(57)【要約】【課題】  翻訳効率の高い非翻訳領域（５’UTR）を有する糸状菌用発現ベクターの提供。【解決手段】  本発明によれば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来の特定の非翻訳リーダー配列を用いることにより翻訳効率を増加させることが可能となり、発現効率の高い糸状菌用発現ベクターが提供される。これにより、種々の有用タンパク質をより効率的に大量製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA：
（ａ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｂ）配列番号１〜４に記載のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｃ）配列番号１〜４に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｄ）配列番号１〜４に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA：
（ａ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｂ）配列番号５〜８に記載のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｃ）配列番号５〜８に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｄ）配列番号５〜８に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列。
【請求項３】
糸状菌細胞内において機能しうるプロモーター領域と、目的のポリペプチドをコードするDNA配列の間の非翻訳領域に請求項１又は２記載の配列を含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項４】
プロモーターが、P-No8142であることを特徴とする、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
目的のポリペプチドをコードするDNA配列が、βグルクロニダーゼ（GUS）をコードするuidA遺伝子であることを特徴とする請求項３又は４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載の発現ベクターを糸状菌に導入して得られた形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を利用することによるポリペプチドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌を宿主とした有用タンパク質の効率的製造に関するものであり、詳細には、翻訳効率の高い新規な非翻訳領域（５’UTR）、該翻訳効率の高い非翻訳領域（５’UTR）を有する発現ベクター、該ベクターを導入された形質転換宿主細胞、およびそれを用いた有用タンパク質ならびにポリペプチドの製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換えによる有用タンパク質生産の宿主としては、大腸菌や枯草菌をはじめ酵母、昆虫、植物細胞、動物細胞等数多くの系が開発されており、生産させようとする目的タンパク質によってより適した系が選択されているのが現状である。糸状菌は多種多様の酵素タンパク質を分泌生産している。特に、アスペルギルス（Aspergillus）属やトリコデルマ（Trichoderma）属は酵素タンパク質を著量に分泌生産する能力に優れているため、工業的な酵素製剤の生産に利用されている。これらの菌株の中には、培養液１リットルあたり２０g以上、小麦フスマ１kgあたり５０gという高い生産性を示すものもある。一方、異種タンパク質の生産においては、タンパク質のフォールディングや糖鎖付加などの翻訳後修飾が本来の生物と同様に行われることが重要である。糸状菌は大腸菌や酵母より進化的に高等動物に近いので、動物由来異種タンパク質を活性ある形で生産することも期待できる。また、麹菌アスペルギルス・オリゼのように古くから発酵食品の製造に用いられているものが多く、その生産物は安全であるというGRAS（generally regarded as safe）グレードとして認められているので、これらの糸状菌による有用タンパク質生産も認可されやすいと考えられる。アスペルギルス・オリゼをはじめとする糸状菌は一般的に有性生活環が認められず、分生子も多核であるために、古典遺伝学的手法による遺伝解析は容易ではなく、分子生物学的研究も他の微生物に比べて遅れていた。しかし、１９８０年代後半になって、産業的に重要な糸状菌について形質転換系が確率され、糸状菌の遺伝子工学が発展してきた。このような状況の中、前述した利点にも後押しされ、糸状菌を宿主としたさまざまな有用タンパク質の生産が報告されるようになってきた（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。また、タンパク質を高発現させるために多くの強力なプロモーターが取得されており、麹菌ではαアミラーゼ遺伝子のプロモーターや（特許文献２参照）、本発明者らの改良型プロモーター（特許文献３参照）などが使用されその有用性が認められている。
【０００３】
しかしながら、糸状菌を宿主とする異種タンパク質、特に高等生物起源のタンパク質の生産については、多くの場合培養液１リットルあたりmgオーダーの低い生産量しか得られていないのが現状である（非特許文献２参照）。一般的に、異種タンパク質の分泌生産量に寄与する要因として、転写量、mRNAの安定性、翻訳効率、翻訳後修飾、分泌経路における品質管理（クオリティーコントロール）、輸送、宿主プロテアーゼによる分解などが指摘されており、障害となっているプロセスを改善するためにさまざまな方法が試みられている（非特許文献３、４参照）。その研究対象は、主に分泌経路であり、分泌機構の解明とその利用を目指したものである。これらは、糸状菌が本来持っている高い分泌能力に着眼したものである。
【０００４】
