(57)【要約】【課題】ヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質を特定し、その構造を解析し、そのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を提供する。更に、この菌に起因する疾患を治療するための、この菌の細胞死誘導活性の阻害剤、及びその予防のためのワクチンを提供する。【解決手段】ヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質が、γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの遺伝子（ＨＰ１１１８）がコードするアミノ酸配列の一部から構成される２種のタンパク質が会合して形成されるタンパク質複合体であることを明らかにした。本発明は、このタンパク質及びこのタンパク質からなるワクチンである。【選択図】　　図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１若しくは配列番号２で表されるアミノ酸配列から成る２種のタンパク質、又は該配列番号１及び該配列番号２の一部が欠損、置換若しくは付加され胃癌由来の細胞株に対する細胞死誘導活性を示す該２種のタンパク質から成るヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質。
【請求項２】
下記いずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質。
（ｂ）配列番号１の一部が欠損、置換若しくは付加され、配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質と会合することにより胃癌由来の細胞株に対する細胞死誘導活性を示すタンパク質。
【請求項３】
下記いずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質。
（ｂ）配列番号２の一部が欠損、置換若しくは付加され、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質と会合することにより胃癌由来の細胞株に対する細胞死誘導活性を示すタンパク質。
【請求項４】
請求項２に記載のタンパク質及び請求項３に記載のタンパク質から成るヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質。
【請求項５】
配列番号１及び配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部を欠損、置換若しくは付加させ、胃癌由来の細胞株に対する細胞死誘導活性を全く若しくはほとんど有せず、ヘリコバクター・ピロリの感染防御効果を有する、請求項１又は４に記載のタンパク質から成るワクチン。
【請求項６】
請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項３に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項６に記載の遺伝子又はその部分及び請求項７に記載の遺伝子又はその部分の少なくとも一方を増幅することから成る、ヘリコバクター・ピロリの病原性株と非病原性株とを識別する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）の細胞死誘導タンパク質に関し、より詳細には、この細胞死誘導タンパク質を構成する２つのタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘリコバクター・ピロリは人間の胃に持続感染し、胃炎や胃潰瘍の原因となる。ヘリコバクター・ピロリは胃の上皮細胞に細胞死を誘導することによって胃炎や胃潰瘍を発生させる。従来、ヘリコバクター・ピロリの感染には抗生物質による除菌療法が適応されているが、薬剤耐性菌の出現などにより除菌不成功な場合も少なくない。よって、新しい治療法や予防法が望まれてきた。
ヘリコバクター・ピロリが持つ細胞死誘導活性を阻害する方法は非常に有力な方法である。この菌の細胞死誘導活性が中和できれば、この菌に感染しても胃上皮細胞に細胞死は誘導されず、従って胃炎や胃潰瘍の発生が抑制できる可能性が高い。
現在までに、この菌が産生する細胞死誘導活性物質の候補として、ＣａｇＡ蛋白、ウレアーゼ、リポ多糖（ＬＰＳ）、空泡化毒素が研究されてきたが（特表２００１−５０９１６７等）、ヘリコバクター・ピロリが持つ細胞死活性誘導の中で、それらが占める役割は極めて小さいものであり、細胞死の誘導には未知の因子が関与することが予想されてきた（Ｋ．　Ｓｈｉｂａｔａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｖｏｌ．６９，　Ｎｏ．５，　３１８１−３１８９　（２００１））。
なお、ゲノムプロジェクトにより１９９７年にヘリコバクター・ピロリの全ゲノムが決定され（Ｔｏｍｂ　Ｊ．　Ｆ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｕｒｅ　Ｖｏｌ．　３８８，５３９−５４７，１９９７）、全塩基配列がデータベースに登録されている。しかし、細胞死を誘導する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列は特定されていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質を特定し、その構造を解析し、そのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を提供することを目的とする。本発明は更に、この菌に起因する疾患を治療するための、この菌の細胞死誘導活性の阻害剤、及びその予防のためのワクチンを提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリから細胞死誘導活性を持つタンパク質を精製し、同定することに成功し、本発明を完成するに至った。この細胞死誘導活性タンパク質は、２種類のタンパク質から構成されていた。