(57)【要約】【課題】　生体試料中の測定対象物質と、測定対象物質に対し結合能を有する物質（結合能物質）との相互作用の結果生じる複合体と、遊離の結合能物質等や該複合体の検出に影響を与える恐れのある共存物質とをHPLCで分離する際に用いられる新規ポリペプチド及びこのポリペプチドを使用した測定対象物質の測定方法の提供。【解決手段】　強酸由来の酸残基を３〜３０個有しアミノ酸残基の総数が３〜３０個であるポリペプチドと生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有する物質との結合物、当該結合物を含んでなる生体試料中の測定対象物質測定用試薬、当該試薬を用いる生体成分測定方法。並びに強酸由来の酸残基を３〜３０個有しアミノ酸残基の総数が３〜３０個であるポリペプチドのＮ末端にスペーサーを介してマレイミド基が結合した化合物。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
強酸由来の酸残基を３〜３０個有し、且つアミノ酸残基の総数が３〜３０個であるポリペプチドと、生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有する物質との結合物。
【請求項２】
ポリペプチドが、４〜２０個の硫酸化チロシン残基を有するポリペプチドである請求項１記載の結合物。
【請求項３】
ポリペプチドが、下記一般式[１] 
　　　　　　　　　　Ａ−(Ｒ4)j−Ｂ            [１]
（式中、jは４〜２０の整数を表す。j個のＲ4の内４〜２０個は硫酸化チロシン残基であり、残りのＲ4は、同一でも異なっていてもよく、強酸由来の酸残基が導入されていないアミノ酸残基を表し、各アミノ酸残基の側鎖の反応活性基に保護基が導入されていてもよい。Ａは水素原子、硫酸化チロシン残基又は強酸由来の酸残基が導入されていないアミノ酸のＮ末端アミノ基の保護基を表し、Ｂは水酸基又はアミノ酸のＣ末端カルボキシル基の保護基を表す。）
で表されるポリペプチドである、請求項１記載の結合物。
【請求項４】
ポリペプチドが、下記一般式[２] 
　　　　　　　　　　Ａ−(Ｒ5)k−Ｂ            [２]
（式中、Ｒ5は強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸残基を表し、同一でも異なっていてもよい。kは４〜２０の整数を表し、Ａは水素原子、強酸由来の酸残基又はアミノ酸のＮ末端アミノ基の保護基を表し、Ｂは水酸基又はアミノ酸のＣ末端カルボキシル基の保護基を表す。但し、k個のＲ5のうち、４〜２０個は硫酸化チロシン残基である。）
で表されるポリペプチドである、請求項１記載の結合物。
【請求項５】
ポリペプチドが、下記一般式[３] 
　　　　　　　　　　Ａ−(Ｒ5)j−(Ｒ6)l−Ｂ            [３]
（式中、Ｒ5は硫酸化チロシン残基を表し、jは４〜２０の整数を表す。Ｒ6は強酸由来の酸残基が導入されていないアミノ酸残基を表す。また、（j＋l）は５〜２１である。Ａは水素原子、硫酸化チロシン残基又は強酸由来の酸残基が導入されていないアミノ酸のＮ末端アミノ基の保護基を表し、Ｂは水酸基又はアミノ酸のＣ末端カルボキシル基の保護基を表す。）
で表される、請求項３記載の結合物。
【請求項６】
強酸由来の酸残基を３〜３０個有し、且つアミノ酸残基の総数が３〜３０個であるポリペプチドのＮ末端にスペーサーを介してマレイミド基が結合した化合物。
【請求項７】
請求項１記載の結合物を含んでなる、生体試料中の測定対象物質測定用試薬。
【請求項８】
生体試料と、請求項１記載の結合物を含んでなる試薬とを反応させ、次いで生じた複合体を陰性電荷を利用する方法により分離し、該複合体量に基づいて生体試料中の測定対象物質量を求めることを特徴とする生体成分測定方法。
【請求項９】
陰性電荷を利用する方法が陰イオン交換法である、請求項８に記載の生体成分測定方法。
【請求項１０】
陰イオン交換法による分離の際に用いられる溶離液中に界面活性剤を共存させる、請求項９に記載の生体成分測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、強酸由来の酸残基を有する新規なポリペプチド及び該ポリペプチドを利用した、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中の測定対象物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　ある特定の物質同士、例えば抗原と抗体、プロテアーゼとその蛋白性プロテアーゼインヒビター、糖鎖とレクチン、酵素とそれに対する基質や補酵素、ホルモン等の生理活性物質とそれに対するレセプターや輸送蛋白、２本鎖ＤＮＡの１対のポリヌクレオチド鎖等は、互いに強い相互作用を及ぼしあい（即ち、互いに親和性を示し）、強固な複合体を形成することが知られている。
【０００３】
　このような相互作用を利用した試料中の測定対象物質の測定方法としては、固相上に上記した如き組合せの物質同士の反応により生ずる複合体を形成させた後に、該固相を利用して所謂Ｂ／Ｆ分離を行う、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）（例えば特開平1-227061号公報、特開平3-44399号公報等に記載の方法）等や、本発明者等の一部が開発した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて複合体と遊離の測定対象物質との分離、所謂Ｂ／Ｆ分離を行う方法（例えば特開平2-28557号公報、特開平3-206964号公報、特開平3-221865号公報、特開平6-66800号公報等に記載の方法）等が挙げられる。
【０００４】
　このような測定方法に於いては、Ｂ／Ｆ分離をいかに効率よく行うかによって測定の精度や分析に要する時間がある程度左右されるため、該Ｂ／Ｆ分離方法について種々の検討がなされている。
【０００５】
　例えば、特開平1-227061号公報、特開平3-44399号公報等の固相を利用してＢ／Ｆ分離を行う方法や、特開平6-66800号公報等に開示されたＨＰＬＣを用いてＢ／Ｆ分離を行う方法に於いては、例えば生体試料中の測定対象物質に対する抗体等にアニオン性物質を予め結合させておき、所謂Ｂ／Ｆ分離を、該測定対象物質とこれに対する抗体との複合体中の該アニオン性物質の性質（陰イオン性）を利用して行っている。
【０００６】
　これらの方法は、Ｂ／Ｆ分離を従来よりも効率よく行うことができる方法ではあるが、使用されているアニオン性物質は何れに於いてもポリアミノ酸に由来するものであって、そのカルボキシル基由来のアニオン性を利用してＢ／Ｆ分離を行っているため、本願発明者らが開発したＨＰＬＣを用いてＢ／Ｆ分離を行う方法に於いては若干問題のある方法等であった。
【０００７】
　即ち、ＨＰＬＣを用いる方法に於いてはＢ／Ｆ分離と共に、該複合体を試料中に共存する測定に影響を与える恐れのある物質や遊離の抗体等と分離する必要があるが、このような分離をポリアミノ酸由来のカルボキシル基のアニオン性を利用して充分に行うためには、該アニオン性物質中にカルボキシル基を約200個程度（アミノ酸残基として200個程度）は導入しなければならなかった。そのため、先ず、該アニオン性物質の調製に手間が掛かるという問題、更には均一の分子量を有するアニオン性物質を大量に調製することが困難なため、このようなアニオン性物質を利用してＨＰＬＣによりＢ／Ｆ分離を行うと、分離の際にピークがテーリング又はリーディングして、測定の精度が低下する場合があるという問題があった。また、ポリグルタミン酸等のカルボキシル基を有するポリアミノ酸を分離のために用いた場合、非特異的反応が生じ、盲検値（ブランク値）や測定値が上昇する等の現象が起こる場合があるので、これを防止するために、例えばγ-ポリグルタミン酸等の適当なポリマーアニオンを添加する必要が生じる等の問題もあった。そのため、更なる改良が求められている現状にある。
【０００８】
【特許文献１】平成１年公開特許公報２２７０６１号
【特許文献２】平成３年公開特許公報４４３９９号
【特許文献３】平成２年公開特許公報２８５５７号
【特許文献４】平成３年公開特許公報２０６９６４号
【特許文献５】平成３年公開特許公報２２１８６５号
【特許文献６】平成６年公開特許公報６６８００号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
　本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、生体試料中の測定対象物質と、該測定対象物質に対して結合能（親和性）を有する物質（以下、結合能物質と略記する。）との相互作用の結果生じる複合体と、遊離の結合能物質等や該複合体の検出に影響を与える恐れのある共存物質とを陰性電荷を利用する方法を用いて分離する際に、該複合体と遊離の結合能物質等とをより効果的に分離するために用いることのできる新規なポリペプチド並びにこのポリペプチドを使用した生体試料中の測定対象物質の測定方法を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
　本発明は、「強酸由来の酸残基を３〜３０個有し、且つアミノ酸残基の総数が３〜３０個であるポリペプチドと、生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有する物質との結合物。」の発明である。
　また、本発明は「強酸由来の酸残基を３〜３０個有し、且つアミノ酸残基の総数が３〜３０個であるポリペプチドのＮ末端にスペーサーを介してマレイミド基が結合した化合物。」の発明である。
　更に、本発明は「強酸由来の酸残基を３〜３０個有し、且つアミノ酸残基の総数が３〜３０個であるポリペプチドと、生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有する物質との結合物を含んでなる、生体試料中の測定対象物質測定用試薬。」の発明である。
　更にまた、本発明は「生体試料と、強酸由来の酸残基を３〜３０個有し、且つアミノ酸残基の総数が３〜３０個であるポリペプチドと、生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有する物質との結合物を含んでなる試薬とを反応させ、次いで生じた複合体を陰性電荷を利用する方法により分離し、該複合体量に基づいて生体試料中の測定対象物質量を求めることを特徴とする生体成分測定方法。」の発明である。
【００１１】
　即ち、本発明者らは、生体試料中の測定対象物質と結合能物質との相互作用の結果生じる複合体と、遊離の結合能物質［又は遊離の測定対象物質。尚、該測定対象物質は、何らかの方法により検出可能な物質（以下、検出物質と略記する。）により標識されていてもよい。］等の該複合体の検出に影響を与える恐れのある共存物質との分離を陰性電荷を利用する方法を用いて行なう際に、該複合体と遊離の結合能物質等とをより明確に分離し得る方法を求めて鋭意研究の途上、該複合体に更に該複合体の性質を変化させ得る適当な性質を有する物質（以下、分離向上物質と略記する。）を結合させ、且つ該分離向上物質の性質に基づいて該複合体と遊離の結合能物質（又は遊離の測定対象物質）等の該複合体の検出に影響を与える恐れのある共存物質との分離操作を行った場合には、分離向上物質を適宜選択して用いることにより該複合体の溶出位置を自在に調節することが可能となること、言い換えれば、適当な分離向上物質を該複合体に結合させることにより該複合体と遊離の結合能物質等とをより明確に分離し得ることを見出し、先に特許出願している（特開平6-66800号公報）。しかしながら、この方法に於いて、該複合体にアニオン性の分離向上物質を結合させて該複合体の分離を行おうとした場合には、上で述べた如き問題が生ずる場合があった。このような問題が生ずることのないアニオン性分離向上物質を見出すべく、本発明者らが更に鋭意研究を行った結果、強酸由来の酸残基を少なくとも３個有するポリペプチドをアニオン性分離向上物質として用いることにより、上で述べた如き問題を解消し得ることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１２】
　本発明のポリペプチドは、強酸由来の酸残基を３〜３０個有するポリペプチドであればよく、構成するアミノ酸残基の種類は特に限定されないが、合成の容易さ等を考慮すると、アミノ酸残基の総数は通常３〜30程度、好ましくは５〜15程度の範囲から適宜選択される。また、強酸としては、pKaが３以下の酸、例えば塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸が挙げられる。
【００１３】
　本発明に於ける強酸由来の酸残基とは、該強酸に由来する酸残基を意味する。また、本発明に於ける酸残基とは、該強酸から水素原子がとれたものをいう。アミノ酸残基とは、アミノ酸のＮ末端の水素原子とＣ末端の水酸基がとれたものをいう。
【００１４】
　本発明に係る強酸由来の酸残基を３〜３０個有し、且つアミノ酸残基の総数が３〜３０個であるポリペプチドの具体例としては、例えば
下記一般式[１] 
　　　　　　　　　　Ａ−(Ｒ4)j−Ｂ            [１]
（式中、jは４〜２０の整数を表す。j個のＲ4の内４〜２０個は硫酸化チロシン残基であり、残りのＲ4は、同一でも異なっていてもよく、強酸由来の酸残基が導入されていないアミノ酸残基を表し、各アミノ酸残基の側鎖の反応活性基に保護基が導入されていてもよい。Ａは水素原子、硫酸化チロシン残基又は強酸由来の酸残基が導入されていないアミノ酸のＮ末端アミノ基の保護基を表し、Ｂは水酸基又はアミノ酸のＣ末端カルボキシル基の保護基を表す。）、
下記一般式[２] 
　　　　　　　　　　Ａ−(Ｒ5)k−Ｂ            [２]
（式中、Ｒ5は強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸残基を表し、同一でも異なっていてもよい。kは４〜２０の整数を表し、Ａは水素原子、強酸由来の酸残基又はアミノ酸のＮ末端アミノ基の保護基を表し、Ｂは水酸基又はアミノ酸のＣ末端カルボキシル基の保護基を表す。但し、k個のＲ5のうち、４〜２０個は硫酸化チロシン残基である。）、
下記一般式[３] 
　　　　　　　　　　Ａ−(Ｒ5)j−(Ｒ6)l−Ｂ            [３]
（式中、Ｒ5は硫酸化チロシン残基を表し、jは４〜２０の整数を表す。Ｒ6は強酸由来の酸残基が導入されていないアミノ酸残基を表す。また、（j＋l）は５〜２１である。Ａは水素原子、硫酸化チロシン残基又は強酸由来の酸残基が導入されていないアミノ酸のＮ末端アミノ基の保護基を表し、Ｂは水酸基又はアミノ酸のＣ末端カルボキシル基の保護基を表す。）
で示されるもの等が挙げられる。
【００１５】
　本発明のポリペプチドに於いて、上記した如き酸残基は通常ポリペプチドの反応活性基に導入されるが、該反応活性基としては、ポリペプチド中の例えば遊離の水酸基、アミノ基、イミノ基、チオール基等が挙げられる。尚、ポリペプチドの主鎖のアミノ基（ポリペプチドのＮ末端のアミノ基）も該反応活性基として使用可能であるが、該ポリペプチドを分離向上物質として使用する場合には、該アミノ基には該酸残基を導入しない方が好ましい。即ち、ポリペプチドのＮ末端のアミノ基を、ポリペプチドと結合能物質とを結合させる際に利用すれば、ポリペプチドと結合能物質との結合様式をある程度一定にできるので、このようにして得られたポリペプチド（即ち、分離向上物質）が結合した結合能物質を生体試料中の測定対象物質の測定に用いれば、より精度よく目的の測定を実施し得るからである。
【００１６】
　本願発明のポリペプチドとしては、例えば下記一般式［Ｉ］
　　　　　　　Ａ−（Ｒ）m−Ｂ　　　　［Ｉ］
（式中、ｍは３以上の整数を表し、好ましくは３〜30、より好ましくは３〜20、更に好ましくは４〜20、更により好ましくは５〜15であり、ｍ個のＲの内少なくとも３個は強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸残基であり、残りのＲは強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸残基又は当該強酸由来の酸残基が導入されていないアミノ酸残基の何れかを表す。尚、Ｒとして表される強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸残基及び当該強酸由来の酸残基が導入されていないアミノ酸残基の種類は、同一でも異なっていてもよく、また、側鎖の反応活性基に保護基等が導入されていてもよく、その結合順序も任意である。Ａは水素原子、強酸由来の酸残基又はアミノ酸のＮ末端アミノ基の保護基を表し、Ｂは水酸基又はアミノ酸のＣ末端カルボキシル基の保護基を表す。）、
下記一般式［II］
　　　　　　　Ａ−（Ｒ1）m'−Ｂ　　　　［II］
［式中、Ｒ1は強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸残基を表し、ｍ'は３以上の整数を表し、好ましくは３〜30、より好ましくは３〜20、更に好ましくは４〜20、更により好ましくは５〜15であり、Ａ及びＢは前記に同じ。尚、ｍ個のＲ1（強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸残基）の種類は、同一でも異なっていてもよく、その結合順序も任意である。］、
下記一般式［III］
　　　　　　Ａ−（Ｒ1）m'−（Ｒ2）n−Ｂ　［III］
［式中、Ｒ2は強酸由来の酸残基を有さないアミノ酸残基を表し、ｎは自然数を表し、Ｒ1、ｍ'、Ａ及びＢは前記に同じ。尚、ｎ個のＲ2（アミノ酸残基）の種類は、同一でも異なっていてもよく、その結合順序も任意である。また、ｍ個のＲ1とｎ個のＲ2の結合順序も任意である。また、（m'＋n）は通常４〜31、好ましくは４〜21、より好ましくは５〜21、更に好ましくは６〜16である。］、
で示されるもの等が挙げられる。
【００１７】
