(57)【要約】【課題】ヒト７回膜貫通型受容体と非ヒト動物の該受容体のオーソログとで反応性が異なり、ヒト７回膜貫通型受容体に特異的に作用する物質の薬理評価を行なうことのできる非ヒト哺乳動物を提供する。【解決手段】本発明により、ヒト７回膜貫通型受容体の細胞内領域を非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する細胞内領域に置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有し、該受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。該非ヒト哺乳動物および、該非ヒト哺乳動物に由来する細胞は、ヒト７回膜貫通型受容体に特異的に作用する物質の薬理評価に有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有し、該キメラ７回膜貫通型受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
ヒト７回膜貫通型受容体の細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換した受容体であって、該非ヒト哺乳動物の細胞において該ヒト受容体に作用するアゴニストに対し細胞応答を示すキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有し、該キメラ７回膜貫通型受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
細胞内領域の任意の部分が以下の（ａ）〜（ｄ）の少なくとも１つの領域を含む部分である請求項２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）Ｎ末端から２番目の細胞内領域
（ｂ）Ｎ末端から３番目の細胞内領域
（ｃ）Ｃ末端の細胞内領域のパルミチン酸結合部位
（ｄ）細胞内領域中のキナーゼによるリン酸化部位
【請求項４】
両方の相同染色体において、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
７回膜貫通型受容体が、以下の（ａ）〜（ｌ）のいずれかに記載の受容体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）Ａ３アデノシン受容体
（ｂ）５−ＨＴ１Ｂセロトニン受容体
（ｃ）ＮＫ１タキキニン受容体
（ｄ）Ｂ２ブラジキニン受容体
（ｅ）β３アドレナリン受容体
（ｆ）カルシトニン受容体
（ｇ）Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体
（ｈ）α２Ａアドレナリン受容体
（ｉ）β１アドレナリン受容体
（ｊ）ＣＣＫＢコレシストキニン受容体
（ｋ）ニューロテンシン受容体
（ｌ）ＤＰプロスタノイド受容体
【請求項６】
非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびサルからなる群から選ばれる非ヒト哺乳動物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
配列番号３２に示すアミノ酸配列を有するキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有し、該キメラＡ３アデノシン受容体を発現するトランスジェニックマウス。
【請求項８】
配列番号３２に示すアミノ酸配列を有するキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体遺伝子のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入されている両方の相同染色体を、ゲノム中に有する請求項７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを非ヒト哺乳動物の受精卵に導入する工程
（ｃ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｄ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入する工程
（ｃ）該胚性幹細胞を非ヒト哺乳動物の受精卵に導入する工程
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを精子に取り込ませる工程
（ｃ）該精子により非ヒト哺乳動物の未受精卵を受精させる工程
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含むレトロウイルスベクターを構築する工程
（ｂ）該レトロウイルスベクターを用いて組換えレトロウイルスを作製する工程
（ｃ）該組換えレトロウイルスを非ヒト哺乳動物の未受精卵に感染させる工程
（ｄ）該未受精卵を体外受精させる工程
（ｅ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含むターゲットベクターを構築する工程
（ｂ）該ターゲットベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入する工程
（ｃ）該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する胚性幹細胞を選択する工程
（ｄ）選択した胚性幹細胞を受精卵に導入する工程
（ｅ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、生殖系列キメラを選択する工程
（ｇ）該生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する個体を選択する工程
（ｈ）（ｇ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入されているホモ接合体を選択する工程
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）構築した発現ベクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入する工程
（ｃ）（ｂ）で得られた細胞の核を脱核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に導入し、発生を開始させる工程
（ｄ）発生を開始した該未受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を含む請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含むターゲットベクターを構築する工程
（ｂ）構築したターゲットベクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入する工程
（ｃ）該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する細胞を選択する工程
（ｄ）選択した細胞の核を脱核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に導入し、発生を開始させる工程
（ｅ）発生を開始した該未受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する個体を選択する工程
（ｇ）（ｆ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入されているホモ接合体を選択する工程
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する細胞。
【請求項１７】
細胞が、卵、精子または胚性幹細胞である請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の細胞に、さらに外来の遺伝子を導入することを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法で作製されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２０】
請求項１６または１７に記載の細胞に、さらに外来の遺伝子を導入して特定の遺伝子を欠損させることを特徴とする、ノックアウト非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法で作製されるノックアウト非ヒト哺乳動物。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の病態モデル動物とを交配させることを特徴とする、キメラ７回膜貫通型受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法により作製される、キメラ７回膜貫通型受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項２４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に、疾患を誘発させることを特徴とする、キメラ７回膜貫通型受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法により作製される、キメラ７回膜貫通型受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項２６】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、７回膜貫通型受容体に対する試験物質の薬理効果の評価方法。
（ａ）請求項１〜８、１９、２１、２３および２５のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｂ）該非ヒト哺乳動物に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該試験物質が該非ヒト哺乳動物に与えた薬理効果を調べる工程
【請求項２７】
以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、７回膜貫通型受容体に対する試験物質の薬理効果の評価方法。
（ａ）請求項１６または１７に記載の細胞に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｂ）該細胞に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該試験物質が該細胞に与えた薬理効果を調べる工程
【請求項２８】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、７回膜貫通型受容体に対する試験物質の薬理効果の評価方法。
（ａ）請求項１７に記載の胚性幹細胞を分化誘導し、分化した細胞を取得する工程
（ｂ）（ａ）で得られた分化した細胞に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｃ）（ａ）で得られた分化した細胞に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該細胞に与えた試験物質の薬理効果を調べる工程
【請求項２９】
試験物質が、ヒトの７回膜貫通型受容体に対するアゴニスト活性が該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログに対するアゴニスト活性の１０倍以上であるアゴニストまたはヒトの７回膜貫通型受容体に対するアンタゴニスト活性が該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログに対するアンタゴニスト活性の１０倍以上であるアンタゴニストである、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の薬理効果の評価方法。
【請求項３０】
試験物質が、以下の（ａ）〜（ｌ）のいずれかに記載の受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の薬理効果の評価方法。
（ａ）Ａ３アデノシン受容体
（ｂ）５−ＨＴ１Ｂセロトニン受容体
（ｃ）ＮＫ１タキキニン受容体
（ｄ）Ｂ２ブラジキニン受容体
（ｅ）β３アドレナリン受容体
（ｆ）カルシトニン受容体
（ｇ）Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体
（ｈ）α２Ａアドレナリン受容体
（ｉ）β１アドレナリン受容体
（ｊ）ＣＣＫＢコレシストキニン受容体
（ｋ）ニューロテンシン受容体
（ｌ）ＤＰプロスタノイド受容体
【請求項３１】
配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ。
【請求項３２】
配列番号３２に示される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項３３】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するマウスＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ。
【請求項３４】
配列番号３に示される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項３５】
配列番号１１に示される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項３６】
請求項３１または３２に記載のＤＮＡを含むターゲットベクター。
【請求項３７】
配列番号１１に示される塩基配列の１〜６３７番目の配列の連続する５００塩基以上の配列からなるＤＮＡおよび配列番号１１に示される塩基配列の３７３５〜５２７０番目の配列の連続する５００塩基以上の配列からなるＤＮＡを含む請求項３６に記載のターゲットベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの該部分に対応する部分で置換されたキメラ７回膜貫通型受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。本発明はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を利用した試験物質の薬理評価方法、ならびに該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製に使用するＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品開発においては動物を用いたヒト疾患モデルでの評価は欠かせず、医薬開発候補化合物を動物モデルを用いてその有効性および毒性を検証していくことが医薬開発上求められている。この場合、主作用と副作用が動物種によって非常に異なるという種差の問題がしばしば起こり、医薬開発上の大きな問題となっている。例えば、マウスでは著効を示す薬物がヒトに対しては全く効かない、ヒト受容体をよく阻害する化合物を見出したがマウスやラットの受容体には阻害効果を示さないといった例が数多く知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
医薬品の標的分子としては、細胞情報伝達に係わる分子の一つである受容体が最も一般的であり、中でも７回膜貫通型受容体を標的とした多くの医薬品が市販されている。
７回膜貫通型受容体は、細胞外領域、細胞膜貫通領域、および細胞内領域からなり、７つの細胞膜貫通領域を有することを特徴とする細胞膜表面上に存在する受容体の総称である。
【０００４】
７回膜貫通型受容体はＧ蛋白質と共役して細胞内に情報を伝えることが明らかにされおり、Ｎ末端から２番目の細胞内領域ループや３番目の細胞内領域ループがＧ蛋白質との相互作用に重要であるとの報告がある（非特許文献２参照）。しかしながら、受容体とＧ蛋白質との相互作用に関与する１次構造上のコンセンサス配列などは見出されておらず、特定のアミノ酸配列というよりはむしろ細胞内領域全体の３次元的な構造がより重要と考えれている。また、Ｃ末端の細胞内領域にパルミチン酸結合部位が存在する場合もあり、Ｇ蛋白質との相互作用に影響を与えていることが知られている（非特許文献３および４参照）。さらに、７回膜貫通型受容体の細胞内領域にはキナーゼの作用を受けてリン酸化される部位が存在し、細胞内情報伝達の制御に関与していると考えられている（非特許文献２、５および６参照）。
【０００５】
７回膜貫通型受容体に選択的に作用するアゴニストあるいはアンタゴニスト等の薬物は、標的となる受容体の細胞外領域あるいは細胞膜貫通領域に結合して薬理活性を示すことが報告されている（非特許文献７、８、９、１０および１１参照）。
【０００６】
７回膜貫通型受容体において、ヒトの７回膜貫通型受容体を標的とした場合と非ヒト哺乳動物の該ヒト受容体に対応する受容体（オーソログ）を標的とした場合とでは異なる薬理効果が示されることがある。具体的な例としては、Ａ３アデノシン受容体に対するアンタゴニスト（特許文献１参照）、５−ＨＴ１Ｂセロトニン受容体に対するアンタゴニスト（非特許文献１２、１３および１４参照）、ＮＫ１タキキニン受容体に対するＣＰ　９６３４５やＲＰ　６７５８０等のアンタゴニスト（非特許文献１０、１１、１５、１６および１７参照）、Ｂ２ブラジキニン受容体に対するアゴニストあるいはアンタゴニスト（非特許文献１８および１９参照）、β３アドレナリン受容体に対するＣＧＰ−１２１７７などのアゴニスト（非特許文献２０参照）、カルシトニン受容体に対するアゴニスト（非特許文献２１参照）、Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体に対するＡＦ−ＤＸ１１６やピレンゼピン（ｐｉｒｅｎｚｅｐｉｎｅ）などのアンタゴニスト（非特許文献２２および２３参照）、α２Ａアドレナリン受容体に対するヨヒンビン（ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ）やラウウォルシン（ｒａｕｗｏｌｓｉｎｅ）などのアンタゴニスト（非特許文献２４および２５参照）、β１アドレナリン受容体に対するＣＧＰ　２０７１２Ａやアテノロール（ａｔｅｎｏｌｏｌ）などのアンタゴニスト（非特許文献２６および２７参照）、ＣＣＫＢコレシストキニン受容体に対するＬ−３６５２６０やＬ−３６４７１８などのアンタゴニスト（非特許文献２８および２９参照）、ニューロテンシン受容体に対するゼノプシン（ｘｅｎｏｐｓｉｎ）や［Ｔｒｐ１１］ニューロテンシンなどのアナログ化合物（非特許文献３０および３１参照）、ＤＰプロスタノイド受容体に対するプロスタグランジンＤ２アナログ化合物（非特許文献３２および３３参照）などをあげることができる。
【０００７】
このような種差の問題を解決する一つの手段として、モデル動物のヒト化、例えばヒトの遺伝子を動物で発現させて化合物の薬理評価を行なう方法が注目されている。
ヒトの遺伝子を動物に発現させることは、トランスジェニックの技術を用いて行うことができる。例えば、ヒトアドレナリンβ２受容体を発現するトランスジェニックマウス（非特許文献３４参照）やヒトブラジキニンＢ２受容体を発現するトランスジェニックマウス（非特許文献３５参照）等が報告されている。しかしながら、単にトランスジェニックの技術を用いるだけでは、導入したヒト遺伝子に対応するオーソログ遺伝子の発現を制御することはできない。動物のオーソログ遺伝子の破壊を行った後にヒトの遺伝子をトランスジェニックの手法を用いて導入することによって、自己のオーソログ遺伝子は発現せず、ヒトの遺伝子のみを発現するトランスジェニック動物が作製できる。例えば、マウスアドレナリンβ３受容体を発現せず、ヒトアドレナリンβ３受容体のみを発現するマウス（非特許文献２０参照）等が報告されている。しかし、この手法ではヒト遺伝子の導入部位をコントロールすることはできないため、導入部位に存在する遺伝子の破壊あるいは導入遺伝子による周辺遺伝子活性等の副次的な表現形の変化をコントロールすることはできない。
【０００８】
これに対し、ポジティブ選択とネガティブ選択を組み合わせた方法を用いて、ヒト遺伝子をそれに対応する非ヒト哺乳動物のオーソログの遺伝子の位置に導入するノックインと呼ばれる遺伝子改変では、上記の欠点が解消される。例えば、ヒトのアポリポ蛋白質Ｅ遺伝子をマウスのアポリポ蛋白質Ｅ遺伝子の位置にノックインしたマウス（非特許文献３６参照）、ヒトの嚢胞性繊維症膜貫通調節蛋白質（Ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ、以下Ｃｆｔｒと略す）遺伝子をマウスのＣｆｔｒ遺伝子の位置にノックインしたマウス（非特許文献３７参照）、ヒトの白血病遺伝子Ｃｂｆｂ−ＭｙＨ１１をマウスのＣｂｆｂ遺伝子の位置にノックインしたマウス（非特許文献３８参照）、ヒトのＫＤＲ遺伝子をマウスのＫＤＲ遺伝子の位置にノックインしたマウス（特許文献２参照）などの作製が報告されている。
【０００９】
しかしながら、このような遺伝子改変動物では、ポジティブ選択のために用いた薬剤耐性遺伝子が標的遺伝子の近傍に残されるため、表現系の解析に際しては薬剤耐性遺伝子のプロモーターやエンハンサーがノックインしたヒト遺伝子の発現に影響を及ぼしていることを考慮する必要がある。置換するヒト遺伝子以外の部分を極力残さないようにする方法として、相同組換えを二度行うダブルリプレースメント法（非特許文献３９、４０および４１参照）や、ポジティブ選択に用いた薬剤耐性遺伝子部分を欠失させるＣｒｅ／ＬｏｘＰ法（非特許文献４２参照）が開発されており、マウスのα−ラクトアルブミン遺伝子をヒトのα−ラクトアルブミン遺伝子に置き換えた遺伝子置換マウス（非特許文献４３および４４参照）、マウスのプリオン遺伝子をヒトのプリオン遺伝子に置き換えた遺伝子置換マウス（非特許文献４５参照）の作製が報告されている。
【００１０】
このような遺伝子置換動物では、ヒト遺伝子産物がその遺伝子産物に対応する非ヒト哺乳動物の因子に代わって発現しているが、非ヒト哺乳動物の遺伝子産物の代わりに導入したヒト遺伝子産物が十分な機能を発揮するかについては置換した遺伝子の個々の性質によって異なる。非ヒト哺乳動物にとっては、ヒト遺伝子の配列はあくまでも変異配列であり機能的に許容できない場合もある。ヒトの遺伝子とそれに対応する非ヒト哺乳動物の遺伝子の種差による違いから、置換したヒト遺伝子産物の生理機能が宿主である非ヒト哺乳動物にとって十分で無い場合には、その標的遺伝子を破壊した場合と同じ表現系が現れる。特に、７回膜貫通型受容体のような、複雑な蛋白質−蛋白質相互作用を介した細胞内情報伝達により機能を発揮する分子の置換では、表現系として、置換した遺伝子産物の機能障害が現れる可能性が高く、大きな問題となっている。
【００１１】
【特許文献１】
国際公開第９８／１５５５５号パンフレット
【００１２】
【特許文献２】
国際公開第９９／１８１９１号パンフレット
【００１３】
【非特許文献１】
ファルマシア，１９９７年，第３３巻，ｐ．１３
【００１４】
【非特許文献２】
アニュアル・レビュー・オブ・ファーマコロジー・アンド・トキシコロジー（Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ），（米国），１９９２年，第３２巻，ｐ．１６７−１８３
【００１５】
【非特許文献３】
ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国），１９８９年，第２６４巻，第１３号，ｐ．７５６４−７５６９
【００１６】
【非特許文献４】
フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ），（オランダ），１９８８年，第２３０巻、第１−２号，ｐ．１−５
【００１７】
【非特許文献５】
ザ・ファセブ・ジャーナル（Ｔｈｅ　ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ），（米国），１９９０年，第４巻，第１１号，ｐ．２８８１−２８８９
【００１８】
【非特許文献６】
ザ・ファセブ・ジャーナル（Ｔｈｅ　ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ），（米国），１９９２年，第６巻，第６号，ｐ．２３２３−２３３１
【００１９】
【非特許文献７】
トレンズ・イン・ファーマコロジカル・サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），（イギリス），１９９１年，第１２巻，第５号，ｐ．１９９−２０３
【００２０】
【非特許文献８】
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），（イギリス），１９９３年，３６２号，第６４１８号，ｐ．３５０−３５３
【００２１】
【非特許文献９】
ザ・ファセブ・ジャーナル（Ｔｈｅ　ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ），（米国），１９８９年，第３巻，第７号，ｐ．１８２５−１８３２
【００２２】
【非特許文献１０】
ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国），１９９２年，第２６７巻，第３６号，ｐ．２５６６８−２５６７１
【００２３】
【非特許文献１１】
ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国），１９９３年，第２６８巻，第４号，ｐ．２３１９−２３２３
【００２４】
【非特許文献１２】
スティーブ・ワトソン（Ｓｔｅｖｅ　Ｗａｔｓｏｎ）およびスティーブ・アーキンストール（Ｓｔｅｖｅ　Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ）編，「ザ・Ｇ−プロテイン・リンクト・リセプター，ファクツ・ブック（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ）」，（イギリス），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，ｐ．１６４−１６６
【００２５】
【非特許文献１３】
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），（イギリス），１９９２年，３６０号，第６４００号，ｐ．１６１−１６４
【００２６】
【非特許文献１４】
ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（イギリス），１９９３年，第６０巻，第１号，ｐ．３８０−３８３
【００２７】
【非特許文献１５】
スティーブ・ワトソン（Ｓｔｅｖｅ　Ｗａｔｓｏｎ）およびスティーブ・アーキンストール（Ｓｔｅｖｅ　Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ）編，「ザ・Ｇ−プロテイン・リンクト・リセプター，ファクツ・ブック（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ）」，（イギリス），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，ｐ．２６２
【００２８】
【非特許文献１６】
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），（米国），１９９１年，第２５１巻，第４９９２号，ｐ．４３５−４３７
【００２９】
【非特許文献１７】
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），（米国），１９９１年，第８８巻，第２２号，ｐ．１０２０８−１０２１２
【００３０】
【非特許文献１８】
スティーブ・ワトソン（Ｓｔｅｖｅ　Ｗａｔｓｏｎ）およびスティーブ・アーキンストール（Ｓｔｅｖｅ　Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ）編，「ザ・Ｇ−プロテイン・リンクト・リセプター，ファクツ・ブック（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ）」，（イギリス），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，ｐ．６８−７０
【００３１】
【非特許文献１９】
バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），（米国），１９９２年，第１８７巻，第３号，ｐ．１３０６−１３１１
【００３２】
【非特許文献２０】
ダイアビーティーズ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ），（米国），１９９８年，第４７巻，第９号，ｐ．１４６４−１４６８
【００３３】
【非特許文献２１】
スティーブ・ワトソン（Ｓｔｅｖｅ　Ｗａｔｓｏｎ）およびスティーブ・アーキンストール（Ｓｔｅｖｅ　Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ）編，「ザ・Ｇ−プロテイン・リンクト・リセプター，ファクツ・ブック（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ）」，（イギリス），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，ｐ．７４−７６
【００３４】
【非特許文献２２】
スティーブ・ワトソン（Ｓｔｅｖｅ　Ｗａｔｓｏｎ）およびスティーブ・アーキンストール（Ｓｔｅｖｅ　Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ）編，「ザ・Ｇ−プロテイン・リンクト・リセプター，ファクツ・ブック（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ）」，（イギリス），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，ｐ．１１
【００３５】
【非特許文献２３】
ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国），１９９１年，第２６６巻，第２６号，ｐ．１７３８２−１７３８７
【００３６】
【非特許文献２４】
スティーブ・ワトソン（Ｓｔｅｖｅ　Ｗａｔｓｏｎ）およびスティーブ・アーキンストール（Ｓｔｅｖｅ　Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ）編，「ザ・Ｇ−プロテイン・リンクト・リセプター，ファクツ・ブック（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ）」，（イギリス），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，ｐ．４２−４４
【００３７】
【非特許文献２５】
モレキュラー・ファーマコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ），（米国），１９９２年，第４２巻，第１号，ｐ．１６−２７
【００３８】
【非特許文献２６】
スティーブ・ワトソン（Ｓｔｅｖｅ　Ｗａｔｓｏｎ）およびスティーブ・アーキンストール（Ｓｔｅｖｅ　Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ）編，「ザ・Ｇ−プロテイン・リンクト・リセプター，ファクツ・ブック（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ）」，（イギリス），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，ｐ．４７−４９
【００３９】
【非特許文献２７】
モレキュラー・ファーマコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ），（米国），１９８０年，第１７巻，第１号，ｐ．１−７
【００４０】
【非特許文献２８】
スティーブ・ワトソン（Ｓｔｅｖｅ　Ｗａｔｓｏｎ）およびスティーブ・アーキンストール（Ｓｔｅｖｅ　Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ）編，「ザ・Ｇ−プロテイン・リンクト・リセプター，ファクツ・ブック（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ）」，（イギリス），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，ｐ．９２
【００４１】
【非特許文献２９】
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），（イギリス），１９９３年，３６２号，第６４１８号，ｐ．３４８−３５０
【００４２】
【非特許文献３０】
スティーブ・ワトソン（Ｓｔｅｖｅ　Ｗａｔｓｏｎ）およびスティーブ・アーキンストール（Ｓｔｅｖｅ　Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ）編，「ザ・Ｇ−プロテイン・リンクト・リセプター，ファクツ・ブック（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ）」，（イギリス），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，ｐ．１９９−２０１
【００４３】
【非特許文献３１】
ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ），（イギリス），１９８０年，第６９巻，第４号，ｐ．６８９−６９２
【００４４】
【非特許文献３２】
スティーブ・ワトソン（Ｓｔｅｖｅ　Ｗａｔｓｏｎ）およびスティーブ・アーキンストール（Ｓｔｅｖｅ　Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ）編，「ザ・Ｇ−プロテイン・リンクト・リセプター，ファクツ・ブック（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ）」，（イギリス），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９９４年，ｐ．２４１−２５１
【００４５】
【非特許文献３３】
「ＩＵＰＨＡＲ・ナインス・インターナショナル・コングレス・オブ・ファーマコロジー（ＩＵＰＨＡＲ　９ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」，（イギリス），マクミラン・プレス（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｒｅｓｓ），１９８４年，ｐ．２９３
【００４６】
【非特許文献３４】
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（ドイツ），１９９６年，第２４１巻，第２号，ｐ．４１７−４２４
【００４７】
【非特許文献３５】
ハイパーテンション（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ），（米国），１９９７年，第２９巻，第１号，ｐ．４８８−４９３
【００４８】
【非特許文献３６】
ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国），１９９７年，第２７２巻，第２９号，ｐ．１７９７２−１７９８０
【００４９】
【非特許文献３７】
ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），（イギリス），１９９７年，第６巻，第７号，ｐ．１１５３−１１６２
【００５０】
【非特許文献３８】
セル（Ｃｅｌｌ），（米国），１９９６年，第８７巻，第４号，ｐ．６８７−６９６
【００５１】
【非特許文献３９】
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），（米国），１９９３年，第１３巻，第７号，ｐ．４１１５−４１２４
【００５２】
【非特許文献４０】
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），（米国），１９９４年，第９１巻，第７号，ｐ．２８１９−２８２３
【００５３】
【非特許文献４１】
バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），（米国），１９９４年，第２０２巻，第２号，ｐ．８３０−８３７
【００５４】
【非特許文献４２】
セル（Ｃｅｌｌ），（米国），１９９３年，第７３巻，第６号，ｐ．１１５５−１１６４
【００５５】
【非特許文献４３】
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），（米国），１９９４年，第１４巻，第２号，ｐ．１００９−１０１６
【００５６】
【非特許文献４４】
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），（米国），１９９５年，第９２巻，第７号，ｐ．２８３５−２８３９
【００５７】
【非特許文献４５】
バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），（米国），１９９６年，第２２２巻，第３号，ｐ．７４２−７４７
【００５８】
【発明が解決しようとする課題】
ヒト７回膜貫通型受容体と非ヒト動物の該受容体のオーソログとで反応性が異なり、ヒト７回膜貫通型受容体に特異的に作用する物質の薬理評価を行なうことのできる非ヒト哺乳動物が求められている。
【００５９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の（１）〜（３７）を提供する。
（１）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有し、該キメラ７回膜貫通型受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（２）ヒト７回膜貫通型受容体の細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換した受容体であって、該非ヒト哺乳動物の細胞において、該ヒト受容体に作用するアゴニストに対し細胞応答を示すキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有し、該キメラ７回膜貫通型受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（３）細胞内領域の任意の部分が以下の（ａ）〜（ｄ）の少なくとも１つの領域を含む部分である（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）Ｎ末端から２番目の細胞内領域
（ｂ）Ｎ末端から３番目の細胞内領域
（ｃ）Ｃ末端の細胞内領域のパルミチン酸結合部位
（ｄ）細胞内領域中のキナーゼによるリン酸化部位
（４）該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入された、両方の相同染色体をゲノム中に有する、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（５）７回膜貫通型受容体が、以下の（ａ）〜（ｌ）のいずれかに記載の受容体である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）Ａ３アデノシン受容体
（ｂ）５−ＨＴ１Ｂセロトニン受容体
（ｃ）ＮＫ１タキキニン受容体
（ｄ）Ｂ２ブラジキニン受容体
（ｅ）β３アドレナリン受容体
（ｆ）カルシトニン受容体
（ｇ）Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体
（ｈ）α２Ａアドレナリン受容体
（ｉ）β１アドレナリン受容体
（ｊ）ＣＣＫＢコレシストキニン受容体
（ｋ）ニューロテンシン受容体
（ｌ）ＤＰプロスタノイド受容体
【００６０】
（６）非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびサルからなる群から選ばれる非ヒト哺乳動物である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（７）配列番号３２に示すアミノ酸配列を有するキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有し、該キメラＡ３アデノシン受容体を発現するトランスジェニックマウス。
（８）配列番号３２に示すアミノ酸配列を有するキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体遺伝子のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入されている両方の相同染色体を、ゲノム中に有する（７）に記載のトランスジェニックマウス。
（９）以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む（１）〜（３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを非ヒト哺乳動物の受精卵に導入する工程
（ｃ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｄ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
（１０）以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む（１）〜（３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入する工程
（ｃ）該胚性幹細胞を非ヒト哺乳動物の受精卵に導入する工程
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
【００６１】
（１１）以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む（１）〜（３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを精子に取り込ませる工程
（ｃ）該精子により非ヒト哺乳動物の未受精卵を受精させる工程
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
（１２）以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む（１）〜（３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含むレトロウイルスベクターを構築する工程
