(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なプラスチック分解酵素、及びそれを生産する微生物を提供する。【解決手段】プラスチックの処理方法として自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、プラスチックは一般に生分解性ではないという問題を有する。我々はプラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有するバークホルデリア属菌、および該微生物が生産するエステル結合含有プラスチック分解能を有する酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチドを見出した。また該微生物、酵素もしくは該酵素を発現する微生物を用いるエステル結合含有プラスチックの分解方法を提供することができた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バークホルデリア属に属し、エステル結合含有プラスチック分解能を有する微生物、またはその変異株。
【請求項２】
バークホルデリア属に属する微生物がバークホルデリア  セパシアである、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
バークホルデリア属に属する微生物が、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６２株、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６３株、またはバークホルデリア  セパシアＴＢ−６５株である、請求項１記載の微生物。
【請求項４】
エステル結合含有プラスチックがポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、ポリエチレンブチレンアジペート、またはポリジエチレンアジペートである、請求項１乃至３記載の微生物。
【請求項５】
エステル結合含有プラスチックがポリウレタンである、請求項１乃至３記載の微生物。
【請求項６】
請求項１乃至３記載の微生物をエステル結合含有プラスチックと接触させる工程を含む、エステル結合含有プラスチックの分解方法。
【請求項７】
エステル結合含有プラスチックがポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、ポリエチレンブチレンアジペート、またはポリジエチレンアジペートである、請求項６記載の分解方法。
【請求項８】
エステル結合含有プラスチックがポリウレタンである、請求項６記載の分解方法。
【請求項９】
バークホルデリア属の微生物由来エステル結合含有プラスチック分解酵素を生産する方法であって、
バークホルデリア属の微生物を培養する工程：
前記培養物から前記酵素を分離・精製する工程：
からなる、前記酵素の生産方法。
【請求項１０】
配列番号１乃至３のいずれかに示すペプチド配列、または該ペプチド配列に１ないし数個のアミノ酸の、欠失、置換、挿入または付加を有するペプチド配列であって、エステル結合含有プラスチック分解酵素活性を維持したペプチド配列からなる、エステル結合含有プラスチック分解酵素。
【請求項１１】
請求項１０に記載のエステル結合含有プラスチック分解酵素であって、配列番号１乃至３のいずれかに示すペプチド配列の最初のアミノ酸から１９番目アミノ酸までが欠失したペプチド配列、または該ペプチド配列に１ないし数個のアミノ酸の、欠失、置換、挿入または付加を有するペプチド配列であって、エステル結合含有プラスチック分解酵素活性を維持したペプチド配列からなる、エステル結合含有プラスチック分解酵素。
【請求項１２】
エステル結合含有プラスチックがポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、ポリエチレンブチレンアジペート、またはポリジエチレンアジペートである、請求項１０または１１記載の酵素。
【請求項１３】
エステル結合含有プラスチックがポリウレタンである、請求項１０または１１記載の酵素。
【請求項１４】
（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に示す塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１乃至３のいずれかに示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の最初のアミノ酸から１９番目アミノ酸までが欠失したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの相補配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）ポリエステル分解活性を有するポリペプチドをコードし（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加された配列、またはその相補配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）の塩基配列にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号４乃至６のいずれかに示される塩基配列を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
エステル結合含有プラスチックがポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、ポリエチレンブチレンアジペート、またはポリジエチレンアジペートである、請求項１４または１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
エステル結合含有プラスチックがポリウレタンである、請求項１４または１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１０または１１記載の酵素をエステル結合含有プラスチックと接触させる工程を含む、エステル結合含有プラスチックの分解方法。
【請求項１９】
エステル結合含有プラスチックがポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、ポリエチレンブチレンアジペート、またはポリジエチレンアジペートである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
エステル結合含有プラスチックがポリウレタンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
請求項１０または１１記載の酵素を発現する遺伝子組換え細胞をエステル結合含有プラスチックと接触させる工程を含む、エステル結合含有プラスチックの分解方法。
【請求項２２】
該細胞が大腸菌である、請求項２１記載のエステル結合含有プラスチックの分解方法。
【請求項２３】
