(57)【要約】【課題】インスレーターを有する任意ＤＮＡの発現ベクターを提供することを課題とする。【解決手段】ウニ由来のＡＲＳ遺伝子インスレーターを用いて、導入遺伝子の不活性化を回避し安定な発現をするベクターを開発することを試みた。このため、マーカー遺伝子を発現するベクターを構築し培養細胞に導入してインスレーターを連結したベクターの機能解析を行った。その結果、発現カセットに対して特定の向きにインスレーターを２つ連結することで、安定に遺伝子を発現をさせることが可能であり、発現量はインスレーターを連結していない場合に比べ１３０倍以上高まることが明らかになった。これらにより、本発明者らが構築したベクターの有効性が明らかになった。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意ＤＮＡの挿入部位、該任意ＤＮＡの発現を制御するプロモーター、および、インスレーターを有するベクターであって、該インスレーターを、該任意ＤＮＡの挿入部位の３’側および該任意ＤＮＡの発現を制御するプロモーターの５’側に、それぞれ、順方向および逆方向に有するベクター。
【請求項２】
インスレーターがウニ、ニワトリまたはショウジョウバエ由来のインスレーターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
インスレーターが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡである、請求項１または２に記載のベクター。
（ａ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が置換、欠失、付加および／または挿入した塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項４】
任意ＤＮＡが挿入された、請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項６】
請求項４に記載のベクターが染色体に導入された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インスレーターを有する任意ＤＮＡの発現ベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核生物の遺伝子は、エンハンサー、プロモーターといった発現制御領域とアミノ酸をコードする領域（構造遺伝子）から構成されている。プロモーターは、構造遺伝子の上流に位置することが厳密に決まっている。一方エンハンサーは、プロモーターや構造遺伝子の上流あるいは下流に位置することもあり、厳密に位置が決まっているわけではない。中には、数百キロ塩基離れたところから遺伝子発現を調節するエンハンサーもある。エンハンサーはその機能として、プロモーターが持つ遺伝子発現活性を数倍〜数百倍まで高めることが知られている。
【０００３】
一般的に一つの染色体上には数千の遺伝子が存在しており、適切な制御が行われそれらの遺伝子は正確に発現している。すなわち、隣り合う遺伝子のエンハンサーが干渉することはなく、無関係な遺伝子のエンハンサーの作用は受けない。このため、このような無関係な遺伝子のエンハンサーの作用を断ち切る機能（エンハンサーブロッキング）を持つＤＮＡ配列が存在する可能性が示唆され解析が行われてきた。１９９３年に、アメリカＮＩＨのＦｅｌｓｅｎｆｅｌｄ博士らがショウジョウバエとニワトリから相次いでこのような機能を担うＤＮＡ配列を発見し、「インスレーター」と命名した。これまでに、インスレーターはニワトリ、ショウジョウバエ、ヒト、ウニなど様々な真核生物において単離され、機能について解析がなされてきた。それらの中で、インスレーターは先に述べたエンハンサーブロッキング活性に関与するばかりでなく、遺伝子の不活性化を阻害するシールドの機能を担うことが明らかになってきた。
【０００４】
染色体上の遺伝子は、細胞種などに応じ発現する必要がない場合に、ＤＮＡのメチル化やヒストンの脱アセチル化といった化学的修飾や、ヘテロクロマチン化といった構造的変化を受け不活性化されている。インスレーターは、これらの不活性化作用から遺伝子を保護しているのである。その具体的な例としてハウスキーピング遺伝子が挙げられる。ハウスキーピング遺伝子は、細胞の生存に不可欠な遺伝子であり、周辺の遺伝子の不活性化とは無関係に発現している。これらの遺伝子の上流、下流、あるいは両端にインスレーターは存在し不活性化を阻害していることが明らかになってきている。
【０００５】
このシールド機能は、受精卵を含む細胞での遺伝子組換えを行う場合に非常に有効なものとなる可能性を持っている。なぜなら、導入遺伝子の不活性化を抑制できる可能性があるからである。細胞での遺伝子組換えは、細胞に遺伝子ベクターを導入し、それらのベクターが染色体に組み込まれることが必須である。しかしながら、ベクターが染色体に組み込まれても周囲のＤＮＡの影響を受け、ＤＮＡのメチル化あるいはヒストンの脱アセチル化を受け不活性化されたり、発現量がごく少なくなること（ポジション・イフェクト）が報告されている。
【０００６】
これまでに、遺伝子ベクターにインスレーターを連結することで、遺伝子の不活性化を回避し、導入遺伝子の発現を安定化させる可能性が示唆されている。これまでに、遺伝子発現ベクターに用いられて来たインスレーターは、ニワトリ由来のＨＳ４インスレーターであり、ＨＳ４インスレーターはＤＮＡの長さが１．２ｋｂあるため遺伝子組換えベクターに用いるのには使いにくいものであった（非特許文献１〜４）。また、遺伝子発現に対し、インスレーターとベクターとの連結の方向性が与える影響について、詳細に解析した報告例はなかった。
【０００７】
