(57)【要約】【課題】動物由来の蛋白質を使用せずに培養細胞を高収率（高回収率及び高生存率）で剥離回収できる細胞剥離剤を提供すること。【解決手段】細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を少なくとも１個有するポリペプチド（Ａ）を有する細胞培養基材（Ｋ）とこの基材（Ｋ）を用いて細胞培養された細胞（Ｓ）とを剥離するための細胞剥離剤であって、蛋白質分解酵素の含有量が細胞剥離剤の重量に基づいて０又は０．１重量％以下であることを特徴とする細胞剥離剤を用いる。キレート剤（Ｂ）を必須成分として含有してなることが好ましく、（Ｂ）としては、ビスカルボキシメチルアミノ基を少なくとも１個有する化合物及び／又はこの塩が好ましく、さらに好ましくはエチレンジアミン四酢酸、ニトロ三酢酸、ウラミル二酢酸及びこれらの金属塩である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を少なくとも１個有するポリペプチド（Ａ）を有する細胞培養基材（Ｋ）とこの基材（Ｋ）を用いて細胞培養された細胞（Ｓ）とを剥離するための細胞剥離剤であって、蛋白質分解酵素の含有量が細胞剥離剤の重量に基づいて０又は０．１重量％以下であることを特徴とする細胞剥離剤。
【請求項２】
キレート剤（Ｂ）を必須成分として含有してなる請求項１に記載の細胞剥離剤。
【請求項３】
キレート剤（Ｂ）が、ビスカルボキシメチルアミノ基を少なくとも１個有する化合物及び／又はこの塩である請求項１又は２に記載の細胞剥離剤。
【請求項４】
キレート剤（Ｂ）が、エチレンジアミン四酢酸、ニトロ三酢酸、ウラミル二酢酸及びこれらの金属塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のキレート剤である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞剥離剤。
【請求項５】
（１）細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を少なくとも１個有するポリペプチド（Ａ）を有する細胞培養基材（Ｋ）及び培地（Ｖ）を用いて細胞培養する工程、
及び（２）請求項１〜４のいずれかに記載の細胞剥離剤を用いて細胞培養基材（Ｋ）と細胞培養された細胞（Ｓ）とを剥離する工程を含む細胞シートの製造方法。
【請求項６】
培地（Ｖ）が無血清培地である請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列の数が、３〜５０個である請求項５又は６に記載の製造方法。
【請求項８】
細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列が、Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ配列、Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ配列、Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ配列（１）、Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ配列（２）、Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ配列（３）、Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ配列（４）、Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ配列（５）、Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　ＬｙｓＡｓｐ　Ｉｌｅ配列（６）、Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ配列（７）、Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ配列、Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ配列（８）及びＨｉｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ配列からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列である請求項５〜７のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞剥離剤及び細胞シートの製造方法に関し、さらに詳しくはトリプシンのような蛋白質分解酵素を含有しない細胞剥離剤及び該剥離剤を用いて得られる細胞シートに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞剥離剤としては、トリプシンのような動物由来の蛋白質分解酵素を用いるものが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
【非特許文献１】
組織培養の技術　第三版、３２頁、日本組織培養学会編、朝倉書店発行
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
