(57)【要約】【課題】安全性に優れ、かつ、種々の塩素化ダイオキシン類について識別性の優れた抗体を取得するためのダイオキシン類のハプテン抗原を提供する。【解決手段】下記の一般式（１）【化１】2004026704.tif 000023（ただし、一般式（１）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はメチル基を示し、Ｒ２は水酸基、カルボキシルアシルオキシ基、カルボキシル基、アミノ基又はチオール基を示す。）により表される化合物。【選択図】　図３
2004026704.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）
【化１】
2004026704.tif 000019
（ただし、一般式（１）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はメチル基を示し、Ｒ２は水酸基、カルボキシルアシルオキシ基、カルボキシル基、アミノ基又はチオール基を示す。）により表される化合物。
【請求項２】
一般式（１）のうち、Ｒ１が水素原子又はハロゲン原子であり、Ｒ２が水酸基又はカルボキシルアシルオキシ基である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一般式（１）のうち、Ｒ１が水素原子又は塩素原子である請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
下記の一般式（２）
【化２】
2004026704.tif 000020
（ただし、一般式（２）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ３はハロゲン原子を示し、Ｒ２は水酸基又はカルボキシルアシルオキシ基を示す。）により表される化合物。
【請求項５】
一般式（２）のうち、Ｒ３が塩素原子である請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
下記の式（３）の構造を有する化合物。
【化３】
2004026704.tif 000021
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載された化合物と高分子化合物との複合体。
【請求項８】
高分子化合物がタンパク質である請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
高分子化合物がウシ血清アルブミン又はウシガンマグロブリンである請求項７又は８に記載の複合体。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか一項に記載の複合体を抗原として用いることを特徴とする、一般式（４）
【化４】
2004026704.tif 000022
（ただし、一般式（４）中、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基又はニトロ基を示す。）で表される化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
【請求項１１】
一般式（４）で表される化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメント。
【請求項１２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１３】
請求項１２に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１４】
寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８２７で寄託されている請求項１３に記載のハイブリドーマ。
【請求項１５】
請求項１１もしくは１２に記載の抗体又はそのフラグメントを用いることを特徴とする、一般式（４）で表される化合物の免疫化学的測定方法。
【請求項１６】
さらに、請求項７から９のいずれか一項に記載の複合体を用いることを特徴とする、請求項１５に記載の免疫化学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ハプテン抗原に関する。詳しくは、ジベンゾパラダイオキシン（以下、ダイオキシンと略記する。）類に対する抗体を取得するための新規ハプテン抗原に関する。本発明は又、該ハプテン抗原に対する抗体として取得されたダイオキシン類に対する抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いたダイオキシン類の免疫化学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体に極めて重大な影響を及ぼす毒性化学物質であるダイオキシン類による環境汚染が問題となってきており、環境又は生体中などにおけるダイオキシン類を測定し、汚染状況を調査することが急務となってきている。そのため、環境又は生体中などにおけるダイオキシン類を測定するための方法の開発が進められている。
【０００３】
ダイオキシン類の測定方法の一つとして、免疫化学的測定方法がある。免疫化学的測定方法においては、ダイオキシン類の抗体を用いて試料中のダイオキシン類の濃度を測定する。しかしながら、ダイオキシン類は低分子であり、そのままでは抗体産生が起こらないハプテン（免疫原性がない）であるため、ダイオキシン類の抗体を作製するにはハプテンをキャリアータンパク質［ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）など］などの高分子化合物と結合させ、免疫原とする必要がある。
【０００４】
この様な方法として、特開昭６３−１４６９１号には、１−アミノ−３，７，８−トリクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンをキャリアータンパクに結合させて得たハプテン抗原を用いてモノクロナール抗体を取得すること、又、該モノクローナル抗体を用いたダイオキシン類の検出方法が開示されている。
【０００５】
