(57)【要約】【課題】新たなｐＨ指示薬およびそれを用いたｐＨ測定方法、特に細胞内におけるｐＨを容易に測定するためのｐＨ指示薬を提供する。【解決手段】一本鎖ポリヌクレオチドの鎖内または前記二本鎖ポリヌクレオチドの鎖間における塩基対の結合形態がｐＨに応じて変化し、かつ、前記一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が、シグナル発生化合物を有し、さらに、前記一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチド鎖の他方の鎖がシグナル制御化合物を有し、前記塩基対の結合形態の変化によって、前記シグナル発生化合物と前記シグナル制御化合物が隣接した際に、前記シグナル制御化合物が前記シグナル発生化合物のシグナルを制御するｐＨ指示薬とする。【選択図】　図１
2004117217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ変化に伴なってシグナルが変化するｐＨ指示薬であって、
一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドを含み、
前記一本鎖ポリヌクレオチドの鎖内または前記二本鎖ポリヌクレオチドの鎖間における塩基対の結合形態がｐＨに応じて変化し、
かつ、前記一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が、シグナル発生化合物を有し、さらに、前記一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチド鎖の他方の鎖がシグナル制御化合物を有し、
前記塩基対の結合形態の変化によって、前記シグナル発生化合物と前記シグナル制御化合物が隣接した際に、前記シグナル制御化合物が前記シグナル発生化合物のシグナルを制御するｐＨ指示薬。
【請求項２】
二本鎖ポリヌクレオチドを含み、
前記二本鎖ポリヌクレオチドの鎖間における塩基対の結合形態が、ｐＨ変化に応じて、ワトソン−クリック型塩基対とフーグスティーン型塩基対とに変化し、
前記一方のポリヌクレオチド鎖が前記シグナル発生化合物を有し、前記他方のポリヌクレオチド鎖が前記シグナル制御化合物を有し、前記両化合物が、前記ワトソン−クリック型塩基対およびフーグスティーン型塩基対のいずれか一方の結合形態の場合にのみ隣接するように、前記各鎖に結合している請求項１記載のｐＨ指示薬。
【請求項３】
前記一方のポリヌクレオチド鎖の５’末端に前記シグナル発生化合物を有し、前記他方のポリヌクレオチド鎖の５’末端に前記シグナル制御化合物を有する請求項２記載のｐＨ指示薬。
【請求項４】
前記一方のポリヌクレオチド鎖が、塩基１２ｎｔあたり４〜１０個のシトシン（Ｃ）を有する請求項２または３のいずれか一項に記載のｐＨ指示薬。
【請求項５】
前記二本鎖ポリヌクレオチドの各鎖の長さが、８〜２０ｎｔの範囲である請求項２〜４のいずれか一項に記載のｐＨ指示薬。
【請求項６】
二本鎖ポリヌクレオチドを構成する二本のポリヌクレオチド鎖の組合わせが、配列番号１と配列番号２との組み合わせ、配列番号３と配列番号４との組み合わせ、配列番号５と配列番号６との組み合わせ、配列番号７と配列番号８との組み合わせ、および配列番号９と配列番号１０との組み合わせのいずれか一つである請求項５記載のｐＨ指示薬。
【請求項７】
一本鎖ポリヌクレオチドを含み、
前記一本鎖ポリヌクレオチドの両端が共に５’末端または３’末端であり、
前記一本鎖ポリヌクレオチドの鎖内における塩基対の結合形態が、ｐＨ変化に応じて、塩基対の形成とその解離とに変化し、
前記一本鎖ポリヌクレオチドが、前記塩基対が形成された際に隣接する部位に、前記シグナル発生化合物と前記シグナル制御化合物とを有している請求項１記載のｐＨ指示薬。
【請求項８】
前記一本鎖ポリヌクレオチドが、塩基２４ｎｔあたり４〜１０個のシトシン（Ｃ）を有する請求項７に記載のｐＨ指示薬。
【請求項９】
前記一本鎖ポリヌクレオチドの長さが１０〜５０ｎｔの範囲である請求項７または８記載のｐＨ指示薬。
【請求項１０】
一本鎖ポリヌクレオチドの両末端が３’末端であり、配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、配列番号５と配列番号６、配列番号７と配列番号８、および配列番号９と配列番号１０のいずれかの一つの配列の組み合わせを含み、前記両配列が、リンカーを介して、５’末端で結合している請求項７または８記載のｐＨ指示薬。
【請求項１１】
リンカーが、ポリリン酸またはポリヌクレオチドである請求項１０記載のｐＨ指示薬。
【請求項１２】
前記シグナルが蛍光シグナルである請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｐＨ指示薬。
【請求項１３】
前記シグナル発生化合物が、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を生じるドナーであり、前記シグナル制御化合物が、前記ドナーに対するアクセプターまたはクエンチャーである請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｐＨ指示薬。
【請求項１４】
前記ドナーが、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７からなる群から選択された少なくとも一つの蛍光団である請求項１３記載のｐＨ指示薬。
【請求項１５】
前記アクセプターが、ＴＡＭＲＡ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ５およびＣｙ７からなる群から選択された少なくとも一つの蛍光団である請求項１３または１４記載のｐＨ指示薬。
【請求項１６】
前記クエンチャーが、Ｃｙ３Ｑ、Ｃｙ５Ｑ、Ｃｙ７Ｑおよびｄａｂｓｙｌからなる群から選択された少なくとも一つの化合物である請求項１３または１４記載のｐＨ指示薬。
【請求項１７】
ポリヌクレオチド鎖がポリデオキシヌクレオチド鎖である請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｐＨ指示薬。
【請求項１８】
ポリヌクレオチド鎖を、リポソーム、塩基性ポリマー、リン酸カルシウムおよび合成ペプチドからなる群から選択された少なくとも一つのキャリアーに保持させた請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｐＨ指示薬。
