(57)【要約】【課題】ＲＮａｓｅを使用することなくＤＮＡを高精製度で植物体から分離できる簡便な抽出方法及びそのための溶出試薬及び抽出キットの提供。【解決手段】ｐＨ７〜９に緩衝された液からなり、ＳＤＳとＥＤＴＡとポリエーテル系消泡剤とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ溶出試薬；前記試薬を植物組織に混合して細胞溶解液を得る工程（ａ）と細胞溶解液にカオトロピック物質を含む核酸吸着液を混合し混合液を得る工程（ｂ）と前記混合液を核酸結合性担体に接触させて該担体にＤＮＡを結合させる工程（ｃ）と前記核酸結合性担体上のＤＮＡを洗浄する工程（ｄ）と前記核酸結合性担体からＤＮＡを分離する工程（ｅ）とを含む植物ＤＮＡの抽出方法；及び前記ＤＮＡ溶出試薬とカオトロピック物質を含む核酸吸着液と核酸結合性担体とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ抽出キット。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ７〜９に緩衝された液からなり、ＳＤＳと、エチレンジアミン四酢酸と、ポリエーテル系消泡剤とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ溶出試薬。
【請求項２】
請求項１記載の植物ＤＮＡ溶出試薬を植物組織に混合して植物組織中の細胞を溶解させ、細胞溶解液を得る工程（ａ）と；
前記細胞溶解液に、カオトロピック物質を含む核酸吸着液を混合し、混合液を得る工程（ｂ）と；
前記混合液を核酸結合性担体に接触させて、該担体にＤＮＡを結合させる工程（ｃ）と；
前記核酸結合性担体上のＤＮＡを洗浄する工程（ｄ）と；
前記核酸結合性担体からＤＮＡを分離する工程（ｅ）とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡの抽出方法。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡ溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ抽出キット。
【請求項４】
前記核酸吸着液が、前記カオトロピック物質としてグアニジン、ＳＣＮ−及びＩ−の塩からなる群より選択されるカオトロピック物質を含み、前記核酸結合性担体が、核酸結合性物質としてシリカを含むことを特徴とする請求項２記載の植物ＤＮＡ抽出キット。
【請求項５】
リセート分離用フィルタ、核酸結合性担体の洗浄液、核酸結合性担体から核酸を分離させる分離液、又はこれらの２種以上の組み合わせをさらに含むことを特徴とする請求項４記載の植物ＤＮＡ抽出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物材料から植物ＤＮＡを抽出、精製するための抽出キット及び抽出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物からその核酸を抽出し精製することは、遺伝子工学等の研究において重要な工程の一つである。このような工程は、多くの場合、数多くの個体について行なわれることが求められるため、その工程はより単純なものであることが好ましい。さらに、このような工程は通常実験室において行なわれるものであるので、実験室において使い勝手がよいものが好ましい。
【０００３】
植物の核酸の抽出方法としては、これまでに数多くのものが知られている。例えば、特許文献１及び２には、核酸を核酸結合性固相担体に結合させてから分離する方法が開示されており、これらの方法ではＤＮＡ及びＲＮＡを効率的に抽出できる。しかしながらこれらの従来の核酸の抽出方法では、ＤＮＡとＲＮＡとの化学的性質が近似していることから、ＤＮＡをＲＮＡから高精製度で分離することが困難であるという問題点がある。
【０００４】
ＲＮＡを含むＤＮＡ試料からのＲＮＡの除去は、通常ＲＮａｓｅを試料溶液中に添加し、ＲＮＡを分解することにより行なわれる。しかし、一般に遺伝子工学の研究においては、ＲＮａｓｅフリーの条件下で実験を行なうことが求められることが多いため、実験室においてＲＮａｓｅを用いる作業には格別の注意を払わなければならないという、実用上の大きな問題点がある。
【０００５】
また、得られる核酸抽出物は、夾雑物が少ないものであることが好ましいが、通常夾雑物の少ない抽出法ほど抽出の工程が複雑である。したがって、工程が単純でありながら且つ夾雑物の少ない抽出方法が求められている。
【０００６】
【特許文献１】
特開平２−２８９５９６号公報
【特許文献２】
