(57)【要約】【課題】簡便かつハイスループットに無細胞タンパク質合成用の遺伝子断片を調製する方法を提供する。【解決手段】無細胞タンパク質合成に用いる鋳型核酸の調製方法であって、部位特異的組換え反応（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって作成され、少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードするＤＮＡ領域を含有するプラスミドより、そのプラスミドを保有する菌体もしくはプラスミドの粗抽出溶液から遺伝子増幅法を用いて、少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードする領域を含有する遺伝子断片の調製方法およびそれを実施するために必要な試薬・キット。また、プラスミドを脱落しにくい宿主大腸菌を用いてプラスミドを調製する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質合成に用いる鋳型核酸の調製方法であって、部位特異的組換え反応（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって作成された、少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードするＤＮＡ領域を含有するプラスミドを鋳型として、該プラスミドを保有する菌体もしくは該プラスミドから遺伝子増幅法を用いて、少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードする領域を増幅する方法。
【請求項２】
複数のサンプルから、遺伝子増幅方法を用いて無細胞タンパク質合成に用いられる程度の量の該鋳型核酸を均一に増幅できる条件で増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
鋳型核酸調製にポリメラーゼチェインリアクションを用いる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
増幅される遺伝子がプロモーター領域と目的タンパク質をコードする領域以外に、翻訳制御配列、翻訳増強配列、リボゾーム結合配列、ＲＮＡポリメラーゼのターミネーター配列および、非翻訳配列の一つ以上の配列を含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
無細胞タンパク質合成に用いる鋳型核酸の調製用試薬であって、少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードするＤＮＡ領域を含有するプラスミドより、そのプラスミドを保有する菌体もしくはプラスミドの粗抽出溶液から遺伝子増幅法を用いて少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードする領域を含有する遺伝子断片を調製するための試薬およびキット。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって調製された遺伝子断片を用いて無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とするタンパク質の合成方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法を用いた、無細胞タンパク質合成用試薬・キット。
【請求項８】
無細胞タンパク質合成用プラスミドの調製方法であって、大腸菌ＢＬ２１　株をプラスミド調製用の宿主とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は無細胞タンパク質合成に用いられる鋳型遺伝子の調製方法に関し、詳しくは「少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードするＤＮＡ領域を含有するプラスミド」より、そのプラスミドを保有する菌体もしくはプラスミドの粗抽出溶液から遺伝子増幅法を用いて「少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードする領域を含有する遺伝子断片」を調製する方法、それを実現するための試薬・キットに関する。また、一方においてプラスミドを脱落しにくい宿主大腸菌株を提供する。
本発明によって、無細胞タンパク質合成における鋳型核酸調製の煩雑さ、プラスミド抽出液に起因するリボヌクレアーゼによりＲＮＡの分解、プラスミドの脱落などの問題点を解消し、無細胞タンパク質合成を容易にすることが可能である。
【０００２】
【従来の技術】
