(57)【要約】【課題】ヒアルロン酸受容体であるＣＤ４４を阻害し、変形性関節症の治療及び／または予防薬として有用な新規化合物およびその製造法を提供すること。【解決手段】グロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ）ＳＡＮＫ  ３０５０２株の培養産物から得られる式（Ｉ）に示される化合物等の提供。【化１】2004275060.tif 000027【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2004275060.tif 000025
（式中、Ｒ１は水素原子又はアセチル基を表し、Ｒ２は水素原子又はマロニル基を表し、Ｒ３は、水素原子又はアセチル基を表す。）で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
請求項１に記載の式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が水素原子である化合物又はその塩。
【請求項３】
請求項１に記載の式（Ｉ）において、Ｒ１がアセチル基、Ｒ２及びＲ３が水素原子である化合物又はその塩。
【請求項４】
請求項１に記載の式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ３がアセチル基、Ｒ２が水素原子である化合物又はその塩。
【請求項５】
請求項１に記載の式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ３がアセチル基、Ｒ２がマロニル基である化合物又はその塩。
【請求項６】
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶；
３）分子式：Ｃ３８Ｈ６２Ｏ１６；
４）分子量：７７４；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０７（２９７００）、２４３（ｓｈ、４６００）、３０６（３９００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである、
３３７７、２９２３、２８５２、１７２６、１６６３、１４６５、１３７９、１２１６、１０７４、１０２９；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１５−１．３５  （２２Ｈ，  ｍ），  １．２９  （３Ｈ，  ｄ，  ６  Ｈｚ），  １．２９  （２Ｈ，  ｍ），  １．４５  （１Ｈ，  ｍ），  １．６３  （１Ｈ，  ｍ），  １．７２  （２Ｈ，  ｍ），  ２．６２  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．９２  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０８  （１Ｈ，  ｄ，  ９．０  Ｈｚ），  ４．２１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２５  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２９  （１Ｈ，  ｍ），  ４．４  （１Ｈ，  ｍ），  ４．５６−４．６１  （３Ｈ，  ｍ），  ４．７７  （１Ｈ，  ｂｒ．  ｓ），  ４．８８  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ５．１６  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ５．２  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２４  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ５．３７  （１Ｈ，  ｓ），  ６．８５  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１７  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ７．３９  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである
２０．２，  ２４．２，  ２５．８，  ２９．７−２９．９  （１１シグナル），  ３６．２，  ４２．３，  ６３．４，  ６３．８，  ６９．６，  ７０．４，  ７１．２，  ７２．３  （２シグナル），  ７３．６，  ７５．８，  ７８．７，  ８１．６，  １０２．４，  １１６．７，  １２２．９，  １３３．４，  １３９．６，  １６４．０，  １７４．８
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ３．６分。
【請求項７】
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶；
３）分子式：Ｃ４０Ｈ６４Ｏ１７；
４）分子量：８１６；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（３２０００）、２４２（ｓｈ、４９００）、３０６（４３００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである
３３９０、２９２５、２８５３、１７３０、１６７１、１４６５、１３７６、１２４９、１０７５、１０３１；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１４−１．２６  （２２Ｈ，  ｍ），  １．３１  （３Ｈ，  ｄ，  ６．５  Ｈｚ），  １．３１  （２Ｈ，  ｍ），  １．４９  （１Ｈ，  ｍ），  １．６４−１．７６  （３Ｈ，  ｍ），  ２．１０  （３Ｈ，  ｓ），  ２．６０  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．９７  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２１  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２４−４．３４  （３Ｈ，  ｍ），  ４．３９  （１Ｈ，  ｄｄ，  ９．０  Ｈｚ，  ９．５  Ｈｚ），  ４．６３  （２Ｈ，  ｍ），  ４．７７  （２Ｈ，  ｓ），  ５．１６  （２Ｈ，  ｓ），  ５．２３  （１Ｈ，  ｍ），  ５．６０  （１Ｈ，  ｓ），  ６．１４  （１Ｈ，  ｄ，  ３．５  Ｈｚ），  ６．８６  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１６  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ７．４０  （１Ｈ，  ｔ，  ８．０  Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２，  ２１．３，  ２４．２，  ２５．８，  ２９．７−３０．０  （１１シグナル），  ３６．３，  ４２．３，  ６３．２，  ６３．９，  ６９．６，  ７０．４，  ７１．２，  ７２．２，  ７３．４  （２シグナル），  ７３．７，  ７８．６，  ８０．４，  １００．０，  １１６．７，  １２２．９，  １３３．７，  １３９．５，  １６３．８，  １７１．１，  １７４．６９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ４．８分。
【請求項８】
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色油状；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ４２Ｈ６６Ｏ１８；
４）分子量：８５８；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９９００）、２４２（４７００）、３０６（３９００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（薄膜法）：νｍａｘ  ｃｍ−１
薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４１８、２９２７、２８５５、１７３８、１６７２、１４６５、１３７５、１２３１、１０７５、１０３２；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１９−１．２６  （２２Ｈ，  ｍ），  １．３６  （３Ｈ，  ｄ，  ５．０  Ｈｚ），  １．３６  （１Ｈ，ｍ），  １．５１  （２Ｈ，  ｍ），  １．７２  （３Ｈ，  ｍ），  １．８２  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１９  （３Ｈ，  ｓ），  ２．６０  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．９５  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２２  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２２−４．３５  （２Ｈ，  ｍ），  ４．３７−４．４  （２Ｈ，  ｍ），  ４．４７  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ４．６１−４．６４  （２Ｈ，  ｍ），  ４．８  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２３  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ５．２８  （１Ｈ，  ｍ），  ５．５８  （１Ｈ，  ｓ），  ５．６９  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ６．１３  （１Ｈ，  ｄ，  ３．５  Ｈｚ），  ６．８６  （１Ｈ，  ｄ，  ７．０  Ｈｚ），  ７．１６  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ７．４０  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２  （２シグナル），  ２１．３，  ２４．２，  ２５．７，  ２９．７−３０．０  （１１シグナル），  ３６．３，  ４２．３，  ４８．６，  ６３．１，  ６３．２，  ６９．６，  ６９．８，  ７０．４，  ７１．９，  ７３．５，  ７３．６，  ７４．０，  ７８．５，  ７９．０，  ９９．６，  １１５．３，  １１６．８，  １２３．０，  １３３．７，  １３９．６，  １６３．９，  １７０．３，  １７０．９，  １７１．１，  １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ７．５分。
【請求項９】
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色油状；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ４５Ｈ６８Ｏ２１；
４）分子量：９４４；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９４００）、２４３（ｓｈ、４７００）、３０７（４２００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（薄膜法）：νｍａｘ  ｃｍ−１
薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４２１、２９２６、２８５５、１７４１、１６７３、１４６５、１３７５、１２２８、１０７１；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１６−１．３２  （２２Ｈ，  ｍ），  １．３６  （３Ｈ，  ｄ，  ６．０  Ｈｚ），  １．３６  （１Ｈ，  ｍ），  １．４９  （２Ｈ，  ｍ），  １．７２  （３Ｈ，  ｍ），  １．７９  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１４  （３Ｈ，  ｓ），  ２．６１  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．７８  （２Ｈ，  ｓ），  ４．０１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２３  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２３−４．２８  （１Ｈ，  ｍ），  ４．３４−４．４１  （３Ｈ，  ｍ），  ４．６０  （１Ｈ，  ｄ，  １０．０  Ｈｚ），  ４．７７  （１Ｈ，  ｍ），  ４．９３  （１Ｈ，  ｍ），  ５．１１  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ５．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ５．５８  （１Ｈ，  ｓ），  ５．６６  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ６．２５  （１Ｈ，  ｓ），  ６．８６  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１７  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ７．４０  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２  （２シグナル），  ２１．２，  ２４．２，  ２５．７，  ２９．７−３０．０  （１１シグナル），  ３６．３，  ４２．３，  ４２．８，  ４８．８，  ６３．３，  ６６．６，  ６９．７，  ６９．８，  ７０．１，  ７２．０，  ７３．２，  ７３．６，  ７３．９，  ７６．０，  ７８．４，  ９９．７，  １１５．４，  １１６．８，  １２２．９，  １３３．６，  １３９．６，  １６３．９，  １６８．０，  １７０．０，  １７０．３，  １７０．８，  １７０．８，  １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ８．５分。
【請求項１０】
グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属し、請求項２乃至９に記載の化合物並びに下記の１）及び２）に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を生産する能力を有する菌を培養し、その培養物から、請求項２乃至９に記載の化合物並びに下記の１）及び２）に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を回収することを特徴とする、請求項２乃至９に記載の化合物並びに下記の１）及び２）に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物の製造方法：
１）下記式（ＩＩ）で表される化合物（以下、「化合物Ｇ１」とする。）又はその塩
【化２】
2004275060.tif 000026
（式中、Ａｃはアセチル基（ＣＯＣＨ３）を表す。）、
２）下記の物理化学的性状を有する化合物（以下、「化合物Ｇ２」とする）又はその塩
▲１▼性質：無色粉末；
▲２▼溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶。；
▲３▼分子式：Ｃ４３Ｈ６６Ｏ２０；
▲４▼分子量：９０２；
▲５▼紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９０００）、２４１（ｓｈ、４５００）、３０５（３２００）ｎｍに吸収極大を示す、
▲６▼赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０８、２９２４、２８５３、１７３９、１６６１、１４５３、１３７７、１２４２、１０６８；
▲７▼  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．２１−１．３１  （２０Ｈ，  ｓ），  １．３６  （３Ｈ，  ｄ，  ６．０  Ｈｚ），  １．３６  （１Ｈ，  ｍ），  １．４８  （４Ｈ，  ｍ），  １．７１  （１Ｈ，  ｍ），  １．８５  （２Ｈ，  ｍ），  １．８８  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１５  （３Ｈ，  ｓ），  ３．３１  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．７８  （２Ｈ，  ｓ），  ４．０１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２７  （１Ｈ，  ｄｄ，  ８．０  Ｈｚ，  １０．５  Ｈｚ），  ４．３４−４．４１  （３Ｈ，  ｍ），  ４．６０  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ４．７７  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．０  Ｈｚ，  １１．５  Ｈｚ），  ４．９３  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２１  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ５．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ５．５８  （１Ｈ，  ｓ），  ５．６６  （１Ｈ，  ｄ，  １０．０  Ｈｚ），  ６．２４  （１Ｈ，  ｓ），  ６．９１  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１４  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ７．３９  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）、
▲８▼１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２  （２シグナル），  ２１．２，  ２５．７，  ２９．８−３０．０  （１０シグナル），  ３０．３，  ３２．７，  ３６．２，  ３６．３，  ４２．８，  ６３．３，  ６６．６，  ６９．７，  ６９．８，  ７０．１，  ７２．０，  ７３．２，  ７３．６，  ７３．９，  ７６．０，  ７８．５，  ９９．６，  １１５．５，  １１７．１，  １２１．８，  １３２．８，  １４６．４，  １６２．６，  １６８．０，  １７０．０，  １７０．３，  １７０．８  （２シグナル），  １７５．０、
▲９▼高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  １１．４分。
【請求項１１】
化合物が請求項２に記載の化合物であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
化合物が請求項３に記載の化合物であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１３】
化合物が請求項４に記載の化合物であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１４】
化合物が請求項５に記載の化合物であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１５】
化合物が化合物Ｇ１であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１６】
グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する菌がグロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ）  であることを特徴とする、請求項１０乃至１５のいずれか一つに記載の製造方法。
【請求項１７】
グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する菌がグロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）であることを特徴とする、請求項１０乃至１５のいずれか一つに記載の製造方法。
【請求項１８】
グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する菌がグロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ  ３０５０２株であることを特徴とする、請求項１０乃至１５のいずれか一つに記載の製造方法。
【請求項１９】
グロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）  Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ  ３０５０２株。
【請求項２０】
請求項２乃至９に記載の化合物群から選択される少なくとも一つの化合物又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項２１】
請求項２乃至９に記載の化合物、化合物Ｇ１及び化合物Ｇ２からなる群から選択される少なくとも一つの化合物又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬及び／又は治療薬：
【請求項２２】
請求項２乃至９に記載の化合物並びに化合物Ｇ１及び化合物Ｇ２からなる群から選択されるいずれか一つの化合物又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬及び／又は治療薬。
【請求項２３】
請求項２乃至９に記載の化合物並びに化合物Ｇ１及び化合物Ｇ２からなる群から選択される少なくとも一つの化合物又はその塩を含有するヒアルロン酸とＣＤ４４との結合阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒアルロン酸受容体であるＣＤ４４を阻害し、変形性関節症の治療及び／又は予防薬として有用な新規化合物およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
変形性関節症は関節軟骨の老化と筋力の低下を基盤に機械的な刺激が加わり、関節にかかる負担に耐えられない軟骨の変性・破壊を生じる疾患である（例えば、非特許文献１参照。）。疼痛が主訴であることが多いため、主な治療には鎮痛薬として非ステロイド性抗炎症薬を投与する対症療法が広く行われている（例えば、非特許文献２参照。）。変形性関節症の根本的な原因である軟骨基質分解の抑制を目指したマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（例えば、非特許文献３参照。）は臨床の場で有効性を発揮するには至っていない。こうした状況下においてヒアルロン酸製剤であるアルツ（ヒアルロン酸ナトリウム関節内注射液、科研製薬株式会社）は現在、変形性関節症に対して有効性を示すほとんど唯一の薬剤である。滑液成分であるヒアルロン酸を関節内に直接投与し、補充することにより疼痛を抑制し、関節軟骨の保護作用をもたらす（例えば、非特許文献４及び５参照。）。しかしながら注射剤としての一般的な問題点である、投与の煩雑さ、患者の負担の大きさに加え、投与可能な部位が肩、膝などの比較的大きな関節に限定されるといった問題が残っている。従って、ヒアルロン酸を直接補充するのではなく、生体内におけるヒアルロン酸の分解を阻害する薬剤は、アルツと同様の作用を持つ上、肩・膝関節のみならず全身の関節炎への効果を持つことが期待される。
【０００３】
生体内におけるヒアルロンの分解は細胞表面に存在するレセプターであるＣＤ４４にヒアルロン酸が結合することから開始されると考えられている（例えば、非特許文献６参照。）。従って、ＣＤ４４とヒアルロン酸の結合を阻害する物質はヒアルロン酸の分解を阻害し、生体内でのヒアルロン酸量を保持、あるいは増加させることにより関節機能改善作用を持つと考えられるが、現在までにはこうした薬理作用を持つ化合物は報告されていない。
【０００４】
式（ＩＩＩ）に示されるカロポロサイド（Ｃａｌｏｐｏｒｏｓｉｄｅ）
【０００５】
【化３】
2004275060.tif 000002
はＣａｌｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓが生産する物質として同定された弱い抗菌活性を有する化合物である（例えば、非特許文献７参照。）。一方、グロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ）（Ｆｒ．：Ｆｒ．）  Ｂｒｅｓ．  ＳＴ００１７１４，  ＤＳＭ  １３７８４はカロポロサイドの類縁化合物を生産し、該化合物が抗腫瘍活性を有することが報告されている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、カラポロサイド及びその類縁化合物がＣＤ４４とヒアルロン酸との結合に影響を及ぼすとの報告はない。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第０２／０７２１１０号パンフレット
【非特許文献１】
「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）」、１９９９年、第３５３巻、ｐ．２１７７−２１７８
【非特許文献２】
「アメリカン・ファミリー・フィジシャン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆａｍｉｌｙ．  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）」、２００２年、第６５巻、ｐ．８４１−８４８
【非特許文献３】
「オステオアルスリティス・アンド・カーティリッジ（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）」、２００２年、第１０巻、ｐ．７８５−７９１
【非特許文献４】
「関節外科」、１９９６年、第１５巻、ｐ．１１７３−１１７９頁
【非特許文献５】
「日本整形外科学会雑誌」、１９９５年、第６９巻、ｐ．７３５−７４３
【非特許文献６】
「ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９３年、第１０６巻、ｐ．３６５−３７５
【非特許文献７】
「ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」、１９９４年、第４７巻、ｐ．１１８８−１１９４
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、生体内でヒアルロン酸の分解を阻害し、疼痛抑制・軟骨保護作用を示す新しい変形性関節症治療薬の開発を目指し、ヒアルロン酸とそのレセプターであるＣＤ４４の結合を阻害する物質の探索を、鋭意実施した。その結果、土壌より分離した、グロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ）ＳＡＮＫ  ３０５０２株の培養液中に、ヒアルロン酸とＣＤ４４の結合を阻害する活性を有するカロポロサイド類縁化合物であるＡ物質（式（ＩＶ））、
【０００８】
【化４】
2004275060.tif 000003
Ｂ物質（式（Ｖ））、
【０００９】
【化５】
2004275060.tif 000004
Ｅ物質（式（ＶＩ））、
【００１０】
【化６】
2004275060.tif 000005
Ｆ物質（式（ＶＩＩ））、
【００１１】
【化７】
2004275060.tif 000006
およびＧ物質（式（ＩＩ））、
【００１２】
【化８】
2004275060.tif 000007
が産生されることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１３】
更に、本発明の他の目的は、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を有効成分とする変形性関節症治療薬を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）
下記式（Ｉ）
【００１５】
【化９】
2004275060.tif 000008
【００１６】
（式中、Ｒ１は水素原子又はアセチル基を表し、Ｒ２は水素原子又はマロニル基を表し、Ｒ３は、水素原子又はアセチル基を表す。）で表される化合物又はその塩、
（２）（１）に記載の式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が水素原子である化合物又はその塩、
（３）（１）に記載の式（Ｉ）において、Ｒ１がアセチル基、Ｒ２及びＲ３が水素原子である化合物又はその塩、
（４）（１）に記載の式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ３がアセチル基、Ｒ２が水素原子である化合物又はその塩、
