(57)【要約】　　　（修正有）【課題】複合汚れに対しても優れた洗浄性を有すると共に、分泌能の高いアルカリプロテアーゼを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列の（ａ）６５位、（ｂ）１０１位、（ｃ）２７３位、（ｄ）３２０位、（ｅ）３５９位、（ｆ）３８７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；（ａ）位置：プロリン、（ｂ）位置：アスパラギン、（ｃ）位置：イソロイシン、グリシン、スレオニン、（ｄ）位置：フェニルアラニン、バリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、（ｅ）位置：セリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、グルタミン、（ｆ）位置：アラニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の（ａ）６５位、（ｂ）１０１位、（ｃ）２７３位、（ｄ）３２０位、（ｅ）３５９位、（ｆ）３８７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：プロリン、
（ｂ）位置：アスパラギン、
（ｃ）位置：イソロイシン、グリシン、スレオニン、
（ｄ）位置：フェニルアラニン、バリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、
（ｅ）位置：セリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、グルタミン、
（ｆ）位置：アラニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、
から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号１の（ａ）６５位、（ｂ）１０１位、（ｃ）２７３位、（ｄ）３２０位、（ｅ）３５９位、（ｆ）３８７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：プロリン、
（ｂ）位置：アスパラギン、
（ｃ）位置：イソロイシン、グリシン、スレオニン、
（ｄ）位置：フェニルアラニン、バリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、
（ｅ）位置：セリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、グルタミン、
（ｆ）位置：アラニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、
から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
産業分野でのプロテアーゼ利用の歴史は古く、衣料用洗剤をはじめとする洗浄剤から繊維の改質剤、皮革処理剤、化粧料、浴剤、食品改質剤或いは医薬品としての利用まで非常に多岐にわたっている。中でも最も工業的に大量に生産されているものが洗剤用プロテアーゼであり、例えば、アルカラーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、サビナーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、マクサカル（登録商標；ジェネンコア社）、ブラップ（登録商標；ヘンケル社）、及びプロテアーゼＫ（花王）等が知られている。
【０００３】
洗剤中にプロテアーゼを配合する目的は、衣料に付着した蛋白質を主成分とする汚れを分解して低分子化し、界面活性剤による可溶化を促進することであるが、実際の汚れは蛋白質だけでなく皮脂由来の脂質や固体粒子等、有機物と無機物が入り混じった複数の成分を内包する複合汚れであり、このような複合汚れに対する洗浄性の高い洗浄剤が望まれていた。
【０００４】
かかる観点から本発明者らは、高濃度の脂肪酸存在下でも十分なカゼイン分解活性を保持し、蛋白質だけでなく皮脂等の混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを数種見出し、先に特許出願した（特許文献１参照）。斯かるアルカリプロテアーゼ群は、その分子量、一次構造、酵素学的性質、特に非常に強い酸化剤耐性を有する点で、従来から知られているバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンとは異なり、新しいズブチリシンサブファミリーに分類することが提唱されている（非特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、このようなプロテアーゼであっても、工業的レベルでの生産を考えた場合、その生産量は十分な量とは言えず、培地中に効率良く分泌されるアルカリプロテアーゼが求められていた。
【０００６】
一方、目的のタンパク質（酵素）を多量に分泌させる試みとしては、宿主菌（生産菌）の変異育種による改良、酵素をコードする遺伝子あるいはその制御を行う遺伝子を改変して分泌量を高める方法が知られているが、ズブチリシンについては酵素の分泌量を高めるような改変の例は見当たらない。
【０００７】
従って、本発明は複合汚れに対しても優れた洗浄性を有すると共に、分泌能の高いアルカリプロテアーゼを提供することを目的とする。
【０００８】
【特許文献１】
国際公開第９９／１８２１８号パンフレット
【非特許文献１】
Ｓａｅｋｉら，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７９，（２０００），３１３−３１９
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記アルカリプロテアーゼの特性を保持しつつ、効率良く培地中に分泌できる新たな酵素の探索を行ったところ、ある種のアルカリプロテアーゼにおいて、当該アミノ酸配列中の特定位置に特定のアミノ酸残基が必要であることを見出した。
【００１０】
すなわち、配列番号１の（ａ）６５位、（ｂ）１０１位、（ｃ）２７３位、（ｄ）３２０位、（ｅ）３５９位、（ｆ）３８７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：プロリン、
（ｂ）位置：アスパラギン、
（ｃ）位置：イソロイシン、グリシン、スレオニン、
（ｄ）位置：フェニルアラニン、バリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、
（ｅ）位置：セリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、グルタミン、
（ｆ）位置：アラニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、
から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。
【００１２】
また本発明は、該アルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のアルカリプロテアーゼは、上記のように、配列番号１の（ａ）６５位、（ｂ）１０１位、（ｃ）２７３位、（ｄ）３２０位、（ｅ）３５９位、（ｆ）３８７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：プロリン、（ｂ）位置：アスパラギン、（ｃ）位置：イソロイシン、グリシン、スレオニン、（ｄ）位置：フェニルアラニン、バリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、（ｅ）位置：セリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、グルタミン、（ｆ）位置：アラニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、から選ばれたものである。
【００１４】
すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおける前記（ａ）〜（ｆ）から選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の当該位置に相当する位置のアミノ酸残基が特定のアミノ酸残基であるプロテアーゼを意味し、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１５】