【請求項１９】
細胞内に導入して、前記細胞内のｐＨを測定するための請求項１〜１８のいずれか一項に記載のｐＨ指示薬。
【請求項２０】
ｐＨ変化に伴なうシグナル変化によってｐＨを測定する方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｐＨ指示薬を使用するｐＨ測定方法。
【請求項２１】
液体試料に前記ｐＨ指示薬を添加する請求項１９記載のｐＨ測定方法。
【請求項２２】
細胞内に前記ｐＨ指示薬を導入して、細胞内のｐＨを測定する請求項１９または２０記載のｐＨ測定方法。
【請求項２３】
シグナルが蛍光であって、蛍光色の変化および色の濃淡を目視で確認する請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のｐＨ測定方法。
【請求項２４】
蛍光強度を測定する請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のｐＨ測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ｐＨ指示薬およびそれを用いたｐＨ測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内で起こる反応の多くは、様々な環境変化によって引き起こされることが知られており、例えば、カチオン濃度の変化やｐＨ変化等が原因の一つとしてあげられている。特に、近年においては、細胞内ｐＨの低下によってアポトーシスが引き起こされると推測されている。このように、細胞内におけるｐＨ変化が、アポトーシスをはじめとする様々な生体反応において、非常に重要な指標となり得ることからも、生化学の分野や臨床医療の分野において、細胞内ｐＨを測定するためのｐＨ指示薬が必要とされている。
【０００３】
このような細胞内ｐＨを測定するためのｐＨ指示薬としては、例えば、ＢＣＥＣＦ（２’−，７’−Ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−４　または　５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）がある（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。これは蛍光化合物であって、ｐＨ変化に応じて蛍光強度が変化するため、その蛍光強度からｐＨを測定することができる。また、近年においては、細胞内ｐＨを測定するためのｐＨプローブとして、例えば、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ　由来のｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）等が実用化されている（例えば、非特許文献４）。このＧＦＰは発光タンパク質であり、ｐＨに依存して蛍光強度が変化することが知られている。したがって、例えば、前記ＧＦＰを細胞内で発現させ、その蛍光強度を測定すれば、前記蛍光強度から前記細胞内のｐＨを決定できるのである。
【０００４】
【非特許文献１】
ステインハルト、マシ゛ア（Ｒ．　Ａ．　Ｓｔｅｉｎｈａｒｄｔ，　Ｄ．　Ｍａｚｉａ）、「ＮＨ４ＯＨに曝露した後のウニの未受精卵におけるＫ＋−伝導性および膜ポテンシャルの発達（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｋ＋−Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ＭｅｍｂｒａｎｅＰｏｔｅｎｔｉａｌｓ　ｉｎ　Ｕｎｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ　Ｓｅａ　Ｕｒｃｈｉｎ　Ｅｇｇｓ　Ａｆｔｅｒ　Ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　ＮＨ４ＯＨ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９７３年、２４１、ｐ．４００−４００１。
【非特許文献２】
トーマス、フ゛ックスハ゛ーム、シ゛ムニアック、ラッカー（　Ｊ．　Ａ．　Ｔｈｏｍａｓ，　Ｒ．　Ｎ．　Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ，　Ａ．　Ｚｉｍｎｉａｋ，　Ｅ．　Ｒａｃｋｅｒ）、「ｉｎ　ｓｉｔｕ　において発生する分光プローブを利用したけエールリッヒ腹水腫瘍細胞の細胞内ｐＨの測定（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐＨ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｅｈｒｌｉｃｈ　Ａｓｃｉｔｅｓ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌｓ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ　Ｐｒｏｂｅ　Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｉｎ　ｓｉｔｕ）」、バイオケミストリー（　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９７９年、　１８、　ｐ．２２１０−２２１８。
【非特許文献３】
ホーン、ノーマン、シュワルツ、サイモン（　Ｗ．　Ｃ．　Ｈｏｒｎｅ，　Ｎ．　Ｅ．　Ｎｏｒｍａｎ，　Ｄ．　Ｒ．　Ｓｃｈｗａｒｔｚ，　Ｒ．Ｓｉｍｏｎｓ）、「トロンビン−促進ヒト血小板における膜ポテンシャルおよび細胞質ｐＨの変化（Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｐＨ　ａｎｄ　ｉｎ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）」、ヨーロッハ゜　シ゛ャーナル　オフ゛　ハ゛イオケミストリー（　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１９８１年、　１２０、　ｐ．２９５−３０２。
【非特許文献４】
