(57)【要約】【課題】高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するための新規な方法を提供する。【解決手段】培養細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養し、「アンジオポエチン関連タンパク質３または４」遺伝子のｍＲＮＡ発現量またはプロモーター活性を検出し、被験物質非存在下で培養した細胞よりも、被験物質存在下で培養した細胞において、検出されたｍＲＮＡの発現量またはプロモーター活性が少なくなるような被験物質を選択する方法。ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性を調節する物質の試験方法であって、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬとその基質とを反応させる系に、被験物質と共に、「アンジオポエチン関連タンパク質３または４」を共存させ、次いで、該タンパク質によるＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性阻害を、被検物質が抑制するか否かを調べることを特徴とする方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、被験物質の、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を試験する方法：
１）哺乳動物由来培養細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養する；
２）上記１）で得られた培養細胞における、下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（ただし、配列中のｔはｕに読み替える）を有するｍＲＮＡの発現量を検出する：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
３）上記工程２）の結果、被験物質非存在下で培養した細胞と、被験物質存在下で培養した細胞との間で、検出されたｍＲＮＡの発現量を比較する。
【請求項２】
哺乳動物由来培養細胞が肝臓由来であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物由来培養細胞が霊長類または齧歯類動物由来であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物由来培養細胞がヒトまたはマウス由来であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がノーザンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がＲＴ−ＰＣＲであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がリボヌクレアーゼ保護アッセイであることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がランオン・アッセイであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段が動物組織または細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡの部分配列で作製された遺伝子チップを用いるものであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
下記の工程を含む、被験物質の、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を試験する方法：
１）培養細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養する；
２）上記１）で得られた培養細胞上清における、下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を、該ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
３）上記工程２）の結果、被験物質非存在下で培養した細胞と、被験物質存在下で培養した細胞との間で、検出されたポリペプチドの量を比較する。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体が、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその一部、同１９−４５５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその一部、または配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその一部と特異的に結合するものであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体が、配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から１３に示されるアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸番号１から１４に示されるアミノ酸配列を特異的に認識するものであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０乃至１２のいずれか一つに記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を該ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する操作が、ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１０乃至１２のいずれか一つに記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を該ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する操作が、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）または放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４記載のＥＬＩＳＡ法においてプレートに固相化する抗体としてマウスハイブリドーマ４５Ｂ１の産生するモノクローナル抗体Ｍａｂ４５Ｂ１を使用することを特徴とする方法。なお、ハイブリドーマ４５Ｂ１は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６３として寄託されている。
【請求項１６】
下記のｉ）および／またはｉｉ）記載の抗体を含むことを特徴とする、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するためのキット：
ｉ）下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｉｉ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から１３に示されるアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸番号１から１４に示されるアミノ酸配列と特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１７】
配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列中の連続した１５乃至３０ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列のアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡを有効成分として含有する高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の遺伝子治療のための組成物。
【請求項１８】
配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７のアミノ酸をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つのアミノ酸をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１９】
配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至２０７に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１８記載のポリペプチド。
【請求項２０】
配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至１９５に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１８記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至１４７に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１８記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２３】
配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２４】
配列表の配列番号１８のアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２５】
配列表の配列番号２０のアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２６】
配列表の配列番号２２のアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２７】
配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２８】
配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２９】
配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３０】
配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３１】
配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３２】
配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３３】
配列表の配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３４】
請求項１８乃至３３記載のアミノ酸配列の一つもしくは数個の部位において、一つ若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、付加もしくは置換されている、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドの同効物。
【請求項３５】
請求項１８乃至３４のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３６】
配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項３７】
配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６０２のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項３８】
配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項３９】
配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４０】
配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１０３９乃至１２６１のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４１】
配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１９０９を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４２】
配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６３９乃至８４６のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４３】
配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１５０３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４４】
配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号７９６乃至１０１５のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４５】
配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１６５４を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４６】
配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号３７３乃至３９４のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４７】
配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１０４８を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４８】
配列表の配列番号２５のヌクレオチド番号１８乃至６６２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４９】
請求項３５乃至４８のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５０】
アデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項４９記載の組換えベクター。
【請求項５１】
請求項４９または５０記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５２】
請求項５１記載の宿主細胞を培養し、次いで、該培養物から、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドを回収することを特徴とする、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項５３】
下記の工程を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法：
１）　非ヒト哺乳動物に、請求項１８乃至３４に記載のポリペプチドから選択される１種又は２種以上のポリペプチド、および被験物質を投与する；および
２）　上記１）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定する。
【請求項５４】
下記の工程を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法：
１）　非ヒト哺乳動物に、請求項５０記載の組換えアデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させる；
２）　上記工程１）の動物に被験物質を投与する；および
３）　上記工程２）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定する。
【請求項５５】
高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法であって、リポタンパク質リパーゼ（以下「ＬＰＬ」という）および／または肝性トリアシルグリセロールリパーゼ（以下「ＨＴＧＬ」という）とその基質とを反応させる系に、被験物質と共に、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、または請求項１８乃至３４記載のポリペプチドを共存させ、次いで、該ポリペプチドによるＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性の阻害作用に対する、被験物質の抑制効果を調べることを特徴とする方法。
【請求項５６】
下記の工程を含む、ＬＰＬ活性を調節する物質の試験方法：１）　下記の▲１▼−ａ乃至▲３▼記載の材料と、被験物質とを共存させた混合物を調製する：
▲１▼−ａ　ＬＰＬを含む材料；
▲２▼−ａ　ＬＰＬの基質を含む材料；
▲３▼　配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、または請求項１８乃至３４記載のポリペプチド；
２）　上記１）の▲１▼−ａ乃至▲３▼の材料のみからなる混合物を、１）とは別個に調製する；
３）　上記１）および２）の混合物において、基質から遊離された脂肪酸の量をそれぞれ測定し、その測定値を比較する。
【請求項５７】
ＬＰＬを含む材料が、哺乳動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
ＬＰＬを含む材料が、げっ歯類または霊長類動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＬＰＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、請求項５６乃至５８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６０】
下記の工程を含む、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性を調節する物質の試験方法：
１）　下記の▲１▼−ｂ乃至▲３▼記載の材料と、被験物質とを共存させた混合物を調製する：
▲１▼−ｂ　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料；
▲２▼−ｂ　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料；
▲３▼　配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチドまたは請求項１８乃至３４記載のポリペプチド；
２）　上記１）の▲１▼−ｂ乃至▲３▼の材料のみからなる混合物を、１）とは別個に調製する；
３）　上記１）および２）の混合物において、基質から遊離された脂肪酸の量を測定し、その測定値を比較する。
【請求項６１】
ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、ヘパリンを静注投与した哺乳動物由来の血漿であることを特徴とする、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、請求項６０または６１記載の方法。
【請求項６３】
ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、哺乳動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であるか、またはヘパリンを静注投与した哺乳動物由来の血漿であることを特徴とする、請求項５９記載の方法。
【請求項６４】
ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、げっ歯類または霊長類動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、請求項５９または６３記載の方法。
【請求項６５】
ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、請求項５９、６３または６４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６６】
下記の１）乃至３）のいずれか一つで表されるＤＮＡ：
１）配列表の配列番号２７に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１で示されるヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号５１０乃至５２６のいずれか一つで示されるヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
２）上記１）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物肝臓由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
３）上記１）記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、哺乳動物肝臓由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項６７】
配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
【請求項６８】
配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項６９】
配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項７０】
下記の１）乃至３）のいずれか一つで表されるＤＮＡ：
１）配列表の配列番号２８に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１で示されるヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１８８乃至２６０のいずれか一つで示されるヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
２）上記１）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
３）上記１）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項７１】
配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から１８８で示されるヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項７２】
配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から１８８で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項７３】
請求項６６乃至７２のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項７４】
外来遺伝子の上流側に外来遺伝子配列と同じ転写の方向で請求項６６乃至７２のいずれか１つに記載のＤＮＡが連結されており、哺乳動物細胞中で外来遺伝子を発現させ得る発現ベクター。
【請求項７５】
外来遺伝子配列がルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子配列であることを特徴とする、請求項７４記載の発現ベクター。
【請求項７６】
外来遺伝子配列がルシフェラーゼをコードする遺伝子配列であることを特徴とする、請求項７４記載の発現ベクター。
【請求項７７】
組換えプラスミドｐＧＬ８−３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６２７）。
【請求項７８】
発現ベクターｐＧＬ１１−４。
【請求項７９】
請求項７３乃至７８のいずれか１つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８０】
下記の工程ｉ）からｉｉｉ）を含む、被験物質の、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を試験する方法：
ｉ）請求項７３乃至７８のいずれか一つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非被存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、請求項７３乃至７８のいずれか一つに記載の発現ベクター中の、外来遺伝子にコードされているタンパク質の産生量を検出または測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の結果、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間での検出または測定結果を比較する工程。
【請求項８１】
下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定する方法：
ｉ）▲１▼請求項７３乃至７８のいずれか一つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）、▲２▼細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）および▲３▼細胞Ａを別の組換えプラスミドで形質転換しているが、該被験ｃＤＮＡは発現しない細胞（以下「細胞Ｃ」という）の▲１▼乃至▲３▼の細胞からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ａ、細胞Ｂおよび細胞Ｃにおける、請求項７３乃至７８のいずれか一つに記載の発現ベクター中の、外来遺伝子にコードされているタンパク質の発現量を測定し比較する工程。
【請求項８２】
「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子プロモーター活性を調節するタンパク質を検出する方法であって、請求項６６乃至６９のいずれか一つに記載のＤＮＡに該タンパク質を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該タンパク質を検出することを特徴とする方法。
【請求項８３】
下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子プロモーター活性を調節する活性を有する物質を試験する方法：
ｉ）請求項６６乃至６９のいずれか一つに記載のＤＮＡを放射標識したものに、マウス細胞の核抽出液および被験物質を加えたもの、ならびにマウス細胞の核抽出液のみを加えたものをそれぞれ調製する；
ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、マウス細胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を比較する。
【請求項８４】
配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなるＤＮＡ、そのアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列からなる核酸またはそれらの誘導体。
【請求項８５】
「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子プロモーター活性を調節するタンパク質を検出する方法であって、請求項７０乃至７２のいずれか一つに記載のＤＮＡに該タンパク質を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該タンパク質を検出することを特徴とする方法。
【請求項８６】
下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子プロモーター活性を調節する活性を有する物質を試験する方法：
ｉ）請求項７０乃至７２のいずれか一つに記載のＤＮＡを放射標識したものに、マウス細胞の核抽出液および被験物質を加えたもの、ならびにマウス細胞の核抽出液のみを加えたものをそれぞれ調製する；
ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、マウス細胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を比較する。
【請求項８７】
配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなるＤＮＡ、そのアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列からなり、請求項７０乃至７２のいずれか一つに記載のＤＮＡが有するプロモーター活性を促進または阻害する核酸またはそれらの誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するための新規な方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の探索または試験に有用な新規ポリペプチドおよび該ポリペプチドを用いた新規試験方法に関する。
【０００３】
また、本発明は、脂質低下剤、特に高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤として有用な、リパーゼ活性を調節する物質を試験するための新規方法に関する。
【０００４】
また、本発明は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験に有用な、プロモーター活性を有する新規ＤＮＡに関する。
【０００５】
【従来の技術】心臓血管疾患は、いまだ世界のほとんどの先進諸国における死亡の主原因である。アテローム性動脈硬化症は、急性冠症候群（不安定狭心症、急性心筋梗塞、虚血性突然死）、脳血栓および脳梗塞の主な病因である。米国では、毎年、アテローム性動脈硬化症によって引き起こされる心筋梗塞により５５万人が死亡していると推定される。１９９１年の統計では、日本での死亡原因の第一位がアテローム性動脈硬化症による心臓血管疾患である。疫学研究により、アテローム性動脈硬化症は、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧症、喫煙などの多くの危険因子によって生じることが判明している。
【０００６】
血清脂質濃度の異常増加を高脂質血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）または高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｅｍｉａ）と呼ぶ。血清脂質にはコレステロール（コレステロールエステル、遊離コレステロール）、リン脂質（レシチン、スフィンゴミエリン等）、トリグリセリド（中性脂肪）、遊離脂肪酸、その他のステロール類などがあるが、とくに臨床的に問題となるのは、血中の中性脂肪およびコレステロールの増加である（ＣＯＭＭＯＮ　ＤＩＳＥＡＳＥ　ＳＥＲＩＥＳ　Ｎｏ．１９高脂血症　中村治雄編集　１９９１年１０月１０日発行南江堂、Ａｕｓｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１０１，　２７７７−２７８２　（２０００））。高コレステロール血症と虚血性心疾患発症との関係については、その因果関係は明確にされており、虚血性心疾患に対する独立した危険因子としての位置が確立され、その予防や治療が積極的に行なわれている。また、近年になって血清コレステロール値ほど疫学的に明確ではないが、高トリグリセリド血症が動脈硬化に関連した諸疾患の危険因子として再認識されてきている（Ｒｕｂｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　３４１，　４１０−４１８　（１９９９））。従って、血中脂質値の適切なコントロールは、虚血性心疾患、脳梗塞などに代表される動脈硬化に関連した諸疾患の予防または治療に極めて重要である（Ｂｒｅｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ　Ｊ　Ｃａｒｄｉｏｌ．　８３，　３Ｆ−１２Ｆ　（１９９９））。
中性脂肪を低下せしめる薬剤としては、フィブリン酸系化合物、例えば、クロフィブレート、フェノフィブレート、ベザフィブレート、ゲムフィブロジルなどが医薬として供されており、血漿中の中性脂肪、およびコレステロールレベルを低下させ、コレステロールレベルの上昇した個体における虚血性心疾患の予防に有用であることが知られている（Ｈａｖｅｌ，　Ｒ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｋａｎｅ，　Ｊ．　Ｐ．　（１９７３）　１３　Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｐｈａｒｍａｃ．　２８７−３０８、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１０２，　２１−２７　（２０００）、Ｆｒｉｃｋ，　Ｍ．　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３１７，　１２３７−１２４５）。
【０００７】
一方、血中コレステロール値を低下させる薬剤としては、コレスチラミン、コレスチポール等の胆汁酸を捕捉してその吸収を阻害するもの（例えば、米国特許第４０２７００９号）、メリナミド（フランス特許第１４７６５６９号）等のアシルコエンザイムＡコレステロールアシル移転酵素（ＡＣＡＴ）を阻害してコレステロールの腸管吸収を抑制するもの等の他、コレステロールの生合成を抑制する薬剤が注目されている。コレステロール生合成抑制薬剤として、特に３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素を阻害するロバスタチン（米国特許第４２３１９３８号）、シンバスタチン（米国特許第４４４４７８４号）、プラバスタチン（米国特許第４３４６２２７号）等が医薬として供されている。
【０００８】
より安全で、かつより効果的な中性脂肪低下作用を示す脂質低下剤を得ることは、高脂血症の予防または治療あるいは動脈硬化の治療または予防に有用な、従って医薬としてより有用な薬剤を提供することになる。
【０００９】
他方、糖尿病は多くの原因因子に由来する疾患過程であり、血漿グルコースレベルの上昇もしくは高血糖症を特徴とする。制御されない高血糖症は、ネフロパシー、ニューロパシー、網膜症、高血圧症、卒中および心疾患を含めた細小血管および大血管疾患に関する危険性の増大に起因して早期死亡率（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）の上昇に関連する。従って、グルコース恒常性の制御は高血糖症、ひいては糖尿病の治療法として決定的に重要である。
【００１０】
本発明の方法において用いられる遺伝子のうち配列表配列番号１に記載のｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオポエチン関連タンパク質３（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３）」をコードするヌクレオチド配列として開示されており、また国際特許出願公開ＷＯ９９／５５８６９号公報には同じヌクレオチド配列が「ｚａｌｐｈａ５」をコードするものとして開示されているが、これらのヌクレオチド配列を有する遺伝子と高脂血症、動脈硬化および高血糖との関連については知られておらず、またその転写制御に関するＤＮＡ配列も知られていない。従って、「アンジオポエチン関連タンパク質３」乃至「ｚａｌｐｈａ５」をコードするヌクレオチド配列の一部またはそれらのプロモーターが、高脂血症、動脈硬化および高血糖の治療または予防剤を試験するために有用であることも知られていない。
【００１１】
「アンジオポエチン関連タンパク質」には６つのファミリーが知られている（「アンジオポエチン関連タンパク質１、２、３、４、５および６」）。「アンジオポエチン関連タンパク質１、２、３、４、５および６」はアンジオポエチンと同様に、アミノ末端側のコイル構造、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインを特徴とする分泌タンパク質である（図７）。例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質３」では、４６０アミノ酸のうち、アミノ末端から１６番目のアミノ酸までがシグナルペプチドで、１７番目から２０７番目のアミノ酸までがヘリックス領域でこの中にコイル構造が含まれ、２０８番目から２４１番目のアミノ酸までがリンカー領域で、２４２番目から４６０番目のアミノ酸までが、フィブリノーゲン結合領域であるとされている。
【００１２】
「アンジオポエチン関連タンパク質１」および「アンジオポエチン関連タンパク質２」はアンジオポエチンの相同性を基にしたＰＣＲによりヒト心臓より同定された（Ｋｉｍ，Ｉ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４４３：　３５３−３５６；　Ｋｉｍ，　Ｉ．，　ｅｔ　ａｌ　（１９９９）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４：　２６５２３−２６５２８）。「アンジオポエチン関連タンパク質１」と「アンジオポエチン関連タンパク質２」との間では５９％の相同性を示す。アンジオポエチン１に対する「アンジオポエチン関連タンパク質１及び２」の相同性は２６−２９％である。アンジオポエチン２に対する「アンジオポエチン関連タンパク質１及び２」の相同性は３４％である。
【００１３】
「アンジオポエチン関連タンパク質１」は幅広い臓器で発現が認められているが、アンジオポエチン様の内皮細胞刺激活性は示さない。一方、「アンジオポエチン関連タンパク質２」については心臓、小腸、脾臓および胃での発現が認められ、血管内皮細胞に対する刺激活性を示したものの、アンジオポエチン１あるいはアンジオポエチン２の受容体である「ＴＩＥ２」への結合は認められなかった。
【００１４】
一方、「アンジオポエチン関連タンパク質３」については、ＥＳＴを用いたホモロジ−検索により見出され、肝臓と腎臓においてのみ発現していること示されている（Ｃｏｎｋｌｉｎ，　Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　６２，　４７７−４８２）。「アンジオポエチン関連タンパク質３」については、Ｃ末端側領域の機能について報告されている（Ｃｏｎｋｌｉｎ，　Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　６２，　４７７−４８２）が、Ｎ末端側領域がいかなる機能を有するかについては知られていなかった。さらに、Ｃ末端側領域を欠いたＮ末端領域のみの欠損体が機能を有することは全く知られていない。また、「アンジオポエチン関連タンパク質３」のパートナー因子については知られておらず、アンジオポエチン関連タンパク質３およびそのパートナー因子を用いて、血中中性脂肪濃度を調節する薬剤をイン・ビトロで試験する方法も知られていない。
【００１５】
「アンジオポエチン関連タンパク質４」はＰＰＡＲγ制御下で脂質代謝あるいはグルコースホメオスターシスに関与するタンパク質（Ｙｏｏｎ，　Ｊ．　Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｍｏｌｅｃ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ　２０，　５３４３−５３４９）、ＰＰＡＲα標的遺伝子で絶食により誘導される脂質因子（Ｋｅｒｓｔｅｎ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　２８４８８−２８４９３）、および内皮細胞にアポトーシスを誘発する肝臓由来の新規「アンジオポエチン関連タンパク質」（Ｋｉｍ，　Ｉ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３４６，　６０３−６１０）として同定されている。「アンジオポエチン関連タンパク質４」は白色脂肪細胞および胎盤での発現が報告されているがアンジオポエチン様の活性の有無については報告されていない。
また、「アンジオポエチン関連タンパク質４」の発現制御に関わる特定のＤＮＡ領域（プロモーター／エンハンサー領域）は同定されておらず、該遺伝子のプロモーターが、高脂血症、動脈硬化や高血糖の治療または予防剤を試験するために有用であることも知られていなかった。
【００１６】
「アンジオポエチン関連タンパク質５」は遺伝子が登録されているだけであり、機能は不明である。
【００１７】
「アンジオポエチン関連タンパク質６」は角膜特異的に発現する遺伝子ｃｏｒｎｅａ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　６　（ＣＤＴ６）として同定された（Ｐｅｅｋ，　Ｒ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．　Ｖｉｓ．　Ｓｃｉ．　３９，　１７８２−１７８８）。「アンジオポエチン関連タンパク質６」はマウス移植癌モデルで腫瘍増殖阻止を示した（Ｐｅｅｋ，　Ｒ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　ｅｐｕｂ　ａｈｅａｄ　ｏｆ　ｐｒｉｎｔ）。
【００１８】
このようにアンジオポエチンが有する血管内皮増殖因子様活性とは異なった機能を「アンジオポエチン関連タンパク質」は担っている可能性が考えられる。
【００１９】
「アンジオポエチン関連タンパク質」ファミリーに共通するカルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインについては、「ＴＩＥレセプター」との結合に関与する領域であるとの報告はなく、また、「アンジオポエチン関連タンパク質」ファミリーに共通するアミノ末端側のコイル構造がどのような機能を有するかは不明である。
【００２０】
さらに、「アンジオポエチン関連タンパク質」ファミリーのカルボキシル末端側のフィブリノーゲン様領域を欠いたアミノ末端領域のみの欠損体が機能を有することは全く知られていなかった。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するための新規な方法を提供することにある。
【００２２】
また、本発明の目的は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の探索または試験に有用な新規ポリペプチドおよび該ポリペプチドを用いた新規試験方法を提供することにある。
【００２３】
また、本発明の目的は、リパーゼ活性を調節する物質、特に、高脂血症および／または動脈効果の予防または治療剤として有用な、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性を上昇させることによって血中脂質濃度を低下せしめる物質を試験するための新規方法を提供することにある。
【００２４】
また、本発明の目的は、「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子および「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の転写制御に関わるプロモーター領域を特定し、該プロモーターの活性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供することにある。より具体的には、高脂血症、動脈硬化もしくは高血糖の治療または予防剤を試験するための新規な方法および該方法において用いられるＤＮＡが提供される。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）　下記の工程を含む、被験物質の、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を試験する方法：
１）哺乳動物由来培養細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養する；
２）上記１）で得られた培養細胞における、下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（ただし、配列中のｔはｕに読み替える）を有するｍＲＮＡの発現量を検出する：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
３）上記工程２）の結果、被験物質非存在下で培養した細胞と、被験物質存在下で培養した細胞との間で、検出されたｍＲＮＡの発現量を比較する。
【００２６】
（２）　哺乳動物由来培養細胞が肝臓由来であることを特徴とする、（１）に記載の方法。
【００２７】
（３）　哺乳動物由来培養細胞が霊長類または齧歯類動物由来であることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
【００２８】
（４）　哺乳動物由来培養細胞がヒトまたはマウス由来であることを特徴とする、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の方法。
【００２９】
（５）　（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がノーザンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットであることを特徴とする方法。
【００３０】
（６）　（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がＲＴ−ＰＣＲであることを特徴とする方法。
【００３１】
（７）　（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がリボヌクレアーゼ保護アッセイであることを特徴とする方法。
【００３２】
（８）　（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がランオン・アッセイであることを特徴とする方法。
【００３３】
（９）　（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段が動物組織または細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡの部分配列で作製された遺伝子チップを用いるものであることを特徴とする方法。
【００３４】
（１０）　下記の工程を含む、被験物質の、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を試験する方法：
１）培養細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養する；
２）上記１）で得られた培養細胞上清における、下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を、該ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
３）上記工程２）の結果、被験物質非存在下で培養した細胞と、被験物質存在下で培養した細胞との間で、検出されたポリペプチドの量を比較する。
【００３５】
（１１）　（１０）に記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体が、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその一部、同１９−４５５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその一部、または配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその一部と特異的に結合するものであることを特徴とする方法。
【００３６】
（１２）　（１０）または（１１）に記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体が、配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から１３に示されるアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸番号１から１４に示されるアミノ酸配列を特異的に認識するものであることを特徴とする方法。
【００３７】
（１３）　（１０）乃至（１２）のいずれか一つに記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を該ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する操作が、ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットであることを特徴とする方法。
【００３８】
（１４）　（１０）乃至（１２）のいずれか一つに記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を該ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する操作が、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）または放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）であることを特徴とする方法。
【００３９】
（１５）　（１４）記載のＥＬＩＳＡ法においてプレートに固相化する抗体としてマウスハイブリドーマ４５Ｂ１の産生するモノクローナル抗体Ｍａｂ４５Ｂ１を使用することを特徴とする方法。なお、ハイブリドーマ４５Ｂ１は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６３として寄託されている。
【００４０】
（１６）　下記のｉ）および／またはｉｉ）記載の抗体を含むことを特徴とする、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するためのキット：
ｉ）下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｉｉ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から１３に示されるアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸番号１から１４に示されるアミノ酸配列と特異的に結合することを特徴とする抗体。
【００４１】
（１７）　配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列中の連続した１５乃至３０ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列のアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡを有効成分として含有する高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の遺伝子治療のための組成物。
【００４２】
（１８）　配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７のアミノ酸をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つのアミノ酸をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４３】
（１９）　配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至２０７に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、（１８）記載のポリペプチド。
【００４４】
（２０）配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至１９５に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、（１８）記載のポリペプチド。
【００４５】
（２１）　配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至１４７に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、（１８）記載のポリペプチド。
【００４６】
（２２）　配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４７】
（２３）　配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４８】
（２４）配列表の配列番号１８のアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４９】
（２５）　配列表の配列番号２０のアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５０】
（２６）　配列表の配列番号２２のアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５１】
（２７）　配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５２】
（２８）　配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５３】
（２９）　配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５４】
（３０）　配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５５】
（３１）　配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５６】
（３２）　配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５７】
（３３）　配列表の配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５８】
（３４）（１８）乃至（３３）記載のアミノ酸配列の一つもしくは数個の部位において、一つ若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、付加もしくは置換されている、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドの同効物。
【００５９】
（３５）　（１８）乃至（３４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００６０】
（３６）　配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６１】
（３７）　配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６０２のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６２】
（３８）　配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６３】
（３９）　配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６４】
（４０）　配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１０３９乃至１２６１のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６５】
（４１）　配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１９０９を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６６】
（４２）　配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６３９乃至８４６のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６７】
（４３）　配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１５０３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６８】
（４４）　配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号７９６乃至１０１５のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６９】
（４５）　配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１６５４を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００７０】
（４６）　配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号３７３乃至３９４のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００７１】
（４７）　配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１０４８を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００７２】
（４８）　配列表の配列番号２５のヌクレオチド番号１８乃至６６２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００７３】
（４９）　（３５）乃至（４８）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【００７４】
（５０）　アデノウイルスベクターであることを特徴とする、（４９）記載の組換えベクター。
【００７５】
（５１）　（４９）または（５０）記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【００７６】
（５２）　（５１）記載の宿主細胞を培養し、次いで、該培養物から、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドを回収することを特徴とする、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドの製造方法。
【００７７】
（５３）　下記の工程を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法：
１）　非ヒト哺乳動物に、（１８）乃至（３４）に記載のポリペプチドから選択される１種又は２種以上のポリペプチド、および被験物質を投与する；および
２）　上記１）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定する。
【００７８】
（５４）　下記の工程を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法：
１）　非ヒト哺乳動物に、（５０）記載の組換えアデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させる；
２）　上記工程１）の動物に被験物質を投与する；および
３）　上記工程２）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定する。
【００７９】
（５５）　高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法であって、リポタンパク質リパーゼ（以下「ＬＰＬ」という）および／または肝性トリアシルグリセロールリパーゼ（以下「ＨＴＧＬ」という）とその基質とを反応させる系に、被験物質と共に、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、または（１８）乃至（３４）記載のポリペプチドを共存させ、次いで、該ポリペプチドによるＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性の阻害作用に対する、被験物質の抑制効果を調べることを特徴とする方法。
【００８０】
（５６）　下記の工程を含む、ＬＰＬ活性を調節する物質の試験方法：
１）　下記の▲１▼−ａ乃至▲３▼記載の材料と、被験物質とを共存させた混合物を調製する：
▲１▼−ａ　ＬＰＬを含む材料；
▲２▼−ａ　ＬＰＬの基質を含む材料；
▲３▼　配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、または（１８）乃至（３４）記載のポリペプチド；
２）　上記１）の▲１▼−ａ乃至▲３▼の材料のみからなる混合物を、１）とは別個に調製する；
３）　上記１）および２）の混合物において、基質から遊離された脂肪酸の量をそれぞれ測定し、その測定値を比較する。
【００８１】
（５７）　ＬＰＬを含む材料が、哺乳動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、（５６）記載の方法。
【００８２】
（５８）　ＬＰＬを含む材料が、げっ歯類または霊長類動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、（５６）または（５７）に記載の方法。
【００８３】
（５９）　ＬＰＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、（５６）乃至（５８）のいずれか１つに記載の方法。
【００８４】
（６０）下記の工程を含む、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性を調節する物質の試験方法：
１）　下記の▲１▼−ｂ乃至▲３▼記載の材料と、被験物質とを共存させた混合物を調製する：
▲１▼−ｂ　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料；
▲２▼−ｂ　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料；
▲３▼　配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチドまたは（１８）乃至（３４）記載のポリペプチド；
２）　上記１）の▲１▼−ｂ乃至▲３▼の材料のみからなる混合物を、１）とは別個に調製する；
３）　上記１）および２）の混合物において、基質から遊離された脂肪酸の量を測定し、その測定値を比較する。
【００８５】
（６１）　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、ヘパリンを静注投与した哺乳動物由来の血漿であることを特徴とする、（６０）記載の方法。
【００８６】
（６２）　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、（６０）または（６１）記載の方法。
【００８７】
（６３）　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、哺乳動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であるか、またはヘパリンを静注投与した哺乳動物由来の血漿であることを特徴とする、（５９）記載の方法。
【００８８】
（６４）　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、げっ歯類または霊長類動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、（５９）または（６３）記載の方法。
【００８９】
（６５）　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、（５９）、（６３）または（６４）のいずれか１つに記載の方法。
【００９０】
（６６）　下記の１）乃至３）のいずれか一つで表されるＤＮＡ：
１）配列表の配列番号２７に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１で示されるヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号５１０乃至５２６のいずれか一つで示されるヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
２）上記１）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物肝臓由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
３）上記１）記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、哺乳動物肝臓由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【００９１】
（６７）　配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
【００９２】
（６８）　配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００９３】
（６９）　配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００９４】
（７０）　下記の１）乃至３）のいずれか一つで表されるＤＮＡ：
１）配列表の配列番号２８に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１で示されるヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１８８乃至２６０のいずれか一つで示されるヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
２）上記１）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
３）上記１）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【００９５】
（７１）　配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から１８８で示されるヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【００９６】
（７２）　配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から１８８で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００９７】
（７３）　（６６）乃至（７２）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【００９８】
（７４）　外来遺伝子の上流側に外来遺伝子配列と同じ転写の方向で（６６）乃至（７２）のいずれか１つに記載のＤＮＡが連結されており、哺乳動物細胞中で外来遺伝子を発現させ得る発現ベクター。
【００９９】
（７５）　外来遺伝子配列がルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子配列であることを特徴とする、（７４）記載の発現ベクター。
【０１００】
（７６）　外来遺伝子配列がルシフェラーゼをコードする遺伝子配列であることを特徴とする、（７４）記載の発現ベクター。
【０１０１】
（７７）　組換えプラスミドｐＧＬ８−３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６２７）。
【０１０２】
（７８）　発現ベクターｐＧＬ１１−４。
【０１０３】
（７９）　（７３）乃至（７８）のいずれか１つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【０１０４】
（８０）　下記の工程ｉ）からｉｉｉ）を含む、被験物質の、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を試験する方法：
ｉ）（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非被存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載の発現ベクター中の、外来遺伝子にコードされているタンパク質の産生量を検出または測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の結果、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間での検出または測定結果を比較する工程。
【０１０５】
（８１）　下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定する方法：
ｉ）▲１▼（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）、▲２▼細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）および▲３▼細胞Ａを別の組換えプラスミドで形質転換しているが、該被験ｃＤＮＡは発現しない細胞（以下「細胞Ｃ」という）の▲１▼乃至▲３▼の細胞からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ａ、細胞Ｂおよび細胞Ｃにおける、（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載の発現ベクター中の、外来遺伝子にコードされているタンパク質の発現量を測定し比較する工程。
【０１０６】
（８２）　「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子プロモーター活性を調節するタンパク質を検出する方法であって、（６６）乃至（６９）のいずれか一つに記載のＤＮＡに該タンパク質を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該タンパク質を検出することを特徴とする方法。
【０１０７】
（８３）　下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子プロモーター活性を調節する活性を有する物質を試験する方法：
ｉ）（６６）乃至（６９）のいずれか一つに記載のＤＮＡを放射標識したものに、マウス細胞の核抽出液および被験物質を加えたもの、ならびにマウス細胞の核抽出液のみを加えたものをそれぞれ調製する；
ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、マウス細胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を比較する。
【０１０８】
（８４）　配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなるＤＮＡ、そのアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列からなる核酸またはそれらの誘導体。
【０１０９】
（８５）　「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子プロモーター活性を調節するタンパク質を分離する方法であって、（７０）乃至（７２）のいずれか一つに記載のＤＮＡに該タンパク質を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該タンパク質を単離することを特徴とする方法。
【０１１０】
（８６）　下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子プロモーター活性を調節する活性を有する物質を試験する方法：
ｉ）（７０）乃至（７２）のいずれか一つに記載のＤＮＡを放射標識したものに、マウス細胞の核抽出液および被験物質を加えたもの、ならびにマウス細胞の核抽出液のみを加えたものをそれぞれ調製する；
ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、マウス細胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を比較する。
【０１１１】
（８７）　配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなるＤＮＡ、そのアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列からなり、（７０）乃至（７２）のいずれか一つに記載のＤＮＡが有するプロモーター活性を促進または阻害する核酸またはそれらの誘導体。
に関する。
【０１１２】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１、３、１１、１５、１７、１９、２１、２３および２５に示される、哺乳動物の血液中の中性脂肪濃度の調節に関与する遺伝子の発現を指標として、被験物質の高脂血症、動脈硬化および高血糖の治療または予防剤としての効果を試験する方法、該方法において用いられる核酸プローブ、プライマーおよび抗体を提供するものである。
【０１１３】
本発明者らは、高脂血症の治療または予防剤の標的遺伝子を探索する目的で、先天的低脂血症マウスの遺伝子を高脂血症マウスの遺伝子と比較することにより、高脂血症の原因遺伝子の染色体上の位置を絞り込んだ結果、高脂血症マウスで高発現する遺伝子を特定することに成功した。この遺伝子由来のｃＤＮＡは、ホモロジー検索の結果、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として開示されていたが、本発明者らは、該ヌクレオチド配列を有する遺伝子を低脂血症マウスに強制発現させ、あるいは動物細胞で発現させたヒト型組換えタンパク質を投与することで、血中の中性脂肪の濃度が上昇することを見出し、該遺伝子がこれまで報告されていない新規な機能を有することを確かめた。
【０１１４】
さらに、先天的に「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子を正常に発現しないコンジェニックマウスと動脈硬化を発症するアポリポプロテインＥ欠損マウスとを掛け合わせることで得られたマウスにおいては、動脈硬化の進展が抑制されることが確かめられた。そこで、該ヌクレオチド配列またはその一部をプローブもしくはプライマーとして用いた遺伝子発現の検出系を利用する、動脈硬化治療または予防剤の新規試験方法を構築することに成功した。また、該ヌクレオチド配列がコードするポリペプチドに特異的な抗体を調製し、該抗体を用いて該ポリペプチドの産生量を検出する実験系を利用する動脈硬化症の治療または予防剤の新規試験方法を構築することに成功した。
【０１１５】
さらに、先天的に「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子を正常に発現しないコンジェニックマウスと動脈硬化を発症するアポリポプロテインＥ欠損マウスまたはレプチン変異遺伝子を有するマウスを掛け合わせることで得られたマウスにおいては、高血糖状態が改善されることを確かめた。そこで、該ヌクレオチド配列またはその一部をプローブもしくはプライマーとして用いた遺伝子発現の検出系を利用することにより、高血糖の治療または予防剤の新規試験方法を構築できることを見出した。また、該ヌクレオチド配列がコードするポリペプチドに特異的な抗体を調製し、該抗体を用いて該ポリペプチドの産生量を検出する実験系を利用する高血糖の治療または予防剤の新規試験方法を構築することに成功した。
【０１１６】
また、本発明者らは、「アンジオポエチン関連タンパク質」が共通して持っているアミノ末端側のコイル構造に着目し、「アンジオポエチン関連タンパク質」、「アンジオポエチン関連タンパク質」のカルボキシル末端側フィブリノーゲン様領域を欠いたアミノ末端領域のみの欠損体ポリペプチドが、哺乳動物において血中の中性脂肪濃度を上昇させる機能を有することを見出した。更に、本発明者らは、「アンジオポエチン関連タンパク質」を血中に投与すると、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様領域が切断され、アミノ末端側のヘリックス領域を有するポリペプチドが生成し、このペプチドが血中脂肪濃度上昇に関与していることも見出した。さらに、本発明者らは、「アンジオポエチン関連タンパク質」または「アンジオポエチン関連タンパク質」のカルボキシル末端側フィブリノーゲン様領域を欠いたアミノ末端領域のみの欠損体ポリペプチドを用いて、イン・ビボおよびイン・ビトロにおいて高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験する方法を確立した。
【０１１７】
「アンジオポエチン関連タンパク質」におけるヘリックス領域、リンカー領域、フィブリノーゲン様領域は例えば、三次元結晶構造解析で決めることができるが、コンピュータープログラムを用いて予測することもできる。このようなプログラムとしては、ＧＣＧ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒ．１０．２（ＣＯＩＬ　ＳＣＡＮ）（Ｌｕｐａｓ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：１１６２−１１６４．１９９１．）が知られている。ヘリックス領域にはコイル構造が存在する。
【０１１８】
上記、コンピュータープログラムあるいは、実験結果によると、「アンジオポエチン関連タンパク質１」では、配列表の配列番号１８のアミノ酸番号１乃至２１までがシグナルペプチド、２２乃至２０２までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、２７７乃至４９１までがフィブリノーゲン様領域であり、「アンジオポエチン関連タンパク質２」では、配列表の配列番号２０のアミノ酸番号１乃至２２までがシグナルペプチド、２３乃至２０６までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、２７６乃至４９３までがフィブリノーゲン様領域であり、「アンジオポエチン関連タンパク質３」では、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至１６までがシグナルペプチド、１７乃至２０７までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、２４２乃至４６０までがフィブリノーゲン様領域であり、「アンジオポエチン関連タンパク質４」では、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号１乃至２５までがシグナルペプチド、２６乃至１４４までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、１８４乃至４０６までがフィブリノーゲン様領域であるり、「アンジオポエチン関連タンパク質５」では、配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１乃至２０までがシグナルペプチド、２１乃至１８５までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、　２５９乃至４７０までがフィブリノーゲン様領域であり、「アンジオポエチン関連タンパク質６」では、配列表の配列番号２４のアミノ酸番号１乃至２６までがシグナルペプチド、２７乃至１２２までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、１３０乃至３４６までがフィブリノーゲン様領域である。
【０１１９】
また、本発明者らは、イン・ビボでの血中中性脂肪濃度上昇作用を担う「アンジオポエチン関連タンパク質３」のパートナー因子について探索を行った結果、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬのリパーゼ活性がアンジオポエチン関連タンパク質３により阻害されることを見出した。そして、アンジオポエチン関連タンパク質３の血中中性脂肪濃度上昇作用を調節する物質をイン・ビトロで試験するための方法として、このＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬのリパーゼ活性阻害作用を利用する方法を開発し、本発明を完成させた。
【０１２０】
アンジオポエチン関連タンパク質３はＬＰＬ活性を阻害することから、該タンパク質とＬＰＬとの相互作用を抑制することにより実質的にＬＰＬ活性を上昇させる物質を見出せば、新しい作用機序を有する、高脂血症または動脈硬化の治療または予防に有用な薬剤を提供することになる。
【０１２１】
また、本発明者らは、マウスゲノムにおける「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の転写開始点と予測される部位（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号４１９）を「１」として、その５’末端側上流４１８ヌクレオチドの部位から、３’末端側下流１０８ヌクレオチド（以下、「−４１８乃至＋１０８」のように表記する。配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５２６）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡにルシフェラーゼをコードするＤＮＡを連結したレポーター遺伝子をヒトＨｅｐＧ２細胞に導入し、ルシフェラーゼの産生量を測定することにより、「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の「−４１８乃至＋１０８」領域がプロモーター活性を有することを見出した。また本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子に連結するマウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５’末端側領域を「＋９３乃至＋１０８」（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号５１１乃至５２６）に短縮すると、プロモーター活性が失われることも見いだした。本発明者らは、さらに、上記プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることにより、該プロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングできることを見出した。
【０１２２】
また、本発明者らは、マウスゲノムにおける「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の転写開始点と予測される部位（配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号９１）を「１」として、その５’末端側上流９０ヌクレオチドの部位から、３’末端側下流１６９ヌクレオチド（以下、「−９０乃至＋１７０」のように表記する。配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２６０に相当）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡにルシフェラーゼをコードするＤＮＡを連結したレポーター遺伝子をサル腎細胞ＣＯＳ１に導入し、ルシフェラーゼの産生量を測定することにより、「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の「−９０乃至＋１７０」領域がプロモーター活性を有することを見出した。また本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子に連結するマウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５’末端側領域を「＋９９乃至＋１７０」（配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１８９乃至２６０に相当）に短縮すると、プロモーター活性が失われることも見出した。
本発明者らは、さらに、上記プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることにより、該プロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングできることを見出した。
【０１２３】
本発明のＤＮＡは、哺乳動物肝臓由来の細胞においてプロモーター活性を有する限り、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５’末端側上流域のいかなるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。好適には、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができるが、本発明はこれに限定されない。
【０１２４】
一方、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５’末端側＋９３乃至＋１０８に相当するヌクレオチド配列（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号５１１乃至５２６）からなるＤＮＡは、実質的にプロモーター活性を有さない。したがって、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５’末端側上流域の−４１８位から＋９２位に相当するヌクレオチド配列（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５１０）に、プロモーター活性に必須の領域が含まれると考えられるので、本発明のプロモーターＤＮＡは、好ましくは配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５１０で示されるヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む。
【０１２５】
また、本発明のＤＮＡは、哺乳動物由来の細胞においてプロモーター活性を有する限り、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５’末端側上流域のいかなるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。好適には、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２６０に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができるが、本発明はこれに限定されない。
【０１２６】
一方、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５’末端側＋９９乃至＋１７０に相当するヌクレオチド配列（配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１８９乃至２６０に相当）からなるＤＮＡは、実質的にプロモーター活性を有さない。したがって、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５’末端側上流域の−９０位から＋９８位に相当するヌクレオチド配列（配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至１８８に相当）に、プロモーター活性に必須の領域が含まれると考えられるので、本発明のプロモーターＤＮＡは、より好適には配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至１８８で示されるヌクレオチド配列を少なくとも一部に含む。
【０１２７】
本発明において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【０１２８】
【発明の実施の形態】
Ｉ．　遺伝子の発現を指標とする方法
本発明の一つの方法は、具体的には例えば、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号１５のヌクレオチド番号１７３から１３９０に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号１７のヌクレオチド番号４３４から１９０９に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号１９のヌクレオチド番号２２から１５００に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号２１のヌクレオチド番号２４２から１６５２に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号２３のヌクレオチド番号８から１０４５に示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子、またはそれらがコードするポリペプチドと同じく血中資質濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を、当該核酸（ｍＲＮＡ）または当該ポリペプチドの特異的検出によって測定し、該遺伝子の発現量を低下させるような被験物質を高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の候補物質として選択するものである。以下、核酸の検出を行う態様とポリペプチドの検出を行う態様とに分けて説明する。
【０１２９】
（Ａ）核酸の検出
１）プローブ
核酸の検出を行う態様のうち、核酸ハイブリダイゼーションを利用する方法において用いられるプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであって、そのヌクレオチド配列は、下記ａ）乃至ｅ）：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡ断片が有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡ断片が有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
のいずれか一つ（ただし、配列中のｔはｕに読み替える）のヌクレオチド配列であればよく、例えば、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチド、該アンチセンス配列中の連続した少なくとも１５ヌクレオチドからなる部分配列を有するポリヌクレオチド、または該アンチセンス配列の改変体等、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有するポリリボヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることにより該ポリリボヌクレオチドを特異的に検出することが可能なものは全て本発明の方法に用いられ得る。それらのうち、上記ａ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドは、例えばマウス肝臓由来のｃＤＮＡライブラリーから配列表の配列番号１に示すヌクレオチド配列情報に基づいて、周知の方法、例えばプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法等によりクローニングしたｃＤＮＡクローンを、周知の方法で直接標識するか、または該ｃＤＮＡクローンを鋳型としたポリメラーゼ反応による複製または転写反応において標識することにより、標識プローブとして得ることができる。また、上記ｂ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドは、例えばヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリーから配列表の配列番号３に示すヌクレオチド配列情報に基づいて、同様の操作を行うことによりクローニングしたｃＤＮＡクローンから標識プローブを得ることができる。一方、上記ｃ）またはｄ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドは、工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター）に平成１１年１１月１９日付で国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０またはＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１が付されている形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９株またはＥ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９株が保持する組換えファージミドから得ることができる。
【０１３０】
さらに、上記ｅ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドは、例えば上記のようにして得られる上記ａ）乃至ｄ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、任意の哺乳動物（好ましくは肝臓）由来のｃＤＮＡライブラリーについてプラークハイブリダイゼーション法やコロニーハイブリダイゼーション法によるクローニングを行って単離したｃＤＮＡクローンから得ることができる。
【０１３１】
さらにまた、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列中の連続した少なくとも１５ヌクレオチドからなる部分配列を有するポリヌクレオチドは、数十ヌクレオチド程度のものであれば化学合成によって得ることが可能である。またあるいは、上記のようにして得られる上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクローン中の任意の部分配列を、例えばＰＣＲ等によってサブクローニングしてから、上記と同様の手法でアンチセンス配列を有するプローブとして調製することもできる。
【０１３２】
例えば、配列表の配列番号１記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列中の連続した数十ヌクレオチドからなる部分配列において、数ヌクレオチドが付加、欠失および／または付加されたようなヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであっても、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする限り、本発明の方法に用いられ得る。そのようなポリヌクレオチドは、化学合成法や、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）等の酵素反応を利用した本発明の属する技術分野における周知の変異導入法を用いて作製することが可能である。
【０１３３】
また、本発明の方法において用いられるプローブは単一のヌクレオチド配列からなるものに限定されない。すなわち本発明の方法においては、例えば上記の要件を満足する複数種類のヌクレオチド配列の混合物をプローブとして用いるか、またははそれら複数種類のヌクレオチド配列をそれぞれ個別に用いた多重検出を行ってもよい。
【０１３４】
２）ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー
本発明における、核酸の検出を行うもう一つの態様は、まずｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素反応を行ってから、ＰＣＲを実施して特異的にＤＮＡ断片を増幅する、いわゆるＲＴ−ＰＣＲを行う方法である。この方法において、目的のヌクレオチド配列を特異的に増幅するためには、目的のｍＲＮＡの特定の部分配列に相補的なアンチセンスプライマーと、該アンチセンスプライマーから逆転写酵素により生成されるｃＤＮＡの配列中の特定の部分配列に相補的なセンスプライマーが用いられる。
【０１３５】
逆転写酵素反応およびＰＣＲの両方に用いられるアンチセンスプライマーは、実質的に上記ａ）乃至ｅ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列中の、連続した少なくとも１８ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる。
【０１３６】
一方、ＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマーの配列は、上記ａ）乃至ｅ）記載のヌクレオチド配列において、上記アンチセンスプライマーの相補鎖にあたる配列中の最も５’末端側の位置よりもさらに５’末端側領域に存在する配列中の連続した少なくとも１８ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２１ヌクレオチドの任意の部分配列からなる。ただし、センスプライマーとアンチセンスプライマーに互いに相補的な配列が存在すると、プライマー同士がアニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され、特異的な遺伝子検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを避けたプライマーの設計を行うことが好ましい。
【０１３７】
これらアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーには、いずれも上記で規定したそれらヌクレオチド配列の５’末端に、上記ａ）乃至ｅ）記載のヌクレオチド配列とは無関係のヌクレオチド配列がリンカーとして付加されていてもよい。ただし、特異的な遺伝子検出の妨げとならないよう、該リンカーは反応中に反応液内の核酸と非特異的アニーリングを起こさないようなものであることが好ましい。
【０１３８】
３）遺伝子発現を検出する細胞または動物
次に、本発明の方法において用いられる培養細胞は、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を発現する哺乳動物細胞であればよい。好ましくは哺乳動物肝臓由来の培養細胞（好ましくは、初代培養肝細胞）であるが、例えば上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入した細胞など、人為的に形質転換された細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）も使用することが可能である。哺乳動物種としては、ヒト、マウス、ラットまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましく、さらに、好ましい細胞としては高脂血症マウスであるＫＫマウス（日本クレア社より入手可能）の初代培養肝細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。また、培養細胞を用いるよりも好適と判断される場合には、哺乳動物個体に被験物質を投与して、その後該動物個体から摘出されたその臓器または組織細胞における上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現を検出する方法も採用し得る。その際、遺伝子発現の検出対象となる臓器または組織は、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を発現するものであればよいが、好ましくは肝臓である。この実施態様における好ましい哺乳動物種はヒト、マウス、ラットまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。例えばマウスとしては前記ＫＫマウスが好ましく用いられるが、本発明はこれに限定されない。
【０１３９】
本発明の方法において用いられる培養細胞は、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を発現可能な条件（ただし被験物質を添加しない場合）であれば、いかなる条件で培養してもよい。例えば、該培養細胞について確立された培養条件が知られており、該条件下において該細胞が上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を発現する場合は、該条件で培養してよい。
【０１４０】
４）被験物質の添加
上記細胞の培養中、被験物質を培養培地に添加し一定期間培養する。被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられる。また、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現を抑制するように設計された核酸またはその誘導体（アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ等を含む）を、被験物質として使用することも可能である。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作成するなどして複数種の投与量を設定してもよい。被験物質存在下で培養する期間も適宜設定してよいが、好ましくは３０分乃至２４時間である。哺乳動物個体に被験物質を投与する場合は、被験物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を使い分ける。
【０１４１】
５）試料の調製
上記のようにして培養した細胞からＲＮＡを抽出するに際しては、培養終了後直ちに細胞をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェノール等リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するのが好ましい。または、細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等のタンパク質タンパク質分解酵素を用いて穏やかに培養基材から分離させるなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにＲＮＡ抽出工程に移行する。
【０１４２】
ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，　Ｎ．，　（１９８７）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１６２，　１５６−１５９）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。
【０１４３】
得られたＲＮＡからさらにｍＲＮＡを精製する方法は以下に説明する通りである。すなわち、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られているので、この特徴を利用して例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、ｍＲＮＡをさらに分画することもできる。ただし、本発明の方法のためには、これらｍＲＮＡの精製工程は必須ではなく、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現の検出が可能である限りにおいて、全ＲＮＡをその後の工程に用いることもできる。
【０１４４】
６）試料の固相化
核酸ハイブリダイゼーションによる検出を行う場合、上記のようにして得られたＲＮＡ試料中の遺伝子を特異的に検出するため、該ＲＮＡ試料をアガロース電気泳動を経てハイブリダイゼーション実験用メンブレン（以下単に「メンブレン」という）に転写する（ノーザンブロット法）か、または直接メンブレンに試料を染み込ませる、いわゆるドットブロット法やスロットブロット法により、メンブレンに固相化する。このメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、ハイボンド−Ｃピュア（アマシャム・ファルマシア社製）等）、ポジティブチャージ・ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−Ｎ＋アマシャム・ファルマシア社製）等）または親水性ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−Ｎ／ＮＸ（アマシャム・ファルマシア社製）等）等が用いられる。
【０１４５】
ノーザンブロット用のアガロース電気泳動方法としては、アガロースホルムアミドゲル電気泳動法、試料をグリオキサールとジメチルスルホキシドで処理し、変性させた後、リン酸緩衝液で作製したアガロースゲルで泳動させる方法およびアガロースゲルメチル水銀電気泳動法（以上Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ．）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１４６】
電気泳動後のゲルからメンブレンにＲＮＡを移す、いわゆるブロッティング方法としては、キャピラリートランスファー法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ．）、バキューム法、電気泳動法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　ｉｎ　”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ　ｅｄ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ．）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材も市販されている（例えば、バイオドット（バイオラッド社製）等）。
【０１４７】
ブロッティング終了後、メンブレンに移し取られたＲＮＡをメンブレンに固定する操作を行う（この操作はメンブレンの材質によって異なり、製品によっては固定操作不要の場合もある）。
【０１４８】
７）プローブの標識
核酸ハイブリダイゼーションによる検出を行うにあたり、上記のようにして固相化させたＲＮＡ試料中の特定のｍＲＮＡを検出するためのプローブの標識方法と検出方法について以下に述べる：
ｉ）放射性同位元素標識
ＤＮＡ断片またはそれを保持するベクター等を材料乃至鋳型として、ニックトランスレーション法（例えば、ニックトランスレーションキット（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）、ランダムプライム法（例えば、マルチプライムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）、末端標識法（例えば、メガラベル（宝酒造（株）社製）、３’−末端ラベリングキット（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）で標識ＤＮＡプローブを調製するか、あるいは鋳型となるＤＮＡをサブクローニングしたベクター中のＳＰ６プロモーターやＴ７プロモーターを利用したイン・ビトロ転写法により標識ＲＮＡプローブを調製する。これらプローブの検出はＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーにより行うことができ、さらにＸ線フィルムの場合はデンシトメトリー（例えば、ＧＳ−７００イメージイングデンシトメーター（バイオラッド社製）を使用）を、イメージングプレートの場合はＢＡＳ２０００ＩＩ（富士フィルム製）システムをそれぞれ用いた定量も可能である。
【０１４９】
ｉｉ）酵素標識
ＤＮＡあるいはＲＮＡ断片を直接酵素標識する。標識に用いられる酵素は例えば、アルカリホスファターゼ（ＡｌｋＰｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＥＣＬダイレクト・ヌクレイック・アッシド・ラベリング・アンド・ディテクション・システム（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）を挙げることができる。プローブの検出は、標識した酵素の触媒反応が検出可能になるような基質、例えば該触媒反応により発色物質を生成したり、発光するような基質を含む酵素反応緩衝液にメンブレンを浸すことにより行う。発色基質を用いた場合は目視により検出することができ、発光基質を用いた場合は放射性同位元素標識の場合と同様にＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーやインスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。さらに、発光基質を用いた場合は、デンシトメトリーやＢＡＳ２０００ＩＩシステムを利用した定量も可能である。
【０１５０】
ｉｉｉ）その他分子による標識
フルオレセイン標識：　ＤＮＡ断片にニックトランスレーション法、ランダムプライム法、または３’末端標識法（アマシャム・ファルマシア社より市販されているＥＣＬ　３’−オリゴラベリングシステムなど）で標識する。あるいはＳＰ６、Ｔ７プロモーターによるイン・ビトロ転写によりＲＮＡに標識する；
ビオチン標識：　ＤＮＡの５’末端を標識（アマシャム・ファルマシア社より市販されているオリゴヌクレオチド・ビオチン・ラベリングキットなど使用）するか、またはＤＮＡ断片にニックトランスレーション法、ランダムプライム法などで標識する。
【０１５１】
ジゴキシゲニン修飾ｄＵＴＰ標識：　ＤＮＡ断片にニックトランスレーション法、ランダムプライム法などで標識する。
【０１５２】
これら標識分子の検出は、いずれの場合も、標識された分子に特異的に結合する分子を放射性同位元素や酵素で標識したものをプローブに結合させる操作を含む。特異的に結合する分子とは、例えばフルオレセインやジゴキシゲニンの場合は抗フルオレセイン抗体や抗ジゴキシゲニン抗体であり、ビオチンの場合はアビジンまたはストレプトアビジンである。これらをプローブに結合させた以降は、その標識された放射性同位元素や酵素により上記ｉ）またはｉｉ）記載と同様の方法にしたがって検出を行うことができる。
【０１５３】
８）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは、本発明が属する技術分野において周知の方法で行われ得る。本発明におけるハイブリダイゼーション溶液または洗浄液の組成と、ハイブリダイゼーション温度または洗浄温度の関係については、例えば文献（バイオ実験イラストレイテッド４、ｐ１４８、秀潤社刊）の記載に従うことができるが、好ましい条件は以下の通りである：
ハイブリダイゼーション溶液：　ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）；
プローブの終濃度（放射標識プローブの場合）：　１乃至２×１０６ｃｐｍ／ｍｌ（好ましくは、２×１０６ｃｐｍ／ｍｌ）；
ハイブリダイゼーション温度および時間：　６８℃、１乃至２４時間。
【０１５４】
メンブレンの洗浄条件：
ｉ）　０．１乃至５×ＳＳＣ（最も好ましくは２×ＳＳＣ）、０．０５乃至０．１％　ＳＤＳ（最も好ましくは０．０５％）ドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」という）中、室温乃至４２℃（最も好ましくは室温）で２０乃至６０分間（最も好ましくは２０分間）振盪する操作を、洗浄液を交換して２乃至６回（最も好適には３回）行う；
ｉｉ）　上記ｉ）の後、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、５０乃至６５℃で、２０乃至６０分間振盪する操作を、洗浄液を交換して２乃至６回行う。または、０．２乃至０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、６２乃至６５℃で、２０乃至６０分間振盪する操作を、洗浄液を交換して２乃至６回行う。最も好適には、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、５０℃で、２０分間振盪する操作を、洗浄液を交換して３回行う。
【０１５５】
洗浄終了後、上記７）に記載したように、プローブの標識法に合わせた検出・定量を行う。また、細胞あたりの発現量が安定していることが知られている遺伝子（例えば、２３ｋＤａ高塩基性タンパク質、α−チューブリン、グリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼ、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼＡ２、リボゾーマルタンパク質Ｓ９、ユビキチン等の遺伝子発現を検出するためのプローブが市販されている）の各試料における発現量を、各試料間のＲＮＡ量の差等に起因するばらつきを補正する目的で同時に測定しておき、この安定的発現遺伝子の発現量を基準とした、検出対象遺伝子発現量の相対値を、被験物質を投与した細胞群と投与しなかった細胞群との間で比較することにより、より精密な評価を行うことができる。
【０１５６】
その結果、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を低下させる被験物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１５７】
９）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＲＴ−ＰＣＲによって核酸の検出を行う態様における、各反応の条件は以下に記載する通りである。なお、ＲＴ−ＰＣＲによる検出のための試料は、通常ポリ（Ａ）＋ＲＮＡにまで精製されている必要はない。
【０１５８】
ｉ）逆転写酵素反応
反応液組成の例（全量２０μｌ）：
全ＲＮＡ　適宜；
塩化マグネシウム　２．５乃至５ｍＭ（好ましくは５ｍＭ）；
１×ＲＮＡ　ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−塩酸（２５℃におけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは８．３））、５０ｍＭ　塩化カリウム）；
ｄＮＴＰｓ　０．５乃至１ｍＭ（好ましくは１ｍＭ）；
アンチセンスプライマー　１μＭ　（アンチセンスプライマーの代用として、市販のランダムプライマーやオリゴ（ｄＴ）プライマー（１２−２０ヌクレオチド）を２．５μＭ添加することもできる）；
逆転写酵素　０．２５乃至１単位／μｌ（好ましくは０．２５単位／μｌ）；
滅菌水で２０μｌに調整する。
【０１５９】
反応温度条件：
３０℃で１０分間保温（ランダムプライマー使用時のみ）した後、４２乃至６０℃（好ましくは４２℃）で１５乃至３０分間（好ましくは３０分間）保温し、さらに９９℃で５分間加熱して酵素を失活させてから、４乃至５℃（好ましくは５℃）で５分間冷却する。
【０１６０】
ｉｉ）ＰＣＲ
反応液組成の例：
塩化マグネシウム　２乃至２．５ｍＭ（好ましくは２．５ｍＭ）；
１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−塩酸（２５℃におけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは８．３））、５０ｍＭ　塩化カリウム；
ｄＮＴＰｓ　０．２乃至０．２５ｍＭ（好ましくは０．２５ｍＭ）；
アンチセンスプライマーおよびセンスプライマー　０．２乃至０．５μＭ（好ましくは０．２μＭ）；
Ｔａｑポリメラーゼ　１乃至２．５単位（好ましくは２．５単位）；
滅菌水を加えて全量を８０μｌに調整し、その全量を、逆転写反応を終了した反応液全量に加えてからＰＣＲを開始する。
【０１６１】
反応温度条件：　まず９４℃で２分間加熱した後、９０乃至９５℃（好ましくは９４℃）で３０秒間、４０乃至６０℃（好ましくは、プライマーの特性から算出される解離温度（Ｔｍ）からそれより２０度低い温度までの範囲内で３０秒間、７０乃至７５℃（好ましくは７２℃）で１．５分間の温度サイクルを２８乃至５０サイクル（好ましくは２８サイクル）繰り返してから、４℃に冷却する。
【０１６２】
ＰＣＲ終了後、反応液を電気泳動し、目的の大きさのバンドが増幅されているか否かを検出する。定量的検出を行うためには、予め段階希釈したｃＤＮＡクローンを標準の鋳型ＤＮＡとして同条件でＰＣＲを実施し、定量的検出が可能な温度サイクル数を定めておくか、または、例えば５サイクルごとに一部反応液をサンプリングしてそれぞれ電気泳動を行う。また例えばＰＣＲ反応時に放射標識ｄＣＴＰを用いることにより、バンド中に取り込まれた放射能の量を指標に定量を行うこともできる。
【０１６３】
被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を低下させた被験物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１６４】
１０）その他の方法
上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を測定する他の方法としては、以下に記載するものを挙げることができる。
【０１６５】
ｉ）リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＮａｓｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）：　ＲＮＡ試料中の、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ（ただし配列中のｔはｕに読み替える）のみに標識プローブをハイブリダイズさせ、二本鎖ポリヌクレオチドを形成させておいてから、試料にリボヌクレアーゼを添加してインキュベーションすると、プローブがハイブリダイズしたｍＲＮＡは二本鎖を形成していることによってリボヌクレアーゼによる消化を免れ、それ以外のＲＮＡは消化されるので、該二本鎖ポリヌクレオチドのみが残る（検出されるｍＲＮＡよりプローブが短ければ、プローブの鎖長に相当する二本鎖ポリヌクレオチドが残る）。この二本鎖ポリヌクレオチドを定量することにより、目的の遺伝子の発現量を測定する。具体的には、例えば以下に記載する方法に従う。
【０１６６】
二本鎖を形成せずに余った標識プローブを二本鎖ポリヌクレオチドと確実に分離して定量を容易にするために、余った標識プローブはリボヌクレアーゼに消化されることが好ましいが、リボヌクレアーゼとして一本鎖ＤＮＡも消化できるようなものを使用すれば、標識プローブはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。標識プローブの調製方法は上記１）および７）の記載に準ずるが、この方法において用いられるプローブの長さは５０乃至５００ヌクレオチド程度が好ましい。
【０１６７】
ＲＮＡプローブは、例えば下記の方法に従って調製される。まず鋳型ＤＮＡをバクテリオファージのプロモーター（Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３プロモーター等）を有するプラスミドベクター（例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社製）など）に挿入する。次にこの組換えプラスミドベクターを、制限酵素で、挿入断片のすぐ下流で一ヶ所だけ切断されるように消化する。得られた直鎖ＤＮＡを鋳型として、放射能標識されたリボヌクレオチド存在下で、イン・ビトロ転写反応を行う。この反応には、ベクター中のプロモーターに合わせてＴ７、ＳＰ６、またはＴ３ポリメラーゼ等の酵素を用いる。以上の操作は例えばリボプローブシステム−Ｔ７、同−ＳＰ６または同−Ｔ３（いずれもプロメガ社製）を用いて行うことができる。
【０１６８】
ＲＮＡ試料を調製するまでの工程は上記３）乃至５）記載の通りである。調製された全ＲＮＡ試料１０乃至２０μｇ相当分と、５×１０５ｃｐｍ相当の過剰量の標識プローブとを用いてリボヌクレアーゼ保護アッセイを行う。この操作は市販のキット（ＨｙｂＳｐｅｅｄ　ＲＰＡ　Ｋｉｔ、アンビオン社製）を用いて行うことができる。得られたリボヌクレアーゼ消化後の試料を、８Ｍ　尿素を含む４乃至１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムでオートラジオグラフィーを行う。以上の操作により、リボヌクレアーゼ消化を免れた二本鎖ポリヌクレオチドのバンドを検出することができ、またその定量は上記７）のｉ）記載の方法に従って実施することができる。さらに、ノーザンブロット解析の場合と同様、各試料間のＲＮＡ量の差等に起因するばらつきを補正する目的で、β−アクチン遺伝子の発現量を同時に測定しておけば、より精密な評価を行うことができる。
【０１６９】
このようにして、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を低下させた被験物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１７０】
ｉｉ）ランオン・アッセイ（Ｒｕｎ−ｏｎ　ａｓｓａｙ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，　Ｍ．　Ｅ．　ａｎｄ　Ｚｉｆｆ，　Ｅ．　Ｂ．　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１１，　４３３−４３８，およびＧｒｏｕｄｉｎｅ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　ＣｅｌｌＢｉｏｌ．　１，　２８１−２８８参照）：　本方法は、細胞から核を単離して目的の遺伝子の転写活性を測定する方法であり、これまでに述べたような細胞内のｍＲＮＡを検出する方法ではないが、本発明においては「遺伝子の発現量を検出する方法」に包含される。単離された細胞核を用いて、試験管内で転写反応を行わせると、核を単離する前に既に転写が開始されｍＲＮＡ鎖が生成されている途中のものが伸長していく反応のみが進行する。この反応時に放射標識したリボヌクレオチドを添加して、伸長していくｍＲＮＡを標識しておき、その中に含まれる、非標識プローブにハイブリダイズするｍＲＮＡを検出することにより、核を単離した時点における目的の遺伝子の転写活性を測定することができる。被験物質の影響が最も顕著に現れる時間のデータを判定に用いるため、培養細胞に被験物質を添加してから核を単離するまでの時間について、例えば添加３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後および２４時間後の細胞から核を単離してそれぞれアッセイを行うなどの方法をとることができる。なお具体的操作方法は、プローブを上記１）の記載に準じて標識しないものを調製する他は、上記参照文献の記載に準ずる。このようにして、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の転写活性を低下させた被験物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１７１】
ｉｉｉ）ＤＮＡチップ解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析
［１］プローブ取得用試料の調製
まず、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料のｍＲＮＡを抽出精製する。ＲＮＡ試料を調製するまでの工程は上記３）乃至５）記載の通りである。
【０１７２】
［２］プローブの標識
ＤＮＡチップ解析またはＤＮＡマイクロアレイ解析用のプローブを作製するための出発材料としては、精製していない全ＲＮＡを用いることもできるが、上記５）に記載された方法で精製されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡであることがより好ましい。
【０１７３】
核酸ハイブリダイゼーションによる検出を行うにあたり、プローブの標識方法と検出方法について以下に述べる。
【０１７４】
アフィメトリクス社製ＤＮＡチップを用いる解析のためのプローブ：　アフィメトリクス社製ＤＮＡチップに添付されたプロトコールに従い、ビオチン標識したｃＲＮＡプローブを用いる。
【０１７５】
ＤＮＡマイクロアレイを用いる解析用のためのプローブ：　逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。このとき、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料をそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。　メンブレンフィルターを用いる解析のためのプローブ：　逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば３２Ｐ、３３Ｐ）で標識されたｄ−ＣＴＰなどを加えておくことによりプローブを標識する。
【０１７６】
［３］固相化試料
上記工程［２］で得られた標識プローブとハイブリダイズさせるための固相化試料としては、以下のようなものを挙げることができる。
【０１７７】
