(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なフルクトシルアミンオキシダーゼの新規な製造手段の提供。【解決手段】例えば、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）由来の特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及びこのＤＮＡを含有する発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することを特徴とする１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに作用し、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼの新規な製造方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２、配列番号：４又は配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する  １−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに作用し、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子。
【請求項２】
配列番号：２、配列番号：４又は配列番号：６に示すアミノ酸配列中のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つ１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに作用し、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を有する修飾された１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに作用し、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号：１、配列番号：３又は配列番号：５に示す塩基配列を有する核酸のエクソン領域とストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができ、且つ１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに作用し、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに作用し、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼの製造方法において、請求項５に記載の宿主細胞を培養し、該培養物から、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに作用し、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼを採取することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（以下フルクトシルバリルヒスチジンと称する）に作用し、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（以下フルクトシルバリルロイシンと称する）に実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードする新規な遺伝子系、及びフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖化蛋白はグルコースなどの還元糖が共存する場合、アミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される。生体内では血液中のヘモグロビンが糖化されたグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化されたグリコアルブミン、血液中のタンパク質が糖化されたフルクトサミンなどが知られている。
【０００３】
これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の病状の診断及び症状の管理の重要な指標となり得るために測定手段の確立は臨床上、極めて有用である。その中でも、現在、糖尿病診断の指標となる最も一般的かつ臨床データのそろっているものは、血中ヘモグロビンＡ１ｃ濃度であり、特にその測定手段の確立が求められている。
【０００４】
従来、アマドリ化合物の測定法としては、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｓｃｉ．，  １０：６５９（１９７９））、ホウ酸を結合させた固体を詰めたカラムを用いる方法（Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ２６：１５９８（１９８２））、抗原−抗体反応を利用する方法（ＪＪＣＬＡ  １８：６２０（１９９３））還元能をテトラゾリウム塩を用いて比色定量する方法（Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  １２７：８７（１９８２））、チオバリビツール酸を用いて比色定量する方法（Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  １１２：１９７（１９８１））等が知られている。しかしながらこれらの方法は、いずれも操作が煩雑であったり、高価な機器が必要であったり、必ずしも正確で迅速な方法ではなかった。
【０００５】
現在、上記方法よりも操作が簡単で、安価に、短時間で精度良く糖蛋白質を測定する方法として、酵素的方法が提案されている。アマドリ化合物を定量する方法として、特公平０５−３３９９７号公報、特公平６−６５３００号公報、特開平０２−１９５９００号公報、特開平０３−１５５７８０号公報、特開平０４−４８７４号公報、特開平０５−１９２１９３号公報、特開平０６−４６８４６号公報、糖尿病の診断のための糖化蛋白質の測定法として、特開平０２−１９５８９９号公報、特開平０２−１９５９０号公報、特開平０５−１９２１９３号公報、特開平０６−４６８４６号公報等が知られている。
【０００６】
上記方法で使用されているフルクトシルアミンオキシダーゼとしてはこれまでにコリネバクテリウム属（特開昭６１−２６８１７８号公報）、アスペルギルス属（特開平３−１５５７８０号公報）、ペニシリウム属（特開平４−４８７４号公報）、フザリウム属（特開平５−１９２１９３号公報、特開平７−２８９２５３号公報、特開平８−１５４６７２号公報）、ギベレラ属（特開平５−１９２１９３号公報、特開平７−２８９２５３号公報）、カンジダ属（特開平６−４６８４６号公報）、アスペルギルス属（特開平１０−３３１７７号公報、特開平１０−３３１８０号公報）由来の酵素が報告されている。
【０００７】
糖化ヘモグロビンの酵素を用いた測定法として、ロイシンのＣ末端側を切断するプロテアーゼとジペプチジルカルボキシペプチダーゼを作用させてβ鎖のＮ末端糖化バリンのみを遊離させる方法が考案された（特開２０００−３００２９４号公報）が、この方法ではプロテアーゼにより多量のペプチドが遊離するため、目的とするフルクトシルバリルヒスチジルロイシンを完全に分解するためには高価なジペプチジルカルボキシペプチダーゼが多量に必要となる等の問題がある。また、Ｎ末端の糖化バリルヒスチジンに作用するフルクトシルアミンオキシダーゼを用いた測定法（特開２００１−９５５９８号公報）が報告されたが、これには糖化ヘモグロビンのα鎖から遊離するフルクトシルバリルロイシンに対する反応性については全く述べられていなかった。
【０００８】
つまり、ヘモグロビンのβ鎖のＮ末端バリンの糖化部位を特異的に認識して測定しているのではなくα鎖およびβ鎖の両方のＮ末端糖化バリンを測定するものであり、本来のヘモグロビンＡ１ｃ、すなわちβ鎖のＮ末端糖化バリンを測定しているものではなかった。
この課題を解決し、本来のヘモグロビンＡ１ｃを測定しうる酵素に関し、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属等の微生物により生産されるフルクトシルアミンオキシダーゼが特願２００３−６７２６６に記載されている。これらのフルクトシルアミンオキシダーゼの諸性質は表１にまとめた。
【０００９】
【表１】
2004275063.tif 000002
【００１０】
ヘモグロビンＡ１ｃの本来の定義であるβ鎖のＮ末端バリンの糖化部位を特異的に認識し、測定するためにフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α鎖のＮ末端バリンの糖化部位であるフルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないヘモグロビンＡ１ｃの測定に適したフルクトシルアミンオキシダーゼである。しかしながらその酵素生産性は最大０．００７ユニット／ｍｌと非常に低く、実用化には酵素生産性の向上が必須である。また、生産性向上に利用できるこの酵素をコードする遺伝子については全く記載されていない。
【００１１】
【特許文献１】
特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献２】
特公平６−６５３００号公報
【特許文献３】
特開平０２−１９５９００号公報
【特許文献４】
特開平０３−１５５７８０号公報
【特許文献５】
特開平０４−４８７４号公報
【００１２】
【特許文献６】
特開平０５−１９２１９３号公報
【特許文献７】
特開平０６−４６８４６号公報
【特許文献８】
特開平０２−１９５８９９号公報
【特許文献９】
特開平０２−１９５９０号公報
【特許文献１０】
特開平０５−１９２１９３号公報
【００１３】
【特許文献１１】
特開平０６−４６８４６号公報
【特許文献１２】
特開昭６１−２６８１７８号公報
【特許文献１３】
特開平３−１５５７８０号公報
【特許文献１４】
特開平４−４８７４号公報
【特許文献１５】
特開平５−１９２１９３号公報
【００１４】
【特許文献１６】
特開平７−２８９２５３号公報
【特許文献１７】
特開平８−１５４６７２号公報
【特許文献１８】
特開平５−１９２１９３号公報
【特許文献１９】
特開平７−２８９２５３号公報
【特許文献２０】
特開平６−４６８４６号公報
【００１５】
【特許文献２１】
特開平１０−３３１７７号公報
【特許文献２２】
特開平１０−３３１８０号公報
【特許文献２３】
特開２０００−３００２９４号公報
【特許文献２４】
特開２００１−９５５９８号公報
【００１６】
【非特許文献１】
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｓｃｉ．，  １０：６５９（１９７９）
【非特許文献２】
Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ２６：１５９８（１９８２）
【非特許文献３】
ＪＪＣＬＡ  １８：６２０（１９９３）
【非特許文献４】
Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  １２７：８７（１９８２）
【非特許文献５】
Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  １１２：１９７（１９８１）
