(57)【要約】【課題】血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法を提供することを課題とする。また、該検査のための試薬を提供することを課題とする。【解決手段】Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域において新たに見出した多型と血圧または体液の調節不良に伴う疾患である高血圧疾患との関連を検討した。その結果、Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域における多型が高血圧の素因であるとの結論を得た。このことから、Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域における多型を解析することで、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査することが可能となった。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法であって、Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型を検出する工程を含み、多型が検出される場合に該疾患に発症しやすい遺伝性素因を有すると判定され、多型が検出されない場合に該疾患に発症しにくい遺伝性素因を有すると判定される方法。
【請求項２】
多型が一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型が、Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子の３’末端非翻訳領域の多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型が、Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子のエクソン２の最後の塩基の１塩基３’側の塩基部位を１番目としたときに、８２番目の塩基部位における多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
８２番目の塩基部位における多型が、グアニンからアデニンへの変異である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
疾患が、高血圧疾患、腎疾患または心不全である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）（ｉ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）該ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
（ｄ）検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する工程
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）で調製したプライマーを用いて、プライマ―伸長反応を行う工程
（ｄ）工程（ｃ）で得られたプライマ―伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う工程
（ｅ）質量測定の結果から遺伝子型を決定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で決定した遺伝子型を対照と比較する工程
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズする、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｄ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｅ）レポーター蛍光の発光を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する工程
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｄ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）および工程（ｃ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｅ）工程（ｄ）でハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる工程
（ｆ）フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる工程
（ｇ）工程（ｆ）により発生する蛍光の強度を測定する工程
（ｈ）工程（ｇ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
【請求項１６】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する工程
（ｅ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）蛍光の偏光度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程
【請求項１８】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）工程（ｄ）で反応に使われた塩基種を判定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で判定された塩基種を対照と比較する工程
【請求項１９】
Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子のエクソン２の最後の塩基の１塩基３’側の塩基部位を１番目としたときに、８２番目の塩基部位における塩基（アデニン）を含む、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための試薬。
【請求項２１】
Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための試薬。
【請求項２２】
