(57)【要約】【課題】安全でありかつ有効性が高い、アルツハイマー病の新たな治療方法や予防方法を開発することを目的として、それに資する技術を提供することが本発明の課題である。【解決手段】本発明により、プロテオミクス技術を利用して、アミロイドβ蛋白質と結合する蛋白質群が包括的に与えられた。これらの蛋白質群の知見は、その蛋白質群を標的とした治療薬を開発する可能性を開くものであると共に、アルツハイマー病の原因解明に大きく寄与するものであると考えられる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオミクス技術を用いて、脳に発現しているアミロイドβ結合蛋白質を包括的に同定する方法。
【請求項２】
前記アミロイドβ結合蛋白質が、アミロイドβ４０との結合能を有することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アミロイドβ結合蛋白質を用いて、アミロイドβとアミロイドβ結合蛋白質との間の相互作用を阻害する医薬をスクリーニングする方法。
【請求項４】
アミロイドβ結合蛋白質を、アルツハイマー病の治療薬の作用標的蛋白質として使用する方法。
【請求項５】
アミロイドβ結合蛋白質を含有することを特徴とする、試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテオミクス技術を用いて、アルツハイマー病の原因であるアミロイドβと結合する性質を有する蛋白質（アミロイドβ結合蛋白質）を包括的に同定する方法に関する。更に本発明は、そのような方法により同定された蛋白質の利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病は、初老期では４０歳代後半から５０歳代にかけ、高齢期では７０歳代後半以降に発症する疾患であり、記憶障害、意欲障害、判断障害、失語、失行、失認、人格障害、感情障害、鏡障害、クリューバー・ビューシー症候群などの症状が現れ、高度の痴呆におちいるという症状を示す。脳の病理変化としては、老人班、アルツハイマー神経原線維変化、神経細胞消失などが認められ、症状の進行とともに病変は高度となり、著名な脳萎縮をきたす。
【０００３】
アルツハイマー病の病態としては、アミロイドβ４０やアミロイドβ４２などのアミロイド蛋白質の異常かつ早期の沈着や、神経細胞内のリン酸化タウ蛋白質の貯留が認められる。また、アセチルコリンなどの神経伝達物質の異常減少が背景にあることが明らかにされている。アルツハイマー型痴呆のなかには、家族性アルツハイマー病もあり、その疾患の原因として第１４、１９、２１のそれぞれの染色体における遺伝子の異常が報告され、また、アミロイドβの前駆体蛋白質におけるアミノ酸配列の点変異の存在が証明されている。
【０００４】
上記で述べたように、アルツハイマー病に罹患した脳においては、大脳新皮質や海馬の神経細胞が脱落すると共に、老人班などの線維性蓄積物が出現する。老人班アミロイドの主要構成成分は上記のアミロイドβ蛋白質（Ａβ）であり、前駆体であるアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）の細胞外領域から膜貫通領域の途中までが２段階のプロテアーゼ作用により切り出され、分泌される。また、アルツハイマー病の初期において、アミロイド蛋白質の蓄積はタウ蛋白質のリン酸化などよりも早く起こる、最も初期に認められる現象である。このように、アルツハイマー病の発症においてアミロイド蛋白質が重要な役割を果たすと考えられており、このような考え方は「アミロイド仮説」と呼ばれている。なお、アルツハイマー病発症機序についての最新の知見については、例えば、岩坪らの総論（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  （２００２）  ｖｏｌ．２０  ｎｏ．６  ｐ６２６−６２９：非特許文献１）において詳しく述べられている。
【０００５】
アミロイド蛋白質生成の第一段階においては、βセクレターゼによるβ切断が起こり、その結果としてＡβのＮ末端が形成される。β切断により生じたＡＰＰのＣ末端断片は、続いてγセクレターゼによる切断を受けるが、この切断部位には多様性がある。主要となる分子種は４０アミノ酸残基からなるＡβ４０であるが、４２アミノ酸残基からなるＡβ４２も１０％程度存在すると言われている。Ａβ４０とＡβ４２の性質にはある程度の差が見られ、アルツハイマー病の病理変化においてＡβ４２は初期から蓄積し始めるが、一方、Ａβ４０はそれより遅れて蓄積する。また、Ａβ４２はＡβ４０と比較してより高い凝集性を示すと言われている。
【０００６】
このように、近年になってアルツハイマー病の詳しい病態が明らかになってきたが、絶対的な予防方法や治療方法はなお見出されていない。現段階においては、脳代謝賦活薬、脳循環改善薬、神経伝達機能調整薬などの、脳機能改善薬を主体とした薬物療法やリハビリテーションが行われている。
【０００７】
ところで、Ａβを標的としたＡβワクチン療法が、アルツハイマー病の新たな治療方法として注目されている。その例として、ＰＤＡＰＰマウスなどのアルツハイマー病のモデル動物をＡβで免疫したところ、Ａβに対する抗体が産生され、アミロイド沈着が抑制されることなどがＳｃｈｅｎｋらにより報告されている（Ｎａｔｕｒｅ  （１９９９）  ｖｏｌ．４００  ｐ１７３−１７７）。このようなワクチン療法が有効であるのは、生成した抗Ａβ抗体が血液脳関門を通って脳ミクログリア内の老人班と反応し、Ｆｃレセプターを介してミクログリアの老人班が貪食されて消失するためであると推定されている。このワクチン療法は臨床実験段階までいったが、炎症反応が認められるという欠点もあるために未だ実用化はされていない。ワクチン療法については、例えば、針谷らの総説（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  （２００２）  ｖｏｌ．２０  ｎｏ．６  ｐ７０６−７０７：非特許文献３）において詳しく述べられている。
【０００８】
また、血液脳関門は血中と脳内におけるＡβの濃度の平衡を調整する役割も担っているが、Ａβのワクチンを投与することにより、Ａβに対する抗体とＡβが血中で結合し、そのために血液脳関門における排出の平衡が血液側へ大きく傾くと考えられる。そのような平衡の変化により脳からのＡβの排出が促進され、脳内のＡβの量は減少すると共に血中のＡβの量は増加すると考えられる。このように、ワクチン療法において血液脳関門を介した排出が促進されるというＳｉｎｋ（流し）仮説（ＤｅＭａｔｔｏｓ  ＲＢ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （２００１）  ｖｏｌ．９８  ｎｏ．１５  ｐ８８５０−８８５５：非特許文献４）も提唱されており、上記のミクログリアの食作用という仮説以上に有力な考え方となっている。