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ、すなわち、カーブラリア属、ピレノケータ属およびアルスリニウム属等由来のフルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく製造することができる方法を提供しようとするものである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく製造する方法として、カーブラリア属、ピレノケータ属およびアルスリニウム属等由来のフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子をクローニングすべく種々検討した結果、カーブラリア属、ピレノケータ属およびアルスリニウム属の微生物からフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡをクローニングすることに成功し、本発明を完成させた。
【００１９】
従って本発明は、配列番号：２、配列番号：４又は配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子、すなわち、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを提供する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号：２、配列番号：４又は配列番号：６に示すアミノ酸配列中のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を有する修飾されたフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子を提供する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号：１、配列番号：３および配列番号：５に示す塩基配列を有する核酸のエクソン領域とストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができ、且つフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
【００２２】
本発明はまた、前記の遺伝子を含んで成るベクター、特に発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、前記ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、前記宿主を培養し、該培養物から、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼを採取することを特徴とする、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼの製造方法を提供する。
【００２３】
また、実質的に作用しない酵素とは測定したい基質に対する活性を１００％とした時、測定対象としたくない基質に対する相対活性が例えば２０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である酵素をいう。
【００２４】
【本発明の実施の形態】
本発明はまず、配列番号：２、配列番号：４又は配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子、すなわちゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを提供する。
【００２５】
しかしながら、ある酵素がその酵素活性を発揮するには、生来のアミノ酸配列の全てがそのまま必要なわけではなく、活性の発現に必須の領域以外の領域においては、アミノ酸の欠失、付加、置換等によりアミノ酸配列が修飾されていても本来の酵素活性を発揮することが知られている。従って本発明は、配列番号：２、配列番号：４又は配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を維持している修飾型フルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子を提供する。
【００２６】
上記の修飾の程度は、ＰＣＲ、部位特定変異誘発等、周知の技術により修飾できる程度であり、且つフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を喪失しない範囲である。例えば、配列番号：２、配列番号：４又は配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の相同性を有するものである。
従って本発明はまた、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を維持している修飾型フルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子を含む。
【００２７】
一旦、酵素をコードする生来のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡがクローニングされれば、該ゲノムＤＮＡ特にそのエクソン部分もしくはｃＤＮＡ、又はそれらの一部をプローブとして用いることにより、同じ酵素活性を有する他の蛋白質をコードするＤＮＡを選択することができる。従って、本発明は、配列番号：１、配列番号：３及び配列番号５に記載の塩基配列を有する核酸、例えばＤＮＡ、特にエクソン部分の配列を有する核酸、例えばＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ、あるいはそれらの断片、例えば好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上、例えば３０残基以上の長さの断片とハイブリダイズすることができ、且つフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸も提供できる。
【００２８】
上記の場合のハイブリダイゼーション条件は、例えば、野村慎太郎、稲澤譲治著「脱アイソトープ実験プロトコール」ｐ．４０（秀潤社、１９９４）に記載の条件  （５００ｍＭ  ＮａＰｉ  緩衝液（ｐＨ７．２），  ７％  ＳＤＳ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）である。上記ハイブリダイゼーションによるスクリーニングの対象となる核酸は特に限定される。例えば合成ＤＮＡ  や、生来のＤＮＡ  を前記のごとく修飾したものでもよいが、天然のＤＮＡ  、例えば、ゲノムＤＮＡ  やｃＤＮＡのライブラリーが好ましい。この様なＤＮＡ  ライブラリーは、例えばカーブラリア属、ピレノケータ属およびアルスリニウム属の微生物等から、常法に従って調製することができる。
【００２９】
本発明のフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸、特にＤＮＡ  は配列番号：１、配列番号：３、又は配列番号：５に示す塩基配列を有するゲノムＤＮＡ  又はそのエクソン部分のみから成るｃＤＮＡである。ゲノムＤＮＡ  のクローニング方法の１例は、実施例１において具体的に記載する。
【００３０】
一旦、ゲノムＤＮＡ  がクローニングされれば、該ゲノムＤＮＡ  、又はその１部分、特にエクソン部分のＤＮＡ  をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするｃＤＮＡを得ることができる。
ｃＤＮＡライブラリーの調製及びプローブハイブリダイゼーションによるそのスクリーニングは常法に従って行うことができる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば前記の出発材料、例えばカーブラリア属、ピレノケータ属、アルスリニウム属微生物等から調製することができる。
【００３１】
また、修飾されたフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡ  は、生来のゲノムＤＮＡ  又はｃＤＮＡを基礎とし、部位特定変異誘発、ＰＣＲ  、ランダム変異、ジーンシャッフリング等の常法に従って行うことができる。また、１又は複数個のアミノ酸が欠失した短縮型酵素をコードするＤＮＡ  は、生来のＤＮＡ  に開始コドン及び／又は終止コドンを導入することによっても得られる。さらに、適当な制限酵素により、生来のＤＮＡを切断することによっても得られる。
【００３２】
本発明はまた、上記のＤＮＡ  を含んで成るベクター、特に発現ベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼを生産するための宿主細胞としては、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡ  がゲノムＤＮＡ  である場合にはスプライシング活性を有する宿主細胞である必要があり、真核性細胞、例えば真菌類、例えば酵母又は糸状真菌類、又は動物細胞、さらには植物細胞が使用される。
【００３３】
酵母としては例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）  属酵母、例えばサッカロミセス・セービシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられ、糸状真菌類としては、例えばアスペルギルス属微生物、例えばアスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、等が挙げられる。動物細胞としては、昆虫細胞、例えばカイコの細胞、哺乳類培養細胞、例えばＣＯＳ  細胞等が挙げられる。さらに植物細胞を用いることもできる。
【００３４】
さらに、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡ  がｃＤＮＡである場合、上記の宿主の他に、原核性宿主、例えば細菌宿主を用いることができる。細菌宿主としては、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の常用の宿主が用いられる。
【００３５】
発現ベクターは、宿主に応じて発現制御配列、例えばプロモーター、ターミネーター等を含有する必要がある。例えば、酵母用のプロモーターとしては解糖系酵素、遺伝子のプロモーター、Ｇａｌ  プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしてはＡｍｙＡプロモーター等が挙げられ、動物細胞用プロモーターとしてはウイルスプロモーター等が用いられる。また、細菌用プロモーターとしては、ウイルスベクター用プロモーター等が用いられる。
宿主としての細胞とそれに適合するベクター系の使用はすでに常用技術となっており、本発明においては、それらの既知の発現系を適宜選択して使用することができる。
【００３６】
本発明はまた、本発明のフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼの製造方法を提供する。本発明のフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼの製造方法によれば、本発明のフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡ  を含んで成る発現プラスミドにより形質転換された宿主を培養する。宿主としては詳細に前記したものを使用し、常法に従って培養、好ましくは液体培養すればよい。
