(57)【要約】【課題】アルデヒド基を導入した固相基板表面にアミノ基を含有する生理活性物質、特にオリゴヌクレオチドを固定する際、固定化効率を向上させ、かつ、スポット形状・サイズの再現性を向上させるため、該生理活性物質を溶解または分散させるための水性組成物を提供すること。【解決手段】生理活性物質を固相基板上に固定化するために生理活性物質を含む溶液を固相基板上に接触させる際に、該生理活性物質を溶解または分散させるための水性組成物であって、界面活性剤および水溶性高分子を含み、かつ、緩衝塩によりｐＨが調整されている水性組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を固相基板上に固定化するために生理活性物質を含む溶液を固相基板上に接触させる際に、該生理活性物質を溶解または分散させるための水性組成物であって、界面活性剤および水溶性高分子を含み、かつ、緩衝塩によりｐＨが調整されていることを特徴とする水性組成物。
【請求項２】
ｐＨが８〜１２に調製されている請求項１記載の水性組成物。
【請求項３】
水溶性高分子が平均分子量１００００〜２０００００のポリビニルアルコールであり，その濃度が０．０００１〜０．１重量％である請求項１または２記載の水性組成物。
【請求項４】
界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを含み，その濃度が０．０００１〜０．１重量％である請求項１〜３いずれか記載の水性組成物。
【請求項５】
粘度が０．１〜２ｍＰａ・ｓである請求項１〜４いずれか記載の水性組成物。
【請求項６】
生理活性物質を請求項１〜５いずれか記載の水性組成物で溶解又は分散したことを特徴とする水性液。
【請求項７】
生理活性物質がアミノ基を含有する請求項６記載の水性液。
【請求項８】
生理活性物質がアミノ基を含有するポリヌクレオチドである請求項７記載の水性液。
【請求項９】
生理活性物質を固相基板上に固定化する方法において、請求項１〜５いずれか記載の水性組成物に該生理活性物質を溶解または分散させた水性液を固相基板上に接触させる工程を含むことを特徴とする生理活性物質の固定化方法。
【請求項１０】
生理活性物質が核酸、タンパク質、糖鎖、糖タンパクのうち少なくとも一つを含む請求項９記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１１】
生理活性物質が核酸である請求項９記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１２】
生理活性物質が塩基数１０〜２００の核酸であり、その分子鎖にアミノ基が導入されている請求項１１記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１３】
固相基板が飽和環状ポリオレフィン樹脂製である請求項９〜１２いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１４】
固相基板表面と純水との接触角が６０〜１８０度である請求項９〜１３いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１５】
固相基板の表面には予めアルデヒド基が導入されている請求項９〜１４いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１６】
生理活性物質がアミノ基を有し、生理活性物質の固相基板への固定化が，アルデヒド基とアミノ基の化学結合を介してなる請求項１５記載の生理活性物質の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸、タンパク質、糖鎖、糖タンパクなどの生理活性物質を固相基板上に固定する際に，生理活性物質を溶解または分散するために用いる水性組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡなどの生理活性物質溶液を固相基板上に点着（スポット）して作製するバイオチップの使用が一般化する中、解析精度の高いバイオチップが求められている。バイオチップの解析精度は、スポットの形状・サイズの安定性、および、検出限界に左右される。スポットの形状・サイズにバラツキが多い場合、バイオチップから読み取ったシグナルを解析、数値化するさいに誤差を生じるため、正確な評価が不可能となる。また、検出限界が低い場合、検体（プローブＤＮＡ）量が少ない場合にシグナルの検出が不可能であったり、Ｓ／Ｎ比が低くなって正確な評価ができなくなる等の障害がある。検出限界の向上のためには、プローブＤＮＡ中にごく微量含まれる遺伝子配列等を正確に検知し、捕捉させる必要がある。そのためには、プローブＤＮＡを捕捉するＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）を固相基板上に高密度に固定することが有効であり、効率の良い固定化手段が求められている。
【０００３】
ＤＮＡの点着は通例、ＳＳＣ（クエン酸―塩化ナトリウム標準緩衝液）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、リン酸緩衝液などの緩衝液、生理的食塩水あるいは滅菌水などにＤＮＡを溶解して行う。しかしながら、これらの溶液を用いた場合、基板と溶液との濡れ性、親和性が低い場合にはスポットの形状が乱れることがある。特に、基板が高分子物質からなる場合、時間の経過とともに表面の親水性官能基がバルク側へと反転し、基板表面が疎水化する場合がある。表面が疎水性であると、スポットする溶液が基板上に十分に残存せず、点着量が不足であったり、スポットの形状、サイズにばらつきが生じたりすることがある。
【０００４】
