(57)【要約】【課題】細胞培養技術や細胞シート工学に利用可能な細胞培養担体を提供する。【解決手段】アニオン性高分子含水ゲルにキトサンを配合した含水ゲル又はアニオン性高分子含水ゲルにキトサンを吸着させた含水ゲルなどのカチオン性基を有する担体を含み、該担体の表面に形成された海島状のポリペプチド修飾部位を含む細胞培養担体。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性基を有する担体を含み、該担体の表面に形成された海島状のポリペプチド修飾部位を含む細胞培養担体。
【請求項２】
担体が高分子化合物、無機化合物、又は有機化合物である請求項１に記載の細胞培養担体。
【請求項３】
担体がガラスである請求項１に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
担体が高分子含水ゲルである請求項１に記載の細胞培養担体。
【請求項５】
担体がアニオン性高分子含水ゲルである請求項４に記載の細胞培養担体。
【請求項６】
カチオン性基を有する担体が、アニオン性高分子含水ゲルにキトサンを配合した含水ゲル又はアニオン性高分子含水ゲルにキトサンを吸着させた含水ゲルである請求項５に記載の細胞培養担体。
【請求項７】
ポリペプチドが細胞接着性ポリペプチドである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の細胞培養担体。
【請求項８】
細胞接着性ポリペプチドが細胞外マトリックス成分である請求項７に記載の細胞培養担体。
【請求項９】
ポリペプチド修飾部位が細胞外マトリックス成分を含む水性ゲルにより形成された請求項８に記載の細胞培養担体。
【請求項１０】
１つの独立したポリペプチド修飾部位の面積が５０μｍ２〜２ｍｍ２である請求項１ないし９のいずれか１項に記載の細胞培養担体。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞培養担体の表面に細胞層を形成させる工程を含む細胞培養方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法により得られた細胞培養物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養技術や細胞シート工学に利用可能な細胞培養担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種幹細胞ならびに体細胞への分化誘導法の発見も多数有り臓器移植に変わる新たな医療としてＴｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇが大きく注目されている。この技術はヒトの治療に直接使用する臓器を体内外で構築することを目的としているが、ｉｎｖｉｔｒｏで臓器様の機能を発現させる手法を数多く実現している。このことから直接臓器を作らず薬理試験用ができ、かつ創薬研究・診断といった膨大な試験数にも対応できるハイスループット（ＨＴＳ）な細胞評価系として期待されている。また、哺乳類の細胞特有の物質生産が可能な新たな技術としても期待されている。
【０００３】
一方、ヒトゲノム計画によるヒトＤＮＡ塩基配列の解析がほぼ終了し、世の中の研究はこの情報を利用したポストゲノムへと移りつつある。近年新聞を賑わしているテーラーメード医薬もその一つであり、医薬品のみならず創薬、投薬の支援ツールも莫大な市場を生むことが期待されている。現在、このようなツールとしてＤＮＡチップやプロテインチップが注目されており米国ベンチャーをはじめ各社が鎬を削っている。
【０００４】
しかしながら、ヒトゲノムプロジェクトの報告したヒト遺伝子の数は３〜４万程度であり、ハエの１．３万と大差が無いうえに種を超えて同一である相同遺伝子が多数ある。このことから、種内の個性をＤＮＡのみで判断することはできないこともわかってきた。ヒト遺伝情報はセントラルドグマに従いＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白と経て細胞が構築されるが、情報伝達は一方通行でなく多くの相互作用やフィードック系を引き連れた非線形な系いわゆる複雑系となっている。生命体にはスタビリティーとロバストネスを持たせる機構が存在する。例えば、肝臓は空腹時、満腹時、飲酒時で同じ遺伝子、細胞、組織でも違う発現系が働く。このため、生命現象を解明するには分子反応のみに注目するのではなく、生命体をシステムとして捕らえたうえでｉｎ　ｖｉｖｏで細胞や臓器を解析することで得られる境界条件元にシミュレーションで考える試みがされている。この新しい分野はバイオシステム工学と呼ばれにわかに注目されている。
【０００５】
生命現象を的確に捉えるには最低限細胞以上のシステムを取り扱う必要があるが、細胞や組織の本来の機能を維持しつつこれらをアレイとして並べたものが要望されており、細胞アレイ構築法の研究が盛となっている。具体的には、リソグラフィーを用いてガラスなどの固体基板表面の親疎水性を制御する方法（Ｓ．　Ｎ．　Ｂｈａｔｉａ　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．，　１４，　３７８　（１９９８）、赤池敏宏ら，　特開平５−１７６７５３号公報、大塚ら，　第３０回医用高分子シンポジウム講演要旨集９頁（２００１）、菊地ら，第３０回医用高分子シンポジウム講演要旨集３５頁（２００１）など）が知られている。もっとも、こうした方法はリソグラフィー用の高価な装置が必要であり、簡便に細胞培養担体を調製することができない問題がある。
【０００６】
