(57)【要約】【課題】本発明は、新規なチロシナーゼ阻害剤を提供する。さらに、表皮への異常なメラニン色素の沈着を予防あるいは改善する等の美白効果に優れ、しかも、副作用の殆どない皮膚に対する安全性に優れた美白化粧料を提供する。【解決手段】一般式（Ｉ）：【化１】2004345969.tif 000007（式中、Ｒは水素原子又はアルキル基を示す）で表される化合物又はその塩を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤、及び美白化粧料等に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2004345969.tif 000005
（式中、Ｒは水素原子又はアルキル基を示す）
で表される化合物又はその塩を有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤。
【請求項２】
一般式（Ｉ）のＲが水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である請求項１に記載のチロシナーゼ阻害剤。
【請求項３】
一般式（Ｉ）のＲが水素原子、メチル基又はエチル基である請求項２に記載のチロシナーゼ阻害剤。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載のチロシナーゼ阻害剤を含む美白化粧料。
【請求項５】
黒米糠からの抽出物を有効成分として含む美白化粧料。
【請求項６】
上記抽出物が、水及び極性有機溶媒からなる群から選ばれた少なくとも一種の抽出溶媒を用いて抽出されたものである請求項５に記載の美白化粧料。
【請求項７】
上記抽出溶媒が、水、アルコール、又はこれらの混合溶媒である請求項６に記載の美白化粧料。
【請求項８】
抽出物が一般式（Ｉ）：
【化２】
2004345969.tif 000006
（式中、Ｒは水素原子又はアルキル基を示す）
で示される化合物又はその塩を含む抽出物である請求項５に記載の美白化粧料。
【請求項９】
さらに、他の美白剤、紫外線吸収剤及び角化改善剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する請求項４〜８のいずれかに記載の美白化粧料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、黒米糠から得られる抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤に関する。さらに、該チロシナーゼ阻害剤を用いた美白化粧料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
しみ・そばかす及び日焼け後の肌への色素沈着は、加齢に伴い発生、増加、或いは消失しにくくなり、中高年齢層にとって悩みとなっている。これらの色素沈着症の発症機構は未だ解明されていないが、太陽光線、特に紫外線やメラノサイト刺激ホルモン等の作用により表皮メラノサイトのメラニン合成機構が亢進するためであると考えられている。
【０００３】
また、表皮角化細胞（ケラチノサイト）の加齢に伴う角化遅延もメラニンの表皮外への排泄速度を遅延させ、メラニン合成能の亢進と合わせて、表皮内のメラニン顆粒密度の増加、即ち臨床的に色素沈着が増加する症状を発現させるものと考えられている。更にそれらの色素沈着部は局部的に存在し、周囲の正常皮膚色と明らかな差異を生ずることもある。
【０００４】
このため上記の後天的な色素沈着部を正常な皮膚色にまで回復させる薬剤や、色素沈着を予防する薬剤が強く望まれており、これまでにも多くの薬剤が開発され商品化されている。
【０００５】
例えば、近年、優れた還元能を有するビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）誘導体を用いた化粧料が提案されているが、ビタミンＣ誘導体は安定性に難があるとともに、外用では殆ど効果が認められていない。
【０００６】
また、欧米において、ハイドロキノンがしみの治療や黒人皮膚を白くする等の用途の薬剤として用いられているが、ハイドロキノンは、それ自体の安全性（刺激性、アレルギー性）に問題があり、また、白斑を生じさせるケースもある等の点から一般用薬剤に配合するには問題がある。
【０００７】
これらの他にもメラニン抑制剤としてインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のチロシナーゼ活性阻害試験で効力を示す種々の物質が報告されている。それらのうち、安息香酸誘導体については、短鎖アルコキシ基を有するサリチル酸誘導体についてインビトロのチロシナーゼ活性阻害及び美白作用が報告されている（特許文献１参照）。しかしながら、報告されているような短鎖アルコキシ置換サリチル酸誘導体をはじめとする公知のメラニン抑制剤でも、未だ十分な美白効果が得られず、更には、皮膚刺激等の安全性も十分とはいえない。
