(57)【要約】【課題】生化学解析用ユニットの吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプタを、感度を低下させることなく測定する。【解決手段】多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域に、リガンドまたはレセプタを結合させる。リガンドまたはレセプタが固定された生化学解析用ユニットＵ１、Ｕ２、Ｕ３を準備し、これを互いに吸着性領域を合わせて密着させ反応容器１０にセットする。続いて、標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドが添加された反応液をポンプ２２を駆動させて３枚の生化学解析用ユニットの吸着性領域を横切るように強制的に流動させ、生化学解析用ユニットＵ１、Ｕ２、Ｕ３のそれぞれの吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに反応液の標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。【選択図】          図２
2004271346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドが添加された反応液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記レセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、該レセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出するアッセイ法において、
前記生化学解析用ユニットを複数枚用い、該複数の生化学解析用ユニットを前記反応液の流動方向に対して直列に並べ、前記複数の生化学解析用ユニットに同一の反応液を強制的に流動させることを特徴とする生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法。
【請求項２】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドが添加された反応液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記リガンドまたはレセプタに前記標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドを検出するアッセイ法において、
前記生化学解析用ユニットを複数枚用い、該複数の生化学解析用ユニットを前記反応液の流動方向に対して直列に並べ、前記複数の生化学解析用ユニットに同一の反応液を強制的に流動させることを特徴とする生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法。
【請求項３】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドが添加された反応液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記リガンドまたはレセプタに前記レセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、レセプタまたはリガンドに標識物質によって標識された標識体を特異的に結合させ、前記レセプタまたはリガンドを検出するアッセイ法において、
前記生化学解析用ユニットを複数枚用い、該複数の生化学解析用ユニットを前記反応液の流動方向に対して直列に並べ、前記複数の生化学解析用ユニットに同一の反応液を強制的に流動させることを特徴とする生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法。
【請求項４】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、補助物質が結合された補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドが添加された反応液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記リガンドまたはレセプタに補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドを特異的に結合させ、前記補助物質に特異的に結合可能な結合可能標識物質を前記補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、該補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドを検出するアッセイ法において、
前記生化学解析用ユニットを複数枚用い、該複数の生化学解析用ユニットを前記反応液の流動方向に対して直列に並べ、前記複数の生化学解析用ユニットに同一の反応液を強制的に流動させることを特徴とする生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法。
【請求項５】
前記複数の生化学解析用ユニットの互いの吸着性領域を合わせ、前記生化学解析用ユニットを重ね合わせて用いることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法。
【請求項６】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを内部に着脱可能に取り付ける取付部を有し、前記リガンドまたはレセプタを特異的に結合させるための反応容器と、該反応容器内に反応液を流動させる流動手段とからなるアッセイ装置において、
