(57)【要約】【課題】簡便かつ大量処理が可能なサイトカインの測定方法を提供。【解決手段】蛍光微量アッセイ技術を基本としたサイトカインの測定方法であり、少量の試料で定量可能であり、洗浄工程が不要である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料を、サイトカイン認識可能な抗体結合固相支持体とサイトカイン認識可能な蛍光標識抗体とに混合し、該抗体結合固相支持体における抗体と該蛍光標識抗体とに結合しているサイトカインを該蛍光標識抗体の蛍光を測定することによって測定する、被検試料中のサイトカイン量を測定する方法（ここに、該蛍光標識抗体と、該抗体結合固相支持体の抗体とはそれぞれサイトカインの別の部位を認識する）。
【請求項２】
該抗体結合固相支持体の固相支持体がビーズである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該蛍光標識抗体と該抗体結合固相支持体の抗体とがいずれもモノクローン抗体である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
サイトカインがガンマーインターフェロンである、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
被検試料がＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞またはＬＡＫ細胞を含む、請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、サイトカインの測定方法に関するものであり、更に詳細には、ＦＬＩＳＡ法によるガンマーインターフェロンなどのサイトカインの測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞免疫学ならびに分子生物学の分野における最新の進歩により、癌細胞ならびにウイルス感染細胞に反応する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識されるエピトープペプチドが多数同定されてきた。これらの進歩によって、癌、ウイルス感染症ならびに種々の自己免疫疾患に対して、ペプチドによる免疫療法の道が開けてきた。細胞性免疫に関与するＴ細胞、特に抗原特異的Ｔ細胞は、生体による癌細胞やウイルス感染細胞の排除に重要な役割を果たしている。また、多発性硬化症や慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患にも抗原特異的Ｔ細胞の関与が知られている。抗原特異的Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、標的細胞表面に提示された抗原ペプチドと主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の複合体を特異的に認識して反応する。それによって、細胞傷害性Ｔ細胞  （ＣＴＬ）は、癌細胞やウイルス感染細胞を傷害し、あるいは自己反応性Ｔ細胞は、自己免疫疾患を引き起こすと考えられている。従って、癌やウイルス感染に対して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を増強し、また自己免疫疾患に対して自己反応性Ｔ細胞を抑制することを目的とする免疫療法を適切に行うには、抗原特異的Ｔ細胞の検出が必須である。それを検出しモニターすることにより、治療前にどのような抗原ペプチドが患者にとって効果的であるかを決定し、あるいは治療後には処置に使用した抗原ペプチドの患者における効果を確認することが重要である。抗原特異的Ｔ細胞を検出するための従来の方法として、限界希釈法、ＥＬＩＳＰＯＴ法、ＭＨＣテトラマー法などが知られている。
【０００３】
限界希釈法は、段階希釈したＴ細胞をプレートにて培養した後、それを、抗原を感作して提示させた標的細胞に対して反応させ、次いで各プレートにおける陽性ウエル数をもとに統計学的な処理を行って抗原特異的Ｔ細胞の頻度を算出する（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２６：１６１４−１６２０，１９８１）。この方法は定量性に優れるが、通常、数段階の希釈を設定し、希釈段階ごとに１プレート（６０−９６ウエル）を用意するため、１検体を解析するために多量のＴ細胞試料を用意しなければならない。また、この方法では、抗原特異的Ｔ細胞の検出感度を上げるため、通常、１週間に１回の頻度で複数回抗原ペプチドを感作したリンパ球を標的細胞として用いるため、操作が煩雑である。
【０００４】
