(57)【要約】【課題】前立腺癌細胞の発生及び／または増殖に関連する遺伝子を見出し、該癌遺伝子を用いた前立腺癌の検出方法、前立腺癌治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法、及び前立腺癌治療及び／または予防用医薬組成物を提供すること。【解決手段】ＴＭＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及び／またはＢＵＣＳ１の発現量を指標とした前立腺癌の検出方法、該検出方法に用いる前立腺癌検出用キット、新規前立腺癌治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法並びに前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物の提供。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程１）乃至４）を含む、前立腺癌の検出方法：
１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の前立腺癌を検出する工程。
【請求項２】
下記の工程１）乃至３）を含む、前立腺癌の検出方法：
１）被験者より採取した検体における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
２）正常人から採取した検体における、上記工程１）の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と上記工程２）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者または被験動物の前立腺癌を検出する工程。
【請求項３】
下記の工程１）乃至４）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）被験物質を添加しないで培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程：
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【請求項４】
下記の工程１）乃至４）を含むことからなる、前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）被験物質を投与しなかった哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）よって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【請求項５】
下記の工程１）乃至３）を含むことからなる、前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
２）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、上記工程１）の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と、上記工程２）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【請求項６】
下記の工程１）乃至３）を含むことからなる、前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
２）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体における、上記工程１）の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と、上記工程２）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【請求項７】
トランジエント・レセプター・ポテンシャル・カチオン・チャンネル，サブファミリーＭ，メンバー４（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ，  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｍ，  ｍｅｍｂｅｒ  ４：以下、「ＴＲＰＭ４」とする。）の陽イオン透過チャンネルを阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程１）乃至３）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
１）ＴＲＰＭ４を細胞表面に発現している細胞を供給する工程；
２）Ｃａ２＋の存在下において１）に記載の細胞と被験物質を接触する工程；
３）細胞内への陽イオンの取り込みが減少するかどうかを決定する工程（ここで、細胞内への陽イオンの取り込みが減少することは被験物質がＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害していることを示す。）
【請求項８】
フォスフォリパーゼＡ１活性を阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程１）及び２）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
１）フォスフォリパーゼＡ１メンバーＡの基質とフォスフォリパーゼＡ１メンバーＡを被験物質と接触する工程；
２）被験物質の存在下で基質を加水分解する活性が減少するかどうかを決定する工程（ここで、基質を加水分解する活性が減少することは被験物質がフォスフォリパーゼＡ１活性を阻害することを示す。）。
【請求項９】
ブチリル・コエンザイムＡ・シンテターゼ１（ｂｕｔｙｒｙｌ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  １：以下，「ＢＵＣＳ１」という。）のアシル−ＣｏＡの合成活性を阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程１）乃至２）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
１）ＢＵＣＳ１の基質とＢＵＣＳ１を被験物質と接触する工程；
２）被験物質の存在下でアシル−ＣｏＡの合成量が減少するかどうかを決定する工程（ここで、アシル−ＣｏＡの合成量が減少することは被験物質がＢＵＣＳ１のアシル−ＣｏＡの合成活性を阻害することを示す。）。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはランオン・アッセイであることを特徴とする、請求項１、３及び４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が動物組織または動物細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡ群の各ＤＮＡの部分配列からなるＤＮＡで作製された遺伝子チップまたはアレイを用いることを特徴とする請求項１、３及び４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
蛋白質の発現量の測定方法が、該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いることを特徴とする、請求項２、５及び６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
蛋白質の発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）であることを特徴とする、請求項２、５及び６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
下記の１）乃至３）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含む、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果判定用キット：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料。
【請求項１５】
下記の１）及び２）の少なくとも一つを含む、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果判定用キット：
１）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
２）上記１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
【請求項１６】
下記の１）乃至３）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含む、前立腺癌の検出用キット：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料。
【請求項１７】
下記の１）及び２）の少なくとも一つを含む、前立腺癌の検出用キット：
１）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
２）上記１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
【請求項１８】
下記の１）乃至５）からなる群から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列または該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオオチドを含む前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列；
２）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列；
３）配列表の配列番号５に示されるヌクレオチド配列；
４）配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列；
５）配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列。
【請求項１９】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質を特異的に認識する抗体を含有する前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、前立腺癌で顕著に発現量が高い遺伝子を用いた前立腺癌の検出方法、前立腺癌の治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法、及び前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌は、欧米や日本などの先進諸国において、依然として主たる死亡原因の一つである。臨床的には、外科的癌組織の切除、放射線治療及び化学療法を含む種々の医学的方法がとられてきているが、悪性形質転換及び癌細胞の増殖に関する十分正確な理解に基づくものとは言えず、多くの場合、その効果は部分的で多くの患者を満足させるものではない。そのような悪性形質転換及び癌細胞の増殖機構に関し、過去１０数年に渡り多くの研究施設において精力的な研究が進められてきた。現在では、正常細胞の増殖は、癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）（増殖促進遺伝子）と癌抑制遺伝子（Ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ）（増殖阻害遺伝子）等様々な遺伝子の質的および量的な変化によって制御されていると考えられている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
細胞内在性の癌遺伝子は、一般的にそれ自体は正常細胞を癌化させる効果は必ずしも強いものではないが、構造変異によりその調節機能が失われると、癌遺伝子となり異常増殖、癌化の直接的な原因となる。例えば、点突然変異で癌を引き起こすＲａｓや、染色体転座により酵素活性の異常亢進を引き起こすＡｂｌ遺伝子などがその一例である。また、変異を生じなくとも、癌遺伝子の発現亢進が、癌化の引き金となる場合も多い。増殖因子受容体ＨＥＲ２／ｎｅｕの遺伝子増幅などによる発現亢進が転移性乳癌で惹起され、その阻害剤が転移性乳癌の治療に用いられているのはその一例である。以上のような事実は、これら癌遺伝子が、癌治療の標的として、極めて妥当な標的分子を提供するという作業仮説を強く示唆している。
【０００４】
癌疾患の中でも前立腺癌は、特に米国で最も頻繁に診断される癌であり、かつ男性の癌死原因の第二番目である。年間およそ３００，０００人の男性が新規に前立腺癌と診断され、また４０，０００人以上の男性が本疾患で死亡している。前立腺癌による死亡は主に転移した疾患に起因しているにも関わらず、新しく診断された患者の６０％近くは前立腺に限局した一次腫瘍を有している。こうした限局癌の患者に対しては外科手術及び放射線治療がしばしば有効であるが、転移伝播した癌患者の場合は、ほとんどの場合治療不能である。現在まで精力的な研究が進められてきているものの、前立腺癌の発生及び進行を引き起こす生物学的な機構に関してはごく僅かしか知られていない。
【０００５】
これら（前立腺癌をはじめとする）癌の発生、進行に関連する遺伝子の発見は、その機構の解明及び治療薬開発の上で極めて有用である。特にその分子機能を阻害することによって、癌細胞の増殖抑制や細胞死を誘導しうるものは、新たな癌治療の標的分子として期待できる。
【０００６】
標的分子の機能阻害による効果を知る代替法として、何らかの方法により、その遺伝子の発現を低下させる手法が用いられる。標的遺伝子と相補的な配列を持つ一本鎖ＤＮＡであるアンチセンスオリゴヌクレオチドやＲＮＡ切断活性を持たせた一本鎖ＲＮＡであるリボザイムを用いた方法などがその例である。これらに加え、最近二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いたＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）が利用できるようになって来た（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００７】
ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡにより、細胞内に存在する相同なｍＲＮＡが特異的に分解される現象で１９９８年に初めて線虫で起こる現象として報告された（例えば、非特許文献３参照。）。哺乳動物では長鎖のｄｓＲＮＡがインターフェロン応答を引き起こしてしまうため（例えば、非特許文献４及び５参照。）、当初はＲＮＡｉ効果を特異的な遺伝子抑制手法として利用するのは困難であると考えられていたが、２００１年にＥｌｂａｓｈｉｒらによってＲＮＡｉ  の中間産物である２１−２３ｍｅｒの短いｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を利用することによってインターフェロン応答を回避しつつＲＮＡｉ効果を誘導できることが報告され（例えば、非特許文献６参照。）、このｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉは、これまでに無い簡便且つ強力な遺伝子発現抑制手法として注目を集めている。
【０００８】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ，  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｍ，  ｍｅｍｂｅｒ  ４（以下、「ＴＲＰＭ４」とする）は、Ｘｕらにより心臓、前立腺、大腸に発現するチャネル様分子として最初にクローニングされ、単鎖型（ＴＲＰＭ４ａ）と長鎖型（ＴＲＰＭ４ｂ）が存在することが報告されている（例えば、非特許文献７参照。）。また、Ｌａｕｂａｒｙらにより、ＴＲＰＭ４ｂがカルシウムではなく、ナトリウムやカリウムイオンを透過させること、そしてカルシウムイオンの動員による刺激でチャネルが開口することが報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。ＴＲＰＭ４はＴＲＰ９とも呼ばれており、前立腺で発現していることが示されているが、正常な前立腺と前立腺癌との間で発現量には差がないと報告されており（例えば、特許文献１参照。）、その機能と癌との関連性については全く明らかになっていない。
【０００９】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ１  ｍｅｍｂｅｒ  Ａ  （以下、「ＰＬＡ１Ａ」とする。）は、ラット血小板のトロンビン刺激培養上清からＳａｔｏらにより精製・同定された蛋白であり、ホスファチヂルセリンやリゾフォスファチヂルセリンなどのセリンリン脂質に特異的に作用し、脂肪酸を切り離すリパーゼとして働くことが知られる（例えば、非特許文献９参照。）。そのヒトオーソログ遺伝子は、Ｎａｇａｉらによってヒト肝よりクローニングされた（例えば、非特許文献１０参照。）。ラットでは、血小板に豊富に発現しているものの、ヒト血小板にはほとんど存在しておらず、様々な臓器で発現が認められる。
【００１０】
ホスファチディルセリンは、細胞内では、プロテインキナーゼＣ（例えば、非特許文献１１参照。）、ｃ−ｒａｆ−１（例えば、非特許文献１２参照。）、一酸化窒素合成酵素（例えば、非特許文献１３参照。）、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰ分解酵素（例えば、非特許文献１４参照。）、ＧＴＰ分解酵素（例えば、非特許文献１５参照。）、ジアシルグリセロールキナーゼ（例えば、非特許文献１６参照。）等を制御することが知られている。一方、細胞外では、血液凝固反応（例えば、非特許文献１７参照。）やマクロファージの貪食能（例えば、非特許文献１８参照。）を活性化することが知られており、その分解酵素であるＰＬＡ１Ａは、それらホスファチディルセリンの作用に対し抑制的に働くことが予想されている（例えば、非特許文献１９参照。）。リゾフォスファチディルセリンについては、ヒト卵巣癌株や乳癌株の細胞内カルシウム濃度を一過性に上昇させ（例えば、非特許文献２０参照。）、また、リンパ腫細胞株Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞にも細胞内カルシウム濃度を上昇させるとの報告がある（例えば、非特許文献２１参照。）。また、ケラチノサイトでは、その細胞増殖を亢進させることも報告されている（例えば、非特許文献２２参照。）。癌との関連については、Ｖａｎ  Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎらが、転移性とその発現が逆相関する遺伝子として単離した遺伝子ｎｍｄ１（例えば、非特許文献２３参照。）と同一であったことが挙げられるが、これらを除いては、癌細胞との関連指摘した報告はなく、その機能と癌特に前立腺癌との関連性については明らかになっていない（例えば、特許文献２参照。）。
【００１１】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｂｕｔｙｒｙｌ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  １  （以下、「ＢＵＣＳ１」という。）は、Ｆｉｊｉｎｏらにより、炭素鎖が４から１６の脂肪酸のうち、特に炭素鎖８のオクタノエート（ｏｃａｔａｎｏａｔｅ）の酸化に関与する酸化酵素として同定された（例えば、非特許文献２４参照。）。ＢＵＣＳ１遺伝子の発現は主に肝臓と腎臓で認められ、ミトコンドリア基質中に局在することが報告されており、アシル−ＣｏＡの生産に寄与していると考えられる。本酵素のＥｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ（ＥＳＴ）が前立腺癌で高く発現していることは報告されているが（例えば、特許文献３参照。）、本酵素と前立腺癌との関係は明らかにはなっていない。
【００１２】
【特許文献１】
国際公開第０２／１０３８２号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第００／２４９１１号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第０１／６０８６０号パンフレット
【非特許文献１】
新津洋司郎、横田淳編、「臨床家のための癌遺伝子／癌抑制遺伝子」、南江堂、１９９９年１０月１６日、Ｐ．１−４６
【非特許文献２】
多比良和誠編、「遺伝子の機能阻害実験法」、羊土社、２００１年９月２０日、ｐ．１９０−２０３
【非特許文献３】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９８年２月１９日、第３９１巻、第６６６９号、ｐ．８０６−８１１
【非特許文献４】
「マイクロバイオロジー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・レビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、１９９８年１２月、第６２巻、第４号、ｐ．１４１５−１４３４
【非特許文献５】
「ザ・インターナショナル・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・セル・バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９７年、７月、第２９巻、第７号、ｐ．９４５−９４９
【非特許文献６】
「ジーンズ・アンド・デヴェロップメンツ（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」）、２００１年１月１５日、第１５巻、第２号、ｐ．１８８−２００
【非特許文献７】
「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２００１年９月１１日、第９８巻、第１９号、ｐ．１０６９２−１０６９７
【非特許文献８】
「セル（Ｃｅｌｌ）」、２００２年５月３日、第１０９巻、第３号、ｐ．３９７−４０７
【非特許文献９】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年１月２４日、第２７２巻、第４号、ｐ．２１９２−２１９８
【非特許文献１０】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年４月１６日、第２７４巻、第１６号、ｐ．１１０５３−１１９５９
【非特許文献１１】
「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９２年１０月２３日、第２５８巻、第５０８２号、ｐ．６０７−６１４）
【非特許文献１２】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９４年４月１日、第２６９巻、第１３号、ｐ．１００００−１０００７
【非特許文献１３】
「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９４年９月１日、第１８０巻、第３号、ｐ．９４５−９５８
【非特許文献１４】
「アドバンセズ・イン・エクスペリメンタル・メディシン・アンド・バイオロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９２年８月１３日、第３１８巻、ｐ．３２５−３３０
【非特許文献１５】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９３年８月１５日、第２６８巻、第２３号、ｐ．１７２４０−１７２４６
【非特許文献１６】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９１年４月１５日、第２６６巻、第１１号、ｐ．７０９６−７１００
【非特許文献１７】
「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｉｔｒｙ）」、１９８８年、第５７巻、ｐ．９１５−９５６
【非特許文献１８】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９０年３月２５日、第２６５巻、第９号、ｐ．５２２６−５２３１
