放出された。明らかに、ブルック症候群の原線維におけるコラーゲン分子は、プロテイナーゼによる減成をより受けやすい。ブルック症候群のコラーゲンＩ型の３重螺旋は正常に変形されるので、ブルック症候群の骨の、ペプシンによるコラーゲンの放出の増加は、アリシン架橋によるヒドロキシアリシン架橋の置換えによる。
正常な骨およびブルック症候群の骨のペプシン溶解したコラーゲンは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付され、次いで、クーマシーブリリアントブルーによって染色された。正常な骨の染色パターンは、３つのβバンド（１；１；１の比のβ１，１、β１，２およびβ２，２）を示し、一方、ブルック症候群の骨の染色パターンは、２つのβバンド（１：２の比のβ１，１およびβ１，２）を示した。βバンドのパターンは、正常な骨およびブルック症候群の骨の間に原線維内のコラーゲン分子の充填における相違があることを示す。
【００７３】
実施例２
尿中のヒドロキシプロリン測定により、骨コラーゲンのインビボ減成がブルック症候群において高められることが示された
尿サンプル（５００μ）を、テフロン（登録商標）でシールされた５ｍｌのガラス管中で、５００μｌの１２Ｍ　ＨＣｌによってオーブン（１１０℃、２０〜２４時間）中で加水分解した。乾燥（ＳｐｅｅｄＶａｃ，　Ｓａｖａｎｔ）後、加水分解物を１ｍｌの水に溶解し、０．１Ｍのホウ酸塩緩衝剤ｐＨ９．５で４００倍に希釈した。２００μｌのサンプルを２５μｌのｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）試薬（１ｍｌのアセトン中の３０ｍｇのＯＰＡ＋１５μｌのβ−メルカプトエタノール）と混合し、室温で１分間反応させた。反応混合物を２５μｌのヨードアセタミド（８０ｍｇ／ｍｌアセトン）と混合し、室温で少なくとも３０秒間インキュベートして過剰のβ−メルカプトエタノールを除去した。次いで、二次のアミノ酸のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびプロリン（Ｐｒｏ）を、アセトン中の６ｍＭの９−フルオレニルメチルクロロホーメート５０μｌを用いて、室温で５分間誘導した。その直後に、サンプルを７００μｌのジエチルエーテルで２回抽出して反応を停止し、過剰の試薬を除去した。０．１Ｍのホウ酸塩緩衝剤ｐＨ８．０中の４００μｌの２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを添加した後、誘導混合物の５０μｌアリコートをＨＰＬＣ系に注入した。こうして、最初の尿サンプルの０．０２０８μｌがカラムに施与された。Ｍｉｃｒｏｐａｋ　ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（１５０ｎｍ　ｘ　４．６ｍｍ；Ｖａｒｉａｎ，　Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）上でのサンプルの逆相クロマトグラフィーを、他の文献に記載されているように行った［Ｒ．Ａ．　Ｂａｎｋら，　１９９６，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２４０：　１６７−１７６］。Ｈｙｐ較正を、Ｓｉｇｍａから得られた、コラーゲン加水分解物のためのアミノ酸標品（Ａ−９５３１；Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ，　ＵＳＡ）を用いて行った。
図１Ａ〜Ｂは、ブルック症候群患者対対照のＨｙｐの尿排泄およびＨｙｐ／Ｐｒｏ比を年齢の関数として示す。全ての患者がＨｙｐの高い排泄を示す。これは、コラーゲンの高い減成速度を示す。尿中のコラーゲン減成産物のほとんどが骨由来である［Ｍ．Ｓ．　Ｃａｌｖｏら，　１９９６，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，　１４：３３３−３６８］、そのデータは、ブルック症候群の患者が骨コラーゲンの高められた回転を有することを示している。これは、ブルック症候群の骨においてヒドロキシアリシン架橋がアリシン架橋によって置き換えられ、コラーゲン網のプロテイナーゼに対する感受性をより高くしたことによる。
【００７４】
実施例３
