(57)【要約】【課題】キイロショウジョウバエ由来の新規なグルクロン酸転移酵素及びその遺伝子を提供する。【解決手段】本発明に係るＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、グルクロン酸転移活性を有し、何れもＧＡＧ鎖の合成に関与するとともに、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、ＨＮＫ−１エピトープの合成に関与する可能性が高い。また、本発明に係る遺伝子は上記３種のタンパク質をコードする遺伝子である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるグルクロン酸転移酵素。
【請求項２】
キイロショウジョウバエ由来である請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち、４９〜９６９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号３に示される塩基配列のうち、６７〜１１６７番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号５に示される塩基配列のうち、８２〜１０３２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項６】
配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項７】
配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるグルクロン酸転移酵素。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１０】
請求項６又は７に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規グルクロン酸転移酵素及びその遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
糖鎖は、接着分子、受容体等として幅広い細胞に存在しており、様々な生物学的現象に関与することが知られている。中でも、プロテオグリカン（ＰＧ）は、細胞間の相互作用や、免疫における細胞認識機構とリンパ球の特異的ホーミング現象、がん細胞の接着と転移等、多方面にわたる生物学的現象において重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。ＰＧは糖鎖部分にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を有しており、このＧＡＧ鎖が上記生物学的現象に関与する機能を担っていると考えられている。
【０００３】
ＧＡＧ鎖は様々なコアタンパク質における特定のセリン残基に共有結合しているが、ＧＡＧ鎖とタンパク質とを橋渡すＧＡＧ−タンパク質結合領域は、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒという四糖−セリン共通構造を有している。なお、ＧｌｃＵＡはグルクロン酸を、ＧａｌはガラクトースをＸｙｌはキシロースを示す。
【０００４】
近年、糖鎖を修飾や変化させることで、糖鎖の機能を修飾したり、修飾された糖鎖を有する細胞の機能を変化させたりする技術、すなわち糖鎖工学の研究開発が進んでいる。糖鎖工学の技術の一つとして、糖転移酵素を用いて糖鎖を修飾・変化させることが行われており、上記ＰＧにおけるＧＡＧ鎖においても、このＧＡＧ鎖を構成するアミノ糖、ウロン酸、ガラクトース等を、糖転移酵素によって糖転移させることで修飾または変化させることが可能となる。また、糖転移酵素を用いることで、生理活性を有する新規な糖鎖を合成して各種医薬品等として応用することもできる。
【０００５】
上記ＧＡＧ鎖を構成する糖のうち、ウロン酸の一種であるグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ，　ＧｌｃＡ）を糖転移する酵素（グルクロン酸転移酵素、グルクロニルトランスフェラーゼ）としては、例えば、ヒト由来のＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．２７３，　６６１５−６６１８，　１９９８）や、ＧｌｃＡＴ−Ｐタンパク質（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ９４，　６０９３−６０９８，　１９９７）、あるいは特開平１０−３１３８６７号公報に開示されているラット由来のグルクロン酸転移酵素等が知られている。
【０００６】
上記ＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は、本発明者らによって初めてｃＤＮＡクローニングされたグルクロン酸転移酵素であり、糖ヌクレオチドであるウリジン二リン酸−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ）を糖供与体とし、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸（ＣＳ／ＤＳ）やヘパリン／ヘパラン硫酸（Ｈｅｐ／ＨＳ）に共通のＧＡＧ−タンパク質結合領域Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ構造を受容体として、β１−３結合でグルクロン酸を転移させる酵素である。
【０００７】
上記ＧｌｃＡＴ−Ｐタンパク質は、脊椎動物の神経組織に特異的に見出されるＨＮＫ−１エピトープ（ＧｌｃＵＡ（３−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）β１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｏ−Ｒ，ＲはＮ−結合型糖鎖）の生合成に関与するグルクロン酸転移酵素であり、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを糖供与体とし、末端にＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖タンパク質を受容体として、β１−３結合でグルクロン酸を転移させる酵素である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）は、古くから遺伝学の実験材料として用いられてきたが、近年では、発生学や神経生物学等の分子レベルの研究においても中心的なモデル生物となっている。しかしながら、キイロショウジョウバエでは、上記グルクロン酸転移酵素は未だ見出されていない。
【０００９】
キイロショウジョウバエ由来の新規なグルクロン酸転移酵素やその遺伝子、あるいはそれに対する抗体は、糖鎖工学の新規な技術を開発する上で、さらに、キイロショウジョウバエの研究からヒトも含めた各種高等生物におけるＧＡＧ鎖等の糖鎖機能を研究する上で、非常に有用である。また、これらの遺伝子や抗体は、ＧＡＧ鎖の関与する病気の診断や、その治療効果の検査などにも有用である。そのため、キイロショウジョウバエから新規なグルクロン酸転移酵素を見出し、これを生産し利用する方法の開発が強く望まれていた。
【００１０】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、キイロショウジョウバエ由来の新規なグルクロン酸転移酵素及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、ヒトのＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質のアミノ酸配列を用いて、キイロショウジョウバエのゲノムライブラリーの中から新規のグルクロン酸転移酵素及びその遺伝子を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
即ち、本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であり、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるグルクロン酸転移酵素。
【００１３】
上記（ａ）のタンパク質は、本発明者が今回キイロショウジョウバエから新たなグルクロン酸転移酵素として単離・同定したものであり、プロテオグリカンにおいて、グリコサミノグリカンとタンパク質との間の連鎖領域の合成に関与するタンパク質である。
【００１４】