データベース上のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）配列またはｍＲＮＡ配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップ（アフィメトリクス社製）（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，　Ｒ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、２０−２４）：
上記ＥＳＴ配列またはｍＲＮＡ配列は、プローブの調製に用いた細胞と同種の動物由来のものであることが最も好ましいが、それに限定されない。ただし、前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として公開されている遺伝子、またはそれらのいずれか一つの部分配列を含む配列が固相化されているものを用いる。
【０１７８】
プローブ調製に用いた細胞と同種乃至近縁の動物の臓器組織（好ましくは肝臓）、もしくは該臓器組織から単離または株化された細胞から得られたｍＲＮＡより作製されたｃＤＮＡ乃至ＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化されたＤＮＡマイクロアレイまたはメンブレンフィルター：
これらｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物は、例えばｍＲＮＡの材料とした動物のＥＳＴデータベース等の配列情報をもとに作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものである。試料調製のための材料としては、前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として公開されている遺伝子を発現している細胞（好ましくは肝臓由来）を用いる。このｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物としては、予め発現量の異なるｍＲＮＡを、サブトラクション法（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　９３，　６０２５−６０３０）、ディファレンシャルディスプレイ法（Ｋａｔｏ，　Ｋ．　（１９９５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２３，　３６８５−３６９０）等を利用して選択しながら作製されたものも含む。また、ＤＮＡマイクロアレイやフィルターは、検出対象となる遺伝子、すなわちＧｅｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として公開されている遺伝子を含む市販品を利用してもよいし、スポッターを用いて前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を固相化したＤＮＡマイクロアレイまたはフィルターを作製することもできる（例えば、宝酒造（株）社製、ＧＭＳ４１７アレイヤー等）。
【０１７９】
この固相化試料に、上記［２］で調製されたプローブを用いて、同じ条件で別個に、あるいは混合して同時にハイブリダイズさせる（Ｂｒｏｗｎ，　Ｐ．　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。
【０１８０】
［４］解析
アフィメトリクス社製ＤＮＡチップを用いる解析の場合：　アフィメトリクス社製ＤＮＡチップに添付のプロトコールに従って、ハイブリダイゼーションおよび解析を行う。
【０１８１】
ＤＮＡマイクロアレイを用いる解析の場合：　例えば、宝酒造（株）社の市販ＤＮＡマイクロアレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーションおよび洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（宝酒造（株）社製）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。
【０１８２】
フィルターを用いる解析の場合：　ハイブリダイゼーションは、本発明が属する技術分野において周知の方法で行われ得る。例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラスイメージ（クロンテック社製））を用いて解析を行う。
【０１８３】
上記いずれの場合も、同一ロットの固相化試料に被験物質存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブと、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブをそれぞれハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーションの条件は同じとする。上記［２］に記載したように、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識した場合は、一つの固相化試料に両プローブの混合物をハイブリダイズさせることもできる（Ｂｒｏｗｎ，　Ｐ．　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。
【０１８４】
解析の結果、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブと、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブとの間で、固相化試料の標的遺伝子、すなわち前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子または「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列を有する遺伝子にハイブリダイズしたプローブ量を測定する。その結果、標的遺伝子にハイブリダイズしたプローブ量を比較して、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブの方が被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブよりも少なかった場合、該被験物質は、前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現を抑制する物質であるので、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１８５】
ｉｖ）その他
上記以外に、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料で、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料に比べて前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を低下させる被験物質の特定を検出する方法として、以下の方法を挙げることができる。
【０１８６】
すなわち、単一の反応において、ＰＣＲをハイブリダイゼーションプロービング（以下「プロービング」という）と組み合わせた「Ｔａｑｍａｎ」として知られる技術（Ｈｏｌｌａｎｄ，　Ｐ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８，　７２７６−７２８０）や、単一の反応においてＰＣＲをプロービングと組み合わせた方法（Ｈｉｇｕｃｈｉｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，　４１３−４１７（１９９２））を利用することもできる。後者の方法では、紫外線で励起されることにより蛍光を発する核酸検出試薬である臭化エチジウムをＰＣＲ反応液に添加する。２本鎖ＤＮＡの存在下で臭化エチジウムの蛍光は増加するので、励起光を照射したときに検出される蛍光の増加は２本鎖ＰＣＲ産物の蓄積に相関し得る。
【０１８７】
さらに、ＰＣＲによる増幅とプロービングとを組み合わせた別の方法として、欧州特許出願公開第０６０１８８９号公報記載の方法を利用することもできる。さらに、ライトサイクラーシステム（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、日本特許公開２０００−３１２６００号公報参照）を用いてｍＲＮＡ量を定量することも可能である。
【０１８８】
（Ｂ）ポリペプチドの検出
次に、本発明の方法の別の実施態様としては、上記した遺伝子発現を検出する実施態様において検出対象となった遺伝子がコードするポリペプチドを検出する方法がある。この実施態様においては、試料中のポリペプチドを９６穴プレートのウェル内底面やメンブレン等に固相化しておいてから、標的のポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた検出が行われる。このうち、９６穴プレートを用いるのは一般に固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）と呼ばれる方法である。一方、メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミド電気泳動を経てメンブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロット法）か、または直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませる、いわゆるドットブロット法やスロットブロット法が挙げられる。
【０１８９】
１）試料の調製
上記のようなポリペプチドを検出する実施態様において用いられる培養細胞の種類に関する条件は、上記した遺伝子発現を検出する実施態様の場合と同様である。また、哺乳動物個体に被験物質を投与して、その後該動物個体から採取された血清等を試料として用いる方法も採用し得る。この場合の好ましい哺乳動物種はヒト、マウス、ラットまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。例えばマウスとしては高脂血症マウスであるＫＫマウスが好ましく用いられるが、本発明はこれに限定されない。培養細胞の培養条件、被験物質の投与方法についても、遺伝子発現を検出する実施態様の場合と同様である。また、高脂血症の治療または予防剤としての活性を調べようとする被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等を挙げることができる。
【０１９０】
本実施態様のための試料を調製するための材料としては、被験物質存在下または非存在下で培養した細胞培養の培養上清または細胞質画分が用いられ得るが、培養上清が好適である。培養上清は、培養終了後回収し、必要によりフィルターろ過滅菌処理を経て、ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料の調製工程に供される。
【０１９１】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例えば回収した培養上清をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。
【０１９２】
ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料の調製方法は以下の通りである。まず、例えば培養上清をトリクロロ酢酸処理してタンパク質タンパク質を沈殿させ、遠心分離により沈殿を得る。この沈殿を氷冷したアセトンで洗浄し、風乾後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（バイオラッド社製等）に溶解する。
【０１９３】
ドット／スロットブロットの場合は、例えば回収した培養上清そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させる。
【０１９４】
２）試料の固相化
上記のようにして得られた試料中のポリペプチドを特異的に検出するため、該試料を固相化する。ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【０１９５】
電気泳動後のゲルからメンブレンにポリペプチドを移す、いわゆるブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｖｏｌｕｍｅ２　ｅｄ　ｂｙ　Ｊ．　Ｅ．　Ｃｏｌｉｇａｎ，　Ａ．　Ｍ．　Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，　Ｄ．　Ｈ．　Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，　Ｅ．　Ｍ．　Ｓｈｅｖａｃｈ，　Ｗ．　Ｓｔｒｏｂｅｒ）、セミドライ式ブロッティング法（上記ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｖｏｌｕｍｅ２　参照）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材も市販されている（例えば、バイオドット（バイオラッド）等）。
【０１９６】
一方、ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば０．０５％　アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃乃至室温で一晩、または３７℃で１乃至３時間静置することにより、ウェル内底面にポリペプチドを吸着させて固相化する。
【０１９７】
３）抗体
本実施態様に用いられる抗体は、上記（Ａ）のａ）からｅ）記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が動物細胞で発現することにより産生されるポリペプチド、好ましくは、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５（より好ましくは同１９−４５５）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその一部、もしくは配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体として好適なものは例えば、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５（より好ましくは、同１９−４５５）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれにも結合するが、他のいかなるマウスまたはヒト由来のタンパク質とも結合しないような抗体を挙げることができる。
【０１９８】
本実施態様のための抗体は、常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、ｐ．３８９−３９７、１９９２）、抗原となるタンパク質タンパク質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５−４９７，　１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，　Ｒ．ｅｄ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐ．３６５−３６７，　１９８０，　Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎ．Ｙ．）に従って、本発明のタンパク質タンパク質に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【０１９９】
一般的に、モノクローナル抗体の製造にあたっては、下記のような作業工程を経る。すなわち、（ａ）抗原として使用する生体高分子を精製、（ｂ）マウスへの抗原の注射による免疫、および血液を採取しアッセイして脾臓摘出の時期を決定することにより成る抗体産生細胞の調製、（ｃ）骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製、（ｄ）脾臓摘出、および脾細胞とミエローマの場合、（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、（ｆ）単一細胞クローンへの分割（　クローニング）、（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植したマウスの飼育、（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、あるいは標識試薬としての特性の検定等の作業工程を経る。
【０２００】
本発明のモノクローナル抗体も上記工程にそって製造することが可能であるが、これに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞、ミエローマ、他の哺乳動物の抗体産生細胞、ミエローマが使用できることは言うまでもない。
【０２０１】
（ａ）　　抗原の精製
抗原としては、請求項１０乃至１２に記載のポリペプチドであればいかなるものでもよいが、本発明のＤＮＡを大腸菌に導入し発現させ、精製することによって得られる融合タンパク質、本発明のＤＮＡでＣＯＳ−１細胞またはＣＨＯ細胞をトランスフェクトして得られる無血清培養上清から精製されたタンパク質などが抗原として有効である。
【０２０２】
（ｂ）　　抗体産生細胞の調製
本発明のＤＮＡをＣＨＯ細胞にトランスフェクトして得られる無血清培養上清から精製されたタンパク質とフロインドの完全、または不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用することが望ましく、これは多用されるマウス由来のミエローマがすべてＢＡＬＢ／ｃマウスを起源にしており、しかもその性質が比較的詳しく研究されており、さらに抗体産生細胞とミエローマがともにＢＡＬＢ／ｃマウス由来であれば、得られるハイブリドーマがＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔内で増殖できるため、複雑な手順なしに腹水よりモノクローナル抗体が得られるという利点があるためである。しかし、本発明がこれに制限されないことは上記の通りである。
【０２０３】
免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射いずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。
【０２０４】
免疫は、一回または適当な間隔で、好ましくは１週間から５週間間隔で複数回繰返し行ってもよい。免疫した動物の血清中の該抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として用いれば、その後の操作の効果を上げることができる。融合には最終免疫後３乃至５日後の動物由来の抗体産生細胞を用いることが好ましい。
【０２０５】
ここで用いる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、感度、迅速性、正確性、および自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法、およびＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【０２０６】
本発明による抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下のような手順により行うことができる。すなわち、抗原を固相に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）　に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させ、さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加え、マウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色などを測定することにより、抗体価算出を行うことができる。
【０２０７】
（ｃ）　　骨髄腫細胞の調製工程
骨髄細胞としては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−ｘ６３　Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７８））、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４．１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９（１９７６）　）、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８））、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０（１９７９））、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８（ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））などを用いることが好ましい。
【０２０８】
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）　、および牛胎児血清（ＦＣＳ　１０％）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地）、Ｉｓｃｏｖｅ´ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、またはＤｕｌｂｅｃｃ´ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前にＴＩＬ培地（ＴＩＬ　Ｍｅｄｉａ　Ｉ（免疫生物研究所）５００ｍｌに、５ｍｌ　ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ−ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ　ＳＯＬＵＴＩＯＮ（シグマ社）、および牛胎児血清（ＦＣＳ　１０％）を加えた培地）で継代培養し、融合当日２×１０７以上の細胞数を確保する。
【０２０９】
（ｄ）　　細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらの適宜の組み合わせから得ることができるが、脾臓細胞が最も一般に用いられる。
【０２１０】
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞と工程（ｃ）で得られた骨髄腫細胞を融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は以下の手順よりなる。
【０２１１】
脾細胞と骨髄腫細胞を培地、またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）でよく洗浄し、脾細胞と骨髄腫細胞の比が５乃至１０：１程度になるように混合し、遠心分離にかける。上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながらポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１０００乃至４０００）と培地との混液を加え数分後に遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞をＴＩＬ培地で懸濁して培養用プレート上の穴に分注する。各穴において細胞の増殖が確認されたら、ＨＡＴ培地（ＴＩＬ培地に、ヒポキサンチン１０−６乃至１０−３Ｍ、アミノプテリン１０−８乃至１０−７Ｍ、チミジン１０−６乃至１０−４Ｍを加えた培地）に置き換える。
【０２１２】
（ｅ）　ハイブリドーマ群の選択
培養用プレートは、ＣＯ２インキュベーター中、３５乃至４０℃で培養する。以後、１乃至３日ごとに培地の半量相当のＨＡＴ培地を加え、ＣＯ２インキュベーター中、３５乃至４０℃で１０乃至１４日間培養する。
【０２１３】
上記ミエローマ細胞は、８−アザグアニン耐性株であり、該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしのハイブリドーマは、ＨＡＴ培地中では生存できない。しかしながら、抗体産生細胞どうし、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができ、さらに抗体産生細胞どうしのハイブリドーマには寿命があるため、ＨＡＴ培地での培養によってハイブリドーマの選択が可能となる。
【０２１４】
コロニー状に生育してきたハイブリドーマの認められる穴について、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）への変換を行う。以後、培養上清の一部をとり、例えば、ＥＬＩＳＡ　法により抗体価を測定する。
以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いたが、その他のものもハイブリドーマの選択に応じて使用することができ、その場合当然使用する培地組成も変化する。
【０２１５】
（ｆ）　　クローニング
上記抗体価の測定により特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈してまきこむ方法、軟寒天培地中にまきこみコロニーをとる軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個の細胞を取りだしまきこむ方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡単でありよく用いられる。
【０２１６】
抗体価の認められた穴について、例えば限界希釈法によりクローニングを２乃至４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
【０２１７】
（ｇ）　ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリドーマは、ＨＴ培地より通常の培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清に、ゲルろ過などを行いＩｇＧ画分を集め精製することにより本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でも増殖させることが可能である。
【０２１８】
また簡便な方法としては、モノクローナル抗体精製キット（例えば、ファルマシア社のＭＡｂＴｒａｐ　ＧＩＩ）を利用することもできる。
【０２１９】
（ｈ）　モノクローナル抗体の同定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスの決定は以下のように行う。同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法がある。オクテルロニー法は、簡単ではあるがモノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮しなければならない。ＥＬＩＳＡ　法、またはＲＩＡ　法を用いれば、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種ＩｇＧサブクラスに対応する抗体を用いることが可能である。また、さらに簡便な方法としてアイソタイピング用のキット（　例えば、アマシャム社製、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット）　を利用することもできる。
【０２２０】
さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、および２８０ｎｍでの吸光度（１．４（ＯＤ２８０）＝イムのグロブリン１ｍｇ／ｍｌ）　より算出することができる。
【０２２１】
なお、本発明のモノクローナル抗体を高濃度、かつ安定的に産生するハイブリドーマクローンは、４５Ｂ１と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６３として寄託されている。
【０２２２】
かくして得られたモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質に対して高い特異性を持っており、さらに上記ハイブリドーマの培養によって均一に得られるため、本発明のタンパク質の単離、精製に用いることができる。例えば、抗原抗体反応を利用した免疫沈降法により、該モノクローナル抗体で本発明のタンパク質の単離、精製が可能である。すなわち、本発明のタンパク質を含む溶液中に該モノクローナル抗体を添加し、室温で保存した後、これにプロテインＧセファロース（ファルマシア社製）を混入し、さらに室温で保存する。遠心操作で沈殿を取得し、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ等で数回洗浄して、再び遠心して得られた沈殿物は、該タンパク質、該モノクローナル抗体、およびプロテインＧセファロースの複合体である。この沈殿物を適当な緩衝液に懸濁後、熱処理することにより該複合体を各成分に解離させてから、遠心を行い上清を回収する。この上清から、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）等により、該タンパク質を容易に単離、精製することが可能である。
【０２２３】
また、該モノクローナル抗体は、該タンパク質の単離、精製用のアフィニティークロマトグラフィー法におけるリガンドとしても用いることができる。アフィニティークロマトグラフィー法は、混合物から担体に特異的に結合する物質のみを単離精製する場合、極めて効果的な方法であり、混合物のゲルろ過と比較して、必要な精製過程を大幅に減少することができる。このアフィニティークロマトグラフィーにおいて有用な固定化モノクローナル抗体の作成は、各種酵素の固定化方法に準じて行うことができ、例えば、ＣＮＢｒ活性化担体を使用する方法が一般に利用でき、またこのような担体としてはクロマトグラフィーに一般的に使用されている各種材料、例えばセルロース、アガロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラス、あるいはこれらの担体にスペーサーを導入したもの、特にセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）、アフィゲル１０（バイオラッド社製）などが好ましい例として挙げられる。この固定化モノクローナル抗体を用いて実際に該タンパク質を精製するには、これらをカラムに充填した後、これに該タンパク質を含む溶液を通塔する。この操作で該タンパク質がカラムに吸着する。溶媒、例えば、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）、塩化ナトリウム溶液、プロピオン溶液、ジオキサン、エチレングリコール、カオトロピック塩、塩酸グアニジン、または尿素などで溶出することにより、吸着した該タンパク質が高純度で溶出する。
【０２２４】
なお、本発明のモノクローナル抗体は、マウス由来のものに限られず、本発明のタンパク質と結合性を有する限り、いかなる哺乳動物由来の抗体でも構わない。また、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するものに限られず、遺伝子工学の手法によって作成されたものでもよい。例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体なども、本発明のタンパク質と結合性を有する限り、本発明のモノクローナル抗体の範疇に含まれる。そのような抗体は、例えば、Ｍａｎ　Ｓｕｎｇ　Ｃｏ　らの方法（Ｍａｎ　Ｓｕｎｇ　Ｃｏ，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４８，　１１４９−１１５４）などに準じて作成することができる。
【０２２５】
本実施態様に用いられる抗体を作製するための抗原としては、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５（好ましくは、同１９−４５５）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号１６のアミノ酸番号２６−４０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号１８のアミノ酸番号２２−４９１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２０のアミノ酸番号２３−４９３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２２のアミノ酸番号２１−４７０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２４のアミノ酸番号２７−３４６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはそれらポリペプチドに任意のアミノ酸配列や担体が付加された形の誘導体を挙げることができるが、好ましくは配列表の配列番号９のアミノ酸番号１−１４からなるポリペプチドのＣ末端または配列番号１０のアミノ酸番号１−１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端に、キーホールリンペットヘモシアニンを担体として結合させたものである。
【０２２６】
配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５（好ましくは、同１９−４５５）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７−１４１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドを遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、上記ヌクレオチド配列を有するＤＮＡを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらにこれらのベクターに適当なプロモーター、および形質発現に関わる配列を導入することにより、それぞれの宿主において遺伝子を発現させることが可能である。
【０２２７】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【０２２８】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【０２２９】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０２３０】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９５，　８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【０２３１】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，　Ｌ．　Ａ．　（１９８０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７，　４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【０２３２】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１，　８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。
【０２３３】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターとともに、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　：　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｐ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｐ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１，　３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【０２３４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，　Ｔ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ，　（１９９２）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．　Ｉ：　３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質タンパク質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，　Ｉ．　Ｍ．　ａｎｄ　Ｖ．Ｃ．　Ｅｍｅｒｙ　（１９９３）　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４２，　１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質タンパク質のＮ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質タンパク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ　Ｗａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．
（１９９８）　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３７９，　１６７−１７４）。
【０２３５】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈａｌｌ，　Ｂ．　Ｄ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５７，　３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０，　１−５）などを好ましく利用できる。また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，　Ｌ．　Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．
２８，　１２５−１３１）。
【０２３６】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【０２３７】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組み合わせなどを例示できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のポリペプチドを大量に製造できる。
【０２３８】
上記のようにして得られる抗体は、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法などの各種免疫学的測定法や免疫組織染色などに用いることができる。
【０２３９】
４）検出
上記３）記載の方法で得られる抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
【０２４０】
標識の種類として好ましいものは酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）を使用する方法のための、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）は種々のものが市販されている。ＲＩＡの場合はＩ１２５等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
【０２４１】
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原であるポリペプチドの量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、それら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
【０２４２】
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法においては、好ましくは市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定することにより定量する。また好ましくは上記３）において抗体作製のために使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行って、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することが可能である。
【０２４３】
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においてはＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができ、デンシトメトリーやＢＡＳ２０００ＩＩシステムを利用した定量も可能である。また、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
【０２４４】
５）測定操作
ｉ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば５％　スキムミルク、０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、１乃至１０％のウシ血清アルブミン、０．５乃至３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６乃至２４時間、または室温で１乃至３時間である。
【０２４５】
次に、メンブレンを０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液中に一定時間浸して、抗体をメンブレン上の抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、直ちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００乃至２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で１乃至３時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０２４６】
ｉｉ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
まず、上記２）の方法で試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
【０２４７】
次に、ウェル内を０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーションし、抗体を抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、直ちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００乃至２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１乃至３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０２４８】
また本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは例えば以下に記載する方法により実施することができる。まず、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５（好ましくは、同１９−４５５）に示されるアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列のいずれか一つにおいて、親水性に富む領域を２箇所選んで、それぞれの領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を上記４）記載のように標識しておく。標識しなかった方の抗体は、上記２）記載の方法に準じて９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０２４９】
６）　評価
以上に記載した方法で、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、その結果上記３）記載の方法で作製された抗体が特異的に結合するポリペプチドの産生量を低下させた被験物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。また、上記３）記載の方法で作製された抗体、およびその他上記の一連の方法に用いられる試薬をまとめることにより、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するためのキットが提供される。
【０２５０】
本発明の方法において検出の対象となるポリペプチドは、上記の抗体作製用の抗原を得る方法の記載に従って得られる他、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７−１４１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡを組み込んだアデノウイルスベクターを利用して動物細胞に産生させることもできる。そのような組換えアデノウイルスベクターを構築する方法として、市販のキット（例えば、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いる方法を例示できる。本発明の方法において検出対象となる遺伝子が哺乳動物の血中中性脂肪濃度と密接に相関していることは、例えば上記のようにして得られる組換えアデノウイルスベクターを有する組換えアデノウイルスを哺乳動物、例えばマウスに感染させて、該組換えアデノウイルスベクターが保持する遺伝子を発現させると血中中性脂肪濃度の上昇が観察されること、上記のようにして得られる組換えタンパク質をマウスに投与すると血中中性脂肪濃度の上昇が観察されること、および先天性低脂血症マウスにおいて配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７−１４１１に示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が高脂血症マウスよりも少ないことから証拠付けられる。
【０２５１】
また、遺伝子操作によって得られる、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を含む外来遺伝子が、該遺伝子を高発現することができるように導入されている非ヒト動物を用いた高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法も本発明に包含される。この方法で用いられる動物は、例えば、上記組換えアデノウイルスを感染させたＫＫ／Ｓａｎマウスや、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７−１４１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡをマウスに導入したトランスジェニックマウス等であるが、これらに限定されない。
【０２５２】
トランスジェニック動物は、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し発生させることにより得ることができ、その手順については、既に確立されている方法に従うことができる［発生工学実験マニュアル（野村達次監修、勝木元也　編、１９８７年刊）、マウス胚の操作マニュアル（”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｂ．　Ｈｏｇａｎ，　Ｆ．　Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ　ａｎｄ　Ｅ．　Ｌａｃｙ著、山内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎　訳、１９８９年刊）、特公平５−４８０９３号公報等参照］。具体的には、例えばマウスの場合、まず雌マウス（血中中性脂肪濃度が通常より低いマウスであることが好ましく、例えばＫＫ／Ｓａｎマウスが好ましいがそれに限定されない）に排卵誘起剤を投与後、同系統の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるための、プロモーターやエンハンサー等の調節遺伝子としては、導入された動物の細胞内で機能するものであればいずれも使用することができる。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩または帝王切開により出生させる。このようにして得られた動物が導入した遺伝子を保持していることを確認する方法としては、該動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型として導入遺伝子に特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲを行う方法、該ＤＮＡを数種の制限酵素で消化後ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜やナイロン膜等にブロッティングしたものについて導入遺伝子の全部または一部を標識したものをプローブとしたサザンブロット解析を行う方法等を挙げることができる。また、導入された遺伝子が実際に動物体内で発現しているか否かは、末梢血中の中性脂肪濃度を測定することにより確認することができる。導入された遺伝子が実際に動物体内で発現している場合は、遺伝子を導入しない動物よりも血中中性脂肪濃度が高くなる。
【０２５３】
そのようにして得られた遺伝子導入動物に被験物質を投与して、血中中性脂肪濃度を低下させる物質を選択する（好ましくは、遺伝子導入しない動物にも被験物質を投与して結果を比較し、遺伝子導入した動物で顕著に血中中性脂肪濃度を低下させる物質を選択する）。この方法では、導入された遺伝子の発現を抑制または阻害する物質のみならず、該遺伝子にコードされるポリペプチド自体の機能や、該ポリペプチドと相互作用して該ポリペプチドの機能発現に寄与する因子（例えば、レセプター）等、該ポリペプチドの作用による血中中性脂肪濃度の上昇に関わる生体反応のいずれかを阻害する物質を見出すことができる。そのような物質も高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０２５４】
本発明はまた、本発明の方法において検出対象とするポリペプチド（以下、単に「検出対象ポリペプチド」という）に特異的に結合する、抗体以外のポリペプチド、すなわち検出対象ポリペプチドのレセプターに関する。該レセプターが細胞膜に存在するタンパク質である場合は、該レセプターは例えば以下に記載する方法に従ってクローニングすることができる。まず、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを哺乳動物細胞で発現可能な組換えベクターを構築し、ＣＯＳ−１に導入してその培養上清を回収し、検出対象ポリペプチドの組換えポリペプチドを精製する。得られた組換えポリペプチドはフルオレセイン・イソチオシアネート（以下「ＦＩＴＣ」という）で標識しておく。次に、種々の哺乳動物組織由来の培養細胞に標識組換えポリペプチドを添加して、標識組換えポリペプチドが細胞膜上に特異的に結合する細胞、すなわちレセプターを発現する細胞を同定する。同定された細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを哺乳動物細胞で発現可能なベクター中に組み込み、レセプターを発現しない細胞（好ましくはＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞、より好ましくはＣＨＯ細胞）で発現させる。このｃＤＮＡライブラリーを発現させた細胞に上記のＦＩＴＣ標識した組換えポリペプチドを添加し、一定時間培養後、細胞を回収して、セルソーターでＦＩＴＣ標識された組換えポリペプチドが結合した細胞を選別する。得られた細胞から導入されたｃＤＮＡをＰＣＲ等によりクローニングする。必要に応じ、以上の操作を繰り返して、最終的にＦＩＴＣ標識組換えポリペプチドに特異的に結合するレセプターをコードするｃＤＮＡをクローニングする。またレセプター自体は、このようにしてクローン化された細胞から回収することができる。
【０２５５】
このようにして、検出対象ポリペプチドのレセプターをコードするｃＤＮＡが得られれば、そのｃＤＮＡライブラリーの材料となった細胞を利用して、さらに検出対象ポリペプチドと該レセプターとの相互作用を阻害する物質や、該レセプターに結合することによって検出対象ポリペプチドと同様の機能を発揮する物質、あるいは検出対象ポリペプチドと該レセプターとの相互作用によって開始されるシグナル伝達を阻害する物質のスクリーニングに利用することができる。具体的には、例えばマウスゲノムＤＮＡを制限酵素消化等により適宜断片化して、それらの一端に緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：レポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている）をコードするＤＮＡが連結されたベクターを、上記ｃＤＮＡライブラリーの材料となった細胞に導入する。この細胞の培養中に、検出対象ポリペプチドの組換えポリペプチド（標識しないもの）を添加して、緑色蛍光タンパク質を産生する細胞をセルソーターで選別する。選別された細胞は該組換えポリペプチドの存在下で緑色蛍光タンパク質を産生する。この細胞を９６穴培養プレートに１ウェルあたりの細胞数がほぼ同じになるように培養し、被験物質のみを添加するか、あるいは該組換えポリペプチドと被験物質を同時添加して一定時間培養した後、蛍光プレートリーダー等を用いて緑色蛍光タンパク質の産生量を測定する。被験物質単独で培養したときに緑色蛍光タンパク質の産生を引き起こす場合、該物質は検出対象ポリペプチドのアゴニストと考えられる。一方、該組換えポリペプチドと被験物質を同時添加したウェルにおける緑色蛍光タンパク質の産生量が、該組換えポリペプチド単独添加のウェルよりも少ない場合、被験物質は検出対象ポリペプチドのアンタゴニストまたは該ポリペプチドのシグナル伝達阻害剤であり、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤として有用であると考えられる。
【０２５６】
このようにして得られたアンタゴニストがタンパク質またはペプチドである場合、該タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の遺伝子治療に用いることができる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば同定されたアンタゴニストタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を解析し、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを合成して種々のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより取得できる。また、アンタゴニスト活性を有するぺプチドが、ランダムに合成された人工ペプチドライブラリー由来である場合は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを化学合成する。遺伝子治療においては、そのようにして得られたアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを、例えばウイルスベクターに組み込んで、該組換えウイルスベクターを有するウイルス（無毒化されたもの）を患者に感染させる。患者体内ではアンタゴニストが産生され、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を阻害するので、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の進展を抑制することができる。
【０２５７】
遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４）、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」，羊土社（１９９６））のいずれの方法も適用することができる。
【０２５８】
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ＴＲ４あるいは変異ＴＲ４をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【０２５９】
また遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）法およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，　１２　（１５）（１９９４））。
【０２６０】
例えば、該遺伝子治療剤がインビボ法により投与される場合は、疾患、症状等に応じ、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等、適当な投与経路により投与される。またインビボ法により投与する場合は、該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【０２６１】
配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列は、いわゆるアンチセンス治療に用いることができる。アンチセンス分子は、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列の一部に相補的な、通常１５乃至３０ｍｅｒからなるＤＮＡ、もしくはそのホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはモルフォリノ誘導体などの安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体として用いられ得る。そのようなアンチセンス分子を、微量注入、リポソームカプセル化により、あるいはアンチセンス配列を有するベクターを利用して発現させるなど、本発明の技術分野において周知の方法で、細胞に導入することができる。このようなアンチセンス療法は、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列がコードするタンパク質の活性を減少させることが有効な病気、特に、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療に有用である。
【０２６２】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造され得る。このような担体と製造方法の例は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．）に記載されている。そして、配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現やその遺伝子産物の活性に異常の認められる高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療に十分な量を各人に投与される。その有効量は、各人の状態、体重、性別、および年齢などの種々の因子や、皮下、局所、経口、および筋肉内といった投与方法の違いによって変化し得る。例えば、静脈注射する場合には、０．０２乃至０．２ｍｇ／ｋｇ／時間で２時間、また、皮下投与の場合には、１乃至２００ｍｇ／ｍ２／日のように変化し得る。
【０２６３】
ＩＩ．　ポリペプチドを用いた試験方法
本発明のポリペプチドは、例えば、（ａ）配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８を５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｂ）配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８を５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６０２のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｃ）配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であってヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｄ）配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｅ）配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４を５’末端とし、ヌクレオチド番号１０３９乃至１２６１のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｆ）配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４を５’末端とし、ヌクレオチド番号１９０９を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｇ）配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２を５’末端とし、ヌクレオチド番号６３９乃至８４６のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｈ）配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２を５’末端とし、ヌクレオチド番号１５０３を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｉ）配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２を５’末端としヌクレオチド番号７９６乃至１０１５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｊ）配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２を５’末端とし、ヌクレオチド番号１６５４を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｋ）配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６を５’末端とし、ヌクレオチド番号３７３乃至３９４のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｌ）配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６を５’末端とし、ヌクレオチド番号１０４８を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、の（ａ）乃至（ｌ）のいずれかを取得し、次いで該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを通常の遺伝子組換えの手法を用いて宿主細胞に生産させることにより得ることができる。
【０２６４】
なお、配列表の、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１２のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−１６に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去される（Ｃｏｎｋｌｉｎ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　６２，　４７７−４８２）ので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１６のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２５に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１８のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２１に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２０のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２２に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２２のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２０に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２４のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２６に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。
【０２６５】
また、原核細胞のような、哺乳動物のタンパク質のシグナルペプチドを切断する機能を有さない宿主を用いて本発明のポリペプチドを生産する方法としては、例えば、（ａ）配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７またはアミノ酸番号１４７乃至１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｂ）配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｃ）配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｄ）配列表の配列番号１８のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｅ）配列表の配列番号２０のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｆ）配列表の配列番号２２のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｇ）配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｈ）配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｉ）配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｊ）配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｋ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｌ）配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、の（ａ）乃至（ｌ）のいずれかのアミノ酸配列のアミノ末端側に、該アミノ酸配列を切断しないプロテアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列が連結し、さらにそのアミノ末端側に特定の化合物と特異的な親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列が連結している、アミノ酸配列からなる融合タンパク質を大腸菌に生産させ、次いで該融合タンパク質を、特定の化合物との親和性を利用して精製した後に、前記プロテアーゼによって、アミノ末端側の上記特定の化合物との親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列を除去する方法を挙げることができる。このような特定の化合物との親和性を利用した精製例としては、例えば、グルタチオン・Ｓ−トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）のアミノ酸配列が連結している融合タンパク質を大腸菌に生産させ、次いで該融合タンパク質をグルタチオンとＧＳＴとの親和性を利用して精製した後、プロテアーゼによってＧＳＴ配列を除去する方法を挙げることができる。ただし、本明細書中の実施例で示されているように、本発明のポリペプチドは、ＧＳＴ配列を除去しない融合タンパク質の状態であっても、その機能を損なわない。
【０２６６】
また、「アンジオポエチン関連タンパク質」のアミノ末端側（シグナルペプチド内）に、精製を容易にするためのヒスチジンタグが挿入され、かつ、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン結合領域を欠失しているポリペプチドも血中中性脂肪濃度上昇機能を失わず、例えば、配列表の配列番号２４に示されるような、「アンジオポエチン関連タンパク質３」のアミノ末端側（シグナルペプチド内）に、精製を容易にするためのヒスチジンタグが挿入され、かつカルボキシル末端側の２５３残基を欠失しているポリペプチドもまた、その機能を保持している。
【０２６７】
すなわち、本発明は、（ａ）配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｂ）配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｃ）配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｄ）配列表の配列番号１８のアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｅ）配列表の配列番号２０のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｆ）配列表の配列番号２２のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｇ）配列表の配列番号２４のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｈ）配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｉ）配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｊ）配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｋ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｌ）配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、の（ａ）乃至（ｌ）のいずれかと、任意のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなり、かつ哺乳動物において血中中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドも包含するものである。なお、この場合、連結されるアミノ酸配列として、各ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質」のアミノ酸配列由来の連続した１８残基以上のアミノ酸配列は含まれない。
【０２６８】
「アンジオポエチン関連タンパク質」のｃＤＮＡのヌクレオチド配列情報は国立遺伝学研究所のデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ）から得ることができる。「アンジオポエチン関連タンパク質１」はアクセッション番号ＸＭ＿００１７２０、「アンジオポエチン関連タンパク質２」はアクセッション番号ＮＭ＿０１２０９８、「アンジオポエチン関連タンパク質３」はアクッセッション番号ＡＦ１５２５６２、「アンジオポエチン関連タンパク質４」はアクセッション番号ＡＦ２０２６３６、「アンジオポエチン関連タンパク質５」はアクセッション番号ＮＭ＿０３１９１７、「アンジオポエチン関連タンパク質６」はアクセッション番号Ｙ１６１３２で登録されている。
【０２６９】
配列表の配列番号１１のヌクレオチド番号１８を５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチドは、例えばヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするｃＤＮＡ、または独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに国際寄託されている組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持する組換えファージミドを鋳型とし、所望のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが増幅されるように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）を行うことにより得ることができる。あるいは、組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持する組換えファージミドｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１に挿入されているｃＤＮＡのヌクレオチド配列中の所望の位置に、該ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームと同一のリーディングフレーム上で終止コドンとなるヌクレオチド配列が挿入されるような部位特異的人工突然変異を施すことにより得ることもできる。
（ａ）配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であってヌクレオチド番号４３４を５’末端とし、ヌクレオチド番号１０３９乃至１２６１のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｂ）配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１９０９を３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｃ）配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド番号２２を５’末端としヌクレオチド番号６３９乃至８４６のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｄ）配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１５０３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｅ）配列表の配列番号２１のヌクレオチド番号２４２を５’末端としヌクレオチド番号７９６乃至１０１５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド、（ｆ）配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１６５４を３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｇ）配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号３７３乃至３９４のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｈ）配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１０４８を３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、の（ａ）乃至（ｈ）はいずれも、ヒトの適当な臓器由来のｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質１、２、４、５、６」をコードするｃＤＮＡ、または、市販のｃＤＮＡクローン（例えばＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入できる）を鋳型とし、所望のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが増幅されるように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを行なうことにより得ることができる。
【０２７０】
しかしながら、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはこれらに限定されず、例えば上記した遺伝子組換えの手法において用いられる宿主のコドン使用頻度を考慮して適宜改変されたものや、また例えば人工合成ＤＮＡを連結して得られたものでも、宿主細胞において、（ａ）配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７またはアミノ酸番号１４７乃至１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｄ）配列表の配列番号１８のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｅ）配列表の配列番号２０のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｆ）配列表の配列番号２２のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｇ）配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｈ）配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｉ）配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｊ）配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｋ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｌ）配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、の（ａ）乃至（ｌ）いずれかのポリペプチドを産生することが可能であるようなヌクレオチド配列を有するものであれば本発明に包含される。
【０２７１】
そのような、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、適当なベクターＤＮＡに組み込んで得られた組換えベクターは、原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換することができる。さらにこれらのベクターに適当なプロモーター、および形質発現に関わる配列を導入することにより、それぞれの宿主において導入した遺伝子を発現することが可能である。
【０２７２】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【０２７３】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株やＪＭ１０９株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【０２７４】
大腸菌内で他の生物由来のタンパク質を発現させる場合には、生物種間におけるコドンの使用頻度の違いにより、翻訳効率が制限されることがあり、これは大腸菌の細胞内のｔＲＮＡ量に偏りがあり、何種類かのｔＲＮＡが枯渇してしまうことが原因と考えられる。このような場合、大腸菌内で比較的量の少ないｔＲＮＡの量を多く発現するようにした株を用いる発現がうまくいくことがある。このような大腸菌としては例えば、大腸菌のＢＬ２１　ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ　（ＤＥ３）−ＲＩＬを挙げることができる。本株は大腸菌内では比較的少量のｔＲＮＡ遺伝子（アルギニン・イソロイシン・ロイシン）のコピー数を増した菌株である。
【０２７５】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０２７６】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９５，　８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【０２７７】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，　Ｌ．　Ａ．　（１９８０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７，　４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【０２７８】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１，　８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。
【０２７９】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　：　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｐ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｐ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１，　３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【０２８０】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，　Ｔ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ，　（１９９２）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．　Ｉ：　３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，　Ｉ．　Ｍ．　ａｎｄ　Ｖ．Ｃ．　Ｅｍｅｒｙ　（１９９３）　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４２，　１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質のアミノ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ　Ｗａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３７９，　１６７−１７４）。
【０２８１】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈａｌｌ，　Ｂ．　Ｄ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５７，　３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０，　１−５）などを好ましく利用できる。また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をアミノ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、アミノ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，　Ｌ．　Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２８，　１２５−１３１）。
【０２８２】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【０２８３】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のポリペプチドを大量に製造できる。
【０２８４】
本発明のポリペプチドは、上記の方法に従って得られる他、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを組み込んだアデノウイルスベクターを利用して動物細胞に産生させることもできる。そのような組換えアデノウイルスベクターを構築する方法として、市販のキット（例えば、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いる方法を例示できる。本発明のポリペプチドが哺乳動物の血中中性脂肪濃度と密接に相関していることは、例えば上記のようにして得られる組換えアデノウイルスベクターを有する組換えアデノウイルスを哺乳動物、例えばマウスに感染させて、該組換えアデノウイルスベクターが保持する遺伝子を発現させると、血中中性脂肪（トリグリセリド）濃度の上昇が観察されることから証拠付けられる。
【０２８５】
「アンジオポエチン関連タンパク質」をマウス血中に投与すると、カルボキシル末端のペプチドが除去されたペプチドが生成する。例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質３」を血中に投与するとアミノ酸の配列番号５２のアミノ酸番号２２１と２２２の間で切断されたポリペプチドと、アミノ酸番号２２４と２２５の間で切断されたペプチドの２種類のポリペプチドが取得できる。即ち、血中脂質濃度の上昇には、「アンジオポエチン関連タンパク質」を投与してもよいし、「アンジオポエチン関連タンパク質」のうちヘリックス領域のみを含むように改変した変異体ポリペプチドを投与してもよい。
【０２８６】
前記方法によって得られる本発明のポリペプチドは、例えば以下に記載するような高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法に用いることができる。
【０２８７】
まず、この方法で用いられる非ヒト動物は、例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質」（例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質３」および／または「アンジオポエチン関連タンパク質４」）を正常に産生しない突然変異遺伝子を有するＫＫ／Ｓａｎマウスや、「アンジオポエチン関連タンパク質」（例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質３」および／または「アンジオポエチン関連タンパク質４」）遺伝子を発現しないように遺伝子操作されたノックアウトマウスが好適であるが、これらに限定されない。
【０２８８】
投与するポリペプチドとしては、▲１▼「アンジオポエチン関連タンパク質３」を正常に産生しない突然変異遺伝子を有するＫＫ／Ｓａｎマウスに対しては、例えば、配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いたり、▲２▼「アンジオポエチン関連タンパク質４」を正常に産生しない突然変異遺伝子を有するＫＫ／Ｓａｎマウスに対しては例えば、配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３乃至１８３のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いることができるが、血中中性脂肪濃度の上昇が確認できる限りにおいてこれらに制限されない。本発明のポリペプチドは単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０２８９】
本発明のポリペプチドの上記動物への投与方法としては、血管への投与、経口投与等が挙げられるが、血中中性脂肪濃度の上昇が確認できる限り、投与方法に制限はない。本発明のポリペプチドの上記動物への投与量は血中脂肪濃度の上昇が確認できる限りにおいて制限されないが、例えば、マウスの尾静脈に投与する場合には、マウス体重１ｇ当たり、０．０１μｇ乃至１０ｍｇの範囲で投与することができる。
【０２９０】
上記動物に本発明のポリペプチドを投与すると、血中中性脂肪（トリグリセリド）濃度の上昇が観察される。
【０２９１】
この実験系においては、本発明のポリペプチドと被験物質を試験動物に投与して、血中中性脂肪濃度が低下する物質を選択する。より好ましくは、▲１▼本発明のポリペプチドのみを投与した動物、▲２▼被験物質のみを投与した動物および、▲３▼両者を投与した動物の間で結果を比較し、▲２▼の動物において血中中性脂肪濃度に影響を及ぼさず、かつ▲３▼の動物において▲１▼の動物と比較して顕著に血中中性脂肪濃度を低下させる物質を、本発明のポリペプチドの機能を特異的に抑制する物質として選択する。この方法では、本発明のポリペプチド自体の機能や、該ポリペプチドと相互作用して該ポリペプチドの機能発現に寄与する因子（例えば、レセプター）等、該ポリペプチドの作用による血中中性脂肪濃度の上昇に関わる生体反応のいずれかを阻害する物質を見出すことができる。そのような物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０２９２】
一方、本発明のポリペプチドはイン・ビトロでＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性を阻害する効果を有するので、以下に記載するようなＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性を調節する物質の試験方法に用いることができる。
【０２９３】
この試験方法は、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性測定方法において、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ反応時に、本発明のポリペプチドと、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性を調節する作用を調べようとする物質（以下「被験物質」という）とを共存させることにより実施することができる。より具体的には、以下に記載する▲１▼−ａ乃至▲３▼または▲１▼−ｂ乃至▲３▼の材料を共存させてＬＰＬ活性を調べる系において、さらに被験物質を加えたときの、ＬＰＬ活性の変化を調べる。
【０２９４】
▲１▼−ａ　ＬＰＬを含む材料
ＬＰＬを含む材料としては、ＬＰＬを産生している、哺乳動物脂肪細胞由来または脂肪細胞の前駆細胞由来の細胞株の培養上清を用いることができる。細胞株が未分化である場合は、脂肪細胞に分化させてから材料を調製することが好ましい。ＬＰＬを産生している細胞株としては例えば、マウス細胞株３Ｔ３−Ｌ１（大日本製薬（株）社より購入可能）、同３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ、同Ｏｂ１７等を挙げることができる。あるいは、ラット白色前駆脂肪細胞（初代培養細胞）を脂肪細胞に分化させた細胞も好適に用いることができるが、本発明はこれらに限定されない。
【０２９５】
また、ＬＰＬを含む材料として、精製ＬＰＬや組換えＬＰＬ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９９６）　２６３，　３１９−２６参照）を使用することもできる。例えば、牛乳由来のＬＰＬ（シグマ社より市販されている）を本発明の方法に使用することが可能である。
【０２９６】
▲１▼−ｂ　ＬＰＬおよびＨＴＧＬを含む材料
ＬＰＬおよびＨＴＧＬを含む材料としては、体重１ｋｇあたり１０乃至１００単位のヘパリンを静注して１０分乃至１５分経過後の哺乳動物から採取した末梢血由来の血漿が好適である。
【０２９７】
▲２▼または▲２▼−ｂ　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料
次に、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料は、これらリパーゼの触媒により脂肪酸を遊離することが知られている物質を含み、かつこれらリパーゼの活性を阻害したり不活性化する成分が含まれていないものであればよいが、例えばグリセロール・トリ［９，１０（ｎ）−３Ｈ］オレイン酸のようにＬＰＬの触媒により遊離される脂肪酸が放射性同位元素で標識してある化合物や、同様に特定の励起波長下で蛍光を発する物質で標識された化合物が特に好適である。また、遊離脂肪酸の量を生化学的な方法で測定する場合には、標識されていない基質（例えばグリセロール・トリオレイン酸）も用いられ得る。
【０２９８】
▲３▼本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドとしては、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、または請求項１８乃至３４記載のポリペプチドを用いることができるが、これらに限定されない。
【０２９９】
本発明の方法における被験物質は、特に限定されず、微生物の培養液や動植物の組織からの抽出物、培養細胞の培養液からの抽出物、人工的に合成された無機または有機化合物、組換えタンパク質、抗体またはその断片、もしくはそれらの中の複数種類の物質を混合した組成物などがいずれも用いられ得る。
【０３００】
その他、反応液には、必要に応じ、ｐＨ調整のための緩衝液や、アルブミンなどのタンパク質成分が添加され得る。
【０３０１】
これらの材料を混合し、以下に記載する条件でＬＰＬ反応を行う：
温度条件：　２７乃至３７℃、好適には３７℃；
反応液のｐＨ：　８．０乃至８．５、好適には８．０；
反応液中の塩化ナトリウム濃度：　０．１乃至０．１５Ｍ、好適には０．１５Ｍ；
反応時間：　１５乃至１２０分、好適には１２０分。
【０３０２】
なお、ヘパリン投与した哺乳動物由来の血漿のように、ＬＰＬとＨＴＧＬの両方を含む材料を用いる場合は、上記条件でＬＰＬとＨＴＧＬとを合わせたリパーゼ活性が測定できる。ＨＴＧＬ活性のみを測定する場合には、他の条件は変えずに塩化ナトリウム濃度を１Ｍにすることにより、ＬＰＬが不活性化された条件でリパーゼ反応を進行させる。ＬＰＬ活性は総リパーゼ活性からＨＴＧＬ活性を差し引いた値となる。
【０３０３】
反応終了後、反応液に有機溶媒を添加、混合してから遊離脂肪酸を含む層と未反応の基質を含む層とを分離させ、前者に集まった遊離脂肪酸の量を測定する。
【０３０４】
また、標識されていない基質を用いた場合の試験方法の例を以下に示す（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．　３０，７４８（１９８４））。
【０３０５】
基質溶液０．５ｍｌ（７．５μｍｏｌ　グリセロール・トリオレイン酸、２２．５ｍｇ　アラビアゴム、１００μｍｏｌ　トリス−塩酸（ｐＨ８．２）、５０μｍｏｌ　塩化ナトリウム、２５ｍｇ　アルブミン、１４０μｌ　ヒト血漿）を３７℃で８０分間インキュベートした後、脂肪細胞培養上清を加え、また同時に本発明のポリペプチドと被験物質を添加して、２８℃で６０分間反応させる。次に反応液に２．５ｍｌのイソプロパノール：ヘプタン：硫酸（２．５ｍｏｌ／Ｌ）＝４０：１０：２（ｖ／ｖ）を加え、１０分間混合し、室温で４０分放置後、有機層を１ｍｌ採取し、窒素乾固する。得られたものを５％　トリトン　Ｘ−１００溶液にて溶解し、市販の脂肪酸測定キット（例えばＮＥＦＡ−テストワコー（和光純薬（株）社製））等を利用して脂肪酸量を測定する。
【０３０６】
上記方法により試験を行った結果、本発明のポリペプチドによるＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性阻害を抑制し、結果的にＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性を上昇させた被験物質は、血中の中性脂肪濃度を低下させる、新しい高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の候補として選択される。
【０３０７】
ＩＩＩ．プロモーターＤＮＡを用いた試験方法
本発明のＤＮＡは、マウスゲノムより作成した遺伝子ライブラリーから、例えば、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｃｏｎｋｌｉｎ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　６２，　４７７−４８２　（１９９９））またはマウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｋｅｒｓｔｅｎ，　Ｓ．，　ｅｔａｌ．　（２０００）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　２８４８８−２８４９３；Ｙｏｏｎ，　Ｊ．　Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２０，　５３４３−５３４９）の５’末端側をプローブとして利用したスクリーニングにより単離することができる。または、この配列の情報に基いて、マウスゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）により、ライブラリーのスクリーニングの工程を経ずに直接本発明のＤＮＡを増幅することもできる。
【０３０８】
なお、本発明のＤＮＡが挿入されている組換えプラスミドｐＧＬ８−３は、２００１（平成１３）年６月７日付で独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６２７が付されている。したがって、本発明のＤＮＡは、当該プラスミドから取得することもできる。
【０３０９】
なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、天然型のプロモーターＤＮＡのヌクレオチド配列の一部を他のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡを調製することが可能である。このように天然型のヌクレオチド配列においてヌクレオチドが置換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。これらのうち好適なものは、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、より好適には配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から１８８で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡである。
【０３１０】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１からヌクレオチド番号５２６で示されるヌクレオチド配列または配列番号２８のヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、プロモーター活性を有するものであればよい。このようなＤＮＡは、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列または配列番号２８のヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド配列と、通常、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列の同一性を有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【０３１１】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェントな条件（ローストリンジェントな条件）では、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ　塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ　クエン酸ナトリウム）またはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７−４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリンジェントな条件）では、前記において、洗浄を０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことにより実施できる。
【０３１２】
このようにして得られた本発明のＤＮＡがプロモーター活性を有するか否かは、下記に説明するように、その下流にルシフェラーゼ等のマーカー遺伝子を連結したもの（以下「レポーター遺伝子」という）で哺乳動物細胞を形質転換し、この形質転換細胞におけるマーカー遺伝子の発現が検出されるか否かを調べることによって確認することができる。
【０３１３】
本発明で用いられる発現ベクターは外来遺伝子の上流側に外来遺伝子配列と同じ転写の方向で本発明のＤＮＡが連結されており、哺乳動物細胞中で外来遺伝子を発現させ得るものである。かかる発現ベクターは、外来遺伝子の上流に本発明のＤＮＡが連結されているため、本発明のＤＮＡ中におけるプロモーターの制御下に外来遺伝子を発現することができる。本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞に導入することにより複製され得る形態であればよく、例えば、適当なレプリコンを有する環状または直線状のいずれであってもよい。
【０３１４】
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のＤＮＡウイルス、またはＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が好ましい。
【０３１５】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、なかでも、ＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【０３１６】
該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）およびリポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　５７０７−５７１７，　Ｓｕｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ　（１９８４）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４，　１６４１−１６４３）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。ただし、培養細胞株がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いる。
【０３１７】
また、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し、発生させることにより得たトランスジェニック動物を用いることもでき、その手順は公知の方法［発生工学実験マニュアル（野村達次　監修、勝木元也　編、１９８７年刊）、特開平５−４８０９３号等参照］に従えばよい。具体的には、例えば、マウスの場合にはまずメスマウスに排卵誘起剤を投与後、同系統のオスと交配し、翌日メスマウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるために本発明のＤＮＡをプロモーターとして有し、エンハンサー等の調節遺伝子は、導入された動物の細胞内で機能するものであれば特に限定されない。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親メスマウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、役２０日後に自然分娩または帝王切開により出生させる。
【０３１８】
こうして得られた動物が、導入遺伝子を保持していることを確認する方法としては、例えば：前記動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡをこれに特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅する方法、該ＤＮＡを制限酵素で消化後、ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをナイロン膜等にブロッティングした後、標識した導入遺伝子の全部または一部をプローブとしてサザンブロット解析を行なう方法等を挙げることができる。
【０３１９】
外来遺伝子としては、対象疾患を治療するためのタンパク質をコードする遺伝子、マーカー遺伝子などが挙げられる。
【０３２０】
以下、本発明のＤＮＡの使用方法について述べる。
【０３２１】
１）誘導型発現ベクターとしての利用
本発明のＤＮＡが、ある特異的な刺激によりプロモーター活性を表すことが判明した場合、所望の遺伝子の上流に本発明のＤＮＡを挿入したベクターなどを作製して体細胞に導入し、該刺激を付加することにより、該所望の遺伝子を誘導的に発現させることができる。
【０３２２】
２）ＤＮＡによる拮抗阻害を利用したＤＮＡのプロモーター活性調節
本発明は、上記プロモーターＤＮＡの配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ（その誘導体を含む。以下「部分配列」という）に関する。このような部分配列を用いることにより、該部分配列自体がプロモーター活性を有するか否かを問わず、上記プロモーターＤＮＡとこれに結合しうるタンパク質（例えば、転写因子）との結合を拮抗阻害する方法を実施することが可能である。例えば、該部分配列が、本発明のＤＮＡ配列上においてそのプロモーター活性を阻害するタンパク質の結合部位に相当する場合には、この方法によりプロモーター活性を促進することができ、逆にプロモーター活性を促進するタンパク質（転写因子を含む）の結合部位に相当する場合には、プロモーター活性を阻害することができる。このような拮抗阻害に用いる部分配列ＤＮＡは、通常少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは１０ヌクレオチド以上の鎖長を有する。また、拮抗阻害に用いるために選択される部分配列の種類としては、例えば、プロモーター上の転写因子の結合コンセンサス部位を含む配列が挙げられる。また、そうした部分配列ＤＮＡの誘導体としては、いくつかの部分配列を連結したものや、それをアデノウイルスベクター等に組み込んで動物細胞への遺伝子導入を可能にしたもの、また、ＤＮＡの３’末端もしくは５’末端にビオチンを連結したもの等が用いられ得る。
【０３２３】
下記実施例において明らかなように、「アンジオポエチン関連タンパク質３」および「アンジオポエチン関連タンパク質４」は、低脂血症マウスで強制発現させると血中の中性脂肪濃度が上昇する。「アンジオポエチン関連タンパク質３」が正常に産生されない変異遺伝子の影響により、顕著な血中脂質濃度の低下、動脈硬化の進展抑制および高血糖の改善が観察され、「アンジオポエチン関連タンパク質４」についても同様の現象が観察されると考えられるので、本発明のＤＮＡが有するプロモーター活性を抑制する機能を有する部分配列またはその誘導体は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防のための医薬組成物の有効成分として有用である。
【０３２４】
３）プロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニング
本発明のＤＮＡのプロモーター活性の調節には、上記のような部分配列等を用いた拮抗阻害の他に、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質を利用する方法を用いることもできる。本発明のＤＮＡは、そのプロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニングに利用することが可能である。したがって、本発明は、下記に示すような、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニング方法に関する。そのようなタンパク質としては、直接本発明のＤＮＡに結合してそのプロモーター活性を促進あるいは阻害するタンパク質の他に、細胞膜受容体や細胞内タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進あるいは阻害するタンパク質が含まれる。
【０３２５】
３−１）プロモーターＤＮＡに結合するタンパク質のスクリーニング
この方法は、本発明のＤＮＡに被験タンパク質試料を接触させ、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質を選択する工程を含む。このような方法としては、例えば、本発明のプロモーターＤＮＡを用いた、これに結合するタンパク質のアフィニティー精製が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、本発明のプロモーターＤＮＡをビオチン化し、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズに結合させてＤＮＡアフィニティービーズを作製する。次いで、これを細胞の核抽出液とインキュベートして本発明のＤＮＡと特異的に結合する核抽出液中のタンパク質を精製し、この構造を決定する。これにより、直接本発明のＤＮＡと結合するタンパク質、およびＤＮＡ結合活性は持たないがサブユニットとして該タンパク質と複合体を形成し本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が精製できる（ＧａｂｒｉｅｌｓｅｎＯ．Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１７，　６２５３−６２６７　（１９８９）、Ｓａｖｏｙｓｋｙ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　９，　１８３９−１８４６　（１９９４））。
【０３２６】
３−２）プロモーター活性を指標にしたタンパク質のスクリーニング
この方法は、本発明のＤＮＡの下流に連結されたマーカー遺伝子［下記５−２）において詳述する］を保持する細胞に被験ＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物を選択する工程を含む。このような方法には、例えば、酵母や動物細胞を用いたｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法が含まれる。具体的には、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を細胞に安定に導入し、次いでこれに遺伝子ライブラリーを導入して、レポーター遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなクローンを選択し、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質を選択する。この方法により、直接本発明のＤＮＡと結合するタンパク質の他に、細胞内の内在性タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質を得ることができる。なお、酵母のｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法（Ｌｉ　Ｊ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　Ｉ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６２，　１８７０−１８７３　（１９９３）、Ｗａｎｇ　Ｍ．Ｍ．ａｎｄ　Ｒｅｅｄ　Ｒ．Ｒ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３６４，　１２１−１２６　（１９９３））などで、「Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック社）」等がキットとして発売されている。
【０３２７】
さらに他の一つの態様は、本発明のＤＮＡの下流に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被験試料を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節するタンパク質を選択する工程を含む。具体的な方法の一例としては、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子が挿入されたレポーター遺伝子を安定に導入した細胞と、被験試料（例えば、遺伝子ライブラリーを導入した細胞の培養上清）とをインキュベートして、マーカー遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質を選択する。この方法では、細胞膜受容体などを介して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性に影響を与えるタンパク質が得られる。
【０３２８】
４）プロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング方法
本発明のＤＮＡを用いて、そのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするＤＮＡを直接単離することも可能である。本発明は、また、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法の一つの態様は、本発明のＤＮＡに被験ＤＮＡの発現産物を接触させ、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。このような方法には、例えば、サウスウエスタン法が含まれる。具体的には、遺伝子ライブラリーを導入した大腸菌で各タンパク質を発現させ、これらをフィルター膜に転写した後、本発明のＤＮＡをプローブとして直接ブロットし、該ＤＮＡプローブと結合するタンパク質を発現するクローンを選択して、これをコードする遺伝子を単離する。この方法により本発明のＤＮＡに結合する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる（実験医学別冊　バイオマニュアルシリーズ「転写因子研究法」（株）羊土社刊、１７７−１８８頁参照）。
【０３２９】
他の一つの態様は、本発明のＤＮＡの下流に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被験ｃＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。このような方法には、例えば、上記した酵母や動物細胞を用いたｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法が含まれる。
【０３３０】
すなわち、本発明のＤＮＡをとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を哺乳動物由来の培養細胞に安定に導入した細胞（以下「細胞Ａ」という）に、さらに該細胞に哺乳動物細胞用発現ベクターに被験ｃＤＮＡが挿入された組換えプラスミドを導入した細胞（以下「細胞Ｂ」という）を培養する。比較対照としては、細胞Ａをそのまま培養するか、あるいは、細胞Ａに被験ｃＤＮＡを含まない哺乳動物細胞用発現ベクターや、被験ｃＤＮＡを含んでいてもそれが発現しない組換えプラスミドを導入した細胞（以下「細胞Ｃ」という）を培養する。細胞Ｂと、細胞Ａまたは細胞Ｃとの間で、マーカー遺伝子の発現量を比較し、マーカー遺伝子の発現を促進するかまたは阻害するようなｃＤＮＡクローンを選択する。この方法では、本発明のＤＮＡと直接結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡだけでなく、細胞内の内在性タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡも得ることができる。
【０３３１】
さらに他の一つの態様は、本発明のＤＮＡの下流に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被験ｃＤＮＡの発現産物を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。具体的な方法の一例を示せば、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を安定にに導入した細胞と、被験ｃＤＮＡの発現産物（例えば、ｃＤＮＡライブラリーを導入した細胞の培養上清）とをインキュベートして、マーカー遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質あるいはそれをコードするｃＤＮＡを単離する。この方法により細胞膜受容体などを介して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性に作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡを得ることができる。
【０３３２】
５）プロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング
本発明のＤＮＡを用いて、そのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニングを行うことも可能である。すなわち本発明は、下記に示すような、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。
【０３３３】
５−１）プロモーターとタンパク質との結合を指標としたスクリーニング
この方法は、被験化合物の存在下で本発明のＤＮＡと被験試料とを接触させ、本発明のＤＮＡと被験試料中のタンパク質との結合を促進または阻害する化合物を選択する工程を含む。具体的には例えば、細胞の核抽出液を、本発明のＤＮＡを放射性同位元素等により標識したプローブと結合させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、核抽出液中のタンパク質と本発明のＤＮＡとの複合体のバンドをゲルシフト法により検出する（実験医学別冊　バイオマニュアルシリーズ「転写因子研究法」（株）羊土社刊、１０７−１１２頁参照）。ＤＮＡプローブ添加の際、被験化合物も添加し、核抽出液中のタンパク質と本発明のＤＮＡとの複合体のバンドの形成を促進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、直接本発明のＤＮＡに作用する化合物および本発明のＤＮＡに結合するタンパク質に作用する化合物が得られる。例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が生体内で本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害するような場合、このタンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を阻害するような化合物は、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進できると考えられる。なお、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が既に単離されていれば、細胞の核抽出液に代えて、該タンパク質の組み換えタンパク質を利用することも可能である。
【０３３４】
５−２）プロモーター活性を指標としたスクリーニング
この方法は、本発明のＤＮＡの３’末端側に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被験化合物を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節する化合物を選択する工程を含む。この方法では、直接、間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物が得られる。
【０３３５】
この方法において、本発明のＤＮＡの３’末端側に連結されるマーカー遺伝子にコードされるマーカータンパク質は、宿主である上記細胞が本発明の方法の一連の過程において産生し得る他のいかなるタンパク質とも区別可能なもの（好ましくは、形質転換前の上記細胞が該マーカータンパク質と同一または類似のタンパク質をコードする遺伝子を持たないようなもの）であればよい。例えば、マーカータンパク質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、マーカー遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるマーカー遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば該マーカー遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。さらに好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなものとして、以下に挙げるようなタンパク質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない：
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：　クロラムフェニコールにアセチル基を付加する。いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出可能。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとしてｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている；
ホタルルシフェラーゼ：　ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量する。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている；
β−ガラクトシダーゼ：　呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしてｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている；
分泌型アルカリホスファターゼ：　呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしてｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている；
緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）：　酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
【０３３６】
培養細胞株に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）、リポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　５７０７−５７１７，　Ｓｕｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ　（１９８４）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．４，　１６４１−１６４３）等を挙げることができるが、これらに限定されず、本発明の属する技術分野において汎用される他の方法も採用することができる。ただし、培養細胞株がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いる。
【０３３７】
このようにして本発明のＤＮＡの３’末端側にマーカー遺伝子が連結された発現ベクターをトランスフェクションした細胞を培養すると、マーカー遺伝子の転写が促進される。マーカー遺伝子の発現が可能な条件下で培養するにあたって、培地中に任意の被験物質を添加した条件および添加しない条件を設定して培養後、マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質の添加によりマーカー遺伝子の発現量に変化が生じるか否かを検定する。「マーカー遺伝子の発現が可能な条件」は、細胞が生存して、タンパク質の生産が可能な条件であればよいが、好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）を使用し、４乃至６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６乃至３８℃（最も好適には３７℃）で２乃至３日間（最も好適には２日間）培養する。
【０３３８】
このような系において、本発明のＤＮＡの３’末端側にマーカー遺伝子が連結された発現ベクターを導入した際のレポーター遺伝子の発現誘導を抑制するような被験物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤として有用な候補物質として選択される。