無細胞タンパク質合成法を用いたタンパク質の合成は近年のバイオテクノロジーの進展にともないその利用価値が急速に注目されるようになりつつある。無細胞タンパク質合成は生体のタンパク質合成に関係する成分を生体外へ取り出し、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡとＡＴＰ、ＧＴＰなどのエネルギー源を添加することにより、半人工的にタンパク質を合成する手段である。その生体材料としては、大腸菌、網状赤血球や、コムギ胚芽が用いられることが多く、現在までに様々な調製方法や利用方法が検討されてきた。
【０００３】
これまで用いられてきたタンパク質合成の手段として組換え微生物や培養細胞などを用いる方法があるが、無細胞タンパク質合成法の利点は、１）生体に負に作用するようなタンパク質（翻訳系に影響を及ぼすものは除く）の合成が比較的容易である、２）簡便に条件を決定することができる（微生物などを用いる場合、最低一ヶ月程度を要するのが普通である）、３）非天然型アミノ酸を用いることができる、ことなどを挙げることができる。
【０００４】
今まで行われてきた無細胞タンパク質合成の鋳型として用いられる遺伝子の多くは無細胞タンパク質合成用にデザインされたプラスミドに目的遺伝子をクローニングし、それを鋳型としてタンパク質合成に用いることが広く行われてきた。一方で、無細胞タンパク質合成用のベクターに目的遺伝子を移し換える煩雑さからＰＣＲ法を用いて、目的遺伝子の上流にプロモーター配列などを融合させたＤＮＡ断片を調製する方法も開発されてきた（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４１４（１９９７）２６８−２７０）。
【０００５】
ただ、ＰＣＲを用いて目的遺伝子に様々な配列、例えばプロモーター配列や翻訳増強配列を導入するためには少なくとも一つの特異的配列を有するプライマーを合成する必要があり、また、３０ｂａｓｅを越えるような長いプライマーを使用する必要があることからＰＣＲの条件設定やコストに問題があった。
【０００６】
一方近年、部位特異的組換え反応（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）などを応用して任意のベクターに目的の配列を簡便に置きかえることが可能となり、プラスミドを用いた無細胞タンパク質合成の方法も再び注目を浴びるようになった。近年、部位特異的組換え反応（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用した組換えベクターおよび組換え用酵素はλファージの部位特異的組換え反応を利用するインビトロテック社のＧＡＴＥＷＡＹシステムなどが商品化され、現在広く使われるようになっている。このシステムを用いることにより、一度遺伝子をエントリーベクターに導入しておくことにより、任意の発現ベクターに容易に目的の遺伝子を移し変え、タンパク質発現実験を行えるようになった。
【０００７】
しかし一方で、無細胞タンパク質合成を実施するにあたり、発現ベクターを大腸菌を用いて大量に調製する必要が生じるが、以下の問題点により迅速な解析の妨げになる場合があり問題となっている。
（１）プラスミド抽出時に混入したリボヌクレアーゼによって合成されたｍＲＮＡが分解されタンパク質が合成されない。
（２）大腸菌内で発現漏れにより微量発現されたタンパク質の影響で、プラスミドのコピー数が低下する、もしくは脱落する。
（３）プラスミド抽出が煩雑でスループットが低い。
（４）プラスミドを一定濃度で調製することが困難。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このような理由から、簡便かつハイスループットに無細胞タンパク質合成用の遺伝子断片を調製する方法が求められていた。すなわち本発明の目的は、部位特異的組換え反応（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって組換えられたプラスミドの無細胞タンパク質合成に必要な領域を遺伝子増幅方法にて増幅する方法および、増幅された遺伝子を鋳型として無細胞タンパク質合成を行う方法を提供することである。また、該方法を実施するの必要な試薬・キットを提供することである。また一方において、プラスミドを脱落しにくい宿主大腸菌を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
我々は、部位特異的組換え反応（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により得られた、少なくともプロモーター配列および目的遺伝子を有するプラスミドにより形質転換された菌体、もしくはプラスミドの粗抽出液を増幅鋳型として遺伝子増幅反応を行うことにより、ほぼ均一濃度の遺伝子断片を効率良く増幅できること、およびその断片を用いて迅速に無細胞タンパク質合成が可能であることを見出し、本発明に至った。また一方において、プラスミドを脱落しにくい、プラスミド調製用大腸菌株を見出し本発明に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の構成からなる。
