(57)【要約】【課題】マルチビタミンドリンクのようなイノシトールに比較して高濃度でグルコースを含んでなる液状サンプルであっても、当該サンプル中のイノシトールを高い精度で定量することができるイノシトールの定量方法を提供すること。【解決手段】少なくともイノシトール及びグルコースを含んでなる液状サンプル中のイノシトールの定量方法であって、イノシトールデヒドロゲナーゼを固定化した担体を充填したイノシトールデヒドロゲナーゼリアクターの前段に、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びムタロターゼを共固定化した担体を充填したグルコース除去酵素リアクターを配してなるフローインジェクションシステムを用いて行うことを特徴とするものである。【選択図】  図１
2004275080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともイノシトール及びグルコースを含んでなる液状サンプル中のイノシトールの定量方法であって、イノシトールデヒドロゲナーゼを固定化した担体を充填したイノシトールデヒドロゲナーゼリアクターの前段に、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びムタロターゼを共固定化した担体を充填したグルコース除去酵素リアクターを配してなるフローインジェクションシステムを用いて行うことを特徴とする定量方法。
【請求項２】
グルコース除去酵素リアクターを通過させた後の液状サンプルと、補酵素酸化体を含む溶液を混合した後、この混合液をイノシトールデヒドロゲナーゼリアクターに導入し、当該リアクター内でイノソースと補酵素還元体を生成させ、生成した補酵素還元体を蛍光検出することを特徴とする請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
液状サンプルが、イノシトールの１００倍以上の濃度でグルコースを含んでなることを特徴とする請求項１又は２記載の定量方法。
【請求項４】
液状サンプルが、少なくともイノシトール、グルコース及び／又はシュークロース、リン酸リボフラビン及び塩酸ピリドキシンを配合してなるマルチビタミンドリンクであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の定量方法。
【請求項５】
液状サンプルを、当該サンプルから予めリン酸リボフラビン及び塩酸ピリドキシンを除去した後に、フローインジェクションシステムに注入することを特徴とする請求項４記載の定量方法。
【請求項６】
グルコース除去酵素リアクターに充填されたグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びムタロターゼを共固定化した担体が、十分量のカタラーゼを固定化したことでその表面が緑色の色調を呈してなることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の定量方法。
【請求項７】
イノシトールデヒドロゲナーゼを固定化した担体を充填したイノシトールデヒドロゲナーゼリアクターの前段に、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びムタロターゼを共固定化した担体を充填したグルコース除去酵素リアクターを配してなることを特徴とするフローインジェクションシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マルチビタミンドリンクのようなイノシトールに比較して高濃度でグルコースを含んでなる液状サンプルであっても、当該サンプル中のイノシトールを高い精度で定量することができるイノシトールの定量方法及びフローインジェクションシステムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）は広く自然界に分布しているが、動物体内での合成は限界があることから成長因子として位置付けられ、代謝異常や病気の指標とされている（非特許文献１参照）。イーグル（Ｅａｇｌｅ）らによってヒト培養細胞で、イノシトール欠乏による増殖阻害と死滅が再現よく起こることが示され、イノシトールはビタミンの一種として認識されるようになり（非特許文献２参照）、他の水溶性ビタミンと共に栄養補給を目的としたマルチビタミンドリンクに配合されている。
【０００３】
イノシトールは検出が困難な化合物として分析化学的な興味を集めており、そのことは分析方法や手法に関する数多くの報告に反映している（例えば非特許文献３参照）。最も一般的なイノシトールの分析方法はガスクロマトグラフィーであり、この方法は高い選択性を示すが検出限界が低いと言われている（非特許文献４参照）。ガスクロマトグラフィーによるマルチビタミンドリンク中のイノシトール分析も報告されており、それはトリメチルクロルシランによる誘導体化を必要とするものであった（非特許文献５参照）。この方法はシリル化したイノシトールを有機溶媒抽出する操作も含まれていることから、操作として煩雑であるばかりでなく環境に対する影響も無視出来ない。
