(57)【要約】【課題】  本発明は、皮膚細胞、特に角化細胞で発現する新規ポリヌクレオチドおよびそのコード遺伝子産物、並びに該ポリヌクレオチドおよび該遺伝子産物を用いる方法に関する。【解決手段】  特に、本発明は、c−Jun  N−末端キナーゼキナーゼキナーゼである、いくつかの新規プロテインキナーゼ、すなわちMLK4、PAK4、PAK5およびYSK2をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は開示されるポリヌクレオチドおよびそれらの遺伝子産物を、薬剤発見、特に皮膚の紫外線光誘導損傷、炎症および乾癬を減少させることが可能な薬剤、並びに外傷治癒を亢進させることが可能な薬剤のスクリーニングに用いる方法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来のMLK4遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子であって、該MLK4遺伝子産物が配列番号2のアミノ酸配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項1の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同である、単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
ヒト由来のMLK4遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチド分子であって、該MLK4遺伝子産物が配列番号2のアミノ酸配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
MLK4遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項4の単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
ヒト由来のPAK4遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子であって、該PAK4遺伝子産物が配列番号4のアミノ酸配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項6の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
配列番号3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同である、単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
ヒト由来のPAK4遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチド分子であって、該PAK4遺伝子産物が配列番号4のアミノ酸配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項１０】
PAK4遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項9の単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項１１】
ヒト由来のPAK5遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子であって、該PAK5遺伝子産物が配列番号6、配列番号8または配列番号10のアミノ酸配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項１２】
配列番号5、配列番号7、配列番号9のnt199〜nt2244、または配列番号11のnt6125〜nt17433のヌクレオチド配列を含む、請求項11の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
配列番号7のエクソンのヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項１４】
配列番号5、配列番号7、配列番号9のnt199〜nt2244、または配列番号11のnt6125〜nt17433のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同である、単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項１５】
ヒト由来のPAK5遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチド分子であって、該PAK5遺伝子産物が配列番号6、配列番号8または配列番号10のアミノ酸配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項１６】
PAK5遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が配列番号5、配列番号7、配列番号9のnt199〜nt2244、または配列番号11のnt6125〜nt17433のヌクレオチド配列を含む、請求項15の単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】
ヒト由来のYSK2遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子であって、該YSK2遺伝子産物が配列番号13のアミノ酸配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項１８】
配列番号12のヌクレオチド配列を含む、請求項17の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
配列番号12のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同である、単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項２０】
ヒト由来のYSK2遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチド分子であって、該YSK2遺伝子産物が配列番号13のアミノ酸配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項２１】
YSK2遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が配列番号12のヌクレオチド配列を含む、請求項20の単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項２２】
請求項1〜21のポリヌクレオチド分子のいずれかを含む、組換えベクター。
【請求項２３】
請求項22の組換えベクターを含む、形質転換宿主細胞。
【請求項２４】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号13からなる群より選択される一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、実質的に精製または単離されているポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、および配列番号13からなる群より選択される一のアミノ酸配列を含む実質的に精製または単離されているポリペプチドを調製する方法であって、請求項23の宿主細胞を、ポリペプチドまたはペプチド断片の発現を導くことが可能な条件下で培養すること、および該細胞培養からポリペプチドまたはペプチド断片を、実質的に精製または単離されている形態で回収することを含む、前記方法。
【請求項２６】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、および配列番号13からなる群より選択される一のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な単離抗体。
【請求項２７】
配列番号13のアミノ酸残基1〜10に特異的な、請求項26の単離抗体。
【請求項２８】
以下の工程を含む、JNKKK遺伝子産物の細胞レベルに影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法：
a）細胞試験試料に試験化合物を適用する工程；
b）該試験試料における、少なくとも1つのJNKKK遺伝子産物の細胞レベルを測定する工程であって、このとき該遺伝子産物が配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号13からなる群より選択される一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号13からなる群より選択される一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするmRNAである、前記工程；および
c）該試験試料における該遺伝子産物のレベルを、参照試料におけるものと比較する工程；
であって、このとき参照試料と比較した該試験試料における該遺伝子産物の細胞レベルの特異的な変化が、該化合物がJNKKK遺伝子由来の遺伝子産物の細胞レベルに影響を及ぼすことを示す、前記方法。
【請求項２９】
遺伝子産物がmRNAである、請求項28の方法。
【請求項３０】
さらに、該試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む、請求項28の方法。
【請求項３１】
ストレス事象が紫外線照射に対する曝露である、請求項28の方法。
【請求項３２】
ストレス事象が炎症性サイトカインに対する曝露である、請求項29の方法。
【請求項３３】
試験試料および参照試料が培養細胞である、請求項28の方法。
【請求項３４】
試験試料および参照試料が培養皮膚組織である、請求項28の方法。
【請求項３５】
試験試料および参照試料が動物である、請求項28の方法。
【請求項３６】
以下の工程を含む、JNKKKの活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法：
a）試験試料に試験化合物を適用する工程；および
b）該試験試料および参照試料におけるJNKKK活性を測定する工程であって、このときJNKKKが配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、および配列番号13からなる群より選択される一のアミノ酸配列を含む、前記工程；
であって、このとき参照試料と比較した該試験試料におけるJNKKK活性を改変する試験化合物が、JNKKKの活性に影響を及ぼす化合物と同定される、前記方法。
【請求項３７】
JNKKKの活性を測定する工程が、JNKKKのキナーゼ活性を測定することを含む、請求項36の方法。
【請求項３８】
さらに、試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む、請求項36の方法。
【請求項３９】
ストレス事象が紫外線照射である、請求項38の方法。
【請求項４０】
ストレス事象が炎症性サイトカインである、請求項38の方法。
【請求項４１】
試験試料および参照試料が培養細胞である、請求項36の方法。
【請求項４２】
試験試料および参照試料が培養皮膚組織である、請求項36の方法。
【請求項４３】
以下の工程を含む、配列番号6、配列番号8もしくは配列番号10のアミノ酸配列を含むPAK5ポリペプチドに結合する化合物、または配列番号13のアミノ酸配列を含むYSK2ポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法：
a）該ポリペプチドと試験化合物を、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに充分な時間、接触させる工程；および
b）該複合体を検出する工程；
であって、したがって、ポリペプチド／試験化合物複合体が検出された場合、PAK5ポリペプチドまたはYSK2ポリペプチドに結合する化合物が同定される、前記方法。
【請求項４４】
以下の工程を含む、JNKKK遺伝子産物をコードする遺伝子の発現に影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングする方法：
（a）試験試料に試験化合物を適用する工程；
（b）該試験試料の細胞における、少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、このとき該遺伝子が配列番号2、4、6、8、10および13からなる群より選択される一のアミノ酸配列を含むJNKKK遺伝子産物をコードする、前記工程；および
（c）該試験試料における該遺伝子の発現レベルを、参照試料におけるものと比較する工程；
であって、このとき参照試料と比較した該試験試料における該遺伝子の発現の特異的な変化が、試験化合物が該遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示す、前記方法。
【請求項４５】
さらに、試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の遺伝子発現反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む、請求項44の方法。
【請求項４６】
試料中のMLK4、PAK4、PAK5、またはYSK2関連ポリヌクレオチドを検出する方法であって、該試料を、特定のポリヌクレオチドに結合して複合体を形成する化合物と、複合体を形成するのに充分な時間、接触させること、および該複合体を検出することを含み、したがって、複合体が検出された場合、それぞれ、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連ポリヌクレオチドが検出される、前記方法。
【請求項４７】
請求項46の方法であって、該試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、そのようなハイブリダイゼーション条件下で特定のポリヌクレオチドにアニールする核酸プライマーと接触させること、およびアニールしたポリヌクレオチドを増幅することを含み、したがって、特定のポリヌクレオチドが増幅された場合、それぞれ、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連ポリヌクレオチドが検出される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜1.発明の属する技術分野＞
本発明は、皮膚細胞、特に角化細胞で発現される、新規ポリヌクレオチド、およびそのコード遺伝子産物、並びに該ポリヌクレオチドおよび該遺伝子産物を用いる方法を提供する。特に、本発明は、c−Jun  N−末端キナーゼキナーゼキナーゼ（JNKKK類）である新規プロテインキナーゼに関する。さらに、本発明は、新規ポリヌクレオチドおよびそのコード産物を、薬剤発見、特に皮膚の紫外線光誘導損傷、炎症および乾癬を減じることが可能な薬剤、および外傷治癒を亢進させることが可能な薬剤のスクリーニングに用いる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
＜2.発明の背景＞
多くの細胞外シグナル、例えば光、増殖因子、サイトカインおよび化学薬品または物理的ストレスは、細胞の細胞質における多階層キナーゼカスケードを活性化する。例えば、上皮増殖因子（EGF）などの増殖因子は、細胞表面上のその同族の（cognate）受容体に結合し、それにより該細胞表面受容体の細胞質部分と関連している細胞内タンパク質rasを活性化するであろう。Rasはリン酸化し、そしてそれにより分裂促進剤活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ（MAPKKK）であるraf1を活性化する。Raf1はその後、（やはりリン酸化により）分裂促進剤活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MEK類）の活性化を誘導し、MEKは続いて細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK類）をリン酸化する。リン酸化されると、ERKは核に移動しリン酸化し、そしてこうして転写因子、例えばストレス活性化プロテインキナーゼ1（SAP1）および三重複合体因子Elk1を活性化する。例えば、Fangerら，  1997，  Current  Opin．  Genet．  Dev．  7：67−74を参照されたい。
【０００３】
ストレス（例えば熱および紫外線（UV）光）およびサイトカイン（例えばTNF−およびIL−1）は、JNKKKと称される、特有の一連のキナーゼキナーゼキナーゼを活性化する。これらは、続いて、c−Jun−N−末端キナーゼ（JNK）およびp38を活性化する特定のJNKKに作用する。最後の2つのキナーゼは、核に入り、ここでリン酸化し、そして転写因子を活性化する。例えば、Dieneら，  1997，  PNAS  94：9687−92を参照されたい。
【０００４】
異なるストレスに対する細胞反応における最初の事象の大部分は、これまでに解明されてきていない。しかし、異なる細胞外シグナルはJNKKKファミリーの異なるメンバーを活性化することが明らかである。したがって、いくつかのJNKKKはTNF−αに特異的に反応性であり、他のものは浸透ショック、さらに他のものはUV照明に特異的に反応性である。Dieneら、1997、上記；Raingeaudら，1995，  J．Biol．Chem．270：7420−6。
【０００５】
角化細胞などの皮膚細胞は、紫外線照射損傷に特にさらされやすい。しかし、角化細胞がどのように紫外線照射ストレスに反応するかに関しては、ほとんど知られていない。環境ストレスに対する角化細胞反応の操作により、多様な皮膚障害のための療法と共に美容的（cosmetic）使用が生じる可能性がある。
【０００６】
したがって、当業には、薬剤スクリーニングのための標的として用いることが可能な、角化細胞情報伝達に関与する構成要素を解明する、大きな必要性がある。したがって、本発明は、角化細胞により発現され、そして紫外線照射に対する細胞反応に関与する、いくつかの新規JNKKK、およびそれらの使用を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
＜3.発明の概要＞
本発明は、MLK4キナーゼ、PAK4キナーゼ、PAK5キナーゼ、およびYSK2キナーゼを含むいくつかの新規JNKKK遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子と共に、これらのポリヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列に関する。本発明はさらに、PAK5キナーゼをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に関する。
