(57)【要約】【課題】腎臓の幹細胞を見いだし、分離する。【解決手段】ミクロディスセクションにより、ネフロン１を、Ｓ１セグメント１１、ＰＣＴ１２、Ｓ２セグメント１３、Ｓ３セグメント１４、ヘンレのループ５、糸球体２に分離する。次に、各部位の細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２が２０ｍｌと、ＩＴＳ−ｍｉｘが２００μｌと、ＨＧＦが５ｐｇと、１Ｍニコチナマイドが１００μｌと、支持細胞培養液が２０ｍｌと、ＦＣＳが１０％と、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリンＧと、１００ｍｇ／ｍｌのストプトマイシンとの混合液に、水溶性デキサメタゾンを終濃度が５×１０−７Ｍとなるように添加した培養液中で培養すると、Ｓ３セグメント１４から、増殖能が高く、自己複製能、分化能を有する細胞が得られる。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の腎臓から分離され、増殖能、自己複製能、分化能を有することを特徴とする腎臓幹細胞／前駆細胞。
【請求項２】
上記腎臓のＳ３セグメントから分離されることを特徴とする請求項１記載の腎臓幹細胞／前駆細胞。
【請求項３】
Ｐａｘ−２、及びＷｎｔ−４が発現していることを特徴とする請求項１又は２記載の腎臓幹細胞／前駆細胞。
【請求項４】
上記哺乳動物は、ラットであることを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項記載の腎臓幹細胞／前駆細胞。
【請求項５】
ダルベッコ改変イーグル培地、ハムＦ１２培地、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、肝細胞増殖因子、デキサメタゾン、ウシ胎児血清、ニコチナマイドを含む培養液を使用して培養することにより、近位尿細管に分化することを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１項記載の腎臓幹細胞／前駆細胞。
【請求項６】
支持細胞の培養液、ダルベッコ改変イーグル培地、ハムＦ１２培地、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、ウシ胎児血清、ニコチナマイドを含む培養液を使用して培養することにより、近位尿細管に分化することを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１項記載の腎臓幹細胞／前駆細胞。
【請求項７】
ダルベッコ改変イーグル培地、ハムＦ１２培地、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、白血病阻害因子、ウシ胎児血清、ニコチナマイドを含む培養液を使用して培養することにより、ヘンレのループ、遠位尿細管、集合管に分化することを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１項記載の腎臓幹細胞／前駆細胞。
【請求項８】
支持細胞の培養液、ダルベッコ改変イーグル培地、ハムＦ１２培地、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、白血病阻害因子、ウシ胎児血清、ニコチナマイドを含む培養液を使用して培養することにより、近位尿細管に分化することを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１項記載の腎臓幹細胞／前駆細胞。
【請求項９】
腎臓を各部位毎に分離する分離ステップと、
上記分離ステップで分離された各部位の細胞を単離する単離ステップと、
上記分離ステップで分離された各部位の細胞を、支持細胞又は支持細胞培養液を含む培養液中で培養し、増殖能が高い細胞を得る培養ステップとを備えることを特徴とする腎臓幹細胞／前駆細胞の分離方法。
【請求項１０】
上記培養ステップでは、上記分離ステップで分離されたＳ３セグメントの細胞を培養することを特徴とする請求項９記載の腎臓幹細胞／前駆細胞の分離方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項８のうちいずれか１項記載の腎臓幹細胞／前駆細胞を、機能が低下している腎臓に移植することを特徴とする腎疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物の腎臓から分離される腎臓幹細胞／前駆細胞、哺乳動物の腎臓から腎臓幹細胞／前駆細胞を分離する方法、及び腎臓幹細胞／前駆細胞を利用した腎臓の治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腎臓とは、主に排泄機能、内分泌機能、調節機能をもつ臓器であり、ホルモンを生成して分泌したり、尿を生成する。ヒトでは、腎臓は、腹腔の背側に２個存在しており、それぞれ膀胱まで伸びた尿管を有している。
【０００３】
腎臓には、ネフロンと呼ばれる基本構造が約１００万個ある。ネフロンは、血液から老廃物を含む水分を濾過し、原尿を生成する糸球体を備えている。糸球体で生成された原尿は、近位尿細管、ヘンレのループ、遠位尿細管、集合管を通過して尿管へ運ばれる。近位尿細管、ヘンレのループ、遠位尿細管では、ナトリウムや水分などを再吸収し、エリスロポイエチンや、ビタミンＤ３を活性化する。また、ネフロンの周囲には間質細胞などがある。原尿は、尿管へ運ばれるまでに約１００倍に濃縮された後、尿管を通過して膀胱まで運ばれ、膀胱から体外へ排泄される。
【０００４】
また、腎臓は、中間中胚葉から発生し、前腎、中腎、後腎の３段階を経て形成される。哺乳動物では、前腎及び中腎のほとんどが後に退行変性し、主に後腎から腎臓が生じる。後腎は、中腎の最も尾側に発生する尿管芽と呼ばれる突起の周りに間葉系細胞が集合して生じる。そして、尿管芽と間葉系細胞とが相互作用し、間葉系細胞が上皮化してＳ字体と呼ばれる状態を経ることによって、糸球体、近位尿細管、ヘンレのループ、遠位尿細管が発生する。また、集合管及び尿管上皮細胞などは、尿管芽より分化する。
【０００５】
近年、慢性腎不全の患者数が増加している。慢性腎不全は、腎臓における疾病又は腎臓以外の器官における疾病が原因で生じた腎臓障害が進行した病態であり、血液中に含有される尿毒素を除去する機能、内分泌機能、調節機能など、正常の腎臓が有する機能が廃絶する。
【０００６】
慢性腎不全が進行すると、正常の腎臓が有する機能が廃絶するために、体内の各臓器に影響が及び、尿毒症となる。具体的には、中枢神経障害、末梢神経障害、心・循環器障害、消化器障害、視力・眼障害、血液・凝固障害、免疫障害、内分泌障害、皮膚障害、骨・関節障害、電解質障害、酸塩基平衡障害などになる。
【０００７】
慢性腎不全は、進行性であり且つ治癒が不可能である。そのため、治療としては腎臓の機能が廃絶する速度を遅らせる保存的加療に主眼がおかれており、最終的には、人工透析や腎臓移植など、腎臓の機能を代替するための治療が必要となる（例えば、特許文献１）。
【０００８】
【特許文献１】
特開平６−１４２１９３号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、腎臓移植は、提供される腎臓の数が絶対的に不足しているために、実施が困難である。具体的に説明すると、新たに人工透析を受ける患者が１年間におよそ３万人であるのに対し、腎臓移植は１年間に約５００〜６００件しか行われていない。そこで、慢性腎不全の患者の大多数は、人工透析を受けている。
