(57)【要約】　　　（修正有）【課題】耐熱性に優れ、広い基質域を有するω−アミノトランスフェラーゼに変異を導入することにより、α，ω−ジアミンに対する活性を向上させる。【解決手段】特定の配列で示されるアミノ酸配列の３０位のスレオニン残基に相当するアミノ酸が、酸性アミノ酸、特にグルタミン酸に置換させることにより、アミノトランスフェラーゼのα，ω‐ジアミンに対する活性を増強させる。また、そのようなアミノトランスフェラーゼに関する遺伝子、その遺伝子を含む染色体外増殖性環状ＤＮＡ、更にはそれにより形質転換された宿主細胞などに関する。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列の一部が欠失し、一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され、他のアミノ酸残基が挿入され、若しくは他のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列に対して変異を導入することにより、α，ω−ジアミンに対する活性が増強されたことを特徴とするアミノトランスフェラーゼ。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列の一部が欠失し、一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され、他のアミノ酸残基が挿入され、若しくは他のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列に対して、配列番号１の３０位のスレオニン残基に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする請求項１に記載のアミノトランスフェラーゼ。
【請求項３】
配列番号１の３０位のスレオニン残基に相当するアミノ酸が酸性アミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のアミノトランスフェラーゼ。
【請求項４】
酸性アミノ酸がグルタミン酸であることを特徴とする、請求項３に記載のアミノトランスフェラーゼ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載されるアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子を含む染色体外増殖性環状ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡによって形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
大腸菌Ｋ１２株又はその誘導体であることを特徴とする、請求項７記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、α、ω−ジアミンに対する活性を向上させた新規なアミノトランスフェラーゼに関するものである。該酵素により生成するアミノアルデヒドは医薬、農薬の合成中間体およびウレタン用触媒の原料として有用である。また該酵素は生体内アミンの定量にも利用される有用な酵素である。
【０００２】
【従来の技術】
α、ω−ジアミンをアミノ基供与体としてアミノトランスフェラーゼ活性を示す酵素に、ジアミンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ番号２．６．１．２９）やポリアミンアミノトランスフェラーゼが知られる。前者の酵素はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．（Ｋｉｍ，Ｋ−Ｈ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７（Ｂ），８１２−８１５，１９７１年）より、後者の酵素はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．（Ｙｏｒｉｆｕｊｉ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，５３７−５４３，１９９７年）より単離された。両酵素とも種々のα、ω−ジアミンに作用するが、Ｅ．　ｃｏｌｉ由来の酵素はα−ケトグルタル酸を、Ａ．　ｓｐ．由来の酵素はピルビン酸を最適なアミノ基受容体とする。酵素の安定性に関しては、Ａ．　ｓｐ．由来の酵素がｐＨ７．０−８．０、７５℃１０分間の保温により、約５０％にまで活性が低下する。一方、Ｅ．　ｃｏｌｉ由来の酵素は報告されてないが、Ｅ．　ｃｏｌｉ由来の他の酵素の例から考えると、耐熱性は同程度もしくはそれ以下と予想される。
【０００３】
本発明者らが先に報告した超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓより単離されたω−アミノトランスフェラーゼ（特願２００１−３５９７７０号）は、リジンやオルニチン等の塩基性アミノ酸、４−アミノ酪酸や５−アミノ吉草酸等のω−アミノ酸以外にも１，４−ジアミノブタンや１，５−ジアミノペンタン等のα，ω−ジアミンにも弱いながらも作用し、幅広い基質域を有する酵素であることが明らかになった。また、安定性については、９５℃、２３時間加熱後の残存活性が５９％を示し、非常に優れた耐熱性を持つことも判った。この様に熱に対する安定性に優れることは、温度ストレスはもとより、温度以外の種々の物理化学的なストレスにも耐性が高く、一般的には酵素が失活したり反応が阻害されるような条件（例えば攪拌によって生じる強い機械的衝撃や高濃度の基質などの存在下、有機溶媒中による反応、酸やアルカリ条件下による反応、界面活性剤存在下による反応）でも反応し得ると期待される。