(57)【要約】【課題】粒径制御が可能で、有機物との複合化が容易であり、かつ有機溶媒を用いない、中空の球状リン酸カルシウムの製造方法を提供する。【解決手段】濃度が０．００１〜０．１ｍｏｌ／ＬのカルシウムイオンＣａ２＋、濃度が０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸イオンＰＯ４３−、およびカルボン酸アミドを含む酸性の第一の水溶液に、そのカルボン酸アミドの加水分解を触媒する酵素、及び第一水溶液中の成分との反応もしくは外部からのエネルギー付与に伴いゲル化しうる有機高分子、例えばアルギン酸塩やアルキルセルロース誘導体の塩を溶解した第二の水溶液からなる滴を加え、有機高分子をゲル化させることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムイオンＣａ２＋、リン酸イオンＰＯ４３−、およびカルボン酸アミドを含む酸性の第一の水溶液に、そのカルボン酸アミドの加水分解を触媒する酵素、及び第一水溶液中の成分との反応もしくは外部からのエネルギー付与に伴いゲル化しうる有機高分子を溶解した第二の水溶液からなる滴を加え、有機高分子をゲル化させることを特徴とする球状リン酸カルシウムの製造方法。
【請求項２】
第一水溶液中のカルシウムイオン濃度が０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、リン酸イオン濃度が０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、カルシウムイオンとリン酸イオンのモル比が０．５：１〜１０：１、第一水溶液中のカルボン酸アミドの総量がカルシウムイオンに対してモル比で０．１倍〜１００倍である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有機高分子がアルギン酸塩、アルキルセルロース誘導体の塩、アルブミン、ペクチン酸、カラゲナン、寒天及びゼラチンのうちから選ばれる一種以上である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第二水溶液が、前記有機高分子を０．１〜１０重量％、前記酵素を第二水溶液全体に対して重量比で１００万分の１〜１００分の１含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、球状のリン酸カルシウムの製造方法に属する。この発明の製造方法で製造される球状リン酸カルシウムは、タンパク質分離用クロマトグラフィーの分離剤、骨充填材、人工骨の原料、ドラッグデリバリーの担体、触媒の担体などに利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】特開平０２−１１９７８４号公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，  Ｖｏｌ．２６，  Ｎｏ．２（１９９３）２２３−２２４
【非特許文献２】（社）日本セラミックス協会２００１年年会講演予稿集，  ２７０
【非特許文献３】ＳＣＩＥＮＣＥ，  Ｖｏｌ．１９８，  １１６４−１１６６（１９７７）
従来、球状のリン酸カルシウムを作製するための方法としては、リン酸カルシウムの微粒子を懸濁させた液体（スラリー）を熱風中に噴霧し、瞬間的に乾燥させる方法（噴霧乾燥法）、緩慢に作用する凝集剤を添加したスラリーを鉱油中に加えて撹拌しながらエマルジョンを作製し、スラリーを液滴状に凝集させる方法（ゲル化法）、発泡剤を加えたスラリーを熱風中に噴霧し、瞬間的に発泡させて中空粒子を得る方法（噴霧発泡法）などが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
これらの方法では、通常直径が数十μｍ程度の球状粒子が得られるが、所望の粒径のものを得ることが困難であること、特に数百μｍ程度の大きな球状粒子を作りにくいこと、中空粒子の場合には粒子の殻の厚みを制御しにくいこと、ゲル化法では鉱油などの有機溶媒を多量に用いる必要があるなどの問題点がある。
また、リン酸カルシウムは、生体との適合性を有する物質であるため、同じく生体と適合する有機物と複合させることにより、軟組織の修復材料として用いることもできるが、上記の方法では有機物との複合化が困難である。
そこで、本発明の課題は、粒径制御が可能で、有機物との複合化が容易であり、かつ有機溶媒を用いない、中空の球状リン酸カルシウムの製造方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
その課題を解決するために、この発明の球状リン酸カルシウムの製造方法は、