【０００９】
【非特許文献１】
若林朋子、岩坪威「Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病はどこまで解明されているか」Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  （２００２）  ｖｏｌ．２０  ｎｏ．６  ｐ６２６−６２９
【非特許文献２】
Ｓｃｈｅｎｋ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄ−β  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｌｉｋｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＤＡＰＰ  ｍｏｕｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９９）  ｖｏｌ．４００  ｐ１７３−１７７
【非特許文献３】
針谷康夫「ワクチン療法」Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  （２００２）  ｖｏｌ．２０  ｎｏ．６  ｐ７０６−７０７
【非特許文献４】
ＤｅＭａｔｔｏｓ  ＲＢ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （２００１）  ｖｏｌ．９８  ｎｏ．１５  ｐ８８５０−８８５５
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の課題は、ワクチン療法より有効かつ安全なアルツハイマー病の治療方法や予防方法を新たな開発することを目的として、それに資する技術を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者は、近年著しい進歩が認められたプロテオミクス技術に注目し、その技術を用いて、Ａβと結合する蛋白質群を包括的に決定した。これらの蛋白質群の知見はアルツハイマー病の原因解明に大きく寄与するものであると共に、その蛋白質群を標的とした治療薬を開発する可能性を開くものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
近年、血液脳関門（ＢＢＢ）を通じた輸送により、脳内から循環血中にＡβを排出しているという機構が提唱されている。上記アミロイド仮説を考えると、アルツハイマー病を治療・予防するためには、Ａβの沈着を防ぐことが重要であると考えられる。いくつかの蛋白質はＡβと結合することによりＡβを脳外へ排出する機構に寄与しており、よってＡβ結合蛋白質は脳内のＡβレベルの制御に関連していると考えられている。それを考えると、Ａβと結合能を有する蛋白質を標的として、Ａβ−Ａβ結合蛋白質との相互作用を阻害するというアプローチにより、Ａβの沈着を防ぐことができる可能性がある。
【００１３】
なおアルツハイマー病においては神経の変性が認められるが、Ａβの蓄積と神経変性の関連性についてはいまだ明らかになっていない。また。Ａβの沈着が起こるメカニズムについてもまだ明らかとなっていない。しかし、Ａβと結合蛋白質がこれらの現象に何らかの役割を果たしているという可能性は高いと考えられる。その観点から考えても、アルツハイマー病の治療・予防において、ＡβとＡβ結合蛋白質との相互作用を阻害することの意義は大きいと考えられる。
【００１４】
ところで近年、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析計（ＭＳ）、更にはデータ解析システムを直結して大量の蛋白質を自動的に測定する、プロテオミクスの新しい技術が開発されてきている。なおプロテオミクスとは、ゲノム情報の最終産物である蛋白質の全体（プロテオーム）を大規模に解析することを意味する。従来の手法においては、蛋白質を同定するためには、先ず目的の蛋白質を分離することが不可欠であると考えられており、そのために、例えば電気泳動法で蛋白質を分離する必要があった。
【００１５】
この様な手法は現在においても蛋白質を同定するための重要な手法であるが、ゲノム情報の蓄積とＭＳの技術革新により、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどを基盤とする、処理能力の高い蛋白質同定技術が生み出された。ＬＣとＭＳを直列に接続した装置がＬＣ−ＭＳであり、ＬＣにタンデム型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を接続した場合には、ＭＳ内での試料の破断分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が可能となる。
【００１６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたプロテオミクス技術においては、蛋白質混合物や複数の蛋白質からなる複合体の構成成分を、トリプシンなどの特異性の高いプロテアーゼで消化し、分離することなく直接同定することができる。ここで同定の基礎となるのは、消化ペプチド断片とその開裂断片の精密な質量値、使用したプロテアーゼに依存する末端のアミノ酸情報、およびそれを高速で処理するＰＣとアルゴリズム解析である。この同定法は配列タグ法と呼ばれ、ペプチドの情報をもとに特定の蛋白質を同定することが可能であり、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）などの断片的な情報を含めて既存の塩基配列情報は全て利用することができる。プロテオソーム研究において、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、配列タグ法による蛋白質同定に汎用されている。このようなプロテオミクス技術は、従来の方法と比べて処理能力（ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）が高いという特徴を有する。なおプロテオミクスによる蛋白質の大規模解析システムの技術については、例えば田岡らの総説（実験医学「細胞内機能性複合体解析のためのタンパク質大規模解析システム」Ｖｏｌ．２０  Ｎｏ１．  （２００２）  ｐ８−１２）などを参照にすることができる。
【００１７】
このようなプロテオミクス技術は多くの可能性を秘めるものであるが、これまで、プロテオミクス技術を用いてＡβ結合蛋白質が包括的に同定されたことはなかった。本発明において、そのような新たな手法を用いてＡβ結合蛋白質が多数同定されたが、本発明の知見はアルツハイマー病の新たな治療薬の開発や、アルツハイマー病の機構の解明に役立つものであると思われる。よって本発明においてＡβ結合蛋白質とは、Ａβとの結合能を有する蛋白質群を包括的に意味するものである。なお本願明細書において「包括的に同定する」とは、プロテオミクス技術を用いて、多数の蛋白質からなる複合物を分離することなく同定する概念を示すものであり、個々の蛋白質を分離した後に同定を行うという従来の技術と区別することを意図するものである。
