(57)【要約】【課題】  細胞周期の制御は植物育種において重要で、該制御により植物細胞の増殖を改変する技術、さらには植物個体の発生分化を改変する技術およびそれに用いる植物遺伝子の開発が求められている。【解決手段】  植物３Rmyb遺伝子が植物細胞の増殖に必須の因子であることを解明することに成功し、該遺伝子を標的とした植物細胞の増殖を改変する技術および植物個体の発生分化を改変する技術が提供され、改変細胞増殖、発生分化を保持した植物細胞及び植物体が得られ、特定の器官の肥大、雄性不稔またはストレス耐性の改善等、好ましい性質をもつ植物体の開発ができる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する野生型の植物細胞に比べて、植物３Rmybタンパク質の活性が改変されている植物細胞。
【請求項２】
植物細胞が、下記(a)〜(f)のいずれか一に記載のDNAまたは(g)に記載の組換えDNA若しくはベクターを、保持するか或いはそれらにより形質転換された植物細胞である請求項１の植物細胞:
(a)  植物３Rmybタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b)  植物３Rmybタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物３Rmybタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(c)  植物３Rmybタンパク質をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
(d)  DNAであって、植物細胞における発現時に、共抑制効果により、植物３Rmybタンパク質をコードするDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ、該DNAと90％以上の相同性を有するDNA、
(e)  DNAであって、植物細胞における発現時に、RNA干渉効果により、植物３Rmybタンパク質をコードするDNAの発現を抑制させるRNAをコードするDNA、
(f)  植物３Rmybタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
(g)  下記の(i)から(iii)を含む組換えDNAまたはベクター:
(i)   細胞内で転写可能なプロモーター、
(ii)  該プロモーター配列にセンス方向またはアンチセンス方向で結合した前記(a)〜(f)のいずれか一に記載のDNA、
(iii) RNA 分子の転写終結およびポリアデニル化に関するシグナル。
【請求項３】
植物３Rmybタンパク質が、MSA配列を介したＧ２／Ｍ期特異的転写を活性化する転写因子である請求項１または２に記載の植物細胞。
【請求項４】
MSA配列を介したＧ２／Ｍ期特異的転写を活性化する転写因子である植物３Rmybタンパク質が、SILX1KRXRXLX3X4PX2XX5X1RXX5KK（配列番号：94、Xは任意のアミノ酸であり、X1はKまたはRであり、X2はL、IまたはVであり、X3はLまたはVであり、X4はSまたはTであり、X5はDまたはEである）で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質である請求項１または２に記載の植物細胞。
【請求項５】
植物３Rmybタンパク質が、配列番号：32、配列番号：51、配列番号：53、配列番号：75または配列番号76のいずれかのアミノ酸配列である請求項１から４のいずれか一に記載の植物細胞。
【請求項６】
植物３Rmybタンパク質がMSA配列を介したＧ２／Ｍ期特異的転写を抑制する転写因子である請求項１または２に記載の植物細胞。
【請求項７】
MSA配列を介したＧ２／Ｍ期特異的転写を抑制する転写因子である植物３Rmybタンパク質が、SCSSXSX6（配列番号：95、Xは任意のアミノ酸であり、X6はK、R、D、EまたはHである）で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質である請求項１または２に記載の植物細胞。
【請求項８】
植物３Rmybタンパク質が、配列番号：55、配列番号：77または配列番号：78のアミノ酸配列である請求項１、２、６又は７に記載の植物細胞。
【請求項９】
対応する野生型の植物細胞に比べて、植物３Rmybタンパク質の発現量が改変されている請求項１から８のいずれか一に記載の植物細胞。
【請求項１０】
対応する野生型の植物細胞に比べて、細胞増殖が改変されている請求項１から８のいずれか一に記載の植物細胞。
【請求項１１】
請求項１から10のいずれか一に記載の植物細胞を含む植物体。
【請求項１２】
請求項11に記載の植物体の子孫またはクローンである植物体。
【請求項１３】
対応する野生型の植物体に比べて、細胞増殖及び／または発生分化が改変されている請求項11または12に記載の植物体。
【請求項１４】
細胞増殖及び／または発生分化の改変のために用いられる請求項11または12に記載の植物体。
【請求項１５】
対応する野生型タンパク質に比べて、転写活性化能が増大している植物３Rmybタンパク質をコードするDNA。
【請求項１６】
転写活性化能が増大している植物３Rmybタンパク質が、転写活性化能を調節する調節領域の機能が消失していることを特徴とするタンパク質である請求項15に記載のDNA。
【請求項１７】
機能を消失した該調節領域が配列番号：89に記載のアミノ酸配列TPSILKKRHRよりC末端側であることを特徴とする請求項16に記載のDNA。
【請求項１８】
機能を消失した該調節領域が配列番号：90に記載のアミノ酸配列NXXTPXRLWX（Xは任意のアミノ酸を示す）中のWよりC末端側であることを特徴とする請求項16に記載のDNA。
【請求項１９】
機能を消失した該調節領域が配列番号：91に記載のアミノ酸配列PPRFPSXDXPF（Xは任意のアミノ酸を示す）からC末端までの領域であることを特徴とする請求項16に記載のDNA。
【請求項２０】
機能の消失がアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入によって生じたものである植物３Rmybタンパク質をコードする請求項15から19のいずれか一に記載のDNA。
【請求項２１】
機能の消失がアミノ酸の欠失によって生じたものである植物３Rmybタンパク質をコードする請求項15から19のいずれか一に記載のDNA。
【請求項２２】
内在性の植物３Rmybタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質をコードするDNA。
【請求項２３】
植物３RmybのDNA結合領域のアミノ酸配列を含むことを特徴とするタンパク質をコードする請求項22に記載のDNA。
【請求項２４】
下記の(i)から(iii)を含む組換えDNAまたはベクター: 
(i)細胞内で転写可能なプロモーター、
(ii)該プロモーター配列にセンス方向またはアンチセンス方向で結合した請求項15から23のいずれか一に記載のDNA、
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関するシグナル。
【請求項２５】
請求項15から24のいずれか一に記載のDNAまたは組換えDNA若しくはベクターを、保持するか或いはそれらにより形質転換された植物細胞。
【請求項２６】
対応する野生型の植物細胞に比べて、細胞増殖が改変されている請求項25に記載の植物細胞。
【請求項２７】
請求請25に記載の植物細胞を含む植物体。
【請求項２８】
請求項27に記載の植物体の子孫またはクローンである植物体。
【請求項２９】
対応する野生型の植物体に比べて、細胞増殖及び／または発生分化が改変されている請求項27または28に記載の植物体。
【請求項３０】
下記(a)〜(i)のいずれかに記載のDNA:
(a) 配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(b) 配列番号:31に記載の塩基配列からなるDNA、
(c) 配列番号:32に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(d) 配列番号:31に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、それぞれ配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(e) 配列番号:32に記載のアミノ酸配列とスコア（Aligned Score）が60以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであって、それぞれ配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(f) 前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
(g) 前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
(h) DNAであって、植物細胞における発現時に共抑制効果により、前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAと90％以上の相同性を有するDNA、
(i) DNAであって、植物細胞における発現時にRNA干渉効果により、前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAと20塩基以上連続して同一であるDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における細胞増殖の制御及び／又は発生分化の制御法、並びにそのために用いられる分子に関する。さらに本発明は、細胞増殖及び／又は発生分化に関与する遺伝子を制御して作出された植物及びその利用技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、他の真核生物と異なる独特の発生学的特徴を有している。植物細胞は移動しないため、細胞分裂、伸張およびプログラム細胞死が形態形成を決定していると考えられている。茎頂と根端の両極に存在する分裂組織において細胞が増殖し、増殖した細胞が分化しながら、積み重なることによって個体が発生分化し、植物の大きさは個体を形成する細胞の数と細胞の大きさによって規定される。環境条件の変化などに対しても細胞周期を変化させることによって、細胞増殖を改変し、植物個体の大きさを環境に適応させている。また植物個体の分化の場面においても細胞周期の制御が重要である。例えば、根の内鞘細胞では細胞周期の特定の時期（G2期）で細胞が停止しており、この細胞が分裂を開始するか否かによって側根の分化が決定される。また、植物の胚軸においては細胞数が規定されているが、暗所においては細胞周期が変化し、核内倍化（エンドリデュプリケーション）によって細胞の大きさが変化する。
そこで植物の成長、形態、ストレス対応などの課題を総括的に扱う植物育種の新しい方法として、植物の細胞分裂の調節、特に細胞周期を制御する方法が重要と考えられている。
【０００３】
一つの細胞はG1期（ギャップ１）、S期(DNA合成期）、G2期（ギャップ２）、 M期（分裂期）の４つの時期からなる細胞周期と呼ばれる一連の過程を経て、２つの娘細胞に分裂する。この細胞周期のSおよびM期の制御に関連する機構が注目され研究されてきた。このうち M期は有糸分裂期とも呼ばれ S期で複製された染色体が娘細胞に正確に分配される時期である。M期への進入についてはサイクリンBに代表されるサイクリンがCDK(Cyclin dependent kinase)と結合し活性化複合体を形成し、染色体の凝集、核膜の崩壊を促す。そしてM期は、染色体の分配後に細胞質を二分する細胞質分裂と呼ばれている過程を経て終了するが、植物細胞の場合、その特異的な構造体である隔膜形成体（フラグモプラスト）が形成され、細胞質分裂が進行する。この隔膜形成体はキネシン様タンパク質であるNACK1、NACK2によって、その形成を制御されている。
植物細胞のM期への進入から終了に至る過程において重要な機能を示すサイクリンB、NACK1およびNACK2はG2/M期特異的な遺伝子発現パターンを示す。これらの遺伝子の時期特異的な発現はプロモーター領域に存在するM-specific activator (MSA)と呼ばれる特定の制御配列によって行われていることが報告されている(非特許文献１) 。また、これまでに植物特有のCDKであるCDKBや、タンパク質の分解に関わっているE2酵素のうちサイクリン特異的なE2酵素と類似性の高い遺伝子以外に、多くの機能未知の遺伝子がM期特異的な発現パターンを示すことが知られている。プロモーター領域が解析されたこれらの遺伝子にはプロモーターにMSA配列が存在している場合が多く、MSA配列によるG2/M期特異的遺伝子発現制御機構は植物において普遍的に保存されていると考えられている。
【０００４】
MSA配列に結合する因子として、これまでに、タバコよりNtmybA1、NtmybA2、Ntm ybBが同定されている（以下これらの総称としてNtmybを使用する）。Ntmybタンパク質のアミノ酸配列上の大きな特徴として動物のc-myb等に存在する不完全な3反復配列から構成されるmyb DNA結合領域(この領域を有するタンパク質を以下3Rmybと略称する)と高い類似性を示すことが挙げられる。植物ではmyb様DNA結合領域を持つ遺伝子は多数存在するが、ほとんどが2反復、または反復のないmyb領域から構成される。例えばゲノムの解読が終了したシロイヌナズナにおいては全ゲノム中にmyb様 DNA結合領域を持つ遺伝子は100種以上存在するが、前記の3反復から構成されるmyb DNA結合領域(3Rmyb)を示す遺伝子は５種のみであり、植物のmyb様タンパク質を構成するスーパーファミリーの中で一部の特殊な存在であることが知られている(非特許文献２)。
Ntmybの機能については植物細胞内での一過的発現の実験において、レポーター遺伝子の転写調節の実験が行なわれており、NtmybA1とNtmybA2はCYM(ニチニチソウサイクリンＢ)プロモーター、NACK1 プロモーターの転写を活性化すること、逆にNtmybBはこれらの転写を抑制することより、NtmybはMSA配列に結合し、G2/M期特異的発現を示す遺伝子の転写調節因子であることが報告されている(非特許文献３)。しかしながら、これらの報告は、多数の遺伝子が周期的に発現して制御される細胞周期において、細胞周期の一点で一時的に発現したNtmybによるレポーター遺伝子の転写活性化の結果に過ぎない。細胞周期や細胞分裂におけるNtmybの機能を示した例は未だ無い。
【０００５】
これまでに、G2/M期特異的発現を示す遺伝子を形質転換して植物の生育を改変した例は報告されている。例えば、サイクリンＢを異所的に発現する形質転換植物では根の伸張が促進され(非特許文献４)、また、M期の終了に必須な遺伝子であるNACK1の発現を抑制した植物やドミナントネガティブ型のNACK1の形質転換植物では、細胞質分裂が不完全であり、草丈が抑制された(非特許文献５)。しかしながら、これらはM期の進行に関与する個別の遺伝子を利用して細胞増殖を制御する試みであり、MSA配列によって発現が制御されている機能が未知な遺伝子も含むG2/M期特異的遺伝子を一括して発現制御した形質転換植物は報告されていない。
Ntmybはc-mybと相同性の高いmyb DNA結合領域を有す。c-mybはタンパク質中に存在するEVESモチーフがmyb DNA 結合領域と結合し、転写能が不活性な状態にあるが、EVESモチーフがプロテインキナーゼによりリン酸化を受けることでタンパク質内の立体構造が変化し、コアクティベーターであるP100がmyb DNA結合領域に結合可能となり、転写能が活性化すると考えれている(非特許文献６)。Ntmybはmyb DNA結合領域以外ではc-mybと類似性は認められず、EVESモチーフ等の制御配列も保存されていないことより、c-mybタンパク質の転写活性化能の調節機構とNtmybの調節機構は異なると考えられる。これまでに、Ntmybの転写活性化能力を調節する領域の存在は報告されていない。
これまでに植物の3Rmybで全長をコードするDNAの報告は双子葉植物であるタバコ、シロイヌナズナのみであり、単子葉植物においては全長3Rmybの報告例は無い。このことより、MSA配列と3RmybによるG2/M期特異的遺伝子発現制御機構が単子葉植物と双子葉植物で保存されているかについて明らかにされた例は無い。
【０００６】
多くが２倍体の動物とは異なり、植物では様々な倍数性を示す例が広く知られている。コムギ属では６倍体であり、キク属では10倍体となっている。これらの倍数性を示す植物は一般的に農業上、有用な形質を示す場合が多く倍数性植物の作出は一つの育種手段として用いられている。これまでの、倍数体の作出技術としてはコルヒチン処理が広く用いられてきた。植物の種子や幼植物、あるいは器官の組織培養細胞にコルヒチン処理を行い、その後植物体を再生することによって選抜されてきた。DNA複製を終え倍数化した細胞がコルヒチンによって紡錘糸形成を阻害され、分裂期をスキップし倍数化した細胞を得ることが出来る。しかし、コルヒチン処理を行う器官や処理時期の検討が必要であり、全ての植物で容易に実施できるものではない。
【０００７】
【非特許文献１】Ito et al., Plant Cell, 10:331(1998)
【非特許文献２】Stracke ら、Curr. Opin. Plant Biol. 4:447.(2001)
【非特許文献３】Ito et al., Plant Cell, 13:1891(2001)
【非特許文献４】Doerner et al., Nature, 380：520 (1996)
【非特許文献５】Nishihama et al., Cell, 109:87(2002)
【非特許文献６】Dash et al., Genes Dev., 10:1858(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のとおり、植物育種において細胞周期の制御は重要であることから、本発明は、植物細胞の増殖を改変する新規な技術を提供することを課題としている。即ち、本発明は、植物細胞の増殖を改変することにより、植物個体の発生分化を改変する技術およびそれに用いる植物遺伝子を提供することを課題としている。
また、本発明は、植物の３Rmyb遺伝子の機能を飛躍的に改変する方法、および機能が改変された新規な３Rmybタンパク分子を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意検討を行い植物３Rmyb遺伝子が植物細胞の増殖に必須の因子であることを解明し、該遺伝子を標的とした植物細胞の増殖を改変する技術および植物個体の発生分化を改変する技術を完成した。また、これらの技術は広範な植物に応用できる技術であることを見出した。
即ち、植物３Rmybタンパク質の活性が改変された植物細胞や植物体を作出し、これらの植物細胞や植物体において、細胞増殖および／または発生分化が改変されていることを明らかにした。
また、特定のアミノ酸配列を有する植物３Rmyb（NtmybA2などに代表される）は細胞周期および細胞分裂に関して正の制御因子であること、一方これらとは異なるアミノ酸配列を有する植物３Rmyb（NtmybBに代表される）は細胞周期および細胞分裂に関して負の制御因子であることを、前記の植物３Rmybタンパク質の活性が改変された植物細胞や植物体を用いて初めて明らかにした。
また、本発明者らは、転写因子である植物３Rmybタンパク質の変異体を新たに作出し、その機能が改変されていることを見出した。それらの変異体を用いて植物細胞や植物体内の植物３Rmybタンパク質の活性が改変されることを見出した。即ち、植物３Rmybタンパク質のアミノ酸配列中に、下流遺伝子を転写する活性を調節する領域を見出し、転写活性化能を改変した分子を作出することに成功した。転写活性化能が飛躍的に向上した植物３Rmybタンパク質変異体や、植物３Rmyb遺伝子の転写産物に対してドミナントネガティブに機能する分子の作出に成功した。
また本発明者らは、単子葉植物であるイネより、新規な植物3Rmyb遺伝子であるOs3RmybA1タンパク質をコードするDNAを単離し、Os3RmybA1タンパク質がタバコ3Rmybタンパク質であるNtmybA2タンパク質と同等の機能を示すことを見出した。
【００１０】
以上の知見に基づき本発明は完成されたものである。
即ち、本発明は、植物３Rmyb遺伝子を標的とした植物における細胞増殖の制御、及び／又は植物個体の発生分化の制御、植物の細胞分裂に関わるOs３RmybA1遺伝子、それらの類似遺伝子およびこれら遺伝子がコードするタンパク質に関する。
本発明において、あるアミノ酸またはアミノ酸配列との類似性を示すスコア（Aligned Score）とは、CLUSTALWプログラム(http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/clustalw-j.html)を使用し、アミノ酸配列を比較した結果において同一または類似なアミノ酸の割合を指す。更に、前記アミノ酸配列の比較は、対象となるアミノ酸配列を最適な形で並べて行われる。以下の説明中、特に断らない場合、二つのアミノ酸配列を最適な形で並べて行われたことを示す。パラメーターはデフォルトである、OUTPUT=clustal、OUTORDER=aliged、MATRIX=blosum、GAPDIST=8、MAXDIV=40、ENDGAPS=OFF、NOPGAPS=OFF、NOHGAPS=OFFで行なった。
【００１１】
より具体的には、本発明は、次なるものを提供するものである。
（１）対応する野生型の植物細胞に比べて、植物３Rmybタンパク質の活性が改変されている植物細胞。
（２）植物細胞が、下記(a)〜(f)のいずれか一に記載のDNAまたは(g)に記載の組換えDNA若しくはベクターを、保持するか或いはそれらにより形質転換された植物細胞である（１）の植物細胞:
(a) 植物３Rmybタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b) 植物３Rmybタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物３Rmybタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(c) 植物の３Rmybタンパク質をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
(d) DNA であって、植物細胞における発現時に、共抑制効果により、植物の３Rmybタンパク質をコードするDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ、該DNAと90％以上の相同性を有するDNA、
(e) DNA であって、植物細胞における発現時に、RNA干渉効果により、植物の３Rmybタンパク質をコードするDNAの発現を抑制させるRNAをコードするDNA、
(f) 植物３Rmybタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
(g) 下記の(i)から(iii)を含む組換えDNAまたはベクター:
(i)細胞内で転写可能なプロモーター、
(ii)該プロモーター配列にセンス方向またはアンチセンス方向で結合した前記(a)〜(f)のいずれか一に記載のDNA、
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関するシグナル。
（３）植物３Rmybタンパク質が、MSA配列を介したＧ２／Ｍ期特異的転写を活性化する転写因子である（１）または（２）に記載の植物細胞。
（４）MSA配列を介したＧ２／Ｍ期特異的転写を活性化する転写因子である植物３Rmybタンパク質が、SILX1KRXRXLX3X4PX2XX5X1RXX5KK（配列番号：94、Xは任意のアミノ酸であり、X1はKまたはRであり、X2はL、IまたはVであり、X3はLまたはVであり、X4はSまたはTであり、X5はDまたはEである）で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質である（１）または（２）に記載の植物細胞。
（５）植物３Rmybタンパク質が、配列番号：32、配列番号：51、配列番号：53、配列番号：75または配列番号76のいずれかのアミノ酸配列である（１）から（４）のいずれか一に記載の植物細胞。
【００１２】
（６）植物３Rmybタンパク質がMSA配列を介したＧ２／Ｍ期特異的転写を抑制する転写因子である（１）または（２）に記載の植物細胞。
（７）MSA配列を介したＧ２／Ｍ期特異的転写を抑制する転写因子である植物３Rmybタンパク質が、SCSSXSX6（配列番号：95、Xは任意のアミノ酸であり、X6はK、R、D、EまたはHである）で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質である（１）または（２）に記載の植物細胞。
（８）植物３Rmybタンパク質が、配列番号：55、配列番号：77または配列番号：78のアミノ酸配列である（１）、（２）、（６）または（７）に記載の植物細胞。
（９）対応する野生型の植物細胞に比べて、植物３Rmybタンパク質の発現量が改変されている（１）から（８）のいずれか一に記載の植物細胞。
（10）対応する野生型の植物細胞に比べて、細胞増殖が改変されている（１）から（８）のいずれか一に記載の植物細胞。
（11）前記（１）から（10）のいずれか一に記載の植物細胞を含む植物体。
（12）前記（11） に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである植物体。
（13）対応する野生型の植物体に比べて、細胞増殖及び／または発生分化が改変されている（11）または（12）に記載の植物体。
（14）細胞増殖及び／または発生分化の改変のために用いられる（11）または（12）に記載の植物体。
（15）対応する野生型タンパク質に比べて、転写活性化能が増大している植物３Rmybタンパク質をコードするDNA。
（16）転写活性化能が増大している植物３Rmybタンパク質が、転写活性化能を調節する調節領域の機能が消失していることを特徴とするタンパク質である（15）に記載のDNA。
（17）機能を消失した該調節領域が配列番号：89に記載のアミノ酸配列TPSILKKRHRよりC末端側であることを特徴とする（16）に記載のDNA。
（18）機能を消失した該調節領域が配列番号：90に記載のアミノ酸配列NXXTPXRLWX（Xは任意のアミノ酸を示す）中のWよりC末端側であることを特徴とする（16）に記載のDNA。
【００１３】
（19）機能を消失した該調節領域が配列番号：91に記載のアミノ酸配列PPRFPSXDXPF（Xは任意のアミノ酸を示す）からC末端までの領域であることを特徴とする植物３Rmybタンパク質をコードする（16）に記載のDNA。
（20）機能の消失がアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入によって生じたものである植物３Rmybタンパク質をコードする（15）から（19）のいずれか一に記載のDNA。
（21）機能の消失がアミノ酸の欠失によって生じたものである植物３Rmybタンパク質をコードする（15）から（19）のいずれか一に記載のDNA。
（22）内在性の植物３Rmybタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質をコードするDNA。
（23）植物３RmybのDNA結合領域のアミノ酸配列を含むことを特徴とするタンパク質をコードする（22）に記載のDNA。
（24）下記の(i)から(iii)を含む組換えDNAまたはベクター: 
(i)細胞内で転写可能なプロモーター、
(ii)該プロモーター配列にセンス方向またはアンチセンス方向で結合した（15）から（23）のいずれか一に記載のDNA、
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関するシグナル。
（25）前記（15）から（24）のいずれか一に記載のDNAまたは組換えDNA若しくはベクターを、保持するか或いはそれらにより形質転換された植物細胞。
（26）対応する野生型の植物細胞に比べて、細胞増殖が改変されている（25）に記載の植物細胞。
（27）前記（25）に記載の植物細胞を含む植物体。
（28）前記（27）に記載の植物体の子孫またはクローンである植物体。
（29）対応する野生型の植物体に比べて、細胞増殖及び／または発生分化が改変されている（27）または（28）に記載の植物体。
【００１４】
（30）下記(a)〜(i)のいずれかに記載のDNA:
(a) 配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(b) 配列番号:31に記載の塩基配列からなるDNA、
(c) 配列番号:32に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(d) 配列番号:31に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、それぞれ配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(e) 配列番号:32に記載のアミノ酸配列とスコア（Aligned Score）が60以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであって、それぞれ配列番号:31に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(f)前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
(g) 前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
(h) DNAであって、植物細胞における発現時に共抑制効果により、前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAと90％以上の相同性を有するDNA、
(i) DNAであって、植物細胞における発現時にRNA干渉効果により、前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ前記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAと20塩基以上連続して同一であるDNA。
【００１５】
本発明において、植物３Rmybタンパク質とは、c-myb様myb領域が不完全に3反復するDNA結合領域を含むアミノ酸配列を含むことを特徴とするタンパク質であり、望ましくは、ヒトc-mybタンパク質のmyb DNA結合領域(配列番号：88の43番目から192番目までのアミノ酸配列)のアミノ酸配列と比較した場合にアミノ酸配列の類似性を示すスコア(Aligned Score) が60以上のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、さらに望ましくはc-myb様myb DNA結合領域に保存されている配列番号：92に記載のアミノ酸配列であるW[S,T]XXE[D,E]XX[L,I,V](本配列中でXは任意のアミノ酸を、[]はその中のいずれか一つのアミノ酸が選択されることを示す)が、間に任意の42アミノ酸を挟み、３反復しているアミノ酸配列を含むタンパク質である。より望ましくは配列番号：93に記載されている以下の150アミノ酸で示される配列WTXEEDXXLXXXVXXUXGX7XWKXIAXXXXXROX5JQCLHRWQKVLXPXLJKGXWOXEEDXXJXXXJXX7XGXXKWSXJOXXXXGRIGKQCRERWUNHLXPXIXX7XXWTXXEX5XXLXXXHXXXGNX7WAEJXX7XLXGX7ODNOIKNXWXSOXKKX7(本配列中でXは任意のアミノ酸、JはI、V、Lのいずれか一つのアミノ酸、OはG、S、T、C、Aのいずれか一つのアミノ酸、X7はK、R、Hのいずれか一つのアミノ酸、UはH、W、Y、Fのいずれか一つのアミノ酸、X5はD、Eのいずれか一つのアミノ酸であることを示している。)、を含むタンパク質である。さらに望ましくは、前記150アミノ酸で示される配列が、WTXEEDXXLXX[A,V]VXX[F,Y]XG[K,R][N,S,R]WK[K,R,N]IAXXXXXR[S,T][D,E][V,L]QCLHRWQKVL[N,D,H]P[D,E,N]L[V,I]KG[P,S,A]W[S,T]XEED[D,E,N]X[I,L]X[E,D,Q][L,M][V,I]X[K,R][Y,N,L]G[P,A,C]XKWSX[I,V][A,S]XX[L,M][P,A]GRIGKQCRERW[H,Y]NHL[D,N]PXI[K,N,R][K,R][D,E,N][A,P]WTX[E,Q]E[E,D]XXL[I,M,C]X[A,S,Y]H[Q,R]X[N,Y,H]GN[K,R]WAE[I,L]X[K,R]XL[P,H]G[R,K][S,T]DN[S,A,G]IKN[H,L]W[H,N]S[S,T][L,V,M]KK[K,R](本配列中でXは任意のアミノ酸、[]はその中のいずれか一つのアミノ酸が選択されることを示し、例えば、[K,R]の場合では、K又はRのいずれか一つのアミノ酸であることを示す)であるタンパク質である。さらにより望ましい植物３Ｒmybタンパク質として配列番号：32、配列番号：51、配列番号：53、配列番号：55、配列番号：75、配列番号76、配列番号77または配列番号78のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質が挙げられる。またさらにより望ましい植物３Rmybタンパク質としては、配列番号：32、配列番号：51、配列番号：53、配列番号：55、のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質が挙げられる。したがって本発明は以下のものも提供する。
【００１６】
（１）  下記(a)〜(f)のいずれか一に記載のDNA、または(g)に記載の組換えDNAまたはベクターを保持する形質転換細胞: 
(a)  配列番号:31、配列番号：50、配列番号：52、配列番号：54のいずれかに記載のDNA、
(b)  配列番号:31 、配列番号：50、配列番号：52、配列番号：54のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
(c)  配列番号：31、配列番号：50、配列番号：52、配列番号：54のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
(d)  DNAであって、植物細胞における発現時に、共抑制効果により、配列番号:31、配列番号：50、配列番号：52、配列番号：54のいずれかに記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、且つ配列番号：31、配列番号：50、配列番号：52、配列番号：54のいずれかに記載のDNAと90％以上の相同性を有するDNA、
(e)  DNAであって、植物細胞における発現時に、RNA干渉効果により、配列番号：31、配列番号：50、配列番号：52、配列番号：54のいずれかに記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ、配列番号：31、配列番号：50、配列番号：52、配列番号：54のいずれかに記載のDNAと20塩基以上連続して同一であるDNA、
(f)  DNAであって、植物細胞における内在性の配列番号：31、配列番号：50、配列番号：52、配列番号：54のいずれかに記載のDNAがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質をコードするDNA、
(g)  下記の(i)から(iii)のいずれかに記載の組換えDNAまたはベクター: 
(i)細胞内で転写可能なプロモーター、
(ii)該プロモーター配列にセンス方向またはアンチセンス方向で結合した(a)〜(f)のいずれか一に記載のDNA、
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関するシグナル。
（２）  （１）の(a)〜(f)のいずれか一に記載のDNA、または（１）の(g)に記載の組換えDNAまたはベクターを保持する形質転換植物細胞。
【００１７】
（３）  植物細胞の増殖改変のために用いるものであることを特徴とする（２）に記載の形質転換植物細胞。
（４）  植物細胞の増殖が改変されている（２）に記載の形質転換植物細胞。
（５）  （２）〜（４）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（６）  （５）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体。  （７）  植物細胞の増殖が改変されている（５）または（６）に記載の形質転換植物体。
（８）  植物個体の発生分化の改変のために用いるものであることを特徴とする（５）または（６）に記載の形質転換植物。
（９）  植物個体の発生分化が改変されている（５）または（６）に記載の形質転換植物。
（１０）  （２）〜（４）に記載の植物細胞または（５）〜（８）のいずれかに記載の植物体より生産された食品及び/又は飼料組成物。
（１１）  （２）〜（４）に記載の植物細胞または（５）〜（８）のいずれかに記載の植物体より生産された化学品。
（１２）  （２）〜（４）に記載の植物細胞または（５）〜（８）のいずれかに記載の植物体より生産されたタンパク質。
（１３）  （２）〜（４）に記載の植物細胞または（５）〜（８）のいずれかに記載の植物体より生産された核酸。
【００１８】
また、本発明は次なるものを提供する。
（１４）  下記(a)から(e)のいずれかに記載のDNA:
(a) 配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(b) 配列番号:31に記載の塩基配列からなるDNA、
(c) 配列番号:32に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(d) 配列番号:31に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、それぞれ配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(e) 配列番号:32に記載のアミノ酸配列とスコア（Aligned Score）が60以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであって、それぞれ配列番号:32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA。
