(57)【要約】      （修正有）【課題】側芽がどのようにして茎から分化するのか、その分子生物学的機構を解明することによって、画一的、安定的、安全に植物の側枝形成を制御する技術が待望される。加えて、培養細胞から不定芽を、一般的、安定的、画一的、容易に誘導できる技術の開発が待望される。【解決手段】特定のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、特定のアミノ酸配列を含むタンパク質、同該ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ構築物で形質転換された植物細胞、組織、器官、植物またはその後代、植物の側芽形成を、増加または減少させる方法であって、ＤＮＡの発現レベルを増加または減少させることを特徴とする方法、並びに培養植物細胞を、組換えＤＮＡ構築物で形質転換することによって、該培養植物細胞から不定芽を形成させる方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列またはその１ないし１０個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補的配列、および
（ｄ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、（ａ）ないし（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
【請求項２】
（ａ）配列番号１の１ないし２０５位、３３８ないし６１２位、１２８３ないし１８０７位、６４ないし２０５位、３３８ないし６１２位、１２８３ないし１３１５位、１ないし２３位、１７８６ないし１８０７位または１３４５ないし１３６４位で示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号５の２２ないし１７１位のアミノ酸配列、またはその１ないし１０個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補的配列、および
（ｄ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、（ａ）ないし（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号５のアミノ酸配列、またはその中の１ないし１０個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項４】
配列番号５の２２ないし１７１位のアミノ酸配列、またはその１ないし１０個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項５】
請求項１または２のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項５の組換えＤＮＡ構築物で形質転換された植物細胞、組織、器官、植物またはその後代。
【請求項７】
植物の側芽形成を、コントロール植物と比較して実質的に増加または減少させる方法であって、請求項１または２のＤＮＡの発現レベルをコントロール植物と比較して、実質的に増加または減少させることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１または２のＤＮＡと、それに機能可能に連結されたプロモーターとを含む組換えＤＮＡ構築物で、植物を形質転換することをさらに含む請求項７の方法。
【請求項９】
請求項１または２のＤＮＡの発現を減少させる配列と、それに機能可能に連結されたプロモーターとを含む組換えＤＮＡ構築物で、植物を形質転換することをさらに含む請求項７の方法。
【請求項１０】
培養植物細胞を、請求項５の組換えＤＮＡ構築物で形質転換することによって、該培養植物細胞から不定芽を形成させる方法。
【請求項１１】
培養植物細胞を、請求項５の組換えＤＮＡ構築物で形質転換することによって、該培養植物細胞から不定芽を形成させることを含む、植物の生産方法。
【請求項１２】
請求項１１の生産方法によって得られる、植物細胞、組織、器官、植物またはその後代。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物ＤＮＡ、タンパク質およびそれらの用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
農業および林業の実際生産現場では、側芽の制御、例えば、枝打ち、腋芽かきは、機械化が困難で労働力を要する作業である。植物成長調節物質などによって、化学的処理によりこれを制御することは部分的に試みられてきた。しかし、未だ画一的、安定的、安全にこれを達成できる技術とはなっていない。
【０００３】
同一種内でも、側芽発生の多い系統、少ない系統、またはほとんどない系統がある。しかし、その遺伝的背景は依然として不明である。そして側芽形成特性について、望まれる形質を有する系統の育成は、明確な育種手段によっては困難なままである。また、側芽がどのようにして茎から分化するのか、その分子生物学的機構は依然として不明である。
【０００４】
同一遺伝子型のクローンを、安定的かつ大量に取得するために、細胞培養系が利用されてきた。この系において、培養細胞から不定芽を形成させることは、培養細胞から植物を再生するためには必須のプロセスであり、これは培養培地中の植物調節物質の選択によって可能な種もある。しかし、カルスから不定芽ができない、または誘導し難い植物が、依然として存在する。一般的、画一的、安定的、容易な手段でこれを達成することは、依然として困難である。
【０００５】
したがって、植物の側芽を、一般的、安定的、画一的に制御できるアプローチの必要性が、依然として存在する。また、育種計画において、側芽の制御に関係する遺伝子を特定することは、明確な育種目標に基づく植物育種を可能とする。さらに、遺伝的に均一なクローンを効率よく多量に生産可能とするために、培養細胞から不定芽を、一般的、安定的、画一的、容易に誘導できるシステムの開発が待望される。
【０００６】
従来より、発明者らは、シロイヌナズナを用いて胚発生過程における茎頂分裂組織の形成および器官の分離に関与するＣＵＣ１（ＣＵＰ−ＳＨＡＰＥＤ  ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ  １）（配列番号２参照）、ＣＵＣ２遺伝子（配列番号３または４参照、いずれも当該遺伝子の多型性遺伝子である）を解析している（図１参照）。ｃｕｃ１もしくはｃｕｃ２単独変異体はごく低頻度で子葉の融合が観察される。一方、ｃｕｃ１  ｃｕｃ２二重変異体は子葉の境界部が盛り上がることで１つのカップ状の子葉を形成し、また茎頂分裂組織が形成されないため、ｓｅｅｄｌｉｎｇ  ｌｅｔｈａｌである。ＣＵＣ１および２はどちらもＮＡＣ  ドメインをもつタンパクをコードしており、転写因子として機能すると考えられている。
【０００７】
Ａｉｄａら（１９９７）は、一連のｃｕｃ突然変異株を調査し、ＣＵＣ１およびＣＵＣ２を単離している（非特許文献１）。これらの二重突然変異株は、胚性成長点分裂組織の形成が完全に阻害され、この二重突然変異株由来のカルスのシュート再生中に不定芽形成が部分的に阻害されていることが記載されている。さらに、ＣＵＣ１およびＣＵＣ２遺伝子が、胚発生性成長転分裂組織の形成およびシュート再生における成長点分裂組織の形成に関与するようであることを記載する。しかし、この二重突然変異株は胚性成長点分裂組織が完全に欠損していることと、この二重突然変異株由来のカルスは不定芽を形成し得ることとを、矛盾なく説明し得る機構については依然として不明である。さらに、ＣＵＣ１およびＣＵＣ２遺伝子の、側芽形成ヘの関与については何ら開示も示唆もされていない。ＣＵＣ１遺伝子の弱い機能欠失を持つ変異体（ｃｕｃ１−６）とＣＵＣ２変異体（ｃｕｃ２−１）との二重変異体では、茎頂分裂組織が形成される。また、この二重変異体では側枝が正常に形成される（桧原、未発表データ）。これらの結果は、ＣＵＣ３遺伝子は、ＣＵＣ１、ＣＵＣ２遺伝子とは異なり、側芽形成機構に関与することが強く示唆される。
【０００８】
また、Ａｉｄａら（１９９７）は、ＣＵＣ１およびＣＵＣ２遺伝子が、機能的に重複する遺伝子であるようであり、いずれか一方の遺伝子の突然変異体は、表現型的に互いに類似し、かつ野生型と比較して弱い変異しか示さないことを記載する（非特許文献１参照）。しかし、Ａｉｄａ（１９９７）らは、本発明のＣＵＣ３遺伝子について、何ら開示も示唆もするところがない。さらに、Ａｉｄａら（１９９７）は、一連のｃｕｃ突然変異株について、何ら有用な特性を開示も示唆もするところがない。
【０００９】
Ｔａｋａｄａらは、ＣＵＣ１遺伝子およびＣＵＣ２遺伝子が高い相同性を有することを記載する（非特許文献２参照）。しかし、Ｔａｋｅｄａらは、本発明のＣＵＣ３遺伝子を何ら記載しない。
【００１０】
さらに、Ｔａｋａｄａらは、ＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターによるＣＵＣ１遺伝子の過剰発現が、異所的不定芽形成を強く促進することを記載する（非特許文献２参照）。また、この不定芽は、おもに子葉上、まれにロゼット葉上に形成されることが記載されている。しかし、Ｔａｋａｄａらは一連の突然変異株の側芽形成特性について、何ら開示も示唆もするところがない。
【００１１】
Ｄａｉｍｏｎらは、ＣＵＣ１またはＣＵＣ２遺伝子の過剰発現が、野生型シロイヌナズナの胚軸由来のカルスにおいて、不定芽形成を促進することを開示している（非特許文献３参照）。
