(57)【要約】      （修正有）【課題】本転写調節因子（ＮＸＦ）の活性調節剤のターゲットとして使用する、本転写調節因子（ＮＸＦ）と他のタンパク質因子との複合体等を提供すること。【解決手段】ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）と下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子との複合体等。＜アミノ酸配列群＞（ａ）ヒト由来のＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７のアミノ酸配列、（ｂ）上記アミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、上記ｈｅｌｉｃａｓｅの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）と下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子との複合体。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列
【請求項２】
ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）と下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子との複合体であって、この転写調節因子の転写活性が複合体形成により調節されることを特徴とする複合体
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列
【請求項３】
請求項１または２記載の複合体を産生する能力を有する一つ又は複数からなるベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項４】
下記の両ＤＮＡを同時に有する一つのベクター又は別々に有する複数からなるベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
＜ＤＮＡ＞
（１）ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（２）下記のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列
【請求項５】
物質が有する、請求項１または２記載の複合体が有する遺伝子転写調節能力を調節する能力の評価方法であって、
（１）請求項３または４記載の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の前記複合体が有する転写調節能力を調節する能力を評価する第三工程、
を有することを特徴とする評価方法。
【請求項６】
請求項５記載の評価方法により評価された調節能力に基づき前記複合体が有する転写調節能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程、
を有することを特徴とする探索方法。
【請求項７】
請求項６記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする治療剤。
【請求項８】
ツーハイブリッドアッセイのための、請求項１または２記載の複合体の使用。
【請求項９】
ツーハイブリッドアッセイのための、請求項３または４記載の形質転換体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、転写活性化複合体及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ダウン症は、常染色体異常のなかで最も多い疾患である。ダウン症の患者では、体細胞中の染色体２１番が正常の２本ではなく、トリソミー（三本）になっており、これが原因で精神遅滞、成長の異常、心臓病、白血病、早期に発症するアルツハイマー症等を生じる。
今までに当該疾患原因遺伝子の単離同定及び機能解析等に関連する多くの研究がなされた結果、（１）中枢神経系細胞の発生、分化において重要な働きをする転写調節因子として知られる  Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｉｎｄｅｄ  ２  （以下、Ｓｉｍ２と記す。）の遺伝子が、ヒト染色体２１番上のダウン症候群のクリティカル領域（ｑ２２．２）に存在しており、（２）この狭いクリティカル領域のみがトリソミーになってもダウン症の症状が発現することから、Ｓｉｍ２遺伝子の発現産物の細胞中での量が増えることがダウン症候群の病因となる要素であることが示唆されている。また（３）ＡＲＮＴ１又はＡＲＮＴ２等のＡＲＮＴファミリーに属する転写共役因子（以下、ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子と記すこともある。）とＳｉｍ２とが結合してなる転写抑制化複合体が、ＣＭＥ配列（５’−ＡＣＧＴＧ−３’：中枢神経系の正中線における転写に必要なエレメントのコア配列であって、当該転写共役因子とＳｉｍ２との蛋白質複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列）に対して抑制的に働くこと、詳細には、Ｓｉｍ２の働きに関して、ＣＭＥ配列を含むプロモーターを機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子の転写に対する活性を検討したところ、Ｓｉｍ２がその結合パートナーである補助因子（即ち、転写共役因子）であるＡＲＮＴファミリー属転写共役因子の転写活性までも強く抑制し、そのＳｉｍ２／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子ヘテロダイマーコンプレックス（即ち、ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子とＳｉｍ２とが結合してなる転写抑制化複合体）がＣＭＥ配列に対して抑制的に働くこと等が明らかにされており、当該転写抑制化複合体による、転写抑制の亢進がダウン症候群の原因の一つであると現在考えられている。
【０００３】
上記の知見に基づき、転写調節因子／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子とのヘテロダイマーコンプレックスとして、ＣＭＥ配列に対して促進的に働くような転写活性化複合体ＮＸＦ／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子ヘテロダイマーコンプレックスが見いだされ報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００２−３５５０７１
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下において、上記の知見に基づき、ＣＭＥ配列に対して促進的に働くような転写活性化複合体ＮＸＦ／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子ヘテロダイマーコンプレックスに相互作用することによりその転写活性を調節するような因子を見出し、その因子と上記ヘテロダイマーコンプレッスクスとの高次の複合体を、例えば、低分子化合物により制御することにより、ダウン症など、本転写調節因子（ＮＸＦ）が関与すると考えられる、例えば、神経疾患等の疾患の治療等に応用することが期待されている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、当該転写調節因子ＮＸＦに対して特異的に相互作用しその転写活性を調節する能力を持つ因子としてＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）を見いだし、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．  ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）と下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子との複合体（以下、本発明複合体と記すこともある。）
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列；
２．  ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）と下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子との複合体であって、この転写調節因子の転写活性が複合体形成により調節されることを特徴とする複合体
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列；
３．  前記１または２記載の複合体を産生する能力を有する一つ又は複数からなるベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
４．  下記の両ＤＮＡを同時に有する一つのベクター又は別々に有する複数からなるベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体
＜ＤＮＡ＞
（１）ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（２）下記のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列；
５．  物質が有する、前記１または２記載の複合体が有する遺伝子転写調節能力を調節する能力の評価方法であって、
（１）前記３または４記載の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の前記複合体が有する転写調節能力を調節する能力を評価する第三工程、
を有することを特徴とする評価方法；
６．  前記５記載の評価方法により評価された調節能力に基づき前記複合体が有する転写調節能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程、
を有することを特徴とする探索方法；
７．  前記６記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする治療剤；
８．  ツーハイブリッドアッセイのための、前記１または２記載の複合体の使用；
