(57)【要約】【課題】　デスルファトヒルジンの生産のための新規な遺伝子系の提供。【解決手段】　デスルファトヒルジンをコードする第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で連結されている酵母のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結されている酵母CUP1プロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成るデスルファトヒルジン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベクター。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　デスルファトヒルジンをコードする第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で連結されている酵母のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結されている酵母CUP1プロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成るデスルファトヒルジン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベクター。
【請求項２】
　上記のCUP1プロモーターが、配列番号：1で表される、0.4kB のBamHI-EcoRI フラグメントである、請求項１に記載の酵母発現ベクター。
【請求項３】
　シグナルペプチドをコードするDNA 配列が、上記酵母のインベルターゼ、α- 因子、フェロモンペプチダーゼ(KEX1)、" キラー毒素" 及び抑制性酸性ホスファターゼ(PHO5)の遺伝子のシグナル及びプレプロ配列、並びにアスペルギルス・アワモリ( Aspergillus awamori)からのグルコアミラーゼのシグナル配列から成るグループから選ばれている、請求項１に記載の酵母発現ベクター。
【請求項４】
　シグナルペプチドをコードする上記のDNA 配列が、上記酵母のインベルターゼ及びPHO5の遺伝子のシグナル配列から成るグループから選ばれている、請求項１に記載の酵母発現ベクター。
【請求項５】
　酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列が、転写終止及びポリアデニレーションのための正しいシグナルを含む酵母遺伝子の3'フランキング配列である、請求項１に記載の酵母発現ベクター。
【請求項６】
　完全な2 ミクロンのDNA を含む、請求項１に記載の酵母発現ベクター。
【請求項７】
　1 〜3 の追加のデスルファトヒルジンの発現カセットを含んで成る、請求項１に記載の酵母発現ベクター。
【請求項８】
　1 つの追加の転写活性化物質ACE1発現カセットを含んで成る、請求項１に記載の酵母発現ベクター。
【請求項９】
　対称性を示し、そしてバクテリアの配列を欠いている、請求項１に記載の酵母発現ベクター。
【請求項１０】
　デスルファトヒルジンをコードする第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で連結されている酵母のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結されている酵母CUP1プロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成るデスルファトヒルジン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベクターを宿している酵母株。
【請求項１１】
　請求項１に記載の酵母発現ベクターを宿している、請求項１０に記載の酵母株。
【請求項１２】
　倍数性が、2 より大きい、または2 に等しい、請求項１０に記載の酵母株。
【請求項１３】
　2 倍体である、請求項１２に記載の酵母株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、組み換えDNA 技術の分野に属し、そして、遺伝子操作された酵母細胞の援助を伴ってのトロンビン阻害剤、より具体的にはデスルファトヒルジンの生産方法、この遺伝子操作された酵母細胞、このデスルファトヒルジンのための遺伝子を担持するハイブリッドベクター、並びに、この酵母細胞及びこのハイブリッドベクターの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　ヒルジンは、ヒル内( 例えば、薬用のヒルであるヒルド・メジシナリス(Hirudo medicinalis)内) で、天然に生じた抗血液凝固剤である。このヒルジンは、一般的に、そのN-末端での疎水性アミノ酸の蓄積及びC-末端での極性アミノ酸の蓄積、3 つのジスルフィド結合、及び抗血液凝固活性をもつ上記作用のポリペプチドである。殆どのヒルジンの独特の特徴は、その分子のC-末端部分にチロシン硫酸塩の残基(Tyr63) が存在することである。よく知られたヒルジン変異体HV1 、HV2 及びHV3 は別として、さらなるヒルジンが天然に存在することが報告されている。例えば、同一阻害剤のファミリーとしてのヒルジンの概念を支持する、M.Scharf et al.FEBS Lett.255,105-110(1989)を参照のこと。
【０００３】
　ヒルジン、例えば上記のヒルジン変異体HV1 は、最も重要な、そして最も具体的に知られているトロンビン阻害剤であって、血液凝固における最終段階( 前駆体フィブリノーゲンの血塊化可能なフィブリンへの変換) を触媒するセリンプロテアーゼである。この血液凝固のカスケードに関する他の酵素は、ヒルジンによっては阻害されない。従来の抗血液凝固の治療における好まれた抗血液凝固剤であるヘパリンに比較して、このヒルジンは、それらの阻害作用を、直接的にトロンビン上で発揮し、そして前者と異なり、アンチトロンビンIII を通して作用しない。
【０００４】
　精製ヒルジンの薬理学的に検出され得る唯一の効果は、血液凝固の阻害及び血栓症の予防である。副作用、例えば、心拍数、呼吸、血圧、栓球数、フィブリノーゲン及びヘモグロビンについての作用は、ヒルジンの犬への、高い投与量における静脈内投与の後には、全く観察されなかった。一連のヒトのモデルにおいては、ヒルジンが、実験的な血栓症（うっ血により、またはトロンビンの注射により誘導される）において、内毒素性ショックにおいて、そしてDIC(散在性の筋肉内血液凝固) においても、効果的であると証明されている。今まで直接比較テストが実施されたときには、ヒルジンが、ヘパリンよりも優れていることが証明されてきた。
【０００５】
　近年、ヒルジン変異体をコードするcDNA及び合成の遺伝子は、微生物宿主、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、及び特にサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)において、クローン化され、そして発現されてきた。その発現生産物は、Tyr 63に上記の硫酸塩のモノエステル基を欠いているのであるが、- そして、それ故" デスルファトヒルジン" と称される- それらが、天然の硫酸塩化されたヒルジンと本質的に同じ生物学的活性を示すことが判明した。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)におけるデスルファトヒルジン変異体の発現に関して、いくつかの強調されるべき点がある。
【０００６】
　強力な構成的または誘導的酵母プロモーター( 例えば、PHO5、GAP 、α- 因子プロモーター) 、酵母のシグナルまたはリーダー配列( 例えば、上記インベルターゼもしくはPHO5のシグナル配列または上記α- 因子のリーダー) を含んで成り、そしてデスルファトヒルジン遺伝子を提供するデスルファトヒルジン発現カセットをもつエピソーム性ベクターを含むサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株は、たとえ、異なった程度までであっても、その発現、及びそれが単離される得る培養培地へのデスルファトヒルジンの輸送を、提供する( 例えば、欧州特許出願番号200655、225633、252854、340170及び341215を参照のこと) 。
【０００７】
　サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)に関して開発された利用可能な発現システムは、医薬として利用できるデスルファトヒルジンにおいて、満足するには程遠い収率しか与えない。この点において、そして臨床研究及び、最終的には治療におけるデスルファトヒルジンが多量に要求されることを考慮すれば、医薬として利用できるデスルファトヒルジンの経済的な大規模生産を可能にする改良法の必要性が存在する。このような方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
　メタロチオネイン(MT)は、真核生物の中に広く分布する、小さい、システインが豊富な金属結合ポリペプチドである。サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)は、上記CUP1遺伝子によりコードされている一種類のMT蛋白を含む。このCUP1座は、酵母細胞に銅耐性を与えることが示されている。銅耐性をもつサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)の2 つの天然変異体が知られている: 0.3mM の銅に対し感受性のある株は、上記CUP1座の単一コピー( 上記CUP1遺伝子の、タンデムに配置された2 つのコピーから成る) を含み、そしてcup1S と称される、一方、0.3mM の銅に対し耐性のある株は、タンデムに反復された数個のコピーを含み、そしてCUP1r と称される。銅耐性は、外からの銅の添加による、CUP1の増幅とCUP1の翻訳の誘導との組合せに基づいている。
【０００９】
　このCUP1遺伝子の銅誘導性転写を促進するために必要な、シス作用の上流の活性化部位(UASC ) 、並びに細胞因子のUAS C への結合が、同定された。この結合因子は、上記CUP1遺伝子の銅誘導性転写のために必須であるACE1(=CUP2) の生産物である。このACE1蛋白は、銅イオンに結合し、このことにより、そのコンフォメーションを変更し、そして、そのDNA 結合ドメインを活性化する転写活性化物質である。上記ACE1蛋白のコンフォメーションの変更は、上記CUP1遺伝子が転写されることを最終的に許容する。このCUP1システムの重要な特徴は、その自動調節である。これは、上記CUP1蛋白それ自身が銅イオンに結合する能力に依存する。それ故、このCUP1蛋白は、細胞内の遊離の銅イオンと複合体を形成することにより、それ自身の合成を抑制するようであり、これが、次に、ACE1の活性化を妨害する。
【００１０】
　酵母による外来蛋白の発現のために、上記のCUP1プロモーターを使用することに関する幾つかの例が文献の中に存在する(T.R.Butt et al.,Microbiol.Rev.51,351-364,1987;T.Etcheverry,Methods Enzymol.185,319-329,1990; 米国特許第4,940,661 号を参照のこと) 。記述された方法は、銅イオンを含む酵母最小培地内で、CUP1発現カセットをもつ発現ベクターを宿す形質転換された酵母株を培養することを含んでいる。化学的に定義された最小培地が選ばれた。なぜなら、複合培地の成分( 蛋白等) が、銅イオンと相互作用( 錯体形成) し、そのことにより、ACE1の活性化を妨害すると、一般的に信じられているからである。達成可能な細胞の密度( 吸光度) 及び、結果として得られることができるタイターは、対応して低い。後者の結果は、今までのところ、遺伝子工学の研究及び生産における上記CUP1プロモーターのシステムに関する広範囲にわたる利用を制限している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
　驚くべきことに、すべての予想に反して、観察され得る発現レベルまたは効率に対する何らの有害な効果を伴わずに、銅により誘導されるCUP1発現カセットと組み合わせて、複合酵母培地を使用できることが見つかった。さらに、上記CUP1プロモーターが、擬- 構成的な方法で使用されたとき、すなわち、酵母によるデスルファトヒルジンの分泌を上記培養培地へ向けるために、ちょうど接種の時に、上記の培養培地に銅を供給するときは、このプロモーターは、強力な構成的酵母プロモーター、例えば、短縮された( 構成的な)GAP("GAPEL") プロモーターよりも優れており、但し、この外来蛋白デスルファトヒルジンは、上記酵母細胞に対し毒性はないことが、驚くべきことに見出された。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
　したがって、本発明は、デスルファトヒルジンの改良された生産方法であって、デスルファトヒルジンをコードする第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で連結されている酵母のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結されている酵母CUP1プロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成るデスルファトヒルジン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベクターを宿す酵母株を複合培養培地内で培養すること、並びに、生産されたデスルファトヒルジンをその培養液から単離することを含んで成り、ちょうど接種の時に、培養培地に、CUP1プロモーターを誘導する量の銅塩を供給するような生産方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
　用語" デスルファトヒルジン" は、文献の中に記載された、またはデスルファトヒルジンをコードするDNA を含む形質転換された微生物株から得られることができる、全てのデスルファトヒルジン化合物を包含すると意図される。このようなデスルファトヒルジンは、例えば、デスルファトヒルジン変異体HV1 、HV2 及びHV3(PA) 、並びにM.Scharf et al.(前記) により記載された他のヒルジン蛋白である。ヒルジン活性をもつヒルジン誘導体( すなわち、トロンビン阻害作用をもつ) も、上記の用語" デスルファトヒルジン" によりカバーされると理解されるべきである。このような誘導体は、例えば、C-末端が短くなったデスルファトヒルジン、すなわち、1 〜7 つの、好ましくは1 〜4 つのアミノ酸をそのC-末端で欠いているデスルファトヒルジン、及び真正なアミノ酸の代わりに単一または複数の例えば1 〜5 つのアミノ酸を置換することにより、後者とは異なっているヒルジンのムテインである。好ましいデスルファトヒルジンは、デスルファトヒルジン変異体HV1 である。
【００１４】