（ｂ）該レトロウイルスベクターを用いて組換えレトロウイルスを作製する工程
（ｃ）該組換えレトロウイルスを非ヒト哺乳動物の未受精卵に感染させる工程
（ｄ）該未受精卵を体外受精させる工程
（ｅ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
（１３）以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む（４）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含むターゲットベクターを構築する工程
（ｂ）該ターゲットベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入する工程
（ｃ）該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する胚性幹細胞を選択する工程
（ｄ）選択した胚性幹細胞を受精卵に導入する工程
（ｅ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、生殖系列キメラを選択する工程
（ｇ）該生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する個体を選択する工程
（ｈ）（ｇ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の染色体において該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入されているホモ接合体を選択する工程
（１４）以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む（１）〜（３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）構築した発現ベクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入する工程
（ｃ）（ｂ）で得られた細胞の核を脱核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に導入し、発生を開始させる工程
（ｄ）発生を開始した該未受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
（１５）以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を含む（４）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含むターゲットベクターを構築する工程
（ｂ）構築したターゲットベクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入する工程
（ｃ）該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する細胞を選択する工程
（ｄ）選択した細胞の核を脱核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に導入し、発生を開始させる工程
（ｅ）発生を開始した該未受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体をゲノム中に有する個体を選択する工程
（ｇ）（ｆ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の染色体において、該キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが、自己のオーソログの遺伝子の７回膜貫通型受容体をコードする領域と置換して挿入されているホモ接合体を選択する工程
【００６２】
（１６）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する細胞。
（１７）細胞が、卵、精子または胚性幹細胞である（１６）に記載の細胞。
（１８）（１６）または（１７）に記載の細胞に、さらに外来の遺伝子を導入することを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（１９）（１８）に記載の方法で作製されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（２０）（１６）または（１７）に記載の細胞に、さらに外来の遺伝子を導入して特定の遺伝子を欠損させることを特徴とする、ノックアウト非ヒト哺乳動物の作製方法。
【００６３】
（２１）（２０）に記載の方法で作製されるノックアウト非ヒト哺乳動物。
（２２）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の病態モデル動物とを交配させることを特徴とする、キメラ７回膜貫通型受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
（２３）（２２）に記載の方法により作製される、キメラ７回膜貫通型受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物。
（２４）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に、疾患を誘発させることを特徴とする、キメラ７回膜貫通型受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
（２５）（２４）に記載の方法により作製される、キメラ７回膜貫通型受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物。
【００６４】
（２６）以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、７回膜貫通型受容体に対する試験物質の薬理効果の評価方法。
（ａ）（１）〜（８）、（１９）、（２１）、（２３）および（２５）のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｂ）該非ヒト哺乳動物に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該試験物質が該非ヒト哺乳動物に与えた薬理効果を調べる工程
（２７）以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、７回膜貫通型受容体に対する試験物質の薬理効果の評価方法。
（ａ）（１６）または（１７）に記載の細胞に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｂ）該細胞に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該試験物質が該細胞に与えた薬理効果を調べる工程
（２８）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、７回膜貫通型受容体に対する試験物質の薬理効果の評価方法。
（ａ）（１７）に記載の胚性幹細胞を分化誘導し、分化した細胞を取得する工程（ｂ）（ａ）で得られた分化した細胞に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｃ）（ａ）で得られた分化した細胞に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該細胞に与えた試験物質の薬理効果を調べる工程
（２９）試験物質が、ヒトの７回膜貫通型受容体に対するアゴニスト活性が該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログに対するアゴニスト活性の１０倍以上であるアゴニストまたはヒトの７回膜貫通型受容体に対するアンタゴニスト活性が該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログに対するアンタゴニスト活性の１０倍以上であるアンタゴニストである、（２６）〜（２８）のいずれか１項に記載の薬理効果の評価方法。
（３０）試験物質が、以下の（ａ）〜（ｌ）のいずれかに記載の受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである、（２６）〜（２８）のいずれか１項に記載の薬理効果の評価方法。
（ａ）Ａ３アデノシン受容体
（ｂ）５−ＨＴ１Ｂセロトニン受容体
（ｃ）ＮＫ１タキキニン受容体
（ｄ）Ｂ２ブラジキニン受容体
（ｅ）β３アドレナリン受容体
（ｆ）カルシトニン受容体
（ｇ）Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体
（ｈ）α２Ａアドレナリン受容体
（ｉ）β１アドレナリン受容体
（ｊ）ＣＣＫＢコレシストキニン受容体
（ｋ）ニューロテンシン受容体
（ｌ）ＤＰプロスタノイド受容体
【００６５】
（３１）配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ。
（３２）配列番号３２に示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（３３）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するマウスＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ。
（３４）配列番号３に示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（３５）配列番号１１に示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（３６）（３１）または（３２）に記載のＤＮＡを含むターゲットベクター。
（３７）配列番号１１に示される塩基配列の１〜６３７番目の配列の連続する５００塩基以上の配列からなるＤＮＡおよび配列番号１１に示される塩基配列の３７３５〜５２７０番目の配列の連続する５００塩基以上の配列からなるＤＮＡを含む（３６）に記載のターゲットベクター。
【００６６】
【発明の実施の形態】
本発明において、７回膜貫通型受容体としては、７つの細胞膜貫通領域を有し、Ｇ蛋白質と共役して細胞内に情報を伝達し得る受容体であればいかなる受容体も包含される。ヒトの７回膜貫通型受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性が、該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログに対する活性の少なくとも１０倍以上、好ましくは２０倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上、特に好ましくは１０００倍以上である、ヒト選択的なアゴニストあるいはアンタゴニストが存在する７回膜貫通型受容体が好ましい。ヒト選択的なアゴニストあるいはアンタゴニストが存在する７回膜貫通型受容体としては、Ａ３アデノシン受容体、５−ＨＴ１Ｂセロトニン受容体、ＮＫ１タキキニン受容体、Ｂ２ブラジキニン受容体、β３アドレナリン受容体、カルシトニン受容体、Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体、α２Ａアドレナリン受容体、β１アドレナリン受容体、ＣＣＫＢコレシストキニン受容体、ニューロテンシン受容体、ＤＰプロスタノイド受容体などの７回膜貫通型受容体をあげることができる。
【００６７】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が発現する７回膜貫通型受容体は、ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分で置換した受容体（以下、キメラ７回膜貫通型受容体ともよぶ）であって、非ヒト哺乳動物の細胞において、該ヒト受容体に作用するアゴニストに対し細胞応答を示すキメラ７回膜貫通型受容体が好ましい。
【００６８】
非ヒト哺乳動物の細胞において、該ヒト受容体に作用するアゴニストに対し細胞応答を示すキメラ７回膜貫通型受容体は、ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域または細胞内領域の任意の部分を非ヒト哺乳動物のオーソログの対応する部分に置換したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを作製し、該ＤＮＡを含む発現ベクターを細胞に導入することにより該キメラ７回膜貫通型受容体を非ヒト哺乳動物の細胞で発現させ、該ヒト受容体に作用するアゴニストを作用させたときの細胞応答を測定し、細胞応答を示すものを選択することによって、得ることができる。７回膜貫通型受容体において、アゴニストと結合するのは、細胞外領域または細胞膜貫通領域であり、Ｇ蛋白質と共役し細胞内の情報伝達を行なうのは、細胞内領域である。したがって、ヒト７回膜貫通型受容体の全ての細胞内領域を非ヒト哺乳動物の細胞内領域に置換したキメラ７回膜貫通型受容体は、非ヒト哺乳動物の細胞において、該ヒト受容体に作用するアゴニストに対し細胞応答を示すと考えられる。また、７回膜貫通型受容体において細胞内情報伝達に関与する部分としては、Ｎ末端から２番目あるいは３番目の細胞内領域、Ｃ末端の細胞内領域のパルミチン酸結合部位、または細胞内領域中のキナーゼによるリン酸化部位等があげられる。したがって、キメラ７回膜貫通型受容体において置換する細胞内領域の任意の部分としては、（１）Ｎ末端から２番目の細胞内領域、（２）Ｎ末端から３番目の細胞内領域、（３）Ｃ末端の細胞内領域のパルミチン酸結合部位、（４）細胞内領域中のキナーゼによるリン酸化部位うちの少なくとも１つの領域を含む部分があげられる。非ヒト哺乳動物の細胞において、ヒト７回膜貫通型受容体に作用するアゴニストに対し細胞応答を示すキメラ７回膜貫通型受容体としては、配列番号３３に示すアミノ酸配列を有する、ヒトＡ３アデノシン受容体の全ての細胞内領域をマウスＡ３アデノシン受容体の対応する細胞内領域に置換したキメラＡ３アデノシン受容体をあげることができる。
【００６９】
ヒト７回膜貫通型受容体に作用するアゴニストに対し、細胞応答を示すキメラ７回膜貫通型受容体を発現する本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ヒト７回膜貫通型受容体に作用する薬物を評価するために用いることができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはサルなどがあげられ、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、サルなどがあげられる。
【００７０】
以下、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法と利用方法について詳細に説明する。
本発明の、キメラ７回膜貫通型受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、１）目的とする遺伝子を動物個体に導入するトランスジェニック動物の作製方法、２）標的遺伝子と目的とする導入遺伝子とを入れ換えた遺伝子置換動物の作製方法、３）目的とした遺伝子改変を施した細胞の核を用いたクローン個体の作製方法等を用いることにより、作製することができる。以下にそれぞれ具体的に説明する。
【００７１】
１．目的とする遺伝子を動物個体に導入するトランスジェニック動物の作製方法を用いた、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
（１）ヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの取得
ヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡとしては、ヒト７回膜貫通型受容体をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡをあげることができる。ゲノムＤＮＡはイントロンを含んでいてもよい。また、コード領域のコドンは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡにおけるコドンに限られるものでなく、該ヒト７回膜貫通型受容体のアミノ酸配列をコードするコドンであれば、いかなるコドンの組み合わせでもよい。ヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの例としては、配列番号１４に示す塩基配列からなるヒトＡ３アデノシン受容体のｃＤＮＡをあげることができる。
【００７２】
塩基配列データベースより、目的のヒトの７回膜貫通型受容体ｃＤＮＡの配列、または該受容体遺伝子のゲノム配列を検索し、その塩基配列情報を取得する。塩基配列データベースから取得できるヒトの７回膜貫通型受容体ｃＤＮＡまたは該受容体遺伝子のゲノム配列としては、例えば、ヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ７７７２９およびＬ７７７３０）をあげることができる。
【００７３】
得られたヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて、該受容体をコードする領域を含むｃＤＮＡの配列またはゲノム配列の領域を適当に選択し、この領域の５’端２０〜４０ｂｐの配列を３’端に含むＤＮＡおよび、この領域の３’端２０〜４０ｂｐの配列と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡを作製する。これらのＤＮＡをプライマーとして用い、ヒトｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、ヒトの該受容体をコードするｃＤＮＡを、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、ヒトの該受容体をコードするゲノムＤＮＡを単離することができる。
【００７４】
ヒトｃＤＮＡは、ヒトの組織または細胞から調製したＲＮＡから作製できる。組織または細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，　３，　１９８７）、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１６２，　１５６，　１９８７；　実験医学，　９，　１９３７，　１９９１）などがあげられる。また、アブソリュートリーＲＮＡ　ＲＴ−ＰＣＲミニプレップ・キット（Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ　ＲＮＡ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ、ストラタジーン社製）、ＲＮイージー・ミニ・キット（ＲＮｅａｓｙ　ＭＩｎｉ　Ｋｉｔ、キアゲン社製）等のキットを用いることによっても調製することができる。全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋　ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）〕等があげられる。さらに、ファーストトラック２．０ｍＲＮＡ分離キット（ＦａｓｔＴｒａｃｋ　２．０　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、インビトロジェン社製）、クィックプレップｍＲＮＡ精製キット（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、アマシャム・バイオサイエンス社製）等のキットを用いることによりヒト組織や細胞からｍＲＮＡを調製することができる。全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する方法としてはモレキュラー・クローニング第３版、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　１９８７−２００１（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＲＴ−ＰＣＲ用スーパースクリプト第一鎖合成システム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ　Ｆｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ−ＰＣＲ、インビトロジェン社製）、プロスター第一鎖ＲＴ−ＰＣＲキット（ＰｒｏＳＴＡＲ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ、ストラタジーン社製）、ＰＣＲ−セレクトｃＤＮＡサブトラクション・キット（ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ　ｃＤＮＡ　Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、クロンテック社製）を用いる方法などがあげられる。クロンテック社等から市販されているヒトの各種組織のｃＤＮＡを用いることもできる。このようにして得られたヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの例として、配列番号１４に示す塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
【００７５】
ヒトゲノムＤＮＡは、ヒトの組織または細胞から、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により調製することができる。または、イージーＤＮＡキット（Ｅａｓｙ−ＤＮＡ　Ｋｉｔ、インビトロジェン社製）、ＤＮＡ抽出キット（ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ストラタジーン社製）等のキットを用いることにより、調製できる。クロンテック社等から市販されているヒトのゲノムＤＮＡを用いることもできる。
【００７６】
（２）非ヒト哺乳動物のオーソログをコードするＤＮＡの取得
トランスジェニック動物を作製する非ヒト哺乳動物の、ヒト７回膜貫通型受容体のオーソログをコードするＤＮＡとしては、非ヒト哺乳動物の該オーソログをコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡをあげることができる。ゲノムＤＮＡはイントロンを含んでいてもよい。また、コード領域のコドンは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡにおけるコドンに限られるものでなく、該オーソログのアミノ酸配列をコードするコドンであれば、いかなるコドンの組み合わせでもよい。非ヒト哺乳動物の該オーソログをコードするＤＮＡの例としては、配列番号３に示す塩基配列からなるマウスＡ３アデノシン受容体のｃＤＮＡをあげることができる。（１）と同様にして、非ヒト哺乳動物のオーソログをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの塩基配列の情報から、非ヒト哺乳動物のオーソログをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを単離することができる。配列情報が塩基配列データベースから得られない場合は、該非ヒト哺乳動物のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、プラークハイブリダイゼーションあるいはコロニーハイブリダイゼーションにより、該遺伝子を含むゲノムＤＮＡクローンを単離する方法により、非ヒト哺乳動物のオーソログをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを単離することができる。プローブとしては、塩基配列データベースから部分配列の情報が得られる場合は、その配列に基づいたプライマーを利用したＰＣＲにより、単離した部分断片を標識したものを用いることができる。データベース上から、部分配列の情報が得られない場合は、（１）で得られたヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを標識したものをプローブとして用いることができる。
【００７７】
ライブラリーの作製、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションおよびプローブの標識と調製は、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法により行なうことができる。
【００７８】
（３）キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの作製
ヒトの７回膜貫通型受容体と該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログのアミノ酸配列、細胞内領域等のドメイン構造を比較し、作製するキメラ７回膜貫通型受容体のアミノ酸配列を設計する。該キメラ受容体をコードするＤＮＡの断片を、以下のようにして単離する。まず、設計したキメラ受容体をコードする塩基配列として、ヒトの該受容体のｃＤＮＡの塩基配列の中で、ヒトの該受容体から非ヒト哺乳動物のオーソログのアミノ酸配列に置換された領域をコードする部分を、非ヒト哺乳動物のオーソログのｃＤＮＡの塩基配列に置換した塩基配列を設計する。このキメラ受容体をコードする塩基配列の中で、ヒト受容体のｃＤＮＡの塩基配列から非ヒト哺乳動物のオーソログのｃＤＮＡの塩基配列に置換された領域またはその近傍に存在する制限酵素サイトを含む配列を選択する。適当な制限酵素サイトがない場合は、キメラ受容体のアミノ酸配列を変えずにコドンを選択することにより適当な制限酵素サイトができるように塩基配列を設計し直す。この選択した塩基配列または該塩基配列と相補的な塩基配列を有するプライマーを、鋳型となるヒト受容体をコードするＤＮＡまたは非ヒト哺乳動物オーソログをコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計し、作製する。作製したプライマーを用いて、ヒト受容体をコードするＤＮＡまたは非ヒト哺乳動物オーソログをコードするＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより、該キメラ受容体をコードするＤＮＡの断片を増幅する。得られたＤＮＡ断片を制限酵素サイトを利用して接続することにより、キメラ受容体をコードするＤＮＡを取得することができる。
【００７９】
以上のようにして得られるキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡとして、ヒトＡ３アデノシン受容体の細胞内領域をマウスＡ３アデノシン受容体の細胞内領域で置換したキメラＡ３アデノシン受容体をコードする、配列番号３２に示した塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
下記（４）に記載した方法に準じて該ＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、非ヒト哺乳動物の細胞に導入することにより該キメラ７回膜貫通型受容体を該細胞で発現させた後、ヒト７回膜貫通型受容体に作用するアゴニストを細胞に添加し、該ヒト７回膜貫通型受容体に応じた細胞応答を測定することにより、該キメラ７回膜貫通型受容体が、非ヒト哺乳動物の細胞において、ヒト７回膜貫通型受容体に作用するアゴニストに対して細胞応答を示すことを確認できる。細胞応答としては、細胞内Ｃａ２＋の上昇、細胞内ｃＡＭＰ量の減少、細胞内ｃＡＭＰ量の上昇等をあげることができる。
【００８０】
（４）キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む導入遺伝子の作製
（３）で得られたキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを非ヒト哺乳動物に導入する際には、適当なプロモーターの下流に該ＤＮＡを連結した発現ベクターを導入遺伝子として用いるのが好ましい。
【００８１】
発現ベクターに用いられるプロモーターとしては、キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを導入する非ヒト哺乳動物の細胞内で転写を開始できるプロモーターであればいずれも用いることができる。たとえばウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、シミアンウイルス、レトロウイルスなど）由来遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来遺伝子〔例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、エリスロポエチン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１、Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナーゼ（Ｔｉｅ２）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロテイナーゼ１組織インヒビター（ＴＩＭＰ１）、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン塩基性タンパク、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、レニン、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）等の解糖系酵素、ヒートショック蛋白質などの遺伝子〕のプロモーター、上記遺伝子のエンハンサー配列やプロモーター配列を融合させたプロモーター〔例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期遺伝子のプロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス１のロング・ターミナル・リピートの一部の配列からなるＳＲαプロモーター、サイトメガロウイルスの前初期（ＩＥ）遺伝子エンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターからなるＣＡＧプロモーターなど〕などがあげられるが、目的とする７回膜貫通型受容体遺伝子のプロモーターを用いることが好ましく、該受容体のヒト遺伝子のプロモーターを用いることが特に好ましい。組織特異的な発現を示す遺伝子のプロモーターを使用することにより、該受容体をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物の特定の組織に発現させることも可能である。また、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、以下のようにして導入した外来遺伝子の発現時期や発現量等を制御することも可能である。
【００８２】
発現ベクター中のキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを２つのｌｏｘＰ配列の間に挿入し、該発現ベクターを用いて（５）に後述する方法でトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する。該トランスジェニック非ヒト哺乳動物に、アデノウイルスベクターを利用してＣｒｅリコンビナーゼを発現させることにより、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現用のアデノウイルスを感染させた部位または時期に特異的にキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡが欠失し、該受容体の発現を抑制することができる。また、（５）に後述する方法でキメラ７回膜貫通型受容体の発現ベクターに加えて、例えば組織特異的な発現を示すプロモーターを利用したＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクターを導入してトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することにより、Ｃｒｅリコンビナーゼが発現する組織でのみ、キメラ７回膜貫通型受容体の発現が抑制されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。
【００８３】
発現ベクターは、キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの下流に、ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化に必要なポリアデニル化シグナルを有していることが好ましい。ポリアデニル化シグナルとしては、上記のウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子に含まれるポリアデニル化シグナル、例えば、ＳＶ４０の後期遺伝子または初期遺伝子、ウサギβグロビン遺伝子、ウシ成長ホルモン遺伝子、目的とする７回膜貫通型受容体遺伝子等の遺伝子のポリアデニル化シグナルをあげることができる。その他目的遺伝子をさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結してもよい。以下、プロモーター、キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルからなるＤＮＡ構築物をキメラ７回膜貫通型受容体発現ユニットと呼ぶ。
【００８４】
さらに発現ベクターには、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、以下Ｅ．　ｃｏｌｉと略す）を用いてベクターを調製するため、Ｅ．　ｃｏｌｉで複製可能な複製開始点およびＥ．　ｃｏｌｉの形質転換体の選択マーカーとなる内因性プロモーターを含む薬剤耐性遺伝子が必要である。薬剤耐性遺伝子としては、Ｅ．　ｃｏｌｉ由来のアンピシリン耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ遺伝子）、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等があげられる。Ｅ．　ｃｏｌｉでの複製可能な複製開始点としては、ｐＢＲ３２２の複製開始点、ｃｏｌＥ１の複製開始点等があげられる。
【００８５】
レトロウイルスを遺伝子の導入に用いる場合は、レトロウイルスベクターにキメラ７回膜貫通型受容体発現ユニットを挿入した組換えレトロウイルスベクターを作製する。該組換えレトロウイルスベクターを、適切なパッケージング細胞に導入することにより、組換えレトロウイルスを生産させることができる。得られた組換えレトロウイルスを受精卵等に感染させることにより、組換えレトロウイルスベクターを導入することができる。パッケージング細胞への組換えレトロウイルスベクターの導入には、公知の遺伝子導入の手法（例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）を用いることができる。
【００８６】
（５）受精卵等への発現ベクターの導入とトランスジェニック非ヒト動物の選択本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、（４）で作製したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を対象となる非ヒト哺乳動物に導入することによって作製できる。具体的には、該遺伝子を対象となる非ヒト哺乳動物の受精卵、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略す）、精子または未受精卵へ導入し、これらの細胞を用いて発生させた個体から、キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子が胚芽細胞を含むすべての細胞の染色体上に組み込まれた個体を選択することにより、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作出できる。作出したトランスジェニック非ヒト哺乳動物の胚芽細胞において該導入遺伝子が存在することは、作出動物の子孫がその胚芽細胞および体細胞の全てに該導入遺伝子を有することで確認することができる。個体の選択は、個体を構成する組織、例えば、血液組織、上皮組織、結合組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織または骨格系組織の一部から調製したゲノムＤＮＡ上に該導入遺伝子が存在することをＤＮＡレベルで確認することによって行われる。このようにして選択された個体は通常、相同染色体の片方に導入遺伝子を有するヘテロ接合体なので、ヘテロ接合体の個体同士を交配することにより、子孫の中から導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ接合体動物を取得することができる。このホモ接合体の雌雄の動物を交配することにより、すべての子孫が該遺伝子を安定に保持するホモ接合体となるので、通常の飼育環境で、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を繁殖継代することができる。
【００８７】
（ｉ）受精卵への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
受精卵への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９４）（以下、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版と略す）、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８　ジーンターゲッティング，　ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社　（１９９５）、発生工学実験マニュアル，　トランスジェニック・マウスの作り方，　講談社　（１９８７）等に記載された方法により行うことができる。
【００８８】
キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を導入する受精卵は、同種の雄非ヒト哺乳動物と雌非ヒト哺乳動物を交配させることによって得られる。例えば、雄マウスと雌マウスを交配することにより、好ましくは近交系の雄マウスと雌マウスを交配することにより、マウスの受精卵が、雄ラットと雌ラットを交配することにより、好ましくはＷｉｓｔａｒ系統の雄ラットとＷｉｓｔａｒ系統の雌ラットを交配することにより、ラットの受精卵が得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモンを例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物がマウスの場合は、雌マウスに卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は２〜２０　ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は０〜１０　ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。非ヒト哺乳動物がラットの場合は、雌ラットに卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、雄ラットと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は２０〜５０　ＩＵ／個体、好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は０〜１０　ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。また、近交系のマウスやＷｉｓｔｅｒ系統のラットを用いる場合は、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：００）で約１週間飼育した８週齢以上のものを用いるのが好ましい。
【００８９】
得られた受精卵にマイクロインジェクション法（Ｗ．　Ｊ．　Ｇｏｒｄｏｎら；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７７，　７３８０，　１９８０、Ｊ．　Ｊ．　Ｍｕｌｌｉｎｓら；　Ｎａｔｕｒｅ，　３４４，　５４１，　１９９０、Ｒ．　Ｅ．　Ｈａｍｍｅｒら；　Ｎａｔｕｒｅ，　３１５，　６８０，　１９８５、Ｖ．　Ｇ．　Ｐｕｒｓｅｌら；　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，　１７，　３０３，　１９８７）やレトロウイルスを用いた方法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等によりキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を導入した後、該受精卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって、導入したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を組み込んだ染色体ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得られる。
【００９０】
マイクロインジェクション法により遺伝子を導入する場合には、受精後約１２〜約２４時間の雄性前核が出現している受精卵を用いることが好ましい。マイクロインジェクション法で導入されるキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子は、環状化状態、直線化状態いずれでも用いることができるが、キメラ７回膜貫通型受容体をコードする領域およびプロモーター等の発現調節領域を破壊しない形で直線化し導入することが好ましい。レトロウイルスを用いた方法により遺伝子を導入する場合には、桑実胚以前（一般には、８細胞期以前）の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
【００９１】
