(57)【要約】【課題】基底膜の構成蛋白等の細胞外マトリックス成分を効率よく産生できる、ＥＨＳ腫瘍由来細胞株等の壁側内胚葉様細胞株、及びその樹立方法、並びに上記壁側内胚葉様細胞株を用いた分泌蛋白の製造方法を提供する。【解決手段】ヒトラミニン用遺伝子等の外来の分泌蛋白用遺伝子を組み込んだＥＨＳ腫瘍由来細胞株等の壁側内胚葉様細胞株。上記構成は、ヒトラミニン用遺伝子等の外来の分泌蛋白用遺伝子が組み込まれているので、ヒト・マウスハイブリッドラミニン−８などの、従来、得られにくい種々な基底膜蛋白といった分泌蛋白を、効率よく大量調製でき、上記分泌蛋白を低コストにて供給できる。【選択図】　図１
2004135519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来の分泌蛋白用遺伝子が組み込まれていることを特徴とする壁側内胚葉様細胞株。
【請求項２】
外来の分泌蛋白用遺伝子は、ヒト分泌蛋白をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の壁側内胚葉様細胞株。
【請求項３】
外来の分泌蛋白用遺伝子は、ヒト基底膜をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の壁側内胚葉様細胞株。
【請求項４】
外来の分泌蛋白用遺伝子は、ヒトラミニンをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の壁側内胚葉様細胞株。
【請求項５】
ＥＨＳ腫瘍細胞由来のＥＨＳＰＥＬ細胞であることを特徴とする請求項１ないし４の何れかに記載の壁側内胚葉様細胞株。
【請求項６】
壁側内胚葉様細胞を動物内から取り出し、培養して得られる壁側内胚葉様細胞株の樹立方法において、
培養前に、赤血球を除去する工程を含むことを特徴とする壁側内胚葉様細胞株の樹立方法。
【請求項７】
壁側内胚葉様細胞を動物内から取り出し、培養して得られる壁側内胚葉様細胞株の樹立方法において、
培養前に、線維芽細胞を除去する工程を含むことを特徴とする壁側内胚葉様細胞株の樹立方法。
【請求項８】
壁側内胚葉様細胞を動物内から取り出し、培養して得られる壁側内胚葉様細胞株の樹立方法において、
フィブロネクチンにてコートされた皿上にて培養される工程を含むことを特徴とする壁側内胚葉様細胞株の樹立方法。
【請求項９】
壁側内胚葉様細胞に対して、外来の分泌蛋白用遺伝子を導入し、その後、選別薬剤を培地に加えて選別を行い、次に、選別薬剤を省いた培地に戻し、培養を継続して、外来の分泌蛋白用遺伝子を安定的に導入する壁側内胚葉様細胞株の樹立方法において、
外来の分泌蛋白用遺伝子の導入と、選別との間にて、上記壁側内胚葉様細胞の培養状態を維持して、上記壁側内胚葉様細胞がオーバーコンフルーエントになるまで培養することを特徴とする壁側内胚葉様細胞株の樹立方法。
【請求項１０】
請求項１ないし５の何れか１項に記載の壁側内胚葉様細胞株を用いて、外来の分泌蛋白用遺伝子に基づく分泌蛋白を産生することを特徴とする分泌蛋白の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし５の何れか１項に記載の壁側内胚葉様細胞株をマウス後肢に移植して、上記壁側内胚葉様細胞株を再形成させ、分泌蛋白を含む粗抽出物を産生することを特徴とする分泌蛋白の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基底膜の構成蛋白等の細胞外マトリックス成分を効率よく産生できる、ＥＨＳ腫瘍由来細胞株等の壁側内胚葉様細胞株及びその樹立方法、並びに壁側内胚葉様細胞株を用いた分泌蛋白の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、上皮細胞や実質細胞は、基底膜との接触による細胞表面のレセプター分子との相互作用により細胞の増殖・生存・分化が制御されていることを示す証拠が多く得られている。
【０００３】
基底膜の主要構成蛋白の一つであるラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖の三本の鎖からなるヘテロ３量体蛋白で、それぞれの鎖については、５種類、３種類（または４種類）、３種類のアイソフォームがそれぞれ知られている。
【０００４】
それらの組み合わせによって、種々な機能をそれぞれ示す各ラミニン−１ないし１２（１５、あるいは、それ以上）が構成されている。ラミニン−１は、α１β１γ１、ラミニン−２は、α２β１γ１、ラミニン−３は、α１β２γ１、ラミニン−４は、α２β２γ１、ラミニン−５は、α３β３γ２、ラミニン−６は、α３β１γ１、ラミニン−７は、α３β２γ１、ラミニン−８は、α４β１γ１、ラミニン−９は、α４β２γ１、ラミニン−１０は、α５β１γ１、ラミニン−１１は、α５β２γ１、ラミニン−１２は、α２β１γ３、ラミニン−１３は、α３β２γ３、ラミニン−１４は、α４β２γ３、ラミニン−１５は、α５β２γ３の各組み合わせである。
