(57)【要約】【課題】ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを基質として用いるコリンエステラーゼ活性測定用試薬を、長期間にわたって安定な液状状態で供給する。【解決手段】β−ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型及びプロトカテキン酸−３，４−ジオキシゲナーゼを主成分とする第一試液と、ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン及びｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを主成分とする第二試液からなるコリンエステラーゼ活性測定用試薬である。このような試験組成にすることにより、β−ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型とｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンの両者を安定化することが可能となり、結果としてコリンエステラーゼ活性測定の試薬組成物の安定化が図られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型及びプロトカテキン酸−３，４−ジオキシゲナーゼを主成分とする第一試液と、ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン及びｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを主成分とする第二試液とからなることを特徴とするｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを基質として用いるコリンエステラーゼ活性測定用試薬。
【請求項２】
第一試液がｐＨ９．０〜１０．５、第二試液がｐＨ６．０〜７．５である、請求項１記載のコリンエステラーゼ活性測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液などの生体に由来する試料中に存在するコリンエステラーゼ活性測定用の試薬に関する。さらに詳しくは、液状状態で長期間安定なコリンエステラーゼ活性測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のコリンエステラーゼ（以下、ＣｈＥと略記する。）活性測定法には以下のようなものがある。
アセチルコリンを基質としてＣｈＥを作用させ、生成する酢酸は反応液のｐＨを低下させるので、この反応に、ｐＨ指示薬であるフェノールレッド等を共存させて、その色調変化からＣｈＥ活性を求める方法（高橋・柴田法）。しかし、この方法は、基質であるアセチルコリンがＣｈＥ以外の酵素に対しても基質として作用し、特異性に問題がある。
【０００３】
ベンゾイルコリンを基質とし、ＣｈＥによって分解された後に残存するベンゾイルコリンを　２４０ｎｍ　で定量し、その経時的な吸光度減少速度を測定する方法（Ｋａｌｏｗ法）。この反応は、反応系と操作が簡単であるであるが、基質阻害がかかることと、汎用の自動分析装置に適用できない点が問題とされた。
さらに、１９８３年の日本臨床化学会第３回夏期セミナーでｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン（以下、ｐＨＢＣと略記する。）基質法が発表された。その後、１９８５年の日本臨床化学会第５回夏期セミナーではヨウ化２，３−ジメトキシベンゾイルチオコリン（以下、ＤＭＢＴと略記する。）基質法が検討されたが、ＣｈＥの至適ｐＨでは基質が不安定であり、さらに、他のＣｈＥ活性測定法と測定値を比較すると相関回帰式で切片を生じることが問題とされた。１９９７年にはベンゾイルチオコリン（以下、ＢＺＴＣと略記する。）基質法について検討されたが、直線性能が低い問題点を有している。２００２年になって、日本臨床化学会においてＣｈＥ活性測定用の勧告法としてｐＨＢＣ基質法を採用することが決定された。
【０００４】
