(57)【要約】  【課題】  TGR23-2リガンドを感度よく特異的に定量することができる抗体、および該抗体を用いるTGR23-2リガンドの検出・定量法、およびこれらを用いた医薬、診断薬の提供。  【解決手段】  TGR23-2リガンドのN端側またはC末端の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、および該抗体を用いたTGR23-2リガンドの検出・定量法、およびこれらを用いた癌の予防・治療剤および診断薬等。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体。
【請求項２】
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１〜７番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する請求項１記載の抗体。
【請求項３】
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１〜３番目、第１〜４番目、第１〜５番目、第１〜６番目、第１〜７番目、第２〜４番目、第２〜５番目、第２〜６番目、第２〜７番目、第３〜５番目、第３〜６番目、第３〜７番目、第４〜６番目、第４〜７番目または第５〜７番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する請求項１記載の抗体。
【請求項４】
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドを認識しない請求項１記載の抗体。
【請求項５】
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する請求項１記載の抗体。
【請求項６】
標識化された請求項１記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項８】
２３Ｌ−１Ｎ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０２）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得る２３Ｌ−１Ｎａで標示される請求項７記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体。
【請求項１０】
配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１５〜１８番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１２〜１４番目、第１２〜１５番目、第１２〜１６番目、第１２〜１７番目、第１２〜１８番目、第１３〜１５番目、第１３〜１６番目、第１３〜１７番目、第１３〜１８番目、第１４〜１６番目、第１４〜１７番目、第１４〜１８番目、第１５〜１７番目、第１５〜１８番目または第１６〜１８番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する請求項９記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドを認識しない請求項９記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する請求項９記載の抗体。
【請求項１４】
標識化された請求項９記載の抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である請求項９記載の抗体。
【請求項１６】
２３Ｌ−２Ｃ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０３）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得る２３Ｌ−２Ｃａで標示される請求項１５記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
請求項１または請求項９記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項１８】
癌または拒食症の予防・治療剤である請求項１７記載の医薬。
【請求項１９】
請求項１または／および請求項９記載の抗体を含有してなる診断薬。
【請求項２０】
請求項１記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法。
【請求項２１】
さらに請求項９記載の抗体を用いることを特徴とする請求項２０記載の定量法。
【請求項２２】
請求項１記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法。
【請求項２３】
請求項１記載の抗体を用いることを特徴とする癌の診断法。
【請求項２４】
さらに請求項９記載の抗体を用いることを特徴とする請求項２２または請求項２３記載の診断法。
【請求項２５】
請求項９記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法。
【請求項２６】
請求項１記載の抗体と、被検液および標識化された配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法。
【請求項２７】
請求項９記載の抗体と、被検液および標識化された配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法。
【請求項２８】
（１）担体上に不溶化した請求項１記載の抗体、標識化された請求項９記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定する、または、
（２）担体上に不溶化した請求項９記載の抗体、標識化された請求項１記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその塩の定量法。
【請求項２９】
請求項７記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項３０】
２３Ｌ−１Ｎ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０２）で標示される請求項２９記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項３１】
請求項２９記載のハイブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から請求項７記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とする請求項７記載のモノクローナル抗体の製造法。
【請求項３２】
請求項１５記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項３３】
２３Ｌ−２Ｃ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０３）で標示される請求項３２記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項３４】
請求項３２記載のハイブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から請求項１５記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とする請求項１５記載のモノクローナル抗体の製造法。
【請求項３５】
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩。
【請求項３６】
哺乳動物に対して、請求項１または請求項９記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、癌または拒食症の予防・治療法。
【請求項３７】
癌または拒食症の予防・治療剤の予防・治療剤を製造するための請求項１または請求項９記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に結合特異性を有する新規な抗体に関する。更に詳しくは、抗原抗体反応に基づく該ポリペプチドまたはその塩の定量法、中和活性を利用する該ポリペプチドまたはその塩が関与する疾患（例、癌など）の診断および予防・治療剤の開発に有用な抗体などに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、創薬のターゲットとなっている遺伝子の約半数が7回膜貫通構造を特徴とするGタンパク質共役型レセプター（GPCR）である。Gタンパク質共役型レセプターTGR23は、ヒト結腸癌細胞LS 174T、LS 180、SW 403およびヒト胃癌細胞KATOIIIなどの癌細胞株および大腸癌組織において発現が亢進しているレセプターであり、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、ヒトTGR23-2リガンドと称することもある）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、ラットTGR23-2リガンドと称することもある）、および配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、マウスTGR23-2リガンドと称することもある）などが、そのリガンドペプチドとして見出された（特許文献１ WO 02/31145号公報）。
【特許文献１】WO 02/31145号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヒトTGR23-2リガンドの生理機能をさらに明らかにするために、ヒトTGR23-2リガンド、ラットTGR23-2リガンドまたはマウスTGR23-2リガンドの中和抗体、これらTGR23-2リガンドを簡便かつ高感度に検出・定量する測定系が切望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトTGR23-2リガンド、ラットTGR23-2リガンドまたはマウスTGR23-2リガンドのN端側およびC端側を特異的に認識する複数のモノクローナル抗体を作製し、これら抗体を用いることにより血液、脳脊髄液、尿などの生体成分中のTGR23-2リガンドの変動を簡便に、高感度に検出・定量できることを見出し、さらに、これら抗体が、TGR23-2リガンドの活性を中和することも見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）  配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、
（２）  配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１〜７番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する上記（１）記載の抗体、
（３）  配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１〜３番目、第１〜４番目、第１〜５番目、第１〜６番目、第１〜７番目、第２〜４番目、第２〜５番目、第２〜６番目、第２〜７番目、第３〜５番目、第３〜６番目、第３〜７番目、第４〜６番目、第４〜７番目または第５〜７番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する上記（１）記載の抗体、
（３ａ）  配列番号：２で表されるアミノ酸配列の第１〜８番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する上記（１）記載の抗体、
（３ｂ）  配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩に特異的に反応する上記（１）記載の抗体、
（４）  配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドを認識しない上記（１）記載の抗体、
（５）  配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（１）記載の抗体、
（６）  標識化された上記（１）記載の抗体、
（７）  モノクローナル抗体である上記（１）記載の抗体、
（８）  ２３Ｌ−１Ｎ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０２）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得る２３Ｌ−１Ｎａで標示される上記（７）記載のモノクローナル抗体、
