(57)【要約】【課題】本発明は、ＤＮＡライブラリーから、所望のＤＮＡを特異的に濃縮または除去されたＤＮＡライブラリーを作製することが可能であり、且つ該ＤＮＡのクローンを直接取得することができる方法を提供することを目的とする。【解決手段】上記課題を解決するために、本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を用いて環状ＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。すなわち、本発明は、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、該第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１）  前記第二のｄｓＤＮＡの第一の鎖の３’末端部分に相同な配列を含み、且つその３’末端の塩基配列が前記第二のｄｓＤＮＡの３’末端の塩基配列とは異なった第三のｓｓ核酸と、ＲｅｃＡタンパク質とを前記ＤＮＡライブラリーに添加し、前記第二のｄｓＤＮＡの３’末端部分と前記第三のｓｓ核酸の相同的組換えを行わせることにより、前記第二のｄｓＤＮＡの３’末端部分に、前記第二のｄｓＤＮＡの第一の鎖、前記第三のｓｓ核酸および前記第二のｄｓＤＮＡの第二の鎖からなる三本鎖部分を形成する工程と；
（２）  工程（１）で得られた相同的組換え体を含むＤＮＡライブラリーにエキソヌクレアーゼＩを添加して、前記三本鎖部分における第二のＤＮＡの第一の鎖部分を消化する工程と；
（３）  ライゲーション処理を施し、前記第一のｄｓＤＮＡを環状化する工程と；
（４）  工程（３）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ＤＮＡライブラリーは、環状ＤＮＡライブラリーであり、前記工程（１）の前に、環状ｄｓＤＮＡを切断する工程を、さらに備えた方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記ライゲーション処理が自己ライゲーションである方法。
【請求項４】
含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡを濃縮することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１）  前記第一のｄｓＤＮＡの第一の鎖の３’末端部分に相同な配列を含み、且つ制限酵素切断部位を形成し得る配列をその３’末端部分に含む第三のｓｓ核酸と、前記第三のｓｓ核酸の３’末端部分とハイブリダイズ可能で且つそのハイブリダイズ部分に制限酵素切断部位を形成できる配列を含み、且つ標識を含む第四のｓｓ核酸とを混合し、前記第三のｓｓ核酸の３’末端部分と前記第四のｓｓ核酸をハイブリダイズさせることにより第五の核酸を形成すると共に、該第五の核酸の二本鎖部分に制限酵素切断部位を形成する工程と；
（２）  前記ＤＮＡライブラリーに、ＲｅｃＡタンパク質と工程（１）で得られた第五の核酸を添加し、前記第一のｄｓＤＮＡの一部と前記第五の核酸中の前記第三のｓｓ核酸部分との間で相同的組換えを行わせることにより、前記第一のｄｓＤＮＡの第一の鎖、前記第三の核酸部分、前記第一のｄｓＤＮＡの第二の鎖からなる三本鎖部分を形成し、その場合に前記第五の核酸中の前記第四の核酸部分の３’末端が前記第一のｄｓＤＮＡの第二の鎖の５’末端に隣接する工程と；
（３）  前記工程（２）で得られたＤＮＡライブラリーにエキソヌクレアーゼＩを添加して、前記三本鎖部分における前記第一のＤＮＡの第一の鎖部分を消化する工程と；
（４）  前記ＤＮＡライブラリーから、前記第四のｓｓ核酸を含む複合体を、標識を媒介して回収する工程と；
（５）  前記工程（４）で回収した前記複合体に適切な制限酵素を作用させることにより、前記制限酵素部位で切断する工程と；
（６）  前記工程（５）で切断したＤＮＡにライゲーション処理を施し、前記第一のｄｓＤＮＡを環状化する工程と；
（７）  工程（６）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記ＤＮＡライブラリーは、環状ＤＮＡライブラリーであり、前記工程（１）の前に、環状ｄｓＤＮＡを切断する工程を、さらに備えた方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の方法であって、前記ライゲーション処理が自己ライゲーションである方法。
【請求項７】
含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することにより、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築するためのキットであって、ＲｅｃＡタンパク質と、適切なバッファーと、エキソヌクレアーゼＩとを含むことを特徴とするキット。
【請求項８】
含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡを濃縮することにより、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築するためのキットであって、ＲｅｃＡタンパク質と、適切なバッファーと、エキソヌクレアーゼＩとを含むことを特徴とするキット。
【請求項９】
請求項９に記載のキットであって、さらにビオチン標識オリゴヌクレオチドと、ストレプトアビジンビーズとを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、部分的なＤＮＡ鎖の相同的組換えによる遺伝子除去方法および遺伝子取得方法に関する。詳細には、ＲｅｃＡタンパク質を使用して、ＤＮＡライブラリーから所望の核酸以外の核酸を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡライブラリー、とりわけｃＤＮＡライブラリーは、遺伝子をクローニングするための極めて有用なツールである。これまでに、ｃＤＮＡライブラリーから多くの遺伝子がクローニングされている。クローニングされた遺伝子は、遺伝子自身の塩基配列を決定するのに用いられるのみならず、該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定したり、該タンパク質を細菌や酵母細胞内で大量に作らせるために用いられている。
【０００３】
しかしながら、ｃＤＮＡライブラリーから容易にクローニングし得るｃＤＮＡは、その鋳型となったｍＲＮＡが細胞中に大量に発現しているｃＤＮＡに限られるため、多くの遺伝子がクローニングされた現在では、クローニングし易いｃＤＮＡの多くは殆どクローニングされてしまい、新規なｃＤＮＡを効率よくクローニングすることが困難になりつつある。
【０００４】
ｃＤＮＡライブラリーから新規なｃＤＮＡを効率よくクローニングするためには、既にクローニングされたｃＤＮＡをライブラリーから除去することが必要であり、この目的のために以下のような技術が考案されている。
【０００５】
この目的を達成するために使用されている最も基本的な方法としては、差引きハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）がある。
【０００６】
該方法では、目的の遺伝子を発現している細胞（又は組織）と目的の遺伝子を発現していない細胞からｍＲＮＡを調製し、一方からｃＤＮＡを合成した後、両者をハイブリダイゼーションさせるので、両細胞に共通するｃＤＮＡのみが除去され、ある組織や細胞に特異的に発現している遺伝子を濃縮、単離することが可能となる。
【０００７】
上記差引きハイブリダイゼーションの例としては、メンブレン上における差引きハイブリダイゼーション法およびヒドロキシアパタイトカラムを用いた差引きハイブリダイゼーション法が知られている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００８】
しかし、メンブレン上における差引きハイブリダイゼーションでは、一度に多くのコロニーを処理することが難しいため、ライブラリー全体の再構築には向いていない。また、偽陽性または偽陰性のシグナルも多いため、検討に時間がかかるという問題を有している。