しかしながら、ｐＨＢＣ基質法に使用されるプロトカテキン酸−３，４−ジオキシゲナーゼ（以下、ＰＣＯと略記する。）とｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（以下、ｐＨＢＨと略記する。）の２種類の酵素には夾雑物質が多く存在するため、日本臨床化学会の勧告法のようにＰＣＯとｐＨＢＨをβ−ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨと略記する。）とともに第一試液中に共存させると、ＮＡＤＰＨを経時的に分解するため、ＣｈＥ活性測定用試薬の液状状態の安定が悪いという欠点があった。そこで、液状状態でも長期間安定な試薬組成とするために、ＮＡＤＰＨを主成分とする第一試液と、ＰＣＯ、ｐＨＢＨ及び基質ｐＨＢＣを主成分とする第二試液から組成される試薬組成が知られている（特許第２７５６８００号公報）。
【０００５】
ところが、ｐＨＢＣを基質とするＣｈＥ活性測定用試薬の保存安定性能を規定する要因には、特許第２７５６８００号公報に記載されているようなＰＣＯ及びｐＨＢＨに含有されている夾雑物質によるＮＡＤＰＨの不安定化のみならず、ＰＣＯやｐＨＢＨの安定性はもちろんのこと、これらの夾雑物質によるｐＨＢＣの不安定化も挙げられる。
ＰＣＯ及びｐＨＢＨに含有されている夾雑物質とは、ＮＡＤＰＨを分解するＮＡＤＰＨ酸化酵素、ｐＨＢＣを分解するＣｈＥなどの酵素や酸化剤である。
ＣｈＥ活性測定用試薬の保存安定性にとってＮＡＤＰＨが安定でなければならないのは、ＣｈＥ活性がＮＡＤＰＨ量の経時的な減少に伴う３４０ｎｍでの吸光度減少速度を測定して求められるからであり、試液中のＮＡＤＰＨ量が少ないと吸光度の減少速度を測定する場合に吸光度測定可能な範囲が狭くなるためである。一方、ｐＨＢＣが不安定な場合、これが単に分解して消滅するのではなく、その分解産物であるｐ−ヒドロキシ安息香酸がｐＨＢＨの基質として作用する。この結果、第一試液と第二試液が混和した時点で、ｐＨＢＣの分解産物がｐＨＢＨと反応して非特異的にＮＡＤＰＨが消費されてしまう。すなわち、ＣｈＥ活性測定用試薬の保存安定性を担うＮＡＤＰＨ量は、第一試液中のＮＡＤＰＨ量のみならず、第二試液中のｐＨＢＣの保存安定性にも左右される。第一試液中でＮＡＤＰＨが安定であっても、第二試液中のｐＨＢＣが不安定であれば、第一試液と第二試液が混合されてＣｈＥ活性の測定を開始する時点で十分な量のＮＡＤＰＨが確保できない。従って、ＣｈＥ活性測定用試薬を液状状態で長期間安定とするためには、第一試液中のＮＡＤＰＨを安定とするのみならず、第二試液中のｐＨＢＣも安定としなければならない。しかしながら、特許第２７５６８００号公報では第二試液中のｐＨＢＣの安定性については考慮されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、ｐＨＢＣを基質として用いるＣｈＥ活性測定用試薬を液状状態で長期間安定とするために、ＮＡＤＰＨの安定化のみならず、ｐＨＢＣの安定化を図るものである。もちろん、ＰＣＯ及びｐＨＢＨの安定化も図らなければならない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
ＮＡＤＰＨの安定化を図るためには、第一試液のｐＨをできるだけアルカリ側とし、さらに、ＮＡＤＰＨを分解する夾雑物質を含有するＰＣＯとｐＨＢＨを第二試液に組成した。しなしながら、そうすると、これらの酵素中に存在する夾雑物質によって今度は第二試液中のｐＨＢＣの分解が促進され、結果的には第一試液と第二試液が混和された時点で存在するＮＡＤＰＨ量は、第二試液中にいずれの酵素も添加しない場合に比べて少なくなる。そこで、ＰＣＯ又はｐＨＢＨのいずれも第二試液に添加するのではなく、いずれか一方を第一試液に組成することを検討した。その結果、ｐＨＢＨを第一試液に添加した場合、ＮＡＤＰＨが安定なアルカリ性の条件ではｐＨＢＨは著しく不安定となった。これに対して、ＰＣＯを第一試液に添加した場合、ＰＣＯ自体が安定であるのみならず、第一試液中のＮＡＤＰＨ及び第二試液中のｐＨＢＨとｐＨＢＣも安定にできることを発明するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明では、ＣｈＥ活性測定用試薬の基質としてｐＨＢＣ、補酵素としてＮＡＤＰＨ、共役酵素としてＰＣＯ及びｐＨＢＨを用いる。第一試液にはＮＡＤＰＨ及びＰＣＯを、第二試液にはｐＨＢＨ及びｐＨＢＣを組成する。このことによって、単にＮＡＤＰＨの安定化を図るのみならず、ｐＨＢＣも安定化させることにより、第一試液と第二試液の混合時にＣｈＥ活性測定に必要な十分量のＮＡＤＰＨ量が存在するようにする。同時にＰＣＯ及びｐＨＢＨも安定とする。
