(57)【要約】【課題】マイクロチャネル内に結合している酵素が能力低下して効率が悪くなったとき、容易に新らしい酵素と交換することができるように、酵素分子を着脱自在に結合した新規なマイクロリアクターを提供する。【解決手段】マイクロチャネル表面に導入されたニッケル錯体を介して、酵素分子が着脱可能に結合されているマイクロリアクターであって、ガラス、石英又はシリカ系セラミックスで構成されたマイクロチャネルを化学修飾してその表面にニッケル錯体を導入し、次いでこれにヒスチジンタグをもつ酵素分子を加えて反応させ、着脱可能に結合させることにより製造する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチャネル表面に導入されたニッケル錯体を介して、酵素分子が着脱可能に結合されていることを特徴とするマイクロリアクター。
【請求項２】
酵素分子がヒスチジンタグをもつ請求項１記載のマイクロリアクター。
【請求項３】
マイクロチャネルの基材が、ガラス、石英又はシリカ系セラミックスである請求項１又は２記載のマイクロリアクター。
【請求項４】
ガラス、石英又はシリカ系セラミックスで構成されたマイクロチャネルを化学修飾してその表面にニッケル錯体を導入し、次いでこれにヒスチジンタグをもつ酵素分子を加えて反応させ、着脱可能に結合させることを特徴とするマイクロリアクターの製造方法。
【請求項５】
マイクロチャネルの化学修飾をアミノアルキルトリアルコキシシラン及びアルキルトリアルコキシシランの混合物を用いて行う請求項４記載のマイクロリアクターの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素を可逆的に着脱可能に結合したマイクロリアクター及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、化学分野、電気機械的分野において、径１０〜１００μｍのキャピラリーやマイクロチャネルを利用して、微量分析、微量合成、微量微生物培養、微量電気泳動、微量電気浸透などの化学的・電気的又は機械的操作を行うことが試みられている（非特許文献１参照）。これらは、少量の試料を用いて、迅速にそれぞれの方法の結果を確認しうるという利点があるため、各方面への応用がはかられている。
【０００３】
ところで、これらの中で化学反応を効率的に行うための装置、いわゆるマイクロリアクターについては、流体化学反応の制御性が向上し、反応生成物の収率、純度の改善が予想される上に、リアクターの幅を狭くすることができ、普通サイズのリアクターに比べ、体積当りの表面積の比率を大きくしうるので、化学反応の効率化の手段として注目されている。
【０００４】
他方、化学、生化学の分野においては、反応効率を向上させるために触媒を使用する場合が多く、この際触媒効率を向上させることが課題となっている。例えば光学活性化合物の不斉合成に際し、酵素や有機金属錯体などの有機分子を用いる場合、これらは無機触媒に比べコスト高になるのを免れないので、触媒効率を改善し、使用量の減少や再利用をはかることが実用化の上で必要になってくる。
したがって、マイクロリアクターについても触媒反応を効率よく行わせるためのマイクロチャネル構造を組み立てることが、これを実用化するために必要な要件となっている。
【０００５】
ところで、マイクロチャネル表面に酵素を固定化したマイクロリアクターにおいては、経時的な触媒能力の低下が避けられないので、効率的にマイクロリアクターを利用するには、能力の低下した酵素を適宜交換することが必要になってくる。しかしながら、従来のマイクロリアクターにおいて、マイクロチャネル内の酵素を交換しようとすれば、能力の低下した酵素を完全に除去したのち、再び煩雑な操作により新らしい酵素を固定させなければならないため、ほとんど実用化は不可能であった。
【０００６】
【非特許文献】
「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，第２８５巻，ｐ８３〜８５
