(57)【要約】【課題】　プリズム・ベースによる流動細胞測光計の励起光学系を提供する。【解決手段】　プリズム・ベースによる細胞測光計の励起光学系は、光源により提供される複数のビームを、向き直し、成形し、結合させ、その結果、対物レンズにより、それらを、細胞測光計のフローセルのチャネル内の僅かに離されたスポットに、集束させることができる。取付けられた分散プリズムの組は、分離された入射を有するビームが、実質的に定位置において重なり合い互いにほぼ平行となって最終プリズムから放射するように、異なる波長のビームを向き直させる。特定の配向及び位置を備えて、取付けられた組の４つの別個の二等辺三角形プリズムを有する好ましい実施の形態が説明されているが、特定の設計パラメータは、ビームの波長の選択、フローセル内のスポット間隔及びプリズム材料の選択により変更してもよい。プリズム系は、ミラー・ベースの光学系と比較して、本来的には、より優れた熱的及び長期的安定性とを有する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
　流動細胞測光計システムにおける、励起光ビームを細胞測光計のフローセルに送るための励起光学系であって、
　異なる波長の光ビームを生成する複数の光源と、
　分散プリズム要素の取り付けられた組であって、前記光源からの全ての光ビームが、連続する各プリズム要素を通過し、かつ前記プリズム要素により異なる量だけ屈折されるように連続して配置され、連続する最終のプリズム要素からの屈折されたビームが実質的に重なり合い、互いにほぼ平行となり、楕円形となるように、光ビームの入射位置及び入射角が選択された、連続して配置された分散プリズム要素の取り付けられた組と、
　最終プリズム要素からのビームを、細胞測光計のフローセル内の僅かに離されたスポットに、集束させる対物レンズと
を備えることを特徴とする細胞測光計の励起光学系。
【請求項２】
　ほぼ平行に屈折されたビームは、最終のプリズム要素の出射面において１°未満の角間隔を有していることを特徴とする請求項１に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項３】
　光ビームは、プリズム要素と定位置関係にある取り付け用の出射結合器を備える光ファイバを介して、取り付けられた分散プリズム要素の組に送られることを特徴とする請求項１に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項４】
　光ビームは、光源がプリズム要素と定位置関係に取り付けられて、取り付けられた分散プリズム要素の組に直接に送られることを特徴とする請求項１に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項５】
　光ビームの少なくとも１つは、取り付けられた光源からの該ビームをプリズム要素に向ける取り付けられた光学ウェッジ部品を介して取り付けられた分散プリズム要素の組に送られ、該光源及びウェッジ部品はプリズム要素に定位置関係で取り付けられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項６】
　光源、光ビーム及び波長の数は３つであることを特徴とする請求項１に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項７】
　光ビームの１つは、約３９５ｎｍから４２０ｎｍまでの範囲の波長を有していることを特徴とする請求項６に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項８】
　光源の１つは、４８８ｎｍの波長の光ビームを提供するアルゴン・レーザであることを特徴とする請求項６に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項９】
　光ビームの１つは、約６３３ｎｍから６４０ｎｍまでの範囲の波長を有していることを特徴とする請求項６に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項１０】