尚、出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Ｗａｌｔｅｒｓ　ＭＣ，　Ｆｉｅｒｉｎｇ　Ｓ，　Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ　ＥＥ，　Ｓｃａｌｚｏ　Ｄ，　Ｇｏｅｋｅ　Ｓ，Ｍａｇｉｓ　Ｗ，　Ｇａｒｒｉｃｋ　Ｄ，　Ｗｈｉｔｅｌａｗ　Ｅ，　Ｍａｒｔｉｎ　ＤＩ．　Ｔｈｅ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ　５’ＨＳ４　ｂｏｕｎｄａｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｂｌｏｃｋｓ　ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１９９９　Ｍａｙ；１９（５）：３７１４−２６
【非特許文献２】Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ　Ｆ，　Ｂｅｌｌ　ＡＣ，　Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ　Ｇ．　　Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ　ｉｎｓｕｌａｔｏｒ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　１９９９　Ｄｅｃ　７；９６（２５）：１４３５４−９
【非特許文献３】Ｙａｎｎａｋｉ　Ｅ，　Ｔｕｂｂ　Ｊ，　Ａｋｅｒ　Ｍ，　Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ　Ｇ，　Ｅｍｅｒｙ　ＤＷ．　Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ　ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ＨＳ４　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｉｎｓｕｌａｔｏｒ　ｉｎ　ｏｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ．　Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　２００２　Ｍａｙ；５（５　Ｐｔ　１）：５８９−９８
【非特許文献４】Ｒｉｖｅｌｌａ　Ｓ，　Ｃａｌｌｅｇａｒｉ　ＪＡ，　Ｍａｙ　Ｃ，　Ｔａｎ　ＣＷ，　Ｓａｄｅｌａｉｎ　Ｍ．　Ｔｈｅ　ｃＨＳ４　ｉｎｓｕｌａｔｏｒ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｔ　ｒａｎｄｏｍ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ．　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　２０００　Ｍａｙ；７４（１０）：４６７９−８７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、インスレーターを有する任意ＤＮＡの発現ベクターを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。１９９９年にＡｋａｓａｋａらが報告したウニ由来のＡＲＳ遺伝子インスレーターを用いて、導入遺伝子の不活性化を回避し安定な発現をするベクターを開発することを試みた。このため、マーカー遺伝子を発現するベクターを構築し培養細胞に導入してインスレーターを連結したベクターの機能解析を行った。その結果、発現カセットに対して特定の向きにインスレーターを２つ連結することで、安定に遺伝子を発現をさせることが可能であり、発現量はインスレーターを連結していない場合に比べ１３０倍以上高まることが明らかになった。これにより、本発明者らが構築したベクターの有効性が明らかになった。
【００１０】
即ち、本発明は、インスレーターを有する任意ＤＮＡの発現ベクターに関し、以下の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。
〔１〕　任意ＤＮＡの挿入部位、該任意ＤＮＡの発現を制御するプロモーター、および、インスレーターを有するベクターであって、該インスレーターを、該任意ＤＮＡの挿入部位の３’側および該任意ＤＮＡの発現を制御するプロモーターの５’側に、それぞれ、順方向および逆方向に有するベクター。
〔２〕　インスレーターがウニ、ニワトリまたはショウジョウバエ由来のインスレーターである、〔１〕に記載のベクター。
〔３〕　インスレーターが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡである、〔１〕または〔２〕に記載のベクター。
（ａ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が置換、欠失、付加および／または挿入した塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
〔４〕　任意ＤＮＡが挿入された、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のベクター。
〔５〕　〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のベクターを保持する形質転換体。
〔６〕　〔４〕に記載のベクターが染色体に導入された形質転換体。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、任意ＤＮＡの挿入部位、該任意ＤＮＡの発現を制御するプロモーター、および、インスレーターを有するベクターであって、該インスレーターを、該任意ＤＮＡの挿入部位の３’側および該任意ＤＮＡの発現を制御するプロモーターの５’側に、それぞれ、順方向および逆方向に有するベクターを提供する。このようなベクターを使用することで、任意ＤＮＡを高い効率で発現する形質転換体を作成することができる。
【００１２】