マツヤマ、ロヒ゜ス、テ゛ウ゛ァロウ、チエン、リート゛（Ｓ．　Ｍａｔｓｕｙａｍａ，　Ｊ．　Ｌｌｏｐｉｓ，　Ｑ．　Ｌ．　Ｄｅｖｅｒａｕｘ，　Ｒ．　Ｙ．　Ｔｓｉｅｎ，　ａｎｄ　Ｊ．　Ｃ．　Ｒｅｅｄ）「ミトコンドリア内および細胞質ゾルのｐＨ変化：アポトーシスの間におけるｃａｓｐａｓｅ活性化を調整する初期事象（Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｉｎｔｒａｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ　ｐＨ：　ｅａｒｌｙ　ｅｖｅｎｔｓ　ｔｈａｔ　ｍｏｄｕｌａｔｅ　ｃａｓｐａｓｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」、ネイチャーセルハ゛イオロシ゛ー（　Ｎａｔ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ）、２０００年、　６，　ｐ．３１８−３２５。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の方法によると、ＧＦＰ遺伝子を細胞内に導入するだけでなく、この遺伝子が実際に発現し、ＧＦＰが合成されることが必要であり、これが満たされて初めてｐＨの測定が可能になる。このため、対象細胞の種類や、前記細胞とＧＦＰ遺伝子を導入するためのプラスミドの組合わせ等、種々の条件を設定する必要ある。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、新たなｐＨ指示薬およびそれを用いたｐＨ測定方法の提供であり、特に細胞内におけるｐＨを容易に測定するためのｐＨ指示薬の提供である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のｐＨ指示薬は、ｐＨ変化に伴なってシグナルが変化するｐＨ指示薬であって、
一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドを含み、
前記一本鎖ポリヌクレオチドの鎖内または前記二本鎖ポリヌクレオチドの鎖間における塩基対の結合形態がｐＨに応じて変化し、
かつ、前記一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が、シグナル発生化合物を有し、さらに、前記一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチド鎖の他方の鎖がシグナル制御化合物を有し、
前記塩基対の結合形態の変化によって、前記シグナル発生化合物と前記シグナル制御化合物が隣接した際に、前記シグナル制御化合物が前記シグナル発生化合物のシグナルを制御する。
【０００８】
このように、ｐＨ変化に応じて塩基対の結合形態が変化するｐＨ指示薬を用いれば、例えば、あるｐＨ条件下では前記シグナル発生化合物と前記シグナル制御化合物とが離れた状態となり、あるｐＨ条件下では、前記両化合物が隣接した状態となる。そして、前記両化合物が隣接した場合には、前記シグナル発生化合物は前記シグナル制御化合物の影響を受けることなくシグナルを発するが、隣接すると、前記シグナル発生化合物は前記シグナル制御化合物によってシグナルが抑制された状態となる。つまり、このようなｐＨ変化に応じた塩基対の結合形態の変化に伴って、シグナルの程度が変化するため、前記シグナルを検出することによって、対応するｐＨを求めることが可能になるのである。このような本発明のｐＨ指示薬であれば、例えば、細胞内ｐＨを測定する場合であっても、細胞内に導入さえすれば、後はシグナルを検出するのみでよいため、確実かつ簡便に細胞内のｐＨを測定することができる。もちろん、前記細胞内のｐＨには限られず、その他各種液体試料、ゾル、ゲル等のｐＨを測定するためのｐＨ指示薬としても有用である。
【０００９】
前述のように、ｐＨに応じて、ポリヌクレオチド鎖の塩基対の結合形態を変化させることは、次のような原理に基づくものである。広く一般に、ワトソン−クリック型塩基対によって二本鎖ＤＮＡがらせん構造をとっていることは周知の事実である。また、このワトソン−クリック型塩基対による二本鎖ＤＮＡに、さらにフーグスティーン塩基対によってポリヌクレオチド鎖が結合し、三本鎖ＤＮＡが形成されることも知られている。さらに、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２００１，４０，ｐｐ３９６−９４０５には、前記ワトソン−クリック型塩基対の二本鎖ＤＮＡと、前記フーグスティーン型塩基対を持つ三本鎖ＤＮＡとが、ｐＨの影響を受けて、相対的に低ｐＨにおいてフーグスティーン型塩基対の三本鎖ＤＮＡに傾き、相対的に高ｐＨにおいてワトソン−クリック型塩基対の二本鎖に傾くことが開示されている（図６参照）。そこで、本発明者らは、これらの事実から、下記式（１）に示すように、５’側と３’側とが塩基対を形成するアンチパラレル型の二本鎖ポリヌクレオチド（式において右側）が、ｐＨ変化に応じて、５’側と５’側とが塩基対を形成するパラレル型ポリヌクレオチド（式において左側）に変化することを見出したのである。また、二本鎖に限られず、例えば、一本鎖ポリヌクレオチド鎖であっても、同様の原理から、同一鎖内で塩基対の形成と解除が起こることも見出したのである。
【化１】
2004117217.tif 000003
【００１０】
なお、前述のようにＤＮＡが二本鎖および三本鎖を形成することは周知の事実であるが、この原理を利用して、例えば、後述するような２本のポリヌクレオチド鎖間の塩基対の結合形態、または一本鎖ポリヌクレオチド鎖内における塩基対の結合形態を、ｐＨ変化に応じて変化させることは、本発明者らが初めて見出したことである。さらに、このようなｐＨ変化に基づく塩基対の結合形態の変化と、前記結合形態の変化に基づくシグナル変化とを組合わせ、本発明のｐＨ指示薬とすることも、本発明者らが初めて見出したものである。
【００１１】
つぎに、本発明のｐＨ測定方法は、ｐＨ変化に伴なうシグナル変化によってｐＨを測定する方法であって、前記本発明のｐＨ指示薬を使用する方法である。前述のように本発明のｐＨ指示薬を用いれば、例えば、細胞内に導入するだけで、確実かつ簡便に細胞内のｐＨを測定できるため、例えば、生化学の分野や、臨床医療の分野において、非常に有用な方法であるといえる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
前述のように、本発明のｐＨ指示薬は、ｐＨ変化に伴なってシグナルが変化するｐＨ指示薬であって、
