(57)【要約】      （修正有）【課題】ホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｉｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）において同定された脂肪族アシル還元酵素と相同的なタンパク質をコードするＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉフェロモン腺由来のｃＤＮＡを単離し、フェロモン腺におけるその酵素に対応するｍＲＮＡの特異的発現を確認し、さらに酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における機能的発現により脂肪族アシル還元酵素活性を確認すること。【解決手段】下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素。（１）Ｂｏｍｂｙｘ由来の特定なアミノ酸配列；（２）Ｂｏｍｂｙｘ由来の特定なアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は（３）Ｂｏｍｂｙｘ由来の特定なアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【請求項２】
下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【請求項３】
下記の何れかの塩基配列を有する脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
【請求項４】
ガ類に由来する遺伝子である、請求項２又は３に記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項２から４の何れかに記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項６】
請求項２から４の何れかに記載の遺伝子又は請求項５に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項１に記載の脂肪族アシル還元酵素を採取することを含む、請求項１に記載の脂肪族アシル還元酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載の脂肪族アシル還元酵素を脂肪酸由来の脂肪族アシルＣｏＡに作用させることによりアシル還元反応を行うことを含む、脂肪族アルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂肪族アシル還元酵素、それをコードする遺伝子、及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、ガ類などから取得することができるフェロモン腺特異的脂肪族アシル還元酵素、それをコードする遺伝子、及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多種のガは、その種固有のフェロモンの混合物を有する。フェロモン混合物は、交配活動におけるコミュニケーション媒体としての役割を果たし、フェロモン混合物の構造的／組成的変化は種特異性の一因となる（非特許文献１）。雌のガにより産生される性フェロモンの主要な一群は、アルデヒド、アルコール、または酢酸エステルなどの酸素含有官能基を有するＣ１０〜Ｃ１８不飽和非環式脂肪族化合物である。これらのフェロモン成分は、フェロモン腺で、アセチル−ＣｏＡから、脂肪酸合成、炭素鎖短縮および不飽和化（またはその逆）、並びにカルボニル炭素の還元的修飾を経てデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成される（非特許文献２及び３）。これらのフェロモン成分の生合成は通常、食道下神経節に由来するフェロモン生合成活性化神経ペプチド（ＰＢＡＮ）と呼ばれる特定の３３個のアミノ酸からなるペプチドホルモンにより誘起される（非特許文献４）。ＰＢＡＮは、ガの種によって、脂肪酸生合成経路における脂肪族アシル還元の一または複数の反応を調節することが示されている（非特許文献５及び６）。
【０００３】
この種の性フェロモンの生合成において、酸素含有官能基の生成に必要な鍵酵素は脂肪族アシル還元酵素である。脂肪族アシル還元酵素は脂肪族アシルフェロモン前駆体を対応するアルコールに変換する。ガの種によって、これらのアルコールはアセチルＣｏＡ：脂肪族アルコールトランスフェラーゼによりアセチル化されるか、またはアルコールオキシダーゼにより対応するアルデヒドへと酸化される場合が多い（非特許文献３）。鱗翅目の性フェロモンの多様な種特異的成分を生成する際に重要な役割を果たすにも関わらず、関与する脂肪族アシル還元酵素はこの大きな分類学上の群から未だ同定・特性決定されていない。
【０００４】
カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）において、８番目と９番目の腹節の間に位置するフェロモン腺は、羽化の日から明期の間に性フェロモンであるボンビコール（ｂｏｍｂｙｋｏｌ）、すなわち（Ｅ，Ｚ）−１０，１２−ヘキサデカジエン−１−オールの産生を始める（非特許文献７及び８）。ボンビコールは、アセチルＣｏＡからパルミチン酸（１６：  Ａｃｙｌ）を経由してｄｅ  ｎｏｖｏ合成され、このパルミチン酸は△１１−不飽和化、△１０，１２−不飽和化および脂肪族アシル基の還元により段階的にボンビコールに変換される（非特許文献２及び９）。ボンビコール産生はＰＢＡＮの制御下にあり、ＰＢＡＮはフェロモン腺に直接作用し、脂肪族アシル基の還元の段階を調節する（非特許文献１０）。ＰＢＡＮ制御下の鍵酵素の一つは脂肪族アシル還元酵素である（非特許文献１１）。
【０００５】
本発明者らは先に、パルミトイル−ＣｏＡを基質として用いて、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉフェロモン腺のホモジネート中に脂肪族アシル還元酵素活性を検出した（非特許文献１１）。さらなる生化学的研究により、この酵素が還元剤としてＮＡＤＨではなくＮＡＤＰＨを必要とすること、そしてその活性が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素の特異的阻害剤であるコンパクチン（ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）により阻害されることが明らかになった（非特許文献１１）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｔａｍａｋｉ，  Ｙ．  （１９８５）  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ｋｅｒｋｕｔ，  Ｇ．  Ａ．  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｌ．  Ｉ．  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ９：  ｐｐ．  １４５−１９１．
【非特許文献２】
Ｂｊｏｓｔａｄ，  Ｌ．  Ｂ．，  Ｗｏｌｆ，  Ｗ．  Ａ．  ＆  Ｒｏｅｌｏｆｓ，  Ｗ．  Ｌ．  （１９８７）  Ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｅｄｓ．  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，  Ｇ．  Ｄ．  ＆  Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ，  Ｇ．  Ｊ．  （Ａｃａｄｅｍｉｃ，  Ｏｒｌａｎｄｏ），  ｐｐ．７７−１２０．
【非特許文献３】
Ｔｉｌｌｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｓｅｙｂｏｌｄ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｊｕｒｅｎｋａ，  Ｒ．  Ａ．  ＆  Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ，  Ｇ．  Ｊ．  （１９９９）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２９，  ４８１−５１４．
【非特許文献４】
Ｒａｉｎａ，  Ａ．Ｋ．  （１９９３）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  ３８，  ３２９−３４９．
【非特許文献５】
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （１９９７）  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖｅｌ．  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  Ｃｈｅｍ．  １，  ３３−４９．
【非特許文献６】
Ｒａｆａｅｌｉ，  Ａ．  （２００２）  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｙｔｏｌ．  ２１３，  ４９−９１．
【非特許文献７】
Ａｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｈａｓｅ，  Ｒ．，  Ｆｕｎａｙｏｓｈｉ，  Ａ．，  Ａｒｉｍａ，  Ｒ．，  ＆  Ｕｃｈｉｙａｍａ，  Ｍ．  （１９８８）  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５２，  １４１−１４７．