９．  ツーハイブリッドアッセイのための、前記３または４記載の形質転換体の使用；
等を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
ＡＲＮＴ１〜３のいずれかの転写共役因子（以下、本ＡＲＮＴ属転写共役因子と記すこともある。）と、下記のいずれかのアミノ酸配列（即ち、本アミノ酸配列）を有する転写調節因子（以下、本転写調節因子と記すこともある。）との複合体は、前記転写共役因子と転写調節因子であるＳｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡ領域（５’−ＡＣＧＴＧ−３’）に結合する能力を有し、前記ＤＮＡ領域の下流に位置する遺伝子の転写を促進する能力を有することを特徴とする転写活性化複合体である。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列（ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する転写調節因子は、ヒト由来の本転写調節因子であり、以下、ｈ本転写調節因子と記すこともある。また、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する転写調節因子は、マウス由来の本転写調節因子であり、以下、ｍ本転写調節因子と記すこともある。また、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する転写調節因子は、ラット由来の本転写調節因子であり、以下、ｒ本転写調節因子と記すこともある。）、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列
【０００８】
本転写調節因子（ＮＸＦ）転写活性化複合体を構成する一つの蛋白質、即ち、ＡＲＮＴ１〜３のいずれかの転写共役因子とは、ＡＲＮＴ１、ＡＲＮＴ２又はＡＲＮＴ３（ＢＭＡＬ１と呼ばれるものと同一なものである）等のいずれかのＡＲＮＴファミリー属転写共役因子である。これら転写共役因子は、相互比較において高い配列同一性を有する転写共役因子である。このような転写共役因子は、転写調節因子であるＳｉｍ２と転写抑制化複合体を形成することにより、  ５’−ＡＣＧＴＧ−３’  で示されるＤＮＡ領域に結合する能力を有し、前記ＤＮＡ領域の下流に位置する遺伝子の転写を抑制する能力を有する。これらの転写共役因子のうち、ＡＲＮＴ１又はＡＲＮＴ２を好ましいものとしてあげることができる。
【０００９】
また、上記の「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ」としては、例えば、高イオン濃度下［例えば、６ＸＳＳＣ（９００ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム）などが用いられる。］に、６５℃の温度条件でハイブリダイズさせることによりＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、低イオン濃度下［例えば、０．１  Ｘ  ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）などが用いられる。］に、６５℃の温度条件で３０分間洗浄した後でも該ハイブリッドが維持されうるＤＮＡをあげることができる。
【００１０】
本発明における転写調節能は、例えば、下記のレポーター遺伝子を用いたアッセイ等に基づき評価することができる。まず、本ＡＲＮＴ属転写共役因子と転写調節因子であるＳｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡ領域５’−ＡＣＧＴＧ−３’、：以下、本応答性ＤＮＡ領域と記すこともある。）を含む転写制御ＤＮＡの下流に連結されたレポーター遺伝子と被験転写調節因子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子とが宿主細胞に導入されてなる形質転換体を作製し、次に前記形質転換体が有する前記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定し、さらに測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験転写調節因子が有する転写調節能を評価すればよい。上記の転写調節能としては、前記ＤＮＡ領域の下流に位置する遺伝子（上記のレポーター遺伝子を用いたアッセイの場合には、レポーター遺伝子を意味する。）の転写を促進する能力又は転写を抑制する能力等があげられる。
【００１１】
上記の評価方法におけるレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子などを利用することができ、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコードする遺伝子が好ましい。
【００１２】
まず、本ＡＲＮＴ属転写共役因子と本応答性ＤＮＡ領域を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と被験転写調節因子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、被験転写調節因子の遺伝子と記すこともある。）とを、宿主細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、Ｈｅｐａ１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＣＯＳ１細胞、ＢＦ−２細胞、ＣＨＨ−１細胞等）に導入することによって形質転換体を作製する。ここで、被験転写調節因子の遺伝子は、例えば、上述のように、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合された基本ベクターに組み込まれた形で宿主細胞へ導入するとよい。本応答性ＤＮＡ領域を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子も、基本ベクターに組み込まれた形で用いるとよい。また例えば、本応答性ＤＮＡ領域を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子が組み込まれたベクターと、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合された被験転写調節因子の遺伝子を保有するベクターとを、マーカー遺伝子を有するベクターとともに宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜することにより、本応答性ＤＮＡ領域を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子及び宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合された被験転写調節因子の遺伝子とが宿主細胞に導入されてなる形質転換体を取得することができる。ここで「宿主細胞で機能可能なプロモーター」としては、例えば、宿主細胞が出芽酵母細胞である場合には、ＧＡＬ１プロモーターのような誘導型プロモーターや、ＡＤＨプロモーター（尚、ＡＤＨ１プロモーターは、例えば、ＡＤＨ１プロモーター及び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５  〔Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ  から入手可能、Ａｍｍｅｒｅｒ  ら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１  ｐａｒｔ（ｐ．１９２−２０１）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。ＡＤＨ１プロモーターは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ  の米国特許出願第２９９，７３３  に含まれており、米国において、工業的、商業目的で使用する場合は、権利者からの権利許諾を必要とする。）のような恒常的に発現するプロモーター等を使用することができる。宿主細胞が動物細胞である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター等をあげることができる。また、転写制御領域としては、例えば、宿主細胞で機能可能な最小プロモーターである、宿主細胞で発現可能な遺伝子由来の最小ＴＡＴＡボックス配列からなるＤＮＡをあげることができ、具体的には、ＴＡＴＡボックス及び転写開始点近傍の約５０塩基程度からなる塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
【００１３】
上述のように作製された形質転換体を、例えば、数時間から数日間培養した後、当該形質転換体が有する前記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する。本応答性ＤＮＡ領域により当該被験転写調節因子が活性化された場合には、レポーター遺伝子の転写が促進され、当該レポーター遺伝子にコードされるレポーター蛋白質が前記形質転換体の細胞内等に蓄積されるかもしくは培地中に分泌される。このレポーター蛋白質の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定することにより、当該形質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定する。具体的には、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合には、前記形質転換体から調製された細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、当該細胞粗抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼ量、ひいては、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、本応答性ＤＮＡ領域を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子を含むが、被験転写調節因子の遺伝子を含まない形質転換体（即ち、対照形質転換体）におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定し、当該測定値と上記のレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値とを比較することにより、被験転写因子の遺伝子が有する転写調節能を評価することができる。
