(57)【要約】【課題】ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法および該ポリペプチドを利用したヒアルロン酸の製造方法を提供すること。【解決手段】ヒアルロン酸合成酵素の細胞質内ループを形成する領域とそのＣ末端側に隣接する直近の膜貫通領域とからなるヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸合成酵素の細胞質内ループを形成する領域とそのＣ末端側に隣接する直近の膜貫通領域とからなるヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
（Ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性及びグルクロン酸転移酵素活性を有する、ヒアルロン酸合成酵素の細胞質内ループを形成する領域と、（Ｂ）オリゴ糖伸長作用を有する、（Ａ）のＣ末端側に隣接する直近の膜貫通領域からなる、請求項１記載のヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
ヒアルロン酸合成酵素が哺乳動物由来のヒアルロン酸合成酵素である請求項１又は２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４】
ヒアルロン酸合成酵素がヒアルロン酸合成酵素−２である請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
ヒアルロン酸合成酵素−２がヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２である請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性及びグルクロン酸転移酵素活性を有し、かつオリゴ糖伸長作用を有するポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて少なくとも１つのアミノ酸が、置換、挿入、削除、又は付加されている請求項６又は７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドと異種蛋白質との融合蛋白質。
【請求項１０】
異種蛋白質が糖結合蛋白質である請求項９に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
糖結合蛋白質がマルトース結合蛋白質である請求項１０に記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドあるいは請求項９〜１１のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の遺伝子を発現可能に含んでなる発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターにより宿主細胞を形質転換した形質転換細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換細胞を培養し、該培養物からヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸共存下、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドあるいは請求項９〜１１のいずれかに記載の融合蛋白質を作用させることにより、ヒアルロン酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを発現するためのベクターおよび該ベクターで形質転換された形質転換体より該ポリペプチドを製造する方法に関する。また、本発明はヒアルロン酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」ともいう）は、高分子量のグルコサミノグリカンであり、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位（ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ：ＧｌｃＡはグルクロン酸を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す）のβ１，４結合による繰り返しからなる直鎖状の多糖である。ＨＡは、脊椎動物において、硝子体、皮膚、靭帯など様々な組織の細胞外マトリックス成分として幅広く存在することが知られている。ＨＡは、他の細胞外マトリックス成分とともに３次元構造の形成に働き、組織の水分保持や柔軟性の維持のような構造物として機能ばかりでなく、ＨＡ結合蛋白質とともに細胞表面受容体との相互作用により、細胞の接着、遊走、分化などの細胞の挙動を調節するとともに、形態形成、創傷治癒、癌の浸潤、転移などの現象にも関与している。
【０００３】
ヒアルロン酸の生合成に関しては、原核生物であるストレプトコッカス属菌を用いた研究が広く行われており、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓからはじめてヒアルロン酸合成酵素遺伝子が単離された（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，　Ｐ．　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６８，　１９１８１　（１９９３））。その後、真核生物である哺乳動物からもヒアルロン酸合成酵素（以下、「ＨＡＳ」ともいう）遺伝子が単離された。最初、ＨＡＳ１（Ｉｔａｎｏ，　Ｎ．　ｅｔａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７１，　９８７５　（１９９６）、Ｉｔａｎｏ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２２２，　８１６　（１９９６）、特開平９−２２４６７４号、ＷＯ９７／３８１１３号、ＷＯ９７／４０１７４号）が単離され、その後ＨＡＳ２（Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７１，　２２９４５　（１９９６）、Ｓｐｉｃｅｒ，　Ａ．　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７１，　２３４００　（１９９６）、ＷＯ９８／００５５１号）、ＨＡＳ３（Ｓｐｉｃｅｒ，　Ａ．　