(57)【要約】【課題】食品加工産業や薬品産業、繊維業界、洗剤業界およびパン製造業界等で有用な耐熱性グリコシダーゼ酵素等を提供する。【解決手段】種々のサーモコッカス（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロサームス（ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）　およびピロコッカス（ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属等の生物に由来する耐熱性グリコシダーゼ酵素等が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号１６〜２８に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有し、グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５塩基を含んでなるポリヌクレオチド；および
（ｄ）配列番号１６〜２８のアミノ酸配列を含んでなる第２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる第１のポリペプチド（ただし、第１のポリペプチドは、グリコシダーゼ活性を有する）または第１のポリペプチドの酵素の少なくとも３０アミノ酸残基を含んでなる酵素をコードするポリヌクレオチド、
よりなる群から選択されるメンバーを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
下記の（ａ）　〜（ｍ）　：
（ａ）　配列番号１６による、
（ｂ）　配列番号１７による、
（ｃ）　配列番号１８による、
（ｄ）　配列番号１９による、
（ｅ）　配列番号２０による、
（ｆ）　配列番号２１による、
（ｇ）　配列番号２２による、
（ｈ）　配列番号２３による、
（ｉ）　配列番号２４による、
（ｊ）　配列番号２５による、
（ｋ）　配列番号２６による、
（ｌ）　配列番号２７による、および
（ｍ）　配列番号２８による
よりなる群から選択されるメンバーのアミノ酸配列を含んでなる酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
下記の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）ＡＴＣＣ受託番号９７３７９中に含まれるＤＮＡによりコードされるポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有する第１のポリヌクレオチド（ただし、前記ポリペプチドはＯＣ１／４Ｖ、Ｆ１−１２Ｇ、９Ｎ２−３１Ｂ／Ｇ、ＭＳＢ−６Ｇ、ＡＥＤＩＩ１２ＲＡ−１８Ｂ／Ｇ、ＧＣ７４−２２ＧおよびＶＣ１−７Ｇ１よりなる群から選択され、また前記第１のポリヌクレオチドはグリコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする）；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５塩基を含んでなるポリヌクレオチド、
よりなる群から選択されるメンバーを含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項２に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞から前記ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現させることを含んでなるポリペプチドの産生方法。
【請求項９】
細胞が請求項６に記載のベクター中に含まれるＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現するように、該ベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクトすることを含んでなる、細胞の作製方法。
【請求項１０】
下記の（ａ）および（ｂ）；
（ａ）配列番号１６〜２８のアミノ酸配列を含んでなる第２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる第１のポリペプチド（ただし、第１のポリペプチドは、グリコシダーゼ活性を有する）；および
（ｂ）（ａ）の酵素の少なくとも３０アミノ酸残基を含んでなる酵素
よりなる群から選択されるメンバーを含むポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１６〜２８に示したアミノ酸配列を有する酵素よりなる群から選択される酵素を有効量で投与することを含んでなる、可溶性のセロオリゴ糖からのグルコースの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は１９９６年１月１１日付けで出願された継続中の特許出願第０８／５８３，７８７号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドがコードしているポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの用途、ならびにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産および単離に係る。より特定的にいうと、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、グルコシダーゼ、α‐ガラクトシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、β‐マンノシダーゼ、β‐マンナナーゼ、エンドグルカナーゼおよびプルラナーゼとして推定的に同定されている。
【０００３】
【従来の技術】
β‐ガラクトシドのグリコシド結合はいろいろな種類の酵素によって開裂され得る。（ｉ）ホスホエノールピルビン酸ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に依存する取込みを介して生成するリン酸化基質に特異的であるホスホ‐β‐ガラクトシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．８５）；（ｉｉ）β‐ガラクトシドに比較的特異的である、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＬａｃＺ酵素によって代表される典型的なβ‐ガラクトシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２３）；（ｉｉｉ）アグロバクテリウム・ファエカリス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆａｅｃａｌｉｓ）、クロストリジウム・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）またはスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）の酵素のようなβ‐グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）［Ｄａｙ，　Ａ．Ｇ．　ａｎｄ　Ｗｉｔｈｅｒｓ，　Ｓ．Ｇ．，　（１９８６）「アルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）からのβ‐グルコシダーゼの精製と特性決定」Ｃａｎ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　６４，　９１４−９２２　；Ｋｅｎｇｅｎ，　Ｓ．Ｗ．Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　Ｅｕｒ．　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２１３，　３０５−３１２；Ａｉｔ，　Ｎ．，　Ｃｒｕｅｚｅｔ，　Ｎ．　ａｎｄ　Ｃａｔｔａｎｅｏ，　Ｊ．　（１９８２）「クロストリジウム・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）から精製したβ‐グルコシダーゼの特性」Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１２８，　５６９−５７７；Ｇｒｏｇａｎ，　Ｄ．Ｗ．　（１９９１）「スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のβ‐ガラクトシダーゼは耐熱性のβ‐Ｄ‐グリコシダーゼのいくつかの活性のひとつに過ぎないことの証拠」Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　５７，　１６４４−１６４９　］。後者のグループのものは、グリコシド結合のβ‐アノマー配置に対して極めて特異的であるが、かなり緩い基質特異性を示し、β‐グルコシド以外にβ‐フコシドやβ‐ガラクトシドも加水分解する。
【０００４】
一般に、α‐ガラクトシダーゼは、多糖骨格上のガラクトース残基の加水分解を触媒するかまたはガラクトースを含む二糖もしくはオリゴ糖の開裂を加水分解する酵素である。
【０００５】
一般に、β‐マンナナーゼは、多糖骨格内のマンノース残基の加水分解を触媒するかまたはマンノース残基を含む二糖もしくはオリゴ糖の開裂を加水分解する酵素である。β‐マンノシダーゼは、マンノースを含む多糖上の非還元末端マンノース残基を加水分解し、またマンノース残基を含む二糖またはオリゴ糖の開裂を加水分解する。
【０００６】
グアーガム（ｇｕａｒ　ｇｕｍ）は、β‐１，４結合したマンノース骨格とα‐１，６結合したガラクトース側鎖から構成される分枝したガラクトマンナン多糖である。グアーの分解に必要とされる酵素はβ‐マンナナーゼ、β‐マンノシダーゼおよびα‐ガラクトシダーゼである。β‐マンナナーゼはマンノース骨格を内部で加水分解し、β‐マンノシダーゼは非還元末端マンノース残基を加水分解する。α‐ガラクトシダーゼはα結合したガラクトース残基を加水分解する。
【０００７】
ガラクトマンナン多糖およびそれを分解する酵素にはさまざまな用途がある。グアーは一般に食品の増粘剤として使われており、また油やガスの回収の際の油圧破壊（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ　ｆｒａｃｔｕｒｉｎｇ）に利用されている。したがって、ガラクトマンナナーゼは産業上グアーの分解と改質に適している。また、掘削（ｄｒｉｌｌｉｎｇ）および油井刺激（ｗｅｌｌ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）に伴なう過激な条件下で活性である耐熱性のガラクトマンナーゼに対するニーズがある。
【０００８】
これらの酵素にはテンサイ糖産業のような各種産業に他の用途もある。米国内のスクロース消費量の２０〜３０％はテンサイ（ｓｕｇａｒ　ｂｅｅｔ）からのスクロースである。原料のテンサイ糖は、テンサイの加工前の貯蔵中に腐敗が始まるとき少量のラフィノースを含有していることがある。ラフィノースはスクロースの結晶化を阻害し、また隠れた（ｈｉｄｄｅｎ）量のスクロースも構成する。したがって、原料のテンサイ糖からラフィノースを除去することには利点がある。α‐ガラクトシダーゼも、豆類のような食品およびその他のガスを含む（ｇａｓｓｙ）食品でラフィノース、スタキオースおよびベルバスコース（ｖｅｒｂａｓｃｏｓｅ）を分解する消化助剤として使われている。
【０００９】
高温において活性で安定なβ‐ガラクトシダーゼはラクトースを含有しない栄養乳製品の製造に優れた酵素であると思われる［Ｃｈａｐｌｉｎ，　Ｍ．Ｆ．　ａｎｄ　Ｂｕｃｋｅ，　Ｃ．　（１９９０）　酵素技術（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１５９〜１６０頁、ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、英国］。また、いくつかの研究により、グリコシル基転移反応によるオリゴ糖の酵素的合成にβ‐ガラクトシダーゼを応用できる可能性が示されている［Ｎｉｌｓｓｏｎ，　Ｋ．Ｇ．Ｉ．　（１９８８）「オリゴ糖の酵素的合成」Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　６，　１５６−２６４　；Ｃｏｔｅ，　Ｇ．Ｌ．　ａｎｄ　Ｔａｏ，　Ｂ．Ｙ．　（１９９０）「酵素的グリコシル基転移によるオリゴ糖合成」Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｊ．，　７，　１４５−１６２　］。このように産業上の可能性があるにもかかわらず、今までのところ、好熱菌のβ‐ガラクトシダーゼで特性決定されたものはほんの少しだけである。報告されている２つの遺伝子は、現在までに記載された中で最も好熱性の有機栄養真正細菌の一種である超好熱菌サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）のβ‐ガラクトシド開裂酵素である［Ｈｕｂｅｒ，　Ｒ．，　Ｌａｎｇｗｏｒｔｈｙ，　Ｔ．Ａ．，　Ｋｏｎｉｇ，　Ｅ．，　Ｔｈｏｍｍ，　Ｍ．，　Ｗｏｅｓｅ，　Ｃ．Ｒ．，　Ｓｌｅｙｔｒ，　Ｕ．Ｂ．　ａｎｄ　Ｓｔｅｔｔｅｒ，　Ｌ．Ｏ．
（１９８６）「Ｔ．マーティマ（Ｔ．　ｍａｒｔｉｍａ）　ｓｐ．　ｎｏｖ．は９０℃まで生育する独特の極めて好熱性の真正細菌の新しい属を表す」Ａｒｃｈ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１４４，　３２４−３３３］。その遺伝子産物はβ‐ガラクトシダーゼの一種およびβ‐グルコシダーゼの一種と同定された。
【００１０】
プルラナーゼはプルランおよびデンプンの枝切り酵素として良く知られている。この酵素はこれら高分子のα‐１，６‐グルコシド結合を加水分解する。この酵素の非常に重要な産業上の用途は甘味料（グルコースまたはマルトース）の製造のためのデンプン分解である。デンプンの分解は二段階で進む。第一段階はα‐アミラーゼによる基質の液化であり、第二段階すなわち糖化段階は収率を上げるために枝切り酵素として添加されるプルラナーゼとβ‐アミラーゼによって行なわれる。
【００１１】
