(57)【要約】　　　（修正有）【課題】非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿より遺伝子工学的手法により得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構造及び非構造領域の抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸断片、およびその製造方法を提供する。【解決手段】非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿よりＲＮＡを抽出し，これよりＤＮＡを増殖する。増殖したＤＮＡを複製できるクローニングベクターでクローニングし，ヌクレオチド配列を決定する。これにより１４種類のクローンを得た。【効果】非Ａ非Ｂ型肝炎患者の診断及び非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスキャリヤーの検出に有用である。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示されるアミノ酸配列で表される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸断片。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が配列番号４に示されるヌクレオチド番号１から８１９までの配列である請求項１記載の核酸断片。
【請求項３】
配列番号５に示されるアミノ酸配列で表される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸断片。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列が配列番号５に示されるヌクレオチド番号３から９９２までの配列である請求項３記載の核酸断片。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の核酸断片が、プロモーターの下流に存在するベクター内のクローニング部位に導入された発現ベクター。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
組換え非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原のペプチドまたはポリペプチドの製造方法であって、
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の核酸断片を適当な宿主細胞内で発現させ得る複製可能な発現ベクターを構築する工程、
前記発現ベクターを宿主細胞内に導入して形質転換体を得る工程、
前記核酸断片を発現させ得る条件下で前記形質転換体を培養して前記組換えペプチドまたはポリペプチドを発現させる工程、及び
前記組換えペプチドまたは組換えポリペプチドを回収する工程
を包含する方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法により得られる組換えペプチドまたは組換えポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構造及び非構造領域の抗原をコードする核酸断片に関する。本発明はまた、該核酸断片を含む発現ベクター及び該ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、該抗原ペプチド又はポリペプチドの製造法及びそれによって得られる組換えペプチド又はポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般にウイルス性肝炎の起因ウイルスとしては主として経口感染するＡ型肝炎ウイルス、血液を介して感染するＢ型肝炎ウイルスが広く知られている。また、Ｂ型肝炎ウイルスに付随して感染するＤ型（δ）肝炎ウイルスの存在も知られている。
【０００３】
これらとは別に、長らく感染性が指摘されながらその病原因子の存在が解からなかった肝炎が存在し、複数のウイルスの存在が示唆されていたが、Ａ型、Ｂ型肝炎ウイルスの存在と他の肝炎要因の除外診断によって非Ａ非Ｂ型肝炎と総称されていた。この中で最近、経口感染によって肝炎を引き起こす非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスが分離同定された。
【０００４】
一方、主として輸血を介して感染する非Ａ非Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルスがワクチンの開発と、輸血用血液のスクリーニングによってほぼ予防が可能となった現在、輸血後肝炎の９０％以上を占め、しかも感染者の５０％以上が慢性化し、肝硬変、肝癌への移行率も高い事から重大な問題となっていた。
【０００５】
本ウイルスについては１９８９年に米国カイロン社のＣｈｏｏ等が人血漿を感染させたチンパンジーの血漿を試料としてイムノスクリーニング法によってウイルス遺伝子をクローニングし、クローニングされたウイルス遺伝子を基に微生物を用いて発現させた抗原を用いた抗体検査による診断法を開発した（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：３５９−３６２　（１９８９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：３６２−３６４　（１９８９）；特表平２−５００８８０号公報）。これを契機として、世界中で活発な研究が開始され、ウイルスの全一次構造も明らかにされており（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８７：９５２４（１９９０）；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８８：２４５１（１９９１）；　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６５，　１１０５（１９９１））、現在広くＨｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）という名称で呼ばれるようになっている。しかし当初カイロン社で開発されたｃ１００−３抗原を用いた試薬では、慢性非Ａ非Ｂ型肝炎患者の７０〜８０％しか検出できなかった（飯野四郎ら、医学と薬学　２６（１）：８７−９５，　１９９１）。しかし、その後米国を初め、日本においても活発にＨＣＶ遺伝子のクローニングが行なわれ、ウイルス構造蛋白であるコア抗原を加えた第二世代の試薬の開発により、ほぼ９０％の患者を検出することが可能となっている（河合忠ら、臨床検査機器・試薬　１４（４）：７２５−７３３，　１９９１）。しかしこの改良された第二世代の試薬においても散発性非Ａ非Ｂ型肝炎患者においてはその４０％程度が検出されるに留まっている。
【０００６】
一方、ＨＣＶの研究の進展と共に、ウイルス遺伝子間でかなり相同性の異なるものの存在が指摘され、少なくとも２種類以上の遺伝子型に分けられるのではないかと考えられるようになりつつある（Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅ　５：３，　２４３（１９９１）；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８８：１０２９２（１９９１））。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、非Ａ非Ｂ型肝炎患者のかなりの部分が第二世代の、構造及び非構造領域の抗原を組み合わせたＨＣＶ抗体検出試薬によって診断可能となってきたが、依然としてこれらの試薬によって検出できない患者が存在する。この原因が、タイプの異なる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスによるものか、全く別の病原因子によるものかは明らかではない。
【０００８】
また、インターフェロン投与等の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の治療法が登場するに伴って、単に抗体を検出するばかりでなく、治療効果の判定の為に、より意義のある遺伝子や抗原の測定が強く望まれている。ところが、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスにはタイプの異なるグループが存在することが明らかにされつつあり、また特にエンベロープと推定される領域においてはかなりの多様性を持つことも明らかにされつつある。ウイルス感染の指標としての抗体測定や抗原測定、遺伝子測定を行うに際しては、ウイルス抗原、および遺伝子の多様性が考慮される必要があるものと考えられ、そのためにはできるだけ多くの種類のウイルス遺伝子とその発現産物を得ておく必要があると考えられる。
【０００９】