【０３３９】
なお、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質が既に得られている場合には、被験化合物の存在下で該タンパク質（またはその誘導体）と本発明のＤＮＡとを接触させ、該タンパク質（またはその誘導体）と本発明のＤＮＡとの結合を促進または阻害する化合物を選択して、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングすることが可能である。具体的には、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを融合した本発明のＤＮＡに結合するタンパク質（ＤＮＡ結合ドメインのみでもよい）を精製して、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビチオン化した本発明のＤＮＡをこのタンパク質と接触させ、該タンパク質と本発明ＤＮＡとの結合をストレプトアビジン化アルカリホスファターゼで検出する。本発明のＤＮＡ添加の際、被験化合物も添加し、該タンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を促進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、直接本発明のＤＮＡに作用する化合物および本発明のに結合するタンパク質に作用する化合物が得られる。例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が生体内で本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する場合、このタンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を阻害するような化合物は本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進できると考えられる。
【０３４０】
なお、下記参考例において明らかなように、「アンジオポエチン関連タンパク質３」および「アンジオポエチン関連タンパク質４」は、低脂血症マウスで強制発現させると血中の中性脂肪濃度が上昇する。「アンジオポエチン関連タンパク質３」が正常に産生されない変異遺伝子の影響により、顕著な血中脂質濃度の低下、動脈硬化の進展抑制および高血糖の改善が観察され、「アンジオポエチン関連タンパク質４」についても同様の現象が観察されると考えられるので、本発明のＤＮＡが有するプロモーター活性を抑制する機能を有する部分配列またはその誘導体は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０３４１】
【実施例】以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　著、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【０３４２】
参考例１．　ｃＤＮＡのクローニング
マウス肝臓を材料として、下記の方法に従って配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを取得した。
【０３４３】
ａ）マウス肝臓からのｍＲＮＡの抽出
９週齢のＫＫマウス（雄、浜松医科大学付属動物実験施設より入手）２匹より解剖して肝臓を摘出後、速やかに液体窒素中に入れて急速凍結させた。この重量を測定し、３．１ｇを乳鉢上で液体窒素存在下で粉砕した。５．５Ｍ　グアニジンチオシアネート（以下ＧＴ）緩衝液（５．５Ｍ　グアニジンチオシアネート、２５ｍＭ　クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％　サルコシル、０．２Ｍ　β−メルカプトエタノール）（３０ｍｌ）を加え、乳棒で破砕し、新たにＧＴ緩衝液（１０ｍｌ）を加え、乳棒で破砕後、溶解液を回収した。また、ＧＴ緩衝液（２０ｍｌ）で乳鉢を洗浄しこの溶液も回収した。３６ｍｌの回収液を３０００ｒｐｍ、１０℃で１０分間遠心後、上清を新しいチューブに移し、各々１８ゲージの注射針で２０回吸引排出を繰り返した。次にセシウム・トリフルオロ酢酸（ＣｓＴＦＡ）を用いた密度勾配遠心による全ＲＮＡの分離を行った。ＣｓＴＦＡ原液（１９ｍｌ）をリボヌクレアーゼ不含再蒸留水（１８．９２４ｍｌ）で希釈し、この希釈液（６．１８ｍｌ）を６本の１３ＰＡ（ベックマン製）チューブに入れ、先に回収したサンプル（１チューブあたり５．２ｍｌ）を重層した。このものをスイングローター（日立工機（株）社製Ｐ４０ＳＴ）を用い超遠心機（日立ＳＣＰ７０Ｈ型）で３００００ｒｐｍ（約１２５０００ｇ）、２０℃で２０．５時間遠心した後、上清を除去して得られたペレットをｍＲＮＡ精製キット（アマシャム・ファルマシア社製クイックプレップｍＲＮＡ精製キット）添付の抽出緩衝液　３．３ｍｌに懸濁した。ｍＲＮＡの精製は該精製キットを添付プロトコールに従って用いることにより行った。このようにして得られた５μｇのｍＲＮＡを鋳型とし、ｃＤＮＡライブラリー作製キット（ストラタジーン社製ＺＡＰエクスプレス・ｃＤＮＡ・ギガパックＩＩＩゴールド・クローニングキット）をその添付プロトコールに従って用いることにより、λファージｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【０３４４】
ｂ）ｃＤＮＡライブラリーの１次スクリーニング
上記ａ）記載の方法で得られたλファージｃＤＮＡライブラリーを感染させた大腸菌を、直径９ｃｍの培養シャーレに作製した寒天培地プレート（ＮＺＹ培地：０．５％　塩化ナトリウム、０．２％　硫酸マグネシウム７水和物、０．５％イーストエキストラクト、１％　カゼイン加水分解物、１．５％　寒天）に、プレート１枚あたり１．８×１０５個のプラークが形成されるように分散させ、３７℃で８時間培養した。このプラーク形成された寒天培地の１４ヶ所について、２５０μｌ用の広径ピペットチップ（ＲＡＩＮＩＮ社製）の底部を用いて寒天培地をプラークごと抜き取り、それら寒天培地片をそれぞれ１００μｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ　塩化ナトリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％　ゼラチン）の入ったプラスチック遠心管に入れ、ボルテックスミキサーを用いて激しく混濁させてから４℃で１乃至２時間放置した後、１２０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収し、ファージ懸濁液とした。
【０３４５】
一方、ＰＣＲに用いるプライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
プライマー１：５’−　ｇａｃｔｇａｔｃａａ　ａｔａｔｇｔｔｇａｇ　ｃｔｔ　−３’（配列表の配列番号５）；およびプライマー２：５’−　ｔｇｃａｔｃｃａｇａ　ｇｔｇｇａｔｃｃａｇ　ａ　−３’（配列表の配列番号６）
を有するオリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡ合成機（モデル３９４：（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）を用い、ホスホアミダイト法（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，　Ｍ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，　Ｍ．　Ｈ．　（１９８１）　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　１０３，　３１８５−３１９１）に従って合成した。
【０３４６】
上記のようにして得られたファージ懸濁液５μｌを、２．５μｌの１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造（株）社製のＴａｑポリメラーゼに添付）、４μｌのｄＮＴＰ混液（各２．５ｍＭ、宝酒造（株）社製のＴａｑポリメラーゼに添付）、各１μｌの各７．５μＭに調整した上記プライマー１および２、０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（宝酒造（株）社製）、１１．２５μｌの滅菌水と混和し、まず９４℃で５分加熱した後、引き続き９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間保温してから、４℃に保存した。反応物は４％のアガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ　３：１アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ社製）で調製した）で電気泳動して、特異的断片の増幅を解析した。このようにして１４のファージ懸濁液をスクリーニングした結果、目的のｃＤＮＡの断片が特異的に増幅される二つの陽性サンプルを得た。
【０３４７】
ｃ）２次スクリーニング
マウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）１００ｎｇを鋳型にして上記ｂ）に記載した条件でＰＣＲを行い、アガロース電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を鋳型として、マルチプライムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム・ファルマシア社）を用いて３２Ｐで標識されたＤＮＡ断片を生成する反応を行った後、反応液をニックカラム（アマシャム・ファルマシア社製）に注入した。このカラムに４００μｌのＴＥ（１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を流して１回洗浄し、さらに４００μｌのＴＥを流して溶出液を回収した。この溶出画分全量を以下の２次スクリーニングに標識プローブとして用いた。
【０３４８】
一方、上記ｂ）で陽性と判定されたファージ懸濁液をＳＭ緩衝液で１００倍希釈し、そのうち２μｌ分のファージを感染させた大腸菌を、直径９ｃｍの培養シャーレに作製した寒天培地プレートに分散させ、３７℃で８時間培養した。このプラーク形成された寒天培地上に、シャーレ内径に合わせた円形のナイロンメンブレン（アマシャム・ファルマシア社製、ハイボンドＮ＋）をのせて、４℃にて５分間放置することによりプラークを移しとった。１８Ｇの注射針を用いてメンブレンの３ヶ所を寒天培地まで貫通することにより位置合わせ用の目印をつけた後、メンブレンを剥がしてアルカリ溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に２分間、次いで中和溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０））に５分間、さらに２×ＳＳＣ、０．２Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）を含む溶液に３０秒間浸した後、室温で完全に風乾させた。
【０３４９】
このメンブレンを２０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、クロンテック社製）中で６８℃、１時間インキュベーション（プレハイブリダイゼーション）した後、標識プローブを含む８ｍｌのハイブリダイゼーション溶液に交換して６８℃、６時間インキュベーションした。次いで、このメンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％　ＳＤＳを含む溶液で、室温下、１５分間緩やかに振盪しながら洗浄する操作を３回繰り返した後、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを含む溶液で５０℃、３０分間洗浄する操作を３回繰り返した。
【０３５０】
洗浄後のメンブレンについてオートラジオグラフィーを行い、陽性と認められた位置の元のプラークを寒天培地から回収して、そのファージ懸濁液について上記ｂ）に記載した条件でＰＣＲを実施した結果、陽性プラーク試料１０個中６個においてＤＮＡ断片の特異的増幅が認められた。
【０３５１】
このうちもっとも強く増幅が認められた試料のファージ懸濁液について、ＺＡＰエクスプレス・ｃＤＮＡ・ギガパックＩＩＩゴールド・クローニングキット（ストラタジーン社製）に添付されたヘルパーファージおよび宿主菌を用いて、該キットに添付のプロトコールに従ってインビボ切り出し（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）を行い、寒天培地上にファージミドを含む大腸菌コロニーを形成させた。これらのコロニーを単離してそれぞれファージミドを抽出し、上記ｂ）に記載の方法でＰＣＲを実施した結果、ＤＮＡ断片の特異的増幅がみられたコロニーを選択、培養し、１．６ｋｂｐのｃＤＮＡインサートを有するファージミド＃５５−１を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９を単離した。
【０３５２】
得られたファージミド＃５５−１に挿入されているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を解析した結果、配列表の配列番号１に示される配列であることが判明した（ただし配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１−８はベクター由来のアダプター配列である）。この配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにマウス・「アンジオポエチン関連タンパク質３」として登録されている配列（登録番号：ＡＦ１６２２２４）と同一であった。なお、このファージミド＃５５−１を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９は、１９９９（平成１１）年１１月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現・独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０が付された。
【０３５３】
実施例１．　ノーザンブロット解析
ａ）マウス臓器からの全ＲＮＡの抽出
参考例１で得られたｃＤＮＡの発現している組織を調べる目的でノーザンブロット解析を実施した。まず、ＫＫマウス（高脂血症マウス）およびＫＫ／Ｓａｎマウス（低脂血症変異マウス。白木ら、第７回糖尿病動物研究会（１９９３年））の精巣（ｔｅｓｔｉｓ）、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、小腸（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、肝臓（ｌｉｖｅｒ）および脳（ｂｒａｉｎ）から全ＲＮＡの抽出を行った。１８週齢のＫＫマウスおよびＫＫ／Ｓａｎマウスを解剖してそれぞれ各臓器を摘出後、速やかに液体窒素内に入れ急凍した後−８０℃に保存した。臓器０．５ｇに対し約１５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製）を加え、超高速ホモジナイザーポリトロン（キネマティカ社製）を用いて氷上でホモジナイズを行った（目盛６で２分間）。これを室温で５分間静置した後、３ｍｌのクロロホルムを加え、手で１５秒間激しく転倒混和した。再び室温で３分間静置してから、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心後、上層を回収し、０．８容量のリボヌクレアーゼ不含イソプロピルアルコールを加えて混和した。これを室温で１０分間静置後、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を除去してリボヌクレアーゼ不含７０％エタノールを加えた。これを１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去して、沈殿を乾燥させてから、−８０℃に保存した。
【０３５４】
ｂ）全ＲＮＡの電気泳動およびブロッティング
回収した各臓器の全ＲＮＡをリボヌクレアーゼ不含再蒸留水で４μｇ／μｌに調整した後、このＲＮＡ液５μｌとＲＮＡ試料緩衝液（１．１５×ＭＯＰＳ緩衝液（１×ＭＯＰＳ緩衝液は２０ｍＭ　ＭＯＰＳ、５ｍＭ　酢酸ナトリウム、１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」という）を含む）、２．４Ｍ　ホルムアルデヒド、５７％　ホルムアミド、７％　グリセロール、１８μｇ／ｍｌ　ブロモフェノールブルー、１８μｇ／ｍｌ　キシレンシアノール、０．１８ｍＭ　ＥＤＴＡ）１６μｌを混合し、６５℃で１０分間保温した後、氷上で５分間放置した。この試料液全量を、１．１７％ホルマリンを含む電気泳動用アガロースゲル（１×ＭＯＰＳ緩衝液、１．１７％　アガロース（高強度、分析用、バイオラッド社製）、０．６６Ｍ　ホルムアルデヒド）の一つのウェルへ注入し電気泳動した。電気泳動は、５００ｎｇ／ｍｌ　臭化エチジウムの入った１×ＭＯＰＳ緩衝液の入ったサブマリン電気泳動槽中、５０Ｖで約１時間通電した後、さらに１００Ｖで約１．５時間通電することにより行った。電気泳動終了後、アガロースゲル中のＲＮＡをキャピラリートランスファー法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）に従ってナイロンメンブレン（ハイボンドＮ＋、アマシャム・ファルマシア社製）に一晩かけて転写した（転写用溶液は２０×ＳＳＣを使用した）。このメンブレンを２×ＳＳＣで５分間洗浄し、風乾させ、クロスリンク用紫外線照射装置（スペクトロリンカーＸＬ−１０００、トミー精工（株）社製）で紫外線を照射（１２００Ｊ／ｃｍ２）してＲＮＡを固定した。
【０３５５】
ｃ）プローブの調製
参考例１のｂ）で合成したプライマーを用い、サーマルサイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９６００、（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）を使用して以下の条件でＰＣＲを行った。まずプライマー（終濃度各０．５μＭ）とツイーン２０（シグマ社製、終濃度０．１％）に滅菌水を加えて７．５μｌとした後、２×ＰＣＲソルーション・プレミックスＴａｑ（宝酒造（株）社製：０．０５単位／μｌ　Ｔａｑポリメラーゼ、０．４ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、２０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１００ｍＭ　塩化カリウム、３ｍＭ　塩化マグネシウムを含む）を７．５μｌ添加した。さらにマウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を１μｌ（１００ｎｇ相当）加え、反応液を調製した。この反応液を、まず９４℃で３分間加熱した後、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で４５秒の温度サイクルを３５回繰り返してから、４℃で保温した。
【０３５６】
このＰＣＲ後の反応液１μｌをとり、ＴＡクローニングキット（デュアルプロモーターバージョンＡ、インビトロジェン社製）を添付のプロトコールに従って用いて、増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドベクターにクローニングした。この組換えプラスミドベクターでコンピテント大腸菌を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、４ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で３７℃で一晩培養した。このうち３．５ｍｌの培養液からプラスミド自動抽出装置（ＰＩ−５０、クラボウ社製）を使用してプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドＤＮＡについてヌクレオチド配列解析を行い、目的のＰＣＲ産物が挿入されていたプラスミドを以下の操作に用いた。
【０３５７】
選択されたプラスミドＤＮＡ　８μｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿を滅菌水１０μｌに溶解した。この溶液に色素液（０．２５％　ブロモフェノールブルー、０．２５％　キシレンシアノール、１５％　フィコール（タイプ４００））を２μｌ加えて、全量をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度８％、１００Ｖ、室温、３時間）した。電気泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色した後、紫外線照射下で目的のＤＮＡに相当するバンド（約２００ｂｐ、配列表の配列番号２９）部分のゲル片を剃刀刃で切り取り、微量遠心チューブに移して粉砕した。このものに３００μｌの溶出緩衝液（０．５Ｍ　酢酸アンモニウム、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％　ＳＤＳ）を加え、３７℃で一晩保温した後、フェノール／クロロホルム抽出を２回、エタノール沈殿を１回行って、沈殿を滅菌水２０μｌに溶解した。
【０３５８】
得られたＤＮＡ溶液５μｌについて、参考例１のｃ）記載の方法で、３２Ｐで標識されたプローブ（４００μｌ）を調製した。
【０３５９】
ｄ）ハイブリダイゼーション
上記ｂ）で作製したメンブレンを２０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、クロンテック社製）中に入れて６８℃で１時間インキュベーション（プレハイブリダイゼーション）した後、３２Ｐ標識プローブを含む２０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液中で、６８℃で一晩インキュベーションした。その後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳを含む溶液中、室温で２０分間、３回洗浄し、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを含む溶液中、５０℃で２０分間、３回洗浄してから、オートラジオグラフィーを行った。
【０３６０】
その結果、検出した遺伝子の発現は肝臓のみでみられ、またその発現量はＫＫマウス（高脂血症マウス）よりもＫＫ／Ｓａｎマウス（低脂血症マウス）で著しく低下していることが明らかとなった（図１）。
【０３６１】
上記実験系において、例えば被験物質存在下または非存在下で培養したＫＫマウス初代培養肝細胞からＲＮＡ試料を調製し、以下同様の操作を行うことにより、被験物質の高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤としての効果を調べることができる。この実験において検出される遺伝子の発現量を低下させるような被験物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。多検体処理を行う場合には、電気泳動を省略してドットブロットやスロットブロットを行うこともできる。
【０３６２】
参考例２．ヒトｃＤＮＡのクローニング
１）プローブの調製
配列表の配列番号１に示されるマウスｃＤＮＡに対応するヒトｃＤＮＡを取得するため、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｔｃｃｔｃｔａｇｔｔ　ａｔｔｔｃｃｔｃｃａ　ｇ　−３’（配列表の配列番号７）；および
５’−　ｔｇｇｔｔｔｇｃｃａ　ｇｃｇａｔａｇａｔｃ　−３’（配列表の配列番号８）
を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【０３６３】
次に、ヒトゲノムＤＮＡ（ベーリンガーマンハイム社製、２００ｍｇ／ｍｌ）１μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（ｒＴａｑ、宝酒造（株）社製、５単位／μｌ）１μｌ、１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造（株）社製）１０μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）１６μｌ、２０μＭのプライマー各２μｌ、および滅菌水６８μｌを混合した。この反応液を、９４℃で５分間加熱した後、引き続き９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温してから、４℃に保存した。この反応液を２％　アガロースゲルにて電気泳動した後、増幅されたＤＮＡバンド部分のゲルを切り出して精製した。このようにして得られたＤＮＡをＤＮＡ標識キット（ＢｃａＢｅｓｔラベリングキット、宝酒造（株）社製）を用いて３２Ｐで標識したものを下記２）においてプローブとして用いた。
【０３６４】
２）ｃＤＮＡライブラリーの１次スクリーニング
市販のヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎ　Ｌｉｖｅｒ　５’−ＳＴＲＥＴＣＨ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ、クロンテック社製）のうち、１×１０６プラークのＤＮＡをナイロンメンブレンに固定した。すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを感染させた大腸菌を直径９ｃｍの培養シャーレに作製した寒天培地プレート２０枚に、１枚あたり５×１０４個のプラークが形成されるように分散させ、３７℃で８時間培養した。このプラーク形成された寒天培地上に、シャーレ内径に合わせた円形のナイロンメンブレン（アマシャム・ファルマシア社製、ハイボンドＮ＋）をのせて、４℃にて５分間放置することによりプラークを移しとった。１８Ｇの注射針を用いてメンブレンの３ヶ所を寒天培地まで貫通することにより位置合わせ用の目印をつけた後、メンブレンを剥がしてアルカリ溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に２分間、次いで中和溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０））に５分間、さらに２×ＳＳＣ、０．２Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）を含む溶液に３０秒間浸した後、室温で完全に風乾させた。次いで、クロスリンク用紫外線照射装置（スペクトロリンカーＸＬ−１０００、トミー精工（株）社製）で紫外線を照射（１２００Ｊ／ｃｍ２）してＤＮＡを固定した。
【０３６５】
このようにして調製されたメンブレンを、上記１）で得られた標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、クロンテック社製）中で６５℃で一晩インキュベーションした。その後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％　ＳＤＳを含む溶液で１５分ずつ３回、室温で洗浄してから、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを含む溶液で３０分ずつ３回、５０℃で洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。
【０３６６】
その結果判明した陽性のシグナルの位置にあったプラークを、上記寒天培地プレートから培地ごと採取し、それぞれ１００μｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ　塩化ナトリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％　ゼラチン）中に入れてよく懸濁してから４℃で２時間放置した後、１２０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収した。
【０３６７】
このようにして得られた１次陽性ファージ液を再び大腸菌に感染させたものを、直径９ｃｍの培養用シャーレに作製した寒天培地上に、シャーレ１枚あたり５００個のプラークが形成されるように培養し、上記の手法を繰り返すことにより２次スクリーニングを行った。得られた２次陽性クローンファージを大腸菌株ＢＭ２５．８（クロンテック社製）に感染させたものを寒天培地上で３７℃で培養して、ファージミドを含む大腸菌コロニーを形成させた。コロニーを単離し、液体培地で少量培養してファージミドを抽出し、制限酵素消化による挿入断片の解析を行った結果、１．６ｋｂｐの挿入断片を有する、クローン＃ｈ５−１を有する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９を単離した。このクローンの挿入断片のヌクレオチド配列を解析した結果、ＧｅｎＢａｎｋにヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」として登録されているのｃＤＮＡ配列（登録番号：ＡＦ１５２５６２）と一致した（配列表の配列番号３。ただし、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１−１４はベクター由来のアダプター配列である）。なお、このファージミド＃ｈ５−１を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９は、１９９９年１１月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現・独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１が付された。
【０３６８】
実施例２．　ポリクローナル抗体の作製
配列表の配列番号１および配列番号３に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２および配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいずれも認識する抗体を作製する目的で、抗原として、それらマウスおよびヒトのポリペプチドの間で保存されている領域から選ばれた２種類のアミノ酸配列：
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（５５−１−Ｎ１、配列表の配列番号９）；および
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（５５−１−Ｃ１、配列表の配列番号１０）
を有するペプチドを化学合成法で合成した（使用機器：パーキンエルマージャパン社製モデル４３３）。ただし、５５−１−Ｎ１のアミノ酸配列は、後に担体としてキーホールリンペットヘモシアニン（以下「ＫＬＨ」という）を結合させるため、本来のアミノ酸配列のＣ末端にシステイン残基が付加されたものである。一方、５５−１−Ｃ１でＫＬＨが結合されるＮ末端のシステインは本来のアミノ酸配列由来のものである。
【０３６９】
次に、合成ペプチド５５−１−Ｎ１　１１．１ｍｇおよびＫＬＨ　２１．５ｍｇ、または５５−１−Ｃ１　１０．２ｍｇとＫＬＨ　２１．２ｍｇを、それぞれＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシニミド（ＥＭＣＳ、同仁化学研究所（株）社製）試薬を用いて縮合させた（縮合反応溶媒として８Ｍ　尿素および０．９％　塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、室温で１５時間保温した）。この反応液を８Ｍ尿素溶液中に入れた後、流水に対して透析し、さらに純水に対して透析を行ってから凍結乾燥し、ＫＬＨが結合したペプチド抗原を得た。これらのペプチド抗原約１０ｍｇに１ｍｌの生理食塩水を加え、超音波発振機（ソニケーター）、ボルテックスミキサー、ガラス棒等を用いて細かい懸濁液にした。その後、生理的食塩水で全量を各７．５ｍｌとし、さらに１ｍｌずつバイアルに小分けして凍結保存した。
【０３７０】
免疫の際には、上記バイアル１本分の抗原溶液を融解し、同量のアジュバンドと混合してそれぞれウサギ２羽の背中に皮下、または皮内に注射した。アジュバンドはフロインド完全アジュバンドを用いて行い、２回目以降の免疫ではフロイントの不完全アジュバンドを用いた。免疫は２週間おきに４回行い、２回目の免疫以降、試験採血を行い血清中の抗体価を固層法による酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で調べた。９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（住友ベークライト（株）社製、９６穴Ｈタイプ）におのおのの抗原ペプチドをコーティングし、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として使用した。４回目の免疫から１３日後に全採血を行った。
【０３７１】
採血後、抗体をアフィニティーカラムを用いて精製した。すなわち、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシニミド（ＥＭＣＳ、同仁化学研究所（株）社製）とアミノアルキルアガロース（バイオラッド社製、アフィゲル１０２）とを反応させて活性化した担体ＥＭＣ−アガロース（約５ｍｌ）にペプチド（５５−１−Ｎ１：７．８２ｍｇ、５５−１−Ｃ１：８．０７ｍｇ）を結合させた。未反応のＥＭＣ基は０．１Ｍ　塩酸メルカプトエチルアミン（５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む）で処理することにより不活化させた。抗血清８５ｍｌをＰＢＳ（０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％　塩化ナトリウム含有）で２倍希釈し、硫安沈殿（終濃度４０％）法により沈殿物を得、この沈殿物をＰＢＳに溶解し、脱塩後ＰＢＳで透析し、この透析内液を粗ＩｇＧ画分とした。アフィニティーカラムへは３回に分けてクロマト操作をした。すなわち、アフィニティーカラムへ粗ＩｇＧ画分１／３量をチャージし、素通り画分をカラムに再注入する操作を３回繰り返した。素通り部分および洗液を合わせた４０ｍｌを非吸着フラクションとして集めた。非特異的にカラムに結合したものを除去するために、１Ｍ　塩化ナトリウム含有ＰＢＳで十分洗浄した後、４Ｍ　塩化マグネシウム溶液、３．５Ｍ　チオシアン酸カリウム溶液および０．１Ｍ　グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．３）を順次カラムに流して、カラム担体上に結合しているペプチドに特異的に結合していた抗体をアフィニティー精製抗体として溶出した。４Ｍ　塩化マグネシウム溶液および３．５Ｍ　チオシアン酸カリウム溶液の溶出液中に目的の抗体が含まれていたので、それぞれの溶出液をＰＢＳに対して透析したものを、以下の操作で抗体として使用した。
【０３７２】
実施例３．　ＣＯＳ−１細胞での発現およびウエスタンブロット解析
参考例２で得られた＃ｈ５−１ファージミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、実施例１のｃ）に記載した方法で、ｃＤＮＡを含む約１．６ｋｂの断片を単離、精製した。一方、高発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（Ｈａｒａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）　ＥＭＢＯ．Ｊ．　１１，　１８７５−、横田崇、新井賢一編集、バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社、ｐ１８−２０）を同様にＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、末端を脱リン酸化した後、上記ｃＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換株についてそれが保有するプラスミドＤＮＡの制限酵素による解析を行い、１．６ｋｂのＤＮＡ断片を有する株を選択してｐＭＥｈ５５−１と命名した。
【０３７３】
次に、ｐＭＥｈ５５−１を保有する形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養した。この培養液から、プラスミド精製キット（ウィザード・ピュアフェクション・プラスミドＤＮＡ精製システム、プロメガ社製）を用いてｐＭＥｈ５５−１　ＤＮＡを回収し、塩化セシウム法で精製した。
【０３７４】
このようにして得られたプラスミドｐＭＥｈ５５−１でＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションした。ＣＯＳ−１細胞へのトランスフェクションは（株）島津製作所製の遺伝子導入装置ＧＴＥ−１を用いて電機穿孔法により行った。すなわち、まずＣＯＳ−１細胞をセミコンフルエントになるまで増殖させたフラスコより、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞を回収し、ＰＢＳ（−）緩衝液（宝酒造（株）社製）で洗浄した。次にその細胞をＰＢＳ（−）緩衝液で６×１０７細胞／ｍｌに懸濁した。上記方法にて回収したプラスミドＤＮＡ（ｐＭＥｈ５５−１）をＰＢＳ（−）緩衝液で２００μｇ／ｍｌに調製した。細胞懸濁液とＤＮＡ溶液を２０μｌずつ混合し、これを電極間隔２ｍｍのチャンバーに入れ、６００Ｖ−３０μｓｅｃのパルスを１秒間隔で２回与えた。そのチャンバーを４℃で５分間冷却した後、中の細胞−ＤＮＡ混合液を１０％　ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ　１０ｍｌに加え、シャーレに移して３７℃、５％　ＣＯ２下で一晩培養した。その後、培養上清を除き、無血清培地（ＤＭＥＭ）で細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ
１０ｍｌを加えて３日間培養した。
【０３７５】
このようにして得られた細胞培養物より培養上清を回収した。ｃＤＮＡを含まないネガティブコントロールプラスミドｐＭＥ１８ＳまたはｐＭＥｈ５５−１でトランスフェクトして得たＣＯＳ−１細胞の無血清培養上清０．３ｍｌをそれぞれトリクロロ酢酸（以下「ＴＣＡ」という）処理してタンパク質を沈殿させ、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を氷冷したアセトンで洗浄し、風乾後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用の２−メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液（バイオラッド社製）に溶解し、４−２０％　ポリアクリルアミド密度勾配ゲル（マルチゲル４／２０、第一化学薬品（株）社製）を用いて、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０３７６】
電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルからバンドを転写緩衝液（１９２ｍＭ　グリシン、２０％　メタノール、２５ｍＭ　トリス）中でゲルメンブレン転写装置（マリソル社製、ＮＰ７５１３）を用いて４℃、９０分、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレン（バイオラッド社製）に転写した。
【０３７７】
転写後のニトロセルロースメンブレンについて、実施例２で得られた抗体（以下「５５−１−Ｎ１抗体」または「５５−１−Ｃ１抗体」という）を用いたウエスタンブロット解析を行った。すなわち、まずニトロセルロースメンブレンを０．０５％のツイーン２０を含むＰＢＳ（以下「０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ」という）で洗浄した（室温で１５分間を１回、次いで５分間を２回）後、プラスチックバッグ（商品名ハイブリバック、コスモバイオ（株）社製）に入れ、５％　スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを２０ｍｌ加え、室温で１時間振とうした。１時間後、メンブレンを取り出し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ中で、１５分間×１回、次いで５分間×２回洗浄した。洗浄後、メンブレンを新しいプラスチックバッグに移し、５５−１−Ｎ１抗体または５５−１−Ｃ１抗体（１００倍希釈）、１％　ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という。シグマ社製）を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを２０ｍｌ添加して室温で１時間振とうした。１時間後、メンブレンを取り出し０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液で１５分間×１回、５分間×２回洗浄した。その後、メンブレンを新しいプラスチックバッグに移し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャム・ファルマシア社製）を１％　ＢＳＡを含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍に希釈した溶液２０ｍｌを入れ、を室温で１時間振とうした。１時間後、メンブレンを取り出し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１５分間×１回、次いで５分間×４回洗浄した。洗浄後、メンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて、５５−１−Ｎ１抗体または５５−１−Ｃ１抗体が結合するバンドの検出を行った（メンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液に１分間浸した後、１時間室温で放置してバックグラウンドを減衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（３秒間））。その結果、両方の抗体により、ｐＭＥｈ５５−１プラスミドＤＮＡを導入して得られたＣＯＳ−１培養上清中に特異的なバンドが検出された（図２）。
【０３７８】
同様の実験は、参考例１で得られたマウスｃＤＮＡを発現させたＣＯＳ−１細胞培養上清についても実施できる。すなわち、参考例１で得られたファージミド＃５５−１　ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化して得られる、約１．６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片をｐＭＥ１８Ｓに組み込んで得られたクローン（ｐＭＥ５５−１）を構築し、上記と同様の方法でＣＯＳ−１細胞に導入し、培養上清を回収する。この培養上清から調製した試料について、５５−１−Ｎ１抗体および５５−１−Ｃ１抗体を用いたウエスタンブロット解析を行うと、いずれの抗体で検出した場合もｐＭＥ５５−１プラスミドＤＮＡを導入して得られたＣＯＳ−１培養上清中に特異的なバンドが検出される。
【０３７９】
上記実験系において、例えば被験物質存在下または非存在下で培養したＫＫマウス初代培養肝細胞の培養上清から試料を調製し、以下同様の操作を行うことにより、被験物質の高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤としての効果を調べることができる。この実験において検出される抗原量を低下させるような被験物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。多検体処理を行う場合には、電気泳動を省略してドットブロットやスロットブロットを行うこともできる。
【０３８０】
実施例４．　組換えアデノウイルスの作製および培養細胞における発現
参考例１で得られたマウス由来のｃＤＮＡを強制発現させるため組換えアデノウイルスは、市販のキット（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いて作製した。すなわち、参考例１で得られたファージミドクローン＃５５−１を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた約１．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をを平滑化したものを挿入ＤＮＡ断片として以下の操作に用いた。
【０３８１】
また、サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターにより発現されるように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）の制限酵素ＳｗａＩ認識部位にインサートＤＮＡ断片を挿入したコスミドｐＡｘＣＡ／ｍＡＰ５を作製した。ｐＡｘＣＡ／ｍＡＰ５　ＤＮＡおよび末端タンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ライフテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）にコ・トランスフェクションして、組換えアデノウイルスＡｄ／ｍＡＰ−５を単離し、さらに２９３細胞中で増幅させた。また、コントロールコスミドｐＡｘＣＡｉＬａｃＺから切り出したＬａｃＺ遺伝子が組み込まれた組換えアデノウイルスベクターを有するアデノウイルスＡｄ／ＬａｃＺを同様に作製し２９３細胞で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行い、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２回繰り返すことによって行った。得られたウイルス液を、１０％　グリセロールを添加したＰＢＳに対して４℃で透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存した。
【０３８２】
このようにして得られた組換えアデノウイルスを、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２）に約５ｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：多重感染度）で感染させ、無血清培地（ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ））で３乃至４日培養した後の培養上清を回収した。この上清１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、１００μｌのトリクロロ酢酸を添加して室温で３分放置した後、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除去し、氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて良く攪拌し、再度卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を除去し、再び氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて良く攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分間遠心して、上清を除いた後、沈殿物を真空乾燥させた。この沈殿物を１０μｌの蒸留水に溶解させ、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製した。試料を中でゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％　ＳＤＳ）後、転写緩衝液中で４℃、１時間、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに転写した。転写したメンブレンは０．５％　スキムミルクを添加したＰＢＳ液で４℃で一晩ブロッキングし、洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、５５−１−Ｎ１抗体の精製前の抗血清と５５−１−Ｃ１抗体の精製前の抗血清を混合したものを５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１００００倍希釈した反応液中に入れて室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で３回洗浄した。さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（バイオラッド社製）を５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１００００倍希釈した反応液中で室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液に１分間浸した後、１時間室温で放置してバックグラウンドを減衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（３秒間）。その結果、組換えアデノウイルスＡｄ／ｍＡＰ−５を感染させたＨｅＬａ細胞培養上清由来のサンプルのレーン中に特異的なバンドが検出された（図３）。
【０３８３】
一方、ファージミドクローン＃ｈ５−１が保持するｃＤＮＡがアデノウイルスベクターに組み込まれたものを有する組換えアデノウイルス（Ａｄ／ｈＡＰ５）を調製して同様の実験を行い、ＨｅＬａ細胞に発現させた培養上清のウエスタンブロット解析を行った結果、同様に特異的なバンドが検出された（図３）。
【０３８４】
実施例５．　組換えアデノウイルスを用いたインビボでの発現
上記のようにして精製された組換えアデノウイルスＡｄ／ｍＡＰ−５またはＡｄ／ＬａｃＺを、１０％グリセロールを含むＰＢＳで２×１０１０ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）／ｍｌに希釈し、それぞれ３匹（Ａｄ／ｍＡＰ−５）または２匹（Ａｄ／ＬａｃＺ）の１３−１４週齢の雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに１００μｌ（２×１０９ｐｆｕ）ずつ尾静脈注射により接種した。接種１日後に各マウスの眼底よりヘマトクリット管で採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍで１５分遠心して血漿を分離し、中性脂肪測定用キット（トリグリセリドＥ−テストワコー、和光製薬（株）社製）を用いて中性脂肪濃度を測定した。Ａｄ／ＬａｃＺ接種マウス群では血中の中性脂肪濃度に有意な差が認められなかったのに対し、Ａｄ／ｍＡＰ−５接種マウス群と他の２群の間には血中の中性脂肪濃度に有意な差が認められた（図４）。
【０３８５】
一方、ファージミドクローン＃ｈ５−１が保持するｃＤＮＡがアデノウイルスベクターに組み込まれたものを有する組換えアデノウイルス（Ａｄ／ｈＡＰ５）で同様の実験を行い、雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに発現させた結果、血中の中性脂肪濃度の有意な上昇がみられ、ヒト型分子がマウス体内でも機能することが判明した（図４）。
【０３８６】
また、これら血中の中性脂肪濃度に有意差が認められたアデノウイルス感染マウス群の肝臓から全ＲＮＡを回収し、実施例１記載の方法でノーザンブロット解析を行ったところ、導入した遺伝子が実際に高発現していることが確認された（図５）。アデノウイルス感染ＫＫ／Ｓａｎマウス群で検出されるバンドは、遺伝子操作を行っていないＫＫマウスで検出されるバンドよりも大きいが、これは組換えアデノウイルスベクター中で有効な転写開始点またはポリ（Ａ）付加シグナルが本来の遺伝子上のものとは異なることに起因すると考えられる。いずれにせよ、組換えアデノウイルスベクターに組み込まれたｃＤＮＡ中の最初の翻訳開始コドンのすぐ５’末端側には、該翻訳開始コドンと同一読み枠上に終始コドンが存在するため、このｍＲＮＡの大きさの違いは翻訳されるアミノ酸配列には影響しない。
【０３８７】
実施例６．　組換えタンパク質の精製およびＮ末端アミノ酸配列の決定
以下に記載する方法に従って、実施例３で作成された、配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するヒトｃＤＮＡが挿入された発現ベクターｐＭＥｈ５５−１で動物細胞を形質転換し、該形質転換細胞の培養上清中に分泌される組換えタンパク質を精製して、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した。
【０３８８】
（１）形質転換体の取得および培養上清の調製
１０％ＦＣＳ（ギブコ・ビーアールエル社製）、１０単位／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン（ギブコ・ビーアールエル社製）を含むαＭＥＭ（ギブコ・ビーアールエル社製）培地でジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−９０９６）を増殖させた後、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６：ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を使用し、ｐＭＥｈ５５−１プラスミドを１μｇ／１０６細胞の割合でトランスフェクトした。具体的には、細胞は２００枚の細胞培養用シャーレ（１５０ｍｍφ、コーニング社製）に１．５×１０７細胞／シャーレで培養し、トランスフェクションにはシャーレ１枚あたり１５μｇのｐＭＥｈ５５−１プラスミドを使用した。トランスフェクション操作後の細胞を上記のＦＣＳを含む培地中で２４時間培養後、培地を無血清αＭＥＭ培地（３０ｍｌ／シャーレ）に交換してから、さらに３日間培養し、無血清培養上清６リットルを回収した。
【０３８９】
（２）組換えタンパク質の精製
１）　カラム（ストリームラインＣ−１００：アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に充填したセファデックスＧ２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１．６リットル分のゲルに、上記（１）で得られた培養上清を６００ｍｌ注入した（流速：２０ｍｌ／分）。次いで、溶離緩衝液（２０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％　アジ化ナトリウム（シグマ社製）、０．０５％　プロテアーゼインヒビター混合液（シグマ社製）、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社製）。以下「Ａ液」という）を流速５０ｍｌ／分でカラムに流し、初めの１５００ｍｌ分の溶出液を回収した。この操作を１０回実施して、上記（１）で得られた６リットルの培養上清の脱塩および低分子除去を行った。
【０３９０】
２）　次に、上記１）で得られた溶出液をＦＰＬＣ装置（バイオパイロットシステム、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用い、以下に記載する条件によりイオン交換クロマトグラフィーを行って分画した。
カラム：　Ｑセファロース・ファストフロー（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１００ｍｌをＸＫ５０／１００カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に充填した。
溶離緩衝液組成：
［Ａ液］　上記参照
［Ｂ液］２０ｍＭ　トリス−塩酸、１Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．０１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビター混合液、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０
流速：　１０ｍｌ／分
分画：　各１０ｍｌ／チューブ
温度：　４℃
溶出条件：　１００％　Ａ液から１００％　Ｂ液への直線濃度勾配（６０分間）塩化ナトリウム濃度　０．３乃至０．４Ｍで溶出された画分を回収した。
【０３９１】
３）　さらに、上記２）のイオン交換クロマトグラフィーで回収された画分について、ＦＰＬＣ装置を用いて、以下に記載する条件の群特異的アフィニティークロマトグラフィーを実施した。
カラム：　アフィゲル　ブルー（バイオラッド社製）１０ｍｌをＸＫ１６／４０カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に充填した。
溶離緩衝液組成：
［Ｃ液］２０ｍＭ　トリス−塩酸、０．５Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．０１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビター混合液、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０
［Ｄ液］２０ｍＭ　トリス−塩酸、１Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．０１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビター混合液、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０
流速：　１．５ｍｌ／分
温度：　４℃
上記２）で回収された画分をカラムに通した後、Ｃ液を６０ｍｌ流して洗浄してから、Ｄ液を１００ｍｌ流して、Ｄ液による溶出液を回収した。
【０３９２】
４）　上記３）で得られた溶出液に等量（１００ｍｌ）のＡ液を加えた。このものについて、ＦＰＬＣ装置を用いて、以下に記載する条件の群特異的アフィニティークロマトグラフィーを実施した。
カラム：　レンチル・レクチン・セファロース４Ｂ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１０ｍｌをＸＫ１６／４０カラムに充填した。
溶離緩衝液組成：
［Ｃ液］　上記参照
［Ｆ液］２０ｍＭ　トリス−塩酸、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．３Ｍ　メチルマンノピラノシド（ｐＨ７．５）、０．０１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビター混合液、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０
流速：　１ｍｌ／分
温度：　４℃
サンプルをカラムに通した後、Ｃ液を５０ｍｌ流して洗浄してから、Ｆ液を５０ｍｌ流して、Ｆ液による溶出液を回収した。
【０３９３】
この溶出液を透析チューブ（排除限界分子量１０ＫＤａ：ギブコ・ビーアールエル社製）に移し、０．０１％　アジ化ナトリウムおよび０．１％　プロテアーゼインヒビター混合液を含むダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬（株）社製）２リットルに対して、４℃で一晩透析した。その後、透析チューブ内の溶液を回収して、そのうち４ｍｌに、４ｍｇ／ｍｌ　デオキシコール酸ナトリウムを含むＴＣＡを１／１０容量（０．４ｍｌ）加え、得られた沈殿を回収し、続いてアセトンを加えて得られた沈殿を回収し、５０μｌの滅菌超純水に溶解した。
【０３９４】
（３）Ｎ末端アミノ酸配列の決定
上記（２）で精製された試料にＰＮＧａｓｅＦ（ニューイングランド・バイオラブ社製）を加え、Ｎ結合型糖鎖を切断した。具体的には、まず５０μｌの試料に６μｌの１０×変性バッファー（ＰＮＧａｓｅＦ試薬に添付）を添加して攪拌し、１０分間煮沸水浴中で加熱した。これを室温に戻した後、６μｌの１０％　ノニデットＰ−４０および６μｌの１０×Ｇ７バッファー（以上ＰＮＧａｓｅＦ試薬に添付）を順に加えて攪拌した。このものにＰＮＧａｓｅＦを３μｌ添加し、攪拌してから３７℃の水浴で２時間以上保温した。
【０３９５】
このＮ結合型糖鎖切断反応後の反応液について、４乃至２０％濃度勾配アクリルアミドゲル（マルチゲル４／２０、第一化学薬品（株）社製）およびミニスラブ式電気泳動装置（日本エイドー（株）社製）を用いた還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。電気泳動後、ゲルメンブラン転写装置（マリソル社製）を用い、ゲル内で分離されたタンパク質を０．２μｍ孔径のポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（バイオラッド社製）に転写した（２ｍＡ／ｃｍ２、４℃で２時間）。転写後の膜を１００％　メタノール（和光純薬（株）社製）で１０秒間濡らした後、超純水で２分間洗浄してから、クーマシー染色液（バイオラッド社製）で５分間染色し、さらに膜をメタノールに浸して２分間脱色した結果、約５０ＫＤａに相当するバンドがみられた。このバンド部分の膜を切り出し、プロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−１０：島津製作所（株）社製）にてＮ末端配列の解析を実施した。
【０３９６】
その結果、上記約５０ＫＤａのバンドのＮ末端アミノ酸配列は
Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ　　（配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７から２７）
であった。このことから、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列にコードされるタンパク質は、哺乳動物細胞では、Ｎ末端の１６個のペプチド（配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６）が切り落とされて、その直後に続くセリン残基（配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７）をＮ末端とする成熟体として分泌されることが明らかとなった。
【０３９７】
参考例３．　組換えタンパク質の精製およびマウスへの投与
実施例６において精製した組換えタンパク質３００μｇを１５週令のＫＫ／Ｓａｎマウス雄４匹に尾静脈投与した。対照として、別の個体４匹にはＰＢＳ（ギブコ・ビーアールエル社製）を投与した（０．５ｍｌ／マウス）。投与１、３、６、２４時間後、それぞれのマウスから７５μｌヘパリン処理済みキャピラリー採血管（フナコシ社製）で眼底採血し、５２００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した（トミー精工（株）社製ＴＨ−１ローター使用）後、血漿を分離し回収した。同様に、精製タンパク質投与前に眼底採血により血漿を分離し、投与前値のサンプルとして回収した。血中の中性脂肪濃度測定は、トリグリグリセライドＥテストワコー（和光純薬（株）社製）を使用した。すなわち、回収した血漿を２μｌずつ９６穴プレート（コーニング社製）に加え、これに発色試薬２００μｌを添加して攪拌後、１０分間室温で静置した。操作終了後、マイクロプレートリーダーで主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度を測定し、主波長の測定値から副波長の測定値を差し引いた値から中性脂肪濃度を算出した。
【０３９８】
その結果を表１に示した。組換えタンパク質の投与により、血中の中性脂肪濃度が上昇することが示された。
【０３９９】
【表１】（単位：ｍｇ／ｄｌ）
2004000101.tif 000002
参考例４．　ベザフィブレート投与による影響
１１週齢の雄Ｚｕｃｋｅｒ　ｆａｔｔｙラット（日本チャールズリバーより購入）２匹に７日間、高脂血症治療剤ベザフィブレート（シグマ社製）をＦ２粉末飼料（船橋農場社製）に０．３％の濃度で混ぜて投与した。対照群のラット（２匹）にはＦ２粉末飼料のみを与えた。両方の条件のラットからそれぞれ血液サンプルを回収した後、肝臓を摘出し、直ちに液体窒素内に入れ急凍した後、−８０℃に保存した。得られた肝臓組織０．１ｇに対し５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製）を加え、超高速ホモジナイザー（ポリトロン、キネマティカ社製）を用いて氷上でホモジナイズを行った（目盛１０で２分間）。これを室温で５分間静置した後、１ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間激しく転倒混和した。再び室温で１０分間静置してから、１２０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した。遠心後、上層を回収し、２．５ｍｌのリボヌクレアーゼ不含イソプロピルアルコールを加えて混和した。これを室温で１０分間静置後、１２０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した後、上清を除去してリボヌクレアーゼ不含７０％エタノールを加えた。これを１２０００×ｇ、室温で５分間遠心分離し、上清を除去して、沈殿を乾燥させてから、−８０℃に保存した。得られたペレットをリボヌクレアーゼを含まない純水に溶解したものを全ＲＮＡ溶液とした。
【０４００】
一本鎖ｃＤＮＡの合成は以下の手順で行った。得られた全ＲＮＡ１μｇにリボヌクレアーゼを含まない純水を加え全量を６μｌとし、１０×ＤＮＡａｓｅ　反応緩衝液（ギブコ・ビーアールエル社製ＤＮａｓｅＩに添付）を１μｌ、ＤＮａｓｅＩ（Ａｍｐグレード、ギブコ・ビーアールエル社製）を１μｌ加え、室温で１５分間保温した後、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ＤＮａｓｅＩに添付）を１μｌ加え、６５℃で１０分間保温した。この溶液に、一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ−ＰＣＲ、ギブコ・ビーアールエル社製）添付のランダムヘキサマープライマーを１μｌ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘを１μｌ加え、６５℃、５分間保温した後、急激に４℃まで冷却し熱変性を行った。引き続き、ｃＤＮＡ合成キット添付の１０×逆転写反応緩衝液を２μｌ、２５ｍＭ　塩化マグネシウムを４μｌ、０．１Ｍ　ジチオスレイトール溶液を２μｌ、リボヌクレアーゼインヒビターを１μｌ加え、２５℃で２分間保温し、その後、添付の逆転写酵素を１μｌ　添加した。このサンプルを２５℃で１０分保温後、４２℃で５０分保温した。さらに７０℃で１５分間保温した後、急激に４℃まで冷却し熱変性を行った。添付のリボヌクレアーゼＨを１μｌ加え、３７℃で２０分間保温してＲＮＡを分解し、−２０℃にて保存した。反応終了後、すべてのサンプルに２９μｌのリボヌクレアーゼを含まない純水を加え、さらにリボヌクレアーゼを含まない純水で５倍希釈したものを下記の定量に用いた。検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液は、対照サンプルの１例の定量用溶液よりリボヌクレアーゼを含まない純水にて５倍ずつの希釈系列を作成することにより調製した。
【０４０１】
一方、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲに用いるプライマーとして、下記の配列：
５’−　ｃａａａｇｃｔｔｇａ　ａａｇｔｃｔａｃｔｇ　ｇａｇｇ　−３’　（配列表の配列番号３０）；および
５’−　ｇｇｔｔｃｔｇａａｃ　ｃａａｇｃｔｇｇｔｃ　ａ　−３’　　（配列表の配列番号３１）
を有するオリゴヌクレオチドを合成した（アマシャム・ファルマシア社に発注）。
【０４０２】
さらに、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲに用いるプローブとして、下記の配列：
５’−　ａａｇａｔｇｇｃｇｃ　ｔｃｃａａｃａｃａｇ　ａｇｔｃａｇ　−３’　（配列表の配列番号３２）
を有し、その５’末端にレポーター色素Ｆａｍ、３’末端にレポーター消光体のＴａｍｕｒａを結合したオリゴヌクレオチドを合成した（ＴａｑＭａｎ　フルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）。また「アンジオポエチン関連タンパク質３」の発現量の標準化をはかる目的で、ラット１８ｓリボゾームＲＮＡの定量を行うこととし、ＴａｑＭａｎ　リボソーマルＲＮＡコントロール・リージェント、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いた。
【０４０３】
これらの材料を用いて、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法による、ラット「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の発現量の定量を行った。ＰＣＲ反応は９６穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）中で行った。反応溶液の組成は１ウェル中、上記方法で得られた一本鎖ｃＤＮＡ溶液５μｌ、ＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）を正方向側、逆方向側ともに０．２μｌ（最終濃度２００ｎＭ）、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用プローブ（６．６μＭ）０．７５μｌ（最終濃度１００ｎＭ）、ＰＣＲ増幅用混合液（ＴａｑＭａｎ　ユニバーサル・ＰＣＲマスター・ミックス、アプライドバイオシステムズジャパン社製）２５μｌ、超純水１８．８５μｌとした。この際、検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液は原液濃度を便宜的に「６２５」とし、以降５倍希釈を繰り返して濃度「６２５」、「１２５」、「２５」、「５」および「１」の溶液について同様に反応液を調製した。ＰＣＲ反応はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器（ＡＢＩ７７００、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて行った。反応は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の反応を４０回繰り返し、１サイクルごとにレポーター色素の発光量を測定した。各サイクルごとのレポーター色素の発光量から１８Ｓリボゾーム、「アンジオポエチン関連タンパク質３」の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸にサイクル数をとった検量線を作成し、各発現定量用サンプルについてはその対数増幅期において任意に設定した一定の発光量を超えたサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の発現量は同一サンプルにおける１８Ｓリボゾームの発現量の値で補正を行った。
【０４０４】
その結果、ラット「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の発現量は、ベザフィブレート投与群において、コントロール群に比べ７３％低下していることが示された。なお、この時用いられたベザフィブレート投与群のラットの血中中性脂肪濃度は、コントロール群に比べて５０％減少していた。
【０４０５】
参考例５．　動脈硬化および血糖値への影響
低脂血症マウスＫＫ／Ｓａｎは配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の変異型（以下「低脂血症変異遺伝子」という）をホモで有し、該ポリペプチドの産生量が先天的に低い。以下に記載する方法に従って動脈硬化モデルマウスまたは高血糖モデルマウスにおける低脂血症変異遺伝子の影響を検討した。
【０４０６】
１）　コンジェニックマウスの作出
ａ）交配様式
ＫＫ／Ｓａｎマウスの雌をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの雄（浜松医科大学附属動物実験施設より入手）と交雑して、戻し交雑第１世代（Ｎ１世代）を作出した。次いで、Ｎ１雌をＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄に再度交雑してＮ２世代を得た。このＮ２個体の尾からゲノムＤＮＡを抽出し、後述ｃ）記載の方法でＰＣＲを行い、低脂血症変異遺伝子をヘテロで持つ個体を選抜した。選抜した雌をさらにＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄と交雑して、Ｎ３世代を作出した。その後、同様の方法でＮ１０世代まで連続して選抜交雑を実施した。次いで、Ｎ１０世代のヘテロの雌雄を交雑し、得られた産児から採取したゲノムについて後述ｃ）記載の方法でＰＣＲを実施して、低脂血症変異遺伝子をホモで持つ雌雄を選抜した。その後、兄妹交配により継代し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景の低脂血症変異コンジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−低脂血症）系統を得た。いずれの動物も温度２３±１℃、湿度５５±１０％、１４時間照明の動物室内で飼育し、ＣＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業（株）製）と７ｐｐｍクロール水を自由摂取させた。
【０４０７】
ｂ）ゲノムＤＮＡの抽出方法
上記ａ）で選抜に用いたマウス（４週齢）より採取した尾（１．５ｃｍ）を８４０μｌの溶解液（７２０μｌの１×ＳＳＣ、８０μｌの１０％　ＳＤＳ、４０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ　プロテイナーゼＫを含む）に浸漬し、５０℃で保温しながら一晩振盪した。次いで、１ｍｇ／ｍｌ　リボヌクレアーゼＡを２０μｌ加えて、５０℃で１時間保温した。その後、フェノール・クロロホルム抽出を２回、エタノール沈殿操作を１回行い、沈殿を１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液１５０μｌに溶解した。その後、分光光度計（Ｕ−３０００、（株）日立製作所製）で２６０ｎｍ波長における吸光度を測定し、滅菌水を加えて濃度を２５ｎｇ／μｌに調整してゲノムＤＮＡ試料とした。
【０４０８】
ｃ）遺伝子型の判定
２種類のマイクロサテライトマーカー検出用プライマーセット（Ｄ４Ｍｉｔ１５およびＤ４Ｍｉｔ２１９、リサーチジェネティクス社製）を用い、サーマルサイクラー（ＰＴＣ−１００、エムジェーリサーチ社製）を使用して以下の条件でＰＣＲを行った。１．５μｌの１０×ＰＣＲバッファー［１００ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ　塩化マグネシウム、５００ｍＭ　塩化カリウムを含む。ロシュ・ダイアグノティクス社製］、２．４μｌの各１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（宝酒造（株）社製）、各０．４５μｌの６．７μＭ　プライマー、０．３５ＵのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に滅菌水を加えて１１μｌとした後、上記ｂ）で調製したゲノムＤＮＡを４μｌ加え、反応液を調製した。この反応液を、まず９４℃で３分間加熱した後、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で４５秒の温度サイクルを３５回繰り返し、さらに７２℃で３分保持してから、４℃で保温した。
【０４０９】
このＰＣＲ後の反応液に色素液（０．１５％　ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）を２μｌ加え、そのうちの５μｌを４％のアガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ　３：１アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ社製）で調製した）で１５０Ｖ、室温で１．５時間乃至２時間、電気泳動した。電気泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色した後、紫外線照射下で目的のＤＮＡに相当するバンドを確認した。プライマーセットＤ４Ｍｉｔ１５で約２８０ｂｐと約３００ｂｐの２種類の断片が増幅され、かつＤ４Ｍｉｔ２１９で約１１０ｂｐと約１２０ｂｐの２種類の断片が増幅されたゲノムを有する個体を「低脂血症変異遺伝子へテロ」、Ｄ４Ｍｉｔ１５で約３００ｂｐの断片のみが増幅され、かつＤ４Ｍｉｔ２１９で約１２０ｂｐの断片のみが増幅されたゲノムを有する個体を「低脂血症変異遺伝子ホモ」とした。
【０４１０】
２）低脂血症変異遺伝子ホモ／ＡｐｏＥホモ欠損個体の作出
ａ）選抜様式
上記１）のａ）で得られたＣ５７ＢＬ／６Ｊ−低脂血症マウスとアポリポタンパク質Ｅ（以下「ＡｐｏＥ」という）ホモ欠損マウス（Ｚｈａｎｇ，　Ｓ．Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８，　４６８−４７１、東京大学医学部器官病態内科学教室より入手）との交雑から交雑第１世代（Ｆ１世代）を作出した。次いで、Ｆ１世代の雌雄を交雑してＦ２世代を得た。Ｆ２世代のうち、ＡｐｏＥをホモで欠損し、低脂血症変異遺伝子をホモで持つ個体（以下「ＡｐｏＥ　ＫＯ−低脂血症マウス」という）と低脂血症変異遺伝子を持たないＡｐｏＥホモ欠損個体（以下「ＡｐｏＥ　ＫＯマウス」という）を下記の方法で遺伝子型を判定することにより選抜した。なお、いずれの動物も上記１）のａ）記載の方法で飼育した。
【０４１１】
ｂ）遺伝子型の判定方法
上記１）のｂ）記載の方法でマウス尾よりゲノムＤＮＡを抽出した。低脂血症変異遺伝子を選抜するために、変異型アレルと野生型アレルにおいてサイズ多型を検出するオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ｇｇｃｔａａａｔａｇ　ｔａａａａｃｃｃｔｇ　ｇｃｇ　−３’　　（配列表の配列番号３３）；および
５’−　ｇｔｇｃｔｔｇｃｔｇ　ｔｃｔｔｔｃｃａｇｔ　ｃｔｔ　−３’　　（配列表の配列番号３４）
を合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを実施すると、低脂血症変異遺伝子では約２４０ｂｐの断片が増幅され、一方変異のない正常遺伝子では、約２３０ｂｐの断片が増幅される。
【０４１２】
また、ＡｐｏＥ欠損を検出するために、欠損型アレル（ネオマイシン耐性遺伝子）を特異的に増幅するための、下記の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ａｇｇａｔｃｔｃｇｔ　ｃｇｔｇａｃｃｃａｔ　ｇｇｃｇａ　−３’　　（配列表の配列番号３５）；および
５’−　ｇａｇｃｇｇｃｇａｔ　ａｃｃｇｔａａａｇｃ　ａｃｇａｇｇ　−３’　（配列表の配列番号３６）
（Ｇａｗ，　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ｌａｂ．　Ａｎｉｍ．　２９，　４４７−４４９参照）
をそれぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを実施すると、鋳型となる遺伝子にＡｐｏＥ欠損変異がある場合のみ２００ｂｐの断片が増幅される。
【０４１３】
さらに、ＡｐｏＥ欠損のない野生型アレルを特異的に増幅するための、下記の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ｔｃｃｃａａｇｔｃａ　ｃａｃａａｇａａｃｔ　ｇａｃ　−３’　　（配列表の配列番号３７）；および
５’−　ｃａｔｃｃａｇａａｇ　ｇｃｔａａａｇａａｇ　ｇｃａ　−３’　　（配列表の配列番号３８）
をそれぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを実施すると、鋳型となる遺伝子にＡｐｏＥ欠損変異がない場合のみ１７４ｂｐの断片が増幅される。
【０４１４】
上記の３セットのプライマーを用いて、上記１）のｃ）に記載した通り、ＰＣＲと電気泳動を実施し、増幅された断片を調べた。その結果、約２４０ｂｐおよび２００ｂｐの断片が検出された個体を「ＡｐｏＥ　ＫＯ−低脂血症マウス」とし、約２３０ｂｐおよび２００ｂｐの断片が検出された個体を「ＡｐｏＥ　ＫＯマウス」として選抜した。
【０４１５】
３）低脂血症変異遺伝子ホモ／レプチン変異遺伝子ホモ個体の作出
ａ）選抜様式
上記１）のａ）で得られたＣ５７ＢＬ／６Ｊ−低脂血症マウスとレプチン変異遺伝子（Ｌｅｐｏｂ）をヘテロで持つＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｅｐｏｂマウス（Ｃｏｌｅｍａｎ，　Ｄ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈｕｍｍｅｌ，　Ｋ．　Ｐ．　（１９７３）　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　９　：２８７−２９３．　浜松医科大学附属動物実験施設より入手）との交雑から交雑第１世代（Ｆ１世代）を作出した。次いで、Ｆ１世代の雌雄を交雑してＦ２世代を得た。Ｆ２世代のうち、レプチン変異遺伝子と低脂血症変異遺伝子をともにホモで持つ個体（以下「ｏｂ−低脂血症マウス」という）と低脂血症変異遺伝子を持たないレプチン変異ホモ個体（以下「ｏｂマウス」という）を下記の方法で遺伝子型を判定することにより選抜した。なお、いずれの動物も上記１）のａ）記載の方法で飼育した。
【０４１６】
ｂ）遺伝子型の判定方法
上記１）のｂ）記載の方法でマウス尾よりゲノムＤＮＡを抽出した。レプチン変異を検出するために、変異型アレルを特異的に増幅するための、下記の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ｔｇａｃｃｔｇｇａｇ　ａａｔｃｔｃｔ　−３’　（配列表の配列番号３９）；および
５’−　ｃａｔｃｃａｇｇｃｔ　ｃｔｃｔｇｇｃ　−３’　（配列表の配列番号４０）；
（Ｎａｍａｅ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｌａｂ．　Ａｎｉｍ．　Ｓｃｉ．　４８，　１０３−１０４参照）
をそれぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを実施すると、鋳型となる遺伝子に変異型アレルがある場合のみ約１００ｂｐの断片が増幅される。
【０４１７】
さらに、レプチン変異のない野生型アレルをを特異的に増幅するための、下記の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ｔｇａｃｃｔｇｇａｇ　ａａｔｃｔｃｃ　−３’　（配列表の配列番号４１）；および
５’−　ｃａｔｃｃａｇｇｃｔ　ｃｔｃｔｇｇｃ　−３’　（前出、配列表の配列番号４０）
をそれぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを実施すると、鋳型となる遺伝子にレプチン変異のない場合のみ約１００ｂｐの断片が増幅される。
【０４１８】
上記の２セットのプライマーおよび上記２）のｂ）に記載した低脂血症変異遺伝子を選抜するための１セットのプライマーを用いて、上記１）のｃ）に記載した通り、ＰＣＲと電気泳動を実施し、増幅された断片を調べた。その結果、約１００ｂｐ（レプチン変異型）および約２４０ｂｐの断片が検出された個体を「ｏｂ−低脂血症マウス」とし、約１００ｂｐ（レプチン変異型）および約２３０ｂｐの断片が検出された個体を「ｏｂマウス」として選抜した。
【０４１９】
４）血清脂質と動脈硬化病変面積の測定
ＡｐｏＥ　ＫＯマウス（雄３匹、２２−２３週齢）およびＡｐｏＥ　ＫＯ−低脂血症マウス（雄３匹、１９−２３週齢）を、いずれも１７時間絶食させた後にエーテル麻酔下で腹大静脈より採血した。次いで血液を３０分放置した後、２０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離を行い、血清を回収した。血清中の中性脂肪濃度についてはトリグリセリドＥ−テストワコー（和光純薬工業（株）社製）を、血清コレステロール濃度についてはコレステロールＣ−テストワコー（和光純薬工業（株）社製）をそれぞれ用いて測定した。
【０４２０】
また、エーテル麻酔下で、各マウスの胸部を切開し、左心室より１単位／ｍｌのへパリンを含む生理食塩液で洗浄した。心臓より大動脈弓部までを取り出し、心臓と大動脈弁部の分岐点が現れるまで脂肪を除去した。脂肪除去後、大動脈直上で切断し、４％中性ホルマリン溶液中で２４時間乃至７日間浸漬固定した。固定後、常法にしたがってパラフィンブロックを作製した。このパラフィンブロックを大動脈弓部側からミクロトームで薄切して、切片に初めて弁が現れてから、５μｍの厚さで連続５枚の切片を採取し、その次の５枚を捨てた。これを１単位として、この方法で全長５００μｍまで薄切した。得られた切片には、ＥｌａｓｔｉｃａＭａｓｓｏｎ染色を施した。
【０４２１】
ＣＣＤカメラ（ＨＣ−２０００、富士写真フィルム（株）社製）を搭載した光学顕微鏡（ＢＸ−５０、オリンパス光学工業（株）社製）下において、ＥｌａｓｔｉｃａＭａｓｓｏｎ染色を施した大動脈弁部横断像をテレビモニター上に映し出し、画像解析プログラム（ＱＷｉｎ、ライカ社製）を用いて病変の境界をトレースし、病変面積を計測した。各個体とも厚さ５０μｍの間隔で合計１０枚の切片について病変面積を計測し、その総和を算出した。
【０４２２】
その結果を表２に示した。
【０４２３】
【表２】
2004000101.tif 000003
以上の結果から、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の変異は、血清脂質の低下とともに動脈硬化病変の進展を抑制することが示された。
５）血糖値の測定
ＡｐｏＥ　ＫＯ（雄９匹、２４週齢）、ＡｐｏＥ　ＫＯ−低脂血症マウス（雄１０匹、２４週齢）、ｏｂマウス（雄１２匹、１７−１８週齢）、およびｏｂ−低脂血症マウス（雄１４匹、１７−１９週齢）を、いずれも１７時間絶食させた後にエーテル麻酔下で腹大静脈より採血した。次いで血液を３０分放置した後、２０００Ｇ、室温で１０分間遠心分離を行い、血清を回収した。血糖値はグルコースＢ−テストワコー（和光純薬工業（株）社製）を用いて測定した。
【０４２４】
ＡｐｏＥ　ＫＯおよびＡｐｏＥ　ＫＯ−低脂血症マウスの結果を表３に、ｏｂマウスおよびｏｂ−低脂血症マウスの結果を表４に示した。
【０４２５】
【表３】
2004000101.tif 000004
【０４２６】
【表４】
2004000101.tif 000005
以上の結果から、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の変異は、ＡｐｏＥ欠損あるいはレプチン変異による高血糖を有意に低下させることが示された。
【０４２７】
実施例７．　モノクローナル抗体の調製
（ａ）　抗原蛋白質の調製
１）生産ＣＨＯ細胞株の作製
ｐＳＲαプロモーター下流（ｐＭＥ１８Ｓプラスミド）にヒトアンジオポエチン関連蛋白質３　ｃＤＮＡが位置する発現ベクターを作製した。この発現ベクターとｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＣＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）−ＭＥＭα（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）−１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン−１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）培地でジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）に共導入し、核酸除去培地において定常株を取得した。次に、本定常株をメトトレキセート０．０８μＭ濃度で生育可能な耐性株を取得し、遺伝子重複による発現量の増加が確認された株を取得した。以後、１．２８、３０、６０μＭのメトトレキセート入り核酸除去ＭＥＭα培地で生育可能な株を取得していき、最終的にコンフルエントな無血清培養の細胞培養用フラスコ上で、５乃至１０ｍｇ／ｌ／３日の生産能を有するアンジオポエチン関連蛋白質３生産ＣＨＯ細胞株を取得した。
このように作製したアンジオポエチン関連蛋白質３生産ＣＨＯ細胞株をコンフルエントまで培養後、無血清ＭＥＭα（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）培地に交換し、３日間培養して無血清培養上清を得た。
２）脱塩、小分子除去
本サンプルをＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１．６リットルのゲルに対して６００ｍｌの割合で２０ｍｌ／ｍｉｎで１０回に分けて、脱塩、小分子を除去した。本サンプルをＦＰＬＣ（Ｂｉｏｐｉｌｏｔ　ｓｙｔｅｍ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーで分画した。
３）分画ＳｔｅｐＩ
カラム：Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をＸＫ５０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１００ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ａ）２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．０１％　ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
Ｂ）２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０．０１％　ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ
フラクション溶液：１０ｍｌ／ｔｕｂｅ
温度：４℃
溶出条件：溶離液Ａ　　⇒　溶離液Ｂ（直線濃度勾配、６０分間）
得られたフラクションについて、各々０．３乃至０．４５Ｍ　ＮａＣｌ濃度で溶出されてくる画分を回収した後、一つの溶液にまとめた。まとめた溶液をサンプルとして、以下の条件で、ＦＰＬＣ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて、群特異的アフィニティークロマトグラフィーを以下の条件で実施した。
４）分画ＳｔｅｐＩＩ
カラム：Ａｆｆｉ　Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ（ＢｉｏＲａｄ）をＫＸ１６（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１０ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ｃ）２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０．０１％ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
Ｄ）２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０．０１％ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４℃
サンプルをアプライ後、Ｃ）液を６０ｍｌを流す。
溶出条件：Ｄ）液を１００ｍｌ流し、一つの溶液として回収した。回収した溶液を等量（１００ｍｌ）のＡ）液と混濁し、作製した２００ｍｌの溶液をサンプルとして以下の条件で、ＦＰＬＣ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いた群特異的アフィニティークロマトグラフィーを以下の条件で実施した。５）分画ＳｔｅｐＩＩＩ
カラム：Ｌｅｎｔｉｌ　ｌｅｃｔｉｎ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をＫＸ１６（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１０ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ｃ）２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０．０１％ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製））
Ｆ）２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ　ＮａＣｌ−０．３Ｍ　　Ｍｅｔｈｙｌｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ｐＨ７．５）−０．０１％　ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製））
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４℃
サンプルをアプライ後、Ｃ）液を５０ｍｌ流す。
溶出条件：Ｆ）液を５０ｍｌ流し、一つの溶液として回収した。
６）透析
回収した液をＤｉａｌｙｓｉｓ　ｔｕｂｉｎｇ−１−７／８　ｉｎ　Ｄｕａｍｅｔｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に移し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（−）（日水製薬社製）、０．０１％　ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．１％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液２リットルで一晩、４℃で透析した。
７）サンプルの確認
透析後、回収したサンプルの濃度は、ＤＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社）、ｗｅｓｔｅｒｎ解析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定し、「アンジオポエチン関連タンパク質３」の蛋白質量を測定した。エンドトキシン濃度はエンドトキシン測定キット（生化学工業）により測定し、２０ｍｇ／ｍｇ以下である事を確認した。このようにして精製した蛋白質を抗原として用いた。
【０４２８】
（ｂ）　免疫マウス脾細胞の調製
８週令のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス３匹にアジュバントとしてフロインド完全アジュバント（ディフコ社）０．５ｍｌを（ａ）で精製した０．５ｍｌ（１００μｇ相当）のアンジオポエチン関連タンパク質３に加え、連結針のついた注射筒内でエマルジョンを形成させた後、皮下注射して免疫した。２回目以降の免疫ではアジュバントとしてフロインド不完全アジュバント（ディフコ社）を用いた。免疫は、約２週間おきに４回行い、２回目の免疫以降、免疫する直前に眼底静脈叢より採血し、血清中の抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」抗体価を以下に述べる固相法による酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で調べた。
【０４２９】
（固相酵素免疫法）９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ヌンク社）の各ウェルに５０ｎｇの精製「アンジオポエチン関連タンパク質３」を分注し、４℃で一晩放置して抗原をプレートウェル底面にコートさせた。プレートを０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製したＢＳＡを１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間放置した。さらに０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄して、これに第一抗体として段階希釈した試料（マウス血清）を３０乃至１００μｌ／ウェル分注し、室温で１時間放置した。その後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオラッド社）の３０００倍希釈液を１００μｌ／ウェル分注し、室温で１乃至２時間放置する。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢパーオキシダーゼ基質液（バイオラッド社；ＴＭＢパーオキシダーゼキット）を１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間保温した後、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェルずつ分注し、ペルオキシダーゼ反応を停止させてから、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社）で４５０ｎｍの吸収を測定し、抗体価を算出した。
【０４３０】
（ｃ）　　マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３）をＴＩＬ培地で培養し、２×１０７以上の細胞を得た。
【０４３１】
（ｄ）　ハイブリドーマの作製
ＤＭＥＭ（日水製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス脾細胞１．４×１０８個とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３）　　１．５×１０７個を混合し、８００ｒｐｍで６分間遠心分離にかけた。沈澱として得られた脾細胞、およびＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３）を混合した細胞群をよくほぐした後、あらかじめＤＭＥＭで５０％に調製したポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００）溶液を２ｍｌ／分となるように一滴ずつ撹拌しながら１分間添加した。次にＤＭＥＭを２ｍｌ／分で１分間、同様にして添加し、この操作をもう一度繰り返した。さらに１６ｍｌのＤＭＥＭを３分間で添加して、８００ｒｐｍで６分間遠心分離した。遠心分離後上清を捨て、３５ｍｌのＴＩＬ培地で懸濁した。
【０４３２】
（ｅ）　ハイブリドーマ群の選別
懸濁液を９６ウェルプレート（コースター社）に１００μｌ／ウェルずつ分注し、７．５％のＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。７日後、５０μｌ／ウェルでＨＡＴ培地を添加した。さらに４日後、同様にして同量のＨＡＴ培地を添加した。その３日後、コロニー状に生育してきた融合細胞のみられるウェルについて培養上清の一部を採取し、抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」抗体価を上記（ｂ）と同様の固相酵素免疫測定法により測定し、それと同時にＨＴ培地へ置き換えた。
【０４３３】
（ｆ）　クローニング
抗体価の認められたウェルについては、限界希釈法によりクローニングを３回繰返し、安定して抗体価の認められたクローンを抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択した。ここで得られたハイブリドーマクローンの１つは、４５Ｂ１と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６３として寄託されている。
【０４３４】
（ｇ）　モノクローナル抗体の精製
抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ４５Ｂ１株の培養上清を回収して、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社）にて濾過滅菌した後、ＭＡｂＴｒａｐ　ＧＩＩ（ファルマシア社）を用いて抗体を精製した。以上の工程を経て抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」モノクローナル抗体ＭＡｂ４５Ｂ１を得た。
【０４３５】
（ｈ）　モノクローナル抗体の抗原特異性
上記（ａ）の１）で作製した「アンジオポエチン関連タンパク質３」生産ＣＨＯ細胞株の無血清培養上清とＣＨＯ細胞の無血清培養上清とをそれぞれ吸着抗原として用いたＥＬＩＳＡにより、Ｍａｂ４５Ｂ１が「アンジオポエチン関連タンパク質３」に特異的であることを確認した。すなわち、「アンジオポエチン関連タンパク質３」生産ＣＨＯ細胞株の無血清培養上清とＣＨＯ細胞の無血清培養上清とをそれぞれ１００μｌずつ９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ヌンク社製）の各ウェルに分注し、４℃で一晩保温して抗体をプレートウェル底面に吸着させた。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μｌ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩保温した。その後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下「ＰＢＳＴ」という）で各ウェルを２回洗浄し、これに、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで段階希釈した抗体産生ハイブリドーマ４５Ｂ１培養上清を１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを５回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで５０００分の１に希釈したＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムバイオサイエンス）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。さらに０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを５回洗浄し、ＡＢＴＳパーオキシダーゼ基質液（ロッシュ・ダイアグノスティクス）を１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間保温した後、４１５ｎｍの吸収を測定した。「アンジオポエチン関連タンパク質３」生産ＣＨＯ細胞株の無血清培養上清を吸着させたウェルでは高い吸光度が見られ抗体の希釈に従って吸光度が減少したのに対し、ＣＨＯ細胞の無血清培養上清を吸着させたウェルでは抗体の希釈によらず低い吸光度しか見られなかった。
【０４３６】
（ｉ）　モノクローナル抗体の分類
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（アマシャム社）を用いて解析した結果、この抗体は、ＩｇＧ１サブクラスの抗体であると同定された。
【０４３７】
実施例８．ＭＡｂ４５Ｂ１を用いた「アンジオポエチン関連タンパク質３」定量系
（ａ）　ウサギ抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」ポリクローナル抗体の作製
アジュバントとしてフロインド完全アジュバント（ディフコ社）０．５ｍｌを実施例７の（ａ）で精製した０．５ｍｌ（１００μｇ相当）の「アンジオポエチン関連タンパク質３」に加え、連結針のついた注射筒内でエマルジョンを形成させた後、雄ウサギの皮下に接種した。２回目以降の免疫ではアジュバントとしてフロインド不完全アジュバント（ディフコ社）を用いた。免疫は、約２週間おきに８回行った。接種後、経時的に部分採血し、抗体価の上昇を調べた。８回目の免疫後７日後に麻酔下で全採血し、５３．５ｍｌの免疫血清を得た。該血清２０ｍｌを、ＭＡｂＴｒａｐ　ＧＩＩキットを用いて精製し、１１５ｍｌの１．６４ｍｇ／ｍｌ　ＩｇＧが得られた。
【０４３８】
以上の工程を経て、ウサギ抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」ポリクローナル抗体（以下「Ｎｏ．１抗体」という）を得た。
【０４３９】
（ｂ）　ＨＲＰ標識Ｆａｂ´化ポリクローナル抗体の作成
１）Ｆ（ａｂ´）２の調製
３０ｍｌの１．６４ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１抗体を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５　０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む）で透析したし、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５　０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む）で濃度を６ｍｇ／ｍｌに合わせた。０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む）にて１０ｍｇ／ｍｌに溶解したブタ胃・ペプシン（シグマ社）２０μｌ（０．２ｍｇ）を０．５ｍｌの６ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１抗体に添加し、３７℃で６時間反応させた。反応液を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　４４（インビトロジェン社）カラム（１．５ｃｍ×４５ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。Ｎｏ．１抗体Ｆ（ａｂ´）２Ｆ画分を２８０ｎｍの吸光度により確認し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。これらの操作を繰り返し、最終的に１１．２ｍｌの２．５ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１　Ｆ（ａｂ’）２抗体が得られた。
【０４４０】
２）Ｆａｂ’の調製
１１．２ｍｌの２．５ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１　Ｆ（ａｂ´）２抗体を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で濃度を５ｍｇ／ｍｌに合わせた。０．４５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１　Ｆ（ａｂ´）２抗体に０．１Ｍ　２−ｍｅｒｃａｐｏｔｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、５０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５０μｌを加え、３７℃、９０分間反応させた。反応液をＵｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　４４（インビトロジェン社）カラム（１．５×４５ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む）、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。Ｎｏ．１　Ｆａｂ´抗体の存在を２８０ｎｍの吸光度により確認した後、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。
これらの操作を繰り返し、最終的に１１．４ｍｌの１．４ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１Ｆａｂ´抗体が得られた。
【０４４１】
３）マレイミドペルオキシダーゼの調製
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（シグマ社）３６．８ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて６．６６ｍｇ／ｍｌに溶解した。Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにてＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）　　ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（シグマ社）を溶解して濃度を７０ｍＭに合わせた。３００μｌの６．６６ｍｇ／ｍｌ西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに３０μｌの７０ｍＭ　Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）　　ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅを加え、３０℃、３０分間反応させた。反応液から沈殿を遠心除去した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５のカラム（１×３０ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０），流速０．４乃至０．６ｍｌ／ｍｉｎ，１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。ペルオキシダーゼを含む画分を４０３ｎｍの吸光度により確認し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。これらの操作を繰り返し、最終的に５．２ｍｌの６．５ｍｇ／ｍｌマレイミドペルオキシダーゼが得られた。
【０４４２】
４）マレイミド化ペルオキシダーゼとＦａｂ´の反応
０．７１ｍｌの１．４ｍｇ／ｍｌのＮｏ．１　Ｆａｂ´抗体に０．２８ｍｌの６．５ｍｇ／ｍｌマレイミド化ペルオキシダーゼを添加し、４℃、２０時間反応させた。反応後、５０ｍＭ　Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅを１０μｌ添加した。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ４４（インビトロジェン社）カラム（１．５×４５乃至１００ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分１．０ｍｌでゲル濾過した。各画分の２８０ｎｍ及び４０３ｎｍにおける吸光度を測定し、さらに各画分のペルオキシダーゼ活性を測定した。各画分に０．２％（ｗ／ｖ）　ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ（シグマ社）を終濃度０．００２％になるように、１０％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを終濃度０．１％になるように添加した後、４℃で保存した。ペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ´の濃度はペルオキシダーゼ活性あるいは４０３ｎｍの吸光度から計算し、１０μｇ／ｍｌ以上の濃度で保存した。これらの操作を繰り返し、最終的に８．６ｍｌの０．７８ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ標識化Ｎｏ．１　Ｆａｂ´抗体を得、以下の実験に用いた。
【０４４３】
（ｃ）「アンジオポエチン関連タンパク質３」定量系の作製
実施例７の（ｇ）で培養上清より得られた精製ＭＡｂ４５Ｂ１を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌに希釈し、これを１００μｌずつ９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ヌンク社製）の各ウェルに分注し、４℃で一晩保温して抗体をプレートのウェル底面に吸着させた。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μｌ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩保温した。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下「ＰＢＳＴ」という）で各ウェルを２回洗浄し、これに、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで段階希釈した試料（精製「アンジオポエチン関連タンパク質３」あるいはヒト血漿）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩保温した。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを７回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ標識化Ｎｏ．１　Ｆａｂ´抗体を１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で３０分間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを９回洗浄し、ＴＭＢパーオキシダーゼ基質液（バイオラッド社　ＴＭＢパーオキシダーゼキット）を１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間保温した後、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェルずつ分注し、ペルオキシダーゼ反応を停止させてから、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）で４５０ｎｍの吸収を測定した。その結果、精製「アンジオポエチン関連タンパク質３」濃度と測定結果が正比例したことから、このＥＬＩＳＡ系により「アンジオポエチン関連タンパク質３」を直線性良く定量可能であることが判明した（図６参照）。ヒト血漿を試料とした場合も該ＥＬＩＳＡ系により検出可能であった。
【０４４４】
実施例９．　アデノウイルスベクターを用いた組換えポリペプチドの産生
（１）ＤＮＡの調製
１）コザック配列の挿入
参考例２記載の、高脂血症の治療または予防剤を試験するための方法において、遺伝子発現量を検出するためにクローニングされたｃＤＮＡに、コザックのコンセンサス配列が付加されたｃＤＮＡクローンを得るため、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｃａｃａａｔｔａａｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｔｔｔａｔｔｇ　−３’（配列表の配列番号４２）
および、制限酵素ＸｈｏＩの特異的認識配列が付加された下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｔｃｔａｇａｇｃｃｔｃｇｔｔｃａｔｔｃａａａｇｃｔｔｔｃｔｇａａｔｃｔｇ　−３’（配列表の配列番号４３）
からなるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ここで、配列番号４２に示されるプライマーの一部は配列表の配列番号５３に示される「アンジオポエチン関連タンパク質３」のｃＤＮＡのヌクレオチド番号２５乃至５５であり、配列番号４３に示されるプライマーの一部は配列表の配列番号５３のヌクレオチド番号１３８５乃至１４１５のアンチセンスに該当する。
【０４４５】
次に、参考例２記載の方法で得られた組換えファージミドｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１に挿入されているヒトｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として開示されているもの）約０．４μｇ／ｍｌを鋳型とし、上記プライマー（それぞれ０．４ｍＭ）、Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社製）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０分の１量）、２ｍＭの塩化マグネシウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは上記サンプルを９４℃で３分間加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の温度サイクル３０回、最後に６８℃で２分間保温の条件で行なった。
【０４４６】
ＰＣＲの結果得られた増幅断片（約１．４ｋｂｐ）を、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）に添付されたプラスミドベクターｐＣＲ２．１へ挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローン（ｐＣＲ／ＫｈＡＰ５）を単離した。ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００、アプライドバイオシステムズ社製）で挿入断片の配列を解析して、ＰＣＲの際に該挿入断片内に変異が生じていないことを確認した。
【０４４７】
次に、ｐＣＲ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、生成した断片のうち、ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするｃＤＮＡを含む断片を、予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した哺乳動物細胞発現ベクターｐＭＥ１８Ｓに挿入することにより、組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を得た。
【０４４８】
２）部分欠失変異体の作製
ａ）カルボキシル末端側領域を欠失した変異体
上記１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＳｐｅＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑端化した後に、ＤＮＡリガーゼ反応を行って再び両端を連結することにより、ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０７番目のアミノ酸残基（セリン）をコードするコドン（ａｔｃ）の後に終止コドン（ｔａｇ）が挿入された組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣを構築した。この組換えプラスミド中の挿入断片のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１１に示す通りである。
【０４４９】
ｂ）アミノ末端側領域を欠失した変異体
上記１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＢｃｌＩおよびＳｐｅＩで消化し、ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０７番目のアミノ酸残基（セリン）までをコードするｃＤＮＡ配列のみを含む断片を除いた後、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ切断末端を平滑端化し、ＤＮＡリガーゼ反応を行って再び両端を連結した。この操作により、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５の中の、ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中の２１乃至２０６番目のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列がプロリンをコードするコドン（ｃｃｔ）で置換された組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤを構築した。この組換えプラスミド中の挿入断片のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１３に示す通りである。
【０４５０】
（２）組換えアデノウイルスの調製
上記（１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣとｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤ中に存在する「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の一部領域欠失変異体をコードする遺伝子が、組込まれた組換えアデノウイルスは、アデノウイルス発現ベクターキット（宝酒造（株）社製）を用いて以下に記載する方法に従って作製した。
【０４５１】
まず、上記で（１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣおよびｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤを、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、得られたそれぞれ約１．４ｋｂおよび約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、切断末端を平滑化した。次に、サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターにより挿入遺伝子が発現されるように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔのＳｗａＩ切断部位にこれらの断片をそれぞれ挿入し、組換えコスミドｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＣＣおよびｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤを調製した。
【０４５２】
これらの組換えコスミドＤＮＡと末端タンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイルス発現ベクターキットに添付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ライフテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）にコ・トランスフェクションして、組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ、Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤを単離し、さらに２９３細胞内で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行うか、または凍結融解を３回繰り返し、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２回繰り返すことによって行った。得られたウイルス液を、１０％　グリセロールを添加したＰＢＳに対して４℃で透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存した。
【０４５３】
（３）組換えアデノウイルスによる目的タンパク質の発現の確認
上記（２）記載の方法で得られた組換えアデノウイルスをＨｅＬａ細胞に感染させて、目的タンパク質の発現を確認した。
【０４５４】
まず、上記（２）記載の方法で得られた組換えアデノウイルスをそれぞれＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２）に約５ｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：多重感染度）で感染させ、無血清培地（ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ））で３乃至４日培養した後の培養上清を回収した。培養上清１ｍｌを１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れ、１００μｌのトリクロロ酢酸溶液（１ｇ／ｍｌ　トリクロロ酢酸、４ｍｇ／ｍｌ　デオキシコール酸）を添加して室温で３分間放置後、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで５分遠心した。上清を除いて、氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分遠心した。上清を除いて、沈殿に再度氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分遠心して、上清を除き、沈殿物を真空乾燥した。この沈殿物をそれぞれ１０μｌの蒸留水に溶解させ、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製した。これら試料をゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％ＳＤＳ）後、転写緩衝液（２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、２０％メタノール）中で４℃、１時間、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに転写した。
