(57)【要約】【課題】本発明は、ｔｔ１９変異株の特徴を解析することを課題とするとともに、ｔｔ１９変異株を引き起こす原因遺伝子を同定し、その性質を解析することを課題とする。さらに、同定された原因遺伝子の性質を利用して、形質転換植物体を提供することもまた課題とする。【解決手段】本発明の発明者らは、ｔｔ１９変異株の原因遺伝子を解析し、そしてｔｔ１９変異株の性質を解明することにより、上記課題について種々検討した結果、トランスパレント・テスタ１９（ＴＴ１９）遺伝子と命名した新規の遺伝子をクローニングし、その遺伝子のＤＮＡ塩基配列の解析およびそのＴＴ１９遺伝子のＤＮＡによりコードされるタンパク質の解析を行うことにより、上述した課題を解決した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列またはこれと縮重の関係にある塩基配列；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列；もしくは
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列との間で少なくとも６０％の塩基配列相同性を有する塩基配列；
からなる群から選択される塩基配列であって、植物細胞中においてフラボノイドを液胞中に区画化させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸。
【請求項２】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；もしくは
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示されるアミノ酸配列との間で少なくとも６０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列；
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、植物細胞中においてフラボノイドを液胞中に区画化させる活性を有するタンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸によりコードされ、植物細胞中においてフラボノイドを液胞中に区画化させる活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１または２に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む、形質転換体植物細胞。
【請求項６】
請求項１または２に記載の核酸を含むトランスジェニック植物。
【請求項７】
請求項５に記載の形質転換体植物細胞を培地中で培養し、もしくは請求項６に記載のトランスジェニック植物を生長させ、培養された形質転換植物細胞もしくはトランスジェニック植物から、液胞中に蓄積されたフラボノイドを採取することからなる、フラボノイドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物細胞中においてフラボノイドを液胞中に区画化させる活性を有するタンパク質、およびそれをコードする遺伝子に関する。本発明はまた、この遺伝子を含有する形質転換体植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フラボノイドは、植物界において特有の二次代謝代謝産物である。それらには、３種類の主要なサブクラス：すなわち、フラボノール類、アントシアニン類、およびプロアントシアニジン類（ＰＡ；いわゆる縮合型タンニン）が含まれる。ＵＶ−Ｂ保護剤、植物と微生物とのあいだのシグナル伝達分子、およびオーキシン輸送の調節物質といった、植物におけるフラボノイドの多数の機能（Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ，  Ｂ．  （２００１）．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２６，  ４８５−４９３中にレビューされる）に関わらず、フラボノイド類の損失または欠失は一般的に、植物の生長および発育において何ら有害性の作用を及ぼすことがなく、そしていくつかの特定の器官における色の変化として容易に検出される。これらの事実が、植物におけるフラボノイド生合成経路を明らかにするために、彩色の減少または変化を伴う変異株を単離するきっかけとなった。
【０００３】
トウモロコシ穀粒におけるフラボノイド色素の変化は、これまでのところ最も徹底的に研究されたものの一つであり、それはアントシアニン経路の立証に寄与した。観葉植物種での分子育種を目的として、ペチュニアおよびキンギョソウにおいて多数の変異株が単離された（Ｍｏｌ，  Ｊ．，  Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｋｏｅｓ，  Ｒ．  （１９９８）．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ３，  ２１２−２１７）。最近１０年間にわたって、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における分子遺伝学が発展してきた。フラボノイド色素を欠失したシロイヌナズナ変異株のほとんどは、トランスパレントテスタ（透明な種皮、ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ  ｔｅｓｔａ；ｔｔ）として記載された（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ，  Ｍ．  （１９９０）．  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆ．  Ｓｅｒｖ．  ２７，  １−４）。
【０００４】
現在までのところ、２１種のｔｔ遺伝子座が同定され、そしてそのうちのほぼ半分について詳細に解析が行われた。ｔｔ変異株についての解析により、シロイヌナズナフラボノイド経路（図１）における多数の構造遺伝子および調節遺伝子がクローニングされ、そして特性決定された。構造遺伝子は、フラボノール合成酵素遺伝子（ＦＬＳ）以外は１−コピーであるため、シロイヌナズナフラボノイド生合成経路は、植物の代謝についての調節および細胞レベル下の構成を解析するためのモデルとして貴重なものである（Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ，  Ｂ．  （１９９９）．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  １０７，  １４２−１４９中でレビューされる）。
【０００５】
フラボノイド合成はサイトゾル中で進行するが、それらの最終生成物のほとんどは、最終的には液胞中に蓄積される。フラボノイド類を含む多くの二次代謝物は、それらを生成する細胞中でさえ細胞傷害性でありそして遺伝毒性を有するものであるため、植物における外来性の毒性化合物に対する隔離システムと同様のまたはそれと関連する隔離システムが存在すると考えられている。植物における外来物質の解毒は、３つの段階：すなわち、（Ｉ）通常は加水分解または酸化により反応性を高くする活性化段階、（ＩＩ）第（Ｉ）段階で代謝された化合物とグルコース、マロン酸またはグルタチオンなどの親水性分子との抱合段階、そして（ＩＩＩ）膜−結合型輸送タンパク質によるサイトゾルからの放出段階、から構成される（Ｃｏｌｅｍａｎ，  Ｊ．Ｏ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ２，  １４４−１５１）。
【０００６】
第（Ｉ）段階での主要な反応は、チトクロームＰ−４５０により触媒され、そしてＰ−４５０酵素の中には、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ、Ｆ３’Ｈ、Ｆ３’５’Ｈなどのフラボノイド生合成経路に関与するものもある（Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ，  ２００１、上述）。アントシアニンの解毒に関して、グルコシル基が３位に結合することが、前駆体（アントシアニジン類）を可溶化するために必要であり、そして対応するトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース：フラボノイドグルコシルトランスフェラーゼ（ＵＦＧＴ）が、アントシアニン経路における構造的酵素の一つであるといわれる。これまでに同定されたアントシアニン類の構造に基づいて、それらはメチル化、アシル化、そしてグリコシル化などの様々な修飾を受けなければならず、そして対応する遺伝子の中には、ペチュニアで同定されたものもあった（例えば、Ｂｒｕｇｌｉｅｒａ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ５，  ８１−９２）。
【０００７】
さらに、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）がアントシアニン色素沈着のために必須であると報告された。トウモロコシのＢＺ２およびペチュニアのＡＮ９は、ＧＳＴタンパク質をコードしており、そしてそれらは、機能的に互いに補い合うことができる（Ａｌｆｅｎｉｔｏ，  Ｍ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０，  １１３５−１１４９）。これらのＧＳＴの機能は、最初は、アントシアニジン−３−グルコシド類のグルタチオン−抱合体を形成することであると考えられた（Ｍａｒｒｓ，  Ｋ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）．  Ｎａｔｕｒｅ  ３７５，  ３９７−４００）。
【０００８】
アントシアニン類と比較すれば、ＰＡ類またはそれらの前駆体の修飾および区画化のメカニズムは、あまりよくわかっていない。ＰＡ蓄積メカニズムに関する現在の仮説モデルは、ダグラスファー（ベイマツ、Ｄｏｕｇｌａｓ−ｆｉｒ）から得られたデータに大きく依存している（Ｓｔａｆｆｏｒｄ，  Ｈ．Ａ．  （１９８９）．  Ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  ｔａｎｎｉｎｓ  （Ｈｅｍｉｎｇｗａｙ，  Ｒ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｋａｒｃｈｅｓｙ  Ｊ．Ｊ．  ｅｄｓ）．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  ４７−７０中にレビューされる）。
【０００９】
ＰＡ類は、開始体としてのフラバン３−オール類および伸長体としてのフラバン３，４−ジオール類（ロイコアントシアニジン類）からなると考えられてきたが、しかし２，３−ｃｉｓ−フラバン３−オール類が伸長体として関与する別の経路が最近示唆された（Ｘｉｅ，  Ｄ．−Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，  ３９６−３９９；図１）。
【００１０】
液胞（または小胞体の内腔；Ｓｔａｆｆｏｒｄ，  １９８９、上述）中へのそれらの取り込みは、ポリマー型ではなく、モノマー型として行われる様である（Ｄｅｂｅａｕｊｏｎ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３，  ８５３−８７１）。前駆体は、徐々に縮合され、そして形成されたポリマーが酸化され、その結果褐色となる（図１）。
【００１１】
縮合工程および酸化工程は、おそらくは酵素的に行われるが、その一方で非酵素的反応を容易に行うことができる（Ｓｔａｆｆｏｒｄ，  １９８９、上述）。おそらくは縮合および／または蓄積工程に関与しているいくつかのオオムギの変異体が、タンニン（プロアントシアニジン）−欠損（ａｎｔ）変異体として報告されたが（Ｇｒｕｂｅｒ，  Ｍ．Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  ｔａｎｎｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ２：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  （Ｇｒｏｓｓ，  Ｇ．Ｇ．，  Ｈｅｍｉｎｇｗａｙ，  Ｒ．Ｗ．，  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｔ．  ｅｄｓ）．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ｐｐ．  ３１５−３４１）、しかしＰＡ前駆体合成後のそれらの区画化、ポリマー化、および酸化についての分子的証拠および生化学的証拠は、未だ明らかになっていない。