前記生化学解析用ユニットを取り付ける取付部が前記反応液の流動方向に対して直列に複数設けられていることを特徴とするアッセイ装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レセプタまたはリガンドを検出するアッセイ法に関し、詳しくは多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを利用して、レセプタまたはリガンドを検出するアッセイ法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロアレイ解析システムやマクロアレイ解析システムにおいては、メンブレンフィルタなどの生化学解析用ユニットの表面の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプタを含む溶液を滴下して多数の吸着性領域を形成し、放射線標識物質、蛍光物質、化学発光基質と接触させることによって化学発光を生じさせる標識物質などによって標識されたレセプタまたはリガンド（ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質）を、吸着性領域に含まれているリガンドまたはレセプタにハイブリダイズ等させてリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、多数の吸着性領域に選択的に含まれている放射性標識物質によって蓄積性蛍光体シートの輝尽性蛍光体層を露光し、露光された輝尽性蛍光体層を励起光によって走査して、輝尽性蛍光体層に含まれている輝尽性蛍光体を励起し、輝尽性蛍光体から放出された輝尽光を光電的に検出して生化学解析用データを生成し、あるいは、多数の吸着性領域を励起光によって走査して多数の吸着性領域に選択的に含まれている蛍光物質を励起し、蛍光物質から放出された蛍光を光電的に検出して生化学解析用データを生成し、あるいは、多数の吸着性領域に選択的に含まれている標識物質を化学発光基質と接触させ、標識物質から放出される化学発光を光電的に検出して生化学解析用データを生成するシステムが開発されている（特開２００２−３５５０３６号公報）。
【０００３】
このシステムによれば、生化学解析用ユニット上に数多くのリガンドまたはレセプタを結合した吸着性領域を高密度に形成して、標識物質によって標識されたレセプタまたはリガンドをハイブリダイズ等させることによって、短時間でレセプタまたはリガンドを解析することが可能になるという利点がある。
【０００４】
従来、生化学解析用ユニットを利用した解析システムにおいては、上記ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーションバッグに生化学解析用ユニットを入れ、ここに標識されたレセプタまたはリガンドを含む反応液を加え、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識されたレセプタまたはリガンドを対流あるいは拡散によって移動させて、リガンドまたはレセプタに標識されたレセプタまたはリガンドを特異的に結合させる、いわゆる振盪方式によって行うのが一般的であった。
【０００５】
しかし、上述の振盪方式の場合、ハイブリダイゼーション反応液をリガンドまたはレセプタを含む多数の吸着性領域に均一に接触させることは困難であり、リガンドまたはレセプタと標識されたレセプタまたはリガンドとを効率的にハイブリダイズさせることができないという問題があった。このような問題を解決するために、本出願人は吸着性領域に標識されたレセプタまたはリガンドを含む反応液を強制的に流動させ、標識されたレセプタまたはリガンドを生化学解析用ユニットの吸着性領域の内部にまで充分に浸透させる方法を提案している（特願２００２−２６８１６号）。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−３５５０３６号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、従来は１回のハイブリダイゼーション反応に対して、１枚の生化学解析用ユニットを使用しており、この１回のハイブリダイゼーション反応に必要とされる反応液量は決まっているため、複数の生化学解析用ユニットを使用してハイブリダイゼーション反応を行う場合には、生化学解析用ユニットの枚数に比例して反応液量が必要であり、また、使用する生化学解析用ユニットの枚数だけハイブリダイゼーション反応を繰り返す必要があった。
【０００８】
このため、解析しようとするレセプタまたはリガンドが複数の生化学解析用ユニットに固定されている場合や、実験を複数回行って平均値をとる必要がある場合には反応液量を増やす必要があるが、サンプル量は限られているため、サンプル濃度が希釈されて感度が低下するという問題がある。また、ハイブリダイゼーション反応を複数回繰り返すために生化学解析用ユニットの枚数に比例して解析時間も長くなり、さらに反応ごとの測定誤差を相殺するための新たな処理が必要になる場合もある。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、解析したいレセプタまたはリガンドが複数の生化学解析用ユニットに固定されている場合であっても、感度を低下させることなく、また反応時間、反応回数を増やすことなく反応を行うことが可能な生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法、およびその方法を実施することが可能なアッセイ装置を提供することを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドが添加された反応液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記レセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、該レセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出するアッセイ法において、前記生化学解析用ユニットを複数枚用い、該複数の生化学解析用ユニットを前記反応液の流動方向に対して直列に並べ、前記複数の生化学解析用ユニットに同一の反応液を強制的に流動させることを特徴とするものである。
