(57)【要約】【課題】本発明は、核酸の２本鎖らせん構造の解消や巻き戻し活性、あるいは１本鎖核酸特異的結合タンパク質の能力を測定する新規な測定方法を提供する。また、本発明は上記測定方法を応用した簡便で、かつ定量性と再現性に優れた測定キットを提供する。【解決手段】本発明の測定方法は、（１）５’末端、または３’末端に蛍光エネルギー供与体を有する第一の１本鎖核酸プローブと、上記第一のプローブと相補性があり第一のプローブの逆末端にエネルギー受容体を有する第二の１本鎖核酸プローブとを調製し、（２）上記１対の核酸プローブを２本鎖核酸として蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を起こさせ、（３）上記２本鎖核酸の２本鎖構造の解消に伴うＦＲＥＴの解除による蛍光スペクトルの変化を測定することを特徴とするものである。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）末端が蛍光エネルギー供与体、もしくは蛍光エネルギー受容体を有する第一の１本鎖核酸プローブと、（２）第一の核酸プローブと相補性を持つ第二の核酸プローブを作製し、（３）第二の核酸プローブにおいて第一の核酸プローブの逆末端は、第一の核酸プローブ末端が蛍光エネルギー供与体である場合は蛍光エネルギー受容体であり、第一の核酸プローブ末端が蛍光エネルギー受容体である場合は蛍光エネルギー供与体であり、（４）２つの核酸プローブをハイブリダイズさせて２本鎖構造を形成させることにより、（５）両プローブ間の末端で近接する蛍光エネルギー受容体と供与体間で蛍光共鳴エネルギー転移を起させて、（６）核酸の２本鎖構造の解消に伴う蛍光共鳴エネルギー転移の解除による蛍光エネルギー供与体、あるいは受容体の蛍光スペクトルの変化を測定することを特徴とする、核酸の２本鎖構造解消の測定方法
【請求項２】
上記核酸がＤＮＡ、またはＲＮＡである請求項１に記載の測定方法
【請求項３】
上記蛍光エネルギー供与体がフルオレセイン系発光団を含み、かつ蛍光エネルギー受容体がローダミン、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄのうちのいれずかであることを特徴とする、請求項１、２に記載の測定方法
【請求項４】
タンパク質による２本鎖核酸の巻き戻し活性を測定することを目的とする、３〜６００  ｎＭの基質となる２本鎖核酸プローブを含む、請求項１〜３に記載の測定方法を利用した測定キット
【請求項５】
上記タンパク質が、ＤＮＡヘリカーゼ、またはＲＮＡヘリカーゼである請求項４記載の測定キット
【請求項６】
巻き戻し後の１本鎖核酸の再結合を防止するため、蛍光エネルギー供与体によりラベルされた第一または第二の核酸プローブと同一の配列を持つ、ラベル化されていない１本鎖核酸をトラッピング鎖として系中に含有することを特徴とする、請求項４、５記載の測定キット
【請求項７】
上記１本鎖核酸トラッピング鎖が、結合対象の１本鎖核酸プローブに対して２．５倍以上のモル比で含有することを特徴とする、請求項４〜６に記載の測定キット
【請求項８】
巻き戻し後の１本鎖核酸の再結合を防止するためのトラッピング剤として、１本鎖核酸特異的結合性タンパク質を系中に含有することを特徴とする、請求項４、５に記載の測定キット
【請求項９】
上記１本鎖核酸特異的結合性タンパク質が、結合対象の１本鎖核酸プローブに対して１０倍以上のモル比で含有することを特徴とする、請求項４、５、８に記載の測定キット
【請求項１０】
上記蛍光エネルギー供与体によりラベルされた第一または第二の核酸プローブと同一の配列を持ち、ペプチド骨格により核酸と同等の構造を持つ非天然化合物をトラッピング鎖として系中に含有することを特徴とする、請求項４、５に記載の測定キット
【請求項１１】
上記非天然化合物のトラッピング鎖濃度が、系中のラベルされたプローブ鎖に対し２．５倍以上のモル比で含有することを特徴とする、請求項４、５、１０に記載の測定キット
【請求項１２】