　本発明のポリペプチド（上記の一般式で表されるものを含む）を生体試料中の測定対象物質を測定する際の分離向上物質として使用する場合には、該ポリペプチドに於ける強酸由来の酸残基は、例えば硫酸、リン酸等の多価強酸由来の酸残基が好ましい。尚、生体試料中にはホスファターゼが共存する可能性もあるので中でも、特にポリペプチドを分離向上物質として使用する場合には、硫酸残基が望ましい。また、該酸残基は、本発明のポリペプチド中に少なくとも３個存在していればよいが、該酸残基の数が多すぎると分離向上物質とし使用し難い（例えば、陰イオン交換法による分離の際に分離やカラム等からの溶出が難しくなる）ので、分離向上物質として使用する場合の該酸残基の数としては、通常３〜30個、好ましくは３〜20個、より好ましくは４〜20個、更に好ましくは５〜15個の範囲から適宜選択され、アミノ酸残基の総数としては、合成の容易さ等を考慮すると、通常３〜30程度、好ましくは３〜20個程度、より好ましくは４〜20個、更に好ましくは５〜15程度の範囲から適宜選択される。尚、該酸残基が３個よりも少ないと、分離向上物質に基づく分離のピークと血清成分由来の溶出ピークとが重なり測定（分析）精度が低くなる、という問題が生ずる。また、分離向上物質に基づく分離のピークと血清等の生体試料中の成分に由来する溶出ピークとの重なりを排除し、より測定精度を高めるためには、該酸残基数は４個以上、好ましくは５個以上であることが望ましい。更にまた、強酸由来の酸残基として硫酸残基を導入する場合には、硫酸残基導入後の水溶液中での安定性を考慮すると、チロシン残基のフェノール性水酸基を利用して導入することが望ましい。
【００１８】
　本発明のポリペプチドに於いて、強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸残基としては、遊離の反応活性基を有するアミノ酸残基であって該反応活性基に強酸由来の酸残基が導入されたものであればよく特に限定されない。より具体的には、例えばチロシン，セリン，トレオニン等の遊離の水酸基を有するアミノ酸残基、例えばリジン，アルギニン等の遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基、例えばヒスチジン，トリプトファン，プロリン，オキシプロリン等の遊離のイミノ基を有するアミノ酸残基、例えばシステイン等の遊離のチオール基を有するアミノ酸残基であって、これらの例えば水酸基，アミノ基，イミノ基，チオール基等の遊離の反応活性基に強酸由来の酸残基が導入されたもの等が挙げられる。尚、強酸由来の酸残基の導入のし易さ等を考慮すると、例えばセリン、トレオニン、チロシン等のアミノ酸残基が好ましく挙げられる。また、本発明のポリペプチドに於ける強酸由来の酸残基を有さないアミノ酸残基としては、通常ペプチド化学の分野でアミノ酸残基と認められるものであればよく特に限定されないが、例えばアラニン、グリシン、β-アラニン等のアミノ酸の残基が好ましいものとして挙げられる。
【００１９】
　本発明のポリペプチドは、(a)適当な数の遊離の活性反応基を有するポリペプチドの少なくとも３個の遊離の活性反応基に強酸由来の酸残基を導入する方法（J.Chem.Soc.Perkin Trans I,(1990),1739-1744等）、(ｂ)強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸を合成原料として、強酸由来の酸残基を少なくとも３個有するポリペプチドを合成する方法（Chem.Pharm.Bull.,41(2),(1993),376-380等）、等により合成すればよい。尚、目的のポリペプチドの収率等を考慮すると、上記の方法の内、(a)の方法の方が好ましい（特に、アミノ酸残基数が多くなった場合。）。但し、上記(b)の方法では、硫酸化反応を行う必要がないので、得られたポリペプチドのＮ末端に、例えばマレイミドカプロン酸残基等の、抗体等の結合能物質と結合し得る官能基を直接導入することができるので、得られたポリペプチドをすぐに結合能物質と結合させることができるという利点はある。
【００２０】
　ポリペプチド又はアミノ酸の遊離の活性反応基に、強酸由来の酸残基を導入する方法としては、例えば水酸基、アミノ基、イミノ基、チオール基等の遊離の反応活性基に強酸由来の酸残基を導入し得る方法であればよく特に限定されない。
【００２１】
　より具体的には、例えばチロシン，セリン，トレオニン等の遊離の水酸基を有するアミノ酸（又はこれらアミノ酸の残基を有するポリペプチド）と、該アミノ酸（残基）の遊離の水酸基に対して１〜20倍当量の例えばHSO3・Cl，HSO3・ジメチルホルムアミド，HSO3・ピリジン等の硫酸化剤や例えば塩化ホスホリル，三塩化リン等のハロゲン化リン等のリン酸化剤とを、例えばジメチルホルムアミド（DMF），ジメチルスルホキシド（DMSO）等の溶媒（無水）中、例えばピリジン，トリエチルアミン，NaH等のアルカリ性物質を触媒として０〜40℃、１〜24時間反応させて、該アミノ酸残基の水酸基に強酸由来の酸残基を導入する方法、例えばリジン，アルギニン等の遊離のアミノ基を有するアミノ酸（又はこれらアミノ酸の残基を有するポリペプチド）或は例えばヒスチジン，トリプトファン，プロリン，オキシプロリン等の遊離のイミノ基を有するアミノ酸（又はこれらアミノ酸の残基を有するポリペプチド）と、該アミノ酸（残基）の遊離のアミノ基（又は／及びイミノ基）に対して１〜20倍当量の例えばHSO3・Cl，HSO3・ジメチルホルムアミド，HSO3・ピリジン等の硫酸化剤や例えば塩化ホスホリル，三塩化リン等のリン酸化剤とを、例えばジメチルホルムアミド（DMF），ジメチルスルホキシド（DMSO）等の溶媒（無水）中、例えばピリジン，トリエチルアミン，NaH等のアルカリ性物質を触媒として０〜40℃、１〜24時間反応させて、該アミノ酸残基のアミノ基（又は／及びイミノ基）に強酸由来の酸残基を導入する方法等が挙げられる。尚、合成の容易さや導入された酸残基の水溶液中での安定性や生体試料中に存在する例えばフォスファターゼ等の酵素等に対する安定性等を考慮すると、本発明に係る強酸由来の酸残基としては、硫酸残基がより好ましい。
【００２２】
　また、本発明のポリペプチドの原料となる、例えば水酸基、アミノ基、イミノ基、チオール基等の遊離の反応活性基を有するポリペプチドは、市販品を用いてもよいし、ペプチド化学の分野で汎用される常法、例えば活性エステル法、混合酸無水物法、アジド法等（「ペプチド合成の基礎と実験」、89〜142頁、泉屋信夫等著、昭和60年１月20日、丸善(株)）により合成したものを用いてもよい。尚、このようなポリペプチドを合成するに際して、Ｎ末端のアミノ基の保護基としては、次の硫酸化工程で安定なもの（酸性条件ではずれる保護基は不適当）が好ましく、例えばアルカリ性条件ではずれる9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基等のウレタン型保護基等が好ましく挙げられる。また、アミノ酸（残基）の側鎖の反応活性基の保護基は、例えばポリペプチドの合成条件、強酸由来の酸残基の導入条件等を考慮して適宜選択すればよく、例えばt-ブチル基、ベンジル基等が好ましく挙げられる。
【００２３】
　本発明に係る結合能物質としては、測定対象となる生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有する物質であれば特に限定されることなく挙げられる。具体的には、例えば生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有する例えば抗体、抗原、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、例えばアミラーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に対するインヒビター、測定対象物質としての核酸鎖に相補的なポリヌクレオチド、例えば甲状腺刺激ホルモン，アセチルコリン，グルタミン酸等に対するレセプター等が好ましく挙げられる。
【００２４】
　本発明に係る結合能物質と本発明のポリペプチドの結合物（以下、本発明の結合物、と略記する。）の調製方法は、該結合能物質の特定反応基と該ポリペプチドの特定反応基とを結合させる方法、該結合能物質の特定反応基を該ポリペプチドで置換する方法、該結合能物質に対して結合能のある物質（例えば抗体、レクチン、抗原、インヒビター、ＤＮＡ等）を介して該結合能物質と該ポリペプチドとを結合させる方法等が挙げられる。具体的には、例えば１）自体公知の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）或は蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等に於いて一般に行われている自体公知の標識物質と抗体との結合方法（例えば、医学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971；図説蛍光抗体、川生明著、第１版、(株)ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書院、1982、等）、２）自体公知の物質の修飾および結合方法（例えば、蛋白質の化学修飾〈上〉〈下〉、瓜谷郁三、志村憲助、中村道徳、船津勝編集、第１版、(株)学会出版センター、1981；ポリエチレングリコール修飾タンパク質、稲田祐二他、生化学、第62巻、第11号、P1351-1362、(社)日本生化学会、1990；DNA PROBES, George H.K. and Mark M.M. STOCKTON PRESS,1989等）等が何れも例外なく挙げられ、これらの方法に準じて行えばよい。
【００２５】
　該結合能物質の特定反応基と該ポリペプチドの特定反応基とを結合させる方法の具体例を挙げると、例えば、先ず、本発明のポリペプチドのＮ末端にスペーサーを介してマレイミド基が結合した化合物（以下、本発明のマレイミド化合物と略記する。）と、常法により調製した抗体のFab'のＳＨ基とを反応させて、本発明のポリペプチドと結合能物質（抗体）との結合物を調製する方法が挙げられる。
【００２６】
　ここで用いられる本発明のマレイミド化合物は、例えば下記の如き一般式[IV]〜[VI]で表される化合物である。
一般式［IV］
　　　　　　　　Ｄ−Ｅ−（Ｒ）m−Ｂ　　　　 ［IV］
（式中、Ｄはマレイミド基を表し、Ｅはスペーサーを表し、Ｒ、ｍ及びＢは前記に同じ。）
一般式［V］
　　　　　　　Ｄ−Ｅ−（Ｒ1）m'−Ｂ　　　　　［V］
（式中、Ｄ、Ｅ、Ｒ1、ｍ'及びＢは前記に同じ。）
一般式［VI］
　　　　　　Ｄ−Ｅ−（Ｒ1）m'−（Ｒ2）n−Ｂ　［VI］
（式中、Ｄ、Ｅ、Ｒ1、Ｒ2、ｍ'、ｎ及びＢは前記に同じ。）
　ここに於いて、これら一般式中でＥで表されるスペーサーとしては、本発明のポリペプチドのＮ末端とマレイミド基とをその両端に結合させ得る性質と、本発明のマレイミド化合物が本発明に係る結合能物質（抗体）と結合するのを妨げない性質とを有するものであれば良く特に限定されないが、例えば−Ｒ4−ＣＯ−で示される基（式中、Ｒ4は２価の炭化水素基を表す。）、より具体的には例えば下記一般式[VII]〜［IX］
　　　　　　−（ＣＨ2）p−ＣＯ−　　　　[VII]
（式中、ｐは１〜１０の整数を表す。）
【００２７】
【化１】
2004117370.tif 000002
（式中、ｑ及びｒは０又は１〜５の整数を表す。）
【００２８】
【化２】
2004117370.tif 000003
（式中、ｑ及びｒは前記に同じ。）
で示される基が挙げられる。
【００２９】
　尚、一般式［VII］〜［IX］中のアルキレン基、フェニレン基及びシクロヘキシレン基には置換基が導入されていてもよく、そのような置換基としては、例えばメチル基，エチル基，プロピル基，ブチル基等の炭素数１〜４の低級アルキル基（直鎖状、分枝状の何れにても可。）、例えば水酸基，カルボキシル基，スルホ基，アミノ基等の親水性を有する基等が挙げられる。
【００３０】
　本発明のマレイミド化合物は、例えば以下の方法により容易に得ることができる。
【００３１】
　即ち、本発明のポリペプチドと、該ポリペプチドのＮ末端のアミノ基に対して１〜100倍モル、好ましくは１〜50倍モル、より好ましくは1.2〜10倍モルの２価性架橋剤（一方の末端にマレイミド基を有し、他方にアミノ基と反応し得る基を有する化合物）、要すれば該アミノ基に対して２〜５倍モルの反応促進剤とを、pH６〜９の適当な緩衝液若しくは適当な有機溶媒中で、４〜37℃で0.2〜10時間反応させた後、反応液を適当なカラムクロマトグラフィーにより精製することにより本発明のマレイミド化合物を得ることができる。
【００３２】
　上記反応に於いて用いられる２価性架橋剤としては、最終的にマレイミド基を本発明のポリペプチドのＮ末端に導入し得るものであれば特に限定されないが、例えばマレイミド基とスクシンイミド基とを有する架橋剤等が挙げられ、より具体的にはスクシイミジル-N-4-マレイミドブチレート、スクシイミジル-N-6-マレイミドカプロイレート、スクシイミジル-N-8-マレイミドカプリレート、スクシイミジル-N-11-マレイミドウンデカノエート、スクシイミジル-N-4-(2-マレイミドエトキシ)スクシニレート、スルホスクシイミジル-N-4-マレイミドブチレート、スルホスクシイミジル-N-6-マレイミドカプロイレート、スルホスクシイミジル-N-8-マレイミドカプリレート、スクシイミジル-N-11-マレイミドウンデカノエート、スクシイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホスクシイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スクシミジル-m-マレイミドベンゾエート、スルホスクシイミジル-m-マレイミドベンゾエート、スクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート、スルホスクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート等が好ましく挙げられる。
【００３３】
　また、反応促進剤としては、例えばトリエチルアミン、ピリジン等の塩基が挙げられる。
【００３４】
　反応時の溶媒として用いられるpH６〜９の緩衝液としては、例えばこのようなpＨを有するリン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン（Bicine）緩衝液、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）緩衝液、3-モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS）緩衝液等のグッド緩衝液等が挙げられ、有機溶媒としては例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。
【００３５】
　また、反応終了後に本発明のマレイミド化合物を精製するために用いられるクロマトグラフィーとしては、例えばゲルカラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、オクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）カラム液体クロマトグラフィー等が挙げられる。
【００３６】
　尚、反応時の溶媒としては有機溶媒の方が好ましい。即ち、有機溶媒中での方がマレイミド基の分解が少ないため、結果的に高収率で本発明のマレイミド化合物を得ることができるからである。
【００３７】
　また、精製もＯＤＳカラム液体クロマトグラフィーにより行う方が、過剰な２価性架橋剤と本発明のマレイミド化合物とをより明確に分離し得るので望ましい。
【００３８】
　上記の如くして得られた本発明のマレイミド化合物は、例えば濃縮乾固、凍結乾燥等により処理することにより、安定に保存可能であるので、本発明のポリペプチドを本発明に係る適当な結合能物質（抗体）に結合するための中間体として極めて有用性の高いものである。
【００３９】
　また、本発明のマレイミド化合物と本発明に係る結合能物質とを結合させて本発明のポリペプチドと結合能物質との結合物を得る方法としては、例えば以下の如く行えばよい。
【００４０】
　即ち、本発明のマレイミド化合物と、常法により調製した抗体のFab'のＳＨ基とを、該抗体の性質を失わせしめないような溶液（例えば免疫学的測定法の分野で通常用いられる緩衝液等）中で４〜37℃で１〜16時間反応させることにより、本発明のポリペプチドと結合能物質（抗体）との結合物を調製することができる。
【００４１】
　また、本発明のポリペプチドのアミノ基と結合能物質のアミノ基とを結合させる方法としては、例えば自体公知のグルタールアルデヒド法等が挙げられ、本発明のポリペプチドのアミノ基と結合能物質の糖鎖とを結合させる方法としては、例えば該糖鎖を過ヨウ素酸で処理してアルデヒド基を形成させこのアルデヒド基と本発明のポリペプチドのアミノ基とを結合させる自体公知の過ヨウ素酸法等が挙げられる。
【００４２】
　尚、結合能物質に、本発明のポリペプチドを結合させる場合、該ポリペプチドの側鎖の反応活性基を利用して行ってもよいが、Ｎ末端のアミノ基を利用して行うことが望ましい。
【００４３】
　即ち、Ｎ末端のアミノ基は通常は一つしかないので、これを利用して結合能物質と結合させると、本発明のポリペプチドと結合能物質との結合モル比は１：１となる。そのため、該結合物を使用して測定対象物質の分離を行うと、１のピークとして分離されてくるから、目的の測定の精度をより向上させることができるからである。尚、本発明のマレイミド化合物は、このような結合物を調製するために有用な物質である。
【００４４】
　また、Ｎ末端のアミノ基を利用して本発明の結合物を調製する場合、本発明のポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基には強酸由来の酸残基を導入しない方が望ましい。即ち、このような本発明のポリペプチドと結合能物質とを結合させる方が、目的の結合物の収率が高くなるからである。
【００４５】
