(57)【要約】【課題】  ガドリニウムが投与された動物における「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面が撮影されたＭＲＩ画像におけるガドリニウムの検出結果と、第１の組織と第２の組織との癒着の程度とを関連づけることを特徴とする、組織癒着の程度の評価方法、及び組織癒着の程度の検出剤を提供する。【解決手段】  本発明検出方法及び本発明検出剤は、体外からの評価が困難な癒着の程度を、簡便、迅速かつ正確に検出できることから極めて有用である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガドリニウムが投与された動物における「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面が撮影されたＭＲＩによる画像におけるガドリニウムの検出結果と、第１の組織と第２の組織との癒着の程度とを関連づけることを特徴とする、組織癒着の程度の評価方法。
【請求項２】
「ガドリニウムの検出結果」が、「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面におけるガドリニウム染色部位の長さであることを特徴とする、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
「癒着の程度」が、癒着の強度であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項４】
「癒着の強度」が、第１の組織と第２の組織とを剥離するために要する力であることを特徴とする、請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
第１の組織が椎体であり、かつ、第２の組織が硬膜を含む脊髄であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項６】
癒着が、椎弓切除術後に生じる癒着であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項７】
ガドリニウムを含有し、第１の組織と第２の組織との癒着の程度の評価が求められている動物に投与され、かつ、投与後に当該動物における「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面が撮影されたＭＲＩによる画像におけるガドリニウムの検出結果と、第１の組織と第２の組織との癒着の程度とを関連づけて組織癒着の程度を評価するために用いられることを特徴とする、組織癒着の程度の検出剤。
【請求項８】
「ガドリニウムの検出結果」が、「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面におけるガドリニウム染色部位の長さであることを特徴とする、請求項７に記載の検出剤。
【請求項９】
「癒着の程度」が、癒着の強度であることを特徴とする、請求項７又は８に記載の検出剤。
【請求項１０】
「癒着の強度」が、第１の組織と第２の組織とを剥離するために要する力であることを特徴とする、請求項９に記載の検出剤。
【請求項１１】
第１の組織が椎体であり、かつ、第２の組織が硬膜を含む脊髄であることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の検出剤。
【請求項１２】
癒着が、椎弓切除術後に生じる組織癒着であることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の検出剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織における癒着の程度の評価方法及び癒着の程度の検出剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書において用いる略号を説明する。
ＭＲＩ：磁気共鳴画像（magnetic resonance imaging）
Ｌ６：第６椎弓
組織の癒着の評価は、癒着防止剤の開発等の上で非常に重要である。しかし、従来は癒着の程度を反映し得る簡便な評価方法が存在せず、この正確な評価は困難であった。
椎弓切除術は、椎間板ヘルニアや脊柱管狭窄症に適応される手術で、脊髄を覆っている硬膜と周辺組織との間に癒着を形成する場合がある。この癒着は術後の再発性疼痛などの原因となる。
ＭＲＩによって椎体を評価することは可能であるが、癒着の程度を直接評価することは困難と考えられていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、組織の癒着の程度を、正確、簡便、迅速かつ安全に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＭＲＩとＭＲＩ用造影剤としてガドリニウムを用いることによって、癒着の程度（癒着の強度等）を正確、簡便、迅速かつ安全に検出することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち本発明は、ガドリニウムが投与された動物における「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面が撮影されたＭＲＩによる画像（ＭＲＩ像）におけるガドリニウムの検出結果と、第１の組織と第２の組織との癒着の程度とを関連づけることを特徴とする、組織癒着の程度の評価方法（以下、本発明検出方法という）を提供する。
