(57)【要約】【課題】粘性が低く、且つ、重量平均分子量／数平均分子量の比が小さく取扱い易いプルランを製造し得るプルラン分解酵素とその製造方法並びに用途を確立することを課題とする。【解決手段】新規プルラン分解酵素と、当該酵素を産生するオーレオバシディウム属に属する微生物を用いる当該酵素の製造方法、当該酵素を用いるプルランの分解方法及び当該酵素を用いる、粘性及び／又はＭｗ／Ｍｎの比が低減されたプルランの製造方法を確立することにより前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するプルラン分解酵素。
（１）作用
プルランに作用させると、α−１，６グルコシド結合に隣接する還元性末端側のα−１，４グルコシド結合をエンド型に加水分解することにより、その粘性を低減する。
（２）基質特異性
プルランのみならず、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース、６３−Ｏ−α−マルトトリオシルマルトトリオース、及び６３−Ｏ−α−（６３−Ｏ−α−マルトトリオシル−マルトトリオシル）−マルトトリオースに作用する。
（３）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、約６７，０００乃至約１０７，０００ダルトン。
（４）等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約３．６乃至約４．６。
（５）至適温度
ｐＨ４．０、６０分間反応で、４０℃付近。
（６）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ約４．０乃至約４．５。
（７）温度安定性
ｐＨ４．０、６０分間保持で、３５℃付近まで安定。
（８）ｐＨ安定性
３５℃、６０分間保持で、ｐＨ約３．８乃至約６．７で安定。
（９）活性阻害
１ｍＭ  Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋及びＦｅ３＋で活性が阻害される。
【請求項２】
プルラン分解酵素が、オーレオバシディウム属に属する微生物由来の酵素である請求項１記載のプルラン分解酵素。
【請求項３】
請求項１又は２記載のプルラン分解酵素を産生する能力を有するオーレオバシディウム属に属する微生物を培養し、培養物から当該プルラン分解酵素を採取することを特徴とするプルラン分解酵素の製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載のプルラン分解酵素を用いるプルランの分解方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載のプルラン分解酵素及び／又は当該プルラン分解酵素活性を有する微生物をプルラン含有溶液に接触せしめ、粘性及び／又は重量平均分子量／数平均分子量の比が低減されたプルランを生成せしめ、これを採取することを特徴とするプルランの製造方法。
【請求項６】
重量平均分子量／数平均分子量の比が３未満であることを特徴とする請求項５記載のプルランの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プルラン分解酵素とその製造方法並びに用途に関し、詳細には、プルランに作用させると、α−１，６グルコシド結合に隣接する還元性末端側のα−１，４グルコシド結合をエンド型に加水分解することによって、その粘性を低減するプルラン分解酵素とその製造方法、当該酵素を用いるプルランの分解方法、並びに当該酵素及び／又は当該酵素を産生する能力を有する微生物を用いる、粘性及び／又は重量平均分子量／数平均分子量の比が低減されたプルランの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】特開平６−６５３０２号公報
【特許文献２】特開平５−３０６３５０号公報
【特許文献３】特公昭６１−２１４８１号公報
【特許文献４】特公平２−４８５６１号公報
【特許文献５】特公昭５３−３１２３４号公報
【非特許文献１】ボア（Ｂｏａ）等、『バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）』、第３０巻、４６３頁乃至４７０頁、１９８７年
【０００３】
プルランは、オーレオバシディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）を単糖類、オリゴ糖類などの糖類を含む栄養培地中で好気的に培養して得られる粘質グルカンであり、主としてマルトトリオースを繰り返し単位とし、これをα−１，６グルコシド結合で結合した化学構造を有する線状高分子多糖であって、通常、広い分子量分布幅を有している。
【０００４】
プルランの工業的製造法は、例えば、特許文献１及び非特許文献１などに開示されており、通常、プルラン産生能を有する微生物を単糖類、オリゴ糖類などの糖類を含む栄養培地中で好気的に培養した後、除菌し、濃縮し、必要に応じて、脱色、脱塩し、プルラン含有溶液を採取するか、又はこれを粉末化してプルラン含有粉末を採取する。更に必要に応じて、分子量分画や有機溶媒沈殿分離などを行うことによって、高純度のプルラン含有物を得ることができる。
【０００５】
プルランは、水溶性、造膜性、光沢性、透明性、ガスバリアー性、耐油性、耐塩性、粘着性、接着性、成形性、可食性、難消化性などの特徴を有していることから、試薬としてはもとより、各種飲食物、化粧品、医薬品、農林水畜産品、鉱工業資材などの基材、接着剤、コーティング剤などとして利用されるほか（特許文献２参照）、各種成形物、例えば、顆粒、錠剤、棒、フィルム、シートなどとして多くの用途に有利に利用できる。特に、狭い分子量分布幅を有するプルランは、血漿増量剤（特許文献３参照）や分子量標準試薬（特許文献４参照）などとして医薬品及び化学品の分野で有用であることが知られている。