【００１２】
また、Ｄａｉｍｏｎらは、ＣＵＣ１とＣＵＣ２遺伝子による形質転換が、カルスからのシュート形成を促進することを記載する（非特許文献３参照）。しかしＤａｉｍｏｎらは、ＣＵＣ３遺伝子を開示も示唆もしていない。
【００１３】
【非特許文献１】
Ｍｉｔｓｕｈｉｒｏ  Ａｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ’’Ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ：  Ａｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｕｐ−ｓｈａｐｅｄ  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ  Ｍｕｔａｎｔ’’，  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．  ９，  ｐｐ．８４１−８５７  （１９９７）。
【非特許文献２】
Ｓｈｉｎｏｂｕ  Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ’’Ｔｈｅ  ＣＵＰ−ＳＨＡＰＥＤ  ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ１  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｓｈｏｏｔ  ａｐｉｃａｌ  ｍｅｒｉｓｔｅｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ’’，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｖｏｌ．  １２８，  ｐｐ．１１２７−１１３５  （２００１）。
【非特許文献３】
Ｙａｓｕｆｕｍｉ  Ｄａｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，’’Ｔｈｅ  ＣＵＰ−ＳＨＡＰＥＤ  ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ  Ｇｅｎｅｓ  Ｐｒｏｍｏｅ  Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  Ｓｈｏｏｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｃａｌｌｉ’’，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｖｏｌ．４４，  ｐｐ．１１３−１２１（２００３）。
【非特許文献４】
Ｍｉｔｓｕｈｉｒｏ  Ａｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ’’Ｓｈｏｏｔ  ａｐｉｃａｌ  ｍｅｒｉｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ：  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｔｈｅ  ＣＵＰ−ＳＨＡＰＥＤ  ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ  ａｎｄ  ＳＨＯＯＴ  ＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ  ｇｅｎｅｓ’’，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｖｏｌ．１２６，  ｐｐ．１５６３−１５７０（１９９９）。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、植物の側芽形成を制御する遺伝子、それによってコードされるタンパク質、およびそれらの用途を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、子葉の境界部や茎頂分裂組織の形成に関与する新しい遺伝子を単離するため、ｃｕｃ２変異体をＥＭＳ処理し、芽生えにおいてカップ型の子葉を形成するものや茎頂分裂組織を欠失するｃｕｃ２エンハンサー変異体の単離を行ってきた。しかし、得られたｃｕｃ２エンハンサー変異体を遺伝学的に調べたところ、ほとんどはＣＵＣ１の新規のアリルであった。
【００１６】
発明者らは残りの変異体に対して鋭意検討の結果、ＣＵＣ１やＣＵＣ２と同一のファミリーに属するＮＡＣボックス遺伝子内に変異を発見した。今回、本発明者らは、この新規遺伝子を単離することに成功した。この新規遺伝子をＣＵＣ３と命名する（配列番号１、図２参照）。ＣＵＣ１とＣＵＣ２の二重突然変異株は、ｃｕｃ表現型を示すが、ＣＵＣ１とＣＵＣ２のいずれかのみの突然変異株は、ｃｕｃ変異表現型を示さない（非特許文献１、前掲参照）。しかし、このＣＵＣ３遺伝子とＣＵＣ１遺伝子が変異した変異株は、ｃｕｃ変異を示す。このＣＵＣ３遺伝子とＣＵＣ２遺伝子が変異した変異株もまた、ｃｕｃ変異を示す。
【００１７】
ＣＵＣ１とＣＵＣ３の二重突然変異株またはＣＵＣ２とＣＵＣ３の二重突然変異株は、子葉の（胚性の）成長点分裂組織が阻害されることに加えて、発明者らは、これら変異株は、側枝形成、特に側枝成長点形成が実質的に阻害されることを発見した（図３参照）。従来、側枝成長点形成に影響する遺伝子は全く単離されていなかった事実に鑑みると、これらの知見は驚くべき発見である。
【００１８】
よって本発明は：
・（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列またはその１ないし１０個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補的配列、および
（ｄ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、（ａ）ないし（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
【００１９】
・（ａ）配列番号１の１ないし２０５位、３３８ないし６１２位、１２８３ないし１８０７位、６４ないし２０５位、３３８ないし６１２位、３３８ないし６１２位、１２８３ないし１３１５位、１ないし２３位、１７８６ないし１８０７位または１３４５ないし１３６４位で示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号５の２２ないし１７１位のアミノ酸配列、またはその１ないし１０個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補的配列、および
（ｄ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、（ａ）ないし（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
【００２０】
・配列番号５のアミノ酸配列、またはその中の１ないし１０個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を含むタンパク質；
・配列番号５の２２ないし１７１位のアミノ酸配列、またはその１ないし１０個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
・前記ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ構築物；
・前記組換えＤＮＡ構築物で形質転換された植物細胞、組織、器官、植物またはその後代；
・植物の側芽形成を、コントロール植物と比較して実質的に増加または減少させる方法であって、前記のＤＮＡの発現レベルをコントロール植物と比較して、実質的に増加または減少させることを特徴とする方法；
【００２１】
・前記ＤＮＡと、それに機能可能に連結されたプロモーター、および所望の適当な転写ターミネーターとを含む組換えＤＮＡ構築物で、植物を形質転換することをさらに含む前記の方法；
・前記のＤＮＡの発現を減少させる配列、それに機能可能に連結されたプロモーター、および所望の適当な転写ターミネーターを含む組換えＤＮＡ構築物で、植物を形質転換することをさらに含む前記の方法；
・培養植物細胞を、前記の組換えＤＮＡ構築物で形質転換することによって、該培養植物細胞から不定芽を形成させる方法；
【００２２】
・培養植物細胞を、前記の組換えＤＮＡ構築物で形質転換することによって、該培養植物細胞から不定芽を形成させることを含む、植物の生産方法；
・前記の生産方法によって得られる、植物細胞、組織、器官、植物またはその後代；
を提供する。
【００２３】
上記タンパク質は、ＮＡＣドメイン領域である配列番号５の２２−１７１位のアミノ酸配列を含むものが好ましい。
上記タンパク質の好ましい変異体は例えば、配列番号５の６９位のグルタミン酸がアスパラギン酸、アスパラギン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、またはセリンに変化したものを含む。
【００２４】
上記タンパク質の好ましい変異体は例えば、配列番号５の３０位のプロリンがセリンに変異したものを含む。
上記タンパク質の好ましい変異体は、例えば、配列番号５の１０３位のトリプトファンを含んでトリプトファン以降が欠失したものを含む。
上記タンパク質の好ましい変異体は、例えば、配列番号５の２５位のグリシンがアスパラギン酸に変異したものを含む。
