(57)【要約】【課題】波長等が異なる複数の光を励起光として用いる測定に共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を適用可能にする。【解決手段】複数のレーザ光源と、その複数のレーザ光源の中から所定のレーザ光源を選択するレーザ光源装置４と、レーザ光源装置４により選択されたレーザ光源からの光をスポット光として試料上に走査する走査ユニット１０２と、試料１０６からの光をアナログ電気信号に変換する光電変換器１１０と、そのアナログ電気信号をデジタル電気信号に変換するＡ／Ｄ変換部２ｂと、そのデジタル電気信号が記録されるメモリ２ｃ等を備えた共焦点レーザ走査型顕微鏡装置であり、そのデジタル電気信号が、メモリ２ｃにおいて、複数のレーザ光源の各々に対して予め定められている異なるアドレスの中の対応するアドレスに記録される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のレーザ光源と、
該複数のレーザ光源の中から所定のレーザ光源を選択するレーザ光源選択手段と、
該レーザ光源選択手段により選択された前記所定のレーザ光源からの光をスポット光として試料上に走査する走査手段と、
前記試料からの光をアナログ電気信号に変換する光電変換手段と、
前記アナログ電気信号をデジタル電気信号に変換するＡ／Ｄ変換手段と、
前記デジタル電気信号が記録される記録手段と、
を備え、
前記デジタル電気信号は、前記記録手段において、前記複数のレーザ光源の各々に対して予め定められている異なるアドレスの中の対応するアドレスに記録される、
ことを特徴とする共焦点レーザ走査型顕微鏡装置。
【請求項２】
前記レーザ光源選択手段によるレーザ光源の選択に同期して当該レーザ光源の強度を変更する、
ことを特徴とする請求項１記載の共焦点レーザ走査型顕微鏡装置。
【請求項３】
前記記録手段には、前記デジタル電気信号と当該デジタル電気信号の基となる光を出射したレーザ光源の強度が関連付けされて記録される、
ことを特徴とする請求項１記載の共焦点レーザ走査型顕微鏡装置。
【請求項４】
複数のレーザ光源の中から所定のレーザ光源を選択し、
該選択した所定のレーザ光源からの光をスポット光として前記試料上に走査し、
前記試料からの光をアナログ電気信号に変換し、
前記アナログ電気信号をデジタル電気信号に変換し、
前記デジタル電気信号を、メモリ上の、前記複数のレーザ光源の各々に対して予め定められている異なるアドレスの中の対応するアドレスに記録する、
ことを特徴とする共焦点レーザ走査型顕微鏡装置の試料情報記録方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置に関する技術分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、走査型顕微鏡装置として、光源からのレーザ光を対物レンズにより微小なスポット光に絞り、このスポット光により観察試料上を走査し、その観察試料からの光、例えば透過光、反射光、又は蛍光等を、フォトマルチプライヤ等の光電変換器により電気信号に変換し、画像モニター上に観察画像を表示するレーザ走査型顕微鏡装置が知られている。
【０００３】
一方、最近では、神経科学や細胞生物学分野における研究手法として、イオン感受性指示薬を用いて細胞内遊離イオン濃度を定量する方法が急速に広がっている。例えば、細胞内のカルシウムイオン濃度の測定では、サンプルである細胞にカルシウムイオン感受性指示薬である蛍光試薬  ｆｕｒａ−２  を用いた蛍光計測が行われる。この蛍光計測では、細胞の特定領域を異なる２つの波長（３４０ｎｍ、３８０ｎｍ）で励起し、刺激物質（  Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ）を投与後、それぞれの蛍光強度の比を求めることにより定量し、その強度変化の分光蛍光光度計による測定や顕微鏡による観察等といったことが行われる。
【０００４】
また、特許文献１には、前述の蛍光試薬  ｆｕｒａ−２  を用いたカルシウムイオン濃度の測定を行う蛍光顕微鏡装置が開示されている。この蛍光顕微鏡装置は、透過波長の異なる複数の干渉フィルタを任意に切り換えることにより、光源からの光のうち、その切り換えられたフィルタにより透過された波長の光のみをサンプルに照射させ、そのサンプルからの光を撮像し画像処理する等して試料像を取得するようにし、蛍光試薬  ｆｕｒａ−２  を用いた２波長励起１波長蛍光測定等のような、波長の異なる複数の光を励起光として用いる測定を行えるようにしたものである。
【０００５】
