(57)【要約】【課題】　本発明は、細胞、特に動物細胞又は組織を培養するための、アルブミン代替物、トランスフェリン代替物、及びインスリン代替物を含んで成る種類の組成物であって、組み換えタンパク質以外には動物タンパク質を伴わない組成物の提供を課題とする。【解決手段】　本発明の組成物は、アルブミン代替物が、１重量％以下の量のポリエチレングリコールであることを特徴とする。本発明の他の対象は、かかる組成物を含んで成る培養培地である。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　細胞、詳細には動物細胞又は組織の培養をするためのアルブミン代替物、トランスフェリン代替物及びインスリン代替物を含んで成る種類の組成物であって、組換えタンパク質以外には動物タンパク質を伴わず、前記アルブミン代替物が１重量パーセント未満の量のポリエチレングリコールであることを特徴とする組成物。
【請求項２】
　エリソルビン酸ナトリウムも含んで成ることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
　前記エリソルビン酸ナトリウムの量が０．１重量％以下、詳細には、５・１０-3重量％未満であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
　前記ポリエチレングリコールの量が１〜５重量％、詳細には１〜３重量％であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
　前記ポリエチレングリコールが、５０〜１００，０００Da、詳細には２０，０００Daの分子量を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
　ポリエチレングリコールと複合されている物質も含んで成ることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
　前記複合した物質が脂質であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
　前記複合した物質が増殖因子であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
　粉末の形態であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
　請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を含んで成ることを特徴とする、細胞、詳細には動物細胞又は組織を培養するための培養培地。
【請求項１１】
　前記組成物を溶かすことによって得られ、前記ポリエチレングリコールの濃度が１０g／l以上であることを特徴とする、請求項１０に記載の培養培地。
【請求項１２】
　前記ポリエチレングリコールの濃度が１０〜５０g／l、詳細には１０〜３０g／lであることを特徴とする、請求項１１に記載の培養培地。
【請求項１３】
　請求項２に従属する場合、前記エリソルビン酸ナトリウムの濃度が１g／l以下、詳細には５０mg／l未満であることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項１４】
　アルブミンも含むことを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項１５】
　前記アルブミンの濃度が５g／ｌ以下であることを特徴とする、請求項１４に記載の培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、細胞、詳細には、動物細胞又は組織細胞を培養するための組成物、及びかかる組成物を含んで成る培養培地に関連する。
【０００２】
　詳細には、本発明は組み換え動物タンパク質以外には動物タンパク質を含まない組成物及び細胞培養培地に関連する。
【背景技術】
【０００３】
　ヒトの中へ直接移植できうる細胞のためのｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養培地の分野では、主成分が血清である培地が既に知られている。しかし、これらの培地は欠点を有する。
【０００４】
　第一に、かかる培地の組成は部分的にしか知られておらず、異なる血清の間で、そして同じ血清の異なるバッチの間での機能的再現性の観点で特に問題をもたらす。
【０００５】