【００１１】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法の別の態様としては、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドが添加された反応液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記リガンドまたはレセプタに前記標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドを検出するアッセイ法において、前記生化学解析用ユニットを複数枚用い、該複数の生化学解析用ユニットを前記反応液の流動方向に対して直列に並べ、前記複数の生化学解析用ユニットに同一の反応液を強制的に流動させることを特徴とするものである。
【００１２】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法の別の態様としては、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドが添加された反応液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記リガンドまたはレセプタに前記レセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、レセプタまたはリガンドに標識物質によって標識された標識体を特異的に結合させ、前記レセプタまたはリガンドを検出するアッセイ法において、前記生化学解析用ユニットを複数枚用い、該複数の生化学解析用ユニットを前記反応液の流動方向に対して直列に並べ、前記複数の生化学解析用ユニットに同一の反応液を強制的に流動させることを特徴とするものである。
【００１３】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法のさらに別の態様としては、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、補助物質が結合された補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドが添加された反応液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記リガンドまたはレセプタに補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドを特異的に結合させ、前記補助物質に特異的に結合可能な結合可能標識物質を前記補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、該補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドを検出するアッセイ法において、前記生化学解析用ユニットを複数枚用い、該複数の生化学解析用ユニットを前記反応液の流動方向に対して直列に並べ、前記複数の生化学解析用ユニットに同一の反応液を強制的に流動させることを特徴とするものである。
【００１４】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法においては、前記複数の生化学解析用ユニットの互いの吸着性領域を合わせ、前記生化学解析用ユニットを重ね合わせて用いることが好ましい。
【００１５】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ装置は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを内部に着脱可能に取り付ける取付部を有し、前記リガンドまたはレセプタを特異的に結合させるための反応容器と、該反応容器内に反応液を流動させる流動手段とからなるアッセイ装置において、前記生化学解析用ユニットを取り付ける取付部が前記反応液の流動方向に対して直列に複数設けられていることを特徴とするものである。
【００１６】
【発明の効果】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法は、生化学解析用ユニットを複数枚用い、この複数の生化学解析用ユニットを反応液の流動方向に対して直列に並べ、複数の生化学解析用ユニットに同一の反応液を強制的に流動させるので、解析したいレセプタまたはリガンドが複数の生化学解析用ユニットに固定されている場合や、実験を複数回行って平均値をとる必要がある場合であっても反応液量を増やす必要がなく、１枚の生化学解析用ユニットを解析する場合と同じサンプル濃度で特異的結合を行うことが可能であり、感度を低下させることがない。
【００１７】
また、１度の反応によって複数枚の生化学解析用ユニットの吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプタにレセプタまたはリガンドを特異的に結合させることができるので、１枚の生化学解析用ユニットを使用して特異的結合する場合と同じ時間で特異的結合を行うことが可能となる。
【００１８】
さらに、複数枚の生化学解析用ユニットを１枚ずつ別個に使用してアッセイを行う場合には、アッセイごとの測定誤差を考慮して解析をする必要があるが、本発明のアッセイ法では、複数枚の生化学解析用ユニットを１度にアッセイすることができるので、測定誤差を相殺するような処理を新たに行う必要がないという利点を有する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明のアッセイ法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図１に示す生化学解析用ユニット１は、孔３が複数設けられた基板２と、孔３の内部に充填され、多孔性材料が基板２と接着された吸着性領域４とからなる。この吸着性領域４には、構造または特性が既知のリガンドまたはレセプタ５が滴下され、その後の処理により固定化されている。
【００２０】
基板２の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【００２１】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−６やナイロン−６，６などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【００２２】
