(57)【要約】【課題】Ｄ−マンノースに対する特異性が高いとともに、補酵素としてＮＡＤを効率的に利用し得るアルドヘキソースデヒドロゲナーゼなどを提供する。【解決手段】補酵素としてＮＡＤＰを共存させるよりも補酵素として同じ濃度のＮＡＤを共存させる方がＤ−マンノースに対する活性が高く、かつ、Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きいアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。この酵素は、血清などの被験試料中のＤ−マンノースの定量に好適に使用できる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を共存させるよりも補酵素として同じ濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを共存させる方がＤ−マンノースに対する活性が高く、かつ、Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きいアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
２−デオキシ−Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きい請求項１に記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
Ｄ−マンノースに対するＫｍが１００ｍＭ以下である請求項１又は２に記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
１５分間の熱処理により酵素活性が実質的に低下しない上限温度が６０℃である請求項１、２又は３に記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
至適温度が７０℃以上である請求項１から４のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
ｐＨ７〜１１での１６時間の処理により酵素活性が実質的に低下しない請求項１から５のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【請求項７】
最大値の８０％以上の活性を示すｐＨが９〜１１である請求項１から６のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【請求項８】
単量体の分子量が２７０００〜３３０００である請求項１から７のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【請求項９】
以下の（１）又は（２）のポリペプチド。
（１）　　配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）　　配列番号１に示すアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を共存させるよりも補酵素として同じ濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを共存させる方がＤ−マンノースに対する活性が高いとともに、Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きいアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
以下の（３）又は（４）のポリヌクレオチド。
（３）　　配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（４）　　配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を共存させるよりも補酵素として同じ濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを共存させる方がＤ−マンノースに対する活性が高いとともに、Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きいアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換体を培養し、この形質転換体からアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを分離し、精製するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項１５】
サーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）を培養し、培養菌体からアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを分離し、精製するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項１６】
請求項１から８のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを含むマンノース測定用試薬。
【請求項１７】
請求項９に記載のポリペプチドとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを含むマンノース測定用試薬。
【請求項１８】
被験試料に請求項１６又は１７に記載のマンノース測定用試薬を添加し、試料中の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド濃度の増加率を定量することにより被験試料中のマンノースを定量するマンノース測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病、真菌感染症、白内障等の診断において行われるマンノースの定量に用いられるアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ及びこの酵素を含むマンノース測定用試薬などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．１１９）（以下、「ＡＨＤＨ」という）は、次式に示すように、Ｄ−アルドヘキソース及びそのアナログの可逆的な酸化反応を触媒する。
【０００３】
Ｄ−アルドヘキソース＋ＮＡＤ　→　Ｄ−ヘキソン酸−δ−ラクトン＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋（ＮＡＤは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを示し、ＮＡＤＨは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを示す。）
ＡＨＤＨに関する報告は少なく、これまで２〜３のバクテリアでのみその性質が明らかにされている。例えば、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｃｅｒｉｎｕｓから得られるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、「ＮＡＤＰ」と略する）依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼがＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２４３（８）　１９６８　ｐｐ１９３６−１９４１に記載されている。また、ＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼがＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２４７（７）　１９７２　ｐｐ２２２２−２２２７に記載されている。このうち、Ｄ−マンノースに対して高い反応性を示すＡＨＤＨは、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｃｅｒｉｎｕｓから得られるＮＡＤＰ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼである。
【０００４】
