(57)【要約】　　　（修正有）【課題】黄色ブドウ球菌検出の為の迅速、正確かつ高感度な方法の提供。【解決手段】黄色ブドウ球菌を検出するための特異的核酸配列。また、黄色ブドウ球菌を検出する方法も開示する。該方法は未知の微生物からの核酸を有する試料を供すること、各々が黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域から選択されるオリゴヌクレオチドを含有し、かつ各々が１４〜４０ヌクレオチドの長さを有する一対のプライマーで核酸を増幅すること、および、増幅産物を検出することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー各々が黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域から選択されるオリゴヌクレオチドを含有し、各プライマーが１４〜４０ヌクレオチドの長さを有する一対の増幅プライマー。
【請求項２】
各プライマーが１４〜３０ヌクレオチドの長さを有する請求項１記載の一対のプライマー。
【請求項３】
各プライマーが１４〜２０ヌクレオチドの長さを有する請求項２記載の一対のプライマー。
【請求項４】
一対のプライマーにおけるオリゴヌクレオチドが、それぞれ、配列番号：２および配列番号：２の相補体から選択される請求項１記載の一対のプライマー。
【請求項５】
一対のプライマーにおけるオリゴヌクレオチドが、それぞれ、配列番号：３および４、または配列番号：５および６である請求項１記載の一対のプライマー。
【請求項６】
プライマー各々が、それぞれ、配列番号：３および４、または配列番号：５および６を含有し、各プライマーが２０〜４０ヌクレオチドの長さを有する一対のプライマーでの黄色ブドウ球菌核酸鋳型の増幅から得られた核酸。
【請求項７】
各プライマーが２０〜３０ヌクレオチドの長さを有する請求項６記載の核酸。
【請求項８】
一対のプライマーが配列番号：３および４、または配列番号：５および６である請求項７記載の核酸。
【請求項９】
黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域から選択されるオリゴヌクレオチドを含有し、１０〜１０００ヌクレオチドの長さを有する核酸。
【請求項１０】
核酸が１０〜５００ヌクレオチドの長さを有する請求項９記載の核酸。
【請求項１１】
核酸が１０〜２５０ヌクレオチドの長さを有する請求項１０記載の核酸。
【請求項１２】
核酸が１０〜５０ヌクレオチドの長さを有する請求項１１記載の核酸。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが配列番号：２またはそれに対して相補的な配列から選択される請求項９記載の核酸。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが配列番号：２またはそれに対して相補的な配列である請求項１３記載の核酸。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが配列番号：７、配列番号：８、またはそれに対して相補的な配列から選択される請求項９記載の核酸。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが配列番号：７、配列番号：８、またはそれに対して相補的な配列である請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
未知の微生物からの核酸を有する試料を供すること、
プライマー各々が黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域から選択されるオリゴヌクレオチドを含有し、各プライマーが１４〜４０ヌクレオチドの長さを有する一対のプライマーで核酸を増幅すること、および増幅産物を検出することを具備し、
それにより、増幅産物の検出が黄色ブドウ球菌の存在を示す、黄色ブドウ球菌を検出する方法。
【請求項１８】
各プライマーが１４〜３０ヌクレオチドの長さを有する請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
各プライマーが１４〜２０ヌクレオチドの長さを有する請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが、それぞれ、配列番号：２および配列番号：２の相補体から選択される請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、それぞれ、配列番号：３および４、または配列番号：５および６である請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
検出工程が、１０〜１０００ヌクレオチドの長さを有し、かつ黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域から選択されるオリゴヌクレオチドを有する核酸プローブに対して増幅産物をハイブリダイズさせることを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
