(57)【要約】【課題】作用機構および制御機構が今までの手段とは異なる、新規な細胞増殖の制御手段を提供すること、特に、新規な組織特異的な細胞増殖制御剤を提供することである。【解決手段】Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子を提供する。当該タンパク質は、特定の器官または組織の形成過程において、細胞増殖に関連する役割を持つことが判明した。その為、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質の発現または活性を制御することにより細胞増殖の制御が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質を有効成分とする、組織特異的な細胞増殖制御剤。
【請求項２】
Ｐａｘ６タンパク質およびＦｏｘｅ３タンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質を有効成分とし、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質の作用を制御することを特徴とする、組織特異的な細胞増殖制御剤。
【請求項３】
Ｐａｘ６タンパク質およびＦｏｘｅ３タンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質を、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質と共に使用することを特徴とする、組織特異的に細胞増殖を制御する方法。
【請求項４】
Ｐａｘ６遺伝子およびＦｏｘｅ３遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子を、Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子と共に使用することを特徴とする、組織特異的に細胞増殖を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織特異的に細胞の増殖を制御するタンパク質およびその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、Ｍａｂ−２１ファミリーの脊椎動物の発生過程における重要性が、ゼブラフィッシュ、カエル、マウスを用いた解析から示唆された。ゼブラフィッシュのＡｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  （ａｃｅ）変異体と  ｎｏ  ｉｓｔｈｍｕｓ  （ｎｏｉ）変異体で、Ｍａｂ２１Ｌ２の発現が変化することから、Ｍａｂ２１Ｌ２が中脳後脳境界領域の形成に関連する可能性が示唆されている（Ｋｕｄｏｈ  ａｎｄ  Ｄａｗｉｄ，  ２００１）。また、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  （ＲＮＡｉ）とａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｏｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  （ＯＤＮ）を用いた解析から、Ｍａｂ２１Ｌ２が脊椎動物の正常発生に不可欠であることが示唆された（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｏｗ，  ２００２ａ）。カエルにおいて、Ｍａｂ２１Ｌ２の発現を阻害すると、脊索や眼の形態異常に加え、原腸陥入や神経発生に異常が生じることが示された（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。マウスではＭａｂ２１Ｌ１とＭａｂ２１Ｌ２を単独、あるいは両方の発現阻害により、神経管の閉塞異常、脊索、眼、体節の形態異常が起こることが示された（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｏｗ，  ２００２ａ）。これらの結果は、線虫のみならず脊椎動物においてもＭａｂ−２１ファミリーが重要な役割を持つことを示唆している。
【０００３】
Ｍａｂ−２１ファミリーは既知の遺伝子と全く相同性が無く、既存のモチーフやドメインも見出されない。したがって、アミノ酸配列一次構造からの機能予測は不可能である。生体内における役割は上記の方法により既に報告されているが、より正確にＭａｂ−２１ファミリーの役割の全貌を明らかにするためには遺伝学的解析が必要であると考えられる。
【０００４】
そこで、Ｍａｂ２１Ｌ１ノックアウトマウスを作出、解析することにより、Ｍａｂ−２１ファミリーの発生過程における役割を明らかにすることを目的として研究を行った。なお、Ｍａｂ２１Ｌ１のアミノ酸配列自体およびＤＮＡ配列自体は既知のものである（Ｍａｒｉａｎｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９））。
【０００５】
当該Ｍａｂ２１Ｌ１ノックアウトマウスでは、水晶体、包皮腺および肋骨などで器官の形態異常が生じていた。そして、当該各器官について詳細に調査したところ、水晶体および包皮腺の形態異常については細胞増殖の低下が起因していることが判った。これより、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質は、細胞増殖を制御する手段となり得ることが判った。
【０００６】
細胞増殖を制御する手段としては、ペプチド（特開平１０−３１６５８１）、タンパク質（特開２００３−０９３０６６）、および金属イオン（特表平０９−５０８３９２）などがある。これらの手段は、創傷の治療、再生治療、および癌治療を目的としており、これらの治療の有用な手段といえる。
【０００７】
しかし、細胞増殖の制御機構は、完全に解明されているとは言い難く、上記既知の手段で完全に細胞増殖を制御できるわけではない。従って、どの細胞に、どの手段を、どういった条件で用いるかというのは、経験的、試行錯誤的に決定するしかない。このような現状においては新規な細胞増殖の制御手段、すなわち、作用機構および制御機構が新規である細胞増殖の制御手段を提供することは創傷の治療、再生治療および癌治療の分野にとっては非常に有意義なこととなる。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００３−０９３０６６
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
作用機構および制御機構が今までの手段とは異なる、新規な細胞増殖の制御手段を提供すること、特に、新規な組織特異的な細胞増殖制御剤を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するべく、発明者らは、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子について鋭意研究を行った。
【００１１】
Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子欠損マウスの作出
生体内でのＭａｂ２１Ｌ１の役割を明らかにするために、Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子欠損マウスの作出を試みた。まず、１２９系統マウスゲノムライブラリーから、Ｍａｂ２１Ｌ１  ｃＤＮＡをプローブとして、Ｍａｂ２１Ｌ１ゲノミッククローンを得た。このクローンを用いて、図１に示したＭａｂ２１Ｌ１  ＯＲＦの上流約  ５ｋｂと下流  ２ｋｂを含む  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒを作製した。定法にしたがって、キメラマウス、およびＦ１マウスを作出し、サザンブロットにより遺伝子型を確認した（図１Ｂ）。得られたヘテロ接合型マウスは正常であった。ヘテロマウスを交配し、得られたこの遺伝子型を生後３週間目で確認した（図１Ｃ）。野生型、ヘテロ接合型、ホモ接合型マウスの出現頻度はそれぞれ約２５％、５０％、２５％であり、メンデル比に合致した。このことから、Ｍａｂ２１Ｌ１は生存には不要であることが判明した。ホモ接合型マウスにおいてＭａｂ２１Ｌ１転写産物が検出されないことから、このマウスがｎｕｌｌ  ｍｕｔａｎｔであることを確認した（図１Ｄ）。
【００１２】
成体Ｍａｂ２１Ｌ１欠損マウスにおける眼形成異常
作出した全ての成体Ｍａｂ２１Ｌ１欠損マウスにおいて、眼形成異常が認められた（図２Ｂ）。ＭＡＢ２１Ｌ１−／−の眼は野生型にくらべ著しく小さかった。組織学的解析から、虹彩、毛様体の消失、および水晶体様組織の痕跡が認められた（図２ｂ）。
また、前眼房は形成されず、予定前眼房領域には網膜色素細胞の浸潤が認められた。角膜において、上皮、間充織の明確な境界は認められなかった（図２ｂ）。
一方、視神経束、および網膜色素細胞層は認められた（図２Ｅ）。また、形態的判断から、神経性網膜を構成する主な層構造である、光受容細胞層（杆状体視細胞と錐状体視細胞）、統合双極細胞層（水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞）視神経細胞層等が認められた（図２ｄ）。
【００１３】
水晶体の発生におけるＭａｂ２１Ｌ１の重要な役割
Ｍａｂ２１Ｌ１−／−はＥ１２．５においては網膜色素上皮の形態異常から、眼形成異常が容易に識別できた。Ｅ１０．５においては、その外観から眼形成異常は観られなかった（図３Ｂ）。Ｅ１６において、水晶体は認められず、組織学的解析から、Ｅ１７において水晶体の消失、および角膜と網膜の異常な膨殉が認められた（図３Ｂ，  Ｄ）。Ｅ１３において、すでに水晶体の消失が認められたが、予定角膜領域、および神経性網膜細胞の層構造に異常は観られなかった（図３Ｆ）。Ｅ１０．５において、水晶体胞は形成されず、形態異常の水晶体プラコードが認められた（図３Ｈ）。Ｅ９．５において、予定水晶体プラコード領域の肥厚に、弱冠の異常が認められた（図３Ｊ）。Ｅ９．０以前の胎仔では、顕著な形態的異常は認識できなかった。以上の結果から、Ｍａｂ２１Ｌ１が水晶体形成において重要な役割を果たすことが明かとなった。
【００１４】
Ｍａｂ２１Ｌ１−／−  における水晶体形成異常を詳細に理解するために、遺伝子マーカーを用いて、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。αＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎはマウス水晶体形成過程で最も初期に発現する水晶体特異的遺伝子であることが知られている（ｖａｎ  Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；  Ｗｉｓｔｏｗ  ａｎｄ  Ｐｉａｔｉｇｏｒｓｋｙ，  １９８８）。Ｅ１０．５において、αＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎは野生型の水晶体胞で発現が観られたが、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−では発現が認められなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。Ｅ１２．５において、αＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎは野生型の水晶体繊維細胞で強く発現し、錐体上皮細胞でも弱い発現が認められた（図４Ａ）。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−では、その発現領域に著しい減少が観られたが、水晶体様痕跡組織に弱い発現が認められた（図４Ｂ）。αＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎは野生型では水晶体繊維細胞に限局して発現が観られた（図４Ｄ）（Ｇｏｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  ｖａｎ  Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−では水晶体痕跡組織に弱い発現が認められた。微量ながら、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎの発現が認められたことから、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−において、水晶体繊維細胞の分化は起こっていると考えられた。この時期の水晶体において、野生型では水晶体上皮細胞と水晶体繊維細胞は容易に識別可能であった。しかしながら、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−水晶体痕跡組織において、水晶体上皮細胞と水晶体繊維細胞は形態的に識別出来なかった。
