(57)【要約】【課題】ｈｕＨＧＦ中にアミノ酸変化を有し、且つ対応する野生型ＨＧＦの実質上完全なレセプター結合親和性を保持している、野生型ヒトＨＧＦ（ｗｔ−ｈｕＨＧＦ）の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）変異体を提供すること。【解決手段】ｈｕＨＧＦのアミノ酸５３４、６７３および／または６９２位にアミノ酸変化を有する、野生型ヒトＨＧＦ（ｗｔ−ｈｕＨＧＦ）の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＨＧＦのアミノ酸５３４、６７３および／または６９２位にアミノ酸置換を有し、実質上完全なレセプター結合親和性を保持している、野生型ｈｕＨＧＦ（ｗｔ−ｈｕＨＧＦ）の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）変異体。
【請求項２】
野生型ｈｕＨＧＦのアミノ酸６９２位にアミノ酸置換を有し、実質上完全なレセプター結合を保持している、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
該アミノ酸置換がセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミンから選ばれる、請求項１または２のいずれかに記載の変異体。
【請求項４】
該アミノ酸置換がセリンである、請求項３に記載の変異体。
【請求項５】
野生型ｈｕＨＧＦアミノ酸配列の５３４および／または６７３位にアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の変異体。
【請求項６】
５３４位のアミノ酸置換がヒスチジンである、請求項５に記載の変異体。
【請求項７】
６７３位のアミノ酸置換がセリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グリシン、アラニン、およびバリンから選ばれる、請求項５に記載の変異体。
【請求項８】
実質上ＨＧＦレセプターの活性化ができない、請求項１−７のいずれかに記載の変異体。
【請求項９】
実質上野生型ｈｕＨＧＦ肝細胞成長刺激活性を欠く、請求項１−８のいずれかに記載の変異体。
【請求項１０】
野生型ｈｕＨＧＦと比較して増大したレセプター結合親和性を有する、請求項１−９のいずれかに記載の変異体。
【請求項１１】
レセプター結合親和性の増大が、野生型ｈｕＨＧＦアミノ酸配列のレセプター結合ドメインにおける変化により達成される、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
該変化がクリングル１ドメイン内にある、請求項１１に記載の変異体。
【請求項１３】
該変化が野生型ｈｕＨＧＦアミノ酸配列のアミノ酸１５９、１６１、１９５および１９７位またはアミノ酸１７３位により定義される部分の内部にある、請求項１２に記載の変異体。
【請求項１４】
該変化が野生型ｈｕＨＧＦのヘアピンドメイン内、ヘアピンドメインのＮ末端、またはヘアピンおよびクリングル１ドメインの間にある、請求項１１に記載の変異体。
【請求項１５】
機能的クリングル２、クリングル３、またはクリングル４ドメインを欠く、請求項１−１４のいずれかに記載の変異体。
【請求項１６】
請求項１−１５のいずれかに記載の変異体をコードしているヌクレオチド配列。
【請求項１７】
請求項１６に記載のヌクレオチド配列を含み、且つこれを適当な宿主細胞中で発現することのできる、複製可能な発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
ＨＧＦ変異体をコードしている核酸を発現するよう請求項１８に記載の宿主細胞を培養し、宿主細胞培養から該変異体を回収することからなる方法。
【請求項２０】
ｈｕＨＧＦレセプターの活性化に起因する病的状態を処置する為の医薬組成物であって、そのレセプターに対する野生型ｈｕＨＧＦの結合を競合的に阻害し得る量の請求項１−１５のいずれかに記載の変異体を薬学上許容し得る担体と混合してなる薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のアミノ酸配列変異体、係る変異体を製造する方法および手段、ならびにそれらを含む薬用組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＧＦは最初、肝細胞に対する分裂促進因子として同定された（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３参照）。非特許文献３は、肝臓を部分的に切除したラットの血清からのＨＧＦの精製を報告した。その後ＨＧＦはラットの血小板から精製され、そのサブユニット構造が決定された（非特許文献４および非特許文献５参照）。ヒト血漿からのヒトＨＧＦ（ｈｕＨＧＦ）の精製は、非特許文献６により最初に記載された。
【０００３】
ラットＨＧＦおよびｈｕＨＧＦは共に分子クローニングされており、「デルタ５　ＨＧＦ」と呼ばれる５個のアミノ酸を欠失する天然に存在する変異体のクローニングおよび配列決定もされている（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０および非特許文献１１参照）。
【０００４】
ヒトの血清から精製された主要な型に相当するｈｕＨＧＦの成熟型は、ヒトのプロホルモンのアミノ酸Ｒ４９４およびＶ４９５の間の蛋白分解的開裂により誘導されるジスルフィド結合したヘテロ二量体である。この開裂工程は、４４０アミノ酸のαサブユニット（Ｍｒ６９ｋＤａ）および２３４アミノ酸のβサブユニット（Ｍｒ３４ｋＤａ）から成る分子を生成する。ｈＨＧＦ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、αおよびβ鎖がいずれもプレプロ前駆体蛋白をコードしている単一オープンリーディングフレーム中にあることを明らかにした。成熟ｈＨＧＦの予想された一次構造において、α鎖のＣｙｓ４８７およびβ鎖のＣｙｓ６０４の間に鎖間Ｓ−Ｓ橋が形成されている（非特許文献８を参照されたい）。メチオニン基で始まる５４のアミノ酸がα鎖のＮ末端に先行する。このセグメントは、特徴ある３１残基の疎水性リーダー（シグナル）配列およびプロ配列を含む。α鎖はアミノ酸（ａａ）５５で始まり、４個のクリングルドメインを含んでいる。いわゆる「ヘアピンドメイン」は、野生型ヒトＨＧＦのアミノ酸残基７０−９６を含んでいる。クリングル１ドメインはおよそａａ１２８からおよそａａ２０６まで及んでおり、クリングル２ドメインはおよそａａ２１１およびおよそ２８８の間にあり、クリングル３ドメインはおよそａａ３０３からおよそａａ３８３まで及んでいると定義され、そしてクリングル４ドメインはα鎖のおよそａａ３９１からおよそａａ４６４まで及んでいる。種々のクリングルドメインの定義は他の蛋白（プロトロンビン、プラスミノーゲン）のクリングル様ドメインとの相同性に基づくものであり、したがって上記の範囲は近似的なものに過ぎない。今までの所、これらのクリングルの機能は決定されていない。ｈｕＨＧＦのβ鎖はセリンプロテアーゼの触媒ドメインと高い相同性を示す（プラスミノーゲンセリンプロテアーゼドメインに対し３８％の相同性）。しかしながら、セリンプロテアーゼの触媒三つ組を形成する３個の残基のうち２個はｈｕＨＧＦにおいて保存されていない。故に、そのセリンプロテアーゼ様ドメインにも拘らず、ｈＨＧＦには蛋白分解活性が無いようであり、またβ鎖の正確な役割は未知のままである。ＨＧＦは４個の推定グリコシル化部位を含んでおり、これらはα鎖の２９４および４０２位ならびにβ鎖の５６６および６５３位に位置している。
【０００５】
ヒト白血球から分離されたｃＤＮＡの一部に、１５塩基対のフレーム内欠失が観察された。このｃＤＮＡ配列をＣＯＳ−１細胞中で一過性発現させると、クリングル１ドメインに５個のアミノ酸を欠く、コードされているＨＧＦ分子（デルタ５　ＨＧＦ）は完全に機能的であることが判明した（非特許文献９）。
【０００６】
成熟ｈｕＨＧＦのＮ末端フィンガーおよび最初の２個のクリングルドメインに対するコード化配列を含むｈｕＨＧＦ転写物の、別のスプライスされた型に相当する、天然に存在するｈｕＨＧＦ変異体が、近年同定された（非特許文献１２および非特許文献１３参照）。ＨＧＦ／ＮＫ２と呼称されるこの変異体は、成熟ＨＧＦの競合的アンタゴニストであると提起された。
【０００７】
ラットＨＧＦのアミノ酸配列とｈｕＨＧＦのそれとの比較は、二つの配列が高度に保存され、且つ同じ性質の構造的特徴を持っていることを明らかにした。ラットＨＧＦ中の４つのクリングルドメインの長さはｈｕＨＧＦと全く同じである。さらに、システイン残基が全く同じ位置にあり、これは類似の三次元構造であることを示唆している（非特許文献１１および非特許文献１０参照）。
【０００８】
ＨＧＦレセプターは、ｃ−Ｍｅｔプロトオンコジーンの産物（非特許文献１４、非特許文献１５参照）、１９０ｋＤａヘテロ二量体（ジスルフィド結合した５０ｋＤａのα鎖および１４５ｋＤａのβ鎖）の貫膜チロシンキナーゼ蛋白（非特許文献１６）であると同定されている。このｃ−Ｍｅｔ蛋白は、ＨＧＦ結合の際１４５ｋＤａβサブユニットのチロシン残基上でホスホリル化される。
【０００９】
ＨＧＦのレベルは、肝不全の患者の血漿中（非特許文献６）および実験的に肝の損傷を誘発した動物の血漿（非特許文献１７）または血清（非特許文献１８）中で上昇する。この応答の速度は速く、肝の再生の間のＤＮＡ合成の第一巡に先行し、これはＨＧＦがこの工程の開始に重要な役割を果たしていることを示唆するものである。より最近になって、ＨＧＦが、メラノサイト、尿細管細胞、ケラチン生成細胞、或る種の内皮細胞および上皮由来の細胞を包含する様々な型の細胞に対する分裂促進因子であることが示された（非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２）。興味深いことに、ＨＧＦは、インビトロで上皮および血管内皮細胞の解離を促進する活性である「散乱因子」としても作用することができる（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５参照）。その上、最近ＨＧＦは上皮のモルフォゲンとして記載された（非特許文献２６）。故に、ＨＧＦは、腫瘍の侵襲および胚の発生において重要であると仮定された。長期にわたるｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターの活性化が、ある種の悪性腫瘍に観察された（非特許文献２７、非特許文献２８）。
【００１０】
【特許文献１】
米国特許第４６８３１９５号（１９８７年７月２８日登録）
【特許文献２】
米国特許第４８１６５６７号（キャビリー等）
【特許文献３】
米国特許第４７４５０５５号
【特許文献４】
欧州特許第２５６６５４号
【特許文献５】
欧州特許第１２０６９４号
【特許文献６】
欧州特許第１２５０２３号
【特許文献７】
欧州特許第２５５６９４号
【特許文献８】
欧州特許第２６６６６３号
【特許文献９】
国際公開第８８／０３５５９号パンフレット
【特許文献１０】
米国特許第４４４４８７８号
【特許文献１１】
国際公開第８８／０３５６５号パンフレット
【特許文献１２】
欧州特許第６８７６３号
【特許文献１３】
国際公開第９０／０２７９８号パンフレット（１９９０年３月２２日公開）
【特許文献１４】
国際公開第８７／０５３３０号パンフレット（１９８７年９月１１日公開）
【特許文献１５】
米国特許第３９５９６４２号
【特許文献１６】
米国特許第３９６９２８７号
【特許文献１７】
米国特許第３６９１０１６号
【特許文献１８】
米国特許第４１９５１２８号
【特許文献１９】
米国特許第４２４７６４２号
【特許文献２０】
米国特許第４２２９５３７号
【特許文献２１】
米国特許第４０５５６３５号
【特許文献２２】
米国特許第４３３０４４０号
【特許文献２３】
米国特許第４６４０８３５号
【特許文献２４】
米国特許第４４９６６８９号
【特許文献２５】
米国特許第４３０１１４４号
【特許文献２６】
米国特許第４６７０４１７号
【特許文献２７】
米国特許第４７９１１９２号
【特許文献２８】
米国特許第４１７９３３７号
【特許文献２９】
国際公開第９１／０８２９８号パンフレット（１９９１年６月１３日公開）
【特許文献３０】
欧州特許出願３０７２４７号（１９８９年３月１５日公開）
【非特許文献１】
マイカロポーロス等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、４４巻４４１４−４４１９頁（１９８４）
【非特許文献２】
ラッセル等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１９巻１８３−１９２頁（１９８４）
【非特許文献３】
ナカムラ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１２２巻１４５０−１４５９頁（１９８４）
【非特許文献４】
ナカムラ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻６４８９−６４９３頁（１９８６）
【非特許文献５】
ナカムラ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２４巻３１１−３１６頁（１９８７）
【非特許文献６】
ゴーダ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１巻４１４−４１９頁（１９８８）
【非特許文献７】
ミヤザワ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１６３巻９６７−９７３頁（１９８９）
【非特許文献８】
ナカムラ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻４４０−４４３頁（１９８９）
【非特許文献９】
セキ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１７２巻３２１−３２７頁（１９９０）
【非特許文献１０】
タシロ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻３２００−３２０４頁（１９９０）
【非特許文献１１】
オカジマ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９３巻３７５−３８１頁（１９９０）
【非特許文献１２】
チャン等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻１３８２−１３８５頁（１９９１）
【非特許文献１３】
ミヤザワ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７巻１５−２２頁（１９９１）
【非特許文献１４】
ボッターロ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻８０２−８０４頁（１９９１）
【非特許文献１５】
ナルディーニ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、６巻５０１−５０４頁（１９９１）
【非特許文献１６】
パーク等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻６３７９−６３８３頁（１９８７）