【０４５５】
転写したメンブレンは０．５％　スキムミルクを添加したＰＢＳ液中に浸して４℃で一晩ブロッキングし、洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、約２７０ｎｇ／ｍｌの５５−１−Ｎ１抗体または約１μｇ／ｍｌの５５−１−Ｃ１抗体および５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ液中に入れて室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で３回洗浄した。なお、これら抗体はいずれも実施例２記載の方法で取得された。５５−１−Ｎ１抗体はヒト「アンジオポエチン関連タンパク質３」のアミノ末端側に特異的に結合する抗体であり、５５−１−Ｃ１抗体は同じくカルボキシル末端側に特異的に結合する抗体である。
【０４５６】
さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（バイオラッド社製）を５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍希釈した反応液中で室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上に置き、発光試薬溶液（ＥＣＬウエスタン検出試薬。アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１分間浸した後、１時間室温で放置してバックグラウンドを減衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（１０秒間）。このＸ線フィルムを現像した結果、組換えアデノウイルスを感染させたＨｅＬａ細胞において、それぞれ目的のポリペプチドが産生されていることが確かめられた。
【０４５７】
（４）組換えアデノウイルスを接種したＫＫ／Ｓａｎマウスの血中中性脂肪濃度の測定
上記で精製した組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣおよびＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤを１０％　グリセロール添加ＰＢＳで２．０×１０１０ｐｆｕ／ｍｌおよび１．０×１０１０ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、それぞれ３匹の１９週齢の雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに３００μｌずつ尾静脈注射により接種した。また、陰性対照として、１０％　グリセロール添加ＰＢＳを３００μｌずつ３匹の１９週齢の雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに尾静脈注射により接種した。
【０４５８】
接種１日後に、各マウスの眼底よりヘマトクリット管で採血し、卓上遠心機で５２００ｒｐｍで１５分間遠心して血漿を分離し、キット（トリグリセリドＥ−テストワコー。和光製薬（株）社製）を用いて中性脂肪濃度を測定した。
【０４５９】
その結果、Ａｄ／　ＫｈＡＰ５　ＦＬＤ接種マウス群と１０％　グリセロール添加ＰＢＳ接種マウス群では、血中の中性脂肪濃度に有意な差が認められなかった（いずれも５０ｍｇ／ｄＬ以下）のに対し、Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ接種マウス群では血中の中性脂肪濃度の顕著な上昇が認められた（３０００ｍｇ／ｄＬ以上）。
【０４６０】
本実施例の方法において、例えばＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣを接種したマウスに、被験物質を投与し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことができる。
【０４６１】
実施例１０．　融合タンパク質の活性評価
（１）融合タンパク質発現形質転換大腸菌の作製
配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至２０７、同アミノ酸番号１７乃至１９５、または同アミノ酸番号１７乃至１４７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末端にグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）が連結している融合タンパク質（以下、順番にそれぞれ「ＧＳＴ−ＣＣ」、「ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ」および「ＧＳＴ−Ｃ１」という。）を以下に記載する方法に従って調製した。
【０４６２】
まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｃｇｇａａｔｔｃｃｃｔｃｃａｇａａｔｔｇａｔｃａａｇ　−３’（ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌおよびＧＳＴ−Ｃ１共用のセンスプライマー。配列表の配列番号４４）；
５’−　ｃｃｇｃｔｃｇａｇａｃｔａｇｔｃｃｔｔｃｔｇａｇｃｔｇ　−３’（ＧＳＴ−ＣＣ用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号４５）；および
５’−　ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔｇａｃｔａｔｇｃｔｇｔｔｇｇｔｔ　−３’（ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号４６）；および
５’−　ｃｃｇｃｔｃｇａｇｇｔｔａｇｔｔａｇｔｔｇｃｔｃｔｔｃ　−３’（ＧＳＴ−Ｃ１用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号４７）を合成した。
【０４６３】
次に、実施例３記載のｃＤＮＡ（ｐＭＥｈ５５−１）を鋳型とし、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、Ｔｂｒ　ＥＸＴＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、上記サンプルを９４℃で３分間加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の温度サイクル３０回、最後に７２℃で５分間の条件で行なった。
【０４６４】
ＰＣＲではそれぞれについて、約５８０ｂｐ（ＧＳＴ−ＣＣ用アンチセンスプライマー使用）、約５４０ｂｐ（ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ用アンチセンスプライマー使用）および約４００ｂｐ（ＧＳＴ−Ｃ１用アンチセンスプライマー使用）のＤＮＡ断片が増幅した。増幅したＤＮＡ断片を回収し、それぞれについて、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化してからウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて切断末端の脱リン酸化処理を行ったプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＳＴをコードする遺伝子を含む。アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に、このＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した、ＤＮＡ断片をそれぞれ挿入し、３種の挿入断片を含む３種のプラスミドクローンを単離した。ＧＳＴ−ＣＣ用アンチセンスプライマーで増幅した断片を有するプラスミドクローンをｐＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ用アンチセンスプライマーを使用して増幅した断片を有するプラスミドクローンをｐＧＳＴ―ＣＣｄｅｌ、ＧＳＴ−Ｃ１用アンチセンス用プライマーを使用して増幅した断片を有するプラスミドクローンをｐＧＳＴ−Ｃ１と命名した。
【０４６５】
プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１または、挿入断片を含まずＧＳＴのみを発現させるためのコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２のそれぞれで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換は大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルにプラスミドを添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で３０秒間保温し、再び氷上で２分間静置してから、３７℃で１時間振盪培養をすることによって行なった。形質転換後の培養液をアンピシリン添加ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した組換え体のコロニーをピックアップして液体培養し、ＩＰＴＧ誘導による組換えタンパク質の発現を確認した。
【０４６６】
（２）融合タンパク質の調製
１）形質転換大腸菌の培養
プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１及びコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換大腸菌をそれぞれ、アンピシリン入りのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１８時間振とう培養した。培養液の一部を新しい培地に添加し、さらに３７℃にて振とう培養を行なった。６００ｎｍでの吸光度が０．５−０．７に達した時に、最終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル・チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加しさらに４時間振とう培養を継続した。
【０４６７】
２）ｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する大腸菌からの細胞破砕液の調製
コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で形質転換した大腸菌の培養液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理して沈殿した菌体を回収した。回収した菌体を超音波処理用緩衝液（５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ）で懸濁し、懸濁液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理した。沈殿を−８０℃で凍結し、次いで室温にて融解して再度超音処理用緩衝液に懸濁した。懸濁液を氷浴中で超音波破砕器（トミー精工（株）社製ＵＤ−２０１）によって、出力＝５、デューティ＝５０の条件で５分間処理した。超音波処理後の破砕液に最終濃度１％となるようにトリトン　Ｘ−１００を添加し混和し、４℃、１００００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心処理し、上清を回収した。上清はＧＳＴｒａｐカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）中に流した。
【０４６８】
３）ｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１を保持する大腸菌からの細胞破砕液の調製
組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１で形質転換した大腸菌の培養液それぞれを、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心処理し、沈殿した菌体を回収した。沈殿した菌体に対して、洗浄用緩衝液（０．５％　トリトン　Ｘ−１００、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）での懸濁、４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の条件での遠心処理、の操作を３回繰り返し、得られた菌体を８Ｍ　尿素溶液に溶解した。この溶液を室温に１時間放置した後、４℃、１３０００ｒｐｍ、３０分間の遠心処理を行ない上清を回収した。組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１で形質転換した大腸菌の由来の培養液から得られた３種の上清について透析を行なった。透析は、４Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、２Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で一晩の順で行なった。透析後、４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心し、上清をそれぞれＧＳＴｒａｐカラム中に流した。
【０４６９】
４）融合タンパク質の精製
上記の工程を経てＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１またはＧＳＴ−ＣＣｄｅｌが吸着したＧＳＴカラムにＰＢＳを流してカラム内を洗浄して不純物を除去した。次いで、１０ｍＭ　還元型グルタチオン溶液を流して、ＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１又はＧＳＴ−ＣＣｄｅｌを溶出させた。溶出液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にで分離した後、ゲルをクマシー染色して、タンパク質の存在を確認した。また、溶出液をＰＢＳで４℃、一晩透析した。ここで、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換体から精製されたタンパク質がＧＳＴであり、以下同様にｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−Ｃ１、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ由来のタンパク質がそれぞれ、ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌである。
【０４７０】
（３）血中中性脂肪濃度上昇活性
上記（２）で得られたＧＳＴ、ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌおよびＧＳＴ−Ｃ１を、ＰＢＳでタンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌに調整した後に、それぞれ３匹、４匹、２匹および５匹の１９週齢の雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに３００μｌずつ尾静脈注射により接種した。採血は摂取前と摂取３０分後に行なった。ヘマトクリット管で各マウスの眼底より採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍ、１５分間遠心して血漿を分離し、接種前後における血中中性脂肪（トリアシルグリセロール）濃度を測定した。
【０４７１】
その結果を図８に示した。図８のグラフ中、縦軸は、血漿１００ｍｌ中の中性脂肪（トリアシルグリセロール）量を示している。横軸は各融合タンパク質を示す。ＧＳＴ接種マウス群（図８の「ＧＳＴ」）では接種前後で差が認められなかったのに対し、ＧＳＴ−Ｃ１接種マウス群（図８の「Ｃ１」）では若干ながら血中中性脂肪濃度の上昇が認められた。一方、ＧＳＴ−ＣＣおよびＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ接種マウス群（図８の「ＣＣ」および「ＣＣｄｅｌ」）では血中中性脂肪濃度の顕著な上昇が認められた。
【０４７２】
本実施例の方法において、例えばＧＳＴ−ＣＣあるいはＣＣｄｅｌを接種したマウスに、被験物質を投与し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことができる。
【０４７３】
実施例１１．　ＬＰＬ活性測定法
（１）ラット脂肪細胞由来ＬＰＬを用いる方法
１）ＬＰＬ試料の調製
ラット白色脂肪前駆細胞（ホクドー社より購入）を増殖用培地［１０％　ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）、１００単位／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ　（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭ　オクタン酸および５０ｎＭ　トリヨードチロニンを含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）］の入った細胞培養用フラスコ（培養面積２５ｃｍ２）中で３７℃で２４時間培養した後、培地を分化誘導用培地（１０％　ＦＣＳ、１００単位／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ　（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭ　オクタン酸、５０ｎＭ　トリヨードチロニン、１０μｇ／ｍｌ　インスリンおよび２．５μＭ　デキサメタゾンを含むＤＭＥＭ）に交換し、３７℃でさらに４８時間培養した。その後、脂肪細胞維持培地（１０％　ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ　（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭオクタン酸、５０ｎＭ　トリヨードチロニンおよび１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含むＤＭＥＭ）に交換し、２乃至３日目に１０％　ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ　インスリンおよび１０単位／ｍｌ　ヘパリンナトリウムを含有するＤＭＥＭ培地を２ｍｌ加え、１時間培養した後、この培養上清を回収してＬＰＬ活性の測定に用いた。
【０４７４】
２）ＬＰＬ活性測定
ＬＰＬ活性の測定法は、文献記載の方法（Ｎｉｌｓｓｏｎ−Ｅｈｌｅ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓｃｈｏｔｚ，　Ｍ．　Ｃ．（１９７６）　Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．　１７，　５３６−５４１）に従った。なお、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（アンジオポエチン関連タンパク質３。）は、実施例６記載の方法に従って調製した。
【０４７５】
まず、上記１）記載の方法で調製した培養上清１００μｌを等量の基質溶液［２ｍＭ　グリセロール・トリ［９，１０（ｎ）−３Ｈ］オレイン酸（１３１ＫＢｅｑ／μｍｏｌ、アマシャム社製）、０．１８９μｇ／ｍｌ　Ｌ　α−ホスファチジルコリン（シグマ社製）、１４ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、１４０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）非働化ＦＣＳ］と混合し、そこへ精製したアンジオポエチン関連タンパク質３を加え、３７℃で１２０分間保温した。その後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ　炭酸カリウム・ほう酸緩衝液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメタノール：クロロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：１００（ｖ／ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌した後、３０００×ｇで１５分間遠心分離した。水−メタノール層の３Ｈカウントを液体シンチレーションカウンターにて測定した。ＬＰＬ活性の１単位は、１μｍｏｌの脂肪酸を１分間に生成する活性として定義した。その結果を表５に示した。
【０４７６】
【表５】
2004000101.tif 000006
アンジオポエチン関連タンパク質３はＬＰＬの活性を用量依存的に抑制した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
（２）　マウスヘパリン静注後血漿を用いる方法
Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスにヘパリンナトリウムを尾静脈投与し（１００単位／ｋｇ）、１０分後に腹大動脈より採血を行ない、遠心分離によりヘパリン静注後血漿を調製し、ＬＰＬ活性測定に使用した。ただし、血漿を用いた場合、上記（１）の２）に記載の条件で測定を行うと、血漿中に含まれる肝臓由来のＨＴＧＬとＬＰＬとの両リパーゼ活性が測定される。そこで、それらを分別して測定するために、まず、上記（１）の２）に記載の条件でリパーゼ反応を行ってリパーゼ活性を測定し、得られた結果を「総リパーゼ活性」とした。一方、別に、終濃度１Ｍとなるように塩化ナトリウムを反応液に加えることによりＬＰＬを不活化した条件でリパーゼ反応を行い、血漿中に残存するＨＴＧＬのリパーゼ活性のみを測定した。このようにして得られた総リパーゼ活性からＨＴＧＬ活性を差し引いた値をＬＰＬ活性とした。その結果を表６に示した。
【０４７７】
【表６】
2004000101.tif 000007
アンジオポエチン関連タンパク質３は、マウスヘパリン静注後血漿中のＬＰＬおよびＨＴＧＬの両者に対してその活性をイン・ビトロで阻害することが明らかになった。この実験系において、総リパーゼ活性を測定するためのリパーゼ反応時に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬまたはＨＴＧＬのいずれかの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。同様に、ＨＴＧＬ活性を測定するためのリパーゼ反応時に被験物質を添加すれば、該物質がＨＴＧＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
【０４７８】
実施例１２．　融合タンパク質のＬＰＬ活性阻害効果
ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌまたはＧＳＴを用いてアンジオポエチン関連タンパク質３の代わりに用いて実施例１１の（１）記載の方法でＬＰＬの活性を測定した。
ＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）を添加したときのＬＰＬ活性を１００％とし、ＧＳＴ−ＣＣあるいはＧＳＴ−ＣＣｄｅｌを添加したときの相対的ＬＰＬ活性を算出した。その結果を表７に示した。
【０４７９】
【表７】
2004000101.tif 000008
ＧＳＴ−ＣＣおよびＧＳＴ−ＣＣｄｅｌはＬＰＬの活性を用量依存的に抑制した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
【０４８０】
実施例１３．　ヒスチジンタグが付加されたポリペプチドの調製とＬＰＬ阻害活性
（１）ヒスチジンタグが付加されたポリペプチドの調製
「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸）をコードするコドンの直後にヒスチジンタグが挿入され、かつアミノ末端から２０８番目以降のアミノ酸配列を欠失したポリペプチドＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓを、以下に記載する方法に従って調製した。
【０４８１】
１）ヒスチジンタグの挿入
「アンジオポエチン関連タンパク質３」の前駆体のアミノ酸配列のアミノ末端から２０番目（成熟体のアミノ酸配列の４番目）に相当するアミノ酸（アスパラギン酸）のカルボキシル末端側に、ヒスチジンタグ（配列表の配列番号２６のアミノ酸番号２１乃至２８に示されるアミノ酸配列）が挿入されるように、実施例９の（１）の１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を改変した。
【０４８２】
まず、一部が相補的な、下記のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
５’−　ｇａｔｃｃｇｃａｔｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔ　−３’（配列表の配列番号４８）および
５’−　ｇａｔｃａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｃｇ　−３’（配列表の配列番号４９）
を合成し、さらに合成ＤＮＡ末端リン酸化試薬フォスファリンク（アプライドバイオシステム社製）を用いて５’末端をリン酸化した。これらをアニーリングさせたものを、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＢｃｌＩで完全に消化して得られた約４．２ｋｂの断片に挿入した。その結果として、上記のアニーリングさせたオリゴヌクレオチドが３単位連結したＤＮＡが、ＢｃｌＩ切断部位に挿入されたプラスミドクローンが得られた。次に、このクローンをＢｃｌＩで消化したものに、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５をＢｃｌＩで完全に消化して得られる約１８０ｂｐの断片を挿入することにより、プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６を得た。
【０４８３】
プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６には、ヒスチジンタグをコードする配列が３単位含まれており、その中の３’末端側の２単位は、目的とは逆の方向に連結された余分な配列である。この配列を省いた断片をＰＣＲにより増幅するために、センス／アンチセンス兼用プライマーとして、以下のヌクレオチド配列：
５’−ｇａａｔｔｇａｔｃａｇｃａｔｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｃｇａｔｃ−３’（配列表の配列番号５０）
からなるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。次いで、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６（０．４μｇ／ｍｌ）を鋳型とし、上記プライマー（０．４ｍＭ）、Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社製）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０分の１量）、２ｍＭの塩化マグネシウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、まず９４℃で２分加熱した後に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間保温するという条件で行なった。
【０４８４】
ＰＣＲの結果得られた増幅断片（２６８ｂｐ）をＢｃｌＩで消化した後、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５をＢｃｌＩで完全に切断して得られた約４．２ｋｂの断片に挿入した。以上の操作により、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５に挿入されているｃＤＮＡ配列中に存在する２ヶ所のＢｃｌＩ切断部位のうち、上流側の切断部位に、ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列（配列表の配列番号２５のヌクレオチド番号７８乃至１０１）が挿入されたＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを得た。
【０４８５】
２）カルボキシル末端側を欠損した改変体の作製
上記１）で得られたプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを制限酵素ＳｐｅＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑化した後に、ＤＮＡリガーゼ反応を行って再び両端を連結することにより、「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０７番目のアミノ酸残基（セリン）をコードするコドン（ａｔｃ）の後に終止コドン（ｔａｇ）が挿入され、またアミノ末端から２０番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸）をコードするコドンの直後にヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列が挿入されたＤＮＡ（配列表の配列番号２５）を含む組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓを構築した。
【０４８６】
３）ＣＯＳ−１細胞での発現
直径１５０ｍｍ組織培養用シャーレ（コーニング社製）に、ＣＯＳ−１細胞（０．５×１０６細胞）を懸濁した１０％　ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という。ギブコ社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という。ギブコ社製）３０ｍｌを入れて、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間培養した。その後、培地を除去してから、トランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００１８０μｌとＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ溶液（いずれもギブコ社製）　３ｍｌとを混濁したもの）に３６μｇのｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓを加えて混ぜたものをＣＯＳ−１細胞に加えることにより、トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間静置した。以上の操作をシャーレ１３０枚分のＣＯＳ−１細胞に対して実施し、総計約４．４Ｌの培養上清を集めた。この培養上清を、０．２２μｍセルロースアセテート製ボトルトップフィルター（コーニング社製）を用いて吸引ろ過して、ろ液を回収した。
【０４８７】
４）発現量、濃度の確認
上記３）で回収されたろ液の一部と、実施例６に記載の方法で精製された「アンジオポエチン関連タンパク質３」についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にウェット法で転写した（０．２Ａ、９０分、４℃）。このニトロセルロース膜を、５％　スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を含むＰＢＳ−０．０５％　ツイーン２０溶液（以下「ＰＢＳ−Ｔ」という）に一晩浸してブロッキングを行った。次いで、ニトロセルロース膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ウエスタンブロットを行った。一次抗体には実施例２記載の５５−Ｎ１抗体を、二次抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を使用した。５５−Ｎ１抗体が特異的に結合したバンドの検出には、ＥＣＬ試薬（アマシャム社製）を用いた。その結果、上記３）で得られたろ液中には約１．０乃至１．５ｍｇ／リットル（全ろ液中に４．４乃至６．６ｍｇ）のＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓが含まれていることが明らかになった。
【０４８８】
５）ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓの精製
上記３）で得られたろ液の全量について、限外ろ過装置（ＴＩＦＦラボスケールおよび３０ＫＤａ孔径の限外ろ過膜（いずれもミリポア社製））を用いて、４４０ｍｌとなるまで限外濃縮した。さらに、得られた試料に、限外ろ過装置中で２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．１％　アジ化ナトリウムおよび０．０５％　プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）を含む緩衝液（ｐＨ７．４）４リットルを徐々に加えながら限外ろ過を続行することにより、溶媒が該緩衝液に置換された試料を得た（液量６００ｍｌ）。
【０４８９】
一方、キレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング　５ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル　５ｍｌを約５ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させた。このカラムに超純水を流して洗浄した後、ＨＰＬＣ送液システム（アマシャム社製）に装着して、以下に記載する条件で試料のアフィニティー精製を行った。
【０４９０】
溶媒：
Ａ液：　２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
Ｂ液：　２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍイミダゾール（ｐＨ７．４）、０．１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
流速：　５ｍｌ／分
精製手順：　試料６００ｍｌをカラムに流した後、Ａ液　８０％、Ｂ液　２０％の緩衝液（０．１Ｍ　イミダゾール濃度に相当）５０ｍｌを流して非吸着物を洗浄除去した。その後、Ｂ液　５０ｍｌをカラムに流し、ヒスチジンタグを有するポリペプチドを溶出させ、溶出液を回収した。この溶出液にＡ液２００ｍｌを加えて、イミダゾール濃度０．１Ｍの溶液としたものを、第２回のアフィニティー精製用試料とした。
【０４９１】
小スケールのキレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング　１ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル　５ｍｌを約１ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させ、次いで超純水を流して洗浄した後、カラムをＨＰＬＣ送液システムに装着し、試料を流してから、カラムをＨＰＬＣから取り外した。次いで、２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ　イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を、１ｍｌ／分の流速で１ｍｌカラムに手動で流して、非吸着物を洗浄除去した。その後、２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．３Ｍ　イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を同様に１ｍｌ／分の流速で流し、溶出液を１ｍｌずつ、５分画（計５ｍｌ）回収した。
【０４９２】
回収した溶出液をそれぞれ透析チューブ（ギブコ社製）に入れて、５００ｍＬのＰＢＳ（ギブコ社製）に対して透析を行った。透析膜外液であるＰＢＳは、３回交換した。最後の透析膜外液を一部採取して、ＬＰＬ活性評価の際の陰性対照試料とした。
【０４９３】
回収した試料中のタンパク質濃度を、プロテインアッセイ（ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を使用）やＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で見積もった結果、計１．８ｍｇのＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓが得られたことが判明した。そして、下記のＬＰＬ活性評価には、第２回のアフィニティー精製により得られた第２および第３の分画をまとめたものを用いた。
【０４９４】
（２）ＬＰＬ活性の測定
上記（１）の５）で得られたＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓ試料を、ＧＳＴ−ＣＣの代わりに用いて、実施例１１の（１）記載の方法でＬＰＬ活性を測定した。その結果を表８に示す。
【０４９５】
【表８】
2004000101.tif 000009
ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓは、ＬＰＬ活性を強く阻害した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
【０４９６】
（３）血中中性脂肪濃度の低下作用
実施例１０の（３）記載の方法に従って、ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓをＫＫ／Ｓａｎマウスに尾静脈投与した（１００μｇ／マウス）。投与前と投与後のマウスから末梢血を採取して中性脂肪濃度を測定した。その結果、投与前のマウスでは血中中性脂肪濃度が４０．５ｍｇ／ｄｌであったのに対し、ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓ投与３０分後では１０６．０ｍｇ／ｄｌに上昇していた。溶媒のみを投与した対照群の投与３０分後の血中中性脂肪濃度は４１．３ｍｇ投与群であった。以上の結果より、ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓは血中中性脂肪濃度を有意に上昇させることが確かめられた。
【０４９７】
実施例１４．ヘパリン結合部位に変異を導入したアンジオポエチン関連タンパク質３の血漿トリグリセリドに対する効果
（１）ヘパリン結合モチーフに変異を導入したアンギオポエチン関連蛋白−３（ＡＲＰ３）のＮ末２０７アミノ酸部分蛋白の構築
実施例１３の２）記載のプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断して得られる約１．４ｋｂｐの断片を単離し、宝酒造製のＭｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍキットに添付のプラスミドｐＫＦ１８ｋのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断点に挿入した。変異導入用プライマーＧＴＣＡＴＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＧＧＣＣＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＣを用い、キットの説明書に従って変異を導入し、プラスミドｐＫＦ１８／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを得た。得られたプラスミドクローンの塩基配列を決定して、変異導入が行われたことおよび他の部分に変異が入っていないことを確認した。結果として、配列表の配列番号１２の６２番目のヒスチジン、６３番目リジン、６５番目のリジンがそれぞれイソロイシン、アスパラギン、アスパラギンへ置換した蛋白をコードするＤＮＡ配列が作製された。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断して約１．４ｋｂｐの断片を単離し、高発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（Ｈａｒａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）　ＥＭＢＯ．Ｊ．　１１，　１８７５−、横田崇、新井賢一編集、バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社、ｐ１８−２０）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断点に挿入した（ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ））。
【０４９８】
（２）ヘパリン結合モチーフに変異を導入したアンギオポエチン関連蛋白−３（ＡＲＰ３）のＮ末２０７アミノ酸部分蛋白の活性に関する検討
１）マウス血漿中トリグリセリド濃度上昇活性
Ａ）組換えアデノウイルスの作製
ＡＲＰ３のＮ末２０７アミノ酸部分蛋白（ＡＲＰ３　ＣＣ）およびヘパリン結合モチーフに変異を導入したＡＲＰ３のＮ末２０７アミノ酸部分蛋白（ＡＲＰ３　ＣＣ（−ＨＢ））を強制発現させるため組換えアデノウイルスは、市販のキット（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いて作製した。すなわち、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓあるいはｐＫＦ１８／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／ＨｉｓをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、得られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片の末端を平滑化したものを挿入ＤＮＡ断片として以下の操作に用いた。
【０４９９】
また、サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターにより発現されるように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）の制限酵素ＳｗａＩ認識部位にインサートＤＮＡ断片を挿入したコスミドｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓおよびｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを作製した。ｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓ　ＤＮＡあるいはｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓ　ＤＮＡと末端タンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ライフテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）にコ・トランスフェクションして、組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓおよびＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを単離し、さらに２９３細胞中で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行い、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２回繰り返すことによって行った。得られたウイルス液を、１０％　グリセロールを添加したＰＢＳに対して４℃で透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存した。
【０５００】
Ｂ）組換えアデノウイルスのマウス接種後の血漿中トリグリセリド濃度
上記のようにして精製された組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓおよびＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを、１０％グリセロールを含むＰＢＳで２×１０１０ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、それぞれ２匹（Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓ）または３匹（Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓ）の２０−２１週齢の雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに２００μｌ（５×１０９ｐｆｕ）ずつ尾静脈注射により接種した。接種前、接種１、２、４、７、１１、１４日後に各マウスの眼底よりヘマトクリット管で採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍ１５分遠心して血漿を分離した。接種後１日後の血漿１μｌを２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製した。試料を中でゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％　ＳＤＳ）後、転写緩衝液（２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、２０％メタノール）中で４℃、１時間、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに転写した。転写したメンブレンは０．５％　スキムミルクを添加したＰＢＳ液で４℃で一晩ブロッキングし、洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、２７０ｎｇ／ｍｌの実施例２記載の５５−１−Ｎ１抗体および５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ液中に入れて室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で３回洗浄した。さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（アマシャム・バイオサイエンス社製）を５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍希釈した反応液中で室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液に１分間浸した後、Ｘ線フィルムを感光させた。その結果、組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓを感染させたマウス血漿中およびＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを感染させたマウス血漿中に特異的なバンドが検出された（図９）。
【０５０１】
続いて中性脂肪測定用キット（トリグリセリドＥ−テストワコー、和光製薬（株）社製）を用いて中性脂肪濃度を測定した。Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓ接種マウス群では血中の中性脂肪濃度が顕著に上昇したのに対し、Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓ接種マウス群では血漿中の中性脂肪濃度はほとんど上昇しなかった（図１０）。
【０５０２】
２）リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）阻害活性
Ａ）組換えタンパクの調製
ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓあるいはｐＫＦ１８／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／ＨｉｓをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬（インビトロジェン社製）を用いて、ＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）に導入し、血清非添加のダルベッコ改変イーグル培地で４日培養した後に培養上清を回収した。培養上清をＴＩＦＦラボスケール（ミリポア社）で３０Ｋのフィルター（ミリポア社）を用いて、約１０分の１量に限外濃縮した。濃縮したサンプルは、１０倍量の５０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーで循環させて、本組成のバッファーに置換した。バッファー置換したサンプルは、予め０．５ｍｌの０．１Ｍ硫酸ニッケルで処理し、５０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーに置換したＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に結合させた後、１００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーで洗浄し、３００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーで溶出した。得られた溶出サンプルを１，０００倍量のＰＢＳ（―）（シグマ社）で３回透析したものをそれぞれ組換えタンパクＡＲＰ３ＣＣ、ＡＲＰ３　ＣＣ（−ＨＢ）とした。
【０５０３】
Ｂ）ＬＰＬ阻害活性
上記で得られた組換えタンパク質のＬＰＬ阻害活性を実施例１１）の（１）の２）記載の方法で検討した。ＡＲＰ３　ＣＣ（―ＨＢ）のＬＰＬ阻害活性はＡＲＰ３　ＣＣのＬＰＬ阻害活性に比べて著しく低かった（図１１）。
【０５０４】
以上より、ＡＲＰ３　ＣＣ（―ＨＢ）はＡＲＰ３の機能阻害剤のスクリーニングの際の陰性対照として利用できる。
【０５０５】
実施例１５．ヒスチジンタグ付加蛋白発現アデノウイルスベクターを接種したマウスの血漿の調製
（１）組換えアデノウイルスの調製
アデノウイルス発現ベクターキット（宝酒造（株）社製）を用いて、以下の方法にしたがって、組換えアデノウイルスを作製した。実施例１３の（１）の１）で得られた、組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、切断末端を平滑化した。次に、サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターにより挿入遺伝子が発現されるように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔのＳｗａＩ切断部位にこれらの断片をそれぞれ挿入し、組換えコスミドｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを調製した。
【０５０６】
この組換えコスミドＤＮＡと末端タンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイルス発現ベクターキットに添付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ライフテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）にコ・トランスフェクションして、組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを単離し、さらに２９３細胞内で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行うか、または凍結融解を３回繰り返し、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２回繰り返すことによって行った。得られたウイルス液を、１０％　グリセロールを添加したＰＢＳに対して４℃で透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存した。
【０５０７】
（２）組換えアデノウイルスによる目的タンパク質の発現の確認
上記（１）記載の方法で得られた組換えアデノウイルスをＨｅＬａ細胞に感染させて、目的タンパク質の発現を確認した。
【０５０８】
まず、上記（１）記載の方法で得られた組換えアデノウイルスをそれぞれＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２）に約５ｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：多重感染度）で感染させ、無血清培地（ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ））で３乃至４日培養した後の培養上清を回収した。培養上清１ｍｌを１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れ、１００μｌのトリクロロ酢酸溶液（１ｇ／ｍｌ　トリクロロ酢酸、４ｍｇ／ｍｌ　デオキシコール酸）を添加して室温で３分間放置後、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで５分遠心した。上清を除いて、氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分遠心した。上清を除いて、沈殿に再度氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分遠心して、上清を除き、沈殿物を真空乾燥した。この沈殿物をそれぞれ１０μｌの蒸留水に溶解させ、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製した。これら試料をゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％ＳＤＳ）後、転写緩衝液（２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、２０％メタノール）中で４℃、１時間、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに転写した。
【０５０９】
転写したメンブレンは０．５％　スキムミルクを添加したＰＢＳ液中に浸して４℃で一晩ブロッキングし、洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、約２７０ｎｇ／ｍｌの実施例２記載の５５−１−Ｎ１抗体および５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ液中に入れて室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で３回洗浄した。
【０５１０】
さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（バイオラッド社製）を５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍希釈した反応液中で室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上に置き、発光試薬溶液（ＥＣＬウエスタン検出試薬。アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１分間浸した後、１時間室温で放置してバックグラウンドを減衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（１０秒間）。このＸ線フィルムを現像した結果、組換えアデノウイルスを感染させたＨｅＬａ細胞において、目的のポリペプチドが産生されていることが確かめられた。
【０５１１】
（３）組換えアデノウイルスを接種したＫＫ／Ｓａｎマウス血漿の調製
上記（１）で精製した組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを１０％グリセロール添加ＰＢＳで７．２×１０９ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、５匹の１８週齢の雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに３００μｌずつ尾静脈注射により接種した。
【０５１２】
接種２日後に、各マウスの腹大動脈より６０μｌの１％ＥＤＴＡを予め入れた注射筒（テルモ社製の２６ゲージの注射針および１ｍｌのシリンジ）を用いて採血し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、転倒混和後に、卓上遠心機で５２００ｒｐｍで１５分間遠心して血漿を分離した。
【０５１３】
（４）ＫＫ／Ｓａｎマウス血漿中目的タンパク質の精製
得られた血漿を１０ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ、４℃で４日間透析後、ＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）へ添加し、２０ｍＭイミダゾール／ＰＢＳおよび１００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ洗浄を行った。溶出は３００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳで行い、各フラクションはゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％　ＳＤＳ）後、ＧｅｌＣｏｄｅ染色（Ｐｉｅｒｃｅ社）を行い目的タンパク質の有無を確認した。
【０５１４】
（５）ＫＫ／Ｓａｎマウス血漿中目的タンパク質切断点の同定
Ｈｉｓ−ｔａｇアフィニティー精製で得たヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」画分に終濃度１０　ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ　（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）を加えて還元した後、終濃度５５　ｍＭ　ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ　（Ｗａｋｏ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を加えアルキル化反応を行った。その後Ｌｙｓｙｌ　Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　（Ｗａｋｏ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を加えて３７　℃で一晩消化、またはＰＮＧａｓｅ　Ｆ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，　Ｂｅｖｅｒｌｙ，　ＭＡ）で３７　℃、２時間糖鎖除去処理を行った後、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｇｒａｄｅ　Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｇｌｕ−Ｃ　（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）を加えて３７　℃で一晩消化した。消化反応液に０．０５　％　ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ　／　Ｈ２Ｏを加えＬＣ／ＥＳＩ　ＭＳ／ＭＳ　（ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔａｎｄｅｍ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）測定の試料とした。ＬＣには逆相クロマトグラフィー担体Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ−２　（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を詰めた自作のエレクトロスプレーニードルをカラムとして用い、ＣａｐＬＣ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｗａｔｅｒｓ，　Ｍｉｌｆｏｒｄ，　ＭＡ）で送液した。溶出溶媒としてＡ液：０．０５　％　ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ　／　Ｈ２Ｏ　、Ｂ液：０．０５　％　ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ　／　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ　を使用し、１時間で０　％から３０　％　までＢ液濃度を直線的に上げるグラジエント溶出を行った。溶出液は直接Ｑ−Ｔｏｆ２　（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，　Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，　ＵＫ）に導入してＥＳＩ　ＭＳ／ＭＳ　測定を行った。
【０５１５】
得られたＭＳスペクトルからヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のペプチドマッピングを行ったところ、Ｌｙｓｙｌ　Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅで消化したサンプルにはヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」に由来するＥＩＥＮＱＬＲＲＴＳＩＱＥＰＴＥＩＳＬＳＳＫＰＲ（アミノ酸残基１９８−２２１）、ＥＩＥＮＱＬＲＲＴＳＩＱＥＰＴＥＩＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲ（１９８−２２４）という２本のペプチドが、ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｇｌｕ−Ｃで消化したサンプルにはＩＳＬＳＳＫＰＲ（２１４−２２１）、ＩＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲ（２１４−２２４）という２本のペプチドが存在した。これらのペプチドのカルボキシル末端はこの２種の酵素の基質認識部位ではない。従ってヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」の血中切断部位としてＡｒｇ２２１とＡｌａ２２２の間およびＡｒｇ２２４とＴｈｒ２２５の間の２ヶ所を確認した。
【０５１６】
実施例１６．　融合アンジオポエチン関連タンパク質４の活性評価
（１）融合タンパク質の調製
配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至１４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末端にグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）が連結している融合タンパク質（以下、「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ」という）を以下に記載する方法に従って調製した。
【０５１７】
まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｃｃｃｇｔｇｃａｇｔｃｃａａｇ−３’（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ用のセンスプライマー。配列表の配列番号５１）；および
５’−　ｃｃｇｃｔｃｇａｇｃｔｇｇｃｔｔｔｇｃａｇａｔｇｃｔｇ−３’（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号５２）を合成した。
【０５１８】
次に、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入したｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ（ｃｌｏｎｅ　４１４９０３９）を鋳型とし、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、上記サンプルを９４℃で３分加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返した後、最後に７２℃で７分間の条件で行なった。
【０５１９】
ＰＣＲで増幅した約３７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化した。ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化してからウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて切断末端の脱リン酸化処理を行ったプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＳＴをコードする遺伝子を含む。アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）にこの断片を挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローンを単離した。このプラスミドクローンをｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎと命名した。
【０５２０】
組換えプラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ、または、挿入断片を含まずＧＳＴのみを発現させるためのコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転換した。形質転換は大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにプラスミドを添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で３０秒間保温し、再び氷上で２分間静置してから、３７℃で１時間振盪培養をすることによって行なった。形質転換後の培養液をアンピシリン添加ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した組換え体のコロニーをピックアップして液体培養し、ＩＰＴＧ誘導による組換えタンパク質の発現を確認した。
【０５２１】
（２）融合タンパク質の調製
１）形質転換大腸菌の培養
プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ、コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換大腸菌をそれぞれ、アンピシリン入りのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１８時間振とう培養した。培養液の一部を新しい培地に添加し、さらに３７℃にて振とう培養を行なった。６００ｎｍでの吸光度が０．５−０．７に達した時に、最終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル・チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加しさらに４時間振とう培養を継続した。
【０５２２】
２）ｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持した大腸菌からの細胞破砕液の調製
コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で形質転換した大腸菌の培養液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理して沈殿した菌体を回収した。回収した菌体を超音波処理用緩衝液（５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ）で懸濁し、懸濁液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理した。沈殿を−８０℃で凍結し、次いで室温にて融解して再度超音処理用緩衝液に懸濁した。懸濁液を氷浴中で超音波破砕器（トミー精工（株）社製ＵＤ−２０１）によって、出力＝５、デューティ＝５０の条件で５分間処理した。超音波処理後の破砕液に最終濃度１％となるようにトリトン　Ｘ−１００を添加し混和し、４℃、１００００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心処理し、上清を回収した。上清はＧＳＴｒａｐカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）中に流した。
【０５２３】
３）ｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを保持する大腸菌からの細胞破砕液の調製
組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎで形質転換した大腸菌の培養液それぞれを、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心処理し、沈殿した菌体を回収した。沈殿した菌体に対して、洗浄用緩衝液（０．５％　トリトン　Ｘ−１００、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）での懸濁、４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の条件での遠心処理、の操作を３回繰り返し、得られた菌体を８Ｍ　尿素溶液に溶解した。この溶液を室温に１時間放置した後、４℃、１３０００ｒｐｍ、３０分間の遠心処理を行ない上清を回収した。得られた上清を透析した。透析は、４Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、２Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で一晩の順で行なった。透析後、４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心し、ＧＳＴｒａｐカラム中に流した。
【０５２４】
４）融合タンパク質の精製
上記の工程を経てＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質（以下、「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ」という）が吸着したＧＳＴカラムにＰＢＳを流してカラム内を洗浄して不純物を除去した。次いで、１０ｍＭ　還元型グルタチオン溶液を流して、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを溶出させた。溶出液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にで分離した後、ゲルをクマシー染色して、タンパク質の存在を確認した。また、溶出液をＰＢＳで４℃、一晩透析した。
【０５２５】
（２）血中中性脂肪濃度上昇活性
上記（１）で精製したＧＳＴおよびＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを、ＰＢＳでタンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌに調整し、それぞれ２匹の１９週齢の雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに約３００μｌずつ尾静脈注射により接種した。採血は摂取前と接種３０分後に行なった。ヘマトクリット管で各マウスの眼底より採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍ１５分遠心して血漿を分離し、接種前後における血中中性脂肪濃度を測定した。結果を表９に示した。
【０５２６】
【表９】
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ＧＳＴ接種マウス群では接種前後で差が認められなかったのに対し、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ接種マウス群では有意に血中中性脂肪濃度の上昇が認められた。
【０５２７】
本実施例の方法において、例えばＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを接種したマウスに、被験物質を投与し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことができる。
【０５２８】
実施例１７．　ＬＰＬ活性阻害効果
（１）ＬＰＬ試料の調製
ラット白色脂肪前駆細胞（ホクドー社より購入）を増殖用培地［１０％　ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）、１００単位／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ　（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭ　オクタン酸および５０ｎＭ　トリヨードチロニンを含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）］の入った細胞培養用フラスコ（培養面積２５ｃｍ２）中で３７℃で２４時間培養した後、培地を分化誘導用培地（１０％　ＦＣＳ、１００単位／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ　（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭ　オクタン酸、５０ｎＭ　トリヨードチロニン、１０μｇ／ｍｌ　インスリンおよび２．５μＭ　デキサメタゾンを含むＤＭＥＭ）に交換し、３７℃でさらに４８時間培養した。その後、脂肪細胞維持培地（１０％　ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭオクタン酸、５０ｎＭ　トリヨードチロニンおよび１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含むＤＭＥＭ）に交換した。２乃至３日後に１０％　ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ　インスリンおよび１０単位／ｍｌ　ヘパリンナトリウムを含有するＤＭＥＭ培地を２ｍｌ加え、１時間培養した後、この培養上清を回収してＬＰＬ活性の測定に用いた。
【０５２９】
（２）ＬＰＬ活性測定
ＬＰＬ活性の測定法は、文献記載の方法（Ｎｉｌｓｓｏｎ−Ｅｈｌｅ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓｃｈｏｔｚ，　Ｍ．　Ｃ．（１９７６）　Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．　１７，　５３６−５４１）に従った。
【０５３０】
まず、上記１）記載の方法で調製した培養上清１００μｌを等量の基質溶液［２ｍＭ　グリセロール・トリ［９，１０（ｎ）−３Ｈ］オレイン酸（１３１ＫＢｅｑ／μｍｏｌ、アマシャム社製）、０．１８９μｇ／ｍｌ　Ｌ　α−ホスファチジルコリン（シグマ社製）、１４ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、１４０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）非働化ＦＣＳ］と混合し、そこへ実施例１５で得られたＧＳＴまたはＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを加え、３７℃で１２０分間保温した。その後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ　炭酸カリウム・ほう酸緩衝液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメタノール：クロロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：１００（ｖ／ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌した後、３０００×ｇで１５分間遠心分離した。水−メタノール層の３Ｈカウントを液体シンチレーションカウンターにて測定した。ＬＰＬ活性の１単位は、１μｍｏｌの脂肪酸を１分間に生成する活性として定義した。さらに、ＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）を添加したときのＬＰＬ活性を１００％とし、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを添加したときの相対的ＬＰＬ活性を算出した。その結果を表１０に示した。
【０５３１】
【表１０】
2004000101.tif 000011
ＧＳＴ−ＡＲＰ４ＮはＬＰＬの活性を用量依存的に抑制した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
【０５３２】
実施例１８．アンジオポエチン関連タンパク質４とグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼとの融合タンパク質の活性評価
（１）融合タンパク質発現形質転換大腸菌の作製
配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至４０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末端にグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）が連結している融合タンパク質（以下、「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ」という。）を以下に記載する方法に従って調製した。
【０５３３】
まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｃｃｃｇｔｇｃａｇｔｃｃａａｇ−３’（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ用のセンスプライマー。配列表の配列番号５５）；および
５’−　ｃｃｇｃｔｃｇａｇｇｇａｇｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇｃｔｇｃ−３’（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号５６）を合成した。
【０５３４】
次に、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入のｃＤＮＡ（Ｉ．Ｄ．　４１４９０３９）１０ｎｇを鋳型とし、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、上記サンプルを９４℃で３分間加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒の温度サイクル３５回、最後に７２℃で５分間の条件で行なった。
【０５３５】
ＰＣＲでは約１１４０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅した。増幅したＤＮＡ断片を回収し、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化した。ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化してからウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて切断末端の脱リン酸化処理を行ったプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＳＴをコードする遺伝子を含む。アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に、このＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化した、ＤＮＡ断片を挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローンを単離した。このプラスミドクローンをｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌと命名した。
【０５３６】
プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌで大腸菌ＥｐｉｃｕｒｉａｎＣｏｌｉ　ＢＬ２１　ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ　（ＤＥ３）−ＲＩＬ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、または、挿入断片を含まずＧＳＴのみを発現させるためのコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転換した。
【０５３７】
形質転換は１０倍希釈したＸＬ１０−Ｇｏｌｄ　β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
ｍｉｘ　２ｍｌを大腸菌Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　Ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ　（ＤＥ３）−ＲＩＬのコンピテントセル　１００ｍｌに予め添加し、氷上で２分置きに攪拌しながら１０分間冷却後にプラスミドを添加し、氷上で３０分間静置後、４２℃で２０秒間保温し、再び氷上で２分間静置してから、ＳＯＣ培養液中で３７℃、１時間振盪培養をすることによって行なった。形質転換後の培養液をアンピシリンおよびクロラムフェニコール添加ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した組換え体のコロニーをピックアップして液体培養し、ＩＰＴＧ誘導による組換えタンパク質の発現を確認した。
【０５３８】
一方、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換はコンピテントセルにプラスミドを添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で３０秒間保温し、再び氷上で２分間静置してから、ＳＯＣ培養液中で３７℃、１時間振盪培養をすることによって行なった。形質転換後の培養液をアンピシリン添加ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した組換え体のコロニーをピックアップして液体培養し、ＩＰＴＧ誘導による組換えタンパク質の発現を確認した。
【０５３９】
（２）融合タンパク質の調製
１）形質転換大腸菌の培養
プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４ＦｕｌｌおよびコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換大腸菌をそれぞれ、アンピシリン／クロラムフェニコールおよびアンピシリン入りのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１８時間振とう培養した。培養液の一部を新しい培地に添加し、さらに３７℃にて振とう培養を行なった。６００ｎｍでの吸光度が０．５−０．７に達した時に、最終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル・チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加しさらに４時間振とう培養を継続した。
【０５４０】
２）ｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する大腸菌からの細胞破砕液の調製
コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で形質転換した大腸菌の培養液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理して沈殿した菌体を回収した。回収した菌体を超音波処理用緩衝液（５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ）で懸濁し、懸濁液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理した。沈殿を−８０℃で凍結し、次いで室温にて融解して再度超音処理用緩衝液に懸濁した。懸濁液を氷浴中で超音波破砕器（トミー精工（株）社製ＵＤ−２０１）によって、出力＝５、デューティ＝５０の条件で５分間処理した。超音波処理後の破砕液に最終濃度１％となるようにトリトン　Ｘ−１００を添加し混和し、４℃、１００００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心処理し、上清を回収した。上清はＧＳＴｒａｐカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）中に流した。
【０５４１】
３）ｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを保持する大腸菌からの細胞破砕液の調製
組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌで形質転換した大腸菌の培養液を、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心処理し、沈殿した菌体を回収した。沈殿した菌体に対して、洗浄用緩衝液（０．５％　トリトン　Ｘ−１００、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）での懸濁、４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の条件での遠心処理、の操作を３回繰り返し、得られた菌体を８Ｍ　尿素溶液に溶解した。この溶液を室温に１時間放置した後、４℃、１３０００ｒｐｍ、３０分間の遠心処理を行ない上清を回収した。組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌで形質転換した大腸菌由来の培養液から得られた上清について透析を行なった。透析は、４Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、２Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で一晩の順で行なった。透析後、４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心し、上清をＧＳＴｒａｐカラム中に流した。
【０５４２】
４）融合タンパク質の精製
上記の工程を経てＧＳＴ又はＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌが吸着したＧＳＴカラムにＰＢＳを流してカラム内を洗浄して不純物を除去した。次いで、１０ｍＭ　還元型グルタチオン溶液（ｐＨ８．０）を流して、ＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを溶出させた。溶出液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて分離した後、ゲルをクマシー染色して、タンパク質の存在を確認した。また、溶出液をＰＢＳで４℃、一晩透析した。ここで、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換体から精製されたタンパク質がＧＳＴであり、ｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを保持する形質転換体から精製されたタンパク質が、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌである。
【０５４３】
（３）血中中性脂肪濃度上昇活性
上記（２）で得られたＧＳＴおよびＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを、ＰＢＳでタンパク質濃度約０．５ｍｇ／ｍｌに調整した後に、それぞれ２匹の１６週齢の雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに１００μｌずつ尾静脈注射により接種した。採血は摂取前と摂取３０分後に行なった。ヘマトクリット管で各マウスの眼底より採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍ、１５分間遠心して血漿を分離し、接種前後における血中中性脂肪（トリアシルグリセロール）濃度を測定した。
【０５４４】
その結果を表１１に示した。ＧＳＴ接種マウス群（表１１の「ＧＳＴ」）では接種前後で差が認められなかったのに対し、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ接種マウス群（表１１の「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ」）では顕著な血中中性脂肪濃度の上昇が認められた。
【０５４５】
本実施例の方法において、例えばＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを接種したマウスに、被験物質を投与し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことができる。
【０５４６】
【表１１】
2004000101.tif 000012
実施例１９．　ＧＳＴ−ＡＲＰ４ＦｕｌｌのＬＰＬ活性阻害効果
実施例１１の（１）の１）記載の方法にしたがって調製した、ラット白色脂肪前駆細胞培養上清１００μｌを等量の基質溶液（２ｍＭ　グリセロール・トリ［９，１０（ｎ）−３Ｈ］オレイン酸（１３１ＫＢｅｑ／μｍｏｌ、アマシャム社製）、０．１８９μｇ／ｍｌ　Ｌ　α−ホスファチジルコリン（シグマ社製）、１４ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、１４０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）非働化ＦＣＳ）と混合し、そこへ実施例１８で得られたＧＳＴ−ＡＲＰ４ＦｕｌｌまたはＧＳＴを加え、３７℃で１２０分間保温した。その後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ炭酸カリウム・ほう酸緩衝液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメタノール：クロロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：１００（ｖ／ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌した後、３０００×ｇで１５分間遠心分離した。水−メタノール層の３Ｈカウントを液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）にて測定した。ＬＰＬ活性の１単位は、１μｍｏｌの脂肪酸を１分間に生成する活性として定義した。さらに、ＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）を添加したときのＬＰＬ活性を１００％とし、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを添加したときの相対的ＬＰＬ活性を算出した。その結果を表１２に示した。
【０５４７】
【表１２】
2004000101.tif 000013
ＧＳＴ−ＡＲＰ４ＦｕｌｌはＬＰＬの活性を用量依存的に抑制した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
【０５４８】
実施例２０．　マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の解析
ａ）ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡの調製
マウスＢＡＣクローン３５５Ｌ−１（リサーチ・ジェネティクス社より購入）を保持する大腸菌を１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１００ｍｌのＬＢ培地で、３７℃で一晩培養した後、培養液を４ｍｌずつ４個のチューブユニットに分注し、ＤＮＡ自動抽出装置（ＰＩ−５０、クラボウ（株）社製）を用いてＤＮＡを抽出した。さらにこのサンプルを塩化セシウム法によって精製した。
【０５４９】
ｂ）　ＤＮＡの断片化
３０ｎｇ／μｌのＢＡＣ　ＤＮＡ　３００μｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、ソニケーター（ソニファイアーＩＩ　２５０、ブランソン社製）、およびスペシャルマイクロチップ（ブランソン社製）を用いて、ソニケーターの出力調整を１、デューティー・サイクルを「コンスタント」の条件にそれぞれ設定して、ＤＮＡを３秒間、２回ソニケーションし断片化した。ＤＮＡの断片化の度合いは、アガロースゲル電気泳動を行って確認した。
【０５５０】
ｃ）　ＤＮＡ断片の末端修復
上記で断片化されたＤＮＡに、終濃度５ｍＭの塩化マグネシウム、０．０５ｍＭのｄＮＴＰ（宝酒造（株）社製）存在下で１０単位のＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）社製）を加え、２５℃で１５分間保温した。さらに、５単位のクレノウ断片（宝酒造（株）社製）を加え、２５℃で１５分間保温して、断片化ＤＮＡの末端を平滑化した。ＤＮＡを精製後、終濃度２ｍＭのＡＴＰ（宝酒造（株）社製）、１単位のポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造（株）社製）およびポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液（ポリヌクレオチドキナーゼに添付、終濃度：５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　塩化マグネシウム、５ｍＭ　ジチオスレイトール）を加え、３７℃で３０分間保温してＤＮＡ末端をリン酸化した。反応終了後、ＴＥ飽和フェノール／クロロホルムにてポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。
【０５５１】
ｄ）　ショ糖密度勾配遠心
１０％ショ糖溶液は、１０ｍｌの５０％ショ糖溶液、０．２５ｍｌの２０×ＳＳＣおよび０．１ｍｌの０．５Ｍ　エチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」という）を混合し、滅菌水で全量５０ｍｌに調整することにより作製した。３８％ショ糖溶液は、３８ｍｌの５０％ショ糖溶液、０．２５ｍｌの２０×ＳＳＣおよび０．１ｍｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡを混合して、滅菌水で全量５０ｍｌに調整することにより作製した。１３ＰＡチューブ（日立工機（株）社製）に３８％ショ糖溶液を５ｍｌ加え、次いで１０％ショ糖溶液を５ｍｌ静かに加えた後、グラジエントフォーマー（グラジエント・メイト、コスモバイオ（株）社製）を用いて速度（ＳＰＥＥＤ）１０、時間（ＴＩＭＥ）２分３０秒および角度（ＡＮＧＬＥ）８°の条件に設定してショ糖密度勾配を作製した。得られたショ糖密度勾配溶液に上記ｃ）で得られたＤＮＡを加え、１５００００×ｇ、２０℃で１６時間遠心分離した。その後、チューブの下部より注射針（１８Ｇ）を用いて穴を開け、チューブ内液を下層から３００μｌずつ分画して回収した。０．８％　アガロースゲルにて各画分の一部を電気泳動し、約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を含んでいた画分を選択し、エタノール沈殿後に１０μｌのＴＥに溶解した。
【０５５２】
ｅ）　ベクター調製およびライブラリーの作製
上記で得られたＢＡＣ　ＤＮＡ由来の約２．０ｋｂ断片と０．１μｇのｐＵＣ１９　ＤＮＡ／ＳｍａＩ（ファーメンタス社製）をＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。反応液をエレクトロポレーション用コンピテント大腸菌（エレクトロ・マックスＤＨ１０Ｂセル、ギブコ・ビーアールエル社製）に加え、エレクトロポレーション用キュベット（ジーンパルサーキュベット　０．１ｃｍ、バイオラッド社製）に移し、エレクトロポレーション装置（ジーンパルサーＩＩ、バイオラッド社製）を用いて、電圧１．８ｋＶ、電気容量２５μＦ、抵抗２００Ωの条件でエレクトロポレーションした。その後１ｍｌのＳＯＣ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）を加え、３７℃で１時間振とうし、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、終濃度５０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（ギブコ・ビーアールエル社製）および終濃度２５μｇ／ｍｌのＩＰＴＧ（ギブコ・ビーアールエル社製）を含むＬＢ固形培地（１．２％　バクトアガー含有）上に塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
【０５５３】
ｆ）ＤＮＡの調製
上記ｅ）の結果、白色を呈したコロニーを選択し、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢＧ培地（１リットル当たり、トリプトン　１２ｇ、イーストエキストラクト　２４ｇ、リン酸一カリウム　２．３ｇ、リン酸二カリウム　１２．５ｇ、グリセロール　４ｍｌおよび１Ｍ　グルコース　２０ｍｌを含む）１．２ｍｌ／ウェルを入れた培養用マイクロウェルプレート（２．２ｍｌ　ディープ・ウェル・プレート、日本ジェネティクス社製）に１コロニー／ウェルで植菌した。プレートの上面を通気性粘着シート（日本ジェネティクス社製）にてシールした後、プレートミキサーを用いて緩やかに撹拌しながら、３７℃で１６．５時間培養した。その後、培養液を６００μｌずつとって、新しい培養用マイクロウェルプレートに分注し、マイクロプレート用遠心機（４Ｋ１５Ｃ、シグマ社製）を用いて、６０００ｒｐｍ、２０℃にて５分間遠心した。上清を除き、沈殿した菌体からＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡｐｒｅｐ　　９６・ターボ・バイオロボット・キット、Ｑｉａｇｅｎ社製）およびＤＮＡ抽出装置（バイオロボット９６００、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＤＮＡを抽出した。
【０５５４】
ｇ）ヌクレオチド配列解析
シークエンシング用プライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｔｇｔａａａａｃｇａ　ｃｇｇｃｃａｇｔ　−３’（−２１Ｍ１３ｆｏｒｗａｒｄ、配列表の配列番号５７）；および
５’−　ｃａｇｇａａａｃａｇ　ｃｔａｔｇａｃｃ　−３’（Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅ、配列表の配列番号５８）
からなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置にて化学合成した。
【０５５５】
上記ｆ）で得られた各ＤＮＡ　１０μｌに対して、プライマー（−２１Ｍ１３ｆｏｒｗａｒｄまたはＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅ）を３．２ｐｍｏｌ、シークエンシング試薬（ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンスＦＳレディ・リアクション・キット、アプライドバイオシステムズ社製）を８μｌ加え、滅菌水にて全量を２０μｌとした。サーマルサイクラー（ジーンアンプ・ＰＣＲシステム９７００、アプライドバイオシステムズ社製）にてサイクルシークエンス反応を実施（９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分を１サイクルとして２５サイクル）して、得られたサンプルをＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００、アプライドバイオシステムズ社製）に供してヌクレオチド配列を解析した。得られた配列データは、ＤＮＡシークエンスソフト（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｅｓ社製）を用いて編集、整列化された。解析の結果、配列表の配列番号２７に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡが目的のプロモーターＤＮＡとして選択された。マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードする遺伝子の転写開始点（エクソン１の５’末端境界部位）はＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されている最も５’末端側が長いＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）である「ＡＩ１９５５２４」を参照して決定した。すなわち、ＡＩ１９５５２４のヌクレオチド配列のうち、ベクター部分を除いた最初のヌクレオチドを転写開始点と判断し、その位置を「１」と定義した。このようにして、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の転写開始点より５’末端側４１８ｂｐから３’末端側１３２ｂｐまでの領域に相当するヌクレオチド配列からなるＤＮＡが同定された。
【０５５６】
実施例２１．　ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターの構築
ａ）プラスミドｐＧＬ８−３の構築
実施例２０の結果を基に、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードする遺伝子の５’末端側上流域を特異的に増幅するためのＰＣＲプライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ａａｇｇｔａｃｃｇｃ　ｔｇｔｔｔｃｃａｇａ　ｔａａａｃａａａ　−３’　（プライマー１、配列表の配列番号５９）；および
５’−　ｔｃａａａｔｇａｔｇ　ａａａｇｇｔｃｔｇｇ　ａｔｃｃａｃｔｃｔｇ　ｇａｔｇｃ　−３’　（プライマー２、配列表の配列番号６０）
からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ化学合成した。
【０５５７】
上記プライマー（終濃度各０．２μＭ）と、ＬＡ　ＰＣＲキット（宝酒造（株）社製）添付の１０×ＬＡバッファー（Ｍｇ＋）を５μｌ、同じく添付ｄＮＴＰを８μｌ、実施例２０のａ）に記載した方法で精製したＢＡＣクローン３５５Ｌ−１　ＤＮＡ　１μｌおよび滅菌水を加えて４９．５μｌとし、キット添付のＬＡ　Ｔａｑポリメラーゼを０．５μｌ加えて全量を５０μｌとした。サーマルサイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９６００、アプライドバイオシステムズ社製）を使用してＰＣＲを実施した（温度条件：９４℃で２分間加熱してから、次に９８℃で２０秒、６８℃で３分の温度サイクルを３０回繰り返し、４℃に冷却、保存した）。
【０５５８】
このＰＣＲ後の反応液中のＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、滅菌水８０μｌに溶解した。このＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで順次消化した。一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩとＢｇｌＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。
【０５５９】
いくつかのコロニーを少量培養して、培養菌体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサー（モデル３７００、（（株）アプライドバイオシステムズ事業部製）を用いて挿入断片のヌクレオチド配列を解析し、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＧＬ８−３と命名した。プラスミドｐＧＬ８−３は、２００１（平成１３）年６月７日付けで独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６２７が付された。このプラスミドを保有する形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液から、プラスミド抽出精製キット（ウィザード・ピュアフェクション・キット、プロメガ社製））を用いてＤＮＡを回収し、精製した。
【０５６０】
ｂ）プラスミドｐＧＬ１３−１の構築
下記のヌクレオチド配列：
５’−　ａａｇｇｔａｃｃａａ　ｔｔｇｃａｔｃｃａｇ　ａｇｔｇｇａｔｃｃａ　ａ　−３’　（配列表の配列番号６１）；および
５’−　ｔｔｇｇａｔｃｃａｃ　ｔｃｔｇｇａｔｇｃａ　ａｔｔｇｇｔａｃｃｔ　ｔ　−３’　（配列表の配列番号６２）
を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
【０５６１】
上記オリゴヌクレオチド各５μｇを混合してアニーリングさせてから、制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで順次消化した。一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩとＢｇｌＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。
【０５６２】
いくつかのコロニーの培養菌体からプラスミドを抽出してＤＮＡシークエンサー（モデル３７００、（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）を用いてヌクレオチド配列を解析し、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の＋９３乃至＋１０８領域に相当するＤＮＡ（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号５１１乃至５２６）が挿入されたプラスミドｐＧＬ１３−１を取得した。このプラスミドを保有する形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液から、プラスミド抽出精製キット（プロメガ社製）を用いてＤＮＡを回収し、精製した。
【０５６３】
ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）ＤＮＡでも同様にして大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを培養し、プラスミド抽出精製キット（プロメガ社製）を用いてＤＮＡを回収し、精製した。このプラスミドＤＮＡをネガティブコントロールとして使用した。
【０５６４】
実施例２２．　アンジオポエチン関連タンパク質３遺伝子のプロモーター活性実施例２１で単離したＤＮＡのプロモーター活性について評価するため、レポーターアッセイを実施した。すなわち、実施例２１で構築したホタルルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＧＬ８−３またはｐＧＬ１３−１）を、ヒト肝臓由来細胞株ＨｅｐＧ２にトランスフェクションして、ホタルルシフェラーゼ活性の変化を調べた。なお、細胞へのトランスフェクション効率についての各プラスミド間の実験ロット差を補正するための内部標準として、ウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ社製）を用いた。
【０５６５】
まず、ＨｅｐＧ２細胞（大日本製薬（株）社より購入）を、１０％ウシ胎児血清（モアゲート社製）、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１ｍＭのピルビン酸を含むＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）中で、３７℃で５％炭酸ガスのインキュベーター内で培養した。セミコンフルエントになるまで増殖させた大角フラスコ（住友ベークライト社製）に、ＰＢＳ（−）（日水製薬（株）社製）を加えて、セルスクレーパー（住友ベークライト（株）社製）を用いて細胞を掻きとって回収した。その細胞を５×１０５個／ウェルで６穴培養プレート（コーニング社製）に蒔き、一晩培養した。１μｇのｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ８−３、あるいはｐＧＬ１３−１　ＤＮＡと０．０４ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ　ＤＮＡを混合して、滅菌水で全量を５μｌとしてＤＮＡ溶液とした。一方、１００μｌのウシ胎児血清を含まないＭＥＭ培地（その他の成分は上記と同様）に６μｌのトランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１、宝酒造（株）社製）を添加し室温で５分間保温した。この溶液に先に調製したＤＮＡサンプルを添加し、室温で５分間保温した。細胞は血清を含まないＭＥＭ培地（その他の成分は上記と同じ）２ｍｌで２回洗浄し、２ｍｌの同培地に置き換えた。ＤＮＡ溶液を３０μｌ／ウェルずつ３ウェルへ添加して、４時間培養後に２ｍｌ／ウェルの１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地（その他の成分は上記と同じ）へ置き換え３７℃で一晩培養した。培養後、培地を除去して２００μｌ／ウェルの細胞溶解剤（Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社製））に溶解して、細胞抽出液を調製した。そして、そのうちの２０μｌを用いて、デュアル−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（プロメガ社製）を、添付のプロトコールに従って用いることにより、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した（ルミナスＣＴ−９０００Ｄ、ダイアヤトロン社製を使用）。実験結果については、内部標準のウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正したホタルルシフェラーゼ活性として表した。
【０５６６】
その結果、ｐＧＬ８−３を導入したＨｅｐＧ２細胞では、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを導入した細胞に比べて約１９倍のルシフェラーゼ活性が観察されたことから、ｐＧＬ８−３に組み込まれた配列表の配列番号２７に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡにはプロモーターとしての活性が存在することが明らかとなった。一方、ｐＧＬ１３−１を導入した細胞では、ルシフェラーゼ活性がｐＧＬ８−３を導入した細胞の１／１０に低下した。以上の結果より、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５１０に示されるＤＮＡ、すなわちマウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５’末端側上流−４１８乃至＋９２に相当する領域にプロモーター活性が存在することが明らかとなった。
【０５６７】
本実施例の方法において、例えばｐＧＬ８−３で形質転換したＨｅｐＧ２細胞を被験物質存在下で培養したときのルシフェラーゼ活性を測定することにより、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する物質の試験を行うことができる。このプロモーター活性を阻害する物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となりうる。
【０５６８】
実施例２３．　「アンジオポエチン関連タンパク質４」プロモーター領域の解析
ａ）マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」プロモーター領域の単離
マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」をコードする遺伝子の５’末端側上流域を特異的に増幅するためのＰＣＲプライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｃｇｇｇｇｔａｃｃｇａｇｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｇａａｇｃａａ　−３’（プライマー１、配列表の配列番号６３）；および
５’−　ｃｃｃａａｇｃｔｔｇｃｃｔｔｇｇｇｔｇｃａｇｃａａｃｇｃｔ　−３’（プライマー２、配列表の配列番号６４）
からなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置（アマシャム　バイオサイエンス株式会社）にて化学合成した。
【０５６９】
マウス１２９Ｓｖ（三共株式会社安全性研究所で飼育）由来のゲノムＤＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、上記プライマー（それぞれ３００ｎＭ）、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を１μｌ、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液＃１を１０分の１量）、１ｍＭの塩化マグネシウム、各０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび滅菌水を加えて全量を５０μｌとしＰＣＲを行った。ＰＣＲはサーマルサイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９７００、アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、上記サンプルを９４℃で２分間加熱した後に、９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で３分の温度サイクル３５回、最後に６８℃で３分間保温の条件で行なった。得られたＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製後、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断を行い、１．０％　１×ＴＡＥアガロース電気泳動による目的バンドの分離後、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造（株）社製）、エタノール沈殿によりＤＮＡの回収を行った。
【０５７０】
一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。
いくつかのコロニーを少量培養して、培養菌体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサー（モデル３７００、（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて挿入断片のヌクレオチド配列を解析し、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２６０に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含む約２．９ｋｂの断片が挿入されたプラスミドを得た（ｐＧＬ２−４）。
このプラスミドを保有する形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液から、プラスミド抽出精製キット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いてＤＮＡを回収し、精製した。
【０５７１】
ｂ）ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターｐＧＬ１１−４およびｐＧＬ１２−４の構築
マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」をコードする遺伝子の５’末端側上流域を特異的に増幅するためのＰＣＲプライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｃｇｇｇｇｔａｃｃａｃａａａｇｃｃｔｇｔｇｇｃａｔｔｇｃａ　−３’（プライマー３、配列表の配列番号６５）；および
５’−　ｃｇｇｇｇｔａｃｃｃｔｃｃｃｃｃａｇａａｃｔｃｃａｇｃｔｇ　−３’（プライマー４、配列表の配列番号６６）
からなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置にて化学合成した。
【０５７２】
プラスミドｐＧＬ２−４を鋳型とし、上記プライマー（それぞれ３００ｎＭ）、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を１μｌ、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液＃１を１０分の１量）、１ｍＭの塩化マグネシウム、各０．２ｍＭのｄＮＴＰｓおよび滅菌水を加えて全量を５０μｌとしＰＣＲを行った。ＰＣＲはサーマルサイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９７００、アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、上記サンプルを９４℃で２分間加熱した後に、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒の温度サイクル３０回、最後に６８℃で３分間保温の条件で行なった。得られたＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製後、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断を行い、１．０％　１×ＴＡＥアガロース電気泳動による目的バンドの分離後、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造（株）社製）、エタノール沈殿によりＤＮＡの回収を行った。
【０５７３】
一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニーを少量培養して、培養菌体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサー（モデル３７００、（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて挿入断片のヌクレオチド配列を解析し、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２６０に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＧＬ１１−４と命名し、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１８９乃至２６０に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＧＬ１２−４と命名した。
【０５７４】
このプラスミドを保有する形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液から、プラスミド抽出精製キット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いてＤＮＡを回収し、精製した。
【０５７５】
マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」をコードする遺伝子の転写開始点（エクソン１の５’末端境界部位）はＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されている最も５’末端側が長いＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）である「ＡＫ０１４５６４」を参照して決定した。すなわち、ＡＫ０１４５６４のヌクレオチド配列のうち、ベクター部分を除いた最初のヌクレオチドを転写開始点と判断し、その位置を「１」と定義した。このようにして、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の転写開始点より５’末端側９０ｂｐから３’末端側１７０ｂｐまでの領域に相当するヌクレオチド配列からなるＤＮＡの単離を行った。
【０５７６】
ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）ＤＮＡも同様にして大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを培養し、プラスミド抽出精製キット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いてＤＮＡを回収し、精製した。このプラスミドＤＮＡをネガティブコントロールとして使用した。
【０５７７】
実施例２４．　アンジオポエチン関連タンパク質４遺伝子のプロモーター活性
実施例２３で単離したＤＮＡのプロモーター活性について評価するため、レポーターアッセイを実施した。すなわち、実施例２３で構築したホタルルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＧＬ１１−４またはｐＧＬ１２−４）を、サル腎臓由来細胞株ＣＯＳ１にトランスフェクションして、ホタルルシフェラーゼ活性の変化を調べた。なお、細胞へのトランスフェクション効率についての各プラスミド間の実験ロット差を補正するための内部標準として、ウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドｐＲＬ−ＴＫ（プロメガ社製）を用いた。
【０５７８】
まず、ＣＯＳ１細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）より購入）を、１０％ウシ胎児血清（ギブコ・ビーアールエル社製）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製、Ｃａｔｌｏｇ　Ｎｕｍｂｅｒ　１１９６５−０９２）中で、３７℃で５％炭酸ガスのインキュベーター内で培養した。２４穴培養プレート（コーニング社製）でセミコンフルエント（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になるまで増殖させ、０．２μｇのｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ１１−４、あるいはｐＧＬ１２−４　ＤＮＡと６ｎｇのｐＲＬ−ＴＫ　ＤＮＡを混合して、滅菌水で全量を５μｌとしてＤＮＡ溶液とした。一方、２０μｌのウシ胎児血清を含まないＤ−ＭＥＭ培地（その他の成分は上記と同様）に１μｌのトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６、ロシュ社製）を添加し軽く攪拌した後、この溶液に先に調製したＤＮＡサンプルを添加し、室温で１５分間保温した。ＤＮＡ溶液を３ウエルへ添加して、３７℃で二晩培養した。培養後、培地を除去し、２５０μｌ／ウエルの細胞溶解剤（Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社製））に溶解して、細胞抽出液を調製した。そして、そのうちの２０μｌを用いて、デュアル−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（プロメガ社製）を、添付のプロトコールに従って用いることにより、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した（ルミナスＣＴ−９０００Ｄ、ダイアヤトロン社製を使用）。実験結果については、内部標準のウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正したホタルルシフェラーゼ活性とし、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃコントロールを１とした時の相対値で表した。
