(57)【要約】【課題】フルクトシルバリンと反応しうる新規フルクトシルアミン酸化酵素の製造方法、およびこれを用いる分析方法を提供する。【解決手段】酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．由来フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んでなる組み換えベクターにより微生物を形質転換することによって得られた形質転換体を培養し、フルクトシルアミン酸化酵素を製造する。【効果】製造されたフルクトシルアミン酸化酵素はフルクトシルバリンに特異的でありこれをもちいたキット・センサーは糖化ヘモグロビン計測に有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のフルクトシルアミン酸化酵素活性を有する蛋白質。
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルアミン酸化酵素活性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質であるフルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子。
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルアミン酸化酵素活性を有する蛋白質
【請求項３】
以下の（ｃ）または（ｄ）の配列であり、フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子。
（ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）上記（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されており、かつフルクトシルアミン酸化酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列  ＧｌｙＰｈｅＰｈｅＰｈｅＧｌｕＡｌａＡｓｐＧｌｕＡｓｎＡｓｎＧＬｕｌｌｅＬｙｓを含むフルクトシルアミン酸化酵素。
【請求項５】
以下のｅ）〜ｈ）の「いずれかの配列を有することを特徴とするフルクトシルアミン酸化酵素。
ｅ）  ＰｈｅＨｉｓＴｙｒＡｓｐＴｙｒＶａｌＡｌａＰｒｏＬｅｕＡｌａＬｙｓＰｒｏＡｓｎＳｅｒＬｙｓＧｌｕＡｒｇ
ｆ）  ＡｓｐＡｌａＰｒｏＬｅｕＬｅｕＨｉｓＡｓｐＬｙｓＧｌｕＴｙｒＴｙｒＧｌｕＧＬｕＬｅｕＧｌｎＬｙｓ−
−ＡｓｎＧｌｙＬｅｕＡｒｇＡｓｎＴｙｒＡｒｇＴｙｒＩｌｅＳｅｒＴｈｒ
ｇ）  ＴｈｒＬｙｓＧｌｙＡｓｐＬｙｓＧｌｙＬｅｕＡｓｐＰｒｏＧｌｕＡｓｐＬｙｓ
ｈ）  ＴｒｐＶａｌＳｅｒＶａｌＧｌｕＡｓｎＰｒｏＴｈｒＰｒｏＨｉｓＬｙｓＬｅｕＧｌｕ
【請求項６】
請求項１〜５においてＰｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株またはＰｉｃｈｉａ属由来であるフルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のフルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養して、該培養物からフルクトシルアミン酸化酵素を採取するフルクトシルアミン酸化酵素の製造方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法で製造されたフルクトシルアミン酸化酵素。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のフルクトシルアミン酸化酵素を含むフルクトシルアミン化合物類の分光学的分析方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のフルクトシルアミン酸化酵素を含むフルクトシルアミン化合物類の電気化学的分析法。
【請求項１３】
ＨｂＡ１ｃをアッセイする方法であって、試料中のＨｂＡ１ｃを分解してフルクトシルバリンを生成し、前記フルクトシルバリンを請求項１〜１０記載のフルクトシルアミン酸化酵素を用いて定量することを含む分光学的分析方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０記載のフルクトシルアミン酸化酵素を含むフルクトシルバリン分光学的アッセイキット。
【請求項１５】
請求項１〜１０記載のフルクトシルアミン酸化酵素を含むＨｂＡ１ｃ分光学的分析方法アッセイキット。
【請求項１６】
請求項１〜１０記載のフルクトシルアミン酸化酵素を用いることを特徴とする、フルクトシルバリンの電気化学的分析法。
【請求項１７】
請求項１〜１０記載のフルクトシルアミン酸化酵素を用いることを特徴とする、ＨｂＡ１ｃの電気化学的分析法。
【請求項１８】
請求項１６ならびに１７記載の電気化学的分析法を特徴とする酵素電極。
【請求項１９】
請求項１８記載の酵素電極を用いることを特徴とする酵素センサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なフルクトシルアミン酸化酵素（ＦＡＯ）に関する。より詳細には、本発明は新規微生物の産生するフルクトシルアミン酸化酵素、ならびにその製造に関する。また、本発明はフルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子、該ＦＡＯをコードする遺伝子断片を組み込んでなる組み換えベクター、該組み換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養することによるＦＡＯの製造方法に関する。また、本発明は、本発明は本発明によって生産されるフルクトシルアミン酸化酵素を用いたＨｂＡ１ｃおよびフルクトシルバリン計測キットならびにセンサーに関する
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質主鎖および側鎖のアミノ基はグルコースなどの還元糖の還元末端と非酵素的に結合して、アマドリ化合物すなわち糖化蛋白質を生ずる。血中においては、ヘモグロビンが糖化されて糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン；ＨｂＡ１ｃ）を生ずることが知られている。糖尿病患者では健常人に比べてヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの存在比率が高いこと、およびＨｂＡ１ｃの血中濃度は過去数週間の血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃ血中濃度は糖尿病の診断および糖尿病患者の血糖コントロールの指標として、臨床試験において極めて重要である。
【０００３】
ＨｂＡ１ｃにおいては、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端のバリンにグルコースが結合していることから、フルクトシルバリンをＨｂＡ１ｃの低分子モデル化合物として用いることができる。すなわち、フルクトシルバリンに対して特異性を有する酵素を用いて、ＨｂＡ１ｃをアッセイすることが可能である。
【０００４】
これまでに、種々の菌株からアマドリ化合物に対して作用する酵素が単離されており、これらの酵素を用いてグリコアルブミン、ＨｂＡ１ｃおよびフルクトサミン等の糖化蛋白質を分析しうることが示唆されている（特開昭６１−２６８１７８、特開昭６１−２８０２９７、特開平３−１５５７８０、特開平５−１９２１９３、特開平７−２８９２５３、特開平８−１５４６７２、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１），１０３−１１０，１９８９、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（２），３３３−３３８，１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（４４），２７２９７−２７３０２，１９９４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１２），４４８７−４４８９，１９９５、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９（３），４８７−４９１，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１），２１８−２２４，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（５１），３２８０３−３２８０９，１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（６），３４３７−３４４３，１９９７）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、フルクトシルバリンと反応しうる新規フルクトシルアミン酸化酵素の構造遺伝子をクローニングし、さらにアミノ酸配列を明らかにすること、およびその情報に従い組換えＤＮＡ技術を用い該酵素の製造方法ならびにこれを用いる分析方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を達成するために種々検討した結果、フルクトシルアミン酸化酵素（ＦＡＯ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んでなる組み換えベクターにより微生物を形質転換することによって得られた形質転換体を培養し、該培養物からＦＡＯを採取することによってＦＡＯを大量生産できることを見いだし、本発明に至った。
【０００７】
すなわち本発明はＦＡＯをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んでなる組み換えベクターで微生物を形質転換することによって得られることを特徴とする形質転換体を培養して培養物からＦＡＯを採取することを特徴とするＦＡＯの製造方法である。
【０００８】
本発明は以下の（ａ）または（ｂ）のフルクトシルアミン酸化酵素活性を有する蛋白質である。
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルアミン酸化酵素活性を有する蛋
【０００９】
また本発明は以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質であるフルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子である。
