(57)【要約】【課題】血清を用いずに限られたアミノ酸の添加のみで細胞増殖を改善することのできる無血清培養用培地を提供する。【解決手段】哺乳動物細胞を無血清条件下で培養するための無血清培養用培地であって、培地にアルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンの９つのアミノ酸をそれぞれ添加した。限られたアミノ酸の添加にもかかわらず細胞増殖効果を飛躍的に改善できる優れた培地を安価に提供することができる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞を無血清条件下で培養するための無血清培養用培地であって、前記培地にアルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンを添加したことを特徴とする無血清培養用培地。
【請求項２】
哺乳動物細胞を無血清条件下で培養するための無血清培養用培地であって、前記培地にアルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンを添加した結果、アルギニン，アスパラギン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンの含有量がそれぞれ０．５ｍＭ以上であることを特徴とする無血清培養用培地。
【請求項３】
アルギニンを１．０〜２．０ｍＭ、アスパラギン酸を０．５〜１．０ｍＭ、グルタミン酸を０．２〜０．５ｍＭ、イソロイシンを０．５〜２．５ｍＭ、ロイシンを０．５〜３．０ｍＭ、リジンを０．５〜２．０ｍＭ、セリンを０．５〜２．０ｍＭ、スレオニンを０．５〜４．０ｍＭ、バリンを０．５〜２．０ｍＭ含有することを特徴とする請求項２記載の無血清培養用培地。
【請求項４】
インシュリン，トランスフェリン，亜セレン酸を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の無血清培養用培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物細胞を無血清条件下で培養するための無血清培養用培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の哺乳動物細胞を培養するための培養用培地としては、生体に近い条件を作り出すために血清を加えたものが主流であり、この血清としては牛胎児血清が最も一般的に用いられている。しかしながら、血清は狂牛病をはじめとする外来性の汚染やウイルスの感染源となり得るため、人体に用いるための細胞の増殖やワクチンの製造といった分野では問題が生じる虞があった。
【０００３】
このような問題を解決するためには、無血清の培養培地を用いればよいと考えられるが、無血清条件下の培養においては、血清から供給されるべきアミノ酸が不足するほか一般に細胞増殖の条件が厳密になるため好適な条件を絞り込む必要があり、培養用培地の調製に非常に手間がかかるといった問題があった。
【０００４】
また、市販の無血清培養用培地には、必須アミノ酸を全体的に高めることでアミノ酸の枯渇を防いだり、新たに成長因子を加えることで増殖改善を目指したりしたものも見られる。しかしながら、必要以上に高いアミノ酸濃度は望ましくない代謝産物が蓄積する原因や増殖阻害の原因となる可能性があるといった問題があった。なお、更なる培地成分の最適化を行なう場合には最低限のレベルを設定して成分を添加し検討した方が効率がよい。しかし、最初からアミノ酸の濃度を高めすぎると検討すべき条件が多くなり好ましくない。
【０００５】
また、新たな成長因子を添加する場合は、増殖改善のために新たな成長因子の添加条件を検討するために労力が必要であり、成長因子は一般に動物由来や組換えのタンパク質であって、動物由来では迷入因子混入の可能性が増し、組換えでは培地価格が上昇する原因となるといった問題があった。
【０００６】
なお、特表２００２−５２００１３号公報には、一部の有効量の極性アミノ酸を補給した細胞培養用培地が開示されているが、この培地は基本的に血清又はアルブミンを含むものであって（段落００３５などを参照）、上記血清を加えた場合の問題点を解決できるものではない。
【０００７】
【特許文献１】
特表２００２−５２００１３号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明かかる課題に鑑みてなされたものであり、血清を用いずに限られたアミノ酸の添加のみで細胞増殖を改善することのできる無血清培養用培地を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、無血清条件下において、アルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンといった限られたアミノ酸を添加することで細胞増殖を改善することができることを見出し、本発明に想到した。
【００１０】
本発明の請求項１記載の無血清培養用培地は、哺乳動物細胞を無血清条件下で培養するための無血清培養用培地であって、前記培地にアルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンを添加したことを特徴とする。
