(57)【要約】【課題】本発明は、ゲノム情報が解明されているシロイヌナズナの細胞から、そのままの状態の液胞を純度高く多量に単離することを可能にすることを目的にしている。【解決手段】本発明は、シロイヌナズナの細胞からプロトプラストを調製し、浸透圧ショックによりプロトプラストを破壊した後、パーコールの密度勾配遠心法により、細胞から液胞を単離する方法に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロイヌナズナの細胞からプロトプラストを調製し、浸透圧ショックによりプロトプラストを破壊した後、パーコールの密度勾配遠心法により、細胞から液胞を単離する方法。
【請求項２】
単離された液胞が、細胞に存在していた状態のままである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、培養細胞である請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シロイヌナズナの細胞からプロトプラストを調製し、浸透圧ショックによりプロトプラストを破壊した後、パーコールの密度勾配遠心法により、細胞から液胞を単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
液胞は、空胞とも称され、細胞内に膜で囲われて存在する水溶液を包含する小胞である。液胞は植物細胞に存在し、正常な動物細胞ではほとんど見られないが、動物でも特殊な細胞や病的細胞（空胞変性）では、顕著な液胞を生じることがある。液胞を包む膜を液胞膜と称し、内部の液体を細胞液（ｃｅｌｌ  ｓａｐ）という。細胞液は、糖類、有機酸類、色素類、アルカロイド類などを含有しており、無機イオンや代謝産物の蓄積の場として知られている。液胞膜は、トノプラストとも呼ばれており、一重の膜で、生体膜に共通する三層構造を有しており、特異的な膜透過性を有している。液胞膜からは、特異的なＨ＋−ＡＴＰアーゼやＨ＋輸送性ピロホスファターゼなどのプロトンポンプが精製されてきている。
液胞は、その特異的な吸水力により膨圧を生じて、細胞壁の緊張状態を保たせており、植物の膨圧形成に重要な役割を果たしている。さらに、代謝産物の移動、細胞内成分の分解といった、植物細胞の恒常性の維持に重要な役割を果たしている。植物では、一般に細胞の老化につれて液胞が大型化し、老化した細胞では液胞が細胞の中央の大部分を占めて、細胞質と核は細胞の周辺にへばりついた観を呈することが多い。
【０００３】
１９７５年にマタイル（Ｍａｔｉｌｅ）が、植物の液胞は動物細胞のリソソームと対比できる器官であるとした（非特許文献１参照）。しかし、液胞には逆の機能を持った、タンパク質を貯蔵するものも見出されてきた。植物の液胞は成長の過程において、タンパク質蓄積型液胞（ＰＳＶ）、分解型液胞（ＬＶ）、栄養器官型液胞（ＶＶ）、そして乾燥種子のプロテインボディ（ＰＢ）と種々の機能を果たす器官であることがわかってきた。また、液胞には、液胞プロセッシング酵素と称されるタンパク質の不活性前駆体を活性化させる酵素が存在することも明らかにされてきた（非特許文献２参照）。
このように、植物細胞における液胞は、単に不要物質を分解するだけの器官ではなく、植物の種子、発芽、成熟などの様々な段階において重要な機能を果たしているものであることが解明されてきたが、これらの機構の解析は未だ十分ではなく、さらなる解析には収率がよく、構造的に無傷で、しかも機能的に活性の高い液胞の単離・精製法が必要とされていた。
【０００４】
すでに、複数の高等植物で、そのままの状態の液胞を単離する手法が報告されており（非特許文献３及び４参照）、それらを用いて多くの研究が進められてきた。しかし、これらの単離法は、その植物材料が持つ性質と密接に関連しており、同様な手法を他の植物材料に応用することは困難であった。
本発明の植物材料であるシロイヌナズナは、高等植物として世界で初めてゲノム構造の解析が終わった種である。ゲノム解析が終了すると、その種が持つ個々の遺伝子構造を極めて容易に同定することが可能になる。多くの研究者が解析しようとしている液胞機能の多くは、液胞で特異的に働くタンパク質により実現するものであり、他の実験材料を用いる限りは、そこで働くタンパク質や、そのタンパク質の構造を指令する遺伝子を単離することは困難を極める。しかし、シロイヌナズナを用いることができれば、液胞で働くタンパク質とその遺伝子をゲノム構造の情報から極めて容易に同定することが可能になり、ゲノムの機能解析に大きく寄与することになる。
本発明は、その目的のためにシロイヌナズナの細胞から、そのままの状態の液胞を純度高く多量に単離することを可能にすることを目的にしている。
