(57)【要約】【課題】種々の素材で構成可能であり、且つ、前記三次元培養法にも対応可能な培養床を提供する。【解決手段】表面に金属酸化物ゲル層を形成してある培養床。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に金属酸化物ゲル層を形成してある培養床。
【請求項２】
前記金属酸化物ゲルが、チタニアゲル、ジルコニアゲル、アルミナゲル、シリカゲルからなる群から選択される１種以上の金属酸化物ゲルである請求項１又は２に記載の培養床。
【請求項３】
前記金属酸化物ゲルに１種以上の化学修飾を施してある請求項１〜３の何れか１項に記載の培養床。
【請求項４】
加水分解することによって金属酸化物ゲルが生じる金属アルコキシドを含む培養床コーティング剤。
【請求項５】
金属アルコキシドを基材の表面にコーティングするコーティング工程と、前記コーティング工程後に前記金属アルコキシドに加水分解処理を施す加水分解工程とを有する培養床製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか１項に記載の培養床において１種以上の細胞を培養する培養工程を有する細胞培養方法。
【請求項７】
前記培養工程において、前記細胞に三次元的な構造を有する集合体を形成させる請求項６に記載の細胞培養方法。
【請求項８】
前記細胞が初代肝細胞である請求項６又は７に記載の細胞培養方法。
【請求項９】
請求項６〜８の何れか１項に記載の細胞培養方法を用いて培養した培養細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞を培養する培養床に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞あるいは組織培養技術は、再生医療、ハイブリッド型人工臓器（バイオ人工臓器ともいう）、有用物質生産、組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニングや内分泌撹乱物質等の影響を評価するための動物実験代替法や細胞チップ等への産業利用が期待されている。
【０００３】
従来、接着性を持つ動物細胞の培養方法は、ポリスチレンやガラス等の培養ディッシュのような基材を用い、その表面を生体由来因子でコーティングしたり、あるいは化学的または物理化学的に処理したりして、その表面上で細胞を接着・伸展させる二次元培養法、いわゆる単層培養法が一般的であった。例えば、生体由来因子であるコラーゲンをコートしたポリスチレンディッシュ上やプラズマ処理によって表面を親水化したポリスチレンディッシュ上で細胞を培養すると、細胞はその表面に付着、伸展し、細胞質が扁平状に伸展した細胞形態をとる。
【０００４】
一方、生体の組織や臓器等から単離した細胞、いわゆる初代細胞は、その由来する組織や臓器の特性や機能を保持している場合が多く、これらの細胞は産業上の利用価値が高い。しかし、ほとんどの場合、単層培養法では各種の細胞が持つ特性や機能が数日・数週の間に消失することが知られていた。特に、初代細胞の中でも高度に分化し、複雑多岐な機能を持つ初代肝細胞の場合、単層培養ではその特性や機能が速やかに失われやすい。例えば、ラット肝臓より単離した肝細胞を単層培養すると、肝臓の重要な機能であるタンパク質合成機能や解毒機能、薬物代謝機能等は培養開始から数日内に低下あるいは消失してしまうことが知られている。これは、単層培養法の場合、細胞は細胞質が扁平した二次元状態となるため、本来生体内で細胞が有している細胞内構造や極性、隣接する細胞との結合による情報交換等の機構が低下・消失し、これに伴って細胞が本来持つ特性や機能が低下・消失するためであると考えられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
このような細胞が本来持つ特性や機能の低下や消失を回避するために、最近では細胞同士を集合化させ、生体組織に類似した三次元構造を構築させる、いわゆる「三次元培養法」が注目されている。このような三次元培養法として、例えば、ポリスチレンからなる基板の表面をアミノ基とカルボキシル基とを有する高分子で表面処理しプラスチャージ（陽イオン）が表面付加されたポリスチレンディッシュ（プライマリア（登録商標）カルチャーウエア、ベクトン・ディッキンソン株式会社）等で肝細胞を培養すると、スフェロイドが形成され、数週間の機能発現ができる（例えば、非特許文献１参照。）。又、フェニルボロン酸基を有するモノマー、アミノ基を有するモノマー、及び２−ヒドロキシエチルメタクリレートの共重合体からなる高分子物質によって基材（シャーレ）表面をコーティングした培養床においても、ラット初代肝細胞によるアルブミン分泌能を維持したスフェロイドの形成が観察された（例えば、特許文献２参照。）。