また、特開昭６３−７４４９４号には、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンとキャリアーの免疫複合体を用いて抗体を取得すること、又、該モノクローナル抗体を用いたダイオキシン類の分析方法が開示されている。
【０００６】
また、特開２００２−１１９２７９号には、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンとキャリアーを結合させた抗原を用いて抗体を取得すること、又、該モノクローナル抗体を用いたダイオキシン類の分析方法が開示されている。
【０００７】
これらの方法を含む、従来のダイオキシン類の免疫化学的測定方法で用いられる、ダイオキシン類に対する抗体を取得するために用いられている既知のハプテン−キャリアータンパク質複合体免疫原では、ダイオキシン骨格の炭素に側鎖を導入し、その末端にキャリアータンパク質を結合させている。
【０００８】
ところで、環境中で問題となっているダイオキシン類は、多塩素化ダイオキシンであり、その塩素化されている位置および数が異なる多数の類縁体が存在する。既知のダイオキシンハプテン抗原は、ダイオキシン骨格の塩素の付く位置に側鎖を導入しているため、このようなハプテン−キャリアー複合体免疫原から作製された抗体は、種々の塩素化ダイオキシンの識別性に問題があると考えられる。
【０００９】
また、人体および環境などに対する危険性の点で、ダイオキシン骨格において４個以上の塩素で置換されたダイオキシン抗原を作製することは望ましくないと考えられる。
【００１０】
したがって、安全性に優れ、かつ、種々の塩素化ダイオキシン類について識別性の優れた抗体を取得するためのダイオキシン類のハプテン抗原の開発が望まれていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明は、上記課題を解決することを目的とし、安全性に優れ、かつ、種々の塩素化ダイオキシン類について識別性の優れた抗体を取得するためのダイオキシン類のハプテン抗原を提供することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ハプテン部分にダイオキシン骨格ではなくダイオキシン類の類似構造体であるキサンテン骨格を有するハプテン抗原を用いて、塩素化ダイオキシン類に対する抗体を取得することに成功し、発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は上記のようにしてなされたものであり、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）　下記の一般式（１）
【００１４】
【化５】
2004026704.tif 000003
【００１５】
（ただし、一般式（１）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はメチル基を示し、Ｒ２は水酸基、カルボキシルアシルオキシ基、カルボキシル基、アミノ基又はチオール基を示す。）により表される化合物。
（２）　一般式（１）のうち、Ｒ１が水素原子又はハロゲン原子であり、Ｒ２が水酸基又はカルボキシルアシルオキシ基である（１）に記載の化合物。
（３）　一般式（１）のうち、Ｒ１が水素原子又は塩素原子である（１）又は（２）に記載の化合物。
（４）　下記の一般式（２）
【００１６】
【化６】
2004026704.tif 000004
【００１７】
（ただし、一般式（２）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ３はハロゲン原子を示し、Ｒ２は水酸基又はカルボキシルアシルオキシ基を示す。）により表される化合物。
（５）　一般式（２）のうち、Ｒ３が塩素原子である（４）に記載の化合物。
（６）　下記の式（３）の構造を有する化合物。
【００１８】
【化７】
2004026704.tif 000005
【００１９】
（７）　（１）から（６）のいずれかに記載された化合物と高分子化合物との複合体。
（８）　高分子化合物がタンパク質である（７）に記載の複合体。
（９）　高分子化合物がウシ血清アルブミン又はウシガンマグロブリンである（７）又は（８）に記載の複合体。
（１０）　（７）から（９）のいずれかに記載の複合体を抗原として用いることを特徴とする、一般式（４）
【００２０】
【化８】
2004026704.tif 000006
【００２１】
（ただし、一般式（４）中、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基又はニトロ基を示す。）で表される化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
（１１）　一般式（４）で表される化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメント。
（１２）　抗体がモノクローナル抗体である（１１）に記載の抗体又はそのフラグメント。
（１３）　（１２）に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（１４）　寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８２７で寄託されている（１３）に記載のハイブリドーマ。
（１５）　（１１）もしくは（１２）に記載の抗体又はそのフラグメントを用いることを特徴とする、一般式（４）で表される化合物の免疫化学的測定方法。
（１６）　さらに、（７）から（９）のいずれかに記載の複合体を用いることを特徴とする、（１５）に記載の免疫化学的測定方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のハプテン抗原
本発明のハプテン抗原は、ハプテン部分がダイオキシン骨格ではなく、ダイオキシン類の類似構造体であるキサンテン骨格を有する化合物であり、塩素化ダイオキシン類に対する抗体を取得するための免疫原となる化合物である。本発明のハプテン抗原のハプテン部分はキサンテン骨格を有する化合物であり、ダイオキシン骨格の塩素化されない酸素原子位置に相当する、キサンテン骨格の９位の炭素の位置に側鎖を導入したことに特徴があり、種々の塩素化ダイオキシンの識別性に優れた抗体を取得するための免疫原となり得る。
【００２３】