エンドグルカナーゼは各種産業用途で使用することができる。たとえば、本発明のエンドグルカナーゼはセルロース内部のβ‐１，４‐グリコシド結合を加水分解することができ、したがって植物バイオマスを燃料や化学物質に変換するのに用いることができる。またエンドグルカナーゼは洗剤製造、織物産業、動物飼料、廃棄物処理、および果実汁の透明化・抽出のためにフルーツジュースや醸造産業にも用途がある。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、グルコシダーゼ、α‐ガラクトシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、β‐マンノシダーゼ、β‐マンナナーゼ、エンドグルカナーゼ、プルラナーゼ等のポリペプチドならびにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供しようとするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、その酵素活性の結果として、グルコシダーゼ、α‐ガラクトシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、β‐マンノシダーゼ、β‐マンナナーゼ、エンドグルカナーゼおよびプルラナーゼと同定された。
【００１４】
本発明の一つの態様では、新規な酵素、ならびにその活性な断片、類似体および誘導体が提供される。
【００１５】
本発明のもう一つの態様では、本発明の酵素をコードしている単離された核酸分子、たとえばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびにそのような酵素の活性のある類似体および断片が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様では、ＡＴＣＣ受託番号第９７３７９号に含まれているＤＮＡによって発現される成熟ポリペプチドをコードしている単離された核酸分子が提供される。
【００１７】
また本発明の別の態様では、本発明の核酸配列を含有する組換え原核および／または真核宿主細胞を、前記酵素の発現を促進する条件下で培養し、次いで前記酵素を回収することからなる、前記ポリペフチドを組換え技術によって製造する方法が提供される。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、そのような酵素を、またはそのような酵素をコードしているポリヌクレオチドを、食品加工産業で、薬品産業で、たとえばラクトースに対する不耐性を治療するために診断用リポーター分子として、トウモロコシの湿式粉砕で、フルーツジュース産業で、パン製造で、織物産業で、また洗剤産業で使用するガラクトースとグルコースにラクトースを加水分解するために利用する方法が提供される。
【００１９】
さらに、本発明の別の態様では、そのような酵素を、グアーガム（ガラクトマンナン多糖）を加水分解して非還元末端マンノース残基を除去するために利用する方法が提供される。またガラクトマンナンのような多糖およびそれを分解する本発明の酵素は各種用途をもっている。グアーガムは食品中に増粘剤として一般に用いられており、また油やガスの回収の際の油圧破壊でも利用されている。したがって、マンナナーゼは産業上グアーガムの分解と改質に関連している。さらに、掘削および油井刺激に伴なう過激な条件で活性である耐熱性のマンナーゼに対するニーズがある。
【００２０】
また、本発明のさらに別の態様では、本発明の核酸配列と特異的にハイブリダイズするのに充分な長さを有する核酸分子からなる核酸プローブが提供される。さらにまた本発明の別の態様では、そのような酵素を、またはそのような酵素をコードしているポリヌクレオチドを、科学的研究に関連してｉｎ　ｖｉｔｒｏの目的で、たとえば、前記ヌクレオチド配列の特定の領域、すなわち保存配列領域を用いることにより、類似の酵素をコードしているかもしれない類似の配列を他の生物から同定するためのプローブを作製するために、利用する方法が提供される。
【００２１】
本発明のこれらの態様およびその他の態様は本明細書の教示から当業者には明らかであろう。
【００２２】
定義
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味しており、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間にある介在配列（イントロン）を包含する。
【００２３】
あるコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列を転写して単一のｍＲＮＡとし、このｍＲＮＡが次いで翻訳されて双方のコード配列から導かれるアミノ酸を有する単一のポリペプチドになるとき、他のコード配列に「機能的に連結」している。これらのコード配列は、発現される配列が最終的にプロセッシングを受けて所望のタンパク質を産生する限り、互いに連続している必要はない。
【００２４】
「組換え」酵素とは、組換えＤＮＡ技術によって産生される酵素、すなわち、所望の酵素をコードしている外因性のＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞から産生される酵素をいう。「合成」酵素とは化学合成によって製造される酵素をいう。
【００２５】
特定の酵素のＤＮＡ「コード配列」または特定の酵素を「コードしているヌクレオチド配列」とは、適当な調節配列の制御の下におかれたときに転写され翻訳されて酵素になるＤＮＡ配列をいう。
【００２６】
発明の概要
本発明の一つの態様によると、図１〜１４の推定アミノ酸配列（配列番号１５〜２８）を有する成熟酵素をコードしている単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様によると、本発明の酵素をコードしている単離されたポリヌクレオチドが提供される。寄託された物質は、本発明の酵素をコードしているＤＮＡを含むゲノムクローンの混合物である。それぞれのＤＮＡを含む各ゲノムクローンはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）に挿入されている。この寄託物は、１９９５年１２月１３日付けで、米国メリーランド州２０８５２、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のパークローンドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）１２３０１にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号第９７３７９号が付与されている。
【００２８】
この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約下で行なわれた。これらの菌株は特許付与後なんの制限・条件もなく公衆に分譲される。これらの寄託物は単に当業者の便宜のためにのみ提供され、寄託物が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２の下で要求されるという承認ではない。本明細書の配列の記載と矛盾する場合には、これら寄託された物質に含まれるポリヌクレオチドの配列およびそれによりコードされているポリペプチドのアミノ酸配列が優先する。寄託された物質を製造、使用または販売するには許可が必要とされ、本明細書によってそのような許可がなされるわけではない。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明のポリヌクレオチドはもともと、以下の生物から得られたゲノム遺伝子ライブラリーから回収された。
【００３０】
Ｍ１１ＴＬは、イエローストーン国立公園（Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐａｒｋ）のダイヤモンドプール（Ｄｉａｍｏｎｄ　Ｐｏｏｌ）から単離されたデスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）の新種である。この生物は、酵母エキス、ペプトンおよびゼラチンを基質として含有する低塩培地中でＮ２／ＣＯ２気相中、８５〜８８℃、ｐＨ７．０で最適に生育する。
【００３１】
ＯＣ１／４Ｖはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属に由来する。この生物は、イエローストーン国立公園（Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐａｒｋ）から単離されたものであり、基質としてセルロースを含有する低塩培地中でＮ２気相中、７５℃で最適に生育する。
【００３２】
ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＶＣ１は、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に由来し、イタリアのヴルカノ（Ｖｕｌｃａｎｏ）から単離されたものであり、基質として元素状イオウ、酵母エキス、ペプトンおよびデンプンを含有する高塩培地（海）中でＮ２気相中、１００℃で最適に生育する。
【００３３】
スタフィロサームス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓ）Ｆ１は、スタフィロサームス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）属に由来し、イタリアのヴルカノ（Ｖｕｌｃａｎｏ）から単離されたものであり、基質として元素状イオウおよび酵母エキスを含有する高塩培地（海）中でＮ２気相中、８５℃、ｐＨ６．５で最適に生育する。
【００３４】
サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）９Ｎ−２は、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）９Ｎ−２属に由来し、東太平洋ライズ（Ｅａｓｔ　Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｒｉｓｅ）の拡散ベント流体（ｄｉｆｆｕｓｅ　ｖｅｎｔ　ｆｌｕｉｄ）から単離されたものであり、８７℃で最適に生育する偏性嫌気性生物である。
【００３５】
サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８は、サーモトゴ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇｏ）属に由来し、イタリアのヴルカノ（Ｖｕｌｃａｎｏ）から単離されたものであり、基質としてデンプンおよび酵母エキスを含有する高塩培地（海）中でＮ２気相中、８５℃、ｐＨ６．５で最適に生育する。
【００３６】
サーモコッカス・アルカリフィルス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌｃａｌｉｐｈｙｌｕｓ）ＡＥＤＩＩ１２ＲＡは、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属に由来し、基質としてポリスルフィドおよび酵母エキスを含有する高塩培地（海）中でＮ２気相中、８５℃、ｐＨ９．５で最適に生育する。
【００３７】
サーモコッカス・キトノファグス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｈｉｔｏｎｏｐｈａｇｕｓ）ＧＣ７４は、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属に由来し、基質としてキチン、肉エキス、元素状イオウおよび酵母エキスを含有する高塩培地（海）中でＮ２気相中、８５℃、ｐＨ６．０で最適に生育する。ＡＰＥＩＩ　１ａは嫌気性条件下海洋培地中で８５℃、ｐＨ６．５で最適に生育する。それは多くの基質を有する。
【００３８】
したがって、ポリヌクレオチドおよびそれによってコードされている酵素はそれらが単離された生物によって識別され、本明細書中では時として、「Ｍ１１ＴＬ」（図１、配列番号１および１５）、「ＯＣ１／４Ｖ−３３Ｂ／Ｇ」（図２、配列番号２および１６）、「Ｆ１−１２Ｇ」（図３、配列番号３および１７）、「９Ｎ２−３１Ｂ／Ｇ」（図４、配列番号４および１８）、「ＭＳＢ８」（図５、配列番号５および１９）、「ＡＥＤＩＩ１２ＲＡ−１８Ｂ／Ｇ」（図６、配列番号６および２０）、「ＧＣ７４−２２Ｇ」（図７、配列番号７および２１）、「ＶＣ１−７Ｇ１」（図８、配列番号８および２２）、「３７ＧＰ１」（図９、配列番号９および２３）、「６ＧＣ２」（図１０、配列番号１０および２４）、「６ＧＰ２」（図１１、配列番号１１および２５）、「ＡＥＰＩＩ　１ａ」（図１２、配列番号１２および２６）、「ＯＣ１／４Ｖ」（図１３、配列番号１３および２７）、ならびに「６ＧＰ３」（図１４、配列番号１４および２８）と称することがある。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、表１に示す公知の遺伝子およびこれにコードされるタンパク質と、ヌクレオチドおよびタンパク質レベルで同一性を示す。
【００４０】
【表１】
2004000189.tif 000002
本発明のポリヌクレオチドと酵素は、表２に示すように互いに相同性を示す。
【００４１】
【表２】
2004000189.tif 000003
表１と２に記載のすべてのクローンは、α−グリコシダーゼまたはβ−グリコシダーゼ活性を有する。
【００４２】
本発明の酵素をコードする単離された核酸分子以外に、本発明はまた、実質的に同様の配列を与える。単離された配列は、もし、（ｉ）これらが後述する条件下で、配列番号１〜８のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるなら、（ｉｉ）または、これらが配列番号１〜８のポリヌクレオチドに対して縮重しているＤＮＡ配列をコードするなら、実質的に同一である。縮重ＤＮＡ配列は、配列番号９〜１６のアミノ酸配列をコードするが、ヌクレオチドのコード配列では変動がある。本明細書において、実質的に同一であるとは、本発明の配列と同様の配列を有する配列を意味する。実質的に同じヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーションまたは配列の比較により同定することができる。実質的に同じ酵素配列は、以下の１つまたはそれ以上により同定することができる：タンパク質分解、ゲル電気泳動、および／または微量配列決定法。
【００４３】