ここで、ヘキソースの１種であるマンノースは、生体内では、主に糖タンパク質や糖脂質などの糖鎖合成に利用されており、糖タンパク質の生合成や分泌、さらには糖タンパク質の機能発現に重要な役割を果たしている。また、マンノースはヒト血中にも微量に存在しているが、食物から吸収されることは殆どなく、主にグルコース代謝系から供給されている。すなわち、グルコース→グルコース−６−リン酸→フルクトース−６−リン酸→マンノース−６−リン酸の経路で供給される。また、マンノース−６−リン酸からマンノース−１−リン酸及びＧＤＰ−マンノースを経て合成されるＧＤＰ−マンノースは、マンノース糖鎖合成のドナーとして、重要な役割を果たしていることが知られている。
【０００５】
ヒトにおけるマンノースの血中の濃度は、平均値で１６〜８１μＭ程度、ＳＤの範囲では１１〜１４２μＭ程度とされている（日本臨牀　５３（増刊号）　ｐ５７９−５８１（１９９５））。
【０００６】
血中のマンノース濃度と各種疾患との関係については、以下の報告があり、血中のマンノース濃度の測定はこれらの疾患の診断に有用であることが示唆されている。例えば、血糖コントロール不良の糖尿病（Ｃｌｉｎｉｃａ．　Ｃｌｉｍｉｃａ　　Ａｃｔａ　２５１；１９９６　ｐｐ９１−１０３）や真菌感染症（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２１（６）　；１９８５　ｐｐ９７２−９７９）の患者では血中マンノース濃度が上昇していた。糖尿病患者では、空腹時の血清マンノース濃度は健常者の３〜５倍に上昇し、グルコース濃度とよく相関していた（防衛医科大学校雑誌１５（４）　ｐ２１７−２２３（１９９０）、Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ　２５１　ｐ９１−１０３（１９９６））。特に、ケトアシドーシスの症例においては約６７０μＭ（健常者平均値の５０倍）に達し、治療により約５０μＭにまで改善した（防衛医科大学校雑誌　１５（４）　ｐ２１７−２２３（１９９０））。糖尿病の合併症としては、網膜症の発症群で、血清マンノース濃度が有意に高値であった（糖尿病　３３（Ｓｕｐ．）　ｐ１４４（１９９０）、糖尿病３４（Ｓｕｐ．）　ｐ２７７（１９９１））。白内障患者のレンズ中の糖鎖に含まれるマンノースの割合は、糖尿病群では非糖尿病群より高かった（防衛医科大学校雑誌　１８（４）　ｐ３０８−３１５（１９９３））。妊娠糖尿病では、妊娠の初期、中期、後期を通じ、糖尿病群の血清マンノース濃度は正常群より高く、妊娠初期のマンノース濃度高値群で自然流産の頻度が高かった（糖尿病　３３（９）　ｐ７１９−７２５（１９９０））。また、免疫力の低下した患者で問題になる真菌症、特に、カンジダ症においては血清マンノース濃度が１１０〜１，３１５μＭ（健常者平均値の６３倍）と、著しく上昇していた（日本臨牀　５３（増刊号）　ｐ５７９−５８１（１９９５　）、日本医事新報Ｎｏ．３２８６　ｐ４６−４８（１９８７））。
【０００７】
現在、血液の生化学検査のほとんどの項目は汎用の自動分析装置で測定されている。しかし、汎用の自動分析装置に対応できない、すなわち特殊な分析装置を必要とし人手により測定しなければならない検査項目もある。このような検査項目は人件費が高くつくために、近年の医療費の高騰により、事実上臨床での検査が困難な状況にある。
【０００８】
ここで、血中マンノース量の測定方法は数多く報告されているが、何れも煩雑な操作を必要とするため、自動分析装置での測定は困難である（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　４３（３）　　ｐ５３３−５３８（１９９７））。現在最も信頼できるマンノースの測定法としては、キャピラリィー・ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法（防衛医科大学校雑誌　１５（４）ｐ２１７−２２３（１９９０））やガスクロマトグラフィー−マススペクトロメトリィー（ＧＣ−ＭＳ）法（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ２５１　　ｐ９１−１０３（１９９６　））などの分離分析法が報告されている。しかし、いずれの方法も、煩雑な前処理と高度なメンテナンス技術を要する特殊な装置を必要とする。
【０００９】
また、酵素を用いたマンノースの測定法も幾つか報告されている。ひとつは、マンノースをヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）によりリン酸化してマンノース−６−リン酸を生成させ、生成したマンノース−６−リン酸をマンノースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．８）によりフルクトース−６−リン酸へ異性化し、さらに、フルクトース−６−リン酸をグルコースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）によりグルコース−６−リン酸に異性化後、検体中のマンノース量に応じて生成したグルコース−６−リン酸を、補酵素の存在下にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９）を用いて酸化し、この反応によって生じた補酵素の還元体を分光光度計で定量する方法である（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　３０（２）　　ｐ２９３−２９４（１９８４））。この酵素系によりマンノースを測定する場合、ヘキソキナーゼは、マンノースの他にグルコースもリン酸化するため、このグルコースから多量のグルコース−６−リン酸が生じ、これがグルコース−６−リン酸脱水素酵素と反応して測定誤差を生じる。特に、ヒト血清中にはグルコースがマンノースの１００倍程度存在するため、測定前にグルコースを除去しておく必要がある。
【００１０】
Ｓｏｙａｍａ等（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　３０（２）　ｐ２９３−２９４（１９８４））と　Ａｋａｚａｗａ等（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　Ｍｅｔａｂ．　６２（５）　　ｐ９８４−９８９（１９８６））は、グルコースオキシダーゼを用いてグルコースを除去するとともにマンノースを定量する方法を報告している。具体的には、グルコースオキシダーゼとカタラーゼとを用いて予め試料中のグルコースを除去し、アデノシン三リン酸の存在下でマンノースにヘキソキナーゼを作用させることによりマンノース−６−リン酸に変換し、続いてマンノース−６−リン酸にマンノース−６−リン酸イソメラーゼを作用させることによりフルクトース−６−リン酸に変換した後、更にフルクトース−６−リン酸にグルコース−６−リン酸イソメラーゼを作用させることによりグルコース−６−リン酸とし、最後に補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤ」という）の存在下で、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させることにより生じた還元型のＮＡＤＨの吸光度（３４０ｎｍ）を分光光度計で測定することによりマンノースを定量している。しかしながら、本測定法ではグルコースの除去が不完全である場合や、長時間グルコース除去反応を行うとマンノースまで反応してしまうという問題があった（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　４３（３）　ｐ５３３−５３８（１９９７））。
【００１１】
マンノースに共存するアルドヘキソースの影響を除去してマンノースを定量する上記酵素法の改良法として、グルコースやフルクトースが共存する試料にアデノシン三リン酸及びＮＡＤＰ存在下にヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼを作用させることによりグルコース及びフルクトースをグルコース−６−リン酸に変換し、更にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを添加してグルコース−６−リン酸をグルコン酸−６−リン酸に変換し、このときに生じるＮＡＤＰＨを塩酸酸性下で分解することによりグルコース等による影響を除去した後に、上記方法と同様にしてマンノースにヘキソキナーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをこの順に作用させて、生じたＮＡＤＰＨの吸光度（３４０ｎｍ）を測定するマンノースの定量方法が、Ｐｉｔｋａｎｅｎ等により報告されている（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　３５（１０）；　１９９７　ｐｐ７６１−７６６）。