【０００５】
これらラミニンアイソフォームは、組織・発生段階において特異的な発現パターンを示すことから、細胞の増殖・生存・分化の制御に対して、独自の働きを有することが示唆されている。
【０００６】
ところが、上記従来の基底膜を用いて、基底膜の構成蛋白、特にラミニンの大量調製が困難であるという問題を生じている。つまり、基底膜は、殆どの場合、その厚さが１００ｎｍ程度に保たれているため、基底膜の構成蛋白、特にラミニンの大量調製が困難である。
【０００７】
唯一、例外的に、マウスのＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍においては、図９に示すように、その腫瘍をマウスにおいて移植継代することにより得られる腫瘍から、基底膜の主要構成蛋白である、ラミニン−１を３−１０ｍｇ／ｍｌ濃度にて含む粗抽出物が容易に得られることが知られている。この粗抽出物は、ラミニン−１の精製の原料としてのみならず、様々な細胞の培養やアッセイに広く使用されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来では、基底膜の構成蛋白、特に、ラミニン−１以外の種々なラミニンは、その大量調製が困難であることから、高価なものとなっており、それを用いた、細胞の増殖・生存・分化に関する研究は、上記コスト高により阻害されているという問題を生じている。
【０００９】
つまり、ＥＨＳ腫瘍では、ラミニン−１を大量に産生することが知られているが、ラミニン−１以外のラミニンの産生は極めて少ない、あるいは検出感度以下の生産量である。そのようなラミニン−１以外のラミニンとしてのラミニン−１０／１１（ラミニン−１０とラミニン−１１との混合物）は、ヒトの胎盤から抽出されるが、そのラミニン含有量は少量で、また抽出法も複雑であるので、極めて高価でコスト高なものとなっている。よって、それらを用いた、細胞の増殖・生存・分化に関する研究は、上記コスト高により阻害されているという問題を生じている。
【００１０】
本発明の目的は、種々なラミニンを、効率よく大量調製できるＥＨＳ腫瘍由来等の壁側内胚葉様細胞株及びその樹立方法、遺伝子導入法、並びに上記壁側内胚葉様細胞株を用いた分泌蛋白の製造方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の壁側内胚葉様細胞株は、以上の課題を解決するために、外来の分泌蛋白用遺伝子が組み込まれていることを特徴としている。上記壁側内胚葉様細胞株においては、外来の分泌蛋白用遺伝子は、ヒト分泌蛋白をコードする遺伝子であってもよい。上記壁側内胚葉様細胞株では、外来の分泌蛋白用遺伝子は、ヒト基底膜をコードする遺伝子であってもよい。上記壁側内胚葉様細胞株においては、外来の分泌蛋白用遺伝子は、ヒトラミニンをコードする遺伝子であってもよい。
【００１２】
上記構成によれば、ヒトラミニン用遺伝子等の外来の分泌蛋白用遺伝子を導入することにより、ヒト・マウスハイブリッドラミニン−８などの種々な基底膜蛋白といった分泌蛋白を、効率よく大量調製できる。
【００１３】
上記壁側内胚葉様細胞株は、ＥＨＳ腫瘍細胞由来のＥＨＳＰＥＬ細胞であってもよい。
【００１４】
本発明に係る、壁側内胚葉様細胞株の樹立方法は、前記の課題を解決するために、壁側内胚葉様細胞を動物内から取り出し、培養して得られる壁側内胚葉様細胞株の樹立方法において、培養前に、赤血球を除去する工程を含むことを特徴としている。
【００１５】
本発明に係る、壁側内胚葉様細胞株の他の樹立方法は、前記の課題を解決するために、壁側内胚葉様細胞を動物内から取り出し、培養して得られる壁側内胚葉様細胞株の樹立方法において、培養前に、線維芽細胞を除去する工程を含むことを特徴としている。
【００１６】
本発明に係る、壁側内胚葉様細胞株のさらに他の樹立方法は、前記の課題を解決するために、壁側内胚葉様細胞を動物内から取り出し、培養して得られる壁側内胚葉様細胞株の樹立方法において、フィブロネクチンにてコートされた皿上にて培養される工程を含むことを特徴としている。
【００１７】
上記方法によれば、上記各工程の少なくとも一つを含むことで、外来の分泌蛋白用遺伝子を安定的に導入できる壁側内胚葉様細胞株を得ることができ、外来の分泌蛋白用遺伝子に基づく、ヒト・マウスハイブリッドラミニン−８などの種々な基底膜蛋白といった分泌蛋白を、効率よく大量調製できる壁側内胚葉様細胞株が得られる。
【００１８】
本発明に係る、壁側内胚葉様細胞株のさらに他の樹立方法は、前記の課題を解決するために、壁側内胚葉様細胞に対して、外来の分泌蛋白用遺伝子を導入し、その後、選別薬剤を培地に加えて選別を行い、次に、選別薬剤を省いた培地に戻し、培養を継続して、外来の分泌蛋白用遺伝子を安定的に導入する壁側内胚葉様細胞株の樹立方法において、外来の分泌蛋白用遺伝子の導入と、選別との間にて、上記壁側内胚葉様細胞の培養状態を維持して、上記壁側内胚葉様細胞がオーバーコンフルーエントになるまで培養することを特徴としている。