【０００９】
本発明によるＣｈＥ活性測定の測定原理は〔式１〕に示した通りである。すなわち、試料中のＣｈＥは基質であるｐＨＢＣを加水分解し、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（以下、ｐＨＢＡと略する。）とコリンを生成させる。生じたｐＨＢＡは溶存酸素と補酵素ＮＡＤＰＨの存在下でｐＨＢＨの作用により水分子と３，４−ジヒドロキシ安息香酸に変換される。この際に補酵素ＮＡＤＰＨは酸化されてＮＡＤＰとなる。このＮＡＤＰＨの減少にともなう３４０ｎｍでの吸光度減少速度を測定することにより、ＣｈＥ活性を求める。
なお、ｐＨＢＨの作用で生じた３，４−ジヒドロキシ安息香酸は再びｐＨＢＨの基質として作用し、ＮＡＤＰＨの酸化反応を進行させ、正誤差を生じる。これを回避するために、３，４−ジヒドロキシ安息香酸を酸化してβ−カルボキシムコン酸への反応を触媒するＰＣＯを用いる。
【００１０】
【式１】
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【００１１】
第一試液中に含有させる成分としては、ＰＣＯとＮＡＤＰＨを組成する。ＮＡＤＰＨ及びＰＣＯの濃度は第一試液と第二試液の混合時にそれぞれ０．１〜０．５ｍＭ、０．０５〜１．０Ｕ／ｍＬが好ましいが、これらの添加濃度に本発明が限定されるものではない。その他の成分として緩衝剤を用いる。緩衝剤としてはトリスが望ましいが、特に緩衝剤の種類と濃度を限定するものではない。さらにアジ化ナトリウム等の防腐剤やポリオキシエチレンアルキルエーテル等の界面活性剤あるいはＥＤＴＡ等のキレート剤を添加しても良い。これらの防腐剤や界面活性剤及びキレート剤はＣｈＥ酵素活性、ＮＡＤＰＨの安定性、及びＰＣＯの安定性と酵素活性に悪影響を及ぼさないものを選択する。ｐＨとしてはＮＡＤＰＨとＰＣＯの両方の安定性を満たす範囲とし、ｐＨ９．０から１０．５の範囲が望ましい。なお、ＰＣＯはシュードモナス属やアシネトバクター属に属する細菌から精製して用いることができる。さらに、これらの遺伝子組換え体を用いることにより、ＮＡＤＰＨを分解する夾雑物質含量を低く抑えた酵素標品を用いたり、細菌培養液から抽出精製する際に、精製度を上げて夾雑物質含量を低く抑えることが好ましい。なお、本発明はＰＣＯの由来生物種や由来臓器、あるいは夾雑物質量を限定するものではない。
【００１２】
第二試液にはＣｈＥの基質であるｐＨＢＣ及びｐＨＢＨを組成する。ｐＨＢＨはシュードモナス属やアシネトバクター属に属する細菌から精製して用いることができる。さらに、これらの遺伝子組換え体を用いることにより、夾雑物質含量を低く抑えた酵素標品を用いたり、細菌培養液から抽出精製する際に、精製度を上げて夾雑物質含量を低く抑えることが好ましい。なお、本発明はｐＨＢＨの由来生物種や由来臓器、あるいは夾雑物質量を限定するものではない。その他の成分として緩衝剤を用いる。緩衝剤としてはトリスが望ましいが、特に緩衝剤の種類と濃度を限定するものではない。さらにアジ化ナトリウム等の防腐剤やポリオキシエチレンアルキルエーテル等の界面活性剤あるいはＥＤＴＡ等のキレート剤を添加しても良い。これらの防腐剤や界面活性剤及びキレート剤はＣｈＥ酵素活性、ｐＨＢＣの安定性、及びｐＨＢＨの安定性と酵素活性に影響を及ぼさないものを選択する。さらにｐＨＢＨの安定化剤として牛血清アルブミンやフラビンアデニンジヌクレオチドを添加することが望ましい。ｐＨとしてはｐＨＢＣとｐＨＢＨの両方の安定性を満たし、かつ第一試液と混和した際にＣｈＥの至適ｐＨ域となるように、ｐＨ６．０から７．５の範囲が望ましい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明を参考例、実施例及び比較例により詳細に説明する。
【００１４】
【参考例１】
ＰＣＯ及びｐＨＢＨのＣｈＥ活性測定用試液での配置とｐＨＢＨの保存安定性