ブルック症候群の患者のＰＬＯＤ２遺伝子の変異分析は、ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシスヒドロキシラーゼであることを示す
ＰＬＯＤ２の個々のエキソンの増幅を、表１に示すプライマーを使用して行った。ＰＣＲ混合物は、０．５μｌのＴａＫａＲａ　１０ｘ　ＰＣＲ緩衝剤、４つのｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）を含む８μｌの混合物、１μｌの前進プライマーおよび１μｌの復帰プライマー（各５０μＭ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ　Ｌａ　Ｔａｑ　ポリメラーゼ（５０Ｕ／μｌ）、２．５μｌのＤＮＡ（２００ｎｇ／μｌ）、５μｌのＤＭＳＯおよび２７μｌのＨ２Ｏで構成された。３５サイクルの増幅が行われた。各サイクルは、９４℃で１分の変性、５６〜６０℃で０．５〜１．５分のアニーリング（プライマーセットごとの正確な条件に関しては表を参照）および６８℃で１分の伸長から成る。増幅されたエキソンは、Ｑｉａｇｅｎ　ＰＣＲ精製キットによって精製された。１０ｎｇの各エキソンを、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　キットを使用してサイクルシークエンスＰＣＲに付し、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（商標）３１０装置を使用して毛管電気泳動によって分析した。
【００７５】
【表１】
2004033188.tif 000003
【００７６】
ファミリーＰＭの２人のブルック症候群の患者のシークエンス分析は、配列ＧＧＹＥＮＶＰＴ（変異されたＧｌｙに下線）においてＧｌｙ→Ｖａｌアミノ酸置換を生じるＧ→Ｔヌクレオチドミスセンス変異を示した。この変異は、両方の対立遺伝子において見られた。２人の患者は、このミスセンス変異の保因者であった（図３を参照）。ファミリーＤＲの１人のブルック症候群患者には、配列ＧＧＹＥＮＶＰＴにおいてＴｈｒ→Ｉｌｅアミノ酸置換を生じるＣ→Ｔヌクレオチドミスセンス変異が見られた。その患者は、この変異に関してホモ接合性であり、一方、両親および健康な妹はヘテロ接合性であった（図４）。ファミリーＰＭおよびＤＲに見られた２つの異なる点変異は、異なるＰＬＯＤ間および異なる種属間において１００％の相同性を示す配列に位置していた。これは、一般的にはリシルヒドロキシラーゼの機能および特にはＰＬＯＤ２の機能におけるこの領域の重要な役割を示唆する。ブルック症候群は、欠陥のあるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性を特徴とする［Ｒ．Ａ．　Ｂａｎｋら，　１９９９，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６：　１０５４−１０５８］。上記した変異は、ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードすることを示す。
ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードするという知見は、コラーゲン合成の間、細胞中のテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの酵素活性レベルを増減することによりコラーゲンのテロペプチドにおけるヒドロキシリシンのレベルを増減するために必要な情報を当業者に提供する。合成されたコラーゲンはその後、増加されたまたは減少された回転時間（ｔｕｒｎｏｖｅｒ　ｔｉｍｅ）を有するコラーゲン物質の調製のために、標準的な精製法によって採取され得る（例えば、新しい組織成長のための支持体、またはコラーゲンに基づく創傷用包帯としてのコラーゲンマトリックス）。
【００７７】
実施例４
増加されたまたは減少された回転時間を有するコラーゲン物質の調製
