(57)【要約】【目的】土壌微生物のモニタリングを簡易に行う。【構成】本発明に係る酵素活性の評価方法においては、まず、油汚染土からサンプルを採取する（１０１）。次に、篩を通過したサンプルを所定量秤取し、これを滅菌中型試験管に入れる（１０３）。次に、滅菌中型試験管内に緩衝液及びＩＮＴ溶液を０．３ｍｌ添加し、ミキサーで１０秒間攪拌して処理物質とする（１０４）。次に、処理物質を滅菌中型試験管内で攪拌させ、静置培養する（１０５）。次に、培養物質から抽出された濾液のＡ４８５を分光分析計で測定する（１０６）。一方、ＩＮＴフォルマザン標準溶液から標準曲線を別途作成しておく（１０７）。次に、上述した濾液のＡ４８５の測定結果を標準曲線に適用し、濾液中のフォルマザンを定量する（１０８）。次に、該定量値から油汚染土内のデヒドロゲナーゼ活性を評価する（１０９）。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
油汚染土に含まれる油分を酵素活性を利用して分解させながら前記油汚染土内の酵素活性を測定する方法であって、前記油汚染土からサンプルを採取し、該サンプルを所定の容器に入れるとともに該容器内に緩衝液及びＩＮＴ（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液を添加して処理物質とし、該処理物質を前記容器内で攪拌させた後、静置培養して培養物質とし、該培養物質から抽出された濾液のＡ４８５（４８５ｎｍの光に対する吸光度）を測定し、ＩＮＴフォルマザン（５−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−１−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−ｐｈｅｎｙｌ  ｆｏｒｍａｚａｎ）標準溶液から作成された標準曲線と前記測定結果とを比較することによって前記濾液中のフォルマザンを定量し、該定量値から前記油汚染土内のデヒドロゲナーゼ活性を評価することを特徴とする油汚染土内における酵素活性の評価方法。
【請求項２】
前記油汚染土からのサンプルの採取工程から前記デヒドロゲナーゼ活性の評価工程に至る一連の工程を所定期間ごとに繰り返し行う請求項１記載の油汚染土内における酵素活性の評価方法。
【請求項３】
請求項２記載の油汚染土内における酵素活性の評価方法を用いた微生物分解方法であって、前記評価工程で前記デヒドロゲナーゼ活性が低下したと評価されたとき、バイオレメディエーション操作における栄養分、通気、温度、ｐＨ、水分調整、光等の培養環境が適切かどうかを判断し、不適切であれば前記培養環境を修正することを特徴とする微生物分解方法。
【請求項４】
請求項２記載の油汚染土内における酵素活性の評価方法を用いた微生物分解方法であって、前記評価工程で前記デヒドロゲナーゼ活性が低下したと評価されたとき、バイオレメディエーション操作における栄養分、通気、温度、ｐＨ、水分調整、光等の培養環境が適切かどうかを判断し、適切であれば前記油分の分解が終了に近いか又は終了したと判断して前記一連の工程を中断し、バイオレメディエーションを終了することを特徴とする微生物分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオレメディエーションにおける微生物のモニタリングに適用される油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
工場跡地等を再利用する場合、基礎工事を行う際、燃料油等の油分やトリクロロエチレンなどの有機塩素化合物といった汚染物質が掘削土に混じって搬出されることがある。また、何らかの事故によって地盤が汚染物質で汚染されるといった事態も想定される。
【０００３】
かかる汚染土をそのまま放置すると、該土に混入している汚染物質が周囲に拡散し、周辺住民の生活に支障を来すとともに、雨水によって土粒子から遊離した場合には、地下水等に混入して水質を汚濁させる原因ともなる。そのため、かかる汚染土については、例えば洗浄によって除去し環境への拡散を防止する必要がある。
【０００４】
一方、最近では、微生物の活性を利用して環境中の汚染物質を分解無害化するバイオレメディエーションの研究が進んできており、油、有機塩素化合物等で汚染された土壌への適用も研究されるようになってきた。
【０００５】
