(57)【要約】【課題】新規細菌Ｄ１株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｄ１）（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４８１）を利用したカロテノイド類の新規合成法及びその合成法によるカロテノイドの提供を目的とする。【解決手段】新規細菌Ｄ１株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｄ１）を培養して得られた菌体からルテイン、アスタキサンチン等のカロテノイド類を溶媒抽出した。【選択図】　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規細菌Ｄ１株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｄ１）（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４８１）を培養して得られた菌体から抽出して得られることを特徴とするカロテノイド類の新規合成法。
【請求項２】
請求項１記載の方法にて得られるカロテノイド類。
【請求項３】
カロテノイド類が、ルテインあるいは、アスタキサンチンである請求項１記載の方法にて得られるカロテノイド類。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌を利用したカロテノイド類（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ）の新規合成法及びそのようにして得られるカロテノイド類に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カロテノイド類は、黄色、オレンジ色、赤色の色素として自然界に広く存在していることが知られている（Ｇｏｏｄｗｉｎ　ａｎｄ　Ｂｒｉｔｔｏｎ，１９８８）。
β−カロテン（β−Ｃａｒｏｔｅｎｅ）のようなカロテノイド色素は、工業的に栄養補助食品として使用されている。
近年、カロテノイド類は、人の健康に関して有用な多くの働きを示すことから、以前にも増して注目を集めている。
【０００３】
例えば、ルテイン（Ｌｕｔｅｉｎ）、リコピン（Ｌｙｃｏｐｅｎｅ）、アスタキサンチン（Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）は、非常に強力な活性酸素消去能を有していて、ガンの予防や免疫能活性化に関与していることが報告されている（Ｊｙｏｃｏｕｃｈｉ等１９９１）。
ルテインは、ビタミンＡの前駆体ではないキサントフィルであり、果物や野菜に最も広く分布しているカロテノイド類の１つである。
ルテインやゼアキサンチン（Ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ）の摂取は白内障、黄斑変成の予防効果があることも知られている（Ｂｕｎｃｅ，１９９４：Ｓｎｏｄｄｅｒｌｙ　１９９５）。
従来、このようなカロテノイド類は植物等から抽出されているが、分布する濃度等が薄いこともあって、抽出方法が大変であり、高価なものになっていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規細菌Ｄ１株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｄ１）（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４８１）を利用したカロテノイド類の新規合成法及びその合成法によるカロテノイドの提供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願出願人等は、動物の羽根や毛の含んだ土壌からの集積培養を試みることにより、寒天培地上に複数のコロニーを得て、そのスクリーニングにより、ケラチン分解活性の高い新規細菌株を得ることができ、先に特許出願した（特願２００１−２６５１８１号）。
このケラチン分解活性を有する新規細菌Ｄ１株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｄ１）は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４８１として寄託されている。
本願出願人等は、その後さらに、このＢａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｄ１株を培養し、詳細に研究調査を重ねた結果、菌体内にルテイン（Ｌｕｔｅｉｎ）、アスタキサンチン（Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）等の多種類のカロテノイド類（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ）が産生、蓄積していることが明らかになった。
【０００６】
例えば、図１に示す培地組成の液体培地にて、Ｄ１株を約２０℃で１０〜１５日間培養したものを遠心分離機等にて菌体と培養液を分離する。
この菌体を蒸留水等にて所定の洗浄処理をした後に、例えば、アセトンとヘキサンの混合液等の抽出液に所定時間浸漬する。
上記溶媒抽出液を窒素置換しながら徐々に濃縮することにより、多くの種類のカロテノイド類が得られる。
【０００７】
上記の方法にて濃縮された残留物をメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析、ＦＴ−ＩＣＲ　ＭＳ（Ｆｏｕｒｉｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　Ｉｏｎ　Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＭＡＬＤＩ　ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で測定解析した結果、ルテイン、アスタキサンチンが同定された。
