(57)【要約】【課題】ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制し、かつ、ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖を抑制する機能を兼ね備えたワクチン用タンパク質、それをコードする遺伝子、及びそれらの利用方法を提供する。【解決手段】ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼにおける活性部位付近のアミノ酸配列のうち、特定領域内の配列からなるタンパク質は、免疫反応により、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を生成することが確認された。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、免疫反応によって、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を生成するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質を含んでなるヘリコバクター・ピロリ菌に対するワクチン。
【請求項４】
請求項２に記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
【請求項５】
請求項１に記載のタンパク質を生体に免疫して、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を含む血清を生産する方法。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質を認識する抗体。
【請求項７】
請求項１に記載のタンパク質を乳牛に免疫した後、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を含む牛乳を上記乳牛より採取する方法。
【請求項８】
請求項１に記載のタンパク質をニワトリに免疫した後、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を含む鶏卵を上記ニワトリより採取する方法。
【請求項９】
請求講２の遺伝子を植物に導入し、発現させることを特徴とする形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を生成するタンパク質、それをコードする遺伝子、該タンパク質を利用したワクチン、及びこれらの利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈ．ピロリ菌）は、細長いＳ字型のグラム陰性菌であり、組織学的に胃潰瘍発症者や消化性潰瘍発症者の胃の生体試料から高い頻度で検出される。このＨ．ピロリ菌を胃内から根絶することによって、胃炎が治癒するととともに、消化性潰瘍の患者の再発率が減少するという報告がされている（例えば、非特許文献１参照）。このことから、Ｈ．ピロリ菌は、ヒトの胃内に感染することによって、急性胃炎、慢性胃炎、萎縮性胃炎などの各種胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍を含む消化性潰瘍、さらには胃癌までをも引き起こす原因となると考えられている。
【０００３】
ヒトの胃内は胃酸の分泌によって酸性が強くなっているため、通常外部から侵入した細菌は生存することができないが、Ｈ．ピロリ菌は、自身の細胞外膜に多量のウレアーゼを生産することで、酸性の強い胃内でも生存することができる。つまり、ウレアーゼが、尿素を加水分解することで発生するアンモニアは、胃内を中性化し、胃内腔内の微生物を取り巻く中性の微小環境をつくりだしているのである。一方、アンモニアが胃や十二指腸の粘膜組織が傷つけられるということが、様々な証拠によって示されている。
【０００４】
上記のようなＨ．ピロリ菌に対して、最近では、感染を防ぐワクチン接種が、Ｈ．ピロリ菌関連疾患の患者を守る手段として提案されている。このようなワクチンの１つとしてＨ．ピロリ菌のウレアーゼあるいはそのサブユニットＢが提案されている（例えば、特許文献１参照）。上記ウレアーゼあるいはそのサブユニットＢは、ワクチンとして生体内に投与されると、抗体を作り出だす。この抗体がウレアーゼと結合することによってウレアーゼの活性を抑制するため、Ｈ．ピロリ菌は酸性の強い胃内で生存できなくなる。従って、このようなワクチンは、Ｈ．ピロリ菌の感染を効率よく阻止することができるのである。
【０００５】
【特許文献１】
特表平９−５０９６６１号公報（１９９７年９月３０日公表）
【０００６】
【非特許文献１】
Ｐｅｒｔｅｒｓｏｎ，  Ｗ．  ｌ．  「Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｃ  Ｕｌｃｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．」  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ｖｏｌ．  ３２４，１０４３−１０４８（１９９１）．
【０００７】
【非特許文献２】
Ｕｄａ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｕｒｅａｓｅ．」  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ８６，  ２７１−２７６（１９９８）．
【０００８】
【非特許文献３】
Ｗａｒｒｅｎ，  Ｊ．Ｒ．  ＆  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｂ．「Ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｃｕｒｖｅｄ  ｂａｃｉｌｌｉ  ｏｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇａｓｔｒｉｔｉｓ．」  Ｌａｎｃｅｔ，  ｉ：  １２７３−１２７５  （１９８３）．
【０００９】
【非特許文献４】
Ｂａｒｅｒ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｔ．Ｓ．Ｊ．，  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，  Ｄ．，「Ｔｈｏｍａｓ，  Ｊ．Ｅ．，  ＆  Ｅａｓｔｈａｍ，  Ｅ．Ｊ．    Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｕｒｅａｓｅ．」  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ４１，  ５９７  （１９８６）．
【００１０】
【非特許文献５】
Ｈａｚｅｌｌ，  Ｓ．，  ＆  Ｌｅｅ，  Ａ．「Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｄｉｓ，  ｕｒｅａｓｅ，  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｉｏｎ  ｂａｃｋ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｕｌｃｅｒｓ．」  Ｌａｎｃｅｔ，  ｉｉ，  １５−１７  （１９８６）．
【００１１】
【非特許文献６】
Ｓｍｏｏｔ，  Ｄ．  Ｔ．，  Ｍｏｂｌｅｙ，  Ｈ．  Ｌ．  Ｔ．，  Ｃｈｉｐｐｅｎｄａｌｅ，  Ｇ．  Ｒ．，  Ｌａｗｉｓｏｎ，  Ｊ．  Ｆ．  ＆  Ｒｅｓａｕ，  Ｊ．  Ｈ．「Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｕｒｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｔｏｘｉｃ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ．」  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ５８，  １９９２−１９９４  （１９９０）．
【００１２】
【非特許文献７】