（１５）  （１４）の(a)から(e)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
（１６）  （１４）の(a)から(e)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
（１７）  DNAであって、植物細胞における発現時に、共抑制効果により、（１４）の(a)から(e)のいずれかに記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ、（１４）の(a)から(e)のいずれかに記載のDNAと90％以上の相同性を有するDNA。
（１８）  DNAであって、植物細胞における発現時に、RNA干渉効果により、（１４）の(a)から(e)のいずれかに記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ、（１４）の(a)から(e)のいずれかに記載のDNAと20塩基以上連続して同一であるDNA。
（１９）  DNAであって、植物細胞における内在性の（１４）の(a)から(e)のいずれかに記載のDNAがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質をコードするDNA。
（２０）  植物の細胞増殖の改変、および／または発生分化の改変のために用いるものであることを特徴とする（１４）〜（１９）のいずれか一に記載のDNA。
【００１９】
（２１）  下記の(i)から(iii)の構成要素を含む組換えDNA又はベクター：
(i) 細胞内で転写可能なプロモーター、
(ii)該プロモーター配列にセンス方向又はアンチセンス方向で結合した（１４）〜（１９）のいずれか一に記載のDNA、
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関するシグナル。
（２２）  （１４）〜（１９）のいずれか一に記載のDNAまたは（２１）に記載の組換えDNA又はベクターを保持する形質転換細胞。
（２３）  （１４）に記載のDNAによりコードされるタンパク質又は部分ペプチド、あるいは植物細胞における内在性の（１４）の(a)〜(e)のいずれかに記載のDNAがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質又はその部分ペプチド。
（２４）  （１４）に記載のDNA又は該DNAを含むベクターを保持する形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞又はその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（２３）に記載のタンパク質の製造方法。
（２５）  （１４）〜（１９）のいずれか一に記載のDNAまたは（２１）に記載の組換えDNA又はベクターを保持する形質転換植物細胞。
（２６）  植物細胞の増殖改変のために用いるものであることを特徴とする（２５）に記載の形質転換植物細胞。
（２７）  植物細胞の増殖が改変されている（２５）に記載の形質転換植物細胞。
（２８）  （２５）〜（２７）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（２９）  （２８）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体。
（３０）  植物細胞の増殖が改変されている（２８）または（２９）に記載の形質転換植物体。
（３１）  植物個体の発生分化の改変のために用いるものであることを特徴とする（２８）または（２９）に記載の形質転換植物体。
（３２）  植物個体の発生分化が改変されている（２８）または（２９）に記載の形質転換植物体。
（３３）  （２５）〜（２７）に記載の植物細胞または（２８）〜（３２）のいずれかに記載の植物体より生産された食品及び/又は飼料組成物。
（３４）  （２５）〜（２７）に記載の植物細胞または（２８）〜（３２）のいずれかに記載の植物体より生産された化学品。
（３５）  （２５）〜（２７）に記載の植物細胞または（２８）〜（３２）のいずれかに記載の植物体より生産されたタンパク質。
（３６）  （２５）〜（２７）に記載の植物細胞または（２８）〜（３２）のいずれかに記載の植物体より生産された核酸。
（３７）  （１４）の(a)〜(e)にいずれかに記載のDNAの転写産物。
（３８）  （３７）に記載の転写産物の量を測定する方法。
（３９）  複数の検体中の（３７）に記載の転写産物の量を相対的に比較する方法。
（４０）  （１４）に記載のDNAにコードされるタンパク質の量を測定する方法。
（４１）  複数の検体中の（１４）に記載のDNAにコードされるタンパク質の量を相対的に比較する方法。
【００２０】
本発明者はNtmybA2タンパク質のC末端領域が転写活性化能を負に調節する領域であること、NtmybA2タンパク質の中程に転写を活性化する領域が存在することを見出した。前述より、本発明者はNtmybA2タンパク質の機能を改変し、転写活性化能が上昇したNtmybA2変異体、転写活性化能が減少したNtmybA2変異体、すなわちドミナントネガティブとして機能するNtmybA2変異体の作出に成功した。
本発明は、また、次なるものを提供する。
（４２）  配列番号：５３で示されるNtmybA2タンパク質において転写活性化能を調節する調節領域の機能を消失した分子のアミノ酸配列をコードするDNA。
（４３）  機能を消失した該調節領域が705〜1042番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（４２）のDNA。
（４４）  機能を消失した該調節領域が631〜1042番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（４２）のDNA。
（４５）  機能が消失した該調節領域が569〜1042番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（４２）のDNA。
（４６）  機能が消失した該調節領域が413〜1042番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（４２）のDNA。
（４７）  機能が消失した該調節領域が243〜1042番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（４２）のDNA。
（４８）  機能が消失した該調節領域が188〜1042番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（４２）のDNA。
（４９）  該調節領域の機能の消失が、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入によって生じた分子である（４２）から（４８）に記載のDNA。
（５０）  該調節領域の機能の消失が、アミノ酸の欠失によって生じた分子である（４２）から（４８）に記載のDNA。
（５１）  配列番号：５３で示されるNtmybA2タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５３で示されるアミノ酸配列の1〜704番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（５２）  配列番号：５３で示されるNtmybA2タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５３で示されるアミノ酸配列の1〜630番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（５３）  配列番号：５３で示されるNtmybA2タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５３で示されるアミノ酸配列の1〜568番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（５４）  配列番号：５３で示されるNtmybA2タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５３で示されるアミノ酸配列の1〜412番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（５５）  配列番号：５３で示されるNtmybA2タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５３で示されるアミノ酸配列の1〜242番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（５６）  配列番号：５３で示されるNtmybA2タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５３で示されるアミノ酸配列の1〜187番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（５７）  配列番号：５１で示されるNtmybA１タンパク質において転写活性化能を調節する調節領域の機能を消失した分子のアミノ酸配列をコードするDNA。
【００２１】
（５８）  機能を消失した該調節領域が715〜1003番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（５７）のDNA。
（５９）  機能を消失した該調節領域が641〜1003番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（５７）のDNA。
（６０）  機能が消失した該調節領域が579〜1003番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（５７）のDNA。
（６１）  機能が消失した該調節領域が459〜1003番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（５７）のDNA。
（６２）  機能が消失した該調節領域が299〜1003番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（５７）のDNA。
（６３）  機能が消失した該調節領域が186〜1003番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（５７）のDNA。
（６４）  該調節領域の機能の消失が、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入によって生じた分子である（５７）から（６３）に記載のDNA。
（６５）  該調節領域の機能の消失が、アミノ酸の欠失によって生じた分子である（５７）から（６３）に記載のDNA。
（６６）  配列番号：５1で示されるNtmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５1で示されるアミノ酸配列の1〜714番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（６７）  配列番号：５1で示されるNtmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５1で示されるアミノ酸配列の1〜640番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（６８）  配列番号：５1で示されるNtmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５1で示されるアミノ酸配列の1〜578番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（６９）  配列番号：５1で示されるNtmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５1で示されるアミノ酸配列の1〜458番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（７０）  配列番号：５1で示されるNtmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５1で示されるアミノ酸配列の1〜298番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（７１）  配列番号：５1で示されるNtmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：５1で示されるアミノ酸配列の1〜185番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（７２）  配列番号：32で示されるOs3RmybA1タンパク質において転写活性化能を調節する調節領域の機能を消失した分子のアミノ酸配列をコードするDNA。
（７３）  機能を消失した該調節領域が709〜993番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（７２）のDNA。
（７４）  機能を消失した該調節領域が635〜993番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（７２）のDNA。
（７５）  機能が消失した該調節領域が575〜993番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（７２）のDNA。
（７６）  機能が消失した該調節領域が426〜993番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（７２）のDNA。
（７７）  機能が消失した該調節領域が257〜993番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（７２）のDNA。
（７８）  機能が消失した該調節領域が203〜993番目までのアミノ酸の領域である分子のアミノ酸配列をコードする（７２）のDNA。
（７９）  該調節領域の機能の消失が、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入によって生じた分子である（７２）から（７８）に記載のDNA。
【００２２】
（８０）  該調節領域の機能の消失が、アミノ酸の欠失によって生じた分子である（７２）から（７８）に記載のDNA。
（８１）  配列番号：32で示されるOs3RmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：32で示されるアミノ酸配列の1〜708番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（８２）  配列番号：32で示されるOs3RmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：32で示されるアミノ酸配列の1〜634番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（８３）  配列番号：32で示されるOs3RmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：32で示されるアミノ酸配列の1〜574番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（８４）  配列番号：32で示されるOs3RmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：32で示されるアミノ酸配列の1〜425番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（８５）  配列番号：32で示されるOs3RmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：32で示されるアミノ酸配列の1〜256番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（８６）  配列番号：32で示されるOs3RmybA1タンパク質の機能が改変された分子としての、配列番号：32で示されるアミノ酸配列の1〜202番目のアミノ酸配列をコードするDNA。
（８７）  下記の(i)から(iii)のいずれかに記載の組換えDNAまたはベクター: 
(i)細胞内で転写可能なプロモーター、
(ii)該プロモーター配列にセンス方向で結合した（４２）から（８６）のいずれか一に記載のDNA、
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関するシグナル。
（８８）  （４２）から（８６）に記載のDNA、または（８７）に記載の組換えDNAまたはベクターを保持する形質転換細胞。
（８９）  植物細胞の増殖改変のために用いるものであることを特徴とする（８８）に記載の形質転換植物細胞。
（９０）  植物細胞の増殖が改変されている（８８）に記載の形質転換植物細胞。
（９１）  （８８）〜（９０）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（９２）  （９１）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体。
（９３）  植物細胞の増殖が改変されている（９１）または（９２）に記載の形質転換植物体。
（９４）  植物個体の発生分化の改変のために用いるものであることを特徴とする（９１）または（９２）に記載の形質転換植物。
（９５）  植物個体の発生分化が改変されている（９１）または（９２）に記載の形質転換植物。
（９６）  （８８）〜（９０）に記載の植物細胞または（９１）〜（９５）のいずれかに記載の植物体より生産された食品及び/又は飼料組成物。
（９７）  （８８）〜（９０）に記載の植物細胞または（９１）〜（９５）のいずれかに記載の植物体より生産された化学品。
（９８）  （８８）〜（９０）に記載の植物細胞または（９１）〜（９５）のいずれかに記載の植物体より生産されたタンパク質。
（９９）  （８８）〜（９０）に記載の植物細胞または（９１）〜（９５）のいずれかに記載の植物体より生産された核酸。
【００２３】
さらに本発明には以下のものも含まれる。
（１００）  下記(a)〜(f)のいずれか一に記載のDNA、または(g)に記載の組み換えDNAまたはベクターを保持する形質転換細胞: 
(a)  植物3Rmybタンパク質をコードするDNA、
(b)  植物3Rmybタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
(c)  植物3Rmybタンパク質をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
(d)  DNAであって、植物細胞における発現時に、共抑制効果により、植物3Rmybタンパク質をコードするDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ、植物3Rmybタンパク質をコードするDNAと90％以上の相同性を有するDNA、
(e)  DNAであって、植物細胞における発現時に、RNA干渉効果により、植物3Rmybタンパク質をコードするDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、かつ、植物3Rmybタンパク質をコードするDNAと20塩基以上連続して同一であるDNA。
(f)  DNAであって、植物細胞における内在性の植物3Rmybタンパク質をコードするDNAがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質をコードするDNA、
(g)  下記の(i)から(iii)のいずれかに記載の組み換えDNAまたはベクター: 
(i)細胞内で転写可能なプロモーター、
(ii)該プロモーター配列にセンス方向またはアンチセンス方向で結合した(a)〜(f)のいずれか一に記載のDNA、
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関するシグナル。
（１０１）  （１００）の(a)〜(f)のいずれか一に記載のDNA、または（１００）の(g)に記載の組み換えDNAまたはベクターを保持する形質転換植物細胞。
（１０２）  植物細胞の増殖改変のために用いるものであることを特徴とする（１０１）に記載の形質転換植物細胞。
（１０３）  植物細胞の増殖が改変されている（１０１）に記載の形質転換植物細胞。
（１０４）  （１０１）〜（１０３）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（１０５）  （１０４）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体。
（１０６）  植物細胞の増殖が改変されている（１０４）または（１０５）に記載の形質転換植物体。
（１０７）  植物個体の発生分化の改変のために用いるものであることを特徴とする（１０４）または（１０５）に記載の形質転換植物体。
（１０８）  植物個体の発生分化が改変されている（１０４）または（１０５）に記載の形質転換植物体。
（１０９）  （１０１）〜（１０３）に記載の植物細胞または（１０４）〜（１０８）のいずれかに記載の植物体より生産された食品及び/又は飼料組成物。
（１１０）  （１０１）〜（１０３）に記載の植物細胞または（１０４）〜（１０８）のいずれかに記載の植物体より生産された化学品。
（１１１）  （１０１）〜（１０３）に記載の植物細胞または（１０４）〜（１０８）のいずれかに記載の植物体より生産されたタンパク質。
（１１２）  （１０１）〜（１０３）に記載の植物細胞または（１０４）〜（１０８）のいずれかに記載の植物体より生産された核酸。
【００２４】
さらに本発明には転写活性化能が増大した植物３Rmybタンパク質が含まれるが、具体的には以下のタンパク質が挙げられる。またこれらのタンパク質をコードするDNAも本発明に含まれる。
（１１３）転写活性化能を調節する調節領域の機能を消失した植物３Rmybタンパク質。  （１１４）機能を消失した該調節領域がC末端より600アミノ酸である（１１３）の植物３Rmybタンパク質。
（１１５）機能を消失した該調節領域がC末端より500アミノ酸である（１１３）の植物３Rmybタンパク質。
（１１６）機能を消失した該調節領域がC末端より420アミノ酸である（１１３）の植物３Rmybタンパク質。
（１１７）機能を消失した該調節領域がC末端より350アミノ酸である（１１３）の植物３Rmybタンパク質。
（１１８）機能を消失した該調節領域がC末端より280アミノ酸である（１１３）の植物３Rmybタンパク質。
望ましくは、以下のタンパク質が挙げられる。
（１１９）機能の消失がアミノ酸の欠失によるものである（１１３）の植物３Rmybタンパク質。
（１２０）アミノ酸の欠失が、C末端より280アミノ酸までの範囲から600アミノ酸までの範囲である（１１３）の植物３Rmybタンパク質。
（１２１）アミノ酸の欠失が、C末端より280アミノ酸までの範囲から500アミノ酸までの範囲である（１１３）の植物３Rmybタンパク質。
より望ましくは、
（１２２）アミノ酸の欠失が、C末端より350アミノ酸までの範囲から420アミノ酸までの範囲である（１１３）の植物３Rmybタンパク質。
（１２３）植物3Rmybタンパク質が配列番号：32、配列番号：51、配列番号：53、配列番号：75、または配列番号：76のいずれかのアミノ酸配列である（１１３）〜（１２２）のいずれか一つに記載のタンパク質。
（１２４）植物3Rmybタンパク質が配列番号：32、配列番号：51、または配列番号：53、のいずれかのアミノ酸配列である（１１３）〜（１２２）のいずれか一つに記載のタンパク質。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により細胞増殖が改変された植物細胞が提供される。またこれらの植物細胞を用いて発生分化が改変された植物体を得ることが可能であり、特定の器官の肥大、雄性不稔またはストレス耐性の改善等、好ましい性質をもつ植物体を得るための新しい方法が提供される。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明では、「遺伝子組換え技術」を利用して所定の核酸を単離・配列決定したり、組換え体を作製したり、所定のペプチドを得ることができる。本明細書中使用できる遺伝子組換え技術としては、当該分野で知られたものが挙げられ、例えば J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人 (1992); "Methods in Enzymology"  シリーズ, Academic Press, New York、例えばR. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (1991); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 216 (Recombinant DNA, Part G), Academic Press, New York (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 217 (Recombinant DNA, Part H) & 218 (Recombinant DNA, Part I), Academic Press, New York (1993); G. M. Attardi et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 260 (Mitochondrial Biogenesis and Genetics, Part A), Academic Press, New York (1995); J. L. Campbell ed., "Methods in Enzymology", Vol. 262 (DNA Replication), Academic Press, New York (1995); G. M. Attardi et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 264 (Mitochondrial Biogenesis and Genetics, Part B), Academic Press, New York (1996); P. M. Conn ed., "Methods in Enzymology", Vol. 302 (Green Fluorescent Protein), Academic Press, New York (1999); S. Weissman ed., "Methods in Enzymology", Vol. 303 (cDNA Preparation and Characterization), Academic Press, New York (1999); J. C. Glorioso et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 306 (Expression of Recombinant Genes in Eukaryotic Systems), Academic Press, New York (1999); M. lan Phillips ed., "Methods in Enzymology", Vol. 313 (Antisense Technology, Part A: General Methods, Methods of Delivery and RNA Studies) & 314 (Antisense Technology, Part B: Applications), Academic Press, New York (1999); J. Thorner et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 326 (Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, Part A: Gene E xpression and Protein Purification), 327 (Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, Part B: Cell Biology and Physiology) & 328 (Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, Part C: Protein-Protein Interactions and Genomics), Academic Press , New York (2000) などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法が挙げられる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる) 。
【００２７】
本発明は植物３Rmybタンパク質の活性が改変されている植物細胞および該植物細胞を含む植物体を提供するが、本発明における植物３Rmybタンパク質の活性の改変には、植物３Rmyb遺伝子の発現の改変または植物３Rmybタンパク質の機能の改変が含まれる。
前記の植物３Rmyb遺伝子の発現の改変とは、該遺伝子の発現を恒常的発現、過剰発現、異所的発現、誘導的発現とすること、または該発現を抑制することを包含し、望ましくは恒常的発現、過剰発現、または該発現を抑制することである。
また、本発明は、植物体内で植物３Rmyb遺伝子の発現を抑制し得る分子を提供する。「植物３Rmyb遺伝子の発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、植物３Rmyb遺伝子の発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNA が植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した (J.R.Ecker およびR.W.Davis, Proc. Natl. Acad. USA. 83:5372(1986))。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNA の発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており (A.R.van der Krolら, Nature 333:866(1988))、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００２８】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNA ポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNA とのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(A) 付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。
【００２９】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNA も、本発明で利用されるアンチセンスDNA に含まれる。使用されるアンチセンスDNA は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3 '側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNA は、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNA の配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNA は、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。配列の相補性は、上記した検索により決定することができる。
アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNA の長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100 塩基以上であり、さらに好ましくは500 塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNA の長さは5kb よりも短く、好ましくは2.5kb よりも短い。
【００３０】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNA を利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA 分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNA を切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNA の部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNA のように400 塩基以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40塩基程度の活性ドメインを有するものもある。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15 のC15 の3'側を切断するが、活性にはU14 が９位のA と塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はC の他にA またはU でも切断されることが示されている (M.Koizumi ら,(1988) FEBS Lett. 228:225) 。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA 配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA 中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA 切断リボザイムを作出することが可能である (M.Koizumi ら,(1988) FEBS Lett. 239:285、M.Koizumi ら,(1989) Nucleic Acids Res. 17:7059) 。例えば、NtmybA2 遺伝子（配列番号:2）のコード領域中には標的となりうる部位が複数存在する。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNA のマイナス鎖に見出される (J.M.Buzayan, Nature, 323:349, 1986) 。このリボザイムも、標的特異的なRNA 切断を起こすように設計できることが示されている (Y.Kikuchi およびN.Sasaki, Nucleic Acids Res., 19:6751(1992))。
【００３１】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35S プロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNA の5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNA からリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である (K.Taira et al., Protein Eng., 3:733(1990); A.M.Dzianott およびJ.J.Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86:4823(1989); C.A.Grosshans およびR.T.Cech, Nucleic Acids Res., 19:3875(1991); K.Taira et al., Nucleic Acids Res., 19 :5125(1991)) 。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる (N.Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 186:1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３２】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNA の形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される (Curr. Biol., 7:R793, 1997; Curr. Biol., 6:810, 1996)。例えば、NtmybA2遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、NtmybA2 遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNA を発現できるように作製したベクターDNA を目的の植物へ形質転換し、得られた植物より生育が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、上記した検索を利用して決定することができる。
