(57)【要約】【課題】蛍光顕微鏡の結像性能を客観的かつ定量的に精度良く評価できる蛍光顕微鏡用解像度評価チャートを提供する。【解決手段】蛍光顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる蛍光顕微鏡用解像度評価チャートであって、基板１上に形成された発光中心を持つ蛍光材料を含有する発光薄膜２と、この発光薄膜２に発光中心を破壊して形成された非発光部分３とを有する。【選択図】　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる蛍光顕微鏡用解像度評価チャートであって、
基板上に形成された発光中心を持つ蛍光材料を含有する発光薄膜と、この発光薄膜に発光中心を破壊して形成された非発光部分とを有することを特徴とする蛍光顕微鏡用解像度評価チャート。
【請求項２】
上記発光中心が蛍光色素分子であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャート。
【請求項３】
上記蛍光色素分子がローダミン６Ｇであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャート。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートを製造するにあたり、
発光中心を持つ蛍光材料を含有した溶液を基板上に展開する第１の工程と、
上記基板上に展開された上記溶液を乾燥させて発光薄膜を形成する第２の工程と、
上記発光薄膜に粒子線を照射して上記発光中心を破壊することにより非発光部分を形成する第３の工程と、
を含むことを特徴とする蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法。
【請求項５】
上記第１の工程では、上記溶液をキャスティングまたはスピンコートにより展開させることを特徴とする請求項４に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法。
【請求項６】
上記第３の工程では、上記粒子線として電子ビームを用いることを特徴とする請求項４または５に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法。
【請求項７】
上記電子ビームの加速電圧を、形成する上記非発光部分の領域に応じて調整することを特徴とする請求項６に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法。
【請求項８】
上記電子ビームによる電子注入量を、形成する上記非発光部分の領域に応じて調整することを特徴とする請求項６に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法。
【請求項９】
上記溶液は、溶媒としてポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）を含有することを特徴とする請求項４〜８のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の蛍光顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる蛍光顕微鏡用解像度評価チャート、およびその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択し、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図５〜図８を参照して説明する。図５は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図５に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図６に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して図７に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図８に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図６の吸収過程や図８の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図６のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図７のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図７の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合には画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図５に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図９は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、更に波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図９はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図９に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１０は、図９と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１０において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では蛍光自体が完全に抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１０の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
