(57)【要約】【課題】生体外において、褥瘡の予防又は治療薬のスクリーニングが可能な新たな評価系を確立し、提供することを目的とする。【解決手段】実験用哺乳動物の皮膚に対して褥瘡様皮膚壊死を発症させ得る加重負荷処置を施し、当該処置解除直後に処置部の皮膚組織を採取して、被験化合物の存在下に培養し、培養後０〜３日目までの皮膚組織の呼吸活性の変化を測定することを特徴とする褥瘡の予防又は治療薬のスクリーニング方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実験用哺乳動物の皮膚に対して褥瘡様皮膚壊死を発症させ得る加重負荷処置を施し、当該処置解除直後に処置部の皮膚組織を採取して、被験化合物の存在下に培養し、培養後０〜３日目までの皮膚組織の呼吸活性の変化を測定することを特徴とする褥瘡の予防又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
加重負荷処置が、加重圧力０．０１５〜１５ＭＰａにて３〜２４時間皮膚を押圧するものである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
実験用哺乳動物の皮膚を摘み上げて２枚の硬質平板の間に挟み、その両側をクリップで固定して押圧するものである請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、褥瘡の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
褥瘡、いわゆる「床ずれ」は、長時間軟部組織に圧迫が加わり、その結果局所に循環障害が起こり壊死や潰瘍をきたした状態をいい、寝たきり患者の仙骨部や坐骨部、大転子部、あるいは踵、踝に好発する難治性の皮膚障害である。そして、褥瘡患者数は、高齢化社会の到来に伴い、益々増加の一途をたどるものと考えられ、社会問題としても捉えられてきている。
【０００３】
このような褥瘡に対する医療側の取り組みは、褥瘡の予防ケアと治療の両面にわたり、褥瘡治療においては、デブリドマン、ドレッシング、洗浄・殺菌とともに皮膚移植も含めて、治療方法が詳細に確立されている。また、創傷治癒における分子レベルの研究成果は、できてしまった褥瘡の治癒にも適用され、有効薬剤や治療手法へと応用されている。
【０００４】
しかし、一方で、褥瘡を未然に防ぐ予防の観点からは、体位変換、寝具の工夫による除圧、栄養管理といった対処がなされているのみであり、２時間に一度必要であるとされている体位変換や医療器具購入など介護側への負担は非常に高いと推察される。また、褥瘡発症に至るまでの要因を生化学的・分子レベルで究明されている成果はほとんどない。
【０００５】
褥瘡発症要因の究明や治癒過程の評価、更には発症を抑制するために有効な薬剤や技術を得るためには、動物を用いた褥瘡発症モデルの作成が不可欠であると考えられ、これまでに、いくつかの動物モデルが提唱されている（例えば非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。
【０００６】
しかし、このようなモデル動物を薬剤のスクリーニングに用いることは、多くの個体が必要となり、また動物へのストレスも大きいことから、好ましくない。
【０００７】
本発明は、生体外において、褥瘡の予防又は治療薬のスクリーニングが可能な新たな評価系を確立し、提供することを目的とする。
【０００８】
【非特許文献１】
上滝博夫ら、臨床医薬（１９９０）６，３，６２７−６３８
【非特許文献２】
府川和永ら、応用薬理（ｌ９８２）２３，６，９９９−ｌ０１１
【非特許文献３】
Ｒ  Ｓａｌｃｉｄｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ（１９９５）３２，２，１４９−１６１