一方、細胞は生体内で組織を形成する際に極性を持って配列することが知られている。例えば、肝細胞は血管内皮細胞側から血液成分を吸収し、逆側から胆汁酸などの代謝物を排泄する。この胆汁酸は細胞毒性が強いため、ガラスなどの不透過性支持体上に細胞を付着させて培養したのでは、長期間の安定な培養が難しいという問題がある。細胞に対して一方向から刺激を与えることで細胞の極性が発現することも知られているが、不透過性支持体上に細胞を付着させて培養したのでは刺激を接着側から与えられない問題がある。また、リソグラフィーを行なうためには光感受性液を予め塗布する必要があるが、物質透過性支持体ではこの光感受性液のほか、反応生成物および現像／定着液が支持体内に浸透してしまい、支持体の変性や支持体中への化合物の残留などにより培養細胞への毒性や刺激が発生するという問題がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、細胞アレイを簡便に調製するための手段としての細胞培養担体を提供することにある。また、本発明の別の課題は、細胞の両面を異なる培地として培養でき、かつ細胞の生育状況を光学顕微鏡で簡便に行なえる細胞培養担体を提供することを目的とする。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記の構成を採用した細胞培養担体を提供することにより上記の課題を解決できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、カチオン性基を有する担体を含み、該担体の表面に形成された海島状のポリペプチド修飾部位を含む細胞培養担体を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、カチオン性基を有する担体が高分子化合物、無機化合物、又は有機化合物である上記の細胞培養担体；カチオン性基を有する担体がカチオン性基を有する高分子化合物、又は表面修飾によりカチオン性基が導入された無機化合物若しくは有機化合物である上記の細胞培養担体が提供される。また、この発明の好ましい態様によれば、該ポリペプチド修飾部位以外の該担体表面がアニオン性多糖類で被覆された上記の細胞培養担体が提供される。
【０００９】
また、上記の発明の別の好ましい態様として、担体が含水ゲルである上記の細胞培養担体が提供され、さらに好ましい態様として含水ゲルが高分子含水ゲルである上記の細胞培養担体、及び含水ゲルがアニオン性高分子含水ゲルである上記の細胞培養担体が提供される。この態様では、カチオン性基を有する担体として、高分子含水ゲルにキトサンを配合した含水ゲル又はアニオン性高分子含水ゲルにキトサンを吸着させた含水ゲルを用いることが好ましい。特に好ましい態様として、担体がアルギン酸を含む含水ゲルであり、カチオン性基を有する担体が該含水ゲルの表面に水溶性カチオン性高分子の水溶液を塗布することにより形成された細胞培養担体、及び担体がアルギン酸を含む含水ゲルであり、カチオン性基を有する担体が該含水ゲルを水溶性カチオン性高分子の水溶液へ浸漬することにより形成された細胞培養担体が提供される。この好ましい態様において、水溶性カチオン性高分子としてキトサンを特に好ましく用いることができる。
【００１０】
さらに好ましい態様では、カチオン性基を有する担体の表面を修飾するポリペプチドが細胞接着性ポリペプチドである上記の細胞培養担体；カチオン性基を有する担体の表面を修飾するポリペプチドが細胞外マトリックス成分である上記の細胞培養担体；カチオン性基を有する担体の表面を修飾するポリペプチドがゲル状の細胞外マトリックス成分である上記の細胞培養担体が提供される。また、１つの独立したポリペプチド修飾部位の面積が５０μｍ２〜２ｍｍ２である上記の細胞培養担体；１つの独立したポリペプチド修飾部位の面積が１００μｍ２〜１ｍｍ２である上記の細胞培養担体が提供される。好ましくは、ポリペプチドの修飾部位は印刷法、スポッティング法、及び／又はインクジェット法により担体表面に形成される。
【００１１】
さらに別の観点からは、上記の細胞培養担体の表面に細胞を播種する工程を含む細胞培養方法；上記の細胞培養担体の表面に細胞層を形成させる工程を含む細胞培養方法；及び、上記の細胞培養方法により得られた細胞培養物が提供される。上記の細胞培養物は、担体表面に海島状に配置されたポリペプチドの表面に形成された細胞層を含んでいる。上記の細胞培養担体の担体がアルギン酸を含む含水ゲルである場合、この細胞培養物からアルギン酸を含む含水ゲルを可溶化することにより実質的に含水ゲルを含まない細胞培養物を得ることができる。すなわち、本発明により、上記の細胞培養担体の表面に細胞層を形成させる工程；及びアルギン酸を含む含水ゲルを可溶化する工程を含む細胞培養物の製造方法が提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本明細書において「細胞培養担体」とは、細胞を培養する際に培養液中で細胞を保持することができる構造体を意味しているが、この用語はいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。
【００１３】
本発明の細胞培養担体は、カチオン性基を有する担体を含み、該担体の表面がポリペプチドで海島状に修飾されていることを特徴としている。本発明の細胞培養担体に含まれる担体としては、高分子化合物、無機化合物、又は有機化合物などを含む単体を挙げることができるが、これらに限定されることはない。例えば金属板やガラスなどを担体として用いることもできる。より具体的には、カチオン性基を有する担体の例としては、例えば、カチオン性基を有する高分子化合物のほか、表面修飾によりカチオン性基が導入された無機化合物若しくは有機化合物などを挙げることができる。カチオン性基としてはｐＨ８以下で正荷電を有する基であればその種類は特に限定されないが、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアジニノ基などが挙げられる。