本発明において、インスレーターとは、ベクターが細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた場合に組み込まれたゲノムの周辺領域環境を遮断するためのシールドとして機能する塩基配列を意味する。
【００１３】
本発明におけるインスレーターとしては、ウニ由来インスレーター、ニワトリ由来インスレーター、ショウジョウバエ由来インスレーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
上記インスレーターとしては、ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター（配列番号：１）、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター（配列番号：２）、ウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーター（配列番号：３）、ショウジョウバエ由来ｇｙｐｓｙインスレーター（Ｃａｉ　ＨＮ，　Ｌｅｖｉｎｅ　Ｍ．　Ｔｈｅ　ｇｙｐｓｙ　ｉｎｓｕｌａｔｏｒ　ｃａｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｓ　ａ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｉｌｅｎｃｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｅｍｂｒｙｏ．　ＥＭＢＯ　Ｊ　１９９７　Ａｐｒ　１；１６（７）：１７３２−４１）が例示できる。
【００１５】
該ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター、ウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーター、またはショウジョウバエ由来ｇｙｐｓｙインスレーターは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、ＰＣＲなどでウニゲノム、ニワトリゲノム、またはショウジョウバエゲノムからクローニングを行ったＤＮＡ断片に対してエンハンサーブロッキングアッセイを行うことにより単離することができる（Ａｋａｓａｋａ　Ｋ，　Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ　Ａ，　Ｔａｋａｔａ　Ｋ，　Ｍｉｔｓｕｎａｇａ　Ｋ，　Ｍｉｂｕｋａ　Ｆ，　Ｕｅｄａ　Ｈ，　Ｈｉｒｏｓｅ　Ｓ，　Ｔｓｕｔｓｕｉ　Ｋ，　Ｓｈｉｍａｄａ　Ｈ．　Ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅａ　ｕｒｃｈｉｎ　ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅｒｖｅｓ　ａｓ　ａｎ　ｉｎｓｕｌａｔｏｒ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ）　１９９９　Ｊｕｌ；４５（５）：５５５−６５）。
【００１６】
また、本発明のインスレーターは、配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡを包含する。ここで「機能的に同等」とは、対象となるＤＮＡが、配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡと同等の生物学的機能（生物学的役割）、生化学的機能（生化学的活性）を有することを指す。このような機能としては、染色体に導入される任意ＤＮＡの不活性化を阻害する機能、エンハンサーブロッキング活性が例示できる。上記「染色体に導入される任意ＤＮＡの不活性化を阻害する」とは、染色体に導入される任意ＤＮＡのメチル化などによる発現抑制を阻害することを意味する。また、上記エンハンサーブロッキング活性とは、染色体上の隣り合う遺伝子のエンハンサーの作用を断ち切る活性を意味する。このような機能や活性は、エンハンサーブロッキングアッセイ、並びにＤＮＡのメチル化感受性のある制限酵素でベクターを導入した細胞のゲノムを切断しサザンブロッティングを行うことで測定できる（Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ　Ｆ，　Ｂｅｌｌ　ＡＣ，　Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ　Ｇ．　Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ　ｉｎｓｕｌａｔｏｒ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ．　ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　１９９９　Ｄｅｃ　７；９６（２５）：１４３５４−９）。
【００１７】
あるＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄｅｄ．，　９．４７−９．５８，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　ｐｒｅｓｓ，　１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者においては、ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター（配列番号：１）、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター（配列番号：２）、もしくはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーター（配列番号：３）、またはその一部を利用して、これと相同性の高いＤＮＡを単離することは、周知の技術である。
【００１８】