蛋白質分解酵素は、細胞外蛋白質を分解することによって細胞を基材から剥離するため、細胞活性が低下しやすく、さらに、細胞間の接着に有効な細胞外蛋白質も分解されやすいため、シート状の細胞が得られにくい。また、トリプシンのような動物由来の酵素には、成分未知の蛋白質等が含まれているため、精製工程が必要となり、この精製工程が複雑な上コストがかかる。さらには、動物由来の酵素には、ウィルス感染の危険性があるため、最近注目されている再生医工学においては動物由来の酵素を含まない安全な剥離剤が強く求められている。本発明の目的は、動物由来の蛋白質を使用せずに培養細胞を高収率（高回収率及び高生存率）で剥離回収できる細胞剥離剤（安全性が高くかつシート状の細胞を容易に得ることができる細胞剥離剤）を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、特定の細胞剥離剤が、特定の細胞培養基材とこの基材を用いて細胞培養した細胞とを容易に剥離することができることを見いだし本発明に到達した。すなわち、本発明の細胞剥離剤は、細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を少なくとも１個有するポリペプチド（Ａ）を有する細胞培養基材（Ｋ）とこの基材（Ｋ）を用いて細胞培養された細胞（Ｓ）とを剥離するための細胞剥離剤であって、蛋白質分解酵素の含有量が細胞剥離剤の重量に基づいて０又は０．１重量％以下である点を要旨とする。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列としては、接着シグナルとして働くものであればいずれも使用でき、例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０）５２７頁に記載されているもの等が挙げられる。この中で接着する細胞が多いという点で、Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ配列、Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ配列、Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ配列（１）、Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ配列（２）、Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ配列（３）、Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ配列（４）、Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ配列（５）、Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ配列（６）、Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ配列（７）、Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ配列、Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ配列（８）及びＨｉｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ配列、Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ配列（７）及びＨｉｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列である。なお、アミノ酸配列はアミノ酸３文字表記で現わし、（　）内にアミノ酸配列表に対応する配列番号を付記した（以下同様である）。
【０００７】
この最小アミノ酸配列の含有量は、１分子中に、少なくとも１個有すればよいが、３個以上が好ましく、さらに好ましくは５個以上、特に好ましくは１０個以上であり、また５０個以下が好ましく、さらに好ましくは４０個以下、特に好ましくは３０個以下である。含有量がこの範囲であると、細胞接着活性が高まる他に、本来の細胞機能を維持した状態で細胞の増殖を促進しやすく、さらに本発明の細胞剥離剤による細胞の剥離が容易となる。
【０００８】
ポリペプチド（Ａ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、細胞に対する毒性が低く、接着性能が高いという点で、５，０００〜５，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは１０，０００〜１，０００，０００、特に好ましくは５０，０００〜５００，０００である。すなわち、ポリペプチド（Ａ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、５，０００以上が好ましく、さらに好ましくは１０，０００以上、特に好ましくは５０，０００以上であり、また５，０００，０００以下が好ましく、さらに好ましくは１，０００，０００以下、特に好ましくは５００，０００以下である。なお、（Ａ）のＭｎは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（Ｎａドデシルスルフェイト−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）で、（Ａ）を水中で展開し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる。
【０００９】
ポリペプチド（Ａ）は、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列以外に、（Ａ）の熱安定性が高まるアミノ酸配列｛シルクフィブロイン由来のＧｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ配列（９）等｝を少なくとも２個有することが好ましく、このアミノ酸配列を３個以上有することがさらに好ましく、５〜３０個有することが特に好ましい。
【００１０】