　プリズム要素の数は４つであることを特徴とする請求項１に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項１１】
　各プリズム要素は、特定の頂角を備えた別個の二等辺三角形プリズムであることを特徴とする請求項１０に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項１２】
　プリズムの頂角が２９°であり、第１及び第３のプリズム要素の各々は、そのプリズムの出射面と垂直線との間の配向角が３１．２３３°で頂点が上向きに取り付けられ、第２及び第４のプリズム要素の各々は、そのプリズムの出射面と垂直線との間の配向角が６．４７°で頂点が下向きに取り付けられ、プリズムの出射面の中心は、座標（−７５．０，１９．１）、（−５０．０，１１．２）、（−２５．０，７．９）及び（０．０，０．０）を有しており、かつプリズムは、実質的にＳｃｏｔｔ光学ガラスＬＦ５（５８１４０９）のフリント・ガラス材料からなることを特徴とする請求項１１に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項１３】
　波長４０５ｎｍの第１光ビームは、第１プリズム要素において−３．７１３°の入射角と（−７９．８２，２３．３２）の入射座標とを有し、波長４８８ｎｍの第２光ビームは、０．０°の入射角と（−８１．４４、２２．４０）の入射座標とを有し、波長６４０ｎｍの第３の光ビームは、＋３．２０９°の入射角と（−８２．８８、２１．５７）の入射座標とを有していることを特徴とする請求項１２に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項１４】
　光源の数には、６．９０４°の入射角を有する３５１ｎｍの光ビームを提供するアルゴン・イオン・レーザが含まれていることを特徴とする請求項１に記載の細胞測光計の励起光学系。
【請求項１５】
　第１及び第４のプリズムは頂点が上向きに取り付けられ、第２及び第３のプリズムは頂点が下向きに取り付けられ、プリズムは、プリズムの組を通る１つのビームの入射及び出射が同一線上になるように、位置され、配向されていることを特徴とする請求項１１に記載の細胞測光計の励起光学系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、励起光を細胞測光計のフローセルに送るための光学システムに関し、かつ、ほぼ平行な、僅かに離され又は重なり合うビームの共通の光路に、異なる波長の光ビームを向けて結合させるための光学システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
　商業的に入手可能な細胞測光計システムは、細胞内におけるサンプル物質を蛍光発光させるために、１つ以上の集束された光ビームを、細胞測光計のフローセルに送る幾種類かの励起システムのいずれかを用いている。既存システムの励起光学系は、典型的には、反射により、光をレーザ源から細胞位置に導く１つ以上のミラーに基づいている。ミラーには、レーザをどの位置に取付けるかについて、ある程度の自由度が与えられる。市販のレーザは、様々な異なる形状、大きさ及び取付け用の特徴をもって流通しているため、その付加された柔軟性は、好都合である。しかしながら、ミラーの取付け台は、これらのシステムの保守諸経費及び長期的信頼性に影響する不安定性の潜在的発生源となっている。
【０００３】
　典型的な細胞測光計システムは、例えば互いに１ｍｍ以内の、ほぼ同位置に送られる幾つかの波長の励起光を必要とする。異なる波長のビームは、典型的には、二色性ミラーを用いることにより結合される。二色性ミラーは、それらを通して送信される光の約１５％を失い、かつ又それらから反射された光の約５％を失う傾向にあるため、これらのミラーは、励起システムの潜在的効率性を減少させる傾向にある。これらも前述の不安定性問題の一因になる。
【０００４】