【００３７】
培養物もしくは菌体を水又は水性緩衝液、例えばリン酸緩衝液等により抽出することにより酵素含有水溶液が得られる。酵素含有液から酵素を採取、精製するには、酵素の精製のための常法を用いればよい。
例えば、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を組合せて使用することができる。
【００３８】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１． ピレノケータ エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃａｅｔａ  ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１０）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡのクローニング
部分アミノ酸配列の決定
特願２００３−の記載の方法に従って、ピレノケータ・エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃａｅｔａ  ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１０）から得た精製酵素の凍結乾燥品６０μｇを用い、常法（マイクロシークエンスのための微量タンパク質精製法、ｐ４８−５２、羊土社、１９９２年）に準じて、酵素の断片を得て、その配列を決定した。即ち、５０μｌの４５ｍＭジチオスレイトールを加え、５０℃、１５分間処理を行い、５μｌの１００ｍＭヨードアセトアミドを加え、１５分間放置した。
【００３９】
１４０μｌの蒸留水を加え、１．０μｇエンドプロテーナーゼＬｙｓ−Ｃ（ロッシュ・ダイアグノスティックス製）を添加後、３７℃、一晩インキュベートした。その断片化した酵素をＨＰＬＣにより分離し、各酵素断片を取得した。その各断片をＮ末端配列シークエンサー（島津製作所製  ＰＰＳＱ−２１）を用いて解析した。得られた配列は次のようになった。
【００４０】
断片（１）Ｖａｌ  Ｘａａ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ（配列番号：７）
断片（２）Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｘａａ  Ｔｒｐ  Ｘａａ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｌａ（配列番号：８）
断片（３）Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ（配列番号：９）
断片（４）Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｌｙｓ（配列番号：１０）
断片（５）Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｘａａ：  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ（配列番号：１１）断片（６）Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ（配列番号：１２）
断片（７）Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ（配列番号：１３）
断片（８）Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ（配列番号：１４）
【００４１】
ピレノケータ エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃａｅｔａ  ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１０）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡのクローニング
（１）  染色体ＤＮＡの調製
サブロー培地（グルコース４．０％、ポリペプトン１．０％、ｐＨ５．６）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、ピレノケータ  エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃａｅｔａ  ｓｐ．）ＹＨ８０７を植菌した。２５℃で４日間振盪培養した後、Ｎｏ．２ろ紙でろ過して菌体を回収した。
【００４２】
液体窒素で菌体を凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕した。ＤＮＡ抽出用緩衝液（５．０％ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１５ｍｌを加え、ゆっくり振盪して溶解した。遠心分離（５，０００ｒｐｍ、６ｍｉｎ、ｒｔ．）により上清を得、フェノール／クロロホルム抽出を３回、エーテル抽出を２回行い、エーテルを蒸発させた後、３Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、エタノール２５ｍｌを加え、−３０℃で３０分間放置した。
【００４３】
遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）により染色体ＤＮＡを回収し、７０％エタノール似て洗浄した後、ＴＥ４００μｌに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液にＲＮａｓｅ  １０μｌ（０．１３２Ｕ）を加え、３７℃で１時間処理した後、プロテイナーゼＫを５μｌ（０．６Ｕ）を加え、５０℃で１時間処理した。フェノール／クロロホルム抽出（２回）、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出（１回）を行った後、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。７０％エタノール溶液により洗浄した後、エタノールを除去し、ＴＥ２００μｌに溶解した。
【００４４】
（２）  フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の増幅
ｉ．  プライマーの設計
断片（１）中の（Ｌｙｓ）  Ｖａｌ  （Ｃｙｓ）  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙの配列（配列番号：１５）からセンスで  Ｐ１  プライマーを設計した。
Ｐ１  ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＧＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ）ＧＧ（配列番号：１６）
断片（２）のＭｅｔ  （Ｃｙｓ）  Ｔｒｐ  （Ｃｙｓ）  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａの配列（配列番号：１７）からアンチセンスで  Ｐ２  プライマーを設計した。
Ｐ２  ＧＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ）ＧＴ（Ｇ／Ａ）ＴＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ）ＧＴ（Ｇ／Ａ）ＣＡＣＣＡ（Ｇ／Ａ）ＣＡＣＡＴ（配列番号：１８）
【００４５】
ｉｉ．  フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の取得
前述の方法で得られた染色体ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰ１プライマーとＰ２プライマーの組み合わせでＰＣＲ反応を３５サイクル行った。その結果、２３０  ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。得られたＤＮＡ断片の塩基配列「配列番号：１９」（配列番号：１の  １１４８  〜  １３７７  番目までの塩基配列）を決定した。
【００４６】
（３）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定
ｉ  ５’上流域のＤＮＡ断片の増幅
「配列番号：１９」から  Ｐ３  プライマーを設計した。
Ｐ３  ＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＡＣＣＧＡ（配列番号：２０）
（配列番号：１の  １２２９  〜  １２５２  番目までの塩基配列の相補配列）
「配列番号：１９」から  Ｐ４  プライマーを設計した。
Ｐ４  ＧＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＡＡＡＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣ（配列番号：２１）
（配列番号：１の  １１９２  〜  １２１５  番目までの塩基配列の相補配列）
【００４７】
５’上流域のＤＮＡ断片の増幅は、次のようにして行った。Ｒａｅｄｅｒ  らの方法（Ｕ．  Ｒａｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｂｒｏｄａ，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ．，  １，  １７−２０  （１９８５））にしたがって調製した  ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１０）株の染色体ＤＮＡを制限酵素  Ｅｃｏ  ＲＩ  で消化した後、宝酒造製  ＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  を用いて、ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ  を行った。
【００４８】
即ち、制限酵素処理断片にＥｃｏ  ＲＩカセット（宝酒造製）を結合させ、このＤＮＡを鋳型  ＤＮＡとして  Ｃ１プライマ−（宝酒造製）及び  Ｐ３プライマ−をそれぞれ使用して、ＰＣＲ反応を３５サイクル行った。１００倍希釈した反応液を鋳型ＤＮＡとしてＣ２プライマ−（宝酒造製）及びＰ４プライマ−を使用して、ＰＣＲ反応をさらに３５サイクル行った。その結果、１，２００  ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。その塩基配列「配列番号：２２」（配列番号：１の１  〜  １，１８０番目の塩基配列）を決定した。
【００４９】
ｉｉ．  ３’下流域のＤＮＡ断片の増幅
「配列番号：２２」から  Ｐ５  プライマーを設計した。
Ｐ５  ＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＣＡＣＧＣＡＴＣＣＧＡＡＧＣＣ（配列番号：２３）（配列番号：１の  １，２６４  〜  １，２８８  番目までの塩基配列）
「配列番号：２２」から  Ｐ６  プライマーを設計した。
Ｐ６  ＧＣＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧ（配列番号：２４）（配列番号：１の  １，３０７  〜  １，３３１  番目までの塩基配列）
