(57)【要約】【課題】酵素活性を持つタンパク質を効率的に作製する手段を提供する。【解決手段】以下の工程を含む酵素活性を持つペプチドの製造方法。（１）目的とする酵素の活性部位を認識する抗体又は認識ペプチドの抗原結合部位を認識するペプチド群を作製する工程（２）工程（１）で作製したペプチド群の中から目的とする酵素の活性を持つペプチドを選択する工程【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む酵素活性を持つペプチドの製造方法。
（１）目的とする酵素の活性部位を認識する抗体又は認識ペプチドの抗原結合部位を認識するペプチド群を作製する工程
（２）工程（１）で作製したペプチド群の中から目的とする酵素の活性を持つペプチドを選択する工程
【請求項２】
ペプチド群を作製する工程が、候補ペプチド群を、目的とする酵素の活性部位を認識する抗体又は認識ペプチドと接触させ、これと結合するペプチド群を選択し、次いで、この選択されたペプチド群を、目的とする酵素と接触させ、これにより前記抗体又は認識ペプチドから解離するペプチド群を選択する工程である請求項１記載の酵素活性を持つペプチドの製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法によって製造された酵素活性を持つペプチド。
【請求項４】
請求項３記載のペプチドを一部として含み、酵素活性を持つタンパク質。
【請求項５】
以下の工程を含む酵素活性を持つペプチドのスクリーニング方法。
（１）候補ペプチド群を、目的とする酵素の活性部位を認識するする抗体又は認識ペプチドと接触させ、これと結合するペプチド群を選択する工程
（２）工程（１）で選択されたペプチド群を、目的とする酵素と接触させ、これにより前記抗体又は認識ペプチドから解離するペプチド群を選択する工程
（３）工程（２）で選択されたペプチド群の中から目的とする酵素の活性を持つペプチドを選択する工程
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチド。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつオキシダーゼ活性を持つペプチド
【請求項７】
請求項６記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素活性を持つペプチドの製造方法、及びその方法によって製造されたペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素活性を持ったタンパク質の創出にはアブザイムが知られている。また、既にある酵素の一部配列を改変することにより酵素活性の増強、特異性の改変等も知られている。前述したアブザイムは遷移状態にある基質のアナログに対し抗体を作製し、その中から酵素活性を持ったものをスクリーニングすることにより得られる。しかしながら、現在まで活性の高いものは得られていない。また、そのほとんどがエステラ―ゼであり、その他のものに関しては報告が少ない。
【０００３】
また、酵素に対するモノクローナル抗体を作製し、その抗体に対するアンチイデオタイプ抗体を作製した場合、アンチイデオタイプ抗体の中には、もとの酵素と類似した構造を持つものがある。このようなアンチイデオタイプ抗体について、酵素活性を指標としてスクリーニングを行うと、微弱ながら酵素活性を持つ抗体が得られることがある。しかしながら、モノクローナル抗体の作製には２〜３ヶ月程度の期間を要し、また、得られたモノクローナル抗体の中から抗原結合部位を認識するものを単離しなくてはならないため、酵素活性を持つ抗体を得るためには、多大な手間と時間を要する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述したような技術的背景の下になされたものであり、酵素活性を持つタンパク質を効率的に作製する手段を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、アンチイデオタイプ抗体を利用して酵素活性を持つ抗体を作製する方法において、モノクローナル抗体の代わりにランダムペプチドを用いることにより、以下のような利点が得られることを見出した。
１）ランダムペプチドライブラリーから目的とするペプチドクローンの選択に要する期間は２週間程度であるため、モノクローナル抗体を用いる場合に比べ、作製時間を短縮できる。
２）選択時に競合的、特異的選択を行うことにより、結合力を有したもの選択するのみでなく、目的とするもの（例：抗原結合部位を認識するペプチド等）を容易に得ることができる。
３）遷移状態物質アナログを使う場合に比べ、目的クローンを得られるセレンディピティーが高い。