【００３３】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を逆位反復に配置したDNA の形質転換によってもたらされるRNA 干渉によっても達成されうる。「RNA 干渉」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を逆位反復に配置したDNA を形質転換により導入すると、外来DNA に由来する二本鎖RNA が発現し、標的遺伝子の発現が抑制される現象のことをいう。RNA 干渉の機構としては、第一段階として標的遺伝子のmRNAと導入配列由来の二本鎖RNA が複合体を形成し会合した配列をプライマーとして相補的なRNA が合成され、第二段階として内在性RNase によってこの複合体が断片化され、第３段階として20-30 塩基対に断片化した二本鎖RNA が二次的なRNA 干渉のシグナルとして機能することによって再び、内在性の標的遺伝子のmRNAを分解すると考えられている。 (Curr. Biol., 7:R793, 1997; Curr. Biol., 6:810, 1996)。例えば、NtmybB遺伝子がRNA 干渉によって抑制された植物体を得るためには、NtmybB遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNA を逆位反復に配置したDNA を発現できるように作製したベクターDNA を目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から生育が促進された植物を選択すればよい。RNA 干渉に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも10塩基以上が連続して同一であり、好ましくは20塩基から100塩基が連続して同一であり、さらに好ましくは50塩基が連続して同一である。またRNA 干渉に用いる遺伝子は、標的遺伝子と少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を有する遺伝子であっても良い。さらにより好ましくは、標的遺伝子と少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を有する遺伝子が逆位反復に配置したものが挙げられる。とりわけ、これらの標的遺伝子と配列の同一性を有する遺伝子がスペーサー配列を挟んで逆位反復に配置されたものが望ましい。配列の同一性は、上記した検索を利用して決定することができる。RNA 干渉に用いる遺伝子の長さとしては、標的遺伝子の全長を使用してもよいが、少なくとも25塩基あれば良く、好ましくは50塩基、より好ましくは100塩基、さらに好ましくは500塩基あれば良い。
また、RNAiは植物ウイルスの感染によっても実現可能である。ゲノムとして一本鎖RNAをもつ植物ウイルスは、その複製過程において二本鎖RNA形態をとる。そこで、植物ウイルスゲノム中に目的遺伝子配列を適当なプロモーターと共に挿入し、この組換えウイルスを植物に感染させた場合、該ウイルスの複製に伴い目的遺伝子配列の二本鎖RNAが生成されることになる。その結果、RNAiの効果を得ることができる（Angell et al., Plant J. 20, 357-362,(1999)）。
【００３４】
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。本発明において「ドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする DNA」とは、該DNA を発現させることによって、植物体が本来持つ本発明の内在性遺伝子がコードするタンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質をコードするDNA のことを指す。対象となるDNA が本発明の内在性遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有するか否かは、上述したように、対象となるDNA が、植物のサイクリンB遺伝子やNACK1遺伝子およびこれらのオルソログの遺伝子の転写量を抑制するか否かにより判定することができる。
ドミナントネガティブ分子よる内在性植物3Rmybタンパク質の機能低下は、NtmybA1タンパク質やNtmybA2タンパク質、Os3RmybA1タンパク質を単離した植物種と異なる植物種に形質転換しても良い。
また、本発明において植物３Rmybタンパク質の活性が改変された植物とは、植物３Rmyb遺伝子の発現またはタンパク質の機能が変化した植物であり、該遺伝子の発現量または発現したタンパク質の機能が野生型と比較して検出可能なレベルで変化している植物が望ましく、発現量の変化とは、恒常的発現、誘導的発現、過剰発現、異所的発現、発現の抑制を含む。このような発現または機能が変化した植物は、形質転換による遺伝子操作法以外に、伝統的な突然変異および選択技術を介して達成してもよい。
【００３５】
また、本発明は、上記本発明のDNA や本発明のDNA の発現あるいは本発明のDNA にコードされるタンパク質の発現を抑制するDNA が挿入された組換えDNA 又はベクターを提供する。該組換えDNA 又はベクターとしては、組換えタンパク質の生産に用いる上記したベクターの他、形質転換植物体作製のために植物細胞内で本発明のDNA あるいは本発明のDNA の発現または本発明のDNAにコードされるタンパク質の発現を抑制するDNA を発現させるためのベクターも含まれる。このような組換えDNA 又はベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」（いずれもClontech社製）、「pTA7001 」、「pTA7002 」(Aoyama ら(1997) Plant J. 11:605) 、「pPZP211」(Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Biol. 25:989(1994)などが挙げられる。
本発明の前記組換えDNA 又はベクターは、本発明のタンパク質を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。本発明において細胞内で発現可能なプロモーターとしては、以下列挙されるものが望ましい。
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Odell et al., Nature, 313:810(1985))、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al., Plant Cell, 3:1155(1991)) 、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al.,Plant Mol. Biol., 23:567(1993))などが挙げられる。
【００３６】
また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al., Plant Mol. Biol., 30:387(1996))やタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター(Ohshima et al., Plant Cell 2:95(1990)) 、低温によって誘導されるイネの「lip19」遺伝子のプロモーター（Aguan et al., Mol. Gen Genet., 240:1(1993)) 、高温によって誘導されるイネの「hsp80」遺伝子と「hsp72」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al., Planta, 193:57(1994)) 、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「rab16」遺伝子のプロモーター（Nundy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1406(1990))、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al., EMBO J., 8:651(1989))、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6624(1987)) などが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「rab16」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。またグルココルチコイドやエストロジェンの処理によって植物内で誘導的遺伝子発現が可能であるシステムを有するベクター系の使用も含有し得る。グルココルチコイド処理によって発現誘導可能なベクターとしてはpTA7001、pTA7002(Aoyama et al., Plant J., 11:605(1997)) や、エストロジェン処理によって発現誘導が可能なベクターとしてはpER10(Zuo et al., Plant J., 24:265(2000)) が挙げられる。また増殖細胞特異的に発現させるためのプロモーターとしては例えばS〜M期に発現するタバコNPK1遺伝子のプロモーター(Nishihama et al., Genes Dev., 15:352(2000))、M期に発現するプロモーターとしてタバコNACK1遺伝子のプロモーター(Nishihama et al., Cell, 109:87(2002))、ニチニチソウCYM遺伝子プロモーター(Ito et al., Plant J.,11:983(1997))、S期に発現するニチニチソウCYS遺伝子プロモーター(Ito et al., Plant J.,11:983(1997))、増殖細胞において細胞周期を通じて発現が認められるシロイヌナズナcdc2a遺伝子のプロモーター(Chung et al., FEBS Lett.,362:215(1995))などが挙げられる。また組織特異的プロモーターの例としては以下の特許文献に見出すことが可能である。
US 5459252およびUS 5633363（根特異的）、US 5097025（（ｉ）種子、（ｉｉ）成熟植物）、US 5391725（（ｉ）葉緑体、（ｉｉ）細胞質ゾル）、US 4886753（根粒）、US 5646333（表皮）、US 5110732（（ｉ）根、（ｉｉ）貯蔵根）、US 5618988（貯蔵器官）、US 5401836およびUS 5792925（根）、US 4943674（果実）、US 5495007（師部）、US 5824857（脈管構造）、前記特許は各々、本明細書に援用される。これらのプロモーターに加え、維管束の前形成層特異的なプロモーターであるシロイヌナズナAtHB8プロモーター(Baima et al. Development 121:4171(1995)) 、茎や根に特異的なシロイヌナズナACL5プロモーター(Hanzawa et al. The EMBO Journal, 19:4248(2000))、地上部に特異的なトマトRBCS3Aプロモーター(Meier et al. Plant Physiol. 107:1105(1995))なども使用することができる。
【００３７】
雄性生殖系の器官または細胞において高い遺伝子発現を示すプロモーターとしてはシロイヌナズナAtNACK2遺伝子プロモーター(PCT/JP02/12268)、シロイヌナズナAVP1遺伝子プロモーター(Mitsuda et al., Plant Mol. Biol, 46:185(2001) )、シロイヌナズナ DAD 1遺伝子プロモーター(Ishiguro et al., Plant Cell, 13:2191(2001))、タバコTA20、TA29遺伝子プロモーター(Goldberg et al., Science, 240:1460(1988))、イネOsg6B 遺伝子プロモーター(Tuchiya et al., Plant Mol. Biol, 26:1737(1994))、トマトLat52 遺伝子プロモーター(Twellr et al., Development, 109:705(1990)) 、タバコg10 遺伝子プロモーター(Rogers et al., Plant Mol. Biol., 45:577(2001)) 、カリフラワーモザイクウイルス 35Sプロモーターに葯特異的遺伝子発現調節配列を挿入した人工的なプロモーター(Ingrid et al., Plant Cell, 4:253(1992))などが挙げられる。
また、本発明は、本発明の前記組換えDNA 又はベクターが導入された形質転換植物細胞を提供する。本発明のベクターが導入される植物細胞には、形質転換植物体作製のための植物細胞が含まれる。植物細胞としては特に制限はなく、知られた植物、例えば栽培植物、有用植物などから選んでそれに適用でき、穀類、豆類、イモ類、種実類、野菜類、果実類として知られた植物、さらには園芸花木樹木などに由来のものを挙げることができる。該植物細胞としては、例えば、ナス科、アブラナ科、イネ科、マメ科、ユリ科、セリ科、ウリ科などのものが挙げられ、好ましくはタバコ、シロイヌナズナ、アブラナ、ダイズ、アズキ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、ゴマ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、ピーマン、キャベツ、ブロッコリー、パセリ、ホウレンソウ、サツマイモ、タロイモ、コンニャク、キャッサバ、ブドウ、リンゴ、モモ、ナシ、カキ、イチゴ、ブルーベリー、プラム、メロン、キュウリ、サトウキビ、ミカン、レモン、オレンジ、オリーブ、綿花などの細胞が挙げられる。本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。植物細胞へのベクターの導入は、例えば、アグロバクテリウムを利用した導入方法 (Hood et al., Transgenic Res., 2:218(1993); Hiei et al., Plant J., 6:271(1994))、エレクトロポレーション法 (Tada et al., Theor. Appl. Genet, 80:475(1990) ) 、ポリエチレングリコール法 (Lazzeri et al., Theor. Appl. Genet, 81:437(1991)) 、パーティクルガン法 (Sanford et al., J. Part. Sci. tech., 5:27(1987))などの方法を用いることが可能であり、当該分野で知られた方法の中から適宜選択して利用することが出来る。
【００３８】
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イネであればFujimuraら (Plant Tissue Culture Lett., 2:74 (1995))の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら (Bio/Technology, 7:581 (1989)) の方法やGorden-Kamm ら (Plant Cell, 2:603 (1990)) が挙げられ、ジャガイモであればVisserら (Theor. Appl. Genet, 78:594 (1989))の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe (Planta, 99:12 (1971)) の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればAkama ら (Plant Cell Reports, 12:7-11 (1992)) の方法が挙げられる。
一旦、ゲノム内に本発明のDNA あるいは本発明のDNA の発現を抑制するDNA が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNA または本発明のDNA の発現を抑制するDNA が導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００３９】
本発明の植物体は、本発明のDNA の発現の調節により、細胞増殖や発生分化が正常な個体と比較して変化しうる。本発明における「細胞増殖の改変」とは、例えば、細胞周期に要する時間の短縮または遅延、細胞周期を構成するG1期、S期、G2期、M期の各期に要する時間の短縮または遅延、細胞周期を構成するG1期、S期、G2期、M期の各期への進入の抑制、細胞周期を構成するG1期、S期、G2期、M期の各期の終了の抑制、細胞周期を構成するG1期、S期、G2期、M期の各期の存在の抑制、細胞の大きさの変化、隔膜形成体が拡大する変化、隔膜形成体の形成の変化、細胞板が拡大する変化、細胞板の形成の変化、細胞分裂回数の変化、細胞中に含まれる核数の変化、または核内のDNA含量の変化を起こすことを包含し、望ましくは、細胞周期に要する時間の短縮または遅延、細胞の大きさの変化、隔膜形成体の形成の変化、細胞板の形成の変化、細胞分裂回数の変化、または核内のDNA含量の変化を起こすことを包含する。本発明において核内のDNA含量の変化とは、倍数性の変化を包含し、望ましくは、倍数性の増加を包含する。また本発明おける「発生分化の改変」とは、例えば、細胞増殖が促進されるために植物体を構成する細胞数が増加すること、細胞増殖が抑制されるために植物体を構成する細胞数が減少すること、細胞増殖が促進されるために植物体の生育速度が促進されること、細胞増殖が抑制されるために植物体の生育速度が抑制されること、植物体の生育速度が促進され花芽を形成するまでの期間が短縮されること、植物体の生育速度が抑制され花芽を形成するまでの期間が延長されること、植物体の生育速度が促進されるが花芽を形成する制御機構には変化が無く大きな植物体において花芽を形成すること、植物体の生育速度が抑制されるが花芽を形成する制御機構には変化が無く小さな植物体において花芽を形成すること、植物体の生育速度が促進され老化するまでの期間が短縮されること、植物体の生育速度が抑制され老化するまでの期間が延長されること、植物体の生育速度が促進されるが老化が開始するまでの制御機構には変化が無く老化が開始するまでに大きな植物体となること、植物体の生育速度が抑制されるが老化が開始するまでの制御機構には変化が無く小さな植物体で老化が開始すること、細胞増殖が促進または抑制されるために組織の形態が変化すること、細胞増殖が促進または抑制されるために組織の大きさが変化すること、細胞増殖が促進または抑制されるために器官の形態が変化すること、細胞増殖が促進または抑制されるために器官の大きさが変化すること、細胞増殖が促進または抑制されるために植物体の形態が変化すること、または細胞増殖が促進または抑制されるために植物体の大きさが変化することを包含し、望ましくは、植物体の生育速度が促進されるが花芽を形成する制御機構には変化が無く大きな植物体において花芽を形成すること、細胞増殖が抑制されるために植物体を構成する細胞数が減少すること、植物体の生育速度が抑制されるが花芽を形成する制御機構には変化が無く小さな植物体において花芽を形成すること、細胞増殖が促進または抑制されるために器官の大きさが変化すること、細胞増殖が促進または抑制されるために植物体の大きさが変化することを包含し、より望��しくは、細胞増殖が促進または抑制されるために植物体の大きさが変化することである。本発明において、細胞増殖が促進または抑制されるために植物体の大きさが変化することとは、細胞増殖が促進されるために植物体が大きくなること、または細胞増殖が抑制されるために植物体が小さくなることである。
【００４０】
本発明において内在性のNtmybA1およびNtmybA2の遺伝子発現量が低下する植物を作出すると、細胞分裂や細胞質分裂が抑制された細胞を伴った生育や増殖が抑制された植物が得られること、内在性のNtmybA2の遺伝子発現量が低下した培養細胞を作出した結果、細胞周期が改変されたことはNtmybA1および、NtmybA2が細胞周期および細胞分裂に関して正の制御因子であることを示すものであり、生育が抑制された植物が作出可能であることを示すものである。
本発明においてNtmybA2を恒常的に発現する形質転換植物や細胞を作出した結果、生育が遅い植物や培養細胞が得られたことは、NtmybA2の異所的な発現により細胞周期が遅延され、生育が抑制された植物が作出可能であることを示すものである。
本発明において内在性NtmybBの遺伝子発現量が低下した形質転換植物や培養細胞では生育や増殖が促進されたことはNtmybBが細胞周期および細胞分裂に関して負の制御因子であることを示すものであり、生育が促進された植物が作出可能であることを示すものである。
本発明においてNtmybBを恒常的に発現する植物では生育が抑制されたことはNtmybBが細胞周期および細胞分裂に関して負の制御因子であることを示すものであり、生育が抑制された植物が作出可能であることを示すものである。
本発明は、サイクリンB遺伝子、NACK関連遺伝子の転写活性化因子であるイネOs3RmybA1遺伝子を提供する。イネより、植物3Rmyb遺伝子であるOs3RmybA1 のcDNAを単離し、その塩基配列を明らかにした。Os3RmybA1のcDNAの塩基配列を配列番号:３１に、この遺伝子がコードするOs3RmybA1 タンパク質のアミノ酸配列を配列番号:３２に示す。
【００４１】
本発明はOs3RmybA1と機能的に同等な単子葉植物の3Rmybタンパク質を提供する。本発明において「同等な機能を有する」または「機能的に同等」とはタンパク質がサイクリンB遺伝子やNACK関連遺伝子の転写活性化因子として機能することを指す。タンパク質がサイクリンB遺伝子やNACK関連遺伝子の転写制御因子であるか否かは、変異株における該タンパク質の発現による機能相補試験や植物細胞内で一過的に発現した該タンパク質による、サイクリンB遺伝子やNACK１遺伝子の転写活性化により決定することができる。
本発明で特徴付けたOs3RmybA1タンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離するための植物としては、単子葉植物の中から選択して利用できる。これらは遺伝子源としても利用できる。
上記したような機能的に同等なタンパク質を取得・単離する方法の一つの態様としては、タンパク質中のアミノ酸に変異を導入する方法が当業者によく知られている。即ち、当業者であれば、公知の方法により、天然型の「Os3RmybA1」タンパク質（例えば、配列番号:32に記載のタンパク質）中のアミノ酸を適宜置換、欠失、付加などして、これと同等の機能を有する改変タンパク質を調製することが可能である。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもある。本発明のタンパク質には、このように天然型の「Os3RmybA1」タンパク質において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有し、天然型のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質も含まれる。タンパク質におけるアミノ酸の改変は、通常、全アミノ酸の50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。アミノ酸の改変は、例えば、変異や置換であれば「T ransformer Site-directed Mutagenesis Kit」や「ExSite PCR-Based Site-directed Mutagenesis Kit」（Clontech社製）を用いて行うことが可能であり、また、欠失であれば「Quantum leap Nested Deletion Kit」（Clontech社製）などを用いて行うことが可能である。
【００４２】
変異・変換・修飾法としては、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法 II 」、p105（広瀬進）、東京化学同人(1986); 日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、p233（広瀬進）、東京化学同人(1992); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, New York (1987); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Academic Press, New York (1983); J. A. Wells  et al., Gene, 34: 315, 1985; T. Grundstroem et al., Nucleic Acids Res., 13: 3305, 1985; J. Taylor et al., Nucleic Acids Res., 13: 8765, 1985; R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York （1987); A. R. Oliphant et al., Gene, 44: 177, 1986 などに記載の方法が挙げられる。例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法) (Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487, 1987; Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331, 1986), カセット変異導入法 (cassette mutagenesis: Wells et al., Gene, 34: 315, 1985), 制限部位選択変異導入法 (restriction selection mutagenesis: Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A, 317: 415, 1986),アラニン・スキャンニング法 (Cunningham & Wells, Science, 244: 1081-1085, 1989), PCR 変異導入法, Kunkel法,  dNTP[αS]法（Eckstein),亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、好ましい変化を与えるものであってよく、当該タンパク質を構成するポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に変化を生ぜしめるものであってよい。該置換、欠失、あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされるものであることもできる。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられ、極性（中性）としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。場合によっては、システインをセリンに、グリシンをアラニンやロイシンに、あるいはロイシンをアラニン、イソロイシン、バリンなどに置き換えてもよい。
本発明のタンパク質は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体または変異体などにすることができる。
【００４３】
また遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然の所定の本発明のタンパク質と実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してアフィニティクロマトグラフィーなどで精製することも可能である。こうした融合タンパク質としては、ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、あるいは、β-ガラクトシダーゼ（β-gal) 、マルトース結合タンパク (MBP), グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST)、チオレドキシン (TRX)又は Cre Recombinaseのアミノ酸配列に融合せしめられたものなどが挙げられる。同様に、ポリペプチドは、ヘテロジーニアスなエピトープのタグを付加され、該エピトープに特異的に結合する抗体を用いてのイムノアフィニティ・クロマトグラフィーによる精製をなし得るようにすることもできる。より適した実施態様においては、該エピトープタグとしては、例えば AU5, c-Myc, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag 41, Glu-Glu, HA, Ha.11, KT3, FLAG (registered trademark, Sigma-Aldrich), Omni-probe, S-probe, T7, Lex A, V5, VP16, GAL4, VSV-G などが挙げられる。(Field et al., Molecular and Cellular Biology, 8: pp.2159-2165 (1988); Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: pp.3610-3616 (1985); Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): pp.547-553 (1990); Hopp et al., BioTechnology, 6: pp.1204-1210 (1988); Martin et al., Science, 255: pp.192-194 (1992); Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: pp.15163-15166 (1991); Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: pp.6393-6397 (1990)など) 。酵母を利用した two-hybrid 法も利用できる。
【００４４】
さらに融合タンパク質としては、検出可能なタンパク質となるようなマーカーを付されたものであることもできる。より好適な実施態様においては、該検出可能なマーカーは、ビオチン／ストレプトアビジン系のBiotin Avi Tag、螢光を発する物質などであってよい。該螢光を発する物質としては、オワンクラゲ (Aequorea victorea)などの発光クラゲ由来の緑色螢光タンパク質(green fluorescent protein: GFP)、それを改変した変異体(GFPバリアント) 、例えば、EGFP (Enhanced-humanized GFP), rsGFP (red-shift GFP), 黄色螢光タンパク質 (yellow fluorescent protein: YFP), 緑色螢光タンパク質 (green fluorescent protein: GFP),藍色螢光タンパク質 (cyan fluorescent protein: CFP), 青色螢光タンパク質 (blue fluorescent protein: BFP)などが挙げられる（宮脇敦史編、実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座３−GFP とバイオイメージング、羊土社 (2000年))。また、上記融合タグを特異的に認識する抗体（モノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む）を使用して検出を行うこともできる。
本発明のタンパク質及びその一部のペプチドの合成には、当該ペプチド合成分野で知られた方法、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用することができる。こうした方法では、例えばタンパク質あるいはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、それ自体公知の各種縮合方法により所望のアミノ酸配列に順次該樹脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくはそれ自体公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。
【００４５】
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、天然のタンパク質としての他、遺伝子組換え技術を利用して調製した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、下記の方法により調製された組換えタンパク質をウサギなどの小動物に免疫して得た抗体を適当な吸着体（CNBr活性化アガロースやトシル活性化アガロース）に結合させてカラムを作製し、得られたカラムを利用してイネの葉のタンパク質抽出液を精製することにより調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、常法、例えば、本発明のタンパク質をコードするDNA を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、該形質転換細胞から精製することにより調製することが可能である。
組換えタンパク質を生産するために用いられる細胞としては、例えば、植物細胞、大腸菌、酵母などの微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。また、細胞内で組換えタンパク質を発現させるためのベクターとしては、例えば、植物、酵母細胞用にはプラスミド「pBI121」や「pBI101」（Clontech社製）、大腸菌用にはプラスミド「pET Expression system 」（Stratagene社製）や「GST gene fusion Vectors 」（Pharmacia 社製）、ほ乳類細胞用にはプラスミド「pMAM」（Clontech社製）、昆虫細胞用にはプラスミド「pBacPAK8.9」（Clontech社製）などが挙げられる。ベクターへのDNA の挿入は、常法、例えば、Molecular Cloning (Maniatis et al., Cold Spring harbor Laboratry Press) に記載の方法により行うことができる。また、宿主細胞へのベクターの導入は、常法により宿主細胞に応じてエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの方法で行うことが可能である。
得られた形質転換細胞からの本発明の組換えタンパク質の精製は、タンパク質の性質に応じ、塩析や有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着体によるカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、SDS 電気泳動、等電点電気泳動などを適宜組み合わせて行うことが可能である。また、本発明の組換えタンパク質をグルタチオンS-トランスフェラーゼなどの標識との融合タンパク質として発現させた場合には、該標識に対するアフィニティークロマトグラフィーなどにより精製することも可能である。
【００４６】
また、本発明は、上記本発明のタンパク質をコードするDNA を提供する。本発明のDNA は、本発明のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、ゲノムDNA 、cDNA、化学合成DNA などが含まれる。ゲノムDNA は、例えば、文献 (Rogers and Bendich, Plant Mol. Biol. 5:69 (1985)) 記載の方法に従って調製したゲノムDNA を鋳型として、本発明のDNA の塩基配列（例えば、配列番号:31に記載の塩基配列）を基に作製したプライマーを用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション(polymerase chain reaction; PCR)を行うことにより調製することが可能である。また、cDNAであれば、常法 (Maniatis et al. Molecular Cloning Cold Spring harbor Laboratry Press) により植物からmRNAを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてPCR を行うことにより調製することが可能である。また、ゲノムDNA やcDNAは、常法によりゲノムDNA ライブラリーまたはcDNAライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば本発明のDNA の塩基配列（例えば、配列番号:31 に記載の塩基配列）を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによっても調製することが可能である。
また、機能的に同等なタンパク質を単離する方法の他の態様としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, J. Mol. Biol. 98:503(1975); Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring harbor Laboratry Press) やPCR 技術（H.A.Erlich (ed.), "PCR technology", Stockton Press, New York (1989))が挙げられる。即ち、当業者にとっては、「Os3RmybA1」遺伝子の塩基配列（配列番号:31）もしくはその一部をプローブとして、「Os3RmybA1」遺伝子の塩基配列（配列番号:31）の一部にハイブリダイズするオリゴ塩基をプライマーとして、これと高い相同性を有するDNAを単離して、該DNAから「Os3RmybA1」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離されたDNAがコードする「Os3RmybA1 」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。
【００４７】