基板２に開ける孔３の開口部の面積（サイズ）は、孔３の密度を高めるために、一般には５ｍｍ２  未満であり、好ましくは１ｍｍ２  未満であり、０．３ｍｍ２  未満がより好ましく、さらには０．０１ｍｍ２  未満であることが好ましい。そして、より好ましくは０．００１ｍｍ２  以上であることが好ましい。
【００２３】
孔３のピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）は０．０５〜３ｍｍの範囲であることが好ましく、孔３の間隔（隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離）は、０．０ｌ〜１．５ｍｍの範囲であることが好ましい。孔３の数（密度）は、一般には１０個／ｃｍ２  以上であり、好ましくは１００個／ｃｍ２  以上、より好ましくは５００個／ｃｍ２  以上、さらには１０００個／ｃｍ２  以上であることが好ましい。そして、好ましくは１０００００個／ｃｍ２  以下、さらには１００００個／ｃｍ２  以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔３は全て図１に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック（単位）に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【００２４】
吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機／無機複合体でもよい。
【００２５】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００２６】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【００２７】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えば、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などがあげられる。
【００２８】
基板２に複数の孔３を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。貼り合わせる際に、吸着性領域を形成するための多孔性材料を加熱して軟化すると、孔内部に吸着性領域が容易に形成される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に１枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを２つのロール間に連続搬送してもよい。
【００２９】
なお、本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法においては、上記の材料や方法によって作製した生化学解析用ユニットを使用することも可能であるが、市販されている生化学解析用ユニットを用いてもよく、また多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いることも可能である。
【００３０】
図２は、本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法に用いられるリアクタ（反応装置）の一の実施の形態を示す概略断面図である。リアクタは、反応容器１０と流動手段２０とからなり、反応容器１０は、反応容器上半部１３と反応容器下半部１４とからなり、反応容器上半部１３は反応容器下半部１４に取り外し可能に設けられている。
【００３１】
反応容器１０は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットＵ１、Ｕ２、Ｕ３、３枚の互いの吸着性領域を合わせ、生化学解析用ユニットを密着させて重ね合わせ、内部に着脱可能に取り付ける、上側挟持片１１と下側挟時片１２からなる取付部を有し、生化学解析用ユニットＵ１、Ｕ２、Ｕ３は反応容器上半部１３を取り外すことによってセットすることができるように構成されている。さらに、反応容器下半部１４の底壁には反応液が流通可能な溶液流入口１５が形成され、反応容器上半部１３の頂壁には同様に反応液が流通可能な溶液流出口１６が形成されている。
【００３２】
流動手段２０は溶液循環パイプ２１とポンプ２２から構成され、溶液循環パイプ２１の一端は反応容器１０の溶液流入口１５に、他端は溶液流出口１６に取り外し可能に取り付けられている。反応液はポンプ２２によって溶液流入口１５から反応容器１０内に入り、生化学解析用ユニットＵ１、Ｕ２、Ｕ３のそれぞれの吸着性領域４を横切るように強制的に流動した後、溶液流出口１６から出て、溶液循環パイプ２１を通って循環するように構成されている。
【００３３】
図３は、本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図である。反応容器３０は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットＵ１、Ｕ２、Ｕ３を、反応容器内部に着脱可能に取り付ける、第１挟持片３１、第２挟持片３２、第３挟持片３３、第４挟持片３４とからなる取付部を有し、生化学解析用ユニットＵ１は第２容器部３６から上の容器部を取り外して第１挟持片３１と第２挟持片３２によって、生化学解析用ユニットＵ２は第３容器部３７から上の容器部を取り外して第２挟持片３２と第３挟持片３３によって、生化学解析用ユニットＵ３は第４容器部３８を取り外して第３挟持片３３と第４挟持片３４によってセットすることができるように構成されている。さらに、第１容器部３５の底壁には反応液が流通可能な溶液流出口４１が、第４容器部３８の頂壁には反応液が流通可能な溶液流入口４０が形成されている。図３に示すように、複数枚の生化学解析用ユニットは必ずしも密着されていなくてもよい。
【００３４】
また、図３では１つの反応容器に複数枚の生化学解析用ユニットを収容するタイプのリアクタを示したが、１枚の生化学解析用ユニットを収容する反応容器を複数個、流動する反応液の１つの流路に、流動方向に対して直列に設けたものであってもよい。
【００３５】