本発明には、ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター、またはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーターとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター、またはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーターと機能的に同等なＤＮＡが含まれる。ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター、またはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーターと機能的に同等なＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ　、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１９】
また、ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター（配列番号：１）、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター（配列番号：２）、またはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーター（配列番号：３）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して、ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター、またはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーターと機能的に同等なＤＮＡを単離することも可能である。
【００２０】
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター、またはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーターと機能的に同等なＤＮＡの塩基配列は、配列番号：１〜３のいずれかに記載の塩基配列と高い相同性を有する場合がある。高い相同性とは、塩基レベルにおいて、通常、少なくとも８０％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。
【００２１】
塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：５８７３−５８７７，　１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，　１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ　＝　１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ　＝　１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００２２】
また、ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター配列、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター配列、またはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーター配列において１もしくは複数の塩基が変異（置換、欠失、付加および／または挿入）した塩基配列からなり、該ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター、またはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーターと機能的に同等なＤＮＡもまた本発明に含まれる。このような変異は自然界においても生じうる。変異する塩基数は、通常、３０塩基以内であり、好ましくは１５塩基以内であり、より好ましくは５塩基以内であり、さらに好ましくは２塩基以内である。
【００２３】
また、あるＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ＤＮＡに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ｇｅｎｅ　１５２，　２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，　ＭＪ，　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｍ．（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１００，　４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，　Ｗ．ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ　Ｗ，　ａｎｄ　Ｆｒｉｔｚ　ＨＪ（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５４，　３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　ＳｃｉＵＳＡ．　８２，　４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ　（１９８８）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　８５，　２７６３−２７６６）などを用いて、ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター配列、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター配列、またはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーター配列に適宜変異を導入することにより、該ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター、ニワトリ由来ＨＳ４インスレーター、またはウニ由来ヒストンＨ２Ａインスレーターと機能的に同等なＤＮＡを調製することができる。
