(57)【要約】    【課題】従来のセルソーティング技術に代わって、光圧(optical forceもしくはoptical pressure)を利用した、微粒子のソーティング技術およびそのための微粒子の回収技術を提供する。    【解決手段】微粒子の流路に、微粒子の流れ方向に交差させてレーザービームを照射し、回収すべき微粒子の運動方向をレーザービームの収束方向に偏向させて該微粒子を回収することを特徴とする微粒子の分別回収方法、および該方法の実施のための、光圧に応答する微粒子を回収するための回収部、レーザービーム照射部、並びに、当該回収部とレーザービーム照射部との間に、光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体を流すための流路を備えた微粒子回収装置。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体の流路に、当該気体または液体の流れ方向に交差させてレーザービームを照射することによって、流路内の、光圧に応答する微粒子の運動方向のみを選択的にレーザービームの収束方向に偏向させて、当該微粒子を光圧に応答しない成分と分別して回収することを特徴とする、光圧に応答する微粒子の分別回収方法。
【請求項２】
微粒子が、光圧に応答する有機もしくは無機高分子材料、金属、細胞、微生物および生体高分子からなる群から選ばれる請求項1に記載の分別回収方法。
【請求項３】
光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体の流路内の、光圧に応答する標的微粒子に対して、当該気体または液体の流れ方向に交差させてレーザービームを照射することによって、流路内の、当該標的微粒子の運動方向のみを選択的にレーザービームの収束方向に偏向させて、当該微粒子を、他の微粒子および光圧に応答しない成分と分別して回収することを特徴とする、標的微粒子の分別回収方法。
【請求項４】
流路が液流によって形成されてなるものである、請求項3に記載の標的微粒子の分別回収方法。
【請求項５】
標的微粒子が、光圧に応答する有機もしくは無機高分子材料、金属、細胞、微生物および生体高分子からなる群から選ばれる請求項3に記載の標的微粒子の分別回収方法。
【請求項６】
標的微粒子が、細胞または微生物である、請求項3に記載の標的微粒子の分別回収方法。
【請求項７】
請求項6に記載の標的微粒子の分別回収方法を、標的微粒子のソーティング方法として用いる、フローサイトメトリー。
【請求項８】
光圧に応答する微粒子を回収するための回収部、レーザービーム照射部、並びに、当該回収部とレーザービーム照射部との間に、光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体を流すための流路を備えた微粒子回収装置であって、
上記回収部が、流路側に開口を向けて配置された少なくとも1つのチャンバーを備え、
上記レーザービーム照射部が、少なくとも1つの照射口を備え、
当該レーザービーム照射口から、レーザービームを、上記流路に交差させて、上記回収部のチャンバーの開口に向けて、当該開口より遠方に収束するように照射するものである、
微粒子回収装置。
【請求項９】
回収部のチャンバーの開口とレーザービーム照射部の照射口とが、流路を隔てて、対向して設けられている請求項8に記載の微粒子回収装置。
【請求項１０】
2以上の照射口を有するレーザービーム照射部、および当該照射口の数に対応する数のチャンバーを有する回収部を備える、請求項8に記載の微粒子回収装置。
【請求項１１】
更に、流路を流れる気体または液体中の微粒子を検出して解析するための、検出および解析部を備える、請求項8に記載の微粒子回収装置。
【請求項１２】
検出および解析部がレーザービーム照射部と連動してなり、検出および解析部で得られるデータに基づいて標的微粒子を選択し、当該選択された標的微粒子に対してのみレーザービームの照射が行われるものである、請求項11に記載の微粒子回収装置。
【請求項１３】
請求項8に記載の微粒子回収装置をソーティング部として備える、セルソーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞などの微粒子の分別回収方法および回収装置、並びにこれらを利用したフローサイトメトリーおよびセルソーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、細胞などの微粒子集団から特定の個々の細胞などを選り分ける方法としては、フローサイトメトリーを基礎としたセルソーティング技術が知られている(例えば、非特許文献1参照)。
【０００３】
この技術では、予め蛍光色素などで標識した抗体を結合させた対象細胞の懸濁液を液流とし、まず、その流路内で該細胞に、標識した蛍光色素に応じて励起光を照射し、各細胞から発する蛍光乃至散乱光の波長や強度を解析して所望の細胞を識別する。次いで、上記光の強度や波長などの解析結果によって識別された特定の性質を有する細胞に電圧を印加して帯電させ、偏向電極を利用して上記で帯電された細胞の弁別、定量、統計解析などを行う。
【０００４】
この方法は、細胞を生存状態のまま大量且つ高速度で処理できる点より、免疫学的分野、血液学的分野、遺伝子工学的分野などにおいて、種々の培養細胞の採取・単離、特定細胞のクローニング・増殖、細胞表面に特定抗原を発現した細胞の分取などに、また、細胞膜分子の動態解析、細胞染色体の解析などに広く用いられている。特に、細胞動態の解析には不可欠な手段となりつつある。また、この技術は臨床分野でも、例えば尿中の有形成分の解析などに利用され始めている。
【０００５】
上記フローサイトメトリーによるセルソーティング技術に利用される細胞解析および細胞分離装置を、セルソータ(蛍光活性化セルソータ、Fluolorescence-Activated Cell Sorter, FACS)と呼んでいる。この装置は、前記蛍光などの解析を行う解析部の下流に更にソーティング部を備えたものである。該ソーティング部としては、代表的には水滴荷電方式が知られている。
【０００６】
