(57)【要約】【課題】本発明は細胞の収縮を調節する能力に基づいた治療方法について示している。このことはアルファ平滑筋作用を阻害もしくは誘発するいずれかの薬剤の投与により実施される。【解決手段】本発明はSMAが線維芽細胞以外の他の多様な細胞の収縮を招くという発見に基づいており、またその活性は以前には知られていなかった。SMA活性を阻害する薬剤はこれらの細胞が収縮するのを妨げるが、SMA活性を誘発する薬剤は収縮を促進する。SMA阻害剤の例には血小板由来成長因子(PDGF)、スタウロスポリン及びインターフェロンが含まれる。SMA誘発剤の例は変換成長因子β(TGF-β)である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において損傷を受けた筋骨格組織を修復するための基質／細胞結合体を作製する方法であって、
前記基質／細胞結合体は、損傷を受けた筋骨格組織の部位に移植するものであり、
患者から採取した筋骨格細胞または骨髄間質幹細胞を基質上で増殖させる段階から成り、
前記段階は、前記細胞をイン・ビトロ（in vitro）でアルファ平滑筋アクチン（SMA）の発現もしくは生物学的作用を阻害または促進するために十分な濃度の薬剤に接触させる、
ことを特徴とする上記方法。
【請求項２】
患者において損傷を受けた上皮組織を修復するための基質／細胞結合体を作製する方法であって、
前記基質／細胞結合体は、損傷を受けた上皮組織の部位に移植するものであり、
患者から採取した上皮細胞または骨髄間質幹細胞を基質上で増殖させる段階から成り、
前記段階は、前記細胞をイン・ビトロ（in vitro）でアルファ平滑筋アクチン（SMA）の発現もしくは生物学的作用を阻害または促進するために十分な濃度の薬剤に接触させる、
ことを特徴とする上記方法。
【請求項３】
前記薬剤が血小板由来成長因子(PDGF)またはインターフェロンである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記の損傷を受けた筋骨格組織が損傷を受けた靭帯である請求項１記載の方法。
【請求項５】
患者の筋骨格の創傷治癒を促進するキットであって、
(a)創傷部位の癒着を促進させるために十分な用量および期間で創傷部位に投与するためのSMA誘発剤、および
(b)瘢痕形成を抑制するために十分な用量および期間で創傷部位に投与するためのSMA阻害剤、
から成る上記キット。
【請求項６】
前記SMA誘発剤がTGF-βである請求項５記載のキット。
【請求項７】
前記SMA阻害剤が、PDGFおよびインターフェロンから成る群から選択される請求項５または６に記載のキット。
【請求項８】
内皮細胞収縮を引き起こすために十分な用量のSMA誘導剤を活性成分として含む、患者の血管系への薬剤の吸収を促進するための医薬組成物。
【請求項９】
鼻内に投与するための請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記SMA誘導剤がTGF-βである請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
腫瘍細胞転移を阻害するのに十分な用量のSMA阻害剤を有効成分として含む、患者における腫瘍細胞転移を阻害するための医薬組成物。
【請求項１２】
前記SMA阻害剤が、PDGFおよびインターフェロンから成る群から選択される請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
骨粗鬆症に関連した一種以上の症状を軽減するために十分な用量のSMA阻害剤を有効成分として含む、骨粗鬆症の患者を治療するための医薬組成物。
【請求項１４】
前記SMA阻害剤がPDGFである請求項１３記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞収縮を制御する方法およびこの制御を利用した医学的治療について示している。その方法は靭帯損傷の治療、骨粗鬆症、創傷治癒、組織工学、薬剤送達、および腫瘍細胞転移の予防に関して重要である。
