(57)【要約】【課題】メンブレンアッセイ法を用いた検体の検査方法において、検体試料の濾過時に濾過フィルターの目詰まりを発生させることなく、検体試料が被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを問題なく通過できるようにして偽陽性の発生を防止し、特異的且つ高感度に被測定物を検出あるいは定量する方法を提供すること。【解決手段】被測定物を含む検体試料を濾過フィルターを用いて濾過した後に、被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置上に滴下する過程を含む、検体試料中の被測定物の存在を検出または定量するためのメンブレンアッセイ法において、検体試料に界面活性剤を含ませ、界面活性剤を含む検体試料を濾過フィルターで濾過する前に該検体試料を超音波処理する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物を含む検体試料を濾過フィルターを用いて濾過した後に、被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置上に滴下する過程を含む、検体試料中の被測定物の存在を検出または定量するためのメンブレンアッセイ法において、前記検体試料に界面活性剤を含ませ、界面活性剤を含む検体試料を濾過フィルターで濾過する前に該検体試料を超音波処理することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記界面活性剤を含有する検体試料中の界面活性剤の終濃度が０．１〜１０Ｗ／Ｖ％である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記検体試料に界面活性剤を含ませる操作は、前記界面活性剤を含む緩衝液に前記検体試料を添加することにより行う請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記濾過フィルターの孔径が０．１〜１μｍである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記被測定物を捕捉するための捕捉物質が被測定物に対する抗体である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記被測定物の検出又は定量は、エンザイムイムノアッセイ法により行われる請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記被測定物がレジオネラ菌である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体試料中の被測定物を測定するための簡易メンブレンアッセイ法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、抗原抗体反応や酵素反応等を利用した、ウイルスや細菌等の病原体の感染の有無、妊娠の有無などの様々な検査を短時間のうちに行う簡易検査試薬やキットが開発されている。病原体構成成分、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等が検出あるいは定量の対象である。簡易検査試薬の多くは、特別な設備を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有しており、例えば、妊娠診断のための簡易検査試薬は一般薬局で販売されている。また、病原体の感染を検査する簡易検査試薬は、他の検査試薬と異なり、大病院や医療検査センター以外にも一般の病院や診療所で広く使用されている。これらの施設は患者が最初に訪れる医療機関である場合が多く、患者から採取した検体についてその場で感染の有無が判明すれば、早い段階で治療措置を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における重要性は益々高まってきている。
【０００３】
現在、簡易検査方法として、メンブレンアッセイ法、特にニトロセルロース等の膜やフィルター等のメンブレンを用いたアッセイ法が一般に知られており、フロースルー式（特許第２１１４５３１号公報）とラテラルフロー式メンブレンアッセイ法（特許第２８９０３８４号公報）に大別される。前者は被測定物を含む溶液を膜に対して垂直方向に通過させるものであり、後者は水平方向に展開させるものである。いずれの場合も被測定物に特異的に結合するメンブレン固相物質、被測定物、被測定物に特異的に結合する標識物質の複合体をメンブレン上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被測定物の検出あるいは定量を行うという点で共通している。
【０００４】
しかし、このようなメンブレンアッセイ法による簡易検査方法では、採取された検体の試験において、被測定物が検体中に存在しないにも係わらず陽性と判定してしまう、いわゆる偽陽性反応が生じることがある。病原体の感染を検査する際に偽陽性反応が発生すると、疾患に関して誤った情報を与えるため、原因の特定を遅らせるばかりでなく、不適切な措置を講じることになり病状がより重篤になる等の重大な結果をもたらすこともあり得る。従って、偽陽性を抑えることは簡易検査方法の主要な使用目的から見て、極めて重要な課題である。