本発明の酵素をコードする核酸分子を単離するための１つの手段は、遺伝子ライブラリーを天然のまたは人工的に作成したプローブと、当該分野で公知の方法（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ．　Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ａｓｓｏｃ．　ａｎｄ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、１９８９、１９９２）を使用してプローブ結合することである。配列番号１〜１４のポリヌクレオチドまたはその断片（少なくとも１２の連続したヌクレオチドを含む）は、特に有用なプローブであることは当業者には理解されるであろう。この目的のための他の特に有用なプローブは、配列番号１〜１４の配列にハイブリダイズすることができる断片（すなわち、少なくとも１２の連続したヌクレオチドを含む）である。
【００４４】
本明細書に開示した特異的な核酸配列とハイブリダイズする核酸配列に関して、ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、またはストリンジェントな条件下で行われる。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの例として、固定化した変性核酸を含有するポリマー膜を、まず０．９Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＨ２　ＰＯ４　、ｐＨ７．０、５．０ｍＭ　Ｎａ２　ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、１０×デンハルツ、および０．５ｍｇ／ｍｌ　ポリリボアデニル酸よりなる溶液中で４５℃で３０分プレハイブリダイゼーションする。次にこの溶液に、約２×１０７　ｃｐｍ　（比活性４〜９×１０３　ｃｐｍ／μｇ）の３２Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを加える。１２〜１６時間のインキュベーション後、０．５％ＳＤＳを含有する１×ＳＥＴ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．８、１ｍＭ　Ｎａ２　ＥＤＴＡ）中で、膜を室温で３０分洗浄し、次に、オリゴヌクレオチドプローブについて、Ｔｍ　１０℃で新鮮な１×ＳＥＴ中で３０分洗浄する。次に膜をオートラジオグラフィーフィルムに暴露して、ハイブリダイゼーションシグナルを検出する。
【００４５】
ストリンジェントな条件は、配列の間に少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、および最も好ましくは少なくとも９７％の同一性がありさえすれば、ハイブリダイゼーションが起きることを意味する。さらに、１００塩基対の配列の一部である、長さが９５塩基対の断片は、１００塩基対の配列から誘導される配列と９５％の同一性を有すると理解される。Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８９）を参照されたい（これは、参考のためその全体が本明細書に組み込まれる）。また、１００塩基対の一部である、長さが９５塩基対の断片は、１００塩基対の配列から誘導される配列と９５％の同一性を有すると理解される。
【００４６】
本明細書において、例えばＢＬＡＳＴＩＮにより互いに正しく整列した時、第１の配列の塩基と別の配列の塩基との間に、それぞれ少なくとも７０％、および好ましくは少なくとも８０％または９０％の同一性があるなら、第１のＤＮＡ（ＲＮＡ）配列は、別のＤＮＡ（ＲＮＡ）配列と少なくとも７０％および好ましくは少なくとも８０％同一である。
【００４７】
本明細書において「同一性」という用語は、参照ポリヌクレオチド（配列番号１〜８）と同じ塩基の割合を含むポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、参照ポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドを構成する塩基の９０％が同一であるポリヌクレオチド塩基を有し、このポリヌクレオチド配列を含む塩基の１０％が異なる塩基を有してもよい。
【００４８】
本発明は、変化がサイレント変化（例えば、変化は、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を変化させない）であるような、参照ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド中の、アミノ酸置換、付加、欠失、融合、および末端切断を引き起こすヌクレオチドの変化に関する。本発明の好適な面において、これらのポリペプチドは、参照ポリペプチドによりコードされるポリペプチドと同じ生物作用を有する。
【００４９】
このようなプローブは、プローブの同定を促進するために、分析的に検出可能な試薬で標識することができ、好ましくは標識されることも理解される。有用な試薬には、特に限定されないが、放射性物質、蛍光性色素、または検出可能な生成物の生成を触媒することができる酵素がある。すなわち、プローブは、他の供給源からＤＮＡの相補的なコピーを単離するため、または関連配列についてこのような供給源をスクリーニングするのに有用である。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドは、表１に示す生物からのゲノム遺伝子ライブラリーから回収した。例えば、遺伝子ライブラリーは、ラムダＺＡＰＩＩクローニングベクター（ストラタジーンクローニングシステムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ））で作成できる。これらのライブラリーについて大量に切断して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファジミド中でライブラリーを作成することができる。こうしてライブラリーを作成し、以下に記載するプロトコル／方法に従って切断が行われる。
【００５１】
切断ライブラリーは、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）ＢＷ１４８９３　Ｆ’ｋａｎ１Ａ株に導入される。次に高温フィルター測定法を使用して発現クローンを同定する。いくつかのグルカナーゼおよびいくつかの他のグリコシダーゼをコードする発現クローンを同定し、再精製する。本発明のポリヌクレオチドおよびこれにコードされる酵素は、上記の活性を提供する。
【００５２】
本発明の酵素のコード配列は、グルコシダーゼまたはガラクトシダーゼ活性を有するクローンについて調製したゲノムＤＮＡをスクリーニングして同定した。
【００５３】
そのような測定法の例は、高温フィルター測定法であり、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）ＢＷ１４８９３　Ｆ’ｋａｎ１Ａ株に切断ライブラリーを導入した後、１　ｍｇ／ｍｌの基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＸＧＬＵ）（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＬｉｍｉｔｅｄまたはＳｉｇｍａ　）を含有する緩衝液Ｚ（以下の調製法を参照）を使用して、高温フィルター測定法により発現クローンを同定した。ＸＧＬＵａｓｅをコードする発現クローンを同定し、Ｍ１１ＴＬ、ＯＣ１／４Ｖ、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＶＣ１、スタフィロサームス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｍｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓ）Ｆ１、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）９Ｎ−２、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８、サーモコッカス・アルカリフィルス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ）ＡＥＤＩＩ１２ＲＡ、およびサーモコッカス・キトノファグス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｈｉｔｏｎｏｐｈａｇｕｓ）ＧＣ７４から再精製した。
【００５４】
Ｚ−緩衝液：（Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｊ．Ｈ．　（１９９２）　Ａ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃｏｕｒｓｅ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４４５頁に記載）
１リットル当たり
Ｎａ２ＨＰＯ４　−７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　１６．１ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４　−７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　５．５ｇ
ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．７５ｇ
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２４６ｇ
β−メルカプトエタノール　　　　　　　　　　　　　　　　２．７ｍｌ
ｐＨを７．０に調整する
高温フィルター測定法
（１）ｆ因子ｆ’ｋａｎ（大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）ＣＳＨ１１８株から）（１）を、ｐｈｏ−ｐｎｈ−ｌａｃ−ＢＷ１４８９３株（２）に導入した。ＢＷ１３８９３（２）。得られるＢＷ１４８９３　Ｆ’ｋａｎ株上に、繊維状ファージライブラリーを蒔いた。（Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｊ．Ｈ．　（１９９２）　Ａ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃｏｕｒｓｅｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｌｅｅ，　Ｋ．Ｓ．，　Ｍｅｔｃａｌｆ，　ら、　（１９９２）　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｗｏｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｉｎ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　Ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７４：　２５０１−２５１０）。
【００５５】
（２）１００μｇ／ｍｌアンピシリン、８０μｇ／ｍｌネチシリン（ｎｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ　）および１ｍＭ　ＩＰＴＧを含有する１００ｍｍのＬＢプレート上で増殖させた後、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　）ＨＡＴＦ膜を使用してコロニーリフトを行った。
【００５６】
（３）フィルターに移したコロニーを、１５０ｍｍガラスシャーレ中でクロロホルム蒸気で溶解させた。
【００５７】
（４）フィルターを、緩衝液で飽和したワットマン３ＭＭろ紙片１つを含有する１００ｍｍのガラスシャーレに移した。
【００５８】
（ａ）ガラクトシダーゼ活性（ＸＧＡＬａｓｅ）について試験する時は、３ＭＭろ紙を、１ｍｇ／ｍｌ　ＸＧＡＬ（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有するＺ緩衝液で飽和させた。溶解したコロニーを有するフィルターをガラスシャーレに移した後、シャーレを８０〜８５℃のオーブン中に入れた。
【００５９】
（ｂ）グルコシダーゼ（ＸＧＬＵａｓｅ）について試験する時は、３ＭＭろ紙を、１ｍｇ／ｍｌ　ＸＧＬＵを含有するＺ緩衝液で飽和させた。溶解したコロニーを有するフィルターをガラスシャーレに移した後、シャーレを８０〜８５℃のオーブン中に入れた。
【００６０】
（５）「陽性」は、フィルター膜上の青いスポットとして観察した。以下のフィルターレスキュー法を使用して、溶解した陽性のコロニーからプラスミドを回収した。パスツールピペット（またはガラス毛細管）を使用して、フィルター膜から青いスポットを円形に抜き取った。２０μｌの水を含有するエッペンドルフ管に、小さいフィルターディスクを入れた。エッペンドルフ管を７５℃で５分間インキュベートし、次にボルテックス混合して、フィルターからプラスミドＤＮＡを溶出させた。サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８−６Ｇ、スタフィロサームス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓ）Ｆ１−１２Ｇ、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＥＤＩＩ１２ＲＡ−１８Ｂ／Ｇ、およびサーモコッカス・キトノファグス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｈｉｔｏｎｏｐｈａｇｕｓ）ＧＣ７４−２２Ｇ、Ｍ１１Ｔ１、およびＯＣ１／４Ｖについて、このＤＮＡを、エレクトロコンピタントな大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）細胞ＤＨ１０Ｂに形質転換した。サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）９Ｎ２−３１Ｂ／Ｇ、およびピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＶＣ１−７Ｇ１については、エレクトロコンピタントなＢＷ１４８９３　Ｆ’ｋａｎ１Ａ大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）を使用した。形質転換プレートでフィルターリフトを繰り返して、「陽性」を同定した。フィルターリフト後、形質転換プレートを３７℃インキュベーターに戻して、コロニーを再生した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢ液に、再精製した陽性物を接種し、３７℃で一晩インキュベートした。これらの培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、プラスミド挿入物の配列を決定した。最初のコロニーリフトで使用したプレートがコンフルエントでないコロニーを含有した場合には、フィルター上の青いスポットに対応する特異的コロニーは、再生したプレート上で同定でき、フィルターレスキュー法を使用する代わりに直接再精製した。
