(57)【要約】【課題】簡便に作成でき、褥瘡様の皮膚壊死状態を再現できる実験モデル動物を提供する。【解決手段】実験用哺乳動物の皮膚を摘み上げて２枚の硬質平板の間に挟み、その両側をクリップで固定し、加重圧力０．０１５〜１５ＭＰａにて３〜２４時間押圧処置することを特徴とする褥瘡モデル動物の作成方法、該方法により作成された褥瘡モデル動物。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実験用哺乳動物の皮膚を摘み上げて２枚の硬質平板の間に挟み、その両側をクリップで固定し、加重圧力０．０１５〜１５ＭＰａにて３〜２４時間押圧処置することを特徴とする褥瘡モデル動物の作成方法。
【請求項２】
押圧処置解除後、１〜７日で、褥瘡様皮膚壊死を発現する請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法により作成された褥瘡モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、褥瘡モデル動物及びその作成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
【０００３】
褥瘡、いわゆる「床ずれ」は、長時間軟部組織に圧迫が加わり、その結果局所に循環障害が起こり壊死や潰瘍をきたした状態をいい、寝たきり患者の仙骨部や坐骨部、大転子部、あるいは踵、踝に好発する難治性の皮膚障害である。そして、褥瘡患者数は、高齢化社会の到来に伴い、益々増加の一途をたどるものと考えられ、社会問題としても捉えられてきている。
【０００４】
このような褥瘡に対する医療側の取り組みは、褥瘡の予防ケアと治療の両面にわたり、褥瘡治療においては、デブリドマン、ドレッシング、洗浄・殺菌とともに皮膚移植も含めて、治療方法が詳細に確立されている。また、創傷治癒における分子レベルの研究成果は、できてしまった褥瘡の治癒にも適用され、有効薬剤や治療手法へと応用されている。
【０００５】
しかし、一方で、褥瘡を未然に防ぐ予防の観点からは、体位変換、寝具の工夫による除圧、栄養管理といった対処がなされているのみであり、２時間に一度必要であるとされている体位変換や医療器具購入など介護側への負担は非常に高いと推察される。また、褥瘡発症に至るまでの要因を生化学的・分子レベルで究明されている成果はほとんどない。
【０００６】
褥瘡発症要因の究明や治癒過程の評価、更には発症を抑制するために有効な薬剤や技術を得るためには、動物を用いた褥瘡発症モデルの作成が不可欠であり、これまでに、いくつかの動物モデルが提唱されている。例えば、ラット大腿部をバネやコンピュータ制御により加重を加える方法（例えば非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）、ラット背部皮膚に金属板を挿入し皮膚を介して磁石を乗せることにより加重する方法（例えば非特許文献４参照）、ブタ背部圧迫法（例えば非特許文献５参照）及びウサギ耳介部圧迫法（例えば非特許文献６参照）等が報告されている。
【０００７】
しかし、これらの方法は、装置・手技に手間と熟練が必要であるという問題があり、更にウサギ耳介部圧迫法においてはウサギ耳介部の皮膚構造とヒト皮膚構造との差異が懸念される。
【０００８】
本発明は、簡便に作成でき、褥瘡様の皮膚壊死状態を再現できる実験モデル動物を提供することを目的とする。
【０００９】
【非特許文献１】
上滝博夫ら、臨床医薬（１９９０）６，３，６２７−６３８
【非特許文献２】
府川和永ら、応用薬理（ｌ９８２）２３，６，９９９−ｌ０１１
【非特許文献３】
Ｒ  Ｓａｌｃｉｄｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ（１９９５）３２，２，１４９−１６１
【非特許文献４】