【００１５】
次に、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−の網膜分化過程に対する影響を調べるために、神経性網膜形成関連遺伝子の発現をｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎで調べた。Ｃｈｘ１０とＢｒｎ３Ｂは共に、神経性網膜の発生に重要な役割を持つ遺伝子であることが知られている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｆｅｒｄａ  Ｐｅｒｃｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。Ｅ１２．５，  Ｅ１５いずれにおいても、野生型とＭａｂ２１Ｌ１−／−でＣｈｘ１０，  Ｂｒｎ３Ｂの発現に差は観られなかった（図４Ｅ−Ｈ）。さらに、網膜発生過程においてＭａｂ２１Ｌ１と発現パターンが類似している遺伝子である、Ｒｘ，  Ｓｏｘ２，  Ｏｔｘ２，  Ｓｉｘ３，  Ｈｅｓ１，  Ｐａｘ６，  Ｌｈｘ２（Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｋａｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｓａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｗａｌｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，  １９９１；  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）に関してもｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行ったところ、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−で顕著な変化は認められなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。
【００１６】
水晶体プラコード形成における、Ｍａｂ２１Ｌ１の重要性
Ｍａｂ２１Ｌ１−／−マウスにおいて、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ陽性の水晶体様組織が認められた。このことから、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−における水晶体形成異常は、水晶体源基の生長不全によるものと考えられた。そこで、Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−とＭａｂ２１Ｌ１−／−の水晶体細胞の増殖をＢｒｄＵを用いて解析した。ＢｒｄＵはＤＮＡ複製期（Ｓ期）の細胞に取り込まれるため、ＢｒｄＵを検出することで、増殖中の細胞を識別できる。水晶体プラコード形成初期の２７体節期（Ｅ９）において、Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−  とＭａｂ２１Ｌ１−／−のＢｒｄＵ取り込み効率に顕著な差は観られなかった（図５Ａ，  Ｂ）。３０体節期において、Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−とＭａｂ２１Ｌ１−／−に形態的な差は観られなかったが、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−の水晶体プラコードで、ＢｒｄＵ陽性細胞の減少が認められた（図５Ｄ）。３２体節期において、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−の水晶体プラコードは陥入が停止し、水晶体胞の形態異常が認められた。また、ＢｒｄＵの取り込みは減少していた（図５Ｆ）。３５体節期において、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−の水晶体プラコードは依然として不完全な状態で陥入が停止しており、この領域で、ＢｒｄＵの取り込みはほとんど観られなかった（図５Ｈ）。水晶体細胞におけるＢｒｄＵ陽性細胞数を定量化した結果を図６に示した。ｔ検定の結果、計測した全ての発生段階で、Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−とＭａｂ２１Ｌ１−／−のＢｒｄＵ  取り込み効率に有意差があることが判明した。水晶体の生長不全に対する、細胞死の関連を検討するために、ＴＵＮＥＬ法（Ｇａｖｒｉｅｌｌｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２））を用いて細胞死を検出した。その結果、３５体節期において、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−の形態異常を起こした水晶体プラコードで、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の増加が認められた（図５Ｊ）。２７体節期から、４０体節期にかけて、３５体節期以外の発生段階ではＴＵＮＥＬ陽性細胞数にＭａｂ２１Ｌ１＋／−とＭａｂ２１Ｌ１−／−  に顕著な差は観られなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｗｏｎ）。
【００１７】
以上の結果から、Ｍａｂ２１Ｌ１が水晶体プラコードの形成過程で、細胞増殖に関連する役割を持つことが判明した。すなわち、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質は、水晶体プラコードの形成過程で、細胞増殖を制御するタンパク質となり得ることを意味する。そのため、本明細書では、水晶体プラコードの形成過程で、細胞増殖を制御するための細胞増殖制御剤を提供する。この場合、当該細胞増殖制御剤はＭａｂ２１Ｌ１タンパク質を含むこととなる。
【００１８】
Ｍａｂ２１Ｌ１欠損マウスの外生殖器形成異常と不妊症
Ｍａｂ２１Ｌ１欠損マウスは眼形成異常の他に、成体雄において外生殖器の一部である包皮腺に形成異常が認められた（図７）。組織学的解析から、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−マウスの包皮腺において、内腔の萎縮が観察された（図７Ｆ）。しかしながら、器官内部を構成する上皮構造、間充識、漿液腺房に顕著な異常は認められなかった（図７Ｈ）。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−マウスは雄、雌は共に野生型との自然交配で重度の不妊性を示した。雌の妊娠が認められたのは、（−／−♂  ｘ  ＋／＋♀）の組み合わせで２０組中１組、（＋／＋♂  ｘ  −／−♀）の組み合わせでは２０組中２組であった。包皮腺以外の外生殖器、および内生殖器に異常は認められず、不妊症の原因は包皮腺形成異常により引き起こされると考えられた。
【００１９】
包皮腺は生後２週間以降に急速に器官形成が発達する器官であることが知られている（Ｒｕｄａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７４）。そこで、発生過程の包皮腺におけるＭａｂ２１Ｌ１の発現をｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより検討した。その結果、マウス新生仔の包皮腺源基においてＭａｂ２１Ｌ１の発現が認められた。その為、成体雄Ｍａｂ２１Ｌ１−／−マウスにおいて包皮腺の形成異常は、Ｍａｂ２１Ｌ１を欠損するさせることにより生じたものであるといえる。
【００２０】
以上の結果から、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質は、包皮腺の形成過程で、細胞増殖を制御するタンパク質となり得ることを意味する。そのため、本明細書では、包皮腺の形成過程で、細胞増殖を制御するための細胞増殖制御剤を提供する。この場合、当該細胞増殖制御剤はＭａｂ２１Ｌ１タンパク質を含むこととなる。
【００２１】
上記のように、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質は、水晶体プラコードおよび包皮腺の形成過程で、細胞増殖を制御するタンパク質となることが判明した。しかし、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質は、水晶体プラコードおよび包皮腺以外の組織および／または細胞においても細胞増殖を制御するタンパク質となるといえる。理由は以下の通りである。
【００２２】
Ｍａｂ−２１ファミリーに属するタンパク質として、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質の他にＭａｂ２１Ｌ２タンパク質が発現することも知られている（Ｍａｒｉａｎｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９），  Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｏｗ，  １９９９）が、その両タンパク質が発現する組織および／または細胞（以下、この段落において「組織等」と称する）は一部重複している。そのため、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質とＭａｂ２１Ｌ２タンパク質の発現パターンとして、
（ａ）Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質は発現しているがＭａｂ２１Ｌ２タンパク質は発現していない組織等
（ｂ）Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質もＭａｂ２１Ｌ２タンパク質も発現している組織等
（ｃ）Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質は発現していないがＭａｂ２１Ｌ２タンパク質は発現している組織等
（ｄ）Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質もＭａｂ２１Ｌ２タンパク質も発現していない組織等
の４パターンがある。この場合、Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子を欠損させると（ａ）の組織等（水晶体プラコードおよび包皮腺など）でのみ形成異常が生じ、Ｍａｂ２１Ｌ２遺伝子（Ｍａｒｉａｎｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９））を欠損させると（ｃ）の組織等でのみ形成異常が生じる。ここで、Ｍａｂ２１Ｌ２タンパク質とＭａｂ２１Ｌ１タンパク質とは同じファミリーに属しアミノ酸配列において９４％の相同性があることからその両タンパク質はお互いに同じ機能を有するといえ、この点を考慮するとＭａｂ２１Ｌ１タンパク質は（ｃ）の組織等においても細胞増殖を制御するタンパク質となるといえる。逆に、Ｍａｂ２１Ｌ２タンパク質は（ａ）の組織等においても細胞増殖を制御するタンパク質となるといえる。更には、その両タンパク質は（ｂ）および（ｄ）の組織等においても細胞増殖を制御するタンパク質となる可能性がある。
【００２３】
そのため、本明細書では、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質（本段落から以下の段落では、「Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質」なる用語には、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質と同じファミリーに属するＭａｂ２１Ｌ２タンパク質をも含めるものとする。また、「Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子」なる用語にはＭａｂ２１Ｌ２遺伝子をも含めるものとする。）を有効成分とする細胞増殖制御剤であって、任意の組織および／または細胞で細胞増殖を制御するための当該細胞増殖制御剤を提供する。