【０００４】
ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（Ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、酸化型β−ジホスホピリジンヌクレオチド（β−Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＮＡＤ＋）の存在下で、イノシトールをイノソース（ｉｎｏｓｏｓｅ）に酸化する。その際生成するイノソースと等モルのＮＡＤ＋が還元型β−ジホスホピリジンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に還元されることから、その変化量をイノシトールの検出に用いる酵素法は古くから利用されてきた（非特許文献６参照）。
【０００５】
初期のミオイノシトールデヒドロゲナーゼを利用した酵素的手法は、ＮＡＤ＋の変化量を吸光検出する単純なもので、検出感度の悪い方法であった。その後、この酵素反応の反応平衡（１．２  ｘ  １０−３Ｍ）が分析化学的に都合が悪いことに注目し、他の酵素反応を付与することで反応平衡を右側（生成物側）に傾けることで、感度を飛躍的に向上することに成功している（非特許文献７参照）。非特許文献７はフローインジェクションシステムを用いたミオイノシトールの検出方法に関する報告であるが、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの作用によるＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変化に対し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）と乳酸オキシダーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）を作用させて最終的に発生する過酸化水素を電気化学的に検出する方法を提案するものである。このような他の反応をカスケードさせる分析法は、検出感度を向上させることは可能であるが、必要とする酵素リアクターの種類の増加を招くことで、日常の管理項目が増加することから、マルチビタミンドリンクの品質試験法としては不適当である。なお、非特許文献７には、イノシトールに比較して高濃度でグルコースを含んでなる液状サンプル中のイノシトールを精度よく検出するための方法について何らの示唆も記載もない。
【０００６】
ところで、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼは、高濃度に存在するグルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）を誤認識することが報告されている（非特許文献８参照）。甘味剤として多量に配合したグルコースや、甘味剤として多量に配合したシュークロースの加水分解物としての多量のグルコースが存在するマルチビタミンドリンクの処方は、分析化学的にみて非常に特殊な環境である。このような特殊な環境にあるイノシトールを検出するためにはイノシトールを検出する前にグルコースを除去する必要がある。この点に関し、非特許文献３のミオイノシトールデヒドロゲナーゼを利用したイノシトール分析の報告でも、グルコースオキシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）を利用したグルコースの除去が試みられているが、ここに記載された方法は、自動分析を目指したものではなく、フローインジェクションシステムについては何らの示唆も記載もない。また、非特許文献９には、シュークロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、グルコース及びフラクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を、酵素リアクターを用いたフローインジェクションシステムによって分別定量する方法が記載されており、試料中に内在するグルコースを除去するために、グルコースオキシダーゼ、ムタロターゼ（ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）及びカタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）を共固定化したセファロース担体を充填したグルコース除去酵素リアクターを利用することが提案されているが、ここでは分析対象物質（シュークロース）に対して除去すべきグルコースの濃度は最大で５倍までの実験しかなされておらず、マルチビタミンドリンクの処方のような、イノシトールの１００倍以上の濃度でグルコースを含む場合などの、特殊な環境にあるイノシトールを精度よく検出するための方法は今だかつて存在しない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｂ．Ｊ．Ｈｏｌｕｂ，  Ａｄｖ．Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．，  ４  （１９８２）  １０７−１４１．