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、褥瘡の予防又は治療薬の評価系について種々検討したところ、動物の皮膚に対して褥瘡様皮膚壊死を発症させ得る加重負荷処置を施した後、当該皮膚組織を採取して培養すると、皮膚組織の呼吸活性が培養１日目に急激に減少し、３日目までにはほぼ消失することが認められ、採取皮膚培養後０〜３日目までの皮膚組織の呼吸活性を測定することにより褥瘡様皮膚壊死の発症を早期に且つ定量的に把握できることを見出した。そして、被験化合物の存在下に当該皮膚組織を培養してその呼吸活性の変化を測定することにより褥瘡の予防又は治療薬の定量的な評価が可能であることを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、実験用哺乳動物の皮膚に対して褥瘡様皮膚壊死を発症させ得る加重負荷処置を施し、当該処置解除直後に処置部の皮膚組織を採取して、被験化合物の存在下に培養し、培養後０〜３日目までの皮膚組織の呼吸活性の変化を測定することを特徴とする褥瘡の予防又は治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の褥瘡の予防又は治療薬のスクリーニング方法は、実験用哺乳動物の皮膚に対して褥瘡様皮膚壊死を発症させ得る加重負荷処置を施し、該処置解除直後に皮膚組織を採取して、被験化合物の存在下に培養し、培養後０〜３日目までの皮膚組織の呼吸活性の変化を測定するものである。
【００１２】
本発明に用いる実験用哺乳動物としては、皮膚に加重負荷処置を施した場合に褥瘡様皮膚壊死を発症し得る動物であれば使用可能であり、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられるが、好ましくは、マウス（ヘアレスマウス）、モルモット、ラット（ヘアレスラット）であり、特にヘアレスマウスが好ましい。
【００１３】
また、動物の週齢も、褥瘡様皮膚壊死を発症し得るものであれば、老若を問わず使用可能であり、例えばマウスの場合、１０週齢〜１１週齢の若齢マウスでも、１１ヶ月齢〜１５ヶ月齢またはそれ以上の老齢マウスでもよい。
【００１４】
動物の皮膚に対して褥瘡様皮膚壊死を発症させ得る加重負荷処置としては、皮膚を一定の加重圧力にて一定時間押圧し、押圧処置解除後数日で褥瘡様の皮膚壊死を発症させ得る処置が挙げられ、具体的には以下に示すクリップ押圧法を用いるのが好ましい。
【００１５】
クリップ押圧法は、実験用哺乳動物の皮膚を摘み上げて２枚の硬質平板の間に挟み、その両側をクリップで固定し、加重圧力０．０１５〜１５ＭＰａにて３〜２４時間押圧処置する方法である。これによれば、押圧処置した動物は、押圧処置解除後、１〜７日で、皮膚壊死及び痂皮化を発症する（図２〜４）。そして、当該組織には炎症初期に見られる多形核白血球を大部分とする細胞浸潤が観察されることから（図７）、外観上及び内部組織上ヒト褥瘡の黒色期に酷似したものと判断でき、褥瘡モデル動物として使用できる。
【００１６】
当該押圧処置は、例えば動物の背部を正中線が対称軸となるように左右から摘み上げ、硬質平板２枚で挟み、その両側をクリップで保持するものであり（図１）、当該押圧処置時間と加重の強さに応じて、動物に対して麻酔を施しても良いし、状況によって無麻酔で行うこともできる。
【００１７】
押圧処置部位は、十分に皮膚が摘み上げられ、２枚の硬質平板にて挟むことができる部位、例えば背部、腹側部、耳介部等が挙げられるが、好ましくは背部が用いられる。
【００１８】
硬質平板としては、クリップによる押圧に耐えることができ、且つ、動物の皮膚に損傷を与えない材質のものであればよく、例えばプラスチック板、アルミニウム板、銅板、鉄板等が好ましい。また、硬質平板は、０．５〜２ｃｍ×０．５〜２ｃｍで、厚さ１〜５ｍｍの大きさのものを用いるのが好ましい。
【００１９】
クリップは、上記２枚の硬質平板に挟まれた皮膚を固定でき、且つ、０．０１５〜１５ＭＰａの圧力を持続的に負荷できるものであればその構造や材質は限定されるものではなく、具体的には事務用のクリップ、洗たくばさみ等が使用でき、好ましくは、クリ−３５（コクヨ社製）が挙げられる。
【００２０】