【背景技術】
【０００２】
細胞収縮は治療的効果のある多種の生物学的活性における役割をはたす。損傷を受けた靭帯を置換するという組織工学的治験計画書の一部としてin vitroにおいて基質上で増殖させた線維芽細胞の収縮が、基質の大きさ、形、および多孔性を変化させ、またそれによって移植の実施を危険にする可能性がある。in vivo において、不適当な収縮のために過剰な拘縮の結果として断裂した靭帯の末端の相互のもしくは骨に対する再付着を困難にし、あるいは下肢の動きを制限する可能性がある。この一連の事柄はまた他の筋骨格組織細胞および内皮細胞と肝臓のような上皮細胞に対して適用される。
【０００３】
細胞収縮はまた創傷治癒に重要な役割を果たす。収縮は初期に治癒を促進する可能性があるが、有意な瘢痕形成および生理学的機能の欠損を招く可能性がある(U.S. 5,741,777参照)。収縮の有害作用は特に外科手術適応の患者および火傷の患者に重篤である。さらに、瘢痕形成は脊髄への損傷もしくは他の重篤な外傷を受けた患者に対して二次的な損傷を引き起こす可能性がある。
【０００４】
ある程度細胞収縮に依存すると考えられている他の生物学的活性は骨粗鬆症(骨芽細胞の収縮がその退縮を引き起こし、骨吸収を促進する)および腫瘍細胞転移に関与する。後者の症例では、代表的な例として癌細胞は血流内に進入し遠隔部位に運ばれて転移増殖する前に内皮細胞バリアーを通過しなければならない。したがって内皮細胞が収縮する(またそれによって退縮する)のを妨げる薬剤は転移をさらに困難にするにちがいない。
【０００５】
靭帯修復、組織工学、創傷治癒、骨粗鬆症および転移におけるその重要性に加えて、細胞収縮を制御する能力は医薬品送達の方法を改善する可能性がある。たとえば、内皮細胞収縮を促進する薬剤は毛細血管壁を通して薬剤が通過するのを助ける、鼻内もしくは筋肉内輸送に関与する可能性がある。そのような薬剤はまた血流内にすでに存在する物質が組織内へ流出するのを助ける可能性がある。
【０００６】
アルファ平滑筋アクチン(SMA)は血管平滑筋細胞の収縮を引き起こす可能性のあるアクチンの特定のイソ型である（Sagaら, Exp.Cell Res. 249: 279-292(1999)）。それは創傷治癒の間筋線維芽細胞内及び線維形成のおこっている組織内に発現することが知られている（Zhangら, Am. J.Pathol.148: 527-537(1996); Jesterら,Opthal. Vis. Sci. 36: 809-819(1995); Darby,ら, Lab.Invest.63: 21-28(1990)）。ヒトの遺伝子型の完全なヌクレオタイド及びアミノ酸配列が報告されている(Herrman,Curr.Opin.Cell Biol.5:48-55(1993))。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はSMAが線維芽細胞以外の他の多様な細胞の収縮を招くという発見に基づいており、またその活性は以前には知られていなかった。SMA活性を阻害する薬剤はこれらの細胞が収縮するのを妨げるが、SMA活性を誘発する薬剤は収縮を促進する。SMA阻害剤の例には血小板由来成長因子(PDGF)、スタウロスポリン及びインターフェロンが含まれる。SMA誘発剤の例は変換成長因子β(TGF-β)である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第一の特徴として、筋骨格組織（骨、関節軟骨、半月軟骨、腱、椎間板及び特に損傷を受けた靭帯を含む）、及び上皮組織を修復する方法を示している。これを実施する手順は患者の体内から細胞を採取すること、それらを基質上で増殖させること、及び損傷を受けた部位、例えば断裂した靭帯の部位、に基質／細胞結合体を移植することである。この方法は「組織工学」と呼ばれている。用いられる細胞は前記の筋骨格もしくは上皮細胞のいずれかである可能性がある。