ポリペプチド（Ａ）としては、（Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）９配列（１０）とＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ配列とを有するポリペプチド、（Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）９配列（１０）とＴｙｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ配列（２）とを有するポリペプチド、（Ｇｌｙ　ＡｌａＰｒｏ　（Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ）４）２配列（１１）とＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ配列とを有するポリペプチド、（Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　（Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ）４）２配列（１１）とＴｙｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ配列（２）とを有するポリペプチド、及び（Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）９配列（１０）とＩｌｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ配列（７）とを有するポリペプチド（特表平３−５０２９３５号公報）等が挙げられる。
【００１１】
市場から入手できるポリペプチド（Ａ）としては、三洋化成工業（株）製プロネクチンＦ｛遺伝子組替大腸菌により製造され、１分子中にＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ配列と（Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）９配列（１０）とを各々約１３個有するＭｎ約１１万のポリペプチド｝、同プロネクチンＦプラス｛プロネクチンＦをジメチルアミノエチルクロライドと反応させて水溶性にしたもの｝、及び同プロネクチンＬ｛遺伝子組替大腸菌により製造され、１分子中にＩｌｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ配列（７）と（Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）９配列（１０）とを各々約７個有するＭｎ約９万のポリペプチド｝等が挙げられる。また、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９６）｛ヒトフィブロネクチン細胞接着シグナルであるＣＳ１シグナルと細胞接着ドメインＴｙｐｅＩＩＩ及びヘパリン結合ドメインＩＩを１つずつ有するＭｎ約６万のポリペプチド（Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ配列を約１個含有）｝、同ＲＧＤＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ｛Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ配列をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ（ＩｇＧ結合ドメイン）に挿入したＭｎ約３万のポリペプチド｝（Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ配列を約１個含有）も（Ａ）として使用可能である。
【００１２】
ポリペプチド（Ａ）の製造方法は特に制限されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にして製造することができ、有機合成法（固相合成法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換微生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって合成することができる。有機合成法に関しては、日本生化学学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、特表平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用いられる。高分子量の（Ａ）を容易に合成できる点で、遺伝子組換微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換大腸菌を用いて合成する方法である。
【００１３】
ポリペプチド（Ａ）の含有量としては、細胞培養基材（Ｋ）の培養表面積１００ｃｍ２あたり、０．１μｇ〜１００ｍｇが好ましく、さらに好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ、特に好ましくは５μｇ〜１ｍｇ、最も好ましくは１０μｇ〜５００μｇである。すなわち、ポリペプチド（Ａ）の含有量としては、細胞培養基材（Ｋ）の培養表面積１００ｃｍ２あたり、０．１μｇ以上が好ましく、さらに好ましくは１μｇ以上、特に好ましくは５μｇ以上、最も好ましくは１０μｇ以上であり、また１００ｍｇ以下が好ましく、さらに好ましくは１０ｍｇ以下、特に好ましくは１ｍｇ以下、最も好ましくは５００μｇ以下である。なお、培養表面積は、細胞培養基材（Ｋ）の表面のうち、培養される細胞が接着し得る表面の表面積を意味する。ここで、細胞が入り込まないような微小な凹凸（例えば、０．１ｍｍ以下）は平坦な表面として取扱うが、培養表面積を高める目的でリブ（畝）等が設けてあるものについてはそのリブの表面積を培養表面積に含まれる。また、細胞培養基材（Ｋ）の培養表面積は、基材メーカーがカタログに記載している培養容器の培養表面積をそのまま適用できる。
【００１４】
