(57)【要約】【課題】ＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝活性を低下させる新たな多型を同定し、該多型を指標とした薬物代謝活性に関する検査方法を提供することを課題とする。【解決手段】３４種の確立された日本人由来の細胞株を用い、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の３種の非同義一塩基多型（Ｔ１８５Ｓ、Ｌ２９３ＰおよびＴ３６３Ｍ）を発見した。さらに、Ｔ１８５Ｓ変異型ＣＹＰ３Ａ４は、野生型ＣＹＰ３Ａ４と比べ、テストステロンを水酸化する活性が低下していることを見出した。従って、Ｔ１８５ＳをもたらすＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型を指標とすることで薬物代謝活性の検査が可能となった。また、ＣＹＰ３Ａ４により薬物が代謝されない場合、該薬物による副作用が出現しやすいと考えられる。よって、上記検査により該薬物による副作用の予測が可能になるものと大いに期待される。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法であって、薬物代謝活性を低下させるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型を検出する工程を含み、多型が検出された場合に、薬物代謝活性が低下しているものと判定される方法。
【請求項２】
被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査する方法であって、請求項１に記載の方法により薬物代謝活性が低下しているものと判定された場合に、副作用の可能性があるものと判定される方法。
【請求項３】
多型が一塩基多型である、請求項１または２に記載の検査方法。
【請求項４】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型が、ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異をもたらす多型である、請求項１または２に記載の検査方法。
【請求項５】
ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異が、トレオニンからセリンへの変異である、請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】
ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異をもたらすＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型が、該遺伝子の１５７２１番目の塩基部位の多型である、請求項４または５に記載の検査方法。
【請求項７】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の１５７２１番目の塩基部位の多型が、シトシンからグアニンへの変異である、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物が、テストステロン、イリノテカン、タキサン系抗癌剤、または、カルバマゼピンである、請求項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項９】
薬物がテストステロンであり、薬物代謝活性がテストステロン６β−水酸化活性である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）（ｉ）被検者から調製したＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）ヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における多型を検出する工程
【請求項１６】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドを含む、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子により代謝される薬物に対する代謝活性を検査するための試薬。
【請求項１７】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドを含む、被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査するための試薬。
【請求項１８】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子により代謝される薬物に対する代謝活性を検査するための試薬。
【請求項１９】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む、被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査するための試薬。
【請求項２０】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞、または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または細胞抽出液に対し、被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を接触させる工程
（ｃ）被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を接触させた細胞または細胞抽出液におけるＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝活性を検出する工程
（ｄ）被験化合物が接触させない場合の活性と比較して、（ｃ）で検出された活性を増加させる化合物を選択する工程
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）スーパーファミリーのメンバーは、臨床的、生理的および毒物学的に重要な化合物の膨大な配列（ａｒｒａｙ）を代謝している（Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，　Ｆ．　Ｐ．：　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　Ｉｎ　Ｏｒｔｉｚ　ｄｅ　Ｍｏｎｔｅｌｌａｎｏ，　Ｐ．　Ｒ．　（ｅｄ．）：　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　，　１９９５，　ｐｐ．　４７３−５３５．；　Ｗａｘｍａｎ，　Ｄ．　Ｊ．，　Ａｔｔｉｓａｎｏ，　Ｃ．，　Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，　Ｆ．　Ｐ．，　ａｎｄ　Ｌａｐｅｎｓｏｎ，　Ｄ．　Ｐ．：　Ｈｕｍａｎ　ｌｉｖｅｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　ｓｔｅｒｏｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　ｓｔｅｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ　６　β−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ−４５０　ｅｎｚｙｍｅ．　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　２６３，　４２４−４３６　（１９８８）；　Ｓｈｉｍａｄａ　Ｔ．　ａｎｄ　Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ　Ｆ．　Ｐ．：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ−４５０ＮＦ，　ｔｈｅ　ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ　ｏｘｉｄａｓｅ，　ｂｅｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｉｖｅｒ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ　Ｓ　Ａ　８６，　４６２−４６５　（１９８９））。ヒトＣＹＰ３Ａ４は、肝、腎および小腸における主要ＣＹＰであり（Ｗａｔｋｉｎｓ，　Ｐ．　Ｂ．：　Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ　ｔｅｓｔｓ　ｏｆ　ＣＹＰ３Ａ　ｅｎｚｙｍｅｓ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　４，　１７１−１８４　（１９９４））、かつＣＹＰにより代謝される薬物代謝の約５０％に関与している（Ｂｅｒｔｚ　Ｒ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｇｒａｎｎｅｍａｎ　Ｇ．Ｒ．：　Ｕｓｅ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄａｔａ　ｔｏ　ｅｓｔｉｍａｔｅ　ｔｈｅ　ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ　ｏｆ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．　Ｃｌｉｎ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．　３２，　２１０−２５８　（１９９７））。ＣＹＰ３Ａ４は発現レベルにおいて顕著な個体間変動を示すので（Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，　Ｆ．　Ｐ．：　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　Ｉｎ　Ｏｒｔｉｚ　ｄｅ　Ｍｏｎｔｅｌｌａｎｏ，　Ｐ．　Ｒ．　（ｅｄ．）：　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　，　１９９５，　ｐｐ．　４７３−５３５）、薬物療法は、選択された亜集団における治療失敗、有害作用、および毒性を含む、予測が困難な様々な臨床の転帰につながり得る。薬物代謝において認められた変動の原因のひとつは、遺伝的多型である。今日までに、いくつかのＣＹＰ３Ａ４の対立遺伝子が発見されており、これらは薬物代謝における個体間差の原因であ���う。
【０００３】