【０５７９】
その結果、ｐＧＬ１１−４を導入したＣＯＳ１細胞では、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを導入した細胞に比べて約３０倍のルシフェラーゼ活性が観察されたことから、ｐＧＬ１１−４に組み込まれた配列表の配列番号２８に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡにはプロモーターとしての活性が存在することが明らかとなった。一方、ｐＧＬ１２−４を導入した細胞では、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを導入した細胞に対して約１．７倍のルシフェラーゼ活性を示すにとどまった。その結果を表１３に示した。以上の結果より、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２６０に示されるＤＮＡ、すなわちマウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５’末端側上流−９０乃至＋１７０に相当する領域にプロモーター活性が存在することが明らかとなった。なお、表中（Ｍｅａｎ±ＳＤ）はルシフェラーゼ活性の平均値と標準偏差を意味する。
【０５８０】
【表１３】
2004000101.tif 000014
本実施例の方法において、例えばｐＧＬ１１−４で形質転換したＣＯＳ１細胞を被験物質存在下で培養したときのルシフェラーゼ活性を測定することにより、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する物質の試験を行うことができる。このプロモーター活性を阻害する物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となりうる。
【０５８１】
【発明の効果】以上述べたように、本発明により、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列からなる遺伝子が、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患に関与する遺伝的素因の一つであり、従って該遺伝子の発現量を抑制する物質が高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得ることが確かめられた。すなわち、本発明の方法、該方法のうち核酸の検出を行う態様においてプローブまたはプライマーとして使用されるポリヌクレオチドおよび同じくポリペプチドの検出を行う態様において使用される抗体は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の探索に有用である。また、本発明のポリペプチドが血中中性脂肪濃度を上昇させる活性を有すること、該活性は融合タンパク質の形状でも保持され得ること、さらに本発明のポリペプチドがＬＰＬ活性の阻害効果を有すること、および本発明のポリペプチドを用いることにより高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験をイン・ビボ、イン・ビトロのいずれにおいても実施できることが示された。
【０５８２】
さらに、本発明により、プロモーター活性を有する新規ＤＮＡが提供された。本発明のＤＮＡは、「アンジオポエチン関連タンパク質３」または「アンジオポエチン関連タンパク質４」の発現量を抑制する物質を試験するための方法に用いることができるので、新しい作用機作を有する高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の開発に有用である。
【０５８３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号９：　ポリクローナル抗体を取得するための抗原として使用された合成オリゴペプチド
配列番号１１：　ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のアミノ末端側領域をコードするＤＮＡ
配列番号１２：　ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のアミノ末端側領域をコードするポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号１３：　ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のカルボキシル末端側領域をコードするペプチドのポリペプチドのＤＮＡ配列
配列番号１４：　ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のカルボキシル末端側領域をコードするポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号２５：　ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓをコードするＤＮＡ
配列番号２６：　ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号４２：　コザックのコンセンサス配列が付加されたＰＣＲプライマー
配列番号４３：　制限酵素ＸｈｏＩの特異的配列が付加されたＰＣＲプライマー
配列番号４４：　ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ及びＧＳＴ−Ｃ１の一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲセンスプライマー
配列番号４５：　ＧＳＴ−ＣＣの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号４６：　ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号４７：　ＧＳＴ−Ｃ１の一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号４８：　ヒスチジンタグをコードする配列を挿入するためのオリゴヌクレオチド
配列番号４９：　ヒスチジンタグをコードする配列を挿入するためのオリゴヌクレオチド
配列番号５０：　プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓの部分断片を増幅するためのセンス／アンチセンスプライマー
配列番号５１：　ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲセンスプライマー
配列番号５２：　ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号５５：　ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲセンスプライマー
配列番号５６：　ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号５７：　シークエンシングプライマー　−２１Ｍ１３ｆｏｒｗａｒｄ
配列番号５８：　シークエンシングプライマー　Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅ
配列番号５９：　ＰＣＲプライマー１
配列番号６０：　ＰＣＲプライマー２
配列番号６１：　プラスミドｐＧＬ１３−１の挿入断片を調製するためのオリゴヌクレオチド
配列番号６２：　プラスミドｐＧＬ１３−１の挿入断片を調製するためのオリゴヌクレオチド
配列番号６３：　制限酵素ＫｐｎＩに特異的な配列を付加したＰＣＲセンスプライマー。
配列番号６４：　制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに特異的な配列を付加したＰＣＲアンチセンスプライマー。
配列番号６５：　制限酵素ＫｐｎＩに特異的な配列を付加したＰＣＲセンスプライマー。
配列番号６６：　制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに特異的な配列を付加したＰＣＲアンチセンスプライマー。
【０５８４】
【配列表】
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【０５８５】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＫＫマウス臓器由来の試料についてのノーザンブロット解析の結果を表す図。
【図２】遺伝子導入ＣＯＳ−１細胞培養上清を試料としたウエスタンブロット解析の結果を表す図。
【図３】遺伝子導入ＨｅＬａ細胞培養上清を試料としたウエスタンブロット解析の結果を表す図。
【図４】組換えアデノウイルスを感染させたＫＫ／Ｓａｎマウスの末梢血中の中性脂肪濃度測定結果を表す図。
【図５】ＫＫマウスおよび組換えアデノウイルスを感染させたＫＫ／Ｓａｎマウスの肝臓由来の試料についてのノーザンブロット解析の結果を表す図。
【図６】精製「アンジオポエチン関連タンパク質３」のＥＬＩＳＡによる検量線を表す図。
【図７】「アンジオポエチン関連タンパク質１乃至５」の構造。左側がアミノ末端、右側がカルボキシル末端である。アンジオポエチン関連タンパク質は、アミノ末端から、シグナルペプチド、ヘリックス領域、フィブリノーゲン様領域からなる。
【図８】融合タンパク質のＫＫ／Ｓａｎマウスにおける血中中性脂肪濃度に及ぼす影響を示した図。
【図９】組換えアデノウイルスを感染させたマウスの血漿を試料としたウエスタンブロット解析の結果を表す図。
【図１０】組換えアデノウイルスを感染させたマウスの末梢血中の中性脂肪濃度測定結果を表す図。
【図１１】ヘパリン結合部位に変異を導入したアンジオポエチン関連タンパク質３のＬＰＬ活性に対する効果を表す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年6月11日(2003.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【特許請求の範囲】
【請求項１】配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７のアミノ酸をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つのアミノ酸をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至２０７に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至１９５に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至１４７に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項６】配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項７】配列表の配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項８】請求項１乃至７記載のアミノ酸配列の一つもしくは数個の部位において、一つ若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、付加もしくは置換されている、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドの同効物。
【請求項９】請求項１乃至８のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項１１】配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６０２のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項１２】配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項１３】配列表の配列番号２５のヌクレオチド番号１８乃至６６２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項１４】請求項９乃至１３のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１５】請求項１４記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】請求項１５記載の宿主細胞を培養し、次いで、該培養物から、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドを回収することを特徴とする、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項１７】下記の工程を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法：
１）　非ヒト哺乳動物に、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至４０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２６３残基を欠くポリペプチド、または請求項１乃至８に記載のポリペプチドから選択される１種又は２種以上のポリペプチド、および被験物質を投与する；および
２）　上記１）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定する。
【請求項１８】下記の工程を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法：
１）　非ヒト哺乳動物に、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８乃至１４５７に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号１５のヌクレオチド番号１７３乃至１３９３に示されるヌクレオチド配列、または請求項９乃至１３のいずれか一つに記載のＤＮＡを含む組換えアデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させる；
２）　上記工程１）の動物に被験物質を投与する；および
３）　上記工程２）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定する。
【請求項１９】高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法であって、リポタンパク質リパーゼ（以下「ＬＰＬ」という）および／または肝性トリアシルグリセロールリパーゼ（以下「ＨＴＧＬ」という）とその基質とを反応させる系に、被験物質と共に、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至４０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２６３残基を欠くポリペプチド、または請求項１乃至８記載のポリペプチドを共存させ、次いで、該ポリペプチドによるＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性の阻害作用に対する、被験物質の抑制効果を調べることを特徴とする方法。
【請求項２０】下記の工程を含む、ＬＰＬ活性を調節する物質の試験方法：
１）　下記の［１］−ａ乃至［３］記載の材料と、被験物質とを共存させた混合物を調製する：
［１］−ａ　ＬＰＬを含む材料；
［２］−ａ　ＬＰＬの基質を含む材料；
［３］　配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至４０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２６３残基を欠くポリペプチド、または請求項１乃至８記載のポリペプチド；
２）　上記１）の［１］−ａ乃至［３］の材料のみからなる混合物を、１）とは別個に調製する；
３）　上記１）および２）の混合物において、基質から遊離された脂肪酸の量をそれぞれ測定し、その測定値を比較する。
【請求項２１】ＬＰＬを含む材料が、哺乳動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】ＬＰＬを含む材料が、げっ歯類または霊長類動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】ＬＰＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、請求項２０乃至２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】下記の工程を含む、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性を調節する物質の試験方法：
１）　下記の［１］−ｂ乃至［３］記載の材料と、被験物質とを共存させた混合物を調製する：
［１］−ｂ　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料；
［２］−ｂ　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料；
［３］　配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至４０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２６３残基を欠くポリペプチド、または請求項１乃至８記載のポリペプチド；
２）　上記１）の［１］−ｂ乃至［３］の材料のみからなる混合物を、１）とは別個に調製する；
３）　上記１）および２）の混合物において、基質から遊離された脂肪酸の量を測定し、その測定値を比較する。
【請求項２５】ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、ヘパリンを静注投与した哺乳動物由来の血漿であることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、哺乳動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、げっ歯類または霊長類動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、請求項２４または２６記載の方法。
【請求項２８】ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、請求項２４乃至２７のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するための新規な方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の探索または試験に有用な新規ポリペプチドおよび該ポリペプチドを用いた新規試験方法に関する。
【０００３】
また、本発明は、脂質低下剤、特に高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤として有用な、リパーゼ活性を調節する物質を試験するための新規方法に関する。
【０００４】
また、本発明は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験に有用な、プロモーター活性を有する新規ＤＮＡに関する。
【０００５】
【従来の技術】心臓血管疾患は、いまだ世界のほとんどの先進諸国における死亡の主原因である。アテローム性動脈硬化症は、急性冠症候群（不安定狭心症、急性心筋梗塞、虚血性突然死）、脳血栓および脳梗塞の主な病因である。米国では、毎年、アテローム性動脈硬化症によって引き起こされる心筋梗塞により５５万人が死亡していると推定される。１９９１年の統計では、日本での死亡原因の第一位がアテローム性動脈硬化症による心臓血管疾患である。疫学研究により、アテローム性動脈硬化症は、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧症、喫煙などの多くの危険因子によって生じることが判明している。
【０００６】
血清脂質濃度の異常増加を高脂質血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）または高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｅｍｉａ）と呼ぶ。血清脂質にはコレステロール（コレステロールエステル、遊離コレステロール）、リン脂質（レシチン、スフィンゴミエリン等）、トリグリセリド（中性脂肪）、遊離脂肪酸、その他のステロール類などがあるが、とくに臨床的に問題となるのは、血中の中性脂肪およびコレステロールの増加である（ＣＯＭＭＯＮ　ＤＩＳＥＡＳＥ　ＳＥＲＩＥＳ　Ｎｏ．１９高脂血症　中村治雄編集　１９９１年１０月１０日発行南江堂、Ａｕｓｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１０１，　２７７７−２７８２　（２０００））。高コレステロール血症と虚血性心疾患発症との関係については、その因果関係は明確にされており、虚血性心疾患に対する独立した危険因子としての位置が確立され、その予防や治療が積極的に行なわれている。また、近年になって血清コレステロール値ほど疫学的に明確ではないが、高トリグリセリド血症が動脈硬化に関連した諸疾患の危険因子として再認識されてきている（Ｒｕｂｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　３４１，　４１０−４１８　（１９９９））。従って、血中脂質値の適切なコントロールは、虚血性心疾患、脳梗塞などに代表される動脈硬化に関連した諸疾患の予防または治療に極めて重要である（Ｂｒｅｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ　Ｊ　Ｃａｒｄｉｏｌ．　８３，　３Ｆ−１２Ｆ　（１９９９））。
中性脂肪を低下せしめる薬剤としては、フィブリン酸系化合物、例えば、クロフィブレート、フェノフィブレート、ベザフィブレート、ゲムフィブロジルなどが医薬として供されており、血漿中の中性脂肪、およびコレステロールレベルを低下させ、コレステロールレベルの上昇した個体における虚血性心疾患の予防に有用であることが知られている（Ｈａｖｅｌ，　Ｒ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｋａｎｅ，　Ｊ．　Ｐ．　（１９７３）　１３　Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｐｈａｒｍａｃ．　２８７−３０８、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１０２，　２１−２７　（２０００）、Ｆｒｉｃｋ，　Ｍ．　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３１７，　１２３７−１２４５）。
【０００７】
一方、血中コレステロール値を低下させる薬剤としては、コレスチラミン、コレスチポール等の胆汁酸を捕捉してその吸収を阻害するもの（例えば、米国特許第４０２７００９号）、メリナミド（フランス特許第１４７６５６９号）等のアシルコエンザイムＡコレステロールアシル移転酵素（ＡＣＡＴ）を阻害してコレステロールの腸管吸収を抑制するもの等の他、コレステロールの生合成を抑制する薬剤が注目されている。コレステロール生合成抑制薬剤として、特に３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素を阻害するロバスタチン（米国特許第４２３１９３８号）、シンバスタチン（米国特許第４４４４７８４号）、プラバスタチン（米国特許第４３４６２２７号）等が医薬として供されている。
【０００８】
より安全で、かつより効果的な中性脂肪低下作用を示す脂質低下剤を得ることは、高脂血症の予防または治療あるいは動脈硬化の治療または予防に有用な、従って医薬としてより有用な薬剤を提供することになる。
【０００９】
他方、糖尿病は多くの原因因子に由来する疾患過程であり、血漿グルコースレベルの上昇もしくは高血糖症を特徴とする。制御されない高血糖症は、ネフロパシー、ニューロパシー、網膜症、高血圧症、卒中および心疾患を含めた細小血管および大血管疾患に関する危険性の増大に起因して早期死亡率（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）の上昇に関連する。従って、グルコース恒常性の制御は高血糖症、ひいては糖尿病の治療法として決定的に重要である。
【００１０】
本発明の方法において用いられる遺伝子のうち配列表配列番号１に記載のｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオポエチン関連タンパク質３（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３）」をコードするヌクレオチド配列として開示されており、また国際特許出願公開ＷＯ９９／５５８６９号公報には同じヌクレオチド配列が「ｚａｌｐｈａ５」をコードするものとして開示されているが、これらのヌクレオチド配列を有する遺伝子と高脂血症、動脈硬化および高血糖との関連については知られておらず、またその転写制御に関するＤＮＡ配列も知られていない。従って、「アンジオポエチン関連タンパク質３」乃至「ｚａｌｐｈａ５」をコードするヌクレオチド配列の一部またはそれらのプロモーターが、高脂血症、動脈硬化および高血糖の治療または予防剤を試験するために有用であることも知られていない。
【００１１】
「アンジオポエチン関連タンパク質」には６つのファミリーが知られている（「アンジオポエチン関連タンパク質１、２、３、４、５および６」）。「アンジオポエチン関連タンパク質１、２、３、４、５および６」はアンジオポエチンと同様に、アミノ末端側のコイル構造、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインを特徴とする分泌タンパク質である（図７）。例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質３」では、４６０アミノ酸のうち、アミノ末端から１６番目のアミノ酸までがシグナルペプチドで、１７番目から２０７番目のアミノ酸までがヘリックス領域でこの中にコイル構造が含まれ、２０８番目から２４１番目のアミノ酸までがリンカー領域で、２４２番目から４６０番目のアミノ酸までが、フィブリノーゲン結合領域であるとされている。
【００１２】
「アンジオポエチン関連タンパク質１」および「アンジオポエチン関連タンパク質２」はアンジオポエチンの相同性を基にしたＰＣＲによりヒト心臓より同定された（Ｋｉｍ，Ｉ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４４３：　３５３−３５６；　Ｋｉｍ，　Ｉ．，　ｅｔ　ａｌ　（１９９９）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４：　２６５２３−２６５２８）。「アンジオポエチン関連タンパク質１」と「アンジオポエチン関連タンパク質２」との間では５９％の相同性を示す。アンジオポエチン１に対する「アンジオポエチン関連タンパク質１及び２」の相同性は２６−２９％である。アンジオポエチン２に対する「アンジオポエチン関連タンパク質１及び２」の相同性は３４％である。
【００１３】
「アンジオポエチン関連タンパク質１」は幅広い臓器で発現が認められているが、アンジオポエチン様の内皮細胞刺激活性は示さない。一方、「アンジオポエチン関連タンパク質２」については心臓、小腸、脾臓および胃での発現が認められ、血管内皮細胞に対する刺激活性を示したものの、アンジオポエチン１あるいはアンジオポエチン２の受容体である「ＴＩＥ２」への結合は認められなかった。
【００１４】
一方、「アンジオポエチン関連タンパク質３」については、ＥＳＴを用いたホモロジ−検索により見出され、肝臓と腎臓においてのみ発現していること示されている（Ｃｏｎｋｌｉｎ，　Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　６２，　４７７−４８２）。「アンジオポエチン関連タンパク質３」については、Ｃ末端側領域の機能について報告されている（Ｃｏｎｋｌｉｎ，　Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　６２，　４７７−４８２）が、Ｎ末端側領域がいかなる機能を有するかについては知られていなかった。さらに、Ｃ末端側領域を欠いたＮ末端領域のみの欠損体が機能を有することは全く知られていない。また、「アンジオポエチン関連タンパク質３」のパートナー因子については知られておらず、アンジオポエチン関連タンパク質３およびそのパートナー因子を用いて、血中中性脂肪濃度を調節する薬剤をイン・ビトロで試験する方法も知られていない。
【００１５】
「アンジオポエチン関連タンパク質４」はＰＰＡＲγ制御下で脂質代謝あるいはグルコースホメオスターシスに関与するタンパク質（Ｙｏｏｎ，　Ｊ．　Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｍｏｌｅｃ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ　２０，　５３４３−５３４９）、ＰＰＡＲα標的遺伝子で絶食により誘導される脂質因子（Ｋｅｒｓｔｅｎ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　２８４８８−２８４９３）、および内皮細胞にアポトーシスを誘発する肝臓由来の新規「アンジオポエチン関連タンパク質」（Ｋｉｍ，　Ｉ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３４６，　６０３−６１０）として同定されている。「アンジオポエチン関連タンパク質４」は白色脂肪細胞および胎盤での発現が報告されているがアンジオポエチン様の活性の有無については報告されていない。
また、「アンジオポエチン関連タンパク質４」の発現制御に関わる特定のＤＮＡ領域（プロモーター／エンハンサー領域）は同定されておらず、該遺伝子のプロモーターが、高脂血症、動脈硬化や高血糖の治療または予防剤を試験するために有用であることも知られていなかった。
【００１６】
「アンジオポエチン関連タンパク質５」は遺伝子が登録されているだけであり、機能は不明である。
【００１７】
「アンジオポエチン関連タンパク質６」は角膜特異的に発現する遺伝子ｃｏｒｎｅａ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　６　（ＣＤＴ６）として同定された（Ｐｅｅｋ，　Ｒ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．　Ｖｉｓ．　Ｓｃｉ．　３９，　１７８２−１７８８）。「アンジオポエチン関連タンパク質６」はマウス移植癌モデルで腫瘍増殖阻止を示した（Ｐｅｅｋ，　Ｒ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　ｅｐｕｂ　ａｈｅａｄ　ｏｆ　ｐｒｉｎｔ）。
【００１８】
このようにアンジオポエチンが有する血管内皮増殖因子様活性とは異なった機能を「アンジオポエチン関連タンパク質」は担っている可能性が考えられる。
【００１９】
「アンジオポエチン関連タンパク質」ファミリーに共通するカルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインについては、「ＴＩＥレセプター」との結合に関与する領域であるとの報告はなく、また、「アンジオポエチン関連タンパク質」ファミリーに共通するアミノ末端側のコイル構造がどのような機能を有するかは不明である。
【００２０】
さらに、「アンジオポエチン関連タンパク質」ファミリーのカルボキシル末端側のフィブリノーゲン様領域を欠いたアミノ末端領域のみの欠損体が機能を有することは全く知られていなかった。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するための新規な方法を提供することにある。
【００２２】
また、本発明の目的は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の探索または試験に有用な新規ポリペプチドおよび該ポリペプチドを用いた新規試験方法を提供することにある。
【００２３】
また、本発明の目的は、リパーゼ活性を調節する物質、特に、高脂血症および／または動脈効果の予防または治療剤として有用な、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性を上昇させることによって血中脂質濃度を低下せしめる物質を試験するための新規方法を提供することにある。
【００２４】
また、本発明の目的は、「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子および「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の転写制御に関わるプロモーター領域を特定し、該プロモーターの活性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供することにある。より具体的には、高脂血症、動脈硬化もしくは高血糖の治療または予防剤を試験するための新規な方法および該方法において用いられるＤＮＡが提供される。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）　下記の工程を含む、被験物質の、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を試験する方法：
１）哺乳動物由来培養細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養する；
２）上記１）で得られた培養細胞における、下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（ただし、配列中のｔはｕに読み替える）を有するｍＲＮＡの発現量を検出する：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
３）上記工程２）の結果、被験物質非存在下で培養した細胞と、被験物質存在下で培養した細胞との間で、検出されたｍＲＮＡの発現量を比較する。
【００２６】
（２）　哺乳動物由来培養細胞が肝臓由来であることを特徴とする、（１）に記載の方法。
【００２７】
（３）　哺乳動物由来培養細胞が霊長類または齧歯類動物由来であることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
【００２８】
（４）　哺乳動物由来培養細胞がヒトまたはマウス由来であることを特徴とする、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の方法。
【００２９】
（５）　（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がノーザンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットであることを特徴とする方法。
【００３０】
（６）　（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がＲＴ−ＰＣＲであることを特徴とする方法。
【００３１】
（７）　（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がリボヌクレアーゼ保護アッセイであることを特徴とする方法。
【００３２】
（８）　（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段がランオン・アッセイであることを特徴とする方法。
【００３３】
（９）　（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手段が動物組織または細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡの部分配列で作製された遺伝子チップを用いるものであることを特徴とする方法。
【００３４】
（１０）　下記の工程を含む、被験物質の、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を試験する方法：
１）培養細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養する；
２）上記１）で得られた培養細胞上清における、下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を、該ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
３）上記工程２）の結果、被験物質非存在下で培養した細胞と、被験物質存在下で培養した細胞との間で、検出されたポリペプチドの量を比較する。
【００３５】
（１１）　（１０）に記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体が、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその一部、同１９−４５５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその一部、または配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその一部と特異的に結合するものであることを特徴とする方法。
【００３６】
（１２）　（１０）または（１１）に記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体が、配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から１３に示されるアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸番号１から１４に示されるアミノ酸配列を特異的に認識するものであることを特徴とする方法。
【００３７】
（１３）　（１０）乃至（１２）のいずれか一つに記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を該ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する操作が、ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットであることを特徴とする方法。
【００３８】
（１４）　（１０）乃至（１２）のいずれか一つに記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を該ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する操作が、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）または放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）であることを特徴とする方法。
【００３９】
（１５）　（１４）記載のＥＬＩＳＡ法においてプレートに固相化する抗体としてマウスハイブリドーマ４５Ｂ１の産生するモノクローナル抗体Ｍａｂ４５Ｂ１を使用することを特徴とする方法。なお、ハイブリドーマ４５Ｂ１は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６３として寄託されている。
【００４０】
（１６）　下記のｉ）および／またはｉｉ）記載の抗体を含むことを特徴とする、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するためのキット：
ｉ）下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｉｉ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から１３に示されるアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸番号１から１４に示されるアミノ酸配列と特異的に結合することを特徴とする抗体。
【００４１】
（１７）　配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列中の連続した１５乃至３０ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列のアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡを有効成分として含有する高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の遺伝子治療のための組成物。
【００４２】
（１８）　配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７のアミノ酸をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つのアミノ酸をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４３】
（１９）　配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至２０７に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、（１８）記載のポリペプチド。
【００４４】
（２０）配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至１９５に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、（１８）記載のポリペプチド。
【００４５】
（２１）　配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至１４７に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、（１８）記載のポリペプチド。
【００４６】
（２２）　配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４７】
（２３）　配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４８】
（２４）配列表の配列番号１８のアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４９】
（２５）　配列表の配列番号２０のアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５０】
（２６）　配列表の配列番号２２のアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５１】
（２７）　配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５２】
（２８）　配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５３】
（２９）　配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５４】
（３０）　配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５５】
（３１）　配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５６】
（３２）　配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５７】
（３３）　配列表の配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５８】
（３４）（１８）乃至（３３）記載のアミノ酸配列の一つもしくは数個の部位において、一つ若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、付加もしくは置換されている、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドの同効物。
【００５９】
（３５）　（１８）乃至（３４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００６０】
（３６）　配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６１】
（３７）　配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６０２のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６２】
（３８）　配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６３】
（３９）　配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６４】
（４０）　配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１０３９乃至１２６１のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６５】
（４１）　配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１９０９を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６６】
（４２）　配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６３９乃至８４６のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６７】
（４３）　配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１５０３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６８】
（４４）　配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号７９６乃至１０１５のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００６９】
（４５）　配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１６５４を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００７０】
（４６）　配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号３７３乃至３９４のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００７１】
（４７）　配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１０４８を３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００７２】
（４８）　配列表の配列番号２５のヌクレオチド番号１８乃至６６２に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００７３】
（４９）　（３５）乃至（４８）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【００７４】
（５０）　アデノウイルスベクターであることを特徴とする、（４９）記載の組換えベクター。
【００７５】
（５１）　（４９）または（５０）記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【００７６】
（５２）　（５１）記載の宿主細胞を培養し、次いで、該培養物から、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドを回収することを特徴とする、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドの製造方法。
【００７７】
（５３）　下記の工程を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法：
１）　非ヒト哺乳動物に、（１８）乃至（３４）に記載のポリペプチドから選択される１種又は２種以上のポリペプチド、および被験物質を投与する；および
２）　上記１）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定する。
【００７８】
（５４）　下記の工程を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法：
１）　非ヒト哺乳動物に、（５０）記載の組換えアデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させる；
２）　上記工程１）の動物に被験物質を投与する；および
３）　上記工程２）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定する。
【００７９】
（５５）　高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法であって、リポタンパク質リパーゼ（以下「ＬＰＬ」という）および／または肝性トリアシルグリセロールリパーゼ（以下「ＨＴＧＬ」という）とその基質とを反応させる系に、被験物質と共に、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、または（１８）乃至（３４）記載のポリペプチドを共存させ、次いで、該ポリペプチドによるＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性の阻害作用に対する、被験物質の抑制効果を調べることを特徴とする方法。
【００８０】
（５６）　下記の工程を含む、ＬＰＬ活性を調節する物質の試験方法：
１）　下記の［１］−ａ乃至［３］記載の材料と、被験物質とを共存させた混合物を調製する：
［１］−ａ　ＬＰＬを含む材料；
［２］−ａ　ＬＰＬの基質を含む材料；
［３］　配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、または（１８）乃至（３４）記載のポリペプチド；
２）　上記１）の［１］−ａ乃至［３］の材料のみからなる混合物を、１）とは別個に調製する；
３）　上記１）および２）の混合物において、基質から遊離された脂肪酸の量をそれぞれ測定し、その測定値を比較する。
【００８１】
（５７）　ＬＰＬを含む材料が、哺乳動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、（５６）記載の方法。
【００８２】
（５８）　ＬＰＬを含む材料が、げっ歯類または霊長類動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、（５６）または（５７）に記載の方法。
【００８３】
（５９）　ＬＰＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、（５６）乃至（５８）のいずれか１つに記載の方法。
【００８４】
（６０）下記の工程を含む、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性を調節する物質の試験方法：
１）　下記の［１］−ｂ乃至［３］記載の材料と、被験物質とを共存させた混合物を調製する：
［１］−ｂ　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料；
［２］−ｂ　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料；
［３］　配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチドまたは（１８）乃至（３４）記載のポリペプチド；
２）　上記１）の［１］−ｂ乃至［３］の材料のみからなる混合物を、１）とは別個に調製する；
３）　上記１）および２）の混合物において、基質から遊離された脂肪酸の量を測定し、その測定値を比較する。
【００８５】
（６１）　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、ヘパリンを静注投与した哺乳動物由来の血漿であることを特徴とする、（６０）記載の方法。
【００８６】
（６２）　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、（６０）または（６１）記載の方法。
【００８７】
（６３）　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、哺乳動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であるか、またはヘパリンを静注投与した哺乳動物由来の血漿であることを特徴とする、（５９）記載の方法。
【００８８】
（６４）　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材料が、げっ歯類または霊長類動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、（５９）または（６３）記載の方法。
【００８９】
（６５）　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、（５９）、（６３）または（６４）のいずれか１つに記載の方法。
【００９０】
（６６）　下記の１）乃至３）のいずれか一つで表されるＤＮＡ：
１）配列表の配列番号２７に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１で示されるヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号５１０乃至５２６のいずれか一つで示されるヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
２）上記１）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物肝臓由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
３）上記１）記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、哺乳動物肝臓由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【００９１】
（６７）　配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
【００９２】
（６８）　配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００９３】
（６９）　配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００９４】
（７０）　下記の１）乃至３）のいずれか一つで表されるＤＮＡ：
１）配列表の配列番号２８に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１で示されるヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１８８乃至２６０のいずれか一つで示されるヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
２）上記１）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
３）上記１）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【００９５】
（７１）　配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から１８８で示されるヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【００９６】
（７２）　配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から１８８で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【００９７】
（７３）　（６６）乃至（７２）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【００９８】
（７４）　外来遺伝子の上流側に外来遺伝子配列と同じ転写の方向で（６６）乃至（７２）のいずれか１つに記載のＤＮＡが連結されており、哺乳動物細胞中で外来遺伝子を発現させ得る発現ベクター。
【００９９】
（７５）　外来遺伝子配列がルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子配列であることを特徴とする、（７４）記載の発現ベクター。
【０１００】
（７６）　外来遺伝子配列がルシフェラーゼをコードする遺伝子配列であることを特徴とする、（７４）記載の発現ベクター。
【０１０１】
（７７）　組換えプラスミドｐＧＬ８−３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６２７）。
【０１０２】
（７８）　発現ベクターｐＧＬ１１−４。
【０１０３】
（７９）　（７３）乃至（７８）のいずれか１つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【０１０４】
（８０）　下記の工程ｉ）からｉｉｉ）を含む、被験物質の、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を試験する方法：
ｉ）（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非被存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載の発現ベクター中の、外来遺伝子にコードされているタンパク質の産生量を検出または測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の結果、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間での検出または測定結果を比較する工程。
【０１０５】
（８１）　下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定する方法：
ｉ）［１］（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）、［２］細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）および［３］細胞Ａを別の組換えプラスミドで形質転換しているが、該被験ｃＤＮＡは発現しない細胞（以下「細胞Ｃ」という）の［１］乃至［３］の細胞からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ａ、細胞Ｂおよび細胞Ｃにおける、（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載の発現ベクター中の、外来遺伝子にコードされているタンパク質の発現量を測定し比較する工程。
【０１０６】
（８２）　「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子プロモーター活性を調節するタンパク質を検出する方法であって、（６６）乃至（６９）のいずれか一つに記載のＤＮＡに該タンパク質を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該タンパク質を検出することを特徴とする方法。
【０１０７】
（８３）　下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子プロモーター活性を調節する活性を有する物質を試験する方法：
ｉ）（６６）乃至（６９）のいずれか一つに記載のＤＮＡを放射標識したものに、マウス細胞の核抽出液および被験物質を加えたもの、ならびにマウス細胞の核抽出液のみを加えたものをそれぞれ調製する；
ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、マウス細胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を比較する。
【０１０８】
（８４）　配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなるＤＮＡ、そのアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列からなる核酸またはそれらの誘導体。
【０１０９】
（８５）　「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子プロモーター活性を調節するタンパク質を分離する方法であって、（７０）乃至（７２）のいずれか一つに記載のＤＮＡに該タンパク質を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該タンパク質を単離することを特徴とする方法。
【０１１０】
（８６）　下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子プロモーター活性を調節する活性を有する物質を試験する方法：
ｉ）（７０）乃至（７２）のいずれか一つに記載のＤＮＡを放射標識したものに、マウス細胞の核抽出液および被験物質を加えたもの、ならびにマウス細胞の核抽出液のみを加えたものをそれぞれ調製する；
ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、マウス細胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を比較する。
【０１１１】
（８７）　配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなるＤＮＡ、そのアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列からなり、（７０）乃至（７２）のいずれか一つに記載のＤＮＡが有するプロモーター活性を促進または阻害する核酸またはそれらの誘導体。
に関する。
【０１１２】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１、３、１１、１５、１７、１９、２１、２３および２５に示される、哺乳動物の血液中の中性脂肪濃度の調節に関与する遺伝子の発現を指標として、被験物質の高脂血症、動脈硬化および高血糖の治療または予防剤としての効果を試験する方法、該方法において用いられる核酸プローブ、プライマーおよび抗体を提供するものである。
【０１１３】
本発明者らは、高脂血症の治療または予防剤の標的遺伝子を探索する目的で、先天的低脂血症マウスの遺伝子を高脂血症マウスの遺伝子と比較することにより、高脂血症の原因遺伝子の染色体上の位置を絞り込んだ結果、高脂血症マウスで高発現する遺伝子を特定することに成功した。この遺伝子由来のｃＤＮＡは、ホモロジー検索の結果、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として開示されていたが、本発明者らは、該ヌクレオチド配列を有する遺伝子を低脂血症マウスに強制発現させ、あるいは動物細胞で発現させたヒト型組換えタンパク質を投与することで、血中の中性脂肪の濃度が上昇することを見出し、該遺伝子がこれまで報告されていない新規な機能を有することを確かめた。
【０１１４】
さらに、先天的に「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子を正常に発現しないコンジェニックマウスと動脈硬化を発症するアポリポプロテインＥ欠損マウスとを掛け合わせることで得られたマウスにおいては、動脈硬化の進展が抑制されることが確かめられた。そこで、該ヌクレオチド配列またはその一部をプローブもしくはプライマーとして用いた遺伝子発現の検出系を利用する、動脈硬化治療または予防剤の新規試験方法を構築することに成功した。また、該ヌクレオチド配列がコードするポリペプチドに特異的な抗体を調製し、該抗体を用いて該ポリペプチドの産生量を検出する実験系を利用する動脈硬化症の治療または予防剤の新規試験方法を構築することに成功した。
【０１１５】
さらに、先天的に「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子を正常に発現しないコンジェニックマウスと動脈硬化を発症するアポリポプロテインＥ欠損マウスまたはレプチン変異遺伝子を有するマウスを掛け合わせることで得られたマウスにおいては、高血糖状態が改善されることを確かめた。そこで、該ヌクレオチド配列またはその一部をプローブもしくはプライマーとして用いた遺伝子発現の検出系を利用することにより、高血糖の治療または予防剤の新規試験方法を構築できることを見出した。また、該ヌクレオチド配列がコードするポリペプチドに特異的な抗体を調製し、該抗体を用いて該ポリペプチドの産生量を検出する実験系を利用する高血糖の治療または予防剤の新規試験方法を構築することに成功した。
【０１１６】
また、本発明者らは、「アンジオポエチン関連タンパク質」が共通して持っているアミノ末端側のコイル構造に着目し、「アンジオポエチン関連タンパク質」、「アンジオポエチン関連タンパク質」のカルボキシル末端側フィブリノーゲン様領域を欠いたアミノ末端領域のみの欠損体ポリペプチドが、哺乳動物において血中の中性脂肪濃度を上昇させる機能を有することを見出した。更に、本発明者らは、「アンジオポエチン関連タンパク質」を血中に投与すると、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様領域が切断され、アミノ末端側のヘリックス領域を有するポリペプチドが生成し、このペプチドが血中脂肪濃度上昇に関与していることも見出した。さらに、本発明者らは、「アンジオポエチン関連タンパク質」または「アンジオポエチン関連タンパク質」のカルボキシル末端側フィブリノーゲン様領域を欠いたアミノ末端領域のみの欠損体ポリペプチドを用いて、イン・ビボおよびイン・ビトロにおいて高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験する方法を確立した。
【０１１７】
「アンジオポエチン関連タンパク質」におけるヘリックス領域、リンカー領域、フィブリノーゲン様領域は例えば、三次元結晶構造解析で決めることができるが、コンピュータープログラムを用いて予測することもできる。このようなプログラムとしては、ＧＣＧ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒ．１０．２（ＣＯＩＬ　ＳＣＡＮ）（Ｌｕｐａｓ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：１１６２−１１６４．１９９１．）が知られている。ヘリックス領域にはコイル構造が存在する。
【０１１８】
上記、コンピュータープログラムあるいは、実験結果によると、「アンジオポエチン関連タンパク質１」では、配列表の配列番号１８のアミノ酸番号１乃至２１までがシグナルペプチド、２２乃至２０２までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、２７７乃至４９１までがフィブリノーゲン様領域であり、「アンジオポエチン関連タンパク質２」では、配列表の配列番号２０のアミノ酸番号１乃至２２までがシグナルペプチド、２３乃至２０６までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、２７６乃至４９３までがフィブリノーゲン様領域であり、「アンジオポエチン関連タンパク質３」では、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至１６までがシグナルペプチド、１７乃至２０７までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、２４２乃至４６０までがフィブリノーゲン様領域であり、「アンジオポエチン関連タンパク質４」では、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号１乃至２５までがシグナルペプチド、２６乃至１４４までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、１８４乃至４０６までがフィブリノーゲン様領域であるり、「アンジオポエチン関連タンパク質５」では、配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１乃至２０までがシグナルペプチド、２１乃至１８５までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、　２５９乃至４７０までがフィブリノーゲン様領域であり、「アンジオポエチン関連タンパク質６」では、配列表の配列番号２４のアミノ酸番号１乃至２６までがシグナルペプチド、２７乃至１２２までがコイル構造が含まれているヘリックス領域、１３０乃至３４６までがフィブリノーゲン様領域である。
【０１１９】
また、本発明者らは、イン・ビボでの血中中性脂肪濃度上昇作用を担う「アンジオポエチン関連タンパク質３」のパートナー因子について探索を行った結果、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬのリパーゼ活性がアンジオポエチン関連タンパク質３により阻害されることを見出した。そして、アンジオポエチン関連タンパク質３の血中中性脂肪濃度上昇作用を調節する物質をイン・ビトロで試験するための方法として、このＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬのリパーゼ活性阻害作用を利用する方法を開発し、本発明を完成させた。
【０１２０】
アンジオポエチン関連タンパク質３はＬＰＬ活性を阻害することから、該タンパク質とＬＰＬとの相互作用を抑制することにより実質的にＬＰＬ活性を上昇させる物質を見出せば、新しい作用機序を有する、高脂血症または動脈硬化の治療または予防に有用な薬剤を提供することになる。
【０１２１】
また、本発明者らは、マウスゲノムにおける「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の転写開始点と予測される部位（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号４１９）を「１」として、その５’末端側上流４１８ヌクレオチドの部位から、３’末端側下流１０８ヌクレオチド（以下、「−４１８乃至＋１０８」のように表記する。配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５２６）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡにルシフェラーゼをコードするＤＮＡを連結したレポーター遺伝子をヒトＨｅｐＧ２細胞に導入し、ルシフェラーゼの産生量を測定することにより、「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の「−４１８乃至＋１０８」領域がプロモーター活性を有することを見出した。また本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子に連結するマウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５’末端側領域を「＋９３乃至＋１０８」（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号５１１乃至５２６）に短縮すると、プロモーター活性が失われることも見いだした。本発明者らは、さらに、上記プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることにより、該プロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングできることを見出した。
【０１２２】
また、本発明者らは、マウスゲノムにおける「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の転写開始点と予測される部位（配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号９１）を「１」として、その５’末端側上流９０ヌクレオチドの部位から、３’末端側下流１６９ヌクレオチド（以下、「−９０乃至＋１７０」のように表記する。配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２６０に相当）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡにルシフェラーゼをコードするＤＮＡを連結したレポーター遺伝子をサル腎細胞ＣＯＳ１に導入し、ルシフェラーゼの産生量を測定することにより、「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の「−９０乃至＋１７０」領域がプロモーター活性を有することを見出した。また本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子に連結するマウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５’末端側領域を「＋９９乃至＋１７０」（配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１８９乃至２６０に相当）に短縮すると、プロモーター活性が失われることも見出した。
本発明者らは、さらに、上記プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることにより、該プロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングできることを見出した。
【０１２３】
本発明のＤＮＡは、哺乳動物肝臓由来の細胞においてプロモーター活性を有する限り、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５’末端側上流域のいかなるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。好適には、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができるが、本発明はこれに限定されない。
【０１２４】
一方、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５’末端側＋９３乃至＋１０８に相当するヌクレオチド配列（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号５１１乃至５２６）からなるＤＮＡは、実質的にプロモーター活性を有さない。したがって、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５’末端側上流域の−４１８位から＋９２位に相当するヌクレオチド配列（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５１０）に、プロモーター活性に必須の領域が含まれると考えられるので、本発明のプロモーターＤＮＡは、好ましくは配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５１０で示されるヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む。
【０１２５】
また、本発明のＤＮＡは、哺乳動物由来の細胞においてプロモーター活性を有する限り、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５’末端側上流域のいかなるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。好適には、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２６０に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができるが、本発明はこれに限定されない。
【０１２６】
一方、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５’末端側＋９９乃至＋１７０に相当するヌクレオチド配列（配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１８９乃至２６０に相当）からなるＤＮＡは、実質的にプロモーター活性を有さない。したがって、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５’末端側上流域の−９０位から＋９８位に相当するヌクレオチド配列（配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至１８８に相当）に、プロモーター活性に必須の領域が含まれると考えられるので、本発明のプロモーターＤＮＡは、より好適には配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至１８８で示されるヌクレオチド配列を少なくとも一部に含む。
【０１２７】
本発明において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【０１２８】
【発明の実施の形態】
Ｉ．　遺伝子の発現を指標とする方法
本発明の一つの方法は、具体的には例えば、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号１５のヌクレオチド番号１７３から１３９０に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号１７のヌクレオチド番号４３４から１９０９に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号１９のヌクレオチド番号２２から１５００に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号２１のヌクレオチド番号２４２から１６５２に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号２３のヌクレオチド番号８から１０４５に示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子、またはそれらがコードするポリペプチドと同じく血中資質濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を、当該核酸（ｍＲＮＡ）または当該ポリペプチドの特異的検出によって測定し、該遺伝子の発現量を低下させるような被験物質を高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の候補物質として選択するものである。以下、核酸の検出を行う態様とポリペプチドの検出を行う態様とに分けて説明する。
【０１２９】
（Ａ）核酸の検出
１）プローブ
核酸の検出を行う態様のうち、核酸ハイブリダイゼーションを利用する方法において用いられるプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであって、そのヌクレオチド配列は、下記ａ）乃至ｅ）：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡ断片が有するヌクレオチド配列；
ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡ断片が有するヌクレオチド配列；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
のいずれか一つ（ただし、配列中のｔはｕに読み替える）のヌクレオチド配列であればよく、例えば、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチド、該アンチセンス配列中の連続した少なくとも１５ヌクレオチドからなる部分配列を有するポリヌクレオチド、または該アンチセンス配列の改変体等、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有するポリリボヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることにより該ポリリボヌクレオチドを特異的に検出することが可能なものは全て本発明の方法に用いられ得る。それらのうち、上記ａ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドは、例えばマウス肝臓由来のｃＤＮＡライブラリーから配列表の配列番号１に示すヌクレオチド配列情報に基づいて、周知の方法、例えばプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法等によりクローニングしたｃＤＮＡクローンを、周知の方法で直接標識するか、または該ｃＤＮＡクローンを鋳型としたポリメラーゼ反応による複製または転写反応において標識することにより、標識プローブとして得ることができる。また、上記ｂ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドは、例えばヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリーから配列表の配列番号３に示すヌクレオチド配列情報に基づいて、同様の操作を行うことによりクローニングしたｃＤＮＡクローンから標識プローブを得ることができる。一方、上記ｃ）またはｄ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドは、工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター）に平成１１年１１月１９日付で国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０またはＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１が付されている形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９株またはＥ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９株が保持する組換えファージミドから得ることができる。
【０１３０】
さらに、上記ｅ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドは、例えば上記のようにして得られる上記ａ）乃至ｄ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、任意の哺乳動物（好ましくは肝臓）由来のｃＤＮＡライブラリーについてプラークハイブリダイゼーション法やコロニーハイブリダイゼーション法によるクローニングを行って単離したｃＤＮＡクローンから得ることができる。
【０１３１】
さらにまた、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列中の連続した少なくとも１５ヌクレオチドからなる部分配列を有するポリヌクレオチドは、数十ヌクレオチド程度のものであれば化学合成によって得ることが可能である。またあるいは、上記のようにして得られる上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクローン中の任意の部分配列を、例えばＰＣＲ等によってサブクローニングしてから、上記と同様の手法でアンチセンス配列を有するプローブとして調製することもできる。
【０１３２】
例えば、配列表の配列番号１記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列中の連続した数十ヌクレオチドからなる部分配列において、数ヌクレオチドが付加、欠失および／または付加されたようなヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであっても、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする限り、本発明の方法に用いられ得る。そのようなポリヌクレオチドは、化学合成法や、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）等の酵素反応を利用した本発明の属する技術分野における周知の変異導入法を用いて作製することが可能である。
【０１３３】
また、本発明の方法において用いられるプローブは単一のヌクレオチド配列からなるものに限定されない。すなわち本発明の方法においては、例えば上記の要件を満足する複数種類のヌクレオチド配列の混合物をプローブとして用いるか、またははそれら複数種類のヌクレオチド配列をそれぞれ個別に用いた多重検出を行ってもよい。
【０１３４】
２）ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー
本発明における、核酸の検出を行うもう一つの態様は、まずｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素反応を行ってから、ＰＣＲを実施して特異的にＤＮＡ断片を増幅する、いわゆるＲＴ−ＰＣＲを行う方法である。この方法において、目的のヌクレオチド配列を特異的に増幅するためには、目的のｍＲＮＡの特定の部分配列に相補的なアンチセンスプライマーと、該アンチセンスプライマーから逆転写酵素により生成されるｃＤＮＡの配列中の特定の部分配列に相補的なセンスプライマーが用いられる。
【０１３５】
逆転写酵素反応およびＰＣＲの両方に用いられるアンチセンスプライマーは、実質的に上記ａ）乃至ｅ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列中の、連続した少なくとも１８ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる。
【０１３６】
一方、ＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマーの配列は、上記ａ）乃至ｅ）記載のヌクレオチド配列において、上記アンチセンスプライマーの相補鎖にあたる配列中の最も５’末端側の位置よりもさらに５’末端側領域に存在する配列中の連続した少なくとも１８ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２１ヌクレオチドの任意の部分配列からなる。ただし、センスプライマーとアンチセンスプライマーに互いに相補的な配列が存在すると、プライマー同士がアニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され、特異的な遺伝子検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを避けたプライマーの設計を行うことが好ましい。
【０１３７】
これらアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーには、いずれも上記で規定したそれらヌクレオチド配列の５’末端に、上記ａ）乃至ｅ）記載のヌクレオチド配列とは無関係のヌクレオチド配列がリンカーとして付加されていてもよい。ただし、特異的な遺伝子検出の妨げとならないよう、該リンカーは反応中に反応液内の核酸と非特異的アニーリングを起こさないようなものであることが好ましい。
【０１３８】
３）遺伝子発現を検出する細胞または動物
次に、本発明の方法において用いられる培養細胞は、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を発現する哺乳動物細胞であればよい。好ましくは哺乳動物肝臓由来の培養細胞（好ましくは、初代培養肝細胞）であるが、例えば上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入した細胞など、人為的に形質転換された細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）も使用することが可能である。哺乳動物種としては、ヒト、マウス、ラットまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましく、さらに、好ましい細胞としては高脂血症マウスであるＫＫマウス（日本クレア社より入手可能）の初代培養肝細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。また、培養細胞を用いるよりも好適と判断される場合には、哺乳動物個体に被験物質を投与して、その後該動物個体から摘出されたその臓器または組織細胞における上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現を検出する方法も採用し得る。その際、遺伝子発現の検出対象となる臓器または組織は、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を発現するものであればよいが、好ましくは肝臓である。この実施態様における好ましい哺乳動物種はヒト、マウス、ラットまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。例えばマウスとしては前記ＫＫマウスが好ましく用いられるが、本発明はこれに限定されない。
【０１３９】
本発明の方法において用いられる培養細胞は、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を発現可能な条件（ただし被験物質を添加しない場合）であれば、いかなる条件で培養してもよい。例えば、該培養細胞について確立された培養条件が知られており、該条件下において該細胞が上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を発現する場合は、該条件で培養してよい。
【０１４０】
４）被験物質の添加
上記細胞の培養中、被験物質を培養培地に添加し一定期間培養する。被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられる。また、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現を抑制するように設計された核酸またはその誘導体（アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ等を含む）を、被験物質として使用することも可能である。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作成するなどして複数種の投与量を設定してもよい。被験物質存在下で培養する期間も適宜設定してよいが、好ましくは３０分乃至２４時間である。哺乳動物個体に被験物質を投与する場合は、被験物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を使い分ける。
【０１４１】
５）試料の調製
上記のようにして培養した細胞からＲＮＡを抽出するに際しては、培養終了後直ちに細胞をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェノール等リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するのが好ましい。または、細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等のタンパク質タンパク質分解酵素を用いて穏やかに培養基材から分離させるなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにＲＮＡ抽出工程に移行する。
【０１４２】
ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，　Ｎ．，　（１９８７）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１６２，　１５６−１５９）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。
【０１４３】
得られたＲＮＡからさらにｍＲＮＡを精製する方法は以下に説明する通りである。すなわち、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られているので、この特徴を利用して例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、ｍＲＮＡをさらに分画することもできる。ただし、本発明の方法のためには、これらｍＲＮＡの精製工程は必須ではなく、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現の検出が可能である限りにおいて、全ＲＮＡをその後の工程に用いることもできる。
【０１４４】
６）試料の固相化
核酸ハイブリダイゼーションによる検出を行う場合、上記のようにして得られたＲＮＡ試料中の遺伝子を特異的に検出するため、該ＲＮＡ試料をアガロース電気泳動を経てハイブリダイゼーション実験用メンブレン（以下単に「メンブレン」という）に転写する（ノーザンブロット法）か、または直接メンブレンに試料を染み込ませる、いわゆるドットブロット法やスロットブロット法により、メンブレンに固相化する。このメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、ハイボンド−Ｃピュア（アマシャム・ファルマシア社製）等）、ポジティブチャージ・ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−Ｎ＋アマシャム・ファルマシア社製）等）または親水性ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−Ｎ／ＮＸ（アマシャム・ファルマシア社製）等）等が用いられる。
【０１４５】
ノーザンブロット用のアガロース電気泳動方法としては、アガロースホルムアミドゲル電気泳動法、試料をグリオキサールとジメチルスルホキシドで処理し、変性させた後、リン酸緩衝液で作製したアガロースゲルで泳動させる方法およびアガロースゲルメチル水銀電気泳動法（以上Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ．）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１４６】
電気泳動後のゲルからメンブレンにＲＮＡを移す、いわゆるブロッティング方法としては、キャピラリートランスファー法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ．）、バキューム法、電気泳動法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　ｉｎ　”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ　ｅｄ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ．）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材も市販されている（例えば、バイオドット（バイオラッド社製）等）。
【０１４７】
ブロッティング終了後、メンブレンに移し取られたＲＮＡをメンブレンに固定する操作を行う（この操作はメンブレンの材質によって異なり、製品によっては固定操作不要の場合もある）。
【０１４８】
７）プローブの標識
核酸ハイブリダイゼーションによる検出を行うにあたり、上記のようにして固相化させたＲＮＡ試料中の特定のｍＲＮＡを検出するためのプローブの標識方法と検出方法について以下に述べる：
ｉ）放射性同位元素標識
ＤＮＡ断片またはそれを保持するベクター等を材料乃至鋳型として、ニックトランスレーション法（例えば、ニックトランスレーションキット（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）、ランダムプライム法（例えば、マルチプライムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）、末端標識法（例えば、メガラベル（宝酒造（株）社製）、３’−末端ラベリングキット（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）で標識ＤＮＡプローブを調製するか、あるいは鋳型となるＤＮＡをサブクローニングしたベクター中のＳＰ６プロモーターやＴ７プロモーターを利用したイン・ビトロ転写法により標識ＲＮＡプローブを調製する。これらプローブの検出はＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーにより行うことができ、さらにＸ線フィルムの場合はデンシトメトリー（例えば、ＧＳ−７００イメージイングデンシトメーター（バイオラッド社製）を使用）を、イメージングプレートの場合はＢＡＳ２０００ＩＩ（富士フィルム製）システムをそれぞれ用いた定量も可能である。
【０１４９】
ｉｉ）酵素標識
ＤＮＡあるいはＲＮＡ断片を直接酵素標識する。標識に用いられる酵素は例えば、アルカリホスファターゼ（ＡｌｋＰｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＥＣＬダイレクト・ヌクレイック・アッシド・ラベリング・アンド・ディテクション・システム（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）を挙げることができる。プローブの検出は、標識した酵素の触媒反応が検出可能になるような基質、例えば該触媒反応により発色物質を生成したり、発光するような基質を含む酵素反応緩衝液にメンブレンを浸すことにより行う。発色基質を用いた場合は目視により検出することができ、発光基質を用いた場合は放射性同位元素標識の場合と同様にＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーやインスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。さらに、発光基質を用いた場合は、デンシトメトリーやＢＡＳ２０００ＩＩシステムを利用した定量も可能である。
【０１５０】
ｉｉｉ）その他分子による標識
フルオレセイン標識：　ＤＮＡ断片にニックトランスレーション法、ランダムプライム法、または３’末端標識法（アマシャム・ファルマシア社より市販されているＥＣＬ　３’−オリゴラベリングシステムなど）で標識する。あるいはＳＰ６、Ｔ７プロモーターによるイン・ビトロ転写によりＲＮＡに標識する；
ビオチン標識：　ＤＮＡの５’末端を標識（アマシャム・ファルマシア社より市販されているオリゴヌクレオチド・ビオチン・ラベリングキットなど使用）するか、またはＤＮＡ断片にニックトランスレーション法、ランダムプライム法などで標識する。
【０１５１】
ジゴキシゲニン修飾ｄＵＴＰ標識：　ＤＮＡ断片にニックトランスレーション法、ランダムプライム法などで標識する。
【０１５２】
これら標識分子の検出は、いずれの場合も、標識された分子に特異的に結合する分子を放射性同位元素や酵素で標識したものをプローブに結合させる操作を含む。特異的に結合する分子とは、例えばフルオレセインやジゴキシゲニンの場合は抗フルオレセイン抗体や抗ジゴキシゲニン抗体であり、ビオチンの場合はアビジンまたはストレプトアビジンである。これらをプローブに結合させた以降は、その標識された放射性同位元素や酵素により上記ｉ）またはｉｉ）記載と同様の方法にしたがって検出を行うことができる。
【０１５３】
８）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは、本発明が属する技術分野において周知の方法で行われ得る。本発明におけるハイブリダイゼーション溶液または洗浄液の組成と、ハイブリダイゼーション温度または洗浄温度の関係については、例えば文献（バイオ実験イラストレイテッド４、ｐ１４８、秀潤社刊）の記載に従うことができるが、好ましい条件は以下の通りである：
ハイブリダイゼーション溶液：　ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）；
プローブの終濃度（放射標識プローブの場合）：　１乃至２×１０６ｃｐｍ／ｍｌ（好ましくは、２×１０６ｃｐｍ／ｍｌ）；
ハイブリダイゼーション温度および時間：　６８℃、１乃至２４時間。
【０１５４】
メンブレンの洗浄条件：
ｉ）　０．１乃至５×ＳＳＣ（最も好ましくは２×ＳＳＣ）、０．０５乃至０．１％　ＳＤＳ（最も好ましくは０．０５％）ドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」という）中、室温乃至４２℃（最も好ましくは室温）で２０乃至６０分間（最も好ましくは２０分間）振盪する操作を、洗浄液を交換して２乃至６回（最も好適には３回）行う；
ｉｉ）　上記ｉ）の後、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、５０乃至６５℃で、２０乃至６０分間振盪する操作を、洗浄液を交換して２乃至６回行う。または、０．２乃至０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、６２乃至６５℃で、２０乃至６０分間振盪する操作を、洗浄液を交換して２乃至６回行う。最も好適には、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、５０℃で、２０分間振盪する操作を、洗浄液を交換して３回行う。
【０１５５】
洗浄終了後、上記７）に記載したように、プローブの標識法に合わせた検出・定量を行う。また、細胞あたりの発現量が安定していることが知られている遺伝子（例えば、２３ｋＤａ高塩基性タンパク質、α−チューブリン、グリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼ、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼＡ２、リボゾーマルタンパク質Ｓ９、ユビキチン等の遺伝子発現を検出するためのプローブが市販されている）の各試料における発現量を、各試料間のＲＮＡ量の差等に起因するばらつきを補正する目的で同時に測定しておき、この安定的発現遺伝子の発現量を基準とした、検出対象遺伝子発現量の相対値を、被験物質を投与した細胞群と投与しなかった細胞群との間で比較することにより、より精密な評価を行うことができる。
【０１５６】
その結果、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を低下させる被験物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１５７】
９）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＲＴ−ＰＣＲによって核酸の検出を行う態様における、各反応の条件は以下に記載する通りである。なお、ＲＴ−ＰＣＲによる検出のための試料は、通常ポリ（Ａ）＋ＲＮＡにまで精製されている必要はない。
【０１５８】
ｉ）逆転写酵素反応
反応液組成の例（全量２０μｌ）：
全ＲＮＡ　適宜；
塩化マグネシウム　２．５乃至５ｍＭ（好ましくは５ｍＭ）；
１×ＲＮＡ　ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−塩酸（２５℃におけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは８．３））、５０ｍＭ　塩化カリウム）；
ｄＮＴＰｓ　０．５乃至１ｍＭ（好ましくは１ｍＭ）；
アンチセンスプライマー　１μＭ　（アンチセンスプライマーの代用として、市販のランダムプライマーやオリゴ（ｄＴ）プライマー（１２−２０ヌクレオチド）を２．５μＭ添加することもできる）；
逆転写酵素　０．２５乃至１単位／μｌ（好ましくは０．２５単位／μｌ）；
滅菌水で２０μｌに調整する。
【０１５９】
反応温度条件：
３０℃で１０分間保温（ランダムプライマー使用時のみ）した後、４２乃至６０℃（好ましくは４２℃）で１５乃至３０分間（好ましくは３０分間）保温し、さらに９９℃で５分間加熱して酵素を失活させてから、４乃至５℃（好ましくは５℃）で５分間冷却する。
【０１６０】
ｉｉ）ＰＣＲ
反応液組成の例：
塩化マグネシウム　２乃至２．５ｍＭ（好ましくは２．５ｍＭ）；
１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−塩酸（２５℃におけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは８．３））、５０ｍＭ　塩化カリウム；
ｄＮＴＰｓ　０．２乃至０．２５ｍＭ（好ましくは０．２５ｍＭ）；
アンチセンスプライマーおよびセンスプライマー　０．２乃至０．５μＭ（好ましくは０．２μＭ）；
Ｔａｑポリメラーゼ　１乃至２．５単位（好ましくは２．５単位）；
滅菌水を加えて全量を８０μｌに調整し、その全量を、逆転写反応を終了した反応液全量に加えてからＰＣＲを開始する。
【０１６１】
反応温度条件：　まず９４℃で２分間加熱した後、９０乃至９５℃（好ましくは９４℃）で３０秒間、４０乃至６０℃（好ましくは、プライマーの特性から算出される解離温度（Ｔｍ）からそれより２０度低い温度までの範囲内で３０秒間、７０乃至７５℃（好ましくは７２℃）で１．５分間の温度サイクルを２８乃至５０サイクル（好ましくは２８サイクル）繰り返してから、４℃に冷却する。
【０１６２】
ＰＣＲ終了後、反応液を電気泳動し、目的の大きさのバンドが増幅されているか否かを検出する。定量的検出を行うためには、予め段階希釈したｃＤＮＡクローンを標準の鋳型ＤＮＡとして同条件でＰＣＲを実施し、定量的検出が可能な温度サイクル数を定めておくか、または、例えば５サイクルごとに一部反応液をサンプリングしてそれぞれ電気泳動を行う。また例えばＰＣＲ反応時に放射標識ｄＣＴＰを用いることにより、バンド中に取り込まれた放射能の量を指標に定量を行うこともできる。
【０１６３】
被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を低下させた被験物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１６４】
１０）その他の方法
上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を測定する他の方法としては、以下に記載するものを挙げることができる。
【０１６５】
ｉ）リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＮａｓｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）：　ＲＮＡ試料中の、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ（ただし配列中のｔはｕに読み替える）のみに標識プローブをハイブリダイズさせ、二本鎖ポリヌクレオチドを形成させておいてから、試料にリボヌクレアーゼを添加してインキュベーションすると、プローブがハイブリダイズしたｍＲＮＡは二本鎖を形成していることによってリボヌクレアーゼによる消化を免れ、それ以外のＲＮＡは消化されるので、該二本鎖ポリヌクレオチドのみが残る（検出されるｍＲＮＡよりプローブが短ければ、プローブの鎖長に相当する二本鎖ポリヌクレオチドが残る）。この二本鎖ポリヌクレオチドを定量することにより、目的の遺伝子の発現量を測定する。具体的には、例えば以下に記載する方法に従う。
【０１６６】
二本鎖を形成せずに余った標識プローブを二本鎖ポリヌクレオチドと確実に分離して定量を容易にするために、余った標識プローブはリボヌクレアーゼに消化されることが好ましいが、リボヌクレアーゼとして一本鎖ＤＮＡも消化できるようなものを使用すれば、標識プローブはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。標識プローブの調製方法は上記１）および７）の記載に準ずるが、この方法において用いられるプローブの長さは５０乃至５００ヌクレオチド程度が好ましい。
【０１６７】
ＲＮＡプローブは、例えば下記の方法に従って調製される。まず鋳型ＤＮＡをバクテリオファージのプロモーター（Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３プロモーター等）を有するプラスミドベクター（例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社製）など）に挿入する。次にこの組換えプラスミドベクターを、制限酵素で、挿入断片のすぐ下流で一ヶ所だけ切断されるように消化する。得られた直鎖ＤＮＡを鋳型として、放射能標識されたリボヌクレオチド存在下で、イン・ビトロ転写反応を行う。この反応には、ベクター中のプロモーターに合わせてＴ７、ＳＰ６、またはＴ３ポリメラーゼ等の酵素を用いる。以上の操作は例えばリボプローブシステム−Ｔ７、同−ＳＰ６または同−Ｔ３（いずれもプロメガ社製）を用いて行うことができる。
【０１６８】
ＲＮＡ試料を調製するまでの工程は上記３）乃至５）記載の通りである。調製された全ＲＮＡ試料１０乃至２０μｇ相当分と、５×１０５ｃｐｍ相当の過剰量の標識プローブとを用いてリボヌクレアーゼ保護アッセイを行う。この操作は市販のキット（ＨｙｂＳｐｅｅｄ　ＲＰＡ　Ｋｉｔ、アンビオン社製）を用いて行うことができる。得られたリボヌクレアーゼ消化後の試料を、８Ｍ　尿素を含む４乃至１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムでオートラジオグラフィーを行う。以上の操作により、リボヌクレアーゼ消化を免れた二本鎖ポリヌクレオチドのバンドを検出することができ、またその定量は上記７）のｉ）記載の方法に従って実施することができる。さらに、ノーザンブロット解析の場合と同様、各試料間のＲＮＡ量の差等に起因するばらつきを補正する目的で、β−アクチン遺伝子の発現量を同時に測定しておけば、より精密な評価を行うことができる。
【０１６９】
このようにして、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を低下させた被験物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１７０】
ｉｉ）ランオン・アッセイ（Ｒｕｎ−ｏｎ　ａｓｓａｙ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，　Ｍ．　Ｅ．　ａｎｄ　Ｚｉｆｆ，　Ｅ．　Ｂ．　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１１，　４３３−４３８，およびＧｒｏｕｄｉｎｅ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　ＣｅｌｌＢｉｏｌ．　１，　２８１−２８８参照）：　本方法は、細胞から核を単離して目的の遺伝子の転写活性を測定する方法であり、これまでに述べたような細胞内のｍＲＮＡを検出する方法ではないが、本発明においては「遺伝子の発現量を検出する方法」に包含される。単離された細胞核を用いて、試験管内で転写反応を行わせると、核を単離する前に既に転写が開始されｍＲＮＡ鎖が生成されている途中のものが伸長していく反応のみが進行する。この反応時に放射標識したリボヌクレオチドを添加して、伸長していくｍＲＮＡを標識しておき、その中に含まれる、非標識プローブにハイブリダイズするｍＲＮＡを検出することにより、核を単離した時点における目的の遺伝子の転写活性を測定することができる。被験物質の影響が最も顕著に現れる時間のデータを判定に用いるため、培養細胞に被験物質を添加してから核を単離するまでの時間について、例えば添加３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後および２４時間後の細胞から核を単離してそれぞれアッセイを行うなどの方法をとることができる。なお具体的操作方法は、プローブを上記１）の記載に準じて標識しないものを調製する他は、上記参照文献の記載に準ずる。このようにして、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の転写活性を低下させた被験物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１７１】
ｉｉｉ）ＤＮＡチップ解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析
［１］プローブ取得用試料の調製
まず、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料のｍＲＮＡを抽出精製する。ＲＮＡ試料を調製するまでの工程は上記３）乃至５）記載の通りである。
【０１７２】
［２］プローブの標識
ＤＮＡチップ解析またはＤＮＡマイクロアレイ解析用のプローブを作製するための出発材料としては、精製していない全ＲＮＡを用いることもできるが、上記５）に記載された方法で精製されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡであることがより好ましい。
【０１７３】
核酸ハイブリダイゼーションによる検出を行うにあたり、プローブの標識方法と検出方法について以下に述べる。
【０１７４】
アフィメトリクス社製ＤＮＡチップを用いる解析のためのプローブ：　アフィメトリクス社製ＤＮＡチップに添付されたプロトコールに従い、ビオチン標識したｃＲＮＡプローブを用いる。
【０１７５】
ＤＮＡマイクロアレイを用いる解析用のためのプローブ：　逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。このとき、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料をそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。　メンブレンフィルターを用いる解析のためのプローブ：　逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば３２Ｐ、３３Ｐ）で標識されたｄ−ＣＴＰなどを加えておくことによりプローブを標識する。
【０１７６】
［３］固相化試料
上記工程［２］で得られた標識プローブとハイブリダイズさせるための固相化試料としては、以下のようなものを挙げることができる。
【０１７７】
データベース上のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）配列またはｍＲＮＡ配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップ（アフィメトリクス社製）（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，　Ｒ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、２０−２４）：
上記ＥＳＴ配列またはｍＲＮＡ配列は、プローブの調製に用いた細胞と同種の動物由来のものであることが最も好ましいが、それに限定されない。ただし、前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として公開されている遺伝子、またはそれらのいずれか一つの部分配列を含む配列が固相化されているものを用いる。
【０１７８】
プローブ調製に用いた細胞と同種乃至近縁の動物の臓器組織（好ましくは肝臓）、もしくは該臓器組織から単離または株化された細胞から得られたｍＲＮＡより作製されたｃＤＮＡ乃至ＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化されたＤＮＡマイクロアレイまたはメンブレンフィルター：
これらｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物は、例えばｍＲＮＡの材料とした動物のＥＳＴデータベース等の配列情報をもとに作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものである。試料調製のための材料としては、前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として公開されている遺伝子を発現している細胞（好ましくは肝臓由来）を用いる。このｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物としては、予め発現量の異なるｍＲＮＡを、サブトラクション法（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　９３，　６０２５−６０３０）、ディファレンシャルディスプレイ法（Ｋａｔｏ，　Ｋ．　（１９９５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２３，　３６８５−３６９０）等を利用して選択しながら作製されたものも含む。また、ＤＮＡマイクロアレイやフィルターは、検出対象となる遺伝子、すなわちＧｅｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として公開されている遺伝子を含む市販品を利用してもよいし、スポッターを用いて前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を固相化したＤＮＡマイクロアレイまたはフィルターを作製することもできる（例えば、宝酒造（株）社製、ＧＭＳ４１７アレイヤー等）。
【０１７９】
この固相化試料に、上記［２］で調製されたプローブを用いて、同じ条件で別個に、あるいは混合して同時にハイブリダイズさせる（Ｂｒｏｗｎ，　Ｐ．　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。
【０１８０】
［４］解析
アフィメトリクス社製ＤＮＡチップを用いる解析の場合：　アフィメトリクス社製ＤＮＡチップに添付のプロトコールに従って、ハイブリダイゼーションおよび解析を行う。
【０１８１】
ＤＮＡマイクロアレイを用いる解析の場合：　例えば、宝酒造（株）社の市販ＤＮＡマイクロアレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーションおよび洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（宝酒造（株）社製）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。
【０１８２】
フィルターを用いる解析の場合：　ハイブリダイゼーションは、本発明が属する技術分野において周知の方法で行われ得る。例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラスイメージ（クロンテック社製））を用いて解析を行う。
【０１８３】
上記いずれの場合も、同一ロットの固相化試料に被験物質存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブと、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブをそれぞれハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーションの条件は同じとする。上記［２］に記載したように、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識した場合は、一つの固相化試料に両プローブの混合物をハイブリダイズさせることもできる（Ｂｒｏｗｎ，　Ｐ．　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。
【０１８４】
解析の結果、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブと、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブとの間で、固相化試料の標的遺伝子、すなわち前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子または「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列を有する遺伝子にハイブリダイズしたプローブ量を測定する。その結果、標的遺伝子にハイブリダイズしたプローブ量を比較して、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブの方が被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブよりも少なかった場合、該被験物質は、前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現を抑制する物質であるので、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１８５】
ｉｖ）その他
上記以外に、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料で、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料に比べて前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を低下させる被験物質の特定を検出する方法として、以下の方法を挙げることができる。
【０１８６】
すなわち、単一の反応において、ＰＣＲをハイブリダイゼーションプロービング（以下「プロービング」という）と組み合わせた「Ｔａｑｍａｎ」として知られる技術（Ｈｏｌｌａｎｄ，　Ｐ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８，　７２７６−７２８０）や、単一の反応においてＰＣＲをプロービングと組み合わせた方法（Ｈｉｇｕｃｈｉｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，　４１３−４１７（１９９２））を利用することもできる。後者の方法では、紫外線で励起されることにより蛍光を発する核酸検出試薬である臭化エチジウムをＰＣＲ反応液に添加する。２本鎖ＤＮＡの存在下で臭化エチジウムの蛍光は増加するので、励起光を照射したときに検出される蛍光の増加は２本鎖ＰＣＲ産物の蓄積に相関し得る。
【０１８７】
さらに、ＰＣＲによる増幅とプロービングとを組み合わせた別の方法として、欧州特許出願公開第０６０１８８９号公報記載の方法を利用することもできる。さらに、ライトサイクラーシステム（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、日本特許公開２０００−３１２６００号公報参照）を用いてｍＲＮＡ量を定量することも可能である。
【０１８８】
（Ｂ）ポリペプチドの検出
次に、本発明の方法の別の実施態様としては、上記した遺伝子発現を検出する実施態様において検出対象となった遺伝子がコードするポリペプチドを検出する方法がある。この実施態様においては、試料中のポリペプチドを９６穴プレートのウェル内底面やメンブレン等に固相化しておいてから、標的のポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた検出が行われる。このうち、９６穴プレートを用いるのは一般に固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）と呼ばれる方法である。一方、メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミド電気泳動を経てメンブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロット法）か、または直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませる、いわゆるドットブロット法やスロットブロット法が挙げられる。
【０１８９】
１）試料の調製
上記のようなポリペプチドを検出する実施態様において用いられる培養細胞の種類に関する条件は、上記した遺伝子発現を検出する実施態様の場合と同様である。また、哺乳動物個体に被験物質を投与して、その後該動物個体から採取された血清等を試料として用いる方法も採用し得る。この場合の好ましい哺乳動物種はヒト、マウス、ラットまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。例えばマウスとしては高脂血症マウスであるＫＫマウスが好ましく用いられるが、本発明はこれに限定されない。培養細胞の培養条件、被験物質の投与方法についても、遺伝子発現を検出する実施態様の場合と同様である。また、高脂血症の治療または予防剤としての活性を調べようとする被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等を挙げることができる。