【０００６】
このように、二次元培養法によって培養された細胞と比較して、三次元培養法によって培養された細胞は、細胞が本来持つ特性や機能を高レベルで長期的に維持できることから、再生医療、ハイブリッド型人工臓器、有用物質生産、組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニングや内分泌撹乱物質等の影響を評価するための動物実験代替法や細胞チップ等の産業利用のための有効な手段として期待されている。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００１−１２８６６０号公報（第［０００３］段落）
【０００８】
【非特許文献１】
「バイオコート（登録商標）ファルコン（登録商標）カタログ  ２００１／０９カタログ」日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、ｐ．１２２〜１２３
【０００９】
【特許文献２】
特許第３０２０９３０号公報（第［０００５］〜［０００７］段落）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記基材の表面処理に用いられた高分子の構造に着目すると、このような高分子によって表面処理可能な基材の材質はポリスチレンのような樹脂類に限定されるという問題点があった。
【００１１】
従って、本発明の目的は、上記問題点に鑑み、種々の素材で構成可能であり、且つ、前記三次元培養法にも対応可能な培養床を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するための本発明の培養床の特徴構成は、請求項１に記載されているように、表面に金属酸化物ゲル層を形成してある点にある。
更に、上記特徴構成において、請求項２に記載されているように、前記金属酸化物ゲルが、チタニアゲル、ジルコニアゲル、アルミナゲル、シリカゲルからなる群から選択される１種以上の金属酸化物ゲルであることが好ましく、
請求項３に記載されているように、前記金属酸化物ゲルに１種以上の化学修飾を施してあることが好ましい。
又、この目的を達成するための本発明の培養床コーティング剤の特徴構成は、請求項４に記載されているように、加水分解することによって金属酸化物ゲルが生じる金属アルコキシドを含む点にある。
又、この目的を達成するための本発明の培養床の製造方法の特徴手段は、請求項５に記載されているように、金属アルコキシドを基材の表面にコーティングするコーティング工程と、前記コーティング工程後に前記金属アルコキシドに加水分解処理を施す加水分解工程とを有する点にある。
又、この目的を達成するための本発明の細胞培養方法の特徴手段は、請求項６に記載されているように、請求項１〜３の何れか１項に記載の培養床において１種以上の細胞を培養する培養工程を有する点にある。
更に、上記特徴手段において、請求項７に記載されているように、前記培養工程において、前記細胞に三次元的な構造を有する集合体を形成させることが好ましく、
請求項８に記載されているように、前記細胞が初代肝細胞であることが好ましい。
又、この目的を達成するための本発明の培養細胞の特徴構成は、請求項９に記載されているように、請求項６〜８の何れか１項に記載の細胞培養方法を用いて培養する点にある。
そして、これらの作用効果は、以下の通りである。
【００１３】