変異型ＣＹＰ３Ａ４対立遺伝子に関する最初の報告は、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂに関するものであり、その変化は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の５’−フランキング領域（Ａ−２９０Ｇ）に位置していた（Ｗａｌｋｅｒ　Ａ．　Ｈ．，　Ｊａｆｆｅ　Ｊ．　Ｍ．，　Ｇｕｎａｓｅｇａｒａｍ　Ｓ．，　Ｃｕｍｍｉｎｇｓ　Ｓ．　Ａ．，　Ｈｕａｎｇ　Ｃ．　Ｓ．，　Ｃｈｅｒｎ　Ｈ．　Ｄ．，　Ｏｌｏｐａｄｅ　Ｏ．　Ｉ．，　Ｗｅｂｅｒ　Ｂ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｒｅｂｂｅｃｋ　Ｔ．　Ｒ．：　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉａｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ＣＹＰ３Ａ４：　ｅｔｈｎｉｃ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｉｓｋ．　Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｒｉｅｆ　ｎｏ．　１９１．　Ｏｎｌｉｎｅ．　Ｈｕｍ　Ｍｕｔａｔ．　１２，　２８９　（１９９８））。その頻度は、アフリカ系アメリカ人（５３％）の方が、他の人種（白人９％、台湾人０％）よりも高い。Ｓａｔａらは、Ｓｅｒ２２２Ｐｒｏ置換を伴うＣＹＰ３Ａ４＊２対立遺伝子の頻度が、白人系フィンランド人集団では２．７％であるが、これは中国人や黒人集団においては認められないことを報告している（Ｓａｔａ　Ｆ．，　Ｓａｐｏｎｅ　Ａ．，　Ｅｌｉｚｏｎｄｏ　Ｇ．，　Ｓｔｏｃｋｅｒ　Ｐ．，　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｖ．　Ｐ．，　Ｚｈｅｎｇ　Ｗ．，　Ｒａｕｎｉｏ　Ｈ．，　Ｃｒｅｓｐｉ　Ｃ．Ｌ．　ａｎｄ　Ｇｏｎｚａｌｅｚ　Ｆ．Ｊ．：　ＣＹＰ３Ａ４　ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｅｘｏｎｓ　７　ａｎｄ　１２：　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａｎ　ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉａｎｔ　ｗｉｔｈ　ａｌｔｅｒｅｄ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒ．　６７，　４８−５６　（２０００）；　Ｐｅｌｔｏｎｅｎ　Ｌ．，　Ｊａｌａｎｋｏ　Ａ．，　ａｎｄ　Ｖａｒｉｌｏ　Ｔ．：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｉｎｎｉｓｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｈｅｒｉｔａｇｅ．　Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　８，　１９１３−１９２３　（１９９９））。この変異は、野生型と比較した場合のニフェジピン固有クリアランスの低下につながる。他方で、Ｍｅｔ４４５Ｔｈｒを伴うＣＹＰ３Ａ４＊３対立遺伝子も、中国人被検者１名において発見された（Ｓａｔａ　Ｆ．，　Ｓａｐｏｎｅ　Ａ．，　Ｅｌｉｚｏｎｄｏ　Ｇ．，　Ｓｔｏｃｋｅｒ　Ｐ．，　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｖ．　Ｐ．，　Ｚｈｅｎｇ　Ｗ．，　Ｒａｕｎｉｏ　Ｈ．，　Ｃｒｅｓｐｉ　Ｃ．Ｌ．　ａｎｄ　Ｇｏｎｚａｌｅｚ　Ｆ．Ｊ．：ＣＹＰ３Ａ４　ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｅｘｏｎｓ　７　ａｎｄ　１２：　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａｎ　ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉａｎｔ　ｗｉｔｈ　ａｌｔｅｒｅｄ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒ．　６７，　４８−５６　（２０００））。
【０００４】
また、ごく最近になって、３種の新たな変異が認められた。２種は、Ｉｌｅ１１８ＶａｌおよびＰｒｏ２１８Ａｒｇ置換を伴う点変異であり、残りの１種はエクソン９の初期（ｅａｒｌｙ）終始コドンのフレームシフト変異により引き起こされた挿入であった（Ｈｓｉｅｈ　Ｋ．　Ｐ．，　Ｌｉｎ　Ｙ．Ｙ．，　Ｃｈｅｎｇ　Ｃ．Ｌ．，　Ｌａｉ　Ｍ．Ｌ．，　Ｌｉｎ　Ｍ．Ｓ．，　Ｓｉｅｓｔ　Ｊ．Ｐ．　ａｎｄ　Ｈｕａｎｇ　Ｊ．Ｄ．　：　Ｎｏｖｅｌ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＣＹＰ３Ａ４　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ．　Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂ．　Ｄｉｓｐｏｓ．　２９，　２６８−２７３　（２００１））。これらの変異の結果、ＣＹＰ３Ａ４の典型的反応であるコルチゾールの６β−水酸化が低下することが知られている（Ｇｅｄ　Ｃ．，　Ｒｏｕｉｌｌｏｎ　Ｊ．Ｍ．，　Ｐｉｃｈａｒｄ　Ｌ．，　Ｃｏｍｂａｌｂｅｒｔ　Ｊ．，　Ｂｒｅｓｓｏｔ　Ｎ．，　Ｂｏｒｉｅｓ　Ｐ．，　Ｍｉｃｈｅｌ　Ｈ．，　Ｂｅａｕｎｅ　Ｐ．　ａｎｄ　Ｍａｕｒｅｌ　Ｐ．：Ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｕｒｉｎａｒｙ　ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　６ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｒｔｉｓｏｌ　ａｓ　ａ　ｍａｒｋｅｒ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０ＩＩＩＡ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．　Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　２８，　３７３−３８７　（１９８９））。
【０００５】
このようにＣＹＰ３Ａ４の変異は薬物代謝活性の低下を引き起こし、該変異を有している被検者は、該薬物に対する解毒能が低下しているものと考えられる。従って、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を医薬品として投与する場合、ＣＹＰ３Ａ４の変異を有する患者に副作用が発現し易いことが想起される。この副作用を忌避するためには、薬物代謝活性の低下を引き起こすようなＣＹＰ３Ａ４上の変異（多型）の同定が期待されていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝活性を低下させる新たな多型を同定し、該多型を指標とした薬物代謝活性に関する検査方法を提供することである。より詳細には、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法、該検査方法に使用するための試薬、および、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、３４種の確立された日本人由来の細胞株を用い、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の３種の一塩基多型（ＳＮＰ）を発見した。これらの３種のＳＮＰ（Ｔ１８５Ｓ、Ｌ２９３ＰおよびＴ３６３Ｍ）は、すでにその配列が報告されており、Ｌ２９３Ｐ変異およびＴ３６３Ｍ変異は触媒活性との関連が明らかにされていた。これに対し、Ｔ１８５Ｓ変異と触媒活性の関連については明確ではなかった。本発明者らは、野生型ＣＹＰ３Ａ４およびＴ１８５Ｓ変異型ＣＹＰ３Ａ４におけるテストステロンの水酸化の測定を、哺乳類の発現システムを用いて実施した。ＨｅｐＧ２細胞におけるｃＤＮＡが媒介した一過性発現において、野生型ＣＹＰ３Ａ４と比べ変異型ＣＹＰ３Ａ４であるＴ１８５Ｓによるテストステロン６β−水酸化、２β−水酸化、および１５β−水酸化は低下していた。ウェスタンブロット分析により、Ｔ１８５Ｓ変異型ＣＹＰ３Ａ４量は野生型ＣＹＰ３Ａ４量に比べてはるかに低いことが示唆された。しかしノーザンブロット分析では、それらのｍＲＮＡレベル間に有意差を示さなかった。従って、ＣＹＰ３Ａ４におけるＴ１８５Ｓ置換は、タンパク質発現効率または酵素タンパク質の安定性のいずれかに影響を及ぼすものと考えられる。
【０００８】
以上の結果から、Ｔ１８５ＳをもたらすＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型を指標とすることにより、薬物代謝活性の検査が可能となった。また、ＣＹＰ３Ａ４により薬物が代謝されない場合、該薬物による副作用が出現しやすいと考えられる。よって、上記検査により該薬物による副作用の予測が可能になるものと大いに期待される。
【０００９】
即ち、本発明は、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法に関し、より具体的には、
〔１〕　ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法であって、薬物代謝活性を低下させるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型を検出する工程を含み、多型が検出された場合に、薬物代謝活性が低下しているものと判定される方法、
〔２〕　被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査する方法であって、〔１〕に記載の方法により薬物代謝活性が低下しているものと判定された場合に、副作用の可能性があるものと判定される方法、
〔３〕　多型が一塩基多型である、〔１〕または〔２〕に記載の検査方法、
〔４〕　ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型が、ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異をもたらす多型である、〔１〕または〔２〕に記載の検査方法、
〔５〕　ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異が、トレオニンからセリンへの変異である、〔４〕に記載の検査方法、
〔６〕　ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異をもたらすＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型が、該遺伝子の１５７２１番目の塩基部位の多型である、〔４〕または〔５〕に記載の検査方法、
〔７〕　ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の１５７２１番目の塩基部位の多型が、シトシンからグアニンへの変異である、〔６〕に記載の検査方法、
〔８〕　ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物が、テストステロン、イリノテカン、タキサン系抗癌剤、または、カルバマゼピンである、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の検査方法、
〔９〕　薬物がテストステロンであり、薬物代謝活性がテストステロン６β−水酸化活性である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法、
〔１０〕　以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
〔１１〕　以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔１２〕　以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔１３〕　以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１４〕　以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１５〕　以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）（ｉ）被検者から調製したＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）ヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における多型を検出する工程〔１６〕　ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドを含む、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子により代謝される薬物に対する代謝活性を検査するための試薬、
〔１７〕　ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドを含む、被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査するための試薬、
〔１８〕　ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子により代謝される薬物に対する代謝活性を検査するための試薬、
