(57)【要約】【課題】環状脂肪族炭化水素類を炭素源として分解資化し、有機溶媒として脂肪族炭化水素類及び脂肪族アルコール類に耐性を有し且つ、遺伝子工学的手法を用いて、抗生物質耐性遺伝子などの外来遺伝子を導入した形質転換株を作成できる微生物を提供する。【解決手段】本発明の新規微生物であるシュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６は、有機溶媒として脂肪族炭化水素類及び脂肪族アルコール類に耐性を有し、環状脂肪族炭化水素類を炭素源として分解資化し得る。本微生物を用いることによって、工業廃液中の難分解性とされていた環状脂肪族炭化水素類を環境にダメージを与えることなく、高濃度で分解資化できる。また、本微生物は、形質転換も可能であることから、幅広い有機化合物の分解資化も可能である。【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６、及び付随的に得られるその子孫および突然変異体。
【請求項２】
１６Ｓ　ｒＲＮＡの部分塩基配列が、配列番号１に記載された塩基配列を含む請求項１記載の微生物。
【請求項３】
請求項１記載の微生物に外来遺伝子を組み込んだ形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は環状脂肪族炭化水素類を炭素源として分解資化し、脂肪族炭化水素類及び脂肪族アルコール類などの有機溶媒に耐性を有する微生物に関するものである。さらには、本発明の新規微生物を宿主とした有機溶媒耐性外来遺伝子発現系の構築に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
有機溶媒耐性微生物は、廃液中の有機化合物など汚染物資の分解（バイオレメディエーション）、水不溶性の有用物質の生産等への応用が期待されている。（“極限環境微生物とその利用”　講談社サイエンティフィック　２０００年）
環状脂肪族炭化水素類は、多くの化学合成の反応溶媒として、また、高分子材料の原料として多量に使用されており、工業廃液に含まれることも多い。この工業廃液の処理としては燃焼処理が考えられるが、環境保護の見地から好ましくない。
【０００３】
近年、環境中の難分解有機化合物の分解などに、酵素や微生物を触媒として使用する技術が注目されている。
しかしながら、環状脂肪族炭化水素類は鎖状脂肪族炭化水素類に比べて、生分解性が低く、効率よい微生物分解は困難とされている。（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９１巻９４頁　２００１年、Ａｐｐｌ，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５４巻　１２１頁　２０００年）
【０００４】
これまでに環状脂肪族炭化水素類を炭素源として資化する微生物としては、シクロヘキサンを炭素源として資化するノカルディア　ｓｐ．（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，７巻　８５頁　１９７９年、及び特開２０００−１０１８７２号公報）、シュードモナス　ｓｐ．（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１２０巻　５９頁　１９８０年）及び、アシネトバクター・シクロヘキサノフィルス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｐｈｉｌｕｓ）（特開昭６１−１２８８９０号公報）、メチロコッカス・カプスラタス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ　）（谷　吉樹ら、“バイオコンバージョン”　医学出版センター　６８頁　１９９３年）等が知られている。しかし、これらの文献は、平板培地に塗布した微生物に、シクロヘキサンを蒸気として与えるか、液体培地中０．２％（シクロヘキサンの培地に対する容量百分率）という低いシクロヘキサン濃度における場合のみの記載であり、これ以上の高い濃度における微生物の成育に関しては開示されていない。また、メチロコッカス・カプスラタスの場合、シクロヘキサンを代謝してシクロヘキサノールを蓄積すると報告されており、有害物質分解に用いる場合、分解途中で新たに有害なシクロヘキサノールが蓄積することは問題である。
【０００５】
近年、分子生物学の発展により、有機化合物を分解する酵素など特定の蛋白質の遺伝子を取り出して、別種の微生物に導入し発現させることが容易になってきた。よって、別種微生物由来の分解酵素遺伝子を組込み、微生物が持っている有機化合物分解酵素系に加えて、分解能力を向上させることも可能である。しかし、一般に、微生物の培養は水系の培地中であり、水に溶け難い有機化合物を大量に処理することは困難である。
【０００６】
“バイオサイエンスとインダストリー”　５４巻　３４頁　１９９６年　には、水不溶性の有機化合物を有機溶媒に溶解し、酵素や微生物を含有する培養液（水）に混合することで該有機化合物を反応させる方法が記載されている。
しかし、この方法では有機溶媒との接触により酵素が失活したり、微生物が死滅してしまうことが多い。
有機溶媒耐性の外来遺伝子導入系としては、特公平８−４５１４号公報にシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）を用いる系が報告されている。しかし、この微生物は有機溶媒を炭素源として資化することができないため、別途、糖などの栄養源を与える必要がある。