【００２４】
Ｍａｂ２１Ｌ１−／−水晶体プラコードにおいて、Ｆｏｘｅ３の発現は減少する
Ｍａｂ２１Ｌ１−／−における水晶体形態異常を詳細に理解するために、水晶体形成関連遺伝子として知られる、ｃ−ｍａｆ，  Ｆｏｘｅ３，  Ｓｏｘ２，  Ｓｉｘ３，  およびＰａｘ６の発現を調べた。Ｆｏｘｅ３はｆｏｒｋｈｅａｄ  ｄｏｍａｉｎをコードする遺伝子であり、予定水晶体プラコードで発現が始まり、水晶体胞、および水晶体上皮で発現が維持されることが知られている（Ｂｌｉｘｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｂｒｏｗｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。また、Ｆｏｘｅ３のｆｏｒｋｈｅａｄ  ｄｏｍａｉｎに変異を持つｄｙｓｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｅｎｓ  （ｄｙｌ）突然変異体マウスは水晶体胞と角膜の不完全分離、および水晶体上皮細胞の増殖異常を示すことが知られている（Ｂｌｉｘｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｏｒｍｅｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。ｃ−ｍａｆはロイシンジッパー型の転写調節因子をコードする遺伝子であり、陥入前の水晶体プラコードで発現が始まり、水晶体繊維細胞で発現が維持されることが知られている（Ｋａｗａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。ノックアウトマウスの解析から、ｃ−ｍａｆは水晶体繊維細胞の分化に重要な役割を持つことが知られている（Ｋａｗａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。Ｓｏｘ２はＨＭＧボックス型の転写調節因子をコードする遺伝子であり、その発現量の上昇と水晶体プラコードの誘導との関連が示唆されている（Ｆｕｒｕｔａ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ，  １９９８；  Ｋａｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。Ｓｉｘ３はｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｌｉｓ  に類似したホメオドメインをコードする遺伝子であり、頭部外胚葉での発現が、水晶体プラコード形成期に始まることが知られている（Ｌａｇｕｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。Ｐａｘ６はペアードタイプのホメオドメインをコードする遺伝子であり、水晶体誘導以前の頭部外胚葉と眼胞に発現しており、水晶体、および眼杯でも発現が維持されることが知られている（Ｗａｌｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，  １９９１）。また、Ｐａｘ６は正常な眼の発生に重要な役割を果たすことが知られている（Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｇｒｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。
【００２５】
これらの、水晶体形成関連遺伝子の発現をＭａｂ２１Ｌ１＋／−とＭａｂ２１Ｌ１−／−で比較した。水晶体誘導以前である、２２体節期の頭部外胚葉において、ＰＡＸ６とＳｉｘ３の発現に変化は観られなかった。２４体節期において、Ｓｏｘ２の発現量上昇と、ｃ−ｍａｆの発現開始がＭａｂ２１Ｌ１−／−でもＭａｂ２１Ｌ１＋／−と同様に認められた。この時期にＦｏｘｅ３の発現はＭａｂ２１Ｌ１＋／−，  Ｍａｂ２１Ｌ１−／−共に認められなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。２８体節期における、Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−予定水晶体プラコードでは、Ｆｏｘｅ３の顕著な発現が認められた（図８Ａ）。一方、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−ではＦｏｘｅ３の発現は認められなかった（図８Ｂ）。これに対し、ＰＡＸ６の発現はＭａｂ２１Ｌ１＋／−とＭａｂ２１Ｌ１−／−で顕著な差が観られなかった（図８Ｃ，  Ｄ）。同様にｃ−ｍａｆ，  Ｓｉｘ３，  Ｓｏｘ２の発現もＭａｂ２１Ｌ１＋／−とＭａｂ２１Ｌ１−／−で差は観られなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。３５体節期において、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−  水晶体プラコードは陥入が停止し、水晶体胞の形態異常が認められた。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−  水晶体プラコードにおいて、Ｆｏｘｅ３の発現は微量ながら検出された（図８Ｆ）。一方ＰＡＸ６，  ｃ−ｍａｆ，  Ｓｏｘ２，  Ｓｉｘ３の発現量はＭａｂ２１Ｌ１＋／−とＭａｂ２１Ｌ１−／−で同程度であった（図８Ｇ，  Ｈ，  ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。４０体節期のＭａｂ２１Ｌ１−／−胚において、形態異常の水晶体プラコードは依然として認められたが、Ｆｏｘｅ３の発現は検出されなかった（図８Ｊ）。この時期にＰＡＸ６，  ｃ−ｍａｆ，  Ｓｏｘ２，  Ｓｉｘ３の発現はＭａｂ２１Ｌ１−／−水晶体プラコードで維持されていた（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。以上の結果から、Ｍａｂ２１Ｌ１はＦｏｘｅ３の水晶体プラコードにおける発現の開始と、それに続く発現の維持に必要であることが判明した。
【００２６】
Ｍａｂ２１Ｌ１−／−において、Ｆｏｘｅ３の発現減少を確認した。Ｆｏｘｅ３は水晶体プラコードの形成に同期して発現が開始するが、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−ではその発現開始時期に遅れが観られた。このことは、水晶体プラコード形成の遅延を示唆する。発生段階が進み３５体節期になると、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−水晶体プラコードでＦｏｘｅ３は微量ながら発現する。このことから、Ｍａｂ２１Ｌ１はＦｏｘｅ３の発現を間接的、あるいは部分的に制御すると考えられる。４０体節期では、Ｆｏｘｅ３の発現は完全に消失する。このことはＭａｂ２１Ｌ１がＦｏｘｅ３  の発現の維持に必要であることを示唆する。３５体節期Ｍａｂ２１Ｌ１−／−水晶体プラコードで観られるＦｏｘｅ３陽性細胞のその後の運命は不明であるが、この時期にＴＵＮＥＬ陽性細胞が増加するため、細胞死により排除されると推察される。この推察は、Ｆｏｘｅ３の突然変異体（ｄｙｌ）で細胞増殖率の低下と、アポトーシスの増加が起こることからも支持される（Ｂｌｉｘｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−において、ＢｒｄＵの取り込み減少と、Ｆｏｘｅ３の発現減少は同時期に観察される。また、ｄｙｌと同様に、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−でもＰＤＧＦＲｅの発現が減少する（Ｂｌｉｘｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。ＰＤＧＦシグナルは細胞増殖を亢進する働きが知られている（Ｈｅｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。よって、Ｆｏｘｅ３の発現減少がＭａｂ２１Ｌ１−／−の水晶体プラコード形成不全を引き起こすと考えられる。
【００２７】
頭部外胚葉と眼胞におけるＭａｂ２１Ｌ１の発現はＰＡＸ６に依存する
Ｐａｘ６はＳｅｙを含む種々の突然変異体の解析から、眼の発生過程で中心的な役割を担うと認識されている（Ａｓｈｅｒｙ−Ｐａｄａｎ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，  ２００１；  Ｇｒｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。最近、Ｌｅ−ｍｕｔａｎｔ  （Ｌｅ）の解析から、Ｐａｘ６の水晶体形成における重要性が再認識された。ＬｅはＰａｘ６の活性を予定水晶体領域で特異的に欠損させたコンディショナルノックアウトマウスであり、水晶体の欠損を伴う眼形成異常を示す（Ａｓｈｅｒｙ−Ｐａｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【００２８】
ＬｅとＭａｂ２１Ｌ１−／−の表現型の類似性は、Ｐａｘ６とＭａｂ２１Ｌ１が同一の遺伝学的経路で働く可能性を示唆する。そこで、Ｐａｘ６  突然変異体であるＳｅｙにおけるＭａｂ２１Ｌ１の発現を調べた。２２体節期のＳｅｙホモ接合体（Ｓｅｙ／Ｓｅｙ）において、Ｍａｂ２１Ｌ１の発現は頭部外胚葉と眼胞両方で発現が顕著に減少していた（図９Ｂ）。３２体節期では、Ｓｅｙ／Ｓｅｙにおいて、弱いながらも頭部外胚葉でＭａｂ２１Ｌ１の発現が認められた（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。３５体節期では、Ｓｅｙ／Ｓｅｙの形態異常を起こした眼胞において、Ｍａｂ２１Ｌ１の発現は野生型にくらべ顕著な減少が認められた。この時期Ｓｅｙ／Ｓｅｙでは水晶体胞は全く形成されないが、予定水晶体領域でＭａｂ２１Ｌ１の弱い発現が認められた（図９Ｄ）。
【００２９】
Ｍａｂ２１Ｌ１−／−マウスで観られる水晶体形成不全と網膜の異常形態はＬｅ−ｍｕｔａｎｔ（Ｌｅ）に観られる眼形成異常と類似する。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−とＬｅの表現型の類似性からＭａｂ２１Ｌ１とＰａｘ６が水晶体形成過程で同一の遺伝学的経路で働く可能性が示唆される。キメラマウスの解析で明らかにされたＭａｂ２１Ｌ１の細胞自立的な役割は、Ｐａｘ６でも同様に見出されている（Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。さらに、Ｐａｘ６とＭａｂ２１Ｌ１は眼胞と頭部外胚葉で重複して発現する。以上の知見から、本研究ではＰａｘ６突然変異ホモ接合体（Ｓｅｙ／Ｓｅｙ）におけるＭａｂ２１Ｌ１の発現を検討した。予想通り、Ｓｅｙ／Ｓｅｙにおいて、Ｍａｂ２１Ｌ１の発現減少が確認された。このことは、Ｍａｂ２１Ｌ１の発現がＰＡＸ６依存的であることを示唆する。一方、Ｍａｂ２１Ｌ１−／−ではＰＡＸ６の発現は変化しない。したがって、Ｍａｂ２１Ｌ１は眼胞と頭部外胚葉において、Ｐａｘ６の遺伝学的下流に位置すると結論する。
【００３０】
上記の結論から、いわゆる当業者に既知の手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）を用いれば、Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子およびＦｏｘｅ３遺伝子を導入した任意の特定の細胞中で、
▲１▼Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質自体を活性・発現量を上げるかまたは下げることにより細胞増殖を制御すること（この場合、Ｐａｘ６タンパク質および／またはＦｏｘｅ３タンパク質は発現していてもよいし、発現していなくてもよい）、または
▲２▼Ｐａｘ６およびＦｏｘｅ３を活性・発現量を上げるかまたは下げることによりＭａｂ２１Ｌ１タンパク質の作用を制御すること（この場合、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質は発現していなければならない）、
が可能である。これらの制御により、ターゲットとなる器官・組織中の細胞のみの増殖（組織特異的な細胞増殖）を制御することが可能となる。
【００３１】
