(57)【要約】【課題】酵素活性がカルシウム濃度に依存しない、特に食品工業で使用しやすい、中性領域に至適酵素活性を有する新規なホスホリパーゼＡを提供する。また、リン脂質の１位のアシル基を加水分解するが、１‐アシルリゾリン脂質を分解する活性を有さず、反応制御の容易なホスホリパーゼＡを提供する。さらに、このようなホスホリパーゼＡを生産する微生物、このようなホスホリパーゼＡの製造方法、このホスホリパーゼＡを用いるリゾリン脂質の製造方法をも提供する。【解決手段】リン脂質の１位のアシル基を加水分解するが、１‐アシルリゾリン脂質分解活性を実質的に有さないホスホリパーゼＡ。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質の１位のアシル基を加水分解するが、１‐アシルリゾリン脂質分解活性を実質的に有さないホスホリパーゼＡ。
【請求項２】
以下の特性１）〜６）を有する、請求項１記載のホスホリパーゼＡ：
１）  ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ法による見かけの分子量が、約１８，０００である；
２）  等電点電気泳動法による等電点が、ｐＩ３．５である；
３）  安定温度については、７５℃以下の温度で完全に失活することはない；
４）  安定ｐＨは、ｐＨ４．５〜ｐＨ１０．０である；
５）  カルシウムの影響については、ｐＨ７．０において大豆レシチンを基質としたとき、塩化カルシウム濃度６ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、酵素活性は実質的に同等である；及び
６）  リパーゼ活性を実質的に有さない。
【請求項３】
大豆又は卵黄由来レシチンを基質とした場合に、以下の特性７）〜１０）をさらに有する、請求項１又は２記載のホスホリパーゼＡ：
７）  活性ｐＨは、ｐＨ４〜ｐＨ９．５である；
８）  活性温度は、６５℃以下である；
９）  最適ｐＨは、ｐＨ７．０付近である；及び
１０）  最適温度は、５０℃付近である。
【請求項４】
微生物由来である、請求項１〜３のいずれか１項記載のホスホリパーゼＡ。
【請求項５】
微生物が糸状菌である、請求項４記載のホスホリパーゼＡ。
【請求項６】
糸状菌がセイリディウム（Ｓｅｉｒｉｄｉｕｍ）属菌である、請求項５記載のホスホリパーゼＡ。
【請求項７】
糸状菌がセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットン〔Ｓｅｉｒｉｄｉｕｍ  ｕｎｉｃｏｒｎｅ  （Ｃｏｏｋｅ  ＆  Ｅｌｌｉｓ）  Ｓｕｔｔｏｎ〕である、請求項６記載のホスホリパーゼＡ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のホスホリパーゼＡを生産する能力を有する単離された微生物。
【請求項９】
糸状菌である、請求項８記載の微生物。
【請求項１０】
セイリディウム（Ｓｅｉｒｉｄｉｕｍ）属菌である、請求項９記載の微生物。
【請求項１１】
セイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットン〔Ｓｅｉｒｉｄｉｕｍ  ｕｎｉｃｏｒｎｅ  （Ｃｏｏｋｅ  ＆  Ｅｌｌｉｓ）  Ｓｕｔｔｏｎ〕である、請求項１０記載の微生物。
【請求項１２】
セイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットン〔Ｓｅｉｒｉｄｉｕｍ  ｕｎｉｃｏｒｎｅ  （Ｃｏｏｋｅ  ＆  Ｅｌｌｉｓ）  Ｓｕｔｔｏｎ〕  ＳＡＮＫ  ３０６９９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ‐８２８９菌株）。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項記載の微生物を、請求項１〜７のいずれか１項記載のホスホリパーゼＡの生産に適した条件下で培養し、その培地又は微生物を回収し、回収された材料から請求項１〜７のいずれか１項記載のホスホリパーゼＡを分離及び／又は精製することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載のホスホリパーゼＡの製造方法。
【請求項１４】
リン脂質を含有する材料を用意し、この材料と請求項１〜７のいずれか１項記載のホスホリパーゼＡとを接触させて酵素反応を起こさせ、リゾリン脂質を含有する反応生成物を生成させ、この生成物を回収することを特徴とする、リゾリン脂質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスホリパーゼＡ及びこの酵素を生産する微生物に関する。具体的には、本発明は、食品工業及び医薬品工業における使用に特に適するホスホリパーゼＡ、特に糸状菌等の微生物に由来するホスホリパーゼＡ、及びこの酵素を生産する糸状菌等の微生物に関する。本発明は、さらに、この酵素の製造方法及びこの酵素を用いるリゾリン脂質の製造方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
レシチンは、動物、植物、菌類に広く分布している代表的なグリセロリン脂質である。レシチンは、界面活性作用、酸化防止作用、生理活性作用等を有し、食品、飼料、医薬品等に利用されている。食品工業においては、卵黄レシチンや大豆レシチン等に代表される天然レシチンが食品添加物として認可されており、商品の性質を改変するために主に乳化剤等として使用され、豊富に供給されている。
【０００３】
一方、リゾレシチンは、レシチンからそのグリセロールの１位及び２位に結合している２つの脂肪酸のうちの１つを解離させた物質であり、１‐アシルリゾレシチン及び２‐アシルリゾレシチンの２種が存在する。
【０００４】
レシチンは水に難溶性であるが、リゾレシチンは水に可溶である。また、リゾレシチンには１‐アシルリゾレシチンと２‐アシルリゾレシチンとがあり、これらはアシル基の位置が異なる。そのため、レシチン、１‐アシルリゾレシチン及び２‐アシルリゾレシチンは、それぞれ食品添加物として使用した場合に、得られる食品の物性が異なる可能性があり、いずれも食品工業においては使用を検討するに値する物質となっている。
【０００５】
リゾレシチンの製造は化学的に行うことも可能である。しかし、食品工業においては天然由来のレシチンを酵素で加水分解することによりリゾレシチンを製造する方が望ましい。また、医薬品の製剤への使用においても、天然由来のリゾレシチンを使用する方が、安全性において優れていると考えられる。
【０００６】
リゾレシチンの製造に用いられる酵素としては、ホスホリパーゼＡ、すなわちホスホリパーゼＡ２及びホスホリパーゼＡ１がある。
ホスホリパーゼＡ２は、水の存在下、反応式：
【０００７】
【化１】
2004261022.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれアルキル基を、Ｒ３は、コリン、エタノールアミン、グリセロール、イノシトール等の基を意味する。）
で示されるように、グリセロリン脂質（例えばレシチン）の２位のエステル結合を加水分解し、１‐アシル‐２‐リゾリン脂質（例えば１‐アシルリゾレシチン）と脂肪酸とを生成する触媒作用を有している。
一方、ホスホリパーゼＡ１は、水の存在下、反応式：
【０００９】
【化２】
2004261022.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれアルキル基を、Ｒ３は、コリン、エタノールアミン、グリセロール、イノシトール等の基を意味する。）
で示されるように、グリセロリン脂質（例えばレシチン）の１位のエステル結合を加水分解し、２‐アシル‐１‐リゾリン脂質（例えば２‐アシルリゾレシチン）と脂肪酸とを生成する触媒作用を有している。
【００１１】
リゾレシチンの製造に用いられるホスホリパーゼＡ２は、動植物に幅広く分布していることが知られている。動物由来の酵素は、ヒト・家畜・爬虫類・昆虫等に存在することが知られている。本目的に使用可能なのは家畜由来の酵素であり、現在、ブタ膵臓由来ホスホリパーゼＡ２（ノボザイムズ社製）が世界的に使用されている。しかし、この酵素は、宗教上の禁忌に触れる恐れがあるため、使用不可能な多くの国があるのは周知の事実である。また、植物由来の酵素は、供給量及びコストの点で工業的に用いるのは困難である。
【００１２】
上記に示した問題点は、微生物由来のホスホリパーゼＡ２によって解決されるものと考えられる。現在までに知られている微生物由来のホスホリパーゼＡ２は、放線菌及び糸状菌によって生産されるものである。これらの酵素は、いずれも医薬品・食品用途においては欠点を有する。
【００１３】
ホスホリパーゼＡ２を生産する放線菌ストレプトマイセス・ビオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）Ａ‐２６８８は、特許文献１及び非特許文献１に記載されている。しかし、これらの文献には酵素の性質に関する記述が無い。また、放線菌は種々の抗生物質を生産する可能性があることから、放線菌由来の酵素は、医薬品への用途には問題ないものの、食品工業では使用しにくい難点がある。
【００１４】
糸状菌テューバー・ボルカイ（Ｔｕｂｅｒ  ｂｏｒｃｈｉｉ）によって産生されるホスホリパーゼＡ２は、非特許文献２に記載されている。しかし、この酵素は、カルシウム濃度により酵素活性が異なり、１ｍＭを超える高いカルシウム濃度条件下では酵素活性が非常に低下することが記載されている。食品工業においては、最近カルシウムを積極的に添加した商品も数多く販売されていることから、カルシウム濃度に依存することなしに使用できる酵素が望まれている。したがって、テューバー・ボルカイ由来の酵素は、医薬品への用途には問題ないものの、食品工業においては実用面から使用しにくいものと考えられる。
【００１５】