よって、有機溶媒耐性を有し、環状脂肪族炭化水素類を炭素源として分解資化することができる微生物、及び形質転換体が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、環状脂肪族炭化水素類を分解資化し、有機溶媒に高度な耐性を有する微生物、及び形質転換体を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によって高濃度の環状脂肪族炭化水素類を分解資化し得るシュードモナス属微生物、及び形質転換体を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
環状脂肪族炭化水素類を資化する本発明の微生物は、通常の微生物学的技術、たとえば浄化設備から環状脂肪族炭化水素類であるシクロヘキサンを成長基質とすることで分離することができる。
【００１０】
環状脂肪族炭化水素類を炭素源として分解資化し得る微生物としてはシュードモナス　ｓｐ．、その子孫あるいは突然変異体が用いられる。なお、この微生物は、発明者によって、２００２年３月１４日に、ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６の番号で、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託されている。
シュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６の菌学的性質を以下に示す。
【００１１】
シュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６の菌学的性質：
種族の特性
細胞形状　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　棒状
幅　　μｍ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．８　〜　１．０
長さ　　μｍ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．５　〜　２．０
運動性　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
グラム染色　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
胞子　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
オキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
カタラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
成長
３７／４５℃　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋／＋
【００１２】
抗生物質中の生育（数値は、ＬＢ培地中の含有量μｇ／ｍｌ）
アンピシリンナトリウム　５０／２００　　　　＋／−
カナマイシン硫酸塩　２／１０　　　　　　　　　　＋／−
ストレプトマイシン硫酸塩　２／１０　　　　　＋／−
テトラサイクリン塩酸塩　２５／５０　　　　　＋／−
【００１３】
酸発生（ＯＦ試験）
グルコース好気的　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
グルコース嫌気的　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
グルコースからのガス発生　　　　　　　　　　　　−
【００１４】
資化性試験
ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
Ｌ−アラビノース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
Ｄ−マンノース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
Ｄ−マンニトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン　　　　　　　　−
マルトース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
キシロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
グルコン酸カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
ｎ−カプリン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
ｄｌ−リンゴ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
クエン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
酢酸フェニル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
【００１５】
生化学試験
硝酸塩還元　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
インドール産生　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
ブドウ糖酸性化　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
アルギニンジヒドロラーゼ　　　　　　　　　　　　　　−
ウレアーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