【０００９】
また、ヒドロキシアパタイトカラムを用いた差引きハイブリダイゼーション法方法では、サイズが３ｋｂを超えるような比較的長い配列を含むｃＤＮＡライブラリーの場合、非特異的ハイブリダイゼーションが起こる可能性が高くなるため、０．４〜２．５ｋｂ程度の比較的短いＤＮＡからなるｃＤＮＡにしか適用できなかった。長い配列は、多機能タンパクや複雑な構造のタンパク質をコードする機能的に重要な遺伝子を含む可能性が高いので、長い配列を含むライブラリーに適用し得ないことは、本方法の大きな欠点である。また、同一の遺伝子に由来し、３’末端と５’末端が共通であるが、中央が異なる配列は、短いｃＤＮＡであっても該方法では区別することができない。
【００１０】
同様の目的を達成するために多用される他の方法として、ディファレンシャルディスプレー法が知られている（非特許文献３）。また、この方法を改良した、ＰＣＲを用いた差引ハイブリダイゼーションが知られている（非特許文献４）。
【００１１】
しかし、これらの方法では、発現レベルの差が著しい場合でないと泳動パターンに差が見いだせず、偽陽性もしくは偽陰性のシグナルが多という欠点も存する。また、クローンを直接得ることができないので、ＰＣＲ産物を基に何らかの方法によりクローンを選択する必要がある。
【００１２】
一方、遺伝子ライブラリーから所望の遺伝子を取得するための従来技術として、上記メンブレン上におけるハイブリダイゼーションが知られている（非特許文献１）。
【００１３】
該方法では、上述した通り、大腸菌等の宿主が生息するプレートから、メンブレンフィルター上にコロニーまたはプラークを写し取る。このようにして作製されたフィルターに対して、検出プローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。シグナルを与えるコロニーまたはプラークは、目的とする遺伝子断片を含むと予想される。従って、そのコロニーまたはプラークを単離培養することにより、目的とする遺伝子断片を取得することができる。
【００１４】
しかし、この技術では、一度に多くのコロニーを処理することが難しいため、まれにしか存在しない遺伝子の取得には向いていない。また、偽陽性または偽陰性のシグナルが多く存在するために検討に時間を要する。
【００１５】
また、液相におけるハイブリダイゼーションを利用する方法も知られている（非特許文献５）。
【００１６】
該方法では、Ｍ１３複製改正点を有するベクターを使用してライブラリーを構築する。これを大腸菌内または試験管内で環状一本鎖ライブラリーに変換する。標識されたプローブと液相中でハイブリダイゼーションを行い、次いで標識を特異的に認識する物質で固相に吸着させることによって単離する。固相からＤＮＡを回収した後、二本鎖ＤＮＡに変換する。これを使用して大腸菌を形質転換させることにより、目的とする遺伝子を取得することができる。
【００１７】
しかし、この方法では、７０％以上の配列が相同である場合、同様に反応してしまうため、任意の場所にプローブを設計することができない。
【００１８】
その他、ライブラリーから所望の遺伝子を取得するために、ＲｅｃＡを用いたクローニングも開示されている（特許文献１）。
【００１９】
該方法は、標識されたプローブと液相中で三本鎖を形成させる。次いで、標識を特異的に認識する物質で固相に該三本鎖を吸着させることによって単離する。固相からＤＮＡを回収した後、このＤＮＡで大腸菌を形質転換することにより、目的とする遺伝子を得ることができる。
【００２０】
しかし、この方法では、開環状二本鎖ＤＮＡしか反応に使用することができないため、特異性および効率が必ずしも高くないという問題がある。
【００２１】
さらに、三本鎖構造によるＤＮＡ伸長反応阻害を用いたクローニングも開示されている（特許文献２）。
【００２２】
該方法は、ライブラリー遺伝子を制限酵素で切断したのち、その末端で三本鎖を形成させる。目的とする遺伝子断片を含むクローンでは三本鎖が形成されることとなる。その結果、三本鎖が形成されたクローンではＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応の基質とならないので、その他のクローンのみが伸長されることとなる。反応後、三本鎖を解消させて、ＤＮＡを再連結させることにより、目的のクローンを得ることができる。
【００２３】
しかし、この方法は、特異性を高めると効率が高くなくなり、効率を高めると特異性が低くなるという問題を有している。
【００２４】
さらに、本発明者は、これまでに、ＲｅｃＡタンパク質を用いて所望の遺伝子の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を開示しているが、線状ＤＮＡライブラリーを加工することはできず、さらなる改良が望まれていた（特許文献４）。
【００２５】
【特許文献１】
特表平６−５００９２６号公報
【００２６】
【特許文献２】
特表平１１−２０６３８１号公報
【００２７】
【特許文献３】
特表平１１−５０９４２３号公報
【００２８】
【特許文献４】
特開２００１−３４６５７６号公報
【００２９】
【非特許文献１】
Ｈｅｄｒｉｃｋ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．、“Ｎａｔｕｒｅ”、（ＵＫ）、１９８４年、５９５５巻、ｐ．１４９−５３
【００３０】
【非特許文献２】
Ｂｏｎａｌｄｏ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄｓｕｂｔｒａｃｒｉｏｎ：  ｔｗｏ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．、“Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ”、（ＵＳＡ）、１９９６年、９巻、ｐ．７９１−８０６
【００３１】
【非特許文献３】
Ｌｉａｎｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ．、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ”、（ＵＳＡ）、１９９５年、２５４巻、ｐ．３０４−２１
【００３２】
【非特許文献４】
Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅｓ．、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ”、（ＵＳＡ）、１９９９年、３０３巻、ｐ．３４９−８０
【００３３】
【非特許文献５】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｐｐｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．１０３５６−０２０
【００３４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術に存する上記課題を解決するためになされたものであり、ＤＮＡライブラリーから、所望のＤＮＡを特異的に濃縮または除去されたＤＮＡライブラリーを作製することが可能であり、且つ該ＤＮＡのクローンを直接取得することができる方法を提供することを目的とする。
【００３５】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の態様において、ＲｅｃＡタンパク質を用いて環状ＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
【００３６】
すなわち、本発明は、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１）  前記第二のｄｓＤＮＡの第一の鎖の３’末端部分に相同な配列を含み、且つその３’末端の塩基配列が前記第二のｄｓＤＮＡの３’末端の塩基配列とは異なった第三のｓｓ核酸と、ＲｅｃＡタンパク質とを前記ＤＮＡライブラリーに添加し、前記第二のｄｓＤＮＡの３’末端部分と前記第三のｓｓ核酸の相同的組換えを行わせることにより、前記第二のｄｓＤＮＡの３’末端部分に、前記第二のｄｓＤＮＡの第一の鎖、前記第三のｓｓ核酸および前記第二のｄｓＤＮＡの第二の鎖からなる三本鎖部分を形成する工程と；
