(57)【要約】【課題】生物由来材料の特定型の細胞群を分離、特に、膵臓器からのランゲルハンス島を分離するに際し、短時間で、容易に膵臓器を消化し、ランゲルハンス島を分離回収処理する方法および装置を提供すること。【解決手段】生物由来材料を、特定型群の細胞クラスターを通過させるが生物由来材料を通過させないスクリーンを有するチャンバーに入れ、１５−３８℃で生理的媒体と共に撹拌し、再循環させることなく、前記細胞がスクリーンの通過を確認した後、冷却された第２の生理的媒体をチャンバー内に入れ、０−１４℃で撹拌し、再循環させることなく、スクリーンを通過する特定の細胞型群を回収する方法および装置。【選択図】　図１
2004033006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来材料からの細胞の一定の特定型群を得る方法であって、
（１）生物由来材料を特定型群の細胞クラスターを通過させるが生物由来材料を通過させないスクリーンを有するチャンバーに入れ、
（２）加熱工程を通過させながら、生理的媒体をチャンバーに流入させ、チャンバー内を１５−３８℃に加温してチャンバーを撹拌し、
（３）再循環させることなく、前記細胞がスクリーンを通過するのを確認した後、冷却工程を通過させながら、第２の生理的媒体をチャンバーに流入させ、チャンバー内を０−１４℃に冷却してチャンバーを撹拌し、次いで、
（４）再循環させることなく、前記スクリーンを通過する特定の細胞型群を回収することを特徴とする生物由来材料の消化・細胞回収方法。
【請求項２】
生物由来材料が膵臓であり、細胞の特定型群がランゲルハンス島である請求項１記載の生物由来材料の消化・細胞回収方法。
【請求項３】
工程（１）において、チャンバーにプロテアーゼを入れることを特徴とする請求項１記載の生物由来材料の消化・細胞回収方法。
【請求項４】
工程（２）において、生物由来材料と接触させる生理的媒体の温度を２５−４０℃に維持し、工程（３）において、流入させる第２の生理的媒体の温度を０−１５℃に維持することを特徴とする請求項１記載の生物由来材料の消化・細胞回収方法。
【請求項５】
チャンバーを上下に振幅させ、かつ、上下方向の振幅軸を中心にして左右回転させることによりチャンバーを撹拌することを特徴とする請求項１記載の生物由来材料の消化・細胞回収方法。
【請求項６】
生理的媒体供給部（ａ）、回路加熱部（ｂ）、回路冷却部（ｃ）、消化チャンバー部（ｄ）および細胞回収部（ｅ）を備え、消化チャンバー部（ｄ）は、撹拌手段、入り口部および出口部を有し、消化チャンバーの入り口部は、回路加熱部（ｂ）と回路冷却部（ｃ）に接続し、回路加熱部（ｂ）と回路冷却部（ｃ）は、切り替え可能な回路を介して生理的媒体供給部（ａ）と接続しており、消化チャンバーは、消化チャンバー内の溶液中の粒子径を調節するスクリーンを介して細胞回収部（ｅ）に接続されていることを特徴とする生物由来材料の消化・細胞回収装置。
【請求項７】
チャンバーを上下に振幅させ、かつ、上下方向の振幅軸を中心にして左右回転させる撹拌装置を備えていることを特徴とする請求項６記載の生物由来材料の消化・細胞回収装置。
【請求項８】
チャンバーが、チャンバー内の温度をモニタリングするセンサーを有することを特徴とする請求項６記載の生物由来材料の消化・細胞回収装置。
【請求項９】
チャンバーの温度を表面温度計で測定することを特徴とする請求項６記載の生物由来材料の消化・細胞回収装置。
【請求項１０】
チャンバーが、透明なプラスチック容器からなることを特徴とする請求項６記載の生物由来材料の消化・細胞回収装置。
【請求項１１】
透明なプラスチックが、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリフェニレンオキシド、グリプタル樹脂、ポリメチルメタクリレート、塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、アクリロニトリルースチレン共重合体、アクリロニトリルーブタジエン共重合体、およびポリクロルフルオロエチレンから選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする請求項１０記載の生物由来材料の消化・細胞回収装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、膵臓等の臓器から必要な細胞や組織を、細胞および組織の機能を損なうことなく、効率よく分離回収する方法および装置に関する。特に、酵素によって膵臓器を消化し、ランゲルハンス島を効率よく分離回収する方法およびその装置に関する。分離精製されたランゲルハンス島は、糖尿病患者内にインシュリンを生成させるため、糖尿病患者に移植することができる。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、日本のみならず世界的に広がっている深刻な疾病である。１９９７年に旧厚生省が行った調査では、「糖尿病が強く疑われる人」約６９０万人、この値に「糖尿病の可能性を否定できない人」６８０万人を加えると、約１３７０万人がリスク群と推定されている。ＷＨＯの推定する全世界の糖尿病人口は、２０００年で１億５千万人あまりであり、２０２５年には約３億人に達するものと予測されている。
