(57)【要約】【課題】　ヒトグルコキナーゼ遺伝子増幅用多重ＰＣＲプライマーセットを提供する。【解決手段】　特定の配列を有するオリゴヌクレオチドセットまたはその変異オリゴヌクレオチドから選択される１種以上のプライマーセットを含むヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的配列増幅用プライマープール。これにより、前記プライマープールを使用した多重ＰＣＲを通じてヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的領域を低コストで、特異的に、速く、かつ高い敏感度で増幅できる。【選択図】　　　　　　図１
2004033221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　以下のプライマーセットよりなる群から選択されるヒトグルコキナーゼ遺伝子の１種以上の標的配列増幅用の１種以上のＰＣＲプライマーセットを含むヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的配列増幅用プライマープール：
　（ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｋ）配列番号２３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセット：
　ここで、前記変異オリゴヌクレオチドは該当オリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端または３’末端及び５’末端すべてに結合または欠失された１ないし３個のさらなるヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。
【請求項２】
　１種以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモータ配列またはＴ３プロモータ配列を含む請求項１に記載のプライマープール。
【請求項３】
　配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１及び２３の配列を有する１種以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモータ配列を含み、配列番号４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，及び２４の配列を有する１種以上のプライマーが５’末端にＴ３プロモータ配列を含む請求項１に記載のプライマープール。
【請求項４】
　ヒトグルコキナーゼ遺伝子の１種以上の標的配列を以下のプライマーセットよりなる群から選択される１種以上のＰＣＲプライマーセットを利用してＰＣＲする段階を含む、ヒトグルコキナーゼ遺伝子の１種以上の標的配列を増幅する方法：
　（ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｋ）配列番号２３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセット：
　ここで、前記変異オリゴヌクレオチドは該当オリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端または３’末端及び５’末端すべてに結合または欠失された１ないし３のさらなるヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。
【請求項５】
　１種以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモータ配列またはＴ３プロモータ配列を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
　配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１及び２３の配列を有する１種以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモータ配列を含み、配列番号４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，及び２４の配列を有する１種以上のプライマーが５’末端にＴ３プロモータ配列を含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
　０．１μＭ〜１μＭ濃度の各プライマーと１００ｎｇ〜１μｇの鋳型ＤＮＡとを混合する段階をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項８】
　前記ＰＣＲは初期変性１〜５分（９０〜９８℃）、変性１０秒〜１分（９０〜９８℃）、アニーリング５秒〜３分（６０〜６５℃）、延長５秒〜５分（７０〜７５℃）、最終延長１〜１０分（７０〜７５℃）の反応条件で行う請求項４に記載の方法。
【請求項９】
　ヒトグルコキナーゼ遺伝子の１種以上の標的ヌクレオチド配列を次のプライマーセットよりなる群から選択される１種以上のＰＣＲプライマーセットを利用して配列分析する方法：
