(57)【要約】【課題】植物の再分化能に関与する遺伝子を単離・同定し、該遺伝子およびその利用方法を提供することを課題とする。【解決手段】湖南早の培養特性に導入したアイソジェニックラインを戻し交配を用い作出した。この作出したアイソジェニックラインと親品種より培養細胞を誘導した。培養後、３〜６ヶ月経過した培養細胞の再分化能を確認後、ディファレンシャルディスプレイ法を用い、ササニシキ及びコシヒカリ由来の培養細胞で発現していなく、高い再分化能を持つ湖南早及びアイソジェニックライン由来の培養細胞で発現している遺伝子の単離を試みた。その結果、再分化関連遺伝子をクローニングすることができた。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において再分化能に関与する、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項４】
請求項１もしくは２に記載のＤＮＡ、または請求項３に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換植物細胞を有する形質転換植物体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項７】
請求項５または６に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項８】
請求項５に記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１もしくは２に記載のＤＮＡ、または請求項３に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項９】
植物細胞における再分化能の有無を判定する方法であって、
（ａ）植物細胞における請求項１に記載のＤＮＡの発現を検出する工程、および
（ｂ）（ａ）で検出された請求項１に記載のＤＮＡの発現量を対照細胞における請求項１に記載のＤＮＡの発現量と比較する工程、を含み、
（ａ）で検出された請求項１に記載のＤＮＡの発現量が対照細胞における請求項１に記載のＤＮＡの発現量より多い場合に、該植物細胞が高い再分化能を有すると判定される方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、植物細胞における再分化能の有無を判定するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の再分化能に関与する遺伝子およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の形質転換系の要素技術として培養細胞の再分化系の確立は重要である。しかしながら、培養細胞の誘導及び再分化系の確立は植物種に依存し、未だ一般的な確立方法は見いだされていない。また同じ植物種でも品種間差が大きく培養系の確立に多くの労力と試行錯誤が現在でも必要である。実際、イネ科植物の培養細胞の再分化能は品種間差が大きいことが報告されている。また、イネ品種コシヒカリ等、経済的に重要な品種でありながら、培養特性が悪く、培養細胞の再分化系の確立が困難な品種が多数知られている。さらに、培養細胞の再分化能は急速に低下しやすく、この点も大きな問題である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の再分化能に関与する遺伝子を単離・同定し、該遺伝子およびその利用方法を提供することにある。より具体的には、植物の再分化能に関与する遺伝子、該遺伝子を有する形質転換植物体、該形質転換植物体の製造方法、該遺伝子をマーカーとして植物の再分化能を判定する方法、および、該方法に使用するための試薬を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、湖南早の培養特性（誘導した培養細胞の増殖が良く、また再分化能も高い形質）を日本型イネ、ササニシキ（Ｂ６Ｆ３）、コシヒカリ（Ｂ４Ｆ３）に導入したアイソジェニックラインを戻し交配を用い作出した。この作出したアイソジェニックラインと親品種より培養細胞を誘導した。培養後、３〜６ヶ月経過した培養細胞の再分化能を確認後、ディファレンシャルディスプレイ法を用い、ササニシキ及びコシヒカリ由来の培養細胞で発現せず、高い再分化能を持つ湖南早及びアイソジェニックライン由来の培養細胞で発現している遺伝子の単離を試みた。その結果、再分化関連遺伝子（２２Ａ遺伝子と命名）を１つクローニングすることができた。さらに、ノーザンハイブリダイゼーション解析により、ディファレンシャルディスプレイの結果と同様にコシヒカリササニシキでは２２Ａ遺伝子の発現が確認されず、湖南早、高い再分化能をもつコシヒカリ、ササニシキアイソジェニックラインで該遺伝子の発現が観察できた。また、コシヒカリと同等に再分化能の低下してしまったコシヒカリアイソジェニックラインでは、該遺伝子の発現が観察できなかった。
【０００５】
また、２２Ａ遺伝子が、湖南早の再分化に関与することを確証するために、２系統の高い再分化能を持つコシヒカリアイソジェニックラインＢ４Ｆ３にコシヒカリを戻し交配しＢ５Ｆ３世代を得、再分化能を確認後、このサンプルを用い再度ノーザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、再分化能の高いコシヒカリアイソジェニックラインでは、該遺伝子の発現が確認でき、再分化能の低下したアイソジェニックラインでは該遺伝子の発現は確認できなかった。
【０００６】
さらに、他の１３品種のイネ品種において、２２Ａ遺伝子の発現を調べるためにノーザンハイブリダイゼーション解析を行った。その結果、該遺伝子の発現が他品種と比較して高い湖南早、ＮｅｐＶａｉ、Ｋｅｌｅ、Ｐａｎｂｉｒａの４品種は継代期間を追っても再分化率の低下もほとんど観察されなかった。これに対し、培養初期から再分化率の低いコシヒカリ、ＩＲ８、および、Ｋｏｎａｎｓｅｎでは該遺伝子の発現は見いだせなかった。幾つかの品種では培養初期にこの遺伝子が発現していたが、培養４ヶ月目には発現がほとんど観察できなくなった。またこれにあわせて再分化率も低下した。
