(57)【要約】【課題】基板上に結合された核酸をプライマーとして利用し、解析対象の核酸を鋳型とする伸長反応を行い、その後、伸長産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ分析を利用する際、塩基配列の解析を高い作業効率で行ことが可能な解析方法を提供する。【解決手段】プライマーとして利用する核酸を基板上に結合する際、鋳型とのハイブリダイズに影響を及ぼさないプライマーの５’側部に、光によって切断される部分構造を設け、伸長反応後、所定の光照射によって、かかる光によって切断される部分構造で選択的に切断する手段を採用する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸塩基配列を決定する方法であって、
（１）塩基配列の解析を所望する核酸（ＤＮＡ）の、該塩基配列の解析を所望とする部位より３’側の塩基配列の一部、または、全部に相補的な核酸（ＤＮＡ）を、前記塩基配列の解析を所望する核酸を鋳型として酵素的核酸伸長反応する際に用いるプライマーとして、光によって切断される部分構造を該プライマー中の前記相補的な塩基配列よりも５’側に含む構造で基板上に固定する工程；
（２）前記塩基配列の解析を所望する核酸を、前記相補的な塩基配列部分で、該基板上に固定されたプライマーとアニールして、ハイブリッドを形成する工程；
（３）酵素的核酸伸長反応に必要な４種の２’−デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ＮはＡ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン）と、伸長反応のターミネーターとして、４種の２’，３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）との適量共存下で、前記ハイブリッドを形成した基板上で、該塩基配列を所望する核酸を鋳型として酵素的伸長反応を行う工程；
（４）前記伸長反応が行われた基板から、鋳型核酸を除去する工程；
（５）光によって切断される部分構造を含む構造で基板に固定されているプライマー部分を含む、鎖長の異なる複数の伸長反応産物に対して、該切断される部分構造が切断される光を照射し、
該光照射によって切断された前記伸長産物の質量分析を行い、
前記伸長産物における、プライマーの分子量からの分子量増加量に基づき、前記伸長物の伸長部分の塩基配列を明らかにする工程；
（６）前記伸長部分の塩基配列に基づいて、前記塩基配列の解析を所望とする核酸の解析を所望する塩基配列の一部、または、全部を解析する工程；
少なくとも、上記（１）〜（６）の各工程を有することを特徴とする核酸塩基配列の決定方法。
【請求項２】
前記質量分析を行う手段が、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳと略す）法であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（５）において、照射される光が、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光は、
波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（５）において、光照射によって切断される部分構造として、
ニトロベンゼンを含む構造を選択することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【化１】
2004033043.tif 000012
化合物Ｉ
【請求項７】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩで示される化合物を用いて構築されていることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【化２】
2004033043.tif 000013
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
【請求項８】
前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５’末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５’末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ガラス基板へのスルファニル基の形成が、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【化３】
2004033043.tif 000014
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
【請求項１３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法により質量分析するにあたり、基板上に固定されている、前記プライマーを含む伸長産物の脱離、及び、イオン化を支援する物質（マトリクス物質）を、少なくとも、前記基板上の質量分析を行う領域にコーティングすることを特徴とする請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
マトリクス物質のコーティングの厚さが、基板上に固定されている、プライマーを含む伸長産物の脱離、及び、イオン化に必要にして十分である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
伸長反応に用いられる酵素が耐熱性であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
複数の核酸の塩基配列を決定する方法であって、
（１）
塩基配列の解析を所望する複数の核酸（ＤＮＡ）の、それぞれの塩基配列の解析を所望とする部位より３’側の塩基配列の一部、または、全部に相補的な複数の核酸（ＤＮＡ）を、前記それぞれの塩基配列の解析を所望する複数の核酸を鋳型として酵素的核酸伸長反応するに必要なプライマーとして、光によって切断される部分構造を該プライマーの上記相補的な塩基配列より５’側に含む構造で基板上にマトリクス状に固定する工程；
（２）
前記塩基配列の解析を所望する複数の核酸を、前記相補的な塩基配列部分で、該基板上に固定されたそれぞれのプライマーとアニールしてハイブリッドを形成する工程；
（３）
酵素的核酸伸長反応に必要な４種の２’−デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ＮはＡ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン）と、伸長反応のターミネーターとての４種の２’，３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）との適量共存下で、前記ハイブリッドを形成した基板上で、該塩基配列を所望する核酸を鋳型として酵素的伸長反応を行う工程；
（４）
前記伸長反応が行われた基板から、鋳型核酸を除去する工程；