雌非ヒト哺乳動物へ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましい。偽妊娠雌非ヒト哺乳動物は自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、ＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物を得ることもできる。ＬＨＲＨの類縁体としては、例えば［３，５−ジヨード−Ｔｙｒ５］−ＬＨＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨＲＨ、［Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨＲＨ、ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０−［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨＲＨエチルアミド等があげられる。ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物が雌ラットの場合は、通常、ＬＨＲＨあるいはその類縁体を投与後、約４日目に雄ラットと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、１０〜６０μｇ／個体、好ましくは約４０μｇ／個体である。
【００９２】
（ｉｉ）ＥＳ細胞への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
ＥＳ細胞への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版　、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８　ジーンターゲッティング，　ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社　（１９９５）、発生工学実験マニュアル，　トランスジェニック・マウスの作り方，　講談社　（１９８７）等に記載された方法により行うことができる。
【００９３】
非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞にキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を導入後、得られたＥＳ細胞を集合キメラ法または注入キメラ法を用いて、非ヒト哺乳動物の受精卵に取り込ませ、該受精卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって導入したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を組み込んだ染色体ＤＮＡを有する細胞を部分的に有する非ヒト哺乳キメラ動物が得られる。
【００９４】
非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞は、マウスのＥＳ細胞（Ｍ．　Ｊ．　Ｅｖａｎｓら；　Ｎａｔｕｒｅ，　２９２，　１５４，　１９８１　；　Ｇ．　Ｒ．　Ｍａｒｔｉｎ；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７８，　７６３４，　１９８１）、ラットのＥＳ細胞（Ｐ．　Ｍ．　Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら；　Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．，　１６３，　２８８，　１９９４）ブタのＥＳ細胞（Ｍ．　Ｂ．　Ｗｈｅｅｌｅｒ；　Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｆｅｒｔｉｌ．　Ｄｅｖ．，　６，　５６３，　１９９４）、サルのＥＳ細胞（Ｊ．　Ａ．　Ｔｈｏｍｓｏｎら；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９２，　７８４４，　１９９６）の各樹立方法、ＵＳ５４５３３５７またはＵＳ５６７０３７２に記載のＥＳ細胞の樹立方法に準じて、樹立することができる。マウスのＥＳ細胞としては、ＡＢ２．２〔レキシコン・ジェネティックス（Ｌｅｘｉｃｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）社製〕等を用いることができる。
【００９５】
ＥＳ細胞への外来性遺伝子の導入には、公知の遺伝子導入の手法（例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウイルスベクター法等）を用いることができる。導入されるキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子は、環状化状態、直線化状態いずれでも用いることができるが、キメラ７回膜貫通型受容体をコードする領域およびプロモーター等の発現調節領域を破壊しない形で直線化し導入することが好ましい。
【００９６】
受精卵は（ｉ）に記載した方法により取得できる。
ＥＳ細胞を集合キメラ法を用いて非ヒト哺乳動物の受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。ＥＳ細胞を注入キメラ法を用いて非ヒト哺乳動物の受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
【００９７】
雌非ヒト哺乳動物へ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌非ヒト哺乳動物は、（ｉ）に記載した方法を用いることで得られる。
ＥＳ細胞の非ヒト哺乳動物と受精卵の非ヒト哺乳動物を、同じ種であるが体毛の色等の外見的な表現型が異なる系統にしておけば、非ヒト哺乳キメラ動物である個体、およびキメラ率（ＥＳ細胞に由来する細胞、すなわち導入した外来性遺伝子組み込んだ染色体ＤＮＡを有する細胞の割合）の高い個体を容易に選択することができる。
【００９８】
キメラ７回膜貫通型受容体発現をコードするＤＮＡを含む遺伝子を組み込んだ染色体ＤＮＡを有する細胞を部分的に有する非ヒト哺乳キメラ動物のうちキメラ率の高い個体（好ましくは、雄）と非ヒト哺乳動物の個体（好ましくは、雌）を交配する。生まれた仔の組織、例えば、血液組織、上皮組織、結合組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織または骨格系組織の一部から調製したゲノムＤＮＡ上に導入したキメラ７回膜貫通型受容体発現ユニットが存在するかどうかをサザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等により調べ、生まれた全ての仔のゲノムＤＮＡ上に導入したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子が存在する場合、親の非ヒト哺乳キメラ動物を生殖系列キメラとして選択する。生殖系列キメラと非ヒト哺乳動物の個体を交配することによって、全身の細胞の染色体上に導入したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を有する個体を仔として得ることができる。この個体は通常、相同染色体の片方にのみ、導入したキメラ７回膜貫通型受容体発現ユニットを有するヘテロ接合体である。さらにその個体の雄雌どうしを交配することにより相同染色体の双方に導入したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子が入ったホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。
【００９９】
（ｉｉｉ）精子への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
精子への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、Ｐｅｒｒｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８４，　１１８０，　１９９９）　やＷａｋａｙａｍａら（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１６，　６３９，　１９９８）によって報告された方法を用いて行なうことができる。
【０１００】
非ヒト哺乳動物の精子に（４）で作製したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を取り込ませた後、得られた精子を顕微受精の方法を用いて未受精卵に受精させ、発生を開始した卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって、精子に取り込ませたキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を染色体上に組み込んだ非ヒト哺乳動物が得られる。
【０１０１】
精子に外来性遺伝子を取り込ませる場合には、細胞膜を破壊した精子を、約０．５〜約１００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは、５〜１０ｎｇ／ｍＬ）の濃度の外来性遺伝子を含む培地（例えば、ＣＺＢ培地やＮＩＭ培地など）中で数分間（好ましくは、１分間程度）インキュベーションする方法を用いることが好ましい。精子の細胞膜を破壊する方法としては、低濃度（例えば、０．０５％）の界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００など）で処理する方法、１０％の仔ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳと略す）を含みＥＤＴＡを含まない培地（例えば、ＣＺＢ培地など）中に懸濁した精子を凍結乾燥する方法　、該精子懸濁液を凍結融解する方法のいずれかが好ましい。このような処理をして細胞膜を破壊した精子は、もはや自発的に受精する能力を失っているが、マイクロマニュピレーター等を用いた顕微受精の方法を用いて受精させることで胚の発生を促すことができる。顕微受精を行う場合には、外来性遺伝子を取り込ませた精子の頭部を減数第二分裂中期にある同種の雌非ヒト哺乳動物未受精卵の細胞質に注入する方法が好ましい。
【０１０２】
（ｉｖ）未受精卵への遺伝子導入と体外受精によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
未受精卵への遺伝子導入と体外受精によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、Ｃｈａｎらによって報告された方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９５，　１４０２８，　１９９８）を用いて行なうことができる。
【０１０３】
非ヒト哺乳動物（好ましくは、マウス、ラット、ウシなど）の未受精卵に、キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を組み込んだレトロウイルスを感染させることで該遺伝子を導入し、得られた卵を体外受精の方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した受精卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって、導入したキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を染色体上に組み込んだ非ヒト哺乳動物が得られる。
【０１０４】
キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を組み込んだレトロウイルスは、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の方法により調製できる。組換えレトロウイルスを未受精卵に感染させる場合には、透明帯を除いた未受精卵を用いることが好ましい。未受精卵の透明帯を除去する方法としては、マイクロマニュピレーター等を用いて物理的に膜を除く方法、化学物質（例えば、酸性タイロードなど）を用いて化学的に膜を溶解して除く方法のいずれかが好ましい。
【０１０５】
２．標的遺伝子と目的とする導入遺伝子とを入れ換えた遺伝子置換動物の作製方法を用いた、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
（１）ヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの取得
１．（１）に記載の方法で、ヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの取得する。後述するように、ヒト７回膜貫通型受容体をコードする領域の５’および３’に非ヒト哺乳動物の７回膜貫通型受容体遺伝子の非コード領域を付加するために、開始コドンおよび終止コドンの近傍のコード領域中に適当な制限酵素サイトが必要であるため、このような制限酵素サイトがない場合は、ＰＣＲのプライマーの配列を、コードするアミノ酸配列は変えずに制限酵素サイトができるようにコドンを選択して設計し、ヒト７回膜貫通型受容体のコード領域中の開始コドンおよび終止コドンの近傍に適当な制限酵素サイトができるようにする。
【０１０６】
（２）該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログ遺伝子を含むゲノムＤＮＡの取得
該受容体の非ヒト哺乳動物のオーソログ遺伝子を含むゲノムＤＮＡを取得する。該ゲノムＤＮＡには、オーソログをコードする領域およびイントロンの他に、オーソログをコードする領域よりも５’側および３’側の領域も含む必要がある。オーソログをコードする領域よりも５’側および３’側の領域は、５００ｂｐ以上、より好ましくは１ｋｂｐ以上、さらに好ましくは３ｋｂｐ以上あるのが好ましい。
【０１０７】
オーソログ遺伝子を含むゲノムＤＮＡを調製する方法としては、該非ヒト哺乳動物のゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、プラークハイブリダイゼーションあるいはコロニーハイブリダイゼーションにより、該遺伝子を含むゲノムＤＮＡクローンを単離する方法があげられる。
ゲノムＤＮＡライブラリーは、該非ヒト哺乳動物の細胞や組織からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素で部分的に切断した後、適当なベクターに挿入し、ベクターに応じたＥ．　ｃｏｌｉ等の適当な宿主に導入することにより作製することができる。ゲノムＤＮＡの調製およびゲノムＤＮＡライブラリーは、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法により作製することができる。ベクターとしては、λ　ＥＭＢＬ３（ストラタジーン社製）、λ　ＤＡＳＨ　ＩＩ（ストラタジーン社製）、λ　ＦＩＸ　ＩＩ（ストラタジーン社製）等のλファージベクター、ＢｅｌｏＢＡＣＩＩ等の細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター、ｐＡｄ１０ｓａｃＢＩＩ等のバクテリオファージＰ１ベクター、ｐＣＹＰＡＣ１等のＰ１人工染色体（ＰＡＣ）ベクター、ＳｕｐｅｒＣｏｓ　Ｉ（ストラタジーン社製）等のコスミドベクター等があげられる。
【０１０８】
プラークハイブリダイゼーションあるいはコロニーハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、該非ヒト哺乳動物の置換する７回膜貫通型受容体のゲノム遺伝子の部分断片、該受容体のｃＤＮＡの部分断片を標識したものを用いることができる。これらの部分断片は、該非ヒト哺乳動物の該受容体遺伝子のゲノム配列またはｃＤＮＡの配列を塩基配列データベースから検索し、この塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより取得することができる。
【０１０９】
プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションおよびプローブの標識と調製は、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法により行なうことができる。
また、該非ヒト哺乳動物の該受容体遺伝子のゲノム配列が塩基配列データベースの検索により得られる場合は、増幅するゲノム配列の領域を適当に選択し、この領域の５’端２０〜４０ｂｐの配列を３’端に含むＤＮＡおよび、この領域の３’端２０〜４０ｂｐの配列と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡを作製し、このＤＮＡをプライマーとし、該非ヒト哺乳動物のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、該非ヒト哺乳動物の該受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離することができる。
【０１１０】
また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）やユニバーサル・ゲノムウォーカー・キット（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ　Ｋｉｔ、クロンテック社製）などのキットを用いることによって、該非ヒト哺乳動物の７回膜貫通型受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離することもできる。
上記の方法で得られる非ヒト哺乳動物の７回膜貫通型受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡとして、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡである、配列番号１０で示される塩基配列を含むマウスゲノムＤＮＡをあげることができる。
【０１１１】
（３）キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの両末端に、該受容体の非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子のゲノム配列の５’非コード領域および３’非コード領域を付加したＤＮＡの作製
相同組換えに必要な、キメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの受容体をコードする領域（開始コドン〜終止コドンの領域）の５’端に、該受容体の非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子のゲノム配列の開始コドンより５’側の適当な長さの非コード領域を付加し、３’端に該ゲノム配列の終止コドンより３’側の適当な長さの非コード領域を付加したＤＮＡは、以下のようにして取得できる。付加する非コード領域の長さは、３’側、５’側とも５００ｂｐ以上であり、１ｋｂｐ以上が好ましく、３ｋｂｐ以上がより好ましい。
【０１１２】
１．（３）に記載の方法に準じて、２．（１）で取得したヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡおよび２．（２）で取得した非ヒト哺乳動物のオーソログ遺伝子からキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを作製する。その際に、Ｎ末端またはＣ末端を含む領域をコードするＤＮＡ断片を、非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子を含むゲノムＤＮＡを鋳型にして取得する場合は、片方のプライマーを該ゲノムＤＮＡの非コード領域の塩基配列に基づいた配列にすることにより、キメラ受容体のＮ末端またはＣ末端を含む領域をコードするＤＮＡ断片の末端に、非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子のゲノム配列の５’非コード領域または３’非コード領域を付加することができる。
【０１１３】
１．（３）に記載した方法に準じてキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを作製する際に、Ｎ末端またはＣ末端を含む領域をコードするＤＮＡ断片を、ヒトの該受容体をコードするＤＮＡを鋳型にして取得する場合は、（ａ）非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子のゲノム配列の、開始コドンより５’側にある適当な制限酵素サイトＸよりもさらに５’側の非コード領域２０〜４０ｂｐの配列を有するＤＮＡ、（ｂ）ヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの開始コドンから開始コドン近傍の制限酵素サイトＡまでの配列と相補的な配列の３’端に、非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子のゲノム配列の開始コドン直前までの非コード領域２０〜４０ｂｐの配列と相補的な配列を付加したＤＮＡ、（ｃ）ヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの終止コドン近傍の制限酵素サイトＢから終止コドンまでの配列の３’端に、非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子のゲノム配列の終止コドン直後の非コード領域２０〜４０ｂｐの配列を付加したＤＮＡ、（ｄ）非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子のゲノム配列の、終止コドンより３’側にある適当な制限酵素サイトＹよりもさらに３’側の非コード領域２０〜４０ｂｐの配列と相補的な配列を有するＤＮＡを作製する。（ａ）と（ｂ）を１組のプライマー、（ｃ）と（ｄ）を１組のプライマーとして、それぞれ２．（１）で取得した非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子を含むゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行なう。（ａ）と（ｂ）のプライマーを用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡを、ヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの開始コドンの近傍にある制限酵素サイトＡおよび５’側非コード領域中の制限酵素サイトＸで切断し、（ｃ）と（ｄ）のプライマーを用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡを、ヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの終止コドンの近傍にある制限酵素サイトＢおよび３’側非コード領域中の制限酵素サイトＹで切断する。これらの断片と、（２）で得られた非ヒト哺乳動物の７回膜貫通型受容体遺伝子のゲノム配列を５’側非コード領域中の制限酵素サイトＸおよびＸよりさらに５’側にある適当な制限酵素サイトＷで切断した断片、および非ヒト哺乳動物の７回膜貫通型受容体遺伝子のゲノム配列を３’側非コード領域中の制限酵素サイトＹおよびＹよりさらに３’側にある適当な制限酵素サイトＺで切断した断片とを連結する。
【０１１４】
上記で得られた、末端に非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子のゲノム配列の５’非コード領域または３’非コード領域が付加した、キメラ受容体のＮ末端またはＣ末端を含む領域をコードするＤＮＡ断片を、１．（３）に記載した方法に準じて作製したキメラ受容体をコードするＤＮＡの各部分断片と制限酵素サイトを利用して連結する。
【０１１５】
（６）ターゲットベクターの作製とＥＳ細胞への導入
非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ　（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８　ジーンターゲッティング，　ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。ターゲットベクターは、（４）または（５）で作製した、ヒト７回膜貫通型受容体またはキメラ７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡの両末端に、該受容体の非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子を含むゲノム配列の５’非コード領域、３’非コード領域を付加したＤＮＡ（以下、相同組換え用ＤＮＡとも称する）、相同組換え体の選別に必要な遺伝子、およびＥ．　ｃｏｌｉを用いたベクターの調製に必要なＥ．　ｃｏｌｉで自律複製可能な複製開始点および薬剤耐性遺伝子を有する。相同組換え体の選別に必要な遺伝子としては、ポジティブ選択（選別に用いた遺伝子を含む組換え体を選別する方法）に用いる、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ネガティブ選択（選別に用いた遺伝子を含まない組換え体を選別する方法）に用いるジフテリアトキシン（ＤＴ）遺伝子等をあげることができる。ポジティブ選択に用いる遺伝子は相同組換え用ＤＮＡの非コード領域内に挿入し、ネガティブ選択に用いる遺伝子は相同組換え用ＤＮＡとは別の位置に挿入する。
【０１１６】
ポジティブ選択に用いる遺伝子は、該遺伝子の発現に必要なプロモーターに連結してもよいし、プロモーターに連結せず、相同組換えが起きた場合に、ＥＳ細胞の染色体上の該受容体のオーソログのプロモーターにより発現させるようにしてもよい。ポジティブ選択に用いる遺伝子の両端に２つのｌｏｘＰ配列を付加して挿入すると、相同組換え体の選別を行なった後に、相同組換え体にＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクターを導入することにより、相同組換え体の染色体からポジティブ選択に用いる遺伝子を除去することができる。
【０１１７】
具体的なターゲットベクターとしては、ｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２（ＷＯ　０１／３３９５７）に、相同組換え用ＤＮＡおよびＤＴ遺伝子の発現ユニットを挿入したベクター、例えば、ｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２にマウスＡ３受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡの非コード領域とヒトＡ３受容体ｃＤＮＡからなる相同組換え用ＤＮＡおよびＤＴ遺伝子の発現ユニットを挿入したｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２、ｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２にマウスＡ３受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡの非コード領域とヒトとマウスのキメラＡ３受容体をコードするＤＮＡからなる相同組換え用ＤＮＡおよびＤＴ遺伝子の発現ユニットを挿入したｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃＡ３Ｒ−ａｒｍ２をあげることができる。
【０１１８】
ＥＳ細胞へのターゲットベクターの導入には、公知の遺伝子導入の手法、例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウイルスベクター法等を用いることができる。導入されるターゲットベクターは、環状、直鎖状いずれの形状でも用いることができるが、相同組換え用ＤＮＡおよび相同組換え体の選別に必要な遺伝子を破壊しない形で直線化し導入することが好ましい。
【０１１９】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８　ジーンターゲッティング，　ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。例えば、ｈｐｒｔ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ｈｐｒｔ遺伝子を欠損したＥＳ細胞に導入後、ＥＳ細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、ｈｐｒｔ遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入したＥＳ細胞をＧ４１８を含む培地で培養し、Ｇ４１８耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ＤＴ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入したＥＳ細胞を培養し、生育してきた株を選別する（相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組換え体は、ＤＴ遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、ＤＴの毒性により生育できない）ことにより、ＤＴ遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第３版）やＰＣＲ等があげられる。
【０１２０】
（７）受精卵へのＥＳ細胞の取り込みと非ヒトトランスジェニック動物の作製
受精卵へのＥＳ細胞の取り込みと、受精卵の非ヒト哺乳動物への移植は、１．（５）（ｉｉ）に記載の方法により行なうことができる。
【０１２１】
得られた仔から１．（５）（ｉｉ）に記載の方法により、全身の細胞の相同染色体の片方に相同組換えによる遺伝子置換を有するヘテロ接合体を得ることができる。さらにその個体の雄雌どうしを交配することにより相同染色体の双方に相同組換えによる遺伝子置換を有するホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。
【０１２２】
このようにして得られたホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、導入した遺伝子がコードするヒトまたはキメラ７回膜貫通型受容体を発現し、自己が持っていたオーソログは発現しないトランスジェニック非ヒト哺乳動物である。このホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、（１）の方法で得られるトランスジェニック非ヒト哺乳動物よりも、４．および５．に後述する試験物質の薬理評価に用いる非ヒト哺乳動物として、（ａ）非ヒト哺乳動物が本来発現している７回膜貫通型受容体のオーソログを発現していないので、薬理評価に用いる場合に該オーソログを介した薬理効果を考慮する必要がない、（ｂ）外来遺伝子の導入部位に存在する遺伝子の破壊あるいは導入遺伝子による導入部位周辺の遺伝子の活性化等の副次的な表現形の変化がおきる可能性がほとんどない、等の点で好ましい。
【０１２３】
３．目的とした遺伝子改変を施した細胞の核を用いたクローン個体の作製方法を用いた、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、文献に記載されたクローンヒツジ（Ｉ．　Ｗｉｌｍｕｔら；　Ｎａｔｕｒｅ，　３８５，　８１０，　１９９７）、クローンウシ（Ｊ．　Ｂ．　Ｃｉｂｅｌｌｉら；　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８０，　１２５６，　１９９８、入谷明；　蛋白核酸酵素，　４４，　８９２，　１９９９）、クローンヤギ（Ａ．　Ｂａｇｕｉｓｉら；　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１７，　４５６，　１９９９）、クローンマウス（Ｔ．　Ｗａｋａｙａｍａら；　Ｎａｔｕｒｅ，　３９４，　３６９，　１９９８、Ｔ．　Ｗａｋａｙａｍａら；　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　２２，　１２７，　１９９９）の作製方法を用い、例えば以下のように作製することができる。
【０１２４】
上記１．あるいは２．に記載した方法を用い、非ヒト哺乳動物（好ましくは、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウシなど）の任意の細胞の染色体上に、キメラまたはヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を導入する。得られた細胞の核を初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）する。
【０１２５】
初期化した細胞の核を除核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に注入することによって発生を開始させる。
発生を開始した卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって導入した遺伝子を発現する、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が得られる。また、２．に記載の方法で、遺伝子置換を行なった細胞の核を用いて得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、通常相同染色体の片方にキメラまたはヒト７回膜貫通型受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子が導入されたヘテロ接合体なので、得られたヘテロ接合体同士を交配することにより、自己のもつ該受容体のオーソログは発現せず、キメラまたはヒト７回膜貫通型受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。このホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物も、２．に記載の方法で得られるホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同様の点で、薬理評価に用いる非ヒト哺乳動物として、（１）の方法で得られるトランスジェニック非ヒト哺乳動物よりも好ましい。
【０１２６】
細胞の核を初期化する方法は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物がヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合は、外来性遺伝子を導入した細胞を５〜３０％、好ましくは１０％のＦＣＳを含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、好ましくは０．５％のＦＣＳを含む貧栄養培地で培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化することが好ましい。非ヒト哺乳動物がマウスなどの場合は、同種の非ヒト哺乳動物の除核した未受精卵に、外来性遺伝子を導入した細胞の核を注入し数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することが好ましい。
【０１２７】
初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物がヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合は、細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の非ヒト哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることが好ましい。非ヒト哺乳動物がマウスなどの場合は、外来性遺伝子を導入した細胞の核を注入した未受精卵を、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激し細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることが好ましい。
【０１２８】
４．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いた試験物質の薬理評価方法
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に試験物質、例えば、７回膜貫通型受容体に選択的に作用するアゴニストまたはアンタゴニスト等を投与し、試験物質を投与しない該動物と比較して、該動物の血圧、呼吸数、体重等の種々の身体的パラメーターの測定、外見や行動の観察、病理組織学的検討等の薬理作用を調べることにより、該試験物質の薬理評価を行なうことができる。
【０１２９】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に各種の疾患を誘発させた病態モデル動物を作製し、該病態モデル動物に試験物質、例えば、７回膜貫通型受容体に選択的に作用するアゴニストまたはアンタゴニスト等を投与し、該病態モデル動物の血圧、呼吸数、体重等の種々の身体的パラメーターの測定、病態や、外見、行動の観察、病理組織学的検討等を、試験物質を投与しない該病態モデル動物と比較して行なうことにより、該試験物質の該疾患に対する有効性および副作用等の薬理評価を行なうことができる。また、この評価に基づき、該疾患の治療薬として好ましい物質を選択することができる。特に、ヒトの７回膜貫通型受容体に対する結合量やアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性が、該受容体の非哺乳動物のオーソログと比較して高いヒト受容体に特異的な薬物では、通常の病態モデル動物を用いた薬理評価は困難であったが、本発明のトランスジェニック動物を用いることにより、薬理評価を行なうことが可能となる。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に誘発させる疾患としては、心疾患（例えば、急性心不全、慢性心不全、心筋炎など）、呼吸器系疾患、関節疾患（例えば、関節リュウマチ、変形性関節症など）、腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症など）、動脈硬化症、乾癬症、高脂血症、アレルギー疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎など）、骨疾患（例えば、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、低カルシュウム血症など）、血液疾患、脳血管性傷害、外傷性脳障害、感染症、痴呆症、癌、糖尿病、肝疾患、皮膚疾患、神経変性疾患および慢性炎症性疾患などがあげられる。病態モデル動物の作製は、「マニュアル疾患モデルマウス」〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　３１　臨時増刊号，　中山書店　（１９９４）〕、「図説・薬理学のための病態動物モデル」〔西村書店　（１９８４）〕、「関節炎モデル動物」〔医歯薬出版　（１９８５）〕、「神経・筋疾患モデル動物」〔医歯薬出版　（１９８２）〕、「活性酸素と病態　疾患モデルからベッドサイドへ」〔学会出版センター　（１９９２）〕等に記載の方法を用いることができる。
【０１３０】
本薬理評価方法および５．および８．に後述する薬理評価方法に供する試験物質としては、Ａ３アデノシン受容体に対するアンタゴニスト（ＷＯ９８／１５５５５；　ＷＯ００／６４８９４；　ＷＯ００／０２８６１；　ＷＯ００／１０３９１；　ＷＯ００／１５２３１；　ＷＯ９９／６５９１２；　ＷＯ９９／６４４１８；　ＷＯ９９／５１６０６；　ＷＯ９７／３３８７９；　ＷＯ９７／２７１７７；　特開平１１−１９３２８１；　特開平９−２９１０８９；　ＵＳ５４４１８８３；　ＵＳ５６４６１５６；　ＵＳ５５７３７７２；　ＧＢ２３２０４３０）、５−ＨＴ１Ｂセロトニン受容体に対するアンタゴニスト（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　１６４，　１９９４；　Ｎａｔｕｒｅ，　３６０，　１６１，　１９９２；　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，　６０，　３８０，　１９９３）、ＮＫ１タキキニン受容体に対するＣＰ　９６３４５やＲＰ　６７５８０等のアンタゴニスト（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　２６２，　１９９４；　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２５１，　４３５，１９９１；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８８，　１０２０８，　１９９１；　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６７，２５６６８，　１９９２；　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６８，　２３１９，　１９９３）、Ｂ２ブラジキニン受容体に対するアゴニストあるいはアンタゴニスト（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　６８，　１９９４；　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１８７，　１３０６，　１９９２）、β３アドレナリン受容体に対するＣＧＰ−１２１７７などのアゴニスト（Ｄｉａｂｅｔｅｓ．，　４７，　１４６４，　１９９８）、カルシトニン受容体に対するアゴニスト（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　７４，　１９９４）、Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体に対するＡＦ−ＤＸ１１６やピレンゼピンなどのアンタゴニスト（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　１１，　１９９４；　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６６，　１７３８２，　１９９１）、α２Ａアドレナリン受容体に対するヨヒンビンやラウウォルシンなどのアンタゴニスト（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　４２，　１９９４；　Ｍｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　４２，　１６，　１９９２）、β１アドレナリン受容体に対するＣＧＰ　２０７１２Ａやアテノロールなどのアンタゴニスト（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　４７，１９９４；　Ｍｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　１７，　１，　１９８０）、ＣＣＫＢコレシストキニン受容体に対するＬ−３６５２６０やＬ−３６４７１８などのアンタゴニスト（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　９２，　１９９４；　Ｎａｔｕｒｅ，　３６２，　３４８，　１９９３）、ニューロテンシン受容体に対するゼノプシンや［Ｔｒｐ１１］ニューロテンシンなどのアナログ化合物（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９，　１９９４；　Ｂｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　６９，　６８９，　１９８０）、ＤＰプロスタノイド受容体に対するプロスタグランジンＤ２アナログ化合物（Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　２４２，　１９９４；　ＩＵＰＨＡＲ　９ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，　Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｒｅｓｓ，　２９３，　１９８４）などをあげることができる。