【００１４】
担体として利用可能なカチオン性基を有する高分子化合物としては、例えば、キトサン、部分脱アセチルキチン、アミノ化セルロース、ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体、ポリビニルアミン、ポリアニリンやこれらの化合物のアニオンポリマーとのポリイオン錯合体などが挙げられる。無機化合物からなる担体の例としては、ガラスを挙げることができる。
【００１５】
表面修飾によりカチオン性基が導入された無機化合物や有機化合物を担体として用いる場合、表面修飾の方法は特に限定されないが、例えば、共有結合を形成する化学反応を用いる方法、イオンの静電相互作用により吸着させる方法、疎水相互作用によりアミノ基を有する化合物を付着させる方法、水不溶性アミノ基含有化合物を塗布する方法などが挙げられる。
【００１６】
より具体的には、共有結合を形成する化学反応を用いる方法としてはカップリング剤（シラン、チタンなど）を用いる方法、メルカプト化合物を用いた自己組織化膜、反応活性基（グアニジル、アルデヒドなど）を有するカチオン性化合物を用いた反応などが挙げられる。イオンの静電相互作用により吸着させる方法としてはアニオン性表面に多価カチオン性化合物やカチオン性高分子化合物を吸着させる方法が挙げられる。疎水相互作用によりアミノ基を有する化合物を付着させる方法としてはＬＢ膜などが挙げられる。水不溶性アミノ基含有化合物を塗布する方法としては油溶性化合物（アルキルアミン、ポリアニリンなど）を有機溶剤に溶解し塗布する方法や酸可溶性化合物（キトサンなど）を酸性溶液で塗布したのちｐＨを上昇させ析出させる方法などが挙げられる。もっとも、表面修飾の方法はこれらの具体例に限定されることはなく、当業者が担体の種類や修飾の目的などに応じて適宜選択可能である。
【００１７】
本発明の細胞培養担体の好ましい態様として、担体が含水ゲルである場合を挙げることができ、含水ゲルの好ましい例として、高分子含水ゲルを挙げることができる。本明細書において、高分子含水ゲルとは化学結合によって網目状構造をとり、網目に多量の水を保有したゲル状の物質を意味しているが、この用語はいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈しなければならない。担体を形成する含水ゲルとして無機物質（シリカゲルなど）の含水ゲルを用いてもよい。
【００１８】
高分子含水ゲルを形成する高分子化合物としては、例えば、アニオン性多糖類（アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、アガロペクチン、カラギーナン、カルボキシメチルセルロースなど）やその塩、カチオン性多糖類（キトサン、部分脱アセチルキチン、アミノ化セルロースなど）やその塩、ノニオン性多糖類（デキストラン、セルロース、酢酸セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、アガロース、アミロース、グリコマンナンなど）、ポリペプチド（コラーゲン、ゼラチン、絹フィブロインなど）、合成高分子（ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの混合物や複合体などを挙げることができる。
【００１９】
カチオン性基を有する含水ゲルとしては、例えば、キトサンの含水ゲルのほか、高分子含水ゲルにキトサンを配合した含水ゲルや、アニオン性高分子含水ゲルにキトサンを吸着させた含水ゲルを好ましく用いることができる。例えば、キトサンを酸で溶解し、ｐＨを上昇させ水不溶化することにより調製された水性ゲル、あるいはキトサンと水溶性アニオン性高分子（アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、アガロペクチン、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸やその共重合体、ポリメタクリル酸やその共重合体、ポリスチレンスルホン酸やその共重合体など）又は両性高分子（ゼラチン、コラーゲンなど）とのポリイオンコンプレックスによる水性ゲルが挙げられる。ポリイオンコンプレックスによる水性ゲルの製造方法としては、例えば、キトサン水溶液とアニオン性又は両性高分子水溶液とを混合する方法、あるいはキトサン水溶液とアニオン性又は両高分子水溶液に水性ゲルを交互に浸漬するいわゆる交互積層（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ）法などが挙げられる。ここで交互積層法を用いる場合は最上層（最終浸漬液）をキトサンとすることが好ましい。キトサンを含む上記の含水ゲルにはゲル化に直接寄与しない化合物を添加してもよい。
【００２０】
担体を構成する含水ゲルとして、アニオン性高分子含水ゲルを用いることができる。アニオン性高分子ゲルとは、アニオン性高分子の分子中の酸基と多価金属イオンとがキレート構造を形成してゲル化したものを意味しているが、この用語はいかなる意味においても限定的に解釈してはならない。アニオン性高分子のゲル化を引き起こし得る多価金属カチオンの具体例としては、例えば、バリウム（Ｂａ）、鉛（Ｐｂ）、銅（Ｃｕ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、カルシウム（Ｃａ）、亜鉛（Ｚｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）等の金属イオンを例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンを例示できる。また、アニオン性高分子含水ゲルは酸基とカチオン残基を有する有機高分子化合物のポリイオンコンプレックスによる含水ゲルでもよい。カチオン残基を有する有機高分子化合物の例としては、ポリリジン、キトサン、ゼラチン、コラーゲンなどの複数のアミノ基を有する化合物が挙げられる。