【０００６】
プルランは、一般的に、他の多糖類、例えば、キサンタンガム、タラガム、ローカストビーンガム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースなどと比較すると低粘性であるものの、分子量の比較的大きいプルランを含有する溶液は、高い粘性を有しているため、種々の用途に加工・利用する場合、その取扱いに熟練を要し、広範な用途に容易に使用できないという欠点を有している。更に、広い分子量分布幅を有するプルランは、造膜性や接着性などの諸特性が不良となりやすい欠点を有している。よって、上述したような諸特性を有し、且つ、低粘性で狭い分子量分布幅を有するプルランが、斯界において希求されている。
【０００７】
このようなプルランを得るには、酸分解や酵素分解により、プルラン中のグルコース分子間の結合を加水分解し、望ましい分子量を有するプルランを分画する方法が挙げられる。酸分解は簡便な方法であるものの、酸分解後にアルカリで中和する際に生じる塩によって味質が変化したり、またこの塩を除去する場合は、操作が煩雑になるという問題がある。次に、酵素分解は、プルランに作用して加水分解を触媒する酵素を利用する方法であり、酵素としては、例えば、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、及び特許文献５記載のグルカナーゼなどが挙げられる。
【０００８】
前記プルラナーゼは、プルラン中のα−１，６グルコシド結合を特異的に加水分解して、最終的にマルトトリオースを生成する酵素であり、プルランに作用させると、マルトトリオース及びマルトトリオース単位からなるオリゴ糖が比較的早く生成するため、得られるプルラン含有物の分子量分布幅は広くなる。一般的に、分子量分布幅は、重量平均分子量（以下、Ｍｗと略す。）を数平均分子量（以下、Ｍｎと略す。）で除した数値（Ｍｗ／Ｍｎ）で表すことができ、Ｍｗ／Ｍｎの比が大きな値であるほど、分子量分布幅は広いことを意味する。逆に、Ｍｗ／Ｍｎの比が１に近づくほど、分子量分布幅は狭いことを意味し、Ｍｗ／Ｍｎの比が１の場合は、分子量が単一であることを意味する。例えば、プルラナーゼでプルランを加水分解する場合、Ｍｗが約３９５，０００でＭｗ／Ｍｎの比が約１．３３のプルランをＭｗが約４６，０００のプルランにまで加水分解すると、Ｍｗ／Ｍｎの比が約１１．１５の幅広い分子量分布幅を有するプルラン含有物が生成する。このような分子量分布幅が広いプルラン含有物は、分子量が数千から数十万のプルランの雑多な混合物であるため、造膜性や接着性などの諸特性が不良となることが多い。
【０００９】
次に、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）をプルランに作用させる場合は、プルラン分子中に僅かに存在するマルトテトラオース構造中のα−１，４グルコシド結合にのみ作用するため、低分子のプルランに分解するには限界があるとともに、多量の酵素が必要であるという欠点がある。
【００１０】
更に、特許文献５のグルカナーゼは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ６２７５に由来し、プルランに作用させると、イソパノース及びイソマルトースなどを生成する。本酵素をプルランに作用させて得られるプルラン含有物は、プルラナーゼの場合と同様に、分子量分布幅が広く、分子量が数千から数十万のプルランの雑多な混合物であることから、造膜性や接着性などの諸特性が不良となることが多い。
【００１１】
斯かる状況に鑑み、粘性が低く、且つ、狭い分子量分布幅を有する、即ち、Ｍｗ／Ｍｎの比が小さく取扱い易いプルランを製造する方法の確立が鶴首されていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記従来技術に鑑み、粘性が低く、且つ、Ｍｗ／Ｍｎの比が小さく取扱い易いプルランを製造し得るプルラン分解酵素とその製造方法並びに用途を確立することを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために、未知のプルラン分解酵素を求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索したところ、意外にも、プルラン産生菌であるオーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属に属する微生物がプルランを合成するだけでなく、産生したプルランの粘性を低減させる新規プルラン分解酵素を産生することを見いだし、当該プルラン分解酵素が下記の理化学的性質を有することを明らかにするとともに、当該プルラン分解酵素の製造方法、当該プルラン分解酵素をプルランに作用させることによるプルランの分解方法、及び当該プルラン分解酵素をプルランに作用させることにより得られる、粘性及び／又はＭｗ／Ｍｎの比が低減されたプルランの製造方法を確立して本発明を完成した。
＜当該プルラン分解酵素の理化学的性質＞
（１）作用
プルランに作用させると、α−１，６グルコシド結合に隣接する還元性末端側のα−１，４グルコシド結合をエンド型に加水分解することによって、その粘性を低減する。
（２）基質特異性
プルランのみならず、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース、６３−Ｏ−α−マルトトリオシルマルトトリオース、及び６３−Ｏ−α−（６３−Ｏ−α−マルトトリオシル−マルトトリオシル）−マルトトリオースに作用する。