【０００７】
以上の結果から、２２Ａ遺伝子が再分化関連遺伝子であること、該遺伝子は高い再分化能を持つ植物細胞を選抜するためのマーカーとして使用できること、並びに、該遺伝子を植物細胞に導入することで、植物細胞に再分化能を付与することができることが判明した。
【０００８】
即ち、本発明は、植物の再分化能に関与する遺伝子およびその利用に関し、より具体的には、
〔１〕植物において再分化能に関与する、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
〔２〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
〔３〕〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
〔４〕〔１〕もしくは〔２〕に記載のＤＮＡ、または〔３〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞、
〔５〕〔４〕に記載の形質転換植物細胞を有する形質転換植物体、
〔６〕〔５〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
〔７〕〔５〕または〔６〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
〔８〕〔５〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔１〕もしくは〔２〕に記載のＤＮＡ、または〔３〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
〔９〕植物細胞における再分化能の有無を判定する方法であって、
（ａ）植物細胞における〔１〕に記載のＤＮＡの発現を検出する工程、および
（ｂ）（ａ）で検出された〔１〕に記載のＤＮＡの発現量を対照細胞における〔１〕に記載のＤＮＡの発現量と比較する工程、を含み、
（ａ）で検出された〔１〕に記載のＤＮＡの発現量が対照細胞における〔１〕に記載のＤＮＡの発現量より多い場合に、該植物細胞が高い再分化能を有すると判定される方法、
〔１０〕〔１〕に記載のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、植物細胞における再分化能の有無を判定するための試薬、
を、提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物において再分化能に関与するＤＮＡを提供する。なお、本発明においては、本発明で単離された２２Ａ遺伝子の　ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１０】
本発明のＤＮＡの由来する植物としては、特に制限はなく、イネ、トウモロコシ、大麦、コムギなどが例示できる。
【００１１】
本発明において、再分化能とは、植物細胞（カルスなど）がもとの植物個体に再生する能力を意味する。これまでは、植物細胞が再分化能を有するか否かは黙視でのみ測定されていた（再分化能培地に植物細胞（カルスなど）を置床した後に該植物細胞からシュート（ｓｈｏｏｔ）が形成されているか否かで判断されていた）が、本発明によって、本発明のＤＮＡや本発明のＤＮＡからコードされるタンパク質をマーカーとして利用することで、植物細胞が再分化能を有するかを判定できるようになった。
【００１２】
本発明の再分化能に関与するＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、本発明のＤＮＡを有するイネ品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号：１）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号：１）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行って調製することも可能である。ｃＤＮＡは、例えば、本発明のＤＮＡを有するイネ品種から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰなどのベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またＰＣＲを行うことにより調製できる。
【００１３】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸からなるタンパク質と構造的に類似しており、再分化能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
【００１４】
あるＤＮＡが再分化能に関与するタンパク質をコードするか否かは、被検ＤＮＡが導入された植物から培養細胞を誘導し、該培養細胞が再分化するか否かを観察することで検証することができる。例えば、再分化能培地に培養細胞を置床して約３週間後に該培養細胞からシュート（ｓｈｏｏｔ）が形成される場合に、被検ＤＮＡは再分化能に関与するタンパク質をコードすると判定される。
【００１５】