ここで、「他種アルカリプロテアーゼ」としては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸化剤耐性を有し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法による分子量が４３，０００±２，０００であることが好ましく、配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するものが挙げられる。特に好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有し、ｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用する、酸化剤耐性を有する、５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を示す、ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である酵素が挙げられる。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ１０）中で、３０℃、２０分間の放置後の残存活性が少なくとも５０％以上を保持していることをいう。
【００１６】
ここで、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、ＫＰ４３〔バチルス　エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕が挙げられ、「配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０［バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０４６４０３］、プロテアーゼＥ−１［バチルスＮｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭＰ−１５９２）由来、特開昭４９−７１１９１、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０４６４０２］、プロテアーゼＹａ［バチルスエスピーＹ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２９）由来、特開昭６１−２８０２６８、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０４６４０４］、プロテアーゼＳＤ５２１［バチルスＳＤ５２１（ＦＥＲＭＰ−１１１６２）由来、特開平３−１９１７８１、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０４６４０５］、プロテアーゼＡ−１［ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８／０１２９３、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０４６４０６］、プロテアーゼＡ−２［ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ９８／５６９２７］や、配列番号１のアミノ酸配列の４６位をロイシンに置換した変異体、５７位をアラニンに置換した変異体、１０３位をアルギニンに置換した変異体、１０７位をリジンに置換した変異体、１２４位をそれぞれリジン及びアラニンに置換した変異体、１３６位をアラニンに置換した変異体、１９３位をアラニンに置換した変異体、１９５位をそれぞれアスパラギン、グルタミン酸、アルギニン、プロリン、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、システイン、アラニン、アスパラギン酸、トリプトファン、グリシン及びフェニルアラニンに置換した変異体、２４７位をそれぞれスレオニン及びアルギニンに置換した変異体、２５７位をバリンに置換した変異体、３４２位をアラニンに置換した変異体、６６位をアスパラギン酸に置換し且つ２６４位をセリンに置換した二重変異体（特願平１２−３５５１６６号）、配列番号１のアミノ酸配列の８４位をアルギニンに置換した変異体、１０４位をプロリンに置換した変異体、２５６位をそれぞれアラニン及びセリンに置換した変異体、３６９位をアスパラギンに置換した変異体（特願平１３−１１４０４８号）、配列番号１のアミノ酸配列の２５１位をそれぞれアスパラギン、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン及びグルタミンに置換した変異体、２５６位をそれぞれセリン、グルタミン、アスパラギン、バリン及びアラニンに置換した変異体（特願平１３−３２９４７２号）又はこれらとアミノ酸配列において８０％以上、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが挙げられる。
なお、アミノ酸配列の相同性は、リップマン−パーソン（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ）法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２７，１４３５，１９８５）によって計算される。
【００１７】
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００１８】
すなわち、上記方法でアミノ酸配列を整列させた図１より、（ａ）配列番号１の６５位のアミノ酸残基はスレオニン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０においては６５位のスレオニン残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基はプロリン残基であるのが好ましい。
【００１９】
（ｂ）配列番号１の１０１位のアミノ酸残基はグリシン残基であるが、ここで、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＥ−１においては１００位のセリン残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基はアスパラギン残基であるのが好ましい。
【００２０】
（ｃ）配列番号１の２７３位のアミノ酸残基はバリン残基であるが、ここで、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＡ−２においては２７２位のバリン残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基は、イソロイシン、グリシン、スレオニン残基であるのが好ましく、イソロイシン残基であるのが特に好ましい。
【００２１】
（ｄ）配列番号１の３２０位のアミノ酸残基はチロシン残基であるが、ここで、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＳＤ−５２１においては３１９位のチロシン残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基は、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン残基であるのが好ましく、フェニルアラニン残基であるのが特に好ましい。
【００２２】
（ｅ）配列番号１の３５９位のアミノ酸残基はスレオニン残基であるが、ここで、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＹａにおいては３５８位のスレオニン残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基は、セリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、グルタミン残基であるのが好ましく、セリン残基であるのが特に好ましい。
【００２３】