【００２４】
本発明のインスレーターは、いかなる形態でもよい。即ち、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。
【００２５】
本発明のベクターは、ＤＮＡ発現ベクターにおける任意ＤＮＡの挿入部位の３’側および該任意ＤＮＡの発現を制御するプロモーターの５’側に、上記インスレーターを、それぞれ、順方向および逆方向に挿入することで製造することができる。例えば、図１に示したように、ｐＧＫ−ＬＵＣ−ｐ（Ａ）などの任意のプロモーターにｃＤＮＡとポリＡ付加シグナルを連結した遺伝子発現カセットをあらかじめ作製し、それをｐＢＳＫ−ＳｍＢｍ（−）　（Ａｋａｓａｋａ　Ｋ，　Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ　Ａ，　Ｔａｋａｔａ　Ｋ，　Ｍｉｔｓｕｎａｇａ　Ｋ，　Ｍｉｂｕｋａ　Ｆ，　Ｕｅｄａ　Ｈ，　Ｈｉｒｏｓｅ　Ｓ，　Ｔｓｕｔｓｕｉ　Ｋ，　Ｓｈｉｍａｄａ　Ｈ．　Ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅａ　ｕｒｃｈｉｎ　ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅｒｖｅｓ　ａｓ　ａｎ　ｉｎｓｕｌａｔｏｒ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ）　１９９９　Ｊｕｌ；４５（５）：５５５−６５）のＳｍａＩサイトよりもＴ３プロモーター側の制限酵素サイトにに連結し、ＦＲベクターの状態にする。更に、そのベクターをＫｐｎＩサイトで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＢｌｕｎｔｉｎｇを行い、そこにｐＢＳＫ−ＳｍＢｍ（−）からＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩで切り出しＢｌｕｎｔｉｎｇした断片をサブクローニングする。目的とするプラスミドが得られたら、ＮｏｔＩで切断することによって、インスレーター＋発現カセット＋　インスレーターの断片が出現することでインスレーターの向きを確認できる。また、任意のプライマーでシークエンシングを行いつなぎ目を確認する。以上の方法でベクターを製作することができる。また、既存のベクターであっても、同様の行程を行うことによってインスレーターを連結したベクターに変更することが可能となる。
【００２６】
本発明は、また、上記ベクターに、任意ＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明の任意ＤＮＡとしては、任意のペプチドをコードするものを例示できるが、本発明の任意ＤＮＡは、これに制限されるものではない。ここで、「ペプチド」とは、アミノ酸同士がペプチド結合により結合した化合物を指す。従って、鎖長の長いペプチドである「ポリペプチド」や「タンパク質」もまた本発明の「ペプチド」に含まれる。本発明において、任意のペプチドとしては、本出願に示したルシフェラーゼのような酵素、ＧＦＰのようなマーカータンパク質、転写因子などの細胞機能タンパク質、または薬剤耐性遺伝子をコードするタンパク質などが例示できるが、本発明の任意のペプチドは、これらに限定されるものではない。
【００２７】
また、本発明は、本発明の任意ＤＮＡを有するベクターが染色体に導入された形質転換体を提供する。
【００２８】
ベクターが導入される宿主としては特に制限はなく、例えば種々の真核細胞等を用いることが可能である。真核細胞を使用する場合、例えば動物細胞、植物細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　２９１：　３５８−３４０，　１９８１）、あるいは昆虫細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ　細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ　細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　１９８０，　７７，　４２１６−４２２０．）やＣＨＯ　Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　１９６８，　６０，　１２７５．）を好適に使用することができる。植物細胞としては、例えばニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が挙げられる。
【００２９】