エステル結合含有プラスチックがポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、ポリエチレンブチレンアジペート、またはポリジエチレンアジペートである、請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
エステル結合含有プラスチックがポリウレタンである、請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子組換え酵素の生産方法であって、
（ｉ）請求項１０または１１記載の酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを含有する宿主細胞を、該宿主細胞の生育に適した条件下で培養する工程；
（ｊ）該酵素を該培養物から分離・精製する工程；
を含む、遺伝子組換え酵素の生産方法。
【請求項２６】
生分解性を評価すべきポリエステルを、請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物、請求項１０または１１に記載の酵素、または請求項１０あるいは１１記載の酵素を発現する遺伝子組換え細胞と接触させて、該ポリエステルの分解程度によりポリエステルの生分解性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なエステル結合含有プラスチック分解微生物、該プラスチック分解酵素および該酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに該微生物、該酵素または該酵素を発現している微生物を利用したプラスチックの分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、プラスチック廃棄物の処理が問題になっている。プラスチック廃棄物の処理方法としては焼却や埋め立てが主であるが、焼却は地球温暖化の促進、埋め立ては埋立地の減少等の問題を抱えている。例えばポリウレタンは、全世界で年間約６００万ｔ，国内では約５５万ｔが消費されている。このうち、その発泡緩衝体は断熱性に優れることから冷蔵庫等の断熱材として大量に利用されている。現在、このポリウレタン廃棄物は不燃ゴミとして埋め立て処分される場合が多いが処分場の不足ならびに環境汚染の問題が生じている。一方、自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、プラスチックは一般に生分解性ではない。
【０００３】
プラスチックを分解することのできる微生物に関する報告は限られている。ポリウレタンは分子内にウレタン結合及びエステル結合またはエーテル結合を含み、それらの結合が切断されることによって分解が進む。ポリオール部分のエステル結合はカビや細菌によって切断されるという報告が数例ある。Ｄａｒｂｙ（Ｄａｒｂｙ  Ｒ．Ｔ．ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ  Ａ．Ｍ．：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，９００−９０５（１９６８））らはカビによる種々のポリウレタン分解試験を行い、エーテル系よりもエステル系ポリウレタンの方が分解を受け易いことや、イソシアネートやポリオールの種類によって分解特性が異なることを報告している。Ｋａｙ（Ｋａｙ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｌ．Ｈ．Ｇ．：Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．，３１，２０９−２２５（１９９１）．）らはエステル系ポリウレタン分解菌として１５種類の菌を単離し、分解力の強かったＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌について分解特性を検討した結果について報告している。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｄａｒｂｙ  Ｒ．Ｔ．ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ  Ａ．Ｍ．著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，９００−９０５（１９６８）
【非特許文献２】
Ｋａｙ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｌ．Ｈ．Ｇ．著、Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．，３１，２０９−２２５（１９９１）
ポリエステルの微生物分解に関しては、生分解性プラスチックとして知られているポリエステル樹脂を中心に数多くの報告がある。しかし、ウレタンの合成原料として一般的に使用されている液状のポリエステルの分解に関する報告は少ない。常盤らは各種の液状ポリエステルを分解するカビを報告しているが（Ｔｏｋｉｗａ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．（１９７７）  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ａｄｉｐａｔｅ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  １４−３．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４１，２６５−２７４）、これらを分解資化する細菌についてはほとんど知られていない。
【非特許文献３】
Ｔｏｋｉｗａ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．（１９７７）  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ａｄｉｐａｔｅ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  １４−３．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４１，２６５−２７４