シロイヌナズナを用いた液胞の単離については、液胞膜の単離が複数の方法で進められているが（非特許文献５参照）、それらは液胞膜に特化しておりそのままの状態の液胞を単離することによる利点は持っていない。また、そのままの状態の液胞を単離できる方法を報告したものが一報存在する（非特許文献６参照）が、方法論が違うため、単離できる液胞の状態が異なり、その後の解析可能性に大きな差が生じるものと考えられる。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｍａｔｉｌｅ，  Ｐｈ．：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｍｏｎｏｇｒ．，  Ｖｏｌ．１．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ．  Ｗｉｅｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７５）
【非特許文献２】
Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２９４，  ８９−９３  （１９９１）
【非特許文献３】
Ｍａｒｔｉｎｏｉａ，  Ｅ．，  Ｈｅｃｋ，  Ｕ．，  Ｗｉｅｍｋｅｎ，  Ａ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８９  （５７９５），  ２９２−２９４．
【非特許文献４】
Ｍａｓｓｏｎｎｅａｕ  Ａ，  Ｍａｒｔｉｎｏｉａ  Ｅ，  Ｄｉｅｔｚ  ＫＪ，  Ｍｉｍｕｒａ  Ｔ．，  Ｐｌａｎｔａ，  （２０００）  ２１１：  ３９０−３９５．
【非特許文献５】
Ｃｚｅｍｐｉｎｓｋｉ，  Ｋａｔｒｉｎ，  Ｆｒａｃｈｉｓｓｅ，  Ｊｅａｎ−Ｍａｒｉｅ，  Ｍａｕｒｅｌ，  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，  Ｂａｒｂｉｅｒ−Ｂｒｙｇｏｏ，  Ｈｅｌｅｎｅ  ＆  Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｒｏｅｂｅｒ，  Ｂｅｒｎｄ，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，  （２００２）  ２９（６）：８０９−８２０
【非特許文献６】
Ｆｒａｎｇｎｅ  Ｎ，  Ｅｇｇｍａｎｎ  Ｔ，  Ｋｏｂｌｉｓｃｈｋｅ  Ｃ，  Ｗｅｉｓｓｅｎｂｏｃｋ  Ｇ，  Ｍａｒｔｉｎｏｉａ  Ｅ，  Ｋｌｅｉｎ  Ｍ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  （２００２）  １２８（２）：  ７２６−７３３
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記した目的のためにシロイヌナズナの細胞から、そのままの状態の液胞を純度高く多量に単離することを可能にすることを目的にしている。さらに、本発明は、液胞で働くタンパク質とその遺伝子をゲノム構造の情報から極めて容易に同定することを可能とし、ゲノム構造の機能解析の新たな手法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ゲノム構造の全てが解明されているシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の液胞の機能を解明し、ゲノム構造との関係を明らかにするために、シロイヌナズナの細胞から液胞を簡便に高純度で大量に得る方法を検討していた。他の植物における液胞を単離する方法は、いくつか知られているけれども、これらの方法ではシロイヌナズナの細胞から液胞を単離することはできなかった。そのために、新たな手法を検討していたところ、パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）の密度勾配遠心法により、シロイヌナズナの細胞から液胞を簡便に高純度で大量に単離・精製することができることを見出した。
【０００８】
本発明は、シロイヌナズナの細胞からプロトプラストを調製し、浸透圧ショックによりプロトプラストを破壊した後、パーコールの密度勾配遠心法により、細胞から液胞を単離する方法に関する。
【０００９】
本発明の方法について、より具体的に説明する。
まず、本発明の方法におけるプロトプラストの調製法の具体例の概要を図１に示す。シロイヌナズナの培養細胞から調製したプロトプラストをセルラーゼなどの酵素で処理した後、酵素を含有する溶液を遠心分離で除き、得られたプロトプラストを密度勾配遠心分離して軽い部分を除く。残った重い部分をさらに遠心分離して３層に分かれた（図１の右側の箇所参照）中の部分を取り出すことによりプロトプラストを調製した。
【００１０】