エスクリン加水分解　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
ゼラチン加水分解　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
β−ガラクトシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
【００１６】
上記形態学、生理学的形質に加えて、本発明微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、１６ＳｒＲＮＡの部分塩基配列（５００塩基）を解析した。（配列番号１）
【００１７】
本発明微生物の生理性状はバージーズマニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ：シュプリンガー・フェアラーク社刊）第二版などの文献情報からシュードモナス・バレアリカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂａｌｅａｒｉｃａ）に類似することが示された。しかし、キシロース、マルトースの資化性は陰性でシュードモナス・バレアリカの定型性状と異なるため種レベルで完全一致する菌株は無く、発明者らは本発明微生物ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６をシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属する新規な菌株であると同定した。
また、１６Ｓ　ｒＲＮＡの部分塩基配列によるＭｉｃｒｏＳｅｑデータベース検索の結果による系統樹（図１）からも、本発明微生物ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６が、シュードモナス・バレアリカに近縁なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に帰属される菌株であることを支持する。
【００１８】
シクロヘキサンを資化しうるシュードモナス属微生物については、前述のようにすでに報告されている。（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１２０巻　５９頁　１９８０年）　しかし、報告されているシュードモナス属微生物は、シクロヘキサノール、シクロヘキサノンなどを資化しうると記載されているのに対し、本発明微生物ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６はシクロヘキサノール、シクロヘキサノンを資化できないことから、これら２種類のシュードモナス属微生物とは明らかに別菌株である。
【００１９】
本発明微生物であるシュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６は、シクロヘキサンを炭素源とする液体培地中で良好な発育を示す。
また、本発明微生物をシクロヘキサンを唯一の炭素源として培養し、得られる培養上清、菌体成分などからは、シクロヘキサノール、シクロヘキサノンなどの代謝物は確認されず、わずかに１，２−シクロヘキセンオキサイドが確認されるのみであった。
【００２０】
ノカルディア　ｓｐ．、シュードモナス　ｓｐ．、アシネトバクター・シクロヘキサノフィルスによるシクロヘキサンの代謝は、まずシクロヘキサノールが生成し、続いて、シクロヘキサノン、カプロラクトンを経由してアジピン酸に至るバイヤービリガー（Ｂａｅｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ）型の代謝経路によると報告されている。しかし、本発明微生物は、代謝中間体に１，２−シクロヘキセンオキサイドが検出されたことから、これまで報告されていたシクロアルカン分解微生物とは全く異なる代謝系でシクロアルカンを代謝している可能性があり、シクロヘキサンから１，２−シクロヘキセンオキサイドを生成するような新規酵素を有している可能性がある。
【００２１】
工業廃液等に含まれる環状脂肪族炭化水素類の分解は、本発明微生物を分解させる環状脂肪族炭化水素類を含有する溶液と接触させることによって行われる。
本発明微生物を環状脂肪族炭化水素類を含有する廃液等と接触させる方法としては、微生物の懸濁液を環状脂肪族炭化水素類を含む培地に直接添加して培養する方法、或いは微生物を多孔質な担体に担持したものを環状脂肪族炭化水素類を含む溶液から気化させた環状脂肪族炭化水素類と接触させる方法等が挙げられる。
【００２２】
本発明微生物による環状脂肪族炭化水素類の分解操作において、事前に、本発明の微生物を、環状脂肪族炭化水素類を唯一の炭素源とした培地により培養し、この微生物の分解酵素を誘発しておくのが好ましい。
通常、この前培養における環状脂肪族炭化水素類の濃度は０．０１〜８０重量％、好ましくは１〜５０重量％である。
【００２３】
前培養の目安は、細胞分散液の６６０ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．６６０）が０．４〜１０、好ましくは０．５〜５である。
【００２４】
本発明の微生物は、培養状態でも使用できるが休止菌体として用いることもできる。
休止菌体は、上記前培養した後、通常の分離方法により集菌することによって調製できる。
【００２５】
本発明の微生物が分解資化しうる環状脂肪族炭化水素類としては、炭素数５〜１０の無置換の飽和環状脂肪族炭化水素類が挙げられるが、好ましくはシクロヘキサンである。
【００２６】