【０００８】
即ち、色素沈着改善（美白）効果及び皮膚に対する安全性の両面を十分に満足する化合物は、未だ提案されておらず、強く要望されているのが現状である。
【０００９】
一方、黒米（Ｏｒｙｚａ  Ｓａｔｉｖａ  Ｌ．  Ｉｎｄｉｃａ）は、黒紫色の穀物であり、南アジアや中華人民共和国の主な米収穫物である。そして、医薬効果を備えた栄養価の高い米として広く知られている。
【００１０】
【特許文献１】
特開平６−４０８８６号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規なチロシナーゼ阻害剤を提供することである。さらに、哺乳動物の表皮への異常なメラニン色素の沈着を予防あるいは改善する等の美白効果に優れ、しかも、副作用の殆どない皮膚に対する安全性に優れた美白化粧料を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記した目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、黒米糠（ｂｌａｃｋ  ｒｉｃｅ  ｂｒａｎ）の抽出物が優れたチロシナーゼ阻害作用を有することを見出し、これをさらに発展させて、ここに本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は、下記の技術思想を提供する。
【００１４】
項１  一般式（Ｉ）：
【００１５】
【化３】
2004345969.tif 000002
【００１６】
（式中、Ｒは水素原子又はアルキル基を示す）
で表される化合物又はその塩を有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤。
【００１７】
項２  一般式（Ｉ）のＲが水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である項１に記載のチロシナーゼ阻害剤。
【００１８】
項３  一般式（Ｉ）のＲが水素原子、メチル基又はエチル基である項２に記載のチロシナーゼ阻害剤。
【００１９】
項４  項１、２又は３に記載のチロシナーゼ阻害剤を含む美白化粧料。
【００２０】
項５  黒米糠からの抽出物を有効成分として含む美白化粧料。
【００２１】
項６  上記抽出物が、水及び極性有機溶媒からなる群から選ばれた少なくとも一種の抽出溶媒を用いて抽出されたものである項５に記載の美白化粧料。
【００２２】
項７  上記抽出溶媒が、水、アルコール、又はこれらの混合溶媒である項６に記載の美白化粧料。
【００２３】
項８  抽出物が一般式（Ｉ）：
【００２４】
【化４】
2004345969.tif 000003
【００２５】
（式中、Ｒは水素原子又はアルキル基を示す）
で示される化合物又はその塩を含む抽出物である項５に記載の美白化粧料。
【００２６】
項９  さらに、他の美白剤、紫外線吸収剤及び角化改善剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する項４〜８のいずれかに記載の美白化粧料。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、黒米糠からの抽出物である、一般式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とするものである。
【００２８】
黒米糠からの抽出物
本願における黒米糠の原料である黒米は、糠層にアントシアニン系の紫色色素を有する有色素米である。また、黒米糠とは、黒米のもみを通常乾燥した後、いわゆるもみすりして玄米とした後、搗米する際に生じる果皮、種皮、外胚乳等の粉砕物をいう。この際、粉砕の程度については、特に限定はないが、例えば、玄米の１５重量％程度までを粉砕物としたものを用いることができ、玄米の１０重量％程度までを粉砕物としたものが好ましい。黒米糠は、そのまま抽出に供することができるが、搗精後に得られた糠を乾燥し、更に、より細かく粉砕した後、抽出に供してもよい。
【００２９】
黒米糠の抽出溶媒としては、特に限定的ではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等のグリコール類、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類等の極性有機溶媒、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の無極性有機溶媒等や水等を用いることができる。これらの抽出溶媒は、一種単独又は二種以上混合して用いることができる。これらの内で、水及び極性有機溶媒からなる群から選ばれた少なくとも一種の溶媒は、優れた抗変異原性活性を有する抽出物を効率よく得ることができる点で好ましい。特に、メタノール、エタノール等のアルコール、又は水をそれぞれ単独で用いるか、或いは、これらの混合溶液を用いる場合には、取り扱いが容易であり、しかも優れた活性を有する抽出物を得ることができる点で好ましい。この場合、特に抽出物を皮膚外用剤の用途で用いる場合には、アルコールとしては、エタノールを用いることが好ましい。