本明細書中、PCR とは、一般的に、Saiki et al., Science, 239:487(1988); 米国特許第 4,683,195号明細書などに記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。一般に、PCR は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行うようなサイクルを繰り返し行うことを含むものである。典型的には、PCR 法で用いられるプライマーは、鋳型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用することができる。代表的な場合には、5'端側のプライマーとしては、少なくとも開始コドンを含有するか、あるいは該開始コドンを含めて増幅できるように選択し、また3'端側のプライマーとしては、少なくともストップコドンを含有するか、あるいは該ストップコドンを含めて増幅できるように選択することが好ましい。プライマーは、好ましくは 5個以上の塩基、さらに好ましくは10個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは18〜35個の塩基からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
PCR は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば  上記文献の他、R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke a nd G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988) などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、PCR は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
【００４８】
PCR は、代表的な場合には、例えば鋳型（例えば、mRNAを鋳型にして合成されたDNA; 1st strand DNA など) と該遺伝子に基づいてデザインされたプライマーとを、10×反応緩衝液 (Taq DNA ポリメラーゼに添付されている) 、dNTPs(デオキシヌクレオシド三リン酸dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）、Taq DNA ポリメラーゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例えば、GeneAmp 2400 PCR system, Perkin-Elmer/Cetus などの自動サーマルサイクラーを用いて一般的なPCR サイクル条件下にそのサイクルを25〜60回繰り返すが、増幅のためのサイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とすることができる。PCR サイクル条件としては、例えば、変性90〜95℃ 5〜100 秒、アニーリング40〜60℃ 5〜150 秒、伸長65〜75℃ 30 〜300 秒のサイクル、好ましくは変性 94 ℃ 15 秒、アニーリング 58℃ 15 秒、伸長 72 ℃ 45 秒のサイクルが挙げられるが、アニーリングの反応温度及び時間は適宜実験によって適当な値を選択できるし、変性反応及び伸長反応の時間も、予想されるPCR 産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。アニーリングの反応温度は、通常プライマーと鋳型DNA とのハイブリッドのTm値に応じて変えることが好ましい。伸長反応の時間は、通常1000bpの鎖長当たり1 分程度がおおよその目安であるが、より短い時間を選択することも場合により可能である。
得られたDNA の塩基配列は、例えば「シークエンサーModel310」（ABI 社製）を利用することにより容易に決定することが可能である。本発明のDNA は、例えば、上記したように組換えタンパク質の調製に用いることができる。さらに、本発明のDNA を植物体内で発現させることにより、細胞増殖が変化した形質転換植物体や発生分化が変化した形質転換植物体を得ることも可能である。
Os3RmybA1 と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションは、55℃でハイブリダイゼーションさせた後、0.1% SDSを含む2XSSC(3M NaCl, 0.3M クエン酸ナトリウム)もしくは2XSSPE(3.6M NaCl, 0.2Mリン酸ナトリウム液(pH7.7), 0.02M Na2-EDTA)中で、55℃で10分間の洗浄を合計３回行うという条件で行なうことができる。よりストリンジェントなハイブリダイゼーションにおいては、65℃でハイブリダイゼーションさせた後、0.1% SDSを含む2XSSCもしくは2XSSPE液中で、65℃で10分間洗浄を合計3回行えば良い。さらに、よりストリンジェントなハイブリダイゼーションにおいては、65℃でハイブリダイゼーションさせた後、0.1% SDSを含む2XSSCもしくは2XSSPE液中で、65℃で10分間洗浄し、次に0.1% SDSを含む1XSSCもしくは1XSSPE液中で、65℃で10分間の洗浄を２回行えばよい。ハイブリダイゼーション液は、「Molecular cloning (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press)」に記載されているもの等を用いればよい。
【００４９】
本明細書中で開示した関連したタンパク質、そのフラグメント、さらにはDNA を含めた核酸(mRNA やオリゴヌクレオチドを含む) は、それらを単独あるいは有機的に使用し、更にはアンチセンス技術、モノクローナル抗体を含めた抗体、トランスジェニク植物などとも適宜組合わせて、ゲノミックス及びプロテオミックス技術に応用できる。また、二本鎖RNA (dsRNA) を使用してのRNAi (RNA interference) 技術への応用の途もある。かくして、一塩基多型(SNP; single nucleotide polymorphisms)を中心とした遺伝子多型解析、核酸アレイ、タンパク質アレイを使用した遺伝子発現解析、遺伝子機能解析、タンパク質間相互作用解析、関連遺伝子解析、農薬解析をすることが可能となる。例えば、核酸アレイ技術では、cDNAライブラリーを使用したり、PCR 技術で得たDNA を基板上にスポッティング装置で高密度に配置して、ハイブリダイゼーションを利用して試料の解析が行われる。
該アレイ化は、針あるいはピンを使用して、あるいはインクジェトプリンティング技術などでもって、スライドガラス、シリコン板、プラスチックプレートなどの基板のそれぞれ固有の位置にDNA が付着せしめられることによりそれを実施することができる。該核酸アレイ上でのハイブリダイゼーションの結果得られるシグナルを観察してデータを取得する。該シグナルは、螢光色素などの標識（例えば、Cy3, Cy5, BODIPY, FITC, Alexa Fluor dyes（商品名), Texas red（商品名) など) より得られるものであってよい。検知にはレーザースキャナーなどを利用することもでき、得られたデータは適当なアルゴリズムに従ったプログラムを備えたコンピューターシステムで処理されてよい。また、タンパク質アレイ技術では、タグを付された組換え発現タンパク質産物を利用してよく、二次元電気泳動(2-DE)、酵素消化フラグメントを含めての質量分析 (MS)(これにはエレクトロスプレーイオン化法(electrospray ionization: ESI), マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(matrix-assisted laser desorption/ionization: MALDI)などの技術が含まれ、MALDI-TOF 分析計、ESI-3 連四重極分析計、ESI-イオントラップ分析計などを使用してよい) 、染色技術、同位体標識及び解析、画像処理技術などが利用されることができる。したがって、本発明には上記で得られるあるいは利用できるNACK2 など及びそれに対する抗体に関連したソフトウエア、データベースなども含まれてよい。
【００５０】
本明細書中、「抗体」との用語は、広義の意味で使用されるものであってよく、所望のOs3RmybA1タンパク質、その構成ポリペプチド及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型(intact)分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、F(ab')2, Fab' 及びFab といったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原又はエピトープ (epitope)結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、クワドローム(quadrome), トリオーム(triome)などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、DNA 組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含していてよい。特に好ましい本発明の抗体は、配列番号:32の53〜202番目の領域から選択されたポリペプチドを特異的に識別できるものが挙げられる。
【００５１】
抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基（エピトープ) に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来やイムノグロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる（例えば、米国特許第4816567 号; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987 など) 。
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、ハイブリドーマ法 (G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp.495-497 (1975)); ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 (Kozbor et al., Immunology Today, 4, pp.72-79 (1983); Kozbor, J. Immunol., 133, pp.3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987);トリオーマ法; EBV-ハイブリドーマ法 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96 (1985))(ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法);米国特許第4946778 号 (単鎖抗体の産生のための技術) が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙げられる: S. Biocca et al., EMBO J, 9, pp.101-108 (1990); R.E. Bird et al., Science, 242, pp.423-426 (1988); M.A. Boss et al., Nucl. Acids Res., 12, pp.3791-3806 (1984); J. Bukovsky et al., Hybridoma, 6, pp.219-228 (1987); M. DAINO et al., Anal. Biochem., 166, pp.223-229 (1987); J.S. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp.5879-5883 (1988); P.T. Jones et al., Nature, 321, pp.522-525 (1986); J.J. Langone et al. (ed.), "Methods in E nzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986); S. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp.6851-6855 (1984); V.T. Oi et al., BioTechniques, 4, pp.214-221  (1986); L. Riechmann et al., Nature, 332, pp.323-327 (1988); A. Tramontano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp.6736-6740 (1986); C. Wood et al., Nature, 314, pp.446-449 (1985); Nature, 314, pp.452-454 (1985) あるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる) 。本発明の抗体は、当該遺伝子発現物の解析、検知などに利用できる他、様々な利用が可能である。
【００５２】
本発明における植物3Rmybタンパク質をコードするDNAを単離する方法としては、前述のハイブリダイゼーションによる方法や、PCRによる方法を用いれば良い。PCRを用いて単離する場合は例えば実施例１に記載の縮重プライマーを用いてPCRを行なうことによって3反復の構造を示すmyb DNA結合領域をコードするDNAを単離することが可能である。PCRの特異性を向上させるためには、目的配列に対して最初に用いたPCRプライマーよりさらに内側にアニーリングするようなPCRプライマーを用いたNested-PCRを行なうことで可能となる。得られたDNAの塩基配列を決定後、Rapid amplification of cDNA ends 法(RACE法、Dorit en al., Current protocols in moleculer biology. Unit15.6(1992))を用いることによってcDNAの5'および、3'末端配列を単離、決定することが可能である。  本発明で特徴付けた植物3Rmybタンパク質を単離するための植物としては、双子葉植物の中から選択して利用できる。これらは遺伝子源としても利用できる。
本発明で特徴付けた双子葉植物や単子葉植物としては、特に制限はなく、広く栽培植物あるいは有用植物として知られたものの中から選択して利用でき、穀類、豆類、イモ類、種実類、野菜類、果実類として知られた植物、さらには園芸花木樹木なども挙げられる。該植物としては、例えば、ナス科、アブラナ科、イネ科、マメ科、ユリ科、セリ科、ウリ科などのものが挙げられ、好ましくはタバコ、シロイヌナズナ、ダイズ、アズキ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ベントグラス、トウモロコシ、アブラナ、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、コンニャク、キャッサバなどが挙げられる。
本発明は、NtmybA1タンパク質、NtmybA2タンパク質、Os3RmybA1タンパク質、AtMYB3R1タンパク質、AtMYB3R4タンパク質の機能を改変し、これらタンパク質の転写活性化能が上昇した分子を作出する方法を提供する。
【００５３】
本発明においてNtmybA1タンパク質の転写活性化能が上昇した分子として機能するためには、
(a)  配列番号:５１に示したNtmybA1 タンパク質において459〜1003番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(b)  さらに望ましくは、配列番号:５１に示したNtmybA1 タンパク質において579〜1003番目のアミノ酸配列を欠失した分子、または715〜1003番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(c)  最も望ましくは配列番号:５１に示したNtmybA1 タンパク質において641〜1003番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
からなる群から選ばれたもののうち少なくとも一つである分子である。
本発明においてNtmybA2タンパク質の転写活性化能が上昇した分子として機能するためには、
(a)  配列番号:５３に示したNtmybA2 タンパク質において413〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(b)  さらに望ましくは、配列番号:５３に示したNtmybA2タンパク質において569〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子、または705〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(c)  最も望ましくは配列番号:５３に示したNtmybA2タンパク質において631〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
からなる群から選ばれたもののうち少なくとも一つである分子である。
本発明においてOs3RmybA1タンパク質の転写活性化能が上昇した分子として機能するためには、
(a)  配列番号:３２に示したOs3RmybA1タンパク質において426〜993番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(b)  さらに望ましくは、配列番号:３２に示したOs3RmybA1タンパク質において575〜993番目のアミノ酸配列を欠失した分子、または709〜993番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(c)  最も望ましくは配列番号:３２に示したOs3RmybA1タンパク質において635〜993番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
からなる群から選ばれたもののうち少なくとも一つである分子である。
本発明においてAtMYB3R1タンパク質の転写活性化能が上昇した分子として機能するためには、
(a)  配列番号: ７５に示したAtMYB3R1タンパク質において583〜776番目のアミノ酸配列を欠失した分子、または691〜776番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(b)  望ましくは配列番号: ７５に示したAtMYB3R1タンパク質において621〜776番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
からなる群から選ばれたもののうち少なくとも一つである分子である。
【００５４】
本発明においてAtMYB3R4タンパク質の転写活性化能が上昇した分子として機能するためには、
(a)  配列番号: ７６に示したAtMYB3R4タンパク質において570〜961番目のアミノ酸配列を欠失した分子、または667〜961番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(b)  望ましくは配列番号: ７６に示したAtMYB3R4タンパク質において608〜961番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
からなる群から選ばれたもののうち少なくとも一つである分子である。
本発明はまた、NtmybA1タンパク質、NtmybA2タンパク質、Os3RmybA1タンパク質、AtMYB3R1タンパク質、AtMYB3R4タンパク質の機能を改変し、これらタンパク質の転写活性化能が野生型と比較して低下、もしくは消失した分子すなわち、内在性植物3Rmyb分子に対してドミナントネガティブ分子として機能する分子を作出する方法を提供する。
本発明においてNtmybA1タンパク質、NtmybA2タンパク質、Os3RmybA1タンパク質、AtMYB3R1タンパク質、AtMYB3R4タンパク質が内在性植物3Rmyb遺伝子に対してドミナントネガティブとして機能するためには,
(a)  配列番号:５１に示したNtmybA1 タンパク質であれば299〜1003番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(b)  さらに望ましくは配列番号:５１に示したNtmybA1 タンパク質で186〜1003番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(c)  配列番号:５３に示したNtmybA2 タンパク質であれば243〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(d)  さらに望ましくは配列番号:５３に示したNtmybA2 タンパク質で188〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(e)  配列番号:３２に示したOs3RmybA1 タンパク質であれば257〜993番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(f)  さらに望ましくは配列番号:３２に示したOs3RmybA1 タンパク質で203〜993番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(g)  配列番号:７５に示したAtMYB3R1 タンパク質であれば241〜776番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(h)  さらに望ましくは配列番号: ７５に示したAtMYB3R1タンパク質で187〜776番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(i)  配列番号:７６に示したAtMYB3R4 タンパク質であれば235〜961番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
(j)  さらに望ましくは配列番号: ７６に示したAtMYB3R4タンパク質で181〜961番目のアミノ酸配列を欠失した分子、
からなる群から選ばれたもののうち少なくとも一つである分子である。
【００５５】
NtmybA2タンパク質の242〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子や、188〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子の転写活性化能が野生型NtmybA2タンパク質よりも低下したこと、加えてNtmybA2タンパク質の188〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子と全長NtmybA2タンパク質の共発現において、NtmybA2タンパク質単独の転写活性能が抑制されたこと、さらに、全長NtmybBタンパク質と188〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子の共発現においてはNtmybBタンパク質単独での転写抑制能が抑制されたことは、NtmybA2タンパク質の243〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子や、188〜1042番目のアミノ酸配列を欠失した分子が内在性植物3Rmybタンパク質に対してドミナントネガティブに機能することを証明するものである。
明細書及び図面において、用語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。代表的な用語の意味を以下に示す。
アミノ酸配列に関しては: 
A:アラニン (Ala)                M:メチオニン (Met)
C:システイン (Cys)              N:アスパラギン (Asn)
D:アスパラギン酸 (Asp)          P:プロリン (Pro)
E:グルタミン酸(Glu)             Q:グルタミン (Gln)
F:フェニルアラニン(Phe)         R:アルギニン (Arg)
G:グリシン(Gly)                 S:セリン (Ser)
H:ヒスチジン(His)               T:スレオニン (Thr)
I:イソロイシン(Ile)             V:バリン (Val)
K:リジン(Lys)                   W:トリプトファン (Trp)
L:ロイシン(Leu)                 Y:チロシン (Tyr)
X:上記のいずれかのアミノ酸あるいは特定の任意のアミノ酸（特別に指定した場
合はその指定したアミノ酸である)(Xaa)
ヌクレオチド配列に関しては: 
A,a:アデニン                     G,g: グアニン
C,c:シトシン                     T,t: チミン
R,r:グアニン又はアデニン         Y,y: チミン／ウラシル又はシトシン
M,m:アデニン又はシトシン         K,k: グアニン又はチミン／ウラシル
S,s:グアニン又はシトシン         W,w: アデニン又はチミン／ウラシル
D,d:アデニン又はグアニン又はチミン／ウラシル
H,h:アデニン又はシトシン又はチミン／ウラシル
V,v:アデニン又はグアニン又はシトシン
N,n:アデニン又はグアニン又はシトシン又はチミン／ウラシル，不明，
又は他の如何なる塩基でもよい（特別に指定した場合はその指定した塩基で
ある）
【００５６】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
なお、DNA の切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Molecular cloning (Maniatis T. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press) 」(J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2nd Edition, 1989 & 3rd Edition, 2001)を含む）に基本的に従った。全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
【実施例１】
【００５７】
イネOs3RmybA1遺伝子の単離と塩基配列の決定
イネより3Rmyb をコードするcDNAの単離と、塩基配列の決定を行った。cDNAを単離するためには、タバコの3RmybであるNtmybA1、NtmybA2、NtmybBのmyb DNA結合領域におけるアミノ酸配列を参考に設計した縮重プライマーを用いてイネカルスより調整したcDNAを鋳型としてPCR反応を行った。縮重PCRの特異性を向上させるために、Nested PCRを実施することにより3反復のmyb DNA 結合領域を示すcDNA断片の単離に成功した。
得られた断片より、5' RACE法、3'RACE法によって全長cDNAの末端配列を決定した。
5'末端配列と3'末端配列を参考に設計したプライマーによって構造遺伝子全長を含むcDNAの単離に成功した。以下に詳細に示す。
（１）mRNAの精製およびcDNA合成
イネ（品種  日本晴）種子より籾を取り除きアンチホルミンを用いて滅菌した後に、N6CI培地（N6無機塩、N6ビタミン(Chuら(1975), Sientia Sinica 18: 659) にsucrose,30g/l、2,4-D 2mg/l、gelrite 2g/lを添加。pH5.8）上で胚盤に由来するカルスを誘導した。
このカルス130mgよりRNeasy plant mini kit (QIAGEN社)を用いて総RNAを抽出した。抽出した総RNAの50μｇより、PolyATtract mRNA Isolation Systems (Promega社)を用いてmRNAを精製した。精製されたmRNAはエタノール沈殿により濃縮した後に、Superscript First-strand syntesis system for RT-PCR(Invitrogen社) を用いてcDNAを合成した。
【００５８】
（２）Myb領域の縮重プライマーを用いたPCRによるクローニング
合成されたcDNA 50μlのうち2μlを使用してPCR反応を行った。PCR反応に用いたプライマーはDEGmybF（5'- GAIGTICARTGYYWICAYMGNTGG -3'; 配列番号:1)及びDEGmybR（5'- YTTYTTDAVIGAISWRTKCCA -3';配列番号:2)である。反応はEx taq(Takara社)を用い、Ex taqに付属する反応バッファー、各200μMのdATP、dTTP、dCTP、dGTP、各10μM のDEGmybFおよびDEGmybRを用いて、50μlの液量で行った。GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems社)を用いて94℃を30秒、42℃を30秒、72℃を30秒のステップを35サイクル繰り返した。反応終了後、PCR反応液をQIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)を用いて精製した。
精製されたPCR反応液を1μlを鋳型として用いて、Nested PCRを行った。2回目のPCR反応に用いたプライマーはDEGmybFとDEGmybRの内側にあたる領域に設計した縮重プライマーDEGmybF2（5'- CARTGYYTICAYMGITGGCARAARG -3'; 配列番号:3)及びDEGmybR2（5'- ACISWISWRTTCCARTTRTGYTT -3';配列番号:4)を用いた。反応はEx taq(Takara社)を用い、Ex taqに付属する反応バッファー、各200μMのdATP、dTTP、dCTP、dGTP、各10μM のDEGmybF2およびDEGmybR2を用いて、50μlの液量で行った。GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems社)を用いて94℃を30秒、58℃を30秒、72℃を30秒のステップを35サイクル繰り返した。反応終了後、PCR反応液をQIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)を用いて精製した。
精製された２回目のPCR反応液を1μlを鋳型として用いて、さらにNested PCRを行った。3回目のPCR反応に用いたプライマーはDEGmybF2とDEGmybR2の内側にあたる領域に設計した縮重プライマーDEGmybF3（5'- CAYMGITGGCARAARGTIYTIRAYCC -3'; 配列番号:5)及びDEGmybR3（5'- HIGCRTTITCISWICKICCIKGIA -3';配列番号:6)を用いた。反応はEx taq(Takara社)を用い、Ex taqに付属する反応バッファー、各200μMのdATP、dTTP、dCTP、dGTP、各10μM のDEGmybF3およびDEGmybR3を用いて、50μlの液量で行った。GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems社)を用いて94℃を30秒、56℃を30秒、72℃を30秒のステップを30サイクル繰り返した。反応終了後、PCR反応液をQIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)を用いて精製した。PCR反応液をアガロースゲルを用いて解析したところ、約300bpのDNAが増幅していることが確認されたため、このDNA断片をpCR4-TOPO (Invitrogen社) にTAクローニングした。3種のクローンより得られたプラスミドに挿入されたDNAをT7プライマー (5'- TAATACGACTCACTATAGGG -3'; 配列番号:7)を用いて塩基配列を決定し、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10を得た。
【００５９】
（３）イネ3Rmyb cDNAの5’末端配列の決定
（１）で得られた3Rmyb DNA 結合領域の断片配列を含むイネ３Rmyb遺伝子の全長c DNAを得るために、cDNAの5’末端側の単離を行った。5'末端側のDNAの単離は5' RACE法で行い、GeneRacer Kit (Invitrogen社) を用いて実施した。前述（１）に記述の方法により誘導したイネ胚盤由来カルス130mgよりRNeasy plant mini kit (QIAGEN社)を用いて総RNAを抽出した。抽出した総RNAを3μｇを鋳型として用い、GeneRacer Kit (Invitrogen社)によりcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10を参考に設計したプライマー78687-R1（5'- CAGCTCGGCCCATTTATTTCCATACATT -3';配列番号:11)とGeneRacer Kit (Invitrogen社)に付属のプライマー GeneRacer 5' Primer (5'- CGACTGGAGCACGAGGACACTGA -3';配列番号:12)を用いPCR反応を行った。反応にはEx taq(Takara社)を用い50μlの液量で行った。GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems社)を用いて94℃を2分の後に、94℃を30秒、72℃を3分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を3分のステップを5サイクル、94℃を30秒、68℃を30秒、72℃を3分のステップを25サイクル行い、最後に72℃で10分の反応を行った。PCR反応液を1μlを鋳型として、プライマー78687-R2（5'- CTTCTTGTGTCCATGCCTCCTTGTTTAT -3';配列番号:13)とGeneRacer Kit (Invitrogen社)に付属のプライマー GeneRacer 5' Nested Primer (5'- GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA -3';配列番号:14)を用いPCR反応を行った。反応にはEx taq(Takara社)を用い50μlの液量で行った。GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems社)を用いて94℃を2分の後に、94℃を30秒、72℃を3分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を3分のステップを5サイクル、94℃を30秒、68℃を30秒、72℃を3分のステップを25サイクル行い、最後に72℃で10分の反応を行った。反応終了後、PCR反応液をQIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)を用いて精製した。増幅されたDNAをpCR4-TOPO (Invitrogen社) にTAクローニングした。得られたプラスミドに挿入されたDNAをT7プライマー (5'- TAATACGACTCACTATAGGG -3'; 配列番号:7)とT3プライマー (5'- AATTAACCCTCACTAAAGGG -3'; 配列番号:15)を用いて塩基配列を決定した。クローン＃26の塩基配列を配列番号：16に、クローン＃27の塩基配列を配列番号：17に示した。
【００６０】
（４）イネ3Rmyb cDNAの3'末端配列の決定
（１）で得られた3Rmyb DNA 結合領域の断片配列を含むイネ３Rmyb遺伝子の全長cDNAを得るために、cDNAの3’末端側の単離を行った。3'末端配列の決定は3' RACE法で行い、GeneRacer Kit (Invitrogen社) を用いて実施した。前述（１）に記述の方法により誘導したイネ胚盤由来カルス130mgよりRNeasy plant mini kit (QIAGEN社)を用いて総RNAを抽出した。抽出した総RNAを5μｇを鋳型として用い、GeneRacer Kit (Invitrogen社)によりcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10を参考に設計したプライマー78687-F1（5'- AGGAGGCATGGACACAAGAAGAGGAAAT -3';配列番号:18)とGeneRacer Kit (Invitrogen社)に付属のプライマー GeneRacer 3' Primer (5'- GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG -3';配列番号:19)を用いPCR反応を行った。反応にはEx taq(Takara社)を用い50μlの液量で行った。GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems社)を用いて94℃を2分の後に、94℃を30秒、72℃を3分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を3分のステップを5サイクル、94℃を30秒、68℃を30秒、72℃を3分のステップを25サイクル行い、最後に72℃で10分の反応を行った。PCR反応液を1μlを鋳型として、プライマー78687-F2（5'- GGAAATAAATGGGCCGAGCTGACAAAAT -3';配列番号:20)とGeneRacer Kit (Invitrogen社)に付属のプライマー GeneRacer 3' Nested Primer (5'- CGCTACGTAACGGCATGACAGTC -3';配列番号:21)を用いPCR反応を行った。反応にはEx taq(Takara社)を用い50μlの液量で行った。GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems社)を用いて94℃を2分の後に、94℃を30秒、72℃を3分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を3分のステップを5サイクル、94℃を30秒、68℃を30秒、72℃を3分のステップを25サイクル行い、最後に72℃で10分の反応を行った。反応終了後、PCR反応液をQIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)を用いて精製した。増幅されたDNAをpCR4-TOPO (Invitrogen社) にTAクローニングした。得られたプラスミドに挿入されたDNAをT7プライマー (5'- TAATACGACTCACTATAGGG -3'; 配列番号:7)とT3プライマー (5'- AATTAACCCTCACTAAAGGG -3'; 配列番号:15)を用いて挿入されたDNA断片の5'側と3'側の塩基配列を決定した。クローン＃31の5'側の塩基配列を配列番号：22に、3'側の塩基配列を配列番号：23に示した。
