(57)【要約】【解決手段】本発明は、例えば、ＬＡＰ（転写活性化因子）の転写／翻訳に影響を与えずに、ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の転写／翻訳を減少、低下又は抑制することができる組み換え遺伝子ベクター及び核酸構築物を提供する。【効果】そのようなベクター及び構築物は、細胞中のＬＡＰ／ＬＩＰ活性の比率を増加する方法、及びＬＡＰ／ＬＩＰの比率に関連した疾患又は状態の症状を治療及び／又は緩和する方法において使用される。本発明はまた、細胞又は個体におけるＬＡＰ／ＬＩＰ活性の比率を変化させることができる薬剤のスクリーニング方法を提供する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＰ（転写活性化因子）活性をコードする組み換えベクターであって、ＬＩＰ活性の発現が阻害されており、かつＬＩＰがＬＡＰ活性を抑制しないようにＬＩＰ活性の発現が阻害される、組み換えベクター。
【請求項２】
ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）遺伝子の一部又は全部のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の組み換えベクターであって、該Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の一部又は全部がＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧの周辺のヌクレオチド配列を含み、かつ当該ヌクレオチド配列がＬＩＰ転写阻害タンパク質の開始コドンＡＴＧを含む変異を有する、組み換えベクター。
【請求項３】
当該変異が、ＡＴＧを別のアミノ酸をコードするコドンに置換したものであり、当該置換されたコドンがＴＴＧではない、請求項２に記載の組み換えベクター。
【請求項４】
当該変異が、ＡＴＧを、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＰｒｏから成る群からのアミノ酸をコードするコドンに置換したものである、請求項３に記載の組み換えベクター。
【請求項５】
当該アミノ酸がＡｌａである、請求項４に記載の組み換えベクター。
【請求項６】
当該アミノ酸がＧｌｙである、請求項４に記載の組み換えベクター。
【請求項７】
当該アミノ酸がＰｒｏである、請求項４に記載の組み換えベクター。
【請求項８】
当該アミノ酸がＡｒｇである、請求項４に記載の組み換えベクター。
【請求項９】
当該組み換えベクターがウイルスベクターである、請求項１から８の何れかに記載の組み換えベクター。
【請求項１０】
ベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターから成る群から選ばれる、請求項９に記載の組み換えベクター。
【請求項１１】
請求項１から１０の何れかに記載の組み換えベクターを含む組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容できる担体を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＬＩＰの開始コドンＡＴＧを別のコドンに置換した変異ＬＡＰポリペプチドであって、置換されたコドンがＴＴＧではない、変異ＬＡＰポリペプチド。
【請求項１４】
置換されたコドンが翻訳停止コドンではない、請求項１３に記載の変異ＬＡＰポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１３又は１４の何れか１項に記載の変異ＬＡＰポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１〜１０の何れかに記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１３又は１４の何れか１項に記載の変異ポリペプチドを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１５に記載の単離された核酸を含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項９又は１０の何れかに記載の組み換えウイルスベクターを含むウイルス粒子。
【請求項２０】
Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子のヌクレオチド配列中のＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧの周辺の約１０〜約１００ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチド又はその相補配列がＬＩＰの発現を減少できる、オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
該オリゴヌクレオチド配列が約１０〜約８０ヌクレオチドの長さである、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド配列。
【請求項２２】
当該オリゴヌクレオチド配列が約１５〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項２０又は２１の何れかに記載のオリゴヌクレオチド配列。
【請求項２３】
請求項２０から２２の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
細胞に、請求項１から１０の何れか１項に記載の組み換えベクター、又は請求項１３又は１４の何れか１項に記載の変異ＬＡＰポリペプチド、又は請求項２０から２２の何れか１項に記載のオリゴペプチドを好適な条件下で接触させることを含む、細胞中のＬＩＰ（転写阻害タンパク質）に対するＬＡＰ（転写活性化因子）の発現量の比率を変化させる方法。
【請求項２６】
該細胞が癌細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該細胞が乳癌細胞又は肝臓癌細胞である、請求項２５又は２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
薬剤が、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子から発現するＬＩＰ（転写阻害タンパク質）に対するＬＡＰ（転写活性化因子）の発現量の比率を変化させるかどうかをスクリーニングする方法であって、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子を該薬剤と接触させてＬＩＰ発現に対するＬＡＰ発現の比率を測定する工程を含む方法。
【請求項２９】
該薬剤が低分子化合物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該薬剤が天然由来物質の抽出物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
比率をノザンブロットにより測定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物細胞が該Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
細胞中のＬＡＰの発現量を増大する薬剤を同定することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
細胞中のＬＩＰの発現量を低下させる薬剤を同定することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
比率をＰＣＲにより測定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
個体におけるＬＩＰ（転写阻害タンパク質）に対するＬＡＰ（転写活性化因子）の発現量の比率の異常に関連する疾患及び／又は状態の症状を治療及び／又は緩和する方法であって、個体に、請求項１から１０の何れか１項に記載の組み換えベクター、又は請求項２０から２２の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項１３又は１４の何れか１項に記載のＬＡＰポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項３７】
該個体が癌患者である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該癌が乳癌又は肝臓癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
癌の症状の治療及び／又は緩和のための医薬の製造における請求項１から１０の何れかに記載の組み換えベクターの使用。
【請求項４０】
癌の症状の治療及び／又は緩和のための医薬の製造における請求項１３又は１４の何れか１項に記載の変異ＬＡＰポリペプチドの使用。
【請求項４１】
癌の症状の治療及び／又は緩和のための医薬の製造における請求項２０から２２の何れかに記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、細胞におけるＬＡＰ／ＬＩＰ比率を調節する組成物及び方法を提供する。特に本発明は、ＬＡＰ（転写活性化因子）活性をコードする組み換えベクターであって、ＬＩＰ活性の発現が阻害されており、かつＬＩＰがＬＡＰ活性を抑制しないようにＬＩＰ活性の発現が阻害される、組み換えベクター、並びに、ＬＩＰ活性の発現を減少させるオリゴヌクレオチド及びアンチセンス核酸を提供する。本発明はさらに、薬剤がＣ／ＥＢＰβ遺伝子から発現されるＬＩＰに対するＬＡＰの発現量の比率を調節するかどうかをスクリーニングする方法も提供する。
【０００２】
【従来技術】
広範な研究及び膨大な進歩にも関わらず、癌は米国における２番目の死因である。癌の形成には連続した遺伝的障害を伴うことが知られている。このような遺伝的障害として報告されているものの多くは、優性癌遺伝子の形質転換機能の獲得やｐ５３などの癌抑制遺伝子の癌抑制機能の損失により引き起こされる。即ち、癌遺伝子の優性ネガティブ変異体や癌抑制遺伝子を癌細胞内に、例えば、ｐ５３を組み込んだレトロウイルスベクターなどを用いて導入することによってこのような遺伝的異変を矯正すれば、癌の症状を緩和及び／又は治療できる可能性がある（Ａｌａｖｉ　Ｊ．Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　２００１，　Ｅｘｐｅｒｔ．　Ｏｐｉｎ．　Ｂｉｏｌ．　Ｔｈｅｒ．　１：２３９−２５２）。
【０００３】
また、癌の治療のためにサイトカイン遺伝子を細胞又は組織に導入することも試みられている。例えば、サイトカイン遺伝子をリンパ球（例えば、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、細胞障害性Ｔ細胞　（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）など）に導入して、導入細胞から分泌されるサイトカインによりリンパ球を活性化して受動免疫能を高めたり、ＴＩＬに直接抗腫瘍性のあるＩＦＮまたはＴＮＦ遺伝子を導入することにより腫瘍局所での抗腫瘍性を高めるという試みがなされている（Ｔｒｅｉｓｍａｎ　Ｊ．　　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４，　Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５６：　４４８−４５７、及びＨｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｍｏｌ．　１５０：４１０４−４１１５）。
さらに、レトロウイルスベクターなどにより腫瘍細胞にサイトカイン遺伝子を導入して、この導入された細胞を腫瘍ワクチンとして用い、宿主の腫瘍特異的免疫細胞を誘導するという試みも報告されている（Ａｄｒｉｓ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　６０：６６９６−６７０３、及びＨｉｒｏｉｓｈｉ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｇｅｎ　Ｔｈｅｒ．　１２：　１９８８−１９９４）。
【０００４】
ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）遺伝子は多数の発達過程に関与している（Ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００１，　Ｊ．　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　Ｖｏｌ．　１５３：　　７８５−７９４）。Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子のヌクレオチド配列中には、２つの転写開始位置が存在し、それぞれの転写位置からタンパク質が翻訳されることにより、ＬＡＰ（転写活性化因子）およびＬＩＰ（転写リプレッサー）が生成する（Ｄｅｓｃｏｍｂｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９１，　Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．　６７，　５６９−５７９）。また、ＬＡＰ／ＬＩＰの比率が増加すると、ある標的遺伝子の転写活性が高くなること、並びに、ラット肝臓の分化の最終段階ではＬＡＰ／ＬＩＰの比率が増大することが報告されている（Ｄｅｓｃｏｍｂｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，上掲）。さらに、Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４，　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｖｏｌ．１３，　Ｎｏ．４，　ｐｐ．８５１−８６０には、肝細胞の分化やその静止状態はＬＡＰ／ＬＩＰ比で調節されることが記載されている。
【０００５】
Ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ．（上掲）には、乳腺の筋上皮細胞および線維芽細胞の表面に発現し、乳腺の形態形成に関与するタンパク質であるエピモルフィンで細胞を処理すると、Ｃ／ＥＢＰβの発現が増大し、コードされるＬＡＰ／ＬＩＰ比が変化することが報告されている。
癌の症状の治療の進歩にも関わらず、癌の症状を治療及び／又は緩和することができる薬剤をスクリーニングする方法、並びに症状を治療及び／又は緩和する方法に対する要求は依然として存在する。
本明細書に開示した全ての特許文献及び刊行物は全体として引用により本明細書中に取り込むものとする。
【０００６】
【発明の概要】
本明細書に開示した本発明は、細胞又は個体におけるＬＡＰ活性／ＬＩＰ活性の比率を調節するための組成物および方法を提供する。
本発明は、ＬＡＰ（転写活性化因子）活性をコードする組み換えベクターであって、ＬＩＰ活性の発現が阻害されており、かつＬＩＰがＬＡＰ活性を抑制しないようにＬＩＰ活性の発現が阻害される、組み換えベクターを提供する。例えば、組み換えベクターは、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）遺伝子の一部又は全部のヌクレオチド配列を含み、該Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の一部又は全部がＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧの周辺のヌクレオチド配列を含み、かつ該ヌクレオチド配列がＬＩＰ転写阻害タンパク質の開始コドンＡＴＧの周辺に変異を有している。別の例としては、開始コドンの周辺の変異は、ＡＴＧを別のアミノ酸をコードするコドンに置換したものであり、該置換されたコドンはＴＴＧではない。別の例としては、該変異は、ＡＴＧを、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＰｒｏから成る群からのアミノ酸をコードするコドンに置換したものである。さらに別の例としては、該変異は、ＡＴＧを、アミノ酸Ａｒｇをコードするコドンに置換したものである。例えば、組み換えベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターである。別の例としては、本発明は本発明のウイルスベクターを含むウイルス粒子を提供する。
【０００７】
本発明はまた、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧを別のコドンに置換した変異ＬＡＰポリペプチドであって、置換されたコドンがＴＴＧではなく、例えば、それは翻訳停止コドンではない、変異ＬＡＰポリペプチドを提供する。例えば、変異ＬＡＰポリペプチドにおいては、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧがＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＡｒｇをコードするコドンで置換されている。本発明はまた、上記ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子のヌクレオチド配列中のＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧの周辺の約１０〜約１００ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチド又はその相補配列がＬＩＰの発現を減少できる、オリゴヌクレオチドを提供する。例えば、オリゴヌクレオチドは、約１０〜約８０ヌクレオチドの長さである。別の例としては、オリゴヌクレオチド配列は、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さである。
【０００８】
本発明はまた、本発明の組み換えベクター、オリゴペプチド又は変異ＬＡＰポリペプチド（または当該ポリペプチドをコードする単離された核酸）を含む、宿主細胞、組成物およびキット、並びにそれらの作成方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、細胞に、本発明の組み換えベクター又は本発明のオリゴペプチド又は本発明の変異ＬＡＰポリペプチドを好適な条件下で接触させることを含む、細胞中のＬＡＰ（転写活性化因子）／ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率を変化させる方法を提供する。例えば、細胞は、乳癌細胞又は肝臓癌細胞などの癌細胞である。本発明はまた、個体におけるＬＡＰ（転写活性化因子）／ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率の異常に関連する疾患及び／又は状態の症状を治療及び／又は緩和する方法であって、個体に、本発明の組み換えベクター、又はオリゴヌクレオチド、又は変異ＬＡＰポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。例えば、疾患又は状態は癌である。本発明はまた、薬剤がＣ／ＥＢＰβ遺伝子から発現するＬＡＰ（転写活性化因子）／ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率を変化させるかどうかをスクリーニングする方法であって、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子を該薬剤と接触させてＬＡＰ発現／ＬＩＰ発現の比率を測定する工程を含む方法を提供する。例えば、該薬剤は低分子化合物である。別の例では、該薬剤は天然由来物質の抽出物である。更に別の例では、比率をノザンブロットにより測定する。例えば、哺乳動物細胞がＣ／ＥＢＰβ遺伝子を含む。例えば、本発明の方法は、細胞中のＬＡＰの発現量を増大する薬剤を同定すること、又は細胞中のＬＩＰの発現量を低下する薬剤を同定することをさらに含むものである。
【００１０】
本発明は、癌の症状の治療及び／又は緩和のための医薬の製造における本発明の組み換えベクターの使用に関する。本発明はまた、癌の症状の治療及び／又は緩和のための医薬の製造における本発明の変異ＬＡＰポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、癌の症状の治療及び／又は緩和のための医薬の製造における本発明の本発明のオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００１１】
本書に開示した発明は、細胞中のＬＡＰ／ＬＩＰの比率を調節するための組成物および方法を提供する。本発明は、細胞中のＬＡＰ／ＬＩＰの比率を変化させるための、例えば、ＬＡＰ／ＬＩＰの比率を増加させるための組成物及び方法を提供する。本書に開示した発明は、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）遺伝子由来の転写活性化因子（ＬＡＰ）／転写リプレッサー（ＬＩＰ）の比率に関連した疾患及び／又は状態の症状を治療及び／又は緩和するための組成物及び方法を提供する。本発明はまた、ＬＡＰ／ＬＩＰの比率を変化させる薬剤のスクリーニングするための組成物及び方法を提供する。
【００１２】
本発明は、ＬＡＰ（転写活性化因子）活性をコードする組み換えベクターであって、ＬＩＰ活性の発現が阻害されている組み換えベクターを提供する。例えば、本発明は、ＬＡＰ（転写活性化因子）活性をコードする組み換えベクターであって、ＬＩＰ活性の発現が阻害され、ＬＩＰがＬＡＰ活性を抑制しないようにＬＩＰ活性の発現が阻害される、組み換えベクターを提供する。本発明は、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧが別のコドンで置換されており、置換されたコドンがＴＴＧではなく、例えば、終始コドンではない、ＬＡＰの変異体をコードする単離された核酸を提供する。本発明は、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧが別のコドンで置換されており、置換されたコドンがＴＴＧではなく、例えば、終始コドンではない、変異体ＬＡＰポリペプチドを提供する。例えば、上記の変異体ＬＡＰポリペプチドは腫瘍溶解活性を示す。
【００１３】
特に、本発明は、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の一部又は全部の核酸を含む組み換えベクターであって、該核酸がＬＩＰの開始コドンＡＴＧの周辺のヌクレオチド配列中に変異を有する組み換えベクターを提供する。例えば、上記の組み換えベクターは腫瘍溶解活性を示し、遺伝子治療、即ち、ＬＡＰ／ＬＩＰの比率に関連した疾患又は状態に罹患した細胞又は個体への投与または送達のために使用することができる。特に、本発明の組み換えベクターは、細胞にＬＡＰ活性を発現する組み換えベクターを投与又は送達するために使用することができる。そのような組み換えベクターは、細胞中のＬＡＰ／ＬＩＰ活性の比率を増加する方法；ＬＡＰ／ＬＩＰの比率に関連した疾患又は状態に罹患した個体においてＬＡＰ／ＬＩＰの比率に関連した疾患又は状態の症状を治療及び／又は緩和する方法；並びに、ＬＡＰ／ＬＩＰの比率を変化させる薬剤のスクリーニング方法において使用することができる。本発明はまた、ＬＩＰの発現を減少、低下又は抑制することができるオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びインタフェアリングＲＮＡを提供する。
【００１４】
本書に開示した本発明は、細胞に本発明の組み換えベクター、あるいはＬＩＰの発現を減少、低下又は抑制することができる本発明のオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はインタフェアリングＲＮＡを接触させることを含む、細胞中におけるＬＡＰ／ＬＩＰの発現量の比率を変化させる方法を提供する。例えば、細胞には、本発明の組み換えベクター、あるいは本発明のオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はインタフェアリングＲＮＡを、エピモルフィンと一緒に接触させる。本発明はまた、本発明の組み換えベクター、あるいは本発明のオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はインタフェアリングＲＮＡを単独で、又は他の治療剤と一緒に、又はエピモルフィンと一緒に、癌に罹患した個体に投与することを含む、癌などの、個体におけるＬＡＰ／ＬＩＰの発現量の比率に関連した疾患及び／又は状態の症状を治療及び／又は緩和する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、薬剤がＣ／ＥＢＰβ遺伝子から発現するＬＡＰ／ＬＩＰの発現量の比率を変化させるかどうかをスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、特定の癌又は悪性細胞が、本発明の組み換えベクター、あるいは本発明のオリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸又はインタフェアリングＲＮＡによる治療に感受性であるかどうかを決定する方法を提供する。従って、本発明はまた、本発明の組み換えベクター、あるいは本発明のオリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸又はインタフェアリングＲＮＡを含むキットを提供する。例えば、本発明のキットは、治療に対する癌細胞の感受性を試験するために使用する組み換えベクターを含む。