【００１０】
人工透析は、主に血液透析と腹膜透析との２つに分類される。
【００１１】
血液透析は、病院で行われ、内シャントという局所麻酔の手術で作った特別な血管に針を刺したり、透析用の管を首などの太い血管に挿入することなどにより、身体から少しずつ血液を取り出し、取り出した血液中に含まれる尿毒素をこし出す装置に通すことによって清浄化し、身体に返す方法である。
【００１２】
また、腹膜透析は、腹腔にカテーテルという管を埋め込んで、カテーテルから透析液を注入してしばらく貯留させることで血液中の尿毒素を透析液に溶け込ませ、尿毒素が溶け込んだ透析液を腹腔の外部に捨てるという操作を繰り返すことによって、血液を清浄化する方法である。
【００１３】
しかしながら、血液透析では、血液中の尿毒素は除去されるものの、内分泌機能、調節機能などの代替となる治療を行うことができない。また、身体の血を一度に全部抜くことはできないことから、少しずつ血液を抜き、抜いた血液を清浄化することとなるため、１回の透析に要する時間が長くなる。具体的には、１回に４時間から５時間程度の時間を要する。さらに、血液透析は、週に３回程度行う必要がある。したがって、血液透析を行うと、患者は、頻繁に通院しなくてはならなくなるとともに病院に拘束される時間が長くなるために、生活に負担がかかる虞がある。
【００１４】
また、腹膜透析では、自己管理ができるために、患者は通院回数を減らすことができるが、代謝障害を受け易いことや、腹膜への負担が大きくなることなどの問題が生じる。
【００１５】
さらに、慢性腎不全の患者は、人工透析を受けるために通院回数が多い。また、例えばカテーテルに埃がたまることで腹膜炎を起こすなどの理由により緊急治療室を訪れたり入院する可能性が高い。したがって、治療にかかる時間及び費用が大きくなり、慢性腎不全の患者とその家族には、多大な負担がかかる。
【００１６】
さらに、現在、人工透析を行う患者の数は約１８万人といわれており、人工透析にかかる医療費は、日本の総医療費の大きな割合を占めている。具体的には、日本の総医療費１３兆円に対して１兆円を占めている。また、人工透析を行う患者は、１年間に３万人増えている。したがって、今後人工透析にかかる医療費はさらに増大し、医療経済が圧迫されることが懸念される。
【００１７】
さらに、現在の医療では、腎疾患を根本的に治癒する方法も確立されていない。腎疾患の治癒方法が確立されていない理由としては、腎臓の形態が複雑であることに加えて、病態が多岐に及んでいることなどが挙げられる。例えば慢性腎炎では、ステロイドや免疫抑制剤を利用した免疫抑制療法、抗血小板剤を利用した方法、抗凝固剤を利用した方法などにより治療を行うが、治癒は困難である。したがって、腎疾患が生じたときには、患者に対して保存的加療を行うことに主眼をおくようになり、その後腎臓の機能が低下して腎不全となると、人工透析、腎臓移植を行う必要が生じる。
【００１８】
腎疾患を治癒する方法としては、腎臓移植の他に遺伝子療法などの研究が進められているが、例えばベクターによって副作用が生じるなどの問題点があり、研究の域を出ていない状態である。
【００１９】
本発明は、以上説明した従来の実状を鑑みて提案されたものであり、腎臓に分化可能であり未分化な細胞である腎臓幹細胞／前駆細胞、及び当該腎臓幹細胞／前駆細胞の分離方法、及び腎臓疾患の治癒方法を提供することを目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上述の目的を達成するために鋭意検討を重ね、腎臓に高い増殖能を有する細胞が存在することを確認し、この高い増殖能を有する細胞を腎臓から分離した。そして、さらに検討した結果、分離した細胞は、増殖能、自己複製能、分化能を有することが判明した。
【００２１】
すなわち、本発明に係る腎臓幹細胞／前駆細胞は、哺乳動物の腎臓から分離され、増殖能、自己複製能、分化能を有することを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る腎臓幹細胞／前駆細胞の分離方法は、腎臓を各部位毎に分離する分離ステップと、上記分離ステップで分離された各部位の細胞を単離する単離ステップと、上記分離ステップで分離された各部位の細胞を、支持細胞又は支持細胞培養液を含む培養液中で培養し、増殖能が高い細胞を得る培養ステップとを備えることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明を適用した腎疾患の治療方法は、哺乳動物の腎臓から分離され、増殖能、自己複製能、分化能を有する腎臓幹細胞／前駆細胞を、機能が低下している腎臓に移植することを特徴とする。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２５】
腎臓幹細胞／前駆細胞が存在する部位の同定
図１に示すように、腎臓中のネフロン１は、腎動脈から分岐した輸出入細動脈、内皮細胞、上皮細胞、メサンギウム細胞、ボーマン嚢上皮細胞よりなる糸球体２を備えている。糸球体２は、血液を濾過して原尿を生成する。糸球体２で生成された原尿は、ボーマン嚢３により集められ、近位尿細管４、ヘンレのループ５、遠位尿細管６、集合管７を通過して尿管へと運ばれる。近位尿細管４は、ボーマン嚢３に続いておりまっすぐに伸びているＳ１セグメント１１と、Ｓ１セグメント１１に続いており屈曲したＰＣＴ（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ  ｔｕｂｕｌｅｓ）１２と、ＰＣＴ１２に続いており皮質に入ってから皮髄境界まで比較的まっすぐに伸びているＳ２セグメント１３と、Ｓ２セグメント１３に続いており皮髄境界からヘンレのループ５まで伸びているＳ３セグメント１４とからなる。また、ネフロン１の周囲には間質細胞などがある。
【００２６】
糸球体２で生成された原尿は、尿管へ運ばれるまでに約１００倍に濃縮される。具体的に説明すると、原尿は、約１日１５０ｌ生成されるが、濃縮されることにより約１．５ｌとなる。
本実施の形態では、最初に、ネフロン１における増殖能を有する細胞の存在位置を確認した。
【００２７】
先ず、約８〜１０週齢である正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（以下、ＳＤラットという。）を準備し、２つのグループに分ける。そして、一方のグループに属するＳＤラットを虚血性急性腎不全とする。なお、以下では、虚血性急性腎不全であるＳＤラットを虚血性急性腎不全モデルという。虚血性急性腎不全モデルは、先ず左腎臓の腎動脈を４０分間駆血することによって左腎臓を虚血し、左腎臓を虚血している間に右腎臓を摘出し、最後に虚血を解除することによって作成した。虚血性急性腎不全モデルは、通常腎不全モデルとして使われている。虚血性急性腎不全モデルは、虚血してから４日後に、近位尿細管４、ヘンレのループ５、遠位尿細管６などが壊死を起こして脱落するが、再生することが知られている。また、他方のグループに属するＳＤラットには、偽手術を施す。
【００２８】
次に、生理食塩水で希釈したブロモデオキシウリジン（以下、ＢｒｄＵという。）を、両方のグループに属する全てのＳＤラットの腹腔内に、体重１ｋｇあたりＢｒｄＵが５０ｍｇとなるように投与した。
【００２９】
そして、ＢｒｄＵを投与してから１週間後に、両方のグループに属する全てのＳＤラットを屠殺して左腎臓を摘出し、摘出した腎臓の切片を作成した。
