(57)【要約】【課題】桿菌の検出能を向上させた細菌測定方法及び装置を提供する。【解決手段】桿菌を形態変化させる抗生剤を検体に添加して試料液を調製する。試料液に含まれる各粒子から大きさ情報として前方散乱光発光時間、前方散乱光強度を検出し、それらをパラメータとしたスキャッタグラムを作成する。細胞壁合成阻害剤により形態変化した桿菌は細長い形態となっており、スキャッタグラム上で夾雑物や他の細菌とは異なった位置に出現する。【選択図】      図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下で培養することにより試料液を調製し、粒子分析装置を用いて試料液中の各粒子から大きさ情報を検出し、検出した大きさ情報に基づき試料液中の桿菌を検出する細菌分析方法。
【請求項２】
前記粒子分析装置により各粒子から散乱光を検出し、検出した散乱光の発光時間を前記大きさ情報として用いる、請求項１に記載の細菌分析方法。
【請求項３】
前記大きさ情報に基づき、試料液に含まれる粒子の粒度分布を作成することを特徴とする、請求項１に記載の細菌分析方法。
【請求項４】
前記抗生剤はペニシリン系抗生剤であることを特徴とする、請求項４に記載の細菌分析方法。
【請求項５】
前記ペニシリン系抗生剤はＰＩＰＣであることを特徴とする、請求項５に記載の細菌分析方法。
【請求項６】
細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下で培養し、培養後の検体に、細菌を特異的に蛍光染色する蛍光染色剤を添加することにより試料液を調製し、粒子分析装置を用いて試料液中に含まれる各粒子から蛍光情報と大きさ情報を検出し、検出した蛍光情報に基づき細菌を弁別し、弁別された細菌の大きさ情報に基づき桿菌を検出する細菌分析方法。
【請求項７】
前記粒子分析装置により各粒子から散乱光を検出し、検出した散乱光の発光時間を前記大きさ情報として用いる、請求項６に記載の細菌分析方法。
【請求項８】
細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下でインキュベートするためのインキュベータ、インキュベート後の検体を試料液としてサンプリングするサンプリング部、サンプリングされた試料液に含まれる各粒子から大きさ情報を検出する検出器を有する測定部、測定部で検出された大きさ情報に基づき桿菌を検出する分析部、を備える細菌分析装置。
【請求項９】
前記測定部は各粒子が発する散乱光を検出し、検出された散乱光の発光時間を前記大きさ情報として用いる、請求項８に記載の細菌分析装置。
【請求項１０】
細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下でインキュベートするためのインキュベータと、インキュベート後の検体に、細菌を特異的に蛍光染色する蛍光染色剤を添加するための染色処理部と、染色処理後の検体を試料液としてサンプリングするサンプリング部と、試料液に含まれる各粒子から蛍光情報を検出する第一の検出器、各粒子から大きさ情報を検出する第二の検出器を有する測定部と、検出された蛍光情報に基づき細菌を弁別し、弁別された細菌の大きさ情報に基づき桿菌を検出する分析部とを備えた細菌分析装置。
【請求項１１】
前記第二の検出器は各粒子が発する散乱光を検出し、検出された散乱光の発光時間を前記大きさ情報として用いる、請求項１０に記載の細菌分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中の細菌を測定する方法及び装置に関し、特に桿菌を特異的かつ高感度に検出する方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査、食品検査、環境水質検査などの様々な分野で、細菌の検査が行われている。細菌は必要に応じて、グラム染色性（グラム陽性菌・陰性菌）や形態上の特徴（球菌・桿菌・らせん菌）により分類される。
【０００３】
検体中の桿菌を検出する検査方法としては、寒天培地を用いた方法が知られている。細菌を培養して増殖させることにより、培地上にコロニーが形成される。このコロニーを顕微鏡で観察して菌種を判定する。またコロニー数を数えて菌数をカウントする。しかしこれらの方法は、コロニーとして肉眼で判別できるようになるまで細菌が増殖するのに１〜２日程度の時間を要し、またコロニーの観察、カウントは手間がかかり労力を要する。
【０００４】
近年、粒子分析装置を用いて細菌を自動測定することが試みられている。粒子分析装置では、試料液中に夾雑物が混入していると、それを測定対象の粒子として誤検知してしまう恐れがある。細菌は通常０．５〜５μｍ前後の大きさであり、その大きさの夾雑物、特に小さな夾雑物全てを除去することは困難な場合が多い。試料液中に細菌と同程度の大きさの夾雑物が存在していると、夾雑物を検出した信号と細菌を検出した信号の区別がつかず、細菌の正確な測定が難しい。