【００１６】
本発明はまた、本発明の組み換えベクター、又は本発明のオリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸又はインタフェアリングＲＮＡを含む組成物、並びに、本発明の組み換えベクター、又は本発明のオリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸又はインタフェアリングＲＮＡの製造方法を提供する。
本発明の実施には、別記しない限り、通常の分子生物学、ウイルス学、微生物学、免疫学、及び当業者に知識内の組み換えＤＮＡ技術が利用される。これらの技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２）；　　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌｓ．　Ｉ　＆　ＩＩ　（Ｄ．　Ｇｌｏｖｅｒ，　ｅｄ．）；　　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　（Ｎ．　Ｇａｉｔ，　ｅｄ．（１９８４））；　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　（Ｂ．　Ｈａｍｅｓ　＆　Ｓ．　Ｈｉｇｇｉｎｓ，　ｅｄｓ．　（１９８５））；　　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　（Ｂ．　Ｈａｍｅｓ　＆　Ｓ．　Ｈｉｇｇｉｎｓ，　ｅｄｓ．　（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　（Ｒ．　Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，　ｅｄ．　（１９８６））；　　Ｐｅｒｂａｌ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（１９８４）；　　Ａｕｓｕｂｅｌ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７，　１９８８，　１９８９，　１９９０，　１９９１，　１９９２，　１９９３，　１９９４，　１９９５，　１９９６）；　及びＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）；　ｖｏｌｓ．　Ｉ，　ＩＩ　＆　ＩＩＩ　（１９８９）などを参照。
【００１７】
Ｉ．ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β　（Ｃ／ＥＢＰβ）；ＬＡＰ及びＬＩＰ
ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（「Ｃ／ＥＢＰ」）は、ＣＣＡＡＴ配列モチーフ（トランスフェリン又はＡｐｏＢ遺伝子等に見られるようなもの）、エンハンサーコア配列モチーフ、又は幾つかのウイルスプロモーターのエンハンサー領域を優先的に認識して結合することができる、あるクラスのエンハンサー結合タンパク質（ＥＢＰｓ）を含む　（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚ，　Ｗ．　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　２：７８６−８００　（１９８９）；　Ｂｒｕｎｅｌ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３：１０１８０−１０１８５　（１９８８）；　Ｍｅｔｚｇｅｒ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５：９９７８−９９８３　（１９９０））。
【００１８】
哺乳類由来のＣ／ＥＢＰβ遺伝子は公知であり、例えば、Ｄｅｓｃｏｍｂｅｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９９０，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　Ｖｏｌ．　４，　ｐｇｓ．１５４１−１５５１及びＡｋｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９０，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　９，　１８９７−１９０６に記載されている。ラット由来のＣ／ＥＢＰβ遺伝子のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を配列番号１および２に記載する。ヒト由来のＣ／ＥＢＰβ遺伝子のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を配列番号３および４に記載する。
Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子には、ＬＡＰ（転写活性化因子）およびＬＩＰ（転写リプレッサー）という２種類の翻訳産物がある。翻訳産物が２種類存在するのは、Ｃ／ＥＢＰβ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β）遺伝子のヌクレオチド配列中に２種類以上の転写開始部位が存在することに起因する。これらの転写開始部位の何れかから転写翻訳が開始することにより、ＬＡＰ（転写活性化因子）またはＬＩＰ（転写リプレッサー）の何れかが生成される。
【００１９】
ＬＡＰは、Ｎ末端側から転写制御部位とＤＮＡ結合部位を有するタンパク質である一方、ＬＩＰはＬＡＰのうちのＤＮＡ結合部位のみを含み、転写制御部位を含まないタンパク質である。両タンパク質は同一のフレームを有しており、即ち、ＬＩＰはＣ末端の１４５アミノ酸をＬＡＰと共有している（Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌ，上掲）。理論に拘束されないが、Ｄｅｓｃｏｍｂｅｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９９１，　Ｃｅｌｌ，　ｖｏｌ．　６７：　ｐａｇｅｓ　５６９−５７９には、ＬＡＰ及びＬＩＰは漏出性のリボソームスキャニング機構によって同一のｍＲＮＡから翻訳されることが示唆されている。ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧは、配列番号１のヌクレオチド配列の４５７から４５９番目、及び配列番号３のヌクレオチド配列の５９５から５９７番目に相当する。
【００２０】
Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌ（上掲）にはＬＡＰ発現及びＳ期が肝臓癌細胞において相互に排他的であることが報告されている。Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌは、ＬＡＰがＧ１／Ｓ境界の以前に肝臓癌細胞の増殖を阻害し、細胞がＳ期に入るのを妨げていることを見出した。Ｄｅｓｃｏｍｂｅｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９９１，　Ｃｅｌｌ　ｖｏｌ．　６７：５６９−５７９には、ＬＡＰ及びＬＩＰが塩基性ＤＮＡ結合ドメイン及びロイシンジッパー二量化ヘリックスを含む１４５個のＣ末端アミノ酸を共有していることが開示されている。Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌ（上掲）には、ロイシンジッパーの完全性が、肝臓癌細胞がＳ期に入るのを防止するために必要であることが開示されている。Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌ（上掲）にはまた、（ＬＡＰのＮ末端活性化ドメインを欠く）ＬＩＰは、肝臓癌の細胞増殖を抑制するのに効果を示さず、細胞周期に対するＬＡＰの阻害的役割を拮抗することが開示されている。理論には拘束されないが、Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌ（上掲）には、ロイシンジッパーと塩基性ドメインを含むＬＩＰの１４５アミノ酸が、ＤＮＡ結合部位について直接的に、又はＬＩＰ／ＬＡＰダイマーを形成して間接的に競合することによってＬＡＰのアンタゴニストとして作用することが示唆されている。従って、本発明は、ＬＩＰの発現が阻害されている、ＬＡＰ（転写活性化因子）活性をコードする組み換えベクターを提供する。例えば、本発明は、ＬＩＰの発現は阻害されており、ＬＩＰがＬＡＰ活性を抑制しないようにＬＩＰの発現が阻害される、ＬＡＰ（転写活性化因子）活性をコードする組み換えベクターを提供する。ＬＡＰ活性は、Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌに開示されたアッセイにおける肝臓癌細胞増殖を阻害するＬＡＰの活性によって、又は本実施例に開示したインビボモデルでの癌形成を阻害することによって、測定することができる。
【００２１】
Ｄｅｓｃｏｍｂｅｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９９１，　Ｃｅｌｌ，　ｖｏｌ．　６７：５６９−５７９には、ＬＡＰｍＲＮＡが３個のインフレームのＡＵＧを有することが開示されている。ＬＡＰは最初のインフレームのＡＵＧで開始し（３９ｋｄのタンパク質）；ＬＩＰは３番目のフレームのＡＵＧで開始する（２０ｋｄのタンパク質）。例えば、組み換えベクターは、Ｎ末端ＬＡＰ活性化ドメイン及び／又はＤＮＡ結合ドメイン及び／又はロイシンジッパーを含み、ＬＡＰ活性を発現し、ここでＬＩＰ活性は阻害される。本発明は、ＬＩＰの開始コドンが別のコドンで置換されており、置換されたコドンはＴＴＧではなく、例えば、それは終始コドンではない、変異体ＬＡＰポリペプチドをコードする核酸を含む、ＬＡＰ活性をコードする組み換えベクターを提供する。本発明はまた、ＬＩＰの開始コドンが別のコドンで置換されており、置換されたコドンはＴＴＧではなく、例えば、それは終始コドンではない、変異体ＬＡＰポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた、ＬＩＰの開始コドンが別のコドンで置換されており、置換されたコドンはＴＴＧではなく、例えば、それは終始コドンではない、変異体のＬＡＰポリペプチドを提供する。本明細書で使用する「変異体ＬＡＰポリペプチド」とは、変異体ＬＡＰポリペプチドが少なくとも１つのＬＡＰ生物活性を保持する限り、ＬＩＰ活性が減少又は抑制されるように、ＬＩＰの開始ＡＴＧコドンの変異を含むものを言う。
【００２２】
本発明は、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の一部又は全部を含み、該Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の一部又は全部がＬＩＰの開始コドンＡＴＧの周辺の領域を含み、かつヌクレオチド配列においてＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧの周辺に変異が導入されている、組み換えベクター、例えば、組み換えウイルスベクター又はウイルス粒子を提供する。本明細書で使用する用語「変異」とは、核酸の挿入、欠失及び置換を包含する。例えば、変異は、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧを別のコドンに置換したものである。例えば、変異は、ＬＡＰをコードする核酸にフレームシフト変異を導入することなく、ＬＩＰの転写／翻訳を減少、低下又は抑制する。例えば、変異は、ＬＡＰの生物活性を保持しながら、ＬＩＰの転写／翻訳を減少、低下又は抑制する。例えば、組み換えベクターは、断片又は一部がＬＡＰ活性を保持した生成物をコードする限り、Ｃ／ＥＢＰβの核酸断片又は一部を含むものである。ＬＡＰ活性は当業者に既知の方法、又は本書に開示した方法により測定することができる。例えば、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧを別のアミノ酸をコードするコドンに置換するが、ここで置換されたコドンはＴＴＧではなく、例えば、置換されたコドンは終始コドンではない。例えば、置換されたコドンは保存されたコドンであり、ＴＴＧではない。例えば、このコドンはＡｌａ、Ｇｌｙ又はＰｒｏをコードする。本書に開示した他の例では、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧはＣＧＣで置換されている。そのような組み換え遺伝子ベクターを細胞又は組織に送達すると、ＬＩＰの転写／翻訳は減少、低下、停止又は抑制する。例えば、ＬＩＰの転写／翻訳は、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子由来のＬＡＰ（転写活性化因子）の転写／翻訳に影響することなく、ＬＩＰの転写／翻訳は減少、低下、停止又は抑制される。例えば、ＬＡＰの少なくとも一つの生物活性は保持されている。例えば、本発明の組み換えベクターを細胞に送達すると、ＬＡＰは支配的に発現する。さらに、本明細書の実施例で実証される通り、Ｃ／ＥＢＰβ変異を導入した遺伝子を含むベクターをヌードマウスに腹腔投与すると、対照と比較して、マウスには癌形成と転移は見られなかった。即ち、本発明においては、インビボの癌細胞がＬＡＰのみの支配的な発現により正常化できることが判明した。