このうち、配列番号２に示すＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は、ヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質と同様の酵素活性を有しており、具体的には、ＧＡＧ鎖に含まれる糖鎖構造のアナログ三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌに対して厳密な受容体基質特異性を示す。それゆえ、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は、ＧＡＧ鎖の合成に関与している可能性が高い。
【００１５】
また、配列番号４に示すＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、および、配列番号６に示すＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、ヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質の基質特異性だけでなく、ヒトＧｌｃＡＴ−Ｐタンパク質と同様の酵素活性を兼ね備えており、上記構造の三糖に加えて、ＨＮＫ−１エピトープに含まれる糖鎖構造アナログも受容体とすることができる。それゆえ、ＨＮＫ−１エピトープだけでなく、様々なβ１−３結合のグルクロン酸の糖転移反応に関与している可能性が示唆される。
【００１６】
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１、３又は５に示される遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
【００１７】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（キイロショウジョウバエ、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、キイロショウジョウバエは、古くから実験動物・モデル動物として広く用いられており、本発明に係る遺伝子やタンパク質を用いた糖鎖工学の技術開発や糖鎖機能の研究だけでなく、さらには、本発明に係る遺伝子やタンパク質のホモログの関与する病気の診断や、その治療効果の検査などに有用である。
【００１８】
本発明に係る抗体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質、又はその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について図１ないし図７に基づいて説明すれば、以下の通りである。尚、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
本発明は、新規なグルクロン酸転移酵素とこれをコードする遺伝子とを見出すとともに、これら遺伝子及びタンパク質の機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明の遺伝子、タンパク質の配列、構造について説明し、次いでこれら遺伝子、タンパク質の機能、利用方法等について説明することとする。また、以下の説明では、グルクロン酸残基をＧｌｃＵＡ、ガラクトース残基をＧａｌ、キシロース残基をＸｙｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン残基をＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基をＧａｌＮＡｃと表記する。また、各残基間の結合は、「β１−３」等として表記する。
【００２１】
本発明者は、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のゲノムライブラリーの中からヒト由来のグルクロン酸転移酵素ＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質との間のアミノ酸ホモロジー検索により３つの遺伝子をスクリーニングし、これら３つの遺伝子の塩基配列を決定し、さらにこれら３つの遺伝子がコードするタンパク質すなわちグルクロン酸転移酵素のアミノ酸配列をそれぞれ決定した。
【００２２】
以下の説明では、キイロショウジョウバエ由来の第１の新規グルクロン酸転移酵素を「ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質」と称し、これをコードする遺伝子を「ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子」と称して説明する。また、第２の新規グルクロン酸転移酵素を「ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質」と称し、これをコードする遺伝子を「ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩ遺伝子」と称して説明する。同様に、第３の新規グルクロン酸転移酵素を「ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質」と称し、これをコードする遺伝子を「ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩ遺伝子」と称して説明する。
【００２３】
（１）本発明に係る遺伝子及びタンパク質の配列、構造
本発明に係る遺伝子は、前述のように、（ａ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｂ）配列番号２、４または６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるグルクロン酸転移酵素をコードする遺伝子であればよい。
【００２４】
本実施の形態では、具体的には、▲１▼配列番号１および図１に示される塩基配列のうち、４９〜９６９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するＤＮＡ（ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子）、▲２▼配列番号３および図２に示される塩基配列のうち、６７〜１１６７番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するＤＮＡ（ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩ遺伝子）、▲３▼配列番号５および図３に示される塩基配列のうち、８２〜１０３２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するＤＮＡ（ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩ遺伝子）、▲４▼これらｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子はキイロショウジョウバエ由来である。
【００２５】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２６】
一方、本発明に係るタンパク質すなわち新規グルクロン酸転移酵素は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号２および図１に示されるアミノ酸配列を有しており、３０６のアミノ酸残基からなっているＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、▲２▼配列番号４および図２に示されるアミノ酸配列を有しており、３６６のアミノ酸残基からなっているＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、▲３▼配列番号６および図３に示されるアミノ酸配列を有しており、３１６のアミノ酸残基からなっているＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質が例示される。
【００２７】