（３）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、約６７，０００乃至約１０７，０００ダルトン。
（４）等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約３．６乃至約４．６。
（５）至適温度
ｐＨ４．０、６０分間反応で、４０℃付近。
（６）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ約４．０乃至約４．５。
（７）温度安定性
ｐＨ４．０、６０分間保持で、３５℃付近まで安定。
（８）ｐＨ安定性
３５℃、６０分間保持で、ｐＨ約３．８乃至約６．７で安定。
（９）活性阻害
１ｍＭ  Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋及びＦｅ３＋で活性が阻害される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のプルラン分解酵素を産生する微生物としては、例えば、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属に属する、オーレオバシディウム・ファーメンタス・バラエティー・ファーメンタス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＩＦＯ  ６４１０、オーレオバシディウム・ファーメンタス・バラエティー・フスカ（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｆｕｓｃａ）ＩＦＯ  ６４０２、オーレオバシディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）ＩＦＯ  ６３５３、オーレオバシディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）ＩＦＯ  ４４６４などの微生物及びそれらの変異株を例示できる。
【００１５】
上記微生物の培養に用いる培地は、これら微生物が生育でき、本発明のプルラン分解酵素の産生能を有するものであればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、上記微生物が生育に利用できればよく、例えば、澱粉、その部分分解物、グルコース、マルトース、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、水飴、スクロース、フラクトース、異性化糖、糖蜜などから選ばれる１種又は２種以上を使用することができる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、及び、例えば、尿素、グルタミン酸塩、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、コーン・スティープ・リカーなどの有機窒素含有物などから選ばれる１種又は２種以上が用いられる。他に無機成分として、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、鉄塩などが適宜用いられる。培地におけるこれら炭素源、窒素源及び無機成分の濃度は、適宜設定すればよい。
【００１６】
上記微生物の培養条件は、通常、約２０乃至約３５℃、好ましくは、約２５乃至約３０℃、ｐＨ約１乃至約９、好ましくはｐＨ約２乃至約８から選ばれる条件で、通常、好気的に行われる。培養時間は、微生物が増殖し始める時間以上であればよく、好ましくは２０時間乃至１５０時間である。また、培養液の溶存酸素濃度は特に制限されないが、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましく、通気量を調節したり、攪拌したり、通気に酸素を追加したり、また、ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段を採用し得る。また、培養方式は、回分培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００１７】
上記のようにして、本発明のプルラン分解酵素産生能を有する微生物を培養した後、得られる培養物から本発明のプルラン分解酵素を回収する。本発明の酵素は主に培養物から菌体を除去した除菌液に存在し、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることも、更には、菌体を適宜担体に固定化し、粗酵素として用いることもでき、常法に従って、濃縮や精製することもできる。培養物から菌体を除去する方法としては、公知の固液分離法、例えば、プレコートフィルター、平膜や中空糸膜などを用いる膜濾過法や遠心分離法などが適宜採用される。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜や中空膜などを用いる膜濃縮法などが適宜採用される。精製法としては、ポリエチレングリコール分画、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどが適宜採用され、これら精製法の一種類以上を適宜組み合わせて行うことによって電気泳動で単一なバンドを示す酵素を得ることができる。
【００１８】