　（ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｋ）配列番号２３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセット：
　ここで、前記変異オリゴヌクレオチドは該当オリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端または３’末端及び５’末端すべてに結合または欠失された１ないし３のさらなるヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。
【請求項１０】
　１種以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモータ配列またはＴ３プロモータ配列を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
　配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１及び２３の配列を有する１種以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモータ配列を含み、配列番号４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，及び２４の配列を有する１種以上のプライマーが５’末端にＴ３プロモータ配列を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
　請求項１に記載のプライマープールを含む、ヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的配列の増幅用キット。
【請求項１３】
　１種以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモータ配列またはＴ３プロモータ配列を含む請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
　配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１及び２３の配列を有する１種以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモータ配列を含み、配列番号４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２及び２４の配列を有する１種以上のプライマーが５’末端にＴ３プロモータ配列を含む請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は多重ＰＣＲ用プライマー、前記プライマーを使用した塩基配列分析法及び前記プライマーを含む標的ＤＮＡ配列増幅用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
　ハイブリッド核酸の検出に使われる方法のうち一つにポリメラーゼ連鎖反応（PCR:Polymerase Chain Reaction）法があり、ＰＣＲ法は当業界では公知である（例えば、特許文献１ないし３）。ＰＣＲ法において、核酸増幅標的配列の対応ストランドに相補的な核酸プライマーが、変性された試料にアニーリングされる。次に、ＤＮＡポリメラーゼ（普通、熱に対して安定的である）が前記ハイブリッドプライマーからＤＮＡ二重ストランドを延長する。次に、標的核酸を増幅するために前記過程を繰り返す。プライマーが前記標的核酸にハイブリッド化されないならば、対応する増幅されるべきＰＣＲ産物もなくなる。この場合、前記ＰＣＲプライマーはハイブリッド化プローブの役割をする。
【０００３】
　ＰＣＲ法において、増幅された核酸産物は多様な方式により、例えば、ラベル付きのプライマーを使用して増幅されたストランドにラベル付きのヌクレオチドを挿入することによって検出できる。ＰＣＲ法に使われるプライマーとしては、放射性物質、蛍光染料、ジゴキシゲニン(digoxygenin;以下、DIG)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、アクリジニウムエステル、ビオチン及びジャックビーンウレアーゼなどでラベルを付したものがあるが、これに限定されない。ラベルが付いていないプライマーにより得られたＰＣＲ産物は、電気泳動ゲルの分離後に染料による可視化などの他の方法によって検出できる。
【０００４】
　ヒトゲノムは約３０億個の塩基配列を有するために、特定の遺伝子を単離して分析することは困難である。このような難点を解決するために導入された実験方法のうち最も画期的な一つが、特定の配列を増幅するＰＣＲ法である。ＰＣＲ法は特定の核酸配列の末端に相補的な塩基よりなるプライマーセット（対）を利用して、それらの間にある遺伝子を短時間内に数十万倍以上増幅させる方法である（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