さて、遺伝子発現において転写プロセスの次に存在する翻訳プロセスも、最終的な生産量に影響すると考えられるが、糸状菌宿主において翻訳プロセスを詳細に解析した報告はなく、その機構は全く解明されていない。それゆえ、翻訳効率（翻訳開始効率）を改善することによりタンパク質の生産量を増大させようとした試みはこれまでなかった。
【０００５】
ここで真核生物一般で提唱されている翻訳機構について説明する。まず、開始tRNAが多くの開始因子とともに４０Sリボソームサブユニットへ結合する。この４０S複合体がキャップ（CAP）構造を有するmRNAの５’末端に結合し、mRNAを３’方向に走査（スキャン）して開始コドン（AUG）を探す。開始コドンが認識されたところで６０Sリボソームサブユニットが結合して８０S開始複合体として完成する。タンパク質合成の速さ（翻訳効率）は開始段階で決定されると考えられており、mRNAの５’端から開始コドンまでのいわゆる５’非翻訳領域（５’UTR）のスキャンニングプロセスが非常に重要となる。翻訳効率に影響を及ぼすmRNA上の因子としては、キャップ構造の有無、５’UTRの２次構造（非特許文献５参照）、開始コドン近傍の塩基配列（非特許文献６、７参照）、および翻訳エンハンサーと定義されている特殊な１次配列（非特許文献８参照）などが示されている。一方、糸状菌の翻訳機構についてはほとんど解明されておらず、５’UTRと翻訳効率との関係を定量的に解析した報告はない。もし、翻訳開始に有効に機能する、つまり翻訳効率の高い５’UTRを取得できれば、それらを利用することにより目的遺伝子の発現を翻訳レベルで増大させるような発現ベクターの構築が可能となる。すなわち、既存の高発現プロモーターを利用した発現系の生産能力をさらに高めることにより、効率的なタンパク質生産システムを確立することが可能になると考えられる。
【特許文献１】特開昭６２−２７２９８８号公報
【特許文献２】特開平０７−５１０６７号公報
【特許文献３】特許第３３４３５６７号公報
【非特許文献１】「バイオテクノロジー（Biotechnology)」，（米国），１９８８年，第6巻，ｐ．１４１９−１４２２
【非特許文献２】宍戸和夫編著，「キノコとカビの基礎科学とバイオ技術」，株式会社アイピーシー，２００２年７月２０日，ｐ．５０９−５２８
【非特許文献３】「アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）」，（ドイツ），１９９７年，第４７巻，第１号，ｐ．１−１１
【非特許文献４】塚越規弘編著，「生物化学実験法（第４５巻）組換えタンパク質生産法」，株式会社学会出版センター，２００１年５月１５日，ｐ．７９−１０２
【非特許文献５】「ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」，（米国），１９９３年，第２６８巻，第９号，ｐ．６４５３−６４６２
【非特許文献６】「ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」，（米国），１９９１年，第２６６巻，第３０号，ｐ．１９８６７−１９８７０
【非特許文献７】「モレキュラーマイクロバイオロジー（Molecular Microbiology）」，（英国），１９９６年，第１９巻，第６号，ｐ．１２２５−１２３９
【非特許文献８】「ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Research）」，（英国），１９９２年，第２０巻，第１７号，ｐ．４６３１−４６３８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまで、糸状菌宿主において数々のタンパク質の発現が試みられている。しかし、翻訳効率（翻訳開始効率）が考慮されたことはなく、翻訳開始に効率的に機能する５’UTR配列、構造などに関する報告はない。
【０００７】
本発明の目的は、上記した現状に鑑み、糸状菌宿主における遺伝子発現系において、その発現ベクターの翻訳効率を高めることによって発現効率の高いベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明者らは鋭意研究を行い、糸状菌宿主において翻訳効率の高い発現ベクターを構築することに成功した。すなわち、レポーター遺伝子を導入した糸状菌用発現ベクターにおいて、５’UTR相当領域のみを改変（置換）し、レポーター遺伝子産物の活性を翻訳効率の指標として評価した結果、翻訳効率の高い５’UTR配列を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA：
（ａ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｂ）配列番号１〜４に記載のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｃ）配列番号１〜４に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｄ）配列番号１〜４に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列、
（２）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA：
（ａ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｂ）配列番号５〜８に記載のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｃ）配列番号５〜８に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列、
（ｄ）配列番号５〜８に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（３）糸状菌細胞内において機能しうるプロモーター領域と、目的のポリペプチドをコードするDNA配列の間の非翻訳領域に（１）又は（２）記載の配列を含有することを特徴とする発現ベクター、
（４）プロモーターが、P-No8142であることを特徴とする、（３）記載の発現ベクター、