本発明の目的は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構造および非構造領域の抗原をコードする新規な核酸断片を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、該核酸断片を含む発現ベクターを提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、該発現ベクターを含む宿主細胞を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、該宿主細胞を培養し、該核酸断片を発現させて得られる該抗原ペプチド又はポリペプチドの製造法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記目的を達成する為に、特定の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿中より既報のものとは異なる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明を完成するに当たっては、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿よりＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を作用させｃＤＮＡを得、２種類のプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０（１９８５））を行うことによりＤＮＡを増幅する。増幅に際して利用するプライマーについては、既報の配列（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６５，　１１０５（１９９１）；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８７：９５２４（１９９０）；Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅ　５：３　２４３（１９９１）；Ｊ．　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌ，　７２：２６９７（１９９１）　）をもとに設定した。増幅したＤＮＡを大腸菌内で複製できるクローニンクベクターを用いてクローニングし、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ鎖終止法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２１４，　１２０５（１９８１））を用いてヌクレオチド配列の決定を行った。
【００１５】
上記方法によって１４種類のクローンを得、各々Ｃ１４−１，Ｃ１４−２，Ｃ１４−３，Ｃ４−１，Ｃ４−２，Ｃ１４−４，Ｃ１４−５，Ｃ１４−６，Ｃ１４−７，Ｃ１４−８，Ｃ１４−９，Ｃ１４−１０，Ｃ１４−１１及びＣ１４−１２と命名した。尚、Ｃ１４及びＣ４は、それぞれ単独の患者より得られた一連のクローンである。得られた１４種類のクローンのうちＣ１４−７クローンを除く１３種類のクローンは大腸菌ＪＭ１０９株に移入した後、形質転換体としてそれぞれ微工研菌寄第１３０２９　号、同第１３０３０　号、同第１３０３１　号、同第１３０２７　号、同第１３０２８　号、同第１３０３２　号、及び同第１３０３３　号（以上、平成４年６月２４日付け寄託）、並びに、ＦＥＲＭ　Ｐ−１３５９２、同Ｐ−１３５９３、同Ｐ−１３５９４、同Ｐ−１３５９５、同Ｐ−１３５９６、及び同Ｐ−１３５９７（以上、平成５年４月９日付け寄託）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１６】
得られた１４種類のクローンは、図１及び図２に示す如く、既報の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列との相同性比較により各々Ｃ１４−１は５’非翻訳領域およびコア領域の一部分、Ｃ１４−３，Ｃ４−１，Ｃ４−２及びＣ１４−５はＮＳ３領域、Ｃ１４−２はＥ２／ＮＳ１領域、Ｃ１４−４はコア／Ｅ１領域、Ｃ１４−６はコア／Ｅ１／Ｅ２／ＮＳ１領域、Ｃ１４−７はＮＳ２／ＮＳ３領域、Ｃ１４−８はＮＳ４／ＮＳ３領域、Ｃ１４−９はＮＳ４／ＮＳ５領域、Ｃ１４−１０，Ｃ１４−１１及びＣ１４−１２はＮＳ５領域と推定された。決定したクローンＣ１４−１，Ｃ１４−２，Ｃ１４−３，Ｃ４−１，Ｃ４−２，Ｃ１４−４，Ｃ１４−５，Ｃ１４−６，Ｃ１４−７，Ｃ１４−８，Ｃ１４−９，Ｃ１４−１０，Ｃ１４−１１及びＣ１４−１２のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列をそれぞれ後記配列表中配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及び１４に示した。
【００１７】
得られた各クローンの特徴を以下に示す。
（１）クローン　Ｃ１４−１
７０１ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号３２０〜７００（１２７アミノ酸）であり、５’非翻訳領域およびコア抗原領域の一部に相当する。
（２）クローン　Ｃ１４−２
９１０ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号１〜９０９（３０３アミノ酸）であり、Ｅ２／ＮＳ１領域の一部に相当する。
（３）クローン　Ｃ１４−３
８５２ヌクレオチドからなり、翻訳領域は１〜８５２（２８４アミノ酸）であり、ＮＳ２およびＮＳ３抗原領域の一部に相当する。
（４）クローン　Ｃ４−１
８１９ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号１〜８１９（２７３アミノ酸）であり、ＮＳ２およびＮＳ３抗原領域の一部に相当する。
（５）クローン　Ｃ４−２
９９２ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号３〜９９２（３３０アミノ酸）であり、ＮＳ３抗原領域の一部に相当する。
（６）クローン　Ｃ１４−４
５９６ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号１〜５９４（１９８アミノ酸）であり、コア抗原領域、およびＥ１抗原領域の一部に相当する。
（７）クローン　Ｃ１４−５
１１４３ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号２〜１１４１（３８０アミノ酸）であり、ＮＳ３抗原領域の一部に相当する。
（８）クローン　Ｃ１４−６
１１３４ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号１〜１１３４（３７８アミノ酸）であり、Ｅ１およびコア、Ｅ２／ＮＳ１領域の一部に相当する。
（９）クローン　Ｃ１４−７
１６６４ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号２〜１６６３（５５４アミノ酸）であり、Ｅ２／ＮＳ１およびＮＳ２、ＮＳ３領域の一部に相当する。
（１０）クローン　Ｃ１４−８
６６７ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号２〜６６７（２２２アミノ酸）であり、ＮＳ４及びＮＳ３領域の一部に相当する。
（１１）クローン　Ｃ１４−９
１１２０ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号２〜１１２０（３７３アミノ酸）であり、ＮＳ４およびＮＳ５領域の一部に相当する。
（１２）クローン　Ｃ１４−１０
１１７４ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号２〜１１７４（３９１アミノ酸）であり、ＮＳ５領域の一部に相当する。
（１３）クローン　Ｃ１４−１１
１０５７ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号２〜１０５７（３５２アミノ酸）であり、ＮＳ５領域の一部に相当する。
（１４）クローン　Ｃ１４−１２
６４８ヌクレオチドからなり、翻訳領域はヌクレオチド番号２〜６４６（２１５アミノ酸）であり、ＮＳ５領域の一部に相当する。
【００１８】
なお、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスゲノムのコード領域はコア／エンベロープの構造領域と非構造領域（ＮＳ）とから構成されており、コード領域の５’端からＣＯＲＥ、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５の順に配列されている（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９９１），　６５：１１０５〜１１１３）。
【００１９】