【００１８】
下記の実施例において、マウスの脳毛細血管内皮細胞と大脳膜由来の蛋白質においてＡβ結合蛋白質の同定を行った。上記のサンプルから粗膜蛋白質を調製し、ビオチニル化したＡβ４０を用いて、Ａβ４０と粗膜蛋白質中のＡβ結合蛋白質とを結合させ、更にアフィニティークロス架橋を行った。架橋したサンプルを可溶化した後にストレプトアビジンビーズを添加し、ビオチニル化したＡβ４０とアビジンとの複合体を形成させた。電気泳動法により蛋白質の分離を行い、得られた各々のバンドに含まれる蛋白質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで同定した。その結果下記の実施例において、Ａβ４０と結合する蛋白質群が同定された。これらの蛋白質はＡβ４０と相互作用し、血液脳関門におけるＡβの輸送に関与する因子の候補であると考えられる。
【００１９】
下記のリストに記載した蛋白質は、本発明のＡβ結合蛋白質として好適なものである。しかしこのリストに記載された蛋白質以外にもＡβと結合する蛋白質は存在している可能性があり、それらの他の蛋白質を用いるという態様もまた、本発明において除外されるものではない。なお、下記のリストにおいて、実施例において同定されたＡβ結合蛋白質を、登録されたＮＣＢＩ番号と共に示す。
【００２０】
（１）原形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号６７５３１４０
（２）ＡＴＰアーゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋トランスポーターアルファ（ＡＴＰａｓｅ，  Ｎａ＋／Ｋ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，  ａｌｐｈａ）：ＮＣＢＩ番号１６３０７５４１、ＮＣＢＩ番号１５４８８８６２
（３）  神経細胞接着分子１（Ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １，  １８０  ｋＤａ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  （Ｎ−ＣＡＭ  １８０））：ＮＣＢＩ番号４００４０２
（４）コンタクチン関連蛋白質（ｃｏｎｔａｃｔｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号７９４９１００、  ＮＣＢＩ番号２０３４７９５５
（５）コンタクチン（Ｃｏｎｔａｃｔｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６６８０９５４
（６）  Ｎ−マレイミド感受性融合蛋白質（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号２０３４７６５９、ＮＣＢＩ番号２０９１３３５５
（７）ニューロコンドリン（ｎｅｕｒｏｃｈｏｎｄｒｉｎ）：ＮＣＢＩ番号１６８７７７７８、ＮＣＢＩ番号４５１２２６１
（８）シナプチン（ｓｙｎａｐｓｉｎ）：ＮＣＢＩ番号７３０５５３３、ＮＣＢＩ番号１８６０６４４６
（９）熱ショック７０ＫＤ蛋白質（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号１１６１２４８９、  ＮＣＢＩ番号２０８２６９４６
（１０）ダーミシジン（ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ）：ＮＣＢＩ番号１６７５１９２１
（１１）アルファ−Ｓ１  カゼイン前躯体（Ａｌｐｈａ−Ｓ１  ｃａｓｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）：ＮＣＢＩ番号１１５６４６
（１２）  ＲＴＮ４：ＮＣＢＩ番号２３３７９８１７、ＮＣＢＩ番号２１８９８５７７
（１３）アンキリン結合細胞接着分子ニューロファスチン（  ａｎｋｙｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｎｅｕｒｏｆａｓｃｉｎ  ［Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ］  ）：ＮＣＢＩ番号１８４２４２９
（１４）  １５０−ｋＤａ酸素制御蛋白質（１５０−ｋＤａ  ｏｘｙｇｅｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号１２８３１２２９
（１５）イオノトロピックグルタミン酸レセプター（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ）：ＮＣＢＩ番号８３９３３１３、ＮＣＢＩ番号２０８７２２６０
（１６）アクチニンアルファ（ａｃｔｉｎｉｎ  ａｌｐｈａ）：ＮＣＢＩ番号１１２３０８０２、ＮＣＢＩ番号２１３０７７３２
（１７）  ＡＴＰアーゼ、Ｈ＋／Ｋ＋トランスポーターアルファＡＴＰａｓｅ，  Ｈ＋／Ｋ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，  ａｌｐｈａ：ＮＣＢＩ番号９０５５１７０、ＮＣＢＩ番号２０１４９７２８
（１８）ダイナミン（Ｄｙｎａｍｉｎ）：ＮＣＢＩ番号４８７８５５、ＮＣＢＩ番号２１９６１２５４
（１９）ジペプチジルアミノペプチダーゼ様蛋白質（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：  ＮＣＢＩ番号４０３８３４８、ＮＣＢＩ番号２２６５３７１５
（２０）アダプター関連蛋白質複合体（ａｄａｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）：ＮＣＢＩ番号２０３４７５７１、ＮＣＢＩ番号６６７１５６３
（２１）アルファグルコシダーゼ２（ａｌｐｈａ  ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ２，  ａｌｐｈａ  ｎｅｕｔｒａｌ）：ＮＣＢＩ番号６６７９８９１
（２２）ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８９０３０２、ＮＣＢＩ番号１６７４１６３３
（２３）アトラスティン（Ａｔｌａｓｔｉｎ）：  ＮＣＢＩ番号２０９０９７８０、ＮＣＢＩ番号１９９２３４４５
（２４）カルシウム／カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼ（Ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号６６７１６６０、ＮＣＢＩ番号１８１５８４２０
