(57)【要約】【課題】試料中に存在する酸素−１７核を含有した化合物を簡便かつ高精度で定量する方法を提供する。【解決手段】［１］酸素−１７核を含有した化合物を定量するに当り、分析法として核磁気共鳴分光法を用い、標準物質として、測定試料とは酸素−１７核の共鳴周波数が異なる物質を用い、該標準物質と測定試料を同時に測定することを特徴とする酸素−１７核を含有した化合物の定量方法。［２］標準物質が、カルボン酸類、ケトン類、エーテル類、アルコール類、エステル類、アミド類、アルデヒド類、スルホキシド類、ニトロアルカン類、尿素類および水から選ばれることを特徴とする上記［１］記載の定量方法。［３］試料管として、同軸二重試料管を用い、試料と標準物質とを混合させずに測定することを特徴とする上記［１］〜［２］いずれかに記載の定量方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸素−１７核を含有した化合物を定量するに当り、分析法として核磁気共鳴分光法を用い、標準物質として、測定試料とは酸素−１７核の共鳴周波数が異なる物質を用い、該標準物質と測定試料とを同時に測定することを特徴とする酸素−１７核を含有した化合物の定量方法。
【請求項２】
酸素−１７核を含有した化合物が、酸素−１７核で標識した水であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
標準物質が、カルボン酸類、ケトン類、エーテル類、アルコール類、エステル類、アミド類、アルデヒド類、スルホキシド類、ニトロアルカン類、尿素類および水から選ばれる含酸素化合物であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
試料が血液であることを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
試料管として、同軸二重試料管を用い、試料と標準物質とを混合させずに測定することを特徴とする請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸素−１７核を含有した化合物の定量方法に関し、詳しくは試料中に存在する酸素−１７核を含有した化合物を、標準物質を用いた核磁気共鳴分光法により定量する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術、発明が解決しようとする課題】
酸素−１７核を含有した化合物、例えば構造の一部を酸素−１７核で標識した化合物は、分析化学、有機化学、生化学、薬物動態学、診断薬等の種々の分野に応用可能である。
しかし酸素−１７は天然存在比が０．０３８％と著しく低いため、酸素−１７核で標識した化合物は、通常は未標識化合物との混合物として得られる。そのため該混合物中の標識化合物の濃度を予め定量しておくことが必要となる。
【０００３】
また例えば、薬物動態学や診断薬の分野においては、血液等の生体試料中における酸素−１７核で標識した化合物の濃度の測定を必要とする場合がある。例えば酸素−１７核で標識した水（以下、Ｈ２１７Ｏと略称する）は、プロトンを検出核とした核磁気共鳴イメージング（以下、ＭＲＩと略称する）において、血流測定を対象とした造影剤として知られており（非特許文献１）、このＭＲＩにおいては、血中のＨ２１７Ｏ濃度を別途測定する必要がある。
【０００４】
一方、酸素−１７核で標識した化合物等の同位体で標識した化合物を定量する方法としては、質量分析による方法が広く用いられているが、水のような低分子化合物における同位体標識化合物の濃度を測定するためには、低分子化合物分析用の汎用性の低い専用設備が必要であるという問題があった。
また薬物動態学や診断薬の分野において、生体試料中の同位体標識化合物の濃度を質量分析法により測定する場合には、該生体試料中には多くの生体成分が混在しこれら混在物が妨害するため、試料の前処理を必要とし（非特許文献２）測定方法が煩雑であるという問題、更には生体試料による装置汚染の問題があった。
【０００５】