【０００３】
近年、糖尿病の根治的治療法として膵島移植が注目を浴びるようになってきている。膵島移植は、生理的な血糖コントロールを可能とし、手技も簡単で、ハイリスク例にも応用できる優れた糖尿病治療法として期待されている。膵島移植は、糖代謝の改善による糖尿病性二次病変の進行阻止または改善を目的としているが、強化インスリン療法やインスリン持続皮下注入療法でも血糖コントロールの難しいインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）は、まさに膵島移植のよい適応であると考えられている。膵島移植は局所麻酔で可能なほどで、手術侵襲が極めて小さいため糖尿病患者にとってより安全であり、血管吻合の必要がないため血管病変の進行により膵（臓器）移植の適応外になった患者でも実施可能である。また、門脈循環にインスリンが放出されるため生理学的にも有利である。さらに、分離膵島の凍結保存による、いわゆるｂａｎｋｉｎｇも可能である等、膵（臓器）移植と比較して多くの利点を有している。
【０００４】
また、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）臨床の実際では、積極的にインスリン療法が用いられている。これは、インスリンを投与することにより、患者自身の膵島β細胞を休息させ、それによりβ細胞の機能が回復してくるのを待つという考え方からであり、近年、積極的に導入され、好結果が報告されている。このことは、ＮＩＤＤＭにおいても、膵島移植によって治療可能であることを示しており、ＮＩＤＤＭ例のβ細胞機能が低下してきている時期に膵島を移植すれば、再びβ細胞機能が回復し、ＮＩＤＤＭの悪化を防止できる可能性も考えられている。
【０００５】
実験的医療の段階から始まった膵島移植は、当初、成績が芳しくなかったが、１９９９年３月よりカナダＥｄｍｏｎｔｏｎにあるＡｌｂｅｒｔａ大学において、新しい画期的なＥｄｍｏｎｔｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌが実施され、膵島移植施行７例全例が、ｉｎｓｕｌｉｎ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔとなったということが報告され（Ｓｈａｐｉｒｏ　ＡＭ，Ｌａｋｅｙ　ＪＲＴ，Ｒｙａｎ　ＥＡ，Ｋｏｒｂｕｔｔ　ＧＳ，Ｔｏｔｈ　Ｅ，Ｗａｒｎｏｃｋ　ＧＬ，Ｋｎｅｔｅｍａｎ　ＮＭ，Ｒａｊｏｔｔｅ　ＲＶ：　Ｎ　Ｅｎｇ　Ｊ　Ｍｅｄ，３４３，２３０−２３８（２０００）を参照。）、このｐｒｏｔｏｃｏｌによる多施設共同トライアルも準備されている。
【０００６】
このように、膵島移植の臨床研究までに発展した理由としては、大動物膵よりの大量膵島分離法の研究がなされ、１９８４年、Ｒｉｃｏｒｄｉ等は、独自の自動膵島分離装置を考案し、ブタ、ヒト膵よりの大量膵島分離に成功したことが大きい。
大量膵島分離に関する技術としては、特表平２−５０４２２２２号公報（米国特許第５０７９１６０号公報に対応）には、細胞亜類型の細胞クラスターを単離する方法が記載されている。この先行技術には、膵臓から膵島を分離する手法および装置が開示されている。
【０００７】
具体的には、脊椎動物の完全な器官からの細胞の一定の特定型群を得る方法であって、
（ａ）完全器官を、特定型群に含まれる細胞を遊離させるに有効な量のプロテアーゼを含有する生理的媒体で膨張させ、
（ｂ）前記膨張器官を通しておよび細胞、すなわち、特定型群の細胞クラスターを通過させるが器官を通過させない分離手段を通して、生理的媒体を、前記細胞を移動させ、かつ、細胞を取り出すのに十分な時間、再循環し、
（ｃ）前記細胞が分離手段の通過を開始した後、前記器官を通しおよび前記分離手段を通して回収手段に新たな生理的媒体を循環し、次いで、
（ｄ）前記分離手段を通過する細胞の特定型群を回収する、
ことを特徴とする方法である。
【０００８】
しかしながら、上記の、膵臓からのランゲルハンス島の分離法は、分離操作の過程で生理的媒体を再循環させるというプロセスがあり、バルブ操作が煩雑になったり、分離時間がかかったりする等の欠点があった。また、ここには、細胞の放出を向上させる手段として、生物由来材料であるところの器官を入れた室中にビー球（ｍａｒｂｌｅｓ）等の滑らかな「向上手段」（ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）を入れることが記載されているが、室、すなわち、生物由来材料である器官をいれたチャンバー全体の撹拌態様については、具体的には示されていない。さらに、生物由来材料である器官を入れた室、すなわち、チャンバーについて、プロセスを容易ならしめるために、消化の状態を目視確認できるように、その素材を透明化したり、また、再利用できるように滅菌可能な素材や低コストのディスポーザブル製品に製作可能な素材等についての記載は一切ない。
