(57)【要約】【課題】本発明の目的は、健常な人のごく普通の日常生活における薬剤等による刺激に対する皮膚の反応性や抵抗力を調べる方法を提供することにある。【解決手段】皮膚の刺激を与えた部位の角質層と刺激を与えない部位の角質層とのそれぞれから採取された測定用試料のアミノ酸量を測定し、刺激を与えた部位の角質層からのアミノ酸量の、刺激を与えない部位の角質層のアミノ酸量に対する増加割合を皮膚の刺激に対する反応性の指標として算出する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の刺激を与えた部位の角質層と刺激を与えない部位の角質層とのそれぞれから採取された測定用試料のアミノ酸量を測定する工程と、
刺激を与えた部位の角質層からの測定用試料中のアミノ酸量の、刺激を与えない部位の角質層からの測定用試料中のアミノ酸量に対する増加割合を皮膚の刺激に対する反応性の指標として算出する工程と、
を有することを特徴とする皮膚表面評価方法。
【請求項２】
角質層のアミノ酸量の測定が、ポストカラム法による自動分析により行われる請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
測定用試料が、粘着テープを皮膚に貼り付けた後に剥離して粘着テープ側に角質層を付着させたものである請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
粘着テープの粘着力に対する校正を行い、且つ粘着テープの貼付け及び剥離の繰り返し操作により角質層を採取する請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
刺激が残留塩素含有水によるものである請求項１〜４のいずれかに記載の評価方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載される評価方法により得られた増加割合について皮膚の抵抗力に関する基準値を設け、増加割合が基準値以上であるかどうかを提示する工程を有することを特徴とする皮膚表面評価方法。
【請求項７】
基準値が１．２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である請求項６に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚トラブルの予知、予防の判断に好適な情報を提供するための皮膚抵抗力の測定及び評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚の状態、例えば各種刺激に対する抵抗力を的確に把握することは、より健康な皮膚を維持するために重要である。そこで、敏感肌を識別する方法として特開平１１−３０４７９８号公報（特許文献１）や、特開２０００−１１６６２３号公報（特許文献２）等に角質細胞の大きさに着目した敏感肌の識別方法が提案されている。
【０００３】
さらに、皮膚の状態によっては、適切な外用剤塗布を実施したり、あるいは、美容を目的とした各種化粧料の使用がなされているのが通常である。このように外的に皮膚表面への塗布操作が行われた場合の皮膚状態の把握、評価方法としては特開平９−２４３６３６号公報（特許文献３）、特開２００２−３７０９９７号公報（特許文献４）等に提案がなされている。
【０００４】
ところで、近年、住環境の変化に伴い、アレルギー体質の人の占める割合は増えてきている。このような人においては、皮膚への種々の刺激に対し敏感になっていることが考えられ、日常生活においても、刺激を極力排除することが望ましいと考えられている。例えば、水道水に残留している残留塩素は、その臭いだけでなく、洗顔、洗髪又は入浴の際などには、皮膚を刺激したり、髪を傷める原因となることが知られており、入浴や洗顔用の水からも残留塩素を除去することが求められている。この問題の解決手段として、脱塩素剤を通水経路中に設けた浄水シャワーが特開平１１−２３９７４０号公報（特許文献５）、特開２０００−２７１０３３号公報（特許文献６）等で提案されている。
【０００５】
しかし、残留塩素その他各種薬剤に対する皮膚の反応性は個人によって異なる。これに対し、皮膚のトラブル要因を予知することが出来れば、予防手段を講じることが可能となり、健康な皮膚の状態を維持することにつなげることが出来る。そこで、このような外的影響による反応性を把握する評価方法が望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１１−３０４７９８号公報
【特許文献２】
特開２０００−１１６６２３号公報
【特許文献３】
特開平９−２４３６３６号公報
【特許文献４】
特開２００２−３７０９９７号公報
