(57)【要約】      （修正有）【課題】ファイトレメディエーションに有用な、重金属の蓄積能が強化された遺伝子組換え植物体を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するタンパク質、もしくは、上記特定のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有し、重金属の移行に関与するトランスポーター機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを植物体に導入し、重金属蓄積能を強化させる。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡで形質転換された植物体。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有し、重金属の移行に関与するトランスポーター機能を有するタンパク質。
【請求項２】
ＤＮＡが、下記の（Ｃ）または（Ｄ）に示すＤＮＡである、請求項１に記載の植物体。
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、重金属の移行に関与するトランスポーター機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３】
重金属の蓄積能が強化された請求項１または２に記載の植物体。
【請求項４】
重金属が、カドミウムである、請求項３に記載の植物体。
【請求項５】
植物体が、アブラナ科、アオイ科、マメ科、アカザ科、ナス科、キク科、ヒユ科、および、イネ科からなる群より選ばれる植物体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項６】
植物体がタバコ、ケナフまたはカラシナである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項７】
植物体がタバコである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の植物体を、重金属で汚染された土壌に生育せしめた後、収穫することを特徴とする、重金属に汚染された土壌の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、重金属の蓄積能を強化させた植物体に関し、本発明の植物体は、重金属汚染土壌や重金属汚染河川湖沼の浄化（ファイトレメディエーション）等に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
植物の持つ蓄積機能や分解機能等を利用した環境汚染物質に対する浄化技術を、ファイトレメディエーションと呼び、環境汚染対策のひとつとして利用が進められている。土壌や湖沼の重金属汚染の場合、その浄化のために土壌や湖沼からの重金属の収奪除去が必要となるが、植物に重金属を蓄積させた後回収し、これを減容化後焼却する方法が合理的でコスト面からも広い範囲に適用できる手段として考えられている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
ファイトレメディエーションに使用できる植物として、これまでに、ハイパーアキュムレーター植物と呼ばれる重金属を高度に吸収蓄積する植物種がいくつか報告されており（例えば、非特許文献２、参照。）、その中でも、カドミウムに対しては、トラスピ属（Ｔｈｌａｓｐｉ  ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｃｅ）植物やミゾソバ（Ｐｅｓｉｃａｒｉａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ  Ｈ．Ｇｒｏｓｓ）がハイパーアキュムレーター植物として知られている。しかし、これらの植物は生育量が少なく、これらを用いて短期間で土壌から必要十分な量のカドミウムを除去することは困難であり、実用化には至っていない。また、栽培植物の中では、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）やカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）がカドミウムや鉛等の重金属を比較的多く蓄積することが知られているが、これらは十分量の重金属蓄積能力を持っているとはいえず、天然の植物体を用いたファイトレメディエーションには限界があった。
【０００４】
そこで、遺伝子組換えにより特定の遺伝子を植物体に過剰発現させることで、重金属蓄積能を増加させるという試みがなされてきた（例えば、非特許文献３参照。）。例えば、重金属を吸着させる目的で、金属結合タンパク質の過剰発現が報告されている。すなわち、金属結合タンパク質であるメタロチオネイン（例えば、非特許文献４参照。）やその基質であるグルタチオンの合成に関与する遺伝子（例えば、非特許文献５参照。）を植物体に過剰発現させた場合、植物体のカドミウム等の重金属蓄積能が向上したことが報告されている。
【０００５】
一方で、各種重金属トランスポータータンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させて、重金属を植物体に取り込ませる試みもなされている。重金属トランスポーターは、重金属の根からの吸収、根から地上部への移行、地上部（葉）での隔離等、重金属を植物体の各組織へ移動させる働きをする。また、重金属の過剰の取り込みや不要な重金属（カドミウム、水銀、鉛、砒素）の取り込みを制御するために、重金属を液胞へ隔離したり、細胞外への排除したりする働きも担っている。
【０００６】
その中で、形質膜に局在する重金属トランスポーターであるＮｒａｍｐ遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナが作製されたが、カドミウムに対する感受性は増加したものの、重金属の蓄積能に変化はなかった（例えば、非特許文献６参照。）。また、液胞の重金属トランスポーターであるＡｔｍｈｘをタバコに過剰発現させた例も報告されているが、蓄積量には変化がなかった（例えば、非特許文献７参照。）。一方で、同じく液胞のトランスポーターであるＡｔｃａｘ２のタバコ過剰発現体において、マグネシウムに対する蓄積能と耐性能の上昇、カドミウムの根における蓄積能の上昇と茎でのわずかな蓄積能の上昇が認められた（例えば、非特許文献８参照。）。
