(57)【要約】【課題】ほとんど全ての生理活性タンパク質及び低分子薬剤の運搬タンパク質について簡便に作製することができ、生理活性タンパク質又は低分子薬剤に徐放性を与え、その薬効を安定的に効率よく発現させることができる徐放性製剤を提供する。【解決手段】シャペロニンと生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質とがペプチド結合を介して連結された融合タンパク質からなる徐放性製剤であって、前記生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質は、シャペロニンリングの内部に収納されている徐放性製剤。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャペロニンと生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質とがペプチド結合を介して連結された融合タンパク質からなる徐放性製剤であって、
前記生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質は、シャペロニンリングの内部に収納されている
ことを特徴とする徐放性製剤。
【請求項２】
融合タンパク質は、生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質がシャペロニンサブユニットのＮ末端、Ｃ末端及び／又はシャペロニンサブユニット同士の連結部にペプチド結合を介して連結されていることを特徴とする請求項１記載の徐放性製剤。
【請求項３】
融合タンパク質は、シャペロニンサブユニットと生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質との間にタンパク質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１又は２記載の徐放性製剤。
【請求項４】
融合タンパク質は、シャペロニンサブユニット同士の連結部にタンパク質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１、２又は３記載の徐放性製剤。
【請求項５】
タンパク質分解酵素の切断アミノ酸配列は、固形腫瘍又は特定臓器の産生するタンパク質分解酵素の認識アミノ酸配列であることを特徴とする請求項３又は４記載の徐放性製剤。
【請求項６】
シャペロニンは、５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成していることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の徐放性製剤。
【請求項７】
シャペロニンリングは、リング面又は側面を介して非共有結合的に会合し、繊維状構造を形成していることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載の徐放性製剤。
【請求項８】
シャペロニンは、バクテリア、古細菌又は真核生物に由来することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の徐放性製剤。
【請求項９】
生理活性タンパク質は、抗体の重鎖、軽鎖及びＦｖ領域単鎖抗体（ｓｃＦｖ抗体）の全長又はこれらの６残基以上の部分タンパク質であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の徐放性製剤。
【請求項１０】
生理活性タンパク質は、サイトカイン類の全長又はその６残基以上の部分タンパク質であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の徐放性製剤。
【請求項１１】
生理活性タンパク質は、ウィルス抗原の全長又はその６残基以上の部分タンパク質であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の徐放性製剤。
【請求項１２】
運搬タンパク質は、血清タンパク質の全長又はその６残基以上の部分タンパク質であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の徐放性製剤。
【請求項１３】
低分子薬剤は、消炎剤、抗凝固剤、抗炎症剤、鎮痛剤又は向精神剤であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は１２記載の徐放性製剤。
【請求項１４】
融合タンパク質は、生理活性タンパク質又は低分子薬剤の運搬タンパク質をコードする遺伝子とシャペロニンサブユニットをコードする遺伝子とを含有する遺伝子を転写・翻訳してなることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３記載の徐放性製剤。
【請求項１５】
生理活性タンパク質又は低分子薬剤の運搬タンパク質をコードする遺伝子は、その全アミノ酸配列を含むｃＤＮＡ又は６残基以上のアミノ酸配列をコードする部分遺伝子であることを特徴とする請求項１４記載の徐放性製剤。
【請求項１６】
シャペロニンと低分子薬剤の運搬タンパク質とがペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であって、
前記シャペロニンは１４〜１８個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成しており、
前記低分子薬剤の運搬タンパク質は、前記シャペロニンリングの内部に収納されている
ことを特徴とする融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ほとんど全ての生理活性タンパク質及び低分子薬剤の運搬タンパク質について簡便に作製することができ、生理活性タンパク質又は低分子薬剤に徐放性を与え、その薬効を安定的に効率よく発現させることができる徐放性製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年のバイオテクノロジーの発展に伴い、サイトカイン類等のタンパク質からなる生理活性物質（以下、生理活性タンパク質ともいう）や、低分子薬剤と結合してこれを運搬するタンパク質（以下、運搬タンパク質ともいう）が単離精製され、大量生産が可能となり、新しい医薬品の候補物質として期待を集めている。