　加えて、血清は病原性因子の潜在的な運搬体である。詳しくは、血清がウシ由来である場合、プリオンによる汚染の危険性はゼロではない。
【０００６】
　これらの欠点を改善するために、血清を伴わない培養培地、又は「血清フリーの」培養培地が提案されてきた。その培地は、それらの本質的な成分として、アルブミン、トランスフェリン及びインスリンなど、血清の代替物として働く精製された天然タンパク質を有する。しかし尚、かかる培地の標準化を達成することは困難であり、そして病原性因子による汚染の危険性は有意なままである。加えて、これらの培地中にタンパク質が存在することで、取扱い中、滅菌ろ過段階での困難、特に多孔性０．２ミクロンの膜による分離中に困難が生ずる。
【０００７】
　更に、かかるタンパク質を含む培養培地は生産コストが高い。
【０００８】
　これらの欠点を解消しようとするために、アルブミン代替物、トランスフェリン代替物及びインスリン代替物を含んで成る培養培地が、特に公文書ＷＯ−９８／３０６７９から、公知である。しかし、かかる培地にはタンパク質がないわけではなく、その理由は、特に用いられているアルブミン代替物自身タンパク質であるからだ。
【０００９】
　この種類の培地は血清を全く含まない培地であるが、タンパク質を使用することに関連した欠点、例えば病原性因子による汚染の危険性及び標準化における困難を完全に解消しない。
【００１０】
　故に、本出願人は、アルブミンを、類似する特性を有するが、上記の欠点がない成分で代替する、試みを行うために、多大な試験を行った。
【特許文献１】ＷＯ９８／０３０６７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
　従って、本出願人は、アルブミン代替物としてポリエチレングリコールを要求された機能を果たす所定の濃度で含んで成る組成物及び培養培地を規定した。
【００１２】
　この組成物及びこの培地は利点を有する。何故なら、それらは、ヒト、動物又は非組換え起源のタンパク質を含んでおらず、完全に管理されそして再現可能な製剤でありそして病原性因子を伝達する危険性がないからである。加えて、この培地では、その後のろ過段階中の取扱いにおける困難が生じない。
【００１３】
　更に、かかる組成物及びかかる培地のコストは、精製された天然タンパク質を含む組成物及び培地よりもかなり低い。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
　これにより、そして最初の観点により、本発明は、細胞、特に動物細胞又は組織細胞を培養するための組成物であって、組み換えタンパク質以外には、動物タンパク質を伴わないアルブミン代替物、トランスフェリン代替物及びインスリン代替物を含んで成る種類の組成物（ここにおいて前記アルブミン代替物は、１重量％以上のポリエチレングリコールである）を提案する。
【００１５】
　１つの実施態様により、前記組成物はエリソルビン酸ナトリウムをも含んで成る。
【００１６】
　第２の観点により、本発明は、かかる組成物を含んで成る培養培地を提案する。
【００１７】
　本発明の他の目的及び利点は、下記の説明中に表れるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
　本発明の組成物は組み換え動物タンパク質以外には、動物タンパク質を伴わない。この理由は、この組成物中でその役割が不可欠である全ての天然タンパク質、即ちアルブミン、トランスフェリン及びインスリンが、同等の特性を有するが、再現性又は病原性因子による感染の問題を生じない成分によって置換されているからである。
【００１９】
　これにより、トランスフェリンは、例えば、硫酸鉄、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ又はグルコン酸などの鉄キレート物質により公知の方法によって置換され、かくして精製されたヒトトランスフェリンが用いられる場合に必ず行われる低温殺菌相が避けられる。
【００２０】
　例えば、インスリンは組換えヒトインスリン又は、亜鉛塩による公知の方法によって置換されている。
【００２１】
　アルブミンに関して、細胞培養の観点から、アルブミンと同じ複数の機能を果たすことができ、アルブミンと同じ欠点を持たない代替物を発見することが必須である。
【００２２】