【非特許文献１７】
リンドロー等、Ｈｅｐａｔｏｌ．、１３巻７３４−７５０頁（１９９１）
【非特許文献１８】
アサミ等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０９巻８−１３頁（１９９１）
【非特許文献１９】
マツモト等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１７６巻、４５−５１頁（１９９１）
【非特許文献２０】
イガワ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１７４巻、８３１−８３８頁（１９９１）
【非特許文献２１】
ハン等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０巻９７６８−９７８０（１９９１）
【非特許文献２２】
ルビン等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻４１５−４１９頁（１９９１）
【非特許文献２３】
ストーカー等、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻２３９−２４２頁（１９８７）
【非特許文献２４】
ワイドナー等、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１１１巻２０９７−２１０８頁（１９９０）
【非特許文献２５】
ナルディーニ等、ＥＭＢＯ　Ｊ．、１０巻２８６７−２８７８頁（１９９１）
【非特許文献２６】
モンテサーノ等、Ｃｅｌｌ、６７巻９０１−９０８頁（１９９１）
【非特許文献２７】
クーパー等、ＥＭＢＯ　Ｊ．、５巻２６２３頁（１９８６）
【非特許文献２８】
ジョルダーノ等、Ｎａｔｕｒｅ、３３９巻１５５頁（１９８９）
【非特許文献２９】
カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アウスベル等編、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウィレイ−インターサイエンス、１９９１、２巻１５章
【非特許文献３０】
メイジおよびラモイ、モノクローナル・アンティボディ・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、７９−９７頁（マーセル・デッカー・Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７）
【非特許文献３１】
フォークナー等、Ｎａｔｕｒｅ、２９８巻２８６頁（１９８２）
【非特許文献３２】
モリソン、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、１２３巻７９３頁（１９７９）
【非特許文献３３】
ケーラー等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻２１９７頁（１９８０）
【非特許文献３４】
ラソ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、４１巻２０７３頁（１９８１）
【非特許文献３５】
モリソン等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻２３９頁（１９８４）
【非特許文献３６】
モリソン、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻１２０２頁（１９８５）
【非特許文献３７】
モリソン等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻６８５１頁（１９８４）
【非特許文献３８】
サムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク（１９８９）
【非特許文献３９】
アーデルマン等、ＤＮＡ、２巻１８３頁（１９８３）
【非特許文献４０】
メシング等、サード・クリーブランド・シンポジアム・オン・マクロモレキュールズ・アンド・リコンビナント・ＤＮＡ（Ｔｈｉｒｄ　Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ）、Ａ．ウォルトン編、エルセヴィア、アムステルダム（１９８１）
【非特許文献４１】
ヴェイラ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３巻３頁（１９８７）
【非特許文献４２】
クレア等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５巻５７６５頁（１９７８）
【非特許文献４３】
クンケル等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４巻３６７−３８２頁（１９８７）
【非特許文献４４】
メシング等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、９巻３０９頁（１９８１）
【非特許文献４５】
マクサム等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５巻４９９頁（１９８０）
【非特許文献４６】
グラハムおよびヴァン・デル・エブ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻５４６頁（１９７８）
【非特許文献４７】
ヒネン、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５巻１９２９−１９３３頁（１９７８）
【非特許文献４８】
コーエン等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、６９巻２１１０頁（１９７２）
【非特許文献４９】
アプリンおよびリストン、ＣＲＣ　Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９−３０６頁（１９８１）
【非特許文献５０】
ハキムディン等、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９巻５２頁（１９８７）
【非特許文献５１】
エッジ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８巻１３１頁（１９８１）
【非特許文献５２】
ソタクラ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８巻３５０頁（１９８７）
【非特許文献５３】
ダスキン等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７巻３１０５頁（１９８２）
【非特許文献５４】
Ｔ．Ｅ．クレイトン、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパティーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・Ｃｏ．、サンフランシスコ、７９−８６頁（１９８３）
【非特許文献５５】
レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１６版、Ａ．オソール編（１９８０）
【非特許文献５６】
レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オスロ等編、１６版、１９８０、マック・パブリッシング・Ｃｏ．
【非特許文献５７】
モーデンティ等、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．、８巻１３５１頁（１９９１）
【非特許文献５８】
マテウッチ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３巻３１８５−３１９１頁（１９８１）
【非特許文献５９】
ヴィエラ等、Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１４２巻３頁（１９８７）
【非特許文献６０】
クレックナー等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１６巻１２５−１５９頁（１９７７）
【非特許文献６１】
ヒグチおよびナカムラ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１７４巻８３１−８３８頁（１９９１）
【非特許文献６２】
ナルディーニ等、ＥＭＢＯ　Ｊ．、１０巻２８６７−２８７８頁（１９９１）
【非特許文献６３】
ゴドフスキー等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻８０８３−８０８７頁（１９８９）
【非特許文献６４】
ベネット等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻２３０６０−２３０６７頁（１９９１）
【非特許文献６５】
デブラッシ等、１９８９
【非特許文献６６】
ガリソンおよびヘインズ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１５０巻２２６９−２７７頁（１９７５）
【非特許文献６７】
ヘルナンデス等、（１９９２）、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．、印刷中
【非特許文献６８】
ルビン等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻４１５−４１９頁（１９９１）
【非特許文献６９】
ボッターロ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻８０２−８０４頁（１９９１）
【非特許出願７０】
ウルリッヒおよびシュレジンガー、Ｃｅｌｌ、６１巻２０３−２１２頁（１９９０）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＧＦアミノ酸配列中の機能的に重要なドメインを同定するために、ＨＧＦの構造−活性関係をより詳細に理解することが望まれる。
【００１２】
ＨＧＦとそのレセプターとの相互作用を司るアミノ酸残基を同定することが特に望ましいであろう。
【００１３】
ＨＧＦの生物活性を司るアミノ酸残基を同定することもまた望ましいであろう。
【００１４】
対応する成熟野生型ＨＧＦと比較して変化した（好ましくは増強された）レセプター結合親和性を有するＨＧＦのアミノ酸配列変異体を提供することがさらに望ましいであろう。
【００１５】
対応する野生型ＨＧＦと比較してレセプター結合親和性は保持または増強されているがＨＧＦの生物活性が実質上無い、ＨＧＦのアミノ酸配列変異体を提供することもまた望ましいであろう。このような分子はＨＧＦ作用の競合的アンタゴニストとして挙動し得る。
【００１６】
対応する野生型ＨＧＦと比較してレセプター結合親和性が保持または増強されており且つ生物活性が増強されているＨＧＦのアミノ酸配列変異体を提供することはさらに望ましいであろう（ＨＧＦアゴニスト）。したがって、対応する成熟野生型ＨＧＦのレセプター結合親和性が保持または改善されているＨＧＦ変異体を提供することが本発明の一つの目的である。対応する成熟野生型ＨＧＦの実質上完全なレセプター結合親和性を保持し、且つＨＧＦレセプター活性化が実質上できないＨＧＦ変異体を提供することが本発明の別の目的である。対応する成熟野生型ＨＧＦの実質上完全なレセプター結合親和性を保持し、且つ生物学的性質が改善されたＨＧＦ変異体を提供することがさらに別の目的である。
【００１７】
これらのおよびさらなる目的は当業者にとって明らかであろう。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
前記の目的は、野生型ＨＧＦアミノ酸配列の様々なドメイン内部にアミノ酸変化を有する、ＨＧＦ変異体の供給によって達成される。
【００１９】
【発明の実施の形態】
一つの態様において、ＨＧＦをインビボで二本鎖型に変換することのできる酵素による蛋白分解的開裂に対し耐性であるＨＧＦ変異体が提供される。この変異体は、好ましくは、ＨＧＦを二本鎖型に変換することのできる酵素により認識される領域内での部位特異的突然変異誘発によって、一本鎖型で安定化される。
【００２０】
或る態様において、このような変異体は、野生型ｈｕＨＧＦアミノ酸配列のアミノ酸４９３、４９４、４９５または４９６位にまたはこれと隣接してアミノ酸変化を有する。この変化は好ましくは野生型ｈｕＨＧＦアミノ酸配列のアミノ酸４９３−４９６位における少なくとも一つのアミノ酸の置換である。
【００２１】
別の態様において、この変異体は、対応する野生型ＨＧＦの実質上完全なレセプター結合親和性を保持し、且つ実質上ＨＧＦレセプター活性化ができない。増強されたレセプター結合親和性を持ち実質上ＨＧＦレセプターを活性化する能力を欠くＨＧＦ変異体が特に好ましい。このような化合物は対応する野生型ＨＧＦの競合的アンタゴニストであり、そして、充分な濃度で存在する時、野生型ＨＧＦがそれらのリガンドに結合するのを阻害することができる。
【００２２】
別の態様において、ＨＧＦのプロテアーゼドメイン内の部位にアミノ酸変化を有し、対応する野生型ＨＧＦのレセプター結合親和性を実質上完全に保持しているＨＧＦ変異体が提供される。
【００２３】
或る特定の態様において、これらの変異体は、対応する野生型ＨＧＦと比較して実質上保持されたまたは改善されたレセプター結合親和性を有し、ＨＧＦの生物活性を実質上欠いている。このような化合物は、充分な濃度で存在するならば、ＨＧＦ作用の競合的アンタゴニストとして作用するであろう。
【００２４】
別の特定の態様において、この変異体は、対応する野生型ＨＧＦと比較して、実質上保持されたまたは改善されたレセプター結合親和性を改善された生物活性と結び付ける。このような変異体は、ＨＧＦアゴニストとして価値がある。
【００２５】
好ましい態様において、この群内のＨＧＦ変異体は、セリンプロテアーゼの触媒部位に対応する領域に変化を含む。より好ましくは、この変化は、野生型ヒトＨＧＦ（ｈｕＨＧＦ）アミノ酸配列の５３４、６７３および６９２位のいずれかにあるか、またはこれらのいずれかに隣接している。
この変化は好ましくは置換である。
【００２６】
特に好ましい態様において、野生型ｈｕＨＧＦ配列のアミノ酸５３４、６７３および６９２位の残基のうち少なくとも２個が別のアミノ酸によって置換されている。
【００２７】
本発明に係るＨＧＦ変異体の好ましい群においては、ｈｕＨＧＦ配列の６７３位のチロシン（Ｙ）および６９２位のバリン（Ｖ）の両者が別のアミノ酸によって置換されている。この変化は、野生型ｈｕＨＧＦのレセプター結合親和性は実質上保持するがＨＧＦの生物活性を実質上欠いているＨＧＦ変異体を生成するかも知れない。
【００２８】
一本鎖から二本鎖への開裂部位の周りおよびプロテアーゼドメイン内での突然変異を有利に結び付けて、改善された生物学的性質が得られるかも知れない。
【００２９】
対応する野生型ＨＧＦに比較して増強したレセプター結合親和性を有する変異体が特に好ましい。レセプター結合親和性の増大は、例えば野生型ＨＧＦアミノ酸配列のレセプター結合ドメインにおける、そして好ましくはクリングル１ドメイン内部における変化によって達成され得る。