【００１４】
本発明複合体は、ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）と本アミノ酸配列を有する転写調節因子（即ち、本転写調節因子）との複合体であり、例えば、本転写調節因子（ＮＸＦ）とＡＲＮＴ属転写共役因子との複合体の本転写調節因子（ＮＸＦ）部分に対してさらに  ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）が相互作用して形成された高次複合体、または、本転写調節因子（ＮＸＦ）とＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）との複合体を含むものである。これらの複合体は、必要に応じて通常の方法等を利用してＡＲＮＴ属転写共役因子を存在させながら、例えば、本転写調節因子（ＮＸＦ）が存在するところ、または、存在させたところへ、同時にＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）を存在させた転換体を培養し、産生された複合体を培養物から回収することにより取得することができるが、多くの場合には、当該複合体を発現する形質転換体の形態で本発明複合体を利用するとよい。
【００１５】
本発明複合体は、本発明複合体を産生する能力を有する一つ又は複数からなるベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。具体的には、（１）ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）のアミノ酸配列（配列番号７で示される公知のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号８で示される公知の塩基配列）を有するＤＮＡ、及び、（２）本転写調節因子（ＮＸＦ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、の両ＤＮＡを同時に有する一つのベクター又は別々に有する複数からなるベクターを宿主細胞に導入して作製すればよい。
【００１６】
このベクターを宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；「  モレキュラー・クローニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法に準じて前記細胞に導入することができる。酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、リチウム法を基にしたＹｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いて導入することができる。
【００１７】
尚、ウイルスをベクターとして用いる場合には、上述のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、前記両ＤＮＡの挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、当該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。
本発明形質転換体を選抜するには、例えば、本ベクターと同時にマーカー遺伝子が導入された宿主細胞を、マーカー遺伝子の性質に応じた方法によって培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、当該選抜薬剤が添加された培地を用いて、本ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。薬剤耐性を付与する遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、当該栄養要求性に対応する栄養素を含まない最少培地を用いて、本ベクターが導入された細胞を培養すればよい。
【００１８】
前記両ＤＮＡが宿主細胞の染色体内に位置する本発明形質転換体を取得するには、例えば、まず本ベクターとマーカー遺伝子を有するベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これらを前述の方法で宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。また、例えば、まず上記のような選抜薬剤を付与する遺伝子をマーカー遺伝子として有する本ベクターを前述の継代培養した後、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養する方法によって宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上ことにより、前記両ＤＮＡが宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を選抜し取得することもできる。導入された本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入された前記両ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーやプローブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、前記両ＤＮＡの存在を検出すればよい。当該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。
【００１９】
上述のようにして得られた形質転換体を培養し、産生された本発明複合体を培養物から回収することにより本発明複合体を製造することができる。
例えば、形質転換体が微生物である場合には、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（ＪａｒＦｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等）等が可能である。培養温度及び培地のｐＨは、微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約１５℃〜約４０℃の培養温度にて、ｐＨが約６〜約８の培地で培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約５日間である。温度シフト型やＩＰＴＧ誘導型等の誘導型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合には、誘導時間は１日間以内が好ましく、通常数時間である。
【００２０】
また、上記形質転換体が哺乳類、昆虫類等の動物細胞である場合には、当該形質転換体は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養することができる。選抜薬剤を利用して当該形質転換体を作製した場合には、当該選抜薬剤の存在下に培養することが好ましい。哺乳類動物細胞の場合には、例えば、終濃度が１０％となるようＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地（ニッスイ社製等）を用いて３７℃、５％ＣＯ２存在下等の条件で数日毎に新しい培養液に交換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば、０．２５％（ｗ／ｖ）程度となるようトリプシンが添加されたＰＢＳ溶液を加えて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続ける。昆虫類動物細胞の場合も同様に、例えば、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び２％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔｌａｔｅを含むＧｒａｃｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ等の昆虫細胞用培養液を用いて培養温度２５℃から３５℃で培養すればよい。この際、Ｓｆ２１細胞等のシャーレからはがれやすい細胞の場合には、トリプシン液を用いずピペッテイングにより分散させ継代培養を行なうことができる。また、バキュロウイルス等のウイルスベクターを含む形質転換体の場合には、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する前、例えば、ウイルス感染後７２時間までとすることが好ましい。
【００２１】
培養物から、本発明形質転換体により産生された本発明複合体の回収は、適宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行えばよく、例えば、まず培養終了後、形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた細胞を通常のバッファー、例えば、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦからなるバッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕する。得られた破砕液を数万ｘｇで数十分間から１時間程度超遠心分離し、上清画分を回収することにより、本発明複合体を含む画分を得ることができる。さらに、前記上清画分をイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、より精製された本発明複合体を回収することもできる。
【００２２】
本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織から、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）等に記載の遺伝子工学的方法に準じて取得することができる。
【００２３】