【特許文献５】
特開平１１−２３９７４０号公報
【特許文献６】
特開２０００−２７１０３３号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
皮膚の状態が悪化していると判断される現象として、最も単純に認識、識別されるのは、皮膚が乾燥状態となり、皮膚表面が、ガサガサし、さらに悪化した場合には角質層が剥離しかけた状態にまでなる。このような状態では、目視による観察でも判別できる。そこで、残留塩素その他各種薬剤による影響の有無の判断をするにあたり、高濃度の薬剤による皮膚への暴露試験等を実施すれば、目視観察においても明確に識別できる皮膚表面状態を創出することは出来る。しかし、このように人の皮膚に対しダメージを与えるような試験の実施は、緊急時以外においては好ましくないと考えられている。一方、低侵襲な方法では皮膚表面状態の変化を目視で確認することが困難な場合が多く、低侵襲な方法での刺激に対する皮膚の反応を目視で観察する場合、各個人の各種薬剤に対する反応性を判断できない場合が多い。
【０００８】
ここで、特開平１１−３０４７９８号公報、特開２０００−１１６６２３号公報においては、形態観察による角質細胞面積等により肌質を分類分けしたものである。そのため、低侵襲な方法による薬剤暴露試験では角質細胞面積にまで変化が及び難く、残留塩素その他各種薬剤に対する反応性を判断することは困難であった。
【０００９】
また、特開平９−２４３６３６号公報の方法によれば、皮膚表面又は皮膚内部に存在する特定物質の定量分析は可能である。しかし、特定物質の時間経過に伴う分泌量の変化、あるいは、皮膚内部の特定生成物に着目した試験方法であり、皮膚状態、特に皮膚に対するダメージの有無を反映した評価方法とはなっていなかった。一方、特開２００２−３７０９９７号公報においては、マウスを用いた角層アミノ酸含有量の定量が提案されているが、低湿度な乾燥状態下での特殊な評価方法であり、本発明者らが目的としている健常な人のごく普通の日常生活における薬剤等による刺激に対する反応性を調べる評価方法とはなっていなかった。
【００１０】
本発明の目的は、健常な人のごく普通の日常生活における薬剤等による刺激に対する皮膚の反応性や抵抗力を調べる方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決する手段】
そこで、これらの問題に対し本発明者らは鋭意検討し、低侵襲な薬剤暴露等の負荷条件下においても、皮膚表面状態の変化を反映し、皮膚表面の荒れ性を評価出来る方法の開発に至ったものである。
【００１２】
本発明には以下の各発明が含まれる。
（１）皮膚の刺激を与えた部位の角質層と刺激を与えない部位の角質層とのそれぞれから採取された測定用試料のアミノ酸量を測定する工程と、
刺激を与えた部位の角質層からの測定用試料中のアミノ酸量の、刺激を与えない部位の角質層からの測定用試料中のアミノ酸量に対する増加割合を皮膚の刺激に対する反応性の指標として算出する工程と、
を有することを特徴とする皮膚表面評価方法。
（２）角質層のアミノ酸量の測定が、ポストカラム法による自動分析により行われる上記項目（１）に記載の評価方法。
（３）測定用試料が、粘着テープを皮膚に貼り付けた後に剥離して粘着テープ側に角質層を付着させたものである上記項目（１）または（２）に記載の評価方法。
（４）粘着テープの粘着力に対する校正を行い、且つ粘着テープの貼付け及び剥離の繰り返し操作により角質層を採取する上記項目（３）に記載の評価方法。
（５）刺激が残留塩素含有水によるものである上記項目（１）〜（４）のいずれかに記載の評価方法。
【００１３】
（６）上記項目（１）〜（５）のいずれかに記載される評価方法により得られた増加割合について皮膚の抵抗力に関する基準値を設け、増加割合が基準値以上であるかどうかを提示する工程を有することを特徴とする皮膚表面評価方法。
（７）基準値が１．２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である上記項目（６）に記載の評価方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明にいう皮膚の抵抗力とは、各種薬剤に対し、皮膚表面状態が悪化する傾向の有無あるいは度合いを示すものであり、皮膚科領域で言う皮膚の正常、異常を指す概念を除く意味である。すなわち、本発明における皮膚の抵抗力は、美容領域で言う、所謂、安定肌、それに対する敏感肌と対比して皮膚の性質を表現する概念として使用している。この抵抗力は、本発明にかかる方法によって薬剤に対する皮膚の反応性を測定することで検査することができる。
【００１５】