なお、図２および図３では生化学解析用ユニットを３枚利用するリアクタを示したが、生化学解析用ユニットの枚数はこれに特に限定されるものではない。好ましい生化学解析用ユニットの枚数は、生化学解析用ユニットの吸着性領域の大きさや反応液の流動速度に関係するため、一概には言えないが、２〜８枚が反応液の流動維持の観点から好ましい。
【００３６】
また、図２および図３では反応液を流動させるためにポンプを利用して反応液を一定方向に循環流動させるリアクタを示しているが、反応液の強制的流動は、シリンジを利用するなどして生化学解析用ユニットの吸着性領域を往復流動するものであってもよいし、反応液が生化学解析用ユニットの下から上（あるいは上から下）に通過するのみで、反応液が循環しないタイプのものであってもよい。
【００３７】
本発明のアッセイ法では、生化学解析用ユニットを複数枚用い、この複数の生化学解析用ユニットを反応液の流動方向に対して直列に並べ、複数の生化学解析用ユニットに同一の反応液を強制的に流動させることによって、反応液量を増やすことなく複数枚の生化学解析用ユニットに固定されているリガンドまたはレセプタを特異的に結合させることができるので、サンプル濃度が希釈されて感度を低下させることがない。また、１枚の生化学解析用ユニットに対してレセプタまたはリガンドを特異的に結合させる時間で、複数枚の生化学解析用ユニットに対してレセプタまたはリガンドを特異的に結合させることができる。
【００３８】
１度にリアクタに取り付ける生化学解析用ユニットは、多孔性の吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプタの種類がそれぞれの生化学解析用ユニット間で同じであってもよいし、多孔性の吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプタの種類がそれぞれの生化学解析用ユニット間で異なっていてもよい。前者の場合には同じ実験を繰り返して行う手間を省きながら実験のサンプル数を増やすことができ、後者の場合には１度の実験で多種類のリガンドまたはレセプタの解析を測定誤差を最小限に抑えて行うことが可能である。
【００３９】
本発明は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットのリガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドが添加された反応液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させてレセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、レセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出するアッセイ法に広く適用することができる。
【００４０】
１つの態様として本発明は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットのリガンドまたはレセプタに、標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドが添加された反応液を、吸着性領域を横切るように強制的に流動させてリガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、標識レセプタまたは標識リガンドを検出するアッセイ法に適用することができる。
【００４１】
標識レセプタまたは標識リガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、標識物質によって標識されたものである。
【００４２】
標識物質としては、放射線標識物質、蛍光標識物質、化学発光基質と接触させることによって化学発光を生じさせる標識物質などがあげられ、標識物質そのものが放射線、発光、発色あるいは光を照射することによって蛍光を放出するものであっても、標識物質に何らかの化学物質を接触させて、標識物質によって化学物質が分解あるいは反応する等して発光、発色あるいは蛍光を放出するものであってもよい。前者の標識物質としては、放射線同位元素、発光物質にアクリジニウムエステル等、発色物質に金コロイド粒子等、蛍光物質にフルオレセイン等を用いることができる。また、後者の標識物質としては、酵素を用いることができ、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。これらの酵素に、化学発光基質あるいは色素基質あるいは蛍光基質を接触させることによってそれぞれ、化学発光、発色、蛍光を放出する。
【００４３】
化学発光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。また、色素基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合にはパラニトロフェノールリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の組合せ、ジアミノベンチジン、テトラメチルベンチジン、酵素がベータガラクトシダーゼの場合にはパラニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。蛍光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合４−メチルウンベリフェニルリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には３（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸、酵素がベータガラクトシダーゼの場合には、４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。
【００４４】
別の態様として、本発明はリガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する複数の生化学解析用ユニットのリガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドが添加された同一のハイブリダイゼーション反応液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させてレセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、レセプタまたはリガンドを標識物質によって標識された標識体と特異的に結合させ、レセプタまたはリガンドを検出するアッセイ法にも利用することができる。