【特許文献１】
特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】
特開２００１−１００１０２号公報
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、従来提案されている明視野方式の透過型顕微鏡に関しては、図１１に示すような解像度評価用標準チャート５１が提案されており、この解像度評価用標準チャート５１の透過像を顕微鏡観察することにより、顕微鏡の基本的な結像性能である２点分解能、線像分布関数、視野等を客観的かつ定量的に評価することができる。
【００１９】
この標準チャート５１は、ガラス基板上にＣｒ等の金属薄膜の蒸着により形成された所定の細線パターンを有しており、その細線パターンの線間隔等は、可視光の場合の回折限界を上回る１００ｎｍをしのぐ精度となっている。
【００２０】
したがって、この標準チャート５１を顕微鏡観察することにより、その細線パターンの回折ボケから顕微鏡システムトータルとしての線像分布関数を測定することができ、また、隣接する特定の２本線の像コントラストを測定することにより、２点分解能を評価することができる。
【００２１】
しかしながら、暗視野顕微鏡である蛍光顕微鏡に関しては、従来、上述したような解像度評価用の標準チャートが全く提案されていない。これは、発光中心をもつ蛍光材料を、基板上に精度良くパターン化する技術が存在しなかったことによる。
【００２２】
そこで、従来は、蛍光顕微鏡に関しては、基板上にサイズが既知の蛍光ビーズを散布した観察試料を作製し、その蛍光ビーズの点像分布関数を測定することにより、蛍光顕微鏡の結像性能を評価するようにしている。
【００２３】
しかし、この場合には、観察試料の作製状況によって蛍光ビーズの散布状況が大きく左右され、しかも実際の蛍光ビーズの散布状況は不明であるため、結像性能を客観的かつ定量的に評価することはできない。特に、顕微鏡の空間分解能の客観的な目安である２点分解能については、その評価が全く不可能である。このため、蛍光顕微鏡の組み立てにおいては、生産ラインでの熟練者の経験に頼ることが多かった。
【００２４】
このように、従来は、蛍光顕微鏡の結像性能を客観的かつ定量的に評価することができない。また、最近では、上述したようにナノスケールの空間分解能を有する超解像蛍光顕微鏡も提案されている。このような背景から、超解像蛍光顕微鏡を含む蛍光顕微鏡の結像性能を客観的かつ定量的に評価できる蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの開発が望まれている。
【００２５】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、蛍光顕微鏡の結像性能を、客観的かつ定量的に精度良く評価できる蛍光顕微鏡用解像度評価チャート、およびその製造方法を提供することにある。
【００２６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、蛍光顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる蛍光顕微鏡用解像度評価チャートであって、
基板上に形成された発光中心を持つ蛍光材料を含有する発光薄膜と、この発光薄膜に発光中心を破壊して形成された非発光部分とを有することを特徴とするものである。
【００２７】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートにおいて、上記発光中心が蛍光色素分子であることを特徴とするものである。
【００２８】
請求項３に係る発明は、請求項２に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートにおいて、上記蛍光色素分子がローダミン６Ｇであることを特徴とするものである。
【００２９】
さらに、上記目的を達成する請求項４に係る発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートを製造するにあたり、
発光中心を持つ蛍光材料を含有した溶液を基板上に展開する第１の工程と、
上記基板上に展開された上記溶液を乾燥させて発光薄膜を形成する第２の工程と、
上記発光薄膜に粒子線を照射して上記発光中心を破壊することにより非発光部分を形成する第３の工程と、
を含むことを特徴とするものである。
【００３０】
請求項５に係る発明は、請求項４に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法において、上記第１の工程では、上記溶液をキャスティングまたはスピンコートにより展開させることを特徴とするものである。
【００３１】
請求項６に係る発明は、請求項４または５に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法において、上記第３の工程では、上記粒子線として電子ビームを用いることを特徴とするものである。
【００３２】
請求項７に係る発明は、請求項６に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法において、上記電子ビームの加速電圧を、形成する上記非発光部分の領域に応じて調整することを特徴とするものである。
【００３３】
請求項８に係る発明は、請求項６に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法において、上記電子ビームによる電子注入量を、形成する上記非発光部分の領域に応じて調整することを特徴とするものである。
【００３４】
請求項９に係る発明は、請求項４〜８のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの製造方法において、上記溶液は、溶媒としてポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）を含有することを特徴とするものである。
【００３５】