（５）目的のポリペプチドをコードするDNA配列が、βグルクロニダーゼ（GUS）をコードするuidA遺伝子であることを特徴とする（３）又は（４）に記載の発現ベクター、
（６）（３）〜（５）のいずれか１項に記載の発現ベクターを糸状菌に導入して得られた形質転換体、ならびに
（７）（６）に記載の形質転換体を利用することによるポリペプチドの製造法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により取得された５’UTR配列を利用することにより、既存の発現ベクターの発現効率を翻訳レベルで増大させることが可能となり、目的タンパク質のさらなる高生産システムが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明発明者らは、配列番号１〜４に示す塩基配列（図３Ｂの配列の二重下線部に相当）を、非常に高い翻訳効率を示す新規５’UTR配列として新たに同定した。すなわち、本発明発明者らは、５’UTR領域に配列番号１〜４に示す配列を含有する発現ベクターを導入した形質転換体のβグルクロニダーゼ(GUS)活性は、これらの配列を含まない、GUS遺伝子（uidA）が元来有する大腸菌由来の５’UTR配列（pBI221由来の配列）を含有するコントロールベクター（pNANG8142）を導入した形質転換体のGUS活性に比べ２〜４倍増加することを見出した（図５参照）。これにより、糸状菌宿主において翻訳効率の高い５’UTR配列を提供するに至った。これらの配列は、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列であっても、同一条件下で配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列と同等の翻訳効率を保持するかぎり本発明に使用することができる。また、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であって、かつ、同一条件下でこれらの配列と同等の翻訳効率を保持するかぎり本発明に使用することができる。さらに配列番号１〜４のいずれかの塩基配列に対して、通常には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％（例えば少なくとも９５％）の相同性を有する塩基配列であって、同一条件下にて、これらの配列と同等の翻訳効率を保持するかぎり本発明に使用することができる。当業者は、これらの塩基配列を有するDNAを、適当な方法を用いて選択、取得あるいは製造することができ、使用することができる。
【００１２】
したがって、本発明は、１の態様において、
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA：
（ａ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｂ）配列番号１〜４に記載のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｃ）配列番号１〜４に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｄ）配列番号１〜４に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
を提供するものである。
【００１３】
なお、「ストリンジェントな条件」とは、配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列と、これと相同性の高い他の塩基配列とのオリゴヌクレオチド二本鎖を形成させるのに充分な条件を意図する。代表的な例として次の条件が挙げられる。すなわち、高イオン濃度下（例えば、６ＸSSC等）に、６５℃の温度条件下でハイブリダイズさせた後、低イオン濃度下（例えば、０．１ＸSSC等）で６５℃、３０分間の洗浄を行うような条件をいう。また、DNA配列の相同性の定義および決定法は当業者によく知られている。
【００１４】
上記の配列番号１〜４に示す配列は、以下の方法を用いて見出され、取得された（詳細は実施例参照）。
糸状菌において、タンパク質の発現は、培養条件などの環境因子に応じて多段階で制御されている。しかし、細胞にとって重要なタンパク質、大量に生産されるタンパク質は、多くの場合、遺伝子の転写、翻訳、翻訳後修飾、他すべての制御段階が効率的に進んでいることが予想される。そこで、翻訳を効率的に開始することのできる５’UTRを取得するために、糸状菌で元来高発現している遺伝子からの取得を考え、ESTデータを利用することとした。すなわち、アスペルギルス・オリゼのESTデータよりさまざまな培養条件下で高発現している遺伝子を選抜し、その推定５’UTR配列を取得した。具体的には、液体培養（富栄養、グルコース）条件下で高発現していた既知遺伝子であるエノラーゼ遺伝子（enoA：the GenBank, EMBL and DDBJ Nucleotide Sequence Database accession No.D63941）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ遺伝子（fbaA：the GenBank, EMBL and DDBJ Nucleotide Sequence Database accession No.AB032272）、液体培養（貧栄養、炭素源なし）条件下で高発現していた機能未知遺伝子（h1）、液体培養（富栄養、グルコース、高温）条件下で高発現していた機能未知遺伝子（k2）、以上４遺伝子について推定５’UTR配列を取得した（それぞれ、配列表の配列番号１〜４に対応する）。なお、ここで言う「機能未知遺伝子」とは既知遺伝子データベース中に高いホモロジーを示す遺伝子が存在しないことを示す。また、「推定５’UTR配列」とはESTデータから得られる配列であって、推定される開始コドンより上流部分の配列をいうものとする。
【００１５】
５’UTR配列を取得する方法の一例として、アスペルギルス・オリゼのゲノムDNAをテンプレートにしたPCR法が挙げられる。EST配列から推定された各５’UTR配列について、両端に制限酵素サイトを付加するようにプライマーをデザインし、PCRを行う。増幅産物を電気泳動で確認後、目的の断片を単離・精製する。この断片の塩基配列を決定し、EST配列と照らし合わせ確認することにより目的の５’UTR配列を取得した。なお、当業者は５’UTR配列を取得する方法としてPCR法以外の方法も適宜使用することができる。