【００３０】
次に、摘出した腎臓の切片をＢｒｄＵ染色する。具体的に説明すると、先ず、プロテナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ社製）によってＤＮＡを露出させる。次に、０．３％Ｈ２Ｏ２とメタノールとを３対１０００の割合で混合した溶液によって内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した後、ＰＢＳにて洗浄する。次に、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で予備インキュベートを行うことにより、切片をブロッキングする。次に、１次抗体である抗ＢｒｄＵ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）と反応させた後、２次抗体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ抗体（ニチレイ社製）と反応させ、ＤＡＢ発色キットによって発色させる。
【００３１】
ＢｒｄＵ染色した切片を位相差顕微鏡によって４００倍の視野で観察し、染色されている細胞の数を各部位毎にカウントしたところ、図２に示すように、第１のグループに属するＳＤラットすなわち急性腎不全モデルであるＳＤラットのＳ３セグメント１４に、ＢｒｄＵ染色されている細胞が多く観察された。なお、図２中Ｉは第１のグループに属するＳＤラットにおいてＢｒｄＵ染色されている細胞の数を示し、図２中ＩＩは第２のグループに属するＳＤラットにおいてＢｒｄＵ染色されている細胞の数を示す。また、図２の縦軸は、４００倍の倍率で切片を観察したときに数えられる細胞数を示している。
【００３２】
以上の結果に基づき、Ｓ３セグメント１４に高い増殖能を有する細胞が存在することが判明した。
【００３３】
腎臓幹細胞／前駆細胞の分離方法
つぎに、腎臓から高い増殖能を有する細胞を分離する。
【００３４】
先ず、約８〜１０週齢であるＳＤラットを準備し、腎臓を摘出する。また、表１（Ａ）に示す組成であるＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａと、表２に示す組成であるＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂとを、それぞれ別々の注射器に入れて氷冷する。本実施の形態では、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａとｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂとを２０ｍｌずつ使用する。また、残りのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａを冷却する。なお、表１（Ａ）中Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｉｘは、表１（Ｂ）に示す終濃度となるように、ＮａＣｌと、ＣＨ３ＣＯＯＮａと、ＮａＨ２ＰＯ４（２Ｈ２Ｏ）と、ＭｇＳＯ４（７Ｈ２Ｏ）とを、５０ｍｌの蒸留水に対して添加したものである。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
【表２】
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【００３７】
次に、摘出した腎臓の大動脈（ａｏｒｔａ）から腎臓の動脈（ｌｔ  ｒｅｎａｌ  ａｒｔｅｒｙ）へ、注射器に入れ氷冷してあるＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＡとＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂとを、順次注入する。
【００３８】
次に、腎臓を、冷却したＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａに浸漬し、切片を切り出す。
【００３９】
次に、切り出した切片を、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ３ｍｌにＶＲＣ１５０μｌを添加したＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ１に浸漬し、３７℃で１０分間、Ｏ２を注入しながらインキュベートする。インキュベートするときには、時々Ｏ２がでていることを確認する。
【００４０】
次に、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ１を捨て、切片を、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ１９ｍｌに対してＶＲＣ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｖａｎａｄｙｌ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ２００ｍＭ溶液；Ｓｉｇｍａ社製）４００μｌを添加したＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ１に浸漬し、冷却する。
【００４１】
次に、２〜３ｍｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ１が入れられたペトリ皿に切片を入れ、ミクロディスセクション（ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を行い、腎臓を各部位毎に分別する。
【００４２】
そして、ミクロディスセクションにより得られた各部位を、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲン（ＢＤバイオサイエンス社製）でコートした９６ウェルプレートに播種し、それぞれ４．５ｇ／ｌグルコースを含有するダルベッコ改変イーグル培地に１０％ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳという。）を添加した培養液中で洗浄した後、以下の表３に示す組成の培養液中で２日に１回培養液を交換しながら１週間培養することにより、細胞が生える。本実施の形態では、各部位ともに約８０％の細胞が生えた。なお、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭという。）としては、Ｓｉｇｍａ社製のものを使用した。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
なお、表３に示す支持細胞培養液は、支持細胞を、４．５ｇ／ｌのグルコース入りのＤＭＥＭに、１０％のＦＣＳと１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリンＧと１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンとを添加した培養液中で、２日間支持細胞を培養した後の培養液を、フィルタに通したものである。また、ＩＴＳ−ｍｉｘはＧｉｂｃｏ社製であり、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを含有する。また、ＨＧＦは、肝細胞増殖因子であり、Ｓｉｇｍａ社製である。