［ＣｈＥ活性測定用第一試液］１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ　９．０）にＮＡＤＰＨを０．３ｍＭとなるように添加した。ＰＣＯを添加する場合にはシュードモナス属由来のＰＣＯ（東洋紡製品）を０．４５Ｕ／ｍＬとなるように添加した。ｐＨＢＨを添加する場合にはシュードモナス属由来のｐＨＢＨ（東洋紡製品）を１．５Ｕ／ｍＬとなるように添加した。水酸化ナトリウムで最終的にｐＨを９．５に調整したものを第一試液とした。
［ＣｈＥ活性測定用第二試液］２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）にｐＨＢＣを３ｍＭとなるように添加した。ＰＣＯを添加する場合にはシュードモナス属由来のＰＣＯ（東洋紡製品）を０．９０Ｕ／ｍＬとなるように添加した。ｐＨＢＨを添加する場合にはシュードモナス属由来のｐＨＢＨ（東洋紡製品）を３．０Ｕ／ｍＬとなるように添加した。最終的に塩酸でｐＨを６．５となるように調整したものを第二試液とした。
［ＰＣＯとｐＨＢＨを添加した試液］ＰＣＯとｐＨＢＨをそれぞれＣｈＥ活性測定用第一試液、第二試液のいずれに添加したかは、表１に記載した。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
［試液の保存条件］ＣｈＥ活性測定用第一試液及び第二試液を調製後、それぞれ３０℃で５日間保存した。
［ｐＨＢＨ活性測定用試薬］５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ８．２）にｐ−ヒドロキシ安息香酸　０．５ｍＭ、ＮＡＤＰＨ　０．３ｍＭ、フラビンアデニンジヌクレオチド　２０μＭの濃度となるように溶解したものをｐＨＢＨ活性測定用試薬とした。
［ｐＨＢＨ活性測定方法］ｐＨＢＨ活性測定用試薬３．０ｍＬをキュベットに分注し、３７℃で約５分間、予備加温した後に、ｐＨＢＨを含有するＣｈＥ活性測定用第一試液あるいは第二試液０．０５ｍＬを添加した。攪拌した後に、３７℃に制御された分光光度計で３４０ｎｍの吸光度を水を対照として３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化量を求めた。盲検は第一試液あるいは第二試液の代わりにｐＨＢＨを含有しない精製水を用いて同様に操作し、１分間当たりの吸光度変化量を求めた。盲検値をｐＨＢＨを含む試料を用いて操作した場合の１分間当たりの吸光度変化量から差し引き、ｐＨＢＨ活性とした。この結果を表２に示した。
【００１７】
【表２】
2004033029.tif 000004
＊残存活性（％）は、調製直後の各試薬中でのｐＨＢＨ活性を１００として、保存後のｐＨＢＨ活性を相対的に表した値。
【００１８】
表２の結果から明らかなように、ｐＨＢＨは第二試液中では安定であるが、第一試液中では不安定であった。また、ｐＨＢＨの安定性にはＰＣＯの共存は影響しないことが判明した。この結果から、ＣｈＥ測定用試薬に用いるｐＨＢＨは第二試液中に添加することとした。
【００１９】
【参考例２】
ＰＣＯ及びｐＨＢＨのＣｈＥ活性測定用試液での配置とＰＣＯの保存安定性
［ＣｈＥ活　性測定用第一試液］参考例１に記載のＢ及びＤ。
［ＣｈＥ活性測定用第二試液］参考例１に記載のＢ及びＤ。
［試液の保存条件］参考例１と同じ。
［ＰＣＯ活性測定用試薬］５０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）にプロトカテキュ酸を０．４ｍＭの濃度となるように溶解したものをＰＣＯ活性測定用試薬とした。
［ＰＣＯ活性測定方法］ＰＣＯ活性測定用試薬３．０ｍＬをキュベットに分注し、３７℃で約５分間、予備加温した後に、ｐＨＢＨを含有するＣｈＥ活性測定用第一試液あるいは第二試液０．０５ｍＬを添加した。攪拌した後に、３７℃に制御された分光光度計で２９０ｎｍの吸光度を水を対照として３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化量を求めた。盲検はＣｈＥ活性測定用第一試液あるいは第二試液の代わりにＰＣＯを含有しない精製水を用いて同様に操作し、１分間当たりの吸光度変化量を求めた。盲検値をＰＣＯを含む試料を用いて操作した場合の１分間当たりの吸光度変化量から差し引き、ＰＣＯ活性とした。その結果を表３に示した。
