(57)【要約】【課題】部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体から該ＤＮＡを効率的かつ簡便に除去する方法、および、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体から該トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを効率的かつ簡便に転位する方法を提供することを課題とする。【解決手段】部位特異的組み換え酵素遺伝子をＦｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法により一過的に高発現させることで、マーカー遺伝子を効率的かつ簡便に除去できるのではないかと考えた。この方法は、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体から該トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを転位する方法にも応用できるものと考えられる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して導入することにより、該部位特異的組換え酵素を一過的に発現させる工程を含む、該部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡの除去方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡが除去された形質転換植物体。
【請求項３】
トランスポゾン転位酵素をコードするＤＮＡを、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して導入することで、トランスポゾン転位酵素を一過的に発現させる工程を含む、該トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンの転位方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンが転位した形質転換植物体。
【請求項５】
請求項２または請求項４に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項６】
請求項２、４または５に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体から該ＤＮＡを効率的かつ簡便に除去する方法に関する。さらに、本発明は、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体から該トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを効率的かつ簡便に転位する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノムＤＮＡ中に挿入されたマーカー遺伝子を除去する方法として、マーカー遺伝子の両端に部位特異的組換え酵素認識配列を配置し、部位特異的組換え酵素によりマーカー遺伝子を切り出し除去することが考案されている。則ち、部位特異的組換え酵素認識配列を付加したマーカー遺伝子を持つ個体と部位特異的組換え酵素遺伝子を導入した個体をかけ合わせることによりマーカー遺伝子の切り出し除去を行う方法（非特許文献１）、予めマーカー遺伝子と誘導性プロモーターによりコントロールされる部位特異的組換えタンパク遺伝子を一緒に部位特異的組換え酵素認識配列の内側に配置し形質転換し、必要な時に部位特異的組換え酵素の発現を誘導することによってマーカー遺伝子の切り出し除去を行う方法（非特許文献２）である。しかしながら上記の２つの方法においては、部位特異的組換え酵素の発現量が充分でなく切り出し除去の効率が極めて低いことが問題点であった。また非特許文献２に記載の方法においては部位特異的組換え酵素の発現を完全に抑制することは現状では困難であり、形質転換処理後、マーカー遺伝子を利用した形質転換体選抜中に、部位特異的組換え酵素の作用により、マーカー遺伝子が抜け落ちる可能性が高い事が問題であった。
【０００３】
しかしながら、これまでに、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ法により、部位特異的組換え酵素遺伝子を一過的に高発現させて、マーカー遺伝子を効率的かつ簡便に除去できる方法については知られていなかった。
【０００４】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Ｏｎｏｕｃｈｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｚｙｇｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．  （１９９５）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４７，６５３−６６０
【非特許文献２】Ｓｕｇｉｔａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｐｙ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  （２０００）  ２２，  ４６１−４６９
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体から該ＤＮＡを効率的かつ簡便に除去する方法を提供することにある。さらに、本発明は、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体から該トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを効率的かつ簡便に転位する方法を提供することもまた目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｙｅ，  Ｇ．−Ｎ．ら（Ｇｕａｎｇ−Ｎｉｎｇ  Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １９  （３），２４９−２５７．）の論文を精査し、ｖａｃｕｕｍ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ法（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  法の一種）によりＧＵＳ遺伝子を導入した場合、一過的にはＧＵＳ遺伝子の非常に強い発現がアラビドプシス植物体で観察されることに気がついた。一方、Ｈｏｄｇｅｓらのグループは（Ｌｙｚｎｉｋ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５，  ２１（４），  ９６９−９７５．）は形質転換トウモロコシ由来のプロトプラストにおいてＦＬＰ遺伝子を一過的に発現させることにより、特異的認識配列であるＦＲＴにはさまれた配列の切り出しが行える事を報告していた。
【０００７】
そこで本発明者らは、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ法の一種であるＦｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法により外来遺伝子が一過的には胚発生の初期に強く発現する事を利用し、部位特異的組換え酵素遺伝子を一過的に高発現させることで、マーカー遺伝子を効率的かつ簡便に除去できるのではないかと考えた。