【００６１】
このような測定法の別の例は、高温フィルター測定法の変法であり、コロニーを含むフィルターを異なる温度で加熱死滅させて（例えば、１０５℃で２０分）、熱安定性を追跡した。３ＭＭろ紙を異なる緩衝液（すなわち、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、１００ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ９．５））で飽和させて、異なる緩衝液条件下で酵素活性を測定した。
【００６２】
β−グルコシダーゼ測定法も使用でき、ここではＧｌｃｐβＮｐが人工基質（アリール−β−グルコシダーゼ）として使用される。ｐ−ニトロフェノール（ｐＮｐ）放出の結果としての４０５ｎｍの吸光度の増加は、サーモスタット式のキュベットホルダーを取り付けたＨｉｔａｃｈｉ　Ｕ−１１００分光光度計で追跡した。測定は、密封した１ｍｌの石英キュベット中で８０℃または９０℃で行った。標準的反応混合物は、１５０ｍＭ　三ナトリウム基質（ｐＨ５．０）（８０℃で）および０．９５ｍＭ　ｐＮｐ誘導体ｐＮｐ＝０．５６１ｍＭ−１・ｃｍ−１）を含有する。反応混合物を所望の温度にして、次に適切な量（最終容量１．０６ｍｌ）の酵素を注入して反応を開始させる。
【００６３】
１Ｕのβ−グルコシダーゼ活性は、１．０μｍｏｌ　ｐＮｐ／分の生成を触媒するのに必要な量であると定義される。Ｄ−セロビオースも、基質として使用できる。
【００６４】
β−ガラクトシダーゼ活性についてのＯＮＰＧ測定法は、Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｊ．Ｈ．　（１９９２）　Ａ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃｏｕｒｓｅ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ＧｅｎｅｔｉｃｓおよびＭｉｌｌ，　Ｊ．Ｈ．　（１９９２）　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　に記載されている（これらは、その全体が参考のため本明細書に組み込まれる）。
【００６５】
β−ガラクトシダーゼ特異的活性についての定量的蛍光測定法は、Ｙｏｕｎｇｍａｎ　Ｐ．，　（１９８７）　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ　Ｔｎ９１７　Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　に記載されている。Ｐｌａｓｍｉｄｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｋ．　Ｈａｒｄｙ編）７９−１０３頁、ＩＲＬプレス、オクスフォード。この方法は、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）７５−７７頁に記載されている（その内容は、参考のためその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含有するＤＮＡの形でもよい。このＤＮＡは２本鎖または１本鎖でもよく、１本鎖なら、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖でもよい。成熟した酵素をコードするコード配列は、図１〜８に示すコード配列（配列番号１〜８）と同一でもよいか、または遺伝コードの重複または縮重の結果として図１〜１４のＤＮＡ（配列番号１〜１４）と同じ成熟酵素をコードする、異なるコード配列でもよい。
【００６７】
図１〜１４の成熟酵素をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５〜２８）は、特に限定されないが：成熟酵素のコード配列のみ；成熟酵素と追加のコード配列（例えば、リーダー配列およびプロタンパク質配列）のコード配列；成熟酵素のコード配列（および、随時追加のコード配列）および非コード配列（例えば、成熟酵素のコード配列のイントロンまたは非コード配列５’および／または３’）を含む。
【００６８】
「酵素（タンパク質）をコードするポリヌクレオチド」という用語は、酵素のコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００６９】
本発明はさらに、図１〜１４の推定アミノ酸配列（配列番号１５〜２８）を有する酵素の断片、類似体および誘導体をコードする、前述のポリヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチドの変種は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレレ変種またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変種でもよい。
【００７０】
すなわち、本発明は、図１〜１４に示すもの（配列番号１５〜２８）と同じ成熟酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびに図１〜１４の酵素（配列番号１５〜２８）の断片、誘導体、または類似体をコードする変種である、このようなポリヌクレオチドの変種を含む。このようなヌクレオチド変種は、欠失変種、置換変種および付加または挿入変種を含む。
【００７１】
前述したように、ポリヌクレオチドはまた、図１〜１４に示すコード配列（配列番号１〜１４）の天然に存在するアレレ変種であるコード配列でもよい。当該分野で公知のように、アレレ変種は、コードされる酵素の機能を実質的に変化させない、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有するポリヌクレオチド配列の代わりの型である。
【００７２】
本発明の完全長遺伝子の断片は、ｃＤＮＡまたは遺伝子ライブラリーのためのハイブリダイゼーションプローブとして、完全長ＤＮＡを単離したり、遺伝子と高い配列類似性および同様の生物活性を有する他のＤＮＡを単離するのに使用できる。好ましくはこのタイプのプローブは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびさらに好ましくは少なくとも３０塩基を有し、例えば少なくとも５０またはそれ以上の塩基を含有してもよい。このプローブはまた、完全長転写体に対応するＤＮＡクローン、ゲノムクローン、および制御領域、プロモーター領域、エキソン、そしてイントロンを含む完全な遺伝子を含有するクローンを同定するのに使用することもできる。スクリーニングの例としては、公知のＤＮＡ配列を使用して遺伝子のコード領域を単離し、オリゴヌクレオチドプローブを合成する。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用して、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定することができる。
【００７３】
本発明は、配列同士が７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有している場合に上述の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドにも関するものである。本発明は、特に、上述のポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明で使用する場合には、「ストリンジェント条件」という用語は、配列同士が９５％以上、好ましくは９７％以上の同一性を有している場合にのみハイブリダイゼーションが生じるような条件のことを称するものである。好適実施態様の一つで上述のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１−１４（配列番号１−１４）のＤＮＡによってコードされる成熟酵素と実質的に同一であるような生物学的機能あるいは活性を保持している酵素をコードしている。
【００７４】
また、このポリヌクレオチドは、上述のように本発明のポリヌクレオチドの任意の部分とハイブリダイズし、本発明のポリヌクレオチドと同一性を有している複数個の塩基で、なおかつ、活性を保持しているか、保持していないかのいずれかであるような１５以上の塩基、好ましくは３０以上の塩基、さらに好ましくは５０以上の塩基を有することができる。こうしたポリヌクレオチドは、たとえば、配列番号１−１４のポリヌクレオチドに対するプローブとして用いることもできるし、たとえば、ポリヌクレオチドの回収に使用したり、診断用プローブあるいはＰＣＲ用プライマーとして使用することもできる。
【００７５】
このように、本発明は、配列番号１５−２８の酵素をコードするポリヌクレオチドと７０％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有しているポリヌクレオチド、ならびにその断片に関するものであり、この断片は、１５以上の塩基、好ましくは３０以上の塩基、さらに好ましくは５０以上の塩基を有する断片であり、本発明のポリヌクレオチドの任意の部分と９０％以上、好ましくは９５％以上、ストリンジェント条件では、さらに好ましくは９７％以上同一であるような断片である。
【００７６】
本発明は、さらに、図１−１４（配列番号１５−２８）の推定アミノ酸配列を有する酵素、ならびにこの酵素の断片、類似体、誘導体に関する。
【００７７】
図１−１４（配列番号１５−２８）の酵素に関して使用する場合には、「断片」、「類似体」、「誘導体」という用語は、こうした酵素と本質的に同一であるような生物学的機能または活性を保持している酵素を称するものである。したがって、類似体としては、プロタンパク質部分を開裂して活性の成熟酵素を生成することによって活性化が可能なプロタンパク質を包含するものである。
【００７８】
本発明の酵素は、組換え酵素、天然酵素、あるいは合成酵素とすることができ、好ましくは組換え酵素である。
【００７９】
図１−１４（配列番号１５−２８）の酵素の断片、類似体、または誘導体は、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されているもの（この置換アミノ酸残基は、遺伝コードでコードされているアミノ酸残基であってもなくてもよい）、または（ｉｉ　）アミノ酸残基の１つ以上が置換基を有しているようなもの、（　ｉｉｉ　）成熟酵素が、別の化合物、たとえば酵素の半減期を延長するための化合物（たとえばポリエチレングリコール）と融合されているもの、または（ｉｖ）成熟酵素に、さらなるアミノ酸、たとえばリーダー配列あるいは分泌配列、あるいは成熟酵素精製用の配列、もしくはプロタンパク質配列が融合されているものとすることもできる。こうした断片、類似体、または誘導体は、当業者にとっては、本発明の教示内容の範囲内であると考えられる。
【００８０】
本発明の酵素およびポリヌクレオチドは、単離形態として提供するのが好ましく、均一状態まで精製しておくのが好ましい。
【００８１】
「単離された」という用語は、当該物質が、そのもとの環境（たとえば、その物質が天然に存在する物質である場合には、天然環境）から取り出されたものであることを意味する。たとえば、生存中の動物内に存在している天然に存在するポリヌクレオチドまたは酵素は単離されていないのに対し、共存物質のすべてあるいはその一部から分離されたポリヌクレオチドまたは酵素は単離されている。こうしたポリヌクレオチドは、ベクターの一部である場合もあり、そして／または、こうしたポリヌクレオチドもしくは酵素は、組成物の一部である場合もある。しかし、そうした場合でも、こうしたベクターまたは組成物が、その天然環境の一部ではないように単離することが可能である。
【００８２】
本発明の酵素は、配列番号１５−２８の酵素（特に、成熟酵素）、ならびに配列番号９−１６の酵素と７０％以上の類似性（好ましくは、９０％以上の同一性）を有する酵素、さらに好ましくは、配列番号１５−２８の酵素と９０％以上の類似性（好ましくは、９０％以上の同一性）を有する酵素、そしてさらに好ましくは、配列番号９−１６の酵素と９５％以上の類似性（好ましくは、９５％以上の同一性）を有する酵素を含むものであり、こうした酵素の部分も含むものである。酵素のこうした部分は、一般に３０以上のアミノ酸、さらに好ましくは５０以上のアミノ酸を含むものである。
【００８３】
当業界では周知のように、２つの酵素間の「類似性」は、一方の酵素のアミノ酸配列とその保存的アミノ酸置換を、もう一方の酵素の配列と比較することによって決定する。
【００８４】
変異体ポリペプチド、すなわち「断片」、「類似体」、または「誘導体」ポリペプチドと、基準ポリペプチドとは、アミノ酸配列が、１個以上の置換、付加、欠失、融合、末端切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、あるいはそれらの任意の組み合わせによって異なっている。
【００８５】
好適な変異体としては、保存的なアミノ酸置換によって基準ポリペプチドと異なるものが挙げられる。こうした置換としては、ポリペプチドの所定のアミノ酸の、似た特性を有する別のアミノ酸による置換が挙げられる。保存的置換とみなされる置換としては、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの間での相互の置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｕの交換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、および芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間での置換が代表的である。
【００８６】
変異体として特に好ましいのは、変異の出発点となった基準ポリペプチドと同一の生物学的機能ならびに活性を保持している変異体である。
【００８７】
本発明の酵素の断片または部分は、ペプチド合成により対応する全長の酵素を生成するにあたって使用することができ、したがって、こうした断片は、全長の酵素を生成するにあたっての中間物質として使用することができる。本発明のポリヌクレオチドの断片または部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成する際に使用することができる。