一方、ホスホリパーゼＡ１も、ホスホリパーゼＡ２と同様に動植物に広く存在することが知られているが、現在のところ実際に食品工業において使用可能なのは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の酵素である（特許文献２及び特許文献３）。しかし、これらのホスホリパーゼＡ１は、酸性においては優れた活性を有しているが、中性〜アルカリ性域での活性が弱い傾向がある。食品工業においては、弱酸性〜中性域で酵素を使用することが多いので、この領域で強い活性を有する酵素の方が望ましい。
【００１６】
さらに、ホスホリパーゼＡ１によって生成される２‐アシルリゾリン脂質は、次第に１‐アシルリゾリン脂質に転位するが、これらのホスホリパーゼＡ１は、この１‐アシルリゾリン脂質をさらに分解してしまう。そのため、これらのホスホリパーゼＡ１を使用する場合、目的とするリゾリン脂質を得るための反応の制御に注意を要する。
【００１７】
【特許文献１】
特開平６‐３２７４６８
【特許文献２】
特開平６‐６２８５０
【特許文献３】
特開平１０‐１５５４９３
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．２７７，ｐ．２００５１（２００２），Ｍ．Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献２】
ＥＭＢＯ  Ｊｏｒｎａｌ  ｖｏｌ．２０，ｐ．５０７９（２００１），Ｅ．Ｓｏｒａｇｎｉ．ｅｔ  ａｌ．
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酵素活性がカルシウム濃度に依存しない、特に食品工業で使用しやすい、中性領域に至適酵素活性を有する新規なホスホリパーゼＡを提供することを目的とする。また、本発明は、１‐アシルリゾリン脂質を分解する活性を有さず、反応制御の容易なホスホリパーゼＡを提供することを目的とする。
本発明は、上記のようなホスホリパーゼＡを生産する微生物を提供することをも目的とする。
また、本発明は、上記のようなホスホリパーゼＡの製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、このホスホリパーゼＡを用いる１‐アシルリゾリン脂質の製造方法を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、目的とする酵素活性を有するホスホリパーゼＡを生産する微生物を見出すべく鋭意研究を行ったところ、セイリディウム（Ｓｅｉｒｉｄｉｕｍ）属糸状菌がそのようなホスホリパーゼＡを生産することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２０】
すなわち、本発明は、１つの態様において、リン脂質の１位のアシル基を加水分解するが、１‐アシルリゾリン脂質分解活性を実質的に有さないホスホリパーゼＡを提供する。本発明のホスホリパーゼＡは、一般に、以下の特性１）〜６）を有する：
１）  ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ法による見かけの分子量が、約１８，０００である；
２）  等電点電気泳動法による等電点が、ｐＩ３．５である；
３）  安定温度については、７５℃以下の温度で完全に失活することはない；
４）  安定ｐＨは、ｐＨ４．５〜ｐＨ１０．０である；
５）  カルシウムの影響については、ｐＨ７．０において大豆レシチンを基質としたとき、塩化カルシウム濃度６ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、酵素活性は実質的に同等である；及び
６）  リパーゼ活性を実質的に有さない。
【００２１】
本発明のホスホリパーゼＡは、大豆又は卵黄由来レシチンを基質とした場合に、一般に以下の特性７）〜１０）をさらに有する：
７）  活性ｐＨは、ｐＨ４〜ｐＨ９．５である；
８）  活性温度は、６５℃以下である；
９）  最適ｐＨは、ｐＨ７．０付近である；及び
１０）  最適温度は、５０℃付近である。
【００２２】
本発明のホスホリパーゼＡは、例えば微生物由来であることができる。好ましくは糸状菌由来であり、さらに好ましくはセイリディウム属菌由来であり、さらにより好ましくはセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットン〔Ｓｅｉｒｉｄｉｕｍ  ｕｎｉｃｏｒｎｅ  （Ｃｏｏｋｅ  ＆  Ｅｌｌｉｓ）  Ｓｕｔｔｏｎ〕由来であり、最も好ましくはセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットン  ＳＡＮＫ  ３０６９９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ‐８２８９、以下「ＳＡＮＫ  ３０６９９株」という）が生産するホスホリパーゼＡである。
【００２３】
本発明は、別の態様において、上記のようなホスホリパーゼＡを生産する能力を有する単離された微生物を提供する。本発明の微生物は、好ましくは糸状菌であり、さらに好ましくはセイリディウム属菌であり、さらにより好ましくはセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットンであり、最も好ましくはＳＡＮＫ  ３０６９９株である。
【００２４】
また、本発明は、別の態様において、上記のような本発明の微生物を、上記のような本発明のホスホリパーゼＡの生産に適した条件下で培養し、その培地又は微生物を回収し、回収された材料から本発明のホスホリパーゼＡを分離及び／又は精製することを特徴とする、本発明のホスホリパーゼＡの製造方法を提供する。
【００２５】
さらに、本発明は、別の態様において、リン脂質を含有する材料を用意し、この材料と上記のような本発明のホスホリパーゼＡとを接触させて酵素反応を起こさせ、リゾリン脂質を含有する反応生成物を生成させ、この生成物からリゾリン脂質を回収することを特徴とする、リゾリン脂質の製造方法をも提供する。
【００２６】
以下に本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において、「Ｘ〜Ｙ」は数値Ｘ及びＹをそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
【００２７】
【発明の実施の形態】
ホスホリパーゼＡ
本発明の酵素は、リン脂質の１位のアシル基を加水分解するが、１‐アシルリゾリン脂質分解活性を実質的に有さないホスホリパーゼＡであることを特徴とする。
【００２８】
本発明のホスホリパーゼＡは、リン脂質の１位を加水分解して２‐アシルリゾリン脂質を生成する。この２‐アシルリゾリン脂質は、次第に転位して１‐アシルリゾリン脂質となるが、本発明のホスホリパーゼＡは、リゾリン脂質を加水分解しないので、最終的には１‐アシルリゾリン脂質が蓄積される。本発明の方法においては、反応時間等の条件を適宜選択することによって、２‐アシルリゾリン脂質又は１‐アシルリゾリン脂質のいずれかを優先的に含有する生成物を得ることができる。酵素反応を充分に長い時間行わせた場合、リゾリン脂質成分としては実質的に１‐アシルリゾリン脂質のみを含む生成物を得ることができる。
【００２９】
従来公知のホスホリパーゼＡは、リン脂質の１位のエステル結合を加水分解し、かつ１‐アシルリゾリン脂質を分解するもの（ホスホリパーゼＡ１）、又は１‐アシルリゾリン脂質分解活性を有さないが、リン脂質の１位のアシル基を加水分解しないもの（ホスホリパーゼＡ２）のいずれかである。したがって、本発明の酵素のような組み合わせの特性を有するホスホリパーゼＡは、現在まで全く知られていなかった。
【００３０】
本発明の酵素は、上記の特性を有する限り、すなわち、リン脂質の１位のアシル基を加水分解するが、１‐アシルリゾリン脂質分解活性を実質的に有さない限り、その供給源（由来）は特に限定されない。天然物由来の場合、好ましくは微生物由来であり、さらに好ましくは糸状菌由来であり、さらにより好ましくはセイリディウム属菌由来であり、それよりさらに好ましくはセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットン由来であり、最も好ましくはＳＡＮＫ  ３０６９９株由来である。
【００３１】
また、本発明の酵素は、上記のような天然物由来の酵素に基づいて遺伝的に改変された酵素であってもよく、天然の供給源から精製されたもののほか、組換え技術によって生産されるもの、あるいは合成によって生産されるものも、本発明の酵素に含まれる。
【００３２】
ＳＡＮＫ  ３０６９９株により生産され精製されるホスホリパーゼＡは、Ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥにより２本のバンド（以下において、移動度のわずかに小さい方を「（精製）酵素ａ」、大きい方を「（精製）酵素ｂ」という）に分かれるが、いずれも以下の諸性質を有する：
【００３３】
１）  ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ法による見かけの分子量：約１８，０００
２）  等電点電気泳動法による等電点：ｐＩ３．５
３）  安定温度：７５℃以下の温度で完全に失活することはない。
４）  安定ｐＨ：ｐＨ４．５〜ｐＨ１０．０
５）  カルシウムの影響：ｐＨ７．０において大豆レシチンを基質としたとき、塩化カルシウム濃度６ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、酵素活性は実質的に同等である。
６）  リパーゼ活性：実質的に有さない。
【００３４】
この酵素ａ及びｂは、さらに、大豆又は卵黄由来レシチンを基質とした場合に以下の諸性質を示す：
７）  活性ｐＨ：ｐＨ４〜ｐＨ９．５
８）  活性温度：６５℃以下
９）  最適ｐＨ：ｐＨ７．０付近
１０）  最適温度：５０℃付近
酵素ａ及びｂのＮ末端アミノ酸配列は、Ｈ２Ｎ‐ＱＦＶＳＩＩＫＡＬＡであり、また、酵素ａについては、さらに内部アミノ酸配列としてＨ２Ｎ‐ＨＤＦＧＹＮＮＹＲがあることがわかっている。
【００３５】
微生物の単離及び同定