【００１２】
また、Ｊａｍｅｓ等は、グルコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２）を用いてグルコースを選択的にリン酸化し、生じたグルコース−６−リン酸をアニオン交換樹脂を充填した遠心型のミニカラムで吸着除去後、吸着されずに通過液中に回収されたマンノースを、前記のヘキソキナーゼ等の酵素系を用いたマンノース測定法で検出している（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　４３（３）　　ｐ５３３−５３８（１９９７））。
【００１３】
また、特開平１１−２６６８９６号公報には、予め被験試料を、ピラノースオキシダーゼやＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素、またはピラノースオキシダーゼやＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素とグルコースオキシダーゼ等のグルコースの１位酸化酵素とを組み合わせ使用することにより処理し、これにより検体中に存在するグルコースを完全に除去してからマンノースを測定する方法が記載されている。
【００１４】
しかしながら、上述した酵素を用いたマンノース測定方法は、数種の酵素反応を組み合わせた複雑な酵素共役系を介することから、すべての酵素の至適条件を設定することが困難である。また、高価な酵素を多数組み合わせて用いるためコスト高になる。更に、生体試料由来の成分や夾雑物の影響を受け易い。
【００１５】
また、特開２００１−１９７９００号公報には、ＮＡＤＰ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼを用いたマンノースの定量方法が記載されている。しかしながら、ＮＡＤＰはＮＡＤより試薬として数倍高価である。
【００１６】
従来、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼとしては、補酵素として、ＮＡＤ依存性のものとＮＡＤＰ依存性のものとがあることが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３（８）　１９６８　ｐｐ１９３６−１９４１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２４７（７）　１９７２　ｐｐ２２２２−２２２７）。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｄ−マンノースに対する特異性が高いとともに、補酵素としてＮＡＤを効率的に利用し得るアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ、このアルドヘキソースデヒドロゲナーゼの効率的な生産方法、及び、感度が高くかつ低コストなマンノース測定用試薬などを提供することを主目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は探索及び研究を重ね、補酵素としてＮＡＤＰよりもＮＡＤに対して依存性が強く、Ｄ−グルコースよりもＤ−マンノースに対して反応性が高い新規なアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ（以下、「ＡＨＤＨ」という）を単離することに成功した。具体的には、探索対象として既に染色体の全塩基配列が決定されている（Ｎａｔｕｒｅ　４０７　（６８０３），　ｐｐ５０８−５１３　（２０００））好熱好酸性アーキアであるサーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）を選び、機能未知遺伝子産物の機能同定をすすめることにより新規なＡＨＤＨを単離し、このＡＨＤＨが上記の補酵素依存性及び基質特異性を有することを見出した。さらに、ＡＨＤＨを遺伝子工学的技術により高生産させ、高純度なＡＨＤＨを安価に大量供給することを可能にして、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の各項のＡＨＤＨなどを提供する。
【００１９】
項１．　補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を共存させるよりも補酵素として同じ濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを共存させる方がＤ−マンノースに対する活性が高く、かつ、Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きいアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【００２０】
項２．　２−デオキシ−Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きい項１に記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【００２１】
項３．　Ｄ−マンノースに対するＫｍが１００ｍＭ以下である項１又は２に記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【００２２】
項４．　１５分間の熱処理により酵素活性が実質的に低下しない上限温度が６０℃である項１、２又は３に記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【００２３】
項５．　至適温度が７０℃以上である項１から４のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【００２４】
項６．　ｐＨ７〜１１での１６時間の処理により酵素活性が実質的に低下しない項１から５のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【００２５】
項７．　最大値の８０％以上の活性を示すｐＨが９〜１１である項１から６のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【００２６】
項８．　単量体の分子量が２７０００〜３３０００である項１から７のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【００２７】
項９．　以下の（１）又は（２）のポリペプチド。
（１）　　配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）　　配列番号１に示すアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を共存させるよりも補酵素として同じ濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを共存させる方がＤ−マンノースに対する活性が高いとともに、Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きいアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【００２８】
項１０．　項９に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２９】
項１１．　以下の（３）又は（４）のポリヌクレオチド。
（３）　　配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（４）　　配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を共存させるよりも補酵素として同じ濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを共存させる方がＤ−マンノースに対する活性が高いとともに、Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きいアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