組織からコラーゲンを単離するための多数の方法が開示されている。このコラーゲンは次いで、コラーゲンに基づくデバイスの調製に使用され得る。主として、コラーゲンの調製には、皮膚または腱が使用される。皮膚のコラーゲンは、ヒドロキシアリシン架橋が非常に少ない。事実、皮膚のコラーゲンは、寿命が短い。腱は、腱の解剖学上の位置に応じて、種々のレベルのヒドロキシアリシン架橋を示す（例えば、Ｒ．Ａ．　Ｂａｎｋら，　１９９９，　Ａｒｔｈｒ．　Ｒｈｅｕｍ．，　５８：　３５−４１を参照）。腱のコラーゲンは、はるかに長い寿命を示す。骨は、中間のレベルのヒドロキシアリシン架橋を示す。ヒドロキシアリシン架橋の量はさらに、骨の種類（皮質または柱）および骨格部位に依存する（例えば、Ｌ．　Ｋｎｏｔｔ　＆　Ａ．Ｊ．　Ｂａｉｌｅｙ，　１９９９，　Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　４０：　３７１−３７９を参照）。少量のおよび多量のヒドロキシアリシン架橋を含む組織由来のコラーゲンを種々の比で混合することにより、増加されたまたは減少された回転時間を示すコラーゲンマトリックスの調製のために使用され得るコラーゲン組成物が得られる。
【００７８】
実施例５
テロペプチド中のリシルヒドロキシル化レベルを高めるための、細胞における組換えＰＬＯＤ２の発現
ヒトＰＬＯＤ１シグナルペプチド配列およびそれに続くＨｉｓ６標識配列を、その分子のありそうなアミノ末端から出発するヒトＰＬＯＤ２ＢのｃＤＮＡに結合した。ＮｈｅｌおよびＢａｍＨＩ制限部位がフランキングした、ＰＬＯＤ１シグナルペプチドおよびＨｉｓ６標識のためのヌクレオチド配列をカバーする、４つの重複オリゴヌクレオチドをアニーリングし、一本鎖になっている５’端を、クローン化したｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって満たした。得られた二本鎖の平滑末端生成物を、ｐＭＯＳＢｌｕｅベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のＥｃｏＲＶ部位に連結した。ヌクレオチド７６〜２２８３をカバーするヒトＰＬＯＤ２ＢｃＤＮＡ配列を、構築物のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ部位に入れてクローン化した。最後に、ＰＬＯＤ１シグナルペプチドを有するＰＬＯＤ２ＢｃＤＮＡ配列をｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｈｅＩ／ＫｐｎＩ部位に入れてクローン化することにより、発現構築物（図６）を作った。エキソン１３Ａのない、スプライシング変異体ＰＬＯＤ２Ａのための同様の構築物は、ＰＬＯＤ２Ａ配列からの同じ断片のために、ＰＬＯＤ２Ｂヌクレオチド配列におけるＰａｃＩ／ＢｓｒＧＩ断片を置き換えることにより得られた。ｐＤＨＰＬ２ｂ．５およびｐＤＨＰＬ２ａ．４と呼ばれる発現構築物は、配列決定することにより確認された。組換え蛋白質は、シグナルペプチド切断の後、Ｎ末端にＨｉｓ６標識を含む。ＨＥＫ２９３細胞は、集密的になるまで、５％ＣＯ２中、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ中で培養された。トランスフェクションのために、３７℃で１６時間インキュベーションした後に７０％の集密度に到達するような密度で、細胞を１０ｃｍ２のウェルにプレーティングした。トランスフェクションの２時間前に、新しい培地を細胞に添加した。脂質に基づくＦｕＧＥＮＥ（商標）６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，　Ｉｎｄｉａｎａ，　ＵＳＡ）を使用して、合計１μｇの各プラスミドを細胞にトランスフェクションした（１：４のμｇＤＮＡ：μｇＦｕＧＥＮＥ比）。ＴＬＨを発現する安定なＨＥＫ２９３クローンを得るために、トランスフェクションの２４時間後に細胞を１００倍に希釈し、７００μｇ／ｍｌのゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む選択培地中、１０ｃｍ２のウェルにプレーティングした。選択培地で２週間培養した後、単一のクローンを拾い上げ、ウエスタンブロット法によってＴＬＨ発現に関するスクリーニングを行った。細胞質ゾルおよび培養培地の両方で、かなりの量のテロペプチドリシルヒドロキシラーゼが認められた。
