(57)【要約】【課題】  残存シラノール基を極めて少なくし、塩基性化合物のテーリングを著しく抑制した高性能液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。【解決手段】  化学修飾剤で表面修飾されたシリカゲルに下記一般式［II］で表されるエンドキャッピング剤を液相または気相で反応させてシリカゲル表面の残存シラノール基にエンドキャッピング剤を化学結合させる。式中、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なり、炭素数１〜４のアルキル基、ｎは環を形成するユニットの係数で２〜１０の整数をそれぞれ意味する。    【化１】2004271522.tif 000010【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学修飾剤で表面修飾されたシリカゲルに下記一般式［II］で表されるエンドキャッピング剤を液相または気相で反応させてシリカゲル表面の残存シラノール基にエンドキャッピング剤を化学結合させることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法。
【化１】
2004271522.tif 000008
式中、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なり、炭素数１〜４のアルキル基、ｎは環を形成するユニットの係数で２〜１０の整数をそれぞれ意味する。
【請求項２】
化学修飾剤が下記一般式［Ｉ］で表されるアルキルシランである請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法。
【化２】
2004271522.tif 000009
式中、Ｘ１は水素原子、ハロゲン原子もしくは炭素数１〜４のアルコキシル基、Ｒ０、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なり、アルキル基またはアリール基をそれぞれ意味する。ａはＲ０の係数で０〜３の整数、ｂはＲ１の係数で０〜３の整数、ｃはＲ２の係数で０〜 ３の整数、ｄはＸ１の係数で１〜３の整数をそれぞれ意味し、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＝４である。
【請求項３】
一般式［Ｉ］のＲ０、Ｒ１ およびＲ２としてのアルキル基が末端にアリール基、アミノ基もしくはシアノ基を有するか、または、非末端にアミド基、カーバメート基またはカーバマイド基、エステル基またはカーボネート基を有する請求項２に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法により製造された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項５】
２９Ｓｉ固体ＮＭＲにより求められるシラノール残量が５％以下である請求項４に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
請求項４または５に記載される液体クロマトグラフィー用充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラム。
【請求項７】
請求項６に記載される液体クロマトグラフィー用カラムを用いた化合物の分析方法または分取方法。
【請求項８】
液体クロマトグラフィーが逆相液体クロマトグラフィーである請求項７記載の化合物の分析方法または分取方法。
【請求項９】
化合物が塩基性化合物である請求項７または８記載の化合物の分析方法または分取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤の新規製造法に関するものである。
【０００２】
液体クロマトグラフィーは医薬品や食品、天然化合物などの分野で重要な分析分離手段として幅広く使用されている。汎用の液体クロマトグラフィー用充填剤は表面をアルキル基などで修飾した多孔性シリカゲルである。表面修飾シリカゲルとしては、表面のＯＨ基にケイ素原子を介してオクタデシル基を導入したもの（ＯＤＳ）が最も一般的であるが、導入基がオクチル基、ブチル基、メチル基などであるものも知られている。また、アルキル基は末端にフェニル基やアミノ基、シアノ基などの官能基を有する場合もある。
【０００３】
しかし、シリカゲルをアルキル化で表面修飾してもシリカ表面にシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）が残存する。残存シラノール基は、塩基性化合物を分析あるいは分取の対象とした場合、同化合物との強い相互作用によりこれを溶出しなかったり、ピークがテーリングするなどの問題がある。それを防ぐため、表面修飾の後、残存シラノール基を二次シリル化によりエンドキャップし、シリカ表面をより不活性にする必要がある。
【背景技術】
【０００４】
従来のエンドキャップ法として、特許文献１には、化学修飾剤で表面修飾されたシリカゲルまたは多孔質ガラスに、エンドキャッピング剤として特定のシクロシロキサン、ハイドロジエンシロキサン、アルコキシシランまたはシロキサンを気相反応させてシリカゲル表面の残存シラノール基にエンドキャッピング剤を化学結合させる方法が記載され、特許文献２には、シリカゲルに特定のポリジメチルシロキサン、ポリフェニルメチルシロキサン、ポリジフェニルジメチルシロキサン、ポリシアノプロピルメチルジメチルシロキサン、ポリシアノプロピルメチルフェニルメチルシロキサンなどを反応させる方法が記載され、特許文献３には、化学修飾剤で表面修飾されたシリカゲルに特定のシラザン、ジシラザン、シロキサン、ポリシロキサンなどの末端付加剤の少なくとも２種を１８０〜２４０℃で気相反応させる方法が記載されている。
【０００５】
しかし、これらの方法では、反応に高温が必要である上、シリカ表面の残存シラノール基を十分に少なくすることができない。そのためこれらの方法で得られた充填剤では塩基性化合物のテーリングが防ぎきれない。
【特許文献１】特開平４−２１２０５８号公報。
【特許文献２】特開平８−３０４３７１号公報。
【特許文献３】特開平１０−７３５７９号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記のような実状から、残存シラノール基を極めて少なくし、塩基性化合物のテーリングを著しく抑制した高性能液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々の検討を行った結果、特定化合物を用い特定条件下でエンドキャッピング反応を行う液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を見出した。
【０００８】
すなわち、本発明による液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法は、化学修飾剤で表面修飾されたシリカゲルに下記一般式［II］で表されるエンドキャッピング剤を液相または気相で反応させてシリカゲル表面の残存シラノール基にエンドキャッピング剤を化学結合させることを特徴とする方法である。
【化１】
2004271522.tif 000002
【０００９】
式中、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なり、炭素数１〜４のアルキル基、ｎは環を形成するユニットの係数で２〜１０の整数をそれぞれ意味する。
【００１０】
上記化学修飾剤は下記一般式［Ｉ］で表されるアルキルシランであることが好ましい。ただし化学修飾剤はこれに限定されない。
【化２】
2004271522.tif 000003
【００１１】
式中、Ｘ１は水素原子、ハロゲン原子もしくは炭素数１〜４のアルコキシル基、Ｒ０、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なり、アルキル基またはアリール基をそれぞれ意味する。ａはＲ０の係数で０〜３の整数、ｂはＲ１の係数で０〜３の整数、ｃはＲ２の係数で０〜 ３の整数、ｄはＸ１の係数で１〜３の整数をそれぞれ意味し、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＝４である。
【００１２】
本明細書および特許請求の範囲において、アルキル基は、直鎖状、分枝状または脂環式のものであってよい。
【００１３】
一般式［Ｉ］中のＲ０、Ｒ１およびＲ２としてのアルキル基は、好ましくは１〜５０、より好ましくは１〜３０の炭素原子を有する。このアルキル基は、末端にアリール基、アミノ基もしくはシアノ基を有するか、または、非末端にアミド基（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）、カーバメート基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）またはカーバマイド基（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）またはカーボネート基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）を有していてもよい。