【００８８】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作した宿主細胞、ならびに組換え的手法による本発明の酵素の生成にも関するものである。
【００８９】
宿主細胞は、本発明のベクターで遺伝的に操作（形質導入、形質転換、またはトランスフェクト）され、ベクターは、たとえば、クローニングベクターあるいは発現ベクターとすることができる。ベクターは、たとえば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態とすることができる。遺伝子操作を行った宿主細胞は、プロモーターを活性化したり、形質転換体を選別したり、本発明の遺伝子を増幅したりするのに適するよう改変した通常の栄養培養液中で培養することができる。培養条件、たとえば、温度、ｐＨなどは、発現に際して選んだ宿主細胞で従来から使用されてきた条件とすることができ、こうした条件は、当業者にはすぐわかるはずである。
【００９０】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え手法で酵素を生成する際に用いることができる。すなわち、たとえば、ポリヌクレオチドを、各種の発現ベクターのうちの任意のものに包含させて、酵素を発現させることができる。こうしたベクターとしては、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列、たとえばＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導したベクター、ワクシニア、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、仮性狂犬病などのウイルス性ＤＮＡがある。しかし、宿主中で複製可能かつ生存可能であるならば、任意の他のベクターを使用することもできる。
【００９１】
適当なＤＮＡ配列のベクターへの挿入は、各種の方法で行うことができる。一般に、ＤＮＡ配列は、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に、公知の方法によって挿入する。こうした方法をはじめとする各種の方法は、当業者にとって周知のものである。
【００９２】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可能なかたちで連結させて、ｍＲＮＡの合成を誘導する。こうしたプロモーターの代表的な例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌のｌａｃまたはｔｒｐ、ラムダファージＰＬプロモーターをはじめとする原核細胞、真核細胞、またはそのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られているプロモーターを挙げることができる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、ならびに転写ターミネーターも有している。ベクターは、発現を増幅する適当な配列を含むこともできる。
【００９３】
また、発現ベクターに１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有させて、形質転換宿主細胞を選別する際に特徴的な表現型、たとえば、真核細胞の培養に際しては、ジヒドロ葉酸還元酵素あるいはネオマイシン耐性、大腸菌ではテトラサイクリンあるいはアンピシリン耐性が示されるようにしておくのが好ましい。
【００９４】
上述のような適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを用いて適当な宿主を形質転換して、宿主にタンパク質を発現させることができる。
【００９５】
適当な宿主の代表的な例としては、細菌細胞、たとえば大腸菌、ストレプトマイセス属、枯草菌；菌類細胞、たとえば、酵母；昆虫細胞、たとえばショウジョウバエＳ２、およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９；動物細胞、たとえば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＢｏｗｅｓ黒色腫；アデノウイルス；植物細胞などを挙げることができる。当業者であれば、本発明の教示内容に照らして、適当な宿主を選ぶことができるはずである。
【００９６】
さらに具体的には、本発明は、上記に概略を説明した１種以上の配列を含む組換え構築物を包含するものである。構築物は、ベクター、たとえばプラスミドまたはウイルスのベクターに、本発明の配列を前向きあるいは逆向きに挿入したものである。この実施態様の好適な一観点では、この構築物は、さらに、調節配列、たとえば、上記配列に作動可能なかたちで連結されている調節配列を含む。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に周知であり、市販されている。そうしたベクターの例を以下に挙げると、細菌のベクターとしては、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９　（Ｑｉａｇｅｎ）　、ｐＤ１０、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、ｐｔｒｃ９９ａ　、ｐＫＫ２２３−３　、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　；真核生物のベクターとしては、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　がある。しかし、宿主内で複製、生存が可能なものであれば、他のプラスミドまたはベクターを使用することもできる。
【００９７】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターあるいは他のベクターを選択マーカーとともに使用することによって、任意所望の遺伝子から選ぶことができる。適当なベクター２種を挙げると、ｐＫＫ２３２−８とｐＣＭ７　がある。細菌のプロモーターの具体例としては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐ、真核生物のプロモーターとしては、前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、マウス・メタロチオネイン−Ｉがある。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の通常レベルの範囲内である。
【００９８】
別の実施態様では、本発明は、上述の構築物を含む宿主細胞に関するものである。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞とすることも、酵母細胞のような下等真核細胞とすることもでき、また、細菌細胞のような原核細胞とすることもできる。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション法、あるいは電気穿孔法によって行うことができる（Ｄａｖｉｓ，　Ｌ．，　Ｄｉｂｎｅｒ，　Ｍ．，　Ｂａｔｔｅｙ，　Ｉ．，　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８６））。
【００９９】
宿主細胞中の構築物は、通常の方法で使用して、組換え配列によってコードされた遺伝子生成物を生成することができる。また、本発明の酵素は、通常のペプチド合成装置によって合成して製造することもできる。
【０１００】
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌をはじめとする各種の細胞中で、適当なプロモーターの制御下で発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡを使用することによって、無細胞翻訳系を用いて、こうしたタンパク質を生成させることもできる。原核および真核細胞宿主とともに使用するのに適したクローニングベクターあるいは発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．，　（１９８９）　に記載されており、本発明は、この刊行物の記載内容を参考として包含するものである。
【０１０１】
本発明の酵素をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増大させることができる。エンハンサーは、通常約１０−３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントで、このエンハンサーがプロモーターに作用して、その転写を促進する。例としては、複製起点より１００−２７０ｂｐ後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点より後期側に位置するポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーがある。
【０１０２】
組換え発現ベクターは、一般に、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点ならびに選択マーカー、たとえば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子、および酵母のＴＲＰ１遺伝子、ならびに高度に発現される遺伝子由来の下流側の構造配列の転写を誘導するプロモーターを含んでいる。こうしたプロモーターは、特に、解糖酵素、たとえば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質等をコードしているオペロンから誘導することができる。異種構造配列は、翻訳開始配列ならびに翻訳終止配列、そしてできれば、翻訳された酵素の分泌を誘導しうるリーダー配列とともに適切な位相で組み立てる。場合によっては、異種配列は、発現された組換え産物を安定化したり、簡便な精製を可能とするなどの所望の特性を付与するＮ末端アイデンティフィケーションペプチド（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む融合酵素をコードすることもできる。
【０１０３】
細菌の場合に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、機能プロモーターと作動性の読み位相（ｒｅａｄｉｎｇ　ｐｈａｓｅ）とした適当な翻訳開始ならびに終止シグナルとともに挿入することによって構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカーと、ベクターを確実に維持するための、また所望に応じて宿主内での増幅を可能とするための複製起点とを有している。形質転換を行ううえで適当な原核細胞宿主としては、大腸菌、枯草菌、サルモネラ菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトマイセス属、スタフィロコッカス属の各種の種が挙げられるが、他の宿主を選択して使用することもできる。
【０１０４】
例を挙げると、細菌の場合に使用できる有用な発現ベクターは、選択マーカーと、周知のクローニングベクターであるｐＢＲ３２２　（ＡＴＣＣ３７０１７）　の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミド由来の細菌の複製起点を含むことができるが、これらに限定されるものではない。こうした市販のベクターとしては、たとえば、ｐＫＫ２２３−３　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　Ｕｐｐｓａｌａ，　Ｓｗｅｄｅｎ）、ＧＥＭ１　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ，　ＵＳＡ）がある。これらｐＢＲ３２２の「主鎖」部分を、適当なプロモーターならびに発現対象構造配列と組み合わせる。
【０１０５】
適当な宿主の系統を形質転換し、この宿主の系統を適切な細胞密度となるまで増殖させた後、選択したプロモーターを適当な手段（たとえば、温度変化あるいは化学的誘導）で誘導して、細胞をさらに一定期間培養する。
【０１０６】
細胞は、通常、遠心して回収し、物理的あるいは化学的手段によって破砕し、得られた粗製抽出物をさらなる精製に備えて保持しておく。
【０１０７】
タンパク質の発現に際して用いた微生物細胞は、凍結解凍の繰り返し、超音波処理、機械的破砕、あるいは細胞溶解剤の使用などの任意の好都合な方法で破砕することができ、こうした方法は、当業者に周知のものである。
【０１０８】
組換えタンパク質の発現にあたっては、各種の哺乳動物細胞培養系を使用することもできる。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｃｅｌｌ，　２３：　１７５　（１９８１）に記載されたサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７系統をはじめとして、適合性のベクターを発現しうる他の細胞系統、たとえば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ細胞系統がある。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終止配列、５’フランキング非転写配列を含むものである。ＳＶ４０スプライス部位ならびにポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を使用して、必要とされる非転写遺伝エレメントを得ることができる。
【０１０９】
組換え細胞培養物からの酵素の回収ならびに精製は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ならびにレクチンクロマトグラフィーなどの方法によって行うことができる。成熟タンパク質の立体配置を完了させる際には、必要に応じてタンパク質再折り畳み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程を用いることができる。最後に、最終的な精製工程として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
【０１１０】