Ｂｕｃｋ，  Ｇ．  Ｅ．「Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．」  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ３，  １−１２  （１９９０）．
【００１３】
【非特許文献８】
Ｇｏｏｄｗｉｎ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｂｌａｋｅ，  Ｐ．  ＆  Ｂｌｉｎｃｏｗ，  Ｅ．「Ｔｈｅ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｕｌｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｄｉｓ．」  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，  １７，  ３０９−３１４  （１９８６）．
【００１４】
【非特許文献９】
Ｎａｇａｔａ，  Ｋ．，  Ｓａｔｏｈ，  Ｈ．，  Ｉｗａｈｉ，  Ｔ．，  Ｓｈｉｍｏｙａｍａ，  Ｔ．  ＆  Ｔａｍｕｒａ，  Ｔ．「Ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｐｒｏｔｏｎ  ｐｕｍｐ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｌａｎｓｏｐｒａｚｏｌｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｕｒｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ：  ｕｎｉｑｕｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ  ｃｅｌｌｓ．」  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ３７，  ７６９−７７４  （１９９３）．
【００１５】
【非特許文献１０】
Ｐａｌｌｅｎ，  Ｍ．Ｊ．  ＆  Ｃｌａｙｔｏｎ，  Ｃ．Ｌ．「Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｕｒｅａｓｅ．」  Ｌａｎｃｅｔ，  ３３６，  １８６−１８７  （１９９０）．
【００１６】
【非特許文献１１】
Ｃｚｉｎｎ，  Ｓ．  Ｊ．  ＆  Ｎｅｄｒｕｄ，  Ｊ．  Ｇ．「Ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ．  Ｉｎｆｅｃｔ．」  Ｉｍｍｕｎ．，  ５９，  ２３５９−２３６３  （１９９１）．
【００１７】
【非特許文献１２】
Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚ，  Ｉ．，  Ｐｏｒｔａ，  Ｎ．，  Ｇｌａｕｓｅｒ，  Ｍ．，  Ｓａｒａｇａ，  Ｅ．，  Ｖａｎｅｙ，  Ａ−Ｃ．，  Ｈａａｓ，  Ｒ．，  Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｈｌ，  Ｊ−Ｐ．，  Ｂｌｕｍ，  Ａ．  Ｌ．  ＆  Ｍｉｃｈｅｔｔｉ，  Ｐ．「Ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｕｒｅａｓｅ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｓ  ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．」  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０９，  １１５−１２１  （１９９５）．
【００１８】
【非特許文献１３】
Ｈｉｒｏｔａ，  Ｋ．，  Ｎａｇａｔａ，  Ｋ．，  Ｎｏｒｏｓｅ，  Ｙ．，  Ｆｕｔａｇａｍｉ，  Ｓ．，  Ｎａｋａｇａｗａ，  Ｙ．，  Ｓｅｎｐｕｋｕ，  Ｈ．，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．  ＆  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｈ．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｕｒｅａｓｅ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．」  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ６９，  ６５９７−６６０３  （２００１）．
【００１９】
【非特許文献１４】
Ｓｕｇｉｎｏ，  Ｎ．，  Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，  Ｋ．，  Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ，  Ｓ．，  Ｔａｍｕｒａ，  Ｈ．，  Ｏｈｎｏ，  Ｍ，  Ｎａｋａｔａ，  Ｍ，  Ｏｇｉｎｏ，  Ｋ，  Ｕｄａ，  Ｔ．，  ＆  Ｋａｔｏ，  Ｈ．「Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｍｅｎｓｔｒｕａｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．」Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  １１，  １０７３−１０７８  （１９９６）．
【００２０】
【非特許文献１５】
Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｔ．，  Ｓｕｇｉｎｏ，  Ｎ．，  Ｆｕｋａｙａ，  Ｔ．，  Ｓｕｇｉｙａｍａ，  Ｓ．，  Ｕｄａ，  Ｔ．，  Ｔａｋａｙａ，  Ｒ．，  Ｙａｊｉｍａ，  Ａ．，  ＆  Ｓａｓａｎｏ，  Ｈ．「Ｓｕｐｅｒ  ｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉｅｓ：  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．」  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，  ７２，  ７２０−７２６  （１９９９）．
【００２１】
【非特許文献１６】
Ｈａｗｔｉｎ，  Ｐ．  Ｒ．，  Ｄｅｌｖｅｓ，  Ｈ．  Ｔ．  ＆  Ｎｅｗｅｌｌ，  Ｄ．  Ｇ．「Ｔｈｅ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｃｋｅｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｒｅａｓｅ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｂｙ  ａｔｏｍｉｃ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．」ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ７７，  ５１−５４  （１９９１）．
【００２２】
【非特許文献１７】
Ｈａ，  Ｎ．  Ｃ．，  Ｏｈ，  Ｓ．  Ｔ．，  Ｓｕｎｇ，  Ｊ．  Ｙ．，  Ｃｈａ，  Ｋ．  Ａ．，  Ｌｅｅ，  Ｍ．  Ｈ．  ＆  Ｏｈ，  Ｂ．Ｈ．「Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｕｒｅａｓｅ．」  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ８，  ５０５−５０９  （２００１）．
【００２３】
【非特許文献１８】