【００２１】
本発明の細胞培養担体を構成する担体として、アニオン性高分子含水ゲルを好ましく用いることができ、アルギン酸を含む含水ゲルが特に好ましく用いられる。アルギン酸を含む含水ゲルとは、アルギン酸の分子中のカルボン酸基と多価金属イオンとがキレート構造を形成してゲル化したものを意味する。アルギン酸は、グルクロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）よりなるブロック共重合体であり、Ｍブロックが有するポケット構造に多価金属カチオンが侵入してエッグボックスを形成してゲル化すると考えられている。
【００２２】
アルギン酸は、褐藻類の細胞壁構成多糖又は細胞間充填物質として天然に存在しており、これらを原料として採取可能である。原料褐藻類の具体例としては、ヒバマタ目ダービリア科ダービリア属（例えばＤ．ｐｏｔａｔｏｒｕｍ）、ヒバマタ目ヒバマタ科アスコフィラム属（例えばＡ．ｎｏｄｏｓｕｍ）、コンブ目コンブ科コンブ属（例えばマコンブ、ナガコンブ）、コンブ目コンブ科アラメ属（例えばアラメ）、コンブ目コンブ科カジメ属（例えばカジメ、ウロメ）、コンブ目レッソニア科レッソニア属（例えばＬ．ｆｌａｖｉｋａｎｓ）の褐藻類を例示できる。また、市販のアルギン酸を使用することもできる。アルギン酸のＧ／Ｍの比は特に限定されないが、Ｇ／Ｍの比が大きいほどゲル形成能が大きいので、Ｇ／Ｍの比は大きい方が好ましく、具体的には０．１〜１であるのが好ましく、０．２〜０．５であるのがさらに好ましい（本明細書において「〜」で示される数値範囲は上限及び下限の数値を含む）。
【００２３】
アルギン酸のゲル化は、常法に従って行なうことができる。アルギン酸のゲル化は、例えばイオン交換を利用して行なうことができる。例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムイオンを添加すると速やかにイオン交換が生じ、アルギン酸カルシウムゲルが得られる。より具体的には、アルギン酸ナトリウム水溶液を所望の厚さで塗布用基板上に塗布し、次いで多価金属カチオンもしくはカチオン残基を有する有機高分子化合物の溶液に浸漬することでアルギン酸カルシウムゲル層が得られる。
【００２４】
上記の方法を行うにあたり、アルギン酸ナトリウムの濃度は特に限定されないが、例えば０．０５質量％〜２０質量％が好ましく、０．５質量％〜１０質量％以下が特に好ましい（本明細書において「〜」で示される数値範囲は上限及び下限の数値を含む）。また、アルギン酸ナトリウムを塗布する厚さとしては、例えば１μｍ〜１００ｍｍが好ましく、１０μｍ〜１０ｍｍが特に好ましい。多価金属カチオン溶液の濃度としては０．０５ｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。多価金属カチオン溶液の溶媒としては、例えば、水、水溶性有機溶剤、又は水と水溶性有機溶剤との混合物を例示することができ、より具体的には、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、又はこれらの混合物が好ましく用いられ、水及びメタノールの混合物が特に好ましく用いられる。
【００２５】
上記の方法を行うにあたり、カチオン残基を有する有機高分子化合物としてポリリジンを用いる場合には、アルギン酸溶液内においてＮ−ヒドロキシコハクイミドと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩でリジンを重合しポリリジンを形成させる方法が好ましく用いられる。もっとも、アルギン酸ゲルを形成する方法は上記の特定の方法に限定されるわけではない。当業者は上記の方法を適宜改変ないし修飾し、あるいは他の手段を適宜選択することにより、アルギン酸ゲルを容易に製造することが可能である。
【００２６】
細胞培養担体における担体としてアニオン性高分子含水ゲルを用いる場合、該含水ゲル表面にカチオン性基を導入する方法は特に限定されないが、例えば、アニオン性高分子含水ゲルを水溶性カチオン性高分子の水溶液と接触させる方法が好ましく用いられる。該水溶液への接触方法としては、アニオン性高分子含水ゲルの表面に水溶性カチオン性高分子の水溶液を塗布する方法、又はアニオン性高分子含水ゲルを水溶性カチオン性高分子の水溶液へ浸漬する方法が好ましく用いられる。
【００２７】
本発明の細胞培養担体では、カチオン性基を有する担体の表面がポリペプチドで海島状に修飾されていることを特徴としている。ポリペプチドとしては細胞接着性ポリペプチドを用いることができる。細胞接着性ポリペプチドとしては、細胞毒性がなく、かつ通常の培養条件で細胞が付着するポリペプチドであればその種類は特に限定されず、天然又は合成の任意のポリペプチドを用いることができる。細胞接着性ポリペプチドの性状は特に限定されないが、好ましくはゲル状の細胞瀬着性ポリペプチドを用いることができる。特に好ましいのは、層状の細胞外マトリックス成分ゲルである。
【００２８】