本発明のプルラン分解酵素の活性は、次のようにして測定する。プルラン（商品名『プルランＰＩ−２０』、株式会社林原商事販売）をストルメヤーの方法（Ｓｔｒｕｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｈ．、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｉｔｙｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１９巻、６１頁乃至７１頁、１９６７年）に従って水素化ホウ素ナトリウムで還元し、得られた還元化プルランを濃度２．０％（ｗ／ｖ）となるように５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解させて基質溶液とし、その基質溶液０．４ｍｌに酵素液０．４ｍｌを加えて、３５℃で６０分間保持した後、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を０．０５ｍｌ添加して反応を停止させ、その反応液中に生成する還元糖量を、改良パーク−ジョンソン（Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）法（Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第９４巻、２０５頁乃至２１３頁、１９８１年）によって定量し、上記の条件下で１分間に１マイクロモルのグルコースに相当する還元糖を生成するために必要な酵素量を酵素活性１単位と定義した。
【００１９】
本発明のプルラン分解酵素の基質としては、通常、Ｍｗが、酵素反応後に得られるプルランのそれよりも大きいプルランが用いられる。基質濃度は、特に限定されず、工業的には、１％（ｗ／ｖ）以上が好適である。反応温度は、酵素が失活しない温度、例えば、４℃乃至５０℃、好ましくは２５℃乃至４０℃の温度で適宜設定すればよい。反応ｐＨは、ｐＨ約３．０乃至約７．０の範囲で調整すればよく、好ましくはｐＨ約３．０乃至約５．０の範囲で適宜調整する。反応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選択すればよく、通常、基質固形物グラム当たり約０．００１乃至約１００単位の酵素使用量で、約０．１乃至約１００時間である。
【００２０】
このようにして得られるプルランは、粘性が適度のレベルにまで低減されているか、又はＭｗ／Ｍｎの比が低減、望ましくは、３未満にまで低減されており、取扱いが容易である上、従来のプルランと同様に、水溶性、造膜性、光沢性、透明性、ガスバリアー性、耐油性、耐塩性、粘着性、接着性、成形性、可食性、難消化性などを有している。
【００２１】
上記のようにして得られるプルラン含有溶液は、常法に従って、活性炭で脱色、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状プルラン製品にすることも、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。必要ならば、更に分子量分画、有機溶媒沈殿分離などにより精製して、より狭い分子量分布幅を有するプルランを得ることも有利に実施できる。このようにして得られる溶液状及び粉末状のプルラン製品及び精製プルラン製品は、分子量標準試薬としてはもとより、飲食物、化粧品、医薬品、農林水畜産品、鉱工業資材など多くの用途に有利に利用できる。
【００２２】
飲食物としては、例えば、菓子、乳酸飲料、ゼリー、流動食、粘性を持つ飲料や調味料、海苔や珍味などの加工食品、ビフィズス菌増殖促進剤、ダイエタリーファイバー食品、低カロリー食品、フィルム状乃至シート状食品など、化粧品としては、例えば、練歯磨き、乳液、クリーム、パック、整髪料、シャンプー、リンス、トリートメント、口紅、入浴剤、口中清涼フィルムなどに原材料または中間製品として有利に利用できる。医薬品としては、例えば、軟膏、錠剤、フィルム剤、カプセル剤、代用血漿など、農林水畜産品としては、例えば、コーティング種子、造粒農薬、成形肥料、成形飼餌料など、鉱工業資材としては、例えば、糊剤、サイジング剤などの紙加工資材、廃水処理剤、溶接棒、鋳型などに原材料または中間製品として有利に利用できる。以下、実験で本発明を詳細に説明する。
【００２３】
【実験１】
＜オーレオバシディウム・プルランスからのプルラン分解酵素の調製＞
【実験１−１】
＜オーレオバシディウム・プルランスの培養＞
スクロース（商品名『グラニュ糖』、台糖株式会社製造）１０．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物（商品名『酵母エキスミーストＳ』、アサヒビール株式会社製造）０．２％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム０．０６％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．２％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０４％（ｗ／ｖ）、硫酸鉄・７水塩０．００１％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を５００ｍｌ容三角フラスコ１０個それぞれに２００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃、１５分間滅菌し、冷却して、オーレオバシディウム・プルランスＩＦＯ  ６３５３を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養した後、得られた培養液を全て混和したものを種培養液とした。
【００２４】