　本発明の結合物を利用した生体成分の測定方法（以下、「本発明の測定方法」と略記する。）としては、本発明の結合物を用いて目的の測定を実施し得る方法であれば特に限定されないが、具体的には例えば以下のような方法が挙げられる。
【００４６】
(1)非競合反応を利用した生体試料中の測定対象物質量の測定方法（測定方法(1)）
　先ず測定対象物質を含む生体由来の試料と、検出物質により標識された結合能物質（以下、「標識結合能物質」と略記する。）と、本発明の結合物（測定対象物質に於ける、標識結合能物質の結合部位と、本発明の結合物の結合部位とは異なっている）とを、要すれば適当な緩衝液中に添加、混合して反応させ、生体試料中の測定対象物質と、標識結合能物質と、本発明の結合物とが結合した複合体を形成させた後、該複合体と遊離の標識結合能物質とを、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン交換クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣ装置装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反応チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等（陰イオン交換法）を使用して分離する。次いで、分離された該複合体に含まれる検出物質の量を、検出物質の性質に応じた測定方法により求める。別に、測定対象物質濃度既知の試料を用い同様の方法により測定を行ない、生体試料中の測定対象物質量と該複合体中の検出物質の量との関係を表わす検量線を作成し、これを用いて、複合体中の検出物質の量に対応する生体試料中の測定対象物質量を求めれば、生体試料中の測定対象物質量が求められる。
【００４７】
　上記反応に於て、複合体を形成させる際の標識結合能物質及び本発明の結合物の使用濃度としては、生体試料中の測定対象物質の検量限界をどの程度に設定するかによっても変動はあるが、通常は反応液中に於て、設定された検量限界濃度に相当する生体試料中の測定対象物質全てと結合し得る濃度以上、好ましくはその２倍濃度以上、より好ましくは５倍濃度以上、更に好ましくは10倍以上が反応液中に存在していることが望ましい。
【００４８】
　尚、測定対象物質自身が何らかの方法により測定（検出）可能な物質である場合には、標識結合能物質を用いずに上記の反応を行ない、得られた複合体中の測定対象物質の性質に応じた測定方法により求めることによっても、同様に試料中の生体試料中の測定対象物質量を求めることができる。
【００４９】
(2)競合反応を利用した生体試料中の測定対象物質量の測定方法（測定方法(2)）
　先ず測定対象物質を含む生体由来の試料、検出物質により標識された測定対象物質（以下、標識測定物質と略記する。）、本発明の結合物とを、要すれば適当な緩衝液中に添加、混合して反応させ、生体試料中の測定対象物質と本発明の結合物との複合体、及び標識測定物質と本発明の結合物との複合体（以下、標識複合体と略記する。）を形成させた後、標識複合体と、遊離の標識測定物質とを、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン交換クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣ装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反応チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等を使用して分離する。次いで、分離された標識複合体に含まれる検出物質の量を、検出物質の性質に応じた測定方法により求める。別に、測定対象物質濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行ない、生体試料中の測定対象物質量と標識複合体中の検出物質の量との関係を表わす検量線を作成し、これを用いて標識複合体中の検出物質の量に対応する生体試料中の測定対象物質量を求めれば、試料中の生体試料中の測定対象物質量が求められる。
【００５０】
　上記の反応に於て、標識複合体を形成させる際の本発明の結合物の使用濃度及び標識測定物質の使用濃度は、生体試料中の測定対象物質の検量限界や測定感度をどの程度に設定するかによって適宜設定すればよく、特に限定されない。但し、標識測定物質の使用濃度は、反応液中に存在する本発明の結合物全てと結合し得る濃度以上に設定しておかなければならないことは言うまでもない。
【００５１】
(3)生体試料中の測定対象物質が同一の作用を有し、且つ同一の検出可能な化学特性を有する２以上の物質である測定方法（測定方法(3)）
　先ず、測定対象物質を含む生体由来の試料と、生体試料中の測定対象物質の少なくとも１つと特異的に結合するがこれらのうちの少なくとも１つとは結合しない性質を有し且つ本発明のポリペプチドが結合した物質（以下、「本発明の結合物Ａ」と略記する。）とを、要すれば適当な緩衝液中に添加、混合して反応させ、特定の生体試料中の測定対象物質と本発明の結合物Ａとの複合体を形成させた後、該複合体と遊離の生体試料中の測定対象物質とを、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン交換クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣ装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反応チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等を使用して分離する。次いで、分離された複合体に含まれる生体試料中の測定対象物質の量又は／及び遊離の生体試料中の測定対象物質の量を、生体試料中の測定対象物質の性質に応じた測定方法により求める。別に、例えば測定対象物質濃度既知の試料を用い同様の方法により測定を行ない、生体試料中の測定対象物質量と該複合体中の測定対象物質の検出可能な性質に基づく測定値との関係を表わす検量線を作成し、これを用いて測定値に対応する生体試料中の測定対象物質量を求めれば、試料中の生体試料中の測定対象物質の何れかの量が求められる。
【００５２】
　上記の反応に於て、複合体を形成させる際の本発明の結合物Ａの使用濃度は、測定対象物質の検量限界や測定感度をどの程度に設定するかによって適宜設定すればよく、特に限定されない。
【００５３】
(4)生体試料中の測定対象物質が、同一の作用を有する２以上の物質又は類似した構造を有するが異なる作用を有する２以上の物質である測定方法（測定方法(4)）
　先ず、測定対象物質を含む生体由来の試料と、生体試料中の測定対象物質の全てに対する結合能物質（以下、「結合能物質Ａ」と略記する。）を検出物質で標識したもの（以下、「標識結合能物質Ａ」と略記する。）及び生体試料中の特定の測定対象物質に対する結合能を有し且つ本発明のポリペプチドが結合した物質（以下、「本発明の結合物Ｂ」と略記する。）を、要すれば適当な緩衝液中に添加、混合して反応させ、生体試料中の測定対象物質と標識結合能物質Ａとの複合体（以下、複合体Ａと略記する。）及び生体試料中の特定の測定対象物質と標識結合能物質Ａと本発明の結合物Ｂとの複合体（以下、複合体Ｂと略記する。）を形成させた後、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の標識結合能物質Ａとを、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン交換クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣ装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反応チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等を使用して分離する。次いで、分離された複合体Ａ中に含まれる検出物質の量又は／及び分離された複合体Ｂ中に含まれる検出物質の量を、検出物質が保有する性質に応じた測定方法により求める。別に、例えば測定対象物質濃度既知の試料を用い同様の方法により測定を行ない、生体試料中の測定対象物質量と該複合体Ａ中に含まれる検出物質の量又は／及び複合体Ｂ中に含まれる検出物質の量との関係を表わす検量線を作成し、これを用いて、複合体中の検出物質の量に対応する生体試料中の測定対象物質量を求めれば、試料中の生体試料中の測定対象物質の何れかの量が求められる。
【００５４】
　尚、結合能物質Ａ自身が何らかの方法により測定（検出）可能な物質である場合には、検出物質により標識されていない結合能物質Ａを用いて上記の反応を行ない、得られた複合体中の結合能物質Ａの量を結合能物質Ａの性質に応じた測定方法により求めることによっても、同様に試料中の生体試料中の測定対象物質量を求めることができる。
【００５５】
(5)生体試料中の測定対象物質が、同一の作用を有する２の物質又は類似した構造を有するが異なる作用を有する２の物質である測定方法（測定方法(5)）
　先ず、測定対象物質を含む生体由来の試料と、標識結合能物質Ａ、生体試料中の測定対象物質１に対する結合能を有し且つ本発明のポリペプチド１が結合した物質（以下、「本発明の結合物Ｃ」と略記する。）及び生体試料中の測定対象物質２に対する結合能を有し且つ本発明のポリペプチド２が結合した物質（以下、「本発明の結合物Ｄ」と略記する。）を、要すれば適当な緩衝液中に添加、混合して反応させ、生体試料中の測定対象物質１と本発明の結合物Ｃと標識結合能物質Ａとの複合体（以下、複合体Ｃと略記する。）及び生体試料中の測定対象物質２と本発明の結合物Ｄと標識結合能物質Ａとの複合体（以下、複合体Ｄと略記する。）を形成させた後、複合体Ｃ、複合体Ｄ及び遊離の標識結合能物質Ａとを、ポリペプチド１及び２の性質の差に基づいて、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン交換クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣ装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反応チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等を使用して分離する。次いで、分離された複合体Ｃ中に含まれる検出物質の量又は／及び複合体Ｄ中に含まれる検出物質の量を、検出物質が保有する性質に応じた測定方法により求める。別に、例えば測定対象物質濃度既知の試料を用い同様の方法により測定を行ない、生体試料中の測定対象物質１（又は２）量と該複合体Ｃ中に含まれる検出物質の量又は／及び複合体Ｄ中に含まれる検出物質の量との関係を表わす検量線を作成し、これを用いて、複合体中の検出物質の量に対応する生体試料中の測定対象物質量を求めれば、試料中の生体試料中の測定対象物質の何れかの量が求められる。
【００５６】
　尚、結合能物質Ａ自身が何らかの方法により測定（検出）可能な物質である場合には、検出物質により標識されていない結合能物質Ａを用いて上記の反応を行ない、得られた複合体中の結合能物質Ａの量を結合能物質Ａの性質に応じた測定方法により求めることによっても、同様に試料中の生体試料中の測定対象物質量を求めることができる。
【００５７】
(6)生体試料中の測定対象物質が、糖鎖構造は異なるが蛋白質構造は実質的に同一な２以上の糖蛋白質である測定方法（測定方法(6)）
　先ず、測定対象の糖蛋白質を含む生体試料と、測定対象の糖蛋白質の少なくとも１つの特定の糖鎖構造を認識するレクチンと、測定対象の糖蛋白質全てに結合する性質を有するが該レクチンが結合した測定対象の糖蛋白質への結合が妨げられる性質を有する抗体と本発明のポリペプチドとの結合物（以下、「ポリペプチド結合抗体」と略記する。）、該レクチンが結合した測定対象の糖蛋白質を含む測定対象の糖蛋白質全てに結合し得る性質を有し且つ検出物質が結合した抗体（以下、「標識抗糖蛋白質抗体」と略記する。）とを反応させて、糖蛋白質とレクチンと標識抗糖蛋白質抗体との複合体と、糖蛋白質とポリペプチド結合抗体と標識抗糖蛋白質抗体との複合体とを形成させた後、これら複合体と遊離の標識抗糖蛋白質抗体とを、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン交換クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣ装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反応チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等を使用して分離する。次いで、分離されたこれら複合体中に含まれる検出物質の量を、検出物質が保有する性質に応じた測定方法により求める。別に、例えば測定対象の糖蛋白質濃度既知の試料を用い同様の方法により測定を行ない、生体試料中の測定対象の糖蛋白質量とこれら複合体中に含まれる検出物質の量との関係を表わす検量線を作成し、これを用いて、これら複合体中の検出物質の量に対応する生体試料中の測定対象の糖蛋白質量を求めれば、試料中の生体試料中の測定対象の糖蛋白質の何れかの量が求められる。
【００５８】
　尚、測定対象の糖蛋白質自身が何らかの方法により測定（検出）可能な物質である場合には、標識抗糖蛋白質抗体を使用しなくとも上記の測定が実施し得ることはいうまでもない。
【００５９】
　本発明を利用した測定方法(1)及び(2)により測定可能な生体試料中の測定対象物質としては、i)生体試料中の測定対象物質と互いに強い相互作用を及ぼしあい、強固な複合体を形成し得る物質が存在し、該物質がそれ自身何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は何らかの検出物質により標識可能なもの、であるか、若しくはii)測定対象物質自体が何らかの検出物質により標識可能なものであって、生体試料中の測定対象物質と互いに強い相互作用を及ぼしあい、強固な標識複合体を形成し得る物質が存在するもの、であれば、特に限定することなく挙げられるが、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれる蛋白質、ペプチド、核酸、糖鎖、脂質、ホルモン、薬物等が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ），ＣＡ１９−９，前立腺特異抗原（ＰＳＡ），癌胎児性抗原（ＣＥＡ），癌細胞の産生する特殊な糖鎖を有する物質等の癌マーカー、例えば免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ），免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ），免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ），β2−ミクログロブリン，アルブミン，フェリチン等の血清蛋白質、例えばＣ−ペプチド，アンジオテンシンＩ等のペプチド、例えばアミラーゼ，アルカリホスファターゼ，γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ）等の酵素、例えばルベラウイルス，ヘルペスウイルス，肝炎ウイルス，ＡＴＬウイルス，ＡＩＤＳウイルス等臨床的に注目されているウイルスに対する抗ウイルス抗体、ウイルス等の病原体のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）或はこれら核酸を構成する１本鎖ポリヌクレオチド、ウイルス等の病原体に由来する抗原性物質、例えばスギその他の草木の花粉や室内塵等のアレルゲンに反応する抗体、例えばリポ蛋白質等の脂質、例えばトリプシン，プラスミン，セリンプロテアーゼ等のプロテアーゼ、例えばインシュリン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ），サイロキシン（Ｔ4），トリヨードサイロニン（Ｔ3），プロラクチン，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）等のホルモン、例えばジゴキシン，フェニトイン，モルヒネ，ニコチン等の薬物、例えば甲状腺刺激ホルモン，アセチルコリン，グルタミン酸等に対するレセプター等が挙げられる。
【００６０】
　本発明を利用した測定方法(1)に係る、標識結合能物質を調製するために用いられる生体試料中の測定対象物質に対する結合能物質としては、これら生体試料中の測定対象物質と互いに強い相互作用を及ぼしあい、強固な複合体を形成する物質で、要すれば、それ自身何らかの方法により測定（検出）可能であるか、或は測定（検出）可能な何らかの検出物質により標識可能なもの（生体試料中の測定対象物質自身が何らかの検出物質により標識可能なものである場合にはこの限りではない。）であれば特に限定することなく挙げられるが、例えば抗原性を有する物質（ハプテンを含む。）に対する抗体、抗体に対する抗原、特定構造の糖鎖に対して結合能を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、例えばトリプシンに対するα1−アンチトリプシン，プラスミンに対するα2−マクログロブリン，セリンプロテアーゼに対するα2−マクログロブリンやα1−アンチキモトリプシン等の特定の酵素に対するインヒビター類、生体試料中の測定対象物質である１本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド鎖、ホルモンに対するレセプター等が挙げられる。
【００６１】
