(57)【要約】【課題】新規な３’−ｔＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドを用いて３’−ｔＲＮａｓｅを簡便かつ均一に作成するための遺伝子工学材料、並びにこれらを用いて作成される新規な組換え３’−ｔＲＮａｓｅを提供する。【解決手段】遺伝子ＥＬＡＣ１の発現産物、または遺伝子ＥＬＡＣ２発現産物の少なくともＣ末端側ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを保有する組換え発現ベクター、この組換え発現ベクターによる形質転換細胞、および前記の組換え発現ベクターの発現産物である組換え３’−ｔＲＮａｓｅ。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子ＥＬＡＣ１の発現産物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
遺伝子ＥＬＡＣ２発現産物の少なくともＣ末端側ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２のポリヌクレオチドを保有する組換え発現ベクター。
【請求項４】
請求項３の組換え発現ベクターによる形質転換細胞。
【請求項５】
請求項３の組換え発現ベクターの発現産物である組換え３’−ｔＲＮａｓｅ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分】
この出願の発明は、ＲＮＡ分子の３’側を特異的に切断するエンドヌクレアーゼ（３’−ｔＲＮａｓｅ）を簡便かつ確実に製造するために有用なポリヌクレオチドと、その遺伝子工学的材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＲＮＡ分子や、ｔＲＮＡ／タンパク質複合体の構造解析等には、均一のＲＮＡ分子を大量に精製することが必要とされているが、このようなＲＮＡ工学においては、ＲＮＡ分子を特異的に切断する酵素（リボヌクレアーゼ：ＲＮａｓｅ）が必須である。
【０００３】
リボヌクレアーゼは、ＲＮＡ鎖の末端から切断してモノヌクレオチドを生成するエキソヌクレアーゼと、内部の３’，５’−ホスホジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼとに大別される。さらにエンドヌクレアーゼには、ピリミジン残基やプリン残基、あるいは任意の塩基を特異的に認識して切断するものと、ＲＮＡのプロセッシングに関わるものが知られている。
【０００４】
この出願の発明者は、ｔＲＮＡの３’プロセッシングに作用する新規なエンドヌクレアーゼ（３’−ｔＲＮａｓｅ）を発明している（特許文献１、非特許文献１）。
【０００５】
この３’−ｔＲＮａｓｅは、比較的大きな形態で転写される前駆体ｔＲＮＡ（ｐｒｅ−ｔＲＮＡ）から３’末端部を除去する役割を持つ酵素である。この酵素はｐｒｅ−ｔＲＮＡを識別ヌクレオチドのすぐ下流で開裂し（非特許文献１、２）、その箇所にＣＣＡ残基が追加されて成熟したｔＲＮＡが作られる。ほ乳類の３’−ｔＲＮａｓｅに独特な特徴としては、酵素と３’開裂ｔＲＮＡの間の複合体が４塩基を認識するＲＮＡカッター（ＲＮａｓｅ  ６５）として機能しうる点、そして３’−ｔＲＮａｓｅにはＲＮＡ干渉の背後にある鍵酵素（非特許文献３）のように、小さなガイドＲＮＡに誘導されて任意のＲＮＡを任意の部位で開裂する能力がある点などが挙げられる（非特許文献４、５、６）。またこの出願の発明者らは、これまでに哺乳類の３’  ｔＲＮａｓｅについて、さまざまなｐｒｅ−ｔＲＮＡ類やｐｒｅ−ｔＲＮＡ様複合体との酵素相互作用に焦点を合わせつつ研究を行っている（非特許文献１、２、４−６、７、８）。
【０００６】
一方、遺伝子ＥＬＡＣ２／ＨＰＣ２は、前立腺癌感受性の候補遺伝子としてクローニングされている（非特許文献９）。遺伝子上の２種類のコモンミスセンス変異は、前立腺癌の発症に対して有意に高い相関関係がある（非特許文献９。１０）。配列分析によれば、ＥＬＡＣ２には進化的に保存された金属依存性の加水分解酵素がコードされていることが示唆されるが（非特許文献９、１１）、この遺伝子産物はＤＮＡらせん内架橋修復タンパク質のファミリーに類似しており（非特許文献１２）、これは癌感受性に対する潜在的な役割に通じるとみられる。しかしながら、この遺伝子ＥＬＡＣ２発現産物の真の機能は全く知られていない。
【０００７】
【特許文献１】
特開平０９−０１９２８９号公報
【非特許文献１】
Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３，  ３６４２−３６４７  （１９９５）．
【非特許文献２】
Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５，  １１４８−１１５５  （１９９７）．
【非特許文献３】
ＭｃＭａｎｕｓ，  Ｍ．  Ｔ．  ＆  Ｓｈａｒｐ，  Ｐ．  Ａ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３，  ７３７−７４７  （２００２）．
【非特許文献４】
Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．  ＲＮＡ  ２，  ５２３−５３４  （１９９６）．
【非特許文献５】
Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｇｅａｒｙ，  Ｓ．，  Ｔａｍｕｒａ，  Ｍ．  ＆  Ｋａｓｐａｒ，  Ｒ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６，  ２５６５−２５７１  （１９９８）．
【非特許文献６】
Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４７２，  １７９−１８６  （２０００）．