（５）（１）に記載の式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ３がアセチル基、Ｒ２がマロニル基である化合物又はその塩、
（６）下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶；
３）分子式：Ｃ３８Ｈ６２Ｏ１６；
４）分子量：７７４；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０７（２９７００）、２４３（ｓｈ、４６００）、３０６（３９００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである、
３３７７、２９２３、２８５２、１７２６、１６６３、１４６５、１３７９、１２１６、１０７４、１０２９；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１５−１．３５  （２２Ｈ，  ｍ），  １．２９  （３Ｈ，  ｄ，  ６  Ｈｚ），  １．２９  （２Ｈ，  ｍ），  １．４５  （１Ｈ，  ｍ），  １．６３  （１Ｈ，  ｍ），  １．７２  （２Ｈ，  ｍ），  ２．６２  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．９２  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０８  （１Ｈ，  ｄ，  ９．０  Ｈｚ），  ４．２１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２５  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２９  （１Ｈ，  ｍ），  ４．４  （１Ｈ，  ｍ），  ４．５６−４．６１  （３Ｈ，  ｍ），  ４．７７  （１Ｈ，  ｂｒ．  ｓ），  ４．８８  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ５．１６  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ５．２  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２４  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ５．３７  （１Ｈ，  ｓ），  ６．８５  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１７  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ７．３９  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）；８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである
２０．２，  ２４．２，  ２５．８，  ２９．７−２９．９  （１１シグナル），  ３６．２，  ４２．３，  ６３．４，  ６３．８，  ６９．６，  ７０．４，  ７１．２，  ７２．３  （２シグナル），  ７３．６，  ７５．８，  ７８．７，  ８１．６，  １０２．４，  １１６．７，  １２２．９，  １３３．４，  １３９．６，  １６４．０，  １７４．８
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ３．６分。
（７）下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶；
３）分子式：Ｃ４０Ｈ６４Ｏ１７；
４）分子量：８１６；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（３２０００）、２４２（ｓｈ、４９００）、３０６（４３００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである
３３９０、２９２５、２８５３、１７３０、１６７１、１４６５、１３７６、１２４９、１０７５、１０３１；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１４−１．２６  （２２Ｈ，  ｍ），  １．３１  （３Ｈ，  ｄ，  ６．５  Ｈｚ），  １．３１  （２Ｈ，  ｍ），  １．４９  （１Ｈ，  ｍ），  １．６４−１．７６  （３Ｈ，  ｍ），  ２．１０  （３Ｈ，  ｓ），  ２．６０  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．９７  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２１  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２４−４．３４  （３Ｈ，  ｍ），  ４．３９  （１Ｈ，  ｄｄ，  ９．０  Ｈｚ，  ９．５  Ｈｚ），  ４．６３  （２Ｈ，  ｍ），  ４．７７  （２Ｈ，  ｓ），  ５．１６  （２Ｈ，  ｓ），  ５．２３  （１Ｈ，  ｍ），  ５．６０  （１Ｈ，  ｓ），  ６．１４  （１Ｈ，  ｄ，  ３．５  Ｈｚ），  ６．８６  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１６  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ７．４０  （１Ｈ，  ｔ，  ８．０  Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２，  ２１．３，  ２４．２，  ２５．８，  ２９．７−３０．０  （１１シグナル），  ３６．３，  ４２．３，  ６３．２，  ６３．９，  ６９．６，  ７０．４，  ７１．２，  ７２．２，  ７３．４  （２シグナル），  ７３．７，  ７８．６，  ８０．４，  １００．０，  １１６．７，  １２２．９，  １３３．７，  １３９．５，  １６３．８，  １７１．１，  １７４．６９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ４．８分、
（８）下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色油状；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ４２Ｈ６６Ｏ１８；
４）分子量：８５８；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９９００）、２４２（４７００）、３０６（３９００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（薄膜法）：νｍａｘ  ｃｍ−１
薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４１８、２９２７、２８５５、１７３８、１６７２、１４６５、１３７５、１２３１、１０７５、１０３２；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１９−１．２６  （２２Ｈ，  ｍ），  １．３６  （３Ｈ，  ｄ，  ５．０  Ｈｚ），  １．３６  （１Ｈ，ｍ），  １．５１  （２Ｈ，  ｍ），  １．７２  （３Ｈ，  ｍ），  １．８２  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１９  （３Ｈ，  ｓ），  ２．６０  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．９５  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２２  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２２−４．３５  （２Ｈ，  ｍ），  ４．３７−４．４  （２Ｈ，  ｍ），  ４．４７  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ４．６１−４．６４  （２Ｈ，  ｍ），  ４．８  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２３  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ５．２８  （１Ｈ，  ｍ），  ５．５８  （１Ｈ，  ｓ），  ５．６９  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ６．１３  （１Ｈ，  ｄ，  ３．５  Ｈｚ），  ６．８６  （１Ｈ，  ｄ，  ７．０  Ｈｚ），  ７．１６  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ７．４０  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２  （２シグナル），  ２１．３，  ２４．２，  ２５．７，  ２９．７−３０．０  （１１シグナル），  ３６．３，  ４２．３，  ４８．６，  ６３．１，  ６３．２，  ６９．６，  ６９．８，  ７０．４，  ７１．９，  ７３．５，  ７３．６，  ７４．０，  ７８．５，  ７９．０，  ９９．６，  １１５．３，  １１６．８，  １２３．０，  １３３．７，  １３９．６，  １６３．９，  １７０．３，  １７０．９，  １７１．１，  １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ７．５分、
（９）下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色油状；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ４５Ｈ６８Ｏ２１；
４）分子量：９４４；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９４００）、２４３（ｓｈ、４７００）、３０７（４２００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（薄膜法）：νｍａｘ  ｃｍ−１
薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４２１、２９２６、２８５５、１７４１、１６７３、１４６５、１３７５、１２２８、１０７１；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１６−１．３２  （２２Ｈ，  ｍ），  １．３６  （３Ｈ，  ｄ，  ６．０  Ｈｚ），  １．３６  （１Ｈ，  ｍ），  １．４９  （２Ｈ，  ｍ），  １．７２  （３Ｈ，  ｍ），  １．７９  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１４  （３Ｈ，  ｓ），  ２．６１  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．７８  （２Ｈ，  ｓ），  ４．０１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２３  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２３−４．２８  （１Ｈ，  ｍ），  ４．３４−４．４１  （３Ｈ，  ｍ），  ４．６０  （１Ｈ，  ｄ，  １０．０  Ｈｚ），  ４．７７  （１Ｈ，  ｍ），  ４．９３  （１Ｈ，  ｍ），  ５．１１  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ５．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ５．５８  （１Ｈ，  ｓ），  ５．６６  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ６．２５  （１Ｈ，  ｓ），  ６．８６  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１７  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ７．４０  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２  （２シグナル），  ２１．２，  ２４．２，  ２５．７，  ２９．７−３０．０  （１１シグナル），  ３６．３，  ４２．３，  ４２．８，  ４８．８，  ６３．３，  ６６．６，  ６９．７，  ６９．８，  ７０．１，  ７２．０，  ７３．２，  ７３．６，  ７３．９，  ７６．０，  ７８．４，  ９９．７，  １１５．４，  １１６．８，  １２２．９，  １３３．６，  １３９．６，  １６３．９，  １６８．０，  １７０．０，  １７０．３，  １７０．８，  １７０．８，  １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ８．５分、
（１０）グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属し、（２）乃至（９）に記載の化合物並びに下記の１）及び２）に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を生産する能力を有する菌を培養し、その培養物から、（２）乃至（９）に記載の化合物並びに下記の１）及び２）に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を回収することを特徴とする、（２）乃至（９）に記載の化合物並びに下記の１）及び２）に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物の製造方法：
１）下記式（ＩＩ）で表される化合物（以下、「化合物Ｇ１」とする。）又はその塩
【００１７】
【化１０】
2004275060.tif 000009
（式中、Ａｃはアセチル基（ＣＯＣＨ３）を表す。）、
２）下記の物理化学的性状を有する化合物（以下、「化合物Ｇ２」とする）又はその塩
▲１▼性質：無色粉末；
▲２▼溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶。；
▲３▼分子式：Ｃ４３Ｈ６６Ｏ２０；
▲４▼分子量：９０２；
▲５▼紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９０００）、２４１（ｓｈ、４５００）、３０５（３２００）ｎｍに吸収極大を示す、