本発明における皮膚の反応性の測定対象部位は、その目的上、非侵襲的または低侵襲的な方法により角質層試料が入手できる部位であれば、いかなる部位をも包含しうる。顔面の頬、額、手の甲、腕、足等、特に限定されない。但し、本発明においては低侵襲な薬剤暴露等刺激を与えた場合の皮膚の反応性（反応の状態）を測定していることから、腕、特に前腕部を測定対象部位として選択することが好ましい。
【００１６】
本発明で用いる角質層試料の採取方法としては、測定対象部位より非侵襲的または低侵襲的に角質層を採取できる方法であれば特に限定されない。しかし、本発明の目的においては、角質層の採取は非侵襲的または低侵襲的であると同時に皮膚表面状態の違いを反映出来る方法が必要であり、採取効率、簡易性、再現性、コスト、粘着剤の均質性の点から粘着性テープ、特にセロハンテープを用いた繰り返し採取法が好ましい。セロハンテープを用いた特定部位への繰り返し採取により測定対象部位より粘着テープの平均粘着力で剥離可能な角質層を採取できる。このとき、皮膚表面状態を比較するためには一定条件下で角質層採取の再現性が得られることが必要であることから、テープ粘着力に対する校正を、一定室温下にて、均質な粘着力を有する粘着テープにより、一定長さ、一定強度による採取により実施し、同一繰り返し回数採取によることが好ましい。
【００１７】
また、採取した角質層試料中の含有成分の分析は、その皮膚表面状態の変化を定量的に検知し得る方法であれば特に限定されない。しかし、本発明においては、角質層試料を非侵襲または低侵襲的に採取した試料を使用することから、採取量は１ｍｇにも達しない極微量試料からの定量が可能な方法が必要である。本発明者らは鋭意検討した結果、美容領域では保湿剤成分としても従来より使用されているアミノ酸に着目した。アミノ酸分析の定量下限値は１〜１０ｎｍｏｌ／ｍｌであり、重量としてはｎｇレベルで含まれていれば検出可能である。そこで、角質層試料中含有成分の分析はアミノ酸分析を使用することとした。ここで、アミノ酸は、皮膚表面状態を維持する保湿成分の中で天然の保湿因子（ＮＭＦ）として構成される成分の中、４０％を占める重要な成分の一つとなっていることから、角質層試料の指標としてアミノ酸を使用することは美容的な意義も深いと考えられる。
【００１８】
粘着テープの皮膚への貼付けと剥離により、皮膚の角質層が粘着テープの粘着層に付着する。この角質層が付着した粘着テープをそのまま、例えば、無菌水に浸漬して分析用試料とすることができる。アミノ酸量定量のためには、アミノ酸は細菌による消費を受けやすい事が知られていることから、角質層試料の取り扱いに注意する必要がある。角質層採取後直ちに定量試験を実施しない場合には、無菌的に、低温、特に凍結状態で角質層試料を保存することが望ましい。また、角質層試料中には、その構成成分として、遊離のアミノ酸とタンパク質等結合状態のアミノ酸が存在することが考えられることから、前処理として、加水分解を実施し、結合アミノ酸を遊離の状態にしておくことが必要である。さらに、アミノ酸の定量方法は、分析感度が前述の感度以上に得られるものであれば特に限定されないが、再現性の高さの点からポストカラム法による自動分析法によることが好ましい。
【００１９】
さらに、刺激に対する抵抗力の測定の為には、各種薬剤に対する影響の有無を判定するため、測定対象部位を一定区画２個以上用意した上で、その一定区画内に所定の薬剤等の暴露を行う部位と、薬剤未含有の同条件による暴露を行う部位を設けることが好ましい。
【００２０】
与える刺激としては、例えば残留塩素含有水、洗剤、化粧品等を挙げることができる。
【００２１】
暴露条件としては、暴露後に発赤等目視観察で判別できるような侵襲的な条件でなく、目視観察的には非侵襲または低侵襲な条件であることが必要である。低侵襲な条件とは、薬剤の種類によって濃度、時間等異なってくるが、例えば残留塩素に対する刺激を調べる場合であれば、水温によっても異なるが、遊離残留塩素濃度としては１〜２ｐｐｍ、暴露時間としては入浴を考慮した４０℃の場合であれば、１０分程度が好ましい。この暴露操作の後、各測定対象部位より角質層試料の採取を実施する。薬剤暴露により皮膚表面状態が悪化していると、前記粘着性テープによる角質層剥離が発生しやすい状態となっていることから、繰り返し採取により有意な差が得られる。このようにして得られた角質層試料中のアミノ酸定量値の比較を行うことにより、皮膚の薬剤に対する反応性を測定することができる。すなわち、刺激を与えた部位の角質層からの測定用試料中のアミノ酸量の、刺激を与えない部位の角質層からの測定用試料中のアミノ酸量に対する増加割合を算出し、その値を皮膚の刺激に対する反応性の指標とすることができる。この割合が大きいほど、皮膚の薬剤に対する反応性が大きいことを示している。