（９）  配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、
（１０）  配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１５〜１８番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する上記（９）記載の抗体、
（１１）  配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１２〜１４番目、第１２〜１５番目、第１２〜１６番目、第１２〜１７番目、第１２〜１８番目、第１３〜１５番目、第１３〜１６番目、第１３〜１７番目、第１３〜１８番目、第１４〜１６番目、第１４〜１７番目、第１４〜１８番目、第１５〜１７番目、第１５〜１８番目または第１６〜１８番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する上記（９）記載の抗体、
（１２）  配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドを認識しない上記（９）記載の抗体、
（１３）  配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（９）記載の抗体、
（１４）  標識化された上記（９）記載の抗体、
（１５）  モノクローナル抗体である上記（９）記載の抗体、
（１６）  ２３Ｌ−２Ｃ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０３）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得る２３Ｌ−２Ｃａで標示される上記（１５）記載のモノクローナル抗体、
（１７）  上記（１）または上記（９）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１８）  癌または拒食症の予防・治療剤である上記（１７）記載の医薬、
（１９）  上記（１）または／および上記（９）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（２０）  上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（２１）  さらに上記（９）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（２０）記載の定量法、
（２２）  上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法、
（２３）  上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする癌の診断法、
（２４）  さらに上記（９）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（２２）または上記（２３）記載の診断法、
（２５）  上記（９）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（２６）  上記（１）記載の抗体と、被検液および標識化された配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（２７）  上記（９）記載の抗体と、被検液および標識化された配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（２８）  （i）担体上に不溶化した上記（１）記載の抗体、標識化された上記（９）記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定する、または、
（ii）担体上に不溶化した上記（９）記載の抗体、標識化された上記（１）記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（２９）  上記（７）記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（３０）  ２３Ｌ−１Ｎ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０２）で標示される上記（２９）記載のハイブリドーマ細胞、
（３１）  上記（２９）記載のハイブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から上記（７）記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とする上記（７）記載のモノクローナル抗体の製造法、
（３２）  上記（１５）記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（３３）  ２３Ｌ−２Ｃ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０３）で標示される上記（３２）記載のハイブリドーマ細胞、
（３４）  上記（３２）記載のハイブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から上記（１５）記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とする上記（１５）記載のモノクローナル抗体の製造法、
（３５）  配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、
（３６）  哺乳動物に対して、上記（１）または上記（９）記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、癌または拒食症の予防・治療法、
（３７）  癌または拒食症の予防・治療剤を製造するための上記（１）または上記（９）記載の抗体の使用などに関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の抗体は、極めて高いTGR23-2リガンドへの結合能を有し、TGR23-2リガンドの細胞内[Ca2+]上昇活性を中和することができ、腫瘍増殖抑制作用も有する。従って、本発明の抗体は、TGR23-2リガンドの作用を抑制することにより、例えば癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）または拒食症などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤などの安全な医薬として使用することができる。好ましくは癌の予防・治療剤である。本発明の抗体を用いる測定法、例えばTGR23-2リガンドのＣ端部（配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端部）を特異的に認識するモノクローナル抗体とTGR23-2リガンドのＮ端部を特異的に認識するモノクローナル抗体とを用いるサンドイッチ法による免疫学的測定法などにより、TGR23-2リガンドを感度よく特異的に定量することができるため、例えば、上記疾患などの診断も可能である。また、本発明の抗体は、TGR23-2リガンドの免疫組織染色にも使用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本明細書におけるタンパク質（ポリペプチド）は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルの何れであってもよい。
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、（1）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列に数（1〜5）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（2）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列に数（1〜5）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（3）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の数（1〜5）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが用いられる。
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、または有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【０００８】
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドとしては、例えば、
（a）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の（i）第１〜３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第１〜４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iii）第１〜５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iv）第１〜６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第１〜７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vi）第２〜４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vii）第２〜５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（viii）第２〜６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ix）第２〜７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（x）第３〜５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xi）第３〜６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xii）第３〜７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiii）第４〜６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiv）第４〜７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
（xv）第５〜７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（b）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の第１〜８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。
配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の、
（i）第１２〜１４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第１２〜１５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iii）第１２〜１６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iv）第１２〜１７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第１２〜１８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vi）第１３〜１５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vii）第１３〜１６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（viii）第１３〜１７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ix）第１３〜１８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（x）第１４〜１６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xi）第１４〜１７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xii）第１４〜１８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiii）第１５〜１７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiv）第１５〜１８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（xv）第１６〜１８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。