【非特許文献８】
Ｆｏｎａｇｙ，  Ａ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．，  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｓ．  （２００１）  Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３０，  １１３−１２３．
【非特許文献９】
Ａｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｈａｓｅ，  Ｒ．，  Ａｒｉｍａ，  Ｒ．，  ＆  Ｕｃｈｉｙａｍａ，  Ｍ．  （１９８８）  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５２，  ４７３−４７８．
【非特許文献１０】
Ｏｚａｗａ，  Ｒ．，  Ａｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｎａｇａｓａｗａ，  Ｈ．，  Ｋａｔａｏｋａ，  Ｈ．，  ＆  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ａ．  （１９９３）  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５７，  ２１４４−２１４７．
【非特許文献１１】
Ｏｚａｗａ，  Ｒ．，  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （１９９６）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２６，  ２５９−２６５．
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｉｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）において同定された脂肪族アシル還元酵素と相同的なタンパク質をコードするＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉフェロモン腺由来のｃＤＮＡを単離し、フェロモン腺におけるその酵素に対応するｍＲＮＡの特異的発現を確認し、さらに酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における機能的発現により脂肪族アシル還元酵素活性を確認することを解決すべき課題とした。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）から新規な脂肪族アシル還元酵素（即ち、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉフェロモン腺脂肪族アシル還元酵素（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲ））をコードするＤＮＡを単離することに成功した。さらに本発明者らは、クローニングされた遺伝子が、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのフェロモン前駆体脂肪酸を優先的に最終アルコール産物であるボンビコールに変換するフェロモン腺特異的長鎖脂肪族アシル還元酵素をコードしていることを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００１０】
本発明の別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００１１】
本発明の別の側面によれば、下記の何れかの塩基配列を有する脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
【００１２】
好ましくは、本発明の遺伝子は、ガ類に由来する遺伝子である。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の本発明の遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の本発明の遺伝子又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、上記の本発明の形質転換体を培養し、培養物から脂肪族アシル還元酵素を採取することを含む、本発明の脂肪族アシル還元酵素の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の本発明の脂肪族アシル還元酵素を脂肪酸由来の脂肪族アシルＣｏＡに作用させることによりアシル還元反応を行うことを含む、脂肪族アルコールの製造方法が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の遺伝子
本発明者らは、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）より脂肪族アシル還元酵素遺伝子の単離を試み、５’ＲＡＣＥ法により、候補遺伝子（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲ）を取得した。取得した遺伝子のアミノ酸配列と塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示す。
【００１５】
即ち、本発明の遺伝子は、下記の何れかのアミノ酸配列を有する脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子である。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００１６】
本発明の遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
【００１７】
本発明において、「脂肪族アシル還元酵素」とは、脂肪族脂肪酸に由来する脂肪族アシルＣｏＡを還元して対応する脂肪族アルコールを生成する能力を有する酵素である。また、「脂肪族アシル還元酵素活性」とは、上記のような脂肪族アシルＣｏＡを還元して対応する脂肪族アルコールを生成する反応を触媒することができる酵素活性を意味する。
【００１８】
本発明の遺伝子及びその相同遺伝子は、例えば、ガ類などの昆虫、具体的には、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、タバコガ類（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ，  Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ，  Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）などから単離できる。
【００１９】
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２０】
本明細書で言う「配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、６０％以上であれば特に限定されないが、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００２１】
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２２】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２３】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２４】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１及び２に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてガ類などの昆虫（例えば、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）など）のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞から常法により作製することができる。
【００２５】
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。上記した昆虫由来の染色体ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２６】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２７】
また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、脂肪族アシル還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００２８】
例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２９】
（２）本発明の脂肪族アシル還元酵素
本発明の脂肪族アシル還元酵素は、下記の何れかのアミノ酸配列を有する。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、脂肪族アシル還元酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００３０】