　本発明を利用した測定方法(1)及び(2)に係る、本発明の結合物を調製するために用いられる生体試料中の測定対象物質に対する結合能物質としては、これら生体試料中の測定対象物質（又は標識測定対象物質、或は測定対象物質と標識結合能物質との複合体）と互いに強い相互作用を及ぼしあい、強固な複合体を形成する物質であれば特に限定することなく挙げられるが、例えば抗原性を有する物質（ハプテンを含む。）に対する抗体、抗体に対する抗原、特定構造の糖鎖に対して結合能を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、例えばトリプシンに対するα1−アンチトリプシン，プラスミンに対するα2−マクログロブリン，セリンプロテアーゼに対するα2−マクログロブリン等の特定の酵素に対するインヒビター類、生体試料中の測定対象物質である１本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド鎖等（但し、標識結合能物質を調製するために用いた結合能物質とは結合部位が異なるもの。）が挙げられる。
【００６２】
　本発明を利用した測定方法(3)により測定可能な生体試料中の測定対象物質としては、それ自身が何らかの方法により測定（検出）可能であって、且つ生体試料中の測定対象物質の少なくとも１つとは互いに強い相互作用を及ぼしあい、強固な複合体を形成するが、それらの少なくとも１つとは結合しない性質を有する物質が存在するものであれば、特に限定することなく挙げられるが、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれる酵素等が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばアミラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ（ＰＫ），チロシンキナーゼ等の酵素等が挙げられる。
【００６３】
　本発明を利用した測定方法(3)に係る、本発明の結合物Ａを調製するために用いられる生体試料中の特定の測定対象物質に対する結合能物質としては、生体試料中の測定対象物質の少なくとも１つとは互いに強い相互作用を及ぼしあい、強固な複合体を形成するが、生体試料中の測定対象物質の少なくとも１つとは結合しない物質であれば特に限定することなく挙げられるが、例えば抗原性を有する物質（ハプテンを含む。）の特定の部分構造或は抗原決定部位に対する抗体、特定構造の糖鎖に対して結合能を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，ヒイロチャワンタケレクチン，ヒママメレクチン，ピーナッツレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、例えばアミラーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に対するインヒビター等が挙げられる。
【００６４】
　本発明を利用した測定方法(4)により測定可能な生体試料中の測定対象物質としては、(a)測定対象物質の全てと結合し、且つそれ自身が何らかの方法により検出可能な性質を有しているか又は検出物質により標識が可能な物質、及び(b)生体試料中の測定対象物質の少なくとも１つとは互いに強い相互作用（affinity；親和力或は親和性）を及ぼしあい、強固な複合体を形成するが、それらの少なくとも１つとは結合しない物質、が存在するものであれば、特に限定することなく挙げられるが、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれる酵素、生理活性物質、癌関連抗原、糖鎖を有する物質等が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばアミラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ，チロシンキナーゼ等の酵素類、例えばステロイドホルモン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ），プロラクチン，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ），α2-マクログロブリン，癌胎児性抗原（ＣＥＡ），α-フェトプロテイン等の癌関連抗原等が好ましく挙げられる。
【００６５】
　本発明を利用した測定方法(4)に係る、標識結合能物質Ａを調製するために用いられる生体試料中の測定対象物質に対する結合能物質としては、生体試料中の測定対象物質の全てと結合し得、且つそれ自身が何らかの方法により検出可能な性質を有しているか又は検出物質により標識し得る物質であれば特に限定することなく挙げられる。具体例としては、例えば抗原性を有する物質（ハプテンを含む。）の特定の部分構造或は抗原決定部位に対する抗体や特定構造の糖鎖に対して結合能を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，ヒイロチャワンタケレクチン，ヒママメレクチン，ピーナッツレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、或はアミラーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に対するインヒビター等が挙げられる。
【００６６】
　本発明を利用した測定方法(4)に係る、本発明の結合物Ｂを調製するために用いられる、生体試料中の特定の測定対象物質に対して結合能を有する結合能物質としては、生体試料中の特定の測定対象物質と遊離の標識結合能物質Ａとの複合体形成反応及び複合体中の検出物質（又は結合能物質Ａ）を検出する反応を阻害しないものであって、生体試料中の特定の測定対象物質に対して結合能を有する物質、或は標識結合能物質Ａに検出物質が結合している場合には該検出物質に対して結合能を有する物質であれば特に限定されることなく挙げられる。具体的には、例えば生体試料中の特定の測定対象物質に対して結合能を有する例えば抗体、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類（但し、結合能物質Ａとは結合部位が異なるもの。）等、或は結合能物質Ａ又は該検出物質に対して結合能を有する例えば抗体、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類等が好ましく挙げられる。
【００６７】
　本発明を利用した測定方法(5)により測定可能な生体試料中の測定対象物質としては、(a)測定対象物質の全てと結合し、且つそれ自身が何らかの方法により検出可能な性質を有しているか又は検出物質により標識が可能な物質、及び(b)生体試料中の測定対象物質１とは互いに強い相互作用（affinity；親和力或は親和性）を及ぼしあい、強固な複合体を形成するが、測定対象物質２とは結合しない物質、(c)生体試料中の測定対象物質２とは互いに強い相互作用（affinity；親和力或は親和性）を及ぼしあい、強固な複合体を形成するが、測定対象物質１とは結合しない物質が存在するものであれば、特に限定することなく挙げられるが、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれる酵素、生理活性物質、癌関連抗原、糖鎖を有する物質等が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばアミラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ，チロシンキナーゼ等の酵素類、例えばステロイドホルモン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ），プロラクチン，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ），α2-マクログロブリン，癌胎児性抗原（ＣＥＡ），α-フェトプロテイン等の癌関連抗原等が好ましく挙げられる。
【００６８】
　本発明を利用した測定方法(5)に係る、標識結合能物質Ａを調製するために用いられる生体試料中の測定対象物質に対する結合能物質としては、生体試料中の測定対象物質の全てと結合し得る、且つそれ自身が何らかの方法により検出可能な性質を有しているか又は検出物質により標識し得る物質であれば特に限定することなく挙げられる。具体例としては、例えば抗原性を有する物質（ハプテンを含む。）の特定の部分構造或は抗原決定部位に対する抗体や特定構造の糖鎖に対して結合能を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，ヒイロチャワンタケレクチン，ヒママメレクチン，ピーナッツレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、或はアミラーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に対するインヒビター等が挙げられる。
【００６９】
　本発明を利用した測定方法(5)に係る、本発明の結合物Ｃ又はＤを調製するために用いられる、生体試料中の特定の測定対象物質１又は２に対して結合能を有する結合能物質としては、生体試料中の測定対象物質１又は２と遊離の標識結合能物質Ａとの複合体形成反応及び複合体中の検出物質（又は結合能物質Ａ）を検出する反応を阻害しないものであって、生体試料中の特定の測定対象物質１又は２に対して結合能を有する物質であれば特に限定されることなく挙げられる。具体的には、例えば生体試料中の測定対象物質１又は２に対して結合能を有する例えば抗体、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類（但し、結合能物質Ａとは結合部位が異なるもの。）等、或は結合能物質Ａ又は該検出物質に対して結合能を有する例えば抗体、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類等が好ましく挙げられる。
【００７０】
　本発明を利用した測定法(6)に於いて用いられるレクチンとしては、種々のレクチン、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等の中から目的の糖鎖構造を認識し得る性質を有するものを適宜選択して用いればよく、特に限定されない。
【００７１】
　本発明を利用した測定法(6)に於いて用いられる、ポリペプチド結合抗体や標識抗糖蛋白質抗体を調製するために用いられる抗体としては、上記した如き性質を有する抗体であれば、常法、例えば「免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、(株)学会出版センター、1981」等に記載の方法に準じて、例えば馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に測定対象を免疫して作製されるポリクローナル性抗体でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタイン（Nature,256巻,495頁,1975）により確立された細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラインからの細胞と測定対象物質で予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させて得られるハイブリドーマが産生する単クローン性抗体でも何れにてもよく、これらを単独で或はこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。
【００７２】
　本発明を利用した測定法(6)により分別測定可能な糖蛋白質の具体例としては、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれる、糖鎖構造は異なるが蛋白質構造は実質的に同一な糖蛋白質が存在するものであって、測定対象の糖蛋白質の少なくとも１つの特定の糖鎖構造を認識するレクチンと、ポリペプチド結合抗体を調製し得る抗体とが存在するものであれば、特に限定されることなく挙げられるが、例えばアミラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ，チロシンキナーゼ等の酵素類、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ），甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ），α2-マクログロブリン，癌胎児性抗原（ＣＥＡ），α-フェトプロテイン等の癌関連抗原、例えばＣＡ１９−９，ＣＡ１２５等の糖鎖抗原等が好ましく挙げられる。
【００７３】
　本発明の測定法(6)に於ける試薬類の使用濃度等について以下に説明する。
【００７４】
　即ち、先ずレクチンの使用濃度は、使用するレクチンの種類、測定対象の糖蛋白質の性質等により変動するが、設定された測定対象糖蛋白質の検出限界濃度の通常10倍以上、好ましくは100倍以上、より好ましくは1000倍以上の濃度で反応時に共存させておくことが望ましい。
【００７５】
　また、ポリペプチド結合抗体の使用濃度は、測定対象糖蛋白質の検出限界をどの程度に設定するかによっても変動するが、レクチンとポリペプチド結合抗体の測定対象糖蛋白質に対する結合定数の違いを考慮した上で設定することが望ましい。例えば、測定対象糖蛋白質、レクチンの種類やその物性、ポリペプチド結合抗体の物性等により変動するものの、下記に示す一般式等を利用して設定することが望ましい。
【００７６】
　ポリペプチド結合抗体濃度≦（レクチンの結合定数）÷（ポリペプチド結合抗体の結合
　　　　　　　　　　　　　　　定数）×（レクチン濃度）
　尚、上記の一般式に係わる結合定数とは、下記（１）式の如き平衡反応に於ける結合定数を示し、下記（２）式により求められる定数である。
【００７７】
　　　　　　 ［Ａ］＋［Ｂ］←→［Ａ・Ｂ］　　　　　　（１）
　　　　　   結合定数＝［Ａ・Ｂ］／（［Ａ］×［Ｂ］）　　（２）
　　　　　［Ａ］：平衡状態に於けるレクチン又はポリペプチド結合抗体の濃度（Ｍ）。
　　　　　［Ｂ］：平衡状態に於ける遊離の測定対象糖蛋白質濃度（Ｍ）。
　　　［Ａ・Ｂ］：レクチン（又はポリペプチド結合抗体）と測定対象糖蛋白質との複合
　　　　　　　　　体の濃度（Ｍ）。
【００７８】
　より具体的に述べれば、例えばレクチンの測定対象糖蛋白質への結合定数が1×106Ｍ-1で、ポリペプチド結合抗体の測定対象糖蛋白質への結合定数が１×108Ｍ-1である場合には、ポリペプチド結合抗体濃度はレクチン濃度の100分の１以下、好ましくは1000分の１以下ということになる。尚、ポリペプチド結合抗体の使用濃度は、設定した検出限界濃度の測定対象糖蛋白質の全てと結合し得る濃度以上である方が望ましいが、それ以下（例えば１／１０程度）であってもよい。
【００７９】
　また、標識抗糖蛋白質抗体の使用濃度は、測定対象糖蛋白質の検出限界をどの程度に設定するかによって変動するが、反応液中の濃度として、設定した検出限界濃度の測定対象糖蛋白質の全てと結合し得る濃度以上、好ましくはその２倍濃度以上、より好ましくはその５倍濃度以上、更に好ましくはその10倍濃度以上としておくことが望ましい。
【００８０】
　尚、以上述べた本発明を利用した測定方法(1)〜(6)を実施するに当たり、複合体を、遊離の結合能物質（標識されているものも含む）、測定対象物質（標識されているものも含む）等から分離する際には、上記した如きＨＰＬＣの代わりに、陰性電荷を利用する方法であって、通常この分野で用いられる物質の陰性電荷の違いに基づいてこれらを電気的に分離する方法、例えば分離用担体を使用しない界面動電分離方法（特公平7-111398号公報等）、分離用担体を使用する電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、例えば核酸のハブリダイゼイション、抗原抗体反応等を電荷の違いを利用して促進した後遊離の核酸鎖や抗体等を電気的に分離する方法（国際公開第95/12808号公報等）等を利用して行っても良い。また、これらの内、分離用担体を使用する電気泳動法等で使用する担体も通常この分野で用いられる担体（例えば濾紙、例えば寒天ゲル、アガーゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、デンプンゲル等のゲル、セルロースアセテート膜等）であれば特に限定されることなく使用可能である。
【００８１】
　本発明の測定方法に於いて用いられる検出物質としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に於いて用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，パーオキシダーゼ，マイクロパーオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられる99mＴc，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）で用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられるが、これらに限定されるものではないことは言うまでもない。
【００８２】
　結合能物質に、上記した如き検出物質を標識する方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或はＦＩＡ等に於いて一般に行われている自体公知の標識方法（例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971；図説蛍光抗体、川生明著、第１版、(株)ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書院、1982等）が何れも例外なく挙げられ、これらに準じて行えばよい。また、標識方法として、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法を利用しても良いことは言うまでもない。
【００８３】
　本発明に係る、それ自身何らかの方法により測定（検出）可能な結合能物質の例としては、例えば酵素、蛍光性物質、発光性物質或は紫外部に吸収を有する物質等のように、それ自身上記した如き検出物質としての性質を有しているものが挙げられる。