この２種類のタンパク質のアミノ酸配列を解析し、データベースを検索した結果、この２つのタンパク質はいずれもＨＰ１１１８という遺伝子にコードされているものであることが分かった。この遺伝子はγ−ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅという酵素をコードしていると報告されている（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ　Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｏｌ．３１，１３５９−１３７２，１９９９）ものであった。しかし、その報告ではこのタンパク質の細胞死誘導活性については調べられておらず、それ以降もこのタンパク質が細胞死誘導活性を持つことを示した報告はない。また、γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅは、細菌やその他非常に多くの種の生物が持つ酵素で、アミノ酸を細胞内に取り込む機能を持つが、この酵素が細胞死誘導活性を持つということは報告されていなかった。
【０００５】
即ち、本発明は、γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの遺伝子（ＨＰ１１１８）がコードするアミノ酸配列の一部から構成される２種のタンパク質が会合して形成されるタンパク質複合体が、ヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導機能を持つことを初めて明らかにしたものである。
【０００６】
即ち、本発明は、配列番号１若しくは配列番号２で表されるアミノ酸配列から成る２種のタンパク質、又は該配列番号１及び該配列番号２の一部が欠損、置換若しくは付加され胃癌由来の細胞株に対する細胞死誘導活性を示す該２種のタンパク質から成るヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質である。
また、本発明は、下記いずれかのタンパク質である。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質。
（ｂ）配列番号１の一部が欠損、置換若しくは付加され、配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質と会合することにより胃癌由来の細胞株に対する細胞死誘導活性を示すタンパク質。
更に本発明は、下記いずれかのタンパク質である。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質。
（ｂ）配列番号２の一部が欠損、置換若しくは付加され、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質と会合することにより胃癌由来の細胞株に対する細胞死誘導活性を示すタンパク質。
また、本発明は上記２つのタンパク質から成るヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質である。
【０００７】
本発明はまた、配列番号１及び配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部を欠損、置換若しくは付加させ、胃癌由来の細胞株に対する細胞死誘導活性を全く若しくはほとんど有せず、ヘリコバクター・ピロリの感染防御効果を有する、請求項１又は４に記載のタンパク質から成るワクチンである。
ここで感染防御効果は以下の方法で調べることができる。ヘリコバクター・ピロリはスナネズミで動物実験感染モデルが確立されている。スナネズミに予めワクチン候補である蛋白を経口投与、あるいは経鼻投与、筋肉注射、皮下注射などにより投与し、免疫を誘導させる。そしてヘリコバクター・ピロリを経口投与し、感染が成立しているかどうかを確認する。この動物実験により感染防御効果が確認されれば、ヒトに対する感染防御効果についても同様に調べる。
本発明は更に、上記２種のタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子であり、これらの遺伝子又はその部分の少なくとも一方を増幅することから成る、ヘリコバクター・ピロリの病原性株と非病原性株とを識別する方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の２種のタンパク質が会合して形成されるタンパク質複合体は、ヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導機能を持つため、ヘリコバクター・ピロリによる胃炎や胃潰瘍に対する治療薬の標的分子とすることができる。
例えば、２つのサブユニットをコードする遺伝子をそれぞれ大腸菌等の発現ベクターに導入して、これらサブユニットを別々に発現させて混合することにより複合体を形成してもよいし、２つのサブユニットをコードする遺伝子を一つの大腸菌等の発現ベクターに導入して、これらサブユニットを同時に発現させて複合体を形成してもよい。
このようにして得たタンパク質複合体を精製して、このタンパク質の細胞死誘導活性を阻害する薬剤を選択するのに用いることができる。細胞死誘導活性は常法に従い胃癌由来の細胞株の細胞死を調べることにより測定することができる。
【０００９】
本発明は、上記タンパク質を用いて、ヘリコバクター・ピロリの持つ細胞死誘導活性を阻害するワクチンを開発することができる。
例えば、動物を用いて上記のようにして得た精製タンパク質複合体を抗原として、経口投与又は鼻腔投与、皮下注射などで免疫をする。そしてその動物に菌体を経口投与し、感染防御が見られるかどうかを調べ、感染防御が見られればさらに人での効果を調べる。また、このタンパク質と、人の細胞が産生する物質と共通抗原があるかどうかについて調べ、もしあるようであれば共通抗原性を持つアミノ酸配列を調べ、その部分を除いたタンパク質を作成し、同様に感染防御効果を調べていく。最終的に人で感染防御効果がみられるタンパク質が出来れば、ワクチンとして用いることができる。
【００１０】
