(57)【要約】【課題】充填後に加熱殺菌を行う飲食品における昆虫の混入に対して、商品の種類に限らずその混入時期を特定できる正確な方法を提供する。【解決手段】昆虫に存在するＲＮＡの残存状態を、好ましくはＲＴ−ＰＣＲを用いて測定することにより、昆虫の死亡時期を特定する。加熱殺菌条件がＦ０＝１未満であってもＦ０＝１以上であっても混入が充填前か充填後かを特定することができる。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫に存在するＲＮＡの残存状態を測定することにより、昆虫の死亡時期を特定する方法。
【請求項２】
ＲＴ−ＰＣＲ法を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
昆虫の死亡時期の特定から飲食品への混入時期を特定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｆ０＝１未満の加熱殺菌を行った飲食品に混入した昆虫について、ＲＮＡの残存状態を測定することによって混入時期を特定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｆ０＝１以上の加熱殺菌を行った飲食品に混入した昆虫について、ＲＴ−ＰＣＲにおける検出可否によって混入時期が充填後か充填前かを特定する、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫の死亡時期の特定方法、特に、飲食品に混入した昆虫の混入時期の特定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
飲食品において、昆虫の混入による苦情品件数は年々増加している。工程内における混入の場合には企業責任となるが、混入品の中には混入時期が工程外である場合、例えば飲みかけのジュースを放置している間の混入であるものも含まれており、これらの苦情品に対して的確に対応するためには混入時期の正確な判断が必要とされる。
【０００３】
従来、混入時期を判断するために用いられてきた手法としては、以下のような酵素活性測定法が挙げられる。通常、故意でない混入の場合には、混入の際に昆虫が死亡するため、いずれの方法も、飲食品への混入時期を昆虫の死亡時期と同時であるとして判断する。
【０００４】
（１）カタラーゼ活性測定法
昆虫に残存するカタラーゼ活性の有無で混入時期を判断する手法である。過酸化水素水を直接昆虫にかけ、酸素の泡の有無によって酵素が残存しているかどうかを判定する。
【０００５】
（２）アセチルコリンエステラーゼ活性測定法
昆虫に残存するアセチルコリンエステラーゼ活性の値から混入時期を判断する手法である。室温で活性は経時的に減少していき、やがて失活する。
【０００６】
しかし、これらの方法は、酵素活性が失われた昆虫、例えば故意に加熱した昆虫や、混入から調査まで長期間経過した昆虫に対する適用は困難である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記の実情から、飲食品製造業界においては、充填後に加熱殺菌を行う飲食品における昆虫の混入に対して、商品の種類に限らずその混入時期を特定できるより正確な方法が必要とされている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題の解決のため種々検討した結果、本発明者等は、混入の際に昆虫が死んだ後にも、昆虫自身が有するＲＮＡ分解酵素であるＲＮａｓｅが働き続けるため、昆虫のＲＮＡが経時的に分解されると考え、この分解現象をＲＴ−ＰＣＲによって検出することでこれを確認した。また、レトルト殺菌処理によりＲＮＡが熱分解を受けることも確認できたので、混入が工程内あるいは工程外のいずれであるかを判断できることを見出した。ＲＮａｓｅは耐熱性があるため、通常家庭で可能な煮沸程度の殺菌では失活しないこと、またＲＮＡについても煮沸程度の殺菌では分解されないことから、本方法によって特定される死亡時期の特定は信頼性及び再現性のあるものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供する。
（１）　昆虫に存在するＲＮＡの残存状態を測定することにより、昆虫の死亡時期を特定する方法。
（２）　ＲＴ−ＰＣＲ法を用いることを特徴とする、上記（１）に記載の方法。
【００１０】