【０００７】
このように重金属トランスポーターの中でも、ファイトレメディエーションに有効なものとそうでないものがあり、いかなる遺伝子を導入すればファイトレメディエーションに有効な植物体が作製できるかは試行錯誤の段階であった。さらに、重金属の蓄積の上昇が見られた遺伝子導入植物体でもまだ実用化には遠く、ファイトレメディエーションに実用可能な遺伝子導入植物体の研究は途上の段階であった。
【０００８】
ところで、ｚｒｃ１は亜鉛耐性に関与するトランスポーターとして酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅより単離された遺伝子であるが、ＺＲＣ１タンパク質は液胞膜に局在して、細胞質中の亜鉛を液胞内に取り込むことで、細胞内の亜鉛イオンの恒常性維持に関わっていることが示唆されていた（例えば、非特許文献９参照。）。また、ｚｒｃ１遺伝子を酵母中で過剰発現させることにより、酵母の亜鉛やカドミウムに対する耐性が向上することが知られており（例えば、非特許文献１０参照。）、この耐性の向上は、過剰の亜鉛やカドミウムを液胞内に隔離することに起因すると考えられていた。しかし、ｚｒｃ１の過剰発現が重金属蓄積能を向上させるといった報告はなく、さらに、ｚｒｃ１は植物においては存在が確認されていなかった。
【０００９】
【非特許文献１】
ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，  １９９５，  Ｖｏｌ．１３，  ｐｐ４６８−４７４．
【非特許文献２】
Ｉｎ  Ｊ．Ｆ．Ｐａｒｒ，  Ｐ．Ｂ．Ｍａｒｓｈ，  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｋｌａ  （ｅｄｓ．）  Ｌａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈａｚａｒｄｏｕｓ  Ｗａｔｅｒｓ．  Ｍｏｙｅｓ  Ｄａｔａ  Ｃｒｏｐ．，  Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ  ，  ＮＪ．，  ２０００，  ｐｐ８５−１０７．
【非特許文献３】
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０００，  ｖｏｌ．３，  ｐｐ１５３−１６２．
【非特許文献４】
Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９７，  ｖｏｌ．８  Ｎｏ．３  ｐｐ２７９−８４．
【非特許文献５】
Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １９９９，  Ｖｏｌ．１１９  Ｎｏ．１，  ｐｐ７３−８０．
【非特許文献６】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ２０００，  ＵＳＡ  ｖｏｌ．９７，  ｐｐ４９９１−４９９６．
【非特許文献７】
ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １９９９，  ｖｏｌ．１８，  ｐｐ３９７３−３９８０．
【非特許文献８】
Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２０００，  Ｖｏｌ．１２４，  ｐｐ１２５−１３３．
【非特許文献９】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２００１，  Ｖｏｌ．２８２，  ｐｐ７９−８３．
【非特許文献１０】
Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．，  １９８９，  ｖｏｌ．２１９，  ｐｐ１６１−１６７．
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題はファイトレメディエーションに実用可能な、重金属の蓄積能が強化された遺伝子組み換え植物体を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために導入する遺伝子を広く検討した結果、酵母由来のｚｒｃ１遺伝子を導入した場合に、カドミウム等の重金属を効率よく蓄積させる植物体が得られることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  下記の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡで形質転換された植物体。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有し、重金属の移行に関与するトランスポーター機能を有するタンパク質。
（２）  ＤＮＡが、下記の（Ｃ）または（Ｄ）に示すＤＮＡである、（１）に記載の植物体。
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、重金属の移行に関与するトランスポーター機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
（３）  重金属の蓄積能が強化された（１）または（２）に記載の植物体。
（４）  重金属がカドミウムである、（３）に記載の植物体。
（５）  植物体が、アブラナ科、アオイ科、マメ科、アカザ科、ナス科、キク科、ヒユ科、および、イネ科からなる群より選ばれる植物体である、（１）〜（４）のいずれかに記載の植物体。
（６）  植物体がタバコ、ケナフまたはカラシナである、（１）〜（５）のいずれかに記載の植物体。
（７）  植物体がタバコである、（１）〜（５）のいずれかに記載の植物体。