　この理由は、アルブミンが存在すること、詳しくは注射可能なアルブミンが存在することで、上記の再現性及びコストの欠点に加え、加熱によって行われるウィルスを不活性化する段階中に欠かせない安定化剤が存在することに関連した問題が生じるからである。実際にこれらの薬剤は細胞培地と適合しない。
【００２３】
　加えて、注射可能なヒトアルブミンは粉末形態では入手不可である。これは、かかるアルブミンを含んで成る培地がそれら自体何故液体形態でしか入手できないのかの理由である。従って、これらの培地が高体積で必要な場合、例えば、生物工学工業で使用するためには、生産及び物流の有意な問題をもたらす液体形態でしか入手可能ではない。
【００２４】
　ポリエチレングリコールをアルブミン代替物として用いることで、特に粉末及び液体の両方の形態において入手可能であるという事実により、これらの欠点を解消することが可能となる。粉末及び液体の両方の形態で入手できることは、必要な形態において組成物を獲得することが可能にもなる。
【００２５】
　ポリエチレングリコールには、細胞培養においてアルブミンと同様の機能特性を有する利点がある。この理由は、培養培地内で、ポリエチレングリコールが特に、浸透性作用、細胞膜に対する安定化作用、及び培養中の細胞生存率の維持作用を発揮するからである。加えて、ポリエチレングリコールは、フリーラジカルの解毒物質及びトラップ物質の役割を果たし、従って、必要な場合、膜脂質の過酸化を防ぐ。
【００２６】
　アルブミンの最適な役割を果たすために、組成物中に導入されるポリエチレングリコールの量は、本発明により、１重量％以上である。
【００２７】
　詳細には、この量は１〜５重量％であり、そして詳細には、１〜３重量％である。
【００２８】
　用いられるポリエチレングリコールは、例えば、５０〜１００，０００Da、詳細には２０，０００Daの分子量を有する。この種類のポリエチレングリコールを使用することは、臨床使用のために必要な量的及び安全性の要求に十分に見合う利点がある。この理由は、これらのポリマーは通常、化粧品及び医薬組成物のための溶媒、合成中間体又は賦形剤として用いられており、従って医薬としての等級を有するからである。
【００２９】
　ある実施態様により、本発明の組成物はエリソルビン酸ナトリウムを０．１重量％以下、詳細には１０-6重量％〜０．１重量％含んで成る。更に詳細には、エリソルビン酸ナトリウムの量は５×１０-3重量％未満であり、そして特に１０-4重量％〜５×１０-3重量％である。かかる分子を組成物中に導入することには、抗酸化物質分子の代わりの役割を果たさせる意味がある。この理由は、エリソルビン酸ナトリウムには強い抗酸化力を有し、にもかかわらず欠点、例えば、ビタミンＣ及びＥ（その抗酸化作用はビタミン活性に制限される）を使用することに関連した欠点がないからである。加えて、エリソルビン酸ナトリウムは、医薬及び食物等級ある。
【００３０】
　更に、ポリエチレングリコールとエリソルビン酸ナトリウムの組み合わせは、考察された用途において、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養における細胞及び組織に関するそれらの相補的保護作用により特に注目されている。
【００３１】
　この相補的作用は、エリソルビン酸ナトリウムが、培養中の細胞及び組織の環境を構成する生物培地に対する抗酸化作用を有し、ポリエチレングリコールとは原則的に、前記組織及び細胞の構造的及び機能的完全性の維持をする作用があるという事実に由来する。
【００３２】
　他の実施態様により、本発明の組成物は、いわゆる「ｐｅｇ化（pegylation）」法によって、ポリエチレングリコールと複合している物質も含んで成ることができる。この理由は、多くの分野において、ポリエチレングリコールは治療機能を有する分子のための担体として用いられているからであり、低分子量（１，０００ｇ／mol未満）又は高分子量（最大で１００，０００ｇ／mol）のポリエチレングリコールが用いられている。
【００３３】
　考察された用途において、この複合物質は、脂質であって良く、この場合ポリエチレングリコールは、タンパク質を含む組成物におけるアルブミンと類似する態様で、脂質の担体としての役割を果たす目的とする。例えば、９００Daの分子量のポリエチレングリコールがコレステロールを固定化するのに用いられて良い。
【００３４】