細胞外マトリックスは、一般的には「動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物で、細胞が合成し、細胞外に分泌・蓄積した生体高分子の複雑な会合体」と定義されており（生化学辞典（第３版）ｐ．５７０，東京化学同人（株））、細胞を物質的に支持する役割や細胞の活性を調節する役割（すなわち細胞外の情報を細胞に伝えその活性に変化を与える役割）等を担っている。細胞外マトリックス成分であるポリペプチドとしては、例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン等を例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、コラーゲン、アテロコラーゲン、マトリゲル（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸よりなるゲル）を例示できる。細胞外マトリックス成分は、常法に従って得ることができる。また、市販の細胞外マトリックス成分を使用してもよい。細胞接着性成分のゲル化は、常法に従って行なうことができる。例えば、細胞接着性成分がコラーゲンである場合には、０．３〜０．５％コラーゲン水溶液を３７℃で１０〜２０分間インキュベーションすることにより、コラーゲンゲルを得ることができる。細胞外マトリックス成分のゲル化の際には、必要に応じてゲル化剤を使用してもよい。
【００２９】
本明細書において「海島状に修飾」という用語は、カチオン性基を有する担体の表面にポリペプチド修飾部位が複数点在していることを意味しており、典型的にはポリペプチド修飾部位が相互に不連続な独立した部位を形成しているものを意味しているが、２以上の修飾部位が相互に連結していてもよい。「海島状」の用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならない。例えば、１つの独立したポリペプチド修飾部位の面積が５０μｍ２〜２ｍｍ２であることが好ましく、１００μｍ２〜１ｍｍ２であることが特に好ましい。カチオン性基を有する担体の表面に海島状にポリペプチド修飾部位を形成する方法は特に限定されないが、例えば、該ポリペプチドの溶液を印刷法（平版、凸版、凹版、グラビアなど）、ピン（キャピラリー、先端凹型、先端烏口など）によるスポッティング法、インクジェット法により担体表面に配置する方法など挙げられるがこれらに限定されることはない。
【００３０】
本発明の細胞培養担体において、海島状のポリペプチド修飾部位以外はアニオン性多糖類で被覆されていることが好ましい。アニオン性多糖類での被覆法としては海島状のポリペプチド修飾部位を担体表面に形成した後、アニオン性多糖類の溶液を該担体表面に塗布するか、該担体をアニオン性多糖類の溶液中に浸漬する方法などが好ましく用いられる。
【００３１】
本発明の細胞培養担体は基板上に形成されていてもよい。担体として含水ゲルを用いる場合には含水ゲルを基板上に形成することが好ましい。基板としては多孔質膜が好ましく用いられるが、多孔質膜の種類は特に限定されない。例えば、アルギン酸ゲルを透過させず、金属イオンなどを透過させることができるものが好ましく用いられる。多孔質膜としては、細孔を有する膜以外に、空隙を有する膜や、細孔と空隙の両方を有する膜等を用いてもよい。多孔質膜の具体例としては、濾紙、限外濾過膜、シリコーンゴム膜、四フッ化エチレン樹脂多孔質膜（ＰＴＦＥ多孔質膜）、不織布、ガーゼ様メッシュ、各種メンブレンフィルター（ナイロン、ポリフッ化ビニリデン、アセチルセルロース、ニトロセルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなど）等を例示でき、好ましいものとしては、メンブレンフィルターであり、特にナイロンメンブレンフィルター膜が好ましい。多孔質膜が細孔を有するものである場合、細孔の大きさは通常は０．０２〜１，０００μｍであり、好ましくは０．０２〜１００μｍであり、さらに好ましくは０．１〜１０μｍである。
【００３２】
本発明の細胞培養担体を用いて、その表面上に細胞を培養することができる。培養し得る細胞の種類は特に限定されないが、例えば、繊維芽細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨芽細胞、骨髄間葉細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞等を例示できる。細胞の培養の際には、通常、細胞濃度１〜１．５万ｃｅｌｌｓ／ｍｌの培養液（例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ１２培地、ＨａｍＦ１０培地）を本発明の細胞培養担体の表面に添加する。細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。通常、培養は担体表面にコンフルエントな単層の細胞層が形成されるまで行なうことができる。
【００３３】
本発明の細胞培養担体を用いて、担体表面に複数種の細胞を平面共培養することができる。例えば、細胞接着性ポリペプチド上でのみ増殖可能な繊維芽細胞や肝細胞等の細胞を培養して担体表面のポリペプチド修飾部位に該細胞の単層を形成させた後、ポリペプチド修飾部位以外の表面を被覆しているアニオン性多糖類上に接着する血管内細胞等の細胞を培養することにより、２種類の細胞を含む細胞培養物を製造できる。
【００３４】
本発明の細胞培養担体を用いた細胞の培養は具体的には次のようにして行なうことができる。細胞培養担体をシャーレ等の内部に設置し、シャーレ内に適当な培養液（例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ１２培地、ＨａｍＦ１０培地）を添加して５分浸漬後、培地交換を３回繰り返したのち１２〜２４時間放置し、培養液を細胞培養担体中に浸潤させる。シャーレ内の培養液を捨て、細胞培養担体のゲル層上に細胞を播き、シャーレ内に適当な培養液（例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ１２培地、ＨａｍＦ１０培地）を添加する。３７℃で１〜２時間放置し、担体表面に細胞を保持（接着）させた後、３７℃で培養を続ける。培養の際には、必要に応じて培養液を交換してもよい。通常は培養０．５〜２日ごとに培養液を交換する。もっとも、細胞培養の方法は上記の特定の方法に限定されることはなく、当業者が適宜選択可能であることは言うまでもない。