スクロース（商品名『グラニュ糖』、台糖株式会社製造）１２．１５％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物（商品名『酵母エキスミーストＳ』、アサヒビール株式会社製造）０．２％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸ナトリウム・１水塩０．１２％（ｗ／ｖ）、リン酸二アンモニウム０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム０．０６％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．０５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０４％（ｗ／ｖ）、硫酸鉄・７水塩０．００１％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を調製した。この培地を容量３０Ｌのファーメンターに約２０Ｌ入れ、１１５℃、１５分間滅菌し、冷却して２７℃とした後、種培養液を５％（ｖ／ｖ）で接種し、２７℃で９６時間通気攪拌培養した。得られた培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１５分間）して菌体を分離し、培養上清約１９Ｌを得た。
【００２５】
【実験１−２】
＜プルランの粘度低減能の測定＞
実験１−１で得られた培養上清を用いて、プルランの粘度低減能を測定した。まず、プルラン（商品名『プルランＰＩ−２０』、株式会社林原商事販売）を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解して濃度１０％（ｗ／ｖ）のプルラン含有溶液を調製した。このプルラン含有溶液１．５ｍｌに実験１−１で得た培養上清０．５ｍｌを加え、３５℃で１８０分間保持した後、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）を０．２ｍｌ添加し、１００℃で１０分間保持して酵素を失活させた後、３０℃まで冷却した。得られた反応溶液の粘度を、回転式Ｅ型粘度計（東京計器株式会社製造）を用いて測定した。併行して、３５℃で１８０分間保持しないこと以外、上記と同じ処理を行ったものを対照溶液とし、その粘度を上記と同様に測定した。
【００２６】
その結果、対照溶液の粘度は２１４ｃＰであるのに対して、実験１−１で得られた培養上清を加えて３５℃で１８０分間保持した反応溶液の粘度は１６７ｃＰであり、この培養上清中にプルラン含有溶液の粘度を低減させる能力を有する物質が存在することが判明した。
【００２７】
【実験１−３】
＜プルラン分解酵素活性の測定＞
実験１−１で得られた培養上清約１９Ｌに硫酸アンモニウムを８０％（ｗ／ｖ）飽和となるように添加して塩析し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１５分間）してその上清を回収後、ろ紙で濾過して濾過液約２２Ｌを得た。この濾過液（約２２Ｌ）について、上述した酵素活性の定義で述べた酵素活性測定法に準じて、プルラン分解酵素活性を測定したところ、プルラン分解酵素活性が認められた。
【００２８】
【実験２】
＜プルラン分解酵素の精製＞
【実験２−１】
＜疎水クロマトグラフィー＞
実験１−３で得られた濾過液約２２Ｌを、予め２Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ』ゲル（東ソー株式会社製）が充填された疎水クロマトグラフィー用カラム（ゲル容量８８０ｍｌ）に供し（流速３ｍｌ／ｍｉｎ）、次いで、硫安濃度が直線的に２Ｍから０Ｍまで減少する濃度勾配で蛋白質を溶出させた。得られた溶出画分について、実験１−３と同様にしてプルラン分解酵素活性を測定したところ、硫安濃度約１．２Ｍ付近の溶出画分にプルラン分解酵素活性が検出され、この画分をプルラン分解酵素活性画分（１）として採取した。このプルラン分解酵素活性画分（１）について、実験１―２と同様にしてプルランの粘度低減能を測定したところ、プルラン粘度低減能を有することが判明した。
【００２９】
上記のプルラン分解酵素活性画分（１）に終濃度２Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、再度、東ソー株式会社製『Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル容量３０ｍｌ）に供し、次いで、硫安濃度が直線的に２Ｍから０Ｍまで減少する濃度勾配で蛋白質を溶出させた。得られた溶出画分について、実験１−３と同様にしてプルラン分解酵素活性を測定したところ、硫安濃度約１．２Ｍ付近の溶出画分にプルラン分解酵素活性が検出され、この画分をプルラン分解酵素活性画分（２）として採取した。
【００３０】
【実験２−２】
＜イオン交換クロマトグラフィー＞
このプルラン分解酵素活性画分（２）を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除いた後、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量３０ｍｌ）に供し、次いで、塩化ナトリウム濃度が直線的に０Ｍから０．３Ｍまで増加する濃度勾配で蛋白質を溶出させた。得られた溶出画分について、実験１−３と同様にしてプルラン分解酵素活性を測定したところ、塩化ナトリウム濃度約０．１５Ｍ付近の溶出画分にプルラン分解酵素活性が検出され、この画分をプルラン分解酵素活性画分（３）として採取した。
【００３１】
このプルラン分解酵素活性画分（３）を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析し、アマシャム・バイオサイエンス株式会社製『ＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５』カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１ｍｌ）に供し、次いで、塩化ナトリウム濃度が直線的に０Ｍから０．３Ｍまで増加する濃度勾配で蛋白質を溶出させ。得られた溶出画分について、実験１−３と同様にしてプルラン分解酵素活性を測定したところ、塩化ナトリウム濃度約０．１５Ｍ付近の溶出画分にプルラン分解酵素活性が検出され、この画分をプルラン分解酵素活性画分（４）として採取した。上述の各精製工程におけるプルラン分解酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