選択的に、骨髄間質幹細胞が用いられる可能性があり、またそれは比較的簡単に手に入るという利点がある。基質はいくつかの異なる型の生物学的に適合した物質から作られる可能性があるが、ポリラクチック酸及びポリグリコリック酸のような、タイプＩコラーゲン及び合成ポリマーが代表的なものとして用いられるであろう。本発明はin vitroにおいて基質上で増殖した細胞がアルファ平滑筋アクチン(SMA)の発現もしくは生物学的作用を阻害あるいは促進するために十分な濃度の薬剤で処理されるこの手順の改良法を示している。特に収縮を阻害するために用いられる可能性のある薬剤はPDGF及びインターフェロンである。SMA活性はアンチセンスオリゴヌクレオタイド、特にヒトSMA遺伝子のプロモーター領域に対して補足的であるオリゴヌクレオタイド、を用いてその発現を妨げることによって低下する可能性がある。特に収縮を促進させるために用いられる可能性のある薬剤はTGF-βである。
【０００９】
本発明はまた損傷の部位に継続的にSMA阻害剤を投与しその後SMA誘発剤を投与することによって患者の損傷を受けた筋骨格組織（特に損傷を受けた靭帯）もしくは上皮組織を治療する方法を示している。その阻害剤は組織の付着を促進するために十分な用量及び期間投与されることが望ましい。付着が起こるために必要な時間は患者によって異なってくるが、代表的な例としては1週間から10週間であろう。付着が起こる程度は臨床検査及び専門家には周知の画像診断法によって測定される可能性がある。付着の後、組織の収縮を起こし、またそれによって更に正常なコンフォメーションをとるように誘発剤が投与されることが望まれる。この手順を用いた治療用治験計画書の一つの例は靭帯損傷部位、例えば膝に、100 ng/mlから500μg/mlの濃度のTGFベータを注射することであろう。例えば4週間後に、治癒が完了するまで同じ濃度のPDGFもしくはインターフェロンの注射を実施する。
【００１０】
もう一つの特徴として、本発明は患者の損傷を受けた筋骨格組織の治癒を促進する手順を示している。最初に、SMA誘発剤（TGF-ベータ、100 ng/mlから500μg/ml）を創傷の癒着を促進するために十分な用量及び期間、損傷を受けた組織の部位に注射する。一度完全に癒着が終了すると、SMA阻害剤（前記の濃度範囲のPDGFもしくはインターフェロン）は瘢痕形成を抑制するために創傷の部位に投与される可能性がある。ほとんどの症例で、局所的送達によって投与が実施されると考えられる。
【００１１】
SMAの誘発剤はまた薬剤吸収を促進するために患者に投与される可能性がある。十分な用量が内皮細胞収縮を誘発するために投与されることが望ましい。例えば、100 ng/mlから500μg/mlの濃度のTGF-βが非経口的もしくは鼻内に2番目の薬剤と併用して投与される可能性がある。
【００１２】
本発明はまた癌患者の腫瘍細胞転移を予防する方法を示している。これは血管系の内皮細胞のＳＭＡを阻害する薬剤を投与することによって行なわれる可能性がある。内皮細胞は収縮しないために、主要な腫瘍塊から流れ出した癌細胞が患者の血流内に入るのが妨げられ、また血流内の癌細胞が組織に浸潤することが妨げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（治療方法）
細胞の収縮を制御する能力は少なくとも6種の異なる治療的応用について重要な意義を持つ。第一に、それはin vitroにおける組織工学法を含めた靭帯修復手順に関して重要である。それらの手順を記載した化学論文はArnoczkyら, J.Bone Joint Surg.70A: 1209-1217(1988); Milachowskiら, Int.Orthop.13:1-11(1989); Arnoczkyら, Clin.Orthop.252: 121-128(1990); Siegelら, Clin.Sports Med. 12:59-80(1993); Stoneら, Am.J.Sports Med.20:104-111(1992); Toyonagaら, Clin.Orthop.179:291-297(1983); Klompmakerら, Biomaterials 12:810-816(1991); Stoneら, J.Bone Joint Surg.79A: 1770-1777(1997); Stoneら,Clin.Orthop.252:129-135(1990); Nehrerら,Biomaterials 18768-776(1997)である。