本発明の微生物を用いた環状脂肪族炭化水素類の分解において、培養基は特に必要とされないが、酵母エキスなどのビタミン源、硫酸アンモニウム、尿素などの窒素源、鉄、ニッケル、コバルトなどの微量金属などの培養基を分解する環状脂肪族炭化水素類の溶液に加える事もできる。好ましい培養基としては表１に示す組成の培養基である。
【００２７】
分解に適用されるｐＨ値は特に限定されないが、好ましくは４〜９である。
分解に適用される温度範囲は１０〜５０℃が好ましく、更に好ましくは２０〜４０℃の温度である。
【００２８】
本発明の微生物が耐性を有する有機溶媒としては、脂肪族炭化水素類、脂肪族アルコール類又はこれらの混合物が挙げられる。
脂肪族炭化水素類としてはｎ−ヘキサン、ｎ−ドデカンなどの炭素原子数５〜１６の分岐を有しても良い鎖状脂肪族炭化水素類、シクロドデカトリエン、シクロペンタンなどの炭素原子数５〜１２の環状脂肪族炭化水素類が挙げられる。
脂肪族アルコール類としては、ヘキサノール、オクチルアルコールなどの炭素原子数２〜１４の分岐を有しても良い鎖状脂肪族アルコール類が挙げられる。
【００２９】
本発明微生物への外来遺伝子導入およびベクターの調製は、公知のシュードモナス属細菌への手法に従って行うことができる。（共立出版　微生物学基礎講座８巻　１０６項　１９８７年）
導入する遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子や、トルエンジオキシゲナーゼのような炭化水素分解酵素遺伝子などが挙げられる。
本発明微生物シュードモナス　ｓｐ．　ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６を抗生物質耐性遺伝子を有するベクター（ｐＴＳ１０３６）により形質転換した微生物は、発明者により、２００２年５月２４日に、ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８９６の番号で、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託されている。
以下、本発明の実施例を説明するが、これらの実施例は本発明を説明するための一例であって、本発明を限定するものではない。
【００３０】
【実施例】
実施例１
シクロヘキサン資化性微生物の分離
シクロヘキサン資化性微生物の分離は、シクロヘキサンを炭素源とした集積培養法（Ｇ．ドリュウス著、“Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅｓ　Ｐｒａｋｔｉｋｕｍ（微生物学の実践）”，第４版，スプリンガー出版，１９８３年）により行った。
振盪フラスコにシクロヘキサンを１ｍｌ、Ｙ培地５０ｍｌ（表１）を入れ、宇部興産株式会社　ケミカル西工場浄化設備内の処理槽から得た汚泥を接種して２５℃で１週間培養した後、濁度の上昇が認められた培養液を新たな培地に３回継代培養した。その培養液を、１リットルあたり１６ｇの寒天を加え、且つ、酵母エキスを除いたＹ培地（寒天平板培地）に塗布し、シクロヘキサン蒸気下、２５℃で培養した。培養２週間後、生じたコロニーからシクロヘキサン資化菌を分離した。
分離したシクロヘキサン資化菌は、前記のシュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６であった。
【００３１】
【表１】
Ｙ　培地組成
2004033045.tif 000002
【００３２】
実施例２
シクロヘキサンの分解試験
三角フラスコにＹ培地（表１）３０ｍｌを入れ、シリコ栓を付して滅菌後、２ｍｌのシクロヘキサンを無菌的に加えて、シュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６を保存スラントから一白金耳採って培地に接種し、３５℃で１日振盪して前培養した。
培養終了時の濁度（Ｏ．Ｄ．６６０）は１．３８であった。
１リットル三角フラスコにＹ培地（表１）５０ｍｌを加えて滅菌したものに前培養液０．５ｍｌを添加接種し、容器内を酸素で充分置換した。
次にシクロヘキサン１ｍｌをホールピペットを用いて正確に加え、素早くシリコン栓にて密栓し、３５℃で２日間旋回振盪（１５０ｒｐｍ）培養した。培養後、容器を４℃に冷却、素早くジクロロメタン３０ｍｌと内標としてトルエン１ｍｌを正確に加え、再び密栓して振盪抽出した。有機層を分取し、ＧＣ分析により残留シクロヘキサンを定量した。
【００３３】
対照実験として、下記の対照実験（１）、対照実験（２）を行った。
対照実験（１）
前培養液無接種とする以外は実施例２と同様の操作を行い、残存するシクロヘキサン量を測定した。
【００３４】
対照実験（２）
菌体成分へのシクロヘキサンの吸着評価
前培養液をオートクレーブで滅菌したものを接種する以外は実施例２と同様の操作を行い、残存するシクロヘキサン量を測定した。
【００３５】
シクロヘキサン分解率（％）は下記式に基づいて算出した。その結果を下記表２に示す。
【数１】
2004033045.tif 000003
【００３６】
【表２】
2004033045.tif 000004
【００３７】
実施例３
シクロヘキサン分解物の分析
菌体の前培養は、１００ｍｌの三角フラスコ３個それぞれにＹ　培地（表１）３０ｍｌを入れ、シリコ栓を付して滅菌後、シクロヘキサン２ｍｌを無菌的に加え、シュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６を保存スラントから一白金耳採って培地に接種して３５℃で一晩振盪培養した。
得られた前培養液を合わせて遠心分離（８０００×ｇ、２０分）し、生理食塩水にて洗菌操作を行った後、Ｏ．Ｄ．６６０が１２になるようにＹ培地を加えて再懸濁した。この懸濁液２ｍｌを２０ｍｌサンプル管に入れ、容器内を酸素で十分置換した後、素早く１００μｌのシクロヘキサンを加え、シール付きキャップにて密栓した。この懸濁液を３５℃にて１６時間振盪培養した後、０．２ｍｇのｎ−ウンデカン（内標）を含む２ｍｌのジエチルエーテルを加えて抽出し、得られた有機層について以下の分析を行った。