【特許文献１】
特開平２−２８５４２号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特許文献１には、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を用いてその測定を行う場合の構成については何も開示されておらず、単に光学的に二次元像を取得する通常の光学顕微鏡装置を用いた場合の構成が開示されているだけである。
【０００７】
また、従来において、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を用いて、前述の２波長励起１波長蛍光測定等のような波長の異なる複数の光を励起光として用いる測定を行う場合の構成は何も開示されていなかった。
本発明の課題は、上記実情に鑑み、波長等が異なる複数の光を励起光として用いる測定に適用可能な共焦点レーザ走査型顕微鏡装置及び試料情報記録方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の態様は、複数のレーザ光源と、該複数のレーザ光源の中から所定のレーザ光源を選択するレーザ光源選択手段と、該レーザ光源選択手段により選択された前記所定のレーザ光源からの光をスポット光として試料上に走査する走査手段と、前記試料からの光をアナログ電気信号に変換する光電変換手段と、前記アナログ電気信号をデジタル電気信号に変換するＡ／Ｄ変換手段と、前記デジタル電気信号が記録される記録手段と、を備え、前記デジタル電気信号は、前記記録手段において、前記複数のレーザ光源の各々に対して予め定められている異なるアドレスの中の対応するアドレスに記録される、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置である。
【０００９】
上記の構成によれば、選択対象となるレーザ光源が変更されることにより、試料に照射される光が切り換えられ、また記録手段において試料からの光に応じたデジタル電気信号が予めレーザ光源毎に定められているアドレスの中の対応するアドレスに記録されるようになる。これにより、複数のレーザ光源を用いて試料に照射する光を高速に切り換えながら試料からの光に応じたデジタル電気信号を正しく記録することができると共に、試料からの光に応じた画像情報を容易に構築することができる。よって、波長等が異なる複数の光を励起光として用いる測定に共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を適用することが可能になる。
【００１０】
本発明の第二の態様は、上記第一の態様において、前記レーザ光源選択手段によるレーザ光源の選択に同期して当該レーザ光源の強度を変更する、構成である。
この構成によれば、レーザ光源の選択に同期してレーザ光源の強度を適切な強度（例えば、より強い強度）に変更することによって、１つのレーザ光源からの光を連続的に試料に照射した場合に比べて１レーザ光源当たりの試料への光の照射光量が減少するのを防止することができる。
【００１１】
本発明の第三の態様は、上記第一の態様において、前記記録手段には、前記デジタル電気信号と当該デジタル電気信号の基となる光を出射したレーザ光源の強度が関連付けされて記録される、構成である。
この構成によれば、試料からの光に応じたデジタル電気信号とそれに関連付けされたレーザ光源の強度に基づいて、そのレーザ光源から出射された光の輝度変動を補正したデジタル電気信号を取得することができる。
【００１２】
本発明の第四の態様は、複数のレーザ光源の中から所定のレーザ光源を選択し、該選択した所定のレーザ光源からの光をスポット光として前記試料上に走査し、前記試料からの光をアナログ電気信号に変換し、前記アナログ電気信号をデジタル電気信号に変換し、前記デジタル電気信号を、メモリ上の、前記複数のレーザ光源の各々に対して予め定められている異なるアドレスの中の対応するアドレスに記録する、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置の試料情報記録方法である。
【００１３】
上記の方法によれば、上記第一の態様と同様の作用・効果を得る。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置の構成例を示した図である。
【００１５】
同図において、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置は、顕微鏡本体１、コンピュータ２、操作パネル３、レーザ光源装置４、及び画像モニター５等を含んで構成され、顕微鏡本体１、操作パネル３、レーザ光源装置４、及び画像モニター５は、それぞれコンピュータ２に接続されている。