【非特許文献１９】
「蛋白質  核酸  酵素」、１９９９年５月２３日、第４４巻、第８巻、ｐ．１０３８−１０４２
【非特許文献２０】
「クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９５年１０月、第１巻、第１０号、ｐ．１２２３−１２３２
【非特許文献２１】
「ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、１９９５年６月、第１６３巻、第３号、ｐ．４４１−４５０
【非特許文献２２】
「アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、１９９８年４月、第２７４巻、第４号、第一部、ｐ．Ｃ１０６５−Ｃ１０７４
【非特許文献２３】
「キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９５年１２月１５日、第５５巻、第２４号、ｐ．６２３７−６２４３
【非特許文献２４】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００１年９月２１日、第２７６巻、第３８号、ｐ．３５９６１−３５９６６
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前立腺癌細胞の発生及び／または増殖に関連する遺伝子を見出し、該癌遺伝子を用いた前立腺癌の検出方法、前立腺癌の治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法、及び前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、他の組織に比べて前立腺で発現量が高い遺伝子のうち、更に前立腺癌で発現量が高い遺伝子として、ＴＭＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を見出し、該遺伝子の発現量を抑えると癌細胞の増殖を抑制できることを見出し、該遺伝子を用いた、前立腺癌の検出方法、新規前立腺癌治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法を開発し、更に、該遺伝子の発現を抑制させる物質を提供し本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（１）下記の工程１）乃至４）を含む、前立腺癌の検出方法：
１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の前立腺癌を検出する工程、
（２）  下記の工程１）乃至３）を含む、前立腺癌の検出方法：
１）被験者より採取した検体における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
２）正常人から採取した検体における、上記工程１）の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と上記工程２）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者または被験動物の前立腺癌を検出する工程、
（３）  下記の工程１）乃至４）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）被験物質を添加しないで培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程：
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（４）  下記の工程１）乃至４）を含むことからなる、前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）被験物質を投与しなかった哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）よって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（５）  下記の工程１）乃至３）を含むことからなる、前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
２）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、上記工程１）の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と、上記工程２）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（６）  下記の工程１）乃至３）を含むことからなる、前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
２）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体における、上記工程１）の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と、上記工程２）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（７）  トランジエント・レセプター・ポテンシャル・カチオン・チャンネル，サブファミリーＭ，メンバー４（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ，  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｍ，  ｍｅｍｂｅｒ  ４：以下、「ＴＲＰＭ４」とする。）の陽イオン透過チャンネルを阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程１）乃至３）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
１）ＴＲＰＭ４を細胞表面に発現している細胞を供給する工程；
２）Ｃａ２＋の存在下において１）に記載の細胞と被験物質を接触する工程；
３）細胞内への陽イオンの取り込みが減少するかどうかを決定する工程（ここで、細胞内への陽イオンの取り込みが減少することは被験物質がＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害していることを示す。）
（８）  フォスフォリパーゼＡ１活性を阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程１）及び２）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
１）フォスフォリパーゼＡ１メンバーＡの基質とフォスフォリパーゼＡ１メンバーＡを被験物質と接触する工程；
２）被験物質の存在下で基質を加水分解する活性が減少するかどうかを決定する工程（ここで、基質を加水分解する活性が減少することは被験物質がフォスフォリパーゼＡ１活性を阻害することを示す。）、
（９）  ブチリル・コエンザイムＡ・シンテターゼ１（ｂｕｔｙｒｙｌ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  １：以下，「ＢＵＣＳ１」という。）のアシル−ＣｏＡの合成活性を阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程１）乃至２）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
１）ＢＵＣＳ１の基質とＢＵＣＳ１を被験物質と接触する工程；
２）被験物質の存在下でアシル−ＣｏＡの合成量が減少するかどうかを決定する工程（ここで、アシル−ＣｏＡの合成量が減少することは被験物質がＢＵＣＳ１のアシル−ＣｏＡの合成活性を阻害することを示す。）、
（１０）  ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはランオン・アッセイであることを特徴とする、請求項１、３及び４のいずれか一つに記載の方法、
（１１）  ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が動物組織または動物細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡ群の各ＤＮＡの部分配列からなるＤＮＡで作製された遺伝子チップまたはアレイを用いることを特徴とする請求項１、３及び４のいずれか一つに記載の方法、
（１２）  蛋白質の発現量の測定方法が、該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いることを特徴とする、（２）、（５）及び（６）のいずれか一つに記載の方法、
（１３）  蛋白質の発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）であることを特徴とする、（２）、（５）及び（６）のいずれか一つに記載の方法、
（１４）  下記の１）乃至３）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含む、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果判定用キット：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料、
（１５）  下記の１）及び２）の少なくとも一つを含む、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果判定用キット：
１）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
２）上記１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体、
（１６）  下記の１）乃至３）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含む、前立腺癌の検出用キット：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料、
（１７）  下記の１）及び２）の少なくとも一つを含む、前立腺癌の検出用キット：
１）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
２）上記１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体、
（１８）  下記の１）乃至５）からなる群から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列または該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオオチドを含む前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列；
２）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列；
３）配列表の配列番号５に示されるヌクレオチド配列；
４）配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列；
５）配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列、
（１９）  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質を特異的に認識する抗体を含有する前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物、
からなる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本明細書中において、前立腺癌の治療及び／または予防効果を有する化合物とは、前立腺癌の増殖を抑制する活性、前立腺癌を縮小する活性、及び／または、前立腺癌の発生を予防する活性を有する化合物をいう。なお、本明細書中においては、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれるものとする。したがって、本発明におけるＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子には、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡが含まれる。本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。また、本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。また、本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。本明細書中において、「細胞の癌化」とは、細胞が接触阻止現象への感受性を喪失することや、足場非依存性増殖を示すこと等、細胞が異常な増殖を示すことをいい、このような異常な増殖を示す細胞を「癌細胞」という。本明細書において、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のそれぞれと「実質的に同一の蛋白質」とは、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のそれぞれが有する細胞の癌化活性等と同一の機能を有する蛋白質をいう。なお本発明における癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）という語には癌遺伝子の他に癌原遺伝子、前癌遺伝子（Ｐｒｏｔｏ−Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）も含む。
【００１６】
１．前立腺癌で発現量が高い遺伝子の検出
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子は、前立腺由来・正常組織サンプルと前立腺由来・腫瘍サンプルにおける発現量の解析から前立腺由来腫瘍において有意に発現量が高いことが本発明者によって明らかとなった。また、正常な各種臓器、組織間の比較ではＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子は他の組織では前立腺に比べ発現量が有意に低下していることが本発明者らによって見出された。ＴＲＰＭ４には長鎖型（ＴＲＰＭ４ｂ）と単鎖型（ＴＲＰＭ４ａ）があり、単鎖型にはさらにスプライシング・バリアント（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ）も知られているが、本明細書において「ＴＲＰＭ４」という用語は特に限定していない限り、これらを特に区別することなく用いている。ＴＲＰＭ４ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１に示されており、そのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は配列番号１のヌクレオチド番号７３乃至３７１４に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号２に示されている。ＴＲＰＭ４ａのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３に示されており、そのＯＲＦは配列番号３のヌクレオチド番号２２３乃至３３４２に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号４に示されている。ＴＲＰＭ４ａのスプライシング・バリアントのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５に示されており、そのＯＲＦは配列番号５のヌクレオチド番号３２４乃至３３７１に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号６に示されている。ＰＬＡ１ＡのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７に示されており、そのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は配列番号７のヌクレオチド番号３２乃至１３９９に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号８に示されている。ＢＵＣＳ１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号９に示されており、そのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は配列番号９のヌクレオチド番号６９乃至１７９９に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号１０に示されている。また、ＴＲＰＭ４ｂの遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ，  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｍ，  ｍｅｍｂｅｒ  ４  （ＴＲＰＭ４），  ｍＲＮＡ  （アクセッション番号：ＮＭ＿０１７６３６）として登録されている。ＴＲＰＭ４ａの遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＲＰ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｘ  ｃｈａｎｎｅｌ  （ＴＲＰＭ４）  ｍＲＮＡ，  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ．（アクセッション番号：ＡＹ０４６３９６）として登録されている。ＴＲＰＭ４ａのスプライシング・バリアントの遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ＦＬＪ２００４１  ｆｉｓ，  ｃｌｏｎｅ  ＣＯＬ００４２３．（アクセッション番号：ＡＫ００００４８）として登録されている。ＰＬＡ１Ａ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ１  ｍｅｍｂｅｒ  Ａ  （ＰＬＡ１Ａ），  ｍＲＮＡ（アクセッション番号：ＮＭ＿０１５９００）として登録されている。ＢＵＣＳ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＨｏｍｏ  ｓａｐ���ｅｎｓ  ｂｕｔｙｒｙｌ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  １  （ＢＵＣＳ１），  ｍＲＮＡ（アクセッション番号：ＮＭ＿０５２９５６）として登録されている。
【００１７】
本明細書中において、「ＴＲＰＭ４遺伝子」とは、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの少なくともいずれか一つ、または、該ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをいう。本明細書中において、「ＰＬＡ１Ａ遺伝子」とは、配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または、該ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをいう。本明細書中において、「ＢＵＣＳ１遺伝子」とは、配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または、該ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをいう。また、本明細書中において、「ＴＲＰＭ４」とは、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の少なくともいずれか一つ、該蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウムイオン存在下で陽イオン透過チャンネルとしての機能を有する蛋白質をいう。「ＰＬＡ１Ａ」とは、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または、該蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フォスフォリパーゼＡ１活性を有する蛋白質をいう。「ＢＵＣＳ１」とは、配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または、該蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシル−ＣｏＡ・シンテターゼ活性を有する蛋白質をいう。
【００１８】
２．前立腺癌の検出方法
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１は前立腺、特に前立腺癌で高い発現が認められるので、前立腺の癌化及び／または癌細胞の増殖に関与していると考えられる。なお、「検体」とは、被験者や臨床検体等から得られた、血液、体液、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻、肺、骨、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ節、筋肉、脂肪組織等の組織、組織の一部または排泄物等の試料を意味するが、本発明においては前立腺か前立腺の一部がより好ましい。
【００１９】
（１）ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を利用した前立腺癌の検出方法
ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を利用した前立腺癌の検出方法は、具体的には、以下の工程１）乃至４）を含む方法である。
１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）に記載の全ＲＮＡ画分と上記工程２）に記載の全ＲＮＡ画分におけるＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程；
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の前立腺癌を検出する工程。
以下、各工程を具体的に説明する。
【００２０】
▲１▼  工程１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
検体から全ＲＮＡ画分を抽出するに際しては、適切な実験の倫理基準に適した方法で入手したヒト由来組織をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェノール等、リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するか又は、該組織の細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等の蛋白質分解酵素を用いて穏やかに組織から細胞を抽出するなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにＲＮＡ抽出工程に移行する。
【００２１】
ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．  ａｎｄ    Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９８７），１６２，１５６−１５９）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。また、市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えば、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン（株）製）、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製））等を試薬に添付のプロトコールに従って用いることもできる。