すなわち、任意の特定の細胞においてのみ（組織特異的）、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質自体の活性・発現を亢進することにより細胞増殖は亢進され、逆に、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質自体の活性・発現を抑制することにより細胞増殖は抑制されることとなる。
【００３２】
また、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質を発現する（または発現している）任意の特定の細胞においてのみ（組織特異的）、Ｐａｘ６タンパク質およびＦｏｘｅ３タンパク質の両タンパク質または何れか一方のタンパク質の活性・発現を亢進することにより細胞増殖は亢進され、逆に、Ｐａｘ６タンパク質およびＦｏｘｅ３タンパク質の両タンパク質または何れか一方のタンパク質の活性・発現を抑制することにより細胞増殖は抑制されることとなる。
【００３３】
このことから、本明細書では、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質を有効成分とする、組織特異的な細胞増殖制御剤を提供し、更にＰａｘ６タンパク質およびＦｏｘｅ３タンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質を有効成分とし、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質の作用を制御することを特徴とする、組織特異的な細胞増殖制御剤を提供する。また、更には、Ｐａｘ６タンパク質およびＦｏｘｅ３タンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質を、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質と共に使用することを特徴とする、組織特異的に細胞増殖を制御する方法、ならびにＰａｘ６遺伝子およびＦｏｘｅ３遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子を、Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子と共に使用することを特徴とする、組織特異的に細胞増殖を制御する方法を提供する。
【００３４】
定義
本明細書中、「タンパク質」なる用語は、天然に存在するタンパク質、またはその一部、さらに人工的に産生されたポリペプチド、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列中の任意の１以上の位置で１以上のアミノ酸が独立して挿入されているタンパク質、および天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列中の任意の位置の１以上のアミノ酸残基が独立して欠失または置換されているタンパク質などを意味するが、この場合、当該タンパク質の機能を維持しているものであればいずれのものでもよい。ここで、「Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質」なる用語には、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列との相同性が９０％以上、特に好ましくは９４％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質をも含まれる。
【００３５】
本明細書中、「制御」なる用語は、亢進または抑制の何れか一方または両方を意味する。
【００３６】
本明細書中、「剤」というときは、任意の特定細胞中に導入した遺伝子を用い当該特定細胞中で発現・産生させる（または発現・産生させた）タンパク質を含有する「剤」であって当該特定細胞中で形成されるものを意味するが、当該特定細胞中で発現・産生させる（または発現・産生させた）タンパク質を当該特定細胞の外へ抽出したタンパク質を含有する「剤」をも意味する。
【００３７】
本明細書中、「タンパク質を使用する」または「遺伝子を使用する」とは、任意の特定細胞中における使用および当該特定細胞外における使用の何れをも意味する。特に、「タンパク質を使用する」という場合には、当該タンパク質を細胞増殖の制御に用いることをいい、「遺伝子を使用する」という場合には、当該遺伝子がコードするタンパク質を発現させるために当該遺伝子を用いることをいう。更には「…タンパク質を、…タンパク質と共に使用する」といった場合には、２以上の当該タンパク質を同時に使用する場合のほかに２以上の当該タンパク質を任意の順番に使用する場合も含まれ、このとき、その２以上のタンパク質は物理的に互いに接触する場合もあれば、接触しない場合もある。また、「…遺伝子を、…遺伝子と共に使用する」といった場合にも、２以上の当該遺伝子を同時に使用する場合のほかに２以上の当該遺伝子を任意の順番に使用する場合も含まれ、その２以上の遺伝子は同一鎖上にコードされている場合もあれば、別々の鎖上にコードされている場合もある。
【００３８】
本明細書中、「Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−」および「Ｍａｂ２１Ｌ１−／−」なる用語は、Ｍａｂ２１Ｌ１が欠損した生体（例えば、マウス）を意味し、ここで「Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−」はへテロ接合体を意味し、「Ｍａｂ２１Ｌ１−／−」はホモ接合体を意味する。
【００３９】
本明細書中、Ｅ１２．５およびＥ１５のような「Ｅ」（ｅｍｂｒｙｏ）なる用語は、胎児の日令を意味し、自然交配により膣栓（交尾後形成される）が確認された日をＥ０．５と表記する。
【００４０】
本明細書中、「タンパク質の作用を制御する」なる用語は、同一の遺伝学的経路において、ある特定タンパク質の上流または下流に位置するタンパク質であって、その上流または下流に位置するタンパク質の発現または活性を制御することにより、当該特定タンパク質の働きを制御することを意味する。
【００４１】
【発明の実施の形態】
Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質を有効成分とする組織特異的な細胞増殖制御剤、ならびにＰａｘ６タンパク質およびＦｏｘｅ３タンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質を有効成分としＭａｂ２１Ｌ１タンパク質の作用を制御することを特徴とする組織特異的な細胞増殖制御剤は、当業者に既知の手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）によって、任意の特定細胞（例えば、ＥＳ細胞）中において容易に作成することができる。すなわち、当業者に既知の手法を用い、適当なベクター（例えば、ウイルスプロモーターを用いた細胞発現ベクター、特にＭＭＴＶベクター、またはヒートショックプロモーターを用いた発現ベクター、特にＨＳＰベクター）中に組み込んだＭａｂ２１Ｌ１遺伝子を宿主細胞（例えば、ＥＳ細胞）中に導入（例えば、エレクトロポレーション法）し、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質を産生させることにより、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質を有効成分とする組織特異的な細胞増殖制御剤が当該宿主細胞中で作成されることとなる。必要に応じ、細胞中で発現したＭａｂ２１Ｌ１タンパク質を当該細胞から抽出すれば、細胞外で使用することも可能となる。更に、必要に応じ、適当なベクター（例えば、ウイルスプロモーターを用いた細胞発現ベクター、特にＭＭＴＶベクター、またはヒートショックプロモーターを用いた発現ベクター、特にＨＳＰベクター）中に組み込んだＰａｘ６遺伝子およびＦｏｘｅ３遺伝子のうちの少なくとも１つを宿主細胞（例えば、ＥＳ細胞）中に導入（例えば、エレクトロポレーション法）し、Ｐａｘ６タンパク質およびＦｏｘｅ３タンパク質のうちの少なくとも１つを産生させることにより、Ｐａｘ６タンパク質およびＦｏｘｅ３タンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質を有効成分としＭａｂ２１Ｌ１タンパク質の作用を制御することを特徴とする組織特異的な細胞増殖制御剤が作成されることとなる。この場合、当該細胞増殖制御剤は、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質を有効成分とする組織特異的な細胞増殖制御剤と、同一の宿主細胞中に同時に存在する場合もあれば、同時に存在しない場合もある。すなわち、Ｐａｘ６遺伝子およびＦｏｘｅ３遺伝子のうちの少なくとも１つは、Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子と同時にまたは別々に宿主細胞中に導入され、それらの遺伝子がコードするタンパク質は同時にまたは任意の順序で宿主細胞中で産生される。また、これらのタンパク質を当該宿主細胞から抽出すれば、細胞外で使用することも可能となる。
【００４２】
Ｐａｘ６タンパク質およびＦｏｘｅ３タンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質を、Ｍａｂ２１Ｌ１タンパク質と共に使用することを特徴とする組織特異的な細胞増殖の制御方法、ならびにＰａｘ６遺伝子およびＦｏｘｅ３遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子を、Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子と共に使用することを特徴とする、組織特異的に細胞増殖を制御する方法もまた、当業者に既知の手法により行う。例えば、それらの遺伝子の導入および発現、それらのタンパク質の活性化などにより組織特異的に細胞増殖が亢進できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）。また、例えば、アンチセンス法（新生化学実験講座２  核酸ＩＶ，１９９３）、ＲＮＡｉ法（Ｓ．  Ｍ．  Ｅｌｂａｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００１））などを用いれば、組織特異的に細胞増殖が抑制できる。
【００４３】
【実施例】
【００４４】
基本的な実験手法はＳａｍｂｒｏｏｋ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）  らの方法に従って行った。
【００４５】
Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒの作製
１２９系統マウスゲノムライブラリーから、Ｍａｂ２１Ｌ１  ｃＤＮＡをプローブとしてＭａｂ２１Ｌ１ゲノミッククローンを単離した。Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒは、図１に示すように、４．９ｋｂ  ５’相同領域（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント）および２．３ｋｂ  ３’相同領域（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント）からなる。当該コーディング領域を、ｐＭＣ１ｎｅｏ  ｐｏｌｙ（Ａ）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）由来のＮｅｏｒ遺伝子カセットで置換した。陰性選択用に、ＭＣ１−ＤＴＡ（ジフテリア毒素Ａ）カセットを３’相同領域の末端に位置させた。
【００４６】
ＥＳ細胞のターゲッティングおよびＭａｂ２１Ｌ１−／−変異体の作出
直線化ターゲッティングベクター（３０μｇ）をＥＳ細胞中にエレクトロポレーションした。４００  Ｇ４１８−耐性クローン由来のゲノムＤＮＡをＫｐｎＩおよびＳａｌＩで消化し、５’および３’プローブを用いサザンブロットした。８つの相同組換え体が得られ、これらのうち、２クローンから８細胞期集合胚法（Ｗｏｏｄ  Ｓ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３））によりキメラマウスを作出した。キメラの雄をＣ５７ＢＬ／６の雌と交配させ、そして標的対立遺伝子の送達は、妊娠したマウスのテールチップＤＮＡをサザンブロッティングすることにより確認した。ヘテロ接合型マウスを交配させ、ホモ接合型マウスを作出した。２つの系統が同じ表現型を示した。子および胎仔の遺伝子型を、５’プローブを用いるサザンブロッティングによるか、または特定のプライマー