（１）無細胞タンパク質合成に用いる鋳型核酸の調製方法であって、部位特異的組換え反応（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって作成された、少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードするＤＮＡ領域を含有するプラスミドを鋳型として、該プラスミドを保有する菌体もしくは該プラスミドから遺伝子増幅法を用いて、少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードする領域を増幅する方法。
（２）複数のサンプルから、遺伝子増幅方法を用いて無細胞タンパク質合成に用いられる程度の量の該鋳型核酸を均一に増幅する条件で増幅する、（１）に記載の方法。
（３）鋳型核酸調製にポリメラーゼチェインリアクションを用いる（１）に記載の方法。
（４）増幅される遺伝子がプロモーター領域と目的タンパク質をコードする領域以外に、翻訳制御配列、翻訳増強配列、リボゾーム結合配列、ＲＮＡポリメラーゼのターミネーター配列および、非翻訳配列の一つ以上の配列を含有することを特徴とする（１）に記載の方法。
（５）無細胞タンパク質合成に用いる鋳型核酸の調製用試薬であって、少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードするＤＮＡ領域を含有するプラスミドより、そのプラスミドを保有する菌体もしくはプラスミドの粗抽出溶液から遺伝子増幅法を用いて少なくともプロモーター領域および目的タンパク質をコードする領域を含有する遺伝子断片を調製するための試薬およびキット。
（６）（１）〜（５）に記載の方法によって調製された遺伝子断片を用いて無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とするタンパク質の合成方法。
（７）（６）に記載の方法を用いた、無細胞タンパク質合成用試薬・キット。
（８）無細胞タンパク質合成用プラスミドの調製方法であって、大腸菌ＢＬ２１株をプラスミド調製用の宿主とする方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明における無細胞タンパク質合成に必要な鋳型核酸は、少なくともプロモーター配列および目的タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。プロモーターとしてはＴ７，　Ｔ３，　ＳＰ６などのプロモーターが好適に使用され、その下流に開始コドンから始まる目的タンパク質をコードする配列を含む。また、プロモーターと目的遺伝子の間に、様々な制御配列を含有しても良い。
【００１２】
本発明でいう部位特異的組換え反応（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）とは、例えばλファージなどの部位特異的組換え系などを意味する。λファージの組換えシステム（ａｔｔＢ×ａｔｔＰ　←→ａｔｔＬ×ａｔｔＲ）は、組換え酵素を用いることにより制限酵素やリガーゼの使用なしで目的遺伝子も目的の部位に組みこむことが出来るシステム（ＧＡＴＥＷＡＹシステム：インビトロジェン社）として広く使われるようになっている。また、ファージＰ１由来のＣｒｅ（ｃａｕｓｅｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）相同組換え酵素が３４ｂｐのｌｏｘＰサイトを認識して相同組換えを起こすことを利用した方法なども様々な分野で使われるようになりつつある。
【００１３】
本発明は遺伝子増幅の際に、プラスミドを保有している菌もしくは、精製したプラスミドを用いる。菌を直接増幅の鋳型として使用する方法は、コロニーダイレクト増幅法として一般的に行われている方法で、菌を液体培地で培養する手間とプラスミドを精製する手間を省略することが出来ることから、一度に多くの菌体をハイスループットに解析する場合に非常に強力な解析方法を提供する。また、一般的に精製したプラスミドは様々な方法に従って精製したものを使用することが出来るが、コロニーをマイクロチューブ中で水溶液に懸濁し、加熱して菌を破裂させ、遠心分離により上清を回収したような液も同様に使用できる。。
【００１４】