項１２．　項１０又は１１に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【００３０】
項１３．　項１２に記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
【００３１】
項１４．　項１３に記載の形質転換体を培養し、この形質転換体からアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを分離し、精製するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【００３２】
項１５．　サーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）を培養し、培養菌体からアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを分離し、精製するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【００３３】
項１６．　項１から８のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを含むマンノース測定用試薬。
【００３４】
項１７．　項９に記載のポリペプチドとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを含むマンノース測定用試薬。
【００３５】
項１８．　被験試料に項１６又は１７に記載のマンノース測定用試薬を添加し、試料中の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド濃度の増加率を定量することにより被験試料中のマンノースを定量するマンノース測定方法。
【００３６】
【発明の実施の形態】
（Ｉ）アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ
補酵素依存性・基質特異性
本発明のＡＨＤＨは、補酵素としてＮＡＤＰを共存させるよりも補酵素として同じ濃度のＮＡＤを共存させる方がＤ−マンノースに対する活性が高く、かつ、Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きい酵素である。
【００３７】
すなわち本発明のＡＨＤＨは、補酵素としてＮＡＤＰよりもＮＡＤへの依存性が強く、かつ、Ｄ−グルコースよりもＤ−マンノースに対する活性が高い又は／及び親和性が高い酵素である。
【００３８】
本発明において、ＡＨＤＨの活性は、補酵素（ＮＡＤ）の存在下でＡＨＤＨによる基質の脱水素反応を行い、還元型補酵素（ＮＡＤＨ）の濃度を反映する３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度を測定することにより求めた値である。具体的には、８０ｍｇ／ｍｌの補酵素を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ（８．０））中に基質を溶解させ、酵素溶液を１／６０容量添加し、３７℃で３４０ｎｍの吸光度の変化を測定する。直線的増加が見られる初期部分の吸光度の変化速度から次式に従い、ＡＨＤＨ活性を算出する。上記条件下で１分間に１μｍｏｌの還元型補酵素を生成する酵素量を１単位とする。
【００３９】
【式１】
2004033077.tif 000002
【００４０】
但し、補酵素としてＮＡＤＰへの依存性を検討する場合には、補酵素としてＮＡＤに代えてＮＡＤＰを用い、還元型ＮＡＤＰＨの濃度を反映する３４０ｎｍの吸光度を測定する。
【００４１】
また、Ｖｍａｘ及びＫｍは、常法に従いラインウィーバー・バークプロットから算出する。
【００４２】
本発明のＡＨＤＨにおいて、Ｄ−マンノースに対する活性は、ＮＡＤの共存下ではＮＡＤＰの共存下での２倍以上、特に５倍以上であることが好ましい。
【００４３】
また本発明のＡＨＤＨは、Ｄ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが、Ｄ−グルコースに対するＶｍａｘ／Ｋｍの１．５倍以上、特に３倍以上であることが好ましい。
【００４４】
本発明のＡＨＤＨはＤ−マンノースに対する親和性が強い。本発明のＡＨＤＨは、Ｋｍが通常１００ｍＭ以下、特に５０ｍＭ以下、さらに特に２５ｍＭであることが好ましい。このＫｍの下限値は特に限定されないが、通常１０ｍＭ程度である。
【００４５】
本発明のＡＨＤＨは、Ｄ−マンノースの他に、Ｄ−グルコース及び２−デオキシ−Ｄ−グルコースに対する脱水素活性を有していてもよい。但し、補酵素としてＮＡＤを用いた場合に、２−デオキシ−Ｄ−グルコースよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きいことが好ましい。特に、補酵素としてＮＡＤを用いた場合に、Ｄ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに対するＶｍａｘ／Ｋｍの１．１倍以上、特に１．２倍以上であることが好ましい。
耐熱性・至適温度
本発明のＡＨＤＨは耐熱性が高い。２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中での１５分間の熱処理に対して６０℃以下であれば実質的に活性が低下しない（実質的に活性が低下しない上限温度が６０℃である）ことが好ましい。また、同条件の７０℃での熱処理により７０％以上活性が残存する酵素であることがより好ましい。
【００４６】
ここで、実質的に活性が低下しないとは、測定誤差範囲を考慮し、９０％以上活性が残存する場合をいう。
【００４７】
また、本発明のＡＨＤＨの至適温度は７０℃以上であることが好ましい。
【００４８】
本発明のＡＨＤＨは、このように耐熱性が高く、また至適温度が高いことにより、保存中に活性が低下し難く、取り扱いが容易である。また、Ｄ−マンノース定量に当たり比較的高温で酵素反応を行えるため、夾雑酵素の影響を除外でき、その分高感度に測定できる。酵素の製造においても、加温処理により容易に夾雑酵素を不溶性画分として除去することが可能である。特に、本発明のＡＨＤＨをコードするＤＮＡを含む組換え体を保持する形質転換体を用いてＡＨＤＨを製造する場合には、宿主が生産するその他の種々の糖脱水素酵素を完全に除去することが望まれるため、これらの酵素を夾雑酵素として容易に除去できる利点は大きい。
ｐＨ安定性・至適ｐＨ
本発明のＡＨＤＨは、アルカリに対して極めて耐性である。１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．３〜７．５）、トリス塩酸（ｐＨ７．１〜９．１）、グリシン水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０〜１１）各緩衝液中での２５℃１６時間の処理により、実質的に活性が低下しないｐＨ範囲は７〜１１程度であることが好ましい。同条件で６０％以上の活性が残存するｐＨ範囲は６．３〜１１程度であることがより好ましい。
【００４９】
ここで、実質的に活性が低下しないとは、測定誤差範囲を考慮し、９０％以上活性が残存する場合をいう。
【００５０】
また、本発明のＡＨＤＨにおいて、最大値の８０％以上の活性を有するｐＨが９〜１１程度であることが好ましい。特に本発明のＡＨＤＨは至適ｐＨが１０であることが好ましい。
【００５１】
本発明のＡＨＤＨは、このように耐アルカリ性に優れるために、測定試薬に用いる緩衝液を広い範囲から選択することができる。
分子量
本発明のＡＨＤＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は３００００±３０００程度である。
アミノ酸配列
本発明のＡＨＤＨとしては、それには限定されないが、以下の（１）又は（２）のポリペプチドからなるものが挙げられる。
（１）　　配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）　　　配列番号１に示すアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、補酵素としてＮＡＤＰを共存させるよりも補酵素として同じ濃度のＮＡＤを共存させる方がＤ−マンノースに対する活性が高いとともに、Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きいアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【００５２】