【００２２】
得られた全ＲＮＡ画分は、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いるのが好ましい。精製方法は特に限定されないが、例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。ただし、本発明の方法のためには、これらｍＲＮＡの精製工程は必須ではなく、検出対象のポリヌクレオチドの発現の検出が可能である限りにおいて、全ＲＮＡ画分をその後の工程に用いることもできる。
【００２３】
▲２▼  工程２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程：
本発明において、正常人とは、癌を有さない人を意味する。正常人であるか否かは、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かで判定することもできるし、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の発現量と、前立腺癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、正常な範囲にあるとして判断することもできる。正常人よりの全ＲＮＡ画分の調製は、上記工程１）と同様に行うことができる。
【００２４】
▲３▼  工程３）上記工程１）に記載の全ＲＮＡ画分と上記工程２）に記載の全ＲＮＡ画分におけるＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程：
ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量の測定方法として、固相化試料を用いた測定方法と、その他のいくつかの測定方法について説明する。
【００２５】
（ａ）  固相化試料を用いた測定方法
（ｉ）  固相化試料
固相化試料としては、例えば以下のものが挙げられる。
【００２６】
（イ）遺伝子チップ：
データベース上のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）配列又はｍＲＮＡ配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップを用いることができる。このような遺伝子チップとしてはアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製の遺伝子チップ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ    Ｇｅｎｅｔ．  （１９９９）２１，ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ，２０−２４）を用いることができるが、これに限定されず、公知の方法に基づき作製してもよい。ヒト細胞由来のｍＲＮＡを解析する場合には、ヒト由来のものが好ましく、例えば、アフィメトリックス社製ヒトＵ９５セット又はＵ１３３セットを用いることができる。しかしながら、それらに限定されず、例えば近縁種の動物由来のものも使用可能である。
【００２７】
（ロ）ヒト、全ＲＮＡあるいは特定の組織から得た全ＲＮＡより作製されたｃＤＮＡ又はＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化された、アレイ又はメンブレンフィルター：
上記ｃＤＮＡ又はＲＴ−ＰＣＲ産物は、ヒトのＥＳＴデータベース等の配列情報を基に作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものである。このｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物は、あらかじめ腫瘍を有するヒトと腫瘍を有さないヒトの間で発現量の異なる全ＲＮＡを、サブトラクション法（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｉ，Ｌ，ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  （１９９６）９３，６０２５−６０３０）、ディファレンシャルディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ，（１９９２）  ２３，３６８５−３６９０）などを利用して選択されたものであってもよい。また、アレイやフィルターは市販のもの（例えば、インテリジーン：タカラバイオ社製等）を使用してもよいし、上記ｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物を市販のスポッターで（例えば、ＧＭＳ４１７アレイヤー：タカラバイオ社製等）を用いて固相化することにより作製してもよい。
【００２８】
（ｉｉ）  プローブの作製と解析
標識プローブは、特定のｍＲＮＡクローンではなく、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものを用いる。プローブ作製のための出発材料としては精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いることが望ましい。以下に、各種固相化試料を用いた場合の、標識プローブの調製方法と検出、解析方法について説明する。
【００２９】
（イ）アフィメトリックス社製遺伝子チップ：
アフィメトリクス社製遺伝子チップに添付されたプロトコール（アフィメトリックス社発現解析技術マニュアル）に従ってビオチン標識したｃＲＮＡプローブを作製する。次いでアフィメトリックス社製遺伝子チップに添付のプロトコール（発現解析技術マニュアル）に従って、アフィメトリックス社製の解析装置（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００）を用いてハイブリダイゼーション及び解析を行い、アビジンによる発光を検出、解析を行なう。
【００３０】
（ロ）アレイ：
逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、ｃＤＮＡの検出ができるようにｃＤＮＡを標識しておくことが必要であり、蛍光色素で標識する場合には、蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。このとき、前立腺癌細胞由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡと対照細胞由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。アレイとして例えば、タカラバイオ（株）社の市販アレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーション及び洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（タカラバイオ（株）社製）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。ただし、使用するアレイとしては市販のものに限定されず、自家製のもの、特別に作製したものでもよい。
【００３１】
（ハ）メンブレンフィルター：
逆転写酵素でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、ｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行ない、例えば、市販のフィルター製マイクロアレーである、アトラスシステム（クロンテック社製）を用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行なった後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クロンテック社製等）を用いて検出、解析を行なう。
【００３２】
前記（イ）乃至（ハ）のいずれに記載の方法も、同一ロットの固相化試料にヒト各組織由来のプローブをハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーション以外の条件は同じとする。蛍光標識プローブを用いる場合には、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることができる（Ｂｒｏｗｎ、Ｐ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，  （１９９９）２１，  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，  ｐ．３３−３７）。
【００３３】
（ｂ）  その他の測定方法
上記以外の測定方法としてサブトラクションクローニング法（実験医学別冊新  遺伝子工学ハンドブック、羊土社刊（１９９６）  ｐ．３２−３５参照）、ディファレンシャルディスプレー法（基礎生化学実験法４  核酸・遺伝子実験  ＩＩ．応用編、東京化学同人（２００１），  ｐ１２５−１２８）、レポーター遺伝子を用いた方法（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター：プロメガ社製を使用。）やβ−ガラクトシダーゼ（例えば、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ：プロメガ社製を使用。）、分泌型アルカリホスファターゼ（例えば、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ：クロンテック社製を使用。）、緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ｐＥＧＦＰ−１：クロンテック社製を使用。））があるがこれらに限定されない。
【００３４】
▲４▼  工程４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の前立腺癌を検出する工程。
【００３５】
正常人由来の検体と被験者由来の検体との間でＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量の差を解析し、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量が有意に増加している検体では癌、特に前立腺癌が存在する可能性が高いと判定することができ、前立腺癌を検出することができる。発現量が有意に増加しているとは、例えば、アフィメトリックス社の遺伝子チップを用いて、アフィメトリックス社のＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒ．３．０を用いて解析した場合、前立腺癌細胞由来の遺伝子の遺伝子発現量（Ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値）が正常な前立腺細胞に比べて有意に増加している場合をいう。なお、該検出は、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択されるいずれか一つの遺伝子の発現量を個別に評価して行うことも可能であるし、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の発現量を総合的に評価して行うこともできる。
【００３６】
また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子の濃度を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かを解析し正常人の値として決められている範囲を超えている場合には前立腺癌を有すると判定することで前立腺癌を検出することもできるし、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子の発現量と、正常人の前立腺癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、被験者から採取した検体におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子の発現量を測定することによって被験者が、前立腺癌を有するか否を判定することもできる。
【００３７】
（２）  ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を利用した前立腺癌の検出方法
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を利用した前立腺癌の検出方法は、具体的には、以下の工程１）乃至３）を含む方法である。
１）被験者より採取した検体における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程：
２）正常人より採取した検体における、上記１）に記載の蛋白質の発現量を測定する工程：
３）上記工程１）で測定された蛋白質の発現量と上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の前立腺癌を検出する工程。
以下、各工程を具体的に説明する。
【００３８】
▲１▼  工程１）被験者より採取した検体における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程：
（ａ）  検体より蛋白質測定用試料の調製
検体は、必要に応じて高速遠心を行うことにより、不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
【００３９】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例えば回収した、前立腺をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば、前立腺または前立腺の一部の抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製等）と混合する。ドット／スロットブロットの場合は、例えば回収した前立腺または前立腺の一部の抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させる。
【００４０】
（ｂ）  試料の固相化
上記のようにして得られた試料中の蛋白質を特異的に検出するためには、試料を免疫沈降法、リガンドの結合を利用した方法等によって、沈殿させ、固相化せずに検出することもできるし、そのまま検出する該試料を固相化することもできる。蛋白質を固相化する場合において、ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【００４１】
ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で蛋白質の検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば０．０５％  アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃乃至室温で一晩、または３７℃で１乃至３時間静置することにより、ウエル内底面に蛋白質を吸着させて固相化する。
【００４２】
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１に対する抗体は、常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、蛋白質１、ｐ．３８９−３９７、１９９２参照。）、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１またはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５−４９７，  １９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，  Ｒ．  ｅｄ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐ．３６５−３６７，  １９８０，  Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．）に従って、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択されるいずれかの蛋白質に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【００４３】
なお、抗原となるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１はＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を精製すればよい。
【００４４】
（ｃ）  ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量の測定
発現量の測定は、抗ＴＲＰＭ４抗体、抗ＰＬＡ１Ａ抗体及び抗ＢＵＣＳ１から選択されるいずれかの抗体を用いてウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法等公知の方法を用いて測定することができる。
【００４５】
▲２▼  工程２）正常人より採取した検体における、上記１）に記載の蛋白質の発現量を測定する工程：
正常人より採取した検体におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択されるいずれかの蛋白質の発現量の測定は上記工程▲１▼と同様の方法で行うことができる。
【００４６】
▲３▼  工程３）上記工程１）で測定された蛋白質の発現量と上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の前立腺癌を検出する工程。
【００４７】
正常人由来の検体と被験者由来の検体との間でＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量の差を解析し、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量が有意に増加している検体では癌、特に前立腺癌が存在する可能性が高いと判定することができ、前立腺癌を検出することができる。なお、該判定は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択されるいずれか一つの蛋白質の発現量に基づいて個別に行うこともできるし、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量を総合的に評価して行うこともできる。
【００４８】
また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の濃度を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かを解析し正常人の値として決められている範囲を超えている場合には前立腺癌を有すると判定することで前立腺癌を検出することもできるし、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量と、正常人の前立腺癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、被験者から採取した検体におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量を測定することによって被験者が、前立腺癌を有するか否かを判定することもできる。
【００４９】
３．ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の検定
ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量は、ヒトの正常組織の間では前立腺に比べ他の組織では有意に低下しており、更に、正常な前立腺に比べ、前立腺癌で発現量が有意に増加していることが本発明者らによって見出された。ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の機能は以下の方法によって調べることができる。
【００５０】
（１）ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の機能を調べる第１の方法としては、まず、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を発現している細胞由来のヒトｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い、完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡをマウス又はヒト細胞に導入して高発現させ、細胞に影響が生じるか否かを検討する。
【００５１】
ｃＤＮＡを動物個体内で発現させるためには、得られた完全長ｃＤＮＡをウイルスベクターに組み込み、動物に投与する方法が挙げられる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のＤＮＡウイルス、又はＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が好ましい。
【００５２】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、なかでも、ＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００５３】
また、培養細胞に対して、完全長ｃＤＮＡをヒト、マウス、ラット等由来の筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、あるいは筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、前立腺細胞等へ導入し、高発現させ、各標的細胞の有する機能、具体的には、糖や脂質の産生や取り込み、あるいはグリコーゲンの蓄積等の糖脂質代謝を調節する機能、あるいは細胞の形態にどの様な影響が現れるかを検討することができる。
【００５４】
完全長ｃＤＮＡを動物又は細胞に導入するにあたっては、適当なプロモーター及び形質発現に関わる配列を含むベクターに該ｃＤＮＡを組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換させる。脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９８１）１，  ｐ．８５４−８６４）、レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ、ｐＬＮＳＸ、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）、コスミドベクターｐＡｘＣｗ（タカラバイオ社製）等が挙げられるが、これに限定されない。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ    Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９８３）  １１，ｐ．１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（１９７３）  ５２，  ｐ．４５６−４５７）、及び電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８２）  １，  ｐ．８４１−８４５）などによりサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．  Ｃｅｌｌ（１９８１）  ２３，ｐ．１７５−１８２，ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｌ．Ａ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８０）  ７７，  ｐ．４１２６−４２２０）、ヒト胎児腎臓由来２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等に取り込ませることができるが、これらに限定されない。かくして所望の形質転換体を得ることができる。
【００５５】