Ｉｋｅｄａ，  Ｙ．，  Ｆｕｊｉｉ，  Ｒ．，  Ｏｇｉｎｏ，  Ｋ．，  Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，  Ｋ．，  Ｈｉｆｕｍｉ，  Ｅ．，  ＆  Ｕｄａ，  Ｔ．「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｕｒｅａｓｅ．」  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ８６，  ２７１−２７６  （１９９８）．
【００２４】
【非特許文献１９】
Ｄｉｘｏｎ，  Ｎ．Ｅ．，  Ｇａｚｚｏｌａ，  Ｃ．，  Ｂｌａｋｅｌｅｙ，  Ｒ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｚｅｒｎｅｒ，  Ｂ．「Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ  ｕｒｅａｓｅ．  Ａ  ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ．  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｎｉｃｋｅｌ？」  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ９７，  ４１３１−４１３３（１９７５）．
【００２５】
【非特許文献２０】
Ｄｉｘｏｎ，  Ｎ．Ｅ．，  Ｂｌａｋｅｌｅｙ，  Ｒ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｚｅｒｎｅｒ，  Ｂ．「Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ  ｕｒｅａｓｅ．  Ｉ．  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｄｒｙ  ａｓｈｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｔｈｅ  ｎｉｃｋｅｌ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｕｒｅａｓｅ．」  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５８，  ４６９−４７３  （１９８０）．
【００２６】
【非特許文献２１】
Ｔａｋｉｓｈｉｍａ，  Ｋ．，  Ｓｕｇａ，  Ｔ．  ＆  Ｍａｍｉｙａ，  Ｇ．「Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｊａｃｋ  ｂｅａｎ  ｕｒｅａｓｅ．」  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７５，  １５１−１６５  （１９８８）．
【００２７】
【非特許文献２２】
Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ａ．Ｔ．，  ａｎｄ  Ｒｅｉｔｈｅｌ，  Ｆ．Ｊ．「Ｔｈｅ  ｔｈｉｏｌ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ  ｕｒｅａｓｅ．」  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  １４１，  ５３８−５４６  （１９７０）．
【００２８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述のようにＨ．ピロリ菌のウレアーゼそのもの、あるいはそのサブユニットを直接生体内に投与し免疫する方法は、いくつかの問題点を有している。
【００２９】
即ち、酵素であるウレアーゼを直接生体に投与すると、酵素反応が生体内で直ちに惹起し種々の複反応を誘導するため、予期せぬ副作用を誘発する可能性が高い。また、ヒトにとって異種タンパク質であるＨ．ピロリ菌由来のウレアーゼあるいはそのサブユニットをヒトに投与することは、不要な免疫応答を惹起した生体に、場合によっては重篤な副作用をもたらしかねない。また、精製したウレアーゼやそのサブユニットを得ることは、多大なコストが必要となる。
【００３０】
さらに、Ｈ．ピロリ菌に対するワクチンとして望ましい機能は、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの酵素活性を抑制することができ、かつ、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制することのできるものであるが、この両方の機能を備えたワクチンは、これまでに開発されていない。
【００３１】
本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであり、投与方法や取り扱いが安全で容易であり、低コストで生産できるタンパク質を、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制し、かつ、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制するワクチンとして提供することを目的とする。さらに本発明は、当該タンパク質の様々な利用方法についても提供する。
【００３２】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼにおける活性部位付近のアミノ酸配列を詳細に解析することにより、該アミノ酸配列の特定領域が、上記ウレアーゼの活性を抑制するばかりか、Ｈ．ピロリ菌の増殖をも抑制するワクチンとして非常に効果的であることを見いだし、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、上記ウレアーゼの有するアミノ酸配列のうち、上記ウレアーゼの活性を抑制し、かつ、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を誘導することができる特定領域内の配列からなるタンパク質を、ヘリコバクター・ピロリ菌に対するワクチンとして用いるものである。
【００３３】
本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、免疫反応によってヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を生成するタンパク質。
【００３４】
上記（ａ）のタンパク質は、Ｈ．ピロリ菌由来のウレアーゼのβサブユニットのアミノ酸配列の一部であり、より具体的には、上記（ａ）のタンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列中の第２０１番目から第３３８番目の領域に相当する。それゆえ、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質は、上記Ｈ．ピロリ菌由来のウレアーゼの抗体を生成する抗原としての機能を有する。それゆえ、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質は、ヒトなどへ投与されると、生体内においてＨ．ピロリ菌に対して働く抗体を生成する。この抗体は、上記ウレアーゼの活性部位である配列番号２に示すアミノ酸配列中の第２０１番目から第３３８番目の領域に結合し、活性を抑制する。また、上記抗体は、Ｈ．ピロリ菌の増殖をも抑制する。なお、上述の「免疫反応によってＨ．ピロリ菌のウレアーゼの活性及びＨ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を生成するタンパク質」とは、言い換えれば、タンパク質の免疫応答によって得られる抗体が、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼと抗原抗体反応し、かつ、Ｈ．ピロリ菌と抗原抗体反応をするということである。
【００３５】
Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの活性が抑制されるため、Ｈ．ピロリ菌は、酸性の強い胃内において生存ができなくなる。また、Ｈ．ピロリ菌の増殖も阻害される。即ち、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質は、Ｈ．ピロリ菌のヒトの胃内における生存及びＨ．ピロリ菌の増殖を阻害することができるため、当該菌の感染阻止あるいは予防に非常に有効に利用できる。