【００１９】
上記方法によれば、外来の分泌蛋白用遺伝子の導入と、選別との間にて、上記壁側内胚葉様細胞の培養状態を維持して、上記壁側内胚葉様細胞がオーバーコンフルーエントになるまで培養することによって、外来の分泌蛋白用遺伝子を安定的に導入した壁側内胚葉様細胞をより確実に樹立できる。
【００２０】
本発明に係る、分泌蛋白の製造方法は、前記の課題を解決するために、上記の何れかに記載の壁側内胚葉様細胞株を用いて、外来の分泌蛋白用遺伝子に基づく分泌蛋白を産生することを特徴としている。
【００２１】
本発明に係る、分泌蛋白の他の製造方法は、前記の課題を解決するために、上記の何れかに記載の壁側内胚葉様細胞株をマウス後肢に移植して、上記壁側内胚葉様細胞株を再形成させ、分泌蛋白を含む粗抽出物を産生することを特徴としている。
【００２２】
上記方法によれば、外来の分泌蛋白用遺伝子に基づく、ヒト・マウスハイブリッドラミニン−８などの種々な基底膜蛋白といった分泌蛋白を、効率よく大量調製できる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明に係るＥＨＳ腫瘍由来等の壁側内胚葉様細胞株、及びその樹立方法、並びに上記壁側内胚葉様細胞株を用いた蛋白の製造方法における実施の形態について図１ないし図９に基づいて説明すれば、以下の通りである。
【００２４】
まず、本発明に係る、ＥＨＳ腫瘍由来の壁側内胚葉様細胞株（ＥＨＳＰＥＬ細胞株）について、その樹立方法に基づいて以下に説明する。最初に、図９に示すように、ＥＨＳ腫瘍を、Ｃ５７ＢＬ６系マウスの各後肢に移植し、増殖させた後、上記各後肢から切り出し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）中にてかみそり（ｒａｚｏｒ）にて細かく切り、３．４Ｕ／ｍｌ濃度の動物組織培養用プロテアーゼ（ディスパーゼＩＩ（登録商標）、ｄｉｓｐａｓｅ　ＩＩ、ロッシュ製）による消化によって付着蛋白を除去して細胞を得た。上記細胞は、順次、１８−、２１−、２３−ゲージの針内を通過させて選別され、遠心分離によって集められた。
【００２５】
ペレット状の上記細胞は、それに混入している赤血球を破壊して除去するために、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．２と１４０ｍＭのＮＨ４Ｃｌとを含む溶液中に再度分散される。混入している赤血球の除去により、細胞の生存率を向上できる。
【００２６】
続いて、上記細胞はＰＢＳ中にて入念に洗浄された。その後、上記細胞に混入している線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を除去するために、上記細胞は、プラスチック皿上に覆うように載置され、１５分後に、上記皿に接着しなかった細胞が集められた。上記の線維芽細胞を除去するため操作を、さらに、２度繰り返した。このように線維芽細胞を除去することによって、線維芽細胞のｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈに起因する上記細胞の生存率の劣化を回避できる。
【００２７】
上記の接着しない細胞は、最終的に、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）にてコートされたペトリ皿（ＩＷＡＫＩ製、日本）上に、１層状に敷き詰められ、下記の培養液中で培養された。フィブロネクチンは、細胞の接着が強く、上記細胞が比較的よく伸長し、培養を促進できる。
【００２８】
上記培養液は、Ｋａｉｇｈｎ改変Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２の栄養素混合液に対して、２％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ、ウシ胎児血清）、ＩＴＸ−Ｓ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ−ｓｅｌｅｎｉｕｍ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，　ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）、牛の下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　Ｅｘｔｒａｃｔ，　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｍｉｔｏ＋　Ｓｅｒｕｍ　Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、および上皮成長因子が添加されたもの（第一培養液）である。
【００２９】