【０００５】
偽陽性反応は、次のような原因で発生すると推測される。被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置を用いる簡易メンブレンアッセイ法では、被測定物が存在すると予測される部位、例えば患者の咽頭や鼻腔等から拭い液を採取して緩衝液に浮遊したり、被測定物を含む鼻汁、尿、糞便等の分泌物や排泄物から一部を採取して緩衝液に浮遊したり、被測定物を含む環境材料を緩衝液に浮遊したりして、メンブレンアッセイ用の試料を作製するが、この場合、前記試料中に被測定物質の他、検体採取部位から剥落した細胞、分泌物、排泄物の成分、被測定微生物以外のその他の微生物等が混入することがある。このような混入物にはプロテオグルカン、糖脂質等の粘性物質をはじめ、様々な生体成分が含まれているため、前記試料をそのままメンブレン上に添加すると、上記成分の一部あるいは全部がメンブレン上あるいはメンブレン中に付着すると考えられる。特にメンブレンとして孔径または保留粒子径が０．２〜１２μｍのものが使用されることが多いが、この孔径または保留粒子径に匹敵する大きさの成分が添加されると、メンブレン中の細孔を塞ぎ緩衝液中の成分の移動を阻害することが考えられる。このような現象により非特異的な反応が起こり、被測定物が検体中に存在しないにも係わらず陽性と判定してしまう、いわゆる偽陽性反応が起こると考えられる。
【０００６】
偽陽性の発生を解決するために、検体試料をあらかじめ濾過して、メンブレン上に添加するという方法が有効である。濾過により検体試料中の偽陽性原因物質が除去されるので、これらの物質がアッセイ装置のメンブレン上あるいはメンブレン中に付着して、偽陽性を引き起こすのを阻止することができる。試料濾過フィルターの孔径または保留粒子径はメンブレンの孔径または保留粒子径より小さいものにすることが必要であり、０．１〜５μｍのフィルターを用いる場合が多い。ところがこの範囲の孔径または保留粒子径のフィルターで濾過する場合、検体試料中の物質がフィルターに目詰まりしてしまい、アッセイ装置のメンブレン上への添加が不可能になってしまうことがある。この問題を解決するための一つの手段は、試料濾過フィルターの構成を工夫することである。孔径または保留粒子径の大きなフィルターから小さなフィルターまでを何枚か重ねた試料濾過フィルターを用いることで、濾過時における検体試料の目詰まりを回避することが可能である。しかし、ここで新たに問題となるのは、被測定物の試料濾過フィルターへの捕捉や吸着である。
【０００７】
例えば、特に被測定物が細菌の場合は、大きさが大で、また形も種々であり、濾過フィルターでの捕捉や吸着が起こりやすく問題となる。
【０００８】
【特許文献１】特許第２１１４５３１号公報
【特許文献２】特許第２８９０３８４号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、メンブレンアッセイ法を用いた検体の検査方法において、検体試料の濾過時に濾過フィルターの目詰まりを発生させることなく、検体試料が被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを問題なく通過できるようにして偽陽性の発生を防止し、特異的且つ高感度に被測定物を検出あるいは定量する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、界面活性剤を含む緩衝液に検体を浮遊させて、界面活性剤の存在下で超音波処理を行ったのち、濾過を行うことにより上記目的を達成することができることを見い出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、被測定物を含む検体試料を濾過フィルターを用いて濾過した後に、被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置上に滴下する過程を含む、検体試料中の被測定物の存在を検出または定量するためのメンブレンアッセイ法において、前記検体試料に界面活性剤を含ませ、界面活性剤を含む検体試料を濾過フィルターで濾過する前に該検体試料を超音波処理することを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の方法は、被測定物を含む検体試料を濾過フィルターを用いて濾過した後に、被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置上に滴下する過程を含む、検体試料中の被測定物の存在を検出または定量するためのメンブレンアッセイ法において、前記検体試料に界面活性剤を含ませ、界面活性剤を含む検体試料を濾過フィルターで濾過する前に該検体試料を超音波処理することを特徴とする。以下、各構成要件について詳細に説明する。
【００１３】
メンブレンアッセイ法