【００２０】
【表３】
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＊残存活性（％）は、調製直後の各試薬中でのＰＣＯ活性を１００として、保存後のＰＣＯ活性を相対的に表した値。
【００２１】
表３の結果から明らかなように、ＰＣＯは第一試液中、第二試液中のいずれにおいても安定であった。また、ＰＣＯの安定性にはｐＨＢＨは影響を与えないことが判明した。この結果から、ＣｈＥ測定用試薬に用いるＰＣＯは第一試液、第二試液のいずれにも添加できることが判明した。
【００２２】
【参考例３】
ＰＣＯ及びｐＨＢＨのＣｈＥ活性測定用試液での配置とＮＡＤＰＨの保存安定性
［ＣｈＥ活性測定用第一試液］参考例２と同じ。
［試液の保存条件］参考例１と同じ。
【００２３】
［ＮＡＤＰＨ測定用試薬］５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を緩衝液として用いた。この緩衝液にα−ケトグルタル酸を３５ｍＭ、塩化アンモニウムを３５ｍＭとなるように添加後、水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に再調整し、さらにプロテウス属由来のグルタミン酸脱水素酵素を７０Ｕ／ｍＬとなるように添加したものを酵素液として用いた。
【００２４】
［ＮＡＤＰＨ測定法］ＣｈＥ活性測定用第一試液０．４ｍＬに対してＮＡＤＰＨ測定用試薬の緩衝液を２．０ｍＬ加え、３７℃で５分間加温後に３４０ｎｍでの吸光度を測定した。さらにＮＡＤＰＨ測定用試薬の酵素液０．６ｍＬを加え、３７℃で５分間加温後に３４０ｎｍでの吸光度を測定した。ＮＡＤＰＨ測定用試薬の酵素液添加後の吸光度値から添加前の吸光度値に０．８（注）を乗じた値を差し引いた値を演算吸光度とした。盲検はＣｈＥ活性測定用第一試液の代わりに精製水を用いて同様に操作し、演算吸光度を求めた。盲検値をＣｈＥ活性測定溶第一試液を用いて操作した場合の演算吸光度から差し引き、ＮＡＤＰＨ量とした。この結果を表４に示した。
【００２５】
（注）ＮＡＤＰＨの定量はＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化させ、３４０ｎｍで減少する吸光度値を測定することによって行う。
しかしながら、３４０ｎｍによる吸光度減少は、ＮＡＤＰＨ測定用試薬の酵素液添加後にＮＡＤＰＨがＮＡＤＰへと酸化される反応に由来する以外に、ＮＡＤＰＨ測定用試薬の酵素液が添加されてＮＡＤＰＨを含む溶液が希釈されることにも由来する。
この希釈による影響を除外するために、希釈による３４０ｎｍにおける吸光度減少分を差し引く。
このＮＡＤＰＨ測定用試薬の酵素液による希釈率は、ＮＡＤＰＨ測定用試薬の酵素液添加前後での液量から下式で計算される。
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【００２６】
【表４】
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＊ＮＡＤＰＨの残存量（％）は、調製直後の各試薬中でのＮＡＤＰＨ量を１００として、保存後のＮＡＤＰＨ量を相対的に表した値。
【００２７】
表４の結果から明らかなように、ＰＣＯはＮＡＤＰＨの安定性には影響を与えないことが判明した。この結果から、ＣｈＥ測定用試薬に用いるＰＣＯは第一試液、第二試液のいずれにも添加できることが判明した。
【００２８】
【参考例４】
ＰＣＯ及びｐＨＢＨのＣｈＥ活性測定用試液での配置とｐＨＢＣの保存安定性
［ＣｈＥ活性測定用第二試液］参考例２と同じ。
［試液の保存条件］参考例１と同じ。
［ｐＨＢＣ中のｐＨＢＡ測定用試薬及び遊離のｐＨＢＡ測定用試薬］参考例１のＡの第一試液と同じ。
【００２９】