更に、プラスチックを分解することのできる酵素に関する報告は、アシドボラックスデラフィルディ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉ）由来のポリブチレンサクシネート分解酵素（Ｕｃｈｉｄａ  Ｈ，  Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｋａｍｂｅ  Ｔ，  Ｓｈｉｇｅｎｏ−Ａｋｕｔｓｕ  Ｙ，  Ｎｏｍｕｒａ  Ｎ，  Ｔｏｋｉｗａ  Ｙ，  Ｎａｋａｈａｒａ  Ｔ（２００２）  Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ＢＳ−３．  Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３：２４５〜２４７）、コマモナスアシドボランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）由来のポリウレタン分解酵素、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属菌（Ｐｒａｎａｍｕｄａ  Ｈ，  Ｔｓｕｃｈｉｉ  Ａ，  Ｔｏｋｉｗａ  Ｙ（２００１）Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１：２５〜２９，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，  Ｔｏｍｉｔａ  Ｔ，Ａｂｅ  Ｎ，Ｋａｍｉｏ  Ｙ（２００１）  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｏｉｌ  ｉｓｏｌａｔｅ，Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  Ｋ１０４−１．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ．６７：３４５〜３５３）およびバチラススミッチイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）由来（Ｓａｋａｉ  Ｋ，Ｋａｗａｎｏ  Ｈ，Ｉｗａｍｉ  Ａ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ｍ（２００１）  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐｏｓｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：２９８〜３００）のポリ乳酸分解酵素に限られている。
【非特許文献４】
Ｕｃｈｉｄａ  Ｈ，  Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｋａｍｂｅ  Ｔ，  Ｓｈｉｇｅｎｏ−Ａｋｕｔｓｕ  Ｙ，Ｎｏｍｕｒａ  Ｎ，Ｔｏｋｉｗａ  Ｙ，ＮａｋａｈａｒａＴ著、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉｓｔｒａｉｎ  ＢＳ−３．  Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３：２４５〜２４７、２００２年
【非特許文献５】
Ｐｒａｎａｍｕｄａ  Ｈ，  Ｔｓｕｃｈｉｉ  Ａ，  Ｔｏｋｉｗａ  Ｙ著、Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．  １：２５〜２９、２００１年
【非特許文献６】
Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，  Ｔｏｍｉｔａ  Ｔ，  Ａｂｅ  Ｎ，  Ｋａｍｉｏ  Ｙ  著、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｏｉｌ  ｉｓｏｌａｔｅ，  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  Ｋ１０４−１．Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ．６７：３４５〜３５３、２００１年
【非特許文献７】
Ｓａｋａｉ  Ｋ，  Ｋａｗａｎｏ  Ｈ，  Ｉｗａｍｉ  Ａ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ｍ著、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐｏｓｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．  ９２：  ２９８〜３００、２００１年
また、酵素を用いた液状ポリエステルの分解については、動物やカビ、細菌由来のリパーゼ、エステラーゼによるものが多く知られているが（例えば、Ｔｏｋｉｗａ  Ｙ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ（１９７７）  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  ｌｉｐａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２７０：７６−７８）、これらの酵素は液状ポリエステルを本来の基質とするものではないため、環境中での分解とは無関係である。
【非特許文献８】
Ｔｏｋｉｗａ  Ｙ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ（１９７７）  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  ｌｉｐａｓｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２７０：７６−７８
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なエステル結合含有プラスチック分解微生物、該プラスチック分解酵素および該酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに該微生物、該酵素または該酵素を発現している微生物を利用したプラスチックの分解方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する、平成１５年２月２６日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請し拒否された、バークホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）ＴＢ−６２株、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６３株、またはバークホルデリア  セパシアＴＢ−６５株、および該微生物が生産するエステル結合含有プラスチック分解能を有する酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチドである。また本発明は、該ポリヌクレオチドを組み込んだ微生物にエステル結合含有プラスチック分解能を有する酵素を発現させ、該酵素を精製取得する方法である。尚、バークホルデリア属に属する微生物がエステル結合含有プラスチックの分解能を有することはこれまで知られていなかった。
【０００７】
更に本発明は、該微生物、酵素もしくは該酵素を発現する微生物を用いるエステル結合含有プラスチックの分解方法である。
本発明の酵素は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する。より具体的には、本発明の酵素は、バークホルデリア  セパシアに由来する、新規なプラスチック分解酵素であり、エステラーゼ活性を有する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
微生物