【００１４】
一般式［Ｉ］中のＲ０、Ｒ１およびＲ２としてのアリール基は、フェニル基、トリル基、ナフチル基などであってよい。
【００１５】
上記方法により製造された液体クロマトグラフィー用充填剤は、２９Ｓｉ固体ＮＭＲにより求められるシラノール基残量が極めて少ない（好ましくは５％以下）ものである。該液体クロマトグラフィー用充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラムは、特に逆相液体クロマトグラフィーに適しており、化合物、とりわけ塩基性化合物の分析および分取において有用である。
【００１６】
原料シリカゲルは、粒子径が通常１〜１０００μｍ、好ましくは２〜２００μｍであり、細孔径が通常１０〜１００００オングストローム、好ましくは５０〜３０００オングストロームであり、表面積が通常１〜１０００ｍ２／ｇ、好ましくは５〜６００ｍ２／ｇ である多孔性シリカゲルである。分析カラム用の充填剤の原料シリカゲルとしては高純度の球形物が好ましい。
【００１７】
一般式［Ｉ］で表される化学修飾剤は、一官能性、二官能性もしくは三官能性の、水素原子、ハロゲン原子またはアルコキシル基を有するアルキルシランまたはアリールシランである。化学修飾剤の具体的な例を表１に例示する。
【表１】
2004271522.tif 000004
【００１８】
化学修飾剤として一般式［Ｉ］で表されるものを用いる場合、シリカゲルの表面修飾反応は、通常６０〜２００℃、好ましくは１００〜１６０℃で、好ましくは液相中で行う。溶媒としては、シリカゲルおよび化学修飾剤とは反応せずかつ上記反応温度下で安定であるものであればよく、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレンなどの芳香族炭化水素、ジクロロベンゼンなどの置換芳香族化合物が好ましい。反応圧は通常常圧であるが、反応を１．５〜５．０ｋｇ／ｃｍ２の加圧条件下で行ってもよい。反応時間は通常０．５〜２０時間、好ましくは３〜１０時間である。ピリジン、イミダゾールのような塩基性化合物を添加することが好ましい。
【００１９】
表面修飾反応後の反応液をそのままつぎのエンドキャッピング反応に用いてもよいが、表面修飾反応液から固形分を取り出してこれを洗浄乾燥してからエンドキャッピング反応に用いてもよい。
【００２０】
一般式［II］で表されるエンドキャッピング剤は二官能性環状シラザンであり、好ましくは１，１，３，３，５，５−ヘキサメチルシクロトリシラザン、１，１，３，３，５，５，７，７−オクタメチルシクロテトラシラザン、１，１，３，３，５，５，７，７，９，９−デカメチルシクロペンタシラザン、１，１，３，３，５，５，７，７，９，９，１１，１１−ドデカメチルシクロヘキサシラザン、１，１，３，３，５，５−ヘキサエチルシクロトリシラザン、１，１，３，３，５，５，７，７−オクタエチルシクロテトラシラザン、１，１，３，３，５，５，７，７，９，９−デカエチルシクロペンタシラザン、１，１，３，３，５，５，７，７，９，９，１１，１１−ドデカエチルシクロヘキサシラザンなどが例示される。これらは単独で用いても２種以上の混合物で用いてもよい。エンドキャッピング剤［II］を一般式［III］で表される二官能性シラン（例えば、ジメチルジクロロシラン、ジメチルジメトキシシランなど）と混合して用いてもよい。
【化３】
2004271522.tif 000005
【００２１】
式中、Ｘ２およびＸ３は、同一または異なり、水素原子、ハロゲン原子または炭素数１〜４のアルコキシル基、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なり、炭素数１〜４のアルキル基またはアリール基をそれぞれ意味する。
【００２２】
エンドキャッピング剤としての二官能性環状シラザンは、トリメチルクロロシランやヘキサメチルジシラザンなどの一官能性のものに比べると、反応できるサイトが多く、より活性であり、またメチルトリクロロシランなどの三官能性のものに比べると、副反応が少ないといった利点がある。二官能性環状シラザンは、類似構造の環状シロキサンに比べると約５０℃ほど高い沸点を有し、液相反応に適している。また、シロキサンの反応では水が副生するのに対し、シラザンを用いた液相反応では、アンモニアが気相に脱して反応の進行に有利である上、未反応シラザンの回収再利用が可能である。