本発明の方法は、検体試料を濾過するための濾過フィルターおよび検体試料中の被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置を用いる、検体試料中の被測定物のメンブレンアッセイ法であって、界面活性剤を含む緩衝液に検体を浮遊させた検体試料を超音波処理した後に、濾過フィルターを用いて濾過し、前記メンブレン上に滴下することにより、前記検体試料中の被測定物の存在を検出あるいは定量することを特徴とする方法である。特に検体試料中に界面活性剤が終濃度で０．１〜１０（Ｗ／Ｖ）％含有されている場合には、目詰まりが防げ、特異的に且つ高感度で被測定物が検出あるいは定量できる。
【００１４】
本明細書において“メンブレンアッセイ法”とは、被測定物に特異的に結合する捕捉物質が固相化されたメンブレンを含むアッセイ装置を用いて検体試料中の被測定物の存在の有無を検査する方法である。典型的な例としては、被測定物と、前記捕捉物質及び標識化検出試薬を反応させてサンドイッチ状の複合体をメンブレン上に形成させ、前記標識物を検出することによりこの複合体の存在を検出又は定量する方法である。被測定物と前記捕捉物質及び標識化検出試薬との反応としては、抗原抗体反応、その他の受容体とレセプターの反応、ビオチンとアビジンの特異的結合反応、相補的配列を持つＤＮＡ同士の反応等が挙げられる。これらのうち、レジオネラ菌の検出等に免疫測定法が広く用いられており、本発明の方法は、このような免疫測定法に好ましく適用することができる。また、本発明の方法は、このような方法に用いるものであれば、被測定物、メンブレン、標識物の種類について限定されるものではない。
【００１５】
本発明のメンブレンアッセイ法は、２種類のメンブレンイムノクロマトグラフ法のいずれか、すなわちフロースルー式メンブレンアッセイ法またはラテラルフロー式メンブレンアッセイ法を利用するものであることが、簡便かつ迅速であるため好ましい。フロースルー式メンブレンアッセイ法は被測定物を含む溶液を、被測定物と特異的に結合する捕捉試薬が塗布されたメンブレンに対して垂直方向に通過させるものであり、被測定物に特異的に結合する捕捉物質、被測定物、被測定物に特異的に結合する標識物質の複合体を膜上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被測定物の検出あるいは定量を行う。ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法は、同様なメンブレンを用いて、メンブレンに対して被測定物を含む溶液を水平方向に展開させる点でフロースルー式メンブレンアッセイ法と異なるが、被測定物の検出原理は同様である。
【００１６】
以下に、本発明の方法についてより具体的な手順の一例を示す。
（１）  患者の尿等から採取した検体を後述するような界面活性剤が含有されている緩衝液に浮遊させて検体試料を調製する。この場合、界面活性剤の終濃度が０．１〜１０Ｗ／Ｖ％になるように、緩衝液中の界面活性剤の濃度及び／又は検体と界面活性剤含有緩衝液との混合比率を適宜選択する。
（２）  この検体試料を超音波発生装置で超音波処理する。
（３）  超音波処理した検体試料を濾過フィルターで濾過する。
（４）  この濾過した検体試料をメンブレンを備えたアッセイ装置中の被測定物に特異的に結合して被測定物を捕捉する捕捉物質が結合したメンブレンに滴下して、被測定物をメンブレン上に捕捉させる。
（５）  前記メンブレン上に、被測定物に特異的に結合する標識化検出試薬を滴下し、捕捉物質−被測定物−標識化検出試薬からなる複合体を形成させる。
（６）  前記複合体中の標識化検出試薬により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中の被測定物の有無を測定する。
【００１７】
界面活性剤
界面活性剤としては、特に限定されるものではなく、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤のいずれでもよい。好ましい例として、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）：ポリエチレングリコールモノ−р−イソオクチルフェニルエーテル、Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ  ８０（商品名）：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（商品名）：ノニデット    Ｐ−４０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ  ３−１４（商品名）：ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネ−ト、ＣＨＡＰＳ：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等あるいはこれらを２種類以上混合したものを用いることができるが、これらに限定されない。
【００１８】
検体試料
本発明の検査方法により分析するための検体試料は、咽頭あるいは鼻腔拭い物を適当な緩衝液中に浮遊させた溶液、鼻腔吸引液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液、便懸濁液、血漿、血清、尿、唾液、羊水、髄液、膿、臓器抽出液、各種組織抽出液等の生体試料、食品抽出液、培養液、上水、下水、湖水、河川水、クーリングタワー水、温泉水、風呂水、海水、土壌抽出液、汚泥抽出液及びそれらを適当な緩衝液で希釈した溶液を用いることができるがこれらに限定されない。