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルアミン酸化酵素活性を有する蛋白質
【００１０】
また本発明は以下の（ｃ）または（ｄ）の配列であり、フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子である。
（ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）上記（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されており、かつフルクトシルアミン酸化酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００１１】
また本発明は配列  ＧｌｙＰｈｅＰｈｅＰｈｃＧｌｕＡｌａＡｓｐＧｌｕＡｓｎＡｓｎＧＬｕＩｌｃＬｙｓを含むフルクトシルアミン酸化酵素。
【００１２】
本発明は以下のｅ）〜ｈ）のいずれかの配列を有することを特徴とするフルクトシルアミン酸化酵素である。
ｅ）  ＰｈｅＨｉｓＴｙｒＡｓｐＴｙｒＶａｌＡｌａＰｒｏＬｅｕＡｌａＬｙｓＰｒｏＡｓｎＳｅｒＬｙｓＧｌｕＡｒｇ
ｆ）  ＡｓｐＡｌａＰｒｏＬｅｕＬｅｕＨｉｓＡｓｐＬｙｓＧｌｕＴｙｒＴｙｒＧｌｕＧＬｕＬｅｕＧｌｎＬｙｓ−
−ＡｓｎＧｌｙＬｅｕＡｒｇＡｓｎＴｙｒＡｒｇＴｙｒＩｌｃＳｅｒＴｈｒｇ）  ＴｈｒＬｙｓＧｌｙＡｓｐＬｙｓＧｌｙＬｅｕＡｓｐＰｒｏＧｌｕＡｓｐＬｙｓ
ｈ）  ＴｒｐＶａｌＳｅｒＶａｌＧｌｕＡｓｎＰｒｏＴｈｒＰｒｏＨｉｓＬｙｓＬｅｕＧｌｕ
【００１３】
また本発明は上記記載
【０００８】〜
【００１２】においてＰｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２６）またはＰｉｃｈｉａ属由来であるフルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子である。
【００１４】
また本発明は上記記載
【０００８】〜
【００１２】においてフルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクターである。
【００１５】
また本発明は上記
【００１４】に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体である。
【００１６】
また本発明は上記
【００１５】に記載の形質転換体を培養して、該培養物からフルクトシルアミン酸化酵素を採取するフルクトシルアミン酸化酵素の製造方法を提供する。
【００１７】
また本発明は上記
【００１６】において記載の方法で製造されたフルクトシルアミン酸化酵素である。
【００１８】
また本発明は上記記載
【０００８】〜
【００１２】のフルクトシルアミン酸化酵素を含むフルクトシルアミン化合物類の分光学的分析方法を提供する。
【００１９】
また本発明は上記記載
【０００８】〜
【００１２】のフルクトシルアミン酸化酵素を含むフルクトシルアミン化合物類の電気化学的分析法を提供する。
【００２０】
また本発明はＨｂＡ１ｃをアッセイする方法であって、試料中のＨｂＡ１ｃを分解してフルクトシルバリンを生成し、前記フルクトシルバリンを
【０００８】
〜
【００１２】のフルクトシルアミン酸化酵素を用いて定量することを含む分光学的分析方法を提供する。
【００２１】
また本発明は上記記載
【０００８】〜
【００１２】のフルクトシルアミン酸化酵素を含むフルクトシルバリン分光学的アッセイキットを提供する。
【００２２】
また本発明は上記記載
【０００８】〜
【００１２】のフルクトシルアミン酸化酵素を含むＨｂＡ１ｃ分光学的分析方法アッセイキットを提供する。
【００２３】
また本発明は上記記載
【０００８】〜
【００１２】のフルクトシルアミン酸化酵素を用いることを特徴とする、フルクトシルバリンの電気化学的分析法を提供する。
【００２４】
また本発明は上記記載
【０００８】〜
【００１２】のフルクトシルアミン酸化酵素を用いることを特徴とする、ＨｂＡ１ｃの電気化学的分析法、ならびにその電気化学的分析法を特徴とする酵素電極、およびその酵素電極を用いることを特徴とする酵素センサーを提供する。
【００２５】
【発明の実施の形態】
【００２６】
フルクトシルアミン酸
【００２７】
これまでに酵母およびＰｉｃｈｉａ属からのフルクトシルアミン酸化酵素の構造遺伝子の報告はない。したがって本酵素の構造遺伝子、アミノ酸配列は新規であり、その組み換えＤＮＡ技術を用いた製造方法は新規方法である。
【００２８】
遺伝子の調製方法
本発明のＦＡＯをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片はＦＡＯ生産菌から得ることができる。該ＦＡＯ生産菌としては具体的にはＰｉｃｈｉａ株は  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが適している
【００２９】
さらに本発明のＦＡＯをコードする遺伝子を含む該ＦＡＯ生産菌としてはＰｉｃｈｉａ  ａｃａｃｉａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ａｌｎｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ａｍｂｒｏｓｉａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ，Ｐｉｃｈｉａ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｏｐｈｏｒａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ，Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｂａｒｋｅｒｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｂｅｓｓｃｙｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｂｉｍｕｎｄａｌｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｂｉｓｐｏｒａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｂｏｖｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｂｕｒｔｏｎｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｃｔｏｐｈｉｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｎａｄｃｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｐｓｕｌａｔｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｓｔｉｌｌａｃ，Ｐｉｃｈｉａ  ｃｈａｍｂａｒｄｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｄｅｌｆｔｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｄｉａｎａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｄｏｒｏｇｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｄｒｙａｄｏｉｄｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｅｕｐｈｏｒｂｉｉｐｈｉｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｂｉａｎｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｒｉｎｏｓｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｆｌｕｘｕｕｍ，Ｐｉｃｈｉａ  ｇａｌｅｉｆｏｒｍｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｇｌｕｃｏｚｙｍａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ，Ｐｉｃｈｉａｈａｍｐｓｈｉｒｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｈａｐｌｏｐｈｉｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｈａｗａｉｉｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｈｅｅｄｉｉ，Ｐｉｃｈｉａｈｅｉｍｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｈｅｎｒｉｃｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｈｏｌｓｔｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｉｎｏｓｉｔｏｖｏｒａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｊａｄｉｎｉｉ（Ｔｏｒｕｌａｙｅａｓｔ），Ｐｉｃｈｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ，Ｐｉｃｈｉａｋｌｕｙｖｅｒｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｌａｃｈａｎｃｅｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｌｙｎｆｅｒｄｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍａｃｌｕｒａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｄｉａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈｙｌｉｖｏｒａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｙｅｒａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｓｕｍａｉｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｎａｋａｓｅｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｎａｋａｚａｗａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｏｆｕｎａｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｏｈｍｅｒｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｏｎｙｃｈｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐｅｔｅｒｓｏｎｉｉ，Ｐｉｃｈｉａｐｈｉｌｏｄｅｎｄｒａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐｈｉｌｏｇａｅａ，Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｌｉｓｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｎｕｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐｏｐｕｌｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐｓｅｕｄｏｃａｃｔｏｐｈｉｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ，Ｐｉｃｈｉａ  ｒａｂａｕｌｅｎｓｉｓ��Ｐｉｃｈｉａ  ｒａｍｅｎｔｉｃｏｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｒｈｏｄａｎｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｓｃｏｌｙｔｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｓｅｇｏｂｉｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｓｉｌｖｉｃｏｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐａｒｔｉｎａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｏｒｏｃｕｒｉｏｓａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｒａｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ，Ｐｉｃｈｉａｓｙｄｏｗｉｏｒｕｍ，Ｐｉｃｈｉａ  ｔａｎｎｉｃｏｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｔｏｌｅｔａｎａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏａｂｓｔｉｎｅｎｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｉａｎｇｕｌａｒｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｖｅｒｏｎａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ  ｘｙｌｏｓａ，Ｐｉｃｈｉａ  ｚｓｏｌｔｉｉ等の酵母をあげることができる。
【００３０】なかでもＰｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２６）由来のＦＡＯをコードする遺伝子が好ましい。
【００３１】
該ＦＡＯをコードする遺伝子はこれらの菌株から抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらにＰＣＲ法の利用によりＦＡＯ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００３２】
上記ＦＡＯをコードする遺伝子としては、例えば（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＡＯ活性を有するタンパク質であるＦＡＯをコードする遺伝子が挙げられる。
【００３３】
さらに、（ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からなるＤＮＡ、または（ｄ）上記（ｃ）の配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されており、かつＦＡＯ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡがある。
【００３４】
本発明において、ＦＡＯをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えば染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡをの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＦＡＯをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
【００３５】
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＦＡＯをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体である染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。
【００３６】
該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＦＡＯ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００３７】
上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００３８】
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００３９】
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ  ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１などが例示される。また、プラスミドとしては、例えぱ、Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１９，ｐＵＣ１１９，ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＥＴ２８あるいはコスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩなどが例示される。
【００４０】
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＦＡＯをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００４１】
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるのであれば特に制限されない。一般的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５  α，ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＢＬ２１などを用いることができる。また本酵素が酵母Ｐｉｃｈｉａ由来であることから、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｕｓなどの真核微生物を宿主として用いることができる。
【００４２】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００４３】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＯを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＦＡＯ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＦＡＯを生成する微生物を選択すればよい。
【００４４】
また別の観点においては単離精製されたＦＡＯのアミノ酸配列を決定し、その情報をもとに該菌株から調製したｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡからＦＡＯ構造遺伝子をクローニングすることもできる。
【００４５】
Ｎ１−１株のｃＤＮＡの調製は以下のようにして行う。まず、Ｎ１−１株からｍＲＮＡを抽出する。Ｎ１−１株をＹＭ培地で前培養（３０℃、５ｍｌ、Ｌ字管）後、ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ  ｖａｌｉｎｅ：ＦＶ（終濃度０．４８％）を唯一の窒素源として加えたＭ９最小培地（Ｍ９／ＦＶ）に１％植菌した（初期濃度０．０１、３０℃、１００ｍｌ、５００ｍｌバッフル）。ＯＤ６６０＝３付近で集菌（５，０００ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）後、２００μｌ  ｂｕｆｆｅｒＡ（１Ｍソルビトール、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１４ｍＭメルカプトエタノール）を加え懸濁した。２０μｌザイモリエイス溶液（１０００Ｕザイモリエイス／１ｍｌ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）を加え混和後、３０℃、３０ｍｉｎ静置した。遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）後、沈殿をＩＳＯＧＥＮ  １ｍｌにより懸濁し、室温、５ｍｉｎ静置した。０．２ｍｌのクロロホルムを加え混和後、室温、３ｍｉｎ静置した。遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）後、水相に０．５ｍｌイソプロパノールを加え混和し、室温、１０ｍｉｎ静置した。遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）後、沈殿に１ｍｌ７０％エタノールを加え混和した。遠心（１５，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）後、沈殿を１５ｍｉｎ真空乾燥した。ここで得られたｍＲＮＡをから該ｃＤＮＡを合成できる。
すなわち、ｍＲＮＡをもとにＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡを調製する常法においてＦＡＯ構造遺伝子を含む断片の増幅が行える。まず、ｍＲＮＡに対して、ＲＮＡ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＡＭＶ  Ｖｅｒ．２．１  ｔａｋａｒａ）のマニュアルに従い、オリゴｄＴアダプタープライマーを用い逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡをエタノール沈殿法により精製後、これをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーには、既報のＦＡＯＤｓの保存配列よりデザインしたＦＡＯ−Ｆ１と、Ｎ１−１株由来ＦＡＯＤのアミノ酸配列解析より得られたアミノ酸１３残基よりデザインしたＦＡＯ−Ｒ２を用いることができる。
ＦＡＯ−Ｆ１５’−ＧＧＸＡＣＸＴＧＧＧＧＸＷＳＸＷＳＸＡＣＸＧＣＸＹＴＸＣＡ−３’
ＦＡＯ−Ｒ２  ３’−ＴＣＹＴＣＲＴＹＸＧＧＹＴＣＶＡＷＲＡＡＲＡＡＸＣＣ−５’
ただしＳ＝Ｃ＋Ｇ  Ｙ＝Ｃ＋Ｔ  Ｒ＝Ａ＋Ｇ  Ｘ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ＋ＴＷ＝Ａ＋ＴＶ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ
これを以下の反応条件でＰＣＲ増幅を行った。
９４℃    １分
６０℃  ３０秒
７２℃  ３０秒
以上を１サイクル
９８℃  ３０秒
６０℃  ３０秒
７２℃    ７分
７２℃    ８分
以上を２５サイクル
Ｔａｑポリメラ−ゼは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭを用いた。このようにして得られたＰＣＲ産物をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  Ｋｉｔ付属のマニュアルに従いグラスミルク精製後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ付属のマニュアルに従いサブクローニングし、カラーセレクションにより、インサートを有するベクターを保持する形質転換体を得た。得られた形質転換体をＬＢ培地で培養（３７℃、１．８ｍｌ、試験管）し、集菌、プラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをＭ１３プライマーフォワード、Ｍ１３プライマーリバース（タカラバイオ（株））を用い、インサートの塩基配列解析を行った。サンプルの調整方法、解析法などはＡＢＩプリズム３１０ジェネティックアナライザー（パーキンエルマーアプライドバイオシステム社）付属のマニュアルにしたがった。
【００４６】
次に、Ｃ末端付近の塩基配列を解析するためにＰＣＲを行った。前項で得られた精製後のｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーには、インサートの塩基配列解析から得られた配列よりデザインしたＦＡＯ−Ｆ３と、アダプタープライマー配列を用いることができる。
ＦＡＯ−Ｆ３：５’−ＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＧＡＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧ−３’
ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ：３’−ＣＧＣＡＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−５’
このようにして得られたｃＤＮＡより求められたＦＡＯの内部部分配列情報をもとに、Ｎ１−１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてインバースＰＣＲによって、本酵素の構造遺伝子全長をクローニングできる。
【００４７】
Ｎ１−１株からのゲノムＤＮＡは以下のように抽出した。Ｎ１−１株をＹＭ培地で培養（３０℃、１００ｍｌ、３００ｍｌバッフル）後、２５ｍｌ培養液に対し、２５ｍｌエタノール、１ｍｌ０．５ＭＥＤＴＡを加え、−３０℃、３０ｍｉｎ静置した。集菌（５，０００Ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）後、１ｍｌ滅菌超純水を加え懸濁した。遠心（８，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）後、沈殿に０．５ｍｌスフェロプラストｂｕｆｆｅｒ（１．２Ｍソルビトール、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ）１％メルカプトエタノール、０．１％ザイモリエイス）を加え懸濁し、３７℃、３０ｍｉｎ静置した。０．５ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３％  ＳＤＳ、０．０１％  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）を加え混和後、６５℃、３０ｍｉｎ静置した。０．２ｍｌの５Ｍ酢酸カリウムを加え混和後、氷上にて１０ｍｉｎ静置した。遠心（１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）後、上清を用いてエタノール沈殿法を行い、沈殿を１５ｍｉｎ真空乾燥した。沈殿を５００μｌのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解後、５μｌのＲＮａｓｅを加え混和し、３７℃、３０ｍｉｎ静置した。
その後フェノール・クロロホルム抽出法、エタノール沈殿法を行った。沈殿を真空乾燥後、１ｍｌ滅菌超純水に溶解した。
【００４８】
このようにして得られたＮ１−１株由来ゲノムＤＮＡに対してインバースＰＣＲによるＦＡＯＤ構造遺伝子断片の増幅が行える。得られたゲノムＤＮＡを制限酵素消化後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２付属のマニュアルに従い、セルフライゲーションを行った。得られた環状ＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲを行った。プライマーにはＦＡＯ構造遺伝子の部分配列よりデザインしたプライマーＦＡＯ−Ｆ５及びＦＡＯ−Ｒ６を用いた。
ＦＡＯ−Ｆ５  ５’−ＧＴＧＣＡＴＡＣＧＡＡＧＡＡＴＧＣＡＡＡＣＧＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＧ−３’
ＦＡＯ−Ｒ６  ３’−ＣＣＡＴＣＣＧＴＴＡＴＣＴＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＣＴＣ−５’
これを以下の反応条件でＰＣＲ増幅を行った。
９４℃    １分
６０℃  ３０秒
７２℃  ３０秒
以上を１サイクル
９８℃  ３０秒
６０℃  ３０秒
７２℃    ７分
７２℃    ８分
以上を２５サイクル
Ｔａｑポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭを用いた。
このようにして得られたＰＣＲ産物を再び精製し、その塩基配列を情報に従い解析する。
【００４９】
このようにして得られるＰＣＲ増幅断片の塩基配列を解析することにより目的遺伝子が得られる。これらの情報から得られたＦＡＯ遺伝子配列情報をもとに、この全長断片を含む遺伝子をＮ１−１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅により調製できる。すなわち、同遺伝子領域を含む配列を増幅するために
ＦＡＯ−Ｎｃｏｌ：５’−ＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＴＡＡＴＴＡＴＡＧＴＴＧＧ−３’
ＦＡＯ−Ｘｂａｌ：３’−ＴＴＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＡＴＣＴＴＧ−５’
をデザインした。これらを上記のＰＣＲサイクルによって反応することにより、目的断片を含むゲノムＤＮＡを増幅できる。
反応条件は以下のサイクルで行った。
2004275168.tif 000002
上記の方法により得られたＦＡＯ遺伝子の塩基配列は、常法により全自動塩基配列解析装置により解読した。また、ＦＡＯのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００５０】
上記のようにして、一度選択されたＦＡＯ遺伝子を保有する組換えベクターより、微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＦＡＯ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＦＡＯ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５１】
また、大腸菌をもちいてＮ１−１株由来ＦＡＯの組み換え生産がおこなえる。得られたＮ１−１株由来ＦＡＯＤの構造遺伝子配列情報からＮ末端、Ｃ末端に相補的なプライマーをデザインした。この際、Ｎ末端側のプライマーにはＮｃｏ  Ｉ（ＦＡＯ−Ｎｃｏ  Ｉ）、Ｃ末端側のプライマーにはＸｂａ  Ｉ（ＦＡＯ−Ｘｂａ  Ｉ）を付加した。
ＦＡＯ−Ｎｃｏｌ：５’−ＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＴＡＡＴＴＡＴＡＧＴＴＧＧ−３’
ＦＡＯ−Ｘｂａｌ：３’−ＴＴＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＡＴＣＴＴＧ−５’
上記記載の方法により得られたｃＤＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡをテンプレートとし、上記のプライマーを用いてＰＣＲによりＦＡＯＤ構造遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ、Ｘｂａ  Ｉ消化し、同制限酵素消化した高発現ベクターｐＴｒｃ９９ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とライゲーション（ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２）プラスミド（ｐＴＮ１）を作成できる。このようにして作成されたｐＴＮ１を大腸菌に形質転換することにより、組み換えＦＡＯＤの生産量が行える。
【００５２】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００５３】
例えばｐＴＮ１を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ培地により培養（３０℃、１５０ｍｌ）バッフル、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）後、ＯＤ６６０＝０．７付近でＩＰＴＧ（終濃度０．３ｍＭ）を加えた。その後、培養温度を３０℃に下げ、１時間ごとに２ｍｌずつ集菌した。得られた菌体を超音波破砕し、破砕液上清を用いてＦＡＯＤ活性測定を行い、Ｌあたりの生産量（Ｕ／Ｌｃｕｌｔｕｒｅ）を算出した。測定にはＦＶ（２ｍＭ）、ＰＰｂ（ｐＨ７．０、５０ｍＭ）、Ｐｈｅｎｏｌ（１．５ｍＭ）、４アミノアンチピリン（１．５ｍＭ）、ペルオキシダーゼ（２Ｕ／ｍｌ）を用いてＰＯＤ／Ｐｈｅｎｏｌ／４Ａ．Ａ．法により５０５ｎｍの吸光度の変化を測定することにより行った。
【００５４】
組み換えＦＡＯの精製は以下のように行える。まず、組み換え大腸菌から該酵素を含む水溶性画分を調製する。ｐＴＮ１／ＤＨ５αをＬＢ培地により培養（３７℃、７１、１０１ファーメンター、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）し、ＯＤ６６０＝０．７付近でＩＰＴＧ（終濃度０．３ｍＭ）によりインダクションをかけ、培養温度を３０℃に下げた。得られた菌体を１００ｍＭＰＰｂ（ｐＨ７．０）に懸濁し、フレンチプレスにより４回破砕を行った。破砕液上清を超遠心（４０，０００ｇ、９０ｍｉｎ）し、上清を１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ７．０）により一晩、４℃にて透析し、水溶性画分を調製できる。さらにえられた水溶性画分を以下のように液体クロマトグラフィーに供することにより精製酵素を調製できる。
【００５５】
まず、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−５ＰＷ）を行う。１０ｍＭＰＰｂ（ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオンクロマトグラフィー用充填カラムＤＥＡＥ−５ＰＷ（５．０ｍｍＩ．Ｄ．×５ｃｍ、トーソー（株））に、得られた水溶性画分を吸着させた。カラム容量３倍量の１０ｍＭＰＰｂ（ｐＨ７．０）で平衡化した後、０．７ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ７．０）でＦＡＯＤを溶出させた。流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、一分ごとに溶出液の回収を行った。溶出物の検出には２８０ｎｍの吸光波長を用いた。得られた活性画分を３５％硫安分画後、上清を次の疎水クロマトグラフィーに供する。３５％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ６．５）で平衡化した疎水カラムクロマトグラフィー用充填カラムＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｈｅ（１ｍｌ、ファルマシア（株））に、上記記載の活性画分を吸着させた。カラム容量３倍量の３５％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ６．５）で平衡化した後、１０ｍＭＰＰｂ（ｐＨ６．５）を用いてＦＡＯＤを溶出させた。流速は２ｍｌ／ｍｉｎとし、１分ごとに溶出物の回収を行った。得られた活性画分を４５％硫安分画後、沈殿を１％マンノース、１００μＭＦＡＤを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液により６時間、４℃にて透析を行った。さらに１００μＭ  ＦＡＤを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ８．０）により６時間、４℃にて透析を行った。透析後のサンプルを次の陰イオン交換クロマトグラフィーに供する。１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオンクロマトグラフィー用充填カラムＢｉｏａｓｉｔ  Ｑ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×５ｃｍ、トーソー（株））に、上記で得られたサンプルを吸着させた。カラム容量３倍量の１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ８．０）で平衡化した後、０．３ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ７．０）でＦＡＯＤを溶出させた。流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、一分ごとに溶出液の回収を行った。得られた活性画分を１０ｍＭＰＰｂ（ｐＨ７．０）により、一晩、４℃にて透析した。このようにして得られた試料の精製度はＳＤＳ／ＰＡＧＥにより検定できる。ファストゲル８−２５を用いて電気泳動を行い、サンプル泳動後のゲルを銀染色した。サンプルの調製方法、泳動法、染色方法はｐｈａｓｔ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ付属のマニュアルにしたがった
【００５６】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。
【００５７】
本酵素を用いてフルクトシルバリン計測キットを構築できる。本発明に従うフルクトシルアミン酸化酵素に加えて、計測に必要な緩衝液、適当なメディエーター、および必要な場合にはペルオキシダーゼ等の酵素、キャリブレーションカーブ作製のためのフルクトシルバリンもしくはその誘導体の標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うフルクトシルアミン酸化酵素は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００５８】
さらに本発明の酵素を用いてはＨｂＡ１ｃアッセイキットを構築できる。ＨｂＡ１ｃを酵素的または化学的に分解することによりフルクトシルバリンが生成し、これを本発明のフルクトシルアミン酸化酵素を用いて定量することによりＨｂＡ１ｃをアッセイすることができる。したがって、本発明のＨｂＡ１ｃアッセイキットは、上述のフルクトシルバリン計測キットにさらに加水分解試薬または蛋白質分解酵素を含む。
【００５９】
また、本発明のフルクトシルアミン酸化酵素を用いて、フルクトシルバリン計測用センサーおよびＨｂＡ１ｃ計測用センサーを構築できる。すなわち、本発明のフルクトシルアミン酸化酵素の作用により消費される酸素または発生する過酸化水素を計測することにより、基質であるフルクトシルバリンの濃度を決定することができる。酸素または過酸化水素を測定する種々のセンサー系が当該技術分野において知られている。電極としては、酸素電極、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、これらを組み合わせて用いてもよい。
【００６０】
酸素電極を用いる場合には、電極表面に本発明の酵素を固定化して、緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。ここに試料を加えて電流の減少値を測定する。
カーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、メディエーターを含む緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。作用電極に一定の電圧を印加し、試料を加えて電流の増加値を測定する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。
【００６１】
さらにカーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する方法として、固定化電子メディエータを用いる系がある。すなわち、作用電極として酵素およびフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどの電子メディエータを吸着あるいは共有結合法により高分子マトリックスに固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。作用電極に一定の電圧を印加し、試料を加えて電流の増加値を測定する。
【００６２】
いずれの電極を用いる場合にも、標準濃度のフルクトシルバリン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のフルクトシルバリン濃度を求めることができる。
【００６３】
ＨｂＡ１ｃ計測用センサーとして用いる場合は、上述のフルクトシルバリン計測用センサーに、さらに蛋白質分解酵素（例えばプロテアーゼ）を固定化した膜などを組み合わせて、複合センサーを構築する。このような、複数の酵素の組み合わせによる連続的反応を用いる複合センサーの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｐ．Ｆ．Ｔｕｎｅｒ，Ｉｓａｏ  Ｋａｒｕｂｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒｏｇｅ  Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ１９８７に記載されている。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６５】
実施例１
ＦＡＯの内部アミノ酸配列の決定