【００１６】
５’UTRの翻訳効率を評価する方法としては、各々の５’UTR配列を導入した発現ベクターにおいて、下流のレポーター遺伝子産物の活性を指標とすることとした。具体的には図１に示すような発現ベクターpNAN8142（「化学と生物」，２０００年，第３８巻，第１２号，ｐ．８３１−８３８）を用いた。このベクターは糸状菌細胞内で高発現するプロモーター（P-No8142）と、同じく糸状菌細胞内で機能するターミネーター（T-agdA）、および形質転換用マーカーであるアスペルギルス・オリゼのniaD遺伝子を含む。このベクターのマルチクローニングサイト（MCS）を利用し、種々の５’UTR配列およびレポーター遺伝子として大腸菌のβグルクロニダーゼ（GUS）をコードする遺伝子であるuidA（pBI221：クローンテック社）を導入した発現ベクターを構築した。こうして得られる発現ベクターの５’UTR部分の概要を、図３に模式的に示す。図中、二重下線で示した領域の配列が、導入した５’UTR配列である。プロモーター（P-No8142）の転写開始点はマルチクローニングサイトよりかなり上流にあるため、これらのベクターの５’UTR領域は、プロモーター（P-No8142）由来の５’UTR配列（部分配列：図３に示す配列の点線部分に相当）の下流に制限酵素サイト（XhoI-SalI、あるいはHindIII）をはさんで各種遺伝子由来の５’UTR配列がつながった融合配列となっている。これらの発現ベクターを用いて、アスペルギルス・オリゼ宿主（硝酸還元酵素欠損株）を形質転換し、得られた形質転換体のサザン解析を行い、導入ベクターが染色体のniaD座位に１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。これらの形質転換体の菌体内のGUS活性を測定することにより、各５’UTR配列の翻訳効率を評価した。当業者は上記５’UTRの翻訳効率を評価する方法を変更・修飾して用いることができる。
上記方法により検討した結果、配列番号１〜４に示す配列（図３Ｂに示す配列の二重下線部に相当）がいずれも高い翻訳効率を示すことを見出した。
【００１７】
さらに、本発明発明者らは、配列番号５〜８に示す塩基配列（図７Ｂの配列の二重下線部に相当）を、非常に高い翻訳効率を示す新規５’UTR配列として新たに同定した。すなわち、５’UTR領域に配列番号５〜８に示す配列を含有する発現ベクターを導入した形質転換体のβグルクロニダーゼ（GUS）活性は、これらの配列を含まないコントロールベクター（pNANG8142）を導入した形質転換体のGUS活性に比べ、８〜１２倍増加することを見出した（図９参照）。これにより、糸状菌宿主においてさらに翻訳効率の高い５’UTR領域を提供するに至った。これらの配列は、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列であっても、同一条件下で配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列と同等の翻訳効率を保持するかぎり本発明に使用することができる。また、配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であって、かつ、同一条件下でこれらの配列と同等の翻訳効率を保持するかぎり本発明に使用することができる。さらに配列番号５〜８の塩基配列に対して、通常には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％（例えば少なくとも９５％）の相同性を有する塩基配列であって、同一条件下にて、これらの配列と同等の翻訳効率を保持するかぎり本発明に使用することができる。当業者は、これらの塩基配列を有するDNAを、適当な方法を用いて選択、取得あるいは製造することができ、使用することができる。
【００１８】
したがって、本発明は、もう一つの態様において、
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA：
（ａ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｂ）配列番号５〜８に記載のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｃ）配列番号５〜８に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
（ｄ）配列番号５〜８に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
を提供するものである。
【００１９】
なお、「ストリンジェントな条件」とは、配列番号５〜８のいずれかに示される塩基配列と、これと相同性の高い他の塩基配列とのオリゴヌクレオチド二本鎖を形成させるのに充分な条件を意図する。代表的な例として次の条件が挙げられる。すなわち、高イオン濃度下（例えば、６ＸSSC等）に、６５℃の温度条件下でハイブリダイズさせた後、低イオン濃度下（例えば、０．１ＸSSC等）で６５℃、３０分間の洗浄を行うような条件をいう。また、DNA配列の相同性の定義および決定法については当業者によく知られている。
【００２０】
上記の配列番号５〜８に示す配列は、以下の方法を用いて見出され、取得された（詳細は実施例参照）。