【００１９】
検体は、例えば患者の咽頭・鼻腔等から滅菌綿棒等の検体採取器具を使用して採取するか、または鼻腔吸引液等を用いることができるが、このようにして得られた検体は、通常検体浮遊液に浮遊させてアッセイを行う。検体浮遊液としては、免疫拡散法、酵素免疫測定法、凝集法等の免疫学的手法による試料検出または定量法において通常使用されるバッファー類等を使用することができる。
【００２０】
より具体的には、生理食塩水、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ゼラチン添加ＰＢＳ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＰＢＳ、グッドの緩衝液、子牛インフュージョンブロス（ＶＩＢ）、ハートインフュージョンブロス、イーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ＢＳＡ添加ＥＭＥＭなどが挙げられるがこの限りではない。また、上記バッファー類は２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
本発明の方法では、このような緩衝液に上記界面活性剤を含ませておくことが好ましい。好ましい界面活性剤含有緩衝液の一例として、界面活性剤０．１〜１０（ｗ／ｖ）％（ただし、検体試料中の終濃度がこの範囲になるように適宜設定）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）５％、塩化ナトリウム  ０．１５Ｍ、ＮａＮ３  ０．１％を含有させた５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
被測定物
本明細書にいう被測定物は、何ら限定されず、検出又は定量しようとするいかなる物質であってもよい。例として、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢｓ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、レジオネラ属菌、炭疽菌、ＭＲＳＡ等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗原、ヒト繊毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタングランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、各種腫瘍マーカー、農薬、環境ホルモン等をあげることができるが、これらに限定されない。
【００２３】
超音波処理
上記の通り、本発明の方法では、界面活性剤含有検体試料を濾過フィルターで濾過する前に検体試料を超音波処理する。超音波処理の条件は、特に限定されないが、通常、市販の超音波処理装置を用い、周波数２０ｋＨｚ、出力１２０〜３５０Ｗ程度で行われる。超音波処理は、検体試料をスピッツ管に入れ、冷却下で５〜２０分間行うことが好ましい。
【００２４】
濾過フィルター
本発明の方法において、検体試料は、上記超音波処理後、濾過フィルターを用いて濾過される。濾過フィルターの孔径または保留粒子径は通常、０．１〜１μｍ、好ましくは０．１〜０．６μｍである。濾過フィルターは被測定物を吸着し易いものでなければ、１種類だけではなく、材質の異なるもの、孔径あるいは保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせても良い。その場合、フィルターを構成するもののうち、最も小さな孔径あるいは保留粒子径のものが、そのフィルターの孔径あるいは保留粒子径となる。濾過フィルターの材質は、特に限定されないが、好ましくはガラス繊維又はニトロセルロースである。
【００２５】
検体試料収容容器
上記濾過フィルターは、該チューブの一端に取り付けて使用されることが好ましい。一端に濾過フィルターが取り付けられたチューブを本明細書において「濾過チューブ」という。濾過チューブ中に検体試料をいれて、一端に取り付けた濾過フィルターを通して濾過し、濾液をメンブレンアッセイ装置のメンブレンに滴下する方法が簡便であり、好ましい。この濾過チューブの具体例の模式図を図３及び図４に示す。濾過チューブは例えば図３に記載されるように先端部ｄと本体部ｅからなる形状であり、先端部の内部に図４に示されるように濾過フィルターｆが備えつけられている。本体部ｅに検体試料を入れ、本体部ｅに濾過フィルターｆを備えた先端部ｄを取り付ける。濾過フィルターｆを通して検体試料を濾過し、濾液をメンブレンアッセイ装置のメンブレンに滴下する。本体部ｅがポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のフレキシブルな材質からなると、濾過フィルターを取り付けた状態で、手などにより内部に圧力を加えることで、容易に検体試料を濾過することができるため好ましい。
【００２６】
アッセイ装置