【０００９】
Ｒｉｃｏｒｄｉ　Ｃ，Ｌａｃｙ　ＰＥ，Ｆｉｎｋｅ　ＥＨ，Ｏｌａｃｋ　ＢＪ，Ｓｃｈａｒｐ　ＤＷ：　Ｄａｉｂｅｔｅｓ，３７，４１３−４２０（１９８８）には、上記の特表平２−５０４２２２２号公報（米国特許第５０７９１６０号公報に対応）と同様の方法が記載されているが、生物由来材料である臓器を入れるチャンバーがステンレスでできており、臓器の消化の進行具合が目視で確認できないという欠点があった。
【００１０】
Ｃｈｅｒｎ　ＨＴ，Ｃｈｅｎ　ＣＦ，Ｌｅｕ　ＦＪ，ＴＳＯＵ　ＳＳ，Ｃｈａｎｇ　ＴＭ，ＳＵＮ　ＡＭ：　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｏｕｎｃｉｌ，ＲＯＣ　Ｐａｒｔ　Ｂ：　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７，１４３−１５１（１９９３）には、Ｒｉｃｏｒｄｉの自動消化装置を用いて、犬の膵臓からランゲルハンス島を大量に分離する方法が記載されているが、本方法も、最初にクローズドループで再循環し、続いてオープンシステムにして操作を行っており、バルブ操作等が煩雑であった。また、消化チャンバーの撹拌方法や素材については何ら言及されていない。
【００１１】
Ｔａｋｅｉ　Ｓ，Ｔｅｒｕｙａ　Ｍ，Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ　Ａｘｅｌ，Ｇａｒｃｉａ　Ｒ，Ｃｈａｎ　ＥＫ，Ｃｈａｒｌｓ　ＭＡ：　Ｐａｎｃｒｅａｓ，９，１５０−１５６（１９９４）には、Ｒｉｃｏｒｄｉの自動消化装置を用いて、ヒトおよびブタからのランゲルハンス島を大量に分離する方法が記載されているが、本方法も、最初にクローズドループで再循環する方法がとられており、バルブ操作等が煩雑であった。また、消化チャンバーの撹拌様式については、なんら言及されていない。一方、消化チャンバーの素材については、透明の材料からなるチャンバーを用いたとの記載があるが、材料の詳細については一切触れられておらず、透明度の度合い、耐熱性、耐衝撃性、加工性、コスト等の観点から適した材料について、これを示唆する記載もない。
【００１２】
Ｓｗａｎｓｏｎ　ＣＪ，Ｏｌａｃｋ　ＢＪ，Ｇｏｏｄｎｉｇｈｔ　Ｄ，Ｚｈａｎｇ　Ｌ，Ｍｏｈａｎａｋｕｍａｒ：　Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６２，７３９−７４９（２００１）には、特表平２−５０４２２２２号公報（米国特許第５０７９１６０号明細書に対応）と同様に、分離操作の過程で生理的媒体を再循環させるというプロセスがあり、バルブ操作が煩雑になったりする等の欠点があった。
【００１３】
一方、生物由来材料を入れたチャンバーの撹拌方法としては、消化チャンバーをアーム型の撹拌装置に備え付け、撹拌を行うことが記載されているが、撹拌を行うためのアームの振幅幅が大きいために撹拌機のスペースをとってしまったり、装置の運転者に障害を与える可能性があり、安全上の問題があった。また、消化チャンバーの素材については一切触れられていない。
米国特許第５８３７４４４号明細書には、臓器を消化するチャンバーと、予め定められたサイズより大きな細胞を留まらせるようなフィルターを有する、細胞（ランゲルハンス島）を回収するチャンバーがクローズドループになっており、そのクローズドの回路において再循環させ、ランゲルハンス島を回収チャンバーに留まらせる態様の装置が開示されている。
【００１４】
この公報の装置の構造は複雑で、実際にランゲルハンス島の分離作業を行う際には操作が煩雑である。さらに、この公報では、ランゲルハンス島の消化分離効率を向上させるための消化チャンバーの撹拌方法については何ら触れられていない。この公報には、消化チャンバーが透明のポリスルホンでできていることが開示されているが、膵島移植の臨床を行うために、ビー玉のような撹拌素子をチャンバー内にいれ、臓器を消化し、さらに、消化後、オートクレーブ滅菌して繰り返し使用するには耐久性が乏しく、一方、繰り返し使用せずに、臨床毎に使い捨てにするためのものとしては、高価であり、加工性が劣るという問題を有していた。
【００１５】
すなわち、これまで膵臓器からのランゲルハンス島を分離ために、臓器の消化の際に生理的適合性媒体を再循環させずに、短時間、かつ、容易にランゲルハンス島分離を進行させ、撹拌のためのスペースをとらない、安全、かつ、効率的に分離する方法はなかった。また、臓器の消化の際に生理的媒体を再循環させずに、短時間で、容易にランゲルハンス島分離を進行させるための回路および撹拌のためのスペースをとらない、安全、かつ、効率的に分離するための撹拌装置、および消化の状態が確認でき、繰り返し使用のための耐滅菌性および耐衝撃性を有したチャンバーまたは低コストなディスポーザブル型のチャンバーを有する装置は存在しなかった。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生物由来材料の特定型の細胞群を分離する方法およびその装置、とりわけ、膵臓器からランゲルハンス島を分離する手段において、短時間、かつ、容易に膵臓器を消化し、ランゲルハンス島を分離回収処理することができる方法および装置を提供することにある。