疾患が、高血圧疾患、腎疾患または心不全である、請求項２０または２１に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝因子と環境因子との相互作用は高血圧の発症に重要な役割を果たすと考えられている。単一遺伝子の全体またはゲノム全体に多数の一塩基多型を有する大規模疫学コホートにおいて相関解析を用いることは、高血圧の要因となる遺伝子を同定するための新たな戦略である（Ｋｒｕｇｌｙａｋ　ＡＪ．　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ　ｌｉｎｋａｇｅ　ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｇｅｎｅｓ．　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９９９；２３：１３９−１４４．、Ｔａｋａｇｉ　Ｓ，　Ｂａｂａ　Ｓ，　Ｉｗａｉ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　２　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ａ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ａｌｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｐｒｅｓｓｏｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｌｃｏｈｏｌ：　Ｔｈｅ　Ｓｕｉｔａ　Ｓｔｕｄｙ．　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．　Ｒｅｓ．　２００１；２４：３６５−３７０．、Ｆｕｋｕｄａ　Ｍ，　Ｏｈｋｕｂｏ　Ｔ，　Ｋａｔｓｕｙａ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍａｓｔ　ｃｅｌｌ　ｃｈｙｍａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｖａｒｉａｎｔ　ｗｉｔｈ　ＨＤＬ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｗｉｔｈ　ｂｌｏｏｄ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｏｈａｓａｍａ　Ｓｔｕｄｙ．　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．　Ｒｅｓ．　２００２；２５：１７９−１８４．）。
【０００３】
ナトリウム利尿ホルモンは心血管系のホメオスタシスに重要な役割を果たしている。Ａ−タイプおよびＢ−タイプのナトリウム利尿ホルモン（ＡＮＰおよびＢＮＰ）は主として心臓組織で産生され、血圧および体液ホメオスタシスに直接に影響を及ぼすことが知られている（Ｏｇａｗａ　Ｙ，　Ｉｔｏｈ　Ｈ，　Ｎａｋａｏ　Ｋ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆａｍｉｌｙ．　Ｃｌｉｎ．　Ｅｘｐ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．
１９９５；２２：４９−５３．）。
【０００４】
Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン　（ＣＮＰ）　は、中枢神経系より同定された利尿作用および血管弛緩作用を持つペプチドホルモンである。ＣＮＰは内皮細胞で産生されるが、その末梢循環レベルは極めて低く、血圧の状態とは相関しないように思われる（Ｃｈｅｕｎｇ　ＢＭ，　Ｂｒｏｗｎ　ＭＪ．　Ｐｌａｓｍａ　ｂｒａｉｎ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｉｎ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．　Ｊ．　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．　１９９４；１２：４４９−４５４．）。一方、中枢神経系におけるＣＮＰの発現レベルは高いことが報告されている（Ｋｏｍａｔｓｕ　Ｙ，　Ｎａｋａｏ　Ｋ，　Ｓｕｇａ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　（ＣＮＰ）　ｉｎ　ｒａｔｓ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎｓ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．　１９９１；１２９：１１０４−１１０６．）。また、ＣＮＰは血圧を降下させることが判明しており、中枢神経系を介して血圧または体液調節に関与すると考えられている（Ｃｈａｒｌｅｓ　ＣＪ，　Ｒｉｃｈａｒｄｓ　ＡＭ，　Ｅｓｐｉｎｅｒ　ＥＡ．　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ａｔｒｉａｌ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ｌｏｗｅｒｓｂｌｏｏｄ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ａｎｄ　ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ　ｓｈｅｅｐ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．　１９９２；１３１：１７２１−１７２６．）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＣＮＰ遺伝子領域の多型と血圧または体液の調節不良に伴う疾患との関連を明らかにし、得られた知見に基づいて、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法を提供することである。また、該検査のための試薬を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
日本人集団におけるＣＮＰの遺伝子バリアントと高血圧との間の相関解析（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ）を行った。４種類の遺伝子バリアントが見付かり、このうち２つはプロモーター領域にあり、１つはミスセンス変異であり、１つは３’非翻訳領域にあった。この４つのバリアントのすべての遺伝子型判定を、吹田スタディに登録した２００６例の被験者を対象に行った。バリアントの１つである３’非翻訳領域内のＧ２６２８Ａは血圧との相関が認められた。多重ロジスティック分析により、Ｇ２６２８Ａ多型の遺伝子型（ＧＧ＝１、ＡＧ＋ＡＡ＝２）（ｐ＝０．００３４）、性別（ｐ＝０．０２８８）、アルコール消費（ｐ＝０．０００２）、年齢（ｐ＜０．０００１）および体容積指数（ｐ＜０．０００１）が高血圧の予測因子であることが示された。高血圧に関するＡＧ＋ＡＡ遺伝子型のＧＧ遺伝子型に対するオッズ比は１．４０であった（ｐ＝０．００３４、９５％ＣＩ　１．１２〜１．７５）。６６歳未満の年齢の若いサブポピュレーションにおける多重ロジスティック分析では、ＡＧ＋ＡＡ遺伝子型のＧＧ遺伝子型に対するオッズ比は１．５８であった（ｐ＝０．００２４、９５％ＣＩ　１．１８〜２．１２）。すなわち、ＣＮＰ　Ｇ２６２８Ａ多型の寄与の程度は年齢の若いサブポピュレーションの方がさらに大きかった。
【０００７】
以上の結果から、ＣＮＰ遺伝子領域における多型を解析することで、高血圧疾患などの血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査することができると考えられる。
【０００８】
即ち、本発明は、