生成物の同定および定量は、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）およびガスクロマトグラフィー（ＧＣ）にて行った。その結果、添加したシクロヘキサンに対して０．０４％の収率に相当する１，２−シクロヘキセンオキサイドが確認された。また、１，２−シクロヘキセンオキサイド以外の代謝物は検出されなかった。（図２、３　参照）
なお、同様にシクロヘキサン未添加試験を行った結果、１，２−シクロヘキセンオキサイドは認められなかった。
【００３８】
ＧＣ／ＭＳ分析条件
ＧＣ／ＭＳ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＧＣＭＳ−ＱＰ５０００
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ製キャピラリーカラム　ＤＢ−１７００　（３０ｍ　ｘ　０．２５ｍｍ）
注入口温度：２２０℃
検出器温度：２５０℃
カラム温度：４０℃／５分　→　１０℃／分　→　２３０℃／５分
【００３９】
ＧＣ分析条件
ＧＣ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＧＣ−１７００
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ製キャピラリーカラム　ＤＢ−１　（１５ｍ　ｘ　０．５３ｍｍ）
検出器：ＦＩＤ　（フレームイオン化検出器）
注入口温度：２２０℃
検出器温度：２５０℃
カラム温度：４０℃／５分　→　１０℃／分　→　２３０℃／５分
【００４０】
実施例４
有機溶媒耐性培養試験
菌体の前培養は、１００ｍｌ三角フラスコにＹ培地（表１）３０ｍｌを入れ、シリコ栓を付して滅菌後、シクロヘキサン１．５ｍｌを無菌的に加え、シュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６を保存スラントから一白金耳採って培地に接種して３５℃で１日振盪培養した。培養終了時の濁度（Ｏ．Ｄ．６６０）は１．３９であった。
次に１００ｍｌ三角フラスコにペプトン０．５重量％、酵母エキス０．１重量％、グルコース２重量％、リン酸カリウム０．０５重量％、無水硫酸マグネシウム０．０５重量％、硫酸鉄七水和物０．００５重量％からなる培地（理化学研究所　微生物系統保存施設（ＪＣＭ）　微生物株カタログ記載　Ｎｏ．３７培地、以下、「ＪＣＭ３７培地」と記す）３０ｍｌを入れ滅菌後、上記前培養液０．５ｍｌを接種した。これに下記表３の濃度となるように有機溶媒を加え、３０℃にて７日間振盪培養を行った。培養開始１、３、７日後に水層を分取し、シュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６の増殖に伴う濁度（Ｏ．Ｄ．６６０）を測定した。
結果を下記表３に示す。本結果よりシュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭＰ−１８７６６が、高濃度の有機溶媒に耐性であることが示された。
【００４１】
【表３】
2004033045.tif 000005
【００４２】
実施例５
有機化合物資化性試験
前培養は実施例４と同じ方法で行った（前培養終了時の濁度（Ｏ．Ｄ．６６０）は１．３８）。次に、１００ｍｌ三角フラスコにＹ培地（表１）５０ｍｌを入れ、シリコ栓を付して滅菌後、前培養液０．５ｍｌを接種した。
これに下記表３の濃度となるように有機化合物（炭素源）を無菌的に加え、３０℃で７日間振盪培養を行った（アジピン酸、ドデカン二酸は、水酸化ナトリウムで、ｐＨ７に調製した１０％水溶液を炭素源として加えた）。培養開始１、３、７日後、静置して水層を分取し、シュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６の増殖に伴う濁度（Ｏ．Ｄ．６６０）を測定した。
その結果を下記表４に示す。
【００４３】
【表４】
2004033045.tif 000006
【００４４】
実施例６
シュードモナス　ｓｐ．（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６）の形質転換
形質転換は、中澤らの方法（遺伝子組換え実用化技術　第４集　サイエンスフォーラム刊　７３頁　１９８３年）に従って行った。
ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ社）に１日生育させたシュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６の培養液１．５　ｍｌ（培養終了時の濁度（Ｏ．Ｄ．６６０）は１．２３）を０．５　Ｍスクロース含有ＬＢ培地を２０　ｍｌ　の入った２００　ｍｌ三角フラスコに接種した。
このフラスコを恒温槽内にて振盪培養した（２００　ｒｐｍ、２８　℃、２時間）。ついで培養液を１５　ｍｌ遠沈管に取り遠心した（８０００　ｒｐｍ、３　ｍｉｎ、４　℃）。得られた沈澱に１０　ｍＭ　塩化ナトリウム含有０．５　Ｍスクロース液１０　ｍｌを加えて再懸濁した後、懸濁溶液を再び遠心して沈澱を得た。この沈澱に５０　ｍＭ塩化カルシウム含有０．５　Ｍスクロース液１０　ｍｌを加えて懸濁した後、氷水中（０　℃）に２０分間静置した。懸濁溶液を再度遠心して沈澱を得た。この沈澱に５０　ｍＭ　塩化ナトリウム液０．４　ｍｌを加えて懸濁した。懸濁液０．２　ｍｌを試験管に取り、ｐＴＳ１０３６（図３：遺伝子組換え実用化技術　第４集　サイエンスフォーラム刊　７３頁　１９８３年）溶液（５０　ｍＭ塩化カルシウム液）および０．１　ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｗａｋｏ社）液３　μｌを加えて混合した。この試験管を氷水中に６０分静置した後４２　℃の温水中に２分間静置した。静置後、ＬＢ培地２．７　ｍｌを加えて恒温槽内で振盪培養した（２００　ｒｐｍ、２８　℃、２時間）。