特開平１１−１６９１７０号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＲＮａｓｅを使用することなく、ＤＮＡを高精製度で植物体から分離することができる簡便な抽出方法及びそれに用いる溶出試薬及び抽出キットを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々検討をおこなったところ、植物組織から核酸を溶出させるための試薬の組成を特定のものとし、これを、核酸結合性固相担体を用いる抽出方法に適用することにより、ＲＮａｓｅを用いなくてもＲＮＡの混入割合が非常に低いＤＮＡ試料を簡便且つ効率的に抽出しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明によれば、ｐＨ７〜９に緩衝された液からなり、ＳＤＳと、エチレンジアミン四酢酸と、ポリエーテル系消泡剤とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ溶出試薬が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、前記植物ＤＮＡ溶出試薬を植物組織に混合して植物組織中の細胞を溶解させ、細胞溶解液を得る工程（ａ）と；前記細胞溶解液に、カオトロピック物質を含む核酸吸着液を混合し、混合液を得る工程（ｂ）と；前記混合液を核酸結合性担体に接触させて、該担体にＤＮＡを結合させる工程（ｃ）と；前記核酸結合性担体上のＤＮＡを洗浄する工程（ｄ）と；前記核酸結合性担体からＤＮＡを分離する工程（ｅ）とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡの抽出方法が提供される。
【００１１】
さらに、本発明によれば、前記ＤＮＡ溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ抽出キットが提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、ｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ７〜８に緩衝された液からなる。具体的にはトリス−ＨＣｌにより緩衝されたもの、即ちトリス等の緩衝剤を含み、塩酸等によりこの範囲のｐＨに調整された液とすることができる。本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬中の前記緩衝剤の含有割合の下限値は、１５０ｍＭ以上、より好ましくは１８０ｍＭ以上とすることができる。上限値は特に限定されないが、通常は５００ｍＭ以下、好ましくは２５０ｍＭ以下とすることができる。
【００１３】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、ＳＤＳを含む。ＳＤＳの含有割合は、植物ＤＮＡ溶出試薬全量に対して０．１〜１０％、好ましくは約０．５％とすることができる。
【００１４】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬中のＥＤＴＡの含有割合は、１０〜５０ｍＭ、好ましくは２０〜３０ｍＭとすることができる。
【００１５】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、さらに、ポリエーテル系消泡剤を含む。前記ポリエーテル系消泡剤としては、例えばオキシエチレン、オキシプロピレン等の重合単位を持つ重合体又はその誘導体を挙げることができる。特に好ましくは、ＰＥ−Ｌ（商品名、和光純薬株式会社製）を用いることができ、その含有割合は、植物ＤＮＡ溶出試薬全量中０．８％以上、好ましくは０．９％以上とすることができる。含有割合の上限は特に限定されないが、２．０％程度とすることができる。
【００１６】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬の調製方法は、特に限定されず、上記各成分を水に溶解することにより調製することができる。
【００１７】
本発明の植物ＤＮＡの抽出方法は、前記本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬を植物組織に混合して植物組織中の細胞を溶解させ、細胞溶解液を得る工程（ａ）を含む。
【００１８】
前記工程（ａ）における前記ＤＮＡ溶出試薬と植物組織との添加割合は、特に限定されないが、例えば５０ｍｇの植物組織に対し、５０〜２５０μｌの割合とすることができ、１００〜２００μｌの割合とすることが特に好ましい。
【００１９】
前記工程（ａ）は、適当なチューブ等の容器に、前記ＤＮＡ溶出試薬と植物組織とを入れ、さらに破砕球を入れて振とうすることにより行なうことができる。前記破砕球としては、セラミック、タングステン、ステンレス、ジルコニア等の球状又は歪んだ球状のビーズ等を用いることができる。破砕球の寸法は特に限定されないが、例えば内径５ｍｍ程度のチューブ中で破砕を行なう場合、直径４ｍｍ程度の破砕球１個を入れて行なうことができる。
【００２０】
特に前記工程（ａ）は、添加するＤＮＡ溶出試薬の一部を先に植物組織と混合し、破砕球等により破砕し、それからＤＮＡ溶出試薬の残りを添加することにより行なうことができる。具体的には例えば、約１００μｌのＤＮＡ溶出試薬と植物組織とをチューブ等の容器に入れ、振とうを行なってから、さらに約１００μｌのＤＮＡ溶出試薬を混合することができる。このように、先に比較的少量の溶出試薬によって、より短時間の破砕操作で、ＤＮＡに物理的な切断をもたらさずに、効率的に破砕を行なうことができる。
【００２１】