　かかるＰＣＲ法は疾病関連遺伝子の分析に多く使われている。特に、前記ＰＣＲ法を通した疾病関連遺伝子の増幅は、医療界にて遺伝子変異分析法に広く利用されている。前記遺伝子変異の分析は、特定の疾病関連遺伝子を増幅させた後、塩基配列の分析、ハイブリッド化及び１本鎖ＤＮＡ高次構造多型（SSCP:single strand conformational polymorphism）分析などの過程を通じて行われる。遺伝子の変異とは、欠失、置換、付加及び逆位などを含むものであって、遺伝子配列に変化が発生したことを意味する。ここには一塩基多型（SNP;Single Nucleotide Polymorphism）も含まれる。
【０００６】
　遺伝子変異の分析法において、標的遺伝子のサイズが小さい場合には単一ＰＣＲにより全体の標的遺伝子の分析を行える。しかし、標的遺伝子のサイズが相対的に大きい場合、例えば、１ｋｂ以上である場合、単一ＰＣＲが適切でないこともある。したがって、標的遺伝子のサイズが大きい場合、いくつかの相異なる標的の遺伝子断片に対してＰＣＲを複数回にかけて行わねばならない。大部分の疾病関連遺伝子のサイズは、普通１．５ｋｂ以上であるために、複数のＰＣＲが単一ＰＣＲ反応より疾病関連遺伝子の変異分析法により多く利用された。
【０００７】
　しかし、複数のＰＣＲは多量のサンプル、例えば、患者のＤＮＡまたは血液を必要とする。また、複数のＰＣＲは、高コスト、労働力及び時間を必要とする。
【０００８】
　前記短所を解消するために講じられた方法が、多重ＰＣＲ法である。多重ＰＣＲ法は、遺伝子の複数の標的配列を一反応容器内で同時に増幅するものである。すなわち、各標的配列を増幅し得るプライマーセット（プライマープール）を一反応容器に入れて、単一ＰＣＲ操作で増幅させる方法である。
【０００９】
　このような多重ＰＣＲ法は、当業界では公知のものである。例えば、特許文献４には複数の公知のＤＮＡ配列欠失を同時に検出する方法が開示されている。前記特許文献４に記述された技術は、標的にハイブリダイズする第１プローブセットを使用する。標的が存在すれば、前記プローブが延長される。延長産物はＰＣＲ法を利用して増幅される。
【００１０】
　多重ＰＣＲ法用プライマーは、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、標的ＤＮＡを十分に増幅させるためにプライマー間の妨害があってはならない。
【００１１】
　かかるプライマーを利用した多重ＰＣＲ法は、単一ＰＣＲに比べて、標的ＤＮＡの増幅にかかる時間、労働力及びコストを大きく減らせる。特に、多重ＰＣＲ法はＤＮＡチップを利用した遺伝子変異の分析時に、１種以上のＤＮＡサンプルを増幅する際に有用である。
【００１２】
　一方、グルコキナーゼ遺伝子における点突然変異はＭＯＤＹ２を誘発することが知られている（例えば、特許文献５）。ＭＯＤＹ２は第２型糖尿病の１０〜３０％以上を占めるＭＯＤＹ疾病（ＭＯＤＹ１，２，３，４，５）（青年期に発病する糖尿病）のうちの１種の疾病である。したがって、ヒトグルコキナーゼ遺伝子の変異の分析により、あらかじめ糖尿病を発症する傾向を予測できる。ゆえに、ＤＮＡチップを利用した変異分析などのヒトグルコキナーゼ遺伝子の迅速な分析のために、ヒトグルコキナーゼ遺伝子増幅用の多重ＰＣＲプライマーセットの開発が要求されている。
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５８２，９８９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５４１，０６０号明細書
【非特許文献１】Saiki et al, 'Science', 1988, 239-487,
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
　本発明の目的は、ヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的配列を多重ＰＣＲ法により増幅する多重ＰＣＲプライマーセットを含むプライマープールを提供することである。
【００１４】
　本発明の他の目的は、前記プライマープールを使用してヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的配列を増幅する方法を提供することである。
【００１５】
　本発明のさらに他の目的は、前記プライマープールを利用してヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的ヌクレオチド配列を分析する方法を提供することである。
【００１６】
　本発明のさらに他の目的は、前記プライマープールを含む標的配列増幅用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
　本発明は、以下のプライマーセットよりなる群から選択されるヒトグルコキナーゼ遺伝子の１種以上の標的配列増幅用の１種以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上のＰＣＲプライマーセットを含むヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的配列増幅用プライマープールである。