【０００９】
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、例えば該ポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応するものであればよく、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１〜７番目までのアミノ酸配列を含むペプチド、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の第１〜８番目のアミノ酸配列を有し、かつこのアミノ酸配列の第９番目をCys-NH2に置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）などが用いられる。このうち好ましくは、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドを認識しないものである。
さらに好ましくは、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活性を中和する抗体である。
好ましい具体例としては、２３Ｌ−１Ｎａで標示されるモノクローナル抗体が挙げられる。
さらに、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、（a）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の（i）第１〜３番目のアミノ酸配列、（ii）第１〜４番目のアミノ酸配列、（iii）第１〜５番目のアミノ酸配列、（iv）第１〜６番目のアミノ酸配列、（v）第１〜７番目のアミノ酸配列、（vi）第２〜４番目のアミノ酸配列、（vii）第２〜５番目のアミノ酸配列、（viii）第２〜６番目のアミノ酸配列、（ix）第２〜７番目のアミノ酸配列、（x）第３〜５番目のアミノ酸配列、（xi）第３〜６番目のアミノ酸配列、（xii）第３〜７番目のアミノ酸配列、（xiii）第４〜６番目のアミノ酸配列、（xiv）第４〜７番目のアミノ酸配列、（xv）第５〜７番目のアミノ酸配列、および（b）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の第１〜８番目のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体などが用いられる。
【００１０】
配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、例えば、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応するものであればよく、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有し、かつこのアミノ酸配列の第１９番目にCysを付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）などが用いられる。このうち好ましくは、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドを認識しないものである。
さらに好ましくは、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活性を中和する抗体である。
好ましい具体例としては、２３Ｌ−２Ｃａで標示されるモノクローナル抗体が挙げられる。
さらに、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の（i）第１２〜１４番目のアミノ酸配列、（ii）第１２〜１５番目のアミノ酸配列、（iii）第１２〜１６番目のアミノ酸配列、（iv）第１２〜１７番目のアミノ酸配列、（v）第１２〜１８番目のアミノ酸配列、（vi）第１３〜１５番目のアミノ酸配列、（vii）第１３〜１６番目のアミノ酸配列、（viii）第１３〜１７番目のアミノ酸配列、（ix）第１３〜１８番目のアミノ酸配列、（x）第１４〜１６番目のアミノ酸配列、（xi）第１４〜１７番目のアミノ酸配列、（xii）第１４〜１８番目のアミノ酸配列、（xiii）第１５〜１７番目のアミノ酸配列、（xiv）第１５〜１８番目のアミノ酸配列、および（xv）第１６〜１８番目のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体などが用いられる。
【００１１】
以下に、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、および配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（以下、両者をあわせて本発明の抗体と称することもある）の抗原の調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えば、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩（以下、TGR23-2リガンドと称することもある）と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する合成ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単にTGR23-2リガンド抗原と称することもある）。
TGR23-2リガンドは、（a）例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（c）TGR23-2リガンドをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造される。
（a）該哺乳動物の組織または細胞からTGR23-2リガンド抗原を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、酸、またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
（b）化学的にTGR23-2リガンド抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述した天然より精製したTGR23-2リガンド抗原と同一の構造を有するもの、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において3個以上、好ましくは8個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を1種あるいは2種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（c）DNAを含有する形質転換体を用いてTGR23-2リガンドを製造する場合、該DNAは、公知のクローニング方法〔例、Molecular Cloning（2nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など〕に従って作成することができる。該クローニング方法とは、（1）TGR23-2リガンドのアミノ酸配列に基づきデザインしたDNAプローブまたはDNAプライマーを用い、cDNAライブラリーからハイブリダイゼーション法によりTGR23-2リガンドをコードするDNAを含有する形質転換体を得る方法、または（2）TGR23-2リガンドのアミノ酸配列に基づきデザインしたDNAプライマーを用い、PCR法によりTGR23-2リガンドをコードするDNAを含有する形質転換体を得る方法などが挙げられる。
【００１２】
TGR23-2リガンド抗原としてのペプチドは、（1）公知のペプチドの合成法に従って、または（2）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
該ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の（i）〜（ii）に記載された方法等が挙げられる。
（i）Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１３】
ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチドを得ることもできる。
【００１４】
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル)カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt、HOOBtなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばN,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜約５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常約１．５〜約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
【００１５】
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Z、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2-ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ7-14アラルキル基、2-アダマンチル、4-ニトロベンジル、4-メトキシベンジル、4-クロロベンジル、フェナシルおよびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
【００１６】
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBzl、Cl-Bzl、2-ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、Bom、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
【００１７】
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばPd-黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
ペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１８】
TGR23-2リガンド抗原は、不溶化したものを直接免疫することもできる。また、TGR23-2リガンド抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）とTGR23-2リガンド抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合または吸着させたTGR23-2リガンド抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同志を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、ＳＰＤＰなど）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
【００１９】
（２）モノクローナル抗体の作製