【００５０】
３’下流域のＤＮＡ断片の増幅は、次のようにして行った。ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７株の染色体  ＤＮＡ  を制限酵素  Ｓａｌ  Ｉ  で消化した後、制限酵素処理断片に  Ｓａｌ  Ｉカセット（宝酒造製）を結合させ、宝酒造製  ＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  を用いて、ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ  を行った。このＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＣ１プライマ−及びＰ５プライマ−を使用して、ＰＣＲ反応を３５サイクル行った。
【００５１】
１００倍希釈した反応液を鋳型ＤＮＡとしてＣ２プライマ−及びＰ６プライマ−を使用して、ＰＣＲ反応をさらに３５サイクル行った。その結果、７２０  ｂｐ  の  ＤＮＡ  断片が特異的に増幅された。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列「配列番号：２５」（配列番号：１の１，３３８  〜  ２，０２５番目の塩基配列）を決定した。
配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２５をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列「配列番号：１」を決定した。
【００５２】
得られた塩基配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ペニスリウム・ヤンシネラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（特開平１１−４６７６９）と６７．１％、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Ｊｅｏｎｇ，  Ｈ．  Ｙ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７８  （５），  ３４４−３５０  （２００２））と６６．７％の相同性を示した。
【００５３】
実施例２．  ピレノケータ エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃａｅｔａ  ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１０）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするｃＤＮＡのクローニング
（１）全ＲＮＡの調製
ＹＭ培地（グルコース１．０％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ｐＨ  ６．０）１００  ｍｌを５００  ｍｌ容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７を植菌した。２５℃で４日間振盪培養した後、Ｎｏ．２ろ紙でろ過して菌体を回収した。培養後の培養物を液体窒素で凍結した後、乳鉢で粉砕し、ライフテックオリエンタル社製  ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ  を用い、そのプロトコールに従って抽出し、全ＲＮＡ  を得た。
【００５４】
（２）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子のｃＤＮＡの取得
Ａ）プライマ−の設計
転写開始点と思われるＡＴＧを推測し、その上流の配列よりＰ７プライマーを設計した。
Ｐ７  ＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＣＣＴＣＧＡＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号：２６）（配列番号：１の９１〜１１７番目までの塩基配列）
断片（５）のＬｙｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａの配列（配列番号：２７）からセンスで  Ｐ８  プライマーを設計した。
Ｐ８  ＡＡＡＧＴＴＧＴＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号：２８）（配列番号：１の８６４〜８８７番目までの塩基配列）
断片（８）のＡｌａ  Ｈｉｓ  Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓの配列（配列番号：２９）からアンチセンスで  Ｐ９  プライマーを設計した。
Ｐ９  ＣＴＴＣＧＧＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＡＧＣ（配列番号：３０）（配列番号：１の８６４〜８８７番目までの塩基配列）
【００５５】
Ｂ）ｃＤＮＡ配列の決定
約１  μｇの全ＲＮＡから３’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ  （宝酒造製）用いて、プロトコールに準じた条件でｃＤＮＡの合成を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてプライマ−に３ｓｉｔｅ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造製）とＰ８プライマー及びＰ７プライマーとＰ９プライマーを用いてＰＣＲ反応を３５サイクル行った。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定して「配列番号：３１」（配列番号：１の２２５〜４４０番目までのアミノ酸配列）、「配列番号：３２」（配列４の１〜２３７番目までのアミノ酸配列）を決定した。配列番号：３１及び配列番号：３２をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列「配列番号：３３」を決定した。
【００５６】
得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ペニスリウム・ヤンシネラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開平１１−４６７６９）と７１％、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Ｊｅｏｎｇ，  Ｈ．  Ｙ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７８  （５），  ３４４−３５０  （２００２））と７４．８％の相同性を示した。
【００５７】
実施例３． ピレノケータ エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃａｅｔａ  ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１０）フルクトシルアミンオキシダーゼの発現
フルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく発現させるため、ピレノケータ  エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃａｅｔａ  ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１０）株からゲノムＤＮＡを再度クローニングした。
ピレノケータ・エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃａｅｔａ  ｓｐ．）ＹＨ８０７フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子塩基配列を基にＰ１０プライマー、Ｐ１１プライマーを設計した。
Ｐ１０  ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＣＡＣＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＴＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号：３４）（配列番号：１の１２４〜１５３番目までの塩基配列にＥｃｏ  Ｔ２２ＩとＢａｍ  ＨＩサイトを付加した配列）
Ｐ１１  ＡＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＣＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＣＣＴＧＡＡＡＡＧＧ（配列番号：３５）（配列番号：１の１，９４１〜１，９７０番目までの塩基配列の相補配列にＥｃｏ  ＲＩサイトを付加した配列）
【００５８】
Ｒａｅｄｅｒ  らの方法（Ｕ．  Ｒａｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｂｒｏｄａ，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ．，  １，  １７−２０  （１９８５））にしたがって調製したピレノケータ・エスピー（  Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．）ＹＨ８０７株の染色体ＤＮＡを単離精製し、そのＤＮＡ  を鋳型ＤＮＡとして  Ｐ１０プライマーとＰ１１プライマーを用いてＰＣＲ  反応を３５サイクル行った。その結果、約  １，９００ｂｐの  ＤＮＡ  断片が得られた。得られた  ＤＮＡ  断片を制限酵素  ＥｃｏＴ２２Ｉ  及び  Ｅｃｏ  ＲＩ  で消化した後、制限酵素  ＥｃｏＴ２２Ｉ  及び  Ｅｃｏ  ＲＩ  で消化したベクター  ｐＴＦ１００  （Ｎ．  Ｋｉｔａｍｏｔｏ，  Ｊ．  Ｍａｔｓｕｉ，  Ｙ．  Ｋａｗａｉ，  Ｙ．  Ｋａｔｏ，  Ｓ．  Ｙｏｓｈｉｎｏ，  Ｋ．  Ｏｈｍｉｙａ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５０，  ８５  −  ９２  （１９９８））に組み込みフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含むベクターｐＴＦＦＡＯＤＰ１００を作製した。
【００５９】
上述の方法で作成した組み込みベクターｐＴＦＦＡＯＤＰ１００  でアスペルギルス・オリゼー（  Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）ＫＢＮ６１６−３９（  ｎｉａＤ−）  株を形質転換した。すべての形質転換株をＧＰ  培地（Ｎ．  Ｋｉｔａｍｏｔｏ，  Ｊ．  Ｍａｔｓｕｉ，  Ｙ．  Ｋａｗａｉ，  Ｙ．  Ｋａｔｏ，  Ｓ．  Ｙｏｓｈｉｎｏ，  Ｋ．  Ｏｈｍｉｙａ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５０，  ８５  −  ９２  （１９９８））  １００  ｍｌを用い、３０℃、５日間液体振盪培養を行ったところ、５．９８ユニット／ｍｌ  のフルクトシルアミンオキシダーゼ活性（基質としてフルクトシルバリルヒスチジンを使用し、測定は特願２００３−６７２６６に準じて行った。）を有するフルクトシルアミンオキシダーゼ高生産アスペルギルス・オリゼー（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）ＦＡＯＤＰ株を得ることができた。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成させる酵素量とした。