押圧処置において皮膚にかかる加重圧力は、０．０１５〜１５ＭＰａが適当であり、安定した褥瘡様皮膚壊死状態を再現できる点で０．０５〜２ＭＰａの範囲が最適である。押圧処置時間は、動物の種類や老若によっても異なるが、３〜２４時間が適当であり、特に１０週齢〜１１週齢の若齢マウスでは４〜６時間、１１ヶ月齢〜１５ヶ月齢の老齢マウスでは３〜６時間が好ましい。
【００２１】
尚、加重負荷処置法としては、上記クリップ押圧法の他に、これまでに褥瘡動物モデルの作成法として提唱されている、ラット大腿部をバネやコンピュータ制御による加重を加える方法（上滝博夫ら、臨床医薬（１９９０）６，３，６２７−６３８；府川和永ら、応用薬理（ｌ９８２）２３，６，９９９−ｌ０１１；Ｒ  Ｓａｌｃｉｄｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ（１９９５）３２，２，１４９−１６１）、ラット背部皮膚に金属板を挿入し皮膚を介して磁石を乗せることにより加重する方法（ＳＭ  Ｐｅｉｒｃｅ，  ｅｔ  ａ１，  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ（２０００）８，１，６８−７６）、ブタ背部圧迫法（Ｂ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ａｒｃｈ  Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｈａｂｉｌ（１９９８）７９，３，２６５−２７２）及びウサギ耳介部圧迫法（矢野英雄ら、整形外科（１９９０）４ｌ，９７６−９８５）等を用いてもよい。
【００２２】
斯くして、皮膚に対して褥瘡様皮膚壊死を発症させ得る加重負荷処置を施した後、当該処置解除直後に処置部の皮膚組織を採取し、被験化合物の存在下培養し、培養後０〜３日目までの皮膚組織の呼吸活性を測定することにより被験化合物の褥瘡に対する作用を評価できる。
【００２３】
皮膚組織の採取は、通常行われる生体からの皮膚組織採取方法に従えばよく、適切な方法により動物をと殺後、当該処置部周辺の皮膚組織を切除する、あるいは、麻酔下にて皮膚組織を切除した後生体側を縫合して動物を延命させる。その後、切除した皮膚組織に対して、皮膚を裏返して筋層と腹膜の間に付着していた結合組織を除去し、筋層がついたままの皮膚全層組織を得、例えば生検トレパンでパンチアウトし、抗菌剤を添加したＰＢＳ（４℃）に集めることにより行われる。
【００２４】
培養は、動物組織又は細胞を培養に通常用いられる培養条件に従って行えばよく、ＭＥＭ培地やＲＰＭＩ  １６４０培地などの栄養基礎培地を、市販品として購入もしくは組成表に従い自前で試薬より調製し中性領域にｐＨを調整したものを用いる。上記のように集めた皮膚組織片を適切な培養シャーレなど、例えば４８穴ウェルプレートに各ウェルに１片づつ、表皮側が上になるように置き、栄養培地を皮膚組織が充分浸漬する程度に一定量加えた後、適切な条件下、例えば３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下の培養装置で無菌的に培養する。その際、適宜選択した被験化合物を任意の濃度となるように、一部のウェル中に加えて共培養する。
【００２５】
被験化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等、何れものものでもよく、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。被験化合物は、通常当該化合物を栄養基礎培地、純水、生理食塩水、ＰＢＳ、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセリン、プロピレングリコール等の溶媒に溶解させて調製すればよい。
【００２６】
呼吸活性の測定は、細胞のミトコンドリア内の酸化還元力を測定することで細胞の数や呼吸活性の程度を定量的に評価できるアラマーブルー試薬、ＭＴＴ色素還元法用のＭＴＴ試薬等を用いた公知の方法を利用すればよく、具体的には、培養液中に、終濃度１０％となるようにアラマーブルー試薬を加えた後、所定の培養を行い、あらかじめ予備的に定めた適切な時間、例えば１〜４時間後の培養液を一部採取し、波長５３０ｎｍ付近で励起させ５９０ｎｍ付近で検出される蛍光強度を測定することにより行われる。