メンブレンを備えたアッセイ装置（メンブレンアッセイ装置ともいう）は、被測定物に特異的に結合する捕捉物質が固相化されたメンブレンを含む装置である。フロースルー式メンブレンアッセイ法を利用するアッセイ装置の具体例は、例えば図１及び２に示されるような装置である。
【００２７】
図１は装置の平面図であり、図２は、図１のＩ−Ｉ’切断断面図である。図１及び２において、ａは、調製した検体試料を滴下する開口部を有し、底面部に試料が通過するための穴（Ａ）を備えたアダプターである。ｂは被測定物に特異的に結合する捕捉物質が結合したメンブレンであり、ｃは液体を吸収する部材である。
【００２８】
メンブレン
メンブレンアッセイ装置中のメンブレンの材質としては、特に限定されないが、好ましくはニトロセルロースから作られた微多孔質物質があげられる。また、セルロースエステルとニトロセルロースの混合物も好適に用いることができる。上記メンブレンの孔径あるいは保留粒子径は濾過フィルターの孔径または保留粒子径以上であり、且つ０．２〜１２μｍであることが好ましく、０．５〜５μｍが特に好ましい。また、メンブレンの厚さは特に限定されないが、通常、１００〜２００μｍ程度である。
【００２９】
捕捉物質
被測定物を捕捉するための捕捉物質は、被測定物と、抗原抗体反応により特異的に結合して、抗原抗体複合体を形成する抗体である。従って、被測定物により使用する捕捉抗体が異なることは当然であるが、一般には被測定物が細菌、ウイルス、ホルモン、その他臨床マーカー等の場合には、これらに対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等があげられる。このような捕捉抗体を上述したメンブレン表面に結合させる方法としては、物理的吸着であってもよく、または、化学的な結合によるものであってもよい。捕捉抗体が結合したメンブレンの調製は、例えば、捕捉抗体を緩衝液等で希釈した溶液をメンブレンに吸着させ、その後乾燥することにより行われる。
【００３０】
検出試薬
検出試薬は、被測定物に特異的に結合し、被測定物と複合体を形成しうるものである。また、標識化検出試薬は、被測定物と複合体を形成した後に何らかの手段で検出可能なように標識された検出試薬である。例えば、被測定物がウイルス等の抗原物質である場合には、そのウイルスに対する抗体であって、酵素等で標識化された抗体が挙げられる。このように酵素で標識された場合には、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成する該酵素の基質を添加することにより、複合体の検出を行うことができる。標識化される前の検出試薬としては、捕捉試薬について述べたものと同じものが挙げられる。また、標識は、酵素、蛍光発光性標識、磁性体標識、放射性同位元素、金コロイド、着色ラテックス等が挙げられる。
【００３１】
酵素標識を用いる場合には、使用される酵素としては例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素が挙げられる。
【００３２】
基質
標識化検出試薬の標識として酵素標識を用いた場合には、通常その酵素に対する基質であって、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成するものを添加する。具体例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）／ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ）、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、グルコース‐６‐リン酸ＮＡＤ＋が挙げられる。
【００３３】
メンブレンアッセイキット
本発明の方法に用いられるメンブレンアッセイキットは、好ましくは、
捕捉抗体が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置
濾過フィルター
検体浮遊緩衝液
洗浄液
酵素標識抗体試薬
酵素基質液
反応停止液
からなるが、更に必要に応じて、キットの性能を検査するための陰性コントロール液、抗原性物質などの被測定物を含む陽性コントロールを含んでいてもよい。
【００３４】
洗浄液
上記洗浄液は、特に限定されないが、界面活性剤を含むトリス緩衝液、グッド緩衝液、リン酸緩衝液等が好ましい例として挙げられる。
【００３５】
反応停止液
本発明のキットには必要により、例えば酵素と基質との反応を停止させるための反応停止液が含まれていてもよい。このような反応停止液としては、例えば、クエン酸、硫酸等があげられる。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１、比較例１〜３
１．モノクローナル抗体の作製
（１）抗レジオネラニューモフィラ１群モノクローナル抗体の作製
レジオネラニューモフィラ１群の加熱抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．  ２５６，  ｐ４９５−４９７（１９７５））によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、レジオネラニューモフィラ１群抗原固相プレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニィティ―クロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、２種類の精製抗レジオネラニューモフィラ１群モノクローナル抗体を得た。