プルラン分解酵素画分（４）として得られた精製プルラン分解酵素標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動法で純度を検定したところ、単一バンドであることが確認され、電気泳動的に極めて高純度の酵素標品であることが判明した。
【００３４】
【実験３】
＜プルラン分解酵素の性質＞
実験２の方法と同様にして得た精製プルラン分解酵素標品（プルラン分解酵素活性画分（４））を用いて、以下の理化学的性質を調べた。
【００３５】
【実験３−１】
＜作用＞
Ｍｗが約４２２，０００のプルランを濃度１６％（ｗ／ｖ）となるように５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解して基質液とした。この基質液１０ｍｌに、精製プルラン分解酵素標品を基質固形物１グラム当たり０．１単位作用させるように加え、３０℃で４８時間保持して反応させた。この反応溶液を経時的に少量分取し、分取した反応溶液の粘度を実験１−２に記載の方法に準じて測定し、更にプルランのＭｗ及びＭｎを以下の高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略す。）を用いて分析した結果を基に、次のように計算して求めた。
【００３６】
＜ＨＰＬＣ条件＞
（１）カラム：『ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷＸＬ  カラム』（東ソー株式会社製造）を２本連結したものを使用。
（２）溶離液：水
（３）カラム温度：３０℃
（４）流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
（５）検出：示差屈折計『ＲＩＤ−１０Ａ』（島津株式会社製造）
＜分子量標準品＞
プルランＰ−５（Ｍｗ＝５，９００）、プルランＰ−１０（Ｍｗ＝１１，８００）、プルランＰ−２０（Ｍｗ＝２２，８００）、プルランＰ−５０（Ｍｗ＝４７，３００）、プルランＰ−１００（Ｍｗ＝１１２，０００）、プルランＰ−２００（Ｍｗ＝２１２，０００）、プルランＰ−４００（Ｍｗ＝４０４，０００）、プルランＰ−８００（Ｍｗ＝７８８，０００）、プルランＰ−１６００（Ｍｗ＝１，６００，０００）、プルランＰ−２５００（Ｍｗ＝２，５２０，０００）（何れも、株式会社林原生物化学研究所製造）を用いた。
＜Ｍｗ及びＭｎの計算方法＞
（１）分子量曲線の作成
プルランの各分子量標準品を上述のＨＰＬＣに供し、各分子量標準品の溶出時間を横軸に、各分子量標準品のＭｗの常用対数を縦軸にして分子量曲線を作成し、回帰式を求めた。
（２）Ｍｗ及びＭｎの計算
分取した反応溶液を上述のＨＰＬＣに供し、検出された全ピークの開始時間から終了時間までを０．２分間隔で分割し、各分割区分の面積（Ｓｉ）を求めた。次に、各分割区分の溶出時間の中間値を（１）の回帰式に挿入し、対応する分子量（Ｍｉ）を算出した。得られたＳｉ及びＭｉの値を式１及び式２に挿入し、分取した反応溶液のＭｗ及びＭｎを算出した。
（式１）  Ｍｗ＝Σ（Ｓｉ×Ｍｉ）／ΣＳｉ
（式２）  Ｍｎ＝ΣＳｉ／Σ（Ｓｉ／Ｍｉ）
得られた結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
2004261132.tif 000003
【００３８】
表２の結果から明らかなように、本発明のプルラン分解酵素を添加することによって、プルラン含有溶液の粘性及びプルランのＭｗ及びＭｎは経時的に低減することが判明した。また、反応初期において、プルラン含有溶液の粘性が著しく低減することから、本発明のプルラン分解酵素は、プルランに対してエンド型に作用することが明らかとなった。
【００３９】
【実験３−２】
＜基質特異性＞
各種糖質を基質に、精製プルラン分解酵素標品の作用を試験した。表３記載の各種糖質を水に溶解して各濃度１％（ｗ／ｖ）の基質水溶液を調製し、この基質溶液に精製プルラン分解酵素標品を基質固形物１グラム当たり１単位ずつ加え、２７℃、ｐＨ４．０で１６時間酵素反応させた。各糖質に対する酵素作用の有無を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用いるシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す）を行い、硫酸−メタノール法で反応生成物を検出した。結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
2004261132.tif 000004
【００４１】
表３の結果から明らかなように、本発明のプルラン分解酵素は、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース、６３−Ｏ−α−マルトトリオシルマルトトリオース、６３−Ｏ−α−（６３−Ｏ−α−マルトトリオシル−マルトトリオシル）−マルトトリオース及びプルランに作用することが判明した。これらの糖質について、酵素反応後の溶液をガスクロマトグラフィー法（以下、「ＧＣ法」と略す。）に供し、反応生成物の保持時間を既知糖質の保持時間と比較することにより、生成物を調べた。尚、ＧＣ分析は、ＧＣ装置として株式会社島津製作所製『ＧＣ−１６Ａ』を、カラムはジー・エル・サイエンス株式会社製『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を充填したステンレスカラム（３ｍｍφ×２ｍ）を用いて、キャリアーガスである窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で流し、１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の速度で昇温させ、検出は水素炎イオン検出器を用いて行った。結果を表４に示す。