　ミラー配向におけるあらゆる変化すなわち大きさΔθの傾きは、２・Δθの光反射角の変化をもたらすので、ミラー・ベースのシステムにおいては、不安定性がある程度発生する。殆どのシステムは多数の連続したミラーを有しているので、各ミラーが、この問題を増幅する。殆どのシステムは、多くの場合、１日に１回程度の頻度で周期的な位置の再調整を必要とする。これは、困難な時間のかかる作業にもなり得る。他のシステムは、極めて安定化すべく特別に設計されたミラーの取付け台を用いており、そのことにより、それらは、時間が経過したり、又は温度変化によって直ぐにずれたりすることはなく、従って、あまり頻繁に位置の再調整を必要としないことになる。しかしながら、これらの特別な取付け台は、非常に高価となりがちである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　本発明の目的は、二色性又は他のミラーの使用を避けて、少数の安価な構成部品で構成し得る、実質的には、より熱的及び長期的安定性を有する流動細胞測光計の励起システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　多数のレーザビームを結合させ、結合された該ビームを細胞測光計のフローセルに向けさせるためのプリズムに基づいた励起光学系が、この目的に合致する。二色性ミラーとは異なり、プリズムの透過率は通常９９％以上であり、より一層の励起効率をもたらす。かつ、あらゆる種類のミラーとも異なり、変化すなわち大きさΔθのプリズムの配向における傾きは、出射ビーム角をΔθよりもはるかに小さくしか変化させず、そのため、取付けられた各プリズム要素は、本来的に、対応するミラー要素よりも大幅に安定している。全てのレーザビームは、共通するプリズムの組を通過する。異なる波長のレーザビームを結合させるのに影響を与えるために、屈折プリズム材料による分散が用いられている。さらに、該プリズムは楕円形ビームを生成する。
【０００７】
　本発明による励起システムは、一連のプリズムに入射される異なる波長のビームを放射する複数の光源を含む。レーザビームは、光ファイバを介して第１プリズムに供給されるか、又はビームが直接第１プリズムまで進むように、レーザが配置されてもよい。或いは１つ以上のレーザビームを正しい入射角に曲げるために、ウェッジ部品が用いられてもよい。任意の数のプリズムを用いることができるが、プリズムを多くすると、入射ビームの間隔を大きくすることが可能になり、プリズムを偶数にすると、波長の１つの出射ビームをその入射ビームと平行にすることが可能になる。１つのプリズム配置においては、１つの波長の入射ビームと出射ビームとが一直線上にもなる。４つのプリズムを備えたシステムが好ましい。プリズムを出射する光ビームは、これらが最終プリズムから僅かに異なる出射角（例えば、１０´のアーク差）を有するように設計されているけれども、空間的には、これらが互いに重なり合うという意味において、結合されている。結合されたビームは、対物レンズのシステムにより細胞測光計のフローセルに集束される。異なるビームの僅かに異なる出射角は、異なる各波長光がフローセル内で僅かに異なるスポット（例えば、２００μｍのスポット間隔）に集束することを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
　図１から図３を参照すると、本発明のプリズム・ベースによる光学系を組み入れている流動細胞測光計の励起システムが示されている。図示されていないが、３つのレーザが、異なる波長の照射光ビームを生成し、これらは、システムにリンクされた光ファイバを通して、取付け台により方向付けられる。第１、第２及び第３の光ファイバの取付け台１１、１２及び１３は、それぞれに、レーザからの照射光を導く光ファイバを受容する。光ファイバの取付け台は、それ自体がプレート１９上に取付けられており、該プレートはブレース２２によりプラットフォーム２０に固定されている。ブレース２２は、プレート１９が定位置に保持されることを保証している。
【０００９】
　一連のプリズム２３から２６が用いられ、照射ビームを、実質的に共通の光路を有する（僅かに離され又は重なり合い、かつほぼ平行な）照射光に結合させる。プリズムはまた、ビームを成形する。（光ビームは、流れストリームのコアの中央位置で照射エネルギーを集中させ、照射点においては楕円形になることが好ましい。）光は、連続するプリズム２３から２６を通して方向付けられているため、異なる波長の照射ビームは、該プリズムにより特異に屈折され、そのことにより、該ビームは、フローセル内の照射位置で、向き直され、位置合わせされる。