具体的には、まず、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織由来の全ＲＮＡを調製する。例えば、脳の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の方法により全ＲＮＡを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン製）がある。得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプライマーをＲＮＡのポリＡ配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、かつ大腸菌ＲＮａｓｅＨを用いてＲＮＡ鎖にニックとギャップを入れることにより得られるＲＮＡをプライマーとして大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖のｃＤＮＡを合成する。更に、合成された二本鎖ｃＤＮＡの両末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化する。末端が平滑化された二本鎖ｃＤＮＡは、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばｃＤＮＡ合成システムプラス（アマシャムファルマシアバイオテク社製）やＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ合成キット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等があげられる。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを例えば、プラスミドｐＵＣ１１８やファージλｇｔ１０などのベクターとリガーゼを用いて連結することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。尚、ｃＤＮＡライブラリーとしては、市販のｃＤＮＡライブラリー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製やＣｌｏｎｔｅｃｈ社製等）を用いることも可能である。
【００２４】
上記のようなｃＤＮＡライブラリーから、着目する因子の増幅したい部分の塩基配列をはさみこむように常法により設計したＰＣＲフォワードプライマーとＰＣＲリバースプライマーを用いるＰＣＲポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）や、着目因子の得たい部分の塩基配列又は該塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、着目因子ＤＮＡを取得することができる。
【００２５】
尚、以上のＰＣＲのプライマーは市販のソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘＳＶ／Ｒ（ソフトウエア開発社製）などで設計することができる。ＰＣＲの条件としては、例えば、反応液５０μｌ中に、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ用１０倍濃緩衝液（宝酒造社製）５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを含む。）５μｌ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ各々の終濃度が０．２５ｍＭ）、２０μＭプライマー  各０．２５〜１．２５μｌ（終濃度が０．１〜０．５μＭ）、鋳型ｃＤＮＡ  ０．１〜０．５μｇ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）１．２５ユニットを含む組成の反応液にて、９５℃で１分間次いで６８℃で３分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行う等の条件が挙げられる。
【００２６】
ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブとしては、１００ｂｐから１０００ｂｐ程度、好ましくは約５００ｂｐ前後のｃＤＮＡ断片を用いればよい。同ｃＤＮＡ断片を例えば３２Ｐ放射能ラベルを行うための市販のラベリングキット例えばアマシャムファルマシア社製ランダムプライマーラベリングキットなどを用いて放射能ラベル等をすることによりスクリーニング用プローブとすればよい。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液（０．１（ｗ／ｖ）フィコール４００、０．１（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）、０．５（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ存在下に、６５℃で保温し、次いで１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）及び０．５（ｗ／ｖ）ＳＤＳ存在下に、室温で１５分間の保温を２回行い、さらに０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）及び０．５（ｗ／ｖ）ＳＤＳ存在下に、６８℃で３０分間保温する条件等をあげることができる。また、例えば、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１０ｘデンハルト溶液及び２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ存在下に６５℃にて保温し、次いで２ｘＳＳＣ中で室温にて３０分間の保温を行い、さらに０．１ｘＳＳＣ中で６５℃にて４０分間の保温を２回行う条件をあげることもできる。このようにして得られた本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡは、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング  ハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年等に記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には例えば、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などの市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。
【００２７】
得られた本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡの塩基配列は、Ｍａｘａｍ  Ｇｉｌｂｅｒｔ法  （例えば、Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ  ＆  Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５６０，１９７７等に記載される）やＳａｎｇｅｒ法（例えばＳａｎｇｅｒ，Ｆ．  ＆  Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４，４４１，１９７５、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，＆  Ｎｉｃｋｌｅｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３，１９７７等に記載される）等により確認することができる。
【００２８】
本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを、当該遺伝子が導入される宿主細胞において利用可能なベクター（以下、基本ベクターと記す。）、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーをもつベクターに、通常の遺伝子工学的手法に準じて組み込むことにより該因子の因子ＤＮＡベクターを構築することができる。
【００２９】
同ベクターの構築に用いることができる基本ベクターとしては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造社製）やファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等をあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドｐＢＰＶ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）もしくはＥＢウイルスプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルス等をあげることができる。さらに、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用プラスミドｐＡＣＴ２や、ウシパピローマウイルスプラスミドｐＢＰＶ、ＥＢウイルスプラスミドｐＣＥＰ４等を用いて該ベクターを構築すると、そのベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。
【００３０】
バキュロウイルスやワクシニアウイルス等のウイルスに本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを組み込むには、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いればよい。このようなトランスファーベクターとしては、例えば、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から市販されているｐＶＬ１３９２，ｐＶＬ１３９３（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｓｕｍｍｅｒｓ  Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３））、ｐＳＦＢ５（Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５８４−５５８８（１９９１））等のプラスミドをあげることができる。本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを前記のようなトランスファーベクターに挿入し、当該トランスファーベクターとウイルスのゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクターとウイルスのゲノムとの間で相同組換えが起こり、本転写調節因子ＤＮＡがゲノム上に組み込まれたウイルスを得ることができる。ウイルスのゲノムとしては、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，Ｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓなどのゲノムを用いることができる。