【００１２】
シロイヌナズナにおいて、フラボノイド類についての区画化メカニズムは、アントシアニン類についてさえ、それらの生合成経路と比較して、未だ明らかになっていない（図１）。このシチュエーションは、主としてｔｔ変異株のほとんどが、フラボノイドの“輸送”工程ではなく、“合成”工程を欠損していることに限定されているという事実により、説明される。例外は、ｔｔ１２変異株の場合である。Ｄｅｂｅａｕｊｏｎら（２００１、上述）は、ＴＴ１２遺伝子を単離し、そしてＴＴ１２が、シロイヌナズナ種子外被におけるＰＡ前駆体の液胞への隔離の、少なくとも一部を担う推定トランスポーターであることを示唆した。
【００１３】
本発明者らは以前に、イオンビーム照射の変異率をシロイヌナズナにおいて研究している際に、２種の新規なｔｔ変異株を得た（Ｓｈｉｋａｚｏｎｏ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。そのうちの一つは、ｔｔ１８変異株（Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ，  ２００１（上述）においてかつてｔｔ１９として命名された）であり、その中ではロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ（ＬＤＯＸ）と推定されるタンパク質をコードする遺伝子が欠陥を起こしていた。もう一方は、ｔｔ１９変異株として定義されるが、現在までのところ、ｔｔ１９変異株の原因遺伝子、およびｔｔ１９変異株の性質は解明されていない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以上のとおりの事情を鑑みてなされたものであり、ｔｔ１９変異株の特徴を解析することを課題とするとともに、ｔｔ１９変異株を引き起こす原因遺伝子を同定し、その性質を解析することを課題とする。さらに、同定された原因遺伝子の性質を利用して、形質転換植物体を提供することもまた課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、ｔｔ１９変異株の原因遺伝子を解析し、そしてｔｔ１９変異株の性質を解明することにより、上記課題について種々検討した結果、トランスパレント・テスタ１９（ＴＴ１９）遺伝子と命名した新規の遺伝子をクローニングし、その遺伝子のＤＮＡ塩基配列の解析およびそのＴＴ１９遺伝子のＤＮＡによりコードされるタンパク質の解析を行うことにより、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の一態様において、植物細胞中においてフラボノイドを液胞中に区画化させる活性を有するタンパク質をコードする核酸を提供する。上述する本発明の核酸には、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列またはこれと縮重の関係にある塩基配列を含む核酸；（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含む核酸；（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列を含む核酸；もしくは（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列との間で少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の塩基配列相同性を有する塩基配列を含む核酸；が含まれる。
【００１７】
また、本発明の別の態様において、植物細胞中においてフラボノイドを液胞中に区画化させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸もまた提供する。上述する本発明の核酸は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸；（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸；もしくは（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示されるアミノ酸配列との間で少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸；からなる群から選択される核酸が含まれる。
【００１８】
本発明はまた、上述したような（ｉ）〜（ｉｖ）に記載する核酸または（ａ）〜（ｃ）に記載する核酸によりコードされ、植物細胞中においてフラボノイドを液胞中に区画化させる活性を有するタンパク質もまた、提供する。
【００１９】
本発明は別の態様において、（ｉ）〜（ｉｖ）に記載する核酸、あるいは（ａ）〜（ｃ）に記載する核酸のいずれかを含有する組換えベクター；上述した組換えベクターのいずれかを含む形質転換体植物細胞；もまた提供する。
【００２０】
本発明はさらに別の態様において、前述した形質転換体植物細胞を培地中で培養し、もしくは前述したトランスジェニック植物を生長させ、培養された形質転換植物細胞もしくはトランスジェニック植物から、液胞中に蓄積されたフラボノイドを採取することからなる、フラボノイドの製造方法；を提供する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の発明者らは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の乾燥種子に対してイオンビームを照射することにより得られた、ｔｔ１９変異株として定義されるシロイヌナズナの変異株の原因遺伝子を同定し、そしてｔｔ１９変異株の性質を解明した。本発明において解析の対象としたｔｔ１９変異株は、茎の基部領域やロゼット葉の色素沈着を持たず、種子外被に褐色色素を持たないことを特徴としている。これは、フラボノイド色素が茎や葉、種子外被に蓄積しないために生じたと考えられる。しかしながら、フラボノイドの合成に関連する遺伝子が変異を生じているためにフラボノイドが蓄積しないのか、それともフラボノイドの輸送や蓄積に関連する遺伝子が変異を生じているからフラボノイドが蓄積しないのかは、視覚的な解析のみでは判断できない。
【００２２】
そのため、本発明の発明者らはまず、原因遺伝子を同定するための研究を行った。その結果、ｔｔ１９変異株においては、転座変異が生じていることがわかった。ｔｔ１９変異株において転座変異を生じた遺伝子座領域をシロイヌナズナ野生型コロンビア（Ｃｏｌ）株において解析し、ｔｔ１９変異株において変異した遺伝子を解析したところ、ｔｔ１９変異株においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示される６４５  ｂｐのオープンリーディングフレームからなる塩基配列を有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２に示されるアミノ酸配列を有する２１４アミノ酸からなるタンパク質をコードする、ＴＴ１９遺伝子と命名した遺伝子が変異を起こしていることがわかった。
【００２３】
上述したＴＴ１９遺伝子のヌクレオチド配列およびＴＴ１９タンパク質のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖｅｒ．  １．７（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  ４６７３−４６８０）により解析したところ、ｍＲＮＡレベルで、ペチュニアのＡＮ９遺伝子の核酸配列と約５５％、トウモロコシのＢＺ２遺伝子の核酸配列と約４０％、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＥＳＴクローンＨ３６８６０の核酸配列と約７５％、の塩基配列相同性を有し、タンパク質レベルでは、Ｈ３６８６０のアミノ酸配列と約７０％、ペチュニアのＡＮ９のアミノ酸配列と約５０％、トウモロコシのＢＺ２のアミノ酸配列と約１５％、のアミノ酸配列相同性を有する。ペチュニアのＡＮ９遺伝子およびトウモロコシのＢＺ２遺伝子は、それぞれペチュニアおよびトウモロコシにおいてアントシアニン色素沈着のために必要であることが知られているグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子である。このことから、上述したＴＴ１９遺伝子は、アントシアニン色素沈着のために必要なＧＳＴ様遺伝子であることが推定された。
【００２４】
ついで、同定されたＴＴ１９遺伝子の機能を解析するために、この遺伝子およびこの遺伝子の真性プロモーターを含む発現ベクターにより、ｔｔ１９変異株を形質転換したところ、シロイヌナズナ野生型Ｃｏｌ株において見られた茎の基部領域やロゼット葉の色素沈着、さらには種子外被に褐色色素の沈着が回復されることが見いだされた。ＴＴ１９の機能をさらに詳細に検討したところ、ＴＴ１９遺伝子が変異していた場合には、フラボノイドは正常に合成されていたものの、合成されたフラボノイドが細胞内の液胞に正常に蓄積されなかったことから、ＴＴ１９タンパク質はフラボノイド色素が液胞に区画化される際に必要とされていることが明らかになった。
【００２５】
一方、本発明のＴＴ１９と核酸レベルおよびアミノ酸レベルで相同性を有するペチュニアのＡＮ９は、ペチュニアにおいてアントシアニン類を液胞に区画化する際に必要とされる分子であることが知られていたことから、この遺伝子を強力なプロモーターであるカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターで制御したＡＮ９遺伝子を用いてシロイヌナズナのｔｔ１９変異株を形質転換し、ＴＴ１９の機能が相補されるかどうかを確認した。その結果、ＡＮ９遺伝子により形質転換しても、アントシアニン類の液胞への区画化は回復するものの、アントシアニジン類などのその他のフラボノイドの液胞への区画化は回復しない、すなわちＴＴ１９遺伝子の機能はＡＮ９遺伝子によっては完全には相補されないことが明らかになった。
【００２６】
以上の結果から、本発明は、植物細胞中においてフラボノイドを液胞中に区画化させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸を提供することができ、ここで本発明の核酸には、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列またはこれと縮重の関係にある塩基配列を含む核酸；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含む核酸；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列を含む核酸；もしくは
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示される塩基配列との間で少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の塩基配列相同性を有する塩基配列を含む核酸；
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸；もしくは
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示されるアミノ酸配列との間で少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸；
が含まれる。
【００２７】
本明細書中で「フラボノイド」という場合、アントシアニン類、アントシアニジン類、タンニン類などが含まれ、そのフラボノイドを液胞中に区画化させる活性という場合、例えば花弁、葉、茎、根、種子などの植物細胞中で合成されたフラボノイドを植物細胞の液胞中に蓄積させ、細胞質中のみならず細胞外へも流出しないようにする活性のことをいう。
【００２８】
本発明において「１もしくは複数個」という場合、「１もしくは複数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のことをいう。また、本発明おいて塩基の「欠失」、「置換」、「付加」を有する核酸は、ＴＴ１９遺伝子の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）において生じ、かつＴＴ１９タンパク質と同様の性質を有するようなタンパク質をコードする核酸をいい、アミノ酸の「欠失」、「置換」、「付加」を有するタンパク質は、ＴＴ１９タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）と同様の性質を有するタンパク質をいう。例えば、アミノ酸の「置換」の場合には、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換、例えばある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換、などの置換が含まれる。