【００４２】
【表４】
2004261132.tif 000005
【００４３】
表４の結果より、本発明のプルラン分解酵素は、プルランのみならず、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース、６３−Ｏ−α−マルトトリオシルマルトトリオース、６３−Ｏ−α−（６３−Ｏ−α−マルトトリオシル−マルトトリオシル）−マルトトリオースに作用することが判明した。また、本発明のプルラン分解酵素は、表４に示す基質の構造中のα−１，６グルコシド結合に隣接する還元性末端側のα−１，４グルコシド結合を加水分解する作用を有することが判明した。
【００４４】
【実験３−３  分子量】
精製プルラン分解酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、約６７，０００乃至約１０７，０００ダルトンの範囲に単一のバンドが検出された。
【００４５】
【実験３−４  等電点】
精製プルラン分解酵素標品を２．２％（ｗ／ｖ）アンフォライン（アマシャム・バイオサイエンス社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、同時に泳動した等電点マーカー（アマシャム・バイオサイエンス社製）と比較して本酵素の等電点を求めたところ、ｐＩ約３．６乃至約４．６であった。
【００４６】
【実験３−５  至適温度】
活性測定法に準じて調べた。結果は、図１に示すように、ｐＨ４．０、６０分間反応で、約４０℃が至適である。
【００４７】
【実験３−６  至適ｐＨ】
活性測定法に準じて調べた。結果は、図２に示すように、３５℃、６０分間反応で、ｐＨ約４．０乃至４．５が至適である。
【００４８】
【実験３−７  温度安定性】
酵素溶液を各温度で６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を活性測定法に準じて調べた。結果は、図３に示すように、ｐＨ４．０で、約３５℃付近まで安定である。
【００４９】
【実験３−８  ｐＨ安定性】
酵素溶液を各ｐＨの１００ｍＭ酢酸緩衝液中で、３５℃、６０分間保持した後、ｐＨを４．０に調整し、残存する酵素活性を活性測定法に準じて調べた。結果は、図４に示すように、ｐＨ約３．８乃至約６．７で安定である。
【００５０】
【実験３−９  活性阻害】
活性測定法に準じて調べた。１ｍＭ  Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋及びＦｅ３＋で活性が阻害される。
【００５１】
【実験４】
【プルラン分解試験】
Ｍｗが約３９５，０００のプルランを含有する水溶液（最終濃度１％（ｗ／ｖ））に、実験２で得た精製プルラン分解酵素標品を基質固形物１グラム当たり０．１単位作用させ、３０℃、ｐＨ４．０で２４時間保持した反応溶液を経時的にサンプリングした。サンプリングした反応溶液を１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、反応溶液中のプルランの分子量を、実験３−１に記載の『ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷＸＬ  カラム』（東ソー株式会社製造）を用いるＨＰＬＣ法にて測定し、更に、糖組成を、『ＭＣＩｇｅｌ  ＣＫ０４ＳＳ  カラム』（三菱化学株式会社製造）を２本連結したものを用いたＨＰＬＣ法にて、水を溶離液とし、カラム温度８０℃、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎの条件で、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（島津株式会社製造）を用いて分析した。併行して、プルラナーゼ（商品名『プロモザイム４００Ｌ』、ノボザイムズジャパン株式会社製造）を、反応ｐＨを５．０とした以外は上記と同様にしてプルランに作用させ、経時的に反応溶液中のプルランの分子量測定及び糖組成分析を行った。本発明のプルラン分解酵素によるプルランの分子量及び糖組成の変化を表５に、プルラナーゼによるプルランの分子量及び糖組成の変化を表６に示した。
【００５２】
【表５】
2004261132.tif 000006
【００５３】
【表６】
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【００５４】
表５及び表６の結果より、プルラナーゼをプルランに作用させた場合、プルラン含有溶液のＭｗ／Ｍｎの比は約４乃至１１まで増加するのに対して、本発明のプルラン分解酵素をプルランに作用させた場合は、Ｍｗ／Ｍｎの比は３未満を維持し、プルランの分子量分布幅を広げることなく、基質としてのプルランより低分子のプルランを製造し得ることが明らかとなった。更に、Ｍｗが約４６，０００のプルランを生成せしめる時の、両酵素のグルコース重合度（ＤＰ）２１以下のオリゴ糖生成量を比較すると、本発明のプルラン分解酵素の場合が１．８％であったのに対し、プルラナーゼの場合は１１．３％であり、本発明のプルラン分解酵素と比較して約７倍の値であった。以上の結果より、本発明のプルラン分解酵素は、グルコース重合度の大きい単位でプルランを分解しやすい特性を有しており、この特性が故に、プルランの分子量分布幅を広げることなく、基質としてのプルランより低分子のプルランを生成すると推定された。尚、基質液として、Ｍｗ／Ｍｎの比が約１０と大きい高分子プルラン含有溶液に本発明のプルラン分解酵素を作用させた際も、上記と同様にプルランのＭｗ及びＭｎは徐々に低減し、更にプルラン含有溶液の粘性及びＭｗ／Ｍｎの比も徐々に低減した。以下、本発明の実施例を述べる。