請求項１〜３に記載の測定方法を利用した、１本鎖核酸特異的結合性タンパク質による２本鎖核酸の形成阻害を測定することを特徴とする、１本鎖核酸特異的結合性タンパク質の性能を評価する測定方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の高次構造の崩壊、特に加熱や酵素により行われる核酸の２本鎖らせん構造の解消・巻き戻し活性や、１本鎖核酸特異的結合性タンパク質の能力を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸のハイブリダイゼーションによる２本鎖形成や変性による２本鎖の１本鎖への巻き戻し状態を測定する方法においては、電気泳動的手法が一般的である。また、２本鎖核酸の酵素的分解に関しては蛍光偏光消失や蛍光共鳴エネルギー転移を用いた手法が存在し広く用いられている。
【０００３】
蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）とは蛍光発光に関わる現象であって、１つの発蛍光団の蛍光スペクトルが他の発色団の励起スペクトルと重複する場合で、かつ発蛍光団同士が近接する位置にある場合においては、１つの発蛍光団の励起エネルギーが他の発蛍光団の蛍光発光を誘導し、それに伴い元の発蛍光団自身はエネルギーを失ってその蛍光強度が減少するという現象を意味する（例えば、非特許文献１、２参照）。本現象は発蛍光団同士の距離に極めて鋭敏であることが知られており、一般的には両者の距離の１０−６に比例する。これらのことから、蛍光共鳴エネルギー転移現象は、分子生物学や細胞生物学における微視的な研究に広く利用されている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００４】
一方、ＤＮＡヘリカーゼのようなＤＮＡの２本鎖を巻き戻して１本鎖化する酵素の活性測定の場合には、基質と該酵素の反応後遊離された１本鎖ＤＮＡを電気泳動的手法により測定するというエンド  ポイント  アッセイが主流であり、長時間を要する上に操作が煩雑で定量性にも乏しいものである。また、ストップド  フローによる蛍光測定法は速度的解析に適したものではあるが、特殊な測定機器を用いるという点で不利である（例えば、非特許文献３、４参照）。
【０００５】
以上のように、酵素的な２重らせん構造の解消を測定する場合には煩雑で定量値に乏しいか、または測定に複雑な手順を要する手法しか存在しないため、簡便かつ再現性良く定量できる測定方法の開発が望まれている。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｌ．  Ｓｔｒｙｅｒ：Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７，  ８１９−８４６，（１９７８）
【非特許文献２】
Ｔａｙｌｏｒら：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｐａｒｔ  Ｂ、
Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２２０−２４５，（１９８９）
【非特許文献３】
Ｏｃｈｅｍら：Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７２，  ２９９１９−２９９２６，（１９９７）
【非特許文献４】
Ｂｊｏｒｎｓｏｎら：Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ、３３，  １４３０６  −１４３１６，（１９９４）
【特許文献１】
特開平１１−５６３９８号公報
【特許文献２】