細胞培養基材（Ｋ）は、培養容器にポリペプチド（Ａ）を有していればよく、培養容器内に練り込まれていてもよく、表面に付着していもよい。培養容器としては特に制限はなく細胞培養に一般に用いられるものが使用でき、プレート、シャーレ、Ｔ−フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアビーズ及びホローファイバー等が用いられる。これらの培養容器の材質としては、細胞培養に使用できるものであればいずれも使用でき、プラスチック、ガラス、天然由来材料（デキストラン、セルロース等）及び無機材料（ヒドロキシアパタイト等）等が挙げられる。
【００１５】
細胞培養基材（Ｋ）を得る方法としては、培養容器にポリペプチド（Ａ）をコーティング処理する方法、及び（Ａ）を培養容器の原料に練り込んだ後、培養容器に成型する方法等が挙げられる。培養容器へのポリペプチド（Ａ）のコーティング方法としては、（Ａ）を溶媒に溶かした溶液を予め作製し、培養容器に加え、所定のコーティング時間静置した後に余分の溶液を捨て乾燥させるか、余分の溶液を捨てずに乾燥させる方法や、（Ａ）の溶液をローラーボトルに加え、所定のコーティング時間ローラーボトルを回転した後に余分の溶液を捨て乾燥させるか、余分の溶液を捨てずに回転させながら乾燥させる方法、（Ａ）の溶液中にマイクロキャリアビーズを入れて所定のコーティング時間必要に応じて攪拌した後に溶液から取り出し必要に応じて乾燥させる方法、及び（Ａ）の溶液をホローファイバー中に所定のコーティング時間循環させ必要に応じて乾燥させる方法等が挙げられる。
【００１６】
ポリペプチド（Ａ）の溶液を作製するために用いられる溶媒としては特に制限はないが、無機塩、有機酸塩、アミノ酸、ビタミン、アルコール、脂質・糖、酸及び／又は塩基を０．１〜５０重量％（好ましくは１〜３０重量％）含有する水溶液及び水等が使用できる。無機塩としては、ハロゲン化金属塩、硫酸金属塩、リン酸金属塩、硝酸金属塩、炭酸金属塩及び過ハロゲン酸金属等が使用でき、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カルシウム、硝酸鉄、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化リチウム過塩素酸ナトリウム及び過塩素酸リチウム等が挙げられる。
【００１７】
有機酸塩としては、蟻酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム及び酒石酸ナトリウム等が挙げられる。アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリン及びグリシン等が挙げられる。ビタミンとしては、コリン、イノシトール、ニコチンアミド、グルタミン、ビタミンＡ及びビタミンＢ１２等が挙げられる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及びブタノール等が挙げられる。脂質・糖としては、脂質、単糖、２糖、オリゴ糖、アミノ糖及び酸性糖等が挙げられる。酸としては、無機酸及び炭素数１〜６の有機酸等が使用でき、塩酸、燐酸、酢酸、蟻酸、フェノール及び硫酸等が挙げられる。塩基としては、無機塩基及び炭素数２〜６の有機塩基等が使用でき、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア及びトリエチルアミン等が挙げられる。水としては、蒸留水、イオン交換水、水道水及びイオン交換蒸留水等が挙げられる。これらの溶媒の中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液及び水が好ましく、さらに好ましくは無機塩を含有する水溶液及び水、特に好ましくは無機塩を含有する水溶液である。
【００１８】
ポリペプチド（Ａ）の溶液の濃度は、溶媒１ｍｌ当り、０．０１μｇ〜１００ｍｇが好ましく、さらに好ましくは０．１μｇ〜１０ｍｇ、特に好ましくは１μｇ〜１ｍｇである。すなわち、（Ａ）の溶液の濃度は、溶媒１ｍｌ当り、０．０１μｇ以上が好ましく、さらに好ましくは０．１μｇ以上、特に好ましくは１μｇ以上であり、また１００ｍｇ以下が好ましく、さらに好ましくは１０ｍｇ以下、特に好ましくは１ｍｇ以下である。コーティング時間としては、用いる細胞培養基材（Ｋ）によっても異なるが、３０秒〜４８時間が好ましく、さらに好ましくは１分〜２４時間、特に好ましくは３分〜１２時間である。すなわち、コーティング時間としては、３０秒以上が好ましく、さらに好ましくは１分以上、特に好ましくは３分以上であり、また４８時間以下が好ましく、さらに好ましくは２４時間以下、特に好ましくは１２時間以下である。必要に応じて行われる乾燥の条件についても特に制限はなく、通常の方法が適用でき、例えば、順風乾燥機や減圧乾燥機等、０〜２００℃、０．００１Ｐａ〜大気圧の圧力下で、１〜１００時間等である。
【００１９】
また、必要に応じて行われる乾燥の前又は後で、無機塩を含有する水溶液又は水で通常の方法で洗浄することもできる。また、コーティングの後で、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限は無く、例えば、放射線（ガンマ線等）滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。
【００２０】
この細胞培養基材（Ｋ）を用いて細胞培養された細胞（Ｓ）としては、細胞接着性を有する細胞であれば特に限定されず、ヒト、サル、マウス、ハムスター及びラット等の初代培養細胞や株化細胞等の公知の細胞等が使用でき、用途によって以下の細胞等が含まれる。医薬品を生産する場合、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎形質転換）細胞、ＭＤＣＫ（イヌ腎形質転換）細胞及びＷＩ３８（ヒト胎児肺）細胞等が挙げられる。皮膚、軟骨、骨、肝臓、腎臓及び角膜等の再生医療に用いる場合、ヒト由来の幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、実質細胞、線維芽細胞及び角質細胞等が挙げられる。動物実験代替のための医薬品スクリーニング、又は眼や皮膚に対する刺激性を評価する場合、ヒト皮膚角化細胞、ヒトやウシの血管内皮細胞、ラット肝細胞及びヒト角膜細胞等が挙げられる。これら細胞（Ｓ）の中で、本発明の細胞剥離剤がシート状の細胞（細胞シート）を得るのに最適であるという観点等から、再生医療に用いられるヒト由来の細胞が好ましい。