本発明の脂肪族アシル還元酵素は、基質である脂肪族アシルＣｏＡに作用するとこれを還元して対応する脂肪族アルコールを生成することができる。上記方法による脂肪族アルコールの製造方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
本発明の脂肪族アシル還元酵素の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。
組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、本明細書の上記（１）に記載した当該脂肪族アシル還元酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の脂肪族アシル還元酵素を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
【００３２】
（３）本発明の組み換えベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌の  ｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
【００３４】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００３５】
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００３６】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００３７】
（４）本発明の形質転換体及びそれを用いた組み換え酵素タンパク質の製造
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００３８】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００３９】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓ１ａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００４０】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００４１】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ１；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６，  ４７（１９８８）等に記載）。
【００４２】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００４３】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の酵素タンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の酵素タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００４４】
（５）本発明の脂肪族アシル還元酵素の利用
本発明の脂肪族アシル還元酵素を脂肪酸由来の脂肪族アシルＣｏＡに作用させることによりアシル還元反応を行うことによって脂肪族アルコールを製造することができる。ここで用いる脂肪酸としては、炭素数１４〜１８の直鎖飽和あるいは不飽和脂肪酸を言う。具体的には、１０，１２−ヘキサデカジエン酸、１１−ヘキサデセン酸、９−ヘキサデセン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸（ステアリン酸）などが挙げられる。
【００４５】
本発明の脂肪族アシル還元酵素を利用して脂肪族アシル還元酵素反応を行うことにより、例えば、性状の異なる多様なワックスを製造することが可能になる。このようなワックスは、潤滑剤、食品、化粧品などの分野で産業上広く使用することができる。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４６】
【実施例】
実施例１：Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ脂肪族アシル還元酵素ｃＤＮＡクローンの単離
（方法）
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（Ｓｈｕｋｏ×Ｒｙｕｈａｋｕ）の卵は、片倉工業（日本、松本市）から購入した。既報の通り（Ｆｏｎａｇｙ，  Ａ．，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．，  Ｕｃｈｉｕｍｉ，  Ｋ．，  Ｏｒｉｋａｓａ，  Ｃ．  ＆  Ｍｉｔｓｕｉ，  Ｔ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｓｃｉ．  １７，  ４７−５４）、幼虫は人工餌で育てた。羽化の直後に切除したＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉフェロモン腺由来の全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡの第一鎖を合成した。ＰＣＲは、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）（受託番号ＡＪ００９６７５）由来のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに基づいたセンスオリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＧＴＣＴＣＧＡＡＡＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＡＣ−３’）（配列番号３）およびオリゴ−ｄＴプライマーを用い、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ）を使用して実施した。温度サイクル条件は、９５℃で３０秒、３０℃で３０秒および７２℃で１分を６サイクル、続いて、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で１分を２５サイクル、そして最後に７２℃で１０分とした。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離した後、１〜２ｋｂに相当するＤＮＡをゲルから回収し、再び同条件を用いて増幅した。次いでＰＣＲ産物を、ｐＧＥＴ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてクローニングし、得られたクローンを配列決定した。
【００４７】
上記の配列解析により、ホホバ脂肪族アシル還元酵素（ＪＪＦＡＲ）（  Ｍｅｔｚ，  Ｊ，  Ｇ．，  Ｐｏｌｌａｒｄ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｌ．，  Ｈａｙｅｓ，  Ｔ．  Ｒ．，  ＆  Ｌａｓｓｎｅｒ，  Ｍ．  Ｗ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２２，  ６３５−６４４）と相同なタンパク質をコードする１２９９ｂｐのクローンの存在が示された。クローンの５’末端を得るために、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、遺伝子特異的プライマー（５’−ＴＣＣＡＣＧＡＡＣＣＣＴＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣ−３’）（配列番号４）およびキットに添付のアンカープライマーを使用して製造業者の指示に従って５’ＲＡＣＥを行った。Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメッセンジャーＲＮＡをフェロモン腺より単離した。５’ＲＡＣＥに用いたタッチダウンＰＣＲの条件は、９４℃で３分間、次いで９４℃で５秒間および５０℃で３分間を３１サイクルとした。この遺伝子の全長ｃＤＮＡを、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ近交系ｐ５０（Ｙｏｓｈｉｇａ，  Ｔ．，  Ｏｋａｎｏ，  Ｋ．，  Ｍｉｔａ，  Ｋ．，  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｔ．，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （２０００）  Ｇｅｎｅ  ２４６，  ３３９−３４５）から調製したフェロモン腺ｃＤＮＡライブラリーから単離した。Ｌｉ−Ｃｏｒ  ＤＮＡシークエンサー（モデル４０００）およびＢａｓｅ  ＩｍａｇＩＲソフトウェアを用いてＤＮＡ配列決定を行った。
【００４８】