この水滴荷電方式による細胞(微粒子)のソーティングは、例えば次の原理を基礎としている。即ち、レーザー光の照射により散乱光と蛍光とが検出された細胞に、これを含む水流が水滴に分かれる寸前に、プラスまたはマイナスの電荷を加えて荷電する。この帯電した細胞を含む水滴を、その落下の途中に電位差を有する2枚の偏光用電極板間に通過させと、該水滴は偏光板に引き寄せられて、その方向を偏向される。帯電されなかった細胞を含む水滴および所望の細胞以外の細胞を含む水滴は垂直に落下するので、所望の細胞のみを含む水滴を分離、回収することができる。
【０００７】
しかるに、このようなセルソーターを利用する技術では、一つの細胞(微粒子)を含む水滴を生成させるための超音波発生装置が必要であり、セルソーター自体非常に高価であることは勿論のこと、運転操作、メンテナンスなどが複雑であり、しかも一度に多種類の微粒子を分別することができないという欠点がある。即ち、電極板を利用する場合は、プラスまたはマイナスのいずれかに帯電させるしかなく、電気的に区別できる細胞はこの2種に限られる不利がある。更に、フローセルやノズルを使い回しするために不純物の混入のおそれがある。また、細胞分別で行われる細胞溶液の超音波による小滴化の際に、有害物質による雰囲気汚染などの問題も伴われる。
【０００８】
以上のように、セルソーターが特に高価であり、運転操作、メンテナンスが煩雑すぎる欠点、不純物が混入する欠点などを解決して、低コストで運転でき、不純物が混入しない方法として、ガラスや高分子材料の基板上に微小な流路を形成させて、その中で細胞などの微粒子を水流にのせてフローサイトメトリーを行い、所望微粒子を分別する技術(マイクロチップを利用する技術)が提案されている(例えば非特許文献2および非特許文献3参照)。
【０００９】
このマイクロチップを利用したセルソーティングは、T字型の流路を形成させて、分別したい細胞とそれ以外の細胞とを、細胞を液送している溶液の方向を切り替えること(流路選択制御)によって分別するものである。
【００１０】
しかしながら、現在提案されている該方法では、液の流れの切り替えは、一回しか行い得ず、それ故一種類の微粒子しか分離できない。液の流れの切り替えを複数回行えば複数の微粒子が分離できると考えられるが、実際には、液の流れの切り替えはその応答時間が遅過ぎるために、複数回の切り替えには複数の送液ポンプが必要となり、それらとチップとの接続、バルブの切り替えなどが複雑なものとなりすぎ、実用化は困難と考えられる。
【非特許文献１】「細胞工学」別冊「フローサイトメトリー自由自在」、監修：中内啓光(筑波大学医学系 免疫学)、秀潤社、1999年7月1日発行、第3-23頁
【非特許文献２】Anne. Y. Fu, et al., "A microfabricated fluorescence-activated cell sorter", Nature Biotechnology, Vol.17, November 1999, pp.1109-1111
【非特許文献３】Anne Y. Fu, et al., "An Integrated Microfablicated Cell Sorter", Analytical Chemistry, Vol.74, No.11, June 1, 2002, pp.2451-2457
【特許文献１】特開平5-18887号公報
【特許文献２】特開平7-104191号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、従来のセルソーティング技術にみられる、例えば水滴を生成させるための装置が必要であることや多数の標的微粒子を一度に分別回収することができない等といった欠点を解消した改良されたソーティング技術、およびそのための微粒子の分別回収技術を提供することにある。
【００１２】
本発明者は、従来公知のフローサイトメトリー、特に水滴荷電方式によるソーティング技術、および液の流れの切り替え(流路選択制御)によるソーティング技術に代わって、光圧(optical forceもしくはoptical pressure)を利用した微粒子のソーティング技術を開発するに初めて成功した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、下記項1-13に記載の発明を提供する。
項1．  光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体の流路に、当該気体または液体の流れ方向に交差させてレーザービームを照射することによって、流路内の、光圧に応答する微粒子の運動方向のみを選択的にレーザービームの収束方向に偏向させて、当該微粒子を光圧に応答しない成分と分別して回収することを特徴とする、光圧に応答する微粒子の分別回収方法。
項2．  微粒子が、光圧に応答する有機もしくは無機高分子材料、金属、細胞、微生物および生体高分子からなる群から選ばれる項1に記載の分別回収方法。
項3．  光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体の流路内の、光圧に応答する標的微粒子に対して、当該気体または液体の流れ方向に交差させてレーザービームを照射することによって、流路内の、当該標的微粒子の運動方向のみを選択的にレーザービームの収束方向に偏向させて、当該微粒子を、他の微粒子および光圧に応答しない成分と分別して回収することを特徴とする、標的微粒子の分別回収方法。
項4．  流路が液流によって形成されてなるものである、項3に記載の標的微粒子の分別回収方法。
項5．  標的微粒子が、光圧に応答する有機もしくは無機高分子材料、金属、細胞、微生物および生体高分子からなる群から選ばれる項3に記載の標的微粒子の分別回収方法。
項6．  標的微粒子が、細胞または微生物である、項3に記載の標的微粒子の分別回収方法。
項7．  項6に記載の標的微粒子の分別回収方法を、標的微粒子のソーティング方法として用いる、フローサイトメトリー。
項8．  光圧に応答する微粒子を回収するための回収部、レーザービーム照射部、並びに、当該回収部とレーザービーム照射部との間に、光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体を流すための流路を備えた微粒子回収装置であって、
上記回収部が、流路側に開口を向けて配置された少なくとも1つのチャンバーを備え、
上記レーザービーム照射部が、少なくとも1つの照射口を備え、
当該レーザービーム照射口から、レーザービームを、上記流路に交差させて、上記回収部のチャンバーの開口に向けて、当該開口の後方に収束するように照射するものである、