上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は、９残基の細胞質アミノ末端（Ｎ末端）と、これに続く１７残基の膜貫通領域と推定されるドメイン（図中下線）を有している。また、上記ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質は、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質と同様、９残基の細胞質アミノ末端（Ｎ末端）と、これに続く２２残基の膜貫通領域と推定されるドメイン（図中下線）を有している。さらに、上記ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、図３および配列番号６に示すように、３１６のアミノ酸残基からなり、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質やＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質よりも長い３５残基の細胞質アミノ末端（Ｎ末端）を有しており、上記各タンパク質と同様、１５残基の膜貫通領域と推定されるドメイン（図中下線）を有している。
【００２８】
また、図４（ａ）に示すように、上記３種類のタンパク質（ショウジョウバエ由来）は、各タンパク質同士だけでなく、ヒト、ラット、及びＣ．　ｅｌｅｇａｎｓ由来のグルクロン酸転移酵素との間にホモロジーを有している（後述の実施例参照）。なお、図４（ａ）におけるｈＧｌｃＡＴ−ＩおよびｈＧｌｃＡＴ−Ｐがヒト由来のグルクロン酸転移酵素であり、ｒＧｌｃＡＴ−Ｓがラット由来のグルクロン酸転移酵素であり、ＳＱＶ−８がＣ．　ｅｌｅｇａｎｓ由来のグルクロン酸転移酵素である。
【００２９】
なお、図４（ａ）において、塗りつぶしたボックスは全てのタンパク質において相同性を示すアミノ酸残基であり、白抜きのボックスは、４種以上のタンパク質において相同性を示すアミノ酸残基であり、矢印で示すアミノ酸残基は、供与体Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌの非還元末端のＧａｌ残基と相互作用するアミノ酸残基であり、下線で示す領域は保存されたＤ×Ｄモチーフであり、アスタリスクで示されるアミノ酸残基はＵＤＰと相互作用するアミノ酸残基であり、ピリオドで示されるアミノ酸残基はグルクロン酸と相互作用するアミノ酸残基である。
【００３０】
ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、哺乳類のグルクロン酸転移酵素にそれぞれ３６〜４０％、２７〜３０％、及び２８〜３０％の相同性を示し、互いに２４〜３５％の相同性を示している。特に、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は、他の２種に比べて、ＳＱＶ−８タンパク質と３９％の高い相同性を示している（ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質は２７％、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は２５％）。これはＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子が、ショウジョウバエにおけるＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子のオルソログの可能性を示唆している。
【００３１】
また、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質においては、何れも、図４（ａ）における二重下線の矢印で示すように、保存されたグルタミン酸残基の代わりにセリン残基を有している。同様に、図４（ａ）における二重下線のアスタリスクで示すように、保存されたアルギニンの変わりにグルタミンを有している。上記グルタミン酸は末端Ｇａｌの６位のヒドロキシル基と互いに作用していることが推測され、上記アルギニンはβリン酸塩相互作用に関与しているため、これらアミノ酸残基がセリンおよびグルタミンに置換されていることは、上記２種類のタンパク質が後述するユニークな基質特異性を示す原因であることが推測される。
【００３２】
図４（ｂ）には、ＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質の全アミノ酸配列の系統樹を示すが、この系統樹では、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質がヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質とともにグループ化され、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は別に分類されている。
【００３３】
前述のように、本発明に係るタンパク質には、前記（ｂ）のタンパク質、即ち、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるグルクロン酸転移酵素も含まれるが、ここで、「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３４】
上記変異タンパク質には、野生型の活性に異常を持つ変異タンパク質（機能欠失型の変異タンパク質と称する）が含まれていても良い。このような機能欠失型の変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、上記機能欠失型の変異タンパク質をコードする遺伝子が含まれても良い。このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
【００３５】
本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡやＦｌａｇ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。また、公知の各種修飾を受けていてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。
【００３６】
（２）新規グルクロン酸転移酵素の機能
上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、およびＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、何れも、新規なグルクロン酸転移酵素活性を有している。（後述の実施例３参照）。
【００３７】
具体的には、糖ヌクレオチドであるウリジン二リン酸−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ）を供与体として用い、ヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質に対する受容体であり、ＧＡＧ−タンパク質結合領域のアナログである三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌを受容体として用いた場合、上記３種類のタンパク質全てがグルクロン酸転移活性を示し、何れも、β結合でグルクロン酸を受容体に転移させている（後述の実施例４参照）。このうち、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質のグルクロン酸転移活性は、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質に比べて比較的低い（表１参照）。
【００３８】
また、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は、上記三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌに対して受容体として厳密な基質特異性を示し、他の受容体についてはグルクロン酸転移活性を示さず、ヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質に類似している。また、他の二つのタンパク質と異なり、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は３７℃で酵素反応させると、グルクロン酸転移活性を示さないが、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質のグルクロン酸転移活性は、２５℃であっても３７℃で測定された活性の８０％以上を示している。
【００３９】
ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は、上記ＧＡＧ−タンパク質結合領域のアナログに対して比較的厳密な受容体基質特異性を示す。この基質特異性は、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ／ＧｌｃＮＡｃ構造とＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ構造（表２参照）等、糖タンパク質に見られる糖鎖受容体として代用されるいくつかの人工基質に対して、グルクロン酸転移活性を示さない。つまり、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は、ヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質と同様の酵素活性を有していることになる。これに対して、線虫Ｃ．　ｅｌｅｇａｎｓにおけるＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質のオルソログであるＳＶＱ−８タンパク質は、上記人工基質に対する著しい活性を示す。
【００４０】
ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質に比べて、上記三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌに対して約１０倍のグルクロン酸転移活性を示している（表１参照）。しかも、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）およびＡＳＯＲ（Ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｒはオリゴ糖鎖の残余を示す）を受容体とすることができる。この転移反応は、糖タンパク質におけるＨＮＫ−１エピトープの合成に伴って生じる。特に、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質は、三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌよりも、二糖Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ及び二糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃとの反応性が高い。加えて、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、二糖Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、二糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、ラクトースを受容体基質とすることができる。それゆえ、これら２種のタンパク質は、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質とは対照的に、受容体において広範囲の基質特異性を有しており、換言すれば、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、ヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質だけでなくヒトＧｌｃＡＴ−Ｐタンパク質と同様の酵素活性を有していることになる。
【００４１】
さらに、酸性糖脂質では、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃやＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃの存在がキイロショウジョウバエ等のハエで報告されているので、上記二糖Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ及び二糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃは酸性糖脂質の代用である。それゆえ、上記ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、キイロショウジョウバエにおけるＧＡＧ鎖および糖タンパク質のＨＮＫ−１エピトープ、糖脂質のオリゴ糖鎖を含む、様々なβ１−３結合ＧｌｃＡの糖転移反応に関与している可能性が示唆される。また、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃという構造も報告されていないが、今後見出される可能性がある。
【００４２】
このように、本発明に係る新規グルクロン酸転移酵素は、３種全てがＧＡＧ鎖に含まれる糖鎖構造の合成に関与している可能性が高く、さらに、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質およびＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質はＨＮＫ−１エピトープの合成にも関与している可能性が高い。
【００４３】
（３）本発明に係るタンパク質、及びその遺伝子の利用方法
本発明に係る新規グルクロン酸転移酵素及びこれをコードする遺伝子等は、以下の有用性を有する。
【００４４】
まず、上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質の何れも、上述したようにグルクロン酸転移酵素であるので、生理活性を有する硫酸化グリコサミノグリカン、すなわちヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸の構造の根元にあるタンパク質への結合四糖構造「ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ」の人工合成に利用することができる。
【００４５】
次に、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、高等動物の神経組織において特異的に合成される糖タンパク質に見出されるオリゴ糖鎖、すなわちＨＮＫ−１エピトープの部分構造の合成にも利用することができる。
【００４６】
上記ＨＮＫ−１エピトープは、脊椎動物の神経組織内において細胞膜に結合する細胞認識分子でのみ見出されており、細胞間接着や細胞−細胞外マトリックスとの接着に関連している。最近、糖鎖抗原は昆虫などの無脊椎生物にも存在していることが明らかとなっており、ＨＮＫ−１エピトープの存在は　幼虫と雌の成虫において実証されたが、脊椎動物とは異なり、神経組織に限らず非神経組織からもＨＮＫ−１エピトープが検出されている。
【００４７】
それゆえ、本発明に係る新規グルクロン酸転移酵素は、ＧＡＧ鎖の研究用試薬だけでなく、特に、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質およびＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質はＨＮＫ−１エピトープの研究用試薬としても利用することができる。
【００４８】
また、糖タンパク質にも糖脂質にも、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃという構造が見出される。ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、上記構造を基質として、糖転移反応により、グルクロン酸をβ１−３結合させることができる。そのため、グルクロン酸をβ１−３結合で含む未知の糖鎖構造の合成にも利用することができる。現時点で、上記の二糖にグルクロン酸をβ１−３結合で結合した糖鎖構造は未だキイロショウジョウバエ等のハエの糖脂質でしか見出されていないが、今後生理活性を有する糖鎖として上記構造を含む糖鎖がヒトを含め高等動物でも見出される可能性は十分に有り得る。ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造も同様である。
【００４９】
以下では、本発明に係る遺伝子、タンパク質等の具体的な利用方法について説明する。
【００５０】
本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、各種ホスト細胞中に導入して、本発明に係るグルクロン酸転移酵素又はその変異タンパク質を発現させることができる。導入された本発明に係る遺伝子又は変異遺伝子は、ホスト細胞中でベクターとして存在してもよいし、ホスト細胞のゲノムＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、ホスト細胞のゲノム中には天然に存在しないが人為的操作の結果、ホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定のホスト細胞のゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加してホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００５１】