靭帯の置換は患者の体から細胞を採取し、それらをコラーゲン及び類似物質を含有した基質上で増殖させることによって準備される可能性がある。in vitroにおける細胞の収縮によってこの手順を複雑にするような基質の変形が生じる。アルファ平滑筋アクチンの活性を調節する薬剤は細胞収縮を制御するために用いることができるということが現在では明らかになっている。本発明はin vitroにおける細胞のいかなる増殖法にも適合しておりまた細胞播種の前に増殖培地及び／もしくは基質に単に阻害剤を加えることも含んでいる。例えば、PDGFはコラーゲン／グリコサミノグリカン基質上で線維芽細胞を増殖させるために用いられるDMEM培地に加えられる可能性がある。PDGFの濃度は一般的に１から500 ng/mlで好ましくは10から50 ng/mlであることが望ましい。靭帯損傷の治療に対するこの治療法はまた骨、関節軟骨、半月軟骨、腱、椎間板の損傷に対して、及び肝臓もしくは他の上皮組織工学のために同じ方法で用いられる。
【００１４】
in vivoにおいて、不適当な細胞収縮は正常なもしくは移植された靭帯が骨に適切に付着するのを困難にする可能性があり、また付着が完了した後の動きを制限する可能性がある。これらの問題を避けるために、SMA阻害剤（例えば100 ng/mlから500μg/mlの濃度のPDGFの製薬学的製剤）が付着を促進するために靭帯損傷の部位に直接注射される可能性がある。標準的な臨床的手順及び画像法が付着が完了したことを示すまで、週に2回規則的に投与が繰り返されることが望ましい。SMAの誘発剤はその後靭帯が収縮を起こしそれによって更に正常のコンフォメーションをとるように損傷部位に注射される可能性がある。例えば、TGF-βが100 ng/mlから500μg/mlの濃度で注射される可能性がある。SMA阻害剤の注射を行なう時、誘発剤の注射が規則的に行なわれ、その結果の断続的な臨床的評価が行なわれることが望ましい。前記のin vitroにおける方法を用いる時、損傷を受けた靭帯のために用いられたin vivoにおける手順を骨、関節軟骨、半月軟骨、腱、及び椎間板の修復に対して全く同じ方法で用いることが可能である。
【００１５】
細胞の収縮はまた創傷の修復に重要な役割を果たす（例えばMast,in Wound Healing: Biochemical and Clinical Aspects, Cohenら,ed., WB Saunders Co.(1992)参照）。アルファ平滑筋アクチンを発現する筋線維芽細胞は皮膚創傷部位の開口縁が治癒を促進するのを助ける(Eddy ら,Am.J. Pathol. 130:252-260(1988); Welchら,J. Cell. Biol. 110:133-145(1990))。更に収縮を促進するためにSMAの誘発剤が創傷部位に投与される可能性がある。例えば、TGFベータが100 ng/mlから500μg/mlの濃度の局所用製剤として投与される可能性がある。創傷の癒着が完了するまでその製剤は何日目か毎に定期的に変えることが望ましい。その後瘢痕形成を抑制するために、一種以上のアルファ平滑筋アクチン阻害剤を含有した製剤を局所的にもしくは局注のいずれかによって投与することが望ましい。例えば、100 ng/mlから500μg/mlの濃度のPDGFを含有する製剤が注射される可能性がある。治癒が完了するまで定期的に注射の反復投与が行なわれる必要がある。
【００１６】