上記培養液としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とＨａｍ’ｓ／Ｆ−１２培地とを含み、さらに、上記各培地に対して、低濃度のＦＢＳ、ｉｎｓｕｌｉｎ、ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ、ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ、ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、上皮成長因子、牛の下垂体抽出物（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｓｅｒｕｍ　Ｅｘｔｅｎｄｅｒ、ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅが添加されたもの（第二培養液）でもよい。
【００３０】
第一培養液は、第二培養液と比べて、ピルビン酸やアミノ酸含量が多く（約４倍量）、ＥＨＳ腫瘍細胞や、ＥＨＳＰＥＬ細胞において、解糖系酵素の発現が低いという知見に基づいて、改善を加えたものである。
【００３１】
ＥＨＳＰＥＬ細胞は、図２（ａ）および（ｃ）に示すような形態の細胞で、細胞を取り除くと、ペトリ皿（ｄｉｓｈ）に細胞外マトリックスが沈着していることが、光学顕微鏡レベルでも観察できる（図２（ｂ）および（ｄ）参照）
次に、ＥＨＳＰＥＬ細胞株のｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ（外来の分泌蛋白遺伝子の導入株）の樹立について、図１に基づいて説明する。ＥＨＳＰＥＬ細胞株は低い細胞密度で培養しようとすると、ほとんど増殖しなくなってしまう。通常、ｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔを得るためには、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、細胞密度を低くしてｓｅｌｅｃｔｉｏｎをする。しかし、ＥＨＳＰＥＬのｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔを得るためには、以下のような方法をとった。
１）培養細胞を１０４／ｃｍ２程度で播き、外来の分泌蛋白遺伝子を有するプラスミド（ｃＤＮＡ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ，　（ＱＩＡＧＥＮ）により、上記培養細胞に対して上記の分泌蛋白遺伝子を導入する。
２）通常は、ｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔを得る場合、翌日に、遺伝子を導入した培養細胞を５−１０倍に薄めて再播種するが、再播種せずに、またｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｒｅａｇｅｎｔ（選別薬剤）も加えず、そのままの培養状態を維持して、４−７日間、培養細胞がｏｖｅｒｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（数層に重層した状態）になるまで培養する（２−３×　ｄｏｕｂｌｉｎｇ　ｔｉｍｅ）。
３）続いて、上記培養細胞に対し、ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｒｅａｇｅｎｔ（選別薬剤）として、ゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｇ４１８）を２００μｇ／ｍｌにて用いたｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（選別）を、２日ないし４日間行った後、ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｒｅａｇｅｎｔを含まない培養液（ｍｅｄｉｕｍ）に戻し、培養を継続、遺伝子導入から約４週間後に、上記培養細胞のｃｏｌｏｎｙを得た。上記ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｒｅａｇｅｎｔとしては、導入遺伝子に応じて、他に、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎやｐｕｒｏｍｙｃｉｎを用いてもよい。
【００３２】
このような状況で得られるｃｏｌｏｎｙはｃｌｏｎａｌｉｔｙに問題があるが、以下の理由でｓｉｎｇｌｅ　ｃｌｏｎｅと考えた。
１）ＥＧＦＰ融合蛋白を遺伝子導入した場合において、ｃｏｌｏｎｙ全体が均一な蛍光を示したｃｌｏｎｅがいくつか認められた（図１（ａ）参照）。