（２）の改変されたポリペプチドは、公知の方法、例えば（１）のポリペプチドをコードするＤＮＡに対して、エキソヌクレアーゼを用いたＤＮＡ欠失導入、リンカー導入、位置指定突然変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法等による塩基配列の改変を行うことや化学合成等によって得ることができる。
【００５３】
ポリペプチドの改変を活性を損なわない範囲で行うために、例えばアミノ酸の置換であれば、類似した側鎖を有するアミノ酸間で置換することが好ましい。具体的には、例えばアスパラギン酸とグルタミン酸との間、トリプトファンとフェニルアラニンとチロシンとの間、リジンとアルギニンとの間、セリンとスレオニンとの間、アスパラギンとグルタミンとの間、バリンとロイシンとイソロイシンとの間などでアミノ酸の置換を行うことが好ましい。
【００５４】
改変に対して耐えられる領域は、活性中心付近以外の部分、すなわち種間で保存されていない領域である。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１３２〜１４９以外の部分である。
【００５５】
（２）のポリペプチドのアミノ酸配列は（１）のポリペプチドのアミノ酸配列との間で、通常８０％以上、特に９０％以上の相同性を有することが好ましい。
塩基配列
本発明のポリヌクレオチドは、上記の（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、このポリペプチドをコードするものであれば、特に限定されないが、特に以下の（３）又は（４）のポリヌクレオチドが好ましい。
（３）　　配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（４）　　配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、補酵素としてＮＡＤＰを共存させるよりも補酵素として同じ濃度のＮＡＤを共存させる方がＤ−マンノースに対する活性が高いとともに、Ｄ−グルコースに対するよりもＤ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが大きいアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明において、「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの双方が含まれる。また、ポリヌクレオチドには、その塩基配列を有するポリヌクレオチドの他にそれに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。また、ＤＮＡの場合には、１本鎖ＤＮＡ及び２本鎖ＤＮＡの双方が含まれる。
【００５６】
本発明において、ストリンジェントな条件としては、２×ＳＳＣ（３００ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸）中で６５℃、１６時間のハイブリダイゼーション条件が挙げられる。
【００５７】
（４）の改変されたポリヌクレオチドは、公知の方法、例えば（３）のポリヌクレオチドに対して、エキソヌクレアーゼを用いたＤＮＡ欠失導入、リンカー導入、位置指定突然変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法等による塩基配列の改変を行うことや化学合成等によって得ることができる。
【００５８】
（４）のポリヌクレオチドの塩基配列は、（３）のポリヌクレオチドの塩基配列との相同性が８０％以上、特に９０％以上、さらに特に９５％以上であることが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２の塩基配列に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてサーモプラズマ属細菌（特にサーモプラズマ・アシッドフィラム）のゲノムライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方法、このゲノムライブラリーをＰＣＲの鋳型として用い、配列番号２の塩基配列に基づき合成したセンスプライマーとアンチセンスプライマーとを組み合わせてＰＣＲを行う方法等により得ることができる。
【００５９】
また、本発明のポリヌクレオチドは、以下の方法によっても得られる。すなわち、例えばサーモプラズマ属細菌（特にサーモプラズマ・アシッドフィラム）の染色体ＤＮＡを常法に従い分離、精製した後、超音波破砕又は任意の制限酵素処理によりＤＮＡを切断する。このＤＮＡ断片をリニアーな発現ベクターの平滑末端または接着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。このようにして得られた組換えベクターを、ベクターに応じた複製可能な宿主微生物に形質転換により導入した後、ベクターのマーカーとＡＨＤＨ酵素活性の発現とを指標としてＡＨＤＨ遺伝子が導入された菌株をスクリーニングする。得られた菌株を培養し、培養菌体から組換えベクターを分離及び精製し、組換えベクターからＡＨＤＨ遺伝子を採取すればよい。
【００６０】
染色体ＤＮＡは、具体的には以下のように採取される。すなわち、微生物を例えば１〜３日間攪拌培養することにより得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いでこれを溶菌させることにより遺伝子含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、弱アルカリ緩衝液による懸濁処及び必要に応じてプロテアーゼ等の酵素、ラウリル硫酸ナトリウム又はドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤処理が挙げられる。このようにして得られた溶解物からＤＮＡを分離・精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせて行えばよい。
【００６１】
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素処理が好ましい。
【００６２】
ベクターは、細菌用ベクターの他、酵母用ベクター、動物細胞用ベクターも使用できる。通常は、細菌用のファージベクター又はプラスミドベクターを用いればよい。例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とするＬａｍｂｄａ−ｇｔ１０又はＬａｍｂｄａ−ｇｔ１１のようなファージベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのようなプラスミドベクターが挙げられる。
【００６３】
このようなベクターを、上述したＡＨＤＨ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用したのと同じ制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター接着断片とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作製する。必要であれば、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用して組換えベクターを作製することもできる。
【００６４】
宿主微生物としては、組換えベクターが安定に自律増殖可能で、外来性遺伝子の形質を発現できるものであればよく、ベクターに応じて細菌、酵母、動物細胞を用いればよい。それには限定されないが、一般的にはエシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＤＨ５α等を用いることができる。
【００６５】
形質転換は、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法などの公知の方法を採用できる。
【００６６】
宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無は、ベクターが備える薬剤耐性マーカーとＡＨＤＨ活性とを同時に発現するコロニーを選択すればよい。例えば当該薬剤耐性マーカーに相当する薬剤を含む平板培地上で生育するコロニーの中から、ＡＨＤＨ活性測定を行うことによりＡＨＤＨを生産する株を選択すればよい。
