(57)【要約】【課題】　新規なアファディン DILドメイン結合性タンパク質(ADIP)遺伝子の提供、並びに、新規なADIPタンパク質の用途を提供することを課題とする。【解決手段】　ネクチンおよびアファディン系がどのように細胞間結合における密着結合および接着結合を組織化するかの洞察を得るために、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行い、新規アファディン結合タンパク質(ADIP)の同定に成功した。該新規タンパク質は、アクチン骨格を制御する薬剤を評価する際に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　下記(a)から(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(a)配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
(c)配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、アファディンまたはアクチニンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
(d)配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アファディンまたはアクチニンとの結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項２】
　請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項３】
　請求項１に記載のポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
【請求項４】
　請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項５】
　請求項４に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたポリペプチドを回収する工程を含む、請求項２に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項６】
　請求項１に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を持つポリヌクレオチド。
【請求項７】
　請求項１に記載のポリヌクレオチドもしくはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項８】
　請求項２に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項９】
　以下の(a)〜(c)の工程を含む、アクチン骨格を制御する薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
(a)アファディンまたはアクチニンと、請求項２に記載のポリペプチドおよび被検化合物を接触させる工程、
(b) アファディンまたはアクチニンと、請求項２に記載のポリペプチドとの結合活性を測定する工程、
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、上記結合活性を変化させる化合物を選択する工程
【請求項１０】
　被検者における請求項２に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を検出することを特徴とする、心臓疾患の検査方法。
【請求項１１】
　以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１０に記載の検査方法。
（ａ）被検者の心筋細胞からRNA試料を調製する工程
（ｂ）該RNA試料に含まれる請求項２に記載のポリペプチドをコードするRNAの量を測定する工程
（ｃ）測定されたRNAの量を対照と比較する工程
【請求項１２】
　以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１０に記載の検査方法。
（ａ）被検者の心筋細胞からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれる請求項２に記載のポリペプチドの量を測定する工程
（ｃ）測定されたポリペプチドの量を対照と比較する工程
【請求項１３】
　心臓疾患が心筋梗塞または心筋炎である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、新規なアファディン DILドメイン結合性タンパク質（ADIP）および該タンパク質をコードする遺伝子ならびに該遺伝子を利用した疾患の治療薬のスクリーニング方法、並びに、該疾患の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　多細胞生物中の細胞は、その隣接細胞を認識し、それらに接着し、細胞間結合を形成する。そのような結合は、形態形成、分化、増殖および移動などの各種の細胞機能において欠かせない役割を備えている（非特許文献１〜６参照）。分極上皮細胞において、細胞間接合は密着結合（tight junctions; TJs）、接着結合（adherens junctions; AJs）およびデスモソームよりなる接合部複合体によって仲介される。これらの結合構造は通常、先端から基底側に整列しているが、デスモソームは他の領域に独立して分布している。
【０００３】
　AJsは当初、アクチンフィラメント（F-アクチン）束が裏打ちされている濃い細胞質プラークによって補強され、近くに並んだ形質膜ドメインとして、超微細構造解析を用いて定義された（非特許文献７参照）。分子解析によると、AJsは、典型的なカドヘリンが細胞接着分子と同様に機能し、アクチンをベースとした細胞骨格および数種の細胞質成分が集合する細胞-細胞接着部位であることを示している（非特許文献８および９参照）。E-カドヘリンは他の典型的なカドヘリンと同様に、細胞外ドメインがCa2+に依存する方法で同種親和性認識および接着性結合を仲介する、シングルパス膜貫通タンパク質である（非特許文献１０参照）。E-カドヘリンは、α-、β-およびγ-カテニン、α-アクチニンおよびビンキュリン（vinculin）を含む周囲の膜タンパク質を通じて、アクチン細胞骨格に会合する（非特許文献１１〜１４参照）。β-カテニンは、E-カドヘリンの細胞質尾部と直接相互作用して、E-カドヘリンを、F-アクチンに直接結合しているα-カテニンに結合させる（非特許文献１５参照）。α-アクチニンおよびビンキュリンは、α-カテニンに直接結合しているF-アクチン-結合タンパク質である（非特許文献１３、１４、および１６参照）。
【０００４】
　E-カドヘリンとアクチン細胞骨格との、これらの末梢膜タンパク質を通した会合により、E-カドヘリンの細胞-細胞接着が強化される（非特許文献１および１７参照）。
【０００５】
　本発明者らは、別の細胞-細胞接着分子であるネクチン、およびネクチンに会合したF-アクチン結合タンパク質であるアファディンも、AJsに局在していることを見出した（非特許文献１８および１９参照）。ネクチンおよびアファディンは、AJsに厳密に局在し、これは、F-アクチン束が裏打ちされている濃い細胞質プラークにより補強された近くに並べられた形質膜ドメインとして、超構造的解析を使用して規定された（非特許文献７、１８、および１９参照）。これに対し、E-カドヘリンは、Ajsに集中しているが、側方形質膜の先端から基底側までより広範に分布している（非特許文献２および２０参照）。ネクチンは、Ca2＋独立的免疫グロブリン様細胞-細胞接着分子である（非特許文献１９、２１〜２５参照）。ネクチンは、現在のところ、4つの膜、すなわちネクチン-1、-2、-3、および-4からなる族を含む。ネクチン-4を除く全ネクチンが、2または3つのスプライス変異体を有し、ネクチン-1α、-1β、-2α、-2δ、-3α、-3β、および-3γアイソフォームが存在している（非特許文献１９、２４〜３０参照）。ネクチン-1は、最初、ポリオウイルス受容体関連タンパク質（PRR1）の1つとして同定された（非特許文献２９参照）。ネクチン-2は最初、ヒトポリオウイルス受容体タンパク質のネズミホモログとして同定されたが（非特許文献２６参照）、後に別のポリオウイルス受容体関連タンパク質（PRR2）であることが判明した（非特許文献２８および２９参照）。それらは後に、α-ヘルペスウイルスの受容体として作用し、該ウイルスの侵入および細胞内への広がりを容易にすることが示され、それぞれHveCおよび-Bと再度命名された（非特許文献３０〜３５参照）。すべてのメンバーは、3つの免疫グロブリン様ループ、1回膜貫通領域、および細胞質領域を有する細胞外ドメインを有する。さらに、ネクチン-1β、-3γ、および-4を除く、すべてのメンバーは、4つのアミノ酸残基（Glu／Ala-X-Tyr-Val）の保存モチーフをそのカルボキシル末端に有する。このモチーフは、アファディンのPDZドメインに結合する（非特許文献１８、１９、２４、および２５参照）。
【０００６】
　アファディンは、少なくとも2つのスプライス変異体、すなわちl-アファディンおよびs-アファディンを有する（非特許文献１８参照）。大きい方のスプライス変異体であるl-アファディンは、ネクチンへ結合し、またF-アクチン結合ドメインを介してF-アクチンに結合する。l-アファディンは、F-アクチンの側面に結合するが、それに架橋して束を形成しない。アファディンは、2つのRas会合ドメイン（RA）、フォークヘッド会合ドメイン（FHA）、希釈ドメイン（DIL）、PDZドメイン、2つのプロリンリッチドメイン（PR）、および1つのF-アクチン結合PRドメインを有する（図１Ａ参照）。DILドメインは、アファディン、および、dilute（DIL）、Myo2およびMyo4を含むV型ミオシンに見出される。しかしその機能は依然として不明である（非特許文献３６参照）。DILドメインを含むMyo4領域が、アダプタータンパク質であるShe3に結合するという近年の知見（非特許文献３７および３８参照）から、DILドメインがタンパク質-タンパク質相互作用に関与することが示される。
【０００７】
　小さい方のスプライス変異体であるs-アファディンは、2つのRA、FHA、DIL、PDZ、および2つのPRドメインを有するが、F-アクチン結合PRドメインを欠失している。ヒトs-アファディンは、急性骨髄性白血病に関与するALL-1融合対として同定された遺伝子である、AF-6の遺伝子産物と同一である（非特許文献３９参照）。特記しない限り、本明細書中で、アファディンはl-アファディンを意味する。
【０００８】
　ネクチンは、線維芽細胞および上皮細胞において、アファディンおよびα-カテニンを介して、ネクチンをベースとした細胞-細胞接着部位にE-カドヘリン-β-カテニン複合体を補充する効力を有する（非特許文献４０および４１参照）。ネクチンはさらに、線維芽細胞および上皮細胞においてアファディンを介して、ネクチンをベースとした細胞-細胞接着部位にZO-1、クローディン、オクルーディン、および接合部接着分子（JAM）を含むTJの成分を補充する効力を有する（非特許文献４１〜４３参照）。クローディンは、TJ鎖を形成する重要な細胞-細胞接着分子であり（非特許文献４４〜４７参照）、オクルーディンおよびJAMは、TJsにおける他の膜貫通タンパク質である（非特許文献４６〜４８参照）。クローディン、オクルーディン、およびJAMは、F-アクチン結合足場分子であるZO-1と相互作用する（非特許文献４９〜６０参照）。アファディン（-／-）マウスおよび（-／-）胚様体の上皮細胞では、AJsおよびTJsの適切な組織化が損なわれている（非特許文献６１参照）。ネクチン-1は、近年、唇裂／口蓋、合指、精神遅滞、および外胚葉異形成を特徴とする、唇裂／口蓋-外胚葉異形成に関与することがポジショナルクローニングにより決定した（非特許文献６２参照）。
【０００９】
　さらに、本発明者らは、近年、ネクチン-アファディン系は、ニューロン中でN-カドヘリンと協動してシナプス形成に関与し（非特許文献６３参照）、ネクチン-アファディン系は、精巣中のセルトリ細胞-精細胞接合部の組織化における重要な接着系を構成する（非特許文献６４参照）ことを見出した。したがって、ネクチンおよびアファディンは、既知の細胞接着分子と共に、またはそれとは独立的に、多種多様の細胞間接合部の組織化に重要である。しかし、ネクチン-アファディン系がこれらの細胞間接合部を組織化する分子機序に関しては、依然として完全に解明されていない。
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【非特許文献３】Vleminckx, K.およびR. Kemler著、「Cadherins and tissue formation: integrating adhesion and signaling. Bioessays.」、1999年、Vol.21、p.211-220
【非特許文献４】Tepass, U.（外４名）著、「Cadherins in embryonic and neural morphogenesis.」 Nat. Rev. Mol. Cell Biol.、2000年、Vol.1、p.91-100
【非特許文献５】Takeichi, M.（外４名）著、「Patterning of cell assemblies regulated by adhesion receptors of the cadherin superfamily.」、Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.、2000年、Vol.355、p.885-890
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【非特許文献６２】Suzuki, K.（外６名）著、「Mutations of PVRL1, encoding a cell-cell adhesion molecule/herpesvirus receptor, in cleft lip/palate-ectodermal dysplasia.」、Nat. Genet.、2000年、Vol.25、p.427-430
【非特許文献６３】Mizoguchi, A.（外１３名）著、「Nectin: an adhesion molecule involved in formation of synapses.」、J Cell Biol.、2002年、Vol.156、p.555-565
【非特許文献６４】Ozaki-Kuroda, K.（外１１名）著、「Nectin couples cell-cell adhesion and actin scaffold at heterotypic adherens junction in testis.」、Curr. Biol.、2002年、Vol.13、p.1145-1150