【００３５】
本発明の細胞培養担体を用いて細胞を培養により得られる細胞培養物は、本発明の細胞培養担体と該担体表面に保持された細胞層からなる細胞アレイとを含んでいるが、細胞培養担体の表面に保持された細胞アレイは、例えば細胞接着性ポリペプチドであるコラーゲンの表面に形成された細胞層であり、例えば単層の細胞層を含む細胞アレイである。
【００３６】
本発明の細胞培養担体を用いた細胞培養物上に、別に調製した細胞シートを載せることによって、重層化培養を行ってもよい。重層化する細胞層として、例えば、血管内皮細胞層、肝細胞層を使用すれば、肝臓の３次元組織構造物を構築できる。この３次元組織構造物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける薬物の透過性試験へ適用できるとともに、動物実験代替モデルや移植用臓器へ応用できる。重層化した細胞層は、細胞層を構成する細胞の種類に応じた培養条件で培養することができる。培養の際には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ１２培地、ＨａｍＦ１０培地等の培地を使用できる。例えば、本発明の細胞培養担体を用いた細胞培養物が平面共培養となっている場合、さらに重層化することで３次元状に細胞組織を構築することが可能となる。
【００３７】
担体としてアルギン酸を含む含水ゲルを用いた場合には、上記のようにして得られた細胞培養物のアルギン酸ゲル層を可溶化処理することにより、培養された細胞を細胞シート又は細胞アレイとして脱離させることもできる。アルギン酸ゲル層の可溶化処理は、アルギン酸ゲルを構成するカチオン成分を除去することにより行うことができる。カチオン種が多価金属イオンの場合は、例えば、リン酸などの多価金属カチオンと錯形成又は難溶性塩を形成するイオンの添加、キレート剤水溶液の使用、培地中の多価金属イオンの低減、培地中の多価金属イオンのキレート剤による隠蔽によって実施できる。通常、細胞培養用の培地にはリン酸イオンが多く存在するため、予め多価金属イオンを除去した培地もしくは多価金属カチオンの総和モル数に対して９０モル％以上のキレート剤を添加した培地に浸漬する方法が細胞への侵襲を低減する観点から好ましく用いられる。該キレート剤の濃度は９０モル％〜１００００モル％が好ましく、９０モル％〜１０００モル％がさらに好ましい。
【００３８】
キレート剤の種類は特に限定されないが、例えば、エチレンジアミンジオルトヒドロキシフェニル酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、１，３−ジアミノプロパノール四酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ｅｄｔａ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ｅｇｔａ）、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸、ニトリロトリメチレンホスホン酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、１，１−ジホスホノエタン−２−カルボン酸、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸、１−ヒドロキシ−１−ホスホノプロパン−１，３，３−トリカルボン酸、カテコール−３，５−ジスルホン酸、ピロリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムが挙げられ、特に好ましくは例えばジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、１，３−ジアミノプロパノール四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸、１，１−ジホスホノエタン−２−カルボン酸、ニトリロトリメチレンホスホン酸、エチレンジアミンテトラホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタホスホン酸、１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ジホスホン酸、１−アミノエチリデン−１，１−ジホスホン酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸やこれらの塩を挙げることができる。これらのうち特に好ましいものとしてはｅｄｔａ、ｅｇｔａを例示できる。
【００３９】
キレート化剤を用いたアルギン酸ゲル層の可溶化処理は、その表面にアルギン酸を含む水性ゲルが形成された多孔質膜からキレート化剤をしみこませて行なうのが好ましい。これによって、多孔質膜とアルギン酸ゲル層とを容易に分離することができ、細胞培養物を多孔質膜から容易に脱離させることができる。アルギン酸ゲル層の可溶化処理によってアルギン酸ゲル層を完全に除去する必要はなく、可溶化されなかったアルギン酸ゲル層が残っていてもよいが、アルギン酸ゲル層はできるだけ可溶化して除去するのが好ましい。
【００４０】