【０００８】
1つの側面において、本発明は、ヒトMLK4遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、MLK4遺伝子産物の部分は、配列番号2のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号1のヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、配列番号2のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、本発明の、前述のMLK4関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの実質的な部分（substantial  portion）であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、MLK4関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトMLK4遺伝子産物またはMLK4関連相同ポリペプチドのペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。特定の、しかし限定しない態様において、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列の下位配列からなるペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１１】
別の側面において、本発明は、ヒトPAK4遺伝子の部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、PAK4遺伝子産物の部分は、配列番号4のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号3のヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、配列番号4のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の、前述のPAK4関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、PAK4関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトPAK4遺伝子産物またはPAK4関連相同ポリペプチドのペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。特定の、しかし限定しない態様において、本発明は、配列番号4のアミノ酸配列の下位配列からなるペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、ヒトPAK5遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、PAK5遺伝子産物の部分は、配列番号6のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、配列番号6のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号5のヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
別の側面において、本発明は、配列番号8のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする部分である、ヒトPAK5遺伝子のヌクレオチド配列の部分を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。限定しない態様において、配列番号8のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号7のヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
本発明はさらに、配列番号5または配列番号7のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、配列番号6または配列番号8のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１７】
別の側面において、本発明は、配列番号10のアミノ酸配列を有する全長ヒトPAK5遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、該ポリヌクレオチド分子は、cDNAのORFに相当する、配列番号9のnt199〜nt2244のヌクレオチド配列を含む。別の限定しない態様において、全長ヒトPAK5遺伝子産物をコードする単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号11のnt6125〜nt17，433のORFのヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
本発明はさらに、配列番号9または配列番号11のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明はさらに、本発明の、前述のPAK5関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、PAK5関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトPAK5遺伝子産物またはPAK5関連相同ポリペプチドのペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。
【００１９】
別の側面において、本発明は、ヒトYSK2遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、YSK2遺伝子産物の部分は、配列番号13のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号12のヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明はさらに、配列番号12のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、配列番号13のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、本発明の、前述のYSK2関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、YSK2関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトYSK2遺伝子産物またはYSK2関連相同ポリペプチドのペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。特定の、しかし限定しない態様において、本発明は、配列番号13のアミノ酸配列の下位配列からなるペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものをクローニングし、そして発現させるための組成物および方法を提供し、これには、本発明のポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものを含むクローニングベクターおよび発現ベクターと共に、本発明のポリヌクレオチド分子、クローニングベクターまたは発現ベクターのいかなるものでもよいものを含む、形質転換宿主細胞および新規株（strain）またはそこから由来する細胞株（cell  line）が含まれる。限定しない態様において、本発明は、ポリヌクレオチド分子の発現のための1つまたはそれ以上の制御要素と機能可能であるように関連している、本発明のポリヌクレオチド分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。
【００２３】
やはり本発明に提供されるのは、本発明のポリヌクレオチド分子がコードする、実質的に精製または単離されているポリペプチドである。特定の、しかし限定しない態様において、該ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を含むヒトMLK4遺伝子産物の部分である。別の特定の、しかし限定しない態様において、該ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含むヒトPAK4遺伝子産物の部分である。別の特定の、しかし限定しない態様において、該ポリペプチドは、配列番号6または配列番号8いずれかのアミノ酸配列を含む、ヒトPAK5遺伝子産物の部分、あるいは配列番号10のアミノ酸配列を含む全長ヒトPAK5遺伝子産物である。別の特定の、しかし限定しない態様において、該ポリペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列を含む、YSK2遺伝子産物の部分である。
【００２４】
本発明はまた、本発明のヒトMLK4、PAK4、PAK5およびYSK2遺伝子産物の部分に相同な、実質的に精製または単離されているポリペプチドも提供する。本発明はまた、本発明の全長ヒトPAK5遺伝子産物に相同な、実質的に精製または単離されているポリペプチドも含む。本発明はさらに、本発明のMLK4、PAK4、およびPAK5遺伝子産物の、実質的に精製または単離されているペプチド断片、並びに配列番号13の最初の6つのアミノ酸を有する、本発明のYSK2遺伝子産物の、実質的に精製または単離されているペプチド断片を提供する。
【００２５】
本発明はまた、本発明の、ヒトMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の、実質的に精製または単離されている部分、あるいは実質的に精製または単離されているヒトPAK5遺伝子産物、あるいは相同ペプチド、あるいはペプチド断片を調製する方法であって、本発明のポリヌクレオチド分子またはベクターで形質転換されている宿主細胞を、本発明のポリペプチドまたはペプチド断片の発現を導くことが可能な（conductive）条件下で培養し、そして細胞培養からポリペプチドまたはペプチド断片を、実質的に精製または単離されている型で回収することを含む、前記方法も提供する。
【００２６】
やはり提供されるのは、本発明の、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物、相同ペプチド、またはペプチド断片に特異的な抗体、および試料において、本発明の、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物、相同ペプチド、またはペプチド断片を検出する方法である。本発明のさらに別の側面は、本発明の、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物、相同ペプチド、またはペプチド断片に結合する化合物を同定する方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、試料において、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連ポリヌクレオチドを検出する方法であって、特定のポリヌクレオチドに結合し、そして該ポリヌクレオチドと複合体を形成する化合物と該試料を、複合体を形成するのに充分な時間、接触させ、そして該複合体を検出する、したがって、複合体が検出された場合、それぞれ、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連ポリヌクレオチドが検出されることを含む、前記方法も提供する。限定しない態様において、該方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、試料を、こうしたハイブリダイゼーション条件下で特定のポリヌクレオチドにアニールする核酸プライマーと接触させ、そしてアニールしたポリヌクレオチドを増幅する、したがって、特定のポリヌクレオチドが増幅された場合、それぞれ、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連ポリヌクレオチドが検出されることを含む。
【００２８】
本発明はさらに、JNKKK遺伝子産物の細胞レベルに影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングする方法であって：（a）試験試料に試験化合物を適用し；（b）該試験試料における、少なくとも1つの遺伝子産物の細胞レベルを測定し、ここで該遺伝子産物は配列番号1、3、5、7、9、11および12からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子由来である；そして（c）該試験試料における該遺伝子産物のレベルを、参照試料におけるものと比較する；ここで参照試料と比較した該試験試料における該遺伝子産物の細胞レベルの特異的な変化は、該試験化合物がJNKKK遺伝子由来の遺伝子産物の細胞レベルに影響を及ぼすことを示す、ことを含む、前記方法を提供する。好ましい態様において、該方法はさらに、試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む。
【００２９】
本発明はさらに、JNKKK遺伝子産物をコードする遺伝子の発現に影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングする方法であって：（a）試験試料に試験化合物を適用し；（b）該試験試料の細胞における、少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを測定し、ここで該遺伝子は配列番号1、3、5、7、9、11および12からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む；そして（c）該試験試料における該遺伝子の発現レベルを、参照試料におけるものと比較する；ここで参照試料と比較した該試験試料における該遺伝子の発現の特異的な変化は、該試験化合物が該遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示す、ことを含む、前記方法を提供する。好ましい態様において、該方法はさらに、試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の遺伝子発現反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む。
【００３０】
本発明のさらに別の側面は、JNKKK遺伝子産物の活性に影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングする方法であって：（a）試験試料に試験化合物を適用し；そして（b）参照試料に対する該試験試料におけるJNKKK遺伝子産物の活性を測定する、ここでJNKKK遺伝子産物は配列番号2、4、6、8、10および13からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む；ここで参照試料と比較した該試験試料におけるJNKKK遺伝子産物活性を改変する試験化合物は、JNKKK遺伝子産物の活性に影響を及ぼす化合物と同定される、ことを含む、前記方法を提供する。好ましい態様において、該方法はさらに、試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む。
【００３１】
＜5.発明の詳細な説明＞
本発明は、皮膚角化細胞で発現される、JNKKKポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子の同定および性質決定に関する。JNKKKのキナーゼドメインは、配列が保存されているため、細胞または細胞種により発現される、実質的にすべてのJNKKKの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）検出のため、プライマーを設計することが可能である。1つの態様において、プライマー対、5’−ATGCA（CA）CANGA（CT）AT（ACT）AA（AG）−3’（配列番号14）（順方向）および5’−GCNAC（CT）TCNGGNGCCATCCA−3’（配列番号15）（逆方向）を用い、新規JNKKKを検出することが可能である。該プライマー対を用いた産物は、共通の150  bp部分である。以下の実施例の項で論じられるように、プライマー対を用い、ヒト表皮角化細胞mRNAをスクリーニングし、そしていくつかの新規JNKKKをコードするポリヌクレオチドを発見した。さらに、本発明は、これらのポリヌクレオチドがコードするJNKKKが、紫外線（UV）光などのストレスに対する細胞反応に関与しているという発見に関する。例として、本発明は、MLK4読み枠（ORF）の部分のヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号1）；PAK4  ORFの部分のヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号3）；PAK5  ORFの部分のヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号5）；PAK5遺伝子の部分のヌクレオチド配列を含む、別の単離ポリヌクレオチド分子（配列番号7）；PAK5遺伝子産物をコードするcDNAのヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号9、nt199〜2244のORF）；PAK5遺伝子のヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号11、nt6125〜17433のORF）；およびYSK2  ORFの部分のヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号12）に関し、以下の項に記載される。
【００３２】
＜5.1.ポリヌクレオチド分子＞
本明細書において、「ポリヌクレオチド分子」、「ポリヌクレオチド配列」、「コード配列」、「読み枠（ORF）」、およびそれらに匹敵する用語は、一本鎖でもまたは二本鎖でもどちらでもよい、DNAおよびRNA分子両方を指すことが意図される。コード配列またはORFは、限定されるわけではないが、原核配列、cDNA配列、ゲノムDNA配列、並びに化学的に合成されたDNAおよびRNA配列を含む可能性がある。「遺伝子産物」は、遺伝子がコードする産物を指すことが意図され、転写されたRNAメッセージ（エクソンおよびイントロンを含む）、スプライシングされたメッセンジャーRNA（mRNA）、およびそれぞれのmRNAがコードする翻訳されたタンパク質産物が含まれる。