（２）  工程（１）で得られた相同的組換え体を含むＤＮＡライブラリーにエキソヌクレアーゼＩを添加して、前記三本鎖部分における第二のＤＮＡの第一の鎖部分を消化する工程と；
（３）  ライゲーション処理を施し、前記第一のｄｓＤＮＡを環状化する工程と；
（４）  工程（３）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法を提供する。
【００３７】
本発明の第二の態様において、ＲｅｃＡタンパク質を用いてＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
【００３８】
すなわち、本発明は、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡを濃縮することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１）  前記第一のｄｓＤＮＡの第一の鎖の３’末端部分に相同な配列を含み、且つ制限酵素切断部位を形成し得る配列をその３’末端部分に含む第三のｓｓ核酸と、前記第三のｓｓ核酸の３’末端部分とハイブリダイズ可能で且つそのハイブリダイズ部分に制限酵素切断部位を形成できる配列を含み、且つ標識を含む第四のｓｓ核酸とを混合し、前記第三のｓｓ核酸の３’末端部分と前記第四のｓｓ核酸をハイブリダイズさせることにより第五の核酸を形成すると共に、該第五の核酸の二本鎖部分に制限酵素切断部位を形成する工程と；
（２）  前記ＤＮＡライブラリーに、ＲｅｃＡタンパク質と工程（１）で得られた第五の核酸を添加し、前記第一のｄｓＤＮＡの一部と前記第五の核酸中の前記第三のｓｓ核酸部分との間で相同的組換えを行わせることにより、前記第一のｄｓＤＮＡの第一の鎖、前記第三の核酸部分、前記第一のｄｓＤＮＡの第二の鎖からなる三本鎖部分を形成し、その場合に前記第五の核酸中の前記第四の核酸部分の３’末端が前記第一のｄｓＤＮＡの第二の鎖の５’末端に隣接する工程と；
（３）  前記工程（２）で得られたＤＮＡライブラリーにエキソヌクレアーゼＩを添加して、前記三本鎖部分における前記第一のＤＮＡの第一の鎖部分を消化する工程と；
（４）  前記ＤＮＡライブラリーから、前記第四のｓｓ核酸を含む複合体を、標識を媒介して回収する工程と；
（５）  前記工程（４）で回収した前記複合体に適切な制限酵素を作用させることにより、前記制限酵素部位で切断する工程と；
（６）  前記工程（５）で切断したＤＮＡにライゲーション処理を施し、前記第一のｄｓＤＮＡを環状化する工程と；
（７）  工程（６）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法を提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、上記第一の態様および第二の態様のＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、前記ＤＮＡライブラリーは、環状ＤＮＡライブラリーであり、前記工程（１）の前に、環状ｄｓＤＮＡを切断する工程さらに備え、および前記ライゲーション処理が自己ライゲーションである方法を提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、上記方法を利用して、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築するためのキットであって、ＲｅｃＡタンパク質と、適切なバッファーと、エキソヌクレアーゼＩとを含むことを特徴とするキットを提供する。
【００４１】
また、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡを取得することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築するためのキットであって、ＲｅｃＡタンパク質と、適切なバッファーと、エキソヌクレアーゼＩとを含むことを特徴とするキットを提供する。
【００４２】
特に、上記キットであって、さらにビオチン標識オリゴヌクレオチドと、ストレプトアビジンビーズとを含むことを特徴とするキットを提供する。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を介して形成される三本鎖構造が標的核酸の末端領域に形成される場合には、三本鎖構造からＲｅｃＡタンパク質を解離させた後にも三本鎖構造が維持されるという本発明者らの発見に基づいてなされたものである。このように、ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造が形成されること、およびＲｅｃＡタンパク質自体は公知である。
【００４４】
ここで、本発明の方法に応用したＲｅｃＡタンパク質およびＲｅｃＡタンパク質の作用機構について説明する（図１）。
【００４５】
ＲｅｃＡタンパク質は、相同的組換え、ＤＮＡの修復、又は大腸菌のＳＯＳ遺伝子の発現などに関与することが知られている。ＲｅｃＡタンパク質の中では、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質が最も有名である。しかしながら、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質に類似した構造及び機能を有するタンパク質は、大腸菌以外の生物にも広く分布していることが知られており、これらのタンパク質は、一般に、ＲｅｃＡ類似タンパク質と呼称されている。
【００４６】
図１のようにＲｅｃＡタンパク質は、一本鎖ＤＮＡに結合した後（ＲｅｃＡ−一本鎖ＤＮＡ繊維）、該一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに対合させて三元複合体（トリプレックス）を形成し、相同ＤＮＡの検索を行った後、ＡＴＰ存在下でＤＮＡ鎖交換反応を触媒する。ＤＮＡ鎖交換反応後には、一本鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡに取り込まれた雑種二本鎖ＤＮＡと元の二本鎖ＤＮＡから分離された一本鎖ＤＮＡが形成される。このとき、元の二本鎖ＤＮＡよりも一本鎖ＤＮＡが短い場合は、元の二本鎖ＤＮＡの一部のみで交換反応が起こることになる。また、交換される一本鎖ＤＮＡの末端が、元の二本鎖ＤＮＡと異なっている場合には、末端配列の異なる雑種二本鎖ＤＮＡが生じることになる。
【００４７】
前述のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一本鎖核酸を二本鎖核酸にランダムに結合させるのではなく、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する相同な領域に結合させる。二つの核酸が「相同」であるということは、ＲｅｃＡタンパク質を介して特異的な三本鎖構造を形成し得る程度に、両核酸が同一であること、又は類似していることを意味する。すなわち、両核酸が同一の配列に対してハイブリダイズ可能であることを意味する。「類似」とは、例えば、二つの塩基配列が少なくとも５０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の同一性であり得る。
【００４８】
本発明の方法は、ＲｅｃＡタンパク質を介して一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡに相同な二本鎖ＤＮＡを結合させて、三本鎖構造ＤＮＡが形成されることを利用して、ＤＮＡライブラリーから所定のＤＮＡを除去する方法である。
【００４９】
本明細書において、「ＲｅｃＡタンパク質」とは、二本鎖核酸の一方のストランド中の任意の領域に、該領域と相同な一本鎖核酸を結合させることにより、前記領域に三本鎖構造を形成させ得るタンパク質を意味する。
【００５０】