【０１３１】
５．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られる細胞を用いた試験物質の薬理評価方法
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られる種々の細胞と、試験物質とを接触させ、試験物質非存在下での細胞と比較して、細胞内のＣａ２＋濃度の上昇等の種々の細胞の応答や細胞の形態の変化等の薬理作用を調べることにより、試験物質の該細胞に対する薬理評価を行なうことができる。
【０１３２】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られるＥＳ細胞を分化誘導することにより、さまざまな種類の細胞を得ることができる。分化の誘導方法としては、ＥＳ細胞を同種同系統の動物の皮下に移植することにより、様々な組織が混じりあった奇形腫瘍（テラトーマ）を誘導する方法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）、適当な条件でインビトロ培養することにより、内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、血液細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイトに分化誘導する方法（Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｆｅｒｔｉｌ．　Ｄｅｖ．，　１０，　３１，　１９９８）をあげることができる。この分化後の細胞と、試験物質とを接触させ、試験物質非存在下での細胞と比較して、細胞内のＣａ２＋濃度の上昇等の種々の細胞の応答や細胞の形態の変化等の薬理作用を調べることにより、試験物質の該細胞に対する薬理評価を行なうことができる。これらの方法によって、ヒトの生体から摘出しにくい細胞や少数しか存在しない細胞などに対する試験物質の薬理評価を行うことができる。
【０１３３】
６．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞、卵、精子または核を用いた遺伝子改変動物の作製
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られるＥＳ細胞、卵、精子または核を用いて、１．〜３．に記載の方法によりキメラ７回膜貫通型受容体を発現し、かつさらなる染色体上の遺伝子の改変を行った遺伝子改変非ヒト哺乳動物を得ることができる。特に、その遺伝子の機能を破壊することである病態が惹起されることが公知になっている遺伝子を２．に記載した相同組換えの手法を利用して欠損させたノックアウト動物や、該遺伝子の機能を阻害するドミナントネガティブ体の遺伝子を１．または３．に記載の方法で導入し発現させたトランスジェニック動物は、病態モデル動物として有用である。
【０１３４】
７．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の動物との交配による遺伝子改変動物の作製と作製された該遺伝子改変動物の利用
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の動物（例えば、ヒト疾患モデル動物）とを交配させることにより、キメラ７回膜貫通型受容体を発現し、かつある表現系（例えば、ヒト病態と類似の症状）を示す遺伝子改変哺乳動物を得ることができる。交配する動物が、ヒト疾患モデル動物であれば、キメラ７回膜貫通型受容体を発現し、かつヒト病態と類似の症状を表現系として示す病態モデル動物が得られる。交配の方法としては、自然交配以外に体外受精の方法があげられる。疾患モデル動物としては、先天性および後天性を疾患を問わずいかなる疾患モデル動物も用いることができる。例えば後天性の病態モデル動物は、「マニュアル疾患モデルマウス」〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　３１　臨時増刊号，　中山書店　（１９９４）〕、「図説・薬理学のための病態動物モデル」〔西村書店　（１９８４）〕、「関節炎モデル動物」〔医歯薬出版　（１９８５）〕、「神経・筋疾患モデル動物」〔医歯薬出版　（１９８２）〕、「活性酸素と病態　疾患モデルからベッドサイドへ」〔学会出版センター　（１９９２）〕等に記載の方法により作製することができる。
【０１３５】
８．遺伝子改変動物を用いた試験物質の薬理評価方法
６および７に記載の方法で得られた遺伝子改変病態モデル動物に試験物質、例えば、７回膜貫通型受容体に作用するアゴニストまたはアンタゴニスト等を投与し、該病態モデル動物の血圧、呼吸数、体重等の種々の身体的パラメーターの測定、病態や、外見、行動の観察、病理組織学的検討等を、試験物質を投与しない該病態モデル動物と比較して行なうことにより、該試験物質の該疾患に対する有効性および副作用等の薬理評価を行なうことができる。また、この評価に基づき、該病態の治療薬として好ましい物質を選択することができる。特に、ヒトの７回膜貫通型受容体に対する結合量やアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性が、該受容体の非哺乳動物のオーソログと比較して高いヒト受容体に選択的な薬物では、通常の病態モデル動物を用いた薬理評価は困難であったが、上記の遺伝子改変病態モデル動物を用いることにより、薬理評価を行なうことが可能となる。
以下に、本発明の実施例を示す。
【０１３６】
【実施例】
実施例１　マウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの単離
（１）マウス脳由来ｃＤＮＡの合成
７週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウス（日本クレア社より購入）のオス３匹より脳を摘出し、ファーストトラック２．０ｍＲＮＡ分離キット（ＦａｓｔＴｒａｃｋ　２．０　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、インビトロジェン社製）を用い、添付マニュアルに従ってポリＡ＋　ＲＮＡを取得した。
取得したマウス脳由来ポリＡ＋　ＲＮＡ　２μｇより、ＰＣＲ−セレクトｃＤＮＡサブトラクション・キット（ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ　ｃＤＮＡ　Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、クロンテック社製）を用い、添付マニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。
【０１３７】
（２）ＰＣＲによるマウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの単離
（１）で合成したマウス脳由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、Ｚ．　Ｚｈａｏらの報告（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　５７，　１，　１９９９）に記載されている、マウスＡ３アデノシン受容体を含むマウスゲノム塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：　ＡＦ０６９７７８）から配列番号１で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマー、および配列番号２で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、マウス脳由来ｃＤＮＡを鋳型として、モレキュラークローニング第３版に記載の方法に従ってＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを１０サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、５４℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを１５サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動し、マウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＩＩ　Ｋｉｔ、ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１３８】
（３）マウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＳ−ｍＡ３Ｒの構築
回収したマウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＨ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｈ、宝酒造社製）に溶解し、６０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、マウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１３９】
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）２μｇを４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行なったのち、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片を５０μＬのアルカリホスファターゼ用バッファー（宝酒造社製）に溶解し、４０単位のウシ小腸由来のアルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を加えて５０℃で３０分間反応を行ない、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により両末端が脱リン酸化された約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１４０】
上記で得た、マウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ断片（約１ｋｂｐ）５０ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）７０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解しライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬ（宝酒造社製）を加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（東洋紡績社製）をコーエン（Ｃｏｈｅｎ）らの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　６９，　２１１０，　１９７２）によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）株を得た。この形質転換株からバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）らの方法（Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　７，　１５１３，　１９７９）に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをｐＢＳ−ｍＡ３Ｒと称す。
【０１４１】
ＤＮＡシークエンサー３７７（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、該プラスミドｐＢＳ−ｍＡ３Ｒに含まれるマウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。その配列を配列番号３として示した。なお、ｐＢＳ−ｍＡ３Ｒに含まれるマウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡのストップコドンの配列は、プライマーの配列に由来するためＴＡＡでなくＴＡＧであるため、配列番号３に示した塩基配列中、ストップコドンの配列は実施例２で決定したマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列に基づいて訂正されている。配列番号３で示される塩基配列と、公知のマウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：　ＡＦ０６９７７８）をソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ　７．３（ソフトウエア開発社製）を用いて比較した結果、塩基配列が１５塩基異なっており（図１）、塩基配列から推定されるマウスＡ３アデノシン受容体のアミノ酸配列（配列番号４）においては７アミノ酸が異なっていた（図２）。
【０１４２】
実施例２　マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡの単離および解析
（１）マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡのスクリーニング
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の配列を有するクローンをＰＣＲで判定するためのＰＣＲプライマーを作製した。すなわち、Ｚ．　Ｚｈａｏらの報告（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　５７，　１，１９９９）に記載されているマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：　ＡＦ０６９７７８）より、エクソン１の一部を含む領域を増幅する、配列番号５で示される塩基配列を有する２３ｍｅｒのプライマーと配列番号６で示される塩基配列を有する２３ｍｅｒのプライマーの組み合わせ（マウスゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、配列番号１１の配列の６３５〜９９３番目に相当する約３６０ｂｐの増幅バンドが検出される）、および配列番号７で示される塩基配列を有する２０ｍｅｒのプライマーと配列番号８で示される塩基配列を有する２０ｍｅｒのプライマーの組み合わせ（マウスゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、配列番号１１の配列の５２７〜１０８８番目に相当する約５６０ｂｐの増幅バンドが検出される）を選択して作製した。各プライマーを倉敷紡績社のゲノムＤＮＡライブラリーＰＣＲスクリーニングサービスへ送付し、これらのプライマーを用いたＰＣＲによるマウスゲノムＤＮＡライブラリー（ベクターｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩ）からのマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のスクリーニングを依頼した。その結果、Ａ３アデノシン受容体遺伝子の配列を含むマウスゲノムＤＮＡが導入されているｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩプラスミドを含むＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ１０Ｂ株の形質転換体のクローンを得ることが出来た。
【０１４３】
（２）マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡの単離
上記のＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ１０Ｂ株クローンより、バーンボイムらの方法に従ってプラスミドを単離した。該プラスミドをｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩと名づけた。次に以下のようにして、得られたプラスミドを各制限酵素で処理し、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子配列を含むラジオアイソトープ標識ＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった。
【０１４４】
まず、上記で単離したｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩプラスミド１００ｎｇをＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＡｃｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩの各制限酵素（宝酒造社製）を１２単位ずつ用い、添付マニュアルに従って３７℃で６時間消化反応を行なうことにより完全に切断したのち、パルスフィールド装置〔バイオ・ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社製〕を用いたアガロースゲル電気泳動を行ない（分離断片サイズ：５−１５０ｋｂｐ用プログラムを使用）、さらにＳｏｕｔｈｅｒｎの方法（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　９８，　５０３，　１９７５）でナイロンフィルター〔ハイボンド（ＨｙｂｏｎｄＴＭ）−Ｎ＋；アマシャム・バイオサイエンス社製〕へ移した。次に、サザンハイブリダイゼーションに用いるプローブを作製するため、マウスゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行なった。すなわち、エクソン１中のマウスＡ３アデノシン受容体をコードする領域を含むＤＮＡを増幅する配列番号７で示される塩基配列を有する２０ｍｅｒのプライマーと配列番号８で示される塩基配列を有する２０ｍｅｒのプライマー、エクソン２中のマウスＡ３アデノシン受容体をコードする領域を含むＤＮＡを増幅する配列番号９で示される塩基配列を有する２３ｍｅｒのプライマーと配列番号１０で示される塩基配列を有する２３ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、上記のｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩプラスミドを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを１０サイクル反復した後、さらに９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを２０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動し、エクソン１中のマウスＡ３アデノシン受容体をコードする領域を含む約５６０ｂｐのＤＮＡ断片、およびエクソン２中のマウスＡ３アデノシン受容体をコードする領域を含む約６００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。これらＤＮＡ断片は、市販のＴ７クイックプライム・キット（Ｔ７　ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅ　Ｋｉｔ、アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ社製）で標識した。
【０１４５】
この標識した各プローブと上記で作製したフィルターを一晩ハイブリダイズさせ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する２×ＳＳＰＥ（３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を用いて６５℃で１５分間の洗浄を３回、０．１％ＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＰＥ（３０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨ２ＰＯ４、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を用いて６５℃で１５分間の洗浄を２回行ない、Ｘ線フィルム〔コダック・サイエンティフィック・イメージング・フィルム（Ｋｏｄａｋ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｆｉｌｍ）Ｘ−ＯＭＡＴＴＭ　ＡＲ、コダック社製〕と重ね合わせて−８０℃で一晩感光させ、翌日現像した。
【０１４６】
このハイブリダイゼーションの結果、ｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩプラスミドをＥｃｏＲＩで切断処理することにより、エクソン１を含む約９ｋｂｐのＤＮＡ断片とエクソン２を含む約６．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が生じることが示された。
続いて、上記のｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩプラスミド５μｇを１００μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、６０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動した後、エクソン１を含む約９ｋｂｐのＤＮＡ断片と、エクソン２を含む約６．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、添付マニュアルに従ってＤＮＡ断片を回収した。
【０１４７】
さらに、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）１μｇを５０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡを５０μＬのアルカリホスファターゼ用バッファーに溶解し、４０単位のウシ小腸由来のアルカリホスファターゼを加えて５０℃で３時間反応を行なった。フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により脱リン酸化された約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１４８】
ｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩプラスミド由来のＥｃｏＲＩ断片であるマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１を含むマウスゲノムＤＮＡ断片（約９ｋｂｐ）１０ｎｇおよびマウスＡ３アデノシン受容体のエクソン２を含むマウスゲノムＤＮＡ断片（約６．５ｋｂｐ）１０ｎｇを、各々ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）４０ｎｇと一緒に１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で３時間結合反応を行なった。
【０１４９】
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをｐＢＳ−ｅｘ１及びｐＢＳ−ｅｘ２と称す。
【０１５０】
（３）マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡの解析
ｐＢＳ−ｅｘ１およびｐＢＳ−ｅｘ２各１μｇをＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＡｃｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩの各制限酵素（宝酒造社製）を１２単位ずつ用い、添付マニュアルに従って３７℃で１６時間消化反応を行なうことにより完全に切断したのち、アガロースゲル電気泳動を行なった。その結果から、Ａ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１およびエクソン２を含む約１５．５ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡに存在する、各制限酵素に対する認識配列の位置を決定した。図３にエクソン１、図４にエクソン２の各制限酵素マップを示した。
次に、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、エクソン１より上流約３００ｂｐの領域から、エクソン２より下流約１．１ｋｂｐの領域までの塩基配列を決定した（図５、配列番号１１）。
【０１５１】
実施例３　ヒトＡ３アデノシン受容体のｃＤＮＡの単離
（１）ヒト肝臓由来ｃＤＮＡの合成
クロンテック社より購入したヒト肝臓ポリＡ＋　ＲＮＡ４μｇを鋳型とし、第一鎖ｃＤＮＡ合成用スーパースクリプト・プレアンプリフィケーション・システム（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、インビトロジェン社製）を用い、添付マニュアルに従ってｃＤＮＡを取得した。
【０１５２】
（２）ＰＣＲによるヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの単離
続いて、取得したヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、Ｍ．　Ｒ．　Ａｔｋｉｎｓｏｎらの報告（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｒｅｓ．，　２９，　１，　１９９７）に記載されているヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むヒトゲノムＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ７７７２９およびＬ７７７３０）に基いて、配列番号１２で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマー、および配列番号１３で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを３０サイクル反復した。このＰＣＲ反応液を２μＬ用いて、上記と同方法で再度ＰＣＲを行なった後、このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動し、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１５３】
（３）ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒの構築
次に、回収したヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（約１ｋｂｐ）２５０ｎｇとプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ＤＮＡライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
【０１５４】
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列を確認した結果、公知のヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列と同じであった。配列番号１４に得られたヒトＡ３アデノシン受容体のｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号１５に該ｃＤＮＡがコードするヒトＡ３アデノシン受容体のアミノ酸配列を示した。以下、このプラスミドをｐＢＳ−ｈＡ３Ｒと称す。ｐＢＳ−ｈＡ３Ｒの構築工程を図６に示した。
【０１５５】
実施例４　マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換するためのターゲットベクターの構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１より約５ｋｂｐ上流のＳｍａＩサイトからエクソン２より下流のＨｉｎｃＩＩサイトまでの領域において、マウスＡ３アデノシン受容体をコードする領域およびイントロンを、キメラＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡをコードする領域に置換したＤＮＡ、およびマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２のＢａｍＨＩサイトからエクソン２より下流のＡｐａＩサイトまでの領域のＤＮＡを含むターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２を、以下に示す（１）〜（２４）の工程で構築した。実施例４から実施例９におけるキメラＡ３アデノシン受容体とは、ヒトＡ３アデノシン受容体の細胞内領域のアミノ酸配列（配列番号１５の３８〜４７番目、１０７〜１２６番目、１９９〜２３０番目および２８５〜３１８番目に相当する）をマウスＡ３アデノシン受容体の細胞内領域のアミノ酸配列（配列番号４の３９〜４８番目、１０８〜１２７番目、２００〜２３１番目および２８６〜３１９番目に相当する）に置換したアミノ酸配列からなるＡ３アデノシン受容体である。配列番号３３にキメラＡ３アデノシン受容体のアミノ酸配列を、配列番号３２にキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの塩基配列を示した。
【０１５６】
（１）プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１の構築
キメラＡ３アデノシン受容体の１９０〜２２５番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の５６８〜６７８番目までの配列）を含むプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１を以下のようにして構築した（図７参照）。キメラＡ３アデノシン受容体の１９０〜２２５番目のアミノ酸配列は、マウスＡ３アデノシン受容体の１９１〜２２６番目のアミノ酸配列のうち、１９６番目のＶａｌがＡｌａ（ヒトＡ３アデノシン受容体の１９５番目に相当する）に置換されている。
【０１５７】
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の配列に基づいて、配列番号１６で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマー、配列番号１７で示される塩基配列を有する２７ｍｅｒのプライマーを合成した。なお、配列番号１７で示される塩基配列は、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子に基づく配列を一部置換して、ヒトＡ３アデノシン受容体に特異的な１９５番目のＡｌａ残基をコードするように設計した。これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｅｘ２を鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、２５単位のＳｐｅＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動して約１１０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１５８】
２．６μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を２０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し５単位のＳｐｅＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動して約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１５９】
上記で得た、約１１０ｂｐのＤＮＡ断片１０ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃｈｉｍｅｒａ−１と称す。
【０１６０】
（２）プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−２の構築
キメラＡ３アデノシン受容体の１２７〜１９０番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の３７９〜５７０番目までの配列）を含むプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−２を以下のようにして構築した（図８参照）。キメラＡ３アデノシン受容体の１２７〜１９０番目のアミノ酸配列は、ヒトＡ３アデノシン受容体の１２７〜１９０番目のアミノ酸配列と同一である。
【０１６１】
ヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子のｃＤＮＡの配列に基づいて配列番号１８で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマー、および配列番号１９で示される塩基配列を有する２９ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、０．０１％のＢＳＡと３７．５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。２０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、１５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動して、約２００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１６２】
２．６μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を２０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し０．０１％のＢＳＡと７．５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７．５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動して、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１６３】
上記で得た、約２００ｂｐのＤＮＡ断片１０ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃｈｉｍｅｒａ−２と称す。
【０１６４】
（３）プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−３の構築
キメラＡ３アデノシン受容体の４４〜１２７番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の１３０〜３８１番目までの配列）を含むプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−３を以下のようにして構築した（図９参照）。キメラＡ３アデノシン受容体の４４〜１２７番目のアミノ酸配列は、ヒトＡ３アデノシン受容体の４４〜１２７番目のアミノ酸配列のうち、４４番目のＧｌｎがＡｒｇに、１１９番目のＬｙｓがＡｒｇに、１２０番目のＡｒｇがＴｈｒに、１２４番目のＨｉｓがＧｌｎに置換されている。
【０１６５】
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列に基づいて、配列番号２０で示される塩基配列を有する３５ｍｅｒのプライマー、および配列番号２１で示される塩基配列を有する３４ｍｅｒのプライマーを合成した。なお、配列番号２０で示される塩基配列は、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡに基づく配列を一部置換して、マウスＡ３アデノシン受容体に特異的な１１９番目のＡｒｇ、１２０番目のＴｈｒ、１２４番目のＧｌｎをコードするように、配列番号２１で示される塩基配列は、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡに基づく配列を一部置換して、マウスＡ３アデノシン受容体に特異的な４４番目のＡｒｇをコードするように、それぞれ設計した。これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収したのち、５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、２５単位のＳｐｅＩと３７．５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をアガロースゲル電気泳動して約２５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１６６】
２μｇのプラスミドＲｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（−）を、５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し２０単位のＳｐｅＩと３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なったのち、該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片ををアガロースゲル電気泳動して、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１６７】
上記で得た、約２５０ｂｐのＤＮＡ断片８０ｎｇとプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒ由来のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃｈｉｍｅｒａ−３と称す。
【０１６８】
（４）プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−４の構築
キメラＡ３アデノシン受容体の１７〜４５番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の４９〜１３５番目までの配列）を含むプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−４を以下のようにして構築した（図１０参照）。キメラＡ３アデノシン受容体の１７〜４５番目のアミノ酸配列は、ヒトＡ３アデノシン受容体の１７〜４５番目のアミノ酸配列のうち、４２番目のＡｒｇがＴｈｒに、４４番目のＧｌｎがＡｒｇに置換されている。
【０１６９】
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列に基づいて、配列番号２２で示される塩基配列を有する３４ｍｅｒのプライマー、および配列番号２３で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒのプライマーを合成した。なお、配列番号２２で示される塩基配列は、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡに基づく配列を一部置換して、マウスＡ３アデノシン受容体に特異的な４２番目のＴｈｒ、４４番目のＡｒｇをコードするように設計した。
【０１７０】
これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、０．０１％のＢＳＡと３７．５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。この反応液をアガロースゲル電気泳動して、約１００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１７１】