【００３０】
野生型ｈｕＨＧＦアミノ酸配列のアミノ酸１５９、１６１、１９５および１９７位、またはアミノ酸１７３位により定義される部分内にアミノ酸変化を有するクリングル１変異体が特に好ましいが、クリングル１ドメイン内の他の位置もまたＨＧＦのレセプター結合親和性および／または特異活性に純粋な影響を及ぼすものと同定されている。
【００３１】
さらに、クリングル１ドメインに先行するアミノ酸位置、特にヘアピンドメインに対するＮまたはＣ末端ちょうどに変化を有するアミノ酸配列変異体は、対応する野生型ＨＧＦと有意に異なった結合性および生物活性を有することが見いだされている。
【００３２】
本発明に係る変異体は、機能的クリングル２および／またはクリングル３および／またはクリングル４ドメインを欠いていてよい。
【００３３】
全ての態様においてｈｕＨＧＦアミノ酸配列変異体が好ましい。
【００３４】
別の態様において、本発明は、上記の変異体をコードしているＤＮＡ配列、係るＤＮＡ配列を含み且つ形質転換された宿主細胞中でこれらを発現することのできる複製可能な発現ベクター、形質転換された宿主細胞、および、該ＨＧＦ変異体をコードしているＤＮＡを発現させるよう、宿主細胞を培養することからなる方法に関するものである。
【００３５】
さらに別の態様において、本発明は、ＨＧＦアゴニストまたはアンタゴニスト特性を有するＨＧＦ変異体を含む治療用組成物に関するものである。
【００３６】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中使用される「肝細胞成長因子」、「ＨＧＦ」および「ｈｕＨＧＦ」という語は、野生型（ヒト）ＨＧＦのレセプターに特異的に結合することのできる（ヒト）成長因子を意味し、この成長因子は典型的には６個のドメイン（フィンガー、クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４およびセリンプロテアーゼドメイン）を持つ構造を有するが、にも拘らず、これが質的なＨＧＦレセプター結合能を尚保持するならば、より少ないドメインを有していてもよく、またはそのドメインのうち幾つかが反復されていてもよい。この定義は特に、セキ等、上記、により開示されるデルタ５ｈｕＨＧＦを包含する。「肝細胞成長因子」および「ＨＧＦ」という語はさらに、任意のヒト以外の動物種由来の肝細胞成長因子、とりわけラットＨＧＦを包含する。
【００３７】
「野生型ヒト肝細胞成長因子」、「天然ヒト肝細胞成長因子」、「野生型ｈｕＨＧＦ」、および「天然ｈｕＨＧＦ」という語は、天然配列のヒトＨＧＦ、即ち、天然供給源から精製された、化学合成された、または組み換えにより生成された、その成熟型、プレ型、プレプロ型、およびプロ型を包含する、非特許文献７または非特許文献８により公表されているｃＤＮＡ配列によりコードされている、天然配列ヒトＨＧＦを指す。非特許文献７および非特許文献８により報告されている配列は１４のアミノ酸において異なっている。この相違の理由は全て明らかである訳ではない。多型性またはクローニングによる産物が可能性の中に入っている。どちらの配列も、本発明の目的のために定義された前記の語によって特に包含されている。各個体のアミノ酸配列における１またはそれ以上のアミノ酸の相違により表わされる、天然の対立遺伝子変異が存在し、且つこれらが個体間に起こるということが理解されるであろう。本明細書中の変異体ｈｕＨＧＦ分子におけるアミノ酸の位置は、非特許文献７の番号付けに従って示される。
【００３８】
「（ＨＧＦ）生物活性」、「生物学的に活性」、「活性」および「活性である」という語は、野生型ヒトＨＧＦにより示される何らかの分裂促進、モトジェニックまたは形態形成活性を意味する。ＨＧＦの生物活性は、例えば肝細胞成長促進のインビトロまたはインビボ検定で測定することができる。一次培養におけるラット成体の肝細胞は、肝細胞の増殖を調節する因子の探求に広く使用されている。したがって、ＨＧＦ変異体の分裂促進作用は、ＨＧＦ分子が一次培養におけるラット肝細胞のＤＮＡ合成を誘導する能力を試験するために好適な検定、例えば実施例２に記載されるような検定において簡便に測定することができる。ヒトの肝細胞は、移植に容認できないと考えられる臓器上の全肝灌流、子供の移植に用いられる成人の肝臓から切り取った部分、胎児の肝臓および他の適応の外科手術の際に摘出された肝臓の残部から取得することもできる。ヒト肝細胞は、正常なラット肝細胞の一次培養を調製するために確立された方法と同様にして培養することができる。肝細胞のＤＮＡ合成は、例えば反復合成のための適当なヒドロキシ尿素対照を用いた［３Ｈ］チミジンのＤＮＡへの取り込みを測定することにより検定することができる。
【００３９】
肝細胞の増殖に及ぼすＨＧＦ変異体の効果は、肝臓の機能不全および再生の動物モデル、例えば部分的肝切除、または四塩化炭素に起因する肝の損傷後のラット、Ｄ−ガラクトサミン誘発急性肝不全モデル等において、インビボで試験することもできる。適切なプロトコルに従って、肝毒、例えばα−ナフチルイソチオシアナート（ＡＮＩＴ）を、再現できる有意な肝臓の酵素およびビリルビンレベルの上昇をもたらすことのできる、前もって定められた濃度で、ラットに投与する。次いでこのラットを、試験されるべきＨＧＦ変異体で処理し、屠殺し、肝臓の酵素およびビリルビンのレベルを測定する。この肝臓はさらに、肝の損傷についても観察する。
【００４０】
本明細書中使用される「野生型（ｈｕ）ＨＧＦの実質上完全なレセプター結合親和性を保持」という表現およびその文法的な変形は、そのＨＧＦ変異体のレセプター結合親和性が、野生型（ｈｕ）ＨＧＦがその天然のレセプターを結合させる親和性の約７０％より低くない、好ましくは約８０％より低くない、より好ましくは約９５％より低くないことを意味する。
【００４１】
「ＨＧＦレセプター活性化が実質上できない」および「ＨＧＦ生物活性を実質上欠く」という語は、ＨＧＦ変異体により表わされる活性が、上記定義による確立されたレセプター活性化またはＨＧＦ生物活性の検定において、野生型（ヒト）ＨＧＦの各活性の約２０％より低い、好ましくは約１５％より低い、より好ましくは約１０％より低い、最も好ましくは約５％より低いことを意味する。
【００４２】
「アミノ酸」および「アミノ酸類」という語は、全ての天然に存在するＬ−α−アミノ酸を指す。この定義はノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインの包含を意味する。アミノ酸は一文字または三文字表記のいずれかによって指定される：
Ａｓｐ　Ｄ　アスパラギン酸　　　　　Ｉｌｅ　Ｉ　イソロイシン
Ｔｈｒ　Ｔ　スレオニン　　　　　　　Ｌｅｕ　Ｌ　ロイシン
Ｓｅｒ　Ｓ　セリン　　　　　　　　　Ｔｙｒ　Ｙ　チロシン
Ｇｌｕ　Ｅ　グルタミン酸　　　　　　Ｐｈｅ　Ｆ　フェニルアラニン
Ｐｒｏ　Ｐ　プロリン　　　　　　　　Ｈｉｓ　Ｈ　ヒスチジン
Ｇｌｙ　Ｇ　グリシン　　　　　　　　Ｌｙｓ　Ｋ　リジン
Ａｌａ　Ａ　アラニン　　　　　　　　Ａｒｇ　Ｒ　アルギニン
Ｃｙｓ　Ｃ　システイン　　　　　　　Ｔｒｐ　Ｗ　トリプトファン
Ｖａｌ　Ｖ　バリン　　　　　　　　　Ｇｌｎ　Ｑ　グルタミン
Ｍｅｔ　Ｍ　メチオニン　　　　　　　Ａｓｎ　Ｎ　アスパラギン
これらのアミノ酸は、それらの側鎖の化学的組成および性質に従って分類することができる。これらは大きく二つの群、荷電および非荷電に分類される。これらの群の各々は、アミノ酸をより正確に分類するため、亜群に分けられる：
【００４３】
Ｉ．荷電アミノ酸
酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性残基：リジン、アルギニン、ヒスチジン
ＩＩ．非荷電アミノ酸
親水性残基：セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン
脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン
芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
「変化」、「アミノ酸変化」、「変異体」および「アミノ酸配列変異体」という語は、野生型（ヒト）ＨＧＦと比較してそれらのアミノ酸配列に幾らかの相違を有するＨＧＦ分子を指す。通常この変異体は、それらの構造中に保持されている野生型（ヒト）ＨＧＦのドメインと少なくとも約８０％の相同性を有するであろうが、好ましくは係るドメインと少なくとも約９０％ホモローガスであろう。
【００４４】
置換ＨＧＦ変異体は、対応する野生型ＨＧＦ配列中少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、代わりに同じ位置に異なったアミノ酸が挿入されているＨＧＦ変異体である。この置換は、分子中ただ１個のアミノ酸が置換されている単一であってよく、または、同じ分子中２個またはそれ以上のアミノ酸が置換されている複数であってもよい。
【００４５】
本来のアミノ酸と電荷および／または構造が有意に異なる側鎖を有するアミノ酸に置換することによって、ＨＧＦ分子の活性に実質的な変化が得られる。この型の置換は、ポリペプチドバックボーンの構造および／または置換の領域における当該分子の電荷もしくは疎水性に影響を及ぼすと予想される。
【００４６】
電荷および／または構造において天然分子と類似の側鎖を有するアミノ酸に置換することによって、ＨＧＦ分子の活性の中等度の変化が予想されるであろう。同類置換と呼ばれるこの型の置換は、ポリペプチドバックボーンの構造または置換の領域における当該分子の電荷もしくは疎水性のいずれをも実質上変化させないと予想される。
【００４７】
挿入ＨＧＦ変異体は、野生型ＨＧＦ分子中の特定の位置のアミノ酸と直接隣接して１またはそれ以上のアミノ酸が挿入されているＨＧＦ変異体である。アミノ酸に直接隣接して、とは、そのアミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかに結合していることを意味する。この挿入は、１またはそれ以上のアミノ酸であってよい。通常、挿入は１または２個の同類アミノ酸から成る。電荷および／または構造において挿入部位と隣接するアミノ酸に類似しているアミノ酸を同類と定義する。これとは別に本発明は、挿入部位に隣接するアミノ酸と実質上異なる電荷および／または構造を有するアミノ酸の挿入を包含する。
【００４８】
欠失変異体は、野生型ＨＧＦ分子中の１またはそれ以上のアミノ酸が除去されている変異体である。通常、欠失変異体は、ＨＧＦ分子の特定の領域において１または２個のアミノ酸が欠失されているであろう。
【００４９】
本明細書全編に使用されるｈｕＨＧＦアミノ酸配列変異体を表現するための表記法を下に記載する。ｈｕＨＧＦのポリペプチド鎖中の特定のアミノ酸の位置を数字で指定する。この数字は、非特許文献７に開示されるような成熟野生型ヒトＨＧＦポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸位置を指す。本出願においては、ｈｕＨＧＦ変異体中の同様に位置する残基は、実際の残基番号が分子内での欠失または挿入のためその番号でなくとも、このような番号によって表記する。これは、例えば、部位特異的欠失または挿入変異体において起こるであろう。アミノ酸は一文字コードを用いて指定する。置換されたアミノ酸は、そのアミノ酸のポリペプチド鎖中の位置を示す数字の左側に野生型アミノ酸を明示し、そしてこの数字の右側に置換された結果のアミノ酸を明示することによって表記する。
【００５０】
例えば、野生型ｈｕＨＧＦ分子のアミノ酸４９４位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）をグルタミン酸（Ｅ）で置換すると、Ｒ４９４Ｅ　ｈｕＨＧＦと表記されるｈｕＨＧＦ変異体が生成する。同様に、野生型ｈｕＨＧＦ分子のアミノ酸６７３位のチロシン（Ｙ）をセリン（Ｓ）に、そしてアミノ酸６９２位のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換することによって得られるｈｕＨＧＦ変異体は、Ｙ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓ　ｈｕＨＧＦと表記される。
【００５１】
欠失変異体は、欠失の各々の端のアミノ酸残基および位置を全て含めて示し、ギリシャ文字デルタ「Δ」を、示されたアミノ酸の左に位置させることによって明記される。１個のアミノ酸の欠失は、Δを一文字コードおよび欠失されたアミノ酸の位置を示す数字の左に位置させることによって示す。
【００５２】
挿入変異体は、挿入されたアミノ酸の周りに括弧「［］」を使用することにより表記し、挿入の位置は、その挿入の両側のアミノ酸の位置を示すことにより表記する。
【００５３】
本発明に係るＨＧＦ変異体のアミノ酸配列における変化は、野生型ヒトＨＧＦアミノ酸配列中のアミノ酸位置に言及して示される（非特許文献７参照）。様々な種由来のホモローガスなアミノ酸配列を並べる方法は、当分野において良く知られている。
【００５４】
「をコードしているＤＮＡ配列」、「をコードしているＤＮＡ」および「をコードしている核酸」という語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序はポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。ＤＮＡ配列はこのようにしてアミノ酸配列をコードしている。
【００５５】
「複製可能な発現ベクター」および「発現ベクター」という語は、一片の外来ＤＮＡをその中に挿入させているかも知れない、通常二本鎖の、一片のＤＮＡを意味する。外来ＤＮＡは、宿主細胞中に天然には見いだされないヘテロローガスなＤＮＡとして定義される。このベクターは、外来またはヘテロローガスなＤＮＡを適当な宿主細胞中に運搬するために使用される。いったん宿主細胞に入るとこのベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製することができ、このベクターおよびその挿入されている（外来）ＤＮＡのコピーが幾つか生成され得る。さらにこのベクターは、外来ＤＮＡをポリペプチドに翻訳させる必要な要素を含んでいる。このようにして、外来ＤＮＡによりコードされているポリペプチドの分子が多数、迅速に合成され得る。
【００５６】
本発明の文脈において、「細胞」、「セルライン」、および「細胞培養」という表現は互換的に用いられ、このような表記は全て子孫を包含する。
【００５７】
「形質転換された（宿主）細胞」、「形質転換体」および「形質転換された」という語は、細胞中へのＤＮＡの導入を意味する。この細胞は「宿主細胞」と称する。導入されたＤＮＡは通常、挿入されたＤＮＡの断片を含むベクターの形をとっている。導入されるＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種由来もしくは宿主細胞とは異なる種由来であってよく、または幾らかの外来ＤＮＡおよび幾らかのホモローガスＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列であってもよい。形質転換体および形質転換された（宿主）細胞という語は、転移の回数に拘らず、当該一次細胞およびそれらから誘導される培養を包含する。全ての子孫は、故意のまたは偶然の突然変異のため、ＤＮＡ含量が正確に等しい訳ではないこともまた理解されるであろう。初めに形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的性質を有する突然変異体子孫が包含される。