【０００５】
夾雑物の影響を低減させて粒子分析装置で細菌を測定する技術としては次のようなものがある。
（１）培養前・培養後の試料をフローサイトメータで測定し、両測定結果の差をとることにより試料中の夾雑物の影響による誤測定を防止する微生物の測定方法及び装置（例えば、特許文献１参照）。
（２）ｐＨ２．０〜４．５において細菌を含む試料にカチオン性界面活性剤を作用させて細菌の色素透過性を亢進させ、細菌の染色性を高めることにより、試料中に夾雑物が存在しても細菌が発する蛍光を検出することにより夾雑物から分離して計数する方法（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
上記のように粒子分析装置を用いると、比較的短時間で細菌を測定できるが、このような方法においてさらに検体中の桿菌を特異的、高感度に検出する方法は提案されていない。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第６１６５７４０号明細書
【特許文献２】
特開２００１−２５８５９０号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、夾雑物が存在していても、検体中の桿菌を特異的、高感度に検出する細菌分析方法及び装置を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み本発明は、細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下で培養することにより試料液を調製し、粒子分析装置を用いて試料液中の各粒子から大きさ情報を検出し、検出した大きさ情報に基づき試料液中の桿菌を検出する細菌分析方法を提供する。
【００１０】
また本発明は、細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下で培養し、培養後の検体に、細菌を特異的に蛍光染色する蛍光染色剤を添加することにより試料液を調製し、粒子分析装置を用いて試料液中に含まれる各粒子から蛍光情報と大きさ情報を検出し、検出した蛍光情報に基づき細菌を弁別し、弁別された細菌の大きさ情報に基づき桿菌を検出する細菌分析方法を提供する。
【００１１】
また本発明は、細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下でインキュベートするためのインキュベータ、インキュベート後の検体を試料液としてサンプリングするサンプリング部、サンプリングされた試料液に含まれる各粒子から大きさ情報を検出する検出器を有する測定部、測定部で検出された大きさ情報に基づき桿菌を検出する分析部、を備える細菌分析装置を提供する。
【００１２】
また本発明は、細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下でインキュベートするためのインキュベータと、インキュベート後の検体に、細菌を特異的に蛍光染色する蛍光染色剤を添加するための染色処理部と、染色処理後の検体を試料液としてサンプリングするサンプリング部と、試料液に含まれる各粒子から蛍光情報を検出する第一の検出器、各粒子から大きさ情報を検出する第二の検出器を有する測定部と、検出された蛍光情報に基づき細菌を弁別し、弁別された細菌の大きさ情報に基づき桿菌を検出する分析部とを備えた細菌分析装置を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
原理
実施例に先立ち、本発明の原理について説明する。
【００１４】
本発明では、抗生剤の存在下で細菌を培養処理することにより桿菌の形態を変化させて試料液を調製する。抗生剤は、細菌に対する作用の仕方から細胞壁合成阻害剤、核酸代謝阻害剤、蛋白合成阻害剤などに分類されるが、このうち細胞壁合成阻害剤を用いる。抗生剤による処理は、抗生剤を添加した培地で細菌を所定時間培養することにより行う。
【００１５】
細胞壁合成阻害剤の存在下で培養された桿菌の形態について説明する。図１４は、細胞壁合成阻害剤の一種であるＰｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ（以下、「ＰＩＰＣ」と呼ぶ。これはペニシリン系の抗生剤である。）添加前の通常の桿菌の形態と、ＰＩＰＣを添加して培養した後の、形態変化を生じた桿菌の形態を模式的に示す図である。ＰＩＰＣの影響により、桿菌は増殖しても細胞分裂時に細胞壁が正常に合成されず、正常に分裂できなくなるため、細長く大きくなってゆく。細長く形態変化した桿菌は、通常の細菌と比べ、明らかに大きな大きさ情報を有することになる。本発明は、抗生剤存在下での培養により桿菌の形態が大きく変化することに着目したものである。