【００３３】
本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子およびオリゴヌクレオチド分子の産生および操作は、当業の範囲内であり、そしてとりわけ、すべて本明細書に援用される、Maniatisら，  1989，  Molecular  Cloning，  A  Laboratory  Manual，  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ausubelら，  1989，  Greene  Publishing  Associates  ＆  Wiley  Interscience，ニューヨーク；Sambrookら，  1989，  Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual，第2版，  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Innisら（監修），  1995，  PCR  Strategies，  Academic  Press，Inc．，サンディエゴ；およびErlich（監修），  1992，  PCR  Technology，  Oxford  University  Press，ニューヨークに記載される組換え技術にしたがい、行うことが可能である。
【００３４】
＜5.1.1.MLK4関連ポリヌクレオチド分子＞
本発明は、ヒトMLK4関連遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、MLK4遺伝子産物の部分は、配列番号2のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号1のヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
本発明はさらに、配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。この点で用いられる場合、「相同」という用語は：（a）配列番号1がコードするのと同じポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のためヌクレオチド配列に、1つまたはそれ以上の沈黙（silent）変異を含む（すなわち縮重変異体（variant））；または（b）BLASTN（GENBANK）などのいかなる標準的なヌクレオチド配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、配列番号1のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、そして最も好ましくは少なくとも約90％のヌクレオチド配列同一性を有し、そして中程度にストリンジェントな条件下、すなわち0．5  M  NaHPO4、7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1  mM  EDTA中で65℃でのフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーション、および0．2  X  SSC／0．1％  SDS中で42℃での洗浄（Ausubelら（監修），  1989，  Current  Protocols  in  Molecular  Biology，  Vol．1，  Green  Publishing  Associates，  Inc．，およびJohn  Wiley  ＆  Sons，  Inc．，ニューヨーク，  p．2．10．3）で、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下、すなわち0．5  M  NaHPO4、7％  SDS、1  mM  EDTA中で65℃でのフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーション、および0．1  X  SSC／0．1％  SDS中で68℃での洗浄（Ausubelら、1989、上記）で、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。より好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。
【００３６】
本明細書において、MLK4関連ポリヌクレオチド分子は：（i）真核細胞由来のMLK4遺伝子産物を、免疫特異的に認識する抗体を生成するのに用いることが可能なペプチドをコードし；または（ii）試験試料におけるMLK4転写物の存在を検出することが可能であり；または（iii）内因性MLK4遺伝子の制御または発現を改変するための方法を可能にすることができ（例えば遺伝子活性化または不活性化技術、例えばイントロンへの転写活性化因子配列の挿入、あるいは1つまたはそれ以上のエクソンの欠失により）；または（iv）PCRなどの標準的な増幅技術を用い、真核細胞において、MLK4  ORFのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を増幅するのに用いることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用（useful  in  practing  the  invention）」である。こうした相同ポリヌクレオチド分子には、ヒト以外の真核種（および特に哺乳動物種、例えばマウス、ウシ、ヒツジ、モルモットおよびラットなど）、または他のヒト単離体に存在する天然発生MLK4遺伝子と共に、天然発生、化学合成、または遺伝子操作いずれでもよい、突然変異MLK4対立遺伝子を含んでもよい。
【００３７】
本発明はさらに、配列番号2のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ヒト由来のMLK4遺伝子産物の部分のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す際、「相同（homologous）」という用語は、配列番号2のアミノ酸配列を含むが、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で保存的に置換されており、生じたアミノ酸配列が、配列番号2に対し、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、そして最も好ましくは少なくとも約90％の配列同一性を有し、アミノ酸配列同一性がBLASTP（GENBANK）などのいかなる標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定され、生じたポリペプチドが本発明を実施するのに有用である、ことを意味する。保存的アミノ酸置換は当業に周知である。こうした置換を作成するための規準には、とりわけ、Dayhof，  M．D．，  1978，  Nat．  Biomed．  Res．  Found．，ワシントンD．C．，  Vol．  5，  Sup．  3に記載されるものが含まれる。より明確には、保存的アミノ酸置換は、一般的に、酸性度、またはその側鎖の極性において関連しているアミノ酸のファミリー内で行われるものである。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般的に4つの群に分けられる：（1）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（2）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（4）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはまた、芳香族アミノ酸として共に分類される。いかなる特定の群内での1つまたはそれ以上の置換、例えばロイシンとイソロイシンまたはバリン、あるいはアスパラギン酸とグルタミン酸、あるいはスレオニンとセリン、あるいはいかなる他のアミノ酸残基と構造的に関連したアミノ酸残基、例えば同様の酸性度、または極性、またはそれらを組み合わせた類似性を有するアミノ酸残基も、一般的に、ポリペプチドの機能に重要でない影響を有するであろう。
【００３８】
本明細書において、MLK4関連ポリペプチドは、該ポリペプチドを用い、真核、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒト細胞または組織由来のMLK4遺伝子産物に対し抗体を作成し、あるいはこうした細胞または組織においてMLK4活性または産生を調節する化合物に関しスクリーニングすることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。
【００３９】
本発明はさらに、本発明の、前述のMLK4関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、MLK4関連ポリヌクレオチド分子の「実質的な部分（substantial  portion）」は、配列番号1のヌクレオチド配列の全長より短いものからなるポリヌクレオチド分子またはそれと相同なポリヌクレオチド分子であるが、前記ヌクレオチド配列の長さの少なくとも約20％、そしてより好ましくは少なくとも約30％を含み、そして有用性がMLK4関連ポリヌクレオチド分子に関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である、前記ポリヌクレオチド分子を意味する。限定しない態様において、MLK4関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトMLK4遺伝子産物のペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。MLK4関連ポリペプチドの「ペプチド断片（peptide  fragment）」は、配列番号2の下位配列からなるポリペプチドを指し、ここで下位配列は、有用性がMLK4関連ポリペプチドに関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である。本明細書において、「ペプチド断片」は、好ましくは、長さが少なくとも約15アミノ酸残基であり、そしてより好ましくは少なくとも約30アミノ酸残基である。
【００４０】
本明細書に開示されるMLK4関連ポリヌクレオチド分子を用い、ヒトMLK4遺伝子産物の部分を発現させ、細胞種または組織におけるMLK4遺伝子産物の発現を検出し、MLK4遺伝子が突然変異している（例えば相同的組換えにより改変されまたは除去されている）新規細胞株を調製し、周知の技術を用い（例えばAboら、以下を参照されたい）、例えばATP結合部位を突然変異させることにより、優性ネガティブMLK4を生成しそして発現させ、そして既知の技術を用い、ヒト以外の真核種、そして特に他の哺乳動物種におけるMLK4ホモログ遺伝子を同定してもよい。したがって、本発明はさらに、MLK4ホモログ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、「MLK4ホモログ遺伝子産物（MLK4  homolog  gene  product）」は、MLK4ホモログ遺伝子がコードする遺伝子産物として定義され、MLK4ホモログ遺伝子は、ヒト以外の異なる真核種由来の遺伝子で、そして当業者により、約70％より大きいアミノ酸レベルでの配列同一性の度合いに基づき、ヒトMLK4遺伝子の相同体と認められるものとして定義される。
【００４１】
MLK4ホモログ遺伝子を含むポリヌクレオチドクローンを同定するための方法は、当業に知られる。例えば、ヒトMLK4  ORFの部分を含むポリヌクレオチド分子を検出可能であるように標識し、そして目的の生物由来のDNAから構築したゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、目的の生物に対する参照生物の関係に基づき、選択することが可能である。異なるストリンジェンシー条件のための必要条件は当業者に周知であり、そしてこうした条件は、ライブラリーおよび標識配列が由来する特定の生物に応じ、予測可能であるように、異なるであろう。とりわけ、バクテリオファージライブラリーに関し、BentonおよびDavis，  1977，  Science  196：180に、そしてプラスミドライブラリーに関し、GrunsteinおよびHogness，  1975，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA，  72：3961−3965に示される技術を用い、ゲノムDNAライブラリーをMLKホモログ遺伝子コード配列に関しスクリーニングしてもよい。前記刊行物は本明細書に援用される。配列番号1に示されるような、MLK4  ORFの部分を含むことが知られるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子、またはその部分に相当するオリゴヌクレオチド分子を、これらのスクリーニング実験におけるプローブとして用いてもよい。あるいは、精製MLK4遺伝子産物のアミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブを合成してもよい。
【００４２】
MLK4ホモログ遺伝子コード配列を含むと同定されるクローンは、適切な生物学的機能に関し、試験してもよい。例えば、適切な読み枠と共に、開始および終止シグナルを同定するため、該クローンを配列解析に供してもよい。クローンされたDNA配列をその後、適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターをその後、相補性に関する試験に対しMLK4をヌルに（null）している細胞（例えばヒト細胞）に形質転換する。形質転換宿主細胞をその後、MLK4情報伝達に関し解析する。
【００４３】
＜5.1.2.PAK4関連ポリヌクレオチド＞
本発明はさらに、ヒトPAK4遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、PAK4遺伝子産物の部分は、配列番号4のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号3のヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
本発明はさらに、配列番号3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。この点で用いられる場合、「相同」という用語は：（a）配列番号3がコードするのと同じポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のためヌクレオチド配列に、1つまたはそれ以上の沈黙変異を含む；または（b）BLASTN（GENBANK）などのいかなる標準的なヌクレオチド配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、配列番号3のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、そして最も好ましくは少なくとも約90％のヌクレオチド配列同一性を有し、そして中程度にストリンジェントな条件下、すなわち0．5  M  NaHPO4、7％  SDS、1  mM  EDTA中で65℃でのフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーション、および0．2  X  SSC／0．1％  SDS中で42℃での洗浄（Ausubelら、1989、上記）で、配列番号4のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下、すなわち0．5  M  NaHPO4、7％  SDS、1  mM  EDTA中で65℃でのフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーション、および0．1  X  SSC／0．1％  SDS中で68℃での洗浄（Ausubelら、1989、上記）で、配列番号4のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。より好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。
【００４５】
本明細書において、PAK4関連ポリヌクレオチド分子は：（i）真核細胞由来のPAK4遺伝子産物を、免疫特異的に認識する抗体を生成するのに用いることが可能なペプチドをコードし；または（ii）試験試料におけるPAK4転写物の存在を検出することが可能であり；または（iii）内因性PAK4遺伝子の制御または発現を改変するための方法を可能にすることができ（例えば遺伝子活性化または不活性化技術、例えばイントロンへの転写活性化因子配列の挿入、あるいは1つまたはそれ以上のエクソンの欠失により）；または（iv）PCRなどの標準的な増幅技術を用い、真核細胞において、PAK4  ORFのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を増幅するのに用いることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。こうした相同ポリヌクレオチド分子には、ヒト以外の真核種（および特に哺乳動物種、例えばマウス、ウシ、ヒツジ、モルモットおよびラットなど）、または他のヒト単離体に存在する天然発生PAK4遺伝子と共に、天然発生、化学合成、または遺伝子操作いずれでもよい、突然変異PAK4対立遺伝子を含んでもよい。
【００４６】
本発明はさらに、配列番号4のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ヒト細胞由来のPAK4遺伝子産物のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す際、「相同」という用語は、配列番号4のアミノ酸配列を含むが、保存的アミノ酸置換が上に定義されるように、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で保存的に置換されており、アミノ酸配列同一性がBLASTP（GENBANK）などのいかなる標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、生じたアミノ酸配列が、配列番号4に対し、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、そして最も好ましくは少なくとも約90％の配列同一性を有し、生じたポリペプチドが本発明を実施するのに有用である、ことを意味する。
【００４７】