本方法は遺伝子増幅法を用いるため、プラスミドのコピー数が減少したようなクローンから無細胞タンパク質合成に十分な核酸を得ることが可能である。本発明は、条件を至適化することにより、複数のサンプルから遺伝子増幅方法を用いて無細胞タンパク質合成に用いられる程度の量の該鋳型核酸を均一に増幅する条件で増幅することを特徴とする。均一とは無細胞タンパク質合成を行うのに十分量の核酸量をいう。これには、増幅反応のプラトー効果を利用するのが良く、最も良く使用される増幅法の一つであるポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を用いる場合は、３０サイクル以上の増幅サイクルを実施するのが良い。約２５サイクルを越えた時点で十分量の核酸が合成されている場合、遺伝子増幅は種々の要因によって増幅率は極端に低下することが知られており、それ以降では核酸の増幅が十分でないものが優先的に増幅されることになる。よって、３０サイクルを越えるサイクルで得られる増幅核酸はほぼ均一な濃度となる。このこのことにより、上で述べたような菌体に含まれるプラスミドのコピー数が均一でない場合でも、解析に用いる核酸を均一に調製できる。
【００１５】
本発明における増幅反応にはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）が好適に使用されるが特に限定されない。具体的には、上流のプロモーターおよび目的遺伝子を増幅できるようにプライマーを設計し、ＰＣＲ反応を実施する。さらに詳しくは、プロモーターの全長を含まないように（前半を含むものは可）設計した上流プライマーと目的配列下流の任意のベクター配列上に下流プライマーを設計することが好ましい。ＰＣＲ方法の方法は一般的な試薬を用いることができ、特に限定されないが、好ましくはＬｏｎｇ　ＰＣＲ用の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼもしくは、コロニーダイレクトＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼなどを用いることで効率良く増幅核酸を得ることが可能となる。
【００１６】
増幅される領域には、プロモーター領域と目的タンパク質をコードする遺伝子以外に、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列、コザック配列やΩ配列などの翻訳制御領域、Ｔ７ターミネーターなどのＲＮＡポリメラーゼのターミネーター配列や、プラスミドなどに起因する非翻訳領域などを含んでも良い。
【００１７】
具体的な方法としては、寒天培地で培養した菌を爪楊枝やマイクロピペット用のチップの先でつつき、準備しておいたＰＣＲ反応液に懸濁した後、ＰＣＲを行う。また、液体培養した培養液、もしくはグリセロールストックを少量用いても良い。どちらにしても菌体をＰＣＲ反応に持ちこみ過ぎないことが重要であり、ＰＣＲ反応液５０μｌに対して、寒天培地上のコロニーを用いる場合は、目視できない程度の菌量で良く、培養液もしくはグリセロールストックの場合は０．１〜１μｌ程度で良い。
【００１８】
粗精製プラスミドを用いる場合は、寒天培養した菌では一度蒸留水もしくは適当な緩衝液に懸濁し、高温にさらすことにより菌体を破壊しＤＮＡを溶液中へ放出させ、遠心分離することにより菌体残査を除去した上清を用いると良い。また、培養液やグリセロールストックを用いる場合は、そのまま高温にさらしても良いが、一度遠心分離により菌を分離し、蒸留水や適当な緩衝液に懸濁した後、寒天培養した菌と同様の処理を行う方がより良い。ここでいう高温とは８０℃〜１２０℃程度のことであり、菌体を破壊し、ＤＮＡを溶液中に放出させるに十分な温度であれば特に限定されない。
【００１９】
本発明の方法で得られた核酸を無細胞タンパク質合成に用いる場合、一般的に以下のような方法を用いる。すなわち、
（１）増幅されたＤＮＡ断片を精製する。
（２）精製したＤＮＡ断片を鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを合成する。
（３）ｍＲＮＡを精製する。
（４）無細胞タンパク質合成を行う。
方法によっては、（２）、（３）の工程を省くこともできる。その場合は（４）の工程で同時にｍＲＮＡを合成する。それぞれの精製の方法は、どのような方法を用いても良いが、緩衝液と塩を除去する程度でも良い場合が多い。
【００２０】
無細胞タンパク質合成の方法は特に限定されず、コムギ胚芽抽出液、大腸菌抽出、ウサギ網状赤血球抽出液などを用いることが出来る。その中でも、改良されたコムギ胚芽抽出液（ＰＮＡＳ，　９７（２）　５５９−５６４　（２０００））がその効率の良さから好適に使用される。
【００２１】
本発明の一態様は、遺伝子増幅用プライマー、遺伝子増幅用酵素、および遺伝子増幅用緩衝液を含む無細胞タンパク質合成用に用いるＤＮＡ鋳型を合成用キットである。
【００２２】
また、本発明の一具体的態様は、遺伝子増幅用プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ用緩衝液を含む無細胞タンパク質合成に用いるＤＮＡ鋳型を合成用キットである。