培養液２００　μｌをカナマイシン（Ｗａｋｏ社）１０μｇ／ｍｌ含有ＬＢ平板培地に塗布し、３７　℃の恒温槽内で１日培養した後、生じたコロニーから形質転換体であるシュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８６９を得た。
【００４５】
形質転換体（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８６９）のプラスミドベクターの確認は、アルカリＳＤＳ法にて（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１−２５頁　１９８９年）プラスミドを抽出し、アガロースゲル電気泳動法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，６−２３頁、１９８９年）にてバンドサイズを確認して行った。形質転換体（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８６９）には、ｐＴＳ１０３６を示す１３．９ｋｂのプラスミドベクターが確認された。
なお、野生株のシュードモナス　ｓｐ．（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６）について同様な操作を行った結果、同サイズのプラスミドは認められなかった。
【００４６】
実施例７
形質転換体（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８６９）の抗生物質及び有機溶媒耐性
前培養は培地に終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようにカナマイシンを加えた以外は、実施例４と同じ方法で行った（培養終了時の濁度（Ｏ．Ｄ．６６０）は１．３８）。
次に、１００ｍｌ三角フラスコに有機溶媒がｎ−ドデカンの場合はＪＣＭ３７培地３０ｍｌ、有機溶媒がシクロヘキサンの場合はＹ培地３０ｍｌを入れ、滅菌後、上記前培養液０．５ｍｌを接種した。これに該培地に対する容量百分率が５０％となるように有機溶媒３０ｍｌを重層し３０℃で３日間振盪培養を行った。培養後、静置して水層を分離し、滅菌水にて１００倍に希釈し、１０μｌをカナマイシン１０μｇ／ｍｌ含有ＪＣＭ３７平板培地に塗布し、３５℃、２日間培養後のコロニー数をカウントした。
培養液あたりの生菌数（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を下記表５に示す。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
【発明の効果】
本発明微生物であるシュードモナス　ｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６は、先行技術のノカルディア　ｓｐ．　（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．）、シュードモナス　ｓｐ．　及び、アシネトバクター・シクロヘキサノフィルス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｐｈｉｌｕｓ）等で開示されている濃度をはるかに超える５０％（培地に対する環状脂肪族炭化水素類の容量百分率）の濃度で環状脂肪族炭化水素類（シクロヘキサン）に耐性を示すと共に資化増殖できる。また、ドデカン、オクチルアルコールなどの有機溶媒にも耐性である。
更に、環状脂肪族炭化水素類の資化性、及び有機溶媒への高度な耐性を保ったまま外来遺伝子を導入することも可能である。
よって、本発明により外来遺伝子を導入可能な有機溶媒耐性及び資化性を有した新規微生物を提供することができる。
以上の特性を有する本発明微生物、シュードモナス　ｓｐ．　ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７６６を用いることによって、工業廃液中の難分解性とされていた環状脂肪族炭化水素類を環境にダメージを与えることなく、高濃度で分解資化できる。また、本微生物は、形質転換も可能であることから、幅広い有機化合物の分解資化も可能である。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のシュードモナス属に属する微生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡの部分遺伝子配列についての、ＭｉｃｒｏＳｅｑデータベース検索の結果による系統樹である。
【図２】シクロヘキサンからの反応生成物が１，２−シクロヘキセンオキサイド以外に検出できないことを示すＧＣ／ＭＳ分析の図である。ここで横軸は保持時間、縦軸は、ＴＩＣ（総イオン強度）を示す。
【図３】シクロヘキサンからの反応生成物が１，２−シクロヘキセンオキサイドであると同定したＧＣ／ＭＳ分析の図である。ここで横軸は質量／電荷の比、縦軸をイオンの相対強度を示す。
【図４】ｐＴＳ１０３６の制限酵素サイトおよび抗生物質耐性遺伝子の転写方向を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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