【００１６】
レーザ光源装置４は、半導体レーザのようなレーザ強度を変更可能な複数のレーザ光源とＡＯＴＦ（音響光学素子）或いはＡＯＭ／ＥＯＭ等の光学素子及びシャッター等を含むレーザ光源切換装置４０１等を備えており、コンピュータ２の制御の基に、出射させるレーザ光の切り換えや、そのレーザ光を出射するレーザ光源の強度を変更する。尚、観察等に使用されるレーザ光は、観察者が操作パネル３を介して指示することによって設定される。また、前述のレーザ光の切り換えは、レーザ光源装置４が、観察者により設定されたレーザ光を出射するレーザ光源の中から所定のレーザ光源を選択することによって行われる。すなわち、レーザ光源装置４がレーザ光源の選択対象を変更することによってレーザ光の切り換えが行われる。
【００１７】
顕微鏡本体１は、励起用ダイクロイックミラー１０１、走査ユニット１０２、レボルバ１０３、対物レンズ１０４、ステージ１０５、ダイクロイックミラー１０７、レンズ１０８、コンフォーカルアパーチャ１０９、及び光電変換器１１０等を含んで構成されている。顕微鏡本体１において、レーザ光源装置４から出射されたレーザ光は、励起用ダイクロイックミラー１０１により反射され、走査ユニット１０２に入射される。走査ユニット１０２は、Ｘ軸方向走査用のガルバノメータミラーとＹ軸方向走査用のガルバノメータミラー等を有し、励起用ダイクロイックミラー１０１により反射されたレーザ光を、コンピュータ２から出力される走査制御信号に従ってＸＹ走査すると共に、Ｘ軸方向走査による１ラインの走査毎に走査制御終了信号をコンピュータ２へ出力する。走査ユニット１０２によりＸＹ走査されたレーザ光は、レボルバ１０３に取り付けられた対物レンズ１０４を介して、ステージ１０５上に載置された観察試料１０６上にスポット光として照射される。このスポット光による観察試料１０６からの光（反射光、透過光、又は蛍光等）は、入射光路に戻され、ダイクロイックミラー１０７により反射されて、レンズ１０８により集光される。レンズ１０８による集光位置には、コンフォーカルアパーチャ１０９が配置され、共焦点光学系を形成している。コンフォーカルアパーチャ１０９を通過した光は、フォトマルチプライヤ等の光電変換器１１０に入力され、アナログ電気信号に変換されて、コンピュータ２へ入力される。
【００１８】
コンピュータ２は、計算・処理部２ａ、Ａ／Ｄ変換部２ｂ、メモリ２ｃ、及び制御プログラム２ｄが記録されている記録媒体（不図示）等を備えている。
Ａ／Ｄ変換部２ｂは、光電変換器１１０から出力された、観察試料１０６に応じたアナログ電気信号をデジタル電気信号に変換する。
【００１９】
メモリ２ｃは、位置情報のメモリ領域と画像メモリ領域とを有し、位置情報のメモリ領域には、走査最終ライン位置等が記録され、画像メモリ領域には、Ａ／Ｄ変換部２ｂによりＡ／Ｄ変換されたデジタル電気信号、すなわち観察試料１０６に応じた画像情報が記録される。例えば、画像メモリ領域には、１０２４画素×７６８画素×１２ビット（４０９６階調）の画素に対応する画像情報が記録される。
【００２０】
計算・処理部２ａは、いわゆるＣＰＵ（中央演算処理部）であり、不図示の記録媒体に記録されている制御プログラム２ｄを読み込み実行することによって、この共焦点レーザ走査型顕微鏡装置全体の動作を制御する。例えば、操作パネル３を介して通知された観察者からの走査開始指示に応じて、走査制御信号を走査ユニット１０２へ出力し、光電変換器１１０から出力された観察試料１０６に応じたアナログ電気信号を、Ａ／Ｄ変換部２ｂによりデジタル電気信号（画像情報）に変換させてメモリ２ｃに転送し、そのメモリ２ｃに転送された画像情報を画像モニター５へ出力し、その画像情報に応じた画像（観察試料像）を画像モニター５に表示させる等の処理を行う。また、その他、操作パネル３を介して通知された観察者からの指示に応じて、走査メニュー等を画像モニター５に表示させる処理や、Ａ／Ｄ変換部２ｂのゲイン，オフセット等の設定処理や、光電変換器１１０の印加電圧，ゲイン，オフセット等の設定処理や、走査ユニット１０２の各種設定処理や、観察等に使用されるレーザ光の設定等といったレーザ光源装置４の設定処理等も行う。
【００２１】
操作パネル３は、キーボードの他、トラックボール、ジョイスティツク、若しくはマウス等のポインティングデバイス等を備え、観察者からの各種指示を受け付け、それをコンピュータ２へ通知する。例えば、観察者から、レーザ光の走査開始指示、画像入力指示、光電変換器１１０の感度調整指示、観察等に使用されるレーザ光の設定指示等を受け付け、それをコンピュータへ通知する。