より詳細には、シロイヌナズナの培養細胞から調製したプロトプラストを塩化カルシウムを含有する５００ｍＭのソルビトール溶液（Ｐ  ｓｏｒ  （５００）溶液）に混合し、これにセルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）Ｙ−Ｃを１％及びペクトリアーゼ（Ｐｅｃｔｒｙａｓｅ）Ｙ２３を０．１％を添加して、２〜３時間処理した。得られた溶液に塩化マグネシウムを含有する４００ｍＭのソルビトール溶液（Ｖｃ  ｓｏｒ  （４００）  溶液）、及び５０％パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）を加えて遠心分離した。５０％パーコールの界面付近に沈殿したプロトプラストを残して、その上部の軽い部分を捨てた。この懸濁液をパーコールにる２５％、７．５％、５％、２．５％の密度勾配をつけて遠心分離を行い、約２５％パーコールの部分に沈殿するプロトプラストを得た。得られた液を遠心分離して、上部の層、中部の層、及び下部の層の３層に分離させた。中部のプロトプラストを含有する層を回収して、液胞を採取するプロトプラストとした。
なお、上部の軽い層は、液胞の分画の混入する恐れがある層であることから、この段階で除いておく必要がある。また、下部の重い層は細胞の破壊物であり不要である。
【００１１】
本発明のプロトプラストの調製法としては、前記した方法に限定されるものではなく、種々のプロトプラストの調製法を採用することができるが、後で液胞を単離する場合に２．５％パーコール液の界面付近に集まるように密度勾配遠心分離法を行うことから、プロトプラストを調製する段階において液胞を分離する条件とほぼ同じ条件による密度勾配遠心分離法を行って、目的の液胞を分離する密度（例えば、２．５％パーコール液の界面付近）に集まるものを予め除いておくことが好ましい。前記した例では、最後の遠心分離において液胞が回収される密度付近のものが除かれている。
このような処理を予め行っておくことにより、次の段階における液胞の回収及び精製を極めて簡便に行うことができる。
【００１２】
次に、本発明の方法における浸透圧ショックについてより具体的に説明する。調製されたプロトプラストの溶液に、浸透圧の低い溶液、例えばソルビトールを含有しない溶液（例えば、下記の実施例１におけるＶｃ  ｓｏｒ  （０）  溶液）を添加して、溶液側の浸透圧を下げて、細胞を膨らませて、浸透圧ショックを与える。さらに必要により浸透圧ショックの状態の希釈溶液を軽く振動させて、プロトプラストの破壊を促進させることもできる。
【００１３】
次いで、液胞の単離を行う。本発明の密度勾配遠心分離による方法の概要を図２に示す。前記で得られたプロトプラストが浸透圧ショックで破壊された溶液の混合物に、各種の濃度のパーコール液、例えば、２．５％、５％、７．５％、２５％のパーコール液を加えて、密度勾配遠心分離を行う。
調製された破壊されたプロトプラストは、２５％パーコール液に存在しているが、これを各種の濃度のパーコール液を用いて密度勾配遠心分離を行うことにより、選択的に液胞のみが２．５％パーコールの界面（図２の層１参照）付近に分離されて集まってくる。
パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）は、溶液の浸透圧を上げずに比重だけを変えることが出来る試薬で、それを加えることによって、異なる密度の溶液を作成することができる。密度の異なる液を重層することで、密度の異なる物質を分離することができる。通常の遠心分離の場合は、時間と加速度によって、沈むものが決まってくるが、密度勾配遠心法では、ある一定の密度の場にその物質を留めることができる。
本発明の方法における密度勾配としては、液胞が集まる２．５％パーコール液程度の密度が必要であるが、他の密度については試料の状況において適宜設定することができる。また、本発明の方法の密度勾配遠心法の遠心の強さについては、液胞が破壊されない強さであればよく、例えば１０００〜５０００ｒｐｍ程度で１〜１５分間の遠心分離が好ましい。
【００１４】
このようにして得られた液胞は、すでに充分な純度を持っているが、必要によりさらに精製することもできる。精製方法としては任意の手段を採用することができるが、得られた液胞の混合液を、再度同じような条件で遠心分離して精製するのが簡便で好ましい。
また、前記した密度勾配遠心法により２５％パーコール部分に残ったプロトプラストには、少量の液胞がのこされている可能性もあるので、必要に応じて、再度、前記と同様に処理して液胞を回収することもできる。
【００１５】
本発明の方法により得られた液胞を、ウエスタンブロット解析などの手段により確認することができる。例えば、前記した方法で得られた液胞を、液胞内液及び液胞膜に分離し、抗体として細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｐ−ＡＴＰａｓｅ）抗体、液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）抗体、及びＢｉｐタンパク質（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体を用いて、ウエスタンブロット解析により確認することができる。