スポットの形状・サイズの安定化の手段として、ＤＮＡ溶液の粘度のコントロールが有効であるとされている（例えば、非特許文献１などを参照）。具体的には、ＤＮＡ溶液に親水性ポリマーや、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の不揮発性液体の添加が試みられ、スポットの形状の安定化に効果のあることが報告されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３など）。しかしながら、上記のような手法では、ターゲットＤＮＡ固定化量の向上、すなわち、検出限界の向上は期待できない。さらに、基板の疎水性が高い場合、粘度のコントロールのみでは濡れ性の最適化が不可能な場合がある。
【０００５】
ターゲットＤＮＡの固相基板上への固定の方法には大別して、吸着による方法と共有結合を形成させる方法がある。吸着による方法は、ポリ―Ｌ―リジンやアミノシランで処理することで基板表面に正電荷を付与し、ＤＮＡのリン酸基との間に静電的な吸着を起こさせるものである。しかしながら、この方法では吸着したＤＮＡの脱落が起こりやすいため、ハイブリダイズが効率的に起こらずＤＮＡの検出が不可能であったり、検出強度にばらつきが生じたりする。
【０００６】
そこで、ＤＮＡの固定には共有結合を形成させる方法が有効である。最も一般的な方法は、基板表面にアルデヒド基などの官能基を導入しておき、末端にアミノ基を導入したＤＮＡを反応させる方法である。この反応は、中間体であるシッフ塩基の形成と、引き続いて起こる脱水反応による共有結合の形成である。このとき、アルデヒド基とアミノ基の反応性を高めることでＤＮＡの固定化効率の向上が期待できる。
しかしながら、スポットの形状・サイズを安定に保ちつつ、アルデヒド基とアミノ基の反応性を高める手段はこれまでに無く、有効な解決法が求められている。
【０００７】
【非特許文献１】「細胞工学別冊  ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」秀潤社、２０００年
【特許文献１】特開２００１−１２８６８３号公報
【特許文献２】特開２００１−１８６８８０号公報
【特許文献３】特許第３３９８３６６号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アルデヒド基を導入した固相基板表面にアミノ基を含有する生理活性物質、特にオリゴヌクレオチドを固定する際、固定化効率を向上させ、かつ、スポット形状・サイズの再現性を向上させるため、該生理活性物質を溶解または分散させるための水性組成物を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）生理活性物質を固相基板上に固定化するために生理活性物質を含む溶液を固相基板上に接触させる際に、該生理活性物質を溶解または分散させるための水性組成物であって、界面活性剤および水溶性高分子を含み、かつ、緩衝塩によりｐＨが調整されていることを特徴とする水性組成物，
（２）ｐＨが８〜１２に調製されている（１）記載の水性組成物，
（３）水溶性高分子が平均分子量１００００〜２０００００のポリビニルアルコールであり，その濃度が０．０００１〜０．１重量％である（１）または（２）記載の水性組成物，
（４）界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを含み，その濃度が０．０００１〜０．１重量％である（１）〜（３）いずれか記載の水性組成物，
（５）粘度が０．１〜２ｍＰａ・ｓである（１）〜（４）いずれか記載の水性組成物，
（６）生理活性物質を（１）〜（５）いずれか記載の水性組成物で溶解又は分散したことを特徴とする水性液，
（７）生理活性物質がアミノ基を含有する（６）記載の水性液，
（８）生理活性物質がアミノ基を含有するポリヌクレオチドである（７）記載の水性液、
（９）生理活性物質を固相基板上に固定化する方法において、（１）〜（５）いずれか記載の水性組成物に該生理活性物質を溶解または分散させた水性液を固相基板上に接触させる工程を含むことを特徴とする生理活性物質の固定化方法，
（１０）生理活性物質が核酸、タンパク質、糖鎖、糖タンパクのうち少なくとも一つを含む（９）記載の生理活性物質の固定化方法，
（１１）生理活性物質が核酸である（９）記載の生理活性物質の固定化方法，
（１２）生理活性物質が塩基数１０〜２００の核酸であり、その分子鎖にアミノ基が導入されている（１１）記載の生理活性物質の固定化方法，
（１３）固相基板が飽和環状ポリオレフィン樹脂製である（９）〜（１２）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法，
（１４）固相基板表面と純水との接触角が６０〜１８０度である（９）〜（１３）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法、
（１５）固相基板の表面には予めアルデヒド基が導入されている（９）〜（１４）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法、
（１６）生理活性物質がアミノ基を有し、生理活性物質の固相基板への固定化が，アルデヒド基とアミノ基の化学結合を介してなる（１５）記載の生理活性物質の固定化方法、
である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