TGR23-2リガンド抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられるが、モノクローナル抗体作製にはマウスが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体の作製に際しては、TGR23-2リガンド抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗TGR23-2リガンドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗TGR23-2リガンド抗体価の測定は、例えば後記の標識化TGR23-2リガンドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法〔Nature、256巻、495頁（1975年）〕に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で、通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００２０】
抗TGR23-2リガンド抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えばTGR23-2リガンドまたはその部分ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗TGR23-2リガンドモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したTGR23-2リガンドを加え、固相に結合したTGR23-2リガンドモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。抗TGR23-2リガンドモノクローナル抗体のスクリーニング、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗TGR23-2リガンド抗体価の測定と同様にして測定できる。
抗TGR23-2リガンドモノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈澱法、等電点沈澱法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など〕に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマ細胞を温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、本発明の抗体を製造することができる。
【００２１】
なお、TGR23-2リガンドの一部領域と反応する抗TGR23-2リガンド抗体を産生するハイブリドーマおよび、TGR23-2リガンドとは反応するがその一部領域とは反応しない抗TGR23-2リガンドモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、たとえばその一部領域に相当するペプチドとハイブリドーマが産生する抗体との結合性を測定することにより行うことができる。
【００２２】
〔１〕本発明の抗体を用いるTGR23-2リガンドの定量法、癌の診断法など
以下にTGR23-2リガンドの定量法（免疫測定法）について、より詳細に説明する。
本発明の抗体を用いることにより、TGR23-2リガンドの測定または組織染色などによる検出を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のF(ab')2、Fab'またはFab画分などを用いてもよい。
本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、TGR23-2リガンド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、サンドイッチ法、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどが用いられるが、感度、特異性の点で後述するサンドイッチ法、競合法が、特にサンドイッチ法が好ましい。
【００２３】
（１）サンドイッチ法
担体上に不溶化した本発明の抗体、標識化された本発明の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することにより被検液中のTGR23-2リガンドを定量する。好ましくは、
（i）担体上に不溶化したTGR23-2リガンドのＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、標識化されたTGR23-2リガンドのＣ端側（配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側）の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のTGR23-2リガンドの定量法、
（ii）担体上に不溶化したTGR23-2リガンドのＣ端側（配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側）の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、標識化されたTGR23-2リガンドのＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のTGR23-2リガンドの定量法などが挙げられる。
さらに好ましくは、TGR23-2リガンドのＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体が、23L-1Naで標示されるモノクローナル抗体で、TGR23-2リガンドのＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体が、23L-2Caで標示されるモノクローナル抗体である定量法である。
【００２４】
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検液を反応（１次反応）させ、さらに標識化された本発明の抗体を反応（２次反応）させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のTGR23-2リガンド量を定量することができる。１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体または標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。サンドイッチ法によるTGR23-2リガンドの測定法においては、例えば、１次反応で用いられる抗体がTGR23-2リガンドのＣ端側（配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側）の部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる抗体はＣ端側の部分ペプチド以外（即ち、Ｎ端側）を認識する抗体が好ましく、１次反応で用いられる抗体がTGR23-2リガンドのＮ端側の部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる抗体は、Ｎ端側の部分ペプチド以外（即ち、Ｃ端側）を認識する抗体が好ましく用いられる。
具体例としては、23L-1Naで標示されるモノクローナル抗体、23L-2Caで標示されるモノクローナル抗体が用いられる。これらの抗体は、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼ（horseradish peroxidase；HRP）で標識化されて用いられるのが好ましい。
【００２５】
（２）競合法
本発明の抗体、被検液および標識化されたTGR23-2リガンドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたTGR23-2リガンドの割合を測定することにより、被検液中のTGR23-2リガンドを定量する。
本反応法は、例えば、固相化法を用いて行う。
具体例としては、抗マウスＩｇＧ抗体（ICN/CAPPEL社製）を固相化抗体として用い、この固相化抗体の存在するプレートに、i)本発明の抗体（例、23L-1Na、23L-2Caなど）、ii）horseradish peroxidase（HRP）で標識化されたTGR23-2リガンド、およびiii）被検液を添加し、反応後、固相に吸着したHRP活性を測定し、TGR23-2リガンドを定量する。
（３）イムノメトリック法
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化された本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは被検液中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
（４）ネフロメトリー
ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００２６】
上記（１）〜（４）において、標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素（例、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕、〔32P〕、〔33P〕、〔35S〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ビオチン、ランタニド元素などが用いられる。さらに、抗体と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
【００２７】
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてTGR23-2リガンドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる［例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunochemical Techniques(Part A)）、同書 Vol. 73（Immunochemical Techniques(Part B)）、同書 Vol. 74（Immunochemical Techniques(Part C)）、同書 Vol. 84（Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays)）、同書 Vol. 92（Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）、同書 Vol. 121（Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)）（以上、アカデミックプレス社発行）など参照］。したがって、本発明のサンドイッチ免疫測定法によりTGR23-2リガンドの測定系を構築する場合、その方法は後述する実施例に限定されない。
以上のように、本発明の抗体は、TGR23-2リガンドを感度良く定量することができるので、TGR23-2リガンドのさらなる生理機能の解明およびTGR23-2リガンドの関与する疾患の診断に有用である。具体的には、本発明の抗体を用いて、体液中（血液、血漿、血清、尿、卵胞液、脊髄液、精液など）に含まれるTGR23-2リガンドの量を測定することにより、TGR23-2リガンドが関与する疾患、例えば癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）、拒食症、摂食亢進症などの疾病、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
例えば、結腸癌の診断においては、体液中のTGR23-2リガンドを定量し、TGR23-2リガンドの量が正常時より多い場合、例えば、血中濃度として約100 fmol/ml以上、好ましくは約150 fmol/ml以上の場合、結腸癌と診断する。
【００２８】
〔２〕本発明の抗体を含有してなる医薬
本発明の抗体は、TGR23-2リガンドの活性（例、TGR23結合活性、TGR23細胞刺激活性、腫瘍増殖作用、摂食行動抑制作用など）を中和するため、TGR23-2リガンドが関与する疾患、例えば癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）または拒食症などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤などの安全な医薬として使用することができる。好ましくは癌の予防・治療剤である。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００２９】
例えば、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の結腸癌の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、非経口投与するのが好都合である。経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００３０】