【００３１】
より具体的には、例えば、バキュロウイルスに本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを組み込む場合には、まずトランスファーベクターｐＶＬ１３９３，ｐＶＬ１３９２等のマルチクローニング部位に当該ＤＮＡを挿入した後、該トランスファーベクターのＤＮＡとＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）とを昆虫細胞Ｓｆ２１株（ＡＴＣＣから入手可能）にリン酸カルシウム法等によって導入することにより、得られる細胞を培養する。次いで培養液から遠心分離等により、本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡが挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を回収し、回収されたウィルス粒子をフェノール等で除蛋白処理することにより、本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを含有するウイルスのゲノムを得ることができる。さらに、得られたウイルスのゲノムを、昆虫細胞Ｓｆ２１株等のウイルス粒子形成能力を有する宿主細胞にリン酸カルシウム法等によって導入することにより、得られる細胞を培養する。このようにして本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを含有するウイルス粒子を増やすことができる。
【００３２】
一方、マウス白血病レトロウイルス等の比較的小さなゲノムに本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを組み込むには、トランスファーベクターを利用せずに、当該ＤＮＡを直接組み込むこともできる。例えば、ウイルスベクタ−ＤＣ（Ｘ）（Ｅｌｉ  Ｇｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，５０４−５１２（１９８６））等は、当該ベクター上のクローニング部位に本因子ＤＮＡを組み込む。得られた本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡの組み込れたウイルスベクターを、例えば、Ａｍｐｌｉ−ＧＰＥ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，３７５５（１９９２））等のパッケージング細胞に導入することにより、当該ＤＮＡの挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を得ることができる。
【００３３】
本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡの上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のような基本ベクターに組み込むことにより、本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを宿主細胞で発現させることの可能なＤＮＡを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡが導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に当該ＤＮＡが発現されるように、当該プロモーターと本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡとを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すＤＮＡをあげることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（ｌａｃＰ）、トリプトファンオペロンのプロモーター（ｔｒｐＰ）、アルギニンオペロンのプロモーター（ａｒｇＰ）、ガラクトースオペロンのプロモーター（ｇａｌＰ）、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター（λ−ｐＬ、λ−ｐＲ）等をあげることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合には、ＡＤＨ１プロモーター等あげることができる。
また、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有する基本ベクターを使用する場合には、前記プロモーターと本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡとが機能可能な形で結合するように、前記プロモーターの下流に当該ＤＮＡを挿入すればよい。
【００３４】
例えば、前述のプラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ等には、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられている。当該クローニング部位に本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを挿入することによって得られるベクターを動物細胞へ導入することにより、当該動物細胞において本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを発現させることができる。これらのプラスミドにはあらかじめＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉを欠失したＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えば、ＣＯＳ細胞等に当該プラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結果として当該プラスミドに組み込まれた本転写調節因子ＤＮＡを大量発現させることもできる。また前述の酵母用プラスミドｐＡＣＴ２はＡＤＨ１プロモーターを有しており、当該プラスミド又はその誘導体のＡＤＨ１プロモーターの下流に本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを挿入すれば、本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを、例えば、ＣＧ１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能なＤＮＡベクターが構築できる。
【００３５】
本発明形質転換体は、本発明複合体を構成する因子をコードするＤＮＡを発現するベクターのほかに、同複合体により活性化されうるプロモーターを機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子のＤＮＡをも含有するような形質転換体であってもよい。
【００３６】
このような形質転換体は、物質が有する、本発明複合体が有する転写調節能力を調節する能力（即ち、本調節能力）の評価方法等に利用することができる。例えば、物質が有する本調節能力の評価方法であって、
（１）上記の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を評価する第三工程；
を有することを特徴とする評価方法（即ち、本発明評価方法）をあげることができる。
【００３７】
さらに当該評価方法により評価された調節能力に基づき前記複合体が有する転写調節能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする探索方法、当該探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする、例えば、ダウン症改善剤等の治療剤（即ち、本発明治療剤）等にも応用することが考えられる。
【００３８】
本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする治療剤（即ち、本発明治療剤）は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明治療剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明治療剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の本発明治療剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
【００３９】
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
【００４０】
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明治療剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００４１】
本発明では、ツーハイブリッドアッセイ用のための本発明複合体や形質転換体等をも提供している。
即ち、本発明は、ツーハイブリッドアッセイのための、（１）本発明複合体の使用に関する発明、（２）ツーハイブリッドアッセイのための、本発明形質転換体及びその使用に関する発明を含んでいる。ここで、ツーハイブリッドアッセイのためのシステムを調製するには、市販のキット、例えば、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等を利用すればよい。
【００４２】
ツーハイブリッドに用いられる本発明複合体は、下記の構成要素Ｉのうち、いずれか一方の構成要素（Ａ又はＢ）及び下記の構成要素ＩＩのうち、いずれか一方の構成要素（Ｘ又はＹ）を有する蛋白質と、下記の構成要素Ｉのうち、他方の構成要素（Ｂ又はＡ）及び下記の構成要素ＩＩのうち、他方の構成要素（Ｙ又はＸ）を有する蛋白質とを含有してなり、両者の蛋白質により形成される複合体である。ここで、例えば、当該両者の蛋白質がリガンドによる制御下において形成してなる複合体であってもよい。