【００２１】
本発明の細胞剥離剤中の蛋白質分解酵素の含有量（重量％）は、細胞剥離剤の重量に基づいて、０又は０．１以下が好ましく、さらに好ましくは０又は０．０５以下、特に好ましくは０又は０．００５以下、最も好ましくは０である。蛋白質分解酵素の含有量がこの範囲内であると細胞外蛋白質の分解が抑制され、細胞活性が低下し難くくなると共に、細胞がシート状で得られやすくなる。このような蛋白分解酵素としては、トリプシン、プロテアーゼ及びコラゲナーゼ等が挙げられる。なお、蛋白質分解酵素は、市販のプロテアーゼ測定キット等を用いて測定プロトコールに基づいて定量される。プロテアーゼ測定キットとしては、モレキュラープローブ社製ＥｎｚＣｈｅｋ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ及びコスモバイオ社製プロテアーゼＡｓｓａｙキット等が挙げられる。
【００２２】
本発明の細胞剥離剤には、細胞剥離成分としてキレート剤（Ｂ）を必須成分として含有することが好ましい。キレート剤（Ｂ）としては、ビスカルボキシメチルアミノ基を少なくとも１個有する化合物（Ｂ１）、カルボキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物（Ｂ２）、ジカルボン酸（Ｂ３）、アミノ基を少なくとも２個有する化合物（Ｂ４）、ヒドロキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物（Ｂ５）、メルカプト基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物（Ｂ６）、β−ジケトン（Ｂ７）、並びにこれらの塩（Ｂ８）等が使用できる。
【００２３】
ビスカルボキシメチルアミノ基を少なくとも１個有する化合物（Ｂ１）としては、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、及びウラミル二酢酸（ＵＤＡ）等が挙げられる。カルボキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物（Ｂ２）としては、α−アラニン、グルタミン酸、チロシン、システイン及びグリシン等が挙げられる。ジカルボン酸（Ｂ３）としては、シュウ酸、フタル酸、サリチル酸、酒石酸及びクエン酸等が挙げられる。アミノ基を少なくとも２個有する化合物（Ｂ４）としては、フェナントロリン及びジメチルグリオキシム等が挙げられる。ヒドロキシル基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物（Ｂ５）としては、８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸及びオキシン等が挙げられる。メルカプト基及びアミノ基を少なくとも１個ずつ有する化合物（Ｂ６）としては、ジチゾン等が挙げられる。β−ジケトン（Ｂ７）としては、アセチルアセトン等が挙げられる。これらの塩（Ｂ８）としては、これらのアルカリ金属（ナトリウム、カリウム及びリチウム等）の塩等が挙げられる。これらのうち、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＵＤＡ及びこれらのアルカリ金属塩が好ましく、さらに好ましくはＥＤＴＡ及びこのアルカリ金属塩、特に好ましくはＥＤＴＡのアルカリ金属塩、最も好ましくはＥＤＴＡ２ナトリウム塩及びＥＤＴＡ４ナトリウム塩である。
【００２４】
キレート剤（Ｂ）をそのまま細胞剥離剤とすることもできるが、細胞剥離剤には、必要により溶媒を含有させることができる。細胞への損傷及び取扱性等の観点から、溶媒に溶解したものが好ましい。溶媒としては特に制限はないが、ポリペプチド（Ａ）の溶液を作製するために用いられる溶媒と同じもの｛無機塩、有機酸塩、アミノ酸、ビタミン、アルコール、脂質・糖、酸及び／又は塩基を０．１〜５０重量％（好ましくは１〜３０重量％）含有する水溶液及び水｝等が使用できる。これらの溶媒の中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液及び水が好ましく、さらに好ましくは無機塩を含有する水溶液及び水、特に好ましくは無機塩を含有する水溶液である。
【００２５】
溶媒を使用する場合、細胞剥離剤中のキレート剤（Ｂ）の含有量（ｍｍｏｌ）は、溶媒１リットル当り、０．０１〜１００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０、特に好ましくは０．５〜５である。すなわち、この場合、細胞剥離剤中のキレート剤（Ｂ）の含有量（ｍｍｏｌ）は、溶媒１リットル当たり、０．０１ｍｍｏｌ以上が好ましく、さらに好ましくは０．１ｍｍｏｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｍｏｌ以上であり、また１００ｍｍｏｌ以下が好ましく、さらに好ましくは１０ｍｍｏｌ以下、特に好ましくは５ｍｍｏｌ以下である。
【００２６】
細胞培養基材（Ｋ）を用いて細胞培養する方法としては特に制限はないが、朝倉書店発行「日本組織培養学会編　組織培養の技術第三版」３２頁に記載の方法等が適用でき、細胞培養基材（Ｋ）及び細胞と培地（Ｖ）とを接触させて、二酸化炭素インキュベーター等の中で放置する方法等が使用できる。
【００２７】