【００６１】
（５）イネ3Rmyb遺伝子の構造領域全長を含むｃDNAの単離と塩基配列の決定
前述（１）に記述の方法により誘導したイネ胚盤由来カルス130mgよりRNeasy plant mini kit (QIAGEN社)を用いて総RNAを抽出した。抽出した総RNAの5μｇより、Superscript First-strand syntesis system for RT-PCR(Invitrogen社) を用いてcDNAを合成した。
合成されたcDNA 50μlのうち1μlを使用してPCR反応を行った。PCR反応に用いたプライマーはOsA1-1F（5'- TGTCTTCAGTCATGATGACAAGCGA -3'; 配列番号:24)及びOsA1-2R（5'- CAAGCTATCTAAAACTTTTCAGAAGATGG -3';配列番号:25)である。反応はPfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (Stratagene社)を用い、PfuTurbo Hotstart DNA Polymeraseに付属する反応バッファー、各200μMのdATP、dTTP、dCTP、dGTP、各1μM のOsA1-1FおよびOsA1-2Rを用いて、50μlの液量で行った。GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems社)を用いて95℃を2分の後に、95℃を30秒、60℃を30秒、72℃を4分のステップを40サイクル繰り返した。最後に72℃で10分、反応した。反応終了後、PCR反応液をQIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)を用いて精製した。PCR反応液をアガロースゲルを用いて解析したところ、約3kbpの単一のDNAが増幅していることが確認されたため、このDNA断片をpCR4-TOPO (Invitrogen社) にTAクローニングした。このDNAが挿入されたプラスミドpCR4-Os3RmybA1を
T7プライマー (5'- TAATACGACTCACTATAGGG -3'; 配列番号:7)、
T3プライマー (5'- AATTAACCCTCACTAAAGGG -3'; 配列番号:15)、
プライマー78687-F1（5'- AGGAGGCATGGACACAAGAAGAGGAAAT -3';配列番号:18)、プライマーOsA1-4F（5'- GATCAACACTTGCAAGAGGA -3';配列番号:26)、
プライマーOsA1-3F（5'- ACAGGGCCTTCTTTTCTGGAC -3';配列番号:27)、
プライマーOsA1-5F（5'- AGCATACCTGAATGTGGGGA -3';配列番号:28)、
プライマーOsA1-6F（5'- TACTCATGATGAAAGCACGG -3';配列番号:29)、
プライマーOsA1-7F（5'- ATCTCCTTCACATGGAAGTC -3';配列番号:30)、
を用いて塩基配列を決定した。得られた塩基配列を配列番号：31に示した。
【実施例２】
【００６２】
配列番号：31のDNAにコードされるアミノ酸配列を配列番号:32に示した。配列番号：32のアミノ酸配列は3反復のmyb DNA結合領域を含んでおり、この配列にコードされる遺伝子をOs3RmybA1とした。Os3RmybA1タンパク質のアミノ酸配列とDDBJに登録番号BAB78687として登録されているゲノム情報より予測されている仮想のアミノ酸配列(配列番号：49)を最適な形で並べた結果、Os3RmybA1 cDNAにコードされるアミノ酸配列はBAB78687のアミノ酸配列とN末端領域では高い類似性を示すが、C末端領域が異なっていた。BAB78687の783番目のアミノ酸以降がOs3RmybA1と異なっており、BAB78687では787アミノ酸より構成されるタンパク質であるが、Os3RmybA1は993アミノ酸から構成されている。これはゲノム配列よりBAB78687の構造領域を予測する際にスプライシング部位の予測が異なっていたためであると考えられる(図１、図２、図３)。
【実施例３】
【００６３】
Os3RmybA1の転写活性化能
単離したOs3RmybA1の機能を、プロモーター領域にMSA制御配列を含むCYM遺伝子の転写活性化能として確認した。すなわち、タバコ培養細胞BY2プロトプラストにおいてカリフラワーモザイクウイルス(CaMV) 35SプロモーターによりOs3RmybA1が発現するプラスミドと、CYMプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子が融合したレポーター遺伝子を含むプラスミドを共導入し、一過性発現によるルシフェラーゼ活性をOs3RmybA1の転写活性化能として定量化した。
【００６４】
（１）プラスミドの構築
発現用プラスミドの構築
pEXP-Os3RmybA1の構築
pCR4-Os3RmybA1をEcoRIで切断し、切り出されるOs3RmybA1を含むDNA断片をpEXP35SをEcoRIで切断して生じるサイトにセンス方向に挿入し、pEXP-Os3RmybA1を構築した。pEXP-Os3RmybA1はカリフラワーモザイクウイルス(CaMV) 35Sプロモーターにより、Os3RmybA1のORF全長を発現するプラスミドである。
また、pEXP-Os3RmybA1と実質的に機能が同等であるプラスミドは以下のように構築可能である。pBI221(Clontech社製)をEcoRIとSacIで切断し、切り出されるDNAの突出末端をKlenow断片を用いて平滑化し、pBluescript(SK-)をXhoIで切断しKlenow断片を用いて平滑化する部位に挿入するとプラスミドpTNが構築される。pBI221をPstIで切断、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化、さらにXbaIを用いて切断し切り出されるDNA断片を、pTNをNotIで切断、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化、さらにXbaIを用いて切断して生成される部位に挿入するとpP35Sプラスミドが構築される。すなわちpP35SプラスミドはCaMV 35Sプロモーターとノパリン合成酵素のターミネーターの間に複数の制限酵素切断部位を有するプラスミドである。pCR4-Os3RmybA1をEcoRIで切断し、切り出されるOs3RmybA1を含むDNA断片を、pP35SをEcoRIで切断して生じるサイトにセンス方向に挿入し、pP35S-Os3RmybA1を構築する。pP35S-Os3RmybA1はCaMV 35Sプロモーターにより、Os3RmybA1のORF全長を発現するプラスミドである。
pEXP-GUSプラスミドの構築
pBI-121 (Clontech社製)をSacIで切断後、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化し、さらにHindIIIで切断して生成されるDNA断片を、pEXP35SをEcoRIで切断後、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化し、さらにHindIIIで切断して生成される部位に挿入してpEXP-GUSを構築した。pEXP-GUSはCaMV 35Sプロモーターにより、GUSを発現するプラスミドである。pEXP-GUSと実質的に機能が同等なプラスミドとしてはpBI221(Clontech社製)が利用可能である。
R-LUCプラスミドの構築
pRL-null Vector プラスミド ( Promega社製 )をBamHIとNheIで切断し、生成される断片を、pBI-221 (Clontech社製)をXbaIとBamHIで切断して生成される部位に挿入した。このプラスミドをXbaIとSacIで切断後にKlenow断片を用いて突出末端を平滑化、切り出されたDNA断片を取り除いた後に、セルフライゲーションを行い、R-LUCプラスミドを構築した。R-LUCプラスミドはCaMV 35Sプロモーターにより、ウミシイタケ(Renilla)由来のルシフェラーゼ(R-LUC)を発現するプラスミドである。
CYM promoter-LUCプラスミドの構築
pDO432プラスミド(Nishiuchi et al., Plant Mol. Biol., 29:599(1995))をHindIIIとSacIで切断し生成されるDNA断片をpBI221 (Clontech社製)をHindIIIとSacIで切断して、CaMV 35S プロモーター領域を含むDNA断片を除いた部位に挿入し、pUC-LUCを構築した。CYMプロモーター領域については常法によりニチニチソウ(Catharanthus roseus) より調整したゲノムDNAを鋳型に用い、PCRにより調整した。PCR反応に用いたプライマーはCYM3（5'- CCGGATCCTTCAATAGAATTTCTTCCA -3'; 配列番号:56)及びCYM5-1（5'- CCAAGCTTACCCATAAATTGTTGGTAAA -3';配列番号:57)である。増幅されたCYM プロモーター領域をBamHIとHindIIIで切断した後に、 pUC-LUCのBamHIとHindIIIの切断により生成される部位に挿入して、CYM promoter-LUCプラスミドを構築した。すなわちCYM promoter-LUCプラスミドは制御配列としてMSA配列を3ヶ所含むCYMプロモーターによりルシフェラーゼ(LUC)が発現するプラスミドである。
【００６５】
（２）BY-2プロトプラストの作成、プラスミドの導入、LUC活性の測定
新しい100mlのLSD液体培地 (Nagataら(1981) Mol. Gen. Genet. 184:161)に植え継いで3日目のタバコ培養細胞BY2より、Evans らの方法によりプロトプラストを調整した(Evansら(1983)  Int. Rev. Cytol.  33：53)。即ち、BY2細胞を2000回転、室温で遠心してLSD液体培地より細胞を回収し、100mlのN2培地(1% Cellulase  "ONOZUKA" RS (ヤクルト社製)、0.5% Hemicellurase (SIGMA社製)、0.1% Pectolyase Y-23 (キッコーマン社製)、7.4g/l CaCl2・2H2O、1.6g/l 酢酸ナトリウム、45g/l マンニトール、pH5.7)を加えた。暗所、27℃で穏やかに回転培養を行い、細胞壁を消化した。3時間後に細胞を500回転、室温の遠心操作により回収した。回収された細胞は50mlのN3培地(7.4g/l CaCl2・2H2O、1.6g/l 酢酸ナトリウム、45g/l マンニトール、pH5.7)を加えて洗浄した。500回転、室温の遠心操作により細胞を回収し、40mlのN4倍地(4.6g/l ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類(和光純薬社製)、100mg/l カザミノ酸、100mg/l myo-inositol、2.8g/l L-proline、97.6mg/l MES、1mg/l Thiamin-HCl、357mg/l KH2PO4、102.6g/l Sucrose、pH5.7)に懸濁した。700回転、室温で10分間遠心操作を行い、培地上層に存在するプロトプラストを回収した。
得られたプロトプラストへのプラスミドDNAの導入はPEG法を用いて行った(Bilangら (1994). In Plant Molecular Biology Manual, pp. A1, 1-16.)。すなわち得られたプロトプラストを40mlのW5(154mM NaCl、124mM CaCl2、5mM KCl、5mM glucose、pH5.8)を用いて洗浄後に室温、500回転、3分の遠心操作でプロトプラストを回収した。この洗浄操作を３回繰り返した。洗浄後のプロトプラストはMMM(15mM MgCl2、0.1% MES、0.5M Mannitol、pH5.8)を用いて2x105個/mlの濃度に調整した。MMMに懸濁したプロトプラスト250μlを試験管に分注し、プラスミドDNA溶液を20μl加えた。穏やかに攪拌したのちにPEG溶液(0.4M mannitol、0.1M Ca(NO3)2溶液に40%  w/vになるようにPEG4000を添加、pH8に調整後、オートクレーブ)を250μl加え、穏やかに攪拌した。最後にLSD液体培地に0.4M mannitolを加えた培地を5ml加え、暗所で20時間培養を行った。培養後、室温、500回転、3分の遠心操作で細胞を回収し、LUCおよびR-LUCの活性測定を行った。これらのの基質としてはDual-Luciferase Reporter assay system (Promega社製)を用い、ルミノメーター LB955 (berthold社製)で測定した。
【００６６】
（３）Os3RmybA1によるCYM プロモーターの活性化
導入したサンプル間の導入効率の標準化は、CaMV 35SプロモーターによってRenillaルシフェラーゼが発現するR-LUCプラスミドを同時に導入し、Renillaルシフェラーゼの活性でLUC活性を補正することによって行った。CaMV 35SプロモーターによりOs3RmybA1の全長が発現するプラスミドであるpEXP-Os3RmybA1、CaMV 35SプロモーターによりGUSが発現するプラスミドpEXP-GUS、前述のCYM promoter-LUCプラスミド、R-LUCプラスミドを用いた。導入は5反復で行った。プラスミドの組み合わせについては
(i)エフェクタープラスミドを含まない組み合わせ(CYM promoter-LUCプラスミド(10μg/1サンプル)＋pEXP-GUSプラスミド(10μg/1サンプル)＋R-LUCプラスミド（1μg/1サンプル）
(ii)エフェクタープラスミドをpEXP-Os3RmybA1とする組み合わせ(CYM プロモーター-LUCプラスミド(10μg/1サンプル)＋pEXP-Os3RmybA1プラスミド(10μg/1サンプル)＋R-LUCプラスミド（1μg/1サンプル）)
(iii)エフェクタープラスミドをpEXP-NtmybA2とする組み合わせ(CYM プロモーター-LUCプラスミド(10μg/1サンプル)＋pEXP-NtmybA2プラスミド(10μg/1サンプル)＋R-LUCプラスミド（1μg/1サンプル）)
で行なった。(i)の組み合わせで導入した場合のLUC比活性（Renillaルシフェラーゼの活性によって標準化されたルシフェラーゼ活性）を１とした場合、(ii)ではLUC比活性が約2.5倍に上昇した。(iii)においても同様にLUC比活性が約2.5倍に上昇した(図４)。Os3RmybA1はCYMプロモーターの転写を活性化することが示された。驚くべきことに、Os3RmybA1はイネからクローニングされたcDNAであるにも関わらず、タバコ細胞内においてタバコのNtmybA2と同じ程度の転写活性化能を示した。イネから単離したOs3RmybA1がタバコ細胞内で、タバコNtmybA2と同等の機能を示したことは、単子葉植物と双子葉植物においてもG2/M期における遺伝子発現調節機構が高度に保存されていることが明らかになった。
【実施例４】
【００６７】
NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、をコードするDNAの単離。
本発明に用いるNtmybA1をコードするDNAの塩基配列を配列番号：50に、アミノ酸配列は配列番号：51に示す。NtmybA2をコードするDNAの塩基配列を配列番号：52に、アミノ酸配列は配列番号：53に示す。NtmybBをコードするDNAの塩基配列を配列番号：54に、アミノ酸配列は配列番号：55に示す。
NtmybA1、NtmybA2、NtmybBをコードするDNAはYeast One-hybrid system (Clontech社製)を用いて単離された(Ito et al., Plant Cell, 13:1891(2001))。培養2日目のBY2細胞より調整したcDNAをpGAD10プラスミド上に挿入しcDNAライブラリーを構築した。MSA配列を含むプロモーターであるNACK1プロモーターとヒスチジン合成酵素(HIS3)が機能的に融合されたレポーター遺伝子が染色体に挿入されたヒスチジン合成酵素(HIS)欠損酵母株を作出し、前述のcDNAライブラリーを形質転換した。形質転換した酵母をヒスチジン無添加培地を用いて選抜し、生育したコロニーより回収した3種のプラスミド(OH53、OH60、OH88)に挿入されたcDNAの塩基配列を決定しNtmybA1、NtmybA2、NtmybB をコードするDNAを得た。OH53プラスミドにはNtmybA1をコードするDNA断片が、OH60プラスミドには全長NtmybA2をコードするDNAが、OH88プラスミドには全長NtmybBをコードするDNAが挿入されていた。OH53は全長を含んでいなかったため、3'RACE法を用いて3'末端配列を決定し、NtmybA1の全長cDNAが挿入されたpGEMe-OH53i6プラスミドを得た。
これらのDNAはPCRやハイブリダイゼーションを用いてより簡便に単離することが可能である。ハイブリダイゼーションを用いる場合は対数増殖期にあるBY2細胞より調整したcDNAを用いてプラスミドやファージ上に構築したライブラリーをスクリーニングすれば良い。用いるプローブはNtmybA1であれば配列番号：50に記載のDNA、NtmybA2であれば配列番号：52に記載のDNA、NtmybBであれば配列番号：54に記載のDNA、を参考に作成することが出来る。
また、PCRにより単離する場合は対数増殖期にあるBY2細胞より調整したcDNAを鋳型に用いる。プライマーはNtmybA1であれば配列番号：50に記載のDNA、NtmybA2であれば配列番号：52に記載のDNA、NtmybBであれば配列番号：54に記載のDNAを参考に設計することが出来る。プラスミドの構築を示した以後の実施例においてOH60やOH88等から制限酵素を用いてNtmybA2やNtmybBを切り出したDNA断片はPCRプライマーに適宜制限酵素認識配列を付加することによってを得ることが可能である。
【実施例５】
【００６８】
pEXP-NtmybA2、pEXP-NtmybBプラスミドの構築
カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S プロモーターにより、NtmybA2およびNtmybBが発現するpEXP-NtmybA2および、pEXP-NtmybBプラスミドを構築した。pEXP35SをSalIで切断して生成するサイトにOH60およびOH88をSalIで切断して切り出されるDNA断片をセンス方向に挿入し、CaMV 35SプロモーターによってNtmybA2またはNtmybBが発現するpEXP-NtmybA2および、pEXP-NtmybBプラスミドを構築した。また、これらのプラスミドと実質的に機能が同等であるプラスミドは以下のように構築可能である。pP35SプラスミドをSalIで切断して生成されるサイトに、OH60または、OH88をSalIで切断して切り出されるDNA断片を挿入することによってpP35S-NtmybA2、pP35S-NtmybBが構築される。すなわち、pP35S-NtmybA2、pP35S-NtmybBはCaMV 35SプロモーターによってNtmybA2またはNtmybBが発現するプラスミドである。
【実施例６】
【００６９】
NtmybA2の転写活性化能を調節する機能領域
NtmybA2はNACK1遺伝子やCYM遺伝子の転写活性化因子である。しかし、NtmybA2タンパク質の転写活性化能力に関わる機能領域は未知である。そこで、この機能領域を探索するために、NtmybA2タンパク質のC末端側から欠失を行った変異体を作成し、これら変異体によるNACK1遺伝子の転写活性化能を測定し、NtmybA2の転写活性化能を調節する機能領域を決定した。
【００７０】
（１）プラスミドの構築
NtmybA2タンパク質のC末端欠質変異体をコードする各種プラスミドの構築
NtmybA2の転写活性化能に機能する領域を検討するために、NtmybA2のアミノ酸配列をC末端側より欠失した以下のNtmybA2変異体を作出した。
(i)    pEXP-NtmybA2T1 (705番目のアミノ酸からC末端までを欠失) 
(ii)   pEXP-NtmybA2T2 (631番目のアミノ酸からC末端までを欠失)
(iii)  pEXP-NtmybA2T3 (569番目のアミノ酸からC末端までを欠失)
(iv)   pEXP-NtmybA2ΔEcoRI (413番目のアミノ酸からC末端までを欠失)
(v)    pEXP-NtmybA2T4 (243番目のアミノ酸からC末端までを欠失)
(vi)   pEXP-NtmybA2T5 (188 番目のアミノ酸からC末端までを欠失)
(i)、(ii)、(iii)、(v)、(vi)のプラスミドはpEXP-NtmybA2を鋳型にしてPCRを用いて欠失DNA断片を作成した。PCRに用いたプライマーはプライマー 35S0 （5' - TATCCTTCGCAAGACCCTTC -3';配列番号:48)と(i)ではプライマー A2-T1-TAG (5'- CCGTCGACTATGCAGCCTCGTCAAACATAA -3';配列番号:43)、(ii)ではプライマー A2-T2-TAG (5'- CCGTCGACTACCACAGCCTAAATGGAGTA -3';配列番号:44)、(iii)ではプライマー A2-T3-TAG (5'- CCGTCGACTATATGCTCGAATTTTCGTTCAC -3';配列番号:45)、(v)ではプライマー A2-T4-TAG (5'- CCGTCGACTAGCATTCTGAAGCTTCCTCC -3';配列番号:46)、(vi)ではプライマー A2-T5-TAG (5'- CCGTCGACTACTTTTTGACGGAACTATTCC -3';配列番号:47)を用いた。PCRによって増幅された各種NtmybA2C末端欠失変異体をコードするDNA断片をSalIで切断後、pEXP35SのSalIで切断して生成される部位にセンス方向に挿入し、(i)、(ii)、(iii)、(v)、(vi)を構築した。
(iv) についてはpEXP-NtmybA2をEcoRIで切断し、切り出されるDNAを除いた後に、セルフライゲーションを行い構築した。また、(i)〜(vi)のプラスミドと実質的に機能が同等なプラスミドは以下のように構築可能である。
(vii)   pP35S-NtmybA2T1 (705番目のアミノ酸からC末端までを欠失) 
(viii)   pP35S-NtmybA2T2 (631番目のアミノ酸からC末端までを欠失)
(ix)   pP35S-NtmybA2T3 (569番目のアミノ酸からC末端までを欠失)
(x)  pP35S-NtmybA2ΔEcoRI (413番目のアミノ酸からC末端までを欠失)
(xi)  pP35S-NtmybA2T4 (243番目のアミノ酸からC末端までを欠失)
(xii)  pP35S-NtmybA2T5 (188番目のアミノ酸からC末端までを欠失)
(vii)、(viii)、(ix)、(xi)、(xii)のプラスミドはpP35S-NtmybA2を鋳型にしてPCRを用いて欠失DNA断片を作成する。
PCRに用いるプライマーはプライマー 35S0 （5'- TATCCTTCGCAAGACCCTTC -3';配列番号:48)と(vii)ではプライマー A2-T1-TAG (5'- CCGTCGACTATGCAGCCTCGTCAAACATAA -3';配列番号:43)、(viii)ではプライマー A2-T2-TAG (5'- CCGTCGACTACCACAGCCTAAATGGAGTA -3';配列番号:44)、(ix)ではプライマー A2-T3-TAG (5'- CCGTCGACTATATGCTCGAATTTTCGTTCAC -3';配列番号:45)、(xi)ではプライマー A2-T4-TAG (5'- CCGTCGACTAGCATTCTGAAGCTTCCTCC -3';配列番号:46)、(xii)ではプライマー A2-T5-TAG (5'- CCGTCGACTACTTTTTGACGGAACTATTCC -3';配列番号:47)を使用する。PCRによって増幅された各種NtmybA2C末端欠失変異体をコードするDNA断片をSalIで切断後、pP35SのSalIで切断して生成される部位にセンス方向に挿入し、(vii)、(viii)、(ix)、(xi)、(xii)を構築する。(x)についてはpP35S-NtmybA2をEcoRIを用いて部分切断し、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化した後に、セルフライゲーションを行い構築する。
NACK1 promoter-LUCプラスミドの構築
pDO432プラスミド(Nishiuchi et al., Plant Mol. Biol., 29:599(1995))をHindIIIとSacIで切断し生成されるDNA断片をpBI221 (Clontech社製)をHindIIIとSacIで切断して、CaMV 35S プロモーター領域を含むDNA断片を除いた部位に挿入し、pUC-LUCを構築した。NACK1プロモーター領域については常法によりタバコ培養細胞BY-2より調整したゲノムDNAを鋳型に用い、PCRにより調整した。PCR反応に用いたプライマーはNAK1P-3（5'- CCGGATCCTCTAGATTTGCGCCTGAGATCTGAG -3'; 配列番号:58)及びNAK1P-5（5'- CCAAGCTTCATAAGCCGATAGAATTCACC -3';配列番号:59)である。増幅されたNACK1 プロモーター領域をBamHIとHindIIIで切断した後に、 pUC-LUCのBamHIとHindIIIの切断により生成される部位に挿入して、NACK1 promoter-LUCプラスミドを構築した。すなわちNACK1 promoter-LUCプラスミドは制御配列としてMSA配列を二ヶ所含むNACK1プロモーターによりLUCが発現するプラスミドである。
【００７１】
（２）C末端領域欠失NtmybA2タンパク質の転写活性化能の変化
実施例３の（２）に記述の方法によりBY-2プロトプラストへプラスミドの導入を行った。エフェクタープラスミドとしては前記（１）の(i)から(vi)までのNtmybA2欠失変異体を発現するプラスミドおよび、全長NtmybA2を発現するプラスミドであるpEXP-NtmybA2、GUSを発現するプラスミドであるpEXP-GUSを用いた。レポーターとしてNACK1 promoter-LUCプラスミドを用いた。レポーター遺伝子の転写活性化はLUC活性として測定した。LUCおよびR-LUC活性の測定方法は実施例３と同様に行なった。R-LUC活性でLUC活性を標準化した値をLUC比活性とした。
pEXP-GUSをエフェクタープラスミドとしたLUC比活性を１とすると、pEXP-NtmybA2では約4倍のLUC比活性が認められた。(i)〜(iii)のプラスミドを用いるとpEXP-NtmybA2よりLUC比活性が上昇し、特に(ii)のプラスミドを用いた場合では約45倍ものLUC比活性の上昇が認められた。(iv)のプラスミドを導入した場合には(iii)と比較してLUC比活性は、pEXP-NtmybA2と同程度まで低下した。(v)、(vi)ではpEXP-NtmybA2よりもLUC活性は低下した。以上の結果より、NtmybA2タンパク質の631番目のアミノ酸からC末端側の領域はNtmybA2の転写活性化能を負に制御する領域であり、413から630番目のアミノ酸配列は転写活性化能を促進する領域として機能することは明白である。また、569番目のアミノ酸からC末端側まで、特に631番目からC末端までの配列を欠失させることによってNtmybA2の転写活性化能を飛躍的に向上できること、また188番目からC末端までのアミノ酸を欠失、および243番目からC末端までのアミノ酸を欠失によってNtmybA2の転写活性化能を低下できることが示された(図５)。
【実施例７】
【００７２】
NtmybA2T5のNtmybA2またはNtmybBに対するドミナントネガティブ効果
実施例６においてNtmybA2タンパク質の１〜242番目のアミノ酸を用いたNtmybA2T4、NtmybA2タンパク質の１〜187番目アミノ酸を用いたNtmybA2T5、では全長NtmybA2よりも転写活性化能が低下した。これは、転写活性化能力が低下、もしくは消失してNtmybA2T4やNtmybA2T5が標的プロモーターのMSA配列に結合することにより、内在性NtmybA1、NtmybA2やNtmybBのMSA配列への結合を阻害し、ドミナントネガティブに機能することを示している。NtmybA２T5のドミナントネガティブ機能をより明確に示すために、NtmybA2とNtmybA2T5および、NtmybBとNtmybA2T5の共発現によるCYMプロモーターの転写活性化を定量化した。
実施例３の（２）に記述の方法により調整したBY-2プロトプラストにNACK1 プロモーター：LUCプラスミド(10μg/サンプル)、R-LUCプラスミド(1μg/サンプル)に加え、pEXP-NtmybA2(10μg/サンプル)＋pEXP-NtmybA2T5(10μg/サンプル)、またはpEXP-NtmybA2(10μg/サンプル)＋pEXP-GUS(10μg/サンプル)を導入し、実施例３の（４）に記述の方法によりLUC活性、R-LUC活性を測定した。プラスミドの導入は5反復で行った。LUC活性をR-LUC活性で標準化したLUC比活性はpEXP-NtmybA2+pEXP-GUSの組み合わせよりもpEXP-NtmybA2+pEXP-NtmybA2T5の組み合わせで低下した。この結果はNtmybA2T5がNtmybA2に対してドミナントネガティブに機能することを証明するものである。
また、NACK1 プロモーター：LUCプラスミド(10μg/サンプル)、R-LUCプラスミド  (1μg/サンプル)に加え、pEXP-NtmybB(10μg/サンプル)＋pEXP-NtmybA2T5(10μg/サンプル)、またはpEXP-NtmybB(10μg/サンプル)＋pEXP-GUS(10μg/サンプル)を導入し、実施例３の（４）に記述の方法によりLUC活性、R-LUC活性を測定した。LUC活性をR-LUC活性で標準化したLUC比活性はpEXP-NtmybB+pEXP-GUSの組み合わせよりもpEXP-NtmybB+pEXP-NtmybA2T5の組み合わせで上昇した。この結果はNtmybA2T5がNtmybBに対してドミナントネガティブに機能することを証明するものである（図６)。
【実施例８】
【００７３】
NtmybA2、NtmybA2T2、およびNtmybB形質転換シロイヌナズナにおける生育の改変
転写活性化型であるNtmybA2、NtmybA2の転写活性化能が飛躍的に向上した変異体であるNtmybA2T2、転写抑制型であるNtm ybBをCaMV 35Sプロモーターにより恒常的に発現する形質転換シロイヌナズナを作出し、生育を比較した。
【００７４】
（１）形質転換用プラスミドの構築
pEXP-NtmybA2T2をKpnIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにXhoIで切断することによって生成されるDNA断片を、国際出願番号PCT/JP02/12268に記載のpBI-RHLをSalIとSmaIで切断することによって生成される部位に挿入し、pBIHm-NtmybA2T2を構築した。pBIHm-NtmybA2T2をSalIで切断し、切り出されるNtmybA2T2を含んだDNA断片を取り除き生成される部位に、pEXP-NtmybBあるいはpEXP-NtmybA2をSalIで切断して生成されるDNA断片を挿入し、pBIHm-NtmybB、pBIHm-NtmybA2を構築した。プラスミドpTH2（Chiuら,Curr Biol 1996 Mar 1;6(3):325-30 ）をNotIで切断し、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化した後にSalIで切断して生成されるsGFPを含んだDNA断片をpBIHm-NtmybA2T2をSalIとSmaIで切断し、NtmybA2T2を含んだDNA断片を取り除いて生成される部位に挿入してpBIHm-GFPを構築した。
すなわち、前記(i) pBIHm-NtmybA2T2、(ii) pBIHm-NtmybB、(iii) pBIHm-NtmybA2及び(iv) pBIHm-GFPは、CaMV 35Sプロモーターによりそれぞれ、NtmybA2T2、NtmybB、NtmybA2、sGFPを発現するプラスミドベクターであり、アグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。これらのプラスミドで形質転換された植物はハイグロマイシンを用いることによって形質転換体を選抜可能である。
前記の(i)から(iv)と実質的に機能が同等なプラスミドは以下に示すように構築可能である。pP35S-NtmybA2T2をSacIとApaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し生成されるDNA断片を、国際出願番号PCT/JP02/12268  に記載のpBI-RHLをSalIで切断し、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化することによって生成される部位に挿入し、pBIHm35S-NtmybA2T2を構築する。pBIHm35S-NtmybA2T2をSalIで切断し、切り出されるNtmybA2T2を含んだDNA断片を取り除き生成される部位に、pP35S-NtmybBあるいはpP35S-NtmybA2をSalIで切断して生成されるDNA断片を挿入し、pBIHm35S-NtmybB、pBIHm35S-NtmybA2を構築する。プラスミドpTH2（Chiuら,Curr Biol 1996 Mar 1;6(3):325-30 ）をNotIとSalIで切断し、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化して生成されるsGFPを含んだDNA断片をpBIHm35S-NtmybA2T2をSalIで切断した後にKlenow断片を用いて突出末端を平滑化して、NtmybA2T2を含んだDNA断片を取り除いて生成される部位に挿入してpBIHm35S-GFPを構築する。
すなわち、前記(v) pBIHm35S-NtmybA2T2、(vi) pBIHm35S-NtmybB、(vii) pBIHm35S-NtmybA2及び(viii) pBIHm35S-GFPは、CaMV 35Sプロモーターによりそれぞれ、Ntm ybA2T2、NtmybB、NtmybA2、sGFPを発現するプラスミドベクターであり、アグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。これらのプラスミドで形質転換された植物はハイグロマイシンを用いることによって形質転換体を選抜可能である。
【００７５】
（２）シロイヌナズナの形質転換
前記（１）で構築した(i)〜(iv)のバイナリーベクターを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株(Agrobacterium tumefacience EHA101 strain)を形質転換し、これらのプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いてFloral dip法(Clough et al.(1998) Plant J. 16:735) によりシロイヌナズナ  エコタイプCol-0を形質転換した。アグロバクテリウムを感染させた花芽より得られた種子を次亜塩素酸と滅菌水を用いて滅菌し、ハイグロマイシン25μg/ml、カルベニシリン100μg/mlを含むMS倍地上に播種した。ハイグロマイシン添加培地上で生育可能な形質転換植物を選択した。
【００７６】
（３）NtmybA2、NtmybA2T2、およびNtmybB形質転換シロイヌナズナにおける生育の改変
選抜した形質転換植物は、角型2号シャーレ(栄研化学社製)中で固化したMS培地(MS無機塩、30% ショ糖、0.4％ ゲランガム)に移植し、垂直に静置して16時間の照明、8時間の暗黒、21℃の条件で栽培を行った。播種後25日後に主根の長さを測定した。pBIHm-GFPを用いて形質転換した対照区では主根の長さが31mm〜35mmの形質転換ラインが最も多かったが、pBIHm-NtmybA2、pBIHm-NtmybA2T2 、pBIHm-NtmybBを用いて形質転換した形質転換植物では主根長が21mm〜25mmの形質転換ラインが最も多く分布し、生育が抑制された植物が作出された。以上の結果より、NtmybA2、NtmybB、NtmybA2T2を恒常的に発現する形質転換シロイヌナズナは生育が改変されていることが明らかとなった。
【実施例９】
【００７７】
NtmybA2T2および、NtmybA2T5の形質転換シロイヌナズナの生育の改変
ドミナントネガティブ型であるNtmybA2T5をCaMV 35Sプロモーターにより恒常的に発現する形質転換シロイヌナズナを作出し、生育を比較した。
NtmybA2の転写活性化能が飛躍的に向上した変異体であるNtmybA2T2をサイクリンB(CYM)プロモーターにより発現する形質転換シロイヌナズナを作出し、生育を比較した。
【００７８】
（１）形質転換用プラスミドの構築
pDBIHm-NtmybA2T5プラスミドの構築
pUC19(Takara社製)をSmaIで切断したサイトにインビトロジェン社より市販されているReading Frame AのDNA断片を挿入し、pUC-RFAを生成した。国際出願番号PCT/JP02/12268  に記載のプラスミドpBI-RHLをBamHIとSpeIで切断したサイトにpUC-RFAをBamHIとSpeIで切断して切り出されるReading Frame Aを挿入し、pDESTBI-1を構築した。