【００４５】
なお、以下の表４に示す組成の培養液を、Ｋ−１ｍｅｄｉｕｍという。すなわち、表３に示す培養液には、Ｋ−１ｍｅｄｉｕｍが含有されている。
【００４６】
【表４】
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【００４７】
次に、生えた細胞をマイクロウェル法により単細胞とし、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲン（ＢＤバイオサイエンス社製）でコートした９６ウェルプレートに播種し、表３に示す組成の培養液中で各細胞毎に培養すると、図３（Ａ）に示すように、Ｓ３セグメント１４の細胞からは、高い増殖能を示す細胞が得られる。また、本実施の形態では、図３（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、他の部位からは、特に高い増殖能を示す細胞は得られなかった。
【００４８】
本実施の形態では、Ｓ３セグメント１４から得られた細胞のうち０．８％は高い増殖能を示し、細胞倍化時間が約１０〜１６時間であった。
【００４９】
また、以上説明したようにＳ３セグメント１４から得られた細胞の外観を倒立型リサーチ顕微鏡ｐｏｗｅｒ  ＩＸ−７１（以下、単に顕微鏡という。）で観察したところ、図４に示すような敷石状形状であった。
【００５０】
幹細胞及び前駆細胞は、高い増殖能、自己複製能、分化能をもつ細胞であるため、以下では、上述した方法によってＳ３セグメント１４から分離された細胞の増殖能をさらに検討するとともに、自己複製能、分化能について検討した。
【００５１】
腎臓幹細胞／前駆細胞の増殖能
つぎに、以上説明した方法によって分離された細胞の増殖能を調べる。
【００５２】
上述した方法によって生えた各部位の細胞を、マイクロウェル法により単細胞にし、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲン（ＢＤバイオサイエンス社製）でコートしたスライドガラスに播種し、表３に示す組成の培養液中で各細胞毎に培養したところ、Ｓ３セグメント１４より得られた細胞からは、他の部位と比較して３個以上の細胞からなるコロニーが多く形成された。
【００５３】
具体的には、図５（Ａ）に示すように、培養後２４時間が経過したときには、Ｓ３セグメント１４より得られた細胞からは、３個以上の細胞からなるコロニーが１２０ウェルあたり１１ユニット形成されたのに対し、Ｓ２セグメント１３より得られた細胞からは、３個以上の細胞からなるコロニーが１２０ウェルあたり１ユニットしか形成されず、さらに、ヘンレのループ５及び糸球体２より得られた細胞からは、３個以上の細胞からなるコロニーがほとんど形成されなかった。また、培養後４８時間が経過したときには、図５（Ｂ）に示すように、Ｓ３セグメント１４より得られた細胞からは、３個以上の細胞からなるコロニーが１２０ウェルあたり２０ユニット形成されたのに対し、Ｓ２セグメント１３より得られた細胞からは、３個以上の細胞からなるコロニーが１２０ウェルあたり３ユニットしか形成されず、さらに、ヘンレのループ５及び糸球体２より得られた細胞からは。３個以上の細胞からなるコロニーが２ユニットしか形成されなかった。
【００５４】
すなわち、Ｓ３セグメント１４から分離した細胞（以下、高増殖能細胞）は、増殖能が高いと考えられる。
【００５５】
細胞表面マーカーの検出
つぎに、高増殖能細胞の表面に発現しているマーカーを検出する。
【００５６】
先ず、高増殖能細胞を、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲンでコートした１２ウェルのチャンバースライドに播種し、表３に示す組成の培養液で１４日間培養した後、チャンバースライドを風乾し、ＰＢＳで洗浄する。
【００５７】
次に、チャンバースライドを５つのグループに分け、それぞれ１次抗体である抗ａｑｕａｐｏｒｉｎ−１（以下、ＡＱＰ−１という。）抗体（ケミコン社製）、抗ｈ−ｍｅｔ抗体（サンタクルツ社製）、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）、抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（以下、Ｅ−ｃａｄという。）抗体（サンタクルツ社製）、抗ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体（サンタクルツ社製）が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。
【００５８】
なお、ＡＱＰ−１は近位尿細管４の細胞のマーカーであり、ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ及びＥ−ｃａｄは上皮細胞のマーカーである。また、Ｖｉｍｅｎｔｉｎは発生時のみに発現する間葉系細胞のマーカーである。また、ｈ−ｍｅｔは、再生時に働くとされている肝細胞増殖因子に対するレセプターであるｃ−ｍｅｔを認識する抗体である。
【００５９】
次に、抗ＡＱＰ−１抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライド、抗ｈ−ｍｅｔ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライド、抗Ｅ−ｃａｄ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたスライドを、それぞれ２次抗体であるＦＩＴＣ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（ケミコン社製）が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。また、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライド、抗ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライドを、それぞれ２次抗体であるロダミン標識抗ラットＩｇＧ抗体（ケミコン社製）が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。
【００６０】
以上の処理を施した各チャンバースライドを蛍光顕微鏡で観察したところ、高増殖能細胞では、図６に示すように、間葉系細胞のマーカーであり発生時に発現するＶｉｍｅｎｔｉｎ、上皮細胞のマーカーであるｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎが強く発現していた。また、再生因子のレセプターであるＥ−ｃａｄも強く発現していた。また、近位尿細管４のマーカーであるＡＱＰ−１、上皮細胞のマーカーであるＥ−ｃａｄについては、弱い発現を示した。
【００６１】
すなわち、高増殖能細胞は、近位尿細管４を構成するＳ３セグメント１４に存在する細胞であるにも拘わらず近位尿細管４の形質を示していないことから、未分化である可能性が示唆された。また、再生因子に対するレセプターを発現していることから、分化能を有する可能性が示唆された。
【００６２】
未分化マーカーの発現の検討
つぎに、未分化な細胞のマーカーであるといわれているＰａｘ−２、Ｗｎｔ−４の発現を検討した。
【００６３】
まず、ｍＲＮＡを抽出することにより、Ｐａｘ−２、Ｗｎｔ−４の発現を検討した。