このようなＤＮＡには、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アリル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００１６】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ　Ｗ　＆　Ｆｒｉｔｚ　Ｈ−Ｊ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１５４：　３５０，　１９８７）が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。このように、自然界において生じた変異により、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても、天然型のタンパク質（配列番号：２）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限りは、本発明のＤＮＡに含まれる。また、たとえ塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わないこと（縮重変異）があるが、このような縮重変異体も本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１７】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ＥＭ：　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　９８：　５０３，　１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ　ＲＫ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：　１３５０，１９８５、Ｓａｉｋｉ　ＲＫ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：　４８７，　１９８８）を利用する方法が挙げられる。すなわち、２２Ａ遺伝子の塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、また２２Ａ遺伝子（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物から２２Ａ遺伝子と高い相同性を有するＤＮＡを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得る配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１８】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できることが期待される。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００１９】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｅｉ．　ＵＳＡ　８７：２２６４−２２６８，　１９９０、Ｋａｒｌｉｎ　Ｓ　＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ：　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：　５８７３，　１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：　４０３，　１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００２０】
また、本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
【００２１】
本発明においては、上記ＤＮＡまたは上記ＤＮＡからコードされるタンパク質は、植物細胞が再分化能を有するか否かを判定するためのマーカーとなりうる。さらに、上記ＤＮＡは、植物細胞に再分化能が高い形質を導入するために用いることが可能である。
【００２２】
さらに、本発明には、本発明のＤＮＡが挿入されたベクター、本発明のＤＮＡまたは該ベクターを保持する形質転換植物細胞、該細胞を有する植物体、該植物体の子孫およびクローン、ならびに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００２３】
本発明において、形質転換植物体を作製するには、本発明のＤＮＡまたは本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。
【００２４】
本発明において、植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。
【００２５】
また、本発明において、「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。また、植物細胞の由来する植物としては、特に制限はない。
【００２６】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１００：　１５０３，　１９９５）。
【００２７】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ　ＳＫ：　Ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｔｏ　Ｐｌａｎｔｓ　（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，　Ｅｄｓ）　ｐｐ．６６−７４，　１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１００：　１５０３，　１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　Ｐ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：　９５７，　１９９１）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　６：　２７１，　１９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００２８】
ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。このようにして作出された植物体から誘導した植物細胞は再分化能が付与された植物細胞となっている。
【００２９】
さらに、本発明は、植物細胞における再分化能の有無を判定する方法を提供する。該方法では、まず、植物細胞における本発明のＤＮＡの発現を検出する。次いで、植物細胞における該ＤＮＡの発現量を対照細胞における該ＤＮＡの発現量と比較する。さらに、植物細胞における該ＤＮＡの発現量が対照細胞における該ＤＮＡの発現量より多い場合に、植物細胞が高い再分化能を有すると判定される。
【００３０】
本発明において、ＤＮＡの発現の検出方法としては、特に制限なく、例えばディファレンシャルディスプレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、および、ＤＮＡアレイ法などが挙げられる。また、ＤＮＡの発現は該ＤＮＡからコードされるタンパク質の発現を指標して検出することもできる。
【００３１】
また、本発明は、本発明の判定方法に使用するための試薬を提供する。その一つの態様としては、本発明のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、植物細胞における再分化能の有無を判定するための試薬が挙げられる。
【００３２】
該オリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００３３】
本発明のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、上記本発明の判定方法におけるプローブ（該プローブが固定された基板を含む）やプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、本発明のＤＮＡの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００３４】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００３５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００３７】
本発明の試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）培養細胞の誘導
種子を滅菌後、Ｏｚａｗａらの方法（Ｏｚａｗａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｅｏｒ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．，　１９８９，　７７，　２０５−２１１．）に従ってイネ培養細胞を誘導した。寒天培地上で、２週間ごとに継代培養を行った。培養細胞誘導後、２ヶ月〜６ヶ月の培養細胞を塚原らの方法（Ｔｓｕｋａｈａｒａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｏｔ．　Ｍａｇ．　Ｔｏｋｙｏ，　１９９２，　１０５，　２２７−２３３．）に従い再分化能を検定した。
【００３９】
（２）ＲＮＡの単離
Ｉｓｏｇｅｎ（和光）のプロトコールに従い継代後、２週間目の培養細胞よりＲＮＡを抽出した。
【００４０】
（３）ディファレンシャルディスプレイ及びＤＮＡフラグメントのクローニングＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ社のプロトコールに従い３３Ｐを用いディファレンシャルディスプレイを行った。差の見られたバンドを切り出した後、ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ社のプロトコールに従いクローニングを行った。
【００４１】
（４）シークエンス及び完全長ｃＤＮＡの単離
得られたバンドをクローニングしＤＮＡを増殖後、シークエンスをＡＢＩのプロトコールに従い行った。シークエンス決定後、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　のプロトコールに従い完全長ｃＤＮＡを得た。このシークエンスを決定した（配列番号：１）。
【００４２】
（５）ノーザンハイブリダイゼーション
得られた遺伝子の３’非翻訳領域またはディファレンシャルディスプレイで得られたシークエンスからプローブを作製し、ノーザン解析を行った。具体的には、ＧＣＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＡＴＧＧＣ（２２ｎｏｒ１；配列番号：２）およびＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＧＣＡＧＡＴ（２２ｎｏｒ２；配列番号：３）の配列を有するプライマーを用いＰＣＲにより２２Ａ遺伝子の３’非翻訳領域を増幅しゲル濾過精製後プローブに用いた。ＭｅｇａＰｒｉｍｅ（Ａｍａｓｈａｍ）を用いＲＩプローブを作成した。Ｉｓｏｇｅｎを用い培養細胞よりＲＮＡを単離後、Ｓｈｏｒｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｏｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　のプロトコールに従い１％ホルムアルデヒド変性ゲルを用い電気泳動を行った後、Ａｍａｓｈａｍ社のＨｙｂｏｎｄＮ＋にｔｒａｎｓｆｅｒ後ＡｍａｓｈａｍのＲａｐｉｄ−ｈｙｂ　ｂｕｆｆｅｒを用いノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【００４３】
［実施例１］