しかしながら、この酵素のα，ω−ジアミンに対する活性は、最も良好な基質であるオルニチンの場合と比較して１％以下に低下するため、実用的な使用には適さなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、耐熱性に優れ、広い基質域を有するω−アミノトランスフェラーゼに変異を導入することにより、α，ω−ジアミンに対する活性を向上させることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列で示されるω−アミノトランスフェラーゼの推測される立体構造をもとに、変異を導入することによって、α，ω−ジアミンに対する活性が向上した新規なアミノトランスフェラーゼを取得し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列の一部が欠失し、一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され、他のアミノ酸残基が挿入され、若しくは他のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列に対して変異を導入することにより、α，ω−ジアミンに対する活性が増強されたことを特徴とするアミノトランスフェラーゼである。また本発明は、上述のアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。さらに本発明は、上述の遺伝子を含む染色体外増殖性環状ＤＮＡである。また本発明は、上述のＤＮＡによって形質転換された宿主細胞である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明の新規なアミノトランスフェラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列の一部が欠失し、一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され、他のアミノ酸残基が挿入され、若しくは他のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列に対して、変異を導入することによって得られるが、ここで配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質として、本発明者らが先に報告した特願２００１−３５９７７０号に記載のＰ．　ｆｕｒｉｏｓｕｓから得られるω−アミノトランスフェラーゼが挙げられる。この酵素の立体構造はまだ明らかではないが、近年のバイオインフォマティックスに関する研究が進展し、インターネットを通じて蛋白質の立体構造の予測が可能となった。本発明者らはその情報を利用して得た予想される立体構造より、３０位のスレオニン残基が基質のアミンと相互作用すると考え、この残基を他のアミノ酸に置換することによりα、ω−ジアミンと酵素の結合を強めることの予測を立てた。この残基は酸性アミノ酸に置換されることが好ましく、特にグルタミン酸に置換されることが好ましい。
【０００８】
目的とする変異体アミノトランスフェラーゼを得るためには、まず遺伝子に変異を導入し、変異型アミノトランスフェラーゼの遺伝子を取得する必要がある。次いで得られた変異遺伝子を発現ベクターに組み入れ、宿主細胞に形質転換し、こうして得られた形質転換体を培養することにより変異体酵素が製造される。
【０００９】
部位特異的な変異導入の方法としては市販されているキットを用いて達成も可能だが、ＰＣＲを用いた方法（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．，ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６３，１９８９年）でも可能である。具体的には、Ｐ．　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のω−アミノトランスフェラーゼの遺伝子を含むプラスミドを鋳型に、配列番号２で示されるプライマーと配列番号５で示されるプライマー、配列番号３で示されるプライマーと配列番号４で示されるプライマーの組合わせでＰＣＲ反応を行ない、増幅される両ＤＮＡ断片を精製後、得られた両断片と配列番号２および配列番号３のプライマーを用いて再度ＰＣＲ反応を行なうことにより、変異導入された遺伝子が得られる。
【００１０】
得られた変異導入されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＰｓｔＩで処理した後にプラスミドｐＰＦＯＡＴ３のＳａｃＩとＰｓｔＩ断片と置換えることにより、変異導入された染色体外増殖性の環状ＤＮＡが得られる。
【００１１】
上記の変異導入された染色体外増殖性の環状ＤＮＡで適切な宿主細胞を形質転換し、形質転換宿主を培養することによって変異体酵素が製造される。プラスミドベクターの構築から形質転換宿主細胞の培養、そして蛋白質の発現に至る操作は遺伝子工学の分野における常法を採用することができ、プラスミドの種類や宿主細胞の選択、蛋白質の発現等は適宜実施可能である。例えば、染色体外増殖性であるプラスミドベクターとしては、ｐＵＣ１８／１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４等を例示することができる。また宿主細胞としては、例えば大腸菌Ｋ１２株や、その誘導体であるＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、Ｗ３１１０、Ｃ６００等を例示できる。