【００６０】
また、同じ培養液を濃縮後、Ｌａｅｍｍｌｉ  の方法に基づく  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  を行ったところ、精製したフルクトシルアミンオキシダーゼと同様の位置にバンドが存在し、同様のフルクトシルアミンオキシダーゼの発現が確認できた。
【００６１】
実施例４． アルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯ６  （ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１１）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡのクローニング
（１）染色体ＤＮＡの調製
サブロー培地（グルコース４．０％、ポリペプトン１．０％、ｐＨ５．６）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、アルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯ６を植菌した。２５℃で４日間振盪培養した後、Ｎｏ．２ろ紙でろ過して菌体を回収した。
【００６２】
液体窒素で菌体を凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕した。ＤＮＡ抽出用緩衝液（５．０％ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１５ｍｌを加え、ゆっくり振盪して溶解した。遠心分離（５，０００ｒｐｍ、６ｍｉｎ、ｒｔ．）により上清を得、フェノール／クロロホルム抽出を３回、エーテル抽出を２回行い、エーテルを蒸発させた後、３Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、エタノール２５ｍｌを加え、−３０℃で３０分間放置した。
【００６３】
遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）により染色体ＤＮＡを回収し、７０％エタノール似て洗浄した後、ＴＥ４００μｌに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液にＲＮａｓｅ  １０μｌ（０．１３２Ｕ）を加え、３７℃で１時間処理した後、プロテイナーゼＫを５μｌ（０．６Ｕ）を加え、５０℃で１時間処理した。フェノール／クロロホルム抽出（２回）、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出（１回）を行った後、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。７０％エタノール溶液により洗浄した後、エタノールを除去し、ＴＥ２００μｌに溶解した。
【００６４】
（２）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の増幅
ｉ．  プライマーの設計
実施例１、実施例２に記載のピレノケータ・エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃａｅｔａ  ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１０）由来フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）を基に下記のＰ１２〜Ｐ１７プライマーを設計した。
配列番号：１のＰｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ａｓｎの配列（配列番号：３６）（８５〜９１番目までのアミノ酸配列）からセンスで  Ｐ１２  プライマーを設計した。
Ｐ１２  ＴＴ（Ｔ／Ｃ）（Ａ／Ｃ）Ａ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＣＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ（配列番号：３７）
【００６５】
配列番号：１のＬｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙの配列（配列番号：３８）（１６４〜１７０番目までのアミノ酸配列）からセンスで  Ｐ１３  プライマーを設計した。
Ｐ１３  ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＧＣ（Ｃ／Ｔ）ＡＴ（Ｃ／Ｔ）ＡＡＣＧＣ（Ｃ／Ｔ）ＡＴ（Ｃ／Ｔ）ＧＧ（配列番号：３９）
配列番号：１のＰｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｇｌｕの配列（配列番号：４０）（２６５〜２７１番目までのアミノ酸配列）からセンスで  Ｐ１４  プライマーを設計した。
Ｐ１４  ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＣＣ（Ｔ／Ａ／Ｃ）ＡＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（配列番号：４１）
配列番号：１のＰｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｇｌｕの配列（配列番号：４２）（２６５〜２７１番目までのアミノ酸配列）からアンチセンスで  Ｐ１５  プライマーを設計した。
Ｐ１５  ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＧＧ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（配列番号：４３）
【００６６】
配列番号：１のＭｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒの配列（配列番号：４４）（３４４〜３５０番目までのアミノ酸配列）からアンチセンスで  Ｐ１６  プライマーを設計した。
Ｐ１６  ＧＴＧＴＣ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）ＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＴ（配列番号：４５）
配列番号：１のＡｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌの配列（配列番号：４６）（３８２〜３８８番目までのアミノ酸配列）からアンチセンスで  Ｐ１７  プライマーを設計した。
Ｐ１７  ＡＣ（Ｃ／Ｇ）ＡＣＧＴＧＣＴＴ（Ａ／Ｇ）ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＴＴ（配列番号：４７）
【００６７】
ｉｉ．  フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の取得
前述の方法で得られた染色体ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰ１２プライマーとＰ１７プライマーの組み合わせでＰＣＲ反応を３５サイクル行った。その結果、約９００  ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。得られたＤＮＡ断片の塩基配列「配列番号：４８」（配列番号：３の６０１  〜  １４９４  番目までの塩基配列）を決定した。
【００６８】
（３）  フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定
ｉ．  ５’上流域のＤＮＡ断片の増幅
「配列番号：４８」から  Ｐ１８  プライマーを設計した。
Ｐ１８  ＴＣＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡ（配列番号：４９）（配列番号：３の  ７２６  〜  ７４８  番目までの塩基配列の相補配列）
「配列番号：４８」から  Ｐ１９  プライマーを設計した。
Ｐ１９  ＡＧＣＡＡＧＧＴＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＴ（配列番号：５０）（配列番号：３の  ６５８  〜  ６８０  番目までの塩基配列の相補配列）
【００６９】
５’上流域のＤＮＡ断片の増幅は、次のようにして行った。Ｒａｅｄｅｒ  らの方法（Ｕ．  Ｒａｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｂｒｏｄａ，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ．，  １，  １７−２０  （１９８５））にしたがって調製した  Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．  ＴＯ６株の染色体ＤＮＡを制限酵素  Ｐｓｔ  Ｉ  で消化した後、宝酒造製  ＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  を用いて、ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ  を行った。
【００７０】
即ち、制限酵素処理断片にＰｓｔ  Ｉカセット（宝酒造製）を結合させ、このＤＮＡを鋳型  ＤＮＡとして  Ｃ１プライマ−（宝酒造製）及び  Ｐ１８プライマ−をそれぞれ使用して、ＰＣＲ反応を３５サイクル行った。１００倍希釈した反応液を鋳型ＤＮＡとしてＣ２プライマ−（宝酒造製）及びＰ１９プライマ−を使用して、ＰＣＲ反応をさらに３５サイクル行った。その結果、約７００  ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。その塩基配列「配列番号：５１」（配列番号：３の１  〜  ６４１番目の塩基配列）を決定した。
【００７１】
ｉｉ．  ３’下流域のＤＮＡ断片の増幅
「配列番号：４８」から  Ｐ２０  プライマーを設計した。
Ｐ２０  ＡＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＧＡＣＡＣＧ（配列番号：５２）（配列番号：３の  １，３７５  〜  １，３９５  番目までの塩基配列）
「配列番号：４８」から  Ｐ２１  プライマーを設計した。
Ｐ２１  ＴＡＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＧＧＣＧＡＣＡＧＣ（配列番号：５３）（配列番号：３の  １，４４３  〜  １，４６４  番目までの塩基配列）
【００７２】