【００２３】
本発明で使用することができるＣ／ＥＢＰβ　（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β）遺伝子の起源は特に限定されず、任意の生物に由来する任意の遺伝子を使用することができる。本発明は、任意の起源に由来するＣ／ＥＢＰβを包含する。例えば、哺乳動物から入手できるＣ／ＥＢＰβ遺伝子を使用してもよい。用語「哺乳動物」とは、哺乳類の任意の個体を意味し、大型動物（牛、羊、馬など）、運動動物（犬及び猫を含む）、及び霊長類（旧世界ザル、新世界ザル、類人猿、ヒトなどを含む）などを含む。例えば、ヒトＣ／ＥＢＰβが使用される。特に、ヒト由来のＣ／ＥＢＰβ遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４として記載する。
【００２４】
本発明で使用するＣ／ＥＢＰβ　（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β）遺伝子は、例えばＰＣＲなどの当業者に公知の技術を用いて哺乳動物培養細胞などから得たｃＤＮＡでもよい。Ｃ／ＥＢＰβを取得できる哺乳動物培養細胞株の例としては、肝臓実質細胞、乳腺上皮細胞及び含脂肪細胞などがある。そのような細胞株は公的機関から入手可能である。あるいは、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子又はその断片又は一部、例えば、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧを含む断片又は一部は、本明細書の配列番号１から４のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて化学的に合成した遺伝子でもよい。
さらに、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の一部又は全部を含む本発明の組み換え遺伝子ベクターをヒトの遺伝子治療剤として、即ち、ヒトへの投与又は送達のために使用する場合は、免疫拒絶の可能性を減少、最小化又は抑制して治療効果を高めるために、ヒト遺伝子を使用することが好ましい。
【００２５】
Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子のヌクレオチド配列中のＬＩＰの開始コドンＡＴＧの周辺のヌクレオチド配列に変異を導入する方法は当業者に既知であり、適切に設計したプライマーを用いるＰＣＲ法を用いる等、通常の組み換え技術によって行う。ＰＣＲ技術は当業者に周知である。
ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧの周辺のヌクレオチド配列中への変異の導入は、ＬＩＰの転写／翻訳を減少、低下、停止又は抑制するように、そして、一例ではＬＡＰ（転写活性化因子）の転写／翻訳には影響しないように行うか、設計される。「ＬＡＰ（転写活性化因子）の転写／翻訳には影響しない」という記載は、導入した変異がＬＡＰの転写／翻訳にフレームシフトを起こすことなく、生物学的活性を有するＬＡＰが発現することを意味する。ＬＡＰは、ＦＧＦ受容体やＩＬ−８などの各種タンパク質の転写を制御している。ＬＡＰはＨｅｐＧ２細胞の増殖を停止することが示されており、ｃ−ｊｕｎプロモーターからの転写を減少する（Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌ，　１９９４，　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊ．　ｖｏｌ　１３：　８５１−８６０を参照）。当業者であれば、例えば、Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌに記載されているようなＨｅｐＧ２の増殖やｃ−ｊｕｎプロモーターからの転写を測定することによって、ＬＩＰ中の開始コドンＡＴＧの周辺に導入された変異がＬＡＰの生物学的活性に影響するかどうかを決定することができる。また、「ＬＩＰの転写／翻訳を減少、低下、停止又は抑制し」という記載は、生物学的活性を有するＬＩＰが対照と比較して低量で発現すること、又はＬＩＰの発現量が検出できないか、ＬＩＰが変異体Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子から発現しないことを意味する。ＬＡＰ及びＬＩＰの転写／翻訳をアッセイする方法は当業者に既知であり、ノザンブロットやＰＣＲが挙げられる。
【００２６】
さらに、本明細書で使用する「ＬＩＰの開始コドンＡＴＧの周辺のヌクレオチド配列」という表現は、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧ（配列番号１のヌクレオチド配列の４５７〜４５９番目のヌクレオチドに相当）から前方（３’）及び後方（５’）側の約１００ヌクレオチドの範囲内のヌクレオチド配列を包含し、例えば、ＡＴＧから前方及び後方に９０ヌクレオチド、例えば、ＡＴＧから前方及び後方に８０ヌクレオチド、例えば、ＡＴＧから前方及び後方に７０ヌクレオチド、例えば、ＡＴＧから前方及び後方に６０ヌクレオチド、例えばＡＴＧから前方及び後方に５０ヌクレオチド、例えばＡＴＧから前方及び後方に４０ヌクレオチド、例えばＡＴＧから前方及び後方に３０ヌクレオチド、例えばＡＴＧから前方及び後方に２０ヌクレオチド、例えばＡＴＧから前方及び後方に１０または５ヌクレオチドを包含し、例えばこのＡＴＧ自体が、別のアミノ酸のコドンで置換されている。他の例では、ＡＴＧはそのままで、ＡＴＧの周囲の核酸、例えばＡＴＧの３’側に変異があり、ＬＩＰからの転写及び／又は翻訳が喪失している。
【００２７】
例えば、ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧは別のコドンで置換されるが、このコドンはＴＴＧではなく、例えば、停止コドンではない。コドン置換が終始コドン以外のコドンであり、ＬＡＰの翻訳にフレームシフトを生じさせない限り、ＡＴＧの代わりに置かれるコドンの種類は特に限定されない。Ｂｕｃｋ　ｅｔ　ａｌ（上掲）には、ＬＡＰロイシンジッパーの完全性（Ｃ末端１４５アミノ酸に見られる）が、肝臓癌細胞がＳ期に入るのを防止するのに必要であることが記載されている。コードされるタンパク質の性質に影響しないアミノ酸をコードするコドンが好ましい。そのようなアミノ酸の例としては、アラニン、グリシン、プロリンが挙げられる。本書に開示した例示的実施態様では、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧはＡｒｇをコードするコドンに置換されている。実施例に示す通り、ｇ６乳癌細胞にこの置換を含むベクターをトランスフェクションしてヌードマウスに導入した場合、ヌードマウスは対照と比較して癌形成能を喪失した。
【００２８】
本発明の組み換え遺伝子ベクターは、上記した変異を内部に導入してあるＣ／ＥＢＰβ遺伝子の一部又は全部を含むベクターである。本発明の組み換え遺伝子ベクターは、好適なベクター中のプロモーターの下流に、変異を内部に導入したヌクレオチド配列を有するＣ／ＥＢＰβ遺伝子を連結する等によって導入することによって構築される。遺伝子配列に変異を導入して組み換えベクターを構築する技術は、当業者に周知である。
例えば、組み換え遺伝子ベクターを細胞に導入する場合、それはＬＡＰの一部又は全部を細胞中に発現できる発現ベクターでもある。例えば、ＬＡＰの一部又は全部は少なくとも１つのＬＡＰ活性を保持する。エピモルフィンはＣ／ＥＢＰβの発現を増大させることが知られている（Ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００１，　Ｊ．　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　Ｖｏｌ．　１５３　ｐｇ．　７８５−７９４）。従って、本発明の一例では、エピモルフィンの一部又は全部をコードする核酸を、本発明の組み換えベクター、特に、少なくとも１つのＬＡＰ活性を有するＬＡＰ遺伝子産物の一部又は全部を発現する組み換えベクターと一緒に、細胞中に導入する。エピモルフィン活性を有するこれらのタンパク質又はペプチドの例としては、エピモルフィン自体（即ち、全長のタンパク質）、エピモルフィンの部分アミノ酸配列を含有し、エピモルフィン活性を有するペピチド、並びにそれらの改変体などが挙げられる。エピモルフィン及びその部分ペプチドなどの詳細については、欧州特許公開第０６９８６６６号、米国特許第５，７２６，２９８号、米国特許第５，８３７，２３９号、国際公開ＷＯ９８／２２５０５号、国際公開ＷＯ０１／９４３８２号公報などに記載されており、これらに記載のエピモルフィン及びその部分ペプチドを使用することもができる。エピモルフィンをコードする核酸は、本発明び組み換えベクターの前、後又は同時に細胞に導入され、これらは同一の組み換えベクター上又は異なるベクター上に存在することができる。
【００２９】
上記の通り、本発明は、ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧを別のコドン（但し、コドンはＴＴＧではない）で置換したＣ／ＥＢＰβ遺伝子であって、本発明の組み換えベクターに組み込んだ遺伝子を提供する。本発明は、宿主細胞に本発明の組み換えベクターを導入する方法を包含する。例えば、ベクターは、組み換えウイルスベクターであり、宿主細胞にウイルスベクターを感染させる。従って、本発明は、遺伝子の細胞への導入及び遺伝子の細胞中での発現を、細胞にベクターを感染させることによって行うことを特徴とする、本発明の組み換えベクターを包含する。例えば、本発明の組み換えベクター等の遺伝子構築物の細胞への導入は、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、脂質仲介トランスフェクション、裸ＤＮＡの取り込み、エレクトロトランスファー、及びウイルス（ＤＮＡウイルスとレトロウイルス仲介の両方）トランスフェクションなどを含む当業者に公知の任意の技術を使用して行うことができる。細胞への遺伝子の導入を行う方法は当業者に周知である。
【００３０】
ＩＩ．ウイルスベクター
動物、即ち、ヒト等の哺乳類用の発現プラスミドを使用することができる。例えば、ベクターはウイルスベクターである。本発明で使用できるベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、及びワクシニアウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。この中でも、レトロウイルスベクターは細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれるので、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させることができることから、レトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。レトロウイルス組み換えベクターの構築及びインビトロ又はインビボでのそれらの使用は文献に広く記載されている（特に、Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ　３　（１９９１）　２０３；　ＥＰ　４５３２４２，　ＥＰ　１７８２２０，　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｅｎｇ．　７　（１９８５）　２３５；　ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３　（１９８５）　６８９などを参照）。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介遺伝子移入用の複製・インコンピテントレトロウイルスの使用方法は十分に確立している（Ｃｏｒｒｅｌｌ，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８６：８９１２；　Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ　（１９８９），　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ８６：６７４８−５２；　Ｃｕｌｖｅｒ，　Ｋ．　（１９９０），　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８８：３１５５；　ａｎｄ　Ｒｉｌｌ，　Ｄ．Ｒ．　（１９９１）　Ｂｌｏｏｄ　７９（１０）：２６９４−７００）。