バークホルデリア属に属し、エステル結合含有プラスチック分解能を有する微生物は、既に公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。微生物のスクリーニングの一例を示せば、エステル系ポリウレタンを一定期間地面に埋設した後取り出し、該ポリウレタン小片を生理食塩水に加え、ボルテックスで微生物を抽出したものを適宜希釈して、ニュートリエント平板培地にエマルジョン化したポリエステル（例えばポリエチレンアジペート）寒天溶液５ｍｌを重層した平板に塗布する。これを３０℃で３日間培養し、コロニー周辺にポリエステルの分解で生じるクリアーゾーンを生成したコロニーを取得することにより行うことができる。
【０００９】
本発明の微生物は、エステル結合含有プラスチックを分解する能力を有するバークホルデリア属菌であればよい。具体的には、代表例として、平成１５年２月２６日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請し拒否された、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６２株、バークホルデリアセパシアＴＢ−６３株、またはバークホルデリア  セパシアＴＢ−６５株が挙げられる。尚、これらの菌株は自己寄託とし、申請により分譲を認めることとする。バークホルデリア属菌の菌学的性質は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（第１巻１９８４年、第２巻１９８６年、第３巻１９８９年、第４巻１９８９年）に記載されている。
【００１０】
更に本発明の微生物は、エステル結合含有プラスチックを分解する能力を有するバークホルデリア属菌であれば、野生株、変異株のいずれでも良い。
変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるエチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、或いは変異剤処理なしで得られる、いわゆる自然突然変異によって取得することも可能である。
【００１１】
バークホルデリア属に属する微生物の培養に用いる培地としては、バークホルデリア属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる塩類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００１２】
本微生物が分解できるエステル結合含有プラスチックは、分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリウレタン、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、およびポリエチレンブチレンアジペートが挙げられる。
【００１３】
ポリウレタンとは、分子中にウレタン結合（−ＮＨＣＯＯ−）を有する高分子化合物の総称で、多官能イソシアネートとヒドロキル基含有化合物との反応により得られ、エステル、エーテル、アミド、ウレア、カルバメートなどの基を有するポリマーである。ヒドロキシル基もしくはイソシアネート基の官能性数を変化させることで多種多様の分岐あるいは架橋ポリマーを調製することができる。用いるポリオールの種類によってエステル系とエーテル系に大別できる。ポリウレタンは、易加工性、耐腐敗性、耐変質性、低比重等の優れた特性により、弾性体、発泡体、接着剤、塗料、繊維、合成皮革など幅広い用途を持っており、自動車部品としても広く使用されている。本発明の分解方法において適用し得るポリウレタン樹脂の数平均分子量は、特に制限はない。
【００１４】
本発明の微生物または酵素により分解されるエステル結合含有プラスチックの数平均分子量は、特に制限はない。ポリエチレンアジペート分子量約２０００、ポリブチレンアジペート分子量約２０００、ポリエチレンブチレンアジペート分子量約２０００、ポリジエチレンアジペート分子量約２５００の分解については実施例に示している。
【００１５】
酵素
本発明の酵素は３０６のアミノ酸から構成され、分子量３２１２１、３２１９３、３２１４５のポリペプチドであり、配列番号１〜３のアミノ酸番号１−３０６で示されるアミノ酸配列により特定される。このアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４〜６に記載されている塩基配列の、オープンリーディングフレーム（読み枠）部分によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００１６】
尚、配列番号１〜３のアミノ酸配列はシグナルペプチド部分を有しており、その切断点は配列番号１〜３のアミノ酸番号１９番目とアミノ酸番号２０番目の間であると推定される。このことから成熟型酵素は２８７のアミノ酸からなるそれぞれ分子量３０４５４、３０５３６、３０４８８のポリペプチドである。これらの酵素はプラスチック以外にエステラーゼの活性測定用の基質であるパラ−ニトロフェニルアセテート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）に対しても分解活性が認められることから、エステラーゼの一種であると考えられる。
【００１７】
本発明のアミノ酸配列には、配列番号１、２または３に示したアミノ酸配列、ならびにその類似体および誘導体が含まれる。さらに、他の微生物に由来する対応するアミノ酸相同配列も本発明に包含される。また、配列番号１、２または３のヌクレオチド配列がコードするいかなるポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
配列番号１、２または３に示すポリペプチドのアミノ酸の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド、例えば配列番号１、２または３に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換されたポリペプチドも、同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのペプチドも、本発明の酵素に含まれる。また、その様なポリペプチドと配列番号１、２または３に示すアミノ酸配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なポリペプチドも、エステル結合含有プラスチック分解反応を触媒するという特徴を有する限り、本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
本酵素が分解できるプラスチックは、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリウレタン、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、およびポリエチレンブチレンアジペートが挙げられる。
【００２０】
遺伝子