ＰＬＯＤ２によってコードされるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼを構成的に発現する細胞を得るために、同じ構築物を使用してコラーゲン産生細胞をトランスフェクションすることができる。そうすることによって、テロペプチド中に高いレベルのヒドロキシリシンを示すコラーゲンが分泌される。これは、プロテイナーゼに対して高められた安定性を有するコラーゲンマトリックスの生成のための分子ベースである。分泌されたコラーゲンは、Ｄ．Ｋ．　Ｆｕｒｕｔｏ　＆　Ｅ．Ｊ．　Ｍｉｌｌｅｒ　（１９８７，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１４４：　４１−６１）に記載されたような種々の方法によって精製することができ、そして、足場の調製のために使用され得る。
【００７９】
実施例６
テロペプチドにおけるリシルヒドロキシル化レベルを高めるための、細胞中での内因性ＰＬＯＤ２発現の刺激
ヒトの皮膚の線維芽細胞を、５％ＣＯ２中、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で、２５ｃｍ２のフラスコにおいて培養した。ほぼ集密的になったとき、線維芽細胞および筋線維芽細胞を、１、５または１０ｎＭのヒト組換えＴＧＦ−β１、−β２または−β３を含む培地中で５０時間インキュベートした。対照として、ヒトの皮膚の線維芽細胞を、ＴＧＦ−βの添加なしに培地中で５０時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、細胞をＰＢＳで洗浄し、６００μｌのＲＬＴ−緩衝剤（ＲＮｅａｓｙキット、Ｑｉａｇｅｎ）によって溶解した。製造者プロトコルにしたがってＲＮＡを単離し、次いで、ｃＤＮＡに逆転写した（第一鎖ｃＤＮＡ合成キット、Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。未処理のおよびＴＧＦ−β処理した細胞におけるＰＬＯＤ２ＢｍＲＮＡのレベルを、実施例８に記載したリアルタイムＰＣＲを使用して定量した。
図９は、ＴＧＦ−β１、−β２または−β３による線維芽細胞の処理が、ＰＬＯＤ２ＢｍＲＮＡレベルを約２０倍増加させることを示す。すなわち、ＴＧＦ−βは、ＰＬＯＤ２ＢｍＲＮＡ発現を増加させ得る剤の１例であり、したがってヒドロキシアリシン経路から誘導される架橋を増加させるために使用され得る。そのようなコラーゲンは、精製され、次いで、プロテイナーゼに対して高められた耐性を示すコラーゲン足場の調製のために使用され得る。
【００８０】
実施例７
テロペプチドにおけるリシルヒドロキシル化レベルを低下させるための、細胞中でのテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性の抑制
子牛（１２〜１４月齢、地元の屠殺場）の中手指節関節からの軟骨細胞をコラゲナーゼ消化によって単離した。軟骨のスライスを細かく刻み、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で一夜、０．１４％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　ＣＬＳ２）中で消化した。懸濁物をろ過した後、細胞を洗浄し、４ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で０．９％ＮａＣｌ中の１．２％（ｗ／ｖ）アルギネート（Ｋｅｌｔｏｎｅ　ＬＶＣＲ）に懸濁し、それを、２２ゲージの針を通して１０２ｍＭのＣａＣｌ２に滴下した。１０分重合を行った後、ビーズを０．９％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌで（３回）および最後に完全培地（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸が補充されたＤＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ））で洗浄した。３７℃の空気中、５％ＣＯ２の湿気のある大気中で、０．５ｍｌの培地につき１０ビーズで細胞を培養した。培地は、１週間に２回補給された。ミノキシジルを完全培地に溶解し、対照条件下での予備培養の７日後に培地に添加した。採取されたビーズを、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む０．９％ＮａＣｌで洗浄し、１０８℃で２０〜２４時間、６ＭのＨＣｌ９００μｌで加水分解した。１アリコートの加水分解物を、Ｒ．Ａ．　Ｂａｎｋら　［１９９６，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２６０：　１６７−１７６］に記載のアミノ酸分析に付した。ヒドロキシプロリンレベルに基づき、３００のヒドロキシプロリン残基／３重螺旋と仮定して、コラーゲンの量を計算した。別のアリコートを、Ｂ．　Ｂｅｅｋｍａｎｎら　［１９９７，　Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．，　２３７：　１３５−１４１］に記載の架橋分析に付した。架橋は、コラーゲン分子１個に対する残基の量として表された。