既報の文献“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ  Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−ｖａｌｉｎｅ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ｋ．Ｓｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１２６−１３２（２００１）に従い、当該株を培養した。Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株由来ＦＡＯの精製酵素を得た。この精製酵素のサンプルを凍結乾燥後、１４５μｇの試料にたいしタンパク濃度２ｍｇ／ｍｌとなるように超純水を加えた。この試料についてラピダス・スラブ電気泳動装置を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミドゲル）を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを５×５ｃｍの大きさに切り出し、ファストシステムＴＭを用いてＰＶＤＦ膜へのブロッティングを２ｈ行った。このＰＶＤＦ膜をクーマシーブルーで染色後、目的のバンドを切り出した。こうして得られた酵素をトリプシンで消化し、これを逆相液体クロマトグラフィーにより分離した。得られた解析パターンの一つのフラクションをアミノ酸シークエンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）により内部アミノ酸配列の決定を行った。その結果、本酵素にはＧｌｙＰｈｅＰｈｅＰｈｅＧｌｕＡｌａＡｓｐＧｌｕＡｓｎＡｓｎＧＬｕＩｌｅＬｙｓから構成されるペプチド配列を含むことが明らかとなった。
【００６６】
実施例２
ＦＡＯをコードする遺伝子のクローニング
Ｎ１−１株のｃＤＮＡの調製は以下のようにして行う。まず、Ｎ１−１株からｍＲＮＡを抽出する。Ｎ１−１株をＹＭ培地で前培養（３０℃、５ｍｌ、Ｌ字管）後、ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ  ｖａｌｉｎｃ：ＦＶ（終濃度０．４８％）を唯一の窒素源として加えたＭ９最小培地（Ｍ９／ＦＶ）に１％植菌した（初期濃度０．０１、３０℃、１００ｍｌ、５００ｍｌバッフル）。ＯＤ６６０＝３付近で集菌（５，０００ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）後、２００μｌ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（１Ｍソルビトール、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１４ｍＭメルカプトエタノール）を加え懸濁した。２０μｌザイモリエイス溶液（１０００Ｕザイモリエイス／１ｍｌ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）を加え混和後、３０℃、３０ｍｉｎ静置した。遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）後、沈殿をＩＳＯＧＥＮ  １ｍｌにより懸濁し、室温、５ｍｉｎ静置した。０．２ｍｌのクロロホルムを加え混和後、室温、３ｍｉｎ静置した。遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）後、水相に０．５ｍｌイソプロパノールを加え混和し、室温、１０ｍｉｎ静置した。遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）後、沈殿に１ｍｌ７０％エタノールを加え混和した。遠心（１５，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）後、沈殿を１５ｍｉｎ真空乾燥した。ここで得られたｍＲＮＡをから該ｃＤＮＡを合成できる。
すなわち、ｍＲＮＡをもとにＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡを調製する常法においてＦＡＯ構造遺伝子を含む断片の増幅が行える。まず、ｍＲＮＡに対して、ＲＮＡ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＡＭＶ  Ｖｅｒ．２．１  ｔａｋａｒａ）のマニュアルに従い、オリゴｄＴアダプタープライマーを用い逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡをエタノール沈殿法により精製後、これをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーには、既報のＦＡＯＤｓの保存配列よりデザインしたＦＡＯ−Ｆ１と、Ｎ１−１株由来ＦＡＯＤのアミノ酸配列解析より得られたアミノ酸１３残基よりデザインしたＦＡＯ−Ｒ２を用いることができる。
ＦＡＯ−Ｆ１５’−ＧＧＸＡＣＸＴＧＧＧＧＸＷＳＸＷＳＸＡＣＸＧＣＸＹＴＸＣＡ−３’
ＦＡＯ−Ｒ２  ３’−ＴＣＹＴＣＲＴＹＸＧＧＹＴＣＶＡＷＲＡＡＲＡＡＸＣＣ−５’
ただしＳ＝Ｃ＋Ｇ  Ｙ＝Ｃ＋Ｔ  Ｒ＝Ａ＋Ｇ  Ｘ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ＋ＴＷ＝Ａ＋ＴＶ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ
これを以下の反応条件でＰＣＲ増幅を行った。
９４℃    １分
６０℃  ３０秒
７２℃  ３０秒
以上を１サイクル
９８℃  ３０秒
６０℃  ３０秒
７２℃    ７分
７２℃    ８分
以上を２５サイクル
Ｔａｑポリメラ−ゼは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭを用いた。このようにして得られたＰＣＲ産物をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ付属のマニュアルに従いグラスミルク精製後、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍ付属のマニュアルに従いサブクローニングし、カラーセレクションにより、インサートを有するベクターを保持する形質転換体を得た。得られた形質転換体をＬＢ培地で培養（３７℃、１．８ｍｌ、試験管）し、集菌、プラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをＭ１３プライマーフォワード、Ｍ１３プライマーリバース（タカラバイオ（株））を用い、インサートの塩基配列解析を行った。サンプルの調整方法、解析法などはＡＢＩプリズム３１０ジェネティックアナライザー（パーキンエルマーアプライドバイオシステム社）付属のマニュアルにしたがった。
次に、Ｃ末端付近の塩基配列を解析するためにＰＣＲを行った。前項で得られた精製後のｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーには、インサートの塩基配列解析から得られた配列よりデザインしたＦＡＯ−Ｆ３と、アダプタープライマー配列を用いることができる。
ＦＡＯ−Ｆ３：５’−ＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＧＡＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧ−３’
ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ：３’−ＣＧＣＡＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−５’
このようにして得られたｃＤＮＡより求められたＦＡＯの内部部分配列情報をもとに、Ｎ１−１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてインバースＰＣＲによって、本酵素の構造遺伝子全長をクローニングできる。
Ｎ１−１株からのゲノムＤＮＡは以下のように抽出した。Ｎ１−１株をＹＭ培地で培養（３０℃、１００ｍｌ、３００ｍｌバッフル）後、２５ｍｌ培養液に対し、２５ｍｌエタノール、１ｍｌ０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加え、−３０℃、３０ｍｉｎ静置した。集菌（５，０００Ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）後、１ｍｌ滅菌超純水を加え懸濁した。遠心（８，０００ｒｐｍ、５ｍ１ｎ、４℃）後、沈殿に０．５ｍｌスフェロプラストｂｕｆｆｅｒ（１．２Ｍソルビトール、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、１％メルカプトエタノール、０．１％ザイモリエイス）を加え懸濁し、３７℃、３０ｍｉｎ静置した。０．５ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３％ＳＤＳ、０．０１％ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）を加え混和後、６５℃、３０ｍｉｎ静置した。０．２ｍｌの５Ｍ酢酸カリウムを加え混和後、氷上にて１０ｍｉｎ静置した。遠心（１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）後、上清を用いてエタノール沈殿法を行い、沈殿を１５ｍｉｎ真空乾燥した。沈殿を５００μｌのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解後、５μｌのＲＮａｓｅを加え混和し、３７℃、３０ｍｉｎ静置した。その後フェノール・クロロホルム抽出法、エタノール沈殿法を行った。沈殿を真空乾燥後、１ｍｌ滅菌超純水に溶解した。
このようにして得られたＮ１−１株由来ゲノムＤＮＡに対してインバースＰＣＲによるＦＡＯＤ構造遺伝子断片の増幅が行える。得られたゲノムＤＮＡを制限酵素消化後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２付属のマニュアルに従い、セルフライゲーションを行った。得られた環状ＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲを行った。プライマーにはＦＡＯ構造遺伝子の部分配列よりデザインしたプライマーＦＡＯ−Ｆ５及びＦＡＯ−Ｒ６を用いた。