上記宿主に本発明のベクターを導入するための方法としては、培養細胞等の宿主細胞へのベクターの導入の場合、例えばリン酸カルシウム法　（Ｃｈｅｎ，　Ｃ．　ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ，　Ｈ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１９８７，　７，　２７４５−２７５２．）、ＤＥＡＥデキストラン法　（Ｌｏｐａｔａ，　Ｍ．　Ａ．　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｒｅｓ．，　１９８４，　１２，　５７０７−５７１７．、Ｓｕｓｓｍａｎ，　Ｄ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ，　Ｇ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１９８５，　４，　１６４２−１６４３．）、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、リポフェクチン法　（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，　Ｂ．　Ｃｅｌｌ，　１９９４，　７，　１０２５−１０３７．、Ｌａｍｂ，　Ｂ．　Ｔ．　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１９９３，　５，　２２−３０．、Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，　Ｓ．　Ｋ．　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９９３，　２５９，　２３０−２３４．）等の方法を用いることが可能である。また、植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００３０】
本発明における形質転換体には、形質転換細胞だけでなく形質転換細胞を有する個体もまた包含される。例えば、宿主として動物を使用する場合、哺乳類動物や昆虫が挙げられる。哺乳類動物としては、特に制限されず、例えば、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ等を用いることができる（Ｖｉｃｋｉ　Ｇｌａｓｅｒ，　ＳＰＥＣＴＲＵＭ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　１９９３）。また、昆虫としては、例えば、カイコが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、植物を使用する場合、例えば、タバコを用いることができるが、これに制限されない。
【００３１】
これら動物や植物の形質転換体は、公知の方法を使用することで作出することが可能である。例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植することで、トランスジェニックヤギを作出することが可能である（Ｅｂｅｒｔ，　Ｋ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９９４）　１２，　６９９−７０２）。
【００３２】
また、例えば目的のペプチドをコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることによりトランスジェニックカイコを作出することができる（Ｓｕｓｕｍｕ，　Ｍ．　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　１９８５，　３１５，　５９２−５９４．）。
【００３３】
また、例えば目的とするペプチドをコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ　５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばニコチアナ・タバカムに感染させることでトランスジェニック植物体を作出することができる（Ｊｕｌｉａｎ　Ｋ．−Ｃ．　Ｍａ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１９９４，　２４，　１３１−１３８．）。
【００３４】
任意ＤＮＡが、任意のペプチドをコードするＤＮＡである場合、該ペプチドは、例えば上記トランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から得ることができる。また、トランスジェニックカイコの繭やトランスジェニック植物体からペプチドを回収することも可能である。
【００３５】
また、上記形質転換細胞を培養することにより生産させることも可能である。培養は公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養であれば、一般的に、培養液としては、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ　、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ等を使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、通常、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
【００３６】
任意のペプチドは、実質的に純粋で均一なペプチドとして精製することができる。ペプチドの分離、精製は、通常のペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればペプチドを分離、精製することができる。または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製することが可能である。
【００３７】
クロマトグラフィーとしては、例えば任意のペプチドに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｅｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．　Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。これらの精製方法を用い、任意のペプチドを高度に精製することもできる。
【００３８】
なお、ペプチドを精製前または精製後に適当なペプチド修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。ペプチド修飾酵素としては、例えばトリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼ等が用いられる。