▲６▼赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０８、２９２４、２８５３、１７３９、１６６１、１４５３、１３７７、１２４２、１０６８；
▲７▼  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．２１−１．３１  （２０Ｈ，  ｓ），  １．３６  （３Ｈ，  ｄ，  ６．０  Ｈｚ），  １．３６  （１Ｈ，  ｍ），  １．４８  （４Ｈ，  ｍ），  １．７１  （１Ｈ，  ｍ），  １．８５  （２Ｈ，  ｍ），  １．８８  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１５  （３Ｈ，  ｓ），  ３．３１  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．７８  （２Ｈ，  ｓ），  ４．０１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２７  （１Ｈ，  ｄｄ，  ８．０  Ｈｚ，  １０．５  Ｈｚ），  ４．３４−４．４１  （３Ｈ，  ｍ），  ４．６０  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ４．７７  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．０  Ｈｚ，  １１．５  Ｈｚ），  ４．９３  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２１  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ５．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ５．５８  （１Ｈ，  ｓ），  ５．６６  （１Ｈ，  ｄ，  １０．０  Ｈｚ），  ６．２４  （１Ｈ，  ｓ），  ６．９１  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１４  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ７．３９  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）、
▲８▼１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２  （２シグナル），  ２１．２，  ２５．７，  ２９．８−３０．０  （１０シグナル），  ３０．３，  ３２．７，  ３６．２，  ３６．３，  ４２．８，  ６３．３，  ６６．６，  ６９．７，  ６９．８，  ７０．１，  ７２．０，  ７３．２，  ７３．６，  ７３．９，  ７６．０，  ７８．５，  ９９．６，  １１５．５，  １１７．１，  １２１．８，  １３２．８，  １４６．４，  １６２．６，  １６８．０，  １７０．０，  １７０．３，  １７０．８  （２シグナル），  １７５．０、
▲９▼高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  １１．４分、
（１１）化合物が（２）に記載の化合物であることを特徴とする、（１０）に記載の製造方法、
（１２）化合物が（３）に記載の化合物であることを特徴とする、（１０）に記載の製造方法、
（１３）化合物が（４）に記載の化合物であることを特徴とする、（１０）に記載の製造方法、
（１４）化合物が（５）に記載の化合物であることを特徴とする、（１０）に記載の製造方法、
（１５）化合物が化合物Ｇ１であることを特徴とする、（１０）に記載の製造方法、
（１６）グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する菌がグロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ）  であることを特徴とする、（１０）乃至（１５）のいずれか一つに記載の製造方法、
（１７）グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する菌がグロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）であることを特徴とする、（１０）乃至（１５）のいずれか一つに記載の製造方法、
（１８）グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する菌がグロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ  ３０５０２株であることを特徴とする、（１０）乃至（１５）のいずれか一つに記載の製造方法、
（１９）  グロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）  Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ  ３０５０２株、
（２０）（２）乃至（９）に記載の化合物群から選択される少なくとも一つの化合物又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する医薬、
（２１）（２）乃至（９）に記載の化合物群並びに化合物Ｇ１及び化合物Ｇ２に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬及び／又は治療薬：
１）下記式（ＩＩ）で表される化合物（以下、「化合物Ｇ１」とする。）又はその塩
【００１８】
【化１１】
2004275060.tif 000010
（式中、Ａｃはアセチル基（ＣＯＣＨ３）を表す。）、
２）下記の物理化学的性状を有する化合物（以下、「化合物Ｇ２」とする）又はその塩
▲１▼性質：無色粉末；
▲２▼溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶。；
▲３▼分子式：Ｃ４３Ｈ６６Ｏ２０；
▲４▼分子量：９０２；
▲５▼紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９０００）、２４１（ｓｈ、４５００）、３０５（３２００）ｎｍに吸収極大を示す、
▲６▼赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０８、２９２４、２８５３、１７３９、１６６１、１４５３、１３７７、１２４２、１０６８；
▲７▼  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．２１−１．３１  （２０Ｈ，  ｓ），  １．３６  （３Ｈ，  ｄ，  ６．０  Ｈｚ），  １．３６  （１Ｈ，  ｍ），  １．４８  （４Ｈ，  ｍ），  １．７１  （１Ｈ，  ｍ），  １．８５  （２Ｈ，  ｍ），  １．８８  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１５  （３Ｈ，  ｓ），  ３．３１  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．７８  （２Ｈ，  ｓ），  ４．０１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２７  （１Ｈ，  ｄｄ，  ８．０  Ｈｚ，  １０．５  Ｈｚ），  ４．３４−４．４１  （３Ｈ，  ｍ），  ４．６０  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ４．７７  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．０  Ｈｚ，  １１．５  Ｈｚ），  ４．９３  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２１  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ５．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ５．５８  （１Ｈ，  ｓ），  ５．６６  （１Ｈ，  ｄ，  １０．０  Ｈｚ），  ６．２４  （１Ｈ，  ｓ），  ６．９１  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１４  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ７．３９  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）、
▲８▼１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２  （２シグナル），  ２１．２，  ２５．７，  ２９．８−３０．０  （１０シグナル），  ３０．３，  ３２．７，  ３６．２，  ３６．３，  ４２．８，  ６３．３，  ６６．６，  ６９．７，  ６９．８，  ７０．１，  ７２．０，  ７３．２，  ７３．６，  ７３．９，  ７６．０，  ７８．５，  ９９．６，  １１５．５，  １１７．１，  １２１．８，  １３２．８，  １４６．４，  １６２．６，  １６８．０，  １７０．０，  １７０．３，  １７０．８  （２シグナル），  １７５．０、
▲９▼高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  １１．４分、
（２２）（２）乃至（９）に記載の化合物並びに化合物Ｇ１及び化合物Ｇ２からなる群から選択されるいずれか一つの化合物又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬及び／又は治療薬、
（２３）（２）乃至（９）に記載の化合物並びに化合物Ｇ１及び化合物Ｇ２からなる群から選択される少なくとも一つの化合物又はその塩を含有するヒアルロン酸とＣＤ４４との結合阻害剤、
に関する。
【００１９】
本明細書において、「Ｆ−１６４３８Ａ」とは、下記式（ＩＶ）
【００２０】
【化１２】
2004275060.tif 000011
で表される化合物または上記（２）に記載の物理化学的性状を有する化合物（以下、「Ａ物質」という。）である。
【００２１】
本明細書において、「Ｆ−１６４３８Ｂ」とは、下記式（Ｖ）
【００２２】
【化１３】
2004275060.tif 000012
で表される化合物または上記（３）に記載の物理化学的性状を有する化合物（以下、「Ｂ物質」という。）である。
【００２３】
本明細書において、「Ｆ−１６４３８Ｅ」とは、下記式（ＶＩ）
【００２４】
【化１４】
2004275060.tif 000013
で表される化合物または上記（４）に記載の物理化学的性状を有する化合物（以下、「Ｅ物質」という。）である。
【００２５】
本明細書において、「Ｆ−１６４３８Ｆ」とは、下記式（ＶＩＩ）
【００２６】
【化１５】
2004275060.tif 000014
で表される化合物または上記（５）に記載の物理化学的性状を有する化合物（以下、「Ｆ物質」という。）である。
【００２７】
本明細書において、「Ｆ−１６４３８Ｇ」とは、下記式（ＩＩ）
【００２８】
【化１６】
2004275060.tif 000015
で表される化合物または上記（６）に記載の物理化学的性状を有する化合物（以下、「Ｇ物質」という。）である。なお、式（ＩＩ）で示される化合物は、前述の国際公開第０２／０７２１１０号パンフレットに記載されている化合物と同一の構造である。なお、Ｇ物質については上記式で表される構造を有する化合物を化合物Ｇ１といい、上記（６）に記載の物理化学的性状を有する化合物を化合物Ｇ２ということがある。
【００２９】
なお、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質の分子式は当業者が通常用いる方法によって決定することができるが、例えば、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルによって決定することができる。また、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質の分子量は当業者が通常用いる方法によって決定することができるが、例えば、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルによって決定することができる。
本発明のＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質は、神奈川県において採集された担子菌子実体の担子胞子より分離されたグロエオポルス・ダイクロウス  ＳＡＮＫ  ３０５０２株（以下、単に「ＳＡＮＫ  ３０５０２株」という。）の培養液中に生産される。すなわち、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質はＳＡＮＫ  ３０５０２株を培養し、その培養物からＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質を回収することによって製造することができる。
【００３０】
本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物は、種々の異性体を有する。本発明においては、これらの異性体がすべて単一の式で示されているが、本発明はラセミ化合物を含むこれらの異性体およびこれらの異性体の混合物も全て含むものである。立体特異的合成法が使用される場合、または光学活性化合物が原料化合物として使用される場合、個々の異性体は直接的に製造してもよいし、一方、異性体の混合物が製造されれば、個々の異性体は常法により得てもよい。
【００３１】
本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物は、当業者に周知の方法を用いて塩にすることができる。本発明はそのような塩も包含する。本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物の塩としては、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はない。なお本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物の塩が医薬以外の用途に用いられる場合、例えば中間体として使用される場合には何ら限定はない。そのような塩としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。より好適には、薬理学的に許容される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩等を挙げることができる。