本発明の微生物は、公知の方法によって植物材料、土壌等の天然物から分離・培養することができる。例えば、ある種の糸状菌は、植物の部分等から分離することができる。具体的には、例えば、セイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットンは、ヒノキ、ローソンヒノキ、サワラ、イトスギ等のヒノキ科の植物、又はネズミサシ、コノテガシワ等の植物において発生する樹脂胴枯病の病原菌である。したがって、この糸状菌は、これらの植物の樹脂胴枯病の病斑部分を採取し、そこに生育する糸状菌（胞子）を当業界で公知の方法で処理することによって分離することができる。
【００３６】
このような菌株の培養は、適当な炭素源、窒素源、例えば、デンプン、麸、コーンスティープリカー、ペプトン、綿実粕、酵母エキス等（好適には、デンプン、コーンスティープリカー、綿実粕）及びリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム等の各種無機塩類等を適宜含有させ、常法により殺菌した液体培地（好適には、ｐＨ４．５〜７．０）又は固体培地を用いて行う。
【００３７】
菌株の培養上清又は培地の抽出液等を試料として用いて、後述する方法により培地中の遊離脂肪酸を検出し、試料がリン脂質の１位のアシル基を加水分解するが、１‐アシルリゾリン脂質分解活性を実質的に有さないホスホリパーゼＡ活性を示す菌株を選択する。
【００３８】
酵素活性は、次のように、反応の結果生成する遊離脂肪酸量を測定することにより確認することができる。すなわち、界面活性剤存在下での活性を測定する場合には、４％（ｗ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ‐１００（Ｓｉｇｍａ（株）製）１０ｍＬに大豆レシチン０．２ｇ（和光純薬工業（株）製）を溶解し、２％（ｗ／ｖ）大豆レシチンとしたもの０．５ｍＬに、０．１Ｍ  塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業（株）製）０．０５ｍＬ及び０．２Ｍ  ３‐（Ｎ‐モルホリノ）プロパンスルホン酸‐水酸化ナトリウム緩衝液（以下「ＭＯＰＳ緩衝液」という）（ｐＨ７）０．２５ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加温した後、試料０．１ｍＬを添加し、３７℃で１０分反応させる。酵素反応後、１Ｎ塩酸を０．１ｍＬ添加し、反応を停止させる。反応停止後、反応液３０μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、例えば遊離脂肪酸測定キットであるデタミナー（協和メディクス（株）製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定する。
【００３９】
界面活性剤の不存在下での活性を測定する場合（水中で激しく懸濁あるいは超音波をかけることにより作製した乳化基質を用いる場合）には、水１０ｍＬに大豆レシチン０．２ｇを懸濁し乳化した２％（ｗ／ｖ）大豆レシチン０．５ｍＬに、０．１Ｍ  塩化カルシウム二水和物０．０５ｍＬ及び０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）０．２５ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加温した後、試料０．１ｍＬを添加し、３７℃で１０分反応させる。酵素反応後、１Ｎ塩酸を０．１ｍＬ添加し、反応を停止する。反応停止後、４％（ｗ／ｖ）トライトン  Ｘ−１００を１ｍｌ加え、反応液３０μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、例えば遊離脂肪酸測定キットであるデタミナーを用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定する。
【００４０】
上記のいずれかの方法で測定した場合に１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位とする。
【００４１】
本発明の微生物は、このように選択された天然の元株のほか、その人工変異株（例えば、変異処理によって酵素生産量を向上させた株）であってもよい。
【００４２】
本発明の微生物は、好ましくは糸状菌であり、さらに好ましくはセイリディウム属菌であり、さらにより好ましくはセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットンであり、最も好ましくはＳＡＮＫ  ３０６９９株である。
【００４３】
ＳＡＮＫ  ３０６９９株は、茨城県つくば市御幸が丘３３  三共株式会社  探索研究所  生物資源研究室敷地内のヒノキの樹脂胴枯病の病斑から分離されたセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットンの単離株である。ＳＡＮＫ  ３０６９９株は、平成１５年２月３日付けで日本国茨城県つくば市東１‐１‐１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ‐８２８９を付された。
【００４４】
ＳＡＮＫ  ３０６９９株は、リン脂質の１位のアシル基を加水分解するが１‐アシルリゾリン脂質分解活性を実質的に有さないホスホリパーゼＡを生産することに加え、以下の特性をも有する（ここで、生育温度は、ＰＤＡスラントに接種し、温度勾配培養器で測定したものであり、色調の表示はコーネルップ及びヴァンシャー著「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー  第三版」（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｗａｎｓｃｈｅｒ，  Ｊ．  Ｈ．，“Ｍｅｔｈｕｅｎｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｏｌｏｕｒ（３ｒｄ．  ｅｄｉｔｉｏｎ），”  Ｅｒｙｅ  Ｍｅｔｈｕｅｎ，  Ｌｏｎｄｏｎ．１９７８年）に従う）：
【００４５】
１）  ポテトデキストロース寒天培地、改変ワイツマン‐シルバーヒュンター培地、マルトエキス寒天培地及び三浦培地のいずれにおいても、糸状菌の同定に用いられるテレオモルフ又はアナモルフの形態を形成しない。
２）  ポテトデキストロース寒天培地上での生育温度は５〜３２℃の範囲であり、最適生育温度は１８〜３０℃である。
３）  ポテトデキストロース寒天培地上で、２３℃、７日間培養後、直径約３０〜約５０ｍｍのコロニーを形成する。菌叢は薄く白色を呈し、縁辺部で短い羊毛状で、全縁となる。裏面は白色を呈す。可溶性色素及び浸出液を形成しない。
４）  改変ワイツマン‐シルバーヒュンター寒天培地上で、２３℃、７日間培養後、直径約８〜約１８ｍｍのコロニーを形成する。菌叢は薄く白色を呈し、縁辺部はやや歯牙状となる。裏面は白色を呈す。可溶性色素及び浸出液を形成しない。
【００４６】
５）  マルトエキス寒天培地上で、２３℃、７日間培養後、直径約３５〜約４５ｍｍのコロニーを形成する。菌叢は薄く白色を呈し、縁辺部は全縁となる。裏面は白色を呈す。可溶性色素、浸出液を形成しない。
６）  三浦培地上で、２３℃、７日間培養後、直径約３５〜約６０ｍｍのコロニーを形成する。菌叢は薄く白色を呈し、縁辺部は全縁となる。裏面は白色を呈す。可溶性色素、浸出液を形成しない。
７）  菌株分離時に病斑より作成したプレパラートを観察したところ、ナグ・ラジ著「コエロマイセテス・アナモルフ・ウィズ・アッペンデージ‐ベアリング・コニディア」（Ｎａｇ  Ｒａｊ，  Ｔ．Ｒ．，“Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｏｕｓａｎａｍｏｒｐｈｓ  ｗｉｔｈ  ａｐｐｅｎｄａｇｅ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｃｏｎｉｄｉａ，”  Ｍｙｃｏｌｏｇｕｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｎｔａｒｉｏ．  １９９３年）に記載されているセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットンによく一致する微細形態を有する。すなわち：
【００４７】
分生子果は、分生子殻あるいは分生子層で、樹皮に潜在して形成され、成熟すると分生子を破生し、外観が黒色噴火口状で、倒楕円形〜楕円形（切片）で、大きさ１００〜２００×９０〜１１０μｍ（切片）となる；
殻壁は、多角菌糸構造で、淡褐色〜無色となる。分生子柄は分生子果の内部の全面から形成され、分枝し、有隔壁で、無色薄壁で、滑面となる。分生子形成細胞は、円筒形で、無色薄壁で、滑面で、大きさ３．７〜１４．７×１．９〜３．２μｍ（平均約８．０×約２．５μｍ）となる；
【００４８】
分生子は、直線状か、あるいは湾曲した紡錘形で、５隔壁６細胞で、大きさ１９．３〜２７．６×６．９〜８．３μｍ（平均約２３．２×約７．８μｍ）となり、ふつう両端にそれぞれ１本の付属糸を有する；
基部細胞は、下部が裁断状の倒円錐形で、無色薄壁で、滑面で、長さ１．９〜４．２μｍ（平均約３．２μｍ）となる；
中央有色細胞は、４細胞で、円筒形で、淡褐色から暗褐色で、薄壁で、滑面で、大きさ１４．６〜１９．６μｍ（平均約１７．２μｍ）となる；
頂部細胞は、円錐形で、無色薄壁で、滑面で、長さ２．１〜４μｍ（平均約３．０μｍ）となる；
頂部付属糸は、管状で、先端部から１本形成され、分枝せず、無色で、長さ１．１〜９．４μｍ（平均約６．５μｍ）となる；
基部付属糸は、管状で、下部裁断面の中央から形成され、１本又は無し、分枝せず、無色で、長さ０．１〜７．３μｍ（平均約３．１μｍ）となる。
【００４９】