（５）
光によって切断される部分構造を含む構造で基板に固定されているプライマー部分を含む、鎖長の異なる複数の伸長反応産物に、該切断される部分構造が切断される光を照射し、該光照射によって切断された各々の伸長産物の質量分析を行い、プライマーの分子量からの分子量増加量に基づき、前記複数の伸長産物の伸長部分の塩基配列を明らかにする工程；
（６）
前記伸長部分の塩基配列に基づいて、前記塩基配列の解析を所望とする複数の核酸の解析を所望するそれぞれの塩基配列の一部、または、全部を解析する工程；少なくとも、上記（１）〜（６）の各工程を有することを特徴とする核酸塩基配列の決定方法。
【請求項１７】
前記質量分析する手段がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光は、
波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
レーザー光が波長３３７ｎｍの窒素レーザー光である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程（５）において、光照射によって切断される部分構造として、
ニトロベンゼンを含む構造を選択することを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【化４】
2004033043.tif 000015
化合物Ｉ
【請求項２２】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩで示される化合物を用いて構築されていることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【化５】
2004033043.tif 000016
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
【請求項２３】
前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５’末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５’末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ガラス基板へのスルファニル基の形成が、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【化６】
2004033043.tif 000017
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
【請求項２８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法により質量分析するにあたり、基板上に固定されている、前記プライマーを含む伸長産物の脱離、及び、イオン化を支援する物質（マトリクス物質）を、少なくとも、前記基板上の質量分析を行う領域にコーティングすることを特徴とする請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
マトリクス物質のコーティングの厚さが、基板上に固定されている、プライマーを含む伸長産物の脱離、及び、イオン化に必要にして十分である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
伸長反応に用いられる酵素が耐熱性であることを特徴とする請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
塩基配列の解析を所望する複数の核酸（ＤＮＡ）の、それぞれの塩基配列の解析を所望とする部位より３’側の塩基配列の一部、または、全部に相補的な複数の核酸（ＤＮＡ）が、前記塩基配列の解析を所望する複数の核酸を鋳型として酵素的核酸伸長反応するに必要なプライマーとして、光によって切断される部分構造を該プライマーの上記相補的な塩基配列より５’側に含む構造で基板上にマトリクス状に固定された核酸プライマーチップ。
【請求項３２】
光によって切断する部分構造を切断する光が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光である請求項３１に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項３３】
前記レーザー光が波長３３７ｎｍの窒素レーザー光である請求項３２に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項３４】
前記光によって切断される部分構造がニトロベンゼンを含む構造である請求項３２または３３に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項３５】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることを特徴とする請求項３４に記載の核酸プライマーチップ。
【化７】
2004033043.tif 000018
化合物Ｉ
【請求項３６】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩで示される化合物を用いて構築されていることを特徴とする請求項３４に記載の核酸プライマーチップ。
【化８】
2004033043.tif 000019
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
【請求項３７】
前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５’末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項３５または３６に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項３８】
前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項３７に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項３９】
前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５’末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項３５または３６に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項４０】
前記ガラス基板へのスルファニル基の形成が、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項３９に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項４１】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることを特徴とする請求項３４に記載の核酸プライマーチップ。
【化９】