【００３１】
アデノウイルスは、高効率のトランスダクションを行うことができ、細胞の効率的なトランスダクションのために細胞増殖を必要としないという利点を有している。アデノウイルス及びアデノウイルベクター系の開発に関する一般的な背景となる文献としては、Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６−４６７；　Ｔａｋｉｆｆ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｌａｎｃｅｔ１１：８３２−８３４；　Ｂｅｒｋｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１：　６００３−６０２０；　Ｇｒａｈａｍ　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ　３：２９１７−２９２２；　Ｂｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６７：５９１１−５９２１；及びＢｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９４）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９１：８８０２−８８０６を参照できる。アデノウイルスベクターは、インビトロで遺伝子をクローニング及び発現するために使用されており（Ｇｌｕｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．　１１７２４，　ｐ．　１８７）、トランスジェニック動物の作出のために使用されており（ＷＯ９５／２２６１６）、ｅｘ　ｖｉｖｏで細胞に遺伝子を移入するために使用されており（ＷＯ９５／１４７８５；　ＷＯ９５／０６１２０）、あるいはインビボで細胞に遺伝子を移入するために使用されている　（特に、ＷＯ９３／１９１９１，　ＷＯ９４／２４２９７，　ＷＯ９４／０８０２６を参照）。
【００３２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ウイルス複製にヘルパーウイルス（アデノウイルスなど）を必要とする、約５ｋｂの線状一本鎖ＤＮＡウイルスのパルボウイルスである（Ｂ．Ｊ．　Ｃａｒｔｅｒ，　ｉｎ　”Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，　ｅｄ．，　Ｐ．　Ｔｉｊｓｓｅｒ，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　ｐｐ．１５５−１６８を参照）。インビトロ及びインビボでの遺伝子導入のためのＡＡＶ由来ベクターの使用は、文献に記載されている（特に、ＷＯ９１／１８０８８；　ＷＯ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７，３６８号，同　５，１３９，９４１号，及びＥＰ　４８８　５２８号を参照）。アデノ随伴ウイルスは、ウイルスゲノムの両端に存在するＴ字型ヘアピン構造をしたＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）を介して宿主細胞の染色体の特定の部位に組み込まれることが知られている。ウイルス蛋白質に関しては、ゲノムの左半分が非構造蛋白質（調節蛋白質）のＲｅｐをコードし、右半分が構造蛋白質のカプシド蛋白質Ｃａｐをコードしている。ＡＡＶベクターを作製するには、その両端にＩＴＲを含むＡＡＶを構築し、目的の遺伝子を有するプラスミド（ＡＡＶベクタープラスミド）または目的の遺伝子を含む核酸をＩＴＲの間に挿入する。一方、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルス蛋白質は別のヘルパープラスミドより供給する。上記両方のプラスミドを２９３細胞にトランスフェクションなどにより導入し、さらにアデノウイルス（ヘルパーウイルス）を感染させると、非増殖性の組み換えＡＡＶ（ＡＡＶベクター）が産生されるようになる。あるいは、宿主細胞はヘルパーウイルス機能をコードする核酸を含む。このＡＡＶベクターは核内に存在するため、細胞を凍結融解して回収し、混入するアデノウイルスは加熱により失活させるか、あるいはＣｓＣｌ勾配などによりＡＡＶから分離される。さらに、ベクターは、塩化セシウム密度勾配超遠心法により精製される。
【００３３】
バキュロウイルスは哺乳細胞でタンパク質を発現させるために使用されている（例えば、米国特許第５，７３１，１８２号を参照）。バキュロウイルスのゲノムは、バキュロウイルスが哺乳細胞に結合してその中に入ることを可能にする哺乳類受容体特異的タンパク質をコードする遺伝子を含む、リガンドＤＮＡの挿入によって改変してもよい。
ワクシニアウイルスは、米国特許第６，１０３，２４４号に記載されている。外来遺伝子を含む組み換えワクシニアウイルスの構築は、Ｐａｎｉｃａｌｉ及びＰａｏｌｅｔｔｉ，　１９８２，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　７９：４９２７−４９３１；　Ｍａｃｋｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８２，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　７９：７４１５−７４１９；及び米国特許第４，７６９，３３０号に記載されている。
【００３４】
レトロウイルスベクターを使用する場合、その例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ，　ＭｏＭＬＶ）などのオンコウイルス由来のものや、ヒト後天性免疫不全症候群ウイルス（Ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ，　ＨＩＶ）などのレンチウイルス由来のものが挙げられる。
通常使用されるレトロウイルスベクターとしては、ＲＮＡウイルスであるマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）の基本骨格を利用するものであり、これは宿主域が広く遺伝子導入効率が比較的高い。レトロウイルスベクターを作製方法は当分野で公知である。簡単に言うと、レトロウイルスベクターを作製するためには、先ずウイルスゲノムから、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）の間のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの大部分を取り除き、その代わりに目的の遺伝子を挿入する。このベクタープラスミドを遺伝子産物、即ち、ウイルス蛋白質（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）を発現するように作られたパッケージング細胞株、即ち、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの核酸を含む細胞株に導入すると、遺伝子産物を発現する組み換えレトロウイルス（レトロウイルスベクター）が培養上清中に産生されるようになる。通常は力価の高いレトロウイルスベクター産生株をクローニングし、同一細胞株を長期的に使用する。上記したようなウイルスベクター産生細胞の培養上澄を用いて標的細胞に感染させるのが一般的である。
【００３５】
アデノウイルスは約３６ｋｂの大きさの線状二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスベクターの作製方法は当分野で公知であり、以下に概略を説明する。例えば、必須のＥ１機能の一部又は全部を欠くアデノウイルスなどの複製欠損アデノウイルスを使用する。アデノウイルスベクターの作製方法の概略を以下に説明する。先ず、Ｅ１遺伝子領域をアデノウイルスから除去してそこに目的の遺伝子を挿入したコスミドを構築する。このコスミドを、Ｅ１遺伝子領域を切断した親ウイルスＤＮＡ（末端蛋白質が付いているものを用いる）とともにＨＥＫ２９３細胞に導入する。すると、細胞内で相同組み換えが起こり、非増殖性のアデノウイルスベクターが産生されるようになる。このウイルスベクターは細胞の凍結融解により回収し、塩化セシウム密度勾配超遠心法により精製する。アデノウイルスベクターの特徴は、高力価のベクターが作製でき、広範囲の細胞に効率良く遺伝子導入でき、非分裂細胞にも遺伝子導入が可能であることなどである。癌細胞へ遺伝子導入するのであれば多少の細胞毒性は問題にならない（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ　Ｊ．　１９９９，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｍｏｌ．　Ｔｈｅｒ．　４：５００−５０９を参照）。また、一過性の遺伝子発現で治療効果を達成できる場合があることから、アデノウイルスベクターは、特に癌の遺伝子治療に適している。
【００３６】
動物細胞を宿主として使用するため、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、βアクチンプロモーター等のプロモーターを使用することができる。また、必要に応じてエンハンサーを使用してもよい。細胞または組織に特異的な発現は、細胞特異的エンハンサー及び／又はプロモーターを使用することにより達成することができる（一般的には、Ｈｕｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ａｄｖ．　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　１７：２７９−２９２を参照）。本発明の組み換えベクターを含む発現ベクターはまた、ベクターを腫瘍細胞に標的化できる腫瘍で上昇調節されている腫瘍マーカー蛋白質又は他の因子の１以上のプロモーター及び／又はエンハンサーを含んでいてもよい。例えば、哺乳類腫瘍細胞で発現の増大が見られるＥｒｂＢ２のプロモーターを利用して、本発明の組み換えベクターを哺乳動物腫瘍細胞に標的化することができる。
【００３７】
動物発現用プラスミドベクターの宿主としては、大腸菌Ｋ１２・ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用できる。このような菌株は公的機関から入手可能である。大腸菌の形質転換は当業者に公知である（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌを参照）。ウイルスベクターは、複製コンピテントでも複製欠損でもよい。複製欠損ウイルスベクターは、適当なヘルパー細胞株、即ち、複製に必須なウイルス機能をコードする核酸を含む細胞株で増殖させる。ウイルスベクターの宿主としては、ウイルス生産能を有する動物細胞であり、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞等が用いられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶ等が使用される。アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞等が用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法、又は当業者に公知の他の方法で行うことができる。
【００３８】
得られた形質転換体は、以下の通り培養し、組み換え遺伝子ベクターを生産することができる。
大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により、本発明の組み換え遺伝子ベクターを取得することができる。
動物細胞の形質転換体を培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。本発明の組み換え遺伝子ベクターを含有するウイルス粒子は培養上清中に放出される。ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法等の当業者に公知の方法により行うことにより、本発明の組み換え遺伝子ベクターを取得することができる。
【００３９】
ＩＩＩ．ＬＩＰの制御
