(57)【要約】【課題】腫瘍細胞において増殖し、抗癌作用を示すウイルスを提供すること。【解決手段】テロメラーゼのプロモーター及びＥ１遺伝子を含むことを特徴とする遺伝子を含むウイルス、及び該ウイルスを用いた抗癌剤。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトテロメラーゼのプロモーター及びＥ１遺伝子を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
ヒトテロメラーゼのプロモーターがｈＴＥＲＴである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
Ｅ１遺伝子が、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むウイルス。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むアデノウイルス。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のウイルスを有効成分とする抗癌剤。
【請求項７】
請求項４若しくは５に記載のウイルス又は請求項６に記載の抗癌剤を用いた癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍細胞において増殖することにより抗腫瘍作用を示すウイルス及び該ウイルスを含む抗癌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、癌の治療の１つとして、遺伝子治療が行われている。しかし、遺伝子治療では、安全性のために非増殖性ウイルスベクターを用いて遺伝子導入するため、標的細胞の範囲にしか適用できず、また、導入効率が低いために満足のいく治療効果が得られていない。
【０００３】
また、癌化した細胞又は不死化した細胞株においてテロメラーゼの活性が増大している頻度が高く、生殖系列の細胞、血球系細胞、上皮系幹細胞等以外の正常な体細胞ではテロメラーゼの活性はほとんど検出されないことが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、腫瘍細胞において増殖し、抗癌作用を示すウイルスを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、テロメラーゼのプロモーターを有し、且つ、増殖能を有するウイルスを癌細胞に感染させることにより、ウイルスの増殖により癌細胞を死滅させることができることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は以下の項１〜７に関する。
【０００７】
１．ヒトテロメラーゼのプロモーター及びＥ１遺伝子を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【０００８】
２．ヒトテロメラーゼのプロモーターがｈＴＥＲＴである上記項１に記載のポリヌクレオチド。
【０００９】
３．Ｅ１遺伝子が、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むことを特徴とする上記項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【００１０】
４．上記項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むウイルス。
【００１１】
５．上記項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むアデノウイルス。
【００１２】
６．上記項４又は５に記載のウイルスを有効成分とする抗癌剤。
【００１３】
７．上記項４若しくは５に記載のウイルス又は請求項６に記載の抗癌剤を用いた癌の治療方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、多くの癌細胞がテロメラーゼ活性を有することから、テロメラーゼのプロモーターを導入した遺伝子を有し、且つ、増殖能を有するウイルスを癌細胞において増殖させることにより、癌細胞を死滅させることを特徴とする。
【００１５】
本発明において用いられるウイルスは特に限定されないが、安全性等の点からアデノウイルスが好ましい。また、アデノウイルスの中でも、使用の簡便さ等の点からタイプ５のアデノウイルスが特に好ましい。
【００１６】
ウイルスのポリヌクレオチドに含まれるＥ１遺伝子とは、ウイルスの有するＤＮＡ複製に関する初期遺伝子（ｅａｒｌｙ：Ｅ）と後期遺伝子（ｌａｔｅ：Ｌ）のうちの初期遺伝子の一つをいい、Ｅ１遺伝子はウイルス・ゲノムの転写の制御に係わるタンパク質をコードしている。