上記の結果、取得した遺伝子のＯＲＦ（塩基配列を配列番号２に記載する）が、予想分子量５２，３２２Ｄａである配列番号１に記載の４６０個のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしていることが示された（図１）。他の還元酵素と同様に、推定されるアミノ酸配列は、２３〜３３残基にわたる保存されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−結合モチーフ［Ｉ，Ｖ，Ｆ］−Ｘ−［Ｉ，Ｌ，Ｖ］−Ｔ−Ｇ−Ｘ−Ｔ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−［Ｇ，Ａ］を含んでいた（Ａａｒｔｓ，  Ｍ．  Ｇ．，  Ｈｏｄｇｅ，  Ｒ．，  Ｋａｌａｎｔｉｄｉｓ，  Ｋ．，  Ｆｌｏｒａｃｋ，  Ｄ．，  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｚ．  Ａ．，  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｂ．  Ｊ．，  Ｓｔｉｅｋｅｍａ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｓｃｏｔｔ，  Ｒ．，  ＆  Ｐｅｒｅｉｒａ，  Ａ．  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １２，  ６１５−６２３）。このタンパク質をＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉフェロモン腺脂肪族アシル還元酵素（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲ）と命名した。推定されるアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴ検索プログラムを用いて公用データバンクで検索した結果、ＪＪＦＡＲ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１４９９１７）と全長にわたって２６％の同一性を示し、有意ではあるが高くない相同性を示した（図２）。Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲの配列はまた、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の雄性不稔２（ＭＳ２）タンパク質（約２３％の同一性）、および多様な生物由来、例えばシビレエイ（Ｔｏｒｐｅｄｏ  ｍａｒｍｏｒａｔａ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ｇｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２７２０７３、ＡＦ０９８５０５およびＡＬ００９１９３）などに由来する機能が未知である他のＭＳ２様タンパク質とも有意な相同性を示した。
【００４９】
実施例２：ノーザンブロット解析
ノーザンブロットは既報の通り実施した（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．，  Ｙｏｓｈｉｇａ，  Ｔ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．，  Ｉｗａｎａｇａ，  Ｍ．，  Ｋｏｓｈｉｂａ，  Ｓ．，  Ｋｉｇａｗａ，  Ｔ．，  Ｈｉｒｏｔａ，  Ｈ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｓ．，  Ｏｋａｎｏ，  Ｋ．，  Ｍｉｔａ，  Ｋ．，  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｔ．，  ＆  Ｔａｔｓｕｋｉ，  Ｓ．  （２００１）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ３１，  ６０３−６０９）。簡単に説明すると、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉの種々の組織から調製した変性全ＲＮＡ（各１０μｇ）を、６．６Ｍホルムアルデヒド／１Ｘ  ＭＯＰＳバッファー中１．２％ゲル上で分離し、キャピラリーブロットによりナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写した。１２９９ｂｐのクローンを、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＤＮＡ標識ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰにより標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。
【００５０】
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲのノーザンブロット解析の結果、フェロモン腺内で２  ｋｂの転写産物の特異的発現が示されたが、試験した他の組織、例えば頭全体、脂肪体、マルピーギ管、飛翔筋、卵巣および精巣などでは検出可能なシグナルは観察されなかった（図３Ａ）。フェロモン腺において、転写産物の量は羽化の１日前に有意に上昇したが、発現量は羽化の後やや減少するようであった（図３Ｂ）。
【００５１】
実施例３：プラスミドの構築および酵母の形質転換
ガラクトース誘導性プロモーターＧＡＬ１の後に本発明の４６０アミノ酸のＯＲＦを含むｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＡＲと命名したプラスミドを、シャトルベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作成した。ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＡＲの構築のために、次の２つのプライマーを設計した。５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＧ−３’（配列番号５）（ＢａｍＨＩサイトを含む）および５’−ＡＡＴＧＴＣＧＡＣＴＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧ−３’（配列番号６）（ＳａｌＩサイトを含む）。ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡、日本）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で１５秒、５０℃で３０秒および６８℃で９０秒の２０サイクルとした。ＰＣＲに用いたｃＤＮＡの第一鎖は、ｐ５０系フェロモン腺全ＲＮＡより調製した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ（タカラ、日本）で二重消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースゲルから精製した。精製したＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで予め消化した線状のｐＥＳＣ−ＬＥＵＴＭベクターに連結し、次いで配列を決定した。次に、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＡＲおよびｐＥＳＣ−ＬＥＵの両プラスミドを用い、ｐＥＳＣ酵母エピトープ標識ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）についての製造業者の指示に従い、酢酸リチウムによりＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＹＰＨ４９９（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。個々のコロニーを１０ｍＬのＬ−ロイシン不含ＳＤドロップアウト培地（アミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素塩基、２％グルコース、０．１３％アミノ酸ドロップアウト粉末）に接種した。３０℃で一晩インキュベートした後、酵母培養物を１００ｍＬのＬ−ロイシン不含ＳＤドロップアウト培地中に１：２０に希釈し、ＯＤ６００が１．０になるまで３０℃で増殖させた。
【００５２】
実施例４：Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲの機能的発現
（方法）
遠心分離後の細胞ペレットを、１００ｍＬの作成直後のＬ−ロイシン不含ＳＧドロップアウト培地（アミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素塩基、２％ガラクトース、０．１３％アミノ酸ドロップアウト粉末）に懸濁し、３０℃で２２時間インキュベートした。脂肪族アシル還元酵素活性を調べるために、培地の一部を作成直後のＬ−ロイシン不含ＳＧドロップアウト培地中で５倍に希釈して２ｍｌとし、０．５ｍＭの種々の脂肪酸および０．２％タージトール（ＮＰ−４０型、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、３０℃で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、培地の一部１ｍＬを、ＳＰＤ１０１０  Ｓｐｅｅｄｖａｃ（登録商標）システム（ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ）を用いて乾燥させ、１ｍＬのｎ−ヘキサンにより抽出した。ヘキサン抽出物を３０μＬに濃縮し、各サンプルの１μＬについてＧＣ／ＭＳを行った。電子衝撃ＧＣ／ＭＳは、ＨＰ−５キャピラリーカラム（内径０．２５ｍｍ×３０ｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＪＥＯＬオートマスサンマススペクトロメーターを用いて行った。カラム温度プログラムは、４０℃で２分間、１０℃／分で１４０℃まで、最後は４℃／分で２２０℃までとした。イオン化電圧は７０ｅＶとし、イオン源の温度は２３０℃とした。不飽和生成物の二重結合の位置は、モノエン酸についてはジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）アダクト（Ｂｕｓｅｒ，  Ｈ．  Ｒ．，  Ａｒｎ，  Ｈ．，  Ｇｕｅｒｉｎ，  Ｐ．，  ＆  Ｒａｕｓｃｈｅｒ，  Ｓ．  （１９８３）  Ａｎｎ．  Ｃｈｅｍ．  ５５，  ８１８−８２２）、および共役ジエン酸については４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡＤ）アダクトのＭＳ解析により確認した（Ｙｏｕｎｇ，  Ｄ．  Ｃ．，  Ｖｏｕｒｏｓ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｈｏｌｉｃｋ，  Ｍ．  Ｆ．  Ｊ．  （１９９０）  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ５２２，  ２９５−３０２；及びＭｃＥｌｆｒｅｓｈ，  Ｊ．  Ｓ．，  ＆  Ｍｉｌｌａｒ，  Ｊ．  Ｇ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｅｃｏｌ．  ２５，  ６８７−７０９）。