【００６７】
選択した菌株からＡＨＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターを分離し、制限酵素処理によりＡＨＤＨをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。さらに、ＰＣＲにより当該ポリヌクレオチドを増幅させることもできる。
【００６８】
ゲノムＤＮＡのプローブ又はプライマーを用いたスクリーニング、形質転換体のＡＨＤＨ活性を指標にしたスクリーニングのいずれの方法を採る場合にも、本発明のポリヌクレオチドは、サーモプラズマ属細菌の他に、アーキオグロバス属、メタノコッカス属、パイロコッカス属等の細菌から得ることもできる。
本発明のＡＨＤＨ・ポリペプチドの製造方法
本発明のＡＨＤＨは、前述した形質転換体又はサーモプラズマ属細菌等の細菌を、通常、液体培地中で培養することにより、形質転換体の菌体内に、又は、分泌シグナル付加したＡＨＤＨの場合には菌体外に生産させることができる。工業的には通気攪拌培養を行うことが好ましい。
【００６９】
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００７０】
培養温度、培地ｐＨ及び培養時間は、生産菌または宿主に応じてＡＨＤＨの生産量の多い条件を選択すればよい。例えば宿主としてエシェリヒア・コリを用いる場合には、培養温度は２０〜４２℃程度が好ましい。培養時間は、温度や培地成分などの培養条件によって異なるが、通常は６〜７２時間程度とすればよい。培地のｐＨはｐＨ６〜９程度のアルカリ性の範囲が好ましい。
【００７１】
また、本発明のＡＨＤＨの最も好ましい生産菌であるサーモプラズマ・アシッドフィラムからＡＨＤＨを採取する場合には、培養温度は５５〜６０℃程度が好ましい。培養時間は、温度や培地成分などの培養条件によって異なるが、通常は２４〜４８時間程度とすればよい。培地のｐＨはｐＨ０．５〜４程度の酸性の範囲が好ましい。
【００７２】
ＡＨＤＨが主に菌体外に分泌される場合には、形質転換体を含む培養液をそのまま利用することもできるが、一般的には、常法に従って、濾過又は遠心分離などにより菌体を除去した培養液を利用すればよい。一方、ＡＨＤＨが主に菌体内に生産される場合には、培養液から菌体を集め、菌体を超音波破砕のような機械的方法又はリゾチームのような酵素的方法で破壊し、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及び／又はトリトンＸ−１００等の界面活性剤を添加して酵素を可溶化し、水溶液中にＡＨＤＨを回収する。
【００７３】
得られたＡＨＤＨ含有溶液を、例えば、減圧濃縮若しくは膜濃縮により濃縮するか、硫酸アンモニウム若しくは硫酸ナトリウムなどを用いた塩析処理又は親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトンなど）による分別沈殿法により沈殿させればよい。また、本発明のＡＨＤＨは耐熱性の高い酵素であることから、５０〜６０℃程度での加熱処理を行うことにより夾雑タンパク質を効果的に除去することができる。さらに、常法に従い、等電点電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、ＡＨＤＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドが得られるまで精製することができる。
【００７４】
本発明のＡＨＤＨは、精製酵素溶液の形態、又は、例えば凍結乾燥、真空乾燥又はスプレードライなどにより粉末化した形態の双方で流通させることができる。精製酵素を溶解させておく緩衝液の種類は特に限定されず、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液又はＧＯＯＤの緩衝液等の公知の緩衝液を使用することができる。緩衝液のｐＨは、ＡＨＤＨの安定ｐＨ範囲である７〜１１程度とすることが好ましい。
マンノース測定用試薬
本発明のマンノース測定用試薬は、本発明のＡＨＤＨ（又は本発明のポリペプチド）とＮＡＤとを含む試薬である。
【００７５】
これらは、乾燥品であってもよいが、緩衝液中に溶解させたものであってもよい。さらに、紙片に含浸させたものであってもよい。緩衝液は、通常ｐＨ７〜９程度、特に７．５〜８．５程度を用いることが好ましい。緩衝液の種類は、上記ｐＨ範囲で緩衝能を有するものであればよく、１０〜５００ｍＭ程度のリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、各種ＧＯＯＤ緩衝液等の公知の緩衝液を使用することができる。
【００７６】
溶液状の試薬である場合には、ＡＨＤＨは０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度、特に１〜１０Ｕ／ｍｌ程度の濃度で含まれていることが好ましい。また、ＮＡＤは０．１〜１０ｍＭ程度、特に０．５〜５ｍＭ程度の濃度で含まれていることが好ましい。ＡＨＤＨに対するＮＡＤの比率が多すぎると試薬が高価なものとなり、少なすぎると酵素反応が十分に進まなくなる。本発明の範囲であればこのような問題は生じない。
【００７７】
また、本発明のマンノース測定用試薬が乾燥品である場合には、ＡＨＤＨの１Ｕに対してＮＡＤが０．１〜１マイクロモル程度、特に０．２〜０．８マイクロモル程度の比率で含まれていることが好ましい。また、緩衝剤として、リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、各種ＧＯＯＤ緩衝剤等を、ＡＨＤＨの１Ｕに対して１〜１００マイクロモル程度の比率で含むことが好ましい。
【００７８】
本発明の試薬には、いずれの試薬形態の場合にも、必要に応じて、溶解補助剤や安定剤としてＢＳＡ、ＥＤＴＡ、グリシン、塩化ナトリウム、トレハロース等の公知の添加剤が含まれていてもよい。
マンノース測定方法
本発明のマンノース測定用試薬を使用して、以下のようにして被験試料中のマンノース量を定量する。
【００７９】
定量に先立ち、被験試料を、必要に応じて推定マンノース濃度が１μＭ〜１０ｍＭ程度になるように、蒸留水又は緩衝液を用いて希釈してもよい。被験試料０．０１ｍｌに対して本発明のマンノース測定用試薬を、ＡＨＤＨ添加量が１〜１０Ｕ／ｍｌ程度となるように添加する。さらに、試料中の還元型ＮＡＤ濃度の増加率を測定する。還元型ＮＡＤ濃度の増加率の測定方法は、特に限定されないが、分光光度計を用いて、３４０ｎｍの吸光度の上昇率を測定するのが簡便である。対照（盲検）として本発明の試薬に代えて蒸留水を添加した同じ試料を用いる。測定時の温度は３７〜７０℃程度、測定時間は吸光度が直線的に増加する範囲であればよいが、通常１２０〜６００秒間程度とすればよい。
【００８０】
試料中に含まれるマンノース濃度は、測定した吸光度変化から盲検の吸光度変化を引いた値を次式に当てはめることにより算出することができる。
【００８１】
【式２】
2004033077.tif 000003
【００８２】
本発明方法の対象にすることができる被験試料は、特に限定されないが、血清、尿、食品抽出物、多糖加水分解物等が挙げられる。
【００８３】
また、本発明の試薬を用いて、被験試料中のＤ−マンノースを定量できる他、Ｄ−マンノースの検出（定性分析）も行える。被験試料に本発明の試薬及びホルマザン色素を加え、発色することを指標にＤ−マンノースの存在を確認できる。
【００８４】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び試験例を示して説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００８５】
ＡＨＤＨ活性測定方法