〔１９〕　ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む、被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査するための試薬、
〔２０〕　以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞、または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または細胞抽出液に対し、被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を接触させる工程
（ｃ）被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を接触させた細胞または細胞抽出液におけるＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝活性を検出する工程
（ｄ）被験化合物が接触させない場合の活性と比較して、（ｃ）で検出された活性を増加させる化合物を選択する工程、を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らにより、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２０９３８９のヌクレオチド配列中１番目の塩基Ａを１番目とする）の１５７２１番目の塩基ＣがＧに、２０１７８番目の塩基ＴがＣに、または、２１９７３番目の塩基ＣがＴに変異することにより、各々、１８５番目のアミノ酸残基がトレオニンからセリン、２９３番目がロイシンからプロリン、３６３番目がトレオニンからメチオニンに変異したＣＹＰ３Ａ４が見出された（各々、ｃ１５７２１ｇ／Ｔ１８５Ｓ、ｔ２０１７８ｃ／Ｌ２９３Ｐ、ｃ２１９７３ｔ／Ｔ３６３Ｍ）。このうち、ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸が変異したＴ１８５Ｓ　変異型ＣＹＰ３Ａ４は、薬物代謝との関連が報告されていないものであった。この変異の結果、ＣＹＰ３Ａ４量の低下またはＣＹＰ３Ａ４の安定性の低下により、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物の生体内での代謝が抑制され、該薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現しやすいと考えられる。従って、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を投与する前に上記の変異について検査し、その結果に基づき該薬物の投与量を調節すること等により、該薬物の副作用を予め忌避することが可能となる。なお、本発明においては、野生型ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の塩基配列を配列番号：１に記載し、野生型ＣＹＰ３Ａ４のアミノ酸配列を配列番号：２に記載する。
【００１１】
本発明は、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法であって、薬物代謝活性を低下させるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型を検出する工程を含み、多型が検出された場合に、薬物代謝活性が低下しているものと判定される方法を提供する。さらに、該方法により薬物代謝活性が低下しているものと判定された場合に、被検者についてＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性があるものと判定される検査方法を提供する。
【００１２】
本発明におけるＣＹＰ３Ａ４は、臨床的、生理的および毒物学的に重要な化合物の膨大な配列（ａｒｒａｙ）を代謝しているチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）スーパーファミリーのメンバーの一つである。特に、ヒトＣＹＰ３Ａ４は、肝、腎および小腸における主要ＣＹＰであり、かつＣＹＰにより代謝される薬物代謝の約５０％に関与している。本発明におけるＣＹＰ３Ａ４とは、ＣＹＰ３Ａ４と同様な活性を有するタンパク質をも含み、そのアミノ酸配列は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に限定されるものではない。例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログであって、機能的に同等なタンパク質も本発明におけるＣＹＰ３Ａ４に含まれる。機能的に同等とは、通常、薬物代謝活性が低下していることを指し、より具体的には、薬物がテストステロンである場合には、テストステロンに対する６β水酸化活性が低下していることを言う。
【００１３】
本発明において、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物とは、ＣＹＰ３Ａ４の作用により生体内で代謝される化合物、または該化合物を有効成分として含有する医薬組成物を言う。例えば、テストステロン、イリノテカン、タキサン系抗癌剤（例えばドセタキセルまたはパクリタキセル）、およびカルバマゼピン、並びに、これらの化合物を有効成分として含む医薬組成物等が挙げられるが、これらに特に限定されない。
【００１４】
ＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝活性は、通常、薬物を水酸化することにより不活性化させる活性として測定することができる。例えば、薬物がテストステロンの場合は、テストステロン６β−水酸化活性を測定することにより、ＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝活性を評価することができる。上記水酸化活性の測定は、当業者においては一般的な方法、例えば、水酸化された生成物をＨＰＬＣによって検出する方法により実施することができる。より具体的には、後述の実施例に示す方法により上記水酸化活性を測定することができる。
【００１５】
多型とは、遺伝学的には、人口中１％以上の頻度で存在している１遺伝子におけるある塩基の変化と一般的には定義される。しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、１％未満の塩基の変化であっても「多型」に含む。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）から数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。さらに、多型部位の数についても特に制限はなく、１個以上の多型を有していてもよい。
【００１６】
本発明における多型としては、好ましくはＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異をもたらすようなＣＹＰ３Ａ４遺伝子上の多型であり、より好ましくはＣＹＰ３Ａ４遺伝子の１５７２１番目の塩基部位の多型であり、さらに好ましくはＣＹＰ３Ａ４遺伝子の１５７２１番目の塩基がＣからＧに変異し、その結果、ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸残基をトレオニンからセリンへと変異する多型を示すことができる。
【００１７】
本発明の検査方法において、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子に生じた多型の検出は、例えば、被検者のＣＹＰ３Ａ４遺伝子の塩基配列を直接決定することにより行うことができる。この方法においてはまず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。ゲノムＤＮＡ試料は、例えば被検者の肝臓、腎臓、小腸などの組織または細胞や血液、口腔粘膜、皮膚、毛髪等から抽出した染色体ＤＮＡを基に、あるいはイントロンを含まないｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを基に調製することができる。
【００１８】
本方法においては、次いで、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことも可能である。本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００１９】
本方法においては、次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。本方法における対照とは、正常な（野生型）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の配列を言う。一般に健常人のＣＹＰ３Ａ４遺伝子の配列は正常であるものと考えられることから、上記工程の「対照と比較する」とは、通常、健常人のＣＹＰ３Ａ４遺伝子の配列と比較することを意味するが、ＧｅｎＢａｎｋに野生型として登録されているＣＹＰ３Ａ４遺伝子の配列（ＡＦ２０９３８９）と比較してもよい。
【００２０】
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【００２１】
例えば、本発明における多型の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。
【００２２】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００２３】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００２４】
該方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｏｎｙｍｏｕｓ　Ａｌｕ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｏｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１１．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．　１９９２　Ｊａｎ　１；　１２（１）：　１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒｓ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．　１９９１　Ａｕｇ　１；　６（８）：　１３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ　ＰＣＲ−ＳＳＣＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．　１９９５　Ａｐｒ　１；　４（５）：　２７５−２８２．）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
【００２５】
具体的には、まず、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００２６】
さらに別の方法は、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００２７】
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：　ＤＧＧＥ法）等を例示することができる。ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。この部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを本発明のプライマー等を用いたＰＣＲ法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するＤＮＡ断片の場合、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
【００２８】
さらに別の方法は、まず、被検者から調製したＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡ、および該ＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する。次いで、該ＤＮＡと該基板を接触させる。さらに、該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子多型を検出する。