更にクローンＣ１４−１，Ｃ１４−２，Ｃ１４−３，Ｃ４−１，Ｃ４−２，Ｃ１４−４，Ｃ１４−５，Ｃ１４−６，Ｃ１４−７，Ｃ１４−８，Ｃ１４−９，Ｃ１４−１０，Ｃ１４−１１及びＣ１４−１２のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列をそれぞれ既報のＨＣＶ１（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　（１９９１），　８８：２４５１〜２４５５）、ＨＣＶＢＫ（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９９１），　６５：１１０５　〜１１１３）、ＨＣＶ−Ｊ１（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　（１９９０），　８７：９５２４〜９５２８）、ＨＣ−Ｊ６（Ｊ．　ＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ　（１９９１），　７２：　２６９７〜２７０４）及びＨＣ−Ｊ８（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９９２），　１８８：３３１〜３４１　）の配列と相同性を比較した結果を下表１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及び１４に示した。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
【表２】
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【００２２】
【表３】
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【００２３】
【表４】
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【００２４】
【表５】
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【００２５】
【表６】
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【００２６】
【表７】
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【００２７】
【表８】
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【００２８】
【表９】
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【００２９】
【表１０】
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【００３０】
【表１１】
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【００３１】
【表１２】
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【００３２】
【表１３】
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【００３３】
【表１４】
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【００３４】
これらの表より、クローンＣ１４−１は公表された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子との間で、ヌクレオチド配列で３．７〜１１．７％、アミノ酸配列で４．７〜１１．０％の相違を示した。またクローンＣ１４−２ではそれぞれ９．３〜３２．５％、９．２〜２７．１％；クローンＣ１４−３ではそれぞれ８．２〜３１．８％、２．５〜２４．５％；クローンＣ４−１ではそれぞれ９．６〜３３．４％、５．９〜２６．４％；クローンＣ４−２ではそれぞれ８．７〜２８．２％、３．９〜１４．８％；クローンＣ１４−４ではそれぞれ９．２〜３５．１％、７．６〜３４．３％；クローンＣ１４−５ではそれぞれ８．５〜２８．５％、４．７〜１３．９％；クローンＣ１４−６ではそれぞれ１２．２〜３６．５％、１３．８〜３７．２％；クローンＣ１４−７ではそれぞれ９．４〜３７．３％、４．９〜３３．４％；クローンＣ１４−８ではそれぞれ９．１〜３４．５％、３．２〜３０．２％；クローンＣ１４−９ではそれぞれ９．９〜３３．３％、４．３〜３１．２％；クローンＣ１４−１０ではそれぞれ１１．１〜４９．４％、９．２〜４１．２％；クローンＣ１４−１１ではそれぞれ６．４〜３０．３％、４．０〜２３．６％；クローンＣ１４−１２ではそれぞれ５．９〜３２．８％、４．７〜２７．４％の相違が認められた。このことは、Ｃ４、Ｃ１４株は現在までに公表されているＨＣＶ株とは別の株であることを示している。
【００３５】
従って、本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿より遺伝子工学的手法により得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構造及び非構造領域の抗原をコードするヌクレオチド配列を含む新規な核酸断片を提供する。
【００３６】
本発明の実施態様により、該核酸断片は、後記配列表中配列番号１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３および１４に示されるアミノ酸配列の全部または一部で表わされる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。また、該ヌクレオチド配列には、遺伝暗号の縮重に基づく全ての配列が包含される。このようなヌクレオチド配列の具体例は、配列番号１に示されるヌクレオチド番号１から７００までの配列の全部または一部、配列番号２に示されるヌクレオチド番号１から９０９までの配列の全部または一部、配列番号３に示されるヌクレオチド番号１から８５２までの配列の全部または一部、配列番号４に示されるヌクレオチド番号１から８１９までの配列の全部または一部、配列番号５に示されるヌクレオチド番号３から９９２までの配列の全部または一部、配列番号６に示されるヌクレオチド番号１から５９４までの配列の全部または一部、配列番号７に示されるヌクレオチド番号２から１１４１までの配列の全部または一部、配列番号８に示されるヌクレオチド番号１から１１３４までの配列の全部または一部、配列番号９に示されるヌクレオチド番号２から１６６３までの配列の全部または一部、配列番号１０に示されるヌクレオチド番号２から６６７までの配列の全部または一部、配列番号１１に示されるヌクレオチド番号２から１１２０までの配列の全部または一部、配列番号１２に示されるヌクレオチド番号２から１１７４までの配列の全部または一部、配列番号１３に示されるヌクレオチド番号２から１０５７までの配列の全部または一部、配列番号１４に示されるヌクレオチド番号２から６４６までの配列の全部または一部である。
【００３７】
本発明はまた、上記核酸配列が、プロモーターの下流に存在するベクター内のクローニング部位に導入された発現ベクターを提供する。さらに、本発明は該発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３８】
ベクターとしては、プラスミド，ファージ等の慣用のベクターの他に、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等）が使用される。ＤＮＡ発現により得られる組換えペプチド又はポリペプチドが糖鎖構造をもつようにするか否かによって、使用し得るプロモーターおよび宿主の種類が決まる。すなわち、組換えペプチド又はポリペプチドが糖鎖構造を含まないようにする場合には、宿主として例えば大腸菌，枯草菌，放線菌等の原核生物を用いることができ、また、プロモーターとして例えばトリプトファン合成酵素オペロン（ｔｒｐ），ラクトースオペロン（ｌａｃ），ラムダファージＰＬ　，ＰＲ　等を用いることができる。この場合には、一般に他のペプチドとの融合体として得られるだろう。一方、組換えペプチド又はポリペプチドが糖鎖構造を含むようにする場合には、宿主として例えば酵母，植物細胞，昆虫細胞，動物細胞等の真核生物が挙げられ、またプロモーターとして酵母等に慣用のプロモーター例えば３−ホスホグリセレートキナーゼ，エノラーゼ等の解糖系酵素に対するプロモーターやアルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーター、哺乳動物細胞で使用され得るウイルスプロモーター例えばポリオーマウイルス，アデノウイルス，サルウイルスＳＶ４０，ワクシニアウイルス，サイトメガロウイルス等由来のプロモーターが挙げられる。
【００３９】
ベクターはさらに、形質転換された細胞の表現型選択を可能にするマーカー配列（例えばアンピシリン，テトラサイクリン耐性遺伝子等）、複製開始点、ターミネーター、リボソーム結合部位等を適宜含み得る。
【００４０】
本発明はさらに、組換え非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチド又はポリペプチドの製造方法を提供する。この方法は、具体的には、本発明の上述の核酸断片を適当な宿主細胞内で発現させ得る複製可能な発現ベクターを構築する工程、