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７２，　８９５７　（１９９７）、ＷＯ９８／００５５１号）が次々に単離された。これらは相同性が高く、ファミリーを形成していると考えられている。また、これら以外にもＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ（Ｋｕｍａｒｉ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７２，　３２５３９　（１９９７）、ＷＯ９９／２３２２７号）やＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，　Ｐ．　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７３，　８４５４　（１９９８）、ＷＯ９９／５１２６５号）などからもＨＡＳ遺伝子がクローニングされた。さらに、既知の遺伝子の中にも上記ＨＡＳと相同性の高いものが存在し、アフリカツメガエルのＤＧ４２（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，　Ｐ．　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７１，　２３６５７　（１９９６））あるいはクロレラ様の緑藻に感染するＰＢＣＶ−１ウィルスのＡ９８Ｒ（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，　Ｐ．　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２７８，　１８００　（１９９７））にＨＡＳ活性があることが報告されている。
【０００４】
これまでにクローニングされたＨＡＳは、そのアミノ酸配列と生化学的解析から、少なくとも２種の異なったＨＡＳのクラスに分類することができると推定されている（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，　Ｐ．　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ．　Ｍｏｌｅｃ．　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．，　５６，　６７０　（１９９９））。それによると、クラス２に含まれるＨＡＳはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ由来のものだけであり、それ以外はクラス１に分類されている。クラス１に属するＨＡＳは細胞質膜に存在し、そのトポロジカルな特徴として、Ｎ末端側、Ｃ末端側の双方に複数の膜貫通領域を有しており、中間の部分は細胞質側にループ状で存在するとされている。また、細胞質側のループ状の部分にヒアルロン酸合成に必要なＮ−アセチルグルコサミン転移酵素およびグルクロン酸転移酵素活性を有する領域が存在していることがマウス由来のＨＡＳ１を例に報告されている（Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７５，　４９７　（２０００））。また、特開２０００−４８８６号ではマウス由来ＨＡＳ１、２、３のＮ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域をそれぞれ適当に組み合わせることにより、ＨＡＳ活性が変化したキメラ蛋白質を作製できることを開示している。しかし、その際内部領域以外の領域にどのような機能があるかについては何ら考察されていない。
【０００５】
これまでの生化学的な解析はこのループ状の部分について行われたものばかりであり、それ以外の部分については行われていない。上記ループ状の部分にＮ−アセチルグルコサミン転移酵素およびグルクロン酸転移酵素活性があることは確認されているが、ヒアルロン酸の合成はこの部分のみで十分なのかそれとも他の部分も必要なのかは全くわかっていない。もしヒアルロン酸合成酵素蛋白質中でヒアルロン酸合成酵素活性発現に必要最小限の領域が明らかになれば、ヒアルロン酸の生合成機構解明に大いに役立つ。
【０００６】
さらに、哺乳動物由来のＨＡＳとしてはＤＧ４２が酵母で発現されている以外はＣＯＳ−１細胞などの動物細胞による発現しか行われておらず、大量生産に有利な大腸菌などの微生物、特に原核生物での発現はこれまでのところ報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、ヒアルロン酸合成酵素におけるヒアルロン酸合成に必要な領域を解明するとともに、上記領域を有するポリペプチドを大量に安価に製造する方法を提供すること、また、該ポリペプチドを用いたヒアルロン酸の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決することを主な目的として鋭意検討した結果、ヒアルロン酸合成酵素が非常に速い速度で高分子量のヒアルロン酸を合成できるためには、単にヒアルロン酸合成酵素蛋白質中にＮ−アセチルグルコサミン転移酵素活性とグルクロン酸転移酵素活性が存在するだけでは不充分で、同じヒアルロン酸を基質とし、ヒアルロン酸の加水分解作用以外に糖転移作用も有するヒアルロニダーゼ（Ｓａｉｔｏｈ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７０，　３７４１　（１９９５））と共通する領域があるのではないかという仮説をたて、数種類のヒアルロニダーゼとヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２をマルチプルアラインメントにより解析した。その結果、ヒアルロン酸合成酵素における細胞質内ループ状部分のＣ末端側部分とそれに隣接する直近の膜貫通領域にヒアルロニダーゼと相同性の高い領域があることを発見した。さらに、本発明者らは、細胞質内ループ状部分のみを有するポリペプチドと、細胞質内ループ状部分と上記膜貫通部分からなるポリペプチドを、遺伝子組換え技術を利用して調製して解析した。その結果、細胞質内ループ状部分のみからなるポリペプチドにはＨＡＳ活性がないが、細胞質内ループ状部分と上記膜貫通部分からなるポリペプチドにＨＡＳ活性があり、ヒアルロン酸合成活性には少なくとも細胞質内ループ状部分とそれに隣接するＣ末端側直近の膜貫通領域が必要であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成に至ったものである。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１０】