【００１６】
試料液中の各粒子から大きさ情報を検出するために、粒子分析装置を用いる。粒子分析装置としては電気抵抗式又は光学式のものを用いることができる。光学式粒子分析装置としては、各粒子にレーザ光を照射して生じた散乱光を信号として検出する分析装置を用いる。フローサイトメータがその代表的装置である。散乱光をパルス状の電気信号として検出し、その信号波形を解析して得られる散乱光強度や散乱光発光時間により、粒子の大きさや形態を詳細に分析できる。
【００１７】
図１５に、検出した前方散乱光信号の波形を例示する。縦軸は信号強度を、横軸は時間を表わす。図中、ノイズ除去のために閾値が設定されており、信号強度が所定の閾値を越えている部分が、粒子を検出している部分とみなされる。ここで前方散乱光強度（以下、「Ｆｓｃ」という）は、粒子の大きさを反映し、前方散乱光発光時間（以下、「Ｆｓｃｗ」という）は検出領域を通過する粒子の長さを反映する。いずれも粒子の大きさに関係する情報であり、散乱光から粒子の大きさに関する情報を得ることができる。
【００１８】
検出する信号としては、散乱光の他、種々の波長の蛍光の信号が適宜用いられる。測定対象の粒子を予め蛍光染色しておき、粒子から蛍光を検出することで、より詳細な粒子の情報を得ることができる。電気抵抗式粒子分析装置を用いる場合は、測定対象となる粒子を含む試料液を流す細孔と、細孔を挟むように配置された電極を有し、細孔を粒子が通過する際の電気抵抗変化をパルス状の電気信号として検出する分析装置を用いる。コールターカウンターがその代表的な装置である。
【００１９】
図１６は、抗生剤で処理せず培養した桿菌を含む試料液▲１▼、抗生剤としてＰＩＰＣを作用させて培養した桿菌を含む試料液▲２▼、をそれぞれフローサイトメータで測定した場合に得られるスキャッタグラムを模式的に表わしたものである。横軸にはＦｓｃｗ、縦軸にはＦｓｃをとっている。横軸においては、右へ行くほどＦｓｃｗの値が大きくなる。縦軸においては、上へ行くほどＦｓｃ値が大きくなる。試料液▲１▼では、桿菌がＦｓｃｗ・Ｆｓｃの値の小さな位置に出現しているが、同様のサイズの夾雑物が存在すると弁別できない。一方、試料液▲２▼では、夾雑物はＦｓｃｗの値の小さな位置に出現しているが、形態が細長く変化した桿菌は極端にＦｓｃｗ値の大きな位置に出現している。抗生剤で処理されていない細菌や夾雑物は、このようにＦｓｃｗ値の大きな位置には通常出現しない。
【００２０】
このように、通常の細菌よりＦｓｃｗ値が大きな位置に粒子が出現していることを確認すれば、桿菌の存在を検出できる。また形態変化した桿菌は通常の細菌や夾雑物が出現しない位置に出現するため、夾雑物の影響を受けずに検出されやすくなり、検出感度が向上する。
【００２１】
さらに夾雑物の影響を低減するために、細菌のみを特異的に蛍光染色する蛍光染色剤を用いて染色処理を施すことができる。特異的に染色された細菌は大きな蛍光強度を有するが、夾雑物は染色されないために蛍光強度をほとんど有しない。そこで、検出した粒子のデータのうち、一定以上の蛍光強度を有するものだけを細菌を検出したデータとして抽出し、そのデータを対象に大きさ情報に基づく分析を行えば、夾雑物の影響を排除した上で桿菌の検出を行うことができる。
【００２２】
なお、抗生剤を添加する前に既に死んでいる菌は細胞分裂をしないため、抗生剤による形態変化を生じない。よって形態変化を生じた桿菌を検出することで、生きた桿菌のみを検出することが可能になる。また、蛍光標識した抗体を細菌の表面抗原と反応させて菌種を分析する方法と、本発明の方法を組み合わせると、細菌が大きくなることにより表面抗原が増えることにより、検出される蛍光信号のＳ／Ｎ比が向上する。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明にかかる自動細菌分析装置につき説明する。この自動細菌分析装置で分析対象とする検体としては、菌を寒天培地で培養し、形成されたコロニーから釣菌し、液体培地に混釈させたものを用いる。また試薬として、桿菌を形態変化させる抗生剤であるＰＩＰＣが用いられる。
【００２４】
自動細菌分析装置
図１は自動細菌分析装置１の外観を実線で、装置内部の概略構成を破線で示したものである。装置の最前面には実線で示すように、各種設定入力を行ったり、また測定結果を表示出力するための液晶タッチパネル１１、検体セット部カバー１２、試薬セット部カバー１３、スタートスイッチ１４を備えている。また破線で示す装置の内部構成において、上部には、装置の動作や分析処理を司る制御部４が配置されている。下部の手前側には、試料液を調製するための試料調製部２が配置されている。下部の奥側には試料液から信号を検出するための測定部３が配置されている。
