(57)【要約】【課題】免疫学的測定方法においてカットオフインデックス値（ＣＯＩ値）により分析する場合に、陰性検体は０値を示すような分析方法を提供する。【解決手段】ＣＯＩ値を、被検検体の反応量から陰性コントロールの反応量を引いた値を、カットオフコントロールの反応量から陰性コントロールの反応量を引いた値で除して計算して得た値とすると、測定に使用する陰性コントロールに増感剤、例えばデキストランを添加して該コントロールの測定値を増加させることにより、被検検体の被測定対象物が陰性の場合にはＣＯＩ値を０とすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質に特異的に結合する蛋白質を不溶性担体に固定し、被測定物質を測定する免疫測定法において、陰性コントロール溶液に増感剤を添加して測定した値をもとにカットオフインデックス値（ＣＯＩ値）を算出することを特徴とする免疫分析方法。
【請求項２】
増感剤がデキストランもしくはその誘導体である請求項１に記載の免疫分析方法。
【請求項３】
増感剤を陰性コントロール溶液に対し、１〜４ｗ／ｖ％添加することを特徴とする請求項１または２に記載の免疫分析方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載の分析方法に使用する増感剤を添加した陰性コントロール試薬または該増感剤を添加した陰性コントロール試薬を含む免疫測定試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、不溶性担体を用い免疫凝集反応により被測定物質を測定するための免疫測定法における免疫分析方法に関し、より詳細には、陰性検体のカットオフインデックス値が０と算出されるように調整された免疫分析方法およびその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
体液中の微量成分などの測定法の１つとして、被測定物質である抗原または抗体に対応した抗体または抗原を不溶性担体に固定させ、被測定物質と抗体または抗原との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の程度を検出することにより、被測定物質を測定する免疫測定法が広く用いられている。このような免疫測定法としては、ラテックス凝集反応を利用したものや赤血球凝集反応を利用したものなどが知られている。
【０００３】
凝集の程度を検出する方法としては、肉眼で判定する方法と、反応液に光を照射し散乱光あるいは透過光を測定する方法とが用いられている。後者の方法、すなわち光学測定法は、検体中の抗原または抗体の定量に用いられている。
【０００４】
定性試験においては、判定は検体の反応量がある一定の値を超える場合に陽性、下回る場合を陰性とするのが一般的である。陽性および陰性を判断する指標として、ある一定の測定値を示すカットオフコントロールを設けると、陽性および陰性の判定が容易となる。例えば、検体の反応量から陰性コントロールの反応量を引いた値を、カットオフコントロールの反応量から陰性コントロールの反応量を引いた値で除して計算して得た値をカットオフインデックス値（以下「ＣＯＩ値」という場合もある。）とすると、その値が１．０以下であれば測定検体は被測定物質が陰性であると判断できる（特開平２００１−３３４５１号公報）。
【０００５】
しかしながら、例えばＣＯＩ値が０．８の場合には陰性と判断できるにもかかわらず、数値が示されているために少しでも被検物質が存在していると勘違いし、被験者等は不安感をもつ場合も生じうる。このような不安感を排除するため、当該技術分野の専門家ではない一般の被験者等が明らかに陰性と判断できるように陰性の検体の測定値は、０と算出できるような免疫測定法における分析方法が求められる。
【０００６】
【特許文献】
特開平２００１−３３４５１号公報
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、免疫学的測定方法においてＣＯＩ値により分析する場合に、陰性検体は０値を示すような分析方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、測定に使用する陰性コントロールに増感剤を添加して該コントロールの測定値を増加させれば、検体中の被測定対象物が陰性の場合にはＣＯＩ値は０を示すことができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
１．被測定物質に特異的に結合する蛋白質を不溶性担体に固定し、被測定物質を測定する免疫測定法において、陰性コントロール溶液に増感剤を添加して測定した値をもとにカットオフインデックス値（ＣＯＩ値）を算出することを特徴とする免疫分析方法、