【非特許文献７】
Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｔａｍｕｒａ，  Ｍ．  ＆  Ｋａｓｐａｒ，  Ｒ．  Ｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８７，  ７２７−７４０  （１９９９）．
【非特許文献８】
Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｔａｍｕｒａ，  Ｍ．  ＆  Ｋａｓｐａｒ，  Ｒ．  Ｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，  １２０８９−１２０９６  （１９９９）．
【非特許文献９】
Ｔａｖｔｉｇｉａｎ，  Ｓ．  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２７，  １７２−１８０  （２００１）．
【非特許文献１０】
Ｒｅｂｂｅｃｋ，  Ｔ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６７，  １０１４−１０１９  （２０００）．
【非特許文献１１】
Ｍｅｌｉｎｏ，  Ｓ．，  Ｃａｐｏ，  Ｃ．，  Ｄｒａｇａｎｉ，  Ｂ．，  Ａｃｅｔｏ，  Ａ．  ＆  Ｐｅｔｒｕｚｚｅｌｌｉ，  Ｒ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２３，  ３８１−３８２  （１９９８）．
【非特許文献１２】
Ｎｉｅｇｅｍａｎｎ，  Ｅ．  ＆  Ｂｒｅｎｄｅｌ，  Ｍ．  Ｍｕｔａｔ．  Ｒｅｓ．  ３１５，  ２７５−２７９  （１９９４）．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明者は、先願発明の３’−ｔＲＮａｓｅについてさらに研究を続け、特に３’−ｔＲＮａｓｅ  ｃＤＮＡのクローニングを目的として研究を行った結果、ヒト前立腺癌感受性遺伝子ＥＬＡＣ２がこの３’−ｔＲＮａｓｅをコードすることを見いだした。さらに発明者は、このＥＬＡＣ２  ｃＤＮＡを用いてＥＬＡＣ２発現産物（３’−ｔＲＮａｓｅ）の欠失変異を作成し、この３’−ｔＲＮａｓｅの活性領域を特定することに成功した。
【０００９】
この出願の発明は、発明者による以上のとおりの新規な知見に基づき、先願発明の３’−ｔＲＮａｓｅと同一の活性を有する短鎖の３’−ｔＲＮａｓｅと、これを遺伝子工学的に作成するための材料としてのポリヌクレオチド等を提供することを課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決する発明として、遺伝子ＥＬＡＣ１の発現産物をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
この出願の発明はまた、遺伝子ＥＬＡＣ２発現産物の少なくともＣ末端側ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
またこの出願の発明は、前記のポリヌクレオチドを保有する組換え発現ベクター、およびこの組換え発現ベクターによる形質転換細胞を提供する。
【００１３】
さらにこの出願の発明は、前記の組換え発現ベクターの発現産物である組換え３’−ｔＲＮａｓｅを提供する。
【００１４】
すなわちこの出願の発明は、先願発明の３’−ｔＲＮａｓｅ（例えばブタ３’−ｔＲＮａｓｅ）が、ヒト前立腺癌感受性遺伝子ＥＬＡＣ２の発現産物と同一種のものであり、しかもその活性部位はＥＬＡＣ２産物のＣ末端側の約半分であること、そしてこのＣ末端側ポリペプチドが遺伝子ＥＬＡＣ１と近似しており、このＥＬＡＣ１発現産物が先願発明の３’−ｔＲＮａｓｅと同一の酵素活性を有していることを見いだして完成されたものである。
【００１５】
従って、この出願の３’−ｔＲＮａｓｅは、構造（アミノ酸配列）とサイズとの相違によって、先願発明（特許文献１）に対して明瞭なる新規性、進歩性を有するものである。
【００１６】
なお、この発明において「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。また「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１００個以上結合した分子を言う。
【００１７】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明において使用する遺伝子工学および分子生物学的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等に記載されている。
【００１８】
以下、この発明の実施形態について詳しく説明する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
この発明の第１のポリヌクレオチドは、遺伝子ＥＬＡＣ１の発現産物コードすることを特徴とする。このポリヌクレオチドは、遺伝子ＥＬＡＣ１の発現産物をコードするゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡ、あるいは人工的に合成されるＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片等である。また、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等のセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。さらにまた、このポリヌクレオチドは、必ずしもＥＬＡＣ１発現産物の完全長をコードする必要はなく、３’−ｔＲＮａｓｅとしての活性を有していることを前提として、ＥＬＡＣ１発現産物の１以上のアミノ酸残基の欠失、付加、他のアミノ酸残基への置換等を含むポリペプチドをコードするものであってもよい。またそのようなアミノ酸変異を含むものとして人工的に合成したポリヌクレオチドであってもよい。