ＦＡＯ−Ｆ５  ５’−ＧＴＧＣＡＴＡＣＧＡＡＧＡＡＴＧＣＡＡＡＣＧＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＧ−３’
ＦＡＯ−Ｒ６  ３’−ＣＣＡＴＣＣＧＴＴＡＴＣＴＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＣＴＣ−５’
これを以下の反応条件でＰＣＲ増幅を行った。
９４℃    １分
６０℃  ３０秒
７２℃  ３０秒
以上を１サイクル
９８℃  ３０秒
６０℃  ３０秒
７２℃    ７分
７２℃    ８分
以上を２５サイクル
Ｔａｑポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭを用いた。
このようにして得られたＰＣＲ産物を再び精製し、その塩基配列を情報に従い解析する。
このようにして得られるＰＣＲ増幅断片の塩基配列を解析することにより目的遺伝子が得られる。これらの情報から得られたＦＡＯ遺伝子配列情報をもとに、この全長断片を含む遺伝子をＮ１−１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅により調製できる。すなわち、同遺伝子領域を含む配列を増幅するために
ＦＡＯ−Ｎｃｏｌ：５’−ＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＴＡＡＴＴＡＴＡＧＴＴＧＧ−３’
ＦＡＯ−Ｘｂａｌ：３’−ＴＴＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＡＴＣＴＴＧ−５’
をデザインした。これらを上記のＰＣＲサイクルによって反応することにより、目的断片を含むゲノムＤＮＡを増幅できる。
反応条件は以下のサイクルで行った。
2004275168.tif 000003
上記の方法により得られたＦＡＯ遺伝子の塩基配列は、常法により全自動塩基配列解析装置により解読した。また、ＦＡＯのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００６７】
実施例３
組換え生産用ベクターの構築
上記のようにして、一度選択されたＦＡＯ遺伝子を保有する組換えベクターより、微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＦＡＯ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＦＡＯ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
また、大腸菌をもちいてＮ１−１株由来ＦＡＯの組み換え生産がおこなえる。得られたＮ１−１株由来ＦＡＯの構造遺伝子配列情報からＮ末端、Ｃ末端に相補的なプライマーをデザインした。この際、Ｎ末端側のプライマーにはＮｃｏ  Ｉ（ＦＡＯ−Ｎｃｏ  Ｉ）、Ｃ末端側のプライマーにはＸｂａ  Ｉ（ＦＡＯ−Ｘｂａ  Ｉ）を付加した。
ＦＡＯ−Ｎｃｏｌ：５’−ＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＴＡＡＴＴＡＴＡＧＴＴＧＧ−３’
ＦＡＯ−Ｘｂａｌ：３’−ＴＴＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＡＴＣＴＴＧ−５’
上記記載の方法により得られたｃＤＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡをテンプレートとし、上記のプライマーを用いてＰＣＲによりＦＡＯＤ構造遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ、Ｘｂａ  Ｉ消化し、同制限酵素消化した高発現ベクターｐＴｒｃ９９ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とライゲーション（ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２）プラスミド（ｐＴＮ１）を作成できる。このようにして作成されたｐＴＮ１を大腸菌に形質転換することにより、組み換えＦＡＯＤの生産量が行える。
【００６８】
実施例４
組み換え大腸菌によるＦＡＯの生産
ＦＡＯの構造遺伝子を含むプラスミドｐＴＮ１が形質転換されている大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＴＮ１を用いてＦＡＯの生産を行った。当該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で１２時間培養を行い、遠心分離機により細胞を集菌した。この細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で破砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０分）により上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。このようにして調製された形質転換大腸菌は細胞内にＦＡＯを発現した。野性型Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１をもちいて該酵素を生産する場合には市販されておらず、かつ入手が困難で高価であるフルクトシルアミン化合物を培地に添加しなければ該酵素は誘導されず生産ができないが、本組換え法では従来、大腸菌組換え技術で用いられているＩＰＴＧを用いて誘導すれば酵素生産は誘導でき、経済的である。また、その生産量は野性型Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株を用いてフルクトシルバリンを用いて誘導生産したときに比べ、単位蛋白質あたり１．５倍以上であった。（表ｘｘ）
【００６９】
実施例５
酵素の精製
組み換えＦＡＯの精製は以下のように行える。まず、組み換え大腸菌から該酵素を含む水溶性画分を調製する。ｐＴＮ１／ＤＨ５αをＬＢ培地により培養（３７℃、７１、１０１ファーメンター、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）し、ＯＤ６６０＝０．７付近でＩＰＴＧ（終濃度０．３ｍＭ）によりインダクションをかけ、培養温度を３０℃に下げた。得られた菌体を１００ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ７．０）に懸濁し、フレンチプレスにより４回破砕を行った。破砕液上清を超遠心（４０，０００ｇ、９０ｍｉｎ）し、上清を１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ７．０）により一晩、４℃にて透析し、水溶性画分を調製できる。さらにえられた水溶性画分を以下のように液体クロマトグラフィーに供することにより精製酵素を調製できる。まず、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−５ＰＷ）を行う。１０ｍＭＰＰｂ（ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオンクロマトグラフィー用充填カラムＤＥＡＥ−５ＰＷ（５．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×５ｃｍ、トーソー（株））に、得られた水溶性画分を吸着させた。カラム容量３倍量の１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ７．０）で平衡化した後、０．７ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ７．０）でＦＡＯＤを溶出させた。流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、一分ごとに溶出液の回収を行った。溶出物の検出には２８０ｎｍの吸光波長を用いた。得られた活性画分を３５％硫安分画後、上清を次の疎水クロマトグラフィーに供する。３５％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ６．５）で平衡化した疎水カラムクロマトグラフィー用充填カラムＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｈｅ（１ｍｌ、ファルマシア（株））に、上記記載の活性画分を吸着させた。カラム容量３倍量の３５％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ６．５）で平衡化した後、１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ６．５）を用いてＦＡＯＤを溶出させた。流速は２ｍｌ／ｍｉｎとし、１分ごとに溶出物の回収を行った。得られた活性画分を４５％硫安分画後、沈殿を１％マンノース、１００μＭ  ＦＡＤを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液により６時間、４℃にて透析を行った。さらに１００μＭ  ＦＡＤを含む１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ８．０）により６時間、４℃にて透析を行った。透析後のサンプルを次の陰イオン交換クロマトグラフィーに供する。１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオンクロマトグラフィー用充填カラムＢｉｏａｓｉｔ  Ｑ（４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×５ｃｍ、トーソー（株））に、上記で得られたサンプルを吸着させた。カラム容量３倍量の１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ８．０）で平衡化した後、０．３ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭＰＰｂ（ｐＨ７．０）でＦＡＯＤを溶出させた。流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、一分ごとに溶出液の回収を行った。得られた活性画分を１０ｍＭ  ＰＰｂ（ｐＨ７．０）により、一晩、４℃にて透析した。このようにして得られた試料の精製度はＳＤＳ／ＰＡＧＥにより検定できる。ファストゲル８−２５を用いて電気泳動を行い、サンプル泳動後のゲルを銀染色した。サンプルの調製方法、泳動法、染色方法はＰｈａｓｔ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ付属のマニュアルにしたがった。精製された酵素の電気泳動写真を図ｘｘに示す。