本発明のハプテンは、　下記の一般式（１）
【００２４】
【化９】
2004026704.tif 000007
【００２５】
（ただし、一般式（１）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はメチル基を示し、Ｒ２は水酸基、カルボキシルアシルオキシ基、カルボキシル基、アミノ基又はチオール基を示す。）により表される化合物である。
【００２６】
ｎは、好ましくは２〜１０、より好ましくは４〜８までのいずれかの整数である。
Ｒ１は、それぞれ独立であって、置換基の位置および種類などは特に限定されない。Ｒ１の具体例としては、水素原子、塩素原子、臭素原子、アミノ基、ニトロ基、メチル基などが好ましく例示できる。
Ｒ２のうち、カルボキシルアシルオキシ基の炭素数としては好ましくは３〜６までのいずれかの整数である。Ｒ２の具体例としては、水酸基、カルボキシルプロピオニルオキシ基、カルボキシルバレイルオキシ基、カルボキシル基、アミノ基又はチオール基などが好ましく例示できる。
【００２７】
本発明のハプテンは、好ましくは、一般式（１）のうち、Ｒ１が水素原子又はハロゲン原子であり、Ｒ２が水酸基又はカルボキシルアシルオキシ基である化合物である。本発明のハプテンは、好ましくは、一般式（１）のうち、Ｒ１が水素原子又は塩素原子である化合物である。
【００２８】
本発明のハプテンは、好ましくは、下記の一般式（２）
【００２９】
【化１０】
2004026704.tif 000008
【００３０】
（ただし、一般式（２）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ３はハロゲン原子を示し、Ｒ２は水酸基又はカルボキシルアシルオキシ基を示す。）により表される化合物である。
ｎは、好ましくは２〜１０、より好ましくは４〜８までのいずれかの整数である。
Ｒ３の具体例としては、塩素原子、臭素原子などが好ましく例示できる。
Ｒ２のうち、カルボキシルアシルオキシ基の炭素数としては好ましくは３〜６までのいずれかの整数である。Ｒ２の具体例としては、水酸基、カルボキシルプロピオニルオキシ基、カルボキシルバレイルオキシ基などが好ましく例示できる。
本発明のハプテンは、好ましくは、一般式（２）のうち、Ｒ３が塩素原子である化合物である。
【００３１】
本発明のハプテンの具体例としては、コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル、アジピン酸モノ８−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）オクチルなどが好ましく例示できる。
【００３２】
本発明のハプテンは、常法（［医薬品の開発、第１０巻診断薬、第３章、廣川書店］、［生化学実験法１１−エンザイムイムノアッセイ、１２章、東京化学同人］等）に従って、高分子化合物と結合させ、塩素化ダイオキシン類に対する抗体を取得するための免疫原とすることができる。高分子化合物としては、タンパク質が好ましく例示できる。このようにハプテンと結合させて免疫原を作製するためのタンパク質をキャリアータンパク質と称する。キャリアータンパク質としては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリンなどが好ましく例示できる。
【００３３】
本発明のハプテン抗原は、ダイオキシン類に対する抗体の免疫原となるにも関わらず、ハプテン部分にダイオキシン骨格を有しない化合物を用いた新規なハプテン抗原である。
【００３４】
（２）本発明のハプテン抗原の製造方法
本発明のハプテン抗原のハプテン部分は、キサンテン骨格を有し、ダイオキシン類の有するダイオキシン骨格において塩素化されない酸素原子位置に相当する、キサンテン骨格の９位の炭素の位置に側鎖が導入されていることを特徴とする。
【００３５】
本発明のハプテンは、例えば、下記の方法により得られる。式（Ａ）で表される化合物
【００３６】
【化１１】
2004026704.tif 000009
【００３７】
（Ｒ５は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はメチル基を示す。）（ただしアミノ基の場合は保護基をつける。）及び式（Ｂ）で表される化合物
【００３８】
【化１２】
2004026704.tif 000010
【００３９】
（Ｒ６は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基又はメチル基を示す。）（ただしアミノ基の場合は保護基をつける。）とを、有機溶媒中、炭酸カリウム、銅粉および沃化銅存在下、加温下で反応させ、式（Ｃ）で表される化合物を得る。
【００４０】
【化１３】
2004026704.tif 000011
【００４１】
（Ｒ５およびＲ６は、前記と同義である。）（ただしアミノ基の場合は保護基をつける。）
【００４２】
式（Ｃ）で表される化合物に、塩化チオニル、次いで塩化アルミニウムを反応させ、式（Ｄ）で表される化合物を得る。
【００４３】
【化１４】
2004026704.tif 000012
【００４４】
（Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。）
【００４５】
式（Ｄ）で表される化合物に、式（Ｅ）で表される化合物
【００４６】
【化１５】
2004026704.tif 000013
【００４７】
（ａは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｘは保護基を示す。）
【００４８】
を有機溶媒中で反応後、脱保護し、式（Ｆ）で表される化合物を得る。なお、Ｘで示される保護基として、テトラヒドロピランが好ましく挙げられる。
【００４９】
【化１６】
2004026704.tif 000014
【００５０】
（Ｒ５、Ｒ６およびａは前記と同義である。）
【００５１】
式（Ｆ）で表される化合物に、式（Ｇ）で表される大過剰の公知の化合物
【００５２】
【化１７】
2004026704.tif 000015
【００５３】
（ｂは１〜４までのいずれかの整数を示す。）
【００５４】
を炭酸カリウム存在下で反応させ、次いで酸クロリドを加水分解し、式（Ｈ）で表される化合物
【００５５】