【００３６】
本発明において、「タンパク質」とは一般に用いられる意味と同様であるが、少なくとも２以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを意味する。上記「タンパク質」には、アミノ酸のみから成る単純タンパク質だけでなく、非アミノ酸成分をも含む複合タンパク質含むものであってもよい。
【００３７】
上記タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１以上の任意のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、免疫反応によって、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を生成する機能をもっていれば、アミノ酸数が変化していてもかまわない。
【００３８】
また、上記「タンパク質」は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよいし、化学合成されたものであってもよいし、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよい。また、上記宿主細胞での発現条件によっては、上記タンパク質は融合タンパク質であってもよい。
【００３９】
また、上記「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、細胞内で発現させたタンパク質の場合には、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法に基づいて、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されるものである。このように、遺伝子工学的手法を用いた場合、上記「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」アミノ酸配列からなるタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異体であると言える。
【００４０】
本発明に係る遺伝子は、上記タンパク質をコードしている遺伝子であり、この遺伝子を適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入すれば、本発明のタンパク質をその宿主内で発現させることができる。
【００４１】
なお、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、上記本発明のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００４２】
それゆえ、本発明には上記遺伝子を導入してなる形質転換体も含まれる。上記形質転換体は、自身の体内において上記本発明に係るタンパク質を発現させることができる。
【００４３】
本発明に係るタンパク質の利用方法として、Ｈ．ピロリ菌に対するワクチンとしての利用法を挙げることができる。即ち、上記タンパク質を含んでなるＨ．ピロリ菌に対するワクチンについても本発明に含まれる。このワクチンをヒトに投与すると、生体内ではＨ．ピロリ菌のウレアーゼに対して特異的な抗体が生成される。また、この抗体は、Ｈ．ピロリ菌の増殖をも抑制する。そのため、上記ワクチンはＨ．ピロリ菌の感染阻止あるいは予防・治療に利用できる。また、上記ワクチンには、免疫原として酵素であるウレアーゼそのもの、あるいは、そのサブユニットは含まれていないため、副作用を生じるような免疫応答が発生することを回避することができる。
【００４４】
本発明に係るタンパク質の他の利用方法として、上記タンパク質を動物などの生体に免疫して、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼに対する抗体を含む血清（抗血清）を生産する方法を挙げることができる。上記抗血清から得られた抗体は、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼに対して特異的に結合するため、ある検体と上記抗体とが免疫反応をしているか否かを判定することによって、上記検体中に当該菌のウレアーゼが含まれているか否かの検出に使用することができる。なお、ここで「免疫する」とは、上記タンパク質を生体内に投与し、免疫反応を起こさせることによって生体内に抗体を生成することを意味する。
【００４５】
上述の抗体の生産方法によって得られる抗体は、通常ポリクローナル抗体であるが、本発明には、上記タンパク質を認識するモノクローナル抗体も含まれる。それゆえ、本発明に係る抗体は、上記タンパク質を認識する抗体である。この抗体のうちポリクローナル抗体は、上述の生産方法によって得ることができ、モノクローナル抗体は、本発明のタンパク質を用いて従来公知のハイブリドーマ技術などによって作製することができる。
【００４６】
上記の抗体は、本発明のタンパク質、あるいはＨ．ピロリ菌のウレアーゼと反応するため、上記タンパク質あるいはウレアーゼを定量することができる。また、上記抗体は、Ｈ．ピロリ菌の感染者を治療する抗体医薬品、Ｈ．ピロリ菌の診断薬として利用できる可能性がある。なお、診断薬として用いる場合、Ｈ．ピロリ菌に感染していると思われるヒト、動物などの胃組織と、上記抗体とを反応させることによって容易に検出することができる。
【００４７】
さらに、本発明に係るタンパク質を乳牛に免疫すると、その乳牛から搾取された牛乳にはＨ．ピロリ菌に対する抗体が含まれる。よって、上記タンパク質を乳牛に投与することによってＨ．ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を含む牛乳を生産することも可能である。このようにして得られた牛乳は、機能性食品として有用である。
【００４８】
また、本発明に係るタンパク質をニワトリに免疫した場合、そのニワトリが産む鶏卵にはＨ．ピロリ菌に対する抗体が含まれる。よって、上記タンパク質をニワトリに投与することによってＨ．ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を含む鶏卵を得ることも可能である。このようにして得られた鶏卵もまた機能性食品として有用である。
【００４９】
また、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を植物に導入してなる形質転植物も含まれる。従って、宿主としての植物に上記遺伝子を導入し、発現させれば、上記タンパク質を含む形質転換植物を得ることができる。この形質転換植物は、Ｈ．ピロリ菌の感染を予防するという機能を備えた上記タンパク質を含んでいるため、食べるワクチンとして利用することができる。上記遺伝子が導入される植物としては、上記タンパク質は加熱によってその構造が破壊されるため、生食に適した野菜であることが好ましい。このような野菜として、具体的にはトマト、キュウリ、ニンジンなどを挙げることができる。
【００５０】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００５１】
（１）本発明に係るタンパク質について
本発明に係るタンパク質の一例として、Ｈ．ピロリ菌由来のウレアーゼのβサブユニットにおける特定領域のアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げて説明する。上記タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を生成するタンパク質である。即ち、上記タンパク質は、アミノ酸を一文字表記によって表した場合、ＮＨ２−ＡＳＮＤＡＳＬＡＤＱＩＥＡＧＡＩＧＦＫＩＨＥＤＷＧＴＴＰＳＡＩＮＨＡＬＤＶＡＤＫＹＤＶＱＶＡＩＨＴＤＴＬＮＥＡＧＣＶＥＤＴＭＡＡＩＡＧＲＴＭＨＴＦＨＴＥＧＡＧＧＧＨＡＰＤＩＩＫＶＡＧＥＨＮＩＬＰＡＳＴＮＰＴＩＰＦＴＶＮＴＥＡＥＨＭＤＭＬＭＶＣＨＨＬＤＫＳＩＫＥＤＶＱＦＡＤＳＲ−ＣＯＯＨという一次構造を有している。このタンパク質が有するアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列中の第２０１番目から第３３８番目の領域に相当する。