また、ＲｅｃＡタンパク質には、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質のみならず、ＲｅｃＡ類似タンパク質も含まれる。上述のように、本発明の方法では、ＲｅｃＡタンパク質が相同なＤＮＡの対合を促進し、三本鎖構造ＤＮＡの形成を触媒する機能を有する限り、本発明の方法において、前記ＲｅｃＡ類似タンパク質も使用することができる。
【００５１】
本発明で使用するのに好ましいＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質である。
【００５２】
本明細書において、「ＤＮＡライブラリー」なる語は、多種類のＤＮＡ断片の集合体を意味し、主に遺伝子ライブラリーとｃＤＮＡライブラリーを総称する用語として使用する。「遺伝子ライブラリー」とは、ファージ又はコスミドに含まれる単一の生物種の全ゲノムＤＮＡ断片の集合体であり、「ゲノムＤＮＡライブラリー」と同義である。「ｃＤＮＡライブラリー」とは、ベクターに挿入された、特定の組織や細胞由来のｍＲＮＡから作成される相補的ＤＮＡ（以下ｃＤＮＡと称する）から作成される多種類のｃＤＮＡ分子種の集合体をいう。前記ＤＮＡ断片は必ずしもファージ、コスミド、またはプラスミド中に含まれて環状化されている必要はなく、たとえばインサート部分のＤＮＡ断片のみからなっていてもよい。ＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ断片の種類は何種類でもよく、２種類であってもよい。
【００５３】
また、本明細書において、二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡは、それぞれｄｓＤＮＡまたはｄｓＲＮＡおよびｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡと略記し、一本鎖核酸は、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡを表し、ｓｓ核酸と略記する。
【００５４】
以下、本発明の方法の詳細について述べる。
【００５５】
本発明の第一の態様において、ＲｅｃＡタンパク質を使用して、ＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
【００５６】
まず、本発明の方法の工程（１）では、ＤＮＡライブラリーから除去すべき第二のｄｓＤＮＡのいずれか一方の鎖（これを第一の鎖とする）の３’末端部分と相同な配列を含み、且つその３’末端の塩基配列が第二のｄｓＤＮＡの３’末端の塩基配列とは異なった第三のｓｓ核酸を作製する。
【００５７】
３’末端部分とは、核酸配列の３’末端近くの領域を含む部分であり、具体的には、３’末端または３’末端の数塩基前から少なくとも１０〜４０番目の塩基まで、より好ましくは６０番目の塩基まで、さらに好ましくは８０番目の塩基まで、さらに好ましくは１００番目の塩基まで、またはそれ以上の塩基までを含む領域を意味する。
【００５８】
ここで、上記第三のｓｓ核酸は、除去すべき第二のｄｓＤＮＡのいずれか一方の鎖（第一の鎖）の３’末端部分と相同な配列を含んでいればよく、したがって第二のｄｓＤＮＡの３’末端部分と相同な配列以外の配列を含んでいてもよい。好ましくは、相同ではない配列は、第三のｓｓ核酸の３’末端部分に含まれる。また、上記第二のｄｓＤＮＡのいずれか一方を第一の鎖とすると、他方の鎖が第二の鎖となる。
【００５９】
一方、上記第三のｓｓ核酸は、第二のｄｓＤＮＡの３’末端と同一の３’末端を有していてはならない。すなわち、第二のｄｓＤＮＡの３’末端に一以上の塩基が欠失または付加された末端配列を有する必要がある。これにより、以下のライゲーション工程で環状化されることがなくなる。
【００６０】
第二のｄｓＤＮＡの第一の鎖に相同な配列を含む第三のｓｓ核酸の作製は、いずれの方法によって行ってもよいが、たとえばインビトロ転写系を使用することができる。たとえば、ｓｓＤＮＡを調製する場合、ＤＮＡライブラリー（所望のインサート）をインビトロ転写可能なベクター（たとえばｐＳＰＯＲＴ１、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫＩＩなど）に載せ換えて、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行う。次に、適切なプライマー（Ｒｏｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｎ６（宝社）など）、および逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）など）を使用してｃＤＮＡを合成する。
【００６１】
最後にフェノール・クロロホルムによってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製することにより、ｓｓＤＮＡを得ることができる。また、ｓｓＲＮＡを作製するのであれば、上記ＲＮＡ合成工程までを行えばよい。上記のようなｃＤＮＡおよびＲＮＡの調製方法は、当業者に周知であろう。
【００６２】
その他、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡにする操作としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、ｐｕｃ１９９等のファージミドベクターをファージ粒子として使用し、ｓｓＤＮＡを回収する操作もあるが、これらに限定されない。
【００６３】
また、以下の実施例に示したように、化学合成によりＤＮＡおよびＲＮＡを作製する方法も当業者に周知であり、これらを利用することもできる。
【００６４】
なお、上記第一および第二のｄｓＤＮＡは、プラスミドやウイルスベクターに担持されており、環状ＤＮＡライブラリーであることが通常であろう。このようにＤＮＡライブラリーが環状である場合、以下の工程ではｄｓＤＮＡは線状化されていることが必要なため、環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする操作を施す必要がある。環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする方法としては、たとえば、適切な制限酵素で環状ＤＮＡを切断すればよい。たとえば、インサートＤＮＡがマルチクローニングサイト等に挿入されているのであれば、該インサートの挿入に使用した部位を制限酵素で切断すればよい。また、インサート部分を切り出して第一または第二のｄｓＤＮＡとして使用してもよい。制限酵素により、環状ＤＮＡライブラリーの一以上の箇所を切断してもよいが、環状ＤＮＡの一カ所のみを切断するものを選択することが好ましい。前記制限酵素による切断は、当業者であれば容易に適切な部位で切断することができるであろう。
【００６５】
次に、ＲｅｃＡタンパク質と第二のｓｓＤＮＡを、線状ＤＮＡライブラリーを含む溶液に添加する。
【００６６】
上記のようにして得られた第二のｄｓＤＮＡに対応する第三ｓｓＤＮＡは、その５’末端部分に第二のｄｓＤＮＡの３’末端と相同な塩基配列を含んでいる。したがって、第二のｓｓＤＮＡとＲｅｃＡタンパク質を加えると、三本鎖構造ＤＮＡの形成反応が進行される（図１を参照）。
【００６７】
ＲｅｃＡタンパク質は、ＡＴＰの存在下において、相同的な組換えを触媒するタンパク質なので、試料中にＡＴＰが存在すると相同的組換えが進行する。したがって、第二のｄｓＤＮＡの第一の鎖の３’末端部分と第三のｓｓ核酸が相同組換えされて、第二のｄｓＤＮＡの３’末端部分に、第二のｄｓＤＮＡの第一の鎖、第三のｓｓ核酸および第二のｄｓＤＮＡの第二の鎖からなる三本鎖部分が形成される（図１を参照）。
【００６８】
上記相同的組換え反応は、適切な反応条件、バッファーにおいて行なわれる。たとえば３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｎｇ程度の第三のｓｓ核酸および１μｇのＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む２０μｌの溶液を、１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、２５ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトール、第一および第二のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーの１０μｌの溶液を混合し、３７℃において１５分間保温すればよい。
