(57)【要約】【課題】Ｂ型肝炎ウイルスを検出するための新規な手段の提供。【解決手段】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）−ＲＮＡを含み、ＨＢＶ−ＤＮＡを持たない体液試料中のＨＢＶ粒子；ＨＢＶ−ＲＮＡを測定することにより、請求項１に記載の粒子を測定する方法；ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるＨＢＶ感染症の治療の効果を判定する方法において、当該治療を受けた患者の体液について、前記の測定を行うことを特徴とする方法；並びに前記の測定により、肝癌発生の危険度を予測、または肝癌発生の危険群を選別する方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）−ＲＮＡを含み、ＨＢＶ−ＤＮＡを持たない体液試料中のＨＢＶ粒子。
【請求項２】
ＨＢＶ−ＲＮＡを測定することにより、請求項１に記載の粒子を測定する方法。
【請求項３】
ＲＴ−ＰＣＲ法により、請求項１に記載の粒子を測定する方法。
【請求項４】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるＨＢＶ感染症の治療の効果を判定する方法において、当該治療を受けた患者の体液について、請求項２または３に記載の測定を行うことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤がラミブジンである、請求項４に記載された方法。
【請求項６】
請求項２または３に記載の測定により、肝癌発生の危険度を予測、または肝癌発生の危険群を選別する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラミブジンなどのＢ型慢性肝炎治療薬の治療効果を判定等に有用な、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）−ＲＮＡを含むウイルス粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染は世界でおよそ３億人に達すると見積もられている。ＨＢＶの感染は急性および慢性の肝炎（Ｂ型肝炎）を引き起こし、さらには肝硬変、肝癌の原因となる。
ＨＢＶ感染患者血清中にはＨＢＶ粒子として、Ｄａｎｅ粒子（感染性を持つ完全ＨＢＶ粒子）に加え不完全なＨＢＶ−ＤＮＡを持つ粒子およびＨＢｓＡｇで形成される小型球状粒子、管状粒子が存在する。さらにプレコアタンパクを構造タンパクとして含みＨＢＶ−ＤＮＡを持たない粒子も存在する（特願２００２−２６１６６６）。本願発明のＨＢＶ粒子にはこれらの粒子を全て含む。
【０００３】
Ｂ型肝炎の診断には、肝組織像に加えて、ＡＬＴ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、ＨＢｃＡｂ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ−ＤＮＡ量などの血清マーカーが用いられる。このうち、抗ウイルス剤の治療効果の判定には血中ＨＢＶ−ＤＮＡ量が重視されている。すなわち、ＨＢＶ−ＤＮＡ量が著しく低下もしくは測定感度以下となり、その状態が長期にわたり維持され、その他の指標も良好な場合、高い治療効果を示したと判断される。
【０００４】
ＨＢＶの遺伝子は約３，２００塩基対からなる環状不完全２本鎖ＤＮＡである。このＨＢＶの遺伝子の複製には逆転写の過程が存在する。複製過程は大別すると次の４段階に分けられる。（１）細胞の核内で内因性のＤＮＡポリメラーゼにより完全２本鎖環状ＤＮＡとなり、これが閉環して閉環２本鎖ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ：  ｃｃｃＤＮＡ）となる。このｃｃｃＤＮＡは超らせん構造をとっている。（２）ｃｃｃＤＮＡを鋳型として細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩによりｍＲＮＡが転写される。このうち最長の３．５ｋｂのものがプレゲノム  ＲＮＡとして、逆転写の鋳型となる。（３）コア粒子内でＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーとしてオリゴヌクレオチドが合成され、プレゲノム  ＲＮＡを鋳型として逆転写により（−）鎖ＤＮＡが合成される。（４）プレゲノム  ＲＮＡの５’末端に残ったオリゴヌクレオチドをプライマーとし、（−）鎖ＤＮＡを鋳型として（＋）鎖ＤＮＡが合成される。
【０００５】