培地（Ｖ）としても特に制限はなく、血清培地及び無血清培地のいずれもが使用可能である。血清培地としては、用いる細胞及びポリペプチド（Ａ）の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ培地等の朝倉書店発行「日本組織培養学会編　組織培養の技術第三版」５８１頁に記載の基礎培地に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ウシ胎児血清、コウシ血清、ウマ血清、ヒト血清及びニワトリ血清等が使用できる。無血清培地としては、市販の無血清培地［味の素（株）製無血清培地ＡＳＦ１０３、同ＡＳＦ１０４、同ＡＳＦ３０１や、ギブコ社製無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭ、同ＶＰ−ＳＦＭ、同ＯＰｔｉＰｒｏ−ＳＦＭ及びＣＤ−ＳＦＭ等］や、上記基礎培地に栄養成分（グルタミン等）、ｐＨ調整剤（炭酸カルシウム、リン酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウム等）及びホルモン類（インシュリン等）等を加えたもの等が挙げられる。血清培地を使用した場合、血清中に成分未知の蛋白質等が含まれること、細胞を用いる医薬品生産の場合には精製工程が複雑となりコストがかかること、さらにウィルス感染の危険性があること等の理由から、血清を含まないいわゆる無血清培地が好ましい。
【００２８】
培地（Ｖ）の使用量（ｍＬ）は、用いる細胞培養基材（Ｋ）の種類や細胞の種類等によって異なるが、細胞培養基材（Ｋ）の培養表面積１ｃｍ２当り、０．０００１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜５、特に好ましくは０．０１〜０．５である。すなわち、培地（Ｖ）の使用量（ｍＬ）は、細胞培養基材（Ｋ）の培養表面積１ｃｍ２当り、０．０００１以上が好ましく、さらに好ましくは０．００１以上、特に好ましくは０．０１以上であり、また５０以下が好ましく、さらに好ましくは５以下、特に好ましくは０．５以下である。
【００２９】
培地には、さらに必要に応じて細胞増殖因子（Ｃ）を含有させることができる。細胞増殖因子（Ｃ）を含有させることにより、細胞の増殖速度をさらに高めたり、細胞活性を高めたり、細胞が本来有する機能を発現させたりすることができる。細胞増殖因子（Ｃ）は細胞を増殖させる活性のある物質であり、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ及びＢＭＰ等が挙げられ、この他に、例えば財団法人名古屋大学出版会発行「上田実編ティッシュエンジニアリング（１９９９年）」４３〜５１頁及び同文献に付記されている参考文献に記載されているもの等も用いられる。これらのうち、細胞の増殖活性が高いものとして、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ及びＥＧＦが好ましく、さらに好ましくはＨＧＦ及びＥＧＦである。
【００３０】
細胞増殖因子（Ｃ）を使用する場合、（Ｃ）の含有量（μｇ）は、培地１０００ｍＬに基づいて、０．００１〜５０，０００が好ましく、さらに好ましくは１〜１００、特に好ましくは１０〜９０である。すなわち、この場合、（Ｃ）の含有量（μｇ）は、培地１０００ｍＬに基づいて、０．００１以上が好ましく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは１０以上であり、また５０，０００以下が好ましく、さらに好ましくは１００以下、特に好ましくは９０以下である。（Ｃ）の含有量がこの範囲であると、細胞の増殖性がさらに促進される。脂肪増殖因子（Ｃ）を培地に添加する方法としては、培地に（Ｃ）を直接加える方法や、予め（Ｃ）を前記の溶媒に溶解又は分散したものを培地に加える方法等が挙げられる。
【００３１】
さらに培地（Ｖ）中には必要に応じて、他の成分（Ｄ）として、公知の安定化剤（酸化防止剤及び抗菌剤等）等を含有させることができる（組織培養の技術　第三版、１９頁、日本組織培養学会編、朝倉書店発行等）。
【００３２】
播種する細胞の量としては用いる細胞培養基材（Ｋ）の種類やポリペプチド（Ａ）の種類等によって異なるが、細胞培養基材（Ｋ）の培養表面積１ｃｍ２当り、０．１個〜１０００万個が好ましく、さらに好ましくは１〜５００万個、特に好ましくは１００〜１００万個である。
【００３３】
細胞培養の条件としては特に制限はないが例えば、次のような条件を採用できる。細胞培養の雰囲気は、二酸化炭素と空気の混合物（二酸化炭素：空気の体積混合比＝０．１〜４０：９９．９〜６０）等の雰囲気が使用できる。細胞培養温度（℃）としては、細胞増殖が活発に行えるという点で、１〜９０が好ましく、さらに好ましくは１０〜５０である。培養期間は、１時間〜１００日間が好ましく、さらに好ましくは１〜３６日間である。培地交換しながら細胞培養することが好ましく、その交換頻度としては、１〜７日毎が好ましく、さらに好ましくは２〜３日毎である。この条件に設定された二酸化炭素インキュベーターを使用することが好ましい。培養条件として特に好ましい例としては、二酸化炭素濃度５体積％、３７℃の条件で、２〜３日毎に培地交換しながら１〜３６日間培養することである。
【００３４】
以上の様に、（１）細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を少なくとも１個有するポリペプチド（Ａ）を有する細胞培養基材（Ｋ）及び培地（Ｖ）を用いて細胞培養する工程に次いで、（２）本発明の細胞剥離剤を用いて細胞培養基材（Ｋ）と細胞培養された細胞（Ｓ）とを剥離する工程を経ることにより、細胞培養された細胞（Ｓ）（特に細胞シート）を得ることができる。この（２）の工程としては、細胞培養した後に培地を除去して、細胞培養基材（Ｋ）及び細胞培養された細胞（Ｓ）をＰＢＳ（−）等で１〜５回洗浄し、これと本発明の細胞剥離剤とを接触させながら静置又は振盪させることが含まれ、これにより、細胞培養基材（Ｋ）から細胞（Ｓ）をシート状又はばらばらの状態で剥離させることができる。なお、ＰＢＳ（−）とは、ｐＨ７．２に調整されたリン酸水素ナトリウム及びリン酸水素カリウムの生理食塩水溶液である。
【００３５】