前記発現ベクターを宿主細胞内に導入して形質転換体を得る工程、
前記核酸断片を発現させ得る条件下で前記形質転換体を培養して前記組換えペプチド又はポリペプチドを発現させる工程、および
前記組換えペプチド又はポリペプチドを回収する工程
を包含する。
【００４１】
形質転換体の培養条件は、使用する宿主細胞に依存して決定され、増殖可能な培地、培養温度、培養時間等が適宜選択される。また、培養物からの組換えペプチド又はポリペプチドの精製は、慣用の技術例えば細胞の超音波破砕、可溶化抽出、硫安分画、各種クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００４２】
本明細書中「組換えペプチド又はポリペプチド」とは、発現ベクターに組み込んだ非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするＤＮＡを発現させて得られるペプチド又はポリペプチド自体または他のペプチド又はポリペプチドとの融合ペプチド又はポリペプチドを意味する。
【００４３】
本発明には、上記方法で得られた組換えペプチド又はポリペプチドも包含される。このようなペプチド又はポリペプチドは、慣用のペプチド合成技術を用いることによって化学合成することも可能であり、これは当業者には自明のことである。
【００４４】
本発明によって得られた組換えポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動後、ウエスターンブロット法により正常人血清及び非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と反応させたところ、図４及び図５に示すように本組換えポリペプチドは非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清とのみ反応した。従って本組換えポリペプチドは非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに特異的な抗原であり、非Ａ非Ｂ型肝炎の診断及び非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの検出に使用可能である。
【００４５】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４６】
実施例１
ＲＴ−ＰＣＲによるＨＣＶ（＃Ｓ１４）遺伝子の検出
　慢性期非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血漿よりＨＣＶ遺伝子をクローニングする方法として少量の血漿でクローニングが可能なＲＴ（リバース・トランスクリプターゼ）−ＰＣＲ法を利用してＨＣＶ遺伝子のクローニングを行った。
【００４７】
先ず、単一の慢性期の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿（＃Ｓ１４）１００μｌに６ＭのＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７５％ザルコシル、０．２Ｍメルカプトエタノール）２００μｌと酵母のｔ−ＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）１μｌを加え撹拌する。更に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μｌ、ＴＥ飽和フェノール（ｐＨ７．５〜８．０）３０μｌ、クロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）７０μｌを加え素早く混合し、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分間静置する。遠心機で１５０００　ｒｐｍ、２０分間４℃で遠心する。水層を採り、等量のイソプロピルアルコールと混合し−２０℃に１時間以上置く。これを１５０００　ｒｐｍ、２０分間４℃で遠心し、沈殿させる。沈殿物を４ＭのＧＴＣ（６Ｍ　ＧＴＣを滅菌水で希釈したもの）１００μｌに溶解し、等量のイソプロピルアルコールと混合し、−２０℃に１時間以上静置する。１５０００　ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心し沈殿物を得る。７０％エタノール１ｍｌで洗浄後、室温で風乾し、１０μｌの滅菌水に溶解しＲＮＡとして使用した。
【００４８】
ｃＤＮＡ合成はＲＮＡ１０μｌをシリコン処理チューブ（０．５ｍｌ）に分注した後、７０℃、３分間加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造）１μｌ（５０単位／μｌ）、ｄＮＴＰ（各２０ｍＭ）１μｌ、１００ｍＭ　ＤＴＴ、５×ＲＴ　ｂｕｆｆｅｒ　（２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３７５ｍＭ　ＫＣｌ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　）４μｌ、ランダムオリゴヘキサマープライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、逆転写酵素（ＢＲＬ）（２００単位／μｌ）１μｌを加え、滅菌水で計２０μｌに合わせる。４２℃で２時間反応後、９４℃で５分間加熱し酵素を失活させた。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは検出ＤＮＡの増幅感度と特異性を挙げる為に２ステップ法を用いた。即ち、先ず２種のプライマーで１回目のＰＣＲをかける（１ｓｔ　ｓｔｅｐ　ＰＣＲ）。次にそのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列の内側に存在する２種のプライマーを用いて２回目のＰＣＲをかける（２ｎｄ　ｓｔｅｐ　ＰＣＲ）方法である。
【００４９】
Ｃ１４−１領域、Ｃ１４−２領域、Ｃ１４−３領域、Ｃ１４−４領域、Ｃ１４−５領域、Ｃ１４−６領域、Ｃ１４−７領域、Ｃ１４−８領域、Ｃ１４−９領域、Ｃ１４−１０領域、Ｃ１４−１１領域、Ｃ１４−１２領域の１２の領域についてプライマーを合成し、２ステップ法に使用した。以下に使用したＰＣＲプライマーを記述する。尚、それぞれの領域は既報の配列（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６５，　１１０５−１１１３　（１９９１）；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７，　９５２４−９５２８　（１９９０）；　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｓ　５：３，　２４３−２５９　（１９９１）；　Ｊ．　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌ．　７２，　２６９７−２７０４　（１９９１））を参考に設定した。又それぞれの増幅領域と既報の配列（ＨＣ−Ｊ６）との位置関係を図１及び図２に示す。
【００５０】
Ｃ１４−１領域については、１ｓｔ　ＰＣＲに際してはプライマー１４−１：５’−ＣＧＡＴＴＧＧＧＧＧＣＧＡ−３’及び１４−２：５’−ＴＴＧＣＡＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＧ−３’を使用し、２ｎｄ　ＰＣＲにはプライマー１４−１と１４−３：５’−ＣＡＴＧＡＧＧＴＣＧＧＣＧＡＡＧＣＣＧＣ−３’を用いた。
【００５１】
Ｃ１４−２領域については、１ｓｔ　ＰＣＲはプライマー１４−８：５’−ＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣ−３’と１４−９：５’−ＧＧＡＣＴＡＣＣＣＧＡＣＣＣＴＴＧＡＴＧＴＡＣＣＡ−３’を使用し、２ｎｄ　ＰＣＲはプライマー１４−１０：５’−ＣＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣ−３’と１４−１１：５’−ＧＣＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＡＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＴＡ−３’を用いた。
【００５２】
Ｃ１４−３領域については、１ｓｔ　ＰＣＲはプライマー１４−１２：５’−ＧＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＣＴＴＧＣＧＧＧＧＡ−３’と１４−１３：５’−ＡＴＡＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＧ−３’を使用し、２ｎｄ　ＰＣＲはプライマー１４−１４：５’−ＴＴＣＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣＣＣＧＡ−３’と１４−１３を用いた。
【００５３】