【００２９】
このような方法としては、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５）が例示できる。被検者からのＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。染色体ＤＮＡから本方法のＤＮＡ試料を調製するには、例えばＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によってＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを調製することも可能である。調製したＤＮＡ試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。
【００３０】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
【００３１】
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−　ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
【００３２】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００３３】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、野生型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子、あるいは多型を有するＣＹＰ３Ａ４遺伝子と特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、検出するＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含むＤＮＡ、または多型を有するＣＹＰ３Ａ４遺伝子に対し、完全に相補的である必要はない。
【００３４】
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。
【００３５】
本発明においては、次いで、該ｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、ＤＮＡ試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
【００３６】
本発明においては、次いで、該ＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。
【００３７】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。また、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだＣＹＰ３Ａ４遺伝子ｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００３８】
その他の本発明の多型の検出が可能な方法としては、
１）質量分析法による方法（Ｇｒｉｆｆｉｎ　ＴＪ　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ　ＬＭ，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　ｖｏｌ．１８，　ｐｐ７７−８４，　（２０００））、
２）Ｔａｑ−Ｍａｎ　ＰＣＲによる方法（Ｌｉｖａｋ　ＫＪ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ａｎａｌ．　ｖｏｌ．１４，　ｐｐ１４３−１４９，　（１９９９）、ＣＹＰへの応用例：Ｈｉｒａｔｓｕｋａ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．　ｖｏｌ．２３，　ｐｐ１１３１−１１３５，　（２０００））、
３）Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによる方法（Ａｈｍａｄｉａｎ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ｖｏｌ．　２８０，　ｐｐ１０３−１１０，　（２０００））、
４）Ｉｎｖａｄｅｒ法による方法（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ　Ｖ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　ｖｏｌ．　１７，　ｐｐ２９２−２９６，　（１９９９）、メディカルドゥ社発行「遺伝子医学」　ｖｏｌ．４，　Ｎｏ．１，　ｐｐ４４−５１およびｐｐ６８−７２　（２０００））
を挙げることができる。以上、種々の検出方法を例示したが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明はまた、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性を検査するための試薬を提供する。このような試薬は、被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査するための試薬になりうる。
【００４０】
本発明の試薬の一つの態様は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドを含む試薬である。
【００４１】
該ポリヌクレオチドは、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該ポリヌクレオチドは、検出するＣＹＰ３Ａ４遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【００４２】
該ポリヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該ポリヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、多型部分を含むＣＹＰ３Ａ４遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００４３】
また、上記ポリヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成ポリヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば市販のポリヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、ポリヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。また、本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、基板として用いても良い。
【００４６】
また、本発明における検査薬の別の態様は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む試薬である。プライマーの長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、多型部分を含むＣＹＰ３Ａ４遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００４７】
上記の試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００４８】
また本発明は、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４９】
本方法においては、まず、１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞、または細胞抽出液を提供する。用いられる「細胞」の由来としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等に由来する細胞が挙げられるが、これらの由来に制限されない。「１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞」としては、内因性の１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４遺伝子を発現している細胞、または外因性の遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外因性の１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４遺伝子が発現した細胞は、通常、該遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。一方、「１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞抽出液」は、当業者であれば周知の方法で作製することができる。例えば市販の試験管内転写翻訳系に１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４遺伝子が挿入された発現ベクターを添加することで調製することができる。
【００５０】
本方法においては、次いで、１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞、または細胞抽出液に対し、被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を接触させる。
【００５１】
本方法に用いる被験化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
【００５２】
本方法に用いるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物としては、上述の薬物などが挙げられるが、テストステロンを好適に使用することができる。
【００５３】
１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞への被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物の「接触」は、通常、該遺伝子を発現する細胞の培養液に被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。また、１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞抽出液への被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物の「接触」方法としては特に制限はなく、例えば該抽出液に直接添加することによって行う。被験化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞または該細胞抽出液へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
【００５４】
本方法においては、次いで、被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を接触させた細胞または細胞抽出液におけるＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝活性を検出する。ＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝活性の検出は、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物（例えばテストステロン、イリノテカン、タキサン系抗癌剤（例えばドセタキセルまたはパクリタキセル）、または、カルバマゼピン）を水酸化する活性を測定することにより実施できるが、薬物としてテストステロンを用いた場合は、好ましくはテストステロン６β−水酸化活性を測定する。
【００５５】