（３）　昆虫の死亡時期の特定から飲食品への混入時期を特定する、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）　Ｆ０＝１未満の加熱殺菌を行った飲食品に混入した昆虫について、ＲＮＡの残存状態を測定することによって混入時期を特定する、上記（３）に記載の方法。
（５）　Ｆ０＝１以上の加熱殺菌を行った飲食品に混入した昆虫について、ＲＴ−ＰＣＲにおける検出可否によって混入時期が充填後か充填前かを特定する、上記（３）に記載の方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
当分野において、レトルト飲食品に対する加熱殺菌の程度の指標として一般にＦ０値が用いられている。加熱殺菌の程度は、飲食品の成分や容器の形態によっても異なるが、コーヒー等の缶製品の場合にはＦ０＝４０程度の殺菌を行うことが多く、ペットボトル製品の場合には、これよりＦ０値が低い殺菌を行っており、Ｆ０＝１未満の殺菌を行うことも多い。
【００１２】
本発明においては、まず、昆虫のＲＮＡが死亡後経時的に減少することを前提としている。そこで、昆虫の死亡後のＲＮＡの経時的分解を検討した。尚、本発明において昆虫は飲食品に混入する可能性のあるものであればいずれでも良く、特定の種類に限定するものではない。
【００１３】
昆虫からのＲＮＡ抽出は汎用法である「グアニジン−塩化セシウム超遠心法」や「ＡＧＰＣ法」を用いるか、もしくは市販のキット（ニッポンジーン「ＩＳＯＧＥＮ」、ＧＩＢＣＯ「ＴＲＩｚｏｌ」など）を利用してもよい。増幅対象とするＲＮＡは大量かつ全ての細胞に広く存在していることからｒＲＮＡの利用が適しているがｍＲＮＡ、ｔＲＮＡの利用も可能である。また増幅する断片の長さはＰＣＲ反応の効率を考えると３００ｂｐ〜７００ｂｐ位が適当で、長すぎると効率が落ちる、短すぎると増幅しないといった事態が生じ得る。
【００１４】
得られたＲＮＡを鋳型として、当分野で通常行われるようにしてＲＴ−ＰＣＲを行う。使用するプライマーは対象とする昆虫の有し得るＲＮＡの塩基配列を解析してこれを基に合成するが、インターネット上の核酸データベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）の情報を利用しても良い。
その結果、検討したいずれの昆虫においても、死亡後にＲＮＡが経時的に分解されることが確認され、この結果は再現性のあるものであった。
【００１５】
次に、ＲＮＡの分解に対する加熱条件の影響を検討した。
Ｆ０＝１未満の加熱殺菌を行うペットボトル製品の場合には、通常家庭で可能な煮沸条件とほぼ同様に、混入（死亡）から約１２週間はＲＮＡを検出することができた。これにより、鋳型量をそろえた対照実験を予め、あるいは同時に行うことによって、その検出結果から昆虫の死亡時期を特定することが可能である。
【００１６】
また、昆虫及びプライマーの種類によっても異なるが、Ｆ０＝１以上の加熱殺菌を行う製品の場合には、Ｆ０＝１の加熱殺菌条件において、鋳型量数十ｎｇ×３５サイクルという条件においてのみＲＮＡを検出することができ、数ｎｇ×２８サイクルのＲＴ−ＰＣＲ条件ではシグナルを検出できなかった。従って、Ｆ０＝１以上の加熱殺菌を行う製品においては、殺菌前に混入した場合にはこれより検出感度の低い場合には検出できないこととなり、検出できた場合には混入が充填後（工程外）であることが明らかである。
【００１７】
また、Ｆ０＝５以上の殺菌を行う商品については数十ｎｇ×３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲ条件においてもシグナルを検出することができなかった。煮沸のみではこれらの条件下でそれぞれ１２週間までＲＮＡを検出できることから、Ｆ０＝１以上の加熱殺菌を行うレトルト商品については、ほとんどのケースが昆虫が混入してから調査までの日数が３週間以下であることを考慮すると、回収した昆虫からＲＮＡが検出されれば混入が工程外の可能性が高いと判断することができる。
尚、昆虫の種類や実験条件によってはＦ０＝５以下ではシグナルが検出される場合があり、シグナルの強度は死亡時から経時的に減少するため、調査に先立って、あるいは同時に対照実験を行うことが好ましい。
【００１８】
飲食品においては、容器にロット番号や製造年月日が明記されており、製造日の特定は容易にできるため、特定された昆虫の死亡時期と製造日を比較することで、昆虫の死亡時期、すなわち混入時期が製造日前であるか否かが容易に明らかになる。
【００１９】
【実施例】
［実施例１］　ＰＥＴボトル試験