湖南早の高い培養特性（誘導した培養細胞の増殖が良く、また再分化能も高い形質）を導入したコシヒカリ、ササニシキアイソジェニックラインを作出した。図１にコシヒカリ及びコシヒカリアイソジェニックラインの再分化の様子を示す。コシヒカリ由来培養細胞は増殖が悪く、褐変し、ほとんど植物体が再分化してこない。しかし湖南早の遺伝子を導入したアイソジェニックライン由来の培養細胞は増殖も良く、再分化率も９０％以上と高かった。そこで、再分化能を確認した培養細胞よりＲＮＡを抽出した後、ディファレンシャルディスプレイを行った。
【００４４】
その結果、高い再分化能を持つ湖南早及びアイソジェニックラインで濃く、ササニシキ、コシヒカリでは非常に薄いバンドを見いだした（図２）。これらのバンドを切り出し、クローニング、シークエンスを行った。このシークエンスを元にＲＴ−ＰＣＲを行い、発現の確認を行った。またこのとき、ディファレンシャルディスプレイ法に用いたコシヒカリＢ４Ｆ３系統で再分化能がコシヒカリレベルに低下してしまった系統も同時にコントロールとして用いた。Ｆａｌｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅで発現に差が見られないもの、再分化能の低いコントロールアイソジェニックラインにも発現が見られ、再分化能に関与しない、湖南早の残存遺伝子と考えられるバンドがほとんどで、最終的に再分化関連遺伝子と考えられたバンド（２２Ａ）は一つであった。
【００４５】
次に、配列番号：４に記載のＤＮＡをＧｅｎｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ　として５’ＲＡＣＥを行い完全長ｃＤＮＡを得た。この遺伝子（２２Ａ；配列番号：１）（２２Ａ遺伝子と命名）はＨｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｒｉｂｉｔｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｍＲＮＡと高いホモロジーを示した。なお、２２Ａ　遺伝子からコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に記載する。
【００４６】
Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｒｉｂｉｔｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ遺伝子は大麦の胚発生後期で特異的に発現していることが報告されている。また該遺伝子がｇｌｕｃｏｓｅを代謝する事も調べられている。さらにイネｅｎｄｓｐｅｒｍライブラリーや幼穂のｒｉｐｅｎｉｎｇ　ｓｔａｇｅのライブラリーで該遺伝子が確認されている。またトウモロコシでも該遺伝子の発現が胚発生過程で起こる事が報告されている。このことから該遺伝子は胚発生関連遺伝子であることが強く示唆される。
【００４７】
［実施例２］
ディファレンシャルディスプレイで得られたシークエンスをプローブにノーザンハイブリダイゼーションを行った（図３）。ディファレンシャルディスプレイの結果と同様に、コシヒカリ、ササニシキでは発現が見られず、湖南早、及び高い再分化能を持つアイソジェニックラインでは２２Ａ　遺伝子の発現が確認できた。また戻し交雑の過程で再分化能がコシヒカリと同様に低下しているアイソジェニックラインもコントロールとして用いた。これらの系統ではコシヒカリと同様に該遺伝子の発現が確認できなかった。
【００４８】
これだけでは戻し交配の結果ランダムに残った湖南早由来の遺伝子の発現が考えられるので、高い再分化能を持つコシヒカリアイソジェニックラインＢ４Ｆ３にコシヒカリを戻し交配しＢ５Ｆ３世代を得、再分化能を確認後、このＢ５Ｆ３世代を用い再度ノーザンハイブリダイゼーションを行った（図４）。具体的には、Ｂ４Ｆ３、２系統とコシヒカリを交配し得られた２系統のコシヒカリアイソジェニックラインを用いノーザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、Ｂ４Ｆ３で得られたノーザンハイブリダイゼーションの結果と同様に高い再分化能を持つ系統では２２Ａ　遺伝子の発現が確認でき、低い再分化能を示した系統では該遺伝子の発現は確認できなかった。
【００４９】
［実施例３］
２２Ａ　遺伝子の発現と再分化能に関連があるかさらに検証するために、イネ品種１３系統を用い再分化率の検定とノーザンハイブリダイゼーションを行った（表１、図５および６）。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
プローブにはＰＣＲで増幅した３’非翻訳領域を用いた。誘導した培養細胞の高い再分化能が長期間、保持される湖南早、Ｐａｎｂｉｒａ、Ｋｅｌｅ及びＮｅｐＶａｉでは２２Ａ　遺伝子は培養細胞誘導初期、及び、４ヶ月経過後でも強く発現していた。他の品種では、培養４ヶ月目には発現がほとんど確認できなくなった。また再分化率も低下した。培養初期から細胞の増殖も悪く再分化能も低いコシヒカリ、ＩＲ８及びＫｏｎａｎｓｅｎでは誘導初期及び培養４ヶ月目の培養細胞いずれでも発現が確認できなかった。そこで培養初期に発現が確認できた日本晴れの培養初期と培養６ヶ月目の培養細胞の再分化能と該遺伝子の発現を調べた。また高い再分化能を長期間保持するＮｅｐＶａｉで再分化能が低下した培養細胞が得られたので、分化能が維持されている培養細胞との比較を行った。各培養細胞の分化率を表２で、ノーザンハイブリダイゼーションの結果を図７で示す。
【００５２】
【表２】
2004000125.tif 000003
【００５３】
日本晴れ培養初期の再分化率は高く、２系統とも１００％の再分化率を示した。しかし培養６ヶ月時点では再分化率は３０％以下に低下していた。またＮｅｐＶａｉ２系統は高い再分化能を示したが、１系統は１０％以下の低い再分化率であった。これら８系統のノーザンハイブリダイゼーションの結果を図７に示している。高い再分化能を持つ培養細胞では２２Ａ　遺伝子の発現が確認でき、低い再分化能を示した培養細胞では発現が確認できないかまたは非常に弱かった。
【００５４】