【００２９】
上述のような「欠失」、「置換」、「付加」を有する塩基配列、または上述のような「欠失」、「置換」、「付加」を有するタンパク質を作成するためには、イオンビーム照射や変異原処理などの細胞レベルでの変異生成処理の他、部位特異的変異生成（Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）やＰＣＲ増幅ミスを用いたランダム変異生成（Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、カセット導入変異生成（Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などの遺伝子工学的変異生成処理などの、本発明の技術分野において既知の様々な方法を用いることができる。
【００３０】
本発明の植物細胞中においてフラボノイドを液胞中に区画化させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列には、ＴＴ１９遺伝子の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列を含むＤＮＡを有し、かつＤＮＡ修復促進活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。
【００３１】
本発明において、ストリンジェントな条件とは、目的の塩基配列が、ＴＴ１９遺伝子をコードする塩基配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）もしくはこれと縮重の関係にある塩基配列との間で、特異的にハイブリダイズ可能である条件をいう。ハイブリダイズ条件は、温度、イオン濃度などの条件を考慮して決定されるが、一般的には温度が高いほど、またイオン濃度が低いほどストリンジェントな程度が高くなることが知られている。このようなストリンジェントな条件の設定は、当業者であれば、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００１））の記載に基づいて行うことができる。これらのストリンジェントな条件の具体的な例としては、例えば、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは４５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または２５℃ないし５０℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。
【００３２】
本発明においてアミノ酸あるいは塩基配列の配列相同性は、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の配列相同性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，  ４８：  ４４３−４５３，  １９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：  １０９１５−１０９１９，  １９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；および（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００３３】
本発明においてアミノ酸あるいは塩基配列の配列相同性解析には、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２５．，  ｐ．  ３３８９−３４０２，  １９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。具体的には、塩基配列解析の場合、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＮ）プログラムで、Ｑｕｅｒｙ塩基配列を入力して、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪなどの塩基配列データベースと照合することができる。また、アミノ酸配列解析の場合、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ）プログラムで、Ｑｕｅｒｙアミノ酸配列を入力して、ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ、ＰＤＢ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲなどのアミノ酸配列データベースと照合することができる。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖｅｒ．  １．７（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）、上述）もまた、用いてもよい。
【００３４】
本発明はまた、植物細胞中においてフラボノイドを液胞中に区画化させる活性を有するタンパク質を提供することができ、ここで本発明のタンパク質には、上述したような（ｉ）〜（ｉｖ）に記載する核酸または（ａ）〜（ｃ）に記載する核酸によりコードされるタンパク質、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。
【００３５】
本発明はまた、前述した（ｉ）〜（ｉｖ）に記載する核酸または（ａ）〜（ｃ）に記載する核酸を含有する組換えベクターもまた提供することができる。このような組換えベクターは、適切なベクター中に本発明の前述した（ｉ）〜（ｉｖ）に記載する核酸または（ａ）〜（ｃ）に記載する核酸を連結することにより得ることができる。本発明において使用することができるベクターとしては、宿主細胞中で複製可能なものであればどのようなものを使用してもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどを使用することができる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２など）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＡＭα１など）、酵母由来のプラスミド（例えばｐＧＩＬＤＡ、ＹＡＣなど）などを使用することができ、ファージＤＮＡとしては、λファージ（λＥＭＢＬ、λＺＡＰ、λｇｔ１０など）などを使用することができる。このようなベクターに前述した（ｉ）〜（ｉｖ）に記載する核酸または（ａ）〜（ｃ）に記載する核酸を挿入するためには、ベクターを適当な制限酵素で切断し、その制限酵素と同じ切断末端を生じる制限酵素により処理した前述した（ｉ）〜（ｉｖ）に記載する核酸または（ａ）〜（ｃ）に記載する核酸を、ベクターの切断部分に挿入する。
【００３６】
このベクター中には、（ｉ）〜（ｉｖ）に記載する核酸または（ａ）〜（ｃ）に記載する核酸に加えて、この核酸の発現を制御するための配列、ベクターのゲノム中への取り込みを促進するための配列（例えばＴ−ＤＮＡ配列など）、および／または選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）の配列を含んでいてもよい。上述の核酸の発現を制御するための配列としては、例えばプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリ（Ａ）付加シグナルなどを使用することができる。ここでプロモーターは、植物で一般に多用されるカリフラワーモザイクウィルス由来の３５Ｓプロモーター以外に、当業者であれば、ベクターを形質転換する植物での目的に応じて適宜選択することができ、例えば植物がシロイヌナズナの花の場合にはシロイヌナズナの花で高発現する内在性の遺伝子のプロモーターを使用することができる。
【００３７】
本発明においては、前述の組換えベクターを含む形質転換体植物細胞もまた、提供することができる。本発明の形質転換体植物細胞は、本発明の組換えベクターを宿主となる植物細胞中に導入することにより得ることができる。本発明において形質転換させる植物細胞は、植物体のうちいずれの部分に由来する細胞であってもよく、例えば、葉、花弁、茎、根、種子などの他、培養植物細胞であってもよい。植物細胞の由来となる植物には特に限定はないが、例えばアブラナ科、イネ科、マメ科などの植物が含まれる。
【００３８】
植物細胞に対する前述の組換えベクターの形質転換は、当該技術分野において既知の形質転換法、例えばアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）などを使用することにより行う。
【００３９】
アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに導入し、この株をバキュームインフィルトレーション法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｃ．  Ｒ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｓｅｒ．  ＩＩＩ  Ｓｃｉ．  Ｖｉｅ，  ３１６，  １１９４−１１９９）、フローラル・ディップ法（Ｃｌｏｕｇｈ，  Ｓ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，  Ａ．Ｆ．  （１９９８）．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １６，  ７３５−７４３）などに従って宿主の無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。
【００４０】
エレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧５００〜６００  Ｖ、１０００μＦ、２０  ｍｓｅｃの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する。
【００４１】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＢＩＯＬＩＳＴＩＣ  ＰＯＳ  １０００／Ｈｅ；  ＢｉｏＲａｄなど）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料により異なるが、通常は１０００〜１１００  ｐｓｉ程度の圧力、５〜１０  ｃｍ程度の距離で行う。
【００４２】
ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）を用いる場合は、主に、培養細胞からプロトプラストを調整し、カルシウム、リン酸の存在下のもとＰＥＧを加えてＤＮＡ細胞に取り込ませる。
【００４３】
植物細胞中に目的とする（ｉ）〜（ｉｖ）に記載する核酸または（ａ）〜（ｃ）に記載する核酸が形質転換されたかどうかについては、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノザンハイブリダイゼーション法、などにより確認することができる。例えばＰＣＲ法により確認する場合、形質転換体植物細胞からＤＮＡを調製し、もしくはｍＲＮＡを採取した後ｃＤＮＡを調製し、当該ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型として用いて、所望の核酸を特異的に増幅させることができる様に設計されたプライマーを使用して、ＰＣＲ法を行うことにより確認する。
【００４４】
本発明においてはさらに、このようにして得られた植物細胞を培養し、再分化・育成することにより、（ｉ）〜（ｉｖ）に記載する核酸または（ａ）〜（ｃ）に記載する核酸を含むトランスジェニック植物を作出することができる。植物細胞を植物体に再分化させる際には、培地から植物ホルモンを取り除くか、または適当な濃度の植物ホルモン、例えばオーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸などを単独でもしくは組み合わせて投与する。
【００４５】