ＳＭ  Ｐｅｉｒｃｅ，  ｅｔ  ａ１，  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ（２０００）８，１，６８−７６
【非特許文献５】
Ｂ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ａｒｃｈ  Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｈａｂｉｌ（１９９８）７９，３，２６５−２７２
【非特許文献６】
矢野英雄ら、整形外科（１９９０）４ｌ，９７６−９８５
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、実験動物の皮膚加重負荷の方法及び条件について種々検討したところ、動物の皮膚を摘み上げて２枚の硬質平板の間に挟み、その両側をクリップで固定して、所定の圧力で一定時間押圧処置することにより、容易に褥瘡様壊死状態を再現できることを見出した。
【００１１】
すなわち本発明は、実験用哺乳動物の皮膚を摘み上げて２枚の硬質平板の間に挟み、その両側をクリップで固定し、加重圧力０．０１５〜１５ＭＰａにて３〜３〜２４時間押圧処置することを特徴とする褥瘡モデル動物の作成方法及び該方法により作成された褥瘡モデル動物を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の褥瘡モデル動物は、実験用哺乳動物の皮膚を摘み上げて２枚の硬質平板の間に挟み、その両側をクリップで固定し、加重圧力０．０１５〜１５ＭＰａにて３〜２４時間押圧処置することにより作成することができ、斯かる押圧処置解除後、１〜７日で、褥瘡様の皮膚壊死が発症する。以下、本発明褥瘡モデル動物の作成法について説明する。
【００１３】
本発明に用いる実験用哺乳動物としては、皮膚を摘み上げて２枚の硬質平板の間に挟むことができ、無麻酔下でも処置部を保持できる動物であれば使用可能であり、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられるが、マウス（ヘアレスマウス）、モルモット、ラット（ヘアレスラット）が好ましく、特に毛周期による皮膚厚変化を考慮する必要のないこと、ヒト褥瘡が特に無毛部皮膚に発生するものであり、皮膚性状が似ていること等の点からヘアレスマウス、ヘアレスラットが好ましい。
【００１４】
また動物は、老若を問わず本発明の褥瘡モデルとすることができ、例えばマウスの場合、１０週齢〜１１週齢の若齢マウスでも、１１ヶ月齢〜１５ヶ月齢またはそれ以上の老齢マウスでもよい。尚、押圧処置による皮膚組織の壊死、痂皮化の起こりやすさには明らかな老若の差異があり、老齢群は短時間処置で褥瘡様皮膚壊死が発生する（実施例３）。
【００１５】
押圧処置部位は、十分に皮膚が摘み上げられ、２枚の硬質平板にて挟むことができる部位、例えば背部、腹側部、耳介部が挙げられるが、好ましくは背部がよい。
押圧処置は、例えば動物の背部を正中線が対称軸となるように左右から摘み上げ、硬質平板２枚で挟み、その両側をクリップで保持すればよい（図１）。
尚、当該押圧処置に際して、処置時間や処置の強さに応じて、適切な麻酔剤を選択し麻酔を施しても良く、短時間で軽微な加重圧力とする場合は無麻酔で行ってもよい。
【００１６】
押圧処置において皮膚にかかる加重圧力は、０．０１５〜１５ＭＰａが適当であり、安定した褥瘡様皮膚壊死状態を再現できる点で０．０５〜２ＭＰａの範囲が最適である。１５ＭＰａ以上では瞬時に皮膚を損傷させることとなり供試動物に過度の苦痛をもたらす恐れがある。
【００１７】
押圧処置時間は、動物の種類や老若によっても異なるが、３〜２４時間が適当であり、特に、１０週齢〜１１週齢の若齢マウスでは４〜６時間、１１ヶ月齢〜１５ヶ月齢の老齢マウスでは３〜６時間が好ましい。３時間未満では褥瘡様組織壊死を発生する頻度が極端に低下し、２４時間以上では長時間にわたり供試動物に過度の苦痛をもたらす恐れがある。
【００１８】