【００６４】
先ず、高増殖能細胞を、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲンでコートした直径１０ｃｍのポリスチレンプレートに播種し、表３に示す培養液中で細胞を培養して回収する。
【００６５】
そして、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して高増殖能細胞からｍＲＮＡを抽出し、得られたｍＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを得る。
【００６６】
次に、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  ２００２  Ｄｅｃ；１３（１２）：２８５０−２８５９に記載されている方法に従いながら、ｃＤＮＡを増幅する。なお、文献中では全容積を１００μｌとしているが、本実施の形態では５０μｌとした。
【００６７】
次に、配列番号１に示すセンスプライマーと、配列番号２に示すアンチセンスプライマーとを使用して、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で５９秒間のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲを行い、Ｐａｘ−２のｃＤＮＡを増幅する。
【００６８】
また、配列番号３に示すセンスプライマーと、配列番号４に示すアンチセンスプライマーとを使用して、９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲを行い、Ｗｎｔ−４のｃＤＮＡを増幅する。
【００６９】
次に、ＰＣＲによって増幅されたそれぞれのｃＤＮＡを、１．２％アガロースゲル電気泳動によって分離する。増幅されたｃＤＮＡのサイズは、図７に示すように、Ｐａｘ−２は３８９ｂｐであり、Ｐａｘ−２をコードするＤＮＡのサイズと同じであった。また、Ｗｎｔ−４は３６６ｂｐであり、Ｗｎｔ−４をコードするＤＮＡのサイズと同じであった。
【００７０】
つぎに、タンパク質を抽出することにより、Ｐａｘ−２、Ｗｎｔ−４の発現を検討する。
【００７１】
先ず、高増殖能細胞を、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲンでコートした直径１０ｃｍのポリスチレンプレートに播種し、表３に示す培養液中で細胞を培養して回収する。
【００７２】
次に、表５に示す組成のバッファで高増殖能細胞を破砕し、遠心して上清を取ることにより、タンパク質の抽出液を得る。
【００７３】
【表５】
2004275079.tif 000007
【００７４】
次に、抽出液中のタンパク質を、ポリアクリルアミドの濃度が１０％であるゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ウェスタンブロッティングによりゲルからＰＶＤＦ膜へ転写する。
【００７５】
なお、本実施の形態では、陰性対照となり、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １９９６  Ｎｏｖ；  ７（１１）：  ２３５７−６３に記載されているヒトメサンギウム細胞（以下、ＨＭＣという。）についても、タンパク質の抽出液を作成し、抽出液中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ウェスタンブロッティングによりゲルからＰＶＤＦ膜へ転写した。
【００７６】
次に、ＰＶＤＦ膜を、Ｔｗｅｅｎ１ｍｌが加えられたＴＢＳ１ｌのうち５０ｍｌに、２．５ｇのスキムミルクを添加したブロッキング緩衝液中に浸漬してブロッキングを行う。
【００７７】
そして、１次抗体である抗Ｐａｘ−２ポリクローナル抗体（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐａｎｙ製）、又は抗Ｗｎｔ−４抗体（サンタクルツ製）と反応させた後、２次抗体であるＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製）と反応させる。
【００７８】
そして、ウェスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ；アマシャム社製）に従った反応を行い、Ｘ線フィルムに露光させることにより、図８（Ａ），（Ｂ）に示すように、Ｐａｘ−２及びＷｎｔ−４の両方が確認された。また、ＨＭＣでは、Ｐａｘ−２及びＷｎｔ−４ともに発現していないことが確認された。
【００７９】
したがって、高増殖能細胞は、Ｐａｘ−２及びＷｎｔ−４が発現していることから、未分化である可能性が示唆された。
【００８０】
高増殖能細胞のｃｅｌｌ  ｌｉｎｅの作成
以上説明したように、高増殖能細胞は、増殖能が高く、自己複製能、分化能を有することから、腎臓への分化が可能である腎臓幹細胞又は腎臓前駆細胞（以下、腎臓幹細胞／前駆細胞という。）である可能性がある。そこで、高増殖能細胞をｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ化した。
【００８１】
高増殖能細胞に対してリポフェクション法によりＳＶ４０遺伝子を組み込むことで、高増殖能細胞をｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ化する。具体的には、ＦｕＧＥＮＥ  ６（ロシュダイアグノシス社製）を使用して、高増殖能細胞をｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ化した。高増殖能細胞の外観は、ＳＶ４０遺伝子を組み込んだときにも敷石形状を保ったままであった。なお、以下では、ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ化した高増殖能細胞を、ｒＫＳ（Ｒａｔ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）５６という。
【００８２】
腎臓幹細胞／前駆細胞の自己複製能
つぎに、ｒＫＳ５６の自己複製能について検討する。
【００８３】
一般に細胞は、培養するだけで自然に不死化することはなく、３０〜５０世代、期間で示すと約９０日で分裂停止期に入り、継代できなくなり死ぬ。
【００８４】
しかし、ｒＫＳ５６を、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲンでコートした９６ウェルプレートに播種し、表３に示す培養液中で培養しながら継代し続けたところ、図９に示すように、１５０日継代しても細胞の増殖能や外観が保たれていた。
【００８５】
また、ｒＫＳ５６に、ｖｙｂｒａｎｔ  ｃｅｌｌ−ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｕｒｏｂｅ社製）を使用してＤｉＯ色素を取り込ませ、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲンでコートした９６ウェルプレートに播種し、表３に示す組成の培養液中で低密度培養を行って顕微鏡で観察したところ、図１０（Ａ）に示すように、ＤｉＯ色素が取り込まれた高増殖能細胞（以下ＤｉＯ細胞という。）が増殖した（１継代目）。次に、増殖したＤｉＯ細胞を回収して単細胞とし、再び低密度培養したところ、図１０（Ｂ）に示すように、ＤｉＯ細胞が再び増殖した（２継代目）。再度、増殖したＤｉＯ細胞を回収して単細胞とし、再び低密度培養したところ、図１０（Ｃ）に示すように、ＤｉＯ細胞が再び増殖した（３継代目）。