【非特許文献２】
Ｈ．Ｅａｇｌｅ，  Ｖ．Ｉ．Ａａｒｏｎ，  Ｅ．Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２２６  （１９５７）  １９１−２０５．
【非特許文献３】
Ｌ．Ｃ．ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，  Ｆ．Ｍ．Ｍａｔｓｃｈｉｎｓｋｙ，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １４１  （１９８４）  ３８２−３８９．
【非特許文献４】
Ｍ．Ａ．Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｖ．Ｒｈｅｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，  １９２  （１９６９）  ３６１−３６３．
【非特許文献５】
Ｋ．Ｓａｇａｒａ，  Ｋ．Ｉｋｕｎａｇａ，  Ｔ．Ａｎｍｏ，  Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｍ．Ｂｕｌｌ．，  ２７  （１９７９）  ８００−８０３．
【非特許文献６】
Ｊ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，  ｉｎ  Ｈ．Ｕ．  Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ），  ３ｒｄ  ｅｄｎ．，  ｖｏｌ  ＶＩ，  Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，  １９８４，  ｐｐ．３６６−３７０．
【非特許文献７】
Ｂ．Ｏ．Ｏｌｓｓｏｎ，  Ｇ．Ｍａｒｋｏ−Ｖａｒｇａ，  Ｇ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ．，  ２０６  （１９８８）  ４９−５５．
【非特許文献８】
Ａ．  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ２７  （１９５８）  ６０８−６１１．
【非特許文献９】
Ｋ．  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｈ．  Ｋａｍｉｋａｄｏ，  Ｈ．  Ｍａｔｓｕｂａｒａ，  Ｙ．  Ｏｓａｊｉｍａ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ６０  （１９８８）  １４７−１５１．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、マルチビタミンドリンクのようなイノシトールに比較して高濃度でグルコースを含んでなる液状サンプルであっても、当該サンプル中のイノシトールを高い精度で定量することができるイノシトールの定量方法及びフローインジェクションシステムを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の点に鑑みてなされた本発明のイノシトールの定量方法は、請求項１記載の通り、少なくともイノシトール及びグルコースを含んでなる液状サンプル中のイノシトールの定量方法であって、イノシトールデヒドロゲナーゼを固定化した担体を充填したイノシトールデヒドロゲナーゼリアクターの前段に、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びムタロターゼを共固定化した担体を充填したグルコース除去酵素リアクターを配してなるフローインジェクションシステムを用いて行うことを特徴とする。
また、請求項２記載の定量方法は、請求項１記載の定量方法において、グルコース除去酵素リアクターを通過させた後の液状サンプルと、補酵素酸化体を含む溶液を混合した後、この混合液をイノシトールデヒドロゲナーゼリアクターに導入し、当該リアクター内でイノソースと補酵素還元体を生成させ、生成した補酵素還元体を蛍光検出することを特徴とする。
また、請求項３記載の定量方法は、請求項１又は２記載の定量方法において、液状サンプルが、イノシトールの１００倍以上の濃度でグルコースを含んでなることを特徴とする。
また、請求項４記載の定量方法は、請求項１乃至３のいずれかに記載の定量方法において、液状サンプルが、少なくともイノシトール、グルコース及び／又はシュークロース、リン酸リボフラビン及び塩酸ピリドキシンを配合してなるマルチビタミンドリンクであることを特徴とする。
また、請求項５記載の定量方法は、請求項４記載の定量方法において、液状サンプルを、当該サンプルから予めリン酸リボフラビン及び塩酸ピリドキシンを除去した後に、フローインジェクションシステムに注入することを特徴とする。
また、請求項６記載の定量方法は、請求項１乃至５のいずれかに記載の定量方法において、グルコース除去酵素リアクターに充填されたグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びムタロターゼを共固定化した担体が、十分量のカタラーゼを固定化したことでその表面が緑色の色調を呈してなることを特徴とする。