本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、培養床の表面に金属酸化物ゲル層を形成し、この金属酸化物ゲルが露出した面上で細胞を培養することによって、細胞同士が集合した三次元構造体を形成し、高いレベルの機能発現を長期的に発揮できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、請求項１に記載されているように、表面に金属酸化物ゲル層を形成してあると、前記金属酸化物ゲル層上で培養細胞同士が集合した三次元構造体を形成し、高いレベルの機能発現を長期的に発揮できる。尚、本明細書において、「培養床」とは、細胞を培養するために使用される容器や細胞を付着させるための足場となる構造を意味するものとする。例えば、非限定的に、セルカルチャーディッシュ、セルカルチャーフラスコ、セルカルチャーチューブ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、ローラーボトル、バイオリアクターの培養タンク、担体、細胞チップの基板等が前記培養床に該当する。前記金属酸化物ゲルの層は、プラスチックのような有機系素材から構成される基材の表面であっても、ガラス、金属等の無機系素材から構成される基材の表面であっても形成可能であるので、従来の三次元培養可能な培養床と比べて、基材の材料の選択の幅が格段に広い。従って、従来利用することができなかった基材を用いた培養床の設計が可能となり、新たな用途への利用も可能となった。更に、金属酸化物ゲルの層は、平らな薄膜状態のコーティングが可能である上、丈夫で安定した特性を有しており、亀裂や剥離が生じ難い。従って、フィルム構造、平板構造、多孔構造、中空構造等の種々の形状を有する基材の表面に容易にコーティングすることができ、種々の培養形態に対応することができる。又、金属酸化物ゲルの層は透明度が高いので、前記培養床上で培養された細胞の観察を容易に行うことができる。
【００１５】
更に、請求項２に記載されているように、前記金属酸化物ゲルには、チタニアゲル、ジルコニアゲル、アルミナゲル、シリカゲルからなる群から選択される１種以上の金属酸化物ゲルを採用することができる。
【００１６】
又、請求項３に記載されているように、前記金属酸化物ゲルに１種以上の化学修飾を施すと、前記培養床の表面の性質を改良することができる。例えば、糖類、アミノ酸、若しくはペプチド類、又はこれらの誘導体等によって前記金属酸化物ゲルに修飾を施すことによって、培養床表面への細胞の接着性を制御することができる。
【００１７】
ここで、請求項４に記載されているように、加水分解することによって金属酸化物ゲルが生じる金属アルコキシドを含むコーティング剤を使用すると、前記コーティング剤を基材表面に塗布し、加水分解させるという簡単な処理を施すことによって、表面に金属酸化物ゲル層が形成された培養床を製造することができる。
【００１８】
即ち、請求項５に記載されているように、コーティング工程において、金属アルコキシドを基材の表面にコーティングし、加水分解工程において、前記コーティング工程後に前記金属アルコキシドに加水分解処理を施すと、上述した培養床を容易に製造することができる。
【００１９】
又、請求項６に記載されているように、培養工程において、請求項１〜３の何れか１項に記載の培養床を用いて１種以上の細胞を培養すると、これらの細胞はその細胞が本来有している特有な機能を維持した状態で長期にわたって培養が可能となり、再生医療、ハイブリッド型人工臓器、有用物質生産、組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニングや内分泌撹乱物質等の影響を評価するための動物実験代替法や細胞チップ等の用途に用いることができる。
【００２０】
更に、請求項７に記載されているように、前記培養工程において、前記細胞に三次元的な構造を有する集合体を形成させることによって、スフェロイド構造のような特定の立体構造が形成され、その細胞に特有な機能を維持することができる。
【００２１】
更に、請求項８に記載されているように、前記細胞が初代肝細胞であると、請求項６又は７に記載された培養方法で培養することによって、アルブミン分泌能などの特有の機能を維持したまま長期間に亘って培養することができる。
【００２２】
従って、請求項６〜８の何れか１項に記載の細胞培養方法を用いて培養された培養細胞は、その細胞が本来有している特有な機能を維持した状態で長期にわたって培養が可能となり、再生医療、ハイブリッド型人工臓器、有用物質生産、組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニングや内分泌撹乱物質等の影響を評価するための動物実験代替法や細胞チップ等の用途に用いることができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を説明する。