【００３９】
また、任意のペプチドをグルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼとの融合ペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組換えペプチドとして宿主細胞内で発現させた場合には、発現させた組換えペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ペプチドの精製後、必要に応じて融合ペプチドのうち、目的のペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａ等により切断し、除去することも可能である。
【００４０】
また、本発明は、本発明のベクターを保持する形質転換細体を提供する。このような形質転換体は、例えば、本発明のベクターを増幅するために使用することができる。ベクターが導入される宿主としては、上記の真核細胞に限定されず、原核細胞を使用することもできる。例えば、原核細胞としては細菌細胞が挙げられる。該細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）、例えばＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。上記宿主に本発明のベクターを導入するための方法としては、大腸菌等の宿主細胞へのベクターの導入の場合、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いることができる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］　ウニ由来インスレーターを用いた遺伝子発現ベクターの構築
インスレーターの機能を明らかにするために、マーカー遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）を連結したベクターを作製し、ルシフェラーゼの発現量を指標としてインスレーターの機能を明らかにする手法を用いた。
【００４２】
図１に示したように、ウニＡＲＳ遺伝子由来インスレーター（５８０ｂｐ）を持つプラスミドｐＢＳＫ−ＳｍＢｍ（−）のＳａｌＩサイトに、ｐＧＫ−ｌｕｃプラスミドよりＳａｌＩで切り出した出したＰＧＫ−ＬＵＣ−ｐ（Ａ）カセット（マーカー遺伝子）をサブクローニングする。得られたクローンについて、ＨｉｎｄＩＩＩによる方向の確認と塩基配列を解析し、インスレーターの向きに対して逆向きにＰＧＫ−ＬＵＣ−ｐ（Ａ）カセットが連結されているものを選択する。得られたクローンのＫｐｎＩサイトに、ｐＢＳＫ−ＳｍＢｍ（−）からＳａｃＩとＥｃｏＲＩで切り出したインスレーター断片をサブクローニングする。得られたクローンについてＮｏｔＩによる方向の確認と塩基配列を読むことで、ＰＧＫ−ＬＵＣ−ｐ（Ａ）カセットの下流に順方向にインスレーターが連結されたクローンを選択する。得られたクローンを遺伝子発現ベクターＯＬ（図２）と呼ぶ。また、同様にして作製したベクタについて、インスレーターの向きと数によりＦＦ、ＦＲ、ＲＦ、ＲＲ、ＩＬ、ＳＬ２、ＳＬ３の７種類（図３）も同時に構築した。
【００４３】
［実施例２］　細胞へのベクターの導入
哺乳類の細胞として、マウスの株化繊維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞をモデルとして用いた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は１０％のウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ）で培養を行った。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、マーカー遺伝子であるＰＧＫ−ＬＵＣ−ｐ（Ａ）にインスレーターを連結したベクターと、薬剤耐性遺伝子ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−ｐ（Ａ）を導入した。それぞれのベクターは、プラスミド領域を除くため制限酵素で切断後アガロースゲル電気泳動を行い図１，２に示したカセット部位分だけを切り出した。回収したカセットは、１／１０量のＰＧＫ−ｐｕｒｏ−ｐ（Ａ）と混合し遺伝子導入用試薬リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞に導入した。遺伝子導入後４８時間後から培地に１μｇ／ｍｌの濃度でピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）を添加し７日間培養し組換え細胞を単離した。なお組換え細胞は、１ベクターあたりランダムに１２クローンずつ単離を行った。
【００４４】
ピューロマイシンによる選択を行ったところ、得られた細胞のコロニー数に関しすべてのベクターに差は認められなかった。また、すべてのベクターに関して１ベクターあたり１２クローンを単離した。それぞれのクローンは、２４穴のマイクロタイタープレートに単離し、細胞が増殖したところで１２穴のマイクロタイタープレート２枚にパッセージしレプリカを作製した。それらのうち１枚をルシフェラーゼ活性測定に用い、もう一枚は細胞のゲノミックＤＮＡ抽出及び保存用に用いた。
【００４５】
［実施例３］　ルシフェラーゼ・アッセイ
それぞれのベクターから得られたクローンに関し、ゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲを行いルシフェラーゼ遺伝子の存在を確認した。
【００４６】
組換え細胞に関して、ＰＲＯＭＥＧＡ社のルシフェラーゼ・アッセイキットを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、その際測定装置としてダイアヤトロンＣＴ−９０００Ｄを用いて蛍光強度を測定した。また、測定に用いた個々のサンプルに含まれるタンパク量を、アマシャム社のプロテインアッセイキットを用いて測定した。データに関しては、個々のクローンについてタンパク１μｇあたりの蛍光量を求めた。また、それらのデータをもとにそれぞれのベクターの蛍光量の平均値を求め同時にグラフ化を行った（図４）。