特開平１１−１７８６００号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、核酸の高次構造の崩壊、特に加熱や酵素により行われる核酸の２本鎖らせん構造の解消や巻き戻し活性、あるいは１本鎖核酸特異的結合タンパク質の能力を測定する新規な測定方法を提供することを課題としている。また、本発明は上記測定方法を応用した簡便で、かつ定量性と再現性に優れた測定キットを提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、蛍光共鳴エネルギー転移（以下、ＦＲＥＴと言う）を利用した簡便かつ定量性の高い新規な２本鎖核酸の１本鎖化測定法を見い出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明におけるＦＲＥＴ現象とは蛍光発光に係る現象であって、１つのエネルギー供与性の発蛍光団（以下、エネルギー供与体、または単にドナーと言う）の蛍光スペクトルが、他のエネルギー受容性の発蛍光団（以下、エネルギー受容体、または単にアクセプターと言う）の励起スペクトルと重なる場合で、かつドナーとアクセプターとが接近する位置にある場合においては、ドナーの励起がアクセプターの蛍光を誘導し、それに伴いドナー自身の蛍光強度は減少するという現象を意味する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を図面に基づいて具体的に説明する。図１は、本発明の測定方法の概略を示した図である。本発明によるＦＲＥＴ体は、図１に示したように蛍光エネルギーの供与体（Ｄ）を結合した１本鎖ドナープローブと、さらに蛍光エネルギーの受容体（Ａ）を結合した１本鎖アクセプタープローブとをハイブリダイズさせた２本鎖ハイブリダイズ体である。すなわち、２種類の１本鎖核酸プローブで構成され、少なくとも、（１）ＦＲＥＴ現象を利用するためのドナー（Ｄ）及びアクセプター（Ａ）を該プローブの末端部に有し、（２）該プローブと相補する末端同士がＤ−Ａ別々の蛍光色素でラベルされている。また、（３）該２本のプローブのハイブリダイゼーションにより２本鎖が形成された場合、ドナー（Ｄ）からアクセプター（Ａ）へのＦＲＥＴが可能となるような空間配置をとり得るように設計されている。したがって、この２本鎖の段階でドナー（Ｄ）の励起波長の光を照射してもＦＲＥＴ現象によるエネルギー転移により、観察される蛍光スペクトルはアクセプター（Ａ）のものとなる。次いで、２分子間でハイブリダイズ体を形成した２本鎖プローブが、被測定タンパク質（例えばＤＮＡヘリカーゼ）による反応で１本鎖となった場合、Ｄ−Ａ間の距離が離れる為にＦＲＥＴ現象が解除されることにより、ドナー（Ｄ）の蛍光スペクトルが測定できることになる。一方、互いに相補的な１本鎖核酸は溶液中では室温でも自然にアニーリングすることが知られている。しかしながら、系内に充分量のラベルされていない相補鎖核酸等を存在させることで、アクセプタープローブがトラッピングされてＦＲＥＴ現象は継続的に解除される。そのため、上記ヘリカーゼ等による２本鎖核酸の巻き戻し反応の活性を好適に測定することが可能である。
【００１１】
本発明の測定方法において、使用可能なエネルギー供与体（ドナー）およびエネルギー受容体（アクセプター）は、ＦＲＥＴを利用することが可能な組み合わせならば特に制限されない。したがって、種々の発蛍光団を有する色素が使用可能であるが、例えばフルオレセイン系、ローダミン系の色素等が好適に使用可能である。本発明においては、特にドナーとしてフルオレセイン発蛍光団を有する色素、およびアクセプターとしてローダミン発色蛍光団を有する色素を用いることが好ましい。フルオレセインは４９２  ｎｍで励起した場合に５１８  ｎｍに蛍光のピークを示し、ローダミンは５７０  ｎｍで励起した場合に５９０  ｎｍに蛍光ピークを示す。また、Ｃｙ３は５５２  ｎｍで励起した場合に５６５  ｎｍに蛍光ピークを示す。ここで、例えばフルオレセインとローダミンがＦＲＥＴを生じるに十分な距離に近接した場合、ドナーとしてのフルオレセインからのアクセプターとしてのローダミンへの蛍光共鳴エネルギー転移に伴い、フルオレセインからの５１８  ｎｍの蛍光強度は減少し、ローダミンに基づく５９０  ｎｍの蛍光強度が増加することになる。
【００１２】