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は新規なアファディン DILドメイン結合性タンパク質(ADIP)遺伝子を提供することにある。また、本発明は、このようにして同定された新規なADIPの用途を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。まず本発明者らは、ネクチンおよびアファディン系がどのようにAJsおよびTJsを組織化するかの洞察を得るために、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、アファディン結合タンパク質の同定を行った。そして、ベイトとしてアファディンのDILドメインを使用し、該ドメインに結合する、新規なアファディン結合タンパク質であるADIP（アファディンDILドメイン相互作用タンパク質）を同定することに成功した。
【００１２】
　ADIPはさらに、α-カテニンへの直接的な結合を介し、E-カドヘリンと間接的に会合することが知られているF-アクチン束形成タンパク質であるα-アクチニンと結合することが判明した（Knudsen, K.A., A.P. Soler, K.R. Johnson, and M.J. Wheelock. 1995. Interaction of alpha-actinin with the cadherin/catenin cell-cell adhesion complex via alpha-catenin. J. Cell Biol. 130:67-77.）。この結果より、ADIPはα-アクチニンを通して、ネクチン-アファディンおよびE-カドヘリン-カテニン系に接続し、アファディンおよびα-アクチニンを通して、AJsにおけるアクチン細胞骨格の組織化に関与することが示唆された。このことから、ADIPはアクチン骨格を制御する薬剤を評価する際に有用であると考えられる。
【００１３】
　また、ADIPは心筋細胞の介在板において非常に強い発現を示したことから、心筋梗塞や心筋炎等の心臓疾患における介在板の機能マーカーとして有効である可能性が考えられる。
【００１４】
　即ち本発明は、新規ADIP遺伝子およびその利用に関し、より具体的には、
〔１〕　下記(a)から(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチド、
(a)配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号：１または３に塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
(c)配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、アファディンまたはアクチニンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
(d)配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アファディンまたはアクチニンとの結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔２〕　〔１〕に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
〔３〕　〔１〕に記載のポリヌクレオチドが挿入されたベクター、
〔４〕　〔１〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔３〕に記載のベクターを保持する宿主細胞、
〔５〕　〔４〕に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたポリペプチドを回収する工程を含む、〔２〕に記載のポリペプチドの製造方法、
〔６〕　〔１〕に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を持つポリヌクレオチド、
〔７〕　〔１〕に記載のポリヌクレオチドもしくはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチド、
〔８〕　〔２〕に記載のポリペプチドに結合する抗体、
〔９〕　以下の(a)〜(c)の工程を含む、アクチン骨格を制御する薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法、
(a)アファディンまたはアクチニンと、〔２〕に記載のポリペプチドおよび被検化合物を接触させる工程、
(b) アファディンまたはアクチニンと、〔２〕に記載のポリペプチドとの結合活性を測定する工程、
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、上記結合活性を変化させる化合物を選択する工程
〔１０〕　被検者における〔２〕に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を検出することを特徴とする、心臓疾患の検査方法、
〔１１〕　以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１０〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者の心筋細胞からRNA試料を調製する工程
（ｂ）該RNA試料に含まれる〔２〕に記載のポリペプチドをコードするRNAの量を測定する工程
（ｃ）測定されたRNAの量を対照と比較する工程
　上記工程の好ましい態様としては、対照と比較して、本発明のポリペプチドをコードするRNAの量が有意に変化していた場合、被検者は、該遺伝子の発現異常に関連するとされる心臓疾患を罹患している、または該疾患を発症する危険を有すると判定する工程、である、
〔１２〕　以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１０〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者の心筋細胞からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれる〔２〕に記載のポリペプチドの量を測定する工程
（ｃ）測定されたポリペプチドの量を対照と比較する工程
　上記工程の好ましい態様としては、対照と比較して、本発明のポリペプチドの量が有意に変化していた場合、被検者は、該遺伝子の発現異常に関連するとされる心臓疾患を罹患している、または該疾患を発症する危険を有すると判定する工程、である、
〔１３〕　心臓疾患が心筋梗塞または心筋炎である、〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の検査方法、
〔１４〕　ポリヌクレオチドが（ａ）である、〔１〕に記載のポリヌクレオチド、
〔１５〕　ポリヌクレオチドが（ｂ）である、〔１〕に記載のポリヌクレオチド、
〔１６〕　（ｃ）のポリヌクレオチドが、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において10%以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるポリヌクレオチドである、〔１〕に記載のポリヌクレオチド、
〔１７〕　（ｃ）のポリヌクレオチドが、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、〔１〕に記載のポリヌクレオチド、
〔１８〕　（ｄ）のポリヌクレオチドが、配列番号：１または３に記載の塩基配列と少なくとも70%の相同性を有するポリヌクレオチドである、〔１〕に記載のポリヌクレオチド、
〔１９〕　配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の相同性を有するポリペプチドである、〔２〕に記載のポリペプチド、
〔２０〕　配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含む、〔２〕に記載のポリペプチド、を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
　本発明者らにより、新規なアファディン DILドメイン結合性タンパク質(ADIP)、および該タンパク質をコードする遺伝子が提供された。本発明のタンパク質は、アクチン骨格を制御する薬剤を評価する際に有用であると考えられる。
【００１６】
　また、本発明のタンパク質は心筋細胞の介在板において非常に強い発現を示すことから、心筋梗塞や心筋炎等の心臓疾患における介在板の機能マーカーとして有効である。本発明の遺伝子の発現量を指標とすることにより、心臓疾患の診断を行うことが可能である。また、本発明のタンパク質は、心臓疾患を治療するための薬剤の候補化合物のスクリーニングに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
　本発明は、アファディンDILドメインに結合する新規なタンパク質であるADIPをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明に含まれる、本発明者らにより同定されたマウスADIPをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号：１に、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また本発明に含まれる、本発明者らによって同定されたラットADIPをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号：３に、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
【００１８】
　本発明はまた、本発明者らにより同定されたポリぺプチドと機能的に同等なポリペプチド、および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。ここで「機能的に同等」とは、対象となるポリペプチドが本発明者らにより同定されたポリぺプチドと同等の生物学的特性を有していることを意味する。ADIPが持つ生物学的特性としては、アファディン、および／またはアクチニンと結合する活性を例示することができる。従って、本発明には、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、アファディンまたはアクチニンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。さらに、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アファディンまたはアクチニンとの結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。上記「結合活性」の測定は、当業者においては周知の方法、例えば、酵母ツーハイブリッド系等により実施することができる。なお、本発明において「アクチニン」とは、通常、「α-アクチニン」を指す。
【００１９】
　本発明のポリヌクレオチドは、当業者においては、一般的に公知の方法により単離することが可能である。例えば、ハイブリダイゼーション技術（Southern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, RK. et al., Science, 1985, 230, 1350.、Saiki, RK. et al., Science 1988, 239, 487.）を利用する方法が挙げられる。すなわち、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその一部をプローブとして、また配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、他の動物（例えば、ヒト等）から配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと高い相同性を有するポリヌクレオチドを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダイゼーション技術やPCR技術によって単離し得る、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、ADIPのヒトホモログをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２０】
　上記ポリヌクレオチドを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M 尿素、0.4％ SDS、0.5×SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4％ SDS、0.1×SSCの条件下では、より相同性の高いポリヌクレオチドを単離できることが期待される。こうして単離されたポリヌクレオチドは、アミノ酸レベルにおいて、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の同一性を指す。
【００２１】
　アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 2264-2268.、Karlin, S. & Altschul, SF., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873.）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul, SF. et al., J Mol Biol, 1990, 215, 403.）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
【００２２】
　本発明のポリヌクレオチドには、ゲノムDNA、cDNAおよびRNA、並びに、化学合成DNA、RNAが含まれる。本発明のポリヌクレオチドの鎖長は、特に制限されないが、少なくとも15、20、30、40、50、100、150、200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、または3000ヌクレオチドの鎖長であることが好ましい。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、ADIPをコードするポリヌクレオチドを有する生物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明のADIPをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１または３）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、本発明のADIPをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１または３）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したPCRを行って調製することも可能である。cDNAは、例えば、ADIPをコードするポリヌクレオチドを有する生物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAPなどのベクターに挿入してcDNAライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またPCRを行うことにより調製できる。