本発明の酵素は、天然に精製された生成物、化学的合成法による生成物、あるいは原核細胞宿主あるいは真核細胞宿主からの組換え法による生成物（たとえば、培養中での、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞からの生成物）とすることができる。組換え法による製造過程で用いる宿主に応じて、本発明の酵素をグリコシル化したり、非グリコシル化したりすることができる。また、本発明の酵素は、最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいても、いなくてもよい。
【０１１１】
β−ガラクトシダーゼは、ラクトースを加水分解して、ガラクトースとグルコースとする。したがって、ＯＣ１／４Ｖ、９Ｎ２−３１Ｂ／Ｇ、ＡＥＤＩＩ１２ＲＡ−１８Ｂ／Ｇ、ならびにＦ１−１２Ｇ酵素は、食品加工業界で、ラクトース含量の少ない牛乳を製造したり、チーズ製造の際に大量に生じる副産物である乳清中に含まれているラクトースからガラクトースまたはグルコースを生成したりする際に用いることができる。一般に、食品加工で使用される酵素、たとえば上述のβ−ガラクトシダーゼは、微生物による汚染を防止するためにも、高温で安定であることが望ましい。
【０１１２】
こうした酵素は、医薬品業界でも用いることができる。この酵素は、ラクトース不耐性を治療する際に使用され、この場合も、熱安定性の酵素が望ましい。熱安定性のβ−ガラクトシダーゼは、診断の用途も有しており、この場合には、レポーター分子として使用される。
【０１１３】
ガラクトシダーゼは、可溶性のセロオリゴ糖に非還元末端から作用して、グルコースを単一生成物として生じる。グルカナーゼ（エンドグルカナーゼおよびエキソグルカナーゼ）は、セルロースの解重合に作用して、さらなる非還元性末端を生じる（たとえば、エンドグルカナーゼでは、内部の結合に作用して、セロビオース、グルコース、ならびにセロオリゴ糖を生成物として生じる）。β−グルコシダーゼは、グルコースが所望の生成物であるような用途で使用される。したがって、Ｍ１１ＴＬ、Ｆ１−１２Ｇ、ＧＣ７４−２２Ｇ、ＭＳＢ８−６Ｇ　（ならびにＯＣ１／４Ｖ、ＶＣ１−７Ｇ１、９Ｎ２−３１Ｂ／Ｇ、ＡＥＤＩＩ１２ＲＡ１８Ｂ／Ｇ）は、穀物の湿潤製粉でのデンプンとグルテンの分離、果実業界での清澄化ならびに機器（ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）の保守、パン製造業界での粘土の低減、繊維業界でのブルージーンズの加工、洗剤業界での添加剤をはじめとする多岐にわたる産業用途で使用することができる。こうした用途でも、またそれ以外の用途でも、熱安定性の酵素が所望されている。
【０１１４】
本発明の配列に対応する酵素に対して生成された抗体は、動物に酵素を直接注入するか、動物、好ましくはヒト以外の動物に酵素を投与することによって得ることができる。こうして得られた抗体は、酵素それ自体と結合する。この方法では、酵素の断片のみをコードする配列であっても、天然の酵素全体と結合する抗体を生成する際に使用することができる。次に、この抗体を用いて、当該酵素を発現している細胞から酵素を単離することができる。
【０１１５】
モノクローナル抗体の調製には、連続的な細胞系の培養により生産される抗体を与えるあらゆる方法を使用することができる。例としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，　１９７５，　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６：４９５−４９７）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３，　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２）、及びヒトモノクローナル抗体を生産するＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、１９８５，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，　Ａｌａｎ　Ｒ．　Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　ｐｐ．　７７−９６）が挙げられる。
【０１１６】
単鎖抗体を生産するためのこれまでに記載された方法（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫原性酵素産物に対する単鎖抗体の製造に利用できる。また、トランスジェニックマウスを使用して本発明の免疫原性酵素産物に対するヒト化抗体を発現することができる。
【０１１７】
本発明の酵素に対して生成された抗体は、その他の生物及びサンプルからの同様の酵素をスクリーニングするのに使用することができる。そのようなスクリーニング方法は当分野で公知であり、例えばそのようなスクリーニングアッセイの一つが「セルラーゼ活性の測定方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）」　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ　１６０，　ｐｐ．　８７−１１６に記載されている。この文献は参考としてその全体を本明細書中に援用する。
【０１１８】
以下の実施例を参考として本発明をさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されないものと解さなければならない。特に記載しない限り、全ての部及び量は重量によるものである。
【０１１９】
以下の実施例の理解を容易にするため、いくつかの頻出する方法及び／または用語について説明する。
【０１２０】
「プラスミド」は小文字のｐとその前及び／または後の大文字及び／または数字で命名される。本明細書で使用する出発プラスミドは、制限なく公衆が利用可能な市販品として利用できるものであるか、文献に記載された方法により利用可能なプラスミドから構築できるものである。また、記載されたものに等価なプラスミドは当分野で公知であり、当業者には明らかである。
【０１２１】
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列のみについて作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的開裂をいう。本明細書において使用した種々の制限酵素は市販品として入手可能で、その反応条件、補因子、及びその他の要件は当業者に知られたものを使用する。分析目的には、典型的には約２０μｇのバッファー溶液中で１μｇのプラスミドあるいはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためにＤＮＡ断片を単離する目的では、典型的にはより大きい容量中で５〜５０μｇのＤＮＡを２０〜２５０単位の酵素により消化する。特定の制限酵素のための適当なバッファー及び基質量は製造業者により記載されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間を通常使用するが、供給者の説明書に従い変更してもよい。消化の後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動にかけて所望の断片を単離する。
【０１２２】
開裂断片のサイズ分けは、Ｇｏｅｄｄｅｌ，　Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　８：４０５７　（１９８０）により記載された８パーセントポリアクリルアミドゲルを使用して行う。
【０１２３】
「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、あるいは二本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、化学合成できるものである。そのような合成オリゴヌクレオチドは５’リン酸を含まず、従ってキナーゼの存在下にＡＴＰを用いてリン酸を付加することなしには他のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片に連結する。
【０１２４】
「連結」は二本の二本鎖核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．ら、上出、ｐ．　１４６）。特に示さない限り、連結は公知のバッファーと条件を使用して、０．５μｇのほぼ等モル量の連結されるＤＮＡ断片あたり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）で行うことができる。
【０１２５】
特に記載しない限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，　Ｆ．及びＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．，　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　５２：４５６−４５７　（１９７３）の方法に記載されたように行った。
【０１２６】
【実施例】
〔実施例１〕
グリコシダーゼ酵素の細菌発現及び精製
本発明の酵素をコードするＤＮＡ、配列番号１〜８は、本明細書に示すプライマーを使用したＰＣＲ法により該ＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターから最初に増幅した。次に増幅した配列をプライマー配列の下に示したそれぞれのＰＱＥベクターに挿入し、酵素を本明細書に記載したプロトコールにより発現させた。それぞれの遺伝子についての５’及び３’プライマー配列は以下の通りである。
【０１２７】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ＡＥＤＩＩ１２ＲＡ　−１８Ｂ／Ｇ
５’ＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＧＡＴＴＧＴＣ　（配列番号２９）
３’ＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＡＧＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＣＣＡＴＡ　（配列番号３０）
ベクター：　ｐＱＥ１２、以下の制限酵素部位、５’　ＥｃｏＲＩ及び３’　ＢｌｇＩＩを含む。
【０１２８】
ＯＣ１／４Ｖ−３３Ｂ／Ｇ
５’ＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＡＴＡＡＧＡＡＧＧＴＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣ　（配列番号３１）
３’ＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＴＴＴＴＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＴ　（配列番号３２）
ベクター：　ｐＱＥ１２、以下の制限酵素部位、５’　ＥｃｏＲＩ及び３’　ＢｌｇＩＩを含む。
【０１２９】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　９Ｎ２　−　３１Ｂ／Ｇ
５’ＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴＡＣＣ
ＡＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＴＣ　（配列番号３３）
３’ＣＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＡＡＣＴＴＣＴＣ　（配列番号３４）
ベクター：　ｐＱＥ３０、以下の制限酵素部位、５’　ＥｃｏＲＩ及び３’　ＫｐｎＩを含む。
【０１３０】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓ　Ｆ１　−　１２Ｇ
５’ＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＡＴＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴ　（配列番号３５）
３’ＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＣＧＡＧＧＴＴＣＴＴＴＡＡＴＣＣ　（配列番号３６）
ベクター：　ｐＱＥ１２、以下の制限酵素部位、５’　ＥｃｏＲＩ及び３’　Ｂｇｌ　ＩＩを含む。
【０１３１】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｈｉｔｏｎｏｐｈａｇｕｓ　ＧＣ７４　−　２２Ｇ
５’ＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＣＴＣ　（配列番号３７）
３’ＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＡＡＧＡＴＣＴＣ　（配列番号３８）
ベクター：　ｐＱＥ１２、以下の制限酵素部位、５’　ＥｃｏＲＩ及び３’　ＢａｍＨＩを含む。
【０１３２】
Ｍｌ１ＴＬ
５’ＡＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＡＧ（配列番号３９）
３’ＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴ　（配列番号４０）
ベクター：　ｐＱＥ７０、以下の制限酵素部位、５’　ＳｐｈＩ及び３’　ＨｉｎｄＩＩＩを含む。
【０１３３】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ　ＭＳＢ８−６Ｇ
５’ＣＣＧＡＣＡＡＴＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＧＡＴＧＡＡＡＴＴ　（配列番号４１）
３’ＣＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＧＧＴＴＴＧＡＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣ　（配列番号４２）
ベクター：　ｐＱＥ１２、以下の制限酵素部位、５’　ＥｃｏＲＩ及び３’　ＫｐｎＩを含む。
【０１３４】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ　ＶＣ１　−　７Ｇ１
５’ＣＣＧＡＣＡＡＴＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＧＴＴＣＣＴＴ　（配列番号４３）