【００２０】
これらのポリヌクレオチドは、公知の配列情報に基づき、公知の方法で取得することができる。例えば、真核生物のＥＬＡＣ１  ｃＤＮＡとしては、ヒト（例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．  ＡＦ３０８６９５）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．  ＡＦ３０８６９７）等が知られている。また植物（Ａ．  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＥＬＡＣ１（Ｓｃｈｉｆｆｅｒ，  Ｓ，  Ｒｏｓｃｈ，  Ｓ，  Ｍａｒｃｈｆｅｌｄｅｒ，  Ａ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２１，  ２７６９−２７７７，  ２００２）も知られている。さらに、細菌由来としては、大腸菌（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ５８７６８）、高熱菌Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＥ００１７５３）等が知られている。従って、例えばｃＤＮＡの場合には、公知の方法（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  １６１−１７０，  １９８２；  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  ２５，  ２６３−２６９，  １９８３；  Ｇｅｎｅ，  １５０，  ２４３−２５０，  １９９４）を用いてｃＤＮＡを合成し、公知の配列情報に基づいて作成したプローブＤＮＡを用いて、それぞれのｃＤＮＡを単離する方法によって取得することができる。また、この発明によって提供されるプライマーセットを用い、各種細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても各ｃＤＮＡを得ることができる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００２１】
この発明の第２のポリヌクレオチドは、遺伝子ＥＬＡＣ２の発現産物の少なくともＣ末端領域ポリペプチドをコードすることを特徴としている。遺伝子ＥＬＡＣ２ポリヌクレオチドは、前記のＥＬＡＣ１ポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）と同様に、公知の配列情報に基づいて入手可能である。例えば、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．  ＡＦ３０４３７０等）、ゴリラ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．  ＡＦ３０８３９４）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．  ＡＦ３０８６９７）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．  ＡＹ１４９９０２）等が知られている。またチンパンジー（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＦ３０８６９８）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＹ１４９９０３）等も知られている。
【００２２】
そして、このようにして入手したＥＬＡＣ２  ｃＤＮＡを適当な制限酵素等で切断することによって、その発現産物のＣ末端ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。この場合の「Ｃ末端ポリペプチド」とは、例えば、前記のＥＬＡＣ１発現産物と実質的に同一サイズのポリペプチド、具体的にはＥＬＡＣ２発現産物のＣ末端側の約半分を意味する。さらに具体的には、実施例に示したように、ヒトＥＬＡＣ２発現産物の第４８２−８２６番アミノ酸配列からなるポリペプチドであるが、これに限定されるものではなく、３’−ｔＲＮａｓｅとしての活性を有する限り、これより短くてもよく、あるいは長くてもよい。
【００２３】
この発明の組換え発現ベクターは、前記のポリヌクレオチドをインビトロ転写するためのベクター、あるいは適当な宿主を形質転換するためのベクターを用いて作成することができる。またこの発明の形質転換細胞は、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞であり、前記の組換え発現ベクターを公知の方法で導入することにより作成することができる。さらにこの発明の３’−ｔＲＮａｓｅは、前記の発現ベクターまたは形質転換細胞からの組換えタンパク質として公知の方法で取得することができる。以下、これらの組換えベクター、形質転換細胞、組換え３’−ｔＲＮａｓｅの実施形態についてまとめて説明する。
【００２４】
この発明の組換え３’−ｔＲＮａｓｅをインビトロ転写翻訳で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、組換え３’−ｔＲＮａｓｅタンパク質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。
【００２５】