本発明の明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
Ｇｌｙ      ：グリシン
Ａｌａ      ：アラニン
Ｖａｌ      ：バリン
Ｌｅｕ      ：ロイシン
Ｉｌｅ      ：イソロイシン
Ｓｅｒ      ：セリン
Ｔｈｒ      ：スレオニン
Ｃｙｓ      ：システイン
Ｍｅｔ      ：メチオニン
Ｇｌｕ      ：グルタミン酸
Ａｓｐ      ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ      ：リジン
Ａｒｇ      ：アルギニン
Ｈｉｓ      ：ヒスチジン
Ｐｈｅ      ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ      ：チロシン
Ｔｒｐ      ：トリプトファン
Ｐｒｏ      ：プロリン
Ａｓｎ      ：アスパラギン
Ｇｌｎ      ：グルタミン
ＴＦＡ      ：トリフルオロ酢酸
ＤＭＦ      ：Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＳＰＤＰ    ：3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル
ＧＭＢＳ    ：N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド
ＢＳＡ      ：ウシ血清アルブミン
ＢＴＧ      ：ウシチログロブリン
ＥＩＡ      ：エンザイムイムノアッセイ
ＨＰＬＣ    ：逆相高速液体クロマトグラフィー
ＨＲＰ      ：西洋ワサビパーオキシダーゼ
ＦＢＳ      ：ウシ胎児血清
ｄ−ＦＢＳ  ：透析済みウシ胎児血清
ＴＭＢ      ：3,3’,5,5’-テトラメチルベンチジン
ＮＭＰ      ：N-メチルピロリドン
Ｂｏｃ      ： ターシャリブトキシカルボニル
Ｆｍｏｃ    ：9-フルオレニルメトキシカルボニル
ＤＣＣ      ：N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｐｂｆ      ：2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
ｔＢｕ      ：ターシャリーブチル
Ｔｒｔ      ：トリチル
Ｔｏｓ      ：パラトルエンスルホニル
ＤＩＥＡ    ：N, N'-ジイソプロピルエチルアミン
ＨＯＢｔ    ：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＡｔ    ：1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
ＰｙＡｏｐ  ：7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリスピロリジノホス
ホニウム ヘキサフルオロホスフェイト
Ｃｌｔ      ：2-クロロトリチル
ＢＨＡ      ：ベンツヒドリルアミン
Ｔｈｒ（ΨＭｅ．ＭｅＰｒｏ）：2,2-ジメチル,5-メチル-1,3-オキサゾリジン
-4-カルボン酸
【００３１】
本明細書において用いられる配列番号は、以下のペプチドのアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１〕
ヒトTGR23-2リガンドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ラットTGR23-2リガンドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
マウスTGR23-2リガンドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
[Cys19]ラットTGR23-2リガンド(1-19)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
[Cys9]ラットTGR23-2リガンド(1-9)のアミノ酸配列を示す。
【００３２】
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞23L-1Nは、2003年2月26日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8302として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞23L-2Cは、2003年2月26日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8303として寄託されている。
なお、各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体については細胞名の後に「a」を付けた形で表す。
【００３３】
以下に、実施例および参考例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
以下で用いられる、1％ BSA、0.4M NaCl、および0.05％ 2mM EDTA・Na〔エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸ニナトリウム塩ニ水和物（Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate）, DOJINDO社〕を含む0.02Mリン酸緩衝液（pH7.0）を、バッファーＣと称する。
【００３４】
実施例１
（１）［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）を含む免疫原の作製
参考例４で得られた［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）とKeyhole Limpet Hemocianin（KLH）との複合体を作製し、免疫原とした。
すなわち、KLH 20mgを、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）1.4mlに溶解させ、N-(γ-マレイミドブチリロキシ)サクシニミド（GMBS）2.2mg（8μmol）を含むDMF溶液 100μlと混合し、室温で40分反応させた。反応後、セファデックスG-25カラムで分画したのち、マレイミド基の導入されたKLH 15mgと［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19） 3.75mgとを混合し、4℃で1日間反応させた。反応後、生理食塩水に対し、4℃で3日間透析した。
（２）免疫
6〜8週令のBALB/C雌マウスに、上記（１）で得られた［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド(1-19)-KLH複合体を、それぞれ約70μg/匹となるよう、完全フロイントアジュバントとともに皮下免疫した。以後3週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとともに2〜3回追加免疫した。
（３）HRP標識化［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）の作製
［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）とHRP（酵素免疫測定法用、ベーリンガーマンハイム社製）とを架橋し、酵素免疫測定法（EIA）の標識体とした。
すなわち、HRP 9.2mg（180nmol）を0.95mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）に溶解させ、GMBS 0.504mg（1.8μmol）を含むDMF溶液50μlと混合し、室温で30分間反応させたのち、セファデックスG-25カラムで分画した。このようにして作製した、マレイミド基の導入されたHRP 6.4mg（126nmol）と参考例４で得られた［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）0.35mg（378nmol）とを混合し、4℃で1日反応させた。反応後ウルトロゲルAcA44（LKB-ファルマシア社製）カラムで分画し、HRP標識化［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）を得た。
【００３５】
（４）［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド(1-19)-KLH複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定
［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド(1-19)-KLH複合体を3週間間隔で2回免疫を行い、その1週間後に眼底採血を行い血液を採取した。さらに血液を、4℃で12,000rpmで15分遠心した後、上清を回収し抗血清を得た。抗血清中の抗体価を下記の方法により測定した。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートを作製するため、まず、抗マウスイムノグロブリン抗体（IgG画分、カッペル社製）を100μg/ml含む0.1M炭酸緩衝液（pH9.6）溶液を96ウェルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で洗浄したのち、各ウェルの余剰の結合部位をふさぐため25％ブロックエース（雪印乳業社製）を含むPBSを300μlずつ分注し、4℃で少なくとも24時間処理した。
得られた抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウェルにバッファーＣ 50μl、およびバッファーＣで希釈した複合体に対する抗血清100μlを加え、4℃で16時間反応させた。次に、該プレートをPBSで洗浄したのち、上記（３）で作製したHRP標識化［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）（バッファーＣで400倍希釈）100μlを加え、室温で1日反応させた。次に、該プレートをPBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性をTMB (3,3’,5,5’-テトラメチルベンチジン)マイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC、フナコシ薬品取り扱い）100μlを加え室温で10分間反応させることにより測定した。反応を1Mリン酸100μlを加え停止させたのち、450nmの吸収をプレートリーダー（BICHROMATIC、大日本製薬社製）で測定した。
結果を図１に示す。免疫した8匹中6匹のマウスの抗血清中に［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）に対する抗体価の上昇が認められた。
【００３６】
（５）抗TGR23-2リガンドモノクローナル抗体の作製
比較的高い抗体価を示したマウスに対して50μgの免疫原を生理食塩水0.2mlに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫4日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エッセンシャルメデイウム（MEM）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞P3-X63.Ag8.U1（P3U1）を用いた（Current Topics in Microbiology and Imnology、81巻、１頁、1978年）。
細胞融合は、原法（Nature、256巻、495頁、1975年）に準じて行なった。