〔１〕血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法であって、Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型を検出する工程を含み、多型が検出される場合に該疾患に発症しやすい遺伝性素因を有すると判定され、多型が検出されない場合に該疾患に発症しにくい遺伝性素因を有すると判定される方法、
〔２〕多型が一塩基多型である、〔１〕に記載の方法、
〔３〕Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型が、Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子の３’末端非翻訳領域の多型である、〔１〕に記載の方法、
〔４〕Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型が、Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子のエクソン２の最後の塩基の１塩基３’側の塩基部位を１番目としたときに、８２番目の塩基部位における多型である、〔１〕に記載の方法、
〔５〕８２番目の塩基部位における多型が、グアニンからアデニンへの変異である、〔４〕に記載の方法、
〔６〕疾患が、高血圧疾患、腎疾患または心不全である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
〔７〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
〔８〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔９〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１１〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１２〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）（ｉ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）該ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
（ｄ）検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する工程
〔１３〕以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）で調製したプライマーを用いて、プライマ―伸長反応を行う工程
（ｄ）工程（ｃ）で得られたプライマ―伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う工程
（ｅ）質量測定の結果から遺伝子型を決定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で決定した遺伝子型を対照と比較する工程
〔１４〕以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズする、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｄ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｅ）レポーター蛍光の発光を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する工程
〔１５〕以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｄ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）および工程（ｃ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｅ）工程（ｄ）でハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる工程
（ｆ）フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる工程
（ｇ）工程（ｆ）により発生する蛍光の強度を測定する工程
（ｈ）工程（ｇ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
〔１６〕以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する工程
（ｅ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
〔１７〕以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）蛍光の偏光度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程
〔１８〕以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）工程（ｄ）で反応に使われた塩基種を判定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で判定された塩基種を対照と比較する工程
〔１９〕Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子のエクソン２の最後の塩基の１塩基３’側の塩基部位を１番目としたときに、８２番目の塩基部位における塩基（アデニン）を含む、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド、
〔２０〕Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔２１〕Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔２２〕疾患が、高血圧疾患、腎疾患または心不全である、〔２０〕または〔２１〕に記載の試薬、
を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン（ＣＮＰ）遺伝子領域の多型を明らかにした。具体的には、配列番号：１に記載の塩基配列の７３３番目の塩基ＧがＡに変異している多型、該塩基配列の１６１２番目の塩基ＧがＣに変異している多型、該塩基配列の２３４７番目の塩基ＧがＴに変異している多型、および、該塩基配列の２６２８番目の塩基ＧがＡに変異している多型を新たに見出した。さらに、該塩基配列の２６２８番目の塩基ＧがＡに変異している多型を検出することにより、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査することができることを明らかにした。
【００１０】
本発明においては、正常な（より高頻度な、あるいは、野生型の）ＣＮＰ遺伝子領域の塩基配列を配列番号：１、および、配列番号：１に記載の塩基配列の２６２８番目の塩基ＧがＡに置換された変異体の塩基配列を配列番号：２に記載する。
【００１１】