　本発明に記載の好適な酵母株は、内因性の2-ミクロンのプラスミドを含むサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)の株またはこの2-ミクロンの内因性プラスミドにより修復（cured)されているような株を含む( 欧州特許出願番号340170を参照のこと）。本発明に記載の好ましい酵母株は、上記の内因性の2-ミクロンのプラスミドを欠いている( いわゆる"cir0 株" と称する) 。好ましい酵母株は、単一または多数のプロテアーゼ- 欠損の酵母株、すなわち、特にカルボキシペプチダーゼysc α及びyscYの蛋白分解活性及び、場合によってさらに、プロテアーゼyscA及び/ またはyscBの活性を欠いている酵母株である( 欧州特許出願番号341215を参照のこと）。
【００１５】
　本発明に記載の方法に好適である酵母株は、0 〜16、特に2 〜6 コピーの、染色体CUP1遺伝子を含む。場合によっては、本発明に記載の酵母株は、1 〜3 つの、染色体ACE1遺伝子の追加的なコピーを含む。本発明のさらなる態様においては、内因性の熱ショック因子蛋白における突然変異をもっている酵母株が使用される。このような突然変異体は、ストレス条件下で、増大されたCUP1の転写を導く(P.Silar et al.,Mol.Cell.Biol.(1991)11,1232-1238を参照のこと) 。
【００１６】
　例えば、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)属由来の酵母株は、1 倍体、2 倍体または多倍体であることができる。好ましい酵母株は、2 に等しいまたはこれより大きい倍数性をもち、これらの株は、例えば8 倍体、4 倍体、3 倍体及び特に2 倍体である。サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)の2 倍体または多倍体株は、例えば、接合型 a及びαの2 つの1 倍体株の接合により、またはプロトプラスト融合法により構築される。本発明の好ましい態様においては、2 倍体の酵母株は、2 つの1 倍体、及びその接合型のみが異なっている相同遺伝子の酵母株を使用して作られる。
【００１７】
　形質転換された酵母株は、当業者に知られた方法を使用して培養される。それ故、本発明に記載の形質転換された酵母株は、その酵母株が生存及び増殖するために必須である成分、例えば同化できる炭素及び窒素源、無機塩、ビタミン、成長促進物質、例えば追加のアミノ酸、砂糖、等を、含む液体の複合培養培地内で培養される。
【００１８】
　酵母を培養するために使用することができる対応する複合培養培地が、当業者によく知られている。例えば、このような培養培地は、トリプトン、ペプトン、肉エキス、マルトエキス、酵母エキス、カサミノ酸、コーンスティープリカー、大豆粉等、並びに特にそれらの混合物を含み、そして場合により、さらに、全ての下記の必須成分が、上記培地に存在すべきでるということを考慮して、砂糖( 例えば、デキストロース、グルコース、シュクロース等) 、ビタミン( 例えば、ビオチン) 、個々のアミノ酸、無機塩( 例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩、さらに、微量元素、例えば、鉄、亜鉛及びマンガンの対応する塩) 等を補われる。好ましい培養培地は、場合によって、無機塩及びビタミンを補われた、商業的に利用可能な培地YPD(酵母エキス(yeast extract) 、ペプトン(peptone) 、デキストロース(dextrose);Methods Enzymol.194,13 を参照のこと）である。
【００１９】
　上記の培養は、従来の技術を使用することにより行われる。この培養条件、例えば、温度、培地のpH及び発酵時間は、デスルファトヒルジンの最大レベルが作り出されるような方法で選択される。選ばれた酵母株は、デスルファトヒルジンの満足すべき収率が得られるように、好ましくは、好気条件下、液浸培地内で、振とうまたは攪拌を伴って、約25°〜33℃の、好ましくは約28℃の温度にて、4 から7 までのpH値で、例えば、約pH5 〜6 で、そして少なくとも1 〜3 日間、好ましくは3 〜4 日間、培養される。培養は、バッチ工程、供給バッチ(fed batch) 工程、連続供給バッチ工程、または連続法として、実施され得る。
【００２０】
　ちょうど接種のとき、上記培養培地に、CUP1プロモーターを誘導する量の銅(II)塩、特に硫酸銅を供給する。銅の最適量( デスルファトヒルジンの最大濃度を提供する量) は、とりわけ、宿主細胞の遺伝的背景、使用される発現ベクターの成分、及び培養培地の組成に依存し、そして熟練者が使用する定型的なテスト、例えば" タイトレーション"(添加銅量の関数として、HPLCによりデスルファトヒルジンの濃度を測定すること) により、測定されることができる。定型テストは、T.Etcheverry( 上記引用文中に、文書中324 ページ) により記載されている。正確な銅濃度の測定が、重要である。なぜなら、不必要に高い銅レベルは、細胞の代謝機構の抑制を引き起こすかもしれないからである。
【００２１】
　使用された酵母株、プロモーター及びシグナルペプチドにかかわらず、生産されたデスルファトヒルジンは、主として( すなわち、90% を超える) 、上記培養培地に分泌される。このデスルファトヒルジンは、常法により、そこから単離され得る。例えば、その最初の段階は、通常、遠心分離法によりその培養液から細胞を分離することにある。結果物である上澄は、大部分の非蛋白物質を取り除くためにポリエチレンイミンによる処理により、そしてその溶液を硫酸アンモニウムで飽和することによる蛋白質の沈殿形成によりデスルファトヒルジンに関して濃縮され得る。宿主蛋白は、存在する場合には、酢酸( 例えば、0.1%、pH4 〜5)により酸性とすることで沈殿させることもできる。デスルファトヒルジンのさらなる濃縮は、n-ブタノールにより上記の酢酸の上澄を抽出することにより達成され得る。
【００２２】
　その他の精製段階は、例えば、脱塩化、クロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロオマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、HPLC、逆相HPLC、等を含む。上記混合液の構成物の分離は、透析により、ゲル電気泳動または無担体電気泳動によるチャージに従って、好適なSephadexカラムによる分子サイズに従って、例えば、抗体、特にモノクロナール抗体を伴う、またはアフィニティークロマトグラフィーに好適な担体と一緒になったトロンビンを伴うアフィニティークロマトグラフィーにより、あるいは、特に文献により知られた他の方法により、行われることもできる。一般的には、本質的に汚染物質を含まないデスルファトヒルジン生産物を得るためには、ほんの少しの精製のみが必要である。
【００２３】
　抗- ヒルジンまたは抗- デスルファトヒルジン抗体( 例えば、モノクロナール抗体) を使用するテスト、トロンビン・テスト[M.U.Bergmeyer(ed.),Methods in Enzymatic Analysis,Vol.II,p.314-316,Verlag Chemie,Weinheim(FRG)1983] または血液凝固テスト[F.Markwardt et al.,Thromb.Haemost. 47,226(1982)] が、上記の単離または精製段階の間、ヒルジンの活性を検出するために使用されることができる。クロマトグラフィー法、例えば、HPLCを使用することも可能である。
【００２４】
　本発明に記載の形質転換された酵母細胞は、以下に示す段階: 
-　デスルファトヒルジンをコードする第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で連結されて　　いる酵母のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結され　　ている酵母CUP1プロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成る　　デスルファトヒルジン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベクターを用意し、
- 　上記の酵母発現ベクターにより酵母を形質転換し、そして非形質転換細胞から形質転換細胞を選び出すこと
を含んで成る組み換えDNA 技術により調製され得る。
【００２５】
　　　　　　　　　　　　　　　　酵母発現ベクター
　本発明は、デスルファトヒルジンをコードする第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で連結されている酵母のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結されている酵母CUP1プロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成るデスルファトヒルジン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベクターに関する。
【００２６】
　上記CUP1プロモーターのDNA 配列は、公知である(T.R.Butt et al.,Proc.Natl.Acad.Sc.USA 81(1984)3332-3336) 。従って、このCUP1プロモーターは、化学的なDNA 合成により用意され得るし、または好適なDNA プローブを使用して、例えば、polymerase chain reaction(PCR)( ポリメラーゼ連鎖反応) により、ゲノムのサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)DNA から単離され得る。本発明において使用されるCUP1プロモーターは、転写開始シグナル、及び-105〜-148位(CUP1 の転写開始部位に対して；P.Fuerst et al.Cell 55(1988)705-717)に位置する上流活性化配列(UASC ) を含む。
【００２７】
　好ましくは、UAS の現存5'制限部位が、例えば、上記CUP1遺伝子の-455位に位置するBamHI 部位(T.R.Butt et al., 前記) が、並びに、化学合成により、またはPCR において使用されたオリゴヌクレオチドにより人工的に誘導される転写開始シグナル( 例えば、EcoRI 部位) の3'制限部位が、利用される。上記の結果物である制限フラグメント、特に、配列番号１の中で表される構築物内に含まれる、例えば、0.4kB のBamHI-EcoRI フラグメントが、酵母のシグナルペプチドをコードするDNA 配列に連結され得る。
【００２８】
　酵母のシグナルペプチド("シグナル配列")をコードするDNA 配列は、好ましくは、普通に分泌されるポリペプチドをコードする酵母遺伝子に由来する。この酵母シグナル配列は、例えば、上記酵母のインベルターゼ、α- 因子、フェロモンペプチダーゼ(KEX1)、" キラー毒素" 及び抑制酵素である酸性ホスファターゼ(PHO5)の遺伝子の、シグナル及びプレプロ配列、並びにアスペルギルス・アワモリ( Aspergillus awamori)からのグルコアミラーゼのシグナル配列である。
【００２９】
　追加の配列、例えば、特異的プロセシング・シグナルを担持することができるプロ- またはスペーサー- 配列も、前駆体分子の正確なプロセシングを容易にする構築物の中に含まれることができる。例えば、このプロセシング・シグナルは、ゴルジ膜内に位置する酵母のエンドペプチダーゼにより認識されるLys-Arg 残基を含む。本発明に記載の好ましいシグナル配列は、酵母のPHO5遺伝子の、及び酵母のインベルターゼ遺伝子のものである。
【００３０】
　デスルファトヒルジンまたはそれらの誘導体をコードするDNA 配列は、ゲノムのヒルDNA から単離されることができ、または2 本鎖デスルファトヒルジンDNA(デスルファトヒルジンのds cDNA)は、デスルファトヒルジンのmRNAに対して相補的に作られて、または、デスルファトヒルジンもしくはそれらの誘導体のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、それ自体既知の方法で、化学的及び酵素的方法により作られる。
【００３１】
　酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列は、好ましくは、転写終止及びポリアデニレーションに関する正しいシグナルを含む酵母遺伝子の3'フランキング配列である。この好ましいフランキング配列は、酵母のPHO5遺伝子のものである。
【００３２】
　酵母CUP1プロモーター、シグナルペプチドをコードするDNA 配列、デスルファトヒルジンをコードするDNA 配列、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列は、それぞれ互いに作用可能な状態で連結されている。すなわち、それらの正常な機能が維持されるような方法で並置される。この列は、上記CUP1プロモーターが、シグナル配列- デスルファトヒルジン遺伝子複合体の正常な発現を生じさせ、上記転写終止シグナルが、本来の転写終了及びポリアデニレーションを生じさせ、そして、上記シグナル配列が、上記シグナル配列の最終コドンがデスルファトヒルジンの遺伝子の最初のコドンに直接的に連結されて成熟デスルファトヒルジンの分泌が生じるような方法で、上記デスルファトヒルジン遺伝子に本来の読み取り枠内で連結されるようなものである。このCUP1プロモーターは、好ましくは、主要mRNAの始点とCUP1遺伝子のATG との間で上記シグナル配列に結合される。このシグナル配列は、翻訳開始のためのそれ自身のATG をもつ。これらの配列の結合は、エンドヌクレアーゼの認識配列を担持する合成オリゴヌクレオチド・リンカーにより、もたらされることができる。
【００３３】
　上記のデスルファトヒルジン発現カセットとは別に、本発明に記載の発現ベクターは、酵母の複製起点を含んで成る。従って、このベクターは、複製起点を含む2 ミクロンのDNA から生じたDNA セグメント、または、2 ミクロンのDNA をもたない酵母株が使われた場合には、2 ミクロンのDNA の全体を含んで成る。後者のタイプのベクターが、好ましい。例えば、本発明に記載のベクターは、連続した形態において、完全な2 ミクロンのDNA を含み、すなわち、2 ミクロンのDNA が、一旦、制限エンドヌクレアーゼで解裂されると、その直線状DNA が、再環化に先立って、そのベクターの他の成分で連結される。
【００３４】
　この制限部位は、REP1、REP2及びFLP 遺伝子の、並びに、2 ミクロンのDNA のORI 、STB 、IR1 及びIR2 部位の正常機能が維持されるように選ばれる。場合によって、この制限部位は、2 ミクロンのDNA のD 遺伝子も無傷であるように選ばれる。好適な制限部位は、例えば、上記D 遺伝子内に位置するユニークPstI部位、並びに上記遺伝子及び部位の全ての外に位置するユニークHpaI及びSnaBI である。しかしながら、2 ミクロンのDNA 内に、上記発現カセット、及び特に前述のような、異なった( 例えば2 つの) 制限部位でのさらなる成分( 以下参照) を挿入することができそうである。
【００３５】