【００４５】
これは、検出するレセプタまたはリガンドを、吸着性領域のリガンドまたはレセプタと標識体によって挟み込む、いわゆるサンドイッチ法と呼ばれる手法に適用したものである。ここでいう、レセプタまたはリガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質である。
【００４６】
標識物質によって標識された標識体とは、前述の標識物質によって標識され、レセプタまたはリガンドの反応部位に特異的に結合することができる抗原、抗体の他、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものを意味する。
【００４７】
さらに別の態様として本発明は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットのリガンドまたはレセプタに、補助物質が結合された補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドが添加された反応液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、補助物質に特異的に結合可能な結合可能標識物質を補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドを検出するアッセイ法にも利用することができる。
【００４８】
補助物質は結合可能標識物質が結合する物質であって、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。また、ビオチンに対するアビジンのような生物学的結合パートナーであってもよい。結合可能標識物質は、補助物質に特異的に結合可能であって前述の標識物質によって標識された物質である。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４９】
【実施例】
（実施例）
大きさが３０ｍｍ×３０ｍｍ、厚み１００μｍのＳＵＳ３０４シート（基板材料シート）に、孔径０．３ｍｍの開口部が円形の微細孔を、エッチングによって孔ピッチ０．４５ｍｍ、孔間隔０．１ｍｍで、１０×１０個を一単位として計１６００個形成した。
【００５０】
次に、基板材料シートの片面に接着剤を塗工し、続いて基板材料シートに形成した孔内部に入り込んだ接着剤を吸引除去した後、乾燥した。続いて、基板材料シートの接着剤を塗工した面に、バイオダインＡ（孔径０．４５μｍ：ポール社製）を重ね、１５０℃に加熱しながら、圧力が１ｃｍ２  当たり３００ｋｇとなるようにプレスして、基板材料シートの孔内部にバイオダインＡを圧入することで、ステンレス障壁と多数孔のポリマー充填領域とからなる生化学解析用ユニットを３枚作製した。
【００５１】
ＴＥバッファに溶解した分子量マーカーｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩ（２５０ｎｌ／μｇ：ロッシュ社製）を５分煮沸後、１分間氷冷しｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを１本鎖とした。これを上記で作製した１枚の生化学解析用ユニット１の吸着性領域にスポットし、その後紫外線を照射（２５４ｎｍ、３３ｍＪ／ｃｍ２  ）して、吸着性領域に１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを固定した。同様にして、生化学解析用ユニット２および生化学解析用ユニット３のそれぞれにＧＦＰ−ｃＤＮＡ、ルシフェラーゼ−ｃＤＮＡを固定した。
【００５２】
次に、５００ｎｇのＧＦＰ−ｃＤＮＡ、１００μＭジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ（アルカリ安定：ロッシュ社製）、１００μＭｄＴＴＰ、５００μＭｄＡＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＣＴＰ、オリゴ−ｄＴ１２−１８プライマー（インビトロジェン社製）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（インビトロジェン社製）を混合し２０μｌとした。ここにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を１μｌ添加し、４２℃で５０分間反応させた後、７０℃で１５分間処理して反応を停止した。ここにＲＮａｓｅＨ（インビトロジェン社製）を１μｌ添加し、３７℃で１５分間ＲＮＡを分解した。これをＣｈｒｏｍａＳｐｉｎＴＥ−３０（クロンテック社製）にて精製し、ジゴキシゲニン標識ＧＦＰを得た。
【００５３】
続いて、５００ｎｇのルシフェラーゼ−ｃＤＮＡ、１００μＭジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ（アルカリ安定：ロッシュ社製）、１００μＭｄＴＴＰ、５００μＭｄＡＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＣＴＰ、オリゴ−ｄＴ１２−１８プライマー（インビトロジェン社製）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（インビトロジェン社製）を混合し２０μｌとした。ここにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を１μｌ添加し、４２℃で５０分間反応させた後、７０℃で１５分間処理して反応を停止した。ここにＲＮａｓｅＨ（インビトロジェン社製）を１μｌ添加し、３７℃で１５分間ＲＮＡを分解した。これをＣｈｒｏｍａＳｐｉｎＴＥ−３０（クロンテック社製）にて精製し、ジゴキシゲニン標識ルシフェラーゼを得た。
【００５４】
ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されたｐＢＲ３２８（ロッシュ社製）、上記で調整したＤＩＧ標識ＧＦＰおよびＤＩＧ標識ルシフェラーゼのそれぞれ１０ｐｇを熱変性し、ハイブリダイゼーションバッファ（６×ＳＳＣ，０．０１ＭＥＤＴＡ，５×ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．５％ＳＤＳ，１００μｇＳｈｅａｒｄ，ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ）５ｍｌに添加した。
【００５５】
上記生化学解析用ユニット１，２，３の基板孔を合わせて密着させて重ね、図１に示すような、反応液を強制的に流動させるリアクタに固定し、リアクタ内に６５℃のプレハイブリダイゼーションバッファ（上記ハイブリダイゼーションバッファと同じもの）５ｍｌを１時間循環させた（線速度０．２ｃｍ／ｓｅｃ）。次に、ＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８、ＤＩＧ標識ＧＦＰ、ＤＩＧ標識ルシフェラーゼが添加されたハイブリダイゼーションバッファを６５℃の条件下１８時間、吸着性領域を横切る方法で循環させてハイブリダイゼーションを行った。続いて、洗浄バッファ１（２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で５分間２回、洗浄バッファ２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で５分間２回循環洗浄した（バッファ温度はいずれも６５℃）。
【００５６】
その後、ブロッキングバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ  に記載のもの）を室温で１０分間循環した後、５０分間循環を停止した。次に、アルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を濃度が１／１００００となるようにブロッキングバッファで希釈し、これを室温で１分間循環した後、６０分間停止した。
【００５７】
続いて、ケミルミ洗浄液（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ  に記載のもの）を１５分間室温で循環させた。これを３回繰り返し、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄ  ｔｏ  ｕｓｅ）を含む溶液と１時間接触させて、３枚の生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光をそれぞれ、冷却ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ１０００：富士写真フイルム社製）によって光電的に検出した。
【００５８】
（比較例）
ＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８、ＤＩＧ標識ＧＦＰ、ＤＩＧ標識ルシフェラーゼそれぞれ１０ｐｇを熱変性し、ハイブリダイゼーションバッファ１５ｍｌに添加し、このハイブリダイゼーションバッファ５ｍｌずつを用いて、３枚の生化学解析用ユニット（ｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ、ＨｉｎｆＩＧＦＰ−ＤＮＡ、ルシフェラーゼＤＮＡをそれぞれ固定した生化学解析用ユニット１，２，３）１枚ずつを別個に反応させた以外は実施例１と同様にして化学発光を行い、発光量を検出した。
【００５９】
実施例および比較例の生化学解析用ユニットにおける、シグナルの相対値を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2004271346.tif 000003
表１から明らかなように、実施例のシグナルは比較例のシグナルに比べて約３倍の感度で検出された。
【００６１】
以上のように、本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法では、生化学解析用ユニットの枚数に応じて反応液量を増やす必要がないので、サンプル濃度が希釈されて感度を低下させることがない。なお、ここでは効果を明確にさせるために、１枚の生化学解析用ユニットの吸着性領域のすべてに同じリガンドを結合させた生化学解析用ユニットを利用したが、すべての吸着性領域に異なるリガンドを結合させた生化学解析用ユニットを利用すれば、一度に多種類のレセプタを検出することが可能である。この場合、多孔性の吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプタの種類がそれぞれの生化学解析用ユニット間で同じものを用いれば、実験のサンプル数（ｎ数）を増やすことが可能である。
【００６２】
さらに、複数枚の生化学解析用ユニットを個別に利用してアッセイを行う場合には、アッセイごとの測定誤差を考慮して解析をする必要があるが、本発明のアッセイ法では、複数枚の生化学解析用ユニットを１度にアッセイすることができるので、測定誤差を相殺するような新たな処理を行う必要がないという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアッセイ法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図２】本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法に用いられるリアクタの実施の形態を示す概略断面図
【図３】本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図
【符号の説明】
１    生化学解析用ユニット
２    基板
３    孔
４    吸着性領域
５    リガンドまたはレセプタ
１０    反応容器
２０    流動手段
Ｕ１    生化学解析用ユニット
Ｕ２    生化学解析用ユニット
Ｕ３    生化学解析用ユニット
【図１】
2004271346.tif 000004
【図２】
2004271346.tif 000005
【図３】
2004271346.tif 000006