本発明は、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法であって、ＣＮＰ遺伝子領域の多型を検出する工程を含み、多型が検出される場合に該疾患に発症しやすい遺伝性素因を有すると判定され、多型が検出されない場合に該疾患に発症しにくい遺伝性素因を有すると判定される方法を提供する。
【００１２】
本発明において、ＣＮＰ遺伝子領域とは、ＣＮＰ遺伝子を含むゲノムＤＮＡ上の一定領域を意味する。該領域には、ＣＮＰ遺伝子の発現制御領域（例えば、プロモーター領域）やＣＮＰ遺伝子の３’末端非翻訳領域などが含まれる。本発明において、ＣＮＰ遺伝子の３’末端非翻訳領域とは、ＣＮＰ遺伝子のエクソン２の最後の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側領域を意味する。このような領域としては、例えば、ＣＮＰ遺伝子のエクソン２の最後の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側に１７８６塩基までの領域やその部分領域（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列の２５４７番目の塩基から４３３２番目の塩基までの配列やその部分配列）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１３】
多型とは、遺伝学的には、母集団中１％以上の頻度で存在している塩基変化と一般的に定義される。しかしながら、本発明における「多型」は、この定義に制限されず、１％未満の塩基の変化も「多型」に含む。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基（時には数千塩基）が欠失、置換あるいは挿入している多型等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、多型部位の数についても特に制限はなく、１個以上の多型を有していてもよい。
【００１４】
本発明における多型としては、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症頻度を上昇させる多型であれば特に制限はないが、好ましくは、ＣＮＰ遺伝子のエクソン２の最後の塩基の１塩基３’側の塩基部位を１番目としたときに、８２番目（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列において、２６２８番目の部位）の塩基部位における多型が挙げられる。また、上記８２番目の多型としては、好ましくは、ＧからＡへの置換変異である。
【００１５】
本発明において、血圧または体液の調節不良に伴う「疾患」としては、特に制限はなく、高血圧疾患、腎疾患または心不全が例示できる。
【００１６】
本発明においては、多型が検出される場合に、血圧または体液の調節不良に伴う疾患に発症しやすい遺伝性素因を有すると判定され、多型が検出されない場合に該疾患に発症しにくい遺伝性素因を有すると判定される。さらに、血圧または体液の調節不良に伴う疾患に罹患している被検者は、その原因が、ＣＮＰ遺伝子領域の多型にあると判定される。
【００１７】
以下、本発明の検査方法の好ましい態様を記載するが、本発明の方法はそれらの方法に限定されるものではない。
【００１８】
本発明の検査方法の好ましい態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、毛髪、手術により採取あるいは切除した組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。
【００１９】
本方法においては、次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、例えば、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。本発明において、「多型部位」とは、多型が存在しうる部位を意味する。具体的には、多型を有する被検者では多型が存在する部位であり、多型を有しない被検者では多型が存在する部位に対応する部位である。よって、本発明において、「多型部位を含むＤＮＡ」には、変異型の多型部位を含むＤＮＡだけでなく、正常型の多型部位を含むＤＮＡも含まれる。
【００２０】
本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００２１】
本方法においては、次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。本発明において、対照とは、正常なＣＮＰ遺伝子領域を含むＤＮＡを言う。一般に健常人のＣＮＰ遺伝子領域を含むＤＮＡの配列は正常であるものと考えられることから、上記「対照と比較する」とは、通常、健常人のＣＮＰ遺伝子領域を含むＤＮＡの配列と比較することを意味するが、ＧｅｎＢａｎｋ等の各種遺伝子データベースもしくは文献等に野生型として記載されているＣＮＰ遺伝子領域を含むＤＮＡの配列または配列番号：１に記載の塩基配列と比較してもよい。
【００２２】
本発明の検査方法は、上記の如く被検者由来のＤＮＡの塩基配列を直接決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【００２３】
例えば、本発明における多型の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。
【００２４】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００２５】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００２６】
該方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｏｎｙｍｏｕｓ　Ａｌｕ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｏｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１１．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．　１９９２　Ｊａｎ　１；　１２（１）：　１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒｓ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．　１９９１　Ａｕｇ　１；　６（８）：　１３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ　ＰＣＲ−ＳＳＣＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．　、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．　１９９５　Ａｐｒ　１；　４（５）：　２７５−２８２．）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異の存在を検出することができる。
【００２７】