【００２２】
続いて、上述のように構成された共焦点レーザ走査型顕微鏡装置の動作について説明する。
本動作では、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置が、複数の蛍光色素が染色された試料に対し、蛍光色素毎に適当な波長（励起波長）を有するレーザ光を出射するレーザ光源を備えて、蛍光色素を効率良く発光させることが行われる。
【００２３】
例えば、２種類の蛍光色素Ａ，Ｂが染色された試料に対しては、蛍光色素Ａに対して適当な励起波長Ａのレーザ光Ａを出射するレーザ光源Ａと蛍光色素Ｂに対して適当な励起波長Ｂのレーザ光Ｂを出射するレーザ光源Ｂによりレーザ光Ａ，Ｂが照射され、レーザ光Ａによる試料からの蛍光Ａ´とレーザ光Ｂによる試料からの蛍光Ｂ´とが発生する。この蛍光Ａ´，Ｂ´は、励起用ダイクロイックミラー１０１を透過しダイクロイックミラー１０７を反射する等して光電変換器１１０に入射して電気信号に変換される。
【００２４】
しかしながら、このようにレーザ光源Ａ，Ｂを同時に点灯（選択）して試料にレーザ光Ａ，Ｂを同時に照射すると次のような問題が生じる。
図２は、励起波長Ａ，Ｂと蛍光Ａ´，Ｂ´の蛍光波長Ａ´，Ｂ´と励起用ダイクロイックミラー１０１の波長特性を示した図である。
【００２５】
同図に示したように、レーザ光Ａ，Ｂを同時に照射した場合、励起用ダイクロイックミラー１０１の波長特性により、蛍光波長Ａ´の蛍光Ａ´と蛍光波長Ｂ´の蛍光Ｂ´の両方が励起用ダイクロイックミラー１０１を透過し、蛍光Ａ´，Ｂ´の両方が光電変換器１１０に入射してしまい、蛍光Ａ´の輝度信号（画像情報）と蛍光Ｂ´の輝度信号（画像情報）を独立して記録（取得）することができない問題が生じる。
【００２６】
そこで、本動作では、蛍光Ａ´の輝度信号を記録する間はレーザ光源Ｂを消灯し、蛍光Ｂ´の輝度信号を記録する間はレーザ光源Ａを消灯するようにレーザ光源の制御を行い、蛍光Ａ´，Ｂ´の輝度信号を独立して記録できるようにしている。すなわち、レーザ光源Ａが選択されているときはレーザ光源Ｂが選択されないように、またレーザ光源Ｂが選択されているときはレーザ光源Ａが選択されないように、レーザ光源の選択制御が行われる。
【００２７】
図３は、そのレーザ光源の制御に係るタイミングチャートである。
同図に示したように、１画素走査毎にレーザ光源ＡのＯＮ／ＯＦＦ（選択／未選択）とレーザ光源ＢのＯＦＦ／ＯＮ（未選択／選択）を行い、それによって発生した蛍光Ａ´，Ｂ´を光電変換し、Ａ／Ｄ変換クロックに従ってＡ／Ｄ変換して蛍光Ａ´，Ｂ´に応じた輝度信号を取得するように制御が行われる。尚、同図において、Ｄ１，Ｄ２は第１画素目における蛍光Ａ´，Ｂ´に応じた輝度信号であり、Ｄ３，Ｄ４は第２画素目における蛍光Ａ´，Ｂ´に応じた輝度信号である。
【００２８】
このように、１画素走査毎のレーザ光源ＡのＯＮ／ＯＦＦ及びレーザ光源ＢのＯＦＦ／ＯＮを、１画面走査（１フレーム走査）を終了するまで繰り返すことによって、蛍光Ａ´，Ｂ´に応じた画像情報がメモリ２ｃに記録される。
但し、画像情報である、Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４，‥といった連続する輝度信号は、予めレーザ光源の各々に対して定められているメモリ２ｃ上の異なるアドレスに記録される。例えば、Ｄ１，Ｄ３，‥といったレーザ光源Ａによる輝度信号は、予めレーザ光源Ａに対して定められている奇数番地のアドレスに記録され、Ｄ２，Ｄ４，‥といったレーザ光源Ｂによる輝度信号は、予めレーザ光源Ｂに対して定められている偶数番地のアドレスに記録される。或いは、Ｄ１，Ｄ３，‥といったレーザ光源Ａによる輝度信号は、予めレーザ光源Ａに対して定められているａａａａから始まる連続したアドレスに記録され、Ｄ２，Ｄ４，‥といったレーザ光源Ｂによる輝度信号は、予めレーザ光源Ｂに対して定められているｂｂｂｂから始まる連続したアドレスに記録される。これにより、それぞれのアドレスに記録された輝度信号に基づいて、それぞれの蛍光に応じた１画面分の画像情報を容易に構築することができる。
【００２９】
以上、本実施形態によれば、試料からの光に応じた輝度信号が、予めレーザ光源毎に定められているメモリ上の対応するアドレスに記録されるようになるので、複数のレーザ光を高速に切り換えながら試料からの光に応じた輝度信号を正しく記録することができ、また試料からのそれぞれの光に応じた１画面分の画像情報を容易に構築することができる。よって、異なる複数の光を励起光として用いる測定に共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を適用することが可能になる。