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑み、マイクロチャネル内に結合している酵素が能力低下して効率が悪くなったとき、容易に新らしい酵素と交換することができるように、酵素分子を着脱自在に結合した新規なマイクロリアクターを提供することを目的としてなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、触媒を固定化したマイクロリアクターについて種々研究を重ねた結果、ガラス、石英又はシリカ系セラミックスで構成されたマイクロチャネル表面には、化学修飾によりニッケル錯体を導入することができ、このニッケル錯体を利用すれば酵素分子を着脱可能に結合しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、マイクロチャネル表面に導入されたニッケル錯体を介して、酵素分子が着脱可能に結合されていることを特徴とするマイクロリアクター、及びガラス、石英又はシリカ系セラミックスで構成されたマイクロチャネルを化学修飾してその表面にニッケル錯体を導入し、次いでこれにヒスチジンタグをもつ酵素分子を加えて反応させ、着脱可能に結合させることを特徴とするマイクロリアクターの製造方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のマイクロリアクターの基材としては、触媒反応において、触媒、反応体、溶媒及び反応生成物に対し、不活性な材料を用いることが必要である。本発明においては、このような材料として、ガラス、石英又はシリカ系セラミックス、例えばシリカやＳｉ／ＳｉＯ２の焼結体を用いる。この基材の形状は、板状体が普通であるが、所望ならば円弧状表面体、球体、粒体であってもよい。
【００１１】
これらの基材に設けるマイクロチャネルはマイクロドリルやレーザを用いる加工やエッチング処理により簡単に刻設することができる。このマイクロチャネルは幅１０〜５００μｍ、好ましくは５０〜４００μｍ、深さ１０〜５００μｍ、好ましくは５０〜４００μｍのサイズで刻設される。このマイクロチャネルの長さには特に制限はなく、使用される基材のサイズに依存するが、通常１００〜３００ｍｍの範囲で選ばれる。
【００１２】
次に、本発明においては、このように刻設されたマイクロチャネル表面に化学修飾により導入されたニッケル錯体を介して酵素分子を結合させることが必要である。
チャネル表面にニッケル錯体を導入するには、まずアミノアルキルトリアルコキシシランとアルキルトリアルコキシシランの混合物を用いて、チャネル表面を化学修飾する。
【００１３】
この際用いるアミノアルキルトリアルコキシシランやアルキルトリアルコキシシランとしては、その中のアルキル基が炭素数１〜４のアルキル基であるもの、例えばアミノエチルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノブチルトリエトキシシランのようなアミノアルキルトリアルコキシシランやメチルトリエトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、プロピルエトキシシランのようなアルキルトリアルコキシシランが好ましい。また、アミノアルキルトリアルコキシシランとアルキルトリアルコキシシランとの混合比としては、質量比で１：９ないし５：５の範囲が好ましい。
【００１４】
この化学修飾は、アミノアルキルトリアルコキシシランとアルキルトリアルコキシシランとの混合物を適当な溶剤に溶解した溶液に、チャネル表面を接触させることにより行われる。この際用いる溶剤としては、メチルアルコール、エチルアルコール、酢酸エチル、アセトン、エチルセロソルブなどがある。そして、アミノアルキルトリアルコキシシランとアルキルトリアルコキシシランとの混合物は、この溶剤中に１〜５体積％の濃度で溶解して用いられる。
この場合、所望ならば、この化学修飾に先立ってチャネル内を、例えば濃硫酸と過酸化水素水との混合物のような強酸化剤を用いて洗浄し、汚染物を除去しておくこともできる。
【００１５】
このようにして化学修飾したのち、さらにジカルボン酸無水物、例えば無水コハク酸で処理し、次いで１‐エチル‐３‐アミノプロピルカルボジイミドとＮ‐ヒドロキシスクシンイミドとの混合物を反応させることにより、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを形成させる。
【００１６】
次いで、この活性エステルに、錯化合物形成剤、例えばＮ‐（５‐アミノ‐１‐カルボキシペンチル）イミノジ酢酸を反応させたのち、可溶性ニッケル塩、例えば硫酸ニッケルの溶液を反応させて、ニッケル錯体を形成させることにより、チャネル表面にニッケル錯体を固定化することができる。
【００１７】
