(57)【要約】【課題】安価かつ簡便なｓｉＲＮＡの転写合成法を開発すること。【解決手段】５’から３’方向に、少なくとも（１）標的核酸配列のアンチセンス配列、（２）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列、（３）標的核酸配列のセンス配列、（４）プロモーター配列のアンチセンス配列、（５）ループを形成する配列、および、（６）プロモーター配列のセンス配列、を含むオリゴヌクレオチドであって、プロモーター配列のアンチセンス配列とセンス配列とがヘアピン構造を介して分子内で二本鎖を形成し、かつ転写された際に標的核酸配列のアンチセンス配列と標的核酸配列のセンス配列の転写産物はトリミング配列を介して分子内で二本鎖を形成する、オリゴヌクレオチド。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’方向に、少なくとも
（１）標的核酸配列のアンチセンス配列、
（２）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列、
（３）標的核酸配列のセンス配列、
（４）プロモーター配列のアンチセンス配列、
（５）ループを形成する配列、および、
（６）プロモーター配列のセンス配列、
を含むオリゴヌクレオチドであって、プロモーター配列のアンチセンス配列とセンス配列とがヘアピン構造を介して分子内で二本鎖を形成し、かつ転写された際に標的核酸配列のアンチセンス配列と標的核酸配列のセンス配列の転写産物はトリミング配列を介して分子内で二本鎖を形成する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
５’から３’方向に、少なくとも
（１）標的核酸配列のアンチセンス配列、
（２）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列、
（３）標的核酸配列のセンス配列、および、
（４）プロモーター配列のアンチセンス配列、
を含むオリゴヌクレオチドであって、転写された際に標的核酸配列のアンチセンス配列と標的核酸配列のセンス配列の転写産物がトリミング配列を介して分子内で二本鎖を形成する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
少なくともプロモーター配列の領域が二本鎖になっている、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドと該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる二本鎖ＤＮＡ。
【請求項５】
標的核酸配列のアンチセンス配列の上流の５’末端にさらにＡＡの２塩基を有する請求項１から４の何れかに記載のオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ。
【請求項６】
ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列が５’−Ｃ（Ｄ）ｋＣＤ−３’（式中、ＤはＡ、Ｔ又はＧを示し、ｋは０から１００の整数を示し、（ｋ＋１）個のＤは互いに同一でも異なっていてもよい）である、請求項１から５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ。
【請求項７】
ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列が５’−ＣＴＡＴＧＣＴ−３’である、請求項１から６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ。
【請求項８】
（３）標的核酸配列のセンス配列と（４）プロモーター配列のアンチセンス配列との間に−ＣＣＣ−が存在する、請求項１から７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ。
【請求項９】
プロモーター配列がＴ７クラスＩＩＩプロモーター配列である、請求項１から８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ。
【請求項１０】
（５）ループを形成する配列が、−ＧＮＡ−を含む配列（ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣを示す）である、請求項１から９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ。
【請求項１１】
５’−ＡＡ−（標的核酸配列のアンチセンス配列）−ＣＴＡＴＧＣＴ−（標的核酸配列のセンス配列）−ＣＣＣ−ＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−ＧＣＧＡＡＧＣ−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’で表されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れかに記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行うことを含む、ｓｈＲＮＡの製造方法。
【請求項１３】
転写をインビトロで行う、請求項１２に記載のｓｈＲＮＡの製造方法。
【請求項１４】
ＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する、請求項１２又は１３に記載のｓｈＲＮＡの製造方法。
【請求項１５】
請求項１２から１４の何れかに記載の方法により製造されるｓｈＲＮＡ。
【請求項１６】
請求項１２から１４の何れかに記載の方法により製造されるｓｈＲＮＡを塩基特異的ＲＮａｓｅで処理することを含む、ｓｉＲＮＡの製造方法。
【請求項１７】
請求項１から１１の何れかに記載のオリゴヌクレオチドを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行ってｓｈＲＮＡを製造し、当該ｓｈＲＮＡを塩基特異的ＲＮａｓｅで処理することを含む、ｓｉＲＮＡの製造方法。
【請求項１８】
請求項１２から１４の何れかに記載の方法により製造されるｓｈＲＮＡ、又は請求項１６又は１７に記載の方法により製造されたｓｉＲＮＡを用いて、ＲＮＡｉにより標的核酸配列を含む遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項１９】
ＲＮＡポリメラーゼ及び塩基特異的ＲＮａｓｅを含む、請求項１２から１４又は１６から１８の何れかに記載の方法を行うための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｓｉＲＮＡの製造方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
（１）逆遺伝学的な遺伝子の機能解析
急速な発展を成し遂げたゲノムプロジェクトは、ヒトを含めたあらゆる生物の全ゲノムＤＮＡ配列を決定しようとしている。２００１年春に発表されたヒトゲノムの概要配列によるとヒトの全遺伝子数は３〜４万種類程度であると見積もられている。これまでの研究では、１万種類に満たない遺伝子について何らかの機能解析を行っているが、残りの２〜３万の遺伝子の機能については未知であり、ヒトを理解するために、これら全遺伝子の機能を明らかにする必要がある。遺伝子の機能を明らかにするためには、それがコードする遺伝子産物、すなわち蛋白質かＲＮＡを同定することのみならず、遺伝子の発現調節機構や他の遺伝子とのネットワークを明らかにすることが重要である。分子遺伝学はそのための有効な手段である。分子遺伝学的な手法が最も開発されている生物として大腸菌、枯草菌、酵母、線虫などのモデル生物を挙げることができる。原核生物の代表例である大腸菌と下等真核生物の代表例である酵母は古くから分子遺伝学が盛んに行われ、１９９７年に大腸菌と酵母の全ゲノム塩基配列がそれぞれ決定されている。大腸菌と酵母の総遺伝子数はそれぞれ約４３００種類と約６１００種類であり、このうちのそれぞれ約２０００遺伝子が機能未知遺伝子として報告された。これらの遺伝子の機能を探る手段として、非必須遺伝子の場合は遺伝子破壊による逆遺伝学的なアプローチ（ノックアウト法）が有効である。酵母に関してはゲノム１倍体の細胞を用いることにより、相同性組換えで比較的簡単に目的の遺伝子を破壊することができる。酵母の非必須遺伝子約５０００種類について、早くから破壊株が構築され、世界中の研究者がそれぞれの研究対象に用いている。大腸菌に関しても日本の研究グループがプロジェクト研究を進行中であり、もうまもなく全遺伝子破壊株のライブラリーが構築されようとしている。