核酸プローブが１０〜５００ヌクレオチドの長さを有する請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
核酸プローブが１０〜２５０ヌクレオチドの長さを有する請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
核酸プローブが１０〜５０ヌクレオチドの長さを有する請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドが配列番号：２またはそれに対して相補的な配列から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドが配列番号：２またはそれに対して相補的な配列である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドが配列番号：７、配列番号；８、またはそれに対して相補的な配列から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
オリゴヌクレオチドが配列番号：７、配列番号：８、またはそれに対して相補的な配列である請求項２８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景）
微生物を検出する従来の方法は、培養基中での時間を消費する増殖、次いで単離および生化学的または血清学的同定によるものである。全プロセスは、通常、２４〜４８時間を要する。細密化生化学分析、抗体−およびＤＮＡ−ベースのテスト、および修飾された慣用的アッセイを含めた、微生物の迅速な検出のための多くの方法が最近開発されている。
【０００２】
黄色ブドウ球菌は多くの食品中毒発生において原因因子として同定されてきた（ＢｅｎｎｅｔおよびＬａｎｃｅｔｔｅ（２００１）細菌学分析マニュアルオンライン（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ　Ｏｎｌｉｎｅ）、第１２章　黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）；米国食品・医薬品局（Ｕ．Ｓ　Ｆｏｏｄ　＆　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、食品衛生・応用栄養センター（Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｆｏｏｄ　Ｓａｆｅｔｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）；ｗｗｗ．ｃｆｓａｎ．ｆｄａ．ｇｏｖ／〜ｂａｍ／ｂａｍ−１２．ｈｔｍｌ）。また、それは、人および動物において多くの日和見感染の原因である主な病原体の１つである（ＫｌｏｏｓおよびＢａｎｎｅｒｍａｌ（１９９５）ブドウ球菌およびミクロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ＆Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕ）、２８２〜２９８頁、Ｉｎ　Ｍｕｒｒａｙら（編）、臨床微生物学のマニュアル（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第６版、米国微生物学会（ワシントン）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｇｎｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。黄色ブドウ球菌の迅速且つ正確な検出は食品中毒発生を防止するために、および黄色ブドウ球菌感染の診断および治療において重要である。
【０００３】
（概要）
本発明は、黄色ブドウ球菌を検出するための黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域から選択される特異的核酸配列に関する。
【０００４】
該黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ１３３５２０（配列番号：１）のヌクレオチド１〜１７９２を以下に示す：
【表１】
2004033214.tif 000002
１つの態様において、本発明は、各々が黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域から選択されるオリゴヌクレオチド（例えば、前記で示したヌクレオチド１〜１２６０（配列番号：２）から選択されたもの、および配列番号：２の相補体から選択された他のもの）を含有し、各プライマーが１４〜４０（例えば、１４〜３０および１４〜２０）ヌクレオチドの長さを有する一対の増幅プライマーをその要旨とする。これらの増幅プライマーは黄色ブドウ球菌を検出するのに用いることができる。そのようなプライマー対の１つの例は配列番号：３（前記で示したヌクレオチド１１２１〜１１４０）および配列番号：４（前記で示したヌクレオチド１３７６〜１３５５の相補体）である。もう１つの例は配列番号：５（前記で示したヌクレオチド９８５〜１００４）および配列番号：６（前記で示したヌクレオチド１３２４〜１３０５の相補体）である。