（８）  （１）〜（７）のいずれかに記載の植物体を、重金属で汚染された土壌に生育せしめた後、収穫することを特徴とする、重金属に汚染された土壌の浄化方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は以下で詳細に説明する。
【００１４】
本発明の植物体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有し、重金属の移行に関与するトランスポーター機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された植物体である。配列番号２に記載のアミノ酸配列は、酵母（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の液胞トランスポーターＺＲＣ１の配列である。
【００１５】
本発明において、上記「数個」とは、例えば１７７個以下、好ましくは１３３個以下、より好ましくは４５個以下、特に好ましくは１０個以下の個数をいう。また、重金属の移行に関与するトランスポーター機能を有するとは、亜鉛やカドミウム等の重金属を細胞内に取り込む機能を有することを意味し、ＤＮＡを適当な細胞に発現させ、細胞におけるこれらの重金属の取り込み能を調べることによって確かめることができる。
【００１６】
本発明の植物体として具体的には、配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡで形質転換された植物体、または、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、重金属の移行に関与するトランスポーター機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡで形質転換された植物体が挙げられる。
【００１７】
ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号１に記載のＤＮＡの一部または全部をプローブとして使用して、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。例えば、酵母または他の生物由来の染色体ＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを含む、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６５℃で上記プローブとハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、「モレキュラークローニング第２版」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９．）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１８】
具体的には、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。ここで言う一定以上の相同性とは、例えば５５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡにつき、形質転換する宿主にあわせて配列番号２のアミノ酸をコードするようにコドンを変化させたものについても、本発明において形質転換させるＤＮＡに含まれる。また、本発明において形質転換に用いるＤＮＡは上記要件を満たす限りにおいては、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＤＮＡに限られない。さらに、発現するタンパク質が（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である限り、一または二以上のイントロンで分断されていてもよい。
【００１９】
ｚｒｃ１をコードするＤＮＡは、一般に市販されている酵母（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）野生株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、公知の配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法等の遺伝子工学的手法を用いて単離することができる。また、ＤＮＡ合成装置等を用いることにより化学的に合成することもできる。
【００２０】
本発明の植物体は、上記ＤＮＡを宿主に応じた発現ベクターに連結し、一般的な形質転換方法で宿主を形質転換し、得られた形質転換植物細胞を再生させることによって得ることができる。宿主としては、アブラナ科、アオイ科、マメ科、アカザ科、ナス科、キク科、ヒユ科、又は、イネ科の植物が好ましい。具体的には、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂｂａｃｕｍ）、ケナフ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ）、カラシナ  （Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、ユリノキ（Ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｔｕｌｉｐｉｆｅｒａ）等の植物が挙げられが、このうち好ましくは、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂｂａｃｕｍ）、ケナフ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）が挙げられる。特に好ましくは、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂｂａｃｕｍ）が挙げられる。
【００２１】