具体的には、まず、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００２８】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００２９】
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：　ＤＧＧＥ法）等を例示することができる。ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。この部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを本発明のプライマー等を用いたＰＣＲ法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するＤＮＡ断片の場合、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
【００３０】
さらに別の方法においては、まず、被検者から調製したＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡ、および、該ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する。
【００３１】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドプローブを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドプローブを固定することができれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−　ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
【００３２】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００３３】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ＣＮＰ遺伝子領域の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。
【００３４】
本方法においては、次いで、該ＤＮＡと該基板を接触させる。この過程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、ＤＮＡをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
【００３５】
本方法においては、次いで、該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、さらに、検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する。
【００３６】
このような方法としては、例えば、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２２：１６４−１６７）等が挙げられる。
【００３７】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。また、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、該プライマーを用いて、プライマ―伸長反応を行う。次いで、プライマ―伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う。次いで、質量測定の結果から遺伝子型を決定する。次いで、決定した遺伝子型を対照と比較する。
【００３８】
このような方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１０６−１１７、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（２０００）：１８：７７−８４）等が挙げられる。具体的には、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。この際、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡをＰＣＲなどを使用して増幅することで調製することが好ましい。次いで、ＰＣＲ産物を鋳型として、ジェノタイピングプライマ―（ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―）のｄｄＮＴＰプライマ―伸長反応を行う。この反応に用いるＰＣＲ産物は、ＰＣＲプライマ―を除去するための精製が行われていることが好ましい。ジェノタイピングプライマ―は、通常、１５ｂｐ以上の長さを有する。プライマ―伸長反応においては、通常、ＰＣＲ産物に対して１０倍以上の過剰のジェノタイピングプライマ―を加えるが、これに制限されるものではない。サーマルサイクルの条件は適宜選択しうるが、ジェノタイピングプライマ―のうち３０〜６０％程度が伸長する条件が好ましい。例えば、９４℃と３７℃の２温度間で２５回程度行うことで適当な伸長効率を得ることができる。次いで、プライマ―伸長反応産物のＭＡＬＤＩプレートへのスポットを行い、次いで、質量測定を行う（マススペクトログラムを作成する）。次いで、マススペクトログラム解析から遺伝子型を決定し、対照と比較する。
【００３９】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズする、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを調製する。次いで、該ＤＮＡに、該ヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、レポーター蛍光の発光を検出する。次いで、検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する。
【００４０】
上記方法としては、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ９４−１０５、Ｇｅｎｅｔ　Ａｎａｌ．　（１９９９）１４：１４３−１４９）等を挙げることができる。具体的には、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブの５’末端にレポーター蛍光を標識する。本発明において、レポーター蛍光としては、ＦＡＭやＶＩＣなどが例示できるが、これらに限定されない。さらに、上記プローブの３’末端にクエンチャー蛍光を標識する。本発明において、クエンチャー蛍光としては、レポーター蛍光を消光できる物質であれば特に制限されない。次いで、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを、被検者から調製したＤＮＡにハイブリダイズさせる。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅する。その結果、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光を標識したヌクレオチドプローブのレポーター蛍光標識部分が切断され、レポーター蛍光が遊離する。本発明において、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、好適にはＴａｑＤＮＡポリメラーゼが例示できるが、これに限定されるものではない。本方法においては、次いで、遊離したレポーター蛍光を検出し、さらに、該レポーター蛍光の発光を対照と比較する。なお、本方法においては、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基が正常型である場合と変異型である場合で異なるレポーター蛍光を標識した２種類のヌクレオチドプローブを用いることで、１回の反応でタイピングすることが可能である。