【００５８】
本明細書中使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という技術は一般に、特許文献１および非特許文献２９に記載のように少量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の断片を増幅する方法を指す。
【００５９】
本明細書中使用される「モノクローナル抗体」という語は、実質上均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、その集団を構成している個々の抗体は、少量存在するかも知れない、天然に存在する可能性のある突然変異を除いて同一である。したがって、修飾語句「モノクローナル」とは、別個の抗体の混合物ではない抗体の性格を示す。モノクローナル抗体は、抗セレクチンリガンド抗体の可変（超可変を含む）ドメインと不変ドメインとのスプライシング（このうち１方だけがセレクチンを指向する）（例えば「ヒト化」抗体）、または軽鎖と重鎖とのスプライシング、または或る種由来の鎖と別の種由来の鎖とのスプライシング、または、供給源の種または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスの指定に拘らず、ヘテロローガスな蛋白との融合、により生成されるハイブリッドおよび組み換え抗体、ならびに抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を包含する。特許文献２、非特許文献３０参照。したがって修飾語句「モノクローナル」は、このような実質上等質な抗体集団から得られるような抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によってその抗体を産生することを必要としていると解釈すべきではない。
【００６０】
「免疫グロブリン」という語は一般に、通常、共に天然の「Ｙ」立体配置でジスルフィド結合している軽鎖または重鎖を含むポリペプチドを指すが、それらの四量体または凝集体を包含するそれらの間の別の結合もまたその範囲内にある。
【００６１】
免疫グロブリン（Ｉｇ）およびそれらの或る変異体は既知であり、多数のものが組み換え細胞培養中で製造されている。例えば、特許文献３、特許文献４、非特許文献３１、特許文献５、特許文献６、非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７、特許文献７、特許文献８、および特許文献９を参照されたい。再構築された免疫グロブリン鎖もまた知られている。例えば、特許文献１０、特許文献１１および特許文献１２ならびにそれらに引用されている文献を参照されたい。本発明に係るキメラの免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができるが、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ３から得る。
【００６２】
ＩＩ．ＨＧＦ変異体の選択
本発明は、ＨＧＦのアミノ酸配列変異体における構造−活性および構造−レセプター結合関係の研究に基づくものである。
【００６３】
本発明に係る或るＨＧＦ変異体は、一本鎖ＨＧＦプロ酵素をインビボでその二本鎖型に変換することのできる酵素による蛋白分解的開裂に対し耐性である。このような酵素はトリプシン様プロテアーゼである。変化の無い時、この蛋白分解的開裂は、野生型ｈｕＨＧＦ配列のＡｒｇ４９４およびＶａｌ４９５の間で起こる。蛋白分解的開裂に対する耐性は、好ましくは、ＨＧＦをその二本鎖型に変換することのできる酵素により認識される領域内、そして好ましくは野生型ｈｕＨＧＦ配列のアミノ酸残基４９３−４９６にあるＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（ＬＲＶＶ）内の部位特異的突然変異誘発によって達成される。本発明に係る変異体は、例えば、野生型ヒトＨＧＦアミノ酸配列中アミノ酸４９３、４９４、４９５および４９６位にまたはこれらに隣接して、単一または複数のアミノ酸置換、挿入または欠失を含んでいてよい。
【００６４】
好ましい変化は、アミノ酸４９４位のアルギニンの、他の任意のアミノ酸、好ましくはグルタミン酸、アスパラギン酸またはアラニンによる置換である。一般に、この位置のアルギニンの、より小さい、非極性のまたは酸性のアミノ酸への置換が一本鎖ＨＧＦ変異体を生成させると信じられている。
【００６５】
これに代わって、またはこれに加えて、４９５位のバリンを別のアミノ酸に置換すると、一本鎖から二本鎖への開裂が遮断されると予想される。よりかさ高いアミノ酸、例えばチロシン、フェニルアラニン等がこの位置での置換に好ましい。
【００６６】
本発明に係る別のＨＧＦ変異体は、ＨＧＦのプロテアーゼドメイン内の部位に変化があり、対応する（好ましくはヒト）野生型ＨＧＦのレセプター結合親和性を実質上完全に保持している。プロテアーゼドメインは野生型ｈｕＨＧＦ配列のアミノ酸４９４位および４９５位の間の開裂部位に続き、既知のセリンプロテアーゼの触媒ドメインと高度の相同性を示す。保存はセリンプロテアーゼの活性部位には適用されない。プロ酵素であるプラスミノーゲンから形成されるヒトプラスミンにおいては、残基Ｈｉｓ４２、Ａｓｐ８５およびＳｅｒ１８１が触媒部位（触媒三つ組）を形成している。この触媒三つ組はセリンプロテアーゼにおいて高度に保存されている。ｈｕＨＧＦアミノ酸配列においては、アスパラギンはアミノ酸５９４位に保持されているが、５３４位（プラスミンの４２位に対応する）はヒスチジンではなくグルタミンにより占められており、そして６７３位（プラスミンの１８１位に対応する）はセリンではなくチロシンにより占められている。ここに記載のプロテアーゼドメイン変化の好ましい群は、アミノ酸６７３位および５３４位の一方または両方を含む。これに代わって、またはこれに加えて、変化はｈｕＨＧＦアミノ酸配列の６９２位にあってよい。全ての例において、この変化は、好ましくは天然ｈｕＨＧＦアミノ酸配列のこれらの位置にある残基が、１またはそれ以上の異なったアミノ酸により置換されたものである。
【００６７】
アミノ酸６７３位のチロシンは、好ましくは、かさ高い芳香族またはヘテロ環部分を持たないアミノ酸によって置換される。このようなアミノ酸は、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グリシン、アラニンおよびバリンを包含する。好ましい変異体において、この位置のチロシンはセリンにより置換されている。
【００６８】
アミノ酸６９２位のバリンは好ましくは極性アミノ酸、例えばセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン、好ましくはセリンにより置換されている。
【００６９】
本発明に係るＨＧＦアミノ酸配列変異体の好ましい群において、６７３位および６９２位の両者が前記アミノ酸のうちの１個、好ましくはセリンにより置換されている。このような変異体はさらにアミノ酸５３４位に変化（好ましくは置換）を含んでいてよい。後者の変化は、野生型ｈｕＨＧＦアミノ酸配列のグルタミンの、ヒスチジンによる置換であってよい。
【００７０】
プロテアーゼドメイン内の単一、二重または三重の突然変異を、野生型ＨＧＦアミノ酸配列中のさらなる変化と合することができる。このようなさらなる変化は、例えば前記のようなＨＧＦ分子の一本鎖から二本鎖への開裂部位またはその周辺とすることができ、実質上一本鎖型である変異体を生成することができる。
【００７１】
さらなる変化は、ＨＧＦ分子のＣ末端またはクリングルドメイン中とすることができる。実施例に開示される欠失突然変異体に加えて、クリングル１ドメイン内に変化を有するＨＧＦ変異体が極めて興味深い。本発明者等は、レセプター結合ドメインがＨＧＦ分子のフィンガーおよびクリングル１領域内に含まれることを見いだしているので、これらのドメイン内のアミノ酸変化は、本発明に係る変異体のレセプター結合性（および生物活性）を有意に変えると予想される。クリングル構造の内部に最も露出している残基の変化（殆どは荷電残基）は特に、ＨＧＦ変異体のレセプター結合性および／または生物活性に著しい変化をもたらすと思われる。
【００７２】
クリングル１ドメイン内の変化は好ましくは、野生型ｈｕＨＧＦアミノ酸配列のアミノ酸１５９、１６１、１９５および１９７位によって定義される区域内、または非ヒトＨＧＦアミノ酸配列の対応する位置にある。別の好ましいアミノ酸変化のための部位は、野生型ｈｕＨＧＦアミノ酸配列の１７３位にある。後者の位置はアミノ酸１５９、１６１、１９５および１９７位により定義される表面に比べ反対側にあり、ＨＧＦの結合性および生物活性へのその関与の理由は、まだ充分明らかにされていない。
【００７３】
本発明の範囲内の幾つかの例示ｈｕＨＧＦ変異体は以下の通りである：Ｒ４９４Ｅ；Ｒ４９４Ｄ；Ｒ４９４Ａ；Ｖ４９５Ｙ；Ｖ４９５Ｆ；Ｒ４９４Ｅ，Ｖ４９５Ｙ；Ｒ４９４Ｅ，Ｖ４９５Ｆ；Ｒ４９４Ｄ，Ｖ４９５Ｙ；Ｒ４９４Ｄ，Ｖ４９５Ｆ；Ｒ４９４Ａ，Ｖ４９５Ｙ；Ｒ４９４Ａ，Ｖ４９５Ｆ；Ｒ４９４［Ｅ］Ｖ４９５；Ｒ４９４［Ｄ］Ｖ４９５；Ｒ４９４［Ａ］Ｖ４９５；Ｒ４９４［Ｙ］Ｖ４９５；Ｒ４９４［Ｆ］Ｖ４９５；Ｒ４９４Ｅ，Ｑ５３４Ｈ；Ｒ４９４Ｅ，Ｙ６７３Ｓ；Ｒ４９４Ｅ，Ｖ６９２Ｓ；Ｒ４９４Ｄ，Ｑ５３４Ｈ；Ｒ４９４Ｄ，Ｙ６７３Ｓ；Ｒ４９４Ｄ，Ｖ６９２Ｓ，Ｒ４９４Ａ，Ｑ５３４Ｈ；Ｒ４９４Ａ，Ｖ６７３Ｓ；Ｒ４９４Ａ，Ｖ６９２Ｓ，Ｒ４９４Ｅ，Ｙ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓ；Ｒ４９４Ｄ，Ｙ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓ，Ｒ４９４Ａ，Ｙ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓ，Ｒ４９４Ｅ，Ｑ５３４Ｈ，Ｙ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓ；Ｒ４９４Ｄ，Ｑ５３４Ｈ，Ｙ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓ；Ｒ４９４Ａ，Ｑ５３４Ｈ，Ｙ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓ；Ｅ１５９Ａ；Ｓ１６１Ａ；Ｆ１６２Ａ，Ｌ１６３Ａ，Ｓ１６５Ａ，Ｓ１６６Ａ；Ｆ１６２Ａ；Ｌ１６３Ａ，Ｓ１６５Ａ，Ｓ１６６Ａ；Ｙ１６７Ｆ；Ｙ１６７Ａ；Ｒ１６８Ａ；Ｑ１７３Ａ；Ｑ１７３Ａ，Ｅ１７４Ａ，Ｎ１７５Ａ；Ｎ１９３Ａ；Ｒ１９５Ａ；Ｒ１９７Ａ；Ｎ１９３Ａ，Ｅ１９５Ａ，Ｒ１９７Ａ；Ｋ５２Ａ；Ｄ５４Ａ；Ｋ５２Ａ，Ｄ５４Ａ；Ｈ１１４Ａ；Ｈ１１４Ａ，Ｅ１１５Ａ，Ｄ１１７Ａ；Ｅ１１５Ａ；Ｄ１１７Ａ；上記変化のいずれかの組合せである変化；上記変化のいずれかを含むΔＫ３および／またはΔＫ４変異体；対応するデルタ５−ｈｕＨＧＦ変異体およびヒト以外の動物ＨＧＦ変異体。
【００７４】
ＩＩＩ．ＨＧＦ変異体の組み立て
部位特異的突然変異誘発を実施するために、例えば非特許文献３８の開示するような当分野で知られる任意の技術を使用することができるが、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発が、本発明に係るＨＧＦ変異体の製造に好ましい方法である。当分野で良く知られているこの方法（非特許文献３９、非特許文献３８参照）は、置換変異体の製造に特に好適であるが、欠失および挿入変異体の製造にも簡便に使用することができる。
【００７５】
認められるように、部位特異的突然変異誘発技術は典型的には、一本鎖型および二本鎖型の両方で存在するファージベクターを使用する。部位特異的突然変異誘発に有用な典型的ベクターは、例えば非特許文献４０に開示されるようなＭ１３ファージのようなベクターを包含する。これらのファージは市販品を容易に入手でき、それらの用途は当業者には一般に良く知られている。これに代わって、一本鎖ファージ複製起点を含むプラスミドベクター（非特許文献４１参照）を使用して一本鎖ＤＮＡを得ることもできる。
【００７６】
オリゴヌクレオチドは、非特許文献４２により記載されるような当分野で良く知られる技術を用いて容易に合成される。
【００７７】
実施例１のＨＧＦ変異体の製造に用いられる特異的突然変異誘発法は、非特許文献４３によって記載された。
【００７８】
１以上のアミノ酸が置換されている突然変異体は幾つかの方法のうちの一つによって生成することができる。もしアミノ酸がポリペプチド鎖において接近しているならば、それらは、所望のアミノ酸置換全てをコードしている１個のオリゴヌクレオチドを用いて同時に突然変異させることができる。しかしながら、もしアミノ酸が互いに幾らかの距離をおいて位置しているならば（例えば１０アミノ酸以上離れている）、所望の変化を全てコードしている単一のオリゴヌクレオチドを作り出すのはより困難である。代わりに、二つの代替法のうち一つを使用することができる。第一の方法では、置換すべきアミノ酸各々について別々のオリゴヌクレオチドを生成させる。次いでこのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングし、そうすると鋳型から合成されるＤＮＡの第二の鎖は所望のアミノ酸置換の全てをコードしているであろう。この代替法は、所望の突然変異体を製造するために２またはそれ以上の突然変異誘発の過程を含む。
【００７９】
野生型ＨＧＦまたは変異体分子をコードしているＤＮＡ配列に突然変異を作る、当分野で知られるもう一つの方法は、出発ＨＧＦ分子をコードしているＤＮＡ配列を、制限酵素による消化によって適当な位置で開裂し、正しく開裂したＤＮＡを回収し、所望アミノ酸配列および平滑端を有するポリリンカーのようなフランキング領域をコードしているオリゴヌクレオチドを合成し（または、ポリリンカーの代わりに、ＨＧＦコード化ＤＮＡの開裂にも使用された制限酵素で合成オリゴヌクレオチドを消化し、それにより粘着端を作り出す）、そしてこの合成ＤＮＡをＨＧＦコード化構造遺伝子の残部にライゲーションすることを含む。
【００８０】
ＰＣＲ突然変異誘発もまた、例えば特許文献１および非特許文献２９に記載のように、本発明に係るＨＧＦ変異体の製造に好適である。以下の考察はＤＮＡに関するものであるが、この技術はＲＮＡにも適用し得るということが理解されるであろう。ＰＣＲ技術は一般に以下の方法を指す。ＰＣＲにおいて少量の鋳型ＤＮＡが出発物質として使用される時、鋳型ＤＮＡ中の対応する領域と配列が僅かに異なるプライマーを使用して、そのプライマーが鋳型と相違する位置においてのみ鋳型配列と異なっている特異的ＤＮＡフラグメントを比較的大量に作り出すことができる。プラスミドＤＮＡに突然変異を導入するためには、プライマーのうち１個は突然変異の位置と一部重複するように、且つその突然変異を含むように設計し；他のプライマーの配列はこのプラスミドの反対の鎖の配列一つながりと同一でなければならないが、この配列は該プラスミドＤＮＡのどこに位置していてもよい。しかしながら、第二のプライマーの配列は第一のプライマーの配列から２００ヌクレオチド以内に位置し、その結果、最終的には、該プライマーを境界とするＤＮＡの増幅された領域全体が容易に配列決定され得ることが好ましい。今述べたようなプライマー対を使用するＰＣＲ増幅は、プライマーにより特定される突然変異の位置で、そして鋳型のコピーは幾分誤りが起こり易いため、ひょっとすると他の位置で異なっているＤＮＡフラグメントの集団を生成する。生成物に対する鋳型の比率が極端に低いと、生成物ＤＮＡフラグメントの大部分は所望の突然変異を組み込む。この生成物は、標準的ＤＮＡ技術を用いて、ＰＣＲ鋳型としての役割を有するプラスミド中の対応領域と置き換えるのに使用される。突然変異体第二プライマーを使用するか、または異なった突然変異体プライマーによる第二のＰＣＲを実施し、得られた二つのＰＣＲフラグメントを同時に三（またはそれ以上）部分ライゲーションでベクターフラグメントにライゲーションすることにより、突然変異を別々の位置に同時に導入することができる。