＜構成要素Ｉ＞
（Ａ）ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）、又は
（Ｂ）本転写調節因子（ＮＸＦ）
＜構成要素ＩＩ＞
（Ｘ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域、又は
（Ｙ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域
【００４３】
尚、この場合には、本転写調節因子（ＮＸＦ）は、リガンドとの複合体を形成するために、前記リガンドが結合する領域を有していてもよい。このような領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとしては、本転写調節因子（ＮＸＦ）の部分塩基配列であり、例えば、配列番号４で示される塩基配列のうち、塩基番号１３２〜２５０７で示される塩基配列を含む塩基配列等をあげることができる。
【００４４】
構成要素ＩＩの（Ｘ）を有する転写調節因子としては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（５’−ＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’）、Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（５’−ＴＡＣＴＧＴＡＴＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＴＡ−３’）、Ｌａｃ  Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（５’−ＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＧＣＡＣＡＡＴＴＣ−３’）、テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（５’−ＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧ−３’）、ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（５’−ＴＡＡＴＧＡＴＧＧＧＣＧ−３’）、ＡＲＮＴ１〜３のいずれかの転写共役因子と転写調節因子であるＳｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列（５’−ＡＣＧＴＧ−３’）等のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡに結合する転写調節因子であって、かつ宿主細胞内で機能可能な転写調節因子をあげることができる。一方、構成要素ＩＩの（Ｙ）を有する転写調節因子としては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質、Ｌｅｘ蛋白質、Ｌａｃ  Ｉ受容体蛋白質、テトラサイクリン受容体蛋白質、ＺＦＨＤ−１蛋白質、Ｂ４２蛋白質、本ＡＲＮＴ属転写共役因子である蛋白質、ＶＰ１６蛋白質等の宿主細胞内で機能可能な転写調節因子をあげることができる。
【００４５】
このような各構成要素からなる複合体は、例えば、本発明形質転換体等により産生される。ツーハイブリッドに用いられるために、通常その形質転換体は、本発明複合体とともに上述構成要素ＩＩの（Ｘ）を有する転写調節因子の応答配列をプロモーター部分に持つレポーター遺伝子を有するのが望ましい。尚、宿主細胞が、利用可能な内在性のレポーター遺伝子を有する場合には、それを利用してもよく、この場合にはレポーター遺伝子の導入を省略することができる。
ここでレポーター遺伝子とは、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子等の通常のレポーターアッセイに用いられるレポーター遺伝子であって、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。構成要素ＩＩの（Ｘ）結合可能なＤＮＡとしては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（５’−ＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’）、Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（５’−ＴＡＣＴＧＴＡＴＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＴＡ−３’）、Ｌａｃ  Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（５’−ＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＧＣＡＣＡＡＴＴＣ−３’）、テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（５’−ＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧ−３’）、ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（５’−ＴＡＡＴＧＡＴＧＧＧＣＧ−３’）、ＡＲＮＴ１〜３のいずれかの転写共役因子と転写調節因子であるＳｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡ領域（５’−ＡＣＧＴＧ−３’）等のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００４６】
例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製のＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイキットを用いる場合は同キット（ＰＴ３２４７−１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の添付説明書を参考に、このような各構成要素を組み合わせながら本発明複合体が発現するように適切にかつ塩基配列の読み枠を合わせて連結させることによりベクターに挿入し、通常の遺伝子工学的手法を用いて同一の宿主細胞に導入することにより、当該形質転換体を作製することができる。
【００４７】
本発明形質転換体を作製するために使用される宿主細胞としては、例えば、出芽酵母細胞、ＨｅＬａ細胞等の哺乳類動物細胞等があげられる
【００４８】
【実施例】
実施例１  （本転写調節因子（ＮＸＦ）（ＥｃｏＲＶ−ＳｔｕＩ）断片相互作用因子の探索）
出芽酵母内でＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に任意の蛋白質断片を融合させたものを発現させるためのプラスミドｐＧＢＫＴ７ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入）に対し、以下のようにしてｍｏｕｓｅ  本転写調節因子（ＮＸＦ）のＥｃｏＲＶ−ＳｔｕＩ断片を導入してＧａｌ４−ｍ本転写調節因子（ＮＸＦ）（ＥｃｏＲＶ−ＳｔｕＩ）融合蛋白発現プラスミドを構築した。
まず、ｍｏｕｓｅ  本転写調節因子（ＮＸＦ）ｃＤＮＡは以下のようにして得た。
５’−ａａｇｃａｃｇｇａｇ  ｇａｇｇａａｇｃｃｇ  ｃｃｇｇｔｇｃｇｔｃ  ｇｇｇａｃ−３’
５’−ｇｇａｇａｇｃｇｇｃ  ｔｃｃａｃｇｔｃｔｔ  ｇａｔｇａｃａａｔａ  ｔｇｃｃａ−３’
の配列を持つポリヌクレオチドをそれぞれＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル３９４）を用いて合成した。このように合成されたポリヌクレオチドをプライマーとして、かつ、マウスＢｒａｉｎ  ｃＤＮＡライブラリー（＃１０６５５−０１７ギブコＢＲＬ社製）１０  ｎｇを鋳型として、反応液５０μｌ当たり上記のポリヌクレオチド１０ｐｍｏｌを添加し、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）及び当該酵素を含むキットに添付されたバッファーを用いてＰＣＲを行った。当該ＰＣＲにおける反応条件は、ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、かつ、９５℃１分間、次いで６８℃３分間を１サイクルとして３５サイクルであった。
得られたＰＣＲ反応液の全量を、低融点アガロース電気泳動（アガロースＬ：ニッポンジーン）に供することにより、増幅ＤＮＡ断片（約２．５ｋｂ）を精製・回収した。
次に、ｐＧＢＫＴ７ベクターをＮｃｏＩで３７℃２時間インキュベートして切断後、アルカリフォスファターゼ処理を６５℃１時間行い切断末端を脱リン酸化し、更にＢｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラ製）で末端を平滑末端化したものをインサート断片導入用ベクターとした。このベクターに結合させるためのインサート断片として、上述のｍｏｕｓｅ本転写調節因子（ＮＸＦ）ｃＤＮＡをＥｃｏＲＶとＳｔｕＩで３７℃２時間切断してアガロースゲル電気泳動で８６０ｂｐのバンドを回収したものを準備し、上述のベクターに対してＴ４Ｌｉｇａｓｅで結合した。正しく結合されＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインとの融合蛋白質を発現できるものをＡＢＩ３７００自動シークエンサーで塩基配列を決定することで選び出し、ｐＧＢＫＴ７−ｍ本転写調節因子（ＮＸＦ）（ＥｃｏＲＶ−ＳｔｕＩ）を完成した。