【００６９】
次に、工程（２）では、工程（１）で得られた相同的組換え体を含むＤＮＡライブラリー溶液にエキソヌクレアーゼＩを添加して、上記三本鎖部分における第二のＤＮＡの第一の鎖部分（第三のｓｓＤＮＡと交換された部分）を消化させる。エキソヌクレアーゼＩは、一本鎖ＤＮＡを３’→５’方向に分解する酵素であり、適切な条件下で該酵素を添加することにより消化させることが可能である。また、同様の活性を有するその他の酵素を使用して、消化することもできる。
【００７０】
上記エキソヌクレアーゼＩによる消化反応は、たとえば、上記混合液に２０ＭｍＡＴＰ、２０ｕｎｉｔ  エキソヌクレアーゼＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、９ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトールを１０μｌの反応開始液として添加し、３７℃において１時間反応させることによって行うことができる。
【００７１】
生じた反応混合液は、以下の工程を行う前にタンパク質を除去しておくことが好ましい。タンパク質の除去は、通常の方法を使用して行えばよく、たとえばフェノール／クロロホルム処理することによって行うことができる。
【００７２】
次に、工程（３）では、工程（２）で得られたｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーをライゲーションして環状化させる。
【００７３】
工程（１）において、環状ＤＮＡライブラリーを切断してＤＮＡライブラリーとして使用した場合は、自己ライゲーション反応が生じさせる。このとき、工程（２）で相同的組換えが生じたＤＮＡは、３’末端の塩基配列が異なっているため、ライゲーション反応が阻害される。一方、相同組換えされていないｄｓＤＮＡ（第一のｄｓＤＮＡ）は、ライゲーションされて環状ＤＮＡが形成される（図２）。
【００７４】
本明細書において、「自己ライゲーション」とは、一本の線状ＤＮＡの５’末端と３’末端がライゲーションされて、環状ＤＮＡとなることを意味する。
【００７５】
また、インサートＤＮＡなどの線状ＤＮＡライブラリーを使用した場合は、適切な制限酵素で消化したベクターを添加してインサートをベクター内に挿入し、環状化させる。この場合も、相同的組換えが生じたＤＮＡでは、３’末端の塩基配列が異なっているため、ライゲーション反応が阻害される。一方、相同組換えされていないｄｓＤＮＡ（第一のｄｓＤＮＡ）は、ライゲーションされて環状ＤＮＡが形成される。
【００７６】
上記のようなライゲーション反応は、通常の方法を使用して行えばよい。たとえば、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってライゲーション反応（３７℃において３０分間）を行って環状ＤＮＡを構築することができる。また、その他の商業的に入手可能なライゲーションキット等を使用してもよい。
【００７７】
本発明において、上記工程（１）から工程（４）からなるサイクルを、さらに２回以上繰り返えしてもよい。
【００７８】
工程（４）では、上記工程で得られたＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する。
【００７９】
除去すべき線状ＤＮＡと含有率を増加させるべき環状ＤＮＡとを分離するには、たとえば、アガロース電気泳動で分離する方法、臭化エチジウム存在下で遠心する方法、などを使用することができる。その他、使用したＤＮＡライブラリー内に薬剤耐性遺伝子が含まれている場合は、前記ＤＮＡを宿主に形質転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択する方法を使用してもよいが、これらに限定されない。
【００８０】
また、本発明の方法において、上記ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を形成させる工程に続いて、上記三本鎖核酸に結合したＲｅｃＡタンパク質を解離させる工程を実施してもよい。
【００８１】
本発明の方法の説明において、図２および上記の説明では、便宜上、２種類のｄｓＤＮＡの中から１種類のｄｓＤＮＡを除去する操作を記載したが、実際の操作では、数千〜数万種類のｄｓＤＮＡの中から数十〜数万種類のｄｓＤＮＡを同時に、または順次に除去することもできる。
【００８２】
本発明の第二の態様において、ＲｅｃＡタンパク質を使用して、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、第一のｄｓＤＮＡを濃縮することによって、第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
【００８３】
本方法の工程（１）では、第三のｓｓ核酸と第四のｓｓ核酸とを作製する。第三のｓｓ核酸は、ＤＮＡライブラリーにおいて濃縮すべき第一のｄｓＤＮＡの第一の鎖の３’末端部分に相同な配列を含み、且つ該ｓｓ核酸の３’末端部分に制限酵素切断部位を形成し得る配列を含むように作製する。
【００８４】
ここで、上記第三のｓｓ核酸は、濃縮すべき第一のｄｓＤＮＡのいずれか一方の鎖（第一の鎖）の３’末端部分と相同な配列を含んでいればよく、したがって第一のｄｓＤＮＡの３’末端部分と相同な配列、または制限酵素切断部位を形成しうる配列以外の配列を含んでいてもよい。また、上記第一のｄｓＤＮＡのいずれか一方の鎖を第一の鎖とすると、他方の鎖が第二の鎖となる。
【００８５】
第四のｓｓ核酸は、第三のｓｓ核酸の３’末端部分（すなわち制限酵素切断部位を形成し得る配列を含む）とハイブリダイズ可能で且つそのハイブリダイズ部分に制限酵素切断部位を形成できる配列を含むように作製する。また、該第四のｓｓ核酸の３’末端は、第二のｄｓＤＮＡの５’末端に隣接する配列を有し、且つ第四のｓｓ核酸には標識をしておく。
【００８６】
第三のｓｓ核酸は、具体的には、以下のように設計すればよい。まず、第三のｓｓ核酸の３’末端部分は、第四のｓｓ核酸とハイブリッドを形成したときに制限酵素切断部位を形成するように、適切な制限酵素切断部位を形成し得る配列が含まれるように設計する。これにより、以下の工程でライブラリーから回収した後に切断し、容易に標識を除去することが可能となる。
【００８７】
制限酵素切断部位を形成し得る配列は、いずれの酵素によって切断される配列であってもよいが、以下の工程においてライゲーション可能な末端配列であることが好ましい。制限酵素切断配列としては、たとえばＤＮＡライブラリーに含まれるマルチクローニングサイトの配列であることが好ましい。具体的には、以下の実施例５に示したように、５’−第二のｄｓＤＮＡに相同な配列−制限酵素切断配列−３’を含むように設計することができる。
【００８８】
このような第三のｓｓＤＮＡの作製は、本発明の第一の態様に記載したように、いずれの方法によって行ってもよいが、たとえばインビトロ転写系を使用することができる。逆転写を行う際のプライマーとして、所望の制限酵素配列が含まれるように設計したプライマーを使用することにより、第三のｓｓ核酸を容易に作成することもできるであろう。たとえば、環状ＤＮＡライブラリーのマルチクローニングサイトを切断して一本鎖としたＤＮＡを第一のｄｓＤＮＡとする場合、該マルチクローニングサイトに相補的な配列を制限酵素切断配列としてプライマーを作製し、逆転写反応を行えばよい。また、化学合成によりＤＮＡおよびＲＮＡを作製する方法も当業者に周知であり、これらを利用することもできる。
【００８９】
第四のｓｓ核酸は、上記第三の核酸の３’末端部分とハイブリダイズ可能で且つそのハイブリダイズ部分に制限酵素切断部位を形成できる配列を含むように設計する。第三の３’末端部分とハイブリダイズ可能な配列は、第三のｓｓ核酸の３’末端部分に相補的な配列であることが好ましい。また、第四のｓｓ核酸の３’末端は、以下の工程で相同的組換えを行ったときに、第一のｄｓＤＮＡの第二の鎖の５’末端に隣接するように設計される。