一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドを含み、
前記一本鎖ポリヌクレオチドの鎖内または前記二本鎖ポリヌクレオチドの鎖間における塩基対の結合形態がｐＨに応じて変化し、
かつ、前記一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が、シグナル発生化合物を有し、さらに、前記一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチド鎖の他方の鎖がシグナル制御化合物を有し、
前記塩基対の結合形態の変化によって、前記シグナル発生化合物と前記シグナル制御化合物が隣接した際に、前記シグナル制御化合物が前記シグナル発生化合物のシグナルを制御する。
【００１３】
このようなｐＨ指示薬としては、例えば、以下に示すような、二本鎖ポリヌクレオチドを含む第１のｐＨ指示薬と、一本鎖ポリヌクレオチドを含む第２のｐＨ指示薬とがあげられる。
【００１４】
（実施形態１）
本発明の第１のｐＨ指示薬は、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドを含み、
前記二本鎖ポリヌクレオチドの鎖間における塩基対の結合形態が、ｐＨ変化に応じて、ワトソン−クリック型塩基対とフーグスティーン型塩基対とに変化し、前記一方のポリヌクレオチド鎖が前記シグナル発生化合物を有し、前記他方のポリヌクレオチド鎖が前記シグナル制御化合物を有し、前記両化合物が、前記ワトソン−クリック型塩基対およびフーグスティーン型塩基対のいずれか一方の結合形態の場合にのみ隣接するように、前記各鎖に結合しているという構成である。
【００１５】
前記両ポリヌクレオチド鎖におけるシグナル発生化合物およびシグナル制御化合物の結合部位は特に制限されず、前述のように、いずれか一方の結合形態の場合にのみ隣接するような部位に結合されていればよい。例えば、一方のポリヌクレオチド鎖の５’末端にシグナル化合物を結合させた場合、他方のポリヌクレオチド鎖の５’または３’のいずれにシグナル制御化合物を結合させてもよいし、また、一方のポリヌクレオチド鎖の３’末端にシグナル化合物を結合させた場合も、他方のポリヌクレオチド鎖の５’または３’のいずれにシグナル制御化合物を結合させてもよい。これらの中でも、例えば、前記一方のポリヌクレオチド鎖の５’末端に前記シグナル発生化合物を有し、前記他方のポリヌクレオチド鎖の５’末端に前記シグナル制御化合物を有することが好ましい。
【００１６】
前記ポリヌクレオチド鎖は、ポリデオキシリボヌクレオチド鎖であることが好ましいが、例えば、ポリリボヌクレオチド鎖、ＰＮＡ（ペプチド核酸）でもよいし、また、これらのポリヌクレオチド鎖が部分的に修飾されていてもよい。このようなポリヌクレオチド鎖は、例えば、従来公知の合成方法によって合成することができる。
【００１７】
また、いずれか一方のポリヌクレオチド鎖が「Ｃ」を含むことが好ましい。相対的に低いｐＨにおいてＣがプロトネーションし、フーグスティーン型塩基対が安定化されるためである。前記ポリヌクレオチド鎖におけるＣの割合は、塩基１２ｎｔあたり、例えば、４〜１０個の範囲である。また、Ｃの連続配列を有してもよく、例えば、２〜６個の連続範囲であってもよい。
【００１８】
前記両ポリヌクレオチド鎖の長さは、同じ長さであることが好ましく、例えば、それぞれ８〜２０ｎｔの範囲であり、好ましくは１２〜１６ｎｔの範囲である。
【００１９】
前記両ポリヌクレオチド鎖の具体的な配列および組合わせとししては、例えば、以下のような（１）〜（５）の組合わせがあげられる。
2004117217.tif 000004
【００２０】
前記シグナルとしては、特に制限されず、目視や各種測定機器によって検出できるものであればよく、例えば、蛍光シグナル等があげられ、例えば、目視や蛍光強度の測定によって検出できる。
【００２１】
前記シグナル発生化合物および前記シグナル制御化合物としては、特に制限されず、従来公知の化合物が使用できる。これらの中でも、前述のように蛍光シグナルが好ましいことから、例えば、前記シグナル発生化合物が、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を生じるドナーであり、前記シグナル制御化合物が、前記ドナーに対するアクセプターまたはクエンチャーであることが好ましい。これらの化合物は、従来公知の方法によって、ポリヌクレオチド鎖に結合させることができる。
【００２２】
前記ドナーとしては、例えば、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、Ｃｙ３（　Ｉｎｄｏｄｉｃａｒｂｏｃｙａｍｉｎｅ　３）、Ｃｙ５（Ｉｎｄｏｄｉｃａｒｂｏｃｙａｍｉｎｅ　５）、Ｃｙ７（　Ｉｎｄｏｄｉｃａｒｂｏｃｙａｍｉｎｅ　７）、ＦＡＭ（３，６−ｄｉｐｉｖａｌｏｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）等の蛍光団があげられる。
【００２３】
前記アクセプターとしては、例えば、ＴＡＭＲＡ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ５、Ｃｙ７等の蛍光団があげられる。
【００２４】
前記ドナーとアクセプターの組合わせとしては、例えば、ＦＩＴＣとＴＡＭＲＡの組合わせ、Ｃｙ３とＣｙ５の組合わせ、Ｃｙ５とＣｙ７の組合わせ等があげられ、これらの中でも、例えば、ＦＩＴＣとＴＡＭＲＡの組合わせ、Ｃｙ３とＣｙ５の組合わせが好ましく、より好ましくはＦＩＴＣとＴＡＭＲＡの組合わせである。
【００２５】
前記クエンチャーとしては、例えば、Ｃｙ３Ｑ、Ｃｙ５Ｑ、Ｃｙ７Ｑ、ｄａｂｓｙｌ等の化合物があげられる。
【００２６】
前記ドナーとクエンチャーの組合わせとしては、例えば、ＦＩＴＣ　とｄａｂｓｙｌとの組合わせ等があげられる。
【００２７】
つぎに、この第１のｐＨ指示薬が、５’末端にドナーが結合されたポリヌクレオチド鎖と、５’末端にアクセプターが結合されたポリヌクレオチド鎖とから構成される二本鎖ポリヌクレオチドであり、これによって液体試料のｐＨを測定する一例を以下に示す。
【００２８】
まず、ドナーおよびアクセプターがそれぞれ結合された前記二本のポリヌクレオチド鎖を加熱し、徐々に温度を下げることによってアニーリングを行い、二本鎖ポリヌクレオチドを形成させる。なお、前記二本のポリヌクレオチド鎖は、二本鎖ではなく、一本鎖ポリヌクレオチド鎖のまま使用することもできるが、ポリヌクレオチド鎖の凝集を防ぐために、予めアニーリングにより二本鎖ポリヌクレオチドの状態で使用することが好ましい。