【０００５】
もう１つの態様において、本発明は、各々が、それぞれ、配列番号：３および４、または配列番号：５および６を含有し、かつ各々が２０〜４０（例えば、２０〜３０）ヌクレオチドの長さを有する一対のプライマーでの黄色ブドウ球菌核酸鋳型の増幅から得られた核酸をその要旨とする。増幅産物は、黄色ブドウ球菌検出用のハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。１つの例において、上流プライマーは配列番号：３であって、下流プライマーは配列番号：４である。もう１つの例において、上流プライマーは配列番号：５であって、下流プライマーは配列番号：６である。
【０００６】
さらにもう１つの態様において、本発明は、長さが１０〜１０００（例えば、１０〜５００、１０〜２５０、または１０〜５０）ヌクレオチドであって、黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域から選択されるオリゴヌクレオチドを含有する核酸をその要旨とする。例えば、オリゴヌクレオチドは配列番号：２またはその相補体、配列番号：７（前記で示したヌクレオチド１１２１〜１３７６）またはその相補体、配列番号：８（前記で示したヌクレオチド９８５〜１３２４）またはその相補体；または配列番号：２、７、または８、またはその相補体から選択される断片であり得る。これらの核酸は黄色ブドウ球菌を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。
【０００７】
また、前記した核酸の２以上を用いて黄色ブドウ球菌を検出する方法も本発明に含まれる。該方法は（１）未知の微生物からの核酸を有する試料を供すること、（２）各々が黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域（例えば、配列番号：２およびその相補体）から選択されるオリゴヌクレオチドを含有し、かつ各々が１４〜４０（例えば、１４〜３０および１４〜２０）ヌクレオチドの長さを有する一対のプライマーで核酸を増幅すること、および（３）増幅産物を検出することを含む。もし検出された増幅産物のサイズがプライマーの位置に従って予測されるならば、黄色ブドウ球菌の存在が示される。一対のプライマーは、例えば、配列番号：３および４、または配列番号：５および６であり得る。検出工程は、長さが１０〜１０００（例えば、１０〜５００、１０〜２５０、または１０〜５０）ヌクレオチドであって、黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域から選択されるオリゴヌクレオチドを含有する核酸に対して増幅産物をハイブリダイズさせることを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、配列番号：２またはその相補体、配列番号：７またはその相補体、配列番号：８またはその相補体；または配列番号：２、７、または８、またはその相補体から選択される断片であり得る。
【０００８】
さらに、黄色ブドウ球菌を検出するためのキットは本発明に含まれる。該キットは前記した核酸の１又は２以上を含む（例えば、プライマー対としての配列番号：３および４およびプローブとしての配列番号：７）。それはＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液、又は前記プローブの１以上がそれに固定化される固体支持体のような他の成分を含むことができる。
【０００９】
本発明は、黄色ブドウ球菌検出のための迅速、正確かつ高感度の方法を提供する。本発明の１又は２以上の態様の詳細を以下に述べる。本発明の他の利点、特徴および目的は詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１０】
（詳細な説明）
本発明は、黄色ブドウ球菌を検出する方法に関する。具体的には、黄色ブドウ球菌を含有することが疑われる試料からの核酸鋳型を一対の黄色ブドウ球菌−特異的プライマーで増幅する。存在する場合には、増副産物をゲル電気泳動および染色によって、またはプローブハイブリダイゼーションによって検出する。検出された増幅産物のサイズがプライマーの位置によって予測されるならば、試料中の黄色ブドウ球菌の存在が示される。
【００１１】
核酸鋳型は、精製されたまたは未精製形態のＤＮＡ（例えば、ゲノム断片または制限断片）またはＲＮＡであり得る。核酸鋳型は水試料または食品試料から得ることができる。それは生物学的試料（例えば、患者または動物からの検体）から得ることもできる。
【００１２】