【００１８】
　（ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットと、
　（ｋ）配列番号２３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドと配列番号２４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドとを含むプライマーセット：
　ここで、前記変異オリゴヌクレオチドは、該当オリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端または３’末端及び５’末端の両方に結合または欠失された１ないし３個のさらなるヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。したがって、前記変異オリゴヌクレオチドは該当オリゴヌクレオチドの一側または両側末端部分の配列を除いては同じヌクレオチド配列を有する。
【００１９】
　本発明はまた、本発明による前記プライマープールを利用してヒトグルコキナーゼ遺伝子の１種以上の標的配列をＰＣＲする段階を含むヒトグルコキナーゼ遺伝子の１種以上の標的配列を増幅する方法を提供する。
【００２０】
　本発明はまた、本発明による前記プライマープールを利用してヒトグルコキナーゼ遺伝子の１種以上の標的配列を分析する段階を含むヒトグルコキナーゼ遺伝子の１種以上の標的配列を分析する方法を提供する。
【００２１】
　さらに、本発明は、本発明による前記プライマープールを含むヒトグルコキナーゼ遺伝子の１種以上の標的ＤＮＡ配列増幅用キットを提供する。前記キットは前記プライマープール以外にｄＮＴＰ溶液、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝溶液を含むＰＣＲ反応に必要な通常の試薬を含む。
【００２２】
　さらにに、本発明は、ヒトグルコキナーゼ遺伝子の遺伝的な変異を決定するのに用いられうる。かかる変異には第２型糖尿病の約１０〜３０％を占める青年期に発病し得る糖尿病の一種であるＭＯＤＹ２疾病の変異が含まれる。ヒトグルコキナーゼ遺伝子の遺伝的な変異を分析することによって、個体の糖尿病発症傾向を予見できる。
【発明の効果】
【００２３】
　本発明によるヒトグルコキナーゼ遺伝子増幅用プライマープールは多重ＰＣＲにより該当遺伝子を効果的に増幅した。特に、本発明の多重ＰＣＲ用プライマープールはＰＣＲ反応に必要な試料が相対的に少なく、ＤＮＡチップを利用した疾病関連遺伝子の分析法などに有用である。
【００２４】
　本発明のプライマープールはヒトグルコキナーゼ遺伝子の塩基配列分析用または増幅用キットに効果的に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
　本発明の理解を深めるために、本明細書に使われる用語の定義を以下に示す。“核酸”とは、一つのヌクレオチドのペントースの３’位置が次のペントースの５’位置にホスホジエステル基によって結合され、前記ヌクレオチド残基（塩基）は、特定の配列に結合されたヌクレオチドの配列である。“ポリヌクレオチド”とは、１００ヌクレオチド以上の配列の核酸である。“オリゴヌクレオチド”とは、短いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部をいう。オリゴヌクレオチドは普通約２ないし約１００塩基の配列である。
【００２６】
　核酸は様々な形態の突然変異を含むと知られている。本明細書において、“点”突然変異とは、単一塩基位置でのヌクレオチド配列の変化をいう。“単一ヌクレオチド多型”（ＳＮＰ）とは、特定の核酸位置で最も頻度の高い塩基からの変異をいう。
【００２７】
　また、本発明において、“標的核酸”とは、対象となる特定の核酸配列をいう。したがって、“標的”とは、対象となる核酸分子内に存在し得る。
【００２８】
　“核酸プローブ”とは、対象となる核酸にハイブリッド化し得るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。核酸プローブは精製された制限産物のように天然に存在するか、合成、組換えまたはＰＣＲ増幅によって生産できる。“核酸プローブ”とは、本発明の方法に使われるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。同じオリゴヌクレオチドがまた増幅用プライマーとしてＰＣＲ法に使われうるが、本明細書では“プライマー”という。ここで、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはホスホロチオエート（phosphorothioate）結合のように変形された結合を含むこともある。
【００２９】