【００１７】
また、Ｅ１遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ等から構成されることが知られている。Ｅ１Ａ遺伝子によりコードされるＥ１Ａタンパク質は、感染可能なウイルス産生に必要な遺伝子群（Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４等）の転写を活性化する。Ｅ１Ｂ遺伝子でコードされるＥ１Ｂタンパク質は、後期遺伝子（Ｌ遺伝子）のｍＲＮＡが感染した宿主細胞の細胞質へ蓄積するのを助け、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、ウイルスの複製を促進する。Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子の配列は、それぞれ以下の配列１及び２に示す。
【００１８】
本発明において、Ｅ１遺伝子は公知のものをそのまま用いることもできるが、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に有するもの、即ち、ＩＲＥＳ配列をＥ１Ａ遺伝子とＥ１Ｂ遺伝子との間に挿入したものを使用することが好ましい。ウイルスが宿主細胞に感染した際に、増殖能が高くなるからである。
【００１９】
ＩＲＥＳとは、ピコルナウイルス科に特異的なタンパク質合成開始シグナルで、１８ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補的な配列があるためリボソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。ピコルナウイルス科のウイルス由来ｍＲＮＡはこの配列を介して翻訳されることが知られている。ＩＲＥＳ配列からの翻訳効率は高く、ｍＲＮＡの途中からでもキャップ構造非依存的にタンパク質合成が行われる。したがって、本ウイルスでは、ヒトテロメラーゼのプロモーターによりＥ１Ａ遺伝子とＩＲＥＳ配列の下流にあるＥ１Ｂ遺伝子の両方が独立に翻訳される。ＩＲＥＳ配列を以下の配列３に示す。
【００２０】
また、本発明のウイルスの遺伝子は、ヒトテロメラーゼのプロモーターをＥ１遺伝子の上流に有することが好ましい。テロメラーゼ活性を有する癌細胞内で増殖を促進することができるからである。ヒトテロメラーゼのプロモーターであれば種類などは限定されないが、その中でｈＴＥＲＴが好ましい。
【００２１】
ｈＴＥＲＴはヒトテロメラーゼ逆転写酵素をコードする遺伝子であり、その５’末端の上流１．４ｋｂｐの領域には多くの転写因子結合配列が確認されている。その領域がｈＴＥＲＴプロモーターと考えられるが、中でも翻訳開始部位の上流１８１　ｂｐの配列が下流の遺伝子発現に重要なコア領域である。本発明において、このコア領域を含むものであれば、限定されずに使用することができるが、このコア領域を完全に含む上流３７８　ｂｐ程度の配列をｈＴＥＲＴプロモーターとして使用するのが好ましい。この３７８　ｂｐ程度の配列は、１８１　ｂｐのコア領域単独の場合と比べて、その遺伝子発現効率が同等であることが確認されている。ｈＴＥＲＴの配列を以下の配列４示す。
【００２２】
本発明のテロメラーゼのプロモーター及びＥ１遺伝子（Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子）を有する遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。
【００２３】
例えば、２９３細胞等のＥ１遺伝子を発現している細胞からＥ１Ａ−Ｓ、Ｅ１Ａ−ＡＳ、Ｅ１Ｂ−Ｓ、Ｅ１Ｂ−ＡＳ等のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はＤＮＡ−ＰＣＲを行うことによりＥ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子を増幅することができる。必要に応じてＴＡクローニングのような公知の方法を用いて配列を確認した後、ＥｃｏＲＩのような公知の制限酵素でＥ１Ａ及びＥ１ＢのＤＮＡ断片を切り出すことができる。
【００２４】
ｐＩＲＥＳのような公知のベクターにＥ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂを挿入し、次いで、ＭｌｕＩ、ＢｇｌＩＩ等の制限酵素で切り出したｈＴＥＲＴプロモーター配列を、Ｅ１Ａの上流にあるＸｈｏＩ等の部位に挿入することができる。
【００２５】