本発明は、宿主細胞中におけるＬＩＰの転写及び／又は翻訳を減少、低下または抑制するための組成物および方法を提供する。そのような組成物としては、宿主細胞中におけるＬＩＰの転写を減少、低下または抑制することができるオリゴヌクレオチド、即ち、オリゴヌクレオチドデコイ、リボザイム、及びインタフェアリングＲＮＡ（ｉＲＮＡ）が挙げられる。従って、本発明は、細胞中におけるＬＩＰの転写及び／又は翻訳を減少または抑制する方法であって、細胞中におけるＬＩＰの転写を減少、低下または抑制することができるアンチセンス核酸、オリゴヌクレオチド、リボザイム、及び／又はインタフェアリングＲＮＡ（ｉＲＮＡ）に細胞を接触させることを含む方法を提供する。ＬＩＰの転写及び翻訳は、当業者に公知の手段によって測定することができ、例えば、ＰＣＲ及びノザンブロットが挙げられる。
【００４０】
本発明は、Ｃ／ＥＢＰβ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β）遺伝子のヌクレオチド配列中のＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧのヌクレオチド配列又はその相補配列を含む、約１０から約１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、オリゴヌクレオチドは、細胞中のＬＩＰの機能を減少、低下又は抑制することができる。
例えばオリゴヌクレオチドは約１０〜約８０ヌクレオチドの長さを有し、例えばオリゴヌクレオチドは約１５〜約５０ヌクレオチドの長さを有し、例えばオリゴヌクレオチドは約２０〜約８０ヌクレオチドの長さを有し、例えばオリゴヌクレオチドは約１５〜約４０ヌクレオチドの長さを有し、例えばオリゴヌクレオチドは約１５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、例えばオリゴヌクレオチドは約１５〜約２５ヌクレオチドの長さを有する。例えば、例えばオリゴヌクレオチドは少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は少なくとも約２０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、オリゴヌクレオチドは最大で約３０、４０、５０、６０、７０又は８０ヌクレオチドの長さを有する。ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧの周辺のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドは、ＬＩＰ発現を減少、低下又は抑制するためのデコイオリゴヌクレオチドとして使用される。さらに、上記ヌクレオチド配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＬＩＰの発現を減少、低下又は抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用される。例えば、配列番号１の４２７番目の核酸Ｇから４８９番目の核酸Ｃまでの配列（６３塩基対）又はその相補鎖を含む核酸、並びに配列番号３の５６５番目の核酸Ｇから６２７番目の核酸Ｔまでの配列（６３塩基対）又はその相補鎖を含む核酸は、オリゴヌクレオチドデコイ及び／アンチセンス核酸を設計することができる領域である。オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、即ち、オリゴヌクレオチドデコイ又はアンチセンス核酸はベクターに組み込まれ、細胞中のＬＩＰの発現量を減少又は低下させるために細胞にトランスフェクションされる。理論には拘束されないが、ＬＩＰのプロモーターなどがオリゴヌクレオチドに結合する。本発明のオリゴヌクレオチドは単独でも使用でき、または本発明の組み換えベクター又は他の治療と一緒に使用することもできる。
【００４１】
上記の両方の場合において、ＬＩＰの発現は減少、低下または抑制し、その結果、Ｃ／ＥＢＰβ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β）遺伝子から発現するＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量に対するＬＡＰ（転写活性化因子）の発現量の比率は増大する。本書中の実施例で実証した通り、癌のインビボモデルにおいて、ＬＩＰの発現を減少させ、それによりＬＡＰ／ＬＩＰの発現の比率を増大することにより、対照と比較して癌形成と転移が減少するという結果を得た。従って、ＬＩＰの発現を減少、低下又は抑制できるオリゴヌクレオチド又はアンチセンス核酸又はｉＲＮＡを細胞に投与又は導入することは、例えば、癌形成及び／又は転移を含む癌に付随する症状の減少、そして例えば腫瘍増殖の遅延に相関する。
【００４２】
インタフェアリングＲＮＡ（ｉＲＮＡ）は、抑制すべき遺伝子に相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により開始される配列特異的な転写後の遺伝子スプライシングの機構である（Ｓｈａｒｐ，　Ｐ．，　２００１，　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　１５：４８５−４９０を参照）。ｍＲＮＡとその相補鎖形態から成るｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成する。この二本鎖領域は、ＲＮＡｓｅＩＩＩ様酵素で分解され、ｍＲＮＡは翻訳されない。細胞に導入する場合、短いｄｓＲＮＡ（小さいインタフェアリングＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡ）も、当該短いｄｓＲＮＡの配列を含むｍＲＮＡを分解するのに有効である。理論には拘束されないが、細胞性ＲＮＡ分解系が細胞中に存在し、ウイルス又はトランスポゾンＲＮＡに対する保護の手段としてｄｓＲＮＡによって刺激されている可能性があることを示唆する証拠がある。本発明は、ＬＩＰの開始コドンＡＴＧの周辺のヌクレオチド配列を含み、ＬＩＰ発現を減少、低下及び／又は抑制できるインタフェアリングＲＮＡ配列を包含する。例えば、ｉＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列の４５７番目から４５９番目のヌクレオチド及び配列番号３のヌクレオチド配列の５９５番目から５９７番目のヌクレオチドに対応するＬＩＰの開始ＡＴＧを標的化するように設計される。ｉＲＮＡの設計手段は当業者に既知である。本発明のｉＲＮＡは単独でも使用することができ、または本発明の組み換えベクター及び／又はＬＡＰ活性を有する変異ＬＡＰポリペプチド及び／又は他の治療と一緒に使用することができる。
【００４３】
あるいはまた、本発明は、例えばＬＡＰの発現に影響を与えずに、ＬＩＰの転写を減少、低下、停止又は抑制するリボザイムの使用をも包含する。ＬＩＰを減少、低下又は抑制することができるリボザイムは単独でも使用することができ、または本発明の組み換えベクター及び／又はＬＡＰ活性を有する変異体ＬＡＰポリペプチド及び／又は他の治療と一緒に使用することができる。
【００４４】
ＬＩＰの発現を減少、低下及び／又は抑制できる特定のオリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸及びｉＲＮＡをスクリーニングするアッセイは当業者に公知であり、本書に記載されている。簡単に言うと、本書中の実施例に開示したアッセイにおいては、ｇ６乳癌細胞株を、被験試料、例えば、本発明の組み換えベクター、オリゴヌクレオチド、アンチセンス又はｉＲＮＡと接触させ、形態および細胞接着について組織学的に試験を行う。ＬＩＰの発現を減少、低下及び／又は抑制できる組み換えベクター、オリゴヌクレオチド、アンチセンス又はｉＲＮＡと接触させた細胞において、その形態は正常の癌でない細胞と同様であろう。また、そのような細胞をヌードマウスに導入して、癌形成能及び転移をアッセイすることができる。ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）遺伝子の一部又は全部のヌクレオチド配列を含み、該Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の一部又は全部がＬＩＰ転写阻害タンパク質の開始コドンＡＴＧの周辺の核酸を含み、該ヌクレオチド配列は該ＬＩＰ転写阻害タンパク質のＡＴＧに変異を含むウイルスベクターなどの組み換えベクターを対照として使用することができる。本書の実施例に記載した組み換えベクターはスクリーニングアッセイにおいて対照として使用できる。
【００４５】
ＩＶ．組成物および用途
組成物
本発明は、本発明の組み換えベクター、組み換えウイルスベクター又はウイルス粒子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ又はｉＲＮＡを含む組成物を包含する。例えば、組成物にはさらに、薬学的に許容できる賦形剤又は担体、又は緩衝剤を含めてもよい。
例えば、上記組成物は、癌及び／又は腫瘍増殖などの、細胞又は個体におけるＬＡＰ／ＬＩＰの比率に関連した疾患又は状態の症状を治療及び／又は緩和するための方法において使用される。例えば、本書に開示した組成物は腫瘍溶解活性を示す。本書で使用する用語「治療する」又は「治療」とは、癌などの疾患や望ましくない状態の１以上の症状を緩和、改善、減少又は安定化すること、並びに疾患又は望ましくない状態の１以上の症状の進行を遅延させることを意味する。本発明の組成物は、当業者に既知の化学療法剤、放射線及び／又は抗体などを含むがこれらに限定されない他の治療法と組み合わせて使用してもよいし、組み合わせなくてもよい。例えば、本発明の組成物は、エピモルフィンの一部又は全部と組み合わせて投与される。
【００４６】
本書で使用する用語「悪性」、「悪性細胞」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」及び「癌細胞」（同義で使用する）とは、比較的自律した増殖を示し、その結果、細胞増殖の制御の有意な喪失を特徴とする異常増殖表現型を示す細胞のことを意味する。用語「腫瘍」は転移性腫瘍と非転移性腫瘍を包含する。
本明細書で使用する「腫瘍溶解活性」とは、腫瘍及び／又は悪性及び／又は癌細胞の増殖の阻害又は抑制；腫瘍及び／又は悪性及び／又は癌細胞の増殖の退行；腫瘍及び／又は悪性及び／又は癌細胞の細胞死、又はさらに別の腫瘍及び／又は悪性及び／又は癌細胞の発生の防止を意味する。本明細書で使用する「腫瘍の増殖の阻害又は抑制」とは、本発明の組成物又は方法を含むＶＳＶの投与に際して、腫瘍の増殖速度の低減、腫瘍増殖を完全に停止すること、存在する腫瘍の大きさを退行させること、存在する腫瘍を絶滅すること、及び／又はさらに別の腫瘍の発生を防止することを意味する。腫瘍の増殖の「抑制」とは、本発明の組成物と接触しない場合の増殖と比較して低減した増殖状態のことを意味する。腫瘍細胞の増殖は、腫瘍サイズの測定、腫瘍細胞の増殖の有無についての３Ｈチミジン取り込みアッセイを用いた測定、又は腫瘍細胞の計測などを含むがこれらに限定されない当業者に公知の方法で評価することができる。腫瘍及び／又は悪性及び／又は癌細胞の増殖の「抑制」とは、以下の状態；腫瘍の増殖の緩和、遅延及び停止、並びに腫瘍の収縮の何れか又は全てを意味する。腫瘍及び／又は悪性及び／又は癌細胞の「成長の遅延」とは、疾患の発達を遅らせ、阻害し、緩和し、妨害し、安定化し、及び／又は延期することを意味する。この遅延は、治療する疾患及び／又は個人の経歴に応じて、時間の長さが変化する。
【００４７】
本発明は、本発明の組み換えベクター、又はＬＩＰ発現、特に本書に記載した悪性細胞及び／又は腫瘍細胞に伴うＬＩＰ発現を減少、低下及び／又は抑制することができるオリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸又はｉＲＮＡを用いて、ＬＡＰ／ＬＩＰの比率を増大させる組成物及び方法を包含する。治療に望ましい個体は、癌、腫瘍又は悪性細胞の発達の危険にあると考えられる個体、例えば、癌、悪性細胞又は腫瘍細胞を含む疾患を以前に患ったことがある個体、又はそのような癌、腫瘍細胞又は悪性細胞の経歴を家系に有する個体などである。本発明の組成物の投与の適性の決定は、血清学的指標及び細胞、組織又は腫瘍生検の組織学的検定などの評価可能な臨床パラメーターに依存する。一般的には、薬学的に許容可能な賦形剤中の組成物を投与する。
【００４８】
従って、本発明は、癌又は腫瘍細胞に本発明の組み換えベクター又は変異ＬＡＰポリペプチド、又は核酸構築物、例えば、オリゴヌクレオチド又はアンチセンス核酸又はｉＲＮＡを接触させ、それによって腫瘍又は細胞中のＬＡＰ／ＬＩＰの比率を増加させる工程を含む、癌又は腫瘍増殖を抑制する方法を提供する。
例えば、そのような組成物は、宿主細胞中のＬＡＰ／ＬＩＰの比率を調節する薬剤をスクリーニングする方法において使用される。例えば、スクリーニング方法を使用して、宿主細胞中のＬＩＰの発現を減少、低下又は抑制する薬剤を同定する。例えば、スクリーニング方法を使用して、宿主細胞中のＬＡＰの発現を増大したり、又は宿主細胞中のＬＡＰの生物学的活性を増大する薬剤を同定する。例えば、薬剤、組み換えベクター又は核酸構築物は、本書に開示したスクリーニングアッセイで測定した場合に腫瘍溶解活性を有する。