（２５）チューブリンアルファ（ｔｕｂｕｌｉｎ  ａｌｐｈａ）：ＮＣＢＩ番号２０８９３１７９、ＮＣＢＩ番号６７５５９０１
（２６）シナプトタグミン（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６６７８１９７
（２７）カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８５７２７８、ＮＣＢＩ番号６７５３２７２
（２８）トゥイーティーホモログ２（ｔｗｅｅｔｙ  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２）：ＮＣＢＩ番号２０８４７９３４
（２９）蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０９１３９２９
（３０）アルドラーゼ（Ａｌｄｏｌａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号７５４８３２２
（３１）グアニンヌクレオチド結合蛋白質（ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６６８００３５、ＮＣＢＩ番号６７５４００８
（３２）アクチン（ａｃｔｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６７５２９５２、ＮＣＢＩ番号２０９１０７３２、ＮＣＢＩ番号２０８１８８４４
（３３）ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ触媒サブユニット（ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ）：ＮＣＢＩ番号２００３６７、ＮＣＢＩ番号７１１０６９３
（３４）トロポモジュリン（Ｔｒｏｐｏｍｏｄｕｌｉｎ）：ＮＣＢＩ番号２０８９０９４８、ＮＣＢＩ番号７７１０１０２
（３５）バキュオラーＡＴＰ合成酵素（Ｖａｃｕｏｌａｒ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号１２５８５５２５
（３６）セプチン（ｓｅｐｔｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６６８５７６３、ＮＣＢＩ番号６７５４８１６
（３７）アセチルコエンザイムＡアシルトランスフェラーゼ（Ａｃｅｔｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８９６２６９、ＮＣＢＩ番号２０３４２３５０
（３８）グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８８９８４６、ＮＣＢＩ番号９０３１３
（３９）グルタミン合成酵素（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号４８３９１８、ＮＣＢＩ番号２０８２５７７２
（４０）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８９７０６１、ＮＣＢＩ番号２０８２９８８９
（４１）リボソーマル蛋白質Ｌ６（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ６）：ＮＣＢＩ番号１４２１０１０６、ＮＣＢＩ番号６７５５３５４
（４２）シナプトフィシン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）：ＮＣＢＩ番号２０９８３０１０、ＮＣＢＩ番号６６７８１９５
（４３）キャッピング蛋白質アルファ（ｃａｐｐｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ）：ＮＣＢＩ番号６６７１６７２、ＮＣＢＩ番号１２８４２２４８
（４４）乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号６６７８６７４
（４５）ＡＴＰアーゼ、Ｈ＋トランスポーター（ＡＴＰａｓｅ，  Ｈ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ）：ＮＣＢＩ番号２０８８６３６７、ＮＣＢＩ番号１５０２９７１９
（４６）理研ｃＤＮＡ  １０１０００１Ｎ１１；ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ３９ＫＤＡサブニット前躯体（ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  １０１０００１Ｎ１１；ＮＡＤＨ−ＵＢＩＱＵＩＮＯＮＥ  ＯＸＩＤＯＲＥＤＵＣＴＡＳＥ  ３９  ＫＤＡ  ＳＵＢＵＮＩＴ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ））：ＮＣＢＩ番号２０８３２５５６、ＮＣＢＩ番号１３３８４７２０
（４７）酸性リボゾーマルリン酸化蛋白質Ｐ０（ａｃｉｄｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＯ）：ＮＣＢＩ番号６６７１５６９、ＮＣＢＩ番号１３２７７９２７
（４８）理研ｃＤＮＡ  ２６１００２０Ｈ１５（ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２６１００２０Ｈ１５）：ＮＣＢＩ番号２０８８３０７０
（４９）ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８７８７４５
（５０）ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋  トランスポーターミトコンドリアＦ１複合体（ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｈ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｆ１  ｃｏｍｐｌｅｘ）：ＮＣＢＩ番号７９４９００３、ＮＣＢＩ番号６６８０７４８
（５１）興奮性アミノ酸トランスポーター（Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）：ＮＣＢＩ番号２０９０８４７７
（５２）チューブリンベータ（ｔｕｂｕｌｉｎ，  ｂｅｔａ）：ＮＣＢＩ番号１２９６３６１５、ＮＣＢＩ番号１３３２４６７９
（５３）３−オキソ酸  ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ  ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号１８２６６６８０
（５４）異種性核リボヌクレオ蛋白質Ｇ（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）：ＮＣＢＩ番号２３２７４０３３、ＮＣＢＩ番号２０８８５３７４