【００２５】
試料調製部の構成
図２は試料調製部２を示す説明図である。試料調製部２は、検体セット部２１、試薬セット部２２、インキュベータ２３、分注装置２４を含む。前記図１の検体セット部カバー１２を開けることにより、検体セット部２１に検体の入った検体容器２５を、インキュベータ２３に微量試験管２７・２８をセットするようになっている。また前記図１の試薬セット部カバー１３を開けることにより、試薬セット部２２に、測定用試薬として用いるＰＩＰＣの入った試薬容器２６をセットするようになっている。インキュベータ２３は、セットされた微量試験管の中の液体を、所定の温度に保ちながら振盪撹拌する。分注装置２４は、その先端から所定量の液体を吸引・吐出するようになっており、また図示しない駆動装置によって上下左右に移動可能となっている。
【００２６】
測定部の構成
図３は測定部３を示す説明図である。図３に示すように、シースフローセル３０７は、試料液をオリフィス３１１に向かって上方へ噴射するノズル３１３と、シース液供給口３１０と、排液口３１４を備える。シースフローセル３０７の近傍には、レーザ光源３１７、コンデンサレンズ３１８、ビームストッパ３１９、コレクタレンズ３２０、ピンホール３２１を有する遮光版３３０、ダイクロイックミラー３２２、ホトダイオード３２５が設けられている。
【００２７】
シース液供給口３１０には陽圧ポンプ３４７で加圧されたシース液容器３０９がバルブ３０５を介して接続される。排液口３１４は図示しない廃液チャンバーに接続される。ノズル３１３は、バルブ３０１を介して陰圧ポンプ３４８に接続され、流路３３９のバルブ３０２側にシリンジポンプ３３３が接続されている。
【００２８】
制御部４の構成
図４は制御部４の構成、および制御部４と装置各部との関係を示すブロック図である。制御部４は、中央演算装置（ＣＰＵ）やＲＯＭ・ＲＡＭ等の記憶装置を有するマイクロコンピュータ、測定部３から送られた信号を処理する回路などを有する。制御部４は、格納部４１、分析部４２、動作制御部４３としての機能を果たす。格納部４１は、試料中の粒子から得た信号の分析に関する分析プログラムや、装置各部の動作を制御する制御プログラムを格納している。また測定部３で検出された信号のデータや、分析プログラムによる処理結果を記憶する。分析部４２は、試料液を測定して測定部３で検出された信号を処理し、処理後の信号を分析する。分析部４２での分析結果は、液晶タッチパネル１１に出力される。動作制御部４３は、格納部４１に格納されている制御プログラムに基づき、装置各部の動作を制御する。
【００２９】
図５は、制御プログラムによる自動細菌分析装置１の全体制御を示すフローチャートである。操作者がスタートスイッチ１４を押すと、制御プログラムが起動し、ステップＳ１（試料調製部制御）、ステップＳ２（測定部制御）、ステップＳ３（分析部制御）が順次実行される。これにより、試料調製部２、測定部３、分析部４２が制御され、自動細菌分析装置１の一連の動作が自動的に行われる。上記ステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３による装置各部の動作を以下に説明する。
【００３０】
ステップＳ１（試料調製部制御）
試料調製部制御による試料調製部２の動作を、図２を用いて説明する。まず分注装置２４が、検体セット部２１にセットされている検体容器２５から検体を吸引し、インキュベータ２３にセットされている微量試験管２７および２８に、１ｍｌずつを分注する。次に分注装置２４は試薬セット部２２からＰＩＰＣを吸引して微量試験管２７に０．２ｍｌを分注し、検体にＰＩＰＣを添加する。この後インキュベータ２３が、ＰＩＰＣの添加された検体が入っている微量試験管２７、および検体のみが入っている微量試験管２８を、温度３７℃に保ちながら１２０分間振盪撹拌することでインキュベートする。これにより、微量試験管２７においてはＰＩＰＣ存在下で培養処理された試料（第一の試料液）が、微量試験管２８においては、ＰＩＰＣを添加せずに培養処理された対照試料液（第二の試料液）が、それぞれ調製される。
【００３１】
試料液が調製されると、分注装置２４が、微量試験管２７から第一の試料液を所定量吸引（サンプリング）し、試料容器３１２に吐出して供給する。試料容器３１２に供給された第一の試料液は、測定部３のシースフローセルに流される。次に、分注装置２４が、微量試験管２９から第二の試料液を所定量吸引（サンプリング）し、試料容器３１２に吐出する。吐出された試料液は、測定部３のシースフローセルに流される。