また、本発明のフローインジェクションシステムは、請求項７記載の通り、イノシトールデヒドロゲナーゼを固定化した担体を充填したイノシトールデヒドロゲナーゼリアクターの前段に、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びムタロターゼを共固定化した担体を充填したグルコース除去酵素リアクターを配してなることを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、フローインジェクションシステムとは、内径数ｍｍ程度のチューブなどに分析対象物である液状サンプルを注入し、この液状サンプルの流れに試薬を混合・反応させた後、検出対象物を吸光光度法や蛍光光度法などで検出するための基本構成を有するシステムを意味する。本発明は、このシステム中にて、少なくともイノシトール及びグルコースを含んでなる液状サンプルと補酵素酸化体を含む溶液を混合した後、当該サンプル中のイノシトールと補酵素酸化体を、イノシトールデヒドロゲナーゼを固定化した担体を充填したイノシトールデヒドロゲナーゼリアクター（以下ＩＤＲと略称する）内で反応させてイノソースと補酵素還元体を生成させ、例えば、生成した補酵素還元体を検出するにあたり、検出誤認を生じさせうるグルコースを予めグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びムタロターゼを共固定化した担体を充填したグルコース除去酵素リアクターを用いて除去することを要旨とするものである。ここで、補酵素酸化体としては酸化型β−ジホスホピリジンヌクレオチド（ＮＡＤ＋）など、補酵素還元体としては還元型β−ジホスホピリジンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）などを用いることができる。
【００１１】
ＩＤＲは、例えば、カラムなどにイノシトールデヒドロゲナーゼを固定化した担体を充填してなる。イノシトールデヒドロゲナーゼは、イノシトールと補酵素酸化体から、イノソースと補酵素還元体を生成させる作用を有する酵素であれば特段限定されるものではないが、担体上に固定化しても安定なものが望ましい。イノシトールデヒドロゲナーゼを固定化する担体としては、ケイソウ土、シリカゲル、ガラスビーズ、アルミナ、セラミック、カーボン、活性炭、モレキュラーシーブ、シリコンゴム、セルロース、アガロース、アミノ酸系ポリマーなどを用いることができる。固定化方法は、吸着法、化学結合法、包括法などのいずれでもよい。
【００１２】
グルコース除去酵素リアクター（以下ＧＥＲと略称する）は、例えば、カラムなどにグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びムタロターゼを共固定化した担体を充填してなる。グルコースオキシダーゼは、β−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化する作用を有する酵素であれば特段制限されるものではない。また、カタラーゼは、グルコースオキシダーゼの作用により、β−Ｄ−グルコースがＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化された際に生成する過酸化水素を水と酸素に分解する作用を有する酵素であれば特段制限されるものではない。また、ムタロターゼは、α−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース間の相互変換反応を触媒する酵素であれば特段制限されるものではない。しかしながら、これらの酵素は、担体上に共固定化しても安定なものが望ましい。これらの酵素を固定化する担体や固定化方法については、上記のイノシトールデヒドロゲナーゼを固定化する担体や固定化方法と同じでよい。
【００１３】
液状サンプルが、甘味剤として配合したグルコースや、甘味剤として配合したシュークロースの加水分解物としてのグルコースを、イノシトールの１００倍以上の濃度で含んでなるマルチビタミンドリンクのようなものである場合、ＧＥＲに当該サンプルを通過させた際、グルコースが完全に除去されなければ、グルコースがＩＤＲに導入されることでイノシトールとの誤認反応を生じさせる公算が高い。従って、ＧＥＲに充填された担体には、十分量のグルコースオキシダーゼが固定化されている必要がある。また、グルコースが完全に除去された場合でも、グルコースが酸化された際に生成する過酸化水素がカタラーゼによって完全に水と酸素に分解されなければ、過酸化水素がＩＤＲに導入されることでＩＤＲの活性を失活させる公算が高い。従って、カタラーゼについても、ＧＥＲに充填された担体には十分量が固定化されている必要がある。本発明者らの知見によれば、カタラーゼの固定化量は、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びムタロターゼを共固定化した担体の表面が、鉄を包接してなることで緑色をしたカタラーゼの色彩を反映して緑色の色調を呈するに至る量であることが望ましい。