【００３０】
溶媒を混合して用いる場合には、各溶媒の混合比は、溶媒の種類に応じて適宜調整すればよいが、例えば、水とアルコールとの混合溶液として用いる場合には、水：アルコール（重量比）＝１：１００〜１００：１程度とすれば良く、１：５０〜５０：１程度とすることが好ましく、ほぼ等重量で用いることがより好ましい。
【００３１】
抽出方法については、特に限定されるものではなく、黒米糠に溶媒を加えた後、抽出物のチロシナーゼ阻害活性を失活させない程度に加温加熱する加熱抽出法や、超臨界抽出法等を適宜適用できる。また、一定量の溶媒に黒米糠を浸漬してバッチ処理する浸漬抽出法や連続的に溶媒を送り続ける連続抽出法等、公知の種々の抽出法を適用できる。
【００３２】
具体的な抽出方法の一例を挙げると、例えば、黒米糠の乾燥重量に対して、０．５〜５重量倍程度、好ましくは、０．８〜１．２重量倍程度の抽出溶媒を加えて浸漬して加熱し、３０〜６０分間程度溶媒を還流させることにより、チロシナーゼ阻害活性を有する成分を抽出することができる。或いは、黒米糠の乾燥重量に対して０．５〜５重量倍程度、好ましくは、０．８〜１．２重量倍程度の抽出溶媒を加えて浸漬し、室温で１〜１４日間程度放置するか、或いは４０〜６０℃程度に加熱して１０〜２０時間程度加熱することにより有効成分を抽出することも可能である、勿論、溶媒量や加熱温度、加熱時間等については、優れたチロシナーゼ阻害活性を有する成分を抽出できるように適宜調整すればよい。
【００３３】
上記した方法によって黒米糠から抽出物を得た後、通常、濾過、遠心分離等の常法によって残渣と固液分離することによって、抽出液を得ることができる。本発明では、得られた抽出液をそのままチロシナーゼ阻害剤として用いることが可能であるが、活性が低い場合もあるため、適宜濃縮又は溶媒を留去して、エキス状や粉末状として用いることもできる。更に、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、ベンゼン等の有機溶媒を１種又は２種以上用いた溶媒分画操作により得られた抽出画分から、活性画分を分取したものをチロシナーゼ阻害剤として用いることも可能である。更に、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて、チロシナーゼ阻害活性作用のある画分又は化合物を取り出して、チロシナーゼ阻害剤とすることができる。これにより、少量の摂取で優れた活性を発揮させることができる。
【００３４】
チロシナーゼ阻害活性化合物の精製・同定
次に、図１を参照して、黒米糠からのチロシナーゼ阻害活性化合物の精製・同定の手順を例示する。
【００３５】
黒米糠をアルコール性溶媒（例えば、メタノール、エタノール）で還流し、アルコール抽出物を得る。この抽出物を水に懸濁させ、ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル、及び水でそれぞれ再抽出し、それらの画分を減圧下濃縮して、ヘキサン画分、クロロホルム画分、酢酸エチル画分、及び水画分を得る。チロシナーゼ阻害活性作用のある酢酸エチル画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分画することにより、チロシナーゼ阻害活性作用のある活性化合物１を得る。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画は、必要に応じ溶出溶媒の極性を変えて数回繰り返してもよい。
【００３６】
各種スペクトル分析により、活性化合物１は、それぞれプロトカテク酸メチルエステル（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）と同定された。さらに、プロトカテク酸メチルエステルの構造類似化合物を合成し（図３）、それらのチロシナーゼ阻害活性について構造活性相関を調べたところ、プロトカテク酸についてもチロシナーゼ阻害活性作用のあることが確認された（図４）。
【００３７】
本発明のチロシナーゼ阻害剤
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、上記の黒米糠からの抽出物又は一般式（Ｉ）：
【００３８】
【化５】
2004345969.tif 000004
【００３９】
（式中、Ｒは水素原子又はアルキル基を示す）
で示される化合物又はその塩を有効成分とする。
【００４０】