また、本発明のヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、細胞死活性を失ったタンパク質を作成して、ワクチンとして利用することもできる。
更に、本発明のヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質をコードする遺伝子を破壊して、病原性を持たないヘリコバクター・ピロリ菌株を作成し、ワクチンとして利用することもできる。
本発明のヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を元にして、この遺伝子を増幅するようなＰＣＲプライマーを作成し、ヘリコバクターピロリの病原性株と非病原性株を識別するのに用いることもできる。
【００１１】
【実施例】
実施例１
　本実施例では、ヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質の精製と同定を行った。
本実施例において、細胞死誘導活性は胃癌由来の細胞株ＡＧＳ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１７３９）に対する細胞死誘導活性をＭＢＬ社のＱｕｉｃｋ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｃａｔ．ＢＶ−Ｋ３０１−１０）を用いて測定した。この細胞死誘導活性は、細胞のミトコンドリア脱水素酵素を指標にして細胞のバイアビリティ（細胞の生きの良さ）を測るものであり、基質を加えて、３７℃で１時間反応後に、４５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度の値がすなわち細胞のバイアビリティを示す。この測定方法では細胞死が多く起こっているほどこの吸光度の値が小さい。
まず、ヘリコバクター・ピロリ２６６９５株（ＡＴＣＣ　ＣＴＬ　７００３９２）を１０％血清添加ＢＨＩ培地（ベクトン・ディッキンソン社、Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ　Ｎｏ．２３７５００）１０００ｍｌで培養した。遠心、集菌後、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ、生理食塩水（０．９％　ＮａＣｌ）に、５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムをｐＨ　７．４になるように加えたもの）に懸濁し、再度遠心して菌体を洗浄した。得られた菌体を５０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、フレンチプレスを用いて１２０ＭＰａで菌体を粉砕した。この粉砕物から５０００×ｇ　１０分の遠心で未破砕の菌体を除き、１００，０００×ｇ　２時間の超遠心で菌体の膜画分を回収した。その膜画分を１Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０に懸濁し、再度１００，０００×ｇ　２時間の超遠心を行った。この条件で、細胞死誘導タンパク質は膜画分より遊離し、上清中に可溶化された。
【００１２】
この上清から、細胞死誘導タンパク質を以下のように精製した。
まず透析によりＮａＣｌの濃度を２５０ｍＭとし、陽イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ　ＳＰ　カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてＮａＣｌ濃度２５０ｍＭ−５００ｍＭの勾配で分画し、細胞死誘導活性を測定した。結果を図１に示す。活性の高い画分１０〜１２を集め、次の精製過程に用いた。
次に、これら細胞死誘導活性のある画分を疎水カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｐｈｅｎｙｌ　カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて硫酸アンモニウム濃度２０％−１０％の勾配で分画し、細胞死誘導活性を測定した。結果を図２に示す。活性の高い画分８〜１２を集め、次の精製過程に用いた。
次に、これら細胞死誘導活性のある画分をゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で５００ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０で分画し、細胞死誘導活性を測定した。結果を図３に示す。活性の高い画分１２〜１４を集め、次の精製過程に用いた。
次に、これら細胞死誘導活性のある画分を透析によりＮａＣｌ濃度２５０ｍＭとし、さらに陽イオン交換カラム（ＭｏｎｏＳ　カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてＮａＣｌ濃度２５０ｍＭ−５００ｍＭの勾配で分画し、細胞死誘導活性を測定した。結果を図４に示す。活性の高い画分７と８を集めた。
【００１３】
以上の操作で精製されたタンパク質を酸性条件下のＮａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥで解析したところ、図５に示すように、バンドは１つのみ認められ、更にそれをＳＤＳ−ＰＡＧＥで２次元展開したところ、図６に示すように、バンドは２つに分かれた（分子量約４０ｋＤａ及び約２２ｋＤａ）。
Ｎａｔｉｖｅ　Ｐａｇｅでは、アクリルアミドゲルにＳＤＳという強力な界面活性剤を加えていないため、タンパク質の３次元構造が保たれる。このバンドが１つであることは、このタンパク質が自然の状態では１つの複合体を形成していることを示す。
一方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、ＳＤＳによりすべてのタンパク質は３次元構造が破壊され、複数のタンパク質が結合している場合もすべて分離する。このバンドが２つに分かれたことは、このタンパク質が２つのサブユニットからなることを示す。
即ち、ヘリコバクターピロリの細胞死誘導タンパク質は、２種類のサブユニットが会合して１つの分子を形成したものであることが分かった。
【００１４】
実施例２