プラスミドpENTR2B(Invitrogen社製)をKpnIとXhoIで切断して生成される部位にpEXP-NtmybA2T5をKpnIとXhoIで切り出されるDNA断片を挿入し、pENTR-NtmybA2T5を構築した。pDESTBI-1とpENTR-NtmybA2T5を混合し、Gateway LR Clonase mix(Invitrogen社製)を用いた部位特異的組換え反応によりpDBIHm-NtmybA2T5を構築した。Gateway LR Clonase mixを用いた反応は試薬に添付のプロトコールに従って実施した。pDBIHm-NtmybA2T5はCaMV 35Sプロモーターにより、NtmybA2T5を発現するプラスミドベクターであり、アグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。これらのプラスミドで形質転換された植物はハイグロマイシンを用いることによって形質転換体を選抜可能である。
pDBIHm-NtmybA2T5と実質的に機能が同等なプラスミドは以下の様にして構築可能である。プラスミドpP35S-NtmybA2T5をSacIIとApaIで切断した後に、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化する。切り出されるDNA断片をpENTR2B(Invitrogen社製)をKpnIとXhoIで切断した後にKlenow断片を用いて突出末端を平滑化して生成される部位に挿入し、pENTR35S-NtmybA2T5を構築する。pDESTBI-1とpENTR35S-NtmybA2T5を混合し、Gateway LR Clonase mix(Invitrogen社製)を用いた部位特異的組換え反応によりpDBIHm35S-NtmybA2T5を構築する。Gateway LR Clonase mixを用いた反応は試薬に添付のプロトコールに従って実施する。pDBIHm35S-NtmybA2T5はCaMV 35Sプロモーターにより、NtmybA2T5を発現するプラスミドベクターであり、アグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。これらのプラスミドで形質転換された植物はハイグロマイシンを用いることによって形質転換体を選抜可能である。
pPCYM-NtmybA2T2プラスミドの構築
常法によりニチニチソウより調整したゲノムDNAを鋳型に用い、PCRによりCYMプロモーター領域を調整した。PCR反応に用いたプライマーはCYM3Pst（5'- AACTGCAGTCTTCAATAGAATTTCTTCCAG -3'; 配列番号:60)及びCYM5-1（5'- CCAAGCTTACCCATAAATTGTTGGTAAA -3';配列番号:57)である。増幅されたCYM プロモーター領域をPstIとHindIII で切断した後に、 pPZP211(Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Biol. 25：989(1994))のPstIとHindIIIの切断により生成される部位に挿入して、pPZP211-CYMプラスミドを構築した。pEXP-NtmybA2T2をSalIで切断し切り出さされる断片をpPZP211-CYMをSalIで切断し生成される部位に挿入し、pPCYM-NtmybA2T2を構築した。pPCYM-NtmybA2T2はCYMプロモーターによってNtmybA2T2を発現するプラスミドベクターであり、アグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。このプラスミドで形質転換された植物はカナマイシンを用いることによって形質転換体を選抜可能である。pPCYM-NtmybA2T2プラスミドは以下のように構築可能である。pP35SNtmybA2T2をSalIで切断して切り出されるDNA断片をpPZP211-CYMをSalIで切断して生成される部位に挿入することで構築可能である。
【００７９】
（２）シロイヌナズナの形質転換
前記（１）で構築したpDBIHm-NtmybA2T5、pPCYM-NtmybA2T2および対象区としてpBIHm-GFPを用いて実施例５で示した方法により、シロイヌナズナ  エコタイプCol-0を形質転換し、形質転換植物を選抜した。pDBIHm-NtmybA2T5およびpBIHm-GFPによって形質転換した形質転換植物の選抜はハイグロマイシン25μg/ml、カルベニシリン100μg/mlを含むMS倍地上で、pPCYM-NtmybA2T2によって形質転換した形質転換植物の選抜はカナマイシン 50μg/ml、カルベニシリン100μg/mlを含むMS倍地上で生育可能な形質転換植物を選択した。形質転換ラインはバーミキュライトとピートモスを1:1で混合した土に移植し、馴化の後に、16時間の照明、8時間の暗黒、21℃の条件で栽培を行った。これらのラインよりそれぞれ自殖による次世代の種子を得て解析に用いた。
【００８０】
（３）NtmybA2変異体によるシロイヌナズナの生育速度の改変
形質転換して得られた植物の自殖による次世代種子を次亜塩素酸と滅菌水を用いて滅菌し、角型2号シャーレ(栄研化学社製)中で固化したMS培地(MS無機塩、30% ショ糖、0.4％ ゲランガム)に播種し、4℃、暗黒化で4日間春化処理を行った。春化処理後、垂直に静置して16時間の照明、8時間の暗黒、21℃の条件で栽培を行った。春化処理後、３日後に主根の長さを測定した。
対照区としてpBIHm-GFPによって形質転換されたラインと比較すると、pDBIHm-NtmybA2T5やpPCYM-NtmybA2T2によって形質転換されたラインでは複数のラインにおいて、生育が抑制された表現型が観察された。
【実施例１０】
【００８１】
NtmybA1とNtmybA2の発現抑制による植物体の生育抑制
内在性遺伝子の発現抑制の手段としてVirus Induced Gene silencing (VIGS)を用いて、NtmybA1とNtmybA2の発現が抑制された植物の表現型を観察できる。VIGSに用いたLgJ、LGFPJプラスミドは東京大学 大学院 総合文化研究科 広域科学専攻 生命環境科学系渡辺雄一郎助教授より分譲頂いた。LgJは植物RNAウイルスであるトマトモザイクウイルス(ToMV)を改変したウイルスをコードするDNAが挿入されたプラスミドである。ToMVの改変点としては複製酵素をコードする領域にアミノ酸置換を導入し、ウイルスの増殖量を低下させることによって病徴を軽減していること、新たなプロモーター配列を導入し外来DNAの発現が可能であること、外来DNA発現用プロモーターの下流にGateway systemの認識配列が挿入されており、Invitrogen社より市販されているLR反応を用いて外来DNAを挿入可能である点が挙げられる。LgJプラスミドよりIn Vitro RNA Transcriptionを行うことにより植物に対して感染性をもった組み換えウイルスRNAが得られる。この組換えウイルスが植物に感染すると外来DNA由来の２本鎖RNAが複製中間体として植物内で発現し、外来DNAとして感染植物由来のDNAを用いていた場合には、対応する植物の内在性遺伝子発現が抑制される。LGFPJはLgJにGFPをコードするDNAが挿入されており、ウイルス感染がGFPの発現により確認可能である。
【００８２】
（１）プラスミドの構築
LA1A2Jの構築
pGEMe-OH53i6 を鋳型としてプライマーVA1-F（5'- ATAGTTCTGTTAAAAAGAAACTG -3';配列番号:37)とプライマーVA1-R（5'- TAACATTGAACAAGAAACATCTTG -3';配列番号:38)を用いてPCRを行い、NtmybA1 cDNAの一部分を含むDNA断片を増幅した。OH60を鋳型としてプライマーVA2-F（5'- ACAAAGTCTTCTCTAACTACG -3';配列番号:39)とプライマーVA2-R（5'- AGCTTCGAGTCGTCTAGCG -3';配列番号:40)を用いてPCRを行い、NtmybA2 cDNAの一部分を含むDNA断片を増幅した。これらのP CR反応にはPyrobest(Takara社製)を用いた。これらのDNA断片をpBluescript(Stratagene社製)をEcoRVで切断して生成されるサイトに挿入し、pBS-VA1、およびpBS-VA2を構築した。PBS-VA2をSmaIとSalIで切断し、切り出されたDNA断片をpBS-VA1をHindIIIで切断、Klenow断片を用いて平滑化し、さらにSalIで切断して生成されるサイトに挿入し、pBS-VA1A2を構築した。pBS-VA1A2を鋳型にプライマーB1T3（5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAATTAACCCTCACTAAAGGG -3';配列番号:41)とプライマーB2T7（5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAATACGACTCACTATAGGGC -3';配列番号:42)を用いてPCRを行い、NtmybA1の一部分を含むDNA断片およびNtmybA2の一部分を含むDNA断片がタンデムに接続され両末端にGateway system (Invitrogen社)のattB1、attB2配列が付加されたDNA断片を得た。このDNA断片とプラスミドpDONR201 (Invitrogen社)を混合し、BP Clonase(Invitrogen社)を用いてBP反応を行い、pDONOR-VA1A2を得た。pDONR-VA1A2をLgJと混合し、LR Clonase(Invitrogen社)反応を行い、LA1A2Jを得た。BP Clonase、およびLR Clonaseを用いた反応については試薬に添付の説明書に従った。
LA1A2J 5μgをMluIを用いて切断し、プラスミドを直鎖化した。フェノール/クロロホルム処理後、エタノール沈殿を行い、10μlの滅菌水に再溶解した。
直鎖化したLA1A2Jを鋳型にin vitro transcriptionを行った。すなわち、5μlの10xT7 buffer (Roche社製、T7 RNA Polymeraseに付属)、2.5μlの0.1M DTT、1μlのRnase-Inhibitor (Roche社製、40units/μl)、5μlのA/C/U/G mixture (ATP、CTP、UTPはそれぞれ20mM。GTPは2mM。)、2.5μlの5mM m7G[5']ppp[5']G (CAP、Roche社製)、14μlの滅菌水、10μl 直鎖化LA1A2Jを混合し、37℃で5分インキュベートした。10μlのT7 RNA Polymerase (20units/μl、Roche社製)を加えさらに37℃で25分インキュベートした。その後、5μlの20mM GTPを加え、37℃で35分インキュベートした。反応終了後、2μlの反応液をアガロースゲルを用いて電気泳動し、RNAが転写されていることを確認した。
LA1A2J RNAはNicotiana benthamiana に接種した。25℃で栽培し、4〜5葉期のNicotiana benthamianaの上位2葉にカーボランダムを薄く振りかけ、1枚の葉あたり、5μlのLA1A2J RNAを接種した。接種後、5分以内に接種葉を滅菌水を用いて洗浄した。5個体に接種を行い、接種後は23℃で栽培を行なった。
対照区としてLGFPJについてもLA1A2Jと同様に、in vitro RNA transcriptionを行い、LGFPJ RNAの接種を行なった。
【００８３】
（２）NtmybA1とNtmybA2の発現が抑制された植物の生育抑制。
NtmybA1およびNtmybA2 mRNA発現量のRT-PCRによる確認
LA1A2JとLGFPJの感染植物のNtmybA1およびNtmybA2のmRNA発現量をRT-PCRにより確認する。草丈が抑制されたLA1A2J RNA接種植物、およびLGFPJ RNA接種植物の茎頂部分よりRNeasy plant mini kit (QIAGEN社)を用いて総RNAを抽出する。総RNAを鋳型としてSuperscript First-strand syntesis system for RT-PCR(Invitrogen社) を用いてcDNAを合成する。得られたcDNAを鋳型として用い、NtmybA1および、NtmybA2の検出にはプライマーA2-583F（5'- GTACAATGCTTGCACCGGTGG -3';配列番号:33)とプライマーA2-1089R（5'- TGTAGACTGGGAACAGCCAGC -3';配列番号:34)を用いる。ｃDNA量の標準化にはEF1αのmRNAの発現量を用い、プライマー
EFF（5'- AGACCACCAAGTACTACTGC -3';配列番号:35)とプライマー EF R（5'- GTCAAGAGCCTCAAGGAGAG -3';配列番号:36)を用いる。合成されたcDNA 50μlのうち1μlを使用してPCR反応を行うことによって用いたcDNA量の標準化とNtmybA1、NtmybA2発現量が解析できる。
LA1A2J RNAを接種し、内在性NtmybA1およびNtmybA2のmRNA発現量が抑制されたNicotiana benthamoianaの植物体においては対照区であるLGFPJ RNAの接種区と比較すると生育が極度に抑制される。
以上より、内在性NtmybA1およびNtmybA2の発現量を減少させることで植物体の生育の抑制が可能であることが明らかになる。
【００８４】
（３）NtmybA1とNtmybA2の発現が抑制された植物における細胞質分裂の抑制、M期進行の抑制。
前記（２）の内在性NtmybA1およびNtmybA2の発現が抑制されたタバコ植物個体の葉における表皮細胞、気孔孔辺細胞を観察する。
葉の裏面より、表皮細胞をピンセットを用いて剥ぎ取り、1%オルセインを含有する乳酸、プロピオン酸の等量混合物で核染色を行う。これらの細胞を微分干渉顕微鏡を用いて観察すると、複数個の核を持った多核化した細胞が観察される。また、多核化細胞に存在する核は大きな核や小さな核が観察される。多核化した細胞は核分裂が進行し、細胞質分裂が阻害されることを、大きさの異なった核の存在は核分裂の異常、およびM期のスキップが起こったための核内染色体の倍数化を示す。すなわち、NtmybA1およびNtmybA2の発現が抑制された細胞ではM期の進入、進行、終了のステップに影響を示している。以上より、NtmybA1およびNtmybA2はM期の正常な進行に必須な遺伝子であることが明らかになる。
【００８５】
（４）NtmybA1とNtmybA2の発現が抑制された植物における細胞周期の変化
前記（２）の内在性NtmybA1およびNtmybA2の発現が抑制されるタバコ植物個体の葉における核内のDNA含量を測定する。接種した葉より３枚上位にある葉を切断し、シャーレ中で1mlのCystain UV Precise P (High Resolution DNA staining kit、Pratec社製)に含まれているnuclei extraction buffer を加え、剃刀の刃を用いて1分間、細断する。10分間室温に保った後に、Partec Cell Trics Disposable filter units (50μm mesh、Pratec社製)を用いてろ過し、ろ液にCystain UV Precise P (High Resolution DNA staining kit、Pratec社製)に含まれているstaining buffer を2ml加える。測定はPloidy Analyser PA (Pratec社製)を用いて行う。
内在性NtmybA1およびNtmybA2の発現が抑制されたタバコ植物個体の葉より調整した核では対象区と比較してS期、G2期を示す４Cのピークが増大しており、さらに対象区では認められない倍数化した核を示す８Cのピークも認められる。４Cのピークが増大していることは、S期、G2期の進行が遅延してること、または、M期への進入の遅延を示している。また倍数化した８Cのピークの存在はM期への進入の阻害、またはM期のスキップを示している。これらより、NtmybA1およびNtmybA2はM期の正常な進行に必須な遺伝子であり、これらの遺伝子発現を抑制することで細胞周期を改変できることが明らかになる。
【実施例１１】
【００８６】
Ntmybの発現が抑制された形質転換タバコ培養細胞BY2の増殖速度の改変
（１）NtmybA1、NtmybA2、NtmybB RNAi用プラスミドの構築
pEXP35SをKpnIで切断し、T4 DNA Polymeraseを用いて突出末端を平滑化した後に、EcoRVで切断して切り出されるDNA断片をpPZP211をEcoRIとHindIIIで切断後にKlenow断片を用いて突出末端を平滑化して生成される部位に挿入し、pPZP211-35Sを構築した。
pBI121(Clontech社製)を鋳型として配列番号:61（5'- GGAATTCGTGTGATATCTACCCGCTTCG -3';配列番号:61)と配列番号:62（5'- CGGGATCCGTTTTTCACCGAAGTTCATGC -3';配列番号:62)で示したプライマーを用いてPCRを行い、GUSのORFを含むDNA断片を増幅した。このDNA断片をEcoRIとBamHIで切断後に、pBluescriptII(SK+, Stratagene社製)をEcoRIとBamHIで切断して生成される部位に挿入し、pGUS1.0を構築した。
OH60を鋳型としてプライマーA2ia3（5'- TTGAATTCCAAGTCTTGGGCTTGACAGAAGAG -3';配列番号:63)とプライマーA2ia5(5'- TTCTCGAGAAGCTTCGTCAAGAATCATTCTCTGATCTG -3';配列番号:64)を用いてPCR反応を行い、得られたNtmybA2の一部分をコードするDNA断片をEcoRIとXhoIで切断した。このDNA断片をpGUS1.0をEcoRIとXhoIで切断して生成される部位に挿入し、pGUS-A2.RNAi-aを構築した。
OH60を鋳型としてプライマーA2ib3（5'- TTGGATCCAAGTCTTGGGCTTGACAGAAGAG -3';配列番号:65)とプライマーA2ib5(5'- CCTCTAGACTAGTGTCGACCGTCAAGAATCATTCTCTGATCTG -3';配列番号:66)を用いてPCR反応を行い、得られたNtmybA2の一部分をコードするDNA断片をBamHIとXbaIで切断した。このDNA断片をpGUS-A2.RNAi-aをBam HIとXbaIで切断して生成される部位に挿入し、pGUS-A2.RNAiを構築した。
OH88を鋳型としてプライマーBia3（5'- TTGAATTCTTGTTGCCTGATAAGGTCGTCTC -3';配列番号:67)とプライマーBia5(5'- TTCTCGAGAAGCTTGAATTTGCCTAGTAGGTTAGTGC -3';配列番号:68)を用いてPCR反応を行い、得られたNtmybBの一部分をコードするDNA断片をEcoRIとXhoIで切断した。このDNA断片をpGUS1.0をEcoRIとX hoIで切断して生成される部位に挿入し、pGUS-B.RNAi-aを構築した。
OH88を鋳型としてプライマーBib3（5'- TTGGATCCTTGTTGCCTGATAAGGTCGTCTC -3';配列番号:69)とプライマーBib5(5'- CCTCTAGACTAGTGTCGACGAATTTGCCTAGTAGGTTAGTGC -3';配列番号:70)を用いてPCR反応を行い、得られたNtmybBの一部分をコードするDNA断片をBamHIとXbaIで切断した。このDNA断片をpGUS-B.RNAi-aをBamHIとXbaIで切断して生成される部位に挿入し、pGUS-B.RNAiを構築した。
【００８７】
pGUS-A2.RNAiをHindIIIで切断して切り出されるDNA断片をpPZP211-35SをHindIIIで切断して生成される部位に挿入し、pPZP211-35S:A2RNAiを構築した。
pGUS-B.RNAiをHindIIIとSalIで切断して切り出されるDNA断片をpPZP211-35SをHindIIIとSalIで切断して生成される部位に挿入し、pPZP211-35S:B:RNAiを構築した。
pPZ P211-35S:A2RNAi、およびpPZP211-35S:B:RNAiはCaMV 35Sプロモーターにより、NtmybA2の部分配列、またはNtmybBの部分配列が逆位反復で発現し、植物内でNtmybA2の部分配列、またはNtmybBの部分配列が二本鎖RNA形態をとるプラスミドベクターであり、アグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。これらのプラスミドで形質転換された植物はカナマイシンを用いることによって形質転換体を選抜可能である。
これらのプラスミドで形質転換されたタバコ植物体や、タバコ培養細胞では発現した二本鎖RNAによりNtmybA2またはNtmybBに対するRNAi効果が得られるプラスミドである。
pPZP211-35S:A2RNAi、およびpPZP211-35S:B:RNAiと実質的に機能が同等であるプラスミドは以下の様に構築可能である。pP35SをSacIIとKpnIで切断し、T4 DNA Polymeraseを用いて突出末端を平滑化した後に、切り出されるDNA断片をpPZP211をEcoRIとHindIIIで切断後にKlenow断片を用いて突出末端を平滑化して生成される部位に挿入し、pPZP211-P35Sを構築する。pGUS-A2.RNAiをHindIIIで切断して切り出されるDNA断片をpPZP211-P35SをHindIIIで切断して生成される部位に挿入し、pPZP211-P35S:A2RNAiを構築する。pGUS-B.RNAiをHindIIIとSalIで切断して切り出されるDNA断片をpPZP211-P35SをHindIIIとSalIで切断して生成される部位に挿入し、pPZP211-P35S:B:RNAiを構築する。pPZP211-P35S:A2RNAi、およびpPZP211-P35S:B:RNAiはCaMV 35Sプロモーターにより、NtmybA2の部分配列、またはNtmybBの部分配列が逆位反復で発現し、植物内でNtmybA2の部分配列、またはNtmybBの部分配列が二本鎖RNA形態をとるプラスミドベクターであり、アグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。これらのプラスミドで形質転換された植物はカナマイシンを用いることによって形質転換体を選抜可能である。
【００８８】
（２）タバコ培養細胞BY2の形質転換
N tmybA2および、NtmybBの発現抑制が細胞増殖に与える影響を決定するために、pPZP211-35S:A2RNAi、pPZP211-35S:B:RNAiまたはベクターコントロールとしてのpPZP211 を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404 株(Agorbacterium tumefacience LBA4404 strain) を介してタバコ培養細胞BY2の形質転換を行った。新しいLSD 液体培地に植え継いで３日目のタバコ培養細胞BY-2とpPZP211-35S:A2RNAi、p PZP211-35S:B:RNAiまたはベクターコントロールとしてのpPZP211を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404 株をYEB 培地で二日間培養した培養物を混合し、25℃、暗黒下で共培養を行った。二日後にタバコ培養細胞BY2をLSD 液体培地を用いて洗浄した後に、カナマイシン 200μg/mlとカルベニシリン300 μg/mLを含有するLSD-0.2%ゲルライト培地に細胞を播き25℃暗黒下で培養を行った。22日後に得られたカナマイシン 耐性カルスにおけるNtmybA2およびNtm ybBの発現量をRT-PCRにより確認した。これらのカルスより、Invitrogen Trizol reagent (Invitrogen社)を用いて総RNAを抽出した。総RNAを鋳型としてSuperscript First-strand syntesis system for RT-PCR(Invitrogen社) を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型として用い、NtmybA2 cDNA を増幅して検出するにはプライマーOH60DB1（5'- CCGGATCCTTCCAGTTCAGCACCATGCTCTG -3';配列番号:73)とプライマーOH60DS6（5'- CCGTCGACCTAAGAGATCTGATAGTTCGATG -3';配列番号:74)を用いた。NtmybB cDNAを増幅し検出するにはプライマーOH88Bam5（5'- CCGGATCCTTCCTCAGTAAAGAAAAGATTGAACTTG -3';配列番号:71)とプライマーOH88DS2（5'- CCGTCGACTTAACAGTTAGGATCATTAACAG -3';配列番号:72)を用いた。合成されたcDNA 50μlのうち1μlを使用してPCR反応を行った。反応はEx taq(Takara社)を用い、Ex taqに付属する反応バッファー、各200μMのdATP、dTTP、dCTP、dGTP、それぞれのプライマーを各1μM用いて、50μlの液量で行った。93℃を30秒、56℃を1分、73℃を２分のステップをNtmybBの検出には27サイクル、NtmybA2の検出には26サイクル繰り返した。これらのPCR産物をアガロースゲル電気泳動を用いて解析した結果、pPZP211-35S:A2RNAiを形質転換して得られたカルスにおいてはベクターコントロールであるpPZP211形質転換カルスと比較してNtmybA2の発現量が低下しており、pPZP211-35S:B.RNAiを形質転換して得られたカルスにおいてはベクターコントロールと比較して、NtmybBの発現量が低下していた。
【００８９】
（３）NtmybA2の発現量が抑制された形質転換BY２細胞における細胞増殖速度の変化
前述のpPZP211-35S:A2RNAiを形質転換し、NtmybA2 mRNAの発現量が抑制されていたカルスの大きさをベクターコントロールと比較したところ、カルスの大きさが小さくなることが示された（図7）。
これらのカルスを構成する細胞の細胞周期を調べるために核内DNA含量を測定した。方法は凍結保存したカルス1個につきCystain UV Precise P (High Resolution DNA staining kit、Pratec社製)に含まれているnuclei extraction buffer
を1ml加え、溶解後、混合した。10分間室温に保った後に、Partec Cell Trics Disposable filter units (50μm mesh、Pratec社製)を用いてろ過し、ろ液にCystain UV Precise P (High Resolution DNA staining kit、Pratec社製)に含まれているstaining buffer を2ml加えた。測定はPloidy Analyser PA (Pratec社製)を用いて実施した。
ベクターコントロールと比較したところNtmybA2 mRNAの発現が抑制されているpPZP211-35S:A2RNAi形質転換カルスではS期、G2期の染色体を示す４Cのピークが増大し、さらにベクターコントロールでは認められない染色体が倍化した核を示す8Cのピークが認められた（図8）。4Cの増大はNtmybA2の発現を抑制した細胞においてはM期への進入が起こりにくいことからS期、G2期の期間が延長することを示している。また8Cの存在はM期への進入阻害が起こり、M期がスキップすることで染色体の倍数化が起こることを示している。これらの結果、細胞周期が遅延し、細胞増殖が抑制され、小さなカルスとなったことが示された。
【００９０】
（４）NtmybBの発現量が抑制された形質転換B Y２細胞における細胞増殖速度の変化
前述のpPZP211-35S:BRNAiを形質転換し、NtmybB mRNAの発現量が抑制されていたカルスの大きさをベクターコントロールと比較したところ、カルスの大きさが大きくなることが示された（図9）。
これらのカルスを構成する細胞の細胞周期を調べるために核内DNA含量を測定した。方法は前述の（４）と同様で実施した。
ベクターコントロールと比較したところNtmybBの発現を抑制したpPZP211-35S:BRNAi形質転換カルスではS期、G2期の染色体を示す４Cのピークが減少していた（図10）。4Cの減少はS期、G2期の短縮、すなわちM期への進入が早まっていることを示している。NtmybBの発現を抑制することによってM期の進入に必須な遺伝子の発現が早まるか、あるいは発現量が上昇することにより、M期への進入が促進された結果、細胞周期が短縮され、細胞増殖が促進し、大きなカルスとなったことが示された。
【実施例１２】
【００９１】
NtmybA2、およびNtmybA2T2を恒常的に発現する形質転換タバコ培養細胞BY2における細胞増殖速度の改変
（１）NtmybA2、およびNtmybA2T2恒常的発現用プラスミドの構築
OH60をSalIで切断して得られるDNA断片を、pPZP211-35SをSalIで切断して生成される部位に挿入して、pPZP211-35S:A2を構築した。
pEXP-NtmybA2T2をSalIで切断して得られるDNA断片を、pPZP211-35SをSalIで切断して生成される部位に挿入して、pPZP211-35S:A2T2を構築した。
すなわち、pPZP211-35S:A2および、pPZP211-35S:A2T2はCaMV 35Sプロモーターによりそれぞれ、NtmybA2、NtmybA2T2を発現するプラスミドベクターであり、アグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。これらのプラスミドで形質転換された植物はカナマイシンを用いることによって形質転換体を選抜可能である。
pPZP211-35S:A2T2と実質的に同じ機能を有するプラスミドは以下のように構築可能である。pP35S-NtmybA2T2、またはOH60をSalIで切断して得られるDNA断片を、pPZP211-P35SをSalIで切断して生成される部位に挿入して、pPZP211-P35S:A2T2、およびpPZP211-P35S:A2を構築する。
【００９２】
（２）タバコ培養細胞BY2の形質転換
NtmybA2、およびNtmybA2T2の恒常的発現が細胞増殖に与える影響を決定するために、pPZP211-35S:A2、pPZP211-35S:A2T2またはベクターコントロールとしてのpZP211 を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404 株(Agorbacterium tumefacience LBA4404 strain) を介してタバコ培養細胞BY2の形質転換を行った。BY2細胞の形質転換は実施例１１の（２）に記述の方法により実施した。22日後に得られたカナマイシン 耐性カルスのNtmybA2およびNtmybA2T2のmRNA発現量をRT-PCRにより確認した。これらのカルスより、Invitrogen Trizol reagent (Invitrogen 社)を用いて総RNAを抽出した。総RNAを鋳型としてSuperscript First-strand syntesis system for RT-PCR(Invitrogen社) を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型として用い、NtmybA2およびNtmybA2T2の検出にはプライマーOH60DB1（5'- CCGGATCCTTCCAGTTCAGCACCATGCTCTG -3';配列番号:73)とプライマーOH60DS6（5'- CCGTCGACCTAAGAGATCTGATAGTTCGATG -3';配列番号:74)を用いた。合成されたcDNA 50μlのうち1μlを使用してPCR反応を行った。反応はEx taq(Takara社)を用い、Ex taqに付属する反応バッファー、各200μMのdATP、dTTP、dCTP、dGTP、それぞれのプライマーを各1μM用いて、50μlの液量で行った。93℃を30秒、56℃を1分、73℃を1分のステップを24サイクル繰り返した。これらのPCR産物をアガロースゲル電気泳動を用いて解析した結果、ベクターコントロールと比較してpPZP211-35S:A2を形質転換して得られたカルスではNtmybA2の発現量が上昇しており、pPZP211-35S:A2T2を形質転換して得られたカルスではNtmybA2T2の発現が確認された。
【００９３】
（３）NtmybA2および、NtmybA2変異体を恒常的に発現する形質転換BY-2細胞における細胞増殖速度の変化
前述のpPZP211-35S:A2、またはpPZP211-35S:A2T2を形質転換し、NtmybA2あるいはNtmybA2T2 mRNAの発現が確認されたカルスの大きさをベクターコントロールと比較したところ、カルスの大きさが小さくなることが示された（図11）。
これらのカルスを構成する細胞の細胞周期を調べるために核内DNA含量を測定した。方法は前述の実施例１１の（３）と同様に実施した。
ベクターコントロールと比較したところ恒常的にNtmybA2を発現しているカルスではS期、G2期の染色体を示す４Cのピークが減少していた。この傾向はNtmybA2の転写活性化能を向上させた変異体であるNtmybA2T2を恒常的に発現させたカルスでさらに顕著に認められた（図13）。
また、これら形質転換細胞の顕微鏡観察の結果、多核化した細胞は認められなかったことから検出された核の数は細胞数を表す。得られた細胞数をベクターコントロールとNtmybA2形質転換カルスやNtmybA2T2形質転換カルスで比較した結果、カルスの大きさと相関して、NtmybA2では細胞数が減少しており、NtmybA2T2ではさらに細胞数の減少が顕著であることが示された（図12）。
これらはNtmybA2およびNtmybA2変異体が恒常的に発現しているカルスにおいてはM期への進入が加速されるが、細胞増殖が抑制され、細胞数が減少することから小さなカルスとなったことが示された。
【実施例１３】
【００９４】
NtmybBの発現量が変化した形質転換タバコにおける生育の変化
（１）プラスミドの構築
OH8 8をSalIで切断して得られるDNA断片を、pPZP211をSalIで切断して生成される部位に挿入して、pPZP211-35S:Bを構築した。
（２）形質転換タバコの作出
RNAiの効果により内在性NtmybBの発現を抑制した形質転換タバコを作出するために、実施例１１の（３）に記述のpPZP211-35S:B.RNAiプラスミドを用いた。恒常的にNtmybBが発現する形質転換タバコを作出するためにpPZP211-35S:Bプラスミドを用いた。それぞれ、pPZP211-35S:B.RNAi、pPZP211-35S:BまたはベクターコントロールとしてのpPZP211 を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404 株(Agorbacterium tumefacience LBA4404 strain) を介してリーフディスク法によりニコチアナ  タバカム  品種SR1(Nicotiana tabacum ver. SR1) の形質転換を行った。
【００９５】
（３）形質転換タバコの生育変化
得られたカナマイシン 耐性個体を栽培し自殖種子を得た。得られた種子を、エタノールと次亜塩素酸によって滅菌後、カナマイシン50μg/mLを含有するMS-0.2% ゲルライト培地に播種し、28℃連続照明の条件下で植物の生育を行った。栽培12日後に得られたカナマイシン耐性個体を土に移植し、28℃連続照明の条件下で25日間、植物の生育を行った。
得られたカナマイシン耐性個体のNtmybB mRNA発現量の変化をRT-PCRにより確認した。播種後22日目の植物体（生重量0.5から0.8g）より、Invitrogen Trizol
reagent (Invitrogen 社)を用いて総RNAを抽出した。総RNAを鋳型としてSuperscript First-strand syntesis system for RT-PCR(Invitrogen社) を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型として用い、NtmybB cDNAの検出にはプライマーOH88Bam5（5'- CCGGATCCTTCCTCAGTAAAGAAAAGATTGAACTTG -3';配列番号:71)とプライマーOH88DS2（5'- CCGTCGACTTAACAGTTAGGATCATTAACAG -3';配列番号:72)を用いた。ｃDNA量の標準化にはEF1αのmRNAの発現量を用い、プライマー EFF（5'- AGACCACCAAGTACTACTGC -3';配列番号:35)とプライマー EFR（5'- GTCAAGAGCCTCAAGGAGAG -3';配列番号:36)を用いた。合成されたcDNA 50μlのうち1μlを使用してPCR反応を行った。反応はEx taq(Takara社)を用い、Ex taqに付属する反応バッファー、各200μMのdATP、dTTP、dCTP、dGTP、それぞれのプライマーを各1μM用いて、50μlの液量で行った。9 3℃を30秒、56℃を1分、73℃を1分のステップを27サイクル繰り返した。EF1αの検出には同じステップを18サイクル繰り返した。これらのPCR産物をアガロースゲル電気泳動を用いて解析した結果、EF1αは全てのサンプルで等量検出されたが、pPZP211-35S:Bを形質転換した＃6のラインにおいてはベクターコントロールと比較してNtmybB cDNAの増幅量が多く、発現量が上昇していることが確認された。またpPZP211-35S:B.RNAiを形質転換した＃２のラインではベクターコントロールと比較して、NtmybB cDNA の増幅がほとんど認められず、発現量の低下が確認された。
NtmybBを恒常的に発現している形質転換タバコ(＃6)ラインにおいてはベクターコントロールと比較して生育が抑制され、内在性NtmybBをRNAiにより抑制された形質転換タバコ(＃２) においてはベクターコントロールと比較して生育が促進された（図14）。NtmybBはM期の進行に必要である遺伝子の発現を抑制するため、NtmybBを過剰発現した形質転換植物では、M期への進入や進行が遅延することで細胞分裂の抑制や細胞周期に要する時間が延長された結果、生育が抑制された表現型となったと考えられる。また逆に、内在性NtmybBの発現を抑制することによって、M期の進行に必要な遺伝子の発現時期は早まるか、あるいは発現量が増大することによってM期への進入や進行が加速し、細胞周期に要する時間が短縮された結果、生育が促進された表現型となったと考えられる。