上記好ましい変異体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡもまた、本発明に含まれる。
【００２５】
本発明のＤＮＡ（ＣＵＣ３遺伝子）は、その発現レベルの増加または減少によって、植物の側枝形成を、コントロール植物と比較して、実質的に変化、例えば増加または減少させる機能を有することを特徴とする。
本発明のＤＮＡは、好ましくは、配列番号２のヌクレオチド配列で示されるＤＮＡ（ＣＵＣ１遺伝子）または配列番号３のヌクレオチド配列で示されるＤＮＡ（ＣＵＣ２遺伝子）の発現レベルが増加または減少するとき、それに対応して本発明のＤＮＡの発現レベルを増加または減少することによって、植物の側枝形成がコントロール植物と比較して、実質的に変化、例えば、増加または減少する機能を有することを特徴とする。
【００２６】
本発明のＤＮＡは、より好ましくは、配列番号２のヌクレオチド配列で示されるＤＮＡの発現レベルが増加または減少するとき、それに対応して本発明のＤＮＡの発現レベルを増加または減少することによって、植物の側枝形成がコントロール植物と比較して、実質的に変化、例えば、増加または減少する機能を有することを特徴とする。
本発明のＤＮＡは、最も好ましくは、配列番号３のヌクレオチド配列で示されるＤＮＡの発現レベルが増加または減少するとき、それに対応して本発明のＤＮＡの発現レベルを増加または減少することによって、植物の側枝形成がコントロール植物と比較して、実質的に変化、例えば、増加または減少する機能を有することを特徴とする。
本発明のＤＮＡの発現レベルを変化、例えば増加または減少させることは、シロイヌナズナのみならず、他の植物、例えば、双子葉植物、単子葉植物、裸子植物、被子植物の側芽形成を変化、たとえば増加または減少させることが可能であるといえる。
【００２７】
実施例４に記載するように、本発明のＤＮＡを、真核細胞コウボに導入したところ、ＧＵＳ活性が増加した。このことは、本発明のＤＮＡによってコードされるタンパク質が、転写制御因子として機能し得ることを指摘している。
【００２８】
「１ないし１０数個のアミノ酸が置換、付加または欠失している」という用語は、タンパク質のアミノ酸配列について使用するとき、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が、置換、付加または欠失していることを意味する。１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失している」アミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列のタンパク質と実質的に相同な機能を有するものが好ましい。
【００２９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は、核酸ハイブリダイゼーション実験、例えば、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションについては、配列に依存し、そして異なる環境パラメーター下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。
【００３０】
核酸のハイブリダイゼーションへの詳細な案内は、Ｔｉｊｉｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２’’Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ’’  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨで具体的配列についての熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃より低いように選択される。典型的には、「ストリンジェント条件」下で、プローブはその標的配列にハイブリダイズするが他の配列にハイブリダイズしない。
【００３１】
Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（定義されたイオン強度およびｐＨでの）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのためのＴｍに同等であるように選択される。サザンまたはノーザンブロットでのフィルター上で１００より多い相補的残基を有する、相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、終夜実施されるハイブリダイゼーションで、５０％ホルムアミドと、１ｍｇのヘパリンで４２℃である。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件の例は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、７２℃、約１５分である。ストリンジェント洗浄条件の例は、０．２ｘＳＳＣ洗浄、６５℃、１５分間である（ＳＳＣバッファーの記載のために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前掲参照）。
【００３２】
しばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するため、高ストリンジェント洗浄の前に、低ストリンジェンシー洗浄を実施する。例えば１００より多いヌクレオチドの２重らせんのための、中度ストリンジェンシー洗浄の例は、４−６ｘＳＳＣ、４０℃、１５分間である。短いプローブ（例えば、約１０ないし５０ヌクレオチド）について、ストリンジェント条件は典型的には、約１．０ＭＮａイオンより低い塩濃度、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）、ｐＨ７．０ないし８．３であり、そして温度は典型的には、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントは条件はまた、脱安定化剤、例えば、ホルムアミドの添加で達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイでの関連のないプローブについて観察されるものより２ｘ（またはより高い）のシグナル対ノイズ比率は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を指摘する。ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、もしそれらがコードするタンパク質が実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。これは例えば、あるコピーの核酸が、遺伝的コードによって許容される最大コドン縮重を使用して創出されるとき起こる。
【００３３】
以下は、本発明の引用ヌクレオチド配列に実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために使用し得る、ハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である：ある引用ヌクレオチド配列は該引用配列に好ましくは、該引用ヌクレオチド配列に、７％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃中と、洗浄は２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で、より望ましくは７％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃中と、洗浄は１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃で、より望ましくはなお７％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃中と、洗浄は０．５ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃で、好ましくは７％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃中と、洗浄は０．１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃で、より好ましくは７％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃中と、洗浄は０．１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃でハイブリダイズする。
【００３４】
組換えＤＮＡ構築物は、適当な宿主細胞において、特定のヌクレオチド配列の発現を指示することのできる核酸配列であって、所望により終結シグナルに機能可能に連結される所望のヌクレオチド配列に、所望により機能可能に連結されるプロモーターを含む配列を意味する。それは典型的にはまた、ヌクレオチド配列の正しい翻訳に要する配列を含む。所望のヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ構築物は、キメラであり得、その構成要素の少なくとも一つがその他の構成要素の少なくとも１つについて異種性であることを意味する。組換えＤＮＡ構築物はまた、天然に存在するが異種性発現のために有用な組換え形態で取得したものであり得る。典型的にはしかし、組換えＤＮＡ構築物は宿主について異種性であり、すなわち組換えＤＮＡ構築物の特定の核酸配列は、宿主に天然に存在せず、そして形質転換事象によって宿主細胞または宿主細胞の祖先に導入されたに違いない。