【０００３】
これらの生理活性タンパク質や低分子薬剤の運搬タンパク質の多くは、体内滞留時間がわずか数分から数十分程度と極端に短い。これはこれらの生理活性タンパク質や低分子薬剤の運搬タンパク質が生体内の各種タンパク質分解酵素により分解を受けてしまうこと、及び、比較的低分子量のものは速やかに腎排泄されてしまうためと考えられている。従って、これらを用いた治療を効果あるものにするためには、高い投与量と長期にわたる治療とを必要とする。しかし、このような治療方法は、投与法・投与量を誤ると疾病が治療できないばかりでなく、重篤な副作用を惹起することがあるという問題があった。
【０００４】
このような問題を解決する方法として、薬物が短時間のうちに放出されて代謝されることなく一定の期間一定の濃度を維持することを可能にする徐放性をもったシステムが提案されている。
【０００５】
近年、徐放性をもったシステムとして、水溶性高分子による生理活性タンパク質や低分子薬剤の運搬タンパク質の包埋化が研究されている（「ＤＤＳの進歩１９９５−１９９６」水島博、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ別冊、中山書店）。この包埋化によって、生理活性タンパク質や低分子薬剤の運搬タンパク質は分子量が増大するため腎排泄速度が減少し、水溶性高分子によりその表面が覆われるためタンパク質分解酵素からの攻撃が立体的にブロックされ、生体内半減期の延長がなされる。これらの水溶性高分子は徐々に分解され、生理活性タンパク質が放出されることによって徐放性が実現される。
【０００６】
しかしながら、このシステムでは、まず生理活性タンパク質や低分子薬剤の運搬タンパク質を作製した後に更に包埋化を行うという非常に複雑で煩雑な工程をともなうという問題点があり、簡便な徐放性製剤の開発が求められていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、ほとんど全ての生理活性タンパク質及び低分子薬剤の運搬タンパク質について簡便に作製することができ、生理活性タンパク質又は低分子薬剤に徐放性を与え、その薬効を安定的に効率よく発現させることができる徐放性製剤を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討の結果、生理活性タンパク質又は低分子薬剤の運搬タンパク質をシャペロニンとの融合タンパク質とすることによって、生理活性タンパク質又は低分子薬剤の運搬タンパク質の高次構造に何らの変化も与えず生理活性を安定に保持したまま血中滞留時間を増大させ得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、シャペロニンと生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質とがペプチド結合を介して連結された融合タンパク質からなる徐放性製剤であって、前記生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質は、シャペロニンリングの内部に収納されている徐放性製剤である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明の徐放性製剤は、シャペロニンと生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質とがペプチド結合を介して連結された融合タンパク質からなる。
細胞に熱ショック等のストレスを与えると、一般的に分子シャペロンと呼ばれるタンパク質群の発現が誘導される。分子シャペロンは、エネルギー物質であるＡＴＰの存在下又は非存在下でタンパク質の折り畳みを支援したり、構造安定化に貢献したりする。これらの分子シャペロンの中でも、その分子量が約６０ｋＤａのものはシャペロニンといわれ、バクテリア、古細菌及び真核生物の全ての生物に存在し、タンパク質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。
【００１０】
シャペロニンはグループ１型とグループ２型に大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、コシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状複合体を補因子とする。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌に見られ、それらの構造や機能に関しては不明な点が多く残されており、グループ１型のコシャペロニンに相当するタンパク質も現在のところ見つかっていない。
【００１１】
シャペロニンは、図１に示したように、５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層のリング構造（以下、構造体をシャペロニン複合体、リングをシャペロニンリングという）を形成する。大腸菌シャペロニンの場合、シャペロニン複合体は内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有する。１層シャペロニンリングのキャビティは６０ｋＤａの球状タンパク質１つが充分に納まる空間を有する。シャペロニンはこのキャビティ内部に、ポリペプチドや変性タンパク質を一時的に格納し、タンパク質の折り畳み構造形成を助け、構造を安定化させる機能をもつ。
【００１２】
種々の細胞由来シャペロニン複合体の立体構造が近年、Ｘ線結晶構造解析によって詳細に明らかにされつつある。隣接するサブユニット間及びリング間の相互作用によるシャペロニン複合体の構成は、アミノ酸間の疎水的相互作用及び静電相互作用によっている。また、シャペロニンのＮ末端及びＣ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっており、特に大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬは、Ｃ末端の少なくとも２３アミノ酸はフレキシビリティの高い構造を示すことがわかっている。