【００３２】
また、本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物またはその塩は、溶剤和物となることがある。例えば、大気中に放置したり、または、再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があるが、そのような溶剤和物も本発明に包含される。
【００３３】
さらに本発明は、生体内において代謝されて本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物に変換される化合物、いわゆるプロドラッグも全て含むものである。
【００３４】
周知のとおり、放線菌は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ  ３０５０２株もこの点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ  ３０５０２株はその全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝学的方法、例えば、組み替え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。即ち本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物を生産する、ＳＡＮＫ  ３０５０２株およびその変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は、すべてＳＡＮＫ  ３０５０２株に包含されるものである。
【００３５】
【発明の実施の形態】
１．生産菌
Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを生産する微生物としては、特に限定されるものではないが、例えば、グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する糸状菌等を挙げることができ、好適にはグロエオポルス・ダイクロウス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）であり、より好適にはグロエオポルス・ダイクロウス  ＳＡＮＫ  ３０５０２株（以下、単に「ＳＡＮＫ  ３０５０２株」という。）である。ＳＡＮＫ  ３０５０２株は、１９９９年６月神奈川県において採集された担子菌子実体の担子胞子より分離された。
【００３６】
本菌の菌学的性状を観察するため、次の各培地上で培養を行った。使用した各培地の組成を以下に記載する。
【００３７】
（ポテトデキストロース寒天培地（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ：以下、「ＰＤＡ」という。））
ニッスイ  ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬（株）製）３９ｇ
寒天  ５ｇ
蒸留水  １０００ｍｌ
（ＷＳＨ培地）
オートミール  １０ｇ
硫酸マグネシウム七水和物  １ｇ
リン酸二水素カリウム  １ｇ
硝酸ナトリウム  １ｇ
寒天  ２０ｇ
蒸留水  １０００ｍｌ
色調の表示は「コーネラップ・ワンスチャー、メチューンハンドブックオブカラー  第３版，エアメチューン、ロンドン、１９７８年」  （Ｋｏｒｎｅｒｕｐ  Ａ，  Ｗａｎｓｃｈｅｒ  ＪＨ  （１９７８）  Ｍｅｔｈｕｅｎ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｏｌｏｕｒ  （３ｒｄ．  ｅｄｉｔｉｏｎ）．  ＥｒｙｅＭｅｔｈｕｅｎ，  Ｌｏｎｄｏｎ）に従った。
【００３８】
ＳＡＮＫ  ３０５０２株の培養下での菌学的性状は次の通りである。
【００３９】
ＰＤＡ上での生長は、２３℃、１週間の培養で２５乃至２７ｍｍである。菌そうは細粉状、白色乃至イエロイッシュホワイト（２Ａ２）である。裏面はペールイエロー（２Ａ３）である。ＷＳＨ上での生長は、２３℃、１週間の培養で３１乃至３３ｍｍである。菌そうは短軟毛状、白色乃至ペールイエロー（４Ａ３）である。裏面はペールイエロー（２Ａ３）である。気菌糸は幅２乃至５μｍ、薄壁で平滑、隔壁にかすがい連結を有する。においや分生子はない。
【００４０】
ＳＡＮＫ  ３０５０２株を同定するため、分離に供試した子実体乾燥標本の菌学的性状を観察した。その乾燥標本の菌学的性状は次の通りである。
【００４１】
子実体は半円形乃至棚状の傘を有し、下部で背着する。傘は幅３ｃｍ以下、厚さ２ｍｍ以下である。傘の上面は短毛で密に被われ、ペールイエロー（４Ａ３）である。肉は薄く白色である。傘下面の子実層托は管孔状、湿時には膠状、乾燥時には樹脂状でバイオレットブラウン（１１Ｆ５）である。管孔は長さ０．６ｍｍ以下、孔の口は１ｍｍあたり７乃至９個で円形である。菌糸は１菌糸型である。原菌糸は幅３乃至６μｍ、厚壁で隔壁にかすがい連結を有する。担子器は１０乃至１４μｍ×３乃至４μｍ、棍棒状で４つの小柄を有し、基部にかすがい連結を有する。担子胞子は３乃至４μｍ×１μｍ、ソーセージ形で薄壁、平滑で無色、非アミロイドである。
【００４２】
本菌の以上のような菌学的性状は、「今関六也・本郷次雄編、原色日本新菌類図鑑（ＩＩ）、保育社、大阪、１９８９年」の、グロエオポルス・ダイクロウスの菌学的性状に関する記載に一致した。よって、ＳＡＮＫ  ３０５０２株をグロエオポルス・ダイクロウス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）と同定した。
【００４３】
なお、ＳＡＮＫ  ３０５０２株は、グロエオポルス・ダイクロウス  ＳＡＮＫ  ３０５０２株として、平成１５年２月２７日付けで日本国茨城県つくば市東１−１−１の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３１０を付与された。
【００４４】
周知の通り、真菌類は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ  ３０５０２株もその点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ  ３０５０２株はその全ての変異株を包含する。
【００４５】
また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも包含される。即ち、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを生産するＳＡＮＫ  ３０５０２株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ  ３０５０２株に包含される。また、組換え、形質導入、形質導入、形質転換等により、未変異株と比較してＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質の生産量が変わったり、各物質の生産割合が変わった変異株も全てＳＡＮＫ  ３０５０２株に包含される。
【００４６】
ＳＡＮＫ  ３０５０２株を培養しＦ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを生産させる際、ｐＨ  ４．０乃至６．５の範囲の培地で培養を行なうことができる。
【００４７】
２．培養
Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを得るための、これらの微生物の培養は、他の発酵生成物を生産するために用いられるような培地中で行うことができる。このような培地には、微生物が同化できる炭素源、窒素源および無機塩を含有する。培養は、液体培養や固体培養等周知の方法で行うことができ、液体培養の場合にはバッチ培養や連続培養等周知の方法を適宜選択して行うことができ、固体培養の場合にはフスマ等を用いることができる。
【００４８】
一般に、炭素源としてグルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニルトース、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、あるいは併用して用いることができる。一般には、培地量の１〜１０重量％で変量する。
【００４９】
窒素源としては、一般に蛋白質およびその加水分解物を含有する物質または無機塩を発酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実油、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等である。窒素源は、単一または併用して培地量の０．２〜１０重量％の範囲で用いる。
【００５０】
培地中に取り入れる栄養無機塩は、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることのできる通常の塩類である。また、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属も含む。
【００５１】
液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。ＳＡＮＫ  ３０５０２株を培養し、Ｆ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を生産する培地のｐＨは、４．０〜６．５に変化できる。
【００５２】
培養温度はＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを生産する微生物が生育できる限りにおいて特に制限はないが、ＳＡＮＫ  ３０５０２株を用いるときは上記培養条件での生育温度は１０℃から３３℃あり、２３℃から３０℃の範囲が生育に良好であり、更にＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つの生産には、２３℃から２７℃が好適である。Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つは、これらの微生物を好気的に培養して得られるが、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等が用いられる。
【００５３】
小規模な培養においては、２３℃で数日間培養を行うのが良好である。培養は、三角フラスコ中で、一段階または複数段階の種の発育工程により開始する。種培養フラスコは定温インキュベーター中で数日間、または充分に成長するまで振とう培養する。成長した種培養液は、その一部または全部を次段階の種培地または生産培地に接種するのに使用される。接種した生産培地を含むフラスコを一定温度で数日間振とう培養し、培養終了後、フラスコの含有物を遠心分離またはろ過により分別する。
【００５４】
大量の培養の場合には、攪拌機、通気装置をつけた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法によれば、栄養培地をタンクの中で作製することができる。栄養培地を１２１℃まで加熱して滅菌し、冷却後この滅菌培地に、あらかじめ成長させてあった種培養液を接種する。培養は２３℃で通気攪拌して行う。この方法は多量の化合物を得るのに適している。
【００５５】
培養の経過にしたがって生産されるＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つの生産量の経時変化を知るには、例えば培養液を等量のアセトンで抽出、アセトン留去後、酸性条件下酢酸エチル抽出し、濃縮、乾固した油状物中のＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の量を後述するヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験、または高速液体クロマトグラフィーに付して測定する。通常は２５０時間から３５０時間の培養でＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つの生産量は最高値に達する。
【００５６】
３．Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の回収
培養物にはＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つが含まれている。なお、培養物としては、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又はは少なくともいずれか一つが含まれている限りにおいて培養中および培養後の菌体と培地の混合物、菌体、培地、培養上清のいずれも用いることができる。培養物中に含まれるＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の量及び各物質の割合は、培養条件等によって変わることがある。
【００５７】
液体培養を行った場合には培養液中の液体部分および菌体に存在するＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質は、菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤とするろ過操作または遠心分離によって分別し、菌体およびそのろ液または上清中に存在するＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質をその物理化学的性状を利用し抽出精製することにより得られる。
【００５８】
例えば、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質は、培養上清を水と混和しない有機溶剤、たとえば、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、メチレンクロライド等の単独またはそれらの組合せにより、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を抽出することにより回収・精製が可能である。
【００５９】
Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の精製には、活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（以上ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（以上三菱化学（株）社製）等を使用することができる。Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを含む培養液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、またはこれらの物質を吸着させた後、メタノール水、アセトン水等の水と有機溶剤との混合溶剤を用いて溶出させることによりこれらの物質を回収することができる。イオン交換樹脂としては、ダウエックス  ５０Ｗｘ４、ダウエックス１ｘ２、ダウエックス  ＳＢＲ−Ｐ（ダウ・ケミカル社製）等が使用される。Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを含む上記のごときイオン交換樹脂の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、またはＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを吸着させた後、塩酸やアンモニア水を用いて溶出させることにより得られる。