ＥＬＩＳＰＯＴ法は、サイトカインに対する抗体をウエル底面にコートしたプレートにＴ細胞と抗原を加えて培養し、Ｔ細胞が産生するサイトカインをトラップさせた後、トラップされたサイトカインを酵素標識抗体と発色基質を用いて視覚化し、陽性スポット数をカウントして特異的Ｔ細胞の頻度を算出する（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １２８：  ６５，  １９９０）。この方法では、バックグラウンドが高く、スポットの陽性と陰性の判定が難しい場合がある。
【０００５】
ＭＨＣテトラマー法は、抗原ペプチド、ＭＨＣおよびβ２ミクログロブリンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで会合させたＨＬＡ・抗原ペプチド複合体の末端をビオチン化した後、蛍光標識したストレプトアビジンを結合させて作製したＭＨＣテトラマーを用いて抗原特異的Ｔ細胞を染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）にて解析する（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：９４，  １９９６）。この方法は、多数の検体の解析が可能であるが、ＴＣＲとＭＨＣテトラマーの結合のみで検出されるので、機能していないＴ細胞も含めて検出される。また、各ペプチドごとのＨＬＡ・抗原ペプチド複合体の作製を必要とする。
【０００６】
これらＥＬＩＳＰＯＴ法やＭＨＣテトラマー法などの従来法は、抗原特異性ＣＴＬの検出には有用である。しかし、これらの方法では、ペプチドを感作した抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって刺激をして、癌患者の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）から抗原特異性ＣＴＬを誘導させるため、一群のペプチドに対する反応性を試験するためにフィーダー細胞として相当数の末梢血単核球細胞を必要としている。
上記したように、抗原特異的Ｔ細胞を検出するための従来法はいずれも、採取すべき血液量、簡便さ、検出感度等、何らかの問題を有している。そこで、比較的少量の血液を用いても複数の抗原ペプチドに対する特異的Ｔ細胞頻度を検定できる簡便な免疫モニターリング系の確立が望まれている。
【０００７】
抗原特異的Ｔ細胞の検出は、ガンマーインターフェロン（ＩＦＮ−γ）などのサイトカインの産生量を定量することによって通常行われている。
ＩＦＮ−γは、種々のリンパ球サブタイプ、例えばＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞などにから産生される。ＩＦＮ−γは、多様な免疫調節効果を有し、癌ワクチンの臨床試験における免疫応答を測定するために広く使用されている。また、ＩＦＮ−γは、ＨＬＡ分子などの細胞表面抗原の発現増強機能を有している。更に、ＩＦＮ−γは、抗原によって刺激されることによって分泌されるので、癌ワクチンの臨床試験における免疫応答を測定するために広く使用されている。
ＩＦＮ−γなどのサイトカインの定量には、ＥＬＩＳＡ  （Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）  法が広く使用されている。しかし、従来のＥＬＩＳＡ法には、多くの静置反応と洗浄工程ならびに過剰量の抗体が必要であるという欠点がある。したがって、このＥＬＩＳＡ法は、多量の試料を素早くスクリーニングするのには適していない。
【０００８】
そこで、本発明者らは、従来のＥＬＩＳＡ法の欠点を解消して、ＩＦＮ−γなどのサイトカインを測定することができる測定方法を見出すべく鋭意検討した結果、ＦＬＩＳＡ  （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）  法を用いることによって所望の効果を奏することを見出すとともに、ガンマーインターフェロンを正確に定量することができることを見出して、この発明を完成するに至った。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、この発明は、従来のＥＬＩＳＡ法の欠点を改善し、ＩＦＮ−γなどのサイトカインを定量することができる新規なサイトカインの測定方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、被検試料を、サイトカイン認識可能抗体（以下、「第１抗体」ともいう）結合固相支持体とサイトカイン認識可能な蛍光標識抗体（以下、「第２抗体」ともいう）とに混合することによって、被検試料中に含まれるサイトカインを、第１抗体結合固相支持体と第２抗体とに結合させることによって、被検試料中の該サイトカインを測定することからなるサイトカインの測定方法を提供する。
【００１１】