　加えて、ポリエチレングリコールは他の多くの物質と複合できうる利点を有し、その複合可能性は、アルブミンのものよりも一層広い。例えば、４５００又は１０，０００Daの分子量のポリエチレングリコールを、ヒト顆粒球ＣＳＦ（造血管系統細胞（haematopoietic strained cell）のための特異的増殖因子である）の細胞培養培地中での活性を高めるために、ヒト顆粒球ＣＳＦに対して固定化して良い。この理由は、増殖因子は培養培地中で非常に急速に消滅するという欠点を有することが知られているからである。しかし、それらがポリエチレングリコールと複合することにより、増殖因子の安定性が向上されうる。
【００３５】
　本発明の他の対象は、かかる組成物を含んで成る培養培地である。
【００３６】
　この培地は、ポリエチレングリコール濃度が１０ｇ／ｌ以上となるように上記のいずれかの組成物を溶かすことによって得られうる。
【００３７】
　ある実施態様によれば、ポリエチレングリコールの濃度は、１０ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌであり、そして詳細には１０ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌである。
【００３８】
　加えて、培養培地はエリソルビン酸ナトリウムを含んで成る組成物を溶かすことによっても得ることができ、そのエリソルビン酸ナトリウムの濃度は１ｇ／ｌ以下であり、そして詳細には、０．０１mg／ｌ〜１ｇ／ｌである。一層詳細には、前記エリソルビン酸ナトリウムの濃度は５０mg／ｌ未満であり、詳細には１mg／ｌ〜５０mg／ｌである。
【００３９】
　かかる培養培地は、予め処方された組成物を所定の体積の液体中に溶かすことによって、即ち本発明の組成物の全成分を同時に溶かすことによって、得ることができうる。
【００４０】
　改良型では、培養培地は、各成分の濃度が要求された数値に合致する培養培地を得るようにするために、本発明の組成物の所定の成分を別々に溶解することによって得ることができうる。
【００４１】
　かかる培養培地の一般構成がこの度記載されている。即ち、この培地は：
−　参照基本製剤、詳細にはＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）、ＲＰＭＩ１６４０などである。これら基本製剤は、本質的に無機塩、アミノ酸、ビタミン及び他の成分、特にグルコースをそのエネルギーを供給するため、そしてＨＥＰＥＳをそのブァファー性能のために含んで成る。
−　基本サプリメント、例えば、詳細には、非必須アミノ酸、無機質及びトレースエレメント、
−　組み換えヒトインスリン又は亜鉛塩からなる代替物、
−　トランスフェリン代替物としての鉄キレート物質、
−　培養培地中５０ｇ／ｌ未満の濃度詳細には１０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ、２５ｇ／ｌ及び３０ｇ／ｌの濃度で用いられた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
−　可能としては、エリソルビン酸ナトリウム（培地中０．０１mg／ｌ〜１ｇ／ｌの濃度で、更に正確には１mg／ｌ〜５０mg／ｌの濃度で用いられる）
−　各々の培養する細胞型の増殖及び代謝活性に対して特異的な分子サプリメント；
を含んで成る。
【００４２】
　これらの特異的サプリメントに関して、前記培地に植物由来の分子を使用することを排除していない。不溶性脂質も、遊離形態又は複合形態で、特にシクロデキストリンとの複合形態で添加されて良い。
【００４３】
　従って、本発明の培地を用いて動物細胞又は組織の培養を行うことが可能である。列示することによって、細胞培養培地の４つの例をこの度説明し、それらは２つの異なる用途のために至適化されている。例１及び例２には、幹細胞及び造血性前駆細胞を増殖させるために至適化された培地を説明しており；例３及び４は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを培養するために至適化された培地を規定する。
【００４４】
　現在のところ、幹細胞及び造血性前駆細胞の培養をするために通常用いられる市販の培地は、Ｘ−ＶＩＶＯの範囲に属する。製造者の説明書によれば、これらの培地は、基本製剤、医薬等級のヒトアルブミン、組換えヒトインスリン及び滅菌されたヒトトランスフェリンから成る。培養培地は、血清抜きの培養培地のためのこの製造基準との比較において開発された。
【００４５】
実施例１：
　幹細胞及び造血性前駆細胞増殖培地を、下記の処方により規定した。
