(57)【要約】【課題】双翅目昆虫を特異的に殺虫する活性を有するタンパク質顆粒を産生する細菌を提供する。【解決手段】本発明の課題はバチラスサリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＭＭ−１９Ｃ１０株又はバチラスサリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＭＭ−５０Ｇ２株によって解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチラスサリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＭＭ−１９Ｃ１０株
【請求項２】
バチラスサリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＭＭ−５０Ｇ２株
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なバチラスサリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）株に関し、詳しくは双翅目昆虫に特異的な殺虫活性を有する結晶性タンパク質顆粒（クリスタル）を産生する、新規なバチラスサリンジエンシス株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
地球温暖化及び都市温室効果による気温上昇に伴い、ハエやカ等の衛生害虫の生育域は年々拡大している。その結果、これまで熱帯特有とされていたマラリヤのようなカを媒介とする病気の発生地域も温帯まで広がり、近い将来世界的に深刻な被害をもたらすことが危惧される。このため双翅目昆虫をはじめとする衛生害虫の効果的な駆除方法の確立を急ぐ必要がある。
害虫の駆除には化学農薬が安価であり即効性も高いことから多用されてきたが他の生物や人類の生活環境への二次的、三次的影響が問題となっている。これに対し細菌、例えば　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　を用いた害虫の駆除は、標的昆虫に対する選択性が高くヒトや家畜への害や農作物の生育への影響は認められず、更に残留性が低いことから微生物農薬としての積極的な利用が世界的に注目されている。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　は土壌中に広く生息するグラム陽性菌で、胞子形成期にクリスタルと呼ばれる結晶性の殺虫タンパク質（Ｃｒｙタンパク質）を含む顆粒を菌体内に産生する。Ｃｒｙタンパク質の殺虫活性はその種類によって異なり、例えばＣｒｙ１は鱗翅目（アオムシ、ケムシ等）、Ｃｒｙ４は双翅目（ボウフラ、ウジ虫）というように高い殺虫特異性を示す。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの亜種　ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ　は、双翅目昆虫特異的な殺虫活性を持ち、カの駆除を目的として実用化されている唯一の菌である。しかし１種類のＢｔの長期間にわたる使用は耐性昆虫の出現を促すことがこれまでの例から知られており、Ｂｔｉに対する耐性昆虫の出現も時間の問題であると考えられている。従って、Ｂｔｉに代わる双翅目昆虫特異的な殺虫活性を有する細菌を見出すことが必要である。また、さらに殺虫活性の高いタンパク質に対する必要もある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者は鋭意研究を行なった。その結果、殺虫性のタンパク質を産性する新規細菌２株を活性汚泥より発見した。これらの細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに属し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＭＭ−１９Ｃ１０及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＭＭ−５０Ｇ２とそれぞれ命名した。
【０００５】
本発明の細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＭＭ−１９Ｃ１０及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＭＭ−５０Ｇ２はそれぞれ以下のような特性を有する。
【表１】
2004000064.tif 000002
2004000064.tif 000003
2004000064.tif 000004
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【０００６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＭＭ−１９Ｃ１０及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＭＭ−５０Ｇ２は共に、胞子形成期に菌体内にクリスタルと呼ばれる結晶性殺虫タンパク質顆粒を形成する。それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８５６及びＦＥＲＭ　Ｐ−１８８５７として独立行政法人産業技術総合研究所に寄託した。
【０００７】
【実施例】
実施例１
活性汚泥からクリスタル形成菌の分離