Ｃ１４−４領域については、１ｓｔ　ＰＣＲはプライマー１４−４：５’−ＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣ−３’と１４−５：５’−ＧＣＣＧＴＴＧＴＡＧＧＴＧＡＣＣＡＧＴＴＣ−３’を使用し、２ｎｄ　ＰＣＲはプライマー１４−６：５’−ＴＧＧＧＴＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣ−３’と１４−５を用いた。
【００５４】
Ｃ１４−５領域については、１ｓｔ　ＰＣＲはプライマー１４−１５：５’−ＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＴ−３’と１４−１６：５’−ＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧＴＡ−３’を使用し、２ｎｄ　ＰＣＲはプライマー１４−１７：５’−ＴＣＧＣＧＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＧＧＴＡＣＡＡ−３’と１４−１８：５’−ＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＣＣＴＣＧＴＴＧＧＴＡ−３’を用いた。
【００５５】
さらに、Ｃ１４−６，Ｃ１４−７，Ｃ１４−８，Ｃ１４−９，Ｃ１４−１０，Ｃ１４−１１及びＣ１４−１２領域については、下記に示すＰＣＲプライマーを用いた。
【００５６】
【表１５】
2004000151.tif 000017
（ＮはＧ，Ａ，Ｔ，Ｃのミックスを示す）。
【００５７】
ＰＣＲの条件は、０．５ｍｌチューブ中に上記ｃＤＮＡ合成反応液を２０μｌと１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ　ＫＣｌ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、０．１％　ｇｅｌａｔｉｎｅ　）８μｌ、１ｓｔ　ｓｔｅｐプライマー２種（各７５ｐｍｏｌｅ　）、２ｍＭ　ｄＮＴＰ　８μｌを加え、滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、Ａｍｐｌｉ　Ｔａｑ　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）１μｌ（５単位）を加え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心する。ＰＣＲ反応は、変性９４℃１分間、アニーリング５５℃１分間、伸長７２℃２分間の条件で３０サイクル行った。次に新しい０．５ｍｌチューブに１ｓｔ　ＰＣＲ反応終了液１０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液９μｌを加え、２ｎｄ　ｓｔｅｐプライマー２種（各７５ｐ　ｍｏｌｅ）、２ｍＭ　ｄＮＴＰ９μｌ、滅菌水で１００μｌとする。９４℃で１０分間加熱し、Ａｍｐｌｉ　Ｔａｑ　１μｌ（５単位）を加え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心し、先の条件で２ｎｄ　ＰＣＲを行う。反応後、反応液１０μｌをアガロースゲル電気泳動し、特異的に増幅されたＤＮＡ断片を検出した。
ＰＣＲ産物（ＨＣＶ＃Ｓ１４のＤＮＡ断片）のクローニングと塩基配列の決定
　ＨＣＶ遺伝子は複製時に変異が導入され易い可能性が考えられた。そこでクローニング時に発生する人為的な変異をできるだけ少なくする為にベクターとしてｐＢＲ３２２（Ｓｕｔｃｈｌｉｆｆｅ，　Ｊ．　Ｇ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，　４３，　７７−９０（１９７９））を改変したベクター（ｐＢＭ）を用いた。ｐＢＭはｐＢＲ３２２の制限酵素ＥｃｏＲ　ＶサイトからＢａｌ　Ｉサイトの間の配列を制限酵素で欠失させ、ＥｃｏＲ　ＩサイトとＨｉｎｄ　ＩＩＩサイト間にｐＵＣ１１９（Ｖｉｅｒｉａ，　Ｊ．，　Ｍｅｓｓｉｎｇ，　Ｊ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　１５３，　３−１１　（１９８７））のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲ　ＩサイトからＨｉｎｄ　ＩＩＩサイトまでを組み込んだ（ΔｐＢＲ　ＭＣＳ）。次にｐＢＲ３２２のＶｓｐ　ＩサイトからＳｃａ　Ｉサイトの間の配列をｐＵＣ１１９のＶｓｐＩサイトからＳｃａ　Ｉサイト間の配列に置き換え、この間のＰｓｔ　Ｉサイトを欠失させ全長３１２２ｂｐのベクターを作製した（図３）。
【００５８】
ＨＣＶのＤＮＡが検出されたＰＣＲ反応液は全量を等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）と混和し、遠心後、その水層を０．５ｍｌチューブに移し、１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、２倍量のエタノールを加え、エタノール沈殿した。沈殿物は１０ｍＭトリス塩酸−１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）（ＴＥ）３００μｌに溶解し、ウルトラフリーＣ３ＴＫ（日本ミリポアリミテッド）にて遠心濾過し、残存プライマー除去、および脱塩を行った。処理液は１０×Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（３０ｍＭトリス酢酸、０．６６Ｍ酢酸カリウム、０．１Ｍ酢酸マグネシウム、５ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）２μｌ、２ｍＭ　ｄＮＰＴ１μｌ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ４単位（宝酒造）を加え滅菌水にて２０μｌとし、１２℃、１５分間反応した。反応後、等量のフェノール／クロロホルム（２５：２４）、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）でそれぞれ１回ずつ抽出を行い、水層をエタノール沈殿した。沈殿物は、７５％エタノールで洗浄後、風乾し、１０×イミダゾール緩衝液（０．５Ｍイミダゾール塩酸（ｐＨ６．４）、０．１８Ｍ塩化マグネシウム、５０ｍＭ　ＤＴＴ）４μｌ、２４％ポリエチレングリコール６０００　１０μｌ、１０ｍＭ　ＡＴＰ　０．５μｌ、Ｔ４ＤＮＡキナーゼ（宝酒造）２０単位を加え滅菌水で４０μｌとし、３７℃、１時間反応して５’末端をリン酸化した。クロロホルム／イソアミルアルコール処理によって酵素を失活させ、水層をエタノール沈殿後、７５％エタノールで洗浄した。沈殿物は低融点アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを単離し、ＴＥ飽和フェノールで２回抽出を行い、ＤＮＡ断片をエタノール沈殿し７５％エタノールで洗浄後、滅菌水１０μｌに溶解しその１μｌをアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片量を決定した。
【００５９】
ここで得られたＤＮＡ断片はあらかじめ制限酵素Ｓｍａ　Ｉにて切断し、アルカリフォスファターゼ処理によりその５’末端の脱リン酸化を行ったｐＢＭベクターとの連結反応を行う。
【００６０】
ｐＢＭ（２０μｌ）は制限酵素反応液５０μｌ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、２０ｍＭ　ＫＣｌ、Ｓｍａ　Ｉ（宝酒造）８０単位）中で３０℃、９０分反応し、６８℃、１５分加熱後エタノール沈殿する。沈殿物を７５％エタノールで洗浄後、風乾し、１０×アルカリフォスファターゼ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭ　ＺｎＣｌ２　、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　）５μｌ、アルカリフォスファターゼ（牛小腸由来；宝酒造）１単位に滅菌水を加え５０μｌとし、３７℃、１時間反応させることにより脱リン酸化した。５００ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）０．５μｌ、１０％ＳＤＳ２．５μｌを加え、更にプロテアーゼＫを終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、５６℃、３０分反応し、酵素を失活させた後、低融点アガロースゲル電気泳動によりベクターを単離し、ＴＥ飽和フェノールで２回抽出を行い、エタノール沈殿して、７５％エタノールで洗浄、風乾後、滅菌水５０μｌに溶解した。その１μｌをアガロースゲル電気泳動し、ベクター量を決定し、終濃度０．１μｇ／ｍｌのＳｍａ　Ｉクローニングベクターとした。
【００６１】
