(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ヒト遺伝子に存在する一塩基多型の検出に有用なポリヌクレオチド等の遺伝子関連材料を提供する。【解決手段】ヒト遺伝子から単離・精製された複数の塩基配列のいずれか、またはそれぞれの一塩基置換配列のいずれかを含むポリヌクレオチドであって、これらのＤＮＡ断片のうち、順次２つのＤＮＡ断片の組合せを１セットとしてＰＣＲ増幅される。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト遺伝子から単離・精製され、配列番号１から１４２０の塩基配列のいずれか、またはそれぞれの一塩基置換配列のいずれかを含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１４２１から３３３０のそれぞれに塩基配列を示したＤＮＡ断片のうち、配列番号１４２１から順次２つのＤＮＡ断片の組合せを１セットとしてＰＣＲ増幅される請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２のポリヌクレオチドの一部であって、配列番号１から１４２０の塩基配列のいずれか、またはそれぞれの一塩基置換配列のいずれかからなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドの一部であって、それぞれの一塩基多型部分を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１４２１から３３３０のそれぞれに塩基配列を示したＤＮＡ断片のうち、配列番号１４２１から順次２つのＤＮＡ断片の組合せからなるＰＣＲプライマーセット。
【請求項６】
請求項４のオリゴヌクレオチドからなる標識化プローブ。
【請求項７】
請求項４のオリゴヌクレオチドの２以上を備えたマイクロアレー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ヒト遺伝子の一塩基多型に関するものである。さらに詳しくはこの出願の発明は、種々のヒト疾患等に関連する遺伝子の一塩基多型を、疾患診断や薬剤反応性診断等に利用するための遺伝子関連材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ＳＮＰｓ）は、ＤＮＡ配列中に見られる多型のうちで最も頻繁に見られる多型である。
【０００３】
このＳＮＰｓは、ゲノム遺伝子の発現産物の質や量に直接的に影響を与えること等によって、何らかの疾患の原因となったり、あるいは薬剤反応性の変化による重篤な副作用の原因となったりする。
【０００４】
従って、ヒトゲノムのＳＮＰｓは、疾患原因の遺伝子や薬剤反応性に関連する遺伝子を探索する際の有用なマーカーとなるばかりか、疾患易羅患性の診断や薬剤副作用の事前判定のためにも有用である。
【０００５】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、既知のヒト遺伝子に存在する新規なＳＮＰｓを、産業上利用可能な形態として提供することを課題としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、ヒト遺伝子から単離・精製され、配列番号１から１４２０の塩基配列いずれか、またはそれぞれの一塩基置換配列のいずれかを含むポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
この第１発明のポリヌクレオチドの一つの態様は、配列番号１４２１から３３３０のそれぞれに塩基配列を示したＤＮＡ断片のうち、配列番号１４２１から順次２つのＤＮＡ断片の組合せを１セットとしてＰＣＲ増幅されるポリヌクレオチドである。
【０００８】
この出願はまた、第２の発明として、前記第１発明のポリヌクレオチドの一部であって、配列番号１から１４２０の塩基配列のいずれか、またはそれぞれの一塩基置換配列のいずれかからなるポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
さらにこの出願は、第３発明として、前記第２発明のポリヌクレオチドの一部であって、それぞれの一塩基多型部分を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
この出願はさらに、第４の発明として、配列番号１４２１から３３３０のそれぞれに塩基配列を示したＤＮＡ断片のうち、配列番号１４２１から順次２つのＤＮＡ断片の組合せからなるＰＣＲプライマーセットを提供する。
【００１１】
またこの出願は、第５の発明として、前記第３発明のオリゴヌクレオチドからなる標識化プローブを提供する。
【００１２】
さらにこの出願は、第６の発明として、前記３発明のオリゴヌクレオチドの２以上を備えたマイクロアレーを提供する。
【００１３】
すなわち、前記各発明は、以下の手続によって特定された一塩基多型を基礎としている。
１．　サンプル
２４人の日本人ボランティアより得たＤＮＡサンプルを使用し、ＳＮＰｓの探索を行った。各サンプルは３人分のＤＮＡを混合して使用した。なお、ボランティアは適切なインフォームドコンセントを受け、また各人のサンプルからは個人情報は除外された。
２．　ＳＮＰｓの探索方法
２．１　　探索領域の選択
既知のヒトゲノム遺伝子のエクソン領域とイントロン領域（発現制御領域を含む）を対象とした。先ず、ＧｅｎＢａｎｋ　ＤＮＡデータベースより、エクソンや発現制御領域（プロモーター）の情報が付加されているヒトゲノム配列を、できる限り反復配列を含まない形で選択した。これらの情報がない配列については、エクソン予測プログラム（ＧＥＮＳＣＡＮ）、あるいはゲノム配列とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ／Ｕｎｉｇｅｎｅ配列とのホモロジー検索（ＢＬＡＳＴ　Ｖｅｒ．　２と一部ｓｉｍ４の併用）により予測されたエクソン周辺領域を選択した。また、ＲｅｆＳｅｑ（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ）のｃｏｎｔｉｇ配列とｍＲＮＡ配列との独自開発ソフトウェアの類似性検索から予測したエクソン周辺領域も対象とした。
２．２　　ＰＣＲ用プライマー
前記のとおりに選択した遺伝子領域を増幅するため、設計プログラム（Ｐｒｉｍｅｒ３．０）を使用して、ＰＣＲ産物の塩基長が０．５から１．５　ｋｂとなるようにＰＣＲ用プライマーを設計した。これらのプライマーは、配列番号１４２１から３３３０のそれぞれに塩基配列を示したＤＮＡ断片であり、配列番号１４２１から順次２つのＤＮＡ断片の組合せからなるプライマーセットをそれぞれに用い、ＤＮＡサンプルを鋳型として、各遺伝子の選択領域をＰＣＲ増幅した。なお、ＰＣＲ産物の配列決定を行うためのインターナルプライマーも個々に設計した。
２．３　　ＰＣＲ産物の配列決定
２本のＰＣＲプライマーと、ＰＣＲ産物の塩基長が０．６ｋｂ以上の場合には２本のインターナルプライマーを用い、公知の方法によりＰＣＲ産物の配列を決定した。また、ＰＣＲ産物を電気泳動した結果、薄い非特異的なバンドが認められた場合には、ＰＣＲプライマーをそのまま使用するのではなく、それらの内側に新たなプライマーを設計して配列決定を行った。反応液の調製には、Ｂｉｏｍｅｋ２０００とＭｕｌｔｉｍｅｋ９６を使用し、配列決定は、ＡＢＩ３７００キャピラリーシークエンサーを使用した。
２．４　　ＳＮＰｓの探索
検出プログラム（Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ）を使用して、ＰＣＲ産物の配列情報からＳＮＰｓを同定した。各ＳＮＰの検証は、実際の塩基配列を個々に確認することによって行った。