生物は、様々な外的刺激（ストレス）に対応するため多様な応答機構を備えており、ストレス応答として知られている。ストレス応答は、細菌から高等動植物まで極めて一般的かつ普遍的な機構であり、細胞あるいは生物個体の生存にとって必須の応答であると考えられる。代表的なストレス応答として熱ショック応答が挙げられる。これは、細胞が高温状態にさらされたとき、その危機的状況から細胞を守るために必要な一群のタンパク質「熱ショックタンパク質（HSP）」が転写レベルで誘導され、生合成される機構である。また、熱ショックタンパク質は高温だけでなく、各種の物理化学的ストレス（圧力、紫外線、重金属イオン、酸素濃度など）によっても発現が誘導され、これらストレスによりダメージを受けた（変性した）タンパク質の高次構造を修復する機能を保持していることから分子シャペロンとも呼ばれる。このように、熱ショックタンパク質は細胞の生存のために重要な役割を担っており、外部環境の変化に応じてすばやく生合成されなければならない。つまり、これらのタンパク質の生合成は転写誘導以降のプロセスも効率的に進行していることが予想される。このような観点から、翻訳を効率的に開始することのできる５'UTRの取得源として熱ショックタンパク質遺伝子に注目した。すなわち、他起源の糸状菌において既にクローニングされている熱ショックタンパク質遺伝子と相同性の高い遺伝子をアスペルギルス・オリゼのESTデータより抽出し、その推定５'UTR配列を取得した。具体的には、Aspergillus nidulans のシャペロン/熱ショックタンパク質遺伝子（Awh11）、おなじくAspergillus nidulans のHSP30遺伝子（hsp30）、Neurospora crassa のHSP70遺伝子（hsp70）、Aspergillus niger のtigA、以上４遺伝子と相同性の高い遺伝子についてその推定５'UTR配列を取得した。「推定５'UTR配列」とはESTデータから得られる配列であって、推定される開始コドンより上流部分の配列をいうものとする。また、開始コドンの推定は、既知遺伝子のフレーム（アミノ酸配列の読み枠）を参考にして行った。５’UTR配列を取得する方法の一例としては、前記PCR法が挙げられるがそれ以外の方法であっても当業者は適宜使用することができる。
【００２１】
５’UTRの翻訳効率の評価は前記載方法と同様、各々の５’UTR配列を導入した発現ベクターにおいて、下流のレポーター遺伝子産物の活性を指標とすることとした。ここでは、コントロール発現ベクターpNANG8142に元々含まれているプロモーター（P-No8142）由来の５’UTR領域（図７Ａの点線部分に相当）を大部分削除し、その下流に制限酵素サイト（HindIII）をはさみ、取得したアスペルギルス・オリゼ由来の各種５’UTR配列を導入したベクターを構築した。こうして得られる発現ベクターの５’UTR部分の概要を、図７Ｂに模式的に示す。図７Ｂにおいて、二重下線で示した領域の配列が、導入した５’UTR配列である。この試験では、コントロールベクターpNANG8142の５’UTR領域のほぼ全域を置換することにより、元々のP-No8142由来の５’UTR配列に起因する影響を小さくできるため、導入したアスペルギルス・オリゼ由来の各種５’UTR配列の効果をより直接的に評価することが可能である。これらの発現ベクターを用いて、アスペルギルス・オリゼ宿主（硝酸還元酵素欠損株）を形質転換し、得られた形質転換体のサザン解析を行い、導入ベクターが染色体のniaD座位に１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。これらの形質転換体の菌体内のGUS活性を測定することにより、各５’UTR配列の翻訳効率を評価した。
上記方法により検討した結果、配列番号５〜８に示す配列（図７Ｂに示す配列の二重下線部に相当）がいずれも非常に高い翻訳効率を示すことを見出した。当業者は上記の５’UTRの翻訳効率の評価法を適宜変更・修飾して用いることができる。
【００２２】
また、本発明は、もう１つの態様において、上記のように提供された配列を、糸状菌細胞内において機能しうるプロモーター領域と、目的のポリペプチドをコードするDNA配列の間の任意の部位に挿入することにより翻訳効率の高い発現ベクターを提供する。ベクターを構築するためのDNA配列の連結、挿入などはそれ自体公知の方法で行うことができる。
【００２３】
糸状菌細胞内において機能しうるプロモーター領域とは、糸状菌細胞内で下流のタンパク質をコードする遺伝子を転写する機能のあるDNA配列であれば特に制限されない。具体的には、αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、セロビオハイドラーゼ、アセトアミダーゼ等の加水分解酵素遺伝子、エノラーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の解糖系酵素遺伝子のプロモーター、トランスレーションエロンゲーションファクター遺伝子等のプロモーターが挙げられる。好適には、P-No8142プロモーターが用いられる。また、目的のポリペプチドとしては特に限定されないが、糸状菌由来の細胞内タンパク質、分泌タンパク質、原核生物由来タンパク質、真核生物由来タンパク質等が挙げられる。好適には、レポーター遺伝子として使用実績の多い大腸菌由来のβグルクロニダーゼ(GUS)が用いられる。
【００２４】
本発明は、さらにもう１つの態様において、上記ベクターを導入して得られる形質転換体に関する。上記ベクターを導入される宿主細胞としては糸状菌細胞であればいずれの細胞であってもよく、好ましくはAspergillus属の糸状菌細胞、より好ましくはAspergillus oryzae細胞が用いられる。糸状菌細胞へのベクターの導入方法および条件は当業者に公知であり適宜選択される。例えば、糸状菌宿主細胞を細胞壁溶解酵素にて処理してプロトプラストを得て、ベクター共存下においてポリエチレングリコール（PEG）、塩化カルシウム共存下でベクターを導入してもよく、あるいは電気パルスを用いてプロトプラスト中にベクターを導入してもよく、その後、プロトプラストから元の糸状菌細胞を再生させるのが一般的である（これらの手法も当業者に公知である）。このようにして得られた形質転換体は、適当な培地にて培養し、タンパク質あるいはポリペプチドの生産に使用することができる。
【００２５】