本発明に係る培養床は、その表面に金属酸化物ゲル層を形成してある。前記金属酸化物ゲル層を構成する金属酸化物ゲルは、例えば、チタニアゲル、ジルコニアゲル、アルミナゲル、シリカゲルであり、これらの１種又は２種以上が混在した状態とすることができる。
【００２４】
前記金属酸化物ゲル層を構成する金属酸化物ゲルに、種々の官能基を導入し１種類または２種類以上の化学修飾が施された誘導体を形成してあっても良い。前記誘導体は、コーティング剤の状態で化学修飾がなされたものを使用して導入してもよく、或いは、金属酸化物ゲル層を培養床の表面に形成した後に、その表面に化学的修飾を施して作成することもできる。
【００２５】
前記金属酸化物ゲル層は、例えば、基材にコーティング剤としての金属アルコキシド溶液を塗布した後、これを加水分解して形成される。例えば、チタニウムアルコキシドを加水分解して得られるチタニアゲル、ジルコニウムアルコキシドを加水分解して得られるジルコニアゲル、アルミニウムアルコキシドを加水分解して得られるアルミナゲル、シランアルコキシドを加水分解して得られるシリカゲル等が挙げられる。前記コーティング剤としての金属アルコキシド溶液の濃度は、均一かつ安定した表面コーティングがなされる濃度であればよく、概ね１％〜９５％程度の濃度が好ましく、特に５％〜５０％の濃度がより好ましい。コーティングの方法は、均一な表面コーティングがなされれば特に制限されず、例えば、非限定的に、スピンコーティング法、スプレーコーティング法、ディップコーティング法、表面ゾルゲル法等を用いることができる。
【００２６】
例えば、平板構造を持つ基板の表面にチタニアゲルをコーティングする場合には、チタニウムアルコキシド溶液を用意し、スピンコーティング法により、基板表面に均一にコーティングする。得られた表面を十分に加水分解することによって、その表面にチタニアゲル層が形成された培養床を提供することができる。
【００２７】
又、前記基材そのものの表面を処理して、前記金属酸化物ゲル層を形成することもできる。
【００２８】
本発明に係る培養床において、金属酸化物ゲルが形成される基材の素材は、ポリスチレン樹脂等のプラスチックに代表される有機系素材であってもよく、さらには、従来困難であった無機系素材（例えば、ガラス、金属）をも採用することができる。
【００２９】
前記金属酸化物ゲル層は薄膜状態のコーティングが可能である上、丈夫で安定した特性を有しており、亀裂や剥離が生じ難いという特性を有しているので、本発明に係る培養床を種々の形状に形成することが容易である。例えば、前記培養床は、フィルム構造、平板構造、多孔質構造、中空構造等の形状とすることができ、複雑な形状にも対応し得るので、ハイブリッド型人工臓器やモジュール等の用途にも使用することができる。
【００３０】
特に、細胞の形態やその変化を観察するために細胞を培養する場合には、顕微鏡下で容易に観察ができる透明度の高い基材を採用することができる。例えば、プラスチックやガラス等の透明度の高い基材の表面に、前記金属アルコキシドを均一に塗布し、その表面を加水分解することによって、金属酸化物ゲル層が表面に形成された透明度の高い培養床を得ることができる。
【００３１】
更に、本発明に係る培養床は、必ずしもその表面全体に前記金属酸化物ゲル層を形成する必要はなく、必要に応じて表面の一部に前記金属酸化物ゲル層を形成してあってもよい。例えば、その表面に部分的に金属酸化物ゲル層が形成されていない部分を設けて、金属酸化物ゲル層の任意のパターンを作成することもできる。即ち、前記金属酸化物ゲル層を形成しない特定部分を粘着性テープ等でマスクした基板を用意し、全体を前記金属酸化物ゲルでコーティングした後に粘着性テープ等をはがすことにより、金属酸化物ゲル層が形成された部分とされてない部分を有する培養床が作製される。
【００３２】
本発明に係る培養床で培養される細胞の種類は、特に限定されない。従って、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、マウス等の何れの動物由来の細胞を培養することができ、又、肝臓、膵臓、腎臓、神経、皮膚等から得られる初代細胞や樹立された細胞株も培養することができる。
【００３３】