前記した方法で得られた液胞をウエスタンブロット解析により確認した結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の左側のレーンは対象のプロトプラストであり、真ん中のレーンは液胞内液であり、右側のレーンは液胞膜である。図３の上段は、細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｐ−ＡＴＰａｓｅ）抗体を用いた場合であり、中段は液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）抗体を用いた場合であり、下段はＢｉｐタンパク質（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体を用いた場合である。
それぞれの抗体で、プロトプラスト（細胞全体）、液胞内溶液、液胞膜標品のタンパク質に抗体が認識できるタンパク質があるかどうか確認した。本発明の方法で得られた液胞には細胞膜の混入は全くなく、Ｂｉｐタンパク質が液胞内液画分にわずかに存在し、液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅは液胞膜画分に強く濃縮されていたことがわかる。
【００１６】
次に、本発明の方法で得られた液胞の標識酵素活性の測定を行った。得られた液胞を、液胞内液（Ｖａｃｕｏｌａｒ  ｓａｐ）と液胞膜（Ｔｏｎｏｐｌａｓｔ）に分離し、それぞれの純度を標識酵素活性の測定により検定した。対象としてプロトプラストを用いた。
標識酵素として、細胞膜の標識酵素として細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｐ−タイプＨ＋−ＡＴＰａｓｅ）を用い、液胞膜の標識酵素  として液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｖ−タイプＨ＋−ＡＴＰａｓｅ  ）を用い、さらにゴルジ体の標識酵素として潜在ＩＤＰａｓｅ（Ｌａｔｅｎｔ  ＩＤＰａｓｅ）を用いて、それぞれの酵素活性を測定した。
細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅは、ＡＴＰの分解活性を特異的阻害剤であるヴァナジン酸の存在化、非存在化で比較した。ＩＤＰａｓｅは、ＩＤＰ（イノシン  ５’−ジホスファイト）の分解活性を測定した。液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅはＡＴＰの分解活性を特異的阻害剤であるバフィロマイシン（Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ）の存在化、非存在化で比較した。
結果を後記する表１に示す。
この結果、本法で単離したそのままの液胞は植物細胞におけるその他の細胞内容物の混入が少なく、特に液胞膜については極めて純度の高い標品であることが分かった。
【００１７】
液胞は、植物細胞において種々の物質の貯蔵庫として働いている。液胞に貯蔵される物質は、植物の生育に取って欠かせない栄養塩から植物が他の生物との関連で蓄積する二次代謝産物まで様々である。液胞の状態を解析することにより、例えば、栄養塩の蓄積機構が分かり、その蓄積過程をコントロールすることができれば、植物の生育を調節することが可能になるほか、食糧生産において作物に与える肥料の量を低減することも可能になる。
また、液胞に蓄積される多くの二次代謝産物は、人間にとって薬品となったり、産業上有用な物質（例  タンニン）であったりするものが多い。これらの物質の合成、蓄積過程をコントロールすることができるようになる。
このように、液胞の機能を解析することは、植物の生育の調節や有用な物質の生産方法の開発において重要なことであるが、とりわけシロイヌナズナにおいては、ゲノム情報が全て解明されており、液胞で機能しているタンパク質の解析を容易に行うことができる。即ち、液胞で働くタンパク質の機能が分からなければ液胞の機能を探ることはできないが、タンパク質の機能を知るためには、当該タンパク質をコードしている遺伝子を同定する方法がより簡便な手法である。したがって、ゲノム情報の分かっているシロイヌナズナのような材料では、あるタンパク質の構造の一部でも分かれば、すぐにそのタンパク質をコードしている遺伝子の全体像を知ることができることから、液胞に存在しているタンパク質の構造の一部でも分かれば、新たにそのタンパク質を生化学的に純化する必要なく、そのタンパク質の構造をゲノムの情報に基づいて知ることが可能となる。