【化１８】
2004026704.tif 000016
【００５６】
（Ｒ５、Ｒ６、ａおよびｂは前記と同義である。）
【００５７】
を得る。
必要に応じて、式（Ｈ）で表される化合物の側鎖の部分に、常法に従って、高分子化合物を結合させる。
【００５８】
（３）本発明の抗体の製造方法
本発明の抗体は、抗原として本発明のハプテン抗原を用い、一般式（４）に示す化合物に反応性を示す抗体を得ること以外は、当業者によく知られた通常の方法を採用することができる。具体的には、本発明の抗体は、例えば、下記のようにして製造することができる。
【００５９】
ポリクローナル抗体を取得する場合は、前記のハプテン−キャリアタンパク質複合体を抗原として、例えば、マウスを常法にしたがって免疫する。使用するマウスの種類は特に限定されないが、一般にはＢＡＬＢ／ｃ系のマウスが用いられる。マウス１匹当たり抗原５０〜１００μｇの割合で、フロイントの完全アジュバント若しくは不完全アジュバントと共に腹腔内若しくは皮下に、又はアジュバントを加えずに静脈内若しくは直接脾臓に免疫する。初回免疫２〜３週間後に同一の方法により追加免疫を行う。
【００６０】
免疫成立の確認は、マウスから採血し、公知のＥＬＩＳＡ法により血中の抗体価を測定することにより実施することができる。
【００６１】
モノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の作製に用いられる方法（Ｋｏｈｌｅｒ，　Ｇ．　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．：　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６　：　４９５−４９７，　１９７５）と同様に調製できる。具体的には、前記ポリクローナル抗体を取得する場合と同様の方法で、マウスを免疫する。使用するマウスの種類、抗原の量もポリクローナル抗体を取得する場合と同様である。
ポリクローナル抗体を取得する場合と同様に免疫成立の確認を実施することができる。なお、細胞融合の３日前に抗原を免疫動物に静脈注射することにより、抗体産生活性を有するハイブリドーマを得る確率を高くすることが可能である。
【００６２】
次に前記のようにして免疫したマウスの脾細胞とミエローマ細胞とを融合させる。ミエローマ細胞としては、ＰＡＩミエローマ細胞（Ｓｔｏｃｋｅｒ，　Ｊ．　Ｗ．，　Ｆｏｒｓｔｅｒ，　Ｈ．Ｋ．，　Ｍｉｇｇｉａｎｏ，　Ｍ．，　Ｓｔａｈｌｉ，　Ｃ．，　Ｓｔａｉｇｅｒ，　Ｇ．，　Ｔａｋａｃｓ，　Ｂ．，　ａｎｄ　Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ，　Ｔ．　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　２　ｎｅｗ　ｍｏｕｓｅ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　’ＰＡＩ’　ａｎｄ　’ＰＡＩ−０’　ｆｏｒｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．　Ｒｅｓ．　Ｄｉｓｃｌｏｓ．，　２１７：　１５５−１５７，　１９８２．）を例示することができる。
【００６３】
細胞融合及びハイブリドーマの選択方法を、例示すれば下記のとおりである。脾細胞及びミエローマ細胞を、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地（以下「ＨＡＴ培地」と記載する。例えば、シグマ社から購入可能。）中で培養する。ミエローマ細胞として、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子又はチミジンキナーゼ遺伝子が変異した変異株を用い、融合処理後の細胞をこの培地で培養すると、融合しない細胞は死滅し、融合した細胞のみが増殖するので、融合細胞を選別することができる。次に、ＥＬＩＳＡ法により目的とするハプテン抗原に対する抗体を産生しているハイブリドーマの選択を下記のとおり行う。
【００６４】
固相ＥＬＩＳＡ法に使用するイムノプレートに、本発明のハプテン抗原をコーティングし、ハイブリドーマ培養上清を適当に希釈して添加し、未吸着物を洗浄除去し、アルカリフォスファターゼ又はパーオキシダーゼを結合させた２次抗体を添加する。未吸着の２次抗体を洗浄して除去し、発色基質としてパラニトロフェニルリン酸（カペル社製）、オルトフェニレンジアミン又は２，２−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸を、使用した酵素に応じて添加し、目的とする抗体を産生している細胞の培養上清を加えた穴を発色させる。このようにして目的とするハイブリドーマが得られ、公知の限界希釈法によりクローニングを行い、ハイブリドーマ・クローンを確立することができる。
【００６５】
本発明のモノクローナル抗体は、上記のようにして得られたハイブリドーマの培養上清から、公知のアフィニティクロマトグラフィー、硫安塩析などによって分離精製することができるが、同系のマウス腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を生成させることにより、１０００〜１００００倍程度に濃縮されたモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００６６】
本発明の抗体は、上記のようにして得ることができる。また、本発明のハプテン抗原の好ましい一形態であるコハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル複合体を免疫原として作製されたハイブリドーマＤｘ−αは、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１　中央第６）に、平成１４年４月１９日に、寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８２７として寄託されているため、これを用いて本発明の抗体の好ましい一形態を得ることもできる。
【００６７】
（４）本発明の抗体
本発明の抗体は、一般式（４）
【００６８】
【化１９】