発現ベクターは宿主との組み合わせを考えて選択することができ、好ましくは宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、本発明の遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，  ｖｏｌ．１５，  ｐｐ８０９−８１４，  １９９５）、ｐＢＩ１２１（ＥＭＢＯ  Ｊ．  ｖｏｌ．６，  ｐｐ３９０１−３９０７，  １９８７）、ｐＬＡＮ４１１またはｐＬＡＮ４２１（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌ．１０，  ｐｐ２８６−２９０，  １９９１）を挙げることができる。ここで、植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  ｖｏｌ．２２０，  ｐｐ３８９−３９２，  １９９０）等が挙げられる。また、植物への該遺伝子の導入方法としては、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法等を挙げることができる。
【００２２】
本発明の好ましい形態は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、もしくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有し、重金属の移行に関与するトランスポーター機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡで形質転換された植物体であって、かつ、重金属蓄積能が強化された植物体である。ここで、重金属として好ましくは、カドミウム、亜鉛、銅、コバルトおよび鉛が挙げられ、特に好ましくはカドミウムが挙げられる。また、重金属蓄積能が強化された植物体とは、例えば、上記の重金属を含有する培地等に形質転換植物体の種子を播種し、さらに３０〜５０日生育させた後、湿式分解することによって植物体から抽出した重金属の重量を植物体の新鮮重で除することによって得られる含有率（％）で比較したときに、同様の条件で生育させた非形質転換体に比べて５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上高い含有率を示す植物体をいう。
【００２３】
本発明はまた、重金属で汚染された土壌に本発明の植物体を生育せしめた後、収穫することを特徴とする、重金属に汚染された土壌の浄化方法を提供する。ここで、生育せしめるとは、植物体を重金属の蓄積が可能な状態で維持することであって、必ずしも植物体が増殖することを要しない。本発明の方法は、例えば、１０ｐｐｍ前後に比較的高い濃度で重金属に汚染された農用地や、数１００ｐｐｍの高濃度に汚染された工場跡地のような場所の浄化に使用することができる。
【００２４】
【実施例】
以下実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２５】
（１）ｚｒｃ１遺伝子発現ベクターの構築
ｚｒｃ１遺伝子を含むプラスミドｐＺＮ１０：（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ｖｏｌ．  ２１９，  ｐｐ１６１−１６７，  １９８９）は、慶応大学の西沢助教授より分譲を受けた。
【００２６】
５’端にＸｂａＩまたはＳａｃＩの制限酵素サイトを有する配列番号３及び４のプライマーを合成し、ｐＺＮ１０を鋳型とし、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いＰＣＲ（９６℃、１分→（９４℃、３０秒→５５℃、４５秒→７２℃、１分）３５サイクル→７２℃、１０分）を行い、約１．４ｋｂの断片を得た。これを制限酵素ＸｂａＩで２時間処理した後、制限酵素ＳａｃＩで１５分、３０分、１時間処理することによって部分分解した。これは、ｚｒｃ１遺伝子の配列にＳａｃＩサイトがあるためである。次いでエタノール沈殿により、断片を回収した。
【００２７】
カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター及びアグロバクテリウム由来のノパリン合成酵素ポリアデニレーション配列を持つ発現ベクター：ｐＨＩＴＣＰ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ｖｏｌ．  ８９，  ｐｐ９８６５−９８６９，  １９９２）を制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩで処理して、余分なＣＰ遺伝子（イネ縞葉枯れ病ウイルス由来の外被タンパク質をコードする遺伝子）を切断した。次に電気泳動により分離し、ベクター領域をゲルから回収して、ライゲーションキット（宝酒造）を用いて、上記で増幅し、部分分解したｚｒｃ１遺伝子断片と連結した。
【００２８】
連結反応物を制限酵素ＥｃｏＲＩで２時間処理した後、制限酵素ＢａｍＨＩで１５分、３０分、１時間処理することにより部分分解した。これはｚｒｃ１遺伝子の配列にＢａｍＨＩサイトがあるためである。次いで、エタノール沈殿により、断片を回収した。これを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したバイナリーベクターｐＫＭ４２４に挿入し、ベクターの構築を完成させた（図１：ｐＫＭ４２４−３５Ｓｚｒｃ１）。
【００２９】
（２）形質転換植物の作出
（２）−１．タバコの形質転換