【００３５】
組換えＤＮＡ構築物のヌクレオチド配列の発現は、構成的ロモーターの、または宿主細胞がある特定の外部刺激に曝露されるときにのみ転写を開始する誘導的プロモーターの制御下であり得る。多細胞生物、例えば植物の場合には、プロモーターはまた特定組織、または器官、または発達の段階に特異的であることができる。
【００３６】
本発明のＤＮＡを、本発明のＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、その後形質転換植物細胞を植物組織、器官、植物に再生する。形質転換される植物細胞は、植物組織、器官、植物に再生可能なものが好ましい。
【００３７】
本発明のＤＮＡを植物細胞に取り込ませるプロセスは、慣行の組換えＤＮＡ技術を使用して実施できる。このような技術は例えば、秀潤社、植物細胞工学シリーズ４『モデル植物の実験プロトコール』に見出される。一般に、これは、当業界で既知である標準的クローニング手法を使用して、該ＤＮＡが異種性である（すなわち通常存在しない）発現系に本発明のＤＮＡ配列を挿入することを含む。この組換えＤＮＡ構築物は、挿入されるタンパク質コード配列の転写および翻訳のため必要なエレメントを含む。多数の当業界で既知のベクター系、例えば、プラスミド、バクテリオファージウイルス、および他の修飾ウイルスを使用できる。好適なベクターは、ウイルスベクター、例えば、ラムダベクター系、λｇｔ１１、λｇｔ１０、およびシャロン４；プラスミドベクター、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＲシリーズ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲＫ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＣＤＮＡＩＩ；および他の類似系を含み得るがこれらに限定されない。形質転換された細胞を、全植物体に再生し、その結果本発明のＤＮＡの発現レベルの変化によってトランスジェニック植物の側芽形成特性が変化、例えば増加または減少する。
【００３８】
本発明にしたがって形質転換の対象となる植物は、単子葉または双子葉植物である、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロコッリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、トウガラシ、セルリー、カボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スイカ、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、シロイヌナズナ、および樹木植物、例えば、針葉樹、例えば、スギ、ヒノキ、広葉樹、常緑樹および落葉樹を含み得るがこれらに限定されない。ひとたび望まれるヌクレオチド配列が特定植物種に形質転換されると、その種中で増殖し、または伝統的育種技法を使用して同じ種、とくに商業的変種／品種の他の変種／品種に移し得る。
【００３９】
好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡのトランスジェニック植物における発現のために、本発明のＤＮＡを植物で機能しうるように適当なプロモーターに連結された、組換えＤＮＡ構築物を構築し得る。プロモーターの選択は、発現についての時間的および場所的要求に依存して、およびまた標的種に依存して変化する。こうして、本発明のヌクレオチド配列の、葉、穂、花序（例えば、穂状花序、円錐花序、穂軸など）、根、および／または実生での発現が好ましい。双子葉植物からの多くのプロモーターが単子葉植物で機能性で、そしてその逆であると示されたが、理想的には、双子葉植物プロモーターを双子葉植物での発現のために、そして単子葉植物プロモーターを単子葉植物での発現のために選択する。しかし、選択されたプロモーターの起源に制限はなく；望まれる細胞でのヌクレオチド配列の発現を駆動するのに機能的であることで十分である。
【００４０】
構成的発現に好ましいプロモーターは、アクチンまたはユビキチンをコードするＤＮＡからのプロモーターおよびＣａＭＶ  ３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターを含み得る。他のプロモーター配列は、限定されないが例えば、化学的に調節されるプロモーター、傷誘導可能なプロモーター、緑色組織特異的プロモーター、根特異的プロモーター、茎特異的プロモーター、および花特異的プロモーターを含み得る。
【００４１】
好適なプロモーターの選択に加えて、植物での本発明のＤＮＡの発現のための構築物は、所望により、異種性ヌクレオチド配列の下流に付着されるべき適当な転写ターミネーターを要する。いくつかのそのようなターミネーターが利用可能かつ当業界で既知である（例えば、ＣａＭＶからのｔｍｌ、ｒｂｃＳからのＥ９）。植物で機能すると知られる任意の利用可能なターミネーターを本発明の内容で使用し得る。
【００４２】
多くの他の配列を、本発明で記載の組換えＤＮＡ構築物中に取り込むことができる。これらは、発現を増強すると知られた配列、例えばイントロン配列（例えば、Ａｄｈｌおよびｂｒｏｎｚｅ１からの）およびウイルスリーダー配列（例えば、ＴＭＶ、ＭＣＭＶおよびＡＭＶからの）配列を含む。
【００４３】
植物形質転換に好適なベクターは、この明細書の他所に記載される。アグロバクテリウムに仲介される形質転換のために、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー配列を有するバイナリーベクターまたはベクターが好適であり、一方直接遺伝子導入法のために、任意のベクターが好適であり、そして所望の構築物のみを含む線形ＤＮＡが好ましくあり得る。直接遺伝子導入法の場合に、単一ＤＮＡ種または共形質転換での形質転換を使用することができる（Ｓｃｈｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：  １０９３−１０９６（１９８６））。直接遺伝子導入法およびアグロバクテリウムに仲介される形質転換の両方のために、形質転換は通常（しかし必須ではない）、抗生物質（カナマイシン、ハイグロマイシン、またはメトトレキセート）へ、または除草剤（バスタ）への抵抗性を提供し得る選択マーカーで企図される。
【００４４】
そのようなマーカーの例は、ネオマイシンアホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホルホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスヒノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、５−エノールピルビル−シキメート−ホスフェートシンターゼ、ハロアリールニトリラーゼ、プロトポルヒリノーゲンオキシダーゼ、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ、ジヒドロプテロエートシンターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびβグルクロニダーゼである。しかし、植物形質転換のための選択またはスクリーニングマーカーの選択は、本発明に重要の点ではない。
【００４５】
双子葉植物の形質転換
双子葉植物の形質転換技法は当分野でよく知られており、アグロバクテリウムに基づく技法及びアグロバクテリウムを必要としない技法を含む。非アグロバクテリウム技法は、プロトプラスト又は細胞による外生遺伝的物質の直接取り込みを含むものである。これは、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションにより仲介される取り込み、パーティクルボンバードメント（粒子衝突）により仲介される送達、又はマイクロインジェクションによって達成できる。これらの技法の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ３：  ２７１７−２７２２（１９８４）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ：  １９９：１６９−１７７（１９８５）；Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｓｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１００１−１００４（１９８６）；及びＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：  ７０−７３（１９８７）により記載されている。それぞれの場合において、形質転換された細胞は、当分野で既知の標準技術を用いて全植物体に再生される。
【００４６】