【００２９】
前記加熱条件は、特に制限されず、加熱温度は、例えば、８０〜９０℃の範囲であり、最終的に、例えば、２５〜３７℃の範囲にまで、温度を下げることが好ましい。
【００３０】
アニーリングの際の溶液は、特に制限されないが、例えば、緩衝液等が好ましく、より好ましくは、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ等のグッドの緩衝液、Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液等の緩衝液である。前記緩衝液のｐＨは、例えば、５．０〜９．０の範囲である。
【００３１】
前記溶液は、さらに、各種塩やキレート剤等を含んでもよい。前記塩としては、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ等があげられ、前記キレート剤としては、ＥＤＴＡ等があげられる。
【００３２】
この二本鎖ポリヌクレオチドを液体試料に添加し、その蛍光を検出して、前記蛍光に対応するｐＨから、前記液体試料のｐＨを決定することができる。
【００３３】
具体的には、図１に示すような反応に基づき、以下のようにしてｐＨが決定できる。なお、同図は、本実施形態におけるｐＨ指示薬のｐＨ変化に伴う塩基対の結合形態の変化、およびＦＲＥＴの現象を示す図である。図示のように、前記液体試料のｐＨが相対的に高い場合（図において左側）、前記二本鎖ポリヌクレオチドは、ワトソン−クリック型塩基対を有するアンチパラレル型二本鎖を形成する。この場合、５’末端のドナーと５’末端のアクセプターは、逆方向に位置するため、ドナーのみの蛍光シグナルが検出される。一方、前記液体試料のｐＨが相対的に低い場合（図において右側）、前記二本鎖ＤＮＡは、フーグスティーン型塩基対を有するパラレル型二本鎖を形成する。この場合、５’末端のドナーと５’末端のアクセプターは、同方向において隣接した状態となるため、ドナーからアクセプターにエネルギー転移（ＦＲＥＴ）が起こり、アクセプターの蛍光シグナルは増加し、ドナーの蛍光シグナルは減少する。つまり、高いｐＨから低いｐＨに変化するに伴い、アンチパラレル型からパラレル型へ変移するため、試料の蛍光シグナルは、ドナーの蛍光シグナル（蛍光強度）が徐々に弱くなり、アクセプターの蛍光シグナルが徐々に強くなっていくのである。したがって、予め、ｐＨに応じた蛍光色の濃淡および色味の変化、または蛍光強度を特定しておくことによって、測定試料の蛍光シグナルから対応するｐＨを決定することができるのである。なお、前記二本鎖ポリヌクレオチドにおける、ｐＨに応じたアンチパラレル型とパラレル型の塩基対の形態は、前記式（１）に示すとおりである。
【００３４】
また、一方のポリヌクレオチド鎖の５’末端にドナーを結合し、他方のポリヌクレオチド鎖の３’末端にアクセプターを結合させた場合でも、同様にｐＨ決定が可能である。この場合には、相対的に高いｐＨ側でアンチパラレル型二本鎖を形成すれば、５’末端のドナーと３’末端のアクセプターが同方向において隣接した状態となるため、ドナーからアクセプターにエネルギー転移が起こり、アクセプターの蛍光シグナルは増加する。そして、相対的に低いｐＨ側でパラレル型二本鎖を形成すれば、前記ドナーとアクセプターは、逆方向に位置するため、ドナーのみの蛍光シグナルが検出される。
【００３５】
このようなｐＨ指示薬によれば、例えば、５．０〜９．０の範囲のｐＨを測定できる。
【００３６】
また、シグナル化合物としてドナーを、シグナル制御化合物としてクエンチャーを有する場合には、ドナーとクエンチャーとが逆方向に位置すれば、ドナーの蛍光シグナルが検出され、ｐＨ変化によって、徐々にドナーとクエンチャーとが隣接するため、蛍光シグナルが消光する。このような蛍光シグナルの変化によってもｐＨを決定することができる。
【００３７】
このようなｐＨ指示薬は、前述のような液体試料のｐＨ測定には限定されず、例えば、後述するように、細胞内に導入させて、細胞内ｐＨを測定する試薬としても有用である。
【００３８】
（実施形態２）
つぎに、本発明の第２のｐＨ指示薬は、例えば、一本鎖ポリヌクレオチドを含み、
前記一本鎖ポリヌクレオチドの両端が共に５’末端または３’末端であり、
前記一本鎖ポリヌクレオチドの鎖内における塩基対の結合形態が、ｐＨ変化に応じて、塩基対の形成とその解離とに変化し、
前記一本鎖ポリヌクレオチドが、前記塩基対が形成された際に隣接する部位に、前記シグナル発生化合物と前記シグナル制御化合物とを有しているという構成である。
【００３９】
前記一本鎖ポリヌクレオチドの長さは、例えば、１０〜５０ｎｔの範囲である。
【００４０】
前記一本鎖ポリヌクレオチドは、前述のようなフーグスティーン型塩基対の形成を利用するため、例えば、両端が３’末端または両端が５’末端となる鎖であることが好ましく、より好ましくは両端が３’末端である。具体的には、対となる同じ長さの二本のポリヌクレオチドが、リンカーを介して５’末端で結合された、両端が３’末端の一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。この二本のポリヌクレオチドの長さは、例えば、それぞれ５〜２５ｎｔの範囲である。この二本のポリヌクレオチドとしては、例えば、前記配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０等の組合わせがあげられる。
【００４１】
前記リンカーとしては、特に制限されないが、例えば、ポリリン酸やポリヌクレオチドがあげられ、前記ポリヌクレオチドとしては、例えば、同じヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドが好ましい。この中でも好ましくは、ポリＴである。ポリＴの長さは、特に制限されないが、例えば、４〜８ｎｔが好ましい。また、ポリリン酸の場合、リン酸基の数は、例えば、２〜１０の範囲である。
【００４２】
前記ポリヌクレオチド鎖は、「Ｃ」を含むことが好ましく、前記ポリヌクレオチド鎖におけるＣの割合は、塩基２４ｎｔあたり、例えば、４〜１０個の範囲である。
【００４３】
例えば、配列番号１および配列番号２のポリヌクレオチドを含み、かつ、両末端が３’である一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、以下に示すようなカルボジイミドを用いた方法やアミダイトを用いた方法等によって合成できる。