上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけでなくターミネーター配列を含めてもよい。
【００５２】
また、上記遺伝子又は変異遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターとともにホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るグルクロン酸転移酵素のＧＦＰ融合タンパク質を発現させてもよい。
【００５３】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００５４】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００５５】
前述したように、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子は、糖鎖研究用の各種試薬だけでなく、キイロショウジョウバエ由来である。キイロショウジョウバエは、無脊椎動物のモデル生物として重要であり、ヒトとの類似する多くの遺伝子を有している。しかも、キイロショウジョウバエは哺乳類に類似した二糖構成単位を含むＧＡＧ鎖を生成することが知られているので、ＧＡＧ鎖の生合成メカニズムが哺乳類に類似していることを示唆される。それゆえ、キイロショウジョウバエの基礎糖鎖生物学の研究用試薬として、さらには、他の動物への応用が可能な試薬として利用できる可能を見出すことができる。
【００５６】
本発明に係る遺伝子やタンパク質等の薬剤化については、従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば研究用試薬の場合、本発明に係る遺伝子を形質転換キット化したり、本発明に係る新規グルクロン酸転移酵素を異種発現系で大量生産し精製したりすればよい。
【００５７】
同様に、本発明に係るグルクロン酸転移酵素に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、又はＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。
【００５８】
また、本発明に係るこれら各遺伝子の一部配列をプローブやプライマーとして用いることができる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００５９】
（４）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係る上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩ遺伝子、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩ遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
【００６０】
例えば、上記各タンパク質をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトやマウスなどのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００６１】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００６２】
また、上記プローブの配列を、上記各タンパク質の機能上重要と考えられる領域（例えば、分泌シグナル配列又はＮ型糖結合領域）の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記各タンパク質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００６３】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記各タンパク質のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト・マウスなどのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００６４】
本発明に係る上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記各タンパク質又はその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記各タンパク質等の本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
【００６５】
上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００６６】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６７】
〔実施例１〕新規グルクロン酸転移酵素の塩基配列及びアミノ酸配列の特定と、相同性検索
ヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質のアミノ酸配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋＴＭのＢＬＡＳＴＰサーチ及びバークレーショウジョウバエ遺伝子プロジェクトのホームページ（ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ）から、３種のグルクロン酸転移酵素をコードする遺伝子を特定した。それらのＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号は、同族関係の高い順に、ＣＡＡ２１８２４、ＡＡＦ５００８２（ＣＧ６２０７　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ）、及びＡＡＦ５２７９５　（ＣＧ３８８１　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ）である。説明の便宜上、それぞれＣＡＡ２１８２４、ＣＧ６２０７、及びＣＧ３８８１と称する。対応するショウジョウバエのＥＳＴクローンは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｉｎｃ．から購入した。
【００６８】
ヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質のアミノ酸配列を使用したＢＬＡＳＴサーチの結果、上記ＣＡＡ２１８２４、ＣＧ６２０７、及びＣＧ３８８１３にコードされるグルクロン酸転移酵素はそれぞれ３１３個、４７９個、及び４４３個のアミノ酸残基から成り立つことが明らかとなった。そこで、ショウジョウバエに発現するかどうか判断するために、テンプレートとしてショウジョウバエの胚のメッセンジャーＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、更なる配列分析のために、推定上の原型のまま増幅されたフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてクローニングした。
【００６９】
その結果、上記３種のグルクロン酸転移酵素はショウジョウバエに発現することが示されたが、ＧｅｎＢａｎｋＴＭの配列がイントロン配列を含む可能性があることも示唆した。
【００７０】
特に５’−及び３’−未翻訳領域の配列情報を取得するために、対応するＥＳＴクローンを購入し配列を割り出した。組み合わせた配列情報からイントロン配列が除去され、新しいメッセンジャーＲＮＡ配列が得られることにより、わずかにサイズダウンされたタンパク質となった。ＣＡＡ２１８２４、ＣＧ３８８１、及びＣＧ６２０７から抽出した修正配列を含む３種類のグルクロン酸転移酵素は、それぞれ、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質（図１）、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質（図２）、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質（図３）と命名した。