必要に応じて、ｐＳｈｕｔｔｌｅなどの公知のベクターに含まれるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをＭｆｅＩ、ＮｈｅＩ等の制限酵素により取り除き、その部位にｐｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂより制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで切り出した配列を挿入することができる（得られらたものを「ｐＳｈ−ｈＡＩＢ」という。）。
【００２６】
ｐＳｈ−ｈＡＩＢからＩ−ＣｅｕＩ、Ｐｌ−ＳｃｅＩ等の制限酵素により必要な部分の配列を切り出し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）等の市販のキットを用いてＡｄｅｎｏ−ＸＶｉｒａｌ　ＤＮＡ等のウイルスのＤＮＡに挿入することができる（得られたものを「ＡｄｅｎｏＸ−ｈＡＩＢ」という。）。
【００２７】
ＡｄｅｎｏＸ−ｈＡＩＢをＰａｃＩ等の公知の制限酵素により線状化した後、２９３細胞等の培養細胞にトランスフェクションし、感染性のある組換えアデノウイルスを作製することができる（得られたものを「ＴＲＡＤ」ということがある。）。
【００２８】
本発明のウイルスは、抗癌剤として使用することができる。例えば、単なる癌の治療だけでなく、手術後の再発予防、転移の防止及び／又は予防等にも使用できる。
【００２９】
本発明の抗癌剤を適用する癌の種類としては、限定されるものではなく、あらゆる種類の癌に用いることができる。特に、例えば、胃、大腸、肺、肝、前立腺、膵、食道、膀胱、胆嚢・胆管、乳房、子宮、甲状腺、卵巣等における固形癌に有効である。
【００３０】
本発明の抗癌剤は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下といった注射、鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、坐剤、外用剤等により生体（対象となる細胞や臓器）に導入することもできる。
【００３１】
生体、即ち癌細胞に導入、即ち感染した本発明のウイルスは、該細胞内で増殖し、該細胞を死滅させることができる。そうすることによって、癌を治療したり、癌細胞の増殖を抑制したり、転移を防いだりすることができる。
【００３２】
また、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。）などと混合して医薬組成物として調整することができる。
【００３３】
本発明の抗癌剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、筋肉、腹腔等への局部注射、静脈への注射等が例示される。
【００３４】
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、一日投与量として、通常有効成分である本発明ウイルスの量を１０６〜１０１１ＰＦＵ程度、好ましくは１０９〜１０１１ＰＦＵ程度とするのがよく、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
【００３５】
また、本発明のウイルスを使用する際には、公知の免疫抑制剤等を用いることにより、生体の免疫を抑制し、該ウイルスが感染し易くすることもできる。
【００３６】
更に、本発明のウイルスは、従来の遺伝子治療で用いられている例えばｐ５３遺伝子を含むような非増殖性ウイルス、公知の抗癌剤及び放射線からなる群から選ばれる少なくとも１種の抗癌剤を併用することもできる。
【００３７】
本発明の抗癌剤は、以下の理由で副作用が生じる可能性は極めて低いと考えられ、非常に安全な製剤であるということができる。
（１）正常の体細胞ではテロメラーゼ活性がほとんどなく、また、造血細胞等の浮遊細胞では本発明のウイルスは感染しにくい。
（２）本発明のウイルスは増殖能を有するので、通常の遺伝子治療で用いられている非増殖性ウイルスよりも低い濃度で使用することができる。
（３）本発明のウイルスが過剰に投与された場合であっても、生体内の通常の免疫作用によって抗ウイルス作用が働く。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するために実施例を挙げるが、いうまでもなく本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
＜ＴＲＡＤの作製＞
２９３細胞から抽出したＲＮＡから特異的プライマー（Ｅ１Ａ−Ｓ：　配列５、Ｅ１Ａ−ＡＳ：　配列６）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、８９７　ｂｐのＥ１Ａ遺伝子を増幅した。２９３細胞から抽出したＤＮＡよりプライマー（Ｅ１Ｂ−Ｓ：　配列７、Ｅ１Ｂ−ＡＳ：　配列８）を用いてＤＮＡ−ＰＣＲを行い、１８２２　ｂｐのＥ１Ｂ遺伝子を増幅した。