本発明者らによる種々の実験検討によると、発光中心を持つ蛍光材料に粒子線を照射すると、その発光中心が壊されて非発光部分が形成されることが判明した。例えば、溶媒に溶かしたＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）にローダミン６Ｇのような発光中心を持つ蛍光色素を混合させて発光材料を形成し、この発光材料を、図１に示すように、適当な基板１上にキャスティングあるいはスピンコートして乾燥させて発光薄膜２を形成した後、この発光薄膜２に電子ビームを照射すると、発光中心が電子ビームのエネルギーによって破壊されて発光しない非発光部分３が形成される。しかも、電子ビームは、そのビーム径が１０ｎｍ程度と非常に細いので、例えば幅２００ｎｍ〜３００ｎｍの極細線や微小面積の非発光部分３を１μｍ以下の間隔で容易に描画することが可能となる。
【００３６】
このような非発光部分３を有する発光薄膜２に、蛍光を起こさせる励起光を照射すると、明るい蛍光の中に電子ビームで描画した非発光部分３が黒色となって明瞭に観測することができる。したがって、この技術を応用すれば、蛍光顕微鏡用解像度評価チャートを作製することが可能となる。
【００３７】
しかも、電子エネルギー（ビームの加速電圧）や電子の注入量（ドーズ量）を変化させれば、非発光中心の量や範囲をコントロールできるので、図２に示すように、非発光部分３に濃淡（階調の変化）を付けることもできる。
【００３８】
なお、加速電圧を高くしたり、ドーズ量を増やしたりすれば、非発光部分３を増やしてコントラストを高めることができるが、図３に加速電圧による入射電子の拡散状態を示すように、加速電圧を高くすると線幅は広がる。しかも、この現象は、発光薄膜２の色素濃度や膜厚とのかねあいによっても変化するものと考えられるので、高コントラストを得ることと、微小寸法の非発光部分３を描画（分解能）することとは相反することになる。しかしながら、加速電圧、ドーズ量を最適化すれば、ナノスケールオーダの線幅を有する非発光部分３の描画が可能である。
【００３９】
【発明の実施の形態】
図４は、本発明の一実施の形態における蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの平面図である。この蛍光顕微鏡用解像度評価チャート１１は、例えばガラス基板上に、発光中心を持つ蛍光材料を含む発光薄膜１２を形成し、この発光薄膜１２に粒子線の照射によって線幅２μｍ〜１０ｎｍ、長さ５００μｍの直線状の非発光部分１３を、１０μｍの間隔で複数本形成したものである。
【００４０】
かかる蛍光顕微鏡用解像度評価チャート１１は、例えば以下に説明するようにして作製することができる。先ず、発光中心を持つ蛍光材料、例えばローダミン６Ｇを、ＰＭＭＡとともにクロロホルムに溶解して均一に分散させた発光材料を作成し、この発光材料を洗浄したガラス基板上にスピンキャストする（第１の工程）。次に、オーブンにてベーク処理を施して発光薄膜１２を形成する（第２の工程）。その後、発光薄膜１２上に導電性コート剤を散布して電子ビーム描画を実施し、非発光部分１３を形成する（第３の工程）。なお、描画条件は、加速電圧２０ｋＶ、ビーム電流２００ｐＡ、一点当たりの描画時間１μｓとする。
【００４１】
このようにすれば、平坦で均一な発光薄膜１２を形成できると共に、この発光薄膜１２上に電子ビーム描画によって非発光部分１３を形成することにより、充分な明るさとコントラストを持つ蛍光顕微鏡用解像度評価チャート１１を作製することができる。
【００４２】
したがって、本実施の形態による蛍光顕微鏡用解像度評価チャート１１を蛍光顕微鏡により観察すれば、線幅１０ｎｍの描画ラインを確認でき、分解能も線間隔２００ｎｍが識別可能であるので、超解像蛍光顕微鏡を含む蛍光顕微鏡の結像性能を、客観的かつ定量的に高精度で評価することができる。
【００４３】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、電子ビームを用いて非発光部分を描画するようにしたが、レーザービームやＸ線ビームのような光子ビームや、イオンビームを用いて描画することもできる。
【００４４】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、発光中心を持つ蛍光材料を含有する発光薄膜を基板上に形成し、この発光薄膜に発光中心を破壊した非発光部分を形成して蛍光顕微鏡用解像度評価チャートを構成したので、この蛍光顕微鏡用解像度評価チャートを用いることにより、蛍光顕微鏡の結像性能を客観的かつ定量的に精度良く評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理を説明するための図である。
【図２】図１に示す非発光部分の濃淡状態を示す図である。
【図３】電子ビームの加速電圧による入射電子の拡散状態を示す図である。
【図４】本発明の一実施の形態における蛍光顕微鏡用解像度評価チャートの平面図である。
【図５】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図６】図５の分子の第１電子励起状態を示す概念図である。
【図７】同じく、第２電子励起状態を示す概念図である。
【図８】同じく、第２電子励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図９】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１０】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１１】透過型顕微鏡で使用される解像度評価用標準チャートを示す図である。
【符号の説明】
１　基板
２　発光薄膜
３　非発光部分
１１　蛍光顕微鏡用解像度評価チャート
１２　発光薄膜
１３　非発光部分
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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