一方、この増加割合は、皮膚の薬剤に対する抵抗力を測定する際の基準としても利用できる。たとえば、皮膚の抵抗力が低下している可能性が高いと判断する際の補充的指標となる増加割合の基準値を設定しておき、その基準値以上の増加割合が得られた場合に、皮膚の抵抗力の低下を警告するようにすることができる。すなわち、皮膚表面状態の悪化の有無を確認するために必要な情報を提示することが可能となる。また、各種薬剤に対する抵抗力が弱いかどうかの判断に必要な情報は、使用する薬剤によっても異なるが、本発明者らが鋭意検討した結果、皮膚に刺激を与えた部位のアミノ酸量が、刺激を与えない部位の角質層中のアミノ酸量の１．２倍（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である場合を、その刺激に対する抵抗力の強弱の基準値として設定することができ、これらの相対比が１．２倍以上の時に抵抗力が弱くなっているとの判断に必要な情報が提供できるとの結論に至った。
【００２２】
なお、本発明の評価方法において、指標とするアミノ酸量は、すべての遊離アミノ酸の合計量を用いても構わないし、一つ、又は全てではない数種類の遊離アミノ酸量を用いても構わない。一つの遊離アミノ酸量を指標として用いる場合、シスチン及びメチオニンは、明確な差が出ない場合があるので好ましくなく、これら以外の遊離アミノ酸量を指標とすることが好ましい。
【００２３】
なお、ここでいう「非侵襲」とは、肌表面に目視可能な変化が生じないことをいい、「低侵襲」とは、肌表面に目視可能な変化が極僅かに生じることをいう。
【００２４】
尚、前述のようにアミノ酸はＮＭＦとして重要な構成成分であることから各種化粧料等に添加、使用されている。そのため、測定対象部位にあらかじめアミノ酸含有化粧料が使用されている場合には、化粧料を除いた本来の皮膚の状態の比較を実施するため、試験開始前に各種薬剤を含まない清浄な水で測定部位を洗浄する等、皮膚表面を化粧料等他の要因を含まない状態にしておくことが重要である。また、試験環境は高温多湿な環境下では発汗の影響等に左右されることから、なるべく低温低湿な環境下での実施が好ましいが、発汗が起こりにくい２０℃未満程度の室温であれば特に問題はない。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
「実験例１；角質層の採取、アミノ酸分析試験」
モニター（成人女性）の前腕部から角質層を採取するのに以下の手法を実施し、いずれも採取後直ちに無菌水１ｍｌを添加した。さらに、塩酸１ｍｌ添加後１１０℃で２２時間加水分解後、アミノ酸分析にかけた。アミノ酸分析は全自動高速アミノ酸分析機ＪＬＣ−３００Ｖ（日本電子）を使用した。また、角質採取時の室温は２０℃、湿度４０％であった。
比較例１；医療用メスを金属面に擦り付けて切れにくくしたものを用意し、角質層を１０回繰り返して擦り、角質片を採取、無菌水１ｍｌに混合した。
実施例１；市販の事務用セキスイセロハンテープ（幅１４ｍｍ）を使用し、１０ｃｍ及び１５ｃｍのテープ片を採取部に押し付けては剥がす操作を１０回繰り返し実施した。これを無菌水１ｍｌ中に浸漬した。
比較例２；市販の梱包用ガムテープ（幅５０ｍｍ）を使用し、採取法２同様の操作を実施。
【００２６】
比較例２については皮膚表面が赤くなる為、途中で中断。比較例１についても数名で実施したところ皮膚表面が赤くなるケースが見られたことから採取法として適切でないと思われた。
【００２７】
また、セロハンテープにつき、別途各テープ長別にステンレス（ＳＵＳ）板上に密着させたテープ片を長さ方向４５度に室温２０℃にてバネばかりを用いて剥離させた際の粘着力についても測定を実施した。
【００２８】
以上の試験につき、各アミノ酸の分析結果を表１に示した。ここで、コントロールとはテープ長１０ｃｍ、１５ｃｍの試験片につき、同様のアミノ酸分析を実施した結果を示す。比較例１では実施例１と比較し、測定できるアミノ酸種が少なくなっていることが判る。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
また、テープ長を変えた実施例１につき、テープコントロールの値を差し引いたアミノ酸総量と幅１０ｍｍ当たりの値に換算したテープ粘着力を図１に示した。粘着力が高くなるに伴い採取出来る角質層総アミノ酸量が増加している。このことから、一定の粘着力により一定温度下において、定量的に角質層中のアミノ酸量の定量化が可能であることがわかった。尚、本実施例においては２水準にて検討実施したが、より正確な校正を目的として３水準以上の検討を実施してもよい。一方、角質層採取法としてはセロハンテープによる方法が、より多くのアミノ酸種を被験者の皮膚表面を傷めることなく試験する有効な手段であることが確認された。