【００６０】
このようにして得られたＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つは、さらにシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、アビセル（旭化成工業（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィーおよび順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製することができる。
【００６１】
本発明の化合物であるＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の精製における所在は次に挙げる方法によって測定することができる。
【００６２】
（高速液体クロマトグラフィー）
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  Ａ物質  ３．６分、Ｂ物質  ４．８分、Ｅ物質  ７．５分、Ｆ物質８．５分、Ｇ物質  １１．４分
４．ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験
Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質はヒアルロン酸がＣＤ４４と結合するのを阻害する活性を有することが本発明者らによって明らかになった。ヒアルロン酸とＣＤ４４との結合阻害試験（「ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験」という。）はヒアルロン酸とＣＤ４４との結合に対する本発明のＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質の影響を調べることができる限りにおいて特に制限されないが、例えば後の（試験例１）に詳述するように、ヒトＣＤ４４発現細胞懸濁液に蛍光ヒアルロン酸と被験化合物（Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質から選択される物質）を添加して、蛍光ヒアルロン酸のＣＤ４４への特異的吸着量を測定する方法を用いることができる。
【００６３】
５．作用
Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質又はその塩は、ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害活性を有することが本発明者らによって明らかになった。したがって、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質またはその塩は、変形性関節症の予防薬および／又は治療薬としての用途に有効である。本発明は特に、Ａ物質又はその塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬および／又は治療薬、Ｂ物質又はその塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬および／又は治療薬、Ｅ物質又はその塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬および／又は治療薬、Ｆ物質又はその塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬および／又は治療薬並びにＧ物質またはその塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬および／又は治療薬を提供する。
【００６４】
変形性関節症の予防薬および／又は治療薬の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与、また注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点眼剤、座薬等による非経口投与を挙げることができる。
【００６５】
本発明の化合物を、上記疾患の予防薬又は治療薬として使用する場合には、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質又はＧ物質、その塩若しくはエステルを、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。
【００６６】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００６７】
本発明の化合物を患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；Ｂｌｕｍｅ  ａｎｄ  Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，１９９４，２３，１１９；Ｃｈｏｎｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８  ）。
０  ．２−０  ．４  μｍ  のサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，７７  ）。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８  の炭素原子、特に１６  −１８  の炭素原子を含有し、飽和している（１４  −１８  の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【００６８】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスの蛋白質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，８４７４  ）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又は蛋白質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げる事ができる。標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ  ；Ｆ  （ａｂ’）２  ）、であり得る。２種又はそれ以上の生物活性剤（例えば、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩とその他の薬剤）は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【００６９】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、静脈内投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を成人に対して、１日当り１乃至６回症状に応じて投与することが望ましい。
【００７０】
【実施例】
次に、実施例、試験例及び製剤例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００７１】
（実施例１）  Ａ物質の精製
（Ａ）培養
培地組成−１で示される培地３０ｍｌを含む１００ｍｌ容三角フラスコを１２１℃で２０分間加熱滅菌した後、２３℃に冷却した。これにグロエオポルス  ダイクロウス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）  Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ  ３０５０２株をスラントより白金耳でかきとり、それを滅菌水３ｍｌでホモジェナイズ後、全量接種し、回転振盪培養機を用いて、２１０ｒｐｍ、２３℃で１６８時間培養したのものを前培養液とした。次に、培地組成−２で示される培地８０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ２本に入れ、１２１℃で２０分間加熱滅菌した。これを２３℃に冷却した後、各三角フラスコに前培養液３ｍｌを接種し、回転数２１０ｒｐｍ、２３℃で３３６時間振盪培養した。
【００７２】
［培地組成−１］
グルコース                ０．４％
麦芽エキス                １．０％
イーストエキス            ０．４％
寒天                      ０．３％
消泡剤ＣＢ−４４２        ０．００５％
滅菌前ｐＨ５．５
［培地組成−２］
マルトース                ２．０％
グルコース                １．０％
ポリペプトン              ０．２％
イーストエキス            ０．０８％
リン酸一カリウム          ０．０５％
硫酸マグネシウム７水和物  ０．１％
塩化第二鉄６水和物        ０．００１％
硫酸亜鉛７水和物          ０．０００２％
塩化カルシウム            ０．００５５％
消泡剤ＣＢ−４４２        ０．００５％
滅菌前ｐＨ無調整
（Ｂ）単離
得られた培養液１６０ｍｌにアセトン１６０ｍｌを加えて抽出した。これをろ過助剤であるセライト５４５（ジョンズ  マンビル  プロダクト  コーポレーション製）を用いてろ過し、アセトン抽出液３００ｍｌを得た。それを減圧下濃縮してアセトンを留去後、塩酸でｐＨを３．０に調整し、酢酸エチル１５０ｍｌで抽出した。それを飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を含む抽出物２０９ｍｇを得た。
【００７３】
次いでこの抽出物をコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  １４０Ｃ１８−ＯＰＮ  ３０ｍｌ）を用いて精製した。抽出物２０９ｍｇをメタノール３ｍｌに溶解してコスモシル２ｇにコーティングした試料をアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：７に懸濁し、あらかじめ、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：７で平衡化したコスモシルカラムに重層した。そして、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝２：３、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝１：１各１６０ｍｌで段階溶出し、１０ｍｌずつ３２分画した（分画の順番にフラクションＮｏ．１〜３２とする。）。
【００７４】
Ａ物質およびＢ物質を含むフラクションＮｏ．１９、２０を集め、活性画分２０ｍｌを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、塩酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ物質およびＢ物質を含む粗精製物４３．４ｍｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８  φ１９×１００ｍｍ）で分離した。あらかじめ５５％アセトニトリル水−０．０２％ギ酸で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物４３．４ｍｇを０．９ｍｌメタノールに溶解した試料溶液０．３ｍｌを注入後、５５％アセトニトリル水−０．０２％ギ酸を溶媒として流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間１０．３から１２．０分までを分取した。残りの試料溶液０．６ｍｌについても同様の操作を行い、Ａ物質を含む活性画分を得た。減圧下濃縮してＡ物質の無色粉末６．１ｍｇを得た。
Ａ物質は、以下の物理化学的性状を示した。
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶；
３）分子式：Ｃ３８Ｈ６２Ｏ１６；
４）分子量：７７４；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０７（２９７００）、２４３（ｓｈ、４６００）、３０６（３９００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである、
３３７７、２９２３、２８５２、１７２６、１６６３、１４６５、１３７９、１２１６、１０７４、１０２９；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、図１に次の通りであり、以下のシグナルが確認できた；
１．１５−１．３５  （２２Ｈ，  ｍ），  １．２９  （３Ｈ，  ｄ，  ６  Ｈｚ），  １．２９  （２Ｈ，  ｍ），  １．４５  （１Ｈ，  ｍ），  １．６３  （１Ｈ，  ｍ），  １．７２  （２Ｈ，  ｍ），  ２．６２  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．９２  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０８  （１Ｈ，  ｄ，  ９．０  Ｈｚ），  ４．２１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２５  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２９  （１Ｈ，  ｍ），  ４．４  （１Ｈ，  ｍ），  ４．５６−４．６１  （３Ｈ，  ｍ），  ４．７７  （１Ｈ，  ｂｒ．  ｓ），  ４．８８  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ５．１６  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ５．２  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２４  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ５．３７  （１Ｈ，  ｓ），  ６．８５  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１７  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ７．３９  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）；８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、図２に示す通りであり、以下に示すシグナルが確認できた。