３’下流域のＤＮＡ断片の増幅は、次のようにして行った。アルスリニウム・エスピーＴＯ６株の染色体  ＤＮＡ  を制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩで消化した後、制限酵素処理断片に  Ｅｃｏ  ＲＩカセット（宝酒造製）を結合させ、宝酒造製  ＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  を用いて、ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ  を行った。このＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＣ１プライマ−及びＰ２０プライマ−を使用して、ＰＣＲ反応を３５サイクル行った。
【００７３】
１００倍希釈した反応液を鋳型ＤＮＡとしてＣ２プライマ−及びＰ２１プライマ−を使用して、ＰＣＲ反応をさらに３５サイクル行った。その結果、１，２００  ｂｐ  の  ＤＮＡ  断片が特異的に増幅された。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列「配列番号：５４」（配列番号：３の１，５００  〜  １，８７６番目の塩基配列）を決定した。
配列番号：４８、配列番号：５１、配列番号：５４をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列「配列番号：３」を決定した。
【００７４】
得られた塩基配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７のフルクトシルアミンオキシダーゼと７０．０％、ペニスリウム・ヤンシネラムのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（特開平１１−４６７６９）と６６．９％、アスペルギルス・ニドランスのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Ｊｅｏｎｇ，  Ｈ．  Ｙ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７８  （５），  ３４４−３５０  （２００２））と７０．７％の相同性を示した。
【００７５】
実施例５． アルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１１）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするｃＤＮＡのクローニング
（１）全ＲＮＡの調製
ＹＭ培地（グルコース１．０％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ｐＨ  ６．０）１００  ｍｌを５００  ｍｌ容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、アルスリニウム・エスピー  ＴＯ６を植菌した。２５℃で４日間振盪培養した後、Ｎｏ．２ろ紙でろ過して菌体を回収した。培養後の培養物を液体窒素で凍結した後、乳鉢で粉砕し、ライフテックオリエンタル社製  ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ  を用い、そのプロトコールに従って抽出し、全ＲＮＡ  を得た。
【００７６】
（２）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子のｃＤＮＡの取得
Ａ）プライマ−の設計
転写開始点と思われるＡＴＧを推測し、その上流の配列よりＰ２２プライマーを設計した。
Ｐ２２  ＧＧＡＴＴＣＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣ（配列番号：５５）（配列番号：３の３１０〜３３６番目までの塩基配列）
断片（５）のＬｙｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａの配列（配列番号：５６）からセンスで  Ｐ２３  プライマーを設計した。
Ｐ２３  ＡＡＧＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＧ（配列番号：５７）（配列番号：３の９７９〜１００２番目までの塩基配列）
断片（８）のＡｌａ  Ｈｉｓ  Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓの配列（配列番号：５８）からアンチセンスで  Ｐ２４  プライマーを設計した。
Ｐ２４  ＧＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＣＧＣＣＧＣＡＣ（配列番号：５９）（配列番号：３の１０６０〜１０８３番目までの塩基配列）
【００７７】
Ｂ）ｃＤＮＡ配列の決定
約１μｇの全ＲＮＡから３’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ  （宝酒造製）用いて、プロトコールに準じた条件でｃＤＮＡの合成を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてプライマ−に３ｓｉｔｅ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造製）とＰ２３プライマー及びＰ２２プライマーとＰ２４プライマーを用いてＰＣＲ反応を３５サイクル行った。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定して「配列番号：６０」（配列番号：３の２１３〜４５２番目までのアミノ酸配列）、「配列番号：６１」（配列番号：３の１〜２３９番目までのアミノ酸配列）を決定した。配列番号：６０及び配列番号：６１をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列「配列番号：６２」を決定した。
【００７８】
得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７のフルクトシルアミンオキシダーゼと８０．２％、ペニシリウム・ヤンシネラムのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開平１１−４６７６９）と７４．６％、アスペルギルス・ニドランスのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Ｊｅｏｎｇ，  Ｈ．  Ｙ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７８  （５），  ３４４−３５０  （２００２））と７４．３％の相同性を示した。
【００７９】
実施例６．アルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１１）フルクトシルアミンオキシダーゼの発現
フルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく発現させるため、アルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１１）株からゲノムＤＮＡを再度クローニングした。
アルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯ６フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の転写開始点下流の配列を基にＰ２５プライマー、Ｐ２６プライマーを設計した。
Ｐ２５    ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＣＧＴＣＡＣＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＡＴＴＧＴＣＧ（配列番号：６３）（配列番号：３の３４４〜３７３番目までの塩基配列にＥｃｏ  Ｔ２２ＩとＢａｍ  ＨＩサイトを付加した配列）
Ｐ２６    ＡＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＴＴＧＧＧＧＡＡＡＣＡＡＡＴＣＡ（配列番号：６４）（配列番号：３の１，８３１〜１，８６０番目までの塩基配列の相補配列にＥｃｏ  ＲＩサイトを付加した配列）
【００８０】
Ｒａｅｄｅｒ  らの方法（Ｕ．  Ｒａｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｂｒｏｄａ，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ．，  １，  １７−２０  （１９８５））にしたがって調製したアルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯ６株の染色体ＤＮＡを単離精製し、そのＤＮＡ  を鋳型ＤＮＡとして  Ｐ２５プライマーとＰ２６プライマーを用いてＰＣＲ  反応を３５サイクル行った。その結果、約  １，５００ｂｐの  ＤＮＡ断片が得られた。得られた  ＤＮＡ  断片を制限酵素  ＥｃｏＴ２２Ｉ  及び  Ｅｃｏ  ＲＩ  で消化した後、制限酵素  ＥｃｏＴ２２Ｉ  及び  Ｅｃｏ  ＲＩ  で消化したベクター  ｐＴＦ１００  （Ｎ．  Ｋｉｔａｍｏｔｏ，  Ｊ．  Ｍａｔｓｕｉ，  Ｙ．  Ｋａｗａｉ，  Ｙ．  Ｋａｔｏ，  Ｓ．  Ｙｏｓｈｉｎｏ，  Ｋ．  Ｏｈｍｉｙａ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５０，  ８５  −  ９２  （１９９８））に組み込みフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含むベクターｐＴＦＦＡＯＤＡ１００を作製した。
【００８１】
上述の方法で作成した組み込みベクターｐＴＦＦＡＯＤＡ１００  でアスペルギルス・オリゼー（  Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）ＫＢＮ６１６−３９（  ｎｉａＤ−）  株を形質転換した。すべての形質転換株をＧＰ  培地（Ｎ．  Ｋｉｔａｍｏｔｏ，  Ｊ．  Ｍａｔｓｕｉ，  Ｙ．  Ｋａｗａｉ，  Ｙ．  Ｋａｔｏ，  Ｓ．  Ｙｏｓｈｉｎｏ，  Ｋ．  Ｏｈｍｉｙａ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５０，  ８５  −  ９２  （１９９８））  １００  ｍｌを用い、３０℃、５日間液体振盪培養を行ったところ、５．３１ユニット／ｍｌ  のフルクトシルアミンオキシダーゼ活性（基質としてフルクトシルバリルヒスチジンを使用し、測定は特願２００３−６７２６６に準じて行った。）を有するフルクトシルアミンオキシダーゼ高生産アスペルギルス・オリゼー（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）ＦＡＯＤＡ株を得ることができた。
【００８２】
また、同じ培養液を濃縮後、Ｌａｅｍｍｌｉ  の方法に基づく  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  を行ったところ、精製したフルクトシルアミンオキシダーゼと同様の位置にバンドが存在し、同様のフルクトシルアミンオキシダーゼの発現が確認できた。
【００８３】
実施例７． カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖｅｔａ）ＹＨ９２３  （ＦＥＲＭ−Ｐ１９２０９）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡのクローニング
（１）染色体ＤＮＡの調製