【００２７】
本培養実験系において、加重負荷処置を行わない動物の皮膚組織の呼吸活性は培養３日目まで維持されるが（図６）、上記の加重負荷処置を行った動物の皮膚組織では、培養直後にはかなり残存していた呼吸活性が培養１日目に急激に減少し、３日目にはほぼ消失する（図７）。呼吸活性のこの変化は、上記クリップ押圧法において、褥瘡様皮膚壊死を発症しない押圧処置（押圧時間が２時間より短い場合）を施した場合の呼吸活性が、経日的に若干の低下がみられるものの、培養後３日目まで呼吸活性が維持されることと明らかに区別できるものである（図７）。
【００２８】
従って、培養後０〜３日目まで、特に培養１日目の皮膚組織の呼吸活性を中心にその変化をモニタリングすることにより、被験化合物が褥瘡に対していかなる作用効果を有するかを定量的に把握することが可能となる。
【００２９】
【実施例】
実施例１  クリップ押圧によるヘアレスマウス背部の押圧処置
（１）押圧処置の方法
雌性ＩＣＲ／ヘアレスマウスの背部を正中線が対称軸となるように左右から摘み上げ、培養シャーレを切り抜いて作成したプラスチック板（１．５ｃｍ×１．０ｃｍ）２枚で挟み、文具用クリップ（コクヨ、クリー３５）で保持し、一定時間押圧した。押圧処置中のマウスを図１に示す。押圧処置後、クリップとプラスチック板を除去し、通常飼育を続けながら、背部の皮膚変化を観察する。
【００３０】
（２）押圧処置時の加重圧力の測定
圧力測定用フィルムである富士プレスケール（富士フィルム）を用いて、押圧処置時に皮膚部位に加わる力を測定した。富士プレスケールは極超低圧用（測定可能圧力範囲；０．２〜０．６ＭＰａ）を用いた。
ヘアレスマウス背部皮膚を採取、筋層下部の結合組織を除去後、筋層同士が隣り合うように２つ折りにした。押圧加重をかける前の皮膚圧力範囲；０．２〜０．６ＭＰａ、２つ折りにした状態でノギスを用いて測定した。１つの皮膚組織につき１０回の測定値を平均した。
次に、圧力測定用フィルムを押圧処置に用いるプラスチック板より周囲約１ｍｍ程度大きく切り抜き、一方のプラスチック板と皮膚の間にフィルムを挟みこんだ状態で、２つ折り皮膚を両面からプラスチックで押さえ、クリップで保持した。そのまま２分間保持した後フィルムを取りだし、フィルムに転着した赤色色素部位のａ＊値を分光反射スペクトル計ＣＭＳ３５ＦＳ（村上色彩科学）で測定した。  富士プレスケールに添付されている標準色見本（０．１〜１．３ＭＰａ）のａ＊値を同様に測定し、圧力標準チャートから加重圧力を算出した。
１枚のフィルムについて３〜１４箇所のａ＊値を測定し、平均の加重圧力を求めた。今回計測を行った１３８点の測定値は、圧力に換算すると最小値：０．２４（ＭＰａ）、最大値；０．４６（ＭＰａ）であり、すべて実験に用いたフィルムの圧力測定可能範囲内であった。
【００３１】
実施例２  押圧処置時間の検討
雌性ＩＣＲ／ヘアレスマウス（１０週齢）の背部を、実施例１の方法で種々の時間（１〜１４時間）押圧処置し、処置後の皮膚の変化を経日的に観察した（図２、３、４）。
４時間以上の押圧処置により５〜７日程度の経過時に皮膚組織は壊死し、ヒト褥瘡の黒色期に酷似した痂皮化形成状態を呈した（図４）。痂皮化に到達する前段階では、紅斑、血斑、浮腫が発生し、またそ程度は押圧時間に依存して悪化する傾向が認められたが（図２、３）、処置５日後には、４時間以上の押圧では、時間に無関係にほぼ同時期に壊死、痂皮化を形成した。
一方、２時間以下の押圧処置においては、観察経過中わずかの紅斑、浮腫が一部の領域で見られた後、５日後、更にそれ以降においても皮膚壊死は起こらなかった（図５、６）。このことから、一定圧力下で押圧負荷を受けた皮膚組織はある負荷時間を超えたとき褥瘡黒色期に酷似した壊死、痂皮化を形成することが明らかとなった。
【００３２】
実施例３  痂皮化した皮膚の病理組織像