項１：ヒアルロン酸合成酵素の細胞質内ループを形成する領域とそのＣ末端側に隣接する直近の膜貫通領域とからなるヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
【００１１】
項２：（Ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性及びグルクロン酸転移酵素活性を有する、ヒアルロン酸合成酵素の細胞質内ループを形成する領域と、（Ｂ）オリゴ糖伸長作用を有する、（Ａ）のＣ末端側に隣接する直近の膜貫通領域からなる、項１記載のヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
【００１２】
項３：ヒアルロン酸合成酵素が哺乳動物由来のヒアルロン酸合成酵素である項１又は２のいずれかに記載のポリペプチド。
【００１３】
項４：ヒアルロン酸合成酵素がヒアルロン酸合成酵素−２である項３記載のポリペプチド。
【００１４】
項５：ヒアルロン酸合成酵素−２がヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２である項４記載のポリペプチド。
【００１５】
項６：配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
【００１６】
項７：配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性及びグルクロン酸転移酵素活性を有し、かつオリゴ糖伸長作用を有するポリペプチド。
【００１７】
項８：配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて少なくとも１つのアミノ酸が、置換、挿入、削除、又は付加されている請求項６又は７のいずれかに記載のポリペプチド。
【００１８】
項９：　項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドと異種蛋白質との融合蛋白質。
【００１９】
項１０：　異種蛋白質が糖結合蛋白質である項９に記載の融合蛋白質。
【００２０】
項１１：　糖結合蛋白質がマルトース結合蛋白質である項１０に記載の融合蛋白質。
【００２１】
項１２：　項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドあるいは項９〜１１のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする遺伝子。
【００２２】
項１３：　項１２に記載の遺伝子を発現可能に含んでなる発現ベクター。
【００２３】
項１４：　項１３に記載の発現ベクターにより宿主細胞を形質転換した形質転換細胞。
【００２４】
項１５：　項１４に記載の形質転換細胞を培養し、該培養物からヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする組換えポリペプチドの製造方法。
【００２５】
項１６：　ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸共存下、項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドあるいは項９〜１１のいずれかに記載の融合蛋白質を作用させることにより、ヒアルロン酸を製造する方法。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００２７】
ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、ヒアルロン酸合成酵素の細胞質内ループを形成する領域と、そのＣ末端側に隣接する直近の膜貫通領域とからなるポリペプチドである。
【００２８】
本発明におけるヒアルロン酸合成酵素は、ヒアルロン酸合成活性を有し、Ｎ末端側およびＣ末端側にそれぞれ複数の膜貫通領域を有し、その中間に細胞質内ループを形成する領域を有するものであれば、特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、例えば、キセノポス　ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）由来ヒアルロン酸合成酵素ＤＧ４２、マウス由来ヒアルロン酸合成酵素１、２又は３、又は、ヒト由来ヒアルロン酸合成酵素１、２又は３などが挙げられる。
【００２９】
中でもヒアルロン酸合成酵素２が好ましい。さらに、ヒト由来のヒアルロン酸合成酵素２が好ましい。
【００３０】
ヒアルロン酸合成活性とは、ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと略することがある）およびウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸　（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＡと略することがある）を糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位（ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ：ＧｌｃＡはグルクロン酸を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す）のβ１，４結合による繰り返し構造を有する多糖あるいはオリゴ糖を合成する能力をいう。
【００３１】
もう一つの本発明のポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるが、該ポリペプチドは配列番号４を有するヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２においてアミノ酸番号６７〜４１４で示されるポリペプチドに相当し、該ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸が、置換、挿入、削除、又は付加されていても構わない。
【００３２】
また、本発明のポリペプチドは上記直近の膜貫通領域にさらにＣ末端側に存在する複数の膜貫通領域の一部、例えば２番目の膜貫通領域など、が付加されていても構わない。
【００３３】
ヒアルロン酸合成酵素のトポロジーは、例えばＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法によるハイドロパシープロットにより推定できる。
