(57)【要約】【課題】イワギリソウ属植物の組織培養による効率的な大量増殖法の提供。【解決手段】イワギリソウ属植物の優良個体から採取した組織片を滅菌処理し、ベンジルアミノプリン及びナフタレン酢酸含有培地で培養して不定芽誘導し、得られた多芽体をナフタレン酢酸含有培地で培養して発根させ、次いで得られた再生個体を培養土に移植して順化させることを特徴とするイワギリソウ属植物の大量増殖法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イワギリソウ属植物の優良個体から採取した組織片を滅菌処理し、ベンジルアミノプリン及びナフタレン酢酸含有培地で培養して不定芽誘導し、得られた多芽体をナフタレン酢酸含有培地で培養して発根させ、次いで得られた再生個体を培養土に移植して順化させることを特徴とするイワギリソウ属植物の大量増殖法。
【請求項２】
組織片が若葉片である請求項１記載のイワギリソウ属植物の大量増殖法。
【請求項３】
組織片の滅菌処理が、エタノール水溶液処理、次いで次亜塩素酸ナトリウム水溶液処理するものである請求項１又は２記載のイワギリソウ属植物の大量増殖法。
【請求項４】
次亜塩素酸ナトリウム水溶液が、非イオン性界面活性剤含有次亜塩素酸ナトリウム水溶液である請求項３記載のイワギリソウ属植物の大量増殖法。
【請求項５】
不定芽誘導培地が、ベンジルアミノプリン０．１〜５ｍｇ／Ｌ及びナフタレン酢酸０．０１〜２ｍｇ／Ｌを含有する培地である請求項１〜４のいずれか１項記載のイワギリソウ属植物の大量増殖法。
【請求項６】
発根培地が、ナフタレン酢酸０．０１〜２ｍｇ／Ｌを含有する培地である請求項１〜５のいずれか１項記載のイワギリソウ属植物の大量増殖法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は絶滅が危惧されている山野草イワギリソウ属植物の組織培養による効率的な大量増殖法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イワギリソウ属は本州の近畿地方以西に分布するイワタバコ科の多年草であり、山地の湿った岩場などに自生する。イワギリソウ属の山野草は、開発行為による自生地の環境破壊や愛好家による不法採取などによって個体数が著しく減少しており、絶滅が危ぶまれている。このうち、イワギリソウは日本の絶滅危惧類のレッドリストに載っており、絶滅危惧ＩＢ類（ＥＮ）に分類されている。サツマイワギリソウは薩摩地方に自生するイワギリソウ属の亜種であるが、植林開発や自然災害により１０年前の１０分の１にまで減少している。
自生地からの不法採取を防止するためには、栽培増殖させた植物体を、苗物や鉢物として山野草市場に供給して陳腐化することにより、その希少価値を低下させることが有効な手段である。イワギリソウ属は主に葉ざしや株分けによる栄養増殖法が取られているが、一般に増殖率が低く、上記の目的を満たすような安定した大量市場供給は難しいのが現状である。
【０００３】
上記の目的を実現する技術として、植物体の葉等の組織を用いた組織培養による大量増殖技術がある。
イワギリソウに関しては、種子を滅菌処理後、発芽させて得られた幼葉を出発材料として組織培養を行うことにより、イワギリソウ属の山野草の大量増殖を行なった報告がある（非特許文献１参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
近重克幸及び名古洋治，近畿中国農業研究，１９９９年９月，第９８号，ｐ．３８−４０．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この報告のように種子を出発材料としたのでは、「種子繁殖では遺伝的分離により均一な個体増殖が難しい」という重大な問題を解決できない。すなわち、種子を用いたのでは、果たしてその種子が親株の優良形質を遺伝的に受け継いでいるかは不明であり、種子から発芽して成長した個体が親株の優良形質を遺伝的に受け継ぎ、しかも成熟して優良個体として確立しうるかどうかは、実際に成長させてからでないと判別できない。従って、成熟個体の形質を未確認のままの種子、そしてその発芽間もない幼個体の展開葉を材料とした場合、形質不良の個体を大量増殖してしまう危険性が大きい。これでは、組織培養による大量増殖技術に期待される有利性は全く失われているといっても過言ではない。