［ｐＨＢＣ中のｐＨＢＡ測定法］ＣｈＥ活性測定用試薬の第二試液Ｂ及びＤ各１．０ｍＬに１．０ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えて沸騰水浴中で３０分間加熱後、３．０ｍＬの１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えた。これから２ｍＬを分取し、ｐＨＢＣ中のｐＨＢＡ測定用試薬１ｍＬを加え、室温で５分間放置後に３４０ｎｍでの吸光度値を求めた。盲検にはＣｈＥ活性測定用試薬の第二試液の代わりに５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用い、３４０ｎｍでの吸光度値を求めた。この盲検での吸光度値をＣｈＥ活性測定用第二試液を用いて得られた吸光度値から差し引いた。この吸光度値に０．１６４（注１）を乗じてｐＨＢＣをｐＨＢＡに換算した濃度（ｍｇ／ｍＬ）を求めた。
【００３０】
（注１）ＣｈＥ活性測定用第二試液中に存在するｐＨＢＣ中のｐＨＢＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、ｐＨＢＣを水酸化ナトリウムでｐＨＢＡに変化させ、さらにｐＨＢＡにＮＡＤＰＨの存在下でｐＨＢＨを作用させると、ＮＡＤＰＨが酸化されてＮＡＤＰとなり、３４０ｎｍでの吸光度が減少することを利用して求められる。
すわわち、３４０ｎｍで減少する吸光度値から減少したＮＡＤＰＨ量を計算すれば、ｐＨＢＡ量が求められる。
減少したＮＡＤＰＨ量は、減少した吸光度値をＮＡＤＰＨの１モルあたりの吸光度値（６．３×１０３）で割ることにより、モル濃度として計算される。
この減少したＮＡＤＰＨのモル濃度にｐＨＢＡの分子量（１３８．１２）を乗ずることにより、ｐＨＢＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）が求められる。
ただし、ｐＨＢＣを含むＣｈＥ活性測定用試薬の第二試液は、ｐＨＢＡ測定前に５倍に希釈、ｐＨＢＣ中のｐＨＢＡ測定用試薬によってさらに１．５倍に希釈されるので、最終的に７．５倍に希釈されている。
従って、求めるｐＨＢＡ濃度は以下の計算式によって求められる。
2004033029.tif 000009
【００３１】
［遊離のｐＨＢＡ測定法］ＣｈＥ活性測定用試薬の第二試液２．０ｍＬにｐＨＢＡ測定用試薬１ｍＬを加え、室温で５分間放置後に３４０ｎｍでの吸光度値を求めた。盲検にはＣｈＥ活性測定用試薬の第二試液の代わりに精製水を用い、３４０ｎｍでの吸光度値を求めた。この盲検での吸光度値をＣｈＥ活性測定用第二試液を用いて得られた吸光度値から差し引いた。この吸光度値に０．０３２９（注２）を乗じて遊離のｐＨＢＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）を求めた。その結果を表５に示した。
【００３２】
（注２）ＣｈＥ活性測定用第二試液中に存在する遊離ｐＨＢＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、ｐＨＢＡにＮＡＤＰＨの存在下でｐＨＢＨを作用させると、ＮＡＤＰＨが酸化されてＮＡＤＰとなり、３４０ｎｍでの吸光度が減少することを利用して求められる。
すわわち、３４０ｎｍで減少する吸光度値から減少したＮＡＤＰＨ量を計算すれば、ｐＨＢＡ量が求められる。
減少したＮＡＤＰＨ量は、減少した吸光度値をＮＡＤＰＨの１モルあたりの吸光度値（６．３×１０３）で割ることにより、モル濃度として計算される。
この減少したＮＡＤＰＨのモル濃度にｐＨＢＡの分子量（１３８．１２）を乗ずることにより、ｐＨＢＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）が求められる。
ただし、ｐＨＢＡを含むＣｈＥ活性測定用試薬の第二試液はｐＨＢＡ測定用試薬によって１．５倍に希釈されている。
従って、求めるｐＨＢＡ濃度は以下の計算式によって求められる。
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【００３３】
【表５】
2004033029.tif 000011
＊ｐＨＢＡの量（％）は、調製直後の各試薬中でのｐＨＢＣのｐＨＢＡ換算値を１００として、保存によりｐＨＢＣが分解して生じた遊離ｐＨＢＡ濃度を相対的に表した値。
【００３４】
表５の結果から明らかなように、ｐＨＢＣの安定性にとっては、ＣｈＥ測定用試薬に用いるＰＣＯを第二試液に添加するよりも第一試液に添加した方が良いことが判明した。