【００１２】
この形質転換体を用いて該耐熱性酵素が生産されるが、用いられる培地は菌株が増殖し得るものであればいずれを使用してもよく、このとき使用する培地として、炭素源にはグルコース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロールなどが、窒素源には肉エキス、ペプトン、トリプトン、酢酸アンモニウムや硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等などが、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩やＮａＣｌなどが、金属イオンには硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸第一鉄・７水和物、塩化カルシウム・２水和物などが使用できる。また、培地には酵母エキス、ビタミン類などを添加することもできる。培養は通気撹拌、振とうによって好気的条件で行なうことが好ましく、ｐＨは６〜８の範囲に調整する。ｐＨの調整に使用するアルカリとしてはアンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アミン化合物など任意のものが使用でき、酸としては塩酸、硫酸、リン酸などが使用できる。培養時間は酵素の生成量が最大になるまで行なえばよく、１２時間〜７２時間程度が好ましい。培養温度としては２０〜４０℃付近が好ましく、培地中の溶存酸素濃度は５〜５０％付近が好ましい。また、必要に応じて酵素の誘導処理を行なうこともできるが、その際使用する誘導剤としては糖類やその誘導体のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などが使用できる。
【００１３】
このようにして培養した培養液より菌体を回収するが、回収方法としては遠心分離やろ過などを用いることができる。回収した菌体を緩衝液に懸濁し破砕するが、使用する緩衝液は酵素が安定に抽出されればいずれの緩衝液でもよく、例えばリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などがあげられる。濃度やｐＨについても同様に酵素が安定に抽出されればいずれの濃度やｐＨでもよいが、好ましくは濃度が１０〜２００ｍＭ、ｐＨが５〜９である。また必要に応じてキレート剤のＥＤＴＡや酸化防止剤の２−メルカプトエタノールやジチオスレイトールを添加できる。菌体の破砕は浸透圧ショックや超音波処理、フレンチプレス処理、マントン・ゴーリン・ホモジナイザー処理などの通常の方法によって処理できる。
【００１４】
得られた酵素抽出液に対し１回目の熱処理を行なうが、それに先立ち酵素の安定化剤を添加することが好ましく、アミノトランスフェラーゼにはピリドキサールリン酸やピリドキサミンリン酸、α−ケトグルタル酸などが挙げられる。熱処理条件は目的とする耐熱性酵素がなるべく安定に回収される条件がよく、好ましくは温度が６０〜１００℃、時間が１０〜１２０分である。また必要に応じて酵素を沈殿法や膜を用いて濃縮、あるいは透析によって低分子化合物を除去したりすることもできるが、沈殿法による濃縮はアセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ポリエチレングリコールなどの有機溶媒や硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの無機塩による塩析が使用できる。膜を用いた濃縮は限外ろ過膜など用いることができ、膜を用いた透析は市販の透析膜が使用できる。その際に使用する膜の分画分子量は目的の酵素が膜外に溶出しなければいずれをも使用できる。
【００１５】
沈殿法による濃縮を行なった場合は緩衝液に再溶解し、不溶物がある場合は遠心分離あるいはろ過により除去する。酵素が耐熱性に優れていれば再度熱処理を行なうことも出来る。２回目の熱処理条件は１回目と同様に酵素が安定に保たれればいずれの条件でもよいが、１回目より高い温度もしくは長い時間で処理すればより多く夾雑蛋白質を除くことができる。
【００１６】
得られた酵素溶液を透析や市販の脱塩カラムにより脱塩を行ない、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを用いることにより更に高純度に精製することができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
実施例１　遺伝子への変異導入
変異導入されたＤＮＡ断片は次の手順により作製した。まず鋳型となる遺伝子を含むＤＮＡとしては、特願２００１−３５９７７０号で報告したプラスミドｐＰＦＯＡＴ３の調製法に従った。
【００１９】
即ち、市販の培地（商品名；マリンブロス２２１６、Ｄｉｆｃｏ社製）を１リットル容のメジュームビンに３７．４ｇ取り、純水１リットルを加えて溶解し、更に少量のリサズリンを酸化還元指示薬として加えて１２０℃で２０分間加圧滅菌した。滅菌後、薬サジ一杯分の元素硫黄粉末を加え、窒素雰囲気下で密栓して９７℃に加熱した。この溶液に２％の２−メルカプトエタノールをリサズリンの赤色が消失するまで滴下し、さらにパイロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８株を植菌して９７℃で一晩培養を行なった。
【００２０】