【００８１】
本発明に係るＨＧＦ変異体をコードしているｃＤＮＡは、さらなるクローニングまたは発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。
【００８２】
好適なベクターは標準的組み換えＤＮＡ法を用いて調製する。分離されたプラスミドおよびＤＮＡフラグメントを開裂させ、整え、特定の順序でライゲーションして所望のベクターを作成する。
【００８３】
ライゲーションの後、ここで挿入された外来遺伝子を有するベクターを適当な宿主細胞中に導入する。形質転換された細胞を、抗生物質、通常は、ベクター上のｔｅｔおよび／またはａｍｐ耐性遺伝子の存在のためにそれらに対し耐性となったテトラサイクリン（ｔｅｔ）またはアンピシリン（ａｍｐ）上での増殖によって選択する。ライゲーション混合物が真核生物宿主細胞中に導入されたならば、形質転換された細胞はＤＨＦＲ／ＭＴＸ系により選択することができる。形質転換された細胞を培養中で増殖させ、次いでプラスミドＤＮＡ（プラスミドとは、目的の外来遺伝子にライゲーションされたベクターを指す）を分離する。次にこのプラスミドＤＮＡを制限地図作成および／またはＤＮＡ配列決定により分析する。ＤＮＡ配列決定は一般に非特許文献４４の方法または非特許文献４５の方法のいずれかによって実施する。
【００８４】
原核生物は、本発明の最初のクローニング工程のための好ましい宿主細胞である。これらは、大量のＤＮＡの迅速な生産、部位特異的突然変異誘発に用いられる一本鎖ＤＮＡ鋳型の生成、多くの突然変異体の同時スクリーニング、および作り出された突然変異体のＤＮＡ配列決定のために特に有用である。本発明に係るＨＧＦ変異体を発現させるためには、真核生物宿主、例えば真核微生物（酵母）および多細胞生物（哺乳動物細胞培養）もまた使用することができる。本発明に係るＨＧＦ変異体の産生において使用するのに好適な原核生物、例えば大腸菌、真核微生物および多細胞生物細胞培養、ならびに発現ベクターは、例えば特許文献１３に開示されている。
【００８５】
クローニングおよび発現方法は当分野で良く知られており、例えば特許文献に開示されている。
【００８６】
哺乳動物細胞が宿主細胞として使用される場合、トランスフェクションは一般に、非特許文献４６に記載されるような燐酸カルシウム沈澱法によって実施する。しかしながら、核注入、電気穿孔、またはプロトプラスト融合といったようなＤＮＡを細胞中に導入するその他の方法もまた好適に用いられる。
【００８７】
宿主として酵母を使用する場合、トランスフェクションは一般に、非特許文献４７に教示されるようにポリエチレングリコールを用いて達成する。
【００８８】
実質的な細胞壁構造を含む原核生物細胞を使用する場合、好ましいトランスフェクションの方法は、非特許文献４８に記載されるような、カルシウムを使用するカルシウム処理、または、より最近では電気穿孔である。
【００８９】
ＨＧＦ変異体は好ましくは分泌蛋白として培地から回収されるが、分泌シグナル無しで直接発現される場合には宿主細胞溶菌液から回収することもできる。この変異体がヒト起源以外の組み換え細胞で発現される場合、その結果この変異体はヒト起源の蛋白を全く持たない。しかしながら、蛋白に関して実質上均質の調製物を得るためには、変異体を組み換え細胞蛋白から精製する必要がある。第一段階として、培地または溶菌液を遠心して粒子細胞断片を除去する。
【００９０】
次に、常套的クロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換、疎水性相互作用、親和、免疫親和クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ；沈澱、例えばエタノール沈澱、硫酸アンモニウム沈澱、または好ましくはセファロースに共有結合させた抗ＨＧＦ（ポリクローナルまたはモノクローナル）抗体による免疫沈降の適当な組合せによって、変異体を、混在する可溶性蛋白から精製する。ヘパリンに対するその高い親和性の故に、ＨＧＦはヘパリン、例えばヘパリン−セファロースカラム上で簡便に精製することができる。当業者には、天然ＨＧＦに適した精製法は、組み換え細胞培養において発現される際のＨＧＦまたはその変異体の性質の変化を考慮した修飾を必要とするということが認識されるであろう。
【００９１】
上記のように、ｈｕＨＧＦは４つの推定的グリコシル化部位を含んでおり、それらはα鎖の２９４および４０２位ならびにβ鎖の５６６および６５３位に位置している。これらの位置はラットＨＧＦアミノ酸配列において保存されている。グリコシル化変異体は本発明の範囲内にある。
【００９２】
ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物基が結合していることを指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物基の酵素結合に対する認識配列である。Ｏ−結合グリコシル化とは、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうち一つがヒドロキシアミノ酸、最も普通にはセリンまたはスレオニンと結合していることを指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまたＯ−結合グリコシル化に含まれ得る。Ｏ−結合グリコシル化部位は、例えばＨＧＦ分子のアミノ酸配列に対し１またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基を付加または置換することにより、修飾することができる。容易にするために、変化は通常、アミノ酸配列変異体に関して上に述べた技術を本質的に使用して、ＤＮＡレベルで施す。
【００９３】
本発明に係るＨＧＦ変異体に対するグリコシドの化学的または酵素的結合を用いて炭水化物置換基の数またはプロフィルを修飾または増加させることもできる。これらの方法は、Ｏ−結合（またはＮ−結合）グリコシル化の可能なポリペプチドの生成を必要としないという点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシ基、（ｃ）遊離ヒドロキシ基、例えばシステインの遊離ヒドロキシ基、（ｄ）遊離スルフヒドリル基、例えばセリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離スルフヒドリル基、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合することができる。これらの方法は、特許文献１４、および非特許文献４９に記載されている。
【００９４】
ＨＧＦ変異体上に存在する炭水化物基は、化学的または酵素的に除去することもできる。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物への暴露を必要とする。この処理は、結合糖以外の殆どのまたは全ての糖の開裂をもたらすが、ポリペプチドは無傷のままである。化学的脱グリコシル化は、非特許文献５０および非特許文献５１により記載されている。炭水化物基は、非特許文献５２により記載されるような種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼによって除去することができる。グリコシル化は、非特許文献５３により記載されるようにツニカマイシンにより抑制される。ツニカマイシンは蛋白−Ｎ−グリコシダーゼ結合の形成を遮断する。
【００９５】
本発明に係るアミノ酸配列変異体のグリコシル化変異体は、適当な宿主細胞の選択によっても生成させることができる。例えば酵母は哺乳動物系とは有意に異なったグリコシル化を導入する。同様に、セレクチン変異体の供給源とは異なった種（例えばハムスター、マウス、昆虫、豚、牛または羊）または組織（例えば肺、肝臓、リンパ、間葉または表皮）の起源を有する哺乳動物細胞が、変異体にグリコシル化を導入する能力について常套的にスクリーニングされている。ＨＧＦ変異体分子の共有結合的修飾は本発明の範囲内に包含される。このような修飾は、ＨＧＦ変異体の標的アミノ酸残基を、選ばれた側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体生成試薬と反応させることによって、または選ばれた組み換え宿主細胞に機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって、常套的に導入される。得られた共有結合的誘導体は、生物活性、ＨＧＦ変異体のイムノアッセイ、または組み換え糖蛋白の免疫親和精製用の抗ＨＧＦ抗体の製造、に重要な残基の同定を目的とする計画に有用である。例えば、ニンヒドリンとの反応後のこの蛋白の生物活性の完全な失活は、少なくとも一つのアルギニンまたはリジン残基がその活性のために決定的であることを示唆し、その後、選択された条件の下で修飾された個々の残基が、その修飾されたアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントの分離によって同定される。このような修飾は当分野における通常の知識の範囲内にあり、過度の実験をすることなく実施される。
【００９６】
二官能試薬による誘導体形成は、ＨＧＦ変異体の分子内凝集体の製造、ならびに検定または親和精製への使用のためにＨＧＦ変異体を水不溶性支持体マトリックスまたは表面に架橋させるために有用である。さらに、鎖間架橋の研究は、コンホメーション構造についての直接的情報を提供するであろう。一般的に使用される架橋試薬は、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、ホモ二官能イミドエステル類、および二官能マレイミド類を包含する。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体生成試薬は、光の存在下で架橋を形成することのできる光活性化中間体を生成させる。別法として、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性水不溶性マトリックスおよび特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１および特許文献２２に記載の系反応性基質も、蛋白の固定化および架橋に使用される。
【００９７】
或る種の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば翻訳後脱アミド化されて対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基となる。これとは別にこれらの残基は緩和な酸性条件下で脱アミド化される。これら残基のいずれの型も本発明の範囲内にある。
【００９８】
その他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシ化、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基のホスホリル化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が包含される（非特許文献５４参照）。
【００９９】
その他の誘導体は、非蛋白性ポリマーに共有結合で結合した本発明に係る新規ＨＧＦ変異体を含む。非蛋白性ポリマーは通常、親水性合成ポリマー、即ち天然では見いだされないポリマーである。しかしながら、天然に存在し、組み換えまたはインビトロ法によって生成されるポリマーは、天然から単離されるポリマーと同様に有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンは本発明の範囲内にある。特に有用なのは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールのようなポリビニルアルキレンエーテル類である。
【０１００】
ＨＧＦ変異体は、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７または特許文献２８に開示される方法によって、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン類のような種々の非蛋白性ポリマーと結合させることができる。
【０１０１】
ＨＧＦ変異体は、例えばコアセルベーション技術または界面重合により製造されるマイクロカプセルに、コロイド薬物デリバリー系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに捕捉することができる。このような技術は非特許文献５６に開示されている。ＨＧＦ変異体配列は、前記に定義された免疫グロブリン不変ドメイン配列に結合させることができる。得られた分子は一般に、ＨＧＦ変異体−免疫グロブリンキメラと称する。このようなキメラは、本質的には特許文献２９に記載のように組み立てることができる。
【０１０２】
通常、ＨＧＦ変異体は、免疫グロブリンの不変領域のＮ末端に、可変領域に代わってＣ末端が融合するが、セレクチン変異体のＮ末端融合もまた望ましい。好ましくは、ＨＧＦ変異体の貫膜領域は融合の前に不活性化または欠失される。
【０１０３】
典型的には、このような融合は、少なくとも、免疫グロブリン重鎖の不変領域の機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持する。融合は、さらに、不変ドメインのＦｃ部分のＣ末端に、または重鎖のＣＨ１もしくは軽鎖の対応領域のＮ末端に直接行なわれる。これは通常、適当なＤＮＡ配列を組み立て、それを組み換え細胞培養中で発現させることによって達成する。しかしながら別法として、本発明に係るＨＧＦ変異体−免疫グロブリンキメラを既知の方法に従って合成することもできる。
【０１０４】
融合がなされる正確な部位は重要でない。個々の部位は良く知られており、ＨＧＦ変異体の生物活性、分泌または結合特性を最適とするように選択することができる。
【０１０５】
幾つかの態様において、ハイブリッド免疫グロブリンは、本質的には特許文献２９に例示されるように、単量体、またはヘテロもしくはホモ多量体として、そしてとりわけ四量体の二量体として組み立てられる。
【０１０６】