【００９０】
さらに、第四のｓｓ核酸には、以下の工程で回収することが可能な標識をしておく。標識は、以下の工程で回収可能な標識であればいずれの標識であってもよいが、たとえばビオチン標識である。また、標識は、第五の核酸の形成が可能な部位であればいずれの部位になされてもよいが、好ましくは、５’末端に標識されていることが好ましい。
【００９１】
具体的には、以下の実施例５に示したように、５’−（標識）−第三のｄｓＤＮＡに３’末端部分とハイブリダイズ可能な配列（すなわち、制限酵素切断配列を含む）−３’（この３’末端は、第二のｄｓＤＮＡの５’末端に隣接する）を有するように設計することができる。
【００９２】
上記のような標識核酸は、化学合成によって作製することができる。たとえばビオチン標識オリゴヌクレオチドであれば、ビオチン標識ヌクレオチドを使用して化学合成することによって作製する方法が当業者に周知である。このような標識オリゴヌクレオチドは商業的に入手可能であり、これらを利用することもできる。
【００９３】
次に、第三のｓｓ核酸と第四のｓｓ核酸を、あらかじめ溶液中で混合し、熱変性して冷却しておく。これにより、それぞれ第三のｓｓ核酸のの制限酵素切断部位を形成し得る配列部分および第四のｓｓ核酸の制限酵素切断部位を形成し得る配列部分を介してハイブリッドが形成され、第五の核酸を形成するとともに、該第五の核酸の二本鎖部分に制限酵素切断部位を形成する。詳細には、該ハイブリッド形成は、第三のｓｓ核酸と第四のｓｓ核酸の混合液を９４℃に加熱し、その後冷却することによって行うことができる。
【００９４】
次に、工程（２）では、ＤＮＡライブラリーを含む溶液に、ＲｅｃＡタンパク質と、工程（１）で得られた第五の核酸（第三のｓｓ核酸と第四のｓｓ核酸のハイブリッド）を添加する（図３）。その結果、第一のｄｓＤＮＡの一部と、第五の核酸中の第三のｓｓ核酸との間に相同的組換えが生じる。相同的組換えは、上記第一の態様の方法と同様に、適切な反応条件、バッファーにおいて行なわれる。たとえば、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、第五の核酸（第三のｓｓ核酸と第四のｓｓ核酸のハイブリッド）１００ｎｇと１μｇのＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む２０μｌの溶液を、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、２５ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトール、第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリー５０ｎｇを含む１０μｌの溶液を混合し、３７℃において１５分間保温すればよい。
【００９５】
上記相同組換えが生じた結果、第一のＤＮＡの第一の鎖、第三の核酸部分、第一のｄｓＤＮＡの第二の鎖からなる三本鎖部分が形成される。このとき、第五の核酸中の第四の核酸部分の３’末端は、第一のｄｓＤＮＡの第二の鎖の５’末端に隣接することとなる。
【００９６】
次に、工程（３）では、工程（２）で得られたＤＮＡライブラリーにエキソヌクレアーゼＩを添加する。その結果、形成された三本鎖部分における第一のＤＮＡの第一の鎖部分が消化される（図３）。このエキソヌクレアーゼＩによる消化も、上記第一の態様の方法と同様に行えばよい（第一の態様の方法の工程（２）を参照）。
【００９７】
エキソヌクレアーゼＩによる消化した後、上記したようにタンパク質を除去しておくことが好ましい。
【００９８】
次に、工程（４）では、ＤＮＡライブラリーから、標識を媒介して第四のｓｓ核酸をＤＮＡ含む複合体を回収する（図３）。この複合体には、第一の核酸の第一の鎖（一部が消化されている）と、第一の核酸の第二の鎖と、第三の核酸および第四の核酸（第五の核酸）とが含まれている。
【００９９】
該複合体の回収は、第四のｓｓ核酸の標識を介して行われる。たとえば、第四のｓｓ核酸の標識がビオチン標識の場合、ストレプトアビジンビーズを使用してＤＮＡ複合体を結合させて、回収することができる。具体的には、複合体を含む溶液にストレプトアビジンビーズを添加して結合させればよい。また、複合体の回収は、標識に応じて、種々の方法で回収することができる。たとえば、標識に対する抗体が固定化されたビーズなどを使用してもよい。
【０１００】
また、上記回収の後、複合体を結合した担体等を洗浄して、固定化されていない核酸（ＤＮＡライブラリーのうち、第一の核酸以外の核酸）を除去しておくことが好ましい。
【０１０１】
次に、工程（５）では、工程（４）で回収した複合体に適切な制限酵素を作用させて、第五の核酸の制限酵素切断部位で切断を行う。制限酵素は、第五の核酸（第三のｓｓ核酸／第四のｓｓ核酸のハイブリッド）の制限酵素切断部位を切断可能な酵素が使用される。すなわち、第三のｓｓ核酸の設計において組み込んだ制限酵素切断部位を形成し得る配列を切断する酵素を使用すればよい。
【０１０２】
本工程によれば、上記工程で回収した標識は、ストレプトアビジンビーズ等の複合体回収用の担体に結合されたままである。一方、所望の制限酵素配列で切断されたＤＮＡ複合体だけが回収用の担体から切断される。したがって、所望の核酸部分のみを容易に回収することができ、標識部分の分離／精製を必要としない。
【０１０３】
また、制限酵素で切断後、上記したようにタンパク質を除去しておくことが好ましい。
【０１０４】
次に、工程（６）では、工程（５）で切断したＤＮＡにライゲーション処理を施し、前記第一のｄｓＤＮＡを環状化する。
【０１０５】
さらに、次の工程では、線状ＤＮＡを除去することにより、第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する。
【０１０６】
ＤＮＡの環状化および線状ＤＮＡの除去は、上記本発明の第一の態様において記載したように行えばよい。たとえば、インサートＤＮＡなどの線状ＤＮＡライブラリーを使用した場合は、通常のクローニングと同様に所望のベクター内に挿入すればよい。具体的には、上記工程（５）で使用した制限酵素と同じ配列で切断したベクター内に、得られたインサートＤＮＡを挿入して環状化させればよい。
【０１０７】
また、本発明の第三の態様において、上記方法を使用して、所望のＤＮＡ含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築するためのキットが提供される。
【０１０８】
上記第一の態様の方法により、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、該第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することにより、該第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築するためのキットには、ＲｅｃＡタンパク質と、適切なバッファーと、エキソヌクレアーゼＩとが含まれる。
【０１０９】
また、上記第二の態様の方法により、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、該第一のｄｓＤＮＡを濃縮することにより、該第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築するためのキットとには、ＲｅｃＡタンパク質と、適切なバッファーと、エキソヌクレアーゼＩとが含まれる。
【０１１０】