以上の結果は、２２Ａ遺伝子が再分化関連遺伝子であること、また、該遺伝子が発現していることにより、培養細胞の再分化能が長期間維持されるように成ることを強く示唆している。培養初期と長期間培養した日本晴れ培養細胞及び高い再分化能持つＮｅｐＶａｉ培養細胞、分化能を失ったＮｅｐＶａｉ培養細胞の該遺伝子の発現解析の結果もこの考えを支持する。
【００５５】
［実施例４］
２２Ａ遺伝子を、単子葉植物で強い発現を誘導するプロモーターであるｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（Ｕｂｉ−１）プロモーター　でドライブする発現ベクターを構築し（図８）、イネ品種、コシヒカリにアグロバクテリウム法で導入した。ハイグロマイシン抵抗性カルスを選抜後、各カルスよりｍＲＮＡを抽出しノーザンハイブリダイゼーションを行い、抵抗性カルスで導入遺伝子の発現を確認した（図９）。
次いで、形質転換カルスを再分化培地に置床し、その再分化率を検定した（図１０、表３）。
【表３】
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値は、３回の独立した実験の平均値を表わす。＋は、標準偏差。
コントロールのカルスとして形質転換処理を行っていないカルスを用いた。また再分化率は「再分化したカルス数／置床したカルス数」で計算した。その結果、形質転換カルスはコントロールのコシヒカリと比較して明らかに再分化率が高く、ほぼ全てのカルスから植物体が再分化した。以上の結果からＯｓ２２Ａ遺伝子は再分化能の高いカルスの誘導に非常に重要な働きをしていると考えられた。
【００５６】
イネ科植物の培養細胞の再分化能は培養過程で急速に低下しやすく、再分化能を長期間維持することは困難であった。エンブリオジェニック・カルス（Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｌｕｓ）と言われる、再分化能の高い培養細胞を継代ごとに選抜する事により、高い再分化能を維持していくことができると多くイネ科植物で報告されている。このエンブリオジェニック・カルス形成にこの遺伝子が何らかの関与をしているのでは考えられた。実際、湖南早、ＮｅｐＶａｉ、Ｋｅｌｅ、Ｐａｎｂｉｒａの培養細胞は白色でコンパクトな形態をしておりエンブリオジェニック・カルスの報告されている形態と酷似していた。
【００５７】
トウモロコシ、小麦等このエンブリオジェニック・カルス形成が報告されているイネ科植物２２Ａ遺伝子の発現を詳細に調べることによりこの関係が明らかに成ると考えられる。また該遺伝子発現をマーカーに高い再分化能を持つ培養細胞を選抜することも可能と考えられた。今までは高い再分化能を持つイネ科植物培養細胞の選抜、維持は黙視でしかできなかったが、２２Ａ遺伝子発現を調べることにより容易に細胞選抜ができると考えられる。
【００５８】
【発明の効果】
本発明者らによって、植物の再分化能に関与する遺伝子が見出された。該遺伝子は、高い再分化能を持つ植物細胞を選抜するためのマーカーとして使用できる。また、該遺伝子を植物細胞に導入することで、植物細胞に再分化能を付与することができる。さらに、植物の再分化能に関与する遺伝子を用いた植物細胞の再分化系の確立によって、より広範囲の植物において、形質転換技術を適用する事が可能となるものと期待される。
【００５９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】コシヒカリおよび各コシヒカリアイソジェニックラインの再分化を示す写真である。
【図２】ディファレンシャルディスプレイで得られたバンドパターンを示す写真である。
【図３】２２Ａ遺伝子の発現パターンを示す写真である。
【図４】各種アイソジェニックラインにおける２２Ａ遺伝子の発現パターンを示す写真である。
【図５】培養初期の各種における２２Ａ遺伝子の発現パターンを示す写真である。
【図６】培養４ヶ月目の各種における２２Ａ遺伝子の発現パターンを示す写真である。
【図７】日本晴れおよびＰａｎｂｉｒａの各培養細胞における２２Ａ遺伝子の発現パターンを示す写真である。
【図８】イネ形質転換に用いるＯｓ２２Ａ　ｃＤＮＡを含むバイナリベクターの構成を示す図である。ＮｏｓＰは、ノパリンシンターゼプロモーター、ＮＰＴ　ＩＩは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、ＮｏｓＴはノパリンシンターゼ遺伝子の３’シグナル、Ｕｂｉ１−Ｐはトウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーター、３５Ｓ−Ｐはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＨｐｔＩＩはハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ＢＲは右ボーダー、ＢＬは左ボーダー、矢印は、転写の方向を示す。
【図９】コシヒカリ由来の形質転換カルスにおけるＯｓ２２Ａの発現パターンをノーザンブロットで分析した結果を示す写真である。レーン１：コシヒカリ、レーン２〜８：コシヒカリ形質転換カルス。カルスからのＴｏｔａｌ　ＲＮＡ（１５μｇ／レーン）を、ノーザンハイブリダイゼーション分析に供した。
【図１０】コシヒカリ及び形質転換したコシヒカリのカルスの再分化の写真である。ハイグロマイシン選抜によりスクリーニング後、形質転換カルスを２，４−Ｄ（２　ｍｇ／Ｌ）、プロリン（１０　ｍＭ）、カゼイン加水分解物（３００　ｍｇ／Ｌ）、スクロース（３０　ｇ／Ｌ）およびゲルライト（４　ｇ／Ｌ）を添加したＮ６培地にて３週間のインターバルでサブカルチャーし、再分化培地へトランスファーした。Ｔｕｂｉ−３は、コシヒカリ由来形質転換カルスである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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