（５５）クレアチンキナーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号１０９４６５７４
（５６）インターロイキンエンハンサー結合因子（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）：ＮＣＢＩ番号１３３８５８７２
（５７）Ｎ−ｍｙｃ下流（Ｎ−ｍｙｃ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）：ＮＣＢＩ番号７３０５３０５
（５８）２’，３’−サイクリック−ヌクレオチド３’−フォスフォジエステラーゼ（  ２’，３’−ｃｙｃｌｉｃ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号３０９１７８
（５９）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８８８９２９、ＮＣＢＩ番号２０８２８３５１
（６０）マレイン酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号６６７８９１６
（６１）ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋  トランスポーター（ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｈ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ）：ＮＣＢＩ番号６６８０７４８
（６２）  ＡＴＰアーゼ、Ｈ＋  トランスポーター（ＡＴＰａｓｅ，  Ｈ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ）：ＮＣＢＩ番号１９５２７０６４、ＮＣＢＩ番号１１８４６６１
（６３）ダーミシジン前躯体（ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）
（６４）Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼアルファ−１サブユニット  （Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ−１  ｓｕｂｕｎｉｔ）：ＮＣＢＩ番号２０５６３２
（６５）ＡＴＰアーゼアルファ２，Ｎａ／Ｋ（ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ２，Ｎａ／Ｋ）：ＮＣＢＩ番号３５８９６０
（６６）（ＮＭ＿０２２０３０）シナプティックベヒクル糖蛋白質２ａ（（ＮＭ＿０２２０３０）  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ２ａ）：ＮＣＢＩ番号３５８９６０
（６７）（ＸＭ＿１２５６７９）ヘキソキナーゼ１類似，  アイソフォームＨＫＩ−Ｒ；  脳型ヘキソキナーゼ（（ＸＭ＿１２５６７９）  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ  １，  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＨＫＩ−Ｒ；  ｂｒａｉｎ  ｆｏｒｍ  ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８６０６７０
（６８）血管アデノシントリホスファターゼサブユニットＢ（ｖａｃｕｏｌａｒ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｂ）：ＮＣＢＩ番号１１８４６６１
（６９）  （ＮＭ＿００７５０５）  ＡＴＰ合成酵素，  Ｈ＋トランスポーター，  ミトコンドリアＦ１複合体，  アルファサブユニットアイソフォーム１（（ＮＭ＿００７５０５）  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｈ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｆ１  ｃｏｍｐｌｅｘ，  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ，ｉｓｏｆｏｒｍ  １）：ＮＣＢＩ番号６６８０７４８
（７０）グルタミン酸／アスパラギン酸トランスポーター（ｇｌｕｔａｍａｔｅ／ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）：ＮＣＢＩ番号９１３７９６
（７１）２’，３’−サイクリック−ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ、ｇｉ｜２７９５４７（２’，３’−ｃｙｃｌｉｃ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ、ｇｉ｜２７９５４７）：ＮＣＢＩ番号２７９５４７
（７２）アクチン、ｇｉ｜２０８９４１０１（ａｃｔｉｎ、ｇｉ｜２０８９４１０１）：ＮＣＢＩ番号２０８９４１０
（７３）グルタミン合成酵素類似（ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ）：ＮＣＢＩ番号２０８２５７７２
（７４）  ｃＡＭＰ−依存性蛋白質キナーゼ触媒サブユニット（ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ）：ＮＣＢＩ番号８５６８０７９、ＮＣＢＩ番号６７５５０７６
（７５）グアニンヌクレオチド結合蛋白質（ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６７５４０１２
（７６）コンタクチン１（ｃｏｎｔａｃｔｉｎ  １）：ＮＣＢＩ番号６６８０９５４
（７７）  ＡＴＰ合成酵素，  Ｈ＋トランスポーターミトコンドリアＦ１複合体（ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｈ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｆ１  ｃｏｍｐｌｅｘ）：ＮＣＢＩ番号７９４９００３
（７８）グルコースホスフェート  イソメラーゼ１  複合体（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  １  ｃｏｍｐｌｅｘ）：ＮＣＢＩ番号２０８２５７５３
（７９）蛋白質キナーゼ，  ｃＡＭＰ依存性ＩＩ型ベータ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ，  ｃＡＭＰ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ，  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｂｅｔａ）：ＮＣＢＩ番号２０８４７７６８