【０００８】
まず、部位特異的組み換えタンパク質として出芽酵母由来のＦＬＰ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを利用し、その認識配列であるＦＲＴ配列をハイグロマイシン抵抗性遺伝子カセットの両外側に配置したコンストラクトを作製した。このコンストラクトではＦＲＴ配列のさらに外側にはマンノピン合成酵素遺伝子のプロモーターとビアラホス耐性遺伝子を配置した。原理的にＦＬＰによりＦＲＴ配列間が除去されればマンノピン合成酵素遺伝子のプロモーターとビアラホス耐性遺伝子が近接しビアラホス耐性を付与する。次いで、本発明者らは、ｐＫＯ１０１を保持するＡ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５株を用いて、Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法により形質転換アラビドプシス植物体を作製した。ｐＫＯ１０１の導入されたアラビドプシス植物体に対して、初期胚特異的プロモーターで働くＦＬＰを保持するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５株を用いてＦｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法を適用し、ビアラホス耐性を指標にして、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子が効率よく除去されるか否かを検討できる。
【０００９】
また、この方法は、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体から該トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを転位する方法にも応用できるものと考えられる。
【００１０】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。
〔１〕部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して導入することにより、該部位特異的組換え酵素を一過的に発現させる工程を含む、該部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡの除去方法。
〔２〕〔１〕に記載の方法により、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡが除去された形質転換植物体。
〔３〕トランスポゾン転位酵素をコードするＤＮＡを、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して導入することで、トランスポゾン転位酵素を一過的に発現させる工程を含む、該トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンの転位方法。
〔４〕〔３〕に記載の方法により、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンが転位した形質転換植物体。
〔５〕〔２〕または〔４〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔６〕〔２〕、〔４〕または〔５〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリウム）を介して導入することにより、該部位特異的組換え酵素を一過的に発現させる工程を含む、該部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡの除去方法を提供する。この方法は、従来の方法と比較して、部位特異的組み換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを高効率に除去できる方法である。また、この方法は、組織培養を必要としないので従来の方法と比較して非常に簡便な方法である。さらに、この方法は、所望の植物に適用できると考えられ、その利用範囲は極めて広いと考えられる。
【００１２】
本発明において、部位特異的組換え酵素とは、部位特異的組換えの過程、即ちＤＮＡの分子内あるいは分子間の特定部位で起こる組換えの過程を触媒する酵素を意味する。また、部位特異的組み換え酵素認識配列とは、部位特異的組み換え酵素の認識配列である４０塩基対程の配列を意味する。部位特異的組換え酵素は認識配列に挟まれたＤＮＡ断片を切り出し環状化させる機能を持つが、逆の反応（環状分子を認識配列を介して挿入する）も行う。
【００１３】
本発明における部位特異的組換え酵素としては、特に制限はないが、例えばＦＲＴ配列を認識する出芽酵母由来のＦＬＰ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ、味噌醤油酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）由来のＲ／ＲＳシステムにおけるＲＳ配列を認識する酵素Ｒ（Ｏｎｏｕｃｈｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４７，  ６５３−６６０、Ｏｎｏｕｃｈｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９，  ６３７３−６３７８）、ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｐ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘシステムにおけるｌｏｘ配列を認識する酵素Ｃｒｅ（Ａｌｂｅｒｔ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ７，  ６４９−６５９、Ｌｉｕ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．    （１９９８）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ８，  １３００−１３０９、Ａｂｍｅｍｓｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｃｅｌｌ  ３２，  １３０１−１３１１）などが例示できる。
【００１４】
本発明において、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡとしては、好ましくはマーカー遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。該マーカー遺伝子としては、特に制限はなく、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラヒス耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、ＧＵＳ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子などの蛍光遺伝子などが例示できる。
【００１５】
また、本発明におけるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとしては、特に制限はなく、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５が例示できる。