【００２３】
　また、本発明は、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と構造的に類似しているタンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。このようなポリヌクレオチドとしては、該タンパク質において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。上記タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能(例えば、以下の文献に記載の機能： Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. & Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413)が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内であると考えられる。
【００２４】
　変異が導入されるアミノ酸残基は、変異前のアミノ酸と側鎖の性質が保持されるようなアミノ酸であることが好ましい（アミノ酸の保存的置換）。アミノ酸側鎖の性質としては、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、および親水性（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）を挙げることができる。また、アミノ酸の側鎖としては、例えば、以下のような機能・特徴のものを例示することができる。脂肪族アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基アミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、含硫アミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボキシアミノ酸とアミドアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基性アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族アミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。
【００２５】
　１もしくは複数のアミノ酸が付加したタンパク質の例としては、ADIPタンパク質を含む融合タンパク質が挙げられる。本発明の融合タンパク質は、当業者に周知の方法によって適宜、作製することができる。例えば、本発明のADIPタンパク質をコードするDNAと、他のタンパク質をコードするDNAとを、読み枠が合うように結合させる方法が挙げられが、この方法に特に制限されない。　本発明のタンパク質と融合させるペプチドとしては、公知の種々のペプチドを用いることができる。例えば、FLAG (Hopp, T. P. et al., Biotechnology (1988) 6, 1204-1210)、6x His、10x His、インフルエンザ アグルチニン(Influenza agglutinin (HA))、ヒトc-myc断片、VSP-GP断片、p18HIV断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗体断片、lck tag、α-チューブリン断片、B-tag、Protein C断片等を挙げることができる。本発明のタンパク質と融合させるタンパク質の例としては、GST (グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、インフルエンザ アグルチニン、イムノグロブリン定常領域、β-ガラクトシダーゼ、MBP (マルトース結合タンパク質)等を挙げることができる。
【００２６】
　上記ポリヌクレオチドを調製するために、当業者によく知られた方法としては、上記したハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術の他に、例えば、該ポリヌクレオチドに対し、site-directed mutagenesis法（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.）により変異を導入する方法が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。また、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）があり、このような縮重変異ポリヌクレオチドも本発明に含まれる。また、本発明の上記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた本発明に含まれる。
【００２７】
　本発明は、本発明のポリヌクレオチドが挿入されたベクター、本発明のポリヌクレオチドまたは該ベクターを保持する宿主細胞、および該宿主細胞を利用した本発明のポリペプチドの製造方法を提供する。
【００２８】
　本発明のベクターとしては、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましい。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。
【００２９】
　本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
【００３０】
　宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
【００３１】
　本発明のポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
【００３２】
　組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
【００３３】
　本発明は、本発明者らにより同定されたポリヌクレオチド（配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖）に相補的な、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T（ただしRNAの場合は U）、G:Cの塩基対からなる2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。このようなヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、15〜100ヌクレオチド、好ましくは15〜35ヌクレオチドの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のDNAの少なくとも一部若しくは全部の配列を含む少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは少なくとも30ヌクレオチドの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。このようなポリヌクレオチドは、好ましくは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするものである。「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、本発明者らにより同定されたポリヌクレオチド（配列番号：１または３）とハイブリダイズし、他のポリペプチドをコードするDNAとはハイブリダイズしないことを意味する。
【００３４】
　また、このポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドが含まれる。このようなポリヌクレオチドには、アンチセンスポリヌクレオチド（アンチセンスDNA/RNA；本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスRNA、および該RNAをコードするDNA）やリボザイム（本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA）が含まれる。
【００３５】
　アンチセンスポリヌクレオチドが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人,pp.319-347,1993)。
【００３６】
　本発明で用いられるアンチセンスポリヌクレオチドは、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドも、本発明で利用されるアンチセンスポリヌクレオチドに含まれる。使用されるアンチセンスポリヌクレオチドは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。アンチセンスポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンス効果を引き起こすために、少なくとも15ヌクレオチド以上、好ましくは100ヌクレオチド、さらに好ましくは500ヌクレオチド以上の鎖長を有し、通常、3000ヌクレオチド以内、好ましくは2000ヌクレオチド以内の鎖長を有する。
【００３７】
　該アンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１または３）の配列情報を基にホスホロチオネート法（Stein, 1988 Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res 16, 3209-21 (1988)）などにより調製することが可能である。
【００３８】
　内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするポリヌクレオチドを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子, (1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191)。
【００３９】
　例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett.228:225)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄子,(1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191、 M.Koizumiら, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7059)。
【００４０】
　また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Y.Kikuchi およびN.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、 菊池洋, (1992) 化学と生物 30:112)。
【００４１】
　本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドは、遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用して、ex vivo法やin vivo法などにより患者へ投与を行うことが考えられる。
【００４２】
　本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。ここで「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにFabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメントが含まれる。
【００４３】
　本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するための免疫原としても使用することができる。抗体は、好ましくは、本発明のポリペプチドに免疫特異的である。「免疫特異的」とは、その抗体が他のポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い親和性を有することを意味する。
【００４４】
　本発明のポリペプチドに結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。本発明のポリペプチドあるいはそのGSTとの融合タンパク質をウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、本発明のポリペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００４５】
　本発明の抗体は、本発明のポリペプチドやこれを発現する細胞の単離、同定、および精製に利用することができる。
【００４６】
　本発明のポリペプチドは、アクチン骨格を制御する薬剤のための候補化合物のスクリーニングにおいて使用することができる。アクチン骨格を制御する薬剤は、本発明のポリペプチドの発現（機能）異常に関連した疾患の治療薬となり得る。同定の対象となる分子は、天然由来であっても、人工的に合成された構造的または機能的な模擬物であってもよい。本発明のポリペプチドは多くの病理を含めて多数の生物学的機能に関与しているものと考えられる。従って、本発明のポリペプチドを活性化する化合物および本発明のポリペプチドの活性化を阻害し得る化合物を発見することが望まれる。
【００４７】
　本発明は、アクチン骨格を制御する薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４８】
　本方法においては、まず、アファディンまたはアクチニンと、本発明のポリペプチドおよび候補化合物とを接触させ、次いで、アファディンまたはアクチニンと、本発明のポリペプチドとの結合活性を測定する。そして、被検化合物を接触させない場合と比較して、上記結合活性を変化させる（増加または抑制させる）化合物を選択する。
【００４９】
　本発明の上記スクリーニング方法により、本発明のポリペプチドのアファディンまたはアクチニンへの結合活性を変化させる化合物として単離される化合物は、例えば、心筋梗塞や心筋炎等の心臓疾患に対する治療薬となるものと期待される。また、該化合物は被検化合物として、本発明の上記スクリーニング方法に供することもできる。
【００５０】
　上記結合活性の測定は、当業者においては周知の方法、例えば、酵母ツーハイブリッドシステム等により、適宜実施することができる。被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、種々の公知化合物やペプチド（例えば、ケミカルファイルに登録されているもの）あるいはファージ・ディスプレイ法（J.Mol.Biol. (1991) 222, 301-310）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分などもスクリーニングの対象となる。その他、生体組織抽出物、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物などが挙げられるが、これらに特に制限されない。