すなわち、本発明の測定方法において使用可能な２種類の１本鎖核酸プローブは図１に模擬的に示されるように、少なくとも片側の末端にそれぞれドナー（Ｄ）およびアクセプター（Ａ）を結合したものであって、さらに相補性を有する両者のハイブリダイズにより２本鎖を形成させることが可能である。この場合、相補鎖の末端はＦＲＥＴ現象が利用できるように、それぞれの逆鎖末端に（Ａ）及び（Ｄ）を結合したものである。このような核酸プローブは通常のハイブリダイズ条件により２本鎖構造を形成し、その結果プローブ両末端に結合した（Ｄ）及び（Ａ）はその空間配置が接近して、ＦＲＥＴ現象を生じるに充分な位置となる。この場合、（Ｄ）に対して光励起するとその励起エネルギーが共鳴的に（Ａ）に転移して、特徴的な蛍光スペクトルを与えることになる。
【００１３】
また、本発明の測定方法においては２種の１本鎖核酸プローブには鎖長の制限は無く、数ｂｐから数ｋｂｐのものが好適に使用可能である。また、ドナーおよびアクセプターをヌクレオチド鎖の５’末端、または３’末端に導入する方法も特に制限されず、一般の有機合成法または酵素反応で結合させて合成可能である。すなわち、一方の１本鎖核酸プローブの５’末端にフルオレセイン発色蛍光団を、それに相補するもう一方の１本鎖核酸プローブの３’末端にローダミン発色蛍光団またＣｙ３系発色蛍光団を、化学合成法か酵素反応で結合させて合成することが可能である。また、同様にしてその逆の配置も合成可能である。
【００１４】
さらに、本発明の測定方法において２種の１本鎖核酸プローブの塩基配列は、使用の目的に応じて適宜選択可能であり特に制限されない。すなわち、これらは互いに相補的であること以外に塩基配列の制限はなく、したがってナンセンスな配列も好適に使用可能である。
【００１５】
本発明の測定キットにおいては、２種の１本鎖核酸プローブを溶液中で適当な温度条件の下でハイブリダイズさせた２本鎖核酸プローブを使用する。この際、１本鎖核酸プローブの濃度が若干異なる場合では、いずれかの１本鎖核酸プローブが残留する場合がある。残留する１本鎖核酸プローブは、使用前に除去しておくことが望ましい。そのためには、アクリルアミドゲルによる電気泳動的分離手法、ゲルろ過のような物理的分離手法、および陰イオン交換カラムなどによる静電的分離手法を用いることができる。本発明の測定キットにおいては、上記のように調製した２本鎖核酸プローブを３〜６００  ｎＭの濃度で使用する。
【００１６】
熱処理または酵素的処理により解離した１本鎖核酸プローブが測定中に再び結合しないようにすることは、本発明の測定方法の簡便性と信頼性を向上させるのに有効な方法である。この方法として、（１）該１本鎖核酸プローブのいずれかと相補的な蛍光ラベルされていない１本鎖核酸をトラッピング鎖として測定系中に添加する、（２）１本鎖核酸特異的結合性タンパク質をトラッピング剤として測定系中に添加する、（３）ペプチド骨格を有する核酸類似の構造を持つ非天然の化合物（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、以下ＰＮＡと言う）をトラッピング鎖として測定系中に添加する、のいずれかの方法を用いることができる。（１）においては、解離したいずれかの１本鎖核酸プローブと該トラッピング鎖が結合し、プローブ鎖同士の再結合を防止する。（２）における１本鎖核酸特異的結合性タンパク質は生物由来のタンパク質であり、１本鎖核酸に特異的に結合して安定化させ、立体障害的に２本鎖への再結合を阻害する。（３）におけるＰＮＡはペプチド骨格を有しており、リン酸基による負電荷の反発がないため１本鎖核酸とより強くハイブリダイズするため、該プローブ同士の再結合を好適に防止することが可能である。（１）〜（３）のいずれの場合も、トラッピング鎖またはトラッピング剤を、対応する１本鎖核酸プローブ量に対して過剰量添加することが望ましい。本発明の測定キットにおいては、トラッピング鎖の場合はモル比で２．５倍以上、１本鎖核酸特異的結合性タンパク質やＰＮＡ等のトラッピング剤についてはモル比で１０倍以上添加することを特徴としている。
【００１７】
本発明の測定方法においては、２種類の発色蛍光団からの蛍光スペクトルの変化を測定して比較する方法について特に制限はない。例えば、ＦＲＥＴが起こっている時点の２種類の発蛍光団のそれぞれの蛍光強度比と、ＦＲＥＴが生じない条件下での２種類の発蛍光団のそれぞれの蛍光強度比とを比較する方法は好適に使用可能である。この場合、さらに高感度の測定を行うために、励起波長の選択、蛍光の選択的測定のためのフィルター、さらに２種類の蛍光を同時に測定する手段などが好適に使用される。また、本発明の測定方法で使用する蛍光スペクトル測定装置は特に制限はなく、通常の装置が好適に使用可能である。