【００３８】
２．酵素標識抗レジオネラ抗体液の作製
（１）  アルカリフォスファターゼ標識抗レジオネラニューモフィラ１群モノクローナル抗体の作製
精製抗レジオネラニューモフィラ１群モノクローナル抗体のうち１種類について４５ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）で透析後、ペプシン１０ｍｇを添加し、３７℃で１時間、Ｆａｂ’消化処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗レジオネラニューモフィラ１群Ｆ（ａｂ’）２  精製画分を得た。前記画分を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、０．１Ｍメルカプトエチルアミンと１０：１の体積比で混合し、３７℃で９０分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗レジオネラニューモフィラ１群Ｆａｂ’精製画分を得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。１０ｍｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ１．５ｍＬを５０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ塩化マグネシウムならびに０．１ｍＭ塩化亜鉛含有）に透析後、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド０．７ｍｇを添加し、３０℃で１時間処理した。処理後の溶液をセファデックスＧ−２５カラムで分画し、最初のピークを回収してマレイミド−アルカリフォスファターゼを得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。濃縮した抗レジオネラニューモフィラ１群Ｆａｂ’とマレイミド−アルカリフォスファターゼを１：２．３の蛋白比で混合し、４℃で２０時間穏やかに撹拌して反応させ、アルカリフォスファターゼ標識抗レジオネラＦａｂ’を得た。反応液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画し、未反応物を除去して精製アルカリフォスファターゼ標識Ｆａｂ’を得た。精製アルカリフォスファターゼ標識抗レジオネラニューモフィラ１群Ｆａｂ’を５（Ｗ／Ｖ）％ウシ血清アルブミン、４（Ｗ／Ｖ）％ポリエチレングリコール６０００、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１（Ｗ／Ｖ）％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ塩化亜鉛の組成からなる標識抗体希釈液で希釈した後、０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過し、アルカリフォスファターゼ標識抗レジオネラニューモフィラ１群モノクローナル抗体液を得た。
【００３９】
３．レジオネラ抗原検出用メンブレンアッセイ装置の作製
レジオネラ抗原検出用メンブレンアッセイ装置は、図１及び２に示すものと同様の構成のものを用いた。メンブレンは、孔径３μｍを有するニトロセルロースメンブレン（サイズ２×２ｃｍ、厚さ１２５μｍ）を用いた。メンブレンへの捕捉抗体の固相は、つぎのようにして行った。すなわち、精製抗レジオネラニューモフィラ１群モノクローナル抗体のうち標識に用いなかった方を精製水で抗体タンパクが１ｍｇ／ｍＬになるように希釈して０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過し、装置のホールに１２μＬをスポットした。スポット後、４５℃の乾燥室で４０分間乾燥を行い、レジオネラ抗原検出用メンブレンアッセイ装置を作製した。
【００４０】
４．レジオネラ抗原の検出
（１）  メンブレンアッセイ法による検出
陽性検体としてレジオネラニューモフィラ１群菌をＢＣＹＥ寒天培地で培養した後、生理食塩液で集菌し、菌数を１０８ＣＦＵ／ｍＬに調整した。陰性検体としてレジオネラニューモフィラ２群菌を上記と同様に培養して、菌数を１０８ＣＦＵ／ｍＬに調整した。
【００４１】
各調製菌液を、界面活性剤を含む検体浮遊緩衝液（組成：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）  １％、ウシ血清アルブミン  ５％、塩化ナトリウム  ０．１５Ｍ、アジ化ナトリウム  ０．０９％、トリス緩衝液  ５０ｍＭ（ｐＨ８．０））で１０ｎ希釈して超音波処理（  レベル５、１０分間  バイオラプター  （株）オリンパス  ）し、０．２２μｍフィルターで濾過し、これを検体試料として試験した。また、比較のために超音波処理を行わない検体試料を調製し試験した（比較例１）。更に、比較のために検体浮遊緩衝液に界面活性剤を加えない比較検討用検体浮遊緩衝液を用い、上記同様に検体試料を調製し試験した（比較例２）。また、検出感度を比較する目的で、市販されているイムノクロマト簡易キットを用いて試験し（比較例３）、検出感度を比較した。