【００４４】
（カルボジイミドを用いた方法）
従来公知のホスホロアミダイト法等によって、前述のような二本のオリゴマーを合成し、さらに両方の５’末端にそれぞれモノリン酸を導入する。これらのオリゴマーを、５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２および２０ｍＭ水溶性カルボジイミド（ＣＤＩ）および　５０ｍＭ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ　（ＭＥＳ）　緩衝液中、０℃で３６時間インキュベートして、下記式の反応を行う。そして、得られた反応物を、１２％変性ゲルで精製して、一本鎖ポリヌクレオチド鎖とする。このような方法は、例えば、Ｆ．　Ｇｅｉｎｇｕｅｎａｕｄ，　Ｊ．　Ｌｉｑｕｉｅｒ，　Ｍ．　Ｇ．　Ｂｒｅｖｎｏｖ，　Ｏ．　Ｖ．Ｐｅｔｒａｕｓｋｅｎｅ，　Ｙ．　Ｉ．　Ａｌｅｘｅｅｖ，　Ｅ．　Ｓ．　Ｇｒｏｍｏｖａ，　Ｅ．　Ｔａｉｌｌａｎｄｉｅｒ，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３９，　１２６５０−１２６５８　（２０００）等に開示されているが、これには限定されない。
【化２】
2004117217.tif 000005
【００４５】
この場合、シグナル化合物とシグナル制御化合物とは、それぞれ前記一本鎖ポリヌクレオチド鎖の両３’末端に導入する。例えば、ドナーであるＦＩＴＣは、前記３’末端に合成機によって導入できる。また、アクセプターであるＴＡＭＲＡは、他方の３’末端を、３’−アミノ修飾Ｃ７　ＣＰＧ（２−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−６−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｅ−ｈｅｘａｎｅ−１−ｓｕｃｃｉｎｏｙｌ）−ｌｏｎｇ　ｃｈａｉｎ　ａｌｋｙｌａｍｉｎｏ−ＣＰＧ　を用いてアミン化した後、さらに　ＴＡＭＲＡ　ＮＨＳ　Ｅｓｔｅｒを反応させ、二段階で導入できる。
【００４６】
（５’−５’をリンケージするアミダイトを用いた方法）
オリゴマーの５’末端同士を連結できるアミダイト試薬　５’−（β−Ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｈｏｓｐｈｉｎｙｌ−３’−（４，　４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの合成を行う。この合成は、例えば、（１）ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅによりチミジンの５’−ＯＨを保護し、（２）チミジンの３’−ＯＨをｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ　（ＤＭＴ）　ｃｈｌｏｒｉｄｅで保護し、（３）１Ｍのｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｆｌｕｏｒｉｄｅを含む　ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ中で、前記５’末端の脱保護を行い、さらに（４）ｃｈｌｏｒｏ（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−Ｎ，　Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ　ｐｈｏｓｐｈｉｔｅを５’末端に導入することによって得ることができる。このような方法は、例えば　Ｊ．　Ｈ．　ｖａｎ　ｄｅ　Ｓａｎｄｅ，　Ｎ．　Ｂ．　Ｒａｍｓｉｎｇ，　Ｍ．　Ｗ．　Ｇｅｒｍａｎｎ，　Ｗ．　Ｅｌｈｏｒｓｔ，　Ｂ．　Ｗ．　Ｋａｌｉｓｃｈ，　Ｅ．　Ｖ．　Ｋｉｔｚｉｎｇ，　Ｒ．　Ｔ．　Ｐｏｎ，　Ｒ．　Ｃ．　Ｃｌｅｇｇ，Ｔ．　Ｍ．　Ｊｏｖｉｎ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４１，　５５１−５５７　（１９８８）等に開示されているが、これには限定されない。
【００４７】
そして、このアミダイト試薬を用いることによって、５’−５’リンケージの連結反応を行い、その後、新たに合成したアミダイトをカップリングすることによって、例えば、下記式のような一本鎖ポリヌクレオチドを合成できる。
【化３】
2004117217.tif 000006
【００４８】
前記式のポリヌクレオチド鎖においては、リンカーとしてチミジンとしているが、これには限定されず、また、リンカーの長さも、特に制限されないが、例えば、４〜８ｎｔの範囲が適当である。なお、両３’末端への化合物の結合は、前述の方法と同様にして行うことができる。
【００４９】
このように、ドナーやアクセプター等の各種化合物が導入された前記一本鎖ポリヌクレオチド鎖は、下記式に示すように、相対的にｐＨが高くなると、鎖内で塩基対を形成しないため、一本鎖ポリヌクレオチドのままであり、例えば、ドナー（Ｄ）の蛍光シグナルが検出される（下記式において上側）。そして、ｐＨが相対的に低くなると、鎖内においてフーグスティーン型塩基対が形成されパラレルヘアピン構造をとるため、例えば、ドナー（Ｄ）とアクセプター（Ａ）とが隣接することによってエネルギー転移が起こり、アクセプター（Ａ）の蛍光シグナルが検出される（下記式において下側）。したがって、前述の実施形態と同様に、塩基対の結合形態の変化に伴なう蛍光シグナルの変化によって、ｐＨを決定できるのである。また、前述のようなリンカーを有さない一本鎖ポリヌクレオチドであっても、ｐＨ変化に応じて、例えば、ステムループ構造の形成と非形成とに変化することを利用して、シグナル検出によりｐＨを決定することもできる。
【化４】
2004117217.tif 000007
【００５０】
（実施形態３）
前記実施形態１および２に示す第１および第２のｐＨ指示薬は、さらに、キャリアーに保持された形態であってもよい。
【００５１】
前記キャリアーとしては、特に制限されず、従来公知のものが使用でき、例えば、リポソーム、ポリエチレンイミン、塩基性ポリマー、リン酸カルシウム、合成ペプチド等が使用できる。また、例えば、細胞内のｐＨを測定する場合には、前述のようなポリヌクレオチド鎖を細胞内に導入し易いことから、例えば、リポソーム等が好ましい。
【００５２】