２）ヒト・マウスハイブリッドラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）−８を高発現するクローンの培養を続けたが、（低発現細胞が混入している場合などに予測されるような）発現量の低下は見られない（図１（ｂ）参照）。さらに、このｃｏｌｏｎｙ（コロニー）から得られた細胞１×１０６個を、Ｃ５７ＢＬ６マウスの後肢に移植することにより、腫瘍の再形成を認めた。
【００３３】
本発明に係る、壁側内胚葉様細胞株としてのＥＨＳＰＥＬ細胞株と、壁側内胚葉様細胞に分化したＦ９細胞株に関する、基底膜成分の産生・沈着について免疫組織染色法を用いて検証した。上記分化は、培地（ＤＭＥＭ　１０％　Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ）に対して、１μＭのａｌｌ　ｔｒａｎｓ　ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　と１ｍＭのｄｉｂｕｔｙｌｙｌ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰとを加えることにより誘導される。
【００３４】
まず、未分化および分化した各Ｆ９細胞株、並びにＥＨＳＰＥＬ細胞株を、４％のｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定、その後、抗ラミニン抗体あるいは抗コラーゲンＩＶ抗体と反応。蛍光二次抗体と反応の後、コンフォーカル顕微鏡で観察した。その結果、図３に示すように、基底膜成分が多く産生され、沈着しているのが分かる（実際は、蛍光で緑色であるが、図では白色部分にて示されている）。
【００３５】
続いて、未分化および分化した各Ｆ９細胞株、並びにＥＨＳＰＥＬ細胞株のラミニン産生量の評価について説明する。まず、各細胞株、１×１０６個の細胞に対して１０ｍｌの前記培養液（ｍｅｄｉｕｍ）を加え、４８時間後に回収、上記培養液１０μｌを、市販されている標品（ＥＨＳラミニン）とともに電気泳動して、上記培養液中に分泌されたラミニンをそれぞれ定量した。その結果を図４に示した。上記結果から、分化したＦ９細胞株、およびＥＨＳＰＥＬ細胞株は、ＥＨＳ腫瘍に匹敵するラミニン産生量を示す。
【００３６】
次に、ＥＨＳＰＥＬ細胞株による組み換えラミニンα４−ＥＧＦＰ融合蛋白遺伝子の発現について調べた。
【００３７】
まず、ヒトラミニンα４−ＥＧＦＰ融合蛋白を発現するプラスミド（ｃＤＮＡ）をｅｆｆｅｃｔｅｎｅ　（ＱＩＡＧＥＮ）により導入した後、蛍光顕微鏡で観察した。その結果から、図５（ａ）および（ｂ）に示すように、細胞質の他、細胞外にマトリックス状に蛍光を発する蛋白（分泌蛋白）が沈着していて、大量の分泌蛋白の産生と沈着（外部への分泌）が観察された。
【００３８】
続いて、さらに遺伝子導入効率を上げるために、ヒトラミニンα４−ＥＧＦＰ融合蛋白を発現する組み換えアデノウイルス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　ＡｄｅｎｏＸ　を用いた）を作成し、ＥＨＳＰＥＬ細胞株に感染させて、ヒトラミニンα４−ＥＧＦＰ融合蛋白を発現する遺伝子を導入した。
【００３９】
図６（ａ）に、蛍光顕微鏡による観察結果を、図６（ｂ）および（ｃ）に、培地のＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ結果を示す。図６（ｂ）が、抗ラミニン抗体（内在性のラミニン−１および、ヒト・マウスハイブリッドラミニン−８を認識）中の抗ヒトα４抗体によるブロット（非還元）、図６（ｃ）は、ヒトα４抗体によるブロット（還元）である。これらの結果から、ＥＨＳＰＥＬ細胞株に、外来の分泌蛋白遺伝子を導入した場合、外来の蛋白を効率よく発現・分泌できることが明らかである。
【００４０】
次に、壁側内胚葉様細胞を用いた組み換え分泌蛋白発現の有用性を検証した結果を説明する。
【００４１】
３種類の壁側内胚葉様細胞株である、ＥＨＳＰＥＬ細胞株、壁側内胚葉分化Ｆ９細胞、ＰＹＳ２細胞株、および、３種類の非壁側内胚葉様細胞、Ａ５４９細胞株、Ｔ９８Ｇ細胞株、ＪＥＧ３細胞株に同じく、前述した組み換えアデノウイルスをそれぞれ感染させて観察した。
【００４２】
図７に示すように、上記の各壁側内胚葉様細胞株では、細胞間にもラミニンα４サブユニット由来の分泌蛋白が沈着していることが分かる。Ａ５４９およびＴ９８Ｇの各細胞株では、細胞内にラミニンα４サブユニット由来の分泌蛋白を産生する細胞数が多いことから、壁側内胚葉様細胞よりも高い遺伝子導入効率がうかがえるが、細胞外へのラミニンα４サブユニット由来の分泌蛋白の沈着は認められない。
【００４３】
これらの結果から、上記の各壁側内胚葉様細胞株は、産生した蛋白を容易に外部に分泌することにより、上記蛋白の産生およびその利用や調製に有用であることが分かる。
【００４４】