　好ましくは、本発明に記載の発現ベクターは、1 つ、またはそれより多くの、特に1 または2 つの、酵母のための選択的遺伝マーカー、並びに、バクテリアの宿主、特に大腸菌(Escherichia coli)のための上記マーカー及び複製起点を含む。
【００３６】
　発明の好ましい態様においては、2 ミクロンのDNA の環状形態の逆に反復するFRT 部位間の2 つの領域は、おおよそ同じ長さをもつ。
【００３７】
　このようなプラスミド誘導体は、2 つの逆に反復するFRT 部位または追加の、3 つ目のFRT 部位を含んで成ることができる。前者の種類のプラスミドを、本明細書中で、" 対称2 ミクロン様ハイブリッドベクター" と称し、後者の種類のプラスミドを、本明細書中で、" 対称2 ミクロン様分散ベクター" と称する。それは、真に対称なプラスミドではないにもかかわらず、それで形質転換された酵母細胞内で、対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターを生じさせる。
【００３８】
　本発明の対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターは、優先的には、バクテリアのまたはウイルスのDNA 配列、すなわちバクテリアのゲノム、プラスミドもしくはウイルス由来のDNA を含まない。しかしながら、本発明の2 ミクロン様分散ベクターは、上記の対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターが上記の分散ベクターから生じているところの、形質転換された酵母内のベクターから切り取られた2 つの直接的に反復したFRT 部位の間の、原核生物起源のDNA 配列を含むことができる。これらのDNA 配列は、以下に記載するようなバクテリアの配列であり、そして、そのベクターに、本質的に構成的な、または機能的な特徴を提供することができ、あるいは、対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターまたは対称分散ベクターを構築するために、非対称の2 ミクロン様プラスミド誘導体のまたは" 非対称の" 分散ベクターの、2 つの逆に反復されたFRT 部位の間の、上記2 つの領域を埋める機能だけをもつこともできる。
【００３９】
　本発明の意味の中において対称である2 ミクロン様ハイブリッドベクターにおいて、またはこのような対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターを生じさせる分散ベクターにおいて、2 つの逆に反復したFRT 間に位置する領域の長さは、約1:1 から約5:4 までの比をもち、すなわち、その大きい方の領域は、その小さい方のものよりも約20% まで、より大きい。
【００４０】
　酵母の選択的遺伝マーカーに関して、そのマーカー遺伝子の表現型の発現による、形質転換細胞のための選択を容易にする、いずれのマーカー遺伝子も使用できる。酵母のための好適なマーカーは、例えば、抗生物質の耐性を発現するもの、または、栄養要求性株の場合には、宿主の病変を補う遺伝子である。対応する遺伝子は、例えば、抗生物質G418、ハイグロマイシンもしくはブレオマイシンに耐性を与え、または、栄養要求性酵母変異株、例えば、URA3、LEU2、LYS2もしくはTRP1遺伝子における原栄養性を提供する。
【００４１】
　上記発現ベクターの増幅が、原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)において、便利に行われるので、原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)の遺伝マーカー、及び原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)の複製起点が、有利に含まれる。これらは、対応する原核生物のプラスミド、例えば、大腸菌(E.coli)のプラスミド、例えば、pBR332またはpUC プラスミド、例えば、pUC18 またはpUC19 ( これらは、原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)の複製起点、及び抗生物質、例えば、アンピシリンに耐性を与える遺伝マーカーの両方を含む) から得ることができる。
【００４２】
　上記CUP1- デスルファトヒルジン発現カセットとは別に、本発明に記載の複製起点及び遺伝マーカーの上記発現ベクターは、場合によって、追加の発現カセット、例えば、1 〜3 つの追加のデスルファトヒルジン発現カセット及び/ または追加の転写活性物質ACE1の発現カセットを含む。この追加のデスルファトヒルジン発現カセットは、それぞれ互いに同じか、または異なり、そして、そのベクターに既に存在する上記CUP1- デスルファトヒルジン発現カセットと同じか、または異なり、そして、それぞれ、デスルファトヒルジンをコードする第二DNA 配列に本来の読み取り枠内で連結されたシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結された酵母のプロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列を含んで成る。
【００４３】
　このような追加のデスルファトヒルジン発現カセット内の好適な酵母プロモーターは、例えば、複合培地内の酵母によるデスルファトヒルジンの発現のために使用され得る構成的または誘導的な酵母プロモーターである。このようなプロモーターは、例えば、上記CUP1、GAPDH(それらの短縮された構成的なバージョン、例えば、GAPFL 等) 、GAL1(10)、PYK 、TPI 、ADH 及びPGK プロモーターである。好ましいのは、上記の構成的なGAPFL プロモーターである。好適なシグナル配列及び転写シグナルは、特に前記のものである。
【００４４】
　対応するデスルファトヒルジン発現カセットは、例えば、欧州特許出願番号341215に記載されている。追加のACE1発現カセットは、それ自体の転写並びに翻訳の開始及び終了シグナルを含み、または、あるいは、ACE1プロモーターとは異なる構成的または誘導的な酵母プロモーター、例えば、CUP1もしくは構成的な( 短縮)GAPDHプロモーター( 例えば、GAPFL プロモーター) により、転写的に制御されている。
【００４５】
　好適なACE1発現カセットは、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のゲノムの1.7 kb EcoRVフラグメント内に含まれる(P.Fuerst et al.(1988)Cell55,705-717を参照のこと) 。そこでの正しいACE1プロモーターは、常法により、他の酵母プロモーターにより置き換えられることができる。上記の追加的デスルファトヒルジン及び/ またはACE 発現カセットの転写の方向は、必須ではなく、そして本発明のベクター内に既に存在する上記CUP1- デスルファトヒルジン発現カセットの転写の方向と同じであることも、または反対であることもできる。
【００４６】
　本発明は、先に定義した新規の発現ベクターの調製方法にも関する。本発明に記載の発現ベクターを、当業者に知られた方法により、例えば、通常の化学的または生物学的なインビトロにおける合成を使用して、予め決めた順序で、デスルファトヒルジンをコードする第二DNA に正しい読み取り枠内で連結された酵母のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結された酵母のCUP1プロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成る上記CUP1- デスルファトヒルジン発現カセットを、酵母及びバクテリアの宿主のための選択的遺伝マーカーを含むDNA フラグメントを、酵母及びバクテリアの宿主のための複製起点を、そして場合により追加のデスルファトヒルジン及び/ またはACE1発現カセットを連結することにより、調製する。
【００４７】
　組み換えDNA 技術を使用して、好ましいベクターを構築し、そして調製する。組み換えDNA 技術による調製のために、好適なDNA フラグメントを、常法によりインビトロにおいて連結する。次に、この連結混合物を、使用される調節要素の性質に依存する好適な原核生物または真核生物宿主に形質転換し、そして、所望のベクターを含む形質転換細胞を、通常の手順に従って選択する。このベクターを、形質転換された宿主により増幅することができ、そして常法により単離することができる。この宿主の選択は、上記ベクター上に位置するその調節配列に依存する。本発明の上記発現ベクターが、原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)において機能的な調節配列を含んで成るので、原核生物宿主、例えば、大腸菌(E.coli)は、上記ベクターの構築及び増幅のために好まれる。
【００４８】
　本発明は、さらに、デスルファトヒルジンをコードする第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で連結された酵母のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結された酵母CUP1プロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成るデスルファトヒルジン発現カセットを含んで成る酵母発現ベクターを宿す酵母株、並びにそれらの生産方法に関する。
【００４９】
　本発明に記載の上記発現ベクターによる酵母の形質転換は、当業者に知られた方法に従って達成され得る。
【００５０】
　好ましい酵母株は、上記のものであり、特に、内因性の2 ミクロンプラスミド("cir 0 株")を回復されており、そして酵母のプロテアーゼ、例えば、ysc α及びyscYにおける単一または多数の欠損があるサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株である。このような酵母株の生産方法は、例えば、欧州特許出願番号340170及び341215に記載されている。染色体CUP1遺伝子の0 〜16個の、特に2 〜6 個のコピーを含む酵母株は知られており、そしてそれ自体公知の方法で調製され得る。
【００５１】
　例えば、例えば2 〜4 個の、CUP1遺伝子の染色体コピーを含む従来の銅感受性酵母株から出発してその酵母のゲノムに欠損を導入するにより、例えば、部位特異的突然変異誘発または遺伝子破壊または遺伝子置換により、CUP1遺伝子のより少ないコピーをもつ酵母株が調製され得る[H.Rudolph et al.,Gene, 36(1985)87-95]。上記染色CUP1遺伝子の配列が知られているので、適切に改良した突然変異誘発性オリゴヌクレオチド・プライマーの調製を含む、よく知られた部位特異的突然変異誘発手順[ 例えば、M.J.Zoller and M.Smith(1983) Methods Enzymol.100,468] を利用した挿入、置換、欠損により、後者を欠陥とすることができる。
【００５２】
　あるいは、上記のゲノムのCUP1遺伝子を、外来DNA により置換することができ、またはこの外来DNA を、このCUP1の好適な制限部位に挿入することができる。例えば、現存する染色体CUP1遺伝子の全部または一部分において欠陥のある酵母突然変異体を調製するために、外来DNA を、このCUP1遺伝子内にある好適な制限部位に挿入することができる。この使用された酵母株が、アミノ酸またはプリン( 例えば、ウラシル) の生合成に関する酵素をコードする染色体遺伝子に欠陥を持つ場合には、対応する無傷の遺伝子( 例えば、URA3) を、その染色体CUP1遺伝子に挿入し、これにより、栄養要求性酵母株において原栄養性を付与し、そしてCUP1からcup1にその遺伝子型を同時に変更することができる。
【００５３】
　この遺伝子置換または特異的突然変異誘発手順は、一般的に当業者に利用されており、そして、完全に再現できる。銅に対し緩やかな耐性をもつ与えられた酵母株の銅耐性を増大させる( すなわち、染色体のCUP1遺伝子の数を増大する) ために、この酵母株を、CUP1座の増幅を引き起こす培地内での高い銅濃度に晒すことができる。結果物である生存酵母細胞は、その親株よりもより多くの染色体CUP1遺伝子( 例えば、10〜16個) を含み、そしてそれ自体公知の方法により上記培地から単離されることができる。
【００５４】
　所望の遺伝的背景をもつ、例えば、破壊された染色体CUP1遺伝子を全部、または一部分もつ、そして/ または特定のプロテアーゼに欠陥をもつ酵母株を創り出す最新の方法は、好適な酵母株の減数分裂交差及び四分子分析にある。この四分子は、その2 媒体細胞から生じ、標準的な遺伝子技術に従い分析される。四分子の4 つの胞子間のランダムな各種取り合わせは、それに続く交差における好適な突然変異体の構築を許容する。ランダム胞子形成を、それに代わるシステムとして使用することもできる。
【００５５】
　上記染色体ACE1遺伝子の1 〜3 個の追加のコピーを含む酵母株を、常法により調製することもできる。例えば、上記ACE1遺伝子を、抗生物質耐性を与える染色体遺伝子の適切な制限部位に挿入することができ、または、上記ACE1遺伝子の上記のような追加のコピー(copies)を含む得られた酵母株に、抗生物質感受性を、そして、それぞれに、その対応するアミノ酸、プリン、またはピリミジン塩基に関する原栄養性を与える、アミノ酸またはプリンまたはピリミジン塩基の合成に関連する遺伝子に挿入することができる。
【００５６】
　以下の実験パートにおいては、本発明の様々な態様を、添付した付属図面を参照しながら記載する。
【００５７】
　以下の例は、本発明を説明するものであり、そして、それらを限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５８】
　　　　　　　　　　　　　　　　　 実験パート
株及びプラスミド
大腸菌(E.coli) DH5αF':Eschericha coli K12F'endA1 hsdR17(r- m + )supE44 thil rec　　A1 pyrA relA1 PHI80lacZdelM15 del(lacZYA-argF)U169;Hanahand D(1983) によるプ　　ラスミドを用いた Eschericha coliの形質転換に関する研究。J.Mol.Biol.166:577(B　　ethesda Research Laboratories)
酵母(S.cerevisiae) H449:Saccharomyces cerevisiaeMATa,ura3 Δ15,leu2-3,leu2-112,p　　rb1,cps1,[cir 0 ].DSM4413;1988年2 月18日。
酵母(S.cerevisiae) HT462/TH3:MATα,cup1::URA3,kex1,prc1,leu2-3;leu2-212; DSM7190　　;1992年7 月22日。
酵母(S.cerevisiae)株55.6B;MATa,his3,leu2,trp1,ura3-52,cup1::URA3;Thiele, D.J. et　　 al.Science 231(1986),854-856　を参照のこと.