１．０ｍＭまたは２．０ｍＭのミノキシジルの存在下で培養されたアルギネートビーズ中のピリジノリン（ＨＰおよびＬＰ）の量は、２０〜５０日の培養期間の後、平均して、約０．１５残基／コラーゲン分子であった。一方、０．３ｍＭのミノキシジルで処理された培養物中のピリジノリンの量は、上記培養期間中に平均して０．３８残基／コラーゲン分子であった。これは、ミノキシジルの高められた濃度が、恐らくはＰＬＯＤ２の発現を抑制することによって、テロペプチドのリシルヒドロキシル化レベルを低下させることを示す。
ミノキシジルがＰＬＯＤ２の発現を抑制することを実証するために、ヒトの皮膚の線維芽細胞および筋線維芽細胞を、５％ＣＯ２中、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で、２５ｃｍ２のフラスコにおいて培養した。ほぼ集密的になったとき、線維芽細胞および筋線維芽細胞を、１ｍＭのミノキシジルを含む培地中で４１時間インキュベートした。ミノキシジルを、１０％ＦＢＳを有する培地中、室温で８時間溶解し、使用の前にろ過した。対照として、ミノキシジルを含まない培地中で４１時間、両方の種類の細胞をインキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、細胞をＰＢＳで洗浄し、６００μｌのＲＬＴ−緩衝剤（ＲＮｅａｓｙキット、Ｑｉａｇｅｎ）によって溶解した。製造者プロトコルにしたがってＲＮＡを単離し、次いで、ｃＤＮＡに逆転写した（第一鎖ｃＤＮＡ合成キット、Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。未処理のおよびミノキシジル処理した細胞におけるＰＬＯＤ２ＢｍＲＮＡのレベルを、実施例８に記載したリアルタイムＰＣＲを使用して定量した。
図８は、ミノキシジルによる筋線維芽細胞の処理が、ＰＬＯＤ２ＢｍＲＮＡレベルを約１５倍減少させることを示す。線維芽細胞におけるＰＬＯＤ２ＢｍＲＮＡレベルは、筋線維芽細胞におけるよりもはるかに低い（実施例８を参照）が、これらの細胞がミノキシジル含有培地で培養されるときは、ｍＲＮＡレベルにおいてなおも４倍の低下が測定され得る。すなわち、ミノキシジルは、ＰＬＯＤ２ＢｍＲＮＡ発現の抑制剤の１例であり、ヒドロキシアリシン経路から誘導される架橋を減少させるために使用され得る。リシルオキシダーゼは、ミノキシジル処理による影響を受けなかった。
【００８１】
実施例８
テロペプチド中のリシルヒドロキシル化レベルを低下させるための、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの抑制
ＴＬＨの発現は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用してＰＬＯＤ２ｍＲＮＡを減成することにより、転写後レベルにおいてダウンレギュレーションされ得る。本発明者らは、ホスホロチオエート化された１０のＡＯＮを設計し、ＰＬＯＤ２ｍＲＮＡによる二本鎖の形成およびその後のＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡの減成に関するそれらの可能性をインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で試験した。１ｘ１０４の筋線維芽細胞からの変性されていないＲＮＡを、最終体積２５μｌの、１５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ（ｐＨ８．０）中、３７℃で４時間、８μＭのＡＯＮと共にインキュベートした。１μｌの１０ｍＭのＤＴＴおよび２ｕのＲＮａｓｅＨを添加し、その混合物を３７℃でさらに２０分間インキュベートすることにより、二本鎖ｍＲＮＡの減成が行われた。