【００８４】
　本発明の測定方法に於いては、本発明のポリペプチドの種類（導入される強酸由来の酸残基の種類や数、構成アミノ酸残基の種類等）により複合体の溶出時間を自由に調節できるので、この性質を利用すれば、分別測定も可能である。
【００８５】
　即ち、強酸由来の酸残基数の異なる本発明のポリペプチドを２種以上用い、且つ各ポリペプチドを結合させる結合能物質の種類を適宜選択することにより、複数の測定対象物質の同時測定（分別測定）を行うことが可能となるのである。
【００８６】
　また、測定に影響を与える血清成分が複数の場合でも、本発明のポリペプチドを用いて複合体のイオン性をこれら血清成分が有するイオン性よりも大きくしておけば、血清成分が測定に及ぼす影響を避けることができるという効果が生ずる。この場合、ステップワイズグラジエントを利用することにより分析に要する時間を短縮することができるという効果が生ずる。
【００８７】
　更にまた、陰イオン交換法に於いて用いられるクロマトグラフィー用の担体（ゲル担体、メンブラン担体、ガラス担体等）は、一般に交換能（イオン性物質の絶対吸着能）が高いので、血清等の生体由来試料の如くイオン性の共存物質の絶対量が多い試料の分析を行う場合であっても、本発明の結合物が結合した複合体を全て吸着することができるので、該複合体を共存物質による影響を殆ど回避できる位置に溶出させることが可能である。また、本発明の測定方法に利用される本発明のポリペプチドは、水に対する溶解度が高いので、これが結合した複合体の水溶性は結合前のそれよりも高くなるので、本発明の測定方法に於いては、分離向上物質（ポリペプチド）が結合した複合体の形成反応時に測定対象物質の変性、失活が起こる可能性は殆どない。
【００８８】
　また、本発明のポリペプチドのアニオン性を利用して目的物とその他の共存物質とを分離するために陰イオン交換法で使用される担体としては、アニオン交換能を有している担体であれば特に限定されることなく挙げられるが、例えばジエチルアミノエチル（DEAE）基、第四級アンモニウム基（例えばＱ基、QAE基等）等のアニオン交換基を有する担体、より具体的には例えばDEAE-MCIゲル（三菱化成(株)商品名)、QAE MCIゲル（三菱化成(株)商品名)、ワコービーズDEAEゲル（和光純薬工業(株)商品名)等のアニオン交換クロマトグラフィー用充填剤やメンブランを用いたメムセップDEAE（日本ミリポアリミテッド(株)商品名）等が挙げられる。尚、市販のクロマトグラフィー用担体、或は樹脂やガラスでできた容器の表面に上記した如きアニオン交換基を常法により結合させたものを自製して使用してもよいことはいうまでもない。
【００８９】
　本発明の結合物を用いる生体成分の測定方法は、陰性電荷を利用する方法を用いた方法であるが故に優れた測定方法である。
【００９０】
　即ち、例えば、ゲル濾過法を利用して生体成分の測定方法を実施するためには適当な長さのカラムを用いることが必要であるので、ゲル濾過法を利用した場合には、陰性電荷を利用する方法を用いた場合に比較して分離時間が長くなるという欠点がある。それ故、分離時間の短縮が要求されるときには、陰性電荷を利用する方法であって、例えば陰イオン交換クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣ装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反応チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等の陰イオン交換法を利用する方が好ましい。さらに、ゲル濾過法には、非常に高い分子量（分子の大きさが約1000オングストローム以上）を持つ生体試料中の測定対象物質の分離には適していない、という欠点もある。
【００９１】
　また、疎水分離法の場合、生体試料中の測定対象物質がタンパク質のような高次構造を持つ生理活性物質であるときには、分離操作の際に使用する有機溶媒により高次構造が破壊されて複合体中の生体試料中の測定対象物質の活性が失われるという問題が生じる場合がある。
【００９２】
　一方、陰イオン交換法は、イオン性の微妙な違いに基づいて、より効果的に生体試料中の測定対象物質を分離することができる。更に、陰イオン交換法によれば、様々なイオン性を持つ本発明のポリペプチドを任意に選択することができるので、最適ｐＨ条件下で生体試料中の測定対象物質の分離を行うことができる。更にまた、本発明のポリペプチドは、それ自体高い水溶性を持つので、これを生体試料中の測定対象物質に結合させても、生体試料中の測定対象物質の沈澱が起こる恐れは殆どなく、安定な状態で分離操作を実行することができる。
【００９３】
　本発明の測定方法を用いて生体試料中の測定対象物質の測定を行った場合には、目的の生体試料中の測定対象物質のピークを血清や尿等の成分の影響を受けない位置に移動させることができる。そればかりか、生体試料中の測定対象物質に応じて適宜適当な性質を有する本発明の結合物を選択して用いることにより、種々の生体試料中の測定対象物質を含む複合体の溶出位置を一致させることができるので、同一分析条件下の陰イオン交換法（例えばＨＰＬＣ）を用いて、多種の生体試料中の測定対象物質の測定を行うことができるという効果も生ずる。
【００９４】
　本発明の測定方法に於いて、陰性電荷を利用する方法により分離された複合体（標識複合体）中に含まれる検出物質（結合能物質、結合能物質Ａ又は生体試料中の測定対象物質）の量の測定は、検出物質（結合能物質、結合能物質Ａ又は生体試料中の測定対象物質）が有している、何らかの方法により検出し得る性質に応じて夫々所定の方法に従って実施される。例えば、その性質が酵素活性の場合にはＥＩＡの常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜63頁、共立出版(株)、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、検出物質が放射性物質の場合にはＲＩＡの常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて液浸型ＧＭカウンター，液体シンチレーションカウンター，井戸型シンチレーションカウンター，ＨＰＬＣ用カウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971等参照。）。また、その性質が蛍光性の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いるＦＩＡの常法、例えば「図説　蛍光抗体、川生明著、第１版、(株)ソフトサイエンス社、1983」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、その性質が発光性の場合にはフォトンカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、252〜263頁、共立出版(株)、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。更に、その性質が紫外部に吸収を有する性質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、検出物質がスピンの性質を有する物質の場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271頁、共立出版(株)、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて夫々測定を行えばよい。
【００９５】
　本発明の測定方法に於いて、生体試料中の測定対象物質と本発明の結合物（結合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ等を含む）、要すれば標識された或はされない結合能物質（結合能物質Ａを含む。）とを反応させて、複合体を形成する際の反応条件、或は生体試料中の測定対象物質と標識測定物質と本発明の結合物とを反応させて、標識複合体を形成する際の反応条件としては、複合体（又は標識複合体）の形成反応を妨げる様な条件でなければ特に限定されないが、常法、例えばＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，アフィニティクロマトグラフィー等の自体公知の方法に於いて複合体等を形成させる際の反応条件に準じて行えばよい。例えば、反応時に緩衝液を用いる場合には、使用される緩衝剤やその他の試薬はこれら自体公知の方法に於いて用いられるものを適宜選択して用いればよい。また、反応時のｐＨとしては、複合体（又は標識複合体）の形成反応を妨げない範囲であれば特に限定されるものではないが、通常２〜10、好ましくは５〜９の範囲が挙げられる。反応時の温度も、複合体（又は標識複合体）の形成反応を妨げない範囲であれば特に限定されるものではないが、通常０〜50℃、好ましくは20〜40℃の範囲が好ましく挙げられる。反応時間は、複合体（又は標識複合体）が形成されるのに要する時間が、生体試料中の測定対象物質と本発明の結合物、及び標識結合能物質等との反応性、或は本発明の結合物及び標識測定物質との反応性により異なるので、各々の性質に応じて数秒間乃至数時間適宜反応させればよい。
【００９６】
　本発明の測定方法に於いて陰イオン交換法を実施するために用いられるＨＰＬＣとしては、装置自身は通常分析の分野に於いて用いられているもので定流速が得られるものであれば特に問題なく用いることができる。
【００９７】
　本発明の測定方法をＨＰＬＣを用いて行う場合、測定対象物質の測定は、ピーク面積又はピークの高さを利用して行えばよい。
【００９８】
　陰イオン交換法、より具体的にはＨＰＬＣにより複合体（又は標識複合体）や遊離の標識結合能物質等との分離を行う際に用いられる溶媒（溶離液）としては、形成された複合体（又は標識複合体）等が再び生体試料中の測定対象物質や標識結合能物質等とに分解されるようなことがなく、且つ複合体（又は標識複合体）に含まれる結合能物質等や検出物質が有している、何らかの方法により検出し得る性質を失わしめるようなものでなければ特に限定されることなく挙げられるが、通常は例えばＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，アフィニティクロマトグラフィー等の自体公知の方法に於いて緩衝液として用いられているようなものが好ましく用いられる。具体例としては、例えばリン酸塩，酢酸塩，クエン酸塩，グッド(Good)の緩衝剤，トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の緩衝剤、例えば塩化ナトリウム，塩化カリウム，硫酸アンモニウム等の塩類、例えばメタノール，エタノール，イソプロピルアルコール，アセトニトリル，テトラヒドロフラン等の極性有機溶媒類及び界面活性剤等を、複合体（又は標識複合体）や遊離の標識結合能物質等の性質に応じて適宜選択し、添加、混合して調製された、ｐＨ２〜10の緩衝液が好ましく用いられる。
【００９９】
　尚、溶離液中に適当な界面活性剤を適宜添加することにより、複合体（又は標識複合体）のピークのテーリングを防止すると共に、複合体（又は標識複合体）や遊離の標識結合能物質等の溶出位置を更に自由に調整することが可能となる。このような目的で使用可能な界面活性剤としては、複合体（又は標識複合体）や遊離の標識結合能物質等の性質に応じて適宜選択されればよくその種類は特に限定されないが、例えばn-ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、塩化 1-ラウリンピリミジウム等の陽イオン系界面活性剤、例えばラウリルベタイン、ラウリル酸アミドプロピルベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、2-アルキル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリウムベタイン、2-ウンデシル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリウムベタイン、N-ラウロイル-N-メチル-β-アラニンナトリウム等の両性系界面活性剤が好ましく挙げられる。また、このような目的で溶離液中に界面活性剤を添加する場合の添加濃度としては、目的の効果が生じる濃度で有れば特に限定されず界面活性剤の種類により若干変動するが、通常0.01〜２％、好ましくは0.05〜１％の範囲から適宜選択される。
【０１００】
　また、本発明の測定方法に於て、ＨＰＬＣによる分離後の測定方式としては、例えば「最新液体クロマトグラフィ、原昭二・辻章夫編、第１版、92〜104頁、南山堂、1978年２月１日発行」等に記載されているような、ＨＰＬＣのカラムからの流出液をそのまま検出部に導き、流出液中の複合体（又は標識複合体）中に含まれる検出物質（又は、結合能物質や測定対象物質）の量を直接測定する方式が、測定が迅速に行えるのでより好ましい。この場合に、結合能物質（又は測定対象物質）が、或は標識結合能物質等（又は標識測定物質）に保持されている検出物質が有している、何らかの方法により検出し得る性質が、例えば酵素活性であれば、ＨＰＬＣのカラムと検出部との間に、酵素活性測定用の試薬を添加し流出液と反応させる、所謂ポストカラム法の反応部を設ける必要があることは言うまでもない。検出物質（又は、結合能物質等又は測定対象物質）の該性質が酵素活性である場合に該反応部に於いて用いられる酵素活性測定用の試薬は、常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜63頁、共立出版(株)、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて調製したものを用いてもよいし、市販されている臨床検査用キットの試薬を適宜選択して利用してもよい。また、検出物質（又は、結合能物質等又は測定対象物質）の該性質が酵素活性以外の場合に於いても、検出感度を増加させる目的で所定の試薬を添加、反応させるために、ＨＰＬＣのカラムと検出部との間に適当な反応部を設けることは任意である。
【０１０１】
　本発明の測定方法に於いて用いられるＨＰＬＣの溶離液として成分の異なるものを複数用いる場合には、その操作法としては濃度勾配法（リニアグラジエント法）により行ってもステップワイズ法により行っても何れにても良いが、ステップワイズ法には、操作が簡便であること、実際の分析時間を短くすることができること、目的のピークがシャープになること等の利点があるので、より望ましい。
【０１０２】
　また、本発明の生体試料中の測定対象物質測定用試薬としては、本発明のポリペプチドと、生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有する物質との結合物を含んでなるものが挙げられ、その他必要に応じて例えば標識測定対象物質、標識結合能物質、緩衝剤、界面活性剤等を適宜含有するものである。尚、夫々の構成要素の好ましい態様、具体例等は上で述べたとおりである。
【発明の効果】
【０１０３】
　本発明は、生体試料中の測定対象物質と、結合能物質との相互作用の結果生じる複合体と、遊離の結合能物質等や該複合体の検出に影響を与える恐れのある共存物質とを陰性電荷を利用する方法を用いて分離する際に、該複合体と遊離の結合能物質等とをより効果的に分離するために用いることのできる新規なポリペプチド並びにこのポリペプチドを使用した生体試料中の測定対象物質の測定方法を提供するものであり、本発明の測定方法を利用して血清等の生体試料中の微量成分の測定を行った場合には、従来のＥＩＡやＲＩＡ等の測定法、或は、分離向上物質としてカルボキシル基を有するポリマーを利用する方法等に比較して容易に且つ極めて短時間で高精度の測定が行な得るという顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ大なる発明である。
【０１０４】
　以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【０１０５】
　尚、以下の実施例で使用する略号は夫々以下のものを示す。
　Ala；アラニン、βAla；β-アラニン、Ser；セリン、Tyr；チロシン、Asp；アスパラギン酸、Fmoc；9-フルオレニルメトキシカルボニル基、Alko；p-アルコキシベンジルアルコール、tBu；t-ブチル基、TFA；トリフルオロ酢酸、BOP；ベンゾチアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト、HOBt；N-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール、DMF；N,N-ジメチルホルムアミド、DIEA；N,N-ジイソプロピルエチルアミン。
【実施例１】
【０１０６】
＜Ala-(Ser(SO3H))5-βAla（ポリペプチド３）の合成＞
（１）Fmoc-Ala-(Ser)5-βAlaの合成
　Fmoc-βAla-Alko 樹脂（100〜200mesh，渡辺化学工業(株)社製）2.3g(βAlaとして1.5mmol)を出発原料とし、文献（J.Org.Chem., 53, 617-624(1988)）記載の方法（BOP/HOBt法）に従って、固相法により合成した。
　即ち、先ず、Fmoc-βAla-Alko 樹脂をピペリジンにより処理してFmoc基を除去した。これと、樹脂上のβAlaに対して３倍当量の所定のアミノ酸を含むDMF溶液、３倍当量のBOP、３倍当量のHOBt及び5.3倍当量のDIEAを加え、室温で２時間カップリング反応（２回）を行う操作により、順次アミノ酸を導入した。尚、導入したアミノ酸の順序はFmoc-Ser(tBu)（和光純薬工業(株)社製）、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ala（和光純薬工業(株)社製）であった。