　プラスミドpDP34:EP-A-340 170, 文書中の図 3; E.coliのためのアンピシリン耐性マーカー並びにURA3及びdLEU2 サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)選択マーカーをもつ酵母- E.coliシャトルベクター。それは、A 形態での完全な2 ミクロン配列を含み、そしてREP1、REP2及びFLP プロフィシェント(proficient)である。DSM4473;1988年3 月14日。
【００５９】
　プラスミドpJDB207/GAPFL-YHIR: 酵母グリセルアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) 遺伝子の、短い、構成的プロモーターの制御下でのデスルファトヒルジン変異体HV1 の発現のための酵母プラスミド。デスルファトヒルジンのコード配列は、好ましい酵母のコドンから成る;EP-A-340 170 を参照のこと。
【００６０】
　プラスミドpTZ18R:pUC18由来のプラスミドは、M13 複製起点を含み、その為、一本鎖に成ることができ、そしてヘルパーM13 ファージの助けを借りてM13 ファージの頭に包み込まれることができる。Mead DA,Szczesna-Skorupa E,Kemper B,　一本鎖DNA 'blue' T7 プロモータープラスミド: クローニング及び蛋白工学のための用途の広い縦に並ぶプロモーターシステム.Protein Engineering 1(1986),67-74(pharmacia).
　プラスミドpFBY2:このプラスミドは、酵母(S.cerevisiae)の2 ミクロンプラスミド由来のFRT を含む166 塩基対のAluIフラグメントを、pTZ18RのHindIII 部位とEcoRI 部位との間に挿入し、そしてXbaIにより切断した2 ミクロンプラスミドの全体を、pTZ18RのユニークXbaI部位に挿入することにより構築される。DSM 6271;1990 年12月14日。
【００６１】
　プラスミドpFBY4:このプラスミドは、pTZ18RのユニークXbaI部位にクローニングされたサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のURA3遺伝子の全体を含む1.1kb のXbaIフラグメントから成る。このプラスミドは、XbaIフラグメントを含む1.1kb のURA のための便利な源として役立つ。 DSM 6272;1990年12月14日。
【００６２】
　プラスミドpFBY5:pFBY5 は、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)の2 ミクロンプラスミドの全体を含む大きなプラスミド、並びに、バクテリアのベクターpUC18 中のサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のURA3及びleu2遺伝子から作られる。このベクターのユニークなSalI部位に、1.1k塩基対のSalIフラグメントが挿入され、このフラグメントは、PHO5シグナル配列に融合したサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)GAPDH 由来のプロモーター、これに融合する合成ヒルジンをコードするDNA フラグメント、次に、これに融合するPHO5ターミネーターから成る発現カセットを含む。DSM 6273;1990 年12月14日。
【００６３】
　プラスミドpFBY29: このプラスミドは、LEU2遺伝子を含む2k塩基対のBamHI/SalIフラグメントから成る。このフラグメントは、pTZ18RのBamHI 部位とSalI部位との間に挿入される。pFBY29は、LEU2を含む2.0k塩基対のフラグメント源として役立つ。DSM 6275;1990 年12月14日。
【００６４】
　別段の定めなき場合、標準的な手順書に従い、全ての操作を実施する( 例えば、maniatis,T.et al.:Molecular cloning:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1982) 。
【００６５】
　例 1: プラスミドpPFY56の構築　CUP1プロモーター、PHO5リーダー配列及び合成ヒルジン遺伝子を含むハイブリッド遺伝子
　分泌デスルファトヒルジンの誘導的・高レベルの発現を達成するために、ヒルジンHV1 及びPHO5リーダー配列をコードするDNA 配列を融合し、そして銅誘導可能CUP1プロモーターの制御下に置く。
【００６６】
　pDP34(欧州特許出願番号340170、その中の図 3を参照のこと) は、大腸菌(E.coli)にのためのアンピシリン耐性マーカー並びにURA3及びdLEU2 酵母選択マーカーをもつ酵母- 大腸菌(E.coli)シャトルベクターである。それは、A 形態で、完全な2 ミクロン配列を含み、そしてREP1、REP2及びFLP プロフィシェントである。プラスミドpDP34 をBamHI により処理する。この制限部位の付着末端を、Klenow DNAポリメラーゼ反応によりフィルインする(T.Maniatis et al.,in:"Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory,1982) 。このDNA をさらにSalIにより切断し、そして11.8kbのベクターフラグメントを分離用0.6%アガロースゲル上で単離する。電気的溶出及びエタノール沈殿によりこのDNA を回収する。
【００６７】
　プラスミドpJDB207/GAPFL-YHIR( 酵母グリセルアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) 遺伝子の、短い、構成的プロモーターの制御下でのデスルファトヒルジン変異体HV1 の発現のための酵母プラスミド; デスルファトヒルジンのコード配列は、好ましい酵母のコドンから成る; 欧州特許出願番号340170を参照のこと) をHindIII により処理する。付着末端を、Klenow DNAポリメラーゼにより平滑末端に変換する。このDNA をエタノール沈殿し、そしてさらに、SalIにより処理する。
【００６８】
　この1.1kb のSalI-[HindIII]/ 平滑末端フラグメントは、pBR322配列、GAPFL プロモーター、デスルファトヒルジンのコード配列( 好ましい酵母コドン) にフレーム内で融合されたPHO5シグナル配列、及びPHO5転写終止フラグメントをもつ完全な発現カセットを含む。この1.1kb フラグメントを分離用0.8%アガロースゲル上で単離し、電気的溶出によりゲルから回収し、そしてDE52イオン交換クロマトグラフィー及びエタノール沈殿により精製する。
【００６９】
　1.1kb フラグメント0.2 ピコモル及び11.8kbベクターフラグメント0.1 ピコモルを、10μl の60mM Tris-HCl pH 7.5,10mM MgCl2 ,5mM DTT,3.5mM ATP及び400 ユニットのT4 DNAリガーゼ(Biolabs) 内で、16時間、15℃で、連結する。1 μl の部分を、大腸菌(E.coli)HB 101Ca2+　細胞を形質転換するために使用する。5 つの形質転換された、アンピシリン耐性コロニーを分析する。プラスミドDNA をBamHI 及びSalI/BamHIにより処理する。正しい制限フラグメントをもつ1 つのコロニーを選び、そしてpDP34/GAPFL-YHIRと呼ぶ( 詳しくは、欧州特許出願番号340170を参照のこと) 。
【００７０】
　PHO5リーダー配列に融合された合成ヒルジン遺伝子を、PHO5転写終止配列をも含む0.5kb のEcoRI フラグメントとして、プラスミドpDP34/GAPFL-YHirから単離する。
【００７１】
　Perkin Elmer製PCR キット及びプライマーとしての以下の2 つのオリゴヌクレオチドを使用したpolymerase chain reaction(PCR)により、酵母(S.cerevisiae)のゲノムの遺伝子から、CUP1プロモーター(T.R.Butt et al.(1984) Proc.Natl.Sci USA 81,3332-3336)をクローニングする。
5'-GGATCCATTACCGACATTTGGGCGCTAT 　( 配列番号３）
5'-GAATTCACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTA ( 配列番号４）
　10mM TRIS pH 8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2 中に2.5 ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ、0.02mMのそれぞれのプライマー、並びに0.2mM のdATP、dCTP、TTP 及びdGTPを含む0.1ml 中で、100ng の酵母のgenomic DNA(酵母株H449から単離した) をインキュベートする。92℃で30秒、42℃で1 分間、そして72℃で1 分間、の30サイクル間、この反応物をインキュベートする。単離し、精製し、そしてBamHI 及びEcoRI による制限酵素処理の後、0.4kb のCUP1プロモーターフラグメントを、BamHI 及びEcoRI により切断されたpBR322に挿入する。
【００７２】
　結果物であるプラスミドpBR322-CUP1 を、EcoRI により制限酵素処理する。このCUP1プロモーターを含む4.4kb のベクターを単離し、精製し、そして0.5kb のヒルジンフラグメントと連結する。大腸菌(E.coli)HB101 を、この得られたプラスミドpPFY53を用い形質転換する。pPFY53を、SalIを用いた処理により、デスルファトヒルジン・フラグメントの本来の方向についてテストする。CUP1プロモーター、PHO5リーダー配列、ヒルジン遺伝子、及びPHO5ターミネーターを含む1082塩基対のBamHI/SalIフラグメントを、配列番号１に示す。
【００７３】
　CUP1- ヒルジン発現カセットを、1.1kb のSalIフラグメントとして、pPFY53から単離する。次に、このフラグメントを、SalIにより線状になったpDP34 に挿入する。大腸菌(E.coli)HB101 を、生ずるプラスミドpPFY56を用い形質転換する。kpnIを用いた処理によりその方向をテストする。この形質転換された大腸菌(E.coli)株を、大腸菌(E.coli)/PFY56と称する。pPFY56を図 1に示す。
【００７４】
　例 2: プラスミドpPFY58の構築　CUP1プロモーターからのヒルジン及びACE1プロモーターからのACE1の同時発現
　Ace1蛋白は、CUP1発現を制御する銅応答性転写因子である。これは、構成的に発現される。制御は、翻訳後に起こる。
【００７５】
　Perkin Elmer製PCR キット及びプライマーとしての以下の2 つのオリゴヌクレオチドを使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR) により、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のゲノムDNA から、ACE1遺伝子(P.Fuerst et al.(1988) Cell 55,705--717)をクローニングする。
5'-GATATCGATCGTGAAAGAATATTTGCT　　　( 配列番号５) 
5'-GATATCATGAGGATGATGACAAAGAAGAC　　( 配列番号６) 
　10mM TRIS pH 8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2 中に2.5 ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ、0.02mMのそれぞれのプライマー、並びに0.2mM のdATP、dCTP、TTP 及びdGTPを含む0.1ml 中で、100ng の酵母のゲノムDNA をインキュベートする。92℃で30秒、42℃で1 分間、そして72℃で1 分間、の30サイクル間、この反応物をインキュベートする。単離し、精製し、そしてEcoRV による制限酵素処理の後、1.7kb のACE1遺伝子フラグメントを、pPFY56( 例 1) のユニークSnaBI 部位に挿入してプラスミドpPFY58を導き、このプラスミドを大腸菌(E.coli)HB101 に形質転換する。NcoIを用いた制限酵素処理によりその方向をテストする。この形質転換された大腸菌(E.coli)株を、大腸菌(E.coli)/PFY58と称する。pPFY58を図 2に示す。
【００７６】
　例 3: プラスミドpPFY59R の構築　CUP1プロモーターからのデスルファトヒルジン及びCUP1プロモーターからのACE1の同時発現
　タイトに調節された、高レベルのACE1発現を達成するために、1.7kb のEcoRV フラグメント( 例 2) 上に存在する構成的なACE1プロモーターを、CUP1プロモーターに交換する。このCUP1プロモーターへのACE1コード配列の融合のために、部位特異的突然変異誘発法により、ACE1の出発コドンの上流にEcoRI 部位を導入する。
【００７７】
　ACE1遺伝子を含む1.7kb のEcoRV フラグメント( 例 2) を、ベクターpBluescriptKS+(Straragene,La Jolla,Ca,USA)のEcoRV 部位にサブクローニングし、プラスミドpKSACE1 を与える。ウラシル-DNA法(Bio-Rad Muta-Gene M13 kit,Bio-Rad,Richmond,Ca,USA) を使用したインビトロ突然変異誘発による新たなEcoRI 部位を導入するためには、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する。5'-CTGATAATCAGTGAATTCACAGAATG-3'　 (配列番号７) 
　最初に、ウラシルを取り込むために、pKSACE1 を、大腸菌(E.coli)CJ236 にトランスフェクトする。CJ236 からの一本鎖DNA を、M13 ヘルパー・ファージを使用して単離する(Stratagene 、前記) 。
【００７８】
　200 ピコモルのオリゴヌクレオチドを、3 μl の1M Tris-HCl pH 8.0、0.3 μl の1M MgCl 2 、0.75μl の0.2M DTT、0.6 μl の20mM ATP及び5 ユニットのT4ポリヌクレオチド・キナーゼを含む0.03mlの液量内でリン酸化する。この混合液を、37℃で60分間そして65℃で15分間インキュベートする。リン酸化されたオリゴヌクレオチドを、以下のように鋳型DNA にアニーリングする:pKSACE1由来のウラシル含有DNA 0.1 ピコモルを、10μl のアニーリング・バッファー(20mM Tris-HCl pH 7.5 、2mM MgCl 2、50mM NaCl)中の2 ピコモルのリン酸化プライマーと共にインキュベートする。この混合液を、80℃で10分間インキュベートし、そして次に、25℃まで徐々に冷却する。
【００７９】