【実施例１４】
【００９６】
NtmybA1タンパク質、NtmybA2タンパク質、Os3RmybA1タンパク質のアミノ酸配列の類似性
NtmybA1タンパク質、NtmybA2タンパク質、Os3RmybA1タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べ、比較した結果を図15〜18に示す。3反復からなるmyb DNA結合領域での高い類似性以外に、実施例６で示されたNtmybA2タンパク質の転写活性化能力を負に制御する領域(631〜1042アミノ酸)や転写活性化能力を促進する領域(413〜630アミノ酸)においてもアミノ酸配列が高い類似性を示した。転写活性化因子として機能するNtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1は転写活性化能を調節する領域においてもアミノ酸の類似性が高く、同様の制御機構を有することが示された。実施例６で示されたNtmybA2の各種欠失領域の位置と、それに対応するNtmybA1およびOs3RmybA1タンパク質の領域を図15〜18の矢印で示した。またNtmybA2の変異体であり、高い転写活性化能を示すNtmybA2T1、NtmybA2T2、NtmybA2T3の欠失領域ではNtmybA1、Os3RmybA1と特に高いアミノ酸の類似性が認められ、3種のタンパク質において保存されているアミノ酸を見出した。すなわちNtmybA2T1であれば欠失領域付近にTPSILKKRHR(配列番号：89 )で示される配列が、NtmybA2T2であればNXXTPXRLWX(配列番号：90)で示される、NtmybA2T3であればPPRFPSXDXPF(配列番号：91)で示される配列を見出した(Xは任意のアミノ酸を示す。)。NtmybA1やOs3RmybA1であればこれらの保存配列よりC末端側を欠失することでNtmybA2T1、NtmybA2T2、NtmybA2T3と同様の機能を示す変異体を作出することが出来る。
【実施例１５】
【００９７】
シロイヌナズナ3RmybとNtmybA1、NtmybA2、NtmybB、Os3RmybA1のアミノ酸配列の類似性。
シロイヌナズナでは全ゲノム中に100種以上のmyb様DNA結合領域を持つタンパク質が知られているが、myb領域が不完全な3反復の配列により構成される構造を示す3Rmybは5種のみであることが報告されている(Strackeら、Curr. Opin. Plant Biol. 4:447.(2001))。しかし、これらの3Rmybで機能が解明されているものは未だ無い。
【００９８】
（１）転写活性化型植物3Rmybにおけるアミノ酸配列の類似性
報告されているシロイヌナズナの3RmybであるAtMYB3R1(GenBank accession no. AAD46772、配列番号：75)、AtMYB3R4(GenBank accession no. AAK54739、配列番号：76)のアミノ酸配列をNtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1のアミノ酸配列と最適な形で並べ、アミノ酸配列の類似性を比較した結果を図19〜25に示した。AtMYB3R1および、AtMYB3R4のアミノ酸配列はNtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1のアミノ酸配列とmyb様DNA結合領域で高い類似性を示すことに加え、NtmybA2において転写活性化能の制御を行うために重要である領域においても高い類似性が認められた。特に、類似性の高い領域においてSILX1KRXRXLUOPJXX5X1RXX5KK(配列番号:94、本配列中でXは任意のアミノ酸、JはI、V、Lのいずれか一つのアミノ酸、OはS、Tのいずれか一つのアミノ酸、X1はK、Rのいずれか一つのアミノ酸、Uは V、Lのいずれか一つのアミノ酸、X5はD、Eのいずれか一つのアミノ酸であることを示している。)の22アミノ酸からなる特徴的な保存配列が認められた。この保存配列は、AtMYB3R1およびAtMYB3R4が、NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1と同様にサイクリンB遺伝子やNACK1遺伝子の転写活性化因子として機能することを示している。
【００９９】
（２）転写抑制型植物3Rmybにおけるアミノ酸配列の類似性
シロイヌナズナの3RmybであるAtMYB3R3(GenBank accession no. AAF25950、配列番号：77)、AtMYB3R5(GenBank accession no. AAK54740、配列番号：78)、のアミノ酸配列はmyb DNA結合領域以外では上記の転写活性化型植物3Rmybとアミノ酸配列の類似性が認められないことから、転写活性型として機能しないことが予測された。そこでAtMYB3R3とAtMYB3R5のアミノ酸配列をNtmybBのアミノ酸配列と最適な形で並べた結果、AtMYB3R3、AtMYB3R5とNtmybBとのアミノ酸の類似性を見出した。比較した結果を図26〜28に示した。AtMYB3R3および、AtMYB3R5のアミノ酸配列はNtmybBのアミノ酸配列とmyb様DNA結合領域で高い類似性を示すことに加え、それ以外の領域においても類似アミノ酸が多数存在したこと、さらにmyb DNA 結合領域よりN末端側に4つSerを中心とするSCSSXSX6(配列番号：95、本配列中でXは任意のアミノ酸、X6は K、R、D、E、Hのいずれか一つのアミノ酸であることを示している。)の7アミノ酸で構成される特徴的な保存配列が認められた。この保存配列はAtMYB3R1、AtMYB3R4、NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1のアミノ酸配列中には認められず、この保存配列は、AtMYB3R3およびAtMYB3R5がNtmybBと同様にサイクリンB遺伝子やNACK1遺伝子の転写抑制因子であることを示している。
【０１００】
（３）植物3Rmybファミリー内で活性化型、抑制型に分類されるサブファミリー
上記（１）、（２）より3Rmybは植物のmybスーパーファミリーの中においても構造的、機能的に特殊な位置を占めており、サイクリンB遺伝子やNACK1遺伝子の転写を調節する因子であることが明らかである。また3Rmybファミリー内においても配列の類似性より、転写活性化型サブファミリーと転写抑制型サブファミリーに分けることが可能であることを見出した。
アミノ酸配列を最適な形で並べるためには、CLUSTALWプログラム（http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/clustalw-j.html）を用いて行い、条件設定は全てデフォルトのまま行った。CLUSTALWプログラムの出力結果である図中のアミノ酸の類似性、同一性を示す記号については“＊”は完全に保存されているサイト、“：”は高度に保存されたサイト、“."は中程度に保存されたサイトを示す。
【実施例１６】
【０１０１】
myb DNA 結合領域を構成するアミノ酸配列の各種植物3Rmyb 間での高い保存性。
これまでに様々な植物種より myb領域が３反復した構造を示す3Rmyb のcDNA断片が単離され報告されている(Kranzら、Plant J. 21:231.(2000)) 。これらの様々な植物の3Rmybのmyb DNA結合領域のアミノ酸配列とヒトc-myb全長アミノ酸配列を比較した。
これらの様々な植物の 3Rmybのmyb DNA 結合領域のアミノ酸配列を比較した。アミノ酸配列の比較に用いた3Rmyb は、Physcomitrella patens より単離されたMYB3R-1(GenBank accession no. AAF78888、配列番号：79、図29〜31ではPhpMYB3R-1と記述) 、Adiantum raddianumより単離されたMYB3R-1(GenBank accession no. AAF67053、配列番号：80、図29〜31ではAdrMYB3R-1と記述) 、Hordeum vulgare より単離されたMYB3R-1(GenBank accession no. AAF78890、配列番号：81、図29〜31ではHvMYB3R-1 と記述) 、Secale cerealeより単離されたMYB3R-1(GenBank accession no. AAF67050、配列番号：82、図29〜31ではScMYB3R-1 と記述) 、Papaver rhoeasより単離されたputative Myb-related domain(GenBank accession no. AAF43043、配列番号：83、図29〜31ではParMYB3R-1と記述) 、AtMYB3R1(図29〜31ではAtMYB3R-1と記述)、AtMYB3R3(図29〜31ではAtMYB3R-3と記述)、AtMYB3R4(図29〜31ではAtMYB3R-4と記述)、AtMYB3R5(図29〜31ではAtMYB3R-5と記述)、NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、Os3RmybA1、ヒトc-myb(swissprot accession no.P10242、配列番号：88)である。Adiantum raddianum、Hordeum vulgare、Secale cerealeより単離されたcDNAは断片であるため、myb DNA結合領域を構成する最初の反復が完全な長さでは示されていない。
ヒトc-mybタンパク質(swissprot accession no.P10242、配列番号：88)の43番目から192番目までのアミノ酸配列にコードされるmyb DNA結合領域と、前述の植物から単離された3Rmybのアミノ酸配列を最適な形で並べた。植物3Rmybではmyb DNA結合領域の全長が含まれていないAdiantum raddianum、Hordeum vulgare、Secale cerealeは除き、その他のものは報告されている全長で比較した。c-mybとの比較によるアミノ酸配列の類似性を表すAligned Scoreを以下に示す。Aligned Scoreは、NtmybA1では62、NtmybA2では65、NtmybBでは60、AtMYB3R1では64、AtMYB3R3では64、AtMYB3R4では63、AtMYB3R5では66、PhpMYB3R-1では66、ParMYB3R-1では66、Os3RmybA1では60の値を示した。以上より植物3Rmybのmyb DNA結合領域はc-mybとの間で高く保存されていることが明らかになった。また植物3Rmybはmyb DNA結合領域をc-mybと比較し60以上のAligned Scoreを示すことが明らかになった。
【０１０２】
さらに、NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、AtMYB3R1、AtMYB3R3、AtMYB3R4、AtMYB3R5、PhpMYB3R-1、ParMYB3R-1、Os3RmybA1、HvMYB3R-1、AdrMYB3R-1、ScMYB3R-1のc-myb様DNA結合領域を示すアミノ酸配列を最適な形で並べることにより、これら13種の植物3Rmybの該領域のアミノ酸配列間に共通して保存されている配列を見出すことに成功した（図29〜31）。
すなわち、各種植物 3Rmyb間のmyb DNA 結合領域に保存されている共通のアミノ酸配列とは
(i)  W[S,T]XXE[D,E]XX[L,I,V] 
(配列番号：92に対応する。本配列中でXは任意のアミノ酸を、[ ] はその中のいずれか一つのアミノ酸が選択されることを示す。)
の9アミノ酸で示されるc-mybのmybモチーフ（MOTIFプログラム（http://motif.genome.ad.jp/）を用いての検索結果において MYB＃1(Myb DNA-binding domain repeat signature 1.)として示されるc mybの3反復 myb DNA結合領域を構成するコンセンサス配列、図中においては黒い太線で示されている配列）が任意の42アミノ酸を挟んで3反復存在することであり（図中においては矢印で示されている間のアミノ酸数）、
さらに詳細には13種のアミノ酸配列中で、同一のアミノ酸、あるいは、化学的性状の類似したアミノ酸で構成されるサイトを保存配列として示した場合に以下の150アミノ酸で示される配列に示すことが可能である（図中においては保存配列として示されている配列）。
(ii)  WTXEEDXXLXXXVXXUXGX7XWKXIAXXXXXROX5JQCLHRWQKVLXPXLJKGXWOXEEDXXJXXXJXX7XGXXKWSXJOXXXXGRIGKQCRERWUNHLXPXIXX7XXWTXXEX5XXLXXXHXXXGNX7WAEJXX7XLXGX7ODNOIKNXWXSOXKKX7
(配列番号：93に対応する。本配列中でXは任意のアミノ酸、JはI、V、Lのいずれか一つのアミノ酸、OはG、S、T、C、Aのいずれか一つのアミノ酸、X7はK、R、Hのいずれか一つのアミノ酸、UはH、W、Y、Fのいずれか一つのアミノ酸、X5はD、Eのいずれか一つのアミノ酸であることを示している。)
アミノ酸配列を最適な形で並べるためには、CLUSTALWプログラム（http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/clustalw-j.html）を用いて行い、条件設定は全てデフォルトのまま行った。
【実施例１７】
【０１０３】
植物3Rmybの単離
実施例１６で示された( i)、さらに詳細には(ii)で示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質をコードするDNAを単離するためには、実施例１の方法により可能となる。
すなわち、目的植物の細胞増殖が盛んな組織、または細胞より調整したcDNAを鋳型として、縮重プライマーを用いたPCRとNested PCRを組み合わせて行う。用いる縮重プライマーとして、1回目のPCR反応には配列番号：１と配列番号：２で示したプライマーセットで行なう。１回目の反応液を、2回目のPCRの鋳型として用いる。2回目のPCRとして行うNested PCR反応には配列番号：３と配列番号：４で示したプライマーセットで行う。2回目のPCR反応液を3回目のPCR反応の鋳型として用いる。3回目のPCRとして行うNested PCR反応には配列番号：５と配列番号：６で示したプライマーセットを用いることでmyb DNA結合領域の一部をコードするDNAを得ることが可能である。得られたDNA断片の塩基配列を参考に、5’RACE法、3’RACE法を行うことによって全長cDNAの5’末端および3’末端の塩基配列を決定することが可能である。RACE法によって得られた末端配列を参考としてプライマーを設計し、PCR反応を行うことによって、全長cDNAを得ることが可能である。細胞増殖が盛んな組織及び細胞としては、目的の植物より誘導したカルス、培養細胞、あるいは芽生えの植物体、植物体の茎頂部分、根端部分などが挙げられる。
【実施例１８】
【０１０４】
植物3Rmybの機能決定
実施例１７の方法により得られた植物3Rmybの機能を決定するためには、目的cDNAがCaMV 35Sプロモーターにより発現可能な植物3Rmybプラスミドを構築し、
(i)  植物3Rmybプラスミド(10μg/サンプル)、NACK1 promoter-LUCプラスミド(10μg/サンプル)、R-LUCプラスミド(1μg/サンプル)
(ii)  pBI221プラスミド(10μg/サンプル)、NACK1 promoter-LUCプラスミド(10μg/サンプル)、R-LUCプラスミド(1μg/サンプル)
で示される(i)または(ii)の組み合わせのプラスミドをタバコ培養細胞BY2より作成したプロトプラストに導入し、LUC活性、R-LUC活性を測定する。R-LUC活性で標準化したLUC活性(LUC比活性)が(ii)と比較して(i )の組み合わせで上昇した場合は用いた植物3Rmybが転写活性化型であることを規定することができる。また(ii)と比較して(i)でLUC比活性が低下した場合は用いた植物3Rmybが転写抑制型であることを決定することができる。プロトプラストの調整方法、プラスミドの導入方法、LUC活性および、R-LUC活性の測定方法は実施例３に記述の方法により実施可能である。
【実施例１９】
【０１０５】
NtmybBの雄性生殖器官特異的発現による雄性不稔植物の作出
雄性生殖器官に特異的に発現するプロモーターを用いてG 2/M期特異的発現遺伝子の転写を抑制するNtmybB遺伝子が発現するプラスミドを用いて植物を形質転換することにより、雄性生殖器官において細胞増殖を改変し、正常な花粉形成を抑制し種子稔性が低下した植物を作出することが可能である。
【０１０６】
（１）プラスミドの構築
NtmybBを雄性生殖器官において特異的に発現する形質転換用プラスミドの構築方法の一例を示す。国際出願番号PCT/JP02/12268に記載のプラスミドであるpENTRAVP1およびpENTR0.6はそれぞれシロイヌナズナAtNACK2遺伝子、またはシロイヌナズナAVP1遺伝子のプロモーターが挿入されたプラスミドであり、これらのプラスミドを鋳型としてpENTRAVP1の場合にはプライマーHindIII-AVP1-298S(5'-CCCAAGCTTAAATTCGGACAAATAGAGCGTAGTCAAC-3'; 配列番号:84)、およびプライマーAVP1+5A(5'- GCCATCTTCTCTCCTCCGTATAAGAG -3'; 配列番号:85)を、pENTR0.6の場合はプライマーHindIII-NACK2-575S(5'- CCCAAGCTTCTCGTTAAGAACCCTTGATC-3'; 配列番号:86)、およびプライマーNACK2+3A+2(5'- GCCATCTTCTACACACAAAATCGAAACC-3'; 配列番号:87)を用いてPCRを行なう。増幅されたDNA断片をHindIIIで切断し、pEXP-NtmybBをSalIとEcoRVを用いて切り出されるNtmybBのDNA断片と同時に、pUC18(Takara社製)をSalIとHindIIIで切断して生成される部位に挿入し、pUC-AVP1-NtmybBおよび、pUC-0.6-NtmybBを構築する。pUC-AVP1-NtmybBおよび、pUC-0.6-NtmybBをSalIで切断後にT4 DNA polymeraseを用いて突出末端を平滑化し、さらにHindIIIを用いて切断し切り出されるDNA断片をpBI121(Clontech社製)をSacIで切断後にT4 DNA polymeraseを用いて突出末端を平滑化し、さらにHindIIIを用いて切断して生成される部位に挿入してpBI-PAVP1-NtmybBおよびpBI-N0.6-NtmybBを構築する。pBI-PAVP1-NtmybBはすなわち、AVP1プロモーターによりNtmybBが発現するアグロバクテリウム法で植物を形質転換可能なバイナリーベクターである。pBI-N0.6-NtmybBはすなわち、AtNACK2プロモーターによりNtmybBが発現するアグロバクテリウム法で植物を形質転換可能なプラスミドベクターである。これらのプラスミドで形質転換された植物はカナマイシンを用いることで選抜可能である。
【０１０７】
（２）シロイヌナズナの形質転換
前記（１）で構築した2種のバイナリーベクターを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス (Agrobacterium tumefacience)を形質転換し、これらのプラスミドを保持する各アグロバクテリウムを用いてFloral dip法（前記実施例８と同様）によりシロイヌナズナ  エコタイプCol-0を形質転換する。アグロバクテリウムを感染させた花芽より得られる種子を次亜塩素酸と滅菌水を用いて滅菌し、カナマイシン50μg/ml、カルベニシリン100μg/mlを含むMS倍地上に播種する。カナマイシン添加培地上で生育可能な形質転換植物を選択する。
（３）形質転換植物の稔性低下
前記（１）のバイナリーベクターを使用して、前記（２）で得られた形質転換植物の鞘中に形成される種子を観察すると、野生型より種子の数が減少し、稔性の低下した植物が得られる。
【実施例２０】
【０１０８】
NtmybBの雄性生殖器官特異的発現による雄性不稔植物の作出
雄性生殖器官に特異的に発現するプロモーターを用いてG2/M期特異的発現遺伝子の転写を抑制するNtmybB遺伝子が発現するプラスミドを用いて植物を形質転換することにより、雄性生殖器官において細胞増殖を改変し、正常な花粉形成を抑制し種子稔性が低下した植物を作出することが可能である。
【０１０９】
（１）プラスミドの構築
雄性生殖器官に特異的発現が認められる遺伝子としてはシロイヌナズナAVP1遺伝子またはシロイヌナズナAtNACK2遺伝子を用い、これらの遺伝子のプロモーター領域をプラスミドの構築に用いる。これら遺伝子のプロモーター領域をコードするDNAは国際出願番号PCT/JP02/12268に記載のpENTRAVP1(AVP1)、およびpENTR0.6(AtNACK2)のプラスミドに挿入されているプロモーター領域が使用可能である。NtmybBをコードするDNAはOH88より調整可能である。これらのDNA断片をpBI121(Clontech社製)のCaMV 35SプロモーターとGUS遺伝子を除去した領域に挿入し、AVP1プロモーター、NtmybB、Nosターミネーターが機能的に融合したプラスミドまたは、AtNACK2プロモーター、NtmybB、Nosターミネーターが機能的に融合したプラスミドを構築する。これらのプラスミドはAVP1プロモーターまたはAtNACK1プロモーターによりNtmybBが発現する、アグロバクテリウムを介して植物を形質転換可能なバイナリーベクターであり、得られた形質転換植物はカナマイシンを用いて選抜可能である。
【０１１０】
（２）シロイヌナズナの形質転換
上記（１）で得られるプラスミドを用いてアグロバクテリウム  ツメファシエンス(Agorbacterium tumefacience)を形質転換し、これらプラスミドを保持する各アグロバクテリウムを用いてFloral dip法（前記実施例８と同様）によりシロイヌナズナ  エコタイプCol-0を形質転換する。アグロバクテリウムを感染させた花芽より得られる種子を次亜塩素酸と滅菌水を用いて滅菌し、カナマイシン50μg/ml、カルベニシリン100μg/mlを含むMS倍地上に播種する。カナマイシン添加培地上で生育可能な形質転換植物を選択する。
（３）形質転換植物の稔性低下
前記（１）のバイナリーベクターを使用して、前記（２）で得られた形質転換植物の鞘中に形成される種子を観察すると、野生型より種子の数が減少し、稔性の低下した植物が得られる。
【実施例２１】
【０１１１】
NtmybA1、NtmybA2の発現が抑制された形質転換タバコの生育改変
RNAiを用いて内在性NtmybA1およびNtmybA2の発現を抑制した形質転換タバコは生育が抑制される。
（１）プラスミドの構築
NtmybA1、あるいはNtmybA2、あるいはNtmybA1とNtmybA2の両者のDNAの一部分の配列を逆位反復となるように接続したDNAを構築する。逆位反復に接続する場合には反復間にスペーサーとしてGUSをコードするDNAを挿入する。この逆位反復に配置したDNAをRNAi DNAとして、CaMV 35Sプロモーター、RNAi DNA、Nosターミネーターが機能的に融合したDNAをpBI-RHLプラスミドに挿入する。これらのプラスミドはCaMV 35SプロモーターによりNtmybA1、あるいはNtmybA2、あるいはNtmybA1とNtmybA2の両者をコードするRNAが2本鎖形態で発現するアグロバクテリウムで形質転換可能なプラスミドであり、形質転換植物はハイグロマイシンで選抜可能である。得られた形質転換植物では発現した２本鎖RNAが引き金となり、植物体中で内在性であるNtmybA1、あるいはNtmybA2、あるいはNtmybA1とNtmybA2の両者の発現が低下した、すなわちRNAiの効果を得ることが可能である。
【０１１２】
（２）タバコの形質転換
前記(１)で構築したプラスミドを用いてアグロバクテリウム  ツメファシエンス(Agorbacterium tumefacience )を形質転換し、プラスミドを保持する各アグロバクテリウムを用いてニコチアナ  タバカム  品種SR1(Nicotiana tabacum ver. SR1)をリーフディスク法で形質転換する。ハイグロマイシン耐性としてカルスより分化、再生した形質転換植物個体より、自殖種子を得る。
（３）形質転換植物における生育改変
前記（１）のバイナリーベクターを用いて形質転換し前記（２）で得られた形質転換植物の自殖種子を播種して生育を観察すると野生型と比較して生育が抑制されたタバコ植物が得られる。
【実施例２２】
【０１１３】
Ntmyb形質転換タバコの生育改変
NtmybA2、NtmybA2T5、NtmybA2T2、NtmybBを発現する形質転換タバコでは生育が抑制される。
RNAiを用いて転写活性型である内在性NtmybA1、内在性NtmybA2および内在性NtmybA1とNtmybA2の両者の発現を抑制した形質転換タバコは生育が抑制される。
【０１１４】
（１）プラスミドの構築
国際出願番号PCT/JP02/12268に記載のプラスミドpRHLをApaIで切断し、T4 DNA polymeraseを用いて突出末端を平滑化後にセルフライゲーションを行なうことによってpRHL2を構築した。pRHL2をXhoIで切断し、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化後にセルフライゲーションを行なうことによってpRHL3を構築した。pRHL3をSpeIで切断し、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化後にセルフライゲーションを行なうことによってpRHL4を構築した。
pENTR2B(Invitrogen社製)をEcoRIで切断して切り出されるccdBカセットを含むDNA断片を、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化し、pDONR201(Invitrogen社製)をXmnIとBsaAIを用いて生成される部位に挿入してpDONR201ΔCm1を構築した。挿入されたDNA断片がpDONR201ΔCm1と逆向きであるプラスミドをpDONR201ΔCm3とした。
pDONR201ΔCm1をApaIとSmaIで切断し、切り出されるDNA断片をpBluescriptII(Stratagene社製)をApaIとSmaIで切断して生成される部位に挿入しpBS-attPを構築した。
pDHu1-1(名古屋大学理学研究科上野宜久助手より譲渡頂いた)をEcoRIで切断し、切り出されたDNAの突出末端をKlenow断片を用いて平滑化した後に、pRHL4をSmaIで切断して生成される部位に挿入しpRHGUSRiLを構築した。
pDONR201ΔCm3をApaIとNruIで切断して切り出されるDNA断片をpRHGUSRiLをApaIとSmaIで切断して生成される部位に挿入してpRHGUSRiP1を構築した。
pBS-attPをApaIで切断後、突出末端をT4 DNA polymeraseを用いて平滑化し、さらにSpeIで切断することによって切り出されるDNA断片をpRHGUSRiP1をXhoIで切断後、突出末端をKlenow断片を用いて平滑化し、さらにSpeIで切断することによって生成される部位に挿入し、pRHGUSRiP2を構築した。
pRHGUSRiP2をBglIIで切断し切り出されるDNA断片をpBI121をBglIIで切断し切り出されたDNA断片を取り除いて生成される部位に挿入してpBI-GUSRiP1を構築した。
実施例１０の（１）に記載のpBS-VA1A2を鋳型にプライマーB1T3（5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAATTAACCCTCACTAAAGGG -3'; 配列番号:41)とプライマーB2T7（5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAATACGACTCACTATAGGGC -3';配列番号:42)を用いてPCRを行い、NtmybA1の一部分を含むDNA断片およびNtmybA2の一部分を含むDNA断片がタンデムに接続され両末端にGateway system (Invitrogen社)のattB1、attB2配列が付加されたDNA断片を得た。このDNA断片とプラスミドpBI-GUSRiP1 (Invitrogen 社)を混合し、BP Clonase(Invitrogen社)を用いてBP反応を行い、NtmybA1の一部分を含むDNA断片およびNtmybA2の一部分を含むDNA断片がタンデムに接続されたDNAをpBI-GUSRiP1 に逆位反復に位置するように挿入し、pBIHm-A1A2RNAiを構築する。
【０１１５】
実施例１０の（１）に記載のpBS-VA1を鋳型にプライマーB1T3（5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAATTAACCCTCACTAAAGGG -3'; 配列番号:41)とプライマーB2T7（5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAATACGACTCACTATAGGGC -3';配列番号:42)を用いてPCRを行い、NtmybA1の一部分を含むDNA断片に両末端にGateway system (Invitrogen社)のattB1、attB2配列が付加されたDNA断片を得る。このDNA断片とプラスミドpBI-GUSRiP1 (Invitrogen社)を混合し、BP Clonase(Invitrogen社)を用いてBP反応を行い、NtmybA1の一部分を含むDNAをpBI-GUSRiP1 に逆位反復に位置するように挿入し、pBIHm-A1RNAiを構築する。
実施例１０の（１）に記載のpBS-VA2を鋳型にプライマーB1T3（5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAATTAACCCTCACTAAAGGG -3'; 配列番号:41)とプライマーB2T7（5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAATACGACTCACTATAGGGC -3';配列番号:42)を用いてPCRを行い、NtmybA2の一部分を含むDNA断片に両末端にGateway system (Invitrogen社)のattB1、attB2配列が付加されたDNA断片を得る。このDNA断片とプラスミドpBI-GUSRiP1 (Invitrogen社)を混合し、BP Clonase(Invitrogen社)を用いてBP反応を行い、NtmybA2の一部分を含むDNAをpBI-GUSRiP1 に逆位反復に位置するように挿入し、pBIHm-A2RNAiを構築する。
すなわち、(i)pBIHm-A1A2RNAiはNtmybA1とNtmybA2の両者をコードするRNAが、(ii)pBIHm-A1RNAiはNtmybA1をコードするRNAが、(iii)pBIHm-A2RNAiはNtmybA2をコードするRNAが、CaMV 35Sプロモーターにより2本鎖形態で発現するアグロバクテリウム法で形質転換可能なバイナリーベクターであり、形質転換植物はハイグロマイシンで選抜可能である。(i)から(iii)のバイナリーベクターを用いて得られた形質転換植物では発現した２本鎖RNAが引き金となり、植物体中で(i)では内在性であるNtmybA1とNtmybA2の両者、(ii)では内在性であるNtmybA1、(iii)では内在性であるNtmybA2の発現量が低下した、すなわちRNAiの効果を得ることが可能である。
【０１１６】
（２）タバコの形質転換
下記のプラスミドを用いてタバコの形質転換を行なう。
(i) pBIHm-A1A2RNAiプラスミド(前記（１）に記述)
(ii) pBIHm-A1RNAiプラスミド(前記（１）に記述)
(iii) pBIHm-A2RNAiプラスミド(前記（１）に記述)
(iv) pBIHm-NtmybA2プラスミド(実施例８の（１）に記述)
(v) pBIHm-NtmybA2T2プラスミド(実施例８の（１）に記述)
(vi) pBIHm-NtmybBプラスミド(実施例８の（１）に記述)
(vii) pDBIHm-NtmybA2T5プラスミド(実施例９の（１）に記述)
(viii) pBIHm-GFPプラスミド(実施例８の（１）に記述) 
(ix) pPZP211プラスミド(実施例９の（１）に記述)
(x) pPCYM-NtmybA2T2プラスミド(実施例９の（１）に記述)
(xi) pPZP211-35S:A2RNAiプラスミド(実施例１１の（１）に記述)
(xii) pPZP-35S:A2プラスミド(実施例１２の（１）に記述)
(xiii) pPZP-35S:A2T2プラスミド(実施例１２の（１）に記述)
(i)から(xiii)のプラスミドを用いてアグロバクテリウム  ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacience)を形質転換し、プラスミドを保持する各アグロバクテリウムを用いてニコチアナ  タバカム  品種SR1(Nicotiana tabacum ver. SR1)をリーフディスク法で形質転換する。(i)から(viii)のプラスミドを用いた場合はハイグロマイシン耐性として、(ix)から(xiii)のプラスミドを用いた場合はカナマイシン耐性として、カルスより分化、再生した形質転換植物個体より、自殖種子を得る。
【０１１７】
（３）形質転換植物における生育改変
前記（２）で得られた形質転換植物の自殖種子を播種して生育を観察する。前記（２）の(viii)を用いて得られた形質転換植物、または野生型を対象として比較すると、前記（２）の(i)から(vii)を用いて得られた形質転換植物は生育が抑制されている。前記（２）の(ix)を用いて得られた形質転換植物、または野生型を対象として比較すると、前記（２）の(x)から(xiii)を用いて得られた形質転換植物は生育が抑制されている。
【実施例２３】
【０１１８】
転写活性化能の変化したNtmybA1、Os3RmybA1、AtMYB3R1、AtMYB3R4変異体の作出
転写活性化型植物3RmybであるNtmybA1、Os3RmybA1、AtMYB3R1、AtMYB3R4のC末端側から欠失することで、転写活性化能が上昇した分子や転写活性化能が低下した分子を作出することができる。欠失する領域は実施例１４や、図１５〜１８、実施例１５や図１９〜２５を参考に決定することが出来る。
すなわち、NtmybA1であれば579から1003番目のアミノ酸配列の欠失や、641から1003番目のアミノ酸配列の欠失、715から1003番目のアミノ酸配列の欠失によって転写活性可能が上昇した変異体を作出することが出来る。Os3RmybA1であれば575から993番目のアミノ酸配列の欠失や、635から993番目のアミノ酸配列の欠失、709から993番目のアミノ酸配列の欠失によって転写活性可能が上昇した変異体を作出することが出来る。AtMYB3R1であれば583から776番目のアミノ酸配列の欠失や、621から776番目のアミノ酸配列の欠失、691から776番目のアミノ酸配列の欠失によって転写活性可能が上昇した変異体を作出することが出来る。AtMYB3R4であれば570から961番目のアミノ酸配列の欠失や、608から961番目のアミノ酸配列の欠失、667から961番目のアミノ酸配列の欠失によって転写活性可能が上昇した変異体を作出することが出来る。
また、NtmybA1であれば186から1003番目のアミノ酸配列の欠失、299から1003番目のアミノ酸配列の欠失によって転写活性化能が低下した変異体を作出することが出来る。Os3RmybA1であれば203から993番目のアミノ酸配列の欠失、257から993番目のアミノ酸配列の欠失によって転写活性化能が低下した変異体を作出することが出来る。AtMYB3R1であれば187から776番目のアミノ酸配列の欠失、2 41から776番目のアミノ酸配列の欠失によって転写活性可能が低下した変異体を作出することが出来る。AtMYB3R4であれば181から961番目のアミノ酸配列の欠失や、235から961番目のアミノ酸配列の欠失によって転写活性可能が低下した変異体を作出することが出来る。
上記の変異体の転写活性化能は実施例３および実施例１８に記載の方法により、BY2プロトプラストでの一過性発現におけるNACK１プロモーターに対する転写を測定することでが決定可能である。これら欠失変異体は野生型と比較して、転写活性化能が上昇、もしくは低下している。
【実施例２４】
【０１１９】
NtmybA2が過剰発現している形質転換タバコの矮性化
（１）タバコの形質転換
前述のプラスミドであるpBIHm-NtmybA2 、pBIHm-GFP を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株(Agrobacterium tumefacience EHA101 strain)を形質転換し、これらのプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いてリーフディスク法によりニコチアナ  タバカム  品種SR1(Nicotiana tabacum ver. SR1) の形質転換を行った。
（２）形質転換タバコにおける導入遺伝子の発現量
得られたハイグロマイシン耐性個体を栽培し自殖種子を得た。NtmybA2 の形質転換ラインであるAW＃3 、AW＃23、およびGFP の形質転換ラインであるG＃3 より得られた自殖種子を、クレハ園芸培土（呉羽化学社製）をつめた13cmポリポットに播種し、27℃で栽培を行った。照明条件は18時間照明、６時間暗黒で行った。これらのラインにおける導入遺伝子の発現をRT-PCR法により確認した。各ラインにつき５個体より未展開の頂葉をサンプリングし、前述の実施例１０（２）の方法により、NtmybA2 を増幅した。アガロースゲル電気泳動によりPCR 産物を解析した結果、AW＃3 、AW＃23のラインでは G＃3 ラインと比較してNtmybA2 の発現量が上昇しており、導入遺伝子の過剰発現が確認された。
（３）NtmybA2 形質転換タバコの矮性化
前記（２）において、NtmybA2 の過剰発現を確認した各個体を引き続き栽培し、草丈、本葉数を継時的に計測した。その結果、NtmybA2 の発現量が上昇しているAW＃3 、 AW＃23、の各個体は G＃3 と比較して草丈（図32）、葉の大きさが小さくなっていた。本葉数についてはやや減少する傾向が認められた（図33）。また、顕著に節間が短くなっていた。以上より、CaMV 35SプロモーターによりNtmybA2 を発現する形質転換タバコでは植物が矮性化することが示された。