上記の活性エステルは、またω‐ヒドロキシアルキルトリアルコキシシランとアルキルトリアルコキシシランとの混合物を有機溶媒、例えばエチルアルコールに溶かした溶液にマイクロチャネルを浸し、室温で３０〜１２０分間反応させたのち、これを取り出し、洗浄後不活性雰囲気中で乾燥させることにより、化学修飾してマイクロチャネルの表面にω‐ヒドロキシアルキル基を導入し、次いで、無水コハク酸を有機溶媒、例えばＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に前記の処理物を浸して２０〜６０分間反応させたのち、縮合剤例えば１‐エチル‐３‐（３‐アミノプロピル）カルボジイミドとＮ‐ヒドロキシスクシンイミドを有機溶媒例えばＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を反応させることにより、形成させることもできる。
【００１８】
このようにして得られるニッケル錯体を表面に結合したマイクロチャネルに、ヒスチジンタグ、すなわちアミノ末端又はカルボキシル末端に連続したヒスチジン残基をもつ酵素を接触させると、この酵素は、ニッケル錯体を介して簡単にマイクロチャネル表面に固定化される。
【００１９】
このようなヒスチジンタグをもつ酵素としては、例えばカゼインキナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素酵素など、遺伝子組み換えを用いて発現系を構築することにより調製可能な酵素がある。
【００２０】
本発明のマイクロチャネル表面にニッケル錯体を介して固定化された酵素分子は、還元処理するか、あるいはイミダゾールやＥＤＴＡのようなキレート剤で処理することにより、容易に脱離させることができ、固定化及び脱離反応は可逆的であるので、触媒能が低下した場合には、簡単に新らしい酵素分子と交換することができる。したがって、本発明のマイクロリアクターは長期間にわたって連続的な運転が可能である。
このようにして、酵素分子を固定したマイクロチャネルを設けられた基板は、必要に応じ透明板で被覆し、マイクロリアクターとして用いる。
【００２１】
図１は、このようにして得た本発明のマイクロリアクターの平面図、図２はマイクロチャネルの断面図であって、不活性材料からなる基板１にマイクロチャネル２が蛇行して刻設され、このマイクロチャネル２の壁面３には、酵素分子が固定されている。
【００２２】
このような構造のマイクロリアクターを用いて酵素反応を行えば、マイクロチャネルのもつ体積に対する表面積の比率の大きさにより、著しく反応効率を高めることができ、しかもマイクロチャネル表面に酵素分子が可逆的に固定化しているため、反応終了後、反応液から酵素分子を分離、回収することなく、マイクロチャネルに基質分子を継続的に導入し、連続的に反応させることができるという利点がある。そして、酵素能力が低下した場合は、還元剤又はキレート化剤をマイクロチャネル内に流すことにより、酵素を脱離させ、新らしい酵素と簡単に交換しうるという利点もある。
【００２３】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例により何ら限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
Ｓｉ／ＳｉＯ２ウエハー基板（３０×３０×５ｍｍ）上に、マイクロドリルを用いて、幅４００μｍ、深さ４００μｍ、長さ２００ｍｍのチャネルを８回屈曲蛇行させて刻設し、このチャネル上をガラス板で被覆することにより、マイクロチャネル構造をもつマイクロリアクター基板を製造した。
次に、これを濃硫酸と３０％過酸化水素水との混合物（体積比７：３）１リットル中に１２時間浸漬してチャネル内を洗浄し、壁面に付着した有機物を分解、除去したのち、超純水で洗浄した。
【００２５】
次いで、３‐アミノプロピルトリエトキシシランとメチルトリエトキシシランを２：８の割合で混合したものを９５％エチルアルコールに溶解させて調製した３体積％溶液で処理した。１時間後エチルアルコールで洗浄し、窒素ガスを通したのち乾燥器内で１１５℃で１時間乾燥し、表面修飾を行った。
【００２６】
このようにして得たマイクロリアクターのチャネル内に無水コハク酸をＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドに１ミリモル／リットルの濃度で溶かした溶液を注入し、３０分反応させたのち、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドで洗浄した。次に１‐エチル‐３（３‐アミノプロピル）カルボジイミドとＮ‐ヒドロキシスクシンイミドを各々１ミリモル／リットルになるように混合した溶液をチャネル内に流してＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを形成させた。