また酸素−１７核で標識した化合物等の同位体元素が磁性核である場合は、核磁気共鳴分光法による分析も可能である。この方法は、非破壊分析方法であり、低分子化合物分析用の専用設備も特に必要としない等の点で他の分析法に比し利点を有している。そして具体的定量方法としては、核磁気共鳴スペクトルの面積値により計算する方法が一般的に行われている（非特許文献３）。
しかしながらこの方法では、試料中に含まれている測定対象である磁性核の密度に応じて、その測定条件、例えば積算回数、検出器のゲイン等を変更する必要があり、このため算出の過程が煩雑となり定量値の精度及び真度が低下するという問題があった。
【０００６】
一方、標準物質を用いて定量する方法として、重水素化化合物を重水素ＭＮＲにより測定する方法が提案されている（特許文献１）。
しかしながら、この方法は、予め重水素標識率９５〜９９％の標準物質を合成し、該標準物質を０．０１〜０．２％となるように希釈して使用する必要があるため、操作が煩雑になるという問題があった。また酸素−１７は、重水素とは異なり濃縮による純度向上が極めて困難であることから、この方法を酸素−１７標識化合物の定量方法として採用することは困難であた。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５  １２９３４（１９９８）
【非特許文献２】
「これならわかるマススペクトロメトリー」化学同人１２８〜１３０頁（２００１）
【非特許文献３】
［高分解能ＮＭＲ］東京化学同人２２３〜２２７頁（１９８３）
【特許文献１】
特開昭５８−１５４６４６
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、酸素−１７核を含有した化合物の定量方法について鋭意検討した結果、分析法として核磁気共鳴分光法を用い、標準物質として、測定試料とは酸素−１７核の共鳴周波数が異なるという特定の物質を用いることにより、試料中の酸素−１７核を含有した化合物の濃度を簡便かつ高精度で定量し得ることを見出すとともに、試料が生体試料等であっても装置汚染の恐れもなく、多くの成分が混在している試料であっても前処理なしでも測定し得、また低分子化合物であっても汎用の設備で定量し得ることを確認し、更に種々の検討を加え、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、［１］酸素−１７核を含有した化合物を定量するに当り、分析法として核磁気共鳴分光法を用い、標準物質として、測定試料とは酸素−１７核の共鳴周波数が異なる物質を用い、該標準物質と測定試料を同時に測定することを特徴とする酸素−１７核を含有した化合物の定量方法、
【００１０】
［２］酸素−１７核を含有した化合物が、酸素−１７核で標識した水であることを特徴とする上記［１］の定量方法、
［３］標準物質が、カルボン酸類、ケトン類、エーテル類、アルコール類、エステル類、アミド類、アルデヒド類、スルホキシド類、ニトロアルカン類、尿素類および水から選ばれる含酸素化合物であることを特徴とする上記［１］または［２］記載の定量方法、
【００１１】
［４］試料が血液であることを特徴とする上記［１］〜［３］いずれかに記載の定量方法、
［５］試料管として、同軸二重試料管を用い、試料と標準物質とを混合させずに測定することを特徴とする上記［１］〜［４］いずれかに記載の定量方法
等を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、酸素−１７核を含有した化合物を定量するに当り、分析法として核磁気共鳴分光法を用い、標準物質として、測定試料とは酸素−１７核の共鳴周波数が異なるという特定の物質を用いることを特徴とするものである。
ここで、標準物質としては、含酸素化合物が使用される。その具体的化合物としては、例えばギ酸、酢酸、無水酢酸、アクリル酸、トリフルオロ酢酸等で代表されるカルボン酸類、アセトン、アセチルアセトン、シクロヘキサノン等で代用されるケトン類、ジエチルエーテル、１，１−ジエトキシエタン、エチルビニルエーテル、フラン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジヒドロピラン等で代表されるエーテル類、メタノール、エタノール、イソブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、エチレングリコール、２−クロロエタノール等で代表されるアルコール類、酢酸エチル、酢酸ビニル、アクリル酸メチル、オルトギ酸メチル等で代表されるエステル類、アセトアミド、ジメチルホルムアミド等で代表されるアミド類、アセトアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラアルデヒド等で代表されるアルデヒド類、ジメチルスルホキシド等で代表されるスルホキシド類、ニトロエタン等で代表されるニトロアルカン類、尿素、ジメチル尿素等で代表される尿素類、水などの酸素を含有する化合物群が挙げられる。