【００１１】
本発明の請求項２記載の無血清培養用培地は、哺乳動物細胞を無血清条件下で培養するための無血清培養用培地であって、前記培地にアルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンを添加した結果、アルギニン，アスパラギン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンの含有量がそれぞれ０．５ｍＭ以上であることを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項３記載の無血清培養用培地は、前記請求項２において、アルギニンを１．０〜２．０ｍＭ、アスパラギン酸を０．５〜１．０ｍＭ、グルタミン酸を０．２〜０．５ｍＭ、イソロイシンを０．５〜２．５ｍＭ、ロイシンを０．５〜３．０ｍＭ、リジンを０．５〜２．０ｍＭ、セリンを０．５〜２．０ｍＭ、スレオニンを０．５〜４．０ｍＭ、バリンを０．５〜２．０ｍＭ含有することを特徴とする。
【００１３】
本発明の請求項４記載の無血清培養用培地は、前記請求項１〜３のいずれか１項において、インシュリン，トランスフェリン，亜セレン酸を含むことを特徴とする。
【００１４】
【発明の実施形態】
以下、本発明の無血清培養用培地について詳細に説明する。
【００１５】
本発明の無血清培養用培地は、哺乳動物細胞を無血清条件下で培養するための無血清培養用培地である。この哺乳動物細胞としては、ＭＤＣＫ細胞，Ｖｅｒｏ細胞，ＣＨＯ細胞，ＧＬ３７細胞，抗体生産用各種ハイブリドーマ細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これら哺乳動物細胞の培養の目的としては、インフルエンザ，日本脳炎などのワクチンの製造のほか、組換え体による医薬品製造，ハイブリドーマによる抗体製造などが挙げられる。
【００１６】
本発明の無血清培養用培地は、培地にアルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンの９つのアミノ酸をそれぞれ添加したものである。なお、これらのアミノ酸は、必須アミノ酸の中から無極性，極性，酸性，塩基性などの様々な性質のアミノ酸を選択して添加したものである。これらのアミノ酸を添加することによって限られたアミノ酸の添加にもかかわらず細胞増殖効果を飛躍的に改善することができる。これらアミノ酸の性質を表１に示す。このように添加するアミノ酸が限られるため、細胞増殖効果を飛躍的に改善できる優れた無血清培養用培地を安価に提供することができる。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
なお、これらのアミノ酸を添加する原料培地は合成培地であって、市販の培地を用いてもよい。市販の培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６２９，１６３０，１６３４，１６４０培地，ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地，ＭｃＣｏｙの５Ａと７Ａ培地，ＨａｍのＦ１０とＦ１２培地，１９９培地，ＮＣＴＣ１０９と１３５培地，Ｔｒｏｗｅｌｌ  Ｔ８培地，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｖ−６１４培地，Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５培地，Ｗａｙｍｏｕｔｈの培地などが挙げられるが、特にＲＰＭＩ培地が好適に用いられる。
【００１９】
本発明の無血清培養用培地は、好ましくはアルギニン，アスパラギン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンの含有量がそれぞれ０．５ｍＭ以上である。また、さらに好ましくは、アルギニンを１．０〜２．０ｍＭ、アスパラギン酸を０．５〜１．０ｍＭ、グルタミン酸を０．２〜０．５ｍＭ、イソロイシンを０．５〜２．５ｍＭ、ロイシンを０．５〜３．０ｍＭ、リジンを０．５〜２．０ｍＭ、セリンを０．５〜２．０ｍＭ、スレオニンを０．５〜４．０ｍＭ、バリンを０．５〜２．０ｍＭ含有する。アミノ酸の含有量をこのように調整することによって、限られたアミノ酸の添加にもかかわらず細胞増殖効果を飛躍的に改善することができる。
【００２０】
また、本発明の無血清培養用培地は、好ましくは成長因子として、インシュリン，トランスフェリン，亜セレン酸を含む。これら成長因子を含むことにより、細胞増殖効果を改善することができる。なお、これらの成長因子を含む培地を原料培地として用いれば、新たに成長因子を加える必要はない。
【００２１】