【００４９】
更に別の例では、本発明は、癌細胞、悪性細胞又は腫瘍細胞が、本発明の組成物による治療に感受性かどうかを決定する方法であって、（ａ）癌、悪性又は腫瘍の細胞を含む試料を第一の部分と第二の部分とに分け；（ｂ）ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）遺伝子の一部又は全部のヌクレオチド配列を含み、該Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の一部又は全部がＬＩＰ転写阻害タンパク質の開始コドンＡＴＧの周辺の領域を含み、かつ該ヌクレオチド配列が該ＬＩＰ転写阻害タンパク質の開始コドンＡＴＧ中に変異を含むウイルスベクター又は組み換えベクター、又はＬＩＰの転写を低下できるオリゴヌクレオチド又はアンチセンス核酸又はｉＲＮＡ、又は本書に開示したスクリーニング方法で同定される薬剤などの組成物で上記第一の部分を処理し；そして（ｃ）上記第一の部分中の死滅細胞の割合が上記第二の部分よりも高いかどうかを決定し、第一の部分中の死滅細胞の割合が上記第二の部分よりも高い場合に、癌、悪性又は腫瘍が該組成物による治療に感受性であるとする、ことを含む方法を提供する。
【００５０】
例えば、本発明はさらに、遺伝子治療剤、即ち、細胞に投与又は送達される薬剤であって、Ｃ／ＥＢＰβ　（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β）遺伝子のヌクレオチド配列中のＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の開始コドンＡＴＧを別のコドンに置換し、置換されたコドンがＴＴＧではないＣ／ＥＢＰβ遺伝子の一部又は全部のヌクレオチド配列を含む組み換え遺伝子を含む薬剤、又は本発明のオリゴヌクレオチド又はアンチセンス核酸又はｉＲＮＡを含む薬剤に関するものである。そのような組成物は、癌の症状の治療及び／又は緩和、例えば、腫瘍の増殖の遅延のための方法において使用することができる。例えば、そのような薬剤は、腫瘍細胞又は悪性細胞に局所的に、即ち、腫瘍内に投与する場合、並びに静脈内投与又は他の経路によって腫瘍又は悪性細胞の先端に投与する場合、腫瘍溶解活性を示す。例えば、本発明の組み換えベクター又は変異ＬＡＰポリペプチド又は核酸構築物（例えば、オリゴヌクレオチド又はアンチセンス核酸又はｉＲＮＡなど）の投与については、処理した細胞を治療後に個体に戻すｅｘ　ｖｉｖｏで行うことができる。
【００５１】
治療すべき癌の具体例としては、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。対象となる癌の好ましい例は、乳癌および肝臓癌である。
【００５２】
本発明の方法で使用するための組成物は、ウイルスベクターなどの組み換え遺伝子ベクター（又はオリゴヌクレオチド又はアンチセンス核酸又はｉＲＮＡ）を有効成分として基剤と一緒に配合することにより製造することができる。
また、上記組み換えウイルスベクターがウイルスベクターに組み込まれている場合は、組換え体ＤＮＡを含有するウイルス粒子を調製し、これを基剤と一緒に配合することにより、遺伝子治療用組成物、即ち、細胞送達剤を製造することができる。
【００５３】
遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等が挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、もしくは界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。また、本発明の薬剤は投与する直前に、必要によりリポソーム等に封入し、癌の症状の治療及び／又は緩和のために用いることができる。
【００５４】
本発明の組成物の生体への導入方法としては、遺伝子を化学的または物理的に導入する方法（遺伝子移入：トランスフェクション）と、ウイルスを用いる方法（遺伝子導入：トランスダクション）とが知られている。
生体内への物理的な遺伝子移入法（トランスフェクション）としては、インビボ・エレクトロポレーション法、並びに遺伝子銃法がある。インビボ・エレクトロポレーション法では、生体組織に直接電圧パルスを印加してＤＮＡを入れる方法である。ＤＮＡを適当な緩衝液（例えば、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ、２５μＭ　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に溶解し、得られた溶液をガラス電極を用いて組織に注入する。遺伝子銃法は、金粒子に付着させたＤＮＡを加速させて細胞内に射入する方法である。大気圧下で、Ｂｉｏｒａｄ社が開発した手持ち銃型のＨｅｌｉｏｓ銃による、インビボ法で個体内に直接、簡単かつ高効率で遺伝子を導入することができる（Ｋｕｏ　Ｃ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．　２００２，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｍｏｌ．　Ｍｅｄ．　６９：１３７−１４７を参照）。遺伝子銃法によれば、エンドソームなどのＤＮＡ分解系の影響を受けず、遺伝子をどの組織にも導入でき、また特定の部位に遺伝子導入することができる点が有利である。
【００５５】
生体内への化学的な遺伝子移入法としては、リポソーム法、膜融合蛋白質−リポソーム法、リポフェクション法などがある（Ｎｉｄｏｍｅ　Ｔ　ａｎｄ　Ｈｕａｎｇ　Ｌ，　２００２，　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．　２４：　１６４７−１６５２）。
リポソームは、リン脂質などの極性脂質が水相中で形成する小胞である。リポソーム形成の際にリポソーム内に取り込まれた遺伝子は膜内に保持される。また、リポソームに特定の蛋白質を化学結合させて、得られた産物を目的とする細胞に集中させるミサイル療法を行なうこと、即ち、目的の細胞を送達の標的にすることも可能である。
【００５６】
膜融合蛋白質−リポソーム法では、各種のウイルスの細胞への進入手段である、ウイルス外被（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）をリポソームに結合させておく。例えば、中性でも融合能が高く、細胞融合で多核細胞を作るセンダイウイルスの膜融合蛋白質を使用することができる。
リポフェクション法はカチオン性脂質を用いる方法である。カチオン性脂質は、導入遺伝子の負電荷を中和すると同時に、形質膜表面の負電荷を中和し、脂質の疎水性によって膜に融合してＤＮＡを巻き込むものと考えられている。カチオン性脂質の具体的商品例としては、リポフェクチン、リポフェクタミン、トランスフェクタムなどがある。このようなカチオン性脂質はリポソーム様の構造をとると考えられるが、導入遺伝子はリポソームの表面に結合されている。
【００５７】
トランスダクションはウイルスを用いて遺伝子を生体に導入する方法であり、遺伝子を高効率で導入できる方法である。具体的には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターなどを使用することができる。
薬学的に許容できる担体は当業者に周知であり、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等張水性緩衝液、及びこれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。そのような許容できる担体の一例は、安定化加水分解タンパク質、ラクトース等の１種以上の安定化剤を含む生理学的にバランスのとれた培地である。担体は好ましくは滅菌である。剤型は投与様式に適したものとするべきである。
【００５８】
所望により、本組成物には、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含めることができる。本組成物は液体溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル剤、持続放出製剤、又は粉末剤とすることができる。経口製剤としては、薬学的規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準担体を含むことができる。
一般的に、成分は別々に供給するか、例えば、活性剤の量を表示するアンプル又は小袋などの密閉容器中に凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として単回投与形態で一緒に混合する。組成物を注入により投与する場合、滅菌希釈剤のアンプルを供給して、成分を投与前に混合することができる。
組成物又は製剤で使用する組成物中の薬剤の正確な量はまた、投与経路、治療されるヒトなどの細胞又は個体の性質に依存し、標準的な臨床技術に従って実務者の判断及び状況に従って決定するべきである。所定の製剤で使用する薬剤の正確な量は、所望の活性、例えば腫瘍溶解活性を生み出すのに必要な組成物の最小量が付与される限りは、重要ではない。約１０ｍｇから１ｍｇ以上程度の投与量範囲が意図される。
【００５９】
本発明のベクター又はウイルス粒子又は核酸組成物の有効投与量は、動物モデル試験系から得た投与量・応答曲線から推定してもよい。
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、患者の年齢、性別もしくは症状、又は投与経路もしくは投与回数、又は剤型によって異なる。一般に、成人では一日当たりの組み換え遺伝子の投与量は、約１μｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、他の例では、約１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。ウイルスとして投与する場合、約１０２から約１０７ｐ．ｆ．ｕ、例えば、約１０３から約１０６ｐ．ｆ．ｕ、例えば、約１０４から約１０５ｐ．ｆ．ｕを投与できる。ポリヌクレオチド構築物、例えば組み換えベクター（即ち、ウイルスとしてパッケージされていない）として投与する場合、約０．０１μｇから約１０００μｇの本発明の構築物を投与することができ、例えば、約０．１μｇから約５００μｇ、例えば、約０．５μｇから約２００μｇを投与できる。１より多くの組成物を同時又は連続的に投与することができる。例えば、本発明の組成物は、エピモルフィンの一部又は全部と一緒に投与される。投与は典型的には、応答をモニターしながら定期的に行う。投与は、例えば、腫瘍内、静脈内又は腹腔内に行う。
【００６０】
多くの方法を使用して、ウイルスベクター又はウイルス粒子などの本発明の組成物を個体に投与又は導入することができ、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内、皮下、及び鼻腔内投与などが挙げられるが、これらに限定されない。組成物を投与する個体は、霊長類であり、別の実施例では哺乳類であり、別の実施例ではヒトであるが、非ヒト哺乳類としては、牛、馬、羊、豚、猫、犬、ハムスター、マウス及びラットなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与でもよいし、あるいは癌原病巣または予想転移部位に対して、局所注射又は経口投与等の局所投与を行ってもよい。さらに、本発明の薬剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、または外科的手術等と組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００６１】
また、エピモルフィンはＣ／ＥＢＰβの発現を増大させる作用が有することが知られている（Ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．１５３，　Ｎｏ．４，　２００１，　７８５−７９４）。従って、本発明の遺伝子治療剤は、エピモルフィン活性を有する蛋白質又はペプチドと組み合わせて使用することにより、その治療効果をさらに高めることができる。
【００６２】
使用
ＬＡＰ（転写活性化因子）／ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率の変化