【００３１】
「実験例２；皮膚表面状態の違いによるアミノ酸分析値の比較」
アトピー性皮膚炎患者の皮膚病変部及び非病変部からの角質層採取、アミノ酸分析を実施した。ここで、皮膚表面評価部位は、目視観察においても明らかに皮膚表面状態が悪化し、乾燥状態となっている病変部と、対象として安定状態を維持できていると目視で判断される非病変部とを一定区画選択した。尚、角質層採取は、セロハンテープ粘着剤のばらつきの影響を無くすため、５ｃｍ長テープ（幅１４ｍｍ）で３回採取を実施した試験片から２ｃｍ長のサンプルを切り出す操作を５回繰り返し計１０ｃｍ分の試験片を使用した。この操作において、テープ剥離繰り返しに伴い、付着角質層量の減少が観察され、繰り返し最終段階においては、テープの有する平均的粘着力で採取し得る角質層が評価部位において採取しつくされていることが分かった。また、アミノ酸分析結果を表２（表２の１及び表２の２）に示す。乾燥状態にあり、角質層が剥離しやすくなっている皮膚病変部は、非病変部と比較し、アミノ酸値が高い値を示していることが判る。この結果から、セロハンテープによる皮膚採取、アミノ酸分析による測定手法が皮膚状態の違いを示す有効な一指標となることが確認された。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
【表３】
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【００３４】
「実験例３；塩素暴露有無による皮膚抵抗力の評価」
水道水中に含まれる残留塩素の、皮膚に与える影響を調べるため以下の試験を実施した。まず、シャワーヘッドとして三菱レイヨン（株）製ピュアピュアＩＩを２本用意し、一方には製品に挿入されている亜硫酸カルシウムカートリッジをそのまま装着した状態で使用し、もう１本は亜硫酸カルシウムカートリッジを外してシャワーヘッドのみとした。そして、この２つのシャワーヘッドに水温４０℃、残留塩素濃度１ｐｐｍの水道水を８Ｌ／ｍｉｎで通水し、被験者前腕部一定区画、局所的に、１０分間暴露試験を実施した。尚、このとき、カートリッジ装着シャワーヘッドからの温水の残留塩素濃度は０ｐｐｍ、カートリッジ非装着シャワーヘッドからの温水の残留塩素濃度は１ｐｐｍであり、前者は脱塩素水暴露、後者が塩素水暴露の条件となっていた。暴露後、エアーで水分を飛ばし、実験例２に示した角質層採取、アミノ酸分析を実施した結果を表３に示す。尚、表中には検出されたアミノ酸種のみを掲載した。
【００３５】
【表４】
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【００３６】
表３中のアミノ酸分析結果より、各モニター（成人女性）別に塩素水暴露部総アミノ酸量と脱塩素水暴露部総アミノ酸量の比を求めると、モニターＸが１．３４、モニターＹが２．４０、モニターＺが１．０６であった。この結果から、モニターＸ，Ｙ両者においては、塩素に対し皮膚抵抗力が弱く、モニターＺは塩素に対して比較的影響を受けにくく、皮膚抵抗力が高いことが判明した。また、このとき各暴露部評価対象部位を目視で観察すると、モニターＸについては、各暴露部において形態的に有意な差は認められなかった。モニターＹについては、極僅かに塩素水暴露部に皮膚表面の乾燥によるがさつきが観察されたが、脱塩素水暴露部においては安定状態にあると観察された。そして、この違いが塩素水暴露及び脱塩素水暴露のアミノ酸定量値にあらわれるものと思われ、モニターＹの方が塩素有無による定量値の比が大きい結果であった。以上のように塩素水の１０分間暴露により、目視観察においては変化が見られないにも関わらず、角質層試料中のアミノ酸量を定量することにより被検者によって皮膚表面状態に塩素が悪影響を与え得ることが判明した。このことより、モニターＸ、Ｙにおいては、日常生活において水道水中から残留塩素を除去した水を入浴、洗顔等に使用することにより皮膚表面状態の悪化を防ぎ、健康な皮膚表面状態を維持することが出来る。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の皮膚の表面評価方法は、非侵襲的または低侵襲的な薬剤の暴露による影響等皮膚に起こる変化を粘着テープを使用した極微量の角質層試料中の、アミノ酸量を定量することにより検知し、皮膚トラブルの予防に有効な評価方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】粘着テープの粘着層の粘着力と、採取される試料中のアミノ酸量の関係を示す図である。
【図１】
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