（４）NtmybA2 形質転換タバコにおける細胞数の減少、および細胞の小型化
前記（３）で用いた栽培したAW＃23の形質転換ラインと野生型タバコの本葉の大きさと表皮細胞を比較した。観察に用いた本葉は野生型、AW＃23共に同じ葉位の完全に展開した葉を用いた。これらの葉の大きさを比較したところ、AW＃23は野生型より約80％小さくなっていた。この葉における表皮細胞を観察するためにリーフディスクを作成し、エタノール：酢酸を９：１で混合した溶液にて脱色、固定を行った。これらのリーフディスクを微分干渉顕微鏡を用いて写真撮影を行い、各50個の表皮細胞の面積を測定した。その結果、野生型と比較してAW＃23では細胞の面積が約45％小さくなっており、AW＃23では細胞の大きさが小さくなっていることが明らかとなった。以上の結果より、AW＃23では葉を構成する細胞の大きさは45％小さくなっているが、葉の大きさはさらに小型化率が高く80％小さくなっていることから、葉の小型化の原因としては細胞が小さくなっていることに加え細胞数が減少しているためであると考えられる。また細胞数の減少は細胞周期の遅延によるものであると考えられる。
【実施例２５】
【０１２０】
シロイヌナズナAtHB8 プロモーターでNtmybA2 が発現する形質転換タバコの矮性化
NtmybA2 がシロイヌナズナAtHB8 遺伝子のプロモーターにより発現する形質転換タバコを作出し、生育を比較する。
【０１２１】
（１）形質転換用プラスミドの構築
pDBIHm-PAtHB8-NtmybA2プラスミドの構築
常法により抽出したシロイヌナズナゲノムDNA を鋳型とし、プライマーPAtHB8-1F (5'-AACTGCAGCGGATAAACCAATTTTCAAATGATA-3'; 配列番号:96)と、プライマーPAtHB8-1700R (5'-CGGGATCCCTTTGATCCTCTCCGATCTCTCTAT-3';配列番号:97)を用いてPCR 反応を行うことによって、シロイヌナズナAtHB8 遺伝子のプロモーター領域を含んだDNA 断片を得た（配列番号：98, AtHB8 promoter GenBank Accession ＃ AL161582(用いた領域89580-91279)）。OH60を鋳型とし、プライマーA2-ATG-Bam (5'-CGGGATCCATGGAAAGTGATAGAATAAGCAC-3';配列番号:99)と、プライマーA2T2-TAA-Not (5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTAACAGCCTAAATGGAGTAAGACAG-3'; 配列番号:100) を用いてPCR 反応を行い、NtmybA2 の一部を含んだDNA 断片を得た。
PCR 反応により得られたAtHB8 プロモーターDNA をPstIとBamHI で切断した。またNtmybA2 の一部を含むDNA 断片は BamHIとNotIで切断した。これら２種のDNA 断片を、pBluescript(Stratagene社製) をPstIとNotIで切断して生成される部位に挿入し、プラスミドpBS-PAtHB8-NtmybA2T2を構築した。
プラスミドpTH2 (Chiuら,Curr Biol 1996 Mar 1;6(3):325-30)をEcoRI で切断し、Klenow断片にて突出末端を平滑化した後に、更にNotIで切断してNOS ターミネーターを含んだDNA 断片を切り出した。このDNA 断片をプラスミドpENTR2B(Invitrogen社製) をNotIとEcoRV で切断して生成する部位に挿入しプラスミドpENTR-NOST1 を構築した。
pBS-PAtHB8-NtmybA2T2をSalIとNotIで切断して切り出されるDNA 断片を、pENTR-NOST1 をSalIとNotIで切断して生成する部位に挿入してプラスミドpENTR-PAtHB8-NtmybA2T2を構築した。
OH60をSalIで切断、Klenow断片を用いて突出末端を平滑化したのちにSpeIで切断してNtmybA2のC末端領域を含んだDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pENTR-PAtHB8-NtmybA2T2をSpeIとSmaIで切断して生成される部位に挿入し、プラスミドpENTR-PAtHB8-NtmybA2を構築した。
前記実施例９において構築したプラスミドpDESTBI-1 とpENTR-PAtHB8-NtmybA2を混合し、Gateway LR Clonase mix(Invitrogen 社製) を用いた部位特異的組換え反応によりpDBIHm-HB8-NtmybA2を構築した。Gateway LR Clonase mixを用いた反応は試薬に添付のプロトコールに従って実施した。pDBIHm-HB8-NtmybA2はAtHB8 プロモーターにより、全長NtmybA2 を発現するプラスミドベクターであり、アグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。これらのプラスミドで形質転換された植物はハイグロマイシンを用いることによって形質転換体を選抜可能である。
【０１２２】
（２）タバコの形質転換
前述のプラスミドであるpDBIHm-HB8-NtmybA2を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株(Agrobacterium tumefacience EHA101 strain)を形質転換し、これらのプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いてリーフディスク法によりニコチアナ  タバカム  品種SR1(Nicotiana tabacum ver. SR1) およびニコチアナ  ベンサミアーナ(Nicotiana bentamiana)の形質転換を行った。
（３）AtHB8 プロモーターでNtmybA2 が発現する形質転換タバコの矮性化
前記（２）において、形質転換した各ラインの自殖種子を得る。これらの種子をクレハ園芸培土（呉羽化学社製）をつめた13cmポリポットに播種し、27℃、で栽培を行う。照明条件は18時間照明、６時間暗黒で行う。これらの植物体は野生型のタバコやVectorのみの形質転換体と比較すると矮性化している。
【実施例２６】
【０１２３】
Atmyb3R1とAtmyb3R4の発現が抑制された形質転換シロイヌナズナにおける倍数性の改変（１）Atmyb3R1, Atmyb3R4  RNAi用プラスミドの構築
Atmyb3R1とAtmyb3R4のRNAiを誘導する形質転換シロイヌナズナを作出するためのプラスミドを構築する。配列番号：７５で示したAtmyb3R1と配列番号：７６で示したAtmyb3R4のcDNAより、250 塩基対以上を含むDNA 配列をPCR によって増幅する。これら２種のDNA をタンデムに接続したDNA を構築する。このDNA 配列を実施例１１に示したプラスミドの構築と同様の方法で、間にGUS が挿入されるように逆位反復に接続したプラスミドを構築する。このプラスミドはCaMV 35Sプロモーターにより挿入したDNA の発現を制御し、形質転換体はカナマイシンで選抜するアグロバクテリウム法によりシロイヌナズナが形質転換可能なバイナリーベクターである。このプラスミドによって形質転換されたシロイヌナズナは導入遺伝子より発現したRNA によりRNAiの効果が得られ、Atmyb3R1とAtmyb3R4の発現量が低下する。
（２）シロイヌナズナの形質転換
前述（１）で構築するプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いてシロイヌナズナ  エコタイプ Col-0をFloral dip法（前記実施例８と同様）にて形質転換する。アグロバクテリウムが感染した植物体より得られた自稙種子をエタノールと次亜塩素酸を用いて滅菌し、滅菌蒸留水を用いてよく洗浄する。これらの種子をカナマイシン50μg/mlの濃度で添加したMS寒天培地に播種し栽培する。形質転換植物はカナマイシン耐性個体として選抜される。
【０１２４】
（３）形質転換シロイヌナズナにおける倍数性の変化
前述（２）で選抜した形質転換体を鉢挙げし、栽培する。これらの形質転換植物より得られた自稙種子ををエタノールと次亜塩素酸を用いて滅菌し、滅菌蒸留水を用いてよく洗浄する。これらの種子をカナマイシン50μg/mlの濃度で添加したMS寒天培地に播種し栽培する。カナマイシン耐性として生育した個体のロゼット葉を用いて実施例１１で示した方法と同様にして、核のDNA 含量を測定する。シロイヌナズナは２倍体であるため、野生型シロイヌナズナのDNA 含量を測定した場合は2C、4C、さらにエンドリデュプリケーションによって核内DNA 含量が増加した8Cや16C を示すピークが観察される。Atmyb3R1とAtmyb3R4の発現量がRNAiの効果によって減少している形質転換シロイヌナズナの核内DNA 含量を測定することで、倍数性の増加した個体が確認される。野生型で認められる2Cを示すピークが認められない個体は４倍体となっている個体である。2C、4Cを示すピークが消失し、8C、16C を示すピークが認められる個体は８倍体の個体である。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
植物育種において重要な細胞周期の制御、そして植物細胞の増殖を改変する技術、さらには植物個体の発生分化を改変する技術が提供される。また該植物細胞増殖の制御・植物個体の発生分化の制御に有用な植物遺伝子並びにその利用技術が提供される。該技術を利用した新規植物の開発・植物育種技術の開発ができる。特に植物３Rmyb遺伝子の機能改変・制御技術並びに機能が改変された新規な３Rmyb遺伝子及び該遺伝子産物や関連分子が提供される。転写活性化能が飛躍的に向上した植物３Rmybタンパク質変異体や、植物３Rmyb遺伝子の転写産物に対してドミナントネガティブに機能する分子も提供され、その利用技術も開発できる。該遺伝子を標的とした植物細胞の増殖を改変する技術および植物個体の発生分化を改変する技術が提供され、改変細胞増殖、発生分化を保持した植物細胞及び植物体が得られ、特定の器官の肥大、雄性不稔またはストレス耐性の改善等、好ましい性質をもつ植物体の開発ができる。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
SEQ ID NO: 1, Oligonucleotide to act as a primer for PCR, n stands for
inosine in positions 3, 6 and 15 and for any base in position 21
SEQ ID NO: 2, Oligonucleotide to act as a primer for PCR, n stands for
inosine 
SEQ ID NO: 3, Oligonucleotide to act as a primer for PCR, n stands for
inosine 
SEQ ID NO: 4, Oligonucleotide to act as a primer for PCR, n stands for
inosine 
SEQ ID NO: 5, Oligonucleotide to act as a primer for PCR, n stands for
inosine 
SEQ ID NO: 6, Oligonucleotide to act as a primer for PCR, n stands for
inosine 
SEQ ID NO: 7, Oligonucleotide to act as a primer for PCR, T7 Primer 
SEQ ID NO: 11, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 12, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 13, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 14, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 15, Oligonucleotide to act as a primer for PCR, T3 primer
SEQ ID NO: 16, n stands for any base
SEQ ID NO: 18, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 19, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 20, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 21, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 24, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 25, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 26, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 27, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 28, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 29, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 30, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 31, Os3RmybA1 ORF
SEQ ID NO: 33, RT-PCR Primer for NtmybA1/A2 
SEQ ID NO: 34, RT-PCR Primer for NtmybA1/A2 
SEQ ID NO: 35, RT-PCR Primer for EF1α
SEQ ID NO: 36, RT-PCR Primer for EF1α
SEQ ID NO: 37, PCR Primer for VIGS A1 DNA 
SEQ ID NO: 38, PCR Primer for VIGS A1 DNA 
SEQ ID NO: 39, PCR Primer for VIGS A2 DNA 
SEQ ID NO: 40, PCR Primer for VIGS A2 DNA 
SEQ ID NO: 41, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 42, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 43, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 44, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 45, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 46, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 47, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 48, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 50, DDBJ Acsession ＃ AB056122, NtmybA1 (DDBJ Acsession ＃
BAB70510) 
SEQ ID NO: 52, DDBJ Acsession ＃ AB056123, NtmybA2 (DDBJ Acsession ＃
BAB70511) 
SEQ ID NO: 54, DDBJ Acsession ＃ AB056124, NtmybB (DDBJ Acsession ＃
BAB70512) 
SEQ ID NO: 56, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 57, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 58, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 59, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 60, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 61, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 62, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 63, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 64, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 65, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 66, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 67, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 68, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 69, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 70, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 71, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 72, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 73, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 74, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 84, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 85, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 86, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 87, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 89, Designed amino acid sequence 
SEQ ID NO: 90, Designed amino acid sequence, X stands for any amino 
acid residue
SEQ ID NO: 91, Designed amino acid sequence, X stands for any amino 
acid residue
SEQ ID NO: 92, Designed amino acid sequence, X stands for any amino 
acid residue in positions 3, 4, 7 and 8, for S or T in position 2, for
D or E in position 6, and for L or I or V in position 9 
SEQ ID NO: 93, Designed amino acid sequence, X stands for H, W, Y or F
in 16 & 9 3, for K, H or R in 19, 67, 102, 123, 129, 134 & 150, for S,
T, G, C or A in 32, 54, 77, 135, 138 & 146, for D or E in 33 & 110, for L, I or V in 34, 49, 61, 65, 76 & 127, and for any residue in others
SEQ ID NO: 94, Designed amino acid sequence, X stands for K or R in 4 & 17, for L or V in 11, for S or T in 12, for L, I or V in 14, for D or E in 16 & 20, and for any amino acid residue in others
SEQ ID NO: 95, Designed amino acid sequence, X stands for K or R or D 
or E or H in position 7 and for any amino acid residue in position 5
SEQ ID NO: 96, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 97, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 99, Oligonucleotide to act as a primer for PCR 
SEQ ID NO: 100, Oligonucleotide to act as a primer for PCR
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】DDBJにAcsession no. BAB78687として登録されているイネの仮想的なタンパク質のアミノ酸配列とOs3RmybA1タンパク質のアミノ酸配列を、最適な形で並べたアミノ酸配列の比較を示す。配列は図２及び３に連続する。
【図２】BAB78687として登録されているイネの仮想的なタンパク質のアミノ酸配列とOs3RmybA1タンパク質のアミノ酸配列を、最適な形で並べたアミノ酸配列の比較を示す。配列は図１の続きで、図３に連続する。
【図３】BAB78687として登録されているイネの仮想的なタンパク質のアミノ酸配列とOs3RmybA1タンパク質のアミノ酸配列を、最適な形で並べたアミノ酸配列の比較を示す。配列は図１及び２からの続きである。
【図４】Os3RmybA1とNtmybA2のCYM promoter-LUCプラスミドをレポータープラスミドとして用いた、CYM プロモーターとLUCの融合遺伝子に対する転写活性化能をLUC比活性上昇率として示す。数値は5反復の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【図５】NtmybA2およびNtmybA2の各種C末端欠失変異体のNACK1 promoter-LUCプラスミドをレポータープラスミドとして用いた、NACK1 プロモーターとLUCの融合遺伝子に対する転写活性化能をLUC比活性上昇率として示す。数値は5反復の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【図６】NtmybA2とNtmybA2T5、またはNtmybBとNtmybA2T5の共発現によるCYM promoter-LUCプラスミドをレポータープラスミドとして用いた、CYM プロモーターとLUCの融合遺伝子に対する転写活性化能をLUC比活性上昇率として示す。数値は5反復の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【図７】pPZP211-35S:A2RNAiを用いて形質転換し、RNA干渉の効果により内在性NtmybA2の発現量が低下した形質転換BY2カルスとpPZP211を形質転換したカルスの大きさを示す写真である。vectorはpPZP211、A2 RNAiはpPZP211-35S:A2RNAiによる形質転換カルスを示している。
【図８】pPZP211-35S:A2 RNAiを用いて形質転換し、RNA干渉の効果により内在性NtmybA2の発現量が低下した形質転換BY2カルスとpPZP211を形質転換したカルスにおける核内DNA含量を測定した結果を示す。vector、およびvector controlはpPZP211、A2 RNAiはpPZP211-35S:A2RNAiによる形質転換カルスを示している。
【図９】pPZP211-35S:BRNAiを用いて形質転換し、RNA干渉の効果により内在性NtmybBの発現量が低下した形質転換BY2カルスとpPZP211を形質転換したカルスの大きさを示す写真である。vector、およびvector controlはpPZP211、B RNAiはpPZP211-35S:BRNAiによる形質転換カルスを示している。
【図１０】pPZP211およびpPZP211-35S:BRNAiを用いて形質転換し、RNA干渉の効果により内在性NtmybBの発現量が低下した形質転換BY2カルスとpPZP211を形質転換したカルスにおける核内DNA含量を測定した結果を示す。vector、およびvector controlはpPZP211、B RNAiはpPZP211-35S:BRNAiによる形質転換カルスを示している。
【図１１】pPZP211-35S:A2または、pPZP211-35S:A2T2を用いて形質転換し、恒常的にNtmybA2またはNtmybA2T2が発現する形質転換BY2カルスとpPZP211を用いて形質転換したカルスの大きさを示す。vectorはpPZP211、35S:A2はpPZP211-35S:A2、35S:A2T2はpPZP211-35S:A2T2による形質転換カルスを示している。
【図１２】pPZP211-35S:A2または、pPZP211-35S:A2T2を用いて形質転換し、恒常的にNtmybA2またはNtmybA2T2が発現する形質転換BY2カルスとpPZP211を用いて形質転換したカルスを構成する細胞数を示す。vectorはpPZP211、35S:A2はpPZP211-35S:A2、35S:A2T2はpPZP211-35S:A2T2による形質転換カルスを示している。
【図１３】pPZP211-35S:A2または、pPZP211-35S:A2T2を用いて形質転換し、恒常的にNtmybA2またはNtmybA2T2が発現する形質転換BY2カルスとpPZP211を形質転換して得られたカルスの核内DNA含量を測定した結果を示す。ControlはpPZP211、35S:A2はpPZP211-35S:A2、35S:A2T2はpPZP211-35S:A2T2による形質転換カルスを示している。
【図１４】pPZP211-35S:Bを用いて形質転換したNtmybBが恒常的に発現している形質転換タバコ、pPZP211-35S:B.RNAiを用いて形質転換したRNAiの効果により内在性NtmybBの発現を抑制した形質転換タバコ、またはpPZP211を用いて形質転換した形質転換タバコの生育を示す写真である。vectorはpPZP211、35S:BはpPZP211-35S:B、B RNAiはpPZP211-35S: B.RNAiによる形質転換タバコを示している。
【図１５】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。図15〜17における矢印はNtmybA2の各種C末端領域欠失変異体作出における領域と、それに対応するNtmybA1、Os3RmybA1のアミノ酸領域を示している。図中の“＊”、“.”、“：”はCLUSTALWプログラムによるアミノ酸の類似性を示す出力結果において“＊”は完全に保存されたアミノ酸のサイト、“：”は高度に保存されたアミノ酸のサイト、“.”は中程度に保存されたアミノ酸のサイトを示している。配列は図１６から１８に連続する。
【図１６】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図１５の続きで、図１７及び１８に連続する。
【図１７】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。図中の四角で囲まれた領域はNtmybA2の欠失領域近辺に認められるNtmybA1、Os3RmybA1との保存配列位置を示している。四角の上に示されたアミノ酸配列は保存配列を示しており、Xは任意のアミノ酸を表す。配列は図１５および１６の続きで、図１８に連続する。
【図１８】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図１５から１７の続きである。
【図１９】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R1(図19〜25においてAtMYB3R-1と記述)、At MYB3R4(図19〜25においてAtMYB3R-4と記述)タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。図中の“＊”、“.”、“：”はCLUSTALWプログラムによるアミノ酸の類似性を示す出力結果において“＊”は完全に保存されたアミノ酸のサイト、“：”は高度に保存されたアミノ酸のサイト、“.”は中程度に保存されたアミノ酸のサイトを示している。配列は図２０から２５に連続する。
【図２０】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図１９の続きで、図２１から２５に連続する。
【図２１】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図１９及び２０の続きで、図２２から２５に連続する。
【図２２】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図１９から２１の続きで、図２３から２５に連続する。
【図２３】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。図中の太線はmyb DNA結合領域以外において特に高くアミノ酸配列が保存されている領域を示している。太線で示した領域において認められる保存配列を太字で示し、本配列中でXは任意のアミノ酸、JはI、V、Lのいずれか一つのアミノ酸、OはS、Tのいずれか一つのアミノ酸、X1はK、Rのいずれか一つのアミノ酸、Uは V、Lのいずれか一つのアミノ酸、X5はD、Eのいずれか一つのアミノ酸であることを示している。配列は図１９から２２の続きで、図２４から２５に連続する。
【図２４】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図１９から２３の続きで、図２５に連続する。
【図２５】NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図１９から２４の続きである。
【図２６】NtmybB、AtMYB3R3(図26〜28においてAtMYB3R-3と記述)、AtMYB3R5(図26〜28においてAtMYB3R-5と記述)タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。図中の“＊”、“.”、“：”はCLUSTALWプログラムによるアミノ酸の類似性を示す出力結果において“＊”は完全に保存されたアミノ酸のサイト、“：”は高度に保存されたアミノ酸のサイト、“.”は中程度に保存されたアミノ酸のサイトを示している。図中の太線はmyb DNA結合領域以外において特に高くアミノ酸配列が保存されている領域を示している。太線で示した領域において認められる保存配列は太字で示し、本配列中でXは任意のアミノ酸、X6は K、R、D、E、Hのいずれか一つのアミノ酸であることを示している。配列は図２７及び２８に連続する。
【図２７】NtmybB、AtMYB3R-3、AtMYB3R-5タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図２６の続きで、図２８に連続する。
【図２８】NtmybB、AtMYB3R-3、AtMYB3R-5タンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図２６及び２７の続きである。
【図２９】Physcomitrella patensより単離されたMYB3R-1（図29〜31中ではPhpMYB3R-1と記述)、Adiantum raddianum より単離されたMYB3R-1(図29〜31中ではAdrMYB3R-1と記述)、Hordeum vulgare より単離されたMYB3R-1(図29〜31中ではHvMYB3R-1と記述)、Secale cereale より単離されたMYB3R-1(図29〜31中ではScMYB3R-1と記述)、Papaver rhoeasより単離されたputative Myb-related domain(図29〜31中ではではParMYB3R-1と記述)、AtMYB3R1(図29〜31中ではAtMYB3R-1と記述)、AtMYB3R3(図29〜31中ではAtMYB3R-3と記述)、AtMYB3R4(図29〜31中ではAtMYB3R-4と記述)、AtMYB3R5(図29〜31中ではAtMYB3R-5と記述)、NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、Os3RmybA1タンパク質における3反復からなるmyb様 DNA結合領域を構成するアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。13種のアミノ酸配列中で、保存されていたアミノ酸のサイトは図中で保存配列として示してある。保存配列中でXは任意のアミノ酸、JはI、V、Lのいずれか一つのアミノ酸、OはG、S、T、C、Aのいずれか一つのアミノ酸、X7はK、R、Hのいずれか一つのアミノ酸、UはH、W、Y、Fのいずれか一つのアミノ酸、X5はD、Eのいずれか一つのアミノ酸であることを示している。図中での太線はMOTIFプログラム（http://motif.genome.ad.jp/）を用いての検索結果においてMYB＃1(Myb DNA-binding domain repeat signature 1.)として示されるc-mybの3反復 myb DNA結合領域で認められるコンセンサス配列を示している。太線間の矢印は前記コンセンサス配列間に存在するアミノ酸数を示している。配列は図３０及び３１に連続する。
【図３０】PhpMYB3R-1、AdrMYB3R-1、HvMYB3R-1、ScMYB3R-1、ParMYB3R-1、AtMYB3R1、AtMYB3R3、AtMYB3R4、AtMYB3R5、NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、Os3RmybA1タンパク質における3反復からなるmyb様 DNA結合領域を構成するアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図２９の続きで、図３１に連続する。
【図３１】PhpMYB3R-1、AdrMYB3R-1、HvMYB3R-1、ScMYB3R-1、ParMYB3R-1、AtMYB3R1、AtMYB3R3、AtMYB3R4、AtMYB3R5、NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、Os3RmybA1タンパク質における3反復からなるmyb様 DNA結合領域を構成するアミノ酸配列を最適な形で並べた結果を示す。配列は図２９及び３０の続きである。
【図３２】栽培NtmybA2遺伝子導入植物体(NtmybA2高発現タバコ)の生育状況（草丈）につきNtmybA2遺伝子を導入していない植物体と比較した結果を示す。
【図３３】栽培NtmybA2遺伝子導入植物体(NtmybA2高発現タバコ)の生育状況（本葉数）につきNtmybA2遺伝子を導入していない植物体と比較した結果を示す。
【図１】
2004290193.tif 000002
【図２】
2004290193.tif 000003
【図３】
2004290193.tif 000004
【図４】
2004290193.tif 000005
【図５】
2004290193.tif 000006
【図６】
2004290193.tif 000007
【図７】
2004290193.tif 000008
【図８】
2004290193.tif 000009
【図９】
2004290193.tif 000010
【図１０】
2004290193.tif 000011
【図１１】
2004290193.tif 000012
【図１２】
2004290193.tif 000013
【図１３】
2004290193.tif 000014
【図１４】
2004290193.tif 000015
【図１５】
2004290193.tif 000016
【図１６】
2004290193.tif 000017
【図１７】
2004290193.tif 000018
【図１８】
2004290193.tif 000019
【図１９】
2004290193.tif 000020
【図２０】
2004290193.tif 000021
【図２１】
2004290193.tif 000022
【図２２】
2004290193.tif 000023
【図２３】
2004290193.tif 000024
【図２４】
2004290193.tif 000025
【図２５】
2004290193.tif 000026
【図２６】
2004290193.tif 000027
【図２７】
2004290193.tif 000028
【図２８】
2004290193.tif 000029
【図２９】
2004290193.tif 000030
【図３０】
2004290193.tif 000031
【図３１】
2004290193.tif 000032
【図３２】
2004290193.tif 000033
【図３３】
2004290193.tif 000034
【配列表】
2004290193000001.app