【００１０】
　プリズム２３から２６は、プレート２１に取付けられ、該プレートは、ブレース２７によりプラットフォーム２０に固定されている。レーザ・ファイバ結合用の取付け台は、各要素を定位置に配置するシステムの設定時に、再調整され得る。これは、取付け台を各要素に合わせて別個に調整するか、又は多数の要素と一緒すなわち両方ともに移動されるように該要素が取付けられるプレートを再配置するか、そのいずれかにより実行され得る。
【００１１】
　照射ビームは、プリズム・ベースによる結合光学系を通過し、次に、レンズ取付け台３１内に保持された対物レンズ系３０を通過する。レンズ取付け台３１は、プラットフォーム２０上に取付けられたレンズ位置決めブロック３３のプレート６１に固定されたアーム６０から延びている。位置決めブロック３３に関連付けられた一組のノブ３４から３６は、対物レンズ３０の位置を調整するために、直交軸ｘ、ｙ及びｚに沿い、レンズ取付け台３１を移動させる。
【００１２】
　照射ビームは、対物レンズ３０を通過し、細胞測光計のフローセル４１の流れチャネル内に集束される。ビームを結合することに加えてプリズム２３から２６はまた、該ビームを楕円形に形成する。粒子が流れチャネルを通過し、かつ照射光ビームを横切るときに、光は、該粒子により散乱させられ、蛍光が発光されることになる。前方の散乱光は、光散乱検出器４３により検出されることになる。大きな角度の散乱光のみならず発光蛍光も同様に、ハウジング５０内に収容されている発光集光レンズにより、集光されることになる。ハウジング５０内に収容されているフローセル４１、光散乱検出器４３及び発光集光レンズは、ブレース２９によりプラットフォーム２０上の適所に保持されるプレート３９に、全て取付けられている。
【００１３】
　図１から図３のシステムにおいて、光ビームを導き、該ビームを所望の照射配向に向き直させ、散乱発光された蛍光を集光するための光学系は、全て定位置に保持される。さらに、フローセルもまた、定位置に保持される。これらの要素は、それぞれプレート上に取付けられており、機器が据え付けられるときに、初めに位置調整されることが必要である。これらの要素の定期的な位置の再調整は、必要とされないことになる。照射レンズは、定期的に位置が再調整される場合がある。しかしながら、単一要素の位置調整は、時間及び位置調整の難しさを大幅に簡素化する。
【００１４】
　ビームを向き直させ結合させるプリズム・ベースによる光学系を用い、該光学系を定位置に取付けることにより、ミラー（及びミラーに付随する光損失又はミラーの不安定度の特性）を必要とせず、光学的要素を頻繁に再調整すべきことを回避して、照射ビームを単一照射ビームに結合させる方法を提供している。フローセルの位置を固定することは、流れチャネルと照射光学系並びに検出光学系との間の距離を一定に保たせることを可能にする。このことは、照射光学系並びに検出光学系もまた、定位置に配置させることを可能にする。また、定位置のフローセル及び集光光学系を有することは、該フローセルが、集光された光の損失を最小限に抑えるように集光レンズに接続されることを可能にする。
【００１５】
　図３から図５を参照すると、プリズム・ベースによる光学系の好ましい実施の形態は、固定支柱すなわちピン、機械的クランプ、又は接着剤のような標準的取付け要素２９によって、特定の配向にプレート２１に取付けられた４つの分散プリズム２３から２６を有する。プリズムの分散は、異なる波長の入射ビームを、一連のプリズムの最後に続く重なり合う位置に結合させる。次に、最終レンズ３０は、最後のプリズム２６から出射する光を、細胞測光計のフローセル４１の流れチャネル内の僅かに離されたスポットに集束させる。図３から図５に示された実施の形態においては、３つの異なる波長の３つの光ビームは、流れチャネル内の３つのスポットに導かれているが、用いられるビーム数は変更可能である。ビームを向き直させ、ビームを減少することに加えて、光ビームはまた、それらを楕円形に形成するために、プリズム２３から２６により、再成形される。流動細胞測光計の用途においては、円形ビームよりも楕円形ビームが、より優れた分解能を提供する。