本明細書において、PAK4関連ポリペプチドは、該ポリペプチドを用い、真核、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒト細胞または組織由来のPAK4遺伝子産物に対し抗体を作成し、あるいはこうした細胞または組織においてPAK4活性または産生を調節する化合物に関しスクリーニングすることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。
【００４８】
本発明はさらに、本発明の、前述のPAK4関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、PAK4関連ポリヌクレオチド分子の「実質的な部分」は、配列番号3の全長より短いものからなるポリヌクレオチド分子またはそれと相同なポリヌクレオチド分子であるが、前記ヌクレオチド配列の長さの少なくとも約20％、そしてより好ましくは少なくとも約30％を含み、そして有用性がPAK4関連ポリヌクレオチド分子に関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である、前記ポリヌクレオチド分子を意味する。限定しない態様において、PAK4関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトPAK4遺伝子産物のペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。PAK4関連ポリペプチドの「ペプチド断片」は、配列番号4の下位配列からなるポリペプチドを指し、ここで下位配列は、有用性がPAK4関連ポリペプチドに関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である。本発明のペプチド断片は、好ましくは、長さが少なくとも約15アミノ酸残基であり、そしてより好ましくは少なくとも約30アミノ酸残基である。
【００４９】
本明細書に開示されるPAK4関連ポリヌクレオチド分子を用い、ヒトPAK4遺伝子産物の部分を発現させ、細胞種または組織におけるPAK4遺伝子産物の発現を検出し、PAK4遺伝子が突然変異している（例えば相同的組換えにより改変されまたは除去されている）新規細胞株を調製し、周知の技術を用い（例えばAboら、以下を参照されたい）、例えばATP結合部位を突然変異させることにより、優性ネガティブPAK4を生成しそして発現させ、そして既知の技術を用い、ヒト以外の真核種、そして特に他の哺乳動物種におけるPAK4ホモログ遺伝子を同定してもよい。したがって、本発明はさらに、PAK4ホモログ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、「PAK4ホモログ遺伝子産物」は、PAK4ホモログ遺伝子がコードする遺伝子産物として定義され、PAK4ホモログ遺伝子は、ヒト以外の異なる真核種由来の遺伝子で、そして当業者により、約70％より大きいアミノ酸レベルでの配列同一性の度合いに基づき、ヒトPAK4遺伝子の相同体と認められるものとして定義される。PAK4ホモログ遺伝子を含むポリヌクレオチドクローンを同定するための方法は、上述のように、当業に知られる。
【００５０】
＜5.1.3.PAK5関連ポリヌクレオチド分子＞
本発明はさらに、ヒトPAK5遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、PAK5遺伝子産物の部分は、配列番号6のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、配列番号6のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号5のヌクレオチド配列を含む。別の好ましい態様において、PAK5遺伝子産物の部分は、配列番号8のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、配列番号8のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号7のヌクレオチド配列を含む。本発明のさらに別の限定しない態様は、PAK5ゲノムDNA（配列番号7を参照されたい）のいかなる1つでもよいエクソンの配列である。本発明のさらに限定しない態様は、PAK5ゲノムDNAのいかなる1つでもよいイントロンの配列である。
【００５１】
本発明はさらに、全長ヒトPAK5遺伝子産物をコードする配列番号9のcDNAヌクレオチド配列（ORFのnt199−2244）を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、ヒトPAK5遺伝子に相当する、配列番号11のヌクレオチド配列（ORFのnt6125−17433）を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００５２】
本発明はさらに、本発明のPAK5遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。この点で用いられる場合、「相同」という用語は：（a）配列番号5、配列番号7、配列番号9または配列番号11がコードするのと同じポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のためヌクレオチド配列に、1つまたはそれ以上の沈黙変異を含む；または（b）BLASTN（GENBANK）などのいかなる標準的なヌクレオチド配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、配列番号5または配列番号7のヌクレオチド配列に対し、あるいは配列番号9または配列番号11のORFに対し、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、そして最も好ましくは少なくとも約90％のヌクレオチド配列同一性を有し、そして中程度にストリンジェントな条件下、すなわち0．5  M  NaHPO4、7％  SDS、1  mM  EDTA中で65℃でのフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーション、および0．2  X  SSC／0．1％  SDS中で42℃での洗浄（Ausubelら、1989、上記）で、配列番号6、配列番号8、または配列番号10のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下、すなわち0．5  M  NaHPO4、7％  SDS、1  mM  EDTA中で65℃でのフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーション、および0．1  X  SSC／0．1％  SDS中で68℃での洗浄（Ausubelら、1989、上記）で、配列番号6、配列番号8、または配列番号10のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。より好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号5または配列番号7のヌクレオチド配列、あるいは配列番号9または配列番号11のORFのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。
【００５３】
本明細書において、PAK5関連ポリヌクレオチド分子は：（i）真核細胞由来のPAK5遺伝子産物を、免疫特異的に認識する抗体を生成するのに用いることが可能なペプチドをコードし；または（ii）試験試料におけるPAK5転写物の存在を検出することが可能であり；または（iii）内因性PAK5遺伝子の制御または発現を改変するための方法を可能にすることができ（例えば遺伝子活性化または不活性化技術、例えばイントロンへの転写活性化因子配列の挿入、あるいは1つまたはそれ以上のエクソンの欠失により）；または（iv）PCRなどの標準的な増幅技術を用い、真核細胞において、PAK5  ORFのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を増幅するのに用いることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。こうした相同ポリヌクレオチド分子には、ヒト以外の真核種（および特に哺乳動物種、例えばマウス、ウシ、ヒツジ、モルモットおよびラットなど）、または他のヒト単離体に存在する天然発生PAK5遺伝子と共に、天然発生、化学合成、または遺伝子操作いずれでもよい、突然変異PAK5対立遺伝子を含んでもよい。
【００５４】
本発明はさらに、配列番号6、配列番号8または配列番号10のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ヒト細胞由来のPAK5遺伝子産物のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す際、「相同」という用語は、配列番号6、配列番号8または配列番号10のアミノ酸配列を含むが、保存的アミノ酸置換が上に定義されるように、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で保存的に置換されており、アミノ酸配列同一性がBLASTP（GENBANK）などのいかなる標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、生じたアミノ酸配列が、配列番号6、配列番号8または配列番号10に対し、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、そして最も好ましくは少なくとも約90％の配列同一性を有し、そして生じたポリペプチドが本発明を実施するのに有用である、ことを意味する。
【００５５】
本明細書において、PAK5関連ポリペプチドは、該ポリペプチドを用い、真核、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒト細胞または組織由来のPAK5遺伝子産物に対し抗体を作成し、あるいはこうした細胞においてPAK5活性または産生を調節する化合物に関しスクリーニングすることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。
【００５６】
本発明はさらに、本発明の、前述のPAK5関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、PAK5関連ポリヌクレオチド分子の「実質的な部分」は、配列番号5、配列番号7、配列番号9（nt199〜2244）または配列番号11（nt6125〜17433）の全長より短いものからなるポリヌクレオチド分子またはそれと相同なポリヌクレオチド分子であるが、前記ヌクレオチド配列の長さの少なくとも約20％、そしてより好ましくは少なくとも約30％を含み、そして有用性がPAK5関連ポリヌクレオチド分子に関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である、前記ポリヌクレオチド分子を意味する。限定しない態様において、PAK5関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトPAK5遺伝子産物のペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。PAK5関連ポリペプチドの「ペプチド断片」は、配列番号6、配列番号8または配列番号10の下位配列からなるポリペプチドを指し、ここで下位配列は、有用性がPAK5関連ポリペプチドに関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である。本発明のペプチド断片は、好ましくは、長さが少なくとも約15アミノ酸残基であり、そしてより好ましくは少なくとも約30アミノ酸残基である。
【００５７】
本明細書に開示されるPAK5関連ポリヌクレオチド分子を用い、PAK5遺伝子産物の部分を発現させ、細胞または組織におけるPAK5遺伝子の発現を検出し、PAK5遺伝子が突然変異している（例えば相同的組換えにより改変されまたは除去されている）新規細胞株を調製し、周知の技術を用い（例えばAboら、以下を参照されたい）、ATP結合部位を突然変異させることにより、優性ネガティブPAK5を生成しそして発現させ、そして標準的な技術を用い、他の真核種または細胞種におけるPAK5ホモログ遺伝子を同定してもよい。したがって、本発明はさらに、PAK5ホモログ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、「PAK5ホモログ遺伝子産物」は、PAK5ホモログ遺伝子がコードする遺伝子産物として定義され、PAK5ホモログ遺伝子は、ヒト以外の真核種由来の遺伝子で、そして当業者により、約80％より大きいアミノ酸レベルでの配列同一性の度合いに基づき、ヒトPAK5遺伝子の相同体と認められるものとして定義される。PAK5ホモログ遺伝子を含むポリヌクレオチドクローンを同定するための方法は、上述のように、当業に知られる。
【００５８】
＜5.1.4.YSK関連ポリヌクレオチド分子＞
本発明はさらに、ヒト細胞由来のYSK2遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、YSK2遺伝子産物は、配列番号13のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号12のヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
本発明はさらに、本発明のYSK2遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。この点で用いられる場合、「相同」という用語は：（a）配列番号12がコードするのと同じポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のためヌクレオチド配列に、1つまたはそれ以上の沈黙変異を含む；または（b）BLASTN（GENBANK）などのいかなる標準的なヌクレオチド配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、配列番号12のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、そして最も好ましくは少なくとも約90％のヌクレオチド配列同一性を有し、そして中程度にストリンジェントな条件下、すなわち0．5  M  NaHPO4、7％  SDS、1  mM  EDTA中で65℃でのフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーション、および0．2  X  SSC／0．1％  SDS中で42℃での洗浄（Ausubelら、1989、上記）で、配列番号13のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして配列番号13の少なくとも最初の6アミノ酸残基をコードし、そして本発明を実施するのに有用である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下、すなわち0．5  M  NaHPO4、7％  SDS、1  mM  EDTA中で65℃でのフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーション、および0．1  X  SSC／0．1％  SDS中で68℃での洗浄（Ausubelら、1989、上記）で、配列番号13のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして配列番号13の少なくとも最初の6アミノ酸残基をコードし、そして本発明を実施するのに有用である。より好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号12のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして配列番号13の少なくとも最初の6アミノ酸残基をコードし、そして本発明を実施するのに有用である。
【００６０】
本明細書において、YSK2関連ポリヌクレオチド分子は：（i）真核細胞由来のYSK2遺伝子産物を、免疫特異的に認識する抗体を生成するのに用いることが可能なペプチドをコードし；または（ii）試験試料におけるYSK2転写物の存在を検出することが可能であり；または（iii）内因性YSK2遺伝子の制御または発現を改変するための方法を可能にすることができ（例えば遺伝子活性化または不活性化技術、例えばイントロンへの転写活性化因子配列の挿入、あるいは1つまたはそれ以上のエクソンの欠失により）；または（iv）PCRなどの標準的な増幅技術を用い、真核細胞において、YSK2  ORFのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を増幅するのに用いることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。こうした相同ポリヌクレオチド分子には、ヒト以外の真核種（および特に哺乳動物種、例えばマウス、ウシ、ヒツジ、モルモットおよびラットなど）、または他のヒト単離体に存在する天然発生YSK2遺伝子と共に、天然発生、化学合成、または遺伝子操作いずれでもよい、突然変異YSK2対立遺伝子を含んでもよい。
【００６１】
本発明はさらに、配列番号13のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ヒト細胞由来のYSK2遺伝子産物のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す際、「相同」という用語は、配列番号13のアミノ酸配列を含むが、保存的アミノ酸置換が上に定義されるように、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で保存的に置換されており、アミノ酸配列同一性がBLASTP（GENBANK）などのいかなる標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、生じたアミノ酸配列が、配列番号13に対し、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、そして最も好ましくは少なくとも約90％の配列同一性を有し、そして生じたポリペプチドが本発明を実施するのに有用である、ことを意味する。
【００６２】
本明細書において、YSK2関連ポリペプチドは、該ポリペプチドを用い、真核、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒト細胞または組織由来のYSK2遺伝子産物に対し抗体を作成し、あるいはこうした細胞または組織においてYSK2活性または産生を調節する化合物に関しスクリーニングすることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。