残りのＲＮＡを逆転写し、プライマー：ｈＰＬＯＤ２ｂＲＴＦ（５’ＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＣＴＣＣＧＡＴＣＡＧＡＧＡＴＧＡ３’）およびｈＰＬＯＤ２ａＲＴＲ４（５’ＴＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＴＡ３’）を用いてＰＣＲに付した。上記プライマーは、ＰＬＯＤ２ａおよびＰＬＯＤ２ｂｃＤＮＡ増幅が１つの反応で区別され得るように選択された。１０のうち２つのＡＯＮが、ＰＬＯＤ２ｍＲＮＡの量を検出できないレベルに低下させることができた。１つは、ＰＬＯＤ２ａおよびＰＬＯＤ２ｂｍＲＮＡの両方を認識し、次の配列を有する。すなわち、開始コドンをカバーする５’ＣＣＣＡＴＡＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣ３’（ＰＬＯＤ２ｃＤＮＡ配列における−１１−５ｎｔ）である。第２のＡＯＮは配列５’ＴＴＣＣＣＴＴＴＧＴＡＡＡＧＴ３’（ＰＬＯＤ２ｂｃＤＮＡ配列における１５００−１５１４ｎｔ）を有し、ＰＬＯＤ２ｂｍＲＮＡに特異的であり、ＰＬＯＤ２ｂ配列における余分のエキソンを認識する。これら２つのＡＯＮは、例えば筋線維芽細胞の治療に有望であり、ＰＬＯＤ２ｍＲＮＡレベルおよびその結果として、これらの細胞によって形成される細胞外マトリックスにおけるＨＰおよびＬＰ架橋の量を減少させる。
【００８２】
実施例９
ＰＬＯＤ２ｍＲＮＡレベルを測定するためのリアルタイムＰＣＲ
ヒトの皮膚の線維芽細胞および培養されたヒトの筋線維芽細胞から得られたＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ＲＮＡサンプル中のゲノムＤＮＡを除去するために、ＲＱ１　Ｒｎａｓｅを含まないＤｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＤｎａｓｅ処理を行った。次いで、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、リアルタイムＰＣＲ増幅に付した。
ＰＬＯＤ２およびβ２−ミクログロブリンのリアルタイムＰＣＲ増幅を、特定のプライマー（ＰＬＯＤ２前進プライマー：５’ＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＣＴＣＣＧＡＴＣＡＧＡＧＡＴＧＡ３’；ＰＬＯＤ２復帰プライマー：５’ＡＡＴＧＴＴＴＣＣＧＧＡＧＴＡＧＧＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴ３’；β２−ミクログロブリン前進プライマー：５’ＴＣＴＴＧＴＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＡ３’；β２−ミクログロブリン復帰プライマー：５’ＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＣＣＴＣ３’）および特定の分子ビーコン（ＰＬＯＤ２：５’ＦＡＭ−ｃｇｔｇｃｇＣＧＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＧＧＣＴＣＴＴｃｇｃａｃｇ−ＤＡＢＣＹＬ３’；β２−ミクログロブリン：５’ＨＥＸ−ｃｇｔｇｃＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧｇｃａｃｇ−ＤＡＢＣＹＬ３’）を使用して行った。ＰＬＯＤ２は、１ｘＰＣＲ緩衝剤（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．５ｍＭのＭｇ２＋、２５０ｎＭの各標的プライマー、β２−ミクログロブリンのための１００ｎＭの各プライマーおよび１単位のＡｍｐｌｉｔａｑ　Ｇｏｌｄ　ポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含む２５μｌの総反応体積中で、β２−ミクログロブリンと共に多重ＰＣＲにおいて増幅された。ＰＣＲは、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（商標）７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍにおいて行われ、９５℃で５分間、次いで９５℃で３０秒を４０サイクル、５６℃で４０秒、および７２℃で３０秒であった。データは、シークエンス検出器Ｖ１．７ソフトウェアを使用して分析された。