【００３４】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２において、Ｎ末端側の膜貫通領域と細胞質内ループを形成する領域との境はアミノ酸番号６０〜７０付近、細胞質内ループを形成する領域とＣ末端側の膜貫通領域との境はアミノ酸番号３８１〜３８７付近、最初の膜貫通領域と次の膜貫通領域との境はアミノ酸番号３９６〜４０５付近にあると推定される。
【００３５】
また、マウス由来ヒアルロン酸合成酵素−１では、それぞれアミノ酸配列のＮ末端から６９番目〜７６番目付近、４０９番目〜４１７番目付近、４２６番目〜４３４番目付近に存在すると推定される。
【００３６】
マウス由来ヒアルロン酸合成酵素−３では、それぞれアミノ酸配列のＮ末端から５９番目〜６８番目付近、３８５番目〜３９１番目付近、４００番目〜４０９番目付近に存在すると推定される。
【００３７】
ヒアルロン酸合成酵素において、細胞質内ループを形成する領域のＣ末端付近からそれに隣接する直近の膜貫通領域にかけ、ヒアルロニダーゼと相同性の高い領域が存在する（図１）。
【００３８】
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を加水分解する酵素であるが、ヒアルロン酸オリゴマーを糖供与体とする糖転移反応も触媒する機能も有する。
【００３９】
細胞質内ループ部分のみを有するポリペプチドでは、ヒアルロン酸合成活性はないが、細胞質内ループ部分にこの相同性の高い領域が加わったポリペプチドでは、ヒアルロン酸合成活性が発現する。
【００４０】
従って、この相同性の高い領域は、細胞質内ループ部分で合成されたヒアルロン酸オリゴマーを、さらにヒアルロニダーゼと同様の糖転移作用により、より鎖長の長いヒアルロン酸を合成する機能を有していると考えられる。また、ヒアルロン酸は細胞質内で生合成された後、細胞外へ排出されることが知られており、この領域がヒアルロン酸の細胞外への輸送に直接関わる、あるいは輸送に関わる蛋白質と相互作用を持つことによって間接的に関わることにより、合成されたヒアルロン酸をスムーズに排出し、ヒアルロン酸の合成を促進しているとも考えられる。さらに、この領域にはヒアルロン酸と結合する部位が存在し、合成されつつあるヒアルロン酸と結合することによりヒアルロン酸合成酵素とより長時間緊密に合成途上のヒアルロン酸が接触し、Ｎ−アセチルグルコサミン転移反応やグルコサミン転移反応が同一基質上でより高度に繰り返し進行し、高分子量のヒアルロン酸を合成されるとも考えられる。
【００４１】
融合蛋白質
本発明のポリペプチドは上記ポリペプチドと異種蛋白質との融合蛋白質でもある。一般に、遺伝子組換え手法を利用して、ポリペプチドを生産するときには、その発現に適した発現ベクターを利用するが、利用する発現ベクターによっては、意図したポリペプチドは発現ベクターに応じて異種蛋白質との融合蛋白質の形で発現されることがしばしばある。これは、発現したポリペプチドがインクルージョンボディになるのを防いだり、発現したポリペプチドの検出や精製を容易にするためである。該異種蛋白質は、上記ポリペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側いずれに適当なペプチドあるいは蛋白質が連結されていても構わないが、好ましくはＮ末端側に連結されたものであり、さらに好ましくは異種蛋白質と上記ポリペプチドとの融合部位に酵素学的または化学的手段により容易に切断できる構造を有するものである。
【００４２】
異種蛋白質は時としてペプチドであるときもしばしばある。異種蛋白質としては、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、グリーン蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）、チオレドキシン（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）、糖結合蛋白質、また次のアミノ酸配列で表されるペプチドＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（アミノ酸一文字表記でＨＨＨＨＨＨ）、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ）、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ）、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（ＭＫＤＧＥＥＹＳＲＡＦＲ）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（ＣＴＰＴＤＶＰＤＹＡＳＬ）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ）、Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＴＤＦＹＬＫ）、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（ＰＰＥＰＥＴ）、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）、Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）などが挙げられる。中でも糖結合蛋白質が好ましい。
【００４３】
糖結合蛋白質とは、単糖類並びに糖残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持する蛋白質であって、例えば、各種レクチン、マルトース結合蛋白質、セルロース結合蛋白質、キチン結合蛋白質などが例示できる。好ましくは、マルトース結合蛋白質、セルロース結合蛋白質、キチン結合蛋白質等であり、より好ましくは、マルトース結合蛋白質（以下ＭＢＰと省略することがある。）である。
【００４４】
糖結合蛋白質は、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。また、該ＭＢＰは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有する限り、必ずしも全配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであってもよい。
【００４５】
ポリペプチド又は融合蛋白質の製造方法