　“相補的”という言葉は、ＡはＴと対をなし、ＣはＧと対をなす塩基対規則によって対象となる核酸（すなわち、ヌクレオチドの配列）と関連して使われる。例えば、配列５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’は３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’と相補的である。相補性は塩基対規則によって核酸塩基の一部だけ対象となる“部分的”な場合がある。一方、塩基対規則によってあらゆる塩基が対象となる場合には、核酸ストランド間で“完全な”または“全体的”な場合もある。
【００３０】
　“相同性”とは相補性の程度をいう。部分的相補性または完全な相補性（すなわち、同一性）がありうる。
【００３１】
　多重ＰＣＲ法によってヒトグルコキナーゼ遺伝子増幅用プライマープールを開発するにおいて、次の事項が考慮される。
【００３２】
　プライマープールはヒトグルコキナーゼ遺伝子に特異的に結合し、標的ＤＮＡを十分に増幅するため、プライマー相互間の干渉があってはならない。また、各プライマーが類似したＴｍ(melting temperature)を有して、プライマー対同士の二量体形成がないことが好ましい。また、各プライマーはヘアピン構造や自己二量体を形成してはならない。マイクロサテライト領域及び反復配列領域はプライマー配列から排除されねばならない。
【００３３】
　以下、本発明を、実施例により詳細に説明する。これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されることはない。
【実施例】
【００３４】
　＜実施例１　ヒトグルコキナーゼ遺伝子の１１標的配列増幅用プライマーの製作＞
　表１に示すように、ＰＣＲ産物の大きさが５ｂｐ以上の差があるようにプライマーをデザインした。また、プライマーが標的ＤＮＡ配列にのみ特異的に結合し、プライマー相互間の干渉がなくて標的ＤＮＡを十分に増幅できるようにデザインされている。さらに、各プライマーは類似したＴｍ値を有し、プライマー対間の二量体形成はなく、かつ、各プライマーはヘアピン及び自己二量体を形成せずに、一つの塩基が４回以上反復しないようにデザインされている。マイクロサテライト領域及び反復配列領域はプライマー配列から排除した。
【００３５】
　HYBsimulatorTM(Advanced Gene Computing Technologies,Inc)をプライマー分析に使用した。
【００３６】
　また、ＰＣＲ産物の増幅効率性を増大させるために、順方向プライマーにはＴ７プロモータ配列（taatacgactcactataggg；配列番号１）を、逆方向プライマーにはＴ３プロモータ配列（gtaaccctcactaaaggga；配列番号２）を５’末端に付けて使用した。
【００３７】
　各プライマーの配列及び特性を下記表１に示す。
【００３８】
【表１】
2004033221.tif 000003
【００３９】
　＜実施例２　単一ＰＣＲによるヒトグルコキナーゼ遺伝子の増幅＞
　実施例１で製作された各プライマーセットを使用してヒトグルコキナーゼ遺伝子標的部位を単一ＰＣＲにより増幅した。反応条件は初期変性（９５℃で５分）、変性（９５℃で３０秒）とアニーリング（６４℃で１５秒）と延長（７２℃で３０秒）の３０回の繰り返し、最終延長（７２℃で３分）であった。反応溶液の組成は次の通りである。
【００４０】
　　ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅが除去された滅菌された水  １２．８μｌ
　　ｄＮＴＰミックス（各ヌクレオチド２．５ｍＭ）            ２μｌ
　　１０Ｘ Ｔａｑ重合酵素緩衝溶液                          ２μｌ
　　プライマーセット（各プライマー１０ｐｍｏｌ）            ２μｌ
　　ゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ〜１．０(ｇ）                   １μｌ
　　Ｔａｑ重合酵素（５Ｕｎｉｔ／μｌ）                  ０．２μｌ
　得られた単一ＰＣＲ産物を１．８％アガロースゲルで電気泳動させた（図１参照）。図１において、レーン１〜１１はエクソン（exon）１ａ、１ｂ、１ｃ、２、３、４、５＆６、７、８、９、１０に該当するＰＣＲ産物を示す。レーン１２は下記実施例３で得た多重ＰＣＲ産物を示し、レーン１３は５０ｂｐ ＤＮＡラダー分子量マーカーを示す。
【００４１】
　図１に示したように、ヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的領域は、実施例１で製作された各プライマーセットを用いて、単一ＰＣＲによって増幅された。
【００４２】
　配列番号２１及び２２のプライマーセットを使用して得られた単一ＰＣＲ産物を分離精製した後、自動配列分析法を使用して塩基配列を分析した。DNAstar ソフトウェア（DNAstar Inc.）を使用して得られた塩基配列（配列番号３４： Sbjct ）を公知のヒトグルコキナーゼ遺伝子エクソン９の塩基配列（配列番号３３： Query ）と比較した（図２参照。）。
【００４３】
　図２に示したように、前記ＰＣＲ産物は公知のヒトグルコキナーゼ遺伝子エクソン９の塩基配列と９８．３％の相同性を示した。整列に使われるギャップ頻度は０％であった。