なお、上記の培地の組成は、以下のとおりである：ポテトデキストロース寒天培地（ポテトデキストロース寒天  ３９ｇ、寒天  ５ｇ、蒸留水  １０００ｍＬ）；改変ワイツマン‐シルバーヒュンター寒天培地（オートミール  １０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物  １ｇ、リン酸２水素カリウム  １ｇ、硝酸ナトリウム１ｇ、寒天  ２０ｇ、蒸留水  １０００ｍＬ）；モルトエキス寒天培地（モルトエキス  ２０ｇ、寒天  ２０ｇ、蒸留水  １０００ｍＬ）；三浦培地（グルコース  １ｇ、イーストエキス  ０．２ｇ、リン酸２水素カリウム  １ｇ、硫酸マグネシウム７水和物  ０．２ｇ、塩化カリウム  ０．２ｇ、硝酸ナトリウム  ０．２ｇ、寒天  １３ｇ、蒸留水  １０００ｍＬ）。
【００５０】
ホスホリパーゼＡの製造
本発明のホスホリパーゼＡは、微生物由来の場合、上記のようにして得られる本発明の微生物を、本発明の酵素の生産に適した条件下で培養し、その培地又は微生物を回収し、回収された材料から本発明のホスホリパーゼＡを分離及び／又は精製することによって製造することができる。本発明のホスホリパーゼＡは、好ましくは糸状菌、さらに好ましくはセイリディウム属菌、さらにより好ましくはセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットン、最も好ましくはＳＡＮＫ  ３０６９９株によって生産される。
【００５１】
微生物の培養のための培地及び培養条件は、その菌株がホスホリパーゼＡを産生するようなものであれば特に限定されない。酵素の生産に適した条件は、一般的には、栄養豊富な培地中で、中程度の温度で、好気的条件下であり、このような条件下で培養すると菌株の良好な生育及び酵素の産生が得られる。そのような培地及び培養条件は、微生物の種類に応じて異なるが、一般に公知である。
【００５２】
具体的には、例えば糸状菌のような菌株の培養は、適当な炭素源、窒素源、例えば、デンプン、麸、コーンスティープリカー、ペプトン、綿実粕、酵母エキス等（好適には、デンプン、コーンスティープリカー、綿実粕）及びリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム等の各種無機塩類等を適宜含有させ、常法により殺菌した液体培地（好適には、ｐＨ４．５〜７．０）又は固体培地に、種菌を接種して、通気攪拌培養法、深部培養法又は麹式培養法で行う。例えば、０．１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）脱脂大豆（日清ソーヤフラワー（株）製）、０．１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）マルトエクストラクト（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、０．１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖（和光純薬工業（株）製）、０．０１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）Ｋ２ＨＰＯ４（和光純薬工業（株）製）、０．０５〜０．５％（Ｗ／Ｖ）ＭｇＳＯ４（和光純薬工業（株）製）の培地中で、１６〜４５℃で、１〜１５日間、１００〜２５０ｒｍｐで振とう培養することにより、培養を行うことができる。
【００５３】
本発明の微生物は、上記のような培養中に培地に酵素を分泌し、又は体内に酵素を蓄積する。本発明の酵素を製造するための材料としての培地又は微生物の回収は、例えば遠心分離によって培養物の微生物と培養上清とを分離し、酵素を含有する画分（ペレット又は上清）を採取することによって行うことができる。
【００５４】
好ましくは、本発明の酵素は培地中に分泌される。培地からの酵素の精製は、例えば以下のようにして行うことができる。本発明の微生物を液体培地で培養し、培地中に酵素を分泌させた後、その培養上清から、硫酸アンモニウム沈殿等によってタンパク質成分を分離する。硫酸アンモニウム分画を行った場合、沈殿物を適当な緩衝液に溶解し、透析等によって塩分を除去することによって、本発明の酵素を分離することができる。こうして得たタンパク質成分を、各種クロマトグラフィ、電気泳動、限外ろ過等の当業者に公知の技法を適宜単独で又は組み合わせで用いて、必要な程度まで精製及び／又は濃縮することによって、精製された本発明のホスホリパーゼＡが得られる。なお、酵素活性は、前述のとおりにして確認することができる。
【００５５】
本発明の酵素は、微生物体内に蓄積された場合、例えば培養物を遠心分離して得た微生物ペレットを適当な緩衝液で懸濁し、超音波処理又はホモジナイザー等によって菌体を破砕し、上記のようにしてタンパク質成分を精製することができる。
【００５６】
リゾリン脂質の製造方法
本発明の酵素を用いて、リゾリン脂質を製造することができる。
本発明のリゾリン脂質の製造方法は、リン脂質を含有する材料を用意し、この材料と本発明のホスホリパーゼＡとを接触させて酵素反応を起こさせ、リゾリン脂質を含有する反応生成物を生成させ、この生成物を回収することを特徴とする。リン脂質を含有する材料としては、大豆レシチン、卵黄レシチン等の種々のレシチンが挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質を含有する材料は、好ましくは、溶液、懸濁液、乳化物、又はペーストの形態である。
【００５７】
このような材料と本発明のホスホリパーゼＡとの接触は、上記の材料を、本発明の微生物の培養上清と混合すること、本発明の精製されたホスホリパーゼＡを添加すること、本発明のホスホリパーゼＡを担持する担体を充填したカラムを通過させること等によって、達成することができる。リン脂質含有材料と本発明の酵素との接触は、酵素反応に適した条件下（例えばｐＨ５〜ｐＨ９、温度３０〜６０℃）で酵素反応に充分な時間行い、リン脂質に本発明のホスホリパーゼＡを作用させる。
【００５８】
上記反応による生成物は、リン脂質の１位が加水分解された２‐アシルリゾリン脂質である。この２‐アシルリゾリン脂質は、次第に転位して１‐アシルリゾリン脂質となるが、リゾリン脂質は、本発明のホスホリパーゼＡによって加水分解されないので、最終的には１‐アシルリゾリン脂質が蓄積される。本発明の方法においては、反応時間等の条件を適宜選択することによって、２‐アシルリゾリン脂質又は１‐アシルリゾリン脂質のいずれかを優先的に含有する生成物を得ることができる。酵素反応を充分に長い時間行わせた場合、リゾリン脂質成分としては実質的に１‐アシルリゾリン脂質のみを含む生成物を得ることができる。
【００５９】
【実施例】
以下の例において、特に示さない限り、酵素活性の測定は次の１〜３の方法に従って行った。
測定法１．  界面活性剤存在下でのホスホリパーゼの脂肪酸遊離活性の測定法大豆レシチン０．２ｇ（和光純薬工業（株）製）を４％（ｗ／ｖ）トライトンＸ‐１００（Ｓｉｇｍａ（株）製）１０ｍＬに溶解し、２％（ｗ／ｖ）大豆レシチンとした。この基質溶液０．５ｍＬに、０．１Ｍ  塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業（株）製）０．０５ｍＬ及び０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）０．２５ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加温した後、試料０．１ｍＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。この反応液に１Ｎ塩酸を０．１ｍＬ添加し、反応を停止した。反応停止後の反応液３０μＬに含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットであるデタミナー（協和メディクス（株）製）でキットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。
１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を１単位とした。
【００６０】
測定法２．  界面活性剤不存在下でのホスホリパーゼの脂肪酸遊離活性の測定法
基質として、大豆レシチン０．２ｇを蒸留水１０ｍＬに懸濁し、ブレンダー（（株）日本精機製作所製）で１２，０００ｒｐｍで１分間乳化した液を作製した。この基質乳化液０．５ｍＬに、０．１Ｍ  塩化カルシウム二水和物０．０５ｍＬ及び０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）０．２５ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加温した後、試料０．１ｍＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。この反応液に１Ｎ塩酸を０．１ｍＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、１ｍＬの４％（ｗ／ｖ）トライトンＸ‐１００を加え、溶解した。この溶液３０μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットであるデタミナーでキットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。
１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を１単位とした。
【００６１】
測定法３．  リパーゼ活性測定法
蒸留水１０ｍＬに、１００ｍｇのオリーブ油（和光純薬工業（株）製）及び５０ｍｇのアラビアガム（和光純薬工業（株）製）を加え、１％（ｗ／ｖ）オリーブ油とし、ブレンダー（（株）日本精機製作所製）で１２，０００ｒｐｍで１分間乳化した。これを基質乳化液とした。この基質乳化液０．５ｍＬに、０．１Ｍ塩化カルシウム二水和物０．０５ｍＬ及び０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）０．２５ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加温した後、試料０．１ｍＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。１Ｎ塩酸を０．１ｍＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、１ｍＬの４％（ｗ／ｖ）トライトンＸ‐１００を加え、懸濁した。反応停止後の反応液３０μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットであるデタミナーでキットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。