図５は、筋線維芽細胞様細胞が、線維芽細胞と比較して、平均してＰＬＯＤ２ｍＲＮＡの４０倍の増加を示すことを示す。筋線維芽細胞は、線維症経過において重要な役割を果たす［Ｃ．　Ｂａｄｉｄら，　２０００，　Ｈｉｓｔｏｌ．　Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．，　１５：　２６９−２８０］。データは、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼが、線維症組織において非常にアップレギュレーションされることを示す。これは、皮膚由来のコラーゲンがコラーゲンにおけるヒドロキシアリシン架橋の非常に低いレベルを示し（０．０２ＨＰ残基／３重螺旋）、一方、筋線維芽細胞を含む組織にあるコラーゲンは、高いレベルのヒドロキシアリシン架橋を示す（０．４５ＨＰ残基／３重螺旋）という本発明者らの観察によってさらに確証される。
テロペプチドリシンのヒドロキシル化がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼによって制御され、ヒドロキシアリシン架橋を含むコラーゲン網はプロテイナーゼに対してより耐性であるので、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼが線維症において重要な酵素であることは明らかである。ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードするという理解は、ＰＬＯＤ２のｍＲＮＡレベルおよび／またはテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの蛋白質レベルおよび／またはテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性レベルを測定することにより、線維症経過の開始および／または進行をモニターするために必要な情報を当業者に提供する。
【００８３】
実施例１０
高スループットアッセイ
ヒドロキシル化性リシン残基を含むペプチド、例えばビオチン−Ｑ−Ｌ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｄ−Ｅ−Ｋ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｖ−Ｐを、０．１ｍｌのＰＢＳにつき１ｎｍｏｌの濃度で溶解する。これを、０．０５ｍｌのウシ血清アルブミン（５ｍｇのアルブミン　Ｓｉｇｍａ　Ａ−７８８８／ｍｌＰＢＳ）、０．０５ｍｌのカタラーゼ（３．９ｍｌのＰＢＳ＋０．１ｍｌのカタラーゼ懸濁物（Ｓｉｇｍａ　Ｃ−１００））、０．１ｍｌの１ｍＭのジチオスレイトール、０．０５ｍｌの２０ｍＭのアスコルビン酸、０．０５ｍｌの１ｍＭの硫酸第一鉄、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼに対する抑制特性が試験されるべき化合物を含む０．１ｍｌのＰＢＳ、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ活性を含む０．１ｍｌのＰＢＳおよび０．０５ｍｌのα−ケトグルタレートの混合物に添加した。その混合物を、３０℃で３時間インキュベートする。混合物のアリコート（１００μｌ）を、９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）上に被覆されたストレプトアビジンに、室温で１５分間、結合させる。非結合画分を、洗浄緩衝剤（ＰＢＳ中の５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗い流した。結合したペプチドを、０．０２５Ｍのホスフェート（ｐＨ７．０）中の０．３６μｇ／ｍｌのＮａｌＯ４　１００μｌと１０分間反応させた。０．１Ｍの酢酸ナトリウム／アセトニトリル（１：２）（ｐＨ４．５）中の３．１μｇ／ｍｌのＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ　ヒドラジド１００μｌを添加する前に、洗浄工程をさらに３回行う。溶液を室温で静かに２時間攪拌する。洗浄緩衝剤による９回の洗浄工程の後、各々５８０ｎｍおよび６０５ｎｍの励起および発光波長において蛍光を測定する（例えば、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒによって）。関与する化合物によるテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの活性の抑制は、上記プロトコルではリシンがアルデヒドに転化され得ないので、蛍光量の低下を生じる。