培養終了後、室温まで培養液を冷却し、残存する元素硫黄及び硫黄酸化物の沈殿を培養液を傾斜させて分離、除去し、８０００回転、２０分の遠心分離により微生物菌体を回収した。
【００２１】
このようにして得られた菌体の一部を１ｍｌのＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。これに１０％ＳＤＳを０．１ｍｌ加えて室温に１０分間静置し、溶菌させた。
【００２２】
これに水相と等容のフェノール−クロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）を加えて穏やかに攪拌し、遠心操作によって水相を回収した。この操作を３回繰り返した後、水相と等容のクロロフォルムによる抽出を行なった。得られた水相に２．５容のエタノールを加え、室温で１０分間静置した後、遠心によって核酸を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、再度遠心して核酸をペレットとして回収し、これを４００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解した。
【００２３】
この溶液に１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（あらかじめＤＮａｓｅを熱処理により除去）を最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように２μｌ加え、３７℃で１時間保温した。これに２０％ＰＥＧ６０００／２．５ＭＮａＣｌを２４０μｌ加えてから０℃で２時間静置した。これを４℃で遠心し、ペレットを７０％エタノールで洗浄して再度遠心した。得られたペレットを乾固させた後４００μｌのＴＥ緩衝液に溶解してＤＮＡ標品とした。これにより１４０μｇのＤＮＡが回収された。
【００２４】
このようにして得られた染色体ＤＮＡを鋳型として特定の配列をもつＤＮＡを以下の手順により増幅した。まずプライマーとしては、増幅させようとするＤＮＡ配列に相当する配列を２０ないし２５塩基含み、かつその５’側に適当な制限酵素認識配列と、さらにその５’側に１ないし３塩基の余分な配列を持つように設計した。この余分な配列は制限酵素が効率的に働くことを助けるものであり、その配列と長さは用いる制限酵素によって異なる。ＳａｃＩについてはＡＴＣＣなる４塩基、ＰｓｔＩについてはＡＡよりなる２塩基が付加することにより制限酵素が十分に切断活性をもつことが知られているので（ＮＥＢ社カタログ）、これを用いることにした。すなわち下記のような配列番号７及び８よりなるＤＮＡ配列をプライマーとすることに決定し、これらのオリゴヌクレオチドを常法により合成した。
【００２５】
配列番号７　５’ＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡ３’
（下線部は、ＳａｃＩの認識部位を示す）
配列番号８　５’ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＡＡＴＴＴＡＴ３’
（下線部は、ＰｓｔＩの認識部位を示す）。
【００２６】
ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）を用い、以下の手順で行なった。すなわち１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液（宝酒造製）を１０μｌ、各２．５ｍＭになるように調製されたｄＮＴＰ混合溶液を８μｌ、鋳型となる染色体ＤＮＡ標品を３５０ｎｇ、上記プライマーＤＮＡを各々１００ｐｍｏｌ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ加えて、全量を１００μｌとした。Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを用いて、＜９４℃、２０秒−６０℃、６０秒−７２℃、１２０秒＞のサイクルを３０回繰り返し、その後７２℃、１０分の伸長反応を行なって終了させた。その一部を１．０％アガロースで分析することにより、約１４００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることが観察された。この反応によって得られたＤＮＡ量は約１０μｇであった。
【００２７】
このようにして得られたＤＮＡを常法に従いフェノール−クロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）抽出で除蛋白し、次いでクロロフォルムによる抽出を行なった。エタノール沈殿により回収したＤＮＡのうち５μｇに６ＵのＳａｃＩと６ＵのＰｓｔＩによる酵素消化を各々３７℃で９０分間行なった。一方、５μｇのプラスミドｐＵＫ０２−Ａ３（特開平３−１５５７８８号参照）ＤＮＡを用いて、これを同様に６ＵのＳａｃＩと６ＵのＰｓｔＩで各々３７℃で２時間酵素消化を行なった。こうして得られた両方の酵素消化物を１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。
【００２８】