イエバエを純水に浸漬してＦ０＝１未満の殺菌を行った後、３０℃で１日〜１２週間保存した。保存期間終了後、昆虫をマルチビーズショッカ―（安井器械）を用いて１５００ｒｐｍ×１０秒間の破砕処理を行った。ＲＮＡ抽出用試薬「ＩＳＯＧＥＮ」（ニッポンジーン）を用いてＲＮＡ画分を調製した。得られたＲＮＡ画分中にはＤＮＡが混在することがあるため、ＤＮａｓｅＩ（フナコシ、ＤＰＲＦ）３１．２５Ｕを加えて、３７℃×６０分間の酵素処理を行った。フェノール（インビトロジェン）、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（インビトロジェン）処理を行った後、酢酸アンモニウムを用いたエタノール沈澱を行った。得られた沈澱を１０分間真空乾燥した後、ＴＥ（ｐＨ８．０）２０μｌに溶解した。
上記のようにして調製したＲＮＡを鋳型として「ＲＮＡ　ＬＡ　ＰＣＲＴＭ　Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．１．１」（ＴａＫａＲａ）を用いて以下の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００２０】
Ａ　ＲＴ反応
鋳型ＲＮＡ量：１ｎｇおよび４０ｎｇ
プライマー：キット添付、Ｒａｎｄｏｍ　９ｍｅｒｓ　２．５μＭ（終濃度）
プログラム：３０℃×１０分、４２℃×３０分、９９℃×５分、５℃×５分　１サイクル
【００２１】
Ｂ　ＰＣＲ反応
プライマー：イエバエの１８ｓｒＲＮＡ全長の塩基配列を解析してこれを基にプライマーデザインソフトウェアＭＢＩ社製「ＯＬＩＧＯ　ｖｅｒ６．０」を用いて以下の配列のオリゴヌクレオチドを設計し、合成した。
上流側：５’　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＣＡＣ　ＧＧＡ　ＣＣ　３’（配列番号１）
下流側：５’　ＡＣＣ　ＣＧＴ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＡＣ　ＡＡＧ　Ｔ　３’（配列番号２）
プログラム：９４℃×２分間　１サイクル
９４℃×３０秒、５５℃×３０秒、７２℃×９０秒、５℃×５分　２８サイクルまたは３５サイクル
【００２２】
Ｃ　電気泳動
反応液の一部をポリアクリルアミドゲル「ＰＡＧミニ第一４／２０」（第一化学薬品）を用いて電気泳動を行い、反応産物を確認した。
尚、全ての試薬に使用した純水はＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅとするため、１２１℃×４０分間のオートクレーブ処理を行っている。
【００２３】
ＰＥＴボトル試験の結果、イエバエのＲＮＡは経時的に分解していることが確認され、鋳型ＲＮＡ量４０ｎｇ、３５サイクルの条件（図１）では加熱殺菌処理後１２週間程度、鋳型ＲＮＡ量１ｎｇ、２８サイクルの条件（図２）では加熱殺菌処理後３週間程度はその存在を検出することが出来た。従って、製造日から１２週間を超えているサンプルでｒＲＮＡが明瞭に検出できた場合には工程外混入の可能性が非常に高いといえる。また、製造日から１２週間を越えないものでは、対照実験と検出されるバンドの濃さを比較することにより、混入が工程外か工程内かを判別することができる。
【００２４】
［実施例２］　レトルト試験
レトルト飲料の製造中に昆虫が混入したケースを想定し、イエバエ、ショウジョウバエ、クロゴキブリの幼虫（体長約３ｍｍ）各３匹を各種飲料（Ａ〜Ｈ）と共にレトルト缶に封入した後、各飲料に対して通常行う強度のレトルト殺菌（Ｆ０＝１，　５，　１０，　４０）を行った後、実施例１と同様の試験を行った。尚、Ｆ０＝１：１１１℃×１０分相当、Ｆ０＝５：１２１℃×５分相当、Ｆ０＝１０：１２１℃×１０分相当、Ｆ０＝４０：１２４℃×２０分相当である。
【００２５】
ＰＣＲに用いるプライマーとしては、イエバエ及びショウジョウバエは実施例１で用いたものと同じ配列番号１及び２に示すオリゴヌクレオチドを用いた。また、クロゴキブリ用プライマーとしては、核酸データベースＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２００２　Ｊａｎ　１；３０（１）：１７−２０）記載のワモンゴキブリ（２種類）の塩基配列を基にプライマーデザインソフトウェアＭＢＩ社製「ＯＬＩＧＯ　ｖｅｒ６．０」を用いて以下の配列のオリゴヌクレオチドを設計し、合成した。
上流側：５’　ＡＧＣ　ＴＣＧ　ＴＡＧ　ＴＣＧ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＧＴＧ　３’（配列番号３）