次に本発明の酵素をコードする遺伝子は、配列番号４、５または６のオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。例えば配列表の配列番号４、５または６に示す、塩基番号１−９１８で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドは、その縮重を含むことができる。縮重とは、異なるヌクレオチドコドンによって１つのアミノ酸がコードされ得る現象をいう。かくして、本発明のプラスチック分解酵素をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は縮重により変化することができる。
【００２２】
本発明には、配列番号４、５または６に示したＤＮＡ配列、配列番号４、５または６に示したＤＮＡ配列の相補配列に高度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．編，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ社，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）］ハイブリダイズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。さらに、配列番号４、５または６に示したＤＮＡ配列の相補配列に中程度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，前掲）］ハイブリダイズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。
【００２３】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドに関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換、付加を行う事により、天然のポリヌクレオチドと同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異ポリヌクレオチドを含むものである。即ち、配列表の配列番号４、５または６に示すポリヌクレオチドの一部が挿入、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドとは、配列番号２に示す塩基配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換されたポリヌクレオチドである。また、その様なポリヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なポリヌクレオチドも、プラスチックを分解する能力を有するという特徴を有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
ＢＬＡＳＴによるホモロジー検索の結果、配列番号４に記載されている塩基配列はラルストニア  ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のリゾホスホリパーゼをはじめとするいくつかの遺伝子と相同性が認められる（図２）。しかし、その相同性は４０％以下と低く、また相同性を持つ遺伝子はすべてゲノムプロジェクトからもたらされた推定遺伝子で、タンパク質として翻訳されていることが証明されているものはない。また、配列番号５および６に記載されている塩基配列は、配列番号４に記載されている塩基配列と高い相同性を有する。
【００２５】
酵素の生産方法
本発明の酵素は、バークホルデリア属に属し、エステル結合含有プラスチック分解能を有する微生物を培養し、該微生物中の酵素を分離・精製することにより、あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞を培養し、該宿主から酵素を分離・精製することにより、生産することができる。
【００２６】
バークホルデリア属に属し、エステル結合含有プラスチック分解能を有する微生物は、公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。具体的には、代表例として、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６２株、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６３株、またはバークホルデリア  セパシアＴＢ−６５株が挙げられる。
【００２７】
バークホルデリア属に属する微生物の培養に用いる培地としては、バークホルデリア属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無核酸類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。ペニバチルス属に属する微生物の培養は、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養により行うことができる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００２８】
本発明の酵素を、遺伝子組換え細胞により生産する方法は以下の通りである。まず、ポリヌクレオチド分子を宿主細胞に導入して組換え微生物を形成することができる何れかのベクターに挿入する。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡ何れか、原核生物または真核生物何れかであり得るが、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。ベクターは染色体外エレメント（例えば、プラスミド）として発現させることができるか、あるいはそれを染色体に組込むことができる。組込まれたポリヌクレオチド分子は、染色体プロモーター制御した、天然もしくはプラスミドプロモーター制御下、または幾つかのプロモーター制御の組合せ下とすることができる。ポリヌクレオチド分子の単一または複数コピーを染色体に組み込むことができる。次に、該ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして組換え細胞を形成させる。トランスフェクトするための適当な宿主細胞はトランスフェクトできる何れかの細菌、菌類（例えば酵母）、昆虫、植物または動物細胞を含む。本発明で使用される好ましい宿主細胞は、限定されるものではないが、例えば大腸菌、バークホルデリア属菌、枯草菌、酵母等を含めた、本発明の酵素の発現に適した何れの微生物細胞も含む。更に、該宿主を、該宿主に適した培養条件にて培養することにより、本発明の酵素を含有した遺伝子組換え細胞を得ることができる。該宿主に適した培養条件は、当業者に周知である。
【００２９】