次に前記ｐＵＫ０２−Ａ３由来の４ｋｂｐ断片とＰＣＲ産物の１．４ｋｂｐ断片を等モル混合し、ライゲーション反応に供した。これにより図１に示したプラスミドｐＰＦＯＡＴ３が得られた。図中、Ａ３／ｌａｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒは大腸菌Ｔ３ファージＡ３プロモーターと大腸菌ｌａｃオペレーターとの融合プロモーターを、ＳａｃＩは制限酵素ＳａｃＩの切断部位を、ＥｃｏＲＩは制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位を、ＰｓｔＩは制限酵素ＰｓｔＩの切断部位を、ω−ＡＴはパイロコッカス・フリオサスのω−アミノ酸アミノトランスファラーゼがコードされている領域を、ｒｒｎＢ　Ｔ１Ｔ２は大腸菌ｒｒｎＢオペロンの転写終結シグナルを、Ａｍｐはアンピシリン耐性の遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製開始部位を、そしてｌａｃＩｑは大腸菌のｌａｃリプレッサーバリアントの遺伝子をそれぞれ示す。
【００２９】
次にプライマーとしては２４塩基の長さからなる配列番号２、２４塩基の長さからなる配列番号３、２７塩基の長さからなる変異導入用の配列番号４、配列番号４と相補鎖を形成する変異導入用の配列番号５を用い、配列番号２と５、配列番号３と４の組合わせで１回目のＰＣＲ反応を行なった。配列番号４および５には制限酵素Ｓａｕ３ＡＩによる認識配列を削除し、それによって変異導入の確認ができるようにした。
【００３０】
配列番号２　５’ＣＡＡＡＣＣＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＡＴＧＡ３’
配列番号３　５’ＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣ３’
配列番号４　５’ＧＣＡＡＣＴＡＣＣＧＡＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＴＧＡＧ３’
配列番号５　５’ＣＴＣＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＧＧＴＡＧＴＴＧＣ３’
（下線部は変異部を示す）。
【００３１】
ＰＣＲ反応の条件はＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）を用い、以下の手順で行なった。すなわち１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液（宝酒造製）を１０μｌ、各２．５ｍＭになるように調製されたｄＮＴＰ混合溶液を８μｌ、鋳型となるプラスミドＤＮＡ標品を１ｎｇ、上記プライマーＤＮＡを各々１００ｐｍｏｌ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ加えて、全量を１００μｌとした。Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを用いて、＜９４℃、２０秒−５５℃、６０秒−７２℃、１２０秒＞のサイクルを３０回繰り返し、その後７２℃、１０分の伸長反応を行なって終了させた。その一部を１．０％アガロースで分析することにより、それぞれ約１５０ｂｐと１４００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることが観察された。
【００３２】
得られたＤＮＡを常法に従いフェノール−クロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）抽出で除蛋白し、エタノール沈殿により回収した。デシケーター内で３分間減圧乾燥後、４０μｌのＴＥ溶液に溶解し、半量を１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。次に精製した両ＤＮＡ断片１０μｌと配列番号２および配列番号３のプライマーを用いて、先のＰＣＲと同条件（プラスミドＤＮＡは除く）で反応させた。その一部を１．０％アガロースで分析することにより、約１５００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることが観察された。得られたＤＮＡを同様にフェノール−クロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）抽出で除蛋白、エタノール沈殿による回収、デシケーター内で３分間減圧乾燥後、４０μｌのＴＥ溶液に溶解した。得られたＤＮＡの半量を４０Ｕの制限酵素ＳａｃＩと４０Ｕの制限酵素ＰｓｔＩで３７℃、２時間酵素消化を行ない、１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。
【００３３】
実施例２　発現ベクターへの導入と組換え大腸菌の作製
実施例１で得られたＤＮＡの半量を４０Ｕの制限酵素ＳａｃＩと４０Ｕの制限酵素ＰｓｔＩで３７℃、２時間酵素消化を行ない、１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。一方プラスミドｐＰＦＯＡＴ３を同様に制限酵素ＳａｃＩとＰｓｔＩにより酵素消化を行なった。こうして得られた両方の酵素消化物を１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。
【００３４】
次に前記ｐＰＦＯＡＴ３由来の約４ｋｂｐ断片と変異導入された１．５ｋｂｐ断片を等モル混合し、ライゲーション反応に供した。反応物を常法に従って大腸菌ＭＣ４１００に導入した。形質転換菌は５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む寒天培地で選択し、生じたコロニーの内４個を常法によってプラスミドを抽出した。得られたプラスミドを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ消化し分析した結果、３個のプラスミドに変異の導入が確認された。得られた変異体をＴ３０Ｅと呼び、以下の実験に供した。