【０１９０】
本実施態様のための試料を調製するための材料としては、被験物質存在下または非存在下で培養した細胞培養の培養上清または細胞質画分が用いられ得るが、培養上清が好適である。培養上清は、培養終了後回収し、必要によりフィルターろ過滅菌処理を経て、ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料の調製工程に供される。
【０１９１】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例えば回収した培養上清をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。
【０１９２】
ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料の調製方法は以下の通りである。まず、例えば培養上清をトリクロロ酢酸処理してタンパク質タンパク質を沈殿させ、遠心分離により沈殿を得る。この沈殿を氷冷したアセトンで洗浄し、風乾後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（バイオラッド社製等）に溶解する。
【０１９３】
ドット／スロットブロットの場合は、例えば回収した培養上清そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させる。
【０１９４】
２）試料の固相化
上記のようにして得られた試料中のポリペプチドを特異的に検出するため、該試料を固相化する。ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【０１９５】
電気泳動後のゲルからメンブレンにポリペプチドを移す、いわゆるブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｖｏｌｕｍｅ２　ｅｄ　ｂｙ　Ｊ．　Ｅ．　Ｃｏｌｉｇａｎ，　Ａ．　Ｍ．　Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，　Ｄ．　Ｈ．　Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，　Ｅ．　Ｍ．　Ｓｈｅｖａｃｈ，　Ｗ．　Ｓｔｒｏｂｅｒ）、セミドライ式ブロッティング法（上記ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｖｏｌｕｍｅ２　参照）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材も市販されている（例えば、バイオドット（バイオラッド）等）。
【０１９６】
一方、ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば０．０５％　アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃乃至室温で一晩、または３７℃で１乃至３時間静置することにより、ウェル内底面にポリペプチドを吸着させて固相化する。
【０１９７】
３）抗体
本実施態様に用いられる抗体は、上記（Ａ）のａ）からｅ）記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が動物細胞で発現することにより産生されるポリペプチド、好ましくは、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５（より好ましくは同１９−４５５）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその一部、もしくは配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体として好適なものは例えば、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５（より好ましくは、同１９−４５５）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれにも結合するが、他のいかなるマウスまたはヒト由来のタンパク質とも結合しないような抗体を挙げることができる。
【０１９８】
本実施態様のための抗体は、常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、ｐ．３８９−３９７、１９９２）、抗原となるタンパク質タンパク質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５−４９７，　１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，　Ｒ．ｅｄ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐ．３６５−３６７，　１９８０，　Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎ．Ｙ．）に従って、本発明のタンパク質タンパク質に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【０１９９】
一般的に、モノクローナル抗体の製造にあたっては、下記のような作業工程を経る。すなわち、（ａ）抗原として使用する生体高分子を精製、（ｂ）マウスへの抗原の注射による免疫、および血液を採取しアッセイして脾臓摘出の時期を決定することにより成る抗体産生細胞の調製、（ｃ）骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製、（ｄ）脾臓摘出、および脾細胞とミエローマの場合、（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、（ｆ）単一細胞クローンへの分割（　クローニング）、（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植したマウスの飼育、（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、あるいは標識試薬としての特性の検定等の作業工程を経る。
【０２００】
本発明のモノクローナル抗体も上記工程にそって製造することが可能であるが、これに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞、ミエローマ、他の哺乳動物の抗体産生細胞、ミエローマが使用できることは言うまでもない。
【０２０１】
（ａ）　　抗原の精製
抗原としては、請求項１０乃至１２に記載のポリペプチドであればいかなるものでもよいが、本発明のＤＮＡを大腸菌に導入し発現させ、精製することによって得られる融合タンパク質、本発明のＤＮＡでＣＯＳ−１細胞またはＣＨＯ細胞をトランスフェクトして得られる無血清培養上清から精製されたタンパク質などが抗原として有効である。
【０２０２】
（ｂ）　　抗体産生細胞の調製
本発明のＤＮＡをＣＨＯ細胞にトランスフェクトして得られる無血清培養上清から精製されたタンパク質とフロインドの完全、または不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用することが望ましく、これは多用されるマウス由来のミエローマがすべてＢＡＬＢ／ｃマウスを起源にしており、しかもその性質が比較的詳しく研究されており、さらに抗体産生細胞とミエローマがともにＢＡＬＢ／ｃマウス由来であれば、得られるハイブリドーマがＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔内で増殖できるため、複雑な手順なしに腹水よりモノクローナル抗体が得られるという利点があるためである。しかし、本発明がこれに制限されないことは上記の通りである。
【０２０３】
免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射いずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。
【０２０４】
免疫は、一回または適当な間隔で、好ましくは１週間から５週間間隔で複数回繰返し行ってもよい。免疫した動物の血清中の該抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として用いれば、その後の操作の効果を上げることができる。融合には最終免疫後３乃至５日後の動物由来の抗体産生細胞を用いることが好ましい。
【０２０５】
ここで用いる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、感度、迅速性、正確性、および自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法、およびＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【０２０６】
本発明による抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下のような手順により行うことができる。すなわち、抗原を固相に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）　に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させ、さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加え、マウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色などを測定することにより、抗体価算出を行うことができる。
【０２０７】
（ｃ）　　骨髄腫細胞の調製工程
骨髄細胞としては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−ｘ６３　Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７８））、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４．１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９（１９７６）　）、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８））、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０（１９７９））、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８（ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））などを用いることが好ましい。
【０２０８】
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）　、および牛胎児血清（ＦＣＳ　１０％）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地）、Ｉｓｃｏｖｅ´ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、またはＤｕｌｂｅｃｃ´ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前にＴＩＬ培地（ＴＩＬ　Ｍｅｄｉａ　Ｉ（免疫生物研究所）５００ｍｌに、５ｍｌ　ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ−ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ　ＳＯＬＵＴＩＯＮ（シグマ社）、および牛胎児血清（ＦＣＳ　１０％）を加えた培地）で継代培養し、融合当日２×１０７以上の細胞数を確保する。
【０２０９】
（ｄ）　　細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらの適宜の組み合わせから得ることができるが、脾臓細胞が最も一般に用いられる。
【０２１０】
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞と工程（ｃ）で得られた骨髄腫細胞を融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は以下の手順よりなる。
【０２１１】
脾細胞と骨髄腫細胞を培地、またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）でよく洗浄し、脾細胞と骨髄腫細胞の比が５乃至１０：１程度になるように混合し、遠心分離にかける。上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながらポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１０００乃至４０００）と培地との混液を加え数分後に遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞をＴＩＬ培地で懸濁して培養用プレート上の穴に分注する。各穴において細胞の増殖が確認されたら、ＨＡＴ培地（ＴＩＬ培地に、ヒポキサンチン１０−６乃至１０−３Ｍ、アミノプテリン１０−８乃至１０−７Ｍ、チミジン１０−６乃至１０−４Ｍを加えた培地）に置き換える。
【０２１２】
（ｅ）　ハイブリドーマ群の選択
培養用プレートは、ＣＯ２インキュベーター中、３５乃至４０℃で培養する。以後、１乃至３日ごとに培地の半量相当のＨＡＴ培地を加え、ＣＯ２インキュベーター中、３５乃至４０℃で１０乃至１４日間培養する。
【０２１３】
上記ミエローマ細胞は、８−アザグアニン耐性株であり、該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしのハイブリドーマは、ＨＡＴ培地中では生存できない。しかしながら、抗体産生細胞どうし、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができ、さらに抗体産生細胞どうしのハイブリドーマには寿命があるため、ＨＡＴ培地での培養によってハイブリドーマの選択が可能となる。
【０２１４】
コロニー状に生育してきたハイブリドーマの認められる穴について、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）への変換を行う。以後、培養上清の一部をとり、例えば、ＥＬＩＳＡ　法により抗体価を測定する。
以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いたが、その他のものもハイブリドーマの選択に応じて使用することができ、その場合当然使用する培地組成も変化する。
【０２１５】
（ｆ）　　クローニング
上記抗体価の測定により特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈してまきこむ方法、軟寒天培地中にまきこみコロニーをとる軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個の細胞を取りだしまきこむ方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡単でありよく用いられる。
【０２１６】
抗体価の認められた穴について、例えば限界希釈法によりクローニングを２乃至４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
【０２１７】
（ｇ）　ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリドーマは、ＨＴ培地より通常の培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清に、ゲルろ過などを行いＩｇＧ画分を集め精製することにより本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でも増殖させることが可能である。
【０２１８】
また簡便な方法としては、モノクローナル抗体精製キット（例えば、ファルマシア社のＭＡｂＴｒａｐ　ＧＩＩ）を利用することもできる。
【０２１９】
（ｈ）　モノクローナル抗体の同定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスの決定は以下のように行う。同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法がある。オクテルロニー法は、簡単ではあるがモノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮しなければならない。ＥＬＩＳＡ　法、またはＲＩＡ　法を用いれば、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種ＩｇＧサブクラスに対応する抗体を用いることが可能である。また、さらに簡便な方法としてアイソタイピング用のキット（　例えば、アマシャム社製、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット）　を利用することもできる。
【０２２０】
さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、および２８０ｎｍでの吸光度（１．４（ＯＤ２８０）＝イムのグロブリン１ｍｇ／ｍｌ）　より算出することができる。
【０２２１】
なお、本発明のモノクローナル抗体を高濃度、かつ安定的に産生するハイブリドーマクローンは、４５Ｂ１と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６３として寄託されている。
【０２２２】
かくして得られたモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質に対して高い特異性を持っており、さらに上記ハイブリドーマの培養によって均一に得られるため、本発明のタンパク質の単離、精製に用いることができる。例えば、抗原抗体反応を利用した免疫沈降法により、該モノクローナル抗体で本発明のタンパク質の単離、精製が可能である。すなわち、本発明のタンパク質を含む溶液中に該モノクローナル抗体を添加し、室温で保存した後、これにプロテインＧセファロース（ファルマシア社製）を混入し、さらに室温で保存する。遠心操作で沈殿を取得し、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ等で数回洗浄して、再び遠心して得られた沈殿物は、該タンパク質、該モノクローナル抗体、およびプロテインＧセファロースの複合体である。この沈殿物を適当な緩衝液に懸濁後、熱処理することにより該複合体を各成分に解離させてから、遠心を行い上清を回収する。この上清から、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）等により、該タンパク質を容易に単離、精製することが可能である。
【０２２３】
また、該モノクローナル抗体は、該タンパク質の単離、精製用のアフィニティークロマトグラフィー法におけるリガンドとしても用いることができる。アフィニティークロマトグラフィー法は、混合物から担体に特異的に結合する物質のみを単離精製する場合、極めて効果的な方法であり、混合物のゲルろ過と比較して、必要な精製過程を大幅に減少することができる。このアフィニティークロマトグラフィーにおいて有用な固定化モノクローナル抗体の作成は、各種酵素の固定化方法に準じて行うことができ、例えば、ＣＮＢｒ活性化担体を使用する方法が一般に利用でき、またこのような担体としてはクロマトグラフィーに一般的に使用されている各種材料、例えばセルロース、アガロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラス、あるいはこれらの担体にスペーサーを導入したもの、特にセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）、アフィゲル１０（バイオラッド社製）などが好ましい例として挙げられる。この固定化モノクローナル抗体を用いて実際に該タンパク質を精製するには、これらをカラムに充填した後、これに該タンパク質を含む溶液を通塔する。この操作で該タンパク質がカラムに吸着する。溶媒、例えば、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）、塩化ナトリウム溶液、プロピオン溶液、ジオキサン、エチレングリコール、カオトロピック塩、塩酸グアニジン、または尿素などで溶出することにより、吸着した該タンパク質が高純度で溶出する。
【０２２４】
なお、本発明のモノクローナル抗体は、マウス由来のものに限られず、本発明のタンパク質と結合性を有する限り、いかなる哺乳動物由来の抗体でも構わない。また、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するものに限られず、遺伝子工学の手法によって作成されたものでもよい。例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体なども、本発明のタンパク質と結合性を有する限り、本発明のモノクローナル抗体の範疇に含まれる。そのような抗体は、例えば、Ｍａｎ　Ｓｕｎｇ　Ｃｏ　らの方法（Ｍａｎ　Ｓｕｎｇ　Ｃｏ，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４８，　１１４９−１１５４）などに準じて作成することができる。
【０２２５】
本実施態様に用いられる抗体を作製するための抗原としては、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５（好ましくは、同１９−４５５）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号１６のアミノ酸番号２６−４０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号１８のアミノ酸番号２２−４９１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２０のアミノ酸番号２３−４９３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２２のアミノ酸番号２１−４７０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２４のアミノ酸番号２７−３４６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはそれらポリペプチドに任意のアミノ酸配列や担体が付加された形の誘導体を挙げることができるが、好ましくは配列表の配列番号９のアミノ酸番号１−１４からなるポリペプチドのＣ末端または配列番号１０のアミノ酸番号１−１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端に、キーホールリンペットヘモシアニンを担体として結合させたものである。
【０２２６】
配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５（好ましくは、同１９−４５５）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７−１４１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドを遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、上記ヌクレオチド配列を有するＤＮＡを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらにこれらのベクターに適当なプロモーター、および形質発現に関わる配列を導入することにより、それぞれの宿主において遺伝子を発現させることが可能である。
【０２２７】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【０２２８】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【０２２９】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０２３０】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９５，　８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【０２３１】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，　Ｌ．　Ａ．　（１９８０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７，　４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【０２３２】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１，　８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。
【０２３３】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターとともに、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　：　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｐ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｐ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１，　３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【０２３４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，　Ｔ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ，　（１９９２）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．　Ｉ：　３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質タンパク質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，　Ｉ．　Ｍ．　ａｎｄ　Ｖ．Ｃ．　Ｅｍｅｒｙ　（１９９３）　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４２，　１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質タンパク質のＮ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質タンパク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ　Ｗａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．
（１９９８）　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３７９，　１６７−１７４）。
【０２３５】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈａｌｌ，　Ｂ．　Ｄ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５７，　３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０，　１−５）などを好ましく利用できる。また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，　Ｌ．　Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８，　１２５−１３１）。
【０２３６】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【０２３７】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組み合わせなどを例示できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のポリペプチドを大量に製造できる。
【０２３８】
上記のようにして得られる抗体は、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法などの各種免疫学的測定法や免疫組織染色などに用いることができる。
【０２３９】
４）検出
上記３）記載の方法で得られる抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
【０２４０】
標識の種類として好ましいものは酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）を使用する方法のための、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）は種々のものが市販されている。ＲＩＡの場合はＩ１２５等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
【０２４１】
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原であるポリペプチドの量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、それら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
【０２４２】
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法においては、好ましくは市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定することにより定量する。また好ましくは上記３）において抗体作製のために使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行って、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することが可能である。
【０２４３】
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においてはＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができ、デンシトメトリーやＢＡＳ２０００ＩＩシステムを利用した定量も可能である。また、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
【０２４４】
５）測定操作
ｉ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば５％　スキムミルク、０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、１乃至１０％のウシ血清アルブミン、０．５乃至３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６乃至２４時間、または室温で１乃至３時間である。
【０２４５】
次に、メンブレンを０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液中に一定時間浸して、抗体をメンブレン上の抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、直ちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００乃至２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で１乃至３時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０２４６】
ｉｉ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
まず、上記２）の方法で試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
【０２４７】
次に、ウェル内を０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーションし、抗体を抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、直ちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００乃至２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１乃至３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０２４８】
また本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは例えば以下に記載する方法により実施することができる。まず、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５（好ましくは、同１９−４５５）に示されるアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列のいずれか一つにおいて、親水性に富む領域を２箇所選んで、それぞれの領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を上記４）記載のように標識しておく。標識しなかった方の抗体は、上記２）記載の方法に準じて９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０２４９】
６）　評価
以上に記載した方法で、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、その結果上記３）記載の方法で作製された抗体が特異的に結合するポリペプチドの産生量を低下させた被験物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。また、上記３）記載の方法で作製された抗体、およびその他上記の一連の方法に用いられる試薬をまとめることにより、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するためのキットが提供される。
【０２５０】
本発明の方法において検出の対象となるポリペプチドは、上記の抗体作製用の抗原を得る方法の記載に従って得られる他、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７−１４１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡを組み込んだアデノウイルスベクターを利用して動物細胞に産生させることもできる。そのような組換えアデノウイルスベクターを構築する方法として、市販のキット（例えば、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いる方法を例示できる。本発明の方法において検出対象となる遺伝子が哺乳動物の血中中性脂肪濃度と密接に相関していることは、例えば上記のようにして得られる組換えアデノウイルスベクターを有する組換えアデノウイルスを哺乳動物、例えばマウスに感染させて、該組換えアデノウイルスベクターが保持する遺伝子を発現させると血中中性脂肪濃度の上昇が観察されること、上記のようにして得られる組換えタンパク質をマウスに投与すると血中中性脂肪濃度の上昇が観察されること、および先天性低脂血症マウスにおいて配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７−１４１１に示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が高脂血症マウスよりも少ないことから証拠付けられる。
【０２５１】
また、遺伝子操作によって得られる、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を含む外来遺伝子が、該遺伝子を高発現することができるように導入されている非ヒト動物を用いた高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法も本発明に包含される。この方法で用いられる動物は、例えば、上記組換えアデノウイルスを感染させたＫＫ／Ｓｎｋマウスや、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７−１４１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡをマウスに導入したトランスジェニックマウス等であるが、これらに限定されない。
【０２５２】
トランスジェニック動物は、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し発生させることにより得ることができ、その手順については、既に確立されている方法に従うことができる［発生工学実験マニュアル（野村達次監修、勝木元也　編、１９８７年刊）、マウス胚の操作マニュアル（”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｂ．　Ｈｏｇａｎ，　Ｆ．　Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ　ａｎｄ　Ｅ．　Ｌａｃｙ著、山内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎　訳、１９８９年刊）、特公平５−４８０９３号公報等参照］。具体的には、例えばマウスの場合、まず雌マウス（血中中性脂肪濃度が通常より低いマウスであることが好ましく、例えばＫＫ／Ｓｎｋマウスが好ましいがそれに限定されない）に排卵誘起剤を投与後、同系統の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるための、プロモーターやエンハンサー等の調節遺伝子としては、導入された動物の細胞内で機能するものであればいずれも使用することができる。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩または帝王切開により出生させる。このようにして得られた動物が導入した遺伝子を保持していることを確認する方法としては、該動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型として導入遺伝子に特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲを行う方法、該ＤＮＡを数種の制限酵素で消化後ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜やナイロン膜等にブロッティングしたものについて導入遺伝子の全部または一部を標識したものをプローブとしたサザンブロット解析を行う方法等を挙げることができる。また、導入された遺伝子が実際に動物体内で発現しているか否かは、末梢血中の中性脂肪濃度を測定することにより確認することができる。導入された遺伝子が実際に動物体内で発現している場合は、遺伝子を導入しない動物よりも血中中性脂肪濃度が高くなる。
【０２５３】
そのようにして得られた遺伝子導入動物に被験物質を投与して、血中中性脂肪濃度を低下させる物質を選択する（好ましくは、遺伝子導入しない動物にも被験物質を投与して結果を比較し、遺伝子導入した動物で顕著に血中中性脂肪濃度を低下させる物質を選択する）。この方法では、導入された遺伝子の発現を抑制または阻害する物質のみならず、該遺伝子にコードされるポリペプチド自体の機能や、該ポリペプチドと相互作用して該ポリペプチドの機能発現に寄与する因子（例えば、レセプター）等、該ポリペプチドの作用による血中中性脂肪濃度の上昇に関わる生体反応のいずれかを阻害する物質を見出すことができる。そのような物質も高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０２５４】
本発明はまた、本発明の方法において検出対象とするポリペプチド（以下、単に「検出対象ポリペプチド」という）に特異的に結合する、抗体以外のポリペプチド、すなわち検出対象ポリペプチドのレセプターに関する。該レセプターが細胞膜に存在するタンパク質である場合は、該レセプターは例えば以下に記載する方法に従ってクローニングすることができる。まず、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを哺乳動物細胞で発現可能な組換えベクターを構築し、ＣＯＳ−１に導入してその培養上清を回収し、検出対象ポリペプチドの組換えポリペプチドを精製する。得られた組換えポリペプチドはフルオレセイン・イソチオシアネート（以下「ＦＩＴＣ」という）で標識しておく。次に、種々の哺乳動物組織由来の培養細胞に標識組換えポリペプチドを添加して、標識組換えポリペプチドが細胞膜上に特異的に結合する細胞、すなわちレセプターを発現する細胞を同定する。同定された細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを哺乳動物細胞で発現可能なベクター中に組み込み、レセプターを発現しない細胞（好ましくはＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞、より好ましくはＣＨＯ細胞）で発現させる。このｃＤＮＡライブラリーを発現させた細胞に上記のＦＩＴＣ標識した組換えポリペプチドを添加し、一定時間培養後、細胞を回収して、セルソーターでＦＩＴＣ標識された組換えポリペプチドが結合した細胞を選別する。得られた細胞から導入されたｃＤＮＡをＰＣＲ等によりクローニングする。必要に応じ、以上の操作を繰り返して、最終的にＦＩＴＣ標識組換えポリペプチドに特異的に結合するレセプターをコードするｃＤＮＡをクローニングする。またレセプター自体は、このようにしてクローン化された細胞から回収することができる。
【０２５５】
このようにして、検出対象ポリペプチドのレセプターをコードするｃＤＮＡが得られれば、そのｃＤＮＡライブラリーの材料となった細胞を利用して、さらに検出対象ポリペプチドと該レセプターとの相互作用を阻害する物質や、該レセプターに結合することによって検出対象ポリペプチドと同様の機能を発揮する物質、あるいは検出対象ポリペプチドと該レセプターとの相互作用によって開始されるシグナル伝達を阻害する物質のスクリーニングに利用することができる。具体的には、例えばマウスゲノムＤＮＡを制限酵素消化等により適宜断片化して、それらの一端に緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：レポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている）をコードするＤＮＡが連結されたベクターを、上記ｃＤＮＡライブラリーの材料となった細胞に導入する。この細胞の培養中に、検出対象ポリペプチドの組換えポリペプチド（標識しないもの）を添加して、緑色蛍光タンパク質を産生する細胞をセルソーターで選別する。選別された細胞は該組換えポリペプチドの存在下で緑色蛍光タンパク質を産生する。この細胞を９６穴培養プレートに１ウェルあたりの細胞数がほぼ同じになるように培養し、被験物質のみを添加するか、あるいは該組換えポリペプチドと被験物質を同時添加して一定時間培養した後、蛍光プレートリーダー等を用いて緑色蛍光タンパク質の産生量を測定する。被験物質単独で培養したときに緑色蛍光タンパク質の産生を引き起こす場合、該物質は検出対象ポリペプチドのアゴニストと考えられる。一方、該組換えポリペプチドと被験物質を同時添加したウェルにおける緑色蛍光タンパク質の産生量が、該組換えポリペプチド単独添加のウェルよりも少ない場合、被験物質は検出対象ポリペプチドのアンタゴニストまたは該ポリペプチドのシグナル伝達阻害剤であり、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤として有用であると考えられる。
【０２５６】
このようにして得られたアンタゴニストがタンパク質またはペプチドである場合、該タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の遺伝子治療に用いることができる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば同定されたアンタゴニストタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を解析し、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを合成して種々のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより取得できる。また、アンタゴニスト活性を有するぺプチドが、ランダムに合成された人工ペプチドライブラリー由来である場合は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを化学合成する。遺伝子治療においては、そのようにして得られたアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを、例えばウイルスベクターに組み込んで、該組換えウイルスベクターを有するウイルス（無毒化されたもの）を患者に感染させる。患者体内ではアンタゴニストが産生され、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を阻害するので、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の進展を抑制することができる。
【０２５７】
遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４）、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」，羊土社（１９９６））のいずれの方法も適用することができる。
【０２５８】
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ＴＲ４あるいは変異ＴＲ４をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【０２５９】
また遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）法およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，　１２　（１５）（１９９４））。
【０２６０】
例えば、該遺伝子治療剤がインビボ法により投与される場合は、疾患、症状等に応じ、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等、適当な投与経路により投与される。またインビボ法により投与する場合は、該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【０２６１】
配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列は、いわゆるアンチセンス治療に用いることができる。アンチセンス分子は、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列の一部に相補的な、通常１５乃至３０ｍｅｒからなるＤＮＡ、もしくはそのホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはモルフォリノ誘導体などの安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体として用いられ得る。そのようなアンチセンス分子を、微量注入、リポソームカプセル化により、あるいはアンチセンス配列を有するベクターを利用して発現させるなど、本発明の技術分野において周知の方法で、細胞に導入することができる。このようなアンチセンス療法は、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列がコードするタンパク質の活性を減少させることが有効な病気、特に、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療に有用である。
【０２６２】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造され得る。このような担体と製造方法の例は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．）に記載されている。そして、配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現やその遺伝子産物の活性に異常の認められる高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療に十分な量を各人に投与される。その有効量は、各人の状態、体重、性別、および年齢などの種々の因子や、皮下、局所、経口、および筋肉内といった投与方法の違いによって変化し得る。例えば、静脈注射する場合には、０．０２乃至０．２ｍｇ／ｋｇ／時間で２時間、また、皮下投与の場合には、１乃至２００ｍｇ／ｍ２／日のように変化し得る。
【０２６３】
ＩＩ．　ポリペプチドを用いた試験方法
本発明のポリペプチドは、例えば、（ａ）配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８を５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｂ）配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１８を５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６０２のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｃ）配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であってヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｄ）配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｅ）配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４を５’末端とし、ヌクレオチド番号１０３９乃至１２６１のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｆ）配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４を５’末端とし、ヌクレオチド番号１９０９を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｇ）配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２を５’末端とし、ヌクレオチド番号６３９乃至８４６のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｈ）配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２を５’末端とし、ヌクレオチド番号１５０３を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｉ）配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２を５’末端としヌクレオチド番号７９６乃至１０１５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｊ）配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２を５’末端とし、ヌクレオチド番号１６５４を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｋ）配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６を５’末端とし、ヌクレオチド番号３７３乃至３９４のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｌ）配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６を５’末端とし、ヌクレオチド番号１０４８を３’末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、の（ａ）乃至（ｌ）のいずれかを取得し、次いで該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを通常の遺伝子組換えの手法を用いて宿主細胞に生産させることにより得ることができる。
【０２６４】
なお、配列表の、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１２のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−１６に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去される（Ｃｏｎｋｌｉｎ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　６２，　４７７−４８２）ので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１６のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２５に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１８のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２１に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２０のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２２に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２２のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２０に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２４のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２６に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。
【０２６５】
また、原核細胞のような、哺乳動物のタンパク質のシグナルペプチドを切断する機能を有さない宿主を用いて本発明のポリペプチドを生産する方法としては、例えば、（ａ）配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７またはアミノ酸番号１４７乃至１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｂ）配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｃ）配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｄ）配列表の配列番号１８のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｅ）配列表の配列番号２０のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｆ）配列表の配列番号２２のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｇ）配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｈ）配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｉ）配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｊ）配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｋ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｌ）配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、の（ａ）乃至（ｌ）のいずれかのアミノ酸配列のアミノ末端側に、該アミノ酸配列を切断しないプロテアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列が連結し、さらにそのアミノ末端側に特定の化合物と特異的な親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列が連結している、アミノ酸配列からなる融合タンパク質を大腸菌に生産させ、次いで該融合タンパク質を、特定の化合物との親和性を利用して精製した後に、前記プロテアーゼによって、アミノ末端側の上記特定の化合物との親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列を除去する方法を挙げることができる。このような特定の化合物との親和性を利用した精製例としては、例えば、グルタチオン・Ｓ−トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）のアミノ酸配列が連結している融合タンパク質を大腸菌に生産させ、次いで該融合タンパク質をグルタチオンとＧＳＴとの親和性を利用して精製した後、プロテアーゼによってＧＳＴ配列を除去する方法を挙げることができる。ただし、本明細書中の実施例で示されているように、本発明のポリペプチドは、ＧＳＴ配列を除去しない融合タンパク質の状態であっても、その機能を損なわない。
【０２６６】
また、「アンジオポエチン関連タンパク質」のアミノ末端側（シグナルペプチド内）に、精製を容易にするためのヒスチジンタグが挿入され、かつ、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン結合領域を欠失しているポリペプチドも血中中性脂肪濃度上昇機能を失わず、例えば、配列表の配列番号２４に示されるような、「アンジオポエチン関連タンパク質３」のアミノ末端側（シグナルペプチド内）に、精製を容易にするためのヒスチジンタグが挿入され、かつカルボキシル末端側の２５３残基を欠失しているポリペプチドもまた、その機能を保持している。
【０２６７】
すなわち、本発明は、（ａ）配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｂ）配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｃ）配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｄ）配列表の配列番号１８のアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｅ）配列表の配列番号２０のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｆ）配列表の配列番号２２のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｇ）配列表の配列番号２４のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｈ）配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｉ）配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｊ）配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｋ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、（ｌ）配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、の（ａ）乃至（ｌ）のいずれかと、任意のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなり、かつ哺乳動物において血中中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドも包含するものである。なお、この場合、連結されるアミノ酸配列として、各ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質」のアミノ酸配列由来の連続した１８残基以上のアミノ酸配列は含まれない。
【０２６８】
「アンジオポエチン関連タンパク質」のｃＤＮＡのヌクレオチド配列情報は国立遺伝学研究所のデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ）から得ることができる。「アンジオポエチン関連タンパク質１」はアクセッション番号ＸＭ＿００１７２０、「アンジオポエチン関連タンパク質２」はアクセッション番号ＮＭ＿０１２０９８、「アンジオポエチン関連タンパク質３」はアクッセッション番号ＡＦ１５２５６２、「アンジオポエチン関連タンパク質４」はアクセッション番号ＡＦ２０２６３６、「アンジオポエチン関連タンパク質５」はアクセッション番号ＮＭ＿０３１９１７、「アンジオポエチン関連タンパク質６」はアクセッション番号Ｙ１６１３２で登録されている。
【０２６９】
配列表の配列番号１１のヌクレオチド番号１８を５’末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチドは、例えばヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするｃＤＮＡ、または独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに国際寄託されている組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持する組換えファージミドを鋳型とし、所望のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが増幅されるように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）を行うことにより得ることができる。あるいは、組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ７２２９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１）が保持する組換えファージミドｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１に挿入されているｃＤＮＡのヌクレオチド配列中の所望の位置に、該ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームと同一のリーディングフレーム上で終止コドンとなるヌクレオチド配列が挿入されるような部位特異的人工突然変異を施すことにより得ることもできる。
（ａ）配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であってヌクレオチド番号４３４を５’末端とし、ヌクレオチド番号１０３９乃至１２６１のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｂ）配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１９０９を３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｃ）配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド番号２２を５’末端としヌクレオチド番号６３９乃至８４６のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｄ）配列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１５０３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｅ）配列表の配列番号２１のヌクレオチド番号２４２を５’末端としヌクレオチド番号７９６乃至１０１５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド、（ｆ）配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１６５４を３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｇ）配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号３７３乃至３９４のいずれか１つのヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、（ｈ）配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号１０４８を３’末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、の（ａ）乃至（ｈ）はいずれも、ヒトの適当な臓器由来のｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質１、２、４、５、６」をコードするｃＤＮＡ、または、市販のｃＤＮＡクローン（例えばＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入できる）を鋳型とし、所望のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが増幅されるように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを行なうことにより得ることができる。
【０２７０】
しかしながら、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはこれらに限定されず、例えば上記した遺伝子組換えの手法において用いられる宿主のコドン使用頻度を考慮して適宜改変されたものや、また例えば人工合成ＤＮＡを連結して得られたものでも、宿主細胞において、（ａ）配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７またはアミノ酸番号１４７乃至１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｄ）配列表の配列番号１８のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｅ）配列表の配列番号２０のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｆ）配列表の配列番号２２のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｇ）配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｈ）配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｉ）配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｊ）配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｋ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｌ）配列表の配列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、の（ａ）乃至（ｌ）いずれかのポリペプチドを産生することが可能であるようなヌクレオチド配列を有するものであれば本発明に包含される。
【０２７１】
そのような、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、適当なベクターＤＮＡに組み込んで得られた組換えベクターは、原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換することができる。さらにこれらのベクターに適当なプロモーター、および形質発現に関わる配列を導入することにより、それぞれの宿主において導入した遺伝子を発現することが可能である。
【０２７２】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【０２７３】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株やＪＭ１０９株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【０２７４】
大腸菌内で他の生物由来のタンパク質を発現させる場合には、生物種間におけるコドンの使用頻度の違いにより、翻訳効率が制限されることがあり、これは大腸菌の細胞内のｔＲＮＡ量に偏りがあり、何種類かのｔＲＮＡが枯渇してしまうことが原因と考えられる。このような場合、大腸菌内で比較的量の少ないｔＲＮＡの量を多く発現するようにした株を用いる発現がうまくいくことがある。このような大腸菌としては例えば、大腸菌のＢＬ２１　ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ　（ＤＥ３）−ＲＩＬを挙げることができる。本株は大腸菌内では比較的少量のｔＲＮＡ遺伝子（アルギニン・イソロイシン・ロイシン）のコピー数を増した菌株である。
【０２７５】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０２７６】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９５，　８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【０２７７】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，　Ｌ．　Ａ．　（１９８０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７，　４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【０２７８】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１，　８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。
【０２７９】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　：　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｐ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｐ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１，　３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【０２８０】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，　Ｔ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ，　（１９９２）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．　Ｉ：　３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，　Ｉ．　Ｍ．　ａｎｄ　Ｖ．Ｃ．　Ｅｍｅｒｙ　（１９９３）　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４２，　１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質のアミノ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ　Ｗａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３７９，　１６７−１７４）。
【０２８１】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈａｌｌ，　Ｂ．　Ｄ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５７，　３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０，　１−５）などを好ましく利用できる。また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をアミノ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、アミノ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，　Ｌ．　Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２８，　１２５−１３１）。
【０２８２】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【０２８３】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のポリペプチドを大量に製造できる。
【０２８４】
本発明のポリペプチドは、上記の方法に従って得られる他、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを組み込んだアデノウイルスベクターを利用して動物細胞に産生させることもできる。そのような組換えアデノウイルスベクターを構築する方法として、市販のキット（例えば、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いる方法を例示できる。本発明のポリペプチドが哺乳動物の血中中性脂肪濃度と密接に相関していることは、例えば上記のようにして得られる組換えアデノウイルスベクターを有する組換えアデノウイルスを哺乳動物、例えばマウスに感染させて、該組換えアデノウイルスベクターが保持する遺伝子を発現させると、血中中性脂肪（トリグリセリド）濃度の上昇が観察されることから証拠付けられる。
【０２８５】
「アンジオポエチン関連タンパク質」をマウス血中に投与すると、カルボキシル末端のペプチドが除去されたペプチドが生成する。例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質３」を血中に投与するとアミノ酸の配列番号５２のアミノ酸番号２２１と２２２の間で切断されたポリペプチドと、アミノ酸番号２２４と２２５の間で切断されたペプチドの２種類のポリペプチドが取得できる。即ち、血中脂質濃度の上昇には、「アンジオポエチン関連タンパク質」を投与してもよいし、「アンジオポエチン関連タンパク質」のうちヘリックス領域のみを含むように改変した変異体ポリペプチドを投与してもよい。
【０２８６】
前記方法によって得られる本発明のポリペプチドは、例えば以下に記載するような高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験方法に用いることができる。
【０２８７】
まず、この方法で用いられる非ヒト動物は、例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質」（例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質３」および／または「アンジオポエチン関連タンパク質４」）を正常に産生しない突然変異遺伝子を有するＫＫ／Ｓｎｋマウスや、「アンジオポエチン関連タンパク質」（例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質３」および／または「アンジオポエチン関連タンパク質４」）遺伝子を発現しないように遺伝子操作されたノックアウトマウスが好適であるが、これらに限定されない。
【０２８８】
投与するポリペプチドとしては、［１］「アンジオポエチン関連タンパク質３」を正常に産生しない突然変異遺伝子を有するＫＫ／Ｓｎｋマウスに対しては、例えば、配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いたり、［２］「アンジオポエチン関連タンパク質４」を正常に産生しない突然変異遺伝子を有するＫＫ／Ｓｎｋマウスに対しては例えば、配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３乃至１８３のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いることができるが、血中中性脂肪濃度の上昇が確認できる限りにおいてこれらに制限されない。本発明のポリペプチドは単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０２８９】
本発明のポリペプチドの上記動物への投与方法としては、血管への投与、経口投与等が挙げられるが、血中中性脂肪濃度の上昇が確認できる限り、投与方法に制限はない。本発明のポリペプチドの上記動物への投与量は血中脂肪濃度の上昇が確認できる限りにおいて制限されないが、例えば、マウスの尾静脈に投与する場合には、マウス体重１ｇ当たり、０．０１μｇ乃至１０ｍｇの範囲で投与することができる。
【０２９０】
上記動物に本発明のポリペプチドを投与すると、血中中性脂肪（トリグリセリド）濃度の上昇が観察される。
【０２９１】
この実験系においては、本発明のポリペプチドと被験物質を試験動物に投与して、血中中性脂肪濃度が低下する物質を選択する。より好ましくは、［１］本発明のポリペプチドのみを投与した動物、［２］被験物質のみを投与した動物および、［３］両者を投与した動物の間で結果を比較し、［２］の動物において血中中性脂肪濃度に影響を及ぼさず、かつ［３］の動物において［１］の動物と比較して顕著に血中中性脂肪濃度を低下させる物質を、本発明のポリペプチドの機能を特異的に抑制する物質として選択する。この方法では、本発明のポリペプチド自体の機能や、該ポリペプチドと相互作用して該ポリペプチドの機能発現に寄与する因子（例えば、レセプター）等、該ポリペプチドの作用による血中中性脂肪濃度の上昇に関わる生体反応のいずれかを阻害する物質を見出すことができる。そのような物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０２９２】
一方、本発明のポリペプチドはイン・ビトロでＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性を阻害する効果を有するので、以下に記載するようなＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性を調節する物質の試験方法に用いることができる。
【０２９３】
この試験方法は、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性測定方法において、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ反応時に、本発明のポリペプチドと、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性を調節する作用を調べようとする物質（以下「被験物質」という）とを共存させることにより実施することができる。より具体的には、以下に記載する［１］−ａ乃至［３］または［１］−ｂ乃至［３］の材料を共存させてＬＰＬ活性を調べる系において、さらに被験物質を加えたときの、ＬＰＬ活性の変化を調べる。
【０２９４】
［１］−ａ　ＬＰＬを含む材料
ＬＰＬを含む材料としては、ＬＰＬを産生している、哺乳動物脂肪細胞由来または脂肪細胞の前駆細胞由来の細胞株の培養上清を用いることができる。細胞株が未分化である場合は、脂肪細胞に分化させてから材料を調製することが好ましい。ＬＰＬを産生している細胞株としては例えば、マウス細胞株３Ｔ３−Ｌ１（大日本製薬（株）社より購入可能）、同３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ、同Ｏｂ１７等を挙げることができる。あるいは、ラット白色前駆脂肪細胞（初代培養細胞）を脂肪細胞に分化させた細胞も好適に用いることができるが、本発明はこれらに限定されない。
【０２９５】
また、ＬＰＬを含む材料として、精製ＬＰＬや組換えＬＰＬ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９９６）　２６３，　３１９−２６参照）を使用することもできる。例えば、牛乳由来のＬＰＬ（シグマ社より市販されている）を本発明の方法に使用することが可能である。
【０２９６】
［１］−ｂ　ＬＰＬおよびＨＴＧＬを含む材料
ＬＰＬおよびＨＴＧＬを含む材料としては、体重１ｋｇあたり１０乃至１００単位のヘパリンを静注して１０分乃至１５分経過後の哺乳動物から採取した末梢血由来の血漿が好適である。
【０２９７】
［２］または［２］−ｂ　ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料
次に、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料は、これらリパーゼの触媒により脂肪酸を遊離することが知られている物質を含み、かつこれらリパーゼの活性を阻害したり不活性化する成分が含まれていないものであればよいが、例えばグリセロール・トリ［９，１０（ｎ）−３Ｈ］オレイン酸のようにＬＰＬの触媒により遊離される脂肪酸が放射性同位元素で標識してある化合物や、同様に特定の励起波長下で蛍光を発する物質で標識された化合物が特に好適である。また、遊離脂肪酸の量を生化学的な方法で測定する場合には、標識されていない基質（例えばグリセロール・トリオレイン酸）も用いられ得る。
【０２９８】
［３］本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドとしては、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、または請求項１８乃至３４記載のポリペプチドを用いることができるが、これらに限定されない。
【０２９９】
本発明の方法における被験物質は、特に限定されず、微生物の培養液や動植物の組織からの抽出物、培養細胞の培養液からの抽出物、人工的に合成された無機または有機化合物、組換えタンパク質、抗体またはその断片、もしくはそれらの中の複数種類の物質を混合した組成物などがいずれも用いられ得る。
【０３００】
その他、反応液には、必要に応じ、ｐＨ調整のための緩衝液や、アルブミンなどのタンパク質成分が添加され得る。
【０３０１】
これらの材料を混合し、以下に記載する条件でＬＰＬ反応を行う：
温度条件：　２７乃至３７℃、好適には３７℃；
反応液のｐＨ：　８．０乃至８．５、好適には８．０；
反応液中の塩化ナトリウム濃度：　０．１乃至０．１５Ｍ、好適には０．１５Ｍ；
反応時間：　１５乃至１２０分、好適には１２０分。
【０３０２】
なお、ヘパリン投与した哺乳動物由来の血漿のように、ＬＰＬとＨＴＧＬの両方を含む材料を用いる場合は、上記条件でＬＰＬとＨＴＧＬとを合わせたリパーゼ活性が測定できる。ＨＴＧＬ活性のみを測定する場合には、他の条件は変えずに塩化ナトリウム濃度を１Ｍにすることにより、ＬＰＬが不活性化された条件でリパーゼ反応を進行させる。ＬＰＬ活性は総リパーゼ活性からＨＴＧＬ活性を差し引いた値となる。
【０３０３】
反応終了後、反応液に有機溶媒を添加、混合してから遊離脂肪酸を含む層と未反応の基質を含む層とを分離させ、前者に集まった遊離脂肪酸の量を測定する。
【０３０４】
また、標識されていない基質を用いた場合の試験方法の例を以下に示す（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．　３０，７４８（１９８４））。
【０３０５】
基質溶液０．５ｍｌ（７．５μｍｏｌ　グリセロール・トリオレイン酸、２２．５ｍｇ　アラビアゴム、１００μｍｏｌ　トリス−塩酸（ｐＨ８．２）、５０μｍｏｌ　塩化ナトリウム、２５ｍｇ　アルブミン、１４０μｌ　ヒト血漿）を３７℃で８０分間インキュベートした後、脂肪細胞培養上清を加え、また同時に本発明のポリペプチドと被験物質を添加して、２８℃で６０分間反応させる。次に反応液に２．５ｍｌのイソプロパノール：ヘプタン：硫酸（２．５ｍｏｌ／Ｌ）＝４０：１０：２（ｖ／ｖ）を加え、１０分間混合し、室温で４０分放置後、有機層を１ｍｌ採取し、窒素乾固する。得られたものを５％　トリトン　Ｘ−１００溶液にて溶解し、市販の脂肪酸測定キット（例えばＮＥＦＡ−テストワコー（和光純薬（株）社製））等を利用して脂肪酸量を測定する。
【０３０６】
上記方法により試験を行った結果、本発明のポリペプチドによるＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性阻害を抑制し、結果的にＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性を上昇させた被験物質は、血中の中性脂肪濃度を低下させる、新しい高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の候補として選択される。
【０３０７】
ＩＩＩ．プロモーターＤＮＡを用いた試験方法
本発明のＤＮＡは、マウスゲノムより作成した遺伝子ライブラリーから、例えば、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｃｏｎｋｌｉｎ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　６２，　４７７−４８２　（１９９９））またはマウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｋｅｒｓｔｅｎ，　Ｓ．，　ｅｔａｌ．　（２０００）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　２８４８８−２８４９３；Ｙｏｏｎ，　Ｊ．　Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２０，　５３４３−５３４９）の５’末端側をプローブとして利用したスクリーニングにより単離することができる。または、この配列の情報に基いて、マウスゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）により、ライブラリーのスクリーニングの工程を経ずに直接本発明のＤＮＡを増幅することもできる。
【０３０８】
なお、本発明のＤＮＡが挿入されている組換えプラスミドｐＧＬ８−３は、２００１（平成１３）年６月７日付で独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６２７が付されている。したがって、本発明のＤＮＡは、当該プラスミドから取得することもできる。
【０３０９】
なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、天然型のプロモーターＤＮＡのヌクレオチド配列の一部を他のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡを調製することが可能である。このように天然型のヌクレオチド配列においてヌクレオチドが置換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。これらのうち好適なものは、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、より好適には配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１から１８８で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡである。
【０３１０】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１からヌクレオチド番号５２６で示されるヌクレオチド配列または配列番号２８のヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、プロモーター活性を有するものであればよい。このようなＤＮＡは、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列または配列番号２８のヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド配列と、通常、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列の同一性を有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【０３１１】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェントな条件（ローストリンジェントな条件）では、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ　塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ　クエン酸ナトリウム）またはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７−４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリンジェントな条件）では、前記において、洗浄を０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことにより実施できる。
【０３１２】
このようにして得られた本発明のＤＮＡがプロモーター活性を有するか否かは、下記に説明するように、その下流にルシフェラーゼ等のマーカー遺伝子を連結したもの（以下「レポーター遺伝子」という）で哺乳動物細胞を形質転換し、この形質転換細胞におけるマーカー遺伝子の発現が検出されるか否かを調べることによって確認することができる。
【０３１３】
本発明で用いられる発現ベクターは外来遺伝子の上流側に外来遺伝子配列と同じ転写の方向で本発明のＤＮＡが連結されており、哺乳動物細胞中で外来遺伝子を発現させ得るものである。かかる発現ベクターは、外来遺伝子の上流に本発明のＤＮＡが連結されているため、本発明のＤＮＡ中におけるプロモーターの制御下に外来遺伝子を発現することができる。本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞に導入することにより複製され得る形態であればよく、例えば、適当なレプリコンを有する環状または直線状のいずれであってもよい。
【０３１４】
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のＤＮＡウイルス、またはＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が好ましい。
【０３１５】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、なかでも、ＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【０３１６】
該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）およびリポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　５７０７−５７１７，　Ｓｕｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ　（１９８４）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４，　１６４１−１６４３）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。ただし、培養細胞株がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いる。
【０３１７】
また、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し、発生させることにより得たトランスジェニック動物を用いることもでき、その手順は公知の方法［発生工学実験マニュアル（野村達次　監修、勝木元也　編、１９８７年刊）、特開平５−４８０９３号等参照］に従えばよい。具体的には、例えば、マウスの場合にはまずメスマウスに排卵誘起剤を投与後、同系統のオスと交配し、翌日メスマウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるために本発明のＤＮＡをプロモーターとして有し、エンハンサー等の調節遺伝子は、導入された動物の細胞内で機能するものであれば特に限定されない。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親メスマウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、役２０日後に自然分娩または帝王切開により出生させる。
【０３１８】
こうして得られた動物が、導入遺伝子を保持していることを確認する方法としては、例えば：前記動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡをこれに特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅する方法、該ＤＮＡを制限酵素で消化後、ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをナイロン膜等にブロッティングした後、標識した導入遺伝子の全部または一部をプローブとしてサザンブロット解析を行なう方法等を挙げることができる。
【０３１９】
外来遺伝子としては、対象疾患を治療するためのタンパク質をコードする遺伝子、マーカー遺伝子などが挙げられる。
【０３２０】
以下、本発明のＤＮＡの使用方法について述べる。
【０３２１】
１）誘導型発現ベクターとしての利用
本発明のＤＮＡが、ある特異的な刺激によりプロモーター活性を表すことが判明した場合、所望の遺伝子の上流に本発明のＤＮＡを挿入したベクターなどを作製して体細胞に導入し、該刺激を付加することにより、該所望の遺伝子を誘導的に発現させることができる。
【０３２２】
２）ＤＮＡによる拮抗阻害を利用したＤＮＡのプロモーター活性調節
本発明は、上記プロモーターＤＮＡの配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ（その誘導体を含む。以下「部分配列」という）に関する。このような部分配列を用いることにより、該部分配列自体がプロモーター活性を有するか否かを問わず、上記プロモーターＤＮＡとこれに結合しうるタンパク質（例えば、転写因子）との結合を拮抗阻害する方法を実施することが可能である。例えば、該部分配列が、本発明のＤＮＡ配列上においてそのプロモーター活性を阻害するタンパク質の結合部位に相当する場合には、この方法によりプロモーター活性を促進することができ、逆にプロモーター活性を促進するタンパク質（転写因子を含む）の結合部位に相当する場合には、プロモーター活性を阻害することができる。このような拮抗阻害に用いる部分配列ＤＮＡは、通常少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは１０ヌクレオチド以上の鎖長を有する。また、拮抗阻害に用いるために選択される部分配列の種類としては、例えば、プロモーター上の転写因子の結合コンセンサス部位を含む配列が挙げられる。また、そうした部分配列ＤＮＡの誘導体としては、いくつかの部分配列を連結したものや、それをアデノウイルスベクター等に組み込んで動物細胞への遺伝子導入を可能にしたもの、また、ＤＮＡの３’末端もしくは５’末端にビオチンを連結したもの等が用いられ得る。
【０３２３】
下記実施例において明らかなように、「アンジオポエチン関連タンパク質３」および「アンジオポエチン関連タンパク質４」は、低脂血症マウスで強制発現させると血中の中性脂肪濃度が上昇する。「アンジオポエチン関連タンパク質３」が正常に産生されない変異遺伝子の影響により、顕著な血中脂質濃度の低下、動脈硬化の進展抑制および高血糖の改善が観察され、「アンジオポエチン関連タンパク質４」についても同様の現象が観察されると考えられるので、本発明のＤＮＡが有するプロモーター活性を抑制する機能を有する部分配列またはその誘導体は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防のための医薬組成物の有効成分として有用である。
【０３２４】
３）プロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニング
本発明のＤＮＡのプロモーター活性の調節には、上記のような部分配列等を用いた拮抗阻害の他に、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質を利用する方法を用いることもできる。本発明のＤＮＡは、そのプロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニングに利用することが可能である。したがって、本発明は、下記に示すような、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニング方法に関する。そのようなタンパク質としては、直接本発明のＤＮＡに結合してそのプロモーター活性を促進あるいは阻害するタンパク質の他に、細胞膜受容体や細胞内タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進あるいは阻害するタンパク質が含まれる。
【０３２５】
３−１）プロモーターＤＮＡに結合するタンパク質のスクリーニング
この方法は、本発明のＤＮＡに被験タンパク質試料を接触させ、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質を選択する工程を含む。このような方法としては、例えば、本発明のプロモーターＤＮＡを用いた、これに結合するタンパク質のアフィニティー精製が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、本発明のプロモーターＤＮＡをビオチン化し、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズに結合させてＤＮＡアフィニティービーズを作製する。次いで、これを細胞の核抽出液とインキュベートして本発明のＤＮＡと特異的に結合する核抽出液中のタンパク質を精製し、この構造を決定する。これにより、直接本発明のＤＮＡと結合するタンパク質、およびＤＮＡ結合活性は持たないがサブユニットとして該タンパク質と複合体を形成し本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が精製できる（ＧａｂｒｉｅｌｓｅｎＯ．Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１７，　６２５３−６２６７　（１９８９）、Ｓａｖｏｙｓｋｙ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　９，　１８３９−１８４６　（１９９４））。
【０３２６】
３−２）プロモーター活性を指標にしたタンパク質のスクリーニング
この方法は、本発明のＤＮＡの下流に連結されたマーカー遺伝子［下記５−２）において詳述する］を保持する細胞に被験ＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物を選択する工程を含む。このような方法には、例えば、酵母や動物細胞を用いたｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法が含まれる。具体的には、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を細胞に安定に導入し、次いでこれに遺伝子ライブラリーを導入して、レポーター遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなクローンを選択し、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質を選択する。この方法により、直接本発明のＤＮＡと結合するタンパク質の他に、細胞内の内在性タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質を得ることができる。なお、酵母のｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法（Ｌｉ　Ｊ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　Ｉ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６２，　１８７０−１８７３　（１９９３）、Ｗａｎｇ　Ｍ．Ｍ．ａｎｄ　Ｒｅｅｄ　Ｒ．Ｒ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３６４，　１２１−１２６　（１９９３））などで、「Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック社）」等がキットとして発売されている。
【０３２７】
さらに他の一つの態様は、本発明のＤＮＡの下流に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被験試料を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節するタンパク質を選択する工程を含む。具体的な方法の一例としては、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子が挿入されたレポーター遺伝子を安定に導入した細胞と、被験試料（例えば、遺伝子ライブラリーを導入した細胞の培養上清）とをインキュベートして、マーカー遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質を選択する。この方法では、細胞膜受容体などを介して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性に影響を与えるタンパク質が得られる。
【０３２８】
４）プロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング方法
本発明のＤＮＡを用いて、そのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするＤＮＡを直接単離することも可能である。本発明は、また、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法の一つの態様は、本発明のＤＮＡに被験ＤＮＡの発現産物を接触させ、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。このような方法には、例えば、サウスウエスタン法が含まれる。具体的には、遺伝子ライブラリーを導入した大腸菌で各タンパク質を発現させ、これらをフィルター膜に転写した後、本発明のＤＮＡをプローブとして直接ブロットし、該ＤＮＡプローブと結合するタンパク質を発現するクローンを選択して、これをコードする遺伝子を単離する。この方法により本発明のＤＮＡに結合する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる（実験医学別冊　バイオマニュアルシリーズ「転写因子研究法」（株）羊土社刊、１７７−１８８頁参照）。
【０３２９】
他の一つの態様は、本発明のＤＮＡの下流に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被験ｃＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。このような方法には、例えば、上記した酵母や動物細胞を用いたｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法が含まれる。
【０３３０】
すなわち、本発明のＤＮＡをとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を哺乳動物由来の培養細胞に安定に導入した細胞（以下「細胞Ａ」という）に、さらに該細胞に哺乳動物細胞用発現ベクターに被験ｃＤＮＡが挿入された組換えプラスミドを導入した細胞（以下「細胞Ｂ」という）を培養する。比較対照としては、細胞Ａをそのまま培養するか、あるいは、細胞Ａに被験ｃＤＮＡを含まない哺乳動物細胞用発現ベクターや、被験ｃＤＮＡを含んでいてもそれが発現しない組換えプラスミドを導入した細胞（以下「細胞Ｃ」という）を培養する。細胞Ｂと、細胞Ａまたは細胞Ｃとの間で、マーカー遺伝子の発現量を比較し、マーカー遺伝子の発現を促進するかまたは阻害するようなｃＤＮＡクローンを選択する。この方法では、本発明のＤＮＡと直接結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡだけでなく、細胞内の内在性タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡも得ることができる。
【０３３１】
さらに他の一つの態様は、本発明のＤＮＡの下流に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被験ｃＤＮＡの発現産物を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。具体的な方法の一例を示せば、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を安定にに導入した細胞と、被験ｃＤＮＡの発現産物（例えば、ｃＤＮＡライブラリーを導入した細胞の培養上清）とをインキュベートして、マーカー遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質あるいはそれをコードするｃＤＮＡを単離する。この方法により細胞膜受容体などを介して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性に作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡを得ることができる。
【０３３２】
５）プロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング
本発明のＤＮＡを用いて、そのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニングを行うことも可能である。すなわち本発明は、下記に示すような、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。
【０３３３】
５−１）プロモーターとタンパク質との結合を指標としたスクリーニング
この方法は、被験化合物の存在下で本発明のＤＮＡと被験試料とを接触させ、本発明のＤＮＡと被験試料中のタンパク質との結合を促進または阻害する化合物を選択する工程を含む。具体的には例えば、細胞の核抽出液を、本発明のＤＮＡを放射性同位元素等により標識したプローブと結合させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、核抽出液中のタンパク質と本発明のＤＮＡとの複合体のバンドをゲルシフト法により検出する（実験医学別冊　バイオマニュアルシリーズ「転写因子研究法」（株）羊土社刊、１０７−１１２頁参照）。ＤＮＡプローブ添加の際、被験化合物も添加し、核抽出液中のタンパク質と本発明のＤＮＡとの複合体のバンドの形成を促進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、直接本発明のＤＮＡに作用する化合物および本発明のＤＮＡに結合するタンパク質に作用する化合物が得られる。例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が生体内で本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害するような場合、このタンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を阻害するような化合物は、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進できると考えられる。なお、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が既に単離されていれば、細胞の核抽出液に代えて、該タンパク質の組み換えタンパク質を利用することも可能である。
【０３３４】
５−２）プロモーター活性を指標としたスクリーニング
この方法は、本発明のＤＮＡの３’末端側に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被験化合物を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節する化合物を選択する工程を含む。この方法では、直接、間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物が得られる。
【０３３５】
この方法において、本発明のＤＮＡの３’末端側に連結されるマーカー遺伝子にコードされるマーカータンパク質は、宿主である上記細胞が本発明の方法の一連の過程において産生し得る他のいかなるタンパク質とも区別可能なもの（好ましくは、形質転換前の上記細胞が該マーカータンパク質と同一または類似のタンパク質をコードする遺伝子を持たないようなもの）であればよい。例えば、マーカータンパク質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、マーカー遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるマーカー遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば該マーカー遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。さらに好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなものとして、以下に挙げるようなタンパク質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない：
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：　クロラムフェニコールにアセチル基を付加する。いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出可能。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとしてｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている；
ホタルルシフェラーゼ：　ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量する。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている；
β−ガラクトシダーゼ：　呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしてｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている；
分泌型アルカリホスファターゼ：　呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしてｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている；
緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）：　酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
【０３３６】
培養細胞株に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）、リポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　５７０７−５７１７，　Ｓｕｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ　（１９８４）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．４，　１６４１−１６４３）等を挙げることができるが、これらに限定されず、本発明の属する技術分野において汎用される他の方法も採用することができる。ただし、培養細胞株がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いる。
【０３３７】
このようにして本発明のＤＮＡの３’末端側にマーカー遺伝子が連結された発現ベクターをトランスフェクションした細胞を培養すると、マーカー遺伝子の転写が促進される。マーカー遺伝子の発現が可能な条件下で培養するにあたって、培地中に任意の被験物質を添加した条件および添加しない条件を設定して培養後、マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質の添加によりマーカー遺伝子の発現量に変化が生じるか否かを検定する。「マーカー遺伝子の発現が可能な条件」は、細胞が生存して、タンパク質の生産が可能な条件であればよいが、好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）を使用し、４乃至６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６乃至３８℃（最も好適には３７℃）で２乃至３日間（最も好適には２日間）培養する。
【０３３８】
このような系において、本発明のＤＮＡの３’末端側にマーカー遺伝子が連結された発現ベクターを導入した際のレポーター遺伝子の発現誘導を抑制するような被験物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤として有用な候補物質として選択される。
【０３３９】
なお、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質が既に得られている場合には、被験化合物の存在下で該タンパク質（またはその誘導体）と本発明のＤＮＡとを接触させ、該タンパク質（またはその誘導体）と本発明のＤＮＡとの結合を促進または阻害する化合物を選択して、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングすることが可能である。具体的には、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを融合した本発明のＤＮＡに結合するタンパク質（ＤＮＡ結合ドメインのみでもよい）を精製して、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビチオン化した本発明のＤＮＡをこのタンパク質と接触させ、該タンパク質と本発明ＤＮＡとの結合をストレプトアビジン化アルカリホスファターゼで検出する。本発明のＤＮＡ添加の際、被験化合物も添加し、該タンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を促進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、直接本発明のＤＮＡに作用する化合物および本発明のに結合するタンパク質に作用する化合物が得られる。例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が生体内で本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する場合、このタンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を阻害するような化合物は本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進できると考えられる。
【０３４０】
なお、下記参考例において明らかなように、「アンジオポエチン関連タンパク質３」および「アンジオポエチン関連タンパク質４」は、低脂血症マウスで強制発現させると血中の中性脂肪濃度が上昇する。「アンジオポエチン関連タンパク質３」が正常に産生されない変異遺伝子の影響により、顕著な血中脂質濃度の低下、動脈硬化の進展抑制および高血糖の改善が観察され、「アンジオポエチン関連タンパク質４」についても同様の現象が観察されると考えられるので、本発明のＤＮＡが有するプロモーター活性を抑制する機能を有する部分配列またはその誘導体は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。
【０３４１】
【実施例】以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　著、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【０３４２】
参考例１．　ｃＤＮＡのクローニング
マウス肝臓を材料として、下記の方法に従って配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを取得した。
【０３４３】
ａ）マウス肝臓からのｍＲＮＡの抽出
９週齢のＫＫマウス（雄、浜松医科大学付属動物実験施設より入手）２匹より解剖して肝臓を摘出後、速やかに液体窒素中に入れて急速凍結させた。この重量を測定し、３．１ｇを乳鉢上で液体窒素存在下で粉砕した。５．５Ｍ　グアニジンチオシアネート（以下ＧＴ）緩衝液（５．５Ｍ　グアニジンチオシアネート、２５ｍＭ　クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％　サルコシル、０．２Ｍ　β−メルカプトエタノール）（３０ｍｌ）を加え、乳棒で破砕し、新たにＧＴ緩衝液（１０ｍｌ）を加え、乳棒で破砕後、溶解液を回収した。また、ＧＴ緩衝液（２０ｍｌ）で乳鉢を洗浄しこの溶液も回収した。３６ｍｌの回収液を３０００ｒｐｍ、１０℃で１０分間遠心後、上清を新しいチューブに移し、各々１８ゲージの注射針で２０回吸引排出を繰り返した。次にセシウム・トリフルオロ酢酸（ＣｓＴＦＡ）を用いた密度勾配遠心による全ＲＮＡの分離を行った。ＣｓＴＦＡ原液（１９ｍｌ）をリボヌクレアーゼ不含再蒸留水（１８．９２４ｍｌ）で希釈し、この希釈液（６．１８ｍｌ）を６本の１３ＰＡ（ベックマン製）チューブに入れ、先に回収したサンプル（１チューブあたり５．２ｍｌ）を重層した。このものをスイングローター（日立工機（株）社製Ｐ４０ＳＴ）を用い超遠心機（日立ＳＣＰ７０Ｈ型）で３００００ｒｐｍ（約１２５０００ｇ）、２０℃で２０．５時間遠心した後、上清を除去して得られたペレットをｍＲＮＡ精製キット（アマシャム・ファルマシア社製クイックプレップｍＲＮＡ精製キット）添付の抽出緩衝液　３．３ｍｌに懸濁した。ｍＲＮＡの精製は該精製キットを添付プロトコールに従って用いることにより行った。このようにして得られた５μｇのｍＲＮＡを鋳型とし、ｃＤＮＡライブラリー作製キット（ストラタジーン社製ＺＡＰエクスプレス・ｃＤＮＡ・ギガパックＩＩＩゴールド・クローニングキット）をその添付プロトコールに従って用いることにより、λファージｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【０３４４】
ｂ）ｃＤＮＡライブラリーの１次スクリーニング
上記ａ）記載の方法で得られたλファージｃＤＮＡライブラリーを感染させた大腸菌を、直径９ｃｍの培養シャーレに作製した寒天培地プレート（ＮＺＹ培地：０．５％　塩化ナトリウム、０．２％　硫酸マグネシウム７水和物、０．５％イーストエキストラクト、１％　カゼイン加水分解物、１．５％　寒天）に、プレート１枚あたり１．８×１０５個のプラークが形成されるように分散させ、３７℃で８時間培養した。このプラーク形成された寒天培地の１４ヶ所について、２５０μｌ用の広径ピペットチップ（ＲＡＩＮＩＮ社製）の底部を用いて寒天培地をプラークごと抜き取り、それら寒天培地片をそれぞれ１００μｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ　塩化ナトリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％　ゼラチン）の入ったプラスチック遠心管に入れ、ボルテックスミキサーを用いて激しく混濁させてから４℃で１乃至２時間放置した後、１２０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収し、ファージ懸濁液とした。
【０３４５】
一方、ＰＣＲに用いるプライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
プライマー１：５’−　ｇａｃｔｇａｔｃａａ　ａｔａｔｇｔｔｇａｇ　ｃｔｔ　−３’（配列表の配列番号５）；およびプライマー２：５’−　ｔｇｃａｔｃｃａｇａ　ｇｔｇｇａｔｃｃａｇ　ａ　−３’（配列表の配列番号６）
を有するオリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡ合成機（モデル３９４：（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）を用い、ホスホアミダイト法（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，　Ｍ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，　Ｍ．　Ｈ．　（１９８１）　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　１０３，　３１８５−３１９１）に従って合成した。
【０３４６】
上記のようにして得られたファージ懸濁液５μｌを、２．５μｌの１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造（株）社製のＴａｑポリメラーゼに添付）、４μｌのｄＮＴＰ混液（各２．５ｍＭ、宝酒造（株）社製のＴａｑポリメラーゼに添付）、各１μｌの各７．５μＭに調整した上記プライマー１および２、０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（宝酒造（株）社製）、１１．２５μｌの滅菌水と混和し、まず９４℃で５分加熱した後、引き続き９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間保温してから、４℃に保存した。反応物は４％のアガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ　３：１アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ社製）で調製した）で電気泳動して、特異的断片の増幅を解析した。このようにして１４のファージ懸濁液をスクリーニングした結果、目的のｃＤＮＡの断片が特異的に増幅される二つの陽性サンプルを得た。
【０３４７】
ｃ）２次スクリーニング
マウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）１００ｎｇを鋳型にして上記ｂ）に記載した条件でＰＣＲを行い、アガロース電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を鋳型として、マルチプライムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム・ファルマシア社）を用いて３２Ｐで標識されたＤＮＡ断片を生成する反応を行った後、反応液をニックカラム（アマシャム・ファルマシア社製）に注入した。このカラムに４００μｌのＴＥ（１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を流して１回洗浄し、さらに４００μｌのＴＥを流して溶出液を回収した。この溶出画分全量を以下の２次スクリーニングに標識プローブとして用いた。
【０３４８】