２．増感剤がデキストランもしくはその誘導体である請求項１に記載の免疫分析方法、
３．増感剤を陰性コントロール溶液に対し、１〜４ｗ／ｖ％添加することを特徴とする前項１または２に記載の免疫分析方法、
４．前項１〜３のいずれか１に記載の分析方法に使用する増感剤を添加した陰性コントロール試薬または該増感剤を添加した陰性コントロール試薬を含む免疫測定試薬キット、からなる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において、被測定物質に特異的に結合する蛋白質とは、被検物質に対して生物学的または物理学的に結合能力を有する蛋白質であれば良く、特に限定されないが、例えば被検物質が抗原である場合にはその抗体、被検物質が抗原である場合にはその抗体のように免疫学的親和性に基づき結合する対の蛋白質が挙げられる。
【００１０】
本発明により測定される測定対象物質は、一般に抗原抗体反応を利用して測定され得る生理活性物質である限り特に限定されず、例えば、蛋白質、脂質などが挙げられ、より詳細には、各種抗原、抗体、レセプターまたは酵素などが挙げられる。さらに具体的には、各種ウイルス（ＨＴＬＶ−１，ＨＩＶ，ＨＣＶ，ＨＢｓ，ＨＢｅ）抗原または抗体、ＣＲＰ、ヒトフィブリノーゲン、ＦＤＰ、リウマチ因子、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、抗ストレプトリジンＯ抗体、梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、抗体などが例示される。
【００１１】
本発明の不溶性担体としては、抗体または抗原を担持し得る適宜の不溶性担体を用いることができる。このような不溶性担体の例としては、有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球及び細胞膜片などが挙げられる。有機高分子粉末としては、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストランなどが例示でき、好ましくはラテックス懸濁液がよい。ラテックスとしては、例えばポリスチレン、ポリスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリルニトリル−ブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等が挙げられる。用いるラテックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度あるいは測定機器によって０．０５〜１．０μｍのものが適宜選択される。無機物質粉末としては、シリカ、アルミナ、あるいは金、チタン、鉄、ニッケル等の金属片などが例示される。
【００１２】
本発明の分析方法は、例えばラテックス凝集反応や血液凝集反応などの従来より公知の各種凝集法を用いることができる。
【００１３】
次に、本発明に係る免疫測定法の詳細を説明する。ある被検物質が免疫学的に陽性または陰性であるかは、予めカットオフコントロールにより判断の指標を決定しておき、検体、カットオフコントロールおよび陰性コントロールを各々測定して得た値から判断することができる。そのためのカットオフインデックスは、例えば次の式１に基づいて計算することができる。つまり、ＣＯＩ値が１以上であれば陽性、１未満であれば陰性と判断する。例えば、検体については３％、カットオフコントロールでは１．５％、陰性コントロールでは０．５％の各測定値を示す場合は、次式に代入して計算すると、ＣＯＩ値は２．５であり、この検体では被検物質が陽性と判断される。一方、検体では０．７％、カットオフコントロールでは１．５％、陰性コントロールでは０．５％の各測定値を示す場合は、ＣＯＩ値は０．２と算出されるから陰性と判断される。しかし、この０．２の数値により、わずかに被検物質が存在するような錯覚が生じる場合がある。
【００１４】
【式１】
2004117039.tif 000002
【００１５】
ラテックス凝集反応や血液凝集反応などの各種凝集法は、凝集促進作用を有する物質、具体的にはポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子物質、デキストラン、デキストラン硫酸等の多糖類等を増感剤として検体希釈用緩衝液等に添加し、測定系全体の凝集度を高めることで測定感度を上昇させることができる。本発明では、さらに陰性コントロールに増感剤を添加することで、該コントロールの測定値を上昇させることができる。
【００１６】