2004033043.tif 000020
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸塩基配列の決定方法に関し、特に、ジデオキシ法基本とする塩基配列解析において、伸長反応に伴いシークエンス・プライマーに付加される一塩基の種類の特定にマトリクス援助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析法を利用する核酸塩基配列の決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
国際的なプロジェクトのもとに、ヒト・ゲノムＤＮＡについて、その全塩基配列の解明の作業が進み、２０００年には、９０％以上の塩基のドラフト・シーケンスが発表されるなど、ヒトの遺伝子を含む遺伝子情報の解明は、近年における科学技術の発展のひとつの大きな成果として、一般にも広く知られるようになってきている。
【０００３】
核酸の塩基配列の読み取り、すなわち、シークエンシングは１９７０年代の初頭から始まり、初期のＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ　７４，　５６０，　１９７７）を経て、現在主流となっているシークエンシング方法は、Ｓａｎｇｅｒらによって開発されたジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　ＵＳＡ　７４，　５４６３，　１９７７）を、その基本原理としている。
【０００４】
ジデオキシ法は、その後、変遷をへて、現在は、それぞれ別種、すなわち、４種の蛍光色素で標識された４種、すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジンの２’，３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を用いるダイ（色素）ターミネーション法と、キャピラリー電気泳動法を組み合わせた手法が、シークエンシング法として主として用いられている。以下、同法について簡単に示した。
（１）塩基配列の解析を所望する核酸（ＤＮＡ）の、該塩基配列の解析を所望とする部位より３’側の塩基配列の一部、または、全部に相補的な核酸（ＤＮＡ）を、上記塩基配列の解析を所望する核酸を鋳型として酵素的核酸伸長反応する際に用いる、シークエンス・プライマーとして、上記塩基配列の解析を所望する核酸とアニールして上記相補的な塩基配列部分でハイブリッドを形成する。
（２）酵素的核酸伸長反応に必要な４種の２’−デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ＮはＡ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン）と、伸長反応のターミネーターとして、上述した４種の蛍光標識２’，３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）との適量共存下で、上記ハイブリッドを形成したシークエンス・プライマーから塩基配列を、所望する核酸を鋳型として酵素的伸長反応を行う。
（３）上記伸長反応が行われたハイブリッド体を、一本鎖に解離する。
（４）得られた複数の鎖長の伸長産物を含む溶液について、キャピラリー電気泳動を行って鎖長分離を行ない、シークエンス・プライマーから一塩基ずつ伸長した部分の蛍光から、伸長した塩基がＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかであるかを知り、伸長部分の一部、もしくは、残部の塩基配列を得る。
（５）上記伸長部分の塩基配列に基づいて、前記、塩基配列の解析を所望とする核酸の解析を所望する塩基配列の一部、または、全部を解析する。
【０００５】
最近では、例えば、９６本、あるいは、３８４本のキャピラリー・バンドルを用いて、同数の電気泳動を２〜３時間で終える装置が開発され、また、これらと同数の伸長反応等の操作に関しても、ロボットを用いた自動化も図られている。また、大量のデーター解析も、高性能のコンピューターによって高速処理可能となってきている。その結果として、すでに述べたヒトの全ゲノム解析等も、これら、蛍光ジデオキシ法とキャピラリー電気泳動法によって行われてきた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これら広く利用されている、蛍光ジデオキシ法とキャピラリー電気泳動法に基づく塩基配列解析法にも、以下に示す問題点が指摘されている。すなわち、既に述べたように、
一回の電気泳動に２〜３時間を必要とすること、
一回の泳動ごとにゲルキャピラリー内のゲルを交換する必要があること、
キャピラリーが高価なうえに定期的にキャピラリーを交換する必要があること、一塩基の差が必ずしも確実に読み取れるわけではなく、そのためにひとつの伸長産物について複数の泳動を行わなければならない場合があること、
酵素伸展反応を個別に行わなければならないこと、等である。
【０００７】
これらの問題点のうち、特に、電気泳動に関する問題点を解決する可能性のある新たな分離分析手段として、マトリクス援助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：以下、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳと略す）法が提案されている。
【０００８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法とは、マトリクスとよばれる、特定の光を吸収する物質と、被検物質を混合して、分析用の、例えば、ステンレス基板に置き（吸着）、ここにマトリクスが吸収する光を照射して、マトリクスから被検物質へのエネルギー移動により被検物質を、脱着／イオン化させる。この脱着イオンを飛行時間的に質量分析するのが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の基本原理である。このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法によれば、一分析が数秒から十数秒で終了し、また、一枚のプレートに、例えば、３８４種のサンプルをのせて、これを自動的に分析すること、また、数十枚のプレートを同様に自動的に分析することも可能である。従って、例えば、一晩に数万種のサンプルの自動測定が可能となり、極めて時間的な効率が高い。また、分子量を絶対値として知ることができるので、曖昧さが排除され、また、プレートは何度でも使用することができるという利点もある。
【０００９】
すなわち、先に述べた核酸の伸長産物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法で分析できれば、極め作業効率の高い核酸のシークエンシングが可能と考えられている。しかしながら、伸長産物は、酵素、各ヌクレオチドモノマー、色素標識各ターミネーター、塩等の混合物であり、こうした場合には、所望の伸長産物を効率よく脱着／イオン化する方法に問題があった（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｏｌ．　１９，４１７，　１９９４）。また、伸展産物を精製するとしても、特に、多くの核酸について、そのシークエンシングを行おうとすると、多大な労力を要する等の課題もあった。