【００６２】
実施例１．ＳＡＮＫ  ３０６９９株の単離及び同定
ＳＡＮＫ  ３０６９９株は、つくば市御幸が丘３３  三共株式会社  探索研究所  生物資源研究室敷地内のヒノキの樹脂胴枯病の病斑から分生子塊を掻き取り、ポテトデキストロース寒天プレートに塗布し、スカーマン式マニュピレーター（東洋理光器（株）製）を使用して単胞子分離することによって分離された。
この菌株について、以下の菌学的性状を調べた。色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー、第三版」（前出）に従った。
【００６３】
（ａ）培養及び形態的性質
培養性状は、この菌株を、ポテトデキストロース寒天培地、改変ワイツマン‐シルバーヒュンター培地、マルトエキス寒天培地及び三浦培地に接種し、２３℃で１週間培養して観察した。培地の組成は以下のとおりであった：
【００６４】
ポテトデキストロース寒天培地（ポテトデキストロース寒天「日水」（日水製薬（株）製）  ３９ｇ、寒天（純正化学（株）製）  ５ｇ、蒸留水  １０００ｍＬ）；
改変ワイツマン‐シルバーヒュンター寒天培地（オートミール（日本食品化工（株）製）  １０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  １ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硝酸ナトリウム  １ｇ、寒天（同上）  ２０ｇ、蒸留水  １０００ｍＬ）；
モルトエキス寒天培地（モルトエキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）  ２０ｇ、寒天（同上）  ２０ｇ、蒸留水  １０００ｍＬ）；
三浦培地（グルコース  １ｇ、イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）  ０．２ｇ、リン酸二水素カリウム  １ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．２ｇ、塩化カリウム  ０．２ｇ、硝酸ナトリウム  ０．２ｇ、寒天（同上）  １３ｇ、蒸留水  １０００ｍＬ）。
【００６５】
ＳＡＮＫ  ３０６９９株の培養性状は以下のとおりであった。
ポテトデキストロース寒天培地上でのコロニー直径は、２３℃、７日間で４６ｍｍに達する。菌叢は薄く白色を呈し、縁辺部で短い羊毛状で、全縁となる。裏面は白色を呈す。可溶性色素及び浸出液を形成しない。
改変ワイツマン‐シルバーヒュンター寒天培地上でのコロニー直径は、２３℃、７日間で１２〜１３ｍｍに達する。菌叢は薄く白色を呈し、縁辺部はやや歯牙状となる。裏面は白色を呈す。可溶性色素及び浸出液を形成しない。
マルトエキス寒天培地上でのコロニー直径は、２３℃、７日間で４０〜４１ｍｍに達する。菌叢は薄く白色を呈し、縁辺部は全縁となる。裏面は白色を呈す。可溶性色素、浸出液を形成しない。
三浦培地培地上でのコロニー直径は、２３℃、７日間で４６〜４９ｍｍに達する。菌叢は薄く白色を呈し、縁辺部は全縁となる。裏面は白色を呈す。可溶性色素、浸出液を形成しない。
いずれの培地でも、糸状菌の同定に用いられるテレオモルフ又はアナモルフの形態を形成しなかった。
【００６６】
（ｂ）生育温度
生育温度は、菌株をＰＤＡスラントに接種し、温度勾配培養器で測定した。ＳＡＮＫ  ３０６９９株は、ポテトデキストロース寒天培地では５〜３２℃までの範囲で生育でき、１８〜３０℃では良好に生育した。
【００６７】
（ｃ）種の同定
ＳＡＮＫ  ３０６９９株は、いずれの培地上においても、糸状菌の同定に用いられるアナモルフ（ａｎａｍｏｒｐｈ）又はテレオモルフ（ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈ）の形態を形成しなかった。そこで、同定は、菌株の分離時に作成したプレパラートを使用し、ナグ・ラジの方法（前出）に従って、微細形態を観察することによって行った。
【００６８】
ＳＡＮＫ  ３０６９９株の微細形態は以下のとおりであった。
分生子果は分生子殻あるいは分生子層で、樹皮に潜在して形成され、成熟すると分生子を破生し、外観が黒色噴火口状で、倒楕円形〜楕円形（切片）で、大きさ１００〜２００×９０〜１１０μｍ（切片）であった；殻壁は多角菌糸構造で、淡褐色〜無色であった。分生子柄は分生子果の内部の全面から形成され、分枝し、有隔壁で、無色薄壁で、滑面であった。分生子形成細胞は、円筒形で、無色薄壁で、滑面で、大きさ３．７〜１４．７×１．９〜３．２μｍ（平均８．０×２．５μｍ）であった。分生子は直線状か、あるいは湾曲した紡錘形で、５隔壁６細胞で、大きさ１９．３〜２７．６×６．９〜８．３μｍ（平均２３．２×７．８μｍ）であり、ふつう両端にそれぞれ１本の付属糸を有していた；基部細胞は下部が裁断状の倒円錐形で、無色薄壁で、滑面で、長さ１．９〜４．２μｍ（平均３．２μｍ）であった；中央有色細胞は４細胞で、円筒形で、淡褐色から暗褐色で、薄壁で、滑面で、大きさ１４．６〜１９．６μｍ（平均１７．２μｍ）であった；頂部細胞は円錐形で、無色薄壁で、滑面で、長さ２．１〜４μｍ（平均３．０μｍ）となった；頂部付属糸は、管状で、先端部から１本形成され、分枝せず、無色で、長さ１．１〜９．４μｍ（平均６．５μｍ）であった；基部付属糸は管状で、下部裁断面の中央から形成され、１本又は無し、分枝せず、無色で、長さ０．１〜７．３μｍ（平均３．１μｍ）であった。
【００６９】
上記の培養性状及び微細形態は、ナグ・ラジ（１９９３年、前出）によって記載されているセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットンによく一致した。
【００７０】
以上の結果に基づいて、ＳＡＮＫ  ３０６９９株をセイリディウム・ユニコーン  （クック・アンド・エリス）  サットンと同定した。
ＳＡＮＫ  ３０６９９株は、ブダペスト条約にしたがって、平成１５年２月３日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８９が付された。
【００７１】
実施例２．  ＳＡＮＫ  ３０６９９株の培養及びその培養液中のホスホリパーゼＡ活性の確認
滅菌した組成培地（蒸留水中、１％（ｗ／ｖ）マルトエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、１％（ｗ／ｖ）脱脂大豆（日清ソーヤフラワー製）、１％（ｗ／ｖ）ショ糖（和光純薬工業（株）製）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｋ２ＨＰＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）２０ｍＬを含む１００ｍＬ容の三角フラスコにＳＡＮＫ  ３０６９９株の種菌を接種し、２６℃にて３日間、２００ｒｐｍの振とう機上で培養を行い、前培養液とした。同培地１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに前培養液を１％（ｖ／ｖ）接種後、２６℃にて６日間、２００ｒｐｍの振とう機上で培養を行った。
【００７２】
培養終了後、４℃条件下、培養液を１２，０００×Ｇにて１５分間、遠心分離した。得られた上清について、基質として大豆レシチン（測定法１）、リゾホスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ社製；測定法１において大豆レシチンの代わりに使用）及びオリーブ油（測定法３）を用いて脂質分解活性を測定した。
【００７３】
上清は、リゾホスファチジルコリン又はオリーブ油を基質として酵素反応を行った場合、活性を全く示さなかったのに対し、大豆レシチンを基質とした場合、上清１ｍＬあたり０．７３Ｕの酵素活性を有していた。したがって、ＳＡＮＫ  ３０６９９株の培養上清中には、リパーゼは生産されておらず、ホスホリパーゼ類が生産されており、そのホスホリパーゼはホスホリパーゼＡであることが判明した。
【００７４】
実施例３．  ＳＡＮＫ  ３０６９９株の培養上清中におけるホスホリパーゼＡの特徴付け
ＳＡＮＫ  ３０６９９株を実施例２記載のとおりに培養して得た培養上清中の酵素の特性を調べた。特に示さない限り、この培養上清を試料として用いた。
【００７５】
３‐１）  活性とｐＨとの関係
種々のｐＨでの培養上清中のホスホリパーゼＡ活性を、基本的に測定法１の活性測定法で調べた。ただし、緩衝液は、０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）の代わりに各ｐＨに調整した次の０．２Ｍ緩衝液を用いた：ｐＨ３．８〜５．４については、酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ５．７〜７．５については、ＭＯＰＳ緩衝液；ｐＨ８．０〜１０．３については、ホウ酸‐炭酸ナトリウム‐塩化カリウム（以下「Ａｔｋｉｎｓ‐Ｐａｎｔｉｎ」という）緩衝液。
結果を、最も活性の高かったｐＨ条件での活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素活性を相対値として図１に示す。この酵素は、ｐＨ約４〜約９．５の広い範囲のｐＨで活性であり、ｐＨ約５〜約８．５の範囲で特に活性が高く、至適ｐＨは６．５付近であった。
【００７６】
３‐２）  酵素活性と温度との関係
ｐＨ７の条件下において、種々の反応温度でホスホリパーゼＡ活性を測定した。活性の測定は測定法１に従って行った。