３．　結果
以上の手続によって、３３４個の既知遺伝子から１４２０個のＳＮＰｓが得られた。各ＳＮＰは、配列表の配列番号１から１４２０にＳＮＰ（置換塩基種）とその前後の塩基配列を示した。
【００１４】
また表１〜２３は、１４２０個のＳＮＰｓの配列番号順に、Ａ欄：ＪＳＮＰ（ＩＭＳ−ＪＳＴ　ＳＮＰ）データベースの登録番号（ＪＳＮＰ−ＩＤ）、Ｂ欄：それぞれのＳＮＰが存在するＤＮＡ配列（遺伝子）のＧｅｎＢａｎｋ登録番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．）、Ｃ欄：ＧｅｎＢａｎｋに登録されたＤＮＡ配列におけるＳＮＰの位置（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ）、Ｄ欄：塩基置換におけるＭａｊｏｒ塩基、Ｅ欄：塩基置換におけるＭｉｎｅｒ塩基、Ｆ欄：ＰＣＲフォワードプライマーの配列番号、Ｇ欄：ＰＣＲリバースプライマーの配列番号を示した。なお、表１〜２３における塩基置換の種類は、ＧｅｎＢａｎｋに登録された塩基配列の当該塩基をＭａｊｏｒ、同定された置換塩基をＭｉｎｏｒとして示したが、これらの違いは塩基種の優位／劣位を必ずしも意味しない。
【００１５】
また、表２４〜４６には、ＳＮＰｓの配列番号順に、Ａ欄：各ＳＮＰが存在する遺伝子の領域［エクソン（Ｅｘｏｎ）かイントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）かプロモーター（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）］、Ｂ欄：遺伝子の略名、Ｃ欄：遺伝子の日本語名を示した。この表２４〜４６に示したとおり、この出願の発明は、様々なヒトタンパク質をコードする遺伝子における一塩基多型を対象としている。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
【表２】
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【００１８】
【表３】
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【００１９】
【表４】
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【００２０】
【表５】
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【００２１】
【表６】
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【００２２】
【表７】
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【００２３】
【表８】
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【００２４】
【表９】
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【００２５】
【表１０】
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【００２６】
【表１１】
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【００２７】
【表１２】
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【００２８】
【表１３】
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【００２９】
【表１４】
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【００３０】
【表１５】
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【００３１】
【表１６】
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【００３２】
【表１７】
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【００３３】
【表１８】
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【００３４】
【表１９】
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【００３５】
【表２０】
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【００３６】
【表２１】
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【００３７】
【表２２】
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【００３８】
【表２３】
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【００３９】
【表２４】
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【００４０】
【表２５】
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【００４１】
【表２６】
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【００４２】
【表２７】
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【００４３】
【表２８】
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【００４４】
【表２９】
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【００４５】
【表３０】
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【００４６】
【表３１】
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【００４７】
【表３２】
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【００４８】
【表３３】
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【００４９】
【表３４】
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【００５０】
【表３５】
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【００５１】
【表３６】
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【００５２】
【表３７】
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【００５３】
【表３８】
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【００５４】
【表３９】
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【００５５】
【表４０】
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【００５６】