（ｆ）配列番号１の３８７位のアミノ酸残基はセリン残基であるが、ここで、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＳＤ−５２１においては３８６位のチロシン残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基は、アラニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン残基であるのが好ましく、アラニン残基であるのが特に好ましい。
【００２４】
プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配列番号１）の（ａ）６５位、（ｂ）１０１位、（ｃ）２７３位、（ｄ）３２０位、（ｅ）３５９位、（ｆ）３８７位に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記「他種アルカリプロテアーゼ」のうちの好適に用いられるもので示す（表１）。
【００２５】
【表１】
2004000122.tif 000002
【００２６】
また、本発明アルカリプロテアーゼにおけるアミノ酸残基の（ａ）〜（ｆ）の選択は、酵素活性及び酵素特性が変化しない限り２個所以上が同時になされていていもよい。２箇所以上が同時になされた場合の好ましい具体例を以下に示す。尚、アミノ酸は３文字表記とし、「＋」は１箇所の置換に対し付加された置換を表し、「／」については表記したいずれのアミノ酸を使用しても良いことを示している。
【００２７】
二重置換体の例としては、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｇｌｙ１０１Ａｓｎ、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｖａｌ２７３（Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｔｈｒ）、Ｇｌｙ１０１Ａｓｎ＋Ｔｈｒ３５９（Ｓｅｒ／Ｌｅｕ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｎ）、Ｖａｌ２７３（Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｔｈｒ）＋Ｔｙｒ３２０（Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｉｅｕ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ）等が挙げられるが、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｓｅｒ３８７Ａｌａ、Ｔｈｒ３５９Ｓｅｒ＋Ｓｅｒ３８７Ａｌａが特に好ましい。
【００２８】
三重変異体の例としては、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｇｌｙ１０１Ａｓｎ＋Ｖａｌ２７３（Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｔｈｒ）、Ｔｙｒ３２０（Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｉｅｕ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ）＋Ｖａｌ２７３（Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｔｈｒ）＋Ｓｅｒ３８７（Ａｌａ／Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ／Ａｒｇ／Ｈｉｓ）、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｔｙｒ３２０（Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｉｅｕ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ）＋Ｔｈｒ３５９（Ｓｅｒ／Ｌｅｕ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｎ）等が挙げられるが、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｇｌｙ１０１Ａｓｎ＋Ｓｅｒ３８７Ａｌａ、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｖａｌ２７３Ｉｌｅ＋Ｔｙｒ３２０Ｐｈｅ、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｔｙｒ３２０Ｐｈｅ＋Ｓｅｒ３８７Ａｌａ等が好ましく、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｖａｌ２７３Ｉｌｅ＋Ｔｈｒ３５９Ｓｅｒ、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｖａｌ２７３Ｉｌｅ＋Ｓｅｒ３８７Ａｌａ、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｔｙｒ３２０Ｇｌｙ＋Ｓｅｒ３８７Ａｌａ等が特に好ましい。
【００２９】
四重変異体の例としては、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｇｌｙ１０１Ａｓｎ＋Ｖａｌ２７３（Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｔｈｒ）＋Ｔｙｒ３２０（Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｉｅｕ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ）、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｔｙｒ３２０（Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｉｅｕ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ）＋Ｔｈｒ３５９（Ｓｅｒ／Ｌｅｕ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｎ）＋Ｓｅｒ３８７（Ａｌａ／Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ／Ａｒｇ／Ｈｉｓ）、Ｇｌｙ１０１Ａｓｎ＋Ｖａｌ２７３（Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｔｈｒ）＋Ｔｙｒ３２０（Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｉｅｕ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ）＋Ｓｅｒ３８７（Ａｌａ／Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ／Ａｒｇ／Ｈｉｓ）等が挙げられるが、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｖａｌ２７３Ｉｌｅ＋Ｔｈｒ３５９（Ｓｅｒ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ）＋Ｓｅｒ３８７（Ｇｌｕ／Ａｌａ）、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｖａｌ２７３Ｉｌｅ＋Ｔｙｒ３２０（Ｖａｌ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ）＋Ｓｅｒ３８７（Ａｌａ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ）等が好ましく、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｖａｌ２７３Ｉｌｅ＋Ｔｈｒ３５９Ｓｅｒ＋Ｓｅｒ３８７（Ａｌａ／Ｌｙｓ）、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｖａｌ２７３Ｉｌｅ＋Ｔｈｒ３５９Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ３８７Ａｌａ、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｖａｌ２７３Ｉｌｅ＋Ｔｙｒ３２０Ｐｈｅ＋Ｓｅｒ３８７（Ｇｌｎ／Ｌｙｓ）、Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ＋Ｖａｌ２７３Ｉｌｅ＋Ｔｙｒ３２０Ｉｌｅ＋Ｓｅｒ３８７Ｇｌｎ等が好ましい。