【００６３】
本発明はさらに、本発明の、前述のYSK2関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、YSK2関連ポリヌクレオチド分子の「実質的な部分」は、配列番号12の全長より短いものからなるポリヌクレオチド分子またはそれと相同なポリヌクレオチド分子であるが、前記ヌクレオチド配列の長さの少なくとも約20％、そしてより好ましくは少なくとも約30％を含み、そして配列番号13の少なくとも最初の6アミノ酸残基をコードし、そして有用性がYSK2関連ポリヌクレオチド分子に関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である、前記ポリヌクレオチド分子を意味する。限定しない態様において、YSK2関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のYSK2遺伝子産物のペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。YSK2関連ポリペプチドの「ペプチド断片」は、配列番号13のアミノ酸配列下位配列からなり、なお配列番号13の残基1〜6の配列を含むポリペプチドを指し、そして該下位配列は、有用性がYSK2関連ポリペプチドに関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である。本発明のペプチド断片は、好ましくは、長さが少なくとも約15アミノ酸残基であり、そしてより好ましくは少なくとも約30アミノ酸残基である。
【００６４】
本明細書に開示されるYSK2関連ポリヌクレオチド分子を用い、ヒトYSK2遺伝子産物の部分を発現させ、細胞種または組織におけるYSK2遺伝子産物の発現を検出し、YSK2遺伝子が突然変異している（例えば相同的組換えにより改変されまたは除去されている）新規細胞株を調製し、周知の技術を用い（例えばAboら、以下を参照されたい）、ATP結合部位を突然変異させることにより、優性ネガティブYSK2を生成しそして発現させ、そして他の真核種または細胞種におけるYSK2ホモログ遺伝子を同定してもよい。本明細書において、「YSK2ホモログ遺伝子産物」は、YSK2ホモログ遺伝子がコードする遺伝子産物として定義され、YSK2ホモログ遺伝子は、ヒト以外の真核種由来の遺伝子で、そして当業者により、約80％より大きいアミノ酸レベルでの配列同一性の度合いに基づき、ヒトYSK2遺伝子の相同体と認められるものとして定義される。YSK2ホモログ遺伝子を含むポリヌクレオチドクローンを同定するための方法は、上述のように、当業に知られる。
【００６５】
＜5.2.オリゴヌクレオチド分子＞
本発明はさらに、本発明の、前述のポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものにハイブリダイズする、または本発明の、前述のポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの相補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド分子を提供する。こうしたオリゴヌクレオチド分子は、好ましくは、少なくとも長さ約10ヌクレオチドであり、そしてより好ましくは、少なくとも長さ約20ヌクレオチドであり、そして中程度にまたは非常にストリンジェントな条件下で、前述のポリヌクレオチド分子の1つまたはそれ以上にハイブリダイズすることが可能である。より短いオリゴヌクレオチド分子に関しては、非常にストリンジェントな条件の例には、〜14塩基オリゴに関しては約37℃での、〜17塩基オリゴに関しては約48℃での、〜20塩基オリゴに関しては約55℃での、そして〜23塩基オリゴに関しては約60℃での、6  X  SSC／0．5％リン酸ナトリウム中の洗浄が含まれる。より長いオリゴヌクレオチド分子（すなわち約100  ntより大きいもの）に関しては、中程度におよび非常にストリンジェントな条件は、相同ポリヌクレオチド分子に関し、上の1．1節に記載されている。ハイブリダイゼーション条件は、利用される特定のオリゴヌクレオチド分子に応じ、当業に知られるように、適切に調整することが可能である。
【００６６】
好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、配列番号1、3、5、7、9、11または12からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対し、あるいは配列番号1、3、5、7、9、11または12からなる群より選択されるヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対し、非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００６７】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物コードポリヌクレオチド分子を増幅する際のプライマーとして、またはJNKKK遺伝子および遺伝子産物の発現を制御する際に有用なアンチセンス分子としてを含め、多様な目的に有用である。増幅は、適切に設計されたオリゴヌクレオチド分子を、標準的技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせて用い、行うことが可能であるが、当業に知られる他の増幅技術、例えばリガーゼ連鎖反応もまた、用いてもよい。例えば、PCRに関しては、適切に設計されたプライマー、増幅しようとするヌクレオチド配列を含むテンプレート、並びに適切なPCR酵素および緩衝液を含む混合物を調製し、そして標準的プロトコルにしたがいプロセシングし、テンプレートの特定のMLK4、PAK4、PAK5、またはYSK2関連ポリヌクレオチド配列を増幅する。
【００６８】
＜5.3.組換え発現系＞
＜5.3.1.発現ベクター＞
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子を含む、組換えクローニングベクターおよび組換え発現ベクターであって、本発明のMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2  ORFの部分、あるいは全長PAK5  ORFを含むポリヌクレオチド分子を含む、前記ポリヌクレオチド分子をクローニングしまたは発現するのに有用である、前記ベクターを提供する。
【００６９】
以下の説明は、他に示されない限り、上に定義されるような、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2  ORFの部分、全長PAK5  ORFを含むポリヌクレオチド分子、およびそれらの遺伝子産物、およびすべての相同ポリヌクレオチド分子、相同ポリペプチド、こうしたポリヌクレオチド分子の実質的な部分、並びにこうした産物およびポリペプチドのペプチド断片を含む、本発明の、前述のポリヌクレオチド分子およびポリペプチドのすべてに適用されることが意図される。
【００７０】
本発明の組換えベクター、特に発現ベクターは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチド分子のコード配列が、ポリペプチドを産生するため、コード配列の転写および翻訳に必要な、1つまたはそれ以上の制御要素と、機能可能であるように関連しているように構築される。本明細書において、「制御要素」という用語には、限定されるわけではないが、ポリヌクレオチドコード配列の発現をドライブするおよび／または制御するのに利用できる、当業に知られる、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび他の要素のヌクレオチド配列が含まれる。また、本明細書において、コード配列は、1つまたはそれ以上の制御要素と「機能可能であるように関連」しており、ここで該制御要素は、コード配列の転写またはそのmRNAの翻訳、あるいは両方を効果的に制御し、そして可能にする。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチド分子を含むよう設計することが可能な、典型的なプラスミドベクターには、とりわけ、pCR−Blunt、pCR2．1（Invitrogen）、およびpGEM3Zf（Promega）が含まれる。さらに、真核細胞、例えば哺乳動物細胞における発現のため、特に設計されているベクターが、Invitrogen（カリフォルニア州サンディエゴ）およびPromegaから商業的に入手可能である。
【００７２】
これらのベクターの制御要素は、その強度および特異性において多様である可能性がある。利用される宿主／ベクター系に応じ、いくつかの適切な転写および翻訳要素のいずれを用いてもよい。細菌のための転写制御領域またはプロモーターの、限定しない例には、β−galプロモーター、T7プロモーター、TACプロモーター、ラムダ左および右プロモーター、trpおよびlacプロモーター、並びにtrp−lac融合プロモーターが含まれる。真核細胞のための転写制御領域またはプロモーターの、限定しない例には、いくつかのみを挙げると、ウイルス制御領域、例えば、SV40初期プロモーター領域、ヘルペス・チミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域、内因性真核遺伝子由来の組織特異的または誘導性プロモーター、例えばアルブミンプロモーター、ミオシン軽鎖−2プロモーター、インスリンプロモーター、メタロチオネインプロモーター、および真菌プロモーター、例えばgal  4プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、および接合因子プロモーターが含まれる。
【００７３】
適切な制御要素と機能可能であるように関連している特定のコード配列を含む組換えベクターを構築するための方法は、当業に周知であり、そしてこれらのいずれを用い、本発明を実施してもよい。これらの方法には、in  vitro組換え技術、合成技術、およびin  vivo遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら、1989、上記；Ausubelら、1989、上記；Sambrookら、1989、上記；Innisら、1995、上記；およびErlich、1992、上記に記載される技術を参照されたい。
【００７４】
融合タンパク質発現ベクターを用い、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物融合タンパク質を発現させてもよい。精製融合タンパク質を用い、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物に対する抗血清を作成し、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の生化学的特性を研究し、異なる生化学的活性を持つMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2融合タンパク質を設計し、または組換え発現系において、発現されたMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の同定または精製を援助してもよい。使用可能な融合タンパク質発現ベクターには、限定されるわけではないが、β−ガラクトシダーゼおよびtrpE融合体、マルトース結合タンパク質融合体、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ融合体およびポリヒスチジン融合体（キャリアー領域）をコードする配列を組み込んだベクターが含まれる。
【００７５】
MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2融合タンパク質が精製に有用な領域を含むよう設計してもよい。例えば、MLK4、PAK4、PAK5およびYSK2−マルトース結合タンパク質融合体はアミロース樹脂を用い精製することが可能であり；MLK4、PAK4、PAK5およびYSK2−グルタチオン−S−トランスフェラーゼ融合タンパク質はグルタチオン・アガロースビーズを用い精製することが可能であり；そしてMLK4、PAK4、PAK5およびYSK2−ポリヒスチジン融合体は二価ニッケル樹脂を用い精製することが可能である。あるいは、キャリアータンパク質またはペプチドに対する抗体を、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製のため、用いてもよい。例えば、モノクローナル抗体の標的エピトープをコードするヌクレオチド配列を、制御要素と機能可能であるように関連するよう、発現ベクター内に設計し、そして配置し、発現されたエピトープがMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドに融合するようにしてもよい。例えば、親水性マーカーペプチドであるFLAGTMエピトープタグ（International  Biotechnologies  Inc．）をコードするヌクレオチド配列を、標準的な技術により、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドのアミノまたはカルボキシル末端に対応する点で、発現ベクター内に挿入してもよい。発現されたMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチド−FLAGTMエピトープ融合産物をその後、商業的に入手可能な抗FLAGTM抗体を用い、検出し、そしてアフィニティー精製してもよい。
【００７６】
MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2融合タンパク質をコードする発現ベクターはまた、特異的なプロテアーゼ切断部位をコードする配列を含むように設計し、特異的なプロテアーゼでの処理により、発現されたMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドが、キャリアー領域または融合パートナーから放出されるようにしてもよい。例えば、融合タンパク質ベクターには、とりわけ、トロンビン、または因子Xa切断部位をコードするDNA配列を含んでもよい。
【００７７】
既知の方法により、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2  ORFの上流でそして読み枠内で、シグナル配列を発現ベクター内に設計し、発現された遺伝子産物の輸送（trafficking）および分泌を指示してもよい。シグナル配列の限定しない例には、とりわけ、α因子、免疫グロブリン、外膜タンパク質、ペニシリナーゼ、およびT細胞受容体由来のものが含まれる。
【００７８】
本発明のクローニングまたは発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされている宿主細胞の選択を援助するため、ベクターは、さらにリポーター遺伝子産物または他の選択可能マーカーのコード配列を含むよう、設計してもよい。こうしたコード配列は、好ましくは、上述のように、制御要素コード配列と機能可能であるように関連している。本発明に有用である可能性があるリポーター遺伝子は当業に周知であり、そしてとりわけ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、xylE、およびチロシナーゼをコードするものが含まれる。選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列は当業に周知であり、そして抗生物質または代謝拮抗物質に対する耐性を与える、または栄養要求性必要条件を供給する遺伝子産物をコードするものが含まれる。こうした配列の例には、とりわけ、メトトレキセート、G418またはミコフェノール酸に対する耐性をコードするものが含まれる。
【００７９】
＜5.3.2.宿主細胞＞
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子または組換えベクターを含む形質転換宿主細胞、およびそこから由来する新規株または細胞株を提供する。本発明の実施に有用な宿主細胞は、好ましくはヒト細胞であるが、他の真核細胞または原核細胞もまた、用いてもよい。こうした他の形質転換宿主細胞には、典型的には、限定されるわけではないが、微生物、例えば、とりわけ、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNAベクターで形質転換されている細菌、あるいは組換えベクターで形質転換されている酵母が含まれる。
【００８０】
望ましい特定の方式で遺伝子産物を修飾しそしてプロセシングする、適切な宿主細胞を選択してもよい。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、糖鎖付加、リン酸化）のための特徴的な機構を有する。例えば、細菌系における発現を用い、非糖鎖付加タンパク質産物を産生してもよい。酵母における発現および分泌は、糖鎖付加タンパク質産物を産生することが可能である。哺乳動物細胞における発現を用い、タンパク質産物の「天然」プロセシングを確実にしてもよい。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる度合いでプロセシング反応に影響を及ぼす可能性がある。
【００８１】
例えばクローニングまたは発現目的のため、宿主細胞として好ましい細菌細胞は、大腸菌（E．  coli）の株である。典型的には、培養で増殖するよう、そしてクローニング技術のために適応させた大腸菌株、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）、米国メリーランド州ロックビル（寄託番号第31343号）または商業的供給源（Stratagene）いずれからも入手可能なDH5α株を、用いることが可能である。好ましい真核宿主細胞には、ヒト細胞、および特に角化細胞が含まれるが、他の哺乳動物細胞および酵母細胞または昆虫細胞もまた、効果的に利用することが可能である。
【００８２】
本発明の組換え発現ベクターは、好ましくは、実質的に均質な細胞培養の1つまたはそれ以上の宿主細胞に形質転換またはトランスフェクションされる。発現ベクターは、一般的に、既知の技術にしたがい、例えばプロトプラスト形質転換、リン酸カルシウム沈澱、塩化カルシウム処理、微量注入、エレクトロポレーション、組換えウイルスとの接触によるトランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、形質導入、接合（conjugation）、または微粒子銃により、宿主細胞に導入される。形質転換体の選択は、標準法により、上述のように、例えば組換えベクターと関連している選択可能マーカー、例えば抗生物質耐性を発現している細胞を選択することにより、行ってもよい。
【００８３】