本方法においては、次いで、被験化合物が接触させない場合の活性と比較して、検出された活性を増加させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、本発明の多型を有する被検者において、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物による副作用を防止または軽減する医薬品候補化合物である。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法により取得される医薬品候補化合物は、分子自体を被検者に投与することも可能であるが、一般的に公知の製剤学的方法により製剤化して投与することも可能である。例えば経口投与の場合、錠剤、散剤、カプセル剤、懸濁液剤等、経皮投与の場合、ハップ剤等を示すことができるが、これらに制限されない。投与方法は、治療効果や予防効果を示し得る限り特に制限はなく、例えば経口投与、経皮投与、注射による血中投与等が考えられる。これらの化合物がＤＮＡである場合、該ＤＮＡを生体内に投与する際には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクター、或いは、ｎａｋｅｄ　ＤＮＡの形態で利用することができる。投与方法としては、ｉｎ　ｖｉｖｏ法およびｅｘ　ｖｉｖｏ法を例示することができる。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００５８】
（１）試薬
テストステロンおよび１１α−ヒドロキシプロゲステロンは、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）から入手した。ヤギ抗ヒトＣＹＰ３Ａ４ポリクローナル抗体は、第一化学薬品株式会社（東京、日本）から購入した。ホースラディシュペルオキシダーゼに複合したウサギ抗ヤギＩｇＧは、（株）医学生物学研究所（名古屋、日本）から購入した。［α−３２Ｐ］−デオキシＣＴＰは、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，　英国）から得た。他の化学物質および試薬は全て、最高級を利用した。
【００５９】
（２）ＤＮＡ抽出
３４名の個別の日本人に由来する確立された細胞株を、ヒューマンサイエンス研究資源（ＨＳＲＲ）バンク（大阪、日本）または国立医薬品食品衛生研究所の厚生労働省研究資源バンク（東京、日本）から入手した。これらの細胞を、バンクの指示に従い培養した。ＤＮＡ抽出は、血液・細胞培養ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｈｉｌｄｅｎ，　独国）を用い、およそ５　Ｘ　１０７個の細胞から行った。
【００６０】
（３）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の配列決定
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマーは、Ｓａｔａらの報告（Ｓａｔａ　Ｆ．，　Ｓａｐｏｎｅ　Ａ．，　Ｅｌｉｚｏｎｄｏ　Ｇ．，　Ｓｔｏｃｋｅｒ　Ｐ．，　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｖ．　Ｐ．，　Ｚｈｅｎｇ　Ｗ．，　Ｒａｕｎｉｏ　Ｈ．，　Ｃｒｅｓｐｉ　Ｃ．Ｌ．　ａｎｄ　Ｇｏｎｚａｌｅｚ　Ｆ．Ｊ．：　ＣＹＰ３Ａ４　ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｅｘｏｎｓ　７　ａｎｄ　１２：　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａｎ　ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉａｎｔ　ｗｉｔｈ　ａｌｔｅｒｅｄｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒ．　６７，　４８−５６　（２０００））を基にデザインした。ＰＣＲは、先に記されたように行った（Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ．，　Ｓａｉｔｏ　Ｙ．，　Ｍｕｒａｙａｍａ　Ｎ．，　Ｓａｅｋｉ　Ｍ．，　Ｓｏｙａｍａ　Ａ．，　Ｓａｉ　Ｋ．，　Ｏｚａｗａ　Ｓ．　ａｎｄ　Ｓａｗａｄａ　Ｊ．：　Ａｐｐａｒｅｎｔ　ｌｏｗ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｘｉｍａｌ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　（ＣＹＰ）　３Ａ５　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．　Ｂｉｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃ．　Ｂｕｌｌ．　２４，　９５４−９５７　（２００１））。
【００６１】
（４）組換えＤＮＡ操作
１．５ｋｂの完全長野生型ＣＹＰ３Ａ４　ｃＤＮＡを含むｐＵＣプラスミド（ｐＵＣ３Ａ４）は、Ｄｒ．　Ｆ．　Ｊ．　Ｇｏｎｚａｌｅｚより入手した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ　Ｆ．　Ｊ．，　Ｓｃｈｍｉｄ　Ｂ．　Ｊ．，　Ｕｍｅｎｏ　Ｍ．，　Ｍｃｂｒｉｄｅ　Ｏ．　Ｗ．，　Ｈａｒｄｗｉｃｋ　Ｊ．　Ｐ．，　Ｍｅｙｅｒ　Ｕ．Ａ．，　Ｇｅｌｂｏｉｎ　Ｈ．　Ｖ．　ａｎｄ　Ｉｄｌｅ　Ｊ．　Ｒ．：　Ｈｕｍａｎ　Ｐ４５０ＰＣＮ１：　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃＤＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｈａｔ　Ｐ４５０ＰＣＮ１　ｉｓ　ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ　ｏｘｉｄａｓｅ．　ＤＮＡ　７，　７９−８６　（１９８８））。Ｔ１８５Ｓ、Ｌ２９３ＰおよびＴ３６３Ｍをコードしている変異型ＣＹＰ３Ａ４　ｃＤＮＡを、ｐＵＣ３Ａ４プラスミドＤＮＡを鋳型とし、Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ位置指定突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）を用い構築した。野生型ＣＹＰ３Ａ４　ｃＤＮＡおよびその変異型ＣＹＰ３Ａ４ｃＤＮＡの配列を、ＤＮＡシークエンス法により確認した。前向きプライマー：５’−ＧＴＡＡＧＧＡＡＡＧＴＡＧＴＧＡＴＧＧＣＴ−３’（配列番号：３）および後向きプライマー５’−ＡＧＴＣＣＴＴＴＡＧＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号：４）をデザインし、野生型ＣＹＰ３Ａ４　ｃＤＮＡおよびその変異型ＣＹＰ３Ａ４　ｃＤＮＡの全１．５ｋｂのコード配列を増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ３．１ベクターに、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｃａｒｌｓｂａｄ，　ＣＡ）を用い、直接クローニングした。野生型ＣＹＰ３Ａ４　ｃＤＮＡおよび変異型ＣＹＰ３Ａ４　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を再度確認した。
【００６２】
（５）細胞培養および一過性トランスフェクション
ヒト肝細胞癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を、ペニシリン１００単位、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの変更イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）において、５％　ＣＯ２、３７℃の加湿した大気中で培養した。ＨｅｐＧ２細胞（１ｘ１０５細胞）を、３５ｍｍ培養皿に播種した。２４時間培養した後、細胞を血清非含有のＯＰＴＩ　ＭＥＭ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ）ですすぎ、その後トランスフェクションした。先に説明された方法（Ｍｕｒａｙａｍａ　Ｎ．，　Ｓａｉ　Ｋ．，　Ｎａｋａｊｉｍａ　Ｙ．，　Ｋａｎｉｗａ　Ｎ．，　Ｏｚａｗａ　Ｓ．，　Ｏｈｎｏ　Ｙ．　ａｎｄ　Ｓａｗａｄａ　Ｊ．　：　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＹＰ２Ａ６　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｕｇｍｅｎｔｓ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｔｅｇａｆｕｒ．　Ｊａｐ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　９２，　５２４−５２８　（２００１））に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＰＬＵＳ試薬（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、ｐＣＲ３．１／ＣＹＰ３Ａ４、ｐＣＲ３．１／Ｔ１８５Ｓ、ｐＣＲ３．１／Ｌ２９３ＰおよびｐＣＲ３．１／Ｔ３６３Ｍプラスミド１μｇをトランスフェクションした。
【００６３】
（６）テストステロンの水酸化アッセイ
トランスフェクションの２４時間後、培養培地を、１００μＭテストステロンを含有する新鮮なＤ−ＭＥＭ（１ｍｌ／皿）と交換し、かつこれらの細胞を更に３時間培養した。インキュベーション後、培地をガラス製チューブに移し、これに１１α−ヒドロキシプロゲステロンを内部標準として添加し、かつテストステロンの代謝産物を、酢酸エチル２ｍｌで抽出した。６β−ヒドロキシテストステロン、２β−ヒドロキシテストステロンおよび１５β−ヒドロキシテストステロンの生成を、先に記されたように（Ｍｕｒａｙａｍａ　Ｎ．，　Ｓｈｉｍａｄａ　Ｍ．，　Ｙａｍａｚｏｅ　Ｙ．，　Ｓｏｇａｗａ　Ｋ．，　Ｎａｋａｙａｍａ　Ｋ，　Ｆｕｊｉｉ−Ｋｕｒｉｙａｍａ　Ｙ．　ａｎｄ　Ｋａｔｏ　Ｒ．：　Ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　ｏｎ　ｌｉｖｅｒ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　３２８，　１８４−１９２　（１９９６））ＨＰＬＣで測定した。
【００６４】
（７）ＣＹＰ３Ａ４タンパク質の免疫ブロッティング
ＨｅｐＧ２細胞中の野生型ＣＹＰ３Ａ４および変異型ＣＹＰ３Ａ４のレベルを測定するために、テストステロン６β−水酸化の測定に使用した細胞から細胞溶解液を調製した。これらのタンパク質濃度は、タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，　Ｈｅｒｃｕｅｓ，　ＣＡ）を用いて測定した。細胞溶解液（２５μｇタンパク質）を、ＳＤＳ−試料緩衝液中に溶解し、１０％　ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、かつニトロセルロース膜に移した（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ　Ｉｎｃ．　Ｄａｓｓｅｌ，　独国）（Ｔｏｗｂｉｎ　Ｈ．，　Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ　Ｔ．　ａｎｄ　Ｇｏｒｄｏｎ　Ｊ．：　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ　ｔｏ　ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｓｈｅｅｔｓ：　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ　Ｓ　Ａ．　７６，　４３５０−４３５４　（１９７９））。免疫染色のために、ヤギ抗ヒトＣＹＰ３Ａ４ポリクローナル抗体（第一化学薬品（株））を一次抗体とし、かつホースラディッシュペルオキシダーゼに複合したウサギ抗ヤギＩｇＧ（（株）医学生物学研究所）を二次抗体として使用したＣＹＰ３Ａ４を、化学発光増強（ＥｎｈａｎｃｅｄＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）キット（Ａｍｅｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で可視化した（Ｐａｍｐｏｒｉ　Ｎ．　Ａ．，　Ｐａｍｐｏｒｉ　Ｍ．　Ｋ．　ａｎｄ　Ｓｈａｐｉｒｏ　Ｂ．　Ｈ．：　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｒｅｄｕｃｅｓ　ｔｈｅ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｎｏｉｓｅ　ｏｎ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１８，　５８８−５９０　（１９９５））。