さらに五重、六重変異体の各組合せでも良い。
【００３０】
本発明のアルカリプロテアーゼが変異体である場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ（親アルカリプロテアーゼということがある）としては、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ」又は上述した「他種アルカリプロテアーゼ」として示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例えばプロテアーゼＫＰ４３の配列番号１で示されるアミノ酸配列の前記（ａ）〜（ｆ）より選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列において当該位置に相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得られる。
【００３１】
本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。すなわち、クローニングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子に対して変異を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行えばよい。
【００３２】
親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍキット（Ｔａｋａｒａ）等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（ＰＣＲ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９９０）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００３３】
得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法としては、例えば当該変異遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させ宿主菌を形質転換する、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる宿主菌の染色体ＤＮＡ上に導入させる、等の方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌等が挙げられ、これらの菌株を用い、資化性の炭素源、窒素源その他必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すればよい。
【００３４】
かくして得られた培養液中からのアルカリプロテアーゼの採取、及び精製は、一般の酵素の採取、及び精製方法に準じて行うことができる。例えば、培養液を遠心分離、又は濾過することで菌体を除き、培養上清液から常法の精製手段により目的酵素を得る。このようにして得られる酵素液は、そのまま用いることもできるが、更に公知の方法により精製、結晶化、粉末化、または顆粒化することもできる。
【００３５】
得られたプロテアーゼは、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有すると共に、形質転換体での分泌能が高い。
ここで、「分泌能が高い」とは、例えば親アルカリプロテアーゼと同一の条件下において（例えばポリペプトンＳ８％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．３％、マルトース１０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０４％、リン酸２水素カリウム０．２％、無水炭酸ナトリウム１．５％、テトラサイクリン３０ｐｐｍから成る培地に植菌（ｖ／ｖ）し、３０℃、３日間振とう培養する）、生産したアルカリプロテアーゼ変異体について培養上清中のプロテアーゼ活性量、タンパク質量を測定した場合、一定量以上の活性量又はタンパク質量を示すことをいい、例えば親アルカリプロテアーゼの５％以上、望ましくは１０％以上、さらに望ましくは２０％以上の活性量又はタンパク質量の増大が認められることを意味する。特に、比活性等の変化が認められなければ活性量とタンパク量の比は、親アルカリプロテアーゼと変異アルカリプロテアーゼでは一定の値をとると考えられることから、活性量又はタンパク質量のどちらか一方を測定しても構わない。
【００３６】
従って、本発明のアルカリプロテアーゼは、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。
洗浄剤組成物中への本発明アルカリプロテアーゼの配合量は、当該プロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜５０００ＰＵが配合できるが、経済性等を考慮し、５００ＰＵ以下が好ましい。
【００３７】
本発明の洗浄剤組成物には、本発明のアルカリプロテアーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明以外のプロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。プロテアーゼとしては市販のアルカラーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、エスペラーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、サビナーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、エバラーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、カンナーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、プロペラーゼ（登録商標；ジェネンコア社）、プラフェクト（登録商標；ジェネンコア社）、ＫＡＰ（花王）等が挙げられる。セルラーゼとしてはセルザイム（登録商標；ノボザイムズ社）、ケアザイム（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０−３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特願２００２−１１６５５３号記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）等が挙げられる。アミラーゼとしてはターマミル（登録商標；ノボザイムズ社）、デュラミル（登録商標；ノボザイムズ社）、プラスター（登録商標；ジェネンコア社）、ＫＡＭ（花王）等が挙げられる。リパーゼとしてはリポラーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、リポラーゼウルトラ（登録商標；ノボザイムズ社）等が挙げられる。
【００３８】
洗浄剤組成物中で本発明のアルカリプロテアーゼ以外のプロテアーゼを併用する場合の配合量は、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜５００ＰＵが好ましい。また、セルラーゼを併用する場合は、特開平１０−３１３８５９号公報の段落〔００２０〕に記載の酵素活性測定方法より決定される単位（Ｕ）に基づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり３００〜３００００００ＫＵが好ましく、アミラーゼを併用する場合は、特開平１１−４３６９０号公報の段落〔００４０〕記載のアミラーゼ活性測定方法より決定される単位（ＩＵ）に基づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり５０〜５０００００ＩＵが好ましい。さらにリパーゼを併用する場合は、特表平８−５０００１３号公報の実施例１記載のリパーゼ活性測定方法より決定される単位（ＬＵ）づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり１００００〜１００００００ＬＵが好ましい。