【００１８】
さらに、本発明の測定方法を応用することにより、新規な１本鎖核酸特異的結合性タンパク質の検索や性能評価を行うことが可能である。この目的のため、本発明の測定方法において、該１本鎖核酸プローブのトラッピング鎖やトラッピング剤無添加の測定系を構築する。まず、加熱または酵素反応により２本鎖核酸プローブを１本鎖とした後、これに試料タンパク質を添加する。次いで、該１本鎖プローブ同士の再結合の状況をドナーまたはアクセプターの蛍光スペクトルの変化、すなわちＦＲＥＴ現象の発現の有無を確認する。この際、試料タンパク質が該１本鎖核酸プローブのいずれとも結合しなければ、プローブの再結合によりＦＲＥＴ現象が発現する。一方、試料タンパク質がいずれかのプローブと結合すればＦＲＥＴは起こらないため、この試料タンパク質は新規な１本鎖核酸特異的結合性タンパク質である可能性が高いことになる。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に従って詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【００２０】（実施例１）
２本鎖ＤＮＡプローブの調製
化学合成法により、配列表の配列１で示される３’末端にフルオレセインが結合した１本鎖のプローブ（１）、および配列２で示される５’末端にテトラメチルローダミンが結合したプローブ（２）をそれぞれ合成した。合成したプローブ（１）と（２）を５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０、３０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）中で９５  ℃で５分間加熱後、室温に３時間放置して２本鎖を形成せしめ、８  ％アクリルアミドゲル電気泳動により２本鎖ＤＮＡに相当するバンドを精製した。これを２本鎖プローブ（Ａ）とした。同様に、配列表の配列１、３で示される１本鎖のプローブ（１）と（３）をそれぞれ合成し、同様のアニーリング操作と精製により２本鎖ＤＮＡを得た。これを２本鎖プローブ（Ｂ）とした。これらの２本鎖プローブをエタノールで沈殿させて乾燥後、それぞれ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０、３０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）に溶解して以下の実施例に用いた。なお、以後の蛍光スペクトルの測定および蛍光強度の測定には、日立製作所製の蛍光分光光度計Ｆ４０１０型を使用した。
【００２１】（実施例２）
２本鎖プローブによるＦＲＥＴの検証
３０  ｎＭの２本鎖プローブ（Ａ）溶液を、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０、３０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）にて調製した。これを波長４９２  ｎｍの光により励起し、その蛍光スペクトルを蛍光光度計を用いて測定した。結果を図２に示した。図２において、１本鎖のプローブ（１）のみ（長破線で示す）では５１８  ｎｍ付近をピークとしたフルオレセインの大きな蛍光スペクトルが認められるのに対し、２本鎖プローブ（Ａ）（短破線で示す）ではＦＲＥＴによりフルオレセインに由来する蛍光がほとんど認められなかった。さらに、３０  ｎＭの２本鎖プローブ（Ａ）溶液を９５  ℃で５分加熱した後、氷上にて急冷して１本鎖化を行った。この溶液に、配列４で示される非ラベル化１本鎖のプローブ（４）を最終的に６０〜３００  ｎＭとなるように加え、室温で１時間放置した。これを波長４９２  ｎｍで励起して蛍光スペクトルを測定した。その結果も図２に同様に示した。図２において、ＦＲＥＴ現象により減少していたフルオレセインの蛍光は、配列４で示される１本鎖のプローブ（４）を添加することにより、濃度依存的に増加した。一方、配列表の配列１と配列４の塩基配列は等しいため、１本鎖化されたプローブ（２）は競合的にプローブ（１）かプローブ（４）にハイブリダイズすることが予想される。図２の結果からも、プローブ（４）の系中の量とＦＲＥＴ現象の解除に基づくフルオレセインの蛍光強度の増加は一致しており、プローブ（２）がプローブ（４）にトラップされていることは明らかである。