　本実施例では、実施例１で精製されたタンパク質の、胃癌由来の細胞株ＡＧＳ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１７３９）、胃癌由来のＫＡＴＯ　ＩＩＩ細胞（ヒューマンサイエンス資源バンク、Ｃａｔ　Ｎｏ．ＪＣＲＢ０６１１）、及び腎癌由来のＨｅＬａ細胞（ヒューマンサイエンス資源バンク、Ｃａｔ　Ｎｏ．ＪＣＲＢ９００４）に対する細胞死誘導活性を調べた。
この細胞死誘導活性は、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社のキット（ＷＳＴ−１）を用いて測定した。その結果を図７及び８に示す。
その結果、実施例１で精製されたタンパク質は、これらいずれの細胞に対しても細胞死誘導活性を持っていたことがわかった。
【００１５】
またこのタンパク質のＡＧＳ細胞に対するアポトーシスの誘導を調べた。
アポトーシスを誘導した細胞と、対照とする細胞をそれぞれトリプシン処理して回収し、蛍光色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２）で染色した。この色素は細胞の核を染める。アポトーシス細胞は核が濃縮し断片化するので、蛍光顕微鏡で観察するとアポトーシス細胞と正常な細胞を容易に判別することができる。細胞をスライドグラスに乗せて、蛍光顕微鏡で、実際にアポトーシスを起こしている細胞と、正常な細胞の数を数え、全細胞数中に占めるアポトーシス細胞の割合を計算した。細胞は少なくとも５００以上数えた。その結果を図９に示す。
その結果、このタンパク質のＡＧＳ細胞に対する細胞死の誘導は主にアポトーシスによるものであることがわかった。
【００１６】
実施例３
　実施例１で精製されたサブユニットのＮ末端アミノ酸配列を常法により分析したところ、いずれもＨＰ１１１８という遺伝子にコードされているものであることが分かった。図１０に、ＨＰ１１１８と２つのサブユニット（１及び２）のアミノ酸配列を示す。即ち、一方のサブユニット１（配列番号１）は、ＨＰ１１１８のアミノ酸配列の２７〜３７９番目のアミノ酸から成り、もう一方のサブユニット２（配列番号２）はＨＰ１１１８のアミノ酸配列の３８０〜５６７番目のアミノ酸から成るものであった。
以上より、ヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質は、図１１に示すように、ＨＰ１１１８遺伝子が転写されて出来たタンパク質のアミノ酸残基の２６番目と２７番目との間及び３７９番目と３８０番目との間で切断されてできるタンパク質（サブユニット１）、並びに３７９番目と３８０番目との間で切断されてできるタンパク質の２種類のタンパク質（サブユニット２）から構成されており、これら２つのサブユニットが会合して１つの分子を形成したものであることが分かった。
【００１７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
実施例１において、細胞死誘導タンパク質を陽イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ　ＳＰ　カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて分画を行った際の各画分の細胞死誘導活性（４５０ｎｍの吸光度）を示す図である。値が小さいほど生細胞が少ないことを示す。
【図２】
実施例１において、細胞死誘導タンパク質を疎水カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｐｈｅｎｙｌ　カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて分画を行った際の各画分の細胞死誘導活性（４５０ｎｍの吸光度）を示す図である。値が小さいほど生細胞が少ないことを示す。
【図３】
実施例１において、細胞死誘導タンパク質をゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて分画を行った際の各画分の細胞死誘導活性（４５０ｎｍの吸光度）を示す図である。値が小さいほど生細胞が少ないことを示す。
【図４】
実施例１において、細胞死誘導タンパク質を陽イオン交換カラム（ＭｏｎｏＳ　カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて分画を行った際の各画分の細胞死誘導活性（４５０ｎｍの吸光度）を示す図である。値が小さいほど生細胞が少ないことを示す。
【図５】
精製されたヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図６】
精製されたヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図７】
精製されたヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質のＡＧＳ細胞及びＨｅｌａ細胞についての細胞死誘導活性（４５０ｎｍの吸光度）を示す図である。値が小さいほど生細胞が少ないことを示す。
【図８】
精製されたヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質のＫＡＴＯ　ＩＩＩ細胞についての細胞死誘導活性（４５０ｎｍの吸光度）を示す図である。値が小さいほど生細胞が少ないことを示す。
【図９】
精製されたヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質によるＡＧＳ細胞のアポトーシス細胞の割合を示す図である。
【図１０】
ＨＰ１１１８遺伝子から転写されてできるタンパク質（５６７アミノ酸残基）、並びにヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質のサブユニット１（配列番号１）及びサブユニット２（配列番号２）のアミノ酸配列を示す図である。
【図１１】
ヘリコバクター・ピロリの細胞死誘導タンパク質の構成を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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