コアタンパクはプレゲノム  ＲＮＡと共にヌクレオキャプシド粒子を形成するが、その内腔で上記のようなＨＢＶ−ＤＮＡが合成された後はじめて、ＨＢｓＡｇを含むエンベロ−プに包まれＨＢＶ粒子を形成するとされている  （Ｇｅｒｅｌｓａｉｋｈａｎ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７０：  ４２９６−４２７４，  １９９６）  。したがって細胞外でＨＢＶ−ＲＮＡのみを持つウイルス粒子は存在しないと考えられてきた。
【０００６】
血清中でのＨＢＶ−ＲＮＡの存在はＳｕらにより示されている  （Ｓｕ，  Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ７：  ２００５−２０１５，  ２００１）。このＨＢＶ−ＲＮＡの存在様式は不明であるが、上記の知見に加えウイルスマーカー陰性でもＨＢＶ−ＲＮＡ陽性例があることから、キャプシド内にパッケージされたウイルス粒子や小型球状粒子・管状粒子ではなく、細胞膜小胞に包まれた状態で放出されていると推測されている。また、血中ＨＢＶ粒子はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子を含むことがＭｉｌｌｅｒらにより報告  （Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｒ．  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １３９：  ５３−６３，  １９８４）  されており、ＨＢＶ−ＤＮＡ，  ＨＢＶ−ＲＮＡ両方を含むウイルス粒子の存在も示唆されている。
【０００７】
上記ウイルス増殖過程のいずれかを阻害することにより、ＨＢＶの遺伝子の複製を阻止し、ウイルスの増殖を抑制することができると考えられる。ここで代表的なＨＢＶの治療薬であるラミブジンについて従来技術を説明するが、本願発明のウイルス粒子はラミブジンによる治療にのみ関係するものではない。ＨＢＶの複製には逆転写の過程があるが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もその増殖に逆転写酵素を必要としていることから、治療薬としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのスクリーニングが行われてきた。
【０００８】
ラミブジンも、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製過程である逆転写を特異的に阻害することから、当初はＨＩＶ治療薬としての開発が行われたが、ＨＢＶに対しても増殖抑制効果を示すことが分かり、１９９２年からＢ型肝炎の治療薬としての開発が始まった。
【０００９】
ラミブジンのＨＢＶに対する作用機構は、はっきりと解明されたわけではないが、次のように考えられている。ラミブジンはヌクレオシド（シチジン）誘導体の抗ウイルス剤で、細胞内で三リン酸誘導体にリン酸化され活性型となる。この薬剤のＨＢＶに対する増殖抑制機序の一つは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）阻害によりプレゲノムＲＮＡの逆転写を阻害することである。
もう一つの機序は、ウイルスＤＮＡ鎖に取り込まれ、その伸長を止めることと考えられている。
【００１０】
このような作用機序により、ＨＢＶ感染症の治療薬としてラミブジンは広く使われてきているが、血中ＨＢＶ−ＤＮＡ量が減少しにくい症例も存在し、その後の耐性株出現や肝炎再燃が問題となることが多い。また、ＨＢＶ−ＤＮＡ量が測定限界未満にまで低下した例の中からも薬剤耐性株の出現する例が少なくなく、ＨＢＶ−ＤＮＡ量による治療効果判定にも問題が残されている。
【００１１】
ラミブジン等の逆転写阻害効果を有する薬剤により、血中ＨＢＶ−ＤＮＡ量は大きく減少するが、肝臓中にはＨＢＶウイルスがｃｃｃＤＮＡとして存在しており、このｃｃｃＤＮＡ量はあまり減少しないと報告されている  （Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ，  Ｓ．，  Ｃ．  Ｂｉｒｃｈ，  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．，  ３０：  ５３６−５５０，  １９９９）  。したがって、こうした薬剤の治療効果を判定するにはＨＢＶ−ＤＮＡ量のみでは充分ではなく、たとえば肝生検による組織学的検査を行う場合もある。しかしながら、肝生検は非常に苦痛を伴い患者に多大な負担を強いなければならない。
【００１２】