−　無水ＣａＣｌ2（１６５mg／ｌ）、ＫＣｌ（３３０mg／ｌ）、ＫＮＯ3（０．０７６mg／ｌ）、無水ＭｇＳＯ4（９７．６７mg／ｌ）、ＮａＣｌ（４５０５mg／ｌ）、ＮａＨＣＯ3（３０２４mg／ｌ）、ＮａＨ2ＰＯ4.Ｈ2Ｏ（１２５mg／ｌ）、Ｎａ2ＳｅＯ3.５Ｈ2Ｏ（０．０１mg／ｌ）、グルコース（４５００mg／ｌ）、ＨＥＰＥＳ（５９５８mg／ｌ）、フェノールレッド．Ｎａ（１５mg／ｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１１０mg／ｌ）、Ｌ−アラニン（２５mg／ｌ）、Ｌ−アルギン酸．ＨＣｌ（８４mg／ｌ）、Ｌ−アスパラギン．Ｈ2Ｏ（２８．４０mg／ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸（３０mg／ｌ）、Ｌ−シスチン．２ＨＣｌ（９１．２４mg／ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（７５mg／ｌ）、Ｌ−グルタミン（５８４mg／ｌ）、グリシン（３０mg／ｌ）、Ｌ−ヒスチジン．ＨＣｌ．Ｈ2Ｏ（４２mg／ｌ）、Ｌ−イソロイシン（１０５mg／ｌ）、Ｌ−ロイシン（１０５mg／ｌ）、Ｌ−リジン．ＨＣｌ（１４６mg／ｌ）、Ｌ−メチオニン（３０mg／ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン（６６mg／ｌ）、Ｌ−プロリン（４０mg／ｌ）、Ｌ−セリン（４２mg／ｌ）、Ｌ−トレオニン（９５mg／ｌ）、Ｌ−トリプトファン（１６mg／ｌ）、Ｌ−チロシン．２Ｎａ．２Ｈ2Ｏ（１０４．２０mg／ｌ）、Ｌ−バリン（９４mg／ｌ）、Ｄ−ビオチン（０．０１３mg／ｌ）、Ｄ−Ｃａパントテン酸（４mg／ｌ）、塩化コリン（４mg／ｌ）、葉酸（４mg／ｌ）、ｉ−イノシトール（７．２mg／ｌ）、ニコチンアミド（４mg／ｌ）、ピリドキシン．ＨＣｌ（４mg／ｌ）、リボフラビン（０．４mg／ｌ）、チアミン．ＨＣｌ（４mg／ｌ）、ビタミンＢ12（０．０１３mg／ｌ）：からなるＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｅｃｃｏ培地）
−　基本サプリメント、詳細にはトレースエレメント、
−　組換えヒトインスリン（１〜１００mg／ｌ）又は塩化亜鉛などのインスリン代替物（０．１〜１０mg／ｌ）、
−　グルコン酸第二鉄（５０〜１０００mg／ｌ）
−　２０，０００DaのＰＥＧ（１０〜３０ｇ／ｌ）
−　これらの細胞を増殖させるための特異的サプリメント、例えば：還元グルタチオン（０．０１〜０．１mg／ｌ）及びヌクレオシド（０．１〜１０mg／ｌ）
である。
【００４６】
実施例２：
　幹細胞及び造血性前駆細胞増殖培地は、実施例１で規定したものとは同じであり、エリソルビン酸ナトリウム（１〜５０mg／ｌ）も含んで成る。
【００４７】
　臍帯血から抽出した原始造血細胞（ＣＤ３４+）を培養培地中に細胞８０００個／mlの濃度で播種した。これらの細胞の増殖を始めさせるために、増殖因子（サイトカイン）の２つの組み合わせを添加した。
−　サイトカインカクテル１番は、ＳＣＦ（５０ng／ml）、ＴＰＯ（５０ng／ml）、ＦＬ（５０ng／ml）、Ｇ−ＣＳＦ（４０Ｕ／ml）、ＧＭ−ＣＳＦ（５Ｕ／ml）、ＩＬ−３（１．７Ｕ／ml）及びＩＬ−６（１０Ｕ／ml）に基づいており、
−　サイトカインカクテル２番は、ＳＣＦ（５０ng／ml）、ＴＰＯ（５０ng／ml）、ＦＬ（５０ng／ml）、ＩＬ−３（１．７Ｕ／ml）及びＩＬ−６（１０Ｕ／ml）に基づいている。
【００４８】
　培養物を、９５％空気／５％ＣＯ2を含んで成る湿気で飽和した雰囲気中３７℃で７日に渡りインキュベートした。増殖の７日後、細胞数及び生存率を測定し、そしてクローン原性前駆細胞の増殖率を測定するために、半固体培地（Ｈ４４３４．Stem Cell Technologies）に細胞を播種した。結果を表１中に示している。
【表１】
2004135672.tif 000002
【００４９】
　これらの結果により示されることは、サイトカインカクテル１番では、本発明の培地を調製するために用いたＩＭＤＭ基本製剤中で細胞増殖の制限が生じた（６３×）ことである。ＰＥＧを除くサプリメントの添加で、この増殖（１４８×）結果を証明した。最後に、ＰＥＧを添加することで本発明の培地の能力が補強され、そしてそれにより参照培地（２２５×）に匹敵する程度の増殖（２１９×）を達成することが可能である。
【００５０】