【００５２】
上記タンパク質は、生体内に投与することで、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を自然に誘導することができる。上記抗体は、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼと結合し、活性を抑制するため、Ｈ．ピロリ菌は強酸下の胃での生存ができなくなる。また、上記抗体は、Ｈ．ピロリ菌の増殖を阻害する。それゆえ、本発明のタンパク質は、ヒト胃内に感染し種々の疾患を引き起こす原因となるＨ．ピロリ菌の感染を予防したり、感染したＨ．ピロリ菌を駆除したりする高性能のワクチンの成分として有用である。このワクチンは、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの酵素活性を抑制し、かつ、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する機能を兼ね備えた高性能なワクチンである。
【００５３】
ところで、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるβサブユニットと配列番号３に示すアミノ酸配列からなるαサブユニットとの６量体で構成される。ウレアーゼは金属酵素であり、その活性部位はβサブユニット中にあり２つのニッケルイオンを保持している。この活性部位は、βサブユニットの１３８アミノ酸残基からなる２０１番目から３３８番目の領域に相当する。この領域には、ニッケルと結合するために重要なシステイン残基と１０個のヒスチジン残基とが位置している。タチナタマメウレアーゼとＨ．ピロリ菌ウレアーゼとの間のこの領域（１３８アミノ酸残基）のアミノ酸配列の相同性は、約６３．０％に昇る。特に、３１３番目から３２５番目の配列（ＥＨＭＤＭＬＭＶＣＨＨＬＤ）は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｆｅｌｉｓ  （１００％），  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（９２．３％，  Ｍ３２６Ｌ），  Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ  （９２．３％，  Ｍ３２６Ｌ），  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  （９２．３％，  Ｍ３２６Ｌ），  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  （９２．３％，  Ｍ３２６Ｌ），  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  （９２．３％，  Ｍ３２６Ｌ）    ａｎｄ  Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ  （８４．６％，  Ｍ３２６Ｌ，  Ｄ３３５Ｎ）などの微生物においてよく保存されている。
【００５４】
さらに、システイン残基、及び８個のヒスチジン残基は、酵素活性の発現に必須の残基であるが、異なる細菌由来であっても、完全に保存されている（同一である）。
【００５５】
図２（Ａ）は、Ｈ．ピロリ菌ウレアーゼのβサブユニットの立体構造である。上述の抽出された配列は、濃い線で示される。図２（Ｂ）には、上記ウレアーゼのβサブユニットの活性部位周辺の詳細な図を示す。活性部位に存在する２つのニッケルイオンの周辺にヒスチジン残基とシステイン残基が存在し、ニッケルイオンと強く相互作用しているように思われる。ウレアーゼの活性に重要なヒスチジン残基とシステイン残基とが上記の抽出された配列中（１３８アミノ酸残基）に存在するということである。
【００５６】
本発明に係るタンパク質は、上述の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、それを種々に変更させたものも含まれる。この「変更させたもの」とは即ち、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、免疫反応によって、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を生成するタンパク質である。
【００５７】
なお、上記タンパク質は、ウレアーゼの立体構造を反映することができるようなアミノ酸数であれば、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの抗体を生成する抗原としての機能は十分に果たすことができる。しかしながら、これに加え、本発明に係るタンパク質は、免疫反応によりＨ．ピロリ菌の増殖をも抑制する抗体を生成するものでなくてはならない。そこで、上記タンパク質は、免疫反応によって、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を生成することのできるアミノ酸数からなっていればよい。
【００５８】
なお、本発明には、上記タンパク質を認識する抗体も含まれるが、上記抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。なお、モノクローナル抗体は、上記タンパク質を抗原として用いて常法のハイブリドーマ技術によって製造することができる。また、ポリクローナル抗体は、宿主動物、例えばラットまたはウサギに、上記タンパク質を投与し、感作された血清を回収することからなる常法によって製造することができる。
【００５９】
（２）本発明に係るタンパク質の取得方法について
本発明に係るタンパク質の取得方法として、適当なものは、遺伝子組み換え技術等を用いる方法である。この場合、上記タンパク質をコードする遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたタンパク質を精製するという方法などを採用することができる。なお、大量発現させることができる適当なプロモーターとともに上記タンパク質をコードする遺伝子を組み込めば、タンパク質を効率よく取得できる可能性がある。また、実施例で述べるように、宿主細胞中で分解されないように、上記タンパク質を融合タンパク質として取得してもよい。
【００６０】
また、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子については、Ｈ．ピロリ菌ウレアーゼのβサブユニットの配列情報に基づいて、そのゲノムＤＮＡ（あるいはｃＤＮＡ）を取得した後、それを鋳型として適当なプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって該当する領域を増幅させることで取得することができる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用して、変異が導入された遺伝子が得られれば、それを導入した形質転換体においては、上述の（ｂ）のタンパク質が翻訳産物として得られる。
【００６１】
上記タンパク質の取得は、Ｈ．ピロリ菌に対するワクチンとして上記特許文献１に提案されていたウレアーゼそのもの、あるいはそのサブユニットの取得に比べて経済的に優れている。
【００６２】
しかしながら、本発明に係るタンパク質の取得方法は、上述に限定されることなく、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよいし、化学合成されたものであってもよい。
【００６３】
（３）本発明のタンパク質などの利用方法について
上述のようにして得られた本発明に係るタンパク質は、動物などの生体へ投与し免疫することによって、抗体を誘導させることができる。この抗体は、上記ウレアーゼと結合してその活性を抑制するため、Ｈ．ピロリ菌の強酸下の胃での生存を阻害するように機能する。また、上記抗体はＨ．ピロリ菌の増殖をも阻害する。そこで、上記タンパク質は、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの酵素活性の抑制、かつ、Ｈ．ピロリ菌の増殖の抑制の機能を兼ね備えた高性能のワクチンとして使用することができる。このワクチンは、Ｈ．ピロリ菌の感染の予防、あるいはＨ．ピロリ菌感染者の治療に有用である。
