(57)【要約】【課題】基板表面への官能基の導入量を簡便に求める方法を提供すること。特に、予め基板表面にアミノ基を導入しておき、これを介してアルデヒド基を導入した際のアルデヒド基導入量を求める検査方法を提供すること。【解決手段】アルデヒド基導入工程前後における基板表面の蛍光発生量を比較することにより、アルデヒド基導入の有無を判定し、導入量を定量化し、さらに、アルデヒド基導入後の基板に還元剤処理を施した際の蛍光発生量の変化によってアルデヒド基導入の有無を判定する基板検査方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に官能基を導入した固相基板の官能基導入量の検査方法であって、基板表面から発する蛍光量を測定することによって官能基導入量を確認することを特徴とする基板検査方法。
【請求項２】
検査対象となる官能基の導入により、基板表面から発する蛍光量が増大する請求項１記載の基板検査方法。
【請求項３】
検査対象となる官能基を不活化し、基板の表面から発する蛍光量を減少させ、蛍光の減少量により官能基の導入量を確認する請求項２記載の基板検査方法。
【請求項４】
官能基の不活化が、還元処理又は酸化処理により行なわれる請求項３記載の基板検査方法。
【請求項５】
検査対象となる官能基がアルデヒド基であり、該アルデヒド基の導入が、アミノアルキルシラン処理とそれに引き続く多官能性アルデヒド処理により行なわれている請求項１〜４いずれか記載の基板検査方法。
【請求項６】
官能基の不活化が、還元処理である請求項５記載の基板検査方法。
【請求項７】
還元処理が金属水素化物によって行なわれる請求項６記載の基板検査方法。
【請求項８】
金属水素化物が水素化ホウ素ナトリウムである請求項７記載の基板検査方法。
【請求項９】
アミノアルキルシランがγ−アミノプロピルトリメトキシシランであり、多官能性アルデヒドがグルタルアルデヒドである請求項５〜８いずれか記載の基板検査方法。
【請求項１０】
固相基板がプラスチック製である請求項１〜９いずれか記載の基板検査方法。
【請求項１１】
プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである請求項１０記載の基板検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面に官能基を導入した固相基板の検査方法に関する。特に、予め導入したアミノ基を介してアルデヒド基を導入する場合の、アルデヒド基導入の有無および導入量を求める方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生理活性物質を基板上に固定したデバイスであるマイクロアレイの使用が一般化しつつある中、安定した品質のマイクロアレイ用基板が求められている。マイクロアレイ用基板はガラスもしくはプラスチック製であることが多いが、通常これらの材料表面は化学的に不活性であることから、生理活性物質を固定化するためには表面修飾を施す必要がある。表面修飾としては、アルデヒド基、アミノ基などの活性な官能基を導入する場合が多い。特にアルデヒド基を導入した基板は、生理活性物質に含まれるアミノ基との間に共有結合を形成し、強固な固定化が可能であることから広く用いられている。（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３）
【０００３】
ガラスやプラスチックなどの不活性な表面に直接アルデヒド基を導入することは比較的困難であるため、まずアミノ基を導入しておき、そのアミノ基を介してアルデヒド基を導入する方法が一般的である。アミノ基を導入する方法として、アミノ基含有シランカップリング剤による表面コーティングがある。この方法では、浸漬、洗浄、熱処理という比較的簡便な工程で表面に官能基を導入することが可能であることから多用されている。
上記のようにアミノ基を導入した表面に、多官能性のアルデヒドを反応させると、アミノ基とアルデヒド基が結合することにより、表面にアルデヒド基が導入される。
基板表面にアルデヒド基が確実に導入されていることの確認は、マイクロアレイ用基板の品質管理の観点から重要である。表面のアルデヒド基の存在は、ＥＳＣＡによる表面分析や、アルデヒドとの結合性を有する試薬等の使用により確認できるが、これらの方法は煩雑な作業を必要とするため、簡便な検査法が求められていた。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１７６９９１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１８１７号公報