本発明は、ギャップレギュレーター遺伝子領域、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ１３３５２０（配列番号；１）のヌクレオチド１〜１７９２（配列番号；１）から選択された黄色ブドウ球菌−特異的プライマーをその要旨とする。この領域は、オープンリーディングフレーム、すなわち、３３７アミノ酸を持つ解糖オペロンレギュレーター蛋白質をコードする前記で示されたヌクレオチド７７９〜１７９２（配列番号：９）を含む。具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ　ＢＬＡＳＴサーチの結果は、配列番号：２のＤＮＡ配列（前記で示したヌクレオチド１〜１２６０）が黄色ブドウ球菌に対して特異的であることを示す。一対の増幅プライマーは、黄色ブドウ球菌を検出するために、配列番号：２およびその相補体から選択することができる。
【００１３】
選択されたプライマー対の１つにおいて、順方向プライマーは２０オリゴヌクレオチドＳｔａ２７、５’−ＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＡＡＴＡＧＣＣＡ−３’（配列番号：３）であり、逆方向プライマーは２２オリゴヌクレオチドＳｔａ２８、５’−ＴＡＴＡＡＴＡＡＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：４）である。
【００１４】
もう１つの選択されたプライマー対において、順方向プライマーは２０オリゴヌクレオチドＳｔａ２９、５’−ＣＧＧＴＡＴＧＧＡＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号：５）であり、逆方向プライマーはもう１つの２０オリゴヌクレオチドＳｔａ３０、５’−ＴＡＧＧＣＧＡＡＡＡＴＧＴＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号：６）である。
【００１５】
典型的には、プライマーは長さが１４〜４０ヌクレオチドである。ＰＣＲアプリケーションマニュアル（ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｉｔｏｎ　Ｍａｎｕａｌ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、１９９５、３７頁参照。本発明においては、各々が黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域から選択されるオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号：３〜６）を含み、長さが１４〜４０（例えば、１４〜３０および１４〜２０）を有する一対のプライマーを用いて、黄色ブドウ球菌鋳型を増幅することができる。黄色ブドウ球菌配列を選択されたオリゴヌクレオチドの５’−末端または３’−末端いずれかに付加することができ；非黄色ブドウ球菌配列を選択されたオリゴヌクレオチドの５’−末端に付加させることができる。非黄色ブドウ球菌配列の例は制限部位を含む配列であり、これを用いて増幅産物のクローニングを促進させることができる。
【００１６】
また、本発明は、黄色ブドウ球菌ギャップレギュレーター遺伝子領域、例えば、配列番号：２またはその相補体、配列番号：７（すなわち、前記したプライマーＳｔａ２７およびＳｔａ２８の間およびそれを含めたＤＮＡ配列）またはその相補体、配列番号：８（すなわち、前記したプライマーＳｔａ２９およびＳｔａ３０の間およびそれを含めたＤＮＡ配列）またはその相補体から選択される黄色ブドウ球菌−特異的プローブをその要旨とする。ＧｅｎＢａｎｋ　ＢＬＡＳＴサーチ結果は、プライマー対Ｓｔａ２７およびＳｔａ２８およびプライマー対Ｓｔａ２９およびＳｔａ３０で増幅した核酸配列は共に黄色ブドウ球菌−特異的であることを示す。これらのプローブは、未増幅黄色ブドウ球菌核酸または前記したプライマー対で増幅した黄色ブドウ球菌核酸にハイブリダイズさせることによって黄色ブドウ球菌を検出するのに用いることができる。典型的には、プローブは長さが１０〜１０００（例えば、１０〜５００、１０〜２５０または１０〜５０）ヌクレオチドを有する。プローブは単に配列番号：２、配列番号：７、配列番号：８、およびそれらの相補的配列であり得る。
【００１７】
プローブは膜（ナイロン膜またはニトロセルロース膜）、ガラスまたはプラスチックポリマーのような固体支持体の表面に固定化することができる。膜へのプローブの固定化は、８０℃において焼くか、またはＵＶ架橋させることによって達成することができる。また、プローブはガラスの表面に塗布した材料（例えば、ポリリシン）に共有結合させることもできる。加えて、プラスチックポリマー上にプローブを固定化する新規な方法が最近開発されている。米国特許出願第／９０６，２０７号参照。別法として、プローブは固体基材上で正確な位置にデ・ノボにて合成することができる。