他の種々のヒドラジド、例えばルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ　ｙｅｌｌｏｗ）、ＢＯＤＩＰＹＬまたはカスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ　Ｂｌｕｅ）が使用され得る。ビオチンの代わりに、ＳｔｒｅｐＦｌａｇ配列がストレプトアビジンへの結合に使用され得る。あるいは、他の化学様式、例えばＨｉｓ−標識されたペプチドとＮｉ２＋担体との組み合わせ、またはＳＡＭＡペプチドとマレイミド被覆されたプレートとの組み合わせが選択され得る。
【００８４】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、健康体の尿および骨形成不全症（ＯＩ）患者の尿と比較したブルック症候群の尿におけるコラーゲン減成生成物（Ｈｙｐ＝ヒドロキシプロリン）のレベル（図１Ａ）およびヒドロキシプロリンとプロリンとの比（Ｈｙｐ：Ｐｒｏ）（図１Ｂ）を示すグラフである。そのデータは、ヒドロキシアリシン架橋がほぼ完全に存在しないことを特徴とするブルック症候群における骨コラーゲンの減成が有意に高められることを示す。
【図２】図２は、遺伝子ＰＬＯＤ２が存在する染色体３の参照区間Ｄ０３Ｓ１７６４〜Ｄ０３Ｓ１５９４（１６４．６〜１６８．３ｃＭ）上のホモ接合性の領域において遺伝子型を示すブルック症候群ファミリー（ファミリーＤＲおよびファミリーＰＭ）の家系図である。黒は発症した個体を示し、斜線はその病気の保因者を示す。その病気と共分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ）するハプロタイプは黒色の箱で示される。両方の家系図はともに、ＰＬＯＤ２が、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼのための候補遺伝子であることの証拠を提供する。
【図３】図３は、配列ＧＧＹＥＮＶＰＴ（変異した残基に下線）においてＧｌｙ→Ｖａｌ変異を生じる、ブルック症候群ファミリーＰＭに見られたミスセンス変異を示すグラフである。
【図４】図４は、配列ＧＧＹＥＮＶＰＴ（変異した残基に下線）においてＴｈｒ→Ｉｌｅ変異を生じる、ブルック症候群ファミリーＤＲに見られたミスセンス変異を示すグラフである。図３および４はともに、ＰＬＯＤ２がテロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードすることの直接的証拠を提供する。
【図５】図５は、多重リアルタイムＰＣＲによって決定された、培養されたヒト線維芽細胞および培養されたヒト筋線維芽細胞中のＰＬＯＤ２ＢのｍＲＮＡレベル（β２−ミクログロブリンｍＲＮＡレベルに対して正規化）を示すグラフである。データは、ＰＬＯＤ２Ｂが、線維症の経過において重要な役割を果たす細胞である筋線維芽細胞において非常に発現されることを示す。
【図６】図６は、哺乳類細胞における組換えＰＬＯＤ２Ｂの発現に使用された、ｐＭＯＳＢｌｕｅベクターから誘導された構築物ｐＤＨＰＬ２ｂ．５を示すグラフである。
【図７】図７は、ヒト骨髄細胞の骨形成分化の間のＰＬＯＤ２Ｂの発現を示すグラフである。ＰＬＯＤ２Ｂ由来のｍＲＮＡの量は、種々の分化段階において本質的に同じである。
【図８】図８は、線維芽細胞および筋線維芽細胞におけるＰＬＯＤ２Ｂの発現が、培養培地へのミノキシジルの添加により抑制されることを示すグラフである。
【図９】図９は、線維芽細胞におけるＰＬＯＤ２Ｂの発現が、培養培地へのＴＧＦ−βの添加により高められることを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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