本発明において、上記ポリペプチドあるいは融合蛋白質は、上記ポリペプチドあるいは融合蛋白質をコードするＤＮＡが、上記性質を有する形で転写・翻訳されるように挿入された発現ベクターで、宿主を形質転換し、得られた形質転換体を適当な培地中で培養し、得られた培養物より採取することにより、得ることができる。
【００４６】
宿主細胞としては、大腸菌、酵母、細菌などの微生物細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞やアラビドプシス細胞などの植物細胞などが挙げられる。ポリペプチドの場合には、宿主細胞として動物細胞を用いることが好ましく、上記融合蛋白質の場合、宿主としては大腸菌などの微生物細胞が好ましい。
【００４７】
ベクターとしては、形質転換する宿主に応じて、種々のものが利用できる。例えば、大腸菌では、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＵＣ１９など、酵母では、ｐＹＥＵｒａ３ＴＭなど、昆虫細胞では、ｐＢＬＵＥ　Ｂａｃ４など、ＣＯＳ−１細胞ではｐＳＶＫ３、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＣＭＶ２など、アラビドプシス細胞ではｐＢＩなどが挙げられる。
【００４８】
上記ポリペプチドをコードするＤＮＡは、公知のヒアルロン酸合成酵素遺伝子の配列（例えば、ヒトＨＡＳ２の場合Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７１，　２２９４５　（１９９６））　に基づいて、公知のいかなる手法によっても調製することができる。例えば、公知のヒアルロン酸合成酵素をコードする領域の全部または一部をカバーする適当なオリゴヌクレオチドプライマー対を合成し、ヒアルロン酸合成能を有する細胞あるいは組織より得られたｃＤＮＡライブラリーを鋳型にＰＣＲを行うことによりクローニングできる。このとき、その後のベクターヘのクローニングを容易にするために、用いるオリゴプライマーの末端に適当な制限酵素認識配列を付加することもできる。
【００４９】
あるいは、公知のヒアルロン酸合成酵素遺伝子配列をもとに適当なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いてヒアルロン酸合成酵素を発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーをプラーク（またはコロニー）ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００５０】
さらに、ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡは、部分または完全精製されたヒアルロン酸合成酵素の全部または一部を抗原として常法により抗体を作製し、これを用いてヒアルロン酸合成酵素を発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーを抗体スクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００５１】
あるいは、当該ＤＮＡは、公知のヒアルロン酸合成酵素遺伝子配列をもとにＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて、センス鎖の部分配列とアンチセンス鎖の部分配列を一部がオーバーラップするように合成し、ＰＣＲ法によってより長い部分配列を二本鎖ＤＮＡとして得るという操作を繰り返すことによって、所望のＤＮＡ配列を得ることもできる。
【００５２】
本発明において、上記ポリペプチドと融合蛋白質を形成する適当なペプチドあるいは蛋白質をコードするＤＮＡは、上述のペプチドあるいは蛋白質をコードするＤＮＡが例示され、好ましくは上述の各種糖結合蛋白質をコードするＤＮＡが例示される。
【００５３】
各種糖結合蛋白質をコードするＤＮＡとしては、マルトース結合蛋白質、セルロース結合蛋白質またはキチン結合蛋白質をコードするＤＮＡが例示され、好ましくは、マルトース結合蛋白質をコードするＤＮＡである。また、該ＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
【００５４】
また、該ＭＢＰをコードするＤＮＡは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。同様に、糖結合蛋白質は、結合する糖に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。例えば、ＭＢＰをコードする遺伝子としてｐＭＡＬ−ｐ２あるいはｐＭＡＬ−ｃ２（共にＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）に由来するものを使用することができる。
【００５５】
例えば、公知のヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２遺伝子の配列をもとに、該酵素をコードする領域全てをカバーでき、かつその末端に制限酵素認識配列を有する配列番号５および６で示されるオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ヒト小腸由来大腸菌組換え型ｃＤＮＡライブラリーより抽出したプラスミドを鋳型にＰＣＲを行うことにより、ヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２をコードするｃＤＮＡを得る。次いで、配列番号７および８に示されるオリゴヌクレオチドを合成し、該ｃＤＮＡをサブクローニングしたプラスミドを鋳型にＰＣＲを行い、目的とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得る。このｃＤＮＡをｐＭＡＬ−ｐ２に挿入することにより、目的とする融合蛋白質の発現ベクターを得ることができる。
【００５６】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、遺伝子工学分野で通常用いられる方法で行うことができる。例えば、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、コンピテント法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００５７】
本発明のポリペプチドあるいは融合蛋白質は、上述の方法で得られた形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物より採取することにより得ることができる。