上記一般式（Ｉ）におけるＲで表されるアルキル基としては、直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜１０のアルキル基が挙げられ、好ましくは直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基が挙げられる。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｉ−ヘキシル基等が例示される。より好ましいＲとしては、水素原子、メチル基、エチル基が挙げられ、特に、水素原子又はメチル基が好ましい。
【００４１】
換言すれば、一般式（Ｉ）で示される化合物の好ましいものとしては、プロトカテク酸、プロトカテク酸メチルエステル、プロトカテク酸エチルエステル等が挙げられる。本発明のチロシナーゼ阻害剤は、これらからなる群から選ばれる少なくとも一種を有効成分として含んでいてもよい。
【００４２】
なお、一般式（Ｉ）で示される化合物は、市販のプロトカテク酸から公知の方法により製造することができる。
【００４３】
一般式（Ｉ）で示される化合物のＲが水素原子の場合、即ち、プロトカテク酸の場合は、遊離カルボン酸の形でも塩の形でも本発明のチロシナーゼ阻害剤として供し得る。該塩としては、本発明の効果に悪影響を与えないものであれば特に制限はなく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩；塩化アンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等のアンモニウム塩：アミノ酸塩等が挙げられる。なお、上記一般式（Ｉ）で示される化合物の塩は、公知の手法により容易に製造することができる。
【００４４】
本発明の美白化粧料
上述の黒米糠からの抽出物及び一般式（Ｉ）で示される化合物は、優れたチロシナーゼ阻害作用を有し、表皮への異常なメラニン色素沈着予防効果等の美白効果に優れている。そのため、美白化粧料として好適に用いることができる。
【００４５】
本発明の美白化粧料において、黒米糠からの抽出物の含有量は、美白化粧料全体に対し、０．０１〜７０重量％程度、好ましくは１〜５０重量％程度である。
【００４６】
本発明の美白化粧料において、上記化合物（Ｉ）又はその塩は、それぞれ単独で又はぞれぞれの任意の２種以上を混合して用いられる。また、本発明の美白化粧料における上記化合物（Ｉ）又はその塩の含有量は、美白化粧料全体に対し、０．０００１〜５０重量％程度、好ましくは０．０１〜２０重量％程度である。
【００４７】
また、本発明の美白化粧料は、上記有効成分に、更に、他の美白剤、紫外線吸収剤及び角化改善剤からなる群から選ばれた１種又は２種以上を配合することにより、美白効果が更に向上し、また、メラニン抑制効果の向上のみならず、日焼けの予防効果を有する美白化粧料として用いることができる。
【００４８】
上記他の美白剤としては、アラントイン、ビタミンＥ誘導体、グリチルリチン、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩等のアスコルビン酸誘導体、コージ酸、アルブチン、パンテチン酸誘導体、プラセンタエキス、抗炎症剤、ヨクイニン、緑茶、葛根、桑白皮、甘草、オウゴン、アロエ、橙皮、カミツレ、霊芝等の各種生薬・植物抽出物等の公知の美白剤が挙げられる。上記美白剤の配合量は、美白化粧料全体に対し、好ましくは０．０００１〜４０重量％、更に好ましくは０．０１〜２０重量％である。
【００４９】
また、上記紫外線吸収剤としては、ジベンゾイルメタン誘導体、ケイ皮酸エステル誘導体、ベンゾフェノン誘導体、ｐ−アミノ安息香酸誘導体等の有機系紫外線吸収剤、及び亜鉛華、雲母、雲母チタン、酸化チタン、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム等の無機系紫外線吸収剤等が挙げられる。上記紫外線吸収剤の配合量は、美白化粧料全体に対し、好ましくは０．１〜２０重量％、更に好ましくは０．５〜１０重量％である。
【００５０】
また、上記角化改善剤としては、スフィンゴシン誘導体や特開平５−１９４１８５号公報に記載のアミン誘導体等が挙げられる。上記角化改善剤の配合量は、美白化粧料全体に対し、好ましくは０．０００１〜４０重量％、更に好ましくは０．０１〜２０重量％である。
【００５１】
また、本発明の美白化粧料には、上記有効成分、上記の公知の美白剤、上記紫外線吸収剤、上記角化改善剤以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、任意の成分を配合することができる。上記の任意の成分は、美白化粧料の剤型に応じて、公知の皮膚外用剤や顔面化粧用化粧料に通常配合される成分、例えば、精製水、エタノール、油状成分、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、薬効成分、粉体、香料、乳化安定剤、ｐＨ調整剤等が用いられる。
【００５２】
具体的には、上記油状成分としては、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン、ミツロウ、カルナバロウ、オリーブ油、ラノリン、高級アルコール、脂肪酸、高級アルコールと脂肪酸の合成エステル油、シリコーン油、フッ素系油剤等が挙げられる。