（８０）ニューロトリミン前躯体類似（ＧＰ６５）（ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ＮＥＵＲＯＴＲＩＭＩＮ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ  （ＧＰ６５））：ＮＣＢＩ番号２０８８４３１７
（８１）仮説上蛋白質ＸＰ＿１６６３５７（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＸＰ＿１６６３５７）：ＮＣＢＩ番号２０５５６２５３
（８２）アクチン（ａｃｔｉｎ）：ＮＣＢＩ番号２０８９４１０１
（８３）  ２’，３’−サイクリック−ヌクレオチド３’−フォスフォジエステラーゼ（  ２’，３’−ｃｙｃｌｉｃ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２７９５４７
（８４）グルタミン合成酵素類似（ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ）：ＮＣＢＩ番号２０８２５７７２
（８５）  Ｎａ＋／Ｋ＋−交換ＡＴＰアーゼ（ＥＣ  ３．６．１．３７）ベータ−２鎖（Ｎａ＋／Ｋ＋−ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ  ＡＴＰａｓｅ  （ＥＣ  ３．６．１．３７）  ｂｅｔａ−２  ｃｈａｉｎ）：ＮＣＢＩ番号９１１２７
（８６）ＳＲＣ基質コルタクチン類似蛋白質（ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ＳＲＣ  ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ  ＣＯＲＴＡＣＴＩＮ）：ＮＣＢＩ番号２０８９５２５５
（８７）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ類似蛋白質（ＧＡＰＤＨ）：ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）  ：ＮＣＢＩ番号２０３４３９９３
（８８）キャッピング蛋白質アルファ２（ｃａｐｐｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  ２）  ：ＮＣＢＩ番号１２８４２２４８
（８９）  ＡＴＰ合成酵素，  Ｈ＋トランスポーターミトコンドリア複合体（ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｈ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ）：ＮＣＢＩ番号１１６０２９１６
（９０）リボゾーム蛋白質Ｌ６（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ６）：ＮＣＢＩ番号１１６０２９１６
（９１）  理研ｃＤＮＡ  １０１０００１Ｎ１１（ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  １０１０００１Ｎ１１）：ＮＣＢＩ番号１３３８４７２０
（９２）Ｎ−エチルマレイミド融合蛋白質接着蛋白質アルファ（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ）：ＮＣＢＩ番号１３３８５３９２
（９３）電圧−依存性アニオンチャネル１（ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  １）：ＮＣＢＩ番号６７５５９６３
（９４）シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６９８１６００
（９５）転写因子Ｅ２Ｆ２類似蛋白質（Ｅ２Ｆ−２）（ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＦＡＣＴＯＲ  Ｅ２Ｆ２（Ｅ２Ｆ−２））：ＮＣＢＩ番号２０８４８８４１
（９６）グアニンヌクレオチド結合蛋白質（ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号１３９３７３９１
【００２１】
なお、実施例において採用した方法は、Ａβ結合蛋白質を採取する目的において好適な方法であるが、目的に応じて適宜改変を行うことによりその他のＡβ結合蛋白質を同定することもできる。例えば、架橋を行うためのクロス架橋試薬として以下の試薬を使用することができるが、クロス架橋試薬はそれらに限定されるものではない。
（１）    ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｂｅｒａｔｅ  （ＤＳＳ）
（２）    １，６−Ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｅ  （ＢＭＨ）
（３）    １−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  （ＥＤＣ）
（４）    Ｎ−［ｇ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ］ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ  （ＧＭＢＳ）
（５）    Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ］ｂｕｔｙｒａｔｅ  （ＳＭＰＢ）
（６）    ｂｅｔａ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  （ＢＭＰＡ）
（７）    １，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  （ＤＦＤＮＢ）
【００２２】
本発明において、アフィニティークロス架橋は、Ａβ４０とＡβ結合蛋白質の間に生じた立体構造を固定する目的で使用しているが、各々のクロス架橋試薬により、架橋ターゲットとなる官能基や結合する官能基間の距離（スペーサー）は異なっている。それを考えると、種々のクロス架橋試薬を変えることにより、その他のＡβ結合蛋白質を同定することが可能である。
【００２３】
また、実施例においてはＡβ４０と結合する蛋白質の同定を行ったが、その多くはＡβ４２とも結合すると考えられる。しかし、［０００５］で述べたようにＡβ４０とＡβ４２にはいくらかの差異がある。よってＡβ４２を用いた場合には他のＡβ結合蛋白質を得ることが可能であり、Ａβ４２結合蛋白質もまたアルツハイマー病の予防・治療に関する有益な知見を提供するものである。よってＡβ４２と結合する蛋白質も本発明の範囲内から除外されるものではない。