微粒子回収装置。
項9．  回収部のチャンバーの開口とレーザービーム照射部の照射口とが、流路を隔てて、対向して設けられている項8に記載の微粒子回収装置。
項10．  2以上の照射口を有するレーザービーム照射部、および当該照射口の数に対応する数のチャンバーを有する回収部を備える、項8に記載の微粒子回収装置。
項11．  更に、流路を流れる気体または液体中の微粒子を検出して解析するための、検出および解析部を備える、項8に記載の微粒子回収装置。
項12．  検出および解析部がレーザービーム照射部と連動してなり、検出および解析部で得られるデータに基づいて標的微粒子を選択し、当該選択された標的微粒子に対してのみレーザービームの照射が行われるものである、項11に記載の微粒子回収装置。
項13．  項8に記載の微粒子回収装置をソーティング部として備える、セルソーター。
【００１４】
上記項1-2に記載する本発明の微粒子の分別回収方法および項8に記載する本発明の微粒子回収装置は、レーザービームの光圧を利用するものであり、該光圧に応答する微粒子をその回収対象として、これを光圧に応答しない成分(流路媒体として使用する気体および液体も、当該成分に含まれる)と分別して回収することができる。
【００１５】
また上記項3-6に記載する本発明の標的微粒子の分別回収方法および項13に記載する本発明のセルソーターは、例えば、従来公知のフローサイトメトリーおよびセルソーターで採用されている検出および解析技術によって光圧に応答する標的の微粒子のみを選択して、上記項1-2および項8と同様にレーザービームを照射することによって、当該標的微粒子のみを他の成分(これには、光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分が含まれる)と分別して回収することができる。
【００１６】
これらの本発明の方法および装置、特に項3-6および項13に記載する方法および装置によれば、大きさや構造(物理的性質)などの相違または標識物質の相違などに応じて、各種の性質や機能を有する多様な細胞の集団から任意の複数種の細胞(標的細胞)を、それぞれ生きている状態で、しかも破壊、その他の損傷を与えることなく、分別回収することができる。従って、本発明方法および装置は、特定細胞のクローニング、増殖・分化因子受容体遺伝子のクローニングなどの支援技術として有用である。また、細胞の諸機能の解析、細胞膜分子、染色体DNA分子などの細胞動態の解析にも有効に利用することができる。更に、細胞工学分野に限らず、例えば臨床分野などにおいても、例えば尿中の有形成分の解析にも有効に利用できる。
【００１７】
また、本発明の装置はマイクロチップの形態にすることもでき、また本発明の方法も、こうしたマイクロチップを用いて容易に且つ簡便に実施することもできる。即ち、従来のFACSなどに比して、高価で煩雑な操作を必要としない利点がある。
【００１８】
しかも、本発明装置を利用すれば、従来提案されているマイクロチップを用いて流体制御を行う技術では困難であった複数種の微粒子を、一度の操作で非常に迅速に(応答速度が速い)、精度よく効率的に弁別することができる。殊に、本発明装置を利用すれば、従来のマイクロチップを用いて流体制御を行う技術に比して、微量のサンプルを利用して簡便に上記微粒子の弁別を行い得る利点もある。
【００１９】
(1)  微粒子の分別回収方法
以下、本発明の微粒子の分別回収方法につき詳述する。
【００２０】
本発明方法においては、まず光圧に応答する微粒子を含む気体または液体の流路に、該気体または液体の流れ方向に交差させてレーザービームを照射して、流路内を流れる回収すべき微粒子の運動方向をレーザービームの収束方向に偏向させることによって実施することができる。
【００２１】
この原理は次の通りである。即ち、照射されたレーザービームの照射領域に光圧に応答する微粒子が流れてくると、該照射領域内には光の場に不均一が生じているため、その中で微粒子はこれを取り囲む物質との間の屈折率、誘電率などの違いによって、これに作用する光の力(光の放射圧、誘電泳動力など)に差を生じる。この力の差によって、光圧に応答する微粒子は流体力学的流れ方向に逆らってビームの軸方向に沿って、光の場の密な位置に向かって移動するのである。この力を光圧(optical force)という。この光圧は、微粒子とそれを取り囲む物質との屈折率(もしくは誘電率)の値の差が大きいほど大きく、また、微粒子の体積が大きいほど大きい。例えば、ポリスチレン微粒子(たとえば直径が1μm)、大腸菌などの微生物乃至その細胞などを水中に懸濁させた液では、一般に大きな光圧が生じる。
【００２２】
従来、このような原理は、微粒子を捕捉するためのレーザートラッピング技術に応用された例がある(特許文献1、特許文献2など参照)。
【００２３】
しかしながら、公知のレーザートラッピング技術は、あくまでも、レンズで絞り込んだレーザー光の焦点位置で微粒子を捕捉する技術であり、該技術によって微粒子の運動方向(流れ方向)を偏向させて微粒子を回収すること、即ち微粒子の流路にレーザービームを照射することによって微粒子をその流れ方向に逆らってビームの進行方向に偏向させて回収しようとする試みは従来知られていない。
【００２４】
事実、例えば上記特許文献1に記載の技術は、微粒子の懸濁液をスライドガラス等のチャンバーに収容し、その懸濁液中サンプリングすべき微粒子にレーザービームを照射して捕捉するものでしかない。捕捉した微粒子は、静電力により電界方向に配向させ、しかる後レーザービーム又はチャンバーを移動させて輸送している。特許文献2に記載の技術も、微粒子をレーザービームでトラップして、その位置および向き(姿勢)を制御する装置に関するものでしかない。いずれも、レーザービームの光圧によって、微粒子の運動方向を偏向し、かつレーザービームの収束方向に微粒子を移動しようとするものではない。
【００２５】