【００３５】
実施例３　変異体酵素Ｔ３０Ｅの調製
実施例２で得られた変異体Ｔ３０Ｅを２００ｍｌ容のバッフル付き３角フラスコを用い５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）４０ｍｌで３７℃、１４時間振とう培養を行なった。この培養液３０ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ４Ｙ培地（１％バクトトリプトン、２％バクトイーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）３リットルに植菌し、５リットル容の発酵槽を用いて３０℃で２０時間好気的培養を行なった。この培養物を常法に従って菌体を集めると４６ｇであった。集めた菌体を２３０ｍｌの５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で洗浄後、同じ緩衝液２５０ｍｌで再度懸濁し、超音波で菌体の破砕をなった。この菌体破砕物にピリドキサールリン酸を１ｍＭの濃度になるよう加え、７０℃の湯浴にて３０分間浸し熱処理を行なった。
【００３６】
生じた沈殿物を遠心分離により除去し、上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムを８０％飽和濃度になるようゆっくり添加し、生じた沈殿を遠心分離により回収した。この沈殿物を２０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に溶解し、８０℃の湯浴にて２０分間浸し生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を回収した。得られた上清を分画分子量１２０００〜１４０００の膜にて一晩透析（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６））を行ない、市販のゲル（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ、商品名、東ソー（株）製）により分画を行ない、ＳＤＳ−ポリクリルアミドゲル電気泳動による分析にて分子量約５２０００を示す、ほぼ単一な成分の画分を回収した。回収した画分に等量のアセトンを０℃にてゆっくり加え、そのまま２時間放置後、遠心分離にて沈殿を回収し、２ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に溶解し、以降の実験に使用した。
【００３７】
実施例４　Ｔ３０Ｅの酵素活性測定
１０ｍＭのＬ−オルニチン塩酸塩及び１０ｍＭのα−ケトグルタル酸を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）中７０℃３０分間保温し酵素反応を行ない、等量の１Ｎ酢酸水溶液を加え反応を停止させた。この溶液１０μｌを取り、エタノール３５μｌ、トリエチルアミン５μｌ、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）５μｌを加え、室温で２０分間反応させたのち、デシケーター内で９０分間減圧乾固させ、一部を高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−ｇｅｌ　ＯＤＳ−８０ＴＭ、商品名、東ソー（株）製を使用）によって生成したグルタミン酸を定量した。溶離液として０．１４Ｍ酢酸ナトリウム−０．０５％トリエチルアミン（ｐＨ６．３５）を用い、アセトニトリルの直線濃度勾配で溶出させ、２５４ｎｍの吸光度で検出し、１分間に１μｍｏｌｅのグルタミン酸を生成する活性を１Ｕとした。蛋白質量の測定にはバイオラッド社のプロテインアッセイキットを使用し、標準蛋白質は牛血清アルブミンを用いた。その結果、実施例３で得られた精製酵素の比活性は０．５４Ｕ／ｍｇを示した。
【００３８】
実施例５　アミノ基供与体に対する基質特異性
アミノ基受容体をα−ケトグルタル酸に固定し、表１に記載した化合物をアミノ基供与体に用いて実施例４と同様に酵素反応を行なった。その結果、表１に示すように本酵素はα，ω−ジアミン類およびω−アミノアルコール類に対して野生型（ＷＴ）より活性が向上し、特に１，５−ジアミノペンタンは野生型の２０倍にまで増大した。
【００３９】
【表１】
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実施例６　アミノ基受容体に対する基質特異性
アミノ基受容体としてスクシニックセミアルデヒドを用いて実施例４に記載した酵素反応を行なった。その結果、本酵素はスクシニックセミアルデヒドに対してα−ケトグルタル酸より約２倍高い１．０Ｕ／ｍｇを示した。アミノ基供与体、及びアミノ基受容体が共にω−アミンである場合のアミノ基交換反応に本酵素が有効であることが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によってα，ω−ジアミンに対する活性が向上した新規なアミノトランスフェラーゼおよびそれをコードするＤＮＡが新規に提供される。
【００４１】
本発明は更に、前記アミノトランスファラーゼを用いることにより、医薬、農薬あるいはウレタン触媒用の原料として有用なアミノアルデヒド化合物を製造や、生体内アミンの定量にも使用することが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＰＦＯＡＴ３を示す図である。
【図１】
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