以下に、前記実施形態１に示す二本のポリヌクレオチド鎖を有するｐＨ指示薬をキャリアーであるリポソームによって細胞に導入し、細胞内のｐＨを測定する方法の例を示す。
【００５３】
まず、二本のポリヌクレオチド鎖を加熱し、徐々に温度を下げることによってアニーリングを行い、二本鎖ポリヌクレオチドを形成させる。アニーリングの条件は特に制限されず、前述と同様に行うことができる。なお、前記二本のポリヌクレオチド鎖は、それぞれ一本鎖のままキャリアーに担持させてもよいが、例えば、細胞内で安定な二重鎖を形成させるために、二本鎖ポリヌクレオチドの状態でキャリアーに担持させることが好ましい。
【００５４】
つぎに、この二本鎖ポリヌクレオチドをリポソームに担持させる。リポソーム内にポリヌクレオチドを保持させる方法は、一般に公知の方法によって行うことができる。例えば、前記二本鎖ポリヌクレオチドと培地、リポソームと培地とを、それぞれ混合し、両混合液をさらに混合して放置することによって、リポソーム内に前記ポリヌクレオチドが保持される。この操作は、通常、室温で行うことができ、前記両混合液を混合した後であり細胞に導入させる前に、例えば、２０分以上放置すればよい。
【００５５】
前記リポソームとしては、例えば、市販の商品名　ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）や、商品名ＰｏｌｙＦｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、商品名ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等が使用できる。
【００５６】
前記培地の種類は特に制限されず、二本鎖ポリヌクレオチドを導入する　ｐＨ　測定対象細胞の種類に応じて適宜決定できる。
【００５７】
つぎに、前記リポソームに保持された二本鎖ポリヌクレオチドを、測定対象細胞に導入する。まず、前記測定対象細胞を、例えば、前記リポソームを導入するに先立って、ウェル（ｗｅｌｌ）に注入する。この際、前記細胞の濃度は、特に制限されないが、例えば、１．０×１０６〜１．０×１０４ｃｅｌｌ／１ｗｅｌｌの範囲である。
【００５８】
そして、この　ｗｅｌｌに前記リポソームと二本鎖ポリヌクレオチドの混合液を添加し、インキュベートを行う。細胞に対するリポソームの添加量は、特に制限されない。
【００５９】
前記インキュベートの条件は、特に制限されず、例えば、細胞の種類に応じて適宜決定できる。具体的には、例えば、温度２５〜４２℃の範囲である。
【００６０】
そして、インキュベート後、ｗｅｌｌから上澄液を取り除き、溶媒で細胞を洗浄してから、シグナルを測定する。このシグナルが蛍光の場合には、例えば、前記細胞を蛍光顕微鏡で観察することによってｐＨを測定できる。
【００６１】
前記洗浄用の溶媒としては、特に制限されず、例えば、生理食塩水、リン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液等が使用できる。
【００６２】
【実施例】
（実施例１）
配列番号１に示す一本鎖ＤＮＡ（５’−ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴ−３’：以下、「Ｔ１」という）を、ホスホロアミダイト法により、ＤＮＡ自動合成機（商品名ＤＮＡシンセサイザーＭｏｄｅｌ３９１：アブライドバイオシステムズ社製）を用いて固相合成した。そして、前記Ｔ１の　５’末端Ｔに、ドナーとして蛍光試薬　ＦＩＴＣ　をホスホロアミダイト法により前記ＤＮＡ自動合成機を用いて導入した。ＦＩＴＣのアミダイト試薬としてはＧｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製を使用した。
【００６３】
一方、配列番号２に示す一本鎖ＤＮＡ（５’−ＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡ−３’：以下、「Ｔ２」という）は、以下に示すようにして合成し、その５’末端のＡには、アクセプターとして　蛍光試薬　ＴＡＭＲＡ　を導入した。具体的には、まず、市販の５’−アミノ−修飾Ｃ６を合成するアミダイト試薬６−（４−Ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌａｍｉｎｏ）ｈｅｘｙｌ−（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（商品名５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６；Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて、５’末端にアミノ−修飾Ｃ６を有するＴ２を、前記ＤＮＡ自動合成機によって合成した。この合成した５’−アミノ−修飾Ｃ６を有するＤＮＡを、通常の方法で脱保護した後、凍結乾燥した。凍結乾燥したＤＮＡ　０．２μｍｏｌを０．１Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３　（ｐＨ９．０）　５００μＬに溶解してから、６当量のＴＡＭＲＡ／ＤＭＳＯ（商品名ＴＡＭＲＡ　ＮＨＳ　Ｅｓｔｅｒ；Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を加え、３７℃の暗室で１〜２時間放置した。その後、反応液を脱塩し、さらにＨＰＬＣで精製を行った。
【００６４】
それぞれのラベル化されたＤＮＡの濃度を、２６０　ｎｍの吸光度から決定し、４　μＭ（２００　μＬ）に調整した。そして、各ラベル化ＤＮＡを１：１の割合で混合し、９０℃で１分間放置した後、室温にゆっくりと温度を下げてアニーリングを行い、ラベル化二本鎖ＤＮＡを調製した。
【００６５】
なお、対照例１として、５’末端にドナー（ＦＩＴＣ）を結合したＴ１と、ドナー・アクセプター未結合のＴ２とをアニーリングした二本鎖ＤＮＡ、および、対照例２として、ドナー・アクセプター未結合のＴ１と、アクセプターを結合したＴ２とをアニーリングした二本鎖ＤＮＡを調製した。
【００６６】