本発明の細胞剥離剤が使用条件において液状の場合｛キレート剤（Ｂ）と溶媒とからなるもの等｝、この使用量（ｍＬ）は用いる細胞培養基材（Ｋ）の種類や細胞の種類等によって異なるが、細胞培養基材の培養表面積１ｃｍ２当り、０．０００１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜５、特に好ましくは０．０１〜０．５である。すなわち、この場合、本発明の細胞剥離剤の使用量（ｍＬ）は、細胞培養基材の培養表面積１ｃｍ２当り、０．０００１以上が好ましく、さらに好ましくは０．００１以上、特に好ましくは０．０１以上であり、また５０以下が好ましく、さらに好ましくは５以下、特に好ましくは０．５以下である。また、本発明の細胞剥離剤が使用条件において固体の場合｛キレート剤（Ｂ）と溶媒とからなるもの等｝、この使用量（ｍｍｏｌ）は用いる細胞培養基材（Ｋ）の種類や細胞の種類等によって異なるが、細胞培養基材の培養表面積１ｃｍ２当り、１×１０−９〜５が好ましく、さらに好ましくは１×１０−７〜０．０５、特に好ましくは５×１０−６〜２．５×１０−３である。すなわち、この場合、本発明の細胞剥離剤の使用量（ｍｍｏｌ）は、細胞培養基材の培養表面積１ｃｍ２当り、１×１０−９以上が好ましく、さらに好ましくは１×１０−７以上、特に好ましくは５×１０−６以上３であり、また５以下が好ましく、さらに好ましくは０．０５以下、特に好ましくは２．５×１０−３以下である。
【００３６】
静置又は振盪させる温度（℃）としては、５〜５０が好ましく、さらに好ましくは１５〜４５、特に好ましくは２５〜４０である。すなわち、この温度（℃）としては、５℃以上が好ましく、さらに好ましくは１５℃以上、特に好ましくは２５℃以上であり、また５０℃以下が好ましく、さらに好ましくは４５℃以下、特に好ましくは４０℃以下である。静置又は振盪させる時間（分間）としては、１〜６０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは５〜１５である。すなわち、この時間（分間）としては、１分間以上が好ましく、さらに好ましくは３分間以上、特に好ましくは５分間以上であり、また６０分以下が好ましく、さらに好ましくは３０分以下、特に好ましくは１５分以下である。
【００３７】
細胞（Ｓ）と細胞培養基材（Ｋ）とを剥離した後、必要に応じて、本発明の細胞剥離剤を除き、ＰＢＳ（−）又は使用した培地で洗浄することにより目的の細胞（Ｓ）（特に細胞シート）が得られる。この細胞（Ｓ）（特に細胞シート）は、そのまま又は適当な支持体に貼付することにより再生医療等に応用することができる。また、この細胞（Ｓ）（特に細胞シート）は、医薬品の薬効評価や代謝毒性評価等の評価キットに使用することもできる。また、ピペットで吸引及び吐出を繰り返すこと等により、細胞懸濁液を得ることができる。この細胞懸濁液は、そのまま、細胞培養に使用することができる。
【００３８】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を、％は重量％を意味する。
＜実施例１＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、（Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）９配列（１０）とＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ配列とを各々約１２個含むＭｎ約１１万の遺伝子組換え大腸菌の産生蛋白質”ＳＬＰＦ”を作製した。次いで、ＳＬＰＦの４．５規定の過塩素酸リチウム溶液（ＳＬＰＦの濃度；１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ（−）でＳＬＰＦの濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、ＳＬＰＦ溶液を作製した。旭テクノグラス製３５ｍｍφ細胞培養ディッシュにＳＬＰＦ溶液を０．５ｍｌ加え、室温で１週間放置して乾燥した。さらにＰＢＳ（−）２ｍｌで２回洗浄して、ＳＬＰＦコート細胞培養基材１を得た（ＳＬＰＦの含有量；培養表面積１００ｃｍ２当たり、５２μｇ）。一方、イヌ腎形質転換（ＭＤＣＫ）細胞を、無血清培地（インビトロジェン製無血清培地ＧｉｂｏｃＯＰｔｉＰｒｏ−ＳＦＭにグルタミンを４ｍｍｏｌ／Ｌ加えたもの）に細胞濃度：５万個／ｍＬに分散したもの３ｍｌを細胞培養基材１に加え、二酸化炭素と空気の混合物（二酸化炭素／空気＝５／９５体積比）中、３７℃で、細胞培養基材１のほぼ全面を細胞で覆われるまで３日間培養を行なった。
【００３９】
無血清培地を除去し、ＰＢＳ（−）２ｍｌで２回洗浄した後、エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩０．１部をＰＢＳ（−）１００部に溶解して調製したエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩０．１％ＰＢＳ（−）溶液（剥離液１）１ｍｌを細胞培養基材１に加え、３７℃で１０分間保持し、剥離液１がこぼれないようにゆるやかな振動を細胞培養基材１に与えたところ、細胞がシート状に剥離した。次いで、剥離液１を除き、ＰＢＳ（−）２ｍｌで１回洗浄後、無血清培地３ｍｌを加え、ピペットで吸引，吐出を繰り返し、細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液を一部採りトリパンブルーで処理し、１ｍｌ当りの死んでいる細胞を発色させその数（死細胞数）を求めた。また、総細胞数を血球盤を用いて顕微鏡下目視により数えた。そして、これらの細胞の数から、下式に従って生存率を求め、総細胞数及び生存率を表１に示した。
【数１】
2004135571.tif 000002
【００４０】
＜実施例２＞