【００１３】
また、Ｍｇ−ＡＴＰの存在化では、シャペロニンは高濃度（１ｍｇ／ｍＬ以上）の濃度でリング面又は側面を介して非共有結合的に会合し，繊維状構造を形成する場合がある（Ｔｒｅｎｔ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，５３８３−５３８８：Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２８３９９−２８４０７）。
【００１４】
バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、遺伝子組換え手法に大腸菌細胞質可溶性画分に容易に大量生産させることが可能である。更に、精製した発現産物を電子顕微鏡観察することによって、様々のシャペロニンが大腸菌でも自己集合し、１０〜２０量体からなる２層リング構造のシャペロニン複合体を形成できることが観察されている。
【００１５】
上記融合タンパク質は、シャペロニンと生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質とがペプチド結合を介して連結されたものであって、シャペロニンは５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成しており、生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質は、シャペロニンリングの内部に収納されている構造を有する。これにより、上記融合タンパク質からなる徐放性製剤を生体に適用すると、生体中のタンパク質分解酵素は、まずシャペロニンを攻撃してその立体構造を徐々に破壊し、その結果、包埋されている生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質は徐々に放出されることになる。また、生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質は、シャペロニンの立体構造内部に包埋されるため、生物活性に微妙な影響を及ぼす高次構造に何らの変化も与えず、生物活性を安定に保持することができる。
【００１６】
上記シャペロニンとしては、バクテリア、古細菌及び真核生物のいずれの由来のものでも用いることができる。また、シャペロニンがそのリング構造への自己集合能が維持されていれば、野生型のみならずアミノ酸変異体も使用可能である。例えば、シャペロニンの各サブユニットの会合力が弱められた変異体である場合には、格納された生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質は早く放出される。
【００１７】
本発明の融合タンパク質におけるシャペロニンと生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質との連結パターンとしては、生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質がシャペロニンリングのキャビティ内に確実に納まるように、シャペロニンサブユニットのＮ末端、Ｃ末端及び／又はシャペロニンサブユニット同士の連結部にペプチド結合を介して連結されることが好ましい。
【００１８】
更に、上記生理活性タンパク質又は低分子薬剤の運搬タンパク質が、ホモ又はヘテロの形態で２量体又はそれ以上の四次構造を形成するものである場合には、生理活性タンパク質又は低分子薬剤の運搬タンパク質を構成する１種又は２種のサブユニットが、互いに連結したシャペロニンサブユニットのＮ末端及びＣ末端にペプチド結合を介して連結されることが好ましい。例えば、シャペロニンサブユニット８個でシャペロニンリングを構成する古細菌由来シャペロニンの場合、シャペロニンサブユニットを８個連結した８量体シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に、２量体を形成することにより生理活性を発現するタンパク質を構成するそれぞれのサブユニットをペプチド結合を介して連結した場合、シャペロニンリング内の極めて近接した領域でそれぞれのサブユニットが存在するため、２量体からなる四次構造を形成しやすく、安定した生理活性の発現が可能となる。
【００１９】
上記融合タンパク質は、シャペロニンサブユニットと生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質との間にタンパク質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することが好ましく、また、シャペロニンサブユニット同士の連結部にタンパク質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することが好ましい。これにより、生体内のタンパク質分解酵素は、まず、シャペロニンサブユニット同士を結合する部位を攻撃してそのリング構造を徐々に破壊し、更に、生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質とシャペロニンサブユニットの結合部位を攻撃して生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質を放出させる。生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質への攻撃は最後となるため、該生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質の薬効の発揮を延長させ得ることができる。
【００２０】
上記タンパク質分解酵素の切断アミノ酸配列としては特に限定されず、例えば、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ，　プラスミン、キモトリプシン等のタンパク質分解酵素の認識部位が挙げられる。