【００８６】
なお、図１０中ＬＭは、低密度培養した細胞を光学顕微鏡によって観察した画像であり、ＦＬは蛍光顕微鏡によって観察した画像であり、ｍｅｒｇｅ１は光学顕微鏡によって観察した画像と蛍光顕微鏡によって観察した画像との二重像である。なお、図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）ＦＬ中において四角で囲った細胞を低密度培養した状態を示した図であり、図１０（Ｃ）は、図１０（Ｂ）において発光している細胞を低密度培養した状態を示した図である。
【００８７】
以上説明した結果より、高増殖能細胞は、自己複製能をもつと考えられる。
【００８８】
ｒＫＳ５６の分化能の検討
つぎに、ｒＫＳ５６の分化能について検討する。
【００８９】
先ず、ｒＫＳ５６を、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲンでコートした９６ウェルプレートに播種し、以下の表６中Ａ〜Ｈに示す組成の培養液で、７日間培養する。
【００９０】
【表６】
2004275079.tif 000008
【００９１】
なお、表６中Ｄで示す条件は、通常の培養液である。なお、表６中ＬＩＦは、白血病阻害因子である。
【００９２】
そして、培養したｒＫＳ５６について、細胞数の変化、細胞の形状、副甲状腺ホルモン（以下、ＰＴＨという。）及びバソプレシン（以下、ＡＶＰという。）に対する反応性を調べる。
【００９３】
細胞数と細胞の形状は、顕微鏡でスライドガラスの表面を観察することによって調べる。また、ＰＴＨ及びＡＶＰに対する反応性は、アマシャム社のｃＡＭＰ  ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  （ＥＩＡ）  ｓｙｓｔｅｍによりｃＡＭＰ量を測定することによって調べる。
【００９４】
細胞数の変化、細胞の形状、ＰＴＨに対する反応性、ＡＶＰに対する反応性を調べた結果、図１１に示すように、表６中Ｂの条件で培養したときに、細胞数の増加が顕著に見られた。また、細胞の形状は敷石形状であり、変化が見られなかった。また、表６中Ｂ、Ｆの条件で培養したときには、図１２（Ａ），（Ｂ）に示すように、図１２（Ｃ）に示す通常の培養液で培養した結果と比較して、ＡＶＰ及びＰＴＨに反応してｃＡＭＰの量が増加するが、ＰＴＨに対する反応性がＡＶＰに対する反応性よりもさらに高く、ＰＴＨ及びＡＶＰに対する反応性が近位尿細管４の細胞の反応性に類似していた。
【００９５】
また、表６中Ｅの条件で培養したときには、細胞の形状は敷石形状であり、変化は見られなかった。しかし、図１２（Ｄ）に示すように、通常の培養液で培養した結果と比較して、ＡＶＰ及びＰＴＨに反応してｃＡＭＰの量が増加するが、ＡＶＰに対する反応性がＰＴＨに対する反応性よりもさらに高く、ＰＴＨ及びＡＶＰに対する反応性が、ヘンレのループ５の細胞、遠位尿細管６の細胞の反応性に類似していた。すなわち、ｒＫＳ５６は、分化能を有する可能性が示唆された。
【００９６】
支持細胞培養液存在下でのｒＫＳ５６の分化
つぎに、ｒＫＳ５６の形質保持因子であると考えられる支持細胞の培養液の存在下でｒＫＳ５６を培養したときと、支持細胞の培養液の非存在下でｒＫＳ５６を培養したときとのｒＫＳ５６の分化の違いについて検討した。
【００９７】
先ず、ｒＫＳ５６を、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲンでコートした直径１０ｃｍのプリスチレンプレートに播種し、以下の表７中Ｊ、Ｋに示す組成の培養液で７日間培養すし、回収する。
【００９８】
【表７】
2004275079.tif 000009
【００９９】
次に、表５に示す組成のバッファでｒＫＳ５６を破砕し、遠心して上清を取ることにより、Ｊに示す組成の培養液で培養したｒＫＳ５６中のタンパク質の抽出液（以下、Ｊ抽出液という。）と、Ｋに示す組成の培養液で培養したｒＫＳ５６中のタンパク質の抽出液（以下、Ｋ抽出液という。）とを得る。
【０１００】
次に、抽出液中のタンパク質を、ポリアクリルアミドの濃度が１０％であるゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ウェスタンブロッティングによりゲルからＰＶＤＦ膜へ転写する。そして、ＰＶＤＦ膜をブロッキング緩衝液中に浸漬してブロッキングを行う。
【０１０１】
次に、１次抗体である抗Ｐａｘ−２ポリクローナル抗体、抗Ｗｎｔ−４抗体、抗ｈ−ｍｅｔ抗体、抗ＡＱＰ−１抗体、又は抗Ｆｌｋ−１抗体（サンタクルツ社製）と反応させた後、２次抗体であるＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体と反応させる。
【０１０２】
そして、ウェスタンブロッティング検出システムに従った反応を行い、１次抗体と反応したタンパク質を発色させると、図１３に示す結果が得られる。
【０１０３】
図１３（Ａ）に示すように、Ｋ抽出液では、Ｊ抽出液と比較してＰａｘ−２の含有量が低減していた。また、図１３（Ｂ）に示すように、Ｋ抽出液では、Ｊ抽出液と比較してＷｎｔ−４の含有量が低減していた。すなわち、支持細胞培養液が含有されていない条件で培養すると、分化が進む可能性が示唆された。
【０１０４】
また、図１３（Ｃ）に示すように、Ｊ抽出液では、血管内皮細胞のマーカーとされているＦｌｋ−１が検出された。すなわち、ｒＫＳ５６は、未分化であるときには血管内皮細胞に分化する可能性があることが示唆された。
【０１０５】
なお、図１４（Ａ），（Ｂ）に示すように、Ｊ抽出液及びＫ抽出液共に、ｈ−ｍｅｔとＡＱＰ−１との含有量はほぼ同じであった。
【０１０６】
なお、図１３及び図１４の縦軸は、アクチンのバンドの濃さを１としたときの各バンドの濃さを示している。
【０１０７】
また、フローサイトメータにより、Ｊに示す組成の培養液で培養された細胞の大きさとＫに示す組成の培養液で培養された細胞の大きさとを測定すると、図１５（Ａ），（Ｂ）に示すように、Ｊに示す組成の培養液で培養した細胞と比較して、図１５（Ｃ），（Ｄ）に示すように、Ｋに示す組成の培養液で培養した細胞には１回り大きな細胞が含まれることが判明した。
【０１０８】
以上の結果から、Ｊに示す組成の培養液、すなわち、支持細胞培養液が存在することにより、ｒＫＳ５６の分化が抑制される可能性が示唆された。
【０１０９】
ｒＫＳ５６の近位尿細管の細胞、ヘンレのループの細胞への分化
つぎに、ｒＫＳ５６を近位尿細管の細胞、ヘンレのループの細胞へ分化させる。
【０１１０】
先ず、近位尿細管４の細胞へ分化させるために、ｒＫＳ５６を、表面をｔｙｐｅＩＶコラーゲンでコートしたチャンバースライドに播種し、表８中Ｌで示す組成の培養液で３週間培養する。また、未分化のままとするために、ｒＫＳ５６を、表８中Ｍで示す組成の培養液で３週間培養する。また、ヘンレのループ５の細胞、遠位尿細管６の細胞、又は集合管７の細胞へ分化させるために、ｒＫＳ５６を、表８中Ｎで示す組成の培養液で３週間培養する。
【０１１１】
【表８】
2004275079.tif 000010
【０１１２】
次に、チャンバースライドを風乾し、ＰＢＳで洗浄する。
【０１１３】