【００５３】
また、上記保湿剤としては、ソルビトール、キシリトール、グリセリン、マルチトール、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、ポリオキシプロピレン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００５４】
また、上記増粘剤としては、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、カラギーナン、ゼラチン等の水溶性高分子、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の電解質等が挙げられる。
【００５５】
また、上記防腐剤としては、尿素、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸ナトリウム等が挙げられる。
【００５６】
また、上記乳化剤としては、レシチン、水素添加レシチン、α−モノアルキルグリセリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、シリコーン乳化剤等が挙げられる。
【００５７】
また、上記薬効成分としては、抗ヒスタミン剤（塩酸ジフェドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸誘導体等）、ホルモン類（エストラジオール、エストロン、エチルエストラジオール、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン等）等が例示される。
【００５８】
また、上記粉体としては、タルク、セリサイト、マイカ、カオリン、シリカ、ベントナイト、バーミキュライト、硫酸バリウム、ベンガラ、酸化鉄、群青等が挙げられる。
【００５９】
また、上記香料としては、リモネン、リナノール、シトラール、β−イオノン、ベンジルベンゾエート、インドール、オイゲノール、オーランチオール、ゲラニオール、リラール、ダマスコン、ベンジルアセテート、ジャスミンラクトン、ガラクソリッド、精油等が挙げられる。
【００６０】
また、上記ｐＨ調整剤としては、乳酸−乳酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム等の緩衝剤が挙げられる。
【００６１】
本発明の美白化粧料は、常法により種々の形態にすることができ、その形態には特に制限されないが、一般には、ローション状、乳液状、クリーム状、軟膏状、スティック状、有機溶媒や精製水などによる溶液状、パック状、ゲル状等とするのが好ましい。即ち、本発明の美白化粧料は、ローション、オイルエッセンス、Ｏ／Ｗ型又はＷ／Ｏ型のクリーム、乳化型化粧料、パック、軟膏、美白ファンデーション等の美白化粧料や、化粧乳液、化粧水、油性化粧料、口紅、ファンデーション、皮膚洗浄剤、ヘアトニック、整髪剤、養毛剤、育毛剤、浴用剤、シャンプー、リンス等の皮膚外用剤として使用される。
【００６２】
本発明の美白化粧料は、紫外線による皮膚の炎症、しみ、そばかす、日焼け後の色素沈着部等の患部に局所的に適用することにより、該部位を治療・改善し正常な皮膚色に戻すことができるものであり、また、予め局所的に適用した場合には、上記症状を予防することができるものである。
【００６３】
【発明の効果】
今回、黒米糠の抽出物に含まれるチロシナーゼ阻害活性を有する化合物（Ｉ）を精製・同定することに成功した。つまり、本発明のチロシナーゼ阻害剤及び美白化粧料は、この化合物（Ｉ）を有効成分とするものである。また、本発明の美白化粧料は、高い美白効果を有すると共に、黒米糠を原料としているため安全性が高いという特長を有している。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明する。
【００６５】
実施例１（チロシナーゼ阻害物質の同定）
（１）チロシナーゼ活性阻害の評価方法
Ｌ−チロシンを基質として用い、チロシナーゼ活性を分光光度計により評価した。０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ６．８）１．７ｍｌ、２０％ポリオキシエチレン  ノニルフェニルエーテル２００μＬ、０．０３％Ｌ−チロシン溶液２５０μＬ、及び試料化合物のジメチルスルホキシド溶液（サンプル溶液）１００μＬを試験管に入れて、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、チロシナーゼ溶液（３０００ユニット／ｍＬ、水に溶解）２５０μＬを試験管に加えて、３７℃で６０分間インキュベートした。酵素活性は、波長４７５ｎｍの吸収を測定することにより定量した。チロシナーゼ活性は、次の式から求めた。
【００６６】
チロシナーゼ活性（％）＝［（Ａ−Ｂ）／（Ｃｐ−Ｃｎ）］×１００