【００３９】
本発明の洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
（１）界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５〜６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０〜４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０〜５０質量％配合することが好ましい。また本発明洗浄剤組成物が漂白剤、または自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。
本発明洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種または組み合わせを挙げることができるが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４の、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００４０】
（２）二価金属イオン補捉剤
二価金属イオン補捉剤は０．０１〜５０質量％、好ましくは５〜４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン補捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩等の縮合リン酸塩、ゼオライト等のアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩等が挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００４１】
（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１〜８０質量％、好ましくは１〜４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号等の非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられ、またトリポリリン酸塩等のリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる
【００４２】
（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸等のホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩等のポリマー、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸等のアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００４３】
（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩等の漂白剤は１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載等の漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００４４】
（６）蛍光剤
本発明洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘ等）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料等）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００４５】
（７）その他の成分
本発明品洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩等）、抑泡剤（シリコーン等）、香料、その他の添加剤を含有させることができる。
【００４６】
本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明アルカリプロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形等にすることができる。
かくして得られる本洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤等として使用することができる。
【００４７】
【実施例】
［プロテアーゼ活性測定法−カゼイン法］
カゼイン１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）１．０ｍＬを３０℃で５分間保温した後、０．１ｍＬの酵素溶液を加え、１５分間反応を行う。反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）を２．０ｍＬ加え、室温で３０分間放置した後、濾過を行い、濾液中の酸可溶性タンパク質をＬｏｗｒｙらの方法の変法により定量した。すなわち、０．５ｍＬの濾液にアルカリ性銅溶液（１％酒石酸ナトリウム・カリウム：１％硫酸銅・５水和物：２％炭酸ナトリウム・０．１Ｎ水酸化ナトリウム＝１：１：１００）を２．５ｍＬ加え、室温で１０分間放置後、フェノール溶液［フェノール試薬（関東化学）を蒸留水にて２倍希釈したもの］を０．２５ｍＬ添加し、３０℃で３０分間保温した。その後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。プロテアーゼ１単位（１ＰＵ）は、上記反応条件で１分間に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。
【００４８】
実施例１
バチルス　エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約２．０ｋｂの範囲に対しランダム変異を与えた。ランダム変異導入法としてはＰＣＲ中の塩基の取り込みエラーを利用するために、ＤＮＡポリメラーゼとしてエラー修復能が無いＴａｑポリメラーゼ：Ｔａｋａｒａ　Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。まず、上記約２．０ｋｂのＤＮＡを増幅できるプライマー１（５’−ＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＧ−３’、配列番号２）及びプライマー２（５’−ＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＣＧＡＴＴＡＣＣＡＴＡＴＴＡＡＴＴＣＣＴＣＴＡＣＣＣ−３’、配列番号３）を用いＰＣＲを行った。プライマー１はセンス鎖の５’末端側にＢａｍＨＩリンカーを、プライマー２はアンチセンス鎖の５’末端側にＸｂａＩリンカーを付与した。反応系として、鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマーを１０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰを２０ｎｍｏｌ、Ｔａｋａｒａ　Ｔａｑ添付反応バッファー１０μＬ、及びＴａｑポリメラーゼ２．５Ｕを含有する１００μＬの系とした。ＰＣＲ条件は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。ＰＣＲ産物をＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ロッシュ）にて精製し、１００μＬの滅菌水で溶出した。次に溶出液１μＬを鋳型ＤＮＡとして、２回目のＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を精製し、以後の実験に供した。
【００４９】