【００３２】
ステップＳ２（測定部制御）
測定部制御による測定部３の動作を、図３を用いて説明する。前記の通り試料容器３１２に第一の試料液が供給されると、まず陰圧ポンプ３４８を駆動する。バルブ３０１・３０２を所定時間開け、陰圧によって試料液をバルブ３０１とバルブ３０２の間の流路３３９に満たす。次にシリンジポンプ３３３が一定流量で流路３３９の試料液をノズル３１３へ押し出すことにより、ノズル３１３から試料液がシースフローセル３０７に吐出される。それと同時にバルブ３０５を開けることによりシース液容器３０９からシース液供給口３１０を介してシース液がシースフローセル３０７に供給される。
【００３３】
これによって試料液は、シースフローセル３０７内でシース液に包まれ、更にオリフィス３１１によって細く絞られて流れる。試料液の流れを、粒子径と同程度まで絞り込むことにより、試料液に含まれた粒子を一列に整列させてオリフィス３１１に流すことができる。
【００３４】
オリフィス３１１を流れる試料流３２６へ、レーザ光源３１７から出射されたレーザ光がコンデンサレンズ３１８で絞られて照射される。試料中の粒子に当たらずそのままフローセル３０７を透過したレーザ光はビームストッパ３１９で遮光される。レーザ光を受けた粒子から発せられる前方散乱光はコレクタレンズ３２０により集光され、遮光板３３０のピンホール３２１を通過する。そしてダイクロイックッミラー３２２に到達する。ダイクロイックミラー３２２で反射された前方散乱光は、ホトダイオード３２５で受光、光電変換されて前方散乱光信号３２８として出力される。前方散乱光信号３２８は、制御部４へ送られ、粒子毎のデータとして格納部４１に記憶される。
【００３５】
試料容器３１２に供給された第一の試料液がシースフローセル３０７に流され、前方散乱光信号が検出されると、前記の通り第二の試料液が試料容器３１２に供給される。そして第一の試料液と同様に、第二の試料液がシースフローセル３０７に流されて前方散乱光信号３２８が検出される。前方散乱光信号３２８は制御部４へ送られ、粒子毎のデータとして格納部４１に記憶される。
【００３６】
ステップＳ３（分析部制御）
分析部制御の詳細について、図６のフローチャートを用いて説明する。フローチャートの各ステップは以下の通りである。
【００３７】
ステップＳ１１：第一の試料液から検出された前方散乱光信号のデータを、格納部４１から読み出す。続いてステップＳ１２へ進む。
ステップＳ１２：第一の試料液中の各粒子から得られた前方散乱光信号に基づき、前方散乱光発光時間（Ｆｓｃｗ）、及び前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を算出する。続いてステップＳ１３へ進む。
ステップＳ１３：ステップＳ１２で算出した粒子毎のＦｓｃｗ・Ｆｓｃをパラメータとしたスキャッタグラムを作成する。続いてステップＳ１４へ進む。
ステップＳ１４：ステップＳ１３で作成された第一の試料液のスキャッタグラムを格納部４１に記憶する。続いてステップＳ１５へ進む。
ステップＳ１５：第二の試料液から検出された前方散乱光信号のデータを、格納部４１から読み出す。続いてステップＳ１６へ進む。
ステップＳ１６：第二の試料液中の各粒子から得られた前方散乱光信号に基づき、前方散乱光発光時間（Ｆｓｃｗ）、及び前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を算出する。続いてステップＳ１７へ進む。
ステップＳ１７：ステップＳ１６で算出した粒子毎のＦｓｃｗ・Ｆｓｃをパラメータとしたスキャッタグラムを作成する。続いてステップＳ１８へ進む。
ステップＳ１８：ステップＳ１７で作成された第二の試料液のスキャッタグラムを格納部４１に記憶する。続いてステップＳ１９へ進む。
ステップＳ１９：第一の試料液、および第二の試料液から得られたスキャッタグラムを格納部４１から読み出す。続いてステップＳ２０へ進む。
ステップＳ２０：読み出したスキャッタグラムを液晶タッチパネル１１に出力する。
【００３８】
液晶タッチパネル１１には、第一の試料液および第二の試料液から得られた二つのスキャッタグラムが同時に表示される。その画面例を図７に示す。画面右側に第一の試料液から得られたスキャッタグラムが、画面左側に第二の試料液から得られたスキャッタグラムが表示され、両者を一目で比較することができるようになっている。
【００３９】
分析結果の例