【００２１】
また、上記タンパク質分解酵素の切断アミノ酸配列を固形腫瘍又は特定臓器の産生するタンパク質分解酵素の認識アミノ酸配列とすれば、生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質を固形腫瘍又は特定臓器付近で効率良く放出させ得ることができ好ましい。即ち、徐々に分解されながら血中を流れる本発明の徐放性製剤が固形腫瘍又は特定臓器に近づくと、それらが作り出すタンパク質分解酵素が徐放性製剤を攻撃して、生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質を放出させ、固形腫瘍又は特定臓器での薬効の発揮させることができる。
【００２２】
上記固形腫瘍又は特定臓器の産生するタンパク質分解酵素の認識アミノ酸配列としては特に限定されず、例えば、固形腫瘍細胞が産生するメタロプロテアーゼやＣＤ４細胞が産生するＨＩＶ感染に関与すると考えられているトリプターゼＴＬ２等の認識部位が挙げられる（「プロテアーゼと生体機能」鈴木紘一、現代科学増刊２２、東京化学同人）。
【００２３】
上記生理活性タンパク質としては特に特定されず、例えば、抗体の重鎖、軽鎖、及びＦｖ領域単鎖抗体（ｓｃＦｖ抗体）；腫瘍懐死因子ＴＮＦ−α、細胞障害性Ｔ細胞から産生されるパーホリン、リンパ球由来のリンホトキシン（ＬＴ）等の殺腫瘍因子等が挙げられる。また、インターロイキン−２やインターロイキン−６等のサイトカイン類、マクロファージ走化性因子（ＭＣＦ）やリンパ球遊走因子（ＬＣＦ）等の走化性因子、血管透過性因子（ＶＰＦ）等の炎症性リンホカイン等も挙げられる。更に、抗腫瘍効果を持つＬ−アスパラギナーゼやアルギナーゼ、抗炎症効果を持つカタラーゼやスーパーオキシドジスムターゼ、代謝酵素欠損症の治療に用いるアデノシンデアミナーゼやビリルビンオキシダーゼ等も挙げられる。また、例えば、血小板由来細胞成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、軟骨細胞をおもな標的とする神経成長因子（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、赤血球を増殖させるエリスロポエチン、肝細胞の増殖を促進する肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）等の細胞成長因子も挙げられる。また、生理活性を有するものであれば、これらの６残基以上の部分タンパク質であってもよい。
【００２４】
生理活性タンパク質としてウィルス抗原の全長又はその６残基以上の部分タンパク質等のワクチンの作用をもつ抗原タンパク質を用いた場合には、本発明の徐放性製剤は有効なワクチンとなり得る。このようなウィルス抗原としては特に限定されず、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）やＣ型肝炎コア抗原（ＨＣｃ）等が挙げられる。
【００２５】
上記低分子薬剤の運搬タンパク質としては、血清タンパク質の全長又はその６残基以上の部分タンパク質であることが好ましい。上記血清タンパク質としては特に限定されないが，アルブミン、グロブリン等が挙げられる（「血清アルブミン
生体におけるその役割」、青木幸一郎ほか、講談社）。
上記低分子薬剤としては特に限定されず、例えば、インドメタシン等の消炎剤、ワルファリン等の抗凝固剤、フェニルブタゾン等の抗炎症剤、イブプロフェン等の鎮痛剤、ジアゼパム等の向精神剤等が挙げられる。
【００２６】
本発明の徐放性製剤を作製する方法としては特に限定されないが、生理活性タンパク質又は低分子薬剤の運搬タンパク質をコードする遺伝子とシャペロニンサブユニットをコードする遺伝子とを含有する遺伝子を転写・翻訳して融合タンパク質を作製する方法が好適である。例えば、生理活性タンパク質又は低分子薬剤の運搬タンパク質をコードする遺伝子とシャペロニンサブユニットをコードする遺伝子とを含有する遺伝子を、同一のプラスミドにポリシストロニックに連結するか、同一の宿主内で共存・複製することが可能な２種の異なるプラスミドのそれぞれに導入し同一の宿主内で共発現させる方法や、生理活性タンパク質又は低分子薬剤の運搬タンパク質をコードする遺伝子とシャペロニンサブユニットをコードする遺伝子とを含有する遺伝子と、シャペロニン又はシャペロニン連結体のみをコードする遺伝子とを、同一のプラスミドにポリシストロニックに連結するか、同一の宿主内で共存・複製することが可能な２種の異なるプラスミドのそれぞれに導入し、同一の宿主内で共発現させる方法等が挙げられる。
この方法によれば、どのような生理活性タンパク質又は低分子薬剤の運搬タンパク質でもシャペロニンと融合したタンパク質として画一的な条件での生産及び精製が可能である。
【００２７】
このようにして得られた融合タンパク質は、生理活性タンパク質の場合はそのままで、低分子薬剤の運搬タンパク質の場合は更に低分子薬剤を結合させることにより本発明の徐放性製剤として使用することができ、従来の工程を大きく・短縮簡便化できる。
シャペロニンと低分子薬剤の運搬タンパク質とがぺプチド結合を介して連結された融合タンパク質であって、上記シャペロニンは５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成しており、上記低分子薬剤の運搬タンパク質は、上記シャペロニンリングの内部に収納されている融合タンパク質もまた、本発明の１つである。
【００２８】
上記宿主としては、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物固体又は昆虫個体のいずれであってもよく、また、無細胞翻訳系であってもよい。
【００２９】