【００４４】
　また、前記エクソン９以外の残りのエクソンに対する単一ＰＣＲ増幅産物もこれと同じ方法により塩基配列を確認したところ、各々公知の該当領域の塩基配列に対して９５％以上の相同性を示した。
【００４５】
　＜実施例３　多重ＰＣＲによるヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的領域の増幅＞
　実施例１で製作された各プライマーセットを使用して多重ＰＣＲを行った。反応条件は、初期変性（９５℃で５分）、変性（９５℃で３０秒）とアニーリング（６４℃で１５秒）と延長（７２℃で３０秒）の３０回の繰り返し、最終延長（７２℃で３分）であった。前記プライマーセットを、一つの反応容器内に添加した、反応溶液の組成は次の通りである。
【００４６】
　　ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅが存在しない滅菌水       １６．４μｌ
　　ｄＮＴＰミックス（各ヌクレオチド２．５ｍＭ）           ５μｌ
　　１０Ｘ Ｔａｑ重合酵素緩衝溶液                          ５μｌ
　　プライマーセット（各プライマー１０ｐｍｏｌ）          ２２μｌ
　　ゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ〜１．０μｇ）                  １μｌ
　　Ｔａｑ重合酵素（５Ｕｎｉｔ／μｌ）                  ０．６μｌ
【００４７】
　得られたＰＣＲ産物を１．８％アガロースゲルで電気泳動させた（図１参照）。図１のレーン１１に示したように、前記プライマーを使用した多重ＰＣＲの結果、ヒトグルコキナーゼ遺伝子の１１種類標的領域（５０７，３１２，２４９，３６５，３５５，２６４，４４６，３７０，３３６，４１０，５５１ｂｐ）がいずれも増幅された。
【００４８】
　＜実施例４　変異プライマーを使用した多重ＰＣＲによるヒトグルコキナーゼ遺伝子の標的部位の増幅＞
　４種のプライマーセット（エクソン１ａ、エクソン３、エクソン４、エクソン９増幅用プライマーセット）の一方の末端に、鋳型となるＤＮＡに相補的な３ヌクレオチドを追加し、他方の末端に３つのヌクレオチドが欠失された変異プライマー（表２）を合成した。表２に示した前記４種のプライマーセットのうち一つのプライマーセットを使用し、残りの３種のプライマーセットは表１に示した該当プライマーセットを使用したことを除いては実施例１と同じ方法により多重ＰＣＲを行った（図３Ａ及び図３Ｂ）。
【００４９】
【表２】
2004033221.tif 000004
【００５０】
　図３Ａは、変異させたエクソン４プライマーセット、および、表１に示したエクソン１ａ、エクソン３及びエクソン９プライマーセットを使用した多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。図３Ｂは、変異させたエクソン９プライマーセット、および、表１に示したエクソン１ａ、エクソン３及びエクソン４プライマーセットを使用した多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真である（エクソン１ａ及び３を変異させたプライマーセットを使用した多重ＰＣＲ産物の電気泳動結果は示さない）。図３Ａ及び図３Ｂにおいて、左側末端のレーンは５０ｂｐ ＤＮＡラダー分子量マーカーを示し、レーン１は全て表１のプライマーセットのみを使用して多重ＰＣＲした結果、レーン２は表２の変異させたエクソン４またはエクソン９用プライマーセットを使用して多重ＰＣＲした結果、レーン３はエクソン４またはエクソン９用プライマーセットを除いて多重ＰＣＲした結果を各々示す。
【００５１】
　図３Ａ及び図３Ｂに示したように、変異させたプライマーセットによって該当遺伝子部位がいずれも増幅されることが分かった。
【００５２】
　＜実施例５　サザンブロット法による多重ＰＣＲ産物の確認＞
　実施例２と実施例３において増幅されたＰＣＲ産物を１．８％アガロースゲル上で電気泳動させた（図１参照）。このゲルを変性溶液（０．５Ｎ ＮａＯＨ＋１．５Ｍ ＮａＣｌ）で１５分間ゆっくり攪拌しながらゲル上の二重ストランドＤＮＡを変性させた。このような過程を２回繰り返した後、蒸溜水でゲルを洗浄して１５分間中和溶液（３Ｍ ＮａＣｌが含まれた０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）でゆっくり攪拌しながら２回中和させた。その後、ゲルに存在するＤＮＡとナイロン膜を２０×ＳＳＣ溶液で約１２時間半反応させてＤＮＡをナイロン膜に移動させた。ナイロン膜を１２０℃で３０分間放置するか、ＵＶ光を照射することによって交差結合させ、蒸溜水によりその膜を１〜２分洗浄した後、乾燥させた。
【００５３】