さらに、ランゲルハンス島を消化する際のチャンバーとして、臨床試験等、繰り返して使用する場合や使い捨て使用の場合の最適なチャンバーを提供するものである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記のような問題点を解決するために鋭意研究を重ねた結果、意外にも、生物由来材料を消化用チャンバー内に入れ、加熱された生理的媒体をチャンバーに流入させたのち、再循環させることなく、第２の冷却された生理的媒体をチャンバーに流入させ、次いで、再循環させることなく前記スクリーンを通過する特定の細胞型群を回収することによって、短時間、かつ、容易に、特定の細胞型群を回収できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
第一の発明は、生物由来材料からの細胞の一定の特定型群を得る方法であって、
（１）生物由来材料を特定型群の細胞クラスターを通過させるが生物由来材料を通過させないスクリーンを有するチャンバーに入れ、
（２）加熱工程を通過させながら、生理的媒体をチャンバーに流入させ、チャンバー内を１５−３８℃に加温してチャンバーを撹拌し、
（３）再循環させることなく、前記細胞がスクリーンを通過するのを確認した後、冷却工程を通過させながら、第２の生理的媒体をチャンバーに流入させ、チャンバー内を０−１４℃に冷却してチャンバーを撹拌し、次いで、
（４）再循環させることなく、前記スクリーンを通過する特定の細胞型群を回収することを特徴とする生物由来材料の消化・細胞回収方法である。
【００１９】
第２の発明は、生理的媒体供給部（ａ）、回路加熱部（ｂ）、回路冷却部（ｃ）、消化チャンバー部（ｄ）および細胞回収部（ｅ）を備え、消化チャンバー部（ｄ）は、撹拌手段、入り口部および出口部を有し、消化チャンバーの入り口部は、回路加熱部（ｂ）と回路冷却部（ｃ）に接続し、回路加熱部（ｂ）と回路冷却部（ｃ）は、切り替え可能な回路を介して生理的媒体供給部（ａ）と接続しており、消化チャンバーは、消化チャンバー内の溶液中の粒子径を調節するスクリーンを介して細胞回収部（ｅ）に接続されていることを特徴とする生物由来材料の消化・細胞回収装置である。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられる生物由来材料として、円口類、棘魚類、板皮類、軟骨魚類、硬骨魚類、両性類、爬虫類、鳥類、哺乳類に属する動物由来の、個体、器官、臓器、組織等である。具体例として、動物個体、胎児、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、副腎、脾臓、胆臓、胎盤、食道、胃、腸、大腸、十二指腸、皮膚、骨、軟骨、目、角膜、羊膜、筋肉、胆管、血管、神経等が挙げられる。
【００２１】
本発明において、細胞の一定の特定型群とは、細胞および細胞クラスターがもつ特徴的なある種の性質を有する細胞の集団および細胞クラスターの集団として定義される。細胞または細胞クラスターが持つ特徴的な性質とは、細胞または細胞クラスターのサイズ、比重、内容物、表面マーカー、分泌タンパク、化学物質による染色性等を指し、それらのうち、同一の性質を有する細胞または細胞クラスターの集団が、細胞の特定型群である。
【００２２】
本発明において、スクリーンとは、網目構造をもった構造物のことをいう。スクリーンによって、網目サイズより小さな細胞、組織片、粒子等は通過できるが、網目サイズより大きなものは通過できないようにすることができる。通常、網目構造をもったガラス板、フィルムまたは金網が用いられるが、適当な網目サイズをもったフィルター等も用いることが可能である。
本発明において、生物由来材料を消化する際に、プロテアーゼを加えることは必ずしも必要ではないが、消化効率を向上させるためにはプロテアーゼを加えることが好ましい。プロテアーゼとは、タンパク質加水分解酵素のことをいう。使用されるプロテアーゼは限定されないが、組織に含まれる細胞を遊離することができる酵素であればいずれでもよい。大抵の構造タンパク質はコラーゲンよりなるので、コラゲナーゼおよび／または「コラゲナーゼ」を含む標品が用いられる。「コラゲナーゼ」は、いくつかのプロテアーゼの種々の粗標品として販売されており、本発明についての有効レベルはもちろん用いるコラゲナーゼ標品の性質にも依存する。
【００２３】
一般に「コラゲナーゼ」は、構造タンパク質を破壊するのに有効であって、現に実質的量でコラゲナーゼを含有する酵素標品を記述するのに用いられる用語である。コラゲナーゼを欠くものも含め、他の「プロテアーゼ」標品も用いることができる。例えば、トリプシンまたはキモトリプシンからなる標品も有効である。近年では、コラゲナーゼの混合物であるところの「リベラーゼＴＭ」（ベーリンガー・マンハイム社製）がランゲルハンス島分離のために好適に用いられる。
標的生物由来材料の組織を「消化するのに有効なプロテアーゼの量」は、目的とする細胞の特定型群を遊離するために生物由来材料に含有される関連構造タンパクを十分な程度に破砕することができる。