また、遺伝子操作により、正常動物において、目的とする遺伝子が高発現するようにトランスジェニック動物を作製し、細胞の形態にどの様な影響が現れるかを検討することも可能である。逆に、前立腺癌を有する動物において、対象とする遺伝子を破壊したノックアウト動物を作製し細胞の状態を判定することができる。
【００５６】
（２）ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の機能を調べる第２の方法としては、癌細胞株においてＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現を抑制し、細胞の機能や増殖の形態にどの様な影響が出るかを調べることもできる。
【００５７】
試験する遺伝子の全ＲＮＡに対するアンチセンス核酸を、細胞に導入し、各標的細胞の機能や形態にどの様な影響が出るかを調べることもできる。
【００５８】
遺伝子の発現を抑制する他の方法としては二本鎖の単鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いる方法を挙げることもできる（「ジーンズ・アンド・デヴェロップメンツ（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」）、２００１年１月１５日、第１５巻、第２号、ｐ．１８８−２００）。例えば、ヒト前立腺細胞株ＬＮＣａＰ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１７４０）あるいはヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１４３５）に対してＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子のいずれかの遺伝子に対するｓｉＲＮＡを文献記載の方法に従って導入し、ｓｉＲＮＡの対象となる遺伝子の発現量及び細胞の増殖率を調べると、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子のいずれの発現量を抑制した場合にも細胞の増殖の抑制が観察される。すなわち、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量の増大が前立腺癌の増殖に関係していることが明らかとなる。
【００５９】
４．ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１、及び／または、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１検出用キット
ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１、及び／または、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１は、以下の１）乃至５）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含むキットを用いて検出することができる。
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料。
４）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
５）上記４）に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
【００６０】
前記１）記載のプライマーは、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づき市販のプライマー設計ソフト（たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ  ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．２）を用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。また、前記２）に記載のプローブは、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、１００乃至１５００塩基長、好ましくは３００乃至６００塩基長である。これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、また、リンカーを付加していてもよい。
【００６１】
上記３）に記載の固相化試料は、上記２）に記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料の作成方法については、既に「２．前立腺癌の検出方法」の項中、「（１）ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を利用した前立腺癌の検出方法」の項で説明した通りであり、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【００６２】
本発明のキットには、更に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物）及び緩衝液を含めることもできる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどが例示できる。緩衝液は使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて選ばれ、必要に応じてＭｇ２＋などが添加されている。
【００６３】
前記、４）及び５）に記載の抗体は上記「２．前立腺癌の検出方法」の項中「（２）  ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を利用した前立腺癌の検出方法」や下記の「６．抗ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１抗体の製造」の項に記載した方法により作製することができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよい。
【００６４】
本発明のキットはＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１、及び／または、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の検出に用いることができ、前立腺癌の有無の判定や、前立腺癌の増殖を抑制する物質のスクリーニングにも用いることができる。
【００６５】
５．前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法
本発明の一つの態様として、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１、及び／または、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくとも一つの発現量を測定することによって前立腺癌に対して治療及び／または予防効果を有する物質のスクリーニングをすることができる。
【００６６】
本発明の一つの態様として、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択されるいずれか一つの蛋白質の活性を阻害する物質を同定することによって、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００６７】
なお、「被験物質」とは、本発明のスクリーニング方法で癌の増殖抑制活性を調べる対象となる物質をいう。被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられる。また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくとも一つのの発現量を低下するように設計された核酸またはその誘導体（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等を含む）を、被験物質として使用することも可能である。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作成するなどして複数種の投与量を設定してもよく、固体、液体等適当な状態で投与することができ、適当なバッファーに溶解したり、安定化剤等を加えてもよい。培養細胞を用いるスクリーニング方法の場合には、培地に添加して培養することができる。培地に添加する場合には培養開始時から添加してもよいし、培養途中で添加しても良く、また、添加の回数も１回に限らない。被験物質存在下で培養する期間も適宜設定してよいが、好ましくは３０分乃至２週間であり、より好ましくは、３０分乃至４８時間である。哺乳動物個体に被験物質を投与する場合は、被験物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を使い分ける。また、前立腺癌に直接塗布または注射することもできる。なお被験物質の投与から、検体を得るまでの時間は適当に選択することができる。
【００６８】
本発明のスクリーニング方法において用いられる培養細胞は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを発現する哺乳動物細胞である限りにおいて、正常な細胞でも、癌細胞等の異常な増殖を示す細胞でもよく、例えば、マウス繊維芽細胞由来細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３、マウス、ラット及びヒト遊離脂肪細胞、マウス、ラット及びヒト初代肝細胞等を挙げることができるがこれらに限定されない。培養細胞の哺乳動物種としては、ヒト、マウスまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましいが、これらに限定されない。なお、培養細胞としてはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰発現している哺乳動物細胞を用いるのがより好ましく、例えばＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入し、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞などを挙げることができる。
【００６９】
腫瘍細胞では以下に示す、▲１▼フォーカス形成、▲２▼コロニー形成、▲３▼スフェロイド増殖等の正常な細胞とは異なる異常な増殖を示す場合が多い。従って、かかる増殖を低減する物質は癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質である可能性が高い。これらの性質は具体的には以下の通りである。
【００７０】
▲１▼  フォーカス形成試験
ＮＩＨ３Ｔ３をはじめとする正常繊維芽細胞は、通常、増殖して密集状態になっても細胞が重なり合うことはなく、単層を形成したところで増殖は止まる。一方、形質転換した細胞、癌細胞では、接触阻止現象への感受性が喪失しており、重なり合いながら増殖を続けることが可能であり、何層にも重なった細胞集団を形成し、単層の細胞の広がりの中に高密度の細胞塊であるフォーカス（Ｆｏｃｕｓ）を作るという特性を持つ（横田淳、山本雅編、バイオマニュアルＵＰシリーズ癌研究プロトコール  羊土社  １６８−１７４（１９９５年１０月１５日刊行）。この現象は、例えば、培養細胞に癌ウイルスを感染させた場合に観察されることから、癌ウイルスの定量にも用いられる場合もあるのみならず（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９６９），ｐ１９８−２１１）、ウイルスや細胞由来の癌遺伝子を含むＤＮＡ断片を細胞にトランスフェクションすることによっても観察することができることから、癌遺伝子、癌抑制遺伝子のスクリーニングに用いられる。
【００７１】
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子を過剰発現させた細胞株と過剰発現させなかった細胞株を通常の方法で培養し、新鮮な培養液に置換した後にマルチウェルプレート（例えば９６穴プレート：コーニング−コスター社製３５９８）に分注し一定時間培養した後に各ウェルあたりのフォーカス数を測定する。各ウェルあたりのフォーカス数を集計した後統計処理を行ない、各ウェルあたりの平均フォーカス数及び標準偏差を算出する。ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを過剰発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞ではＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子を過剰発現させなかった細胞に比べ、フォーカス数が顕著に増加していることが観察される。
【００７２】
▲２▼  コロニー形成試験
正常な細胞は、血液細胞を除き、接着する足場のない状態におくと増殖できないことが知られる。これに対して形質転換した細胞、癌細胞は、足場のない状態でも増殖しうる特性をもつ。この特性変化は、これは軟寒天培地中における増殖コロニーの形成で容易に調べることが可能である（横田淳、山本雅編、バイオマニュアルＵＰシリーズ  癌研究プロトコール  羊土社  １６８−１７４（１９９５年１０月１５日刊行）。
【００７３】
ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを過剰発現させた細胞株と過剰発現させなかった細胞株を通常の方法で培養し、新鮮な培養液に置換した後に軟寒天培地（例えば０．３３％  Ｂａｃｔｏａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ社製）及び２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁し、寒天培地（例えば０．６６％  Ｂａｃｔｏａｇａｒ及び２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）の上に重層する。通常の条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２）で培養し、形成された軟寒天中の増殖コロニー数を測定する。マルチウェルプレート（例えば１２穴プレート：コーニング−コスター社製３５１２）を用いて培養した場合には、一定時間培養した後に各ウェルあたりのコロニー数を測定する。各ウェルあたりのコロニー数を集計した後統計処理を行ない、各ウェルあたりの平均コロニー数及び標準偏差を算出する。ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを過剰発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞株ではＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれかひとつを過剰発現させなかった細胞に比べ、コロニー数が顕著に増加していることが観察される。
【００７４】
▲３▼  スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）増殖試験
形質転換した細胞、癌細胞の足場非依存的な増殖という特性は、スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状態での培養によっても容易に評価することができる。スフェロイドは細胞が多数集合した凝集体のことであり、細胞接着を極めて低く抑えた培養プレートでの培養によって容易に形成しうる。スフェロイド状態での培養は、通常の単層培養とは異なり、「▲２▼コロニー形成試験」に示したのと同様に足場非依存的な状態での培養に類似し、生体内に近い条件下で機能を観察することができる（住友ベークライト社ＳＵＭＩＬＯＮ理化学機器総合カタログ）。ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを過剰発現させた細胞株と該遺伝子を過剰発現させなかった細胞株を通常の方法で培養し、新鮮な培養液に置換し、細胞非付着性マルチウェルプレート（例えばスフェロイド９６Ｕ：住友ベークライト社製ＭＳ−００９６Ｓ）に分注する。通常の条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ２）で培養し、培養開始後一定時間経過後にプレート上に形成されるスフェロイドの大きさを測定する。スフェロイドの大きさは例えば顕微鏡下、接眼方眼ミクロメータ−（三啓社製：Ｓ−６）を用いて測定することができ、スフェロイドの大きさの指標としてスフェロイドの直径を用いることができる。ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを過剰発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞株では該遺伝子を過剰発現させなかった細胞に比べ、スフェロイドの直径の顕著な増加が観察される。
【００７５】
本発明のスクリーニング方法には、培養細胞を用いず、哺乳動物個体に被験物質を投与して、その後該動物個体から摘出されたその臓器または組織細胞におけるＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの発現を検出する方法も含まれる。遺伝子発現の検出対象となる臓器または組織は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を発現するものであればよいが、好ましくは癌が発生している組織であり、より好ましくは前立腺である。哺乳動物種としては非ヒト哺乳動物を用いることができ、マウス、ラットまたはハムスターが好ましく、マウスまたはラットがより好ましい。なお、ヒト、サル、マウスまたはラット由来の腫瘍を皮下、皮内あるいは腹腔等に移植した腫瘍モデル動物である、担癌動物（ヒト癌株を移植したヌードマウス、同種移植マウスなど）、あるいは、癌を自然発生する系統の動物（天然に同定された動物及び遺伝子改変動物を含む。例えば、ｐ５３ノックアウトマウス（Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）、３５６巻、ｐ．２１５−２２１）、Ｍｙｃトランスジェニックマウス（Ａｄａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）、３１８巻、ｐ．５３３−５３８）、ＴＲＡＭＰマウス（Ｆｏｓｔｅｒら、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９７）、５７巻、ｐ．３３２５−３３３０）などを用いることもできる。更に、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳの少なくともいずれか一つを過剰発現させた動物を用いることもできる。また、癌誘発処置を行なった動物を用いることもできる。
【００７６】
本発明の方法において用いられる培養細胞は、被験物質を添加しない場合にＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを発現可能な条件であれば、いかなる条件で培養してもよい。例えば、該培養細胞について公知の培養条件が知られており、該条件下において該細胞がＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを発現する場合は、該条件で培養してもよい。また、哺乳動物個体から摘出した臓器または組織におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現を検出する場合における、該動物の飼育条件も、被験物質を添加しない場合にＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つを発現可能な条件であればよい。
【００７７】
なお、被験物質の、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現に対する影響を調べるためには、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量を測定する方法と、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの翻訳産物である、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現量を測定する方法がある。ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子、及び／または、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現を抑える被験物質は癌、好適には前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質であると考えられる。
【００７８】
培養細胞からの、全ＲＮＡの抽出、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量の測定、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量の測定については、上記「２．前立腺癌の検出方法」の項に記載した方法に従って行うことができる。
【００７９】
（１）  ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを用いる方法
本発明のスクリーニング方法としては例えば、哺乳動物由来培養細胞を用いる方法、及び哺乳動物個体を用いる方法についてそれぞれ以下のようになる。
【００８０】
▲１▼  哺乳動物由来培養細胞を用いる方法
（ｉ）  以下の工程イ）乃至ハ）を含む：
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
ロ）イ）由来の全ＲＮＡと被験物質を添加しないで培養した哺乳動物培養細胞由来全ＲＮＡの間における、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの発現量の差を検出する工程；
ハ）ロ）に記載の遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の、前立腺癌に対する治療、及び／または予防効果を判定する工程。
【００８１】
（ｉｉ）以下の工程イ）乃至ニ）を含む。
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
ロ）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
ハ）上記イ）由来の全ＲＮＡ画分とロ）由来の全ＲＮＡ画分における、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量を測定する工程；
ニ）上記イ）由来の全ＲＮＡ画分とロ）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記ハ）によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の、前立腺癌に対する治療、及び／または治療効果を判定する工程。
【００８２】
▲２▼哺乳動物個体を用いる方法
（ｉ）以下の工程１）乃至３）を含む。
イ）被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
ロ）イ）由来の全ＲＮＡと被験物質を投与しなかった動物個体より採取した検体より得た全ＲＮＡの間における、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量の差を検出する工程；
ハ）上記ロ）に記載の遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療、及び／または予防効果を判定する工程。
【００８３】
（ｉｉ）以下の工程イ）乃至ニ）を含む。
イ）被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
ロ）被験物質を投与しなかった哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
ハ）上記工程イ）由来の全ＲＮＡと上記工程ロ）由来の全ＲＮＡにおける、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量を測定する工程；