バイオレメディエーションとは、細菌やかびなどの微生物の分解能力を利用して汚染物質を分解し、無害化する方法であり、汚染物質が含まれた土壌などを微生物の活動に最適な水分・栄養・通気などの環境に調整して微生物の活性を向上させることにより、自然状態よりも効率よく汚染物質の分解を行うことができる。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００３−３８１９９号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
一方、バイオレメディエーションによって汚染物質を分解するにあたっては、その分解状況を把握するべく、微生物のモニタリング、すなわち微生物を計数することが不可欠となる。
【０００８】
このような微生物のモニタリングは、従来、培養法、直接計数法、遺伝子解析法などによって行われていたが、培養法は、培養条件によって検出する微生物が限定されたり、有害物質を分解する微生物については培養期間が長くなり計数判定に一ヶ月程度を要するなどの問題を生じていた。
【０００９】
さらに、直接計数法では、染色液によっては土粒子との区別が難しかったり、生菌、死菌の区別なく計数されてしまったりするという問題や、遺伝子解析法では、土壌中の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する効率が悪いという問題を生じていた。
【００１０】
本発明は、上述した事情を考慮してなされたもので、汚染土内の汚染物質を微生物分解する際、バイオレメディエーションの効果を確認するための土壌微生物のモニタリングを簡易に行うことが可能な油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法は請求項１に記載したように、油汚染土に含まれる油分を酵素活性を利用して分解させながら前記油汚染土内の酵素活性を測定する方法であって、前記油汚染土からサンプルを採取し、該サンプルを所定の容器に入れるとともに該容器内に緩衝液及びＩＮＴ（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液を添加して処理物質とし、該処理物質を前記容器内で攪拌させた後、静置培養して培養物質とし、該培養物質から抽出された濾液のＡ４８５（４８５ｎｍの光に対する吸光度）を測定し、ＩＮＴフォルマザン（５−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−１−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−ｐｈｅｎｙｌ  ｆｏｒｍａｚａｎ）標準溶液から作成された標準曲線と前記測定結果とを比較することによって前記濾液中のフォルマザンを定量し、該定量値から前記油汚染土内のデヒドロゲナーゼ活性を評価するものである。
【００１２】
また、本発明に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法は、前記油汚染土からのサンプルの採取工程から前記デヒドロゲナーゼ活性の評価工程に至る一連の工程を所定期間ごとに繰り返し行うものである。
【００１３】
また、本発明に係る微生物分解方法は、請求項２記載の油汚染土内における酵素活性の評価方法を用いた微生物分解方法であって、前記評価工程で前記デヒドロゲナーゼ活性が低下したと評価されたとき、バイオレメディエーション操作における栄養分、通気、温度、ｐＨ、水分調整、光等の培養環境が適切かどうかを判断し、不適切であれば前記培養環境を修正するものである。
【００１４】
また、本発明に係る微生物分解方法は、請求項２記載の油汚染土内における酵素活性の評価方法を用いた微生物分解方法であって、前記評価工程で前記デヒドロゲナーゼ活性が低下したと評価されたとき、バイオレメディエーション操作における栄養分、通気、温度、ｐＨ、水分調整、光等の培養環境が適切かどうかを判断し、適切であれば前記油分の分解が終了に近いか又は終了したと判断して前記一連の工程を中断し、バイオレメディエーションを終了するものである。
【００１５】
微生物、植物根系、動物遺体から派生した酵素は、土壌中のさまざまな有機無機成分の変換に関与しているが、土壌中に所定の酵素が存在するかどうかは、その酵素が特異的に触媒する反応の有無やその程度を測定することで調べることができる。
【００１６】