ｍ１Ｆ、５’−ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣ−３’
ｍ１Ｒ、５’−ＧＣＡＧＡＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧ−３’、および
ｎｅｏＲ、５’−ＧＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣ−３’
を用いるＰＣＲによるか、何れかにより決定した。
【００４７】
ＰＣＲ条件は、９４℃１分間、５５℃１分間、そして７２℃１分間を３５サイクルである。予想されるＰＣＲ産物の大きさは、野生型および標的対立遺伝子、それぞれ、１４５および２５５ｂｐである。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−の表現型は、１２９とＢ６ｘ１２９のハイブリッドのバックグラウンドを有するものと同じであった。ここで記載した結果は、Ｂ６ｘ１２９ハイブリッドの遺伝学的バックグラウンドを有する突然変異体マウスを分析することにより得られた。
【００４８】
組織切片の作製
摘出したマウス胎仔を４％パラホルムアルデヒド［  ４％  Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  （Ｃｈｙｏｄａ  Ｊｕｎｙａｋｕ  Ｉｎｃ．），  ０．１Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．４］中に４度で一晩静置し、固定した。５０％，  ６０％，  ７０％，  ８０％，  ９０％，  ９５％，  １００％  エタノールに各３０分ずつ浸して脱水した。さらにＭｅｔｈｙｌ  Ｂｅｎｚｏａｔｅ  に組織片が沈むまで浸し、キシレンに１時間ずつ３回、キシレン：パラフィン＝１：１に３７℃で１時間、パラフィン  （Ｗａｋｏ  ｍｐ５０−５２℃）に５４℃で３０分ずつ２回浸した後、包埋した。ミクロトームで８μｍに薄切し、ＭＡＳ  コートしたスライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）に伸展した。４０℃で一晩乾燥した後室温で保存した。
【００４９】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
操作手順は基本的にＮｉｅｔ  らの方法にしたがった（Ｎｉｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６））。特筆すべき事項を以下に示す。
＜Ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ  ＩＳＨ＞
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理：  Ｅ８〜Ｅ９，  ５ｍｉｎ，  Ｅ１０〜Ｅ１１，  １５ｍｉｎ，  Ｅ１２〜Ｅ１３，  ３０ｍｉｎ，  ３７℃ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  ７３．５℃，  Ｗａｓｈ，  ７３．５℃
＜Ｓｅｃｔｉｏｎ，  ＩＳＨ＞
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理：  ５ｍｉｎ  室温
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  ６５℃，  ５ｘＳＳＣ
Ｗａｓｈ，  ６５℃，  ２ｘＳＳＣまたは０．２ｘＳＳＣ
プローブの鋳型は基本的に、ＰＣＲで増幅した断片をｐＢＳＫに挿入して作製した。
プローブはＤＩＧ  ＲＮＡ  ｌｅｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてラベルした。
Ｆｏｘｅ３，  Ｒｘ，  Ｂｍｐ４，  Ｂｍｐ７，  Ｓｏｘ２，  ｃ−ｍａｆ，  Ｃｈｘ１０，  Ｏｔｘ２，  Ｓｉｘ３，  Ｈｅｓ１，  Ｂｒｎ３ｂ，  αＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ，  αＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ，  Ｐａｘ６  （Ｂｌｉｘｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｆｕｒｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｋａｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｋａｗａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｓａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  ｖａｎ  Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；  Ｗａｌｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，  １９９１；  Ｗｉｓｔｏｗ  ａｎｄ  Ｐｉａｔｉｇｏｒｓｋｙ，  １９８８；  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）．
【００５０】
免疫組織化学染色
組織切片をキシレンに１０分間、３回、１００％、９０％、７０％エタノールに各５分間浸し、脱パラフィンした。１０  ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）中で５分間、ｍｉｃｒｏｗａｖｅ処理した後、０．０２Ｍ  ＰＢＳ  で洗い、３％過酸化水素に１０分間浸し脱色した。０．０２Ｍ  ＰＢＳ  で３分間２回洗った後、０．５％  スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ）  ０．０２Ｍ  ＰＢＳで希釈した１次抗体をのせ、４℃で一晩静置した。  ０．０２Ｍ  ＰＢＳ  で３分間、３回洗い、１００倍希釈した２次抗体（ＨＲＰ  標識ー抗ウサギＩｇＧ，  ＭＢＬ，  ４５８  ）  をのせ、３７℃で１時間静置した。  ０．０２Ｍ  ＰＢＳで３分間３回洗った後、発色溶液［０．０１％  過酸化水素、０．０１％  ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  （ＤＡＢ）  （Ｗａｋｏ），    ０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，  ｐＨ７．５］  中、３７℃で５−１５分間発色した。  ０．０２Ｍ  ＰＢＳで反応を停止した後、キシレンに透徹しＥＮＴＥＬＬＡＮ  （ＭＥＲＫ）で封入した。１次抗体の希釈倍率を以下に示す：抗ＰＡＸ６抗体（１：１０００）（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【００５１】
細胞増殖、細胞死の検出
妊娠雌マウスに３ｍｇの  Ｂｒｏｍｏ−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ  （ＢｒｄＵ）を腹腔注射し、１時間後に胎仔を摘出し、４％ＰＦＡで固定した。パラフィン切片を作製し、免疫組織染色と同様に切片の前処理をし、ＢｒｄＵ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ  （Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，  Ｒｏｃｈｅ）を用い、抗ＢｒｄＵ抗体により染色した。細胞死の検出はＩｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＨＲＰ，  Ｒｏｃｈｅ）に従って、ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  （ＴＵＮＥＬ）法により検出した。
【００５２】
Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ
成体の尻尾、または胎仔のＹｏｒｋ  Ｓａｃ  を  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １％  ＳＤＳ，  １５０μｇ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  （ＳＩＧＭＡ）］  中で溶解し、フェノールクロロホルム処理、エタノール沈殿により、ゲノム  ＤＮＡ  を回収した。Ｍａｂ２１Ｌ１，  Ｍａｂ２１Ｌ２ノックアウトマウスはＥＳ細胞の選別、Ｆ１はｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔにより遺伝子型を確認し、系統の維持、その後の解析はＰＣＲにより遺伝子型を確認した。以下にＰＣＲに用いたｐｒｉｍｅｒを示す。
ｍ１Ｆ：５’−ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣ−３’，
ｍ１Ｒ：５’−ＧＣＡＧＡＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧ−３’
ｎｅｏＲ：５’−ＧＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣ−３’．
ｍ２Ｆ：５’−ＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＡＡＣ−３’，
ｍ２Ｒ：５’−ＣＧＴＡＧＧＡＧＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣ−３’
ＰＣＲ  の条件は：  ３５  ｃｙｃｌｅｓ  ａｔ  ９４℃  ｆｏｒ  １  ｍｉｎｕｔｅ，  ５５℃  ｆｏｒ  １  ｍｉｎｕｔｅ，  ａｎｄ  ７２℃  ｆｏｒ  １  ｍｉｎｕｔｅ．
Ｓｅｙ変異体の遺伝子型はＧｒｉｎｄｌｅｙらの方法に従った（Ｇｒｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。
【００５３】
引用文献
Ａｓｈｅｒｙ−Ｐａｄａｎ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，  Ｐ．  （２００１）．  Ｐａｘ６  ｌｉｇｈｔｓ−ｕｐ  ｔｈｅ  ｗａｙ  ｆｏｒ  ｅｙｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３，  ７０６−１４．
Ａｓｈｅｒｙ−Ｐａｄａｎ，  Ｒ．，  Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，  Ｔ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｘ．  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，  Ｐ．  （２０００）．  Ｐａｘ６  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｎｓ  ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｅｎｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｃｏｒｒｅｃｔ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒｅｔｉｎａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｙｅ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４，  ２７０１−１１．
Ｂｌｉｘｔ，  Ａ．，  Ｍａｈｌａｐｕｕ，  Ｍ．，  Ａｉｔｏｌａ，  Ｍ．，  Ｐｅｌｔｏ−Ｈｕｉｋｋｏ，  Ｍ．，  Ｅｎｅｒｂａｃｋ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｓｏｎ，  Ｐ．  （２０００）．  Ａ  ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｇｅｎｅ，  ＦｏｘＥ３，  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｅｎｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｎｓ  ｖｅｓｉｃｌｅ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４，  ２４５−５４．