以上のようにして作製した、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に着目因子の断片が融合した蛋白質を発現するプラスミドを以下のようにして酵母に導入した。すなわち、酢酸リチウム法をベースにしたＹｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ２（Ｋ１６０６−１；クロンテック社製）のキットを用いて、キットの取扱説明書の方法に従って出芽酵母株ＡＨ１０９（ＰＴ３１８３−１；クロンテック社製Ｐｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  Ｌｉｂｒａｒｙに付属）に対してプラスミドＤＮＡを導入し、（−Ｔｒｐ）のＳＤ培地上に形質転換ＡＨ１０９として酵母コロニーを単離分離した。同組換え酵母コロニーのおのおのの組換え酵母クローンは、ＡＤＨ１プロモーターの制御下に、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に着目因子の断片が融合した蛋白質を発現している。
次に、Ｌｉｂｒａｒｙ  ｈｏｓｔ酵母株であるＹ１８７にｐＡＣＴ２−ヒトＢｒａｉｎ  ｃＤＮＡ  ライブラリーがあらかじめ導入されているｃＤＮＡライブラリー（ＨＹ４００４ＡＨ；Ｐｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）２ｘ１０７ｃｅｌｌｓに対して、上述のＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に着目因子の断片が融合した蛋白質を発現している組換えＡＨ１０９酵母株５ｘ１０９を混合し、５０ｍｌのＹＰＤＡ完全液体培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入）中３０℃で３０ｒｐｍで２４時間インキュベートし、Ｍａｔｉｎｇを完了させた。このようなＭａｔｉｎｇの結果、１つの酵母細胞中に、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に着目因子の断片が融合した蛋白質と、ｐＡＣＴ２由来のＧａｌ４の転写活性化領域と任意の因子の蛋白断片の融合蛋白質の両者が同時に発現する組換え体が作製できた。このＭａｔｉｎｇ完了酵母培養液を五十等分してそれぞれをＳＤ（−Ａｄｅ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ／＋Ｘ−ａｌｐｈａ−Ｇａｌ）プレートに塗り広げ、３０℃で２週間培養した。その結果、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に着目因子の断片が融合した蛋白質と、ｐＡＣＴ２由来のＧａｌ４の転写活性化領域と任意の因子の蛋白断片の融合蛋白質の両者が酵母細胞中で相互作用した結果としてＡＨ１０９がもともと保持していたレポーター遺伝子が活性化し、Ａｄｅ非要求性、Ｈｉｓ非要求性及びＸ−ａｌｐｈａ−Ｇａｌ代謝活性獲得というフェノタイプを獲得したクローンのコロニーがプレート上に青い３ｍｍ程度のコロニーとして出現した。このコロニーの一部をかきとり、以下のプライマー対を利用したコロニーＰＣＲで、ｐＡＣＴ２ベクタ−のインサート断片である任意の因子のＤＮＡを増幅した。プライマー対の配列は、５’−ｔａｔｃｔａｔｔｃｇａｔｇａｔｇａａｇａｔａｃｃｃｃａｃｃａａａｃｃｃ−３’，  ５’−ｇａａｇｔｇａａｃｔｔｇｃｇｇｇｇｔｔｔｔｔｃａｇｔａｔｃｔａｃｇａｔ−３’であった。
ＰＣＲの条件は、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ製）及び付属バッファーを用いて、９５℃５分の熱変性後、（９５℃１分６８℃３分）を１サイクルとして３５サイクルであった。得られた特異的ＰＣＲ産物をＡＢＩ社製３７００オートシークエンサーで塩基配列を決定した。その結果、本転写調節因子（ＮＸＦ）に相互作用するこの任意の因子の断片は、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿１４５６４６のＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）  （  Ｌｉｎ，Ｓ．，  Ｙｉｎｇ，Ｋ．，  Ｗａｎｇ，Ｚ．，  Ｘｉｅ，Ｙ．  ａｎｄ  Ｍａｏ，Ｙ．    ＴＩＴＬＥ      Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ
ｇｅｎｅ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ）  であることが判明した。
【００４９】
実施例２  （動物培養細胞内Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイ）
上述の酵母のＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｓｓａｙの陽性クローンのインサート断片をもつｐＡＣＴ２プラスミドをＹｅａｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｋ１６１１−１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で、同キットの説明書に従って酵母から回収後、同プラスミドをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断し次にＢｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラ製）で平滑末端化後、約５６０ｂｐのインサート断片をアガロース電気泳動で回収した。この断片を次に、動物細胞内Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｓｓａｙ用ベクターｐＶＰ１６ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入）をＢａｍＨＩで３７℃２時間切断後アルカリフォスファターゼで６５℃１時間処理して末端を脱リン酸化し、更にＢｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラ製）で平滑末端化したベクターに対して、Ｔ４Ｌｉｇａｓｅで結合させた。得られたプラスミドは動物培養細胞中で、ＶＰ１６の転写活性化ドメインのＣ末端に着目遺伝子が融合した蛋白質を発現することができる。ＶＰ１６の転写活性化ドメインと着目遺伝子の翻訳枠が合っていることはＡＢＩ社製３７００ＤＮＡシークエンサーで塩基配列を決定することで確認した。
一方、ｐＭベクター（市販キットＫ１６０２−１に含まれる；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入した）をＢａｍＨＩで３７℃２時間切断後アルカリフォスファターゼで６５℃１時間処理して末端を脱リン酸化し、更にＢｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラ製）で平滑末端化したベクターに対して、ｍｏｕｓｅ本転写調節因子（ＮＸＦ）ｃＤＮＡをＥｃｏＲＶとＳｔｕＩで３７℃２時間切断してアガロースゲル電気泳動で８６０ｂｐのバンドを回収したものをＴ４Ｌｉｇａｓｅで結合させた。得られたプラスミドは、動物培養細胞中で、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に着目遺伝子が融合した蛋白質を発現することができる。Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインと着目遺伝子の翻訳枠が合っていることはＡＢＩモデル３７００型オートシークエンサーを用いたダイターミネーター法で塩基配列を決定することで確認した。
このようにして、Ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイ用のプラスミドからインサート断片を、動物培養細胞中でＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイを行うためのプラスミドベクターへと移動することで、動物培養細胞中でＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイを行うためのプラスミドの準備ができた。
同アッセイに用いるレポータープラスミドはＧａｌ４応答配列をもつｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−Ｇａｌｘ４を用いた。本プラスミドは、ＴＡＴＡ最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流にＧａｌ４のＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡがタンデムに４コピー導入されたものである。本プラスミドは以下のようにして作製した。まず、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡを有する２種のオリゴヌクレオチド（５´−ｃｇｃｇｔｃｇａｇｃ  ｔｃｇｇｇｔｃｇｇａ  ｇｇａｃｔｇｔｃｃｔ  ｃｃｇａｃｔｇｃｔｃ  ｇａｇｔｃｇａｇｃｔ  ｃｇｇｇｔｃｇｇａｇ  ｇａｃｔｇｔｃｃｔｃ  ｃｇａｃｔｇｃｔｃｇ  ａｇａ−３´、５´−ｃｇｃｇｔｃｔｃｇａ  ｇｃａｇｔｃｇｇａｇ  ｇａｃａｇｔｃｃｔｃ  ｃｇａｃｃｃｇａｇｃ  ｔｃｇａｃｔｃｇａｇ  ｃａｇｔｃｇｇａｇｇ  ａｃａｇｔｃｃｔｃｃ  ｇａｃｃｃｇａｇｃｔ  ｃｇａ−３´）をハイブリダイズした後にＴ４  Ｋｉｎａｓｅで５´末端をリン酸化し、これをＴ４  Ｌｉｇａｓｅでタンデムに結合させた。得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを、低融点アガロース（ＮｕｓｅｉｖｅＧＴＧ；ＦＭＣｂｉｏ社製）を用いた電気泳動に供することにより、当該二本鎖オリゴヌクレオチドがタンデムに２つ結合してなるＤＮＡ断片を回収した。これをインサート断片とし、ｐＧＬ３−ＴＡＴＡベクターをＭｌｕＩで切断した後アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ  Ｃ７５；宝酒造製）処理したもの０．１μｇに、Ｔ４  Ｌｉｇａｓｅ（宝酒造製）で１６℃１６時間反応させることにより結合させた。このようにして、ＴＡＴＡ最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡが４コピー導入されたレポーター遺伝子プラスミドであるｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−Ｇａｌｘ４を得た。
実施例３  （動物培養細胞内Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイ）