内皮細胞におけるアルファ平滑筋アクチンの発現及び活性は薬剤送達を促進するために用いられる可能性がある。特に、SMAの誘発剤は内皮細胞の収縮を促進するために用いられ、それによって患者の血管系への薬剤の吸収を容易にする可能性がある。このように、TGF-βのような薬剤はその吸収を助けるように筋注用の薬剤と併用される可能性がある。選択的に、ＳＭＡ誘発剤は肺毛細血管内に治療用薬剤が吸収されるのを促進するための鼻内用医薬品合成製剤に含まれる可能性がある。TGF-βの場合には、100 ng/mlから500μg/mlの範囲の濃度が製剤に用いられると考えられる。
【００１７】
内皮細胞収縮を阻害する薬剤（例えばPDGF）は患者の血流からの細胞の侵入および流出を更に困難にするであろう。腫瘍細胞転移をおこす主要な事象の一つは血管内に及び血管から外へ細胞が通過することであるため、SMA阻害剤は固形腫瘍のある患者の治療に用いられる可能性がある。阻害剤は全身性に注射されるかもしくは腫瘍発生部位に直接投与される可能性がある。阻害剤の局所用製剤はまた一つの例として様々なタイプの皮膚癌の治療に有用であることが証明される可能性がある。
【００１８】
アルファ平滑筋アクチン阻害剤はまた骨粗鬆症の患者の治療に用いられる可能性がある。PDGFもしくはインターフェロンのような薬剤の全身的な注射はカルシウムの吸収のために骨芽細胞退縮を阻害し、またそれによって破骨細胞が骨の表面に接近するのを妨げるために用いられる可能性がある。この治療はカルシウム、ビタミンＤおよび副甲状腺ホルモンのような薬剤の投与を含めた骨粗鬆症の治療の他の確立された方法と併用して用いられるであろうと期待されている。PDGFもしくはインターフェロンが阻害剤として用いられる時、それらは代表的な例として100 ng/mlから500μg/ml濃度の範囲で製薬学的な合成製剤として注射されることが考えられている。持続性の製剤はまた骨粗鬆症の患者の治療に適切であり、非経口的な反復投与よりもさらに便利である可能性がある。
【００１９】
（用量）
患者に投与されるアルファ平滑筋阻害剤もしくは誘発剤の総用量は治療の特定の条件、投与の経路および客観的な治療に基づいて決定される。患者に投与される阻害剤もしくは誘発剤の代表的な日用量は用いられた薬剤によって１μgから10 mgである。局所的、鼻内適用の及び局注用の製剤は代表的な例としてまたこの範囲に含まれる。これらの用量は単に目標値であり、個々の患者のために選択された実際の用量は臨床的な条件に基づいて、また専門家には周知の方法に基づいて参加医師によって決定されるであろう。薬剤は単独で、もしくは多様な用量処方計画の中に組み入れられ、単独で、もしくは他の治療用薬剤と併用して投与される可能性がある。
【００２０】
（剤型及び投与経路）
本発明はあらゆる投与経路及びあらゆる剤型に適合する。治療の特定の条件によって、一つの剤型が他の剤型より便利で、あるいはより効果的な傾向がある。例えば、局注はin vivoにおける靭帯修復のためにより好まれる投与経路であるが、皮膚癌の治療には一般的に局所的投与がより好まれる。非経口的及び局所用製剤の他に、薬剤は口から、経口的に、内服で鼻内に、直腸内に、膣内に、舌下に、及び経皮的に投与される可能性がある。個々の剤型は錠剤、丸剤、カプセル、散剤、噴霧薬、坐薬、皮膚用貼付剤、懸濁液、溶液及び乳剤を含む非経口用及び経口用液剤である。持続性の剤型がまた用いられる可能性がある。全ての剤型が専門的に標準的な方法を用いて準備される可能性がある。(例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences,16th, Ed. A. Oslo Editor,Easton, PA (1980)参照)。
【００２１】