【００４０】
それぞれのＰＣＲ産物のＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　Ｄｕａｌ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ；　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を行い、シークエンスを確認した後、制限酵素ＥｃｏＲＩにより、各々９１１　ｂｐ（Ｅ１Ａ）、１８３６　ｂｐ（Ｅ１Ｂ）のＤＮＡ断片を切り出した。
【００４１】
ｐＩＲＥＳベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のＭｌｕＩ切断部位にＥ１Ａを、ＳａｌＩ部位にＥ１Ｂをそれぞれ順方向に挿入した（Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ）。
【００４２】
制限酵素ＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩで切り出した４５５　ｂｐのｈＴＥＲＴプロモーター配列を、Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ＢのＥ１Ａ上流にあるＸｈｏＩ部位に順方向に挿入した（ｐｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ）。
【００４３】
ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターに含まれるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを制限酵素ＭｆｅＩおよびＮｈｅＩ処理により取り除き、その部位にｐｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂより制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで切り出した３８２８　ｂｐの配列を挿入した（ｐＳｈ−ｈＡＩＢ）。
【００４４】
ｐＳｈ−ｈＡＩＢより制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰｌ−ＳｃｅＩにより４３８１　ｂｐの配列を切り出し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のＡｄｅｎｏ−Ｘ　Ｖｉｒａｌ　ＤＮＡに挿入した（ＡｄｅｎｏＸ−ｈＡＩＢ）。ＡｄｅｎｏＸ−ｈＡＩＢを制限酵素ＰａｃＩ処理で線状化した後、２９３細胞にトランスフェクションし、感染性のある組換えアデノウイルスを作製した（ＴＲＡＤ）。ＴＲＡＤの模式図を図１に示す。
【００４５】
実施例２
＜ヒト癌細胞及び正常細胞におけるテロメラーゼ活性の比較＞
ヒト肺癌細胞（Ａ５４９、Ｈ２２６Ｂｒ、Ｈ１２９９）、ヒト大腸癌細胞（ＳＷ６２０、ＤＬＤ−１、ＬｏＶｏ）、ヒト胎児腎臓細胞２９３、ＳＶ４０遺伝子導入で不死化したヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ、ヒト正常線維芽細胞（ＷＩ３８、ＮＨＬＦ）の１０種類の細胞からＲＮＡｚｏｌ　（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒおよびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　ＤＮＡ　ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてリアルタイム定量的ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＲＴ）−ＰＣＲを行い、それぞれの細胞におけるｈＴＥＲＴ遺伝子発現レベルを比較した。結果を図２に示す。
【００４６】
最も発現レベルの高かったＡ５４９細胞を１．０として比較すると、Ａ５４９、Ｈ２２６Ｂｒ、Ｈ１２９９、ＳＷ６２０、ＤＬＤ−１、ＬｏＶｏなどの癌細胞及び２９３細胞では０．１８〜１．００のｈＴＥＲＴ遺伝子発現が確認されたが、不死化したＨＵＶＥＣ細胞やＷＩ３８、ＮＨＬＦなどの正常細胞ではその発現は検出されなかった。
【００４７】
実施例３
＜ヒト癌細胞及び正常細胞における、ＴＲＡＤ感染後のＥ１Ａ及びＥ１ＢのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現＞