本発明においては、前述した形質転換体植物細胞を培地中で培養し、もしくは前述したトランスジェニック植物を生長させ、培養された形質転換植物細胞もしくはトランスジェニック植物から、液胞中に蓄積されたフラボノイドを採取することからなる、フラボノイドの製造方法；を提供することもできる。植物細胞を培養するための培地としては、当該技術分野において既知の植物培養用培地、例えばＭＳ基本培地、ＬＳ基本培地、プロトプラスト培養培地（ＬＳ培地を改変したもの）などを使用することができ、これらの培地に対してショ糖、各種ビタミン、アミノ酸などの添加物を添加してもよい。
【００４６】
培養する際には、固体培地を用いた固体培養法、液体培地を用いた液体培養法のいずれを使用してもよい。培養を行う場合には、培地のｐＨを５．０〜７．０に調節し、２０〜３０℃、好ましくは２３〜２８℃前後で、５日〜２ヶ月間、培養する。トランスジェニック植物を生長させる際には、圃場および温室内での土壌栽培、温室内での水耕栽培、人工培養器などを使用することができる。
【００４７】
培養植物細胞またはトランスジェニック植物の液胞中に蓄積されたフラボノイドは、植物細胞もしくはトランスジェニック植物から液胞を採取するか、さらに得られた液胞からフラボノイドを精製することによって採取することができる。本発明においては、セルラーゼ、ペクチナーゼなどの酵素を用いて細胞壁を溶解し、可溶化溶液中での超音波破砕処理や磨砕処理などにより細胞を破壊し、さらにろ過または遠心分離などにより不溶物を除去した後、メタノール、ヘキサンあるいはアセトンなどの有機溶媒画分を採取することにより、植物細胞もしくはトランスジェニック植物からフラボノイドを含む液胞を含有する溶液を得る。このようにして調製された液胞からフラボノイドを精製するためには、さらに、各種クロマトグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーなど）、などを、単独または組み合わせて行う。
【００４８】
本発明をさらに具体的に説明するため、以下に実施例を記載する。本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【００４９】
【実施例】
実施例１：植物材料の作出
ｔｔ１９変異株の変異生成および単離は、以前に記載されている（Ｓｈｉｋａｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３、上述）。簡単に説明すると、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）エコタイプコロンビア（Ｃｏｌ）株の乾燥種子（２６，０００粒）に、１５０  Ｇｙの加速炭素イオン粒子を照射することにより、変異を起こさせた（Ｔａｎａｋａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７ａ）．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｂｉｏｌ．  ７２，  １２１−１２７）。この処理を行った種子の２代目以降の後代（１００，０００個体）の中から、茎の基部領域やロゼット葉の色素沈着を持たず、種子外被に褐色色素を持たないことを指標として、変化を生じた個体を候補変異株として選抜した。その後、これらの候補変異株を遺伝学的、生理学的、および分子生物学的などの方法に従って解析し、既知の変異を有さない２種のＭ２系統を単離した。これらは、対立遺伝子であり、ｔｔ１９−１変異株およびｔｔ１９−２変異株と命名した。
【００５０】
なお、エコタイプ、ランズバーグ株（Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ；Ｌｅｒ株）をＴＴ１９遺伝子の分子マッピングのために使用した。また、本明細書中の実施例において陰性対照として使用するａｓｔ／ｂａｎ−４変異株およびｔｔ４（Ｃ１）変異株（本明細書の以下において、単に「ｔｔ４変異株」と呼ぶ）はそれぞれ、以前に記載された方法にしたがって作出した（それぞれ、Ｔａｎａｋａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７ｂ）．  Ｇｅｎｅｓ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｓｙｓｔ．  ７２，  １４１−１４８およびＳｈｉｋａｚｏｎｏ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）．  Ｇｅｎｅｓ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｓｙｓｔ．  ７３，  １７３−１７９）。ａｓｔ／ｂａｎ−４変異株は、ＡＳＴ／ＢＡＮ−４対立遺伝子を両方とも欠損するＢＡＮ遺伝子についてのヌル変異体であり、そしてｔｔ４変異株は、ＴＴ４対立遺伝子を両方とも欠損するＴＴ４遺伝子についてのヌル変異体である。これらの変異体のそれぞれは、Ｃｏｌ株のバックグラウンドを有する。
【００５１】
実施例２：ｔｔ１９変異株の表現型特性
実施例１において作出した２種のｔｔ１９変異株（ｔｔ１９−１変異株およびｔｔ１９−２変異株）について視覚的観察を行ったところ、栄養増殖部分に関して、アントシアニン類由来の紫色の色素沈着は、ｔｔ１９変異株の茎の基部領域では視覚的に観察されなかった（図２Ａ、Ｂ）。
【００５２】
続いて、２種のｔｔ１９変異株におけるアントシアニン含量を評価した。２３℃、１６時間−明光条件に調節した育成装置中で生長させた、約４５日齢の野生型コロンビア（Ｃｏｌ）株、ｔｔ１９−１変異株、ｔｔ１９−２変異株およびｔｔ４変異株の植物から、ロゼット葉（１００  ｍｇ）を採取した。それらを液体窒素条件下ですり潰し、そして５  ｍｌの１％ＨＣｌ／メタノールと混合した。暗条件下にて穏やかに懸濁しながら２５℃で２晩抽出した後、Ｆｏｌｃｈ分配を行い、そして上層についてのＯＤ３００−７００を分光光度計（ＤＵ５３０，  Ｂｅｃｋｍａｎ，  ＵＳＡ）を使用して測定した。平均値を、ｔｔ４変異株の場合に２回の実験から得た以外は、５回の独立した実験から得た。
【００５３】
Ｃｏｌ株において、５３０  ｎｍ付近での吸光度の鋭いピークが顕著だったが、一方でｔｔ１９変異株の両方ともで、対応するピークの大きな減少が観察された。平均ＯＤ５３０値は、Ｃｏｌ株、ｔｔ１９−１変異株、ｔｔ１９−２変異株、およびｔｔ４変異株においてそれぞれ、０．０９１±０．０１１、０．０４１±０．００９、０．０３８±０．００４、および０．００８±０．００１であった。ｔｔ１９変異株におけるアントシアニン蓄積は、温室などの強光条件下で培養することにより、いくらか増強された（データは示していない）。
【００５４】
ｔｔ１９変異株の種子外被は、Ｃｏｌ株での褐色およびｔｔ４変異株での黄色と比較して、熟成段階で淡−褐色を示した（図２Ｃ）。しかしながら、ｔｔ１９変異株種皮の褐色化は、乾燥期間が長期化するにしたがって進行した。ｔｔ１９変異株の種子外被は、長期間の乾燥の後にようやく、Ｃｏｌ株の種子外被と同程度に暗色化した（図２Ｄ）。その他の表現型形質は、ｔｔ１９変異株においては正常であるようであった。
【００５５】
実施例３：ナリンゲニン処理
本実施例においては、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の幼苗におけるアントシアニン色素沈着に対するナリンゲニンの添加の効果を調べた。
【００５６】
糖類はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の幼苗におけるアントシアニン色素沈着を誘導することが知られる（Ｔｓｕｋａｙａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９７，  １４１４−１４２１）。ナリンゲニン処理実験の前に、アントシアニン蓄積の誘導のために適切なスクロースの濃度を決定した。
【００５７】
Ｃｏｌ株の乾燥種子の表面を、７０％ＥｔＯＨで１分間、ついで０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む次亜塩素酸ナトリウム溶液（約０．３％有効塩素）中で１０分間滅菌し、そして滅菌蒸留水中で５回すすいだ。この種子を、０、１、２、５、１０、または２０％のいずれかの濃度のスクロースを含有する、ＭＳ／スクロース／アガー（０．８％）プレート上に播いた。４℃にて５日間の春化処理の後、このプレートを２３℃に設定した連続明期条件の育成チャンバー中でインキュベートし、そして実体顕微鏡により毎日観察した（Ｓｔｅｍｉ  ＳＶ１１，  Ｚｅｉｓｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）。結果を図３Ａに示す。
【００５８】
Ｃｏｌ株の幼苗において、スクロース濃度が５％まで上昇すればするだけ、上部胚軸領域（ｕｐｐｅｒ  ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ）および子葉の裏面（ａｂａｘｉａｌ）と辺縁領域（ｍａｒｇｉｎａｌ）で、著しく、アントシアニン色素沈着が深まった（図３Ａ）。１０％のスクロースでは発育の遅延が引き起こされ、そして２０％のスクロースではＣｏｌ株での発芽（ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）が阻害された（データは示していない）。２種のｔｔ１９変異株もまた、プレート上での発芽（ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）および幼苗発育が、１０％より多いスクロースにより、遅延することを示した。したがって、５％のスクロースが、本実験において最適であると考えられた。
【００５９】
Ｃｏｌ株、ｔｔ１９−１変異株、ｔｔ１９−２変異株、およびｔｔ４変異株の乾燥種子の表面を、７０％ＥｔＯＨで１分間、ついで０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む次亜塩素酸ナトリウム溶液（約０．３％有効塩素）中で１０分間滅菌し、そして滅菌蒸留水中で５回すすいだ。それらを０．１  ｍＭナリンゲニン（Ｓｈｉｒｌｅｙ，  Ｂ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ８，  ６５９−６７１）を含むＭＳ／スクロース／アガー（０．８％）プレート（５％の濃度のスクロースを含有）またはナリンゲニンを含まないプレート（５％の濃度のスクロースを含有）上に播いた。ＮｏｈとＳｐａｌｄｉｎｇ（Ｎｏｈ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｓｐａｌｄｉｎｇ，  Ｅ．Ｐ．  （１９９８）．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１６，  ５０３−５０９）により記載されたように、５０％ＥｔＯＨ中に溶解したナリンゲニン（Ｓｉｇｍａ）を、オートクレーブ処理した後にＭＳ培地に添加した。４℃にて５日間の春化処理の後、これらのプレートを２３℃に設定した連続明期条件の育成チャンバー中でインキュベートし、そして実体顕微鏡により毎日観察した（Ｓｔｅｍｉ  ＳＶ１１，  Ｚｅｉｓｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）。結果を図３に示す。
【００６０】
Ｃｏｌ株の幼苗において、ナリンゲニンの添加により、アントシアニン色素沈着がある程度増大した（図３Ｂ）。５％スクロース培地での幼苗発育においていくつかの影響が観察されたが、以前に記載されたように（Ｋｕｂａｓｅｋ，  Ｗ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４，  １２２９−１２３６）、ｔｔ４変異株は、ナリンゲニン処理により、アントシアニン色素沈着を示した（図３Ｆ）。一方で、ｔｔ１９変異株では、ナリンゲニン処理に関わらず、アントシアニンの蓄積は示されなかった（図３Ｄ）。これらの結果から、ＴＴ１９遺伝子は、アントシアニン生合成経路におけるＦ３Ｈ反応から下流の段階において、機能することが示される（図１を参照）。
【００６１】
実施例４：バニリン処理