下流側：５’　ＧＣＴ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＧＧＴ　ＴＡ　３’（配列番号４）
【００２６】
レトルト試験の結果では、イエバエについてはＦ０＝５以上のレトルト殺菌を行った場合、鋳型ＲＮＡ量４０ｎｇ、３５サイクルの条件ではシグナルは検出されず（図３及び４）、Ｆ０＝１のレトルト殺菌を行った場合、鋳型ＲＮＡ量１ｎｇ、２８サイクルの条件ではシグナルは検出されず（図５）、イエバエのＲＮＡは煮沸及びＦ０＝１未満の殺菌を行った場合に比べ、はるかに熱分解していることが判った。以上の結果、本発明により、イエバエの場合、Ｆ０＝５以上の加熱殺菌を行った飲食品については鋳型ＲＮＡ量４０ｎｇ、３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲで、Ｆ０＝１の加熱殺菌を行った飲食品については、鋳型ＲＮＡ量１ｎｇ、２８サイクルＲＴ−ＰＣＲでシグナルを確認することができれば、昆虫の混入時期が工程外である可能性が高いと判断することが可能となった。
【００２７】
また、ショウジョウバエについてはＦ０＝５以上のレトルト殺菌を行った場合、全てのサンプルについて鋳型ＲＮＡ量４０ｎｇ、３５サイクルの条件ではシグナルは検出されず（図６）、レトルト品については、鋳型ＲＮＡ量４０ｎｇ、３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲでシグナルを確認することによって、昆虫の混入時期が工程外である可能性が高いと判断することが可能となった。
【００２８】
さらに、クロゴキブリについてもイエバエの場合とほぼ同様の結果（Ｆ０＝５の時、不明瞭なシグナルが見られる）が得られ（図７）、Ｆ０＝５以上の加熱殺菌を行った飲食品については鋳型ＲＮＡ量４０ｎｇ、３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲで明瞭なシグナルを確認することによって、昆虫の混入時期が工程外である可能性が高いと判断することが可能となった。
【００２９】
以上の結果、本発明により、Ｆ０＝５以上の加熱殺菌を行った飲食品についてはいずれの昆虫についてもほぼ同様の結果が得られ、本発明は他の昆虫についても広く利用できると考えられる。また、Ｆ０＝１及び１未満の加熱殺菌を行った場合にも、対照実験との比較から混入が工程外であるか工程内であるかを容易に判別することができる。
【００３０】
【発明の効果】
上記したように、本発明によって昆虫に存在するＲＮＡの残存状態を測定して昆虫の死亡時期を特定することができる。充填後に加熱殺菌を行う飲食品においては、製品によって処理された加熱殺菌の強度が明らかであり、またその時期もロット番号や製造日の表示から特定できることから、製品の種類や加熱殺菌の強度によらず、製品への昆虫の混入が充填の前であるか否かを容易に判別することができる。
【００３１】
【配列表】
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【００３２】
【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成プライマー
配列番号２：合成プライマー
配列番号３：合成プライマー
配列番号４：合成プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】鋳型量４０ｎｇ、サイクル数３５の条件におけるＰＥＴボトル試験の結果を示す。
【図２】鋳型量１ｎｇ、サイクル数２８の条件におけるＰＥＴボトル試験の結果を示す。
【図３】鋳型量４０ｎｇ、サイクル数３５、Ｆ０＝４０の条件におけるイエバエを用いたレトルト試験の結果を示す。ＰはＦ０＝１未満の殺菌を行ったＰＥＴボトルの結果である。
【図４】鋳型量４０ｎｇ、サイクル数３５、Ｆ０＝１〜１０の条件におけるイエバエを用いたレトルト試験の結果を示す。
【図５】鋳型量１ｎｇ、サイクル数２８、Ｆ０＝１の条件におけるイエバエを用いたレトルト試験の結果を示す。
【図６】鋳型量４０ｎｇ、サイクル数３５の条件におけるショウジョウバエを用いたレトルト試験の結果を示す。
【図７】鋳型量４０ｎｇ、サイクル数３５の条件におけるクロゴキブリを用いたレトルト試験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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