約５ｘ１０６のＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ２存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により分散し、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で２回洗浄した後、再度５ｘ１０６に細胞密度がなるようにＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に分散させた。この細胞分散液０．４ｍｌに対して、前記のように調製されたレポーター遺伝子プラスミド（ｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−Ｇａｌｘ４）（例えば３μｇ）と前記のように調製されたキメラ蛋白質を発現するプラスミド（例えばそれぞれ３μｇ）を混合した後、この混合物をエレクトロポレーション用キュベットに移し、Ｇｅｎｅパルサー（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用いたエレクトロポレーション法により２２０Ｖ、９５０μＦの条件でトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に置換してさらに６穴プレート内で約２４時間培養した。次いで、ウェルから培地を除き、器壁に接着している細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、５倍に希釈したＰＧＣ５０（東洋インキ社製）をウェルあたり２００μｌずつ加えてさらに室温に３０分間放置した。この細胞液２０μｌずつオペークプレート（コーニングコースター社製）上に分注し、当該プレートを酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）にセットし、５０μｌの基質液ＰＧＬ１００（東洋インキ社製）を自動分注した後、各ウェル内のルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。
その結果、図１から明らかなように、Ｇａｌ４−ＤＮＡ結合ドメイン−本転写調節因子（ＮＸＦ）（ＥｃｏＲＶ−ＳｔｕＩ）融合蛋白質およびＶＰ１６転写活性化ドメイン−ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）融合蛋白質の両者が存在するときのみにＧａｌ４応答レポーター遺伝子の強い活性化が観察された。Ｇａｌ４−ＤＮＡ結合ドメイン−本転写調節因子（ＮＸＦ）（ＥｃｏＲＶ−ＳｔｕＩ）融合蛋白質のみ、またはＶＰ１６転写活性化ドメイン−ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）融合蛋白質のみではこのようなＧａｌ４応答レポーター遺伝子の活性化は観察されなかった。このことから、本転写調節因子（ＮＸＦ）（ＥｃｏＲＶ−ＳｔｕＩ）断片とＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）との間の特異的相互作用が存在することが明らかとなった。
本アッセイ系において、プラスミドを細胞に導入後、培養液中に調べたい因子、または化合物を共存させることにより、それらの因子または化合物が本発明複合体の活性を調節するかどうか検討することができる。
具体的には、約５ｘ１０６のＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ２存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養する。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により分散し、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で２回洗浄した後、再度５ｘ１０６に細胞密度がなるようにＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に分散させる。この細胞分散液０．４ｍｌに対して、前記のように調製されたレポーター遺伝子プラスミド（ｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−Ｇａｌｘ４）（例えば３μｇ）と前記のように調製されたキメラ蛋白質を発現するプラスミド（例えばそれぞれ３μｇ）を混合した後、この混合物をエレクトロポレーション用キュベットに移し、Ｇｅｎｅパルサー（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用いたエレクトロポレーション法により２２０Ｖ、９５０μＦの条件でトランスフェクションを行う。トランスフェクション後、培地を披験物質を含むまたは含まないＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ入り）に置換してさらに６穴プレート内で約２４時間培養する。次いで、ウェルから培地を除き、器壁に接着している細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、５倍に希釈したＰＧＣ５０（東洋インキ社製）をウェルあたり２００μｌずつ加えてさらに室温に３０分間放置する。この細胞液２０μｌずつオペークプレート（コーニングコースター社製）上に分注し、当該プレートを酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）にセットし、５０μｌの基質液ＰＧＬ１００（東洋インキ社製）を自動分注した後、各ウェル内のルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定する。測定結果を、披験物質を含む場合と含まない場合で比較検討する。
この評価方法により評価された披験物質の調節能力に基づき、前記複合体が有する転写調節能力を調節する能力を有する物質を選抜する。
【００５０】
【発明の効果】
本発明により、本転写調節因子（ＮＸＦ）の活性調節剤のターゲットとして使用する、ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）と本転写調節因子（ＮＸＦ）との複合体等が提供可能となった。例えば、低分子化合物により制御することにより、ダウン症など、本転写調節因子（ＮＸＦ）が関与すると考えられる、例えば、神経疾患等の疾患の治療等に応用することが期待されている。
【００５１】
【配列表】
2004290098.tif 000002
2004290098.tif 000003
2004290098.tif 000004
2004290098.tif 000005
2004290098.tif 000006
2004290098.tif 000007
2004290098.tif 000008
2004290098.tif 000009
2004290098.tif 000010
2004290098.tif 000011
2004290098.tif 000012
2004290098.tif 000013
2004290098.tif 000014
2004290098.tif 000015
2004290098.tif 000016
2004290098.tif 000017
2004290098.tif 000018
2004290098.tif 000019
2004290098.tif 000020
2004290098.tif 000021
2004290098.tif 000022
2004290098.tif 000023
2004290098.tif 000024
2004290098.tif 000025
2004290098.tif 000026
2004290098.tif 000027
2004290098.tif 000028
2004290098.tif 000029
2004290098.tif 000030
2004290098.tif 000031
2004290098.tif 000032
2004290098.tif 000033
2004290098.tif 000034
2004290098.tif 000035
2004290098.tif 000036
2004290098.tif 000037
2004290098.tif 000038
2004290098.tif 000039
2004290098.tif 000040
2004290098.tif 000041
2004290098.tif 000042
2004290098.tif 000043
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本転写調節因子（ＮＸＦ）（ＥｃｏＲＶ−ＳｔｕＩ）断片とＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）の複合体形成を確認するための動物培養細胞ツーハイブリッドアッセイの結果を示す図である。レポーター遺伝子プラスミドとしてｐＧＬ３−ＴＡＴＡ−Ｇａｌｘ４を全部のレーンで用いている。各レーンの下の表示は、レポーター遺伝子プラスミドに作用させた因子を示す。レーン１は、レポータープラスミドのみ。レーン２は、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン−本転写調節因子（ＮＸＦ）（ＥｃｏＲＶ−ＳｔｕＩ）融合蛋白質のみ。レーン３はＶＰ１６転写活性化ドメイン−ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）融合蛋白質のみ。レーン４は、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン−本転写調節因子（ＮＸＦ）（ＥｃｏＲＶ−ＳｔｕＩ）融合蛋白質に加えてＶＰ１６転写活性化ドメイン−ＤＥＡＨ−ｂｏｘ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＡＡＭ７３５４７  （ＬＯＣ９０９５７）融合蛋白質を加えた。レーン５は、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインのみを発現するｐＭベクターに加えてＶＰ１６の転写活性化ドメインのみを発現するｐＶＰ１６ベクターを加えた。このレーンは陰性対照に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図１】
2004290098.tif 000044