【００３０】
尚、本実施形態では、２種類の蛍光を観察する場合を例に説明したが、３種類以上の蛍光を観察する場合においても、各画素の各蛍光に応じた輝度信号を、予め観察等に使用するレーザ光を出射するレーザ光源毎に定められているメモリ上の対応するアドレスに記録させることで、各蛍光に応じた画像情報を正しく取得することができる。
【００３１】
また、本実施形態において、図３のタイミングチャートに示したように、２種類のレーザ光源を１画素走査内でＯＮ／ＯＦＦさせて２種類のレーザ光を１画素走査内で切り換えるようにすると、切り換えを行わない場合に比べて試料に照射されるレーザ光の光量が半分になる。そこで、Ａ／Ｄ変換クロックに同期して行われる毎回のＡ／Ｄ変換の際に、レーザ光源の強度を適切な強度に変更して試料に照射させるレーザ光の光量を最適化するようにしても良い。例えば、前述の２種類のレーザ光を切り換えて使用する場合には、レーザ光源の強度を、切り換えを行わないで１種類のレーザ光を使用する場合の２倍の強度に変更するようにすれば良い。このようにすることで、光量の減少を補正することができる。尚、Ａ／Ｄ変換クロックは、レーザ光源のＯＮ／ＯＦＦ（選択／未選択）と同期しているので、レーザ光源の強度変更は、レーザ光源のＯＮ／ＯＦＦに同期して行われるものでもある。また、このようなレーザ光源の強度変更は、３種類以上のレーザ光を切り換えて使用する場合にも同様にして行われることは述べるまでもない。
【００３２】
また、本実施形態において、レーザ光源装置４から出射されるレーザ光の輝度を取得するための光電変換部を新たに設け、試料からの光に応じた輝度信号をメモリ２ｃに記録する際に、その光電変換部の出力であるレーザ光に応じた輝度信号も関連付けて記録するようにしても良い。すなわち、試料からの光に応じた輝度信号と、その基となるレーザ光を出射したレーザ光源の強度を関連付けて記録するようにしても良い。このようにすることで、レーザ光源装置４から出射されたレーザ光の輝度変動によって得られた試料からの光に応じた輝度信号を補正することができ、またレーザ光源装置４から出射されるレーザ光の雑音を除去するよりも正確に試料からの情報を得ることができる。例えば、任意の画素の輝度信号Ｄａと関連付けされて記録されたレーザ光に応じた輝度信号からレーザ光の出力が１０％低下していたと判断された場合には、その任意の画素の輝度信号としてＤａを１．１倍した値を新たに記録するようにすることで、輝度信号を補正することができる。また、必要に応じてそれを画像モニター５に表示させるようにしても良い。
【００３３】
以上、本発明の共焦点レーザ走査型顕微鏡装置及び試料情報記録方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良及び変更を行っても良いのはもちろんである。
【００３４】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、複数のレーザ光を高速に切り換えながら試料からの光に応じた輝度情報を正しく記録することができると共に、試料からのそれぞれの光に応じた画像情報を容易に構築することができるので、異なる複数の光を励起光として用いる測定に共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を適用することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置の構成例を示した図である。
【図２】励起波長Ａ，Ｂと蛍光Ａ´，Ｂ´の蛍光波長Ａ´，Ｂ´と励起用ダイクロイックミラーの波長特性を示した図である。
【図３】レーザ光源の制御に係るタイミングチャートである。
【符号の説明】
１      顕微鏡本体
２      コンピュータ
２ａ    計算・処理部
２ｂ    Ａ／Ｄ変換部
２ｃ    メモリ
２ｄ    プログラム
３      操作パネル
４      レーザ光源装置
５      画像モニター
１０１  励起用ダイクロイックミラー
１０２  走査ユニット
１０３  レボルバ
１０４  対物レンズ
１０５  ステージ
１０６  観察試料
１０７  ダイクロイックミラー
１０８  レンズ
１０９  コンフォーカルアパーチャ
１１０  光電変換器
【図１】
2004271946.tif 000003
【図２】
2004271946.tif 000004
【図３】
2004271946.tif 000005