2004026704.tif 000017
【００６９】
（ただし、一般式（４）中、Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子、アミノ基又はニトロ基を示す。）で表される化合物のうちの一つ又は複数と反応性を示す抗体又はそのフラグメントである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
本発明の抗体のフラグメントとは、抗原に結合するのに十分な抗体の部分領域のことをいい、例えば、抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２などが挙げられる。
本明細書においては、単に「抗体」というときは、「抗体又はそのフラグメント」のことを意味することがある。
【００７０】
本発明の抗体は、公知の免疫クロマト法などにより、抗体のアイソタイプを決定することができる。
【００７１】
既知のダイオキシン類の中で、２，３，７，８−テトラクロロダイオキシンがその毒性が最強であり、最も問題視されている。本発明の新規ハプテン抗原の好ましい一形態であるコハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシルタンパク質複合体のハプテン部分は、２，３，７，８−テトラクロロダイオキシンのダイオキシン骨格における塩素の置換数、置換位置が、キサンテン骨格において同じであるダイオキシン類似体である。このハプテン抗原を免疫原として取得された本発明の抗体が、２，３，７，８−テトラクロロダイオキシンの２位の塩素をアミノ基又はニトロ基に置換したダイオキシンを認識したことから、本抗体は２，３，７，８−テトラクロロダイオキシンを認識する可能性が高いと考えられる。
【００７２】
既知のダイオキシン類−タンパク質複合体抗原では、人体および環境に対する危険性の点で、４個以上の塩素で置換されたダイオキシン類の抗原を作製することは望ましくないと考えられるが、本発明の新規ハプテン抗原は、１，２，３，４，５，６，７，８の任意の位置に塩素を有していても毒性は報告されておらず、安全性に優れている。
【００７３】
（５）本発明の免疫化学的測定方法
本発明の免疫化学的測定方法は、本発明の抗体又はそのフラグメントを用いて免疫化学的に測定することを特徴とする、ダイオキシン類の免疫化学的測定方法である。本発明の方法は、抗原及び抗体として本発明のハプテン抗原及び本発明の抗体を用いる以外は、当業者によく知られている通常の免疫学的測定方法を適用することができる。本発明の免疫化学的測定方法の具体的な形態は、本発明のハプテン抗原を固相に固定化し、測定するダイオキシン類と本発明の抗体を添加し、固定化されたハプテン抗原に対して結合した抗体を検出することによって、前記ダイオキシン類を免疫学的に検出又は定量する方法である。本発明の免疫化学的測定方法の他の形態は、本発明のモノクローナル抗体を固相に固定化し、測定するダイオキシン類と本発明のハプテン抗原を添加し、固定化された抗体に対して結合したハプテン抗原を検出することによって、または、測定するダイオキシン類と標識物質で標識化したダイオキシン類（標識化ダイオキシン類）を添加し、固定化された抗体に対して結合した標識化ダイオキシン類を検出することによって、前記ダイオキシン類を免疫学的に検出又は定量する方法である。
【００７４】
ハプテン抗原を固定化し、モノクローナル抗体との反応において、固定化ハプテン抗原とダイオキシン類とを競合させる間接競合法では、固定化されたハプテン抗原に結合したモノクローナル抗体を検出することによって、試料中のダイオキシン類を測定することができる。固定化されたハプテン抗原に結合したモノクローナル抗体の検出は、モノクローナル抗体として標識物質で標識化した標識化モノクローナル抗体を用い、この標識物質を検出することによって行うことができる。また、固相に非標識モノクローナル抗体を添加した後、さらに、このモノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した２次抗体を前記固相に添加し、この標識物質を検出することによっても、固定化されたハプテン抗原に結合したモノクローナル抗体を間接的に検出することができる。
【００７５】
２次抗体は、モノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体であり、マウスモノクローナル抗体に対しては抗マウスイムノグロブリン抗体が用いられる。また、モノクローナル抗体のクラスがＩｇＧであれば、２次抗体としては抗ＩｇＧ抗体が好ましいが、抗ＩｇＧ抗体を含んでいれば、他のクラスのイムノグロブリンに対する抗体を含んでいても差し支えない。
【００７６】
ハプテン抗原を固定化する固相としては、アガロースビーズ、ラテックス粒子、ポリスチレン、ナイロンなどのイムノプレートが挙げられる。これらの固相にハプテン抗原を含有する試料を含む緩衝液を入れるか、又はハプテン抗原を溶解した緩衝液に固相を浸漬することによって、ハプテン抗原を固相に固定化することができる。また、ドットブロット又はウェスタンブロットによっても、ニトロセルロースフィルターやナイロンメンブレンにハプテン抗原を固定化することができる。
【００７７】
モノクローナル抗体を標識する標識物質としては、酵素、ビオチン、ケイ光物質、発光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素の検出は、酵素反応により発色する色素を基質として用いることにより行うことができる。このような酵素及び基質については後述する。ビオチンの検出は、アビジンもしくはストレプトアビジンで標識した酵素をさらにビオチンに結合させることにより、又はアビジンもしくはストレプトアビジンを介してビオチニル化した酵素を結合させることにより、酵素の検出と同様にして行うことができる。
【００７８】
モノクローナル抗体を固定化し、モノクローナル抗体との反応において、ダイオキシン類と標識物質で標識化したダイオキシン類を競合させる直接競合法では、固定化されたモノクローナル抗体に結合した標識化ダイオキシン類を検出することによって、試料中のダイオキシン類を測定することができる。