従って、成熟して確実に優良な形質を発現しているイワギリソウ属植物の優良個体の組織を出発材料として、組織培養により優良個体と同様の優良クローン株を大量増殖する技術が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、イワギリソウの優良個体の組織を出発材料とし、これを滅菌処理、特にエタノール処理と次亜塩素酸ナトリウム処理を組み合せた滅菌処理した後、特定の植物ホルモン含有培地を用いた不定芽誘導、発根培養及び順化することにより、極めて高効率でイワギリソウ属植物の優良クローン株が大量増殖できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、イワギリソウ属植物の優良個体から採取した組織片を滅菌処理し、ベンジルアミノプリン及びナフタレン酢酸含有培地で培養して不定芽誘導し、得られた多芽体をナフタレン酢酸含有培地で培養して発根させ、次いで得られた再生個体を培養土に移植して順化させることを特徴とするイワギリソウ属植物の大量増殖法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の大量増殖法に用いられるイワギリソウ属植物としては、イワギリソウ、サツマイワギリソウ等が挙げられる。
【０００９】
本発明においては、原料として優良個体から採取した組織片を用いる。その結果、本発明は種子を原料とする場合に比べて、確実に優良形質を有するイワギリソウが大量増殖できる。ここで、組織片としては、葉、特に若葉由来の組織片（若葉片）が好ましい。
【００１０】
本発明においては、組織片の滅菌処理が極めて重要であり、エタノール水溶液処理、次いで次亜塩素酸ナトリウム水溶液処理するのが好ましい。また、次亜塩素酸ナトリウム水溶液には、界面活性剤を添加するのがさらに好ましい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤が好ましい。滅菌処理は、組織片を水洗し、次いで５０〜９０％エタノール水溶液で洗浄し、次いで０．０１〜１重量％濃度の界面活性剤を含有させた有効塩素濃度０．０２〜０．５重量％となるように希釈した次亜塩素酸ナトリウム水溶液で処理し、さらに水洗することにより行うのが好ましい。
滅菌処理した組織片は、さらに３ｍｍ×３ｍｍ〜１０ｍｍ×１０ｍｍ程度に切って用いのが好ましい。
【００１１】
滅菌処理した組織片は、ベンジルアミノプリン及びナフタレン酢酸含有培地で培養して不定芽を誘導させる。培地中のベンジルアミノプリンの濃度は、０．１〜５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．２〜２ｍｇ／Ｌが特に好ましい。また、ナフタレン酢酸の濃度は０．０１〜２ｍｇ／Ｌ、さらに０．０２〜１ｍｇ／Ｌ、特に０．０４〜１ｍｇ／Ｌが好ましい。用いられる培地としては、ＭＳ培地、改変ＭＳ培地、Ｂ５培地、Ｗｈｉｔｅ培地等が挙げられる。培養条件は、２２〜２８℃、１０〜２０時間明条件で２〜５ヶ月行うのが好ましい。
【００１２】
上記条件の培養により、枯死がほとんどなく、一組織片５０以上もの不定芽が誘導される。
【００１３】
得られた多芽体は、ナフタレン酢酸含有培地で培養することにより発根させる。発根培地中のナフタレン酢酸濃度は０．０１〜２ｍｇ／Ｌ、さらに０．０１〜１ｍｇ／Ｌ、特に０．０１〜０．５ｍｇ／Ｌが好ましい。発根培地としては、ＭＳ培地、改変ＭＳ培地、Ｂ５培地、Ｗｈｉｔｅ培地等が挙げられる。培養条件は、２２〜２８℃、１０〜２０時間明条件で、１〜３ヶ月行うのが好ましい。
【００１４】
上記条件の培養により、良好な根がほぼ１００％発生し、イワギリソウ属植物の再生個体が得られる。必要に応じて、上記発根培地で植え継ぐことにより再生個体をさらに生長させると同時に個体数を増やすこともできる。
【００１５】
次に得られた再生個体は、必要に応じて適当な大きさに分割し、培養土に移植して順化させる。用いられる培養土は特に限定されず、例えばバーミキュライト及びパーライトの混合培養土が好ましい。順化条件は、２２〜２８℃で弱光下、始めの２〜３週間は、急な乾燥をさけるのが好ましい。
【００１６】
かくしてイワギリソウ属植物の優良個体由来のポット苗が大量に生産される。
【００１７】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００１８】
実施例
１．組織片の滅菌処理
イワギリソウ及びサツマイワギリソウの鉢植え苗の優良個体を用いた。３月から７月頃の株から、若い葉を選んで葉柄を少し残して切り取り、下記の方法で滅菌処理をした。その際、物理的ダメージを極力与えないように、葉の取扱いには十分注意し、ピンセットでつまむ箇所は葉柄のところのみと決めて取り扱うようにする。
【００１９】
（１）まず水道水で葉のごみ等を洗浄除去するが、この際も葉表面をこすったり、毛を逆なでしたりしないようにする。
（２）葉表面の空気の泡が除去されるように注意しながら、７０％エタノール溶液中で２０秒間ゆっくりと振り洗いする。
（３）次に、界面活性剤としてポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（商品名、Ｔｗｅｅｎ　２０）を約０．０３〜０．０８％となるように加えた有効塩素濃度０．１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液中で、１０分間スターラーでゆっくり撹拌しながら滅菌処理する。この時、葉は１枚づつ処理する。複数枚を一度にビーカー内で撹拌すると、互いに擦れ合って物理的ダメージの一因となる。また、撹拌の際に容器の壁に葉がぶつからないように注意する。