【００６５】
（８）ノーザンブロット
総ＲＮＡを、培養した細胞（１ｘ１０７〜１ｘ１０８細胞）から、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従い使用し単離した。ノーザンブロット分析は、標準の方法を用いて行った（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．，　ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９，　ｐｐ．　７．３７−７．５７．）。ＣＹＰ３Ａ４のハイブリダイゼーションプローブとして、完全長ＣＹＰ３Ａ４　ｃＤＮＡを、ｐＣＲ３．１／ＣＹＰ３Ａ４のＰＣＲにより増幅し、かつ得られたＰＣＲ産物をゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）ｃＤＮＡも、同じくＲＴ−ＰＣＲＣｏｎｔｒｏｌ　Ａｍｐｌｉｍｅｒ　Ｓｅｔｓ　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ）を用い、ＰＣＲ合成した。調製したＰＣＲ産物を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ　ＩＩ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、［α−３２Ｐ］デオキシＣＴＰで標識し、かつＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０カラム（Ｇ−５０　Ｍｉｃｒｏ　Ｃｏｌｕｍｎ，　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製した。
【００６６】
［実施例１］　　生体内代謝に関与するＣＹＰ３Ａ４の遺伝子多型の検出
本発明者らは、テストステロン、イリノテカン等の生体内の代謝に関与するＣＹＰ３Ａ４の遺伝子多型を検出を試みた。その結果、個別の日本人３４名から確立された細胞株から、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子のコード領域に３種の非同義一塩基多型（ＳＮＰ）を発見した。これら３種のＳＮＰは各々独立して、表１に記した各３種の細胞株に個別に認められた。これらの３種のＳＮＰ（Ｔ１８５Ｓ、Ｌ２９３ＰおよびＴ３６３Ｍ）は、すでにその配列が報告されており、Ｌ２９３ＰおよびＴ３６３Ｍは触媒活性との関連が明らかにされていた（Ｄａｉ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｅｘｐ　Ｔｈｅｒ，　２００１，　２９９，　８２５−８３１．、Ｅｉｓｅｌｔ，　Ｒ．　ｅｔａｌ．，　Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，　２００１，　１１，　４４７−４５８．）。これに対し、Ｔ１８５Ｓとの触媒活性の差異については明確ではなかった。なお、ｃ１５７２１ｇ、ｔ２０１７８ｃおよびｃ２１９７３ｔの周辺配列を、それぞれ、配列番号：５、６および７に示す。
【００６７】
【表１】
2004000004.tif 000002
【００６８】
［実施例２］　　野生型ＣＹＰ３Ａ４およびその変異型ＣＹＰ３Ａ４の触媒活性の評価
野生型ＣＹＰ３Ａ４　（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．，　ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９，　ｐｐ．　７．３７−７．５７．）およびその変異型ＣＹＰ３Ａ４の触媒活性を評価するために、まず、完全長野生型ＣＹＰ３Ａ４断片より、Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）を用いて３個の変異型ＣＹＰ３Ａ４（Ｔ２８５Ｓ、Ｌ２９３Ｐ、Ｔ３６３Ｍ）を作製した。さらに、野生型ヒトＣＹＰ３Ａ４並びにＴ１８５Ｓ、Ｌ２９３ＰおよびＴ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４をコードしている完全長ｃＤＮＡ挿入断片を含むｐＣＲ３．１プラスミドを調製した。このプラスミドＤＮＡを、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＰＬＵＳ試薬を用いてトランスフェクションした。この一過性トランスフェクションシステムを、ウェスタンブロット法により評価し、最大レベルのＣＹＰ３Ａ４発現がトランスフェクションの２４時間後に認められることがわかった。従って、野生型ＣＹＰ３Ａ４および３種の変異型ＣＹＰ３Ａ４のテストステロンヒドロキシラーゼ活性を、トランスフェクションの２４時間後の培養物にテストステロンを添加し、かつ３時間培養物の上清中の代謝物を定量することにより測定した。
【００６９】
その結果、高いテストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性が、野生型ＣＹＰ３Ａ４が発現しているＨｅｐＧ２細胞において認められる一方（表２）、非常に低レベルの６β−水酸化（２３．４±６．９ｐｍｏｌ／時／皿）がｐＣＲ３．１ベクターをトランスフェクションしたヌル細胞において認められた。テストステロン６β−水酸化活性は３種の変異型ＣＹＰ３Ａ４全てにおいて認められたが、Ｔ１８５ＳおよびＴ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４は、野生型ＣＹＰ３Ａ４と比べて有意に低い１皿あたりの活性を示した（表２）。他方Ｌ２９３Ｐ変異型ＣＹＰ３Ａ４は、野生型ＣＹＰ３Ａ４よりも約１．５倍高いテストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性を示した（表２）。同様の傾向が、２β−および１５β−水酸化活性についても認められた。野生型ＣＹＰ３Ａ４と３種の変異型ＣＹＰ３Ａ４の間で、６β−ヒドロキシラーゼ活性の総テストステロンヒドロキシラーゼ活性（６β−ヒドロキシラーゼ、２β−ヒドロキシラーゼおよび１５β−ヒドロキシラーゼ）に対する比には、有意差は認められなかった（表２）。トランスフェクションの２４時間後の細胞数において著しい変化を示した変異型ＣＹＰ３Ａ４はなかった。まとめると、テストステロン６β−水酸化活性の低下は、Ｔ１８５ＳおよびＴ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４において認められたが、Ｌ２９３Ｐ変異型ＣＹＰ３Ａ４では認められなかった。ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸残基がトレオニンからセリンに変化した多型の機能変化をテストステロン６β−水酸化活性の減弱として捉えたことは本実施例が初めてである。
【００７０】
【表２】
2004000004.tif 000003
【００７１】
なお、表２に示す活性は、ｐｍｏｌ産物／時／皿として表示されている。また、６β−ＯＨ、２β−ＯＨおよび１５β−ＯＨは、それぞれ、６β−水酸化、２β−水酸化および１５β−水酸化を示す。また、＊はｐ＜０．００１対野生型（スチューデントｔ−検定）を示す。さらに、ＮＤは活性が検出されなかったことを意味する。
【００７２】
［実施例３］　　野生型ＣＹＰ３Ａ４および変異型ＣＹＰ３Ａ４の免疫ブロット分析解析
次に本発明者らは、ＨｅｐＧ２細胞において発現された野生型ＣＹＰ３Ａ４および変異型ＣＹＰ３Ａ４の免疫ブロット分析を行った。先のテストステロン水酸化の測定に使用したものと同じ細胞を分析した。免疫ブロット分析は、野生型ＣＹＰ３Ａ４（図１Ａ、レーン２）および変異型ＣＹＰ３Ａ４（図１Ａ、レーン３〜８）を発現している細胞において、５２ｋＤａに移動した免疫反応性タンパク質の発現を確認した（Ｄｏｎａｎｓｋｉ　Ｔ．　Ｌ．，　Ｌｉｕ　Ｊ．，　Ｈａｒｌｏｗ　Ｇ．　Ｒ　ａｎｄ　Ｈａｌｐｅｒｔ　Ｊ．　Ｒ．：　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｓｕｂｓｔｒａｒｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　４　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｙｒｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　３Ａ４：　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｓｔｅｒｏｉｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　α−ｎａｐｈｔｈｏｆｌａｖｏｎｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｈｙｓ．　３５０，　２２３−２３２　（１９９８））が、ヌル細胞（図１Ａ、レーン１）においてはこれを確認しなかった。ヒト肝ミクロソームにおいて、本発明者らは、同じ位置に移動した太いタンパク質バンドを発見した（図１Ａ、レーン９）。ＣＹＰ３Ａ４の発現レベルは、公知のヒト肝ミクロソームにおけるＣＹＰ３Ａ４レベル（１２７ｐｍｏｌ　ＣＹＰ３Ａ４／ｍｇタンパク質）を基に推定した（Ｇｅｎｔｅｓｔ　Ｃｏｒｐ．，　Ｗｏｂｕｒｎ，　ＭＡ）。それらの含量は、野生型ＣＹＰ３Ａ４は２８．９±１．２ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、Ｔ１８５Ｓ変異型ＣＹＰ３Ａ４は２３．６±４．２ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、Ｌ２９３Ｐ変異型ＣＹＰ３Ａ４は３０．３±４．４ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、およびＴ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４は１６．６±０．５ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった。ＣＹＰ３Ａ４の含量は、ｃＤＮＡが発現した試料におけるテストステロン６β−水酸化活性とよく相関していた（ｒ＝０．７１）。
【００７３】
［実施例４］　　ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡの発現レベルの測定
本発明者らは、ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡの発現レベルをノーザンブロット法により試験した。ヌル構築物でトランスフェクションした細胞において、ＣＹＰ３Ａ４に関連したｍＲＮＡバンドは、検出されなかった（図２、上側パネル、レーン１および１０）。Ｇ３ＰＤＨ　ｍＲＮＡレベルは、使用した全てのトランスフェクションした細胞でほとんど同じであり、したがって相対ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡレベルの計算に使用した（図２、下側パネル）。他方、ｃＤＮＡをトランスフェクションした細胞は、明らかに野生型ＣＹＰ３Ａ４ｍＲＮＡまたは変異型ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡを発現した（図２、上側パネル、レーン２〜９）。このＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡレベル間に統計学的有意差はなかった（変異型ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ対野生型ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ比：Ｔ１８５Ｓ、１．０４；Ｌ２９３Ｐ、１．０４；Ｔ３６３Ｍ、１．００）。従って、これらの変異型ＣＹＰ３Ａ４は、ＣＹＰ３Ａ４　ｃＤＮＡの転写率については変わりないことが分かった。