【００１４】
液状サンプル中のイノシトールの定量は、イノシトールと補酵素酸化体を、ＩＤＲ内で反応させてイノソースと補酵素還元体を生成させ、生成した補酵素還元体を蛍光検出することが、非特許文献７に記載されたような他の酵素反応のカスケードを必要とせず、高い検出感度が得られることから望ましい。
【００１５】
しかしながら、液状サンプルが、少なくともイノシトール、グルコース及び／又はシュークロース、リン酸リボフラビン及び塩酸ピリドキシンを配合してなるマルチビタミンドリンクである場合、蛍光性物質であるリン酸リボフラビン及び塩酸ピリドキシンは、ＩＤＲ内で生成した補酵素還元体の蛍光検出に悪影響を及ぼすことが予想される。従って、液状サンプルがこのようなマルチビタミンドリンクである場合、当該サンプルから予めリン酸リボフラビン及び塩酸ピリドキシンを除去した後に、フローインジェクションシステムに注入することが望ましい。液状サンプルからのリン酸リボフラビンの除去は、例えば、オクタデシルシリル化シリカゲルカートリッジに液状サンプルを通過させることで行えばよい。また、液状サンプルからの塩酸ピリドキシンの除去は、例えば、強陽イオン交換カートリッジに液状サンプルを通過させることで行えばよい。
【００１６】
図１は、本発明のフローインジェクションシステムの具体例の流路図である。ポンプＡは、オートサンプルインジェクター（Ｉｎｊ．）から注入された液状サンプルのキャリアー液を流すポンプである。ポンプＢは、補酵素酸化体を含む溶液を流すポンプである。オートサンプルインジェクター（Ｉｎｊ．）から注入された液状サンプルは、キャリアー液とともにＧＥＲに導入されてグルコースが除去された後、補酵素酸化体を含む溶液と混合され、ＩＤＲに導入される。ＩＤＲ内では、イノシトールと補酵素酸化体からイノソースと補酵素還元体が生成し、生成した補酵素還元体を蛍光検出器（Ｄ）にて検出し、データ処理装置（Ｃｐ）でデータ化されて液状サンプル中のイノシトール量が出力される。
【００１７】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。
【００１８】
（実験方法）
１．材料
ミオイノシトール及びウシ肝臓由来のカタラーゼ（ＥＣ  １．１１．１．６，  凍結乾燥粉末，  ５０００−１５０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）は和光純薬株式会社より入手した（東京，日本）。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（ミオイノシトール：  ＮＡＤ＋  ２−オキシドリダクターゼ，  ＥＣ  １．１．１．１８，  凍結乾燥粉末，  ２５−５０  ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）はシグマより入手した（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）。微生物由来のグルコースオキシダーゼ（β−Ｄ−グルコース：  オキシゲン  １−オキシドレダクターゼ，  ＥＣ  １．１．３．４，  凍結乾燥粉末，  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ３００  ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ）及び酵母由来の酸化型β−ジホスホピリジンヌクレオチド（β−ＮＡＤ＋）はオリエンタル酵母株式会社より入手した（大阪，日本）。ブタ腎臓由来のムタロターゼ（ＥＣ  ５．１．３．３，  凍結乾燥粉末，  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  １５００  ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）はＢｉｏｚｙｍｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＬＴＤ．より入手した（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）。アミノプロピルコントロールド多孔質ガラス（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ＣＰＧ，  １４００  Å  孔径，  １２０−２００  メッシュ）はＣＰＧ社より入手した（Ｌｉｎｃｏｒｎ，  Ｐａｒｋ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）。本研究に用いた液状サンプルとしてのプロトタイプのマルチビタミンドリンクの処方は、１００ｍＬ中にイノシトール５０ｍｇを含有し、その他の有効成分として、硝酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸アミド、タウリン及びカフェインを処方した。また、甘味剤としてグルコースを１００ｍＬ中に７０００ｍｇ含有し、その他の甘味剤としてソルビトールを処方した。ドリンク中のイノシトールとグルコースの濃度比率は１：１４０に設定した。