【００２３】
エンドキャッピング剤の使用量は、エンドキャッピング剤／表面修飾シリカゲルの重量比で通常０．１〜２０で、好ましくは０．２〜２である。
【００２４】
エンドキャッピング剤はそれ自体をそのまま反応に使用してもよいが、有機溶媒で希釈して使用することもでき、この場合コストが削減できる。希釈に用いる有機溶媒は、エンドキャッピング剤と反応せずかつ反応温度下で安定であるものであればよく、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレンなどの芳香族炭化水素、ジクロロベンゼンなどの置換芳香族化合物が好適である。希釈倍率は、溶媒／エンドキャッピング剤の重量比で通常０．１〜２００で、好ましくは１〜２０である。
【００２５】
エンドキャッピング反応は気相で行ってもよいが、液相で行うと反応設備が簡易なものでよい上にバッチ当たりの処理量を増やすことができる。
【００２６】
エンドキャッピング反応の反応温度は好ましくは１００〜２００℃、より好ましくは１４０〜１８０℃である。反応温度が高いほどエンドキャッピング反応を促進する効果があるが、設備にかかる負担が大きい。
【００２７】
エンドキャッピング反応は常圧でも行えるが、１．５〜５．０ｋｇ／ｃｍ２の加圧条件下で行うことが好ましい。また、反応温度に近い沸点を有する有機溶媒を選択することで、反応時の圧力を低く抑えることができ、反応設備の耐圧性に対する要求が緩和される。
【００２８】
エンドキャッピング反応の反応時間は通常０．５〜２０時間、好ましくは３〜１０時間である。
【００２９】
エンドキャッピング反応後、固液分離により未反応のエンドキャッピング剤を回収し、再利用することができる。分離した固形分をメタノールで洗浄し、乾燥して液体クロマトグラフィー用充填剤を得る。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、２００℃以下という比較的温和な温度で、したがって比較的簡易な反応設備でかつ低コストで、高性能液体クロマトグラフィー用充填剤を製造することができる。
【００３１】
本発明による液体クロマトグラフィー用充填剤は、シラノール基残量が極めて少なく(２９Ｓｉ固体ＮＭＲにより求められるシラノール基残量が好ましくは５％以下)、塩基性化合物のテーリングを著しく抑制し、ピークの対称性を大幅に改善した高性能なものであり、特に逆相液体クロマトグラフィーに適し、かつ塩基性化合物の分析および分取に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の実施例を幾つか挙げ、本発明を具体的に説明する。ただし、これら実施例は本発明を限定するものではない。比較として従来のエンドキャッピング剤を用いた例を挙げる。また、市販の代表的なＯＤＳカラムについても比較試験を行った。
【００３３】
実施例１
シリカゲルとしてダイソーゲルＳＰ−１００−５Ｐ（球形高純度シリカゲル、平均粒子径５μｍ、細孔径１００オングストローム、表面積４５０ｍ２／ｇ）１５ｇを２００ｍｌトルエン中で共沸脱水したのち、化学修飾剤としてオクタデシルジメチルクロロシラン４．７ｇとピリジン１．３ｇを加え、この混合物を加熱して５時間還流させ、反応混合物の冷却およびろ過の後、得られた固形分をメタノールで数回洗浄し、乾燥して、表面修飾シリカゲル１９ｇを得た。
【００３４】
得られた表面修飾シリカゲル１９ｇとエンドキャッピング剤として１，１，３，３，５，５−ヘキサメチルシクロトリシラザン２０ｇとキシレン２００ｇをオートクレーブに仕込み、液相中で温度１６０℃、圧力１．５〜３．０ｋｇ／ｃｍ２で５時間エンドキャップ反応 を行い、反応混合物の冷却およびろ過の後、得られた固形分をメタノールで数回洗浄し、乾燥して、液体クロマトグラフィー用充填剤２０ｇを得た。
【００３５】
実施例２
化学修飾剤としてオクタデシルメチルジクロロシラン５．０ｇを用いピリジンの添加量を２．６ｇに変えた以外、実施例１と同じ操作を行い、液体クロマトグラフィー用充填剤２０ｇを得た。
【００３６】
実施例３
化学修飾剤としてオクタデシルトリクロロシラン５．３ｇを用いピリジンの添加量を３．９ｇに変えた以外、実施例１と同じ操作を行い、液体クロマトグラフィー用充填剤２０ｇを得た。
【００３７】
比較例１