特に、本発明の方法により単離される液胞は、純度が高く、かつ大量に製造することができるために、単離されてきた液胞に存在するタンパク質の分離や同定が容易であり、液胞で機能しているタンパク質の解析に極めて有用なものである。
【００１８】
本発明の方法は、浸透圧ショックによるプロトプラストの破壊と、パーコールによる密度勾配遠心分離法の組み合わせによる、簡便な方法で高純度の液胞の単離・精製をそのままの状態で可能にしたものであり、植物の生育状態における各段階の液胞の機能解析に重要な手法を提供するものである。
【００１９】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２０】
実施例１  （液胞の単離）
（１）使用する溶液の調製
（Ａ）Ｐ  ｓｏｒ  （５００）  溶液
１０ｍＭ  Ｍｅｓ（２−モルホリノエタンスルホン酸）、
１ｍＭ  ＣａＣｌ２、
５００ｍＭ  ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、
トリス（Ｔｒｉｓ）でｐＨ５．６−６．０に調整する。
（Ｂ）Ｖｃ  ｓｏｒ  （ｎ）  溶液
３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、
２ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコール  ビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）、
３０ｍＭ  カリウムグルコネート（Ｋ−Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
ｎ  ｍＭ  ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）
トリス（Ｔｒｉｓ）でｐＨ７．２に調整する。
（Ｃ）Ｖｃ  ｓｏｒ  （４００）  溶液
３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、
２ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコール  ビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）、
３０ｍＭ  カリウムグルコネート（Ｋ−Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
４００ｍＭ  ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）
トリス（Ｔｒｉｓ）でｐＨ７．２に調整する。
（Ｄ）Ｖｃ  ｓｏｒ  （２００）  溶液
３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、
２ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコール  ビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）、
３０ｍＭ  カリウムグルコネート（Ｋ−Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
２００ｍＭ  ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）
トリス（Ｔｒｉｓ）でｐＨ７．２に調整する。
（Ｅ）Ｖｃ  ｓｏｒ  （２００）  （ｘ  ％  Ｐｅｒｃｏｌｌ）溶液
３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、
２ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコール  ビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）、
３０ｍＭ  カリウムグルコネート（Ｋ−Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
２００ｍＭ  ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）
ｘ％  パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）
トリス（Ｔｒｉｓ）でｐＨ７．２に調整する。
【００２１】
（２）  単離方法