バークホルデリア属に属しエステル結合含有プラスチック分解能を有する微生物、あるいは本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞からの本発明の酵素の分離・精製は、通常細胞からの蛋白質の分離・精製に用いられる方法を用いることにより行うことができる。具体的には、細胞を破壊後、通常用いられる分離精製手段を用いることにより行うことができる。細胞の破壊には、制限的でない例として、超音波処理、高圧ホモジナイザー処理、浸透圧ショック法が挙げられる。分離精製手段は、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。更に、遺伝子組換えによる酵素の生産では、組み換え型酵素のＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出し、組み換え型酵素はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。
【００３０】
プラスチック分解方法
更に、本発明は、本酵素により、もしくは該酵素を発現する微生物を利用した、エステル結合含有プラスチックを分解する方法を提供する。つまり、本発明のエステル結合含有プラスチックを分解する方法は、酵素のエステル結合含有プラスチックを分解する作用を利用するもの、該酵素を発現する微生物の増殖過程でエステル結合含有プラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する、あるいは該酵素を発現する微生物菌体、例えば休止菌体を利用するものである。
【００３１】
あるいは、本発明の酵素を発現する微生物菌体を常法により凍結乾燥した粉末状、その粉末と各種ビタミンやミネラル、必要な栄養源、例えば酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン等を配合した後に打錠した錠剤等固形状の形態の調製物としてプラスチックの処理に提供しても良い。また、該酵素を発現する微生物菌株を活性汚泥およびコンポストの成分として利用することもできる。
【００３２】
本発明の酵素を、該酵素を含有する錠剤等として利用に供することもできる。酵素の粗酵素液、粗酵素粉末、または精製酵素の他に、通常酵素錠剤等に用いられる他の成分、例えば安定化剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、増量剤、結合剤等を適宜配合してもよい。また、剤型も特に限定されず、用途に応じて散財、顆粒剤、錠剤等の剤型を選択すればよい。
【００３３】
本発明の方法に用いる酵素は、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６２株、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６３株、またはバークホルデリア  セパシアＴＢ−６５株から調製される酵素に限定されるわけではなく、組換えＤＮＡ技術によって創製された微生物、例えば発現ベクターに接続された該酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主、例えば大腸菌、バークホルデリア属菌、枯草菌、酵母等により生産された酵素を使用することも可能である。
【００３４】
組換えＤＮＡ技術による微生物の創製は、当該分野において通常用いられている方法により行うことができる。例えば、エステル結合含有プラスチック分解酵素遺伝子の高効率発現系の構築は、現在最も効率的なポリペプチド発現用宿主−ベクター系の一つであるｐＥＴシステムを用いて構築することができる。
【００３５】
本発明の方法で使用する酵素は、必ずしも十分に精製する必要はないが、酵素の精製が望まれるときは、通常蛋白質の精製に用いられる方法、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。一例を示せば、組み換え型酵素のＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出する。組み換え型酵素はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。
【００３６】
本発明のエステル結合含有プラスチックを分解する方法により分解できるプラスチックは、前記した通り、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリウレタン、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンアジペート、およびポリエチレンブチレンアジペートが挙げられる。
【００３７】
分解に共されるエステル結合含有プラスチックは、例えば液体の培地中にエマルジョンとして、あるいは液状、粉体の形で加えても良いし、フィルム、ペレット等の塊として加えても良い。なお、培地に対するエステル結合含有プラスチックの投入量は、０．０１〜１０重量％が望ましい。添加する酵素あるいは微生物量は極少量であってもよいが、分解効率を考慮してエステル結合含有プラスチックに対して湿重量として、酵素の場合は０．００１重量％以上、微生物の場合は０．１重量％以上が好ましい。また、分解に供するエステル結合含有プラスチックは、１種類であっても複数種類であっても良い。
【００３８】
精製酵素あるいは粗精製酵素のエステル結合含有プラスチックを分解する作用を利用する態様では、エステル結合含有プラスチックの分解に際し、緩衝液にエステル結合含有プラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００３９】
本発明の酵素を発現する微生物の増殖過程でエステル結合含有プラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する態様では、エステル結合含有プラスチックを単一の炭素源として与えることも、他の炭素源とともに与えることもできる。使用し得る培地としては、用いる微生物に適した培地であれば特に制限はないが、炭素源としては、グルコース等、及び該微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無機塩を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００４０】
微生物の有する酵素のエステル結合含有プラスチックを分解する作用を利用する態様、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用する態様では、エステル結合含有プラスチックの分解に際し、該微生物の増殖を伴わないため、緩衝液にエステル結合含有プラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００４１】
本発明において、酵素を発現する増殖中の微生物をエステル結合含有プラスチックの分解に利用する場合は、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養を行えばエステル結合含有プラスチックの分解がみられる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養条件としては、培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００４２】
エステル結合含有プラスチックの分解に要する時間は、分解に供するプラスチックの種類、組成、形状及び量、使用した微生物の種類及び樹脂に対する相対量、その他種々の培養条件等に応じて変化しうる。