本発明方法において、流路に流す気体または液体は、上述したように、光圧が作用する(光圧に応答する)微粒子を含むものであればよい。即ち、流路に流す気体乃至液体は、光圧に応答する微粒子と光圧に応答しない成分とを含むものであればよい。なお、媒体として使用する気体乃至液体は、上記でいう光圧に応答しない成分に含まれる。気体乃至液体中に含まれる微粒子は、気体や液体などの媒体とは屈折率、誘電率などが相違し、これによって光圧に差を生じるものであればよい。該微粒子の代表例としては、細胞、微生物、生体高分子物質などが挙げられる。細胞には、動物細胞(赤血球など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類；タバコモザイクウイルスなどのウイルス類；イースト菌などの菌類などが含まれる。生体高分子物質には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。
【００２６】
また本発明方法が適用できる光圧に応答する微粒子は、上記例示のものに限定されることなく、レーザートラッピング技術によってトラップされることの知られている各種の微粒子、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。
【００２７】
上記微粒子は、通常、ナノメートルからマイクロメートルのオーダの粒径、より具体的には約20nm−50μmの粒径を有しているのが好ましい。その形状、大きさ、質量などは特に制限されない。一般にその形状は球形であるのが普通であるが、非球形であってもよい。
【００２８】
上記微粒子は、一般には、これを気体または液体等の媒体に混合して、気流もしくは液流の状態で前記流路に流すことができる。気流または液流を形成する媒体としては、従来のレーザートラッピング技術に利用されている各種の気体および液体を挙げることができる。液流を形成する好ましい媒体(液媒)としては、純水、PBS(リン酸塩緩衝生理食塩水)などを例示することができる。該媒体は、光圧に応答する微粒子との関連において、その屈折率などが当該微粒子のそれよりも小さいものであるのが好ましい(この意味で、本発明では「光圧に応答しない成分」という)。流路に流される特に好ましい液体としては、細胞を上記液媒に配合または懸濁させた懸濁液等を挙げることができる。該液流中の細胞数は、特に制限されるものではないが、一般には1×105〜1×107個/ml程度とするのが普通である。その流速は、レーザービームの照射によってその流れ方向を、レーザービームの収束方向に偏向できることを前提として、微粒子の種類、これに照射するレーザービームの種類などに応じて適宜決定できる。
【００２９】
本発明方法において、利用されるレーザービームは、その種類、照射条件などにおいて、従来のレーザートラッピング技術に利用されるそれらと同様のものとすることができる。代表的なレーザービームとしては、例えばNd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet)レーザービーム(波長：1064nm)、Nd:VAN (neodymium-doped vanadate)レーザービーム(波長：1064nm)などを利用できる。このレーザービームは、生物に対する影響が少ない点で特に好適である。その照射条件は、具体的には、CW(continuous waveもしくは連続波)において100mW〜2Wの条件を利用することができる。レーザービームの照射は、間欠的にまたは連続して行うことができる。
【００３０】
本発明ではこのレーザービームの照射を、微粒子を含む気体または液体の流れ方向に交差させて行うことが重要である。この照射によって、気流または液流中の微粒子は、その運動方向が、気体または液体の流れ方向に逆らって、レーザービームの進行方向(収束方向)に偏向されて、光圧に応答しない成分とは分別して回収可能となるのである。例えばレーザービームの収束方向に、流路側に開口を向けて適当な回収用チャンバーを配置すれば、目的とする微粒子のみが選択的に該チャンバー内に回収され、蓄積される(濃縮)。
【００３１】
尚、レーザービームの照射は、一般には気流または液流の方向に対して直角となる方向に行われるのが好ましいが、気流または液流の方向と交差する限り、即ち、微粒子の流れる方向が偏向される限り、特にその角度は重要ではない。
【００３２】
光圧に応答する、異なる特性を有する複数の微粒子を標的とする場合、例えば、前記回収用チャンバーを並列させて複数個配置し、各チャンバーの開口に向けて、複数のレーザービームを照射すれば、これによって目的とする各微粒子(標的微粒子)の各々を、別々のチャンバー内に回収することができる。
【００３３】
(2)  標的微粒子の分別回収方法
前述する本発明に従う微粒子の分別回収方法は、これを例えばフローサイトメトリーのソーティング方法に応用することができる。即ち、本発明方法は、フローサイトメトリーにおけるソーティング部としての従来の水滴荷電方式に代替することができる。本発明方法を利用したフローサイトメトリーによれば、所望の微粒子(標的微粒子)のみを選択的に分別回収(ソーティング)することができる。
【００３４】
本発明方法を応用したフローサイトメトリー(セルソーティング、FACS)は、例えば以下の如くして実施できる。
【００３５】
即ち、回収対象とする微粒子(光圧に応答する微粒子)を含む試料(気体または液体)について、予め公知のフローサイトメトリーの検出部および解析部における操作と同様の操作を行って散乱光(前方散乱光、側方散乱光)や蛍光などを検出、解析する。次いで、この微粒子を含む試料(気体または液体)を本発明方法に従って流路に流し、当該気体または液体の流れに交差させて、この流路内を通過する回収したい所望の微粒子(標的微粒子)に対して選択的にレーザービームを照射すれば、標的微粒子のみがその運動方向をレーザービームの収束方向に偏向されて、他の微粒子および光圧に応答しない成分とは分別して回収される。
【００３６】
上記標的微粒子の好ましい具体例としては、一般的なFACSに従って蛍光色素などで標識された抗体を結合(コーティング)させた細胞、同様に蛍光色素などで標識した生体高分子などを挙げることができる。これらの選択は、従来のFACSに準じて実施することができる。例えば、アルゴンレーザーを照射することによって、蛍光の強度および波長もしくは散乱光強度を検出し、得られる検出結果(データ)を解析することによって、標的微粒子とする特定の蛍光強度やその波長、散乱光強度などを有する微粒子を選択することができる。
【００３７】