サブロー培地（グルコース４．０％、ポリペプトン１．０％、ｐＨ５．６）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖｅｔａ．  ）ＹＨ９２３を植菌した。２５℃で４日間振盪培養した後、Ｎｏ．２ろ紙でろ過して菌体を回収した。
【００８４】
液体窒素で菌体を凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕した。ＤＮＡ抽出用緩衝液（５．０％ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１５ｍｌを加え、ゆっくり振盪して溶解した。遠心分離（５，０００ｒｐｍ、６ｍｉｎ、ｒｔ．）により上清を得、フェノール／クロロホルム抽出を３回、エーテル抽出を２回行い、エーテルを蒸発させた後、３Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、エタノール２５ｍｌを加え、−３０℃で３０分間放置した。
【００８５】
遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）により染色体ＤＮＡを回収し、７０％エタノール似て洗浄した後、ＴＥ４００μｌに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液にＲＮａｓｅ  １０μｌ（０．１３２Ｕ）を加え、３７℃で１時間処理した後、プロテイナーゼＫを５μｌ（０．６Ｕ）を加え、５０℃で１時間処理した。フェノール／クロロホルム抽出（２回）、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出（１回）を行った後、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。７０％エタノール溶液により洗浄した後、エタノールを除去し、ＴＥ２００μｌに溶解した。
【００８６】
（２）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の増幅
ｉ．  プライマーの設計
実施例４に記載のＰ１２〜Ｐ１７プライマーを設計した。
【００８７】
ｉｉ．  フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の取得
前述の方法で得られた染色体ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰ１３プライマーとＰ１７プライマーの組み合わせでＰＣＲ反応を３５サイクル行った。その結果、それぞれ約８００  ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。得られたＤＮＡ断片の塩基配列「配列番号：６５」（配列番号：６の  １０２１  〜  １７９０  番目までの塩基配列）を決定した。
【００８８】
フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定
ｉ．  ５’上流域のＤＮＡ断片の増幅
「配列番号：６５」から  Ｐ２７  プライマーを設計した。
Ｐ２７  ＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＧＡＴ（配列番号：６６）（配列番号：５の  １０８３  〜  １１０６  番目までの塩基配列の相補配列）
「配列番号：６５」から  Ｐ２８  プライマーを設計した。
Ｐ２８  ＣＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣ（配列番号：６７）（配列番号：５の  １０６２  〜  １０８６  番目までの塩基配列の相補配列）
【００８９】
５’上流域のＤＮＡ断片の増幅は、次のようにして行った。Ｒａｅｄｅｒ  らの方法（Ｕ．  Ｒａｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｂｒｏｄａ，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ．，  １，  １７−２０  （１９８５））にしたがって調製したカーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖｅｔａ）  ＹＨ９２３株の染色体ＤＮＡを制限酵素  Ｘｂａ  Ｉ  で消化した後、宝酒造製  ＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  を用いて、ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ  を行った。
【００９０】
即ち、制限酵素処理断片にＸｂａ  Ｉカセット（宝酒造製）を結合させ、このＤＮＡを鋳型  ＤＮＡとして  Ｃ１プライマ−（宝酒造製）及び  Ｐ２７プライマ−をそれぞれ使用して、ＰＣＲ反応を３５サイクル行った。１００倍希釈した反応液を鋳型ＤＮＡとしてＣ２プライマ−（宝酒造製）及びＰ２８プライマ−を使用して、ＰＣＲ反応をさらに３５サイクル行った。その結果、１，２００  ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。その塩基配列「配列番号：６８」（配列番号：５の１  〜  １０４４番目の塩基配列）を決定した。
【００９１】
ｉｉ．  ３’下流域のＤＮＡ断片の増幅
「配列番号：６５」から  Ｐ２９  プライマーを設計した。
Ｐ２９  ＴＧＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＡＣＣ（配列番号：６９）（配列番号：５の  １，７１３  〜  １，７３８  番目までの塩基配列）
「配列番号：６５」から  Ｐ３０  プライマーを設計した。
Ｐ３０  ＡＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＧＧＣＡＣＡＣＡ（配列番号：７０）（配列番号：５の  １，７３６  〜  １，７５７  番目までの塩基配列）
【００９２】
３’下流域のＤＮＡ断片の増幅は、次のようにして行った。カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖｅｔａ）  ＹＨ９２３株の染色体  ＤＮＡ  を制限酵素  Ｓａｌ  Ｉ  で消化した後、制限酵素処理断片に  Ｓａｌ  Ｉカセット（宝酒造製）を結合させ、宝酒造製  ＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  を用いて、ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ  を行った。このＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＣ１プライマ−及びＰ２９プライマ−を使用して、ＰＣＲ反応を３５サイクル行った。１００倍希釈した反応液を鋳型ＤＮＡとしてＣ２プライマ−及びＰ３０プライマ−を使用して、ＰＣＲ反応をさらに３５サイクル行った。その結果、１，０００  ｂｐ  の  ＤＮＡ  断片が特異的に増幅された。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列「配列番号：７１」（配列番号：５の１，７７５  〜  ２，２１２番目の塩基配列）を決定した。
配列番号：６５、配列番号：６８、配列番号：７１をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列「配列番号：５」を決定した。
【００９３】
得られた塩基配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７のフルクトシルアミンオキシダーゼと７５．０％、アルスリニウム・エスピーＴＯ６のフルクトシルアミンオキシダーゼと７１．５％、ペニシリウム・ヤンシネラムのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（特開平１１−４６７６９）と６７．２％、アスペルギルス・ニドランスのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Ｊｅｏｎｇ，  Ｈ．  Ｙ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７８  （５），  ３４４−３５０  （２００２））と６７．８％の相同性を示した。
【００９４】
実施例８． カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖｅｔａ．  ）ＹＨ９２３  （ＦＥＲＭ−Ｐ１９２０９）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするｃＤＮＡのクローニング
（１）全ＲＮＡの調製
ＹＭ培地（グルコース１．０％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ｐＨ  ６．０）１００  ｍｌを５００  ｍｌ容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖｅｔａ）ＹＨ９２３を植菌した。２５℃で４日間振盪培養した後、Ｎｏ．２ろ紙でろ過して菌体を回収した。培養後の培養物を液体窒素で凍結した後、乳鉢で粉砕し、ライフテックオリエンタル社製  ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ  を用い、そのプロトコールに従って抽出し、全ＲＮＡ  を得た。
【００９５】
（２）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子のｃＤＮＡの取得
Ａ）プライマ−の設計
転写開始点と思われるＡＴＧを推測し、その上流の配列よりＰ３１プライマーを設計した。
Ｐ３１  ＴＣＡＴＴＴＡＧＡＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＣ（配列番号：７２）（配列番号：５の４７１〜５００番目までの塩基配列）
断片（５）のＬｙｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａの配列（配列番号：７３）からセンスで  Ｐ３２  プライマーを設計した。
Ｐ３２  ＡＡＡＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＴＧ（配列番号：７４）（配列番号：５の１，１６２〜１，１８７番目までの塩基配列）
断片（８）のＡｌａ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕの配列（配列番号：７５）からアンチセンスで  Ｐ３３  プライマーを設計した。
Ｐ３３  ＴＣＣＴＣＡＧＧＣＧＴＡＡＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＧＣ（配列番号：７６）（配列番号：５の１，２９２〜１，３１７番目までの塩基配列）
【００９６】
Ｂ）ｃＤＮＡ配列の決定
約１μｇの全ＲＮＡから３’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ  （宝酒造製）用いて、プロトコールに準じた条件でｃＤＮＡの合成を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてプライマ−に３ｓｉｔｅ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造製）とＰ３２プライマー及びＰ３１プライマーとＰ３３プライマーを用いてＰＣＲ反応を３５サイクル行った。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定して「配列番号：７７」（配列番号：５の２１３〜４４０番目までのアミノ酸配列）、「配列番号：７８」（配列番号：５の１〜２３７番目までのアミノ酸配列）を決定した。配列番号：７７及び配列番号：７８をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列「配列番号：７９」を決定した。