【００１０】
これらの課題を解決する手段として、固相上にプライマーを固定して、ここで酵素伸長反応を行ない、その後、伸長産物を固相から切り出してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法によって質量分析を行ない、シークエンシングを行う方法が考案された（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｖｏｌ．　２９，　Ｎｏ．　１８，　３８６４，　２００１）。この方法は、リンカーから伸長する任意のヌクレオチド部位に酸分解可能なＮ−Ｐインターヌクレオチド結合を導入し、酸性のマトリクスに、トリフルオロ酢酸等の酸性物質を混入して、上記Ｎ−Ｐ結合を切断して、切断されたフラグメントを分析するもので、ジデオキシ法を併用することにより、原理的には、切断点以降の塩基配列情報を得ることができる。また、切断前であれば、プライマー部分を含む伸長産物は固相に固定されているので、それ以外の、鋳型、ヌクレオチドモノマー等の夾雑物を除くのが比較的容易である。しかしながら、この方法には、以下に示す問題点がある。すなわち、核酸は、酸性においてデピュリネーションと呼ばれる現象によって、アデノシン、グアノシンのプリン部位で非選択的な切断を起こすため、上記のＮ−Ｐ結合切断時の酸性を強くすることができず、その結果、切断、脱着、イオン化の効率が悪く、そのために質量分析の十分な感度を得ることができないのである。また、上記文献に示されている方法では、一枚基板に対して、一種のプライマーが結合されているのみなので、複数の核酸のシークエンシングを同時に行うためには、それに対応する数の基板に対して、伸長反応が必要であるという問題点もあった。
【００１１】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、固相上にプライマーを固定して、ここで酵素伸長反応を行ない、その後、伸長産物を固相から切り出してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法によって質量分析を行ない、シークエンシングを行う工程を採用する際、伸長産物の固相からの切断を、酸分解可能なＮ−Ｐインターヌクレオチド結合を導入し、トリフルオロ酢酸等の酸性物質を混入して、かかるＮ−Ｐ結合を切断する手段でなく、酸性物質を利用することなく、固相に対して連結されているプライマーの部分中において、部位選択的に切断可能な手段を採用し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法によって質量分析する際、脱着、イオン化の効率を維持できる核酸塩基配列の解析方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、鋭意検討した結果、固相に対して連結されているプライマーの部分中において、部位選択的に切断可能な手段として、固相に対するプライマーの連結部で選択的に切断可能な手段として、光によって切断される部分構造を該プライマー中、鋳型とのハイブリダイズに影響を与えない５’側に設け、伸長反応後、所定の光照射によって、かかる光によって切断される部分構造で選択的に切断する方法を採用することで、酸性においてデピュリネーションと呼ばれる現象によって、アデノシン、グアノシンのプリン部位で非選択的な切断を起こすという従来法の原理的な課題を回避して、極め作業効率の高い核酸のシークエンシングが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明にかかる核酸塩基配列の決定方法は、
核酸塩基配列を決定する方法であって、
（１）塩基配列の解析を所望する核酸（ＤＮＡ）の、該塩基配列の解析を所望とする部位より３’側の塩基配列の一部、または、全部に相補的な核酸（ＤＮＡ）を、前記塩基配列の解析を所望する核酸を鋳型として酵素的核酸伸長反応する際に用いるプライマーとして、光によって切断される部分構造を該プライマー中の前記相補的な塩基配列よりも５’側に含む構造で基板上に固定する工程；
（２）前記塩基配列の解析を所望する核酸を、前記相補的な塩基配列部分で、該基板上に固定されたプライマーとアニールして、ハイブリッドを形成する工程；（３）酵素的核酸伸長反応に必要な４種の２’−デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ＮはＡ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン）と、伸長反応のターミネーターとして、４種の２’，３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）との適量共存下で、前記ハイブリッドを形成した基板上で、該塩基配列を所望する核酸を鋳型として酵素的伸長反応を行う工程；
（４）前記伸長反応が行われた基板から、鋳型核酸を除去する工程；
（５）光によって切断される部分構造を含む構造で基板に固定されているプライマー部分を含む、鎖長の異なる複数の伸長反応産物に対して、該切断される部分構造が切断される光を照射し、
該光照射によって切断された前記伸長産物の分子量をマトリクス援助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：以下、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳと略す）法によって分析し、
前記伸長産物における、プライマーの分子量からの分子量増加量に基づき、前記伸長物の伸長部分の塩基配列を明らかにする工程；
（６）前記伸長部分の塩基配列に基づいて、前記塩基配列の解析を所望とする核酸の解析を所望する塩基配列の一部、または、全部を解析する工程；
少なくとも、上記（１）〜（６）の各工程を有することを特徴とする核酸塩基配列の決定方法である。その際、前記工程（５）において、照射される光が、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光であることが好ましい。また、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光は、波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることがより好ましい。
【００１４】
本発明の方法では、前記工程（５）において、光照射によって切断される部分構造として、ニトロベンゼンを含む構造を選択することができる。例えば、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることができる。
【００１５】
【化１０】
2004033043.tif 000002
【００１６】
化合物Ｉ