ニ）ハ）に記載の遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療及び／または予防効果を判定する工程。
【００８４】
（２）  ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を用いる方法
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現量を測定することを利用したスクリーニング方法については哺乳動物培養細胞を用いた方法と動物個体を用いた方法についてそれぞれ以下の工程を含む。
【００８５】
▲１▼  哺乳動物由来培養細胞を用いる方法
（ｉ）以下の工程１）及び２）を含む：
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現量を測定する工程；
ロ）イ）で測定された蛋白質の発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００８６】
（ｉｉ）以下の工程イ）乃至ハ）を含む：
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程；
ロ）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、上記イ）に記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
ハ）上記イ）で測定された蛋白質の発現量と、上記ロ）で測定された該蛋白質の発現量の差を検出し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００８７】
（ｉｉｉ）    以下の工程イ）乃至ハ）を含む：
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質を固相化する工程；
ロ）上記固相化蛋白質における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程；
ハ）上記ロ）で検出されたＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００８８】
（ｉｖ）以下の工程イ）乃至ホ）を含む：
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質を固相化する工程；
ロ）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質を固相化する工程；
ハ）上記工程イ）に記載の固相化蛋白質におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
ニ）上記工程ロ）に記載の固相化蛋白質におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
ホ）上記工程ハ）で測定された蛋白質の発現量と、上記工程ニ）で測定された蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００８９】
▲２▼  哺乳動物個体を用いる方法
（ｉ）    以下の工程イ）及びロ）を含む：
イ）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程；
ロ）上記工程イ）で測定されたＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現量と、被験物質を投与されなかった哺乳動物個体から採取した検体における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００９０】
（ｉｉ）  以下の工程イ）乃至ハ）を含む：
イ）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
ロ）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体における、該蛋白質の発現量を測定する工程；
ハ）イ）で測定されたＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量と、ロ）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００９１】
（ｉｉｉ）以下の工程イ）乃至ハ）を含む：
イ）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相化する工程；
ロ）上記固相化蛋白質における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程；
ハ）上記ロ）で検出されたＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量と、被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体中における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療及び／または予防効果を判定する工程。
【００９２】
（ｉｖ）以下の工程イ）乃至ホ）を含む：
イ）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相化する工程；
ロ）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相化する工程；
ハ）上記工程イ）に記載の固相化蛋白質における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
ニ）上記ロ）に記載の固相化蛋白質における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
ホ）上記ハ）で検出された蛋白質の発現量と、上記ニ）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００９３】
（３）  ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの活性を阻害する物質を同定することによる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１は正常な前立腺に比べ前立腺癌で有意に発現量が増加しているので、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの活性を阻害する物質は前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質となり得る。ＴＲＰＭ４はカルシウムイオン存在下で陽イオン透過チャンネルとしての機能を有する（例えば、Ｃｅｌｌ，  ２００２，  Ｖｏｌ．１０９，  ｐ３９７−４０７及びＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ２００１，  Ｖｏｌ．９８，  ｐ１０６９２−１０６９７参照。）。ＰＬＡ１ＡはフォスフォリパーゼＡ１（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ１）メンバー蛋白質であり、フォスフォリパーゼＡ１活性を有する。フォスフォリパーゼＡ１活性とはリン脂質のグリセロールの１位（リン酸エステルが結合している部位を３位とした場合）における脂肪酸とのエステル結合を特異的に加水分解する活性である。ＢＵＣＳ１はアシル−ＣｏＡ・シンテターゼ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）の１種であり、炭素数４〜１６の脂肪酸、好適にはオクタン酸をアシル−ＣｏＡ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡ）に活性化する活性を有する酵素である。以下，ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ、ＢＵＣＳのそれぞれについて活性を阻害する物質を取得することを特徴とする、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法を示す。
【００９４】
▲１▼  ＴＲＰＭ４
ＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程イ）乃至ハ）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
イ）ＴＲＰＭ４を細胞表面に発現している細胞を供給する工程；
ロ）Ｃａ２＋の存在下においてイ）に記載の細胞と被験物質を接触する工程；
ハ）細胞内への陽イオンの取り込みが減少するかどうかを決定する工程（ここで、細胞内への陽イオンの取り込みが減少することは被験物質がＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害していることを示す。）。
【００９５】
以下、各工程を更に詳しく説明する。
イ）ＴＲＰＭ４を細胞表面に発現している細胞は、当業者に公知の方法で取得することができ、例えば、Ｃｅｌｌ，  ２００２，  Ｖｏｌ．１０９，  ｐ３９７−４０７に記載されている方法で取得することができる。すなわち、ＴＲＰＭ４のｃＤＮＡをアミノ末端にフラッグ・エピトープ・タグ（Ｆｌａｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇ）を付けたｐＣＤＮＡ４／ＴＯ  ｖｅｃｔｏｒ（インビトロジェン社製）に挿入し、そのプラスミドをあらかじめｐＣＤＮＡ６／ＴＲ（インビトロジェン社製）で形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞にエレクトロポレーションで導入し、ゼオシンを用いて細胞表面にフラッグ・タグが付いたＴＲＰＭ４が発現している細胞を選択する。
ロ）Ｃａ２＋の存在下においてイ）に記載の細胞と被験物質を接触する工程においては、フラッグ・タグが付いたＴＲＰＭ４を細胞表面に発現するＨＥＫ−２９３細胞をＣａ２＋を含む適当な培地で培養し、被験物質を添加する。なお、細胞の培養は例えば、Ｃｅｌｌ，  ２００２，  Ｖｏｌ．１０９，  ｐ３９７−４０７に記載されている方法に準じて行うことができる。また、被験物質の濃度は測定条件に応じて適当に定めることができる。
ハ）細胞内への陽イオンの取り込みが減少するかどうかを決定する工程における、細胞内の陽イオン濃度の測定は、例えば、Ｃｅｌｌ，  ２００２，  Ｖｏｌ．１０９，  ｐ３９７−４０７に記載されている方法に準じて行うことができるがこれらの方法に限られず、例えば、ＦＬＩＰＲ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  や  ＦＬＩＰＲ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）等を用いて測定することもできる。
このような方法によって測定された細胞内の陽イオン濃度の上昇が被験物質を添加しない場合に比べ減少する場合、被験物質はＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害していることを示し、そのような被験物質はＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害する物質であると同定され、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質であると決定することができる。
【００９６】
▲２▼  ＰＬＡ１Ａ
フォスフォリパーゼＡ１活性を阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程イ）及びロ）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
イ）ＰＬＡ１Ａの基質とＰＬＡ１Ａを被験物質と接触する工程；
ロ）被験物質の存在下で基質を加水分解する活性が減少するかどうかを決定する工程（ここで、基質を加水分解する活性が減少することは被験物質がフォスフォリパーゼＡ１活性を阻害することを示す。）。
【００９７】
以下、各工程を更に詳しく説明する。
【００９８】
イ）ＰＬＡ１Ａの基質とＰＬＡ１Ａを被験物質と接触する工程におけるＰＬＡ１の基質としては、ＰＬＡ１の基質になり得るグリセロリン脂質であれば特に制限はなく、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールポリリン酸、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リゾリン脂質などを挙げることができ好適には、ホスファチジルセリンを用いることができる。
ＰＬＡ１ＡはＰＬＡ１Ａの活性を測定できる限りにおいて、どの様な状態でも良く、培養上清、部分製製品、精製品を適当に選択して用いることができ、例えば、下記の「６．」の項の「（１）抗原の調製」に記載した方法によって調整することができる。
【００９９】
ロ）被験物質の存在下で基質を加水分解する活性が減少するかどうかを決定する工程における基質を加水分解する活性は、例えば、特開平１０−２０１４７９に記載の方法によって測定することができる。具体的には公知の方法（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０１，  １９８７，  ｐ５３−６１）に従って調製した１−［１４Ｃ］パルミトイル−２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォセリンを基質として、０．４ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に４．０ｍＭの基質と酵素をＰＬＡ１Ａを加え３７℃で適当な時間反応させた後、Ｄｏｌｅの溶液（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２３５，  １９６０，  ｐ．２５９５−２５９９）を加えて反応を停止、遊離された脂肪酸を抽出した後、放射能を測定する。
【０１００】
このような方法によって測定されたＰＬＡ１Ａの基質を加水分解する活性が、被験物質を添加なかった場合に比べ減少している場合、被験物質がフォスフォリパーゼＡ１活性を阻害することを示し、そのような被験物質はフォスフォリパーゼＡ１活性を阻害する物質として同定され、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質であると決定することができる。
【０１０１】
▲３▼  ＢＵＣＳ１
ＢＵＣＳ１のアシル−ＣｏＡ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡ）の合成活性を阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程イ）乃至ロ）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
イ）ＢＵＣＳ１の基質とＢＵＣＳ１を被験物質と接触する工程；
ロ）被験物質の存在下でアシル−ＣｏＡの合成量が減少するかどうかを決定する工程（ここで、アシル−ＣｏＡの合成量が減少することは被験物質がＢＵＣＳ１のアシル−ＣｏＡの合成活性を阻害することを示す。）
以下、各工程を更に詳しく説明する。
イ）ＢＵＣＳ１の基質とＢＵＣＳ１を被験物質と接触する工程における、ＢＵＣＳ１の基質としてはオクタン酸（Ｏｃｔａｎｏａｔｅ）を用いることができ、ＢＵＣＳ１はＢＵＣＳ１の活性を測定できる限りにおいて、どの様な状態でも良く、培養上清、部分製製品、精製品を適当に選択して用いることができ、例えば、下記の「６．」の項の「（１）抗原の調製」に記載した方法によって調整することができる。
【０１０２】
ロ）被験物質の存在下でアシル−ＣｏＡの合成量が減少するかどうかを決定する工程における、アシル−ＣｏＡの合成量が減少するかどうかは、ＢＵＣＳ１の活性を測定することによって決定することができる。ＢＵＣＳ１の活性測定は例えば、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７６，  ２００１，  ｐ．３５９６１−３５９６６やＪ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７６，  ２００１，  ｐ．１１４２０−１１４２６に記載の方法によってできるＢＵＣＳ１の活性を測定できる限りにおいて、これらの方法に限定されない。以下に具体例を示す。１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．０，  １０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １０ｍＭ  ＡＴＰ，  １ｍＭ  ＣｏＡ，  １０ｍＭ  ［１４Ｃｉ］オクタン酸（ｏｃｔａｎｏａｔｅ）（１０００  ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）に適当量の被験物質を添加して全量０．２ｍｌにする。オクタン酸はＴｒｉｔｏｎＸ−１００で最終濃度１％  ｗ／ｖにしたものを用いる。３７℃で１分間プレインキュベーションし、ＢＵＣＳ１の酵素溶液を添加して酵素反応を開始する。３０分間のインキュベーションの後に５０μｌの３０％のメタリン酸を添加して酵素反応を停止する。酵素反応産物である［１４Ｃ］アシル−ＣｏＡはクロマトグラフィー・メディア（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｍｅｄｉａ）（ＩＴＬＣ−ＳＧタイプ、ゲルマン・サイエンシーズ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にスポットし、水飽和エーテル／ギ酸（７：１）で洗浄し放射活性を測定し、アシル−ＣｏＡの合成量を決定する。同様の実験を被験物質を添加しない条件でも行い、アシル−ＣｏＡの合成量を決定する。このような方法によって測定されたＢＵＣＳ１の活性が被験物質を添加しなかった場合に比べ減少している場合、被験物質がＢＵＣＳ１の活性を阻害することを示し、そのような被験物質はＢＵＣＳ１の活性を阻害する物質として同定され、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質であると決定することができる。
【０１０３】
（４）  その他の方法
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰発現させた哺乳動物個体に被験物質を投与した場合と投与しなかった場合について、経時的に癌の発生率、癌の大きさ、及び／または生存率等を測定する。被験物質を投与した哺乳動物で癌の発生率が有意に低下している、癌の大きさが有意に小さい、及び／または、生存率が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは、約５０％以上上昇した場合に、被験物質は癌に対する治療及び／または予防効果を有する化合物として選択することができる。
【０１０４】
６．抗ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１抗体の製造
（１）  抗原の調製
抗ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１抗体のいずれかを作製するための抗原としては、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
【０１０５】
前記抗原ポリペプチドはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかをヒトの腫瘍組織あるいは腫瘍細胞から直接精製して使用することができ、また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの遺伝子を発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかのｃＤＮＡは例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかのｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）［Ｓａｉｋｉ，  Ｒ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，  ４８７−４９  参照］を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
【０１０６】
ポリペプチドのイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）が挙げられるが、これに限定されない。ＲＴＳを用いる場合を例に挙げると、目的の遺伝子をＴ７プロモーターにより制御される発現ベクターにクローニングし、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏの反応系に添加すると、最初に鋳型ＤＮＡよりＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡが転写され、その後大腸菌溶解液中のリボソーム等により翻訳が行われ、目的のポリペプチドが反応液中に合成される（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，  １，  ２０−２３  （２００１），  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，  ２，  ２８−２９  （２００１）。
【０１０７】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【０１０８】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、及びベクターがいずれも使用できる。
【０１０９】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０１１０】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ９５，  ８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【０１１１】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，  Ｙ．  （１９８１）  Ｃｅｌｌ  ２３，  １７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｌ．  Ａ．  （１９８０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７，  ４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【０１１２】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １，  ８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。