【００７０】
実施例６
酵素活性の検討
実施例５で得られた精製酵素用いて、ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ  ｖａｌｉｎｅ、Ｎε−ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ  ｌｙｓｉｎｅ、ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ  ｇｌｙｓｉｎｅ、ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ  ａｌａｎｉｎｅ、ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ  ｌｅｕｓｉｎｅ、ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、グルコース、サルコシンに対する反応性の検討を行った。測定には基質（１０ｍＭ）、ＰＰｂ（ｐＨ７．０、５０ｍＭ）、Ｐｈｅｎｏｌ（１．５ｍＭ）、４アミノアンチピリン（１．５ｍＭ）、ペルオキシダーゼ（２Ｕ／ｍｌ）を用いてＰＯＤ／Ｐｈｅｎｏｌ／４Ａ．Ａ．法により５０５ｎｍの吸光度の変化を測定することにより行った。得られた酵素の活性ならびに基質特異性について大腸菌を用いて生産された組換えＦＡＯならびに酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１野性株で生産された酵素と比較した結果を表ＸＸに示す。このように、組換えＤＮＡにより、より高い活性を有するＦＡＯを生産することができた。
【００７１】
実施例７
フルクトシルアミン類のアッセイ
本発明のフルクトシルアミン酸化酵素を用いてフルクトシルバリンをアッセイした。ペルオキシダーゼ〜４−アミノアンチピリン系を用いた測定系を用いて、本発明のフルクトシルアミン酸化酵素（ＦＡＯ）に対し、フルクトシルバリン酸化活性のフルクトシルバリン濃度依存性について測定した。１．５ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、２．０ｍＭフェノール、２Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の存在下で、室温で１分間反応させた時の５０５ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素反応速度とした。０．１ｍＭから５ｍＭの間で直線性が見られ、この濃度範囲内でのフルクトシルバリン定量が可能であった。
【００７２】
実施例８
フルクトシルバリン酸素電極型酵素センサー
実施例５に従い調製したＦＡＯ１００マイクロリットル（５．７ｍｇ蛋白質／ｍｌ）をキムワイプに含浸し、これをＤＫＫ社製酸素電極に装着し透析膜によって覆った。作成した酵素電極を３０℃に保温した１０ｍｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）内に挿入した。ここに１Ｍのフルクトシルバリン水溶液５０マイクロリットルを随時添加し、その時の電流減少値を観測した。すなわち、本発明の新規フルクトシルアミン  酸化酵素を用いた酵素センサーにより、５ｍＭ−２０ｍＭの範囲でフルクトシルバリンの定量を行うことができた。
【００７３】
実施例９
メディエータ型酵素センサー
実施例５に従い調製したＦＡＯ０．３４ｕｎｉｔ分を、凍結乾燥し、カーボンペースト２０ｍｇと混合し、カーボンペースト電極に充填し、濾紙上で表面を平らにした。１％グルタルアルデヒド３０分間、表面を架橋した後、１０ｍＭリジンで２０分処理することで未反応のアルデヒド基をつぶした。これを酵素電極とし、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で１時間以上室温で撹拌し、平衡化した。メディエーターとして終濃度１ｍＭのメトキシＰＭＳを含む、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を反応溶液とし、総量を１０ｍｌとした。そこに作用電極として作製したカーボンペースト電極を用い、対極として白金電極、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用い＋０．１５Ｖの電位を印加した。測定は２５℃で行った。電流値が定常になったところ（約１時間）で、基質（フルクトシルバリン）溶液を１００μｌずつ注入した。基質の注入に伴って得られるピーク電流の、定常電流値からの高さを応答電流値として用いた。フルクトシルバリンを加えていないときの電流値を０Ａとし応答電流値を計測した。このときのフルクトシルバリン濃度に対する応答電流値は濃度に依存していた。注入したフルクトシルバリン濃度に対し、０．１ｍＭから０．６ｍＭの範囲で応答電流値との間に直線性を示し、この範囲において計測可能であることが示された。サンプルを注入後、定常電流値を示すまでには４分ほどであった。
【００７４】
実施例１０
過酸化水素検出型センサー
まず酵素固定化膜を調製した。実施例５に従い調製したＦＡＯ５０μｌ（０．０５ｕｎｉｔ分）と光架橋性樹脂プレポリマーであるＰＶＡ−ＳｂＱ水溶液０．２３ｇを混合し、プレート上に２１ｃｍ２の面積に薄く伸ばした。暗所で５時間風乾した後、両面を蛍光灯の光に５分ずつさらした。この膜を光固定化酵素膜とし４℃で保存した。作製した膜を、ＢＡＳ社製白金電極（モデルＮｏ．１１−１０１２）表面に被覆してからナイロンネットをかぶせＯリングで固定して酵素電極とし、作用極とした。参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対極には白金電極を用いた。恒温セル（２５℃）に５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１０ｍｌ加え、光架橋性樹脂固定化酵素電極をしんせきした。ポテンシオスタットを用いて電位＋０．６Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌを印加し、電流値が定常になったところ（約１時間）で、基質（フルクトシルバリン）溶液を１００μｌずつ注入した。基質の注入に伴って得られるピーク電流の、定常電流値からの高さを応答電流値として用いた。構築したバッチ型のシステムを用いて、フルクトシルバリン濃度に依存した応答曲線が得られた。注入したフルクトシルバリン濃度に対し、０．０５ｍＭから２ｍＭの範囲で直線性を示し、この範囲において計測可能であることが示された。
【００７５】
実施例１１
プルシアンブルー型センサー
グラッシーカーボン電極（ＢＡＳ社、モデルＮｏ．１１−２０１２）上で０．１Ｍ塩化カリウム緩衝液中に終濃度２ｍＭヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）カリウムと、２ｍＭの塩化（ＩＩＩ）鉄を加え、２５℃、６０秒間、＋０．４Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの電位を印加し、フィルムを付着させた。その後、−０．０５Ｖから０．３５Ｖの電位を印加（１０回）していくことでフィルムを形成させていき、プルシアンブルーフィルム固定化電極を作製した。実施例５に示した方法（０．１３６ｕｎｉｔ）で作製したＦＡＯ固定化膜でプルシアンブルーフィルム固定化電極を被覆した。参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対極には白金電極を用いた。恒温セル（２５℃）に５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１０ｍｌ加え、を用いた。ポテンシオスタットを用いてプルシアンブルーフィルム固定化酵素電極に０．０５Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌを印加し、電流値が定常になったところ（約１時間）で、基質（フルクトシルバリン）溶液を１００μｌずつ注入した。基質の注入に伴って得られるピーク電流の、定常電流値からの高さを応答電流値として用いた。構築したバッチ型のシステムを用いて、フルクトシルバリン濃度に依存した再現性の良い結果が得られた。注入したフルクトシルバリン濃度に対し、０．１ｍＭから１．６ｍＭの範囲で応答電流値との間に直線性を示し、この範囲において計測可能であることが示された。サンプルを注入後、定常電流値を示すまでには６分ほどであった。
【００７６】
【発明の効果】
本発明によりＰｉｃｈｉａ  ｓｐ．由来の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）測定用の酵素、フルクトシルアミン酸化酵素の構造遺伝子をクローニングし、大腸菌において組換え生産することに成功した。このことにより、大量にＦＡＯを生産できるようになった。本酵素は臨床検体の分析に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株由来フルクトシルアミン酸化酵素のアミノ酸配列ならびに遺伝子配列を示す。アミノ酸配列は配列表・配列番号１に対応し、遺伝子配列は配列表・配列番号２に対応する。
【図２】図２は、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株由来フルクトシルアミン酸化酵素のアミノ酸配列を示した配列表・配列番号１を示す。
【図３】図３は、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株由来フルクトシルアミン酸化酵素の遺伝子配列を示した配列表・配列番号２を示す
【図４】図４は本発明に用いられたＰＣＲプライマーを表す。
【図５】図５は発現ベクターｐＴＮ１を表す。
【図６】図６は組換えＦＡＯの大腸菌での生産を表す。
【図７】図７は組換えＦＡＯの電気泳動写真を表す。
【図８】図８は組換えＦＡＯの活性と基質特異性を表す。
【図１】
2004275168.tif 000004
【図２】
2004275168.tif 000005
【図３】
2004275168.tif 000006
【図４】
2004275168.tif 000007
【図５】
2004275168.tif 000008
【図６】
2004275168.tif 000009
【図７】
2004275168.tif 000010
【図８】
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