本発明の抽出方法は、前記細胞溶解液に、カオトロピック物質を含む核酸吸着液を混合し、混合液を得る工程（ｂ）を含む。工程（ｂ）において、前記核酸吸着液の添加量は、特に限定されないが植物組織５０ｍｇに対し、１５０〜２５０μｌの割合とすることができる。
【００２２】
前記核酸吸着液は、カオトロピック物質として、グアニジンの塩（チオシアン酸塩、塩酸塩等）、並びにＳＣＮ−及びＩ−の塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）等を含むことができる。前記核酸吸着液中の前記カオトロピック物質の含有割合は、１Ｍ〜２０Ｍ、好ましくは５〜１５Ｍとすることができる。
【００２３】
前記核酸吸着液は、さらに、ｐＨを一定とするための緩衝剤を含むことができる。当該緩衝剤としては、酢酸ナトリウム緩衝剤等を挙げることができる。
【００２４】
前記工程（ｂ）終了後、得られた混合液は、一旦遠心分離し上澄のみを取ってから次の工程に供することが好ましい。
【００２５】
また、前記混合液は、必要に応じて、リセート分離用フィルタに通す工程（ｂ’）に供してから、次の工程に供することができる。前記リセート分離用フィルタは特に限定されず、現在商業的に入手可能なリセートのクリーニング用のフィルタ等を挙げることができる。前記混合液をリセート分離用フィルタに通す操作は、特に限定されないが、底部がフィルタとなったウェルの形状を有するものなどの通常のフィルタに前記混合液を入れ、遠心することにより行なうことができる。
【００２６】
本発明の抽出方法は、前記混合液を核酸結合性担体に接触させて、該担体にＤＮＡを結合させる工程（ｃ）を含む。前記核酸結合性担体は、通常固相の担体とすることができ、好ましくは細胞の溶解液を容易に接触させることができる粒子、フィルタ、反応容器等の形状とすることができる。前記担体の材質は、カオトロピック物質の存在下でＤＮＡを吸着することができるものであれば特に限定されないが、核酸吸着能を有するものであれば特に限定されないが、シリカ、又は他の物質上にシリカを結合させたもの等を好ましく挙げることができる。
【００２７】
工程（ｃ）を行なう操作は特に限定されないが、例えば前記分離用フィルタを通過した前記混合液をそのまま、核酸結合性担体のフィルタに通過させることにより行うことができる。
【００２８】
本発明の抽出方法は、前記核酸結合性担体上のＤＮＡを洗浄する工程（ｄ）を含む。工程（ｄ）を行なう操作は特に限定されないが、例えば、前記混合液を通過させＤＮＡを結合させた核酸結合性担体のフィルタに、洗浄液を、植物組織５０ｍｇあたり対し５０〜２５０μｌ程度の割合で通過させることにより行うことができる。前記洗浄液は、固相からのＤＮＡの溶出を促進せずに他の物質を担体から洗い落とすことができる物質であれば特に限定されず、４０〜８０％、好ましくは約７０％エタノール等のアルコール等を含む水溶液を挙げることができる。
【００２９】
本発明の抽出方法は、前記核酸結合性担体からＤＮＡを分離する工程（ｅ）を含む。この工程を行なう操作は、例えば核酸結合性担体から核酸を分離させる分離液を前記核酸結合性担体のフィルタに通し、通過した液をＤＮＡ溶液として回収することにより行なうことができる。前記分離液としては、適当なｐＨの緩衝液を適宜用いることができる。具体的には例えば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、含１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を挙げることができる。
【００３０】
前記工程（ｅ）で得られたＤＮＡ溶液は、そのまま、ＰＣＲテンプレート等のための試料として用いることができる。特に、前記工程（ｅ）で得られたＤＮＡ溶液は、ＲＮａｓｅによるさらなる処理を行なわなくても、ＲＮＡの混入割合が少ないＤＮＡ試料として用いることができる点が大きな特徴である。いかなる理論にも拘束されないが、特定の溶出試薬を用いて溶出を行なうことにより、ＤＮＡが効率よく植物組織から溶出し且つ核酸結合性担体に選択的に捕捉されるために、このような効果が得られるものと思われる。
【００３１】
本発明の植物ＤＮＡ抽出キットは、前記ＤＮＡ溶出試薬と、前記カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、前記核酸結合性担体とを含む。また、必要に応じて、前記リセート分離用フィルタ、前記核酸結合性担体の洗浄液、核酸結合性担体から核酸を分離させる分離液、又はこれらの２種以上の組み合わせをさらに含むことができる。本発明の植物ＤＮＡ抽出キットは、これらを含むことにより、前記本発明の植物ＤＮＡの抽出方法を容易に実施することができる。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬、本発明の植物ＤＮＡ抽出キット及び植物ＤＮＡの抽出方法は、特定の組成の溶出試薬を採用することにより、ＲＮａｓｅを用いなくても、夾雑物が少なく、ＲＮＡ混入割合の少ないＤＮＡ試料を簡便且つ効率的に抽出することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００３４】
【実施例１】