硬質平板としては、クリップによる押圧に耐えることができ、且つ、動物の皮膚に損傷を与えない材質のものであればよく、例えばプラスチック板、アルミニウム板、銅板、鉄板等が好ましい。
また、硬質平板は、０．５〜２ｃｍ×０．５〜２ｃｍで、厚さ１〜５ｍｍの大きさのものを用いるのが好ましい。
【００１９】
クリップは、上記２枚の硬質平板に挟まれた皮膚を固定でき、且つ、０．０１５〜１５ＭＰａの圧力を持続的に負荷できるものであればその構造や材質は限定されるものではなく、具体的には事務用のクリップ、洗たくばさみ等が使用でき、好ましくは、クリ−３５（コクヨ社製）が挙げられる。
【００２０】
斯くして、押圧処置した動物は、押圧処置解除後、１〜７日で、皮膚壊死及び痂皮化を発症する（図２〜４）。そして、当該組織には炎症初期に見られる多形核白血球を大部分とする細胞浸潤が観察されることから（図７）、外観上及び内部組織上ヒト褥瘡の黒色期に酷似したものと判断でき、褥瘡モデルとして使用できる。
【００２１】
そして、当該モデル動物に試験化合物を投与し、皮膚壊死、痂皮化等の褥瘡に伴う諸症状の変化を経時的に観察することにより、褥瘡の予防又は治療薬のスクリーニングを行うことができる。この場合、試験化合物の動物への投与は、例えば、経皮投与、経口投与、静脈注射などが挙げられ、動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量も、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００２２】
【実施例】
実施例１  クリップ押圧によるヘアレスマウス背部の押圧処置
（１）押圧処置の方法
雌性ＩＣＲ／ヘアレスマウスの背部を正中線が対称軸となるように左右から摘み上げ、培養シャーレを切り抜いて作成したプラスチック板（１．５ｃｍ×１．０ｃｍ）２枚で挟み、文具用クリップ（コクヨ、クリー３５）で保持し、一定時間押圧した。押圧処置中のマウスを図１に示す。押圧処置後、クリップとプラスチック板を除去し、通常飼育を続けながら、背部の皮膚変化を観察する。
【００２３】
（２）押圧処置時の加重圧力の測定
圧力測定用フィルムである富士プレスケール（富士フィルム）を用いて、押圧処置時に皮膚部位に加わる力を測定した。富士プレスケールは極超低圧用（測定可能圧力範囲；０．２〜０．６ＭＰａ）を用いた。
ヘアレスマウス背部皮膚を採取、筋層下部の結合組織を除去後、筋層同士が隣り合うように２つ折りにした。押圧加重をかける前の皮膚圧力範囲；０．２〜０．６ＭＰａ、２つ折りにした状態でノギスを用いて測定した。１つの皮膚組織につき１０回の測定値を平均した。
次に、圧力測定用フィルムを押圧処置に用いるプラスチック板より周囲約１ｍｍ程度大きく切り抜き、一方のプラスチック板と皮膚の間にフィルムを挟みこんだ状態で、２つ折り皮膚を両面からプラスチックで押さえ、クリップで保持した。そのまま２分間保持した後フィルムを取りだし、フィルムに転着した赤色色素部位のａ＊値を分光反射スペクトル計ＣＭＳ３５ＦＳ（村上色彩科学）で測定した。富士プレスケールに添付されている標準色見本（０．１〜１．３ＭＰａ）のａ＊値を同様に測定し、圧力標準チャートから加重圧力を算出した。
１枚のフィルムについて３〜１４箇所のａ＊値を測定し、平均の加重圧力を求めた。今回計測を行った１３８点の測定値は、圧力に換算すると最小値：０．２４（ＭＰａ）、最大値；０．４６（ＭＰａ）であり、すべて実験に用いたフィルムの圧力測定可能範囲内であった。
【００２４】
実施例２  押圧処置時間の検討
雌性ＩＣＲ／ヘアレスマウス（１０週齢）の背部を、実施例１の方法で種々の時間（１〜１４時間）押圧処置し、処置後の皮膚の変化を経日的に観察した（図２、３、４）。