Ｂｒｏｗｎｅｌｌ，  Ｉ．，  Ｄｉｒｋｓｅｎ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｊａｍｒｉｃｈ，  Ｍ．  （２０００）．  Ｆｏｒｋｈｅａｄ  Ｆｏｘｅ３  ｍａｐｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｙｓｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｅｎｓ  ｌｏｃｕｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｎ  ｌｅｎｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ２７，  ８１−９３．
Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，  Ｍ．，  Ｎｏｖａｋ，  Ｊ．，  Ｌｉａｎｇ，  Ｍ．  Ｙ．，  Ｂａｓｕ，  Ｓ．，  Ｐｌｏｄｅｒ，  Ｌ．，  Ｈａｗｅｓ，  Ｎ．  Ｌ．，  Ｖｉｄｇｅｎ，  Ｄ．，  Ｈｏｏｖｅｒ，  Ｆ．，  Ｇｏｌｄｍａｎ，  Ｄ．，  Ｋａｌｎｉｎｓ，  Ｖ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）．
Ｏｃｕｌａｒ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  ｍｏｕｓｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｃｈｘ１０  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｎｕｌｌ  ａｌｌｅｌｅ：  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １２，  ３７６−８４．
Ｃｈｏｗ，  Ｋ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｃｈａｎ，  Ｋ．  Ｗ．  （１９９９）．  Ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｅｎｏｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｏｒｇａｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｄｅｖ  Ｇｒｏｗｔｈ
Ｄｉｆｆｅｒ  ４１，  ６２９−３７．
Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｈｉｌｌ，  Ｒ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｅｓｔ，  Ｊ．  Ｄ．  （２０００）．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐａｘ６  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ａｎｄ  ｆａｃｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｙｅ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，  ９４５−５６．
Ｆｅｒｄａ  Ｐｅｒｃｉｎ，  Ｅ．，  Ｐｌｏｄｅｒ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｙｕ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ａｒｉｃｉ，  Ｋ．，  Ｈｏｒｓｆｏｒｄ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，  Ａ．，  Ｂａｐａｔ，  Ｂ．，  Ｃｏｘ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｄｕｎｃａｎ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｋａｌｎｉｎｓ，  Ｖ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）．  Ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅ  ＣＨＸ１０．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５，  ３９７−４０１．
Ｆｕｊｉｗａｒａ，  Ｍ．，  Ｕｃｈｉｄａ，  Ｔ．，  Ｏｓｕｍｉ−Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｅｔｏ，  Ｋ．  （１９９４）．  Ｕｃｈｉｄａ  ｒａｔ  （ｒＳｅｙ）：  ａ  ｎｅｗ  ｍｕｔａｎｔ  ｒａｔ  ｗｉｔｈ  ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｔｈｏｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｓｅｙ  ｍｕｔａｎｔ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ５７，  ３１−８．
Ｆｕｒｕｋａｗａ，  Ｔ．，  Ｋｏｚａｋ，  Ｃ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｃｅｐｋｏ，  Ｃ．  Ｌ．  （１９９７）．  ｒａｘ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐａｉｒｅｄ−ｔｙｐｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅ，  ｓｈｏｗｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｆｏｌｄ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｒｅｔｉｎａ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４，  ３０８８−９３．
Ｆｕｒｕｔａ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ，  Ｂ．  Ｌ．  （１９９８）．  ＢＭＰ４  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｅｎｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２，  ３７６４−７５．
Ｆｕｒｕｔａ，  Ｙ．，  Ｐｉｓｔｏｎ，  Ｄ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ，  Ｂ．  Ｌ．  （１９９７）．  Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （ＢＭＰｓ）  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｄｏｒｓａｌ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
１２４，  ２２０３−１２．
Ｇａｎ，  Ｌ．，  Ｘｉａｎｇ，  Ｍ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｌ．，  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｄ．  Ｓ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ｗ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，  Ｊ．  （１９９６）．  ＰＯＵ  ｄｏｍａｉｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂｒｎ−３ｂ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３，  ３９２０−５．
Ｇａｖｒｉｅｌｌｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１９，  ４９３−５０１（１９９２）Ｇｏｒｉｎｇ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｂｒｅｉｔｍａｎ，  Ｍ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｔｓｕｉ，  Ｌ．  Ｃ．  （１９９２）．  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｌｅｎｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ５４，  ７８５−９５．
Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，  Ｄ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，  Ｒ．  Ｅ．  （１９９５）．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐａｘ−６  ｉｎ  ｅｙｅ  ａｎｄ  ｎａｓａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１，  １４３３−４２．
Ｈｅｌｄｉｎ，  Ｃ．  Ｈ．，  Ｏｓｔｍａｎ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｒｏｎｎｓｔｒａｎｄ，  Ｌ．  （１９９８）．  Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３７８，  Ｆ７９−１１３．
Ｈｉｌｌ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｆａｖｏｒ，  Ｊ．，  Ｈｏｇａｎ，  Ｂ．  Ｌ．，  Ｔｏｎ，  Ｃ．  Ｃ．，  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｇ．  Ｆ．，  Ｈａｎｓｏｎ，  Ｉ．  Ｍ．，  Ｐｒｏｓｓｅｒ，  Ｊ．，  Ｊｏｒｄａｎ，  Ｔ．，  Ｈａｓｔｉｅ，  Ｎ．  Ｄ．  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ，  Ｖ．  （１９９１）．  Ｍｏｕｓｅ  ｓｍａｌｌ  ｅｙｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｐａｉｒｅｄ−ｌｉｋｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ−  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４，  ５２２−５．
Ｉｎｏｕｅ，  Ｔ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｏｓｕｍｉ，  Ｎ．  （２０００）．  Ｆａｔｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｌａｔｅ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２１９，  ３７３−８３．
Ｋａｍａｃｈｉ，  Ｙ．，  Ｕｃｈｉｋａｗａ，  Ｍ．，  Ｃｏｌｌｉｇｎｏｎ，  Ｊ．，  Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｋｏｎｄｏｈ，  Ｈ．  （１９９８）．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｏｘ１，  ２  ａｎｄ  ３  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｏｆ  ｌｅｎｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５，  ２５２１−３２．