増幅した約２．０ｋｂのＤＮＡ断片の末端制限酵素リンカーを、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ（ロッシュ）により切断した。増幅ＤＮＡを組み込むべき発現ベクターとしてはバチルス属細菌内で複製可能であるｐＨＡ６４（特願平８−３２３０５０：プロモーター６４の下流にＢａｍＨＩ、ＸｂａＩサイトを有する）を用いた。ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ処理した増幅ＤＮＡ断片及び同じくＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ処理したｐＨＡ６４を混合した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡）により、リガーゼ反応を行った。エタノール沈殿により、リガーゼ反応液からＤＮＡを回収し，以後の形質転換用のＤＮＡとした。
【００５０】
形質転換すべき宿主としてバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（以後ＫＰ−４３株と略す）を用いた。形質転換法はエレクトロポレーション法により行い、ＳＳＨ−１０（島津製作所）及びジーンパルサーキュベット（バイオラッド）を用い形質転換を行った。
【００５１】
ＫＰ４３株の形質転換体をスキムミルク含有アルカリ寒天培地［スキムミルク（ディフコ）１％（ｗ／ｖ）、バクトトリプトン（ディフコ）１％、酵母エキス（ディフコ）０．５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％、無水炭酸ナトリウム０．０５％、テトラサイクリン１５ｐｐｍ］に生育させ、ハローの形成状況により、プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。
プロテアーゼ遺伝子がｐＨＡ６４に挿入されたプラスミドを保持している形質転換されたＫＰ４３株を選抜し、以後の培養に供した。
【００５２】
各形質転換体について単集落分離、ハロー形成の確認を行い、試験管中の５ｍＬ種母培地［ポリペプトンＳ（日本製薬）６．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％、マルトース１．０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、リン酸２水素カリウム０．１％、無水炭酸ナトリウム０．３％、テトラサイクリン３０ｐｐｍ］に植菌し、３０℃、３２０ｒｐｍで一晩前培養した。この種母培養液を５００ｍＬ容坂口フラスコ中の２０ｍＬ主培地［ポリペプトンＳ８％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．３％、マルトース１０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０４％、リン酸２水素カリウム０．２％、無水炭酸ナトリウム１．５％、テトラサイクリン３０ｐｐｍ］に１％植菌（ｖ／ｖ）し、３０℃、１２１ｒｐｍで３日間培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性はカゼイン法により、タンパク質量はプロテインアッセイキット（和光純薬）を用いて測定した。野生型酵素遺伝子を有する形質転換体を同条件で培養した場合の培養上清の値と比較することにより、プロテアーゼ活性の向上が認められた変異プロテアーゼ遺伝子を選抜した。尚、培養上清中のタンパク質量はプロテアーゼ活性とほぼ比例して増加していることから、得られた変異体はタンパク質の分泌量が向上するのに必要な変異が導入されたことが、示唆された。
【００５３】
選抜された形質転換体からＨｉｇｈ　ｐｕｒｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ロッシュ）を用いプラスミドを回収し、塩基配列を決定した。プラスミドＤＮＡ３００ｎｇを鋳型として、プライマーとＢｉｇ　Ｄｙｅ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（アプライドバイオシステム）を用いて２０μＬの反応系でＰＣＲを行い、ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　３７７型（アプライドバイオシステム）を用いた解析に供した。
【００５４】
その結果、プロテアーゼ活性が向上した変異体は６５位のスレオニンがプロリン、１０１位のグリシンがアスパラギン、２７３位のバリンがイソロイシン、３２０位のチロシンがフェニルアラニン、３５９位のスレオニンがセリン、３８７位のセリンがアラニンにそれぞれ置換されており、これにより約５％のプロテアーゼ活性の向上が認められた（表２）。
【００５５】
更に上記変異部位を組合わせることにより、プロテアーゼ活性の向上を検討した。部位特異的変異の手段としては、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍキットを用い、以下のプライマーにより、変異部位の組み合わせを検討した。プライマー３：６５位のスレオニン（Ｔ）をプロリン（Ｐ）に置換する（５’−ＡＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＡＴＧ−３’、配列番号４）
プライマー４：１０１位のグリシン（Ｇ）をアスパラギン（Ｎ）に置換する（５’−ＴＣＴＡＴＣＡＴＧＧＡＴＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＧ−３’、配列番号５）プライマー５：２７３位のバリン（Ｖ）をイソロイシン（Ｉ）に置換する（５’−ＣＴＴＣＧＴＧＡＧＣＡＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣ−３’、配列番号６）プライマー６：３２０位のチロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換する（５’−ＡＡＣＧＴＴＧＣＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＣＣ−３’、配列番号７）
プライマー７：３５９位のスレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）に置換する（５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＧＴＡＡＣＧ−３’、配列番号８）
プライマー８：３８７位のセリン（Ｓ）をアラニン（Ａ）に置換する（５’−ＴＧＡＣＴＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＴＡＡＣ−３’、配列番号９）
【００５６】
変異導入用鋳型プラスミドの作製は、カナマイシン選択用アンバー変異マーカーを有するｐＫＦ１８ｋのマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ、ＸｂａＩサイトに、前記スクリーニングで得られた変異プロテアーゼ遺伝子を導入することにより構築した。
【００５７】
部位特異的変異導入用ＰＣＲにはＴａｋａｒａ　ＬＡ　Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。５’末端をリン酸化したセレクションプライマー（Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ　キット添付）及びプライマー３〜８の各変異導入プライマーを各々５ｐｍｏｌ及び鋳型プラスミド１０ｎｇを用い変異導入ＰＣＲを行った。反応条件は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物を用い大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換することにより、変異プラスミドを得た。得られた変異プラスミドは先述の塩基配列決定法に従い変異部位を確認した。
【００５８】
部位特異的変異により変異導入されたプロテアーゼ遺伝子をｐＨＡ６４に導入し、ＫＰ−４３株を形質転換し、先述の条件で培養することで、野生型酵素に比べプロテアーゼ活性が更に増大する変異部位の組み合せを検討した。
【００５９】