【０００６】
この「ガドリニウムの検出結果」は、「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面におけるガドリニウム染色部位の長さであることが好ましい。また、この「癒着の程度」は、癒着の強度であることが好ましい。また、この「癒着の強度」は、第１の組織と第２の組織とを剥離するために要する力であることが好ましい。また、「第１の組織」が椎体であり、かつ、「第２の組織」が硬膜を含む脊髄であることが好ましい。この「癒着」は、椎弓切除術後に生じる癒着であることが好ましい。
【０００７】
また本発明は、ガドリニウムを含有し、第１の組織と第２の組織との癒着の程度の評価が求められている動物に投与され、かつ、投与後に当該動物における「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面が撮影されたＭＲＩによる画像におけるガドリニウムの検出結果と、第１の組織と第２の組織との癒着の程度とを関連づけて組織癒着の程度を評価するために用いられることを特徴とする、組織癒着の程度の検出剤（以下、本発明検出剤という）を提供する。この「ガドリニウムの検出結果」は、「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面におけるガドリニウム染色部位の長さであることが好ましい。また、この「癒着の程度」は、癒着の強度であることが好ましい。また、この「癒着の強度」は、第１の組織と第２の組織とを剥離するために要する力であることが好ましい。また、「第１の組織」が椎体であり、かつ、「第２の組織」が硬膜を含む脊髄であることが好ましい。この「癒着」は、椎弓切除術後に生じる組織癒着であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明検出方法及び本発明検出剤は、体外からの評価が困難な癒着の程度を、簡便、迅速かつ正確に検出できることから極めて有用である。またこれらは、臨床の現場のみならず、医薬品開発又は医療用具の評価等へも応用することができることから極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明検出方法
本発明検出方法は、ガドリニウムが投与された動物における「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面が撮影されたＭＲＩによる画像におけるガドリニウムの検出結果と、第１の組織と第２の組織との癒着の程度とを関連づけることを特徴とする、組織癒着の程度の評価方法である。
【００１０】
本明細書における「ガドリニウム」の用語には、ガドリニウム自体のみならず、ガドリニウムを含有する化合物等をも包含する。例えば、通常のＭＲＩ用造影剤として用いられているガドジアミド水和物（gadodiamide hydrate）、 ガドテリドール（gadoteridol）、ガドテル酸メグルミン（meglumine gadoterate）、ガドペンテト酸メグルミン（meglumine gadopentetate）等は、いずれもガドリニウムを含有しており、これらのいずれをも用いることができる。
【００１１】
ガドリニウムが投与される動物は、組織癒着の程度を評価することが求められている動物である。動物の種は特に限定されないが、脊椎動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましく、ヒトであることが特に好ましい。
【００１２】
ガドリニウムの投与量・投与方法も特に限定されないが、ガドリニウムを含有するＭＲＩ用造影剤の通常の投与量・投与方法を採用することができる。投与方法として具体的には、静脈内への投与が好ましい。
【００１３】
ガドリニウムの投与の後、ＭＲＩによって「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面が撮影された画像を得る。ＭＲＩは通常の方法によって行えば良いが、組織癒着を評価する第１の組織と第２の組織の断面をＭＲＩによる画像中に収める必要がある。具体的には、第１の組織と第２の組織との接触面（癒着面）に対して垂直な面を画像面とすることが好ましい。ただし、画像面は第１の組織と第２の組織との接触面（癒着面）に対して厳密に垂直である必要はなく、第１の組織と第２の組織の断面が撮像されていればよい。このようなＭＲＩの画像上で、ガドリニウムに由来するシグナルを検出する。
【００１４】
ガドリニウムに由来するシグナルは、通常、ＭＲＩの画像上で白く検出され、これをガドリニウムの検出結果とする。この「ガドリニウムの検出結果」は、ガドリニウムに由来する白い部分の面積として数値化してもよく、白さの強度として数値化してもよく、ほぼ一定の幅をもったシグナルとして検出される場合にはその白い部分の「長さ」として数値化してもよい。
【００１５】
本発明検出方法では、「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面を撮影したＭＲＩによる画像を用いることから、長さを「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面におけるガドリニウム染色部位の長さとして評価することが好ましい。これによって癒着の程度を検出することができるが、この「癒着の程度」は癒着の強度であることが好ましい。この「癒着の強度」は、第１の組織と第２の組織とを剥離するために要する力（引き抜き強度）であることが好ましい。