さらに、これら細胞株の培養上清を抗ヒトα４抗体によりＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　（非還元）した結果を、図８に示した。図８の結果から、ＥＨＳＰＥＬ細胞株、分化Ｆ９細胞株、ＰＹＳ２細胞株では、培地中にヒト・マウスハイブリッドラミニン−８が分泌されているが、Ａ５４９およびＴ９８Ｇの各細胞株では先に述べたように、遺伝子導入効率がより高いにもかかわらず、前述した組み換えアデノウイルスをそれぞれ強く感染させても、ヒト・マウスハイブリッドラミニン−８分泌はほとんど認められない。
【００４５】
続いて、上記の各壁側内胚葉様細胞株に関する遺伝子発現パターンの解析結果について説明する。
【００４６】
レチノイン酸とｃＡＭＰ処理により壁側内胚葉細胞に分化するＦ９細胞の未分化状態のもの、壁側内胚葉状態のもの、およびＥＨＳＰＥＬ細胞よりＲＮＡを抽出、ランダムプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを作成後、各遺伝子に特異的なプライマーおよび、セファイド社のＲｅａｌ−ｔｉｍｅ　ｓｍａｒｔ　ｃｙｃｌｅｒを用いて、各遺伝子の発現をそれぞれ定量した。それらの結果を、表１および表２にそれぞれ示した。
【００４７】
【表１】
2004135519.tif 000003
【００４８】
【表２】
2004135519.tif 000004
【００４９】
Ｆ９細胞の壁側内胚葉細胞に分化にともない発現が上昇する遺伝子群（マトリックス遺伝子、転写因子、分子シャペロン、など）が、ＥＨＳＰＥＬ細胞株においても高く発現していることから、ＥＨＳＰＥＬ細胞株等の壁側内胚葉様細胞株は、マトリックス産生に特化した細胞であると考えられる。
【００５０】
上記のように、ＥＨＳ腫瘍由来の細胞から、外来の分泌遺伝子が導入可能で、培養可能なＥＨＳＰＥＬ細胞株を樹立した。さらにこのＥＨＳＰＥＬ細胞株の遺伝子発現パターンの解析から、このＥＨＳＰＥＬ細胞株が、ｐａｒｉｅｔａｌ　ｅｎｄｏｄｅｒｍ細胞（壁側内胚葉）細胞の性質を持つ細胞株であることを明らかとした。
【００５１】
壁側内胚葉細胞が、齧歯類においてライヒェルト膜（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ’ｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）と呼ばれる、非常に厚い基底膜様構造を作り上げることはよく知られているが、本発明者らは、遺伝子発現パターンの解析から、ＥＨＳＰＥＬ細胞株がラミニンなどマトリックス成分遺伝子群のみならず、分子シャペロン、蛋白修飾酵素、小胞体輸送に関連する蛋白の遺伝子などが、高く発現する事を見いだし、いわば、このＥＨＳＰＥＬ細胞株、並びに、その関連と考えられる壁側内胚葉細胞が、“マトリックス産生に特化した工場“としての性質を持つ分子的基盤を明らかにした。
【００５２】
本発明者らが樹立したＥＨＳＰＥＬ細胞株に類似した細胞としては、米国特許第５，３５４，６６６号公報（Ｉｏｚｚｏら、公開日は１９９４年１０月１１日）に開示された細胞が挙げられる。ただ、Ｉｏｚｚｏらは、この細胞をむしろ、基底膜成分の分泌機構などの研究に有用として主張しており、上記公報には、基底膜成分大量産生系としての利用という発想について何ら開示も示唆もされていない。実際、上記米国特許公報において、この細胞のラミニン産生量の記載も、その当時に外来の分泌蛋白遺伝子の導入という概念もあった筈であるがそのような発想についても何ら開示も示唆もされていない。
【００５３】
このほかに、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社は、ＥＨＳ腫瘍由来細胞により産生されたＥＨＳ　Ｎａｔｒｉｘという細胞外マトリックスを製品として販売しているが、同じくＥＨＳ腫瘍由来細胞を組み換え分泌蛋白の産生系として利用するという発想は全く持っていないことが推察される。
【００５４】
以前、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社に対してＥＨＳ　Ｎａｔｒｉｘという製品およびその原料となる細胞の内容を問い合わせたところ、彼らが使用している細胞は、米国特許第５，３５４，６６６号公報（Ｉｏｚｚｏら）に記載のものではなく、同じく米国のＧ．　ＭａｒｔｉｎあるいはＨｙｎｄａ　Ｋｌｅｉｎｍａｎ（ｍａｔｒｉｇｅｌの特許を保持：米国特許第４，８２９，０００号公報、公開日は１９８９年５月９日）の許可を得て、調製されているとの返答を得ている。
【００５５】
本発明者らはＥＨＳＰＥＬ細胞株を用いて、
１．ラミニンα４サブユニット−ＥＧＦＰ融合蛋白遺伝子を導入することにより、この細胞が蛍光マトリックスを培養皿に沈着することすなわちゲル状マトリックス産生能を保持することと、そこに外来蛋白を組み込むことができることを確認した。