好ましい態様においては、ＨＧＦレセプターのための結合部位を含む配列のＣ末端を、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＧ１のエフェクター機能を含む、抗体のＣ末端部分（特にＦｃドメイン）のＮ末端に融合させる。重鎖不変領域全体をレセプター結合部位を含む配列に融合させることは可能である。しかしながら、より好ましくは、パパイン開裂部位（これはＩｇＧ　Ｆｃを化学的に規定し、重鎖不変領域の最初の残基を１１４とする時の残基２１６［コベット等、上記］、または他の免疫グロブリンの類似部位である）のすぐ上流のヒンジ領域で始まる配列を融合に使用する。特に好ましい態様においては、レセプター結合部位を含むアミノ酸配列を、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３重鎖のヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３またはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインと融合させる。融合が行なわれる正確な部位は重要でなく、最適な部位は常套的な実験により決定することができる。
【０１０７】
ＨＧＦ変異体−免疫グロブリンキメラは、例えば、プロテインＡ精製、免疫組織化学、および免疫沈降技術において、抗ＨＧＦ抗体に代わって使用することができ、ＨＧＦ−ＨＧＦレセプター相互作用の阻害剤のスクリーニングを容易にすることができる。治療学的には、これらは対応するＨＧＦ変異体分子と比較して、より長い半減期といったような利点を付与することが期待される。
【０１０８】
ＩＶ．治療用組成物
増強されたレセプター結合親和性を有するＨＧＦ変異体を使用して、野生型ＨＧＦがそのレセプターに結合することを遮断することができる。これにより、ＨＧＦレセプターの活性化に付随する病理学的状態、例えば慢性のＨＧＦレセプター活性化に付随する悪性腫瘍の処置が可能となる。
【０１０９】
本発明に係る化合物は、ＨＧＦ生成物を薬学上許容し得る担体と合することによる既知の方法に従って調合し、薬学上有用な組成物を製造することができる。好適な担体およびそれらの製剤は、非特許文献５６に記載されている。これらの組成物は、典型的には、ＨＧＦ変異体の有効量、例えば約０．５ないし約１０ｍｇ／ｍｌ程度を適当量の担体と共に含有させ、患者への有効な投与に好適な薬学上許容し得る組成物を製造する。変異体は、非経口的に、または有効な形で血流まで運搬されることが確実な他の方法によって投与することができる。
【０１１０】
本発明の実施に使用されるＨＧＦ変異体の臨床投与に特に適した組成物は、無菌水溶液または凍結乾燥蛋白のような無菌の水和され得る粉末を包含する。典型的には、適当量の薬学上許容し得る塩もまた、その製剤を等張とするために、製剤中に使用される。
【０１１１】
本発明に係る薬用組成物の用量および所望の薬物濃度は、構想される個々の用途に応じて変わり得る。ラットの実験における典型的な有効用量は、静脈内ボーラス注射として投与される約２５０μｇ／ｋｇである。当分野で知られる、例えば非特許文献５７およびそこに引用されている参考文献に開示されるような方法で、用量の種間比較を行なうことができる。
【０１１２】
以下の実施例は本発明の実施のために現在考えられる最良の様式を例示するに過ぎず、本発明を限定するものと解すべきではない。
【０１１３】
【実施例】
Ｖ．実施例
プロホルモンからα／β二量体への開裂ならびにクリングルおよびプロテアーゼ様ドメインの構造的および機能的重要性を決定するため、一連の組み換えｈｕＨＧＦ（ｒｈｕＨＧＦ）変異体を生成させた。突然変異は、ＣＭＶを基礎とする発現プラスミドでｈｕＨＧＦ　ｃＤＮＡ中に導入し、各変異体を発現しているヒト２９３細胞の安定な集団からの条件培地を、ＨＧＦ変異体の大きさおよび発現のレベルを監視するためのウェスタンブロッティングによって検定した。
【０１１４】
各ｈｕＨＧＦ誘導体の濃度を二つの型のサンドイッチＥＬＩＳＡ検定により確認した。ＥＬＩＳＡにより判明した発現レベルの相違はウェスタンブロット上に観察された相違と相関した。殆どの変異体について、発現のレベルは１−５ｍｇ／ｍｌの範囲であった。発現レベルが０．６ｍｇ／ｍｌより低い変異体については、その条件培地を濃縮した。
【０１１５】
次に、一次培養中の肝細胞における分裂促進活性およびＨＧＦレセプターに結合する能力を測定した。ＨＧＦレセプターの細胞外ドメインをヒトＩｇＧの不変領域（Ｆｃ）に融合させ、結合を溶液中で実施した。
【０１１６】
ｒｈｕＨＧＦ変異体の組み立て、検定方法および種々の突然変異体によって得られた結果の分析を以下の実施例に記載する。
【０１１７】
実施例１
ｈｕＨＧＦ変異体の組み換え生成
Ａ．部位特異的突然変異誘発
プラスミドＤＮＡの分離、ポリアクリルアミドおよびアガロースゲル電気泳動を、非特許文献３８に開示されるように実施した。
【０１１８】
ＣＭＶプロモーターを有する哺乳動物発現プラスミドｐＲＫ５．１（ジェネンテク・Ｉｎｃ．）を、培地中にＨＧＦ変異体の分泌をさせるｈｕＨＧＦの突然変異誘発に使用し、生物活性および結合について直接検定した。この発現ベクターはｐＲＫ５の誘導体であり、その組み立ては、特許文献３０に開示されている。このｐＲＫ５．１ベクターをコードしているヌクレオチド配列を図５−７（配列番号１）に示す。
【０１１９】
使用されたｈｕＨＧＦ　ｃＤＮＡは、前に公開された７２８アミノ酸型に相当する（非特許文献７参照）。
【０１２０】
突然変異誘発は、入手し得る市販の大腸菌ｄｕｔ−　ｕｎｇ−菌株を用い、クンケルの方法に従って実施した（非特許文献４３）。インビトロ突然変異誘発およびプライマーの配列決定に用いられるオリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステム・３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を使用し、記載のようにして調製した（非特許文献５８）。所望の突然変異体を作り出すために、所望のアミノ酸置換をコードしている配列のオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーとして使用した。このオリゴヌクレオチドを、標準的方法によって生成された一本鎖ｐＲＫ５１−ｈｕＨＳＡとアニーリングした（非特許文献５９）。
【０１２１】
３種のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）、およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物を、製造者によりキットで供給されるｄＣＴＰ（ａＳ）と呼ばれる修飾チオ−デオキシリボヌレオシンと合し、一本鎖ｐＲＫ５．１−ｈｕＨＧＦに加え、これに該オリゴヌクレオチドをアニーリングした。
【０１２２】
この混合物にＤＮＡポリメラーゼを加えると、突然変異を受けた塩基以外はｐＲＫ５．１−ｈｕＨＧＦと同一のＤＮＡ鎖が生成した。さらに、この新たなＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ（ａＳ）を含み、これが制限エンドヌクレアーゼ消化から保護する役割を果たした。ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素で切れ目を入れた後、この鋳型鎖をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼにより、突然変異誘発オリゴマーを含む領域を過ぎて消化した。次いで分子のハット（ｈａｔ）を部分的に一本鎖にしたまま反応を停止した。次に、４種の全デオキシリボヌクレオチド三燐酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガーゼの存在下で、完全な二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖分子をＤＮＡポリメラーゼによって生成させた。
【０１２３】
以下のオリゴヌクレオチドを調製し、ｐＲＫ５．１−ｈｕＨＧＦ変異体分子の生成のためのプライマーとして使用した：
Ｒ４９４Ｅ　ｈｕＨＧＦ：ＴＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＴＴＴＡＣＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＧＴＴＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＧＡＴ
（配列番号２）
Ｒ４９４Ｄ　ｈｕＨＧＦ：ＧＡＡＴＣＣＣＡＴＴＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＡＡＴＴＧＴＴＴＣＧ
（配列番号３）
Ｒ４９４Ａ　ｈｕＨＧＦ：ＣＣＣＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＴＴＴＣＧ
（配列番号４）
Ｑ５３４Ｈ　ｈｕＨＧＦ：ＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣＡ
（配列番号５）
Ｙ６７３Ｓ　ｈｕＨＧＦ：ＡＧＴＧＧＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴ
（配列番号６）
Ｖ６９２Ｓ　ｈｕＨＧＦ：ＴＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＧＡＣＡＣ
（配列番号７）
ΔＫ１　ｈｕＨＧＦ：ＧＣＡＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＧＡＧＴＴＴＣＴＡＡＴＧＴＡＧＴＣ
（配列番号８）
ΔＫ２　ｈｕＨＧＦ：ＣＡＴＡＧＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＧＡＡＣＡ
（配列番号９）
ΔＫ３　ｈｕＨＧＦ：ＴＣＣＡＴＧＴＧＡＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＡ
（配列番号１０）
ΔＫ４　ｈｕＨＧＦ：ＴＧＴＧＧＴＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＡ
（配列番号１１）
Ｎ−３０３　ｈｕＨＧＦ：ＡＣＣＴＴＧＧＡＴＧＣＡＴＴＡＡＧＴＴＧＴＴＴＣ
（配列番号１２）
Ｎ−３８４　ｈｕＨＧＦ：ＴＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＡＴＴＡＡＴＣＡＣＡＧＴ
（配列番号１３）
α−鎖：ＧＴＴＣＧＴＧＴＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＴＴＡＣＣＴＡＴＣＧＣＡＡＴＴＧ
（配列番号１４）
【０１２４】
Ｙ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓ　ｈｕＨＧＦ変異体は、この２つの突然変異を作るために用いられる両方のオリゴヌクレオチドを使用し、鋳型としての野生型ｈｕＨＧＦから得た。
【０１２５】
上のプロトコルを用いて生成された突然変異体ｈｕＨＧＦ組み立て物を、コンピテントな細胞の調製および形質転換のための標準的塩化カルシウム法（非特許文献３８参照）を用いて、大腸菌宿主菌株ＭＭ２９４ｔｏｎＡに導入した。ＭＭ２９４ｔｏｎＡ（これはＴ１ファージに対して耐性である）は、Ｔｎ１０トランスポゾンのｔｏｎＡ遺伝子への挿入およびこれに続く不正確な切取りによって調製された。次いでこの遺伝子を、トランスポゾン挿入突然変異誘発（非特許文献６０）を用いて大腸菌宿主ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）に挿入した。
【０１２６】
サムブルック等、上記、の標準的ミニプレプ法を用いた細菌形質転換体の個々のコロニーからのＤＮＡ抽出物。このプラスミドをセファクリルＣＬ６Ｂスピンカラムを通過させることによりさらに精製し、次いで、配列決定ならびに制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１２７】
Ｂ．ヒト胚腎臓２９３細胞のトランスフェクション。
正しい配列を有するプラスミドを用いてヒト胎児腎２９３細胞を燐酸カルシウム法によってトランスフェクトした。２９３細胞は６ウェルプレートに７０％密集となるまで増殖させた。ｈｕＨＧＦプラスミドＤＮＡ変異体２．５μｇを１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ　ＣａＣｌ２（１５０μｌ）に溶解した。ここに５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　ＮａＰＯ４（１５０μｌ）を加え（攪拌しながら滴下する）、２５℃で１０分間沈澱を生成させた。次いで、懸濁した沈澱を、６ウェルプレート中の個々のウェルに入った細胞に加えた。細胞の単層をこのＤＮＡ沈澱の存在下に４時間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、無血清培地で７２時間培養した。安定な集団が形成されたならば、ＨＧＦｃＤＮＡを、エピソーム性ＣＭＶ駆動発現プラスミドｐＣｉｓＥＢＯＮにサブクローニングした（製造はＧ．カシアンス、Ｃ．ホー、Ｒウェーバー、Ｓ．ウィリアムズ、Ｄ．ゲッデルおよびＤ．リュング）。ｐＣｉｓＥＢＯＮはｐＲＫ５誘導体であって、その基礎となっているヌクレオチド配列は図８−１３（配列番号１５）に示されている。この集団をネオマイシン選択培地で直接選択した。
【０１２８】
実施例２
検定方法
他のいかなる既知の成長因子とも似ていない構造の分子であるＨＧＦの多面的活性に鑑み、この因子とそのレセプターとの分子相互作用を理解することが重要である。実施例１に記載のように生成されたｈｕＨＧＦ変異体を、一次培養中で肝細胞のＤＮＡ合成を誘導する能力、およびｈｕＨＧＦレセプターの可溶性型との結合について競合する能力を分析した。
【０１２９】
Ａ．野生型ｈｕＨＧＦおよびｈｕＨＧＦ変異体の蛋白定量
二つのモノクローナル抗体を用いる特異的二部位ｈｕＨＧＦサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、野生型組み換えｈｕＨＧＦ（ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦ）、一本鎖およびプロテアーゼ置換変異体を定量した。微量定量プレート（マキシソーブ、ナンク）を、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６に入れた１０ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗ｒｈｕＨＧＦ抗体Ａ３．１．２（ＩｇＧ２ａ表現型、親和性：３．２ｘ１０−８ｍｏｌ）で、４℃で一夜被覆した。プレートを、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ（シグマ）、０．０１％チメロサール、ｐＨ７．４で遮断し、引続き洗浄した後、連続希釈したＨＧＦ試料を二つずつ調製し、平行してＣＨＯ−発現されたｒｈｕＨＧＦ（４０−０．１ｎｇ／ｍｌ）を標準として使用した。これら希釈液５０μｌを、１：１５００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたモノクローナル抗ｒｈｕＨＧＦ抗体Ｂ４．３（ＩｇＧ１表現型、親和性：１．３ｘ１０−８ｍｏｌ）５０ｍｌと共にＲＴで２時間同時にインキュベートした。０．０４％ｏ−フェニレンジアミン−ジヒドロクロリド（シグマ）および０．０１２％（ｖ／ｖ）過酸化水素（シグマ）をＰＢＳに加えることにより、基質を調製し、１００ｍｌを、洗浄したプレートにＲＴで１５分間加えた。各ウェルに２．２５Ｍ硫酸５０ｍｌを加えることにより、反応を停止させた。４０５ｎｍにおける吸光度をバックグラウンドとして差し引いた４９０ｎｍにおける吸光度を、微量定量プレート読み取り機で測定した（Ｖｍａｘ、モレキュラー・ディヴァイシズ、メンロ・パーク、ＣＡ）。このデータをジェネンテク・Ｉｎｃ．の開発した四パラメータ曲線当てはめプログラムを用いて変形した。