具体的には、上記本発明の方法によるＤＮＡライブラリーの構築を行うためのキットには、ＲｅｃＡタンパク質と、適切なバッファーと、エキソヌクレアーゼＩとが別々に含まれるキットであってもよい。たとえば、たとえば上記方法によるＤＮＡライブラリーの構築を行うための一回の量として、１μｇＲｅｃＡタンパク質、２０ｕｎｉｔエキソヌクレアーゼＩが該キットに含まれ、適切なバッファーとして、ＲｅｃＡタンパク質が作用可能なバッファー、およびエキソヌクレアーゼＩが作用可能なバッファーを含むことができる。適切なバッファーは、たとえば、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールの溶液と、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、９ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトールの溶液であってもよく、上記方法を行う際に、両溶液にＲｅｃＡタンパク質、エキソヌクレアーゼＩをそれぞれ溶解、混合して使用されてもよい。好ましくは、ＲｅｃＡタンパク質およびエキソヌクレアーゼＩは、適切なバッファーに溶解された状態で提供される。たとえば、ＲｅｃＡタンパク質は、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、ＲｅｃＡタンパク質１μｇを含む分部交換反応用液Ｉとして、エキソヌクレアーゼＩは、２０ＭｍＡＴＰ、２０ｕｎｉｔ  エキソヌクレアーゼ  Ｉを含む３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、９ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトールを１０μｌ反応開始液として、適切なバッファーに混合された状態で提供されることが好ましい。さらに、該キットは、上記内容物以外のものを含んでいてもよく、たとえばＤＮＡライブラリーの構築に必要なＤＮＡ（たとえばプラスミドＤＮＡ）、適切な制限酵素などを含んでいてもよい。
【０１１１】
さらに、上記第二の態様の方法により、ＤＮＡライブラリーを構築するためのキットには、上記内容物の他に、（上記第二の態様の方法における第四のｓｓＤＮＡとして）標識ヌクレオチドと、該標識を回収可能な担体とを含むことが好ましい。特に、標識ヌクレオチドは、ビオチン標識されたヌクレオチドであり、該ビオチン標識を介して標識ヌクレオチドを回収可能な担体は、ストレプトアビジンビーズであることが好ましい。
【０１１２】
以下、実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。
【０１１３】
なお、図に示されている具体的な反応や構造などは、あくまでも理解を容易にする目的で記載されているにすぎないので、実際には、それらの細部が図面と一致しない場合があり得る。
【０１１４】
【実施例】
（実施例１）
インサートなしプラスミドの除去
分部交換反応用液Ｉは、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、ベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（＋）配列特異的オリゴＤＮＡ（５’−ＡＴＣＣＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣ−３’）１００ｎｇと１μｇＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む２０μｌの溶液である。分部交換反応用液ＩＩは、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、２５ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトール、インサートの有無があるプラスミドＤＮＡ混合物を一箇所のみ切断する制限酵素ＮｏｔＩにより消化した線状二本鎖ＤＮＡ５０ｎｇを含む１０μｌの溶液である。ＩおよびＩＩを混合した後、３７℃において１５分間保温してから、２０ＭｍＡＴＰ、２０ｕｎｉｔ  エキソヌクレアーゼ  Ｉ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、９ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトールを１０μｌ反応開始液として添加した。３７℃において１時間反応させた。除タンパク質操作後、ライゲーション反応を行い、これを大腸菌に導入してプラスミドを回収した。ベクターは、９９％以上除去されていることがわかる（図４）。
【０１１５】
（実施例２）
プラスミド除去とオリゴヌクレオチドの長さ。
【０１１６】
分部交換反応用液Ｉは、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、ベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（＋）配列特異的オリゴＤＮＡである、ｐＢＳＳＮ２５：５’−ＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣ−３’、ｐＢＳＳＮ３０：５’−ＣＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣ−３’、ｐＢＳＳＮ４０：５’−ＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣ−３’、ｐＢＳＳＮ６０：５’−ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣ−３’を各１００ｎｇと１μｇＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む２０μｌの溶液である。分部交換反応用液ＩＩは、１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、２５ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトール、インサートの有無があるプラスミドＤＮＡ混合物を一箇所のみ切断する制限酵素ＮｏｔＩにより消化した線状二本鎖ＤＮＡ５０ｎｇを含む１０μｌの溶液である。ＩおよびＩＩを混合した後、３７℃において１５分間保温してから、２０ＭｍＡＴＰ、２０ｕｎｉｔ  エキソヌクレアーゼ  Ｉ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、９ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトールを１０μｌ反応開始液として添加した。３７℃において１時間反応させた。除タンパク質操作後、ライゲーション反応を行い、これを大腸菌に導入してプラスミドを回収した。
【０１１７】
４０塩基以上でベクター除去効率が顕著によいことが判明した（図５）。
【０１１８】
（実施例３）
ＲＮＡを用いたベクター除去
ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（＋）をＮｏｔＩで消化後、Ｔ７プロモーターを用いて試験管内でＲＮＡ合成を行い、常法に従ってＲＮＡを精製した。
【０１１９】
分部交換反応用液Ｉは、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、試験管内で合成されたＲＮＡ１００ｎｇと１μｇＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む２０μｌの溶液である。分部交換反応用液ＩＩは、１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、２５ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトール、インサートの有無があるプラスミドＤＮＡ混合物を一箇所のみ切断する制限酵素ＮｏｔＩにより消化した線状二本鎖ＤＮＡ５０ｎｇを含む１０μｌの溶液である。ＩおよびＩＩを混合した後、３７℃において１５分間保温してから、２０ＭｍＡＴＰ、２０ｕｎｉｔ  エキソヌクレアーゼ  Ｉ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、９ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトールを１０μｌ反応開始液として添加した。３７℃において１時間反応させた。除タンパク質操作後、ライゲーション反応を行い、これを大腸菌に導入してプラスミドを回収した。
【０１２０】