２０．２，  ２４．２，  ２５．８，  ２９．７−２９．９  （１１シグナル），  ３６．２，  ４２．３，  ６３．４，  ６３．８，  ６９．６，  ７０．４，  ７１．２，  ７２．３  （２シグナル），  ７３．６，  ７５．８，  ７８．７，  ８１．６，  １０２．４，  １１６．７，  １２２．９，  １３３．４，  １３９．６，  １６４．０，  １７４．８
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ３．６分。
【００７５】
（実施例２）  Ｂ物質の精製
実施例１に記載のＨＰＬＣでの分離にて、保持時間１３．５から１６．２分までを分取し、Ｂ物質を含む活性画分を得た。減圧下濃縮してＢ物質の無色粉末１３．５ｍｇを得た。
【００７６】
Ｂ物質は以下の物理学的性状を示した。
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶；
３）分子式：Ｃ４０Ｈ６４Ｏ１７；
４）分子量：８１６；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（３２０００）、２４２（ｓｈ、４９００）、３０６（４３００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである
３３９０、２９２５、２８５３、１７３０、１６７１、１４６５、１３７６、１２４９、１０７５、１０３１；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、図３に通りであり、以下に示すシグナルが確認できた；
１．１４−１．２６  （２２Ｈ，  ｍ），  １．３１  （３Ｈ，  ｄ，  ６．５  Ｈｚ），  １．３１  （２Ｈ，  ｍ），  １．４９  （１Ｈ，  ｍ），  １．６４−１．７６  （３Ｈ，  ｍ），  ２．１０  （３Ｈ，  ｓ），  ２．６０  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．９７  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２１  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２４−４．３４  （３Ｈ，  ｍ），  ４．３９  （１Ｈ，  ｄｄ，  ９．０  Ｈｚ，  ９．５  Ｈｚ），  ４．６３  （２Ｈ，  ｍ），  ４．７７  （２Ｈ，  ｓ），  ５．１６  （２Ｈ，  ｓ），  ５．２３  （１Ｈ，  ｍ），  ５．６０  （１Ｈ，  ｓ），  ６．１４  （１Ｈ，  ｄ，  ３．５  Ｈｚ），  ６．８６  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１６  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ７．４０  （１Ｈ，  ｔ，  ８．０  Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、図４に示す通りであり、以下に示すシグナルが確認できた；
２０．２，  ２１．３，  ２４．２，  ２５．８，  ２９．７−３０．０  （１１シグナル），  ３６．３，  ４２．３，  ６３．２，  ６３．９，  ６９．６，  ７０．４，  ７１．２，  ７２．２，  ７３．４  （２シグナル），  ７３．７，  ７８．６，  ８０．４，  １００．０，  １１６．７，  １２２．９，  １３３．７，  １３９．５，  １６３．８，  １７１．１，  １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ４．８分。
【００７７】
（実施例３）  Ｅ物質の精製
実施例１に記載のコスモシルカラムを用いての精製にて、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を含むフラクションＮｏ．２１からＮｏ．２３を集め、活性画分３０ｍｌを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、塩酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＥ物質、Ｆ物質およびＧ物質を含む粗精製物８２．４ｍｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８  φ１９×１００ｍｍ）で分離した。あらかじめ６０％アセトニトリル水−０．０２％ギ酸で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物８２．４ｍｇを１．０ｍｌメタノールに溶解した試料溶液０．２ｍｌを注入後、６０％アセトニトリル水−０．０２％ギ酸を溶媒として流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間１３．５から１５．０分までを分取した。残りの試料溶液０．８ｍｌについても同様の操作を行い、Ｅ物質を含む活性画分を得た。減圧下濃縮してＥ物質の無色油状物２１．９ｍｇを得た。
【００７８】
Ｅ物質は以下の物理化学的性状を示した。
１）性質：無色油状；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ４２Ｈ６６Ｏ１８；
４）分子量：８５８；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９９００）、２４２（４７００）、３０６（３９００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（薄膜法）：νｍａｘ  ｃｍ−１
薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４１８、２９２７、２８５５、１７３８、１６７２、１４６５、１３７５、１２３１、１０７５、１０３２；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、図５に示す通りであり、以下のシグナルが確認できた；
１．１９−１．２６  （２２Ｈ，  ｍ），  １．３６  （３Ｈ，  ｄ，  ５．０  Ｈｚ），  １．３６  （１Ｈ，ｍ），  １．５１  （２Ｈ，  ｍ），  １．７２  （３Ｈ，  ｍ），  １．８２  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１９  （３Ｈ，  ｓ），  ２．６０  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．９５  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２２  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２２−４．３５  （２Ｈ，  ｍ），  ４．３７−４．４  （２Ｈ，  ｍ），  ４．４７  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ４．６１−４．６４  （２Ｈ，  ｍ），  ４．８  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２３  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ５．２８  （１Ｈ，  ｍ），  ５．５８  （１Ｈ，  ｓ），  ５．６９  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ６．１３  （１Ｈ，  ｄ，  ３．５  Ｈｚ），  ６．８６  （１Ｈ，  ｄ，  ７．０  Ｈｚ），  ７．１６  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ７．４０  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、図６に示す通りであり、以下のシグナルが確認できた；
２０．２  （２シグナル），  ２１．３，  ２４．２，  ２５．７，  ２９．７−３０．０  （１１シグナル），  ３６．３，  ４２．３，  ４８．６，  ６３．１，  ６３．２，  ６９．６，  ６９．８，  ７０．４，  ７１．９，  ７３．５，  ７３．６，  ７４．０，  ７８．５，  ７９．０，  ９９．６，  １１５．３，  １１６．８，  １２３．０，  １３３．７，  １３９．６，  １６３．９，  １７０．３，  １７０．９，  １７１．１，  １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ７．５分。
【００７９】
（実施例４）  Ｆ物質の精製
実施例３に記載のＨＰＬＣでの分離にて、保持時間１５．６から１７．１分までを分取し、Ｆ物質を含む活性画分を得た。減圧下濃縮してＦ物質の無色油状物２９．１ｍｇを得た。
Ｆ物質は以下の物理化学的性状を示した：
１）性質：無色油状；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ４５Ｈ６８Ｏ２１；
４）分子量：９４４；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９４００）、２４３（ｓｈ、４７００）、３０７（４２００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（薄膜法）：νｍａｘ  ｃｍ−１
薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４２１、２９２６、２８５５、１７４１、１６７３、１４６５、１３７５、１２２８、１０７１；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、図７に示す通りであり、以下に示すシグナルが確認された；
１．１６−１．３２  （２２Ｈ，  ｍ），  １．３６  （３Ｈ，  ｄ，  ６．０  Ｈｚ），  １．３６  （１Ｈ，  ｍ），  １．４９  （２Ｈ，  ｍ），  １．７２  （３Ｈ，  ｍ），  １．７９  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１４  （３Ｈ，  ｓ），  ２．６１  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．７８  （２Ｈ，  ｓ），  ４．０１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２３  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２３−４．２８  （１Ｈ，  ｍ），  ４．３４−４．４１  （３Ｈ，  ｍ），  ４．６０  （１Ｈ，  ｄ，  １０．０  Ｈｚ），  ４．７７  （１Ｈ，  ｍ），  ４．９３  （１Ｈ，  ｍ），  ５．１１  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ５．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ５．５８  （１Ｈ，  ｓ），  ５．６６  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ６．２５  （１Ｈ，  ｓ），  ６．８６  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１７  （１Ｈ，  ｄ，  ８．０  Ｈｚ），  ７．４０  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、図８に示す通りであり、以下に示すシグナルが確認された；
２０．２  （２シグナル），  ２１．２，  ２４．２，  ２５．７，  ２９．７−３０．０  （１１シグナル），  ３６．３，  ４２．３，  ４２．８，  ４８．８，  ６３．３，  ６６．６，  ６９．７，  ６９．８，  ７０．１，  ７２．０，  ７３．２，  ７３．６，  ７３．９，  ７６．０，  ７８．４，  ９９．７，  １１５．４，  １１６．８，  １２２．９，  １３３．６，  １３９．６，  １６３．９，  １６８．０，  １７０．０，  １７０．３，  １７０．８，  １７０．８，  １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  ８．５分。
【００８０】
（実施例５）  Ｇ物質の精製
実施例３に記載のＨＰＬＣでの分離にて、保持時間２３．７から２７．０分までを分取し、Ｇ物質を含む活性画分を得た。減圧下濃縮してＧ物質の無色粉末２．８ｍｇを得た。
【００８１】
Ｇ物質は以下の物理化学的性状を示した。
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶。；
３）分子式：Ｃ４３Ｈ６６Ｏ２０；
４）分子量：９０２；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９０００）、２４１（ｓｈ、４５００）、３０５（３２００）ｎｍに吸収極大を示す、
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０８、２９２４、２８５３、１７３９、１６６１、１４５３、１３７７、１２４２、１０６８；
７）  １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、図９に示す通りであり、以下に示すシグナルが観察された；
１．２１−１．３１  （２０Ｈ，  ｓ），  １．３６  （３Ｈ，  ｄ，  ６．０  Ｈｚ），  １．３６  （１Ｈ，  ｍ），  １．４８  （４Ｈ，  ｍ），  １．７１  （１Ｈ，  ｍ），  １．８５  （２Ｈ，  ｍ），  １．８８  （３Ｈ，  ｓ），  ２．１５  （３Ｈ，  ｓ），  ３．３１  （２Ｈ，  ｔ，  ７．５  Ｈｚ），  ３．７８  （２Ｈ，  ｓ），  ４．０１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２７  （１Ｈ，  ｄｄ，  ８．０  Ｈｚ，  １０．５  Ｈｚ），  ４．３４−４．４１  （３Ｈ，  ｍ），  ４．６０  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ４．７７  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．０  Ｈｚ，  １１．５  Ｈｚ），  ４．９３  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２１  （１Ｈ，  ｄ，  ９．５  Ｈｚ），  ５．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ５．５８  （１Ｈ，  ｓ），  ５．６６  （１Ｈ，  ｄ，  １０．０  Ｈｚ），  ６．２４  （１Ｈ，  ｓ），  ６．９１  （１Ｈ，  ｄ，  ７．５  Ｈｚ），  ７．１４  （１Ｈ，  ｄ，  ８．５  Ｈｚ），  ７．３９  （１Ｈ，  ｄｄ，  ７．５  Ｈｚ，  ８．０  Ｈｚ）、