すなわち、酵素の存在量は、上述した特異的触媒反応における反応速度に比例するという性質を利用して測定することが可能であり、特異的触媒反応における単位時間当たりの反応産物の生成または基質の減少速度が酵素活性と呼ばれている。
【００１７】
ここで、従来、土壌中のデヒドロゲナーゼ活性を測定する方法が知られている。すなわち、デヒドロゲナーゼは、基質をＡＨ、電子受容体をＢとすると下記の脱水素反応を触媒することが既に知られている。
【００１８】
【式１】
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【００１９】
ここで、Ａは酸化された基質、ＢＨは還元された受容体であり、電子受容体Ｂは、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）、又は２−（Ｐ−ヨードフェニル）−３−（Ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロタイド（ＩＮＴ）が用いられ、基質Ａはグルコースが用いられる。
【００２０】
一方、本発明においては、基質Ａとしてグルコースを使用せず、油汚染土に含まれる油分を基質Ａとするものである。
【００２１】
すなわち、本出願人は、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）による酸化還元反応の触媒作用を利用することによって、油汚染土の分解状況を評価できないかという点に着眼し、さまざまな実験を繰り返した結果、デヒドロゲナーゼの触媒作用を利用して油汚染土内の油分、ひいてはバイオレメディエーションの進捗状況を評価することができる新規な発明をなしたものである。
【００２２】
ちなみに、従前のデヒドロゲナーゼ活性の測定方法で基質Ａとして用いられるグルコースは言うまでもなく、単糖類（炭水化物のうち、加水分解によってそれ以上小さな単位にならないもの）の一種であって、ブドウ糖とも別称される物質であり、本発明の基質である油分とは、全く異なる物質である。
【００２３】
また、脱水素酵素といっても、脱水素による酸化還元反応をすべて触媒できるわけではなく、触媒として関与できるかどうかは、基質と電子受容体との組み合わせに大きく依存する。
【００２４】
すなわち、グルコースを基質とし、ＩＮＴ溶液を電子受容体とする酸化還元反応にデヒドロゲナーゼが触媒として作用することが知られていても、基質が変われば、ＩＮＴ溶液を電子受容体とした酸化還元反応をデヒドロゲナーゼが触媒できるかどうかは、本来、当業者にとっても推測することすら不可能である。
【００２５】
本出願人は、上述した着眼の下、基質が油分である場合にも電子受容体をＩＮＴ溶液としてデヒドロゲナーゼ活性を測定することができるというきわめて有意義な知見を得たものであることを付言しておく。
【００２６】
本発明に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法においては、まず、油汚染土からサンプルを採取する。
【００２７】
ここで、サンプルの採取は、油汚染土内の油分を微生物分解している工程、言い換えれば油汚染土にバイオレメディエーションを行っている工程の任意の時期に行えばよい。
【００２８】
油汚染土内のデヒドロゲナーゼ活性を測定する対象となる酵素は、油分及びＩＮＴの酸化還元反応を触媒できるのであれば、どのような脱水素酵素でもかまわないし、土中菌由来であるか、外来菌由来であるかも問わない。
【００２９】
バイオレメディエーションを行うにあたっては、油分を酸化分解する酵素活性ができるだけ高くなるよう、栄養分や水分を随時補給するとともにｐＨ等を適宜維持し、好気性細菌由来の酵素であれば、十分な通気（酸素）を確保する。
【００３０】
次に、採取したサンプルを所定の容器に入れるとともに、該容器内に緩衝液及びＩＮＴ（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液を添加して処理物質とする。
【００３１】
ＩＮＴ溶液は、光に不安定であることが多いため、使用しないときは冷暗所に保存しておくのが望ましい。
【００３２】
次に、処理物質を容器内で攪拌させ、しかる後、静置培養して培養物質とする。
【００３３】
攪拌は、撹拌器、振とう器等を用いても良いし、攪拌効果が得られる限り、容器を手で振るようにしてもかまわない。
【００３４】