陰性コントロールの測定値を高く設定することができれば、本来陰性の検体のＣＯＩ値を０にすることができる。具体的には、カットオフコントロールの測定値１．５％で検体では０．７％の場合には、陰性コントロールの測定値が０．８％であれば、ＣＯＩ値は０と算出され、陰性と判断できる。陰性コントロールの測定値を高く設定するために、上記ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子物質、デキストラン、デキストラン硫酸等の多糖類等を増感剤として添加することができる。例えば添加するデキストランの分子量は１０，０００〜２，０００，０００のものを使用することができる。
【００１７】
添加する増感剤の量は、特に限定されないが、例えば陰性プール血清の測定値よりやや高い測定値になるように増感剤の添加量を適宜選択することができる。具体的には、デキストラン（分子量２，０００，０００）の場合には陰性コントロール溶液に対して、１．０〜４．０ｗ／ｖ％、好ましくは３．０〜４．０ｗ／ｖ％の範囲から適切な数値を選択することができる。
【００１８】
測定方法は、公知の方法に従い、用いられる不溶性担体の大きさもしくは濃度、反応時間を設定することにより、散乱光強度、吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を測定することにより行うことができ、これらの方法を２種以上併用してもよい。
【００１９】
本発明は、上記分析方法に使用する試薬、具体的には増感剤を陰性コントロールに添加した試薬あるいは該陰性コントロールを含む免疫測定用試薬キットにも及ぶ。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明の内容を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１）陰性コントロールへのデキストランの添加
本実施例では、ＨＴＬＶ−１の測定に使用する陰性コントロール（５ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン溶液）に、各々０、１、２、３、４ｗ／ｖ％となるようにデキストラン（分子量２，０００，０００）を添加し、デキストラン添加陰性コントロール検体とし、デキストランの添加によるＣＯＩに及ぼす効果を調べた。
【００２２】
ラテックス粒子懸濁液１ｍＬ（５ｍｇのラテックス担体を含む）について、各種ＨＴＬＶ−１抗原（ｐ１９を３μｇ、ｇｐ４６を４μｇおよびｐ２１を２μｇ）を感作した。
【００２３】
各濃度のデキストランを添加した陰性コントロール検体および抗ＨＴＬＶ−１抗体陰性プール血清について、各種ＨＴＬＶ−１抗原感作ラテックス粒子を用い、シスメックス社製測定装置（ＰＡＭＩＡ−５０）によりＳｙｓｍｅｘ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｖｏｌ．２０　Ｎｏ．１，　ｐ７７−８６（１９９７）に記載の方法に従い測定を行った。反応プレートのウェルに、ラテックス凝集反応用緩衝液を８０μｌ、検体を１０μｌおよび上記調製したラテックス粒子を含む溶液を１０μｌを添加し、４５℃で反応させた。反応を開始して約１５分後に１９μｌの反応混合物を装置のチャンバ内の９５０μｌのシース液に加えて５１倍に稀釈した。稀釈により凝集反応を停止させ、その後、ＰＡＭＩＡ−５０装置により凝集度を求めた。
【００２４】
その結果、図１に示すように陰性コントロールはデキストランの添加濃度に応じて凝集度の増加が確認された。本実施例では、デキストラン濃度が２ｗ／ｖ％の場合に陰性プール血清よりやや高い値を示した。
【００２５】
実施例１により得られた陰性コントロール測定値に基づき、ＨＴＬＶ−１抗原陽性検体および陰性検体について、各々ＣＯＩ値を換算して求めた。ＨＴＬＶ−１抗原陽性検体の凝集率を３％、陰性検体の凝集率を０．７％、カットオフコントロールの値を１．５％としてシミュレーションにより換算した。陰性検体の値が陰性コントロールより低い実測値の場合は、ＣＯＩ値は０と算出した。その結果を表１に示した。デキストランを陰性コントロールに添加することにより、陰性検体および陽性検体のＣＯＩ値の違いがより明確に示された。
【００２６】
【表１】
2004117039.tif 000003
【００２７】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の免疫分析方法、つまり、陰性コントロールに増感剤を添加して陰性コントロールの測定値を増加させてカットオフインデックス（ＣＯＩ）値を算出することにより、陰性検体についてはＣＯＩ値が０を示し、信頼性の高い検査結果を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各濃度のデキストランを添加したときの陰性コントロールの測定結果を示す図である。（実施例１）
【図１】
2004117039.tif 000004