【００３５】
【実施例】
本発明によるＣｈＥ活性測定用試薬
［ＣｈＥ活性測定用第一試液］１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）にＮＡＤＰＨを０．３ｍＭとなるように添加した。さらにシュードモナス属由来のＰＣＯ（東洋紡製品）を０．４５Ｕ／ｍＬとなるように添加した。水酸化ナトリウムで最終的にｐＨを９．５に調整したものを第一試液とした。
［ＣｈＥ活性測定用第二試液］２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にｐＨＢＣを３ｍＭとなるように添加した。さらにシュードモナス属由来のｐＨＢＨ（東洋紡製品）を３．０Ｕ／ｍＬとなるように添加した。最終的に塩酸でｐＨを６．５となるように調整したものを第二試液とした。
【００３６】
［試液の保存条件］第一試液及び第二試液を調製後、それぞれ２〜１０℃で保存した。
［測定試料］ヒト血漿より精製したＣｈＥを約８００Ｕ／Ｌとなるように生理的食塩水で溶解し、さらに生理的食塩水を用いて１０段階の等差希釈系列を作成し、測定用試料とした。この他にヒト血清１００検体を測定した。
［ＣｈＥ活性測定方法］日立７１７０形自動分析装置を用い、表６に記載の測定条件でＣｈＥ活性を測定した。
［測定結果］測定試料として精製水を用いて測定した際の初期吸光度（最初の測光ポイントにおける吸光度値で、反応混液中でのＮＡＤＰＨ量を反映する）を表７に、また、図１にＣｈＥの希釈系列の測定結果を示した。
【００３７】
【表６】
2004033029.tif 000012
【００３８】
【表７】
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【００３９】
【比較例】
従来の技術によるＣｈＥ活性測定用試薬
［第一試液］１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）にＮＡＤＰＨを０．３ｍＭとなるように添加した。水酸化ナトリウムで最終的にｐＨを９．５に調整したものを第一試液とした。
［第二試液］２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）にｐＨＢＣを３ｍＭとなるように添加した。さらに、シュードモナス属由来のＰＣＯ（東洋紡製品）を０．９０Ｕ／ｍＬ、シュードモナス属由来のｐＨＢＨ（東洋紡製品）を３．０Ｕ／ｍＬとなるように添加した。最終的に塩酸でｐＨを６．５となるように調整したものを第二試液とした。
［試液の保存条件］実施例と同じ。
［測定試料］実施例と同じ。
［ＣｈＥ活性測定方法］実施例と同じ。
【００４０】
測定試料として精製水を用いて測定した際の初期吸光度（最初の測光ポイントにおける吸光度値で、反応混液中でのＮＡＤＰＨ量を反映する）を表８に、また、図２にＣｈＥの希釈系列の測定結果を示した。
【００４１】
【表８】
2004033029.tif 000014
【００４２】
実施例と比較例におけるヒト血清１００検体の測定値を比較した結果を図３に示した。
【００４３】
【発明の効果】
前記実施例と比較例の結果から、以下の点が確認された。従来の技術であるＣｈＥ活性測定用試薬に比べて本発明の方が経時的な初期吸光度の低下は小さい結果が得られた。さらに従来技術では経時的に直線性能が低下するのに対し、本発明では経時的な直線性能の低下が認められず、優れた保存安定性を示した。
【００４４】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例におけるコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）の希釈系列の測定結果を示す。
【図２】比較例におけるコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）の希釈系列の測定結果を示す。
【図３】本発明の実施例と比較例におけるヒト血清１００検体の測定値を比較した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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