次に、表８中Ｌ、Ｍ、Ｎの条件で細胞を培養したチャンバースライドを、それぞれ１次抗体である抗ＡＱＰ−１抗体又は抗ＴＨＰ抗体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。なお、ＴＨＰは、ヘンレのループ５の上行脚の細胞、遠位尿細管６の細胞のマーカーである。
【０１１４】
次に、各チャンバースライドを、２次抗体であるＦＩＴＣ標識抗ラビットＩｇＧ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。
【０１１５】
以上の処理を施した各チャンバースライドを顕微鏡で観察したところ、図１６に示すように、表８中Ｌの条件で培養された細胞では、ＡＱＰ−１は強く発現しており、ＴＨＰの発現は見られなかった。また、表８中Ｍの条件で培養された細胞では、ＡＱＰ−１は弱く発現しており、ＴＨＰの発現は見られなかった。また、表８中Ｎの条件で培養された細胞では、ＴＨＰの発現は弱いものの全体に見られた。
【０１１６】
したがって、ｒＫＳ５６は、表８中Ｌで示す組成の培養液で培養したときには近位尿細管４の細胞に分化し、表８中Ｎで示す組成の培養液で培養したときにはヘンレのループ５の細胞、遠位尿細管６の細胞、又は集合管７の細胞へ分化することが確認された。すなわち、ｒＫＳ５６は、分化能を有することが確認された。
【０１１７】
ｒＫＳ５６による管腔構造の形成
つぎに、ｒＫＳ５６が管空構造を形成する能力を有するか否かを確認した。
【０１１８】
先ず、約１５０ｇの成体ＳＤラットに対し、約５×１０４個のｒＫＳ５６を、腹壁筋肉内の所定の位置に、墨汁とともに移植する。
【０１１９】
そして、２８日後にＳＤラットを屠殺し、筋肉に切片を作成する。
【０１２０】
次に、切片をヘマトキシリン染色する。なお、墨汁によって染まっている位置に移植した細胞が存在すると考えられるので、墨汁によって染まっている位置をヘマトキシリン染色する。
【０１２１】
ヘマトキシリン染色した位置を蛍光顕微鏡などによって確認したところ、図  １７（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、管腔形成している組織が確認された。なお、図１７（Ａ）、（Ｂ）は管腔の横断面を示しており、図１７（Ｃ）、（Ｄ）は管腔構造を接線方向に切断した断面を示している。さらに、図１７（Ａ），（Ｃ）は、倍率１００倍の画像であり、図１７（Ｂ），（Ｄ）は、倍率４００倍の画像である。
【０１２２】
次に、切片を、１次抗体である抗ＡＱＰ−１抗体、抗ｈ−ｍｅｔ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｅ−ｃａｄ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。
【０１２３】
次に、抗ＡＱＰ−１抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライド、抗ｈ−ｍｅｔ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライド、抗Ｅ−ｃａｄ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライドを、それぞれ２次抗体であるＦＩＴＣ標識抗ラビットＩｇＧ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。また、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライドを、それぞれ２次抗体であるロダミン標識抗ラットＩｇＧ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。
【０１２４】
以上の処理を施した各チャンバースライドを顕微鏡で観察したところ、図１８に示すように、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｈ−ｍｅｔは強く発現していることが確認された。また、ＡＱＰ−１、Ｅ−ｃａｄについては部分的に陰性であるものの、発現が確認された。なお、他のマーカーの発現は確認されなかった。したがって、ｒＫＳ５６は、例えば近位尿細管４など、管腔を形成する系統への分化能を有していると考えられる。
【０１２５】
以上検討した結果から、ｒＫＳ５６は、増殖能、自己複製能、分化能を有しており、腎臓の幹細胞／前駆細胞であることが確認された。
【０１２６】
ｒＫＳ５６の腎臓への生着
つぎに、ｒＫＳ５６が腎臓に生着するか否かを検討した。
【０１２７】
最初に、ｒＫＳ５６にｖｙｂｒａｎｔ  ｃｅｌｌ−ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ社製）を使用してＤｉＯ色素を取り込ませる。
【０１２８】
次に、約１５０ｇである成体ＳＤラットを使用して虚血性急性腎不全モデルを作成する。
【０１２９】
次に、ＤｉＯ色素を取り込ませたｒＫＳ５６を、表３に示す培養液に混合し、虚血性急性腎不全モデルの腎皮膜下経路に、注射器によって移植した後、閉腹する。
【０１３０】
そして、７日後に屠殺して腎臓を摘出して切片を作成し、顕微鏡で観察する。観察した結果、図１９（Ａ）、（Ｂ）に示すように、ＤｉＯ色素が取り込まれたｒＫＳ５６は、近位尿細管４に生着しており、また、間質にも存在していた。
【０１３１】
なお、図１９（Ｃ）、（Ｄ）に示す顕微鏡写真の右下部分には糸球体２が存在するが、糸球体２が存在する位置には、ＤｉＯ色素が取り込まれたｒＫＳ５６の存在は認められなかった。しかしながら、糸球体２の周囲の尿細管にはＤｉＯ色素が取り込まれたｒＫＳ５６の存在が認められた。
【０１３２】
なお、図１９（Ａ）、（Ｃ）は光学顕微鏡で観察した結果を示す画像であり、（Ｂ）、（Ｄ）は蛍光顕微鏡で観察した結果を示す画像である。
【０１３３】
ｒＫＳ５６を使用した虚血性腎不全モデルへの治療
最後に、ｒＫＳ５６を機能が低下した腎臓に移植することにより、腎臓の機能を回復させることが可能であることを確認した。
【０１３４】
先ず、約１５０ｇである成体ＳＤラットを使用して虚血性急性腎不全モデルを作成する。
【０１３５】
次に、虚血性急性腎不全モデルを２つのグループに分け、一方のグループに属するラットには、ＤｉＯ色素が取り込まれており、表３に示す培養液に懸濁した１．６×１０６個のｒＫＳ５６を、注射によって腎皮膜下経路に移植する。なお、以下では、ｒＫＳ５６を移植したＳＤラットのグループを治療群といい、ｒＫＳ５６を移植していないグループを未治療群という。
【０１３６】
そして、治療群のＳＤラットと未治療群のＳＤラットとを、治療群のＳＤラットに対して治療を施してから４日目及び７日目に屠殺する。虚血性急性腎不全モデルは、通常、約４日目に最も腎臓の機能が悪化して約７日目に回復することから、本実施の形態では、４日目及び７日目に屠殺した。
【０１３７】
そして、４日目に屠殺したラットから腎臓を摘出して切片を作成する。作成した切片を顕微鏡で観察したところ、図２０に示すように、治療群のＳＤラットでは、ｒＫＳ５６は主にＳ２セグメント１３及びＳ３セグメント１４に生着していた。
【０１３８】
また、作成した切片を、１次抗体である抗ＡＱＰ−１抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートした後、２次抗体であるロダミン標識抗ラビットＩｇＧ抗体（ケミコン製）が添加されたＰＢＳ中でインキュベートし、顕微鏡で観察したところ、治療群のＳＤラットに生着したｒＫＳ５６には、図２０に示すように、ＡＱＰ−１の発現が見られた。
【０１３９】