上記に説明してきた自動細菌分析装置１を用いて検体を分析した結果の例を示す。検体は以下の通り調製したものを用いた。まずＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天培地にグラム陰性桿菌であるＥ．ｃｏｌｉを添加し一晩培養し、培地に形成されたコロニーから釣菌したものをミューラーヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ）液体培地に混釈して５分間振盪した後、フローサイトメータによって菌数を測定し、６×１０５／ｍｌ濃度の菌液を調製した。これをＥ．ｃｏｌｉ含有検体とした。また、グラム陰性桿菌であるＥ．ｃｌｏａｃａｅについても同様の作業にて菌液を調製し、これをＥ．ｃｌｏａｃａｅ含有検体とした。また試薬としては、濃度６４μｇ／ｍｌのＰＩＰＣを用いた。
【００４０】
本装置により前記Ｅ．ｃｏｌｉ含有検体を分析して得られたスキャッタグラムを図８に、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ含有検体を分析して得られたスキャッタグラムを図９に示す。いずれのスキャッタグラムも、横軸にＦｓｃｗ、縦軸にＦｓｃをとっている。横軸においては、右へ行くほどＦｓｃｗの値が大きくなる。縦軸においては、上へ行くほどＦｓｃ値が大きくなる。
【００４１】
図８のスキャッタグラムのうちＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ含有検体にＰＩＰＣを添加せずに培養処理して調製した対照試料液を測定した結果である。Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ含有菌液にＰＩＰＣを添加して培養処理して調製した試料液を測定した結果である。Ａ（ＰＩＰＣ無し）ではＦｓｃｗ値、Ｆｓｃ値共に小さな位置に粒子が出現している。この位置は、正常に増殖して形態変化していない桿菌や、他の細菌である球菌の出現位置と重なる位置である。Ｂ（ＰＩＰＣ有り）では図中、破線で囲んだ位置に形態変化したＥ．ｃｏｌｉが出現している。形態変化したＥ．ｃｏｌｉの出現位置はＦｓｃｗ値が大きく、弁別が容易である。
【００４２】
図９のスキャッタグラムのうちＡは、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ含有菌液にＰＩＰＣを添加せずに培養処理して調製した対照試料液を測定した結果である。Ｂは、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ含有菌液にＰＩＰＣを添加して培養処理して調製した試料液を測定した結果である。Ａ（ＰＩＰＣ無し）ではＦｓｃｗ値、Ｆｓｃ値共に小さな位置に粒子が出現している。この位置は、正常に増殖して形態変化していない桿菌や、他の細菌である球菌の出現位置と重なる位置である。Ｂ（ＰＩＰＣ有り）では図中、破線で囲んだ位置に形態変化したＥ．ｃｌｏａｃａｅが出現している。形態変化したＥ．ｃｌｏａｃａｅの出現位置はＦｓｃｗ値が大きく、弁別が容易である。
【００４３】
このようにスキャッタグラム上で、通常は細菌や夾雑物が出現しないようなＦｓｃｗの値の大きな位置に粒子が出現していることを確認することにより、試料液中に桿菌が存在しているとわかる。
【００４４】
変形例
測定前に、試料液をフィルタで濾過するといった処理を行わない場合、通常の細菌よりも大きな夾雑物が試料液に混入する場合がある。このような場合、抗生剤により形態変化した桿菌と夾雑物の大きさが重なり、桿菌検出の感度が低下する恐れがある。そこで、細菌を予め蛍光染色し、試料液中の粒子から蛍光を検出することによって、細菌と夾雑物の弁別がより確実なものとなる。
【００４５】
以下、前記実施例の変形例として、細菌を蛍光染色して桿菌の検出を行う自動細菌分析装置につき説明する。なおこの変形例における自動細菌分析装置は、前記実施例で用いた自動細菌分析装置１とほぼ共通の構成を有するので、対応する部位については同じ符号を用いて説明する。装置外観および装置内部の概略構成は図１に示したものと同様であり、また全体制御のフローは図５に示したものと同様である。試料調製部２、測定部３の構成および動作、分析部４１における分析制御のフローについて、以下に説明する。
【００４６】
図１０は試料調製部２を示す図である。前記図２に示した構成との違いは、試薬セット部２２に、ＰＩＰＣの入った試薬容器２６とは別に蛍光染色剤の入った試薬容器２９をセットできるようになっている点である。
【００４７】
この変形例の細菌分析装置で分析対象となる検体、および使用されるＰＩＰＣは、前記実施例と同様である。蛍光染色剤は、エチレングリコール１リットルに以下の構造式を有するポリメチン系色素４０ｍｇを溶解させたものを用いる。この色素は細菌の核酸と特異的に結合する性質を有するため、この色素を含む染色剤により、夾雑物を染色することなく細菌のみを特異的に染色することが可能である。