【００１６】
　プリズム２３から２６を配置するには幾つかの方法がある。図３から図５に見られる好ましい構成においては、プリズムが、二等辺三角形の形状をしたＳｃｈｏｔｔ光学ガラスの型式ＬＦ５（５８１４０９）からなり、２９°の頂角を有する。他の光学材料、プリズム形状（例えば、正三角形プリズム）及びプリズムの頂角が、適切な配向及び位置修正を加えて用いられてもよい。プリズムは、好ましい実施の形態においては、離れていることが分る。しかしながら、Ｚｅｎｇｅｒ及びＷｅｒｎｉｃｋｅのプリズム構造のような異なる光学材料（異なる屈折率）の接合されたプリズム構造もまた、（容易に入手可能な光学設計用のソフトウェアで求められる）適切な設計修正を加えて、用いられてもよい。異なる波長の入射ビームを、実質的に重なり合い、実質的に平行な出射ビーム（例えば、１°以下の出射角間隔、好ましくは、１０´だけのアーク間隔）に向け直し再成形する分散プリズムの配置は、受け入れ可能である。
【００１７】
　図３から図５において、プリズムの配向角θ１及びθ２は、それぞれ３１．２３３°及び６．４７°である。第１プリズム２３及び第３プリズム２５は、頂点が上に向けられる一方で、第２プリズム２４及び第４プリズム２６は、頂点が下に向けられている。点Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、プリズム２６、２５、２４及び２３のプリズム面の中心にある。（図５の軸により示される方向を参照して）それらの（Ｘ、Ｙ）座標の位置は、ミリメートル単位で、それぞれ下記の通りである。
Ａ＝（０．０，０．０）
Ｂ＝（−２５．０，７．９）
Ｃ＝（−５０．０，１１．２）
Ｄ＝（−７５．０，１９．１）
【００１８】
　これらの位置及び配向によって、例えば、４０５ｎｍ（紫）、４８８ｎｍ（青）及び６４０ｎｍ（赤）などの異なる波長の３つのビームは、適切な入射点Ｅ１、Ｅ２及びＥ３において適切な入射角で第１プリズム２３内に入射され、点Ａでの実質的に重なり合う位置におけるプリズム２６からの出射までに、プリズム２３から２６により、向き直されることになる。以下の表は、特定波長の３つのビームについての入射座標及び入射角を示す。その位置及び角度は、異なる波長が選択された場合には、異なることになる。例えば、１つの波長は、約３９５ｎｍと４２０ｎｍとの間に入るかもしれない。第２の波長は、アルゴン・イオン・レーザにより提供され得るものであり、４８８ｎｍ又は３５１ｎｍの波長を有している。第３の波長は、約６３３ｎｍと６４０ｎｍとの間の範囲内に入るかもしれない。所与の波長についての入射パラメータは、プリズム面の角度及び特定波長についてのプリズム材料（例えば、ＳｃｈｏｔｔガラスＬＦ５）の屈折率を用いて、点Ａについての出射座標（０，０）及び点Ａでの所望の出射角（例えば、−０．１６８５°、０°、＋０．１６８５°）から逆算することにより、求めることができる。これは、通常、光学設計のソフトウェアを用いてなされる。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
　これらの４０５ｎｍ、４８８ｎｍ及び６４０ｎｍのビームは、−０．１６８５°、０°及び＋０．１６８５°の角度をなして、点Ａから出射する。６８ｍｍの有効焦点距離を有する対物レンズ３０によって、そのビームは、細胞測光計のフローセル４１のチャネル内のそれぞれの焦点で２００μｍの間隔を有することになる。
【００２１】
　図１及び図２に示される実施の形態は、光学装置のプレート１９上に取付けられた単一モードの光ファイバの出射結合器１１から１３を備えたレーザのファイバ結合を用いている。これは、該レーザを、熱の影響がないシステムの領域内に遠く離して取付けことができることを意味する。（流動細胞測光計の用途において用いられる幾つかのレーザは、１０００Ｗを越える熱を発生する。）遠く離して取付けることはまた、レーザ・パッケージの異なる形状及び取付け用特徴に対応させることを非常に容易にする。最も重要なことに、ファイバ取付け台は、２μｒａｄ／°Ｃ以下のビームの位置決め安定性を有している。ミラーに代替するプリズムの使用によりもたらされる固有の安定性改善とあいまって、高価な取付け台の必要性は、実質的に軽減される。