これらの化合物群の中から、酸素−１７核の共鳴周波数が、測定試料の酸素−１７の共鳴周波数とは異なる化合物が選ばれる。
【００１３】
なかでも、測定の対象化合物が、Ｈ２１７Ｏである場合には、標準物質として、酢酸、アセトン、アセチルアセトン、１，１−ジエトキシエタン、ジヒドロピラン、メタノール、エタノール等から選ばれる化合物を用いることが好ましい。酢酸を用いることがより好ましい。
【００１４】
本発明においては、標準物質が、測定試料に対して反応性が無い場合や、反応性があっても非常に低い場合であって、両者が混合により均一となる場合は、両者を混合して測定することにより試料中の、酸素−１７核を含有した化合物を定量し得る。
また例えば図１に示すような同軸二重試料管等を用いて、標準物質と測定試料とを混合させずに測定することもできる。このような同軸二重試料管等を用いる場合は、標準物質が、測定試料と反応する場合や混合しない場合に、好ましく用いられる。
【００１５】
ここで、同軸二重試料管等を用いる場合は、例えば測定試料と標準物質における酸素−１７の感度比や横緩和時間の値に応じて、外管２の水平断面積における内周円に囲まれた断面積（図１における直径Ａの円）から、内管１の水平断面における外周円に囲まれた断面積（図１における直径Ｂの円）を引いた面積と、内管１の水平断面積における内周円に囲まれた断面積（図１における直径Ｃの円）との比を調整した二重管を作成し、内管に測定試料を外管に標準物質を入れて測定することにより、測定試料と標準物質における信号強度のバランスをはかることができ、これにより定量の真度、再現性等を向上し得る。
【００１６】
例えば、標準物質における酸素−１７の感度が、測定試料における感度の約半分程度である場合には、測定試料外管の内側の断面積から内管の断面積を引いた値が、内管の内側における断面積の１から４倍程度になるように二重管を作成することが好ましい。
また測定試料と標準物質における酸素−１７の感度がほぼ同程度で、横緩和時間もほぼ同程度である場合には、測定試料外管の内側の断面積と、外管の内側の断面積から内管の断面積を引いた値が、等しくなるように二重管を作成することが好ましい。
このような二重管を用い、例えば内管に測定試料を外管に標準物質を入れて測定することにより、核磁気共鳴装置の検出領域に含まれる測定試料と標準物質の量がほぼ等しくなるので、測定試料と標準物質における信号強度のバランスをはかることができ、これにより定量の真度、再現性等を向上し得る。
【００１７】
本発明においては、上記のように測定試料と標準物質を用い、両者を混合し又は同軸二重管を用いることにより混合せずに、両者を同時に測定する。その際、標準物質として、測定試料とは酸素−１７核の共鳴周波数が異なる物質を用いることにより、核磁気共鳴スペクトル上には、測定試料由来のスペクトルと標準物質由来のスペクトルが分離して検出される。
例えば、測定試料が水で標準物質が酢酸である場合は、Ｈ２１７Ｏ由来の酸素−１７の核磁気共鳴スペクトルから約２５５ｐｐｍの位置に酢酸由来の酸素−１７の核磁気共鳴スペクトルを検出することができる（図２）。ここで、標準物質由来のスペクトルの積分値に対する測定試料由来のスペクトルの積分値の割合（以下、相対積分値と略称する）は、試料中に含まれる酸素−１７核のモル数を反映しているので、この相対積分値を用いて、測定試料中のＨ２１７Ｏ濃度を定量することができる。
【００１８】