　全アミノ酸を導入後、樹脂をMeOH洗浄し、TFA：アニソール（95：5）混液20mlを加えて室温で１時間撹拌反応させて、目的のポリペプチドを樹脂から切断すると同時にtBu 基（Serの水酸基の保護基）を切断させた。反応終了後、樹脂を濾去し、濾液を減圧濃縮後エーテルを加え反応生成物を沈澱させた。沈澱を集め、デシケータで乾燥させ、Fmoc-Ala-(Ser)5-βAla　0.84gを得た。
【０１０７】
（２）Ala-(Ser(SO3H))5-βAla（ポリペプチド３）の合成
　（１）で合成したFmoc-Ala-(Ser)5-βAla 547mg(0.67mmol)をDMF40mlに溶解し、更にDMF・SO3溶液30ml［DMF・SO3（Fluka社製）2.57gをDMF：ピリジン（4：1） 混液30mlに溶解したもの］を加え、４℃で１晩反応させた。反応液に更に同量のDMF・SO3溶液を加え、４℃、１晩更に反応させた。反応終了後、反応液をアセトン400mlに加え、生じた沈澱を濾取し、沈澱をDMF40mlに溶かしてピペリジン8ml を加え、室温で４０分間撹拌反応させてFmoc基を切断させた。反応液をアセトン500mlに加え、生じた沈澱を濾取し、アセトン、エーテル洗浄後デシケータで乾燥させた。得られた沈澱を、陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでゲル濾過に供しAla-(Ser(SO3H))5-βAla（ポリペプチド３） 210mgを得た。
　反応生成物のアミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィーの結果を表１に示す。
　尚、アミノ酸分析は、ワコーＰＴＣ−アミノ酸分析システム（和光純薬工業(株)社製）により行った（以下、同じ。）。
【実施例２】
【０１０８】
＜Ala-Tyr(SO3H)3-βAla（ポリペプチド11）の合成＞
　Fmoc-βAla-Alko 樹脂 0.77g(0.5mmol)を出発原料とし、実施例１（１）と同じ試薬を用い、同様の操作を行って所定のアミノ酸を導入した。尚、導入したアミノ酸の順序はFmoc-Tyr(SO3Na)（Bachem社製）、Fmoc-Tyr(SO3Na)、Fmoc-Tyr(SO3Na)、Fmoc-Alaであった。
　反応終了後、樹脂をMeOH洗浄し、DMF：ピペリジン（4:1）混液50mlを加え、室温で１時間撹拌反応を行って、Fmoc基を切断させた。溶媒を濾去し、樹脂をMeOH洗浄した後、TFA：H2O：m-クレゾール（45：5：2）を加え、窒素ガス置換後４℃、16時間撹拌反応させて、目的のポリペプチドを樹脂から切断させた。反応液から樹脂を濾去し、濾液を減圧濃縮後エーテルで反応生成物を沈澱させた。沈澱を、陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでゲル濾過に供し、Ala-Tyr(SO3H)3-βAla（ポリペプチド11）180mgを得た。
　反応生成物のアミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィーの結果を表１に併せて示す。
【実施例３】
【０１０９】
＜Ala-(Tyr(SO3H))5-βAla（ポリペプチド14）の合成＞
（１）Fmoc-Ala-(Tyr)5-βAlaの合成
　Fmoc-βAla-Alko Resin 2.3g(1.5mmol)を出発原料とし、実施例１（１）と同じ試薬を用い、同様の操作を行って所定のアミノ酸を導入した。尚、導入したアミノ酸の順序はFmoc-Tyr(tBu)（渡辺化学社製）、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Alaであった。
　反応終了後、樹脂をMeOH洗浄し、TFA：チオアニソール：1,2-エタンジチオール（95：5：1）混液を加え室温で１時間撹拌反応させて、ポリペプチドを樹脂から切断すると同時にtBu基（Tyrの水酸基の保護基）を切断させた。反応終了後、樹脂を濾去し、得られた濾液を減圧濃縮後エーテルを加え反応生成物を沈澱させた。沈澱を濾取し、デシケータで乾燥させ、Fmoc-Ala-(Tyr)5-βAla 1.71gを得た。
【０１１０】
（２）Ala-(Tyr(SO3H))5-βAla（ポリペプチド14）の合成
　（１）で得られたFmoc-Ala-(Tyr)5-βAla 0.5gをDMF3mlと混合したものに、DMF・SO3溶液15ml（DMF・SO3 3.2gをDMF：ピリジン（4：1）15mlに溶解したもの）を加え、４℃、１晩反応させた後エーテルを加えて反応生成物を沈澱させた。沈澱をDMF10mlに溶かし、ピペリジン2.5mlを加え、室温で１時間撹拌反応させた。反応液にエーテル150mlを加えた後に、生じた沈澱を濾取した。得られた沈澱を水 ４mlに溶かし、反応生成物をODSカラム液体クロマトグラフィーで分取した［カラム：Wakosil 10C18(2.0φx25cm)（和光純薬工業(株)社製）、溶離条件：10mM AcONa(pH6.0)，2→60%アセトニトリル］。得られた目的物を含む画分を、更にゲルろ過により処理して、Ala-(Tyr(SO3H))5-βAla（ポリペプチド14）203mgを得た。
　反応生成物のアミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィーの結果を表１に併せて示す。
【実施例４】
【０１１１】
＜硫酸化ポリペプチド（ポリペプチド1,2,4〜9、18及び20〜22）の合成＞
　実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作を行って、表１に記載のポリペプチド1,2,4〜9,18及び20〜22を合成した。また、実施例２と同じ試薬を用い、同様な操作を行って、表１に記載のポリペプチド10を合成した。
　尚、ポリペプチド６を合成する際の出発原料としてはFmoc-Ser(tBu)-O-polymer（国産化学(株)製）を用い、ポリペプチド21及び22を合成する際の出発原料としてはFmoc-Tyr(tBu)-Alko Resin（100〜200 mesh,渡辺化学工業(株)製）を用いた。
　得られた各種ポリペプチドのアミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィーの結果を表１に併せて示す。
【実施例５】
【０１１２】
＜硫酸化ポリペプチド（ポリペプチド12,13,15〜17及び19）の合成＞
　実施例３と同じ試薬を用い、同様の操作を行って、表１に記載のポリペプチド12,13,15〜17及び19を合成した。尚、ポリペプチド12,16を合成する際の出発原料としてはFmoc-βAla-Alko 樹脂（100〜200mesh，渡辺化学工業(株)社製）を用い、ポリペプチド13,15,17,19を合成する際の出発原料としてはFmoc-Tyr(tBu)-Alko Resin（100〜200 mesh,渡辺化学工業(株)製）を用いた。
　反応生成物のアミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィーの結果を表１に併せて示す。
【実施例６】
【０１１３】
＜Ala-(Tyr(PO3H2))5-βAla（ポリペプチド23）の合成＞
　Fmoc-βAla-Alko Resin 780mg(0.5mmol)を出発原料とし、実施例１（１）と同じ試薬を用い、同様の操作を行って所定のアミノ酸を導入した。尚、導入したアミノ酸の順序はFmoc-Tyr(PO3H2)（Nova biochem社製）、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Alaであった。
　反応終了後樹脂をMeOH洗浄し、次いでDMF：ピペリジン（4:1）混液50mlを加え、室温で１時間撹拌反応させてFmoc基を切断させた。反応終了後、樹脂を濾取し、MeOHで洗浄した後、TFA：フェノール：H2O：チオアニソール：エタンジオール（33：2：2：2：1）混液20mlを加え室温で１時間撹拌反応させてポリペプチドを樹脂から切断させた。反応終了後、樹脂を濾去し、濾液にエーテルを加えて反応生成物を沈澱させた。得られた沈澱を、陰イオンカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過に供して、Ala-(Tyr(PO3H2))5-βAla（ポリペプチド23）760mgを得た。
　反応生成物のアミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィーの結果を表１に併せて示す。
【実施例７】
【０１１４】
＜4-マレイミドブチリル-Ala-(Tyr(PO3H2))5-βAla（ポリペプチド24）の合成＞
　Fmoc-βAla-Alko Resin 780mg(0.5mmol)を出発原料とし、実施例１（１）と同じ試薬を用い、同様の操作を行って所定のアミノ酸を導入した。尚、導入したアミノ酸の順序はFmoc-Tyr(PO3H2)（Nova biochem社製）、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Ala、マレイミドブチリル酸であった。
　反応終了後、樹脂をMeOHで洗浄し、これをTFA：アニソール（95：5）混液で処理してポリペプチドを樹脂から切断させた。樹脂を濾去し、得られた濾液にエーテルを加えて沈澱を生じさせた。得られた沈澱を、ODSカラム［カラム：Wakosil 5C18(2.0φx25cm)（和光純薬工業(株)社製）、溶離条件：0.1% TFA，0→10%アセトニトリル］、次いでゲル濾過に供し、4-マレイミドブチリル-Ala-(Tyr(PO3H2))5-βAla（ポリペプチド24） 820mgを得た。
　反応生成物のアミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィーの結果を表１に併せて示す。
【０１１５】
【表１】
2004117370.tif 000004
【実施例８】
【０１１６】
＜陰イオン交換カラムでのアニオン性ポリペプチドの溶出位置の検討＞
（試料）
　実施例１〜７で得られたポリペプチド１〜24を夫々5mg/ml含有する水溶液を試料とした。
　尚、対照として(Asp)9-βAla（以下、「Asp9」と略記する。BOP/HOBt法により自製した。）、平均分子量6000のポリアスパラギン酸（以下、「Asp6K」と略記する。シグマ社製）又は平均分子量50000のポリアスパラギン酸（以下、「pAsp」と略記する。シグマ社製）を夫々5mg/ml含有する水溶液も試料として調製した。
（分析条件）
　カ ラ ム：POROS-DEAE(4.6φx10mm、パーセプティブ社製)。
　溶離液Ａ：50mM リン酸緩衝液（pH7.6）。
　溶離液Ｂ：50mM リン酸緩衝液（pH7.6、5M NaCl含有）。
　流　　速：1ml/min。
　検　　出：硫酸化セリン残基含有ポリペプチドについて；UV220nm。
　　　　　　硫酸化チロシン残基含有ポリペプチドについて；UV260nm。
　　　　　　リン酸化チロシン残基含有ポリペプチドについて；UV260nm。
　グラジエント条件：０→５min　Ａ＝100％
　　　　　　　　　　５→30min　Ｂ＝０→100％
　　　　　　　　　　30→35min　Ｂ＝100％
（測定操作）
　試料20μlを上記条件のＨＰＬＣにより分析した。
【０１１７】
（結果）
　各ポリペプチドの溶出に要する塩濃度（以下、「溶出塩濃度」と略記する。）を図１に示す。尚、図１中、●は溶出ピーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶出し始めと終わりの塩濃度の範囲，すなわち、ピーク幅を示す。また、図の横軸の各記号及び番号はポリペプチドの種類（表１のポリペプチドNo.及び略号）を示す。
　図１の結果から以下のようなことが判る。
　(1)強酸由来の酸残基（硫酸基、リン酸基）数を増加させることにより、溶出塩濃度が高くなることが判る。
　(2)ポリペプチド3（硫酸残基数：５）及び11（硫酸残基数：３）はAsp9と同等の溶出塩濃度を示し、ポリペプチド6（硫酸残基数：10）、8（硫酸残基数：９）、9（硫酸残基数：10）、12,13（硫酸残基数：４）及び14,15（硫酸残基数：５）はAsp6KやpAspと同等の溶出塩濃度を示すこと、言い換えれば、本発明のポリペプチドは、従来のカルボン酸残基を有するポリペプチドよりも短い鎖長のもの（アミノ酸残基数が少ないもの）で、同等の効果（陰イオン交換カラムへ保持される強さの程度が同等であるという効果）が得られることが判る。
　(3)陰イオン交換カラムへ保持される強さの程度は、強酸由来の酸残基の種類や数、該酸残基を導入するアミノ酸残基の種類、カラム充填剤の性質等により変化する。例えば、硫酸化セリン残基を有するポリペプチド２〜９についての結果と硫酸化チロシン残基を有するポリペプチド10〜20についての結果とを比較すると、強酸由来の酸残基数が同じ場合には、硫酸化チロシン残基を有するポリペプチドの方が溶出塩濃度が高くなることが判る。尚、この結果は、今回使用したカラム充填剤の基材が若干疎水性を有するものであるため、ベンゼン環を有するチロシン残基を保有するポリペプチドの方がカラムに保持され易く、その結果見かけの溶出塩濃度が高くなった、と考えられる。また、硫酸残基を５個有するポリペプチド３及び14についての結果とリン酸残基を５個有するポリペプチド23及び24の結果との比較から、硫酸残基を有するポリペプチドの方が溶出塩濃度が高くなることが判る。これらの結果から、導入する酸残基の種類や数、構成アミノ酸残基の種類、カラム充填剤の種類等を適宜選択することにより、任意の溶出塩濃度を有するポリペプチドを選択し得ることが判る。
【０１１８】
　(4)強酸由来の酸残基を導入するアミノ酸残基の種類や数、並びに該酸残基の種類や数が同じであっても、ポリペプチド中のその他のアミノ酸残基の存在によって、陰イオン交換カラムへ保持される強さの程度は変化する。例えば、硫酸化チロシン残基を有するポリペプチド12〜19の結果から、硫酸化チロシン残基数が同じでも、β-アラニン残基の有無により、溶出塩濃度が変動する（β-アラニン残基を導入することにより溶出塩濃度は低くなる）ことが判る。この結果から、該酸残基を導入したアミノ酸残基以外に適当なアミノ酸残基を導入することによっても、任意の溶出塩濃度を有するポリペプチドを調製し得ることが判る。
　(5)比較例のpAsp-1及びpAsp-2（製造ロットの異なるpAsp）により得られた結果から、従来のカルボン酸残基を有するポリペプチドでは、製造ロットにより溶出塩濃度が変化すること、言い換えれば、目的のピークのテーリングの状況が変化すること、即ち均一の分子量を有するポリペプチドを得難いということが判る。これに対し、本発明のポリペプチドは、ペプチド合成により均一のものを容易に得られるので、pAspに於けるこのような問題は生じない。
【実施例９】
【０１１９】
＜抗体−硫酸化ポリチロシン結合物の調製＞
（１）4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8-βAlaの調製
　実施例４で調製したAla-(Tyr(SO3H))8-βAla １mgを 0.1M リン酸緩衝液（pＨ7.0）500μlに溶解し、これにスルホスクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート（ピアス・ケミカル社製）1.2mgを加え37℃で３時間反応させた。この反応液をスーパーデックス・ペプチドカラム（16mm ID×30cm：ファルマシア社製）で処理して、余剰の試薬を除き4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8-βAla0.84mgの水溶液を得た（収率７５％）。
（２）Fab'フラグメントの調製
　抗ＡＦＰモノクローナル抗体・Ａ４−４（以下、「AFP-A4-4」と略記する。和光純薬工業(株)製） 10mgを常法に従って処理して、Ｆ（ab’）2フラグメントとし（５mg。収率８０％）、更にこれを常法により処理してFab'フラグメント（以下、「AFP-A4-4・Fab'」と略記する。） 3.1mgを得た（収率６２％）。
（３）Ala-(Tyr(SO3H))8-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結合物の調製
　上記（１）で得た4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8-βAla3.1mgと、上記（２）で得たAFP-A4-4・Fab'3.1mgとを0.1M リン酸緩衝液（pＨ7.0）中で、４ ℃で16時間反応させた。この反応液を、スーパーデックス 200pg カラム(26mmID×60cm：ファルマシア社製)に供して余剰の4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8-βAlaを除去し、更にDEAE TOYOPEARLカラム（10mmID×２cm：東ソー(株)製）で処理して吸着画分を回収し、Ala-(Tyr(SO3H))8-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結合物１mgを得た（収率１５％）。
【実施例１０】
【０１２０】
＜抗体−硫酸化ポリチロシン結合物の調製
（１）4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8の調製＞
　実施例４で調製したAla-(Tyr(SO3H))8（ポリペプチド19）25 mgを ＤＭＦ3mlに溶解し、これにスルホスクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート （ピアス・ケミカル社製）10 mgを加え室温で１時間反応させた。この反応混液をODSカラム［カラム：Wakosil 5C18(2.0φx25cm)（和光純薬工業(株)社製）、溶離条件：50mM酢酸アンモニウム pH6，2→60%アセトニトリル］で処理し、得られた目的物を含む画分を濃縮乾固し4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO3H))826.5 mgを得た（収率９５％）。