ＳＬＰＦの代わりに、特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、（Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）９配列（１０）とＩｌｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ配列（７）とを各々約７個含むＭｎ約９万の遺伝子組換え大腸菌の産生蛋白質”ＳＬＰＬ”を作製し、使用すること以外は、実施例１と同様にして、ＳＬＰＬコート細胞培養基材２を得た（ＳＬＰＬの含有量；培養表面積１００ｃｍ２当たり、５２μｇ）。そして、実施例１と同様に細胞培養を行った後、実施例１と同様に剥離液１で処理したところ、細胞がシート状に剥離した。実施例１と同様にして細胞懸濁液を得た後、総細胞数及び生存率を求め、その結果を表１に示した。
【００４１】
＜実施例３＞
インビトロジェン社製トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（トリプシン濃度；０．２５％、ＥＤＴＡ２ナトリウム濃度；０．０４％）１部と実施例１で得られた剥離液１の６１．５部との混合物（トリプシン濃度；０．００４％、ＥＤＴＡ２ナトリウム濃度；０．０９９％；剥離液２）を、剥離液１の代わりに用いること以外は実施例１と同様に処理をしたところ、細胞がシート状に剥離した。実施例１と同様にして細胞懸濁液を得た後、総細胞数及び生存率を求め、その結果を表１に示した。
【００４２】
＜実施例４＞
インビトロジェン社製トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（トリプシン濃度；０．２５％、ＥＤＴＡ２ナトリウム濃度；０．０４％）１部と実施例１で得られた剥離液１の２４部との混合物（トリプシン濃度；０．０１％、ＥＤＴＡ２ナトリウム濃度；０．０９８％；剥離液３）を、剥離液１の代わりに用いること以外は実施例１と同様に処理をしたところ、細胞がシート状に剥離した。そして、実施例１と同様にして細胞懸濁液を得た後、総細胞数及び生存率を求め、その結果を表１に示した。
【００４３】
＜実施例５＞
インビトロジェン社製トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（トリプシン濃度；０．２５％、ＥＤＴＡ２ナトリウム濃度；０．０４％）１部と実施例１で得られた剥離液１の４部との混合物（トリプシン濃度；０．０５％、ＥＤＴＡ２ナトリウム濃度；０．０８８％；剥離液４）を、剥離液１の代わりに用いること以外は実施例１と同様に処理をしたところ、細胞は若干裂け目があるシート状に剥離した。実施例１と同様にして細胞懸濁液を得た後、総細胞数及び生存率を求め、その結果を表１に示した。
【００４４】
＜比較例１＞
剥離剤１の代わりにインビトロジェン社製トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（トリプシン濃度；０．２５％、ＥＤＴＡ２ナトリウム濃度；０．０４％）をそのまま剥離剤５として使用する以外は実施例１と同様に行った。実施例１と同様に細胞培養を行った後、剥離液４を用いて実施例１と同様にして処理したところ、細胞が１個ずつばらばらに剥離し、シート状にはならなかった。そして、大豆トリプシンインヒビターのＰＢＳ（−）溶液（濃度；０．５ｍｇ／ｍｌ）を２ｍｌ加えた後、シャーレ内の細胞、剥離液及びインヒビターのＰＢＳ（−）溶液の全量を１５ｍｌ遠沈管に移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。上層を除き、無血清培地３ｍｌを加え、ピペットで吸引及び吐出を繰り返し、細胞懸濁液を得た後、実施例１と同様にして総細胞数及び生存率を求め、その結果を表１に示した。
【００４５】
＜比較例２＞
細胞培養基材１の代わりに、Ｉ型コラーゲンをコートした旭テクノグラス製３５ｍｍφ細胞培養ディッシュ（ＩＷＡＫＩコラーゲンタイプＩコート製品４０００−０１０）を細胞培養基材３として使用すること以外は実施例１と同様にして細胞培養を行った後、実施例１と同様に剥離液１で処理したところ、細胞はほとんど剥離しなかった。そこで、剥離液１を除き、ＰＢＳ（−）２ｍｌで１回洗浄後、無血清培地３ｍｌを加え、ピペットで吸引，吐出を繰り返したところ、わずかな量の細胞が分散した液を得た。実施例１と同様にして総細胞数及び生存率を求め、その結果を表１に示した。
【００４６】
【表１】
2004135571.tif 000003
【００４７】
以上の実施例及び比較例から、本発明の細胞剥離剤と細胞培養基材（Ｋ）を用いた場合、簡単に、高収率（従来のトリプシン法より高い回収率で、細胞の生存率も高い）で細胞を剥離回収できることが明らかである。一方、本発明の細胞剥離剤を使用せず、従来の蛋白質分解酵素を用いる細胞剥離剤を使用した場合、シート状の細胞は得られず、さらに細胞の生存率は不十分であった。また、コラーゲンをコートした細胞培養基材を使用した場合、細胞がほとんど剥離せず、細胞はほとんど回収できなかった。すなわち、本発明の細胞剥離剤と細胞培養基材（Ｋ）を用いた場合のみ、細胞シートが簡単に得られ、また、高収率（高回収率及び高生存率）で細胞回収ができるのである。
【００４８】
【発明の効果】
本発明の細胞剥離剤は、細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ａ）を含有する細胞培養基材（Ｋ）を用いて細胞培養された細胞に対して用いると、細胞（Ｓ）を極めて高い収率（高回収率及び高生存率）で剥離回収できる。従って、細胞を傷つけたり、動物製蛋白質等の混入若しくは汚染等もなく、極めて容易かつ効率的に培養細胞を得ることができる。すなわち、本発明の細胞剥離剤を用いることにより、安全性が高くかつシート状の細胞を容易に得ることができる。
【００４９】
【配列表】
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2004135571.tif 000005
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