アグロバクテリウムにより仲介される形質転換は、その高い形質転換効率及び多くの異なる種に対する広範な用途の故に、双子葉植物の形質転換のための好ましい技術である。アグロバクテリウム形質転換は、典型的には、興味の持たれる外来ＤＮＡを有するバイナリーベクター（例えばｐＣＩＢ２００又はｐＣＩＢ２００１）を、共存するＴｉプラスミド上又は染色体のいずれかに宿主アグロバクテリウム菌株（例えば、ｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１のための菌株ＣＩＢ５４２（Ｕｋｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：  １５９−１６９（１９９３））が持っているｖｉｒ遺伝子の補完に依存するかも知れない適当なアグロバクテリウム菌株に、移入させることを含む。アグロバクテリウムへの組換えバイナリーベクターの移入は、組換えバイナリーベクターを有するＥ．ｃｏｌｉであって、ｐＲＫ２０１３のようなプラスミドを持ち、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム菌株に移動させることのできるヘルパーＥ．ｃｏｌｉ菌株を使用する、三元交配法によって達成する。別法として、この組換えバイナリーベクターは、ＤＮＡ形質転換によってアグロバクテリウムに移入させることができる（Ｈｏｅｆｇｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：  ９８７７（１９８８））。
【００４７】
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常、アグロバクテリウムをその植物由来の外植体と共培養することを含み、当分野で周知のプロトコルに従うものである。形質転換された組織は、該バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡボーダーの間に存在する抗生物質又は除草剤抵抗性マーカーを有する選択培地上で再生する。
【００４８】
或るＤＮＡで植物細胞を形質転換するもう一つのアプローチは、不活性又は生物活性の粒子を植物組織及び細胞に推進させることを含む。この技術はすべてＳａｎｆｏｒｄの米国特許第４９４５０５０、５０３６００６、及び５１００７９２号に開示されている。一般に、この方法は、不活性又は生物活性粒子を、当該細胞の外表面を貫通させその内部への取り込みをもたらすのに有効な条件の下で、細胞へと推進させることを含む。不活性粒子を利用する場合、所望のＤＮＡを含むベクターで当該粒子を被覆することによって、このベクターを細胞内に導入することができる。別法として、ベクターによって標的細胞を取り巻き、その結果、該粒子の通り跡によってベクターを細胞内に運び入れることもできる。生物活性粒子（例えば、導入したいＤＮＡをそれぞれ含んでいる乾燥コウボ細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージ）もまた植物細胞組織中に推進させることができる。
【００４９】
単子葉植物の形質転換
殆どの単子葉植物種の形質転換もまた、現在では常法となっている。好ましい技術は、ＰＥＧ又はエレクトロポレーション技法を用いるプロトプラスト中への直接導入法、及びカルス組織中へのパーティクルボンバードメント（粒子衝突）を含む。形質転換は単一ＤＮＡ種又は多重ＤＮＡ種（即ち共形質転換）で企図することができ、これらの技術は共に本発明での使用に好適である。共形質転換は、完全なベクター構築を回避し、そして、所望の及び選択マーカーの遺伝子について連鎖していない遺伝子座を有するトランスジェニック植物を作出する利点を持ち得、それにより、もしそれが望ましいとされるならば、以後の世代で選択マーカーを除去することが可能となる。しかしながら、共形質転換を使用することの不利な点は、別々のＤＮＡ種が当該ゲノム中に組み込まれる頻度が１００％未満であることである（Ｓｃｈｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：  １０９３−１０９６（１９８６））。
【００５０】
特許出願ＥＰ０２９２４３５、ＥＰ０３９２２２５、及びＷＯ９３／０７２７８は、選抜された近交系トウモロコシからのカルス及びプロトプラストの調製、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを用いるプロトプラストの形質転換、及び形質転換されたプロトプラストからのトウモロコシ植物の再生のための技術を記載している。Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：  ６０３−６１８（１９９０））およびＦｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（１９９０））は、パーティクルボンバードメントを用いるＡ１８８に由来するトウモロコシ系統の形質転換のための技術を公表している。さらに、ＷＯ９３／０７２７８及びＫｏｚｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：  １９４−２００（１９９３））は、パーティクルボンバードメントによる選抜近交系トウモロコシの形質転換の技術を記載している。この技術は、授粉の１４−１５日後のトウモロコシ雌穂から切り取った１．５−２．５ｍｍ長の未熟なトウモロコシ胚、及びボンバードメントのためのＰＤＳ−１０００Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ装置を利用するものである。
【００５１】
イネの形質転換もまた、プロトプラスト又はパーティクルボンバードメントを利用する直接遺伝子導入法技法によって実施することができる。プロトプラストにより仲介される形質転換が、Ｊａｐｏｎｉｃａ型及びＩｎｄｉｃａ型について記載されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ７：  ３７９−３８４（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：  ２７４−２７７（１９８９）；  Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８；  ７３６−７４０（１９９０））。いずれの型もパーティクルボンバードメントを使用して常法により形質転換可能である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：  ９５７−９６２（１９９１））。さらに、ＷＯ９３／２１３３５は、エレクトロポレーションによるイネの形質転換技法を記載している。
【００５２】
特許出願ＥＰ０３３２５８１は、Ｐｏｏｉｄｅａｅプロトプラストの生成、形質転換及び再生のための技術を記載している。これらの技術によりＤａｃｔｙｌｉｓ及びコムギの形質転換が可能となる。さらに、Ｃ型長期再生可能カルスの細胞へのパーティクルボンバードメントを用いるコムギの形質転換が、Ｖａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１５５３−１５５８（１９９３））によって、また、未熟な胚及び未熟な胚に由来するカルスのパーティクルボンバードメントを用いるコムギの形質転換がＶａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６６７−６７４（１９９２））及びＷｅｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０２：  １０７７−１０８４（１９９３））により記載されている。しかしながらコムギの形質転換のための好ましい技術は、未熟な胚のパーティクルボンバードメントによるコムギの形質転換を含むものであって、遺伝子送達前の高シュクロース又は高マルトース段階のいずれかを含んでいる。ボンバードメントに先立ち、体細胞胚の誘導のため、３％シュクロース及び３ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含有するＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇａ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １５：  ４７３−４９７（１９６２））に任意の数の胚（長さ０．７５−１ｍｍ）を平板培養し、これを暗所で進める。選択されたボンバードメントの日に、胚を誘導培地から取り、浸透調節物質（即ち、所望濃度、典型的には１５％のシュクロース又はマルトースを含有する誘導培地）上に配置する。
【００５３】
この胚を２−３時間原形質分離させ、次いでボンバードメントさせる。標的プレート当たり２０個の胚が典型的であるが、それが重要という訳ではない。適当な遺伝子を持つプラスミド（例えばｐＣＩＢ３０６４又はｐＳＧ３５）を、標準法を用いてマイクロメーターサイズの金粒子上に沈殿させる。胚の各プレートを、〜１０００ｐｓｉの爆発圧、標準８０メッシュスクリーンを用いるＤｕＰｏｎｔ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（商標）ヘリウム装置で撃つ。ボンバードメント後、この胚を暗所に戻し、約２４時間回復させる（依然として浸透調節物質上で）。２４時間後、胚を浸透調節物質から取り、誘導培地上に戻し、ここで再生の前に約１ヶ月間保持する。およそ１ヶ月後、発達しつつある胚形成性カルスを発達させる胚の外植体を、適当な選択剤（ｐＣＩＢ３０６４の場合１０ｍｇ／Ｌ  ｂａｓｔａ、そしてｐＳＯＧ３５の場合２ｍｇ／Ｌのメソトレキサート）をさらに含有する再生培地（ＭＳ  ＋  １ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、５ｍｇ／Ｌ  ＧＡ）に移す。およそ１ヶ月後、発達した苗条を、半分の強度のＭＳ、２％シュクロース、及び同濃度の選択剤を入れた、「ＧＡ７」として知られる、より大きな無菌容器に移す。