　得られた4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8のＮＭＲデータを以下に示す。
1H-NMR(270 MHz,DMSO-d6) δppm:7.16 (s,2H マレイミドプロトン)
　また、実施例９（１）の結果との比較から、この方法の方がマレイミド基をＮ末端に導入したポリペプチドを収率良く得ることができることが判る。
　更に、この方法により得られた4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8は、15℃以下で保存すれば分解することなく安定に保存し得ることも判ったので、実施例９（１）の方法で得られたもの（水溶液状態のもの。一日程度で殆ど分解する。）よりも使用し易いことも判った。
（２）Fab'フラグメントの調製
　抗ＡＦＰモノクローナル抗体・Ａ４−４（以下、「AFP-A4-4」と略記する。和光純薬工業(株)製） 30mgを常法に従って処理して、Ｆ（ab'）2フラグメントとし（１６mg。収率８０％）、更にこれを常法により処理してFab'フラグメント（以下、「AFP-A4-4・Fab'」と略記する。）11.1mgを得た（収率７０％）。
（３）Ala-(Tyr(SO3H))8とAFP-A4-4・Fab'との結合物の調製
　上記（１）で得た4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8 1mgと、上記（２）で得たAFP-A4-4・Fab'11.1mgとを 50 mM リン酸緩衝液 pH 6.5で、４℃ 16時間反応させた。この反応液を、POROS DEAEカラム（6mmID×1cm：パーセプティブ社製）で、Ala-(Tyr(SO3H))8とAFP-A4-4・Fab'との結合物を分画し6mgを得た（収率６０％）。
【０１２１】
　この結果と実施例９（３）の結果との比較から、本実施例（１）の方法で得られたマレイミド基がＮ末端に導入されたポリペプチドを用いることにより、本発明のポリペプチドとFab'との結合物を効率よく得ることができることが判る。
　尚、この理由については明らかではないが、実施例９（１）では遊離のスルホスクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレートの除去をスーパーデックス・ペプチドカラムを用いて行っており、本実施例（１）では、これをＯＤＳカラムを用いているためではないかと考えられる。即ち、マレイミド基を導入した本発明のペプチドと遊離のスルホスクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレートの分子量差が小さいため、スーパーデックス・ペプチドカラムではこれらを充分に分離することができず、Fab'との反応の際に遊離のスルホスクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレートがFab'と反応したため、結果的にAla-(Tyr(SO3H))8-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結合物の収率が低下した、と考えらえれる。
【実施例１１】
【０１２２】
＜アニオン性ポリペプチドと抗体との結合物の陰イオン交換クロマト溶出位置の検討＞
（試料）
　実施例９と同じ試薬を用い同様の操作を行って、表１に記載の各種アニオン性ポリペプチドとAFP-A4-4・Fab'との結合物を調製し、これを１mg/ml含有する水溶液を試料とした。但し、ポリペプチド24はN末端にマレイミド基が結合しているため、4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート化処理を行わずに、そのままAFP-A4-4・Fab'と結合させた。
　また、対照として、市販のpAsp（2Lot）についても実施例９と同じ試薬を用い同様の操作を行って、AFP-A4-4・Fab'との結合物とし、これを１mg/ml含有する水溶液を調製して試料とした。
　尚、ポリペプチド22については、目的のAFP-A4-4・Fab'との結合物は得られなかった。これは、ポリペプチドのN末端にアニオン性アミノ酸残基が存在すると電荷的な原因により抗体との結合（より正確にはポリペプチドと架橋剤との結合）効率が低下するためと考えられる。
（分析条件及び測定操作）
　実施例８と同様に行った。但し、検出は何れの場合もUV280nmで行った。
【０１２３】
（結果）
　各種ポリペプチドとAFP-A4-4・Fab'との結合物の溶出塩濃度並びにピーク幅を図２に示す。尚、図２中、●は溶出ピーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶出し始めと終わりの塩濃度の範囲（即ち、ピーク幅）を示す。また、図の横軸の各記号はポリペプチドの種類（表１のポリペプチドNo.及び略号）を示す。
　図２の結果から以下のことが判る。
【０１２４】
　(1)抗体と結合させることにより、溶出塩濃度は、ポリペプチド単独の場合よりも若干下がるが、各種ポリペプチド間並びにpAspの溶出塩濃度との相対関係は、実施例８で得られたそれと同一であることが判る。
　(2)図２には示していないが、POROS-DEAE(4.6φx10mm、陰イオン交換カラム)を用いて実施例８の分析条件で血清成分の分析を行った場合、血清中の共存物質の溶出ピーク頂点での塩濃度は、0.3 Ｍ付近であった。このことから、ポリペプチド１（硫酸残基数：１）と抗体との結合物を分離向上物質として用いた場合には、目的のピークが血清中の共存物質のピークと重なり測定（分析）の精度が低下することが判った。また、図２の結果からは、ポリペプチド１程ではないが、ポリペプチド２（硫酸残基数：３）、ポリペプチド１０（硫酸残基数：１）及びポリペプチド１１（硫酸残基数：３）と抗体との結合物を分離向上物質として用いた場合にも、若干血清中の共存物質の影響により測定（分析）の精度が低下することが示唆された。
【０１２５】
　尚、今回使用した充填剤であるPOROS-DEAEは、基材が若干疎水性を有するものであるため、硫酸化チロシン残基を有するポリペプチド10〜20と抗体との結合物の方が、硫酸化セリン残基を有するポリペプチドと抗体との結合物に比較して見かけの溶出塩濃度が高くなっている。そのため、硫酸残基を１個しか有さないがチロシン残基を有しているポリペプチド10と抗体との結合物の見かけの溶出塩濃度は、硫酸化セリン残基を３個有するポリペプチド２と抗体との結合物のそれと同程度である。
　しかしながら、使用する充填剤を、その基材が親水性のものに変更して上記と同様の実験を行うと、硫酸化チロシン残基を１個しか有さないポリペプチド10と抗体との結合物の見かけの溶出塩濃度は、硫酸化セリン残基を１個しか有さないポリペプチド１と抗体との結合物のそれと同程度となって、血清中の共存物質のピークと重なり測定（分析）の精度が低下すると予想される。
　これらの結果から、分離向上物質としては、強酸由来の酸残基が少なくとも３個、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上有するポリペプチドが望ましいことも判る。
【実施例１２】
【０１２６】
＜硫酸化セリン含有ポリペプチドと硫酸化チロシン含有ポリペプチドの水溶液中での安定性の検討＞
　Ala-(Ser(SO3H))8-βAla（ポリペプチド４）又はAla-(Tyr(SO3H))5-βAla（ポリペプチド14）を、pH6〜10の緩衝液中、40℃で保存し、安定性の検討を行った。
（試料）
　ポリペプチド４又は14を下記緩衝液に各々終濃度１mg/mlとなるように溶解したものを試料とした。
　　緩衝液: pH 6.0　2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）。
　　　　　　pH 7.0　3-モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS）。
　　　　　　pH 8.0　N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPS）。
　　　　　　pH 9.0　TAPS。
　　　　　　pH10.0　N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸（CAPSO）。
　尚、緩衝液濃度は全て50mMとした。
（保存方法）
　各試料を40℃で所定日数保存した。
【０１２７】
（結果）
　保存６日目と19日目での試料中のポリペプチド残存率（％）を、実施例８の分析条件及び操作方法により求めた、調製直後の試料に於けるポリペプチドのピーク面積と所定日数保存後の試料に於けるポリペプチドのピーク面積とに基づいて求めた。
　ポリペプチド４についての測定結果を図３に、ポリペプチド14についての測定結果を図４に夫々示す。尚、各図中、黒棒は保存６日目の試料について得られた結果を、また、白棒は保存19日目の試料について得られた結果を夫々示す。
　図３の結果から、ポリペプチド４については、保存時のpＨが上がるにつれて分解が促進されることや、一番安定であったpＨ６に於いても16日間保存後には１割以上が分解されること等が判る。
　一方、図４の結果から、ポリペプチド14は全てのpHで安定であることが判る。
　これらの結果から、チロシン残基に導入された硫酸基は、セリン残基に導入された硫酸基よりもpHの影響を受けにくく安定であること、即ち分離向上物質として使用する場合により好ましい性質を有していることが判る。
【実施例１３】
【０１２８】
＜ＴＳＨ（Thyroid stimulating hormone,甲状腺刺激ホルモン）の測定＞
（パーオキシダーゼ標識抗ＴＳＨ抗体Fab'フラグメントの調製）
　抗ＴＳＨ抗体（以下、「TSH-1」と略記する。和光純薬工業(株)製）を常法により処理してFab'フラグメントとし、これに常法によりパーオキシダーゼ（東洋紡社製）を結合させてパーオキシダーゼ標識抗ＴＳＨ抗体Ｆab'フラグメント（以下、「TSH-1・Fab'-POD」と略記する。）を調製した。
（抗体液１）
　TSH-1・Fab'-PODを５nM含有する50mM MOPS 緩衝液（pH 7.5）を調製し、抗体液１とした。
（抗体液２）
　TSH-1と認識部位が異なることが確認されている抗ＴＳＨモノクローナル抗体（以下、「TSH-2」と略記する。和光純薬工業(株)製）を常法により処理してFab'フラグメント（以下、「TSH-2・Fab'」と略記する。）とし、これと、Ala-(Tyr(SO3H))5-βAla（ポリペプチド14）又はAla-(Ser(SO3H))5-βAla（ポリペプチド３）との結合体を、実施例９（３）と同様の操作により調製した。
　これらの何れかを50nM含有する50mM MOPS 緩衝液（pH 7.5）を調製し、抗体液２とした。
（試料）
　市販のＴＳＨ（genzyme社製）を50mM MOPS緩衝液（pH 7.5、0.5％牛血清アルブミン含有）に70pMとなるように添加したものを試料とした。
（HPLCの使用条件）
カラム：0.46¢x1.0cm。
充填剤：POROS-DEAEゲル（パーセプティブ社商品名）。
溶離液Ａ：50mM MOPS 緩衝液 pH7.5。
溶離液Ｂ：50mM MOPS 緩衝液 pH7.5、3M 塩化ナトリウム。
基質液：25mM 4-N-アセチルアミノフェノール（同仁化学研究所(株)社製）水溶液。
流　速：溶離液Ａ＋溶離液Ｂ；1.0ml/min、基質液；0.1ml/min。
反応部：0.025¢x1000cm （60℃保温）。
検　出：励起波長 328nm、蛍光波長 432nmで測定した。
グラジエント条件：０→10min　Ｂ＝０→100％
（測定操作）
　抗体液１ 100μl、試料50μl及び抗体液２ 50μlを混合し、25℃で30分間放置した後、該混合液の10μlを上記条件のＨＰＬＣにより測定（分析）した。
【０１２９】
（結果）
　ＨＰＬＣ分析の結果、各種物質の溶出塩濃度（塩化ナトリウム濃度）は以下の如くであった。
　・TSH-1・Fab'-POD及びTSH-1・Fab'-PODとＴＳＨとの複合体：０〜0.1M。
　・TSH-1・Fab'-POD、ＴＳＨ及び、TSH-2・Fab'とAla-(Tyr(SO3H))5-βAla（ポリペプチド14）の結合物との複合体：0.5〜1.2M。
　・TSH-1・Fab'-POD、ＴＳＨ及び、TSH-2・Fab'とAla-(Ser(SO3H))5-βAla（ポリペプチド３）の結合物との複合体：0.25〜0.45M。
　以上の結果より、硫酸化ポリペプチドと抗体との結合物を使用することにより、共存する遊離のPOD標識抗体と測定対象物質を含む複合体とをより明確に分離することができるようになることや、硫酸化ポリペプチドの種類を適宜選択することにより、目的の複合体の溶出位置を自由に調節することができるようになること等が判る。
　尚、硫酸化ポリペプチドが結合した複合体のピークを利用することにより、試料中のＴＳＨについて良好な検量線が得られること、言い換えればＴＳＨ量の定量が可能となることも判った。
【実施例１４】
【０１３０】
＜Fab'とアニオン性ポリペプチドとの結合物を用いたAFPの測定＞
（パーオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体Fab'フラグメントの調製）
　AFP-A4-4とは異なるエピトープを認識する抗ＡＦＰ抗体・ＷＡ−１（以下、「AFP-WA-1」と略記する。和光純薬工業(株)製）を常法により処理してＦab'フラグメントとし、これに常法によりパーオキシダーゼ（東洋紡社製）を結合させてパーオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体Fab'フラグメント（以下、「AFP-WA-1・Fab'-POD」と略記する。）を調製した。
（試薬）
　実施例11で調製した、表１に記載の各種アニオン性ポリペプチドとAFP-A4-4・Fab'との結合物のうちの所定のものを 200nM、AFP-WA-1・Fab'-PODを 100nM及びポリビニルアルコール（アルドリッチ社製）を0.2(W/V)%含有するMOPS緩衝液（pH7.5）を調製し、試薬とした。
（試料）
　市販のAFPを50mM MOPS緩衝液（pH7.5、0.2(W/V)%ポリビニルアルコール含有）に100ng/mlとなるように添加、溶解したものを試料とした。
（ＨＰＬＣ条件）
　カラム：POROS-DEAE（4.6φX10mm）。
　溶離液Ａ：50mM MOPS緩衝液（pH7.5）。
　溶離液Ｂ：50mM MOPS緩衝液（3M NaCl含有。pH7.5）。
　基質液：50mM MOPS緩衝液（90mM 4-N-(4-カルボブチリル)アミノフェノール及び20mM H2O2含有。pH7.5）。
　流　速：Ａ＋Ｂ液　1ml/min（基質液は0.1ml/min）。
　反応部：0.025φX1000cm。
　温　度：60℃。
　検　出：励起波長 328nm／蛍光波長 432nm。
　グラジェント条件：実施例８と同じ。
（測定方法）
　試薬 100μlと試料 10μlとを混合し、8℃、10分間反応させた後、混合液の20μlを上記条件のHPLCにより分析した。
【０１３１】
（結果）　
　各種ポリペプチドとAFP-A4-4・Fab'との結合物、AFP-WA-1・Fab'-POD及びAFPとの複合体（抗原抗体複合体）の溶出塩濃度並びにピーク幅を図５に示す。尚、図５中、●は溶出ピーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶出し始めと終わりの塩濃度の範囲（即ち、ピーク幅）を示す。また、図の横軸の各記号はポリペプチドの種類（表１のポリペプチドNo.及び略号）を示す。
　図５の結果から、以下のことが判る。
　(1)AFP-A4-4・Fab'に結合したポリペプチドの種類により、抗原抗体複合体の溶出塩濃度（溶出位置）が変化する。尚、各抗原抗体複合体の溶出される順序は、AFP-A4-4・Fab'とポリペプチドとの結合物の溶出される順序（実施例１１及び図２参照。）と同じであった。また、この結果から、ポリペプチドの種類を適宜選択することにより、目的の抗原抗体複合体の溶出塩濃度を適宜設定し得ることも判る。
　(2)遊離のAFP-WA-1・Fab'-PODの溶出塩濃度は0〜0.1Mであったので、何れのポリペプチドを用いた場合でも、遊離のAFP-WA-1・Fab'-PODと抗原抗体複合体とを完全に分離することができた。特に、ポリペプチド４〜９、11〜21を用いた場合には、抗原抗体複合体の溶出塩濃度を0.3M以上とすることができるので、これらポリペプチドを分離向上物質として用いることにより、血清中の共存物質による測定への影響をより確実に回避することができる。
　尚、既に述べたように、今回使用した充填剤であるPOROS-DEAEは、基材が若干疎水性を有するものであるため、硫酸化チロシン残基を有するポリペプチド10〜20と抗体との結合物から形成された抗原抗体複合物の方が、硫酸化セリン残基を有するポリペプチドと抗体との結合物から形成されたそれらに比較して見かけの溶出塩濃度が高くなっているため、硫酸残基を１個しか有さないがチロシン残基を有しているポリペプチド10と抗体との結合物から形成される抗原抗体複合物の見かけの溶出塩濃度は、硫酸化セリン残基を３個有するポリペプチド２と抗体との結合物から形成される抗原抗体複合物のそれと同程度となっている。
　しかしながら、使用する充填剤を、その基材が親水性のものに変更して上記と同様の実験を行うと、硫酸化チロシン残基を１個しか有さないポリペプチド10と抗体との結合物から形成される抗原抗体複合物の見かけの溶出塩濃度は、硫酸化セリン残基を１個しか有さないポリペプチド１と抗体との結合物から形成される抗原抗体複合物のそれと同程度となって、血清中の共存物質のピークと重なり測定（分析）の精度が低下すると予想される。