スポットの形状・サイズの安定化について記述する。バイオチップを作成する際には通例、ＳＳＣ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、リン酸緩衝液などの緩衝液、あるいは蒸留水、生理的食塩水に生理活性物質を溶解して点着する。しかしながら、これらの溶液を用いた場合、基板と溶液の濡れ性、親和性が低い場合にはスポットの形状、サイズにバラツキの生じることがある。これを解決するためには、溶液に水溶性高分子などの添加物を加えて、基板と溶液の親和性の向上を図ることが有効である。さらに、水溶性高分子の添加量を変化させることにより、スポットした溶液の乾燥速度をコントロールすることが可能となる。スポットの乾燥速度が早すぎると、生理活性物質の固定化量にムラが発生する場合や、反応時間が不十分で固定化量が低くなる場合がある。
【００１１】
本発明に用いる水溶性高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコールに代表される合成高分子、セルロースおよびその誘導体、ゼラチン等に代表される天然高分子が挙げられるが、ポリビニルアルコールが特に好ましい。
水溶性高分子の添加量は、好ましくは０．０００１〜１０重量％、より好ましくは０．００１〜１重量％であり、最も好ましくは０．００１〜０．１重量％である。水溶性高分子の添加量が１０重量％を超えると，粘度が高すぎて、溶液の取り扱い、スポット装置の洗浄などに支障を及ぼすため、好ましくない。逆に、０．０００１重量％未満では、水溶性高分子の添加効果が現れないため，好ましくない。
【００１２】
本発明の水性組成物において、溶液の取り扱い，スポット装置の洗浄などの操作に支障を及ぼさず，かつ，基板との親和性を向上させるために，最適の粘度範囲が存在する。すなわち，本発明の水性組成物の好ましい粘度は，０．１〜２ｍＰａ・ｓであり，より好ましくは０．５〜１．８ｍＰａ・ｓであり，さらに好ましくは０．８〜１．６ｍＰａ・ｓであり，最も好ましくは１〜１．２ｍＰａ・ｓである。
【００１３】
水溶性高分子の平均分子量は、１００００〜１００００００が好ましく、１００００〜５０００００がより好ましく、１００００〜２０００００がさらに好ましく、５００００〜１５００００が最も好ましい。
水溶性高分子以外の添加物には、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等があり、適宜用いることができる。
【００１４】
以下、基板がプラスチック製の場合について記述する。高分子物質の表面近傍の分子鎖は自由度が比較的高く、外部の環境に応じて表面（界面）自由エネルギーを低下させる方向に表面性質が変化することがある。たとえば、高分子物質表面を水と接触させると、界面自由エネルギーを低下させようと、表面近傍の分子鎖中の親水性官能基は表面に向かって配向し、疎水鎖はバルク側に配向する傾向を示す。逆に、高分子表面が真空や空気に暴露された場合、表面自由エネルギーを低下させるため、親水性官能基はバルク側に潜り込み、表面は疎水化される傾向がある。
【００１５】
基板の保存は通例、空気中あるいは減圧空気中あるいは真空中にて行われるため、上述のように基板表面は保存日数とともに疎水化する。このため、長期保存後の基板表面は基板作製時よりも疎水性となっており、安定なスポットが困難である場合が多い。これを解決するためには、スポットする溶液の界面張力を低下させることが有効である。すなわち、固定化すべき生理活性物質を含む溶液に界面活性剤を添加することにより、溶液と基板表面との濡れ性を高め、スポットの形状およびサイズを安定化する。
【００１６】
本発明に用いる界面活性剤としては、一般的なものを用いることができ、アニオン性、カチオン性あるいはノニオン性であってもよいが、ノニオン性がより好ましい。また、界面活性剤は常温常圧で液状のものが好ましい。常温常圧で固体のものは、スポットが乾燥した際に凝集し、スポットが不均一となる場合がある。ノニオン性界面活性剤として、グリセリン脂肪酸エステル類、プロピレングリコール脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類などを好適に用いることができるが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類がより好ましく、最も好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである。
界面活性剤の添加量は０．００００１〜１０重量％が好ましく、０．０００１〜１重量％がより好ましく、０．０００１〜０．１重量％が最も好ましい。過剰量の界面活性剤の添加は生理活性物質の基板上への固定化を阻害することがあり、好ましくない。また、溶液と基板表面の濡れ性が高すぎてもスポット形状が安定しないため、適量の界面活性剤の添加が重要となる。逆に、界面活性剤添加量が過少であると、十分な濡れ性向上の効果が得られないため、好ましくない。
【００１７】
固定化効率の向上について記述する。本発明にて用いるバイオチップ作成用の固相基板は、表面に化学的に活性なアルデヒド基を有するものであることが好ましい。固定化するＤＮＡは、オリゴＤＮＡであっても長鎖ＤＮＡであってもよく、分子鎖末端あるいは主鎖上にアルデヒド基と反応する官能基、特にアミノ基を有することが好ましい。基板の素材としてはプラスチックを用いることが好ましい。プラスチックは加工性、表面処理性に富むことから、バイオチップ用基板の材料として有用である。プラスチックとしては、自己蛍光が低く、耐熱性、耐薬品性に優れるものを用いることが好ましく、飽和環状ポリオレフィンなどを好適に利用可能である。
【００１８】
基板への生理活性物質の固定化効率を向上させるためには、生理活性物質に含まれるアミノ基と、基板表面のアルデヒド基との反応性を高めることが有効である。アルデヒド基とアミノ基との反応は、中間体であるシッフ塩基の形成と、引き続いて起こる脱水反応による共有結合の形成である。この反応の最適ｐＨは７以上であり、ｐＨが高くなるほど反応性は大きくなる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）などを参照）。このため、スポットする生理活性物質溶液のｐＨを７以上に調整することにより固定化効率の向上が期待できる。溶液のｐＨとしては、好ましくは７以上、より好ましくは８〜１２であり、９〜１１が最も好ましい。ｐＨおよび塩濃度の調整のために、各種塩類を適宜使用することができる。