アグロバクテリウムを使用する単子葉植物の遺伝子導入もまた、今日では常法となっている。アグロバクテリウムを使用する単子葉植物の形質転換の開示は、引用によりここに含めるＷＯ９４／００９７７及び米国特許第５５９１６１６号を参照されたい。
【００５４】
プラスチドの形質転換
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃ．ｖ．’Ｘａｎｔｈｉ  ｎｂ’の種子を、Ｔアガー上で１インチ円配列でプレートあたり７本発芽させ、そして本質的に記載のとおり（Ｓｖａｂ，  Ｚ．  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，  Ｐ．  （１９９３）ＰＡＮＳ  ９０，  ９１３−９１７）、プラスミドｐＰＨ１４３およびｐＰＨ１４５からのＤＮＡでコートされた１μｍタングステン粒子（Ｍ１０，  Ｂｉｏｒａｄ，  Ｈｅｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で、播種１２−１４日後にボンバードする。ボンバードした実生を、２日間Ｔ培地上でインキュベートし、その後、葉を切除しそして明光（３５０−５００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）中で背軸側を上にして、５００μｇ／ｍｌ  スペクチノマイシンジヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ，  Ｗｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含むＲＭＯＰ培地（Ｓｖａｂ，  Ｚ．，  Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，  Ｐ．  （１９９０）ＰＮＡＳ  ８７，  ８５２６−８５３０のプレート上に置く。ボンバードメント３ないし８週後に白化した葉の下に現れる抵抗性シュートを、同じ選択培地上にサブクローン化し、カルスを形成させるままにし、そして二次シュートを単離およびサブクローン化する。独立サブクローにおける形質転換したプラスチドゲノムコピーの完全な分離（ホモプラスミシティー）を、サザンブロッティングの標準的技法によって評価する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）。
【００５５】
ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化した総細胞性ＤＮＡ（Ｍｅｔｔｌｅｒ，  Ｉ．  Ｊ．  （１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ５，  ３４６−３４９）を、１％トリスボレート（ＴＢＥ）アガロースゲル上に分離し、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、そしてｒｐｓ７／１２プラスチドターゲティング配列の一部を含むｐＣ８からの０．７ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡフラグメントに対応する、３２Ｐ標識したランダムプライマー化ヌクレオチド配列で探索する。ホモプラスミックシュートをスペクチノマイシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地（ＭｃＢｒｉｄｅ，  Ｋ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）ＰＮＡＳ  ９１，  ７３０１−７３０５）上で無菌的に発根させ、そして温室に移す。
【００５６】
本発明の核酸配列で形質転換して取得した植物は、単子葉および双子葉植物を含む任意の広範囲の植物種であることができ、しかし、本発明の方法で使用される植物は好ましくは、前記した農業的に重要な標的作物のリストから選択される。生産および品質について重要な他の特性と組み合わせた、本発明のＤＮＡの発現を、育種を通して後代植物に取りこませる。育種アプローチおよび技法は、当業界で既知である。例えば、Ｗｅｌｓｈ  Ｊ．  Ｒ．  Ｆｕｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ（１９８１）；  Ｃｒｏｐ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  Ｗｏｏｄ  Ｄ．  Ｒ．（Ｅｄ．）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（１９８１）；  Ｍａｙｏ  Ｏ．，  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）；  Ｓｉｎｇｈ，  Ｄ．Ｐ．，  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｅｓｔｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ＮＹ（１９８６）；  Ｗｒｉｃｋｅ  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ，  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  Ｗａｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｂｅｒｌｉｎ（１９８６）参照。
【００５７】
本発明の組換えＤＮＡ構築物で形質転換された植物組織、器官、植物、またはその後代は、側芽形成特性、特に側芽成長点形成がコントロール植物と比較して実質的に変化、たとえば増加または減少しているものが好ましい。
【００５８】
本発明のＤＮＡ（ＣＵＣ３遺伝子）の発現レベルを増加または減少させることは、好ましくは、それに対応して、ＣＵＣ１遺伝子および／またはＣＵＣ２遺伝子の発現レベルを増加または減少させる得る。植物における特定のＤＮＡの発現レベルを増加または減少させることは、当業界で既知の手段を使用して実施し得る。特定のＤＮＡの発現レベルを増加させるための手段は、構成的プロモーターの使用、該ＤＮＡのコピー数の増加を含み得るがこれらに限定されない。
【００５９】
植物における特定のＤＮＡの発現を増加する方法は、別個の組換えＤＮＡ構築物による植物細胞の形質転換、例えば、該遺伝子の転写を強力に駆動し得る構成的プロモーターと、該遺伝子をセンス方向で融合したキメラ遺伝子を作製し、これを発現カセット中で標的植物細胞において発現させることを含み得る。該別個の組換えＤＮＡ構築物は、所望により複数コピーの該遺伝子を含み得る。植物での発現に好適な構成的プロモーターには、アクチンまたはユビキチンをコードする遺伝子からのプロモーターおよびＣａＭＶ  ３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターを含み得るがこれらに限定されない。
【００６０】
植物における特定の遺伝子の発現レベルを減少させるための手段は、内生ＣＵＣ３遺伝子それ自体の突然変異誘発、例えば、突然変異原による処理、部位特異的突然変異誘発、ミスマッチ修復、インビトロ突然変異誘発によって内生ＣＵＣ３遺伝子それ自体を変異させること、および別個の組換えＤＮＡ構築物による植物細胞の形質転換、例えば、特定の遺伝子の発現レベルを減少させる配列を含む組換えＤＮＡ構築物による植物細胞の形質転換を含み得るがこれらに限定されない。
【００６１】
植物における特定の遺伝子の発現を減少する方法は、該遺伝子の発現レベルを減少させる配列、例えばアンチセンス配列を使用するアンチセンス技術、センス配列を使用するコサプレッション技術、およびリボザイムをコードする配列を使用するリボザイムアプローチを含み得る。アンチセンス効果は、エッカーらが一過性遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することで、初めて実証した（Ｊ．  Ｒ．  Ｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗ．  Ｄａｖｉｓ，  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．ＵＳＡ．８３：５３７２）。その後、タバコ、ペチュニアおよびトマトでアンチセンスＲＮＡの発現によって標的遺伝子の発現が低下されることが報告されており、現在では植物における遺伝子発現を抑制する手段として確立されている。
【００６２】
コサプレッション技術は、標的遺伝子配列と同一または類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によってもたらされる現象を利用する。コサプレッションは、植物に標的遺伝子と同一または類似の配列を有する遺伝子を、形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的遺伝子の両方の遺伝子の発現が抑制される現象のことをいう。コサプレッションの機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される効果である（Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．７：Ｒ７９３，  １９９７；  Ｃｕｕｒ．  Ｂｉｏｌ．６：８１０，  １９９６）。
【００６３】