形質転換の宿主としてタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ＳＲ１株（Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．２４４  ｐｐ２９−３０，  １９７３）を用い、リーフディスク法によって遺伝子導入を以下のようにして行った。まず、プラスミドｐＫＭ４２４−３５Ｓｚｒｃ１を凍結融解法でアグロバクテリウム（ＥＨＡ１０１株：Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１６８  ｐｐ１２９１−１３０１，  １９８６）に導入した。次に、無菌培養したタバコから若葉を切りとり、葉脈を含むように約１ｃｍ平方に切った。これをＭＳ培地（３％ショ糖を含む）を入れたシャーレに移し、終夜培養した遺伝子導入アグロバクテリウムの懸濁液を加えパラフィルム（ＳＨＯＷＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ）でシールした。暗所、２７℃で２日間培養した後、葉片をＭＳ培地で洗い、ペーパータオルで水分をとり、葉の表面を下にして抗生物質（２００μｇ／ｍｌ  カナマイシン、５００μｇ／ｍｌ  クラフォラン）、ホルモン（０．１μｇ／ｍｌ  ナフタレン酢酸，１．０μｇ／ｍｌ  ベンジルアミノプリン）を含むＭＳ寒天培地（３％ショ糖を含む）にのせた。２７℃、１６時間明／８時間暗の条件で２〜３週間培養した後、分化してきた茎葉を切りとり、ホルモンフリーのＭＳ培地に移し変え発根を誘導させた。根が十分に成長した植物体は１／５００量のハイポネックス（ハイポネックス社）を含む培養土（バーミキュライト：ピートモス＝１：１）に移し、ビニール袋をかぶせて人工気象機中で数週間順化させた。順化の終了した植物体は隔離温室内で生育させ自家受粉させて種子を得た。
【００３０】
（２）−２．シロイヌナズナの形質転換
上述のｚｒｃ１遺伝子を挿入したバイナリーベクター（ｐＫＭ４２４−３５Ｓｚｒｃ１）を含むアグロバクテリウムを用いて、減圧浸潤法（モデル植物の実験プロトコール、秀潤社（２００１年）ｐｐ１０９−１１３）によりシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）に以下の手順で導入した。即ち、上記のアグロバクテリウム形質転換体をＹＥＢ培地（０．５％  Ｐｅｐｔｏｎｅ，  ０．５％  Ｂｅｅｆ  ｅｘｔｒａｃｔ，  ０．１％  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，  ０．５％  ｓｕｃｒｏｓｅ）にて増殖させ、４０００ｇ、１５分の遠心により集菌して湿潤用培地（１／２ＭＳ−Ｂ５培地，  ０．５％  ｓｕｃｒｏｓｅ，  ０．５％  ＭＥＳ，  ０．０４４μＭ  ＢＡＰ，  ０．０８％  Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（日本ユニカー））に再懸濁を行った。この懸濁液に、２〜１０ｃｍ程度抽苔させたシロイヌナズナを、減圧下（５〜１０ｃｍＨｇ）で約１５分湿潤させた。その後、通常どおり、培養器中で生育、結実させ、採種した。得られた種子（Ｔ１）をカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＭＳ培地で選抜し、Ｔ１個体よりＴ２種子を得た。Ｔ２個体をさらにカナマイシンで選抜後、分離比が１コピー挿入系統の３：１になるものについて、Ｔ３種子を得た。遺伝子導入の確認は、配列番号３および４のプライマーを用いたＰＣＲ（９６℃、１分→（９４℃、３０秒→５６℃、４５秒→７２℃、１分）  ３０サイクル→７２℃、１０分）により行った。Ｔ３種子において遺伝子導入された個体をＰＣＲ＋、遺伝子が欠落した個体をＰＣＲ−とし、以後の解析に用いた。
【００３１】
（３）形質転換植物のノザン解析
全ＲＮＡを、Ｔ２世代の植物体よりＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６２：  １５６−１５９  （１９８７））に従って調製した。各々のＲＮＡとしては、シロイヌナズナは５μｇ、タバコは１０μｇの全ＲＮＡを２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで分離した。バキュジーン（ファルマシア社）を使用して、ハイボンド−Ｎ＋（アマシャム社）へ転写し、このナイロン膜をノザン解析に使用した。
【００３２】
ｚｒｃ１遺伝子の一部又は全部をプローブとして使用した。ランダムプライマーキット（アマシャム社）を用いて、プローブとするＤＮＡ断片（２５ｎｇ）をα−３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルした。ナイロン膜を、４２℃で３時間以上、プレハイブリダイズ溶液（５０％フォルムアミド、２×ＳＳＰＥ（０．３  Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２Ｍ  リン酸ナトリウム、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ）、２５０μｇキャリアＤＮＡ、０．５％スキムミルク、１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））中でプレハイブリダイズした後、ラベルされたプローブを加えて、４２℃で一昼夜ハイブリダイズした。２×及び０．１×のＳＳＣ溶液（２０×ＳＳＣ：３  Ｍ  ＮａＣｌ、０．３  Ｍ  クエン酸ナトリウム）（４２〜６５℃）で洗浄後、Ｘ線フィルムに露光してバンドの有無を確認した。
【００３３】
結果を図２および図３に示す。供試したＲＮＡ量の目安を示すため、エチジウムブロマイドで染色したリボゾーマルＲＮＡの量も示した。形質転換したシロイヌナズナのＴ２世代においてｚｒｃ１の発現が確認できた（図２）。また、タバコのＴ２世代においても、ｚｒｃ１の発現が確認できた（図３、レーン３〜２２）。一方、非形質転換タバコにおいてはｚｒｃ１の発現が見られなかった（図３、レーン１、２）。
【００３４】
（４）抗体の作製
発現させた遺伝子産物を解析するために、以下の手順で、大腸菌にＺＲＣ１タンパク質の一部を合成させ、これをウサギに免疫し、抗体の作製を行った。ｐＺＮ１０を鋳型として、５’端にＥｃｏＲＩまたはＸｈｏＩの制限酵素サイトをつけた配列番号５及び６のプライマー、または配列番号７及び８のプライマーを合成し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いＰＣＲ（９６℃、３０秒→（９４℃、１０秒→６０℃、２０秒→７２℃、１分）３０サイクル）を行い、各々約３００ｂｐの断片を得た。これを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで３時間処理した。次いでエタノール沈殿により、断片を回収した。これを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで処理したｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に挿入し、発現ベクターを構築した。このベクターをキットのプロトコールに沿って、大腸菌に導入してＺＲＣ１部分タンパク質をＧＳＴとの融合タンパク質として発現、精製した。次に、トロンビンによりＧＳＴ部分を切断し、０．１％ＳＤＳを含んだ１５％濃度のポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行い、目的のＺＲＣ１のバンドを切り出し、ゲルより抽出した後、ウサギに免疫し、抗血清を得た。