　引き続き、相補鎖を合成する:10 μl のアニーリング反応物を、4 μl の2mM　dNTP's 、0.75μl の0.5M Tris-HCl pH 7.5、0.75μl の0.1M MgCl 2 、2.2 μl の0.2M DTT、1 ユニットのT4 DNAポリメラーゼ及び2 ユニットのT4 DNAリガーゼと共にインキュベートする。この反応液を、氷上で10分間、25℃で10分間、そして37℃で90分間インキュベートする。生ずる2 本鎖DNA を、大腸菌(E.coli)JM101 に形質転換する。プラスミドを調製し、そして正確なEcoRI 部位について分析する。この新たなEcoRI 部位をもつ1 つのプラスミドをpKSACE1-Eco 名付ける。
【００８０】
　ACE1プロモーターを伴わず、ACE1コーディング配列及び終止配列を含むpKSACE1-Eco 由来の1.5kb のEcoRI フラグメントを、ACE1をCUP1プロモーターの制御下に置くために、ベクターpBR322-CUP1(例 1) のEcoRI 部位にクローニングする。この生ずるプラスミドpCup-ACEを、大腸菌(E.coli)HB101 にトランスフェクトする。
【００８１】
　pCup-ACE由来の1.2kb のBamHI/SnaBI フラグメントを、BamHI により線状にしたベクターpDP34 に連結する。10フェムトモルのBamHI により線状にしたベクターDNA 、30フェムトモルのBamHI/SnaBI フラグメント、20mM Tris pH 7.5、5mM MgCl2 、1mM DTT 、0.1mM ATP 及び1 ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μl 中で、連結を実施する。25℃で60分間のインキュベーション後、20mM Tris-HCl pH 7.5、5mM MgCl2 、1mM DTT 、0.1mM dNTP's及び1 ユニットの大腸菌(E.coli)DNA ポリメラーゼKlenowフラグメントを含む50μl 中で、この分子を平滑末端にする。この混合液を、37℃で10分間インキュベートする。
【００８２】
　次に、この平滑末端の分子を、15℃で18時間、20mM Tris-HCl pH 7.5、5mM MgCl2 、1mM DTT 、0.1mM ATP 及び1 ユニットのT4 DNAリガーゼを含む100 μl 中での連結により、環状にする。生ずるプラスミドpPFY54を、大腸菌(E.coli)HB101 にトランスフェクトし、そしてPvuII を用いた制限酵素処理により、方向についてテストする。
【００８３】
　CUP1- ヒルジン発現カセット( 例 1) を含むpPFY53由来の1.1kb のSalIフラグメントを、salIにより直線状になったベクターpPFY54にサブクローニングする。この得られたプラスミドpPFY59R を、大腸菌(E.coli)HB101 にトランスフェクトする。その方向をKpnIを用いた処理によりテストする。pPFY59R を担持する大腸菌(E.coli)株を、大腸菌(E.coli)/PFY59R と名付ける。pPFY59R を、図 3に示す。
【００８４】
　例 4: pPFY79の構築　2 つの異なるプロモーターからのデスルファトヒルジンの発現
　ヒルジンのmRNAレベルを増大するために、ヒルジン・コーディング配列を、2 つの異なるプロモーターから同時に発現することができる。
【００８５】
　CUP1- ヒルジン発現カセットを、プラスミドpPFY53( 例 1) からの1.1kb のSalIフラグメントとして単離する。このフラグメントを、ベクターpDP34/GAPFL-YHirのユニークSalI部位にクローニングする。生ずるプラスミドpPFY79内のSalIフラグメントの方向を、BamHI を用いた制限酵素処理によりテストする。pPFY79によりトランスフェクトされた大腸菌(E.coli)HB101 を、大腸菌(E.coli)/PFY79と名付ける。pPFY79を図 4に示す。
【００８６】
　例 5: プラスミドpPFY56、pPFY58、pPFY59R 、pPFY79及びpDP34-GAPFL-YHirのよるサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)の形質転換
　サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1456を、欧州特許出願番号341215に記載されたように構築する。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株H449から出発して、2 つの引き続く一連の実験において、2 つのカルボキシペプチダーゼysc α及びyscYを、それぞれ、それらをコードする遺伝子であるKEX1及びPRC1の破壊により、株H449から取り除く。最初に、ysc αをコードする遺伝子であるKEX1を破壊する。この目的のために、株H449を、KEX1をコード遺伝子をコードするDNA フラグメントにより形質転換する。ここで、URA3遺伝子の全体が、KEX1コーディング領域に挿入される。
【００８７】
　ウラシルの原栄養性形質転換細胞を選択し、そしてysc α活性の無いことについてテストする。次に、KEX1座に挿入されたURA3遺伝子を、URA3遺伝子の破壊された変異体であるura3Δ( 欧州特許出願番号341215を参照のこと) を含むプラスミドを用いた形質転換により破壊する。ura3栄養要求性の形質転換細胞を選択し、そして以下の段階において、カルボキシペプチダーゼyscYをコードするそれらの内因性PRC1遺伝子内で破壊する。KEX1の破壊について記載したような、全体として類似する方法で、この実験を実施する。最終結果物である株H449相同遺伝子誘導体はTr1456と称され、そして以下の遺伝子型: 
Tr1456 = MATa,leu2-3,112,ura3,prb1,kex1::ura3,prc1::ura3,[cir 0 ] 
をもつ。
【００８８】
　プラスミドpDP34-GAPFL-YHir、pPFY56、pPFY58、pPFY59R 及びpPFY79による株Tr1456形質転換を、Dohmen et al.[1989,Curr.Genet.15,319-325] に従い実施する。形質転換された酵母細胞を、ロイシンが補われ、そしてウラシルが欠如した酵母最小培地のプレート上で選択する。単一の形質転換酵母クローンを単離し、、これを: 
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1456/pDP34/GAPFL-YHir
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1456/pPFY56
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1456/pPFY58
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1456/pPFY59R 
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1456/pPFY79
と称する。
【００８９】
　例 6: 異なる銅濃度下での最小培地におけるデスルファトヒルジン発現
　サッカロミセス・セレビシエ(saccharomyces　cerevisiae)Tr1456/pPFY56、サッカロミセス・セレビシエ(saccharomyces　cerevisiae)Tr1456/pPFY58及びサッカロミセス・セレビシエ(saccharomyces　cerevisiae)Tr1456/pPFY59R を、
　　Difco 酵母ナイトロジェンベース
　　( アミノ酸の含まない) 　　　　　　　　6.7 
　　L-アスパラギン　　　　　　　　　　　 10 
　　L-ヒスチジン　　　　　　　　　　　　　1 
　　L-ロイシン　　　　　　　　　　　　　　0.1 
　　グルコース　　　　　　　　　　　　　 20 
(g/l) から成る2 つの引き続きの培養において、それぞれ増殖させる。
【００９０】
　第一の培養を、30℃で60時間、そして 180r.p.m.で実施する。第二の培養を、第一培養の2%( 体積対体積) により接種し、そして30℃で24時間、そして180r.p.m. で実施する。24時間後、培養液を遠心分離し、細胞を生理食塩水で1 回洗浄し、そして、それに異なった濃度の硫酸銅が添加されている新しい培地( 前を参照のこと）の、元の液量内に再懸濁する。この細胞を、30℃、180r.p.m. で、さらに24時間増殖させ、その後、遠心分離によりその細胞を取り出し、そして上澄み中のデスルファトヒルジン量を、特許出願340170中に開示されたようにHPLCにより測定する。結果を表 1に要約する。
【００９１】
【表１】
2004000288.tif 000002
【００９２】
　選ばれた条件下、デスルファトヒルジンは、上記プラスミド構築物の1 つを含む全ての形質転換細胞において発現される。発現は、絶対的に銅依存性である。なぜなら、添加銅の非存在下では、デスルファトヒルジンが殆ど見られないからである。これらの条件下での最適銅濃度は、0.05と0.25mMとの間にある。
【００９３】
　例 7: 複合培地中での、CUP1- プロモーターに対するGAPFL-プロモーターの制御下での、デスルファトヒルジン濃度の比較
　以前に、欧州特許出願番号340170に記載されたように、デスルファトヒルジンの発現は、強いGAPDH プロモーターの短いフラグメントの制御下、豊富な、複合培地において最適となった。それ故、プラスミドを含むCUP1- プロモーターを、これらの以前に開示された条件下に、+/- 銅添加を行い比較する。さらに、銅添加についての最適時間点を測定する。
【００９４】
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)TR1456/pPFY56 、またはTR1456/pPFY58 、またはTR1456/pPFY59R、またはTR1456/pDP34/GAPFL-YHir の細胞を、
　　Difco 酵母ナイトロジェンベース
　　( アミノ酸の含まない) 　　　　　　　　6.7 
　　L-アスパラギン　　　　　　　　　　　 10 
　　L-ヒスチジン　　　　　　　　　　　　　1 
　　L-ロイシン　　　　　　　　　　　　　　0.1 
　　グルコース　　　　　　　　　　　　　 20 
(g/l) から成る20mlの合成培地内で、2 つの引き続きの予培養において、それぞれ増殖させる。
【００９５】
　上記培地のpHを5.8 に調整する。第一の予培養を、28℃で60時間、そして 180r.p.m.で実施する。第二の予培養を、第一予培養の2%( 体積対体積) により接種し、そして28℃で24時間、そして180r.p.m. で実施する。主培養の培地は、
　　ペプトン　　　　　　　　　　　　　　　5 
　　酵母エキス　　　　　　　　　　　　　 10 
　　グルコース　　　　　　　　　　　　　 20 
　　シュクロース　　　　　　　　　　　　 40 
　　硫酸アンモニウム　　　　　　　　　　　3 
　　リン酸2 水素カリウム　　　　　　　　　2 
　　硫酸マグネシウム7 水塩　　　　　　　　0.5 
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　0.1 
　　塩化カルシウム　　　　　　　　　　　　0.1 
　　ビオチン　　　　　　　　　　　　　　 10-5 
から成る。
【００９６】
　主培養(100ml培地) を、約2 x 106 細胞/ml により接種し、そして28℃で96時間、そして180r.p.m. でインキュベートする。200μMの濃度での無菌硫酸銅を、主培養の接種後、0 時間、または7 時間、または11時間、または14時間、または24時間目に、主培養に添加する。この発酵の終了時に、この培養液の一部分を取り出し、遠心分離によりその細胞を取り出し、そしてこの培養液の上澄を、前記のように、デスルファトヒルジンについて分析する。結果を以下の表 2に示す。
【００９７】
【表２】
2004000288.tif 000003
【００９８】
　上記プロモーターを" 擬- 構成的" 方法( すなわち、プロモーターによる誘導が、主培養の接種と一緒に起こる) で使用したとき、並びに、ACE1- 遺伝子が、ヒルジン発現カセットを含むプラスミド上に存在するとき、CUP1- プロモーターからのデスルファトヒルジンの最も高い発現を得る。期待に反して、本明細書中に開示する誘導条件下では、強力な構成的GAPDH-プロモーターの改良変異体の制御下のヒルジン発現カセットを含む株サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)TR1456/pDP34/GAPFL-YHir を用いてよりも、株サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)TR1456/pPFY58 及びTR1456/pPFY59Rを用いて、より高い濃度のヒルジンを得る。
【００９９】
　例 8: 複合培地中でのデスルファトヒルジンのCUP1指令分泌ついての銅濃度の最適化
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)TR1456/pPFY56 、又はTR1456/pPFY58 、又はTR1456/pPFY59R、又はTR1456/pDP34/GAPFL-YHir を、前セクションに記載したように、20mlの合成培地中で、2 つの引き続きの予培養において、それぞれ増殖させる。主培養を、前記の複合培地中で行い、そして約2 x 106 細胞/ mlにより接種し、そして28℃で96時間、そして180r.p.m. でインキュベートする。主培養の接種の直後、下記濃度での無菌硫酸銅を培地に添加する。その濃度は0 μM 、又は50μM 、又は200 μM 、又は500 μM 、又は1mM 、又は2.5mM 、又は5mM である。発酵終了時、培養液の一部を取り出し、細胞を遠心分離により取り出し、そして培養上澄液を前記のようにデスルファトヒルジンについて分析する。結果を以下の表 3に示す。
【０１００】
【表３】
2004000288.tif 000004
【０１０１】
　最適銅濃度では、ヒルジン発現カセットがGAPDH-プロモーターの強構成的なGAPFL-フラグメント制御下にあるときよりも、CUP1-YHir 発現カセットを使用したときに、はるかに高い濃度のデスルファトヒルジンを得る。200 〜500 μM より低い銅濃度では、転写活性物質ACE1の遺伝子を含むプラスミドpPFY58及びpPFY59R が、ACE1を欠いているプラスミドpPFY56よりも優れている。
【０１０２】
　例 9: タンデムに並んだ2 つのヒルジン発現カセットをもつプラスミドpDP34/[GAPFL-HIR]Dの構築