結果を、最も高い活性を示した温度条件で測定された活性を１００％とし、各温度における酵素活性を相対値として図２に示す。この酵素は、約７０℃近くまでの温度範囲で活性があり、約６０℃以下の温度範囲で高い活性を示し、約３７℃〜約６０℃で特に活性が高く、至適温度は約５０℃であった。
【００７７】
３‐３）  温度安定性
培養上清を種々の温度で３０分間予備加温した後、残存する酵素活性を測定した。活性の測定は測定法１に従って行った。
結果を、４℃に保存した培養上清試料の活性を１００％とし、各温度で処理した後の残存する活性を相対値として図３に示す。この酵素は、約５５℃で３０分間の処理で不活化するが、約５０℃までの温度で３０分間の処理に対しては安定であった。
【００７８】
３‐４）  ｐＨ安定性
培養上清を種々のｐＨで予備加温した後、残存する酵素活性を測定した。活性の測定は測定法１に従って行った。試料は、培養上清５００μＬに各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液５００μＬを加えて均一にし、４℃又は３７℃にて１時間保温して作製した。以下の緩衝液を用いた：ｐＨ３．２〜４．０については、第二クエン酸ナトリウム‐塩酸緩衝液；ｐＨ４．４〜７．２については、酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ７．３〜８．３については、ＭＯＰＳ緩衝液；ｐＨ８．９〜１０．１については、Ａｔｋｉｎｓ‐Ｐａｎｔｉｎ緩衝液。
結果を、４℃における活性を１００％とし、各ｐＨにおける活性を相対値として図４に示す。この酵素は、ｐＨ約３．５以上（少なくともｐＨ１０．１まで）で安定であった。
【００７９】
３‐５）  培養上清中のリパーゼ活性
培養上清中におけるリパーゼ活性の測定を測定法３に従って行った。リパーゼ活性は認められないことが確認された。
【００８０】
実施例４．  ＳＡＮＫ  ３０６９９株の生産するホスホリパーゼＡの精製
以下の精製において、ホスホリパーゼ活性の測定は、すべて測定法１に従って行った。
実施例２と同様にして得られた培養上清５００ｍＬに、硫酸アンモニウム３０５ｇを氷冷下撹拌しながら徐々に加えた。この混合溶液を４℃で一晩静置した後、１２，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、沈殿物を分取した。沈殿物を３５０ｍＬの１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、この溶液を、１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）各回４，０００ｍＬに対し１２時間ずつ５回、透析膜（三光純薬（株）製、再生セルロース膜、３６／３２、分子量カットオフ１４，０００）を使用して透析した。透析後の溶液を１８，０００×Ｇで遠心し、沈殿物を除去して上清を採取した。
【００８１】
この上清を、予め１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（東ソー（株）製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に吸着させた。このカラムを１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄した後、１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）６００ｍＬ中に作製した０〜０．３５Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を用いて、カラムに吸着した成分を溶出させた。１本あたり７．５ｍＬの画分を集め、これらの画分中のホスホリパーゼ活性を検出した。ホスホリパーゼＡ活性は、塩化ナトリウム濃度が０．１８Ｍ〜０．２５Ｍの画分中（１０５ｍＬ）に溶出された。
【００８２】
上記の活性画分１０５ｍＬを、２０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）各回４，０００ｍＬに対し１２時間ずつ３回、上記と同じ透析膜で透析した後、予め２０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ１０／１０（商標）（ファルマシア（株）製）カラム（直径１．０×１０ｃｍ）に添加し、吸着させた。カラムを２０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄した後、２０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３００ｍＬ中に作製した０〜０．３Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を用いて、カラムに吸着した成分を溶出させた。１本あたり５ｍＬの画分を集め、これらの画分中のホスホリパーゼ活性を検出した。ホスホリパーゼＡ活性は塩化ナトリウム濃度が０．１５Ｍ〜０．２Ｍの画分（５０ｍＬ）に溶出された。
【００８３】
上記の活性画分５０ｍＬを、２０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）各回４，０００ｍＬに対し１２時間ずつ２回、上記と同じ透析膜で透析した後、予め２０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５（商標）（ファルマシア（株）製）カラム（直径０．５×５ｃｍ）に添加し、吸着させた。カラムを２０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄した後、１Ｍ  塩化ナトリウム（２ｍＬ）でカラムに吸着した成分を溶出させた。
【００８４】
上記の活性画分２００μＬを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＨＲ１０／３０（商標）（ファルマシア（株）製）カラム（直径１．０×３０ｃｍ）でゲルろ過した（１０ｍＭ  トリス‐塩酸／１５０ｍＭ  塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎ）。１本あたり０．９ｍＬの画分を集め、これらの画分中のホスホリパーゼ活性を検出したところ、ホスホリパーゼＡ活性は、５．１ｍＬ〜５．４ｍＬ画分に溶出された。これらの活性画分（１．８ｍＬ）をプールした。
【００８５】
上記で得られた溶出液（１．８ｍＬ）をＮａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ（ゲル濃度１５％）にかけた。泳動後、ゲルをクマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）で染色した。精製酵素は、２つのバンドａ及びｂ（移動度のわずかに小さい方を「酵素ａ」、大きい方を「酵素ｂ」という）に分かれた。これらのバンドをそれぞれ切り出し、４％（ｗ／ｖ）トライトンＸ‐１００適量で懸濁し、４℃で７２時間撹拌した。さらに、この混合物を０．４５μｍのフィルター（クラボウ製、クロマトディスク  １３Ａ（商標））でろ過した後、１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）各回３００ｍＬに対し１２時間ずつ５回、透析膜（三光純薬（株）製、再生セルロース膜、２０／３２、分子量カットオフ１４，０００）を使用して透析した。
【００８６】
これを、さらに、１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したビバピュアマキシスピンカラム（ザルトリウス社製、ＴｙｐｅＤ）に添加し、吸着させた。カラムを１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄しトライトンＸ‐１００を除去した後、１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１Ｍ  塩化ナトリウム（３０ｍＬ）でカラムに吸着した成分を溶出させた。得られた溶出液（３０ｍＬ）を限外ろ過膜（ザルトリウス社製、ビバスピン２（商標）、分画分子量１０，０００）を用いて濃縮した（最終容量２００μＬ）。以下の実施例においては、これらの溶液を「（精製）酵素（ａ及び／又はｂ）」又は「精製酵素溶液」と呼ぶことがあり、特に示さない限り、これらの溶液を試料として用いた。
【００８７】
実施例５．  精製されたホスホリパーゼＡ（酵素ａ及びｂ）の特徴付け
実施例４において精製された２種のホスホリパーゼＡ（酵素ａ及びｂ）について、以下のようにそれらの特性を調べた。特に示さない限り、酵素ａ及びｂのそれぞれについて実験を行った。
【００８８】
５‐１）  活性とｐＨとの関係（界面活性剤存在下）
種々のｐＨでの精製酵素の活性を、基本的に測定法１の活性測定法で調べた。ただし、緩衝液は、０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）の代わりに各ｐＨに調整した次の０．２Ｍ緩衝液を用いた：ｐＨ３．６〜５．５については、酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ６．０〜７．７については、ＭＯＰＳ緩衝液；ｐＨ７．１〜８．６については、トリス‐塩酸緩衝液；ｐＨ８．９〜１０．３については、Ａｔｋｉｎｓ‐Ｐａｎｔｉｎ緩衝液。
【００８９】
結果を、最も活性の高かったｐＨ条件での活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素活性を相対値として図５に示す。２種の酵素ａ及びｂは、同様のｐＨ‐活性曲線を示し、いずれも、ｐＨ約４〜約９．５の広い範囲で活性があり、ｐＨ約５〜約９の範囲で特に活性が高く、至適ｐＨは７付近であった。
【００９０】
５‐２）  活性と温度との関係（界面活性剤存在下）
ｐＨ７の条件下において、種々の反応温度で活性を測定した。活性の測定は測定法１に従って行った。