【００３５】
（５）ウエスタン解析
ＭＳ培地で無菌栽培したタバコの根２ｇを、乳鉢に入れた４ｍＬのバッファーＡ（７５ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．６）、２５０ｍＭ  ｓｏｒｂｉｔｏｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＰＭＳＦ、２ｍＭ  ＤＴＴ）中で細かくすりつぶした。３，６００×ｇで１０分間の遠心後、上清を新しいチューブに移し、さらに１５６，０００×ｇで６０分間遠心した。ここで得られた沈澱をサンプルバッファー３０μｌ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ６．８）、４％  ＳＤＳ、２０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１２％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ）に懸濁することで粗膜画分とした。この画分にサンプルバッファーを添加した後、ただちに０．１％ＳＤＳを含んだ１０％濃度のポリアクリルアミドゲルによって電気泳動をおこなった。ゲル上のタンパク質はｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＡＴＴＯ）によってＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。抗体によるシグナルの検出は、ＥＣＦ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、キットのプロトコールに沿って行った。図４に見られるように、発現量は多くないものの予測される位置（４７ｋＤａ）にバンドが検出できた。
【００３６】
（６）形質転換植物のカドミウム耐性能及びカドミウム蓄積能の検定
（６）−１．形質転換シロイヌナズナのカドミウム耐性能の検定
シロイヌナズナ形質転換体のカドミウム耐性能及びカドミウム蓄積能を検定した。カドミウム耐性能の生物検定は以下のように行った。１％アガロースを含むＭＳ培地に終濃度７００μＭになるように１Ｍ塩化カドミウム（フィルター滅菌処理）を加えて、滅菌したＴ２種子または非形質転換体（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）の種子を播種した。２２℃、１６時間明／８時間暗の条件下で１０日間培養し、双葉が展開し緑化したものをカドミウム耐性発芽個体としてカウントした。図５に見られるように、対照であるｗｉｌｄ  ｔｙｐｅが７００μＭでは完全に死滅するのに比べて、形質転換体は１０日目でも生存する系統が認められ、カドミウム耐性が増加したことが確かめられた。
【００３７】
（６）−２．形質転換シロイヌナズナのカドミウム蓄積能の検定
形質転換シロイヌナズナのカドミウム蓄積能の検定を以下のようにして行った。滅菌したカドミウム汚染土壌（沖積土、０．１Ｎ  ＨＣｌ抽出で約２．５ｍｇ／ｋｇカドミウムを含む）にｗｉｌｄ  ｔｙｐｅおよび形質転換（Ｔ３世代：ＰＣＲ＋およびＰＣＲ−）シロイヌナズナの種子を播種し、４３日後に地上部を採取し、植物体の新鮮重（ＦＷ）及び吸収カドミウム濃度を測定した。カドミウム濃度は、以下のようにして測定した。収穫した植物体の新鮮重を秤量した後、湿式分解に供した。湿式分解の方法は以下の通りとした。各試料全量と濃硫酸０．１ｍｌ、過酸化水素水０．５ｍｌを５０ｍｌ容試験管に分注し、ブロックヒーターで２００℃に加熱した。加熱は３０分間行い、試料液が無色透明、過酸化水素が蒸発し終わった状態を確認した後放冷した。過酸化水素水が蒸発した後も無色透明とならなかった試料液は、一度放冷した後再度過酸化水素水を０．５ｍｌ程度添加し、２００℃で３０分間加熱することを繰り返した。試料液が無色透明となったものは湿式分解を終了したものとし、放冷後、超純水で１ｍｌに定容した。得られた溶液をさらに１０倍に希釈し、希釈液２ｍｌをカドミウム濃度測定に供した。カドミウムの濃度測定にはＡＴＯＭＩＣ  ＡＢＳＯＲＰＴＩＯＮ  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ  Ａ−２０００  （ＨＩＴＡＣＨＩ）による原子吸光法を用いた。供試した植物体が吸収したカドミウムの蓄積量は、得られた希釈液中のカドミウム濃度から算出した。また、植物体内のカドミウム含有率は、植物体が吸収したカドミウムの量と供試植物の新鮮重から求めた。
【００３８】
その結果、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅのシロイヌナズナと比べて、形質転換体ＰＣＲ＋、特にｚｒｃ１／５ではカドミウム含有率（図６）の増加と植物体当たりのカドミウム蓄積量（図７）の増加が認められた。
【００３９】
（６）−３．形質転換タバコのカドミウム蓄積能の検定
次に、形質転換タバコを用いて、カドミウム添加培地及びカドミウム汚染土壌における生育量およびカドミウム蓄積量の測定を行った。まず、２００μＭ塩化カドミウム及び０．１％ショ糖を含むＭＳ寒天培地に、カナマイシンで選抜した９日目の形質転換タバコを移植した。対照としてＳＲ１株を用いた。次に、これらを３０日間生育させた後、地上部を切り取り新鮮重及びカドミウム濃度を測定した。測定した新鮮重を生育量とした。