Ｋａｗａｕｃｈｉ，  Ｓ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｓ．，  Ｎａｋａｊｉｍａ，  Ｏ．，  Ｏｇｉｎｏ，  Ｈ．，  Ｍｏｒｉｔａ，  Ｍ．，  Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，  Ｍ．，  Ｙａｓｕｄａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｍ．  （１９９９）．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｎｓ  ｆｉｂｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｃ−  Ｍａｆ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，  １９２５４−６０．
Ｋｕｄｏｈ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｄａｗｉｄ，  Ｉ．  Ｂ．  （２００１）．  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｍａｂ２１ｌ２  ｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅ  ｅｙｅ  ａｎｄ  ｔｅｃｔｕｍ  ｆｒｏｍ  ｅａｒｌｙ  ｓｏｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｎｗａｒｄｓ．  Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １０９，  ９５−８．
Ｌａｇｕｔｉｎ，  Ｏ．，  Ｚｈｕ，  Ｃ．  Ｃ．，  Ｆｕｒｕｔａ，  Ｙ．，  Ｒｏｗｉｔｃｈ，  Ｄ．  Ｈ．，  ＭｃＭａｈｏｎ，  Ａ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ，  Ｇ．  （２００１）．  Ｓｉｘ３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｃｔｏｐｉｃ  ｏｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２２１，  ３４２−９．
Ｌａｕ，  Ｇ．  Ｔ．，  Ｗｏｎｇ，  Ｏ．  Ｇ．，  Ｃｈａｎ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｋｏｋ，  Ｋ．  Ｈ．，  Ｗｏｎｇ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ｃｈｉｎ，  Ｋ．  Ｔ．，  Ｌｉｎ，  Ｍ．  Ｃ．，  Ｋｕｎｇ，  Ｈ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｃｈｏｗ，  Ｋ．  Ｌ．  （２００１）．  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ＸＭａｂ２１ｌ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８０，  １３７８−８４．
Ｌｉｕ，  Ｉ．  Ｓ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｐｌｏｄｅｒ，  Ｌ．，  Ｖｉｄｇｅｎ，  Ｄ．，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｏｏｙ，  Ｄ．，  Ｋａｌｎｉｎｓ，  Ｖ．  Ｉ．  ａｎｄ  ＭｃＩｎｎｅｓ，  Ｒ．  Ｒ．  （１９９４）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅ  （Ｃｈｘ１０）：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｒｅｔｉｎａ  ａｎｄ  ｉｎｎｅｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌａｙｅｒ．  Ｎｅｕｒｏｎ  １３，  ３７７−９３．
Ｌｉｕ，  Ｋ．，  Ｌｉ，  Ｌ．，  Ｎｉｓｓｏｎ，  Ｐ．  Ｅ．，  Ｇｒｕｂｅｒ，  Ｃ．，  Ｊｅｓｓｅｅ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．  Ｎ．  （２０００ａ）．  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓａｍ６８  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，  ４０１９５−２０１．
Ｍａｒｉａｎｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ８，  ２３９７−２４０６（１９９９）Ｍａｔｓｕｏ，  Ｉ．，  Ｋｕｒａｔａｎｉ，  Ｓ．，  Ｋｉｍｕｒａ，  Ｃ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ａｉｚａｗａ，  Ｓ．  （１９９５）．
Ｍｏｕｓｅ  Ｏｔｘ２  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆ  ｒｏｓｔｒａｌ  ｈｅａｄ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９，  ２６４６−５８．
Ｎｉｅｔｏ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｐａｔｅｌ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，  Ｄ．  Ｇ．  （１９９６）．  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５１，  ２１９−３５．
Ｏｌｉｖｅｒ，  Ｇ．，  Ｍａｉｌｈｏｓ，  Ａ．，  Ｗｅｈｒ，  Ｒ．，  Ｃｏｐｅｌａｎｄ，  Ｎ．  Ｇ．，  Ｊｅｎｋｉｎｓ，  Ｎ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，  Ｐ．  （１９９５）．  Ｓｉｘ３，  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓ  ｇｅｎｅ，  ｄｅｍａｒｃａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｂｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｌａｔｅ  ａｎｄ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｙｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１，  ４０４５−５５．
Ｏｒｍｅｓｔａｄ，  Ｍ．，  Ｂｌｉｘｔ，  Ａ．，  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，  Ａ．，  Ｍａｒｔｉｎｓｓｏｎ，  Ｔ．，  Ｅｎｅｒｂａｃｋ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｓｏｎ，  Ｐ．  （２００２）．  Ｆｏｘｅ３  ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｐｅｔｅｒｓ’  ａｎｏｍａｌｙ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４３，  １３５０−７．
Ｑｕｉｎｎ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｗｅｓｔ，  Ｊ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，  Ｒ．  Ｅ．  （１９９６）．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐａｘ６  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｙｅ  ａｎｄ  ｎａｓａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １０，  ４３５−４６．
Ｒｉｎｇ，  Ｂ．  Ｚ．，  Ｃｏｒｄｅｓ，  Ｓ．  Ｐ．，  Ｏｖｅｒｂｅｅｋ，  Ｐ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｂａｒｓｈ，  Ｇ．  Ｓ．  （２０００）．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｌｅｎｓ  ｆｉｂｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｍａｆ  ｇｅｎｅ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，  ３０７−１７．
Ｒｕｄａｌｉ，  Ｇ．，  Ｒｏｕｄｉｅｒ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｖｉｖｅｓ，  Ｃ．  （１９７４）．  Ｔｈｅ  ｐｒｅｐｕｔｉａｌ  ｇｌａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｌｅ  ｍｏｕｓｅ．  Ｐａｔｈｏｌ  Ｂｉｏｌ  （Ｐａｒｉｓ）  ２２，  ８９５−９９．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ＥＦ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  （１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｆａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．
Ｓａｓａｉ，  Ｙ．，  Ｋａｇｅｙａｍａ，  Ｒ．，  Ｔａｇａｗａ，  Ｙ．，  Ｓｈｉｇｅｍｏｔｏ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  Ｓ．  （１９９２）．  Ｔｗｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｈａｉｒｙ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｓｐｌｉｔ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６，  ２６２０−３４．
Ｓ．  Ｍ．  Ｅｌｂａｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ，４１１，  ４９４（２００１）Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｅ．  Ｅ．，  Ｊｅｎｎｅ，  Ｋ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，  Ｍ．  Ｇ．  （１９９４）．  Ｂｒｎ−３．２：  ａ  Ｂｒｎ−３−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｎｅｕｒｏｎ  １２，  ２０５−１８．
ｖａｎ  Ｌｅｅｎ，  Ｒ．  Ｗ．，  ｖａｎ  Ｒｏｏｚｅｎｄａａｌ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｌｕｂｓｅｎ，  Ｎ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｅｎｍａｋｅｒｓ，  Ｊ．  Ｇ．  （１９８７）．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｅｙｅ  ｌｅｎｓ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２０，  ４５７−６４．