【００４３】
培地中のエステル結合含有プラスチックの分解の確認は、例えば、分解に供したプラスチックの重量減少の測定、エマルジョンとして供する場合はプラスチックの分解によるクリアーゾーンの形成により測定することができる。
【００４４】
ポリエステルの生分解性評価方法
さらに本発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物、請求項９、１１または１２に記載の酵素、または請求項９、１１あるいは１２記載の酵素を発現する遺伝子組換え細胞を用いる、ポリエステルの生分解性評価方法である。
【００４５】
上記微生物、酵素および細胞は、天然より分離された微生物および酵素を含有するため、分解試験に供するポリエステルが自然界において分解されるのかの評価に用いることができる。
【００４６】
例えば、請求項９、１１または１２に記載の酵素をリン酸緩衝液に適量入れ、そこに評価サンプルとしてポリエステルを投入し、数日間３０℃にて培養し、ポリエステルの分解を測定することにより、該評価サンプルの生分解性を評価することができる。
【００４７】
本発明のポリエステルの生分解性評価方法は、生分解性を有する新規ポリエステルの設計にも有用である。
【００４８】
【実施例】本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１  エステル結合含有プラスチック分解菌のスクリーニング
実験材料
平均分子量の異なる数種類のポリジエチレンアジペート（ＭＷ＝５５４、９３５、２，５００、２，６９０）とトリレン−２，４−ジイソシアネート（２，４−ＴＤＩ）をＯＨ基とイソシアネート基の比が１：１になるように無水状態で混合し、エステル系ポリウレタンを合成した。これら各種ポリウレタンを一定期間地面に埋設した後取り出し、微生物の分離源とした。
【００４９】
検索方法
ニュートリエント平板培地（肉エキス３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ）にエマルジョン化した各種ポリエステル（ポリエチレンアジペート、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンブチレンアジペート、ポリジエチレンアジペート）寒天溶液５ｍｌを重層した。分離源のポリウレタン小片を生理食塩水に加え、ボルテックスで微生物を抽出したものを適宜希釈して平板に塗布した。これを３０℃で３日間培養し、コロニー周辺にポリエステルの分解で生じるクリアーゾーンを生成したコロニーをポリエステル分解菌とした。
【００５０】
スクリーニング結果
７０種類の土壌埋設ポリウレタン小片から、高いポリエステル分解活性を持った細菌を３株取得した。これらをそれぞれＴＢ−６２、ＴＢ−６３、ＴＢ−６５とし、−８０℃にて凍結保存した。
【００５１】
分離微生物の同定
生理学的試験は一般的な方法に従って行った。同定にはＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：  ＷＩＬＬＩＡＭＳ＆ＷＩＬＫＩＮＳ  Ｃｏ．，（１９８４）を参考にした。また、米国ＢＩＯＬＯＧ社製の微生物同定システム（Ｍｉｃｒｏｌｏｇ  ３）も使用した。１６ｓ  ｒＤＮＡの配列決定と解析はダイレクトＰＣＲ法を用い、プライマーには真正細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡのほぼ全長を増幅することのできる２７Ｆおよび１４９２Ｒのプライマーセットを使用した。
【００５２】
ＴＢ−６２、ＴＢ−６３、ＴＢ−６５について生理試験を行った結果、すべてグラム陰性の桿菌であり、運動性を有していた。また、ＢＩＯＬＯＧの結果より、ＴＢ−６３、ＴＢ−６５の２株がバークホルデリア属、ＴＢ−６２株がバークホルデリア  セパシアに近縁との結果を得た。
【００５３】
【表１】
2004261102.tif 000002
【００５４】
【表２】
2004261102.tif 000003
【００５５】
【表３】
2004261102.tif 000004
【００５６】
さらに、コロニーダイレクトＰＣＲによって本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡのほぼ全長を増幅し、そのうちの上流領域と下流領域それぞれ約５００ｂｐの塩基配列を決定した。３菌株の上流領域４７５ｂｐの配列を配列表に示す（それぞれ配列番号７、８、９）。この配列に基づいてＢＬＡＳＴにより相同性検索を行ったところ、３株すべてがバークホルデリア  セパシアであると同定された。
【００５７】
実施例２  得られた微生物によるポリエステルの分解試験
実施例１のスクリーニングの場合と同様に、ニュートリエント平板培地にエマルジョン化した各種ポリエステル（ポリエチレンアジペート分子量約２０００、ポリブチレンアジペート分子量約２０００、ポリエチレンブチレンアジペート分子量約２０００、ポリジエチレンアジペート分子量約２５００）寒天溶液５  ｍｌ  を重層したものを用いた。ここに供試菌を塗布した。これを３０℃で３日間培養し、コロニー周辺にポリエステルの分解で生じるクリアーゾーンの大きさにより、分解力を判定した。
【００５８】
実験結果を表４に示した。分解力はＴＢ−６２株が最も強く、また、ＴＢ−６３株の基質特異性は他の２株と異なっていた。
【００５９】
【表４】
2004261102.tif 000005
【００６０】
実施例３  バークホルデリア  セパシアＴＢ−６２株由来エステル結合分解酵素遺伝子のクローニング
方法
エステル結合分解酵素遺伝子の取得を目的として、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６２株の遺伝子ライブラリー作成を行った。定法によりゲノムＤＮＡを調製し、制限酵素Ｓａｕ３Ａ１による部分分解を行った。これをアガロースゲル電気泳動に供し、約４〜６ｋｂｐの大きさの断片を回収した。この回収されたｐＵＣ１８ベクターのマルチクローニングサイト上ＢａｍＨ１サイトに連結した。これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポレーションで導入し、得られた形質転換体を遺伝子ライブラリーとした。
【００６１】
これを、乳化させた０．５％ポリエチレンブチレンアジペートを重層したＬＢ（１０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）平板培地にて、３７℃、１〜３日間培養した。コロニー周辺にクリアゾーンが確認された形質転換体をピックアップし、候補株として保存した。
【００６２】
結果