アルギン酸ゲル層を可溶化処理して得られる細胞培養物は細胞層又は細胞アレイを含んでいるので、細胞層の重層化又は転写などに使用できる。細胞層の重層化の際には、予め培養した細胞上に荷重をかけた状態で培養したのちアルギン酸ゲルを可溶化してもよく、あるいはアルギン酸ゲル層を可溶化して得られる細胞培養物同士を重層化してもよい。また、アルギン酸ゲル層を可溶化して得られる細胞培養物を別に作製した細胞層に重層化してもよい。重層化する細胞層の細胞の種類は、同一であっても異なっていてもよい。重層化する細胞層の数は特に限定されないが、通常１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３である。また、細胞層の転写際には、別の細胞培養用基材上に荷重をかけた状態で培養したのちアルギン酸ゲルを可溶化してもよく、あるいはアルギン酸ゲル層を可溶化して得られる細胞培養物を他の媒体に転写してもよい。好ましい重層化又は転写方法としては予め培養した細胞上もしくは別の細胞培養基材上に荷重をかけた状態で培養したのちアルギン酸ゲルを溶解する方法を挙げることができる。
【００４１】
荷重をかけた細胞の培養法は特に限定されず、細胞が転写される細胞又は基材にムラが生じない程度に充分荷重がかけられていればいかなる方法でもよい。ここで、荷重をかける際に細胞が密閉されると窒息をすることから、転写する側もしくは受ける側の少なくとも一方が細胞培養基材が水透過性のゲルや多孔質膜もしくはこれらの組み合わせでできていることが好ましい。また、ムラ無く転写するには細胞面を充分に覆う状態で荷重をかける必要があるが、均一に接触することで酸素の拡散を妨害することとなるため、不織布（ナイロン、ポリエステル、ステンレスなど）等を介して酸素の拡散を妨げないで荷重することが好ましい。
【００４２】
荷重をかけた細胞の培養法における荷重は０．１ｇ／ｃｍ２〜５０ｇ／ｃｍ２であることが好
ましく、０．５ｇ／ｃｍ２〜１０ｇ／ｃｍ２であることがさらに好ましい。荷重をかけた細胞の培養の時間は充分な細胞の転写が実現できれば特に限定されないが、４時間〜７２時間が好ましく、６時間〜４８時間がさらに好ましい。
【００４３】
本発明の細胞培養担体は、いかなる方法で滅菌されてもよいが、電子線、γ線、Ｘ線、紫外線などの放射線による滅菌が好ましく用いられ、電子線、γ線、紫外線がさらに好ましく用いられ、電子線滅菌が特に好ましい。本発明の電子線滅菌の照射線量としては０．１ｋＧｙ以上６５ｋＧｙ以下が好ましく、１ｋＧｙ以上４０ｋＧｙ以下が特に好ましい。ＥＯＧ滅菌などの化学滅菌、高圧蒸気ガス滅菌などの高熱をかける滅菌は細胞接着性層やアルギン酸ゲル層を分解するため好ましくない。このように滅菌した細胞培養担体は無菌条件下であれば長期間に渡って室温保管が可能である。上記滅菌法は単独もしくは複数種の組み合わせで実施されてもよく、同一種の滅菌法を繰り返し使用してもよい。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
実施例１：細胞培養担体の作製
（１）アルギン酸含水ゲル膜の調製
５重量％のアルギン酸ナトリウム（和光純薬製）水溶液を５００μｍの厚さでステンレス基板上に塗布し、塗布物を０．５ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム水／メタノール（容量比８０／２０）溶液に浸漬した。塗布物が充分ゲル化したのち、塗布物を流水で洗浄した。さらに、膜が変形しないように４辺を挟んだ状態で乾燥し、アルギン酸カルシウム含水ゲル膜を得た。
【００４５】
（２）キトサン修飾
上記（１）で得たアルギン酸含水ゲル膜を１重量％の水溶性キトサン（和光純薬製）水溶液に１時間浸漬したのち、流水で１時間以上洗浄した。キトサン修飾膜は乾燥せず水中に保管した。
（３）コラーゲン修飾
上記（２）で得たキトサン修飾膜を０．０３ｍｇ／ｍｌとなるように水で希釈したＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＩＣ（新田ゼラチン製ｔｙｐｅＩコラーゲン水溶液）を先端烏口状のステンレスピンでスポットしたのち、流水で１時間以上洗浄した。さらに、膜が変形しないように４辺を挟んだ状態で乾燥し、海島状にコラーゲンで表面修飾したアルギン酸カルシウム含水ゲル膜（サンプル１）を得た。このときのスポットの様子を図１に示す。また、スポットをキャピラリー（Ｄｒｕｍｍｍｏｎｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＭＩＣＲＯＣＡＰＳ、容量５μｌ）でスポットしたものをサンプル２とした。
【００４６】
（４）ヒアルロン酸修飾
サンプル１および２を０．１重量％ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬製、鶏冠製）水溶液に１時間浸漬したのち、流水で１時間以上洗浄した。さらに、膜が変形しないように４辺を挟んだ状態で乾燥し、サンプル３および４（海島状にコラーゲンで表面修飾し、コラーゲン修飾部位以外をヒアルロン酸で被覆したアルギン酸カルシウム含水ゲル膜）を得た。
【００４７】
（５）コラーゲン付着部の評価
▲１▼免疫染色