したがって、たとえば血液検査により肝臓中ＨＢＶ量を反映するマーカーがあれば治療効果の判定に非常に有用であり、患者の負担を軽くするのみならず、より効果的な治療を可能にすることができる。
我々はこうした見地から研究を行い、従来の報告に反し、血液中にＨＢＶ−ＤＮＡを含まず、ＨＢＶ−ＲＮＡを含むウイルス粒子が存在することをはじめて見出した。さらに、このウイルス粒子の測定法を開発し、この測定結果が治療効果の判定に有用なマーカーとなることを示した。
【００１３】
【非特許文献１】
Ｇｅｒｅｌｓａｉｋｈａｎ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７０：  ４２９６−４２７４，  １９９６
【非特許文献２】
Ｓｕ，  Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ７：  ２００５−２０１５，  ２００１
【非特許文献３】
Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｒ．  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １３９：  ５３−６３，  １９８４
【非特許文献４】
Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ，  Ｓ．，  Ｃ．  Ｂｉｒｃｈ，  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．，  ３０：  ５３６−５５０，  １９９９
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、薬剤による治療効果の判定には血清ＨＢＶ−ＤＮＡ量が重視されているが、その判定基準としては充分ではない。
従って本発明の目的は、ラミブジン等の逆転写阻害効果を有するＢ型肝炎治療薬の治療効果の判定に有用なウイルス粒子を提供することである。
このウイルス粒子を測定することにより、Ｂ型肝炎の効果的な治療に貢献できる新たな診断薬を開発することができる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は血液等の体液中に存在する、ＨＢＶ−ＲＮＡを含みＨＢＶ−ＤＮＡを含まないＨＢＶ粒子を提供する。この粒子はＨＢＶの構造蛋白を持つという点でＳｕらの報告にある血清中ＨＢＶ−ＲＮＡとは異なっており、また、ＨＢＶ−ＤＮＡを含まないことからＨＢＶ−ＤＮＡ，  ＨＢＶ−ＲＮＡを共に含むウイルス粒子とも異なる。
また本発明は、このＨＢＶ粒子を測定する方法を提供する。
さらに本発明は、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＨＢＶ−ＲＮＡを定量することにより、このＨＢＶ粒子を定量する方法を提供する。
本発明により、Ｂ型肝炎の治療成績を向上させ耐性株や肝炎再燃を極力避ける効果が期待できる。
【００１６】
本発明はラミブジンに代表されるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の治療において、ＨＢＶ−ＲＮＡを測定することにより、治療効果を判定する方法に関する。
また本発明は、ＨＢＶ−ＤＮＡとＨＢＶ−ＲＮＡを同時に検出する方法であるものを含む。
さらに本発明は上記のＨＢＶ−ＲＮＡを検出するする方法、あるいは診断薬、診断キットを提供する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本願発明者らはラミブジン治療を行った患者血清中のＨＢＶ−ＤＮＡおよびＨＢｃＡｇの測定を行った。その結果、ラミブジン治療により患者血清中からＨＢＶ−ＤＮＡは完全に消失するが、ＨＢｃＡｇが減少するけれども完全には消失しない検体があることを見出した。
【００１８】
これらの検体についてＨＢＶ−ＲＮＡの測定を行ってみると、ＨＢＶ−ＤＮＡとは異なる動態を示すことがわかった。つまりラミブジン治療を行った患者検体中に、ＨＢＶ−ＲＮＡとＨＢＶの構造蛋白が存在するが、ＨＢＶ−ＤＮＡは消失していることが証明された。血清などの患者検体中にはＲＮＡを分解するＲＮａｓｅが多量に存在しているため、ＨＢＶ−ＲＮＡが検体中に遊離の状態で存在することはなく、ＨＢｃＡｇやＨＢｓＡｇなどのＨＢＶ構造蛋白と不完全なウイルス粒子を形成しているものと考えられる。
【００１９】
このＨＢＶ−ＤＮＡを含まず、ＨＢＶ−ＲＮＡを含みＨＢＶ構造蛋白から作られるＨＢＶ粒子は新規な物質である。またこのＨＢＶ粒子を測定することは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるＨＢＶ感染症の治療において、薬剤の治療効果を判定するために役立つと考えられる。特にＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤がラミブジンである場合に有用である。さらに肝癌発生の危険度を予測、または肝癌発生の危険群を選別することに有用である。