【００７４】
［実施例５］　　変異型ＣＹＰ３Ａ４のテストステロン６β−水酸化の代謝回転速度の測定
本発明者らは、細胞溶解液中に発現されたタンパク質レベルを基にこれらの変異型ＣＹＰ３Ａ４のテストステロン６β−水酸化の代謝回転速度を計算した（図３Ａ）。Ｔ１８５Ｓ変異型ＣＹＰ３Ａ４およびＴ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４に関する速度は、各々、野生型ＣＹＰ３Ａ４の４５．９％および３６．３％であった。Ｌ２９３Ｐ　変異型ＣＹＰ３Ａ４については、この速度は野生型ＣＹＰ３Ａ４と顕著に異なっていなかった（３６０．８±１０．６ｐｍｏｌ／時／ｐｍｏｌ　Ｌ２９３Ｐ、対、２９１．６±３５．５ｐｍｏｌ／時／ｐｍｏｌ野生型ＣＹＰ３Ａ４）。同様の結果が、２β−水酸化または１５β−水酸化についても得られた（図３、ＢおよびＣ）。本発明者らは更に、野生型ＣＹＰ３Ａ４および変異型ＣＹＰ３Ａ４を発現しているＨｅｐＧ２細胞からミクロソームを調製した。最終濃度１ｍｇ／ｍｌ（総タンパク質として）のミクロソームを用い、テストステロン水酸化アッセイ（Ｐａｍｐｏｒｉ　Ｎ．　Ａ．，　Ｐａｍｐｏｒｉ　Ｍ．　Ｋ．　ａｎｄ　Ｓｈａｐｉｒｏ　Ｂ．　Ｈ．：Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｒｅｄｕｃｅｓ　ｔｈｅ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｎｏｉｓｅｏｎ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１８，　５８８−５９０　（１９９５））を行い、かつＴ１８５ＳおよびＴ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４が、野生型ＣＹＰ３Ａ４（３８９．１ｐｍｏｌ／分／ｎｍｏｌ　ＣＹＰ３Ａ４）およびＬ２９３Ｐ変異型ＣＹＰ３Ａ４（３６１．３ｐｍｏｌ／分／ｎｍｏｌ　ＣＹＰ３Ａ４）よりも、より低いテストステロン６β−水酸化を示す（各々、２１４．９および１６４．４ｐｍｏｌ／分／ｎｍｏｌ　変異型ＣＹＰ３Ａ４）ことが分かった。インキュベーション混合液へのヒトＰ４５０レダクターゼの添加は、テストステロン６β−水酸化活性に対しいかなる作用も示さなかった。
【００７５】
以上の結果から、Ｔ３６３Ｍ置換が、テストステロン６β−水酸化の最も顕著な低下を引き起こすことがわかった。ＣＹＰ３Ａ４の活性部位に関する情報の大半は、ＣＹＰ１０１（Ｐ４５０ｃａｍ）およびＣＹＰ１Ｏ２（Ｐ４５０ＢＭ−３）、周知の結晶化した細菌ＣＹＰを基にしたホモロジーモデルに由来している（Ｐｏｕｌｏｓ　Ｔ．Ｌ．，　Ｆｉｎｚｅｌ　Ｂ．Ｃ．　ａｎｄ　Ｈｏｗａｒｄ　Ａ．Ｊ．：　Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０ｃａｍ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１９５，　６８７−７００　（１９８７）；　Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ　Ｋ．　Ｇ．，　Ｂｏｄｄｕｐａｌｌｉ　Ｓ．　Ｓ．，　Ｈａｓｅｒｍａｎｎ　Ｃ．　Ａ．，　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｊ．　Ａ．，　Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ　Ｊ．：　Ｃｒｙｓｔａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈｅｍｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　Ｐ４５０ＢＭ−３，　ａ　ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　Ｐ４５０’ｓ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１，　７３１−７３６　（１９９３）；　Ｓｚｋｌａｒｚ　Ｇ．　Ｄ．，　Ｈａｌｐｅｒｔ　Ｊ．　Ｒ．：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　３Ａ４．　Ｊ．　Ｃｏｍｐｕｔ．　Ａｉｄｅｄ　Ｍｏｌ．　Ｄｅｓ．　１１，　２６５−２７２　（１９９７）；　Ｐｏｕｌｏｓ　Ｔ．　Ｌ．，　Ｆｉｎｚｅｌ　Ｂ．　Ｃ．，　Ｇｕｎｓａｌｕｓ　Ｉ．　Ｃ．，　Ｗａｇｎｅｒ　Ｇ．　Ｃ．　ａｎｄ　Ｋｒａｕｔ　Ｊ．：　Ｔｈｅ　２．６−Å　ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ−４５０．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６０，　１６１２２−１６１３０　（１９８５）；　Ｓｃｈｌｉｃｈｔｉｎｇ　Ｉ．，　Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ　Ｊ．，　Ｃｈｕ　Ｋ．，　Ｓｔｏｃｋ　Ａ．　Ｍ．，　Ｍａｖｅｓ　Ｓ．　Ａ．，　Ｂｅｎｓｏｎ　Ｄ．　Ｅ．，　Ｓｗｅｅｔ　Ｒ．　Ｍ．，　Ｒｉｎｇｅ　Ｄ．，　Ｐｅｔｓｋｏ　Ｇ．　Ａ．，　ａｎｄ　ＳｌｉｇａｒＳ．　Ｇ．：　Ｔｈｅ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０ｃａｍ　ａｔ　ａｔｏｍｉｃ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７，　１６１５−１６２２　（２０００）；　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｐ．　Ａ．，　Ｃｏｓｍｅ　Ｊ．，　Ｓｒｉｄｈａｒ　Ｖ．，　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｅ．　Ｆ．　ａｎｄ　ＭｃＲｅｅ　Ｄ．　Ｅ．：　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ：　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　１，　１２１−１３１　（２０００）；　Ｌｉ　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｐｏｕｌｏｓ　Ｔ．　Ｌ．：　Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０ＢＭ−３　ｈａｅｍ　ｄｏｍａｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，　ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ　ａｃｉｄ．���Ｎａｔ．　Ｓｔｒｕｃｔ．　Ｂｉｏｌ．　４，　１４０−１４６　（１９９７））。Ｇｏｔｏｈは、哺乳類のＣＹＰにおいて６種の推定基質認識部位（ＳＲＳ）を提唱している（Ｇｏｔｏｈ　Ｏ．：　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ｉｎ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　ｆａｍｉｌｙ　２　（ＣＹＰ２）　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｆｅｒｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｃｏｄｉｎｇ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６７，　８３−９０　（１９９２））。Ｈｅらは、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ１０１の配列を整列し、ＳＲＳ−５をＣＹＰ３Ａ４の残基３６４−３７７の領域に位置させた（Ｈｅ　Ｙ．Ａ．，　Ｈｅ　Ｙ．　Ｑ．，　Ｓｚｋｌａｒｚ　Ｇ．　Ｄ．　ａｎｄ　Ｈａｌｐｅｒｔ　Ｊ．　Ｒ．：　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｋｅｙ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　５　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　３Ａ４　ｂｙ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ａｎｄ　ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６，　８８３１−８８３９　（１９９７））。彼らは、ＳＲＳ−５の突然変異がステロイドヒドロキシラーゼ活性に強く影響することを報告している。例えば、Ａｒｇ−３６５およびその水素結合網は、ＣＹＰ３Ａ４の三次元構造の維持に貢献しているであろう。従ってＳＲＳ−５の残基３６３のトレオニンは、水素結合網の形成に寄与するように思われ、かつそのメチオニンとの置換は、触媒機能の喪失をもたらすであろう。本発明者らの免疫ブロット法のデータは、ＨｅｐＧ２細胞におけるトランスフェクションの２４時間後に、Ｔ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４含量が、野生型ＣＹＰ３Ａ４よりも明確に低いにもかかわらず、他のｍＲＮＡレベルにおいては、有意差は認められないことを指摘している。従って、ＣＹＰ３Ａ４のＴｈｒ−３６３は、ＣＹＰ３Ａ４の三次元構造の維持に寄与し、かつＴ３６３Ｍ置換は該タンパク質の安定性の低下を引き起こすであろう。しかし、Ｔ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４の翻訳率が比較的低い可能性を排除することはできない。
【００７６】
最近Ｅｉｓｅｌｔらが、２１３名の中央ヨーロッパおよび西ヨーロッパ人のＤＮＡ検体を研究し、Ｔ３６３Ｍを含む８種の新たな非同義ＳＮＰを発見したことを報告した（Ｅｉｓｅｌｔ　Ｒ，　Ｄｏｍａｎｓｋｉ　ＴＬ，　Ｚｉｂａｔ　Ａ，　Ｍｕｅｌｌｅｒ　Ｒ，　Ｐｒｅｓｅｃａｎ−Ｓｉｅｄｅｌ　Ｅ，　Ｈｕｓｔｅｒｔ　Ｅ，　Ｚａｎｇｅｒ　ＵＭ，　Ｂｒｏｃｋｍｏｌｌｅｒ　Ｊ，　Ｋｌｅｎｋ　ＨＰ，　Ｍｅｙｅｒ　ＵＡ，　Ｋｈａｎ　ＫＫ，　Ｈｅ　ＹＡ，　Ｈａｌｐｅｒｔ　ＪＲ，　Ｗｏｊｎｏｗｓｋｉ　Ｌ．：　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　ＣＹＰ３Ａ４　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｖａｒｉａｎｔｓ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１，　４４７−４５８　（２００１））。彼らは、細菌の発現システムを用い、その機能的特徴を説明している。Ｔ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４は、テストステロン６β−水酸化、２β−水酸化および１５β−水酸化並びにプロゲステロン６β−水酸化において、野生型ＣＹＰ３Ａ４と比較して低い活性を示した。彼らは更に、Ｔ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４の低い発現および／または不安定性は、その活性に影響しうることも結論した。
【００７７】