一般に、シロイヌナズナ野生型種皮（ｔｅｓｔａ）の褐色には、主としてＰＡ類の酸化が寄与する（Ｃｈａｐｐｌｅ，  Ｃ．Ｃ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）．  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．  Ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  （Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，  Ｅ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，  Ｃ．Ｒ．  ｅｄｓ）．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  ９８９−１０３０）。バニリンは、酸性条件下でＰＡ前駆体のモノマーユニットおよびＰＡ類の末端ユニット（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｕｎｉｔｓ）と反応し、結果として蓄積部位における赤色色素の沈着が生じる（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，  Ｓ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）．  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｎｕｔｒ．  ２４，  ４０１−４４９）。本実施例においては、これらのＰＡ前駆体の存在および／または分布を決定するため、バニリン処理を未成熟ｔｔ１９変異株の種子において行った。
【００６２】
本質的にはＤｅｂｅａｕｊｏｎら（２０００）の方法にしたがって、バニリン処理を行った。ＤＡＦ１０までのサンプルを、全組織標本観察により研究した。ＤＡＦ１０の後に、バニリン処理種子由来の種子外被部分を解剖学的に単離し、そして内種皮層を顕微鏡を用いて観察した（Ａｘｉｏｓｋｏｐ，  Ｚｅｉｓｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）。結果を図４に示す。
【００６３】
開花後日数（ＤＡＦ）１において、Ｃｏｌ株およびｔｔ１９の両方において赤色化が認識され、そして両者の間で著しい変化は観察されなかった（図４Ａ、Ｂ）。しかしながら、ＤＡＦ３あたりから後には、Ｃｏｌ株の種子とｔｔ１９変異株の種子との間での赤色色素の沈着パターンには、明らかな違いがあった（図４Ｃ〜Ｆ）。最も顕著な相違は、ＤＡＦ５において観察された（図４Ｃ、Ｄ）。すなわち、Ｃｏｌ株の種皮（ｔｅｓｔａ）においては、赤色色素が大型の中央部液胞中に蓄積し、それらのそれぞれは、内種皮（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）層の細胞内部で、完全に拡張したようであった（図４Ｃ）。
【００６４】
一方で、ｔｔ１９変異株の種皮（ｔｅｓｔａ）においては赤色色素が明らかに検出されたが、それらの空間的存在（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）は、Ｃｏｌ株におけるそれよりも限定的であり、そして内種皮層のそれぞれの細胞内でのいくつかのより小さな液胞内に赤色色素が蓄積した（図４Ｄ）。赤色色素の分布における相違が、ＤＡＦ９〜１０まで連続的に検出され、その後は、おそらくは種子外被の硬化のためであると思われるが、全組織観察は困難であった。そのように硬化した種子外被におけるＰＡ前駆体の分布を調べるため、本発明者らは、種子外被切片（ｓｅｇｍｅｎｔ）を解剖学的に単離し、そしてその最も内側の（内皮ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）層を観察した。ＤＡＦ１７での例を、図４ＥおよびＦにおいて示す。Ｃｏｌ株において、赤色色素沈着は非常に弱く、その構成細胞の周縁で観察された（図４Ｅ）。対照的に、ｔｔ１９変異株では、赤色色素は、内種皮細胞のそれぞれの内部に完全に満たされた（図４Ｆ）。
【００６５】
実施例５：ＴＴ１９遺伝子の分子マッピング
本実施例においては、野生型Ｌｅｒをｔｔ１９−１変異株またはｔｔ１９−２変異株と交配したことから生じたＦ２個体を使用して、ＴＴ１９遺伝子の分子マッピングを行った。
【００６６】
具体的には、Ｃｏｌ株のバックグラウンドを有するｔｔ１９−１変異株およびｔｔ１９−２変異株と、野生型Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ（Ｌｅｒ）株とを交配させてＦ２個体を得た場合、理想的には、一つのマーカーに関してＣｏｌ型とＬｅｒ型との比率を調べると、Ｃｏｌ型：Ｌｅｒ型＝１：１に近くなる。しかしながら、これらのＦ２個体をｔｔ１９変異表現型をマーカーとして選別すると、このマーカーは必ずＣｏｌ型となるため、ゲノム上でＴＴ１９遺伝子座に近づくにつれ、Ｌｅｒ型に対するＣｏｌ型の比率が上昇することになる。この性質を利用して、ＴＴ１９遺伝子座の可能性のある領域を徐々に特定していった。
【００６７】
ｔｔ１９−１変異株およびｔｔ１９−２変異株と、野生型Ｌｅｒ株との交配から、それぞれ、ｔｔ表現型を示す４５のＦ２植物および１０３のＦ２植物を得た。製造者の指示に従ってＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することにより、ゲノムＤＮＡをロゼット葉から抽出した。ＣＡＰＳマーカーおよびＳＳＬＰマーカーとの連鎖との関連で、標準的な方法にしたがってそれらのＦ２ゲノムＤＮＡを使用して、分子マッピングを行った（Ｂｅｌｌ，  Ｃ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｅｃｋｅｒ，  Ｊ．Ｒ．  （１９９４）．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９，  １３７−１４４）。
【００６８】
ｔｔ１９−１変異株の対立遺伝子については、ＲＩマップ上での染色体５の２０．６  ｃＭ、２３．７  ｃＭ、および２５．３  ｃＭのＤＮＡマーカーを用いた場合、それらの組換え頻度が徐々に減少することが示され、そしてＴＴ１９遺伝子は２９．５  ｃＭ付近に位置した。一方で、４２．２  ｃＭおよび５０．５  ｃＭマーカーでの組換え値からは、ＴＴ１９遺伝子は３５．５  ｃＭ付近に位置した。加えて、ＴＴ１９遺伝子についてのこれら２つの可能性のある位置の間の領域における組換えは、４５のＦ２個体間では決して観察されなかった。この現象は、イオンビームにより誘導された変異株においてしばしば見いだされ、そしてこの現象によりｔｔ１９−１変異株中では、２９．５  ｃＭおよび３５．５  ｃＭ付近を切断点とする逆位が生じているという仮説が導かれる。
【００６９】
ついで、ｔｔ１９−２変異株の対立遺伝子のマッピングを行った。ｔｔ１９−２変異株の対立遺伝子については、３５  ｃＭ付近の染色体部位中への組換え値が１０３のＦ２個体間で徐々に減少した。これらの結果により、ＴＴ１９遺伝子は３５  ｃＭ領域の周辺に位置し、そしてｔｔ１９−１変異株においては推定される大型の逆位の切断点の一つが、ＴＴ１９遺伝子座と一致する、と推論することが可能になる。
【００７０】
上述した推論に基づいて、本発明者らはまず第一に、ｔｔ１９−２変異株の遺伝子座のマップ位置が限定される５つのＢＡＣクローンまたはＰ１クローンについてアノテーションに焦点を絞った。ｔｔ１９変異株の主要な特徴は、アントシアニン類を欠損しているかまたはそのレベルが減少していることであるため、ＴＴ１９遺伝子はアントシアニン類の合成および／または蓄積に関与する可能性がある。まさに、いくつかのＴＴ１９候補物を限定された５種のＢＡＣクローンまたはＰ１クローンで見いだすことができた。
【００７１】
次に、ｔｔ１９−２変異株の対立遺伝子からのマッピングデータに基づいて、本発明者らは、最も可能性のある候補物と考えられたＰ１クローンＭＫＰ１１にあるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−様遺伝子と推定される遺伝子の解析を始めた。
【００７２】
ＴＴ１９遺伝子の候補として最も可能性の高いＧＳＴ−様遺伝子に関して、その全体領域をカバーする４組のプライマーを推定ＴＴ１９遺伝子座付近で設計した；
ＴＴ１９−ｆ０（５’−ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＧＴＣ  ＡＣ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）およびＴＴ１９−ｒ０（５’−ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＴＡＧ  ＡＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）；
ＴＴ１９−ｆ１（５’−ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＡＧ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）およびＴＴ１９−ｒ１（５’−ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＡＧ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）；
ＴＴ１９−ｆ２（５’−ＧＧＴ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＧＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）およびＴＴ１９−ｒ２（５’−ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＣＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）；そして
ＴＴ１９−ｆ３（５’−ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＡＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）およびＴＴ１９−ｒ３（５’−ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＴＣ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）。これらのプライマーは、２種類のｔｔ１９変異株のゲノムＤＮＡに対して、ＧＳＴ−様遺伝子が破壊されている場合には増幅することができず、破壊されていない場合には増幅することができるように設定した。
【００７３】
これらのプライマーの組み合わせを使用して、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、最初の変性段階を９５℃にて１０分間、その後９４℃にて０．５分間、５７℃にて０．５分間そして７２℃にて１分間を１サイクルとして４０サイクル、そして７２℃にて７分間の最後の伸長段階、からなるプログラムにより行った。増幅フラグメントは、１．５％アガロースゲル電気泳動で分離した。その結果、４種の断片のうち２種は、ｔｔ１９−１変異株では増幅されなかったことから、ｔｔ１９−１変異株のこれらの非−増幅ＤＮＡ領域においては大型の逆位の切断点と推定されるものが存在することが示唆された。
【００７４】
実施例６：ＴＴ１９遺伝子の分子クローニング
本実施例においては、増幅フラグメントの回収、精製および配列決定により、ＴＴ１９遺伝子の分子クローニングを行った。
【００７５】
２種のｔｔ１９変異遺伝子座における再構成された場所を含むＤＮＡフラグメントを単離するため、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ−ＰＣＲ）（Ｌｉｕ，  Ｙ．−Ｇ．，  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔｉｅｒ，  Ｒ．Ｆ．  （１９９５）．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２５，  ６７４−６８１）を行った。
【００７６】
まず、２セットの３種の特異的ネステッドプライマー
ＭＫＰ１１−Ｒ４，  ５’−ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  Ｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）；ＭＫＰ１１−Ｒ５，  ５’−ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  Ｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）；ＭＫＰ１１−Ｒ６，  ５’−ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＣＧＧ  ＴＴＡ  Ｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）；そして
