(57)【要約】【課題】高効率な工業的製造方法で、光学活性α−ヒドロキシケトンを得る。【解決手段】ピルビン酸脱炭酸酵素生成能を有する微生物を用い、かつ式［１］Ｒ１−ＣＨＯ　　・・・［１］（ここで、Ｒ１は、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）で表されるアルデヒド、ピルビン酸、及び界面活性剤を培養液中に添加することを特徴とする式［２］Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯ−ＣＨ３　　・・・［２］（ここで、Ｒ１は、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）で表わされる光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法によって解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルビン酸脱炭酸酵素生産能を有する微生物、式［１］
Ｒ１−ＣＨＯ　　・・・［１］
（ここで、Ｒ１は、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表されるアルデヒド、ピルビン酸及び／又はピルビン酸塩、及び界面活性剤を用いることを特徴とする式［２］
Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯ−ＣＨ３　　・・・［２］
（ここで、Ｒ１は、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表される光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【請求項２】
請求項１において、反応液より前記式［２］で表される光学活性α−ヒドロキシケトンをエーテル抽出にて採取することを特徴とする光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【請求項３】
ピルビン酸脱炭酸酵素生産能を有する微生物を培養して得られた菌体、もしくはそれらの処理物を用いる請求項１または２に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項において、光学活性α−ヒドロキシケトンが光学活性フェニルアセチルカルビノール、光学活性ｐ−ヒドロキシフェニルアセチルカルビノール、または光学活性ｐ−メトキシフェニルアセチルカルビノールである光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【請求項５】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とする、請求項１〜４いずれか１項に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【請求項６】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルエステル類、ソルビタンアルキルエステル類、及びポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類からなるグループから選ばれた少なくとも一つの物質からなるものである、請求項５に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【請求項７】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル類である請求項６に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が１０〜１８であることを特徴とする、請求項５に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が１３〜１５であることを特徴とする、請求項８に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【請求項１０】
界面活性剤を反応液中に０．００００１〜１０％（ｗ／ｖ）存在させて反応を行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【請求項１１】
界面活性剤を反応液中に０．０００１〜１％（ｗ／ｖ）存在させて反応を行うことを特徴とする、請求項１０に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性α−ヒドロキシケトン光学活性α−ヒドロキシケトンは、各種医農薬、香料などの重要な合成原料であり、さらに安価に製造し得れば、種々の合成原料に使用され得る。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性α−ヒドロキシケトンの１種であるＬ―フェニルアセチルカルビノールは、古くは、ベンズアルデヒドからパン酵母により生成するノイベルグ法やベンズアルデヒドとアセトアルデヒドまたはピルビン酸からサッカロマイセス属及びキャンディダ属などの酵母やザイモモナス属の細菌などにより、生成することが知られている。（特許文献１，非特許文献１等）。また、特許文献２には、ザイモモモナス属由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ存在下において、アセトアルデヒドとベンズアルデヒドからフェニルアセチルカルビノールを製造する方法が開示されている。同様に、ザイモモモナス属由来のピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を有する産生微生物を用いたアシロインの生成方法についても特許文献３に開示されている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９００４６３１号明細書
【０００４】
【特許文献２】特表２００１−５１４８９９公報
【０００５】
【特許文献３】特表平１１−５０５７１０公報
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，１（４），３２１−３１（１９８８）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
かかる従来法は収率、収量の点で満足いくものではなかった。本発明の課題は、微生物による光学活性α−ヒドロキシケトンの高効率な工業的製造方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解決するため、さらに生産性の高い光学活性α−ヒドロキシケトンの製法について鋭意研究した結果、以下の構成を有することにより、光学活性α−ヒドロキシケトンの蓄積濃度、生成収率が著しく向上することを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、基本的には、ピルビン酸脱炭酸酵素生産能を有する微生物、式［１］
Ｒ１−ＣＨＯ　　・・・［１］
（ここで、Ｒ１は、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表されるアルデヒド、ピルビン酸及び／又はピルビン酸塩、及び界面活性剤を用いることを特徴とする式［２］
Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯ−ＣＨ３　　・・・［２］