また、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩで示される化合物を用いて構築されていることもできる。
【００１７】
【化１１】
2004033043.tif 000003
【００１８】
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
その際、前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５’末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることが望ましい。例えば、前記ガラス基板への１級アミノ基の形成は、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行うことができる。あるいは、前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５’末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われている形態とすることも可能である。この時、例えば、前記ガラス基板へのスルファニル基の形成は、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行うことができる。
【００１９】
さらには、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることも可能である。
【００２０】
【化１２】
2004033043.tif 000004
【００２１】
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
本発明の方法において、伸長反応に用いられる酵素が耐熱性であることが好ましい。加えて、特に、前記プライマーが固定されている基板は、複数のプライマー核酸がマトリクス状に配置された核酸チップの形態であり、
前記工程（３）において、該核酸チップ上で、該プライマー核酸の一部、または、全部について、それらの鋳型とともに酵素的核酸伸長反応を行ない、
前記工程（４）において、該伸長反応が行われたマトリクス部分についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法により分析する形態とすると、より好ましい。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をより詳しき説明する。
【００２３】
本発明の核酸塩基配列の決定方法では、以下の工程（１）〜（６）の各工程を行うことで核酸塩基配列の決定がなされる点に特長を有する。
工程（１）
基配列の解析を所望する核酸（ＤＮＡ）の、該塩基配列の解析を所望とする部位より３’側の塩基配列の一部、または、全部に相補的な核酸（ＤＮＡ）を、上記塩基配列の解析を所望する核酸を鋳型として酵素的核酸伸長反応するに必要なプライマーとして、光によって切断される部分構造を該プライマーの上記相補的な塩基配列よ５’側に含む構造で基板上に固定する工程；
工程（２）
上記塩基配列の解析を所望する核酸を、上記相補的な塩基配列部分で、上記基板上に固定されたプライマーとアニールしてハイブリッドを形成する工程；
工程（３）
酵素的核酸伸長反応に必要な４種の２’−デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ＮはＡ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン）と、伸長反応のターミネーターとての４種の２’，３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）との適量共存下で、上記ハイブリッドを形成した基板上で、塩基配列を所望する核酸を鋳型として酵素的伸長反応を行う工程；
工程（４）
上記伸長反応が行われた基板から鋳型核酸を除去する工程；
工程（５）
光によって切断される部分構造を含む構造で基板に固定されているプライマー部分を含む、鎖長の異なる複数の伸長反応産物に、該切断される部分構造が切断される光を照射し、該光照射によって切断された上記伸長産物の分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法によって分析し、プライマーの分子量からの分子量増加量に基づき、上記伸長物の伸長部分の塩基配列を明らかにする工程；
工程（６）
上記伸長部分の塩基配列に基づいて、前記、塩基配列の解析を所望とする核酸の解析を所望する塩基配列の一部、または、全部を解析する工程。
【００２４】
本発明の方法によれば、伸長反応産物の基板からの切断を光照射によって行うので、上記文献の方法、すなわち、酸性物質を用いて切断する方法における課題である、デピュリネーションと呼ばれる現象によって、アデノシン、グアノシンのプリン部位で非選択的な切断の影響を本質的に回避することが可能となる。
【００２５】
その際、照射される光がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光であれば、予め切断用の光照射を分析に先だって行う必要がないばかりか、切断と脱着、イオン化が同時に可能なのできわめて都合がよい。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法で用いられるレーザーは、一般的に波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であるが、以下に示すようにこの波長で切断されうる有機構造はいくつかあり、従って窒素レーザーを本発明に利用することが可能である。もっとも、本発明は、この波長のレーザーに限定されるものではなく、例えば、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーの波長５３２ｎｍ第二次高調波等も使用することができる。核酸は紫外線照射によりチミン二量体を形成するなどのダメージを受けることが知られているが、チミン二量体を形成を引き起こす紫外線の波長は、核酸塩基の吸収波長帯である、およそ、２５０〜２７０ｎｍであり、したがって、本発明で使用する上記レーザー波長は核酸にダメージを与えることなく好適に使用し得る。
【００２６】
本発明に使用される、光照射によって切断される構造は、特に限定されるものではないが、例として、ニトロベンゼン含む構造をあげることができる。より具体的な構造としては、下記の化合物Ｉ、または、一般式ＩＩを用いて構築される構造をあげることができる。
【００２７】
【化１３】
2004033043.tif 000005
【００２８】
化合物Ｉ
【００２９】
【化１４】
2004033043.tif 000006
【００３０】
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