本発明は、さらなる態様において、上記発現ベクターを糸状菌に導入して得られた形質転換体を培養して、糸状菌宿主において目的のポリペプチドを効率的に生産させる方法をも開示するものである。上記発現ベクターを導入するための糸状菌宿主の形質転換は、自体公知の方法で行うことができる（上記参照）。得られた形質転換体の培養も、常法により適当な培地、培養条件を適宜選択することにより行うことができ、目的のタンパク質あるいはポリペプチドを生産させることができる。当業者は使用菌株および目的ポリペプチドに応じて形質転換体の培養方法および条件、例えば培地組成や培養温度、ｐＨ等を適宜選択することができる。培地としては、固体（例えば小麦フスマ培地）あるいは液体であってよく、例えば、スターチ、グルコース、麦芽エキス、酵母エキス等の天然成分を配合した培地、デキストリン・ペプトン培地、あるいは合成培地などを用いることができる。使用するプロモーターが誘導性のプロモーターである場合には、培地に誘導物質を添加してさらなる増産を図ることもできる。タンパク質あるいはポリペプチドは菌体内に産生されるものであってもよく、菌体外に分泌されるものであってもよい。生産されたタンパク質あるいはポリペプチドは、その種類や性質に応じて当業者に公知の適当な方法で定性、定量し、また、必要に応じて単離・精製することができる。
【００２６】
このように、本発明により取得された５’UTR配列を利用することにより、既存の発現ベクターの発現効率を翻訳レベルで増大させることが可能となり、目的タンパク質のさらなる高生産システムが提供される。
【００２７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の実施例はこれらに限られるものではない。
【実施例１】
【００２８】
実施例１：pNANG8142ベクターにおける５’UTR部分置換実験
コントロールベクターpNANG8142（下記参照）の５’UTR領域において、３’側の一部分（pBI221由来の配列）を、アスペルギルス・オリゼ由来の各種５’UTR配列（配列番号１〜４）に置換したベクターを用いてGUS発現量を比較し、置換効果を調べた。
【００２９】
（１）GUS遺伝子(uidA)、およびuidAが元来有する５’UTR配列を導入したGUS発現用コントロールベクターpNANG8142の構築
糸状菌用高発現ベクターpNAN8142（図１）のマルチクローニングサイト（MCS）を利用し、大腸菌のβグルクロニダーゼ（GUS）遺伝子uidA、およびuidAが元来有する５’UTR配列（pBI221由来の配列）を導入したコントロールベクターpNANG8142（図２）を構築した。
まず、pBI221（クローンテック社）のGUS遺伝子の５’上流のSmaIサイトで消化し、これにSalIリンカーを付けてセルフライゲーションした後、次に３’下流のSacIサイトで消化後、平滑末端化してXbaIリンカーを付け同様にセルフライゲーションしてpBI221-SXを得た。このpBI221-SXからGUS遺伝子を含む約１．９kbのSalI-XbaI断片を切り出し、pNAN8142のマルチクローニングサイトのSalI、XbaIサイトに挿入してGUS発現用コントロールベクターpNANG8142を得た。このベクターにおける５’UTR部分の概要を図３Ａ（配列番号９）に模式的に示す。
【００３０】
（２）アスペルギルス・オリゼ由来の各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）の単離
アスペルギルス・オリゼのゲノムDNAを常法により調整し、PCR用のテンプレートとした。次にESTデータより選抜した４遺伝子（enoA、fbaA、h1、k2）の推定５’UTR配列について、上流にHindIIIサイトが、下流にGUS遺伝子の一部およびStuIサイトが付加するようにプライマーを設計しPCR反応を行った。下流に付加した配列は５’−ATGTTAAGGCCT−３’（AGGCCT：StuIサイト）となる。得られた増幅産物をHindIII、StuIで消化し以後の操作に用いた。
【００３１】
（３）各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）を導入したGUS発現ベクターの構築
上記取得５’UTR配列（enoA 5'UTR, fbaA 5'UTR, h1 5'UTR, k2 5'UTR、それぞれ配列番号１、２、３および４）を導入したGUS発現ベクターを以下のように構築した。ここでは、一例としてenoA 遺伝子の５’UTR配列（配列番号１）を導入したベクターpNANG-enoAUTR（図４）の構築方法について示す。
まず、pBI221よりGUS遺伝子の部分領域StuIサイトからSnaBIサイトまでを含む約０．４kbの断片をPCR法により取得した。ここでStuIサイトとは本来のGUS遺伝子が有しないサイトであり、本来のGUS遺伝子の開始コドン以下の下流の配列５’−ATGTTACGTCCT−３’において下線の２塩基をそれぞれC→A、T→Gに置換することにより造成された認識サイト（AGGCCT）である（この塩基置換はGUS遺伝子においてアミノ酸配列の置換を伴わない塩基置換である）。またSnaBIサイトの下流にはXbaIサイトを付加させるようにプライマーを設計しPCRに用いた。この増幅断片をpUC19のSmaIサイトに導入し、pUC-uidA１を得た。次に、実施例１の（２）で得られたenoA遺伝子の５’UTR断片を、HindIII、StuI消化したpUC-uidA１に導入し、pUC-uidA２を得た。次に、実施例１の（１）で得られたpNANG8142をSnaBI、XbaIで消化し、約１．５kbのGUS遺伝子部分断片を切り出し、この断片をSnaBI、XbaI消化したpUC-uidA２に導入することによりpUC-uidA３を得た。次に、pUC-uidA３をHindIII消化後、平滑末端化処理を行い、さらにXbaIで消化することにより、enoA遺伝子の５’UTR配列とGUS遺伝子全長を含む約１．９kbの断片を切り出した。この断片を、XhoI消化後平滑末端化処理を行い、さらにXbaIで消化したpNAN8142に導入することにより、enoA遺伝子の５’UTR配列を含むGUS発現ベクターpNANG-enoAUTRを得た。ここで、平滑末端化処理にはT4DNAポリメラーゼを用いているため、平滑化されたHindIII、XhoI末端のライゲーションにより再びHindIIIサイト（AAGCTT）が造成されている。
なお、他の５’UTR配列を導入したベクターについては、実施例１の（２）で取得したそれぞれの断片を、HindIII、StuI消化によりenoA遺伝子の５’UTR配列部分を除いたpNANG-enoAUTRに導入することにより構築した（pNANG-fbaAUTR、pNANG-h1UTR、pNANG-k2UTR）。これらのベクターの５’UTR部分の概要を図３Ｂに模式的に示す（配列番号１０〜１３）。図３Ｂに示した塩基配列（配列番号１０〜１３）については実際に解析を行い、確認した。