リン酸化したＤＮＡ断片はＳｍａ　Ｉクローニングベクター２５ｎｇに対してモル比で１５倍から２０倍量加え、１０×ライゲーション緩衝液（０．６６Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、５０ｍＭ　ＤＴＴ）２μｌ、１０ｍＭヘキサミン塩化コバルト２μｌ、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）２μｌ、１０ｍＭ　ＡＴＰ１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）３５０単位を加え、滅菌水で２０μｌとし、１６℃で一夜連結反応を行った。この反応液にｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）０．５μｌを加え、エタノール沈殿後、７５％エタノールで洗浄し、その沈殿物を１０μｌの滅菌水に溶解し、その半量を用いて大腸菌ＪＭ１０９株、又はＳＣＳ１株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株（コンピテントセル）は既報（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１６６，　５７７　（１９８３））に基づいて調製したものを用いた。
【００６２】
形質転換菌はＬＢ−Ａｍｐプレート（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）上で一夜培養した後、プレート上に出現したコロニーをそれぞれ３ｍｌ　ＬＢ−Ａｍｐの入った１５ｍｌチューブで培養し、１．５ｍｌの培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーション（Ｍａｎｉａｔｉｓら，　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　１９８２　）を行い、１５μｌのＤＮＡ液を調製した。内、２〜３μｌを制限酵素ＥｃｏＲ　ＩとＨｉｎｄ　ＩＩＩ　各４単位、反応緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、１ｍＭ　ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ）１０μｌ中で３７℃、１時間反応させた後、アガロースゲル電気泳動を行い、挿入されたＤＮＡ断片の大きさを確認した。
【００６３】
各１２の領域はＣ１４−１が約７１０ｂｐ、Ｃ１４−２領域が約９５０ｂｐ、Ｃ１４−３領域が約８５０ｂｐ、Ｃ１４−４領域が約６００ｂｐ、Ｃ１４−５領域が約１２００ｂｐ、Ｃ１４−６領域が約１１３４ｂｐ、Ｃ１４−７領域が約１６６４ｂｐ、Ｃ１４−８領域が約６６７ｂｐ、Ｃ１４−９領域が約１１２０ｂｐ、Ｃ１４−１０領域が約１１７４ｂｐ、Ｃ１４−１１領域が約１０５７ｂｐ、Ｃ１４−１２領域が約６４８ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ確認された。
【００６４】
得られた１２種類のＤＮＡは更にＳａｎｇｅｒ等のジデオキシターミネーション法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２１４，　１２０５−１２１０　（１９８１））を用い、その塩基配列を決定した。又、このＤＮＡ塩基配列決定に使用したそれぞれの領域クローンをＣ１４−１、Ｃ１４−２、Ｃ１４−３、Ｃ１４−４、Ｃ１４−５、Ｃ１４−６、Ｃ１４−７、Ｃ１４−８、Ｃ１４−９、Ｃ１４−１０、Ｃ１４−１１、Ｃ１４−１２と命名した。又、決定した遺伝子の塩基配列及びそれより推定されるアミノ酸配列をＣ１４−１は配列番号１として、Ｃ１４−２は配列番号２、Ｃ１４−３は配列番号３、Ｃ１４−４は配列番号６、Ｃ１４−５は配列番号７、Ｃ１４−６は配列番号８、Ｃ１４−７は配列番号９、Ｃ１４−８は配列番号１０、Ｃ１４−９は配列番号１１、Ｃ１４−１０は配列番号１２、Ｃ１４−１１は配列番号１３、Ｃ１４−１２は配列番号１４として示した。上記プラスミドは形質転換体としてＣ１４−１は微工研菌寄第１３０２９　号、Ｃ１４−２は同第１３０３０　号、Ｃ１４−３は同第１３０３１　号、Ｃ１４−４は同第１３０３２　号、Ｃ１４−５は同第１３０３３　号として平成４年６月２４日付けで、また、Ｃ１４−６はＦＥＲＭ　Ｐ−１３５９２　、Ｃ１４−８は同Ｐ−１３５９３　、Ｃ１４−９は同Ｐ−１３５９４　、Ｃ１４−１０は同Ｐ−１３５９５　、Ｃ１４−１１は同Ｐ−１３５９６　、Ｃ１４−１２は同Ｐ−１３５９７　として平成５年４月９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００６５】
実施例２
ＲＴ−ＰＣＲによるＨＣＶ（＃４）遺伝子の検出
　上記実施例１で示したと同様の方法にて、実施例１とは異なる単一の慢性非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿からのＨＣＶ（＃４）遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｃ４−１及びＣ４−２領域の増幅ＤＮＡ断片を検出した。
【００６６】
用いたプライマーを以下に示した。
【００６７】
Ｃ４−１領域については、１ｓｔ　ＰＣＲはプライマー４−１：５’−ＡＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＣ−３’と４−２：５’−ＡＣＴＧＴＧＣＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＴ−３’を使用し、２ｎｄ　ＰＣＲはプライマー４−３：５’−ＴＡＣＴＴＣＴＡＧＧＡＣＣＧＧＣＣＧＡＴ−３’と１４−１３：５’−ＡＴＡＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＧ−３’を用いた。
【００６８】
Ｃ４−２領域については、１ｓｔ　ＰＣＲはプライマー４−４：５’−ＴＧＧＡＧＣＧＴＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＧＧ−３’と４−５：５’−ＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＴＧＴＡ−３’を使用し、２ｎｄ　ＰＣＲはプライマー４−４と４−６：５’−ＣＡＣＡＴＴＴＧＧＴＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧ−３’を用いた。
ＰＣＲ産物のクローニングと塩基配列の決定
　クローニングに際しては、ベクターとしてｐＵＣ１１９を用い、そのＳｍａ　Ｉサイトと、上記プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した遺伝子断片を実施例１で示した方法によってクローニングし、塩基配列を決定した。又、このＤＮＡ塩基配列決定に使用したそれぞれの領域クローンをＣ４−１、Ｃ４−２と命名した。決定した遺伝子の塩基配列及びそれより推定されるアミノ酸配列をＣ４−１は配列番号４として、Ｃ４−２は配列番号５として示した。上記プラスミドは形質転換体としてＣ４−１は微工研菌寄第１３０２７　号、Ｃ４−２は同第１３０２８　号として平成４年６月２４日付で寄託されている。
【００６９】
実施例３
大腸菌を用いたＨＣＶ（＃Ｓ１４）由来遺伝子の発現（その１）
ａ）発現プラスミドの構築
上記実施例１において得られたクローンＣ１４−１のＤＮＡを利用してプライマーＢ１：５’−ＣＡＴＧＡＧＣＡＴＡＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡＧ−３’とＢ２：５’−ＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧＴＧＴＣＧＡＴＧＡＣＣＴＴＡＣＣＣ−３’を用いて実施例１のＰＣＲ条件でＰＣＲを行い、約３８０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ反応液は全量を実施例１の方法でクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で処理し、その水層をエタノール沈殿し、ＴＥ３００μｌに溶解後、遠心瀘過し、残存プライマー除去及び脱塩を行い、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理後、Ｔ４ＤＮＡキナーゼ処理によって５’末端を燐酸化した。得られたＤＮＡ断片は反応緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、１ｍＭ　ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ）中でＰｓｔ　Ｉ２０単位を加えて消化し、低融点アガロースゲル電気泳動を行った。アガロースゲルよりＤＮＡを単離し、ＴＥ飽和フェノールで２回抽出後、エタノール沈殿し、減菌水１０μｌに溶解し、約３８０ｂｐのＤＮＡ断片として精製した。ここで得られたＤＮＡ断片は発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア）をあらかじめ上述の条件にて制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで切断し、更に実施例１に示した条件にて制限酵素Ｓｍａ　Ｉで切断し、アルカリフォスファターゼ処理によりその５’末端の脱燐酸化を行ったそのベクター２５ｎｇと実施例１の条件でＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行い、大腸菌ＪＭ１０５株を用い、形質転換した。