これらの各二本鎖ＤＮＡを、１００ｍＭ　ＮａＣｌおよび　１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ　を含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）と、１００ｍＭ　ＮａＣｌおよび　１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ　を含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）とにそれぞれ添加し、４９４ｎｍで励起させて、各波長における蛍光強度を測定した。これらの結果を図２および図３に示す。なお、これらの図は、各波長における前記溶液の蛍光強度を示すグラフであり、図２はｐＨ９．０の結果を示し、図３はｐＨ５．０の結果を示す。また、図中において「５’−ＦＩＴＣ，５’−ＴＡＭＲＡ」は実施例１を示し、「５’−ＦＩＴＣ」は対照例１を示し、「５’−ＴＡＭＲＡ」は対照例２を示す。
【００６７】
図２に示すように、ｐＨ９．０においては、実施例１の二本鎖ＤＮＡはアンチパラレル型をとり、ドナーとアクセプターが離れて存在するため、４９４ｎｍの波長で励起されたドナーの蛍光シグナルのみが検出され、アクセプターのシグナルはみられなかった。なお、実施例１で見られる蛍光シグナルは、対照例１と同様のシグナルであることから、ドナーのシグナルであることが確認できた。アクセプターのみを有する対照例２は、アクセプターが４９４ｎｍで励起されないことからシグナルは検出されなかった。一方、図３に示すように、ｐＨ５．０においては、実施例１の二本鎖ＤＮＡはパラレル型をとり、ドナーとアクセプターが隣接するため、４９４ｎｍの波長で励起されたドナーのシグナルと、ドナーからのエネルギー転移によるアクセプターの蛍光シグナルとが検出された。前記実施例１の二つのシグナルがドナーとアクセプターによることは、ドナーのみを有する対照例１およびアクセプターのみを有する対照例２のシグナルと重なることから確認できた。なお、図３において対照例２のアクセプターにピークが見られるが、これは波長４９４ｎｍで励起させたピークである。なお、実施例１について、ｐＨ５．０およびｐＨ９．０におけるドナーとアクセプターとの距離を求めた結果、ｐＨ９．０におけるアンチパラレル型二本鎖ＤＮＡでは、４．９×１０−９（４９Å）であり、ｐＨ５．０におけるパラレル型二本鎖ＤＮＡでは、３．８×１０−９（３８Å）であった。
【００６８】
このように、実施例のｐＨ指示薬によれば、ｐＨに応じて塩基対の結合形態が変化するため、これを利用して蛍光シグナルを検出することによって、測定試料のｐＨを決定できるといえる。
【００６９】
（実施例２）
前記実施例１で調製したドナーとアクセプターによるラベル化二本鎖ＤＮＡのｐＨ指示薬を用いて、ｐＨ変化に応じた蛍光シグナルの変移を確認した。
【００７０】
以下に示す　１００ｍＭ　ＮａＣｌおよび　１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ　を含む　ｐＨ５．０〜９．０　の各種緩衝液を準備し、室温中、光路長１ｍｍのＵＶセルに、前記ラベル化二本鎖ＤＮＡが　４μＭとなるように、緩衝液と共に添加した。そして、前記セルにＵＶ（ハンディーＵＶ；フナコシ社製）を照射して、その色調変化を観察した。この時の励起波長は、２５４　ｎｍを最大強度に持つブロード光である。なお、対照例３として、下記式に示すＢＣＥＣＦ（２’−，７’−Ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−４　または　５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を前記各種緩衝液に　４　μＭとなるように添加して、その色調変化を確認した。
【化５】
2004117217.tif 000008
【００７１】
実施例２についての写真を図４に、対照例３についての写真を図５に示す。なお、これらの写真は、励起波長を拾わないように、４５５ｎｍのフィルターを備え付けて撮影した。
【００７２】
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液　　　　　　　ｐＨ５．０、　５．５
５０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液　　　　　　　　　　　　　ｐＨ６．０、　７．０
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液　　　　　　　　ｐＨ８．０、　９．０
【００７３】
図５に示すように、ＢＣＥＣＦ　を用いた対照例３の色調は、溶液のｐＨ変化に依存しており、例えば、ｐＨが低下するに従ってその蛍光強度が弱くなった。一方、図４に示すように、実施例についても、ｐＨが９．０から低下するに伴なって、色が薄くなり、ｐＨ７．０からｐＨ６．０の間で緑から黄色に色調が変化し、さらにｐＨが低下することによって黄色の色味が濃くなった。これは、ｐＨの低下に伴ないＦＩＴＣ由来の緑の蛍光強度が減少し、一方、ＴＡＭＲＡ　由来の黄色の蛍光強度が増加したためである。
【００７４】
【発明の効果】
このように本発明のｐＨ指示薬によれば、ｐＨ変化に応じたシグナルの変化によってｐＨを測定でき、特に細胞内のｐＨに関しては、容易かつ簡便な測定が可能である。したがって、例えば、生化学の分野や臨床医療の分野における細胞内のｐＨ測定等に非常に有用である。
【００７５】
【配列表】
2004117217.tif 000009
2004117217.tif 000010
2004117217.tif 000011
2004117217.tif 000012
2004117217.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態における、ｐＨ変化に伴う塩基対の結合形態の変化、およびＦＲＥＴの現象を示す概略図である。
【図２】本発明の一実施例における、蛍光シグナルのピークを示すグラフである。
【図３】前記実施例における、蛍光シグナルのピークを示すグラフである。
【図４】本発明のその他の実施例における、ｐＨ変化に伴う蛍光色の変化を示す写真である。
【図５】比較例における、ｐＨ変化に伴う蛍光色の変化を示す写真である。
【図６】ワトソン−クリック型塩基対とフーグスティーン型塩基対の形態を示す模式図である。
【図１】
2004117217.tif 000014
【図２】
2004117217.tif 000015
【図３】
2004117217.tif 000016
【図４】
2004117217.tif 000017
【図５】
2004117217.tif 000018
【図６】
2004117217.tif 000019