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ  （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、図１０に示す通りであり、以下に示すシグナルが観察された；
２０．２  （２シグナル），  ２１．２，  ２５．７，  ２９．８−３０．０  （１０シグナル），  ３０．３，  ３２．７，  ３６．２，  ３６．３，  ４２．８，  ６３．３，  ６６．６，  ６９．７，  ６９．８，  ７０．１，  ７２．０，  ７３．２，  ７３．６，  ７３．９，  ７６．０，  ７８．５，  ９９．６，  １１５．５，  １１７．１，  １２１．８，  １３２．８，  １４６．４，  １６２．６，  １６８．０，  １７０．０，  １７０．３，  １７０．８  （２シグナル），  １７５．０、
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相：  アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０  ｎｍ
保持時間：  １１．４分。
【００８２】
（試験例１）ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験
ヒトＣＤ４４のｃＤＮＡはヒトリンパ節由来ｃＤＮＡライブラリー（ＴＡＫＡＲＡ）を鋳型にＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーはデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）より得られたＣＤ４４ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）：  Ｕ４０３７３：配列表の配列番号１）のヌクレオチド番号６５乃至８５に示されるヌクレオチド配列の５’側にＳａｌ  Ｉ切断点とＫｏｚａｃ配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５巻、８１２５‐８１４８頁、１９８７年）を導入したプライマー１：
５’−ＡＧＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＣ−３’（配列表の配列番号３）と配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１１３０乃至１１５０に示されるヌクレオチド配列の相補鎖の５’側にＨｉｎｄ  ＩＩＩ切断点を導入したプライマー２：
５’−ＡＧＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣ−３’（配列表の配列番号４）を用いた。ＰＣＲ増幅産物を制限酵素Ｓａｌ  Ｉ（ＴＡＫＡＲＡ）とＨｉｎｄ  ＩＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ）により切断し、この断片を発現ベクター、ｐＲＫ５（ファーミンジェン）に組み込んだ。これをリン酸カルシウム法によりｐＳＶ２ｎｅｏ（インビトロジェン）とともにコラーゲンコートシャーレ上で１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン）を用い培養したヒト腎臓上皮由来細胞株ＨＥＫ２９３（ＣＲＬ−１５７３、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション）に導入し、抗生物質Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）により遺伝子導入細胞を選択した。抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体（バイオメダ）を用い、一般的なウエスタンブロッティングによりＣＤ４４の発現を確認した。このＣＤ４４発現細胞を４日間培養したあとカルシウムイオン、マグネシウムイオンフリーのダルベッコリン酸バッファー（以下、ＰＢＳと称する。）で洗浄し、２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳでシャーレからはがした。遠心（１８００×ｇ、５分）により細胞を回収した後、０．２Ｍ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  トリス塩酸バッファーｐＨ７．８（以下、バッファーＡと称する。）で２度洗浄した。細胞を再度バッファーＡに懸濁し、２分間の超音波処理による破砕の後、４００×ｇで１０分間遠心した。この上清を２０，０００×ｇで１時間遠心し、沈殿をバッファーＡで１度洗浄後、バッファーＡ中で超音波処理し、均一化したものをＣＤ４４発現細胞膜懸濁液とした。
【００８３】
蛍光ヒアルロン酸はベルダーらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４巻、２５１−２５７頁、１９７５年）に若干の修正を加え、以下のように調製した。５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業、鶏冠由来、分子量７．１×１０５）を４０ｍｌの蒸留水に溶解し、２０ｍｌのジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）と混合した。この混合液にアセトアルデヒド（２５μｌ、フルカ）とシクロヘキシルイソシアニド（２５μｌ、フルカ）を含むＤＭＳＯ（０．５ｍｌ）に溶解したフルオロセインアミン−アイソタイプＩ（２５ｍｇ、アルドリッチ）を加えた。室温（約２５℃）で５時間攪拌した後、２４０ｍｌの塩化ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、沈殿した蛍光ヒアルロン酸を遠心（１０００×ｇ、１５分）で回収した。これを６０ｍｌの蒸留水に溶解し、２４０ｍｌの塩化ナトリウム飽和エタノールで沈殿させ、回収する作業を２度繰り返した後、１０ｍｌの蒸留水に溶解し、透析により脱塩を行い、蛍光ヒアルロン酸溶液とした。
上記ＣＤ４４発現細胞膜懸濁液（タンパク質濃度として２００μｇ／ｍｌ）を、９６ウェルガラス繊維濾紙黒色プレート（ユニフィルター、疎水性ＧＦ／Ｃ膜、ワットマン）に１ウェルに対し１００μｌ分注し、ここへメタノールで溶解した被検化合物を１μｌ添加した後、さらに蛍光ヒアルロン酸０．２μｇを添加した。室温で１時間インキュベートした後、液体をマルチスクリーン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて吸引濾過した。これにバッファーＡを１ウェルあたり２５０μｌ添加し、吸引濾過する操作を６回繰り返すことによりフィルターに吸着した細胞膜を洗浄した。洗浄後、１ウェルに対し０．３Ｎ  水酸化ナトリウムを１００μｌ添加し、アルボ（アマシャム−ファルマシア）により、励起光４８５ｎｍによる発光光５３５ｎｍを測定し、ＣＤ４４発現細胞膜への蛍光ヒアルロン酸の結合量を検出した。蛍光ヒアルロン酸の非特異的結合は過剰量の非標識ヒアルロン酸（終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加えることにより検出した。蛍光ヒアルロン酸の全結合と非特異的結合の差を特異的結合とし、特異的結合に対する阻害率（％）を算出した。表１に、Ｆ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を終濃度でそれぞれ５０、２５、１２．５および６．２５μｇ／ｍｌ添加した場合の阻害率（％）の平均値と標準偏差を示した。Ｆ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質はヒアルロン酸とＣＤ４４との結合を顕著に阻害し、ＩＣ５０値はそれぞれ８．０、１１．０、２３．４、１１．３、１１．７μｇ／ｍｌであった（表１）。
【００８４】
【表１】
2004275060.tif 000016
【００８５】
（製剤例）
（製剤例１）ソフトカプセル剤
消化性油状物、例えば、大豆油、綿実油又はオリーブ油中に入れた実施例１で得られたＡ物質の混合物を調製し、正置換ポンプでゼラチン中に注入して、１００  ｍｇの活性成分を含有するソフトカプセルを得、洗浄後、乾燥する。同様に１００ｍｇの実施例２で得られたＢ物質、実施例３で得られたＥ物質、実施例４で得られたＦ物質及び実施例５で得られたＧ物質を活性成分として含有するソフトカプセルを得る。
【００８６】
（製剤例２）錠剤
常法に従って、１００  ｍｇの実施例１で得られたＡ物質、０．２  ｍｇのコロイド性二酸化珪素、５  ｍｇのステアリン酸マグネシウム、２７５  ｍｇの微結晶性セルロース、１１  ｍｇ  のデンプン及び９８．８  ｍｇ  のラクトースを用いて製造する。尚、所望により、剤皮を塗布した。同様に１００ｍｇの実施例２で得られたＢ物質、実施例３で得られたＥ物質及び実施例４で得られたＦ物質及び実施例５で得られたＧ物質を有効成分として含む錠剤を製造する。
【００８７】
（製剤例３）懸濁剤
５  ｍｌ中に、１００  ｍｇの実施例１で得られたＡ物質、１００  ｍｇのナトリウムカルボキシ基メチルセルロ−ス、５  ｍｇの安息香酸ナトリウム、１．０  ｇ  のソルビトール溶液  （日本薬局方）  及び０．０２５  ｍｌのバニリンを含有するように製造する。同様に、実施例２で得られたＢ物質、実施例３で得られたＥ物質、実施例４で得られたＦ物質及び実施例５で得られたＧ物質を含有する懸濁剤を製造する。
（製剤例４）注射剤
１．５  重量％  の実施例１で得られたＡ物質、１０容量％  のプロピレングリコール中で撹拌し、次いで、注射用水で一定容量にした後、滅菌して製造する。同様に実施例２で得られたＢ物質、実施例３で得られたＥ物質及び実施例４で得られたＦ物質及び実施例５で得られたＧ物質を含有する注射剤を製造する。
【００８８】
【発明の効果】
本発明により、新規化合物であるＦ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質及びＦ物質、並びにＦ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質、及びＧ物質を生産する新規微生物グロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ  ３０５０２株が提供され、グロエオポルス・ダイクロウス  （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｃｈｒｏｕｓ  （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ  ３０５０２株を用いたＦ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質及びＦ物質及びＧ物質の製造方法が提供された。また、Ｆ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質をおよびＧ物質がヒアルロン酸とＣＤ４４との結合を顕著に阻害する活性を有することを見出し、Ｆ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質の少なくともいずれか一つ又はその塩を有効成分として含有する、変形性関節症の予防薬及び／又は治療薬が提供された。
【００８９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：ＣＤ４４用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号４：ＣＤ４４用ＰＣＲアンチセンスプライマー
【００９０】
【配列表】
2004275060.tif 000017
2004275060.tif 000018
2004275060.tif 000019
2004275060.tif 000020
2004275060.tif 000021
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2004275060.tif 000023
2004275060.tif 000024
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ物質の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図２】Ａ物質の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図３】Ｂ物質の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図４】Ｂ物質の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図５】Ｅ物質の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図６】Ｅ物質の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図７】Ｆ物質の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図８】Ｆ物質の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図９】Ｇ物質の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図１０】Ｇ物質の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図１】
2004275060.tif 000028
【図２】
2004275060.tif 000029
【図３】
2004275060.tif 000030
【図４】
2004275060.tif 000031
【図５】
2004275060.tif 000032
【図６】
2004275060.tif 000033
【図７】
2004275060.tif 000034
【図８】
2004275060.tif 000035
【図９】
2004275060.tif 000036
【図１０】
2004275060.tif 000037