Ｓｃｈｅｎａら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：４６７；Ｋｏｚａｌら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２　（７）：７５３；Ｃｈｅｎｇら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４（２）：３８０；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、１９９５、Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９（３）：４４２；Ｐｅａｓｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：５０２２；Ｆｏｄｏｒら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ　３６４：５５５；ａｎｄ　Ｆｏｄｏｒら、ＷＯ９２／１００９２参照。
【００１８】
標的ＤＮＡ配列（すなわち、未増幅黄色ブドウ球菌核酸または前記プライマー対で増幅した黄色ブドウ球菌核酸）は、それを固定化されたプローブに結合させることによって検出することができる。検出を容易にするには、標識された増幅産物を標識された増幅プライマーで生じさせることができる。別法として、標識は増幅後に化学的にまたは酵素的に行うことができる。標識試薬の例は、限定されるものではないが、蛍光分子（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、放射性同位体（例えば、３２Ｐおよび１２５Ｉ）、比色試薬およびケミルミネセント試薬を含む。ビオチンおよびジゴキシゲニンは、膜またはプラスチックポリマー上での比色検出で頻繁に使用される。Ｃｙ３およびＣｙ５のような蛍光標識はガラス上での検出に広く用いられる。加えて、人工タギングテール（例えば、蛋白質またはその抗体）をプライマーの５’−末端またはプローブのいずれかの端部にコンジュゲートすることができる。ＳｔｅｔｓｅｎｋｏおよびＧａｉｔ，２０００，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５（１６）：４９００参照。
【００１９】
本発明の黄色ブドウ球菌検出方法の特異性は予期せぬほど高い。黄色ブドウ球菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌種、赤痢菌種、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）およびストレプトコッカス・アガラクティー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）からの核酸鋳型を選択されたプライマー対Ｓｔａ２７およびＳｔａ２８またはプライマー対Ｓｔａ２９およびＳｔａ３０で増幅した場合、黄色ブドウ球菌のみを増幅することができ、他の細菌から調製した鋳型の増幅はない（以下の実施例１参照）。最も予測できないのは、他のブドウ球菌種（例えば、ｈｏｍｉｎｉｓ、ｃｏｈｎｉｉ，ｃａｒｎｕｓｕｓ，ｌｅｎｔｕｓ，ｗａｒｎｅｒｉ，ｓｉｍｕｌａｎｓ，ｘｙｌｏｓｕｓ，ｃａｐｒａｅ，ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，ａｒｌｅｔｔａｅ，ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ，ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ，ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ，およびｃａｐｉｔｉｓ：以下の実施例１参照）から調製した鋳型から黄色ブドウ球菌鋳型を区別する２つのプライマー対の能力である。
【００２０】
本発明の黄色ブドウ球菌検出方法の感度は予期せぬことに高い。具体的には、検出することができる黄色ブドウ球菌ＤＮＡの量は、プライマー対Ｓｔａ２７／Ｓｔａ２８での１ｍｌの１０２ｃｆｕ／ｍｌ培養からの抽出物と同程度に低く、およびプライマー対Ｓｔａ２９／Ｓｔａ３０での１ｍｌの１０４ｃｆｕ／ｍｌ培養からの抽出物と同程度に低い（後記実施例２参照）。
【００２１】
複数微生物の同時同定のための他の種−特異的核酸配列と組み合わせて前記した黄色ブドウ球菌−特異的配列を用いることも本発明に含まれる。
【００２２】
さらに、単一のヌクレオチド多形が起こる位置において、ヌクレオチド変異が本発明で記載したプライマーおよびプローブで許容される。単一のヌクレオチド多形を特定の遺伝子型または表現型と関連付けることができるので、これらのプライマーおよびプローブを用いて、異なる黄色ブドウ球菌株を区別し、分類することができる。
【００２３】
以下の具体的実施例は単に例示的なものと解釈されるべきであって、断じて開示の残りを限定するものではない。さらに技巧を凝らすことなく、当業者であれば、本明細書中の記載に基づき、本発明を十分に利用できると考えられる。本明細書中で引用した全ての刊行物はここに引用してその全体を一体化させる。
【００２４】
【実施例１】
実施例１　特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いた黄色ブドウ球菌の検出