プローブ（１）  とプローブ（３）とをハイブリダイズした２本鎖プローブ（Ｂ）についても、全く同様の実験を行い、その結果を図３に示した。２本鎖プローブ（Ｂ）においても２本鎖プローブ（Ａ）の場合と全く同様の結果が得られたことから、エネルギー受容体となる蛍光色素をテトラメチルローダミンからＣｙ３に換えた場合においても、本発明の測定方法が成立することが示された。
【００２２】（実施例３）
１本鎖核酸特異的結合性タンパク質存在下におけるＦＲＥＴ現象の検証
３０  ｎＭの２本鎖プローブ（Ａ）溶液を、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０、３０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）にて調製した。この溶液を９５  ℃で５分間加熱し氷上にて急冷して、大腸菌由来１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ストラテジーン社製、以下ＳＳＢと言う）を最終的に０〜９００  ｎＭとなるように添加して室温で１時間放置し、波長４９２  ｎｍの光で励起し５１８  ｎｍの蛍光強度を測定した。その結果を図４に示した。図４の結果から、解離した１本鎖のプローブ（１）およびプローブ（２）にＳＳＢが結合し、それに伴うＦＲＥＴ現象の解消が認められた。また、ＦＲＥＴの解消の度合いは系中に添加したＳＳＢの濃度に依存していた。すなわち、系中に６００  ｎＭ  以上のＳＳＢが添加されると１本鎖のプローブ鎖が有効にトラップされるため、ＦＲＥＴが解除されることが示された。したがって、本発明の測定キットにおいてＳＳＢの添加は有効であることが示された。
【００２３】（実施例４）
ＰＮＡ存在下におけるＦＲＥＴ現象の検証
３０  ｎＭの２本鎖プローブ（Ａ）溶液と、種々の濃度の配列５で示されるＰＮＡ（グライナー  ジャパン社製）溶液を、２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ  ８．０、２０  ｍＭ  ＮａＣｌを含む）にて調製した。２本鎖プローブ（Ａ）溶液を９５  ℃で５分加熱して氷上にて急冷した後、ＰＮＡ溶液を０〜１００  ｎＭになるように添加して室温にて３時間以上放置した。これを、波長４９２  ｎｍで励起して５１８  ｎｍの蛍光強度を測定した。その結果を図５に示した。図５の結果から、実施例３で示したＳＳＢの場合と全く同様に、ＰＮＡが７５  ｎＭ以上存在するとエネルギー受容体側のプローブ（２）鎖を有効にトラップしてＦＲＥＴが解除されることが示された。したがって、本発明の測定キットにおいてＰＮＡの添加も有効であることが示された。
【００２４】（実施例５）
本発明の測定方法を用いたＤＮＡヘリカーゼの活性測定
配列表の配列６で示される１本鎖のプローブ（６）と配列７で示される１本鎖のプローブ（７）を、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０、３０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）中で９５  ℃で５分間加熱後、室温に３時間放置し２本鎖を形成させた。これを、８  ％アクリルアミドゲル電気泳動に供して２本鎖ＤＮＡに相当するバンドを精製した。これを２本鎖プローブ（Ｃ）とした。２本鎖プローブ（Ｃ）を３０  ｎＭになるように２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ  ８．