Ｗａｌｔｈｅｒ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，  Ｐ．  （１９９１）．  Ｐａｘ−６，  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐａｉｒｅｄ  ｂｏｘ  ｇｅｎｅ，  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ＣＮＳ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３，  １４３５−４９．
Ｗｉｓｔｏｗ，  Ｇ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｐｉａｔｉｇｏｒｓｋｙ，  Ｊ．  （１９８８）．  Ｌｅｎｓ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｓ：  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５７，  ４７９−５０４．
Ｗｏｎｇ，  Ｒ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｃｈｏｗ，  Ｋ．  Ｌ．  （２００２ａ）．  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｂ２１ｌ１  ａｎｄ  Ｍａｂ２１ｌ２  ｍｅｓｓａｇｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ  ａｒｒｅｓｔｓ  ａｘｉａｌ  ｔｕｒｎｉｎｇ，  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｎｏｔｏｃｈｏｒｄ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ  ６５，  ７０−７．
Ｗｏｎｇ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ｃｈａｎ，  Ｋ．  Ｋ．  ａｎｄ  Ｃｈｏｗ，  Ｋ．  Ｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｂ２１ｌ１  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  ８７，  １８５−１８８（１９９９）
Ｗｏｏｄ  Ｓ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，  ８７−８９（１９９３）
Ｘｕ，  Ｙ．，  Ｂａｌｄａｓｓａｒｅ，  Ｍ．，  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｐ．，  Ｒａｔｈｂｕｎ，  Ｇ．，  Ｏｌｔｚ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｇ．  Ｄ．，  Ｊｅｓｓｅｌｌ，  Ｔ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ａｌｔ，  Ｆ．  Ｗ．  （１９９３）．  ＬＨ−２：  ａ  ＬＩＭ／ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０，  ２２７−３１．
「新生化学実験講座２  核酸ＩＶ」，東京化学同人，日本生化学会，１９９３年４月１５日，ｐ３１９−３４７
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、創傷の治療、再生治療、および癌治療の分野において、作用機構および制御機構が新規である細胞増殖の制御手段、特に組織特異的に細胞増殖を制御する手段が提供されることになる。これにより、様々な細胞、例えば、幹細胞、神経幹細胞、ドーパミン陽性細胞などを試験管内で調整することが可能となり、そのような様々な細胞の増殖を制御するためのキットを製造することも可能となる。
現在までに、多くの細胞増殖を制御する手段（遺伝子およびタンパク質など）が開示されているが、本発明において使用するタンパク質およびその遺伝子は、従来のものとはアミノ酸配列およびＤＮＡ配列が全く異なっている。そのため、本明細書に開示のタンパク質は、従来のものとは全く異なった作用機構および制御機構により、細胞増殖を制御するといえる。
【００５５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｍａｂ２１Ｌ１欠損マウスの作製を示したものである。（Ａ）野生型Ｍａｂ２１Ｌ１ゲノム（上）とターゲッティングベクター（中）、遺伝子欠損型ゲノム（下）の制限酵素地図。（Ｂ）サザンブロットによるＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇ。（左）ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ処理後のサンプルを５’側プローブで検出したもの。野生型は８ｋｂ、欠損型は１９ｋｂのバンドとして検出された。（右）ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ処理後のサンプルを３’側プローブで検出したもの。野生型は７．５ｋｂ、欠損型は１９ｋｂのバンドとして検出された。（Ｃ）ＰＣＲによるＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇ。野生型は１４５ｂｐ、欠損型は２２５ｂｐのバンドとして検出された。（Ｄ）Ｍａｂ２１Ｌ１のｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ  ｉｎ  ｓｔｉｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ。Ｅ１０．５  Ｍａｂ２１Ｌ１−／−胚ではシグナルが検出されなかった。
【図２】成体Ｍａｂ２１Ｌ１欠損マウスの眼形成異常を示したものである。（Ａ）成体Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−マウスと（Ｂ）Ｍａｂ２１Ｌ１−／−マウス。（Ｃ）摘出した眼。（左）Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−、（右）Ｍａｂ２１Ｌ１−／−。（Ｄ、Ｅ）眼の組織切片のＨＥ染色像。（Ｄ）Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−  （Ｅ）  Ｍａｂ２１Ｌ１−／−。（ａ−ｄ）ＤおよびＥの枠の拡大図。ｃｏ：角膜、ｉｎｌ：内顆粒層、ｉｒ：虹彩、ｌｒｕ：水晶体様痕跡組織、ｏｎ：眼柄、ｏｎｌ：外顆粒層、ｐｅ：網膜色素上皮。スケールバー：１ｍｍ（Ｄ、Ｅ）、２００μｍ（ａ、ｂ）、１００μｍ（ｃ、ｄ）。
【図３】発生過程におけるＭａｂ２１Ｌ１欠損マウスの眼形成異常を示したものである。（Ａ）Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−マウスおよび（Ｂ）Ｍａｂ２１Ｌ１−／−マウスの外観、（Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ）Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−と（Ｄ，Ｆ、Ｈ、Ｊ）Ｍａｂ２１Ｌ１−／−のＨＥ染色像。Ｅ１７  Ｍａｂ２１Ｌ１−／−は角膜の膨殉（矢尻）と網膜の厚化（カギカッコ）が観られたが、視神経束（矢印）が認められた。Ｅ１０．５は形成不全を起した水晶体プラコードが認められた（矢尻）。Ｅ９．５は頭部外胚葉の肥厚が少なく、且つ狭い領域で認められた（カギカッコ）。スケールバー：２００μｍ（Ｃ、Ｄ）、１００μｍ（Ｅ、Ｆ）、５０μｍ（Ｇ−Ｊ）。
【図４】Ｍａｂ２１Ｌ１欠損マウスにおけるｃｒｙｓｔａｌｌｉｎと網膜形成関連遺伝子の発現を示したものである。（Ａ−Ｄ）Ｅ１２．５のｉｎ  ｓｔｉｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ。（Ｅ−Ｆ）Ｅ１５のｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ。（Ａ、Ｂ）αＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ、（Ｃ、Ｄ）γＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ、（Ｅ、Ｆ）Ｃｈｘ１０、（Ｇ、Ｈ）Ｂｒｎ３ｂ。水晶体様痕跡組織にｃｒｙｓｔａｌｌｉｎの発現が認められた。スケールバー：１００μｍ（Ａ−Ｄ）、２００μｍ（Ｅ−Ｆ）。
【図５】Ｍａｂ２１Ｌ１欠損マウスにおける細胞増殖と細胞死を示したものである。（Ａ−Ｈ）ＢｒｄＵの免疫組織染色像。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−ではＢｒｄＵの取り込み減少が認められた（カギカッコ）。（Ｉ、Ｊ）ＴＵＮＥＬ法による細胞死の検出。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−でＴＵＮＥＬ陽性細胞が若干増加した（矢尻）。ｌｐ：水晶体プラコード、ｎｒ：神経性網膜、ｏｎ：視神経束、ｏｖ：眼胞、ｐｅ：網膜色素上皮、ｐｌ：水晶体孔、ｌｖ：水晶体胞、ｓｅ：頭部外胚葉、ｓｏ：体節期。スケールバー：５０μｍ。
【図６】Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−およびＭａｂ２１Ｌ１−／−水晶体源基におけるＢｒｄＵ取り込み効率を示したものである。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−において、ＢｒｄＵ陽性細胞の割合（％ＢｒｄＵ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌｓ）は減少した。有意水準はｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により算出した。＊＊Ｐ＜０．００４、＊Ｐ＜０．０００１。
【図７】Ｍａｂ２１Ｌ１欠損マウスにおける包皮腺形成の異常を示したものである。（Ａ）Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−成体雄マウスの外生殖器。（Ｂ）Ｍａｂ２１Ｌ１−／−成体雄マウスの外生殖器。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−では包皮腺形成異常が認められた（矢印）。Ｐｕ：包皮腺、Ｐ：ペニス、Ｔ：精巣。（Ｃ）摘出された包皮腺  （左）Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−  （右）Ｍａｂ２１Ｌ１−／−。（Ｄ）摘出されたペニス  （右）Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−  （左）Ｍａｂ２１Ｌ１−／−。（Ｅ−Ｈ）包皮腺の組織切片のＨＥ染色像。（Ｅ）Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−  （Ｆ）Ｍａｂ２１Ｌ１−／−  （Ｇ）Ｅの拡大図  （Ｈ）Ｆの拡大図。
【図８】Ｍａｂ２１Ｌ１＋／−およびＭａｂ２１Ｌ１−／−水晶体源基におけるＰＡＸ６とＦｏｘｅ３の発現を示したものである（２８体節期、３５体節期および４０体節期）。（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊ）Ｆｏｘｅ３のｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ。（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）ＰＡＸ６の免疫組織染色像。Ｍａｂ２１Ｌ１−／−においてＦｏｘｅ３の発現減少が観られた（矢尻）。スケールバー：５０μｍ。
【図９】Ｓｅｙ／ＳｅｙにおけるＭａｂ２１Ｌ１の発現を示したものである（２２体節期および３５体節期）。（Ａ、Ｃ、Ｅ）野生型。（Ｂ、Ｄ、Ｆ）Ｓｅｙ／Ｓｅｙ。Ｓｅｙ／Ｓｅｙにおいて、Ｍａｂ２１Ｌ１の発現は頭部外胚葉と眼胞で減少した。Ｍａｂ２１Ｌ２の発現に変化は観られなかった。スケールバー：１００μｍ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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