【００７１】
Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　分析により、上記３種類のタンパク質は、何れも小胞体−ゴルジに存在するグリコシルトランスフェラーゼの特徴を示す、タイプＩＩの膜貫通型トポロジーを含むことが示唆された。
【００７２】
日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のホームページにある配列方法ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて、公知のグルクロン酸転移酵素との複合的な配列のアライメントを実施した。その結果、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、哺乳類のグルクロン酸転移酵素にそれぞれ３６〜４０％、２７〜３０％、及び２８〜３０％の相同性を示し、互いに２４〜３５％の相同性を示した。また、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質がＳＱＶ−８タンパク質とかなり高い相同関係（３９％）を示しており、これはＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子が、キイロショウジョウバエにおけるヒトＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子のオルソログの可能性を示唆している（図４（ａ）・（ｂ））。
【００７３】
〔実施例２〕溶液性のグルクロン酸転移酵素の発現系構築
ｉｎ−ｆｒａｍｅ　ＢａｍＨＩ部位を含む配列番号７の５’−プライマー、及び、ＢａｍＨＩ部位を含む配列番号８の３’−プライマーを用いて、アミノ末端から２７のアミノ酸を欠いた不完全な形のＣＡＡ２１８２４を、ショウジョウバエＥＳＴクローンＧＨ０５０５７から取り出した相補ＤＮＡと停止コドン直後に増幅させた。
【００７４】
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＣＣ−３’　　（配列番号７）
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＧＣＣ−３’　（配列番号８）
また、ｉｎ−ｆｒａｍｅ　ＢａｍＨＩ部位を含む配列番号９の５’−プライマー、及び、終止コドンの下流の５９ｂｐに位置するＢａｍＨＩ部位を含む配列番号１０の３’−プライマーを使用して、６１のアミノ酸を欠いた溶解性のＣＧ３８８１を、テンプレートであるＧＨ２２３３２クローンから取り出した相補ＤＮＡと増幅させた。
【００７５】
５’−ＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＴＴ−３’　（配列番号９）
５’−ＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＡＴＴＣＧＡＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧ−３’　（配列番号１０）
ｉｎ−ｆｒａｍｅ　ＢａｍＨＩ部位を含む配列番号１１の５’−プライマー、及び、終止コドンの下流の２８ｂｐに位置するＢａｍＨＩ部位を含む配列番号１２の３’−プライマーを用いて、アミノ末端にある５９のアミノ酸を欠いた溶解性のＣＧ６２０７を、ＲＥ２６９６７クローンから取り出したプラスミドと増幅させた。
【００７６】
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＴＴＧＴ−３’　（配列番号１１）
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＣＴＣＣＴＴＧＣＴＡＡＴ−３’　（配列番号１２）
ＰＣＲ反応はすべてＰｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行われた。増幅されたフラグメントをＢａｍＨＩでダイジェストし、哺乳類の発現ベクターであるｐＥＦ−ＢＯＳ／ＩＰのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。融合タンパク質は、分泌作用のための分割インスリンシグナル配列及び、発現した融合タンパク質を精製するためのプロテインＡを有するキメラタンパク質となっている。
【００７７】
〔実施例３〕溶解性グルクロン酸転移酵素の発現及び酵素活性の確認
上記それぞれの発現ベクター６．７μｇを、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６（Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて各ＣＯＳ−１細胞に導入した。トランスフェクションされた細胞を４８時間３０℃で培養した後、１ｍｌの培養液を分取した。そして、グルクロン酸転移酵素に対するＩｇＧ抗体を担持した１０μｌのＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズとともに４℃２時間培養した。
【００７８】
遠心分離により上記ビーズを分離し、酵素アッセイのためのバッファーで洗浄し、懸濁させた。これによって、１０μｌの再懸濁させた上記ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）、１７１μＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、１４．３μＭのＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ（１．１×１０５ｄｐｍ、ＰａｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、及び、１ｎｍｏｌの各受容体を含んだ、全容積が３０μｌのグルクロン酸転移酵素アッセイ用の混合液を調製した。
【００７９】
テストした上記各受容体とは、三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ（Ｄｒ．　Ｎａｎｃｙ　Ｂ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ（シカゴ大学）贈呈）、　Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクトース、二糖Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ）、二糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ）、及びＡＳＯＲ（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５２，　６５３６−６５４３）である。ＣＡＡ２１８２４を２５℃でインキュベートした以外、反応混合物はすべて３７℃でインキュベートした。放射性同位体でラベルしたＡＳＯＲの生成物を、ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭペプチドカラムでゲル濾過して、供与体であるＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡから分離させた。
【００８０】
Ｄｏｗｅｘ　１−Ｘ８　（ＰＯ４２−　ｆｏｒｍ，　１００−４００　ｍｅｓｈ；　Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をパスツールピペットカラムに詰めて、このカラムに、用いられないＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡを選択的に除去した反応混合物をアプライすることにより、他の受容体で得られた［１４Ｃ］でラベルされた生成物を分離した。分離した成物は全て１．２％（ｗ／ｖ）の２，５−ジフェニルオキサゾール及び３３％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含むシンチレーション流動体を用いて、液体シンチレーション・カウンタ（ＴＲＩ−ＣＡＲＢ　２９００ＴＲ，Ｐａｃｋａｒｄ　Ｃｏ．）により定量化した。その結果を表１及び２に示す。
【００８１】
なお、表１の酵素活性のデータは２つの独立した実験結果の平均である。また、ＮＤはｎｏｔ　ｄｅｔｅｃｔｅｄであり、具体的には、０．５ｐｍｏｌ／ｍｌ　ｍｅｄｉｕｍ／ｈ未満であったことを示す。