【００７０】
形質転換菌はＬＢ−Ａｍｐプレート（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）上で一夜培養後、プレート上に出現したコロニーをそれぞれ３ｍｌのＬＢ−Ａｍｐの入った１５ｍｌチューブで培養し、その１．５ｍｌを遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーション（　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ，　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，１９８２）　を行い、１５μｌのＤＮＡ液を調製した。内２−３μｌを制限酵素ＥｃｏＲ　ＩとＰｓｔ　Ｉ各４単位、反応緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、ｌｍＭ　ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ）１０μｌ中で３７℃、１時間反応させた後、アガロースゲル電気泳動を行い、約３８０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されているクローンを得た。
ｂ）ウエスタンブロット法による発現の確認及び非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との反応
　上記大腸菌クローンを３ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地で３７℃、３時間前培養した後、その５０μｌを新しいＬＢ−Ａｍｐ培地５ｍｌに接種し、３７℃、２時間培養した。培養液に終濃度２ｍＭになるようにＩＰＴＧ（和光純薬）を加え、更に３７℃、３時間培養した。培養液１．５ｍｌを１３０００ｒｐｍ　、２分間遠心し、集菌後、ＴＥ１ｍｌで菌を洗浄し、１３０００　ｒｐｍ、２分間遠心し、再び集菌した。集菌したペレットに５０μｌの滅菌水および５０μｌの２×サンプル緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、１０％ＳＤＳ、５％　２−メルカプトエタノール、０．２％ブロムフェノルブルー）を加え懸濁混和し、懸濁液を１００℃、５分間煮沸後氷冷下で超音波処理し、−７０℃で凍結融解を２回繰り返しサンプルとした。
【００７１】
上記サンプル３０μｌをＭＩＮＩ　ＰＲＯＴＥＡＮ　ＩＩ　Ｄｕａｌ　ＳｌａｂＣｅｌｌ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，　２２７，　６８０（１９７０））に準じて１５ｍＡ，１．５時間ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、ゲルを取り出し、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）を密着させＭＩＮＩ　ＴＲＡＮＳ　ＢＬＯＴ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて２５０ｍＡ、１．７５時間転写した。転写後、メンブレンを５％スキムミルク、２％ＢＳＡを含む緩衝液Ｉ’（１０ｍＭ　Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）、１％ＢＳＡ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ）に浸漬し、室温で２時間ブロッキングした。５％スキムミルク、２％ＢＳＡを含む緩衝液Ｉ’で４０倍希釈した血清検体にブロッキングしたメンブレンを入れ、室温で４時間反応させた。反応後、メンブレンを緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ　Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、２％スキムミルクを含む緩衝液Ｉ’で１００ｍｕ／ｍｌに希釈した抗人ＩｇＧ−ＰＯＤ標識抗体液（ヤギ抗体）にいれ、室温で３０分間反応させた。反応後、メンブレンを取り出し、緩衝液ＩＩで５回洗浄した。洗浄したメンブレンを発色液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５％４−クロロ１ナフトール、０．０１８％Ｈ２　Ｏ２　、１６．７％メタノール）に浸漬し、室温で１５分間反応させた。
【００７２】
結果を図４に示した。図４においては、非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清５例（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．　５）　と健常人血清５例（Ｎｏ．　６〜Ｎｏ．　１０）についてウエスタンブロットを行った結果を示したが、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清でのみ、全てに強い陽性反応が検出され、発現した抗原が、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の診断及び非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスキャリヤーの検出に有用であることが示された。
【００７３】
実施例４
大腸菌を用いたＨＣＶ（＃Ｓ１４）由来遺伝子の発現（その２）
ａ）発現プラスミドの構築
実施例１において得られたクローンＣ１４−３とＣ１４−５のＤＮＡを緩衝液（Ｔａｋａｒａ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｈ　）中でそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によりそれぞれ約９３０ｂｐと約９５０ｂｐのＤＮＡ断片を単離し、ＴＥ飽和フェノール及びクロロホルム処理後、エタノール沈殿し、滅菌水２５μｌに溶解することによって精製した。精製した各ＤＮＡをそれぞれ上記緩衝液中で制限酵素ＳｃａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によりそれぞれ約７８０ｂｐと９２０ｂｐのＤＮＡを単離し、ＴＥ飽和フェノール及びクロロホルム処理後、エタノール沈殿することによって精製した。精製した２種類のＤＮＡ、及び予め上記緩衝液中、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９株を用い、形質転換した。
【００７４】
形質転換菌はＬＢ−Ａｍｐプレート（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）上で一晩培養後、プレート上に出現したコロニーをそれぞれ３ｍｌのＬＢ−Ａｍｐの入った１５ｍｌチューブで培養し、その１．５ｍｌを遠心処理により集菌し、プラスミドのミニプレパレーション（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ，　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，１９８２）を行い、２０μｌのＤＮＡ液を調製した。調製したＤＮＡ液の４μｌを緩衝液（Ｔａｋａｒａ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｈ　）中ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動することによって約１７００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されているクローン（２８−１４Ｄ）を得た。このクローン２８−１４ＤのＤＮＡを利用してプライマーＦ２：５’−ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣ−３’とプライマーＲ：５’−ＣＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＡＣ−３’を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、上記ＤＮＡ１μｌに１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ　ＫＣｌ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、０．１％ｇｅｒａｔｉｎｅ）５μｌ、プライマーＦ２、Ｒ（各２４０ｐＭ）、２５ｍＭ　ｄＮＴＰ　０．２μｌ、Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）０．２μｌ（１単位）を加え、滅菌水で５０μｌとした後撹拌し、ミネラルオイルを重層し、変性９４℃０．５分間、アニーリング５５℃０．５分間、伸長７２℃１分間の条件で４４サイクル行った。反応後、反応液の全量をＴＥ飽和フェノール及びクロロホルム処理し、その水層をエタノール沈殿し、滅菌水４０μｌに溶解し、緩衝液（Ｔａｋａｒａ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｈ　）５μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＩ２０単位、ＰｓｔＩ２０単位を加えて消化した。消化後１．５％アガロースゲル電気泳動により約８６０ｂｐのＤＮＡ断片を単離し、ＴＥ飽和フェノール及びクロロホルム処理後エタノール沈殿し、５μｌの滅菌水に溶解することにより精製ＤＮＡを得た。ここで得られたＤＮＡ断片はその１μｌを、発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア）を予め制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断し、上述の条件で精製した物１μｌと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を用い、形質転換した。