【０００３】
（２）ＲＮＡｉの登場
また、多細胞生物のモデルであり、１０００個に満たない全ての細胞の系譜が明らかとなっている線虫に関しても、１９９８年に全ゲノム配列が決定され、全１９０００遺伝子の存在が明らかとなった。線虫の遺伝子にはヒトの相同遺伝子が多量に含まれていることから、これらの遺伝子の役割を解明することはヒトの遺伝子の解析につながっている。
【０００４】
線虫の遺伝子欠失変異体の作成には、大腸菌や酵母で盛んに行われている通常の遺伝子破壊法ではなく、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ又はＲＮＡｉ）による遺伝子発現抑制法（ノックダウン法）が用いられている。ＲＮＡｉとは細胞に、特定の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡをトランスフェクトすると、ターゲット遺伝子に特異的な発現抑制制御が起こる現象である。１９９８年に２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入すると発現抑制の効果が数段良くなるという結果が発表された（非特許文献１）。現在ではアンチセンスＲＮＡではなくｄｓＲＮＡ遺伝子発現抑制法をＲＮＡｉと呼ぶ。いくつかの手法が開発されているが特に線虫の卵にｄｓＲＮＡをマイクロインジェクションする方法がさかんに行われ、すでに全ての遺伝子を対象にした発現抑制実験が大々的な行われ（非特許文献２、及び非特許文献３）、逆遺伝学的な遺伝子の解析ツールとして一躍脚光を浴びている。
【０００５】
（３）ＲＮＡｉの作用メカニズム
ヒト遺伝子を逆遺伝学的に解析するためには、現状でマウスの相同遺伝子を破壊したノックアウトマウスの解析が最も有効な手段である。しかし、哺乳動物の体細胞ゲノムは２倍体であり、そのうちの一つを破壊したキメラマウスを掛け合わせることでホモのノックアウトマウスを作出するという行程が必要である。したがって、一つの遺伝子の破壊には多大な労力と資金と時間がかかるため、ポストゲノム時代に要求される網羅的かつ迅速なアプローチにはそぐわないのが実状である。ＲＮＡｉは遺伝子の発現を転写レベルで抑制するため、早くから多くの研究者が哺乳動物細胞への適用を検討してきた。ところが、哺乳動物細胞においては、線虫やハエなどで行われている長いｄｓＲＮＡを導入すると、タンパク質リン酸化酵素ＰＫＲと２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素（２’，５’−ＡＳ）が活性化され、塩基配列非特異的なｍＲＮＡの分解とタンパク合成のシャットダウンが生じてしまうという根本的な問題があった（非特許文献４、及び非特許文献５）。この問題を解く鍵は、線虫におけるＲＮＡｉの発現抑制メカニズムの解析がもたらした。ｄｓＲＮＡは細胞に導入されるとＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーに属するＤｉｃｅｒというｄｓＲＮＡ特異的なＲＮＡ切断酵素の作用により、２１−２３ｍｅｒの短い二本鎖ＲＮＡ断片にプロセスされる（非特許文献６、及び非特許文献７）。各ＲＮＡ断片のアンチセンス鎖がターゲットのｍＲＮＡに結合し、その複合体にＲＩＳＣ  （ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるＲＮＡ分解酵素複合体が作用することでターゲットが破壊されるというものである（非特許文献８）。さらに線虫の場合は一度卵に導入すると発現抑制の持続時間が長く、世代を超えて発現抑制効果が持続することが知られているが、これは、アンチセンス鎖がターゲットのｍＲＮＡに結合した際にＲＮＡ依存的ＲＮＡレプリカーゼの働きにより、さらに大量のｄｓＲＮＡが増幅されるという機構（ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）によるもの（非特許文献９）であることが明らかにされている。
【０００６】
（４）哺乳動物細胞への適用−ｓｉＲＮＡ
Ｔｕｓｃｈｌのグループはこのような研究結果を踏まえ、哺乳動物細胞の長いｄｓＲＮＡに対する防御機構を回避するため、初めから短いｄｓＲＮＡを導入することを思いついた。標的遺伝子に相補的な塩基配列を有す２１塩基のｄｓＲＮＡを数十ｎＭという低濃度でヒト培養細胞にトランスフェクションしたところ、標的遺伝子の特異的発現抑制が観測された（非特許文献１０）。発現抑制効果を示す最も有効なＲＮＡ長は２１ｍｅｒで、３’末に２塩基がオーバーハングしたｄｓＲＮＡであると報告されており（非特許文献１０、非特許文献１１）、このような２０ｍｅｒ前後の短い２本鎖のＲＮＡは一般にｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  （ｓｉＲＮＡ）と呼ばれている。これまで、遺伝子の機能解析をするためには、ノックアウト技術が使用されてきたが、ｓｉＲＮＡを使用する方法が確立されれば、大幅な実験時間の短縮とコストの削減が実現することが期待される。
【０００７】
（５）有機合成法
２１塩基の短いＲＮＡの作成には、ホスホアミダイト法による有機化学的に合成したＲＮＡが広く一般に使用されている。有機合成の利点は配列の選択性がないこと（どのような配列のＲＮＡでも合成可能である）が挙げられる。また、３’末の２塩基のオーバーハングをＤＮＡのＴＴにすると遺伝子発現抑制活性が若干向上することが知られている（非特許文献１０）ことから、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ核酸を有機合成的に作製できることも長所として挙げられる。現在、合成ＲＮＡの受託生産が行われており、現時点でｓｉＲＮＡの最も一般的な作製法である。ところが、ホスホアミダイト法によるＲＮＡの有機合成はＤＮＡと比較して反応時間が長く合成時間がかかること、また２’水酸基保護基があるために脱保護に時間がかかること、さらには生産コストと品質管理コストがかかるなどの短所が指摘されている。また、最近の研究で、ｓｉＲＮＡをデザインする際に１９塩基の相補的な配列を標的遺伝子内のどの位置に設定するかで、遺伝子発現抑制効果に差が出ることが知られている。したがって、一般的には一つの遺伝子をノックダウンする際には複数の個所にｓｉＲＮＡをデザインする必要があり、合成ＲＮＡでｓｉＲＮＡを供給するには限界があり決して汎用的な技術とは言いがたい。
【０００８】
（６）試験管内転写合成法