本発明で利用する、プライマーが結合した基板の具体的な作製方法としては、一例として、基板が表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、プライマーの５’末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、該アミノ基と、該スルファニル基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、すなわち、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われる方法をあげることができる。この際、ガラス基板への１級アミノ基の形成は、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いる方法を例とすることができる。
【００３１】
【化１５】
2004033043.tif 000007
【００３２】
上記の方法で、構築された基板に結合するプライマーの構造の一例を、上の化学式（左）に示す。また、光照射によって切断された構造の例を、同じく、上の化学式（右）に示す（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＶｏｌ．　２６　Ｎｏ．　５，　１９９２）。例示するように、切断された後の核酸の切断された部位の構造は、切断される前の構造と同じであることがわかる。すなわち、この場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法によるシークエンシング時には、伸長反応によって、プライマーの元の分子量から一塩基ずつの増加が観察されることが期待される。
【００３３】
基板作製方法の他の例としては、基板が表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、プライマーの５’端にアミノ基が結合されており、該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、すなわち、スルファニル基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われる方法をあげることができる。その際、ガラス基板へのスルファニル基の形成は、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行われる方法が例示できる。
【００３４】
また、本発明の方法に利用可能な、ニトロベンゼンを含む構造の他の例として、下記の化合物ＩＩＩで構築される構造をあげることができる。この場合、プライマー核酸を核酸自動合成機で合成する際に、５’末端に基板に結合させるべき官能基を有するユニットを導入する直前に化合物ＩＩＩにより、光開裂が可能な構造を導入することができる。この場合、基板に結合させるべき官能基としては、アミノ基、スルファニル基を例としてあげることができ、そのような官能基を核酸自動合成機中で導入する試薬は、例えば、グレンリサーチ社から販売されているので、それらを適宜利用すればよい。また、基板側の処理は、既述のシランカップリング剤を利用した方法を、この場合でも採用可能である。
【００３５】
【化１６】
2004033043.tif 000008
【００３６】
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
これまで述べてきたように、本発明の方法では、固相上に固定されたプライマーとアニールした核酸を鋳型として、酵素的核酸伸長反応を行うが、その際、伸長反応に用いる酵素と、プライマーが結合した基板、あるいは、鋳型核酸それぞれの共存下でアニール、ついで、伸長反応を行うことができれば効率がよいが、アニールの際には、場合によりプライマー結合基板、鋳型核酸を９０℃程度に昇温させる必要がある。その場合、一般的な酵素では、このような高温に耐えることができない。このような場合、耐熱性の酵素を用いると都合がよい。そのような酵素の例として、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アマシャムファルマシアバイオテク）をあげることができる。
【００３７】
さて、従来技術の有する問題点のひとつとして、伸長反応等の反応を、シークエンシングを所望する核酸について個別に行う必要がある点をすでにあげた。また、それは、プライマーが固相上に結合されていても同様である点もすでに述べた。
【００３８】
本発明ではこの問題点を解決する手段として、複数のプライマー核酸が、これまで述べた手段を用いて、マトリクス状に固定配置された、言謂、核酸チップ上で、該プライマー核酸の一部、または、全部について、それらの鋳型とともに酵素的核酸伸長反応を行ない、該伸長反応が行われたマトリクス部分について、既述したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法により分析する方法を採用することを特長のひとつとする。この際、プライマーの塩基配列を、すくなくとも一回の伸長反応液中に含まれるシークエンシングを所望とする各々の核酸についてユニークな配列とすれば、各々の核酸は、それぞれの伸長反応に必要なプライマーのみを認識するので、これらの全ての核酸を鋳型とする伸長反応を一枚のチップ上で、一度の反応で行うことが可能である。
【００３９】
核酸チップの作製方法の例として、特開平１１−１８７９００号公報には、１級アミノ基が形成された基板に、スルファニル基を有する核酸との結合に、下記の化学式ＩＶで示す、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシイミドを用いる例の記載があるが、本発明では、この化学式ＩＶの化合物に代えて、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を用いることで、各マトリクスにおいて、それぞれ核酸塩基配列の解析が可能となる。
【００４０】
【化１７】
2004033043.tif 000009
【００４１】
化合物ＩＶ
さて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法では、先に述べたように、測定したい物質（被検物質、本発明ではプライマー部分を含む伸長産物）を脱離、及び、イオン化させるために、マトリクスという物質を被検物質と共存させる。その方法として、よく行われる方法は、マトリクスの飽和溶液に被検物質を適当な濃度で溶解し、この共存溶液の、例えば、数μｌを、適宜アドレスが施されたステンレスプレートに滴下、乾燥させ、マトリクスの結晶内に被検物質が適当な濃度で共存している状態とする。この場合、マトリクスの結晶状態、三次元形態、被検物質の濃度によっては、スペクトルが得られなかったり、得られたとしても、Ｓ／Ｎ比、精度が良好でない場合がある。また、マトリクスの結晶の表面に微小ではあれ、凹凸、傾斜がある場合には、マトリクス中に被検物資が存在するために、場合によっては飛行時間に影響を与える結果、マススペクトルのマス精度に悪影響を与えることがある。本発明では、伸長産物は平滑な基板表面に固定化されているので、飛行時間に影響を与える懸念は比較的小さい。また、被検物質に対するマトリクス物質の供給も、場合により、基板に対してマトリクスを薄膜状にコーティングすることにより、均一に行うことができ、また、マトリクスの結晶状態も良好となるために、良好なマス精度を得ることが可能となり、結果として、精度のよい塩基配列の決定が行われる。