実施例１と同じ化学修飾剤を用いて同じ操作で得られた表面修飾シリカゲル１９ｇを、エンドキャッピング剤としてトリメチルクロロシラン２０ｇとトルエン２００ｇ中に仕込み、液相中で温度１１０℃、常圧で５時間エンドキャップ反応を行い、得られた反応混合物を実施例１と同様に処理して液体クロマトグラフィー用充填剤２０ｇを得た。
【００３８】
比較例２
実施例１と同じ化学修飾剤を用いて同じ操作で得られた表面修飾シリカゲル１９ｇとヘキサメチルジシラザン２０ｇとトルエン２００ｇをオートクレーブに仕込み、液相中で温度１４０℃、圧力１．５〜３．０ｋｇ／ｃｍ２で５時間エンドキャップ反応を行い、得られた反応混合物を実施例１と同様に処理して液体クロマトグラフィー用充填剤２０ｇを得た。
【００３９】
比較例３
Ｇ社製ＯＤＳカラムＩ（内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用意した。
【００４０】
比較例４
Ｙ社製ＯＤＳカラムＰ（内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用意した。
【００４１】
比較例５
Ｎ社製ＯＤＳカラムＭ（内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用意した。
【００４２】
比較例６
Ｓ社製ＯＤＳカラムＣ（内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用意した。
【００４３】
評価試験
１）シラノール基残量の定量
実施例および比較例で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤すなわちエンドキャップされたシリカゲルについて、高分解能５００ＭＨｚ２９Ｓｉ固体ＮＭＲ（日本電子社製「Ｊｅｏｌ  ＥＣＰ−５００」）を用いて、シングルパルスマジックアングルスピニング法で、下記条件で、Ｓｉ種のＮＭＲ測定を行い、得られたＮＭＲスペクトルから下記式によりシラノール基残量を算出した。
【００４４】
シラノール基残量＝［Ｑ３／（Ｑ３＋Ｑ４ ］×１００％
Ｑ３：−１００ｐｐｍ付近にシラノール基を持つＳｉ種に属するピークの積分値
Ｑ４ ：−１１０ｐｐｍ付近にシラノール基を持たないＳｉ種に属するピークの積分値
シラノール基残量はもちろん低い方がよく、５％以下であることが好ましい。２９Ｓｉ−ＮＭＲ測定条件
回転数：５０００Ｈｚ
磁場強度：１１．７Ｔ
共鳴周波数：９９．３６ＭＨｚ
パルス長：２．８μｓ
測定周期：２５ｓ
スキャン回数：２５００
実施例１〜３および比較例１〜２で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤の２９Ｓｉ−ＮＭＲチャートを図１、図３、図５、図７および図９にそれぞれ示す。これらから分かるように、実施例１〜３の液体クロマトグラフィー用充填剤では、残存シラノール基（−１００ｐｐｍ付近のピーク（Ｑ３））は検出されなかった。
【００４５】
実施例１〜３および比較例１〜２の液体クロマトグラフィー用充填剤について求めたシラノール基残量を表２に示す。表２から分かるように、実施例１〜３の液体クロマトグラフィー用充填剤ではシラノール基残量は０％であり、好ましい結果であった。比較例１〜２の液体クロマトグラフィー用充填剤ではシラノール基残量が多く、好ましくない結果であった。
【００４６】
２）液体クロマトグラフィー評価
実施例および比較例で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤をステンレススチールカラム（内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に充填し、アミトリプチリンを標準サンプルに用いて、液体クロマトグラフィー評価試験を行った。アミトリプチリンは抗うつ作用を有する強塩基性の化合物であり（ｐＫａ＝９．４）、液体クロマトグラフィにおいてテーリングが激しく分析が難しい代表的な化合物である。液体クロマトグラフィー評価試験は、移動相を構成する緩衝液として残存シラノール基の影響を最も受けやすいもの（ｐＨ７．０、温度２０℃）を用い、下記操作条件で行った。実施例１〜３および比較例１〜６の液体クロマトグラフィー用充填剤のアミトリプチリンの液体クロマトグラフィーチャートを図２、図４、図６、図８、図１０、図１１、図１２、図１３および図１４にそれぞれ示す。
【００４７】