また、細胞内部や表面上に存在する種々の被験対象、例えば細胞内で発現された蛋白質などを、二種以上の蛍光色素や例えばGFP(Green fluorescent protein,緑色発光蛋白質)などの発光蛋白質を用いて多重染色すれば、所望の発光波長を発する複数種の微粒子を、それぞれ標的微粒子として、同時に選択することができる。これらの操作は、従来公知のフローサイトメトリー乃至セルソーターの検出部および解析部における各操作と同様のものとすることができる(例えば、非特許文献1参照)。
【００３８】
本発明ソーティング方法は、微少量の溶液を流路に流すサンプルとして使用して、その中の微粒子の検出および分別回収が可能な方法であるため、例えば、抗原抗体反応を利用する免疫検出系に好適に適用することができる。この場合、予め使用する抗体を蛍光物質で標識しておくことにより、抗原抗体反応等の免疫反応によって生じたマイクロメートルサイズの微粒子を、選択的に、レーザービーム照射によって流路からチャンバーに誘導することができ、該チャンバーに分別回収され、蓄積(濃縮)された微粒子を測定することによって、免疫反応物を高感度で検出することができる。特に、この方法において用いる抗体の種類に応じて異なる蛍光物質を利用することによって、蛍光強度や波長の相違に基づいて、同時に異なる複数種の抗原抗体反応物(すなわち、異なる細胞など)を分別回収して解析することができる(多重検出)。
【００３９】
なお、蛍光標識によらない場合、蛍光物質に代えて、抗体の種類に応じて異なる大きさのビーズを用いることもできる。この場合、当該ビーズに抗体をコーティングした後、該抗体を血液などの検体サンプルと混合して免疫反応させ、得られた反応物(微粒子)を含む液体を流路に流すサンプルとして使用すると、微粒子の大きさの相違に基づいて、同時に異なる複数種の抗原抗体反応物(すなわち、異なる細胞など)を分別回収して解析することができる。
【００４０】
(3)  微粒子回収装置
本発明の微粒子回収装置は、光圧に応答する微粒子を回収するための回収部と、レーザービーム照射部と、当該回収部とレーザービーム照射部との間に、光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体を流すための流路とを備えている。上記回収部は流路側に開口を向けて配置された少なくとも一つのチャンバーを備えており、また上記レーザービーム照射部は少なくとも一つの照射口を備えている。更に上記レーザービーム照射口からのレーザービームの照射は、上記流路に交差させて、上記回収部のチャンバーの開口に向けて行われ、且つレーザービームが回収部のチャンバーの開口より遠方に収束するように行われる。
【００４１】
本発明の一実施態様である微粒子回収装置の概略図を図1および2に示す。当該図1および2は、後記実施例に詳述する蛍光ラテックスビーズ(直径約2μm)を回収するための、マイクロチップ形態の本発明装置の概略図である。図1(a)は微粒子回収装置の正面図である。図1(b)は、図1(a)中、点線で囲った部分を拡大した図であって、加えて、レーザービーム照射部(3)の照射口(3a)からレーザービーム(3b)を照射している様子を示すものである。
【００４２】
また、図7は、上記図1および2に示される本発明微粒子回収装置の流路(2)と回収部(1)を正面から撮影した画像図である。この図7では、理解を容易にするために、流路(2)に赤インクを通液している。向かって右側および左側の赤スポット部が、それぞれ流路入口(5)および流路出口(6)であり、その間をつなぐ赤いラインが流路(2)である。当該微粒子回収装置(チップ)は、5mm厚のPDMS基板(60mm×24mm、5mm厚)に、図1(a)に示すように、流路入口(5)および流路出口(6)となる穴をあけ、両者をつなぐように50μm幅および25μm深さの溝を作成する(これが、流路(2)となる)。さらに当該溝に垂直になるように、35μm幅×35μm奥行きおよび25μm深さの溝を作成する(これが、チャンバー(1a、1b)となる)。次いで、当該基板の上から溝を覆うように、100μm厚のPDMS製のフィルム(60mm×24mm、5mm厚)を貼り合わせる。斯くして、微粒子回収装置の流路(流路(2))と回収部(回収チャンバー(1a、1b))が形成される。
【００４３】
各図に示される本発明微粒子回収装置は、2つのチャンバー(図1(b)中、1aおよび1b)を有する微粒子回収部(図1(b)中、1)、1つの照射口(図1(b)中、3a)を有するレーザービーム照射部(図1(b)中、3)、並びに、当該微粒子回収部(1)とレーザービーム照射部(3)との間に流路(図1(b)中、2)を備えている。また、照射口(3a)は、あいだに流路(2)を介して、微粒子回収部のチャンバー(1a)の開口と対向するように配置されており、開口からチャンバー内にレーザービームが入るようになっている。さらに、回収するための標的微粒子を含む気体または液体試料は、図2中aから、流路入口(5)を介して流路(2)に入り、当該流路(2)を流路入口(5)から流路出口(6)方向に流れて、次いで当該流路出口(6)からbに排出されるように設計されている。なお、図1(b)において、(4)は微粒子回収装置の底面を構成する外壁である。当該外壁と微粒子回収部(1)との間に、流路(2)が構成されている。
【００４４】
図1に示す微粒子回収部は、35μm×25μm(底面若しくは開口の面積)×35μm(開口部から底面までの長さ、奥行き)の容積を有するチャンバー(1a,1b)を有している。しかし、本発明装置の微粒子回収部に設けられるチャンバーの容積および開口の大きさは、これに限定されることなく、微粒子回収装置の使用目的、回収部の大きさ、その1チャンバー内に回収したい微粒子の大きさおよびその量や、照射するレーザービームの径などに応じて適宜選択設定することができる。また図1に示す流路(2)は、断面積が50μm×25μmの立方形の流路径を備えている。しかし、本発明装置の流路(2)の断面形状やその断面積(言い換えれば、流路径)は、これに限定されることなく、流路を流す気体および液体の別、および微粒子の大きさなどに応じて適宜選択設定することができる。
【００４５】
当該微粒子回収装置による微粒子の回収は、例えば、以下のように実施される。まず、回収したい標的微粒子を含有する気体または液体試料(好ましくは液体試料)を、流路入口(5)から流路出口(6)に向けて、流路(2)内に流す。試料が流路(2)を流れている間に、照射口(3a)からチャンバー(1a)内に集光するように、レーザービーム(3b)を照射する。そうすると、照射口(3a)から出たレーザービームは、回収したい標的微粒子を含有する気体または液体試料が流れている流路(2)に照射される。このとき、当該流路(2)のレーザービーム照射領域に標的微粒子が入ると、当該標的微粒子はレーザービームの光圧の作用を受けて、その標的微粒子の進行方向がチャンバー(1a)方向に偏向され、かくしてチャンバー(1a)内に回収される。