【００４２】
上記、マトリクス物質のコーティングは、ディッピング、スピンコーティング法等を適宜利用することができる。また、コーティングの厚さに関しては、厚すぎると、場合によっては、マトリクス物質の層内部に被検物質が埋め込まれた状態となるため、被検物質の基板表面からの切断、脱離、イオン化が良好に行われない場合がある。また、薄すぎると、被検物質がマトリクスから顔を出した状態となり、やはり、基板表面からの切断、脱離、イオン化が良好に行われない場合がある。従って、コーティングの厚さは、被検物質の切断、脱離、イオン化に必要、且つ、十分な厚さに選択することが最も好ましい。その際、上記、被検物質の切断、脱離、イオン化に必要、且つ、十分なマトリクス物質のコーティングの厚さは、被検物質が存在する基板からの高さと同程度から千倍程度が好適であるが、もちろん、この厚さに限定されるものではない。
【００４３】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。
【００４４】
（実施例１）
ｄＴ４０プライマーによる核酸結合基板の作製
特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法に準じて、核酸プライマーが一様に結合した基板を作製した。前記公開公報に記載の方法と異なる点は、核酸プライマーの固定に利用する二官能性架橋剤を、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシイミド（化合物ＩＶ）から、一般式ＩＩで示される化合物のひとつである下記化合物Ｖ、すなわち、スクシイミジル６−（４−ブロモメチル−３−ニトロベンゾイル）アミノヘキサノエートに変更したことと、基板上に、マトリクス状ではなく、一様に核酸プライマーを結合させている点である。
【００４５】
【化１８】
2004033043.tif 000010
【００４６】
化合物Ｖ
（１）基板洗浄
２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、洗浄済基板をそのまま次の表面処理工程に供した。
【００４７】
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン　ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いで、この溶液に（１）で得た洗浄済基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
【００４８】
次いで、化合物Ｖ（同仁化学研究所）５ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１（容量比）混合溶媒に濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った石英基板を、この化合物Ｖの溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基と化合物Ｖのスクシイミド基を反応させた。この段階で基板表面に化合物Ｖ由来のブロモエチル基が存在することになる。化合物Ｖの溶液から引き上げた基板は、ＤＭＳＯ／エタノール混合溶媒、及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
【００４９】
（３）プローブＤＮＡの合成
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して、配列番号１の一本鎖核酸（ｄＴの４０量体）を合成した。なお、配列番号１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には、合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いることによって、スルファニル（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程は、全て合成業者に依頼して行った。また、配列番号１の核酸の分子量計算値は、１２３０２．１７Ｄａである。
2004033043.tif 000011
（４）ＤＮＡの基板への結合
（３）に記載の配列番号１の一本鎖ＤＮＡを、８μＭの濃度で、グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液に溶解した。
【００５０】
次に、上記ＤＮＡ溶液２５μｌを、（２）で表面処理したガラス基板にのせ、１８ｍｍ×１８ｍｍのカバーガラスで覆い、ガラス板表面のブロモエチル基と核酸プローブ末端のスルファニル基とを室温で反応させた。３０分後、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。
（実施例２）
伸長反応と、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析
（１）伸長反応
予め、ＤＮＡシーケンシング用ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ：アマシャムファルマシアバイオテク）を、添付の希釈用バッファーで１ｕｎｉｔ／μｌに希釈しておく。
【００５１】
０．５ｍｌのエッペンドルフチューブに、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅに添付の反応バッファー４．５μｌ、Ｐｏｌｙ（ｄＡ）溶液（アマシャムファルマシアバイオテク：平均鎖長３００を０．２５μｇ／μｌの濃度で純水に溶解したもの）５μｌを採り、４種デオキシリボヌクレオチド混液（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｇｒａｄｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｄＮＴＰｓ：アマシャムファルマシアバイオテク；１００ｍＭ）１μｌ、４種ジデオキシリボヌクレオチド混液（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｇｒａｄｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｄｄＮＴＰｓ：アマシャムファルマシアバイオテク；５ｍＭ）１μｌを加え、さらに純水を加えて、総容量を４３μｌに調製する。
【００５２】
この溶液に、予め希釈しておいたＴｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ溶液を２μｌ加え、よく混合した後、２０μｌをハイブリダイゼーション用インキュベーション・チャンバー（ＣｏｖｅｒＷｅｌｌ　２０μｌ　Ｃｈａｎｂｅｒ：フナコシ）のウェル内に注ぎ、この上に、実施例１で作製したＤＮＡ結合基板の処理をほどこした側が液に触れるようにおき、液が漏れないように密着させる。温度調節が可能なホットプレートに、チャンバーをおいて、８５℃で１０分間加熱し、ついで、５０℃のインキュベーター中で３０分間放置して、伸長反応を行った。反応終了後、基板をチャンバーから剥して、８５℃の純水で２分間洗い、次に、流純水で１分間リンスして、基板から鋳型ＤＮＡ、未反応のモノマーなどを洗い流した。つぎに、基板に窒素ガスを吹き付けて水を除去した後、イオン交換樹脂ＡＧ　５０Ｗ−Ｘ８（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の適当量を１００μｌに分散して、チップ表面の分析対象部分を含む領域にのせ、５分間、室温に放置して脱塩処理を行った。ついで、純水で洗浄し、窒素ガスで水を除いた後、真空デシケーター中で保存した。