【００５１】
　また本発明は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常に関連した疾患の検査方法に関する。本発明のポリペプチドは、生体内で重要な機能を有すると考えられ、その発現の異常は、種々の疾患の原因となり得る。従って、本発明のポリペプチドの発現を指標とすることにより、このような疾患の検査を行うことも可能である。
【００５２】
　本発明において「疾患の検査」とは、疾患の症状を呈している被検者の治療戦略を立てるための検査のみならず、被検者が疾患にかかりやすいか否かを判断するために行う予防のための検査、または既に罹患しているか否かの検査も含まれる。
【００５３】
　ADIPは心筋細胞の介在板で非常に強く発現していることから、ADIPの発現異常により心臓疾患を引き起こす可能性が考えられる。従って、本発明の上記疾患とは、通常、心臓疾患であり、より具体的には、心筋梗塞または心筋炎を例示することができる。
【００５４】
　本発明の検査方法の一つの態様は、被検者における本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域における変異を検出することを含む方法である。
【００５５】
　一つの方法は、被検者における本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を直接決定することによって検査を行う方法である。この方法においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。DNA試料は、被検者の細胞、例えば心筋細胞から抽出した染色体DNAあるいはRNAを基に調製することができる。染色体DNAから本方法のDNA試料を調製するには、例えば染色体DNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターにクローニングして、ゲノムライブラリーを作製すればよい。RNAから本方法のDNA試料を調製するには、例えば、逆転写酵素を用いて、RNAからcDNAライブラリーを作製すればよい。本方法においては、次いで、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むDNAを単離する。該DNAの単離は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むDNAにハイブリダイズするプローブを用いて、ゲノムライブラリーやcDNAライブラリーのスクリーニングをすることにより行うことができる。また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムDNAライブラリー、cDNAライブラリー、あるいはRNAを鋳型としたPCRによって単離することもできる。本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。選択したDNAの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。本方法においては、次いで、決定したDNAの塩基配列を、対照と比較する。本方法における「対照」とは、正常な（野生型の）本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むDNAの塩基配列を言う。このような比較の結果、被検者のDNAの塩基配列が対照と異なっていた場合には、被検者は、疾患に罹患しているまたは発症の危険があると判定される。
【００５６】
　また、例えば、心筋症または心筋梗塞等の心臓疾患の患者から取得される本発明のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を、本発明の「対照」とすることも可能である。この場合には、被検者のDNAの塩基配列が対照と同じであった際に、被検者は疾患に罹患しているまたは発症の危険があると判定される。
【００５７】
　本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のDNAの塩基配列を決定する方法以外に、種々の方法を用いることができる。
【００５８】
　その一つの方法においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、調製したDNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。
【００５９】
　このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR−RFLP法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブDNAを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムDNA以外にも被検者から調製したRNAを逆転写酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このcDNAを鋳型としてPCRで本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むDNAを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００６０】
　別の方法は、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００６１】
　このような方法としては、例えばPCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型)法(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.)が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のDNA試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したDNA鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりDNA断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
【００６２】
　具体的には、まず、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むDNAをPCR法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常200〜400bp程度の長さが好ましい。PCRは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。PCRの際に、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅DNA産物を標識することができる。あるいはPCR反応液に32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてPCRを行うことにより、増幅DNA産物を標識することも可能である。さらに、PCR反応後にクレノウ酵素等を用いて、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅DNA断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識されたDNA断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（5から10％程度）のグリセロールを添加することにより、DNA断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各DNA断片の性質により変動するが、通常、室温（20から25℃）で行い、好ましい分離が得られないときには4から30℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、DNA断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、PCRによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したDNAを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００６３】
　さらに別の方法は、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したDNAのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００６４】
　このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に1本鎖へと解離する。この部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むDNAを本発明のプライマー等を用いたPCR法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するDNA断片の場合、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
【００６５】
　上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料DNAでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含むDNAをPCR法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだ対照cDNA等から調製した標識RNAとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼAによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００６６】
　本発明の検査方法の他の態様は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を検出することを含む方法である。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳が含まれる。従って、「発現産物」には、mRNAおよびタンパク質が含まれる。
【００６７】
　本発明の好ましい態様においては、被検者における本発明のポリぺプチドをコードする遺伝子の発現量を検出することを特徴とする、心臓疾患の検査方法が提供される。
【００６８】
　本方法においては、まず被検者の細胞（例えば、心筋細胞）からRNA試料を調製し、該試料中の本発明のポリペプチドをコードするRNA量を測定する。そして、測定したRNA量を対照と比較する。
【００６９】
　このような方法としては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いたノーザンブロッティング法、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーを用いたRT-PCR法等を例示することができる。
【００７０】
　また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写レベルにおける検査においては、DNAアレイ（新遺伝子工学ハンドブック、村松正實・山本雅、羊土社、p280-284）を利用することもできる。具体的には、まず、被検者から調製したcDNA試料、および本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する。基板に固定されるポリヌクレオチドプローブは、複数種の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するために、複数種であってもよい。被検者からのcDNA試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。cDNA試料の調製の好ましい態様においては、まず被検者の細胞から全RNAの抽出を行う。細胞としては、例えば心筋細胞などが例示できる。全RNAの抽出は、例えば次のようにして行うことができる。純度の高い全RNAが調製できる方法であれば、既存の方法およびキット等を用いることが可能である。次いで、抽出した全RNAを鋳型として、逆転写酵素を用いてcDNAの合成を行い、cDNA試料を調製する。全RNAからのcDNAの合成は、当業者に周知の方法で実施することができる。調製したcDNA試料には、必要に応じて、検出のための標識を施す。標識物質としては、検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、蛍光物質、放射性元素等を挙げることができる。標識は、当業者によって一般的に行われる方法(L Luo et al., Gene expression profiles of laser-capturedadjacent neuronal subtypes. Nat Med. 1999, 117-122)で実施することができる。
【００７１】
　ここでいう「対照」とは、通常、健常者の心筋細胞より調製したRNA試料における本発明のポリペプチドをコードするRNAの量を指す。
【００７２】
　上記方法において、対照と比較して、本発明のポリペプチドをコードするRNAの量が有意に変化していた場合、被検者は、該遺伝子の発現異常に関連するとされる心臓疾患を罹患している、または該疾患を発症する危険を有すると判定される。また、心臓疾患を既に罹患していることが判明している被検者においては、その原因が、上記ポリペプチドをコードするRNAの発現量の変化にあるものと判定される。
【００７３】
　また、本発明の検査方法は、被検者の細胞（例えば、心筋細胞）におけるタンパク質の発現量を測定することにより、下記の如く実施することができる。まず、被検者の細胞からタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料に含まれる本発明のポリぺプチドの量を測定する。次いで、測定された該ポリペプチドの量を対照と比較する。
【００７４】
　このような方法としては、SDSポリアクリルアミド電気泳動法、並びに該タンパク質に結合する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法(ELISA)、および免疫蛍光法を例示することができる。
【００７５】
　上記の方法において、対照と比較して、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現量が有意に変化していた場合、被検者は、心臓疾患を今後発症する疑いがある（危険性が高い）、もしくは既に心臓疾患を罹患していると判定される。また、心臓疾患を既に罹患していることが判明している被検者においては、その原因が、上記記載のポリヌクレオチドの発現量の変化にあるものと判定される。
【実施例】
【００７６】
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００７７】