上記で得たサンプルをＰＢＳ＋（ＧＩＢＣＯ製１０×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ，　ｗｉｔｈｏｕｔ　Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，　ｗｉｔｈｏｕｔ　Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　１００ｍｌに水８９９ｍｌと１００ｇ／ｌ塩化マグネシウム六水和物と１００ｇ／ｌ塩化カルシウムを含んだ水溶液１ｍｌを混合）で膜を洗浄したのち、マニュアルに従って調製したＴＢＳ　Ｂｌｏｔｔｏ　Ｂ溶液に室温で２時間浸漬した。ＴＢＳ　Ｂｌｏｔｔｏ　Ｂ溶を充分に除去したのち、一次抗体として抗Ｔｙｐｅ−Ｉコラーゲンウサギ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）をかけ１時間放置し、その後ＰＢＳ＋で洗浄した。次いで、二次抗体としてペルオコシダーゼ標識した抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ製Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋　ＴＭ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）をかけ１時間放置したのち、ＰＢＳ＋で洗浄した。洗浄液を充分除去したのち、氷冷下ＤＡＢ基質液（ＤＡＫＯ製Ｌｉｑｕｉｄ　ＤＡＢ＋　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｒｏｍｏｇｅｎ　Ｓｙｓｔｅｍをマニュアルに従って調液したもの）で２分間反応させた。サンプル１〜４にはいずれも海島状のコラーゲン付着部が形成されえていることがわかった。１つの独立したコラーゲン付着部の面積はサンプル１及び３で０．０５ｍｍ２、サンプル２及び４では０．８ｍｍ２であった。サンプル３の染色の様子を図２に示す。
【００４８】
▲２▼ＸＰＳ
上記で得たサンプルの表面をＸＰＳのＮ原子、Ｃ原子、Ｏ原子それぞれの１ｓ軌道の化学シフトを解析することで最表層の化合物を評価したところ、サンプル１〜４のコラーゲンスポット部がコラーゲンからなること、及びコラーゲンスポット部以外の部分はサンプル１及び２ではキトサン、サンプル３及び４ではヒアルロン酸からなることがわかった。
【００４９】
（６）滅菌
上記で得られた担体に対してＵＶ滅菌３時間、電子線滅菌２０ｋＧｙの６種類の滅菌を施したところ、いずれも菌が確認されなかった。滅菌処理を施していないサンプルからは５９００個／ｍ２の菌が確認された。
【００５０】
比較例１
実施例１においてアルギン酸含水ゲルの代わりにポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）およびガラスを用いてコラーゲン修飾までの操作を行ったところ、コラーゲンの付着は確認されなかった。
【００５１】
実施例２：ガラスの修飾
担体としてガラスを用い、１０重量％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（和光純薬製）水溶液に浸漬し、５０℃で２時間放置したのち、流水で１時間洗浄してアミノ基導入ガラスを調製した。実施例１においてアルギン酸含水ゲルの代わりにこのアミノ基導入ガラスを用いてコラーゲン修飾までの操作を行ったところ、コラーゲンの付着が確認された。
【００５２】
実施例３：細胞の培養
次のようにして細胞培養担体を用いた細胞の培養を行なった。
（１）使用細胞
ＣＨＬ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｌｕｎｇ　Ｃｅｌｌ）
（２）使用培地
Ｅａｇｌｅ最小培地、１０％牛胎児血清
（３）細胞培養担体
実施例１のサンプル３及び４、並びに細胞培養担体をポリスチレン製細胞培養用シャーレの底面に両面テープで貼り付けたものをＵＶ滅菌した後、培地を添加して５分浸漬し、培地交換を３回繰り返したのち一晩放置して培地を細胞培養担体中に浸潤させた。ポリスチレン製細胞培養用シャーレのみを比較例として同様の操作を行った。
【００５３】
（４）細胞の播種
予め培養しておいた細胞をトリプシン処理で回収し、細胞濃度を５００００ｃｅｌｌ／ｍｌに調整した。セル及びシャーレ内の培地を捨てた後、この細胞液を細胞数１００００ｃｅｌｌ／ｃｍ２となるようにシャーレ内に播種して培地を添加した。
（５）培養
ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で２日間培養した。
【００５４】
（６）結果
いずれのサンプルも細胞接着性、細胞培養担体の剥離、及び細胞毒性に問題はなかった。実施例１のサンプル３及び４についてはコラーゲン付着部のみに細胞が海島状に培養され、細胞アレイが形成されていた。
【００５５】
試験例：アルギン酸カルシウム、キトサンおよびコラーゲンへの吸着評価
実施例１で調製したアルギン酸カルシウム含水ゲル、キトサン修飾したアルギン酸カルシウム含水ゲル、及びキトサン修飾したアルギン酸カルシウム含水ゲルを０．０３ｍｇ／ｍｌとなるように水で希釈したＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＩＣ（新田ゼラチン製ｔｙｐｅＩコラーゲン水溶液）に浸漬した後に水洗して調製したコラーゲン修飾ゲルを、コラーゲン、キトサン、ヒアルロン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウムのそれぞれ０．１重量％の水溶液に浸漬し、水洗したのちＸＰＳで吸着性を評価した。結果を表１に示す。キトサン上には評価した全ての高分子化合物が付着し、コラーゲン上には評価した全ての高分子化合物が付着しなかった。
【００５６】
【表１】
2004033136.tif 000002
【００５７】
【発明の効果】
本発明の細胞培養担体を用いて細胞を培養することにより細胞アレイを容易に形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞接着性ポリペプチド（コラーゲン）を担体表面にスポットして海島状の修飾部位を形成する様子を示した図である。
【図２】担体表面に形成された海島状のコラーゲン修飾部位を免疫染色した結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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