【００４６】
図2は、図1に示す微粒子回収装置について、レーザービーム照射部(3)をより詳細に記載する図である。但し、当該図2に示すレーザービーム照射部(3)を有する微粒子回収装置は、本発明の一態様であって、本発明はこれに特に制限されるものではない。図2において、(7)はNd:VANレザー、(8)はビームエキスパンダー、(9)は反射ミラー1、(10)は二色性ミラー2、(11)は二色性ミラー1、および(12)は対物レンズ1をそれぞれ示す。(13)は水銀ランプ、(14)はNDフィルター(neutral-density filter)を、および(15)は励起用バリアフィルターを示す。また、(16)は蛍光用バリアフィルター、(17)は反射ミラー2、(18)はレーザービームカットフィルター、および(19)はCCDカメラ1を示す。
【００４７】
当該図2に示す態様によれば、レーザービーム照射源であるNd:VANレザー(7)から発振されたレーザービームは、その進行方向前方に位置するビームエキスパンダー(8)によってそのビーム径が調整される。次いで、当該レーザービームは、反射ミラー1(9)、二色性ミラー2(10)および二色性ミラー1(11)によって屈曲されて、対物レンズ1(12)を通過し、照射口(3b)から、微粒子回収部のチャンバー(1a)の開口に向けて照射される。こうすることによって、Nd:VANレーザー(7)からのレーザービーム(3b)をチャンバー(1a)に集光させることができる。
【００４８】
この時、チャンバーの開口より遠方、好ましくはチャンバーの底部付近にレーザービームが収束するように調整することが好ましい。なお、レーザービームの収束は、例えば上記の如く対物レンズを用いることによって行うことができる。図2中の対物レンズ1(12)は、上下移動自在となっており、その移動によってレーザービームの収束位置を上下に調節することが可能である。なお、上述するように、レーザービームの収束位置は、微粒子回収部(1)のチャンバーの開口より遠方であればよい。なお、開口より遠方であればチャンバー内および外を問わない。好ましくは、チャンバー内および外を問わず、チャンバーの底部付近である。
【００４９】
ここで、使用するレーザービームは、円形のものが普通であるが特にこれに限定されず、楕円形などのものであってもよい。
【００５０】
本発明装置の好ましい態様として、図1に示すように、微粒子回収部のチャンバーの開口とレーザービーム照射部の照射口とが、流路を隔てて対向して設けられている態様を挙げることができる。この態様によれば、レーザービームは、流路、言い換えれば標的微粒子を含む気体または液体の流れ(気流または液流)に直角となるように入射される。但し、これに限定されることなく、レーザービームが流路と交差して、微粒子回収部のチャンバーに開口に入射されるものであれば、微粒子回収部のチャンバーおよびレーザービーム照射部の照射口の配置は任意に設定することができる。
【００５１】
また、本発明微粒子回収装置の他の好ましい態様としては、2以上の照射口を備えるレーザービーム照射部と、当該照射口の数に対応する複数のチャンバーを備えた微粒子回収部とを備える態様を例示することができる。こうした装置によれば、光圧に応答する複数の標的微粒子を、各々別個のチャンバーに分別回収することができる。
【００５２】
このような多重ソーティング装置の一例の概略図を図3に示す。該図において(101)は、回収したい標的微粒子を含む液体または気体試料を収納したリザーバを示す。当該図において (104-1)、(104-2)、(104-3)、・・・および(104-n)は、微粒子回収用のチャンバー〔(104-1a)、(104-2a)、(104-3a)、・・・および(104-na)〕を備えた微粒子回収部を示す〔図1でいう微粒子回収部(1)およびチャンバー(1a、1b)に対応する〕。また(105)はレーザービーム照射部を含むレーザービームコントローラーを示す(図1でいうレーザービーム照射部(3)に対応する)。ここで、レーザービーム照射部に設けられた複数の照射口〔(105-1)、(105-2)、(105-3)、・・・および(105-n)〕の数に対応して、微粒子回収部も複数のチャンバー〔(104-1a)、(104-2a)、(104-3a)、・・・および(104-na)〕を備えている。(2)は上記試料が流れる流路であり、(106)はそれを回収する排液用リザーバを示す。
【００５３】
かかる態様の本発明微粒子回収装置は、前述するレーザービーム照射部、微粒子回収部および流路に加えて、流路を流れる気体または液体中の光圧に応答する微粒子を、検出して解析するための検出および解析部を備えることが好ましい。この場合、当該検出および解析部に対して、レーザービーム照射部、微粒子回収部および流路から構成される装置部分をソーティング部ということもできる。当該ソーティング部と検出および解析部を備えるものが、セルソーターである。なお、図3中、(102)および(103)が検出部に相当し、(102)は検出用レーザー、(103)は検出器を示す。また図3中、解析部は(105)で示すレーザーコントローラー内に組み込まれている。
【００５４】
ここで、検出および解析部は、従来公知のフローサイトメトリー乃至セルソーターで用いられる検出および解析部と同様のものとすることができる。例えば、検出部は、流路内を流れる試料(液体試料または気体試料、好ましくは液体試料)の流路(液流、気流)にレーザー光(例えば、アルゴン、ダイオード、ダイ、ヘリウムネオンなどのsingle laserまたはDual laser)を当てて、該流路を通過した微粒子から得られる、前方散乱光(FSC)若しくは側方散乱光(SSC)、または標的微粒子を予め蛍光物質で標識した場合は、当該蛍光標識した微粒子の各種蛍光を測定するための検出器を備えたものとすることができる。また、解析部は、上記検出器によって検出されたデータをデジタル変換してサイトグラム、ヒストグラムとして表示するための解析表示装置を備えたものとすることができる。なお、上記前方散乱光(FSC)は例えば細胞の大きさ、側方散乱光(SSC)は例えば細胞の内部構造の複雑さをそれぞれ反映して光強度が変化する。また、フローサイトメトリー乃至セルソーターで標的微粒子の標識に使用される蛍光物質もよく知られており、これらを本発明で同様に使用することができる(例えば、非特許文献1参照)。