以上詳述したとおり、本発明の無血清培養用培地は、哺乳動物細胞を無血清条件下で培養するための無血清培養用培地であって、アルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンを添加したものである。また、アルギニン，アスパラギン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンの含有量がそれぞれ０．５ｍＭ以上であり、好ましくは、アルギニンを１．０〜２．０ｍＭ、アスパラギン酸を０．５〜１．０ｍＭ、グルタミン酸を０．２〜０．５ｍＭ、イソロイシンを０．５〜２．５ｍＭ、ロイシンを０．５〜３．０ｍＭ、リジンを０．５〜２．０ｍＭ、セリンを０．５〜２．０ｍＭ、スレオニンを０．５〜４．０ｍＭ、バリンを０．５〜２．０ｍＭ含有する。したがって、限られたアミノ酸の添加にもかかわらず細胞増殖効果を飛躍的に改善できる優れた無血清培養用培地を安価に提供することができる。さらに、インシュリン，トランスフェリン，亜セレン酸を含むので、細胞増殖効果を改善することができる。
【００２２】
【実施例】
以下の具体的実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２３】
市販のＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、アルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンの９種類のアミノ酸をそれぞれ添加した。更に成長因子としてインシュリン，トランスフェリン，亜セレン酸，エタノールアミンを１Ｌ当りそれぞれ、１０ｍｇ，５．５ｍｇ，６．７μｇ，２ｍｇ培地に添加し、ＭＤＣＫ３３０１６細胞（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）を培養して増殖改善効果を調べた。培養は２５０ｍＬスピンナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ社製）を用い、培養容量１００ｍＬ，温度３７℃，播きこみ細胞密度１．２×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとして４日間培養を行った。その間２日目と４日目の細胞密度を測定した。なお、アミノ酸を添加しないＲＰＭＩ１６４０培地をコントロールとした。
【００２４】
図１にコントロールのＲＰＭＩ１６４０培地（Ａ），アミノ酸を添加した本発明の第一実施例による無血清培養用培地（Ｂ），第一実施例の０．６倍のアミノ酸を添加した第二実施例による無血清培養用培地（Ｃ）のアミノ酸濃度を示し、図２にはそれぞれの細胞密度の測定結果を示す。図２において、アルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンの９種類のアミノ酸を添加した第一実施例（Ｂ）と第二実施例（Ｃ）において、これらアミノ酸を添加しなかったコントロール（Ａ）と比較して約１．６倍の増殖改善効果が見られ、これらのアミノ酸を添加することによる顕著な細胞の増殖改善効果が確認された。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載の無血清培養用培地は、哺乳動物細胞を無血清条件下で培養するための無血清培養用培地であって、前記培地にアルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンを添加したので、限られたアミノ酸の添加にもかかわらず細胞増殖効果を飛躍的に改善できる優れた無血清培養用培地を安価に提供することができる。
【００２６】
本発明の請求項２記載の無血清培養用培地は、哺乳動物細胞を無血清条件下で培養するための無血清培養用培地であって、前記培地にアルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンを添加した結果、アルギニン，アスパラギン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンの含有量がそれぞれ０．５ｍＭ以上であるので、限られたアミノ酸の添加にもかかわらず細胞増殖効果を飛躍的に改善することができる。
【００２７】
本発明の請求項３記載の無血清培養用培地は、前記請求項２において、アルギニンを１．０〜２．０ｍＭ、アスパラギン酸を０．５〜１．０ｍＭ、グルタミン酸を０．２〜０．５ｍＭ、イソロイシンを０．５〜２．５ｍＭ、ロイシンを０．５〜３．０ｍＭ、リジンを０．５〜２．０ｍＭ、セリンを０．５〜２．０ｍＭ、スレオニンを０．５〜４．０ｍＭ、バリンを０．５〜２．０ｍＭ含有するので、限られたアミノ酸の添加にもかかわらず細胞増殖効果を飛躍的に改善することができる。
【００２８】
本発明の請求項４記載の無血清培養用培地は、前記請求項１〜３のいずれか１項において、インシュリン，トランスフェリン，亜セレン酸を含むので、細胞増殖効果を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例の無血清培養用培地のアミノ酸濃度を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例における細胞密度の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
2004275047.tif 000004