（４）滅菌した葉をオートクレーブ滅菌した蒸留水で、３回洗浄する。この時も、物理的ダメージを極力加えないように上記と同様の注意をする。
（５）滅菌蒸留水で洗浄した葉を滅菌濾紙の上に取り出して、余分な水を吸収させる。
（６）葉の周囲の切り込みのある部分は、滅菌不十分なことが多いので、ここで約３〜５ｍｍ幅位切り取って除去する。
（７）上記のように滅菌処理した葉を、主軸の中心のところでカットして２分する。次に主軸に直行する方向に幅数ｍｍに切り、それを長さ１ｃｍ前後に切り分けて葉小片とした。
【００２０】
２．不定芽の誘導
滅菌処理した葉から得られた葉小片を、寒天培地に置床して培養した。培養は２５℃±２℃、１６時間３０００ｌｕｘ明条件で行った。不定芽誘導培地としては、改変ＭＳ培地（通常のＭＳ培地の組成中、硫酸アンモニウムと硝酸カリウムの濃度を１／２としたもの）にショ糖２％、寒天０．８％を添加したものを基本培地として、これに植物ホルモンとしてベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を０〜１ｍｇ／Ｌ、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を０〜０．２ｍｇ／Ｌ添加し、オートクレーブ滅菌（１２０℃，　１．２ａｔｍ，　２０分間）したものを用いた。約３ヶ月後の不定芽形成率等を表１に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
イワギリソウ、サツマイワギリソウの双方とも、ホルモン無添加条件では１００％の個体が褐変枯死した。またイワギリソウでは、ＢＡＰのみを１ｍｇ／Ｌ添加した条件でも１００％褐変枯死した。不定芽形成率としては、イワギリソウではＢＡＰ１ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌを添加した条件で８０％と特に高かった。サツマイワギリソウではＢＡＰ１ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ０〜２ｍｇ／Ｌを添加した条件でほぼ一定の３３％前後の値だった。置床した葉の小片（１０ｍｍ×５ｍｍ）１片当りの不定芽発生数を平均値として示した。イワギリソウ、サツマイワギリソウの双方ともＢＡＰ１ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ０．０２〜０．２ｍｇ／Ｌを添加した条件で６０〜１５０個の多数の不定芽が発生した。不定芽の状態としては、ＢＡＰ１ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌを添加した条件で葉が大きく生長しており優れていた。
【００２３】
３．発根
各培地上で培養を続けてシュートを十分に生長させてから、多芽体を適当に分割して発根培地に置床し、前述と同様の条件で培養することにより発根させさらに生長させた。発根培地としては、不定芽誘導培地と同様の改変ＭＳ培地を用い、これにＮＡＡ０〜０．２ｍｇ／Ｌを添加したものをオートクレーブ滅菌して用いた。
１．５ヶ月後の発根率と根の状態を表２に示した。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
表２からわかるように、イワギリソウ、サツマイワギリソウの双方ともＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌを添加した条件で最も発根率が高く、ほぼ１００％近くが発根し、また根の状態も良好だった。ＮＡＡ無添加でも発根したが、根の状態が悪かった。ＮＡＡ０．０２ｍｇ／Ｌ添加条件では７０〜８０％が発根し、根の状態も良好であった。
【００２６】
４．順化
発根培地で生長した再生個体を分割して、さらに同一の発根培地で植え継ぐことにより、再生個体をさらに生長させると同時に、個体数を増やした。得られた再生個体を適当な大きさに分割し、バーミキュライト：パーライト＝３：１の混合培養土に移植し、実験室北側の窓際で管理し順化を行った。
順化率としては１．５ヶ月後にイワギリソウが８８％、サツマイワギリソウが９６％と、両者とも高い順化率を示した。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、イワギリソウ属の優良な形質を確実に発現している優良個体の組織切片から、再生植物体を得ることができる。本発明により、遺伝的に不均一である種子を経ることなく、優良個体から直接且つ短期間にイワギリソウ属の優良個体由来のポット苗を大量に生産することができ、山野草イワギリソウ属の安定した市場供給を可能ならしめる。