【００２４】
有効であるために必要とされる濃度は、生物由来材料および用いるコラゲナーゼ標品によって変化するが、膵臓からランゲルハンス島を遊離するためには、一般に適当なコラゲナーゼの０．５〜３ｍｇ／ｍｌが有効である。有効な濃度は、消化の温度、ｐＨおよび程度をはじめとする消化の条件による。上記の量は、これらの変数の最適化を想定している。特定の場合に有効であるのに必要とされる「コラゲナーゼ」の量の確認は、別のプロテアーゼ酵素標品の有効レベルの決定と同様、当業者が容易に実施できるものである。
【００２５】
本発明おける生理的媒体とは、生体組織に適合し得る適切なイオン強度およびｐＨを有する緩衝溶液のことをいう。この媒体は、抗生物質、栄養物（例えば、胎児ウシ血清（ＦＢＳ））等の補完物を含有していてもよい。この種の代表的媒体は、ハンク溶液（Ｈａｎｋ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リンゲル溶液、ＬＡＰ−１溶液、ＵＷ溶液等が挙げられる。ｐＨおよびイオン強度条件は、消化または灌流の対象となる生物由来材料に調和するように正確に調節することができる。
【００２６】
本発明の方法および装置は、いずれの生物由来材料に対しても適用可能であるが、とりわけ膵臓からのランゲルハンス島を分離するのに有効である。
本発明の方法は、膨張させた生物由来材料の清化および担体媒体による生物由来材料の灌流によるランゲルハンス島の除去を包含する。ランゲルハンス島の分離精製は次いで、ＣＯＢＥ２９１１（米国、Ｇａｍｂｒｏ社製）等のような自動比重遠心分離機を用いて実施してもよい。
【００２７】
本発明は、１つの局面において、脊椎動物の臓器から必要細胞または組織を得る方法であって、部分的に消化した臓器の生理的媒体による連続的移動により目的とする細胞を回収する方法に関する。
本発明の方法においては、担体媒体による臓器の消化のプロセスを早めるために、１５−３８℃の高められた温度で行い、臓器を通過した後のすべてのプロセス面において、コラゲナーゼを不活性化し細胞を保存するために担体媒体を冷却する。回収においては、細胞を低温に維持した回収器に通す。
【００２８】
細胞が検出中に現れるのにいくらかの時間を要するので、媒体は、最初高められた温度にしておき、臓器を通して少量ずつ連続的に流入される。細胞が出口スクリーンを通して出現し、臓器の消化が最適になった時点で、低温にした新たな媒体を連続的に供給し、目的とする細胞、組織を含む流出液を回収する。このとき、今、分解している臓器もこのプロセス段階では０〜１４℃の低温に維持する。
【００２９】
消化プロセス中、消化を早めるためおよび短時間で全工程を処理が行えるようにするために、消化チャンバーを撹拌する必要がある。撹拌の様式については限定はないが、チャンバーが上下に振幅し、かつ、上下方向の振幅軸を中心にして、左右回転しながら撹拌できるようにすることが好ましい。この撹拌方法によって、チャンバー中の撹拌向上物体は、より効率的にチャンバー内の媒体の混合および目的とする細胞クラスターの放出を促進することができる。
【００３０】
消化プロセス中、消化の状態を容易に確認できるようにするためには、消化チャンバーは透明な素材でできていることが好ましく、取り扱い性や加工性を考慮するとプラスチック製であることが好ましい。
膵島移植の臨床を行うために、ビー玉のような撹拌素子を消化チャンバー内にいれ、臓器を消化したり、使用後、オートクレーブ滅菌して繰り返し使用するためには、消化チャンバーは、ある程度の耐衝撃性および耐熱性が必要である。これらの条件を満たす素材としては、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリフェニレンオキシド、グリプタル樹脂等が挙げられ、好ましくはポリカーボネートである。
【００３１】
一方、繰り返し使用せずに、臨床の際や実験毎に使い捨てにするためには、安価、かつ、加工性に優れたプラスチックで作製された消化チャンバーが必要である。具体的には、ポリメチルメタクリレート、塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、アクリロニトリル−スチレン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体、ポリクロルフルオロエチレン等の素材が挙げられる。好ましくは、ポリメチルメタクリレート、塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンである。
【００３２】
次に、本発明の方法に用いられる装置について説明する。本発明の装置は、（ａ）生理的媒体供給部、（ｂ）回路加熱部、（ｃ）回路冷却部、（ｄ）消化チャンバー部および（ｅ）細胞回収部を備え、（ｄ）消化チャンバー部は、撹拌手段、入り口部および出口部を有し、消化チャンバーの入り口部は、（ｂ）回路加熱部と（ｃ）回路冷却部に接続し、（ｂ）回路加熱部と（ｃ）回路冷却部は、切り替え可能な回路を介して（ａ）生理的媒体供給部と接続しており、消化チャンバーは、消化チャンバー内の溶液中の粒子径を調節するスクリーンを介して（ｅ）細胞回収部に接続されている。