２．６μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を、５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し０．０１％のＢＳＡと７．５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なったのち、該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１７２】
上記で得た、約１００ｂｐのＤＮＡ断片１０ｎｇとプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒ由来のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃｈｉｍｅｒａ−４と称す。
【０１７３】
（５）プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１＋２の構築
キメラＡ３アデノシン受容体の１２７〜２２６番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の３７９〜６７８番目までの配列）を含むプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１＋２を以下のようにして構築した（図１１参照）。
【０１７４】
２．６μｇのプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１を、１００μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、３０単位のＥｃｏＲＩと２５単位のＳｐｅＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約１１０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１７５】
３μｇのプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−２を、１００μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３７．５単位のＢａｍＨＩと３７．５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約２００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１７６】
２．６μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を、２０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７．５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、６単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１７７】
上記で得た、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１由来のＤＮＡ断片（約１１０ｂｐ）１０ｎｇとプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−２由来のＤＮＡ断片（約２００ｂｐ）１０ｎｇ、およびプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃｈｉｍｅｒａ−１＋２と称す。
【０１７８】
（６）プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−３＋４の構築
キメラＡ３アデノシン受容体の１７〜１２７番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の４９〜３８１番目までの配列）を含むプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−３＋４を以下のようにして構築した（図１２参照）。
【０１７９】
１．２μｇのプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−３を、５０μＬのＮＥバッファー３（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）に溶解し、２４単位のＢｓｉＷＩを加えて５５℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約２５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１８０】
１μｇのプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−４を、５０μＬのＮＥバッファー３に溶解し、２４単位のＢｓｉＷＩを加えて５５℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１８１】
上記で得た、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−３由来のＤＮＡ断片（約２５０ｂｐ）１０ｎｇとプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−４由来のＢｓｉＷＩとＥｃｏＲＩ断片（約３．１ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃｈｉｍｅｒａ−３＋４と称す。
【０１８２】
（７）プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１＋２＋３＋４の構築
キメラＡ３アデノシン受容体の１７〜２２６番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の４９〜６７８番目までの配列）を含むプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１＋２＋３＋４を以下のようにして構築した（図１３参照）。
【０１８３】
３μｇのプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１＋２を、１００μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩと２０単位のＢｇｌＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１８４】
２．８μｇのプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−３＋４を、１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、６０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１８５】
上記で得た、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１＋２由来のＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）１０ｎｇと、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−３＋４由来のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ断片（約３．３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃｈｉｍｅｒａ−１＋２＋３＋４と称す。
【０１８６】
（８）プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１の構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより上流約３５０ｂｐのマウスゲノムＤＮＡ配列を有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１を以下のようにして構築した（図１４参照）。
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより上流３５０ｂｐのマウスゲノムＤＮＡ断片を得るため、プラスミドｐＢＳ−ｅｘ１を鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の塩基配列に基いて配列番号２４で示される塩基配列を有する２７ｍｅｒのプライマー、および配列番号２５で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｅｘ１を鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５２℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、６０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動して、約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１８７】
２．８μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１８８】
上記で得た、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより上流約３５０ｂｐのＤＮＡ断片５０ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｎ１と称す。
【０１８９】
（９）プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２の構築
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの開始コドンより下流約２００ｂｐの塩基配列を有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２を以下のようにして構築した（図１５参照）。
【０１９０】
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ配列の開始コドンより下流約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得るため、プラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列に基いて配列番号２６で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒのプライマー、および配列番号２７で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５２℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。
【０１９１】
このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、６０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動して、約２００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１９２】
２．８μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１９３】
上記で得た、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの開始コドンより下流約２００ｂｐのＤＮＡ断片５０ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｎ２と称す。
【０１９４】
（１０）プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ３の構築
プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１のマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより５’側の配列の下流に、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２由来のＤＮＡ断片（ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの開始コドンより下流約２００ｂｐのＤＮＡ断片）を導入した、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ３を以下のようにして構築した（図１６参照）。
【０１９５】
２．３μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２を、４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＳｐｈＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約２００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
１．６μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１を、４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＳｐｈＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１９６】
上記で得た、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片（約２００ｂｐ）１０ｎｇとプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片（約３．３５ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｎ３と称す。
【０１９７】
（１１）プラスミドｃＡ３Ｒ−Ｎの構築
キメラＡ３アデノシン受容体の１〜２２６番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の１〜６７８番目までの配列）の上流にマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより上流のマウスゲノム配列約３５０ｂｐを挿入した配列を含むプラスミドｃＡ３Ｒ−Ｎを以下のようにして構築した（図１７参照）。
【０１９８】
２．８μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ３を、１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、０．０１％のＢＳＡと５０単位のＮｃｏＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、５０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１９９】
２．４μｇのプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１＋２＋３＋４を、１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、０．０１％のＢＳＡと５０単位のＮｃｏＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、５０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２００】
上記で得た、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ３由来のＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片（約４００ｂｐ）８０ｎｇとプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１＋２＋３＋４由来のＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片（約３．６ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃＡ３Ｒ−Ｎと称す。
【０２０１】
（１２）プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ５の構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１よりも上流５ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡの配列を有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ５を以下のようにして構築した（図１８参照）。
３．３μｇのプラスミドｐＢＳ−ｅｘ１を、０．０１％のＢＳＡを含む２０μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、４単位のＳｍａＩと５単位のＳａｃＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なったのち、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２０２】
１．１μｇのプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを、５０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２０単位のＮｄｅＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ平滑化キット（宝酒造社製）を用い、回収したＤＮＡ断片の両末端を添付マニュアルに従って平滑化処理した。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なったのち、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２０３】
上記で得た、プラスミドｐＢＳ−ｅｘ１由来のＤＮＡ断片（約５ｋｂｐ）１μｇとプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒ由来のＮｄｅＩ（平滑末端処理済み）−ＳａｃＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｎ５と称す。
【０２０４】
（１３）プラスミドａｒｍ１＋ｃＡ３Ｒ−Ｎの構築
キメラＡ３アデノシン受容体の１〜２２６番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の１〜６７８番目までの配列）の上流にマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより上流のマウスゲノム配列約５．４ｋｂｐを挿入した配列を含むプラスミドａｒｍ１＋ｃＡ３Ｒ−Ｎを以下のようにして構築した（図１９参照）。
【０２０５】
４μｇのプラスミドｃＡ３Ｒ−Ｎを、５０μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し２０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２０６】
３．４μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ５を、５０μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し２０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２０７】
上記で得た、プラスミドｃＡ３Ｒ−Ｎ由来のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約１ｋｂｐ）１０ｎｇとプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ５由来のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約９ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをａｒｍ１＋ｃＡ３Ｒ−Ｎと称す。
【０２０８】
（１４）プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−５の構築
キメラＡ３アデノシン受容体の２２５〜２８４番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の６７３〜８５２番目までの配列）を含むプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−５を以下のようにして構築した（図２０参照）。キメラＡ３アデノシン受容体の２２５〜２８４番目のアミノ酸配列は、ヒトＡ３アデノシン受容体の２２５〜２８４番目のアミノ酸配列と同一である。
【０２０９】
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列に基づいて、配列番号２８で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマー、および配列番号２９で示される塩基配列を有する３０ｍｅｒのプライマーを合成した。これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、３７．５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。この反応液をアガロースゲル電気泳動して、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２１０】
２．６μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を、２０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７．５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２１１】
上記で得た、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片１２ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃｈｉｍｅｒａ−５と称す。
【０２１２】
（１５）プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−６の作製
キメラＡ３アデノシン受容体の２８２〜３１８番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の８４４〜９５７番目までの配列）およびマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の終止コドン以降の約３６０ｂｐの配列を含むプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−６を以下のようにして構築した（図２１参照）。キメラＡ３アデノシン受容体の２８２〜３１８番目のアミノ酸配列は、マウスＡ３アデノシン受容体の２８３〜３１９番目のアミノ酸配列のうち、２８５番目のＣｙｓがＴｙｒに置換されている。
【０２１３】
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の配列に基づいて、配列番号３０で示される塩基配列を有する３２ｍｅｒのプライマー、および配列番号３１で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマーを合成した。なお、配列番号３０で示される塩基配列は、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子に基づく配列を一部置換して、ヒトＡ３アデノシン受容体に特異的な２８４番目のＴｙｒをコードするように設計した。これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｅｘ２を鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、３７．５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。この反応液をアガロースゲル電気泳動して、約４７０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２１４】
２．６μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を、２０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し７．５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２１５】
上記で得た、約４７０ｂｐのＤＮＡ断片２４ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃｈｉｍｅｒａ−６と称す。
【０２１６】
（１６）プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−５＋６の構築
キメラＡ３アデノシン受容体の２２５〜３１８番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の６７３〜９５７番目までの配列）およびマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の終止コドン以降の約３６０ｂｐの配列を含むプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−５＋６を以下のようにして構築した（図２２参照）。
【０２１７】
２μｇのプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−５を、１００μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、３０単位のＥｃｏＲＩと２５単位のＭｌｕＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２１８】
２μｇのプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−６を、１００μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、３０単位のＥｃｏＲＩと２５単位のＭｌｕＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約３．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２１９】
上記で得た、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−５由来のＥｃｏＲＩ−ＭｌｕＩ断片（約１８０ｂｐ）１０ｎｇと、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−６由来のＥｃｏＲＩ−ＭｌｕＩ断片（約３．５ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃｈｉｍｅｒａ−５＋６と称す。
【０２２０】
（１７）プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１の構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２に存在するポリアデニル化シグナルを含む約１．８ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡを有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１を以下のようにして構築した（図２３参照）。
【０２２１】
５μｇのプラスミドｐＢＳ−ｅｘ２を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、３０単位のＰｓｔＩと３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なったのち、該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を蒸留水２０μＬに溶解し、アガロースゲル電気泳動後、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２２２】
２．８μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、３０単位のＰｓｔＩと３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２４時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。
上記で得た、Ａ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２に存在するポリアデニル化シグナルを含むマウスゲノムＤＮＡ断片（約１．８ｋｂｐ）１００ｎｇとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（約３ｋｂｐ）３０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
【０２２３】
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｃ１と称す。
【０２２４】
（１８）プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ２の構築
プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１からポリアデニル化シグナルより下流の配列を約１．６ｋｂｐ除き、かつその下流にＳａｃＩＩ認識配列を付加したプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ２を以下のようにして構築した（図２４参照）。
【０２２５】
２μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１を１００μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、５０単位のＨｉｎｃＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なったのち、該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、５０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を蒸留水２０μＬに溶解したのちアガロースゲル電気泳動を行ない、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２２６】
続いて、配列番号３４で示される１７ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡ、および配列番号３５で示される１３ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡを作製し、各１０ｐｍｏｌずつを蒸留水１００μＬに加え、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻すことにより各合成オリゴＤＮＡをアニーリングさせた。
上記で得た、マウスゲノムＤＮＡの配列約１．６ｋｂｐを取り除いたプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１由来のＨｉｎｃＩＩとＫｐｎＩ断片（約３．２ｋｂｐ）３０ｎｇとアニーリング済み合成オリゴＤＮＡ　０．２ｐｍｏｌを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１時間結合反応を行なった。
【０２２７】
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｃ２と称す。
【０２２８】
（１９）プラスミドｃＡ３Ｒ−Ｃの構築
キメラＡ３アデノシン受容体の２２５〜３１８番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の６７３〜９５７番目までの配列）およびマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の終止コドン以降のＨｉｎｃＩＩサイトまでの約５００ｂｐの配列を含むプラスミドｃＡ３Ｒ−Ｃを以下のようにして構築した（図２５参照）。
【０２２９】
１μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ２を、１００μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、０．０１％のＢＳＡと５０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、１５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動して、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２３０】
１．５μｇのプラスミドｃｈｉｍｅｒａ−５＋６を、１００μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、０．０１％のＢＳＡと５０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２３１】
上記で得た、プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ２由来のＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（約１５０ｂｐ）１０ｎｇと、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−５＋６由来のＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（約３．７ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃＡ３Ｒ−Ｃと称す。
【０２３２】
（２０）プラスミドｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築
２つのｌｏｘＰ配列の間に、ＰＧＫプロモーターの下流につながったｈｐｒｔ遺伝子が存在するプラスミドｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２のＳｍａＩ／ＢａｍＨＩサイト間に、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエキソン２の非翻訳領域中のＢａｍＨＩサイトからエキソン２の下流のＡｐａＩサイトまでの約２．８ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡを挿入したプラスミドｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を、以下のようにして構築した（図２６参照）。
【０２３３】
３μｇのプラスミドｐＢＳ−ｅｘ２を、０．０１％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）を含む１００μＬのユニバーサルバッファーＭ（宝酒造社製）に溶解し、７５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１２時間消化反応を行なった。この反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＬ（宝酒造社製）に溶解し、７５単位のＡｐａＩを加えて３７℃で１２時間消化反応を行なった。この反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１０μＬの蒸留水に溶解し、アガロースゲル電気泳動後、約４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。続いて、ＤＮＡ平滑化キット（宝酒造社製）を用いて、回収したＤＮＡ断片の両末端を添付マニュアルに従って平滑化処理した。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を１５μＬのユニバーサルバッファーＫ（宝酒造社製）に溶解し、７．５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約２．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。この断片は、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２の非翻訳領域中のＢａｍＨＩサイトから下流のＡｐａＩサイトまで約２．８ｋｂｐに相当するゲノムＤＮＡであり、エクソン２の非翻訳領域中のポリアデニル化シグナルを含む。
【０２３４】
２．８μｇのプラスミドｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２（ＷＯ　０１／３３９５７）を０．０１％ＢＳＡを含む１００μＬのユニバーサルバッファーＴ（宝酒造社製）に溶解し、７５単位のＳｍａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１２時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、２０μＬの蒸留水に溶解した。
【０２３５】
上記で得た、Ａ３アデノシン受容体のエクソン２を含むマウスゲノムＤＮＡ断片（約２．８ｋｂｐ）９０ｎｇとプラスミドｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２由来のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約５．７ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２と称す。
【０２３６】
（２１）プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築
（２０）で構築したｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２にＥｃｏＲＩとＳａｃＩＩの認識配列を付加したプラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を以下のようにして構築した（図２７参照）。
【０２３７】
２μｇのプラスミドｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、４０単位のＨｐａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、５０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を蒸留水１５μＬに溶解した後、アガロースゲル電気泳動し、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２３８】
続いて、配列番号３６で示される３８ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡ、および配列番号３７で示される３４ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡを作製し、各１０ｐｍｏｌずつを蒸留水１００μＬに加え、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻すことによりアニーリングさせた。
上記で得た、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２由来のＨｐａＩ−ＫｐｎＩ断片（約９ｋｂｐ）３０ｎｇとアニーリング済み合成オリゴＤＮＡ　０．２ｐｍｏｌを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１時間結合反応を行なった。
【０２３９】
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２と称す。
【０２４０】
（２２）プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築
キメラＡ３アデノシン受容体の２２５〜３１８番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３２の６７３〜９５７番目までの配列）およびマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の終止コドン以降のＨｉｎｃＩＩサイトまでの約５００ｂｐの配列を、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２のｈｐｒｔ遺伝子の上流に導入した、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２を以下のようにして構築した（図２８参照）。
【０２４１】
２μｇのプラスミドｃＡ３Ｒ−Ｃを、１００μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、０．０１％のＢＳＡと５０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約８００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２４２】