なお、図２０中ＦＬは、ＤｉＯ色素が取り込まれている細胞が生着している状態を顕微鏡で観察した画像であり、図２０中ＡＱＰ−１は、ＡＱＰ−１が発現している状態を顕微鏡で観察した画像であり、図２０中ｍｅｒｇｅ２は、ＤｉＯ色素が取り込まれている細胞が生着している状態を顕微鏡で観察した画像とＡＱＰ−１が発現している状態を顕微鏡で観察した画像との二重像である。
【０１４０】
また、４日目に屠殺したラット及び７日目に屠殺したＳＤラットから、血液と尿を採取し、クレアチニン濃度、クレアチニンクリアランス、尿中Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下、Ｕ−ＮＡＧという。）濃度、１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（以下、活性化ビタミンＤ３という。）濃度を測定することで、腎臓の機能について調べたところ、図２１に示す結果が得られた。なお、クレアチニン濃度、Ｕ−ＮＡＧ濃度、活性化ビタミンＤ３濃度の測定は、株式会社エスアールエルにて行われた。また、クレアチニンクリアランスは、クレアチニン濃度から算出した。なお、本実施の形態では、４日目に屠殺した６匹のＳＤラットと、６日目に屠殺した６匹のＳＤラットとから、それぞれ血液及び尿を採取した。
【０１４１】
図２１（Ａ）に示すように、クレアチニン濃度は、４日目及び７日目共に、治療群と未治療群との間で有意差は見られなかった。また、図２１（Ｂ）に示すように、クレアチニンクリアランスは、治療群では４日目にすでに回復しているのに対し、未治療群では７日目に回復した。また、図２１（Ｂ）に示すように、Ｕ−ＮＡＧは、未治療群では低下していないのに対し、治療群では悪化が抑制されていた。また、図２１（Ｄ）に示すように、活性化ビタミンＤ３濃度は、治療群で有意に上昇していた。
【０１４２】
したがって、ｒＫＳ５６を移植することにより、虚血性急性腎不全のラットでは、４日目にクレアチニンクリアランスが軽度回復していることから、糸球体２の病変が抑制されたと考えられる。また、Ｕ−ＮＡＧ濃度の上昇が抑制されたことから、近位尿細管４、遠位尿細管６、間質の病変が抑制されたと考えられる。また、活性化ビタミンＤ３濃度が上昇していることから、ＰＴＨの分泌が惹起されたと考えられる。すなわち、ｒＫＳ５６を移植することにより、腎不全を治癒できる可能性が示唆された。
【０１４３】
【発明の効果】
本発明に係る腎臓幹細胞／前駆細胞は、哺乳動物の腎臓から分離され、増殖能、自己複製能、分化能を有している。したがって、腎臓に移植することによって、腎疾患の治癒が可能となる。
【０１４４】
また、本発明に係る腎臓幹細胞／前駆細胞の単離方法は、腎臓を各部位毎に分離する分離ステップと、分離ステップで分離された各部位の細胞を単離する単離ステップと、分離ステップで分離された各部位の細胞を、支持細胞又は支持細胞培養液とともに培養し、増殖能が高い細胞を得る培養ステップとを備える。したがって、本発明に係る腎臓幹細胞／前駆細胞の単離方法によれば、増殖能、複製能、分化能を有した腎臓幹細胞を単離することができる。
【０１４５】
また、本発明に係る腎疾患の治療方法では、哺乳動物の腎臓から分離され、増殖能、自己複製能、分化能が高い腎臓幹細胞／前駆細胞を、機能が低下した腎臓に移植する。したがって、本発明に係る腎疾患の治療方法によれば、腎臓を再生して腎臓の機能を回復することが可能となるため、腎疾患の治癒が可能となる。
【配列表】
2004275079.tif 000011
2004275079.tif 000012
【配列表フリーテキスト】配列番号１〜４は合成プライマーである、配列番号１，３はセンスプライマーであり、配列番号２，４はアンチセンスプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【図１】腎臓を説明するための模式図である。
【図２】各部位において、ＢｒｄＵ染色された細胞の数を示す図である。
【図３】Ｓ３セグメントから分離された細胞が、他の部位から分離された細胞と比較して増殖能が高いことを示す図である。
【図４】各部位より分離された細胞を培養したときにおける３個以上のコロニーの数を示す図である。
【図５】Ｓ３セグメントから分離された高増殖能細胞の外観を示す図である。
【図６】Ｓ３セグメントから分離された高増殖能細胞を培養した日数と、日数に応じた外観とを示す図である。
【図７】Ｓ３セグメントから分離された高増殖能細胞が自己増殖能をもつことを示す図である。
【図８】高増殖能細胞の表面における、ｈ−ｍｅｔ、ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＡＱＰ−１、Ｅ−ｃａｄの発現を示す図である。
【図９】高増殖能細胞から分離したＰａｘ−２のＤＮＡとＷｎｔ−４のＤＮＡとを電気泳動した状態を示す図である。
【図１０】高増殖能細胞にＰａｘ−２とＷｎｔ−４とが発現していることを示す図である。
【図１１】各条件でｒＫＳ５６を培養したときの、ｒＫＳ５６の数を示す図である。
【図１２】各条件でｒＫＳ５６を培養したときの、ホルモン反応性の違いを示す図である。
【図１３】ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で支持細胞を培養して得られた培養液を添加しないことで、Ｐａｘ−２、Ｗｎｔ−４、Ｆｌｋ−１の発現が低減することを示す図である。
【図１４】ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で支持細胞を培養して得られた培養液の添加に拘わらず、ＡＱＰ−１、ｈ−ｍｅｔの発現が変化しないことを示す図である。
【図１５】ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で支持細胞を培養して得られた培養液を添加しないでｒＫＳ５６を培養したときには、１回り大きな細胞が見られることを示す図である。
【図１６】表８に示す組成の培養液でｒＫＳ５６を培養したときの、ＡＱＰ−１とＴＨＰの発現の違いを示す図である。
【図１７】ｒＫＳ５６がＳＤラットの腹壁筋肉内に移植され、管腔構造を形成していることを示す図である。
【図１８】腹壁筋肉内にｒＫＳ５６が移植されたＳＤラットにおいて、移植されたｒＫＳ５６に、ＡＱＰ−１、ｈ−ｍｅｔ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎが、発現していることを示す図である。
【図１９】移植したｒＫＳ５６が生着していることを示す図である。
【図２０】急性腎不全モデルにｒＫＳ５６が生着していることを示す図である。
【図２１】クレアチニン濃度、クレアチニンクリアランス、Ｕ−ＮＡＧ濃度、活性化ビタミンＤ３濃度などを示す図である。
【符号の説明】
１  ネフロン、２  糸球体、３  ボーマン嚢、４  近位尿細管、５  ヘンレのループ、６  遠位尿細管、７  集合管、１１  Ｓ１セグメント、１２  ＰＣＴ、１３  Ｓ２セグメント、１４  Ｓ３セグメント
【図１】
2004275079.tif 000013
【図２】
2004275079.tif 000014
【図３】
2004275079.tif 000015
【図４】
2004275079.tif 000016
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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