ヒト大腸癌細胞ＳＷ６２０及びヒト正常線維芽細胞ＷＩ３８をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養し、０．１及び１　ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の濃度でＴＲＡＤを感染させ、３６時間後にＲＮＡを回収した。陽性コントロールとして２９３細胞を用いた。
【００４８】
ＧｅｎｅＡｍｐ　ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｃｏｒｅ　Ｋｉｔを用いてＲＴを行い、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子に対するプライマーを用いてＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　９７００　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により３０サイクルの増幅を行った。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル上で泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。バンドの強度をイメージアナライザーにて測定し、ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして定量化してグラフ化した。
【００４９】
ヒト大腸癌細胞ＳＷ６２０及びヒト正常線維芽細胞ＷＩ３８をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養し、０．１及び１　ＭＯＩの濃度でＴＲＡＤを感染させ４８時間後に付着細胞を回収、溶解液中で３０分反応させた後に遠沈し、上清のタンパク質濃度を測定した。１２％ポリアクリルアミドゲル上で泳動し、膜にトランスファーした後、抗アデノウイルス５型Ｅ１Ａ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いてウエスタンブロット解析を行った。結果を図３に示す。
【００５０】
癌細胞であるＳＷ６２０においては、ＴＲＡＤの感染により明らかに強いＥ１Ａ遺伝子（５０２　ｂｐ）、Ｅ１Ｂ遺伝子（５４３　ｂｐ）の発現がみられたが、正常細胞であるＷＩ３８では弱い発現がみられたのみであった（図３Ａ）。陽性コントロールの２９３細胞では、中等度の発現が認められた。
【００５１】
ウエスタンブロット解析では、ＳＷ６２０において０．１　ＭＯＩ、１　ＭＯＩとＴＲＡＤの濃度に従ってＥ１Ａタンパク質の発現が増強した（図３Ｂ）。一方、ＷＩ３８では１　ＭＯＩでもほとんど発現が検出さなかった。
【００５２】
実施例４
＜ヒト癌細胞及び正常細胞におけるＴＲＡＤ感染後の細胞内増殖の検討＞
ヒト癌細胞ＳＷ６２０、Ｈ１２９９及びヒト正常細胞ＷＩ３８、ＮＨＬＦにＴＲＡＤを１　ＭＯＩで２時間３７℃で感染させ、ＴＲＡＤを含む培養液を捨て、新しい培養液で１回洗浄、さらに新しい培養液を加えた。その直後にＤａｙ　０としてスクレーパーで細胞を回収、凍結融解を繰り返した後に１　ｍｌの培養液に浮遊させた。更に、同様の方法でＤａｙ　１、２、３、５、７にウイルスを回収し、力価測定を行った。結果を図４に示す。
【００５３】
正常細胞であるＷＩ３８やＮＨＬＦでは、１０２　ＰＦＵのＴＲＡＤが３日目には１０５　ＰＦＵ程度と１００〜１０００倍の増殖がみられたが、癌細胞であるＳＷ６２０やＨ１２９９では１０７〜１０８　ＰＦＵと１０５〜１０６倍の増殖が認められ、癌細胞特異的なウイルス増殖が確認された。
【００５４】
実施例５
＜ヒト癌細胞および正常細胞におけるＴＲＡＤの細胞障害活性＞
２４ウェルプレートに、５種類のヒト癌細胞（ＳＷ６２０、Ｈ１２９９、Ａ５４９、ＤＬＤ−１、Ｈ２２６Ｂｒ）を６〜８×１０４個／ウェル、及び２種類のヒト正常細胞（ＷＩ３８、ＮＨＬＦ）を２〜４×１０４個／ウェルで蒔き、２４時間後にＴＲＡＤを０．０１、０．１、１、２、５　ＭＯＩで感染させた。感染から９６時間後に、顕微鏡下にＳＷ６２０、ＤＬＤ−１、ＮＨＬＦ細胞の形態学的変化を観察した。更に、すべての細胞において、培養液を捨て、生細胞をＣｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅで染色し、スキャナーにてマクロ画像を取り込んだ。
【００５５】
９６ウェルプレートにＳＷ６２０、Ｈ１２９９を１０４個／ウェル、ＮＨＬＦを５×１０３個／ウェルで蒔き、ＴＲＡＤを０（非感染細胞）、０．０１、０．１、１　ＭＯＩで感染させ、ＸＴＴアッセイにてＤａｙ　１、２、３、５、７に生細胞数を計測した。４ウェルずつで測定し、非感染細胞を１．０として平均値＋／−　ＳＤにてグラフ化した。結果を図５、６及び７に示す。