〔実施例１〕　発現ベクター構築
　哺乳動物発現ベクターであるpCMV-FLAG、pCMV-T7、およびpCMV-HAは、N末端FLAG-、T7-、およびHA-タグ化タンパク質をそれぞれ発現するように設計した（Takaesu, G., S. Kishida, A. Hiyama, K. Yamaguchi, H. Shibuya, K. Irie,. J. Ninomiya-Tsuji, and K. Matsumoto. 2000. TAB2, a novel adaptor protein, mediates activation of TAK1 MAPKKK by linking TAK1 to TRAF6 in the IL-1 signaltransduction pathway. Mol. Cell. 5:649-658.）。
【００７８】
　アファディンのDILドメイン（aa606〜983）を発現している哺乳動物発現ベクターは、pCMV-T7を用いて構築した。
【００７９】
　マウスADIP（mADIP）およびラットADIP（rADIP）を発現している哺乳動物発現ベクターである、pCMV-HA-mADIP（aa1〜615）、pCMV-HA-rADIP-C（aa159〜613）、pCMV-HA-mADIP-C（aa339〜615）、pCMV-Flag-mADIP-C（aa339〜615）、およびpCMV-Flag-mADIP-M（aa152〜436）は、pCMV-FLAGおよびpCMV-HAを用いて構築した。
【００８０】
　α-アクチニン-1（ヒト、BC015766；GenBank）を発現している哺乳動物発現ベクターであるpCMV-HA-α-アクチニン-1-C（aa406〜892）は、pCMV-HAを用いて構築した。
【００８１】
　mADIPおよびrADIPのグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）融合またはMBP-融合ベクターであるMBP-mADIP（aa1〜615）、MBP-rADIP-C（aa159〜613）、MBP-mADIP-C（aa339〜615）、GST-rADIP-C（aa159〜613）、GST-mADIP-N（aa1〜226）およびGST-mADIP-C（aa339〜615）は、pGEX-KG（Guan, K.L., and J.E. Dixon. 1991. Eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli: an improved thrombin cleavage and purification procedure of fusion proteins with glutathione S-transferase. Anal. Biochem. 192:262-267.）およびpMal-C2（New England Biolabs）を用いて構築した。
【００８２】
〔実施例２〕　抗体の調製
　rADIPのC末端部分（aa159〜613;rADIP）、mADIPのN末端部分（aa1〜226;mADIP-N）およびmADIPのC末端部分（aa339〜615;mADIP-C）の断片を持つ各GST融合タンパク質を、大腸菌内で作製・精製後、ウサギpAbを上昇させる各抗原として使用した。
【００８３】
　rADIPおよびmADIP-Cに対する2種類のpAbであるM05およびM01はそれぞれ、MBP-rADIP-C（aa159〜613）およびMBP-mADIP-C（aa339〜615）とのアフィニティー精製後に使用した。mADIP-Nに対するpAbであるM57は、GST-mADIP-N（aa1〜226）とのアフィニティー精製後に使用した。
【００８４】
　GST-およびMBP-融合タンパク質は、グルタチオン-セファロースビーズ（Amersham-Pharmacia Biotech）およびアミロースレジンビーズ（New England Biolabs）をそれぞれ使用して精製した。
【００８５】
　マウス抗アファディン mAbは、文献記載のように調製した（Sakisaka, T, H. Nakanishi, K. Takahashi, K. Mandai, M. Miyahara, A. Satoh, K.Takaishi, and Y. Takai. 1999. Different behavior of l-afadin and neurabin-II during the formation and destruction of cell-cell adherens junction. Oncogene. 18:1609-1617.）。
【００８６】
　ラット抗E-カドヘリンmAb（ECCD2）は、M． Takeichi博士（Center for Developmental Biology，RIKEN，Kobe，Japan）から寄贈された(A. Nagafuchi, Y. Shirayoshi, K. Okazaki, K. Yasuda, and M. Takeichi, "Transformation of cell adhesion properties by exogenously introduced E-cadherin cDNA.", Nature, 1987, 329(6137): 341-3) and Y. Shirayoshi et al. (Y. Shirayoshi, T.S. Okada, and M. Takeichi, "The calcium-dependent cell-cell adhesion system regulates inner cell mass formation and cell surface polarization in early mouse development.", Cell, 1983, 35(3 Pt 2): 631-8.)。マウス抗ZO-1mAbはChemiconより購入した。マウス抗α-アクチニン、抗ビンクリンおよび抗-Flag-M2 mAbはSigma Chemicalsより購入した。ウサギ抗α-アクチンpAbはSanta Cruzより購入した。マウス抗T7 mAbはNovagenより購入した。
【００８７】
〔実施例３〕　細胞の培養およびタンパク質濃度
　HEK293、MDCK、ネクチン-2α-Lおよびネクチン-2α-ΔC-L細胞は、10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養した。
【００８８】
　タンパク質濃度は、参照タンパク質としてウシ血清アルブミンを用いて決定した（Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.）。
【００８９】
〔実施例４〕　アファディン結合タンパク質の同定
　アファディンに結合するタンパク質を同定するため、本発明者らは、DILドメイン（aa606〜983）を含むアファディンの領域をベイト（bait）として使用して、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実施した。アファディンの概略構造を図１Ａに示す。
【００９０】
　ベイトベクターであるpGBDU-アファディン（aa511〜981）は、アファディンのaa残基をコードする挿入断片を、pGBDU-C1（James, P., J. Hallady, and E.A. Craig. 1996. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144:1425-1436）にサブクローニングすることにより作製した。
【００９１】
　11日齢マウスの胚、ラット脳、ラット肺、およびヒト精巣cDNAから構築した酵母ツーハイブリッドライブラリーを、クロンテックから購入した。
【００９２】
　酵母株PJ69-4A（MATa trp1-901 leu2-3、112 ura3-52 his3-200 gal4Δ gal80Δ GAL2-ADE2 LYS2：：GAL1-HIS3 met2：：GAL7-lacZ）を使用したツーハイブリッドスクリーニングを文献記載（James, P., J. Hallady, and E.A. Craig. 1996. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144:1425-1436）のように実施した。酵母操作は、標準的な手順を用いて、文献記載（Kaiser, C.A., A. Adams, and D.E. Gottschling. 1994. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.）のように実施した。
【００９３】
　結果、マウス胚ライブラリーの2×105個のクローン、および、ラット脳ライブラリーの2×105個のクローンをスクリーニングし、それぞれ31および25個の陽性クローンを得た。4つのマウスクローンおよび1つのラットクローンが、ヒトKIAA0923のカルボキシル末端部分に類似したタンパク質をコードしていた（AB023140；GenBank／EMBL／DDBJ）。ADIPは特異的にアファディンのDILドメインに結合したが、酵母Myo4のDILドメインには結合しなかったことが判明した（図１Ｂ）。なお、図示されたプラスミドを持つ酵母形質転換体は、HIS3レポーター活性を評価するために、ヒスチジン欠失合成完全培地上に画線し、30℃で3日間インキュベートしたものである。
【００９４】
　本発明者らは、このタンパク質をADIP（アファディン DILドメイン相互作用タンパク質）と命名した。ADIPは、3つのコイル状コイルドメインを有し、第三のコイル状コイルドメイン（aa339〜480）を含む領域は、アファディンのDILドメインの結合に必要であった（図２Ａおよび図３Ａ）。
【００９５】
〔実施例５〕　マウスADIPおよびラットADIPの全長cDNA
　マウスおよびラットのADIPの全長cDNAに関し、GenbankおよびEMBLデータベースに対しBLAST検索を実施した。GenbankおよびEMBL配列のヒトサブセットに対するBLAST検索により得たヒットのセレクションを使用して、KIAA0923のヒトホモログのcDNA配列をアセンブルした（AB023140；GenBank／EMBL／DDBJ）。KIAA0923のcDNAは、T．Nagase博士（かずさDNAリサーチ研究所）から提供された(T. Nagase, K. Ishikawa, M. Suyama, R. Kikuno, M. Hirosawa, N. Miyajima, A. Tanaka, H. Kotani, N. Nomura, and O. Ohara, "Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. XIII. The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large proteins in vitro.", DNA Res., 6 (1), 63-70 (1999)。
【００９６】
　mADIP（アクセッション番号：AF532969）およびrADIP（アクセッション番号：AF532970）の全長cDNAは、それぞれマウスおよびラット脳cDNA（Clontech）から、以下のプライマーセットを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により作製した；mADIP cDNAでは、5'-CGTAGGAGAGTGACAGGAGCTG-3'（配列番号：５）、5'-GGTTATCGAGTTTTTCTACATGAC-3'（配列番号：６）；rADIP cDNAでは、5'-CGTAGGAGAGTGACAGGAGCTG-3'（配列番号：７）、5'-TTCCTGTTTTTGCACTGTAGCTG-3'（配列番号：８）。
【００９７】
　PCR産物は、pCR4B（Invitrogen）にサブクローニングし、ヌクレオチド配列解析を、ジデオキシヌクレオチド終結法により、DNAシーケンサー（モデル3100；Applied Biosystems，Inc．）を使用して実施した。
【００９８】
　マウスおよびラット全長cDNAは、それぞれ、計算分子量70，954の615aaおよび計算分子量70，684の613aaからなるタンパク質をコードしていた（図２Ａ）。
マウスADIP（mADIP）およびラットADIP（rADIP）のaa配列は、互いに92％同一であり、それぞれヒトKIAA0923のaa配列に88％および87％同一であった（図２Ａ）。
【００９９】
〔実施例６〕　トランスフェクション
　単離cDNAがADIPの全長をコードするかどうかを確認するために、HEK293細胞を、赤血球凝集素（HA）タグ化全長mADIPを発現する、pCMV-HA-mADIPでトランスフェクトした。トランスフェクションは、CalPhos mammalian transfectionキット（Clontech）を用いた。MDCKおよびHEK293細胞抽出物を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）に付した。SDS-PAGEはLaemmli（Laemmuli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 277:680-685）記載のように行った。その後、抗ADIPポリクローナル抗体（pAbs）である3つの抗ADIP pAb（M57、M01、およびM05）を用いたウエスタンブロットにかけた。
【０１００】
　その結果、HA-mADIPを発現しているHEK293細胞抽出物から、HAタグ化ADIPの分子量に類似した約78kDaの分子量を有するタンパク質が検出された（図２Ｂ）。
【０１０１】
　したがって、本発明者らは、単離cDNAが、ADIPの全長をコードすると結論づけた。
【０１０２】
〔実施例７〕　ADIP機能同定−α-アクチニンへの結合
　ADIPの機能に関する洞察を得るために、本発明者らは、ADIP結合タンパク質（群）の同定を試みた。上記したように、ADIPは、3つのコイル状コイルドメインを有し、ADIPの第三のコイル状コイルドメイン（aa339〜480）を含む領域は、アファディンのDILドメインに結合するのに必要である。
【０１０３】
　本発明者らは、ベイトとして、全部で3つのコイル状コイルドメイン（aa152〜436）を含むADIPの領域を使用して、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実施した。ベイトベクターであるpGBD-mADIP-B（aa152〜436）は、mADIPのaa残基をコードする挿入断片をpGBD-C1（James, P., J. Hallady, and E.A. Craig. 1996. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144:1425-1436）にサブクローニングすることにより構築した。
【０１０４】