モノクローナル抗体を固定化する固相としては、アガロースビーズ、ラテックス粒子、ポリスチレン、ナイロンなどのイムノプレートが挙げられる。これらの固相にモノクローナル抗体を含有する試料を含む緩衝液を入れるか、又はモノクローナル抗体を溶解した緩衝液に固相を浸漬することによって、モノクローナル抗体を固相に固定化することができる。また、ドットブロット又はウェスタンブロットによっても、ニトロセルロースフィルターやナイロンメンブレンにモノクローナル抗体を固定化することができる。
ダイオキシンを標識する標識物質としては、酵素、ビオチン、ケイ光物質、発光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素の検出は、酵素反応により発色する色素を基質として用いることにより行うことができる。このような酵素及び基質については後述する。ビオチンの検出は、アビジンもしくはストレプトアビジンで標識した酵素をさらにビオチンに結合させることにより、又はアビジンもしくはストレプトアビジンを介してビオチニル化した酵素を結合させることにより、酵素の検出と同様にして行うことができる。
【００７９】
また、モノクローナル抗体を固定化し、固定化したモノクローナル抗体との反応において、ハプテン抗原とダイオキシン類とを競合させる直接競合法では、固定化されたモノクローナル抗体に結合したハプテン抗原を検出し、試料中のダイオキシン類を測定することができる。固定化されたモノクローナル抗体に結合したハプテン抗原の検出は、ハプテン抗原として標識物質で標識化した標識化ハプテン抗原を用い、この標識物質を検出することによって行うことができる。
【００８０】
モノクローナル抗体を固定化する固相としては、間接競合法に用いたものと同様のものを用いることができる。
ハプテン抗原を標識する標識物質および酵素の検出などは、間接競合法に用いたものと同様のものを用いることができる。
【００８１】
本発明の方法の一形態である間接競合法によるダイオキシン類を測定する具体的な方法を例示する。
９６穴イムノプレートの穴に、リン酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と記載する）などのバッファで希釈したハプテン抗原を入れ、４℃で１晩吸着させ、のちイムノプレートをＰＢＳを用いて洗浄する。
【００８２】
この後、モノクローナル抗体などの非特異的吸着を防止するために、ブロックエース（雪印乳業社製）などのブロック溶液を各穴に添加して３７℃で１時間又は４℃で１晩ブロッキングした。
【００８３】
次いで、０．０２％ツィーン２０ＰＢＳ（ＰＢＳに０．０２％の割合でツィーン２０を混合した液。以下、「ＴＰＢＳ」と記載する。）で洗浄後、予めダイオキシン類を測定する試料と３７℃で２時間反応させた前記本発明のモノクローナル抗体（一次抗体）を加え、３７℃で４５分間反応させ、プレートをＴＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体、又はペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体などの標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、３７℃で４５分間反応させる。前記と同様にプレートを洗浄し、発色基質を添加し、室温で１５分間反応させ、発色基質の極大吸収を示す波長の吸光度により酵素活性を測定する。
【００８４】
アルカリフォスファターゼを用いた場合には、発色基質としてパラニトロフェニルリン酸などを、ペルオキシダーゼを用いた場合には、発色基質としてオルトフェニレンジアミン又は２，２−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸などを例示することができる。
【００８５】
本発明のモノクローナル抗体の力価及び交差性は、ＥＬＩＳＡ法などにより、測定することができる。
【００８６】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、その要旨をこえない限り、これらの実施例に限定されるものではない。
【００８７】
【実施例１】新規ハプテンの合成およびキャリアータンパク質との結合
以下のようにして、コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシルタンパク質複合体を合成した。
【００８８】
【化２０】
2004026704.tif 000018
【００８９】
（ｉ）４，５−ジクロロ−２−（３，４−ジクロロフェノキシ）安息香酸（Ｉ）の合成
２，４，５−トリクロロ安息香酸（１．４８ｇ　６．５６ｍｍｏｌ）、３，４−ジクロロフェノール（１．０７ｇ　６．５６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２０ｇ）、銅粉（０．４ｇ）および沃化銅（０．４ｇ）を１００ｍｌのニトロベンゼンに懸濁し、アルゴン雰囲気下で１７５℃　２．５時間加熱した。ニトロベンゼンの大部分を減圧留去した後、水を加えて共沸により完全に留去した。残留水溶液を塩酸で酸性にした後、析出した結晶を濾取、水洗後乾燥した。このものを酢酸エチル−ヘキサンから再結晶して標題の化合物を白色結晶として得た（得量：０．８５ｇ）。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）　６．８７ｐｐｍ（ｄｄ　１Ｈ）　７．０８ｐｐｍ（ｓ　１Ｈ）　７．１１ｐｐｍ（ｄ　１Ｈ）　７．４４ｐｐｍ（ｄ　１Ｈ）８．１７ｐｐｍ（ｓ　１Ｈ）
【００９０】
（ｉｉ）２，３，６，７−テトラクロロ−９−オキソキサンテン（ＩＩ）の合成
４，５−ジクロロ−２−（３，４−ジクロロフェノキシ）安息香酸（８００ｍｇ　２．２７ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの塩化チオニルに溶解し、３０分間還流した。減圧下で塩化チオニルを留去した後、残渣を塩化メチレンに溶解し、氷水浴上で塩化アルミニウム（５００ｍｇ　３．７５ｍｍｏｌ）を攪拌しながら徐々に加えた。塩化アルミニウム添加後更に１時間攪拌した。反応液を塩酸溶液にあけ、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を、塩酸溶液および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄後、濃縮乾固し、薄褐色固体を得た（約５００ｍｇ）。このものをクロロホルムに溶解後、ヘキサンを徐々に加え副産物である２，３，７，８−テトラクロロ−９−オキソキサンテンを結晶化させ濾別除去した。濾液を濃縮乾固した後、残渣をクロロホルム−メタノールから再結晶し標題の化合物を得た（得量：２００ｍｇ）。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）　７．６６ｐｐｍ（ｓ　２Ｈ），　８．３８ｐｐｍ（ｓ　２Ｈ）