　(3)以上の結果から、ポリペプチドを分離向上物質として用いるためには、ポリペプチド中の強酸由来の酸残基数は３〜20個、好ましくは４〜30個、より好ましくは５〜15個と考えられる（酸残基数を多くするとカラムからの溶出塩濃度が高くなりすぎるので、測定操作上好ましくない。）。
【０１３２】
　(4)溶出塩濃度の異なるポリペプチドを２種以上組み合わせて（例えばポリペプチド４〜７、８、９、11〜14の何れかと、ポリペプチド７、16〜21の何れかの組み合わせ）、夫々を適当な結合能物質と結合させて用いることにより、類似構造を有する２以上の物質（例えば、糖鎖構造等構造の一部のみが異なる２以上の物質、アイソザイム、１つの抗原に対して異なるエピトープを認識する２以上の抗体等）の分別測定を実施することが可能になる。
　(5)ポリペプチドとしてpAsp-1及びpAsp-2（製造ロットの異なるpAsp）を用いた場合の結果から、従来のカルボン酸残基を有するポリペプチドでは、製造ロットにより溶出塩濃度が変化し、目的のピークのテーリングの状況が変化すること、言い換えれば、均一の分子量を有するポリペプチドを得難いという問題を有することが示唆された。これに対し、本発明のポリペプチドは、ペプチド合成により均一のものを容易に得られるので、pAspに於けるこのような問題は生じない。
　尚、実施例11で調製した、抗体液１ 100μl、試料50μl及び抗体液２［TSH-2・Fab'とAla-(Ser(SO3H))5-βAla（ポリペプチド３）の結合物含有］ 50μlとを混合し、25℃で30分間放置して得た混合液の20μlを上記条件のＨＰＬＣにより測定（分析）したところ、ポリペプチド３を用いてAFPの測定（分析）を行った場合の抗原抗体複合体の溶出塩濃度で目的の抗原抗体複合体が溶出された（図５の「ポリペプチドの略号TSH」の項に、溶出塩濃度のデータを併せて示す。）。この結果から、本発明のポリペプチドを分離向上物質として用いることにより、測定対象物質が異なる場合であっても一定の分析条件のＨＰＬＣを用いて目的の測定（分析）を実施し得ることが判る。
【実施例１５】
【０１３３】
＜本発明のポリペプチドを用いた、糖鎖構造の異なるＡＦＰの分別測定法＞
（試液１）
　抗体として抗ＡＦＰモノクローナル抗体・ＷＡ−２（以下、「AFP-WA-2」と略記する。和光純薬工業(株)製。尚、この抗体の抗原認識部位は、AFP-WA-1及びAFP-A4-4のそれとは異なっている。）を、また、ポリペプチドとしてAla-(Tyr(SO3H))5-βAlaを用いた以外は実施例９と同じ試薬を用い、同様の操作を行って調製したAFP-WA-2・Fab'とAla-(Tyr(SO3H))5-βAlaの結合物を 139nM、レンズ豆レクチン（以下、「ＬＣＡ」と略記する。和光純薬工業(株)製）を１mg/ml、塩化マグネシウムを１mM及び塩化カルシウムを１mM含有する50mM MES緩衝液（pＨ6.5）を調製し、試液１とした。
（試液２）
　実施例12で調製したAFP-WA-1・Fab'-PODを 147nM、実施例９で調製したAla-(Tyr(SO3H))8-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結合物を 156nM、及びポリビニルアルコールを0.2(W/V)%含有する 50nM MOPS緩衝液（pＨ7.5）を試液２とした。
（試料）
　ヒト肝細胞癌由来ＡＦＰをＬＣＡ固定化カラムを用いてＬＣＡ非結合性ＡＦＰとＬＣＡ結合性ＡＦＰに分画した。これらの何れかを、ＡＦＰを含まないヒト血清中に100ng/mlとなるように添加して、試料１（ＬＣＡ非結合性ＡＦＰ含有）及び試料２（ＬＣＡ結合性ＡＦＰ含有）とした。
（ＨＰＬＣ条件）
　・カラム　：POROS-DEAE(4.6mmID×10mm)。
　・緩衝液Ａ：50mM TAPS緩衝液（pＨ8.5、0.25M NaCl含有）。
　　緩衝液Ｂ：50mM TAPS緩衝液（pＨ8.5、３M NaCl含有）。
　・基質液　：50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5、90mM 4-N-(4-カルボブチリル)アミノフェノール及び20mM Ｈ2Ｏ2含有）。
　・グラジェント条件：緩衝液Ａ＋Ｂ、流速２ｍｌ／分。
　　　　　　　　　　　０→２分　　Ｂ＝０％
　　　　　　　　　　　２→4.5分　 Ｂ＝13％
　　　　　　　　　　　4.5→８分　 Ｂ＝100％
　　　　　　　　　８→8.5分　 Ｂ＝０％
　・ポストカラム：ＰＯＤ基質添加（基質液、0.1ml/min）。
　　　　　　　　　60℃、30秒間反応
　・検出：励起波長　328nm／蛍光波長　432nm。
（測定操作）
　試液１ 100μlと、試料１又は試料２ 10μlとを混合し、８℃で10分間反応させた。次いで、これに試液２ 10μl加え、更に20分間反応させた。この反応混液80μlを上記条件のＨＰＬＣで測定（分析）した。
【０１３４】
（結果）
　測定結果を図６に示す。尚、図中、実線（−）は試料１について得られたデータを、また、点線（----）は試料２について得られたデータを夫々示す。
　図６の結果から、ＡＦＰ、AFP-WA-2・Fab'とAla-(Tyr(SO3H))5-βAlaの結合物及びAFP-WA-1・Fab'-PODとの抗原抗体複合体（複合体１）は2.9分の位置に、また、複合体１に更にAla-(Tyr(SO3H))8-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結合物が結合した抗原抗体複合体（複合体２）は5.8分の位置に溶出され、夫々は明確に分離されることが判る。
　また、図６の結果から、ＬＣＡ非結合性ＡＦＰを含む試料１に於いては、生成する抗原抗体複合体は、Ala-(Tyr(SO3H))8-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結合物が結合した複合体２が主であり、ＬＣＡ結合性ＡＦＰを含む試料２に於いては、生成する抗原抗体複合体は、複合体１が主であることも判る。この結果は、Ala-(Tyr(SO3H))8-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結合物はＬＣＡとの競合反応によりＡＦＰとの反応が阻害されることを示している。
　また、生成する両複合体量に対する複合体１量比（複合体１比）を求めたところ（表２参照）、この値が試料中のＬＣＡ結合性ＡＦＰ比率を反映すること、言い換えれば、この値を利用することにより試料中のＬＣＡ結合性ＡＦＰ比率を測定し得ることも判明した。
【０１３５】
比較例
　AFP-WA-2・Fab'とAla-(Tyr(SO3H))5-βAlaの結合物の代りにAFP-WA-2・Fab'と平均分子量6,000のアスパラギン酸ポリマーとの結合物を、また、Ala-(Tyr(SO3H))8-βAlaとAFP-A4-4・Fab'の結合物の代りにAFP-A4-4・Fab'と平均分子量28,800のアスパラギン酸ポリマーとの結合物を用いた以外は、実施例15と同じ実験を行い、複合体１比を求めた。
　尚、ここで使用した試液１に、平均分子量55万のγ−ポリグルタミン酸を100 μg/mlとなるように添加したものを用いても上記と同じ実験を行い複合体１比を求めた。
　結果を表２に併せて示す。
【０１３６】
【表２】
2004117370.tif 000005
【０１３７】
　表２の結果から、比較例の方法（ポリアスパラギン酸を用いる方法）では試料１で複合体１比が高めにでる傾向があること、言い換えれば非特異的反応が生じる傾向がみられ、この現象を抑制するためにγPGA等の陰イオン性添加剤を添加する必要があることが判る。
　これに対し、本発明のポリペプチドを使用した場合には、このような添加剤は不要である。従って、本発明のポリペプチドを分離向上物質として用いる測定方法は、従来から分離向上物質として用いられていたポリアスパラギン酸等のカルボキシル基を有するポリマーを用いる測定方法に比較して、この点でも優れた測定方法であることが判る。
　尚、このような現象が起こる理由については明らかではないが、例えば以下のように推測される。
　即ち、ポリアスパラギン酸のような陰イオン性高分子では分子が比較的大きいために電荷や立体障害等による抗原抗体反応の阻害が起こって上記のような現象が生じ、一方、本願のポリペプチドは、分子が小さいが故に抗原抗体反応への影響は殆ど発生しないと推測される。
【実施例１６】
【０１３８】
＜溶離液への界面活性剤の添加効果の検討＞
（測定用試薬）
　実施例９で調製したポリペプチド18とAFP-A4-4 Fab'との結合物を200nM及び実施例14で調製したAFP-WA-1・Fab'-PODを100nM含有する 50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5）を測定用試薬とした。
（試料）
　実施例14と同じ。
（ＨＰＬＣ条件）　
　・カラム：POROS-DEAE(4.6mmID×10mm)。
　・緩衝液Ａ：50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5。所定の界面活性剤を0.1(W/V)%含有）。
　　緩衝液Ｂ：50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5、３M NaCl及び所定の界面活性剤を0.1(W/V)%含有）。
　・基質液：50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5、90mM 4-N-(4-カルボブチリル)アミノフェノール及び20mM Ｈ2Ｏ2含有）。
　・グラジェント条件：緩衝液Ａ＋Ｂ、流速１ｍｌ／分。
　　　　　　　　　　　０→５min　Ａ＝100％
　　　　　　　　　　　５→30min　Ｂ＝０→100％
　　　　　　　　　　　30→35min　Ｂ＝100％
　・ポストカラム：ＰＯＤ基質添加（基質液、0.1ml/min）。
　　　　　　　　　60℃、30秒間反応
　・検　出：励起波長　328nm／蛍光波長　432nm。
　尚、溶離液中に添加した界面活性剤の種類を表３に示す。
【０１３９】
【表３】
2004117370.tif 000006
【０１４０】
（測定操作）
　測定用試薬 100μlと、試料 10μlとを混合し、８℃で10分間反応させた。次いで、この反応液20μlを上記条件のＨＰＬＣで測定（分析）した。
【０１４１】
（結果）
　各種界面活性剤を添加した溶離液について得られた、AFPの抗原抗体複合物の溶出塩濃度並びにピーク幅を図７に示す。尚、図７中、●は溶出ピーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶出し始めと終わりの塩濃度の範囲（即ち、ピーク幅）を示す。また、図の横軸の各記号は界面活性剤の種類（表３の界面活性剤No.）を示す。
　図７の結果から、以下のことが判る。
　(1)界面活性剤を添加することにより、ピーク幅を狭くすることができること、言い換えれば、溶出時のピークのテーリングを防止し得ること、更に言い換えれば、測定精度を向上させることができることが判る。また、この効果は、陽イオン系界面活性剤及び両性系界面活性剤で顕著に現れることも判る。
　(2)界面活性剤を添加することにより、溶出塩濃度（溶出位置）が変動すること、言い換えれば、界面活性剤の種類を適宜選択することにより目的の抗原抗体複合物の溶出塩濃度を適宜設定し得ることが判る。
【実施例１７】
【０１４２】
＜電気泳動での分離＞
（試料）
　実施例10で作製したAFP-A4・Fab'、Ala-(Tyr(SO3H))8とAFP-A4-4・Fab'の結合物、実施例15で作製したAFP-WA2・Fab'、Ala-(Tyr(SO3H))5-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合物を各々１mg／mlとなるように50mM MOPS緩衝液(pH7.5)で希釈したものを試料とした。
（測定操作）　
　１％アガロースゲルの試料溝に各々の試料４μlをアプライし、試料溝側を陰極として電圧200Vで30分電気泳動を行った後、Quick-CBB（和光純薬工業(株)商品名）を用いてタンパク質の染色を行い、各々の試料のRf値を測定した。
（結果）
　各々のRf値は、AFP-A4・Fab' 0.38、Ala-(Tyr(SO3H))8とAFP-A4-4・Fab'の結合物 0.66、AFP-WA2・Fab' 0.06、Ala-(Tyr(SO3H))5-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合物 0.22であった。
　この結果より、硫酸化ペプチドを結合することにより、陰性電荷が増え、移動度が大きくなることが判る。また、硫酸化ペプチドの硫酸残基数が多いほど移動度が大きくなることも判る。
【実施例１８】
【０１４３】
＜硫酸化ペプチド結合抗体と抗原反応物の分離＞
（試料）
　実施例 50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5）で0.5mg／mlになるように調製したAFP 50 μlに、実施例17で調製したAla-(Tyr(SO3H))8とAFP-A4-4・Fab'の結合物（１mg／ml）50μl、又はAla-(Tyr(SO3H))5-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合物（１mg／ml）50μl、又はMOPS緩衝液（pＨ7.5）50μlを加え、37℃で30分間反応させたものを試料とした。
（測定操作）
　１％アガロースゲルの試料溝に各々の試料４μlをアプライし、試料溝側を陰極として電圧200Vで30分間電気泳動を行った後、抗AFP抗体を結合したニトロセルロース膜で抗体親和転写（ブロッティング）を室温で30分行った。この膜を洗浄液(0.9％ NaCl）で２回洗浄した。この膜を抗AFP抗体液中に37℃で30分間浸した後、洗浄液で２回洗浄した。次にこの膜をPOD標識抗IgG抗体液中に37℃で30分浸した後、洗浄液で２回洗浄した。更にこの膜を発色液（0.37mM ニトロテトラゾリウムブルー,2.6mM β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型,0.01 ％過酸化水素）中で発色させ、抗原抗体反応物のRf値を測定した。
（結果）
　Ala-(yr(SO3H))8とAFP-A4・Fab'の結合物とAFPの抗原抗体反応物のRf値は0.63、Ala-(Tyr(SO3H))5-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合物とAFPの抗原抗体反応物のRf値は0.20、AFPのみのRf値は0.85であった。
　上記の結果並びに実施例17の結果から明らかな如く、Ala-(Tyr(SO3H))8とAFP-A4-4・Fab'の結合物とAFPの抗原抗体反応物のRf値と、Ala-(Tyr(SO3H))8-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合物とAFPの抗原抗体反応物のRf値は、夫々Ala-(Tyr(SO3))8とAFP-A4-4・Fab'の結合物のRf値及びAla-(Tyr(SO3H))5-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合物のRf値と殆ど同じであった。このように、AFPの陰性電荷は、Ala-(Tyr(SO3H))8とAFP-A4-4Fab'の結合物とAFPの抗原抗体反応物のRf値やAla-(Tyr(SO3H))5-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合物とAFPの抗原抗体反応物のRf値には殆ど影響を及ぼさないことが判る。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】実施例８で得られた、アニオン交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるアニオン性ポリペプチドの溶出位置を示したものである。
【図２】実施例11で得られた、アニオン交換カラムを用いたＨＰＬＣによる、抗体のFab'フラグメントとアニオン性ポリペプチドの結合物の溶出位置を示したものである。
【図３】実施例12で得られた、硫酸化セリン残基を有するポリペプチドの各種pＨ溶液中での保存安定性のデータを示すものである。
【図４】実施例12で得られた、硫酸化チロシン残基を有するポリペプチドの各種pＨ溶液中での保存安定性のデータを示すものである。
【図５】実施例14で得られた、アニオン交換カラムを用いたＨＰＬＣによる、各種抗原抗体複合体の溶出位置を示したものである。
【図６】実施例15に於て得られたＨＰＬＣによる試料の測定（分析）溶出パターンを示す。
【図７】実施例16に於て得られた、アニオン交換カラムを用いたＨＰＬＣによる、各種抗原抗体複合体の溶出位置を示したものである。
【符号の説明】
【０１４５】
　図１、図２及び図５中、●は溶出ピーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶出し始めと終わりの塩濃度の範囲（即ち、ピーク幅）を示す。また、図の横軸の各記号はポリペプチドの種類（表１のポリペプチドNo.及び略号）を示す。
【０１４６】
　図３及び図４中、黒棒は保存６日目の試料について得られた結果を、また、白棒は保存19日目の試料について得られた結果を夫々示す。
【０１４７】
　図６中、実線（−）は試料１について得られたデータを、また、点線（----）は試料２について得られたデータを夫々示す。
【０１４８】
　図７中、●は溶出ピーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶出し始めと終わりの塩濃度の範囲（即ち、ピーク幅）を示す。また、図の横軸の各記号は界面活性剤の種類（表３の界面活性剤No.）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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