静置培養期間、すなわちインキュベーション時間は、基本的には任意であって培養に必要十分な時間を適宜設定すればよいが、本出願人が実験を繰り返した結果、従前のデヒドロゲナーゼ活性測定方法におけるインキュベーション時間（６時間）では不十分であることが判明し、１０〜２０時間程度確保するのが望ましいことがわかった。
【００３５】
これは、基質の違い、すなわち反応系の違いに起因するものであると思われ、この点からも、本発明が従前のデヒドロゲナーゼ活性測定方法とは本質的に異なるものであることがわかる。
【００３６】
次に、培養物質から抽出された濾液のＡ４８５（４８５ｎｍの光に対する吸光度）を分光分析計で測定する。
【００３７】
一方、ＩＮＴフォルマザン（５−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−１−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−ｐｈｅｎｙｌ  ｆｏｒｍａｚａｎ）標準溶液から標準曲線を別途作成しておく。
【００３８】
標準曲線（検量線）は、ＩＮＴフォルマザン標準溶液に対し、上述したと同様にＡ４８５（４８５ｎｍの光に対する吸光度）を分光分析計で測定し、その測定値である吸光度をフォルマザンの濃度に関連付けてプロットすればよい。標準曲線を作成するにあたっては、殺菌土壌の吸光度をＩＮＴフォルマザン標準溶液の測定結果から差し引くことでいわゆるバックグランド補正を行う。
【００３９】
次に、上述した濾液のＡ４８５（４８５ｎｍの光に対する吸光度）の測定結果を標準曲線に適用し、濾液中のフォルマザンを定量する。
【００４０】
次に、該定量値から油汚染土内のデヒドロゲナーゼ活性を評価する。
【００４１】
油汚染土内における酵素活性の評価方法は、バイオレメディエーションを行っている油汚染土に対して任意の時期に行うことができるが、前記油汚染土からのサンプルの採取工程から前記デヒドロゲナーゼ活性の評価工程に至る一連の工程を所定期間ごとに繰り返し行うようにすれば、デヒドロゲナーゼ活性の時間的変動を定量的に把握することが可能となり、それをバイオレメディエーション操作にフィードバックすることが可能となる。
【００４２】
すなわち、本発明に係る微生物分解方法においては、上述した評価工程でデヒドロゲナーゼ活性が増大していると判断された場合には、油分が順調に分解されていると判断できるので、バイオレメディエーション操作を変更せず、上述した一連の工程を繰り返せばよい。
【００４３】
一方、上述した評価工程で前記デヒドロゲナーゼ活性が低下したと評価されたとき、バイオレメディエーション操作における栄養分、通気、温度、ｐＨ、水分調整、光等の培養環境が適切かどうかを判断し、不適切であれば前記培養環境を修正し、適切であれば前記油分の分解が終了に近いか又は終了したと判断して前記一連の工程を中断し、バイオレメディエーションを終了する。
【００４４】
なお、デヒドロゲナーゼ活性が低下する原因としては、バイオレメディエーションの進行に伴う栄養分の枯渇が最も可能性が高い。したがって、デヒドロゲナーゼ活性が低下した場合、まず栄養分の補給を行うことが望ましい。
【００４５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法の実施の形態について、添付図面を参照して説明する。なお、従来技術と実質的に同一の部品等については同一の符号を付してその説明を省略する。
【００４６】
図１は、本実施形態に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法の手順を示したフローチャートである。同図でわかるように、本実施形態に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法においては、まず、油汚染土からサンプルを採取する（ステップ１０１）。
【００４７】
ここで、サンプルの採取は、バイオレメディエーション中の油汚染土を対象とする。
【００４８】
バイオレメディエーションを行うにあたっては、油分分解作用を有する酵素活性ができるだけ高くなるよう、栄養分や水分を随時補給するとともにｐＨ等を適宜維持し、好気性細菌由来の酵素であれば、十分な通気（酸素）を確保する。
【００４９】
次に、採取したサンプルから粗粒分を取り除くべく、数ｍｍ程度、例えば２ｍｍの篩に通す（ステップ１０２）。
【００５０】
次に、篩を通過したサンプルを所定量、例えば１ｇ秤取し、これを所定の容器である滅菌中型試験管に入れる（ステップ１０３）。
【００５１】