【００１６】
本発明における「部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体」は、例えば、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させることで作製できる。
【００１７】
本発明において、植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入ＤＮＡを発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここで言う「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００１８】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。パーティクルガン法においては、例えば、バイオラッド社のものを用いることが可能である。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １００：  １５０３，  １９９２）。
【００１９】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作製する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ  ＳＫ：  Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ  （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，  Ｅｄｓ）  ｐｐ．６６−７４，  １９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １００：  １５０３，  １９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：  ９５７，  １９９１）、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（例えば、単子葉植物の超迅速形質転換法（特許第３１４１０８４号））など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００２０】
また、本発明における「部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体」は、例えば、後述の方法により、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを、ｉｎｔａｃｔな植物体に直接的に導入することで作製できる。
【００２１】
本発明においては、このように作製された部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体に、部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して導入する。これによって、部位特異的組換え酵素が一過的に発現し、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡが除去される。
【００２２】
本発明において、部位特異的組み換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体に、部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して導入する方法としては、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ法を好適に用いることができる。
【００２３】
ここで、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ法とは、植物からカルス誘導やプロトプラスト単離等を行わずに、ｉｎｔａｃｔな植物体に直接遺伝子導入を行う方法を意味する。特にアラビドプシスで開発された方法は蕾の時期の植物体の花序をアグロバクテリウム菌液に浸すだけで形質転換を行う方法で極めて簡便な方法である（ｖａｃｕｕｍ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ法の場合は浸した後に減圧処理を行う）。形質転換（遺伝子の導入）は卵細胞に対して行われると考えられており、自殖種子の０．１〜０．５％が形質転換種子となる。
【００２４】
本方法は従来の方法と比べ組織培養を経ない形質転換法のため、ｓｏｍａｃｌｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ（体細胞突然変異）を誘発する可能性が低く、また操作が極めて簡便で形質転換体が得られるまでの期間が短いという利点がある。
【００２５】
本発明において、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ法（Ｂｅｎｔ  Ａ．Ｗ．  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔａ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｕｓｅｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２４，  １５４０−１５４７）としては、Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法、ｖａｃｕｕｍ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ法、Ｉｎｃｉｓｉｏｎ／Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ法、アグロバクテリウム菌液をスプレーして感染するＦｌｏｒａｌ  ｓｐｒａｙ法（Ｃｈｕｎｇ  ＭＨ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ９（６）  ４７１−４７６）などが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明において、部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡが除去されたか否かは、該ＤＮＡが薬剤耐性遺伝子や蛍光遺伝子であれば、部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換植物体、該形質転換植物体の細胞、または、該形質転換植物体の種子などの薬剤耐性能の消失や蛍光の消失、また、サザン法、ＰＣＲ法などで判断することができる。
【００２７】
また、トランスポーゼス（転位酵素）が特異的な配列を認識してトランスポゾンを切り出す過程は部位特異的組み換え酵素がその認識配列を切り出す過程と類似していることから、本発明者らは、トランスポゾン転位酵素をコードするＤＮＡを、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して導入することで、トランスポゾン転位酵素を一過的に発現させる工程を含む、該トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンの転位方法を提供する。
【００２８】