　プラスミドpDP34/[GAPFL-HIR]Dは、タンデムに配置された2 つのヒルジン発現カセットから成るDNA 挿入物を含んで成る。この2 つのカセットは、同一であり、そしてPHO5シグナル配列及び短く構成的なGAP49(TDH3) プロモーター(GAPFL) の制御下のデスルファトヒルジンHV1 のコード配列並びにPHO5転写ターミネーターを含む。プラスミドpJDB207/[GAPFL-HIR]Dは、酵母ベクターpJDB207 中にこのタンデム発現カセットをもつ。この構築物は、EP225633に記載されている。　pJDB207/[GAPFL-HIR]Dを、ユニークHindIII 部位で切断する。
【０１０３】
　この制限部位の付着末端を、klenow DNAポリメラーゼにより平滑末端に変換する。0.01mg/ml のエチジウムブロマイドの存在中での部分的なSalI処理により、2 つの発現カセットをもつ2.1kb のSalI- 平滑末端フラグメントの単離をすることができる。プラスミドpDP34(例 1を参照のこと) をBamHI を切断し、klenow DNAポリメラーゼにより処理し、そしてSalIにより処理する。単離された大きなベクター・フラグメントを、2.1kb のSalI- 平滑末端フラグメンントをクローニングするために使用する。正しいクローンをpDP34/[GAPFL-HIR]Dと称し、反時計廻りの方向にクローンイングされたタンデム・カセットをもつ。
【０１０４】
　例 10:それぞれ1 つまたは2 つのヒルジン発現カセットをもつプラスミドを使用して得られるヒルジン濃度の比較
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)TR1456/pPDP34/GAPFL-YHir、又はTR1456/pPFY56 、又はTR1456/pPFY79 、又はTR1456/pDP34/[GAPFL-HIR]D を、例 7に記載したように、2 つの引き続きの前培養、次の主培養において、それぞれ増殖させる。主培養を、約2 x 106 細胞/ mlにより接種し、そして28℃で96時間、そして180r.p.m. でインキュベートする。
【０１０５】
　主培養の接種の直後、下記濃度での無菌硫酸銅を添加する。その濃度は0 μM 、又は50μM 、又は200 μM 、又は500 μM 、又は、750 μM 、又は1mM 、又は2.5mM である。発酵終了時、培養液の一部を取り出し、細胞を遠心分離により取り出し、そして培養上澄液をHPLCによりデスルファトヒルジンについて分析する。結果を以下の表 4に示す。
【０１０６】
【表４】
2004000288.tif 000005
【０１０７】
　上記実験の条件下、構成的なGAPFL-YHir発現カセット及び第 2の、銅誘導CUP1-YHir 発現カセットを含むプラスミドpPFY79は、1.) 構成的な発現カセットのみを含むpPD34/GAPFL-YHirの如きプラスミドよりも、または 2.)銅誘導発現カセットのみを含むpPFY56/CUP1-Hir の如きプラスミドよりも、または 3.)2 つの構成的な発現カセットを含むpDP34/GAPFL-YHir+GAPFL-YHir の如きプラスミドよりも優れている。
【０１０８】
　例 11:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株Tr1456の銅耐性相同遺伝子変異体の構築
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株Tr1456は、- ほとんどは実験酵母株と同様に- 、培地への銅添加に対し中程度に耐性である。この耐性は、内因性CUP1座の約3 つのコピーを含む2kb の染色体DNA セグメントの存在による[D.Hamer,et al.Science 228(1985),685-690] 。培地中の大量の銅の存在下、より高い耐性変異体が得られるが、これは、上記の2kb のCUP1含有染色体DNA セグメントのタンデムの反復による。
【０１０９】
　このような高い耐性変異体を構築するために、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1456を、例 6に記載したように、合成最小培地に接種し、1.2mM の硫酸銅を補給する。この培養を、30℃で8 日間、そして180r.p.m. で行う。次ぎに、この培養液を、銅添加のない、単一コロニーを得るのに好適な濃度での合成最小培地上にプレーテングする。選択された個々のコロニーからのDNA を調製し、EcoRI により処理し、アガロースゲル上で分離し、そしてサザンブロット法によりCUP1座の存在及び長さについて分析する。実験条件は、Hamer et al.[ 前記を参照のこと] に従う。CUP1座の少なくとも10コピーの中の、CUP1座の電気泳動法での移動における、その存在を表すシフトをもつ1 つのコロニーを選び、そしてサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1631と称する。
【０１１０】
　例 12:　プラスミドpPFY56、pPFY58、及びpPFY59R によるサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1631の形質転換
　プラスミドpPFY56、pPFY58、及びpPFY59R によるサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1631の形質転換を、前記のように実施した。単一の形質転換酵母クローンを単離し、そして、
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1631/pPFY56、
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1631/pPFY58及び
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1631/pPFY59R 
と称する。
【０１１１】
　例 13:高銅濃度での形質転換銅耐性サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1631と形質転換株Tr1456との比較
　サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1631/pPFY56 、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1631/pPFY58 、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1631/pPFY59Rの細胞、並びにサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1456/pPFY56 、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1456/pPFY58 、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1456/pPFY59Rの細胞を、例 7及び8 に記載するように培養する。主培養の接種直後、主培養液に、0 、0.5mM 、1mM 、2mM または4mM の硫酸銅を添加する。この培養を30℃で72時間、そして180r.p.m. で行う。発酵終了時、培養液の一部を取り出し、細胞を遠心分離により取り出し、そして培養上澄液をHPLCによりデスルファトヒルジンについて分析する。結果を以下の表 5に示す。
【０１１２】
【表５】
2004000288.tif 000006
【０１１３】
　上記結果は、培養培地中の高い銅濃度での、形質転換銅耐性株サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1631における優れたデスルファトヒルジン生産性を示している。
【０１１４】
　例 14:サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株55.6B(cupp::URA3) とサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株TR1456との接合及び銅感受性に関するその胞子の分析
　CUP1座の中に欠損のあるサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株55.6B(MATa his3 leu2 trp1 ura3-52,cup1::URA3;Thiele,D.J.et al.Science231(1986),854-856を参照のこと) を、CUP1座の約3 つのコピーを担持する株TR1456(MATa leu2-3,212,ura3D5 kex1 prb1 prc1) と接合させる。遺伝子型cup1::URA3/CUP1 の2 倍体のヘテロ接合細胞を、この接合体から単離する。この2 倍体から生じる4 倍体を、標準的な遺伝子技術[Methods in Yeast genetics 1986(Sherman F.,Fink G.R.,Hicks J.B.,eds.)Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.]に従って分析される。それぞれの4 倍体の4 つの胞子の子孫を、0 μM 、250 μM 、500 μM または1mM の硫酸銅を補ったYPD 寒天プレート(2回蒸留した水1 リッター当たり、10g の酵母エキス、20g のペプトン、20g のグルコース及び25g の寒天) 上での増殖能力についてテストする。
【０１１５】
　破壊されたcup1::URA3遺伝子を受け継いでいる胞子が、銅寒天上で僅かに増殖する子孫を生じさせるのに対し、無傷のCUP1遺伝子を受け継いでいる胞子は、銅寒天上で活発に増殖する子孫を生じさせる。幾つかの完全な四分子の2 つの銅感受性胞子の子孫を、株TR1456とのそれらの接合能力についてテストする。適切な接合型の胞子の子孫を、TR1456と接合し、そして遺伝子型cup1::URA3/CUP1 の2 倍体ヘテロ接合細胞を、この接合体から単離する。上記2 倍体細胞から生じた四分子を分析し、そしてその胞子を、前記のように硫酸銅の感受性についてテストする。
【０１１６】
　約50の完全四分子から得られた銅感受性コロニーを、SD寒天( 水1 リッター当たり、アミノ酸を含まない6.7gのBacto 酵母ナイトロジェンベース、20g のグルコース及び25g の寒天) 上、並びに200Mのロイシンを補ったSD寒天上での増殖についてテストする。このSD寒天上で増殖しないが、200Mのロイシンを補ったSD寒天上では増殖するコロニーは、遺伝子型cup1::URA3,HIS3,TRP1,leu2-3,212 をもち、そしてさらなる研究のために選択される。
【０１１７】
　例 15:プロテアーゼyscY及びプロテアーゼysc アルファの追加的欠損に関する確認cup1::URA3突然変異体の分類並びに突然変異体の形質転換
　例 14 の下で開示されたように得られたサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)cup1::URA3突然変異体を、KEX1及びPRC1遺伝子によりコードされるプロテアーゼの欠損に関して、さらに分類する。このKEX1遺伝子内に欠損のあるコロニーを、それらのa-因子分泌能力の減少に基づいて同定する。野生型KEX1遺伝子を担持するコロニーとKEX1遺伝子において突然変異誘発されたコロニーとの間を区別するために使用される手順の詳細な説明については、欧州特許出願番号341215、文書中の例 1として見いだすことができる。
【０１１８】
　上記PRC1遺伝子内欠損コロニーを、1 遺伝子の生産物、すなわちプロテアーゼyscYの蛋白分解活性を測定する生化学的なテストにより同定する。このテストは、EP341215に記載されている。遺伝子型cup1::URA3 kex1 prc1 leu2-3,212 の単一コロニーを拾い上げ、そしてサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)HT462/TH3 と称する。株HT462/TH3 の細胞を、それぞれ、プラスミドpDP34/GAPFL-YHIR、又はプラスミドpPFY56、又はプラスミドpPFY58、又はプラスミドpPFY59R のいずれかにより形質転換する。形質転換のために使用される方法は、EP341215に開示されている。プラスミドpPFY56、又はプラスミドpPFY58、又はプラスミドpPFY59R 、又はプラスミドpDP34/GAPFL-YHIRのいずれかを含む単一形質転換酵母コロニーを拾い上げる。
【０１１９】
　それぞれのタイプの1 つの形質転換コロニーをさらなる研究のために選び、そして、それぞれを、
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TH3/pPFY56 、
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TH3/pPFY58 、
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TH3/pPFY59R、及び
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TH3/pDP34/GAPFL-YHIR
と称する。
【０１２０】
　例 16:　実験室規模での形質転換株TH3 の発酵
　サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TH3/pDP34/GAPFL-YHIR 、又はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TH3/pPFY56 、又はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TH3/pPFY58 の細胞を、例 7に記載したように、20mlの合成培地の2 つの引き続きの前培養において、それぞれ増殖させる。主培養を、例 7に開示した複合培地上で行う。約2 x 106 細胞/ mlにより主培養を接種し、そして28℃で66時間、そして180r.p.m. でインキュベートする。主培養の接種の直後、下記濃度での無菌硫酸銅を主培養液に添加する。その濃度は0 μM 、5 μM 、10μM 、25μM 、50μM 、100 μM 、500 μM である。発酵終了時、培養液の一部を取り出し、細胞を濾過により取り出し、そして培養上澄液をHPLCによりデスルファトヒルジンについて分析する。結果を以下の表 6に示す。
【０１２１】
【表６】
2004000288.tif 000007
【０１２２】
　CUP1遺伝子の染色体性コピーが欠損している宿主細胞、例えば、TH3 においては、CUP1-YHir 発現カセットに加えてACE1プロモーター下のACE1遺伝子のコピーを含むプラスミドが導入されるとき、ヒルジンの最大生産量を得る。
【０１２３】
　プロモーター誘導のための硫酸銅の最適濃度は、3 つまたはそれより多くのCUP1座のコピーを含む株を使用したときよりも、はるかに低い。
【０１２４】
　例 17: 50L規模でのデスルファトヒルジン変異体HV1 の生産