【００２３】
更に、本発明はプラスミドを脱落しにくい宿主大腸菌を提供する。具体的には、プラスミドの調製に大腸菌ＢＬ２１株を用いる。更に好ましくはＢＬ２１　ＣＯＤＯＮ　ＰＬＵＳ　ＲＩＬ株、ＢＬ２１　ＣＯＤＯＮ　ＰＬＵＳ　（ＤＥ３）　ＲＩＬ株、ＢＬ２１　ＣＯＤＯＮ　ＰＬＵＳ　ＲＰ株、ＢＬ２１　ＣＯＤＯＮ　ＰＬＵＳ　（ＤＥ３）　ＲＰ株を用いることにより、プラスミドを脱落させることなくプラスミドを高濃度で回収することが容易になる。具体的な方法としては、低収率であったプラスミド溶液を用いてＢＬ２１　ＣＯＤＯＮ　ＰＬＵＳ　（ＤＥ３）　ＲＩＬを形質転換することが考えられる。
【実施例】
以下に、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００２４】
実施例１　コムギ胚芽無細胞タンパク質合成用ＧＡＴＥＷＡＹベクターの構築
コムギ胚芽抽出液を用いたタンパク質合成用ベクター（ｐＥＵ３−ＮＩＩ）（東洋紡績製：Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．：　ＣＰＳ−６０１）をインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙシステムのｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒへ変換するために、Ｇａｔｅｗａｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（インビトロジェン社）を用いた。具体的にはｒｆＢ　ｃａｓｓｅｔｔｅをマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＶに導入し、ＭＣＳの最上流にｒｆＢ　ｃａｓｓｅｔｔｅの導入されたコムギ無細胞合成用ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ（ｐＥＵ−Ｄｅｓｔ）を構築した。
一方において、エントリークローンの調製も同時に行った。具体的には、大腸菌ＤＮＡ　　１ｎｇを鋳型に、配列番号１および２に記載のオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、大腸菌ＤＨＦＲ遺伝子（４８０ｂｐ）を増幅した。増幅にはＫＯＤ　−Ｐｌｕｓ−（東洋紡製）を使用し、以下のサイクルを用いて増幅反応を行った（９４℃（２ｍｉｎ）＜９４℃（１５ｓｅｃ），６０℃（３０ｓｅｃ），　６８℃（１ｍｉｎ）：３０サイクル＞の条件を用いた）。この反応に用いた配列番号１に示すプライマーにはａｔｔＢ１配列が、配列番号２に示すプライマーにはａｔｔＢ２配列が付加されている。次に、この反応によって得られた増幅ＤＮＡを精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ　Ｃｌｅａｎ　ｕｐ：東洋紡製）を用いて精製し、ＧＡＴＥＷＡＹ　ＢＰ　ＣＬＯＮＡＳＥ　（インビトロジェン社製）を用いてｐＤＯＮＲ２０１プラスミド（インビトロジェン社製）と組換え反応を行い、ＤＨＦＲが挿入されたエントリーベクター（ｐＥＮＴＲ−ＤＨＦＲ）を調製した。
最後に、上で調製したｐＥＵ−ＤＥＳＴ（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ）とｐＥＮＴＲ−ＤＨＦＲ（ｅｎｔｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ）をＧＡＴＥＷＡＹ　ＬＲ　ＣＬＯＮＡＳＥ（インビトロジェン社製）を用いて組換えを行い、最終的な発現用ベクターを調製した。具体的には、ＬＲ組換えを行った溶液を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し選択培養を行うことにより発現ベクターを保有する大腸菌のみを分離した。こららの操作は全てインビトロジェンのＧＡＴＥＷＡＹインストラクションマニュアルに従った。
ここで得られたＤＨＦＲ発現用ベクターを保有する大腸菌ＤＨ５αはＬＢ／Ａｍｐ培地で液体培養した後、最終濃度２５％になるようにグリセロールを添加し、−８０℃にて保存した（グリセロールストック）。
【００２５】
実施例２　ＰＣＲ反応
まず、実施例１で得られたグリセロールストックを２５％グリセロール溶液で１／５希釈の系列を作成し、これをＰＣＲの鋳型とした。
次に、次の分量でＰＣＲ反応溶液を調製し、以下に示す温度条件でＰＣＲ反応を実施した。
Ｆｏｒｗｏｒｄ　ｐｒｉｍｅｒを配列番号３にＲｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒを配列番号４にそれぞれ示す。
（反応組成：１サンプル分）
滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３７．６（μｌ）
１０×ＫＯＤ　Ｄａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　５
２５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５Ｆｏｒｗｏｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５０ｐｍｏｌｅ／μｌ）　　　　　　　　　０．２
Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５０ｐｍｏｌｅ／μｌ）　　　　　　　　　０．２
ＫＯＤ　Ｄａｓｈ　（２．５Ｕ／μｌ）　　　　　　　　　　　　　　　　　１
グリセロールストック希釈液　　　　　　　　　　１
（反応サイクル）
９４℃（５ｍｉｎ）＜９４℃（２０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７４℃（１ｍｉｎ）：３０サイクル＞
その結果、１／１２５希釈したものまで増幅バンドを目的位置に確認することが出来た。少なくとも１／２５希釈までのものについては、ｍＲＮＡ合成に十分使用できる量のＤＮＡが合成された。
【００２６】
【実施例３】ｍＲＮＡ合成・精製
ＰＣＲ後のＤＮＡの精製は、Ｇ−２５スピンカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。具体的には、滅菌蒸留水で平衡化したスピンカラムにＰＣＲ反応液５０μｌを添加し、液交換を行った。このようにして精製したＤＮＡを以下の実験に用いた。
ｍＲＮＡの合成は以下の組成で３７℃、４時間行った。転写に用いたＴ７　ＲＮＡポリメラーゼは東洋紡製を用いた。
精製ＰＣＲ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３６（μｌ）
１０×Ｂｕｆｆｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
２５ｍＭ　ＮＴＰｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ）　　　　　　　　１
Ｔ７　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５０Ｕ／μｌ）　　　　　　３
ｍＲＮＡの精製にもＧ−２５スピンカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いた。具体的には、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ　７．６）にて平衡化したスピンカラムに転写終了液５０μｌを添加し、ｂｕｆｆｅｒ交換を行い、以下のタンパク質合成実験を行った。
【００２７】
【実施例４】タンパク質合成
タンパク質の合成はＰＲＯＴＥＩＯＳ　Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｃｏｒｅ　ｋｉｔ（東洋紡製）のＲＩバッチ法のプロトコールに従って２６℃にて３時間行った。その後、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルにて電気泳動を行い、Ｘ線フィルムを４日間感光させた。１／２５希釈したグリセロールストックから増幅されたＤＮＡを用いて行った結果を図２に示した。図２に示すように明瞭なバンドが確認でき、本方法が十分タンパク質合成に使用できることが証明された。
【００２８】
【発明の効果】
本発明により、本発明によって、無細胞タンパク質合成における鋳型核酸調製の煩雑さ、プラスミド抽出液に起因するリボヌクレアーゼによりＲＮＡの分解、プラスミドの脱落などの問題点を解消し、無細胞タンパク質合成を容易にすることが可能となる。
【００２９】
【配列表】
2004000083.tif 000002
【００３０】
2004000083.tif 000003
【００３１】
2004000083.tif 000004
【００３２】
2004000083.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】グリセロールストック鋳型としてＰＣＲ増幅したＤＮＡの電気泳動結果を示す図
１：グリセロールストック原液，　２：グリセロールストック１／５，　３：グリセロールス
トック１／２５，　４：グリセロールストック１／１２５，　Ｍ：１ｋｂラダーマーカー
【図２】図１に示した増幅ＤＮＡを鋳型として、合成したｍＲＮＡを用いて合成したＤＨＦＲタンパク質の電気泳動結果を示す図
【図１】
2004000083.tif 000006
【図２】
2004000083.tif 000007