【００４０】
また、カドミウム汚染土壌（沖積土、０．１Ｎ  ＨＣｌ抽出で約２．５ｍｇ／ｋｇカドミウムを含む）にカナマイシンで選抜した形質転換体の４週間目の幼苗を移植し、３０日後に地上部及び地下部を採取し、乾燥重量（ＤＷ）及びカドミウム濃度を測定した。カドミウム濃度の測定は、ＭＳ寒天培地および汚染土壌のいずれに生育させた場合においても、以下のようにして行った。収穫した植物体の重量を秤量した後、湿式分解に供した。湿式分解の方法は以下の通りとした。各試料全量と濃硫酸０．１ｍｌ、過酸化水素水０．５ｍｌを５０ｍｌ容試験管に分注し、ブロックヒーターで２００℃に加熱した。加熱は３０分間行い、試料液が無色透明、過酸化水素が蒸発し終わった状態を確認した後、放冷した。過酸化水素水が蒸発した後も無色透明とならなかった試料液は、一度放冷した後、再度、過酸化水素水を０．５ｍｌ程度添加し、２００℃で３０分間加熱することを繰り返した。試料液が無色透明となったものは湿式分解を終了したものとし、放冷後、超純水で１ｍｌに定容した。得られた溶液をさらに１０倍に希釈し、希釈液２ｍｌをカドミウム濃度測定に供した。カドミウムの濃度測定にはＡＴＯＭＩＣ  ＡＢＳＯＲＰＴＩＯＮ  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ  Ａ−２０００による原子吸光法を用いた。供試した植物体が吸収したカドミウムの量は、得られた希釈液中のカドミウム濃度から算出した。また、植物体内のカドミウム含有率は、植物体が吸収したカドミウムの量と供試植物の乾燥重から求めた。
【００４１】
結果を図８〜図１０に示す。寒天培地（図９）及び汚染土壌（図１０）のいずれにおいても、形質転換体では、カドミウム含有率、または、カドミウム蓄積量が著しく増加した。また、形質転換体の生育量は非形質転換体に比べて多いことがわかった（図８）。
【００４２】
（７）ｚｒｃ１産物の植物細胞内での局在の観察
酵母由来のｚｒｃ１が植物体内でも液胞に局在することを調べるため、以下のように、ｚｒｃ１をコードするＤＮＡをＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするＤＮＡに連結させて、融合タンパク質を作製し、共焦点レーザー走査顕微鏡でその局在を観察した。
【００４３】
（７）−１．ＺＲＣ１−ＧＦＰ融合タンパク質発現ベクターの作製
ｚｒｃ１遺伝子の終止コドンを削り、ＺＲＣ１タンパク質のＣ末端に続けて４個のグリシンを付加するように設計した配列番号９及び１０のプライマー用い、ｐＺＮ１０を鋳型とし、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いてＰＣＲ（９６℃、３０秒→（９６℃、１５秒→６０℃、２０秒→７２℃、２分）３０サイクル）を行い、約１．４ｋｂの断片を得た。
【００４４】
ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）を含むプラスミド（ＣａＭＶ３５Ｓ  Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ｎｏｓ３’（ｐＵＣ１８）  ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．６，  ｐｐ３２５−３３０，  １９９６）は、静岡県立大学の丹羽康夫講師より分譲を受けた。これをＮｃｏＩで３時間処理した後、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで末端平滑化処理をし、これにＰＣＲで増幅したｚｒｃ１断片を挿入した。得られたプラスミドの中から、ＺＲＣ１―Ｇ×４リンカー―ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）の融合タンパク質をコードしているプラスミドを選抜し、ｐＵＣ１８−３５Ｓ−ＺＲＣ１―ｌｉｎｋｅｒ―ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）と命名した。
【００４５】
（７）−２．シロイヌナズナ培養細胞による一過性発現解析
プラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓ−ＺＲＣ１―ｌｉｎｋｅｒ―ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）はＰＥＧ法で以下のようにして、シロイヌナズナ培養細胞に導入した。シロイヌナズナ培養細胞（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ｖｏｌ．１３，  ｐｐ７０７−７１６，  １９９８）は東京大学の梅田助教授から分譲を受けた。継代後６日目の培養細胞を２．５ｇ量り取り、２５ｍＬの酵素液（０．４Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ，  ５ｍＭ  ＥＧＴＡ，  ０．１％  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ  ＲＳ（ヤクルト製薬），  ０．０５％  ｐｅｃｔｒｉａｓｅ  Ｙ−２３（協和化成））に懸濁し、３０℃で１時間ゆっくりと振とうし、プロトプラスト化した。４５μｍのメッシュで濾過した後、濾液を１０００ｒｐｍで１０分間遠心してプロトプラストを沈殿させ、上清を捨てた。２５ｍＬの洗浄液（０．４Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ，  ７０ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ５ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ  ５．７））に懸濁した後、９００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、これをもう一度繰り返した。次いで１２  ｍＬのＭＳ−ｍａｎｎｉｔｏｌ  ｍｅｄｉｕｍ（０．４Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ，  ０．００４％  Ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ，  ０．００００４％  Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ，  ０．００００４％  Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ，  ０．０００４％  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１  ｉｎ  １×ＭＳ  ｍｅｄｉｕｍ、ｐＨ  ５．８）に懸濁し、９００ｒｐｍで１０分間遠心し、２ｍＬ溶液を残して上清を除いた後懸濁し、２００μｌずつ１５ｍＬのチューブに分注した。