この発明の好ましい態様として、この発明は、第１抗体と、第２抗体とは、それぞれ測定対象の同一サイトカインの別の部位を認識できることからなるサイトカインの測定方法を提供する。この発明の測定方法に使用される第１抗体と、第２抗体のように、ガンマーインターフェロンなどのサイトカインの別の部位を認識できるようにすることは、サイトカインをより確実に測定することを可能にし、測定精度を向上させるのに有用である。
【００１２】
また、好ましい態様として、この発明のサイトカインの測定方法においては、第２抗体結合固相支持体の固相支持体としてビーズを使用している。かかる固相支持体としてビーズを使用することは、所定の抗体を結合したビーズが容易に入手できるという大きな利点がある。
【００１３】
更に、この発明の好ましい態様においては、第１抗体と、第２抗体とがいずれもモノクローン抗体であるサイトカインの測定方法が提供される。モノクローン抗体を使用することは、サイトカインの測定がより確実に行うことができるという利点がある。
【００１４】
この発明は、その更に好ましい態様としては、サイトカインに結合した第２抗体の蛍光を測定することによって、サイトカインの量を測定することからなるサイトカインの測定方法を提供する。かかるサイトカイン認識可能抗体の蛍光を測定することは、サイトカインをより正確にかつ確実に測定することができるという利点がある。
【００１５】
更に、この発明は、その好ましい態様としては、例えば、Ｄ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞またはＬＡＫ細胞などの抗原特異的Ｔ細胞から産生されるガンマーインターフェロンの測定方法を提供する。ガンマーインターフェロンを測定することは、ガンマーインターフェロンが種々の抗原特異的Ｔ細胞から産生されるところから、多様な生物学的性質、例えば免疫調節活性，抗ウイルス活性、抗腫瘍活性、ＨＬＡ分子のような細胞表面抗原の発現増加などを有するとともに、抗原で刺激した後に分泌されるので、癌ワクチンの臨床試験において免疫応答をモニターするために幅広く使用することができるという大きな利点がある。
【００１６】
【発明の実施の態様】
この発明に係るサイトカインの測定方法は、被検試料を、サイトカイン認識可能な抗体結合固相支持体（この固相支持体に結合しているサイトカイン認識可能な抗体を「第１抗体」ともいう）とサイトカイン認識可能な蛍光標識抗体（第２抗体）とに混合することによって、被検試料中に含まれるサイトカインを、第１抗体結合固相支持体と第２抗体とに結合させることによって、被検試料中のサイトカインに結合した上記蛍光標識抗体の蛍光を測定することによってサイトカインを測定することから構成されている。
【００１７】
この発明に係る測定方法によって測定できるサイトカインとしては、特に限定されるものではないが、特にガンマーインターフェロンを挙げることができる。ガンマーインターフェロン以外のサイトカインを測定する場合には、第１抗体結合固相支持体と第２抗体とを、その測定対象のサイトカインを測定できるように調製することによって測定することができるようになる。
【００１８】
また、この発明の測定方法は、被検試料中に含まれるガンマーインターフェロンなどのサイトカインを測定することができるので、被検試料としては特に限定されるものではなく、血液そのものまたは血液から分離された血清やリンパ球などの血液試料中のサイトカインを測定するのに使用することができる。
ガンマーインターフェロンなどのサイトカインは、例えば、刺激した後の抗原特異的Ｔ細胞に対して適当な標的細胞を反応させることによって抗原特異的Ｔ細胞から産生される。したがつて、サイトカインを定量することによって抗原特異的Ｔ細胞を検出することができる。
【００１９】
この発明の測定方法に使用されるサイトカイン認識可能な蛍光標識抗体（第２抗体）は、例えば、ガンマーインターフェロンなどのサイトカイン認識可能な抗体と、この抗体を標識する蛍光色素とから構成されている。かかる抗体としては、例えば、ガンマーインターフェロンなどのサイトカインを認識できる抗体であれば、モノクローン抗体であっても、ポリクローン抗体であってもよく、また、その由来も特定の動物に限定されるものではなく、例えば、所望の性質を発揮するものであればヒト、マウスなどいずれの動物由来の抗体であってもよい。
他方、上記抗体を標識する蛍光色素としては、かかるサイトカインに結合する抗体を標識するとともに、その蛍光がＦＭＡＴによって測定することができるものであればいずれも使用することができる。かかる蛍光色素としては、例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５などを挙げることができる。なお、Ｃｙ５は、その蛍光測定波長は、６５０−６８５ｎｍであり、Ｃｙ５．５は、その蛍光測定波長は、６８５−７２０ｎｍである。