【００４１】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブを調製する。また、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブを調製する。次いで、調製したＤＮＡに、上記２種類のヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる。本発明において、一本鎖ＤＮＡ切断酵素としては、特に制限はなく、例えば下記のｃｌｅａｖａｓｅが例示できる。本方法においては、次いで、フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる。次いで、発生する蛍光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。
【００４２】
上記方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ９４−１０５、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（２０００）１０：３３０−３４３）等が挙げられる。具体的には、まず、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブ（プローブＡ）を合成する。また、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブ（プローブＢ）を合成する。次いで、これらプローブを調製した鋳型ＤＮＡにハイブリダイズさせる。この際、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基に対応するプローブＢの塩基（任意の塩基）が鋳型ＤＮＡとプローブＡとの間に侵入する。この侵入部位を認識して、該部位に対応するプローブＡの塩基と該塩基の１塩基３’側の塩基の間を切断するエンドヌクレアーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）を用いてハイブリダイズしたＤＮＡを切断する。これにより、フラップ部分が遊離する。次いで、遊離したフラップ部分と、フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブ（検出用プローブ）をハイブリダイズさせる。該検出用プローブは、一般的にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）プローブとよばれる。該プローブにおいて、５’側は自身で相補的に結合できる。また、３’側はフラップと相補的な配列を有している。また、自身で相補的に結合できる５’側において、５’末端にはレポーター蛍光が標識され、該５’末端の３’側にはクエンチャー蛍光が標識されている。遊離したフラップの３’末端の塩基が、ＦＲＥＴプローブにハイブリダイズする結果、該プローブのレポーター蛍光が標識された相補結合部位に侵入することで、ｃｌｅａｖａｓｅが認識する構造が生成される。本方法においては、ｃｌｅａｖａｓｅによるレポーター蛍光標識部分の切断によって遊離したレポーター蛍光を検出し、さらに、測定した蛍光の強度を対照と比較する。
【００４３】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（２０００）１０：１０３−１１０）等が挙げられる。
【００４４】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う。次いで、蛍光の偏光度を測定する。次いで、測定した蛍光の偏光度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９９９）９：４９２−４９８）等が挙げられる。
【００４５】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う。次いで、一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定する。次いで、判定された塩基種を対照と比較する。このような方法として、例えば、ＳＮｕＰＥ法（Ｒａｐｉｄ　Ｖｏｍｍｕｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　（２０００）１４：９５０−９５９）等が挙げられる。
【００４６】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これとＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。
【００４７】
本発明は、本発明の検査方法などに利用することができる、ＣＮＰ遺伝子領域のオリゴヌクレオチドであって、ＣＮＰ遺伝子のエクソン２の最後の塩基の１塩基３’側の塩基部位を１番目としたときに、８２番目の塩基部位における塩基Ａ（例えば、配列番号：２に記載の塩基配列における２６２８番目の塩基Ａ）を含む、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを提供する。本発明において、オリゴヌクレオチドには、ポリヌクレオチドが含まれる。
【００４８】
さらに、本発明は、本発明の検査方法に使用するための試薬を提供する。その一つの態様としては、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査試薬が挙げられる。
【００４９】
該オリゴヌクレオチドは、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００５０】
ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブ（該プローブが固定された基板を含む）やプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、多型部分を含むＣＮＰ遺伝子のプロモータ―領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００５１】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００５３】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００５４】