【００４６】
ｐＵＣ１８−３５Ｓ−ＺＲＣ１―ｌｉｎｋｅｒ―ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）を２０μｇずつ、上記で分注したプロトプラストに加えた。コントロールとして、ＣａＭＶ３５Ｓ  Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ｎｏｓ３’（ｐＵＣ１８）を用いたが、これも同じようにプロトプラスト液に加えた。２００μｌのＰＥＧ溶液（２５％  ＰＥＧ６０００，  １００ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２−４Ｈ２Ｏ，  ４５０ｍＭ  ｍａｎｎｉｔｏｌ  ｐＨ  ９．０）を加えて静かに懸濁し、２０分室温で放置した。５ｍＬの停止液（２７５ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２−４Ｈ２Ｏ，  ｐＨ  ６．０）を加えて、８００ｒｐｍで８分間遠心し、上清を捨てた。８ｍＬのＭＳ−ｍａｎｎｉｔｏｌ  ｍｅｄｉｕｍにプロトプラストを懸濁した後、ペトリディッシュに移して暗所で培養し、形質転換後１２時間以降に共焦点レーザー走査顕微鏡システム（ｃｏｎｆｏｒｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｒａｄｉａｎｃｅ  ２０００，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．）  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ａ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  （ＥＣＬＩＰＳＥ    ＴＥ３００，  Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．））を用いて観察した。結果を図１１に示す。ＣｏｎｔｒｏｌのＧＦＰは細胞質に局在したのに対し、ｚｒｃ１−ＧＦＰは、酵母と同様に植物でも液胞に局在することが確認された。
【００４７】
【発明の効果】
本発明の植物体は、生育を阻害されることなく、カドミウム、亜鉛等の重金属を高効率で蓄積させることができ、ファイトレメディエーションに有用である。
【００４８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｚｒｃ１発現ベクターの模式図。３５Ｓ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ：カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター、Ｉ：ヒマ由来のカタラーゼ遺伝子の第１イントロン、Ｎｏｓ  Ｔ：アグロバクテリウム由来のノパリン合成酵素のポリアデニレーションシグナル。
【図２】形質転換シロイヌナズナにおけるｚｒｃ１のｍＲＮＡの発現量を示す図（写真）。ｒＲＮＡ：リボゾーマルＲＮＡ、ｚｒｃ１：ｚｒｃ１遺伝子の転写産物。
【図３】形質転換タバコにおけるｚｒｃ１のｍＲＮＡの発現量を示す図（写真）。ｒＲＮＡ：リボゾーマルＲＮＡ、１，２：ＳＲ１（非形質転換タバコ）、３−７：ｚｒｃ１／１，  ８−１２：ｚｒｃ１／２，  １３−１７：ｚｒｃ１／４，  １８−２２：ｚｒｃ１／６。
【図４】形質転換タバコの根の液胞膜画分におけるＺＲＣ１タンパク質の発現量を示す図（写真）。
【図５】カドミウム高含有培地（７００μＭ）における、形質転換シロイヌナズナの生存率を示すグラフ図。
【図６】汚染土壌（沖積土：カドミウム含有率４ｍｇ／ｋｇＦＷ）で栽培したシロイヌナズナのカドミウム含有率を示すグラフ図。ＰＣＲ＋：ｚｒｃ１遺伝子導入個体、ＰＣＲ−：ｚｒｃ１遺伝子欠落個体。
【図７】汚染土壌（沖積土：カドミウム含有率４ｍｇ／ｋｇＦＷ）で栽培したシロイヌナズナの植物体当たりのカドミウム蓄積量を示すグラフ図。ＰＣＲ＋：ｚｒｃ１遺伝子導入個体、ＰＣＲ−：ｚｒｃ１遺伝子欠落個体。
【図８】カドミウム含有寒天培地での形質転換タバコの生育量を示すグラフ図。ＳＲ１：非形質転換タバコ、ｌｉｎｅ１／ｌｉｎｅ２：形質転換タバコ。
【図９】カドミウム含有寒天培地での形質転換タバコのカドミウム蓄積量を示すグラフ図。ＳＲ１：非形質転換タバコ、ｌｉｎｅ１／ｌｉｎｅ２：形質転換タバコ。
【図１０】汚染土壌（沖積土：カドミウム含有率４ｍｇ／ｋｇＦＷ）で生育させた形質転換タバコの乾燥重量とカドミウム含有率の相関を示す図。
【図１１】ＺＲＣ１−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を示す図（写真）。Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＧＦＰタンパク質のみ。ＺＲＣ１−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）：ＺＲＣ１とＧＦＰの融合タンパク質。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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