【００６４】
なお、上記のタンパク質を用いた動物の免疫方法は、特に限定されるものではなく、従来から一般的に行われている方法を各種動物に応じて適宜用いることができる。後述の実施例には、その一例を記載する。
【００６５】
また、乳牛に対してある抗原を免疫すると、その乳牛から搾取される牛乳にも当該抗原に対する抗体が含まれるということが知られている。この方法を利用して本発明に係るタンパク質を乳牛に免疫すれば、その乳牛から搾取された牛乳に上記タンパク質の抗体を含有させることができる。この抗体は、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体であることから、上記タンパク質が免疫された乳牛から採取された牛乳には、Ｈ．ピロリ菌の感染を予防する成分が含まれていると言える。それゆえ、この方法を利用して牛乳を採取すれば、その牛乳に機能性食品としての付加価値を付与することができる。同様に、ニワトリに対してある抗原を免疫すると、そのニワトリが産む鶏卵にも当該抗原に対する抗体が含まれるということが知られている。従って、上記タンパク質をニワトリに免疫すれば、そのニワトリが産む鶏卵にも上記タンパク質の抗体を含有させることができ、機能性食品として有用である。
【００６６】
また、上記「形質転換体」とは、形質転換植物を含む意味であり、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を植物に発現可能に導入すれば形質転換植物となる。形質転換体、形質転換植物の範疇には、生物個体；根、茎、葉、生殖器官（花器官および種子を含む）などの各種器官；各種組織；細胞；などが含まれる。さらには、プロトプラスト、誘導カルス、再生個体およびその子孫なども含まれるものとする。上記形質転換体の生産において、宿主として食用に適した植物を採用すれば、得られた形質転換植物は食べるワクチンとして利用することができる。
【００６７】
【実施例】
本発明の実施例について、実験１ないし実験９に基づいて以下に説明する。
【００６８】
〔実験１〕Ｈ．ピロリ菌の培養
Ｈ．ピロリ菌ＡＴＣＣ４３５０４を、７％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）を含むブルセラブロス培地（ＢＢＬ，  Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）中で培養した。培養は、微好気性環境下（５％Ｏ２、１０ＣＯ２、８５％Ｎ２）、３７℃で２〜４日間行った。
【００６９】
〔実験２〕ゲノムＤＮＡの調製
実験１で培養したＨ．ピロリ菌のペレットを、１ＭＮａＣｌ１ｍｌで洗浄し、５２０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ８．０）で再懸濁した。１ｍｇのプロテアーゼと３０μｌの１０％ＳＤＳを添加し、この混合物を５６℃で２０分間インキュベートした。その後、１００μｌの５ＭＮａＣｌと８０μｌの１０ｍｇ／ｍｌＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）／ＮａＣｌを添加し、できた混合物を６５℃で２０分間インキュベートした。反応混合物を、界面がはっきりするまでフェノール／クロロホルムで数回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈殿し、適当な溶液に溶解した。このＤＮＡが、Ｈ．ピロリ菌のゲノムＤＮＡである。
【００７０】
〔実験３〕ＵｒｅＢ遺伝子のクローニング
実験２で抽出したゲノムＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲのための鋳型として使用した。使用したプライマーは、ＢａｍＨＩサイト（下線部で示す）を含む前方プライマー（センスプライマー）：５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＴＴＣＴＡＡＣＧＡＴＧＣＧＡＧＣ−３’、ＥｃｏＲＩ部位（下線部で示す）を含む反転プライマー（アンチセンスプライマー）：５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＴＴＧＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＣＴＧ−３’である。これらは、本発明の配列番号１で示されるタンパク質を発現させるための活性部位であるＤＮＡを増幅させるためのプライマーである。ＰＣＲは、９５℃１０分間のホットスタート、それに続いて、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃２分間を３０サイクル、７２℃１０分間の最終伸長反応という条件で実施した。
【００７１】
ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル電気泳動で可視化したところ、約４３０塩基対のＤＮＡ断片が検出された。これは、予想した塩基対サイズと一致していた。このＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ簡易ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）へクローニングし、発現タンパク質（発現ＵｒｅＢと呼ぶ）の塩基配列を、サイクルシークエンシングキット（Ｐｈｅｒｍａｃｉａ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して確認した。
【００７２】
発現ＵｒｅＢのアミノ酸配列を１文字表記したものを図１の下段に示す。図１の上段は、配列番号２で示すＨ．ピロリ菌ウレアーゼのβサブユニットの１９９番目から３４０番目に相当するアミノ酸配列（これを抽出ＵｒｅＢと呼ぶ）を１文字表記したものである。つまり、図１の上段の第３番目から第１４０番目までの配列が、配列番号１で示す配列に対応する。下段の発現ＵｒｅＢのアミノ酸配列において、第２番目と第１４１及び１４２番目のアミノ酸残基は、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩサイトを含むプライマー配列に相当する。発現ＵｒｅＢにはこの２つの制限酵素サイトが導入されるので、抽出ＵｒｅＢと比べると、太字で示すように、Ｎ末端の１アミノ酸残基（Ｎ２Ｓ）及びＣ末端の２アミノ酸残基（Ｉ１４１Ｅ及びＲ１４２Ｆ）がそれぞれ変化している。
【００７３】
〔実験４〕組変えＵｒｅＢタンパク質の発現と精製
ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）タンパク質と融合された組換えＵｒｅＢ（ＵｒｅＢ−ＧＳＴと呼ぶ）の発現用プラスミドを構築するために、上記実験３でＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで処理した。このＤＮＡ断片と、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで処理して脱リン酸化した発現ベクターｐＧＥＸ−１λＴ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とを結合させた。構築されたプラスミドを、ｐＧＥＸ−ＵＡと名付けた。
【００７４】
続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、ｐＧＥＸ−ＵＡで形質転換し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導した。このときの培養液は、細胞密度（Ｏ．Ｄ．：６００ｎｍ）が０．６であった。この培養液を３７℃で５時間インキュベートした後、培養細胞を採取し、超音波処理した。さらに、可溶性融合タンパク質を、蒸留水で抽出後、グルタチオンセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。その後、サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（セファロース６  ＨＲ１０／３０）を実施し、精製された発現タンパク質であるＵｒｅＢ−ＧＳＴを単離した。なお、この発現タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析したところ、４１ＫＤａのメインバンドを確認した。これは予想した分子量に相当するものであった。