脾臓細胞およびP3U1をそれぞれ、血清を含有しないMEMで3度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比率を5:1になるよう混合して、800回転で15分間遠心を行ない細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈澱を軽くほぐし、45％ポリエチレングリコール（PEG）6000（コッホライト社製）を0.3ml加え、37℃温水槽中で7分間静置して融合を行なった。融合後、細胞に毎分2mlの割合でMEMを添加し、合計15mlのMEMを加えた後600回転15分間遠心して上清を除去した。この細胞沈澱物を10％牛胎児血清を含有するGITメデイウム（和光純薬）(GIT-10％ FCS)に、P3U1が1ml当り2×105個になるように浮遊し、24穴マルチディッシュ（リンブロ社製）に1ウェル1mlずつ192ウェルに播種した。播種後、細胞を37℃で5％炭酸ガスインキュベーター中で培養した。24時間後、HAT（ヒポキサンチン 1×10-4M、アミノプテリン 4×10-7M、チミジン 1.6×10-3M）を含んだGIT-10％ FCS培地（HAT培地）を1ウェル当り1mlずつ添加することにより、HAT選択培養を開始した。HAT選択培養は、培養開始3、6および9日後に旧液を1ml捨てた後、1mlのHAT培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後9〜14日で認められ、培養液が黄変したとき（約1×106セル/ml）、上清を採取し、上記（４）に記載の方法に従って抗体価を測定した。
［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド(1-19)-KLH複合体を免疫したマウス由来のハイブリドーマの抗体産生細胞株を選択した例として、マウスNo.2およびNo.6の（図１参照）を用いて細胞融合を行い、得られたハイブリドーマの抗体産生状態を、図２〜図４に示す。得られた抗体産生ハイブリドーマの中から、表１に記載の計3種類のハイブリドーマを選択した。
【表１】
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次に、上記で得られたハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングに付した。クローニングに際しては、フィーダー細胞としてBALB/Cマウスの胸腺細胞を5×105個／ウェルになるように加えた。クローニング後、ハイブリドーマを、あらかじめミネラルオイル0.5mlを腹腔内投与されたマウス（BALB/C）に1〜3×106セル/匹を腹腔内投与したのち、6〜20日後に抗体含有腹水を採取した。
モノクローナル抗体は、得られた腹水よりプロテイン-Aカラムにより精製した。腹水6〜20mlを等量の結合緩衝液〔3.5M NaCl、0.05％ NaN3を含む1.5Mグリシン（pH9.0）〕で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビナントプロテイン-A-アガロース（Repligen社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液〔0.05％NaN3を含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.0）〕で溶出した。溶出液をPBSに対して4℃、2日間透析したのち、0.22μmのフィルター（ミリポア社製）により除菌濾過し、4℃あるいは-80℃で保存した。
モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの決定に際しては、精製モノクローナル抗体結合固相を用いるエンザイム−リンクトイムノソーベントアッセイ（ELISA）法を行った。すなわち、抗体2μg/mlを含む0.1M炭酸緩衝液（pH9.6）溶液を96ウェルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放置した。上記（１）に記載の方法に従って、ウェルの余剰の結合部位をブロックエースでふさいだのち、アイソタイプタイピングキット(Mouse-TyperTMSub-Isotyping Kit バイオラッド社製)を用いるELISAによって固相化抗体のクラス、サブクラスを調べた。得られた3種のモノクローナル抗体はいずれもH鎖がIgG1、L鎖がκであった。
【００３７】
実施例２
競合法酵素免疫測定法を用いた抗体の認識部位の検討
［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド(1-19)-KLH複合体を免疫原として作製したモノクローナル抗体の反応特異性を以下の方法により調べた。
まず、得られた3種類のモノクローナル抗体溶液の抗体価を、上記実施例１−（４）記載の方法により調べ、競合法-EIAに用いる抗体濃度として、標識体の結合量が飽和結合量の約50％となる抗体濃度を決定した（約10〜50ng/ml）。次に、上記実施例１−（４）記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに、（i）23L-1Naは50 ng/ml、23L-1Caは10 ng/ml、または23L-2Caは30 ng/mlとなるようそれぞれバッファーＣで希釈された抗ラットTGR23-2リガンド（1-19）抗体溶液50μl、（ii）バッファーＣで希釈されたヒトTGR23-2リガンド溶液50μl、ラットTGR23-2リガンド溶液50μl、マウスTGR23-2リガンド溶液50μl 、または［Cys9-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-9）溶液50μl（後述の実施例８）、および（iii）実施例１−（３）で得られたHRP標識化［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）（バッファーＣで250倍希釈）50μlを、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに加え、4℃で16時間反応させた。反応後、PBSで洗浄したのち抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート上の酵素活性を、上記実施例１−（４）記載の方法により測定した。
結果を表１に示す。この結果から3種類の抗体の認識部位は以下のように考えられた。
23L-1Naは、ヒトTGR23-2リガンド、ラットTGR23-2リガンドおよびマウスTGR23-2リガンドと反応性を有し、さらに［Cys9-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-9）とも反応する。よって、23L-1Naの認識部位はこれらのペプチドの共通部位である、ヒトTGR23-2リガンド（1-7）（配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第1〜7番目のアミノ酸配列）であると考えられる。
23L-1Caは、ラットTGR23-2リガンドと反応性を有するが、ヒトTGR23-2リガンド、マウスTGR23-2リガンド、および［Cys9-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-9）に対しては反応性を有していない。よって、23L-1Caの認識部位は、10位のバリンを中心としたラットTGR23-2リガンド（9-12）（配列番号：２で表されるアミノ酸配列の第9〜12番目のアミノ酸配列）であると考えられる。
23L-2Caは、ラットTGR23-2リガンドおよびマウスTGR23-2リガンドと反応性を有するが、ヒトTGR23-2リガンドおよび［Cys9-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-9）に対しては反応性を有していない。よって、23L-2Caの認識部位は、16位のアルギニンを中心としたラットTGR23-2リガンド（15-18）およびマウスTGR23-2リガンド（15-18）（配列番号：２および配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第15〜18番目のアミノ酸配列）であると考えられる。
【００３８】
次に、例として、各モノクローナル抗体の競合法-EIAの結果を、図５、図６および図７に示す。
23L-1Naは、ヒトTGR23-2リガンド、ラットTGR23-2リガンドおよびマウスTGR23-2リガンドの標準曲線から、最大反応に対する割合(B/B0)=0.5を与える濃度は、ヒトおよびマウスTGR23-2リガンドは60nM、ラットTGR23-2リガンドは100nMであることが分かった（図５）。これらの結果から、23L-1Naは、ヒトTGR23-2リガンド、ラットTGR23-2リガンドおよびマウスTGR23-2リガンドのいずれに対しても高い反応性を示しているものと考えられる。
23L-1Caは、ヒトTGR23-2リガンド、ラットTGR23-2リガンドおよびマウスTGR23-2リガンドの標準曲線から、最大反応に対する割合(B/B0)=0.5を与える濃度は、ラットTGR23-2リガンドは20nMであり、ヒトTGR23-2リガンドおよびマウスTGR23-2リガンドとは反応性を示さない（図６）。これらの結果から、23L-1Caは、ラットTGR23-2リガンドに対してのみ高い反応性を示しているものと考えられる。
23L-2Caは、ヒトTGR23-2リガンド、ラットTGR23-2リガンドおよびマウスTGR23-2リガンドの標準曲線から、最大反応に対する割合(B/B0)=0.5を与える濃度は、ラットTGR23-2リガンドは20nM、マウスTGR23-2リガンドは40nMであり、ヒトTGR23-2リガンドとは反応性を示さない（図７）。これらの結果から、23L-2Caは、ラットTGR23-2リガンドおよびマウスTGR23-2リガンドに対してのみ高い反応性を示しているものと考えられる。
【００３９】
実施例３
HRP標識化抗TGR23-2リガンドモノクローナル抗体（23L-2Ca-HRP）の作製
23L-2Ca精製画分8.91 mg（59.4 nmol）を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に、GMBS 0.59 μmolを含むDMF 50μlを加え、室温で40分反応させた。反応液をセファデックスG-25カラム（溶離液、0.1Mリン酸緩衝液、pH6.7）で分離し、マレイミド基の導入された抗体画分6.23 mgを得た。次に、HRP 17.1 mg（428 nmol）を含む0.02Mリン酸緩衝液（0.15M NaClも含む）（pH6.8）1.14mlに、SPDP 6.42 μmolを含むDMF 60μlを加え、室温で40分反応させた。次に、64.2 μmolのジチオスレイトールを含む0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）0.4mlを加え、室温で20分反応させた後、セファデックスG-25カラム（溶離液、2mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0）で分離し、SH基の導入されたHRP 9.2 mgを得た。次に、SH基の導入されたHRP 8mgとマレイミド基の導入された抗体画分3 mgとを混合し、コロジオンバッグ（ザルトリウス社製）で約0.5mlにまで濃縮したのち、4℃で16時間放置した。反応液を0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で平衡化したSephacrylS-300HRカラム（Pharmacia社製）に供し、23L-2Ca-HRP複合体画分を精製した。
【００４０】
実施例４
サンドイッチ法-EIA
実施例１で得られた精製したモノクローナル抗体23L-1Naを15μg/ml含む0.1M炭酸緩衝液（pH9.6溶液）を96ウェルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放置した。ウェルの余剰の結合部位をPBSで4倍希釈したブロックエース400μlを加え不活化した。
上記調製済みプレートに、バッファーＣで希釈したヒトTGR23-2リガンド、ラットTGR23-2リガンドおよびマウスTGR23-2リガンド標準液100μlを加え、4℃で24時間反応させた。PBSで洗浄したのち、上記実施例３で作製した23L-2Ca-HRP（バッファーＣで3,000倍希釈）100μlを加え、4℃で24時間反応させた。PBSで洗浄したのち、実施例１−（４）記載の方法によりTMBマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システムを用いて固相上の酵素活性を測定した（酵素反応30分）。
結果を図８に示す。