次に、滅菌中型試験管内に下記のように作製した緩衝液０．７ｍｌ及びＩＮＴ（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液０．３ｍｌをそれぞれ添加し、ミキサーで１０秒間攪拌して処理物質とする（ステップ１０４）。
【００５２】
緩衝液は、ｔｒｉｓｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  １．５ｇを５０ｍｌの滅菌蒸留水に溶解するとともに、１ｍｏｌ／ｌの塩酸でｐＨ７．６に調整し、濃度を０．２５ｍｏｌ／ｌとした。
【００５３】
ＩＮＴ溶液は、２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩＮＴ）１ｇを８０ｍｌの滅菌蒸留水に溶解するとともに、滅菌水で１００ｍｌにメスアップする（濃度１％）。メスアップした後は、ＩＮＴ溶液が光に不安定であることが多いため、使用するまで冷暗所に保存しておく。
【００５４】
次に、処理物質を、温度を３０゜Ｃとして遮光条件下で静置培養し、培養物質とする（ステップ１０５）。
【００５５】
静置培養期間、すなわちインキュベーション時間は、従前のデヒドロゲナーゼ活性測定方法で行われている６時間では不十分であり、本実施形態では測定の便宜も考慮して１８時間とした。
【００５６】
このインキュベーション時間の差は、従前のデヒドロゲナーゼ活性では基質をグルコースとしたのに対し、本実施形態では基質を油分としたことによって反応系が異なるものになったことに起因するものと考えられる。
【００５７】
次に、培養物質から抽出された濾液のＡ４８５（４８５ｎｍの光に対する吸光度）を分光分析計で測定する（ステップ１０６）。
【００５８】
濾液を抽出するにあたっては、まず、静置培養した滅菌中型試験管にメタノールを約９ｍｌ加え、１分間攪拌した後、Ｎｏ．５Ｃの濾紙で濾過した。
【００５９】
一方、ＩＮＴフォルマザン（５−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−１−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−ｐｈｅｎｙｌ  ｆｏｒｍａｚａｎ）標準溶液から標準曲線を別途作成しておく（ステップ１０７）。
【００６０】
ＩＮＴフォルマザン標準溶液は、５−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−１−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−ｐｈｅｎｙｌ  ｆｏｒｍａｚａｎ  １０ｍｇをメタノール約８０ｍｌに溶解し、メタノールで１００ｍｌにメスアップする。ＩＮＴフォルマザン標準溶液も、光に不安定であるため、使用するまで冷暗所に保存しておく。
【００６１】
標準曲線（検量線）は、予めＩＮＴフォルマザン標準溶液をメタノールで希釈して１００×１０−６ｇ／ｍｌ（１００ｍｃｇ／ｍｌ）の溶液を作製し、さらにメタノールで希釈して、１２．５、２５、５０、１００×１０−６ｇ／ｍｌ（ｍｃｇ／ｍｌ）の４種類の溶液を作製しておき、かかる溶液に対し、上述したと同様にＡ４８５（４８５ｎｍの光に対する吸光度）を分光分析計で測定し、その測定値である吸光度をフォルマザンの濃度に関連付けてプロットすればよい。標準曲線を作成するにあたっては、殺菌土壌の吸光度をＩＮＴフォルマザン標準溶液の測定結果から差し引くことでいわゆるバックグランド補正を行う。
【００６２】
次に、上述した濾液のＡ４８５（４８５ｎｍの光に対する吸光度）の測定結果を標準曲線に適用し、濾液中のフォルマザンを定量する（ステップ１０８）。
【００６３】
次に、該定量値から油汚染土内のデヒドロゲナーゼ活性を評価する（ステップ１０９）。
【００６４】
次に、デヒドロゲナーゼ活性の評価の結果、該活性が増大しているのであれば（ステップ１１０，ＹＥＳ）、油分が順調に分解されていると判断できるので、バイオレメディエーション操作を変更せず、所定期間後、再び、油汚染土からのサンプルの採取工程（ステップ１０１）からデヒドロゲナーゼ活性の評価工程（ステップ１０９）に至る一連の工程を繰り返し行う。
【００６５】
一方、デヒドロゲナーゼ活性が低下している場合には（ステップ１１０，ＮＯ）、バイオレメディエーション操作における栄養分、通気（酸素）、温度、ｐＨ、水分調整、光等の培養環境が適切かどうかを判断する（ステップ１１１）。