ＲＮＡを用いても除去反応が可能であることが判明した（図６）。
【０１２１】
（実施例４）
ｃＤＮＡライブラリーから存在量の多いクローンの除去
ヒト脳由来プラスミドｃＤＮＡライブラリーの挿入遺伝子を片方の末端で切断する制限酵素ＭｕｌＩで消化した。このプラスミドを鋳型としてＴ３転写システム（Ａｍｂｉｏｎ）でＲＮＡ合成を行った。それぞれ得られたＲＮＡ５μｇにＲａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ  ６（宝）６．２５μｇを添加して熱変性した後、氷水で急冷する。ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡）４０ｕｎｉｔ、５×Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌを添加した。次いで、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５μｌを添加して２０μｌにした。これを３７℃で６０分間反応させてｃＤＮＡを合成する。次いで、フェノール・クロロホルムにより除タンパク質をした後、ｃＤＮＡを精製する。
【０１２２】
分部交換反応用液Ｉは、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｎｇの逆転写されたｃＤＮＡと１μｇＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む２０μｌの溶液である。分部交換反応用液ＩＩは、１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、２５ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトール、インサートの有無があるプラスミドＤＮＡ混合物を一箇所のみ切断する制限酵素ＮｏｔＩにより消化した線状二本鎖ＤＮＡ５０ｎｇを含む１０μｌの溶液である。ＩおよびＩＩを混合した後、３７℃において１５分間保温してから、２０ＭｍＡＴＰ、２０ｕｎｉｔ  エキソヌクレアーゼ  Ｉ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、９ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトールを１０μｌ反応開始液として添加した。３７℃において１時間反応させた。タンパク質分解操作をした後ＤＮＡを精製する。Ｔ４ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、３７℃で３０分間ライゲーション反応を行い、ＤＮＡを精製した。次いで、大腸菌を形質転換することによって存在量の多いクローンの除去を行った。
【０１２３】
除去前後のライブラリー０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、を鋳型として用いて、存在量の多い遺伝子３種類および少ない遺伝子３種類の変化をＰＣＲによって検討した。存在量の多い遺伝子は除去され、存在量の少ない遺伝子が相対的に濃縮されていることが明らかである（図７）。
【０１２４】
（実施例５）
希少遺伝子の濃縮
希少遺伝子を単離するモデル実験として、ヒト・アルファ２マクログロブリン遺伝子断片を含むプラスミドの濃縮実験を行った。
【０１２５】
目的とするクローンを用いて試験管内でＴ３プロモーターによりＲＮＡ合成を行った。そのＲＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチドＣ２３Ｒ６００：５’−ＧＡＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＡＣＡＣＣＡＧ−３’をプライマーとして逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｔ３プロモーター近傍からマルチクローニングサイトを含むビオチン化標識オリゴヌクレオチドｂｉｏ−Ｔ３ＢｓｔＸ：５’−ＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＡＧ−３’と逆転写されたｃＤＮＡを混合して熱変性後、会合させる。
【０１２６】
分部交換反応用液Ｉは、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、ビオチン化標識オリゴヌクレオチドを会合させたｃＤＮＡ１００ｎｇと１μｇＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む２０μｌの溶液である。分部交換反応用液ＩＩは、１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、２５ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトール、目的とする遺伝子を様々な割合で含むプラスミドＤＮＡを一箇所のみ切断する制限酵素ＮｏｔＩにより消化した線状二本鎖ＤＮＡ５０ｎｇを含む１０μｌの溶液である。ＩおよびＩＩを混合した後、３７℃において１５分間保温してから、２０ＭｍＡＴＰ、２０ｕｎｉｔ  エキソヌクレアーゼ  Ｉ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を含む３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．９）、９ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトールを１０μｌ反応開始液として添加した。３７℃において１時間反応させた。除タンパク質操作後、ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）によってプラスミドを分離した。制限酵素ＮｏｔＩ消化を行い、ストレプトアビジンビーズからプラスミドを回収し、上記同様にライゲーションを行った。次いで、これを大腸菌に導入した。
【０１２７】
上記処理を行わないで直接ライゲーションした後、これを大腸菌に導入した場合と比較して、１０００倍以上の濃縮があることがＰＣＲ（Ｃ２３Ｆ１９８：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＣＴ−３’、Ｍ１３Ｆ：５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）により判明した（図８）。
【０１２８】
【発明の効果】
本発明の第一の態様の方法により、所望のＤＮＡライブラリーから所望の核酸以外の核酸を除去することが可能となり、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築することができる。
【０１２９】
また、本発明の第二の態様の方法により、所望のＤＮＡライブラリーから所望の核酸を取得することが可能となり、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築することができる。
【０１３０】
さらに、本発明のキットを使用することにより、上記ＤＮＡライブラリーの構築および上記所望の核酸の取得が容易となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の部分的ＤＮＡ鎖交換の作用機構の概略図。
【図２】本発明の遺伝子除去方法の基本原理を示した図。
【図３】本発明の遺伝子濃縮方法の基本原理を示した図。
【図４】インサートなしプラスミドを除去した結果を示す電気泳動写真。
【図５】プラスミド除去とオリゴヌクレオチドの長さの関係を示す電気泳動写真。
【図６】ＲＮＡを使用してベクターを除去した結果を示す電気泳動写真。
【図７】ｃＤＮＡライブラリーから存在量の多いクローンを除去した結果を示す電気泳動写真。
【図８】希少遺伝子を濃縮した結果を示す電気泳動写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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