【００２０】
このウイルス粒子を測定するには検体中のＨＢＶ−ＲＮＡを測定できる方法であれば、どのような方法でも用いることが可能である。好ましくはＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  （ＲＴ）−ＰＣＲが挙げられる。またウイルス粒子を測定するにはＲＮＡを測定するだけでなく、ＨＢＶ−ＲＮＡと粒子を形成しているＨＢＶの構造蛋白を測定してもよい。
【００２１】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
【００２２】
実施例１． 血清中のＨＢＶ遺伝子量の測定
（Ａ）ＨＢＶプレゲノムの精製
Ｄａｎｅ粒子（感染力のあるＨＢＶ粒子：完全ＨＢＶ粒子）中のＨＢＶ遺伝子を単離するため、ＨＢＶ患者血清をハイピュアーウイルス核酸キット（ロシュ・ダイアグノスティック社）により以下の方法で精製した。ラミブジン治療を受けたＨＢＶ患者血清１００μＬを健常人血清１００μＬと混和し２００μＬ血清サンプルとした。血清サンプルに２００μＬのワーキング溶液〔５０μＬのポリＡキャリアーＲＮＡ（４ｍｇ／ｍＬ）と２．５ｍＬの結合緩衝液［６Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  Ｕｒｅａ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ４．４），２０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ｖ／ｖ）］〕と５０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（１８ｍｇ／ｍｌ）を加えて混合し、７２℃で１０分間加熱した。
【００２３】
１００μＬのイソプロパノールとサンプルを混合し、ハイピュアーフィルターチューブに注入した。８０００ｒｐｍで１分間遠心し、通過液を捨てたのち、５００μＬの阻害物除去緩衝液［５Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．６）］を注入し、８０００ｒｐｍで１分間遠心した。４５０μＬの洗浄緩衝液［２０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］を加えて、８０００ｒｐｍで１分間遠心し、再度４５０μＬの洗浄緩衝液で洗浄し、１３０００ｒｐｍで１０秒間遠心した。５０μＬの滅菌水をフィルターチューブに注入し、８０００ｒｐｍで１分間遠心し、通過液を採取して血清中のＨＢＶ遺伝子溶液とした。
【００２４】
（Ｂ）血清中のＨＢＶ  ＤＮＡの定量
血清ＨＢＶ  ＤＮＡの定量は、ライトサイクラー（ロシュ・ダイアグノスティック社）を用いたＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法により行った。
リアルタイムＰＣＲは、１０×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ（ロシュ・ダイアグノスティック社）を２μＬ、ＨＢＶ遺伝子溶液を４μＬ、１０μＭのＨＢＶのＳ領域に対する２つのプライマー［ＨＢＳ−Ｆ：５′−ＡＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＣ−３′（配列番号：１），ＨＢＳ−Ｒ：５′−ＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴ−３′（配列番号：２）］を各々２μＬ、４μＭのＴａｑＭａｎプローブ［ＨＢＳ−Ｐ：５′ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）−ＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ−３′ＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）  （配列番号：３）］を２μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を２μＬ混和し、滅菌水を加えて２０μＬの反応液として行った。
【００２５】
条件としては、前処理を９５℃で１０分間、ＤＮＡ変性を９５℃で５秒間、アニーリングを６０℃で１５秒間、ＤＮＡ合成を７２℃で８秒間で行い、ＴａｑＭａｎプローブから発せられた蛍光を測定し、血清中のＨＢＶ  ＤＮＡ量を定量した。（表１）