また、本発明における検査試薬の別の態様は、ＣＮＰ遺伝子領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む検査試薬である。プライマーの長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、多型部分を含むＣＮＰ遺伝子のプロモータ―領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００５５】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００５６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）被検者
一般人口を代表するように抽出された疫学調査、吹田スタディの選択基準とデザインは以前に報告されている（Ｔａｋａｇｉ　Ｓ，　Ｂａｂａ　Ｓ，　Ｉｗａｉ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　２　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ａ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ａｌｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｐｒｅｓｓｏｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｌｃｏｈｏｌ：　Ｔｈｅ　Ｓｕｉｔａ　Ｓｔｕｄｙ．　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．　Ｒｅｓ．　２００１；２４：３６５−３７０．）。具体的には、吹田市住民３０万人より、３０歳代男１４４０人、３０歳代女性１４４０人、４０歳代男性１４４０人、４０歳代女性１４４０人、５０歳代男性１４４０人、５０歳代女性１４４０人、６０歳代男性１４４０人、６０歳代女性１４４０人、７０歳代男性１４４０人、７０歳代女性１４４０人、計１４４００人を、無作為に選び出し、手紙を書いて、検診を呼びかけた。一年に２０００から２５００人の受診がある。１９９７年に受診された方で、遺伝子検査に同意された方を対象として調べた。本実施例では被検者に関する情報は匿名とした。被検者約３７００例から遺伝子解析に関するインフォームドコンセントを得た上で、被検者２００６例においてＣＮＰの遺伝子型を判定した。収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ以上または拡張期血圧９０ｍｍＨｇ以上の場合に被検者を高血圧と分類した。降圧薬を服用していた被検者も高血圧と分類した。
【００５７】
（２）ＤＮＡ解析
被検者２４例から得たゲノムＤＮＡを配列解析用のテンプレートとして用いた。プロモーター領域（最大−１ｋｂ）とコード領域（エクソン１および２）の配列を決定した。プロモーターおよびエクソン１の領域は以下のプライマーによって増幅した；５’−ｇｇａａｇｔｔｇａｃｃａｃｃｔｇｔｃａｃｇｇｃｔ−３’（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｅ０３５９８の５７０〜５９４）（配列番号：３）および５’−ｃｔｔｃｃｃｔｃｔｃｔｃｃｔｇｇｇｔｃｃｔｇｃ−３’（１９０４〜１８８２）（配列番号：４）。エクソン１、イントロン１およびエクソン２の領域は以下のプライマーによって増幅した；５’−ｃｔｇｃａａａｔｇｇａｇｔｔｃｃｃｃｔｇｔｇ−３’（１３３９〜１３６０）（配列番号：５）および５’−ｇａａｇｃｃａｇｇｔｇｇｇｔｔｃａａｃｃａｇ−３’（２７９２〜２７７０）（配列番号：６）。多型はＴａｑＭａｎシステムによって決定した。プライマーとプローブの概要を下記の表１に示す。
【００５８】
（３）統計分析
値は平均±平均値標準誤差（ＳＥＭ）として表した。統計分析はすべてＪＭＰ統計分析パッケージ（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．）を用いて行った。多重回帰分析と多重ロジスティック分析は他の共変量を用いて行った。血圧値の残差は性別、年齢および体容積指数（ＢＭＩ）を調整することによって算出した。数値データの群間差は一元配置ＡＮＯＶＡと独立ｔ検定によって算出した。頻度の差と連鎖不平衡の程度は分割表分析によって検定した。
【００５９】
［実施例１］　　ＣＮＰ多型の同定
本発明者らは、２４人の被検者を対象にＣＮＰ遺伝子領域のシークエンスを行い、４種類の遺伝的変異を見いだした（表１、図１および２）。
【００６０】
【表１】
2004033051.tif 000002
【００６１】
ＣＮＰ遺伝子変異のＴａｑＭａｎ法による検出方法を示す。多型のヌクレオチド番号はＧｅｎＢａｎｋデータベース中の配列に従って付けた（登録番号Ｅ０３５９８）。Ｇ７３３Ａ（ＣＮＰ１）とＧ１６１２Ｃ（ＣＮＰ２）はプロモーター領域にあり、Ｇ２３４７Ｔ（ＣＮＰ３）はエクソン２にあってアミノ酸変化Ｇｌｙ６１Ｖａｌを生じ、Ｇ２６２８Ａ（ＣＮＰ４）はＣＮＰ　ｍＲＮＡの３’非翻訳領域にある。多型の対別にみた連鎖不平衡を表２にまとめた。また、遺伝子型の頻度を表３に示す。
【００６２】
【表２】
2004033051.tif 000003
各遺伝的多型間の連鎖不平衡の程度を示す。ＬＤの程度は分割表分析（Ｐｅａｒｓｏｎ）によって評価した。χ二乗値を示している。＊　ｐ＝０．０６、＊＊　ｐ＜０．０００１である。
【００６３】
【表３】
2004033051.tif 000004
対象患者の特徴を示す。値は平均（ＳＥＭ）として表した。ＢＭＩ；体容積指数（ｋｇ／ｍ２）、アルコール；日本酒の量（カップ／日）に換算したアルコール消費量、ＴＣｈｏｌ；総コレステロール（ｍｇ／ｄｌ）、ＴＧ；トリグリセリド（ｍｇ／ｄｌ）、ＨＤＬ；ＨＤＬコレステロール　ｍｇ／ｄｌ、ＭＩ；心筋梗塞、ＣＶＡ；脳血管発作を示す。＊＊　ｐ＜０．０１、＊　ｐ＜０．０５である。
【００６４】
［実施例２］　相関解析
さらに、本発明者らは、吹田スタデーを用いて、これら４種類の変異と血圧レベルの相関を調べた。表３は試験集団の特性を示している。Ｇ２３４７Ｔ多型のＧＴ遺伝子型は高血圧例での頻度が高かった。Ｇ２６２８Ａ多型ではＡＧ遺伝子型とＡＡ遺伝子型の頻度が高血圧例で高かった。
【００６５】
また、性別、年齢、ＢＭＩ、アルコール消費およびＣＮＰ遺伝子型を含めた多重ロジスティック分析により、性別（ｐ＝０．０２８８）、年齢（ｐ＜０．０００１）、体容積指数（ｐ＜０．０００１）、アルコール消費（ｐ＝０．０００２）およびＡ２６２８Ｇ遺伝子型（ＧＧ＝１、ＡＧ＋ＡＡ＝２）（ｐ＝０．００３４）が高血圧状態の予測因子であることが示された。Ｇ２６２８Ａ多型のＡＧ遺伝子型＋ＡＡ遺伝子型の高血圧に関するオッズ比は、ＧＧ遺伝子型との比較で１．４０（９５％ＣＩ　１．１２〜１．７５）であった。
【００６６】
【表４】
2004033051.tif 000005
Ｇ２６２８Ａ遺伝型に基づく６６歳未満対象者の総括を示す。ＳＢＰ；収縮期血圧（ｍｍＨｇ）、ＤＢＰ；拡張期血圧（ｍｍＨｇ）、ＨＴＮ；高血圧あり、ＨＴＮ薬物療法；高血圧に対する薬物療法を示す。他の略号は表３と同じである。
【００６７】