プロトプラストを前記（Ａ）のＰ  ｓｏｒ  （５００）溶液に混合し、これにセルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）Ｙ−Ｃを１％及びペクトリアーゼ（Ｐｅｃｔｒｙａｓｅ）Ｙ２３を０．１％を添加して、２〜３時間処理した。得られた溶液に前記（Ｃ）のＶｃ  ｓｏｒ  （４００）  溶液、及び５０％パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）を加えて、８００〜１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。５０％パーコールの界面付近に沈殿したプロトプラストを残して、その上部の軽い部分を捨てた。この懸濁液を７．５％、５％、２．５％の密度勾配遠心を行い、約２５％パーコールの部分を残し、２．５％パーコールの界面の上〜５％パーコールの下の界面に来るプロトプラストを捨てた。残った液を８００〜１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。中部のプロトプラストを含有する層を残し、上部の軽い層及び下部の重い層を捨てた。上部の軽い層は、液胞の分画の混入する恐れがある層であることから、この段階で除いておく必要がある。また、下部の重い層は細胞の破壊物であり不要である。以上の操作をまとめたものを図１として示す。
中部の層に残った部分に（Ｂ）のｎが０であるＶｃ  ｓｏｒ  （０）  溶液、即ちソルビトールを含有しない溶液を残った液と同量加えて、ソルビトールの濃度を希釈し、細胞を膨らませて、浸透圧ショックを与えた。浸透圧ショックの状態の得られた希釈溶液を軽く振動させて（針は通さない）、プロトプラストの破壊を促進させた。
【００２２】
次いで、液胞の単離を行う。前記で得られたＶｃ  ｓｏｒ  （２００）  溶液（Ｖｃｓｏｒ  （４００）  溶液が２倍に希釈された結果の溶液）の混合物に、各種の濃度のパーコール液を加えて、８００〜１０００ｒｐｍで２〜３分間、３０００ｒｐｍで８分間の密度勾配遠心分離を行った。目的の液胞は０％溶液と２．５％パーコールの界面（図２の層１参照）に集まるので、この部分を回収して、再度の遠心分離で精製した。
２５％パーコール部分に残ったプロトプラストを集めて、再度、前記と同様に処理して液胞の回収の使用した。
以上の液胞の単離の処理をまとめたものを図２に示す。
【００２３】
実施例２  （ウエスタンブロット解析）
実施例１の方法で得られた液胞を、液胞内液及び液胞膜に分離し、抗体として細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｐ−ＡＴＰａｓｅ）抗体、液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）抗体、及びＢｉｐタンパク質（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体を用いて、ウエスタンブロット解析を行った。発色法としては、アルカリフォスファターゼを用いた発色法を用いた。また、対象としてプロトプラストを用いた。
結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の左側のレーンは対象のプロトプラストであり、真ん中のレーンは液胞内液であり、右側のレーンは液胞膜である。図３の上段は、細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｐ−ＡＴＰａｓｅ）抗体を用いた場合であり、中段は液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）抗体を用いた場合であり、下段はＢｉｐタンパク質（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体を用いた場合である。
それぞれの抗体で、プロトプラスト（細胞全体）、液胞内溶液、液胞膜標品のタンパク質に抗体が認識できるタンパク質があるかどうか確認した。液胞には細胞膜の混入は全くなく、Ｂｉｐタンパク質が液胞内溶液画分にわずかに存在し、液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅは液胞膜画分に強く濃縮されていた。
【００２４】
実施例３  標品の標識酵素活性の測定
実施例１で得られた液胞を、液胞内液（Ｖａｃｕｏｌａｒ  ｓａｐ）と液胞膜（Ｔｏｎｏｐｌａｓｔ）に分離し、それぞれの純度を標識酵素活性の測定により検定した。対象としてプロトプラストを用いた。
標識酵素として、細胞膜の標識酵素として細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｐ−タイプＨ＋−ＡＴＰａｓｅ）を用い、液胞膜の標識酵素  として液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｖ−タイプＨ＋−ＡＴＰａｓｅ  ）を用い、さらにゴルジ体の標識酵素として潜在ＩＤＰａｓｅ（Ｌａｔｅｎｔ  ＩＤＰａｓｅ）を用いて、それぞれの酵素活性を測定した。