【００３３】
スクリーンは、チャンバーを出る粒子のサイズを調節するものであり、細胞の流出および生物由来材料の保持を可能にする最も好都合な濾過手段である。しかしながら、流出する細胞のサイズ区別が必要とされない場合、単にチャンバー内に生物由来材料を保持するために用いることができる。
チャンバー内の望ましい消化温度を維持できるようにするための温度監視手段を有することが好ましい。チャンバーに温度センサーを設けたり、外部からチャンバーの表面温度を測定できるようにしておくことができる。
【００３４】
本発明の装置は、膵臓組織からのランゲルハンス島の調製に特に適するが、その他、肝臓からの肝細胞、皮膚からの脂肪細胞、脾臓からの脾細胞等や各種臓器や生物由来材料からの幹細胞の調製等にも適用できる。本発明は、いずれの脊椎動物種の生物由来材料にも適用可能であるが、特に、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ等に適している。
灌流は、生物由来材料からの目的とする細胞集団の放出を監視できるような方法で行う。細胞の放出の向上のため、生物由来材料含有チャンバーの撹拌をこのプロセス中行い、撹拌の効果は、チャンバー中にビー玉等を入れることによって高められる。撹拌は、チャンバーが設置された震盪機の上下の振幅運動のスピードを変えることによって、上下の振幅運動の軸に対して左右回転する運動も連動しており、撹拌の程度をコントロールすることができる。
【００３５】
本発明の装置の例を図面より説明する。図１は、本発明の装置の平面図、図２は、その側面図の例である。装置本体（１）には、生理的媒体用容器（２）、可変ポンプ（３）、冷却用ステンレス容器（５）に収納された冷却用ラジエーター（４）、加熱用ステンレス容器（７）に収納された加熱用ラジエーター（６）と投げ込み恒温装置（８）、消化用チャンバー（１０）、消化用チャンバーに接続された回路（シリコンチューブ（１２））を受けるチューブ受け（１３）が設置されている。
【００３６】
消化用チャンバー（１０）は、当面の全生物由来材料を入れるに適当な寸法のチャンバーであればよい。それはまた振とう機等の撹拌装置上にチャンバーをおいたときに媒体の撹拌を助けるビー玉または他の撹拌向上手段（１０１）を含む。第２図に示すように、チャンバー（１０）は、２つの入り口（Ａ）および（Ｂ）を有しており、この入り口を通じて灌流媒体がチャンバー中に入ることができる。入り口の数は任意であるが、運転のしやすさを考慮すると１つまたは２つであることが好ましい。
【００３７】
生物由来材料を含有する消化用チャンバー（１０）は、特定型膵細胞を単離するのに適した孔径を有するスクリーン（１１）を備えている。膵臓からのランゲルハンス島の単離のための代表的孔径は種に依存し、マウスランゲルハンス島では２３０μｍ、ヒトランゲルハンス島では２８０μｍである。スクリーン（１１）は、チャンバー（１０）の出口側の媒体流出部の手前に設置されてある。スクリーンは、チャンバーを２つの部分に分離し、スクリーンを切り換え、上部および下部チャンバーのねじ部（１０２）によってチャンバーを再密閉することにより交換できる。消化用チャンバー（１０）には、温度の監視を可能にする熱伝対手段（１０３）が備えられている。
【００３８】
消化を行う場合には、生物由来材料をチャンバー（１０）に入れ、チャンバーを追加のプロテアーゼ含有の生理的適合媒体で満たす。適当な媒体はハンク溶液、リンゲル溶液等を包含する。生物由来材料に適した孔径のスクリーンをチャンバーに入れ、チャンバーを密閉する。密閉された消化チャンバーを灌流媒体が流入する入り口部と出口部で接続する。媒体の供給は、当初、媒体供給容器（２）で設定され、媒体供給容器（２）には全系に供給するに十分な媒体が加えられる。この媒体は、ポンプ（３）で、回路加熱部（ｂ）（加熱系回路（６））から消化チャンバー（１０）に供給される。温度は、温度センサー（９）または外部の表面温度測定計で監視し、チャンバー内温度が１５〜３８℃、好ましくは約３７℃になるようにする。
【００３９】
消化が進み、ランゲルハンス島細胞を回収容器中で確認できるようになった時点で、新たな生理的適合性媒体を、回路冷却部（ｃ）（冷却系回路（４））を通じて消化チャンバー（１０）に供給される。温度は温度センサー（９）または外部の表面温度測定計で監視し、チャンバー内温度が０〜１４℃、好ましくは約４℃になるようにする。
チャンバー出口から流出してくる特定型群細胞を含んだ媒体は、回収容器（１４）に流入し、約０〜４℃で冷却され回収保存される。
【００４０】
消化プロセス中、消化を早めるため、また短時間で全工程を処理が行えるようにするために、チャンバーを撹拌する必要がある。撹拌の様式は、チャンバーが上下に振幅し、かつ、上下方向の振幅軸を中心にして、左右回転しながら撹拌できるようにすることが好ましい。この撹拌方法によってチャンバー中の撹拌向上物体は、より効率的にチャンバー内の媒体の混合および目的とする細胞クラスターの放出を促進することができる。