【００４２】
試験操作手順
１）調製した検体試料をアッセイ装置のアダプターの開口部からメンブラン上へ０．２ｍＬ滴下し、吸収するまで室温で静置した。
２）洗浄液をアダプターの開口部からメンブラン上へ０．２ｍＬ滴下し、吸収するまで室温で静置した。
３）アルカリフォスファターゼ標識抗レジオネラニューモフィラ１群モノクローナル抗体液をアダプターの開口部から０．２ｍＬ滴下し、吸収するまで室温で静置した。
４）アダプターを取り外し、洗浄液をメンブラン全体に０．２ｍＬ滴下し、吸収するまで室温で静置した。
洗浄液組成：
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００      １％
アジ化ナトリウム        ０．０９％
トリス緩衝液  ５０ｍＭ（ｐＨ８．０）
５）基質液をメンブラン全体に０．２ｍＬ滴下し、１０分間、室温で静置した。
基質液組成：
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸  ０．１５ｍｇ／ｍＬ
ニトロテトラゾリウムブルー                    ０．３  ｍｇ／ｍＬ
塩化マグネシウム                                    ５ｍＭ
アジ化ナトリウム                              ０．０９％
トリス緩衝液                                    １００ｍＭ（ｐＨ９．５）
６）反応停止液をメンブラン全体に０．２ｍＬ滴下し、吸収するまで室温で静置した。
反応停止液組成：
クエン酸      １００ｍＭ
７）試験領域（捕捉抗体固相領域）の発色の有無を目視により観察した。
アダプターの開口部と同じ形状に青紫色の着色が認められる場合は陽性（＋）、着色が認められない場合は陰性（−）と判定した。
【００４３】
結果
界面活性剤入り検体浮遊緩衝液を用い超音波処理を行った検体試料での結果は表１に示した。比較例１（界面活性剤なし、超音波処理あり）の結果は表２に示した。比較例２（界面活性剤あり、超音波処理なし）の結果は表３に示した。比較例３（市販されているイムノクロマト簡易キットを用いて試験）の結果は表４に示した。
【００４４】
【表１】
表１    実施例１の結果
2004361206.tif 000002
【００４５】
【表２】
表２    比較例１の結果
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【００４６】
【表３】
表３    比較例２の結果
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【００４７】
【表４】
表４    比較例３の結果
2004361206.tif 000005
【００４８】
上記試験結果からわかるように、本発明の方法を用いた場合（実施例１）は、陽性検体は菌濃度１０３ＣＦＵ／ｍＬで陽性（＋）、陰性検体は陰性（−）と判定された。これに対して、比較検討のために界面活性剤を加えない検体浮遊緩衝液を用いた場合（比較例１）ならびに超音波処理を行わない場合（比較例２）は、陰性検体は陰性（−）であったが陽性検体が菌濃度１０６ＣＦＵ／ｍＬ以上でないと陽性（＋）と判定されなかった。これらの結果から、本発明の方法を用いた場合は高い検出感度ならびに特異性があることが確かめられた。
【００４９】
また、実用されているイムノクロマト簡易キット（比較例３）との比較では、イムノクロマト簡易キットが１０５ＣＦＵ／ｍＬで陽性（＋）であったのに対して、本発明法は１０３ＣＦＵ／ｍＬで陽性（＋）となり、本発明法は１００倍高い検出感度が得られた。
【００５０】
これらの結果から、本発明の方法により、高感度で特異性が高く且つ迅速に検出が行えることが確かめられた。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の方法により、検体試料の濾過時に濾過フィルターの目詰まりを起こすことなく、偽陽性の発生を防止することができ、操作が容易かつ信頼性の高いメンブレンアッセイ法を確立することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施態様であるメンブレンアッセイ装置の平面図である。
【図２】図１のＩ−Ｉ’切断端面図である。
【図３】本発明において使用される検体試料用濾過チューブの一実施態様を示す。
【図４】図３の検体試料用濾過チューブ先端部の透視図を示す。
【符号の説明】
Ａ  穴
ａ  アダプター
ｂ  メンブレン
ｃ  液体吸収部材
ｄ  濾過チューブ先端部
ｅ  濾過チューブ本体部
ｆ  濾過フィルター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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