【表４１】
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【００５７】
【表４２】
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【００５８】
【表４３】
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【００５９】
【表４４】
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【００６０】
【表４５】
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【００６１】
【表４６】
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【００６２】
なお、以上のとおりの情報は、ＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に２００２年７月１５日付で公表される予定である。
【００６３】
以下、この発明の実施形態について詳しく説明する。
【００６４】
【発明の実施の形態】
この出願の第１発明のポリヌクレオチドは、配列番号１から１４２０の塩基配列いずれか、またはそれぞれの一塩基置換配列のいずれかを含むヒト遺伝子由来のポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ鎖またはその相補鎖である。あるいは、遺伝子のエクソン領域に由来するポリヌクレオチドの場合には、ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖、またはＲＭＡ（ｍＲＮＡ）から合成されたｃＤＮＡ鎖、もしくはそれらの相補鎖である。なお、この出願において、ポリヌクレオチドとは、１００　ｂｐ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を意味し、オリゴヌクレオチドとは、５〜９９　ｂｐまでのＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を意味する。
【００６５】
このようなポリヌクレオチドは、公知のデータベース配列情報や、この発明によって提供される塩基配列情報（配列番号１〜１４２０）に基づいて合成したプローブを用い、ヒトゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。また、各遺伝子配列の任意の２箇所の配列（１５−４０ｂｐ、好ましくは１５−３０ｂｐ）に対応するプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって取得することができる。この出願は、このようなプライマーセットとして、配列番号１４２１から３３３０のそれぞれに塩基配列を示したＤＮＡ断片のうち、配列番号１４２１から順次２つのＤＮＡ断片の組合せからなるプライマーセット（第４発明）を提供する。
【００６６】
第２発明のポリヌクレオチドは、配列番号１から１４２０のそれぞれに塩基配列を示した８１〜１２１ｂｐのＤＮＡ鎖および／またはＲＮＡ鎖である。また、第３発明のオリゴヌクレオチドは、第２発明のポリヌクレオチドの一部であって、それぞれの一塩基多型部分を含む５〜９９ｂｐ、好ましくは１０〜５０ｂｐのＤＮＡ鎖および／またはＲＭＡ鎖である。これらのポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、第１発明のポリヌクレオチドを断片化することによって取得することができる。あるいは、公知の方法によって化学合成することによっても取得することができる。
【００６７】
以上のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、それらを被験サンプルＤＮＡから調製し、その一塩基多型部位における塩基置換の有無を調べることによって、疾患原因の遺伝子や薬剤反応性に関連する遺伝子の探索、あるいは疾患易羅患性の診断や薬剤副作用の事前判定に利用することができる。
【００６８】
そのような遺伝子探索や診断・判定における塩基置換の検出は、第５発明の標識プローブを用いたハイブリダイゼーション法によって行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブの標識は、酵素、蛍光色素、放射性同位元素等を適宜に用いることができる。プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを「ストリンジェント条件」で行うことによって、一塩基の置換を検出することができる。ストリンジェント条件とは、被験サンプルＤＮＡと標識ＤＮＡプローブとの特異的なハイブリッド形成を可能とする条件であり、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアミド等）の濃度、温度条件によって規定される（例えば、米国特許Ｎｏ．　６，１００，０３７参照）。また、標識ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばＡｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｒｏｂｅ法、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等の公知の方法を採用することができる。
【００６９】
さらに、一塩基置換の検出は、ＰＣＲ産物を直接シークエンシングする方法の他に、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法等を行ってもよい。また、Ｒｏｌｌｉｎｇ　Ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｏｌｉｇｏ　Ｂａｓｅ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法の公知の方法を採用することもできる。
【００７０】
さらにまた、一塩基置換の検出は、第６発明のマイクロアレーを用いることによって高効率で行うことができる。マイクロアレーは、オリゴヌクレオチドを基盤上に直接合成したものであってもよく、あるいはヌクレオチドが結合するような素材でコーティングした基盤上にオリゴヌクレオチドをスポットしたものであってもよい。そして、標識化した被験サンプルＤＮＡと基盤上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの有無を指標として、被験サンプルＤＮＡにおける一塩基多型を同定することができる。
【００７１】
その他にも、例えば、この発明によって提供される一塩基多型がフレームシフト変位を生じさせている場合には、遺伝子転写産物（ｍＲＮＡやｃＤＮＡ、タンパク質等）の変異を検出することによっても、疾患易羅患性の診断や薬物反応性の判定を行うこともできる。あるいは、変異タンパク質が産生される場合には、正常タンパク質および／または変異タンパク質に対する抗体を用いて診断・判定を行うこともできる。
【００７２】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ヒト遺伝子に存在する一塩基多型の検出に有用なポリヌクレオチド等の遺伝子関連材料が提供される。これによって、疾患原因の遺伝子や薬剤反応性に関連する遺伝子の探索、あるいは疾患易羅患性の診断や薬剤副作用の事前判定が可能となる。
【００７３】
【配列表】
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