カルシウムイオンＣａ２＋、リン酸イオンＰＯ４３−、およびカルボン酸アミドを含む酸性の第一の水溶液に、そのカルボン酸アミドの加水分解を触媒する酵素、及び第一水溶液中の成分との反応もしくは外部からのエネルギー付与に伴いゲル化しうる有機高分子を溶解した第二の水溶液からなる滴を加え、有機高分子をゲル化させることを特徴とする。
カルボン酸アミドは尿素を含む広義に解され、一般式ＲＣＯＮＨ２で示されるものであればよい。すなわちＲは特に指定されず、カルボン酸からカルボキシル基を除いた残基の他、アミノ基でもよい。Ｒがアミノ基のときは尿素となる。
【０００５】
カルボン酸アミドは、リン酸カルシウムの沈殿を生じさせる沈殿剤を生成するための酵素反応の基質である。すなわち、カルボン酸アミドは酵素の最適示活温度で下記反応式（１）又は（２）のように酵素によって分解されて、水溶液のｐＨを上昇させる。カルボン酸アミドの加水分解生成物は、カルボン酸（又は二酸化炭素）とアンモニアであるが、酸性の第一水溶液中でこれらが多量に生成すると、第一水溶液のｐＨは生成物の緩衝作用によって次第に中性に近づく。
ＲＣＯＮＨ２＋２Ｈ２Ｏ→ＲＣＯＯＨ＋ＮＨ４＋＋ＯＨ−  （１）
Ｈ２Ｎ−ＣＯ−ＮＨ２＋３Ｈ２Ｏ→２ＮＨ４＋＋ＯＨ−＋ＣＯ２  （２）
【０００６】
リン酸カルシウムの溶解度はｐＨが上昇するにつれて低下するので、これらの化学反応の進行に伴ってリン酸カルシウムが沈殿する。尿素を加水分解する酵素にはウレアーゼがあり、尿素以外のカルボン酸アミドを加水分解する酵素には、アミダーゼ、エステラーゼ、アシラーゼおよびリパーゼがある。
ところで、前記有機高分子が第一水溶液中の成分との反応に伴ってゲル化するものであるとき、第一水溶液に第二水溶液からなる滴を加えると、滴が第一水溶液を取り込んで粒子状にゲル化する。従って、上記の酵素による基質の加水分解反応は、有機高分子ゲル粒子の中で徐々に進行する。すなわち、ゲル粒子の内部およびゲル粒子の近傍でのみリン酸カルシウムが沈殿し、結果としてゲル粒子の形状を反映した中空球状のリン酸カルシウムが生成する。従って、第二水溶液からなる滴の直径により、得られるリン酸カルシウムの粒径が決まるので、粒径を容易に制御することができる。また、粒子の殻の厚みは、反応時間を加減することによって制御することができる。
【０００７】
第一水溶液は、カルシウムイオンを望ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、特に望ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌ、およびリン酸イオンを望ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、特に望ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌの範囲で含み、かつカルシウムとリン酸のモル比が望ましくは０．５：１〜１０：１、特に望ましくは１：１〜３：１の範囲にあり、ｐＨが望ましくは２〜６、特に望ましくは３〜５の範囲にある。カルシウムイオンとリン酸イオンの濃度がこれより高い場合には水溶液の調製が困難であり、少ない場合には十分な量のリン酸カルシウムを得ることができない。また、ｐＨが上記の範囲より低い（酸性）と、酵素の失活を招き、高いとカルシウムイオンとリン酸イオンを十分に溶解させることができない。
上記の反応によって十分な量のリン酸カルシウムを生成するには、基質をカルシウムイオンに対してモル比で０．１倍〜１００倍、望ましくは１倍から１０倍の範囲で存在するのが好ましい。
【０００８】
前記有機高分子がアルギン酸塩もしくはアルキルセルロース誘導体の塩であるとカルシウムイオンとの反応によりゲル化するので好ましい。また有機高分子がアルブミンであると穏やかな加熱により、寒天あるいはゼラチンであると冷却によりゲル化する。このように有機高分子が外部からのエネルギー付与に伴ってゲル化するものであるときは、その方法で予めゲル化させた後に第一水溶液に加えると良い。更にまた、有機高分子がペクチン酸である場合には糖との反応により、有機高分子がカラゲナンである場合には冷却しながらのカリウムイオンとの反応によりゲル化する。これらの場合は、第一水溶液に糖あるいはカリウムイオンを予め添加しておけばよい。尚、糖は沈殿物生成後に焼成することにより除去可能である。また、カリウムイオンについては、製造される球状リン酸カルシウムの用途が、カリウムが残っていても支障のないものであれば除去する必要はない。
【０００９】
第二水溶液は、前記有機高分子を望ましくは０．１〜１０重量％、特に望ましくは１〜５％、前記酵素を第二水溶液全体に対して重量比で望ましくは１００万分の１〜１００分の１、特に望ましくは５万分の１〜５０００分の１含む。有機高分子の濃度が０．１重量％より低いとゲル化しにくいし、１０重量％より高いと溶解しにくいからである。