【特許文献３】特表２００２−５３２６９９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、基板表面へのアルデヒド基の導入量を求めるための簡便な検査方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）表面に官能基を導入した固相基板の官能基導入量の検査方法であって、基板表面から発する蛍光量を測定することによって官能基導入量を確認することを特徴とする基板検査方法、
（２）検査対象となる官能基の導入により、基板表面から発する蛍光量が増大する（１）記載の基板検査方法、
（３）検査対象となる官能基を不活化し、基板の表面から発する蛍光量を減少させ、蛍光の減少量により官能基の導入量を確認する（２）記載の基板検査方法、
（４）官能基の不活化が、還元処理又は酸化処理により行なわれる（３）記載の基板検査方法、
（５）検査対象となる官能基がアルデヒド基であり、該アルデヒド基の導入が、アミノアルキルシラン処理とそれに引き続く多官能性アルデヒド処理により行なわれている（１）〜（４）いずれか記載の基板検査方法、
（６）官能基の不活化が、還元処理である（５）記載の基板検査方法、
（７）還元処理が金属水素化物によって行なわれる（６）記載の基板検査方法、
（８）金属水素化物が水素化ホウ素ナトリウムである（７）記載の基板検査方法、
（９）アミノアルキルシランがγ−アミノプロピルトリメトキシシランであり、多官能性アルデヒドがグルタルアルデヒドである（５）〜（８）いずれか記載の基板検査方法、
（１０）固相基板がプラスチック製である（１）〜（９）記載の基板検査方法、
（１１）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（１０）記載の基板検査方法、
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の基板検査方法は、主として基板表面へのアルデヒド基の導入が確実に行われたことを確認し、アルデヒド基の導入量を求めるための手段である。
基板表面へのアルデヒド基の導入方法として好適に用いられるのは、アミノ基導入の後に多官能性アルデヒドを反応させる方法である。アミノ基の導入手段としては、アミノアルキルシランによる処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティングなどが挙げられるが、処理の簡便性、均一性の観点から、アミノアルキルシランによる処理が一般的である。多官能性アルデヒドとしてはグルタルアルデヒドが多用されている。
【０００８】
アミノアルキルシラン処理により基板表面にアミノ基を導入した後、グルタルアルデヒド処理を施すと、アミノ基とアルデヒド基が反応してシッフ塩基（一般式  Ｒ−ＣＨ＝Ｎ−Ｒ’）が生じる。シッフ塩基はπ電子結合を含むため、グルタルアルデヒド処理後の基板表面は蛍光を発し易い状態にあると推測された。実際に、アミノアルキルシラン処理後の基板と、グルタルアルデヒド処理後の基板の蛍光発生量（励起波長６４０ｎｍ、蛍光波長６６６ｎｍ）を比較したところ、グルタルアルデヒド処理後の基板で蛍光発生量が大幅に増大していた。また、アミノアルキルシラン溶液とグルタルアルデヒド溶液を混合した際に生成する沈殿物が著しい蛍光性を示した。これらの結果から、アミノ基とアルデヒド基の反応が蛍光発生量を増大させることが明らかとなった。したがって、基板表面の蛍光発生量の変化を追跡することにより、基板へのアルデヒド基導入の状態を調べることが可能である。すなわち、アルデヒド基導入工程の前後において基板表面の蛍光発生量を測定し、工程後の蛍光発生量の方が高ければアルデヒド基導入が確実に行われたことを確認できる。さらに、別途手段によりアルデヒド基の導入量を定量し、蛍光発生量との相関を調べることにより、蛍光発生量の測定によるアルデヒド基の定量が可能となる。
【０００９】
アミノ基とアルデヒド基の反応によって生じるシッフ塩基は、金属水素化物などの還元剤によって還元され、アミン結合（一般式  Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ’）に変換されることが知られている。このとき、シッフ塩基には存在したπ電子結合が消失するため、蛍光を発しにくい構造となる。したがって、還元処理前後の蛍光発生量を比較し、還元処理後の蛍光発生量の方が高ければ、シッフ塩基が存在していたことが定性的に確認可能であり、ひいてはアルデヒド基導入の有無を確認可能である。還元剤としては金属水素化物を好ましく用いることができ、より好ましくは水素化ホウ素ナトリウムである。溶媒中に水素化ホウ素ナトリウムを溶解した溶液中に基板を所定時間浸漬することにより還元反応を進めることができる。水素化ホウ素ナトリウムの濃度は好ましくは０．０１〜２重量パーセント、より好ましくは０．０１〜１重量パーセント、最も好ましくは０．１〜０．５重量パーセントである。溶媒は緩衝液、純水等を用いることができるが、アルコールなどの有機溶媒を含んでも良い。好ましく用いられる水性溶媒は、液性が中性付近のリン酸緩衝溶液とエタノールの混合溶媒である。