実施例１〜３および比較例１〜６の液体クロマトグラフィー用充填剤について、非対称係数（Ａｓ）を下記式のように１０％ピーク高さ基準で計算した。得られた値を表２および表３に示す。非対称係数は好ましくは３．０以下、理想的には１．０であり、値が低いほどピークの対称性がよく、テーリングが少ないことを意味する。これらの表から分かるように、実施例１〜３の液体クロマトグラフィー用充填剤では、非対称係数は３．０以下であり、好ましい結果であった。比較例１〜６の液体クロマトグラフィー用充填剤では、非対称係数は３．０を大きく上回り、好ましくない結果であった。
【００４８】
Ａｓ＝ｂ／ａ
ａ：１０％ピーク高さにおけるピーク前半のピーク幅である。
【００４９】
ｂ：１０％ピーク高さにおけるピーク後半のピーク幅である。
【００５０】
液体クロマトグラフィーの操作条件
移動相：２０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ＝７．０）
／メタノール
＝３５／６５ (体積比)
流速：１．４ｍｌ／分
カラム温度：２０℃
検出器：ＵＶ２４０ｎｍ
サンプル：アミトリプチリン（０．７５ｍｇ／ｍｌ、１０μｌ）
【表２】
2004271522.tif 000006
【表３】
2004271522.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例１で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤の２９Ｓｉ−ＮＭＲチャートである。
【図２】実施例１で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤を用いたアミトリプチリンの液体クロマトグラフィーチャートである。
【図３】実施例２で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤の２９Ｓｉ−ＮＭＲチャートである。
【図４】実施例２で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤を用いたアミトリプチリンの液体クロマトグラフィーチャートである。
【図５】実施例３で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤の２９Ｓｉ−ＮＭＲチャートである。
【図６】実施例３で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤を用いたアミトリプチリンの液体クロマトグラフィーチャートである。
【図７】比較例１で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤の２９Ｓｉ−ＮＭＲチャートである。
【図８】比較例１で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤を用いたアミトリプチリンの液体クロマトグラフィーチャートである。
【図９】比較例２で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤の２９Ｓｉ−ＮＭＲチャートである。
【図１０】比較例２で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤を用いたアミトリプチリンの液体クロマトグラフィーチャートである。
【図１１】比較例３のＧ社製ＯＤＳカラムＩを用いたアミトリプチリンの液体クロマトグラフィーチャートである。
【図１２】比較例４のＹ社製ＯＤＳカラムＰを用いたアミトリプチリンの液体クロマトグラフィーチャートである。
【図１３】比較例５のＮ社製ＯＤＳカラムＭを用いたアミトリプチリンの液体クロマトグラフィーチャートである。
【図１４】比較例６のＳ社製ＯＤＳカラムＣを用いたアミトリプチリンの液体クロマトグラフィーチャートである。
【図１】
2004271522.tif 000011
【図２】
2004271522.tif 000012
【図３】
2004271522.tif 000013
【図４】
2004271522.tif 000014
【図５】
2004271522.tif 000015
【図６】
2004271522.tif 000016
【図７】
2004271522.tif 000017
【図８】
2004271522.tif 000018
【図９】
2004271522.tif 000019
【図１０】
2004271522.tif 000020
【図１１】
2004271522.tif 000021
【図１２】
2004271522.tif 000022
【図１３】
2004271522.tif 000023
【図１４】
2004271522.tif 000024