【００５５】
【実施例１】
プルラン（Ｍｗが約４５８，０００、Ｍｎは約６６，８００、Ｍｗ／Ｍｎの比が約６．９）を濃度１０％（ｗ／ｖ）となるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解し、粘度１２０ｃＰの基質溶液を調製した。この基質溶液に実験２の方法で得た精製プルラン分解酵素標品をプルランの固形物１グラム当たり０．１単位作用させるように加え、３０℃で８時間保持してプルランを分解させ、プルラン溶液を得た。
【００５６】
本品は、粘度８．６ｃＰと粘性が低く、且つ、Ｍｗ／Ｍｎの比が３．９であり、狭い分子量分布幅を有する、取り扱いが容易なプルラン溶液であり、造膜性、光沢性、透明性、ガスバリアー性、耐油性、耐塩性、粘着性、接着性、成形性、可食性、難消化性などを有していることから、分子量標準試薬はもとより、飲食物、化粧品、医薬品、農林水畜産品、鉱工業資材など多くの用途に有利に利用できる。
【００５７】
【実施例２】
８時間の保持時間を２４時間とした以外は、実施例１と同様にし、プルラン溶液を得た。
【００５８】
本品は、粘度４．７ｃＰと粘性が低く、且つ、Ｍｗ／Ｍｎの比が２．９であり、狭い分子量分布幅を有する、取り扱いが容易なプルラン溶液であり、造膜性、光沢性、透明性、ガスバリアー性、耐油性、耐塩性、粘着性、接着性、成形性、可食性、難消化性などを有していることから、分子量標準試薬としてはもとより、飲食物、化粧品、医薬品、農林水畜産品、鉱工業資材など多くの用途に有利に利用できる。
【００５９】
【実施例３】
培養時間を７２時間とした以外は、実験１−１と同様にして、オーレオバシディウム・プルランスを培養した。続いて、この培養液のｐＨを、水酸化ナトリウムを用いて４．５に調整し、温度を３５℃に設定した後、このｐＨ及び温度に制御しつつ、実験２の方法で得たプルラン分解酵素を培養液１ｍｌ当たり０．００５単位加え、緩やかに攪拌しながら４時間保持してプルランを分解した。得られた培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１５分間）して菌体を分離し、プルランを含有する上清を得、常法に従って、脱色、脱塩精製し、乾燥、粉末化してプルラン粉末を得た。
【００６０】
本品は、Ｍｎが約１０万、Ｍｗ／Ｍｎの比が２．８５と３未満であり、狭い分子量分布幅を有する、取り扱いが容易なプルランであり、水溶性、造膜性、光沢性、透明性、ガスバリアー性、耐油性、耐塩性、粘着性、接着性、成形性、可食性、難消化性などを有していることから、分子量標準試薬としてはもとより、飲食物、化粧品、医薬品、農林水畜産品、鉱工業資材など多くの用途に有利に利用できる。
【００６１】
【実施例４】
４時間の保持時間を１０時間とした以外は、実施例３と同様にし、プルラン粉末を得た。
【００６２】
本品は、Ｍｎが約４万、Ｍｗ／Ｍｎの比が、２．９０であり、狭い分子量分布幅を有する、取り扱いが容易なプルランであり、水溶性、造膜性、光沢性、透明性、ガスバリアー性、耐油性、耐塩性、粘着性、接着性、成形性、可食性、難消化性などを有していることから、分子量標準試薬としてはもとより、飲食物、化粧品、医薬品、農林水畜産品、鉱工業資材など多くの用途に有利に利用できる。
【００６３】
【発明の効果】
上述のように、本発明は、プルラン分解酵素とその製造方法並びに用途に関し、詳細には、プルランに作用させると、α−１，６グルコシド結合に隣接する還元性末端側のα−１，４グルコシド結合をエンド型に加水分解し、その粘性を低減するプルラン分解酵素とその製造方法、及び当該酵素を用いるプルランの分解方法、並びに当該酵素又は当該酵素を産生する能力を有する微生物を用いる、低粘性で狭い分子量分布幅を有するプルランの製造方法に関する。斯かる本発明によれば、低粘性で狭い分子量分布幅を有するプルランを味質の変化無く、容易に製造し得る。斯かるプルランは、粘性が低く、且つ、Ｍｗ／Ｍｎの比が小さく、取扱いが容易である上、水溶性、造膜性、光沢性、透明性、ガスバリアー性、耐油性、耐塩性、粘着性、接着性、成形性、可食性、難消化性などを有していることから、試薬はもとより、飲食物、化粧品、医薬品、農林水畜産品、鉱工業資材など多くの用途に有利に利用できる。
【００６４】
本発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義ある発明である。
【００６５】
【図面の簡単な説明】
【図１】オーレオバシディウム・プルランスＩＦＯ  ６３５３由来のプルラン分解酵素の活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】オーレオバシディウム・プルランスＩＦＯ  ６３５３由来のプルラン分解酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】オーレオバシディウム・プルランスＩＦＯ  ６３５３由来のプルラン分解酵素の温度安定性を示す図である。
【図４】オーレオバシディウム・プルランスＩＦＯ  ６３５３由来のプルラン分解酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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