【００２４】
本発明は、Ａβ結合蛋白質を用いて、ＡβとＡβ結合蛋白質との結合を阻害する医薬をスクリーニングする方法を提供するものである。上記で述べたように、アルツハイマー病では、Ａβが脳の局所に蓄積する老人班が認められる。Ａβの凝集が起こるにはコアとなる蛋白質が必要なので、得られた結合阻害剤が老人班形成阻害効果を発揮する可能性がある。このように、ＡβとＡβ結合蛋白質との結合は強く病態と相関していることから、ＡβとＡβ結合蛋白質の間の結合を通常の方法によりアッセイすることにより、老人班の形成を阻害する活性を有するアルツハイマー病の治療薬をスクリーニングすることができる。
【００２５】
既に述べた様に、アルツハイマー病においては神経の脱落が起こり、これが痴呆症のもっとも大きな原因となる。Ａβがどのようにして神経を変性させるのかについては未だ議論が続いているが、結合阻害剤を用いてＡβとＡβ結合蛋白質との間の結合を抑制してＡβの沈着を防止することにより、神経毒性を抑制できる可能性もある。
【００２６】
ＡβとＡβ結合蛋白質との結合を阻害する物質のスクリーニングは、例えば、本技術分野で汎用されている結合アッセイの方法を用いて行うことができる。具体的には、Ａβ結合蛋白質が膜蛋白質である場合には、その蛋白質をコードする遺伝子を細胞に導入してその細胞表面上に発現させて、Ａβ結合蛋白質を発現している細胞とＡβとを反応させることにより、両者の間の結合を測定することができる。なお、その際にスクリーニングする対象である化合物を反応系に添加し、Ａβを放射活性などで標識しておけば、その化合物の結合阻害能を評価することができる。
【００２７】
また、Ａβ結合蛋白質が可溶性蛋白質である場合には、インビトロの無細胞系で例えばタグ（ｔａｇ）を付けた状態で結合蛋白質を合成し、抗タグ抗体で結合蛋白質を精製することにより、タグが付加された結合蛋白質を得ることができる。その後、スクリーニングする対象である化合物と、精製された結合蛋白質とＡβを反応させる。抗タグ抗体で免疫沈降を行うことにより、結合蛋白質と共沈したＡβの量を、例えばウエスタンブロットにより測定することができる。
【００２８】
また、金の薄膜上に固定したＡβ結合蛋白質と他の分子との間の相互作用を、機械を用いて測定することもできる。具体的には、金の薄膜上にＡβ結合蛋白質を固定し、次いでＡβを添加して結合蛋白質と結合させ、スクリーニングする対象である化合物を添加する。この際のＡβ結合蛋白質からの解離を測定することにより、その化合物の結合阻害能を評価することができる。なお、表面プラズモ共鳴を利用して、金の薄膜上に固定した分子と他の分子との相互作用を測定するための装置が市販されており、この目的のために使用することができる。このような機械を用いた方法は、多検体を容易に処理することができるという利点がある。
【００２９】
また、水晶の振動によって分子同士の相互作用を測定する装置も市販されている。その装置を用いて、水晶振動子上にＡβ結合蛋白質を固定することにより、上記と同様の手法を用いて、スクリーニング対象化合物の結合阻害能を評価することができる。
【００３０】
更に、本発明のＡβ結合蛋白質の発現を促進または抑制する化合物をスクリーニングすることもできる。ワクチン療法において、Ａβに対する抗体が血中に存在すると脳内のＡβレベルが低下するのは、血液脳関門を介してＡβが排出されているからであると考えられている。この排出機構において、Ａβ結合蛋白質とＡβが結合してトランスサイトーシスによりＡβが血液側に排出されることにより、Ａβの排出が促進されている可能性がある。よって、Ａβ結合蛋白質の発現を誘導することにより、又はＡβ結合蛋白質の輸送機能を促進することにより、Ａβの抗体を用いたＡβワクチン療法と同等若しくはそれ以上のＡβ排除能を付与することができる可能性がある。この方法は免疫反応を利用したものではないために、ワクチン療法とは異なり、炎症反応などの危険性が少ない。よって本発明のＡβ結合蛋白質は、ワクチン療法に替わり得るアルツハイマー病の新たな治療法を提供する可能性がある。
【００３１】
Ａβ結合蛋白質の発現を変化させる化合物をスクリーニングするためには、ゲノムデータベースから結合蛋白質の遺伝子のゲノム配列を検索・同定し、転写開始部位周囲およそ５ｋｂｐ程にルシフェラーゼやガラクトシダーゼ等のレポーター遺伝子をつなげ、培養細胞に導入する。転写開始部位周囲には転写制御部位が存在するために、細胞内のレポーター遺伝子の発現に対する化合物の影響を計測することにより、目的とする化合物のスクリーニングを効果的に行うことができる。
【００３２】
また、本発明のＡβ結合蛋白質を含むキットを作製することもまた可能である。当該キットは一つまたは複数のＡβ結合蛋白質と、標識したＡβを含むキットであり、好ましくは塩強度とｐＨが適切に調整された緩衝液もまた含む。本キットにおいて、結合蛋白質との結合を検出するためにＡβは標識されている。標識の方法は特に限定されるものではないが、放射標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識、２、４−ジニトロフェノール標識など、本技術分野で知られている種々の技術が含まれる。そして、このキットを用いて通常の結合アッセイなどを行い、Ａβと結合蛋白質との結合を阻害する物質のスクリーニング等に利用することができる。本キットにおいて、一つのみならず多数のＡβ結合蛋白質を含むことは、本発明の好ましい態様であり、膜蛋白質と可溶性蛋白質など、性質が異なった複数の結合蛋白質を含むことは特に好ましい。
【００３３】
【実施例】
下記の実施例において本発明を更に詳しく解説するが、如何なる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００３４】
なお、本実施例において使用したアミロイドβとビオチニル化試薬は、下記のとおりである。
Ａβ４０：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ
ＭＷ＝４３１２
ビオチニル化試薬：Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチニレーションキット（ＰＩＥＲＣＥ社製）
【００３５】
（Ａβ４０のビオチニル化）
Ａβの水溶液とビオチニル化試薬の水溶液を調製し、過剰量のビオチニル化試薬をＡβに添加した。その後氷浴上で２時間または室温で３０分間放置してビオチニル化を行った。更にカラムにより未反応のビオチニル化試薬を除去し、ＨＡＢＡアッセイにより導入されたビオチン量を測定した。
【００３６】
（マウス脳毛細血管豊富画分膜タンパクサンプルの調製）