　形質転換株サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1456/pPFY56または株サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1456/pDP34/GAPFL-YHIRの日常細胞貯蔵物を、50L 規模でのデスルファトヒルジンの生産のための接種源として使用する。
【０１２５】
　日常細胞貯蔵物のアンプルを、液体窒素コンテナ内のベーパー相内に保存する。1 つのアンプルの含有物は、振とうフラスコ培養の接種のために使用され、この振とうフラスコは、
　　　　酵母ナイトロジェンベース　　　　　　　 8.4
　　　　L-アスパラギン1 水塩　　　　　　　　　11.4
　　　　L-ヒスチジン　　　　　　　　　　　　　 1.0
　　　　L-ロイシン　　　　　　　　　　　　　　 0.1
　　　　D-グルコース1 水塩　　　　　　　　　　20.0
(g/L) から成る選択培地を含んで成る。
【０１２６】
　上記500mL フラスコは、100mL の培地を含み、そして28℃で48時間、orbital 振とう機上で、180 回転/ 分の振とう速度にてインキュベートされる。
【０１２７】
　第 2の振とうフラスコ前培養液は、4 つのバッフルをもつ2Lフラスコ内に含まれる600mL の同じ培地を含んで成る。第一予培養液からの接種レベルは、5%(30mL)であり、そしてこのフラスコを、28℃で48時間、orbital 振とう機上で、120 回転/ 分の振とう速度にてインキュベートする。
【０１２８】
　第3 の前培養液を、4 つのバッフル及び直径115mm のシングルディスクタービン攪拌翼を備えた50L のステンレス鋼バイオリアクター内で発酵する。前記培地を、本培養のためにも使用し、出発液量は、30L である。600mL の培養液を含むシングルの2Lフラスコを、50L のバイオリアクターに接種するために使用する(2.5%)。この発酵を、28℃の温度で48時間継続する。この攪拌速度は、600 回転/ 分、通気速度は、0.5vvmであり、そしてリアクターを、0.3barの加圧を伴って操作する。
【０１２９】
　供給バッチ工程のために追加的に装備された、同様の50L バイオリアクターを、デスルファトヒルジンの生産段階のために使用する。
【０１３０】
　　　　　肉ペプトン(Merck) 　　　　　　　　6.0 
　　　　　酵母エキス　　　　　　　　　　　 37.5 
　　　　　硫酸アンモニウム　　　　　　　　　6.0 
　　　　　硫酸マグネシウム7 水塩　　　　　　1.0 
　　　　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　0.1 
　　　　　2 水素リン酸カリウム　　　　　　　4.0 
(g/L) から成る培地を本段階で使用する。
【０１３１】
　発酵の間に添加されるグルコース1 水塩の溶液を補うために、24L に減量される。第3 前培養段階からの接種レベルは、2.5%である。この発酵を、28℃の温度で78時間継続し、この攪拌速度は、900 回転/ 分に設定する。加圧は、初期に3.3barに設定し、そして48時間後、1.0barまで増加する。初期のエアー流量は、0.25vvm であるが、これを、9 時間後0.5vvmに、24時間後0.75vvm に増加し、そして終盤にはさらに、48時間後1.0vvmに増加する。発酵の経過の間の加圧及び通気の増加を、適当な酸素供給を確保し、そして20% の空気の飽和度よりも上の溶存酸素分圧を維持するために行う。
【０１３２】
　接種に引き続いて、500mL の脱イオン水に溶解した10g の硫酸銅5 水塩を、CUP1プロモーターの制御下にあるデスルファトヒルジンの発現を開始するために培養液に添加する。
【０１３３】
　pH値は、発酵の前半部分の間、水酸化アンモニウムの自動供給により維持されるところの5.0 の値になる。増殖している酵母細胞によるエタノールの過剰生産を回避するために、濃グルコース1 水塩溶液(70%) を、60mL/ 時間の一定初期速度で供給する。18時間後、5mL/時間から、発酵の終わりに360mL/時間の最終値になるような率を伴い、供給速度を線型に増加する。この炭素源の限定供給( 供給- バッチ技術) は、単純なバッチ培養により可能であるよりも、はるかに高い最終バイオマス濃度及びデスルファトヒルジン濃度を支持する。
【０１３４】
　シリコンベースの消泡剤の少量添加を、必要な時に泡を調節するために使用する。バイオリアクターからの出口ガスの一部を、酸素消費量及び二酸化炭素発生速度についての情報を提供するために、オンライン分析する。上記溶存酸素分圧も、滅菌適性Clark type電極を使用してオンラン分析する。
【０１３５】
　6 時間毎の間隔で、サンプルを上記発酵物から取り出し、そして吸光度(OD)について測定し、そしてグルコース、エタノール、リン酸塩及びマグネシウムについて分析する。デスルファトヒルジン濃度を、HPLCにより観察する。発酵の終点に、分泌デスルファトヒルジンを、培養上澄み液から回収する。サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1456/pPFY56 の発酵濃度を、銅添加を伴わない、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1456/pDP34/GAPFL-YHIR の同一発酵と比較する。結果を表 7に示す。
【０１３６】
【表７】
2004000288.tif 000008
【０１３７】
　上記CUP1システムにより、デスルファトヒルジンの最終濃度だけでなく、デスルファトヒルジンの比生産性を、構成的なGAPFL-YHIRシステムと比較して、かなり改善する。
【０１３８】
　例 18: 50L規模で生産されたデスルファトヒルジン変異体HV1 の単離及び精製
　酵母株Tr1456/pPFY56 を用いた50L 発酵( 例 17 を参照のこと) の培養液からデスルファトヒルジンを単離する。逆相高速液体クロマトグラフィー及び分析的アニオン交換クロマトグラフィーによる精製をモニタリングするイン- プロセスコントロールが実施される。得られたデータを、酵母株Tr1456/pDP34-GAPFL-YHir を用いた50L 発酵の結果物と比較する。
【０１３９】
　本発酵の終了後、pHを約3 に調整し、そして培養液を疎水性ポリマー樹脂にかける。吸収されたデスルファトヒルジンをもつこの樹脂を1MのNaCl溶液で洗浄し、そして酢酸アンモニウム緩衝液で溶出する。蛋白活性を含む分画において、pH(pH3) 及び誘導性を調整する。次ぎにデスルファトヒルジンを、カチオン交換クロマトグラフィー(Macro-Prep S,Biorad) を使用して、続く限外濾過により、さらに精製する。高分子量化合物及び着色不純物を取り除くために、ゲル濾過を使用する。pHを5 に調整した後、デスルファトヒルジン含有分画を、アニオン交換樹脂(Macro-Prep Q,Biorad) 上でクロマトグラフィーにかける。得られたデスルファトヒルジン溶液を、逆相HPLC及びアニオン交換クロマトグラフィーによる精製について分析する。プラズマ発光分光法(plasma emission spectroscopy)を使用して銅の含有量を測定する。
【０１４０】
　実験データは、株Tr1456/pPFY56 を用いたデスルファトヒルジンの生産が、あたかも株Tr1456/pDP34-GAPFL-YHir を用いて生産されたような、HPLC及びFPLCに関して少なくとも同質のデスルファトヒルジンの品質を導くことを示している。銅誘導発酵において得られる、より高い濃度により、その下流のプロセシングのための、デスルファトヒルジンの増加された収率を得る。発酵培地への銅の添加は、その副産物のパターンにおいて有意な変更を生じさせない。本データは、銅が、ppm より低いレベルまで容易に取り除かれる得ることを示している。
【０１４１】
　例 19: pFBY23 の構築
　CA緩衝液(20mM のトリス( ヒドロキシメチル) アミノメタン;7mMの MgCl 2 ;5mMのジチオトレイトール;100mMのKCl;HCl でpH 7.5に) 中でのFspIにより、2 μg のpFBY2 を完全に解裂する。制限エンドヌクレアーゼを、65℃で10分間の加熱により不活性化する。水を添加することによりその容積を倍にし、そのDNA フラグメントを、0.05mMのそれぞれのdATP、dCTP、dGTP及びdTTPの存在下、37℃で30分間、T4ポリメラーゼの1 ユニットにより、平滑末端とする。この酵素を、65℃で10分間の加熱により不活性化する。エタノール沈殿の後、このDNA を、HindIII 及びEcoRI により再び切断する。
【０１４２】
　これらのフラグメントを、TAE 緩衝液(40mM のトリス( ヒドロキシメチル) アミノメタン;2mMのエチレンジアミンテトラ酢酸(2ナトリウム塩);酢酸でpH 7.6に) 中の2%LGT ゲル( 低ゲル化温度のアガロース) 上で分離する。170 塩基対及び523 塩基対のフラグメントを切り出し、そしてDNA をElutipD 商標登録クロマトグラフィーにより精製する。
【０１４３】
　2 μg のpTZ18Rを、CA緩衝液中でEcoRI 及びHindIII により完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。2.8k塩基対のバンドを切り出し、そのDNA をElutipD 商標登録クロマトグラフィーにより精製する。
【０１４４】
　調製されたフラグメントのそれぞれの約20ngを、室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼにより、10pMの配列GGGATCCCのリン酸化されていないBamHI リンカー及び1mM のATP 及び連結緩衝液と一緒に連結する。
【０１４５】
　この連結混合物を、40μl のコンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し、そしてアンピシリン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート( 水1 リッター当たり16g のトリプトン;10gの酵母エキス;10gのNaCl) 上に置く。37℃で16時間のインキュベーション後、白いコロニーを拾い上げ、そしてその正しい挿入物の存在を確認するためのEcoRI HindIII の二重処理、及びその前のFspI部位内のBamHI リンカーを示すためのHindIII/BamHI の二重処理を使用して、ミニスクリーニング(miniscreened)する。
【０１４６】
　例 20:　pFBY24の構築
　2 μg のpFBY23を、CA緩衝液中でHindIII 及びEcoRI により完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。701 塩基対のバンドを切り出し、そのDNA をElutipD 商標登録クロマトグラフィーにより精製する。
【０１４７】
　2 μg のpFBY2 を、CA緩衝液中でHindIII 及びPstIにより完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。3.8k塩基対のフラグメントを切り出し、そのDNA をElutipD 商標登録クロマトグラフィーにより精製する。
【０１４８】
　2 μg のpFBY2 を、CA緩衝液中でPstI及びXbalI により完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。1.95k 塩基対のフラグメントを切り出し、そのDNA をElutipD 商標登録クロマトグラフィーにより精製する。
【０１４９】
　2 μg のpFBY2 を、CA緩衝液中でXbalI 及びEcoRI により完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。2.9k塩基対のフラグメントを切り出し、そのDNA をElutipD 商標登録クロマトグラフィーにより精製する。
【０１５０】
　1mM のATP 及び連結緩衝液の存在下、室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼにより、用意したフラグメントのそれぞれの約20ngを共に連結する。
【０１５１】
　この連結混合物を、40μl のコンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し、そしてアンピシリン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート上に置く。37℃で16時間のインキュベーション後、白いコロニーを拾い上げ、そしてその正しい挿入物の存在を確認するためのEcoRI HindIII 及びPstI XbalIの二重処理、並びに新規のBamHI 部位の存在を示すためのBamHI を使用して、ミニスクリーニング(miniscreened)する。
【０１５２】
　pFBY24は、プラスミドpTZ18R及び直接的に繰替えされたFRT 部位により分割された2 μプラスミドの完全な配列をもつpFBY2 と同一である。但し、FLP 遺伝子の3'末端のFspI部位にBamHI を挿入にてある。
【０１５３】
　例 21: pFBY74 の構築
　2 μg のpFBY29を、CA緩衝液中でbamHI により完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。2.0k塩基対のバンドを切り出し、そのDNA をElutipD 商標登録クロマトグラフィーにより精製する。
【０１５４】
　2 μg のpFBY24を、CA緩衝液中でbamHI により完全に解裂する。ベクターの自己連結を防止するために、65℃で30分間、BAP 緩衝液(50mM のトリス( ヒドロキシメチル) アミノメタン;50mM のNaCl;HClでpH8.0 に) 中の500 ユニットのBAP により、5'のリン酸塩基を取り除く。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。9.3k塩基対のバンドを切り出し、そのDNA をElutipD 商標登録クロマトグラフィーにより精製する。
【０１５５】
　1mM のATP 及び連結緩衝液の存在下、室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼにより、用意したフラグメントのそれぞれの約20ngを共に連結する。
【０１５６】
　この連結混合物を、40μl のコンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し、そしてアンピシリン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート上に置く。37℃で16時間のインキュベーション後、白いコロニーを拾い上げ、そしてその正しい挿入物の存在及び方向を確認するためのBamHI 並びにSalI XbalIの二重処理を使用して、ミニスクリーニング(miniscreened)する。
【０１５７】