表１に示す組成の植物ＤＮＡ溶出試薬１及び表２に示す核酸吸着液１を、各成分を蒸留水に溶解することにより調製した。
【００３５】
【表１】
2004290030.tif 000002
【００３６】
【表２】
2004290030.tif 000003
【００３７】
【実施例２】
実施例１にて調製した溶出試薬１及び核酸吸着液１を用いて、以下の手順（ａ）〜（ｅ）により、表３及び表４に示す各種の植物試料について、ＤＮＡの抽出を行なった。
（ａ）５０ｍｇ又は１００ｍｇの植物試料とジルコニアビーズ（直径４ｍｍ）一つを、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｓ  （Ｑｉａｇｅｎ社製、商品番号１９５６０）の各チューブに入れた。２００μｌの溶出試薬１を、各チューブに加え、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ  Ｃａｐｓ  （Ｑｉａｇｅｎ社製、商品番号１９５６６）で蓋をし、ミキサーミル（Ｑｉａｇｅｎ社製、商品名ＭＭ３００、商品番号８５１００）で、３０  １／ｓにて１．５分間撹拌した。植物試料が完全に粉砕されるまで、この撹拌を最大４回繰返し、細胞溶解液を得た。
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞溶解液に、核酸吸着液１を２００μｌ添加し、手で激しく撹拌し、遠心機（商品名ＣＦ１６ＲＸ、日立製作所製、スイングバケットローターＴ５Ｓ３２を備える）を用い、４８００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みを得、混合液とした。
（ｃ）リセートのクリーニング用のフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品名ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＮＡ）を、核酸結合性担体フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品名ＭｕｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＦＢ）上に、遠心分離用アダプタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品番号ＭＡＣＦ  ０９６  ０４）を用いてセットし、フロースルーコレクションプレート上に置いた。（ｂ）で得た上澄み２００μｌをクリーニング用フィルタの各ウェル上に置き、２分間１００ｒｐｍで遠心し、リセートを核酸結合性担体フィルタまで移動させた。
（ｄ）クリーニング用フィルタを取り除き、核酸結合性担体フィルタの各ウェル上に２００μｌの７０％エタノール水溶液を加え、１５００ｒｐｍで２分間遠心し、フィルタを通過した液を廃棄した。
（ｅ）核酸結合性担体フィルタの各ウェルに、６０℃に加温した５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を加え、１分間放置した。核酸結合性担体フィルタを９６ウェルＶボトムプレートに、遠心アダプタを用いて取り付け、２０００ｒｐｍで１分間遠心し、Ｖボトムプレート中に、植物ＤＮＡ抽出物溶液を得た。
【００３８】
得られた植物ＤＮＡ抽出物溶液について、ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）を測定し、収量（μｇ）を求め、また、核酸の純度の指標であるＯＤ２６０／２８０を測定した。結果を表３及び表４に示す。
【００３９】
【表３】
2004290030.tif 000004
【００４０】
【表４】
2004290030.tif 000005
【００４１】
また、抽出したゲノムＤＮＡの１／５量を０．８％アガロースゲル／０．５ＸＴＢＥバッファーで電気泳動し、エチジウムブロミドで染色した後写真撮影を行なった。その結果、ＤＮＡのテイリングの少ない、鮮明なバンドが観察された。
【００４２】
【実施例３】
実施例２の工程（ａ）において、植物試料とビーズと１００μｌの溶出試薬１とをチューブに加え、植物試料が完全に破砕されるまで撹拌を繰返し、さらにその後１００μｌの植物試料を加えて細胞溶解液を得た他は、実施例２と同様に操作し、ＤＮＡの抽出を行ない、ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）を測定し、収量（μｇ）を求め、ＯＤ２６０／２８０を測定した。結果を表５に示す。
【００４３】
【表５】
2004290030.tif 000006
【００４４】
【実施例４】
実施例３において得たシロイヌナズナのＤＮＡ抽出液を、ＤＮＡ量が５００ｎｇとなるようにとり、これにＥｃｏＲＩを常法で２時間作用させた後、実施例２で行なったのと同様に電気泳動し、さらに、常法にしたがってサザンブロッティングを行なった。その結果、ブロッティングしたメンブレン上には単一の明確なバンドが表れ、本発明にしたがって得たＤＮＡ抽出液は、夾雑物による制限酵素の作用への悪影響がなく、ＲＮＡによるクロスハイブリダイゼーションの影響もなく、サザン解析にも用いうる良好な品質であることが確認された。