前記培養床は、接着性の動物細胞、特に、単層培養では細胞が有する機能が低下あるいは消失する培養細胞の培養に好適である。前記培養床を用いて培養した培養細胞はスフェロイド等の立体構造を形成しやすいので、その細胞が本来有する機能を高いレベルで長期的に維持することができる。
【００３４】
従って、前記培養細胞はハイブリッド型人工臓器、有用物質生産、組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニングや内分泌撹乱物質等の影響を評価するための動物実験代替法や細胞チップ等の技術を開発するためのバイオ素子として利用することができる。例えば、前記細胞は、前記培養床の前記金属酸化物ゲル層に付着してスフェロイド等の立体構造をとるので、基板上にこのような細胞を付着させてバイオセンサの素子として利用することができる。
【００３５】
【実施例】
以下に本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
実施例で使用した肝細胞の調製、肝細胞の機能であるアルブミン分泌活性の測定、培養各期間における細胞数の測定は以下のように行った。
【００３６】
〔肝細胞の調製〕
０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（和光純薬社）溶液１５０ｍｌを用意した。７週齢の雄ウイスター系ラット（体重２５０ｇ）の肝門脈にカニューレを導入し、脱血液を３０ｍｌ／分で５分間流した後、３７℃に加温したコラゲナーゼ溶液を１５ｍｌ／分で１０分間流した。前記コラゲナーゼによって処理された肝臓を培養液に入れ、メス及びピペットを使って初代ラット肝細胞を分散させた。得られた肝細胞懸濁液を３回洗浄し、前記初代ラット肝細胞以外の細胞を取り除いた（９５％以上の純度）。このようにして単離した初代ラット肝細胞（以下「肝細胞」という。）を培養実験に使用した。
〔アルブミン分泌速度〕
培養培地中に分泌されたアルブミンを酵素標識免疫測定法（イライザメイト（ＥＬＩＳＡ  ｍａｔｅ）（カークガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＭＤ））を使用）により定量し、単位細胞数あたりのアルブミン分泌速度（μｇ／１０６  細胞／日）に換算した。
〔細胞数の測定法〕
培養各期間における細胞数の測定は、クリスタルバイオレットにより細胞核を染色し、核数を計数する方法を用いた。細胞と核の割合は１：１．４５であることから、この関係をもとに細胞数を算出した。このようにして算出した細胞数をもとに、上記の単位細胞（１０６  細胞）当りのアルブミン分泌速度を算出した。
【００３７】
〔実験例〕
直径３５ｍｍのファルコン（登録商標）ポリスチレンディッシュ（ベクトン・ディッキンソン  バイオサイエンス製）表面にチタニアゲルコートした培養床を作製した。即ち、約３０μｌの２５％チタニウムノルマルブトキシド（キシダ化学製）／エタノール溶液をスピンコーティング法（６０００ｒｐｍ、３０秒間）によって前記ポリスチレンディッシュの表面にコーティングした。その後、室温、９０％湿度の穏やかな条件下で２４時間、表面の加水分解を行い、チタニアゲル薄膜でコーティングされたチタニアゲルコートディッシュを得た。このようにして作製したチタニアゲルコートディッシュをアルコール滅菌および６時間の紫外線滅菌し、肝細胞の培養実験に使用した。
【００３８】
調製した肝細胞を、下記の無血清培地で懸濁し、細胞密度が２．５×１０５細胞／ｍｌの肝細胞懸濁液を得た。この懸濁液２ｍｌを前記チタニアゲルコートディッシュに播種した。
【００３９】
肝細胞の培養には、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）（ギブコ製）１３．５ｇ／Ｌに、６０ｍｇ／Ｌ  プロリン、５０ｎｇ／ｍｌ  ＥＦＧ（フナコシ製）、１０ｍｇ／Ｌ  インシュリン（シグマ製）、７．５ｍｇ／Ｌ  ヒドロコルチゾン（和光純薬製）、０．１μＭ  硫酸銅・５水和物（和光純薬製）、３μｇ／Ｌ  セレン酸（和光純薬製）、５０ｐＭ  硫酸亜鉛・７水和物（和光純薬製）、５０μｇ／Ｌ  リノール酸（シグマ製）、５８．８ｍｇ／Ｌ  ペニシリン（明治製菓製）、１００ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシン（明治製菓製）１．０５ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム（和光純薬製）、１．１９ｇ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（同人堂製）を加えた無血清培地を用い、５％炭酸ガス、９５％大気の雰囲気下で培養を行った。また、上記記載の無血清培地（新鮮培地）２ｍｌを用いて、２日毎に培地交換を行った。