一方、上記ｂ）で陽性と判定されたファージ懸濁液をＳＭ緩衝液で１００倍希釈し、そのうち２μｌ分のファージを感染させた大腸菌を、直径９ｃｍの培養シャーレに作製した寒天培地プレートに分散させ、３７℃で８時間培養した。このプラーク形成された寒天培地上に、シャーレ内径に合わせた円形のナイロンメンブレン（アマシャム・ファルマシア社製、ハイボンドＮ＋）をのせて、４℃にて５分間放置することによりプラークを移しとった。１８Ｇの注射針を用いてメンブレンの３ヶ所を寒天培地まで貫通することにより位置合わせ用の目印をつけた後、メンブレンを剥がしてアルカリ溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に２分間、次いで中和溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０））に５分間、さらに２×ＳＳＣ、０．２Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）を含む溶液に３０秒間浸した後、室温で完全に風乾させた。
【０３４９】
このメンブレンを２０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、クロンテック社製）中で６８℃、１時間インキュベーション（プレハイブリダイゼーション）した後、標識プローブを含む８ｍｌのハイブリダイゼーション溶液に交換して６８℃、６時間インキュベーションした。次いで、このメンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％　ＳＤＳを含む溶液で、室温下、１５分間緩やかに振盪しながら洗浄する操作を３回繰り返した後、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを含む溶液で５０℃、３０分間洗浄する操作を３回繰り返した。
【０３５０】
洗浄後のメンブレンについてオートラジオグラフィーを行い、陽性と認められた位置の元のプラークを寒天培地から回収して、そのファージ懸濁液について上記ｂ）に記載した条件でＰＣＲを実施した結果、陽性プラーク試料１０個中６個においてＤＮＡ断片の特異的増幅が認められた。
【０３５１】
このうちもっとも強く増幅が認められた試料のファージ懸濁液について、ＺＡＰエクスプレス・ｃＤＮＡ・ギガパックＩＩＩゴールド・クローニングキット（ストラタジーン社製）に添付されたヘルパーファージおよび宿主菌を用いて、該キットに添付のプロトコールに従ってインビボ切り出し（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）を行い、寒天培地上にファージミドを含む大腸菌コロニーを形成させた。これらのコロニーを単離してそれぞれファージミドを抽出し、上記ｂ）に記載の方法でＰＣＲを実施した結果、ＤＮＡ断片の特異的増幅がみられたコロニーを選択、培養し、１．６ｋｂｐのｃＤＮＡインサートを有するファージミド＃５５−１を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９を単離した。
【０３５２】
得られたファージミド＃５５−１に挿入されているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を解析した結果、配列表の配列番号１に示される配列であることが判明した（ただし配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１−８はベクター由来のアダプター配列である）。この配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにマウス・「アンジオポエチン関連タンパク質３」として登録されている配列（登録番号：ＡＦ１６２２２４）と同一であった。なお、このファージミド＃５５−１を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＢＫ／ｍ５５−１　ＳＡＮＫ　７２１９９は、１９９９（平成１１）年１１月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現・独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４０が付された。
【０３５３】
実施例１．　ノーザンブロット解析
ａ）マウス臓器からの全ＲＮＡの抽出
参考例１で得られたｃＤＮＡの発現している組織を調べる目的でノーザンブロット解析を実施した。まず、ＫＫマウス（高脂血症マウス）およびＫＫ／Ｓｎｋマウス（低脂血症変異マウス。白木ら、第７回糖尿病動物研究会（１９９３年））の精巣（ｔｅｓｔｉｓ）、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、小腸（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、肝臓（ｌｉｖｅｒ）および脳（ｂｒａｉｎ）から全ＲＮＡの抽出を行った。１８週齢のＫＫマウスおよびＫＫ／Ｓｎｋマウスを解剖してそれぞれ各臓器を摘出後、速やかに液体窒素内に入れ急凍した後−８０℃に保存した。臓器０．５ｇに対し約１５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製）を加え、超高速ホモジナイザーポリトロン（キネマティカ社製）を用いて氷上でホモジナイズを行った（目盛６で２分間）。これを室温で５分間静置した後、３ｍｌのクロロホルムを加え、手で１５秒間激しく転倒混和した。再び室温で３分間静置してから、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心後、上層を回収し、０．８容量のリボヌクレアーゼ不含イソプロピルアルコールを加えて混和した。これを室温で１０分間静置後、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を除去してリボヌクレアーゼ不含７０％エタノールを加えた。これを１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去して、沈殿を乾燥させてから、−８０℃に保存した。
【０３５４】
ｂ）全ＲＮＡの電気泳動およびブロッティング
回収した各臓器の全ＲＮＡをリボヌクレアーゼ不含再蒸留水で４μｇ／μｌに調整した後、このＲＮＡ液５μｌとＲＮＡ試料緩衝液（１．１５×ＭＯＰＳ緩衝液（１×ＭＯＰＳ緩衝液は２０ｍＭ　ＭＯＰＳ、５ｍＭ　酢酸ナトリウム、１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」という）を含む）、２．４Ｍ　ホルムアルデヒド、５７％　ホルムアミド、７％　グリセロール、１８μｇ／ｍｌ　ブロモフェノールブルー、１８μｇ／ｍｌ　キシレンシアノール、０．１８ｍＭ　ＥＤＴＡ）１６μｌを混合し、６５℃で１０分間保温した後、氷上で５分間放置した。この試料液全量を、１．１７％ホルマリンを含む電気泳動用アガロースゲル（１×ＭＯＰＳ緩衝液、１．１７％　アガロース（高強度、分析用、バイオラッド社製）、０．６６Ｍ　ホルムアルデヒド）の一つのウェルへ注入し電気泳動した。電気泳動は、５００ｎｇ／ｍｌ　臭化エチジウムの入った１×ＭＯＰＳ緩衝液の入ったサブマリン電気泳動槽中、５０Ｖで約１時間通電した後、さらに１００Ｖで約１．５時間通電することにより行った。電気泳動終了後、アガロースゲル中のＲＮＡをキャピラリートランスファー法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）に従ってナイロンメンブレン（ハイボンドＮ＋、アマシャム・ファルマシア社製）に一晩かけて転写した（転写用溶液は２０×ＳＳＣを使用した）。このメンブレンを２×ＳＳＣで５分間洗浄し、風乾させ、クロスリンク用紫外線照射装置（スペクトロリンカーＸＬ−１０００、トミー精工（株）社製）で紫外線を照射（１２００Ｊ／ｃｍ２）してＲＮＡを固定した。
【０３５５】
ｃ）プローブの調製
参考例１のｂ）で合成したプライマーを用い、サーマルサイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９６００、（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）を使用して以下の条件でＰＣＲを行った。まずプライマー（終濃度各０．５μＭ）とツイーン２０（シグマ社製、終濃度０．１％）に滅菌水を加えて７．５μｌとした後、２×ＰＣＲソルーション・プレミックスＴａｑ（宝酒造（株）社製：０．０５単位／μｌ　Ｔａｑポリメラーゼ、０．４ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、２０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１００ｍＭ　塩化カリウム、３ｍＭ　塩化マグネシウムを含む）を７．５μｌ添加した。さらにマウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を１μｌ（１００ｎｇ相当）加え、反応液を調製した。この反応液を、まず９４℃で３分間加熱した後、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で４５秒の温度サイクルを３５回繰り返してから、４℃で保温した。
【０３５６】
このＰＣＲ後の反応液１μｌをとり、ＴＡクローニングキット（デュアルプロモーターバージョンＡ、インビトロジェン社製）を添付のプロトコールに従って用いて、増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドベクターにクローニングした。この組換えプラスミドベクターでコンピテント大腸菌を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、４ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で３７℃で一晩培養した。このうち３．５ｍｌの培養液からプラスミド自動抽出装置（ＰＩ−５０、クラボウ社製）を使用してプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドＤＮＡについてヌクレオチド配列解析を行い、目的のＰＣＲ産物が挿入されていたプラスミドを以下の操作に用いた。
【０３５７】
選択されたプラスミドＤＮＡ　８μｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿を滅菌水１０μｌに溶解した。この溶液に色素液（０．２５％　ブロモフェノールブルー、０．２５％　キシレンシアノール、１５％　フィコール（タイプ４００））を２μｌ加えて、全量をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度８％、１００Ｖ、室温、３時間）した。電気泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色した後、紫外線照射下で目的のＤＮＡに相当するバンド（約２００ｂｐ、配列表の配列番号２９）部分のゲル片を剃刀刃で切り取り、微量遠心チューブに移して粉砕した。このものに３００μｌの溶出緩衝液（０．５Ｍ　酢酸アンモニウム、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％　ＳＤＳ）を加え、３７℃で一晩保温した後、フェノール／クロロホルム抽出を２回、エタノール沈殿を１回行って、沈殿を滅菌水２０μｌに溶解した。
【０３５８】
得られたＤＮＡ溶液５μｌについて、参考例１のｃ）記載の方法で、３２Ｐで標識されたプローブ（４００μｌ）を調製した。
【０３５９】
ｄ）ハイブリダイゼーション
上記ｂ）で作製したメンブレンを２０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、クロンテック社製）中に入れて６８℃で１時間インキュベーション（プレハイブリダイゼーション）した後、３２Ｐ標識プローブを含む２０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液中で、６８℃で一晩インキュベーションした。その後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳを含む溶液中、室温で２０分間、３回洗浄し、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを含む溶液中、５０℃で２０分間、３回洗浄してから、オートラジオグラフィーを行った。
【０３６０】
その結果、検出した遺伝子の発現は肝臓のみでみられ、またその発現量はＫＫマウス（高脂血症マウス）よりもＫＫ／Ｓｎｋマウス（低脂血症マウス）で著しく低下していることが明らかとなった（図１）。
【０３６１】
上記実験系において、例えば被験物質存在下または非存在下で培養したＫＫマウス初代培養肝細胞からＲＮＡ試料を調製し、以下同様の操作を行うことにより、被験物質の高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤としての効果を調べることができる。この実験において検出される遺伝子の発現量を低下させるような被験物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。多検体処理を行う場合には、電気泳動を省略してドットブロットやスロットブロットを行うこともできる。
【０３６２】
参考例２．ヒトｃＤＮＡのクローニング
１）プローブの調製
配列表の配列番号１に示されるマウスｃＤＮＡに対応するヒトｃＤＮＡを取得するため、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｔｃｃｔｃｔａｇｔｔ　ａｔｔｔｃｃｔｃｃａ　ｇ　−３’（配列表の配列番号７）；および
５’−　ｔｇｇｔｔｔｇｃｃａ　ｇｃｇａｔａｇａｔｃ　−３’（配列表の配列番号８）
を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【０３６３】
次に、ヒトゲノムＤＮＡ（ベーリンガーマンハイム社製、２００ｍｇ／ｍｌ）１μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（ｒＴａｑ、宝酒造（株）社製、５単位／μｌ）１μｌ、１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造（株）社製）１０μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）１６μｌ、２０μＭのプライマー各２μｌ、および滅菌水６８μｌを混合した。この反応液を、９４℃で５分間加熱した後、引き続き９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温してから、４℃に保存した。この反応液を２％　アガロースゲルにて電気泳動した後、増幅されたＤＮＡバンド部分のゲルを切り出して精製した。このようにして得られたＤＮＡをＤＮＡ標識キット（ＢｃａＢｅｓｔラベリングキット、宝酒造（株）社製）を用いて３２Ｐで標識したものを下記２）においてプローブとして用いた。
【０３６４】
２）ｃＤＮＡライブラリーの１次スクリーニング
市販のヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎ　Ｌｉｖｅｒ　５’−ＳＴＲＥＴＣＨ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ、クロンテック社製）のうち、１×１０６プラークのＤＮＡをナイロンメンブレンに固定した。すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを感染させた大腸菌を直径９ｃｍの培養シャーレに作製した寒天培地プレート２０枚に、１枚あたり５×１０４個のプラークが形成されるように分散させ、３７℃で８時間培養した。このプラーク形成された寒天培地上に、シャーレ内径に合わせた円形のナイロンメンブレン（アマシャム・ファルマシア社製、ハイボンドＮ＋）をのせて、４℃にて５分間放置することによりプラークを移しとった。１８Ｇの注射針を用いてメンブレンの３ヶ所を寒天培地まで貫通することにより位置合わせ用の目印をつけた後、メンブレンを剥がしてアルカリ溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に２分間、次いで中和溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０））に５分間、さらに２×ＳＳＣ、０．２Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）を含む溶液に３０秒間浸した後、室温で完全に風乾させた。次いで、クロスリンク用紫外線照射装置（スペクトロリンカーＸＬ−１０００、トミー精工（株）社製）で紫外線を照射（１２００Ｊ／ｃｍ２）してＤＮＡを固定した。
【０３６５】
このようにして調製されたメンブレンを、上記１）で得られた標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、クロンテック社製）中で６５℃で一晩インキュベーションした。その後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％　ＳＤＳを含む溶液で１５分ずつ３回、室温で洗浄してから、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを含む溶液で３０分ずつ３回、５０℃で洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。
【０３６６】
その結果判明した陽性のシグナルの位置にあったプラークを、上記寒天培地プレートから培地ごと採取し、それぞれ１００μｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ　塩化ナトリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％　ゼラチン）中に入れてよく懸濁してから４℃で２時間放置した後、１２０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収した。
【０３６７】
このようにして得られた１次陽性ファージ液を再び大腸菌に感染させたものを、直径９ｃｍの培養用シャーレに作製した寒天培地上に、シャーレ１枚あたり５００個のプラークが形成されるように培養し、上記の手法を繰り返すことにより２次スクリーニングを行った。得られた２次陽性クローンファージを大腸菌株ＢＭ２５．８（クロンテック社製）に感染させたものを寒天培地上で３７℃で培養して、ファージミドを含む大腸菌コロニーを形成させた。コロニーを単離し、液体培地で少量培養してファージミドを抽出し、制限酵素消化による挿入断片の解析を行った結果、１．６ｋｂｐの挿入断片を有する、クローン＃ｈ５−１を有する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９を単離した。このクローンの挿入断片のヌクレオチド配列を解析した結果、ＧｅｎＢａｎｋにヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」として登録されているのｃＤＮＡ配列（登録番号：ＡＦ１５２５６２）と一致した（配列表の配列番号３。ただし、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１−１４はベクター由来のアダプター配列である）。なお、このファージミド＃ｈ５−１を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１　ＳＡＮＫ　７２２９９は、１９９９年１１月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現・独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９４１が付された。
【０３６８】
実施例２．　ポリクローナル抗体の作製
配列表の配列番号１および配列番号３に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２および配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいずれも認識する抗体を作製する目的で、抗原として、それらマウスおよびヒトのポリペプチドの間で保存されている領域から選ばれた２種類のアミノ酸配列：
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（５５−１−Ｎ１、配列表の配列番号９）；および
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（５５−１−Ｃ１、配列表の配列番号１０）
を有するペプチドを化学合成法で合成した（使用機器：パーキンエルマージャパン社製モデル４３３）。ただし、５５−１−Ｎ１のアミノ酸配列は、後に担体としてキーホールリンペットヘモシアニン（以下「ＫＬＨ」という）を結合させるため、本来のアミノ酸配列のＣ末端にシステイン残基が付加されたものである。一方、５５−１−Ｃ１でＫＬＨが結合されるＮ末端のシステインは本来のアミノ酸配列由来のものである。
【０３６９】
次に、合成ペプチド５５−１−Ｎ１　１１．１ｍｇおよびＫＬＨ　２１．５ｍｇ、または５５−１−Ｃ１　１０．２ｍｇとＫＬＨ　２１．２ｍｇを、それぞれＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシニミド（ＥＭＣＳ、同仁化学研究所（株）社製）試薬を用いて縮合させた（縮合反応溶媒として８Ｍ　尿素および０．９％　塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、室温で１５時間保温した）。この反応液を８Ｍ尿素溶液中に入れた後、流水に対して透析し、さらに純水に対して透析を行ってから凍結乾燥し、ＫＬＨが結合したペプチド抗原を得た。これらのペプチド抗原約１０ｍｇに１ｍｌの生理食塩水を加え、超音波発振機（ソニケーター）、ボルテックスミキサー、ガラス棒等を用いて細かい懸濁液にした。その後、生理的食塩水で全量を各７．５ｍｌとし、さらに１ｍｌずつバイアルに小分けして凍結保存した。
【０３７０】
免疫の際には、上記バイアル１本分の抗原溶液を融解し、同量のアジュバンドと混合してそれぞれウサギ２羽の背中に皮下、または皮内に注射した。アジュバンドはフロインド完全アジュバンドを用いて行い、２回目以降の免疫ではフロイントの不完全アジュバンドを用いた。免疫は２週間おきに４回行い、２回目の免疫以降、試験採血を行い血清中の抗体価を固層法による酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で調べた。９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（住友ベークライト（株）社製、９６穴Ｈタイプ）におのおのの抗原ペプチドをコーティングし、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として使用した。４回目の免疫から１３日後に全採血を行った。
【０３７１】
採血後、抗体をアフィニティーカラムを用いて精製した。すなわち、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシニミド（ＥＭＣＳ、同仁化学研究所（株）社製）とアミノアルキルアガロース（バイオラッド社製、アフィゲル１０２）とを反応させて活性化した担体ＥＭＣ−アガロース（約５ｍｌ）にペプチド（５５−１−Ｎ１：７．８２ｍｇ、５５−１−Ｃ１：８．０７ｍｇ）を結合させた。未反応のＥＭＣ基は０．１Ｍ　塩酸メルカプトエチルアミン（５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む）で処理することにより不活化させた。抗血清８５ｍｌをＰＢＳ（０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％　塩化ナトリウム含有）で２倍希釈し、硫安沈殿（終濃度４０％）法により沈殿物を得、この沈殿物をＰＢＳに溶解し、脱塩後ＰＢＳで透析し、この透析内液を粗ＩｇＧ画分とした。アフィニティーカラムへは３回に分けてクロマト操作をした。すなわち、アフィニティーカラムへ粗ＩｇＧ画分１／３量をチャージし、素通り画分をカラムに再注入する操作を３回繰り返した。素通り部分および洗液を合わせた４０ｍｌを非吸着フラクションとして集めた。非特異的にカラムに結合したものを除去するために、１Ｍ　塩化ナトリウム含有ＰＢＳで十分洗浄した後、４Ｍ　塩化マグネシウム溶液、３．５Ｍ　チオシアン酸カリウム溶液および０．１Ｍ　グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．３）を順次カラムに流して、カラム担体上に結合しているペプチドに特異的に結合していた抗体をアフィニティー精製抗体として溶出した。４Ｍ　塩化マグネシウム溶液および３．５Ｍ　チオシアン酸カリウム溶液の溶出液中に目的の抗体が含まれていたので、それぞれの溶出液をＰＢＳに対して透析したものを、以下の操作で抗体として使用した。
【０３７２】
実施例３．　ＣＯＳ−１細胞での発現およびウエスタンブロット解析
参考例２で得られた＃ｈ５−１ファージミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、実施例１のｃ）に記載した方法で、ｃＤＮＡを含む約１．６ｋｂの断片を単離、精製した。一方、高発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（Ｈａｒａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）　ＥＭＢＯ．Ｊ．　１１，　１８７５−、横田崇、新井賢一編集、バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社、ｐ１８−２０）を同様にＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、末端を脱リン酸化した後、上記ｃＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換株についてそれが保有するプラスミドＤＮＡの制限酵素による解析を行い、１．６ｋｂのＤＮＡ断片を有する株を選択してｐＭＥｈ５５−１と命名した。
【０３７３】
次に、ｐＭＥｈ５５−１を保有する形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養した。この培養液から、プラスミド精製キット（ウィザード・ピュアフェクション・プラスミドＤＮＡ精製システム、プロメガ社製）を用いてｐＭＥｈ５５−１　ＤＮＡを回収し、塩化セシウム法で精製した。
【０３７４】
このようにして得られたプラスミドｐＭＥｈ５５−１でＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションした。ＣＯＳ−１細胞へのトランスフェクションは（株）島津製作所製の遺伝子導入装置ＧＴＥ−１を用いて電機穿孔法により行った。すなわち、まずＣＯＳ−１細胞をセミコンフルエントになるまで増殖させたフラスコより、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞を回収し、ＰＢＳ（−）緩衝液（宝酒造（株）社製）で洗浄した。次にその細胞をＰＢＳ（−）緩衝液で６×１０７細胞／ｍｌに懸濁した。上記方法にて回収したプラスミドＤＮＡ（ｐＭＥｈ５５−１）をＰＢＳ（−）緩衝液で２００μｇ／ｍｌに調製した。細胞懸濁液とＤＮＡ溶液を２０μｌずつ混合し、これを電極間隔２ｍｍのチャンバーに入れ、６００Ｖ−３０μｓｅｃのパルスを１秒間隔で２回与えた。そのチャンバーを４℃で５分間冷却した後、中の細胞−ＤＮＡ混合液を１０％　ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ　１０ｍｌに加え、シャーレに移して３７℃、５％　ＣＯ２下で一晩培養した。その後、培養上清を除き、無血清培地（ＤＭＥＭ）で細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ
１０ｍｌを加えて３日間培養した。
【０３７５】
このようにして得られた細胞培養物より培養上清を回収した。ｃＤＮＡを含まないネガティブコントロールプラスミドｐＭＥ１８ＳまたはｐＭＥｈ５５−１でトランスフェクトして得たＣＯＳ−１細胞の無血清培養上清０．３ｍｌをそれぞれトリクロロ酢酸（以下「ＴＣＡ」という）処理してタンパク質を沈殿させ、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を氷冷したアセトンで洗浄し、風乾後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用の２−メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液（バイオラッド社製）に溶解し、４−２０％　ポリアクリルアミド密度勾配ゲル（マルチゲル４／２０、第一化学薬品（株）社製）を用いて、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０３７６】
電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルからバンドを転写緩衝液（１９２ｍＭ　グリシン、２０％　メタノール、２５ｍＭ　トリス）中でゲルメンブレン転写装置（マリソル社製、ＮＰ７５１３）を用いて４℃、９０分、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレン（バイオラッド社製）に転写した。
【０３７７】
転写後のニトロセルロースメンブレンについて、実施例２で得られた抗体（以下「５５−１−Ｎ１抗体」または「５５−１−Ｃ１抗体」という）を用いたウエスタンブロット解析を行った。すなわち、まずニトロセルロースメンブレンを０．０５％のツイーン２０を含むＰＢＳ（以下「０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ」という）で洗浄した（室温で１５分間を１回、次いで５分間を２回）後、プラスチックバッグ（商品名ハイブリバック、コスモバイオ（株）社製）に入れ、５％　スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを２０ｍｌ加え、室温で１時間振とうした。１時間後、メンブレンを取り出し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ中で、１５分間×１回、次いで５分間×２回洗浄した。洗浄後、メンブレンを新しいプラスチックバッグに移し、５５−１−Ｎ１抗体または５５−１−Ｃ１抗体（１００倍希釈）、１％　ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という。シグマ社製）を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを２０ｍｌ添加して室温で１時間振とうした。１時間後、メンブレンを取り出し０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液で１５分間×１回、５分間×２回洗浄した。その後、メンブレンを新しいプラスチックバッグに移し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャム・ファルマシア社製）を１％　ＢＳＡを含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍に希釈した溶液２０ｍｌを入れ、を室温で１時間振とうした。１時間後、メンブレンを取り出し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１５分間×１回、次いで５分間×４回洗浄した。洗浄後、メンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて、５５−１−Ｎ１抗体または５５−１−Ｃ１抗体が結合するバンドの検出を行った（メンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液に１分間浸した後、１時間室温で放置してバックグラウンドを減衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（３秒間））。その結果、両方の抗体により、ｐＭＥｈ５５−１プラスミドＤＮＡを導入して得られたＣＯＳ−１培養上清中に特異的なバンドが検出された（図２）。
【０３７８】
同様の実験は、参考例１で得られたマウスｃＤＮＡを発現させたＣＯＳ−１細胞培養上清についても実施できる。すなわち、参考例１で得られたファージミド＃５５−１　ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化して得られる、約１．６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片をｐＭＥ１８Ｓに組み込んで得られたクローン（ｐＭＥ５５−１）を構築し、上記と同様の方法でＣＯＳ−１細胞に導入し、培養上清を回収する。この培養上清から調製した試料について、５５−１−Ｎ１抗体および５５−１−Ｃ１抗体を用いたウエスタンブロット解析を行うと、いずれの抗体で検出した場合もｐＭＥ５５−１プラスミドＤＮＡを導入して得られたＣＯＳ−１培養上清中に特異的なバンドが検出される。
【０３７９】
上記実験系において、例えば被験物質存在下または非存在下で培養したＫＫマウス初代培養肝細胞の培養上清から試料を調製し、以下同様の操作を行うことにより、被験物質の高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤としての効果を調べることができる。この実験において検出される抗原量を低下させるような被験物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。多検体処理を行う場合には、電気泳動を省略してドットブロットやスロットブロットを行うこともできる。
【０３８０】
実施例４．　組換えアデノウイルスの作製および培養細胞における発現
参考例１で得られたマウス由来のｃＤＮＡを強制発現させるため組換えアデノウイルスは、市販のキット（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いて作製した。すなわち、参考例１で得られたファージミドクローン＃５５−１を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた約１．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をを平滑化したものを挿入ＤＮＡ断片として以下の操作に用いた。
【０３８１】
また、サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターにより発現されるように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）の制限酵素ＳｗａＩ認識部位にインサートＤＮＡ断片を挿入したコスミドｐＡｘＣＡ／ｍＡＰ５を作製した。ｐＡｘＣＡ／ｍＡＰ５　ＤＮＡおよび末端タンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ライフテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）にコ・トランスフェクションして、組換えアデノウイルスＡｄ／ｍＡＰ−５を単離し、さらに２９３細胞中で増幅させた。また、コントロールコスミドｐＡｘＣＡｉＬａｃＺから切り出したＬａｃＺ遺伝子が組み込まれた組換えアデノウイルスベクターを有するアデノウイルスＡｄ／ＬａｃＺを同様に作製し２９３細胞で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行い、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２回繰り返すことによって行った。得られたウイルス液を、１０％　グリセロールを添加したＰＢＳに対して４℃で透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存した。
【０３８２】
このようにして得られた組換えアデノウイルスを、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２）に約５ｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：多重感染度）で感染させ、無血清培地（ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ））で３乃至４日培養した後の培養上清を回収した。この上清１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、１００μｌのトリクロロ酢酸を添加して室温で３分放置した後、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除去し、氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて良く攪拌し、再度卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を除去し、再び氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて良く攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分間遠心して、上清を除いた後、沈殿物を真空乾燥させた。この沈殿物を１０μｌの蒸留水に溶解させ、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製した。試料を中でゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％　ＳＤＳ）後、転写緩衝液中で４℃、１時間、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに転写した。転写したメンブレンは０．５％　スキムミルクを添加したＰＢＳ液で４℃で一晩ブロッキングし、洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、５５−１−Ｎ１抗体の精製前の抗血清と５５−１−Ｃ１抗体の精製前の抗血清を混合したものを５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１００００倍希釈した反応液中に入れて室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で３回洗浄した。さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（バイオラッド社製）を５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１００００倍希釈した反応液中で室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液に１分間浸した後、１時間室温で放置してバックグラウンドを減衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（３秒間）。その結果、組換えアデノウイルスＡｄ／ｍＡＰ−５を感染させたＨｅＬａ細胞培養上清由来のサンプルのレーン中に特異的なバンドが検出された（図３）。
【０３８３】
一方、ファージミドクローン＃ｈ５−１が保持するｃＤＮＡがアデノウイルスベクターに組み込まれたものを有する組換えアデノウイルス（Ａｄ／ｈＡＰ５）を調製して同様の実験を行い、ＨｅＬａ細胞に発現させた培養上清のウエスタンブロット解析を行った結果、同様に特異的なバンドが検出された（図３）。
【０３８４】
実施例５．　組換えアデノウイルスを用いたインビボでの発現
上記のようにして精製された組換えアデノウイルスＡｄ／ｍＡＰ−５またはＡｄ／ＬａｃＺを、１０％グリセロールを含むＰＢＳで２×１０１０ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）／ｍｌに希釈し、それぞれ３匹（Ａｄ／ｍＡＰ−５）または２匹（Ａｄ／ＬａｃＺ）の１３−１４週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに１００μｌ（２×１０９ｐｆｕ）ずつ尾静脈注射により接種した。接種１日後に各マウスの眼底よりヘマトクリット管で採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍで１５分遠心して血漿を分離し、中性脂肪測定用キット（トリグリセリドＥ−テストワコー、和光製薬（株）社製）を用いて中性脂肪濃度を測定した。Ａｄ／ＬａｃＺ接種マウス群では血中の中性脂肪濃度に有意な差が認められなかったのに対し、Ａｄ／ｍＡＰ−５接種マウス群と他の２群の間には血中の中性脂肪濃度に有意な差が認められた（図４）。
【０３８５】
一方、ファージミドクローン＃ｈ５−１が保持するｃＤＮＡがアデノウイルスベクターに組み込まれたものを有する組換えアデノウイルス（Ａｄ／ｈＡＰ５）で同様の実験を行い、雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに発現させた結果、血中の中性脂肪濃度の有意な上昇がみられ、ヒト型分子がマウス体内でも機能することが判明した（図４）。
【０３８６】
また、これら血中の中性脂肪濃度に有意差が認められたアデノウイルス感染マウス群の肝臓から全ＲＮＡを回収し、実施例１記載の方法でノーザンブロット解析を行ったところ、導入した遺伝子が実際に高発現していることが確認された（図５）。アデノウイルス感染ＫＫ／Ｓｎｋマウス群で検出されるバンドは、遺伝子操作を行っていないＫＫマウスで検出されるバンドよりも大きいが、これは組換えアデノウイルスベクター中で有効な転写開始点またはポリ（Ａ）付加シグナルが本来の遺伝子上のものとは異なることに起因すると考えられる。いずれにせよ、組換えアデノウイルスベクターに組み込まれたｃＤＮＡ中の最初の翻訳開始コドンのすぐ５’末端側には、該翻訳開始コドンと同一読み枠上に終始コドンが存在するため、このｍＲＮＡの大きさの違いは翻訳されるアミノ酸配列には影響しない。
【０３８７】
実施例６．　組換えタンパク質の精製およびＮ末端アミノ酸配列の決定
以下に記載する方法に従って、実施例３で作成された、配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するヒトｃＤＮＡが挿入された発現ベクターｐＭＥｈ５５−１で動物細胞を形質転換し、該形質転換細胞の培養上清中に分泌される組換えタンパク質を精製して、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した。
【０３８８】
（１）形質転換体の取得および培養上清の調製
１０％ＦＣＳ（ギブコ・ビーアールエル社製）、１０単位／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン（ギブコ・ビーアールエル社製）を含むαＭＥＭ（ギブコ・ビーアールエル社製）培地でジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−９０９６）を増殖させた後、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６：ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を使用し、ｐＭＥｈ５５−１プラスミドを１μｇ／１０６細胞の割合でトランスフェクトした。具体的には、細胞は２００枚の細胞培養用シャーレ（１５０ｍｍφ、コーニング社製）に１．５×１０７細胞／シャーレで培養し、トランスフェクションにはシャーレ１枚あたり１５μｇのｐＭＥｈ５５−１プラスミドを使用した。トランスフェクション操作後の細胞を上記のＦＣＳを含む培地中で２４時間培養後、培地を無血清αＭＥＭ培地（３０ｍｌ／シャーレ）に交換してから、さらに３日間培養し、無血清培養上清６リットルを回収した。
【０３８９】
（２）組換えタンパク質の精製
１）　カラム（ストリームラインＣ−１００：アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に充填したセファデックスＧ２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１．６リットル分のゲルに、上記（１）で得られた培養上清を６００ｍｌ注入した（流速：２０ｍｌ／分）。次いで、溶離緩衝液（２０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％　アジ化ナトリウム（シグマ社製）、０．０５％　プロテアーゼインヒビター混合液（シグマ社製）、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社製）。以下「Ａ液」という）を流速５０ｍｌ／分でカラムに流し、初めの１５００ｍｌ分の溶出液を回収した。この操作を１０回実施して、上記（１）で得られた６リットルの培養上清の脱塩および低分子除去を行った。
【０３９０】
２）　次に、上記１）で得られた溶出液をＦＰＬＣ装置（バイオパイロットシステム、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用い、以下に記載する条件によりイオン交換クロマトグラフィーを行って分画した。
カラム：　Ｑセファロース・ファストフロー（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１００ｍｌをＸＫ５０／１００カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に充填した。
溶離緩衝液組成：
［Ａ液］　上記参照
［Ｂ液］２０ｍＭ　トリス−塩酸、１Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．０１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビター混合液、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０
流速：　１０ｍｌ／分
分画：　各１０ｍｌ／チューブ
温度：　４℃
溶出条件：　１００％　Ａ液から１００％　Ｂ液への直線濃度勾配（６０分間）塩化ナトリウム濃度　０．３乃至０．４Ｍで溶出された画分を回収した。
【０３９１】
３）　さらに、上記２）のイオン交換クロマトグラフィーで回収された画分について、ＦＰＬＣ装置を用いて、以下に記載する条件の群特異的アフィニティークロマトグラフィーを実施した。
カラム：　アフィゲル　ブルー（バイオラッド社製）１０ｍｌをＸＫ１６／４０カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に充填した。
溶離緩衝液組成：
［Ｃ液］２０ｍＭ　トリス−塩酸、０．５Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．０１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビター混合液、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０
［Ｄ液］２０ｍＭ　トリス−塩酸、１Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．０１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビター混合液、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０
流速：　１．５ｍｌ／分
温度：　４℃
上記２）で回収された画分をカラムに通した後、Ｃ液を６０ｍｌ流して洗浄してから、Ｄ液を１００ｍｌ流して、Ｄ液による溶出液を回収した。
【０３９２】
４）　上記３）で得られた溶出液に等量（１００ｍｌ）のＡ液を加えた。このものについて、ＦＰＬＣ装置を用いて、以下に記載する条件の群特異的アフィニティークロマトグラフィーを実施した。
カラム：　レンチル・レクチン・セファロース４Ｂ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１０ｍｌをＸＫ１６／４０カラムに充填した。
溶離緩衝液組成：
［Ｃ液］　上記参照
［Ｆ液］２０ｍＭ　トリス−塩酸、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．３Ｍ　メチルマンノピラノシド（ｐＨ７．５）、０．０１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビター混合液、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０
流速：　１ｍｌ／分
温度：　４℃
サンプルをカラムに通した後、Ｃ液を５０ｍｌ流して洗浄してから、Ｆ液を５０ｍｌ流して、Ｆ液による溶出液を回収した。
【０３９３】
この溶出液を透析チューブ（排除限界分子量１０ＫＤａ：ギブコ・ビーアールエル社製）に移し、０．０１％　アジ化ナトリウムおよび０．１％　プロテアーゼインヒビター混合液を含むダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬（株）社製）２リットルに対して、４℃で一晩透析した。その後、透析チューブ内の溶液を回収して、そのうち４ｍｌに、４ｍｇ／ｍｌ　デオキシコール酸ナトリウムを含むＴＣＡを１／１０容量（０．４ｍｌ）加え、得られた沈殿を回収し、続いてアセトンを加えて得られた沈殿を回収し、５０μｌの滅菌超純水に溶解した。
【０３９４】
（３）Ｎ末端アミノ酸配列の決定
上記（２）で精製された試料にＰＮＧａｓｅＦ（ニューイングランド・バイオラブ社製）を加え、Ｎ結合型糖鎖を切断した。具体的には、まず５０μｌの試料に６μｌの１０×変性バッファー（ＰＮＧａｓｅＦ試薬に添付）を添加して攪拌し、１０分間煮沸水浴中で加熱した。これを室温に戻した後、６μｌの１０％　ノニデットＰ−４０および６μｌの１０×Ｇ７バッファー（以上ＰＮＧａｓｅＦ試薬に添付）を順に加えて攪拌した。このものにＰＮＧａｓｅＦを３μｌ添加し、攪拌してから３７℃の水浴で２時間以上保温した。
【０３９５】
このＮ結合型糖鎖切断反応後の反応液について、４乃至２０％濃度勾配アクリルアミドゲル（マルチゲル４／２０、第一化学薬品（株）社製）およびミニスラブ式電気泳動装置（日本エイドー（株）社製）を用いた還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。電気泳動後、ゲルメンブラン転写装置（マリソル社製）を用い、ゲル内で分離されたタンパク質を０．２μｍ孔径のポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（バイオラッド社製）に転写した（２ｍＡ／ｃｍ２、４℃で２時間）。転写後の膜を１００％　メタノール（和光純薬（株）社製）で１０秒間濡らした後、超純水で２分間洗浄してから、クーマシー染色液（バイオラッド社製）で５分間染色し、さらに膜をメタノールに浸して２分間脱色した結果、約５０ＫＤａに相当するバンドがみられた。このバンド部分の膜を切り出し、プロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−１０：島津製作所（株）社製）にてＮ末端配列の解析を実施した。
【０３９６】
その結果、上記約５０ＫＤａのバンドのＮ末端アミノ酸配列は
Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ　　（配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７から２７）
であった。このことから、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列にコードされるタンパク質は、哺乳動物細胞では、Ｎ末端の１６個のペプチド（配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６）が切り落とされて、その直後に続くセリン残基（配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７）をＮ末端とする成熟体として分泌されることが明らかとなった。
【０３９７】
参考例３．　組換えタンパク質の精製およびマウスへの投与
実施例６において精製した組換えタンパク質３００μｇを１５週令のＫＫ／Ｓｎｋマウス雄４匹に尾静脈投与した。対照として、別の個体４匹にはＰＢＳ（ギブコ・ビーアールエル社製）を投与した（０．５ｍｌ／マウス）。投与１、３、６、２４時間後、それぞれのマウスから７５μｌヘパリン処理済みキャピラリー採血管（フナコシ社製）で眼底採血し、５２００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した（トミー精工（株）社製ＴＨ−１ローター使用）後、血漿を分離し回収した。同様に、精製タンパク質投与前に眼底採血により血漿を分離し、投与前値のサンプルとして回収した。血中の中性脂肪濃度測定は、トリグリグリセライドＥテストワコー（和光純薬（株）社製）を使用した。すなわち、回収した血漿を２μｌずつ９６穴プレート（コーニング社製）に加え、これに発色試薬２００μｌを添加して攪拌後、１０分間室温で静置した。操作終了後、マイクロプレートリーダーで主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度を測定し、主波長の測定値から副波長の測定値を差し引いた値から中性脂肪濃度を算出した。
【０３９８】
その結果を表１に示した。組換えタンパク質の投与により、血中の中性脂肪濃度が上昇することが示された。
【０３９９】
【表１】（単位：ｍｇ／ｄｌ）
2004000101.tif 000120
参考例４．　ベザフィブレート投与による影響
１１週齢の雄Ｚｕｃｋｅｒ　ｆａｔｔｙラット（日本チャールズリバーより購入）２匹に７日間、高脂血症治療剤ベザフィブレート（シグマ社製）をＦ２粉末飼料（船橋農場社製）に０．３％の濃度で混ぜて投与した。対照群のラット（２匹）にはＦ２粉末飼料のみを与えた。両方の条件のラットからそれぞれ血液サンプルを回収した後、肝臓を摘出し、直ちに液体窒素内に入れ急凍した後、−８０℃に保存した。得られた肝臓組織０．１ｇに対し５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製）を加え、超高速ホモジナイザー（ポリトロン、キネマティカ社製）を用いて氷上でホモジナイズを行った（目盛１０で２分間）。これを室温で５分間静置した後、１ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間激しく転倒混和した。再び室温で１０分間静置してから、１２０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した。遠心後、上層を回収し、２．５ｍｌのリボヌクレアーゼ不含イソプロピルアルコールを加えて混和した。これを室温で１０分間静置後、１２０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した後、上清を除去してリボヌクレアーゼ不含７０％エタノールを加えた。これを１２０００×ｇ、室温で５分間遠心分離し、上清を除去して、沈殿を乾燥させてから、−８０℃に保存した。得られたペレットをリボヌクレアーゼを含まない純水に溶解したものを全ＲＮＡ溶液とした。
【０４００】
一本鎖ｃＤＮＡの合成は以下の手順で行った。得られた全ＲＮＡ１μｇにリボヌクレアーゼを含まない純水を加え全量を６μｌとし、１０×ＤＮＡａｓｅ　反応緩衝液（ギブコ・ビーアールエル社製ＤＮａｓｅＩに添付）を１μｌ、ＤＮａｓｅＩ（Ａｍｐグレード、ギブコ・ビーアールエル社製）を１μｌ加え、室温で１５分間保温した後、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ＤＮａｓｅＩに添付）を１μｌ加え、６５℃で１０分間保温した。この溶液に、一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ−ＰＣＲ、ギブコ・ビーアールエル社製）添付のランダムヘキサマープライマーを１μｌ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘを１μｌ加え、６５℃、５分間保温した後、急激に４℃まで冷却し熱変性を行った。引き続き、ｃＤＮＡ合成キット添付の１０×逆転写反応緩衝液を２μｌ、２５ｍＭ　塩化マグネシウムを４μｌ、０．１Ｍ　ジチオスレイトール溶液を２μｌ、リボヌクレアーゼインヒビターを１μｌ加え、２５℃で２分間保温し、その後、添付の逆転写酵素を１μｌ　添加した。このサンプルを２５℃で１０分保温後、４２℃で５０分保温した。さらに７０℃で１５分間保温した後、急激に４℃まで冷却し熱変性を行った。添付のリボヌクレアーゼＨを１μｌ加え、３７℃で２０分間保温してＲＮＡを分解し、−２０℃にて保存した。反応終了後、すべてのサンプルに２９μｌのリボヌクレアーゼを含まない純水を加え、さらにリボヌクレアーゼを含まない純水で５倍希釈したものを下記の定量に用いた。検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液は、対照サンプルの１例の定量用溶液よりリボヌクレアーゼを含まない純水にて５倍ずつの希釈系列を作成することにより調製した。
【０４０１】
一方、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲに用いるプライマーとして、下記の配列：
５’−　ｃａａａｇｃｔｔｇａ　ａａｇｔｃｔａｃｔｇ　ｇａｇｇ　−３’　（配列表の配列番号３０）；および
５’−　ｇｇｔｔｃｔｇａａｃ　ｃａａｇｃｔｇｇｔｃ　ａ　−３’　　（配列表の配列番号３１）
を有するオリゴヌクレオチドを合成した（アマシャム・ファルマシア社に発注）。
【０４０２】
さらに、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲに用いるプローブとして、下記の配列：
５’−　ａａｇａｔｇｇｃｇｃ　ｔｃｃａａｃａｃａｇ　ａｇｔｃａｇ　−３’　（配列表の配列番号３２）
を有し、その５’末端にレポーター色素Ｆａｍ、３’末端にレポーター消光体のＴａｍｕｒａを結合したオリゴヌクレオチドを合成した（ＴａｑＭａｎ　フルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）。また「アンジオポエチン関連タンパク質３」の発現量の標準化をはかる目的で、ラット１８ｓリボゾームＲＮＡの定量を行うこととし、ＴａｑＭａｎ　リボソーマルＲＮＡコントロール・リージェント、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いた。
【０４０３】
これらの材料を用いて、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法による、ラット「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の発現量の定量を行った。ＰＣＲ反応は９６穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）中で行った。反応溶液の組成は１ウェル中、上記方法で得られた一本鎖ｃＤＮＡ溶液５μｌ、ＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）を正方向側、逆方向側ともに０．２μｌ（最終濃度２００ｎＭ）、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用プローブ（６．６μＭ）０．７５μｌ（最終濃度１００ｎＭ）、ＰＣＲ増幅用混合液（ＴａｑＭａｎ　ユニバーサル・ＰＣＲマスター・ミックス、アプライドバイオシステムズジャパン社製）２５μｌ、超純水１８．８５μｌとした。この際、検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液は原液濃度を便宜的に「６２５」とし、以降５倍希釈を繰り返して濃度「６２５」、「１２５」、「２５」、「５」および「１」の溶液について同様に反応液を調製した。ＰＣＲ反応はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器（ＡＢＩ７７００、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて行った。反応は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の反応を４０回繰り返し、１サイクルごとにレポーター色素の発光量を測定した。各サイクルごとのレポーター色素の発光量から１８Ｓリボゾーム、「アンジオポエチン関連タンパク質３」の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸にサイクル数をとった検量線を作成し、各発現定量用サンプルについてはその対数増幅期において任意に設定した一定の発光量を超えたサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の発現量は同一サンプルにおける１８Ｓリボゾームの発現量の値で補正を行った。
【０４０４】
その結果、ラット「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の発現量は、ベザフィブレート投与群において、コントロール群に比べ７３％低下していることが示された。なお、この時用いられたベザフィブレート投与群のラットの血中中性脂肪濃度は、コントロール群に比べて５０％減少していた。
【０４０５】
参考例５．　動脈硬化および血糖値への影響
低脂血症マウスＫＫ／Ｓｎｋは配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の変異型（以下「低脂血症変異遺伝子」という）をホモで有し、該ポリペプチドの産生量が先天的に低い。以下に記載する方法に従って動脈硬化モデルマウスまたは高血糖モデルマウスにおける低脂血症変異遺伝子の影響を検討した。
【０４０６】
１）　コンジェニックマウスの作出
ａ）交配様式
ＫＫ／Ｓｎｋマウスの雌をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの雄（浜松医科大学附属動物実験施設より入手）と交雑して、戻し交雑第１世代（Ｎ１世代）を作出した。次いで、Ｎ１雌をＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄に再度交雑してＮ２世代を得た。このＮ２個体の尾からゲノムＤＮＡを抽出し、後述ｃ）記載の方法でＰＣＲを行い、低脂血症変異遺伝子をヘテロで持つ個体を選抜した。選抜した雌をさらにＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄と交雑して、Ｎ３世代を作出した。その後、同様の方法でＮ１０世代まで連続して選抜交雑を実施した。次いで、Ｎ１０世代のヘテロの雌雄を交雑し、得られた産児から採取したゲノムについて後述ｃ）記載の方法でＰＣＲを実施して、低脂血症変異遺伝子をホモで持つ雌雄を選抜した。その後、兄妹交配により継代し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景の低脂血症変異コンジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−低脂血症）系統を得た。いずれの動物も温度２３±１℃、湿度５５±１０％、１４時間照明の動物室内で飼育し、ＣＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業（株）製）と７ｐｐｍクロール水を自由摂取させた。
【０４０７】
ｂ）ゲノムＤＮＡの抽出方法
上記ａ）で選抜に用いたマウス（４週齢）より採取した尾（１．５ｃｍ）を８４０μｌの溶解液（７２０μｌの１×ＳＳＣ、８０μｌの１０％　ＳＤＳ、４０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ　プロテイナーゼＫを含む）に浸漬し、５０℃で保温しながら一晩振盪した。次いで、１ｍｇ／ｍｌ　リボヌクレアーゼＡを２０μｌ加えて、５０℃で１時間保温した。その後、フェノール・クロロホルム抽出を２回、エタノール沈殿操作を１回行い、沈殿を１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液１５０μｌに溶解した。その後、分光光度計（Ｕ−３０００、（株）日立製作所製）で２６０ｎｍ波長における吸光度を測定し、滅菌水を加えて濃度を２５ｎｇ／μｌに調整してゲノムＤＮＡ試料とした。
【０４０８】
ｃ）遺伝子型の判定
２種類のマイクロサテライトマーカー検出用プライマーセット（Ｄ４Ｍｉｔ１５およびＤ４Ｍｉｔ２１９、リサーチジェネティクス社製）を用い、サーマルサイクラー（ＰＴＣ−１００、エムジェーリサーチ社製）を使用して以下の条件でＰＣＲを行った。１．５μｌの１０×ＰＣＲバッファー［１００ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ　塩化マグネシウム、５００ｍＭ　塩化カリウムを含む。ロシュ・ダイアグノティクス社製］、２．４μｌの各１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（宝酒造（株）社製）、各０．４５μｌの６．７μＭ　プライマー、０．３５ＵのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に滅菌水を加えて１１μｌとした後、上記ｂ）で調製したゲノムＤＮＡを４μｌ加え、反応液を調製した。この反応液を、まず９４℃で３分間加熱した後、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で４５秒の温度サイクルを３５回繰り返し、さらに７２℃で３分保持してから、４℃で保温した。
【０４０９】
このＰＣＲ後の反応液に色素液（０．１５％　ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）を２μｌ加え、そのうちの５μｌを４％のアガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ　３：１アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ社製）で調製した）で１５０Ｖ、室温で１．５時間乃至２時間、電気泳動した。電気泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色した後、紫外線照射下で目的のＤＮＡに相当するバンドを確認した。プライマーセットＤ４Ｍｉｔ１５で約２８０ｂｐと約３００ｂｐの２種類の断片が増幅され、かつＤ４Ｍｉｔ２１９で約１１０ｂｐと約１２０ｂｐの２種類の断片が増幅されたゲノムを有する個体を「低脂血症変異遺伝子へテロ」、Ｄ４Ｍｉｔ１５で約３００ｂｐの断片のみが増幅され、かつＤ４Ｍｉｔ２１９で約１２０ｂｐの断片のみが増幅されたゲノムを有する個体を「低脂血症変異遺伝子ホモ」とした。
【０４１０】
２）低脂血症変異遺伝子ホモ／ＡｐｏＥホモ欠損個体の作出
ａ）選抜様式
上記１）のａ）で得られたＣ５７ＢＬ／６Ｊ−低脂血症マウスとアポリポタンパク質Ｅ（以下「ＡｐｏＥ」という）ホモ欠損マウス（Ｚｈａｎｇ，　Ｓ．Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８，　４６８−４７１、東京大学医学部器官病態内科学教室より入手）との交雑から交雑第１世代（Ｆ１世代）を作出した。次いで、Ｆ１世代の雌雄を交雑してＦ２世代を得た。Ｆ２世代のうち、ＡｐｏＥをホモで欠損し、低脂血症変異遺伝子をホモで持つ個体（以下「ＡｐｏＥ　ＫＯ−低脂血症マウス」という）と低脂血症変異遺伝子を持たないＡｐｏＥホモ欠損個体（以下「ＡｐｏＥ　ＫＯマウス」という）を下記の方法で遺伝子型を判定することにより選抜した。なお、いずれの動物も上記１）のａ）記載の方法で飼育した。
【０４１１】
ｂ）遺伝子型の判定方法
上記１）のｂ）記載の方法でマウス尾よりゲノムＤＮＡを抽出した。低脂血症変異遺伝子を選抜するために、変異型アレルと野生型アレルにおいてサイズ多型を検出するオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ｇｇｃｔａａａｔａｇ　ｔａａａａｃｃｃｔｇ　ｇｃｇ　−３’　　（配列表の配列番号３３）；および
５’−　ｇｔｇｃｔｔｇｃｔｇ　ｔｃｔｔｔｃｃａｇｔ　ｃｔｔ　−３’　　（配列表の配列番号３４）
を合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを実施すると、低脂血症変異遺伝子では約２４０ｂｐの断片が増幅され、一方変異のない正常遺伝子では、約２３０ｂｐの断片が増幅される。
【０４１２】
また、ＡｐｏＥ欠損を検出するために、欠損型アレル（ネオマイシン耐性遺伝子）を特異的に増幅するための、下記の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ａｇｇａｔｃｔｃｇｔ　ｃｇｔｇａｃｃｃａｔ　ｇｇｃｇａ　−３’　　（配列表の配列番号３５）；および
５’−　ｇａｇｃｇｇｃｇａｔ　ａｃｃｇｔａａａｇｃ　ａｃｇａｇｇ　−３’　（配列表の配列番号３６）
（Ｇａｗ，　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ｌａｂ．　Ａｎｉｍ．　２９，　４４７−４４９参照）
をそれぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを実施すると、鋳型となる遺伝子にＡｐｏＥ欠損変異がある場合のみ２００ｂｐの断片が増幅される。
【０４１３】
さらに、ＡｐｏＥ欠損のない野生型アレルを特異的に増幅するための、下記の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ｔｃｃｃａａｇｔｃａ　ｃａｃａａｇａａｃｔ　ｇａｃ　−３’　　（配列表の配列番号３７）；および
５’−　ｃａｔｃｃａｇａａｇ　ｇｃｔａａａｇａａｇ　ｇｃａ　−３’　　（配列表の配列番号３８）
をそれぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを実施すると、鋳型となる遺伝子にＡｐｏＥ欠損変異がない場合のみ１７４ｂｐの断片が増幅される。
【０４１４】
上記の３セットのプライマーを用いて、上記１）のｃ）に記載した通り、ＰＣＲと電気泳動を実施し、増幅された断片を調べた。その結果、約２４０ｂｐおよび２００ｂｐの断片が検出された個体を「ＡｐｏＥ　ＫＯ−低脂血症マウス」とし、約２３０ｂｐおよび２００ｂｐの断片が検出された個体を「ＡｐｏＥ　ＫＯマウス」として選抜した。
【０４１５】
３）低脂血症変異遺伝子ホモ／レプチン変異遺伝子ホモ個体の作出
ａ）選抜様式
上記１）のａ）で得られたＣ５７ＢＬ／６Ｊ−低脂血症マウスとレプチン変異遺伝子（Ｌｅｐｏｂ）をヘテロで持つＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｅｐｏｂマウス（Ｃｏｌｅｍａｎ，　Ｄ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈｕｍｍｅｌ，　Ｋ．　Ｐ．　（１９７３）　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　９　：２８７−２９３．　浜松医科大学附属動物実験施設より入手）との交雑から交雑第１世代（Ｆ１世代）を作出した。次いで、Ｆ１世代の雌雄を交雑してＦ２世代を得た。Ｆ２世代のうち、レプチン変異遺伝子と低脂血症変異遺伝子をともにホモで持つ個体（以下「ｏｂ−低脂血症マウス」という）と低脂血症変異遺伝子を持たないレプチン変異ホモ個体（以下「ｏｂマウス」という）を下記の方法で遺伝子型を判定することにより選抜した。なお、いずれの動物も上記１）のａ）記載の方法で飼育した。
【０４１６】
ｂ）遺伝子型の判定方法
上記１）のｂ）記載の方法でマウス尾よりゲノムＤＮＡを抽出した。レプチン変異を検出するために、変異型アレルを特異的に増幅するための、下記の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ｔｇａｃｃｔｇｇａｇ　ａａｔｃｔｃｔ　−３’　（配列表の配列番号３９）；および
５’−　ｃａｔｃｃａｇｇｃｔ　ｃｔｃｔｇｇｃ　−３’　（配列表の配列番号４０）；
（Ｎａｍａｅ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｌａｂ．　Ａｎｉｍ．　Ｓｃｉ．　４８，　１０３−１０４参照）
をそれぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを実施すると、鋳型となる遺伝子に変異型アレルがある場合のみ約１００ｂｐの断片が増幅される。
【０４１７】
さらに、レプチン変異のない野生型アレルをを特異的に増幅するための、下記の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−　ｔｇａｃｃｔｇｇａｇ　ａａｔｃｔｃｃ　−３’　（配列表の配列番号４１）；および
５’−　ｃａｔｃｃａｇｇｃｔ　ｃｔｃｔｇｇｃ　−３’　（前出、配列表の配列番号４０）
をそれぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを実施すると、鋳型となる遺伝子にレプチン変異のない場合のみ約１００ｂｐの断片が増幅される。
【０４１８】
上記の２セットのプライマーおよび上記２）のｂ）に記載した低脂血症変異遺伝子を選抜するための１セットのプライマーを用いて、上記１）のｃ）に記載した通り、ＰＣＲと電気泳動を実施し、増幅された断片を調べた。その結果、約１００ｂｐ（レプチン変異型）および約２４０ｂｐの断片が検出された個体を「ｏｂ−低脂血症マウス」とし、約１００ｂｐ（レプチン変異型）および約２３０ｂｐの断片が検出された個体を「ｏｂマウス」として選抜した。
【０４１９】
４）血清脂質と動脈硬化病変面積の測定
ＡｐｏＥ　ＫＯマウス（雄３匹、２２−２３週齢）およびＡｐｏＥ　ＫＯ−低脂血症マウス（雄３匹、１９−２３週齢）を、いずれも１７時間絶食させた後にエーテル麻酔下で腹大静脈より採血した。次いで血液を３０分放置した後、２０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離を行い、血清を回収した。血清中の中性脂肪濃度についてはトリグリセリドＥ−テストワコー（和光純薬工業（株）社製）を、血清コレステロール濃度についてはコレステロールＣ−テストワコー（和光純薬工業（株）社製）をそれぞれ用いて測定した。
【０４２０】
また、エーテル麻酔下で、各マウスの胸部を切開し、左心室より１単位／ｍｌのへパリンを含む生理食塩液で洗浄した。心臓より大動脈弓部までを取り出し、心臓と大動脈弁部の分岐点が現れるまで脂肪を除去した。脂肪除去後、大動脈直上で切断し、４％中性ホルマリン溶液中で２４時間乃至７日間浸漬固定した。固定後、常法にしたがってパラフィンブロックを作製した。このパラフィンブロックを大動脈弓部側からミクロトームで薄切して、切片に初めて弁が現れてから、５μｍの厚さで連続５枚の切片を採取し、その次の５枚を捨てた。これを１単位として、この方法で全長５００μｍまで薄切した。得られた切片には、ＥｌａｓｔｉｃａＭａｓｓｏｎ染色を施した。
【０４２１】
ＣＣＤカメラ（ＨＣ−２０００、富士写真フィルム（株）社製）を搭載した光学顕微鏡（ＢＸ−５０、オリンパス光学工業（株）社製）下において、ＥｌａｓｔｉｃａＭａｓｓｏｎ染色を施した大動脈弁部横断像をテレビモニター上に映し出し、画像解析プログラム（ＱＷｉｎ、ライカ社製）を用いて病変の境界をトレースし、病変面積を計測した。各個体とも厚さ５０μｍの間隔で合計１０枚の切片について病変面積を計測し、その総和を算出した。
【０４２２】
その結果を表２に示した。
【０４２３】
【表２】
2004000101.tif 000121
以上の結果から、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の変異は、血清脂質の低下とともに動脈硬化病変の進展を抑制することが示された。
５）血糖値の測定
ＡｐｏＥ　ＫＯ（雄９匹、２４週齢）、ＡｐｏＥ　ＫＯ−低脂血症マウス（雄１０匹、２４週齢）、ｏｂマウス（雄１２匹、１７−１８週齢）、およびｏｂ−低脂血症マウス（雄１４匹、１７−１９週齢）を、いずれも１７時間絶食させた後にエーテル麻酔下で腹大静脈より採血した。次いで血液を３０分放置した後、２０００Ｇ、室温で１０分間遠心分離を行い、血清を回収した。血糖値はグルコースＢ−テストワコー（和光純薬工業（株）社製）を用いて測定した。
【０４２４】
ＡｐｏＥ　ＫＯおよびＡｐｏＥ　ＫＯ−低脂血症マウスの結果を表３に、ｏｂマウスおよびｏｂ−低脂血症マウスの結果を表４に示した。
【０４２５】
【表３】
2004000101.tif 000122
【０４２６】
【表４】
2004000101.tif 000123
以上の結果から、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の変異は、ＡｐｏＥ欠損あるいはレプチン変異による高血糖を有意に低下させることが示された。
【０４２７】
実施例７　モノクローナル抗体の調製
（ａ）　抗原蛋白質の調製
１）生産ＣＨＯ細胞株の作製
ｐＳＲαプロモーター下流（ｐＭＥ１８Ｓプラスミド）にヒトアンジオポエチン関連蛋白質３　ｃＤＮＡが位置する発現ベクターを作製した。この発現ベクターとｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＣＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）−ＭＥＭα（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）−１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン−１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）培地でジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）に共導入し、核酸除去培地において定常株を取得した。次に、本定常株をメトトレキセート０．０８μＭ濃度で生育可能な耐性株を取得し、遺伝子重複による発現量の増加が確認された株を取得した。以後、１．２８、３０、６０μＭのメトトレキセート入り核酸除去ＭＥＭα培地で生育可能な株を取得していき、最終的にコンフルエントな無血清培養の細胞培養用フラスコ上で、５乃至１０ｍｇ／ｌ／３日の生産能を有するアンジオポエチン関連蛋白質３生産ＣＨＯ細胞株を取得した。
このように作製したアンジオポエチン関連蛋白質３生産ＣＨＯ細胞株をコンフルエントまで培養後、無血清ＭＥＭα（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）培地に交換し、３日間培養して無血清培養上清を得た。
２）脱塩、小分子除去
本サンプルをＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１．６リットルのゲルに対して６００ｍｌの割合で２０ｍｌ／ｍｉｎで１０回に分けて、脱塩、小分子を除去した。本サンプルをＦＰＬＣ（Ｂｉｏｐｉｌｏｔ　ｓｙｔｅｍ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーで分画した。
３）分画ＳｔｅｐＩ
カラム：Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をＸＫ５０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１００ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ａ）２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．０１％　ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
Ｂ）２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０．０１％　ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ
フラクション溶液：１０ｍｌ／ｔｕｂｅ
温度：４℃
溶出条件：溶離液Ａ　　⇒　溶離液Ｂ（直線濃度勾配、６０分間）
得られたフラクションについて、各々０．３乃至０．４５Ｍ　ＮａＣｌ濃度で溶出されてくる画分を回収した後、一つの溶液にまとめた。まとめた溶液をサンプルとして、以下の条件で、ＦＰＬＣ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて、群特異的アフィニティークロマトグラフィーを以下の条件で実施した。
４）分画ＳｔｅｐＩＩ
カラム：Ａｆｆｉ　Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ（ＢｉｏＲａｄ）をＫＸ１６（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１０ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ｃ）２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０．０１％ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
Ｄ）２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０．０１％ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４℃
サンプルをアプライ後、Ｃ）液を６０ｍｌを流す。
溶出条件：Ｄ）液を１００ｍｌ流し、一つの溶液として回収した。回収した溶液を等量（１００ｍｌ）のＡ）液と混濁し、作製した２００ｍｌの溶液をサンプルとして以下の条件で、ＦＰＬＣ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いた群特異的アフィニティークロマトグラフィーを以下の条件で実施した。５）分画ＳｔｅｐＩＩＩ
カラム：Ｌｅｎｔｉｌ　ｌｅｃｔｉｎ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をＫＸ１６（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１０ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ｃ）２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０．０１％ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製））
Ｆ）２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ　ＮａＣｌ−０．３Ｍ　　Ｍｅｔｈｙｌｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ｐＨ７．５）−０．０１％　ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製））
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４℃
サンプルをアプライ後、Ｃ）液を５０ｍｌ流す。
溶出条件：Ｆ）液を５０ｍｌ流し、一つの溶液として回収した。
６）透析
回収した液をＤｉａｌｙｓｉｓ　ｔｕｂｉｎｇ−１−７／８　ｉｎ　Ｄｕａｍｅｔｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に移し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（−）（日水製薬社製）、０．０１％　ＮａＮ３（ＳＩＧＭＡ社製）−０．１％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液２リットルで一晩、４℃で透析した。
７）サンプルの確認
透析後、回収したサンプルの濃度は、ＤＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社）、ｗｅｓｔｅｒｎ解析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定し、「アンジオポエチン関連タンパク質３」の蛋白質量を測定した。エンドトキシン濃度はエンドトキシン測定キット（生化学工業）により測定し、２０ｍｇ／ｍｇ以下である事を確認した。このようにして精製した蛋白質を抗原として用いた。
【０４２８】
（ｂ）　免疫マウス脾細胞の調製
８週令のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス３匹にアジュバントとしてフロインド完全アジュバント（ディフコ社）０．５ｍｌを（ａ）で精製した０．５ｍｌ（１００μｇ相当）のアンジオポエチン関連タンパク質３に加え、連結針のついた注射筒内でエマルジョンを形成させた後、皮下注射して免疫した。２回目以降の免疫ではアジュバントとしてフロインド不完全アジュバント（ディフコ社）を用いた。免疫は、約２週間おきに４回行い、２回目の免疫以降、免疫する直前に眼底静脈叢より採血し、血清中の抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」抗体価を以下に述べる固相法による酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で調べた。
【０４２９】
（固相酵素免疫法）９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ヌンク社）の各ウェルに５０ｎｇの精製「アンジオポエチン関連タンパク質３」を分注し、４℃で一晩放置して抗原をプレートウェル底面にコートさせた。プレートを０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製したＢＳＡを１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間放置した。さらに０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄して、これに第一抗体として段階希釈した試料（マウス血清）を３０乃至１００μｌ／ウェル分注し、室温で１時間放置した。その後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオラッド社）の３０００倍希釈液を１００μｌ／ウェル分注し、室温で１乃至２時間放置する。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢパーオキシダーゼ基質液（バイオラッド社；ＴＭＢパーオキシダーゼキット）を１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間保温した後、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェルずつ分注し、ペルオキシダーゼ反応を停止させてから、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社）で４５０ｎｍの吸収を測定し、抗体価を算出した。
【０４３０】
（ｃ）　　マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３）をＴＩＬ培地で培養し、２×１０７以上の細胞を得た。
【０４３１】
（ｄ）　ハイブリドーマの作製
ＤＭＥＭ（日水製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス脾細胞１．４×１０８個とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３）　　１．５×１０７個を混合し、８００ｒｐｍで６分間遠心分離にかけた。沈澱として得られた脾細胞、およびＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３）を混合した細胞群をよくほぐした後、あらかじめＤＭＥＭで５０％に調製したポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００）溶液を２ｍｌ／分となるように一滴ずつ撹拌しながら１分間添加した。次にＤＭＥＭを２ｍｌ／分で１分間、同様にして添加し、この操作をもう一度繰り返した。さらに１６ｍｌのＤＭＥＭを３分間で添加して、８００ｒｐｍで６分間遠心分離した。遠心分離後上清を捨て、３５ｍｌのＴＩＬ培地で懸濁した。
【０４３２】
（ｅ）　ハイブリドーマ群の選別
懸濁液を９６ウェルプレート（コースター社）に１００μｌ／ウェルずつ分注し、７．５％のＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。７日後、５０μｌ／ウェルでＨＡＴ培地を添加した。さらに４日後、同様にして同量のＨＡＴ培地を添加した。その３日後、コロニー状に生育してきた融合細胞のみられるウェルについて培養上清の一部を採取し、抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」抗体価を上記（ｂ）と同様の固相酵素免疫測定法により測定し、それと同時にＨＴ培地へ置き換えた。
【０４３３】
（ｆ）　クローニング
抗体価の認められたウェルについては、限界希釈法によりクローニングを３回繰返し、安定して抗体価の認められたクローンを抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択した。ここで得られたハイブリドーマクローンの１つは、４５Ｂ１と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６３として寄託されている。
【０４３４】
（ｇ）　モノクローナル抗体の精製
抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ４５Ｂ１株の培養上清を回収して、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社）にて濾過滅菌した後、ＭＡｂＴｒａｐ　ＧＩＩ（ファルマシア社）を用いて抗体を精製した。以上の工程を経て抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」モノクローナル抗体ＭＡｂ４５Ｂ１を得た。
【０４３５】
（ｈ）　モノクローナル抗体の抗原特異性
上記（ａ）の１）で作製した「アンジオポエチン関連タンパク質３」生産ＣＨＯ細胞株の無血清培養上清とＣＨＯ細胞の無血清培養上清とをそれぞれ吸着抗原として用いたＥＬＩＳＡにより、Ｍａｂ４５Ｂ１が「アンジオポエチン関連タンパク質３」に特異的であることを確認した。すなわち、「アンジオポエチン関連タンパク質３」生産ＣＨＯ細胞株の無血清培養上清とＣＨＯ細胞の無血清培養上清とをそれぞれ１００μｌずつ９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ヌンク社製）の各ウェルに分注し、４℃で一晩保温して抗体をプレートウェル底面に吸着させた。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μｌ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩保温した。その後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下「ＰＢＳＴ」という）で各ウェルを２回洗浄し、これに、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで段階希釈した抗体産生ハイブリドーマ４５Ｂ１培養上清を１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを５回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで５０００分の１に希釈したＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムバイオサイエンス）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。さらに０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを５回洗浄し、ＡＢＴＳパーオキシダーゼ基質液（ロッシュ・ダイアグノスティクス）を１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間保温した後、４１５ｎｍの吸収を測定した。「アンジオポエチン関連タンパク質３」生産ＣＨＯ細胞株の無血清培養上清を吸着させたウェルでは高い吸光度が見られ抗体の希釈に従って吸光度が減少したのに対し、ＣＨＯ細胞の無血清培養上清を吸着させたウェルでは抗体の希釈によらず低い吸光度しか見られなかった。
【０４３６】
（ｉ）　モノクローナル抗体の分類
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（アマシャム社）を用いて解析した結果、この抗体は、ＩｇＧ１サブクラスの抗体であると同定された。
【０４３７】
実施例８．ＭＡｂ４５Ｂ１を用いた「アンジオポエチン関連タンパク質３」定量系
（ａ）　ウサギ抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」ポリクローナル抗体の作製
アジュバントとしてフロインド完全アジュバント（ディフコ社）０．５ｍｌを実施例７の（ａ）で精製した０．５ｍｌ（１００μｇ相当）の「アンジオポエチン関連タンパク質３」に加え、連結針のついた注射筒内でエマルジョンを形成させた後、雄ウサギの皮下に接種した。２回目以降の免疫ではアジュバントとしてフロインド不完全アジュバント（ディフコ社）を用いた。免疫は、約２週間おきに８回行った。接種後、経時的に部分採血し、抗体価の上昇を調べた。８回目の免疫後７日後に麻酔下で全採血し、５３．５ｍｌの免疫血清を得た。該血清２０ｍｌを、ＭＡｂＴｒａｐ　ＧＩＩキットを用いて精製し、１１５ｍｌの１．６４ｍｇ／ｍｌ　ＩｇＧが得られた。
【０４３８】
以上の工程を経て、ウサギ抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」ポリクローナル抗体（以下「Ｎｏ．１抗体」という）を得た。
【０４３９】
（ｂ）　ＨＲＰ標識Ｆａｂ´化ポリクローナル抗体の作成
１）Ｆ（ａｂ´）２の調製
３０ｍｌの１．６４ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１抗体を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５　０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む）で透析したし、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５　０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む）で濃度を６ｍｇ／ｍｌに合わせた。０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む）にて１０ｍｇ／ｍｌに溶解したブタ胃・ペプシン（シグマ社）２０μｌ（０．２ｍｇ）を０．５ｍｌの６ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１抗体に添加し、３７℃で６時間反応させた。反応液を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　４４（インビトロジェン社）カラム（１．５ｃｍ×４５ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。Ｎｏ．１抗体Ｆ（ａｂ´）２Ｆ画分を２８０ｎｍの吸光度により確認し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。これらの操作を繰り返し、最終的に１１．２ｍｌの２．５ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１　Ｆ（ａｂ’）２抗体が得られた。
【０４４０】
２）Ｆａｂ’の調製
１１．２ｍｌの２．５ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１　Ｆ（ａｂ´）２抗体を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で濃度を５ｍｇ／ｍｌに合わせた。０．４５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１　Ｆ（ａｂ´）２抗体に０．１Ｍ　２−ｍｅｒｃａｐｏｔｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、５０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５０μｌを加え、３７℃、９０分間反応させた。反応液をＵｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　４４（インビトロジェン社）カラム（１．５×４５ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む）、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。Ｎｏ．１　Ｆａｂ´抗体の存在を２８０ｎｍの吸光度により確認した後、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。
これらの操作を繰り返し、最終的に１１．４ｍｌの１．４ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏ．１
Ｆａｂ´抗体が得られた。
【０４４１】
３）マレイミドペルオキシダーゼの調製
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（シグマ社）３６．８ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて６．６６ｍｇ／ｍｌに溶解した。Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにてＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）　　ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（シグマ社）を溶解して濃度を７０ｍＭに合わせた。３００μｌの６．６６ｍｇ／ｍｌ西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに３０μｌの７０ｍＭ　Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）　　ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅを加え、３０℃、３０分間反応させた。反応液から沈殿を遠心除去した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５のカラム（１×３０ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０），流速０．４乃至０．６ｍｌ／ｍｉｎ，１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。ペルオキシダーゼを含む画分を４０３ｎｍの吸光度により確認し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。これらの操作を繰り返し、最終的に５．２ｍｌの６．５ｍｇ／ｍｌマレイミドペルオキシダーゼが得られた。
【０４４２】
４）マレイミド化ペルオキシダーゼとＦａｂ´の反応
０．７１ｍｌの１．４ｍｇ／ｍｌのＮｏ．１　Ｆａｂ´抗体に０．２８ｍｌの６．５ｍｇ／ｍｌマレイミド化ペルオキシダーゼを添加し、４℃、２０時間反応させた。反応後、５０ｍＭ　Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅを１０μｌ添加した。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ４４（インビトロジェン社）カラム（１．５×４５乃至１００ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分１．０ｍｌでゲル濾過した。各画分の２８０ｎｍ及び４０３ｎｍにおける吸光度を測定し、さらに各画分のペルオキシダーゼ活性を測定した。各画分に０．２％（ｗ／ｖ）　ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ（シグマ社）を終濃度０．００２％になるように、１０％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを終濃度０．１％になるように添加した後、４℃で保存した。ペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ´の濃度はペルオキシダーゼ活性あるいは４０３ｎｍの吸光度から計算し、１０μｇ／ｍｌ以上の濃度で保存した。これらの操作を繰り返し、最終的に８．６ｍｌの０．７８ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ標識化Ｎｏ．１　Ｆａｂ´抗体を得、以下の実験に用いた。
【０４４３】
（ｃ）「アンジオポエチン関連タンパク質３」定量系の作製
実施例７の（ｇ）で培養上清より得られた精製ＭＡｂ４５Ｂ１を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌに希釈し、これを１００μｌずつ９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ヌンク社製）の各ウェルに分注し、４℃で一晩保温して抗体をプレートのウェル底面に吸着させた。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μｌ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩保温した。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下「ＰＢＳＴ」という）で各ウェルを２回洗浄し、これに、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで段階希釈した試料（精製「アンジオポエチン関連タンパク質３」あるいはヒト血漿）を１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩保温した。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを７回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ標識化Ｎｏ．１　Ｆａｂ´抗体を１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で３０分間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを９回洗浄し、ＴＭＢパーオキシダーゼ基質液（バイオラッド社　ＴＭＢパーオキシダーゼキット）を１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間保温した後、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェルずつ分注し、ペルオキシダーゼ反応を停止させてから、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）で４５０ｎｍの吸収を測定した。その結果、精製「アンジオポエチン関連タンパク質３」濃度と測定結果が正比例したことから、このＥＬＩＳＡ系により「アンジオポエチン関連タンパク質３」を直線性良く定量可能であることが判明した（図６参照）。ヒト血漿を試料とした場合も該ＥＬＩＳＡ系により検出可能であった。
【０４４４】
実施例９．　アデノウイルスベクターを用いた組換えポリペプチドの産生
（１）ＤＮＡの調製
１）コザック配列の挿入
参考例２記載の、高脂血症の治療または予防剤を試験するための方法において、遺伝子発現量を検出するためにクローニングされたｃＤＮＡに、コザックのコンセンサス配列が付加されたｃＤＮＡクローンを得るため、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｃａｃａａｔｔａａｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｔｔｔａｔｔｇ　−３’（配列表の配列番号４２）
および、制限酵素ＸｈｏＩの特異的認識配列が付加された下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｔｃｔａｇａｇｃｃｔｃｇｔｔｃａｔｔｃａａａｇｃｔｔｔｃｔｇａａｔｃｔｇ　−３’（配列表の配列番号４３）
からなるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ここで、配列番号４２に示されるプライマーの一部は配列表の配列番号５３に示される「アンジオポエチン関連タンパク質３」のｃＤＮＡのヌクレオチド番号２５乃至５５であり、配列番号４３に示されるプライマーの一部は配列表の配列番号５３のヌクレオチド番号１３８５乃至１４１５のアンチセンスに該当する。
【０４４５】
次に、参考例２記載の方法で得られた組換えファージミドｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１に挿入されているヒトｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として開示されているもの）約０．４μｇ／ｍｌを鋳型とし、上記プライマー（それぞれ０．４ｍＭ）、Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社製）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０分の１量）、２ｍＭの塩化マグネシウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは上記サンプルを９４℃で３分間加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の温度サイクル３０回、最後に６８℃で２分間保温の条件で行なった。
【０４４６】
ＰＣＲの結果得られた増幅断片（約１．４ｋｂｐ）を、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）に添付されたプラスミドベクターｐＣＲ２．１へ挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローン（ｐＣＲ／ＫｈＡＰ５）を単離した。ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００、アプライドバイオシステムズ社製）で挿入断片の配列を解析して、ＰＣＲの際に該挿入断片内に変異が生じていないことを確認した。
【０４４７】
次に、ｐＣＲ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、生成した断片のうち、ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするｃＤＮＡを含む断片を、予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した哺乳動物細胞発現ベクターｐＭＥ１８Ｓに挿入することにより、組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を得た。
【０４４８】
２）部分欠失変異体の作製
ａ）カルボキシル末端側領域を欠失した変異体
上記１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＳｐｅＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑端化した後に、ＤＮＡリガーゼ反応を行って再び両端を連結することにより、ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０７番目のアミノ酸残基（セリン）をコードするコドン（ａｔｃ）の後に終止コドン（ｔａｇ）が挿入された組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣを構築した。この組換えプラスミド中の挿入断片のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１１に示す通りである。
【０４４９】
ｂ）アミノ末端側領域を欠失した変異体
上記１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＢｃｌＩおよびＳｐｅＩで消化し、ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０７番目のアミノ酸残基（セリン）までをコードするｃＤＮＡ配列のみを含む断片を除いた後、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ切断末端を平滑端化し、ＤＮＡリガーゼ反応を行って再び両端を連結した。この操作により、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５の中の、ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中の２１乃至２０６番目のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列がプロリンをコードするコドン（ｃｃｔ）で置換された組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤを構築した。この組換えプラスミド中の挿入断片のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１３に示す通りである。
【０４５０】
（２）組換えアデノウイルスの調製
上記（１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣとｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤ中に存在する「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の一部領域欠失変異体をコードする遺伝子が、組込まれた組換えアデノウイルスは、アデノウイルス発現ベクターキット（宝酒造（株）社製）を用いて以下に記載する方法に従って作製した。
【０４５１】
まず、上記で（１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣおよびｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤを、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、得られたそれぞれ約１．４ｋｂおよび約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、切断末端を平滑化した。次に、サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターにより挿入遺伝子が発現されるように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔのＳｗａＩ切断部位にこれらの断片をそれぞれ挿入し、組換えコスミドｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＣＣおよびｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤを調製した。
【０４５２】
これらの組換えコスミドＤＮＡと末端タンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイルス発現ベクターキットに添付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ライフテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）にコ・トランスフェクションして、組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ、Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤを単離し、さらに２９３細胞内で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行うか、または凍結融解を３回繰り返し、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２回繰り返すことによって行った。得られたウイルス液を、１０％　グリセロールを添加したＰＢＳに対して４℃で透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存した。
【０４５３】
（３）組換えアデノウイルスによる目的タンパク質の発現の確認
上記（２）記載の方法で得られた組換えアデノウイルスをＨｅＬａ細胞に感染させて、目的タンパク質の発現を確認した。
【０４５４】
まず、上記（２）記載の方法で得られた組換えアデノウイルスをそれぞれＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２）に約５ｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：多重感染度）で感染させ、無血清培地（ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ））で３乃至４日培養した後の培養上清を回収した。培養上清１ｍｌを１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れ、１００μｌのトリクロロ酢酸溶液（１ｇ／ｍｌ　トリクロロ酢酸、４ｍｇ／ｍｌ　デオキシコール酸）を添加して室温で３分間放置後、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで５分遠心した。上清を除いて、氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分遠心した。上清を除いて、沈殿に再度氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分遠心して、上清を除き、沈殿物を真空乾燥した。この沈殿物をそれぞれ１０μｌの蒸留水に溶解させ、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製した。これら試料をゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％ＳＤＳ）後、転写緩衝液（２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、２０％メタノール）中で４℃、１時間、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに転写した。
【０４５５】
転写したメンブレンは０．５％　スキムミルクを添加したＰＢＳ液中に浸して４℃で一晩ブロッキングし、洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、約２７０ｎｇ／ｍｌの５５−１−Ｎ１抗体または約１μｇ／ｍｌの５５−１−Ｃ１抗体および５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ液中に入れて室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で３回洗浄した。なお、これら抗体はいずれも実施例２記載の方法で取得された。５５−１−Ｎ１抗体はヒト「アンジオポエチン関連タンパク質３」のアミノ末端側に特異的に結合する抗体であり、５５−１−Ｃ１抗体は同じくカルボキシル末端側に特異的に結合する抗体である。
【０４５６】
さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（バイオラッド社製）を５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍希釈した反応液中で室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上に置き、発光試薬溶液（ＥＣＬウエスタン検出試薬。アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１分間浸した後、１時間室温で放置してバックグラウンドを減衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（１０秒間）。このＸ線フィルムを現像した結果、組換えアデノウイルスを感染させたＨｅＬａ細胞において、それぞれ目的のポリペプチドが産生されていることが確かめられた。
【０４５７】
（４）組換えアデノウイルスを接種したＫＫ／Ｓｎｋマウスの血中中性脂肪濃度の測定
上記で精製した組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣおよびＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＦＬＤを１０％　グリセロール添加ＰＢＳで２．０×１０１０ｐｆｕ／ｍｌおよび１．０×１０１０ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、それぞれ３匹の１９週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに３００μｌずつ尾静脈注射により接種した。また、陰性対照として、１０％　グリセロール添加ＰＢＳを３００μｌずつ３匹の１９週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに尾静脈注射により接種した。
【０４５８】
接種１日後に、各マウスの眼底よりヘマトクリット管で採血し、卓上遠心機で５２００ｒｐｍで１５分間遠心して血漿を分離し、キット（トリグリセリドＥ−テストワコー。和光製薬（株）社製）を用いて中性脂肪濃度を測定した。
【０４５９】
その結果、Ａｄ／　ＫｈＡＰ５　ＦＬＤ接種マウス群と１０％　グリセロール添加ＰＢＳ接種マウス群では、血中の中性脂肪濃度に有意な差が認められなかった（いずれも５０ｍｇ／ｄＬ以下）のに対し、Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ接種マウス群では血中の中性脂肪濃度の顕著な上昇が認められた（３０００ｍｇ／ｄＬ以上）。
【０４６０】
本実施例の方法において、例えばＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣを接種したマウスに、被験物質を投与し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことができる。
【０４６１】
実施例１０．　融合タンパク質の活性評価
（１）融合タンパク質発現形質転換大腸菌の作製
配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至２０７、同アミノ酸番号１７乃至１９５、または同アミノ酸番号１７乃至１４７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末端にグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）が連結している融合タンパク質（以下、順番にそれぞれ「ＧＳＴ−ＣＣ」、「ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ」および「ＧＳＴ−Ｃ１」という。）を以下に記載する方法に従って調製した。
【０４６２】
まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｃｇｇａａｔｔｃｃｃｔｃｃａｇａａｔｔｇａｔｃａａｇ　−３’（ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌおよびＧＳＴ−Ｃ１共用のセンスプライマー。配列表の配列番号４４）；
５’−　ｃｃｇｃｔｃｇａｇａｃｔａｇｔｃｃｔｔｃｔｇａｇｃｔｇ　−３’（ＧＳＴ−ＣＣ用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号４５）；および
５’−　ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔｇａｃｔａｔｇｃｔｇｔｔｇｇｔｔ　−３’（ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号４６）；および
５’−　ｃｃｇｃｔｃｇａｇｇｔｔａｇｔｔａｇｔｔｇｃｔｃｔｔｃ　−３’（ＧＳＴ−Ｃ１用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号４７）を合成した。
【０４６３】
次に、実施例３記載のｃＤＮＡ（ｐＭＥｈ５５−１）を鋳型とし、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、Ｔｂｒ　ＥＸＴＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、上記サンプルを９４℃で３分間加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の温度サイクル３０回、最後に７２℃で５分間の条件で行なった。
【０４６４】
ＰＣＲではそれぞれについて、約５８０ｂｐ（ＧＳＴ−ＣＣ用アンチセンスプライマー使用）、約５４０ｂｐ（ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ用アンチセンスプライマー使用）および約４００ｂｐ（ＧＳＴ−Ｃ１用アンチセンスプライマー使用）のＤＮＡ断片が増幅した。増幅したＤＮＡ断片を回収し、それぞれについて、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化してからウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて切断末端の脱リン酸化処理を行ったプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＳＴをコードする遺伝子を含む。アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に、このＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した、ＤＮＡ断片をそれぞれ挿入し、３種の挿入断片を含む３種のプラスミドクローンを単離した。ＧＳＴ−ＣＣ用アンチセンスプライマーで増幅した断片を有するプラスミドクローンをｐＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ用アンチセンスプライマーを使用して増幅した断片を有するプラスミドクローンをｐＧＳＴ―ＣＣｄｅｌ、ＧＳＴ−Ｃ１用アンチセンス用プライマーを使用して増幅した断片を有するプラスミドクローンをｐＧＳＴ−Ｃ１と命名した。
【０４６５】
プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１または、挿入断片を含まずＧＳＴのみを発現させるためのコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２のそれぞれで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換は大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルにプラスミドを添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で３０秒間保温し、再び氷上で２分間静置してから、３７℃で１時間振盪培養をすることによって行なった。形質転換後の培養液をアンピシリン添加ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した組換え体のコロニーをピックアップして液体培養し、ＩＰＴＧ誘導による組換えタンパク質の発現を確認した。
【０４６６】
（２）融合タンパク質の調製
１）形質転換大腸菌の培養
プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１及びコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換大腸菌をそれぞれ、アンピシリン入りのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１８時間振とう培養した。培養液の一部を新しい培地に添加し、さらに３７℃にて振とう培養を行なった。６００ｎｍでの吸光度が０．５−０．７に達した時に、最終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル・チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加しさらに４時間振とう培養を継続した。