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．６ｍｌ、１．５Ｍ　Ｄ−マンノース水溶液０．３ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌＮＡＤ水溶液０．１ｍｌをキュベットに調製し、３７℃で約５分間予備加温する。次いで、酵素溶液０．０５ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、蒸留水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、ＮＡＤＨ濃度を反映する３４０ｎｍの吸光度の変化を５〜６分間記録し、その初期直線部分から１分間あたりの吸光度変化を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、同様にして吸光度変化を測定する。このようにして求めた吸光度変化速度から次式に従い酵素活性を算出する。上記条件下で１分間に１マイクロモルの還元型補酵素（ＮＡＤＨ）を生成する酵素量を１単位とする。
【００８６】
【式３】
2004033077.tif 000004
【００８７】
Ｖｍａｘ・Ｋｍ
Ｖｍａｘ及びＫｍは、常法に従いラインウィーバーバークプロット等から求める。
【００８８】
実施例１（染色体ＤＮＡの分離）
サーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ２５９０５株の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。
【００８９】
同菌株を、酵母エキス（ディフコ社製）１ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１．３２ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．３７２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．２４７ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．０７４ｇ／ｌ、１０ｍｌ／ｌの微量元素溶液（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ１．９３ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ０．１８ｇ／ｌ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ０．４５ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２２ｍｇ／ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ５ｍｇ／ｌ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ３ｍｇ／ｌ、ＶＯＳＯ４・２Ｈ２Ｏ３ｍｇ／ｌ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１ｍｇ／ｌを加え、硫酸でｐＨを１．３に調節した培地で５８℃、二晩振とう培養した後、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１５分間）により集菌した。
【００９０】
遠心チューブ内に残存する培養液をキムワイプで拭き取った後、細胞１ｇあたり２０％シュークロース、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ＳＤＳを含んだ溶液１５ｍｌに懸濁し、１５０μｌのプロテアーゼＫ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）と１５０μｌのＲＮＡｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）とを加え、３７℃、１２時間保温した。これを等量のクロロホルム／フェノール溶液で処理後遠心分離により水層を分取する操作を３回繰り返した。
【００９１】
得られた水層に６００μｌの５Ｍ　ＮａＣｌを加え混合した後、０．８倍量のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和後に出現するＤＮＡを硝子棒に巻き付け精製ＤＮＡ標品とした。この精製ＤＮＡを５ｍｌの１ｍＭ　ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）溶液（以下、ＴＥと略記する）に再溶解し、２００μｌの５ＭＮＡＣｌを加え混合した後０．８倍量のイソプロピルアルコールを加え再抽出したＤＮＡを７０％エタノール溶液で洗浄後、風乾の後１ｍｌのＴＥ（トリス塩酸−ＥＤＴＡ）緩衝液で溶解した。
【００９２】
実施例２（ＡＨＤＨをコードするＤＮＡを含む組換えベクターの調製）
サーモプラズマ・アシッドフィラムＴａ０７５４の染色体遺伝子の塩基配列（ＡＬ１３９２９９−Ｔａ０７５４；ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ）に基づき、配列番号３に示す４２塩基からなるセンスプライマーと配列番号４に示す２９塩基からなるアンチセンスプライマーを合成した。このプライマーセットと、Ｐｆｕｔｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼとを用い、実施例１で得られたＤＮＡを鋳型として、以下のサイクルでＰＣＲを行った。
【００９３】
ステップ１：９４℃、１分間
ステップ２：５８℃、１分間
ステップ３：７２℃、２．５分間（３０サイクル）
得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて泳動すると、０．７８ｋｂの大きさの特異的バンドが認められた。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化し、このＤＮＡ断片を同じくＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化することにより得られたベクターｐＥＴ２８の開環物とライゲーションした。このようにして、組み換えベクターｐＥＴ／Ｔａ０７５４を得た。この組み換えベクターによりエシェリヒア・コリＸＬ１／Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を形質転換した。
【００９４】
実施例３（塩基配列の決定）
ｐＥＴ／Ｔａ０７５４の約０．　８ｋｂｐの挿入ＤＮＡについて、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）及びＡＢＩ３１００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定した。決定した塩基配列のオープンリーディングフレーム及びこれに対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２及び配列番号１に示した。アミノ酸配列から求められるタンパク質の分子量は約２８，９００であった。
【００９５】
実施例４（形質質転換体の作製）
エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のコンピテントセルをｐＥＴ／Ｔａ０７５４で形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔａ０７５４）を得た。
【００９６】
実施例５（形質転換体からのＡＨＤＨの製造）
ＬＢ培地１００ｍｌを５００ｍＬフラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過した１０ｍｇ／ｍｌカナマイシン、３４ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ナカライテスク社）０．１ｍｌを添加した。この培地にＬＢ培地で予め３０℃、１７時間振とう培養したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔａ０７５４）の培養液１ｍｌを接種し、３７℃で９時間通気攪拌培養した。
【００９７】
ＬＢ培地９００ｍｌを２Ｌフラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過した１０ｍｇ／ｍｌカナマイシン、３４ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ナカライテスク社製）０．９ｍｌを添加した。この培地に先程の９時間培養したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔａ０７５４）の培養液１００ｍｌを接種し、３７℃で１７時間通気攪拌培養した。培養終了時の培養液１ｍｌ中に含まれる菌体中のＡＨＤＨ活性は約４Ｕ／ｍｌであった。