【００９７】
得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７のフルクトシルアミンオキシダーゼと８６．１％、アルスリニウム・エスピーＴＯ６のフルクトシルアミンオキシダーゼと８０．３％、ペニシリウム・ヤンシネラムのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開平１１−４６７６９）と７５．２％、アスペルギルス・ニドランスのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Ｊｅｏｎｇ，  Ｈ．  Ｙ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７８  （５），  ３４４−３５０  （２００２））と７４．６％の相同性を示した。
【００９８】
実施例９． カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖｅｔａ）ＹＨ９２３  （ＦＥＲＭ−Ｐ１９２０９）フルクトシルアミンオキシダーゼの発現
フルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく発現させるため、カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖｅｔａ）ＹＨ９２３株からゲノムＤＮＡを再度クローニングした。
カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖｅｔａ）ＹＨ９２３フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列を基にＰ３４プライマー、Ｐ３５プライマーを設計した。
Ｐ３４  ＧＡＣＡＴＧＣＡＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＧＴＴ（配列番号：８０）（配列番号：５の４７７〜５０６番目までの塩基配列にＥｃｏ  Ｔ２２ＩとＢａｍ  ＨＩサイトを付加した配列）
Ｐ３５    ＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＧＡＧＴＧＴＡＣＣＣ（配列番号：８１）（配列番号：５の１，８０５〜１，８３９番目までの塩基配列の相補配列）
Ｐ３６    ＣＡＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＧＡＴ（配列番号：８２）（配列番号：５の１，８２８〜１，８６２番目までの塩基配列）
Ｐ３７  ＡＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＣＧＣＡＣＣ（配列番号：８３）（配列番号：５の２，２８１〜２，２１０番目までの塩基配列の相補配列にＥｃｏ  ＲＩサイトを付加した配列）
【００９９】
Ｒａｅｄｅｒ  らの方法（Ｕ．  Ｒａｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｂｒｏｄａ，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ．，  １，  １７−２０  （１９８５））にしたがって調製したカーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖｅｔａ）ＹＨ９２３株の染色体ＤＮＡを単離精製し、そのＤＮＡ  を鋳型ＤＮＡとして  Ｐ３４プライマーとＰ３５プライマー、Ｐ３６プライマーとＰ３７プライマーを用いてＰＣＲ  反応を３５サイクル行った。その結果、約  １，４００ｂｐと約４００ｂｐの  ＤＮＡ  断片が得られた。得られた  ＤＮＡ  断片を制限酵素  ＥｃｏＴ２２Ｉ  及び  Ｅｃｏ  ＲＩ  で消化した後、制限酵素  ＥｃｏＴ２２Ｉ  及び  Ｅｃｏ  ＲＩ  で消化したベクター  ｐＴＦ１００  （Ｎ．  Ｋｉｔａｍｏｔｏ，  Ｊ．  Ｍａｔｓｕｉ，  Ｙ．  Ｋａｗａｉ，  Ｙ．  Ｋａｔｏ，  Ｓ．  Ｙｏｓｈｉｎｏ，  Ｋ．  Ｏｈｍｉｙａ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５０，  ８５  −  ９２  （１９９８））に組み込みフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含むベクターｐＴＦＦＡＯＤＣ１００を作製した。
【０１００】
上述の方法で作成した組み込みベクターｐＴＦＦＡＯＤＣ１００  でアスペルギルス・オリゼー（  Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）ＫＢＮ６１６−３９（  ｎｉａＤ−）  株を形質転換した。すべての形質転換株をＧＰ  培地（Ｎ．  Ｋｉｔａｍｏｔｏ，  Ｊ．  Ｍａｔｓｕｉ，  Ｙ．  Ｋａｗａｉ，  Ｙ．  Ｋａｔｏ，  Ｓ．  Ｙｏｓｈｉｎｏ，  Ｋ．  Ｏｈｍｉｙａ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５０，  ８５  −  ９２  （１９９８））  １００  ｍｌを用い、３０℃、５日間液体振盪培養を行ったところ、６．５２ユニット／ｍｌ  のフルクトシルアミンオキシダーゼ活性（基質としてフルクトシルバリルヒスチジンを使用し、測定は特願２００３−６７２６６に準じて行った。）を有するフルクトシルアミンオキシダーゼ高生産アスペルギルス・オリゼー（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）ＦＡＯＤＣ株を得ることができた。
【０１０１】
また、同じ培養液を濃縮後、Ｌａｅｍｍｌｉ  の方法に基づく  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  を行ったところ、精製したフルクトシルアミンオキシダーゼと同様の位置にバンドが存在し、同様のフルクトシルアミンオキシダーゼの発現が確認できた。
【０１０２】
比較例１． ペニシリウム・ヤンシネラムＮＢＲＣ６５８１由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの基質特異性
＜培養方法と酵素調製方法＞
５００ｍｌの坂口フラスコに１００ｍｌの０．５％のフルクトシル−ε−リジン、１．０％のグルコース、０．１％のリン酸２カリウム、０．１％リン酸１ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０１％塩化カリウム、０．２％酵母エキスを含有する培地（ｐＨ  ６．０）をそれぞれ入れ、殺菌後、ペニシリウム・ヤンシネラムＮＢＲＣ６５８１菌株を植菌し、２８℃、４８時間間振とう培養した。培養終了後、集菌し、液体窒素で凍結した菌体を乳鉢で磨砕して菌体破砕を行い、４０  ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．３）を加えて、５℃で１晩放置した後、遠心分離して無細胞抽出液を得た。
【０１０３】
得られた無細胞抽出液を濃縮後、０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化したハイロード１６／６０スーパーデックス２００ｐｇ（アマシャムファルマシア  バイオテク製）によるゲルろ過を行い、フルクトシルバリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ画分（分子量約５０，０００〜１０，０００）を集めた。得られたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ画分を濃縮し、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを得た。得られた酵素液のフルクトシルバリンに対する活性は４．３ｍＵ／ｍｌであった。
【０１０４】
得られたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いてフルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルバリルロイシンに対する作用を調べた。測定方法は特願２００３−６７２６６に準じて行った。その結果、ペニシリウム・ヤンシネラムＮＢＲＣ６５８１由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、フルクトシルバリルヒスチジンならびにフルクトシルバリルロイシンには全く作用しなかった。
【０１０５】
比較例２． アスペルギルス・ニドランスＦＧＳＣＡ４由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの基質特異性
＜培養方法と酵素調製方法＞
５００ｍｌ坂口フラスコに１００ｍｌの１．０％のフルクトシルバリン、２．０％のグルコース、１．０％のポリペプトンを含有する培地（ｐＨ６．０）をそれぞれ入れ、殺菌後、アスペルギルス・ニドランスＦＧＳＣＡ４株を植菌し、３０℃、４８時間振とう培養した。培養終了後、集菌し、液体窒素で凍結した菌体を乳鉢で磨砕して菌体破砕を行い、４０ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）を加え、５℃で一晩放置した後、遠心分離して無細胞抽出液を得た。
【０１０６】
得られた無細胞抽出液を濃縮した後、０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化したハイロード１６／６０スーパーデックス２００ｐｇ（アマシャムファルマシアバイオテク製）による濾過を行い、フルクトシルバリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ画分（分子量約５０，０００〜１０，０００）を集めた。得られたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ画分を濃縮し、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを得た。得られた酵素液を用いて特願２００３−６７２６６に準じてフルクトシルバリンに対する活性を測定したところ、３．５ｍＵ／ｍｌであった。
【０１０７】
また、得られたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いてフルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルバリルロイシンに対する対する作用を同様に調べた結果、アスペルギルス・ニドランスＦＧＳＣＡ４由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、フルクトシルバリルヒスチジン及びフルクトシルバリルロイシンに全く作用しなかった。
【０１０８】
【配列表】
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