【００３２】
（４）形質転換体の取得とGUS活性の測定
上述のように得られた５種類のGUS発現ベクター（pNANG8142、pNANG-enoAUTR、pNANG-fbaAUTR、pNANG-h1UTR、pNANG-k2UTR）を用いて、常法（プロトプラスト−PEG法）によりアスペルギルス・オリゼを形質転換し、ベクターが宿主ゲノムのniaD座位に1コピーのみ導入された形質転換体を選択した。形質転換体をデキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％KH2PO4、０．０５％、MgSO4・７H2O）で３０℃、２日間振とう培養後、集菌し、乳鉢を用いて液体窒素中ですりつぶした。この菌体破砕物を緩衝液に懸濁し、遠心分離した上清を粗酵素液とした。得られた粗酵素液のGUS活性を公知の方法（Proc Natl Acad Sci，１９８６年，第８３巻，第２２号，ｐ．８４４７−８４５１）に準じて測定した。その結果を図５に示す。
本発明の５’UTRのかわりにpBI221の５’UTR配列を有するコントロールベクター（pNANG8142）導入株と比較し、いずれの株においても顕著なGUS活性の上昇が確認された。pNANG-fbaAUTR導入株で約2倍、pNANG-enoAUTR、pNANG-h1UTR、pNANG-k2UTR各導入株においては約４倍の活性上昇を示した。
【００３３】
（５）形質転換体のノザン解析
実施例１の（３）で構築した、アスペルギルス・オリゼ由来の各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）を導入したGUS発現ベクターの導入株において、顕著なGUS活性の上昇が確認された。しかし、GUS活性の上昇は、翻訳効率の増加以外にも、転写活性を増加させるcis因子がその非翻訳リーダー配列内にあることや、転写産物（mRNA）の安定性が増加したことなどによるmRNA量の増加が原因として考えられる。そこで、mRNA量の確認を目的にノザン解析を行った。
形質転換体を１５mlのデキストリン・ペプトン培地で３０℃、２日間振とう培養後、ガラスフィルターで集菌し、滅菌水で洗浄した。この菌体を新しいデキストリン・ペプトン培地１５mlに移し、さらに３０℃で１２時間振とう培養後、おなじくガラスフィルターで集菌し滅菌水で洗浄した後、RNAの抽出に用いた。RNAの抽出にはセパゾール RNA I Super（ナカライテスク社）を用いた。得られた総RNA５μgについて、ホルムアルデヒド・アガロースゲル電気泳動を行い、Hybond-N+メンブレン（アマシャムファルマシアバイオテク社）にブロットした後、GUS遺伝子領域をプローブとしたノザン解析を行った。プローブの標識および検出は、AlkPhos Direct System（アマシャムファルマシアバイオテク社） を用いた。
この結果、図６に示すように、いずれの形質転換体においても検出されたシグナルの強さは同等であり、ほぼ同程度のGUS遺伝子のmRNAが蓄積していることが確認された。
このように、各形質転換体のmRNA量に違いは認められず、また、発現するGUSタンパク質はアミノ酸配列において全く同一であることから、取得したアスペルギルス・オリゼ由来の各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）を導入した形質転換体で確認されたGUS活性の上昇は、翻訳段階で生じており、単位mRNAあたりの翻訳効率が上昇したためであることが示唆された。
【実施例２】
【００３４】
実施例２：pNANG8142ベクターにおける５’UTR置換実験
コントロールベクターpNANG8142において、プロモーター（P-No8142）の転写開始点下流（３’側）の５’UTR領域の大部分を、アスペルギルス・オリゼ由来の各種５’UTR配列（配列番号５〜８）に置換したベクターを用いてGUS発現量を比較し、置換効果を調べた。
【００３５】
（１）P-No8142d断片の取得
pNANG8142に含まれるプロモーター（P-No8142）領域において、転写開始点より下流の５’UTRに相当する領域（図７Ａの点線部分に相当）の大部分を削除した領域を、新たなプロモーター領域（P-No8142d）として取得した。具体的には、pNANG8142（図２）のP-No8142領域（PstI-SalI領域）において、５’端はそのままに、３’端についてはSalIサイト（GTCGAC：図７ＡのSalIサイトに等しい）から上流（５’側）に107塩基欠失させ、その間の領域について、PCR増幅を行った。なお、増幅断片の下流にはHindIIIサイトが付加するようにプライマーを設計した。得られた増幅産物をPstI、HindIIIで消化し以後の操作に用いた。
【００３６】
（２）アスペルギルス・オリゼ由来の各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）の単離
ESTデータより抽出した、４種類の熱ショックタンパク質遺伝子ホモログ、Awh11ホモログ（AoAwh11）、hsp30ホモログ（Aohsp30）、hsp70ホモログ（Aohsp70）、tigAホモログ（AotigA）の推定５’UTR配列について、実施例１の（２）に記載した方法と同様、上流にHindIII配列サイトが、下流にGUS遺伝子の一部およびStuIサイトが付加するようにプライマーを設計しPCR反応を行った。得られた増幅産物をHindIII、StuIで消化し以後の操作に用いた。
【００３７】
（３）P-No8142dの下流に各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）を導入したGUS発現ベクターの構築
ここでは、一例としてAwh11ホモログ（AoAwh11）遺伝子の５’UTR配列（配列番号５）を導入したベクターpNANGd-AoAwh11UTR（図８）の構築方法について示す。