そこで、最近注目されているのは、試験管内転写反応でｓｉＲＮＡを作製する方法である。試験管内転写反応は合成ＤＮＡを鋳型として酵素的にＲＮＡを転写合成するため、比較的安価で合成できる上、同じデザインの有機合成ｓｉＲＮＡよりも遺伝子発現抑制効果が高いという報告もある。ＰｉｃａｒｄらはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用し、２組の鋳型ＤＮＡよりセンス鎖とアンチセンス鎖の２本のＲＮＡを作製し、それを二本鎖化して使用している（非特許文献１２）。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは開始塩基がＧであると効率よく転写できるため、ｓｉＲＮＡの５’末端は必ずＧであるという制約付きであるものの、有機合成ｓｉＲＮＡよりもはるかに安価でしかも高い活性を示すという利点がある。また、最近Ａｍｂｉｏｎ社より、転写法によるｓｉＲＮＡ作製キット（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）が発売された。まずセンス鎖とアンチセンス鎖用の２組の鋳型ＤＮＡを作製し、それを転写してセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成し、それらを２本鎖化して、最後に一本鎖領域をＲＮａｓｅ処理で取り除くことで作製する方法である。キットにはＴ７プロモーターを含んだ鋳型作成用合成ＤＮＡと、鋳型作成用の酵素と試薬、転写用のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと試薬、鋳型の消化とＲＮＡ一本鎖領域を除去するＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ、ｓｉＲＮＡの精製用カートリッジなどから構成されているが、これ以外に２９塩基の鋳型用合成ＤＮＡが、一デザインにつき２本用意する必要がある。このキットを使用する場合、鋳型作成用の合成ＤＮＡが計３本必要であり、また反応ステップが煩雑という問題がある。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｆｉｒｅ，  Ａ．，  Ｘｕ，  Ｓ．，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｋｏｓｔａｓ，  Ｓ．Ａ．，  Ｄｒｉｖｅｒ，  Ｓ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｏ，  Ｃ．Ｃ．  （１９９８）  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１，  ８０６−１１．
【非特許文献２】
Ｆｒａｓｅｒ，  Ａ．Ｇ．，  Ｋａｍａｔｈ，  Ｒ．Ｓ．，  Ｚｉｐｐｅｒｌｅｎ，  Ｐ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃａｍｐｏｓ，  Ｍ．，  Ｓｏｈｒｍａｎｎ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ａｈｒｉｎｇｅｒ，  Ｊ．  （２０００）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｉ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０８，  ３２５−３０．
【非特許文献３】
Ｇｏｎｃｚｙ，  Ｐ．，  Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ，  Ｃ．，  Ｏｅｇｅｍａ，  Ｋ．，  Ｃｏｕｌｓｏｎ，  Ａ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｃｏｐｌｅｙ，  Ｒ．Ｒ．，  Ｄｕｐｅｒｏｎ，  Ｊ．，  Ｏｅｇｅｍａ，  Ｊ．，  Ｂｒｅｈｍ，  Ｍ．，  Ｃａｓｓｉｎ，  Ｅ．，  Ｈａｎｎａｋ，  Ｅ．，  Ｋｉｒｋｈａｍ，  Ｍ．，  Ｐｉｃｈｌｅｒ，  Ｓ．，  Ｆｌｏｈｒｓ，  Ｋ．，  Ｇｏｅｓｓｅｎ，  Ａ．，  Ｌｅｉｄｅｌ，  Ｓ．，  Ａｌｌｅａｕｍｅ，  Ａ．Ｍ．，  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｃ．，  Ｏｚｌｕ，  Ｎ．，  Ｂｏｒｋ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｈｙｍａｎ，  Ａ．Ａ．  （２０００）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡｉ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ＩＩＩ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０８，  ３３１−６．
【非特許文献４】
Ｍａｎｃｈｅ，  Ｌ．，  Ｇｒｅｅｎ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｓｃｈｍｅｄｔ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｗｓ，  Ｍ．Ｂ．  （１９９２）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＤＡＩ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １２，  ５２３８−４８．
【００１０】
【非特許文献５】
Ｍｉｎｋｓ，  Ｍ．Ａ．，  Ｗｅｓｔ，  Ｄ．Ｋ．，  Ｂｅｎｖｉｎ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｂａｇｌｉｏｎｉ，  Ｃ．  （１９７９）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’，５’−ｏｌｉｇｏ（Ａ）  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２５４，  １０１８０−３．
【非特許文献６】
Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．，  Ｃａｕｄｙ，  Ａ．Ａ．，  Ｈａｍｍｏｎｄ，  Ｓ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ，  Ｇ．Ｊ．  （２００１）  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ａ  ｂｉｄｅｎｔａｔｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０９，  ３６３−６．
【非特許文献７】
Ｚａｍｏｒｅ，  Ｐ．Ｄ．，  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．，  Ｓｈａｒｐ，  Ｐ．Ａ．  ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌ，  Ｄ．Ｐ．  （２０００）  ＲＮＡｉ：  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ａｔ  ２１  ｔｏ  ２３  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌｓ．  Ｃｅｌｌ，  １０１，  ２５−３３
【非特許文献８】
Ｈａｍｍｏｎｄ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．，  Ｂｅａｃｈ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ，  Ｇ．Ｊ．  （２０００）  Ａｎ  ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０４，  ２９３−６
【００１１】
【非特許文献９】