　性能の類似性が、サイトカインカクテル２番を用いることで確認された。全ての場合、７日間の培養後に測定した細胞の生存率は優れている（８５％〜９７％）。次いで、クローン原性細胞の培養により、実施例２の培養培地の高質性が、クローン原性前駆細胞（半個体培地中、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞のコロニーを起こすことができる前駆細胞）を増殖させる観点から優れていることが証明された。
【００５１】
　得られたコロニーの分析を表２に詳細に示している。
【表２】
2004135672.tif 000003
【００５２】
　クローン原性指数（播種した１００個の細胞について数えられたコロニーの総数）は本発明の培地とその参照との間で不変（試験された４００個の細胞について約１３０個のコロニーが数えられた）である。しかしながら、様々な型のコロニー間での分布も本発明の培地についての利点に類似している。即ち、注目のＣＦＵ混合及びＣＦＵ−ＧＭの前駆細胞をより良く表している。臍帯血のヒト細胞ＣＤ３４+の増殖の程度及びＣＦＵ混合型のクローン原性前駆細胞の特有の保存に対するＰＥＧの効果を本発明の培地の他の製剤並びに市販の参照培地において分析することができた（結果は示していない）。
【００５３】
実施例３：
　モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの工業生産をするための培地を下記の処方により規定した。
−　Ｃａ（ＮＯ3）2.４Ｈ2Ｏ（１００mg／ｌ）、ＫＣｌ（４００mg／ｌ）、ＭｇＳＯ4.７Ｈ2Ｏ（１００mg／ｌ）、ＮａＣｌ（５０００mg／ｌ）、ＮａＨＣＯ3（２０００mg／ｌ）、ＮａＨ2ＰＯ4.７Ｈ2Ｏ（１５１２mg／ｌ）、グルコース（２０００mg／ｌ）、グルタチオン（還元）（１mg／ｌ）、ＨＥＰＥＳ（５９５７．４mg／ｌ）、フェノールレッド．Ｎａ（５mg／ｌ）、Ｌ−アルギニン（２００mg／ｌ）、Ｌ−アスパラギン．Ｈ2Ｏ（５０mg／ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸（２０mg／ｌ）、Ｌ−シスチン（５０mg／ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（２０mg／ｌ）、Ｌ−グルタミン（３００mg／ｌ）、グリシン（１０mg／ｌ）、Ｌ−ヒスチジン（１５mg／ｌ）、ヒドロキシ−Ｌプロリン（２０mg／ｌ）、Ｌ−イソロイシン（５０mg／ｌ）、Ｌ−ロイシン（５０mg／ｌ）、Ｌ−リジン．ＨＣｌ（４０mg／ｌ）、Ｌ−メチオニン（１５mg／ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン（１５mg／ｌ）、Ｌ−プロリン（２０mg／ｌ）、Ｌ−セリン（３０mg／ｌ）、Ｌ−トレオニン（２０mg／ｌ）、Ｌ−トリプトファン（５mg／ｌ）、Ｌ−チロシン（２０mg／ｌ）、Ｌ−バリン（２０mg／ｌ）、ｐ−アミノ安息香酸（１mg／ｌ）、Ｄ−ビオチン（０．２mg／ｌ）、Ｄ−Ｃａパントテン酸（０．２５mg／ｌ）、塩化コリン（３mg／ｌ）、葉酸（１mg／ｌ）、ｉ−イノシトール（３５mg／ｌ）、ニコチンアミド（１mg／ｌ）、ピリドキシン．ＨＣｌ（１mg／ｌ）、リボフラビン（０．２mg／ｌ）、チアミン．ＨＣｌ（１mg／ｌ）、ビタミンＢ12（０．００５mg／ｌ）：からなるＲＰＭＩ１６４０基本製剤
−　基本補体、特にトレースエレメントのための基本補体
−　塩化亜鉛などのインスリン代替物（０．０１〜１０mg／ｌ）
−　グルコン酸第二鉄（５０〜１０００mg／ｌ）
−　２０，０００DaのＰＥＧ（１０〜３０ｇ／ｌ）
−　ハイブリドーマを増殖させるための特異的補体、例えば：ヌクレオシド（０．１〜１０mg／ｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１〜１００mg／ｌ）、プトレッシン２ＨＣｌ（０．０５〜５mg／ｌ）、ヒポキサンチン（０．１〜１０mg／ｌ）
である。
【００５４】
実施例４：
　モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの工業培養をするための培地を、エリソルビン酸ナトリウムを添加（１〜５０mg／ｌ）して実施例３のものと同じようにして規定した。
【００５５】
　モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの培養のために、ＩＭＤＭ及びＤＭＥＭ／ＨＡＭ−Ｆ１２（１／１）基本製剤も推奨されている。次いで、本発明の培地の補体を、用いた基本製剤により規定する。即ち、基本ＤＭＥＭ／ＨＡＭ−Ｆ１２は、直接、プトレッシン、ヒポキサンチン、チミジン又はピルビン酸ナトリウムなどの分子を含む。
【００５６】
　組成物から得た培養培地は、従って、治療目的で動物細胞及び組織の培養をするために、特に：
−　体細胞、詳細には、骨髄、末梢血液及び臍帯血に由来する幹細胞及び造血性前駆細胞の培養、
−　免疫細胞、詳細には、ＰＢＬ（末梢血管リンパ球）、ＬＡＫ（リンホカイン活性化キラー細胞）及びＴＩＬ（腫瘍浸潤性リンパ球）の培養及び活性化、
−　単球及びマクロファージの培養、
−　抗原提示細胞、詳細には、樹状細胞の生産、
−　肝細胞の培養（特に、バイオ人工肝臓の移植又は調製をするため）、
−　ランゲルハンス島の培養（特に、糖尿病の治療を背景として）、
−　間充織幹細胞の増殖及び分化（特に骨欠損（bone deficit）の治療を背景として）、
−　筋細胞の培養（特に心臓欠損の治療を背景として）、
−　神経細胞、体細胞、胎児又は胚細胞の培養（特に神経変性疾患の治療を背景として）、
−　角膜組織又は他の組織の培養、
−　胚性幹細胞の培養、
−　治療目的のための細胞及び組織の解凍、洗浄及び凍結、
をするために用いることができうる。
【００５７】
　本発明により、治療目的のためのヒト細胞の所定の調製をするために例えば、ＰＥＧがアルブミンに一部置き代えられている培養培地を用いることもできうる。これにより、培養培地は、最初に本発明の組成物を溶かして、次に必要量のアルブミンを添加することによって得られる。例えば、培養培地に対して加えられたアルブミンの量は５ｇ／ｌ未満であって良く、それは即ち、一般には最大で５０％の必要なアルブミンがＰＥＧで置換されているということである。
【００５８】
　動物タンパク質を使用することに関連した潜在的な汚染の問題を解決するために、次いで注射可能なヒトアルブミン（ＨＳＡ）を使用することが好ましい。
【００５９】
　例えば、アルブミンは、正常な末梢血液由来の造血幹細胞（増殖させるのが困難な細胞）の増殖において優位な役割をし、そして樹状細胞の回収をするためにも有用（プラスティックの支持体から細胞を除去するのに役立つ）でありうる。
【００６０】
　アルブミンを含む培養培地の生産の例を下に示している。
【００６１】
実施例５：
　臍帯血から抽出した原始造血細胞（ＣＤ３４+）を培養培地中に細胞８０００個／mlの濃度で播腫した。これらの細胞の増殖を始めさせるために、増殖因子（サイトカイン）：ＳＣＦ（４０ng／ml）、ＴＰＯ（４０ng／ml）、ＦＬ（４０ng／ml）、ＩＬ−３（１．７Ｕ／ml）及びＩＬ−６（１０Ｕ／ml）を添加した。培養物を、９５％空気／５％ＣＯ2の湿気で飽和した雰囲気中３７℃で７日に渡りインキュベートした。増殖の７日後、細胞数及び生存率を測定した。結果を表３中に示している。
【表３】
2004135672.tif 000004
【００６２】
　これらの結果により示されたことは、アルブミン含量が減少した場合に、これらの細胞が増殖する程度が（アルブミン含量を１０ｇ／ｌから２ｇ／ｌにすると、３０４×から２４２×となる）減少するということである。アルブミンの一部代替、詳細には２０，０００DaのＰＥＧにより代替することで、培養培地の性能を維持させることが可能（例えば、アルブミン含量を３ｇ／ｌに制限した培地で２９９×）である。
【００６３】
　従って、アルブミン及びその代替物の類似及び付加特性により、アルブミン含量を有意に減らして、その結果かかる培地の運転費を下げることが可能であると考えられる。
【００６４】
　本発明の組成物から得た培養培地がその特性及びその低運転費を有することで、それは生物工学産業分野における幅広い分野の用途、詳細には：
−　モノクローナル抗体がヒトに直接注射できうる場合に特に、これらの抗体を生産するハイブリドーマの培養（この用途では、本発明の培地には汚染されている免疫グロブリンを有さない利点がある）
−　治療、ワクチン、診断又は研究目的のために、細胞、特にミエローマ及びＣＨＯ（チャイニーズハムスターオバレイ細胞）でトランスフェクトされた又はされていない、多くの細胞株を培養することによって生産された分子の調製
−　細胞の培養による生物物質（biological entities）の生産、詳細には、遺伝子治療のためのウィルスベクターの生産
を含んで成る分野での用途がもたらされる。