具体的には、試料の測定に先立って、Ｈ２１７Ｏ濃度の明らかな試料、典型的には蒸留水を用いて、上記の要領で核磁気共鳴スペクトルを計測し、酢酸由来のスペクトル積分値に対する蒸留水中におけるＨ２１７Ｏ由来のスペクトルの相対分析値を求める。この値を、蒸留水におけるＨ２１７Ｏの天然存在比（０．０３８％）で除することにより、Ｈ２１７Ｏ  １％当りの相対積分値を求め、試料における相対積分値をＨ２１７Ｏ１％当りの相対積分値で除することによって、試料中のＨ２１７Ｏ濃度を求めることができる。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例にのみに限定されるものでないことは言うまでもない。
【００２０】
実施例１  蒸留水中のＨ２１７Ｏ濃度測定における平衡精度の確認
外径１０ｍｍの同軸二重管の外管（外径９．９８ｍｍ、内径９．０３ｍｍ）に酢酸を、内管（外径４．９６５ｍｍ、内径４．２２０ｍｍ）に蒸留水を入れ、酸素−１７（以下、１７Ｏと略記する）核の核磁気共鳴スペクトルの測定を行った。核磁気共鳴装置は、Ｖａｒｉａｎ社製、ＵＮＩＴＹｐｌｕｓ５００型スペクトロメター（１７Ｏ核共鳴周波数６７．８ＭＨｚ）を用い、２５℃で測定した。フリップ角は８０°とし、積算回数は８１９２回とした。尚、ＮＭＲロック及び試料管のスピニングは行わずに測定した。試料の調製及び測定を６回繰返し行い平衡精度を評価した。
【００２１】
代表的な核磁気共鳴スペクトルを図２に、平衡精度の測定結果を表１に示す。繰返し測定における相対積分値の平均及び標準偏差は、それぞれ４３．９０及び０．２６であった。このばらつきは、Ｈ２１７Ｏ濃度に換算すると０．０００２％に相当し、Ｈ２１７Ｏの存在比が０．０３８％であることを考慮すると、このばらつきは極めて小さいので、本法における再現性は非常に良好であることが確認された。
【００２２】
【表１】
2004286712.tif 000002
【００２３】
実施例２  イヌ由来血中のＨ２１７Ｏ濃度測定における直線性及び真度の確認
イヌ由来の血液１．９ｍＬに種々のＨ２１７Ｏ濃度（０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５及び１％）の水０．１ｍＬを混合し試料を調製した。これらのＨ２１７Ｏを混合した試料と混合しない試料（ＮＡ）を用いる以外は、実施例１に準拠して核磁気共鳴スペクトルを測定した。
【００２４】
各資料におけるＨ２１７Ｏの相対積分値及び添加回収率の計算結果を表２に示す。
また各資料におけるＨ２１７Ｏ添加量に対しするＨ２１７Ｏの相対積分値の増加量をプロットしたグラフを図３に示す。このプロットにおける回帰直線の相関係数は、０．９９９０であり、本法における直線性は極めて良好であることが確認された。
【００２５】
【表２】
2004286712.tif 000003
（Ｈｔ：ヘマトクリット値、＊：Ｈ２１７Ｏの核磁気共鳴スペクトルの積分値より算出した値）
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、分析法として核磁気共鳴分光法を用い、標準物質として、測定試料とは酸素−１７核の共鳴周波数が異なるという特定の物質を用いることにより、試料中の酸素−１７核を含有した化合物の濃度を簡便かつ高精度で定量し得る。加えて、試料が生体試料等であっても装置汚染の恐れもなく、多くの成分が混在している試料であっても前処理なしでも測定し得、また低分子化合物であっても汎用の設備で定量し得るので、本発明は酸素−１７核を含有した化合物の定量方法として有利である。
また本発明の同軸二重試料管等を用いる方法によれば、標準物質が、測定試料と反応する場合や混合しない場合であっても、簡便かつ高精度で定量し得るので、本発明はこの点でも有利となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】同軸二重管の概念図
【図２】水（蒸留水）及び酢酸を同時に測定した時の代表的な１７Ｏ核  核磁気共鳴スペクトル
【図３】イヌ由来血液におけるＨ２１７Ｏの添加量と、１７Ｏ核における核磁気共鳴スペクトルの相対積分値の増加量との関係を示す図
【符号の説明】
１・・・内管
２・・・外管
Ａ・・・外管内径
Ｂ・・・内管外径
Ｃ・・・内管内径
【図１】
2004286712.tif 000004
【図２】
2004286712.tif 000005
【図３】
2004286712.tif 000006