このサンドイッチ法-EIAは、ラットTGR23-2リガンドを3 fmol/mｌ、マウスTGR23-2リガンドを10 fmol/mｌで検出することが可能であり、ヒトTGR23-2リガンドとは1000 fmol/mLまで反応しなかった。したがって、固相抗体として23L-1Naを用い、標識体として23L-2Ca-HRPを用いるサンドイッチ法-EIAは、ラットTGR23-2およびマウスTGR23-2リガンドを極めて高感度にかつ極めて選択的に検出することが可能であることがわかる。
【００４１】
実施例５ 
23L-1Naおよび23L-2CaによるマウスTGR23-2リガンドの生物活性の中和作用
23L-1Naおよび23L-2CaによるマウスTGR23-2リガンドに対する中和活性を、WO 02/31145号公報の参考例１記載のTGR23-2発現CHO細胞を用いた細胞内[Ca2+]濃度上昇活性を指標に、FLIPR（Molecular Devices社）を用いて測定を行った。
TGR23-2発現CHO細胞を、3×104cells/mlとなるように透析処理済ウシ胎児血清(以後dFBS) （JRH BIOSCIENCES 社）を含むDulbecco's modified Eagle medium（DMEM）培地（日水製薬株式会社）（10％ dFBS-DMEM）に懸濁し、FLIPR用96穴プレート（Black plate clear bottom、Coster社）に分注器を用いて各ウェルに200μlずつ播種し（4×104cells/200μl/ウェル）、5％ CO2インキュベーター中にて37℃で一晩培養した後用いた（以後、細胞プレートとする）。FLIPRアッセイバッファー〔ニッスイハンクス２（日水製薬株式会社）9.8g、炭酸水素ナトリウム 0.35g、HEPES 4.77g、6M水酸化ナトリウム溶液でpH7.4に合わせた後、1Lにフィルアップし、フィルター滅菌処理したもの〕20ml、250mM プロベセシド（SIGMA社）200μl、ウシ胎児血清（FBS）210μlを混合した。また、Fluo 3-AM（同人化学研究所）2バイアル（50μg）を、ジメチルスルフォキサイド 40μl、20％ Pluronic acid（Molecular Probes社）40μlに溶解し、これをH/HBSS〔ヘペスバッファードハンクスバランス溶液（ニッスイハンクス2（日水製薬株式会社） 9.8g、炭酸水素ナトリウム 0.35g、HEPES 4.77 g 、水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた後、フィルター滅菌処理）〕20 ml、250 mM プロベセシド 200 μlおよびFBS 200 μlを含むH/HBSS−プロベセシド−FBS溶液に加え、混和後、8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに、各ウェル100μlずつ分注し、5％ CO2インキュベーター中で37℃1時間インキュベートした（色素ローディング）。23L-1Naおよび23L-2Caを、2.5mM プロベセシドおよび0.2％ BSAを含むHanks'/HBSS 120μlにて希釈し、マウスTGR23-2リガンド（5.0 x 10-10M）と37℃で1時間インキュベーション後、各フラクション5μlを、FLIPR用96穴プレート（V-Bottomプレート、Coster社）へ移した（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローディング終了後、Hanks'/HBSSに2.5mM プロベセシドを加えた洗浄バッファーで、プレートウォッシャー（Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを4回洗浄し、洗浄後100μlの洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレートをFLIPRにセットし、測定を行った（FLIPRにより、サンプルプレートから50μlのサンプルが細胞プレートへと移される）。
結果を図９に示す。
これより、マウスTGR23-2リガンド（5.0 x 10-10M）の活性を、23L-1Naは、10倍モル濃度の高い5 x 10-9 Mで約74％まで、100倍モル濃度の高い5 x 10-8 Mで約15％まで抑制したことがわかる。23L-2Caは、マウスTGR23-2リガンド（5.0 x 10-10M）の活性を、10倍モル濃度の高い5 x 10-9 Mで約65％まで、100倍モル濃度の高い5 x 10-8 Mで約12％まで抑制したことがわかる。
以上の結果から、23L-1Naおよび23L-2Caは、マウスTGR23-2リガンドの細胞内[Ca2+]濃度上昇活性を中和することが明らかとなり、これら抗体はマウスTGR23-2リガンドの中和抗体として使用可能であることがわかる。
【００４２】
実施例６
血漿中のマウスTGR23-2リガンドの定量
雄性Balb/Cマウス（6週齢）血漿を、同量のバッファーＣで2倍希釈し、上記実施例４記載のサンドイッチ法-EIAにより、マウスTGR23-2リガンドを定量した。
結果を表２に示す。
【表２】
2004275186.tif 000003
マウスの血液血漿中に27.6±3.76 fmol/ml（mean±SEM，n=22）の高濃度のマウスTGR23-2リガンドが検出された。
【００４３】
実施例７
TGR23-2リガンド中和抗体投与によるヌードマウスでの腫瘍増殖に及ぼす影響
TGR23-2リガンドに対して中和活性を示す23L-2Ca投与によるヒト結腸癌細胞株LS 174T担癌ヌードマウスでの腫瘍増殖に及ぼす影響を検討した。
PBSに溶解した結腸癌細胞株LS 174Tを2 x 106 cells/200μl/mouseの割合で雌性ヌードマウス(BALB/cAnN-nu, 6週齢)の左腹部皮下に投与した。投与10日目に、腫瘍スケールを測定し、腫瘍の大きさが均一になるよう42匹から24匹を選択し、12匹ずつ2群に群分けを行った。群分けを行った日から23L-2Caおよびコントロール抗体として23L-2Caと同じIgGサブクラス構造（IgG1、κ）である抗ヒトメタスチンモノクローナル抗体（KIS-1Na）（Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 88巻, 914-919頁, 2003年）をマウス腹腔内に、3 mg/kg/day の用量で14日間連続投与した。腫瘍のスケールを一日おきに測定し、腫瘍体積は (長径)×(短径)2/2で算出した。
結果を図１０に示す。
これより、投与開始2日目から17日目まで、23L-2Ca投与群においてLS 174Tの腫瘍体積の有意な低下が観察された。
【００４４】
実施例８
[Cys9]ラットTGR23-2リガンド(1-9)アミド（配列番号：５）の製造
市販 p−メチルBHA樹脂（0．80 m mole／g resin）をベプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc−Strategy（NMP-HOBt）ベプチド合成方法でBoc-Cys(MeBzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Asn, Boc-Arg(Tos)の各Bocアミノ酸誘導体を配列順に導入し目的の保護ベプチド樹脂を得た。この樹脂0.21gをp−クレゾール1.5ml、と共に無水弗化水素10 ml中、0℃ 60分攪拌した後、弗化水素を減圧留去し、残留物ヘジエチルエーテルを加え沈澱を濾過した。この沈澱を50％酢酸水で抽出し、不溶部分を除き、抽出液を十分に濃縮後、50％酢酸水で充填したセファデックス（商標）G−25カラム（2.0 x 80cm）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集め凍結乾燥し、白色粉末40mgを得た。半量をLiChroprep（商品名）RP-18を充填したクロマトカラム（2.6 x 60cm）に付し、0.1％ TFA水 200mlで洗浄、0.1％ TFA水 300mlと0.1％TFA含有33％アセトニトリル水 300mlを用いた線型勾配溶出を行い、主要画分を集め凍結乾燥し目的とするペプチド10mgを得た。
質量分析によるM+    925.5（計算値925.0）
HPLC溶出時間：11.5分
溶出条件
カラム：Wakosi15C18T   (4.6  x 100mm)
溶離液：A液:0.1％TFA水、B液:0.1％TFA含有アセトニトリルを用いA/B：95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（25分）
流速：1.0 ml/分
【００４５】
参考例１
ヒトTGR23-2リガンドの製造
市販のBoc-Ser(Bzl)-OCH2-PAM樹脂を、ペプチド合成機ACT90の反応槽に入れ、DCMで膨潤後TFAでBocを除去し、DIEAで中和した。この樹脂をNMPに懸濁し、HOBt-DIPCIでBoc-Lys(Cl-Z)を縮合した。反応後ニンヒドリンテストで遊離のアミノ基の有無を調べ、ニンヒドリンテストがプラスの時には同じアミノ酸を再度縮合した。再縮合後においてもニンヒドリンテストがプラスの時には無水酢酸でアセチル化した。このサイクルを繰り返し、Boc-Ala、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gln、Boc-Phe、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Lys(Cl-Z)、Boc-Lys(CL-Z)、Boc-Met、Boc-Gly、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Gly、Boc-Val、Boc-Gly、Boc-Asn、Boc-Arg(Tos)、Boc-Phe、Boc-Ser(Bzl)を配列順に縮合し、所望の保護ペプチド樹脂0.24ｇを得た。この樹脂をp-クレゾール1.5 mlとともにフッ化水素約15 ml中、0℃で60分攪拌した後フッ化水素を減圧留去し、残留物にジエチルエーテルを加えて濾過した。濾過物に水と酢酸を加えペプチドを抽出し、樹脂と分離した。抽出液を濃縮し50％酢酸で充填したセファデックス（商標）G-25カラム（2.0 x 80 cm）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集め凍結乾燥した。その一部(45 mg)をLiChroprep（商標）RP-18を充填した逆相クロマトカラム（2.6 x 60 cm）に付け、0.1％ TFA 水 200mlで洗浄、0.1％ TFA 水 300mlと0.1％ TFA含有 25％ アセトニトリル水 300mlを用いた線型勾配溶出を行い、主要画分を集め凍結乾燥し目的とするペプチド12.7 mgを得た。
ESI-MS：分子量 MW  2188.0(理論値 2187.5)
HPLC溶出時間  10.6分
カラム条件：
カラム：Wakosil 5C18T  4.6 x 100mm 
溶離液：A液−0.1％ TFA水、B液−0.1％TFA含有アセトニトリルを用いA/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（25分）
流速：1.0 ml/分
【００４６】
参考例２
ラットTGR23-2リガンドの製造
市販の2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33 mmol/g) にFmoc-Ala-OHを導入したFmoc-Ala-O-Clt resin (0.638 mmol/g) 0.25 mmol分をペプチド合成機ABI 433Aの反応槽に入れ、Fmoc/DCC/HOBt法を用い、固相合成を行なった。Fmocアミノ酸の側鎖保護基はArgにはPbf基、SerにはtBu基、LysにはBoc基、AsnにはTrt基を用いた。他のアミノ酸は側鎖無保護のものを用い、上記に示す配列の17位ArgからN末端方向へ順に14位Serまでペプチド鎖を導入した。得られたFmoc-ラットTGR23-2リガンド(14-18)-O-Clt resin (0.25 mmol)をFmoc-Lys(Boc)-Thr(Psi(Me,Me)pro)-OH (NOVA社製, 製品番号05-20-1116) 381.1 mg (0.625 mmol)、PyAOP 326.1 mg (0.625 mmol)、HOAt 85.1 mg (0.625 mmol)、DIEA 435.5 ml (2.5 mmol)で処理することで、12位Lys、13位Thrを導入した。続いて得られたFmoc-[Thr(Psi(Me,Me)pro)13]-ラットTGR23-2リガンド(12-18)-O-Clt resin を用いてペプチド合成機による固相合成を再開、11位LysからN末端方向へ順に1位Serまでペプチド鎖を導入し、目的の保護ペプチド樹脂573.5 mgを得た。