【００２６】
（Ｃ）血清中のＨＢＶ遺伝子（ＤＮＡ＋ＲＮＡ）の定量
次に血清中のＨＢＶ遺伝子量を測定するために、逆転写酵素反応を加えた。ＨＢＶ遺伝子溶液の１０μＬに１μＬの２０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，１０ｍＭ  ｄＧＴＰ，１０ｍＭ  ｄＣＴＰ，１０ｍＭ  ｄＴＴＰ）と０．２μＬの１０μＭ  ＨＢＳ−Ｒプライマーを混和し、６５℃で５分間加熱後、氷中で急冷した。４μＬの５×逆転写緩衝液［２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］、０．２μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ、０．６μＬのＲＮａｓｅインヒビター（４０単位／μＬ）と３μＬの滅菌水を混和し、４２℃で２分間アニ−リング反応を行い、１μＬの逆転写酵素（２００単位／μＬ）を加えて２０μＬの反応液とし、４２℃で５０分間逆転写反応させ、逆転写酵素の不活化処理を７０℃で１５分間行った。
【００２７】
この反応液の４μＬを上記のＨＢＶ  ＤＮＡ定量系に適用させることで、血清中のＨＢＶ遺伝子量、すなわち血清中のＨＢＶ  ＤＮＡとＲＮＡの合計量が測定できる。また、ＨＢＶ遺伝子量からＨＢＶ  ＤＮＡ量を減算することにより、血清中のＨＢＶ  ＲＮＡ量を推計することが可能である。（表１）
【００２８】
実施例２． ＨＢｃ抗原の測定
（Ａ）抗体固相プレートの作製
ＨＢｃ抗原ＨＢｅ抗原両方に反応する３種のモノクローナル抗体ＨＢ４４（認識部位３１−４９アミノ酸）、ＨＢ６１（認識部位１３１−１４０アミノ酸）およびＨＢ１１４（認識部位１−８１アミノ酸）をマイクロタイタープレートウェルに感作し、固相化する。ＰＢＳで洗浄後、カゼインを含む溶液でブロッキングし、この溶液を除いた後、乾燥させた。
【００２９】
（Ｂ）検体の前処理
５０μＬの前処理液（１５％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、３％  ＣＨＡＰＳ、１％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド）を１００μＬの検体（血清、血漿など）と混合し、７０℃で３０分処理した。
（Ｃ）１次反応
各抗体固相ウェルに１００μＬの反応緩衝液（ｐＨ８．０）および前処理した検体を５０μＬ加え、穏やかに撹拌しながら室温２時間反応させた。
【００３０】
（Ｄ）２次反応
ウェルを洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ＨＢ５０（認識部位１６８−１７６アミノ酸）モノクローナル抗体を含む溶液を１００μｌ加え、室温１時間反応させた。
（Ｅ）基質反応
ウェルを洗浄後、ＣＤＰ  Ｓｔａｒ  ｗｉｔｈ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１００μＬ加え、室温２０分間反応後各ウェルの発光量をマイクロプレートルミノメーターで測定した。標準抗原での発行量と比較し、検体中ＨＢｃ抗原の濃度を算出した（表１）。
【００３１】
実施例３． ラミブジン治療を受けたＨＢＶ患者血清での検討
表１に示すように、ラミブジン治療開始１ヶ月前の検体では、血中ＨＢＶ  ＤＮＡとＲＮＡはほぼ同様の血中ウイルス量を示したが、１ヶ月間投与の検体では、血中ＨＢＶ  ＤＮＡが６．１×１０３  コピー／ｍＬに対して血中ＨＢＶ  ＲＮＡが１．０×１０５コピー／ｍＬと明らかに血中ＨＢＶ  ＲＮＡ量が優位となっていた。さらに、８ヶ月間投与及び１９ヶ月間投与の検体においては、血中ＨＢＶ  ＤＮＡがほとんど検出できない場合でも、血中ＨＢＶ  ＲＮＡが２〜７×１０３コピー／ｍｌ残存していた。
【００３２】
一方、コアタンパク濃度は投与前には６１０  ｐｇ／ｍｌであったが、投与１ヵ月後には５６  ｐｇ／ｍｌまで低下したもののその低下率はＨＢＶ−ＤＮＡより小さく、さらに投与８，  １９ヶ月では２１，  ２０  ｐｇ／ｍｌとほとんど低下していなかった。ＨＢｃ抗原濃度の変化は（ＨＢＶ−ＤＮＡ  ＋  ＨＢＶ−ＲＮＡ）量の変化とほぼ一致していた。
これらの結果から、ラミブジン治療中の患者血清中には、ＨＢＶ  ＤＮＡを含む完全ウイルス粒子はほとんど存在せず、ＨＢＶ  ＲＮＡのみを含むＨＢＶ粒子が多量に存在していることが示唆される。
【００３３】
【表１】
2004290013.tif 000002
【００３４】
【配列表】
2004290013.tif 000003
2004290013.tif 000004