３．２μｇのプラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を、１００μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、０．０１％のＢＳＡと５０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約８．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２４３】
上記で得た、プラスミドｃＡ３Ｒ−Ｃ由来のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩＩ断片（約８００ｂｐ）１００ｎｇと、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２由来のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩＩ断片（約８．５ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２と称す。
【０２４４】
（２３）ｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築
キメラＡ３アデノシン受容体をコードする塩基配列（配列番号３２の配列）の上流にマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより上流のマウスゲノム配列約５．４ｋｂｐを付加し、下流にマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の終止コドン以降のＨｉｎｃＩＩサイトまでの約５００ｂｐの配列を付加した配列をプラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２のｈｐｒｔ遺伝子の上流に導入した構造のプラスミドｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２を以下のようにして構築した（図２９参照）。
【０２４５】
２．５μｇのプラスミドａｒｍ１＋ｃＡ３Ｒ−Ｎを、１００μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、５０単位のＳｐｅＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２４６】
２μｇのプラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２を、１００μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、５０単位のＮｈｅＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２４７】
上記で得た、プラスミドａｒｍ１＋ｃＡ３Ｒ−Ｎ由来のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約７ｋｂｐ）１００ｎｇと、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２由来のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約９ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２と称す。
【０２４８】
（２４）ｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築
プラスミドｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２のマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンよりも上流約５．４ｋｂｐの配列の上流にジフテリア毒素（ＤＴ）発現ユニットを挿入した、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２を以下のようにして構築した（図３０参照）。
【０２４９】
３．５５μｇのプラスミドｐＫＯ　ＳｅｌｅｃｔＤＴ（レキシコン・ジェネティックス社製）を、４０μＬのＮＥバッファー４に溶解し、２単位のＲｓｒＩＩを加えて３７℃で２４時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２５０】
２．５μｇのプラスミドｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２を、１００μＬのＮＥバッファー４に溶解し、５単位のＲｓｒＩＩを加えて３７℃で２４時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約１６ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２５１】
上記で得た、プラスミドｐＫＯ　ＳｅｌｅｃｔＤＴ由来のＲｓｒＩＩ断片（約１．３ｋｂｐ）５０ｎｇとプラスミドｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２由来のＲｓｒＩＩ断片（約１６ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２と称す。
【０２５２】
また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、該プラスミドｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２に含まれるキメラＡ３アデノシン受容体をコードする塩基配列（配列番号３２）を確認した。また、本実施例で作製したキメラＡ３アデノシン受容体遺伝子の構造を、図３１に模式的に示した。
【０２５３】
実施例５　ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターの構築
（１）プラスミドｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳの構築
ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むプラスミドｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳを以下のようにして構築した（図３２参照）。
プラスミドｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ｐＨＰＲＴｐ（ＷＯ　０１／３３９５７）のＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む配列番号３８で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマー、および配列番号３９で示される塩基配列を有する３５ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、プラスミドｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ｐＨＰＲＴｐを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を０．０１％ＢＳＡを含む４０μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、１５単位のＸｂａＩおよび１０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２５４】
３μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を０．０１％ＢＳＡを含む４０μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、１５単位のＸｂａＩおよび１０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
上記で得た、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）１００ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＸｂａＩ−ＳａｃＩＩ断片（約３ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
【０２５５】
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを確認した。以下、このプラスミドをｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳと称す。
【０２５６】
（２）ｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＢＳの構築
Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を有するプラスミドｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＢＳを以下のようにして構築した（図３３参照）。
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列に基づいて、ＦＬＡＧタグをコードする配列を含む配列番号４０で示される塩基配列を有する５５ｍｅｒのプライマー、および配列番号４１で示される塩基配列を有する３０ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、プラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を０．０１％ＢＳＡを含む５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３７．５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２５７】
３μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を０．０１％ＢＳＡを含む４０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３０単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２５８】
上記で得た、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を含むＤＮＡ断片（約１ｋｂｐ）１００ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるＮ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を確認した。以下、このプラスミドをｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＢＳと称す。
【０２５９】
（３）プラスミドｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳの構築
Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列の下流にＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを付加したプラスミドｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳを以下のようにして構築した（図３４参照）。
【０２６０】
１．２５μｇの上記（２）で作製したプラスミドｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＢＳを０．０１％ＢＳＡを含む４０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３０単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。この反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２６１】
２．５μｇの上記（１）で作製したプラスミドｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳを０．０１％ＢＳＡを含む５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３０単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。この反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２６２】
上記で得た、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を含むＤＮＡ断片（約１ｋｂｐ）４０ｎｇとプラスミドｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳ由来のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３．３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２　Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で３時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳと称す。
【０２６３】
（４）ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築
ＣＡＧプロモーターを含む、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧを、以下のようにして構築した（図３５参照）。
【０２６４】
３μｇの上記（３）で作製したプラスミドｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳを４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩと１５単位のＥｃｏＲＶを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列の下流にＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片）を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２６５】
４μｇのプラスミドｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ｐＨＰＲＴｐを、５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、２０単位のＨｐａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。この反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２６６】
上記で得た、プラスミドｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳ由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片（約１．５ｋｂｐ）１００ｎｇとｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ｐＨＰＲＴｐ由来のＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片（約８ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で３時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧと称す。
【０２６７】
実施例６　キメラＡ３アデノシン受容体の発現ベクターの構築
ＣＡＧプロモーターを含むキメラＡ３アデノシン受容体の哺乳類細胞用発現ベクターｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧを、以下に示す（１）〜（４）の工程で構築した。
（１）Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの作製
キメラＡ３アデノシン受容体をコードする配列（配列番号３２）に基づいて、ＦＬＡＧタグをコードする配列を含む配列番号４０で示される塩基配列を有する５５ｍｅｒのプライマー、および配列番号４２で示される塩基配列を有する３４ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、実施例４（２４）で作製したプラスミドｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２を鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を０．０１％ＢＳＡを含む５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３７．５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。この消化反応により、ＰＣＲにより増幅した断片は、５’末端のＥｃｏＲＩサイトだけでなく、キメラＡ３アデノシン受容体をコードする配列中に存在するＥｃｏＲＩサイトでも切断される。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたキメラＡ３アデノシン受容体のＮ末側をコードする約７００ｂｐのＤＮＡ断片と、Ｃ末側をコードする約３００ｂｐのＤＮＡ断片それぞれを、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２６８】
（２）プラスミドｃＡ３Ｒ（Ｎ）　ｉｎ　ｐＢＳの構築
Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたキメラＡ３アデノシン受容体のＮ末側をコードする配列を有するプラスミドｃＡ３Ｒ（Ｎ）　ｉｎ　ｐＢＳを以下のようにして構築した（図３６参照）。
【０２６９】
２μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）２μｇを４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡを５０μＬのアルカリホスファターゼ用バッファーに溶解し、４０単位のウシ小腸由来のアルカリホスファターゼを加えて５０℃で１時間反応を行ない、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により末端が脱リン酸化された約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０２７０】
上記のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）１００ｎｇと、（１）で作製したＮ末端にＦＬＡＧタグが付加されたキメラＡ３アデノシン受容体のＮ末側をコードする配列を含むＤＮＡ断片（約７００ｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
【０２７１】
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるＮ末端にＦＬＡＧタグが付加されたキメラＡ３アデノシン受容体のＮ末側をコードする配列７００ｂｐを確認した。以下、このプラスミドをｃＡ３Ｒ（Ｎ）　ｉｎ　ｐＢＳと称す。
【０２７２】
（３）プラスミドｃＡ３Ｒ（Ｃ）　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築
ＣＡＧプロモーター、およびキメラＡ３アデノシン受容体のＣ末側をコードする配列の下流にＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを付加した配列を有するプラスミドｃＡ３Ｒ（Ｃ）　ｉｎ　ｐＣＡＧを以下のようにして構築した（図３７参照）。
【０２７３】
２．５μｇの実施例５（４）で作製したプラスミドｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳを、０．０１％ＢＳＡを含む５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３７．５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＶを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。
【０２７４】
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
４μｇのプラスミドｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ｐＨＰＲＴｐを５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、２０単位のＨｐａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２７５】
上記で得た、プラスミドｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳ由来のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＶ断片（約３００ｂｐ）５０ｎｇ、プラスミドｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ｐＨＰＲＴｐ由来のＨｐａＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約８ｋｂｐ）５０ｎｇ、および（１）で単離したキメラＡ３アデノシン受容体のＣ末側をコードする配列を含むＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
【０２７６】
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃＡ３Ｒ（Ｃ）　ｉｎ　ｐＣＡＧと称す。
【０２７７】
（４）プラスミドｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築
キメラＡ３アデノシン受容体の哺乳類細胞用発現ベクターｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧを以下のようにして構築した（図３８参照）。
【０２７８】
４μｇの上記（２）で作製したプラスミドｃＡ３Ｒ（Ｎ）　ｉｎ　ｐＢＳを４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたキメラＡ３アデノシン受容体のＮ末側をコードするＤＮＡ断片）を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２７９】
上記（３）で作製したプラスミドｃＡ３Ｒ（Ｃ）　ｉｎ　ｐＣＡＧ　２μｇを４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約８．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡを５０μＬのアルカリホスファターゼ用バッファーに溶解し、４０単位のウシ小腸由来のアルカリホスファターゼを加えて５０℃で３０分間反応を行ない、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により末端が脱リン酸化された約８．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０２８０】
上記で得た、プラスミドｃＡ３Ｒ（Ｎ）　ｉｎ　ｐＢＳ由来のＥｃｏＲＩ断片（約７００ｂｐ）１００ｎｇとプラスミドｃＡ３Ｒ（Ｃ）　ｉｎ　ｐＣＡＧ由来のＥｃｏＲＩ断片（約８．６ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で３時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧと称す。
【０２８１】
実施例７　ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターおよびキメラＡ３アデノシン受容体の発現ベクターの哺乳類細胞への導入と特異的薬物の反応性の評価
（１）一過性発現による薬物反応性の評価
宿主細胞マウスミエローマ細胞Ｐ３．Ｘ６３／Ａｇ８．Ｕ１（以下Ｐ３Ｕ１と略す）に、アポエクオリンの発現プラスミドｐＣＡＧ−ＡＥＱ−ｐＨＰＲＴｐを導入した安定形質転換細胞株であるクローン２１△ｈｐｒｔ株（ＷＯ　０１／３３９５７）に、実施例６（４）で構築した発現プラスミドｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧ、および実施例７（４）で構築した発現プラスミドｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧをそれぞれ導入し、ヒトＡ３アデノシン受容体およびキメラＡ３アデノシン受容体の一過的発現細胞株を作製した。クローン２１△ｈｐｒｔ株が発現するアポエクオリンは発光基質セレンテラジンおよび分子状酸素と蛋白質複合体エクオリンを形成し、エクオリンはＣａ２＋との結合により発光する。
【０２８２】
クローン２１△ｈｐｒｔ細胞株へのプラスミドｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧおよびｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの導入は、エレクトロポレーション法により以下のようにして行なった。
該細胞株を８×１０６個／ｍＬになるようにＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、４ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２）に懸濁し、この細胞懸濁液２００μＬと４μｇのプラスミドｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧまたは４μｇのｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧ　をエレクトロポレーション用キュベット〔ジーン・パルサー・キュベット（Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｃｕｖｅｔｔｅ）、電極間距離２ｍｍ、バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）社製〕に入れ、パルス電圧０．２５ｋＶ、電気容量１２５μＦの条件で遺伝子導入し、１０ｍＬのＦＣＳを含むＲＰＭＩ　１６４０培地（インビトロジェン社製）に懸濁後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
【０２８３】
これら一過性発現細胞株を用いて、ヒトＡ３アデノシン受容体およびキメラＡ３アデノシン受容体がマウス細胞内において正常に機能することが出来るかを検証するため、Ａ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストであるクロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）−アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド〔ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ６−（３−ｉｏｄｏｂｅｎｚｙｌ）−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎａｍｉｄｅ、以下Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡと略す〕（Ｋ．　Ａ．　Ｊａｃｏｂｓｏｎ；　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｓｃｉ．，　１９，　５，　１９９８）に対する応答性（細胞内Ｃａ２＋上昇量）を以下のようにしてエクオリンの発光量で評価した。コントロール細胞として、各Ａ３アデノシン受容体発現プラスミドを導入していないクローン２１△ｈｐｒｔ株を用い、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する応答性を調べた。
【０２８４】
培養後、各細胞株を１×１０６個／ｍｌになるように１０μｍｏｌ／Ｌのセレンテラジン〔モレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）社製〕を含むＲＰＭＩ　１６４０培地に懸濁し、培養用ガラスチューブ（岩城硝子社製）へ懸濁液を１００μＬずつ分注して４時間培養した。
培養後、各細胞株の発光量を１秒間毎に５秒間、ルミノメーターＡｕｔｏ　Ｌｕｍａｔ　ＬＢ９５３〔ＥＧ＆Ｇベルトールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）社製〕で測定したのち、２μｍｏｌ／ＬのＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ溶液（１０ｍｍｏｌ／ＬになるようにＤＭＳＯに懸濁した溶液をＲＰＭＩ　１６４０培地で希釈した溶液）を各培養用ガラスチューブへ１００μＬずつ添加し、添加直後からの発光量を１秒間毎に６０秒間測定した。また、コントロールとして、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡが含まれていないＤＭＳＯを用いて同様の測定を行なった。
【０２８５】
本測定の結果を図３９に示す。Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを最終濃度１μｍｏｌ／Ｌで加えた結果、各プラスミドを導入していないコントロール細胞株と比較して、ヒトＡ３アデノシン受容体を一過性発現させた細胞株では約２倍、キメラＡ３アデノシン受容体を一過性発現させた細胞株では約４倍のエクオリン発光量の上昇がみられた。
以上の結果より、一過性発現させたヒトＡ３アデノシン受容体およびキメラＡ３アデノシン受容体がマウスミエローマ細胞の細胞膜に局在し、かつＡ３アデノシン受容体特異的なアゴニストに対して正常な応答性（Ｃａ２＋上昇）を有することが示された。また、マウス細胞内においては、ヒトＡ３アデノシン受容体と比較するとキメラＡ３アデノシン受容体の方がＡ３アデノシン受容体特異的アゴニストに対する応答性が高いことが示された。
【０２８６】
（２）安定発現株を用いた薬物反応性の評価
クローン２１△ｈｐｒｔ株に、実施例５（４）で構築した発現プラスミドｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧ、および実施例６（４）で構築した発現プラスミドｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧを導入し、ヒトＡ３アデノシン受容体およびキメラＡ３アデノシン受容体の安定発現細胞株を作製した。これら安定発現細胞株を用いて、ヒトＡ３アデノシン受容体およびキメラＡ３アデノシン受容体がマウス細胞内において正常に機能することができるかを検証するため、Ａ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストであるＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する応答性（細胞内Ｃａ２＋上昇量）をエクオリンの発光量で評価した。
【０２８７】
クローン２１△ｈｐｒｔ細胞株へのプラスミドｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧおよびｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの導入は、（１）に記載したエレクトロポレーション法に準じて行なった。遺伝子導入し、１０ｍＬのＦＣＳを含むＲＰＭＩ　１６４０培地に懸濁後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。培養後、ＨＡＴ培地添加物〔ＨＡＴ−Ｍｅｄｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　（５０×）、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）社製、アミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む〕を２００μＬ添加し、さらに６日間培養することでアミノプテリン耐性株を取得した。取得した薬剤耐性株の生細胞数を計測し、５個／ｍＬになるように、２％ＨＴ培地添加物（ＨＴ−Ｍｅｄｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　　（５０×）、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ社製、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む）および１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ　１６４０培地を用いて希釈し、１００μＬ／穴で９６穴プレートに播種した。１週間後、単一コロニーを形成した穴の細胞を回収することにより、プラスミドｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧを導入した細胞群から４クローンの細胞株、プラスミドｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧを導入した細胞群からは９クローンの細胞株を得ることができた。各クローンは１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ　１６４０培地を用いて拡大培養を行なった。
【０２８８】
培養後、各細胞株のＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する応答性を（１）に記載した方法に準じて測定した。各プラスミドを導入していないコントロール細胞株（クローン△ｈｐｒｔ細胞株）と比較して、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現させた細胞株では、４クローン株中３クローン株で有意な発光量の上昇がみられた（図４０参照）。特にクローン４は、コントロール細胞株と比べて６倍以上の発光量の上昇がみられた。また、キメラＡ３アデノシン受容体を発現させた細胞株では、９クローン株全てで発光量の上昇がみられた（図４１参照）。特にクローン２は、６倍以上の発光量の上昇がみられた。さらに、ヒトＡ３アデノシン受容体の安定発現株およびキメラＡ３アデノシン受容体の安定発現株にそれぞれについて、各クローン株の発光量の平均値を比較することにより、マウス細胞内ではヒトＡ３アデノシン受容体と比べてキメラＡ３アデノシン受容体の方がＡ３アデノシン受容体特異的なアゴニストに対する応答性が高いことが示された。
【０２８９】
以上の結果より、安定発現させたヒトＡ３アデノシン受容体およびキメラＡ３アデノシン受容体がＡ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストに対して正常な応答性（Ｃａ２＋上昇）を有することが示された。また、マウス細胞内においては、ヒトＡ３アデノシン受容体と比較するとキメラＡ３アデノシン受容体の方がＡ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストに対する応答性が高いことが示された。
【０２９０】
実施例８　相同組換え体を検出するためのサザンハイブリダイゼーションに用いる５’側および３’側プローブの作製
（１）５’側プローブの作製
実施例４で作製したターゲットベクターによって相同組換えが正確に行われたかどうかは、サザンハイブリダイゼーションにより解析するが、そのサザンハイブリダイゼーションで用いる５’側プローブとする、ターゲットベクターに含まれるマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１の上流のマウスゲノム配列よりもさらに５’側のゲノム配列を含むＤＮＡを以下のようにして作製した（図４２参照）。
【０２９１】
３μｇのプラスミドｐＢＳ−ｅｘ１を０．０１％ＢＳＡを含む２０μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、８単位のＳｍａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、１０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２９２】
５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を０．０１％ＢＳＡを含む５０μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、２４単位のＳｍａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、２０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０２９３】
上記で得た、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１よりも上流のマウスゲノムＤＮＡ断片（約１．２ｋｂｐ）１００ｎｇとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片（約３ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるマウスゲノム配列を確認した。配列番号４３にその塩基配列を示す。以下、このプラスミドをｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ５’と称す。
【０２９４】
サザンハイブリダイゼーションで用いる５’側プローブは、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ５’を鋳型としたＰＣＲにより作製した。すなわち、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ５’に含まれるマウスゲノム配列に基づいて、配列番号４４で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマー、および配列番号４５で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーおよび、鋳型としてｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ５’を用いてＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動して約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。以下、このＤＮＡ断片を５’側プローブとして用いる。
【０２９５】
（２）３’側プローブの作製
サザンハイブリダイゼーションで用いる３’側プローブとする、ターゲットベクターに含まれるマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２よりも下流のマウスゲノム配列よりもさらに３’側のマウスゲノム配列を含むＤＮＡを以下のようにして作製した（図４３参照）。
【０２９６】
３μｇのプラスミドｐＢＳ−ｅｘ２を２０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、１０単位のＮｈｅＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約６００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
３μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）を４０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、２０単位のＳｐｅＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なったのち、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。次に、回収したＤＮＡを５０μＬのアルカリホスファターゼ用バッファーに溶解し、４０単位のウシ小腸由来のアルカリホスファターゼを加えて５０℃で３０分間反応を行ない、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により末端が脱リン酸化された約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０２９７】
上記で得た、マウスＡ３アデノシン受容体のエクソン２よりも下流のマウスゲノムＤＮＡ断片（約６００ｂｐ）１００ｎｇとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）由来のＳｐｅＩ断片（約３ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるマウスゲノム配列を確認した。配列番号４６にその塩基配列を示す。以下、このプラスミドをｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ３’と称す。
【０２９８】