【０１３０】
ＨＧＦポリクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、全てのクリングル欠失およびＣ末端切除変異体を定量した。簡潔に述べると、微量定量プレート（ナンク）を、５ｍｇ／ｍｌのモルモットポリクローナル（抗ＣＨＯ発現ｒｈｕＨＧＦ）ＩｇＧ抗体調製物（ジェネンテク・Ｉｎｃ．）で上記のように被覆した。この抗体は、ウェスタンブロットの目視調査と比較する時、ＨＧＦ先端切除型のみならずｒｈｕＨＧＦをも認識するので、ＨＧＦ変異体の監視に理想的である。プレートを遮断し、２９３細胞上清の２倍連続希釈液（１：１０３−６．１０６）を加え、４℃で一夜インキュベートした。精製されたＣＨＯ発現ｒｈｕＨＧＦ（１００−０．７８ｎｇ／ｍｌ）を標準として使用し、平行してインキュベートした。プレートを洗浄し、同じポリクローナル抗体の１：５００希釈（およそ４００ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートしたが、この場合は、変異体の検出のため西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートさせた（上記を参照されたい）。ウェスタンブロッティングを実施して、発現されたＨＧＦ変異体の大きさを測定した。これについては、標準的方法を用い、ポリクローナルＩｇＧ抗体調製物（５００ｎｇ／ｍｌ）を使用してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングを実施した。化学ルミネセンス検出法（アマーシャム）およびヤギ抗モルモットＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（１：５０００）を、製造者の記載に従ってブロットの発色に使用した。
【０１３１】
Ｂ．可溶性ＨＧＦレセプター結合検定
ＨＧＦの肝細胞への結合に関する先の研究は、ｈｕＨＧＦが高い親和性でその細胞表面レセプターに結合できることを示した（Ｋｄ〜２４−３２ｐＭ；非特許文献６１参照）。本発明者等は、細胞表面硫酸ヘパリンプロテオグリカンへのＨＧＦの非特異的結合の故に、可溶性型のレセプターを用いてＨＧＦ結合を調べることを選んだ（非特許文献６２参照）。
【０１３２】
細胞上清（もし濃度が６００ｎｇ／ｍｌより低ければアミコンフィルターで濃縮する）を、２９３細胞から発現され分泌される、ヒトＩｇＧのＦｃ不変領域に融合させたヒトＨＧＦレセプター（ｈｕＨＧＦｒ）の細胞外ドメインへの、ＣＨＯ発現１２５Ｉ　ｒｈｕＨＧＦ（２−５ｘ１０３Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、Ｔ．ジオンチェク、ジェネンテク・Ｉｎｃ．の好意により提供された）の結合を溶液内で遮断する能力について試験した。
【０１３３】
１．ｈｕＨＧＦｒ−ＩｇＧキメラの組み立て
ｈｕＨＧＦｒをコードしている全長のｃＤＮＡクローンを、ｃＤＮＡライブラリーおよびＰＣＲ増幅から分離された部分的ｃＤＮＡを結合することにより組み立てた。アミノ酸１−２７０に対するコード化配列を、５０量体のオリゴヌクレオチド（５’−ＡＴＧＡＡＧＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣ−３’）（配列番号１６）でスクリーニングされたヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｔ．メイソン、ジェネンテクにより提供された）から分離した。アミノ酸８０９−１３９０をコードしている配列は、オリゴヌクレオチドプローブ（５’−ＣＡＣＴＡＧＴＴＡＧＧＡＴＧＧＧＧＧＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＣＡＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡ　ＣＣＧＴ−３’）（配列番号１７）でスクリーニングされたヒト肝臓ライブラリー（ストラガジェン）から分離された。
【０１３４】
ライブラリーの平板培養、ハイブリダイゼーションおよびフィルターの洗浄に対する条件は記載の通りであった（非特許文献６４参照）。ＰＣＲを用いて、Ａ５４９細胞からＨＧＦｒの残基２７１−８０８を含むｃＤＮＡクローン（ｃ−ｍｅｔ）を分離した。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素およびベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズにより供給された緩衝液を使用する１００μｌの反応中で、ＨＧＦｒに対し特異的なプライマー（５’−ＴＡＧＴＡＣＴＡＧＣＡＣＴＡＴＧＡＴＧＴＣＴ−３’）（配列番号１８）を用いる逆転写に、１０μｇの総ＲＮＡを使用した。この反応混合物の１０分の１をＰＣＲ増幅に使用した。このＰＣＲ反応は、１０μｌの逆転写反応液、１０ｍＭ　ＫＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ（ＮＨ４）ＳＯ４、６ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、１ＵのヴェントＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）、ならびに前進プライマー（５’−ＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＧＴＣＣＡＡＡＧ−３’）（配列番号１９）および逆行プライマー（５’−ＣＡＧＧＧＧＧＡＧＴＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴ−３’）（配列番号２０）各々５０ｐｍｏｌを含有する１００μｌ容量で実施した。３０サイクルの変性（９５℃１分間）、アニーリング（５５℃４５秒間）および伸長（７２℃２分間）の後、ＰＣＲ生成物を低融解温度アガロースゲルから回収した。全長のＨＧＦｒ　ｃＤＮＡをベクターｐＲＫ７にサブクローニングし（特許文献１３参照）、二本鎖ＤＮＡ配列決定をジデオキシヌクレオチド法により実施した。
【０１３５】
ｈｕＨＧＦｒの細胞外ドメインのコード化配列を、二段階の工程でヒトＩｇＧ１重鎖のそれに融合させた。ＰＣＲを用いて、ＨＧＦｒアミノ酸９２９のコード化配列に対する３’に唯一のＢｓｔＥＩＩ部位を有するフラグメントを生成させた。７２℃で３分間の伸長時間、および４０ｎｇの全長ＨＧＦｒ発現ベクターを鋳型として使用する外は上記のようにして、５’プライマー（ベクター中、ＨＧＦｒコード化配列の上流に位置する）および３’プライマー（５’−ＡＧＴＴＴＴＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＡＴＣＡＴＴＣＴＧＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’）（配列番号２１）を、１００μｌの反応中で使用した。増幅の後、このＰＣＲ生成物をこの組み立て物の唯一のＢｓｔＥＩＩ部位を介してヒトＩｇＧ−γ１重鎖ｃＤＮＡに結合させた（非特許出願６４参照）。得られた組み立て物は、ＢｓｔＥＩＩ部位（アミノ酸ＶおよびＴのコード化配列を添加する）を介してヒトＩｇＧ−γ１重鎖のアミノ酸２１６−４４３のコード化配列に融合された、ｈｕＨＧＦｒのアミノ酸１−９２９のコード化配列を含んでいた。この組み立て物の配列決定は上記のように実施した。
【０１３６】
２．結合検定
ウサギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ特異抗体（ジャクソン・イミュノリサーチ）１ｍｇ／ｍｌにより４℃で被覆した分割可能な微量定量プレート（ナンク）で結合検定を実施し、プレートを０．０５％トゥイーン２０（バイオラド）を含有するＰＢＳで注意深く洗浄した。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで遮断した後、この同じ緩衝液に、ウェル当り２５ｍｌの５０ｐＭ　１２５Ｉ−ｒｈｕＨＧＦを加えた。各ウェルに、５０ｍｌの細胞上清の連続希釈液（１：２５−１：６０００）、精製したＣＨＯ発現ｒｈｕＨＧＦ（２５０００−０．０６４ｐＭ）または培地を全く同じように加えた。続いて、５０ｐＭのＨＧＦレセプター：ＩｇＧ融合蛋白２５ｍｌを加え、プレートを穏やかに振盪しながらインキュベートした。４時間後、平衡に達した時にプレートを洗浄し、ウェルをガンマカウンターで個別に計数した。非特異的に結合した放射活性の量は、ＨＧＦレセプター：ＩｇＧを５００倍過剰の非標識ｒｈｕＨＧＦとインキュベートすることによって判断した。各類似体の解離定数（Ｋｄ）を、ＥＬＩＳＡにより決定されたｈｕＨＧＦ濃度を使用し、本質的には記載のようにして（非特許出願６５）、当てはめられた阻害曲線からＩＣ５０において算出した。
【０１３７】
Ｃ．生物学的検定
ＷＴ　ｈｕＨＧＦおよび変異体の生物活性を、一次培養中のラット肝細胞のＤＮＡ合成を誘導する能力によって測定した。肝細胞は、公開されている灌流技術に少しの改良を加えて分離した（非特許出願６６）。簡潔に述べると、雌のスプラーグ・ドーレイラット（１６０−１８０ｇ）の肝臓を、０．０２％コラゲナーゼＩＶ型（シグマ）を含有する無Ｃａ＋＋Ｈｅｐｅｓ緩衝化塩水１００ｍｌにより、門脈から灌流した。２０分後、この肝臓を摘出し、緩衝液に入れ、穏やかに攪拌して肝細胞を結合組織および血管から分離し、ナイロンメッシュで濾過した。次に、細胞を遠心により洗浄し、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、微量元素（０．０１％）、トランスフェリン（１０ｍｇ／ｍｌ）およびアプロチニン（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するウィリアムズ培地Ｅ（ジブコ）中に１ｘ１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。精製されたＣＨＯ発現ｒｈｕＨＧＦ（１−０．０３１ｍｇ／ｍｌ）、２９３上清（１：４−１：２５６）または培地のいずれかの２倍連続希釈液の存在下で、肝細胞を９６ウェル微量定量プレート（ファルコン）中でインキュベートした。３７℃で４８時間インキュベートした後、０．５ｍＣｉの３Ｈ−ＴｄＲ（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、アマーシャム）を各ウェルに加え、さらに１６時間インキュベートした。細胞を濾紙上に収穫し、これを洗浄し、乾燥し、シンチレーション液の添加後、ベックマン計数機で計数した。それぞれのｈｕＨＧＦ変異体について、単位／ｍｇで表現される非活性（ＳＡ）を、ＥＬＩＳＡで得られるＨＧＦ濃度を用いた半最大増殖（１単位／ｍｌとして定義する）において算出した。
【０１３８】
Ｄ．Ａ５４９細胞上でのチロシンホスホリル化の誘導
ヒト肺癌腫細胞（Ａ５４９）の単層を、１０％牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下に３７℃で維持した。血清涸渇細胞を２００ｎｇ／ｍｌ　ｒｈｕＨＧＦと共にまたは無しで３７℃で５分間インキュベートし、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤の混合物を含有する溶菌緩衝液で抽出した。この溶菌液を抗Ｍｅｔ　ＣＯＯＨ抗体によって免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体でブロッティングした（上記のウェスタンブロッティングを参照されたい）。
【０１３９】
実施例３
開裂部位突然変異体の分析
プロテアーゼの開裂部位は、通常、Ｐ１位に塩基性残基を、そしてＰ’１位およびＰ’２位に二つの疎水性アミノ酸残基を含み、これらは開裂されるペプチド結合の後に続いている。提唱されたｈｕＨＧＦの開裂部位（Ｐ１　Ｒ４９４、Ｐ’１　Ｖ４９５、Ｐ’２　Ｖ４９６）はこの意見に合致する。本発明者等は、Ｐ１　Ｒ４９４をＤ、Ｅ、またはＡのいずれかに置換することによりｈｕＨＧＦの開裂を遮断しようと試みた。これらの細胞において発現されるＷＴ　ｒｈｕＨＧＦの主要な型は、見かけの分子量６９ｋＤａを有するα鎖の存在により判断されるような二本鎖の物質に開裂される（図２）。還元条件下においてこれらの変異体は単一のバンドとして、予想される一本鎖ＨＧＦの大きさ９４ｋＤａに移動することから、これらの突然変異の各々はｒｈｕＨＧＦのプロセシングを遮断するらしく思われた。これらの変異体は、一次培養中の肝細胞の増殖を誘導する能力を全く欠いていた（図３Ａ）。しかしながら、これらの変異体を、ＨＧＦレセプター：ＩｇＧ融合蛋白との結合についてＷＴ　ｒｈｕＨＧＦと競合する能力を分析すると、それらの阻害曲線はＷＴ　ｒｈｕＨＧＦのそれと大体似かよっていた（図３Ｂ）。これらの曲線から決定されたＫｄは、ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦが高い親和性（５０−７０ｐＭ）でこの融合蛋白に結合することを示し、一方、全ての一本鎖変異体はＷＴ　ｒｈｕＨＧＦと比較しておよそ２ないし１０倍のＫｄ（１００−５００ｐＭ）を示した。ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦと比較した残余の肝細胞増殖活性およびレセプター結合能力としての、少なくとも三つの独立した検定の結果を第Ｉ表にまとめる。
【０１４０】
本発明者らの結合研究は、ＷＴｒｈｕＨＧＦが、ヒグチおよびナカムラ（１９９１）により肝細胞上に見いだされたものに類似の、単一クラスの高親和性結合部位（５０−７０ｐＭ）を有する可溶性レセプター融合蛋白と結合することを示した。しかしながら、この可溶性レセプターは実際には、ＩｇＧＡのＦｃ部分にあるヒンジのジスルフィド橋によって結合している二量体であることから、細胞上でのＨＧＦの結合は多少異なっているかも知れない。
【０１４１】
全ての一本鎖変異体の特異活性（ＳＡ）対Ｋｄ比の直接比較は、これらが、試験された最高濃度において不活性であり（ＳＡ＜３％）、一方レセプター結合親和性は２−３の因子によって低下するのみであることを示した。
【０１４２】
これらの結果は、ＨＧＦの二本鎖型への開裂が分裂促進活性に必要であること、即ち、一本鎖ＨＧＦはプロマイトジェンであって、ＨＧＦの非開裂型は、親和性は低いものの、ＨＧＦレセプターに結合することを、強く立証している。
【０１４３】
胎盤から分離された（非特許文献６７参照）またはトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中で発現された（非特許出願６８参照）ＨＧＦの主要な型は、一本鎖型である。分裂促進検定で試験する時、この一本鎖型のＨＧＦは生物学的に活性であることが見いだされている。本発明者等のデータと共に考え合わせると、この事は、この一本鎖ＨＧＦは分裂促進検定の間は活性化されて二本鎖型となっていることを示唆している。