【０４６７】
２）ｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する大腸菌からの細胞破砕液の調製
コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で形質転換した大腸菌の培養液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理して沈殿した菌体を回収した。回収した菌体を超音波処理用緩衝液（５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ）で懸濁し、懸濁液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理した。沈殿を−８０℃で凍結し、次いで室温にて融解して再度超音処理用緩衝液に懸濁した。懸濁液を氷浴中で超音波破砕器（トミー精工（株）社製ＵＤ−２０１）によって、出力＝５、デューティ＝５０の条件で５分間処理した。超音波処理後の破砕液に最終濃度１％となるようにトリトン　Ｘ−１００を添加し混和し、４℃、１００００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心処理し、上清を回収した。上清はＧＳＴｒａｐカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）中に流した。
【０４６８】
３）ｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１を保持する大腸菌からの細胞破砕液の調製
組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１で形質転換した大腸菌の培養液それぞれを、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心処理し、沈殿した菌体を回収した。沈殿した菌体に対して、洗浄用緩衝液（０．５％　トリトン　Ｘ−１００、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）での懸濁、４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の条件での遠心処理、の操作を３回繰り返し、得られた菌体を８Ｍ　尿素溶液に溶解した。この溶液を室温に１時間放置した後、４℃、１３０００ｒｐｍ、３０分間の遠心処理を行ない上清を回収した。組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１で形質転換した大腸菌の由来の培養液から得られた３種の上清について透析を行なった。透析は、４Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、２Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で一晩の順で行なった。透析後、４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心し、上清をそれぞれＧＳＴｒａｐカラム中に流した。
【０４６９】
４）融合タンパク質の精製
上記の工程を経てＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１またはＧＳＴ−ＣＣｄｅｌが吸着したＧＳＴカラムにＰＢＳを流してカラム内を洗浄して不純物を除去した。次いで、１０ｍＭ　還元型グルタチオン溶液を流して、ＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１又はＧＳＴ−ＣＣｄｅｌを溶出させた。溶出液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にで分離した後、ゲルをクマシー染色して、タンパク質の存在を確認した。また、溶出液をＰＢＳで４℃、一晩透析した。ここで、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換体から精製されたタンパク質がＧＳＴであり、以下同様にｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−Ｃ１、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ由来のタンパク質がそれぞれ、ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌである。
【０４７０】
（３）血中中性脂肪濃度上昇活性
上記（２）で得られたＧＳＴ、ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌおよびＧＳＴ−Ｃ１を、ＰＢＳでタンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌに調整した後に、それぞれ３匹、４匹、２匹および５匹の１９週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに３００μｌずつ尾静脈注射により接種した。採血は摂取前と摂取３０分後に行なった。ヘマトクリット管で各マウスの眼底より採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍ、１５分間遠心して血漿を分離し、接種前後における血中中性脂肪（トリアシルグリセロール）濃度を測定した。
【０４７１】
その結果を図８に示した。図８のグラフ中、縦軸は、血漿１００ｍｌ中の中性脂肪（トリアシルグリセロール）量を示している。横軸は各融合タンパク質を示す。ＧＳＴ接種マウス群（図８の「ＧＳＴ」）では接種前後で差が認められなかったのに対し、ＧＳＴ−Ｃ１接種マウス群（図８の「Ｃ１」）では若干ながら血中中性脂肪濃度の上昇が認められた。一方、ＧＳＴ−ＣＣおよびＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ接種マウス群（図８の「ＣＣ」および「ＣＣｄｅｌ」）では血中中性脂肪濃度の顕著な上昇が認められた。
【０４７２】
本実施例の方法において、例えばＧＳＴ−ＣＣあるいはＣＣｄｅｌを接種したマウスに、被験物質を投与し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことができる。
【０４７３】
実施例１１．　ＬＰＬ活性測定法
（１）ラット脂肪細胞由来ＬＰＬを用いる方法
１）ＬＰＬ試料の調製
ラット白色脂肪前駆細胞（ホクドー社より購入）を増殖用培地［１０％　ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）、１００単位／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ　（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭ　オクタン酸および５０ｎＭ　トリヨードチロニンを含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）］の入った細胞培養用フラスコ（培養面積２５ｃｍ２）中で３７℃で２４時間培養した後、培地を分化誘導用培地（１０％　ＦＣＳ、１００単位／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ　（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭ　オクタン酸、５０ｎＭ　トリヨードチロニン、１０μｇ／ｍｌ　インスリンおよび２．５μＭ　デキサメタゾンを含むＤＭＥＭ）に交換し、３７℃でさらに４８時間培養した。その後、脂肪細胞維持培地（１０％　ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ　（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭオクタン酸、５０ｎＭ　トリヨードチロニンおよび１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含むＤＭＥＭ）に交換し、２乃至３日目に１０％　ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ　インスリンおよび１０単位／ｍｌ　ヘパリンナトリウムを含有するＤＭＥＭ培地を２ｍｌ加え、１時間培養した後、この培養上清を回収してＬＰＬ活性の測定に用いた。
【０４７４】
２）ＬＰＬ活性測定
ＬＰＬ活性の測定法は、文献記載の方法（Ｎｉｌｓｓｏｎ−Ｅｈｌｅ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓｃｈｏｔｚ，　Ｍ．　Ｃ．（１９７６）　Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．　１７，　５３６−５４１）に従った。なお、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（アンジオポエチン関連タンパク質３。）は、実施例６記載の方法に従って調製した。
【０４７５】
まず、上記１）記載の方法で調製した培養上清１００μｌを等量の基質溶液［２ｍＭ　グリセロール・トリ［９，１０（ｎ）−３Ｈ］オレイン酸（１３１ＫＢｅｑ／μｍｏｌ、アマシャム社製）、０．１８９μｇ／ｍｌ　Ｌ　α−ホスファチジルコリン（シグマ社製）、１４ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、１４０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）非働化ＦＣＳ］と混合し、そこへ精製したアンジオポエチン関連タンパク質３を加え、３７℃で１２０分間保温した。その後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ　炭酸カリウム・ほう酸緩衝液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメタノール：クロロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：１００（ｖ／ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌した後、３０００×ｇで１５分間遠心分離した。水−メタノール層の３Ｈカウントを液体シンチレーションカウンターにて測定した。ＬＰＬ活性の１単位は、１μｍｏｌの脂肪酸を１分間に生成する活性として定義した。その結果を表５に示した。
【０４７６】
【表５】
2004000101.tif 000124
アンジオポエチン関連タンパク質３はＬＰＬの活性を用量依存的に抑制した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
（２）　マウスヘパリン静注後血漿を用いる方法
Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスにヘパリンナトリウムを尾静脈投与し（１００単位／ｋｇ）、１０分後に腹大動脈より採血を行ない、遠心分離によりヘパリン静注後血漿を調製し、ＬＰＬ活性測定に使用した。ただし、血漿を用いた場合、上記（１）の２）に記載の条件で測定を行うと、血漿中に含まれる肝臓由来のＨＴＧＬとＬＰＬとの両リパーゼ活性が測定される。そこで、それらを分別して測定するために、まず、上記（１）の２）に記載の条件でリパーゼ反応を行ってリパーゼ活性を測定し、得られた結果を「総リパーゼ活性」とした。一方、別に、終濃度１Ｍとなるように塩化ナトリウムを反応液に加えることによりＬＰＬを不活化した条件でリパーゼ反応を行い、血漿中に残存するＨＴＧＬのリパーゼ活性のみを測定した。このようにして得られた総リパーゼ活性からＨＴＧＬ活性を差し引いた値をＬＰＬ活性とした。その結果を表６に示した。
【０４７７】
【表６】
2004000101.tif 000125
アンジオポエチン関連タンパク質３は、マウスヘパリン静注後血漿中のＬＰＬおよびＨＴＧＬの両者に対してその活性をイン・ビトロで阻害することが明らかになった。この実験系において、総リパーゼ活性を測定するためのリパーゼ反応時に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬまたはＨＴＧＬのいずれかの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。同様に、ＨＴＧＬ活性を測定するためのリパーゼ反応時に被験物質を添加すれば、該物質がＨＴＧＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
【０４７８】
実施例１２．　融合タンパク質のＬＰＬ活性阻害効果
ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌまたはＧＳＴを用いてアンジオポエチン関連タンパク質３の代わりに用いて実施例１１の（１）記載の方法でＬＰＬの活性を測定した。
ＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）を添加したときのＬＰＬ活性を１００％とし、ＧＳＴ−ＣＣあるいはＧＳＴ−ＣＣｄｅｌを添加したときの相対的ＬＰＬ活性を算出した。その結果を表７に示した。
【０４７９】
【表７】
2004000101.tif 000126
ＧＳＴ−ＣＣおよびＧＳＴ−ＣＣｄｅｌはＬＰＬの活性を用量依存的に抑制した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
【０４８０】
実施例１３．　ヒスチジンタグが付加されたポリペプチドの調製とＬＰＬ阻害活性
（１）ヒスチジンタグが付加されたポリペプチドの調製
「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸）をコードするコドンの直後にヒスチジンタグが挿入され、かつアミノ末端から２０８番目以降のアミノ酸配列を欠失したポリペプチドＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓを、以下に記載する方法に従って調製した。
【０４８１】
１）ヒスチジンタグの挿入
「アンジオポエチン関連タンパク質３」の前駆体のアミノ酸配列のアミノ末端から２０番目（成熟体のアミノ酸配列の４番目）に相当するアミノ酸（アスパラギン酸）のカルボキシル末端側に、ヒスチジンタグ（配列表の配列番号２６のアミノ酸番号２１乃至２８に示されるアミノ酸配列）が挿入されるように、実施例９の（１）の１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を改変した。
【０４８２】
まず、一部が相補的な、下記のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
５’−　ｇａｔｃｃｇｃａｔｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔ　−３’（配列表の配列番号４８）および
５’−　ｇａｔｃａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｃｇ　−３’（配列表の配列番号４９）
を合成し、さらに合成ＤＮＡ末端リン酸化試薬フォスファリンク（アプライドバイオシステム社製）を用いて５’末端をリン酸化した。これらをアニーリングさせたものを、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＢｃｌＩで完全に消化して得られた約４．２ｋｂの断片に挿入した。その結果として、上記のアニーリングさせたオリゴヌクレオチドが３単位連結したＤＮＡが、ＢｃｌＩ切断部位に挿入されたプラスミドクローンが得られた。次に、このクローンをＢｃｌＩで消化したものに、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５をＢｃｌＩで完全に消化して得られる約１８０ｂｐの断片を挿入することにより、プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６を得た。
【０４８３】
プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６には、ヒスチジンタグをコードする配列が３単位含まれており、その中の３’末端側の２単位は、目的とは逆の方向に連結された余分な配列である。この配列を省いた断片をＰＣＲにより増幅するために、センス／アンチセンス兼用プライマーとして、以下のヌクレオチド配列：
５’−ｇａａｔｔｇａｔｃａｇｃａｔｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｃｇａｔｃ−３’（配列表の配列番号５０）
からなるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。次いで、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６（０．４μｇ／ｍｌ）を鋳型とし、上記プライマー（０．４ｍＭ）、Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社製）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０分の１量）、２ｍＭの塩化マグネシウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、まず９４℃で２分加熱した後に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間保温するという条件で行なった。
【０４８４】
ＰＣＲの結果得られた増幅断片（２６８ｂｐ）をＢｃｌＩで消化した後、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５をＢｃｌＩで完全に切断して得られた約４．２ｋｂの断片に挿入した。以上の操作により、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５に挿入されているｃＤＮＡ配列中に存在する２ヶ所のＢｃｌＩ切断部位のうち、上流側の切断部位に、ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列（配列表の配列番号２５のヌクレオチド番号７８乃至１０１）が挿入されたＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを得た。
【０４８５】
２）カルボキシル末端側を欠損した改変体の作製
上記１）で得られたプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを制限酵素ＳｐｅＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑化した後に、ＤＮＡリガーゼ反応を行って再び両端を連結することにより、「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０７番目のアミノ酸残基（セリン）をコードするコドン（ａｔｃ）の後に終止コドン（ｔａｇ）が挿入され、またアミノ末端から２０番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸）をコードするコドンの直後にヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列が挿入されたＤＮＡ（配列表の配列番号２５）を含む組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓを構築した。
【０４８６】
３）ＣＯＳ−１細胞での発現
直径１５０ｍｍ組織培養用シャーレ（コーニング社製）に、ＣＯＳ−１細胞（０．５×１０６細胞）を懸濁した１０％　ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という。ギブコ社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という。ギブコ社製）３０ｍｌを入れて、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間培養した。その後、培地を除去してから、トランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００１８０μｌとＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ溶液（いずれもギブコ社製）　３ｍｌとを混濁したもの）に３６μｇのｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓを加えて混ぜたものをＣＯＳ−１細胞に加えることにより、トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間静置した。以上の操作をシャーレ１３０枚分のＣＯＳ−１細胞に対して実施し、総計約４．４Ｌの培養上清を集めた。この培養上清を、０．２２μｍセルロースアセテート製ボトルトップフィルター（コーニング社製）を用いて吸引ろ過して、ろ液を回収した。
【０４８７】
４）発現量、濃度の確認
上記３）で回収されたろ液の一部と、実施例６に記載の方法で精製された「アンジオポエチン関連タンパク質３」についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にウェット法で転写した（０．２Ａ、９０分、４℃）。このニトロセルロース膜を、５％　スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を含むＰＢＳ−０．０５％　ツイーン２０溶液（以下「ＰＢＳ−Ｔ」という）に一晩浸してブロッキングを行った。次いで、ニトロセルロース膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ウエスタンブロットを行った。一次抗体には実施例２記載の５５−Ｎ１抗体を、二次抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を使用した。５５−Ｎ１抗体が特異的に結合したバンドの検出には、ＥＣＬ試薬（アマシャム社製）を用いた。その結果、上記３）で得られたろ液中には約１．０乃至１．５ｍｇ／リットル（全ろ液中に４．４乃至６．６ｍｇ）のＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓが含まれていることが明らかになった。
【０４８８】
５）ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓの精製
上記３）で得られたろ液の全量について、限外ろ過装置（ＴＩＦＦラボスケールおよび３０ＫＤａ孔径の限外ろ過膜（いずれもミリポア社製））を用いて、４４０ｍｌとなるまで限外濃縮した。さらに、得られた試料に、限外ろ過装置中で２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．１％　アジ化ナトリウムおよび０．０５％　プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）を含む緩衝液（ｐＨ７．４）４リットルを徐々に加えながら限外ろ過を続行することにより、溶媒が該緩衝液に置換された試料を得た（液量６００ｍｌ）。
【０４８９】
一方、キレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング　５ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル　５ｍｌを約５ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させた。このカラムに超純水を流して洗浄した後、ＨＰＬＣ送液システム（アマシャム社製）に装着して、以下に記載する条件で試料のアフィニティー精製を行った。
【０４９０】
溶媒：
Ａ液：　２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
Ｂ液：　２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍイミダゾール（ｐＨ７．４）、０．１％　アジ化ナトリウム、０．０５％　プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
流速：　５ｍｌ／分
精製手順：　試料６００ｍｌをカラムに流した後、Ａ液　８０％、Ｂ液　２０％の緩衝液（０．１Ｍ　イミダゾール濃度に相当）５０ｍｌを流して非吸着物を洗浄除去した。その後、Ｂ液　５０ｍｌをカラムに流し、ヒスチジンタグを有するポリペプチドを溶出させ、溶出液を回収した。この溶出液にＡ液２００ｍｌを加えて、イミダゾール濃度０．１Ｍの溶液としたものを、第２回のアフィニティー精製用試料とした。
【０４９１】
小スケールのキレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング　１ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル　５ｍｌを約１ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させ、次いで超純水を流して洗浄した後、カラムをＨＰＬＣ送液システムに装着し、試料を流してから、カラムをＨＰＬＣから取り外した。次いで、２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ　イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を、１ｍｌ／分の流速で１ｍｌカラムに手動で流して、非吸着物を洗浄除去した。その後、２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．３Ｍ　イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を同様に１ｍｌ／分の流速で流し、溶出液を１ｍｌずつ、５分画（計５ｍｌ）回収した。
【０４９２】
回収した溶出液をそれぞれ透析チューブ（ギブコ社製）に入れて、５００ｍＬのＰＢＳ（ギブコ社製）に対して透析を行った。透析膜外液であるＰＢＳは、３回交換した。最後の透析膜外液を一部採取して、ＬＰＬ活性評価の際の陰性対照試料とした。
【０４９３】
回収した試料中のタンパク質濃度を、プロテインアッセイ（ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を使用）やＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で見積もった結果、計１．８ｍｇのＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓが得られたことが判明した。そして、下記のＬＰＬ活性評価には、第２回のアフィニティー精製により得られた第２および第３の分画をまとめたものを用いた。
【０４９４】
（２）ＬＰＬ活性の測定
上記（１）の５）で得られたＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓ試料を、ＧＳＴ−ＣＣの代わりに用いて、実施例１１の（１）記載の方法でＬＰＬ活性を測定した。その結果を表８に示す。
【０４９５】
【表８】
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ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓは、ＬＰＬ活性を強く阻害した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
【０４９６】
（３）血中中性脂肪濃度の低下作用
実施例１０の（３）記載の方法に従って、ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓをＫＫ／Ｓｎｋマウスに尾静脈投与した（１００μｇ／マウス）。投与前と投与後のマウスから末梢血を採取して中性脂肪濃度を測定した。その結果、投与前のマウスでは血中中性脂肪濃度が４０．５ｍｇ／ｄｌであったのに対し、ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓ投与３０分後では１０６．０ｍｇ／ｄｌに上昇していた。溶媒のみを投与した対照群の投与３０分後の血中中性脂肪濃度は４１．３ｍｇ投与群であった。以上の結果より、ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓは血中中性脂肪濃度を有意に上昇させることが確かめられた。
【０４９７】
実施例１４．ヘパリン結合部位に変異を導入したアンジオポエチン関連タンパク質３の血漿トリグリセリドに対する効果
（１）ヘパリン結合モチーフに変異を導入したアンギオポエチン関連蛋白−３（ＡＲＰ３）のＮ末２０７アミノ酸部分蛋白の構築
実施例１３の２）記載のプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断して得られる約１．４ｋｂｐの断片を単離し、宝酒造製のＭｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍキットに添付のプラスミドｐＫＦ１８ｋのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断点に挿入した。変異導入用プライマーＧＴＣＡＴＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＧＧＣＣＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＣを用い、キットの説明書に従って変異を導入し、プラスミドｐＫＦ１８／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを得た。得られたプラスミドクローンの塩基配列を決定して、変異導入が行われたことおよび他の部分に変異が入っていないことを確認した。結果として、配列表の配列番号１２の６２番目のヒスチジン、６３番目リジン、６５番目のリジンがそれぞれイソロイシン、アスパラギン、アスパラギンへ置換した蛋白をコードするＤＮＡ配列が作製された。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断して約１．４ｋｂｐの断片を単離し、高発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（Ｈａｒａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）　ＥＭＢＯ．Ｊ．　１１，　１８７５−、横田崇、新井賢一編集、バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社、ｐ１８−２０）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断点に挿入した（ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ））。
【０４９８】
（２）ヘパリン結合モチーフに変異を導入したアンギオポエチン関連蛋白−３（ＡＲＰ３）のＮ末２０７アミノ酸部分蛋白の活性に関する検討
１）マウス血漿中トリグリセリド濃度上昇活性
Ａ）組換えアデノウイルスの作製
ＡＲＰ３のＮ末２０７アミノ酸部分蛋白（ＡＲＰ３　ＣＣ）およびヘパリン結合モチーフに変異を導入したＡＲＰ３のＮ末２０７アミノ酸部分蛋白（ＡＲＰ３　ＣＣ（−ＨＢ））を強制発現させるため組換えアデノウイルスは、市販のキット（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いて作製した。すなわち、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓあるいはｐＫＦ１８／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／ＨｉｓをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、得られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片の末端を平滑化したものを挿入ＤＮＡ断片として以下の操作に用いた。
【０４９９】
また、サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターにより発現されるように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）の制限酵素ＳｗａＩ認識部位にインサートＤＮＡ断片を挿入したコスミドｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓおよびｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを作製した。ｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓ　ＤＮＡあるいはｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓ　ＤＮＡと末端タンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ライフテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）にコ・トランスフェクションして、組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓおよびＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを単離し、さらに２９３細胞中で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行い、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２回繰り返すことによって行った。得られたウイルス液を、１０％　グリセロールを添加したＰＢＳに対して４℃で透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存した。
【０５００】
Ｂ）組換えアデノウイルスのマウス接種後の血漿中トリグリセリド濃度
上記のようにして精製された組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓおよびＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを、１０％グリセロールを含むＰＢＳで２×１０１０ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、それぞれ２匹（Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓ）または３匹（Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓ）の２０−２１週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに２００μｌ（５×１０９ｐｆｕ）ずつ尾静脈注射により接種した。接種前、接種１、２、４、７、１１、１４日後に各マウスの眼底よりヘマトクリット管で採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍ１５分遠心して血漿を分離した。接種後１日後の血漿１μｌを２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製した。試料を中でゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％　ＳＤＳ）後、転写緩衝液（２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、２０％メタノール）中で４℃、１時間、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに転写した。転写したメンブレンは０．５％　スキムミルクを添加したＰＢＳ液で４℃で一晩ブロッキングし、洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、２７０ｎｇ／ｍｌの実施例２記載の５５−１−Ｎ１抗体および５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ液中に入れて室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で３回洗浄した。さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（アマシャム・バイオサイエンス社製）を５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍希釈した反応液中で室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液に１分間浸した後、Ｘ線フィルムを感光させた。その結果、組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓを感染させたマウス血漿中およびＡｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを感染させたマウス血漿中に特異的なバンドが検出された（図９）。
【０５０１】
続いて中性脂肪測定用キット（トリグリセリドＥ−テストワコー、和光製薬（株）社製）を用いて中性脂肪濃度を測定した。Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓ接種マウス群では血中の中性脂肪濃度が顕著に上昇したのに対し、Ａｄ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓ接種マウス群では血漿中の中性脂肪濃度はほとんど上昇しなかった（図１０）。
【０５０２】
２）リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）阻害活性
Ａ）組換えタンパクの調製
ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓあるいはｐＫＦ１８／ＫｈＡＰ５　ＣＣ（−ＨＢ）／ＨｉｓをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬（インビトロジェン社製）を用いて、ＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）に導入し、血清非添加のダルベッコ改変イーグル培地で４日培養した後に培養上清を回収した。培養上清をＴＩＦＦラボスケール（ミリポア社）で３０Ｋのフィルター（ミリポア社）を用いて、約１０分の１量に限外濃縮した。濃縮したサンプルは、１０倍量の５０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーで循環させて、本組成のバッファーに置換した。バッファー置換したサンプルは、予め０．５ｍｌの０．１Ｍ硫酸ニッケルで処理し、５０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーに置換したＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に結合させた後、１００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーで洗浄し、３００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーで溶出した。得られた溶出サンプルを１，０００倍量のＰＢＳ（―）（シグマ社）で３回透析したものをそれぞれ組換えタンパクＡＲＰ３
ＣＣ、ＡＲＰ３　ＣＣ（−ＨＢ）とした。
【０５０３】
Ｂ）ＬＰＬ阻害活性
上記で得られた組換えタンパク質のＬＰＬ阻害活性を実施例１１）の（１）の２）記載の方法で検討した。ＡＲＰ３　ＣＣ（―ＨＢ）のＬＰＬ阻害活性はＡＲＰ３　ＣＣのＬＰＬ阻害活性に比べて著しく低かった（図１１）。
【０５０４】
以上より、ＡＲＰ３　ＣＣ（―ＨＢ）はＡＲＰ３の機能阻害剤のスクリーニングの際の陰性対照として利用できる。
【０５０５】
実施例１５．ヒスチジンタグ付加蛋白発現アデノウイルスベクターを接種したマウスの血漿の調製
（１）組換えアデノウイルスの調製
アデノウイルス発現ベクターキット（宝酒造（株）社製）を用いて、以下の方法にしたがって、組換えアデノウイルスを作製した。実施例１３の（１）の１）で得られた、組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、切断末端を平滑化した。次に、サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターにより挿入遺伝子が発現されるように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔのＳｗａＩ切断部位にこれらの断片をそれぞれ挿入し、組換えコスミドｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを調製した。
【０５０６】
この組換えコスミドＤＮＡと末端タンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイルス発現ベクターキットに添付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ライフテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）にコ・トランスフェクションして、組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを単離し、さらに２９３細胞内で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行うか、または凍結融解を３回繰り返し、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２回繰り返すことによって行った。得られたウイルス液を、１０％　グリセロールを添加したＰＢＳに対して４℃で透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存した。
【０５０７】
（２）組換えアデノウイルスによる目的タンパク質の発現の確認
上記（１）記載の方法で得られた組換えアデノウイルスをＨｅＬａ細胞に感染させて、目的タンパク質の発現を確認した。
【０５０８】
まず、上記（１）記載の方法で得られた組換えアデノウイルスをそれぞれＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２）に約５ｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：多重感染度）で感染させ、無血清培地（ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ））で３乃至４日培養した後の培養上清を回収した。培養上清１ｍｌを１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れ、１００μｌのトリクロロ酢酸溶液（１ｇ／ｍｌ　トリクロロ酢酸、４ｍｇ／ｍｌ　デオキシコール酸）を添加して室温で３分間放置後、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで５分遠心した。上清を除いて、氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分遠心した。上清を除いて、沈殿に再度氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分遠心して、上清を除き、沈殿物を真空乾燥した。この沈殿物をそれぞれ１０μｌの蒸留水に溶解させ、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製した。これら試料をゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％ＳＤＳ）後、転写緩衝液（２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、２０％メタノール）中で４℃、１時間、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに転写した。
【０５０９】
転写したメンブレンは０．５％　スキムミルクを添加したＰＢＳ液中に浸して４℃で一晩ブロッキングし、洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、約２７０ｎｇ／ｍｌの実施例２記載の５５−１−Ｎ１抗体および５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ液中に入れて室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で３回洗浄した。
【０５１０】
さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（バイオラッド社製）を５％　ウシ胎児血清を含む０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍希釈した反応液中で室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上に置き、発光試薬溶液（ＥＣＬウエスタン検出試薬。アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１分間浸した後、１時間室温で放置してバックグラウンドを減衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（１０秒間）。このＸ線フィルムを現像した結果、組換えアデノウイルスを感染させたＨｅＬａ細胞において、目的のポリペプチドが産生されていることが確かめられた。
【０５１１】
（３）組換えアデノウイルスを接種したＫＫ／Ｓｎｋマウス血漿の調製
上記（１）で精製した組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを１０％グリセロール添加ＰＢＳで７．２×１０９ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、５匹の１８週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに３００μｌずつ尾静脈注射により接種した。
【０５１２】
接種２日後に、各マウスの腹大動脈より６０μｌの１％ＥＤＴＡを予め入れた注射筒（テルモ社製の２６ゲージの注射針および１ｍｌのシリンジ）を用いて採血し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、転倒混和後に、卓上遠心機で５２００ｒｐｍで１５分間遠心して血漿を分離した。
【０５１３】
（４）ＫＫ／Ｓｎｋマウス血漿中目的タンパク質の精製
得られた血漿を１０ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ、４℃で４日間透析後、ＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）へ添加し、２０ｍＭイミダゾール／ＰＢＳおよび１００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ洗浄を行った。溶出は３００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳで行い、各フラクションはゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ　トリス、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％　ＳＤＳ）後、ＧｅｌＣｏｄｅ染色（Ｐｉｅｒｃｅ社）を行い目的タンパク質の有無を確認した。
【０５１４】
（５）ＫＫ／Ｓｎｋマウス血漿中目的タンパク質切断点の同定
Ｈｉｓ−ｔａｇアフィニティー精製で得たヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」画分に終濃度１０　ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ　（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）を加えて還元した後、終濃度５５　ｍＭ　ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ　（Ｗａｋｏ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を加えアルキル化反応を行った。その後Ｌｙｓｙｌ　Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　（Ｗａｋｏ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を加えて３７　℃で一晩消化、またはＰＮＧａｓｅ　Ｆ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，　Ｂｅｖｅｒｌｙ，　ＭＡ）で３７　℃、２時間糖鎖除去処理を行った後、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｇｒａｄｅ　Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｇｌｕ−Ｃ　（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）を加えて３７　℃で一晩消化した。消化反応液に０．０５　％　ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ　／　Ｈ２Ｏを加えＬＣ／ＥＳＩ　ＭＳ／ＭＳ　（ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔａｎｄｅｍ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）測定の試料とした。ＬＣには逆相クロマトグラフィー担体Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ−２　（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を詰めた自作のエレクトロスプレーニードルをカラムとして用い、ＣａｐＬＣ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｗａｔｅｒｓ，　Ｍｉｌｆｏｒｄ，　ＭＡ）で送液した。溶出溶媒としてＡ液：０．０５　％　ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ　／　Ｈ２Ｏ　、Ｂ液：０．０５　％　ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ　／　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ　を使用し、１時間で０　％から３０　％　までＢ液濃度を直線的に上げるグラジエント溶出を行った。溶出液は直接Ｑ−Ｔｏｆ２　（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，　Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，　ＵＫ）に導入してＥＳＩ　ＭＳ／ＭＳ　測定を行った。
【０５１５】
得られたＭＳスペクトルからヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のペプチドマッピングを行ったところ、Ｌｙｓｙｌ　Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅで消化したサンプルにはヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」に由来するＥＩＥＮＱＬＲＲＴＳＩＱＥＰＴＥＩＳＬＳＳＫＰＲ（アミノ酸残基１９８−２２１）、ＥＩＥＮＱＬＲＲＴＳＩＱＥＰＴＥＩＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲ（１９８−２２４）という２本のペプチドが、ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｇｌｕ−Ｃで消化したサンプルにはＩＳＬＳＳＫＰＲ（２１４−２２１）、ＩＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲ（２１４−２２４）という２本のペプチドが存在した。これらのペプチドのカルボキシル末端はこの２種の酵素の基質認識部位ではない。従ってヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」の血中切断部位としてＡｒｇ２２１とＡｌａ２２２の間およびＡｒｇ２２４とＴｈｒ２２５の間の２ヶ所を確認した。
【０５１６】
実施例１６．　融合アンジオポエチン関連タンパク質４の活性評価
（１）融合タンパク質の調製
配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至１４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末端にグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）が連結している融合タンパク質（以下、「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ」という）を以下に記載する方法に従って調製した。
【０５１７】
まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｃｃｃｇｔｇｃａｇｔｃｃａａｇ−３’（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ用のセンスプライマー。配列表の配列番号５１）；および
５’−　ｃｃｇｃｔｃｇａｇｃｔｇｇｃｔｔｔｇｃａｇａｔｇｃｔｇ−３’（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号５２）を合成した。
【０５１８】
次に、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入したｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ（ｃｌｏｎｅ　４１４９０３９）を鋳型とし、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、上記サンプルを９４℃で３分加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返した後、最後に７２℃で７分間の条件で行なった。
【０５１９】
ＰＣＲで増幅した約３７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化した。ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化してからウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて切断末端の脱リン酸化処理を行ったプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＳＴをコードする遺伝子を含む。アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）にこの断片を挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローンを単離した。このプラスミドクローンをｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎと命名した。
【０５２０】
組換えプラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ、または、挿入断片を含まずＧＳＴのみを発現させるためのコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転換した。形質転換は大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにプラスミドを添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で３０秒間保温し、再び氷上で２分間静置してから、３７℃で１時間振盪培養をすることによって行なった。形質転換後の培養液をアンピシリン添加ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した組換え体のコロニーをピックアップして液体培養し、ＩＰＴＧ誘導による組換えタンパク質の発現を確認した。
【０５２１】
（２）融合タンパク質の調製
１）形質転換大腸菌の培養
プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ、コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換大腸菌をそれぞれ、アンピシリン入りのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１８時間振とう培養した。培養液の一部を新しい培地に添加し、さらに３７℃にて振とう培養を行なった。６００ｎｍでの吸光度が０．５−０．７に達した時に、最終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル・チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加しさらに４時間振とう培養を継続した。
【０５２２】
２）ｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持した大腸菌からの細胞破砕液の調製
コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で形質転換した大腸菌の培養液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理して沈殿した菌体を回収した。回収した菌体を超音波処理用緩衝液（５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ）で懸濁し、懸濁液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理した。沈殿を−８０℃で凍結し、次いで室温にて融解して再度超音処理用緩衝液に懸濁した。懸濁液を氷浴中で超音波破砕器（トミー精工（株）社製ＵＤ−２０１）によって、出力＝５、デューティ＝５０の条件で５分間処理した。超音波処理後の破砕液に最終濃度１％となるようにトリトン　Ｘ−１００を添加し混和し、４℃、１００００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心処理し、上清を回収した。上清はＧＳＴｒａｐカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）中に流した。
【０５２３】
３）ｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを保持する大腸菌からの細胞破砕液の調製
組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎで形質転換した大腸菌の培養液それぞれを、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心処理し、沈殿した菌体を回収した。沈殿した菌体に対して、洗浄用緩衝液（０．５％　トリトン　Ｘ−１００、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）での懸濁、４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の条件での遠心処理、の操作を３回繰り返し、得られた菌体を８Ｍ　尿素溶液に溶解した。この溶液を室温に１時間放置した後、４℃、１３０００ｒｐｍ、３０分間の遠心処理を行ない上清を回収した。得られた上清を透析した。透析は、４Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、２Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で一晩の順で行なった。透析後、４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心し、ＧＳＴｒａｐカラム中に流した。
【０５２４】
４）融合タンパク質の精製
上記の工程を経てＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質（以下、「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ」という）が吸着したＧＳＴカラムにＰＢＳを流してカラム内を洗浄して不純物を除去した。次いで、１０ｍＭ　還元型グルタチオン溶液を流して、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを溶出させた。溶出液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にで分離した後、ゲルをクマシー染色して、タンパク質の存在を確認した。また、溶出液をＰＢＳで４℃、一晩透析した。
【０５２５】
（２）血中中性脂肪濃度上昇活性
上記（１）で精製したＧＳＴおよびＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを、ＰＢＳでタンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌに調整し、それぞれ２匹の１９週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに約３００μｌずつ尾静脈注射により接種した。採血は摂取前と接種３０分後に行なった。ヘマトクリット管で各マウスの眼底より採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍ１５分遠心して血漿を分離し、接種前後における血中中性脂肪濃度を測定した。結果を表９に示した。
【０５２６】
【表９】
2004000101.tif 000128
ＧＳＴ接種マウス群では接種前後で差が認められなかったのに対し、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ接種マウス群では有意に血中中性脂肪濃度の上昇が認められた。
【０５２７】
本実施例の方法において、例えばＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを接種したマウスに、被験物質を投与し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことができる。
【０５２８】
実施例１７．　ＬＰＬ活性阻害効果
（１）ＬＰＬ試料の調製
ラット白色脂肪前駆細胞（ホクドー社より購入）を増殖用培地［１０％　ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）、１００単位／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ　（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭ　オクタン酸および５０ｎＭ　トリヨードチロニンを含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）］の入った細胞培養用フラスコ（培養面積２５ｃｍ２）中で３７℃で２４時間培養した後、培地を分化誘導用培地（１０％　ＦＣＳ、１００単位／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ　（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭ　オクタン酸、５０ｎＭ　トリヨードチロニン、１０μｇ／ｍｌ　インスリンおよび２．５μＭ　デキサメタゾンを含むＤＭＥＭ）に交換し、３７℃でさらに４８時間培養した。その後、脂肪細胞維持培地（１０％　ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１７μＭ　パントテン酸、３３μＭ（＋）−ビオチン、１００μＭ　アスコルビン酸、１μＭオクタン酸、５０ｎＭ　トリヨードチロニンおよび１０μｇ／ｍｌ　インスリンを含むＤＭＥＭ）に交換した。２乃至３日後に１０％　ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ　インスリンおよび１０単位／ｍｌ　ヘパリンナトリウムを含有するＤＭＥＭ培地を２ｍｌ加え、１時間培養した後、この培養上清を回収してＬＰＬ活性の測定に用いた。
【０５２９】
（２）ＬＰＬ活性測定
ＬＰＬ活性の測定法は、文献記載の方法（Ｎｉｌｓｓｏｎ−Ｅｈｌｅ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓｃｈｏｔｚ，　Ｍ．　Ｃ．（１９７６）　Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．　１７，　５３６−５４１）に従った。
【０５３０】
まず、上記１）記載の方法で調製した培養上清１００μｌを等量の基質溶液［２ｍＭ　グリセロール・トリ［９，１０（ｎ）−３Ｈ］オレイン酸（１３１ＫＢｅｑ／μｍｏｌ、アマシャム社製）、０．１８９μｇ／ｍｌ　Ｌ　α−ホスファチジルコリン（シグマ社製）、１４ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、１４０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）非働化ＦＣＳ］と混合し、そこへ実施例１５で得られたＧＳＴまたはＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを加え、３７℃で１２０分間保温した。その後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ　炭酸カリウム・ほう酸緩衝液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメタノール：クロロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：１００（ｖ／ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌した後、３０００×ｇで１５分間遠心分離した。水−メタノール層の３Ｈカウントを液体シンチレーションカウンターにて測定した。ＬＰＬ活性の１単位は、１μｍｏｌの脂肪酸を１分間に生成する活性として定義した。さらに、ＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）を添加したときのＬＰＬ活性を１００％とし、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを添加したときの相対的ＬＰＬ活性を算出した。その結果を表１０に示した。
【０５３１】
【表１０】
2004000101.tif 000129
ＧＳＴ−ＡＲＰ４ＮはＬＰＬの活性を用量依存的に抑制した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
【０５３２】
実施例１８．アンジオポエチン関連タンパク質４とグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼとの融合タンパク質の活性評価
（１）融合タンパク質発現形質転換大腸菌の作製
配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至４０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末端にグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）が連結している融合タンパク質（以下、「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ」という。）を以下に記載する方法に従って調製した。
【０５３３】
まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｃｃｃｇｔｇｃａｇｔｃｃａａｇ−３’（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ用のセンスプライマー。配列表の配列番号５５）；および
５’−　ｃｃｇｃｔｃｇａｇｇｇａｇｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇｃｔｇｃ−３’（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号５６）を合成した。
【０５３４】
次に、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入のｃＤＮＡ（Ｉ．Ｄ．　４１４９０３９）１０ｎｇを鋳型とし、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔｂｒ　ＥＸＴ　ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、上記サンプルを９４℃で３分間加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒の温度サイクル３５回、最後に７２℃で５分間の条件で行なった。
【０５３５】
ＰＣＲでは約１１４０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅した。増幅したＤＮＡ断片を回収し、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化した。ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化してからウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて切断末端の脱リン酸化処理を行ったプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＳＴをコードする遺伝子を含む。アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に、このＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化した、ＤＮＡ断片を挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローンを単離した。このプラスミドクローンをｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌと命名した。
【０５３６】
プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌで大腸菌ＥｐｉｃｕｒｉａｎＣｏｌｉ　ＢＬ２１　ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ　（ＤＥ３）−ＲＩＬ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、または、挿入断片を含まずＧＳＴのみを発現させるためのコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転換した。
【０５３７】
形質転換は１０倍希釈したＸＬ１０−Ｇｏｌｄ　β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ　ｍｉｘ　２ｍｌを大腸菌Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　Ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ　（ＤＥ３）−ＲＩＬのコンピテントセル　１００ｍｌに予め添加し、氷上で２分置きに攪拌しながら１０分間冷却後にプラスミドを添加し、氷上で３０分間静置後、４２℃で２０秒間保温し、再び氷上で２分間静置してから、ＳＯＣ培養液中で３７℃、１時間振盪培養をすることによって行なった。形質転換後の培養液をアンピシリンおよびクロラムフェニコール添加ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した組換え体のコロニーをピックアップして液体培養し、ＩＰＴＧ誘導による組換えタンパク質の発現を確認した。
【０５３８】
一方、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換はコンピテントセルにプラスミドを添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で３０秒間保温し、再び氷上で２分間静置してから、ＳＯＣ培養液中で３７℃、１時間振盪培養をすることによって行なった。形質転換後の培養液をアンピシリン添加ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した組換え体のコロニーをピックアップして液体培養し、ＩＰＴＧ誘導による組換えタンパク質の発現を確認した。
【０５３９】
（２）融合タンパク質の調製
１）形質転換大腸菌の培養
プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４ＦｕｌｌおよびコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換大腸菌をそれぞれ、アンピシリン／クロラムフェニコールおよびアンピシリン入りのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１８時間振とう培養した。培養液の一部を新しい培地に添加し、さらに３７℃にて振とう培養を行なった。６００ｎｍでの吸光度が０．５−０．７に達した時に、最終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル・チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加しさらに４時間振とう培養を継続した。
【０５４０】
２）ｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する大腸菌からの細胞破砕液の調製
コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で形質転換した大腸菌の培養液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理して沈殿した菌体を回収した。回収した菌体を超音波処理用緩衝液（５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ）で懸濁し、懸濁液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理した。沈殿を−８０℃で凍結し、次いで室温にて融解して再度超音処理用緩衝液に懸濁した。懸濁液を氷浴中で超音波破砕器（トミー精工（株）社製ＵＤ−２０１）によって、出力＝５、デューティ＝５０の条件で５分間処理した。超音波処理後の破砕液に最終濃度１％となるようにトリトン　Ｘ−１００を添加し混和し、４℃、１００００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心処理し、上清を回収した。上清はＧＳＴｒａｐカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）中に流した。
【０５４１】
３）ｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを保持する大腸菌からの細胞破砕液の調製
組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌで形質転換した大腸菌の培養液を、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心処理し、沈殿した菌体を回収した。沈殿した菌体に対して、洗浄用緩衝液（０．５％　トリトン　Ｘ−１００、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）での懸濁、４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の条件での遠心処理、の操作を３回繰り返し、得られた菌体を８Ｍ　尿素溶液に溶解した。この溶液を室温に１時間放置した後、４℃、１３０００ｒｐｍ、３０分間の遠心処理を行ない上清を回収した。組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌで形質転換した大腸菌由来の培養液から得られた上清について透析を行なった。透析は、４Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、２Ｍ　尿素溶液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で一晩の順で行なった。透析後、４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心し、上清をＧＳＴｒａｐカラム中に流した。
【０５４２】
４）融合タンパク質の精製
上記の工程を経てＧＳＴ又はＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌが吸着したＧＳＴカラムにＰＢＳを流してカラム内を洗浄して不純物を除去した。次いで、１０ｍＭ　還元型グルタチオン溶液（ｐＨ８．０）を流して、ＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを溶出させた。溶出液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて分離した後、ゲルをクマシー染色して、タンパク質の存在を確認した。また、溶出液をＰＢＳで４℃、一晩透析した。ここで、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換体から精製されたタンパク質がＧＳＴであり、ｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを保持する形質転換体から精製されたタンパク質が、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌである。
【０５４３】
（３）血中中性脂肪濃度上昇活性
上記（２）で得られたＧＳＴおよびＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを、ＰＢＳでタンパク質濃度約０．５ｍｇ／ｍｌに調整した後に、それぞれ２匹の１６週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに１００μｌずつ尾静脈注射により接種した。採血は摂取前と摂取３０分後に行なった。ヘマトクリット管で各マウスの眼底より採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍ、１５分間遠心して血漿を分離し、接種前後における血中中性脂肪（トリアシルグリセロール）濃度を測定した。
【０５４４】
その結果を表１１に示した。ＧＳＴ接種マウス群（表１１の「ＧＳＴ」）では接種前後で差が認められなかったのに対し、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ接種マウス群（表１１の「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ」）では顕著な血中中性脂肪濃度の上昇が認められた。
【０５４５】
本実施例の方法において、例えばＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを接種したマウスに、被験物質を投与し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことができる。
【０５４６】
【表１１】
2004000101.tif 000130
実施例１９．　ＧＳＴ−ＡＲＰ４ＦｕｌｌのＬＰＬ活性阻害効果
実施例１１の（１）の１）記載の方法にしたがって調製した、ラット白色脂肪前駆細胞培養上清１００μｌを等量の基質溶液（２ｍＭ　グリセロール・トリ［９，１０（ｎ）−３Ｈ］オレイン酸（１３１ＫＢｅｑ／μｍｏｌ、アマシャム社製）、０．１８９μｇ／ｍｌ　Ｌ　α−ホスファチジルコリン（シグマ社製）、１４ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、１４０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）非働化ＦＣＳ）と混合し、そこへ実施例１８で得られたＧＳＴ−ＡＲＰ４ＦｕｌｌまたはＧＳＴを加え、３７℃で１２０分間保温した。その後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ炭酸カリウム・ほう酸緩衝液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメタノール：クロロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：１００（ｖ／ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌した後、３０００×ｇで１５分間遠心分離した。水−メタノール層の３Ｈカウントを液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）にて測定した。ＬＰＬ活性の１単位は、１μｍｏｌの脂肪酸を１分間に生成する活性として定義した。さらに、ＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）を添加したときのＬＰＬ活性を１００％とし、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを添加したときの相対的ＬＰＬ活性を算出した。その結果を表１２に示した。
【０５４７】
【表１２】
2004000101.tif 000131
ＧＳＴ−ＡＲＰ４ＦｕｌｌはＬＰＬの活性を用量依存的に抑制した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を有するか否かを調べることができる。
【０５４８】
実施例２０．　マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の解析
ａ）ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡの調製
マウスＢＡＣクローン３５５Ｌ−１（リサーチ・ジェネティクス社より購入）を保持する大腸菌を１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１００ｍｌのＬＢ培地で、３７℃で一晩培養した後、培養液を４ｍｌずつ４個のチューブユニットに分注し、ＤＮＡ自動抽出装置（ＰＩ−５０、クラボウ（株）社製）を用いてＤＮＡを抽出した。さらにこのサンプルを塩化セシウム法によって精製した。
【０５４９】
ｂ）　ＤＮＡの断片化
３０ｎｇ／μｌのＢＡＣ　ＤＮＡ　３００μｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、ソニケーター（ソニファイアーＩＩ　２５０、ブランソン社製）、およびスペシャルマイクロチップ（ブランソン社製）を用いて、ソニケーターの出力調整を１、デューティー・サイクルを「コンスタント」の条件にそれぞれ設定して、ＤＮＡを３秒間、２回ソニケーションし断片化した。ＤＮＡの断片化の度合いは、アガロースゲル電気泳動を行って確認した。
【０５５０】
ｃ）　ＤＮＡ断片の末端修復
上記で断片化されたＤＮＡに、終濃度５ｍＭの塩化マグネシウム、０．０５ｍＭのｄＮＴＰ（宝酒造（株）社製）存在下で１０単位のＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）社製）を加え、２５℃で１５分間保温した。さらに、５単位のクレノウ断片（宝酒造（株）社製）を加え、２５℃で１５分間保温して、断片化ＤＮＡの末端を平滑化した。ＤＮＡを精製後、終濃度２ｍＭのＡＴＰ（宝酒造（株）社製）、１単位のポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造（株）社製）およびポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液（ポリヌクレオチドキナーゼに添付、終濃度：５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　塩化マグネシウム、５ｍＭ　ジチオスレイトール）を加え、３７℃で３０分間保温してＤＮＡ末端をリン酸化した。反応終了後、ＴＥ飽和フェノール／クロロホルムにてポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。
【０５５１】
ｄ）　ショ糖密度勾配遠心
１０％ショ糖溶液は、１０ｍｌの５０％ショ糖溶液、０．２５ｍｌの２０×ＳＳＣおよび０．１ｍｌの０．５Ｍ　エチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」という）を混合し、滅菌水で全量５０ｍｌに調整することにより作製した。３８％ショ糖溶液は、３８ｍｌの５０％ショ糖溶液、０．２５ｍｌの２０×ＳＳＣおよび０．１ｍｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡを混合して、滅菌水で全量５０ｍｌに調整することにより作製した。１３ＰＡチューブ（日立工機（株）社製）に３８％ショ糖溶液を５ｍｌ加え、次いで１０％ショ糖溶液を５ｍｌ静かに加えた後、グラジエントフォーマー（グラジエント・メイト、コスモバイオ（株）社製）を用いて速度（ＳＰＥＥＤ）１０、時間（ＴＩＭＥ）２分３０秒および角度（ＡＮＧＬＥ）８°の条件に設定してショ糖密度勾配を作製した。得られたショ糖密度勾配溶液に上記ｃ）で得られたＤＮＡを加え、１５００００×ｇ、２０℃で１６時間遠心分離した。その後、チューブの下部より注射針（１８Ｇ）を用いて穴を開け、チューブ内液を下層から３００μｌずつ分画して回収した。０．８％　アガロースゲルにて各画分の一部を電気泳動し、約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を含んでいた画分を選択し、エタノール沈殿後に１０μｌのＴＥに溶解した。
【０５５２】
ｅ）　ベクター調製およびライブラリーの作製
上記で得られたＢＡＣ　ＤＮＡ由来の約２．０ｋｂ断片と０．１μｇのｐＵＣ１９　ＤＮＡ／ＳｍａＩ（ファーメンタス社製）をＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。反応液をエレクトロポレーション用コンピテント大腸菌（エレクトロ・マックスＤＨ１０Ｂセル、ギブコ・ビーアールエル社製）に加え、エレクトロポレーション用キュベット（ジーンパルサーキュベット　０．１ｃｍ、バイオラッド社製）に移し、エレクトロポレーション装置（ジーンパルサーＩＩ、バイオラッド社製）を用いて、電圧１．８ｋＶ、電気容量２５μＦ、抵抗２００Ωの条件でエレクトロポレーションした。その後１ｍｌのＳＯＣ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）を加え、３７℃で１時間振とうし、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、終濃度５０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（ギブコ・ビーアールエル社製）および終濃度２５μｇ／ｍｌのＩＰＴＧ（ギブコ・ビーアールエル社製）を含むＬＢ固形培地（１．２％　バクトアガー含有）上に塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
【０５５３】
ｆ）ＤＮＡの調製
上記ｅ）の結果、白色を呈したコロニーを選択し、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢＧ培地（１リットル当たり、トリプトン　１２ｇ、イーストエキストラクト　２４ｇ、リン酸一カリウム　２．３ｇ、リン酸二カリウム　１２．５ｇ、グリセロール　４ｍｌおよび１Ｍ　グルコース　２０ｍｌを含む）１．２ｍｌ／ウェルを入れた培養用マイクロウェルプレート（２．２ｍｌ　ディープ・ウェル・プレート、日本ジェネティクス社製）に１コロニー／ウェルで植菌した。プレートの上面を通気性粘着シート（日本ジェネティクス社製）にてシールした後、プレートミキサーを用いて緩やかに撹拌しながら、３７℃で１６．５時間培養した。その後、培養液を６００μｌずつとって、新しい培養用マイクロウェルプレートに分注し、マイクロプレート用遠心機（４Ｋ１５Ｃ、シグマ社製）を用いて、６０００ｒｐｍ、２０℃にて５分間遠心した。上清を除き、沈殿した菌体からＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡｐｒｅｐ　　９６・ターボ・バイオロボット・キット、Ｑｉａｇｅｎ社製）およびＤＮＡ抽出装置（バイオロボット９６００、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＤＮＡを抽出した。
【０５５４】
ｇ）ヌクレオチド配列解析
シークエンシング用プライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｔｇｔａａａａｃｇａ　ｃｇｇｃｃａｇｔ　−３’（−２１Ｍ１３ｆｏｒｗａｒｄ、配列表の配列番号５７）；および
５’−　ｃａｇｇａａａｃａｇ　ｃｔａｔｇａｃｃ　−３’（Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅ、配列表の配列番号５８）
からなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置にて化学合成した。
【０５５５】
上記ｆ）で得られた各ＤＮＡ　１０μｌに対して、プライマー（−２１Ｍ１３ｆｏｒｗａｒｄまたはＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅ）を３．２ｐｍｏｌ、シークエンシング試薬（ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンスＦＳレディ・リアクション・キット、アプライドバイオシステムズ社製）を８μｌ加え、滅菌水にて全量を２０μｌとした。サーマルサイクラー（ジーンアンプ・ＰＣＲシステム９７００、アプライドバイオシステムズ社製）にてサイクルシークエンス反応を実施（９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分を１サイクルとして２５サイクル）して、得られたサンプルをＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００、アプライドバイオシステムズ社製）に供してヌクレオチド配列を解析した。得られた配列データは、ＤＮＡシークエンスソフト（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｅｓ社製）を用いて編集、整列化された。解析の結果、配列表の配列番号２７に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡが目的のプロモーターＤＮＡとして選択された。マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードする遺伝子の転写開始点（エクソン１の５’末端境界部位）はＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されている最も５’末端側が長いＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）である「ＡＩ１９５５２４」を参照して決定した。すなわち、ＡＩ１９５５２４のヌクレオチド配列のうち、ベクター部分を除いた最初のヌクレオチドを転写開始点と判断し、その位置を「１」と定義した。このようにして、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の転写開始点より５’末端側４１８ｂｐから３’末端側１３２ｂｐまでの領域に相当するヌクレオチド配列からなるＤＮＡが同定された。
【０５５６】
実施例２１．　ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターの構築
ａ）プラスミドｐＧＬ８−３の構築
実施例２０の結果を基に、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードする遺伝子の５’末端側上流域を特異的に増幅するためのＰＣＲプライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ａａｇｇｔａｃｃｇｃ　ｔｇｔｔｔｃｃａｇａ　ｔａａａｃａａａ　−３’　（プライマー１、配列表の配列番号５９）；および
５’−　ｔｃａａａｔｇａｔｇ　ａａａｇｇｔｃｔｇｇ　ａｔｃｃａｃｔｃｔｇ　ｇａｔｇｃ　−３’　（プライマー２、配列表の配列番号６０）
からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ化学合成した。
【０５５７】
上記プライマー（終濃度各０．２μＭ）と、ＬＡ　ＰＣＲキット（宝酒造（株）社製）添付の１０×ＬＡバッファー（Ｍｇ＋）を５μｌ、同じく添付ｄＮＴＰを８μｌ、実施例２０のａ）に記載した方法で精製したＢＡＣクローン３５５Ｌ−１　ＤＮＡ　１μｌおよび滅菌水を加えて４９．５μｌとし、キット添付のＬＡ　Ｔａｑポリメラーゼを０．５μｌ加えて全量を５０μｌとした。サーマルサイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９６００、アプライドバイオシステムズ社製）を使用してＰＣＲを実施した（温度条件：９４℃で２分間加熱してから、次に９８℃で２０秒、６８℃で３分の温度サイクルを３０回繰り返し、４℃に冷却、保存した）。
【０５５８】
このＰＣＲ後の反応液中のＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、滅菌水８０μｌに溶解した。このＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで順次消化した。一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩとＢｇｌＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。
【０５５９】
いくつかのコロニーを少量培養して、培養菌体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサー（モデル３７００、（（株）アプライドバイオシステムズ事業部製）を用いて挿入断片のヌクレオチド配列を解析し、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＧＬ８−３と命名した。プラスミドｐＧＬ８−３は、２００１（平成１３）年６月７日付けで独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６２７が付された。このプラスミドを保有する形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液から、プラスミド抽出精製キット（ウィザード・ピュアフェクション・キット、プロメガ社製））を用いてＤＮＡを回収し、精製した。
【０５６０】
ｂ）プラスミドｐＧＬ１３−１の構築
下記のヌクレオチド配列：
５’−　ａａｇｇｔａｃｃａａ　ｔｔｇｃａｔｃｃａｇ　ａｇｔｇｇａｔｃｃａ　ａ　−３’　（配列表の配列番号６１）；および
５’−　ｔｔｇｇａｔｃｃａｃ　ｔｃｔｇｇａｔｇｃａ　ａｔｔｇｇｔａｃｃｔ　ｔ　−３’　（配列表の配列番号６２）
を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
【０５６１】
上記オリゴヌクレオチド各５μｇを混合してアニーリングさせてから、制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで順次消化した。一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩとＢｇｌＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。
【０５６２】
いくつかのコロニーの培養菌体からプラスミドを抽出してＤＮＡシークエンサー（モデル３７００、（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）を用いてヌクレオチド配列を解析し、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の＋９３乃至＋１０８領域に相当するＤＮＡ（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号５１１乃至５２６）が挿入されたプラスミドｐＧＬ１３−１を取得した。このプラスミドを保有する形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液から、プラスミド抽出精製キット（プロメガ社製）を用いてＤＮＡを回収し、精製した。
【０５６３】
ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）ＤＮＡでも同様にして大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを培養し、プラスミド抽出精製キット（プロメガ社製）を用いてＤＮＡを回収し、精製した。このプラスミドＤＮＡをネガティブコントロールとして使用した。
【０５６４】
実施例２２．　アンジオポエチン関連タンパク質３遺伝子のプロモーター活性実施例２１で単離したＤＮＡのプロモーター活性について評価するため、レポーターアッセイを実施した。すなわち、実施例２１で構築したホタルルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＧＬ８−３またはｐＧＬ１３−１）を、ヒト肝臓由来細胞株ＨｅｐＧ２にトランスフェクションして、ホタルルシフェラーゼ活性の変化を調べた。なお、細胞へのトランスフェクション効率についての各プラスミド間の実験ロット差を補正するための内部標準として、ウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ社製）を用いた。
【０５６５】
まず、ＨｅｐＧ２細胞（大日本製薬（株）社より購入）を、１０％ウシ胎児血清（モアゲート社製）、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１ｍＭのピルビン酸を含むＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）中で、３７℃で５％炭酸ガスのインキュベーター内で培養した。セミコンフルエントになるまで増殖させた大角フラスコ（住友ベークライト社製）に、ＰＢＳ（−）（日水製薬（株）社製）を加えて、セルスクレーパー（住友ベークライト（株）社製）を用いて細胞を掻きとって回収した。その細胞を５×１０５個／ウェルで６穴培養プレート（コーニング社製）に蒔き、一晩培養した。１μｇのｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ８−３、あるいはｐＧＬ１３−１　ＤＮＡと０．０４ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ　ＤＮＡを混合して、滅菌水で全量を５μｌとしてＤＮＡ溶液とした。一方、１００μｌのウシ胎児血清を含まないＭＥＭ培地（その他の成分は上記と同様）に６μｌのトランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１、宝酒造（株）社製）を添加し室温で５分間保温した。この溶液に先に調製したＤＮＡサンプルを添加し、室温で５分間保温した。細胞は血清を含まないＭＥＭ培地（その他の成分は上記と同じ）２ｍｌで２回洗浄し、２ｍｌの同培地に置き換えた。ＤＮＡ溶液を３０μｌ／ウェルずつ３ウェルへ添加して、４時間培養後に２ｍｌ／ウェルの１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地（その他の成分は上記と同じ）へ置き換え３７℃で一晩培養した。培養後、培地を除去して２００μｌ／ウェルの細胞溶解剤（Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社製））に溶解して、細胞抽出液を調製した。そして、そのうちの２０μｌを用いて、デュアル−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（プロメガ社製）を、添付のプロトコールに従って用いることにより、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した（ルミナスＣＴ−９０００Ｄ、ダイアヤトロン社製を使用）。実験結果については、内部標準のウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正したホタルルシフェラーゼ活性として表した。
【０５６６】
その結果、ｐＧＬ８−３を導入したＨｅｐＧ２細胞では、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを導入した細胞に比べて約１９倍のルシフェラーゼ活性が観察されたことから、ｐＧＬ８−３に組み込まれた配列表の配列番号２７に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡにはプロモーターとしての活性が存在することが明らかとなった。一方、ｐＧＬ１３−１を導入した細胞では、ルシフェラーゼ活性がｐＧＬ８−３を導入した細胞の１／１０に低下した。以上の結果より、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至５１０に示されるＤＮＡ、すなわちマウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５’末端側上流−４１８乃至＋９２に相当する領域にプロモーター活性が存在することが明らかとなった。
【０５６７】
本実施例の方法において、例えばｐＧＬ８−３で形質転換したＨｅｐＧ２細胞を被験物質存在下で培養したときのルシフェラーゼ活性を測定することにより、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する物質の試験を行うことができる。このプロモーター活性を阻害する物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となりうる。
【０５６８】
実施例２３．　「アンジオポエチン関連タンパク質４」プロモーター領域の解析
ａ）マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」プロモーター領域の単離
マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」をコードする遺伝子の５’末端側上流域を特異的に増幅するためのＰＣＲプライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｃｇｇｇｇｔａｃｃｇａｇｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｇａａｇｃａａ　−３’（プライマー１、配列表の配列番号６３）；および
５’−　ｃｃｃａａｇｃｔｔｇｃｃｔｔｇｇｇｔｇｃａｇｃａａｃｇｃｔ　−３’（プライマー２、配列表の配列番号６４）
からなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置（アマシャム　バイオサイエンス株式会社）にて化学合成した。
【０５６９】
マウス１２９Ｓｖ（三共株式会社安全性研究所で飼育）由来のゲノムＤＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、上記プライマー（それぞれ３００ｎＭ）、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を１μｌ、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液＃１を１０分の１量）、１ｍＭの塩化マグネシウム、各０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび滅菌水を加えて全量を５０μｌとしＰＣＲを行った。ＰＣＲはサーマルサイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９７００、アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、上記サンプルを９４℃で２分間加熱した後に、９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で３分の温度サイクル３５回、最後に６８℃で３分間保温の条件で行なった。得られたＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製後、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断を行い、１．０％　１×ＴＡＥアガロース電気泳動による目的バンドの分離後、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造（株）社製）、エタノール沈殿によりＤＮＡの回収を行った。
【０５７０】
一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。
いくつかのコロニーを少量培養して、培養菌体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサー（モデル３７００、（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて挿入断片のヌクレオチド配列を解析し、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２６０に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含む約２．９ｋｂの断片が挿入されたプラスミドを得た（ｐＧＬ２−４）。
このプラスミドを保有する形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液から、プラスミド抽出精製キット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いてＤＮＡを回収し、精製した。
【０５７１】
ｂ）ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターｐＧＬ１１−４およびｐＧＬ１２−４の構築
マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」をコードする遺伝子の５’末端側上流域を特異的に増幅するためのＰＣＲプライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
５’−　ｃｇｇｇｇｔａｃｃａｃａａａｇｃｃｔｇｔｇｇｃａｔｔｇｃａ　−３’（プライマー３、配列表の配列番号６５）；および
５’−　ｃｇｇｇｇｔａｃｃｃｔｃｃｃｃｃａｇａａｃｔｃｃａｇｃｔｇ　−３’（プライマー４、配列表の配列番号６６）
からなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置にて化学合成した。
【０５７２】
プラスミドｐＧＬ２−４を鋳型とし、上記プライマー（それぞれ３００ｎＭ）、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を１μｌ、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液＃１を１０分の１量）、１ｍＭの塩化マグネシウム、各０．２ｍＭのｄＮＴＰｓおよび滅菌水を加えて全量を５０μｌとしＰＣＲを行った。ＰＣＲはサーマルサイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９７００、アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、上記サンプルを９４℃で２分間加熱した後に、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒の温度サイクル３０回、最後に６８℃で３分間保温の条件で行なった。得られたＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製後、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断を行い、１．０％　１×ＴＡＥアガロース電気泳動による目的バンドの分離後、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造（株）社製）、エタノール沈殿によりＤＮＡの回収を行った。
【０５７３】
一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニーを少量培養して、培養菌体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサー（モデル３７００、（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて挿入断片のヌクレオチド配列を解析し、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２６０に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＧＬ１１−４と命名し、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１８９乃至２６０に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＧＬ１２−４と命名した。
【０５７４】
このプラスミドを保有する形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液から、プラスミド抽出精製キット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いてＤＮＡを回収し、精製した。
【０５７５】
マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」をコードする遺伝子の転写開始点（エクソン１の５’末端境界部位）はＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されている最も５’末端側が長いＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）である「ＡＫ０１４５６４」を参照して決定した。すなわち、ＡＫ０１４５６４のヌクレオチド配列のうち、ベクター部分を除いた最初のヌクレオチドを転写開始点と判断し、その位置を「１」と定義した。このようにして、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の転写開始点より５’末端側９０ｂｐから３’末端側１７０ｂｐまでの領域に相当するヌクレオチド配列からなるＤＮＡの単離を行った。
【０５７６】
ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）ＤＮＡも同様にして大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを培養し、プラスミド抽出精製キット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いてＤＮＡを回収し、精製した。このプラスミドＤＮＡをネガティブコントロールとして使用した。
【０５７７】
実施例２４．　アンジオポエチン関連タンパク質４遺伝子のプロモーター活性実施例２３で単離したＤＮＡのプロモーター活性について評価するため、レポーターアッセイを実施した。すなわち、実施例２３で構築したホタルルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＧＬ１１−４またはｐＧＬ１２−４）を、サル腎臓由来細胞株ＣＯＳ１にトランスフェクションして、ホタルルシフェラーゼ活性の変化を調べた。なお、細胞へのトランスフェクション効率についての各プラスミド間の実験ロット差を補正するための内部標準として、ウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドｐＲＬ−ＴＫ（プロメガ社製）を用いた。
【０５７８】
まず、ＣＯＳ１細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）より購入）を、１０％ウシ胎児血清（ギブコ・ビーアールエル社製）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製、Ｃａｔｌｏｇ　Ｎｕｍｂｅｒ　１１９６５−０９２）中で、３７℃で５％炭酸ガスのインキュベーター内で培養した。２４穴培養プレート（コーニング社製）でセミコンフルエント（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になるまで増殖させ、０．２μｇのｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ１１−４、あるいはｐＧＬ１２−４　ＤＮＡと６ｎｇのｐＲＬ−ＴＫ　ＤＮＡを混合して、滅菌水で全量を５μｌとしてＤＮＡ溶液とした。一方、２０μｌのウシ胎児血清を含まないＤ−ＭＥＭ培地（その他の成分は上記と同様）に１μｌのトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６、ロシュ社製）を添加し軽く攪拌した後、この溶液に先に調製したＤＮＡサンプルを添加し、室温で１５分間保温した。ＤＮＡ溶液を３ウエルへ添加して、３７℃で二晩培養した。培養後、培地を除去し、２５０μｌ／ウエルの細胞溶解剤（Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社製））に溶解して、細胞抽出液を調製した。そして、そのうちの２０μｌを用いて、デュアル−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（プロメガ社製）を、添付のプロトコールに従って用いることにより、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した（ルミナスＣＴ−９０００Ｄ、ダイアヤトロン社製を使用）。実験結果については、内部標準のウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正したホタルルシフェラーゼ活性とし、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃコントロールを１とした時の相対値で表した。
【０５７９】
その結果、ｐＧＬ１１−４を導入したＣＯＳ１細胞では、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを導入した細胞に比べて約３０倍のルシフェラーゼ活性が観察されたことから、ｐＧＬ１１−４に組み込まれた配列表の配列番号２８に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡにはプロモーターとしての活性が存在することが明らかとなった。一方、ｐＧＬ１２−４を導入した細胞では、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを導入した細胞に対して約１．７倍のルシフェラーゼ活性を示すにとどまった。その結果を表１３に示した。以上の結果より、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２６０に示されるＤＮＡ、すなわちマウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５’末端側上流−９０乃至＋１７０に相当する領域にプロモーター活性が存在することが明らかとなった。なお、表中（Ｍｅａｎ±ＳＤ）はルシフェラーゼ活性の平均値と標準偏差を意味する。
【０５８０】
【表１３】
2004000101.tif 000132
本実施例の方法において、例えばｐＧＬ１１−４で形質転換したＣＯＳ１細胞を被験物質存在下で培養したときのルシフェラーゼ活性を測定することにより、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する物質の試験を行うことができる。このプロモーター活性を阻害する物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となりうる。
【０５８１】
【発明の効果】以上述べたように、本発明により、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列からなる遺伝子が、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患に関与する遺伝的素因の一つであり、従って該遺伝子の発現量を抑制する物質が高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得ることが確かめられた。すなわち、本発明の方法、該方法のうち核酸の検出を行う態様においてプローブまたはプライマーとして使用されるポリヌクレオチドおよび同じくポリペプチドの検出を行う態様において使用される抗体は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の探索に有用である。また、本発明のポリペプチドが血中中性脂肪濃度を上昇させる活性を有すること、該活性は融合タンパク質の形状でも保持され得ること、さらに本発明のポリペプチドがＬＰＬ活性の阻害効果を有すること、および本発明のポリペプチドを用いることにより高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験をイン・ビボ、イン・ビトロのいずれにおいても実施できることが示された。
【０５８２】
さらに、本発明により、プロモーター活性を有する新規ＤＮＡが提供された。本発明のＤＮＡは、「アンジオポエチン関連タンパク質３」または「アンジオポエチン関連タンパク質４」の発現量を抑制する物質を試験するための方法に用いることができるので、新しい作用機作を有する高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の開発に有用である。
【配列表フリーテキスト】
配列番号９：　ポリクローナル抗体を取得するための抗原として使用された合成オリゴペプチド
配列番号１１：　ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のアミノ末端側領域をコードするＤＮＡ
配列番号１２：　ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のアミノ末端側領域をコードするポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号１３：　ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のカルボキシル末端側領域をコードするペプチドのポリペプチドのＤＮＡ配列
配列番号１４：　ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のカルボキシル末端側領域をコードするポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号２５：　ＫｈＡＰ５　ＣＣ／ＨｉｓをコードするＤＮＡ
配列番号２６：　ＫｈＡＰ５　ＣＣ／Ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号４２：　コザックのコンセンサス配列が付加されたＰＣＲプライマー
配列番号４３：　制限酵素ＸｈｏＩの特異的配列が付加されたＰＣＲプライマー配列番号４４：　ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ及びＧＳＴ−Ｃ１の一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲセンスプライマー
配列番号４５：　ＧＳＴ−ＣＣの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号４６：　ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号４７：　ＧＳＴ−Ｃ１の一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号４８：　ヒスチジンタグをコードする配列を挿入するためのオリゴヌクレオチド
配列番号４９：　ヒスチジンタグをコードする配列を挿入するためのオリゴヌクレオチド
配列番号５０：　プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓの部分断片を増幅するためのセンス／アンチセンスプライマー
配列番号５１：　ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲセンスプライマー
配列番号５２：　ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号５５：　ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲセンスプライマー
配列番号５６：　ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌの一部をコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号５７：　シークエンシングプライマー　−２１Ｍ１３ｆｏｒｗａｒｄ
配列番号５８：　シークエンシングプライマー　Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅ
配列番号５９：　ＰＣＲプライマー１
配列番号６０：　ＰＣＲプライマー２
配列番号６１：　プラスミドｐＧＬ１３−１の挿入断片を調製するためのオリゴヌクレオチド
配列番号６２：　プラスミドｐＧＬ１３−１の挿入断片を調製するためのオリゴヌクレオチド
配列番号６３：　制限酵素ＫｐｎＩに特異的な配列を付加したＰＣＲセンスプライマー。
配列番号６４：　制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに特異的な配列を付加したＰＣＲアンチセンスプライマー。
配列番号６５：　制限酵素ＫｐｎＩに特異的な配列を付加したＰＣＲセンスプライマー。
配列番号６６：　制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに特異的な配列を付加したＰＣＲアンチセンスプライマー。
【０５８３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＫＫマウス臓器由来の試料についてのノーザンブロット解析の結果を表す図。
【図２】遺伝子導入ＣＯＳ−１細胞培養上清を試料としたウエスタンブロット解析の結果を表す図。
【図３】遺伝子導入ＨｅＬａ細胞培養上清を試料としたウエスタンブロット解析の結果を表す図。
【図４】組換えアデノウイルスを感染させたＫＫ／Ｓｎｋマウスの末梢血中の中性脂肪濃度測定結果を表す図。
【図５】ＫＫマウスおよび組換えアデノウイルスを感染させたＫＫ／Ｓｎｋマウスの肝臓由来の試料についてのノーザンブロット解析の結果を表す図。
【図６】精製「アンジオポエチン関連タンパク質３」のＥＬＩＳＡによる検量線を表す図。
【図７】「アンジオポエチン関連タンパク質１乃至５」の構造。左側がアミノ末端、右側がカルボキシル末端である。アンジオポエチン関連タンパク質は、アミノ末端から、シグナルペプチド、ヘリックス領域、フィブリノーゲン様領域からなる。
【図８】融合タンパク質のＫＫ／Ｓｎｋマウスにおける血中中性脂肪濃度に及ぼす影響を示した図。
【図９】組換えアデノウイルスを感染させたマウスの血漿を試料としたウエスタンブロット解析の結果を表す図。
【図１０】組換えアデノウイルスを感染させたマウスの末梢血中の中性脂肪濃度測定結果を表す図。
【図１１】ヘパリン結合部位に変異を導入したアンジオポエチン関連タンパク質３の血漿トリグリセリドに対する効果を表す図。