【００１６】
そして本発明検出方法における「第１の組織」及び「第２の組織」も特に限定されないが、「第１の組織」は椎体であることが好ましく、この場合における「第２の組織」は硬膜を含む脊髄であることが好ましい。
【００１７】
そして、本発明検出方法によって検出される「癒着」も、生体組織間で形成される組織癒着である限りにおいて特に限定されないが、椎弓切除術後に生じる癒着であることが好ましい。
【００１８】
＜２＞本発明検出剤
本発明検出剤は、ガドリニウムを含有し、第１の組織と第２の組織との癒着の程度の評価が求められている動物に投与され、かつ、投与後に当該動物における「第１の組織と第２の組織との境界面」の断面が撮影されたＭＲＩによる画像におけるガドリニウムの検出結果と、第１の組織と第２の組織との癒着の程度とを関連づけて組織癒着の程度を評価するために用いられることを特徴とする、組織癒着の程度の検出剤である。
【００１９】
「ガドリニウムの検出結果」、「癒着の程度」及び「癒着の強度」の意味については「＜１＞本発明検出方法」と同様である。また、「第１の組織」及び「第２の組織」、並びに「癒着」の意味についても「＜１＞本発明検出方法」と同様である。
【００２０】
本発明検出剤の剤形は特に限定されないが、ガドリニウムを有効成分とする通常のＭＲＩ用造影剤と同様の剤形を採用することが好ましい。具体的には、液剤とすることが好ましい。
本発明検出剤中のガドリニウムの含有量も特に限定されないが、液剤とする場合には、例えば0.01mmol/L〜1.0mmol/L程度が例示される。
【００２１】
本発明検出剤の製剤化は、公知の方法を用いることができる。また、製剤化にあたり、有効成分であるガドリニウムに悪影響を与えず、かつ本発明の効果に悪影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。
【００２２】
本発明検出剤が投与される動物、本発明検出剤の投与量・投与方法についても前記の「＜１＞本発明検出方法」と同様である。
本発明検出剤は、前記の「＜１＞本発明検出方法」に従って使用することができる。以下の実施例においては、組織間の癒着の強度の物理的指標として癒着した組織を剥離するために要する力（引き抜き強度）を、組織にセットしたクランプへの負荷重量（グラム（ｇ））または負荷（ニュートン（N））として測定した。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１
材料及び方法
NZWウサギ（ｎ＝１０）の第６腰椎の椎弓を切除［L6 ラミネクトミー(Laminectomy)］した（図１）。４週間目にガドリニウムを投与して、ＭＲＩ像を撮像した。
【００２４】
ＭＲＩ像の一例を図２に示す。図２の「Ｔ１」はガドリニウムを投与しなかった場合のＭＲＩ像を、「Ｔ１  ＦＳ  Ｇａｄ」はガドリニウムを投与した場合のＭＲＩ像を示す。ガドリニウムを投与して脂肪由来の信号を抑制した画像（図２の「Ｔ１  ＦＳ  Ｇａｄ」）では、瘢痕組織（椎体と硬膜との間）が白く強調されているのがわかる。
【００２５】
また、椎体と硬膜との境界面の断面部分の拡大像を図３に示す。図３中の「グレード０」は、椎体と硬膜との境界面の断面部分における、ガドリニウム染色部位の長さのグレードが「０」のものの一例を示したものである。この例において、椎体と硬膜との境界面の断面部分におけるガドリニウム染色部位の長さは０．００ｍｍである。
【００２６】
図３中の「グレード１」は、椎体と硬膜との境界面の断面部分における、ガドリニウム染色部位の長さのグレードが「１」のものの一例を示したものである。この例において、椎体と硬膜との境界面の断面部分におけるガドリニウム染色部位の長さは１．３１ｍｍである。
【００２７】
図３中の「グレード２」は、椎体と硬膜との境界面の断面部分における、ガドリニウム染色部位の長さのグレードが「２」のものの一例を示したものである。この例において、椎体と硬膜との境界面の断面部分におけるガドリニウム染色部位の長さは２．４３ｍｍである。
【００２８】
この要領で、第６腰椎の椎弓を切除した部位を２．５ｍｍ間隔でＭＲＩ撮像して、椎体と硬膜との境界面の断面部分におけるガドリニウム染色部分の長さを測定し、各個体ごとにその長さの平均値を求めた。その一例を図４に示す。
【００２９】
その後、脊柱を取り出し、癒着形成面（後方）の反対側（前方）の脊柱を１７ｍｍ程度開窓した。開窓部にクランプをセットして、脊髄（硬膜を含む）を引き離すために必要な引き抜き強度を測定した（図５）。実際に脊髄（硬膜を含む）を引き離している様子を図６に示す。引き離しに必要な引き抜き強度は癒着の程度を直接反映していることから、癒着の程度の指標となる。脊髄（硬膜を含む）を引き離している様子と、その引き離しの距離(Displacement)及びこれに要する引き抜き強度（負荷重量：グラム(ｇ)）との関係の一例を図７に示す。また、実際の測定結果を図８に示す。
【００３０】
また、引き離しに必要な最大引き抜き強度（最大負荷：ニュートン（N））と、ＭＲＩで測定された「椎体と硬膜との境界面の断面部分におけるガドリニウム染色部位の長さ」との相関を解析した。結果を図９に示す（ｎ＝９、p<0.10）。また、「椎体と硬膜との境界面の断面部分におけるガドリニウム染色部位の長さ」が１．２ｍｍ以下のものについては、事実上、癒着がないものとして除外した場合の相関の解析結果を図１０に示す（ｎ＝６、p<0.05）。