０、２０  ｍＭ  ＮａＣｌ、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１  ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５０  μｇ／ｍｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ，  １２０  ｎＭの配列５で示されるＰＮＡ  を含む）に溶解し、種々の濃度の大腸菌由来ＤＮＡ  Ｈｅｌｉｃａｓｅ  ＩＩ  ７０／８０  （日本ジーン社製）を添加した。４  ｍＭのＡＴＰ存在下または非存在下において３７  ℃で３０分間反応し、波長４９２  ｎｍの光により励起したときの５１８  ｎｍにおける蛍光強度を測定した。その結果を図６に示した。図６の結果から、ヘリカーゼの添加量が増加するにしたがい、ＦＲＥＴ現象の解除によるフルオレセインの蛍光強度も濃度依存的に強くなっていくことが示された。このことから、ＤＮＡヘリカーゼによりＤＮＡの二本鎖が巻き戻されて１本鎖ＤＮＡが生成されていることが明らかとなった。すなわち、ヘリカーゼに代表される核酸の２本鎖構造を解消させる酵素等の測定に対して、本発明の測定方法が極めて有効であることが示された。
【００２５】
【配列表】
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【００２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定方法の概略を示す図である。図中のＤおよびＡはそれぞれドナー、アクセプターの蛍光色素を表す。これら１対の１本鎖プローブをハイブリダイズさせて２本鎖プローブとし、ＦＲＥＴを生じさせる。この段階でドナーＤの励起波長の光を照射しても、ＦＲＥＴ現象によりＤの蛍光エネルギーはＡに転移されてＤの蛍光はわずかしか測定されない。この２本鎖プローブを熱変性または酵素反応により１本鎖化すると、ＤとＡの距離が離れてＦＲＥＴは解除され、Ｄの励起によりＤの蛍光スペクトルを測定することができる。この際、１本鎖アクセプタープローブと相補的な非ラベル化１本鎖プローブ、１本鎖核酸特異的結合性タンパク質、あるいはＰＮＡ等を添加しておくとアクセプタープローブがトラップされてＦＲＥＴの解除が継続される。
【図２】本発明に係るＦＲＥＴ現象を示す図である。この図では、ドナーとしてフルオレセインでラベルしたプローブ（１）と、アクセプターとしてテトラメチルローダミンでラベルしたプローブ（２）の組み合わせを表示した。ＦＲＥＴ現象により２本鎖プローブ（Ａ）の蛍光はほとんど認められない。また、１本鎖化後にプローブ（２）と相補的な非ラベル化プローブ（４）を添加すると、再結合によるＦＲＥＴが濃度依存的に解除される。
【図３】図２と全く同様の実験を、ドナーとしてフルオレセインでラベルしたプローブ（１）と、アクセプターとしてＣｙ３でラベルしたプローブ（３）の組み合わせで行い、その結果を表示した。この組み合わせにおいても、プローブ（４）の添加によりＦＲＥＴが濃度依存的に解除される。
【図４】熱変性により１本鎖化した２本鎖プローブ溶液に、種々の濃度のＳＳＢを添加した場合の波長４９２  ｎｍ  における蛍光強度を示す図である。ＳＳＢの添加により再結合が阻害されて、濃度依存的にＦＲＥＴが解除されていることを示す。
【図５】図４と全く同様の実験を、ＳＳＢの代わりにＰＮＡを用いて行い、その結果を表示した。ＰＮＡもＳＳＢと全く同様の効果を示すことが分かる。
【図６】２本鎖プローブ（Ｃ）をヘリカーゼで処理した場合の、波長４９２  ｎｍ  における蛍光強度の変化を示す図である。ヘリカーゼ濃度の増加に伴い、巻き戻しによる１本鎖プローブ量が増加してＦＲＥＴが解除され、フルオレセインの蛍光強度が濃度依存的、かつ直線的に上昇することが分かる。すなわち、本発明の測定方法はヘリカーゼの活性測定法として好適であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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