（１）細菌株
細菌株の４つの群を本実施例で用いた（以下の表１参照）：
（ａ）１５のブドウ球菌種（ａｕｒｅｕｓ，ｈｏｍｉｎｉｓ，ｃｏｈｎｉｉ，ｃａｒｎｕｓｕｓ，ｌｅｎｔｕｓ，ｗａｒｎｅｒｉ，ｓｉｍｕｌａｎｓ，ｘｙｌｏｓｕｓ，ｃａｐｒａｅ，ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，ａｒｌｅｔｔａｅ，ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ，ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ，ｈｏｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓおよびｃａｐｉｔｉｓ）を含めブドウ球菌群；
（ｂ）６４の株（８つの非病原性および５６の病原性サブタイプ／血清タイプ）を含む大腸菌群；
（ｃ）５６のサルモネラ菌種を含むサルモネラ菌群；および
（ｄ）１１の病原性株（４つの赤痢菌種；３つのコリ型細菌エンテロバクター・エロゲネス、シトロバクター・フロインディおよび肺炎桿菌；３つの他の食品で生じる病原性細菌株リステリア・モノサイトゲネス、腸炎ビブリオおよびセレウス菌；および１つのウシ乳房炎を引き起こす１つの感染性細菌株、ストレプトコッカス・アガラクティー）を含む他の細菌群。
【００２５】
これらの細菌株は、カルチャーコレクション・リサーチセンター（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＣＲＣ；台湾、新竹（Ｈｓｉｎ−Ｃｈｕ，Ｔａｉｗａｎ）），食品・薬品国立研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇｓ）（ＮＬＦＤ；中華民国、台湾、台北（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．））、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ；米国、メリーランド州、ロックヴィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ））、米国農務省（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）（ＵＳＤＡ；米国、ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ））、ワクチン開発センター（Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（ＣＶＤ；米国、メリーランド州、バルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）のメリーランド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍａｒｙｌａｎｄ））、および屏東科学技術大学（Ｐｉｎｇｔｕｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＰＴ；中華民国、台湾、屏東（Ｐｉｎｇｔｕｎｇ，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．））等の異なる源から入手した。
【００２６】
（２）細菌培養
個々の細菌株の培養
１白金耳の各テスト株をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天（ＬＢ；０．５％酵母エキス、１％トリプシン、０．５％ＮａＣｌ、１．５〜２％寒天）上で平板培養し、３７℃にて一晩（１４時間）インキュベートした。単一のコロニーを拾い、３ｍｌの滅菌したＬＢブロスに接種し、１５０〜１８０ｒｐｍにて震盪しつつ、３７℃で一晩インキュベートした。各細菌培養の密度は〜１×１０１０細胞）ｍｌであった。
【００２７】
細菌混合物の調製
ブドウ球菌群では、混合物は全ての１５の一晩培養物（各々０．０５ｍｌ）を組み合わせることによって調製した。大腸菌群およびサルモネラ菌群では、同一群において各１０の細菌株（各々０．０５ｍｌ）の一晩培養物を組み合わせることによって「プレミックス」を調製した。大腸菌群における最後のプレミックスは１４の株を有し、サルモネラ菌群における最後のプレミックスは６つの株を有する。次いで、１００マイクロリットルの各プレミックスを合わせることによって「最終ミックス」を調製した。他の細菌群では、全ての１１の一晩培養物（各々０．０５ｍｌ）を合わせることによって混合物を調製した。
【００２８】
（３）細菌ゲノムＤＮＡの調製