サザンハイブリダイゼーションで用いる３’側プローブを作製するため、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ３’を鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ３’に含まれるマウスゲノムＤＮＡ配列に基づいて、配列番号４７で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマー、および配列番号４８で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーおよび、鋳型としてｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ３’を用いてＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを３０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動して、約２４０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。以下、このＤＮＡ断片を３’側プローブとして用いる。
【０２９９】
実施例９　キメラＡ３アデノシン受容体を発現するトランスジェニックマウスの作製
（１）ＥＳ細胞へのターゲットベクターの導入
マウスＥＳ細胞ＡＢ２．２（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｃ１００、以下ＡＢ２．２細胞と称す）の培養は、Ｍ１５培地〔１５％ＦＣＳ（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｂ１００）、１０−４ｍｏｌ／Ｌのβメルカプトエタノール（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｍ２６０）、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（レキシコン・ジェネティクス社製）、５０単位／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｍ２５０）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｍ２０５）〕を用いて、フィーダープレート上で３７℃、５％ＣＯ２条件下で行なった。
【０３００】
フィーダープレートは、以下のようにゼラチンコート処理を施した細胞培養用ディッシュにマイトマイシンＣ処理したマウス胚線維芽細胞（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｃ２００、以下、ＳＴＯ細胞と称す）を培養して作製した。まず、０．１％ゼラチン溶液（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｍ２１０）で２時間以上、細胞培養用ディッシュ（９６穴プレート、２４穴プレート、３ｃｍディッシュ、６ｃｍディッシュ、８．５ｃｍディッシュ）の培養面を覆うことによりゼラチンコート処理を行なった。続いて、購入したＳＴＯ細胞を融解後、ＳＴＯ培地（７％のＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、５０単位／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）に４．４×１０５個／ｍＬになるよう懸濁し、ゼラチンコート処理を施した細胞培養用ディッシュに、９６穴プレートには０．０７ｍＬ／穴、２４穴プレートには０．５ｍＬ／穴、３ｃｍディッシュには２ｍＬ／枚、６ｃｍディッシュには４ｍＬ／枚、８．５ｃｍディッシュには１２ｍＬ／枚を播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間以上培養したものをフィーダープレートとした。
【０３０１】
ＡＢ２．２細胞はＭ１５培地に懸濁した後、フィーダープレートに播種して培養を開始した。Ｍ１５培地は９６穴プレートには０．１ｍＬ／穴、３ｃｍディッシュには２ｍＬ／枚、６ｃｍディッシュには４ｍＬ／枚、８．５ｃｍディッシュには１０ｍＬ／枚、マルチディッシュおよび２４穴プレートには０．５ｍＬ／穴を使用した。細胞がコンフルエントに到達する前に以下のようにして継代を行なった。まず、継代に先駆け、２時間前にＭ１５培地を交換した。細胞をＰＢＳ（レキシコン・ジェネティクス社製）で２回洗浄した後、９６穴プレートには０．０２５ｍＬ／穴、２４穴プレートには０．２５ｍＬ／穴、３ｃｍディッシュには１ｍＬ／枚、６ｃｍディッシュには２ｍＬ／枚、８．５ｃｍディッシュには２ｍＬ／枚の０．０４％ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシン溶液（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｍ２２０、以下、トリプシン溶液と略す）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１５分間放置した。等量のＭ１５培地を添加し、３ｍＬトランスファーピペット（ファルコン社製、カタログ番号７５７５）を用いて４０回激しくピペッティングし細胞を分散させた。細胞を含む溶液から、遠心分離により細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をＭ１５培地に再び懸濁し、新しいフィーダープレート上に播種することで継代を行なった。
【０３０２】
ＡＢ２．２細胞へのターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の導入は、以下のようにして、エレクトロポレーション法により行なった。実施例４（２４）で得られたターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２は、制限酵素ＳａｌＩで切断して直鎖状にし、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡを含む１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）に溶解したものを用いた。購入したＡＢ２．２細胞３．０×１０６個を６ｃｍディッシュに播種し、４８時間培養した後、８．５ｃｍディッシュへ継代し、さらに２４時間培養した。２４時間後、７ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、上記の継代方法に準じて細胞を回収した。回収した細胞１．０×１０７個を０．９ｍＬのＰＢＳに懸濁し、２５μｇの直鎖状ｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２をエレクトロポレーション用キュベット（ジーン・パルサー・キュベット、電極間距離４ｍｍ、バイオ・ラッド社製、カタログ番号１６５−２０８８）内で混合した。エレクトロポレーション装置ジーンパルサー（バイオ・ラッド社製）を用いて、パルス電圧０．２３ｋＶ、電気容量５００μＦの条件で遺伝子導入し、７０ｍＬのＭ１５培地に懸濁後、７枚の８．５ｃｍフィーダープレートに１０ｍＬずつ播種し、２４時間培養した。
【０３０３】
２４時間後、１００×ＨＡＴ添加物（ＨＡＴ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　（１００×）、インビトロジェン社製、カタログ番号３９９２、アミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む）を１×濃度で含むＭ１５培地で５日間培養した後、１００×ＨＴ添加物（ＨＴ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　（１００×）、インビトロジェン社製、カタログ番号１１０６７−０３０、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む）を１×濃度で含むＭ１５培地でさらに３日間培養することでアミノプテリン耐性コロニーを出現させた。各コロニーを、以下のようにして単離し、培養を継続した。まず、出現したコロニーをＰＢＳで２回洗浄した後、プラスチック製の滅菌チップを用いて計５１２コロニーを直接拾いあげて、３０μＬのトリプシン溶液を添加した丸底９６穴プレート（ファルコン社製、カタログ番号３０７７）へ１コロニー／穴になるように移した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で１５分間以上放置した後、７０μＬ／穴のＭ１５培地を添加し、プラスチック製の滅菌チップで４０回激しくピペッティングを行ない細胞を分散させた。細胞懸濁液を、各穴に１００μＬのＭ１５培地を添加した９６穴フィーダープレートに播種して３日間培養を行なった。
【０３０４】
３日後、以下のようにしてレプリカプレートを作製し、さらに５日間培養した。まず、上記の９６穴フィーダープレートで培養した細胞を１００μＬ／穴のＰＢＳで２回洗浄した後、２５μＬのトリプシン溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１５分間以上放置した。２５μＬのＭ１５培地を添加し、プラスチック製の滅菌チップで４０回激しくピペッティングを行ない分散させた。続いて２０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ、シグマ・アルドリッチ社製、カタログ番号Ｄ２６５０）、４０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（以下、２×フリージング培地と称す）を５０μＬ添加して混合した細胞懸濁液から５０μＬを分取し、あらかじめゼラチンコート処理し、１００μＬ／穴のＭ１５培地を添加しておいた９６穴プレートに移すことにより、レプリカプレートを作製した。残りの細胞懸濁液を含むプレートはマスタープレートとして−８０℃で凍結保存した。
【０３０５】
（２）サザンハイブリダイゼーションによる相同組換え体の選択
（１）で作製した５１２コロニーのレプリカプレートのうちの２８８コロニーのレプリカプレートを５日間培養後、培地を除いて１００μＬ／穴のＰＢＳで２回洗浄した後、細胞溶解液〔１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．５％サルコシル、１ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（インビトロジェン社製、カタログ番号２５５３０−０４９）〕を５０μＬ／穴ずつ加え、密封容器の中へ十分水を含ませた紙と共に入れたのち、６０℃で２４時間保温し、細胞を溶解させた。細胞の溶解液に、７５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌを含むエタノールを１００μＬ／穴ずつ加えて室温で３０分間以上放置し、ゲノムＤＮＡを沈殿させた後、９６穴プレートを逆さにすることにより溶液を廃棄した。続いて１５０μＬ／穴の７０％エタノールで３回洗浄した後、室温で２０分間放置することにより残ったエタノールを揮発させた。
【０３０６】
１２単位のＥｃｏＲＩと５μｇのリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製；カタログＮｏ．Ｒ５１２５）を含むユニバーサルバッファーＨ　３０μＬ／穴を添加して、激しくピペッティングを行ないゲノムＤＮＡをよく溶解させてから、３７℃で２０時間消化反応を行なった。反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎの方法（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　９８，　５０３，　１９７５）でナイロンフィルター（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ＋、アマシャム・バイオサイエンス社製）へ移した。実施例８で作製した５’側プローブおよび３’側プローブを、Ｔ７クイックプライム・キット（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて［α−３２Ｐ］　ｄＣＴＰ（ＮＥＮ社製）で標識した。この標識した各プローブと上記で作製したフィルターを一晩ハイブリダイズさせ、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＰＥを用いて６５℃で１５分間の洗浄を３回、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＰＥを用いて６５℃で１５分間の洗浄を２回行ない、Ｘ線フィルム（コダック・サイエンティフィック・イメージング・フィルムＸ−ＯＭＡＴＴＭ　ＡＲ、コダック社製）と重ね合わせて−８０℃で一晩感光させ、翌日現像した。
【０３０７】
上記のサザンハイブリダイゼーションでは、野生型のマウスゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合、５’側プローブを用いることにより約９ｋｂｐのＤＮＡ断片、３’側プローブを用いることにより約６．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出される。一方、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２によって正常に相同組換えが引き起こされ、マウスゲノムＤＮＡ中のマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子がキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換されている場合には、５’側プローブを用いることにより約８．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が、３’側プローブを用いることにより約８．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出される（図４４参照）。
【０３０８】
以上のサザンハイブリダイゼーションの結果、解析したＥＳ細胞のアミノプテリン耐性株２８８コロニーのうち、１３コロニーのＥＳ細胞（１Ｂ２、１Ｃ１２、１Ｄ７、１Ｄ１２、２Ａ１０、２Ｄ１２、２Ｆ１０、２Ｈ６、３Ｄ９、３Ｆ８、３Ｆ１１、３Ｈ４、３Ｈ１０）が片方の染色体においてマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子がキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換された相同組換え体であることが判明した。
【０３０９】
相同組換え体である１３コロニーのＥＳ細胞について、以下のようにして凍結保存用ストックを作製した。
１３コロニーの凍結保存したマスタープレートを融解し、各相同組換え体を含む細胞懸濁液を、２ｍＬ／穴のＭ１５培地を添加した２４穴フィーダープレートの各穴に播種し、２４時間培養した。培地を交換し、２日間培養を行なった後、３ｃｍディッシュのフィーダープレートに継代しさらに３日間培養した。（１）に記載した継代方法に準じて、ディッシュより剥離後、回収した細胞を０．５ｍＬのＭ１５培地に懸濁した。さらに０．５ｍＬの２×フリージング培地を加えて混合した懸濁液を、０．１ｍＬずつ細胞凍結用チューブに分注し、−８０℃で凍結保存し、ストックとして保管した。
【０３１０】
（３）相同組換え体からの薬剤耐性遺伝子の除去
（２）で得た相同組換え体より、形態と増殖能が良い４クローン（１Ｂ２、１Ｄ７、３Ｈ４、３Ｈ１０）を選び、Ｃｒｅ発現ベクターを導入することにより、ｌｏｘＰ配列間に存在する薬剤耐性遺伝子（ｈｐｒｔ遺伝子）の除去を行なった。上記４クローンの凍結保存ストックを各クローン１本ずつ融解し、それぞれ２ｍＬ／穴のＭ１５培地の入った２４穴フィーダープレートに播種して２日間培養した。３ｃｍディッシュフィーダープレートへ継代し、２４時間後に培地交換を行なった。さらにその２４時間後、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＬのトリプシン溶液を添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で１５分間放置した後、１ｍＬのＭ１５培地を添加し、３ｍＬトランスファーピペットを用いて４０回激しくピペッティングすることにより細胞を剥離させた。遠心分離により細胞を沈殿させて回収し、０．９ｍＬのＰＢＳに懸濁させた。該細胞懸濁液とＣｒｅ発現ベクターｐＢＳ１８５（インビトロジェン社製）２５μｇを０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡを含む１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）に溶解させたものを用いて、（１）に記載したエレクトロポレーション法に準じて細胞に遺伝子導入し、１０ｍＬのＭ１５培地に懸濁後、８．５ｃｍディッシュのフィーダープレートに播種し、２４時間培養した。２４時間後、培地交換を行ない、さらに３日間培養した。
【０３１１】
培養した細胞を７ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、（１）に記載した継代方法に準じて、ディッシュより剥離して回収し、１０ｍＬのＭ１５培地に懸濁し、細胞数を測定した。続いて、１０００×の６−チオグアニン（シグマ・アルドリッチ社製）を１×濃度で含むＭ１５培地を用いて、５００個／ｍＬ、５０個／ｍＬ、５個／ｍＬに細胞を希釈し、各１０ｍＬずつ８．５ｃｍディッシュのフィーダープレートに播種して７日間培養することでｈｐｒｔ遺伝子欠損コロニーを出現させた。これら各コロニーを（１）に記載した方法に準じて、単離し、９６穴フィーダープレートに播種して３日間培養を行なった。形態の良いクローンを、各コロニーについて１２クローンずつそれぞれ２４穴フィーダープレートへ継代し、２日間培養を行なった。さらに形態の良い５クローンずつをそれぞれ３ｃｍディッシュのフィーダープレートに継代して３日間培養を行なった。細胞を（１）に記載した継代方法に準じてディッシュより剥離して、回収し、０．５ｍＬのＭ１５培地に懸濁した。該細胞懸濁液に、さらに０．５ｍＬの２×フリージング培地を加えて混合した懸濁液を０．１ｍｌずつ細胞凍結用チューブに分注し、計２０クローン（１Ｂ２−１〜−５、１Ｄ７−１〜−５、３Ｈ４−１〜−５、３Ｈ１０−１〜−５）を−１６０℃で凍結保存用ストックとして保管した。
【０３１２】
（４）サザンハイブリダイゼーションによるｈｐｒｔ遺伝子の除去の確認
上記、２０クローンの凍結保存用ストックを各１本ずつ融解し、２ｍＬのＭ１５培地の入ったゼラチンコート処理済み３ｃｍディッシュに播種して３日間培養を行なった。３日後、培地を除いて１ｍＬのＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、（２）に記載の細胞溶解液を１．７５ｍＬずつ加え、密封容器の中へ十分水を含ませた紙と共に入れたのち、６０℃で２４時間保温し、細胞を溶解させた。細胞の溶解液に７５ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むエタノールを３ｍＬずつ加えて室温で３０分間以上放置した後、滅菌チップの先にひっかけるようにしてゲノムＤＮＡを回収した。このゲノムＤＮＡを７０％エタノールで３回洗浄した後、室温で２０分間放置することによりエタノールを揮発させた。ゲノムＤＮＡを２００μｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡおよび０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡを含む１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）１００μＬに溶解した。得られた各ゲノムＤＮＡを１２μｇずつ１２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液を滅菌チップで３回ピペッティングすることにより未消化のゲノムＤＮＡを切断した。さらに０．５ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１．２μＬおよびエタノール３００μＬを加えたのち、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ないゲノムＤＮＡの沈殿を得た。
【０３１３】
ゲノムＤＮＡの沈殿を０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡを含む１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）２０μＬに溶解したのち、全量をアガロースゲル電気泳動し、（２）に記載の方法に準じて、ナイロンフィルターに移し、３２Ｐで標識した３’側プローブとサザンハイブリダイゼーションを行なった。上記のサザンハイブリダイゼーションにより、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子がキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換されているマウスゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合には、（２）で示す通り、３’側プローブを用いることにより約８．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出されるが、Ｃｒｅ蛋白質によってｌｏｘＰ配列の間に存在するＰＧＫプロモーターおよびｈｐｒｔ遺伝子（約３．８ｋｂｐ）が除去されていると約５ｋｂｐと短いＤＮＡ断片が検出される（図４５参照）。
【０３１４】
サザンハイブリダイゼーションの結果より、解析した２０クローン全てにおいてキメラＡ３アデノシン受容体遺伝子の下流に存在していたｌｏｘＰ配列の間に挟まれていたＰＧＫプロモーターおよびｈｐｒｔ遺伝子（約３．８ｋｂｐ）がマウスゲノム上より除去されていることが確認された。
【０３１５】
（５）キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを有するＥＳ細胞を用いたキメラマウスの作製
（４）で樹立したＡ３アデノシン受容体遺伝子の片方のアリルをキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したＥＳ細胞のうち、形態と増殖性の良い３クローン（１Ｄ７−２、３Ｈ４−２、３Ｈ１０−２）をマウス胚盤胞へ注入するため、フィーダープレート上で培養を行なった。各クローンの凍結保存用ストック１本を融解後、１０ｍＬのＭ１５培地に懸濁し、遠心分離して沈殿させ細胞を回収した。細胞をＭ１５培地を０．５ｍＬ／穴添加した２４穴フィーダープレートに播種し培養を開始した。２日後、３ｃｍディッシュのフィーダープレートに継代した。さらに２日後、ＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄した後、０．５ｍＬのトリプシン溶液を加えて、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で１５分間放置した。０．５ｍｌのＭ１５培地を添加し、３ｍＬトランスファーピペットを用いて４０回激しくピペッティングして懸濁したところに、ＦＣＳを加えて混合し、該細胞懸濁液をマウス胚盤胞への注入に用いた。
【０３１６】
マウス胚盤胞は、過排卵処理を施した雌のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを同系の雄マウスと自然交配させ、４日後に摘出した子宮の内部をＭ１５培地で潅流することにより取得した。取得したマウス胚盤胞を３７℃、５％　ＣＯ２条件下で胚盤胞腔が十分に膨らむまで放置した後、約４℃に冷却した２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳを含むＭ１５培地中に移し、マイクロインジェクター（成茂科学社製）およびマイクロマニピュレーター（成茂科学社製）を装備した倒立顕微鏡（ニコン社製）下で観察しながら、注入針を操作し、各ＥＳ細胞クローン（１Ｄ７−２、３Ｈ４−２、３Ｈ１０−２）１０〜１５個ずつをそれぞれ胚盤胞腔内へ顕微注入した。該胚盤胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下で胚盤胞腔が膨らむまで放置した後、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版に記載された方法に従い、偽妊娠の雌ＭＣＨ系統マウスの卵管側子宮部分に移植後、着床させた。偽妊娠の雌ＭＣＨ系統マウス（１０週齢以降）は、発情期前期から発情期にある雌ＭＣＨ系統マウスを精管結紮雄マウスＭＣＨ系統マウス１０週以降の個体と移植３日前の１７：００に１：１で同居、交配させ、翌朝９：００に膣栓確認を行ない、２日後に上記の目的で使用した。
【０３１７】
注入したＥＳ細胞（１Ｄ７−２、３Ｈ４−２、３Ｈ１０−２）の寄与により、黒色の被毛の中に茶褐色の被毛が現れたキメラ個体のうちキメラ率が４０％を超える雄の個体が、１Ｄ７−２より３匹、３Ｈ１０−２より１２匹得られた。
【０３１８】
（６）キメラ個体の交配によるキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを有するヘテロ接合体マウスの取得
（５）で得られたキメラ個体を８週齢まで飼育した後、雌のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ系統８週齢以降の個体と１：１で交配させ産仔を得た。該産仔のうち、茶褐色の被毛を有する個体の尾より、（４）に記載の方法に準じてゲノムＤＮＡを調製し、各ゲノムＤＮＡ１２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、（４）に記載の方法に準じてサザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果、その結果、１Ｄ７−２と３Ｈ１０−２から産まれた産仔において、実施例１０に示すように、６．５ｋｂｐと５．０ｋｂｐの２本のバンドが見られ、片方の染色体上のＡ３アデノシン受容体遺伝子がキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換されたヘテロ接合体マウスが含まれていた。したがって、キメラ率が４０％を超えていたキメラ個体は生殖系列キメラマウスであると同定した。このヘテロ接合体マウスは、自己のＡ３アデノシン受容体と共にキメラＡ３アデノシン受容体を発現するマウスである。
【０３１９】
（７）キメラＡ３アデノシン受容体のみを発現するマウスの取得
上記（６）で得られたヘテロ接合体マウスを８週齢まで飼育した後、雄と雌を交配させ産仔を得た。該産仔の個体の尾より、（４）に記載の方法に準じて、ゲノムＤＮＡを調製し、サザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果、実施例１０に示すように、５．０ｋｂｐのバンドのみが見られ、両方の染色体においてＡ３アデノシン受容体遺伝子がキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換しているホモ接合体マウスが、産仔に含まれていた。このホモ接合体マウスは、マウスＡ３アデノシン受容体の代わりにキメラＡ３アデノシン受容体を発現するマウスである。
【０３２０】
実施例１０　Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウスのゲノム構造解析
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア）、実施例９の（６）に記載したＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したヘテロ接合体マウス、および実施例９の（７）に記載したＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスより尻尾を採取し、実施例９（４）と同様にしてゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡをＴＥバッファー（インビトロジェン社製）に溶解した後、１０μｇのゲノムＤＮＡを１６時間ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）で切断し、実施例９の（２）に記した方法でサザンハイブリダイゼーションを行なった。
【０３２１】
実施例８の（１）記載の５’側プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは約９ｋｂｐのバンド、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したヘテロ接合体マウスでは約９ｋｂｐと約８．５ｋｂｐのバンド、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスでは約８．５ｋｂｐのバンドが検出された（図４６）。続いて、実施例８の（２）記載の３’側プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは約６．５ｋｂｐのバンド、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したヘテロ接合体マウスでは約６．５ｋｂｐと約５．０ｋｂｐのバンド、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスでは約５．０ｋｂｐのバンドが検出された（図４７）。以上の結果は図４４および図４５にて模式的に示したゲノム構造と合致しており、該ヘテロ接合体マウスでは、片方の染色体上のＡ３アデノシン受容体遺伝子がキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換されていることが、該ホモ接合体マウスは両染色体上のＡ３アデノシン受容体遺伝子がキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換されていることが確認された。
【０３２２】
実施例１１　Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスからの骨髄細胞由来マスト細胞の作製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび実施例９の（７）で作製したＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスより取得した骨髄細胞より、以下に記すＳｕｐａｊａｔｕｒａらの方法（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１６７，　４，２００１）に準じた方法により、骨髄細胞由来マスト細胞（以下、ＢＭＭＣと略す）を作製した。
【０３２３】
オスＢＡＬＢ／ｃＡマウス（日本クレア）２０匹より脾臓を摘出後ホモジナイズにより単離した脾臓細胞を、脾臓細胞培養培地〔１０％ＦＣＳ（ハイクローン社製）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（インビトロジェン社製）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　２メルカプトエタノール（インビトロジェン社製）、５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン（ナカライテスク社製）、３．４ｍｇ／ＬのＰｈｙｔｏｌａｃｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ（ヨウシュヤマゴボウ）由来レクチン（シグマ−アルドリッチ社製）を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（インビトロジェン社製）〕にて２×１０６細胞／ｍＬに懸濁し、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で５日間培養した。培養後、培養上清を回収した。以下、該培養上清をＰＷＭ−ＳＣＭ（ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェンで刺激した脾臓細胞の培養上清の略）と呼ぶ。
【０３２４】
続いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび実施例９の（７）で作製したＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスの大腿骨よりそれぞれ骨髄細胞を回収し、ＢＭＭＣ培地〔１０％ＦＣＳ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社製）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ非必須アミノ酸（インビトロジェン社製）、５０μｍｏｌ／Ｌの２メルカプトエタノール、５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン、１０％のＰＷＭ−ＳＣＭを含むＲＰＭＩ　１６４０培地（インビトロジェン社製）〕にて３７℃、５％　ＣＯ２条件下で培養を行なった。４日おきに新鮮な培地に交換し、培養開始後２８日目に以下に示した抗体染色を行なった。
【０３２５】
２×１０５細胞をダルベッコのリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと表す）（インビトロジェン社製）で洗浄後、０．２μｇのフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略す）で標識したトリニトロフェノール（以下ＴＮＰと略す）特異的ＩｇＥ〔ＫＭ３９３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ１４２）より取得〕および０．２μｇのフィコエリスリン（以下、ＰＥと略す）で標識した抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（ファーミンジェン社製）を含むＰＢＳにて、氷上で１時間反応した。反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）にてＦＩＴＣおよびＰＥの蛍光強度を測定した。マスト細胞の細胞膜上には、ＩｇＥ　Ｆｃ受容体およびｃ−ｋｉｔが存在し、ＩｇＥと抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体の両抗体が結合することが報告されているが（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，　１６，　４４１，　２００２）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来細胞（図４８）およびＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウス由来細胞（図４９）の９５％以上が両抗体で染色され、これら細胞群がＢＭＭＣに分化していることが確認された。
【０３２６】
実施例１２　細胞内Ｃａ２＋量測定によるヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの評価
Ａ３アデノシン受容体アゴニストならびにアンタゴニストによるＢＭＭＣの細胞内Ｃａ２＋量の変動を以下に示す方法により測定した。
【０３２７】
ＴＮＰ特異的ＩｇＥを１００ｎｇ／ｍＬで添加したＢＭＭＣ培地にて、実施例１１で作製したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスそれぞれのＢＭＭＣを、１×１０６細胞／ｍＬ、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。培養後、ＢＭＭＣをカルシウム測定緩衝液〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１１５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ（純正化学社製）、５．４ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ（ナカライテスク社製）、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２（ナカライテスク社製）、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２（ナカライテスク社製）、１３．８ｍｍｏｌ／Ｌグルコース（ナカライテスク社製）、０．２％　ＢＳＡ（シグマ−アルドリッチ社製）、２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、シグマ−アルドリッチ社製）〕で２回洗浄したのち、最終濃度５μｍｏｌ／ＬのＦｌｕｏ−３　ＡＭ（モレキュラープローブズ社製）と最終濃度０．５％のプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７（シグマ−アルドリッチ社製）を加えたカルシウム測定緩衝液に懸濁して３７℃、５％　ＣＯ２条件下で１時間培養した。培養後、カルシウム測定緩衝液で２回洗浄し、２．５×１０５細胞／ｍＬになるようにカルシウム測定緩衝液で懸濁後、１００μｌずつ９６穴プレートに分注して、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で３０分培養した。培養後、（ａ）カルシウム測定緩衝液のみ添加、（ｂ）最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加、（ｃ）最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加する１０分前に最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加、もしくは（ｄ）最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＰ−ＢＳＡ（コスモバイオ社製）を添加した。（ａ）〜（ｄ）それぞれの細胞について、細胞内Ｃａ２＋量の指標として、ＦＤＳＳ　６０００（浜松ホトニクス社製）を用いて、励起波長４８０ｎｍによって生じる波長５３０ｎｍの蛍光を、ブルーダイクロイックミラーに透過させた後、吸光５２０〜５６０ｎｍフィルターで１分間測定した。
【０３２８】
図５０に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣではＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加による細胞内Ｃａ２＋量の増加が観察されたが、その増加はＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加の１０分前に最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した場合においても同様に観察され、アンタゴニストによる抑制は見られなかった。一方、図５１に示すように、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣではＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加による細胞内Ｃａ２＋量の増加が観察され、さらにその増加はＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加の１０分前に最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加することにより完全に抑制された。したがって、ヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストは、ＢＭＭＣにおいてＡ３アデノシン受容体を介した細胞内Ｃａ２＋の増加を抑制することが確認された。このことは通常のマウスのＢＭＭＣでは確認できなかったのに対し、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣを用いることにより初めて確認することができた。なお、両ＢＭＭＣにおいて、細胞に結合しているＴＮＰ特異的ＩｇＥの抗原であるＴＮＰ−ＢＳＡ添加により、細胞内Ｃａ２＋量の増加が観察され（図５０および５１）、抗原によるＩｇＥの架橋を介したマスト細胞の活性化が正常に起きていることを確認した。
【０３２９】
以上の結果より、通常のマウスでは不可能であったヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの薬理評価（細胞内Ｃａ２＋量測定）が、本発明のＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウスを用いることによって可能であることが明らかとなり、本マウスはヒトＡ３アデノシン受容体に対する特異的薬物の薬理評価に有用であることが示された。
【０３３０】
実施例１３　脱顆粒の測定によるヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの評価