【００７５】
形質転換菌は、ＬＢ−Ａｍｐプレート（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）上で一晩培養後、プレート上に出現したコロニーをそれぞれ３ｍｌのＬＢ−Ａｍｐの入った１５ｍｌチューブで培養し、その１．５ｍｌを遠心処理により集菌し、プラスミドのミニプレパレーション（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ，　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，１９８２）を行い、２０μｌのＤＮＡ液を調製した。調製したＤＮＡ液の４μｌを緩衝液（Ｔａｋａｒａ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｈ　）中ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動することによって約８６０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されているクローンを得た。
ｂ）ウエスタンブロット法による発現の確認及び非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との反応
上記大腸菌クローンを３ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地で３７℃、３時間前培養した後、その５０μｌを新しいＬＢ−Ａｍｐ培地５ｍｌに接種し、３７℃、２時間培養した。培養液に終濃度２ｍＭになるようにＩＰＴＧ（和光純薬）を加え、更に３７℃、３時間培養した。培養液１．５ｍｌを１３０００ｒｐｍ　、２分間遠心し集菌後、ＴＥ１ｍｌで菌を洗浄し、１３０００　ｒｐｍ、２分間遠心し、再び集菌した。集菌したペレットに５０μｌの滅菌水及び５０μｌの２×サンプル緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、１０％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、０．２％ブロムフェノルブルー）を加え懸濁混和し、懸濁液を１００℃、５分間煮沸後氷冷下で超音波処理し、−７０℃で凍結融解を２回繰り返しサンプルとした。
【００７６】
上記サンプルをＭＩＮＩ　ＰＲＯＴＥＡＮ　ＩＩ　Ｄｕａｌ　Ｓｌａｂ　Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，　２２７，　６８０（１９７０））に準じて１５ｍＡ，１．５時間ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、ゲルを切り出し、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）を密着させＭＩＮＩ　ＴＲＡＮＳ　ＢＬＯＴ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて２５０ｍＡ、１．７５時間転写した。転写後、メンブレンを５％スキムミルク、２％ＢＳＡを含む緩衝液Ｉ’（１０ｍＭ　Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）、１％ＢＳＡ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ）に浸漬し、室温で２時間ブロッキングした。５％スキムミルク、２％ＢＳＡを含む緩衝液Ｉ’で４０倍希釈した血清検体にブロッキングしたメンブレンを入れ、室温で４時間反応させた。反応後、メンブレンを緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ　Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、２％スキムミルクを含む緩衝液Ｉ’で１００ｍｕ／ｍｌに希釈した抗人ＩｇＧ−ＰＯＤ標識抗体液（ヤギ抗体）に入れ、室温で３０分間反応させた。反応後、メンブレンを取り出し、緩衝液ＩＩで５回洗浄した。洗浄したメンブレンを発色液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５％４−クロロ１ナフトール、０．０１８％Ｈ２　Ｏ２　、１６．７％メタノール）に浸漬し、室温で１５分間反応させた。
【００７７】
結果を図５に示した。図５においては、非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清５例（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．　５）　と健常人血清５例（Ｎｏ．　６〜Ｎｏ．　１０）についてウエスタンブロットを行った結果を示したが、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清でのみ、全てに強い陽性反応が検出され、発現した抗原が、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の診断に有用であることが示された。
【００７８】
【発明の効果】
本発明により、従来既報の配列と塩基配列、アミノ酸配列においてその相同性を異にするＨＣＶ遺伝子がクローニングされた。本発明によって得られた塩基配列は非Ａ非Ｂ型肝炎患者の核酸診断への利用が期待でき、又塩基配列をもとに作製されたポリペプチドは、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の抗体測定に応用できる他、モノクローナル抗体を作製することにより抗原検出系への応用が期待できる。特に、エンベロープ領域においてはワクチンへの応用も考えられ、ＨＣＶ感染症の診断、予防に大きく貢献するものと考えられる。
【００７９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】この図は、ＰＣＲによるＨＣＶ＃Ｓ１４株および＃４株のクローニング戦略を示す。図中、各領域に付した上側の数字はＨＣ−Ｊ６上のヌクレオチド配列の位置を示し、また下側の数字は使用したＰＣＲプライマーの名称を示す。なお、括弧内の数字はＤＮＡ断片の長さ（ｂｐ）を示す。
【図２】この図は、ＰＣＲによるＨＣＶ＃Ｓ１４株のクローニング戦略を示す。図中、各領域に付した上側の数字はＨＣ−Ｊ６上のヌクレオチド配列の位置を示し、また下側の数字は使用したＰＣＲプライマーの名称を示す。なお、括弧内の数字はＤＮＡ断片の長さ（ｂｐ）を示す。
【図３】この図は、クローニング用ベクターｐＢＭの構築工程を示す。
【図４】この図は、慢性非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清５例（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５）と健常人血清５例（Ｎｏ．６〜Ｎｏ．１０　）について本発明発現抗原（実施例３参照）を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す写真である。
【図５】この図は、慢性非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清５例（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５）と健常人血清５例（Ｎｏ．６〜Ｎｏ．１０）について本発明発現抗原（実施例４参照）を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す写真である。レーンＭは分子量マーカーを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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