その結果、Ｔ６５Ｐ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ３５９Ｓ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｙ３２０Ｆ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｔ３５９Ｓ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｙ３２０Ｆ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｇ１０１Ｎ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｔ３５９Ｓ＋Ｓ３８７Ａの組み合わせにおいて１０〜３０％のプロテアーゼ活性の向上が認められた（変異部位の組み合わせは＋で示した。表１）。
【００６０】
更に以下のプライマーを使用し、６５位、１０１位、２７３位、３２０位、３５９位、３８７位のアミノ酸を任意のアミノ酸に置換し、それぞれの位置のアミノ酸が上記置換アミノ酸とは別のアミノ酸に置換が可能か否かを検討し、更にその組み合わせを検討した。
プライマー９：６５位のスレオニン（Ｔ）を任意のアミノ酸（Ｘ）に置換する（５’−ＣＧＡＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＮＮＮＡＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＡＣＧＣ−３’、配列番号１０）
プライマー１０：１０１位のグリシン（Ｇ）を任意のアミノ酸（Ｘ）に置換する（５’−ＣＴＡＴＣＡＴＧＧＡＴＡＧＣＮＮＮＧＧＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＧ−３’、配列番号１１）
プライマー１１：２７３位のバリン（Ｖ）を任意のアミノ酸（Ｘ）に置換する（５’−ＣＧＴＧＡＧＣＡＴＴＴＴＮＮＮＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣＡＣＡＣＣ−３’、配列番号１２）
プライマー１２：３２０位のチロシン（Ｙ）を任意のアミノ酸（Ｘ）に置換する（５’−ＣＣＣＴＧＡＡＣＧＴＴＧＣＣＮＮＮＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＣＣ−３’、配列番号１３）
プライマー１３：３５９位のスレオニン（Ｔ）を任意のアミノ酸（Ｘ）に置換する（５’−ＣＣＣＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣＡＮＮＮＧＣＴＴＣＣＧＴＡＡＣＧＣ−３’、配列番号１４）
プライマー１４：３８７位のセリン（Ｓ）を任意のアミノ酸（Ｘ）に置換する（５’−ＧＧＡＡＡＴＧＡＣＴＴＴＡＣＴＮＮＮＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＴＡＡＣＴＧＧ−３’、配列番号１５）
【００６１】
その結果、２７３位のバリンはイソロイシン以外にグリシン、スレオニンへの置換、３２０位のチロシンはフェニルアラニン以外にバリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、グリシンへの置換、３５９位のスレオニンはセリン以外にロイシン、バリン、イソロイシン、グルタミンへの置換、３８７位のセリンはアラニン以外にリジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジンへの置換により、野生型と比べ酵素の分泌が向上していることが認められ、それぞれの位置で上記アミノ酸置換が可能であることが確認された。
【００６２】
その組み合わせの一部の結果を示すと、Ｔ６５Ｐ＋Ｙ３２０Ｆ＋Ｓ３８７Ｅ、Ｔ６５Ｐ＋Ｙ３２０Ｇ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｔ３５９Ｓ＋Ｓ３８７Ｅ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｔ３５９Ｌ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｔ３５９Ｉ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｇ＋Ｔ３５９Ｓ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｔ３５９Ｓ＋Ｓ３８７Ｋ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｔ３５９Ｖ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｔ３５９Ｑ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｙ３２０Ｔ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｙ３２０Ｆ＋Ｓ３８７Ｅ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｙ３２０Ｆ＋Ｓ３８７Ｋ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｔ＋Ｙ３２０Ｆ＋Ｓ３８７Ａ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｙ３２０Ｌ＋Ｓ３８７Ｈ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｙ３２０Ｖ＋Ｓ３８７Ｑ、Ｔ６５Ｐ＋Ｖ２７３Ｉ＋Ｙ３２０Ｉ＋Ｓ３８７Ｑの組み合わせにおいて１０〜３０％のプロテアーゼ活性の向上が認められた（表２）。
【００６３】
【表２】
2004000122.tif 000003
【００６４】
上記変異部位の組み合わせにより得られる、アルカリプロテアーゼは形質転換体での酵素の分泌を向上させる以外は親アルカリプロテアーゼの特性、すなわち、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有する性質を保持していることを確認した。
実施例２
（１）洗剤の調製
撹拌翼を有した１ｍ３の混合槽に水４６５ｋｇを加え、水温が５５℃に達した後に４０％（ｗ／ｖ）ポリアクリル酸ナトリウム水溶液１３５ｋｇを添加した。１５分間撹拌した後に、炭酸ナトリウム１２０ｋｇ、硫酸ナトリウム６０ｋｇ、亜硫酸ナトリウム９ｋｇ、蛍光染料３ｋｇを添加した。更に１５分間撹拌した後に、ゼオライト３００ｋｇを添加し、３０分間撹拌して均質なスラリーを得た（スラリー中の水分は５０質量％）。このスラリーを噴霧乾燥塔の塔頂付近に設置した圧力噴霧ノズルから噴霧することでベース顆粒を得た（噴霧乾燥塔に供給する高温ガスは塔下部より温度が２２５℃で供給し、塔頂より１０５℃で排出）。次にレディゲミキサー（松阪技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付）に上記ベース顆粒１００質量部を投入し、主軸（１５０ｒｐｍ）の攪拌下、非イオン性界面活性剤２０質量部、直鎖アルキル（炭素数１０〜１３）ベンゼンスルホン酸ナトリウム２２質量部、脂肪酸（炭素数１４〜１８）ナトリウム４質量部、ポリエチレングリコール２質量部、水４質量部の混合液を３分間で投入し、その後５分間攪拌を行った。更にこのミキサーに結晶性ケイ酸ナトリウム２０質量部とゼオライト１０質量部を投入し、表面被覆を行い洗剤ベースを得た。
洗剤ベース９９質量％に本発明プロテアーゼ粒子０．５質量％、及び香料０．５質量％を混合して最終粒状洗剤Ａを得た。
【００６５】
（２）使用した原料
非イオン性界面活性剤：エチレンオキサイド平均付加モル数が８．５のエマルゲン１０８ＫＭ（花王（株）製）
ポリアクリル酸ナトリウム水溶液：平均分子量１００００（特公平２−２４２８３号公報の実施例に記載の方法に従って製造した）
炭酸ナトリウム：デンス灰（セントラル硝子（株）製）
ゼオライト：平均粒径が３．５μｍのゼオライト４Ａ型（東ソー（株）製）
ポリエチレングリコール：Ｋ−ＰＥＧ６０００（平均分子量８５００，花王（株）製）
結晶性ケイ酸ナトリウム：粉末ＳＫＳ−６（ヘキストトクヤマ（株）製）
本発明プロテアーゼ粒子：表２記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した造粒物（６ＰＵ／ｇ）
蛍光染料：チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバガイギー社製）
【００６６】
実施例３
（１）洗剤の調製