約２万のコロニーを検索した結果、１株の候補クローンを取得した。プラスミド抽出して解析した結果、約２．５ｋｂｐのインサートを確認した。この２．５ｋｂｐの断片をシークエンスした結果、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が認められ（図１）、そのうちの１つ（ｅｂａＡ１）が細菌由来のリパーゼと３０〜３５％の相同性が認められた。本ＯＲＦ部分のみをＰＣＲによって増幅し、再度大腸菌に導入した結果、ポリエチレンブチレンアジペートを重層寒天平板上でクリアゾーンの形成が認めたれたことから、本ＯＲＦがポリエステル分解酵素本体であると断定した。本遺伝子の全塩基配列を配列番号４に示した。本酵素は３０６アミノ酸からなり、Ｎ末端から１９アミノ酸がシグナル配列であると推定された（配列番号１）。分子量は前駆体で３２，１２１Ｄａ、シグナルを除いた成熟（ｍａｔｕｒｅ）型で３０，４５４Ｄａと計算された。ＢＬＡＳＴによるホモロジー検索の結果、本遺伝子はラルストニア  ソラナセラム由来のリゾホスホリパーゼをはじめとするいくつかの遺伝子と相同性が認められた（図２）。しかし、その相同性は４０％以下と低く、また相同性を持つ遺伝子はすべてゲノムプロジェクトからもたらされた推定遺伝子で、タンパク質として翻訳されていることが証明されているものはなかった。
【００６３】
実施例４  発現ベクターを用いた配列番号４のヌクレオチド配列（ｅｂａＡ）の高発現
方法
高発現ベクターへの配列番号４のヌクレオチド配列の組み込み
配列番号４のヌクレオチド配列の開始コドンから停止コドンまでをＰＣＲで増幅し、発現ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，  ＵＳＡ）のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入、ｐＥＢＡ−ＰＥＴを作成した。これをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、ＬＢ（１０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）培地へ植菌、３２℃、４時間培養後、ＩＰＴＧを添加（終濃度０．１ｍＭ）し、３時間酵素の発現を誘導した。これを集菌、超音波にて破砕、遠心して得た上清を、粗酵素液とした。
【００６４】
活性測定法
エステラーゼ活性の測定は、基質としてｐ−ニトロフェニルアセテートを用い、酵素反応によって生じたｐ−ニトロフェノールの量を、４０５ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生じさせる酵素量を１ｕｎｉｔとした。
【００６５】
ポリエステル分解活性は基質としてポリエチレンブチレンアジペートをエマルジョン化したものを用いた。１００ｍｌの蒸留水（２００ｐｐｍのＰｌｙｓｕｒｆ  Ａ２１０Ｇを含む）に、ジクロロメタンに溶解した０．５ｇのポリエチレンブチレンアジペートを添加し、１０，０００ｒｐｍ、５分間ホモジナイザーで撹拌した。８０℃で１〜２時間加温し、溶液中のジクロロメタンを除去した。これをエマルジョン溶液とした。１．８ｍｌのエマルジョン溶液に、０．２ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１ｍｌの酵素溶液を添加し、３０℃で１時間反応を行った。反応終了後、５８０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の減少量を、ポリエチレンブチレンアジペート分解活性とした。
【００６６】
結果
常法によりペリプラズム画分を回収し、酵素活性を測定したところ、エステラーゼ活性（１３．６Ｕ／ｍｌ）が認められた。また、ポリエチレンブチレンアジペート分解活性は、１時間で９８％のＯＤ減少率が認められた。また、本画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約３３，０００の位置に太いバンドが観察され、これは配列番号４の配列に基づく推定分子量とほぼ一致した。
【００６７】
一方、コントロール系（配列番号４のヌクレオチド配列を含まない空のプラスミド）において、エステラーゼ活性はほとんど見られず、ポリエチレンブチレンアジペート分解活性は全く観察されなかった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいても、強く発現したバンドは認められなかった。
【００６８】
実施例５  バークホルデリア  セパシアＴＢ−６３株およびＴＢ−６５株由来エステル結合分解酵素遺伝子のクローニング
方法
バークホルデリア  セパシアＴＢ−６２株由来の配列番号４記載のヌクレオチド配列を基にして、遺伝子の全体を増幅可能なプライマーを作成し、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６３株およびＴＢ−６５の全染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った。得られたバンドを、前述と同様の方法で発現ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）に挿入した。これをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、乳化ポリエチレンブチレンアジペートを重層したＬＢ（１０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む）平板培地へ植菌した。
【００６９】
結果
ＰＣＲを行ったところ、両方の菌株において特定なバンドの増幅が認められた。そこで、これらのＰＣＲ産物を発現ベクターに組み込み、ポリエチレンブチレンアジペート分解活性を調べた。その結果、どちらのＰＣＲ産物からも、ポリエチレンブチレンアジペート分解酵素活性が認められた。そこで、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６３株由来のエステル結合分解酵素遺伝子を配列番号５、バークホルデリア  セパシアＴＢ−６５株由来のエステル結合分解酵素遺伝子を配列番号６とし、それぞれシーケンスを行った。その結果、これらの遺伝子はバークホルデリア  セパシアＴＢ−６２株由来のエステル結合分解酵素遺伝子である配列番号４記載の配列と同一ではなかったが、高い相同性を持っていた（図３）。
【００７０】
【配列表】
2004261102.tif 000006
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2004261102.tif 000014
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、候補クローンのプラスミド抽出して解析して得た約２．５ｋｂｐのインサート中の、シークエンス結果に基づく遺伝子地図を示す。３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が認められた。
【図２】図２は、ＢＬＡＳＴによるホモロジー検索の結果を示す。ホモロジーの認められた遺伝子は、全てゲノムプロジェクトから得られた推定タンパク質（リパーゼまたはリゾホスホリパーゼ）である。図ではその遺伝子を持つ菌株名で示してある。
【図３】図３は、配列番号１、配列番号２、配列番号３記載の配列を比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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