Ａ３アデノシン受容体アゴニストおよびアンタゴニストのＢＭＭＣの脱顆粒に対する作用を、以下に記すＳｕｐａｊａｔｕｒａらの方法（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１６７，　４，　２００１）に準じた方法により、脱顆粒により細胞外に放出されたβヘキサミニダーゼ活性を指標に測定した。ＴＮＰ特異的ＩｇＥを１００ｎｇ／ｍＬで添加したＢＭＭＣ培地にて、実施例１１で作製したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスそれぞれ由来のＢＭＭＣを１×１０６細胞／ｍＬ、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。培養後、ＰＢＳで２回洗浄を行ない、Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液〔１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ（純正化学）、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ（ナカライテスク社製）、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４（国産化学）、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２（ナカライテスク社製）、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２（ナカライテスク社製）、０．１％　（ｗ／ｖ）　グルコース（ナカライテスク社製）、０．１％　（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ（シグマ）、ｐＨ７．４に調整〕に懸濁した。それぞれのＢＭＭＣに、（ａ）何も添加しない、（ｂ）最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡのみ添加（ｃ）ＢＭＭＣに脱顆粒を誘導するため、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＰ−ＢＳＡを添加、（ｄ）最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加して１分後に、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＰ−ＢＳＡを添加、（ｅ）最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した１分後に、最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加し、さらに１分後に最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＰ−ＢＳＡを添加、（ｆ）Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加せず、最終濃度１μｍｏｌ／ＬＫＦ２６７７７を添加した後に、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＰ−ＢＳＡを添加、の各条件で薬剤を添加した。（ａ）〜（ｆ）それぞれの細胞を３７℃で３０分間反応させた後、２０００ｇで５分間遠心分離して反応を停止させ、上清を回収した。回収した上清を、βヘキサミニダーゼの基質である４ｎｍｏｌ／Ｌのｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−グルコサミニド（シグマ−アルドリッチ社製）を含む４０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸（ナカライテスク社製）溶液（ｐＨ４．５に調整）に加えて３７℃で１時間保温した。保温後、等量の０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン（ナカライテスク社製）溶液（ｐＨ１０．７に調整）を加え、４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（バイオラッド）を用いて測定することにより、上清中のβヘキサミニダーゼ活性を測定した。
【０３３１】
図５２に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣはＴＮＰ刺激により脱顆粒が誘導された結果、細胞外にβヘキサミニダーゼを放出した。さらに、脱顆粒はＴＮＰ刺激前に最終濃度１μｍｏｌ／Ｌ　Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加することにより約２倍程度上昇した。しかし、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加の１分前に最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した場合においても、その脱顆粒は抑制されず同様に観察された。一方、図５３に示すように、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣではＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加によって脱顆粒が促進され、その促進はＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加の１０分前に最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加することにより完全に抑制された。したがって、ヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストは、Ａ３アデノシン受容体を介したＢＭＭＣの脱顆粒を抑制することが確認された。このことは通常のマウスのＢＭＭＣでは確認できなかったのに対し、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣを用いることにより初めて確認することができた。
【０３３２】
以上の結果より、通常のマウスでは不可能であったヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの薬理評価（脱顆粒測定）が、本発明のＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウスを用いることによって可能であることが明らかとなり、本マウスはヒトＡ３アデノシン受容体に対する特異的薬物の薬理評価に有用であることが示された。
【０３３３】
実施例１４　アポトーシス測定によるヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの評価
Ｈｉｒａｇｕｎらの方法（Ｃｌｉｎ．　Ｅｘｐ．　Ａｌｌｅｒｇｙ，　３０，　４３３，　２０００）に準じて、実施例１１で作製したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣおよびＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣを、ＰＷＭ−ＳＣＭ不含ＢＭＭＣ培地にて４×１０５細胞、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で４日間培養することによりアポトーシスを誘導し、４８時間後および９６時間後の生細胞数を測定した。その結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣの生存細胞数は培養４８時間後に約５０％、９６時間後には約２５％に減少し、培養時に最終濃度１００ｎｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加しても生存細胞数に変化はみられなかった（図５４）。一方、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣの生存細胞数は培養４８時間後に約５０％、９６時間後には約２５％に減少し、さらに培養時に最終濃度１００ｎｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加することにより培養４８時間後の細胞生存率は約３０％とさらに低下した（図５５）。
【０３３４】
上記の培養後４８時間の各ＢＭＭＣを、インサイチュ・アポトーシス検出キット（タカラバイオ社製）を用いてＴＵＮＥＬ染色を行ないアポトーシスを検出した。その結果、ＰＷＭ−ＳＣＭ不含ＢＭＭＣ培地で培養したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣの約５０％においてアポトーシスが観察された（図５６）。また、培養時に最終濃度１００ｎｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加してもアポトーシスの割合に変化はみられなかった（図５６）。一方、ＰＷＭ−ＳＣＭ不含ＢＭＭＣ培地で４８時間培養したＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣの約５０％においてアポトーシスが観察され、培養時に最終濃度１００ｎｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加するとアポトーシスを起こしている細胞の割合は約７０％に上昇した（図５７）。したがって、ヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストは、成長因子の欠乏により誘導されるＢＭＭＣのアポトーシスを促進することが確認された。このことは通常のマウスのＢＭＭＣでは確認できなかったのに対し、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣを用いることにより初めて確認することができた。
【０３３５】
以上の結果より、通常のマウスでは不可能であったヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの薬理評価（アポトーシス測定）が、本発明のＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウスを用いることによって可能であることが明らかとなり、本マウスはヒトＡ３アデノシン受容体に対する特異的薬物の薬理評価に有用であることが示された。
【０３３６】
実施例１５　膵臓細胞を用いたヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの評価
Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウスの膵臓細胞を用いて、Ａ３アデノシン受容体アゴニストならびアンタゴニストによる細胞内Ｃａ２＋量の変動を以下に示す方法により測定した。
【０３３７】
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスより膵臓を摘出後、ホモジェナイズにより膵臓細胞を単離した。単離したそれぞれの膵臓細胞について、（ａ）緩衝液のみ添加、（ｂ）最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加、（ｃ）最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加する１０分前に最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した場合それぞれの細胞内Ｃａ２＋濃度の変動を、実施例１２と同様にして測定した。図５８に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来膵臓細胞ではＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加による細胞内Ｃａ２＋量の増加が観察され、その増加はＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加の１０分前に最終濃度１００μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した場合においても同様に観察され、アンタゴニストによる抑制は見られなかった。一方、図５９に示すように、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来膵臓細胞ではＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加による細胞内Ｃａ２＋量の増加が観察され、さらにその増加はＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加の１０分前に最終濃度１００（ＭのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加することにより完全に抑制された。したがって、ヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストは、膵臓細胞においてＡ３アデノシン受容体を介した細胞内Ｃａ２＋の増加を抑制することが確認された。このことは通常のマウスのＢＭＭＣでは確認できなかったのに対し、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣを用いることにより初めて確認することができた。
【０３３８】
以上の結果より、通常のマウス由来膵臓細胞では不可能であったヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの薬理評価（細胞内Ｃａ２＋量測定）が、本発明のＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウスを用いることによって可能であることが明らかとなり、本マウスはヒトＡ３アデノシン受容体に対する特異的薬物の薬理評価に有用であることが示された。また、本評価により、ヒト膵臓細胞での細胞内情報伝達の異常によって引き起こされるヒト疾患にヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストが薬理効果を示す可能性が初めて示された。
【０３３９】
【発明の効果】
本発明により、ヒト７回膜貫通型受容体と非ヒト動物の該受容体のオーソログとで反応性が異なり、ヒト７回膜貫通型受容体に特異的に作用する物質の薬理評価を行なうことのできる非ヒト哺乳動物が提供される。
【０３４０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−発明者：山野和也；井上美保；佐藤光男；
発明者：市村通朗；政木茂浩
マウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号４−マウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号５−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号６−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号７−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号８−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号９−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号１０−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号１２−ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号１３−ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号１６−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号１７−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号１８−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号１９−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号２０−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号２１−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号２２−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号２３−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号２４−Ａ３受容体遺伝子の開始コドンの上流のマウスゲノムＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号２５−Ａ３受容体遺伝子の開始コドンの上流のマウスゲノムＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号２６−ヒトＡ３受容体ｃＤＮＡの開始コドンの下流のＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号２７−ヒトＡ３受容体ｃＤＮＡの開始コドンの下流のＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号２８−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号２９−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号３０−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号３１−キメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ作製用プライマー
配列番号３２−キメラＡ３アデノシン受容体をコードする塩基配列
配列番号３３−キメラＡ３アデノシン受容体のアミノ酸配列
配列番号３４−Ａ３Ｒ−Ｃ２構築用オリゴＤＮＡ
配列番号３５−Ａ３Ｒ−Ｃ２構築用オリゴＤＮＡ
配列番号３６−ｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２構築用オリゴＤＮＡ
配列番号３７−ｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２構築用オリゴＤＮＡ
配列番号３８−ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号３９−ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号４０−ＦＬＡＧタグを付加したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号４１−ＦＬＡＧタグを付加したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号４２−ＦＬＡＧタグを付加したキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号４４−マウスＡ３受容体遺伝子５’側プローブ増幅用プライマー
配列番号４５−マウスＡ３受容体遺伝子５’側プローブ増幅用プライマー
配列番号４７−マウスＡ３受容体遺伝子３’側プローブ増幅用プライマー
配列番号４８−マウスＡ３受容体遺伝子３’側プローブ増幅用プライマー
【０３４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明にて決定したマウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ配列と、公知であるマウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ配列を比較した結果を示す。下線は両者で異なる塩基配列を示している。
【図２】図２は、本発明にて決定したマウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列と、公知であるマウスＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列を比較した結果を示す。＊は両者で異なるアミノ酸配列を示している。
【図３】図３は、Ａ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１を含む約９ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡ配列に存在する、各制限酵素に対する認識配列を示す。
【図４】図４は、Ａ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２を含む約６．５ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡ配列に存在する、各制限酵素に対する認識配列を示す。
【図５】図５は、本発明で決定したＡ３アデノシン受容体遺伝子を含む約５．２ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡ配列、および公知であるＡ３アデノシン受容体遺伝子を含む約６ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡ配列の領域を示す。
【図６】図６は、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒの構築を示す。
【図７】図７は、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡで置換するためのターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１工程、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１の構築を示す。
【図８】図８は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第２工程、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−２の構築を示す。
【図９】図９は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第３工程、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−３の構築を示す。
【図１０】図１０は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第４工程、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−４の構築を示す。
【図１１】図１１は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第５工程、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１＋２の構築を示す。
【図１２】図１２は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第６工程、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−３＋４の構築を示す。
【図１３】図１３は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第７工程、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−１＋２＋３＋４の構築を示す。
【図１４】図１４は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第８工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１の構築を示す。
【図１５】図１５は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第９工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２の構築を示す。
【図１６】図１６は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１０工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ３の構築を示す。
【図１７】図１７は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１１工程、プラスミドｃＡ３Ｒ−Ｎの構築を示す。
【図１８】図１８は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１２工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ５の構築を示す。
【図１９】図１９は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１３工程、プラスミドａｒｍ１＋ｃＡ３Ｒ−Ｎの構築を示す。
【図２０】図２０は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１４工程、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−５の構築を示す。
【図２１】図２１は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１５工程、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−６の構築を示す。
【図２２】図２２は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１６工程、プラスミドｃｈｉｍｅｒａ−５＋６の構築を示す。
【図２３】図２３は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１７工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１の構築を示す。
【図２４】図２４は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１８工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ２の構築を示す。
【図２５】図２５は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第１９工程、プラスミドｃＡ３Ｒ−Ｃの構築を示す。
【図２６】図２６は、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡで置換するためのターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第２０工程、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築を示す。
【図２７】図２７は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第２１工程、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築を示す。
【図２８】図２８は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第２２工程、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築を示す。
【図２９】図２９は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第２３工程、プラスミドｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築を示す。
【図３０】図３０は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全２４工程）の第２４工程、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｃｈｉＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築を示す。
【図３１】図３１は、上段にキメラＡ３アデノシン受容体の模式図を、下段にヒトとマウスのＡ３アデノシン受容体のアミノ酸配列を示す。上段の実線はキメラＡ３アデノシン受容体中のヒトＡ３アデノシン受容体の領域を、点線はマウスＡ３アデノシン受容体の領域を示す。下段の下線はＡ３アデノシン受容体の細胞内領域を、アステリスクはヒトとマウスで共通するアミノ酸配列を、数字はそれぞれの段の右端のアミノ酸残基の番号を示す。
【図３２】図３２は、ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築（全４工程）の第１工程、プラスミドｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳの構築を示す。
【図３３】図３３は、ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築（全４工程）の第２工程、プラスミドｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＢＳの構築を示す。
【図３４】図３４は、ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築（全４工程）の第３工程、プラスミドｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ　ｉｎ　ｐＢＳの構築を示す。
【図３５】図３５は、ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築（全４工程）の第３工程、プラスミドｈＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築を示す。
【図３６】図３６は、キメラＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築（全３工程）の第１工程、プラスミドｃＡ３Ｒ（Ｎ）　ｉｎ　ｐＢＳの構築を示す。
【図３７】図３７は、キメラＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築（全３工程）の第２工程、プラスミドｃＡ３Ｒ（Ｃ）　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築を示す。
【図３８】図３８は、キメラＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築（全３工程）の第３工程、プラスミドｃＡ３Ｒ　ｉｎ　ｐＣＡＧの構築を示す。
【図３９】図３９は、ヒトＡ３アデノシン受容体またはキメラＡ３アデノシン受容体を一過的に発現させたマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１の、Ａ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する反応性（細胞内Ｃａ２＋の上昇量）を測定した結果を示す。横軸は時間（秒）で、矢印の時点でＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを細胞に添加した。縦軸はエクオリンの発光量で、細胞内Ｃａ２＋の上昇量を表す。●はヒトＡ３アデノシン受容体を発現させたＰ３Ｕ１細胞、▲はキメラＡ３アデノシン受容体を発現させたＰ３Ｕ１細胞、△はコントロールのＰ３Ｕ１細胞、□はＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加しなかったコントロールのＰ３Ｕ１細胞の測定結果である。
【図４０】図４０は、ヒトＡ３アデノシン受容体を安定発現させたマウスミエローマ細胞株（計４株）のＡ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する反応性（細胞内Ｃａ２＋の上昇量）を測定した結果を示す。横軸は時間（秒）で、矢印の時点でＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを細胞に添加した。縦軸はエクオリンの発光量で、細胞内Ｃａ２＋の上昇量を表す。●、▲、黒い四角および◆はヒトＡ３アデノシン受容体を安定発現させたＰ３Ｕ１細胞、□はコントロールのＰ３Ｕ１細胞の測定結果である。
【図４１】図４１は、キメラＡ３アデノシン受容体を安定発現させたマウスミエローマ細胞株（計９株）のＡ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する反応性（細胞内Ｃａ２＋の上昇量）を測定した結果を示す。横軸は時間（秒）で、矢印の時点でＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを細胞に添加した。縦軸はエクオリンの発光量で、細胞内Ｃａ２＋の上昇量を表す。●、○、▲、黒い四角、囲んだ×、△、◆、×および◇はヒトＡ３アデノシン受容体を安定発現させたＰ３Ｕ１細胞、□はコントロールのＰ３Ｕ１細胞の測定結果である。
【図４２】図４２は、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ５’が含むマウスゲノムＤＮＡのＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片の位置を模式的に示す。
【図４３】図４３は、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ３’が含むマウスゲノムＤＮＡのＮｈｅＩ断片の位置を模式的に示す。
【図４４】図４４は、Ａ３アデノシン受容体遺伝子周辺のマウスゲノム構造および、相同組換えによりマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子がキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換された時の同マウスゲノム構造を示す。
【図４５】図４５は、相同組換えによりマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子がキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換された時のマウスゲノム構造および、ＣｒｅリコンビナーゼによりｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列の間に存在する薬剤耐性マーカー（ＰＧＫプロモーター及びｈｐｒｔ遺伝子）が除去された時の同マウスゲノム構造を示す。
【図４６】図４６は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したヘテロ接合体マウスおよびホモ接合体マウスのゲノムＤＮＡに対する５’側プローブを使用したサザンハイブリダイゼーションの解析結果を示す。レーン１はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、レーン２はヘテロ接合体マウス、レーン３はホモ接合体マウスの結果を示す。
【図４７】図４７は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したヘテロ接合体マウスおよびホモ接合体マウスのゲノムＤＮＡに対する３’側プローブを使用したサザンハイブリダイゼーションの解析結果を示す。レーン１はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、レーン２はヘテロ接合体マウス、レーン３はホモ接合体マウスの結果を示す。
【図４８】図４８は、ＴＮＰ特異的ＩｇＥおよび抗ｃ−ｋｉｔ抗体を用いたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣのＦＡＣＳによる解析を示す。ａ）は未染色のＢＭＭＣ、ｂ）は抗体によって染色したＢＭＭＣのＦＡＣＳ解析結果を示す。縦軸はＰＥ標識した抗ｃ−ｋｉｔ抗体により染色された細胞の蛍光強度、横軸はＦＩＴＣ標識したＴＮＰ特異的ＩｇＥにより染色された細胞の蛍光強度を示す。
【図４９】図４９は、ＴＮＰ特異的ＩｇＥおよび抗ｃ−ｋｉｔ抗体を用いた、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウス由来ＢＭＭＣのＦＡＣＳによる解析を示す。ａ）は未染色のＢＭＭＣ、ｂ）は抗体によって染色したＢＭＭＣのＦＡＣＳ解析結果を示す。縦軸はＰＥ標識した抗ｃ−ｋｉｔ抗体により染色された細胞の蛍光強度、横軸はＦＩＴＣ標識したＴＮＰ特異的ＩｇＥにより染色された細胞の蛍光強度を示す。
【図５０】図５０は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣの細胞内Ｃａ２＋量の変動を示す。ａ）はカルシウム測定緩衝液のみを添加した結果、ｂ）は最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加した結果、ｃ）は最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを加える１０分前にヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した結果、ｄ）は最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＰ−ＢＳＡを添加した結果を示す。縦軸はＣａ２＋により励起されるＦｌｕｏ−３の波長５３０ｎｍの蛍光量を、薬物添加前の値を１．０とした相対値で示す。横軸は薬物添加後の時間を秒で示す。
【図５１】図５１は、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣの細胞内Ｃａ２＋量の変動を示す。ａ）はカルシウム測定緩衝液のみを添加した結果、ｂ）は最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加した結果、ｃ）は最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを加える１０分前にヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した結果、ｄ）は最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＰ−ＢＳＡを添加した結果を示す。縦軸はＣａ２＋により励起されるＦｌｕｏ−３の波長５３０ｎｍの蛍光量を、薬物添加前の値を１．０とした相対値で示す。横軸は薬物添加後の時間を秒で示す。
【図５２】図５２は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣの脱顆粒を示す。縦軸は細胞外に放出されたβヘキサミニダーゼ活性（全活性を１００％とする）を示す。黒のバーは最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加の場合、白のバーは非添加の場合を示す。
【図５３】図５３は、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣの脱顆粒を示す。縦軸は細胞外に放出されたβヘキサミニダーゼ活性（全活性を１００％とする）を示す。黒のバーは最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加の場合、白のバーは非添加の場合を示す。
【図５４】図５４は、ＰＷＭ−ＳＣＭ非含培地での培養時における、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣの細胞数変動を示す。縦軸は細胞数、横軸は培養開始からの時間（時間）を示す。▲は最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＨ２６７７７添加の場合、●は非添加の場合を示す。
【図５５】図５５は、ＰＷＭ−ＳＣＭ非含培地での培養時における、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣの細胞数変動を示す。縦軸は細胞数、横軸は培養開始からの時間（時間）を示す。▲は最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＨ２６７７７添加の場合、●は非添加の場合を示す。
【図５６】図５６は、ＴＵＮＥＬ染色により測定した、ＢＭＭＣ培地およびＰＷＭ−ＳＣＭ非含ＢＭＭＣ培地で４８時間培養したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣにおける、細胞のアポトーシス率を示す。縦軸はアポトーシスを示す細胞の割合（％）を示す。白のバーはＢＭＭＣ培地、黒のバーはＰＷＭ−ＳＣＭ非含ＢＭＭＣ培地での結果を示す。
【図５７】図５７は、ＴＵＮＥＬ染色により測定した、ＢＭＭＣ培地およびＰＷＭ−ＳＣＭ非含ＢＭＭＣ培地で４８時間培養したＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣにおける、細胞のアポトーシス率を示す。縦軸はアポトーシスを示す細胞の割合（％）を示す。白のバーはＢＭＭＣ培地、黒のバーはＰＷＭ−ＳＣＭ非含ＢＭＭＣ培地での結果を示す。
【図５８】図５８は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来膵臓細胞の細胞内Ｃａ２＋量の変動を示す。ａ）はカルシウム測定緩衝液のみを添加した結果、ｂ）は最終濃度１００μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加した結果、ｃ）は最終濃度１００μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを加える１０分前に最終濃度１００μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した結果を示す。縦軸はＣａ２＋により励起されるＦｌｕｏ−３の波長を薬物添加前の値を１．０とした相対値で示す。横軸は薬物添加後の時間を秒で示す。
【図５９】図５９は、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウス由来膵臓細胞の細胞内Ｃａ２＋量の変動を示す。ａ）はカルシウム測定緩衝液のみを添加した結果、ｂ）は最終濃度１００μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加した結果、ｃ）は最終濃度１００μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを加える１０分前に最終濃度１００μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した結果を示す。縦軸はＣａ２＋により励起されるＦｌｕｏ−３の波長を薬物添加前の値を１．０とした相対値で示す。横軸は薬物添加後の時間を秒で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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