（ここで、Ｒ１は、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表される光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の特徴は、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）生産能を有する微生物を用い、ピルビン酸及び、アルデヒドから光学活性α−ヒドロキシケトンを生成させるに際して、反応液中に界面活性剤を添加することで、常温で、高収量の光学活性α−ヒドロキシケトンを生成するところにある。
【００１０】
さらに具体的に説明すると、使用する微生物はピルビン酸脱炭酸酵素生産能を有する微生物であれば、他に薬剤に対する耐性、栄養要求性などの性質を有するもの、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（ＰＤＣ遺伝子）を導入した組換え株等であっても良く、ピルビン酸脱炭酸酵素を生産する能力を持つ微生物はすべて本発明に含まれるものである。例えば、トルロプシス属またはキャンデイダ属に属する微生物が好ましく、さらに好ましくは、トルロプシス・グラブラータ、トルロプシス・キャンデイダ、キャンデイダ・メタノロベッセンス、キャンデイダ・ボイディニ、キャンデイダ・テナスである。具体的には、特願平１０−１９０５９１、特願平１０−１９０５９２に記載された微生物などが好ましく使用でき、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｇｌａｂｒａｔａ）Ｐ１２０−５ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１６７４５等）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｇｌａｂｒａｔａ）Ｂ２６（ＦＥＲＭ　Ｐ−１６７４４等）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｇｌａｂｒａｔａ）ＩＦＯ　０００５、トルロプシス・キャンデイダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｃａｎｄｉｄａ）ＴＲ−４５３２（ＦＥＲＭ　Ｐ−１４５９９等）、キャンデイダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ）ＴＲ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５０７６等）、及び、キャンデイダ・テナス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｅｎｕｉｓ）（ＩＦＯ　０７１６等）などが挙げられる。
【００１１】
本発明で使用するアルデヒドとしては、式［１］
Ｒ１−ＣＨＯ　　・・・［１］
（ここで、Ｒ１は、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表わされるものならばいずれでも良く、所望する光学活性α−ヒドロキシケトンに対応するものを用いる。例えば、ベンズアルデヒド、ヒドロキシベンズアルデヒド、アニスアルデヒド、プロピオンアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、ケイ皮アルデヒド、フラフールなどが挙げられる。
【００１２】
又、本発明で用いられるアルデヒドは、Ｒ１が、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、又はアルケニル基が組み合わされたもので表されるアルデヒドであっても良い。
【００１３】
本発明で用いられるピルビン酸及び／又はピルビン酸塩は、それらの純品乃至は混合物を添加しても良いし、本発明の製造方法過程で、他の成分から生成するものであっても良い。例えば、培養液中の栄養分を元に当該微生物乃至はその他の微生物の作用やその他の物理・化学的作用により誘導されるものであっても良い。又、ピルピン酸塩とは、特に限定されるものではないが、陽イオンが好ましくは金属元素（より好ましくはアルカリ金属又はアルカリ土類金属、更に好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウム）である。
【００１４】
本発明の製造方法により得られる光学活性α−ヒドロキシケトンとは、
式（２）
Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯ−ＣＨ３　　・・・（２）
（ここで、Ｒ１　は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表され、Ｒ１　は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、又はアルケニル基、或いはそれらが組み合わされたもので表されるケトンならば特に限定されるものではない。光学活性α−ヒドロキシケトンとして好適なものをいくつか例示するならば、光学活性フェニルアセチルカルビノール、光学活性ｐ−ヒドロキシフェニルアセチルカルビノール、または光学活性ｐ−メトキシフェニルアセチルカルビノール等である。
【００１５】
なお、本発明で得られる光学活性α−ヒドロキシケトンの立体配置は、通常、Ｒ１　がフェニル基の場合のＬ−フェニルアセチルカルビノールと同じ立体配置であるＬ体（旋光度マイナス）である。
【００１６】
また、本発明において使用する界面活性剤（好ましくは非イオン性界面活性剤）としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルエステル類、ソルビタンアルキルエステル類、及びポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類等が好ましいものであり、それらの中で、その親水性を表す数値であるＨＬＢが、好ましくは１０〜１８、さらに好ましくは１３〜１５の範囲のものが特に好適に用いることができる。好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル型非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）、Ｎｏｎａｌ３１０（商品名）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
ここにある非イオン性界面活性剤のＨＬＢとは、「新・界面活性剤入門」（藤本武彦著、昭和４８年、三洋化成工業株式会社発行）等に記載されているＧｒｉｆｆｉｎの計算式（非イオン性界面活性剤のＨＬＢ＝親水基部分の分子量／界面活性剤の分子量×２０）から算出されるものである。
【００１８】
本発明の製造方法においては、反応液中に、前記界面活性剤は好ましくは０．００００１〜１０％（ｗ／ｖ）さらに好ましくは０．０００１〜１％（ｗ／ｖ）存在していることが好ましい。
【００１９】
培養液、培養液から得られた菌体、もしくはそれらの処理物に前記の通りの条件で界面活性剤存在下、前記式（１）で表されるアルデヒドを、好ましくは０．５〜５重量％、さらに好ましくは１〜２重量％，及びピルビン酸を１〜５重量％、さらに好ましくは１〜２重量％を添加する。その後、好ましくは５〜７２時間、さらに好ましくは５〜３０時間反応することにより目的とするα−ヒドロキシケトンが得られるものである。
【００２０】
以下、本発明におけるピルビン酸脱炭酸酵素生産能を有する微生物の培養方法について更に詳細に説明する。培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地を使用する。