【００４１】
出口媒体中の細胞の存在を検出できる手段が出口側回路のサンプリング部（１５）に備えられていてもよい。これにより、流出液中における目的細胞の存在の監視を行うことができる。細胞は顕微鏡で直接見ることができる。ランゲルハンス島の場合、ジチゾン（ｄｉｔｈｉｚｏｎｅ）で染色することによって確認できる。
目的細胞が検出された後の本発明方法の最後の工程は、分解中の生物由来材料を通して流した新鮮媒体による細胞の回収である。プロテアーゼを含有する必要のない新たな生理的媒体の温度は０〜１５℃の範囲である。細胞の大半を洗い出すのに十分な低温媒体が用いられ、流出液および／またはさらに精製した流出液から遠心分離等の適当な手段によって細胞クラスターを回収することができる。
【００４２】
目的とする細胞が出口媒体中で検出されると、最終回収工程を開始する。回路加熱部（ｂ）（加熱系回路（６））を通じての消化チャンバーへの生理的媒体流入を停止し、灌流回路を回路加熱部（ｂ）（加熱系回路（６））から回路冷却部（ｃ）（冷却系回路（４））に切り替え、再び消化チャンバー内へ流入させる。これは、回路冷却部（ｃ）（冷却系回路（４））を通じて流入させる媒体が低温であることによって、プロテアーゼによる過消化を防ぐために役立つ。
具体的には、新たな生理的媒体を供給容器（２）からバルブ（６０）によって加熱回路をバイパスして供給し、消化チャンバー（１０）を通し、回収容器（１４）に流出させる。このとき、何回かのフラスコの取り換えを行ってもよい。回収はチャンバーから細胞がもはや流出しなくなるまで続ける。本方法における、各部分の時間は、生物由来材料の性質および量、消化および回収で用いられる特定条件によって変化する。しかしながら、代表的な時間は１０〜３０分程度である。
【００４３】
細胞を回収した後、これをいずれかの常套手段によってさらに精製することができる。１つの好ましい手段は、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）やパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）による勾配遠心分離である。単離される特定の細胞に適したほかの精製方法ももちろん用いることができる。しかしながら、ランゲルハンス島について、重要で、有効な精製方法はフィコール遠心分離である。
この方法を行うため、回収フラスコからの細胞懸濁液にフィコール勾配を与え、遠心分離してランゲルハンス島細胞を含有する精製画分を回収する。
【００４４】
上記方法によると９０％以上、好ましくは９５％以上の純度でランゲルハンス島を調製できる。ヒトの膵臓から得られるランゲルハンス島は、当然のことながら、適当な免疫抑制剤を用いることによって、そのまま膵島移植に使用できる。また、後で使用するために、適当な材料中に封入することによって保存できる。このようなカプセル化により免疫応答が抑制され、その結果、異種移植への使用も可能となる。例えばブタ等のランゲルハンス島をヒトに移植することができる。
【００４５】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００４６】
【実施例１】
消化装置の製作
図１および図２に示す消化装置を製作した。図１は装置の平面図、図２は、その側面図である。装置の構成要素およびその仕様を表１に示す。
【００４７】
【実施例２】
雑種成犬を用いた膵島分離実験。
雑種成犬（５頭）から膵臓を摘出し、実施例１で作製した装置を用いてランゲルハンス島の分離を行った。
具体的には、雑種成犬を麻酔下に開腹し、膵臓摘出後、直ちに氷冷し、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ緩衝液）にコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、ｔｙｐｅ　Ｓ−１）を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した液１００ｍｌを膵管に挿入したカニューレによりゆっくりと注入した。その後、生理的媒体流入口および流出口にシリコン製チューブを接続した消化チャンバーに上記の膵臓とビー球（直径２ｃｍ）７個を入れた。さらにコラゲナーゼ溶液１００ｍｌと３７℃のＥｕｒｏ　Ｃｏｌｌｉｎｓ溶液を加え、スクリーン（ステンレス製メッシュ、孔径：０．８５ｍｍ）を取り付け、チャンバーの蓋を閉めて、震盪機にセットした。
【００４８】
その後、ＨＢＳＳ溶液（１〜１．５Ｌ）を満たした生理的媒体供給容器からポンプを介して３７℃に加熱した加熱回路（加熱ラジエーター）をゆっくりと通過させ、消化チャンバー内に流入させながら、チャンバーを上下に振幅し、かつ、上下方向の振幅軸を中心にして、左右回転させながら撹拌した。流出口から出てくる細胞群を含む溶液を、氷で冷却された２５０ｍｌ容の遠沈管（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収した。その際、回収液が遠沈管の容量を越える前に新たな遠沈管を用意した。また、経時的にその少量をとり、Ｄｉｔｈｉｚｏｎｅ溶液によって染色し、分離ランゲルハンス島細胞の状態を顕微鏡で観察した。