【００５３】
基質として用いた遊離脂肪酸は、ミリスチン酸（１４：  Ａｃｉｄ）（和光、日本）、ペンタデカン酸（１５：  Ａｃｉｄ）（ナカライ、日本）、Ｄ３標識したパルミチン酸（ヘキサデカン−１６，１６，１６，−ｄ３酸、Ｄ３−１６：  Ａｃｉｄ）（Ｉｓｏｔｅｃ）、ヘプタデカン酸（１７：  Ａｃｉｄ）（Ｓｉｇｍａ）、ステアリン酸（１８：  Ａｃｉｄ）（関東化学、日本）、ノナデカン酸（１９：  Ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）、エイコサン酸（２０：  Ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）、（Ｅ）−９−パルミトレイン酸（Ｅ９−１６：１  Ａｃｉｄ）（フナコシ、日本）、および（Ｚ）−９−パルミトレイン酸（Ｚ９−１６：１  Ａｃｉｄ）（フナコシ、日本）である。（Ｅ）−１１−パルミトレイン酸（Ｅ１１−１６：１  Ａｃｉｄ）および（Ｚ）−１１−パルミトレイン酸（Ｚ１１−１６：１  Ａｃｉｄ）は、その対応するアルデヒドから調製したが、これらのアルデヒドは、ｎ−ペンチルトリフェニルホスホニウムブロミドおよび１１−（テトラヒドロ−２−ピラニルオキシ）−ウンデカナールとのＷｉｔｔｉｇ反応を利用して合成した。保護基を除去し、硝酸銀シリカゲルカラムで（Ｅ）−異性体と（Ｚ）−異性体とを分離した後、クロロクロム酸ピリジニウムおよびＪｏｎｅｓ試薬を用いて両方の異性体を酸化し、対応する各遊離脂肪酸とした（Ｂｏｗｅｒｓ，  Ａ．，  Ｈａｌｓａｌｌ，  Ｔ．  Ｇ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｅ．  Ｒ．  Ｈ．，  ＆  Ｌｅｍｉｎ  Ａ．  Ｊ．  （１９５３）  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９５３，  ２５４８−２５６０）。（Ｅ，Ｚ）−１０，１２−ヘキサデカジエン酸（Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄ）を既知のアルデヒドである（Ｅ）−１２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ−２−ドデセン−１−アール（Ｕｅｎｉｓｈｉ，  Ｊ．  Ｋａｗａｈａｍａ，  Ｒ．，  Ｉｚａｋｉ，  Ｙ．，  ＆  Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，  Ｏ．  （２０００）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５６，  ３４９３−３５００）から次のように合成した。アルデヒドを、ｎ−ブタニルトリフェニル−ホスホニウムブロミドおよびナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドから調製したＷｉｔｔｉｇ試薬（Ｂｅｓｔｍａｎｎ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｓｕ・，  Ｊ．  ＆  Ｖｏｓｔｒｏｗｓｋｙ，  Ｏ．  （１９８１）  Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．  Ｃｈｅｍ．，
１９８１，  ２１１７−２１３８）と反応させた。続いて脱保護により、６％の対応する１２Ｅ−異性体および約３％の対応する（１０Ｚ，１２Ｚ）−異性体（１Ｈ−ＮＭＲ解析）を含むボンビコール（Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２  ＯＨ）を得て、これをＪｏｎｅｓ酸化させ（Ｂｏｗｅｒｓ，  Ａ．，  Ｈａｌｓａｌｌ，  Ｔ．  Ｇ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｅ．  Ｒ．  Ｈ．，  ＆  Ｌｅｍｉｎ  Ａ．  Ｊ．  （１９５３）  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９５３，  ２５４８−２５６０）、１Ｈ−ＮＭＲ解析において＞８８％の幾何学的純度をもつＥ，Ｚ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄを得た。Ｅ，Ｚ−異性体をＯＤＳカラム上でＨＰＬＣにより均一になるまで精製した。少量のＥ，Ｅ−異性体も別途精製し、Ｅ，Ｚ−異性体とＥ，Ｅ−異性体の１：１混合物を得た。
【００５４】
（結果）
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲの還元酵素活性および基質特異性を調べるために、本発明の４６０アミノ酸のＯＲＦを含むプラスミドｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＡＲを構築し、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＹＰＨ４９９において誘導性ＧＡＬ１プロモーターの制御下でＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲタンパク質を発現させた。ガラクトースにより誘導して３０℃で２２時間インキュベートした後、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＡＲで形質転換した酵母細胞がヘキサデカノール（１６：ＯＨ）を産生するのに対し、空のベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵで形質転換した細胞はヘキサデカノール（１６：ＯＨ）を産生しないことを確認した（図４Ａおよび４Ｂ）。Ｄ３標識したパルミチン酸を含む培地でインキュベートしても、取り込みおよび対応するアルコールＤ３−ヘキサデカノール（Ｄ３−１６：ＯＨ）への還元が確認されたため（図４Ｃ）、様々な脂肪酸をインキュベーション培地に添加することにより、発現したＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲの基質特異性をさらに調べた（図５から７）。これらの実験では、添加した脂肪酸から誘導される脂肪アルコールの産生を内在性の１６：ＯＨと比較することによって基質特異性を評価した。この内在性の１６：ＯＨは、図４Ａおよび４Ｂに示す通り、導入されたＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲの作用により内因性基質から産生されたものである。飽和長鎖脂肪酸を用いた一連の実験において（図４Ｃおよび５）、１５：  Ａｃｉｄは対応するアルコール（１５：ＯＨ）に優先的に還元された。１７：  Ａｃｉｄおよび１８：  Ａｃｉｄの対応するアルコールである１７：ＯＨおよび１８：ＯＨへの還元が起こったが、この還元は１５：  Ａｃｉｄまたは１６：  Ａｃｉｄの還元ほどは効率的ではなかった。さらに、１４：  Ａｃｉｄから対応するアルコールへの還元はわずかに検出できたが（図５Ａ）、１９：  Ａｃｉｄおよび２０：  Ａｃｉｄは還元されなかった。これらの結果から、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲが実際に、異なる基質特異性で長鎖脂肪族アシル還元酵素活性を示すことが示された。
【００５５】