【００４７】
インスレーターを連結していないベクターであるＰＧＫ−ＬＵＣ−ｐ（Ａ）は平均４４１の活性を示したのに対し、インスレーターを１コピー連結したＦＦ、ＦＲ、ＲＦ（図３）では、それぞれ４６７２、２５８５、５６８７という活性を示しＰＧＫ−ＬＵＣ−ｐ（Ａ）の５．９〜１２．９倍という高い活性を示した。これらのことから、インスレーターを１コピー連結しただけで、インスレーターの向きと位置によって違いはあるものの、遺伝子の不活性化を回避する能力があることが明らかになった。
【００４８】
インスレーターをカセットの上流と下流に２コピー連結した場合に、ＩＬ、ＳＬ２、ＳＬ３（図３）では、それぞれ３３５３、１０９９、１３７７という活性を示した。これはＰＧＫ−ＬＵＣ−ｐ（Ａ）の活性の２．５〜７．６倍の活性であり、１コピーのインスレーターを連結した場合よりも低いことが明らかになった。しかしながら、ＯＬ（図１）では、ルシフェラーゼ活性は５７８００であり、これはＰＧＫ−ＬＵＣ−ｐ（Ａ）の１３１倍に相当する。これらのことから、２コピーのインスレーターをベクターに連結する場合には、その方向によって遺伝子の発現量に大きな差が生じることが明らかになった。中でも、カセットの上流と下流に外向きにインスレーターを連結ことで非常に高い遺伝子発現を示すことが明らかになった。このような結果は、これまでに報告されている他のインスレーターでは全く見られていないことから、ウニＡＲＳインスレーターが遺伝子の不活性化を回避するシールドとしての能力が極めて高いことを示している。また、ＯＬのようにインスレーターを連結することが、遺伝子組み換えを行う場合に、高い効率で遺伝子を発現させる手段として有効であることが明らかになった。
【００４９】
これまでに、インスレーターがベクターの中に２コピー存在すると、インスレーターどうしが結合してループを形成し、遺伝子の不活性化を阻害する可能性が示唆されている。我々の結果では、２コピー連結したインスレーターの方向によって遺伝子発現の差が認められた。このような差が生じた原因として、インスレーターの方向によってループを形成しにくい組み合わせがあるのではないかという可能性が示唆された。
【００５０】
【発明の効果】
これまで多くの学術的研究、あるいは医薬品開発のための基礎研究の領域において培養細胞を用いた遺伝子組換え、あるいは遺伝子組換え動物の作製がなされてきた。しかしながら、これらの遺伝子組換え実験において、遺伝子組換え細胞あるいは遺伝子組換え動物が得られても、導入した遺伝子が発現しない現象が起きることが知られており、大きく効率を低下させる原因の一つとなっていた。これらの現象の原因の一つとして、導入遺伝子がポジション・イフェクトを受け不活性化されてしまうことが明らかにされてきた。しかしながら、これまではこの現象を回避する手だてはなかった。しかしながら、本発明において開発されたインスレーターを連結した発現ベクターを用いることで、遺伝子の不活性化を回避でき、効率よく導入遺伝子を発現させられることが明らかになった。このベクターは、以下の研究・開発などにおいて非常に有効である。
【００５１】
（１）培養細胞系での遺伝子組換え
脊椎動物の細胞には、細胞内免疫機能の一つとしてウィルスなどの外来遺伝子が染色体に組み込まれた場合に、ＤＮＡのメチル化やヒストンの脱アセチル化を行い、その遺伝子を不活性化することが知られている。このため、遺伝子組換えのために遺伝子発現ベクターを導入しても、これらの作用によって導入遺伝子が発現しない、あるいは発現してもその発現量が非常に少ないなどの現象が起きることが知られている。インスレーターを連結したベクターを用いることで、これらを回避でき効率よく導入遺伝子を発現する組換え細胞が得られる。
【００５２】
（２）遺伝子組換え動物の作出
遺伝子組換え動物は、遺伝子発現ベクターＤＮＡ溶液を直接受精卵の核に注入して作出するため非常に作出効率が悪い。一般的に、導入遺伝子を持つ個体が得られる効率はマウスで１０％程度、家畜では１％未満である。さらに、低い効率で生まれた遺伝子組換え動物であっても、ポジション・イフェクトを含む導入遺伝子の不活性化を受けるため、導入遺伝子の発現する割合はそのうち数割にすぎない。インスレーターを用いた遺伝子発現ベクターを用いることにより、これらの現象を回避し遺伝子組換え動物で導入遺伝子を高い効率で発現させられる。
【００５３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ウニ由来インスレーターを連結したベクターの作製概念を示す図である。灰色矢印はウニＡＲＳ遺伝子インスレーター（５８０ｐｂ）を示す。また、矢印の向きはインスレーターの連結されている方向を示す。ＰＧＫはマウスＰＧＫ−１プロモーター、ＬＵＣはルシフェラーゼ遺伝子、ＳＶｐ（Ａ）はＳＶ４０ウィルス由来ポリＡ付加シグナルを示している。
【図２】ウニ由来インスレーターを用いた遺伝子発現ベクターを示す図である。ベクターを構成するパーツに関しては、図１と同じである。インスレーターの向きと数が異なる。
【図３】ウニ由来インスレーターを用いた遺伝子発現ベクターを示す図である。ベクターを構成するパーツに関しては、図１と同じである。インスレーターの向きと数が異なる。
【図４】ベクターを導入した細胞でルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。各ベクターごとに得られた１２クローンのルシフェラーゼ活性を平均化してグラフ化してある。ＯＬベクターを導入したクローンのルシフェラーゼ活性が非常に高いことが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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