クリップ押圧によって形成した壊死、痂皮化部位を摘出し、切片を作成、ＨＥ染色像の顕微鏡観察を行った。１２ヶ月齢ヘアレスマウスに２４時間押圧、押圧解除後２日の摘出皮膚組織像を図５に示す（図５（ａ））。押圧解除して２日後の皮膚を採取したため、痂皮化形成の直後である。切片像（図５（ｂ））は表皮〜筋層にいたる全領域で、細胞の死滅（壊死）状態が認められた（ＨＥ染色像中左上）。また、広い領域に多形核白血球を大部分とする細胞浸潤が観察され、炎症初期の皮膚組織であると考えられた。このような皮膚組織像観察から、本発明押圧処置により壊死、痂皮化したヘアレスマウスの皮膚組織は、外観上および内部組織上ヒト褥瘡の黒色期に酷似したものと判断できる。
【００３３】
実施例４  採取皮膚の呼吸活性（１）
（１）方法
ヘアレスマウス（♀、１０週齢）を用い、実施例１の方法に従いクリップ押圧処置（押圧処置１，２，４，６，１０，１４時間）した。押圧解除直後にと殺、すみやかに背部皮膚を採取した。皮膚を裏返して筋層と腹膜の間に付着していた結合組織をハサミとピンセットで除去し、筋層がついたままの皮膚全層組織を得た。押圧処置した部位および無処置部位を４ｍｍφ生検トレパンでパンチアウトし、最終濃度１００Ｕ／ｍＬ、ペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ（以下、抗菌剤と記す）を添加したＰＢＳ（−）中（４℃）に集めた。全皮膚片を採取した後、抗菌剤添加ＲＰＭＩ  １６４０培地と１／１０量のアラマーブルーを入れた４８ウェルプレート（２００μｌ／ウェル）に、１ウェルにつき１片づつの皮膚片を表皮側が上になるように浮かべ、３７℃／５％ＣＯ２、９５％大気下で培養を行った。
【００３４】
種々の押圧時間における呼吸活性の差異を同時に評価するために、各押圧処置の開始時刻をずらして設定し、処置終了が同時刻になるようにした。
１．５時間あるいは３時間後に培地を別のウェルプレートに回収し（１８０μｌ）、蛍光測定を行い、（Ｅｘ：５３０ｎｍ、Ｅｍ：５９０ｎｍ）、皮膚組織の呼吸活性量の指標とした。
各処置について４片の測定値を平均した。本培養実験系において、無処置皮膚組織の生存は、採取３日後まで維持されるものと考えられた。そこで、押圧処置皮膚の呼吸活性変化を評価する際において、無処置皮膚組織の呼吸活性量をコントロールとして、コントロールに対する各処置条件での呼吸活性比を評価することにした。
【００３５】
呼吸活性測定のためにアラマーブルーを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（２００μｌ）で一回洗浄、再び抗菌剤添加ＲＰＭＩ  １６４０を２００μｌ／ウェル加えて培養を続けた。翌日１０％アラマーブルー含有ＲＰＭＩ  １６４０に置き換え、１．５時間あるいは３時間後に液を回収し、前日と同様の測定を行った。以降、組織採取日の３日後まで毎日、上述の培地置き換えによる呼吸活性を測定した。
【００３６】
（２）結果
非押圧部位皮膚組織の呼吸活性量としてアラマーブルーの蛍光強度を図６に示した。呼吸活性は、組織採取後３日経過の時点まで顕著な変化は観られなかった。図７に、押圧処置時間を変えた場合の呼吸活性比（縦軸）変化を、組織採取後の日数を横軸として示した。
押圧処置後の組織の採取当日（０日）の呼吸活性比は、押圧処置時間が長くなると極端に低下する傾向が認められ、採取１日後以降はほぼ完全に呼吸活性が消失した。一方、２時間押圧と４時間押圧条件間で０日においては呼吸活性比に顕著な差はみられなかったのに対し、組織採取後１日経過以降の呼吸活性比の変化には大きな違いが認められた。すなわち、押圧時間が２時間より短い場合は、経日的に若干の呼吸活性低下がみられるものの、採取後３日まで呼吸活性が維持された。一方、４時間押圧では、採取後１日でほぼ完全に呼吸活性が消失した。
【００３７】
実施例５  採取皮膚の呼吸活性（２）
若齢マウスおよび老齢マウスそれぞれに１〜４時間の押圧処置を施した後の採取皮膚呼吸活性の経日変化を図８に示した。