【００８２】
【表１】
2004033064.tif 000002
【００８３】
【表２】
2004033064.tif 000003
【００８４】
ヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質に対する受容体基質である三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌを受容体として用い、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを供与体基質として用いたとき、上記３種類のタンパク質全てが、表１に示すように、グルクロン酸転移活性を示した。
【００８５】
表１から明らかなように、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質のグルクロン酸転移活性は、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質に比べて比較的低いものであった。ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は、上記三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌに対して厳密な基質特異性を示し、他の受容体についてはグルクロン酸転移活性を示さなかった。この点において、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質はヒトＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質に類似している。さらに、他の二つのタンパク質と異なり、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質は３７℃で酵素反応させると、グルクロン酸転移活性を示さない。一方、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質のグルクロン酸転移活性は、２５℃であっても３７℃で測定された活性の８０％以上を示しており、２５℃でも３７℃でもグルクロン酸転移活性については変化が見られなかった。
【００８６】
さらに、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌに加え、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡからグルクロン酸をＮ−アセチルラクトサミンおよびＡＳＯＲにも転移させた。この転移反応は、糖タンパク質におけるＨＮＫ−１エピトープの合成に伴って生じる。
【００８７】
しかも、表１及び２に示すように、上記各タンパク質は、グルクロン酸を、二糖Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ及び二糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃにも転移させた。特に、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質は、三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌよりも、二糖Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ及び二糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃとの反応性が高いことがわかった。つまり、二糖Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ及び二糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃの方が、三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４ＸｙｌよりもＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩに対して優れた受容体であった。
【００８８】
ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質の双方とも、上記二種類の二糖のうち、二糖Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃよりも二糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃが受容体として好ましい結果が示された。さらに、ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を受容体とした場合、上記双方のタンパク質ともに、グルクロン酸の著しい転移が観察された。上記各受容体は、還元末端がガラクトース残基であるが、その結合はβ１−３結合またはβ１−４結合となっている。それゆえ、上記ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質は、何れも、受容体側のガラクトース残基への反応性は限定的ではなく、広範囲の基質特異性を持つことを示している。この点については、上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質の反応性とは明らかに異なっている。
【００８９】
なお、コントロールとして、上記各タンパク質のＤＮＡを含まない「空」のベクターをＣＯＳ−１細胞に導入し、これから培養液を得たが、この培養液は、グルクロン酸転移酵素活性を全く示さなかった。したがって、本実施例で得られた酵素活性は、全て発現した組み換え酵素に起因する。
【００９０】
〔実施例４〕各グルクロン酸転移酵素により形成されるグルクロニル糖鎖の構造確認
三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ、及びＡＳＯＲの２つの異なる受容体で得られる反応生成物は、β−グルクロニダーゼ分解により構造確認した。反応混合物から得られた生成物（グルクロン酸が転移したグルクロニル糖鎖）は実施例３で説明した方法で分離し、全容積２０μｌの５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファーに溶解し、ｐＨ４．５、３７℃の条件で、２０ｍＵのリンゴ貝のβ−グルクロニダーゼ（ＥＣ　３．２．１．３１）とともに一晩ダイジェストし、その後ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭゲル濾過クロマトグラフィーによりアッセイした。
【００９１】
受容体が三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌである場合の結果を図５に、受容体がＡＳＯＲである場合の結果を図６に示す。なお、図５では、ＡがＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質を、ＢがＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質を、ＣがＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質を用いた場合の結果を示している。同様に、図６では、ＡがＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質を、ＢがＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質を用いた場合の結果を示している。図５及び図６の何れも、縦軸が［１４Ｃ］のラジオアクティビティで、横軸がクロマトグラフィーのフラクション番号である。白抜きの円はβ−グルクロニダーゼで消化していないサンプルを、塗りつぶした正方形はβ−グルクロニダーゼで消化したサンプルを、矢印は遊離したグルクロン酸の抽出ピークを、白抜きの三角はカラムのトータルボリュームを、塗りつぶした三角はボイドボリュームを示す。
【００９２】
得られた反応生成物をβ−グルクロニダーゼで消化すると、何れの反応生成物からも［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡが完全に放出されており、放射能レベルの最高点が、消化していない反応生成物の抽出位置から遊離したグルクロン酸の抽出位置に移行している。それゆえ、上記３種類のタンパク質全てにより転移された非還元末端のグルクロン酸残基がβ結合を有していることが分かる。