トランスポゾンによる遺伝子のタギングは現在主として２成分系で行われている。この方法はトランスポーゼスを持たないトランスポゾン（非自立的トランスポゾン）を有する植物体とトランスポーゼスが発現している植物体を交配して、非自立的トランスポゾンを転移させ、また、再度転移しない様に次世代でトランスポーゼス遺伝子を分離させる方法であり、多大な労力と時間を必要としている。これに対して本発明の方法はトランスポーゼスをコードするＤＮＡを、非自立的トランスポゾンを有する植物体に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して導入することで、トランスポーゼスを一過的に発現させ、非自立的トランスポゾンを転移させる方法であり、高効率の転移が期待され、また、次世代でトランスポーゼス遺伝子を分離させる必要もない。
【００２９】
本発明におけるトランスポゾン転位酵素としては、特に制限はないが、例えばトウモロコシのＡｃ／Ｄｓ系が挙げられる。
【００３０】
本発明における「トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体」は、例えば、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させること、また、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ法により、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを植物体に導入することで作製できる。本発明においては、このように作製されたトランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体に、トランスポゾン転位酵素をコードするＤＮＡを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介して導入する。これによって、トランスポゾン転位酵素が一過的に発現し、トランスポゾン転位酵素を持たないトランスポゾンが転位する。
【００３１】
部位特異的組み換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体から該ＤＮＡが除去された形質転換植物体や、転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体から該転位酵素を持たないトランスポゾンが転位した形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔１〕  ｐＫＯ１０１、ＦＬＰ遺伝子一過的発現ベクターの作製
部位特異的組み換え酵素として出芽酵母由来のＦＬＰ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（ｐＯＧ４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、その認識配列であるＦＲＴ配列をハイグロマイシン抵抗性遺伝子カセット（ＣａＭＶ３５ｓプロモーター＋ハイグロマイシン抵抗性遺伝子＋ＣａＭＶ３５ｓターミネーター）の両外側に配置したコンストラクトを作製した（図１Ａ）。このコンストラクトではＦＲＴ配列のさらに外側にはマンノピン合成酵素遺伝子のプロモーターとビアラホス耐性遺伝子を配置し、ＦＬＰの働きによりＦＲＴ配列に挟まれたハイグロマイシン抵抗性遺伝子カセットが抜けることにより、ビアラホス耐性遺伝子が発現する事が期待される（図２）。また、ＦＬＰ遺伝子を発現させるために図１に示したバイナリーベクター（ｐＳｋｐ−１ＦＬＰ）を作製した（図１Ｂ）。上記のベクターはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５にエレクトロポレーション法により導入した。
【００３３】
〔２〕  アラビドプシスの形質転換
ｐＫＯ１０１を保持するＡ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５を用いてＦｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法  （Ｃｌｏｕｇｈ，  Ｓ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，  Ａ．Ｆ．    （１９９８）．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １６，  ７３５−７４３．）  によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ    ｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃｏｌ−０  を形質転換した。得られた形質転換種子は２０  ｍｇ／Ｌの濃度のハイグロマイシンを含む０．４％  ゲルライトを固化剤としたＭＳ培地  （Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，  Ｆ．  （１９６２）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  １５，  ４７３−４９７．）  上に播種し、ハイグロマイシンを含む培地上で生育してきた植物体を形質転換植物体の候補として実験に用いた。
【００３４】
〔３〕  ＦＬＰ遺伝子の一過的発現によるマーカー遺伝子の除去
〔２〕で得られたｐＫＯ１０１導入アラビドプシス形質転換植物体に対して、Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法  によりｐＳｋｐ−１ＦＬＰを保持するＡ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５を感染させ  ＦＬＰ遺伝子を一過的に発現させる。ＦＬＰ遺伝子の一過的発現によってＦＲＴ配列間が切り出されると、ゲノム中に残されたｍａｓプロモーターとｂａｒ遺伝子が連結し植物体はビアラホス耐性となる。従って、ＦＬＰ遺伝子の一過的発現によってビアラホス耐性を示す植物体が効率よく得られたときに、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子が効率よく除去されたと判断される。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によって、部位特異的組み換え酵素認識配列に挟まれたＤＮＡを有する形質転換植物体から該ＤＮＡを効率的かつ簡便に切り出し除去を行うことが可能となる。さらに、転位酵素を持たないトランスポゾンを有する形質転換植物体から該転位酵素を持たないトランスポゾンを効率的かつ簡便に転位させることが可能となる。これらの方法は、所望の植物に適用できると考えられ、その利用範囲は極めて広いと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に用いたベクターを示す図である。（Ａ）はｐＫＯ１０１を示し、（Ｂ）はｐＳｋｐ−１−ＦＬＰ（アラビドプシス用  ＦＬＰ一過的発現用）を示す。
【図２】ＦＬＰによるＦＲＴ配列間の切り出しを示す図である。ＦＬＰの一過的発現によってＦＲＴ配列間が切り出されると、ゲノム中に残されたｍａｓプロモーターとｂａｒ遺伝子が連結し植物体はビアラホス耐性となる。一方、切り出されたＤＮＡ断片は細胞中で複製できずに分解されハイグロマイシン耐性を失う。
【図１】
2004275011.tif 000002
【図２】
2004275011.tif 000003