ＭＫＰ１１−Ｆ７，  ５’−ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）；ＭＫＰ１１−Ｆ８，  ５’−ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）；ＭＫＰ１１−Ｆ９，  ５’−ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）；
のそれぞれを、ｔｔ１９−１変異遺伝子座の逆位ＤＮＡの２種の結合部配列を単離するために使用した。
【００７７】
３種のオリゴヌクレオチド；
ｂＣＣ５−８−Ｒ１（５’−ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＧＣＣ  ＴＡＡ  ＣＣＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７）、ｂＣＣ５−８−Ｒ２（５’−ＧＡＧ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）、およびｂＣＣ５−８−Ｒ３（５’−ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９）
を、ｔｔ１９−２変異株における特異的ネステッドプライマーとして使用した。
【００７８】
Ｌｉｕら（Ｌｉｕ，  Ｙ．−Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５ａ）．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ８，  ４５７−４６３）により記載された配列に基づいて、２種の任意の縮重プライマー（ＡＤ２（５’−ＮＧＴ  ＣＧＡ  ＳＷＧ  ＡＮＡ  ＷＧＡ  Ａ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２０）およびＡＤ３（５’−ＷＧＴ  ＧＮＡ  ＧＷＡ  ＮＣＡ  ＮＡＧ  Ａ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１））を合成した。もう一つのＡＤプライマー（ＡＤ１）の配列は、５’−ＧＴＮ  ＣＧＡ  ＳＷＣ  ＡＮＡ  ＷＧＴ  Ｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２）であった。ここで「Ｓ」はＧまたはＣを示し、「Ｗ」はＡまたはＴを示し、そして「Ｎ」はいずれかの塩基であることを示す。
【００７９】
５回の高ストリンジェントなサイクルにおけるアニーリング温度を６５℃にし、２．５分間のそれぞれの伸長段階を３分間にすること以外はＬｉｕら（１９９５ａ、上述）の方法に従って、特異的ネステッドプライマーセットおよび所定のＡＤプライマーを使用して、エッペンドルフＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒグラジエント（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中でＴＡＩＬ−ＰＣＲサイクルを行った。上述したように、ＰＣＲ産物を分画し、精製し、そして配列決定した。
【００８０】
得られたＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物の配列決定から、ＧＳＴ−様遺伝子の下流領域が、染色体５でのＢＡＣ  Ｆ１８Ｏ２２の配列と完全に相補的な配列と、逆方向で結合し、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）−ＤＮＡ−様１３  ｂｐ配列を境界部に有することが示された（図５Ａ）。フィラー−ＤＮＡ−様配列（１３  ｂｐ）の起源は、それと同一の配列がシロイヌナズナゲノムの全体にわたり分散されているため、明らかではなかった。逆位のもう一つの再結合点もまた、ＴＡＩＬ−ＰＣＲにより決定し、そしてそれを配列決定し、Ｆ１８Ｏ２２およびＭＫＰ１１配列を含有するフラグメントが検出され、これにも７  ｂｐの境界部のフィラー−ＤＮＡ−様断片が伴った（図５Ａ）。
【００８１】
したがって、ｔｔ１９−１変異株においては、Ｆ１８Ｏ２２ならびにＭＫＰ１１上のＧＳＴ−様遺伝子の第２イントロンを切断点とする逆位が生じていると、本発明者らは結論付けた。この逆位のサイズは、シロイヌナズナゲノムデータベースに基づいて、長さ約１０００  ｋｂと推定された。ＴＡＩＲにより発行されたアノテーションにより、ＢＡＣ  Ｆ１８Ｏ２２上の切断点には、遺伝子は存在しないことが示される。さらに、Ｆ１８Ｏ２２中の６  ｂｐフラグメント（ＴＡＧＡＡＡ）が、逆位の境界部において逆向きに重複されたことが示された。
【００８２】
ＰＣＲ解析を、ｔｔ１９−２変異株におけるＧＳＴ−様遺伝子座についても行った。ｆ１プライマーとｒ１プライマーとを使用すると、増幅は観察されず、このことからｔｔ１９−２変異株がｆ１−ｒ１領域での切断点を伴うようなＤＮＡ再構成を行った可能性があることが示される。ＴＡＩＬ−ＰＣＲにより、翻訳開始部位を＋１と定義した場合、−５３ヌクレオチドがさらに１６．７  ｋｂ上流の領域と再結合されたことが示された（図５Ｂ）。配列解析では、再結合部位からＧＳＴ−様遺伝子のエクソン３の６０  ｂｐ下流までの領域ではその他の変異を見いだされなかった。ＧＳＴ−様遺伝子座から削除されたＤＮＡ領域の一部は、ｔｔ１９−２変異株ゲノム中にてＰＣＲにより増幅され、そしてそれらの配列は、野生型の配列と完全に同一であった。
【００８３】
したがって、長さ１６．７  ｋｂのフラグメントは、転座部位は本研究では検出されなかったが、ｔｔ１９−２変異株のその他のゲノム領域中に転座されるようである。ｔｔ１９−１変異株の場合と同様に、シロイヌナズナのアノテーションにより、ｔｔ１９−２変異株の対立遺伝子の１６．７  ｋｂのフラグメントの上流切断点上には、遺伝子が存在しないことが示される。
【００８４】
実施例７：系統発生的解析
ｔｔ１９変異株の両方（すなわち、ｔｔ１９−１変異株およびｔｔ１９−２変異株）がＧＳＴ−様遺伝子中の変異を有するため、本発明者らは、それがＴＴ１９遺伝子であると予想した。この予想を確認するため、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ｖｅｒ．  １．７（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）、上述）を使用して、マルチプルアラインメントを行った。ＰＨＹＬＩＰ  ｖｅｒ．  ３．５７（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｊ．  （１９９５）．  ＰＨＹＬＩＰ  （Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｃｋａｇｅ）  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５７ｃ．  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓｅａｔｔｌｅ）を使用して、ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法（Ｓａｉｔｏｕ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｎｅｉ，  Ｍ．  （１９８７）．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．，  ４，  ４０６−４２５）を行った。結果を図６および図７に示す。
【００８５】
野生型ＴＴ１９遺伝子の推定アミノ酸配列は、シロイヌナズナＥＳＴクローンＨ３６８６０のアミノ酸配列と約７０％、およびペチュニアＧＳＴ遺伝子、ＡＮ９のアミノ酸配列と、約５０％の高い同一性を示す（図６Ａ）。いくつかの植物ＧＳＴを使用する系統発生的解析から、ＴＴ１９は最初にＨ３６８６０と、その後ＡＮ９と、クラスター形成されたことが示された（図６Ｂ）。
【００８６】
実施例８：野生型ＴＴ１９遺伝子の機能解析
本実施例においては、野生型ＴＴ１９遺伝子をｔｔ１９変異株に導入することにより、ｔｔ１９変異株の表現型が野生型に回復するかどうかを確認した。
【００８７】
野生型ＴＴ１９遺伝子をＰ１クローンＭＫＰ１１（Ｌｉｕ，  Ｙ．−Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５ｂ）．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ７，  ３５１−３５８）から単離した。ＴＴ１９遺伝子の真性のプロモーターを含むＴＴ１９遺伝子を含有するＫｐｎＩ／ＳａｃＩフラグメント（約２．４  ｋｂ）を、上述したようにアガロースゲルから分画・回収し、同一の酵素により消化したｐＵＣ１９中にサブクローン化した。ベクターアームとインサートとの境界部分を配列決定した後、ゲノムＴＴ１９遺伝子を単離し、そしてバイナリーベクターｐＢＩ１０１中に導入した（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，  Ｒ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６，  ３９０１−３９０７）。
【００８８】
境界領域を含むインサートの配列を確認した後、バイナリーベクターを、エレクトロポレーションにより、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＶ３１０１中にトランスフォームした。バイナリーベクターをもつＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍクローンをアグロバクテリウム法の改変方法であるフローラル・ディップ法（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，  １９９８、上述）によりｔｔ１９変異株に感染させ、そしてＴ１幼苗をえた。カナマイシン（５０  ｍｇ／ｌ）およびクラフォラン（Ｃｌａｆｏｒａｎ）（１６６  ｍｇ／ｌ）を用いてＴ１種子をスクリーニングした後、形質転換体を生育させ、そしてそれらの表現型を主としてフラボノイド色素沈着の関連で観察した。
【００８９】
ｔｔ１９変異株系統のいずれかに由来する５種の独立した形質転換体植物（ｔｔ１９／ＡＵ：ＴＴ１９系統と命名）のすべてで、幼苗へのアントシアニン蓄積（図７Ａ）ならびに熟成ステージでの種皮（ｔｅｓｔａ）への褐色色素沈着（図７Ｂ）が野生型レベルまで回復された。これは、ＴＴ１９遺伝子の破壊がｔｔ１９変異株のフラボノイド欠損表現型の原因となることを示す。
【００９０】
実施例９：ＴＴ１９およびその他のフラボノイド遺伝子の発現
本実施例においてはまず、ＴＴ１９遺伝子に対応するｃＤＮＡクローンをＧｅｎＢａｎｋデータベース中で検索した。ｍＲＮＡに対して非常に高い相同性を有する１つのクローン１６９Ｍ６を見いだした。このｃＤＮＡクローンの配列決定により、それが、４５  ｂｐの５’非−翻訳領域および２７２  ｂｐの３’非−翻訳領域およびポリ−Ａテールを伴う、ＴＴ１９遺伝子のコード領域（本明細書中では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）と完全に同一の配列からなることを見いだした。この結果に基づいて、１６９Ｍ６はＴＴ１９遺伝子の転写に由来すると考えることができた。さらに、ｔｔ１９−２変異株の対立遺伝子における切断点は、推定転写開始部位から９  ｂｐ上流に位置していることが示された（図５Ｂ）。
【００９１】
ＴＴ１９遺伝子が２種のｔｔ１９変異株中で発現されるかどうかを決定するため、温室内で６週間生長させたロゼット葉由来の全ＲＮＡを使用して、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを行った。
【００９２】
まず、温室内で生長させた６週齢の植物の様々な組織から、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮａｓｅ−不含ＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコルにしたがって使用することにより、ゲノムＤＮＡの混入を防止した。幼苗および根からのＲＮＡの調製のために、連続明期の条件の２３℃のインキュベーター中、幼苗をＭＳ／スクロース（１％）／アガー（０．８％）プレート上で垂直方向にそれぞれ５および１０日間生育させ、そしてＲＮＡ抽出を上述したように行った。
【００９３】