【００７５】
〔実験５〕ウサギの免疫処置
ポリクローナル抗ＵｒｅＢ抗血清（ＵｒｅＢ抗血清）、抗ヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ抗血清（ネガティブコントロール）、及びＨ．ピロリ菌ウレアーゼモノクローナル血清（ポジティブコントロール）を得るために、以下のようにしてウサギの皮下に免疫処理を行った。抗原として、実験４で得られたＵｒｅＢ−ＧＳＴ、抗ヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ、及びＨ．ピロリ菌ウレアーゼを各１ｍｇ、それぞれ１ｍｌのＰＢＳに溶解し、１ｍｌの完全フロイントアジュバンド（ＣＦＡ）で乳化した。ウサギ一羽に対して、乳化した混合物を全量で２ｍｌ免疫した。その後ウサギには、ＣＦＡの代わりに不完全フロイントアジュバンド（ＩＦＡ）を使用すること以外は同様の方法で、２週間間隔で追加抗原刺激を施した。４回目の追加抗原刺激の後、免疫したウサギから採血を行い、血清サンプルをＥＬＩＳＡ法によってテストした。その結果得られた抗血清を、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼと結合したセファロース４Ｂを使用したアフィニティクロマトグラフィーで精製した。
【００７６】
〔実験６〕  ＵｒｅＢ抗血清の免疫反応性
実験５で精製したＵｒｅＢ抗血清（抗体）について、異なるいくつかのウレアーゼ及びＨ．ピロリ菌に対する免疫反応性を、ＥＬＩＳＡ法によって調査した。その結果が図３である。図３に示すように、ＵｒｅＢ抗血清は、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼだけでなく、ＵｒｅＢ−ＧＳＴとも強く反応した。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ及びタチナタマメのウレアーゼとも強く交差反応した。しかし、ＵｒｅＢ抗血清は、タチナタマメのウレアーゼよりもＢａｃｉｌｌｕｓのウレアーゼと強く交差反応した。これは、ＢａｃｉｌｌｕｓのウレアーゼとＨ．ピロリ菌のウレアーゼとの相同性（６７．６％）が、タチナタマメのウレアーゼとＨ．ピロリ菌のウレアーゼとの相同性（６３．０％）よりも高いためであると考えられる。
【００７７】
また、ＵｒｅＢ抗血清は、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）とは結合せず、Ｈ．ピロリ菌とは結合した。細菌の表面に発現するウレアーゼ分子の数は明らかではない。このため、Ｈ．ピロリ菌に対するＵｒｅＢ抗血清の反応性は、免疫プレート上にＨ．ピロリ菌をコーティングすることによって、ＥＬＩＳＡ法を使用した実験では評価できない。しかしながら、ＵｒｅＢ抗血清は、完全なＨ．ピロリ菌といくらかは反応した。
【００７８】
〔実験７〕Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼ活性に対する阻害分析
２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）５０μｌ中に精製したＨ．ピロリ菌ウレアーゼ１μｇを溶解したものを、９６穴のマイクロタイタープレート中で、室温で９０分間、実験５で精製した各抗血清（５０μｌ中に１０μｇ）とともにプレインキュベートした。この実験では、ヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ坑血清をコントロールとして使用した。プレインキュベートの後、１００μｌの反応溶液を、１００ｍＭ尿素と０．００５％のフェノールレッドとを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）１００μｌと混合した。マイクロプレートリーダーを使用して、室温で数時間にわたって３０分間隔で、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７９】
この測定の結果が図４である。図４では、●がＵｒｅＢ抗血清、■がヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤに対する抗血清（ネガティブコントロール）、▲がＨ．ピロリ菌ウレアーゼモノクローナル血清（ＨｐＵ−２モノクローナル抗体、ポジティブコントロール）の５４０ｎｍにおける吸光度を示している。また、図４（ａ）〜（ｃ）は、抗血清の濃度が、それぞれ、２５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌの場合ある。本図は、コントロールであるヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤに対する抗血清の曲線よりも下になるとウレアーゼ活性に対して阻害効果があり、上になると促進効果があることを示す。図４に示すように、ＵｒｅＢ抗血清（抗体）は、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼ活性に対して濃度依存的な阻害を示した。
【００８０】
そして、Ｈ．ピロリ菌ウレアーゼ活性に対する抗血清の阻害率を求めた。すなわち、図４において、ＵｒｅＢ抗血清、ＨｐＵ−２モノクローナル抗体について、コントロールであるヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤに対する抗血清の吸光度を基に、本実験での阻害率を計算した。（ヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤに対する抗血清のグラフで吸光度が１／２となる反応時間を取り、その時点における各抗血清の示す吸光度と比較し、その割合を阻害率とした。）なお、吸光度が、ヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤに対する抗血清とは離れていない場合を阻害率０％とした。図４（ａ）に示すように、２５μｇ／ｍｌのＵｒｅＢ抗血清は、阻害率３７％という強い阻害活性を示した。また、図４（ｂ）に示すように、ＵｒｅＢ抗血清が５μｇ／ｍｌの場合は、上記阻害活性は２１．５％であった。ポジティブコントロールとして使用されたＨｐＵ−２モノクローナル抗体は、非特許文献２で報告されているのと同様の阻害活性を示した。一方で、このＨｐＵ−２モノクローナル抗体は、Ｈ．ピロリ菌に対する増殖阻害作用は示さなかった。
【００８１】
〔実験８〕胃の生検標本の免疫組織化学的染色
Ｈ．ピロリ菌に感染した胃組織を用いて免疫組織化学的染色を行った。ホルマリンに混合された、Ｈ．ピロリ菌に感染したパラフィン包埋ヒト胃組織を使用した。４μｍの切開片をキシレンで脱パラフィン処理し、等級化されたエタノールで再水和した。そして、内因性のペルオキシターゼ活性を、３％Ｈ２Ｏ２でブロッキングした。切開片を、Ｈ２Ｏで洗浄した後、実験５で精製されたＵｒｅＢ抗血清とともに、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌの濃度で、室温で６０分間インキュベートし、Ｈ２Ｏで３回各５分間洗浄した。スライドを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋（ＨＲＰ．Ｒａｂｂｉｔ）試薬（Ｄａｋｏ  Ｊａｐａｎ  Ｃｏ  Ｌｔｄ．，  Ｋｙｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）とともに、室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。染色には、ＤＡＢ基質キット（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｃｏ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を使用した。
【００８２】