２．ＥＨＳＰＥＬ細胞にヒトラミニンα４鎖を安定的に組み込んだ細胞株を樹立した。この細胞を動物に再接種することにより、マトリックス成分を大量に含む腫瘍を再形成させることができた。この腫瘍から、組み換えの、例えばヒト・マウスハイブリッドラミニン−８を大量に含むＥＨＳ腫瘍粗抽出物を得ることが可能であると考えられる。この粗抽出物は、半組み換えヒト・マウスハイブリッドラミニン−８精製の原料としてのみならず、ヒト・マウスハイブリッドラミニン−８含有基底膜成分マトリックスとして、そのまま細胞工学などに利用することが可能であると予測される。
３．２．と同様の方法でラミニンα５サブユニットを導入することにより、半組み換えラミニン−１０精製の原料／ラミニン−１０含有粗抽出物を調整することが可能であると考えられる。同様にα３サブユニットを導入してラミニン−６の産生、α２サブユニットを導入してラミニン−２の産生がそれぞれ可能であると考えられる。
４．壁側内胚葉細胞由来細胞（ＥＨＳＰＥＬ、分化Ｆ９、ＰＹＳ２細胞など）にラミニンα４−ＥＧＦＰ融合蛋白の遺伝子を導入すると他の細胞群よりも効率よく、ハイブリッドあるいは半組み換えヒト・マウスハイブリッドラミニン−８を産生し、外部に分泌して、マトリックスとして沈着することを示した。
【００５６】
また、ＥＨＳ腫瘍の粗抽出物（マトリゲル）はラミニン−１精製の原料としてのみならず、さまざまな細胞の培養やアッセイに広く使用されている。ここにラミニン−１を構成するサブユニット（遺伝子）以外のラミニンサブユニットを組み込むことにより、もともとのＥＨＳ腫瘍の粗抽出物と異なる細胞特異性を持つ培養基質として使用できる製品を製造することが産業上可能となる。例えばラミニン−８を含むマトリゲルは、血管内皮細胞や脂肪細胞の培養に有効である可能性があり、ラミニン−１０を含むマトリゲルは、通常のマトリゲルよりも強い細胞接着活性・細胞生存の支持などを示すことが予測される。
【００５７】
それゆえ、本発明は、壁側内胚葉由来細胞に対して、外来の分泌蛋白遺伝子を導入することにより、人工高機能基底膜成分含有ゲル・遺伝子組み換え分泌蛋白を効率よく、大量に産生できて、上記分泌蛋白を低コスト化できる。
【００５８】
前記のＦ９細胞株とは、１２９／Ｓｖマウス６日胚を精巣内に移植することにより発生したテラトカルシノーマＯＴＴ６０５０−９７０の幹細胞をクローン化したものである（Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．７０，　ｐｐ２９８８−２９９２，　ｐｐ３８９９−３９０３（１９７３）参照）。
【００５９】
前記のＡ５４９細胞株とは、ヒト肺癌細胞株である（Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ，　Ｖｏｌ．１７，　ｐｐ６２−７０（１９７６）参照）。前記のＪＥＧ３細胞株とは、ヒトの妊娠性絨毛癌の肺転移巣よりヌードマウスを経由して樹立されたものである（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒ．，　Ｖｏｌ．３２，　ｐｐ６８３−６８７（１９７１）参照）。
【００６０】
前記のＰＹＳ２細胞株は、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　（１９７４　Ａｕｇ．），　８４（１），　ｐｐ．１３−２７　（Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ａｍｕｒｉｎｅ　ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，　Ｌｅｈｍａｎ　Ｊ．Ｍ．，　Ｓｐｅｅｒｓ　Ｗ．Ｃ．，　Ｓｗａｒｔｚｅｎｄｒｕｂｅｒ　Ｄ．Ｅ．，　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｇ．Ｂ．）、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　（１９８２　Ｆｅｂ．），　９２（２），　ｐｐ．３５７−３６７　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕａｌ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｏｈｅｐａｒａｎ　ｓｕｌｆａｔｅｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｂｙ　ＰＹＳ−２，　ａ　ｂａｓｅｍｅｎｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ，　Ｏｏｈｉｒａ　Ａ，　Ｗｉｇｈｔ　Ｔ．Ｎ．，　ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ　Ｊ．，　Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ　Ｐ．）に記載のものである。
【００６１】