Ｌｉｐａｒｄｉ，  Ｃ．，  Ｗｅｉ，  Ｑ．  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｍ．  （２００１）  ＲＮＡｉ  ａｓ  ｒａｎｄｏｍ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ  ＰＣＲ：  ｓｉＲＮＡ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｃｏｎｖｅｒｔ  ｍＲＮＡ  ｉｎｔｏ  ｄｓＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｄｅｇｒａｄｅｄ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｎｅｗ  ｓｉＲＮＡｓ．  Ｃｅｌｌ，  １０７，  ２９７−３０７
【非特許文献１０】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｈａｒｂｏｒｔｈ，  Ｊ．，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｗ．，  Ｙａｌｃｉｎ，  Ａ．，  Ｗｅｂｅｒ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  （２００１ａ）  Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１，  ４９４−８
【非特許文献１１】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  （２００１ｂ）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ２１−  ａｎｄ  ２２−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  １５，  １８８−２００．
【非特許文献１２】
Ｄｏｎｚｅ，  Ｏ．  ａｎｄ  Ｐｉｃａｒｄ，  Ｄ．  （２００２）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉＲＮＡｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３０，  ｅ４６
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、安価かつ簡便なｓｉＲＮＡの転写合成法を開発することを解決すべき課題とした。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本明細書の図１に概要を示す方法によりｓｉＲＮＡを転写合成する方法により、安価かつ簡便にｓｉＲＮＡを転写合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明によれば、５’から３’方向に、少なくとも
（１）標的核酸配列のアンチセンス配列、
（２）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列、
（３）標的核酸配列のセンス配列、
（４）プロモーター配列のアンチセンス配列、
（５）ループを形成する配列、および、
（６）プロモーター配列のセンス配列、
を含むオリゴヌクレオチドであって、プロモーター配列のアンチセンス配列とセンス配列とがヘアピン構造を介して分子内で二本鎖を形成し、かつ転写された際に標的核酸配列のアンチセンス配列と標的核酸配列のセンス配列の転写産物はトリミング配列を介して分子内で二本鎖を形成する、オリゴヌクレオチドが提供される。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、５’から３’方向に、少なくとも
（１）標的核酸配列のアンチセンス配列、
（２）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列、
（３）標的核酸配列のセンス配列、および、
（４）プロモーター配列のアンチセンス配列、
を含むオリゴヌクレオチドであって、転写された際に標的核酸配列のアンチセンス配列と標的核酸配列のセンス配列の転写産物がトリミング配列を介して分子内で二本鎖を形成する、オリゴヌクレオチドが提供される。
上記オリゴヌクレオチドにおいては、少なくともプロモーター配列の領域が二本鎖になっていてもよい。
本発明の別の態様によれば、上記のオリゴヌクレオチドと該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる二本鎖ＤＮＡが提供される。
【００１６】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列のアンチセンス配列の上流の５’末端にさらにＡＡの２塩基を有する。
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドでは、ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列は、５’−Ｃ（Ｄ）ｋＣＤ−３’（式中、ＤはＡ、Ｔ又はＧを示し、ｋは０から１００の整数を示し、（ｋ＋１）個のＤは互いに同一でも異なっていてもよい）である。
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドでは、ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列は５’−ＣＴＡＴＧＣＴ−３’である。
【００１７】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドでは、（３）標的核酸配列のセンス配列と（４）プロモーター配列のアンチセンス配列との間に−ＣＣＣ−が存在する。
好ましくは、プロモーター配列はＴ７クラスＩＩＩプロモーター配列である。
好ましくは、（５）ループを形成する配列は、−ＧＮＡ−を含む配列（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧを示す）である。
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、５’−ＡＡ−（標的核酸配列のアンチセンス配列）−ＣＴＡＴＧＣＴ−（標的核酸配列のセンス配列）−ＣＣＣ−ＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−ＧＣＧＡＡＧＣ−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’で表されるオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のオリゴヌクレオチドを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行うことを含む、ｓｈＲＮＡの製造方法が提供される。
好ましくは、転写はインビトロで行う。
好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の方法により製造されるｓｈＲＮＡが提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の側面によれば、上記の方法により製造されるｓｈＲＮＡを塩基特異的ＲＮａｓｅで処理することを含む、ｓｉＲＮＡの製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のオリゴヌクレオチドを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行ってｓｈＲＮＡを製造し、当該ｓｈＲＮＡを塩基特異的ＲＮａｓｅで処理することを含む、ｓｉＲＮＡの製造方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の方法により製造されるｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを用いて、ＲＮＡｉにより標的核酸配列を含む遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＮＡポリメラーゼ及び塩基特異的ＲＮａｓｅを含む、本発明の方法を行うための試薬キットが提供される。