かかる蛍光色素を抗体に標識する方法としては、慣用されているいずれの標識方法であれば、いずれの標識方法も使用することができる。
【００２０】
この発明に使用するサイトカイン認識可能な抗体結合固相支持体としては、第２抗体によって認識されるサイトカインを同時に認識することができる抗体（第１抗体）を結合した固相支持体（以下、「結合固相支持体」ともいう）であればいずれでもよく、かかる固相支持体としてはビーズなどを挙げることができる。この固相支持体に結合することができる抗体としては、第１抗体によって認識されるサイトカインを同時に認識することができる抗体である限り、いずれの抗体であってもよく、更に、モノクローン抗体であっても、ポリクローン抗体であってもよく、また、その由来も特定の動物に限定されるものではなく、例えば、所望の性質を発揮するものであればヒト、マウスなどいずれの動物由来の抗体であってもよい。
【００２１】
以下、この発明にかかるサイトカイン測定方法について簡単に説明をする。
この発明に係るサイトカイン測定方法は、被験検体を、第１抗体結合固相支持体と第２抗体とに混合して、第１抗体と第２抗体の両者に同時に認識された被験検体中のサイトカインを、第２抗体の標識蛍光を指標として測定することからなっている。
被験検体中に測定対象のガンマーインターフェロンなどのサイトカインが含まれている場合には、かかるサイトカインは、結合固相支持体の第１抗体と第２抗体とに認識されて結合固相支持体に結合される。このようにサイトカインを結合した結合固相支持体は、一定時間静置すると、下層に沈殿層を形成する。この沈殿層中の結合固相支持体にサイトカインを介在して結合している第２抗体の標識蛍光色素の蛍光を測定することによって、蛍光強度、ひいてはサイトカイン量を測定することができる。
【００２２】
この発明において、蛍光によるサイトカインの測定は、蛍光微量アッセイ技術（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ＦＭＡＴ）  に基づいて本発明者らが開発したＦＬＩＳＡ法によって行うことができる。ＦＬＩＳＡ法は、少量の試料で定量可能であり、洗浄工程が不要であることに大きな特長がある。
【００２３】
蛍光微量アッセイ技術  （ＦＭＡＴ）は、ヘリウム／ネオンレーザーを使用したユニークなマクロ共焦イメージシステムを使用して、マルチウエルトレイの内底面に存在する蛍光性ビーズに自動的に焦点を当てるとともにスキャンをすることができる。このシステムでは、焦点深度が残留量に比べて１００ミクロン程度と小さいことから、バックグラウンド蛍光がビーズに結合している蛍光に対して最小になるようになっている。したがって、このシステムでは非結合発蛍光団を除去することが不要であるという特長がある。また、ＦＬＩＳＡ法は、従来のＥＬＩＳＡ法に匹敵する線状ダイナミック領域  （ｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ）と感度とを有している。
好ましい態様では、サイトカインがガンマーインターフェロンであり、かつ被験検体と第１抗体結合固相支持体および蛍光標識第２抗体との混合物を洗浄せずにそのまま、標識蛍光の測定に使用する。また、ガンマーインターフェロンの測定に当たり、被検試料として、刺激した後の抗原特異的Ｔ細胞に対して適当な標的細胞を反応させた、そのような抗原特異的Ｔ細胞の培養上清そのものを、本発明の方法に使用できる。
【００２４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
実施例１：ＦＬＩＳＡ法によるガンマーインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の定量
（装置）
ＦＭＡＴ装置としては、バーコードリーダーと、６０枚のプレートを装着できるロボットプレートハンドラー（Ｚｙｍａｒｋ）とを一体的に取り付けた検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。ヘリウム／ネオンレーザ（６３３  ｎｍ）を使用して、マイクロプレートの底部のトポロジーをマップした。レーザは１  ｍｍ  ｘ  １  ｍｍ  ｘ  １００  μｍ（厚み）の領域を２５６回スキャンし、発生した蛍光を、励起ビームとして同一光路と、フィルター中の光電子増倍管による検出のためのビームスプリッタを通過するように設定した（図１）。
【００２５】
（抗体コーテイングビーズ）
抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｍ７００Ａ、ＥＮＤＧＥＮ）４  μｇを８００  μｌのＰＢＳ溶液（０．０１％  ＮａＮ３）で希釈した。この溶液に、２００  μｌのヤギ抗マウス  ＩｇＧ（Ｆｃ）ポリスチレンビーズ  （０．５％  ｗ／ｖ；  ビーズ径６  μｍ，  Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製）を添加して、室温でゆっくり撹拌しながら１８時間インキュベートした。８０００  ｘ  ｇで２分間遠心分離をした後、上清を除去し、得られたモノクローナル抗体でコートしたビーズを上記ＰＢＳ溶液１  ｍｌに再度懸濁した。得られたビーズを繰り返し洗浄して、上記ＰＢＳ溶液中（８  ｘ  １０６  ｂｅａｄｓ／ｍｌ）に４℃で保存した。
【００２６】
（Ｃｙ５．５の抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体への結合）
上記と別の抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体Ｍ−７０１（ＥＮＤＧＥＮ）をＣｙ５．５ラベリングキット（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）によってラベルした。つまり、上記抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体１ｍｇを５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ  ７．０）１  ｍｌに溶解した後、上記抗体溶液１００  μｌに対してカップリングバッファ５  μｌを添加し完全に撹拌した。得られた抗体溶液にＣｙ５．５蛍光色素を添加し、室温で１時間静置した後、遊離の染料をゲルろ過カラムクロマトグラフィで分離した。
【００２７】
（ＩＦＮ−γの蛍光微量イムノアッセイ）（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）
試料またはＩＦＮ−γ標準溶液をそれぞれ５０  μｌ量９６ウエルプレートに入れ、各ウエル中に、上記ビーズ混合物（抗体ビーズ：Ｃｙ５．５抗体：ＦＬＩＳＡバッファ  （ＰＢＳ，  １％  ＢＳＡ，  ０．３５  Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０，  ０．０１％  ＮａＮ３）＝７０：５：５０００）  ５０  μｌを加え、この中に試料またはＩＦＮ−γ標準試料を入れて混合した。得られた混合液を室温で４時間暗所に静置した。静置後、９６ウエルプレートをＦＭＡＴスキャナーでスキャンしてビーズ当たりの平均蛍光量を記録した。
【００２８】
（ＩＦＮ−γの標準カーブ作成）
Ｃｙ５．５結合抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体および抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体結合ビーズを各試料と混合し、室温で３．５時間暗所で静置した。ビーズはＩＦＮ−γの介在により蛍光色素と結合し、各プレート底部に移動した。ＦＭＡＴスキャナによってビーズに結合した蛍光をレーザスキャンすることによって検出した。ＩＦＮ−γの標準溶液は、ＲＰＭＩ−１６４０と１０％  ＦＣＳとの混合液によって２倍に順次希釈し、ＩＦＮ−γの標準カーブをＦＭＡＴスキャナを用いて作成した（図２）。ＦＬＩＳＡによるＩＦＮ−γの線状動的領域（ｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ）は１５．６−２，０００  ｐｇ／ｍｌ  （２．１  ｌｏｇ  ｒａｎｇｅ）であった。このように、ＦＬＩＳＡ法はＩＦＮ−γの比較的高濃度の領域で高い安定性を有しているのに対して、ＥＬＩＳＡ法はＩＦＮ−γの比較的低濃度の領域（１０−１，０００  ｐｇ／ｍｌ）で高い安定性を有している。更に、ビーズ結合蛍光の強度はＩＦＮ−γ濃度に従って増加した。
【００２９】
（培養試料中のＩＦＮ−γ測定）
培養試料中のＩＦＮ−γを正確に定量することができるかどうかを試験するために、種々の癌関連ペプチドによって刺激された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって産生されるＩＦＮ−γ量を、ＦＬＩＳＡ法とＥＬＩＳＡ法とによってそれぞれ測定した。その結果を図３Ｂに示す。ＦＬＩＳＡ法とＥＬＩＳＡ法とで測定した同一試料の標準偏差値（ＳＤ）の平均はそれぞれ８８と６５であった。両者による結果については重大な相違は観察されなかった。ＦＬＩＳＡ法とＥＬＩＳＡ法との間の相関係数は０．９６７であった。
この結果、ＦＬＩＳＡ法は、ＣＴＬの培養液におけるＣＴＬの培養液内のＩＦＮ−γなどの、生物試料中のＩＦＮ−γを正確に定量することができた。しかし、ＲＰＭＩ−１６４０混合物（ＲＰＭＩ−１６４０  ＋  １０％  ＦＣＳ）よりもＦＬＩＳＡバッファー（１％  ＢＳＡ，  ０．０１％  ＮａＮ３／Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）を用いた場合の方が測定感度が高かった。