（２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析
伸長反応を行った基板を、以下の条件でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析を行った。なお、分析時、基板はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ分析用のステンレスプレート（日本ブルカー・ダルトニクス）に、ステンレスピンとステンレス製の基板押さえを用いて固定した。
装置名：ａｕｔｏｆｌｅｘ　Ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ（日本ブルカー・ダルトニクス）
レーザー：窒素レーザー
加速電圧：２０ＫＶ
測定モード：リニアモード
イオン化：ポジティブ
内部標準：オリゴヌクレオチド；６１１７、９１９１Ｄａ
仕様マトリクス：３−ヒドロキシ−２−プロピオン酸（３−ＨＰＡ）
（３）分析結果
分子量１２５８８．９５Ｄａを最小として、３０４．１９Ｄａの分子量が順次増加していく質量スペクトルが観察された。配列番号１のＤＮＡが光照射によって切断された場合の分子量計算値は１２３０２．１７であり、ここに、ｄｄＴＴＰが結合した（結合部分は単純なリン酸ジエステルとなる）場合の分子量計算値は１２５９０．３６Ｄａとなる。また、ｄｄＴＴＰによってターミネートされる前に、ｄＮＴＰが順次付加されていくと、その分子量増加計算値は３０４．１９Ｄａである。よって、観察された順次分子量が増加していくピークはｄＮＴＰが一分子ずつ増加しているものと考えられ、ここから逆に、モデル的に塩基配列を求めようとした鋳型のＤＮＡがアデノシンの連続配列であることを知ることができる。すなわち、本発明の方法により核酸の塩基配列の解析が可能であることがわかる。
【００５３】
なお、観察された分子量の絶対値が、理論分子量からズレを生じている理由は、質量較正に用いた内部標準と実際に分析したＤＮＡの分子量差が大きかったため、測定値に系統的なズレを生じた結果と考えられる。
【００５４】
（実施例３）
ファージＤＮＡ塩基配列のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる解析
（１）ＤＮＡチップの作製
基板として、スライドグラス上に黒色テフロン樹脂のウェル（直径２ｍｍ）が３０個形成されたテフロンプリント・スライドグラス（ＥＲ−２１２：フナコシ薬品）を用い、実施例１の洗浄前に、ＵＶ−オゾン処理を施した後に、実施例の洗浄、および、表面処理を行った。
配列番号：２
５’　ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ　３’
次に、配列番号２のＤＮＡを実施例１と同様に溶解し、上記表面処理を施したスライドグラスのウェルに４μｌずつ供給し、保湿チャンバー中に室温下３０分間放置し、ＤＮＡと基板を反応させた。次いで、純水で洗浄し、純水中に保存した。なお、配列番号２の核酸は、一本鎖（＋ｓｔｒａｎｄ）バクテリオファージＭ１３の６３１８から６３０１の塩基配列に相補的な塩基配列であり、分子量計算値は５７２８．８４である。
（２）伸長反応
実施例２の鋳型ＤＮＡをＭ１３ｍｐ１８（＋）Ｓｔｒａｎｄ　ＤＮＡ（アマシャムファルマシアバイオテク）２．５μｇとする以外は全く同様な条件で伸長反応と後処理を行った。また、脱塩処理も各ウェルについて行った。
【００５５】
（３）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析
伸長反応を行ったＤＮＡチップをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳにより分析した。なお、分析はウェルの内部にレーザーのスポットを照射して行った。また、使用した内部標準核酸は３６４５Ｄａ、６１１７Ｄａ、９１９１Ｄａである。
【００５６】
（４）分析結果
分子量６０４２．１０Ｄａを最小として、分子量が順次増加していく質量スペクトルが観察された。配列番号２のＤＮＡにｄｄＧＴＰが結合した場合、その分子量計算値は、６０４２．０５Ｄａなので、最初にプライマーに付加したのはＧ、すなわち、鋳型ではＣの配列であることがわかる。同様にして、順次分子量増分に基づき解析を進め、鋳型の塩基配列は、最初のＣからＣＧＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＡＣＧＧＡＣＧＴ　ＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡ　ＴＣＴＣＣＴＡＧＧＧ　ＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴ　ＣＧＡＧＣＴＴＡＡＧ・・・と約１８０塩基まで解析された。解析された塩基配列は、文献に記載されている塩基配列と完全に一致した。これにより、本発明の方法により、プライマー・チップを用いて鋳型の塩基配列の解析が可能であることがわかる。
（実施例４）
Ｐｏｌｙ（ｄＡ）、ファージＤＮＡ塩基配列の同時解析
実施例３と同様な方法で、実施例２と実施例３で用いた二種のプライマーをチップ上の異なるマトリクスに搭載したＤＮＡチップを作製し、実施例２で用いたＰｏｌｙ（ｄＡ）、実施例３で用いたＭ１３ｍｐ１８（＋）Ｓｔｒａｎｄ　ＤＮＡの共存下で伸長反応を行ない、これまで述べた方法より、各マトリクスについてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる解析を行った。その結果、各マトリクスから、それぞれ、実施例２と実施例３と同様な塩基配列情報がえられた。すなわち、プライマー・チップの各マトリクスに、対象とする鋳型核酸にユニークなプライマーを搭載し、これを一括した伸長反応に供することにより、それぞれの鋳型について、その塩基配列の解析を並行して進めることが可能であることがわかる。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の方法を用いることで、基板上に結合された核酸をプライマーとして利用し、解析対象の核酸を鋳型とする伸長反応を行い、その後、伸長産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析により、前記伸長反応の鋳型とする、解析対象核酸の塩基配列の解析を高い作業効率で行うことが可能となった。また、複数の核酸を、基板上に配置されたプライマー・チップを用いることで、簡便に同様の塩基配列の解析も可能となった。