【００２１】
【発明の実施の形態】
（１）オリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に、少なくとも、
（１）標的核酸配列のアンチセンス配列、
（２）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列、
（３）標的核酸配列のセンス配列、
（４）プロモーター配列のアンチセンス配列、
（５）ループを形成する配列、および、
（６）プロモーター配列のセンス配列、
を含むオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
標的核酸配列とは、発現を抑制することを意図する遺伝子中の核酸配列である。発現を抑制することを意図する遺伝子としては任意の遺伝子を使用できる。このような標的遺伝子としては、クローニングはされているが機能が未知の遺伝子も含まれる。あるいは、標的遺伝子は、外来性レポータータンパク質またはその変異タンパク質の遺伝子であってもよい。このような外来性レポータータンパク質またはその変異タンパク質の遺伝子の核酸配列を使用した場合は、本発明の技術においてＲＮＡｉ効果を容易に検出及び評価することができる。標的核酸配列の長さは、転写産物が所望のＲＮＡｉ効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には１０塩基から５０塩基程度であり、好ましくは１０塩基から３０塩基程度であり、より好ましくは１５塩基から２５塩基程度である。また、標的核酸配列のセンス配列とアンチセンス配列の長さは同一であることが好ましいが、転写産物が所望のＲＮＡｉ効果を発揮できる限り、長さは多少相違していてもよい。
【００２３】
ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列とは、塩基特異的ＲＮａｓｅで切断される塩基配列を意味する。
塩基特異的ＲＮａｓｅの種類は特に限定されないが、例えば、Ｇ特異的ＲＮａｓｅとしてＲＮａｓｅＴ１、ＡとＧ特異的ＲＮａｓｅとしてＲＮａｓｅＵ２、Ｃ特異的ＲＮａｓｅとしてＲＮａｓｅＣＬ３、ＣとＵ特異的ＲＮａｓｅとしてＲＮａｓｅＡまたはＲＮａｓｅＩ、ＡとＵ特異的ＲＮａｓｅとしてＲＮａｓｅＰｈｙＭなどを挙げることができる。
【００２４】
例えば、ＲＮａｓｅＴ１などのＧ特異的ＲＮａｓｅを使用する場合には、Ｇを含むようにトリミング配列を設計することができ、具体的には、トリミング配列として、５’−Ｃ（Ｄ）ｋＣＤ−３’（式中、ＤはＡ、Ｔ又はＧを示し、ｋは０から１００の整数を示し、（ｋ＋１）個のＤは互いに同一でも異なっていてもよい）を使用することができ、一例としては、５’−ＣＴＡＴＧＣＴ−３’を挙げることができる。
同様に、ＡとＧ特異的ＲＮａｓｅの場合には、トリミング配列として５’−Ｙ（Ｒ）ｋＹＲ−３’を使用することができ、Ｃ特異的ＲＮａｓｅの場合には、トリミング配列として５’−Ｇ（Ｈ）ｋＧＨ−３’を使用することができ、ＣとＵ特異的ＲＮａｓｅの場合には、トリミング配列として５’−Ｒ（Ｙ）ｋＲＹ−３’を使用することができ、ＡとＵ特異的ＲＮａｓｅの場合には、トリミング配列として５’−Ｓ（Ｗ）ｋＳＷ−３’を使用することができる。ここで、ＹはＣ又はＴを示し、ＲはＡ又はＧを示し、ＨはＡ、Ｃ又はＴを示し、ＳはＣ又はＧを示し、ＷはＡ又はＴを示す。
【００２５】
本発明で用いるプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターであれば特に限定されない。プロモーター配列としては、例えば、Ｔ７クラスＩＩＩプロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列またはＴ３プロモーター配列などを使用することができる。
本発明におけるループを形成する配列は、−ＧＮＡ−を含む配列（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧを示す）であることが好ましい。このような配列を用いることにより、本発明のオリゴヌクレオチドでは、プロモーター配列のアンチセンス配列とセンス配列とがヘアピン構造を介して分子内で二本鎖を形成できる（Ｙｏｓｈｉｚａｗａ  Ｓ，他、ＧＮＡ  ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｏｏｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｉｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉｈａｉｒｐｉｎｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  １９９７  Ａｐｒ  ２２；３６（１６）：４７６１−７）。これにより、本発明のオリゴヌクレオチドを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行うことにより、標的核酸配列の逆向き反復配列から成るＲＮＡを合成することができる。また、ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行うと、標的核酸配列のアンチセンス配列と標的核酸配列のセンス配列の転写産物はトリミング配列を介して分子内で二本鎖を形成するようになる。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、５’から３’方向に、少なくとも
（１）標的核酸配列のアンチセンス配列、
（２）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列、
（３）標的核酸配列のセンス配列、および、
（４）プロモーター配列のアンチセンス配列、
を含むオリゴヌクレオチドであって、転写された際に標的核酸配列のアンチセンス配列と標的核酸配列のセンス配列とがトリミング配列を介して分子内で二本鎖を形成する、オリゴヌクレオチドが提供される。この場合、プロモーター配列はアンチセンス鎖の一本鎖だけなので、プロモーター配列のセンス配列を有するオリゴヌクレオトドを別に添加して二本鎖を形成してから、ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行うことができる。
【００２７】
本発明のさらに別の態様によれば、（６）プロモーター配列のセンス配列のさらに３’末端側に、塩基配列が存在していてもよく、例えば、標的核酸配列のセンス配列および標的核酸配列のアンチセンス配列のそれぞれに相補的な塩基配列が存在していてもよい。
【００２８】
また、本発明の好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチドの５’末端（即ち、標的核酸配列のアンチセンス配列の上流側）にＡＡの２塩基を付加することができる。
また、本発明の好ましい態様によれば、標的核酸配列のセンス配列とプロモーター配列のアンチセンス配列との間に塩基配列−ＣＣＣ−を挿入することができる。このような配列を挿入することによってＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの合成効率を高めることができる。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドの一例としては、５’−ＡＡ−（標的核酸配列のアンチセンス配列）−ＣＴＡＴＧＣＴ−（標的核酸配列のセンス配列）−ＣＣＣ−ＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−ＧＣＧＡＡＧＣ−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’で表されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。標的核酸配列が１９塩基の場合の例を図１に示す。