　前述のようにＤＮＡ付着膜を２０ｍｌハイブリッド化溶液に入れて、６２℃で約２時間プレハイブリッド化反応を行い、前記溶液を捨てた。その後、ＤＮＡ付着膜とＤＩＧ（ジゴキシゲニン）標識のプローブ５ｐｍｏｌ／ｍｌとをハイブリッド化溶液容器１０ｍｌに入れて、６２℃で約１２時間反応させた。この反応中にＤＩＧ標識のプローブは膜にあるＤＮＡと相補的な遺伝子部位に結合する。そして、結合されていないプローブを除去するために２×洗浄用溶液（２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ）により常温で５分間２回繰り返して洗浄し、０．５×洗浄用溶液（０．５×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ）により６２℃で１５分間２回繰り返して洗浄した。
【００５４】
　その後、ＤＩＧに結合する抗体を入れる前に、他の部分に抗体が付着されないように２０ｍｌブロッキング溶液で３０〜６０分間処理した後、新しいブロッキング溶液（２０ｍｌ）にアルカリ性ホスファターゼを結合させたヒツジ抗−ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）を１μｌ添加して約３０分間反応させた。次いで、洗浄緩衝液（１００ｍＭ マレイン酸，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５（常温２０），０．３％ Ｔｗｅｅｎ２０）により１５分ずつ２回洗浄した。その後、膜上にあるＤＮＡとプローブとの結合を確認するために、アルカリ性ホスファターゼの基質であるＣＤＰ−スター（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ）を検出緩衝溶液に１：１００の割合で混ぜたもので膜を５分間処理した後、Ｘ線フィルムに感光させた。感光させたフィルムを現像してプローブの付着位置を確認し、その結果を図４に示す。図４において、エクソン１ａ、エクソン１ｂ、エクソン３、エクソン４、エクソン８、エクソン９、エクソン１０は該当各エクソンの単一ＰＣＲ産物を示し、ｍは多重ＰＣＲ産物を示す。
【００５５】
　図４によれば、単一ＰＣＲと多重ＰＣＲとの同じ位置でプローブがハイブリッド化されることによって、増幅された産物が同一であることが分かった。
【００５６】
　＜実施例６　配列分析による多重ＰＣＲ産物の確認＞
　実施例３と同じ方法で増幅した多重ＰＣＲ産物を鋳型とし、各エクソン増幅用プライマーを使用して塩基配列分析ＰＣＲを行った。そのうちエクソン１ｃ（図５）及びエクソン７（図６）増幅用プライマーを各々使用して塩基配列分析ＰＣＲを行った結果を図５および図６に示した。図５及び図６は、配列分析結果を公知のヒトグルコキナーゼ遺伝子の該当エクソンと塩基配列とを比較したものであり、図５は、グルコキナーゼのエクソン１ｃの公知配列（配列番号３５：Query ）を多重ＰＣＲ産物配列（配列番号 ３６：Sbjct ）と整列させた結果を示し、図６は、グルコキナーゼのエクソン７の公知配列（配列番号３７：Query ）を多重ＰＣＲ産物配列（配列番号３８：Sbjct ）と整列させた結果を示す。
【００５７】
　その結果、本発明の多重ＰＣＲによって得られたヒトグルコキナーゼクソン１ｃ及びエクソン７配列は公知の配列といずれも９５％以上の相同性を表した。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ヒトグルコキナーゼ遺伝子のエクソン１〜１０部分の単一ＰＣＲ産物及び多重ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す写真である。
【図２】エクソン９増幅用プライマーを使用した単一ＰＣＲ産物の塩基配列（Sbjct；配列番号３４）と公知のヒトグルコキナーゼ遺伝子エクソン９の塩基配列（Query；配列番号３３）とを比較して示す図面である。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、変異させたプライマーセットを利用して得られた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図４】各エクソン別プライマーセットをプローブとして使用した単一ＰＣＲ産物及び多重ＰＣＲ産物のサザンブロット写真である。
【図５】多重ＰＣＲ産物の塩基配列と公知のヒトグルコキナーゼ遺伝子の該当領域の塩基配列とを比較した図面であって、グルコキナーゼのエクソン１ｃの公知の配列（Query；配列番号３５）を多重ＰＣＲ産物配列（Sbjct；配列番号３６）とを比較した結果を示す。
【図６】多重ＰＣＲ産物の塩基配列と公知のヒトグルコキナーゼ遺伝子の該当領域の塩基配列とを比較した図面であって、グルコキナーゼのエクソン７の公知の配列（ Query：配列番号３７ ）と多重ＰＣＲ産物配列（ Sbjct；配列番号３８ ）とを比較した結果を示す。
【図１】
2004033221.tif 000005
【図２】
2004033221.tif 000006
【図３】
2004033221.tif 000007
【図４】
2004033221.tif 000008
【図５】
2004033221.tif 000009
【図６】
2004033221.tif 000010
【配列表】
2004033221000001.app