【００２７】
このマイクロチャネルにＮ‐（５‐アミノ‐１‐カルボキシペンチル）イミノジ酢酸をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を送液して固定化した。これをリン酸緩衝液で洗浄したのち、硫酸ニッケル水溶液を流通させてニッケル錯体を形成させた。
【００２８】
上記マイクロチャネルに、アミノ末端に６個の連続したヒスチジン残基、いわゆるヒスチジンタグをもつ酵素カゼインキナーゼのリン酸緩衝液溶液を流通させ、固定化を行った。得られたカゼインキナーゼを固定化したマイクロリアクターを用いて、基質であるカゼインのリン酸化反応を行った。１００マイクロモル／リットルの濃度に調製した基質のトリス緩衝溶液をシリンジポンプでマイクロチャネル内に注入し、得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフで分析し反応を評価した。反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。シリンジポンプによる送液速度を変化させて、滞留時間を変化させていったところ、図３に示すような反応収率を得た。
【００２９】
このマイクロリアクターをＥＤＴＡ溶液で処理したのち、再度硫酸ニッケル溶液を流通させてニッケル錯体を形成させてカゼインキナーゼを固定化し、基質のリン酸化反応を行った。この操作を再度繰り返して反応を行ったところ、図３に示すように初回と同等の反応効率を得ることができた。
【００３０】
実施例２
３‐アミノプロピルトリエトキシシランの代りにヒドロキシプロピルシランを用いて、実施例１と同様にしてマイクロチャネル内を表面処理し、次いでピリジン中で無水コハク酸を反応させてエステル結合を形成させたのち、Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミドを用いて活性エステル化し、Ｎ‐（５‐アミノ‐１‐カルボキシペンチル）イミノジ酢酸を導入した。得られたマイクロリアクターにヒスチジンタグをアミノ末端側に持つアルカリ性ホスファターゼの溶液を注入し、２時間循環流通させ、アルカリ性ホスファターゼの固定を行った。
上記の操作で得られたアルカリ性ホスファターゼを固定化したマイクロリアクターを用いて、基質であるリン酸化クマリンの加水分解反応を行ったところ、実施例１及び２と同等の結果を得た。
【００３１】
実施例３
３‐アミノプロピルトリエトキシシランの代りに、ヒドロキシプロピルシランを用いて、実施例１と同様の方法でマイクロチャネル内を表面処理し、次いでピリジン中で無水コハク酸と反応させてエステル結合を形成させたのち、Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミドを用いて活性エステル化し、Ｎ‐（５‐アミノ‐１‐カルボキシペンチル）イミノジ酢酸を導入した。得られたマイクロリアクターにヒスチジンタグをアミノ末端側に持つ乳酸脱水素酵素の溶液を注入し、２時間循環流通させ、乳酸脱水素酵素の固定を行った。
上記の操作で得られた乳酸脱水素酵素を固定化したマイクロリアクターを用いて、基質であるピルビン酸の還元反応による乳酸の合成を行ったところ、このマイクロリアクターにより、実施例１及び２と同等の反応収率で、乳酸を製造することができた。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によると、マイクロチャネル壁面に触媒を可逆的に固定化したマイクロリアクターを用いることにより、化学産業で重要な技術である酵素触媒反応を容易に効率化することができる。また酵素の性能低下の問題を克服した次世代型のマイクロリアクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１及び実施例２において使用したマイクロリアクターの平面図。
【図２】同じマイクロリアクターのマイクロチャネルの横断面図。
【図３】実施例１により得られた反応収率の時間変化及び酵素の連続脱離・固定化反応による性能の変化を示す棒グラフ。
【符号の説明】
１  基板
２  マイクロチャネル
３  壁面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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