【００１９】
２．酵素の固定化及び酵素リアクターの調製
ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの固定化及び酵素リアクターの調製法は、非特許文献７に基づいて行った。ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（５０ｕｎｉｔｓ）は、アミノプロピルコントロールド多孔質ガラス（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ＣＰＧ）に対してグルタルアルデヒドを介して５℃で１晩カップリングさせることで固定化した。固定化ミオイノシトールデヒドロゲナーゼは、５０  ｘ  ４  ｍｍ  Ｉ．Ｄ．のステンレススチールカラムにスラリー法で充填し、ＩＤＲとした。
グルコースオキシダーゼ／ムタロターゼ／カタラーゼの共固定化とＧＥＲの調製は、基本的にＩＤＲの調製法を踏襲した。０．５ｇのａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ＣＰＧを減圧化で２．５％のグルタルアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で１時間活性化し、ガラスフィルター上で水５００ｍＬにより洗浄した。得られたグルタルアルデヒド活性型ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ＣＰＧとグルコースオキシダーゼ（８０００ｕｎｉｔｓ）、ムタロターゼ（１００００ｕｎｉｔｓ）及びカタラーゼ（２３００００ｕｎｉｔｓ）は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬ中で５℃で１晩反応した。得られた共固定化グルコースオキシダーゼ／ムタロターゼ／カタラーゼは、それぞれ５００ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄後、２５０  ｘ  ２．１  ｍｍ  Ｉ．Ｄ．のステンレススチールカラムにスラリー法で充填し、ＧＥＲ−１とした。
更に活性の高いＧＥＲを得るために、上記のようにして５℃で１晩カップリングした共固定化グルコースオキシダーゼ／ムタロターゼ／カタラーゼに対して、グルコースオキシダーゼ（８０００ｕｎｉｔｓ）、ムタロターゼ（１００００ｕｎｉｔｓ）及びカタラーゼ（２３００００ｕｎｉｔｓ）を再度添加し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬ中で室温４時間反応した。得られた高活性共固定化グルコースオキシダーゼ／ムタロターゼ／カタラーゼをそれぞれ５００ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄後、２５０  ｘ  ２．１  ｍｍ  Ｉ．Ｄ．のステンレススチールカラムにスラリー法で充填し、ＧＥＲ−２とした。
【００２０】
３．装置及び手順
フローインジェクションシステムは図１に示したものを利用した。ポンプＡにより０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液を行い、ＧＥＲによるグルコースの除去を行った。ポンプＢにより４ｍＭのＮＡＤ＋  を含む０．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液を行い、ポンプＡの流れとミキサー内で混合後、ＩＤＲへ導入した。両液混合後のｐＨはイノシトールデヒドロゲナーゼの最適ｐＨであるｐＨ８．５であることを確認した。
ポンプ２台（ＬＣ−１０ＡＤ，  Ｓｈｉｍａｄｚｕ，  京都）、カラムオーブン１台（ＣＴＯ−１０ＡＣ，  Ｓｈｉｍａｄｚｕ）及びオートサンプルインジェクター１台（ＳＩＬ−１０ＡＸＬ，  Ｓｈｉｍａｄｚｕ）は、システムコントローラー（ＣＴＯ−１０ＡＣ，  Ｓｈｉｍａｄｚｕ）により制御した。生成したＮＡＤＨの検出は、蛍光検出器（１１００  ｓｅｒｉｅｓ，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）により行った。
ＧＥＲ及びＩＤＲは、カラムオーブン（ＣＴＯ−１０ＡＣ，  Ｓｈｉｍａｄｚｕ）内で３０℃に加温し、それぞれ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）の混合液（１：１）により平衡化した。液状サンプルは、オートサンプルインジェクターを通して２０μＬ注入した。液状サンプルを、ポンプＡのリン酸緩衝液の流れに乗ってＧＥＲに導入し、液状サンプル中のβ−Ｄ−グルコースをグルコースオキシダーゼによりＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化させるとともに、副生成物として生成する過酸化水素は、カタラーゼにより水と酸素に分解させた。つづいて、ポンプＡの流れとポンプＢの流れを（Ｎｏｎ−Ｍｅｔａｌ  ｓｔａｔｉｃ  ｍｉｘｅｒ，  ２５０μＬ  ｖｏｌｕｍｅ，  ＧＬ  ｓｃｉｅｎｃｅ，  東京）内で混合し、ＩＤＲに導入した。ＩＤＲ内において液状サンプル中のイノシトールの量依存的に生成するＮＡＤＨは、蛍光検出器（Ｅｍ：３４０ｎｍ，Ｅｘ：４６０ｎｍ）により検出した。