【０１４４】
第二の所見は、本発明者等の競合結合検定により示唆されたように、一本鎖変異体はＨＧＦレセプターと結合する実質的な能力を保持しているということである。この事により、一本鎖ＨＧＦは不活性な状態で細胞表面ＨＧＦレセプターにインビボで結合し、その後適当なプロテアーゼにより活性な二本鎖型に開裂され得るという興味深い可能性が出てくる。
【０１４５】
実施例４
プロテアーゼドメイン突然変異の影響
ＨＧＦのプロテアーゼドメインの機能的重要性を解明するために、可能性あるセリンプロテアーゼ活性部位を再構成するための単一、二重および三重突然変異を実施した。これらの変異体の組み立ては実施例１に記載されている。
【０１４６】
本発明者等は、単一、二重または三重突然変異のいずれかとして、ＨＧＦ残基Ｑ５３４をＨに、Ｙ６７３をＳに、またはＶ６９２をＳに置き換えた。分裂促進活性およびレセプター結合に及ぼすそれらの影響の分析は、単一突然変異Ｑ５３４Ｈはｗｔ　ｒｈｕＨＧＦ（それぞれ３．３　１０４単位／ｍｇおよび７０ｐＭ）と比較した場合、ＳＡ（５．２ｘ１０４単位／ｍｇ）またはＫｄ（６０ｐＭ）のいずれをも有意に変化させないが、一方Ｙ６７３ＳおよびＶ６９２Ｓは、ＳＡをそれぞれおよそ５および１０倍低下させることを示した。実際これら二つの変異体は、ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦについて見られる最大プラトーに到達することはなかった（ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦプラトーのおよそ５０％）。興味深いことに、これらの変異体はＷＴｒｈｕＨＧＦと類似のＫｄを示した。他の二重および三重変異体も全てＨＧＦレセプターを結合させる能力を保持していたが、明らかに低下したＳＡを示した（第Ｉ表）。二重変異体Ｑ５３４Ｈ，Ｙ６７３ＳおよびＹ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓならびに三重変異体Ｑ５３４Ｈ，Ｙ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓの残余ＳＡは、ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦと比較して３％より低かった。しかしながら、これらの変異体のＫｄはＷＴ　ｒｈｕＨＧＦと有意に異なってはいなかった（第Ｉ表）。これらの変異体は、ＨＧＦのβ鎖内部の突然変異は分裂促進活性を遮断するが、それでも尚これらはＨＧＦレセプターに結合できることを示している。したがって、これらの突然変異体は、レセプター結合に続く活性の点では不完全である。
【０１４７】
これらの結果は、β鎖はレセプター結合にとって必要ではないが、或る残基（例えばＹ６７３およびＶ６９２）はＨＧＦの構造および／または活性にとって決定的であることを示している。極性残基Ｓによる非極性残基Ｖ６９２の置換は、セリンプロテアーゼにおいて見いだされるように活性部位残基Ｄ５９４に対する新たな水素結合が導入されたならば、構造的トランジションをもたらしたのかも知れない。より小さい残基ＳによるＹ６７３の置換もまた、幾らかの局部的構造修飾を導入し得る。これに対して、極性残基Ｑ５３４を似かよった大きさの別の極性残基Ｈで置換しても、この残基が露出されるようなＨＧＦコンホメーションの劇的な相違をもたらしそうもなく、事実Ｑ５３４Ｈ変異体はｒｈｕＨＧＦと類似であった（第Ｉ表）。
【０１４８】
実施例５
Ｃ末端およびクリングル欠失の影響
α鎖がＨＧＦ結合または活性にとって必要であるか否かを確認するために、実施例１に記載されるようにＣ末端切除を行ない、α鎖のみを含む変異体、または第三（Ｎ−３８４）もしくは第二（Ｎ−３０３）クリングルの後で先端切除した変異体を生成させた。
【０１４９】
β鎖を欠失または図１に示される連続する番号のクリングルに加えてβ鎖を欠失することによって、ＨＧＦのＣ末端切除を幾つか実施した。第一クリングルを伴うＮ末端ドメインに相当する一つの変異体（Ｎ−２０７）は、ウェスタンブロッティングまたはポリクローナル抗体製造を用いるＥＬＩＳＡのいずれによっても検出し得るレベルの蛋白を発現せず、したがってこれはこれ以上調べなかった。ＨＧＦの最初の二つのクリングル（Ｎ−３０３）、三つのクリングル（Ｎ−３８４）または完全なα鎖を含む変異体の発現は、２５０−６００ｎｇ／ｍｌと低かった。ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦと比較したこれらの変異体の残余ＳＡおよびＫｄの一覧を第Ｉ表に示す。試験された濃度において、バックグラウンドレベルより高い活性は観察されず、この事は、これらの変異体が生物活性を失っていることを示すものである。しかしながら、結合競合は、変異体Ｎ−３０３、Ｎ−３８４またはα鎖が実質的な結合能力を尚保持している（ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦ結合と比較して２３％まで）事を示した。したがって、ＨＧＦのＮ末端の２７２の残基（変異体Ｎ−３０３の成熟型）が、ＨＧＦレセプターとの高親和性結合にとって充分である。各クリングルドメインの欠失の結果を第１表に示す。ＨＧＦの第一クリングルの欠失（変異体ΔＫ１）は生物活性に最も大きく影響し、少なくとも１００倍の低下（ＳＡ＜ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦの０．２％）を示した。同様に、この変異体の結合もまた、２ｍｇ／ｍｌまでは結合についてｗｔ　ｒｈｕＨＧＦと競合しないといったような影響を受けた。全ての他のクリングルの欠失（変異体ΔＫ２、ΔＫ３またはΔＫ４）もまた、著しく低下した分裂促進活性を誘発した（第Ｉ表）。しかしながら、これらの欠失変異体のＫｄは、ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦで観察されるそれと近いままであった。
【０１５０】
これらのデータは、クリングルＫ３およびＫ４はレセプター結合に必要でないことを示している。本発明者等のデータは、アミノ酸配列がＨＧＦ／ＮＫ２と極めて類似している変異体Ｎ−３０３がＨＧＦレセプターとの結合について有効に競合する能力を保持している（Ｋｄ〜２８０ｐＭ）という意味において、非特許文献１３および非特許文献１２による先の観察を支持するものである。さらに、Ｎ−３０３はレセプターへの結合にとって充分であるという知見、および第二クリングルはＨＧＦレセプターへの結合に必要ない（該分子の残部という状況において）という知見は、レセプター結合ドメインがｈｕＨＧＦのフィンガーおよび第一クリングル内に含まれるということを示唆する。運悪く本発明者等はこの変異体の発現を本発明者等のポリクローナル抗血清を用いて検出することができなかったが、これは、その変異体Ｎ−２０７（第一クリングルの後の欠失）が２９３細胞で発現されないことを示唆している。
【０１５１】
実施例６
ｈｕＨＧＦレセプターのチロシンホスホリル化の誘導
本発明者等は、ＨＧＦレセプターにインビトロで結合するが分裂促進活性については不完全な変異体Ｒ４９４ＥまたはＹ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓが、Ａ５４９細胞においてＨＧＦレセプターのチロシンホスホリル化を刺激するかどうかを決定した。血清涸渇細胞を、精製されたＷＴ　ｒｈｕＨＧＦまたは変異体で処理し、ＨＧＦレセプターの免疫沈降物をホスホチロシン抗体でブロッティングおよびプロービングした。ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦによる刺激は、ＨＧＦレセプターの１４５ｋＤａβ−サブユニットのチロシンのホスホリル化を導いた（図４）。いずれの変異体も、ＨＧＦレセプターのホスホリル化を誘導する低下した能力を表わした。
【０１５２】
ＨＧＦによるＨＧＦレセプターβ−サブユニットに対するチロシンホスホリル化の刺激はかつて報告された（非特許文献６９、非特許文献１５、参照）。本明細書中のデータは、変異体Ｒ４９４ＥおよびＹ６７３Ｓ，Ｖ６９２Ｓは可溶性ＨＧＦレセプターを結合させることができるが、ＩｇＧ蛋白はインビトロでＡ５４９細胞におけるチロシンホスホリル化の刺激には有効でないことを示している。この結果の一つの解釈は、これらの変異体はＡ５４９細胞上のＨＧＦレセプターを結合させることはできるが、有効なホスホリル化の誘導に必要な機能、例えばレセプターの二量体化という点では不完全であるという事である。上皮および血小板由来の成長因子のような、内因性チロシンキナーゼを有する他のレセプター蛋白について、キナーゼ機能の活性化にはレセプター−レセプター相互作用または二量体化が必要であることが示されている（総説については非特許出願７０参照）。そうではなく、これらの変異体は、細胞−表面付随ＨＧＦレセプターを結合させることができないのかも知れない。
【０１５３】
ＨＧＦの特異な構造は、この分子の生物活性を調節する複数の事象があり得ることを示唆している。調節の初期段階は、生物学的に活性な二本鎖型を生成するための開裂工程であろう。興味深いことに、開裂は、単にレセプター結合を調節するのではなく、ＨＧＦレセプターの活性化に要するその後の事象を調節しているかも知れない。本発明者等のデータはさらに、レセプター結合にとって絶対に必要である訳ではないβ鎖が、レセプター活性化工程に寄与していることをも示唆している。これらの変異体は、ＨＧＦレセプターにおける前兆となる事象の分析に有用であり得る。
【０１５４】
実施例７
ヘアピンドメインおよびクリングル１ドメイン変異体
第２表および第３表に列挙されるｈｕＨＧＦ変異体を作成し、それらの特異活性（ＳＡ）およびＫｄ比を前記実施例の記載と本質上同様にして測定した。
【０１５５】
上の記載は個々の好ましい態様についてのものであるが、本発明はこれらに限定されないことが理解できるであろう。本発明の総体的概念を逸脱することなく、開示される態様に様々な修飾が施され得ることが当業者には考えられるであろう。このような修飾は全て本発明の範囲内にあることが意図される。
【０１５６】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【０１５７】
【発明の効果】
本発明は肝細胞成長因子（ＨＧＦ）アミノ酸配列変異体に関するものである。好ましい変異体は、ＨＧＦをその二本鎖型にインビボで変換することのできる酵素による蛋白分解的開裂に対し耐性であり、そして／またはＨＧＦのプロテアーゼドメイン内に突然変異を含む。
【０１５８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｈｕＨＧＦのαおよびβサブユニットの概略図である。α鎖には、アミノ酸１−３１を含むシグナル配列（囲まれている領域）、予想されたフィンガーおよびそれぞれ３個のジスルフィド結合を有する４個のクリングルドメインが示されている。ｈｕＨＧＦのヘテロ二量体α／β型の生成のための開裂部位は、Ｐ１開裂残基Ｒ４９４のすぐ後に続いている。この最後の残基は特異的にＥ、ＤまたはＡのいずれかに置換されてＨＧＦ一本鎖変異体を生成した。この開裂部位に続くβ鎖はセリンプロテアーゼとの相同性を有する。αおよびβ鎖はＣ４８７（α）およびＣ６０７（β）の間の唯一のジスルフィド結合により結合している（非特許文献８）。β鎖内部の３個の残基は個々にまたは組み合わせて置換され、セリンプロテアーゼの真正な残基を再構成した。Ｃ末端切除変異体の成熟型の該略図を下に示す：Ｎ−２０７、第一のクリングルの後で欠失；Ｎ−３０３、第二のクリングルの後で欠失；Ｎ−３８４、第三のクリングルおよびα鎖の後で欠失。各クリングルの欠失（ΔＫ１、ΔＫ２、ΔＫ３およびΔＫ４）が導入された変異体もまた示す。各々の場合において、欠失はクリングル全体をＣ１からＣ６へと特異的に除く。
【図２】図２は、野生型ｒｈｕＨＧＦおよび一本鎖変異体のウェスタンブロットの結果を示している。野生型ｒｈｕＨＧＦ（ＷＴ）または変異体Ｒ４９４Ｅ、Ｒ４９４ＡまたはＲ４９４Ｄのいずれかを発現する安定な２９３細胞または模擬的にトランスフェクトさせた２９３細胞から得られた条件培地を、８％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル上で還元条件下に分画しブロッティングした。このブロットを、主にα鎖でエピトープを認識するポリクローナル抗ＨＧＦ抗血清と反応させた。マーカーの分子量（キロダルトン）は示されている通りである。さらに、ｈｕＨＧＦのα鎖および非開裂一本鎖型の位置を示す。このポリクローナル抗体は、検出され得る量のｈｕＨＧＦを発現しない、対照によりトランスフェクトされた２９３細胞にさえ存在する未確認バンド（＊）と交差反応することに留意されたい。
【図３】図３：野生型（ＷＴ）ｒｈｕＨＧＦおよび一本鎖変異体の分裂促進活性（Ａ）および競合的レセプター結合（Ｂ）。（Ａ）実施例２に記載されるように、ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦおよび変異体が一次培養中のラット肝細胞のＤＮＡ合成を誘導する能力によって、生物活性を測定した。代表的検定における二つの測定値の平均ｃｐｍを示す。対照細胞からの模擬上清はこれらの細胞においてＤＮＡ合成を刺激しなかった（バックグラウンドレベルより高いｃｐｍの増加が無い）。（Ｂ）競合的結合を行なうため、ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦまたは変異体を含むヒト２９３細胞の上清の様々な希釈液を、実施例２に記載のように、ｈｕＨＧＦレセプター−ＩｇＧ融合蛋白５０ｐＭと共にインキュベートした。データは、代表的実験からの競合しているリガンドのパーセンテージとして結合の阻害を表わし、対照２９３細胞からのバックグラウンド値を差し引くことにより補正した。
【図４】図４：野生型ｒｈｕＨＧＦ、一本鎖またはプロテアーゼドメインｈｕＨＧＦ変異体による、ＨＧＦレセプターの１４５ｋＤａβサブユニット上のリガンド誘導チロシンホスホリル化のウェスタンブロット。精製されたｗｔ　ｒｈｕＨＧＦ（ＷＴ）、一本鎖（Ｒ４９４Ｅ）または二重プロテアーゼ変異体（Ｙ６７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓ）２００ｎｇ／ｍｌを加えずに（−）または加えて５分間インキュベートしたＡ５４９細胞からの溶菌液を調製し、抗ＨＧＦレセプター抗体で免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体でブロッティングした。分子量（キロダルトン）は記載の通りである。
【図５】図５は、プラスミドｐＲＫ５．１をコードしているヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
【図６】図５の続き。
【図７】図６の続き。
【図８】図８は、プラスミドｐ．ＣＩＳ．ＥＢＯＮをコードしているヌクレオチド配列を示す（配列番号１５）。
【図９】図８の続き。
【図１０】図９の続き。
【図１１】図１０の続き。
【図１２】図１１の続き。
【図１３】図１２の続き。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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