　本発明者らは、ラット肺ライブラリーの7×105個のクローンをスクリーニングし、18個の陽性クローンを得た。9個のクローンが、α-アクチニン-1（ヒト、BC015766；GenBank）のC末端部分をコードした。α-アクチニンは、F-アクチン架橋活性を示す十分に特徴づけられたタンパク質である（Burridge, K., and J.R. Feramisco. 1981. Non-muscle alpha actinins are calcium-sensitive actin-binding proteins. Nature. 294:565-567.）。ヒトα-アクチニンの4つのアイソフォームが同定されている：非筋肉アクチニン-1およびアクチニン-4、および筋肉アクチニン-2およびアクチニン-3（Millake, D.B., A.D. Blanchard, B. Patel, and D.R. Critchley. 1989. The cDNA sequence of a human placental alpha-actinin. Nucleic. Acids. Res. 17:6725.；Youssoufian, H., M. McAfee, and D.J. Kwiatkowski. 1990. Cloning and chromosomal localization of the human cytoskeletal alpha-actinin gene reveals linkage to the beta-spectrin gene. Am. J. Hum. Genet 47:62-71.；Beggs, A.H., T.J.Byers, J.H. Knoll, F.M. Boyce, G.A. Bruns, and L.M. Kunkel. 1992. Cloning and characterization of two human skeletal muscle alpha-actinin genes located on chromosomes 1 and 11. J. Biol. Chem. 267:9281-9288.；Honda, K., T.Yamada, R. Endo, Y.Ino, M. Gotoh, H. Tsuda, Y.Yamada, H. Chiba, and S. Hirohashi. 1998. Actinin-4, a novel actin-bundling protein associated with cell motility and cancer invasion. J. Cell Biol. 140:1383-1393.）。
【０１０５】
　本解析により推定したところ、ADIPはα-アクチニン-1に加えてα-アクチニン-2に結合した（データは示さず）。これは、ADIPのα-アクチニンへの結合は、α-アクチニン-1に特異的ではないことを示すものである。また、ADIPの第一コイル状コイルドメイン（aa1〜226）のみを含む領域がα-アクチニン-1に結合し（図３Ａ）、α-アクチニン-1のC末端の2つのEFハンドモチーフが、ADIPへのその結合に必要であることが明らかになった（図９Ａ）。
【０１０６】
　これらの結果により、ADIPの第一コイル状コイルドメインは、α-アクチニン-1のEFハンドモチーフに結合することが示された。
【０１０７】
〔実施例８〕　免疫沈降およびアフィニティークロマトグラフィー
　インビトロおよびインビボでのADIPのアファディンへの結合をさらに確認するために、本発明者らは、免疫沈降およびアフィニティークロマトグラフィー解析を実施した。
【０１０８】
　HEK293細胞を用いた共免疫沈降実験は、次のように行った；種々の組合わせの発現プラスミドを用いて、HEK293細胞にトランスフェクトした。細胞を緩衝液A 1ml（pH7．5の20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1％ Triton X-100、1mM EDTA、10μM α-フェニルメタンスルホニルフッ化塩酸塩、および10μg/ml アプロチニン）中で懸濁し、10秒間隔で10秒間、3回超音波処理し、氷上で30分間インキュベートした。100,000 x gで15分間遠心分離し、細胞抽出物（タンパク質1.2mg）を得て、次にprotein G Sepharose 4 Fast Flowビーズ（Amersham-Pharmacia Biotechnology）を用いたインキュベーションにより予備洗浄した。細胞抽出物を、20μlの抗FLAG M2 mAbで被覆したprotein G Sepharose 4 Fast Flowビーズを用いて4℃で18時間インキュベートした。ビーズを緩衝液Aで洗浄後、ビーズをSDS試料緩衝液（pH6.7の60mM Tris-HCl、3％ SDS、2％ 2-メルカプトエタノール、5％グリセロール）中で10分間沸騰して、結合タンパク質を溶出させた。次に試料をSDS-PAGEにかけ、続いてウエスタンブロットを行った。
【０１０９】
　MDCK細胞を用いた共免疫沈降実験は以下のように行った：2個の10cm皿上のMDCK細胞を緩衝液A 2ml中で超音波処理し、続いて100,000 x gで15分間、超遠心分離処理を行った。細胞抽出物はprotein A Sepharose CL-4Bビーズ（Amersham-Pharmacia Biotechnology）を用いたインキュベーションにより、予備洗浄し、次に20μlの抗ADIP pAb（M05）で被覆したprotein A Sepharose CL-4Bビーズを用いて4℃で18時間インキュベートした。ビーズを緩衝液Aで洗浄した後、ビーズをSDS試料緩衝液中で10分間沸騰して、結合タンパク質を溶出させた。次に試料をSDS-PAGEにかけ、続いてウエスタンブロットを行った。
【０１１０】
　MDCK細胞を用いたアフィニティークロマトグラフィーは以下のように行った：2枚の10cm皿上のMDCK細胞を、2mlの緩衝液中で超音波処理し、続いて100,000 x gで15分間、超遠心分離を行った。上清を、20μl（湿潤体積）のアミロース樹脂ビーズ（New England Biolabs）に固定化したMBPまたはMBP-mADIP（それぞれ200pmol）によって4℃で18時間インキュベートした。ビーズを緩衝液Aによって広範囲に洗浄した後、結合タンパク質を20mMマルトースを含む緩衝液Aによって溶出した。溶出液はSDSサンプル緩衝液中で沸騰させた。次にサンプルをSDS-PAGEにかけ、次に抗アファディン mAbによってウエスタンブロットを行った。
【０１１１】
　FLAGタグ化mADIP-Cを持つアファディンのT7タグ化DILドメインの共免疫沈降を行った。発現ベクターは図３Ｂ中に図示されているように、HEK293細胞内にトランスフェクトされた。アファディンのT7タグ化DILドメインは、抗T7および抗Flag mAbを用いたウエスタンブロットによって示されるように、Flagタグ化mADIP-Cと特異的に共免疫沈降した。
【０１１２】
　次に、内因性アファディンを発現しているMDCK細胞の抽出物を、アミロース-レジンビーズ上に固定した全長mADIP（aa1〜615）のマルトース結合タンパク質（MBP）融合タンパク質と共にインキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で洗浄した後、結合したタンパク質を溶出し、溶出液をSDS-PAGEに、その後、抗アファディン mAbを用いたウエスタンブロットにかけた。アファディンは実際にMBP-mADIPに結合したが、MBP単独には結合しなかった（図３Ｃ）。
【０１１３】
　最後に、ADIPがインビボでアファディンに結合することを確認するために、本発明者らは、内因性アファディンが、MDCK細胞の抽出物から、内因性ADIPと共免疫沈降したかどうかを調べた。内因性ADIPを、抗ADIP pAbを用いて、MDCK細胞の抽出物から免疫沈降した場合、内因性アファディンが共免疫沈降した（図３Ｄ）。アファディンは、対照IgGと共免疫沈降しなかった。二重ハイブリッド解析及びこれらの結果により、ADIPは、インビトロおよびインビボでの両方でアファディンに結合することが示された。
【０１１４】
〔実施例９〕　ADIPの組識分布及び亜細胞分布
　ノーザンブロッティングは、文献記載のように行った（Sambrook, J., E.F Fritsch, and T Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 7.1-7.87.）。mADIP cDNA断片（bp552〜3194）は、標準ランダムプライミング法によって［α32P］によって放射線標識し、マウス複数組織ノーザンブロット（Clontech）にプローブとして用いた。
【０１１５】
　結果、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および精巣を含む全マウス組織に、〜4．3kbのmRNAが検出された（図４Ａ）。また、より小さなバンド（〜3．0kb）が、肝臓および精巣に検出された（図４Ａレーン5および8）。
【０１１６】
　また、種々のマウス組識のホモジネート（それぞれタンパク質30μg）をSDS-PAGE（10%ポリアクリルアミドゲル）にかけ、続いて抗ADIP pAbであるM57を使用したウエスタンブロット解析を行った。結果、〜78kDaのタンパク質が検出された。これは、HEK293およびMDCK細胞、およびマウスの脾臓、肺、および腎臓で検出されたADIPと同じサイズであった（図４Ｂレーン3、4、7および9）。より小さなバンド（心臓では〜60kDa、精巣では〜76kDaおよび〜40kDa）も検出され、ADIPのより小さなスプライス変異体が発現され得ることが示唆された（図４Ｂレーン1および8）。
【０１１７】
　ラット肝臓における亜細胞分画解析は、文献記載のように行った（Kawabe, H., H. Nakanishi, M. Asada, A. Fukuhara, K. Morimoto, M. Takeuchi, and Y.Takai. 2001. Pilt, a novel peripheral membrane protein at tight junctions in epithelial cells. J. Biol. Chem. 276:48350-48355）。各画分（それぞれタンパク質30μg）をSDS-PAGE（10%ポリアクリルアミドゲル）にかけ、続いて抗ADIP pAbであるM57または抗アファディン mAbを用いてウエスタンブロットを行った。結果、ADIPはAJsおよびTJsの豊富な画分に豊富で、且つここではアファディンも豊富であった（図４Ｃレーン4および5）。ADIPの組識分布をウエスタンブロット解析した際に、肝臓で〜78kDaのタンパク質を検出できなかった理由は、おそらく、発現レベルが低いためと考えられる（図４Ｂレーン5）。
【０１１８】
　これらの結果から、ADIPの発現レベルは組織に応じて変化するが、広範に発現されていることが示された。
【０１１９】
〔実施例１０〕　上皮細胞のAJsにおけるアファディンとADIPの共局在化
　アファディンは、F-アクチン束の裏打ちされたAJsに厳密に局在していることが示されている（Mandai et al., J. Cell Biol. 1997, 139: 517-528)。そこで、本発明者らは、ADIPが、MDCK細胞のAJsにおいてアファディンと共局在しているかどうかを、免疫蛍光顕微鏡により調べた。
【０１２０】
　マウス組織の培養細胞および凍結切片の免疫蛍光顕微鏡法は、文献記載のように行った（Mandai, K., H. Nakanishi, A. Satoh, H. Obaishi, M. Wada, H. Nishioka, M. Itoh, A. Mizoguchi, T. Aoki, T. Fujimoto, Y. Matsuda, S. Tsukita, and Y. Takai. 1997. Afadin: A novel actin filament-binding protein with one PDZ domain localized at cadherin-based cell-to-cell adherens junction. J. Cell Biol. 139:517-528.；Takahashi, K., H. Nakanishi, M. Miyahara, K. Mandai, K. Satoh, A. Satoh, H. Nishioka, J. Aoki, A. Nomoto, A. Mizoguchi, and Y. Takai. 1999. Nectin/PRR: an immunoglobulin-like cell adhesion molecule recruited to cadherin-based adherens junctions through interaction with Afadin, a PDZ domain-containing protein. J. Cell Biol. 145:539-549.）。詳しくは、MDCK細胞を、抗ADIP(MO5)、抗アファディン、抗ビンクリンAbsの種々の組み合わせによって二重染色した。
【０１２１】
　結果、ADIPおよびアファディンは、細胞-細胞接合部に共局在した（図５Ａ）。本質的に同様の結果が、3つの抗ADIP pAbであるM57、M01、およびM05で得られた。
【０１２２】
　さらに、ADIPについて、ゴルジ複合体のマーカーであるゴルジ58kタンパク質で同時染色した。結果、核周囲領域で、ゴルジ複合体において染色された（図５Ａ）。
【０１２３】
〔実施例１１〕　ADIPと内因性アファディンの局在の比較
　ADIPとアファディンの共局在を確認するために、HAタグ化ADIP（rADIP-C；aa159〜613）を、安定して発現するネクチン-2α-Lおよびネクチン-2α-ΔC-L細胞を、LIPOFECTAMINE 2000（Invitrogen）を用いて調製した。
【０１２４】
　全長ネクチン-2α（ネクチン-2α-L細胞）またはC末端の4つのaaが欠失したネクチン-2α（ネクチン-2α-ΔC-L細胞）を安定して発現しているカドヘリン欠損L細胞で一過的に発現させ、発現タンパク質の局在を、内因性アファディンの局在と比較した。全長ネクチン-2αは、アファディンに結合できるが、ネクチン-2α-ΔCは結合できない（Takahashi, K., H. Nakanishi, M. Miyahara, K. Mandai, K. Satoh, A. Satoh, H. Nishioka, J. Aoki, A. Nomoto, A. Mizoguchi, and Y. Takai. 1999. Nectin/PRR: an immunoglobulin-like cell adhesion molecule recruited to cadherin-based adherens junctions through interaction with Afadin, a PDZ domain-containing protein. J. Cell Biol. 145:539-549.）。
【０１２５】