【０１１３】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，  Ｇ．  （１９８３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １１，  １２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，  Ｆ．  Ｌ．  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ａ．  Ｊ．  （１９７３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，  ４５６−４５７）、及び電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １，  ８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞、あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  ：  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｐ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｐ．  （１９８２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １，  ３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【０１１４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，  Ｔ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  Ｉ：  ３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，  Ｉ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｖ．Ｃ．  Ｅｍｅｒｙ  （１９９３）  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４２，  １３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ  Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ３７９，  １６７−１７４）。
【０１１５】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，  Ｊ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  Ｂ．  Ｄ．  （１９８２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７，  ３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０，  １−５）などを好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，  Ｌ．  Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２８，
１２５−１３１）。
【０１１６】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【０１１７】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大量に製造できる。
【０１１８】
（２）  抗ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１モノクローナル抗体の製造ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと特異的に結合する抗体の例として、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
【０１１９】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその認識特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
【０１２０】
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
【０１２１】
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製したＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかまたはその一部を使用することができる。また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを発現する組換え体細胞より調製した膜画分、またはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを発現する組換え体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを抗原として使用することもできる。
【０１２２】
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全または不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウスまたはラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統ＡＫＲ  、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ  、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ  、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＲ  、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ  、ＦＬ、ＨＴＨ  、ＨＴ１  、ＬＰ、ＮＺＢ  、ＮＺＷ  、ＲＦ、Ｒ  ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ  、ＷＢ、１２９  等が、またラットの場合には、たとえば、Ｌｏｗ  、Ｌｅｗｉｓ  、Ｓｐｒａｑｕｅ  、Ｄａｗｅｌｅｙ  、ＡＣＩ  、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。これらのマウス及びラットは例えば日本チャ−ルスリバー、日本ＳＬＣ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ等実験動物飼育販売業者より入手することができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスでは  ＢＡＬＢ／ｃ  系統が、ラットではｌｏｗ  系統が被免疫動物として特に好ましい。また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。なお、これらマウスまたはラットの免疫時の週齢は、好ましくは５〜１２週齢、さらに好ましくは６〜８週齢である。
【０１２３】
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかまたはこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．Ｉ．  ＩＩ．  ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．  ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ．  Ｔｈｏｍａｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  （１９６４）  等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。これらの免疫法のうち、この発明において好適な方法を具体的に示せば、たとえば以下のとおりである。すなわち、まず、抗原である膜蛋白画分、もしくは抗原を発現させた細胞を動物の皮内または腹腔内に投与する。ただし、免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、前半は皮内投与を行い、後半または最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることができる。抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数３〜６回、投与間隔２〜６週間が好ましく、投与回数３〜４回、投与間隔２〜４週間がさらに好ましい。投与回数を過度に増やすと抗原を浪費し、また投与間隔を広げすぎると動物の老化による細胞の低活性化を招くために好ましくない。また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、０．０５〜５  ｍｌ、好ましくは  ０．１〜０．５ｍｌ  程度とする。追加免疫は、以上の通りの抗原投与の１〜６週間後、好ましくは２〜４週間後、さらに好ましくは２〜３週間後に行う。この追加免疫の時期が６週間目より遅すぎたり、１週間目より早すぎると追加免疫の効果が少ない。なお、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等により異なるが、一般に、例えばマウスの場合には、０．０５〜５  ｍｌ、好ましくは  ０．１〜０．５  ｍｌ、さらに好ましくは  ０．１〜０．２  ｍｌ程度とする。不必要の大量投与は免疫効果を低下させるだけでなく、被免疫動物にとっても好ましものではない。
【０１２４】
上記追加免疫から１〜１０日後、好ましくは２〜５日後、さらに好ましくは２〜３日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ球を無菌的に取り出す。なお、その際に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。
【０１２５】
ここで用いられる抗体価の測定法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、及び操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法がより好適である。
【０１２６】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製または部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【０１２７】
これらの脾臓細胞またはリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，  ４９５，  １９７５；  Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．，  ６，５１１，  １９７７；  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２６６，  ５５０，  １９７７；  Ｗａｌｓｈ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２６６，  ４９５，  １９７７）に従って行うことができる。例えば、脾臓細胞の場合には、細胞を細切してステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
【０１２８】
（ｃ）  骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）の調製
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕｌ）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）等から入手することができる。
【０１２９】
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］  、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％  ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【０１３０】
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．Ｉ．  ＩＩ．  ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．  ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  （１９６４）  等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下のとおりである。すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量１５００〜６０００、好ましくは２０００〜４０００のポリエチレングリコール溶液中で、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１〜１０分間、好ましくは５〜８分間混合する。
【０１３１】
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法〔Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，  ４９５  （１９７５）；  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２６６，  ５５０  （１９７７）〕が用いられる。この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞およびハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノブテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
【０１３２】
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる〔例えばＢａｒｂａｒａ，  Ｂ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，  Ｍ．Ｓ．  ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照〕。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられる。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。この方法では、マイクロプレートにラット胎児由来繊維芽細胞株、あるいは正常マウス脾臓細胞、胸腺細胞、腹水細胞などのフィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）を接種しておく。一方、あらかじめハイブリドーマを０．２〜０．５個／０．２ｍｌになるように培地中で希釈し、この希釈したハイブリドーマの浮遊液を各ウェルに０．１ｍｌずつ入れ、一定期間毎（例えば３日毎）に約１／３の培地を新しいものに交換しながら２週間程度培養を続けることによってハイブリドーマのクローンを増殖させることができる。
【０１３３】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗ＴＲＰＭ４、抗ＰＬＡ１Ａ及び抗ＢＵＣＳ１のいずれかのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【０１３４】
（ｇ）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
【０１３５】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製または部分精製したＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つ、もしくはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを発現させた細胞をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗ＴＲＰＭ４抗体、抗ＰＬＡ１Ａ抗体及び抗ＢＵＣＳ１抗体の少なくともいずれか一つを結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。なお、このようなスクリーニングは、上記のようにハイブリドーマをクローニングした後で行なってもよいし、その前に行なってもよい。
【０１３６】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。
【０１３７】
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）（プリスタン）等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。たとえば，ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、Ｔ細胞を不活性化した後、２０日後に１０６  〜１０７  個のハイブリドーマ・クローン細胞を血清を含まない培地中に浮遊（０．５ｍｌ）させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水にたまったところでマウスより腹水を採取する。この方法により、培養液中に比べて約１００倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
【０１３８】
上記方法により得たモノクローナル抗体は、例えばＷｅｉｒ，  Ｄ．Ｍ．：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９７８）  に記載されている方法で精製することができる。すなわち、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等である。これらの方法のうち、硫安塩析法を３〜４回、好ましくは３〜６回繰り返すことによって、モノクローナル抗体を精製することが可能である。しかしこの方法では精製モノクローナル抗体の収率が極めて低くなる。そのため、硫安分画法を１〜２回行なった粗精製モノクローナル抗体について、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等から選ばれた少なくとも１種類、好ましくは２種類の方法を行なうことによって、高純度に精製されたモノクローナル抗体を高収率で得ることができる。硫安塩析法と他法との組合せおよび順序としては、▲１▼硫安塩析法−イオン交換クロマトグラフィー法−ゲル濾過法、▲２▼硫安塩析法−イオン交換クロマトグラフィー法−アフィニティークロマトグラフィー法、▲３▼硫安塩析法−ゲル濾過法−アフィニティークロマトグラフィー法等を例示することができるが、高純度でかつ高収率にモノクローナル抗体を得るためには、上記▲３▼の組合せが好ましい。
【０１３９】
精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ  ＧＩＩキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。
【０１４０】
かくして得られるモノクローナル抗体は、ＴＲＰＭ４を抗原として用いた場合には、ＴＲＰＭ４に対して、ＰＬＡ１Ａを抗原として用いた場合には、ＰＬＡ１Ａに対して、そしてＢＵＣＳ１を抗原として用いた場合にはＢＵＣＳ１に対して高い抗原特異性を有する。
【０１４１】
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
【０１４２】
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
【０１４３】
（３）ヒト化抗ＴＲＰＭ４抗体、ヒト化抗ＰＬＡ１Ａ抗体及びヒト化抗ＢＵＣＳ１抗体の作製
得られた抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、抗原性の問題からヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１抗体を作製することが望ましい。ヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１抗体の作製は、次に述べるような手法により得ることができる。即ち、▲１▼ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−４存在下、抗原であるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及ＢＵＣＳ１のいずれかで感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８２３）と細胞融合させることにより目的の抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングする。得られた抗体産生ハイブリドーマが生産する抗体は、ヒトＴＲＰＭ４に対してはヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、ヒトＰＬＡ１Ａに対しては抗ヒトＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１に対しては抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体である。これらの抗体の中からＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の活性を中和する抗体をそれぞれ選別する。しかしながら、このようにヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作する方法では、一般的に抗原に対して高親和性の抗体を得るのは困難である。従って、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに高親和性のモノクローナル抗体を得るには、上記のようにして得られた低親和性のヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体を高親和化する必要がある。それには、上記のようにして得られ、中和抗体であるものの低親和性であるヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体のそれぞれのＣＤＲ領域（特にＣＤＲ−３）にランダム変異を導入し、これをファージで発現させてヒトＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを固相化したプレートを用いてファージディスプレー法により、抗原であるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のそれぞれに強力に結合するファージを選択し、そのファージを大腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有するＣＤＲのアミノ酸配列を決定すればよい。このようにして得られたヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体をコードする遺伝子を一般的に使用されている哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで、発現させることによりヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体が得られる。これらの中から、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のそれぞれの生物活性を中和し、かつ高親和性である目的のヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体を選別することができる。また、▲２▼Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、本発明と同じように常法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ｐ．４９５−４９７，  １９７５）によりマウス型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体を作製し、ヒトＴＲＰＭ４、ヒトＰＬＡ１Ａ及びヒトＢＵＣＳ１のいずれかの生物活性を中和し、かつ高親和性を有するモノクローナル抗体を選択する。この高親和性マウス型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体のＣＤＲ−領域（ＣＤＲ−１、２および３）をヒトＩｇＧのＣＤＲ領域に移植するＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ（Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ：  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，  ｐ２９３−２９９，  １９９１）の手法を駆使することによりヒト型化が可能である。