【００９１】
（ｉｉｉ）６−テトラヒドロピラニルオキシヘキシルリチウム（ＩＩＩ）の合成
６−ブロモヘキサノール（４ｍｌ）と２，３−ジヒドロピラン（４ｍｌ）を混合し、室温で３０分間攪拌した。混合物をエバポレーターで濃縮し油状物を得た。油状物（２ｇ　８ｍｍｏｌ）をジエチルエーテルに溶解し、アルゴン雰囲気下、氷水浴上で金属リチウム（１１２ｍｇ　１６ｍｍｏｌ）に攪拌しながら徐々に添加した。氷水浴上で２時間攪拌後、反応液の一部をとり、キノリンを指示薬として、２−プロパノールキシレン溶液で滴定し、６−テトラヒドロピラニルオシヘキシルリチウム濃度を算出した。
【００９２】
（ｉｖ）９−ヒドロキシ−９−（６−ヒドロキシヘキシル）−２，３，６，７−テトラクロロキサンテン（ＩＶ）の合成
２，３，６，７−テトラクロロ−９−オキソキサンテン（２００ｍｇ　０．６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、アルゴン雰囲気下、氷−メタノール浴上で、攪拌しながら６−テトラヒドロピラニルオキシヘキシルリチウム　ジエチルエーテル溶液を１．４当量加えた。氷−メタノール浴上で３０分間攪拌後、希塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、洗浄濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、９−ヒドロキシ−９−（６−テトラヒドロピラノキシヘキシル）−２，３，６，７−テトラクロロキサンテンを得た（１５０ｍｇ）。９−ヒドロキシ−９−（６−テトラヒドロピラノキシヘキシル）−２，３，６，７−テトラクロロキサンテンをメタノールに溶解し、パラトルエンスルホン酸一水和物を耳掻き１杯加え、室温で１．５時間攪拌した。希塩酸を加え酢酸エチルで抽出し、抽出液を洗浄濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、９−ヒドロキシ−９−（６−ヒドロキシヘキシル）−２，３，６，７−テトラクロロキサンテンを得た（得量：７０ｍｇ）。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）　　０．７４ｐｐｍ（ｍ　２Ｈ）　１．１５ｐｐｍ（ｍ　４Ｈ），　１．２６ｐｐｍ（ｔ　２Ｈ），　１．３９ｐｐｍ（ｍ　２Ｈ），　３．５４ｐｐｍ（ｔ　２Ｈ），　７．２５ｐｐｍ（ｓ　２Ｈ），　７．５６ｐｐｍ（ｓ　２Ｈ）
【００９３】
（ｖ）コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル（Ｖ）の合成
塩化メチレンに炭酸カリウム（２００ｍｇ）及び二塩化スクシニル（１ｍｌ）を加え、氷水浴上で攪拌しながら９−ヒドロキシ−９−（６−ヒドロキシヘキシル）−２，３，６，７−テトラクロロキサンテン（７０ｍｇ）塩化メチレン溶液を徐々に滴下した。氷水浴上で１５分間攪拌し、引続き室温で３０分間攪拌した。水およびテトラヒドロフランを加え、更に水酸化ナトリウム溶液を加え室温で１５分間攪拌した。塩酸にて酸性とし酢酸エチルで抽出し、乾燥後濃縮乾固した。残渣を薄層クロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）にて精製して標記の化合物を白色結晶として得た（得量：３０ｍｇ）。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）　　１−２ｐｐｍ（ｍ　６Ｈ），　２．４９ｐｐｍ（ｑ　２Ｈ），　４．０１ｐｐｍ（ｍ　４Ｈ），　４．１２ｐｐｍ（ｔ　２Ｈ），　５．９２ｐｐｍ（ｔ　１Ｈ），　７．２０ｐｐｍ（ｓ　１Ｈ），　７．２５ｐｐｍ（ｓ　１Ｈ），　７．５５ｐｐｍ（ｓ　１Ｈ），　７．５６ｐｐｍ（ｓ　１Ｈ）
【００９４】
（ｖｉ）コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシルタンパク質複合体（ＶＩ）の合成
コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル（１０ｍｇ　０．０２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下でジメチルホルムアミド（５ｍｌ）に溶解し、トリブチルアミン（１０μｌ）およびクロロぎ酸イソブチル（４μｌ）を加え室温で２０分間攪拌し、Ａ液を調製した。
ウシ血清アルブミン（７０ｍｇ）を水３ｍｌに溶解し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを９．０に調整し、水を加えて６ｍｌとし、更にジメチルホルムアミド６ｍｌを加え、Ｂ液を調製した。
Ｂ液を氷水浴上で攪拌し、ｐＨが８．０〜９．０となる様０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で調整しながら、Ａ液を徐々に滴下した。滴下後、更に３時間氷水浴上で攪拌した。Ａ＋Ｂ混合液を、水に一晩透析後、凍結乾燥を行い白色粉末（７０ｍｇ）を得た。常法に従い、ウシ血清アルブミンのアミノ基を定量したところ、ウシ血清アルブミン１分子当たり、コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシルが２５．３分子結合していた。
ウシガンマグロブリンについても同様に実施した。ウシガンマグロブリン１分子当たり、コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシルが５．４分子結合していた。
【００９５】
【実施例２】新規ハプテン−キャリアータンパク質複合体を抗原としたモノクローナル抗体の作製