【００９３】
〔実施例５〕半定量的なＲＴ−ＰＣＲによる３種類のグルクロン酸転移酵素の発現レベル
ショウジョウバエＲａｐｉｄ−ＳｃａｎＴＭ　遺伝子発現パネル（ＯｒｉＧｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ）により、ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩ遺伝子、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩ遺伝子の成長段階における発現時期、及び発現場所を比較するために、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。この方法では、数量的ではないが、上記３種類のショウジョウバエの遺伝子における発現パターンを比較することが可能である。
【００９４】
上記遺伝子発現パネルは、構成的に発現したリボソーム蛋白質をコードするメッセンジャーＲＮＡであるＲＰ４９トランスクリプトに対して標準化されたショウジョウバエの組織及び発生段階が異なる第一ストランド相補ＤＮＡを含んでいる。
【００９５】
各遺伝子に使用したプライマーは、ＣＡＡ２１８２４については、配列番号１３の５’−プライマー及び配列番号１４の３’−プライマーを用いた。これらプライマーにより、６３９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【００９６】
５’−ＣＧＧＴＴＴＴＴＡＣＣＡＡＣＴＧＣＣ−３’　（配列番号１３）
５’−ＧＡＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣＣＧＴＧＡＴ−３’　　（配列番号１４）
また、ＣＧ３８８１については、配列番号１５の５’−プライマー及び配列番号１６の３’−プライマーを用いた。これらプライマーにより４９７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【００９７】
５’−ＧＴＴＧＴＡＣＧＡＴＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣ−３’　（配列番号１５）
５’−ＡＧＣＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＣＧＡＧＡ−３’　（配列番号１６）
また、ＣＧ６２０７については、配列番号１７の５’−プライマー及び配列番号１８の３’−プライマーを用いた。これらプライマーにより７１５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【００９８】
５’−ＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣ−３’　　（配列番号１７）
５’−ＡＧＡＡＣＴＴＧＡＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣ−３’　　　　（配列番号１８）
ＰＣＲ反応は、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施し、その反応条件は、９４℃３分間プレインキュベートし、９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃６０秒を３５サイクル実施した。電気泳動の結果を図７に示す。なお、図７では、レーン１が０−４ｈの胚、レーン２が４−８ｈの胚、レーン３が８−１２ｈの胚、レーン４が１２−２４ｈの胚、レーン５が第１令幼虫、レーン６が第２令幼虫、レーン７が第３令幼虫、レーン８がさなぎ、レーン９が雄の頭部、レーン１０が雌の頭部、レーン１１が雄の胴部、レーン１２が雌の胴部である。
【００９９】
ＲＴ−ＰＣＲの結果、上記３種類の遺伝子の転写産物すべてが潜在的に発現していた。ただし図７の結果は、約１ｎｇの１０００倍濃度であり、１０００倍の濃度以下の場合は増幅されたバンドが弱すぎて確認できなかった。胚の成長の早期段階（０−４ｈの胚）でさえ、測定可能な量の転写産物が、全ての酵素について検出された。特に、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩ遺伝子及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩ遺伝子はＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子に比べてかなり強く発現していた。これは、ショウジョウバエの胚の成長段階においてＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩ遺伝子及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩ遺伝子が重要であることを示唆している。
【０１００】
【発明の効果】
本発明にかかる新規なグルクロン酸転移酵素は、３種とも全てＧＡＧ鎖の合成に関与している可能性が高く、そのうち２種は哺乳類のグルクロン酸転移酵素とは対照的に、ＧｌｃＡＴ−Ｉの活性とＧｌｃＡＴ−Ｐの活性とを併せ持ち、ＨＮＫ−１エピトープの合成に関与する可能性が高い。それゆえ、本発明は、ＧＡＧ鎖やＨＮＫ−１エピトープに関わる研究や、これら糖鎖に関わる糖鎖工学技術に使用可能な各種試薬として好適に利用することができるという効果を奏する。また、上記グルクロン酸転移酵素はキイロショウジョウバエから単離されたので、キイロショウジョウバエの研究用試薬だけでなく、線虫Ｃ．　ｅｌｅｇａｎｓやヒト等にも応用可能な各種薬剤に利用する可能性を見出せるという効果を奏する。
【０１０１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る新規グルクロン酸転移酵素であるＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図２】本発明に係る新規グルクロン酸転移酵素であるＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩ遺伝子の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図３】本発明に係る新規グルクロン酸転移酵素であるＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩ遺伝子の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図４】（ａ）は、上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質と、ヒト、線虫Ｃ．　ｅｌｅｇａｎｓ、およびラット由来のグルクロン酸転移酵素のアミノ酸配列を比較した配列図であり、（ｂ）は、ＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質の全アミノ酸配列の系統樹ある。
【図５】上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質によりグルクロン酸が転移した三糖Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌをβ−グルクロニダーゼで分解してゲル濾過クロマトグラフィーによりアッセイした結果を示すグラフである。
【図６】上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉタンパク質、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩタンパク質、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩタンパク質によりグルクロン酸が転移したＡＳＯＲをβ−グルクロニダーゼで分解してゲル濾過クロマトグラフィーによりアッセイした結果を示すグラフである。
【図７】上記ＤｍＧｌｃＡＴ−Ｉ遺伝子、ＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩ遺伝子、及びＤｍＧｌｃＡＴ−ＰＩＩ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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