【００２１】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときアルコール類などを１〜１５％、窒素源として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、のごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿素等を０．１〜４．０％、有機微量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が０．００００００１％〜０．１％、また必要に応じて、コーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜５％をそれぞれ適当に含有する培地が用いられる。これらの他に、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄、等が微量成分として添加される。さらに、必要に応じてチアミン、ナイアシン、ピリドキシン、ビオチンなどの要求ビタミン、またはこれらを含有する酵母エキス、コーンスティープリカー、その他の天然物を添加した培地を使用すればよい。好ましくは消泡剤なども添加し、培養条件の安定化を図る。また培養温度は１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜３５℃が用いられる。これらの条件の下に２４時間振とうまたは撹拌培養を行う。
【００２２】
この培養物、もしくはのそれらの処理物（例えば固定化菌体など）を用い、式（１）で表されるアルデヒドを好ましくは０．０１〜１Ｍ、さらに好ましくは０．０５〜０．５Ｍ、ピルビン酸ナトリウムを好ましくは０．０１〜１Ｍ、さらに好ましくは０．０５〜０．５Ｍ、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００（商品名）　０．００００１〜１０％（ｗ／ｖ）さらに好ましくは０．０００１〜１％（ｗ／ｖ）、チアミンピロリン酸を好ましくは０．００１〜２ｍＭ、さらに好ましくは０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭ、硫酸マグネシウムを好ましくは０．００００１〜５ｍＭ、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜０．５ｍＭ、リン酸二水素カリウムを好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜６０ｍＭ添加し、ｐＨを好ましくは５〜８、さらに好ましくは６〜７、温度を好ましくは２０〜４０℃、さらに好ましくは２５〜３５℃として、好ましくは２〜５０時間、さらに好ましくは５〜３０時間振とうまたは撹拌培養を行うことで、高収量の光学活性α−ヒドロキシケトンを生成させることができる。
【００２３】
光学活性α−ヒドロキシケトンの好ましい精製方法を説明する。培養が完了した時点で反応液を冷却した後エーテルで３回抽出する。このエーテル１５ｍｌ中のエーテル抽出液を硫酸ソーダで脱水し、エーテル抽出液を濃縮する。その後、減圧で蒸留し、５ｍＨｇ７０〜９０℃の留分を集める。
【００２４】
【実施例】
以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、下記の実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げるものであり、これによって本発明の範囲は何ら限定されるものではない。
【００２５】
（比較例１、実施例１ａ〜１ｃ）
界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ―１００）の濃度によるｐ−ヒドロキシフェニルアセチルカルビノール生成量への影響
ＧＰ培地〔組成：ブドウ糖　２０ｇ、酵母エキス　２ｇ、硫酸マグネシウム　０．５ｇ、ポリペプトン（カゼイン製ペプトン）　５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、蒸留水　１Ｌ、ｐＨ５．６〜５．８〕５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものにキャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ　　ｂｏｉｄｉｎｉｉ）ＴＲ−１（ＦＥＲＭ−ＢＰ−５０７６）株を植菌し、３０℃にて１日振とう培養後、同様にして調製したＧＰ培地１Ｌを分注した２Ｌ容坂口フラスコに、５０ｍｌの培養液を接種し、再度３０℃にて１日振とう培養を行った。遠心分離（１００００×ｇ、１０分間）を用いて菌体を回収し、以下の実験に用いた。
【００２６】
表１に示す通り、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００（ＨＬＢ値１３．５）の濃度を調節した酵素反応液〔組成（最終濃度）：ＴｒｉｔｏｎＸ―１００　０．００１％、０．０１％、０．１％、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド　１００ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム　２７０ｍＭ、チアミンピロリン酸　０．１ｍＭ、硫酸マグネシウム　０．１ｍＭ、リン酸二水素カリウム５０ｍＭ、ｐＨ６．５〕１００ｍｌに上記の菌体懸濁液（１６ｇ／Ｌ）２０ｍｌを添加し、３０℃で１６時間反応させた。遠心（１００００×ｇ、２分間）した後、上清を０．５ｍｌ分取し、０．５ｍｌのアセトニトリルを加え撹拌後、再度遠心（１００００×ｇ、２分間）を行った。ＨＰＬＣを用いて上清液中のヒドロキシフェニルアセチルカルビノール生成量を測定した。
【００２７】
ＴｒｉｔｏｎＸ―１００各濃度におけるｐ−ヒドロキシフェニルアセチルカルビノール生成量の測定結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2004000175.tif 000002
【００２９】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
（比較例２、実施例２ａ〜２ｃ）
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわりにアニスアルデヒドを用いる以外は、実施例１と同様に実験を行った。生成したｐ−メトキシフェニルアセチルカルビノール生成量の測定結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
2004000175.tif 000003
【００３１】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
（比較例３、実施例３ａ〜３ｃ）
アニスアルデヒドのかわりにベンズアルデヒドを用いる以外は、実施例２と同様に実験を行った。また生成したフェニルアセチルカルビノール生成量の測定結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】
2004000175.tif 000004
【００３３】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
【００３４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、高収率で、光学活性α−ヒドロキシケトンを得ることが出来る。さらに、得られた光学活性α−ヒドロキシケトンは、副生物であるアルコールの含有量が少なく、産業上極めて有用である。