両群ともに、押圧処置時間に依存して呼吸活性比の経日的低下が増強する傾向が認められた。また、同時間押圧処置した時の呼吸活性比を老若間で比較すると、いずれの押圧時間においても、老齢マウス皮膚の方がより強く呼吸活性が低下する傾向が認められ、老齢マウス２時間押圧と若齢マウス３時間押圧で呼吸活性比の低下が同程度であった。４時間押圧の条件下においては、老齢マウスの方が採取０日目に若干低く、採取１日後以降においては、老齢、若齢ともにほぼ完全に呼吸活性が消失した。
【００３８】
実施例６  各種薬剤による、押圧後皮膚組織の呼吸活性低下阻害作用の評価
ヘアレスマウス（♀、１０〜１１週齢）を用い、実施例１の方法に従いクリップ押圧処置（押圧処置３時間）した。
被験化合物として、Ｌ−（＋）アスコルビン酸（Ｗａｋｏ）、アミノグアニジン（Ｓｉｇｍａ）、インドメタシン（Ｓｉｇｍａ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（以下Ｌ−ＮＡＣ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を０．５Ｍになるよう６０％エタノール／２０％プロピレングリコール／２０％水溶媒に溶解させてストック溶液として−２０℃保存した。
押圧処置直後に皮膚組織片を採取し、それぞれの化合物のストック溶液を１０％アラマーブルー含有のＲＰＭＩ  １６４０培地で希釈し（最終薬剤濃度；５０μＭ）、３７℃／５％ＣＯ２で培養後３時間の蛍光強度を測定した。得られた測定値をそれぞれの薬剤存在下における無処置皮膚片の蛍光強度で除して呼吸活性比を求めた。アラマーブルーを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（各薬剤を５０μＭで含有）に置き換えて翌日まで培養し、再び１０％アラマーブルー含有ＲＰＭＩ  １６４０（各薬剤含有）で３時間培養して、押圧処置翌日の呼吸活性を求めた。押圧処置２日後、３日後も同様に呼吸活性を測定した。結果を下記表１に示す（それぞれの測定日において、非押圧皮膚組織の呼吸活性を１００としたときの各薬剤添加時の呼吸活性比を示した）。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
これより、誘導型一酸化窒素合成酵素の選択的阻害剤であるアミノグアニジン、酵素ラジカル消去能を有するアスコルビン酸、トコフェロール、Ｌ−ＮＡＣには、一定時間押圧した後の皮膚組織の呼吸活性低下を抑制する作用が認められた。しかし、抗炎症作用を有するインドメタシンには、そのような呼吸活性低下抑制の作用は認められなかった。
【００４１】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法によれは、動物を用いることなく、しかも動物を用いた場合に比べて迅速に、且つ定量的に被験化合物の褥瘡に対する予防又は治療効果を評価できることから、褥瘡の予防又は治療薬の開発に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、加重押圧処置状態のマウスを示す写真である。
【図２】図２は、加重押圧処置解除１日後の皮膚外観を示す写真である。
【図３】図３は、加重押圧処置解除２日後の皮膚外観を示す写真である。
【図４】図４は、加重押圧処置解除７日後の皮膚外観を示す写真である。
【図５】図５は、加重押圧処置（２４時間）解除２日後の皮膚外観と組織像を示す写真である。
（ａ）：皮膚外観（１２ヶ月ヘアレスマウス）、（ｂ）：組織像（ＨＥ染色像）
【図６】図６は、無処置マウスから採取した皮膚の呼吸活性量を示すグラフである。
【図７】図７は、加重押圧処置マウスから採取した皮膚の呼吸活性比を示すグラフである。
【図８】図８は、加重押圧処置マウスから採取した皮膚の呼吸活性比（老若の比較）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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