マウスを頚椎脱臼により屠殺して脳を摘出し、大脳を単離した（１匹分＝０．３ｇ）。リン酸緩衝液を加えて氷上で１０回ホモジナイズし、デキストラン溶液を加え、更にホモジナイズした。ホモジネートを４５００ｘｇで  １６分間遠心し（４℃）、上層の脂肪層及び上清を除いた。ペレットに緩衝液を加えて懸濁し、ナイトロジェンキャビテーション法（８００ｐｓｉ，  ３０分間，  ４℃）により細胞を破砕した。懸濁液を１０，０００ｘｇで１６分間遠心し（４℃）、その上清を更に１００，０００ｘｇ  （４０，２００ｒｐｍ）で６５分間遠心（４℃）した。ペレットに懸濁緩衝液を加えてピペッティングし、プロテアーゼ阻害剤を添加してサンプルを調製した。
【００３７】
（マウス大脳膜タンパクサンプルの調製）
マウスを頚椎脱臼により屠殺して脳を摘出し、大脳を単離した（１匹分＝０．３ｇ）。デンシティーグラジエント緩衝液を加え、プロテアーゼ阻害剤の存在下、氷上で１０回ホモジナイズした。ナイトロジェンキャビテーション法（８００ｐｓｉ，３０分間，４℃）により細胞を破砕し、懸濁液をチューブに入れ、１０，０００ｘｇで１６分間遠心（４℃）した。更に、上清を１００，０００ｘｇ（４０，２００ｒｐｍ）で６５分間遠心（４℃）した。ペレットに懸濁緩衝液６００ｕＬを加えてピペッティングし、プロテアーゼ阻害剤を添加してサンプルを調製した。
【００３８】
（Ａβ４０との結合）
サンプルにビオチニル化したＡβを添加し、Ａβの最終濃度を約１０ｕＭとした。全量が１．２ｍＬとなるように結合緩衝液を加えて攪拌と反転を行い、２５℃で２０から３０分間放置した。
【００３９】
（クロス架橋反応及びタンパクの可溶化）
ＤＳＳまたはＢＭＨなどのクロス架橋試薬をジメチルスルフォキシドに溶解し、２５℃で３０分間放置してＡβ４０の架橋反応を行った。１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し（４℃）、遠心ペレットに可溶化緩衝液とプロテアーゼ阻害剤を添加し、ピペッティングした後、４００ｒｐｍで一晩震盪（４℃）することにより可溶化を行った。
【００４０】
（Ａβ−蛋白質複合体の精製）
クロス架橋を行ったサンプルに、ストレプトアビジンビーズの添加を行った。４００ｒｐｍで１時間震盪（４℃）して、ビオチンとアビジンを結合させた。１５，０００ｒｐｍで３分間遠心（４℃）して上清を除く事により、生成した複合体を得た。遠心ペレットにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加え、９５℃で２ｍｉｎ加熱することにより、電気泳動用のサンプルを調製した。
【００４１】
（電気泳動）
泳動槽にアクリルアミドゲルをセットし、泳動槽に泳動バッファーを満たすことにより電気泳動（ラウリル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の準備を行った。サンプルを必要に応じて変性させて（９５℃，３分間）ゲルにアプライした。０．０４Ａの定電流の条件下（電圧は１００Ｖから２００Ｖ）でサンプルの泳動を行った。電気泳動後のゲルにつき、通常の方法で銀染色を行った。
【００４２】
（質量分析）
上記の電気泳動によって得られたバンドを切り出し、各バンドについてＬＣ−ＭＳ／ＭＳで解析することにより、Ａβと結合している分子を同定した。具体的なプロセスとしては、ＭＳ／ＭＳ測定により得られたデータを基にして、データベース検索を行うことによりＡβ結合蛋白質を同定した。多くの場合には１つのＭＳ／ＭＳデータから複数の蛋白質名が得られるが、それら複数の蛋白質のうち、分子量の最も大きなものを一つ選択した。各バンドから検出されたペプチドフラグメントと、そのフラグメントの配列から同定された蛋白質を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2004361227.tif 000002
【００４４】
【表２】
2004361227.tif 000003
【００４５】
【表３】
2004361227.tif 000004
【００４６】
【表４】
2004361227.tif 000005
【００４７】
【表５】
2004361227.tif 000006
【００４８】
【表６】
2004361227.tif 000007
【００４９】
【表７】
2004361227.tif 000008
【００５０】
【表８】
2004361227.tif 000009
【００５１】
【表９】
2004361227.tif 000010
【００５２】
【表１０】
2004361227.tif 000011
【００５３】
【表１１】
2004361227.tif 000012
【００５４】
上記のＡβ結合蛋白質の中で、Ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）は受容体と共役して細胞内情報伝達に関与する因子である。Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎがそのような役割を担っていることを考えると、受容体に結合した物質の取り込み機構に重要な役割を果たしている。よってＧ−ｐｒｏｔｅｉｎは、Ａｂの細胞内取り込みに関与している可能性が考えられる。
【００５５】
Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ２ａ  （ＳＶ２ａ）は１２回膜貫通のトランスポーター様構造をとっていることから、Ａｂの輸送に関与している可能性が考えられる。また、ＳＶ２ａのノックアウトマウスは生後すぐに重篤な痙攣を起こして死亡することから、中枢神経機能に重要な役割を果たしていると考えられる。
【００５６】
Ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １  （Ｎ−ＣＡＭ１８０）については、アルツハイマー病などの痴呆疾患において、そのｍＲＮＡの発現量が低下することが報告され、アルツハイマー病との関連が示唆されている。また、Ｎ−ＣＡＭ１８０はシナプス間結合に必要な因子であり、Ａｂとの相互作用によってＮ−ＣＡＭ１８０の機能が阻害される可能性が考えられる。
【００５７】
Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＮＳＦ），  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  （ＳＮＡＰ，  ＮＡＰＡ），  およびｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ，  ｓｙｎｔａｘｉｎは、小胞膜輸送の制御に関する分子である。よって、Ａｂの細胞内輸送に関与するか、もしくは、Ａｂが結合することによって細胞内輸送が阻害される可能性が考えられる。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、プロテオミクス技術を利用して、Ａβと結合する蛋白質群が包括的に与えられた。これらの蛋白質群の知見は、その蛋白質群を標的とした治療薬を開発する可能性を開くものであると共に、アルツハイマー病の原因解明に大きく寄与するものであると考えられる。