ＬＩＰ発現を減少、低下又は抑制できるか、ＬＡＰ発現を増大できる、本書中上記の組み換え遺伝子ベクター又はオリゴヌクレオチド又はアンチセンス核酸、又はｉＲＮＡを含む医薬組成物などの本発明の組成物を用いることによって、細胞中に発現されるＬＡＰ（転写活性化因子）／ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率を変化させることができる。従って、本発明は、細胞中のＬＡＰ（転写活性化因子）／ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率を変化させる方法であって、細胞に本明細書に記載の組み換えベクター又は本明細書に記載のオリゴヌクレオチド又はアンチセンス核酸又はｉＲＮＡを好適な条件下で接触させることを含む方法を提供する。この方法も本発明の範囲内である。特に本発明においては、ＬＡＰ（転写活性化因子）／ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率を変化させて、ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）発現量に対するＬＡＰ（転写活性化因子）の比率（ＬＡＰの発現量／ＬＩＰの発現量）を上昇させることによって、本発明の組成物の抗癌作用又は腫瘍溶解作用、又は例えば、腫瘍抑制作用を達成することができる。即ち、癌患者におけるＬＡＰ（転写活性化因子）／ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率の異常を正常に戻す工程を含む、癌に関連する症状を治療及び／又は緩和する方法、例えば、癌の増殖を抑制する方法も本発明の範囲内である。
【００６３】
抗癌剤のスクリーニング方法
本発明は、Ｃ／ＥＢＰβ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β）遺伝子から発現されるＬＡＰ（転写活性化因子）およびＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率を指標として用いる、薬剤のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法によれば、癌患者におけるＬＡＰ（転写活性化因子）／ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率の異常を正常に戻す作用を有する物質を選択することができる。このようにして選択される癌患者におけるＬＡＰ（転写活性化因子）／ＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率の異常を正常に戻す作用を有する物質は、例えば、癌の増殖を遅延させるなどの癌の症状を治療及び／又は緩和するために有用である。
【００６４】
Ｃ／ＥＢＰβ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β）遺伝子から発現されるＬＡＰ（転写活性化因子）およびＬＩＰ（転写阻害タンパク質）の発現量の比率は、当業者に既知の常法、例えば、ノザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、又はウエスタンブロット法などにより測定することができる。なお、これらの方法においてＬＡＰおよびＬＩＰを検出するために使用するプローブ、プライマー又は抗体は、本明細書に記載したＬＡＰ及びＬＩＰのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を用いて常法により当業者であれば適宜入手・作製することができる。本発明のスクリーニング方法に供される被験物質の種類は特に限定されず、任意の物質を使用することができる。被験物質は、オリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸、ｉＲＮＡ、低分子合成化合物、又は天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。ある実施例としては、被験物質は低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６５】
【実施例】
実施例１：ベクターの構築
（ａ）　ラットのＬＡＰの全配列をｐＴｅｔＴ−ｓｐｌｉｃｅ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）に組み込んだベクター（Ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ　Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，　Ｖｏｌ．１５３，Ｎｏ．４，　２００１，　７８５−７９４）をテンプレートとし、以下のプライマー（プライマー１：ＧＧＧ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＣＧＣＣＡＴ　ＧＧＡ　ＡＧＴ　ＧＧＣ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＣＴＡＣ（配列番号５）；およびプライマー２：ＡＴＡ　ＴＧＣ　ＴＡＧ　ＣＧＣ　ＧＧＧ　ＣＧＣ　ＧＴＣ　ＧＴＣ　ＣＧＣ　ＧＣＧ　ＣＴＴ　ＧＣＡ（配列番号６））、ならびにＬＡＴａｇ（タカラ）を用いて、ＬＩＰ領域を欠損したＬＡＰｃＤＮＡを作成し、ＢａｍＨＩ，ＮｈｅＩ処理して末端を制限サイトにした。
（ｂ）　プロメガｐＴＡＲＧＥＴ（プロメガ）のベクターをＮｈｅＩ，ＢａｍＨＩで処理し、ここにライゲーションキット（タカラ）を用いて上記（ａ）で作製したｃＤＮＡを挿入した。
（ｃ）　ＰｔｅｔＬＡＰをテンプレートとして、以下のプライマー（プライマー３：ＡＴＡ　ＴＧＣ　ＴＡＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＧＣＴ　ＴＣＣ　ＣＧＴ　ＴＣＧ　ＣＣＣ　ＴＧＣ　ＧＣＧ（配列番号７）；およびプライマー４：ＡＴＡ　ＴＧＣ　ＴＡＧ　ＣＡＧ　ＴＧＡ　ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＧＡＧ　ＧＣＣ　ＡＧＣ　ＡＧＣ　ＧＧＣ（配列番号８））と、ＬＡＴａｇ（タカラ）を用いて、ＬＩＰ領域ｃＤＮＡを作成し、ＮｈｅＩ処理で末端をＮｈｅＩサイトにした。
【００６６】
（ｄ）　いったん大腸菌内で増殖し、精製した（ｂ）のプラスミドを、ＮｈｅＩで切断し、アルカリホスファターゼ（タカラＢＡＰ）で末端を脱リン酸化し、タカラライゲーションキットを用いて▲３▼を挿入した。
（ｅ）　配列を決定を行うことにより、プラスミドＬＡＰ内のＬＩＰ翻訳開始コドンであるＡＴＧが、ＣＧＣに置換していることを確認した（変異導入ＬＡＰの確認）。
（ｆ）　ｐＴｅｔ−ｓｐｌｉｃｅベクター（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）のＥｃｏＲＩサイトを切断し、ＢＡＰ処理した後、（ｅ）から切り出した変異導入ＬＡＰを含むＥｃｏＲＩ切断フラグメントを挿入した。（ｐＴｅｔ−ｓｐｌｉｃｅ変異導入ＬＡＰの作製）
【００６７】
実施例２：細胞培養と遺伝子導入
ｇ６細胞（乳癌細胞株）（Ｄｅｓｐｒｅｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒ．　１：９９−１１０：Ｒｏｓｋｅｌｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．　１９９４，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．　９１，　１２３７８−１２３８２；　Ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，　Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．　１４０：１５９−１６９）を増殖培地（５％のＦＢＳ［Ｈｙｃｌｏｎｅ］、５μｇ／ｍｌのインスリン　［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］、および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加したＤＭＥ／Ｆ１２　［ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ］　）中で維持した。ｇ６細胞（５×１０５）に、実施例１で得たベクター（５μｇ）、ｐＴｅｔ．ｔＴＡＫベクター（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（５μｇ）、及びｐＳＶ４０ｎｅｏ　（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２，　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．　３：６９９−７０９）（０．５μｇ）をリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を取扱説明書に従って使用してトランスフェクションした。テトラサイクリンの継続的な存在下でネオマイシン耐性クローンを選択した後、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下および非存在下においてＬＡＰの発現をウエスタンブロットにより分析した。ｇ６ＬＡＰ、ｇ６ＬＡＰ’、ｇ６ＬＡＰ”細胞株は、この方法で単離した。
【００６８】
実施例３：変異導入ＬＡＰによる細胞の形態変化
ｇ６細胞とｇ６ＬＡＰ細胞の形態を図１に示す。テトラサイクリンなしで培養すると、変異導入ＬＡＰ遺伝子を発現させた細胞では細胞接着がみられ、形態的にも正常細胞に類似していた。
【００６９】
実施例４：変異導入ＬＡＰによるＥ−カドヘリンの発現誘導
ウエスタンブロットを通常の方法に従って行った。２４穴プレートで培養した細胞に５００μｌのＳＤＳサンプルバッファーを加えた。細胞を回収し、超音波処理した。得られた試料を４〜２０％ゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜にブロットし、５％スキムミルクを含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で１時間ブロックした。ＴＢＳＴ中で１／５００希釈した抗Ｅ−カドヘリン抗体（ＥＣＣＤ２，タカラ）と１時間反応させた。ＴＢＳを用いて１０分間の洗浄を２回行った。ＴＢＳＴ中で１／１０００希釈した抗ラットＩｇＨＲＰラベル（アマシャムファルマシマ）と１時間反応させた。ＴＢＳで１０分間で３回、十分に洗浄した後、ＥＣＬ（アマシャムファルマシマ）を用いてオートラジオグラフィを行った。結果を図２に示す。図２の結果から分かるように、テトラサイクリンを含まない培地で変異導入したＬＡＰの発現を誘導した結果（ｇ６ＬＡＰ、ｇ６ＬＡＰ’、ｇ６ＬＡＰ”の３つの異なるクローン）、Ｅ−カドヘリンの発現が誘導された。
【００７０】
実施例５：ヌードマウスへの移植
ｇ６細胞、ｇ６ＬＡＰ細胞、ｇ６ＬＡＰ’細胞、およびｇ６ＬＡＰ”細胞をテトラサイクリンの非存在下で培養し、それぞれ１０７個を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）５匹を購入し、２匹にはｇ６、残り３匹にはｇ６ＬＡＰ，ｇ６ＬＡＰ’，ｇ６ＬＡＰ”を１０７ずつ腹腔内に注入した。３０日後、全マウスを殺し、開腹したところ、ｇ６移植マウスでは、癌の発生および転移が顕著であった。一方、ｇ６ＬＡＰ、ｇ６ＬＡＰ’又はｇ６ＬＡＰ”を移植したマウスでは、癌の発生及び転移は認められなかった。以上の結果から、変異導入ＬＡＰ遺伝子を有するｇ６ＬＡＰ細胞、ｇ６ＬＡＰ’細胞、およびｇ６ＬＡＰ”細胞では、癌形成能が喪失していることが実証された。
【００７１】
【配列表】
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＜２１０＞　７＜２１１＞　３６＜２１２＞　ＤＮＡ＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜２２０＞＜２２３＞　Ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ＜４００＞　７ａｔａｔｇｃｔａｇｃ　ｇｇｃｃｇｇｃｔｔｃ　ｃｃｇｔｔｃｇｃｃｃ　ｔｇｃｇｃｇ　　　　　　　　　３６＜２１０＞　８＜２１１＞　３６＜２１２＞　ＤＮＡ＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜２２０＞＜２２３＞　Ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ＜４００＞　８ａｔａｔｇｃｔａｇｃ　ａｇｔｇａｃｃｃｇｃ　ｃｇａｇｇｃｃａｇｃ　ａｇｃｇｇｃ　　　　　　　　　３６
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｇ６細胞とｇ６ＬＡＰ細胞の形態を示す。
【図２】図２は、変異導入ＬＡＰによるＥ−カドヘリンの発現誘導の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月15日(2003.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】提出物件の目録
【補正方法】追加
【補正の内容】
【外国語明細書】
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