リボザイムとは、触媒活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でも、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，  （１９９０）  蛋白質核酸酵素，３５：２１９１）。このようなリボザイムを用いて本発明で標的遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００６４】
植物細胞に突然変異を誘発する方法は、当業界で既知の任意の技術にしたがって実施できる。該方法は、化学物質、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、およびブレオマイシン類よりなる群から選択される化学突然変異誘発物質を使用し得る。また、当該方法は、ＵＶ、γ線、Ｘ線、および高速ニュートロンよりなる群から選択される放射線を照射することによっても実施し得る。
【００６５】
本明細書で使用する用語の定義は以下の通りである。
【００６６】
遺伝子：用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連した任意のＤＮＡのセグメントを意味するために広く使用する。こうして、遺伝子は、コード配列および／またはそれらの発現に要する調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する予測できないＤＮＡセグメントを含む。遺伝子は、所望の源からのクローニングまたは既知のまたは予測される配列情報からの合成を含む種々の源から取得することができる。
遺伝子の「発現」は、内生遺伝子または外来性、異種性遺伝子および／または導入遺伝子の転写及び／または翻訳を意味する。アンチセンス構築物の場合、例えば、発現は、アンチセンスＤＮＡの転写のみを意味し得る。
【００６７】
「植物」は、任意の発達段階の任意の植物、特に種子植物、例えば、単子葉または双子葉植物である。「植物」はまた、植物の一部、例えば、葉、茎、根、花または花部分、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿し木、細胞、または組織培養物または任意の他の植物の部分または産物を含み得る。
その「後代」は、ある植物から有性生殖または無性生殖によって生産される任意の植物、例えば種子、苗、シュート、球根、塊茎、根茎、またはある植物から伝統的増殖法および／または育種法の適用によって得られる任意の植物を含み得る。
「植物細胞」は、植物の構造的、および生理学的単位であり、プロトプラストおよび細胞壁を含む。植物細胞は、単離単一細胞または培養細胞の形態で、または高度に組織化された単位、例えば、植物組織、植物器官、または全植物体の一部としての形態であり得る。
【００６８】
「培養植物細胞」は、植物単位の培養（物）、例えば、種々の発達段階の、プロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚のう、接合子および胚の培養物を意味する。
【００６９】
「植物器官」は、植物の明瞭かつ可視的に構成されたおよび分化した部分、例えば、根、茎、葉、花芽、または胚である。
本明細所で使用する用語「不定芽」は、植物の定芽を除くすべての芽を意味する。例えば、植物の葉、茎またはカルス上に形成される芽は不定芽である。ここで、用語「定芽」は、頂芽、腋芽、副芽などのように、一定の部位に生ずる芽を意味する。
本明細書で使用する用語「不定根」は、根以外の器官、例えばカルスから二次的に形成される根を意味する。
本明細書で使用する用語「側芽」は、茎軸の側方へ発生する芽、例えば、限定するものではないが、腋芽、主芽、および副芽を含み得る。
「側芽を形成する」は、当初は目視的または顕微鏡的に側芽を視認し得なかった側芽が、視認し得る状態となることをいう。
「側芽形成を、コントロール植物と比較して実質的に増加または減少させる」は、コントロール植物の側芽形成と比較して、慣行の統計学的手法、例えば、ｔ−検定、分散分析、多変量解析、ダンカンの多重検定等によって統計学的に、例えば、１０％、５％、３％、１％、０．０５％、０．０１％の有意水準で有意に側芽形成、特に側芽成長点形成が増加または減少していることを意味する。
【００７０】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を含むコード領域の上流の非翻訳ヌクレオチド配列であり、そしてＤＮＡの転写を開始する。該プロモーター領域はまた、遺伝子発現のレギュレーターとして作用する他のエレメントを含み得る。
「プロトプラスト」は、細胞壁を欠く、または細胞壁の一部のみを有する単離植物細胞である。
【００７１】
「遺伝子の変異」は、ＤＮＡのヌクレオチド配列中の検出可能なすべての変化を含む。遺伝子の変異の例は、点変異、欠失、重複、逆位、挿入、および転座等を含み得るがこれらに限定されない。
【００７２】
「形質転換」は、宿主細胞または生物に異種性核酸を導入するためのプロセスである。特に、「形質転換」は、所望の生物のゲノムへのＤＮＡ分子の安定的組みこみを意味する。形質転換された細胞、組織または植物は、形質転換プロセスの最終産物のみならず、またそのトランスジェニック後代を含むと理解される。
【００７３】
なお、本明細書の用語の意味は突起した用語以外、本発明の属する技術分野の当業者が通常用い得る意味に解釈すべきである。また、遺伝子導入、突然変異処理、塩基配列の決定および植物の発芽、育成、管理は、本発明の属する技術分野の当業者の任意に既知の方法により実施し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  （１９８９）等）。
【００７４】
【実施例】
実施例１：突然変異株の誘発
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）エコタイプＬｅｒ系統のｃｕｃ２−１突然変異株を、本質的にＡｉｄａら、１９９７、前掲の記載にしたがって取得する。得られたｃｕｃ２−１突然変異株を、Ｆｕｋａｋｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１０，  ９３３−９４３（１９９１）に記載のように、一定の白色光下で、２３℃の制御条件下で成長させる。このｃｕｃ２−１突然変異体の種子にエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理する事により新しい変異（ｃｕｃ３−１，−２，−３，−４）を誘発する。ＥＭＳ処理は以下の手順でドラフト内において行う。１５ｍｌファルコンチューブに２ｍｌのＢ５（３．３ｇ／ｌ  ガンボーグＢ５培地用混合塩類）溶液以下に組成を示す）に８μｌのＥＭＳ溶液を加え、よく撹拌する。ｃｕｃ２変異体の種子約５０００粒を加え、８時間常温で放置する。その後、Ｂ５溶液で種子を１０回洗浄する。
【００７５】
実施例２：ＣＵＣ３遺伝子の単離
ＣＵＣ３遺伝子はポジショナルクローニング法によって単離する。具体的には、秀潤社植物細胞工学シリーズ１４『植物のゲノム研究プロトコール』２−５−ｂ「シロイヌナズナのマップベースクローニング法」（ｐ９５−１０２）に従って実施する。
【００７６】
「マッピング」
野生型がＬｅｒのｃｕｃ３−１，ｃｕｃ２−１と野生型のＣｏｌを交配して、Ｆ２世代でｃｕｃｕ２ｃｕｃ３表現型を示したものを選び出し、各個体から独立に通常の方法でＤＮＡを抽出する。最初のマッピングでは、約４０本の染色体についてＣｏｌとＬｅｒでポリモルフィズムを示すＤＮＡマーカーを用いて調べると、第１染色体上のＮＧＡ６９２と強い連鎖が見られＣＵＣ３が第１染色体に座上する事が解る。続いてさらに染色体約４０本について調べると、Ａｔ１ｇ７６４２０に変異があることが明らかになる。
塩基配列の決定は、本質的に製造者の指示にしたがってパーキンエルマー社のＡＢＩ３１００  ＤＮＡシークエンサーを用いて行なう。結果は以下の通りである。
ＣＵＣ３遺伝子の構造
【表１】
2004290064.tif 000002
【００７７】
ＣＵＣ３遺伝子の特徴的な構造部分は、以下の通りである。
2004290064.tif 000003
【００７８】
実施例３：突然変異部位の決定
上記で得られるＣＵＣ３遺伝子内の突然変異部位の決定は、本質的に製造者の指示にしたがって、パーキンエルマー社のＡＢＩ３１００  ＤＮＡシークエンサーを用いて、ｃｕｃ３変異体におけるＣＵＣ３遺伝子内の塩基配列が野生型のものと異なる部位を決定した。
ｃｕｃ３−１      第一イントロンと第一エキソンの境目のＡＧ：ＧＴ−＞ＡＧ：ＡＴに変異、イントロンの切り出しができないと推定
ｃｕｃ３−２      １塩基置換により３０番目のプロリンがセリンに変化
ｃｕｃ３−３      １塩基置換により１０３番目のトリプトファンがストップコドンに変化ｃｕｃ３−４      １塩基置換により２５番目のグリシンがアスパラギン酸に変化
塩基配列の決定は、本質的に製造者の指示にしたがって、パーキンエルマー社のＡＢＩ３１００  ＤＮＡシークエンサーを用いて行う。
【００７９】
実施例４：酵母を使った転写活性化の検定
フォワードプライマー：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴ−３’（配列番号６）および
リバースプライマー５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡＧＧ−３’（配列番号７）
をプライマーとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造）を用いてＰＣＲでＣＵＣ３のＯＲＦを増幅する。鋳型には発芽７日目のシロイヌナズナの芽生え由来の全ＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡを用いる。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングする。再びそのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片をｐＧＢＴ９のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位にリクローニングし、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のｙｅａｓｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｈａｎｄｂｏｏｋに従って、酵母Ｙ１８７株に形質転換を行い、β−ガラクトシダーゼの活性を測定する。結果は、ＣＵＣ３が転写因子として機能することを指摘する。
【００８０】
【表２】
2004290064.tif 000004
【００８１】
実施例５：形質転換カルスを使った不定芽形成能の検定
滅菌したシロイヌナズナの種子をＧＭ培地上に蒔き、発芽後寒冷紗の下で、弱光により胚軸を徒長させる。７日間培養の後、胚軸を切り出し、６日間ＣＩＭ培地上で培養しカルス化させる。このカルスをアグロバクテリウムをＯＤ６００＝  ０．２と成るよう懸濁したＢ５−ＭＥＳに浸しその後、ＣＩＭプレート上でアグロバクテリウムと２日間共培養する。次にカルスを洗浄液で１０回以上洗い、その後抗菌用の抗生物質の入ったＳＩＭ選択培地上で培養しシュート形成を誘導する。
上記のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）にクローニングしたＣＵＣ３  ｃＤＮＡをＳｐｅＩ／ＸｈｏＩ断片として切り出し、ｐＤＨ１２３のＳｐｅＩ／ＸｈｏＩ部位にリクローニングし、アグロバクテリウムＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０に形質転換する。
【００８２】
ＧＭプレート
ムラシゲ−Ｓｋｏｏｇ塩                            ４．３  ｇ／Ｌ
スクロース                                      １０．０  ｇ／Ｌ
ミオイノシトール                            ０．１  ｇ／Ｌ
０．０５％  （ｗ／ｖ）  ＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ５．７）        ５．０  ｍｌ／ｌ
チアミン塩酸塩                              ２０．０  μｇ／Ｌ
ニコチン酸                                        １．０  μｇ／Ｌ
ピリドキシン塩酸塩                        １．０  μｇ／Ｌ
ビオチン                                            １．０  μｇ／Ｌ
ゲランガム                                          ５．０  ｇ／ｌ
【００８３】
カルス誘導培地（ＣＩＭ）
ガンボルグのＢ５塩                              ３．３ｇ／Ｌ
グルコース                                        ２０ｇ／Ｌ
ミオイノシトール                              ０．１ｇ／Ｌ
ＭＥＳ  ＫＯＨ                                                ０．５ｇ／Ｌ
チアミン塩酸塩                                ２０．０  μｇ／Ｌ
ニコチン酸                                          １．０  μｇ／Ｌ
ピリドキシン塩酸塩                          １．０  μｇ／Ｌ
ビオチン                                              １．０  μｇ／Ｌ
２，４−Ｄ                                            ０．５ｍｇ／Ｌ
カイネチン                                  ０．１ｍｇ／Ｌ
ゲランガム                                            ７．５  ｇ／Ｌ
【００８４】
シュート誘導培地（ＳＩＭ）
ガンボルグのＢ５塩塩                            ３．３ｇ／Ｌ
グルコース                                          ２０ｇ／Ｌ
ミオイノシトール                                ０．１ｇ／Ｌ
ＭＥＳ  ＫＯＨ                                                  ０．５ｇ／Ｌ
チアミン塩酸塩                              ２０．０  μｇ／Ｌ
ニコチン酸                                        １．０  μｇ／Ｌ
ピリドキシン塩酸塩                        １．０  μｇ／Ｌ
ビオチン                                            １．０  μｇ／Ｌ
ＩＡＡ                                            ０．１５  ｍｇ／Ｌ
２ｉＰ                                              ０．５  ｍｇ／Ｌ
ゲランガム                                          ７．５  ｇ／Ｌ
【００８５】
Ｂ５−ＭＥＳ
ガンボルグのＢ５塩                              ３．３  ｇ／Ｌ
ＭＥＳ  ＫＯＨ                                                ０．５  ｇ／Ｌ洗浄液
Ｂ５−ＭＥＳに２００ｍｇ／Ｌ  バンコマイシン，  ２００ｍｇ／Ｌ  ｃｌａｆｏｒａｎ（セフォタキシム  ナトリウム）を加えた。
選択培地はＳＩＭに１００ｍｇ／Ｌ  ａｕｇｐｅｎｉｎ（カリウム  ｃｌａｖｕｌａｎａｔｅ  ：  ｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ  ナトリウム  ＝  １：１５），    ２０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシンＢを加えた。
結果はＣＵＣ３  ｃＤＮＡによる形質転換が、カルスから不定芽を誘導することを示している。
【表３】
2004290064.tif 000005
【００８６】
【発明の効果】
本発明に記載の新規遺伝子を使用して、植物の側枝形成を制御する、分子生物学的手段が得られる。そしてこの手段により、植物育種において側枝形成特性が変化した植物系統を取得することが可能となると言う顕著な効果がもたらされる。また本発明の新規遺伝子を使用して、培養植物細胞から不定芽／不定根を安定的かつ容易に誘導することによって、同一遺伝子型のクローンを大量増殖することが可能となるという顕著な効果がもたらされる。
【００８７】
【配列表】
2004290064.tif 000006
2004290064.tif 000007
2004290064.tif 000008
2004290064.tif 000009
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2004290064.tif 000013
2004290064.tif 000014
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2004290064.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｃｕｃ１ｃｕｃ２、ｃｕｃ１ｃｕｃ３およびｃｕｃ２ｃｕｃ３突然変異株のカップ形状子葉（ｃｕｐ  ｓｈａｐｅｄ  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）を示す。
【図２−１】図２−１は、ＣＵＣ３のヌクレオチド配列を示す。
【図２−２】図２−２は、ＣＵＣ３のヌクレオチド配列を示す。
【図２−３】図２−３は、ＣＵＣ３のヌクレオチド配列を示す。
【図２−４】図２−４は、ＣＵＣ３のヌクレオチド配列を示す。
【図３】図３は、野生型およびｃｕｃ２ｃｕｃ３の２サブタイプの突然変異株シロイヌナズナを示す。野生型は正常に側芽を形成するのに対し、ｃｕｃ２−１ｃｕｃ３−２は側芽形成が抑制され、ｃｕｃ２−１ｃｕｃ３−１は側芽形成が完全に阻害された。
【図４】図４は、ＣＵＣ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２−１】
2004290064.tif 000019
【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
2004290064.tif 000023
【図４】
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