Ａ：試料サンプルの吸収（０．１Ｍリン酸バッファ、ポリオキシエチレン  ノニルフェニルエーテル、Ｌ−チロシン溶液及びサンプル溶液）
Ｂ：ブランクの吸収（０．１Ｍリン酸バッファ、ポリオキシエチレン  ノニルフェニルエーテル、蒸留水及びサンプル溶液）
Ｃｐ：ポジティブコントロールの吸収（０．１Ｍリン酸バッファ、ポリオキシエチレン  ノニルフェニルエーテル、Ｌ−チロシン溶液及びＤＭＳＯ）
Ｃｎ：ポジティブコントロールの吸収（０．１Ｍリン酸バッファ、ポリオキシエチレン  ノニルフェニルエーテル、蒸留水及びＤＭＳＯ）
（２）黒米糠からのチロシナーゼ活性阻害化合物の単離
上記（１）のチロシナーゼ阻害活性試験を用いた黒米糠からの活性成分の抽出工程を図１に示す。黒米糠（４．０ｋｇ）をメタノールで１２時間還流しメタノール抽出物（６０６ｇ）を得た。この抽出物を水に懸濁させ、ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル及び水でそれぞれ再抽出した。各画分を減圧下濃縮して、ヘキサン画分（１６３ｇ）、クロロホルム画分（３．６０ｇ）、酢酸エチル画分（１２．４ｇ）及び水画分（４２７ｇ）を得た。これらの画分をチロシナーゼ阻害活性試験に供したところ、図２に示すように酢酸エチル画分が最も強い阻害効果を示した。この酢酸エチル画分を、クロロホルム−メタノールの溶出液を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、画分１〜４に画分した。画分１がチロシナーゼ阻害活性を示した。この画分１を、クロロホルム−アセトンの溶出液を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、画分５〜８に画分した。阻害活性を有する画分６を、さらに再度シリカゲルを用いたクロマトグラフィーで精製することにより、白黄色オイルとして活性化合物１を３５９ｍｇ得た。
【００６７】
活性化合物１は、下記に示すスペクトルデータにより、プロトカテク酸メチルエステルと同定された。
ＥＩ−ＭＳ，  ｍ／ｚ  １６８  （［Ｍ］＋，  ３５．４  ％），  １３７  （１００  ％），  １０９  （２５．３  ％），  ８１  （１８．２  ％），  ６３  （１１．１  ％），  ５３  （１８．２  ％）；  ＩＲ  （ＫＢｒ，  νｍａｘ  ｃｍ−１）  ３３３８，  １６８５，  １６０４，  １５２１，  １４３８，  １３０１；  １Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  アセトン−ｄ６）  δ  ７．３９  （１Ｈ，  ｄ  ，  Ｊ＝２．０  Ｈｚ，  Ｈ−２），δ  ７．３４  （１Ｈ，  ｄｄ  ，  Ｊ＝２．０，  ８．３  Ｈｚ，  Ｈ−６），  δ  ６．８０  （１Ｈ，  ｄ  ，  Ｊ＝８．３  Ｈｚ，  Ｈ−５），δ  ３．８０  （３Ｈ，  ｓ，  Ｈ−８）；    １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  アセトン−ｄ６）  δ  １６６  （−ＣＯＯＣＨ３），δ  １５０  （Ｃ−４），  δ  １４５  （Ｃ−３），  δ  １２３  （Ｃ−６），  δ  １２２  （Ｃ−１），  δ  １１７  （Ｃ−２），  δ  １１５  （Ｃ−５），  δ  ５１  （−ＣＯＯＣＨ３）．
実施例２（構造活性相関）
（１）構造類似化合物の合成
上記の活性化合物であるプロトカテク酸メチルエステルと構造類似化合物を、市販のものとして入手或いはそれらから公知の方法により合成した（図３）。具体的には、化合物３，５及び７は、それぞれ市販のバニリン酸（４）、イソバニリン酸（６）及びベラトルム酸（８）を、濃硫酸とメタノールによりメチルエステル化して製造した。
（２）チロシナーゼ活性阻害の比較
チロシナーゼ活性に対する化合物１〜８（図３）の阻害効果を図４に示す。化合物１及び２は、０．５０μｍｏｌ／ｍＬの濃度において、７５．４％及び６０．１％のチロシナーゼ阻害活性を示した。すなわち、これらのＩＤ５０値はそれぞれ、０．２８及び０．４２μｍｏｌ／ｍＬとなる。これに対し、化合物３〜８はチロシナーゼ阻害活性を示さなかった。
【００６８】
この結果から、ベンゼン環上のＣ−３及びＣ−４位の水酸基が、チロシナーゼ活性阻害の重要なファクターであるといえる。
【図面の簡単な説明】
【図１】黒米糠からのチロシナーゼ活性阻害化合物の単離工程を示す図である。
【図２】黒米糠から各抽出画分のチロシナーゼ活性阻害効果を示すグラフである。
【図３】チロシナーゼ活性阻害を評価した化合物１〜８を示す図である。
【図４】化合物１〜８のチロシナーゼ活性阻害効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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