本発明の徐放性製剤の徐放効果はｉｎ　ｖｉｔｒｏとｉｎ　ｖｉｖｏで確認することができる。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける確認方法としては、例えば、精製した徐放性製剤を緩衝液に融解した溶液を調製し、これに適当なタンパク質分解酵素を添加して放置し、溶出した生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質のタンパク質濃度をウエスタンブロットやＥＬＩＳＡ等の方法により測定する方法等が挙げられる。Ｉｎ　ｖｉｖｏにおける確認方法としては、例えば、マウスに徐放性製剤を皮下投与し、投与後定期的に採血し、生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質の血中濃度を測定する方法等が挙げられる。
【００３０】
本発明の徐放性製剤は、生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質を生体内において生物学的に安定に保ち、例えば、血中で緩やかに生理活性タンパク質又は低分子薬剤が結合した運搬タンパク質を放出させ、それらの血中濃度を長時間にわたって保持する等持続的に作用させ得る。更に、タンパク質分解酵素の切断アミノ酸配列を挿入する等によって、固形癌細胞や特定の臓器で効率よく速やかな薬効を発揮させることができる。
本発明の徐放性製剤によれば、発熱、悪寒等の副作用が少なく、低毒性で、より安全かつ効果的な治療が可能である。
本発明の徐放性製剤は、薬学的に許容される担体、希釈剤等を用いて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の固形製剤；シロップ剤、注射剤等の液状製剤として用いることができ、経口的用法又は皮下、静脈内、筋肉内直腸内等の非経口的用法によりにヒトをはじめとするサル、イヌ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット等の哺乳動物に投与することができる。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）
（１）シャペロニンβサブユニット（ＴＣＰβ）２量体とＨＣＶコア抗原（ＨＣＶｃ）との融合タンパク質の調製
配列１に示されたシャペロニンβサブユニット（ＴＣＰβ）遺伝子をＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ＫＳ−１株ゲノムを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によってクローニングした。ＴＣＰβ遺伝子が一方向に２回連結した遺伝子断片が挿入されたＴ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴＤ（ＴＣＰβ）２を構築した。
一方、既知のＨＣＶコア抗原（ＨＣＶｃ）のＤＮＡ配列をもとにＤＮＡ合成装置を用いて作製したプライマーを使用してＰＣＲ法によりＨＣＶｃのＤＮＡ断片を得た。
発現ベクターｐＥＴＤ（ＴＣＰβ）２に得られたＨＣＶｃのＤＮＡ断片を挿入し、発現ベクターｐＥＴＣＳＤ−ＴＩＩ２ＨＣを作製した。
得られたｐＥＴＣＳＤ−ＴＩＩ２ＨＣを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ｘＹＴ培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で３０℃で２４時間培養し、ＴＣＰβ２量体とＨＣＶｃの融合タンパク質を発現させた。
【００３３】
培養終了後に大腸菌を超音波で破砕し、遠心操作後その上清を順にニッケルキレートカラム及びＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによって融合タンパク質を精製した。得られた融合タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、抗ＨＣＶコア抗原モノクロナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、強い発色が認められた。これによりＴＣＰβ２量体とＨＣＶｃとの融合タンパク質が発現していることを確認した。
【００３４】
（２）ＴＣＰβ２量体とＨＣＶｃとの融合タンパク質からのＨＣＶｃの徐放
得られたＴＣＰβ２量体とＨＣＶｃの融合タンパク質を１ｍＭＥＤＴＡ−Ｎａ存在下でインキュベーションした後、５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。濃度０．５ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質溶液３００μＬに対して２．６単位のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）を作用させ、１０℃でインキュベーションし、１時間ごとにサンプルとして１０μＬを採取した。採取したサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、抗ＨＣＶコア抗原モノクロナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、インキュベーション時間に応じて融合タンパク質からＨＣＶｃが徐放されていることが確かめられた（図２）。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、ほとんど全ての生理活性タンパク質及び低分子薬剤の運搬タンパク質について簡便に作製することができ、生理活性タンパク質又は低分子薬剤に徐放性を与え、その薬効を安定的に効率よく発現させることができる徐放性製剤を提供できる。
【配列表】
2004026714.tif 000002
2004026714.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌シャペロニン（ＧｒｏＥＬ）複合体の立体構造を模式的に表す図である。
【図２】実施例１で行ったＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ作用後の融合タンパク質のウエスターンブロッティングの結果を示す図である。
【図１】
2004026714.tif 000004
【図２】
2004026714.tif 000005