　pFBY74は、酵母内でバクテリアの配列を失った2 ミクロンのプラスミドを含んでいる対称なLEU2である。
【０１５８】
　例 22:　プラスミドpMK5x1及びpMK5x2の構築: 酵母内でバクテリアの配列を失い、そしてCUP1p-ヒルジン発現カセットを含む2 つの対称な2 ミクロン・プラスミド
　2 μg のプラスミドpFBY4 を、EcoRI により解裂する。得られたDNA-フラグメントを分析用0.8%アガロースゲル上で分離し、切り出し、そしてElutipD 商標登録クロマトグラフィー(Schleicher und Schuell,Dassel,Germany)により精製する。このフラグメントを、0.05M のdATP、dCTP、dGTP及びdTTPのそれぞれの存在下、37℃で30分間、引き続き、1 ユニットのT4ポリメラーゼにより平滑末端とする。このポリメラーゼを、65℃で10分間、加熱により不活性とする。
【０１５９】
　室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼにより、0.4 ピコモルの配列GGTCGACCのリン酸化されていないSalIリンカー及び1mM のATP と一緒に、約30ngのフラグメントを連結する。この連結混合物を、40μl のコンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し(Hanahan,D.:J.Mol.Biol.166(1983),557) 、そしてその細胞を、アンピシリンを添加したLB培地上にプレーティングする。アンピシリン耐性コロニーを拾い上げ、そしてその前のEcoRI 部位内にSalIリンカーを示すためのSalIを用いてのそれらのプラスミドDNA の切断による分析を行う。得られたプラスミドを、pMK2と呼ぶ。
【０１６０】
　2 μg のpMK2をBamHI により切断する。その5'のリン酸塩基を、65℃で30分間、BAP-緩衝液中のBAP(ウシ・アルカリ性ホスファターゼ) の500 ユニットにより除去する。このフラグメントを分析用0.8%アガロースゲル上で分離し、切り出し、そしてElutipD 商標登録クロマトグラフィー(Schleicher und Schuell,Dassel,Germany)により精製する。このフラグメントを、0.05M のdATP、dCTP、dGTP及びdTTPのそれぞれの存在下、37℃で30分間、引き続き、1 ユニットのT4ポリメラーゼにより平滑末端とする。このポリメラーゼを、65℃で10分間、加熱のより不活性とする。
【０１６１】
　2 μg のpPFY53( 例 1を参照のこと) をSalIにより解裂する。CUP1p-ヒルジン発現カセットを含む1.3kb のフラグメントを、前記のように、分析用0.8%アガロースゲル上で分離し、精製し、そしてT4ポリメラーゼにより平滑末端とする。この連結混合物を、コンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し(Hanahan,D.:J.Mol.Biol.166(1983),557) 、そしてその細胞を、アンピシリンを添加したLB培地上にプレーティングする。アンピシリン耐性コロニーを拾い上げ、そして正しい挿入物の存在を確認するため、及び方向を決定するために、XbaIを用いて分析する。生成されたプラスミドを、pMK3/1及びpMK3/2と呼ぶ。pMK3/1は、URA3遺伝子と比べて同じ方向にあるCUP1p-ヒルジン発現カセットを含むが、pMK3/2は、これと逆方向にあるそれぞれの遺伝子を含む。
【０１６２】
　2 μg のpFBY74をSnaBI により切断する。前記のように、BAP により、5'のリン酸塩基を取り除き、そして得られたDNA-フラグメントを0.8%アガロースゲル及びElutipD 商標登録クロマトグラフィーを介して精製する。2 μg のpMK3/2をSalIにより切断する。CUP1p-ヒルジン発現カセット及びURA3を含む2.6kb のフラグメントを、前記のように、ゲルで精製し、そして平滑末端とする。
【０１６３】
　切断されたpFBY74及びpMK3/2フラグメントのそれぞれ約20ngを共に連結し、そして前記のように、コンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞に形質転換する。正しい挿入物を確認するため、及び方向を決定するために、SalI及びNcoIによりそれらのプラスミドDNA を切断して、アンピシリン耐性コロニーを分析する。2 つのプラスミドが得られ、pMK5x1及びpMK5x2と呼ぶ。これらの2 つのプラスミドの違いは、そのLEU2遺伝子と比べて、前者においては、CUP1p-ヒルジン発現カセットが逆であるのに、後者においては、同じ方向をもつということである。
【０１６４】
　例 23:　株TR1456の接合型のスイッチング
　2 倍体の酵母株の世代は、それぞれ、α及び aの接合型の2 つの1 倍体株の接合を介して生まれる。1 倍体株TR1456の相同遺伝子の2 倍体変異体、接合型 a( 例 5を参照のこと) 、を得るためにTr1456の反対の接合型を、接合型のスイッチングを介して操作しなければならない。この方法の背景及び原理は、herskowitz and jensen(1991),Methods in Enzymology,Vol.194,p.132-146 に概説されている。
【０１６５】
　GAL10 プロモーターの制御下のHOエンドヌクレアーゼ遺伝子、URA3マーカー及びCEN4ファンクションを含むプラスミドpGAL-HO により、株TR1456を形質転換する(Herskowitz and Jensen(1991),Methods in Enzymology,Vol.194,p.132-146) 。ロイシンを補いそしてウラシルを欠いた酵母最小培地上での形質転換及び選択を、例 5に記載したように実施する。単一の形質転換酵母クローンを単離し、そして、
　　　　Difco 酵母ナイトロジェンベース
　　　　w/o アミノ酸　　　　　　　　　　　　 8.4
　　　　L-アスパラギン　　　　　　　　　　　10
　　　　L-ヒスチジン　　　　　　　　　　　　 1
　　　　L-ロイシン　　　　　　　　　　　　　 0.1
　　　　グルコース　　　　　　　　　　　　　20
(g/l) から成る20mlの合成培地中で1 つのクローンを増殖させる。
【０１６６】
　30℃で一夜、そして180rpmで前培養を行う。引き続き培養液を、前記の培地であるが0.25% のグルコースしか含まないものの中で、20倍希釈する。この培養液を、再び30℃及び180rpmでインキュベートし、そしてグルコース消費量を、グルコース・テスター・スティク(Diabur-Test 500商標登録,Boehringer Mannheim) を使用してモニターする。グルコースを使い尽くと直ちに、GAL10 プロモーターを誘導するために、2%の最終濃度までガラクトースをフラスコに添加する。30℃及び180rpmで7 時間インキュベートした後、培養液1ml を取り出し、そしてその細胞を洗浄し、例 7に記載した複合培地の10mlに再懸濁し、さらに30℃及び180rpmで4 時間インキュベートする。
【０１６７】
　次にその細胞のサンプルを取り出し、水で希釈し、そして、以下の複合培地(g/l):
　　　　Bacto 酵母エキス　　　　　　　　　　20
　　　　Bacto ペプトン　　　　　　　　　　　10
　　　　Bacto 寒天　　　　　　　　　　　　　20
　　　　グルコース　　　　　　　　　　　　　20
上に、プレート当たり約200 細胞の濃度でプレーティングする。
【０１６８】
　コロニーが約2mm の大きさになるまで、30℃で2 日間、上記プレートをインキュベートする。
【０１６９】
　次に、このコロニーを、接合型形成のための標準的な検定('ハロー検定')により、細胞の型(　a, αまたは a/ α) についてテストする。使用した手順は、Sprague(1991),Methods in Enzymology,Vol.194,p.77-93 により、広範囲にわたって記載されている。
【０１７０】
　α- 接合型を示す8 つのコロニーを拾い上げ、そしてそれぞれを、以下の複合培地(g/l):
　　　　Bacto ペプトン　　　　　　　　　　　 20 
　　　　Bacto 酵母エキス　　　　　　　　　　 10 
　　　　グルコース　　　　　　　　　　　　　 20 
の5ml に接種する。
【０１７１】
　 30 ℃で16時間、そして180rpmで細胞を増殖させる。細胞のサンプルを取り出し、水で希釈し、そして前記のように、複合培地上に、プレート当たり約200 細胞の濃度でプレーティングする。コロニーが約2mm の大きさになるまで、30℃で2 日間、上記プレートをインキュベートする。これらのコロニーを、ハロ検定を使用して、α- 接合型についてテストする。付随して、例 5に記載したように、ロイシンを補いそしてウラシルを欠いた最小培地上でこのコロニーを複製する。pGAL-HO プラスミドを欠いているコロニーは、この培地上では増殖できない、なぜならば、それらは、URA3マーカーを欠いているからである。
【０１７２】
　繰り返しα- 接合型を示し、そして上記のpGAL-HO プラスミドを欠いている1 つのコロニーを、拾い上げ、複合培地上に再び塗布(restreaked)する。この株は、同一遺伝子の、TR1456の反対のα- 接合型を表し、そしてGPY110と呼ばれる。
【０１７３】
　例 24:　株TR1456 a及びGPY11 αを使用しての2 倍体の形成
　株TR1456及び株GPY11 の斑点(patch) を、
　　　　Bacto ペプトン　　　　　　　　　　　20
　　　　Bacto 酵母エキス　　　　　　　　　　10
　　　　グルコース　　　　　　　　　　　　　20
　　　　Bacto 寒天　　　　　　　　　　　　　10
(g/l) から成るYPD プレート上で、爪楊枝により注意深く混合する。
【０１７４】
　上記のプレートを、細胞が接合することを可能にするために、室温でインキュベートする。約12時間後、この接合混合物の接種物を、水で希釈し、そしてその一部分を、一本線としてYPD プレートに塗布する。Leitz 顕微鏡( 倍率250 倍) と組み合わせたCIT Alcatel Micromanipulatorを使用して、このプレートを、マイクロマニピュレーションに供する。接合体は、それらの特徴的な形により、顕微鏡により簡単に検出できる。10〜20の潜在的な接合体を、YPD プレート上でその接合混合物から分離する。
【０１７５】
　次に、このプレートを、接合体がコロニーを形成するまで、2 〜3 日間、室温でインキュベートする。この接合体の2 倍体の状態を、前記のような接合フェロモンの生産に関する' ハロ検定' を行うことにより確認する。2 倍体の細胞は、α- 因子または a- 因子のどちらも分泌しない。
【０１７６】
　1 つの確認された2 倍体のコロニーを選び、そしてGPY18 と呼ぶ。これは、株TR1456の同一遺伝子の2 倍体の変異体である。
【０１７７】
　例 25:　振とうフラスコ内の複合培地上で増殖する、プラスミドpPFY56またはpMK5x2で形質転換された株TR1456及びGPY18 によるデスルファトヒルジンの生産
　例 5に記載されたように、株TR1456及びGPY18 の細胞を、それぞれ、プラスミドpPFY56( 例 1) 及びpMK5x2により形質転換する。
【０１７８】
　株TR1456/pPFY56 、TR1456/pMK5x2 、GPY18/pPFY56及びGPY18/pMK5x2を、それぞれ、28℃で72時間そして250rpmで、前培養液(10ml;例 23 に組成を記載した) 中で増殖させる。主培養の培地(50ml)を例 7に記載した。但し、硫酸銅を、1mM の濃度まで添加する。主培養液を、0.1 の吸光度600 での予培養液からの細胞により接種する。この培養を、28℃で72時間、そして250rpmで行う。発酵の後、細胞を、遠心分離により取り出し、そして上澄み液中のデスルファトヒルジン量を、EP-A-340 170に開示したようにHPLCにより測定する。結果を表 8に要約する。
【０１７９】
【表８】
2004000288.tif 000009
【０１８０】
　上記実験の条件下、2 倍体の株GPY18 は、その1 倍体の親株TR1456に比べて、より高いヒルジン濃度を示した。プラスミドpMK5x2による形質転換は、プラスミドpPFY56に比べて、その1 倍体またはその2 倍体のいずれにおいても、より高いヒルジン濃度を導く。
微生物の寄託
　以下の微生物株を、the Deuiche Sammlung von Mikroorganismen(DSM),Mascheroder Weg 1b,D-3300 Braunschweigに寄託した( その寄託番号及び寄託日を以下に示す) 。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)H449
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　DSM 4413　 1988 年 2月18日
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)HT462/TH3 
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　DSM 7190　 1992 年 7月22日
大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY2　　　　　　　DSM 6271　 1990 年12月14日
大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY4　　　　　　　DSM 6272　 1990 年12月14日
大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY5　　　　　　　DSM 6273　 1990 年12月14日
大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY29 　　　　　　DSM 6275　 1990 年12月14日
大腸菌(E.coli) JM109/pDP34　　　　　　　　DSM 4473　 1988 年 3月14日
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】図 1は、プラスミドpPFY56の図解説明図である。
【図２】図 2は、プラスミドpPFY58の図解説明図である。
【図３】図 3は、プラスミドpPFY59R の図解説明図である。
【図４】図 4は、プラスミドpPFY79の図解説明図である。
【符号の説明】
【０１８２】
term…PHO5転写ターミネーター
CUP1p 、GAPFLp及びACE1p 中のp …プロモーター
【図１】
2004000288.tif 000010
【図２】
2004000288.tif 000011
【図３】
2004000288.tif 000012
【図４】
2004000288.tif 000013
【配列表】
2004000288000001.app