【００５８】
例えば、上述のｐＭＡＬ−ｐ２から得られた発現ベクターで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株の場合、用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものが好適であり、無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，カゼインの加水分解物，酵母抽出物，ポリペプトン，パクトトリプトン，ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源および窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源［例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム，リン酸水素二カリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン，カナマイシン）など］を培地中に添加してもよい。
【００５９】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適にはｐＨ６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で、１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。
【００６０】
また、融合蛋白質の発現が誘導蛋白質遺伝子のプロモーター系によって制御されるので、誘導物質を添加する必要がある。添加時期は培養開始時でもよいが、対数増殖期初期が好ましい。誘導物質の添加濃度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類などによって適宜変更することができる。
【００６１】
本発明の融合蛋白質は、得られた菌体をリゾチーム処理、超音波破砕などの方法により破砕し、遠心分離することにより無細胞抽出液を得、さらに無細胞抽出液を超遠心分離することにより、膜画分として得ることができる。
【００６２】
また、得られた膜画分より、ジキトキニンやＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）などの界面活性剤を用いて、可溶化し、通常の精製方法により精製することもできる。精製方法としては、例えば硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどによる塩析、遠心分離、透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などが挙げられ、これらを適当に組み合わせることにより精製することができる。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、ヒアルロン酸合成酵素活性に必要な最小限の領域からなるものであって、全長のヒアルロン酸合成酵素と比べて、ポリペプチドのサイズが小さく、特に疎水性の高い領域が減少している。これにより、ポリペプチドの製造におけるインクルージョンボディ（生理活性のない不溶性タンパク質）の形成が抑えられ、再生用緩衝液での希釈工程や、活性を有する立体構造に再び戻すリフォールディング工程における生産効率の低下が抑制される。また、プラスミドへの挿入サイズが小さくなるので、全体としての発現プラスミドのサイズが小さくなり、細胞内での安定性が高まって、発現効率も向上する。
【００６４】
本発明によって、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドが、効率よく、大量に取得できる。
【００６５】
ヒアルロン酸製造方法
本発明において、ヒアルロン酸は上述の方法により製造された本発明のポリペプチドあるいは融合蛋白質を適当な緩衝液中、１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１〜１２０時間、好ましくは５〜７２時間、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＡと接触させることにより製造される。用いることのできる緩衝液としては中性付近、好ましくはｐＨが６〜９、さらに好ましくはｐＨが７〜８に調整し得るものであれば特に制限はないが、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などが挙げられる。また、反応液中にマグネシウムイオン、マンガンイオンなどの２価金属イオンや反応液を還元的な雰囲気に保つためにジチオスレイトールや２−メルカプトエタノールなどのチオール化合物を加えても構わない。さらに、反応液中にＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＡあるいはヒアルロン酸オリゴマーを受容体として加えても構わない。合成されたヒアルロン酸は一般的な分離精製方法、例えば、透析、ゲルろ過クロマトグラフィーを含む各種カラムクロマトグラフィーなど、により単離することができる。
【００６６】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにかかる実施例により限定されるものではない。
【００６７】
実施例１　ヒト由来ＨＡＳ２をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト小腸由来大腸菌組換え型ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造社製）を約５０００個ずつ９６穴マイクロプレートに培養し、各ウェルのプラスミドをアルカリＳＤＳ法により抽出した。既に報告されている配列番号３記載のヒトヒアルロン酸合成酵素２（ｈｕｍａｎ　ＨＡＳ２：Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７１，　２２９４５　（１９９６））ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号５、及び６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。