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉにおいては、性フェロモンであるボンビコールは、Ｚ１１−１６：１  Ａｃｙｌを経由して生合成され、さらに脱飽和されてＥ，Ｚ１０，１２−１６：２：  Ａｃｙｌとなり、最後に還元されてボンビコール（Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２：ＯＨ）となる（Ａｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｈａｓｅ，  Ｒ．，  Ａｒｉｍａ，  Ｒ．，  ＆  Ｕｃｈｉｙａｍａ，  Ｍ．  （１９８８）  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５２，  ４７３−４７８）。そこで、さらに不飽和Ｃ１６脂肪酸を用いて基質特異性を調べた。試験したモノ不飽和Ｃ１６脂肪酸の中で、Ｚ１１−１６：１  ＡｃｉｄおよびＥ１１−１６：１  Ａｃｉｄの両方が、対応するアルコールへと還元された（図６Ａおよび６Ｂ）。対照的に、Ｚ９−１６：１  ＡｃｉｄまたはＥ９−１６：１  Ａｃｉｄのいずれかを基質として利用した場合は、対応するアルコールへの還元が減少することが確認された（図６Ｃおよび６Ｄ）。ジ不飽和脂肪酸であるＥ，Ｚ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄ（すなわちボンビコール前駆体脂肪酸）の実験により、この基質が優先的に還元されて、最終アルコール産物であるボンビコールに変換されることが示された（図７Ａ）。Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２  ＡｃｉｄおよびＥ，Ｅ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄの１：１混合物をインキュベーション培地に添加すると、Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄが選択的に還元され、ボンビコールが主な産物であった（図７Ｂ）。同様に、Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：１  ＡｃｉｄおよびＺ１１−１６：１  Ａｃｉｄの１：１混合物をインキュベーション培地に添加すると、Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄが選択的に還元され、ボンビコールに変換された（図７Ｃ）。これらの結果は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲがボンビコール前駆体脂肪酸に対して強い基質選択性を有していることを示す。これらの発現解析を通して、検出可能な量の中間体アルデヒドは存在しなかった。また、雄のＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉの典型的な交配行動が、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲを発現する酵母細胞により引き起こされた（図８）。
【００５６】
（実施例１〜４の考察）
長鎖の第一アルコールは、遊離アルコールとして存在する場合と、より一般的には様々な生物におけるロウの場合のように結合状態で存在する場合の両方がある（Ｋｕｎｓｔ，  Ｌ．，  ＆  Ｓａｍｕｅｌｓ，  Ａ．  Ｌ．  （２００３）  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２，  ５１−８０）。これらのアルコールは、特に動物神経系組織に豊富なエーテル脂質の前駆体として機能することもできる。昆虫において、長鎖脂肪アルコールは、ロウとして表皮の外面を保護するために広く用いられているが（Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ，  Ｇ．  Ｊ．，  ＆  Ｄｉｌｌｗｉｔｈ，  Ｊ．  Ｗ．  （１９８５）  Ｃｏｍ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ，  ｅｄｓ．  Ｋｅｒｋｕｔ，  Ｇ．Ａ．  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｌ．Ｉ．  １３，  ｐｐ１１７−１５４）、多くのガの種においては種特異的フェロモン成分の前駆体としても重要な役割を果たしている（Ｔｉｌｌｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｓｅｙｂｏｌｄ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｊｕｒｅｎｋａ，  Ｒ．  Ａ．  ＆  Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ，  Ｇ．  Ｊ．  （１９９９）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２９，  ４８１−５１４）。
【００５７】
脂肪族アルコール合成の生化学は、長鎖脂肪アルコールが対応する脂肪族アシルＣｏＡの還元を通じて主に生合成されることを示している。アルデヒドを生成する脂肪族アシル還元酵素（ＦＡＲ）と異なり、アルコールを生成するＦＡＲは通常不可欠の膜タンパク質であり、脂肪族アシルＣｏＡの四電子還元を触媒し、中間体アルデヒドを放出せずに遊離の第一アルコールを生じる（Ｍｅｔｚ，  Ｊ，  Ｇ．，  Ｐｏｌｌａｒｄ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｌ．，  Ｈａｙｅｓ，  Ｔ．  Ｒ．，  ＆  Ｌａｓｓｎｅｒ，  Ｍ．  Ｗ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２２，  ６３５−６４４；及びＢｕｒｄｅｔｔ，  Ｋ．，  Ｌａｒｋｉｎｓ，  Ｌ．  Ｋ．，  Ｄａｓ，  Ａ．  Ｋ．，  ＆  Ｈａｊｒａ，  Ａ．  Ｋ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６，  １２２０１−１２２０６）。ガにおけるの性フェロモン産生の基礎となる分子機構を理解することを目的として、本発明者らは以前にＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉフェロモン腺のホモジネート中に長鎖ＦＡＲ活性を検出した。また、パルミトイル−ＣｏＡを基質として用い、中間体アルデヒドを放出することなく、対応するヘキサデカノールへの還元も確認されている（Ｏｚａｗａ，  Ｒ．，  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （１９９６）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２６，  ２５９−２６５）。さらにまた、ＣＨＡＰを界面活性剤として用いることにより、この酵素をフェロモン腺のミクロソーム分画から可溶化できることも確認されている（Ｆｏｎａｇｙ，  Ａ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．，  Ｏｚａｗａ，  Ｒ．，  Ｏｋａｎｏ，  Ｋ．，  Ｔａｔｓｕｋｉ，  Ｓ．，  Ｍａｅｄａ，  Ｓ．  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （１９９９）  Ｃｏｍｐ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂ．  １２４，  ５１−６０）。これらの知見は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉの性フェロモンの産生に関与するＦＡＲが、アルコールを生成するものであることを示唆している。これまでに文献発表されたアルコール生成ＦＡＲ遺伝子はＪＪＦＡＲのものだけであり、これは種子のロウ脂肪酸を対応する脂肪アルコールへと変換する（Ｍｅｔｚ，  Ｊ，  Ｇ．，  Ｐｏｌｌａｒｄ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｌ．，  Ｈａｙｅｓ，  Ｔ．  Ｒ．，  ＆  Ｌａｓｓｎｅｒ，  Ｍ．  Ｗ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２２，  ６３５−６４４）。
【００５８】
本発明においては、ｐｇＦＡＲ  ｃＤＮＡの一部を増幅するために、Ａ．  ｉｐｓｉｌｏｎ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの配列から設計したセンスオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴ−ｄＴを選択した。以前の研究では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの特異的阻害剤であるコンパクチンが、インビトロアッセイにおいてフェロモン腺ＦＡＲ活性を阻害することを示していた（Ｏｚａｗａ，  Ｒ．，  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （１９９６）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２６，  ２５９−２６５）。この知見からフェロモン腺ＦＡＲが他のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとの配列相同性を示すことが予測された。本発明では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ相同体のｃＤＮＡを取得することはできなかったが、意外なことにもＪＪＦＡＲと相同的なタンパク質をコードするクローンを単離することができた。このクローンによりコードされるタンパク質（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲと命名）は全長にわたりＪＪＦＡＲと２６％の同一性を有しており、多くの他のレダクターゼタンパク質と同様に、Ｎ末端領域に、一個のコンセンサスＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合モチーフを含んでいた（図１および図２）。Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲのノーザンブロット解析の結果、その発現は特にフェロモン腺において羽化の少し前に開始することが判明し（図３）、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲがおそらくこの種のフェロモン生合成経路に関与していることが示唆された。