新規ハプテン−ウシ血清アルブミン複合体を免疫抗原として、常法に従いハイブリドーマ細胞を作製し、モノクローナル抗体を得た。
具体的には、コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル−ウシ血清アルブミン複合体抗原１００μｇを等量のフロイントの完全アジュバントと混合して６週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウス５匹の腹腔内に投与した。さらに３週後に同量の抗原を等量のフロイント不完全アジュバントと混合して同様に腹腔内に投与、１週後に後眼窩静脈より採血して血清を分離し、抗体価の上昇をコハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル−ウシガンマグロブリン複合体抗原を用いたＥＬＩＳＡ法にて確認した。抗体価の上昇したマウスに対して１００μｇの抗原を尾静脈内投与し、３日後に脾臓を摘出した。単離した脾臓細胞とＰＡＩミエローマ細胞をＰＥＧ法にて５：１で細胞融合し、ハイブリドーマ細胞をＨＡＴ選択にて得た。さらに抗体産生陽性細胞をＥＬＩＳＡ法にて選択した。増殖の後、サブクローニングを行い腹腔内投与して腹水を採取した。腹水から硫安塩析およびプロテインＧアフィニティカラムにて抗体の精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認すると共に抗体のアイソタイプを免疫クロマト法で決定した。
結果として、ＩｇＧ１クラスの抗体Ｄｘ−αおよび５Ｂ−１が得られた。
【００９６】
【実施例３】抗体の力価および既知ダイオキシンハプテン抗原との反応性１）力価
モノクローナル抗体力価の測定
コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル−ウシガンマグロブリン複合体を１０μｇ／ｍｌとなるようＰＢＳに溶解した液を、９６穴イムノプレートに１穴当たり１００μｌずつ分注し、冷蔵庫中で一晩インキュベートした。１穴当たり約３００μｌのＰＢＳで３回洗浄後、２５％ブロックエースを１穴当たり２５０μｌ分注し、３７℃で１時間又は冷蔵庫で一晩インキュベートした（抗原固定プレート）。直ぐに使用しない場合は、冷蔵庫中で保管した。
抗原固定プレートを０．０２％ツイーン２０ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３回洗浄後、ＴＰＢＳで種々の濃度に希釈したモノクローナル抗体を５０μｌずつ分注し、３７℃で４５分インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１００μｌずつ分注し、３７℃４５分インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼの発色基質であるパラニトロフェニルリン酸溶液を１００μｌずつ分注し、室温で１５分間反応させ、波長４０５ｎｍでの吸光度をプレートリーダーにて測定した。
結果を図１に示す。２種類のモノクローナル抗体（Ｄｘ−α，５Ｂ−１）は、共に発色下限濃度は約１５ｎｇ／ｍｌで、５０％発色濃度は約１２０ｎｇ／ｍｌであった。
【００９７】
２）既知ダイオキシンハプテン抗原との反応性
Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｇｙ　８２巻２５６−２６３頁（１９８６年）に従い合成した２−アジパミド−３，７，８−トリクロロジベンゾパラダイオキシン−ウシガンマグロブリン複合体を検出用抗原としてモノクローナル抗体力価の測定方法と同様の方法で実施した。
結果を図２に示す。Ｄｘ−ａモノクローナル抗体が既知ダイオキシンハプテンと交差反応を示した。発色下限濃度は約０．５μｇ／ｍｌで、５０％発色濃度は約６０μｇ／ｍｌであった。
【００９８】
【実施例４】間接競合法によるダイオキシン類との交差性の確認
Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｇｙ　８２巻２５６−２６３頁（１９８６年）に従い合成した２−アミノ−３，７，８−トリクロロジベンゾパラダイオキシン（Ｄｘ−ＮＨ２）及び２−ニトロ−３，７，８−トリクロロジベンゾパラダイオキシン（Ｄｘ−ＮＯ２）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＰＢＳにて２００倍希釈した液を原液とし、０．５％ＤＭＳＯ　ＰＢＳにて種々の濃度に希釈した。ダイオキシン希釈液とモノクローナル抗体（Ｄｘ−α）０．２５μｇ／ｍｌ溶液を等量混合し、３７℃で２時間インキュベートした。
【００９９】
前記モノクローナル抗体力価の測定の項で作製した抗原固定プレートをＴＰＢＳで３回洗浄後、ダイオキシン−モノクローナル抗体混合液を１００μｌずつ分注し、３７℃で４５分インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１００μｌずつ分注し、３７℃で４５分インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼの発色基質であるパラニトロフェニルリン酸溶液を１００μｌずつ分注し、室温で１５分間反応させ、波長４０５ｎｍでの吸光度をプレートリーダーにて測定した。
結果を図３に示す。モノクローナル抗体Ｄｘ−αは、Ｄｘ−ＮＨ２及びＤｘ−ＮＯ２と交差反応性を示した。５０％競合濃度は、Ｄｘ−ＮＨ２で約４μｇ／ｍｌ、Ｄｘ−ＮＯ２で約１２μｇ／ｍｌであった。
【０１００】
【発明の効果】
本発明により、安全性に優れ、かつ、種々の塩素化ダイオキシン類について識別性の優れた抗体を取得するためのダイオキシン類のハプテン抗原が提供される。
【０１０１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、モノクローナル抗体の力価を示す図である。
【図２】図２は、モノクローナル抗体の既知ダイオキシンハプテンとの交差反応性を示す図である。
【図３】図３は、モノクローナル抗体のダイオキシン誘導体との競合反応性を示す図である。
【図１】
2004026704.tif 000024
【図２】
2004026704.tif 000025
【図３】
2004026704.tif 000026