【００６６】
判断の結果、培養環境が不適切であれば（ステップ１１１，ＮＯ）、培養環境を修正した上（ステップ１１２）、上述した一連の工程を繰り返す。
【００６７】
デヒドロゲナーゼ活性が低下する原因として、バイオレメディエーションの進行に伴う栄養分の枯渇が最も可能性が高い。したがって、デヒドロゲナーゼ活性が低下した場合、まず栄養分の補給を行うという修正を行うことが考えられる。
【００６８】
また、判断の結果、培養環境が適切であれば（ステップ１１１，ＹＥＳ）、油分の分解が終了に近いか又は終了したと判断して上述した一連の工程を中断し、バイオレメディエーションを終了する（ステップ１１３）。
【００６９】
以上説明したように、本実施形態に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法によれば、バイオレメディエーションを行っている油汚染土内の油分分解状況を現地にて簡易に知ることができる。
【００７０】
すなわち、バイオレメディエーションを行っている油汚染土からサンプルを採取し、該サンプルを緩衝液及びＩＮＴ溶液とともに滅菌中型試験管に入れて攪拌し、これを静置培養した後、分光分析計で吸光度を計測し、該計測結果を、別途作成しておいた標準曲線に当てはめてフォルマザンを定量しデヒドロゲナーゼ活性を評価することにより、油分の分解の程度を知ることが可能となるとともに、標準曲線は、最初に一度作成しておけば足りるので、現地で行う必要がある工程は簡易な工程に限られるとともに、使用する機器も分光分析計だけなので、微生物等の専門家でなくても、油汚染土のデヒドロゲナーゼ活性を確実かつ容易に知ることが可能となる。
【００７１】
また、本実施形態にかかる油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法によれば、油汚染土からのサンプルの採取工程からデヒドロゲナーゼ活性の評価工程に至る一連の工程を所定期間ごとに繰り返し行うようにしたので、デヒドロゲナーゼ活性の時間的変動を定量的に把握することができる。
【００７２】
そのため、それをバイオレメディエーション操作にフィードバックすることにより、栄養分の補給時期を遅滞なく知ることができるとともに、油分分解の終了をも知ることが可能となる。
【００７３】
本実施形態では、油汚染土からのサンプルの採取工程からデヒドロゲナーゼ活性の評価工程に至る一連の工程を所定期間ごとに繰り返し行うようにしたが、バイオレメディエーション中の所定時期だけに上述した一連の工程を適用するようにしてもかまわない。かかる構成においても、その時点における油汚染土のデヒドロゲナーゼ活性を測定することができることには上述の実施形態と何ら変わりはない。
【００７４】
次に、本実施形態に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法の作用効果を以下の通り、実験で確認した。
【００７５】
まず、バイオレメディエーション処理を行っている油汚染土において、油分濃度が異なる２つの区域を処理区Ａ、処理区Ｂと定め、これらの処理区Ａ，Ｂに対し、上述した手順でデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
【００７６】
ここで、処理区Ａは、Ｃ重油で汚染された区域であってノルマルヘキサンで抽出すると、油分濃度が４７００ｍｇ／ｋｇであり、処理区Ｂは、同じくＣ重油で汚染された区域であってノルマルヘキサンで抽出すると、油分濃度が９２００ｍｇ／ｋｇであった。
【００７７】
これらの処理区Ａ，Ｂでは、バイオレメディエーション開始時に栄養分を添加し、通常はシートで覆うことで水分の蒸散を防ぎつつ、週に二回、畝状に形成された油汚染土を攪拌した。
【００７８】
図２は、バイオレメディエーション開始からの経過日数とフォルマザン濃度との関係を処理区Ａ，Ｂについてそれぞれ示したグラフである。処理区Ａは正方形で、処理区Ｂは円でそれぞれプロットしてある。
【００７９】
同図から、バイオレメディエーションが開始してから２ヶ月までは、フォルマザン濃度が増加していることがわかる。これは、油汚染土内の微生物活性が上昇することによりフォルマザンの濃度が増加したことを示すものである。
【００８０】
図３は、バイオレメディエーション開始からの経過日数と油分含有量（ソクステック（登録商標）による測定）との関係を示したグラフである。図２と同様、処理区Ａは正方形で、処理区Ｂは円でそれぞれプロットした。