前記のＴ９８Ｇ細胞株は、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　（１９７９），　９９，　ｐｐ．４３−５４，　ＰｕｂＭｅｄ：７９２１６６０９　（Ｔ９８Ｇ：　ａｎ　ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｔｈａｔ　ｅｘｈｉｂｉｔｓ　ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｐｈａｓｅ　Ｇ１　ａｒｒｅｓｔ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．，　ＲＦ３２７６８，　Ｓｔｅｉｎ　Ｇ．Ｈ．）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．　（１９９２）　５２，　ｐｐ．２５２３−２５２９　ＰｕｂＭｅｄ：　９２２３３４１４　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｈｏｒｔ　ａｒｍ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　９　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｍａｓ，　ＲＦ３３４９７，　Ｏｌｅｏｐａｄｅ　ｅｔ　ａｌ．）　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　（１９９７）　５７，　ｐｐ．３５２６−３５３１　ＰｕｂＭｅｄ：　９７４１３６３８　（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ　ｂａｓｉｃ　ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ　ｔｕｍｏｒｓ，　ＲＦ４２１５５，　Ｒｏｓｔｍｉｌｙ　ＲＣ　ｅｔ　ａｌ．）に記載のものである。
【００６２】
【発明の効果】
本発明の壁側内胚葉様細胞株は、以上のように、ヒトラミニンをコードする遺伝子（サブユニット）等の外来の分泌蛋白用遺伝子が組み込まれている構成である。
【００６３】
それゆえ、上記構成は、ヒトラミニンをコードする遺伝子（サブユニット）等の外来の分泌蛋白用遺伝子が組み込まれているので、ヒト・マウスハイブリッドラミニン−８などの種々な基底膜蛋白といった分泌蛋白を、効率よく大量調製でき、上記分泌蛋白を低コスト化できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る、外来の分泌蛋白遺伝子（ｌａｍｉｎｉｎ−α４−ＥＧＦＰ融合遺伝子）が導入された壁側内胚葉様細胞株としてのＥＨＳＰＥＬ細胞株における、分泌蛋白としてのヒト・マウスハイブリッドラミニン−８の産生を示す図であって、（ａ）の左側は細胞株の外来遺伝子由来の蛍光蛋白の安定導入を示す平面図であり、（ａ）の右側は細胞株の光学顕微鏡像を示す平面図であり、（ｂ）はｌａｍｉｎｉｎ−α４に由来するラミニン−８の産生を示す電気泳動図である。
【図２】（ａ）〜（ｄ）は、上記ＥＨＳＰＥＬ細胞株の形態を示す平面図である。
【図３】（ａ）〜（ｄ）は、Ｆ９細胞株との比較により、上記ＥＨＳＰＥＬ細胞株による基底膜成分（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン）の産生・沈着を示す平面図である。
【図４】上記ＥＨＳＰＥＬ細胞株、およびＦ９細胞株のラミニン分泌を示す電気泳動図である。
【図５】（ａ）および（ｂ）は、上記ＥＨＳＰＥＬ細胞株に対する一時的遺伝子導入の効率を示す平面図であり、（ｃ）および（ｄ）は、上記ＥＨＳＰＥＬ細胞株に対する、外来の分泌蛋白遺伝子（ｌａｍｉｎｉｎ−α４−ＥＧＦＰ融合遺伝子）の導入を示す平面図である。
【図６】（ａ）は、上記ＥＨＳＰＥＬ細胞株に対する、外来の分泌蛋白遺伝子（ｌａｍｉｎｉｎ−α４−ＥＧＦＰ融合遺伝子）発現組み換えアデノウイルスによる、遺伝子導入を示す平面図であり、（ｂ）、（ｃ）は、上記導入を示す電気泳動図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、上記各壁側内胚葉様細胞株への組み換えアデノウイルスによる、遺伝子導入を示す平面図であり、（ｄ）〜（ｆ）は、それぞれ、非壁側内胚葉様細胞株への組み換えアデノウイルスによる、遺伝子導入を示す平面図である。
【図８】上記各壁側内胚葉様細胞株への組み換えアデノウイルスによる、遺伝子導入に起因するラミニン産生の有用性を示す電気泳動図である。
【図９】（ａ）は、上記ＥＨＳ腫瘍のマウス内での培養を示す平面図であり、（ｂ）は、上記マウスにおける腫瘍部の解剖結果の平面図であり、（ｃ）は、上記ＥＨＳ腫瘍の細胞の平面図であり、（ｄ）はラミニン産生を示す平面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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