　結果、アファディンは、文献記載のように（Miyahara, M., H. Nakanishi, K. Takahashi, K. Satoh-Horikawa, K. Tachibana, and Y. Takai. 2000. Interaction of nectin with afadin is necessary for its clustering at cell-cell contact sites but not for its cis dimerization or trans interaction. J. Biol. Chem. 275:613-618.；Tachibana, K., H. Nakanishi, K. Mandai, K. Ozaki, W. Ikeda, Y. Yamamoto, A. Nagafuchi, S. Tsukita, and Y. Takai. 2000. Two cell adhesion molecules, nectin and cadherin, interact through their cytoplasmic domain-associated proteins. J. Cell Biol. 150:1161-1176.）、ネクチン-2α-L細胞では、ネクチン-2αをベースとした細胞-細胞接着部位に集中した。また、内因性発現HA-ADIPは、ネクチン-2αをベースとした細胞-細胞接着部位に集中し、ネクチン-2α-L細胞ではアファディンと共局在を示した（図６Ａ）。
【０１２６】
　しかし、内因性発現HA-ADIPは、ネクチン-2α-ΔC-L細胞では、細胞-細胞接着部位に集中していなかった（図６Ｂ）。
【０１２７】
〔実施例１２〕接合部複合領域におけるADIPの正確な局在
　接合部複合領域でのADIPの正確な局在を調べるために、マウス小腸の凍結切片を、抗ADIP pAb、抗アファディン mAb、および抗ZO-1 mAbで三重に染色した。小腸凍結切片を用いるのは、TJsおよびAJsがこの細胞型においてよく分離していたからである（Itoh, M., A. Nagafuchi, S. Yonemura, T Kitani-Yasuda, S. Tsukita, and S. Tsukita. 1993. The 220-kD protein colocalizing with cadherins in non-epithelial cells is identical to ZO-1, a tight junction-associated protein in epithelial cells: cDNA cloning and immunoelectron microscopy. J Cell Biol. 121:491-502.）。なお、ZO-1は、TJsのマーカーであることが知られている（Stevenson, B.R., J.D. Siliciano, M.S. Mooseker, and D.A. Goodenough. 1986. dentification of ZO-1: a high molecular weight polypeptide associated with the tight junction (zonula occludens) in a variety of epithelia. J. Cell Biol. 103:755-766.；Itoh, M., A. Nagafuchi, S. Yonemura, T Kitani-Yasuda, S. Tsukita, and S. Tsukita. 1993. The 220-kD protein colocalizing with cadherins in non-epithelial cells is identical to ZO-1, a tight junction-associated protein in epithelial cells: cDNA cloning and immunoelectron microscopy. J Cell Biol. 121:491-502.）。
【０１２８】
　極薄凍結切片手法を用いたマウス小腸吸収上皮細胞の免疫電子顕微鏡法は、文献記載のように行った（Mandai, K., H. Nakanishi, A. Satoh, H. Obaishi, M. Wada, H. Nishioka, M. Itoh, A. Mizoguchi, T. Aoki, T. Fujimoto, Y. Matsuda, S. Tsukita, and Y. Takai. 1997. Afadin: A novel actin filament-binding protein with one PDZ domain localized at cadherin-based cell-to-cell adherens junction. J. Cell Biol. 139:517-528.）。
【０１２９】
　結果、ADIPはアファディンと共局在を示したが、吸収上皮においては、ZO-1よりも僅かに基底側に局在していた（図７Ａおよび７Ｂの矢印）。
【０１３０】
　また、ADIPは、F-アクチン束に裏打ちされたAJsに専ら局在し、TJsおよびデスモソームには存在しないことが判明した（図７Ｃ）。ADIPのこの局在パターンは、アファディンおよびネクチンのものと同じであった。しかし、AJsに集中しているが、側方形質膜の先端から基底側までより広範に分布を示す、E-カドヘリンの局在パターンとは異なっていた（Mandai, K., H. Nakanishi, A. Satoh, H. Obaishi, M. Wada, H. Nishioka, M. Itoh, A. Mizoguchi, T. Aoki, T. Fujimoto, Y. Matsuda, S. Tsukita, and Y. Takai. 1997. Afadin: A novel actin filament-binding protein with one PDZ domain localized at cadherin-based cell-to-cell adherens junction. J. Cell Biol. 139:517-528.；Takahashi, K., H. Nakanishi, M. Miyahara, K. Mandai, K. Satoh, A. Satoh, H. Nishioka, J. Aoki, A. Nomoto, A. Mizoguchi, and Y. Takai. 1999. Nectin/PRR: an immunoglobulin-like cell adhesion molecule recruited to cadherin-based adherens junctions through interaction with Afadin, a PDZ domain-containing protein. J. Cell Biol. 145:539-549.）。
【０１３１】
　これらの結果から、ADIPは、F-アクチン束に裏打ちされた細胞-細胞AJsにおいて、アファディンおよびネクチンと共局在することが示された。
【０１３２】
〔実施例１３〕　ADIPシグナル
　ADIPシグナルは、MDCK細胞においてビンクリンシグナルが検出された、限局的接着部位には検出されなかった（図５Ｂ）。
【０１３３】
　心臓では、コスタメアと呼ばれる、限局的接着部位が十分に発達し、心筋細胞の側方境界に沿って周期的に位置していた（Terracio, L., D.G. Simpson, L. Hilenski, W. Carver, R.S. Decker, N. Vinson, and T.K. Borg. 1990. Distribution of vinculin in the Z-disk of striated muscle: analysis by laser scanning confocal microscopy. J. Cell Physiol. 145:78-87.）。ビンクリンはコスタメアに局在し、一方、ネクチンおよびアファディンはそうではないことが分かっている（Mandai, K., H. Nakanishi, A. Satoh, H. Obaishi, M. Wada, H. Nishioka, M. Itoh, A. Mizoguchi, T. Aoki, T. Fujimoto, Y. Matsuda, S. Tsukita, and Y. Takai. 1997. Afadin: A novel actin filament-binding protein with one PDZ domain localized at cadherin-based cell-to-cell adherens junction. J. Cell Biol. 139:517-528.；Takahashi, K., H. Nakanishi, M. Miyahara, K. Mandai, K. Satoh, A. Satoh, H. Nishioka, J. Aoki, A. Nomoto, A. Mizoguchi, and Y. Takai. 1999. Nectin/PRR: an immunoglobulin-like cell adhesion molecule recruited to cadherin-based adherens junctions through interaction with Afadin, a PDZ domain-containing protein. J. Cell Biol. 145:539-549.）。
【０１３４】
　ADIPシグナルは、ビンクリンシグナルが検出されたコスタメアには検出されなかった（図７Ｄの矢印）。
【０１３５】
　ADIPおよびビンクリンシグナルの両方が、細胞-細胞AJsに対応する、介在板（intercalated disc）で検出された（図７Ｄのくさび）。
【０１３６】
　これらの結果より、ADIPは細胞-マトリックス接合部には局在しないことが示された。
【０１３７】
〔実施例１４〕　Ca2＋スイッチアッセイ
　次に、本発明者らは、MDCK細胞におけるAJsの破壊および形成中のアファディンの局在と比較した、ADIPの局在を調べた。
【０１３８】
　MDCK細胞を用いるCa2+スイッチ実験は、文献記載のようにして行った（Kartenbeck, J., M. Schmelz, W.W. Franke, and B. Geiger. 1991. Endocytosis of junctional cadherins in bovine kidney epithelial (MDBK) cells cultured in low Ca2+ ion medium. J. Cell Biol. 113:881-892.）。簡潔には、MDCK細胞（1×105）を、12ウェル培養皿内の18mmガラスカバースリップに播種した。48時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、血清を含まないDMEM中で2mM Ca2+にて60分間培養した。次に細胞を2μM Ca2+（5mM EGTAを含むDMEM）にて120分間培養した。培養後、細胞をPBSで洗浄し、再度血清を含まないDMEM中で2mM Ca2+にて60分間培養した。細胞をホルボールエステル、すなわち12-O-テトラデカノイル-ホルボール-13-アセテート（TPA）で処理した場合、細胞をPBSで洗浄して、血清を含まないDMEM中で2mM Ca2＋にて60分間培養した。次に細胞を、5mM EGTAを含む2μM Ca2+で120分間培養した。培養後、100nM TPAを培地に加え、細胞をさらに60分間培養した。
【０１３９】
　結果、培養培地中のCa2＋濃度を、2mMから2μMに切り替えた場合、MDCK細胞は、文献記載のように（Kartenbeck, J., M. Schmelz, W.W. Franke, and B. Geiger. 1991. Endocytosis of junctional cadherins in bovine kidney epithelial (MDBK) cells cultured in low Ca2+ ion medium. J. Cell Biol. 113:881-892.）、徐々に互いから脱着した。アファディン、E-カドヘリンおよびADIPシグナルは、2mMのCa2＋で培養した細胞の細胞-細胞接着部位に高度に集中していた（図８Ａ）。これらの細胞を2μMのCa2＋で120分間培養した場合、E-カドヘリンシグナルは消失し、細胞内小胞上に一部出現した（図８ＢのE-カドヘリン）。アファディンシグナルはほとんど、形質膜の遊離表面上に留まり、文献記載のように（Sakisaka, T, H. Nakanishi, K. Takahashi, K. Mandai, M. Miyahara, A. Satoh, K.Takaishi, and Y. Takai. 1999. Different behavior of l-afadin and neurabin-II during the formation and destruction of cell-cell adherens junction. Oncogene. 18:1609-1617.；Fukuhara, A., K. lrie, H. Nakanishi, K. Takekuni, T Kawakatsu, W. Ikeda, A. Yamada, T.Katata, T.Honda, T.Sato, K. Shimizu, H. Ozaki, H. Horiuchi, T.Kita, and Y.Takai. 2002. Involvement of Nectin in the Localization of Junctional Adhesion Molecule at Tight Junctions Oncogene. In press.）、環様構造を形成した（図８Ｂのアファディン）。これらの条件下で、ADIPシグナルはほとんど、形質膜の遊離表面から消失した（図８ＢのADIP）。
【０１４０】
　次に、2μMのCa2＋で120分間予め培養したMDCK細胞を、2mMのCa2＋で60分間再度培養し、細胞-細胞接着部位でのADIPの蓄積について、E-カドヘリンの蓄積と比較して調べた。2mMのCa2＋でインキュベート後、E-カドヘリンシグナルは、アファディンが局在する細胞-細胞接着部位に再度集中した（図８ＣのE-カドヘリン）。ADIPシグナルもまた、細胞-細胞接着部位において再度集中した（図８ＣのADIP）。
【０１４１】