さらに、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける機能的発現実験の結果、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲがアルコールを生成する長鎖ＦＡＲであり、異なる基質特異性を示すことが確認された（図４から図７）。炭素鎖長１４〜２０で分析された飽和長鎖脂肪酸中、１５：  Ａｃｉｄおよび１６：  Ａｃｉｄが優先的にそれらに対応するアルコールに還元されることが判明した。さらに、不飽和Ｃ１６脂肪酸を用いた基質特異性の解明により、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲは二重結合の位置および異性体の性質を厳密に認識しており、ボンビコール前駆体Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄに対して強い選択性を示すことを確認した（図６および図７）。最後に、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲを発現する酵母細胞は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉの雄に典型的な交配行動を引き起こした（図８）。これらの知見を総合することにより、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲが、ボンビコールの生合成の脂肪族アシル還元反応に関与するフェロモン腺特異的酵素であり、脂肪酸を最終的アルコール産物であるボンビコールに優先的に還元することを示している。
【００５９】
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉの雌は、ＰＢＡＮのホルモンシグナルに反応して、羽化したのちに性フェロモンボンビコールの産生を始めるため（Ｆｏｎａｇｙ，  Ａ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．，  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｓ．  （２００１）  Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３０，  １１３−１２３；及びＡｒｉｍａ，  Ｒ．，  Ｔａｋａｈａｒａ，  Ｋ．，  Ｋａｄｏｓｈｉｍａ，  Ｔ．，  Ｎｕｍａｚａｋｉ，  Ｆ．，  Ａｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｕｃｈｉｙａｍａ，  Ｍ．，  Ｎａｇａｓａｗａ，  Ｈ．，  Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ａ．，  ＆  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ａ．  （１９９１）  Ａｐｐｌ．．  Ｅｎｔ．  Ｚｏｏｌ．  ２６，  １３７−１４７）、フェロモン産生細胞は羽化迄にフェロモン産生の準備がととのっていなければならず、多数の油滴状顆粒が羽化の１日前に細胞質に急速に蓄積される（Ｆｏｎａｇｙ，  Ａ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．，  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｓ．  （２００１）  Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３０，  １１３−１２３；及びＦｏｎａｇｙ，  Ａ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．，  Ｏｋａｎｏ，  Ｋ．，  Ｔａｔｓｕｋｉ，  Ｓ．，  Ｍａｅｄａ，  Ｓ．，  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （２０００）  Ｊ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４６，  ７３５−７４４）。油滴状顆粒の機能は、ボンビコール前駆体脂肪酸をトリアシルグリセロール（ＴＧ）の形態で貯蔵することである（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｓ．，  Ｆｏｎａｇｙ  Ａ．，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ．，  Ｗａｎｇ  Ｆ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｎ．，  Ｅｓｕｍｉ  Ｙ．，  ＆  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ．  （２００２）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ３２，  １４４７−１４５５）。羽化に伴って、ＴＧのリポリシスが起こり、その結果ボンビコール前駆体脂肪酸が遊離し、さらに脂肪族アシルＣｏＡ中間体を経由して還元されてボンビコールとなる（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．，  Ｏｚａｗａ，  Ｒ．，  Ｕｃｈｉｕｍｉ，  Ｋ．，  ＆  Ｋｕｒｉｈａｒａ，  Ｍ．  （１９９６）  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６０，  ３６９−３７３）。この経路において、ＰＢＡＮはＴＧリポリシスおよび脂肪族アシル還元の反応を促進する（Ｏｚａｗａ，  Ｒ．，  Ａｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｎａｇａｓａｗａ，  Ｈ．，  Ｋａｔａｏｋａ，  Ｈ．，  ＆  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ａ．  （１９９３）  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５７，  ２１４４−２１４７；及びＭａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｓ．，  Ｆｏｎａｇｙ  Ａ．，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ．，  Ｗａｎｇ  Ｆ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｎ．，  Ｅｓｕｍｉ  Ｙ．，  ＆  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ．  （２００２）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ３２，  １４４７−１４５５）。この後者の工程において、ｐｇＦＡＲはＰＢＡＮ制御下の鍵酵素である（Ｏｚａｗａ，  Ｒ．，  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （１９９６）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２６，  ２５９−２６５）。ＰＢＡＮがＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲに作用する正確な制御機構はまだ解明されていないが、このペプチドが翻訳レベルまたは���訳後レベルでこの酵素活性を調節していることは明らかである。なぜなら、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲの発現上昇は、蛹の時期、すなわち、ＰＢＡＮの放出前に起こるからである（図３Ｂ）。アシルＣｏＡデサチュラーゼ相同体並びに２つのアシルＣｏＡ結合タンパク質であるｐｇＡＣＢＰおよびｍｇＡＣＢＰをコードするフェロモン腺特異的遺伝子の発現上昇が、羽化の１日前に起こることは既報の通りである（Ｙｏｓｈｉｇａ，  Ｔ．，  Ｏｋａｎｏ，  Ｋ．，  Ｍｉｔａ，  Ｋ．，  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｔ．，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （２０００）  Ｇｅｎｅ  ２４６，  ３３９−３４５；及びＭａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．，  Ｙｏｓｈｉｇａ，  Ｔ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．，  Ｉｗａｎａｇａ，  Ｍ．，  Ｋｏｓｈｉｂａ，  Ｓ．，  Ｋｉｇａｗａ，  Ｔ．，  Ｈｉｒｏｔａ，  Ｈ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｓ．，  Ｏｋａｎｏ，  Ｋ．，  Ｍｉｔａ，  Ｋ．，  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｔ．，  ＆  Ｔａｔｓｕｋｉ，  Ｓ．  （２００１）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ３１，  ６０３−６０９）。同様に、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲの発現上昇も羽化の直前に起こるため、フェロモン産生に必要な分子基盤が、調和のとれた機構によりＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのフェロモン腺で形づくられてきたものと考えられる。