３’ＣＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＴＣＣＴＣ　（配列番号４４）
ベクター：　ｐＱＥ１２、以下の制限酵素部位、５’　ＥｃｏＲＩ及び３’　ＫｐｎＩを含む。
【０１３５】
Ｂａｎｋｉａ　ｇｏｕｌｄｉエンドグルカナーゼ　（３７ＧＰ１）
５’ＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＡＧＣＧＡＣＧＣＴＣＧＣ　（配列番号４５）
３’ＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＧＧＴＴＧＴＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＴＡＧＧＣ　（配列番号４６）
ベクター：　ｐＱＥ５２、以下の制限酵素部位、５’　ＢａｍＨＩ及び３’　ＨｉｎｄＩＩＩを含む。
【０１３６】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ　α−ガラクトシダーゼ　（６ＧＣ２）
５’ＴＴＴＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＡＴＣＴＧＴ
ＧＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＣＧＧＡＡＡＧ　（配列番号４７）
３’ＴＣＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＴＴＣＧＴＡＧＡＡＧ（配列番号４８）
ベクター：　ｐＱＥＴ、以下の制限酵素部位、５’　ＥｃｏＲＩ及び３’　ＨｉｎｄＩＩＩを含む。
【０１３７】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ　β−マンナナーゼ　（６ＧＰ２）
５’ＴＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣ　（配列番号４９）
３’ＴＴＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＴＡＴＴＣＡＣＡＴＡＣＣＴＣＣ（配列番号５０）
ベクター：　ｐＱＥｔ、以下の制限酵素部位、５’　ＨｉｎｄＩＩＩ及び３’　ＥｃｏＲＩを含む。
【０１３８】
ＡＥＰＩＩ　１ａ　β−マンナナーゼ　（６３ＧＢ１）
５’ＴＴＴＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＴＡＴＧＧＧＧＣ　（配列番号５１）
３’ＴＴＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣ（配列番号５２）
ベクター：　ｐＱＥｔ、以下の制限酵素部位、５’　ＨｉｎｄＩＩＩ及び３’　ＥｃｏＲＩを含む。
【０１３９】
ＯＣ１／４Ｖエンドグルカナーゼ　（３３ＧＰ１）
５’ＡＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＧＴＡＧＡＡＡＧＡＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＡＴＧＴＴＣＴＴ（配列番号５３）
３’ＴＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧ（配列番号５４）
ベクター：　ｐＱＥｔ、以下の制限酵素部位、５’　ＢａｍＨＩ及び３’　ＥｃｏＲＩを含む。
【０１４０】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａプルラナーゼ　（６ＧＰ３）
５’ＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＣＡＴＡＧＡＡＧＧＴＴＡＣ　（配列番号５５）
３’ＡＴＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＡＧＡＡＣＧＴＡＣＧＣ（配列番号５６）
ベクター：　ｐＱＥｔ、以下の制限酵素部位、５’　ＥｃｏＲＩ及び３’　ＨｉｎｄＩＩＩを含む。
【０１４１】
示した制限酵素部位は、それぞれの遺伝子について示した細菌発現ベクター上の制限酵素部位に対応する（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｉｎｃ．　Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，　ＣＡ）。ｐＱＥベクターは抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ−制御可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグ、及び制限酵素部位をコードする。
【０１４２】
示した制限酵素でｐＱＥベクターを消化した。増幅した配列をそれぞれのｐＱＥベクターに連結し、ＲＢＳをコードする配列とともにフレーム内に挿入した。そしてこの連結混合物を使用して、エレクトロポレーションにより大腸菌株Ｍ１５／ｐＲＥＰ４　（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｉｎｃ．）を形質転換した。Ｍ１５／ｐＲＥＰ４は、プラスミドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含み、これはｌａｃＩリプレッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を与える。形質転換体は、ＬＢプレート上で増殖するその能力により同定し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ　（１００μｇ／ｍｌ）及びＫａｎ（２５　μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中で一晩（Ｏ／Ｎ）液体培養した。このＯ／Ｎ培養物を使用して１：１００〜１：２５０の比率で大規模な培養に接種した。細胞を０．４〜０．６の間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ．６００）まで増殖させた。そしてＩＰＴＧ　（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を１　ｍＭの最終濃度に添加した。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することによりＰ／Ｏの解放を誘導し、遺伝子発現を増加させる。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。その後遠心分離により細胞を回収した。
【０１４３】
また上記のプライマー配列は、上記したハイブリダイゼーション法により沈殿物質から標的遺伝子を単離するのに使用できる。
【０１４４】
〔実施例２〕
沈殿したゲノムクローンからの選択されたクローンの単離
単離することが望まれる特定の遺伝子について実施例１に記載したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して沈殿した物質をスクリーニングすることによりクローンを直接単離する。具体的なオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＮＡシンセサイザーを使用して合成する。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してオリゴヌクレオチドを３２Ｐ−ＡＴＰで標識し、標準的なプロトコールにより精製する（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ，　ＮＹ，　１９８２）。沈殿したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中のクローンを使用して細菌宿主を形質転換することができ、それを２０，０００〜５０，０００　ｐｆｕ／１５０　ｍｍプレートの密度に１．５％アガープレート上に播種する。標準的なスクリーニングプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，　１９９３）に従いナイロンメンブランを使用してこれらのプレートをスクリーニングする。具体的には、変成し固定したＤＮＡを有するナイロンメンブランを、６　ｘ　ＳＳＣ、２０　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、０．４％　ＳＤＳ、５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５００　μｇ／ｍｌ変成超音波処理サケ精子ＤＮＡ、そして６ｘ　ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中でプレハイブリダイズさせる。１時間のプレハイブリダイゼーションの後、１　ｘ　１０６　ｃｐｍ／ｍｌ　３２Ｐ−プローブとともに、ハイブリダイゼーションバッファー、６　ｘ　ＳＳＣ、２０　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、０．４％　ＳＤＳ、５００　μｇ／ｍｌ変成超音波処理サケ精子ＤＮＡとハイブリダイズさせる。４５〜５０℃において６　ｘ　ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄バッファーでメンブランを２０〜３０分洗浄し、乾燥させ、Ｋｏｄａｋ　Ｘ線フィルムに一晩露出する。陽性のクローンを単離し、二次、三次のスクリーニングにより精製する。精製されたクローンを配列決定し、プライマー配列に対するその実体を確認する。
【０１４５】
クローンを単離した後、目的の遺伝子に対応する二種のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して沈殿した物質から遺伝子を増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応は、目的の遺伝子のＤＮＡの０．５μｇを含む２５μｌの反応混合物中で行う。反応混合物は、１．５−５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％　（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５　ｐｍｏｌの各プライマー、及び０．２５単位のＴａｑポリメラーゼである。ＰＣＲ（９４℃で１分の変成、５５℃で１分のアニーリング、７２℃で１分の伸長）の３５サイクルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ自動サーマルサイクラーで行う。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、予想される分子量のＤＮＡバンドを切り出し、精製する。ＤＮＡ産物をサブクローニングし、配列決定することによりＰＣＲ産物が所望の遺伝子であることを確認する。新たに精製された遺伝子の末端のヌクレオチド配列決定を行い、全長の配列を確認する。そしてエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化あるいはプライマーウォーキングにより完全長遺伝子の完全な配列決定を行う。
【０１４６】
〔実施例３〕
ガラクトシダーゼ活性のスクリーニング
アッセイされ得るα−ガラクトシダーゼタンパク質活性についてのスクリーニング手順は以下の通りである。
【０１４７】
基質プレートは標準的なプレート化手順により得た。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ大腸菌宿主（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）をＮＺＹ培地でＯ．Ｄ．６００＝１．０に希釈する。１５　ｍｌチューブに、２００μｌの希釈宿主細胞をファージとともに接種する。穏やかに攪拌し、チューブを３７℃で１５分インキュベートする。１　ｍＭ　ＩＰＴＧを含む約３．５ｍｌのＬＢ最上層アガロース（０．７％）を各チューブに加えＮＹＺプレートの全表面に注ぐ。放冷させ、３７℃で一晩インキュベートする。アッセイプレートは、基質ｐ−ニトロフェニルα−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）（２００　ｍｇ／１００　ｍｌ）（１００　ｍＭ　ＮａＣｌ，　１００　ｍＭリン酸カルシウム）　１％　（ｗ／ｖ）アガロースとして得る。プラークにニトロセルロースを重ね、４℃で３０分インキュベートした後、ニトロセルロースを取り外し、基質プレート上に重ねる。その後基質プレートを７０℃で２０分インキュベートする。
【０１４８】
〔実施例４〕
マンナナーゼ活性についてのクローンのスクリーニング
固相スクリーニングアッセイを一次スクリーニング法として使用し、β−マンナナーゼ活性についてクローンを試験した。
【０１４９】
Ｙ１０９０−大腸菌宿主株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）の培養溶液をＮＺＹ培地でＯ．Ｄ．６００＝１．０に希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ　λ　ｇｔｌ１ライブラリーからの増幅ライブラリーをＳＭ（ファージ希釈バッファー）中に、１：１０００で５　ｘ　１０７　ｐｆｕ／μｌに希釈し、そして１：１００で５　ｘ　１０２　ｐｆｕ／μｌに希釈した。その後８μｌのファージ希釈物（５　ｘ　１０２　ｐｆｕ／μｌ）を２００μｌの宿主細胞中に播種した。それらをその後１５　ｍｌチューブ中で３７℃で１５分間インキュベートした。
【０１５０】
約５２℃の約４　ｍｌの溶融ＬＢ最上層アガロース（０．７％）を各チューブに加え、混合物をＬＢアガープレートの表面上に注いだ。そしてアガープレートを３７℃で５時間インキュベートした。プレートを複製し、１０　ｍＭ　ＩＰＴＧ−浸漬Ｄｕｒａｌｏｎ−ＵＶＴＭナイロンメンブラン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）で一晩誘導した。ナイロンメンブラン及びプレートを針でマークしてその定位を保持し、そしてナイロンメンブランを取り外して４℃で貯蔵した。
【０１５１】