次に、ＴＴ１９およびその他のフラボノイド遺伝子の発現に関して、５００  ｎｇの全ＲＮＡを使用し、Ｔａｋａｒａ  ＲＮＡ  ＬＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ｖｅｒ．  １．１，  Ｔａｋａｒａ）を製造者のプロトコルにしたがって用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲプログラムは、最初の変性段階を９５℃にて２分間、その後９４℃にて０．５分間、５７℃にて０．５分間そして７２℃にて１．５分間を１サイクルとして３０サイクル、そして７２℃にて７分間の最後の伸長段階からなる。ホットスタート法をすべてのＲＴ−ＰＣＲ反応に行った。
【００９４】
ＴＴ１９発現について、ＴＴ１９−ＲＴ／ｆ２（５’−ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＣＡＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２３）およびＴＴ１９−ＲＴ／ｒ１（５’−ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２４）を、特異的プライマーとして使用した。Ｎｅｓｉら（Ｎｅｓｉ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２，  １８６３−１８７８）により報告されたプライマー対を使用して、伸長因子１αＡ４（ＥＦ１αＡ４）の発現を内部標準として決定した。これらのＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ５４８  ｂｐおよび７０９  ｂｐであった。
【００９５】
カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）、フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’Ｈ）、およびジヒドロフラボノール４−リダクターゼ（ＤＦＲ）について、ここで使用したプライマーは、ＤＦＲ−リバースプライマーを除き、Ｎｅｓｉら（２０００、上述；Ｎｅｓｉ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３，  ２０９９−２１１４）によるプライマーと同一であり：  ＣＨＳについてＣＨＳ−ＵＰ；５’−ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  Ｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５）およびＣＨＳ−ＲＰ；５’−ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  Ｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６）；
Ｆ３’ＨについてＦ３’Ｈ−ＵＰ；５’−ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＣＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２７）およびＦ３’Ｈ−ＲＰ；５’−ＣＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  Ｃ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２８）；および
ＤＦＲについてＤＦＲ−ＵＰ；５’−ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  Ｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９）およびＤＦＲ−ＲＴ／ｒ１；５’−ＧＡＣ  ＡＣＧ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＣＣＴ  Ｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３０）
それぞれのＰＣＲ産物のサイズは、７１２  ｂｐ、８５１  ｂｐ、および４９７  ｂｐの長さであった。
【００９６】
カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）、およびロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ（ＬＤＯＸ）発現について、特異的プライマーを以下の様に設計した：
ＣＨＩについてＣＨＩ−ｆ１（５’−ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＣＧＣ  ＣＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１）およびＣＨＩ−ｒ１（５’−ＣＧＡ  ＡＡＡ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  Ｇ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２）；
Ｆ３ＨについてＦ３Ｈ−ｆ１（５’−ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  Ｔ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３３）およびＦ３Ｈ−ｒ１（５’−ＣＣＡ  ＣＧＧ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  Ｔ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３４）；
ＬＤＯＸについてＬＤＯＸ−ｆ２（５’−ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＴＧＣ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  Ｔ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５）およびＬＤＯＸ−ｒ２（５’−ＡＡＡ  ＧＣＧ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＴＣＧ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  Ｇ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３６）。ＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ５３５  ｂｐ、８０８  ｂｐ、そして７１４  ｂｐの長さであった。
【００９７】
予想されたように、単一のバンドがＣｏｌ株ＲＮＡでは増幅されたが、一方でｔｔ１９−１変異株およびｔｔ１９−２変異株由来のＲＮＡサンプルでは、バンドは検出されなかった（図８）。したがって、ＴＴ１９遺伝子の発現は、２種のｔｔ１９変異株中では破壊されたことが示された。
【００９８】
Ｃｏｌ植物の様々な器官におけるＴＴ１９遺伝子の発現パターンもまた、調べた。ＴＴ１９遺伝子の発現は、幼苗、根、茎、葉、花芽、花、および発育中の長角果（ｓｉｌｉｑｕｅ）を含む、試験したすべての器官において検出された（データは示していない）。このことから、ＴＴ１９遺伝子は、植物全体レベルで定常的に発現していることが示される。さらに、ＲＴ−ＰＣＲはまた、ＴＴ１９遺伝子発現の破壊が、ＣＨＳ、ＣＨＩ、Ｆ３Ｈ、Ｆ３’Ｈ、ＤＦＲ、およびＬＤＯＸなどの、その他のフラボノイド構造遺伝子の発現に影響を与えないことを示した（図８）。
【００９９】
実施例１０：ｔｔ１９  ｂａｎ二重変異株解析
本実施例においては、ｔｔ１９遺伝子とバニュルス（ＢＡＮＹＵＬＳ；ＢＡＮ）（Ａｌｂｅｒｔ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １１，  ２８９−２９９）の二重変異株を作出し、その解析を通じて、ＴＴ１９遺伝子の作用機序を明らかにすることを目的として行った。
【０１００】
バニュルス（ＢＡＮＹＵＬＳ；ＢＡＮ）は、シロイヌナズナのＰＡ生合成経路に特異的に関与する酵素の一つをコードし（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３、上述；図１参照）、ＢＡＮ遺伝子の機能喪失変異は、結果として種子外被にフラバン３−オール類を生じさせなかった（Ｄｅｖｉｃ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １９，  ３８７−３９８）。予備的実験により、アントシアニンスポットを有する種皮（ｔｅｓｔａ）（ａｓｔ）変異株（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７ｂ、上述）が、ｂａｎ変異体により相補されないことが示された。このことから、ａｓｔがｂａｎの対立遺伝子であり（Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ，  ２００１、上述）、そしてＢＡＮにおいて４９  ｂｐ（＋１１４〜１６２  ｎｔ）の欠失を生じ、その結果ヌル変異体を生じることが示された。したがって、本明細書の以下において、ａｓｔはｂａｎ−４と呼ばれる。ｔｔ１９およびｂａｎのあいだの相互作用を研究するため、ｔｔ１９対立遺伝子のいずれかとｂａｎ−４とを有する二重変異株を構築し、そしてその表現型を特定した。
【０１０１】
ｔｔ１９  ｂａｎ二重変異株の作出は、次のように行う。まずｔｔ１９変異株とｂａｎ変異株とをかけ合わせることにより作出されるＦ１個体を作出する。このＦ１個体は、すべての個体がｔｔ１９遺伝子座およびｂａｎ遺伝子座についてともにヘテロであるという特徴を有する。ついで、このＦ１個体の自殖によりＦ２個体を作出し、これらのＦ２個体の中から、理論的には６．２５％含まれるｔｔ１９  ｂａｎ二重変異株を、ＴＴ１９およびＢＡＮの塩基配列に基づいて選抜する。
【０１０２】
アントシアニン類の色素沈着は、ｔｔ１９  ｂａｎ二重変異株の葉および茎においては観察されなかった。二重変異株の未成熟種子外被において、非常に漏出性の（ｌｅａｋｙ）アントシアニンの着色が認識されたが、顕著なそして早発の蓄積は観察されなかった（図９Ａ）。これらの結果から、植物全体レベルで、ｔｔ１９は、アントシアニン蓄積に関してｂａｎに対して上位性のものであったことが示される。バニリン分析により、ｂａｎの場合（Ｄｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、上述）および本明細書中で使用したｂａｎ−４の場合（データは示していない）と同様に、ＰＡ前駆体は二重変異株の未成熟種子外被において決して検出されないことが示された。熟成段階での種子色に関して、ｂａｎは灰色がかった曇った褐色を示し、ｔｔ１９は淡−褐色を、そして二重変異株は淡い灰色がかった淡−褐色を示した（図９Ｂ）。追加的な乾燥期間の後の二重変異株においては、成熟後の種子色の暗色化を引き起こす（図２Ｄ）ｔｔ１９の特徴の一つが、明らかに欠損しており、そして種子色における変化が何も観察されなかった（図９Ｃ）。
【０１０３】
実施例１１：ペチュニアＡＮ９によるｔｔ１９変異の機能的相補
本実施例においては、ＴＴ１９の機能を決定するため、ＴＴ１９の推定ホモログであるペチュニアＡＮ９を、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターのもとで制御し、そしてこのコンストラクトをｔｔ１９変異株中に導入することにより、ｔｔ１９変異株における色素蓄積の欠損を、ペチュニアにおけるホモログであるＡＮ９遺伝子により相補できるかどうかについて検討した。
【０１０４】
ペチュニア（Ｖ２６株）ＡＮ９  ｃＤＮＡを、花芽の全ＲＮＡから上述したＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ペチュニアＡＮ９を増幅するために、ＡＮ９−５’（５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７）およびＡＮ９−３’（５’−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＡＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８）をＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマーとして使用した。アニーリング温度が５５℃である以外は実施例９に上述したようにして、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＴＡ−クローニング産物を配列決定することにより、すべてのＡＮ９  ｃＤＮＡクローンのエクソン３にヌクレオチド置換が見いだされ、その結果刊行物に記載された配列と比較すると、１アミノ酸の置換が導かれていた（Ｖａｌ８０→Ａｓｐ８０）。