得られた沈殿物は、乾燥後に焼成することにより、沈殿物の結晶化が進んで化学的耐久性が増すので好ましい。焼成後にできる結晶相は、第一水溶液中のカルシウムイオンとリン酸イオンとのモル比で決まる。可能な結晶相としては、例えば水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、リン酸３カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、リン酸８カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）、リン酸２カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）などが挙げられる。
酵素の最適示活性温度は、酵素の種類および起源によって異なるが、通常の場合３０〜４０℃である。ただし、６０℃以上あるいは２０℃以下に最適示活温度をもつ酵素もあるので、本発明では特に温度は指定しない。
【００１０】
第一水溶液に第二水溶液からなる滴を加える手段としては、スポイトによる滴下や噴霧などの他、振動オリフィス法が挙げられる。振動オリフィス法は、超音波振動させた孔径数十μｍ程度のオリフィスから第二水溶液を噴出させるものである。この方法によれば液滴の粒径は、下記式によって決められ、振動周波数や第二水溶液濃度を制御することにより、粒径の揃った微小な液滴を作成することができるものである。
ｄ＝｛（６ＱＣ）／（πｆ）｝１／３
ｄ：粒径
Ｑ：溶液の流速（噴出速度）
Ｃ：溶液中の溶質の体積濃度
ｆ：振動周波数（Ｈｚ）
【００１１】
【実施例】
−実施例−
硝酸カルシウム０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、リン酸２水素アンモニウム０．０１５ｍｏｌ／Ｌ、尿素０．０３３ｍｏｌ／Ｌを含むｐＨ＝４．０の水溶液（第一水溶液）を３００ｍＬ調製した。次にアルギン酸アンモニウム０．３ｇ、ウレアーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ由来）１．０ｍｇを含むゾル状の水溶液（第二水溶液）を１０ｍＬ調製し、これを第一水溶液に注射器で滴下した。滴下された液滴は、およそ３秒後に直径約２ｍｍの球状のゲル粒子になった。滴下終了後、溶液を３７℃の恒温槽に入れ、４８時間保持した。４８時間の保持の間、ゲル粒子は徐々に白色を呈した。その後、ゲル粒子を取り出し、乾燥したところ、直径約１ｍｍの粒子になった。乾燥ゲル粒子の走査型電子顕微鏡写真を図１に示す。これを６００℃で３時間焼成した後に、粒子を破断して顕微鏡で観察したところ、殻の厚さが約１５０ミクロンの中空球であった。また粉末Ｘ線回折測定の結果、この粒子は水酸アパタイトであることがわかった。
【００１２】
−比較例１−
実施例１と同様に第一水溶液を３００ｍＬ調製した。次にアルギン酸アンモニウム０．３ｇを１．０ｍｏｌ／Ｌのアンモニア水１０ｍＬに溶解し、この溶液を実施例１と同様に第一水溶液に滴下したところ、液滴が第一水溶液に接触すると同時に液滴界面でリン酸カルシウムが析出し、そのまま固化した。液滴は球形にゲル化することができず、ヒトデのように不規則な形状であった。
【００１３】
−比較例２−
硝酸カルシウム０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、リン酸２水素アンモニウム０．０１５ｍｏｌ／Ｌを含むｐＨ＝４．０の水溶液を３００ｍＬ調製した。次にアルギン酸アンモニウム０．３ｇを尿素２．０ｍｏｌ／Ｌを含む１０ｍＬの水に溶かし、ウレアーゼ１．０ｍｇを加えて撹拌した後に前者の水溶液に注射器で滴下した。滴下された液滴は、およそ３秒後に直径約２ｍｍの球状のゲル粒子になった。滴下終了後、溶液を３７℃の恒温槽に入れ、４８時間保持した。その後粒子を取り出し、乾燥したが、リン酸カルシウムの生成量が不十分であったため、乾燥時に粒子が扁平に変形した。
【００１４】
【発明の効果】
以上の通り、この発明によれば所望の粒径の球状リン酸カルシウムを製造することができるので、種々の用途に最適のリン酸カルシウム粒子を提供することができ、例えばクロマトグラフィーの性能、骨充填材や人工骨の特性、担体特性の著しい向上に資する。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例の球状リン酸カルシウム粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１】
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