まず、実施例２の（１）で得られたP-No8142d断片を、PstI、HindIII消化によりP-No8142断片を取り除いたpNANG-enoAUTR（実施例１の（３）により得られたもの：図４参照）に導入し、pNANGd-enoAUTRを得た。次に、実施例２の（２）で得られたAoAwh11の５’UTR断片を、HindIII、StuI消化によりenoA遺伝子の５’UTR断片を取り除いたpNANGd-enoAUTRに導入し、pNANGd-AoAwh11UTRを得た。pNANGd-AoAwh11UTRではコントロールベクターpNANG8142の５’UTR領域の大部分をAoAwh11の５’UTR配列に置換した構造となっている。なお、他の５’UTR配列を導入したベクターについては、実施例２の（２）で取得したそれぞれの断片を、HindIII、StuI消化によりAoAwh11の５’UTR配列部分を取り除いたpNANGd-AoAwh11UTRに導入することにより構築した（pNANGd-Aohsp30UTR、pNANGd-Aohsp70UTR、pNANGd-AotigAUTR）。これらのベクターの５’UTR部分の概要を図７Ｂに模式的に示す（配列番号１４〜１７）。図７Ｂに示した塩基配列については実際に解析を行い、確認した。
【００３８】
（４）形質転換体の取得とGUS活性の測定
上述のように得られた４種類のGUS発現ベクター（pNANGd-AoAwh11UTR、pNANGd-Aohsp30UTR、pNANGd-Aohsp70UTR、pNANGd-AotigAUTR）を用いて、実施例１の（４）に記載した手順に従い形質転換体を取得し、GUS活性を測定した。その結果を図９に示す。
コントロールベクター（pNANG8142）導入株と比較し、本発明の５’UTR配列を有するGUS発現ベクター導入株では、いずれの株においても顕著なGUS活性の上昇が確認された。pNANGd-Aohsp30UTR導入株で約８倍、pNANGd-Aohsp70UTR導入株で約１０倍、pNANGd-AoAwh11UTRおよびpNANGd-AotigAUTR各導入株においては約１２倍の活性上昇を示した。
【００３９】
（５）形質転換体のノザン解析
実施例１の（５）に記載した手順に従い、ノザン解析を行った。
この結果、図１０に示すように、コントロールベクターpNANG8142導入株、pNANGd-Aohsp30UTR導入株、pNANGd-Aohsp70UTR導入株間ではGUS遺伝子のmRNA量に大きな差は見られず、pNANGd-Aohsp30UTR導入株、pNANGd-Aohsp70UTR導入株で見られた顕著なGUS活性の上昇が翻訳レベルで生じたものであることが確認された。一方、pNANGd-AoAwh11UTR導入株、pNANGd-AotigAUTR導入株ではpNANG8142導入株と比較し、GUS遺伝子mRNA量の増加が観察された。
このことから、用いたAoAwh11およびAotigAの５’UTR配列は、転写を促進させる効果、あるいは生じたmRNAの安定性を増加させる効果を有していると推察された。しかしながら、これらの株で見られたmRNA量の増加はGUS活性の上昇量を説明できる程の顕著な差ではないことから、GUS活性が上昇した主な要因はやはり翻訳レベルにあり、単位mRNAあたりの翻訳効率が上昇したためであることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の非翻訳リーダー配列を用いることにより、翻訳効率を増加させることが可能であり、発現効率の高い糸状菌用ベクターが構築できる。さらに、本発明の発現ベクターを用いることにより、糸状菌を宿主として種々の有用タンパク質、ポリペプチド等をより効率的に大量製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】糸状菌用高発現ベクターpNAN8142を示す図である。
【図２】GUS発現用コントロールベクターpNANG8142の構築手順を示す図である。
【図３】各種GUS発現ベクターの５’UTR部分の概要を示す図である。（A）は、コントロールベクターpNANG8142の５’UTR部分を示し、（B）はアスペルギルス・オリゼ由来の各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）を導入したGUS発現ベクターの５’UTR部分を示す。
【図４】ベクターpNANG-enoAUTRの構築手順を示す図である。
【図５】各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）を導入した形質転換体のGUS活性を示すグラフである。値は、3回行った実験の平均値である。
【図６】各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）を導入した形質転換体のノザン解析のバンドパターンを示す図である。
【図７】各種GUS発現ベクターの５’UTR部分の概要を示す図である。（A）は、コントロールベクターpNANG8142の５’UTR部分を示し、（B）はアスペルギルス・オリゼ由来の各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）を導入したGUS発現ベクターの５’UTR部分を示す。
【図８】ベクターpNANGd-AoAwh11UTRの構築手順を示す図である。
【図９】各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）を導入した形質転換体のGUS活性を示すグラフである。値は、3回行った実験の平均値である。
【図１０】各種非翻訳リーダー配列（５’UTR配列）を導入した形質転換体のノザン解析のバンドパターンを示す図である。
【図１】
2004275177.tif 000002
【図２】
2004275177.tif 000003
【図３】
2004275177.tif 000004
【図４】
2004275177.tif 000005
【図５】
2004275177.tif 000006
【図６】
2004275177.tif 000007
【図７】
2004275177.tif 000008
【図８】
2004275177.tif 000009
【図９】
2004275177.tif 000010
【図１０】
2004275177.tif 000011
【配列表】
2004275177000001.app