宿主細胞に発現ベクターが導入されたら、宿主細胞染色体またはエピソームいずれかにおける、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連コード配列の組込みおよび維持を、標準的技術により、例えばサザンハイブリダイゼーション解析、制限酵素解析、逆転写酵素PCR（rt−PCR）を含むPCR解析により、または免疫学的アッセイにより、期待される遺伝子産物が検出されることを確認してもよい。組換えMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連コード配列を含むおよび／または発現している宿主細胞は、当業に周知の少なくとも4つの一般的なアプローチのいずれにより同定してもよく、該アプローチには：（i）DNA−DNA、DNA−RNA、またはRNA−アンチセンスRNAハイブリダイゼーション；（ii）「マーカー」遺伝子機能の存在の検出；（iii）宿主細胞におけるMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2特異的mRNA転写物の発現により測定されるような転写レベルの評価および（iv）例えばイムノアッセイにより測定されるような成熟ポリペプチド産物の存在の検出が含まれる。
【００８４】
＜5.3.3.JNKKKポリペプチドの発現および性質決定＞
MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連コード配列が適切な宿主細胞に安定して導入されたら、形質転換宿主細胞をクローン的に増殖させ、そして生じた細胞をMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連遺伝子産物の最大産生を導くことが可能な条件下で増殖させる。こうした条件には、典型的には、高密度に細胞を増殖させることが含まれる。発現ベクターが誘導性プロモーターを含む場合、適切な誘導条件、例えば温度シフト、栄養素の枯渇、無償性の（gratuitous）誘導因子の添加（例えば炭水化物類似体、例えばイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（IPTG））、過剰な代謝副産物の集積、またはそれらに匹敵するものが、発現を誘導するのに必要とされるように使用される。
【００８５】
発現されたMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連遺伝子産物が宿主細胞内に保持される場合、細胞を採取しそして溶解し、そして、タンパク質分解を最小限にするため、当業に知られる抽出条件下、例えば4℃でまたはプロテアーゼ阻害剤の存在下で、あるいは両方の条件下で、産物を溶解物から単離し、そして精製する。発現されたMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連遺伝子産物が宿主細胞から分泌される場合、枯渇した栄養素培地を、単純に収集し、そしてそこから産物を単離する。
【００８６】
発現されたMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連遺伝子産物は、適切なように、限定されるわけではないが、以下の方法：硫酸アンモニウム沈澱、サイズ分画、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、密度遠心分離、およびアフィニティークロマトグラフィーのいかなる組み合わせをも含む、標準的な方法を用い、細胞溶解物または培地から単離しまたは実質的に精製してもよい。発現されたMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連遺伝子産物が生物学的活性を示す場合、適切なアッセイの使用により、精製法の各工程で、調製の純度の増加をモニターしてもよい。発現されたMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連遺伝子産物が生物学的活性を示しても示さなくても、各々、例えば大きさ、またはそうでなければMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2に特異的な抗体との反応性に基づき、あるいは融合タグの存在により、検出することが可能である。
【００８７】
本発明はこうして、本発明のポリヌクレオチド分子がコードする実質的に精製または単離されているポリペプチドを提供する。特定の、しかし限定しない態様において、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を含む、ヒトMLK4遺伝子産物、またはその部分である。別の特定の、しかし限定しない態様において、ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含む、ヒトPAK4遺伝子産物、またはその部分である。さらに別の特定の、しかし限定しない態様において、ポリペプチドは、配列番号6、8または10のアミノ酸配列を含む、ヒトPAK5遺伝子産物、またはその部分である。さらに別の特定の、しかし限定しない態様において、ポリペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列を含む、ヒトYSK2遺伝子産物、またはその部分である。本発明はさらに、本発明のMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2のいかなるものでもよいものに相同な、実質的に精製または単離されているポリペプチドを提供し、相同ポリペプチドは上に定義される通りである。本発明はさらに、本発明の、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物のペプチド断片または相同ポリペプチドを提供し、ペプチド断片は上に定義される通りである。本発明の、実質的に精製または単離されているポリペプチドは、多様な目的、例えばMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2タンパク質と相互作用する、そしてしたがってMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2活性（情報伝達に関与する事象を含む）に影響を及ぼす化合物の候補である化合物に関するスクリーニング、およびMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物に対して向けられる抗体の作成などに有用である。こうした化合物および抗体を、治療法で用い、皮膚に対するUV損傷を治療しまたは予防してもよい。
【００８８】
本明細書において、ポリペプチドは、該ポリペプチドが特定の調製において、成分重量の大部分（すなわち少なくとも約50％）を構成する場合、「実質的に精製」されている。また、本明細書において、ポリペプチドは、該ポリペプチドが特定の調製において、成分の少なくとも約90重量％を構成する場合、「単離」されている。また、本明細書において、ポリヌクレオチド分子は、該分子が特定の調製において、核酸成分の少なくとも約90重量％を構成する場合、または例えばゲル電気泳動技術により測定されるように、他のすべてのポリヌクレオチド分子から分離されているように見える場合、「単離」されている。
【００８９】
本発明はさらに、本発明の、実質的に精製または単離されているMLK4遺伝子産物、PAK4遺伝子産物、PAK5遺伝子産物、YSK2遺伝子産物またはペプチド断片を調製する方法であって、本発明のポリヌクレオチド分子または組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされている宿主細胞を、特定の遺伝子産物、ポリペプチド、またはペプチド断片の発現を導くことが可能な条件下で培養し、ここで前記組換えベクターはそれぞれ、本発明のMLK4遺伝子産物、PAK4遺伝子産物、PAK5遺伝子産物、YSK2遺伝子産物またはペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含み、該ヌクレオチド配列は、1つまたはそれ以上の制御要素と機能可能であるように関連している、そして細胞培養から、実質的に精製または単離されている型で、発現された遺伝子産物、ポリペプチド、またはペプチド断片を回収することを含む、前記方法を提供する。
【００９０】
充分な純度のMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物が得られたら、SDS−PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列解析、キナーゼ活性などの生物学的活性によるものを含む、標準的方法により、性質決定してもよい。例えば、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物のアミノ酸配列は、標準的なペプチド配列決定技術を用い、決定することが可能である。MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物は、それぞれMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の疎水性および親水性領域を同定するため、親水性解析（例えば、HoppおよびWoods，  1981，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  78：3824を参照されたい）、または類似のソフトウェアアルゴリズムを用い、さらに性質決定してもよい。構造解析を行い、特定の二次構造を取るMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の領域を同定してもよい。生物物理的方法、例えばX線結晶解析（Engstrom，  1974，  Biochem．  Exp．  Biol．  11：7−13）、コンピューターモデリング（EletterickおよびZoller（監修），  1986，  Current  Communications  in  Molecular  Biology，  Cold  Spring  Harbor  Laboratory，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー中）、および核磁気共鳴（NMR）を用い、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物およびそれらの基質の間の相互作用の部位をマッピングしそして研究してもよい。これらの研究から得た情報を用い、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物上の特定の部位を、これらの遺伝子産物と相互作用し、そして活性を改変させる薬剤候補の潜在的な標的として選択してもよい。
【００９１】
＜5.4.抗体＞
本発明はさらに、本発明の、MLK4遺伝子産物、PAK4遺伝子産物、PAK5遺伝子産物、YSK2遺伝子産物に対し、あるいは相同ポリペプチドまたはペプチド断片に対し結合する、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。こうした抗体は、天然MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物を精製する、あるいはMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の活性または生物学的機能を解析するアフィニティー試薬として、用いてもよい。
【００９２】
抗体は、本発明の、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2関連ポリペプチドのいずれに対し作成してもよい。抗MLK4、抗PAK4、抗PAK5または抗YSK2特異的抗体を産生するのに知られる方法にしたがい、限定されるわけではないが、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスを含む、多様な宿主動物を用いてもよい。当業に知られる多様なアジュバントを用い、抗体産生を亢進してもよい。
【００９３】
標準的技術を用い、ポリクローナル抗体を免疫化動物から得て、そして抗MLK4、抗PAK4、抗PAK5または抗YSK2特異性に関し試験してもよい。あるいは、培養中の連続する細胞株による抗体分子産生を提供するいかなる技術を用い、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を調製してもよい。これらには、限定されるわけではないが、元来KohlerおよびMilstein（Nature，  1975，  256：495−497）に記載されたハイブリドーマ技術；ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kosborら，  1983，  Immunology  Today  4：72；Coteら，  1983，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  80：2026−2030）；およびEBV−ハイブリドーマ技術（Coleら，  1985，  Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy，  Alan  R．  Liss，  Inc．，  pp．77−96）が含まれる。あるいは、一本鎖抗体産生のため記載された技術（例えば米国特許第4，946，778号を参照されたい）を適応させ、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2特異的一本鎖抗体を産生してもよい。これらの刊行物は、本明細書に援用される。
【００９４】
MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドに特異的な結合部位を含む抗体断片もまた、本発明に含まれ、そして既知の技術により生成することが可能である。こうした断片には、限定されるわけではないが、損なわれていない（intact）抗体分子のペプシン消化により生成することが可能な、F（ab’）2断片、およびF（ab’）2断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することが可能な、Fab断片が含まれる。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築し（Huseら，  1989，  Science  246：1275−1281）、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドに対し望ましい特異性を有するFab断片の迅速な同定を可能にしてもよい。
【００９５】
モノクローナル抗体および抗体断片を産生するための技術は当業に周知であり、そして、とりわけ、HarlowおよびLane，  1988，  Antibodies：A  Laboratory  Manual，  Cold  Spring  Harbor  Laboratory；およびJ．W．  Goding，  1986，  Monoclonal  Antibodies：Principles  and  Practice，  Academic  Press，ロンドンにさらに記載されている。上に引用されたすべての刊行物は、本明細書に援用される。
【００９６】
＜5.5.アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム＞
やはり本発明の範囲内にあるのは、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2  mRNAに結合する、該mRNAを分解するおよび／または該mRNAの翻訳を阻害するよう機能する、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートおよびリボザイムを含むオリゴヌクレオチド配列である。
【００９７】
アンチセンスRNA分子およびアンチセンスDNA分子を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的mRNAに結合し、そしてタンパク質翻訳を妨げることにより、mRNAの翻訳を直接遮断するよう、作用する。例えば、少なくとも約15塩基でそしてMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドをコードするDNA配列の特有の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば慣用的なホスホジエステル技術により、合成することが可能である。
【００９８】
リボザイムは、RNAの特異的な切断を触媒することが可能な酵素性RNA分子である。リボザイム作用の機構は、相補的な標的RNAに対するリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーションの後、ヌクレオチド鎖切断（endonucleolytic  cleavage）を伴う。MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2  mRNA配列のヌクレオチド鎖切断を特異的にそして効果的に触媒する、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子もまた、本発明の範囲内である。
【００９９】
いかなる潜在的なRNA標的内の特異的なリボザイム切断部位も、まず、以下の配列、GUA、GUU、およびGUCを含む、リボザイム切断部位に関し標的分子をスキャンすることにより、同定される。同定されたら、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約15および20リボヌクレオチドの間の短いRNA配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にする可能性がある二次構造などの予測される構造的特徴に関し、評価してもよい。候補標的の適切さはまた、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用い、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性（accessibility）を試験することにより、評価してもよい。
【０１００】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは両方とも、既知の方法により調製することが可能である。これらには、例えば固相ホスホアミト（phosphoamite）化学合成などの化学合成のための技術が含まれる。あるいは、アンチセンスRNA分子は、RNA分子をコードするDNA配列のin  vitroまたはin  vivo転写により、生成してもよい。こうしたDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込む多様なベクターに組み込んでもよい。