なお、その他に多くのカロテノイドと推定されるピークが認められた。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係るカロテノイド類の抽出例及び、カロテノイドの同定結果について詳述する。
図１に示すような培地組成を用いて約２０℃にてＤ１株を振とう培養した。
このときの培養方法としては、暗室培養、グルコース添加暗室培養、室内光培養の３種類とした。
２日ごとに供試体とし、１６日間培養した。
供試体は、回転速度１００００ｒｐｍ、２０分間遠心分離機にかけ、菌体として分離した。
この菌体を蒸留水にて３回洗浄し、カロテノイド類の抽出に用いた。
【０００９】
上記のように分離した菌体２〜３ｇに、アセトン：ヘキサン（１：１）混合液２０ｍｌを加え、約２時間ゆっくり撹拌しながら抽出し、遠心分離機を用いて抽出液を分離した。
なお、光酸化を防ぐために、抽出容器を室内光から遮蔽した。
抽出液は橙赤色を呈していた。
ａ：ルテイン標準溶液、ｂ：暗室培養、ｃ：グルコース添加暗室培養、ｄ：室内光培養した場合のそれぞれ抽出液の吸光度曲線を図２のグラフに示す。
その結果、ｄの室内光培養したものからの抽出液がａのルテイン標準溶液に近く、最も多量にルテインが合成されていることが判明した。
【００１０】
図３に薄層クロマトグラフの分析結果を示し、
１：ルテイン標準液、２：Ｄ１株からの抽出液（暗室培養）、
３：Ｄ１株からの抽出液（室内光培養）
４：抽出液にルテイン添加、５：ルテイン標準液の展開結果をそれぞれ示す。なお、展開溶媒は、石油エーテル：アセトン：ジエチルアミン＝（１０：４：１）の組成液を用いた。
この結果から、抽出液にルテインが存在することが確認できた。
【００１１】
上記のようにして、２日ごとの供試体の増殖（菌体濃度）を示す６００ｎｍの吸光度変化を図４に示し、菌体重量変化を図５に示し、ルテイン濃度変化を図６にそれぞれ示す。
図４の菌体濃度の変化及び図５の菌体重量変化よりＤ１株そのものは、４日頃にピークを示し、その後に減少に転じている。
また、グルコース添加暗室培養のものの菌体重量変化が大きいことも明らかになった。
図６に示すルテインの変化グラフが８日頃にピークを示し、菌体の重量の変化に対して約４日遅いピークとなっている。
また、図５と比較するとグルコース添加により菌体重量が増加してもルテインの生成が比例して増えることはなく、むしろ単位重量当たりでは減少していた。
従って、グルコースはルテイン生成を促進しないことが明らかとなった。
【００１２】
上記抽出操作を２回繰り返し得られた抽出液を合わせて窒素置換しながら徐々に溶媒を蒸発させて抽出物を濃縮した。
この濃縮されて得られた色素をＨＰＬＣ用のメタノールに溶解し、１００％メタノールを移動相とし、Ｃ１８カラム（２５ｃｍ×４．５ｍｍＩＤ、孔径５μｍ）に流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍ法）にてＨＰＬＣ分析した。
なお、検出はＵＶ−Ｖｉｓ検出装置を用いて波長４５０ｎｍで検出した。
【００１３】
その検出結果を図７及び図８に検出チャートとして示す。
図９に示すチャートのピーク１Ｓが、ルテイン標準サンプルの示すピークであり、図１０に示すチャートのピーク２Ｓがアスタキサンチンの標準サンプルの示すピークである。
これに対して、図７が１１日間室内光培養のもの、図８が１６日間室内光培養のものであり、標準サンプルと比較してピーク１がルテインでピーク２がアスタキサンチンであることが同定できた。
なお、ルテイン及びアスタキサンチンのピークをスパイキング方法にても確認できた。
【００１４】
ルテインに相当するピーク部分をＨＰＬＣの溶離液から分取し、ＦＴ−ＩＣＲ　ＭＳ及び、ＭＡＬＤＩ　ＭＳで測定した結果、分子量５６８．９を示し、ルテイン（Ｃ４０Ｈ５６Ｏ２）の分子量５６８．９に一致した。
【００１５】
【発明の効果】
本発明においては、新規細菌Ｄ１株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｄ１）が、その細胞内にルテイン、アスタキサンチンを始めとして多くのカロテノイド類を蓄積することが明らかになり、微生物を利用した新規合成方法が得られ、簡単に抽出できることから人の健康に有用なカロテノイド類の安価な入手方法として期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】細菌Ｄ１株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｄ１）の培養に用いた培地組成の例を示す。
【図２】細菌Ｄ１株からの抽出液の吸光度曲線をルテイン標準サンプルと比較したグラフを示す。
【図３】薄層クロマトグラフの分析結果を示す。
【図４】培養液の吸光度変化を示す。
【図５】菌体の重量変化を示す。
【図６】ルテインの濃度変化を示す。
【図７】室内光培養した細菌Ｄ１株からの抽出液を濃縮した残留物のＨＰＬＣ分析チャートを示す。
【図８】室内光の下での培養期間を長くしたものの抽出液を濃縮した残留物のＨＰＬＣ分析チャートを示す。
【図９】比較としてルテイン標準サンプルのＨＰＬＣ分析チャートを示す。
【図１０】アスタキサンチン標準サンプルのピークを示すＨＰＬＣ分析チャートを示す。
【符号の説明】
１Ｓ　　ルテイン標準サンプルのピーク
２Ｓ　　アスタキサンチン標準サンプルのピーク
１　　　ルテインに対応するピーク
２　　　アスタキサンチンに対応するピーク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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