　本発明者らは次に、2μMのCa2＋で120分間予め培養したMDCK細胞を、2μMのCa2＋で、TPAと共に60分間インキュベートした場合、TJ様構造が形成され、アファディンおよびZO-1はそこに蓄積するが、E-カドヘリンは蓄積しないことが示された（Balda, M.S., L. Gonzalez-Mariscal, K. Matter, M. Cereijido, and J.M. Anderson. 1993. Assembly of the tight junction: the role of diacylglycerol. J. Cell Biol. 123:293-302.；Asakura, T, H. Nakanishi, T Sakisaka, K. Takahashi, K. Mandai, M. Nishimura, T.Sasaki, and Y.Takai. 1999. Similar and differential behaviour between the nectin-afadin-ponsin and cadherin-catenin systems during the formation and disruption of the polarized junctional alignment in epithelial cells. Genes Cells. 4:573-581.；Fukuhara, A., K. lrie, H. Nakanishi, K. Takekuni, T Kawakatsu, W. Ikeda, A. Yamada, T.Katata, T.Honda, T.Sato, K. Shimizu, H. Ozaki, H. Horiuchi, T.Kita, and Y.Takai. 2002. Involvement of Nectin in the Localization of Junctional Adhesion Molecule at Tight Junctions Oncogene. In press.；Fukuhara, A., K. Irie, A. Yamada, T Katata, T.Honda, K. Shimizu, H. Nakanishi, and Y.Takai. 2002. Role of Nectin in Organization of Tight Junctions in Epithelial Cells. Genes Cells. In press.）。また、アファディンシグナルはTPA誘導TJ様構造に局在したが、ADIPまたはE-カドヘリンシグナルは局在しなかった（図８Ｄ）。
【０１４２】
　これらの結果により、ADIPは、接合部複合体の破壊および形成中のアファディンの局在挙動とは異なる局在挙動を示すことが示された。
【０１４３】
〔実施例１５〕　ADIPのα-アクチニン-1へのインビトロおよびインビボでの結合
　ADIPのα-アクチニン-1へのインビトロおよびインビボでの結合を確認するために、本発明者らは、免疫沈降解析を実施した。
【０１４４】
　HEK293細胞を、α-アクチニン-1のHAタグ化C末端部分（HA-α-アクチニン-1-C；aa406〜892）およびFLAGタグ化ADIP（FLAG-mADIP-M；aa152〜436）を用いて同時トランスフェクトした。
【０１４５】
　FLAGタグ化ADIPを、抗FLAG mAbを用いて細胞抽出物から免疫沈降した場合、HA-α-アクチニン-1-Cは、HA mAbを使用してウエスタンブロットにより検出したところ、共免疫沈降した（図９Ｂ）。
【０１４６】
　FLAG-mADIP-Mを、抗FLAG Abを用いて、FLAGタグ化mADIP（FLAG-mADIP-M；aa152〜436）のみを一過的に発現しているHEK293細胞の抽出物から免疫沈降した場合、内因性α-アクチニンが共免疫沈降した（図９Ｃ）。
【０１４７】
　最後に、内因性ADIPを、MDCK細胞の抽出物から、抗ADIP pAbを用いて免疫沈降した場合、内因性α-アクチニンが共免疫沈降した（図９Ｄ）。α-アクチニンは、対照IgGでは共免疫沈降しなかった。
【０１４８】
　これらの結果より、ADIPは、インビトロおよびインビボの両方でα-アクチニンに結合することが示された。
【０１４９】
〔実施例１６〕　MDCK細胞のAJsにおけるα-アクチニンとADIPの共局在化
　α-アクチニンは、α-カテニンと相互作用し、AJsに局在することが示されているので（Knudsen, K.A., A.P. Soler, K.R. Johnson, and M.J. Wheelock. 1995. Interaction of alpha-actinin with the cadherin/catenin cell-cell adhesion complex via alpha-catenin. J. Cell Biol. 130:67-77.）、本発明者らは、免疫蛍光顕微鏡により、ADIPがMDCK細胞のAJsにおいてα-アクチニンと共局在するかどうかを調べた。
【０１５０】
　結果、ADIPおよびα-アクチニンは、細胞-細胞接合部で共局在した（図１０Ａ）。α-アクチニンはさらに、限局的接着部位に局在し、一方、ADIPはそうではなかった（データは示さず）。
【０１５１】
　接合部複合体領域におけるADIPおよびα-アクチニンの共局在をさらに確認するために、マウス小腸の凍結切片を、抗ADIP pAbおよび抗α-アクチニンmAbで二重染色した。
【０１５２】
　結果、吸収上皮において、ADIPはα-アクチニンと共局在した（図１０Ｂ）。ADIPの局在は、上記したようにAJsに厳密に限定され、一方、α-アクチニンの局在は、側方形質膜の先端から基底側までより広範に分布していた（図１０Ｂ）。
【０１５３】
　これらの結果により、ADIPは、F-アクチン束で裏打ちされた細胞-細胞AJsにおいて、アファディンおよびα-アクチニンと複合体を形成することが示される。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】アファディンのDILドメインへのADIPの結合を示す図および写真である。（A）：アファディンの概略構造。RA、Ras会合ドメイン；FHA、フォークヘッド会合ドメイン；DIL、希釈ドメイン；PDZ、PDZドメイン；PR、プロリンリッチドメイン。（B）：アファディンのDILドメインへのADIPの特異的結合を示す、酵母二重ハイブリッドアッセイ。
【図２】ADIPのアミノ酸配列を示す図および写真である。（A）：ラットADIP、マウスADIPおよびヒトKIAA0923の推定アミノ酸配列。グレーの塗りつぶしは、同一配列を表わす。推定上のコイル状コイルドメインには下線を付した。（B）：天然および組換えADIPタンパク質の分子量を比較した図である。pCMV HA mADIPをHEK293細胞にトランスフェクトし、細胞溶解物をSDS-PAGE（10％ポリアクリルアミドゲル）にかけ、続いて抗ADIP Ab（M57）を用いてウエスタンブロットを行った。対照であるHEK293細胞およびMDCK細胞の細胞溶解物も同様にSDS-PAGEにかけ、続いてウエスタンブロットを行った。レーン1、対照HEK293細胞（タンパク質1μg）；レーン2、pCMV HA　mADIP-トランスフェクトHEK293細胞（タンパク質1μg）；およびレーン3、MDCK細胞（タンパク質1μg）。
【図３】ADIPのアファディンへのインビトロおよびインビボ結合を示す図および写真である。（A）：マウスADIPの概略構造。CC、コイル状コイルドメイン。ADIPのアファディンまたはα-アクチン結合領域の酵母二重ハイブリッド解析。ADIP、アファディン（DILドメイン）およびα-アクチニンはpGBDUまたはpGAD内に構築され、レポーター酵母菌株に同時形質転換された。HIS3およびADE2レポーター遺伝子の発現によって示されるように、アファディンまたはα-アクチニンへのADIPの結合は、それぞれヒスチジンおよびアデニンが欠如した合成完全培地上での増殖を評価することによって計測した。＋、相互作用あり；-、相互作用なし；およびNT、試験せず。（B）：FLAGタグ化mADIP-Cを持つアファディンのT7タグ化DILドメインの共免疫沈降。発現ベクターは図示されているように、HEK293細胞内にトランスフェクトされた。アファディンのT7タグ化DILドメインは、抗T7および抗Flag mAbを用いたウエスタンブロットによって示されるように、Flagタグ化mADIP-Cと特異的に共免疫沈降した。（C）：MBP-mADIPへのアファディンのインビトロ結合。MDCK細胞の抽出物を、アミロース樹脂ビーズ上に固定化されたMBPまたはMBP-mADIP（全長）とインキュベートした。次にビーズをSDS-PAGE（10％ポリアクリルアミドゲル）にかけ、続いて抗アファディン mAbを用いてウエスタンブロットを行った。（D）：内因性アファディンと、MDCK細胞による内因性ADIPとの共免疫沈降。MDCK細胞の溶解物は、抗ADIP抗体（M05）と免疫沈降させ、抗ADIP pAb（M05）および抗アファディン mABを用いてウエスタンブロットによって解析した。結果は3つの独立した実験の代表である。
【図４】ADIPの組織および亜細胞分布を示す写真である。（A）：ノーザンブロット解析。マウスRNAブロット膜（Clontech）をADIP cDNAの32P標識断片（bp 552〜3194）によってハイブリダイズし、続いてオートラジオグラフィーを行った。レーン1、心臓；レーン2、脳；レーン3、脾臓；レーン4、肺；レーン5、肝臓；レーン6、骨格筋；レーン7、腎臓；およびレーン8、精巣（短期暴露）。（B）ウエスタンブロット解析。種々のマウス組織のホモジネート（それぞれタンパク質30μg）をSDS-PAGE（10％ポリアクリルアミドゲル）にかけ、続いて抗ADIP　Ab（M57）を用いてウエスタンブロットを行った。レーン1、心臓；レーン2、脳；レーン3、脾臓；レーン4、肺；レーン5、肝臓；レーン6、骨格筋；レーン7、腎臓；レーン8、精巣およびレーン9、MDCK細胞。（C）：ラット肝臓におけるADIPの亜細胞分布。ラット肝臓の亜細胞分画を実施し、各画分（それぞれタンパク質30μg）をSDS-PAGE（10％ポリアクリルアミドゲル）にかけ、続いて抗ADIP　pAb（M57）または抗アファディン mAbを用いてウエスタンブロットを行った。レーン1、ホモジネート画分；レーン2、可溶性画分；レーン3、ペレット画分；レーン4、毛細胆管に豊富な画分；そしてレーン5、AJsおよびTJsに豊富な画分。結果は3つの独立した実験の代表である。
【図５】MDCK細胞内のAJsにおけるADIPの局在化を示す写真である。MDCK細胞は、抗ADIP（M05）、抗アファディン、抗ビンクリンAbsの種々の組み合わせによって二重染色した。（A）、ADIPおよびアファディン；（B）、ADIPおよびビンクリン。バーは、10μm。結果は3つの独立した実験の代表である。
【図６】ネクチン-2α-L細胞におけるアファディンとのADIPの同時局在化を示す写真である。（A）：ネクチン-2αをベースとした細胞-細胞接着部位へのADIPの補充。一時的にHAタグ化ADIP（rADIP-C；aa159〜613）を発現するネクチン-2α-L細胞を、抗HAおよび抗アファディン mAbによって二重染色した。矢印は、ネクチン-2αをベースとした細胞-細胞接着部位。（B）：ネクチン-2α-ΔCをベースとした細胞-細胞接着部位へのADIPの補充なし。一時的にHAタグ化ADIP（rADIP-C；aa159〜613）を発現するネクチン-2α-ΔC-L細胞を、抗HAおよび抗アファディンmAbによって二重染色した。矢印は、ネクチン-2α-ΔCをベースとした細胞-細胞接着部位。バーは10μm。結果は3つの独立した実験の代表である。
【図７】マウス小腸吸収上皮細胞中のAJsにおけるADIPおよびアファディンの同時局在化を示す写真である。（A）および（B）：ADIP、アファディンおよびZO-1の局在化。（A）において、凍結切片は抗ADIP pAb（M01）および抗アファディンならびに抗ZO-1 mAbによって三重染色した。（B）において、凍結切片は、抗ADIP pAb（M01）および抗アファディン mAb（左）によって、抗ADIP pAb（M01）および抗ZO-1 mAb（右）によって二重染色した。矢印はアファディンシグナルと同時局在化したADIPシグナル。矢はZO-1シグナルよりもやや基底側に局在化したADIPシグナル。バーは、10μm。（C）：マウス小腸吸収上皮細胞におけるADIPの超微細局在化。マウス小腸吸収上皮細胞は、超薄凍結切片技法を用いて、抗ADIP pAb（M01）によって標識した。AJ、接着結合；DS、デスモソーム；TJ、密着結合；およびバーは0．1μm。（D）：マウス心細胞内の細胞マトリックス結合におけるADIPの不在。凍結切片は、抗ADIP pAb（M01）および抗ビンクリンmAbによって二重染色した。矢印は、介在板；矢はコスタメア；およびバーは50μm。結果は3つの独立した実験の代表である。
【図８】MDCK細胞におけるAJsおよびTJsよりなる接合部複合体の破壊および形成の間のADIPの挙動を示す写真である。MDCK細胞は、抗ADIP（M05）、抗アファディンおよび抗E-カドヘリンAbによって三重染色した。（A）：2mM　Ca2＋（正常Ca2＋）にて培養した細胞におけるADIP、アファディンおよびE-カドヘリンの局在化。（B）：培地Ca2＋の正常濃度から低濃度への減少による、形質膜からのADIPの免疫蛍光シグナルの消失。MDCK細胞は2μM Ca2＋にて120分間培養した（低Ca2＋）。（C）：Ca2＋濃度の低濃度から正常濃度への増加による、細胞-細胞接着部位へのADIPの補充。MDCK細胞は2μM Ca2＋にて120分間培養し、次に2mM Ca2＋によって60分間インキュベートした（低Ca2＋＋正常Ca2＋）。（D）：TPA誘発TJ様構造へのADIPの補充なし。MDCK細胞は2μM Ca2＋にて120分間培養し、次に100nM TPAによって60分間インキュベートした（低Ca2＋＋TPA）。バーは10μm。結果は3つの独立した実験の代表である。
【図９】α-アクチニンへのADIPのインビボ結合を示す写真である。（A）：α-アクチニン-1の概略構造。CH、カルポニン相同体ドメイン；SPEC、スペクトリン様反復；およびEF、EFハンド。α-アクチニン-1のADIP結合領域の酵母二重ハイブリッド解析。HIS3およびADE2レポーター遺伝子の発現によって示されるように、ADIPへのα-アクチニン-1の結合は、それぞれヒスチジンおよびアデニンが欠如した合成完全培地上での増殖を評価することによって計測した。＋、相互作用あり；＋／-、弱い相互作用あり；および-、相互作用なし。（B）：HAタグ化α-アクチニン-1-CとFlagタグ化mADIP-Mとの共免疫沈降。発現ベクターは図示したように、HEK293細胞にトランスフェクトされた。HAタグ化α-アクチニン-1-Cは、抗HAおよび抗Flag　mAbによるウエスタンブロットによって示されるように、Flagタグ化mADIP-Mと特異的に共免疫沈降した。（C）：内因性α-アクチニンとFlagタグ化mADIP-Mの共免疫沈降。発現ベクターは図示したように、HEK293細胞にトランスフェクトされた。内因性α-アクチニン-1は、抗α-アクチニンpAbおよび抗Flag　mAbによるウエスタンブロットによって示されるように、Flagタグ化mADIP-Mと特異的に共免疫沈降した。（D）：内因性α-アクチニンおよび内因性アファディンと、MDCK細胞による内因性ADIPとの共免疫沈降。MDCK細胞の溶解物は、抗ADIP抗体（M05）と免疫沈降させ、抗ADIP（M05）、抗α-アクチニンおよび抗アファディン Abを用いたウエスタンブロットによって解析した。結果は3つの独立した実験の代表である。
【図１０】MDCK細胞およびマウス小腸吸収上皮細胞内のAJsにおけるα-アクチニンおよびADIPの局在化を示す写真である。（A）：MDCK細胞におけるADIPおよびα-アクチニンの局在化。細胞は、抗ADIP pAB（M05）および抗αアクチンmAbによって二重染色した。（B）：マウス小腸吸収上皮細胞におけるADIPおよびα-アクチニンの局在化。凍結切片は、抗ADIP pAb（M01）および抗α-アクチンmAbによって三重染色した。バーは、10μm。結果は3つの独立した実験の代表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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