【００６０】
フェロモン前駆体脂肪酸を対応するアルコールへと還元することは、ガの種に関わらず、酸素を含有する性フェロモン成分の生合成における共通の段階である（Ｔｉｌｌｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｓｅｙｂｏｌｄ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｊｕｒｅｎｋａ，  Ｒ．  Ａ．  ＆  Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ，  Ｇ．  Ｊ．  （１９９９）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２９，  ４８１−５１４）。予測とは反対に、本発明では、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲがボンビコール前駆体脂肪酸に対して強い基質特異性を示すことが判明した（図７）。この知見は、異なった種のガに由来する長鎖ｐｇＦＡＲが、様々な基質特異性をもつｐｇＦＡＲファミリーを構成することを示唆する。多くのガは、種固有のフェロモン混合物を有し、複数のフェロモン成分の正確な割合は種特異性を規定している（Ｊｕｒｅｎｋａ，  Ｒ．  Ａ．，  ＆  Ｒｏｅｏｌｆｓ，  Ｗ．  Ｌ．  （１９９３）  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｌｉｐｉｄｓ：  Ｃｅｈｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ｓｔａｎｌｅｙ−Ｓａｍｕｅｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｗ．，  ＆  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｂｒａｓｋａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｉｎｃｏｌｎ，  Ｎｅｂｒａｓｋａ．  ｐｐ．  ３５３−３８８）。従って、個々のｐｇＦＡＲの基質特異性が個々のガの種のフェロモン混合物中の成分の正確な割合を規定している可能性を示唆する。
【００６１】
【発明の効果】
本発明により新規な脂肪族アシル還元酵素遺伝子が提供される。本発明の脂肪族アシル還元酵素を利用して脂肪族アシル還元酵素反応を行うことにより、例えば、性状の異なる多様なワックスを製造することが可能になる。このようなワックスは、潤滑剤、食品、化粧品などの分野で産業上広く使用することができる。
【００６２】
【配列表】
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【００６３】
2004290148.tif 000003
2004290148.tif 000004
2004290148.tif 000005
【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲのｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列である。５’ＲＡＣＥに用いたプライマー配列に対応する領域に下線を引いた。一回目のＰＣＲで得られたＣ末端部分を枠で囲んで示す。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合モチーフは二重の下線で示す。
【図２】図２は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲとその関連タンパク質との複数アライメントである。コンセンサス残基には黒く影を付けてある。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合モチーフを枠で囲んで示す。ＢｍｐｇＦＡＲはＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲ、ＪＪＦＡＲはホホバＦＡＲ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１４９９１７）、ＡｔＭＳ２はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＭＳ２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７３６５２）である。
【図３】図３は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲのノーザンブロット解析の結果を示す。
（Ａ）成体組織における発現。レーン１は頭部、２は脂肪体、３はマルピーギ管、４は飛翔筋、５は卵巣、６は精巣、７はフェロモン腺である。各組織は、新たに羽化した雌のガから切除した（０日）。精巣は、新たに羽化した雄のガから切除した。
（Ｂ）フェロモン腺における発現。羽化の前後で雌から切除したフェロモン腺を全ＲＮＡ抽出に用いた。０日は羽化の日に対応する。
【図４】図４は、ＴＩＣおよび質量クロマトグラムを用いた酵母細胞抽出物における脂肪アルコールのＧＣ／ＭＳ解析である。
（Ａ）ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＡＲにより形質転換した酵母細胞。
（Ｂ）ｐＥＳＣ−ＬＥＵにより形質転換した対照酵母細胞。
（Ｃ）ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＡＲにより形質転換し、Ｄ３標識したパルミチン酸と共にインキュベートした酵母細胞。
凍結乾燥した酵母細胞からｎ−ヘキサンにより脂肪族アルコールを抽出した。
ｍ／ｚ  ２２７およびｍ／ｚ  ２２４のフラグメントイオンは、Ｄ３標識したヘキサデカノール（Ｄ３−１６：ＯＨ）およびヘキサデカノール（１６：ＯＨ）の［Ｍ−１８］＋にそれぞれ対応する。
【図５】図５は、ＴＩＣおよび質量クロマトグラムを用いた酵母細胞抽出物における脂肪アルコールのＧＣ／ＭＳ解析である。ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＡＲにより形質転換した酵母細胞を０．５ｍＭの飽和Ｃ１４〜Ｃ１８脂肪酸の存在下でインキュベートした。
（Ａ）１４：  Ａｃｉｄ。ｍ／ｚ  １９６は１４：ＯＨの［Ｍ−１８］＋に対応する。
（Ｂ）１５：  Ａｃｉｄ。ｍ／ｚ  ２１０は１５：ＯＨの［Ｍ−１８］＋に対応する。
（Ｃ）１７：  Ａｃｉｄ。ｍ／ｚ  ２３８は１７：ＯＨの［Ｍ−１８］＋に対応する。
（Ｄ）１８：  Ａｃｉｄ。ｍ／ｚ  ２５２は１８：ＯＨの［Ｍ−１８］＋に対応する。
【図６】図６は、ＴＩＣおよび質量クロマトグラムを用いた酵母細胞抽出物における脂肪アルコールのＧＣ／ＭＳ解析である。ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＡＲにより形質転換した酵母細胞を０．５ｍＭのモノ−エンＣ１６脂肪酸の存在下でインキュベートした。
（Ａ）Ｚ１１−１６：１  Ａｃｉｄ
（Ｂ）Ｅ１１−１６：１  Ａｃｉｄ
（Ｃ）Ｚ９−１６：１  Ａｃｉｄ
（Ｄ）Ｅ９−１６：１  Ａｃｉｄ
ｍ／ｚ  ２２２は１６：１  ＯＨの［Ｍ−１８］＋に対応する。
【図７】図７は、Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄのボンビコールへの変換である。ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＡＲにより形質転換した酵母細胞をＣ１６脂肪酸の存在下でインキュベートした。
（Ａ）  ０．５ｍＭ  Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄ
（Ｂ）  ０．２５  ｍＭ  Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２  ＡｃｉｄとＥ，Ｅ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄとの１：１混合物
（Ｃ）  ０．５  ｍＭ  Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：１  ＡｃｉｄとＺ１１−１６：１  Ａｃｉｄとの１：１混合物。
【図８】図８は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｐｇＦＡＲを発現する酵母細胞によって引き起こされる雄のＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉの交尾行動である。酵母細胞を、０．５  ｍＭ  Ｅ，Ｚ１０，１２−１６：２  Ａｃｉｄの存在下でインキュベートした。
（Ａ）形質転換した酵母細胞を含むバイアルの揮発性内容物に露出する前
（Ｂ〜Ｅ）キャップ除去後の最初の３分間における雄のガの一連の行動
【図１】
2004290148.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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