【００５５】
本発明の微粒子回収装置の好ましい一態様によれば、当該装置は、上記検出部および解析部が、ソーティング部におけるレーザービーム照射部と連動してなり、検出部で得られ解析部で解析されたデータに基づいて、流路の照射予定領域に、選択された標的微粒子が流れてきた時にのみ、当該標的微粒子に選択的にレーザービームが照射されるように設計される。
【００５６】
このような好適な本発明微粒子回収装置を利用すれば、光圧に応答する複数の微粒子を含む試料(気体試料または液体試料)の中から、微粒子個々の特性に応じて、1または2以上の標的微粒子を、選択的に区別して各々分別回収することができる。
【００５７】
例えば、一例として図3に示す本発明装置を利用した標的微粒子の分別回収方法を説明すると次の通りである。
【００５８】
複数の異なる標的微粒子(例えば細胞、微生物または蛋白質など)のそれぞれに、蛍光標識した各抗体を抗原抗体反応等の免疫反応により結合させ、これを含む試料溶液(例えば細胞等の浮遊液)をノズル等を利用して高流速で線状に流し、これにレーザーを照射すると当該液流中を通過した標的微粒子から、散乱光と蛍光が発せられる。かかる光の強度や蛍光波長等を検出部で測定し、得られた結果を解析部で解析する。次いで得られた情報(データ)を元にしてレーザーコントローラー(105)によりレーザービームの照射位置および時期等を決定し、流路(2)を標的の微粒子が通過する時に、当該標的微粒子に選択的にレーザービームを照射する。レーザービームが照射された標的微粒子は、光圧によってその流れ方向が偏向し、回収部のチャンバー内に回収される。斯くして、回収する標的微粒子が複数ある場合であっても、それが発する散乱光や蛍光の強度や波長の違いに基づいて、それぞれ別個に分別し回収部(104-1)・・・および(104-n)の各チャンバーに回収することができる。なお、各チェンバーに回収された微粒子(例えば、細胞、微生物または蛋白質など)は、該チャンバー内で免疫反応の検出を行うかまたは各チェンバーに蓄積された微粒子を取り出して別個に常法に従う生化学的分析に供して免疫検定を行うこともできる。
【００５９】
上記においては、レーザービーム照射口を回収チャンバーの数だけ用意することもできるが、これに代えて、既知のレーザー操作技術を利用してポリゴンミラーなどを用いて1本のレーザーの方向を変えて、レーザー照射位置および時期を走査、制御することも可能である。
【００６０】
なお、個々の標的微粒子の回収は、レーザービーム照射口から発せられるレーザービームの光圧によって標的微粒子の流れ方向を偏向させた結果として行われるものである。標的微粒子の流れ方向を偏向させる位置は、レーザービーム照射口を制御することによって行うこともできるし、また照射口の位置は固定したままで回収部またはそのチャンバー位置を移動させることによって行うこともできる。
【００６１】
上記図3に示す装置は、複数の蛍光情報を有する細胞を、その蛍光情報ごとに別々のチャンバーに回収する場合(マルチソーティング)に応用できる。この場合も、各チャンバーに回収された各細胞の分析は、該チャンバー内で行うこともでき、またチャンバーから取り出して分析することもできる。このような本発明の装置を利用することによって一つの装置(例えば、チップ形態にした場合は一枚のチップ)で、同時に複数の異なる細胞を分別回収することができる。
【発明の効果】
【００６２】
以上のように、本発明回収方法および装置は、光圧を利用することによって、光圧に応答する微粒子を、レーザービームの収束方向に偏向移動させることで、所望の回収チャンバーに回収することができるものである。また当該方法および装置は、従来のフローサイトメトリーやセルソーターにおける検出および解析技術を使用することにより、光圧に応答する複数の微粒子の中から、所望の標的微粒子を選別することもできる方法および装置である(多重分別回収)。当該本発明で利用する光圧は、それ自体制御容易であり、しかもその利用によって本発明の装置およびその周辺装置の簡略化をも図り得る利点がある。更に、本発明方法および装置を利用する微粒子のソーティング技術では、従来の水滴荷電方式のような水滴にするといった流体制御の必要がなく、少量の試料を利用して容易に所望の微粒子のソーティングを行い得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。
【００６４】
実施例1
(1)  試験方法
この試験には図1および図2に示す本発明の微粒子回収装置(マイクロチップ形態)を利用した。
【００６５】
チップに設けられた微粒子回収部(1)は、微粒子を回収するための2つのマイクログローブ(35μm×35μm×25μm、チャンバー(1a),(1b))を備えている。また、微粒子を含有する試料を通液するマイクロチャネル(50μm幅×25μm深さ、流路(2))は、外壁(4)(PDMS製)によって外部と仕切られている。対物レンズ1(図2の12)の作動距離を考慮して、上記チャンバー(1a)(マイクログローブ)の底部付近にNd:VANレーザービーム(波長：1064nm)が収束するように、外壁(4)の厚さは300μmとした。
【００６６】
この試験には倒立蛍光顕微鏡(Axiovert135TV,Carl Zeiss)を、レーザー操作システムと結合させて用いた。Nd:VANレーザー(7)から照射されたレーザービームは、外壁(4)に面する顕微鏡対物レンズ(12)を用いて集光し、チャンバー(1a)内に導入した。なお、レーザー光路内にビームエキスパンダー(8)を挿入することで、ビーム径を調整し、同一の対物レンズにおいてレーザー焦点と観察面とを一致させた。
【００６７】
また、流路(2)を流れる微粒子の挙動を観察し、該微粒子の蛍光像を撮影するために、他の対物レンズ2(20)およびカラーCCDカメラ2(21)を、水平方向に設置した。当該CCDカメラ2(21)によって、流路(2)から進行方向を変えてチャンバー(1a)に導入される微粒子の映像を撮影することができる。また、回収したチャンバー内の微粒子を下方向から撮影できるように、CCDカメラ1(19)を配置した。
【００６８】