上記に加え、さらに▲３▼ヒト抹消血リンパ球をＳｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに移植し、この移植されたＳＣＩＤマウスはヒト型抗体を生産する（Ｍｏｓｉｅｒ  Ｄ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，  ｐ２５６−２５９，  １９８８；  Ｄｕｃｈｏｓａｌ  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５，  ｐ２５８−２６２，  １９９２）ので、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを抗原として感作し、スクリーニングすることにより、ＴＲＰＭ４、ＰＡＬ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに特異的なヒト型モノクローナル抗体を生産するリンパ球をそのマウスから採取することができる。得られたリンパ球を前述のヒト型抗体の作製法▲１▼と同様に、マウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８２３）と細胞融合させ、得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。このようにして得られたハイブリドーマを培養することにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を大量に製造でき、上述の方法と同様に精製することにより精製品を得ることができる。また、目的のヒト型モノクローナル抗体をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）をクローニングし、この遺伝子を遺伝子工学的手法により適当なベクターに組み込み、各種動物細胞、混注細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現させることにより、遺伝子組換えヒト型モノクローナル抗体を大量に製造することができる。得られた培養液から上述と同様の方法により精製することにより、精製されたヒト型モノクローナル抗体を大量に得ることができる。更に、上述の方法で得られた抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体の中から、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの生物活性を中和する抗体は、生体内でのＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの生物活性、即ち、癌細胞の増殖を阻害することから、医薬として、特に癌、好適には前立腺癌に対する治療及び／または予防剤として期待される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの生物活性の中和活性は例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを過剰発現している細胞における細胞の癌化の抑制活性で測定することができる。例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰発現しているマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３を培養し、培養系に種々の濃度で過剰発現している蛋白質に応じて、抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１抗体の少なくともいずれか一つを添加し、フォーカス形成、コロニ���形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１抗体の前立腺癌に対する治療及び／または予防効果は、例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰に発現しているトランスジェニック動物に過剰発現している蛋白質に応じて、抗ＴＲＰＭ４、抗ＰＬＡ１Ａ及び抗ＢＵＣＳ１抗体の少なくともいずれか一つを投与し、癌細胞の変化を測定することができる。
【０１４４】
６．抗ＴＲＰＭ４モノクローナル抗体、抗ＰＬＡ１Ａモノクローナル抗体及び抗ＢＵＣＳ１モノクローナル抗体を含有する医薬
上述の「５．抗ＴＲＰＭ４モノクローナル抗体、抗ＰＬＡ１Ａモノクローナル抗体及び抗ＢＵＣＳ１モノクローナル抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗ヒトモノクローナル抗体の中から、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及び抗ＢＵＣＳ１のそれぞれの生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及び抗ＢＵＣＳ１のそれぞれの生物活性を中和する抗体は、生体内でのＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及び抗ＢＵＣＳ１のそれぞれの生物活性、即ち、細胞の癌化を阻害することから、医薬として、特に癌に対する治療及び／または予防剤として期待される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗ＴＲＰＭ４抗体、抗ＰＬＡ１Ａ抗体及び抗ＢＵＣＳ１抗体のそれぞれの生物活性の中和活性は例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰発現している細胞における細胞の癌化の抑制活性で測定することができる。例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰発現しているマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３を培養し、培養系に種々の濃度で抗ＴＲＰＭ４抗体、抗ＰＬＡ１Ａ抗体及び抗ＢＵＣＳ１抗体の少なくともいずれか一つを添加し、フォーカス形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ＴＲＰＭ４抗体、抗ＰＬＡ１Ａ抗体及び抗ＢＵＣＳ１抗体のそれぞれの前立腺癌に対する治療及び／または予防効果は、例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを過剰に発現しているトランスジェニック動物に過剰に発現している蛋白質に対する抗体を投与し、癌細胞の変化を測定することができる。
【０１４５】
このようにして得られたＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択されるいずれかの生物活性を中和する抗体は、医薬として特に癌の治療及び／または予防を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。
【０１４６】
本発明の抗体はドキソルビシン、エビルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、９−カンプトテシン、シスプラチン、ＡｒａＣ、５ＦＵ、ネオカルチノシタチン、抗ＨＥＲ２抗体、ＴＲＡ８、ＴＲＡＩＬ等の抗癌活性を有する物質と併用して用いることもできる。併用する場合は、同時に投与しても良いし、別個に投与しても良い。本発明の抗体は製剤化して経口的あるいは非経口的に投与することができる。本発明の抗体を含む製剤は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物として、ヒトあるいは動物に対し安全に投与されるものである。また、製剤は、ドキソルビシン、エビルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、９−カンプトテシン、シスプラチン、ＡｒａＣ、５ＦＵ、ネオカルチノシタチン、抗ＨＥＲ２抗体、ＴＲＡ８、ＴＲＡＩＬ等の抗癌活性を有する物質も含有する製剤でも良い。医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。モノクローナル抗体は高分子蛋白質であることから、バイアル瓶などのガラス容器や注射筒などへの吸着が著しい上に不安定であり、種々の物理化学的因子、例えば、熱、ｐＨ及び湿度等により容易に失活する。従って、安定な形で製剤化するために、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤などを添加する。安定化剤としてはグリシン、アラニン等のアミノ酸類、デキストラン４０及びマンノース等の糖類、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられ、またこれらの二種以上を併用してもよい。これらの安定化剤の添加量は、抗体の重量にたいして０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。これら安定化剤を加えることにより、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の保存安定性を向上することができる。緩衝剤としては、例えばリン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。緩衝剤は、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水溶液のｐＨを調製し、抗体の安定性、溶解性に寄与する。緩衝剤の添加量としては、例えば液状製剤あるいは凍結乾燥製剤を採用解した後の水量に対し、１〜１０ｍＭとするのが好ましい。界面活性剤としては、好ましくはポリソルベート２０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレングリコール等、特に好ましくはポリソルベート８０が挙げられ、またこれらの２種以上を併用してもよい。界面活性剤の添加量としては、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水重量に対して０．００１〜１．０％添加することが好ましい。以上のような安定化剤、緩衝剤、あるいは吸着防止剤を加えて本発明抗体の製剤を調製することができるが、特に医療用または動物用注射剤として用いる場合は、浸透圧として許容される浸透圧比は１〜２が好ましい。浸透圧比は、製剤化に際して塩化ナトリウムの増減により調製することができる。製剤中の抗体含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜調整することができ、ヒトに対するヒト型抗体の投与量は、それぞれの抗体のＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１に対する親和性、即ち、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のそれぞれに対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができる。ヒト型抗ＴＲＰＭ４抗体、ヒト型抗ＰＬＡ１Ａ抗体及びヒト型抗ＢＵＣＳ１抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜３０日間に１回投与すればよい。
【０１４７】
７．直接相互作用する物質の探索
本発明の他の一つの態様としては、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの活動を抑制するような物質を得ることを目的とした、該蛋白質の立体構造をベースとしたドラッグデザインの手法を含む。このような手法は、ラショナルドラッグデザイン法として知られており、酵素活性などの機能や、リガンド、コファクター、またはＤＮＡへの結合などを効率よく阻害もしくは活性化させるような化合物の探索に利用されている。この例として、すでに上市されている抗ＨＩＶ剤であるプロテアーゼの阻害剤がよく知られている。ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の三次元構造解析においても、Ｘ線結晶解析や核磁気共鳴法といった一般的によく知られている手法が利用できると考えられる。さらに、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の機能を抑制する物質の探索には、コンピュータードラッグデザイン（ＣＡＤＤ）を活用した設計も可能である。この例としては、慢性関節リウマチ治療の新たなゲノム新薬として期待されているＡＰ−１の働きを阻害する低分子化合物（国際特許出願公開ＷＯ９９／５８５１５号）などが知られている。このような方法により、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つに直接結合したり、あるいはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つと他の因子との相互作用を阻害することにより、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の機能を抑制するような物質を得ることができる。
【０１４８】
さらに、他の一つの態様は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかが会合するポリペプチド、すなわち、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかのパートナー蛋白質に関する。すなわち、本発明は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の活性を調節するパートナー蛋白質のスクリーニング方法に関する。
【０１４９】
このスクリーニング方法の一つの態様は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに被験蛋白質試料を接触させ、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに結合する蛋白質を選択する工程を含む。このような方法としては、例えば、精製したＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを用いて、これに結合する蛋白質のアフィニティー精製を行う方法が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１にヒスチジン６個よりなる配列をアフィニティータグとして融合したものを作製して、これを細胞の抽出液（予めニッケル−アガロースカラムにチャージして、このカラムを素通りした画分）と４℃で１２時間インキュベートし、次いで、この混合物に別途ニッケル−アガロース担体を加えて４℃で１時間インキュベートする。ニッケル−アガロース担体を洗浄バッファーで十分洗浄した後、１００ｍＭイミダゾールを加えることにより、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと特異的に結合する細胞抽出液中の蛋白質を溶出させて精製し、この構造を決定する。このようにして、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと直接結合する蛋白質、及びＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかとの結合活性は持たないが、サブユニットとしてＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに直接結合する蛋白質と複合体を形成することにより間接的にＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに結合する蛋白質が精製できる［実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ５「転写因子研究法」ｐｐ２１５−２１９（羊土社刊）］。
【０１５０】
別の方法としては、ファーウエスタンブロット法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ７６−８１（羊土社刊）］や、酵母や哺乳類動物細胞を用いたツーハイブリッドシステム法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ６６−７５（羊土社刊）、「チェックメイト・マンマリアン・ツーハイブリッドシステム」（プロメガ社製）］によるクローニングも可能であるが、これらの方法に限定されない。
【０１５１】
このようにして、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと直接もしくは間接的に相互作用するパートナー蛋白質のｃＤＮＡが得られれば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと該パートナー蛋白質との相互作用を阻害する物質の機能的スクリーニングに利用することができる。具体的には、例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質を調製して、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビオチン化した該パートナー蛋白質をこの融合蛋白質と接触させ、該融合蛋白質との結合をストレプトアビジン化アルカリフォスファターゼで検出する。ビオチン化した該パートナー蛋白質添加の際、被験物質も添加し、融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合を促進あるいは阻害する物質を選択する。この方法では、融合蛋白質に直接作用する物質または該パートナー蛋白質に直接作用する物質が得られる。
【０１５２】
融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合が間接的であり、何らかの別の因子を介しているような場合には、例えば該因子を含むような細胞抽出液存在下で、同様に上記アッセイを行う。この場合には、該因子に対して作用するような物質も選択される可能性がある。
【０１５３】
また、得られたパートナー蛋白質が、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの機能を抑制する活性を有している場合には、既に記載したＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの遺伝子の発現ベクターを応用した試験方法に従って、抗癌剤、例えば、前立腺癌の治療または予防剤として有用な候補物質のスクリーニングを行うことができる。また、得られたパートナー蛋白質が、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの機能を抑制する活性を有している場合には、このような抑制因子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、前立腺癌の遺伝子治療に用いることができる。
【０１５４】
そのようなポリヌクレオチドは、例えば同定された阻害因子のアミノ酸配列を解析し、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを合成してｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより取得できる。また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの機能の阻害活性を有するぺプチドが、ランダムに合成された人工ペプチドライブラリー由来である場合は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを化学合成する。
【０１５５】
遺伝子治療においては、そのようにして得られた阻害因子をコードする遺伝子を、例えばウイルスベクターに組み込んで、該組換えウイルスベクターを有するウイルス（無毒化されたもの）を患者に感染させる。患者体内では抗癌因子が産生され、癌細胞の増殖抑制機能を有するので、前立腺癌の治療が可能となる。
【０１５６】
遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４）、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」，羊土社（１９９６））のいずれの方法も適用することができる。
【０１５７】
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ＴＲ４あるいは変異ＴＲ４をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【０１５８】
また遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）法及びヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，  １２  （１５）（１９９４））。
【０１５９】
例えば、該遺伝子治療剤がインビボ法により投与される場合は、疾患、症状等に応じ、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等、適当な投与経路により投与される。またインビボ法により投与する場合は、該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【０１６０】
配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１、３、５、７及び９から選択される少なくとも一つに示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列または該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列は、いわゆるアンチセンス治療に用いることができる。アンチセンス分子は、配列表の配列番号１、３、５、７及び９からなる群から選択される少なくとも一つに示されるヌクレオチド配列の一部に相補的な、通常１５乃至３０ｍｅｒからなるＤＮＡ、もしくはそのホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはモルフォリノ誘導体などの安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体として用いられ得る。そのようなアンチセンス分子を、微量注入、リポソームカプセル化により、あるいはアンチセンス配列を有するベクターを利用して発現させるなど、本発明の技術分野において周知の方法で、細胞に導入することができる。このようなアンチセンス療法は、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列がコードする蛋白質の活性が増加しすぎることによって引き起こされる病気の治療または予防に有用である。
【０１６１】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造され得る。このような担体と製造方法の例は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．）に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤は、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、または、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げ��ことができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【０１６２】