この樹脂の全て(0.25 mmol)をTFA、thioanisole、m-cresol、水、triisopropylsilane、ethandithiol (80:5:5:5:2.5:2.5)の混合液9 ml中で室温、90分間攪拌した後、反応溶液にエーテルを加え、白色粉末を析出させ遠心分離後、上清を除く操作を3回繰り返した。残渣を水で抽出後、凍結乾燥し白色粉末を219.4 mg得た。得られた粗ペプチドをYMC Pack R&D-ODS-5-B S-5, 120Aカラム (30 x 250 mm)を用いた分取HPLCで、A液: 0.1％ TFA-水、B液: 0.1％ TFA含有アセトニトリルによるA/B: 90/10〜70/30への直線型濃度勾配溶出(60分)を行ない、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末を得た。
得られた粉末を全て水に溶解、混合したあと、溶液にBIO-RAD社製イオン交換樹脂AG1 x 8 100-200 mesh chloride formを酢酸塩化した樹脂を3 ml分加え、20分撹拌後濾過により樹脂と不純物を除いた後、凍結乾燥して酢酸塩として白色粉末107.0 mgを得た。
ESI-MS：M+ 1954.2 (理論値 1954.2)
HPLC溶出時間：15.2分
溶出条件
カラム：YMC AM 301 (4.6 x 100mm)
溶離液：A液: 0.1％ TFA-水、B液: 0.1％ TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜50/50へ直線型濃度勾配溶出(25分)
流速：1.0 ml/分
【００４７】
参考例３
マウスTGR23-2リガンドの製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.12 mmol/g) にFmoc-Gln(Trt)-OH を導入したFmoc-Gln(Trt)-O-Clt resin (0.408 mmol/g) 0.25 mmol分を用い、参考例１に記載したラットTGR23-2リガンドの製造と同様に固相合成を行ない、目的の保護ペプチド樹脂324.7 mgを得た。
この樹脂100 mgを参考例１と同様に処理し、白色粉末を50.0 mg得た。得られた粗ペプチドをYMC SH-343-5 S-5、120Aカラム (20 x 250 mm)を用いた分取HPLCで、A液: 0.1％ TFA-水、B液: 0.1％ TFA含有アセトニトリルによるA/B: 92/8〜72/28への直線型濃度勾配溶出(60分)を行ない、目的物を含む分画を集めて凍結乾燥し、白色粉末22.6 mgを得た。
ESI-MS：M+ 2182.8 (理論値 2182.5)
HPLC溶出時間：14.1分
溶出条件
カラム：YMC AM 301 (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1％ TFA-水、B液: 0.1％ TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜50/50へ直線型濃度勾配溶出(25分)
流速：1.0 ml/分
【００４８】
参考例４
[Cys19]ラットTGR23-2リガンド(1-19)（配列番号：４）の製造
市販 H-Cys(Trt)-O-Clt 樹脂 (0.63mmol/g) 0.25mmol分をペプチド合成機ABI 433A の反応曹に入れ、 Fmoc/ DCC/ HOBt法を用い、固相合成を行った。Fmocアミノ酸の側鎖保護基はArgにはPbf基、SerにtBu基、LysにBoc基、AsnにTrt基を用いた。他のアミノ酸は側鎖無保護のものを用い、上記に示す配列の18位AlaからN末端方向へ順に14位Serまでペプチド鎖を導入した。得られたFmoc-rTGR23L(14-18)-O-Clt 樹脂 (0.25mmol)のうち半分(0.125mmol)を20％ピペリジン/DMFでFmoc基を除去した後、Fmoc-Lys(Boc)-Thr(ΨMe.MePro)-OH (NOVA社製)304.9mg(0.5mmol), PyAOP 260.9mg(0.5mmol), 0.5M HOAt/DMF溶液1ml(0. 5mmol), DIEA 326.6μl(1.88mmol)で処理することで12位Lys、13位Thrを導入した。続いて得られたFmoc-[Thr(ΨMe.MePro)13, Cys19]ラットTGR23-2リガンド(12-19)-O-Clt 樹脂を用いてペプチド合成機による固相合成を再開、11位LysからN末端方向へ順に1位Serまでペプチド鎖を導入し、目的の保護ペプチド樹脂234.0mgを得た。
この樹脂100 mgをTFA, thioanisole, m-cresol, H2O, triisopropylsilane, ethandithiol(80:5:5:5:2.5:2.5)の混合液1.5ml中で室温、90分間攪拌した後、反応溶液にエーテルを加え、白色粉末を析出させ遠心分離後、上清を除く操作を3回繰り返した。残渣を酢酸水溶液で抽出後、凍結乾燥し得られた白色粉末をYMC SH-343-5 S-5, 120Aカラム(20 x 250mm)を用いた分取HPLCで、A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルによるA/B: 86/14から76/24への直線型濃度勾配溶出(60分)を行い、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末26.1mgを得た。
質量分析による(M+H)+   2056.6 (計算値2057.1)
HPLC溶出時間  15.3 分
溶出条件
カラム：YMC-AM301   (4.6 x 100mm)
溶離液：A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜50/50へ直線型濃度勾配溶出(25分)
流速：1.0ml/分
【００４９】
参考例５
ヒトTGR23-2リガンドのラット側脳室内投与による摂餌量に及ぼす影響
ラットは、照明時間を8時から20時、室温25℃において飼育した。8週齢Wistar系雄性ラット（手術時体重260〜280g）をペントバルビタール50 mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、ラット脳定位固定装置に固定した。切歯用バーはインターオーラルラインから3.3 mm低くした。頭蓋骨を露出し、側脳室にガイドカニューレAG-8（内径0.4 mm、外径0.5 mm、エイコム）を埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開けた。また、その周囲3箇所にアンカービスを埋めた。ステンレス製ガイドカニューレAG-8を、その先端が側脳室の上部に位置するように挿入した。定位座標は、PaxinosとWatson(1998)のアトラスに従い、ブレグマより、AP：-0.8 mm、L：1.5 mm、H：-4.5mmとした。ガイドカニューレは歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミーカニューレAD-8（外径 0.35 mm、エイコム社）を挿入し、キャプナット（エイコム社）で固定した。術後、ラットは個別のケージで飼育し、粉末飼料へ1週間馴化させた。
ガイドカニューレを埋め込んでから約1週間飼育して術後の回復および粉末飼料への馴化を待ち、ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミーカニューレを取り外し、代わりにPTFE（ポリ四フッ化エチレン）チューブ（長さ50 cm、内径0.1 mm、外径0.35 mm、エイコム社）につないだステンレス製マイクロインジェクションカニューレAMI-9（内径0.17 mm、外径0.35 mm、エイコム社）を挿入した。マイクロインジェクションカニューレの長さは、その先端1 mmがガイドカニューレから露出するように調節しておいた。PTFEチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、大塚蒸留水、ヒトTGR23-2リガンドを溶解させた蒸留水を5μl/分の流速で計10μl（10 nmol/ラット）を側脳室に注入した。注入終了後2分待ってからマイクロインジェクションカニューレを取り外し、再びダミーカニューレをキャップナットで固定した。注入は、19時から20時の間に行ない、その後の摂餌量を摂餌量測定措置Feed-Scale（Columbus社）を用いて30分毎に投与4時間後まで経時的に測定した。
結果を図１１に示す。
これより、ヒトTGR23-2リガンド投与群は、対象群に比し、投与1.5および2時間後において有意（p<0.05）な摂餌量の減少が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）-BTG複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定結果を表す。図中、−◇−はマウスNo.1、−□−はマウスNo.2、−△−はマウスNo.3、−○−はマウスNo.4、−◆−はマウスNo.5、−■−はマウスNo.6、−▲−はマウスNo.7、−●−はマウスNo.8を表す。
【図２】［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）-BTG複合体を免疫したマウス由来のハイブリドーマが、抗体を産生している状態（吸光分析の結果）を表す。
【図３】［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）-BTG複合体を免疫したマウス由来のハイブリドーマが、抗体を産生している状態（吸光分析の結果）を表す。
【図４】［Cys19-NH2］ラットTGR23-2リガンド（1-19）-BTG複合体を免疫したマウス由来のハイブリドーマが、抗体を産生している状態（吸光分析の結果）を表す。
【図５】23L-1Naの競合法-EIAの結果を表す。図中、−●−はヒトTGR23-2リガンドとの反応性を、−○−はラットTGR23-2リガンドとの反応性を、−■−はマウスTGR23-2リガンドとの反応性を表す。
【図６】23L-1Caの競合法-EIAの結果を表す。図中、−●−はヒトTGR23-2リガンドとの反応性を、−○−はラットTGR23-2リガンドとの反応性を、−■−はマウスTGR23-2リガンドとの反応性を表す。
【図７】23L-2Caの競合法-EIAの結果を表す。図中、−●−はヒトTGR23-2リガンドとの反応性を、−○−はラットTGR23-2リガンドとの反応性を、−■−はマウスTGR23-2リガンドとの反応性を表す。
【図８】23L-1Naおよび23L-2Ca-HRPを用いたサンドイッチ法EIAの結果を表す。図中、−●−はヒトTGR23-2リガンドとの反応性を、−○−はラットTGR23-2リガンドとの反応性を、−■−はマウスTGR23-2リガンドとの反応性を表す。
【図９】23L-1Naまたは23L-2Ca共存時におけるマウスTGR23-2リガンドのTGR23-2発現CHO細胞に対する細胞内[Ca2+]濃度上昇活性に対する中和作用を表す。マウスTGR23-2リガンド（5x10-10M）を、モル濃度で23L-1Naまたは23L-2Caと1：1、1：10、1:100または1:1000の各割合で、室温で1時間反応後の細胞内[Ca2+]濃度上昇活性を示す。図中、黒棒は23L-1Naを、白棒は23L-2CaをマウスTGR23-2リガンドとそれぞれ共存させた時の、TGR23-2発現CHO細胞における細胞内 [Ca2+]濃度上昇活性のコントロール（抗体非添加時）に対する割合を示す。
【図１０】TGR23-2リガンドに対して中和活性を示す23L-2Caおよびコントロール抗体投与によるヒト結腸癌細胞株LS 174T担癌ヌードマウスでの腫瘍の増殖曲線を示す。図中、−●−は23L-2Ca投与群の増殖曲線を、−○−はコントロール抗体(KIS-1Na) 投与群の増殖曲線を示す。値は平均値±標準偏差（mean±SE）（n=12）を示す。＊はコントロール抗体（KIS-1Na）投与群に比べて、P値が0.05以下であることを示す。＊＊はコントロール抗体（KIS-1Na）に比べて、P値が0.01以下であることを示す。
【図１１】ヒトTGR23-2リガンドまたは蒸留水をラット側脳室内に投与後4時間までの30分ごとの摂餌量の経時的変動を示す。図中、−●−はヒトTGR23-2リガンド投与群を、−○−は蒸留水投与群を示す。値は平均値±標準誤差 (n=8) で示す。＊は蒸留水投与群に対して有意な（p＜0.05）差であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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