ヒメネス染色については、以下のようにして行った。胃の生検標本を、脱パラフィン化し、蒸留水に水和した。上記切開片を石炭酸フクシン溶液で１分間濾過した。水中での洗浄後、スライドを１％マラカイトグリーンで５秒間染色した後、水で洗浄し、空気中で乾燥させた。
【００８３】
ＤＡＫＯ社製の抗血清を、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼに対する抗血清として、ポジティブコントロールとして使用した（Ｄａｋｏ  Ｊａｐａｎ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ）。
【００８４】
上記免疫組織化学的染色の結果が図５である。図５において矢印で指された微粒子が染色されたＨ．ピロリ菌である。図５（ａ）は、ヒメネス染色の結果であり、上記切開片はＨ．ピロリ菌に感染していることがわかる。図５（ｂ）は、ＵｒｅＢ抗血清が使用されたときの染色反応である。Ｈ．ピロリ菌による感染部位が粘膜表面においてはっきりと観察されている。図５（ｃ）は、ポジティブコントロールとして使用されたＤＡＫＯの抗血清（Ｈ．ピロリ菌ウレアーゼに対する抗血清）の反応を示している。Ｈ．ピロリ菌による感染部位がはっきりと観察されている。図５（ｄ）は、ネガティブコントロールであるヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤに対する抗血清の反応である。これらの結果により、本発明によるＵｒｅＢ組換え抗原（ＵｒｅＢ−ＧＳＴ）によって誘導される抗血清は、感染したＨ．ピロリ菌と結合できるということが示される。
【００８５】
〔実験９〕インビトロでの分析
実験５で精製したＵｒｅＢ抗血清を使用して、インビトロでの細菌増殖への影響を試験した。
【００８６】
Ｈ．ピロリ菌ＡＹＣＣ４３５０４を、７％ウシ胎児血清を含むブルセラブロス培地で、２〜４日間、３７℃で培養後、４℃、４０００×ｇで１０分間遠心分離にかけて収集した。得られた細菌を、ブルセラブロスで懸濁し、約３×１０５／ｍｌに希釈した。そして、１００μｌの分割量を、精製された抗ロングペプチド血清（ＰＢＳ中に５０，１０および２μｇ／ｍｌ）を１００μｌ含む９６穴のマイクロプレートの各穴に添加した。ヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ抗血清をネガティブコントロールとして使用した。マイクロプレートを、３７℃で、５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、および８５％Ｎ２の大気中でインキュベートした。０、２４、４８および７２時間のインキュベート後、生育細胞の定量化するために、１０μｌの分割量を各穴から取り出し、希釈後、ＢＨＩ−寒天プレートの上に接種した。このプレートを３７℃で４日間インキュベートしたところ、コロニーが観測できた。これらの実験は繰り返して実施した。Ｈ．ピロリ菌の増殖の阻害率は、抗血清０μｇ／ｍｌの場合を含む種々の濃度の抗血清（あるいは抗体）におけるコロニー数を比較することによって算出した。
【００８７】
図６がその結果である。図６（ａ）に示すように、Ｈ．ピロリ菌がコントロール抗血清（ヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤに対する抗血清）とともにインキュベートされた場合、コントロール抗血清はＨ．ピロリ菌の増殖を抑制しなかった。一方、図６（ｂ）に示すように、ＵｒｅＢ抗血清では、血清濃度１μｇ／ｍｌの場合は阻害率約４０％で、血清濃度１００μｇ／ｍｌの場合は阻害率約８０％で、それぞれＨ．ピロリ菌の増殖を著しく阻害した。この阻害能は、図６（ｃ）に示すように、ＵｒｅＢ抗血清を作製するのと同じ方法で作製した、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼに対する抗血清の阻害能に匹敵していた。
【００８８】
以上に記述したように、本実施例において作製されたＵｒｅＢ−ＧＳＴをウサギに免疫することによって得られたＵｒｅＢ抗血清には、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼと抗原抗体反応をする抗体が生産されていることが確認された。即ち、上記抗血清中の抗体は、上記ウレアーゼの抗体として作用していると言える。また、上記ＵｒｅＢ抗血清は、明らかにＨ．ピロリ菌の増殖を抑制していた。すなわち、上記抗血清中の抗体は、Ｈ．ピロリ菌の抗体として作用していると言える。
【００８９】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係るタンパク質は、免疫反応によって、Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すると共に、Ｈ．ピロリ菌の増殖を抑制する抗体を生成することができる。上記タンパク質は、Ｈ．ピロリ菌が有するウレアーゼのβサブユニットにおける一次構造の特定の一部領域を含むものである。そのため、Ｈ．ピロリ菌に対して特異的に作用する抗体を効率よく誘導することができ、Ｈ．ピロリ菌に対するワクチンとして有用である。
【００９０】
上記タンパク質をワクチンとして使用すれば、ウレアーゼやそのサブユニットを用いた場合に起こり得る重篤な副作用を回避することができる。また、本発明のタンパク質は、ウレアーゼやそのサブユニットに比べ、精製のコストが削減できるという点でも優れている。さらに、上記ワクチンは、Ｈ．ピロリ菌ウレアーゼの活性阻害及びＨ．ピロリ菌の増殖の抑制という両方の能力を兼ね備なえているという点で、非常に優れている。
【００９１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】上段は、Ｈ．ピロリ菌ウレアーゼのβサブユニットの１９９番目から３４０番目に相当するアミノ酸配列（抽出ＵｒｅＢ）を１文字表記によって示した図である。下段は、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩサイトを含むプライマー配列を反映した発現ＵｒｅＢのアミノ酸配列を１文字表記によって示した図である。
【図２】（ａ）はＨ．ピロリ菌のウレアーゼのβサブユニット立体構造を示す模式図であり、（ｂ）は（ａ）における活性部位周辺の立体構造を詳細に示す模式図である。
【図３】ＵｒｅＢ抗血清の免疫反応性をしらべた結果を示すグラフである。
【図４】Ｈ．ピロリ菌のウレアーゼ活性に抗血清を反応させたときの５４０ｎｍにおける吸光度を表すグラフである。（ａ）は抗血清の濃度が２５μｇ／ｍｌの場合、（ｂ）は抗血清の濃度：５μｇ／ｍｌの場合、（ｃ）は抗血清の濃度：０．２μｇ／ｍｌの場合である。また、●はＵｒｅＢ抗血清（本発明）、■はヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤに対するの抗血清（ネガティブコントロール）、▲はＨ．ピロリ菌ウレアーゼモノクローナル血清（ＨｐＵ−２モノクローナル抗体、ポジティブコントロール）である。
【図５】Ｈ．ピロリ菌に感染した胃の組織断片（ａ）と抗血清とを反応させた後（ｂ）〜（ｄ）の免疫組織化学的染色の結果を示す模式図である。（ａ）はヒメネス染色の結果である。（ｂ）はＵｒｅＢ抗血清（本発明）を反応させた場合、（ｃ）はＤＡＫＯの抗血清（ポジティブコントロール／Ｈ．ピロリ菌ウレアーゼに対する抗血清）を反応させた場合、（ｄ）は、ヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤに対する抗血清（ネガティブコントロール）を反応させた場合である。
【図６】インビトロにおけるＨ．ピロリ菌の阻害率を表すグラフである。（ａ）はヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤに対するの抗血清（ネガティブコントロール）の場合、（ｂ）はＵｒｅＢ抗血清（本発明）の場合、（ｃ）は、Ｈ．ピロリ菌ウレアーゼに対する抗血清（ポジティブコントロール）の場合である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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