【００４８】
【化１】
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【００４９】
検体の入った検体容器２５、微量試験管２７・２８、ＰＩＰＣの入った試薬容器２６、蛍光染色剤の入った試薬容器２９をセットした後、試料調製部２は以下のように動作する。まず分注装置２４が、検体セット部２１にセットされている検体容器２５から検体を吸引し、インキュベータ２３にセットされている微量試験管２７および２８に１ｍｌずつを分注する。次に分注装置２４は試薬容器２６からＰＩＰＣを吸引して微量試験管２７に０．２ｍｌを分注し、検体にＰＩＰＣを添加する。この後インキュベータ２３が、ＰＩＰＣの添加された検体が入っている微量試験管２７、および検体のみが入っている微量試験管２８を、温度３７℃に保ちながら１２０分間振盪撹拌することでインキュベートする。続いて分注装置２４は試薬容器２９から蛍光染色剤を吸引して微量試験管２７および２８に０．２ｍｌずつを分注する。この後インキュベータ２３が、微量試験管２７および２８を、温度４２℃に保ちながら１０秒間振盪撹拌して蛍光染色処理を施す。これにより、微量試験管２７においてはＰＩＰＣ存在下で培養処理され、かつ蛍光染色処理の施された試料液（第一の試料液）が調製される。微量試験管２８においては、ＰＩＰＣを添加せずに培養処理され、かつ蛍光染色処理の施された対照試料液（第二の試料液）が、それぞれ調製される。
【００５０】
調製された第一の試料液、第二の試料液が分注装置２４によってサンプリングされて試料容器３１２に供給され、測定部３のシースフローセル３０７へ流されるまでの動作は前記実施例と同様である。
【００５１】
図１１は、この変形例における測定部３の構成を示す図である。図３に示した前記実施例の測定部３と比較すると、フィルタ３２３およびホトマルチプライヤチューブ３２４を有し、試料液中の粒子から前方散乱光信号に加え蛍光信号を検出する機能を有する点で異なる。試料液からの前方散乱光信号の検出は前記実施例と同様に行われる。蛍光信号の検出は以下のように行われる。レーザ光を照射された試料液中の粒子から発せられた蛍光は、コレクタレンズ３２０により集光され、遮光板３３０のピンホール３２１を通過する。そしてダイクロイックッミラー３２２に到達する。前方散乱光よりも波長の長い蛍光は、ダイクロイックミラー３２２をそのまま透過し、フィルタ３２３で更に散乱光が除かれた後にホトマルチプライヤチューブ３２４で受光、光電変換されて蛍光信号３２７として出力される。蛍光信号３２７は、制御部４へ送られる。検出された前方散乱光も前記実施例と同様、前方散乱光信号３２８として制御部４へ送られる。
【００５２】
第一の試料液、第二の試料液から検出された蛍光信号３２７および前方散乱光信号３２８は、検出された粒子毎に対応付けられたデータとして制御部４の格納部４１に記憶される。そして分析部４２は、分析プログラムにより、各試料液から検出された粒子毎の蛍光信号３２７および前方散乱光信号３２８のデータを分析する。以下、図１２のフローチャートを用いて分析部制御の詳細を説明する。
【００５３】
ステップＳ２１：第一の試料液から検出された粒子のデータ（蛍光信号・前方散乱光信号のデータを含む）を、格納部４１から読み出す。続いてステップＳ２２へ進む。
ステップＳ２２：第一の試料液中の各粒子から得られた蛍光信号に基づき、蛍光強度（Ｆｌ）を算出する。続いてステップＳ２３へ進む。
ステップＳ２３：ステップＳ２２で算出したＦｌに基づき、Ｆｌが所定値以上の粒子のデータのみを抽出する。続いてステップＳ２４へ進む。
ステップＳ２４：ステップＳ２３で抽出された粒子のデータに関し、前方散乱光信号３２８に基づいて前方散乱光発光時間（Ｆｓｃｗ）、及び前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を算出する。続いてステップＳ２５へ進む。
ステップＳ２５：ステップＳ２４で算出した粒子毎のＦｓｃｗ・Ｆｓｃをパラメータとしたスキャッタグラムを作成する。続いてステップＳ２６へ進む。
ステップＳ２６：ステップＳ２５で作成された第一の試料液のスキャッタグラムを格納部４１に記憶する。続いてステップＳ２７へ進む。
ステップＳ２７：第二の試料液から検出された粒子のデータ（蛍光信号・前方散乱光信号のデータを含む）を、格納部４１から読み出す。続いてステップＳ２８へ進む。
ステップＳ２８：第二の試料液中の各粒子から得られた蛍光信号に基づき、蛍光強度（Ｆｌ）を算出する。続いてステップＳ２９へ進む。
ステップＳ２９：ステップＳ２８で算出したＦｌに基づき、Ｆｌが所定値以上の粒子のデータのみを抽出する。続いてステップＳ３０へ進む。