配列を整列しモデリングする研究から、基質ポケットおよび／または基質接近（ａｃｃｅｓｓ）溝のヘリックスおよびループ構成部位が割り当てられた（Ｃｏｓｍｅ　Ｊ　ａｎｄＪｏｈｎｓｏｎ　Ｅ．　Ｆ．：　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　２Ｃ５　ｔｏ　ｂｅ　ａ　ｓｏｌｕｂｌｅ，　ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ．　Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｔｈａｔ　ａｌｔｅｒ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ，　ａｎｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　２５４５−２５５３　（２０００））。ＣＹＰ１０２において、おそらく基質の接近および排出をもたらすであろう、Ｎ末端βシートドメインとＦ−Ｇループの間、タンパク質の表面から活性部位にかけて、明確な溝があった（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｐ．　Ａ．，　Ｃｏｓｍｅ　Ｊ．，　Ｓｒｉｄｈａｒ　Ｖ．，　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｅ．　Ｆ．　ａｎｄ　ＭｃＲｅｅ　Ｄ．　Ｅ．：　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ：　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　１，　１２１−１３１　（２０００））。基質ポケット内に位置する残基が置換されると、水酸化の領域選択性（ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）が変わる（Ｌｕｏ　Ｚ．，　Ｈｅ　Ｙ．　Ａ．，　ａｎｄＨａｌｐｅｒｔ　Ｊ．　Ｒ．：　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　３６３　ａｎｄ　２０６　ｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０　２Ｂ１　ｆｒｏｍ　ａ　ｓｔｅｒｏｉｄ　１６−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｔｏ　ａ　１５　ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ．　Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　３０９，　５２−５７　（１９９４））。二次元構造情報から、ＣＹＰ３Ａ４のＴｈｒ−１８５残基がこの領域に存在していることがわかる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｐ．　Ａ．，　Ｃｏｓｍｅ　Ｊ．，　Ｓｒｉｄｈａｒ　Ｖ．，　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｅ．　Ｆ．　ａｎｄ　ＭｃＲｅｅ　Ｄ．　Ｅ．：　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ：　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　１，　１２１−１３１　（２０００））。Ｔ１８５Ｓ置換は、低下したテストステロン６β−水酸化、２β−水酸化および１５β−水酸化をもたらした。Ｔ１８５Ｓ−置換したタンパク質レベルは、野生型ＣＹＰ３Ａ４と比較してわずかな減少のみが認められた（図１ＡおよびＢ）。Ｔ１８５Ｓ置換は、基質接近溝の構造を変化することが可能である。
【００７８】
Ｌ２９３Ｐ置換は、テストステロンヒドロキシラーゼ活性に顕著な影響を及ぼさなかったが、この置換はＳＲＳ−４内において生じ、これは様々な動物の種間で高度に保存され、かつ基質特異性および触媒活性に関連すると考えられている（Ｇｏｔｏｈ　Ｏ．：　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ｉｎ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　ｆａｍｉｌｙ　２　（ＣＹＰ２）　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｆｅｒｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｃｏｄｉｎｇ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６７，　８３−９０　（１９９２）；　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｅ．　Ｆ．　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ　Ｍ．　Ｒ．：　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｐ４５０ｓ　ａｎｄ　ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｕｎｋｎｏｗｎ．　Ｉｎ　Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ　Ｓ．　Ｅ．　ａｎｄ　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｊ．Ａ　（ｅｄ．）：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９６，　ｐｐ．　３１５−３２７）。Ｄｏｍａｎｓｋｉらは、Ｆ３０４Ａ置換が、野生型よりもより大きいプロゲステロンヒドロキシラーゼ活性を示すが、Ｔ３０９Ａ変異型ＣＹＰ３Ａ４は、野生型酵素と同様の酵素活性を有すると報告している（Ｄｏｎａｎｓｋｉ　Ｔ．　Ｌ．，　Ｌｉｕ　Ｊ．，　Ｈａｒｌｏｗ　Ｇ．　Ｒ　ａｎｄ　Ｈａｌｐｅｒｔ　Ｊ．　Ｒ．：　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｓｕｂｓｔｒａｒｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　４　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｙｒｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　３Ａ４：　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｓｔｅｒｏｉｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　α−ｎａｐｈｔｈｏｆｌａｖｏｎｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｈｙｓ．　３５０，　２２３−２３２　（１９９８）；　Ｓｔｅｖｅｎｓ　Ｊ．　Ｃ．，　Ｄｏｍａｎｓｋｉ　Ｔ．　Ｌ．，　Ｈａｒｌｏｗ　Ｇ．　Ｒ．，　Ｗｈｉｔｅ　Ｒ．　Ｂ．，　Ｏｒｔｏｎ　Ｅ．　ａｎｄ　Ｈａｌｐｅｒｔ　Ｊ．　Ｒ．：　Ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｅｒｏｉｄ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　ＲＰＲ　１０６５４１　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｆｏｒ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ−４５０　３Ａ４　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　２９０，　５９４−６０２　（１９９９））。Ｄｏｍａｎｓｋｉらは、Ｆ３０４Ａ置換が、酵素の固有の機能には影響しないが、おそらく特にプロゲステロンおよびテストステロンの結合に影響するであろうということを示唆している。従って、２９３番目周辺のアミノ酸置換の作用を、現時点で説明することは難しい。本発明者らの最近の研究から、日本人のＤＮＡ検体中にＬ２９３Ｐ置換も認められた。
【００７９】
【発明の効果】
新たな変異型ＣＹＰ３Ａ４の発見およびその変異型ＣＹＰ３Ａ４の特徴決定は、ＣＹＰ３Ａ４が媒介した薬物代謝を予想する上で非常に重要である。しかし、日本人に関するＣＹＰ３Ａ４対立遺伝子の遺伝的多型に関する情報はほとんどなかった。これに対し、本発明者らは、日本人由来のサンプルからＴ１８５Ｓ変異型ＣＹＰ３Ａ４を見出し、該変異型ＣＹＰ３Ａ４は薬物の解毒的代謝能が低下していることを示した。従って、本酵素により代謝される薬物を医薬品として投与する場合、本多型を有する患者に副作用が発現しやすいものと考えられる。本発明によって、ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型を利用した検査方法、および、多型遺伝子を利用した本酵素活性増強のための化合物をスクリーニングする方法などが提供されることにより、上記副作用を忌避できるものと大いに期待される。
【００８０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】野生型ＣＹＰ３Ａ４およびその変異型ＣＹＰ３Ａ４のウェスタンブロット分析結果を示す写真である。Ａは、ＣＹＰ３Ａ４　ｃＤＮＡの野生型およびその３種の変異型の各々でトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞から調製した細胞溶解液、Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞から調製した該ミクロソームタンパク質を示す。細胞溶解液（２０μｇ）およびミクロソームタンパク質（２５μｇ）を電気泳動し、ブロットした。Ａにおいて、レーン１はｐＣＲ３．１／ヌル細胞由来のサンプル、レーン２は野生型ＣＹＰ３Ａ４、レーン３および４はＴ１８５Ｓ変異型ＣＹＰ３Ａ４、レーン５および６はＬ２９３Ｐ変異型ＣＹＰ３Ａ４、レーン７および８はＴ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４、レーン９はヒト肝ミクロソーム（５μｇ）を示す。Ｂにおいて、レーン１はｐＣＲ３．１／ヌル細胞由来のサンプル、レーン２は野生型ＣＹＰ３Ａ４、レーン３はＴ１８５Ｓ変異型ＣＹＰ３Ａ４、レーン４はＬ２９３Ｐ変異型ＣＹＰ３Ａ４、レーン５はＴ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４、レーン６はヒト肝ミクロソーム（５μｇ）を示す。
【図２】野生型ＣＹＰ３Ａ４およびその３種の変異型ＣＹＰ３Ａ４をコードしているｍＲＮＡのノーザンブロット分析結果を示す写真である。トランスフェクションの２４時間後、総ＲＮＡを各試料から調製し、かつ電気泳動し、膜に移し、特異的プローブでハイブリダイズした。レーン１および１０はｐＣＲ３．１／ヌル細胞由来のサンプル、レーン２および３は野生型ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ、レーン４および５はＴ１８５Ｓ変異型ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ、レーン６および７はＬ２９３Ｐ変異型ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ、レーン８および９はＴ３６３Ｍ変異型ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡを示す。ＣＹＰ３Ａ４に関連したｍＲＮＡおよび対照としてのＧ３ＰＤＨ　ｍＲＮＡを、各々上段および下段に示した。
【図３】野生型ＣＹＰ３Ａ４およびその変異型ＣＹＰ３Ａ４のテストステロンヒドロキシラーゼ活性を示す図である。野生型ＣＹＰ３Ａ４およびその変異型ＣＹＰ３Ａ４をコードするＤＮＡをＨｅｐＧ２細胞へトランスフェクション後の２４時間後に、培地を交換し、テストステロン１００μＭをこの細胞に添加した。次いで、テストステロン水酸化を測定した。Ａはテストステロン６β−水酸化、Ｂはテストステロン２β−水酸化、Ｃはテストステロン１５β−水酸化を示す。各値は、４回の処置の平均を垂直バーで示した標準偏差と共に表している。＊は、　Ｐ＜０．０１対野生型（スチューデントｔ−検定）を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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