長野県上伊那郡南箕輪町し尿処理施設から採取した活性汚泥を滅菌水で２０００倍に希釈した。この希釈液を６０℃、１０分間加熱処理して胞子のみとした後、ＬＢ寒天培地に広げて３０℃、４８時間培養した。生じたコロニーを一つずつ顕微鏡観察して、菌体内に胞子とともにクリスタルを形成していることが確認できた菌株を分離した
【０００８】
実施例２
クリスタル形成菌の双翅目昆虫に対する殺虫検定
クリスタルの殺双翅目昆虫活性を評価するため、分離した菌を死滅期（菌体は溶菌し、培養液には胞子、クリスタル、細胞残渣が残る）まで培養してボウフラに供試した。
分離したクリスタル形成菌株をそれぞれＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で９６〜１２０時間振とう培養した。顕微鏡観察によりクリスタル形成を確認した後、培養液を遠心分離して沈殿物（胞子、クリスタル、細胞残渣を含む）を回収した。これを滅菌水で適宜希釈し、アカイエカ３齢幼虫１６匹に与えた。そのまま２５℃におき、２４時間後の死虫数がコントロール（絶食状態で２４時間おいたもの）と比べて有意に多いものを選抜した。これにより、ＭＭ−１９Ｃ１０及びＭＭ−５０Ｇ２の２株を得た。
【０００９】
実施例３
ＭＭ−１９Ｃ１０及びＭＭ−５０Ｇ２の菌株同定及び生理性状試験
単離した２菌株の同定及び生理性状試験を行なった。結果は表１に示す。同定及び生理性状試験は（株）エヌシーアイエムビー・ジャパンに委託して行なった。２菌株ともＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　に属することがわかった。
【００１０】
実施例４
ＭＭ−１９Ｃ１０及びＭＭ−５０Ｇ２が産生するクリスタルの殺虫力評価
（ｉ）クリスタルの精製
ＭＭ−１９Ｃ１０及びＭＭ−５０Ｇ２をＬＢ液体培地で３０℃、１２０時間振とう培養した。顕微鏡観察で溶菌及びクリスタル形成を確認した後、培養液を遠心分離（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＪＬ−１６．２５０ローター、６０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して沈殿物を回収した。これに氷冷滅菌水１０ｍｌを加え、ソニケーション２分間により懸濁した。懸濁液を遠心分離（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＪＡ−１７ローター、８０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して沈殿物を回収し、氷冷滅菌水２０ｍｌに再懸濁した。この氷冷滅菌水による洗浄操作を計４回行ない、最後に沈殿物を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌに懸濁した。
超遠心用チューブ（３０ｍｌ容）に、７９％シュークロース／１０ｍＭ　ＫＣｌ／５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌ、７２％シュークロース／１０ｍＭ　ＫＣｌ／５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）９ｍｌ、６７％シュークロース／１０ｍＭ　ＫＣｌ／５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）７ｍｌを順に重層し、さらにクリスタル懸濁液２ｍｌを重層した。超遠心分離（ＢＥＣＫＭＡＮ　　ＲＰＳ−２５ローター、２３５００ｒｐｍ、４℃、１４時間）により、７２−７９％シュークロース界面に現れたクリスタルのバンドを回収した。これに５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）２０ｍｌを加えて懸濁し、遠心分離（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＪＡ−１７ローター、８０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して沈殿物を回収した。この洗浄操作を４回行なった後、沈殿物を０．５ｍｌの滅菌水に懸濁して精製クリスタル標品とした。
【００１１】
（ｉｉ）クリスタル標品の濃度検定
精製クリスタルにＮａ２ＣＯ３（終濃度５０ｍＭ）とＤＴＴ（ジチオスレイトール）（終濃度１０ｍＭ）を加え、３７℃で３０分間可溶化処理を行なった。可溶化クリスタルを適宜希釈し、Ｄｙｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ＢｉｏＲａｄ社製，　Ｂｒａｄ　Ｆｏｒｄ法，ＢＳＡを標準タンパク質として検量線を作成）を用いて濃度検定を行なった。その結果、精製クリスタル標品のタンパク質濃度はＭＭ−１９Ｃ１０　４２．１ｍｇ／ｍｌ、ＭＭ−５０Ｇ２　９８．５ｍｇ／ｍｌであった。
【００１２】
（ｉｉｉ）殺ボウフラ活性検定（ＬＣ５０）
アカイエカ３齢幼虫を１００μｌの水と共に９６穴マイクロタイタープレートに一匹ずつ分注し、そのまま２５℃、３時間静置して絶食状態にした。精製クリスタル標品の２倍希釈系列を作成し、それぞれの濃度のものを１００μｌずつ１６匹（１６ウェル）に与えた。２５℃で２４時間静置した後、死虫数をカウントした（表２）。各タンパク質濃度における死虫数を基に近似直線を算出し、５０％のボウフラが死ぬ濃度（ＬＣ５０）を求めた。その結果、精製クリスタル標品のＬＣ５０は、ＭＭ−１９Ｃ１０　０．８３μｇ／ｍｌ、ＭＭ−５０Ｇ２　１．２９μｇ／ｍｌであった。
【表２】
2004000064.tif 000006