ステップＳ３０：ステップＳ２９で抽出された粒子のデータに関し、前方散乱光信号３２８に基づいて前方散乱光発光時間（Ｆｓｃｗ）、及び前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を算出する。続いてステップＳ３１へ進む。
ステップＳ３１：ステップＳ３０で算出した粒子毎のＦｓｃｗ・Ｆｓｃをパラメータとしたスキャッタグラムを作成する。続いてステップＳ３２へ進む。
ステップＳ３２：ステップＳ３１で作成された第二の試料液のスキャッタグラムを格納部４１に記憶する。続いてステップＳ３３へ進む。
ステップＳ３３：第一の試料液、および第二の試料液から得られたスキャッタグラムを格納部４１から読み出す。続いてステップＳ３４へ進む。
ステップＳ３４：読み出したスキャッタグラムを液晶タッチパネル１１に出力する。
【００５４】
蛍光染色処理により、試料液中の細菌のみが特異的に蛍光染色されているため、上記ステップＳ２３およびＳ２９においては一定以上のＦｌを有する粒子を細菌として抽出し、夾雑物を検出したデータを分析対象から除去することができる。図１３は、第一の試料液から得られたスキャッタグラムの一例を模式図として示したものであり、形態変化した桿菌のみがＦｓｃｗ値の大きな位置に出現している。この変形例では、スキャッタグラムを作成する前に、粒子から検出されるＦｌに基づき細菌と夾雑物が弁別される。そして弁別の結果、細菌として抽出されたデータのみについて、大きさ情報をパラメータとしたスキャッタグラムが作成される。そのためスキャッタグラム上には夾雑物のデータが出現せず、細菌のみが出現する。
【００５５】
【発明の効果】
本発明では、桿菌を抗生剤により形態変化させ、夾雑物や他の種類の菌とは明らかに異なる大きさ情報を持たせるようにすることで、形態変化をしていない場合には出現位置が重なってしまっていた球菌や夾雑物との弁別を容易にし、桿菌検出の特異度が向上する。また形態変化した桿菌は通常の細菌や夾雑物が出現しない位置に出現するため、夾雑物の影響を受けずに検出されやすくなり、検出感度が向上する。ここで、細菌を特異的に染色する蛍光染色剤により細菌を予め蛍光染色し、試料液中の粒子から蛍光を検出すれば、細菌と夾雑物の弁別がより確実なものとなる。
【００５６】
さらに、形態変化を生じるのは、添加前において生きていた桿菌であり、添加の時点で死んでいる菌は細胞分裂をしないため形態変化を生じない。よって形態変化を生じた桿菌を検出することで、試料中の桿菌における生菌のみを検出することが可能になる。また、蛍光標識した抗体を細菌の表面抗原と反応させて菌種を分析する方法と、本発明の方法を組み合わせると、細菌が大きくなることにより表面抗原が増え、検出される蛍光信号のＳ／Ｎ比が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の自動細菌分析装置の装置構成を示す図である。
【図２】本発明の自動細菌分析装置の試料調製部を示す図である。
【図３】本発明の自動細菌分析装置の測定部を示す図である。
【図４】本発明の自動細菌分析装置の制御部と装置各部との関係を示すブロック図である。
【図５】本発明の自動細菌分析装置の全体制御のフローを示す図である。
【図６】本発明の自動細菌分析装置における分析部制御のフローを示す図である。
【図７】本発明の自動細菌分析装置の液晶タッチパネルに表示される画面の一例である。
【図８】本発明の自動細菌分析装置により作成されたスキャッタグラムの一例である。
【図９】本発明の自動細菌分析装置により作成されたスキャッタグラムの一例である。
【図１０】変形例における試料調製部を示す図である。
【図１１】変形例における測定部を示す図である。
【図１２】変形例における分析部制御のフローを示す図である。
【図１３】変形例の自動細菌分析装置により作成されたスキャッタグラムの一例を示す模式図である。
【図１４】桿菌の形態変化前、形態変化後の様子を示す模式図である。
【図１５】粒子から検出される信号波形について説明する図である。
【図１６】形態変化前の桿菌、形態変化後桿菌をそれぞれ測定して得られるスキャッタグラムの一例を示す模式図である。
【符号の説明】
１  自動細菌分析装置
２  試料調製部
３  測定部
４  制御部
５  出力部
６  入力部
１１  液晶タッチパネル
１２  検体セット部カバー
１３  試薬セット部カバー
１４  スタートスイッチ
４１  格納部
４２  分析部
４３  動作制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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