【００９１】
結果を、最も高い活性を示した温度条件で測定された活性を１００％とし、各温度における酵素活性を相対値として図６に示す。図６に示すとおり、ｐＨ７において、２種の精製酵素ａ及びｂのホスホリパーゼＡ活性は、約７０℃近くまでの温度範囲で認められ、約６０℃以下の温度範囲で高く、約３７℃〜約５５℃で特に高く、至適温度は、いずれも約５０℃であった。
【００９２】
５‐３）  温度安定性
精製酵素溶液を種々の温度で３０分間予備加温した後、残存する酵素活性を測定した。活性の測定は測定法１に従って行った。
結果を、４℃に保存した酵素試料の活性を１００％とし、各温度で処理した後の残存する活性を相対値として図７に示す。図７に示すとおり、２種の精製酵素ａ及びｂは、いずれも非常に温度安定性が高く、７５℃以下では完全に失活することはなく、７０℃でも３０％程活性が残存していたが、５０℃以下で安定であり、４５℃以下で特に安定であった。
【００９３】
５‐４）  ｐＨ安定性
精製酵素溶液を種々のｐＨで予備加温した後、残存する酵素活性を測定した。活性の測定は測定法１に従って行った。試料は、精製酵素溶液５００μＬに各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液５００μＬを加えて均一にし、４℃又は３７℃にて１時間保温して作製した。以下の緩衝液を用いた：ｐＨ２．４〜３．５については、第二クエン酸ナトリウム‐塩酸緩衝液；ｐＨ４．５〜６．０については、酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ６．４〜７．５については、ＭＯＰＳ緩衝液；ｐＨ８．４〜１０．５については、Ａｔｋｉｎｓ‐Ｐａｎｔｉｎ緩衝液。
【００９４】
結果を、４℃における活性を１００％とし、各ｐＨにおける活性を相対値として図８に示す。図８に示すとおり、２種の精製酵素ａ及びｂは、いずれもｐＨ安定性が高く、ｐＨ約３．５以上で安定であり、ｐＨ４．５以上では８０％以上の活性が残存していた。安定ｐＨの上限は、少なくともｐＨ１０であり、調べた範囲で最高のｐＨ１０．５までは充分に安定であったので、それ以上のｐＨ（例えばｐＨ１１）でも安定である可能性がある。
【００９５】
５‐５）  精製酵素ａの活性とｐＨとの関係（界面活性剤不存在下）
精製酵素ａについて、種々のｐＨでの活性を、基本的に測定法２に従って、乳化した基質を用いて測定した。ただし、緩衝液は、０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）の代わりに次のものを用いた：ｐＨ３．５〜５．６については、酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ６．１〜７．７については、ＭＯＰＳ緩衝液；ｐＨ７．９〜８．６については、トリス‐塩酸緩衝液；ｐＨ９．１〜１０．３については、Ａｔｋｉｎｓ‐Ｐａｎｔｉｎ緩衝液。
【００９６】
結果を、最も活性の高かったｐＨ条件での活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素活性を相対値として図９に記載した。この条件下で、精製酵素ａは、ｐＨ約４〜約９．５の広い範囲で活性であり、ｐＨ約４．５〜約９の範囲で特に活性が高く、至適ｐＨは７付近であった。
【００９７】
５‐６）酵素反応の位置選択性
精製酵素ａ及びｂがそれぞれホスホリパーゼＡ１又はＡ２のいずれであるかを調べるために、以下の実験を行った。
ホスファチジルコリン２−オレオイル−１−パルミトイル（Ｓｉｇｍａ（株）製）１００ｍｇを蒸留水５ｍＬに懸濁した。この混合物に、０．１Ｍ  塩化カルシウム二水和物０．５ｍＬ及び０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）２．５ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加温した後、精製酵素１ｍＬ（２ｕ／ｍＬ）を添加し３７℃で２４時間反応させた。
【００９８】
この酵素反応液をエチルエーテルで抽出し、濃縮した。この濃縮液（５ｍＬ）を、ＴＬＣ（ＰＬＣプレート（２０×２０ｃｍ）、シリカゲル６０Ｆ２５４、２ｍｍ）上で、移動層としてｎ‐ヘキサン：エチルエーテル＝２：８を用いて展開した。Ｒｆ＝０．５付近に展開された遊離脂肪酸をかきとり、クロロホルムで抽出した。このクロロホルム溶液をエバポレーターで濃縮し、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ‐ＧＳＸ４００で１Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００９９】
その結果、この反応液中に含有されていた遊離脂肪酸は、主にパルミチン酸であり、オレイン酸は５％以下の含量であった。したがって、精製酵素は、リン脂質の１位を優先的に分解する性質を有していることがわかった。このことから、これらの精製酵素は、いずれもホスホリパーゼＡ２ではなく、ホスホリパーゼＡ１であると判定された。
【０１００】
５‐７）基質選択性
基質として表１に示す各リン脂質又はリゾリン脂質を用いて、以下のようにしてｐＨ７．０における精製酵素の基質選択性を調べた。各基質はＳｉｇｍａ（株）から購入した。４％（ｗ／ｖ）トライトンＸ‐１００  １ｍＬに２０ｍｇの各基質を溶解した。このように調製したそれぞれの基質０．２ｍＬに０．１Ｍ  塩化カルシウム二水和物０．０２ｍＬ及び０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）０．１ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加温した後、試料０．０４ｍＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。１Ｎ塩酸を０．０４ｍＬ添加し、反応を停止した。反応停止後の反応液３０μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットであるデタミナーでキットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。
【０１０１】
結果を、２％大豆レシチンを基質とした場合の活性を１００％とし、それぞれの基質についての精製酵素ａ及びｂの活性を相対活性として表１に示す。
【０１０２】
【表１】
2004261022.tif 000004
【０１０３】
いずれの酵素も、その由来（大豆又は卵黄）を問わず、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジルイノシトールを加水分解するが、１‐アシル‐２‐リゾホスファチジルコリンは加水分解しないことがわかった。したがって、本発明の酵素は、この点において従来のホスホリパーゼＡ１とは異なる全く新規なホスホリパーゼＡであることが判明した。
【０１０４】
５‐８）  精製酵素のリパーゼ活性
蒸留水１０ｍＬに１００ｍｇのオリーブ油（和光純薬工業（株）製）、大豆油（和光純薬工業（株）製）又はナタネ油（和光純薬工業（株）製）及び５０ｍｇのアラビアガム（和光純薬工業（株）製）を加え、ブレンダー（（株）日本精機製作所）で１２，０００ｒｐｍで１分間乳化した。この１％（ｗ／ｖ）基質０．５ｍＬに、０．１Ｍ  塩化カルシウム二水和物０．０５ｍＬ及び０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）０．２５ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加温した後、試料０．１ｍＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。この反応液に１Ｎ塩酸を０．１ｍＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、１ｍＬの４％（ｗ／ｖ）トライトンＸ‐１００を加え、懸濁した。この反応停止後の反応液３０μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットであるデタミナーでキットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。
【０１０５】
結果を、２％大豆レシチンを基質とした場合の活性を１００％とし、それぞれの基質についての精製酵素ａ及びｂの活性を相対活性として表２に示す。
【０１０６】
【表２】
2004261022.tif 000005
【０１０７】
精製酵素ａ及びｂのそれぞれについて、いずれの基質についても分解活性が認められなかった。したがって、これらの酵素はリパーゼ活性を有さないことが確認された。
【０１０８】
５‐９）  酵素反応に対するカルシウム及び界面活性剤の影響
４％（ｗ／ｖ）トライトンＸ‐１００  １０ｍＬに大豆レシチン０．２ｇを溶解して調製した基質（「界面活性剤あり」）及び蒸留水１０ｍＬに大豆レシチン０．２ｇを懸濁してブレンダーで１分間乳化して調製した基質（「界面活性剤なし」）の２種の基質（２％（ｗ／ｖ）大豆レシチン）を用意した。各基質０．５ｍＬに、終濃度６〜１００ｍＭとなる濃度の塩化カルシウム二水和物０．０５ｍＬ及び０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）０．２５ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加温した後、試料０．１ｍＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。同様に、塩化カルシウム溶液の代わりに０．０５ｍＬの蒸留水を添加した反応液も用意した（塩化カルシウム濃度「０」）。これらの反応液に１Ｎ塩酸を０．１ｍＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、１ｍＬの４％（ｗ／ｖ）トライトンＸ‐１００を加え、懸濁した。この反応停止後の反応液３０μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットであるデタミナーでキットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。