ＭｉｃｒｏＬＹＳＩＳ（登録商標）（マイクロゾーン社、英国（Ｍｉｃｒｏｚｏｎｅ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫ））を用いることによって、ゲノムＤＮＡを細菌混合物から単離した。１７μｌのＭｉｃｒｏＬＹＳＩＳ（登録商標）緩衝液を３マイクロリットルの各細菌培養ミックスと混合した。提案された熱サイクリングプロフィール：工程１−６５℃で５分間、工程２−９６℃で２分間、工程３−６５℃で４分間、工程４−９６℃で１分間、工程５−６５℃で１分間、工程６−９６℃で３０秒間、および工程７−２０℃に保持にて、製造業者のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡを抽出した。熱サイクリング処理後のＭｉｃｒｏＬＹＳＩＳ（登録商標）／ＤＮＡ混合物を、増幅用のＤＮＡ鋳型として直接適用した。理論的には、そのようなＭｉｃｒｏＬＹＳＩＳ（登録商標）／ＤＮＡ混合物の１μｌは、各細菌株の１．８×１０４〜１．４×１０５細胞から抽出したゲノムＤＮＡを含有した。
【００２９】
（４）黄色ブドウ球菌−特異的オリゴヌクレオチドプライマーでの細菌ゲノムＤＮＡの増幅
増幅混合物
５０マイクロリットルの増幅反応混合物は５μｌの１０×Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（米国、ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））、５μｌの２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２（プロメガ社）、５μｌの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ（プロメガ社）、１μｌの各オリゴヌクレオチドプライマー（２０μＭ）、１μｌの前記した合計ゲノムＤＮＡ鋳型、１ＵのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社）、および滅菌したｄＨ２Ｏを含有する。
【００３０】
増幅条件
増幅はＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて以下のように行った：９５℃で２分間；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の３０サイクル；および６分間７２℃における最終伸長。
【００３１】
（５）アガロース電気泳動による増幅産物の分析
ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、氷酢酸でｐＨを調整）中にて、２％アガロースでの電気泳動によって増幅産物（５０μｌ）を分析し、臭化エチジウムで染色した。
【００３２】
実験結果は、選択されたオリゴヌクレオチドプライマーが、黄色ブドウ球菌を検出するのに予期せぬことに高度に特異的であることを示す。細菌株を群、すなわち、群（ａ）〜（ｄ）でテストすると、予期された増幅産物（プライマー対Ｓｔａ２７／Ｓｔａ２８につき２５０ｂｐおよびプライマー対Ｓｔａ２９／Ｓｔａ３０につき３００ｂｐの分子量）はブドウ球菌群において検出できたに過ぎなかった。他の３つの群では増幅産物は観察されなかった。さらに、１５のブドウ球菌株を個々にテストすると、予期された増幅産物は黄色ブドウ球菌で検出されたに過ぎなかった。他の１４のブドウ球菌株では増幅産物は観察されなかった。
【００３３】
実施例２　黄色ブドウ球菌−特異的オリゴヌクレオチドプライマーの検出感度黄色ブドウ球菌の一晩培養を３７℃にてＬＢブロス中で増殖させ、細胞濃度、コロニー形成単位／ｍｌ（ｃｆｕ／ｍｌ）を測定した。ゲノムＤＮＡを１ｍｌの１０９ｃｆｕ／ｍｌ培養から抽出し、１ｍｌの１００〜１０７ｃｆｕ／ｍｌ培養からの抽出物と同等の濃度に系列的に希釈した。
【００３４】
黄色ブドウ球菌ゲノムＤＮＡの系列希釈を鋳型として用いる以外は、実施例１に記載しているように増幅を行った。予期せぬことに、検出できた黄色ブドウ球菌ＤＮＡの量は、プライマー対Ｓｔａ２７／Ｓｔａ２８での１ｍｌの１０２ｃｆｕ／ｍｌ培養からの抽出物と同程度に、およびプライマー対Ｓｔａ２９／Ｓｔａ３０での１ｍｌの１０４ｃｆｕ／ｍｌ培養からの抽出物と同程度に低かった。
【００３５】
【表２】
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【表３】
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他の態様
本明細書中に開示した特徴の全てはいずれかの組合せにて組み合わせることができる。本明細書中に開示した各特徴は、同一、同等または同様の目的に供する別の特徴によって置き換えることができる。かくして、明示的に特記しない限り、各開示された特徴は同等または同様な特徴のジェネリックシリーズの例に過ぎない。
【００３６】
前記から、当業者であれば、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の必須的特徴を容易に確認することができ、本発明の種々の変形および修飾をなして、それを種々の用法および条件に適合させることができる。かくして、他の具体例も以下の請求の範囲の範囲内のものである。
【外国語明細書】
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