【００２２】
　図６において、１つの変形例は、（最大３５％までの光損失を有することがある）光ファイバを用いずに、例えば、特定角度で光学装置のプレートにさらに取付けられているレーザ１１１から１１３を用いて、レーザビーム１１５から１１７を直接プリズム１２３に放射している。図７において、別の変形例は、１つ以上のレーザビーム２１５から２１７を所望角度及び所望入射位置に曲げる（ここでは、２１５及び２１７だけがこのように曲げられている）のに、ウェッジ部品２１８から２２１の組を用いている。ウェッジ部品２１８から２２１は、僅かではあるがより高い熱及びずれの不安定性の犠牲を払い、いかに該レーザが位置決めされるかについて、より大きな自由を与える。しかしながら、この構成は、ミラーを用いるシステムに比べるとより頑丈である。
【００２３】
　図８は、図３から図５に示された配置とは異なるプリズム３２３から３２６の配置を示す。ここでは、第２対のプリズム要素３２５及び３２６の配向が、図３から図５における対の２５及び２６との関連では反転されている。すなわち、第１プリズム３２３と第４プリズム３２６とは、頂点が上に向けられ、第２プリズム３２４と第３プリズム３２５とは、頂点が下に向けられている。その上、４つのプリズムの配置は、中間の２つのプリズム３２４及び３２５が、この図における外側のプリズム３２３と３２６より垂直方向により低く見えるように、変えられている。図３から図５の場合と同様に、図８における配置もまた、レーザビームを結合し、それらを再成形して、それらを楕円形に形成する。図８の配置についての利点は、結合された出射ビーム３３０が、中央の入射ビーム３１６と実質的に平行であるばかりでなく、同一線上になることである。潜在的な不都合は、図８における入射ビーム３１５から３１７間の角間隔が、図３から図５における入射ビーム間の角間隔よりも小さくなるということである。
【００２４】
　プリズム配置における他の変形が可能である。例えば、任意の数のプリズムを用いることができる。４つの代わりに２つのプリズムを用いる場合には、入射の角間隔は、相当する４つのプリズムの配置よりも小さくなる。６つのプリズムは、さらにより大きい入射の角間隔を可能にするが、取付けられる追加要素という代償及び不安定性の潜在的増加という代償を払うことになる。同じように、単一プリズムは、同じく重なり合う近接した平行出射を達成するために入射ビームのさらにより小さな角間隔を持たせることになるが、出射ビームのいずれもが、その対応する入射ビームとは平行とはならないことになる。それにもかかわらず、これらの代替技術はやはり、細胞測光計のフローセル内で僅かに離されて集束されたスポットを生成するのに必要とされる異なる波長のビームの分散結合を、提供することになる。各構成の熱的及び長期的安定性は、取付けられた同じ数の構成部品を有するミラー・ベースのシステムに比べ、遥かに優れていることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明による流動細胞測光計の励起システムの斜視図である。
【図２】本発明による流動細胞測光計の励起システムの側面図である。
【図３】図２の励起システムにおけるプリズム配置の拡大図である。
【図４】図１から図３に見られる実施の形態の主要光学構成部品の概略図である。
【図５】好ましいプリズム設計の特定の主要パラメータを示す図４の実施の形態におけるプリズムの概略図である。
【図６】レーザ源からの光をプリズムの１つ目に結合する異なる方法を示す別の実施の形態の概略図である。
【図７】レーザ源からの光をプリズムの１つ目に結合する異なる方法を示す別の実施の形態の概略図である。
【図８】図４に見られる配置とは別のプリズム配置を図示する概略図である。
【符号の説明】
【００２６】
１１，１２、１３：光ファイバ取付け台
２３，２４，２５、２６：プリズム
３０：対物レンズ
３１：レンズ取付け台
４１：フローセル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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