【００４０】
肝細胞の培養状態を評価するために、培養の各期間において、位相差顕微鏡による細胞形態観察を行った。また、肝細胞の機能発現を評価するために、培養の各期間において、培養培地中に分泌されたアルブミンの定量および細胞核の計数による細胞数の算出を行い、これらの結果に基づいてアルブミン分泌活性を評価した。
【００４１】
〔比較例〕
一方、比較例として、２．５×１０５細胞／ｍｌの前記肝細胞懸濁液２ｍｌを直径３５ｍｍのコラーゲンコートディッシュ（岩城硝子製）に播種することによって単層培養を行い、前記実験例と比較した。尚、培養条件、機能評価方法等は特に明記したものを除いて、上記実験例の場合と同様の方法を用いた。
【００４２】
〔結果〕
図１（ａ）、（ｂ）に、チタニアゲルコートディッシュ上（実験例）とコラーゲンコートディッシュ上（比較例）とに前記肝細胞を播種した直後（培養０日目）における肝細胞の形態を示した（位相差顕微鏡で観察）。播種直後においては、実験例、比較例の何れにおいても前記肝細胞が前記ディッシュ表面上に分散した状態にあり、肝細胞の存在形態はほとんど変わらない。
【００４３】
図２（ａ）、（ｂ）に、培養５日目におけるチタニアゲルコートディッシュ上とコラーゲンコートディッシュ上とにおける前記肝細胞の形態を示した（位相差顕微鏡で観察）。図２（ａ）に示すように、チタニアゲルコートディッシュ上では、培養初期に分散状態であった肝細胞が徐々に集合化し、肝細胞同士が結合、凝集化し三次元的な構造を有する細胞集合体であるスフェロイドを多数形成した。図３（ａ）に示す走査型電子顕微鏡写真によっても、チタニアゲルコートディッシュ上で肝細胞が集合し、積層した三次元構造をとっていることが確認された。このようにして形成されたスフェロイドは、１ヶ月以上、良好な形態を維持した。これに対し、図２（ｂ）に示すように、コラーゲンコートディッシュ上では、肝細胞はディッシュ表面に付着後伸展し扁平な単層（二次元状）の状態で存在していた。図３（ｂ）に示す走査型電子顕微鏡写真によっても、前記肝細胞がディッシュ表面に伸展しており、スフェロイドが形成されていないことが確認された。
【００４４】
図４に、実験例と比較例に係るディッシュを用いて肝細胞を培養したときのアルブミン分泌速度の経日変化を示す。チタニアゲルコートディッシュ上でスフェロイドを形成し三次元培養された肝細胞の単位細胞数当たりのアルブミン分泌活性は、培養経過に伴って上昇し、高いレベルの活性を少なくとも１ヶ月以上良好に維持した。これに対し、コラーゲンコートディッシュ上で単層培養されたラット肝細胞の単位細胞数当たりのアルブミン分泌活性は、播種後数日で速やかに低下していき、播種から７日後以降培養経過に伴ってその活性は消失していった。
【００４５】
これらの結果より、表面にチタニアゲル層を形成してある培養床を用いてラット初代肝細胞を培養すると、細胞同士が集合化した三次元構造体が形成され、このようにして培養された培養細胞は、高いレベルの機能発現を長期的に維持できることが明らかになった。
【００４６】
尚、チタニアゲル以外の金属酸化物ゲルの層をその表面に形成してある培養床やポリスチレン以外の基材に金属酸化物ゲル層を形成してある培養床でも同様な結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験例及び比較例に係る播種直後のラット肝細胞の位相差顕微鏡写真。
【図２】実験例及び比較例に係る播種５日目のラット肝細胞の位相差顕微鏡写真。
【図３】実験例及び比較例に係る播種５日目のラット肝細胞の走査型電子顕微鏡写真。
【図４】実験例及び比較例に係るラット肝細胞によるアルブミン分泌速度の経日変化を表すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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