【００５６】
ＳＷ６２０、Ｈ１２９９、Ａ５４９、ＤＬＤ−１、Ｈ２２６Ｂｒなどの癌細胞では、ＴＲＡＤの濃度依存性に細胞数が減り、青く染まる領域が減少しているのがわかる。一方、ＷＩ３８、ＮＨＬＦなどの正常細胞では、青く染色される生細胞数の顕著な減少は認められなかった。（図５）。
【００５７】
顕微鏡所見では、ＳＷ６２０、ＤＬＤ−１細胞はプレートの底面から剥がれて円形化し、細胞密度も減少していたが、ＮＨＬＦではほとんど形態学的変化はみられず、細胞数の減少も認められなかった（図６）。
【００５８】
ＳＷ６２０およびＨ１２９９では、１　ＭＯＩのＴＲＡＤの感染により３日目までのほぼ１００％の細胞死が観察され、０．１　ＭＯＩでも８０％以上の細胞数減少が認められた。ＮＨＬＦでは３日目にはほとんど細胞数の減少はみられず、７日目には１　ＭＯＩのＴＲＡＤで６０％程度の細胞数の低下が観察されたが、０．０１　ＭＯＩでは全く影響されなかった（図７）。
【００５９】
実施例６
＜動物モデルを用いたＴＲＡＤの抗腫瘍活性の検討＞
５　−　６週齢ヌードマウスの背部皮下にヒト肺癌細胞Ｈ３５８を５×１０６個移植し、直径が約５　−　６　ｍｍとなった時点で、ｐ５３遺伝子を発現する非増殖性アデノウイルスベクター（Ａｄ−ｐ５３）を１×１０８　ＰＦＵ、３×１０８　ＰＦＵ、１×１０９　ＰＦＵを連日２日間腫瘍内局所注入した。その後、直交する腫瘍径を定期的に測定し、推定腫瘍重量を（長径）×（短径）２／２で算出した。コントロールとして挿入遺伝子をもたない非増殖性アデノウイルスベクターｄｌ３１２を用いた。
【００６０】
５　−　６週齢ヌードマウスの背部皮下にヒト大腸癌細胞ＳＷ６２０を５×１０６個移植し、直径が約５　−　６　ｍｍとなった時点で、２×１０７　ＰＦＵのｄｌ３１２及び４×１０３　ＰＦＵのＴＲＡＤを連日３日間腫瘍内局所注入した。同様に腫瘍径を測定し、推定腫瘍重量を算出した。結果を図８及び９に示す。
【００６１】
３×１０８　ＰＦＵ、１×１０９　ＰＦＵのＡｄ−ｐ５３投与によりＨ３５８腫瘍の増殖は有意に（ｐ　＜　０．０５）抑制された。しかし、１×１０８　ＰＦＵのＡｄ−ｐ５３投与では有意な増殖抑制は認められなかった（図８）。また、コントロールのｄｌ３１２の投与では腫瘍増殖は全く影響されなかった。
【００６２】
抗腫瘍効果がみられたＡｄ−ｐ５３よりも極めて低濃度である４　ｘ　１０３　ＰＦＵのＴＲＡＤの腫瘍内投与により、有意差をもって（ｐ＜０．０５）ＳＷ６２０腫瘍の増殖が抑制された。コントロールのｄｌ３１２の投与では腫瘍増殖は全く影響されなかった。
【００６３】
【発明の効果】
本発明のウイルスは効率良く癌細胞において増殖し、癌細胞を死滅させることがわかる。また、本発明のウイルスは増殖能を有しているので、投与するウイルスを低濃度にすることにより、副作用を抑制することもできる。
【００６４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウイルスの構造の模式図を示す。非増殖性ウイルスベクターでは欠失しているＥ１遺伝子領域に、ｈＴＥＲＴプロモーターとＥ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列、Ｅ１Ｂ遺伝子よりになる増殖カセット（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ）が挿入されている。
【図２】ヒト癌細胞および正常細胞におけるテロメラーゼ活性の比較を示す。
【図３】ヒト癌細胞および正常細胞におけるＴＲＡＤ感染後のＥ１Ａ及びＥ１Ｂ　のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を示す。
【図４】ヒト癌細胞および正常細胞におけるＴＲＡＤ感染後の細胞内増殖の検討を示す。
【図５】ヒト癌細胞および正常細胞におけるＴＲＡＤの細胞障害活性（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ染色による検討）を示す。
【図６】ヒト癌細胞及び正常細胞におけるＴＲＡＤの細胞障害活性（顕微鏡所見）を示す。
【図７】ヒト癌細胞及び正常細胞におけるＴＲＡＤの細胞障害活性（ＸＴＴアッセイによる検討）を示す。
【図８】ヌードマウスとヒト肺癌細胞Ｈ３５８を用いた非増殖性ｐ５３遺伝子発現アデノウイルスベクターの腫瘍内局所投与の抗腫瘍効果を示す。
【図９】ヌードマウス及びヒト大腸癌細胞ＳＷ６２０を用いたＴＲＡＤの腫瘍内局所投与の抗腫瘍効果の示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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