【００１９】
【実施例】
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。
（ＤＮＡ溶液の調整）
ＤＮＡ溶液１；  ５’末端にアミノ基を導入した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡを０．２μｇ／μｌの濃度で純水に溶解した。
ＤＮＡ溶液２；  ローダミン標識を施した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（溶液１のアミノ基導入オリゴＤＮＡと相補的な配列を有するもの）を０．００２μｇ／μｌの濃度で所定の緩衝溶液に溶解した。
【００２０】
（水性組成物の調整）
（実施例１）
０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液と０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を１：９の配合で混合した。この溶液に、ポリビニルアルコール（平均重合度２０００、ケン化度９９．９％、和光純薬工業（株）製）を０．０５重量％の濃度で溶解した。さらに、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（「ＴＷＥＥＮ−２０」、和光純薬工業（株）製）を０．００５重量％の濃度で溶解した。この水性組成物の粘度を，ＪＩＳ  Ｚ８８０３に記載の方法にしたがって測定したところ，１．１ｍＰａ・ｓであった。この水性組成物とＤＮＡ溶液１を等量混合し、ＤＮＡの最終濃度が０．１μｇ／μｌである水性液を調整した。  水性液のｐＨは１１であった。
【００２１】
（比較例１）
０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液と０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を１：９で混合した。この水性組成物とＤＮＡ溶液１を等量混合し、水性液を調整した。水性液のｐＨは１１であった。
（比較例２）
純水にポリビニルアルコールを０．０５重量％の濃度で溶解した。この水性組成物とＤＮＡ溶液１を等量混合し、水性液を調整した。水性液のｐＨは５であった。
（比較例３）
純水にポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを０．００５重量％の濃度で溶解した。この水性組成物とＤＮＡ溶液１を等量混合し、水性液を調整した。水性液のｐＨは５であった。
（比較例４）
純水とＤＮＡ溶液１を等量混合し、水性液を調整した。水性液のｐＨは５であった。
（比較例５）
２倍濃度のＳＳＣ緩衝液（０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液）とＤＮＡ溶液１を等量混合し、水性液を調整した。水性液のｐＨは７であった。
（比較例６）
市販のリン酸緩衝溶液（２倍濃度）とＤＮＡ溶液１を等量混合し、水性液を調整した。水性液のｐＨは７．４であった。
【００２２】
（スポットおよびハイブリダイゼーション）
実施例１および比較例１〜６の方法で調整した水性液溶液を９６穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて基板上に点着した。基板として、表面にアルデヒド基を導入したプラスチック製のものを用いた。基板はアルデヒド基導入処理後、３０日経過したものを用いた。点着終了後、余分なアルデヒド基をブロッキングしたのち、基板表面とＤＮＡ溶液２を恒温で一定時間接触させることにより、固定化されたオリゴＤＮＡとローダミン標識オリゴＤＮＡをハイブリダイズさせた。洗浄ののち、マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅ」（パッカードバイオチップテクノロジー社製）を用いてスポットの蛍光を検出した。スキャナーに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いてスポットの蛍光量を数値化した結果を表１に示す。スキャンしたスポットの形状を示す画像を図１〜図７に示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
【発明の効果】
本発明の水性組成物を用いることで、ＤＮＡの固定化効率の向上、および、ＤＮＡ溶液を基板上に点着する際の形状・サイズの安定化が実現された。特に、基板表面が疎水化しており、一般的な水性組成物を用いた際に基板との濡れ性が低くスポット形状が安定しない場合においても、本発明の水性組成物の使用により安定した固定化が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１のスポットの形状を示す画像
【図２】比較例１のスポットの形状を示す画像
【図３】比較例２のスポットの形状を示す画像
【図４】比較例３のスポットの形状を示す画像
【図５】比較例４のスポットの形状を示す画像
【図６】比較例５のスポットの形状を示す画像
【図７】比較例６のスポットの形状を示す画像
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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