アルファ平滑筋アクチンの阻害剤及び誘発剤は製薬学的製剤で通常用いられるあらゆる賦形剤及び添加物、例えばタルク、アラビアゴム、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水溶性もしくは非水溶性溶媒、油、パラフィン誘導体、グリコール等と併用して用いられる可能性がある。着色料及び香料がまた製剤、特に経口投与の薬剤に加えられる可能性がある。溶液は水もしくはエタノール、1,2-プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪アルコール、トリグリセライド、グリセリンの部分的エステル等のような生理学的に適合した有機溶媒を用いて準備される可能性がある。非経口的合成製剤は静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下送達のために用いられる可能性がある。これらの製剤は従来の方法を用いて製造されまた滅菌等張生理食塩水、水、1,3-ブタネジオール、エタノール、1,2-プロピレングリコール、水と混合したポリグリコール、リンゲル液等である可能性がある。
【００２２】
細胞収縮の阻害剤及び誘発剤はまた組織治癒を促進するための移植片として、及びin vitroにおける細胞の播種のための足場として用いられる基質と併用して使用できる。これらの症例では、阻害剤及び誘発剤は基質によって吸収され、幾らかの症例では化学的に基質と結合し得る。
【００２３】
（治療方法の利点）
細胞収縮を制御する能力は一つの治療計画として広く利用されてはいない。このように、この文書の中に記載された方法は既に確立された手順を補足するために役立つ可能性がある。アルファ平滑筋アクチンの発現及び作用は多くの異なる細胞型の収縮を招くことが認められているため、また収縮は多くの異なる生物学的過程にとって重要であるため、一連の阻害剤もしくは誘発剤が幾つかの治療処方計画に寄与する可能性がある。
【実施例】
【００２４】
膝関節半月軟骨の多様な型の損傷は結果的に治癒しない欠損を引き起こし、痛みと機能障害を招く。数種の型の有孔被吸収性基質はこの組織の再生を促進するために単独でもしくは培養された細胞と共に播種されて用いられる可能性がある。本研究の目的はタイプＩ及びタイプIIコラーゲン基質に播種された半月軟骨細胞の収縮性の性質をin vitroにおいて評価することであった。
【００２５】
多くの結合組織において、収縮性の表現型（筋線維芽細胞）をもつ線維芽細胞は治癒及び病理学的状態において重要な役割を果たすことが認められた。この表現型は、もし半月軟骨細胞に表現された場合、組織工学のために開発された細胞を播種した基質の性質に影響を与える可能性がある。本研究において、収縮性のアクチンイソ型、アルファ平滑筋（アルファＳＭアクチン）の存在が二次元及び三次元培地内の正常な子牛の半月軟骨組織及び半月軟骨細胞において免疫組織化学法によって測定された。
【００２６】
子牛の半月軟骨細胞はタイプI及びタイプIIコラーゲングリコサミノグリカン（GAG）基質に播種した。基質の直径は2-3日毎に測定された。アルファSMアクチンの二次元培地の免疫組織化学染色が1、3、及び７日後に、また播種された基質の染色が1、7、14、及び21日目に実施された。透過電子顕微鏡法(TEM)が選択された検体で実施された。
【００２７】
3週間後に、播種されたタイプI基質はほとんど50%の有意な収縮を示したが、タイプII基質及び播種されていない両方の型の対照は同じ時間が過ぎてもほとんど収縮を示さなかった。アルファSMアクチン発現型の陽性の染色は正常組織の細胞の10%に見られたが、単層及び両方の型の基質に播種された全ての細胞内に存在した。代表的な細胞播種基質のTEMはおよそ7 nm bicのマイクロフィラメントを示し、筋線維芽細胞表現型と一致した。我々の知る限りでは、損傷を受けていない膝半月軟骨のアルファSMアクチン含有細胞についての他の報告はない。ある条件下で、半月軟骨細胞が筋線維芽細胞発現型を発現できるという発見は半月軟骨の治癒及び組織再生を促進するための移植に対する組織反応における役割を示唆している。
【００２８】
全ての引用された文献は参考文献の中に十分組み入れられている。本発明についてここに十分記載したことにより、本発明の趣旨もしくは範囲あるいはその具体例に影響を与えることなしに、条件、規定要因等のこれ以上の広い範囲内で実施される可能性があるということが熟練した専門家によって理解されるであろう。