【００２１】
４．試料溶液及び標準溶液の調製
標準溶液は、ミオイノシトールを１０５℃４時間乾燥し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３μｇ／ｍＬ濃度に希釈した。
試料溶液の調製は、マルチビタミンドリンク中の蛍光物質であるリン酸リボフラビン及び塩酸ピリドキシンの除去を必要とした。リン酸リボフラビンの除去は、オクタデシルシリル化シリカゲルカートリッジ（Ｃ１８  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  ６ｃｃ（１ｇ），  Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）で行い、塩酸ピリドキシンの除去は、強陽イオン交換カートリッジ（ＳＣＸ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  ＢＯＮＤ  ＥＬＵＴ  ＬＲＣ−ＳＣＸ，  ５００ＭＧ，  Ｖａｒｉａｎ  Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で行った。Ｃ１８  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ及びＳＣＸ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅを直列で接続し、シリンジを用いてメタノール及び水の順番で、それぞれ１０ｍＬをゆっくり通液し平衡化した。２０ｍＭのクエン酸溶液で１０倍希釈したマルチビタミンドリンク２ｍＬを平衡化したカートリッジに供し、２０ｍＭのクエン酸溶液１５ｍＬにてイノシトールを溶出した。その溶出液に水を加えて２０ｍＬとし、その液６ｍＬ正確にとり、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて２０ｍＬとし、試料溶液とした。
【００２２】
（実験結果）
１．イノシトールの検出
イノシトールの濃度勾配系列を調製し、図１に示したフローインジェクションシステムで分析した。得られたシグナル及び用量反応曲線（ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅ）を図２及び図３に示した。本システムにおけるイノシトールの検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）は、０．０１μｇ／ｍＬであった。この蛍光検出による検出感度は、吸光光度検出の検出感度（Ｓ／Ｎ＝３：１０μｇ／ｍＬ）と比較して、約１００倍優れていた。そして、他の酵素反応をカスケードすることで検出感度を向上した非特許文献７の報告と比較しても同等の感度を得ることが出来た。また、１〜５μｇ／ｍＬ濃度範囲における検量線は、相関係数（ｒ）は０．９９９３と良好な直線性を示したが原点を通過しなかった。よって本システムの利用は、標準溶液の３濃度をとり、それらのピーク高さより得られる検量線より、試料溶液中のイノシトール濃度を求める検量線法を選択することとした。
【００２３】
２．グルコースの除去
イノシトールデヒドロゲナーゼは、高濃度に存在するグルコースを誤認識することから、本システムにおけるイノシトール検出もグルコースの影響を受ける。よって本法の課題は、マルチビタミンドリンクの甘味剤として配合されるグルコースの除去をＧＥＲによって行うことを目標としている。ＧＥＲの評価を行うために、イノシトール、グルコース及びそれらの混合サンプルをリン酸緩衝液で希釈し、調製法の異なるＧＥＲ−１及びＧＥＲ−２のグルコース除去活性を、イノシトールのグルコース溶液からの回収率として示した結果を表１に示す。なお、イノシトール及びグルコースの混合比率は、マルチビタミンドリンクの処方を考慮して、１：１４０とした。
【００２４】
【表１】
2004275080.tif 000003
【００２５】
穏やかな条件でグルコースオキシダーゼ、ムタロターゼ及びカタラーゼの共固定化を行ったＧＥＲ−１では、１μｇ／ｍＬ濃度のグルコース由来のシグナルは認められなかったが、イノシトール１μｇ／ｍＬ及びグルコース１４０μｇ／ｍＬの混合溶液では、イノシトールの回収率に約６％の正の妨害が認められた。また連続分析を行う上で、得られるイノシトールのシグナル高さが減衰していく現象が認められた。これら問題点の原因は、３種の酵素の固定化量が充分でないことに起因し、ＩＤＲによるイノシトール検出に対して微量に残存するグルコースがイノシトールの検出を妨害すると共に、カタラーゼによる過酸化水素の除去が充分でないことで、ＧＥＲの下流に位置するＩＤＲが過酸化水素の影響を受け、イノシトールのシグナル強度が繰り返し分析に対応して減衰したと予想された。