この試験では直径2μmの蛍光ラテックスビーズ(Polysciences, Inc.)を光圧に応答する微粒子として用いた。該微粒子を超純水に1×105個/mlとなる濃度で懸濁させた液をサンプル液として利用した。該サンプル液は、シリンジポンプ(シリンジフィーダー)を利用して(a)を通じて流路入口(5)より流路(2)内に導入した。流路(2)内を流れるサンプル液の速度は、192μm/秒とした。流路(2)を通過したサンプル液は、流路出口(6)から(b)に回収した。
【００６９】
レーザービーム(3b)は、2つのチャンバー(1a、1b)の内の一つ(1a)に集光させた。このチャンバー(1a)を微粒子回収用チャンバーとし、他の一つ(1b)を負のコントロール用チャンバーとした。
【００７０】
(2)  結果
ある特定の蛍光ラテックスビーズAにスポットをあて、流路中での動きを追った図を図4に示す。図4中、黒矢印(上方向を示す)は、レーザービーム照射光の位置および照射方向を示し、白矢印はビーズAの位置および運動方向を示す。この図から、流路内を液流にのって流れてきたビーズA(図4の(a)参照、これをt=0とする。)は、レーザービーム照射領域にくると(図4の(b)参照、t=0.13)、運動方向がビームの進行方向に偏向し(図4の(c)参照、t=0.17)、回収部のチャンバー内に入ることがわかる(図4の(d)参照、t=0.21)。即ち、流路を流れる2μmの蛍光ビーズは、Nd:VANレーザービーム(1600mW)の照射領域に入ると、流体力学的な力および重力による流れに逆らって、光圧によってビームの光軸に沿って偏向してビーム照射の集束方向に移動して、チャンバーに回収される。
【００７１】
この方法では、レーザービームを当てるか否かによって特定の標的微粒子を選別して個々のチャンバーに回収することができる。
【００７２】
本方法における光学的回収能を確認するために、流路内を通過する蛍光ラテックスビーズが経時的にチャンバー内に回収蓄積(濃縮)できるか否かを調べた。即ち、レーザービームの照射を連続的に行って、チャンバー(1a)(35μm×35μm×25μm)内の蛍光強度を経時的に測定した。得られた結果を図5に示す。
【００７３】
なお、蛍光強度は、ビデオテープに記録した画像をコンピュータに取り込んだ後、画像解析ソフト(NIH image: http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)を用いて、チャンバー内領域のビデオフレーム毎(30フレーム/秒)の蛍光強度を解析することにより求めた。その値は相対値(図5におけるa.u.はarbitrary unitの略である)を示す。
【００７４】
図5は、横軸に経過時間(秒)(レーザービームの照射時間)および縦軸に上記蛍光強度(単位：a.u.)をとり、チャンバー(1a)内の蛍光強度の推移を経時的に記載したグラフである。
【００７５】
図5に示される結果から明らかなように、チャンバー(1a)内の蛍光強度は、90秒間に亘って、時間に比例して増加することがわかる。このことから、レーザービームを連続的に照射することによって、流路を通過する標的微粒子の流れを光圧によってチャンバー方向に偏向させて、当該チャンバー内に標的微粒子を回収蓄積(濃縮)できることがわかる。
【００７６】
90秒後のCCDカメラによる撮影結果は図6に示されるとおりである。図6中、(a)は回収チャンバー(1a)を、(b)は回収チャンバー(1b)を示す。「白矢印 flow」は、流路内での、蛍光ラテックスビーズを含む液体(サンプル液)の流れ方向を示し、黒矢印はレーザービームの照射方向を示す。
【００７７】
図6に示されるように、チャンバー(1a)は、その容積の約1/3まで蛍光ビーズで満たされた。これに対して、レーザービームの光圧が作用しない負のコントロールチャンバー(チャンバー(1b))では、蛍光は観察されず、ラテックスビーズは回収されていないことが確認された。この結果は、一連の回収および濃縮が、微粒子が光圧(レーザービーム照射による)を受けることによる偏向および移動に基づいて生じていることを裏付けるものである。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は細胞などの微粒子の回収方法および回収装置並びにこれらを利用したフローサイトメトリーおよびセルソーターを提供する。
【００７９】
本発明の回収方法および装置は、例えば、細胞のクローニング、増殖・分化因子受容体遺伝子のクローニングなどの支援技術として有用である。また、細胞の諸機能の解析、細胞膜分子、染色体DNA分子などの細胞動態の解析にも有用である。更に、細胞工学分野に限らず、例えば臨床分野などにおいても有効に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明の微粒子回収装置の一態様(実施例)を示す概略図である。(a)は微粒子回収装置一部(回収部と流路)の正面図を、(b)は、(a)中、点線で囲った部分を拡大した図である。
【図２】図1に示す微粒子回収装置のレーザービーム照射部をより詳細に記載する概略図である。
【図３】多重回収および多重検出に適した本発明微粒子回収装置(多重ソーティング装置)の一態様を示す概略図である。
【図４】実施例1で行った試験の結果を示す(蛍光ラテックスビーズAが、レーザービーム照射を受けることによって、回収チャンバーに回収される様子を経時的に撮影した)画像図である。
【図５】実施例1で行った試験において、回収チャンバー内に微粒子が経時的に回収、蓄積されることを示す、該チャンバー内の蛍光強度推移を示すグラフである。
【図６】実施例1で行った試験において、レーザービーム照射90秒後に、回収チャンバーと負のコントロールチャンバーとを撮影した画像図である。
【図７】図1(a)に対応する、微粒子回収装置の一部(流路と回収部)を正面から写した画像図である。
【符号の説明】
【００８１】
(1)  微粒子回収部
(1a),(1b)  微粒子回収部に設けられたチャンバー
(2)  流路
(3)  レーザービーム照射部
(3a) レーザービーム照射口
(3b) レーザービーム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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