【００３０】
以下、図１を参照して本発明の特に好ましい具体例についてさらに説明する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる試験管内転写反応では合成するＲＮＡをコードする鋳型ＤＮＡ領域は一本鎖でよく、プロモーター部分のみが二本鎖であればよいということがしられている（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，  Ｏ．Ｃ．  （１９８９）  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １８０，  ５１−６２）。したがって、図１のような９１塩基の一本鎖合成ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いることができる。転写合成するＲＮＡはｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）とし１９塩基のセンス鎖−アンチセンス鎖の間を７塩基のループ（トリミングループ）で連結した構造である。アンチセンス鎖の３’末端にはＵＵの２塩基のオーバーハングを施した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのクラスＩＩＩプロモーター領域は二本鎖である必要があるため、ＧＡＡトリループによるＤＮＡの安定なヘアピン構造（Ｈｉｒａｏ，  Ｉ．，  Ｋａｗａｉ，  Ｇ．，  Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，  Ｓ．，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｙ．，  Ｉｓｈｉｄｏ，  Ｙ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｍｉｕｒａ，  Ｋ．  （１９９４）  Ｍｏｓｔ  ｃｏｍｐａｃｔ  ｈａｉｒｐｉｎ−ｔｕｒｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｅｘｅｒｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，  ｄ（ＧＣＧＡＡＧＣ）  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：  ａｎ  ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｉｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｈｅａｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２２，  ５７６−８２）を導入した。このため、この鋳型ＤＮＡは水溶液中で確実に図１のようにプロモーター領域が二本鎖の構造をとることが予想される。転写開始部位には効率のよいＧＧＧ配列をデザインした。この鋳型は９１塩基のうち１９塩基のセンス鎖−アンチセンス鎖のみが任意の配列であって、それ以外の５３塩基はすべて固定の配列である。この鋳型デザインの特徴は、一本の合成ＤＮＡがそのままｓｈＲＮＡの鋳型として機能する点であり、ＸＸＸらの方法やＡｍｂｉｏｎの転写キットが３本のＤＮＡを使用することと、さらにはＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ酵素）による鋳型の作製行程が必要なことを考慮すると、非常に簡便でかつ合理的である。転写されたｓｈＲＮＡはセンス鎖−アンチセンス鎖で１９塩基の二本鎖部分を形成し、ＡＧＣＡＵＡＧ（ＸＧＸＸＸＸＧ）のトリミングループ部位を持っている。５’末端にはＧＧＧの一本鎖部位を持ち、３’末端にはＵＵの一本鎖オーバーハングを有する。トリミングループの特徴は４−１０塩基程度のループであり、ループの入口５’側から２番目にＧさらにはループの３’末にＧを配置する必要がある。次にｓｈＲＮＡをリボヌクレアーゼＴ１による限定分解（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を用いてワンステップでｓｉＲＮＡに変換する。転写反応後に、反応液に直接マグネシウムイオン（ＭｇＣｌ２など）を終濃度で５０−１００ｍＭ加え、反応液を氷上（０℃）で１０分間プレインキュベーションを行う。次にＧ特異的に���断するリボヌクレアーゼＴ１（ＲＮａｓｅ  Ｔ１）を加えで、氷上（０℃）で３０〜６０分反応させる。この処理で、５’末端のＧＧＧ配列とトリミングループの５塩基ＣＡＵＡＧが特異的に除去される。得られたｓｉＲＮＡはセンス鎖−アンチセンス鎖それぞれの３’末端に２塩基のオーバーハングが付加されている。したがって、この鋳型のデザインを用いれば、任意のターゲット配列を有するｓｉＲＮＡが簡便かつ効率よく合成できる。
【００３１】
（２）ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの製造、並びにそれらを用いたＲＮＡｉ
図１に関連して上記（１）において説明した通り、本発明のオリゴヌクレオチドを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行うことによるｓｈＲＮＡを製造することができ、この方法で製造されるｓｈＲＮＡは、ヘアピン部分に塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるトリミング配列を含んでいる点で新規であり、このようなｓｈＲＮＡ自体も本発明の範囲内である。
本発明の方法では、転写をインビトロで行うことができる。また、ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ＲＮＡポリメラーゼなどを使用することができ、中でもＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
【００３２】
ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応は当業者に既知の常法で行なうことができ、例えば、鋳型のオリゴヌクレオチドを含む溶液に、塩化マグネシウム、ＮＴＰ、スペルミジン、ジチオスレイトールを加え、最後にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを適当な濃度になるように加えて反応を行なうことができる。また、反応液中から副生成物であるピロリン酸を除去して転写反応を促進するために、ピロフォスファターゼを加えることが好ましい。このような反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートすることにより転写反応を行うことができる。
【００３３】
さらに、上記方法により製造されるｓｈＲＮＡを塩基特異的ＲＮａｓｅで処理することによって、トリミング配列が切断されてｓｉＲＮＡを産生することができる。塩基特異的ＲＮａｓｅとしては、Ｇで特異的に切断するＲＮａｓｅＴ１、Ｃで特異的に切断するＲＮａｓｅＣＬ３などを使用することができる。また、ＲＮａｓｅによる処理は、一本鎖のループの部分のみを切断するという観点から、高濃度の塩の存在下、例えば、１００ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で行なうことが好ましい。
【００３４】
ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの精製は以下のように行なうことができる。先ず、反応産物をフェノール処理およびクロロホルム処理などの常法によりタンパク質を除去した後、１５％ポリアクリルアミドゲルにロードして電気泳動し、目的のｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡのバンド部分のみを切り出し、次いで、このゲルを細かくすりつぶし、適当な溶液（例えば、０．５Ｍ    塩化ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ    ＥＤＴＡを含む溶液）中に浸し、一定時間３７℃で振とうすることによってＲＮＡをゲルから溶出させることができる。この溶液からゲルを除去した後、エタノールを加えてＲＮＡを沈殿させ、ペレットを少量の純水に溶解して回収することにより、精製した目的ＲＮＡを得ることができる。
【００３５】
上記した本発明の方法で製造されるｓｈＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡを用いて、ＲＮＡｉにより標的核酸配列を含む遺伝子の発現を抑制することが可能である。
例えば、ＨｅＬａ細胞などの培養細胞を用いる場合には、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと適当なトランスフェクション試薬（例えば、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥなど）とを混合し、培養細胞に添加することによりｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを培養細胞にトランスフェクションする。培養細胞は好適な条件下で培養することにより、ＲＮＡｉ効果が細胞内で起こり、標的核酸配列を含む遺伝子の発現が抑制される。遺伝子の発現の抑制は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット又はウエスタンブロットなどにより確認することができ、又は発現を抑制する遺伝子の機能が判明している場合には、細胞の表現型を観察することによって確認することも可能である。
【００３６】
（３）試薬キット
さらに本発明によれば、ＲＮＡポリメラーゼ及び塩基特異的ＲＮａｓｅを含む上記した本発明の方法を行なうための試薬キットが提供される。本発明の試薬キットには、上記酵素を用いた反応を行なうのに必要な他の試薬および／又は緩衝液を含めることができる。
例えば、ＲＮＡポリメラーゼを用いた酵素反応の反応系には、ＲＮＡポリメラーゼ以外に、塩化マグネシウム、ＮＴＰ、スペルミジン、ジチオスレイトール、及びピロフォスファターゼなどを含めることができるので、これらの試薬の全て又は一部を本発明の試薬キットに含めることができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３７】
【実施例】
実施例
▲１▼目的
本発明の方法により作製したｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの活性を、ラミンＡ／Ｃタンパク質のノックダウンによって確認する。有機合成したｓｉＲＮＡとの活性の比較も行う。
【００３８】
▲２▼実験方法
鋳型ＤＮＡの設計
ｓｈＲＮＡ転写合成の鋳型となるＤＮＡは、ホスホアミダイト法による有機合成によって製造されたもの（北海道システムサイエンス社）を用いた。鋳型ＤＮＡの長さは９１塩基であり、１本鎖のまま用いた。配列は、５’−ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＡＴＡ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  Ａ−３’（配列番号１）である。この鋳型ＤＮＡの配列は、３’末端側にＴ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼのプロモーター領域（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡ−３’）（配列番号２）を２箇所に相補的になるように配置し、この部分がヘアピン状に折りたたまれることによってプロモーター領域が２本鎖となるように設計した。これによって、合成ＤＮＡを２本用意しなくともＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる認識が可能となり、コストの低減を図ることができた。さらに、Ｔ７プロモーター領域の２本鎖化をより安定させるために、２箇所のＴ７プロモーター配列（センスおよびアンチセンス）の間にはヘアピン構造を安定化させる効果を有するＧＡＡトリループを導入した。これによって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応の効率の向上が期待される。
【００３９】
一方、鋳型ＤＮＡの５’末端側にはヒトのラミンＡ／ＣタンパクをコードするＤＮＡの配列のうちの１９塩基の配列（５’−ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  Ａ−３’）（配列番号３）を、５’側からセンス、アンチセンスの順に配置した。そして、センス鎖とアンチセンス鎖の間の部分にはリボヌクレアーゼＴ１による限定分解のターゲットサイトとなるべきトリミングループ（ＣＴＡＴＧＣＴ）を配置した。これによって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写産物は、トリミングループ（ＡＧＣＡＵＡＧ）を含むヘアピン構造を有するＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）となる。
【００４０】
試験管内転写法によるｓｈＲＮＡの合成
ｓｈＲＮＡの転写合成は、上記の鋳型ＤＮＡの濃度が５０ｎＭ、ｐＨ７．８の条件下で、塩化マグネシウム、ＮＴＰ、スペルミジン、ジチオスレイトールを加え、最後にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを終濃度０．０２μｇ／ｍＬとなるように加えて反応を開始させた。また、反応液中から副生成物であるピロリン酸を除去して転写反応を促進するために、酵母由来ピロフォスファターゼ（ＳＩＧＭＡ社）を終濃度０．４７μｇ  ／ｍＬとなるように加えた。これを、３７℃で６０分間インキュベートして転写反応を行わせた。反応混合物を１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にかけ、目的となるｓｈＲＮＡの生成が確認された。
【００４１】
ｓｈＲＮＡの限定分解によるｓｉＲＮＡの生成（トリミング）
上記の転写反応液に対して、塩化マグネシウムを終濃度１００ｍＭになるように加えて、氷上（０℃）で１０分間プレインキュベーションした。次に、Ｇ特異的に切断するリボヌクレアーゼＴ１（ＳＩＧＭＡ社）を３０μｇ  ／ｍＬとなるように加えて、氷上（０℃）で３０分反応させた。これによりトリミングループ中の２箇所のＧの３’末端側のみ限定的に切断され、ＣＡＵＡＧの配列の部分のみ除去される。低温かつ高マグネシウム濃度のため、二本鎖を組んでいる部分は配列中にＧを含んでいても切断されることはない。この反応混合物を１５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にかけ、目的となるｓｉＲＮＡの生成が確認された。
【００４２】
精製
上記の反応液に対してフェノール処理を２回、クロロホルム処理を１回施して除タンパクした後、１５％ポリアクリルアミドゲルにロードして電気泳動し、目的のｓｉＲＮＡのバンド部分のみをカッターで切り出した。次にこのゲルを細かくすりつぶし、０．５Ｍ    塩化ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ    ＥＤＴＡを含む溶液中に浸し、１２時間３７℃で振とうすることでＲＮＡをゲルから溶出させた。この溶液からゲルを除去した後、エタノールを加えてＲＮＡを沈殿させ、ペレットを少量の純水に溶解して回収した。