【０１０９】
結果を、酵素ａ及びｂのそれぞれについて、界面活性剤ありの基質に終濃度６ｍＭとなるように塩化カルシウム二水和物を加えた反応における活性を１００％とし、各反応液の活性を相対酵素活性として図１０に示す。
精製酵素ａ及びｂの両方について、塩化カルシウム濃度ゼロではかなり活性が低かったが、塩化カルシウム濃度６ｍＭ〜１００ｍＭの範囲では、酵素活性はカルシウム濃度に影響されず、実質的に同等であった。各カルシウム濃度で、精製酵素ａ及びｂはいずれも界面活性剤の存在下の方が界面活性剤不存在下の場合よりも高い活性を示したが、界面活性剤不存在下でも界面活性剤存在下の場合の約８０％の活性を示した。
【０１１０】
５‐１０）  分子量の測定
１５％ポリアクリルアミドゲルによるＳＤＳ‐ＰＡＧＥ法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））により、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２で精製したホスホリパーゼＡ（精製酵素ａ及びｂの両方を含む）の分子量を求めた。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２で精製したホスホリパーゼＡ  １５μＬをサンプル緩衝液と混合してゲルに載せ、１６０Ｖの定電圧で１．５時間泳動した。分子量標準タンパク（「マーカー」；ＳＤＳ‐ＰＡＧＥマーカー、ファルマシア製  ＬＭＷ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｃａｒｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）は、以下のものを含んでいた：ａ，ホスホリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、分子量９４，０００：ｂ，アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、分子量６７，０００：ｃ，オブアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、分子量４３，０００：ｄ，カルボニック・アンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ）、分子量３０，０００：ｅ，トリプシン・インヒビター（ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、分子量２０，１００：ｆ，α‐ラクトアルブミン（α‐ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）、分子量１４，４００。
泳動後のゲルをＣＢＢ染色した結果から、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる精製酵素ａ及びｂの見かけの分子量は、いずれも約１８，０００であった。
【０１１１】
５‐１１）  等電点の測定
精製酵素ａ及びｂのそれぞれを、等電点電気泳動（日本生化学会編「生化学実験講座１  タンパク質の化学Ｉ  分離精製」、東京化学同人（東京）刊（１９７６）、２６２〜３１２頁）に供した。精製酵素の等電点は、酵素ａ及びｂいずれについてもｐＩ約３．５であった。
【０１１２】
５‐１２）  Ｎ末端アミノ酸配列の決定
精製酵素ａ及びｂのそれぞれを、上の５−１０に記載したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。このゲルから、エレクトロブロッティング法（平野  久著「遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析：ブロッティングとシークエンシング」、東京化学同人（東京）刊（１９９３））に従って、精製酵素ａ及びｂをそれぞれＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製、Ｓｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＧＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（商標）、１０×１５ｃｍ）に転写し、Ｎ末端アミノ酸配列解析装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ  ｃＬＣ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）で配列を解析した。
【０１１３】
精製酵素ａ及びｂのＮ末端アミノ酸配列は以下のとおりであり、同じであった。
【０１１４】
ａ：Ｈ２Ｎ‐ＱＦＶＳＩＩＫＡＬＡ
ｂ：Ｈ２Ｎ‐ＱＦＶＳＩＩＫＡＬＡ
【０１１５】
５‐１３）  内部アミノ酸配列の決定
精製酵素ａを、限外ろ過膜（ザルトリウス社製  ビバスピン２（商標）  分画分子量１０，０００）を用いて約１ｍｇ／ｍＬ程度まで濃縮した。この濃縮酵素液５０μｌに、変性緩衝液（６Ｍ  塩酸グアニジン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  炭酸水素アンモニウム、ｐＨ７．８）５０μＬ及び５０ｍＭ  ジチオスレイトール  １μＬを加え、９５℃で１０分間反応させた。室温まで冷却後、反応液に、変性緩衝液に溶解した５０ｍＭ  ヨードアセトアミド５μＬを加え、暗所室温で１時間反応させた。この溶液を、Ｓｌｉｄｅ‐Ａ‐Ｌｙｚｅｒ  ＭｉｎｉＤｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔｓ  Ｐｌｕｓ  Ｆｌｏａｔ（商標）（ＰＩＥＲＣＥ社製、分画分子量１０，０００）を用いて水１Ｌに対して１回透析した。得られた溶液にトリプシン（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ、  Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｇを加え、３７℃で２４時間酵素反応させた。反応液をＨＰＬＣ装置（ＨＩＴＡＣＨＩ製、ＬＣ‐Ｏｒｇａｎｉｚｅｒ、Ｌ‐４２００  ＵＶ‐ＶＩＳ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｌ‐６０００  Ｐｕｍｐ、Ｌ‐６２００  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｐｕｍｐ）にかけて分解アミノ酸のピークを分離した。分離条件を以下に示す。
【０１１６】
カラム：ＯＤＳ  １２０Ｔ  ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ
Ａ緩衝液：０．１％ＴＦＡ／水
Ｂ緩衝液：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
グラジエント：１０％Ｂ→７０％Ｂ  ３０ｍｉｎ
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
【０１１７】
分離した分解アミノ酸のうち、Ｂ緩衝液濃度３３％程度に出現したピークを分取した。このピークについてアミノ酸配列解析装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ  ｃＬＣ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）で配列を解析した。結果をＮ末端側から示す。
Ｈ２Ｎ‐ＨＤＦＧＹＮＮＹＲ
【０１１８】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素活性がカルシウム濃度に依存しない、特に食品工業で使用しやすい、中性領域に至適酵素活性を有するホスホリパーゼＡ及びそれを生産する微生物が提供される。本発明のホスホリパーゼＡは、リン脂質の１位のアシル基を加水分解するが、１‐アシルリゾリン脂質を分解する活性を有さないという全く新規な特性を有し、反応制御が容易である。
また、本発明によれば、リン脂質から１‐アシルリゾリン脂質又は２‐アシルリゾリン脂質を選択的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の糸状菌培養上清中のホスホリパーゼＡのｐＨ活性曲線である。
【図２】本発明の糸状菌培養上清中のホスホリパーゼＡの温度活性曲線である。
【図３】本発明の糸状菌培養上清中のホスホリパーゼＡの温度安定性を示すグラフである。
【図４】本発明の糸状菌培養上清中のホスホリパーゼＡのｐＨ安定性を示すグラフである。
【図５】本発明の精製酵素のｐＨ活性曲線である。黒丸は精製酵素ａ、黒三角は精製酵素ｂを表す。
【図６】本発明の精製酵素の温度活性曲線である。黒丸は精製酵素ａ、黒三角は精製酵素ｂを表す。
【図７】本発明の精製酵素の温度安定性を示すグラフである。黒丸は精製酵素ａ、黒三角は精製酵素ｂを表す。
【図８】本発明の精製酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。黒丸は精製酵素ａ、黒三角は精製酵素ｂを表す。
【図９】本発明の精製酵素ａのｐＨ活性曲線（界面活性剤不存在下）である。
【図１０】本発明の精製酵素の活性とカルシウム濃度との関係を示すグラフである。丸は精製酵素ａ、三角は精製酵素ｂについての結果を表し、それぞれ黒色は界面活性剤存在下（＝界面活性剤あり）、白色は界面活性剤不存在下（＝界面活性剤なし）での測定結果である。
【図１】
2004261022.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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