組換え３’−ｔＲＮａｓｅを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有するベクターにポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主微生物を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、そのポリヌクレオチドがコードしている３’−ｔＲＮａｓｅを微生物中で発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００２６】
組換え３’−ｔＲＮａｓｅを真核細胞で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換え発現ベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、３’−ｔＲＮａｓｅを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として３’−ｔＲＮａｓｅを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この発明の３’−ｔＲＮａｓｅを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２７】
３’−ｔＲＮａｓｅを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的タンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２８】
なお、以上の方法によって得られる組換え３’−ｔＲＮａｓｅには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾された３’−ｔＲＮａｓｅもこの発明の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００２９】
以上のとおりに作成された組換え３’−ｔＲＮａｓｅは、例えば特許文献１に開示されているような目的（ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける遺伝子工学または診断薬への応用）等に使用することができる。また、その際の具体的手続き等についても特許文献１に準ずることができる。
【００３０】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３１】
【実施例】
実施例１：ブタ３’−ｔＲＮａｓｅの精製と配列決定
文献（Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３，  ３６４２−３６４７，  １９９５）の記載に従い、ブタ肝臓由来３’  ｔＲＮａｓｅを分画、さらにグリセロール勾配の超遠心により精製した。この最終の活性分画をＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲルにて分離後、ゲルストリップ中の酵素をトリプシン消化し、この精製タンパク質を質量分析機により分析した。その結果、４種類のペプチドが検出された。ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＳＴデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索により、このタンパク質はＥＬＡＣ２遺伝子産物であることが示唆された。図１に、検索の結果を示す。ブタ由来のペプチド（４個）がそれぞれヒトＥＬＡＣ２アミノ酸配列中に存在することが確認された。幾つかのアミノ酸ミスマッチは種差によるものである。
実施例２：ＥＬＡＣ２産物の発現と精製
ＥＬＡＣ２産物が実際に３’−ｔＲＮａｓｅ活性を有することを確認するため、ＥＬＡＣ２  ｃＤＮＡの全タンパク質コーディング領域をヒト精巣ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲ増幅し、大腸菌発現ベクターｐＴＹＢ１１にクローニングした。このベクターで大腸菌を形質転換し、培養物からｃｈｉｔｉｎビーズを用いたバッチ法により、ｉｎｔｅｉｎ部分を除去した組換えタンパク質を精製した。精製タンパク質の分析は、ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル上で実施し（図２ａ）、タンパク質バンドがその組換えタンパク質に対応することを質量分析機を用いて確認した。
実施例３：ＥＬＡＣ２産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔＲＮＡ  ３’プロセッシングアッセイ
実施例２で得た精製組換えタンパク質を、［α−３２Ｐ］ＵＴＰにより均一に標識したヒトｐｒｅ−ｔＲＮＡＡｒｇ（図３ａ）存在下、３７℃、標準アッセイ条件下でインキュベートした（Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３，  ３６４２−３６４７，  １９９５を参照）。開裂反応は１０％ポリアクリルアミドゲル−８Ｍ尿素ゲル上で分析した。
【００３２】
その結果、この精製組換えタンパク質はｐｒｅ−ｔＲＮＡＡｒｇを特定部位で開裂する能力があることが確認された（図２ｂ）。
【００３３】
さらに、正確な開裂部位を決定するため、長い開裂産物を対象にした化学的ＲＮＡシーケンス解析を行った。すなわち、前記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３’−ｔＲＮａｓｅアッセイにおいて生じた非標識５’開裂産物を［５’−３２Ｐ］ｐＣｐとＴ４  ＲＮＡリガーゼを用いて３’末端標識およびゲル精製し、化学的ＲＮＡシーケンス解析（Ｐｅａｔｔｉｅ，  Ｄ．  Ａ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６，  １７６０−１７６４，  １９７９）に供した。シーケンス反応の分析は、２０％ポリアクリルアミドゲル−８Ｍ尿素ゲル上で実施した。