【００３１】
ＭＲＩで測定された「椎体と硬膜との境界面の断面部分におけるガドリニウム染色部位の長さ」と、実測された最大引き抜き強度（最大負荷：ニュートン（N））（癒着の程度）は相関傾向を示した。
【００３２】
本実施例ではウサギを用いたが、例えばヒトに本方法を用いた場合には、ウサギに比して対象部位が遙かに大きいので、より正確な評価が可能であると考えられる。
【００３３】
実施例２
モデル動物として、NZWウサギ（体重４〜5.2kg、n=20）を用いた。麻酔下、第５から第７腰椎部位の背部中央切開を行った。第６腰椎部位の棘突起を取り除き、次いで黄色靱帯及び周辺組織を取り除いた。次いで14匹につき、切開部分の硬膜を取り除き、残り６匹については硬膜を残し、洗浄、止血後、傷口をふさいだ。
【００３４】
30日後、ガドリニウムをウサギ耳介静脈に投与し、鎮静下、背臥位でMRI撮像した。撮像は、4.0 functional MRI を用いて行った。切除部位のMRI撮像は、ガドリニウム投与前及び投与後に行い、解析した。
【００３５】
MRI撮像後、ウサギを屠殺し、切除部位の組織標本を下記に従って作製した。第４までの腰椎と仙骨を取り除き、第５から第７腰椎部位の標本を作製した。
【００３６】
標本を順次濃度を上げたアルコールで脱水し、メチルメタクリレート（methyl methacrylate: MMA）を用いて固定した。次いで切除部位の切片を作製した。作製した組織切片を半透明のスライドガラスに接着し、スライドガラスをReichert-Jung Ultrafrase で約50μmにまで削りだし（mill down）、次いでMassson-Goldner Trichromeで染色し、組織断面の標本を作製した。
【００３７】
代表的な例として、ガドリニウム投与前のMRI像（A、C）、ガドリニウム投与後のMRI像（B、D）及び上記で得られた組織標本の写真（E、F）を図１１に示す。
【００３８】
これらの標本において、瘢痕の有無及び硬膜あるいは脊髄への瘢痕癒着の長さを評価した。この瘢痕癒着の長さは、ガドリニウム投与前の画像における脊髄又は硬膜縁を確認し、その画像をガドリニウム投与後の画像と比較することによって決定した。それぞれの組織切片においても同様の評価ができ、その結果、図１２に示されるように、MRI像と組織画像は、一致することが確認できた。図１２に、ガドリニウム投与後のMRI像（D）と、組織標本（F）の写真における瘢痕と硬膜あるいは脊髄間癒着の長さを実線で示した。癒着の程度は硬膜を取り除いたウサギにおいて著しく高かった。
【００３９】
また、MRI像より評価した癒着の長さと組織標本により評価した癒着の長さの相関性を図１３に示した。なお、硬膜を取り除いたウサギ３匹に麻痺が起こり、１匹に感染症が認められたため、これら４匹は評価に用いなかった。図１3より、これらの結果には高い相関（R2=0.9349）が認められた。
【００４０】
以上の結果から、癒着組織部位を、ガドリニウム投与後、MRI撮像することにより、該組織の癒着の程度が正確に評価されることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ウサギの第６腰椎の椎弓切除部位を示す図である。
【図２】ＭＲＩ像の一例を示す図である。
【図３】椎体と硬膜との境界面の断面部分のＭＲＩの拡大像を示す図である。
【図４】ＭＲＩの撮影領域及び撮影間隔を示すとともに、その結果の一例を示す図である。
【図５】脊髄（硬膜を含む）を引き離すまでの様子を示す図である。
【図６】脊髄（硬膜を含む）を引き離している様子を示す図である。
【図７】脊髄（硬膜を含む）を引き離している様子と、その引き離しの距離(Displacement)及びこれに要する引き抜き強度（負荷重量：ｇ）との関係を示す図である。
【図８】脊髄（硬膜を含む）の引き離しの距離(Displacement)及びこれに要する引き抜き強度（負荷：N）の測定結果を示す図である。
【図９】引き離しに必要な最大引き抜き強度と、ＭＲＩで測定された「椎体と硬膜との境界面の断面部分におけるガドリニウム染色部位の長さ」との相関の解析結果を示す図である。
【図１０】「椎体と硬膜との境界面の断面部分におけるガドリニウム染色部位の長さ」が１．２ｍｍ以下のものを除外した場合の相関の解析結果を示す図である。
【図１１】対応するＭＲＩ標本（A, B, C, D）を合わせた組織のMRI画像と、組織標本（E）の解剖特徴との相関性を示す図である。ガドリニウム投与前画像とガドリニウム投与後画像を比較することにより、ＭＲＩにおける癒着長さを評価することができる。組織標本（F）の癒着長さも同様に測定される。
【図１２】瘢痕と硬膜あるいは脊髄間の癒着の長さを、ガドリニウム投与後の画像と組織標本に基づき、両者の境界面の長さを測定することにより求めた図である。
【図１３】MRI画像による瘢痕癒着の長さと組織画像の瘢痕癒着の長さとの強い相関性を明らかにする回帰分析を示す図である。標本としては、切除された硬膜（四角印）と無傷硬膜（丸印）を用いた。癒着長さがゼロの外れ値は、組織断片で融合が自発的に生じてしまったためであると思われる。
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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