Ａｚｏ−ガラクトマンナン上層を、λプラークを含むＬＢプレートに置いた。該上層は１％アガロース、５０　ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ　７、０．４％　Ａｚｏｃａｒｏｂ−ガラクトマンナンを含むものである（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，　Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。プレートを７２℃でインキュベートした。Ａｚｏｃａｒｏｂ−ガラクトマンナン処理プレートを４時間後に観察し、一晩インキュベートに戻した。Ａｚｏｃａｒｏｂ−ガラクトマンナンプレート上の透明化した領域により推定の陽性物を同定した。二つの陽性クローンが観察された。
【０１５２】
陽性のクローンを回収したものに相当する上記のナイロンメンブランをプレート上に方向を合わせて広げ、陽性クローンについての透明化領域の位置に一致する部分を切り出した。メンブランの切り出した部分から、各部分を５００μｌのＳＭ（ファージ希釈バッファー）及び２５μｌ　ＣＨＣｌ３に浸漬することによりファージを溶出した。
【０１５３】
〔実施例５〕
マンノシダーゼ活性についてのクローンのスクリーニング
固相スクリーニングアッセイを一次スクリーニング法として使用し、β−マンノシダーゼ活性についてクローンを試験した。
【０１５４】
Ｙ１０９０−大腸菌宿主株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）の培養溶液をＮＺＹ培地でＯ．Ｄ．６００＝１．０に希釈した。ＡＥＰＩＩ　１ａ　λ　ｇｔｌ１ライブラリーからの増幅ライブラリーをＳＭ（ファージ希釈バッファー）中に、１：１０００で５　ｘ　１０７　ｐｆｕ／μｌに希釈し、そして１：１００で５　ｘ　１０２　ｐｆｕ／μｌに希釈した。その後８μｌのファージ希釈物（５　ｘ　１０２　ｐｆｕ／μｌ）を２００μｌの宿主細胞中に播種した。それらをその後１５　ｍｌチューブ中で３７℃で１５分間インキュベートした。
【０１５５】
約５２℃の約４　ｍｌの溶融ＬＢ最上層アガロース（０．７％）を各チューブに加え、混合物をＬＢアガープレートの表面上に注いだ。そしてアガープレートを３７℃で５時間インキュベートした。プレートを複製し、１０　ｍＭ　ＩＰＴＧ−浸漬Ｄｕｒａｌｏｎ−ＵＶＴＭナイロンメンブラン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）で一晩誘導した。ナイロンメンブラン及びプレートを針でマークしてそれらの定位を保持し、その後ナイロンメンブランを取り外して４℃で貯蔵した。
【０１５６】
ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノ−ピラノシド上層を、λプラークを含むＬＢプレート上にアプライした。該上層は１％アガロース、５０　ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ　７、０．４％　ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノ−ピラノシドを含むものである（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，　Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。プレートを７２℃でインキュベートした。　ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノ−ピラノシド処理プレートを４時間後に観察し、一晩インキュベートに戻した。　ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノ−ピラノシドプレート上の透明化した領域により推定の陽性物を同定した。二つの陽性クローンが観察された。
【０１５７】
陽性のクローンを回収したものに相当する上記のナイロンメンブランをプレート上に方向を合わせて重ね、陽性クローンについての透明化領域の位置に一致する部分を切り出した。メンブランの切り出した部分から、個々の部分を５００μｌのＳＭ（ファージ希釈バッファー）及び２５μｌ　ＣＨＣｌ３に浸漬することによりファージを溶出した。
【０１５８】
〔実施例６〕
プルラナーゼ活性についてのスクリーニング
アッセイされ得るプルラナーゼタンパク質活性のスクリーニング手順は以下の通りである。
【０１５９】
基質プレートは標準的なプレート化手順により得た。宿主細胞をＮＺＹあるいは適当な培地でＯ．Ｄ．６００＝１．０に希釈する。１５　ｍｌチューブに、２００μｌの希釈宿主細胞をファージとともに接種する。穏やかに攪拌し、チューブを３７℃で１５分インキュベートする。約３．５　ｍｌのＬＢ最上層アガロース（０．７％）を各チューブに加え、混合物をプレート化し、放冷させ、３７℃で約２８時間インキュベートする。以下の基質の４．５　ｍｌの上層を注ぐ。
【０１６０】
１００　ｍｌ合計容量
０．５　ｇ　　レッドプルランレッド　（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，　Ａｕｓｔｒａｌｉａ）
１．０　ｇ　　アガロース
５　ｍｌ　　　バッファー　（トリス−ＨＣｌ　ｐＨ　７．２　＠　７５℃）
２　ｍｌ　　　５　Ｍ　ＮａＣｌ
５　ｍｌ　　　ＣａＣｌ２　（１００　ｍＭ）
８５　ｍｌ　　ｄＨ２Ｏ
プレートは室温で冷却し、その後７５℃で２時間インキュベートする。陽性物は基質の分解を示すものとして観察される。
【０１６１】
〔実施例７〕
エンドグルカナーゼ活性のスクリーニング
アッセイされ得るエンドグルカナーゼタンパク質活性のスクリーニング手順は以下の通りである。
【０１６２】
１．遺伝子ライブラリーを、大腸菌宿主中で、ＬＢアガロースを最上層アガロースとして、６　ＬＢ／ＧｅｌＲｉｔｅ／０．１％ＣＭＣ／ＮＺＹアガープレート上に播種する（約４，８００プラーク形成単位／プレート）。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。
【０１６３】
２．プレートを１時間４℃に冷却する。
【０１６４】
３．プレートに室温で１時間Ｄｕｒａｌｏｎメンブラン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を重ね、メンブランの向きを合わせてプレートから持ち上げ、４℃で貯蔵する。
【０１６５】
４．最上層アガロース層を除去し、プレートを約３時間３７℃でインキュベートする。
【０１６６】
５．プレート表面をＮａＣｌでリンスする。
【０１６７】
６．プレートを０．１％コンゴーレッドで１５分間染色する。
【０１６８】
７．プレートを１　Ｍ　ＮａＣｌにより脱染する。
【０１６９】
８．プレート上で同定された推定の陽性物をＤｕｒａｌｏｎメンブランから単離する（陽性物はクローンの周囲の透明化した領域により同定される）。５００　μｌ　ＳＭ　＋　２５μｌ　ＣＨＣｌ３中でインキュベートして溶出することによりファージをメンブランから溶出する。
【０１７０】
９．インサートＤＮＡを任意の適当なクローニングベクター中にサブクローン化し、以下のプロトコールを使用してサブクローンをＣＭＣアーゼ活性について再アッセイする。
【０１７１】
ｉ）　クローンの１　ｍｌの一晩微量調製物を最大速度で３分間遠心分離する。
【０１７２】
ｉｉ）　上清をデカントし、ＬＢ／ＧｅｌＲｉｔｅ／０．１％　ＣＭＣプレート中に形成された「ウェル」を充填するのに使用する。
【０１７３】
ｉｉｉ）　３７℃で２時間インキュベートする。
【０１７４】
ｉｖ）　０．１％コンゴーレッドにより１５分間染色する。
【０１７５】
ｖ）　１Ｍ　ＮａＣｌで１５分間脱染する。
【０１７６】
ｖｉ）　クローン周囲の透明化領域により陽性物を同定する。
【０１７７】
これまでの開示を参照することにより本発明の多くの改変や変形が可能である。従って本発明は、添付の請求の範囲の範囲内で、特に記載したもの以外にも実施することができる。
【０１７８】
【発明の効果】
本発明の酵素およびこれらをコードするポリヌクレオチドは、食品加工産業で、薬品産業で、たとえばラクトースに対する不耐性を治療するための診断用リポーター分子として、トウモロコシの湿式粉砕で、フルーツジュース産業で、パン製造で、織物産業で、また洗剤産業で使用するガラクトースとグルコースにラクトースを加水分解するために使用される。
【０１７９】
【配列表】
2004000189.tif 000004
2004000189.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
添付の図面は本発明の具体例を例示したものであり、請求の範囲に包含される本発明の範囲を限定する意味はない。
【図１ａ】図１ａは、本発明のＭ１１ＴＬの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。本発明の配列の配列決定はすべて３７８自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｉｎｃ．）を用いて実施した。
【図１ｂ】図１ｂは、本発明のＭ１１ＴＬの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。本発明の配列の配列決定はすべて３７８自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｉｎｃ．）を用いて実施した。
【図２】図２は、ＯＣｌ／４Ｖ−３３Ｂ／Ｇの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、Ｆ１−１２Ｇの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図４ａ】図４ａは、９Ｎ２−３１Ｂ／Ｇの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、９Ｎ２−３１Ｂ／Ｇの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図５ａ】図５ａは、ＭＳＢ８−６Ｇの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、ＭＳＢ８−６Ｇの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、ＡＥＤＩＩ１２ＲＡ−１８Ｂ／Ｇの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図７ａ】図７ａは、ＧＣ７４−２２Ｇの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、ＧＣ７４−２２Ｇの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図８ａ】図８ａは、ＶＣ１−７Ｇ１の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、ＶＣ１−７Ｇ１の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図９ａ】図９ａは、３７ＧＰ１の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、３７ＧＰ１の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図９ｃ】図９ｃは、３７ＧＰ１の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１０ａ】図１０ａは、６ＧＣ２の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１０ｂ】図１０ｂは、６ＧＣ２の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１０ｃ】図１０ｃは、６ＧＣ２の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１１ａ】図１１ａは、６ＧＰ２の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１１ｂ】図１１ｂは、６ＧＰ２の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１１ｃ】図１１ｃは、６ＧＰ２の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１１ｄ】図１１ｄは、６ＧＰ２の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１２ａ】図１２ａは、６３ＧＢ１の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１２ｂ】図１２ｂは、６３ＧＢ１の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１２ｃ】図１２ｃは、６３ＧＢ１の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１３ａ】図１３ａは、ＯＣ１／４Ｖの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１３ｂ】図１３ｂは、ＯＣ１／４Ｖの全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１４ａ】図１４ａは、６ＧＰ３の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１４ｂ】図１４ｂは、６ＧＰ３の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１４ｃ】図１４ｃは、６ＧＰ３の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１４ｄ】図１４ｄは、６ＧＰ３の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１４ｅ】図１４ｅは、６ＧＰ３の全長ＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
2004000189.tif 000076
【図６】
2004000189.tif 000077
【図７ａ】
2004000189.tif 000078
【図７ｂ】
2004000189.tif 000079
【図８ａ】
2004000189.tif 000080
【図８ｂ】
2004000189.tif 000081
【図９ａ】
2004000189.tif 000082
【図９ｂ】
2004000189.tif 000083
【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１４ｅ】
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