【００９８】
培養液中の菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波で破砕し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液を６０℃で６０分間熱処理し、遠心分離を行い、上清液を得た。
【００９９】
ポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画を行った後、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（ファルマシアバイオテク社）によるゲル濾過により脱塩し、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク社）カラムクロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク社）カラムクロマトグラフィーにより分離、精製を行い、精製酵素標品を得た。本方法により得られたＡＨＤＨ標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりほぼ単一なバンドを示した。この酵素標品の比活性は３８Ｕ／ｍｇ−ｓｏｌｉｄ−タンパク質であった。
【０１００】
ＡＨＤＨの耐熱性・至適温度
実施例５により得られたＡＨＤＨを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃及び９０℃の各温度条件で、それぞれ１５分間処理した後、ＮＡＤ存在下でのＤ−マンノースに対する活性を測定した。結果を、図１に示す。図１から、活性が実質的に低下しない上限温度は、６０℃であることが分かる。なお、ここでは、リン酸緩衝液中での耐熱性を調べたが、他の緩衝液を用いても同様の結果が得られる。
【０１０１】
また、実施例５により得られたＡＨＤＨについて、１００ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃及び７０℃の各温度条件下で、ＮＡＤ存在下でのＤ−マンノースに対する活性を測定した。結果を図２に示す。図２から、本酵素の至適温度は７０℃以上であると考えられる。
【０１０２】
ｐＨ安定性・至適ｐＨ
実施例５により得られたＡＨＤＨを、リン酸カリウム（ｐＨ６．３〜７．５）、トリス塩酸（ｐＨ７．１〜９．１）、グリシン水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０〜１１）の各１００ｍＭ緩衝液中で、２５℃の温度条件で、それぞれ１６時間処理し、Ｄ−マンノースに対する活性を測定した。結果を、図３に示す。図３から、活性が実質的に低下しない下限ｐＨは７であることが分かる。なお、ここではリン酸緩衝液、トリス緩衝液及びグリシン緩衝液中でのｐＨ安定性を調べたが、他の緩衝液を用いる場合にも同様の結果が得られる。
【０１０３】
また、実施例５により得られたＡＨＤＨをリン酸カリウム（ｐＨ６．３〜７．５）、トリス塩酸（ｐＨ７．１〜９．１）、グリシン水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０〜１１）の各０．１Ｍ緩衝液中で、３７℃の温度条件下で、Ｄ−マンノースに対する活性を測定した。結果を図４に示す。図４から、本酵素の至適ｐＨは１０であることが分かる。
【０１０４】
分子量
実施例５により得られたＡＨＤＨの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した場合の分子量は、約３００００であった。
【０１０５】
基質特異性
実施例５により得られたＡＨＤＨのＤ−マンノース、Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに対するＮＡＤ共存下での活性を測定し、ラインウィーバー・バークプロットからＶｍａｘ及びＫｍを算出した。Ｄ−グルコース及び２−デオキシ−Ｄ−グルコースを基質とする場合は、上記の活性測定方法に準じてＡＨＤＨ活性を測定した。結果を以下の表１に示す。
【０１０６】
【表１】
2004033077.tif 000005
【０１０７】
表１の結果、本酵素は、Ｄ−マンノースに対するＶｍａｘ／Ｋｍが最も高く、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに対しても比較的高い活性を有することが分かる。また、上記の二つの基質に対するより活性は低いが、本酵素はＤ−グルコースに対しても活性を有することが分かる。
補酵素依存性
実施例５により得られたＡＨＤＨのＤ−マンノースをはじめとする種々の糖に対する活性を、補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを用いて測定し、相対活性値を算出した。ＮＡＤＰを用いる場合及び基質としてＤ−マンノース以外の単糖を用いる場合も、上記の活性測定法に準じてＡＨＤＨ活性を測定した。結果を以下の表２に示す。
【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
表２の結果、本酵素は、補酵素としてＮＡＤＰを用いる場合よりもＮＡＤを用いる場合の方が、Ｄ−マンノースに対して格段に高い活性を示すことが分かる。なお、本酵素が活性を示す他の基質（２−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、β−Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フコース）に対しても同様である。
【０１１０】
【発明の効果】
本発明によると、Ｄ−マンノースに対する特異性が高いとともに、補酵素としてＮＡＤを効率的に利用し得るアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ、このアルドヘキソースデヒドロゲナーゼの効率的な生産方法、及び、感度が高くかつ低コストなマンノース測定用試薬などが提供される。
【０１１１】
さらにいえば、本発明のＡＨＤＨはＤ−グルコース等に対するよりもＤ−マンノースに対する活性が高いため、本発明のＡＨＤＨは、血清などの被験試料中に夾雑アルドヘキソースが含まれている場合でも、Ｄ−マンノースを感度良く定量することができる。また、本発明のＡＨＤＨは、補酵素として安価なＮＡＤを効率的に利用できるため、低コストにＤ−マンノースを定量することができる。
【０１１２】
さらに、本発明のＡＨＤＨは、極めて耐熱性に優れるため、保存時に活性が低下し難く、取り扱いが容易である。また、被験試料中のＤ−マンノースを定量するにあたり、比較的高温下で定量を行えるために、夾雑酵素の影響を除外でき、その分高感度な定量を行える。
【０１１３】
また、本発明のＡＨＤＨはアルカリ性溶液に対して耐性であるため、試薬に用いる場合の緩衝剤を広い範囲から選択できる。
【０１１４】
また、本発明によると、ＡＨＤＨをコードするポリヌクレオチド配列が提供されたため、ランダム変異処理や部位特異的変異処理のようなタンパク質工学的手法により、ＡＨＤＨの基質親和性又は基質特異性（Ｋｍ）、反応性（Ｖｍａｘ）などを改良することができる。
【０１１５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】サーモプラズマ・アシッドフィラム由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼの温度に対する安定性を示す図である。
【図２】サーモプラズマ・アシッドフィラム由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼの活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図３】サーモプラズマ・アシッドフィラム由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼのｐＨに対する安定性を示す図である。
【図４】サーモプラズマ・アシッドフィラム由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼの活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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