【００４３】
ノックダウン
ＨｅＬａ細胞（１ｘ１０４個）を４８ウェルのディッシュに蒔き、０．２ｍｌの培地（Ｄ−
ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ）で一晩培養した（３０−５０％コンフルエント）。７．４  ｆｍｏｌから７．４  ｐｍｏｌのラミンＡ／Ｃに対応したｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡに２５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）を加えた。また、１μｌのＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉで希釈し、室温で１０分間放置した。２つの溶液をゆっくりと混合し、さらに室温で２０分放置した。一晩培養した細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭで洗浄した後、それぞれのウェルに１２０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを加えた。ｓｉＲＮＡとＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの混合液を３０μｌ加え、ゆっくり混合した。そのままＣＯ２インキュベーター中で３７℃で４時間保温した。２２５μｌの培地（ＤＭＥＭ＋３０％  ＦＢＳ）を加え、さらに４０時間培養した。培地を除き、細胞に５０μｌの２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを加えて溶かし、エッペンドルフチューブへ移した。氷上で１０秒×５回ソニケーションを行い、１００℃で１分加熱したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとした。
【００４４】
ウェスタンブロッティング
３０μｌのサンプルを１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。６ｘ９ｃｍに切ったＰＶＤＦ膜（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭ−Ｐ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ０．４５μｍ，  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を１００％メタノールに２分間浸漬させた。その後、膜を転写緩衝液（Ｔｒｉｓ  ３．０３ｇ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  １４．４ｇ、ＳＤＳ  ０．１ｇ、ＭｅＯＨ  １００ｍｌ  をＭｉｌｌｉＱで１Ｌにした）で３０分室温で振とうした。泳動の終了したゲルをセミドライ式のブロッターにセットし、膜をのせ、その上に転写緩衝液で湿らせたろ紙（３ＭＭ、ワットマン社）を乗せた。室温で４００ｍＡで９０分転写した。転写後、膜を１０％スキムミルク（ＴＢＳ）に浸し、３７℃で１時間ブロッキングを行った。膜を１００倍希釈した抗ラミンＡ／Ｃ１次抗体（Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ（６３６）：ｓｃ−７２９２，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と反応させた（室温、１時間）。コントロールとして、抗チューブリン抗体（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩ−β−ＴＵＢＬＩＮ：Ｔ５２９３，  ＳＩＧＭＡ）を用いた。反応後に膜をＴＢＳで３回洗浄し、１５００倍希釈の２次抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｃｏｎｇｕｇａｔｅｄ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｕｌｉｎｓ：Ｐ０１６１，  ＤＡＫＯ）と反応させた（室温、１時間）。ＴＢＳで３回洗浄した後、ＥＣＬで発光させ、オートラジオグラフィーでラミンＡ／Ｃを定量した。
【００４５】
▲３▼結果と考察
５０ｎＭのｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの結果を図２に示した。いずれの細胞もチューブリンが同程度の発光を示していること、またコントロールに用いた別のターゲットに対するｓｉＲＮＡではラミンＡ／Ｃのノックダウンが観測されていないことから、実験は成立している。転写で作製したｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡいずれの場合も有機合成で作製したｓｉＲＮＡよりも活性が高いことが示された。
またｓｉＲＮＡの濃度を変化させてノックダウンしたデータを図３に示した。この結果からも、転写で作製したｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは有機合成で作製したｓｉＲＮＡよりも活性が高く、５ｎＭ程度からノックダウンの活性が見えていることが判明した。
【００４６】
【発明の効果】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いることにより、安価かつ簡便にｓｉＲＮＡを転写合成することが可能である。特に、本発明の利点は以下の点にある。
（１）（実施例の場合には９１塩基である）鋳型ＤＮＡを一本作製するだけでいい。
（２）標的核酸配列の塩基以外は固定の配列を使用できる。
（３）はじめの塩基（実施例では４４塩基）はあらかじめ合成したものを使用するので合成時間の短縮と鋳型ＤＮＡのコストが大幅に削減できる。
（４）合成ＤＮＡをそのまま転写に使用できる。
（５）ワンチューブでの転写合成が可能（９６プレートでの適用可能）である。
（６）転写したＲＮＡはｓｈＲＮＡなのでそのまま使うことも可能である。
（７）ｓｈＲＮＡからｓｉＲＮＡの変換がワンステップで行なえる。
（８）センスとアンチセンスを別々に転写していないのでアニーリング操作が不要である。
（９）１本鎖ＲＮＡが生じないのでｓｉＲＮＡの収量がよい。
【００４７】
【配列表】
2004261002.tif 000002
【００４８】
2004261002.tif 000003
【００４９】
2004261002.tif 000004
【００５０】
2004261002.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のｓｉＲＮＡ転写合成法の一例の概要を示す。
【図２】図２は、ラミンＡ／Ｃタンパク質を標的としたｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの活性の比較を示す。ＨｅＬａ細胞を用い、ラミンＡ／Ｃに対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ（各５０ｎＭ）でノックダウンのち抗ラミンＡ／Ｃ抗体でウエスタンブロット分析を行なった。
【図３】図３は、ラミンＡ／Ｃタンパク質を標的としたｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの活性の比較を示す。転写合成したｓｉＲＮＡとｓｈＲＮＡは、共に有機合成ｓｉＲＮＡよりも低濃度で効果が現れる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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