【０１０５】
次に、実施例８に上述したようにして、プラスミドをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩにより消化し、そしてインサートを、ｐＵＣ１９中にサブクローン化した。対照実験のために、ＥＳＴクローン１６９Ｍ６のインサートをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化することにより回収し、それぞれがＢａｍＨＩ−認識部位およびＳａｃＩ−認識部位を含む２種の特異的アダプターを用いてライゲーションし、そしてｐＵＣ１９中にサブクローン化した。ベクターアームとインサートとの境界部分を配列決定した後、２種類のｃＤＮＡ（ＴＴ１９  ｃＤＮＡおよびＡＮ９  ｃＤＮＡ）を単離し、そしてバイナリーベクタｐＢＩ１２１中に導入し（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，  Ｒ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）、上述）、相補解析を行った。境界領域を含むインサートの配列を確認した後、２種類のバイナリーベクターを、エレクトロポレーションにより、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＶ３１０１中に別々にトランスフォームした。バイナリーベクターをもつＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍクローンをアグロバクテリウム法の改変方法であるフローラル・ディップ法（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，  １９９８、上述）によりｔｔ１９変異株に感染させ、そしてＴ１幼苗をえた。カナマイシン（５０  ｍｇ／ｌ）およびクラフォラン（Ｃｌａｆｏｒａｎ）（１６６  ｍｇ／ｌ）を用いてＴ１種子をスクリーニングした後、形質転換体を生育させ、そしてそれらの表現型を主としてフラボノイド色素沈着の関連で観察した。
【０１０６】
すべての生存Ｔ１幼苗（ｔｔ１９／３５Ｓ：ＡＮ９系統）は、選択培地上でアントシアニン色素沈着を示した（図７Ｃ）。しかしながら、熟成段階での種子色は、すべてのトランスジェニック植物において、ｔｔ表現型のままであった（図７Ｄ）。
【０１０７】
ＲＴ−ＰＣＲは、これらのＴ１植物中の発育中の長角果（ｓｉｌｉｑｕｅ）において、ＡＮ９が十分に発現していることを示した（データは示していない）。３５Ｓ：ＴＴ１９  ｃＤＮＡコンストラクトを用いた対照実験では、淡−褐色の種子を有するいくつかの植物がこのトランスジェニック系統中に含まれるが（表１）、ＴＴ１９がＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター制御下においてもｔｔ１９の種子色を相補することが確認された（図７Ｄ）。
【０１０８】
【表１】
2004267173.tif 000002
【０１０９】
【発明の効果】
本発明は、上述したように植物体細胞内の液胞にフラボノイドを蓄積させる機能を有するＴＴ１９遺伝子を提供する。ＴＴ１９遺伝子のこのような特徴を利用して、ＴＴ１９遺伝子の活性を調節することにより、植物の最も代表的な色素であり、ポリフェノール類で機能性色素としても注目されているアントシアニン色素量を制御することや、抗酸化作用などで注目されているタンニン量を制御させることができる。特に、植物体内での例えばプロモーターを活性化することなどにより、ＴＴ１９遺伝子の発現を向上させることにより、アントシアニンの液胞への蓄積量を高めたり、タンニンの液胞内蓄積量を高めることができる。また、細胞培養などによるバイオリアクターにＴＴ１９遺伝子を使用することにより、色素やポリフェノール類を含むフラボノイドの合成・生産が可能となる。
【０１１０】
【配列表】
2004267173.tif 000003
2004267173.tif 000004
2004267173.tif 000005
2004267173.tif 000006
2004267173.tif 000007
2004267173.tif 000008
2004267173.tif 000009
2004267173.tif 000010
2004267173.tif 000011
2004267173.tif 000012
2004267173.tif 000013
2004267173.tif 000014
2004267173.tif 000015
2004267173.tif 000016
2004267173.tif 000017
2004267173.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるフラボノイド生合成経路および蓄積経路を示す。それぞれの段階を触媒する酵素、並びにかっこ内に記載した対応する遺伝子座が示される。調節遺伝子座を箱囲みで示す。推定される段階は、点線矢印として示す。アントシアニン類およびプロアントシアニジン類は液胞中に蓄積し、フラボノール類の一部は細胞壁に対して分泌されることに注目すべきである。ＣＨＳは、カルコン合成酵素；ＣＨＩは、カルコンイソメラーゼ；Ｆ３Ｈは、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３’Ｈは、フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ；ＤＦＲは、ジヒドロフラボノール４−還元酵素；ＦＬＳは、フラボノール合成酵素；ＬＤＯＸは、ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ；ＬＡＲは、ロイコアントシアニジン還元酵素；ＡＮＲは、アントシアニジン還元酵素；ＴＴは、トランスパレントテスタ（ＴＲＡＮＳＰＡＲＥＮＴ  ＴＥＳＴＡ）；ＴＴＧは、トランスパレントテスタグラブラ（ＴＲＡＮＳＰＡＲＥＮＴ  ＴＥＳＴＡ  ＧＬＡＢＲＡ）；ＢＡＮは、バニュルス（ＢＡＮＹＵＬＳ）；をそれぞれ示す。
【図２】図２は、ｔｔ１９変異株の表現型特性を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、育成チャンバー中で１ヶ月生育させたＣｏｌ株（Ａ）およびｔｔ１９−１変異株（Ｂ）における、茎の基部でのフラボノイド色素の蓄積を示す。（Ｃ）は、Ｃｏｌ株（左）、ｔｔ１９−１変異株（中央）、およびｔｔ４変異株（右）の熟成段階での成熟長角果を示す。（Ｄ）は、熟成段階（Ｃ）からさらに７週間乾燥させた長角果を示す。スケールバーは、１  ｍｍを示す。
【図３】図３は、０．１  ｍＭナリンゲニンを含むＭＳ／スクロース／アガープレートまたは０．１  ｍＭナリンゲニンを含まないＭＳ／スクロース／アガープレートで生育させたシロイヌナズナ幼苗を示す。（Ａ）および（Ｂ）はＣｏｌ株を、（Ｃ）および（Ｄ）はｔｔ１９−１変異株を、（Ｅ）および（Ｆ）はｔｔ４変異株をそれぞれ示す。（Ａ）、（Ｃ）および（Ｅ）は、ナリンゲニン不存在下で生育させ、一方で（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｆ）はナリンゲニン存在下で生育させた。すべての幼苗は、連続明期条件の下、２３℃にて５日間生育させた。スケールバーは、１  ｍｍを示す。
【図４】図４は、Ｃｏｌ株（［Ａ］、［Ｃ］、および［Ｅ］）およびｔｔ１９−１変異株（［Ｂ］、［Ｄ］、および［Ｆ］）の種子外被におけるＰＡ前駆体の沈着パターンを示す。（Ａ）および（Ｂ）はＤＡＦ１の未成熟種子を、（Ｃ）および（Ｄ）はＤＡＦ５の未成熟種子を、（Ｅ）および（Ｆ）はＤＡＦ１７の種子外被部分を、それぞれ示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
【図５】図５は、２種のｔｔ１９変異株中の変異遺伝子座の模式図を示す。（Ａ）はｔｔ１９−１変異株における構造変化を示す。ＧＳＴ−様遺伝子座が関与する大型の逆位が生じた。ＧＳＴ−様遺伝子のエクソンは、黒四角で示す。ＢＡＣ  Ｆ１８Ｏ２２の染色体領域は灰色で示す。フィラーＤＮＡ領域を、網掛け四角で示す。６  ｂｐフラグメント（Ｆ１８Ｏ２２の９８５０６−９８５１１  ｎｔに相当）は、逆位フラグメントの両方の境界において複製されている点に注目すべきである。それらを黒矢印で示した。（Ｂ）は、ｔｔ１９−２変異株におけるＧＳＴ−様遺伝子座の変異を示す。エクソンを黒四角で示す。灰色の矢印は、転写開始部位を示す。それぞれの番号は、ＢＡＣ  ＭＫＰ１１中でのｎｔ位置を示す。ＭＫＰ１１の７４３−１７４６６  ｎｔ中のフラグメントの一部を、ＰＣＲおよび配列解析によりｔｔ１９−２変異株ゲノム中で検出したが、しかし転座位置は不明である。
【図６】図６は、ＴＴ１９のタンパク質配列および系統樹を示す。（Ａ）は、ＴＴ１９（Ａｔ−ＴＴ１９）、シロイヌナズナＥＳＴ  Ｈ３６８６０（Ａｔ−Ｈ３６８６０）、ペチュニアＡＮ９（Ｐｈ−ＡＮ９）、タバコｐａｒＢ（Ｎｔ−ｐａｒＢ）、トウモロコシＧＳＴＩ、ＧＳＴＩＩＩ、ＧＳＴＩＶ、およびＢＺ２（Ｚｍ−ＧＳＴＩ、Ｚｍ−ＧＳＴＩＩＩ、Ｚｍ−ＧＳＴＩＶ、およびＺｍ−ＢＺ２）、そしてコムギＧＳＴＡ１（Ｔａ−ＧＳＴＡ１）の推定アミノ酸配列の複数アラインメントを示す。これらのＧＳＴについてのすべての参照は、Ａｌｆｅｎｉｔｏら（１９９８、上述）中に含まれる。同一なアミノ酸部位を、アスタリスクで示した。（Ｂ）は、（Ａ）において示されたＧＳＴタンパク質間の系統樹を示す。ｕｎｒｏｏｔｅｄコンセンサスツリーがｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法により得られた。ブートストラップ値は、それぞれの枝に示す。
【図７】図７は、その真性プロモーターを有する野生型ＴＴ１９遺伝子（［Ａ］および［Ｂ］）またはＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターにより発現制御されるペチュニアＡＮ９遺伝子（［Ｃ］および［Ｄ］）による、ｔｔ１９変異株の機能的相補を示す。（Ａ）および（Ｃ）はアントシアニン色素沈着を伴うＴ１幼苗であり、（Ｂ）および（Ｄ）は、熟成段階での種子色を示す。左から右へ：Ｃｏｌ株の長角果、ｔｔ１９の長角果、およびＴ１の長角果。陽性対照として、３５Ｓ：ＴＴ１９コンストラクトを含むＴ１の長角果を、（Ｄ）の一番右に示した。スケールバーは、１  ｍｍを示す。
【図８】図８は、Ｃｏｌ株（レーン１）、ｔｔ１９−１変異株（レーン２）、およびｔｔ１９−２変異株（レーン３）におけるフラボノイド構造遺伝子についてのＲＴ−ＰＣＲを示す。ＥＦ１αＡ４、伸長因子１αＡ４；その他の略語は、図１中に含まれる。
【図９】図９は、ｔｔ１９  ｂａｎ二重変異株の種皮表現型を示す。（Ａ）はＤＡＦ８の未成熟長角果を示す。左から右へ：Ｃｏｌ株、ｔｔ１９、ｔｔ１９  ｂａｎ二重変異株、およびｂａｎ。（Ｂ）はＤＡＦ２０の成熟長角果を示す。左から右へ：Ｃｏｌ株、ｔｔ１９、ｔｔ１９  ｂａｎ二重変異株、そしてｂａｎ。（Ｃ）はさらに熟成段階から７−週間の乾燥の後の種子色を示す。左から右へ：Ｃｏｌ株、ｔｔ１９、ｔｔ１９  ｂａｎ二重変異株、およびｂａｎ。スケールバーは、１  ｍｍを示す。
【図１０】図１０は、シロイヌナズナにおけるフラボノイド後期生合成経路およびそれらの蓄積を示す。ＵＦＧＴ、ＵＤＰ−グルコース：フラボノイドグルコシルトランスフェラーゼ；ＧＳＴ−様、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−様；ＧＳ−Ｘポンプ、グルタチオン−特異的ポンプ；その他の略語は、図１中に含まれる。
【図１】
2004267173.tif 000019
【図２】
2004267173.tif 000020
【図３】
2004267173.tif 000021
【図４】
2004267173.tif 000022
【図５】
2004267173.tif 000023
【図６】
2004267173.tif 000024
【図７】
2004267173.tif 000025
【図８】
2004267173.tif 000026
【図９】
2004267173.tif 000027
【図１０】
2004267173.tif 000028