本発明の化合物を患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織または細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織または細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；Ｂｌｕｍｅ  ａｎｄ  Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，１９９４，２３，１１９；Ｃｈｏｎｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８  ）。
【０１６３】
０．２−０．４  μｍのサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，７７  ）。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種またはそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８の炭素原子、特に１６−１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４−１８の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【０１６４】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的または能動的のいずれかであってもよい。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスの蛋白質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，８４７４  ）、モノクローナル抗体（またはその適切な結合部分）、糖、糖脂質または蛋白質（またはその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、または天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げる事ができる。標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子またはその適切なオリゴペプチドフラグメント、または（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ  ；Ｆ  （ａｂ’）２  ）、であり得る。２  種またはそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。内容物の細胞内安定性及び／または標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【０１６５】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、注射の場合には、１回当り下限０．１ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限１０００ｍｇ（好適には、５００ｍｇ）を皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
【０１６６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【０１６７】
実施例１  ヒトＴＲＰＭ４の発現プロファイル解析
配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列と部分的に重複するヌクレオチド配列を有するＥＳＴプローブ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＨＧ−Ｕ１３３  ｐｒｏｂｅ  ２１９３６０＿ｓ＿ａｔ：アフィメトリックス社製）について、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社製のデータベース（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １．４．２）を用いて発現プロファイル解析を行なった。
【０１６８】
まず、前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺由来・腫瘍サンプル８７例について遺伝子発現量を比較したところ、前立腺由来・腫瘍サンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＜０．０００１：図１）。
【０１６９】
次に、該データベースにおける前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺以外の正常組織サンプル群（脂肪組織サンプル３７例、骨サンプル８例、乳房サンプル７４例、心臓サンプル５２２例、腎臓サンプル９９例、肝臓サンプル６１例、肺サンプル１２２例、リンパ節サンプル１３例、筋肉サンプル４２例、卵巣サンプル９６例、膵臓サンプル４６例、胎盤サンプル８例、皮膚サンプル６６例、脾臓サンプル４１例、胸腺サンプル７０例、甲状腺サンプル２７例、子宮サンプル５９例）についてＴＲＰＭ４の遺伝子発現量を比較したところ、前立腺以外の正常組織サンプル群において有意に低く抑えられていた（乳房サンプルでのＰ値＝０．０００２、胎盤サンプルでのＰ値＝０．００３５、それ以外の臓器サンプルでのＰ値＜０．０００１：図２）。
【０１７０】
実施例２  ヒトＰＬＡ１Ａの発現プロファイル解析
配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列と部分的に重複するヌクレオチド配列を有するＥＳＴプローブ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＨＧ−Ｕ１３３  ｐｒｏｂｅ  ２１９５８４＿ａｔ：アフィメトリックス社製）について、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社製のデータベース（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １．４．２）を用いて発現プロファイル解析を行なった。
【０１７１】
まず、前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺由来・腫瘍サンプル８７例について遺伝子発現量を比較したところ、前立腺由来・腫瘍サンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＜０．０００１：図３）。
【０１７２】
次に、該データベースにおける前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺以外の正常組織サンプル群（脂肪組織サンプル３７例、乳房サンプル７４例、大腸サンプル２２１例、十二指腸サンプル８２例、胆のうサンプル８例、心臓サンプル５２２例、卵巣サンプル９６例、直腸サンプル４９例、皮膚サンプル６６例、小腸サンプル９５例、脾臓サンプル４１例、胸腺サンプル７０例、甲状腺サンプル２７例）についてＰＬＡ１Ａの遺伝子発現量を比較したところ、前立腺以外の正常組織サンプル群において有意に低く抑えられていた（脂肪組織サンプルでのＰ値＝０．０００３、胆のうサンプルでのＰ値＝０．００４１、甲状腺サンプルでのＰ値＝０．０１２７、それ以外の臓器サンプルでのＰ値＜０．０００１：図４）。
【０１７３】
実施例３  ヒトＢＵＣＳ１の発現プロファイル解析
配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列と部分的に重複するヌクレオチド配列を有するＥＳＴプローブ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＨＧ−Ｕ１３３  ｐｒｏｂｅ  ２１５４３２＿ａｔ：アフィメトリックス社製）について、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社製のデータベース（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １．４．２）を用いて発現プロファイル解析を行なった。
【０１７４】
まず、前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺由来・腫瘍サンプル８７例について転写量を比較したところ、前立腺由来・腫瘍サンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＜０．０００１：図５）。
【０１７５】
次に、該データベースにおける前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺以外の正常組織サンプル群（脂肪組織サンプル３７例、大腸サンプル２２１例、十二指腸サンプル８２例、腎臓サンプル９９例、肺サンプル１２２例、直腸サンプル４９例、小腸サンプル９５例、胸腺サンプル７０例、甲状腺サンプル２７例）についてＢＵＣＳ１の遺伝子発現量を比較したところ、前立腺以外の正常組織サンプル群において有意に低く抑えられていた（Ｐ値は順に、０．０２７、０．００９１、０．００５３、０．０２８８、０．０００６、０．００２２、０．００５６、０．０００９、０．０４４１：図６）。
【０１７６】
実施例４  ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３のｓｉＲＮＡによる増殖抑制
（１）細胞株とその継代培養
ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１７４０）あるいはヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１４３５）を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ：Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（旭テクノグラス社製）を用いて、７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（住友ベークライト社製：ＭＳ−２３２５０）中でコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）にならないよう注意しつつ５％ＣＯ２，３７℃条件下で培養し、対数増殖期のうちにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）を用いて新しい組織培養フラスコに移して継代培養した。
【０１７７】
（２）ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３のｓｉＲＮＡによる増殖抑制試験および遺伝子発現抑制試験
ポリＤ−リジンコートされた組織培養２４穴シャーレ（Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ  ２４−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ：ベクトンディッキンソン社製）にヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰあるいはＰＣ−３を４ｘ１０４個ずつまき、０．４ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で一晩培養した。培養上清を０．４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に交換した後、さらにいずれかの遺伝子に相同なｓｉＲＮＡ、２００ｎＭおよび１．２％ＤＭＲＩＥ−Ｃ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を含む０．２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に交換し４時間培養することでｓｉＲＮＡを細胞に導入した。
ここで、ＴＲＰＭ４用のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は配列表の配列番号１のヌクレオチド番号３３０乃至３４８に相同であり、配列表の以下の配列：
５’−ＧＣＡＣＡＧＣＡＡＵＵＵＣＣＵＣＣＧＧＡＴＴ−３’（配列表の配列番号１１）及び、
５’−ＵＣＣＧＧＡＧＧＡＡＡＵＵＧＣＵＧＵＧＣＴＴ−３’（配列表の配列番号１２）の組み合わせからなり、
ＰＬＡ１Ａ用のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１３２乃至１５０に相同であり、以下の配列：
５’−ＡＧＵＧＣＧＣＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列表の配列番号１３）
５’−ＣＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＡＧＣＧＣＡＣＵＴＴ−３’（配列表の配列番号１４）の組み合わせからなり、ＢＵＣＳ１用のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は配列表の配列番号９のヌクレオチド番号６２３乃至６４１に相同であり、以下の配列：
５’−ＧＣＵＣＣＵＧＧＵＧＵＣＵＧＡＵＣＡＣＴＴ−３’（配列表の配列番号１５）
５’−ＧＵＧＡＵＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴ−３’（配列表の配列番号１６）の組み合わせからなる。
【０１７８】
培養液を新鮮な０．４ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、一晩培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）を用いて細胞を回収し、２ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、９６ウェルプレート（コーニングコースター社製カタログ番号３５９８あるいは３９１７）に０．１ｍｌずつ分注し５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した。ｓｉＲＮＡを細胞に導入２４時間後及び６日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（プロメガ株式会社製）を添付のプロトコールに従い用いて細胞内ＡＴＰを測定した。ネガティブコントロールとしてヒトには存在しないルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ポジティブコントロールとしてヒトの必須遺伝子であるＥｇ５遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた。
【０１７９】
ルシフェラーゼ用のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は以下の配列：
５’−ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡＴＴ−３’（配列表の配列番号１７）、
５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＵＵＣＣＧＣＧＵＡＣＧＴＴ−３’（配列表の配列番号１８）の組み合わせからなる。
また、ヒトＥｇ５に対するｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は以下の配列：
５’−ＣＵＧＧＡＵＣＧＵＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＴＴ−３’（配列表の配列番号１９）、
５’−ＣＵＧＣＣＵＵＣＵＵＡＣＧＡＵＣＣＡＧＴＴ−３’（配列表の配列番号２０）の組み合わせからなる。
【０１８０】
ｓｉＲＮＡを細胞に導入した２日後にＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｋｉｔ（４）（キアゲン社製）を添付のプロトコールに従い用いて細胞内全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡをＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（５０）（キアゲン社製）を添付のプロトコールに従い用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ−ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ（キアゲン社製）を添付のプロトコールに従い用いて対象遺伝子の発現量を測定した。この発現量の測定には対象遺伝子内部配列を特異的に増幅することができるオリゴヌクレオチドＤＮＡを用いた。
ＴＲＰＭ４増幅用のＲＴ−ＰＣＲプライマーは、以下の配列：
５’−ＴＴＣＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣＴＣ−３’（プライマー１：配列表の配列番号２１）、
５’−ＡＣＡＣＴＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＣ−３’（プライマー２：配列表の配列番号２２）からなり、
ＰＬＡ１Ａ増幅用のＲＴ−ＰＣＲプライマーは、以下の配列：
５’−ＡＣＣＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＧＡＴＡＡＡＣＣＡＡＧ−３’（プライマー３：配列表の配列番号２３）、
５’−ＴＴＣＡＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣ−３’（プライマー４：配列表の配列番号２４）からなり、
ＢＵＣＳ１増幅用のＲＴ−ＰＣＲプライマーは、以下の配列：
５’−ＡＣＡＡＡＴＣＣＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＣ−３’（プライマー５：配列表の配列番号２５）、
５’−ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＧＣ−３”（プライマー６：配列表の配列番号２６）からなる。
【０１８１】
また、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰについての結果を表１にまとめた。
【０１８２】
【表１】
2004267118.tif 000002
【０１８３】
ルシフェラーゼ遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡをヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰに導入後１〜６日目までの５日間での細胞増殖率を１００％とした場合、ポジティブコントロールとしてヒトの必須遺伝子であるＥｇ５遺伝子配列に対するｓｉＲＮＡ、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡを用いるとそれぞれ３０％±１０％、７２％±１０％、５２％±７％、７２％±１３％（平均±標準偏差（ＳＤ））に細胞増殖率が低下した。ｓｉＲＮＡ導入２日後に実施した遺伝子発現量の測定では、ルシフェラーゼ遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡを導入した場合の遺伝子発現量を１００％とした場合、対象遺伝子ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１の発現量は、それぞれ２５％、３６％、０％に抑制されていることが示された。対象遺伝子ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１の発現を抑制することでヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰの増殖が抑制されることが示唆された。
【０１８４】
ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３についての結果を表２にまとめた。
【０１８５】
【表２】
2004267118.tif 000003
【０１８６】
ルシフェラーゼ遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡをヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３に導入後の１〜６日目の５日間での細胞増殖率を１００％とした場合、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡを用いるとそれぞれ７１％±１０％，  ７４％±８％，  ８５％±１０％に細胞増殖率が低下した。ｓｉＲＮＡ導入２日後に実施した遺伝子発現量の測定では、ルシフェラーゼ遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡ、ＬＵＣを導入した場合の遺伝子発現量を１００％とした場合、対象遺伝子ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１の発現量は、それぞれ６７％，  ５１％，  ０％に抑制されていることが示された。対象遺伝子ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１の発現を抑制することでヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３の増殖が抑制されることが示唆された。
【０１８７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１１：ＴＲＰＭ４に対するｓｉＲＮＡセンスストランド；
配列番号１２：ＴＲＰＭ４に対するｓｉＲＮＡアンチセンスストランド；
配列番号１３：ＰＬＡ１Ａに対するｓｉＲＮＡセンスストランド；
配列番号１４：ＰＬＡ１Ａに対するｓｉＲＮＡアンチセンスストランド；
配列番号１５：ＢＵＣＳ１に対するｓｉＲＮＡセンスストランド；
配列番号１６：ＢＵＣＳ１に対するｓｉＲＮＡアンチセンスストランド；
配列番号１７：ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡセンスストランド；
配列番号１８：ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡアンチセンスストランド；
配列番号１９：Ｅｇ５に対するｓｉＲＮＡセンスストランド；
配列番号２０：Ｅｇ５に対するｓｉＲＮＡアンチセンスストランド；
配列番号２１：ＴＲＰＭ４に対するＲＴ−ＰＣＲ用センスプライマー；
配列番号２２：ＴＲＰＭ４に対するＲＴ−ＰＣＲ用アンチセンスプライマー；
配列番号２３：ＰＬＡ１Ａに対するＲＴ−ＰＣＲ用センスプライマー；
配列番号２４：ＰＬＡ１Ａに対するＲＴ−ＰＣＲ用アンチセンスプライマー；
配列番号２５：ＢＵＣＳ１に対するＲＴ−ＰＣＲ用センスプライマー；
配列番号２６：ＢＵＣＳ１に対するＲＴ−ＰＣＲ用アンチセンスプライマー。
【０１８８】
【配列表】
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【０１８９】
【発明の効果】
本発明により、前立腺癌で特異的に発現している、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を見出し、該遺伝子が癌細胞の発生及び／または増殖に関連する遺伝子であることを見出し、該癌遺伝子を用いた前立腺癌の検出方法、前立腺癌治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法、及び癌治療及び／または予防用医薬組成物を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＲＰＭ４の前立腺正常組織と腫瘍組織における発現量を示す図。
【図２】ＴＲＰＭ４の各臓器（正常組織）ごとの発現量を示す図。
【図３】ＰＬＡ１Ａの前立腺正常組織と腫瘍組織における発現量を示す図。
【図４】ＰＬＡ１Ａの各臓器（正常組織）ごとの発現量を示す図。
【図５】ＢＵＣＳ１の前立腺正常組織と腫瘍組織における発現量を示す図。
【図６】ＢＵＣＳ１の各臓器（正常組織）ごとの発現量を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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