【００３４】
その結果、この開裂は識別ヌクレオチドの後で生じており、ブタ肝臓由来の３’−ｔＲＮａｓｅによる開裂（Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３，  ３６４２−３６４７，  １９９５）と同様であることが確認された（図３）。
実施例４：酵母オーソログ（ＹＫＲ０７９Ｃ）のｔＲＮＡ  ３’プロセッシングアッセイ
ＥＬＡＣ２産物の酵母（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）オーソログであるＹＫＲ０７９Ｃ（Ｔａｖｔｉｇｉａｎ，  Ｓ．  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２７，  １７２−１８０，  ２００１）について、実施例３と同様にｔＲＮＡ  ３’プロセッシングアッセイを行った。すなわち、ＰＣＲ増幅したＹＫＲ０７９Ｃのタンパク質コーディング領域を大腸菌発現ベクターｐＧＥＸ４Ｔ−３にクローニングし、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現させ、実施例２と同様にしてグルタチオンビーズを用いて組換えタンパク質を精製した（図２ａ）。次いで、実施例３と同様にして、ｐｒｅ−ｔＲＮＡＡｒｇに対する開列反応を試験した。その結果、ｐｒｅ−ｔＲＮＡＡｒｇの識別部位が正確に３’プロセッシングされることが確認された（図２ｂおよび３）。
実施例５：ＥＬＡＣ２産物の活性領域の分析
ＥＬＡＣ２オーソログの複数タンパク質配列の解析から、これらのタンパク質のＮ末端側の半分領域と比べてＣ末端側の半分領域はかなり類似性が高いことが判明している（Ｔａｖｔｉｇｉａｎ，  Ｓ．  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２７，  １７２−１８０，  ２００１）。このため、触媒ドメインを含む重要ドメインは、３’ｔＲＮａｓｅのＣ末端側の半分に存在することが想定される。この点を検証するため、Ｎ末端またはＣ末端側の半分のコーディング領域が欠落した２種類の組換え発現ベクターｐＴＹＢ１１を作成し、Ｃ末端半分（ＥＬＡＣ２−ΔＮ：ａ．ａ．４８２−８２６）およびＮ末端半分（ＥＬＡＣ２−ΔＣ：ａ．ａ．１−４８１）の組換え３’−ｔＲＮａｓｅについて、実施例３と同様にしてｔＲＮＡ３’プロセッシング活性を測定した（図２ａ）。
【００３５】
その結果、Ｃ末端半分の酵素は識別ヌクレオチドの後でヒトｐｒｅ−ｔＲＮＡＡｒｇを開裂することができたが、Ｎ末端半分の３’ｔＲＮａｓｅは全くその能力が見られず（図２ｂおよび３）、３’ｔＲＮａｓｅのＣ末端側の半分が活性発現に不可欠であることが確認された。
【００３６】
さらに、ヒトゲノム中にはＥＬＡＣ１という遺伝子が存在しているが、このＥＬＡＣ１産物は３’ｔＲＮａｓｅ（ＥＬＡＣ２産物）のＣ末端側半分に対応している（Ｔａｖｔｉｇｉａｎ，  Ｓ．  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２７，  １７２−１８０，  ２００１）。そこで、このＥＬＡＣ１  ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、大腸菌発現ベクターｐＧＥＸ４Ｔ−３にクローニングして、実施例２と同様に組換えタンパク質を精製し、実施例３と同様にしてｔＲＮＡの３’プロセッシング活性を有するか否かを分析した。
【００３７】
その結果、ＥＬＡＣ１酵素もｐｒｅ−ｔＲＮＡＡｒｇを予想部位でを開裂させる能力があることが判明した（図２ｂおよび３）。
【００３８】
以上の結果から、ＥＬＡＣ２産物である３’−ｔＲＮａｓｅは、そのＣ末端領域にｔＲＮＡ３’プロセッシング活性を有することが確認された。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、新規な３’−ｔＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドを用いて３’−ｔＲＮａｓｅを簡便かつ均一に作成するための遺伝子工学材料、並びにこれらを用いて作成される新規な組換え３’−ｔＲＮａｓｅが提供される。
【００４０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ブタ３’−ｔＲＮａｓｅを精製したゲル電気泳動像（左）と、ブタ３’−ｔＲＮａｓｅおよびヒトＥＬＡＣ２発現産物のＣ末端側アミノ酸配列の比較図（右）である。アミノ酸配列の比較図におけるヒトＥＬＡＣ２の配列は配列表の配列番号１、ブタ３’−ｔＲＮａｓｅ由来のペプチド４種はそれぞれ配列番号２、３、４および５に示した。
【図２】各種ＥＬＡＣ２−関連組換えタンパク質についてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔＲＮＡ  ３’プロセッシング活性を試験した結果である。（ａ）は組換えタンパク質のプロフィールを示す電気泳動像である。（ｂ）はｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔＲＮＡ  ３’プロセッシングアッセイの結果を示す電気泳動像である。
【図３】各種の組換え３’ｔＲＮａｓｅによる正確な開裂部位を決定した試験結果である。（ａ）はヒトｐｒｅ−ｔＲＮＡＡｒｇの二次構造である。矢印は３’ｔＲＮａｓｅによる開裂部位を示す。この塩基配列は配列表の配列番号６に併せて示す。（ｂ）は５’開裂産物のＲＮＡ配列解析の結果を示す電気泳動像である。最初のヌクレオチドＧは識別部分に対応している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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