細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅは、ＡＴＰの分解活性を特異的阻害剤であるヴァナジン酸の存在化、非存在化で比較した。ＩＤＰａｓｅは、ＩＤＰ（イノシン  ５’−ジホスファイト）の分解活性を測定した。液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅはＡＴＰの分解活性を特異的阻害剤であるバフィロマイシン（Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ）の存在化、非存在化で比較した。
結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
2004267048.tif 000002
【００２６】
表１の横並びの欄は、左からプロトプラスト（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）、液胞内液（Ｖａｃｕｏｌａｒ  ｓａｐ）、液胞膜（Ｔｏｎｏｐｌａｓｔ）をそれぞれ示し、表１の縦の欄は、上から液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｖ−タイプＨ＋−ＡＴＰａｓｅ  ）、潜在ＩＤＰａｓｅ（Ｌａｔｅｎｔ  ＩＤＰａｓｅ）、細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｐ−タイプＨ＋−ＡＴＰａｓｅ）をそれぞれ示す。表１のカッコ内の数値は、それぞれの標品において液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｖ−タイプＨ＋−ＡＴＰａｓｅ  ）の活性を１としてときの相対値を示している。
この結果、本法で単離したそのままの液胞は植物細胞におけるその他の細胞内容物の混入が少なく、特に液胞膜については極めて純度の高い標品であることが分かった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明は、ゲノム情報が全て解明されているシロイヌナズナの液胞を、そのままの状態で効率よく単離・精製する方法を提供する。本発明の方法によれば、液胞が細胞内に存在していた状態で単離・精製してくることができるので、この単離液胞をゲノム情報と組み合わせることで、液胞膜上に存在すると考えられる種々の膜輸送体や液胞内酵素の同定、あるいは液胞内代謝産物の検出や同定を容易に行うことができ、植物における液胞の果たす機能を解明することが可能となる。また、液胞は、植物細胞において種々の物質の貯蔵庫として働いている。液胞に貯蔵される物質は、植物の生育に取って欠かせない栄養塩から植物が他の生物との関連で蓄積する二次代謝産物まで様々である。液胞の機能が解明されることにより、例えば、栄養塩の蓄積機構が分かり、その蓄積過程をコントロールすることができれば、植物の生育を調節することが可能になるほか、食糧生産において作物に与える肥料の量を低減することも可能になる。
また、液胞に蓄積される多くの二次代謝産物は、人間にとって薬品となったり、産業上有用な物質（例  タンニン）であったりするものが多い。これらの物質の合成、蓄積過程をコントロールすることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法における、プロトプラストの調製法の例の概要を示したものである。
【図２】図２は、本発明の方法における、パーコール液による密度勾配遠心分離法の例の概要を示したものである。
【図３】図３は、本発明の方法により得られた液胞のウエスタンブロット解析法の結果を示した図面に代わる写真である。図３の左側のレーンは対象のプロトプラストであり、真ん中のレーンは液胞内液であり、右側のレーンは液胞膜である。図３の上段は、細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｐ−ＡＴＰａｓｅ）抗体を用いた場合であり、中段は液胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ  （Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）抗体を用いた場合であり、下段はＢｉｐタンパク質（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体を用いた場合である。
【図１】
2004267048.tif 000003
【図２】
2004267048.tif 000004
【図３】
2004267048.tif 000005