４時間以上の押圧処置により５〜７日程度の経過時に皮膚組織は壊死し、ヒト褥瘡の黒色期に酷似した痂皮化形成状態を呈した（図４）。痂皮化に到達する前段階では、紅斑、血斑、浮腫が発生し、またそ程度は押圧時間に依存して悪化する傾向が認められたが（図２、３）、処置５日後には、４時間以上の押圧では、時間に無関係にほぼ同時期に壊死、痂皮化を形成した。
一方、３時間以下の押圧処置においては、観察経過中わずかの紅斑、浮腫が一部の領域で見られた後、５日後、更にそれ以降においても皮膚壊死は起こらなかった（図５、６）。このことから、一定圧力下で押圧負荷を受けた皮膚組織はある負荷時間を超えたとき褥瘡黒色期に酷似した壊死、痂皮化を形成することが明らかとなった。
【００２５】
実施例３  動物個体の老若差異の検討
若齢群（１０週齢）と老齢群（１５ヶ月齢）について、１，２、３時間の押圧処置を別々のマウスに対して実施し、皮膚変化を経日的に観察した（図５、６）。
若齢群においては、３時間押圧で３例中３匹、２時間押圧で３例中１匹に解除５日後の時点で、押圧プラスチック板端に接する部分に一致してわずかな壊死が認められたのみであった。
一方、老齢群においては、２時間押圧で３例中１匹に領域１／５程度の壊死と痂皮化が、３時間押圧で全例（３匹）に領域全体〜１／２程度の壊死と痂皮化が認められた（押圧解除５日後）。
以上のことから、押圧処置による皮膚組織の壊死、痂皮化の起こりやすさには明らかな老若の差異が認められた。
尚、若齢ヘアレスマウス（１１週齢）と老齢ヘアレスマウス（１１ヶ月齢）で、押圧時に皮膚に加わる力に大きな違いはみられなかった（それぞれ、０．３４±０．０５、０．３４±０．０４（ＭＰａ）、有意差なし、図８）。また、評価時の皮膚の厚み（表皮側を外側に向けて２つ折りにした状態）は若齢群で１．２±０．１（ｍｍ）であり、老齢群（１．７±０．２ｍｍ））に比べて有意に薄かった（Ｐ＜０．００１、図９）。
【００２６】
実施例４  痂皮化した皮膚の病理組織像
クリップ押圧によって形成した壊死、痂皮化部位を摘出し、切片を作成、ＨＥ染色像の顕微鏡観察を行った。１２ヶ月齢ヘアレスマウスに２４時間押圧、押圧解除後２日の摘出皮膚組織像を図７に示す（図７（ａ））。押圧解除して２日後の皮膚を採取したため、痂皮化形成の直後である。切片像（図７（ｂ））は表皮〜筋層にいたる全領域で、細胞の死滅（壊死）状態が認められた（ＨＥ染色像中左上）。また、広い領域に多形核白血球を大部分とする細胞浸潤が観察され、炎症初期の皮膚組織であると考えられた。このような皮膚組織像観察から、本発明押圧処置により壊死、痂皮化したヘアレスマウスの皮膚組織は、外観上および内部組織上ヒト褥瘡の黒色期に酷似したものと判断できる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、褥瘡様の皮膚壊死を発症する褥瘡モデル動物を麻酔処置等することなく簡易に作成でき、これを用いることにより褥瘡発症要因の究明や褥瘡の予防又は治療剤を評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、押圧処置状態のマウスを示す写真である。
【図２】図２は、押圧処置解除１日後の皮膚外観を示す写真である。
【図３】図３は、押圧処置解除２日後の皮膚外観を示す写真である。
【図４】図４は、押圧処置解除７日後の皮膚外観を示す写真である。
【図５】図５は、老若による組織壊死の違いを示す写真である（押圧処置解除２日後）。
【図６】図６は、老若による組織壊死の違いを示す写真である（押圧処置解除５日後）。
【図７】図７は、押圧処置（２４時間）解除２日後の皮膚外観と組織像を示す写真である。
（ａ）：皮膚外観（１２ヶ月ヘアレスマウス）、（ｂ）：組織像（ＨＥ染色像）
【図８】図８は、押圧処置時の皮膚にかかる圧力を示すグラフである。
【図９】図９は、押圧処置前の皮膚厚を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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