【０１０１】
細胞内安定性および半減期を増加させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに多様な修飾を導入してもよい。可能性がある修飾には、限定されるわけではないが、分子の5’および／または3’端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、あるいはオリゴヌクレオチド骨格内のホスホロチオエートの使用またはホスホジエステル結合の代わりの2’−O−メチルの使用が含まれる。
【０１０２】
＜5.6.JNKKK遺伝子産物の検出、並びに診断および治療的使用＞
本発明の、MLK4、PAK4、PAK5およびYSK2ポリペプチド分子、オリゴヌクレオチド、およびポリペプチドと共に、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドを認識する本発明の抗体は、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の発現における改変から生じる疾患または異常の診断に有用である。発現における改変は、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子の転写における増加または減少、あるいはMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の翻訳における増加または減少いずれでもよい。あるいは、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子配列における突然変異、対立遺伝子、または多型の存在は、限定されるわけではないが、紫外線光または他のストレスにより引き起こされる皮膚損傷、あるいは乾癬に対する感受性の増加または減少を含む、疾患または異常と相関させることが可能である。
【０１０３】
核酸に基づく検出法は、当業に周知であり、そしてハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンおよびサザンハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイ、および連結連鎖反応（LCR）アッセイ、または上記の組み合わせ（例えばin  situハイブリダイゼーション）が含まれる。こうしたアッセイは、上述のような、相補的配列を含む、本発明の、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを利用する。RNA遺伝子産物の解析が望ましい場合、当業に知られるように、特定のアッセイは、典型的には、増幅および／またはハイブリダイゼーションの前に逆転写工程を含むであろう。こうした核酸に基づく技術は、一般の当業者により設計し、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子発現のレベル、あるいは特定の突然変異、対立遺伝子または多型の存在または非存在をアッセイしてもよい。
【０１０４】
タンパク質またはポリペプチドに基づく検出法もまた、一般の当業者に周知であり、そして例えば免疫学的アッセイ、例えば標識標的のウェスタンブロット、免疫沈降、およびELISAアッセイが含まれる。これらのアッセイは、上述の本発明の抗体を用いる。再び、こうしたアッセイは、細胞または生物により発現されるMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドのレベル、あるいはMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドにおける突然変異、対立遺伝子、または多型の存在または非存在を測定してもよい。
【０１０５】
異常な状態が、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の過剰産生または産生不足と関連している場合、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、異常な状態を予防する、改善するまたはそうでなければ治療するのに有用である可能性がある。例えば、遺伝子配列を細胞に導入することにより、遺伝子治療を用い、細胞が不適切なレベルのMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物を発現している、あるいは異常なまたは不活性なMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドを発現している異常を治療してもよい。いくつかの例において、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の過剰発現により特徴付けられる異常な状態は、以下に記載される遺伝子治療技術を用い、予防しまたは治療することが可能である。特に、遺伝子治療ベクターが、上述のような本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムを発現するよう設計し、それによりポリペプチドに効果的に翻訳されるMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の量を減少させてもよい。
【０１０６】
レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターを、標的細胞集団への組換えMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリヌクレオチドの搬送に用いてもよい。当業者に周知の方法を用い、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを構築してもよい。例えば、Maniatisら，  1989，  Molecular  Cloning，  A  Laboratory  Manual，  Cold  Spring  Harbor  Laboratory，ニューヨーク；およびAusubelら，  1989，  Current  Protocols  in  Molecular  Biology，  Greene  Publishing  Associates  and  Wiley  Interscience，ニューヨークに記載される技術を参照されたい。あるいは、いくつかの例のみを挙げると、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリヌクレオチドを含む、組換え非ウイルスベクターを、標的細胞への搬送のため、リポソームに再構成してもよいし、あるいは例えば「DNAワクチン」におけるように、裸のポリヌクレオチドとして搬送してもよい。
【０１０７】
＜5.7.薬剤スクリーニング適用＞
ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドを含む、MLK4、PAK4、PAK5およびYSK2遺伝子産物は、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物に特異的に結合し、そしてしたがってそれぞれ、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとしての潜在的な使用を有する化合物を同定する、スクリーニングアッセイに用いてもよい。特定の好ましい使用において、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドのキナーゼ活性に影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングするのに有用である。
【０１０８】
本発明はしたがって、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドに特異的に結合する分子を検出するアッセイを提供する。例えば、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリヌクレオチドを発現している組換え細胞を用い、それぞれMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドを組換え的に産生してもよいし、そしてそれぞれMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドに結合する分子に関しスクリーニングしてもよい。前述を行うのに用いることが可能な方法は、一般的に、当業に知られる。
【０１０９】
多様性ライブラリー、例えば無作為またはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーを、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドに特異的に結合する分子に関しスクリーニングしてもよい。用いてもよい多くのライブラリーが当業に知られ、例えば化学合成ライブラリー、組換え（例えばファージディスプレー）ライブラリー、およびin  vitro翻訳に基づくライブラリーがある。
【０１１０】
化学合成ライブラリーの例は、Fordorら，  1991，  Science  251：767−773；Houghtenら，  1991，  Nature  354：84−86；Lamら，  1991，  Nature  354：82−84；Medynski，  1994，  Bio／Technology  12：709−710；Gallopら，  1994，  J．  Medicinal  Chemistry  37（9）：1233−1251；Ohlmeyerら，  1993，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  90：10922−10926；Erbら，  1994，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  91：11422−11426；Houghtenら，  1992，  Biotechniques  13：412；Jayawickremeら，  1994，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  91：1614−1618；Salmonら，  1993，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  90：11708−11712；1993年10月14日付けのPCT刊行物第WO  93／20242号；並びにBrennerおよびLerner，  1992，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  89：5381−5383に記載されている。
【０１１１】
ファージディスプレーライブラリーの例は、ScottおよびSmith，  1990，  Science  249：386−390；Devlinら，  1990，  Science，  249：404−406；Christian，  R．B．ら，  1992，  J．  Mol．  Biol．  227：711−718；Lenstra，  1992，  J．  Immunol．  Meth．  152：149−157；Kayら，  1993，  Gene  128：59−65；並びに1994年8月18日付けのPCT刊行物第WO  94／18318号に記載されている。
【０１１２】
in  vitro翻訳に基づくライブラリーには、限定されるわけではないが、1991年4月18日付けのPCT刊行物第WO  91／05058号；およびMattheakisら，  1994，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  91：9022−9026に記載されるものが含まれる。
【０１１３】
1つの例において、非ペプチドライブラリー、例えばベンゾジアゼピンライブラリー（例えばBuninら，  1994，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  91：4708−4712を参照されたい）をスクリーニングしてもよい。Simonら，  1992，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  89：9367−9371に記載されるものなど、ペプトイドライブラリーもまた用いてもよい。用いてもよいライブラリーの別の例は、ペプチドにおけるアミド官能性がペルメチル化（permethylated）されており、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリーを生成しているものであり、Ostreshら（1994，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  91：11138−11142）に記載されている。
【０１１４】
ライブラリーのスクリーニングは、一般的に知られる多様な方法のいずれにより、達成してもよい。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する、以下の参考文献：ParmleyおよびSmith，  1989，  Adv．  Exp．  Med．  Biol．  251：215−218；ScottおよびSmith，  1990，  Science  249：386−390；Fowlkesら，  1992，  BioTechniques  13：422−427；Oldenburgら，  1992，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  89：5393−5397；Yuら，  1994，  Cell  76：933−945；Staudtら，  1988，  Science  241：577−580；Bockら，  1992，  Nature  355：564−566；Tuerkら，  1992，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  89：6988−6992；Ellingtonら，  1992，  Nature  355：850−852；すべてLadnerらに対する米国特許第5，096，815号、米国特許第5，223，409号、および米国特許第5，198，346号；RebarおよびPabo，  1993，  Science  263：671−673；並びにPCT刊行物第WO  94／18318号を参照されたい。
【０１１５】
特定の態様において、スクリーニングは、固相に固定したMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドとライブラリーメンバーを接触させ、そして該ポリペプチドに結合するライブラリーメンバーを採取することにより、行ってもよい。こうしたスクリーニング法の例は、「パンニング（panning）」技術と呼ばれ、例としてParmleyおよびSmith，  1988，  Gene  73：305−318；Fowlkesら，  1992，  BioTechniques  13：422−427；PCT刊行物第WO94／18318号；および上に引用された他の参考文献に記載されている。
【０１１６】
別の態様において、酵母において相互作用するタンパク質を選択するためのツーハイブリッド系（FieldsおよびSong，  1989，  Nature  340：245−246；Chienら，  1991，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA  88：9578−9582）を用い、細胞内でMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドに特異的に結合する分子を同定してもよい。
【０１１７】
本発明の別の側面において、薬剤のための候補化合物をスクリーニングするための方法が提供される。こうした薬剤を用い、患者において、紫外線光誘導損傷、炎症および乾癬を減少させ、そして外傷治癒を亢進させることが可能である。患者は動物、典型的には哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０１１８】
例えば、本発明のMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の発現に影響を及ぼす化合物に関し：（a）試験試料に試験化合物を適用し；（b）該試験試料における、少なくとも1つのMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の発現を測定し；そして（c）該試験試料における該遺伝子の発現を、参照試料におけるものと比較することにより、スクリーニングすることが可能である。参照試料と比較した該試験試料における遺伝子産物の細胞レベルの特異的な変化は、該化合物がJNKKK遺伝子由来の遺伝子産物の細胞レベルに影響を及ぼすことを示す。「遺伝子産物の細胞レベルの特異的な変化」という用語により、レベルの変化が細胞における総合的な転写または翻訳レベル（アッセイされる遺伝子産物に依存する）を改変することなく起こることを意味する。例えば、mRNAを測定する場合、「特異的な変化」を引き起こす化合物は、一般的な転写リプレッサーである化合物ではない。同様に、例えば、タンパク質レベルをアッセイする際、「特異的な変化」を引き起こす化合物は、一般的な翻訳リプレッサーではない。転写または翻訳に対する全体的な影響が試験化合物の存在下で起こるかどうかは、コントロールのハウスキーピング遺伝子産物（例えば2例のみを挙げると、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子産物またはアクチン遺伝子産物）に関しアッセイすることにより、決定することが可能である。
【０１１９】
また、ストレス事象の存在下またはストレス事象に対する反応における、試験化合物の、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子またはポリペプチドの発現または細胞反応に対する影響をアッセイすることも可能である。細胞に適用するストレス事象は、紫外線照射に対する曝露であってもよい。好ましい紫外線照射は、320−400  nmの範囲内の波長のUV−Aであってもよいし、または280−320  nmの範囲内の波長のUV−Bであってもよいし、または200−280  nmの範囲内の波長のUV−Cであってもよい。スクリーニング目的のため、試料に適用する他の種類のストレス事象は、例えばTNF−α、IL−1、インターフェロン類、FGF類またはPDFGなどの炎症性サイトカインに対する曝露であってもよい。さらに別の種類のストレス事象は、熱ショック、浸透ショック、ヒ素などの毒性化学薬品に対する曝露、（例えば溶媒での）透過性バリアーの破壊などである。
【０１２０】