表４は、６６歳未満の試験集団の特性をＧ２６２８Ａ多型の種類別に示したものである。年齢の若いこのサブポピュレーションにおける多重ロジスティック分析からは、年齢（ｐ＜０．０００１）、体容積指数（ｐ＜０．０００１）、アルコール消費（ｐ＝０．００２９）およびＡ２６２８Ｇ遺伝子型（ＧＧ＝１、ＡＧ＋ＡＡ＝２）（ｐ＝０．００２４）が高血圧状態の予測因子であることが示された。Ｇ２６２８Ａ多型のＡＧ遺伝子型＋ＡＡ遺伝子型の高血圧に関するオッズ比は、ＧＧ遺伝子型との比較で１．５８（９５％ＣＩ　１．１８〜２．１２）であった。すなわち、ＣＮＰ　Ｇ２６２８Ａ多型の寄与の程度は年齢の若いサブポピュレーションの方がさらに大きかった。
【００６８】
ＣＮＰは脳全体で多量に発現され、最も濃度が高いのは下垂体前葉である（Ｋｏｍａｔｓｕ　Ｙ，　Ｎａｋａｏ　Ｋ，　Ｓｕｇａ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　（ＣＮＰ）　ｉｎ　ｒａｔｓ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎｓ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．　１９９１；１２９：１１０４−１１０６．）。グアニル酸シクラーゼ活性を有するＣＮＰ受容体（ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ；ＮＰＲＢ）は神経由来の組織に多く、末梢血管系には少ないため、ＣＮＰの直接的な末梢降圧作用はＡＮＰおよびＢＮＰよりも弱い（Ｋｏｌｌｅｒ　ＫＪ，　Ｌｏｗｅ　ＤＧ，　Ｂｅｎｎｅｔ　ＧＬ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｔｈｅ　Ｂ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｙ　Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　（ＣＮＰ）．　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　１９９１；２５２：１２０−１２３．、Ｓｕｇａ　Ｓ，　Ｎａｋａｏ　Ｋ，　Ｈｏｓｏｄａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆａｍｉｌｙ，　ａｔｒｉａｌ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ，　ｂｒａｉｎ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９２；１３０：２２９−２３９．）。しかし、ＣＮＰの脳室内注入によって血圧およびアルドステロン分泌が低下することが示されている（Ｃｈａｒｌｅｓ　ＣＪ，　Ｒｉｃｈａｒｄｓ　ＡＭ，　ＥｓｐｉｎｅｒＥＡ．　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ａｔｒｉａｌ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ｌｏｗｅｒｓ　ｂｌｏｏｄ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ａｎｄ　ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｓｈｅｅｐ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．　１９９２；１３１：１７２１−１７２６．）。このため、ＣＮＰの遺伝的差異が中枢神経系に対する作用を介して血圧に影響を及ぼすことも考えられる。
【００６９】
本発明者らはＣＮＰの４つの多型を解析し、このうち２つはプロモーター領域にあり、１つはコード領域にあってアミノ酸変化を伴い、残る１つは３’非翻訳領域にあった。このミスセンス変異は生物活性に極めて重要なループ構造の外にあり（Ｏｇａｗａ　Ｙ，　Ｉｔｏｈ　Ｈ，　Ｎａｋａｏ　Ｋ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆａｍｉｌｙ．　Ｃｌｉｎ．　Ｅｘｐ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１９９５；２２：４９−５３．）、生物学的に大きな意味はないと思われる。血圧との相関が認められたのは３’非翻訳領域内のＧ２６２８Ａ遺伝子型のみであった。本発明者らはこの３’非翻訳領域の多型がＣＮＰ　ｍＲＮＡの安定性に影響するのではないかと推測した（Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ　ＣＭ，　Ｉｙｅｒ　ＶＲ，　Ｗｅｒｓｔｉｕｋ　ＥＳ，　Ｇｒｏｖｅｒ　ＡＫ．　Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　３’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ　（３’−ＵＴＲ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍＲＮＡ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２００１；２２４：５３−６７．）。しかしながら、本発明者らの予備的な実験からこの仮説は否定された。よって、この多型の生物学的な意義は現在のところ不明である。この３’非翻訳領域における多型との連鎖不平衡の差異の方が重要な可能性があり、それには生物学的な意義があるという可能性がある。
【００７０】
【発明の効果】
本発明によって、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法および該検査のための試薬が提供された。該検査方法および該検査試薬を使用することで、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査できるようになった。また、該検査方法および該検査試薬を使用することで、血圧または体液の調節不良に伴う疾患に罹患している被検者は、その原因が、血圧または体液の調節不良に伴う疾患に発症しやすい遺伝性素因にあることを認識することができるようになった。このような検査によって、血圧または体液の調節不良に伴う疾患の発症予防または適切な治療を、個人個人に適した方法でより効果的に行うことができるものと大いに期待される。具体的には、血圧または体液の調節不良に伴う疾患に発症しやすい遺伝性素因者は、食塩感受性が高い可能性があり、生活習慣の上で、減塩が強く推奨される。また、該遺伝性素因者の血圧が既に高い場合、利尿剤が効果を持つ可能性が高い。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトのＣＮＰ遺伝子領域の配列を示す図である。アミノ酸をコードする部分は網がけしてある。
【図２】図１の続きを示す図である。アミノ酸をコードする部分は網がけしてある。
【図１】
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【図２】
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