配列番号５に示す塩基配列は配列番号３に示される塩基配列中１〜２８で示される塩基配列の５’末端にＢａｍＨＩ認識部位が付加された配列を含み、配列番号６に示す塩基配列は配列番号３に示される塩基配列中１６４５〜１６５６で示される塩基配列の３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識部位が付加された配列に相補的な配列を含む。これらオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、上記プラスミドを鋳型に、Ｅｘｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、目的とするサイズのＰＣＲ産物を有するウェルを選取した。更に同様の操作により大腸菌のシブリングセレクションを３回行い、最終的に５０クローンより成るプラスミドに絞りこんだ。該プラスミドを鋳型に、配列番号５および６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ｅｘｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、３０サイクルのＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法により決定したところ、配列番号３で示される配列を含んでいることが確認された。ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、切断断片をアガロース電気泳動により精製した。
一方、プラスミドｐＭＡＬ−ｐ２ｘ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）も制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、切断断片をアガロース電気泳動により精製した。これら断片をライゲーションさせ、プラスミドｐｈＨＡＳ２ＯＲＦＭＡＬｐ２ｘを得た。
【００６８】
実施例２　ｈｕｍａｎ　ＨＡＳ２の細胞内ループ部分および膜貫通部分からなるポリペプチド断片をコードするｃＤＮＡの取得
配列番号７に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号１に示される塩基配列中１〜２８（配列番号３に示される塩基配列中１９９〜２２６に相当する）で示される塩基配列の５’末端にＢａｍＨＩ認識部位が付加された配列を含み、後者は配列番号１に示される塩基配列中１０３２〜１０４４（配列番号３に示される塩基配列中１２３０〜１２４２に相当）で示される塩基配列の３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識部位が付加された配列に相補的な配列を含むように調整した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、実施例１で得たプラスミドｐｈＨＡＳ２ＯＲＦＭＡＬｐ２ｘを鋳型にＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法により決定したところ、配列番号１で示される塩基配列中１〜１０４４（配列番号３で示される塩基配列中１９９〜１２４２に相当）で示される塩基配列を含んでいることが確認された。
【００６９】
実施例３　ｈｕｍａｎ　ＨＡＳ２の細胞内ループ部分からなるポリペプチド断片をコードするｃＤＮＡの取得
配列番号７に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。後者は配列番号１に示される塩基配列中９２１〜９３３（配列番号３に示される塩基配列中１１１９〜１１３１に相当）で示される塩基配列の３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識部位が付加された配列に相補的な配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、実施例１で得たプラスミドｐｈＨＡＳ２ＯＲＦＭＡＬｐ２ｘを鋳型にＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法により決定したところ、配列番号１で示される塩基配列中１〜９３３（配列番号３で示される塩基配列中１９９〜１１３１に相当）で示される塩基配列を含んでいることが確認された。
【００７０】
実施例４　発現ベクターｐｈＨＡＳ２ＰＳＭＡＬｐ２ｘの構築
実施例２で得たＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、切断断片をアガロース電気泳動により精製した。一方、プラスミドｐＭＡＬ−ｐ２ｘ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）も制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、切断断片をアガロース電気泳動により精製した。これら断片をライゲーションさせ発現ベクターｐｈＨＡＳ２ＰＳＭＡＬｐ２ｘを得た。
【００７１】
実施例５　発現ベクターｐｈＨＡＳ２ＣａｔａＭＡＬｐ２ｘの構築
実施例３で得たＰＣＲ産物を用いて、実施例４と同様にして、発現ベクターｐｈＨＡＳ２ＣａｔａＭＡＬｐ２ｘを得た。
【００７２】
実施例６　融合蛋白質の調製
常法に従い、実施例１、４あるいは５で得た発現ベクターｐｈＨＡＳ２ＯＲＦＭＡＬｐ２ｘ、ｐｈＨＡＳ２ＰＳＭＡＬｐ２ｘ及びｐｈＨＡＳ２ＣａｔａＭＡＬｐ２ｘで大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転換した。形質転換体を０．２％　ｇｌｕｃｏｓｅおよび１００μｇ／ｍｌ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢ培地５ｍｌの入った試験管に一白金耳植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液０．７５ｍｌを上記培地７５ｍｌの入った坂口フラスコに植菌した。３７℃で振とう培養し、培養液の６００ｎｍにおける吸光度が０．６−０．８に達した時点で、終濃度１００μＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３７℃で４時間培養を続けた。
【００７３】