そこで、充分な３種の酵素（グルコースオキシダーゼ、ムタロターゼ及びカタラーゼ）を固定化するために、共固定化操作において新たに酵素を加え、室温で更に４時間固定化反応を継続し得られたＧＥＲ−２の性能評価を行った。その結果、イノシトール及びグルコースの混合液においても、高濃度で存在するグルコース（１４０〜４２０μｇ／ｍＬ）の影響を排除し、添加したイノシトール（１〜５μｇ／ｍＬ）をほぼ１００％回収することが出来た。
ＧＥＲ−１に充填された、３種の酵素を共固定化した担体の表面は白色であったが、ＧＥＲ−２に充填された３種の酵素を共固定化した担体の表面は緑色の色調を呈していた。この現象は、ＧＥＲ−２においては、グルコースオキシダーゼ、ムタロターゼ及びカタラーゼの固定化量が増加しており、鉄を包接してなることで緑色をしたカタラーゼの色彩を反映したものであると考えられた。
【００２６】
３．マルチビタミンドリンク中のイノシトールの分析
上記の通り、イノシトールを５０ｍｇ／１００ｍＬ及びグルコースを７０００ｍｇ／１００ｍＬ配合するマルチビタミンドリンクを調製した。その他有効成分として、硝酸チアミン、リン酸リボフラビン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸アミド、タウリン及びカフェインを処方し、また、甘味剤としてグルコースの他、ソルビトールを処方した。本システムは生成するＮＡＤＨを蛍光検出する事から、マルチビタミンドリンク中の蛍光性物質が検出の妨害となることが予想され、検討した結果、リン酸リボフラビン及び塩酸ピリドキシンがＮＡＤＨの蛍光検出を妨害した。液状サンプルであるマルチビタミンドリンクからリン酸リボフラビン及び塩酸ピリドキシンを除去するために、上記の通り、Ｃ１８  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ及びＳＣＸ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅに当該サンプルを通液し、通過画分をイノシトールの試料溶液とすることで、簡単に妨害を除去する事が出来た。
マルチビタミンドリンクに対して、イノシトールを３濃度で添加して回収率を求めた結果を表２に示す。表２から明らかなように、どの濃度においてもほぼ１００％の回収率が得られ、本システムがマルチビタミンドリンク中のイノシトールの分析に十分応用可能なことを示すことが出来た。
【００２７】
【表２】
2004275080.tif 000004
【００２８】
（考察）
本研究においては、マルチビタミンドリンクによく処方され、イノシトールデヒドロゲナーゼによるイノシトールの検出を妨害するグルコースの除去が急所であった。グルコースオキシダーゼを用いたグルコース除去に関する報告はいくつか見あたるものの、定量対象とグルコースの濃度差が１００倍以上あった例はない。今回十分なグルコース除去活性を得るために、３種の酵素を２段階のステップで固定化することで、充分なグルコース除去活性を得たばかりでなく、ＩＤＲの安定性に影響する過酸化水素を消去することが出来た。また、本研究の完成のもう一つの要因として、蛍光検出の選択により、充分な検出感度（Ｓ／Ｎ＝３：０．０１μｇ／ｍＬ）が得られた事が挙げられる。この感度は、イノシトールデヒドロゲナーゼの反応に対して、検出感度を向上するために乳酸デヒドロゲナーゼ及び乳酸オキシダーゼの反応をカスケードした非特許文献７の報告と比較しても、同等以上の感度である。蛍光検出の選択により、検出感度向上するため酵素リアクターを必要としなかったことから、試験法の規格化及び分析バリデーションにおいて複雑な管理を必要とする酵素カラムの種類を最小限に留めることができた。これは品質管理試験法として採択するにあたり、判断基準として重要なことである。
高いグルコース除去活性を有するＧＥＲと、ＩＤＲ−蛍光検出の組み合わせにより、高濃度グルコースを含有するマルチビタミンドリンク中に存在するイノシトールを充分な精度にて定量することが出来た。またその迅速性は１分析１０分以内であり、これまでの品質管理方法と比較して大きなアドバンテージを得ることが出来た。本システムは有機溶媒を使用せず、１時間に６サンプルの処理が可能な迅速性を有するものであり、環境への優しさ、迅速性及び経済性において満足できるレベルである。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、マルチビタミンドリンクのようなイノシトールに比較して高濃度でグルコースを含んでなる液状サンプルであっても、当該サンプル中のイノシトールを高い精度で定量することができるイノシトールの定量方法及びフローインジェクションシステムが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のフローインジェクションシステムの具体例の流路図である。
【図２】実施例におけるイノシトールの所定濃度における標準シグナルを示すグラフである。
【図３】同、用量反応曲線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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