【００８１】
これらのグラフから、バイオレメディエーション開始から二ヶ月までの間に処理区Ａ，Ｂにおいて油分濃度が減少しており、図１で示したフォルマザン濃度の増大と整合していることがわかる。
【００８２】
一方、三ヶ月経過した時点の測定では、フォルマザン濃度が処理区Ａ，Ｂとも大きく低下していることが図２でわかる。
【００８３】
そこで、上述した手順に従ってバイオレメディエーション操作を行った。
【００８４】
すなわち、上述したようにデヒドロゲナーゼ活性が低下したことがわかったため（ステップ１１０，ＮＯ）、バイオレメディエーション操作における培養環境が不適切であると判断し（ステップ１１１，ＹＥＳ）、栄養分として硝酸態窒素を三ヶ月目に追加する培養環境の修正を行った（ステップ１１２）。
【００８５】
図４は、バイオレメディエーションの経過日数に伴う硝酸態窒素の濃度変化をプロットしたグラフであり、二ヶ月目に硝酸態窒素が枯渇していることがわかる。
【００８６】
バイオレメディエーション操作の培養環境を修正してから一ヶ月後（最初から起算すれば４ヶ月後）、再び、油汚染土からのサンプルの採取工程（ステップ１０１）からデヒドロゲナーゼ活性の評価工程（ステップ１０９）に至る一連の工程を行った。
【００８７】
その結果、図２でわかる通り、処理区Ａでは、培養環境を修正したにもかかわらず、デヒドロゲナーゼ活性が低下しているので（ステップ１１１，ＮＯ）、基質である油分の分解が終了に近いか又は終了していると判断し、バイオレメディエーションを終了する（ステップ１１３）。なお、油分の分解がほぼ終了していることは、図３でわかる通り、実際に確認できた。
【００８８】
一方、処理区Ｂでは、図２でわかる通り、培養環境を修正した結果、デヒドロゲナーゼ活性が増大したので（ステップ１１０，ＹＥＳ）、油分の分解は未だ終了していないと判断し、上述した一連の工程を繰り返しつつ、バイオレメディエーションを継続した。なお、油分の分解が未だ終了していないことは、図３でわかる通り、実際に確認できた。
【００８９】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法によれば、バイオレメディエーションを行っている油汚染土内の油分分解状況を現地にて簡易に知ることができる。すなわち、バイオレメディエーションを行っている油汚染土からサンプルを採取し、該サンプルを緩衝液及びＩＮＴ溶液とともに容器に入れて攪拌し、これを静置培養した後、分光分析計で吸光度を計測し、該計測結果を、別途作成しておいた標準曲線に当てはめてフォルマザンを定量しデヒドロゲナーゼ活性を評価することにより、油分の分解の程度を知ることが可能となるとともに、標準曲線は、最初に一度作成しておけば足りるので、現地で行う必要がある工程は簡易な工程に限られるとともに、使用する機器も分光分析計だけなので、微生物等の専門家でなくても、油汚染土のデヒドロゲナーゼ活性を確実かつ容易に知ることが可能となる。
【００９０】
また、油汚染土からのサンプルの採取工程からデヒドロゲナーゼ活性の評価工程に至る一連の工程を所定期間ごとに繰り返し行うようにしたので、デヒドロゲナーゼ活性の時間的変動を定量的に把握することができる。そのため、それをバイオレメディエーション操作にフィードバックすることにより、栄養分の補給時期を遅滞なく知ることができるとともに、油分分解の終了をも知ることが可能となる。
【００９１】
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施形態に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法の手順を示したフローチャート。
【図２】本実施形態に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法の作用効果を示すグラフ。
【図３】本実施形態に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法の作用効果を示すグラフ。
【図４】本実施形態に係る油汚染土内における酵素活性の評価方法及びそれを用いた微生物分解方法の作用効果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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