菌体を遠心分離により集め、２ｍｌの３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、２０％ショ糖、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）で菌体を懸濁し、リゾチーム処理し、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、沈殿を集めた。沈殿を上記緩衝液２ｍｌで懸濁し、超音波にて細胞壁を破砕した後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を得た。上清をさらに、４３，０００ｒｐｍ　（１００，０００×ｇ）で１時間超遠心を行い、融合蛋白質が局在する膜画分を集め、０．２ｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．４）に懸濁した。得られた膜画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウェスタンブロッティングを行うことによって目的物であるＭＢＰ融合蛋白質の発現の確認を行った。目的融合蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ではクマシーブリリアントブルー染色にて、ウェスタンブロッティングは一次抗体として抗ＭＢＰウサギ抗血清、二次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗ウサギヤギＩｇＧを使用し、コニカイムノステイニングキット（コニカ社製）により検出した。形質転換体Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ｐｈＨＡＳ２ＰＳＭＡＬｐ２ｘ）および形質転換体Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ｐｈＨＡＳ２ＣａｔａＭＡＬｐ２ｘ）から得られた膜画分には目的とする融合蛋白質が発現していることが確認されたが、形質転換体Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ｐｈＨＡＳ２ＯＲＦＭＡＬｐ２ｘ）から得られた膜画分には発現は確認されなかった。超音波破砕後の細胞破砕液を用いて同様に融合蛋白質の発現を調べたが、発現は認められなかった。発現ベクターの欠落あるいは挿入断片の欠落など細胞内での発現ベクタアーの安定性に問題があったものと考えられる。形質転換体Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ｐｈＨＡＳ２ＰＳＭＡＬｐ２ｘ）から得られた膜画分を膜画分Ａ、形質転換体Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ｐｈＨＡＳ２ＣａｔａＭＡＬｐ２ｘ）から得られた膜画分を膜画分Ｂとした。膜画分に含まれる蛋白質量は、牛血清アルブミンを標準として、ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）により測定した。
【００７４】
実施例７　ヒアルロン酸合成酵素活性の測定
蛋白質として０．５ｍｇ含む実施例６で得た膜画分ＡあるいはＢ、１ｍＭジチオスレイトール、２０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラ酢酸、１５％グリセロール、０．５ｍＭウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡと略する）、０．５ｍＭウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと略する）、０．１μＭ　ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ、０．２４μＭ　ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、グルクロン酸１２５μｇを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを３７℃で１時間インキュベーションすることにより反応させた。反応後、反応液を１０分間煮沸させることにより反応を停止させた。反応液を二分して、片方に０．５単位のストレプトコッカス　ジスガラクティアーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）由来ヒアルロニダーゼ（生化学工業社製）を添加し、３０℃で４時間さらにインキュベーションした。１０分間煮沸させることによりヒアルロニダーゼを失活させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＨＲ１０／３０　（アマシャムファルマシア社製）　カラムクロマトグラフィー（溶出液：０．２Ｍ酢酸アンモニウム）で、０．５ｍｌずつ分画し、各画分の放射活性を測定した。結果は図２に示した。その結果、膜画分Ａを用いた反応液からは、ヒアルロニダーゼで低分子化される産物が観察され、ヒアルロン酸合成活性があることが確認された。一方、膜画分Ｂを用いた反応液からはそのような産物は観察されず、ヒアルロン酸合成活性は確認されなかった。
【００７５】
【発明の効果】
上述したように、本発明によりヒアルロン酸合成活性を有したヒアルロン酸合成酵素断片であるポリペプチドを得ることができ、該ポリペプチドはヒアルロン酸合成機構の解明に有用である。また、本発明により前記ポリペプチドの発現ベクターおよび該発現ベクターにより形質転換された形質転換体を得ることができ、これらを利用することにより、ヒアルロン酸合成活性を有したポリペプチドを安価に大量に得ることができる。また、該ポリペプチドを利用してヒアルロン酸を容易に得ることができる。
【００７６】
【配列表】
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2004000026.tif 000004
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2004000026.tif 000013
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒト由来ＨＡＳ２と各種ヒアルロニダーゼとをマルチプルアライメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を行ったときの、相同性が高い部分として得られた領域を示す図面である。
【図２】
図２は、膜画分Ａの反応液のクロマトグラムの測定結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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