1つの好ましい態様において、薬剤スクリーニング法は：（a）試験試料に試験化合物を適用し；（b）該試験試料および参照試料をストレス事象に曝露し；（c）該試験試料における、少なくとも1つの遺伝子産物の発現を測定し、ここで該遺伝子産物の転写物は、配列番号1、3、5、7、9、11および12からなる群より選択される配列を含む；そして（d）該試験試料における該遺伝子産物の発現を、参照試料におけるものと比較することにより、ストレス事象に対する細胞反応を遮断するまたはそうでなければ調節する際の試験化合物の有効性を決定することを含む。試験化合物がストレス事象に反応し、転写物の発現を有意に減少させる場合、該試験化合物は、該ストレス事象に対する細胞反応を遮断するのに潜在的に有効である可能性がある薬剤候補として同定される。MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の発現は、上述のいかなる方法を用い、測定してもよい。本アッセイに用いるのに最も好ましい遺伝子産物は、PAK5およびYSK2遺伝子産物である。
【０１２１】
別の好ましい態様において、薬剤スクリーニングの方法は：（a）試験試料に試験化合物を適用し；（b）該試験試料にストレス事象を適用し；そして（c）該試験試料におけるそして参照試料におけるMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドの量を測定する、ここでMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドは配列番号2、4、6、8、10および13からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む；ここで参照試料と比較した該試験試料におけるMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドの量の減少は、試験化合物がストレス反応を潜在的に遮断することが可能な薬剤候補として同定される、ことを伴う。
【０１２２】
本発明のさらに別の側面は、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドの活性に影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングする方法である。試験化合物を試験試料に適用し、そして参照試料に比較した該試験試料におけるMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドの活性を測定してもよい。参照試料に比較した該試験試料におけるMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチド活性を改変する試験化合物は、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドの活性に潜在的に影響を及ぼす可能性がある薬剤候補として同定される。全長MLK4、PAK4、PAK5およびYSK2ポリペプチドは各々キナーゼであり；したがって、これらのポリペプチドの活性にはキナーゼ活性並びにATPおよびその類似体に対する結合が含まれる。他の活性には、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドキナーゼ活性を活性化する活性化因子と相互作用する能力、下流標的タンパク質との相互作用、およびアミノ末端制御ドメインを介した阻害剤との相互作用が含まれる。
【０１２３】
別の好ましい態様において、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドの活性、例えばキナーゼ活性、ATPおよびその類似体への結合、または下流標的タンパク質の活性化を、ストレス事象の適用に対する反応において、試験試料および参照試料においてアッセイし、そして比較し、薬剤候補の有効性を予測してもよい。薬剤候補が、特定のストレス事象、例えば紫外線照射による、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドの機能の誘導を妨げる場合、該薬剤候補は、該ストレス反応を遮断するのに有効である可能性がある。
【０１２４】
いくつかの好ましい態様において、試験試料および参照試料は培養細胞、組織または器官である。他の好ましい態様において、試験試料および参照試料は生存動物である。特に好ましい態様において、ヒト皮膚の小さな生検（例えば約5  mm3）を培養し、そして例えば紫外線照射、1つまたはそれ以上の増殖因子、サイトカイン、薬剤、ホルモンまたはビタミンで処理する。明示された時間後（処理が紫外線照射である場合、典型的には24−48時間後）、MLK4、PAK4、PAK5またはYSK2遺伝子産物の発現に関し、またはMLK4、PAK4、PAK5またはYSK2ポリペプチドの活性に関し、生検を試験する。
【０１２５】
本発明は記載されてきているが、以下の実施例は、例示の手段として提供され、そして限定ではない。
【実施例】
【０１２６】
＜実施例1：YSK2、MLK4、PAK4およびPAK5  cDNAのクローニング＞
本実施例は、本発明の新規JNKKKのクローニングに用いる方法を例示する。
（材料および方法）
正常ヒト包皮表皮角化細胞は、ストーニーブルックのニューヨーク州立大学のM．  Simon博士の好意により提供された。3T3フィーダー層を用い、培養を開始し、そしてその後、使用するまで液体窒素中で凍結した。融解すると、ウシ脳下垂体抽出上皮増殖因子、インスリン、甲状腺ホルモンおよびヒドロコルチゾンを補った、明示された血清不含角化細胞増殖培地（KGM）（角化細胞−SFM、GIBCO）中で、フィーダー細胞なしに、角化細胞を増殖させた。
【０１２７】
RT−PCRキット（Promega  Corp．、ウィスコンシン州マディソン）を用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）増幅のため、角化細胞由来のメッセンジャーRNAを用いた。JNKKまたはJNKKKのキナーゼドメインの間の相同領域に対応するプライマーを設計し、RT−PCRを用い、角化細胞mRNA由来の150  bp  PCR産物を増幅した。該プライマーは、キナーゼドメイン領域に対応する以下の配列を含む。
順方向：5’−ATGCA（CA）CANGA（CT）AT（ACT）AA（AG）−3’（配列番号14）
逆方向：5’−GCNAC（CT）TCNGGNGCCATCCA−3’（配列番号15）
RT−PCRに用いた実際のプライマーはまた、クローニング部位も含んだ。これらの配列は以下の通りである：
順方向：5’−CCCGAATTCATGCA（CA）CANGA（CT）AT（ACT）AA（AG）−3’（配列番号16）
逆方向：5’−CCCGAATTCGCNAC（CT）TCNGGNGCCATCCA−3’（配列番号17）
PCR産物をサブクローニングし、そして配列決定した。
【０１２８】
（結果）
配列決定した70の異なるクローンの中で、10の異なるJNKKKが同定され、そのうち4つが新規であるようであった。他のJNKKKとの、欧州分子生物学ネットワーク（European  Molecular  Biology  Network）におけるタンパク質データベース（HYPERLINK  http：／／www．expasy．ch；http：／／www．expasy．ch；http：／／www．ch．embnet．orgで利用可能）に対するアミノ酸配列比較により、4つの新規JNKKKは、いくつかの異なるファミリーの、多様な既知のJNKKKに対し、ある程度の相同性を示すことが明らかになった。1つのJNKKKクローンは、12−131位で、ネズミYSK2遺伝子配列の134塩基領域（emb：U49949の503−384位に対応、Osadaら，  1997，  Oncogene  14：2047−2057）に91％同一であり；それゆえ、本クローンは、ヒト角化細胞YSK2（配列番号12）と名付けられた。さらに、2つのヒト発現配列タグ（EST）はヒト角化細胞YSK2に関連していた。特に、ヒトEST  emb：AA557573（NCI−CGAP、“National  Cancer  Institute，  Cancer  Genome  Anatomy  Project  （CGAP），  Tumor  Gene  Index  http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／ncicgap”、未刊行）は、ヒトYSK遺伝子配列（配列番号12）と、配列番号12の6−142位およびemb：AA557573の32−168位に対応する137  bp領域で、96％同一性を示した。ヒトEST  emb：AA578088（NCI−CGAP、“National  Cancer  Institute，  Cancer  Genome  Anatomy  Project  （CGAP），  Tumor  Gene  Index  http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／ncicgap”、未刊行）もまた、配列番号12と、配列番号12の6−141位およびemb：AA578088の35−170位に対応する136  bp領域で、96％同一性を示した。
【０１２９】
MLK4（配列番号1）と称される別のJNKKKクローンは、JNKKKのMLKファミリーのメンバーに50％〜78％同一であった。最後に、PAK4（配列番号3）およびPAK5（配列番号5）と称される2つのJNKKKクローンは、JNKKKのPAKファミリーのメンバーに同様の同一性を示した。しかし、欧州分子生物学ネットワークタンパク質データベースにおいて、MLK4またはPAK5のいずれにも、相同体配列を発見することはできなかった。PAK4の最初の配列検索では、PAK4がPAK遺伝子ファミリーの新規メンバーであることが示されたが、本研究の途中で、ヒトPAK4の全長配列が公表された（Aboら，  1998，  EMBO  J  22：6527−6540）。
【０１３０】
同定された異なるJNKKKの相対存在量は、以下の表1に示される。
【０１３１】
【表１】
2004290197.tif 000002
【０１３２】
*LIMKは、JNKKKファミリーに関係しているがそのメンバーではないプロテインキナーゼである。Frangiskakisら，  1996，  Cell  86：59−69。BPAG1は基底角化細胞に豊富なタンパク質である。BPAG1のmRNAは、我々のオリゴヌクレオチドの3’末端の8塩基により認識される2つの部分を含む。
【０１３３】
MLK4、PAK4、PAK5およびYSK2  mRNAのRT−PCR産物（配列番号1、3、5、12）を、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓由来のmRNAに対するノーザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いた。図2は、試験された器官で、PAK4遺伝子の発現が遍在性であることを示す。しかし、PAK5遺伝子は、角化細胞および脳で強く発現しているが、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓では発現していないか、または弱くしか発現していない。MLK4遺伝子は、角化細胞、腎臓および膵臓で発現しているが、脳、胎盤、肺、肝臓、および骨格筋で発現していない。PAK4、PAK5およびMLK4の転写物の大きさは、それぞれ3．4、4．4、および4．8  kbである。
【０１３４】
＜実施例2：PAK5遺伝子のゲノム配列＞
オリゴヌクレオチド5’−GAGTGACTCCATCCTGC−3’（配列番号18）および5’−GTAGGGGGTTCCCACCA−3’（配列番号19）を用い、PAK5遺伝子を含む、商業的に入手可能なP1ヒトライブラリー（Genome  Systems，  Inc．、ミズーリ州セントルイス）からゲノムクローンを同定した。P1ゲノムクローンを部分的に配列決定し、そしてさらなるコード配列を推定した。推定したエクソンを示したポリヌクレオチド配列を、配列番号7として示す。配列番号8は、部分的なゲノム配列から推定したアミノ酸配列を示す。PAK5遺伝子の部分的な図式的な構造を図1に表す。PLC−2遺伝子は、P1クローンのPAK5遺伝子と連鎖することが見出された。PLC−2遺伝子は、染色体15にマッピングされてきており；したがってPAK5遺伝子もまた、染色体15上に存在するはずである。
【０１３５】
PAK5タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号8）は、特にキナーゼドメイン（配列番号8のアミノ酸残基93〜311）において、PAK4（配列番号4）のものと非常に似ている。本発明のいかなるJNKKKのキナーゼドメインも、基質をリン酸化する、酵素的に活性があるドメインとして有用性がある。PAK5キナーゼドメインの配列は、ATP結合に必須の保存されるリジン（K）残基（配列番号8のアミノ酸残基120）を含む。PAK4から類推すると、PAK5においてこのリジン残基をアラニンまたはメチオニン残基に変化させる突然変異は、PAK5酵素活性を消失させるであろう一方、リジン残基をグルタミンに変化させる突然変異は、全長PAK5タンパク質を恒常的に活性にするであろう。キナーゼドメインの外側では、PAK4およびPAK5の間にはより低い相同性が観察される。PAK5の21残基カルボキシ末端伸長は、PAK4のものより4アミノ酸長い。さらに、PAK5タンパク質の入手可能なアミノ末端配列は、PAK4以外のいかなる既知のタンパク質にも類似性を持たない。したがって、PAK5タンパク質のカルボキシ末端およびアミノ末端領域は共に、PAK5を免疫特異的に認識する抗体を生成するのに有用であろう。
【０１３６】
PAK5の全長ヒトcDNA配列のORFは、配列番号9のnt199〜244に示される。ヒトPAK5遺伝子の全長DNA配列は、配列番号10に示され、ORFはnt6125〜17433である。
＜実施例3：YSK2およびPAK5  mRNAの紫外線照射誘導発現＞
本実施例において、新規JNKKKの発現に対する多様な波長の紫外線照射の影響を調べた。UV−C光（220〜290  nmの短波長紫外線照射）およびUV−A光（320〜400  nmの長波長紫外線照射）両方の影響を別個に解析した。
【０１３７】
角化細胞は、上の実施例1．1項に記載されるように増殖させた。細胞は、3−10  mJ／cm2のUV−C光または1−5  J／cm2のUV−A光での照明の前に、2回の1：4継代を通じ増やした。曝露6または24時間後に細胞を採取した。Qiagenのキットを用い、ポリA  mRNAを細胞から精製した。
【０１３８】
図3Aは、YSK2遺伝子がUV−C光により誘導されることを示す。角化細胞は、10  mJ／cm2のUV−C光に曝露した。コントロールおよびUV−C光処理細胞由来のメッセンジャーRNAを、電気泳動により分離し、そしてノーザンブロットにより膜に移した。その後、32P−dNTPで標識した190  bpのYSK2  RT−PCR産物をプローブとして用い、膜をハイブリダイズした。図3Aが示すように、角化細胞におけるYSK2遺伝子の発現は、UV−C光曝露により非常に亢進した。
【０１３９】
図3Bは、PAK5遺伝子がUV−A光処理により誘導されることを示す。ヒト角化細胞をUV−A光（5  mJ／cm2）に曝露し、採取し、そして細胞からmRNAを調製した。処理および未処理細胞におけるPAK4およびPAK5  mRNAのレベルを、ディファレンシャルディスプレーを用い、比較した。LiangおよびPardee，  1992，  Science  257：967−71。上記のプライマー、配列番号14および15、または配列番号16および17を用い、増幅を行った。その後、PAK4およびPAK5  DNAを明確にするため、生じた増幅DNAを制限酵素TaqIで消化した。結果により、PAK5が紫外線照射により誘導されることが立証される。
【０１４０】
ディファレンシャルディスプレー実験（図3Aおよび3B）は、YSK2およびPAK5遺伝子両方の発現が紫外線照射により誘導されることを示す。しかし、2つの遺伝子の誘導は、紫外線照射の波長に依存する。YSK2遺伝子発現は、短波長紫外線照射（220〜290  nm）であるUV−Cにより誘導される。対照的に、PAK5遺伝子発現は、長波長紫外線照射（320〜400  nm）であるUV−Aにより誘導される。紫外線照射によるYSK2およびPAK5遺伝子発現誘導により、2つの遺伝子の産物が細胞外紫外線照射（または他のストレスシグナル）を伝達する情報伝達カスケードに関与していることが示唆される。MLK4およびPAK4  mRNA遺伝子発現は、これらの実験において、紫外線照射により誘導されなかったが、この事実により、光または他のストレスに応する角化細胞反応における役割を除外することはできない。これらの遺伝子産物は、遺伝子発現におけるいかなる変化よりも前の、ストレスに反応する初期細胞事象に関与している可能性がある。
【０１４１】
前述の明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするに充分である。実際、分子生物学、医学の分野または関連分野の当業者に明白である、本発明を行うための上述の手段の多様な修飾は、請求項の範囲内であることが意図される。
【０１４２】
上に引用されるすべての参考文献は、完全に本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図1は、PAK5遺伝子の構造を説明する概略図である。
【図２】図2は、MLK4、PAK4およびPAK5遺伝子の組織特異的発現を例示するノーザンブロットである。メッセンジャーRNAは、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓から単離し、変性ゲルの示されるレーンに泳動し、そして膜にブロットした。同じブロットを続けて（ハイブリダイゼーションの間に剥がした後）、MLK4、PAK4およびPAK5に特異的な標識150塩基対プローブにハイブリダイゼーションした。
【図３】図3は、紫外線照射に反応したYSK2およびPAK5遺伝子の誘導を示す。図3Aは、未処理の（コントロール）またはUV−C照射で5日間処理した（コントロール）角化細胞由来のmRNAのノーザンブロットである。ブロットを、YSK2遺伝子に特異的な150塩基対プローブにハイブリダイズした。図3Bは、UV−A光に反応したPAK4およびPAK5遺伝子の発現レベルにおけるいかなる変化をも調べるよう設計した、ディファレンシャル・ディスプレー実験を示す。角化細胞を0、6または24時間UV−A光に曝露し、採取し、そしてmRNAを解析した。PAK4およびPAK5メッセージに対応するバンドを示している。
【図１】
2004290197.tif 000003
【図２】
2004290197.tif 000004
【図３】
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【配列表】
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