まず固形分５０質量％のスラリーを熱風温度２５０℃で噴霧乾燥し、ポリアクリル酸ナトリウム（質量平均分子量１００００）７質量％、炭酸ナトリウム２６質量％、硫酸ナトリウム２０質量％、塩化ナトリウム６質量％、蛍光染料０．５質量％、ゼオライト４０質量％、水０．５質量％のベース顆粒を得た。
次にレディゲミキサー（松阪技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付）に上記ベース顆粒１００質量部を投入し、主軸（１５０ｒｐｍ）の攪拌下、非イオン性界面活性剤２０質量部、直鎖アルキル（炭素数１０〜１３）ベンゼンスルホン酸ナトリウム２２質量部、脂肪酸（炭素数１４〜１８）ナトリウム４質量部、ポリエチレングリコール２質量部、水４質量部の混合液を３分間で投入し、その後５分間攪拌を行った。更にこのミキサーに結晶性ケイ酸ナトリウム２０質量部とゼオライト１０質量部を投入し、表面被覆を行い洗剤ベースを得た。
洗剤ベース９５質量％に漂白剤粒子２．８質量％、漂白活性剤粒子１．２質量％、本発明プロテアーゼ粒子０．５質量％、及び香料０．５質量％を混合して最終粒状洗剤Ｂを得た。
【００６７】
（２）使用した原料
非イオン性界面活性剤：エチレンオキサイド平均付加モル数が８．５のエマルゲン１０８ＫＭ（花王（株）製）
ポリアクリル酸ナトリウム水溶液：平均分子量１００００（特公平２−２４２８３号公報の実施例に記載の方法に従って製造した）
炭酸ナトリウム：デンス灰（セントラル硝子（株）製）
ゼオライト：平均粒径が３．５μｍのゼオライト４Ａ型（東ソー（株）製）
ポリエチレングリコール：Ｋ−ＰＥＧ６０００（平均分子量８５００，花王（株）製）
結晶性ケイ酸ナトリウム：ＳＫＳ−６（ヘキストトクヤマ（株）製）
本発明プロテアーゼ粒子：表２記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した造粒物（６ＰＵ／ｇ）
蛍光染料：チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバガイギー社製）
漂白剤粒子：炭酸ナトリウム・過酸化水素付加物（特開２０００−２５６６９９号公報の段落〔００１９〕記載の漂白剤粒子と同様にして得た）
漂白活性剤粒子：ラウロイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウムの造粒物（特開２０００−２５６６９９号公報の段落〔００１８〕記載の漂白活性剤粒子と同様にして得た）
【００６８】
実施例４
表３に示す液体洗浄剤組成物（洗剤Ｃ、及び洗剤Ｄ）を調製した。
【００６９】
【表３】
2004000122.tif 000004
【００７０】
１）炭素数１２〜１４の２級アルコール由来のアルキル基を有するポリオキシエチレン（平均７モル付加）アルキルエーテル（ソフタノール７０、日本触媒化学工業製）
２）炭素数１２〜１４の２級アルコール由来のアルキル基を有するポリオキシエチレン（平均１２モル付加）アルキルエーテル（ソフタノール１２０、日本触媒化学工業製）
３）炭素数１０〜１４の直鎖第１級アルコールにＥＯを平均５モル、ＰＯを平均２モル、ＥＯを平均３モルの順にブロック付加させたもの
４）ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ＥＯを平均８モル付加させたもの５）ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ＥＯを平均１１．５モル付加させたもの
６）ナローレンジポリオキシエチレンアルキル（ｓｅｃ−Ｃ１２／Ｃ１３）エーテル
７）炭素数１０〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
８）アミド／エーテル変性シリコーンポリマー（東レ・ダウコーニングシリコーン（株）製、ＢＹ１６−９０６）
９）特開平１０−６０４７６号公報の１１頁６行〜１３行記載の方法で合成したフェノキシポリエチレングリコール、アクリル酸、マレイン酸共重合体（質量平均分子量１００００、固形分５１．２％）
１０）ペンテン／マレイン酸（５０／５０モル比）コポリマーのナトリウム塩（質量平均分子量７０００）
１１）表２記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品（１５ＰＵ／ｇ）
【００７１】
実施例５
下記の表４に示す組成のうち、過炭酸ナトリウムと炭酸ナトリウム（デンス灰）を攪拌混合しながら、ポリアクリル酸ナトリウム４０％水溶液、及び直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、又は非イオン性界面活性剤、又はラウロイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加した。次いで特開昭６２―２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した本発明プロテアーゼ粒子を添加し、全体的に均一になる程度攪拌することにより、漂白剤を調製した。
【００７２】
【表４】
2004000122.tif 000005
【００７３】
１）粒経５００〜７００μｍ
２）炭素数１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
３）ポリオキシエチレンアルキルエーテル（アルキル基の炭素数１２〜１４、ＥＯ平均付加モル数１２）
４）平均分子量８，０００
５）表２記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した造粒物（６ＰＵ／ｇ）
【００７４】
実施例６
下記の表５に示す全自動食器洗浄機用洗浄剤組成物（洗剤Ｇ、及びＨ）を調製した。
【００７５】
【表５】
2004000122.tif 000006
【００７６】
１）ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（平均分子量２，０００）
２）炭素数１２〜１４のｓｅｃ−アルコールのエチレンオキサイド７モル、及びプロピレンオキサイド８．５モル付加物
３）ＪＩＳ　２号珪酸ナトリウム
４）アクリル酸−マレイン酸共重合体
５）デュラミル６０Ｔ（ＴＭ）（ノボザイムズ社製）
６）表２記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した造粒物（６ＰＵ／ｇ）
【００７７】
実施例７
下記の表６に示す各成分を用い、硬質表面用洗浄剤組成物（洗剤Ｊ）を得た。
【００７８】
【表６】
2004000122.tif 000007
【００７９】
１）ポリオキシエチレン（ＥＯＰ＝４）アルキル（Ｃ１２）エーテル硫酸エステルナトリウム
２）ポリオキシエチレン（ＥＯＰ＝８）アルキル（Ｃ１２）エーテル
３）アルキル（Ｃ１２）ポリグルコシド（縮合度１．３）
４）モノ長鎖第３級アルキル（Ｃ１２）ジメチルアミンオキシド
５）アルキル（Ｃ１２）ヒドロキシジメチルスルホベタイン
６）分子量１００００
７）表２記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品（１５ＰＵ／ｍＬ）
【００８０】
実施例８
前記洗剤Ａ（実施例２参照）を用いて下記表７記載の粒状洗剤を得た。
【００８１】
【表７】
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【００８２】
１）表２記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した造粒物（６ＰＵ／ｇ）
２）特開平５−２５４９２号公報に記載のプロテアーゼＫ−１６を特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき、５ＰＵ／ｇとしたもの
３）ＫＡＣ−５００（花王（株）製）
４）リポラーゼ１００Ｔ（ＴＭ）（ノボザイムズ社製）
【００８３】
【発明の効果】
本発明によれば、高濃度の脂肪酸存在下でも活性を有し、蛋白質だけでなく皮脂等の混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有すると共に、分泌能の高いアルカリプロテアーゼを提供できる。
【００８４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列を整列させた図である。
【図１】
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