【００１０】
以上の過程をまとめると、基板表面のアミノ化（工程１）、グルタルアルデヒド処理（工程２）、還元処理（工程３）を工程１、２、３の順に行う際に、工程２後における基板表面の蛍光発生量の増大、および、工程３後における蛍光発生量の減少を確認することで、アミノ基を介したアルデヒド基の導入を確認する。
【００１１】
基板表面の蛍光量を測定する方法としては、蛍光顕微鏡やマイクロアレイスキャナーなどに代表される、励起光発生装置、蛍光検出装置、光学フィルター等を組み合わせた測定装置を用いることができる。定量的な解析のためには、蛍光量を数値化する必要がある。すなわち、別途手段で求めたアルデヒド基の導入量から検量線を作成することにより、蛍光量よりアルデヒド基の導入量を算出することが可能となる。
【００１２】
蛍光量測定の際の励起光波長は、好ましくは４００〜７００ｎｍ、より好ましくは５００〜７００ｎｍ、さらに好ましくは６００〜７００ｎｍである。発生する蛍光の波長は、ストークス・シフトのため励起光波長よりも長波長側に現れる。励起光波長が４００ｎｍ以下の場合、基板の素材自体からの蛍光発生量が大きくなることが多く、表面の官能基導入状態を調べる目的には不適当である。
【００１３】
マイクロアレイ用基板の素材としては、一般的にガラス、プラスチック、金属などが用いられている。本発明の検査方法は表面の蛍光量を測定するため、素材の種類によらず適用可能であるが、基板の素材自体の蛍光発生量が過大であると表面の官能基に由来する蛍光の検出が困難となるため、低蛍光性の素材であることが好ましい。ガラスや金属は一般的に蛍光性が低く、これらの素材からなる基板に対しては本発明の検査方法は好適に利用可能である。素材がプラスチックの場合には、低蛍光性プラスチックであることが好ましい。低蛍光性プラスチックとしては飽和環状ポリオレフィンが好ましい。飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。素材がプラスチックの場合、他の素材と比較してアルデヒド基の導入量が多くなるため、本発明の検査方法が特に有効である。
【００１４】
【実施例】
工程１；基板をアミノ基含有シランカップリング剤（信越シリコーン（株）製  ＫＢＭ−９０３）水溶液（２％）に浸漬した。純水でリンス後、熱処理を施すことで基板表面にアミノ基を導入した。
工程２；工程１でアミノ基を導入した基板をグルタルアルデヒド水溶液（１％）に浸漬することで、アミノ基を介してアルデヒド基を導入した。
工程３；ｐＨ７．４のリン酸緩衝液とエタノールを４：１の体積分率で混合した溶液に、０．２５重量パーセントの濃度で水素化ホウ素ナトリウムを溶解した。この溶液にアルデヒド基を導入した基板を浸漬することでアルデヒド基の還元処理を施した。
【００１５】
（実施例１）
市販の顕微鏡用スライドグラスに工程１〜３を施した。工程２の後、および、工程３の後におけるスライドグラス表面の蛍光発生量を測定した。基板表面の蛍光発生量はマイクロアレイスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ＬＩＴＥ，  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて評価した。測定条件は、レーザー出力９０％、検出感度７０％、励起波長６４０ｎｍ、蛍光波長６６６ｎｍであった。
【００１６】
（実施例２）
飽和環状ポリオレフィンを平板状に加工して基板を作製した。基板表面を親水化したのち、工程１〜３を施した。工程２の後、および、工程３の後における基板表面の蛍光発生量を実施例１と同様に測定した。
【００１７】
（比較例１）
表面処理を施さないスライドグラスに工程３を施した。工程３の前後におけるスライドグラス表面の蛍光発生量を実施例１と同様に測定した。
【００１８】
（比較例２）
表面処理を施さない飽和環状ポリオレフィン製基板に工程３を施した。工程３の前後における基板表面の蛍光発生量を実施例１と同様に測定した。
【００１９】
実施例および比較例にて測定した蛍光量を表１に記す。
【００２０】
【表１】
2004286701.tif 000002
【００２１】
【発明の効果】
本発明の基板検査方法により、固相基板表面へのアルデヒド基導入の確認、および、導入量の定量を簡便に行うことが可能となった。