【００４９】
Ｄｉｔｈｉｚｏｎｅ染色によって、ランゲルハンス島が確認された後、生理的媒体としてＥｕｒｏ　Ｃｏｌｌｉｎｓ溶液を生理的媒体供給容器に満たし、さらに、加熱系回路（加熱ラジエーター）から氷で冷却された冷却系回路（冷却ラジエーター）に媒体が流れるように、バルブを切り替えた。
その後、Ｅｕｒｏ　Ｃｏｌｌｉｎｓ溶液（１〜１．５Ｌ）を満たした生理的媒体供給容器からポンプを介して氷で冷却された冷却回路（冷却ラジエーター）をゆっくりと通過させ、消化チャンバー内に流入させながら、チャンバーを上下に振幅し、かつ、上下方向の振幅軸を中心にして、左右回転させながら撹拌した。流出口から出てくる細胞群を含む溶液は、氷で冷やされたＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　（米国、Ｓｉｇｍａ社製）５ｍｌを添加した２５０ｍｌ容の遠沈管（米国、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収した。その際、回収液が遠沈管の容量を越える前に新たな遠沈管を用意した。
【００５０】
その後、回収した溶液に含まれる細胞群は、Ｅｕｒｏ　Ｃｏｌｌｉｎｓ溶液で２００×ｇ、４℃にて３回遠心洗浄をした。そうして得られた細胞群は、比重ｄが、ｄ＝１．１０８のＤｅｘｔｒａｎ　Ｔ７０またはＦｉｃｏｌの溶液２００ｍｌに懸濁させ、ｄ＝１．１０８、ｄ＝１．０９４、ｄ＝１．０８１であるところのＤｅｘｔｒａｎ　Ｔ７０の溶液とＥｕｒｏ　Ｃｏｌｌｉｎｓ溶液を順に重層するか、ｄ＝１．１０８、ｄ＝１．０９４、ｄ＝１．０８１であるところのＦｉｃｏｌ溶液とＥｕｒｏ　Ｃｏｌｌｉｎｓ溶液を順に重層し、ｃｅｌｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、ＣＯＢＥ　２９９１（米国、Ｇａｍｂｒｏ社製）を用いて遠心分離し、比重ｄ＝１．１０８とｄ＝１．０９４の界面に集まる細胞集団（ランゲルハンス島）を回収した。
【００５１】
回収されたランゲルハンス島を２５ｍｌのＥｕｒｏ　Ｃｏｌｌｉｎｓ溶液に懸濁させた。そのうちの０．１ｍｌをとり、ｄｉｔｈｉｚｏｎｅによって染色し、５０μｍ以上のものをランゲルハンス島の数として２回カウントした。同時に、純度も位相差顕微鏡にて見積もった。その結果を表２に示す。その膵島細胞収量は１３７，７１５±１４，６７７ＩＥＱ（７２，８５０±２，６６６ｉｓｌｅｔｓ）、６，２６０±６６７ＩＥＱ／ｇ膵、純度＞９５％（ｎ＝５）であった。
その後、回収したランゲルハンス島は、１００ｍｇ／ｄｌのグルコースと１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で、３回遠心洗浄した。これらのランゲルハンス島を１０ｍｌの同じ培地中で３７℃，５％ＣＯ２、９５％Ａｉｒの条件下で培養した。
【００５２】
２日間培養後、ｓｔａｔｉｃ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔを実施した。すなわち、５０個のランゲルハンス島を、３．３ｍＭのグルコース存在下で３７℃、１時間培養し、その後、３．３ｍＭのグルコースで刺激した際に産出されるインスリン濃度を測定した。さらに、その後、１６．７ｍＭのグルコースで刺激し、３７℃、１時間培養後の産出されたインスリン濃度を測定した。インスリン濃度の測定は、酵素免疫測定キット（Ｇｌａｚｙｍｅ、Ｓａｎｙｏ社製）を用いて行った。その結果を表３に示す。低グルコース（３．３ｍＭ）刺激によるインスリン分泌１０２．６±３２．８μＵ／ｍｌから高グルコース（１６．７ｍＭ）刺激によるインスリン分泌２３３．４±４０．６８μＵ／ｍｌへと約２．３倍へ上昇した（ｎ＝４）。
以上のことから、実施例２の方法は、膵臓から、短時間で、容易、効率的、かつ、細胞の機能を障害することなくランゲルハンス島を分離できることが確認された。
【００５３】
【表１】
2004033006.tif 000003
【００５４】
【表２】
2004033006.tif 000004
【００５５】
【表３】
2004033006.tif 000005
【００５６】
【発明の効果】
本発明は、生物由来材料の特定型の細胞群を分離、とりわけ、膵臓器からのランゲルハンス島を分離する方法およびその装置であって、本発明によると、短時間、かつ、容易に膵臓器を消化し、ランゲルハンス島を分離回収処理することができる。
さらに、本発明のよると、ランゲルハンス島を消化する際のチャンバーとして、臨床試験等、繰り返して使用する場合や、使い捨て使用の場合の最適なチャンバーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の生物由来材料の消化・細胞回収装置の一例の平面図。
【図２】図１の生物由来材料の消化・細胞回収装置の平面図。
【図１】
2004033006.tif 000006
【図２】
2004033006.tif 000007