ＦＬＩＳＡ法については３８４ウエルプレートについても同様の処理をした結果、９６ウエルプレートを用いて行った結果と本質的には同一であった。また、試料とビーズとの混合物の最終容量を２５  μｌにすることにより、培養に要する時間を２時間に短縮できた。
【００３０】
（ＦＬＩＳＡ法とＥＬＩＳＡ法とのＩＦＮ−γ測定に必要な作業時間の比較）
ＩＦＮ−γの測定に要する作業時間についてのＦＬＩＳＡ法とＥＬＩＳＡ法との比較結果を図４に示す。比較実験においては、１５枚、３０枚、４５枚および６０枚のプレートをＦＬＩＳＡ法とＥＬＩＳＡ法とによってそれぞれ測定するのに要する時間（反応時間は除外）を比較した。図４からも明らかなように、ＦＬＩＳＡ法による測定時間は、従来のＥＬＩＳＡよりもほぼ１／６に短縮することができ、ＥＬＩＳＡ法による測定時間よりも著しく短縮でき、作業効率を向上させるのに有効であることが判明した。また、ＦＬＩＳＡ法は、プレート１枚当たりの測定時間も、ＥＬＩＳＡ法よりも著しく短くなり、測定の大幅な効率向上に寄与することも判明した。このような測定時間の差は、ＦＬＩＳＡ法が均一系のアッセイであるため洗浄工程を必要としないのに対して、ＥＬＩＳＡ法が非均一系のアッセイであるため洗浄工程を必要とすることに起因している。
その上、ＦＬＩＳＡ法においては、３８４ウエルプレートを使用することにより培養時間を更に短縮することが可能となり、ＩＦＮ−γの測定時間を全体として大幅に短縮することができる。３８４ウエルプレートを使用する場合には、各ウエル中の試料とビーズとの混合物の内容量は僅かに２０  μｌである。
【００３１】
【発明の効果】
ＦＬＩＳＡ法とＥＬＩＳＡ法との比較試験の結果、ＦＭＡＴスキャナは、ビーズと蛍光を使用してＩＦＮ−γを正確に検出することができることを示した。ＦＬＩＳＡ法は、また従来のＥＬＩＳＡ法に対して、線状動的領域と感受性とにおいて十分に匹敵できることも判明した。更に、ＩＦＮ−γの産生量を測定することは、癌ワクチンを用いた多くの臨床試験において広く使用されていて、ＥＬＩＳＡ法はＩＦＮ−γの測定のためには十分に確立された方法であるが、複数回の培養工程と洗浄工程を必要とするとともに、過剰量の抗体を必要とする。
これに対して、この発明に使用するＦＬＩＳＡ法は、ＩＦＮ−γの測定時間が短縮され、処理費用も軽減されるとともに、均一系のアッセイであることから、非結合抗体、リガントならびに発蛍光団を除去するための洗浄工程を必要とせず、また、更に静置時間も短くかつ抗体の必要量も少ないという大きな利点がある。
更に、ＦＬＩＳＡ法は、３８４ウエルプレートを使用することにより、静置時間を更に短縮することが可能となり、ＩＦＮ−γの測定時間を全体として大幅に短縮することができるという大きな利点も有している。
ここで、サイトカインのうちでも特にＩＦＮ−γを定量することの利点は、ＩＦＮ−γがＣＤ４＋細胞やＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞などの様々なリンパ球サブタイプによって産生され、かつ、多様な生物学的性質、例えば免疫調節活性，抗ウイルス活性、抗腫瘍活性、ＨＡＬ分子のような細胞表面抗原の発現増加などを有するとともに、抗原で刺激した後に分泌されるので、癌ワクチンの臨床試験の多くで免疫応答をモニターするのに幅広く使用されていることにある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＬＩＳＡ法の原理を説明する説明図である。
【図２】ＦＬＩＳＡ法によるＩＦＮ−γの標準カーブを示すグラフである。
【図３】生物試料中のウエル毎のＩＦＮ−γ産生量を示すグラフである。（Ａ）癌患者のＰＢＭＣを，ＩＬ−２の存在下で１０  μＭペプチドと共に２４ウエルプレート中で培養し、培養７日と１４日目に再刺激した後、ＩＦＮ−γ産生を測定した結果を示す。各カラムは２回のアッセイの平均値を示していて、濃灰色で塗りつぶしたカラムはＦＬＩＳＡによる測定結果を、淡灰色で塗りつぶしたカラムはＥＬＩＳＡによる測定結果を示している。（Ｂ）ＦＬＩＳＡとＥＬＩＳＡとによって測定されたＩＦＮ−γ産生レベル間の関係を示すグラフである。
【図４】図４は、プレートのウエル数によるＦＬＩＳＡとＥＬＩＳＡとに要する作業時間の比較を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
2004150997.tif 000003
【図３】
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【図４】
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