【０００６】
本発明は、以上のような知見に基づき完成されたものである。
【０００７】
即ち、本発明の第一は、以下の工程を含む酵素活性を持つペプチドの製造方法である。
（１）目的とする酵素の活性部位を認識する抗体又は認識ペプチドの抗原結合部位を認識するペプチド群を作製する工程
（２）工程（１）で作製したペプチド群の中から目的とする酵素の活性を持つペプチドを選択する工程
【０００８】
本発明の第二は、上記方法によって製造された酵素活性を持つペプチドである。
【０００９】
本発明の第三は、上記ペプチド（本発明の第二）を一部として含み、酵素活性を持つタンパク質である。
【００１０】
本発明の第四は、以下の工程を含む酵素活性を持つペプチドのスクリーニング方法である。
（１）候補ペプチド群を、目的とする酵素の活性部位を認識するする抗体又は認識ペプチドと接触させ、これと結合するペプチド群を選択する工程
（２）工程（１）で選択されたペプチド群を、目的とする酵素と接触させ、これにより前記抗体又は認識ペプチドから解離するペプチド群を選択する工程
（３）工程（２）で選択されたペプチド群の中から目的とする酵素の活性を持つペプチドを選択する工程
【００１１】
本発明の第五は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドである。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつオキシダーゼ活性を持つペプチド
【００１２】
本発明の第六は、上記ペプチド（本発明の第五）をコードするポリヌクレオチドである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）ペプチドの製造方法
本発明の酵素活性を持つペプチドの製造方法は、以下の（１）及び（２）の工程を含むものである。
【００１４】
工程（１）：この工程では、目的とする酵素の活性部位を認識する抗体又は認識ペプチドの抗原結合部位を認識するペプチド群を作製する。
【００１５】
酵素は、活性の測定方法が確立されたものが好ましく、呈色反応を伴う活性測定法が確立されたものが特に好ましい。使用可能な酵素の具体例としては、酸化酵素、エステラーゼ、リパーゼ、転移酵素、浸潤酵素、リガーゼ、加水分解酵素等々を例示でき、これらの中ではオキシダーゼ又はペルオキシダーゼが好適である。
【００１６】
上記ペプチド群の作製は、例えば、候補ペプチド群を、目的とする酵素の活性部位を認識する抗体又は認識ペプチドと接触させ、これと結合するペプチド群を選択し、次いで、この選択されたペプチド群を、目的とする酵素と接触させ、これにより前記抗体又は認識ペプチドから解離するペプチド群を選択することにより行うことができる。
【００１７】
候補となるペプチド群は、特定の規則に従って合成されたものであってもよく、また、ランダムに合成されたものであってもよい。ペプチド群に含まれるペプチドの種類は特に限定されないが、１０１０以上が好ましい。各ペプチドは、ファージディスプレー法などに従い、ファージや酵母などのタンパク質（例えば、ファージのＰＩＩＩやＰＶＩＩＩなど）との融合タンパク質として提示された状態にあることが好ましい。ペプチドの長さは特に限定されないが、７〜１２残基程度のペプチドが好ましい。また、ペプチドは直鎖状、環状のいずれもでもよい。
【００１８】
活性部位を認識する抗体は、通常の方法でモノクローナル抗体を作製し、その中から活性部位を認識するものを選択することにより得られる。酵素の活性部位の構造がわかっている場合には、モノクローナル抗体の代わりにペプチド（認識ペプチド）を用いてもよい。また、市販されている抗体や既に作製、解析されている抗体などを使ってもよい。
【００１９】
具体的な作製方法としては、以下に示すような方法を例示できる。
【００２０】
活性部位を認識する抗体等をポリスチレン等の担体に固定し、その後、カゼイン等の溶液により抗体等の付着していない部分をブロッキングする。候補となるペプチド群を加え、１〜数時間反応させる。０．０５〜０．５％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）などで１０〜数十回程度洗浄する。その後、ブロッキングに用いた溶液より濃いカゼイン等の溶液を加え１〜数時間静置する。再びＴＰＢＳで洗浄したのち、目的とする酵素の溶液（酵素の濃度は、抗体の１０〜１００倍の分子数となるようにする）を加える。１〜数時間静置し、溶出してくるペプチドを回収する。
【００２１】
工程（２）：この工程では、工程（１）で作製したペプチド群の中から目的とする酵素の活性を持つペプチドを選択する。
【００２２】
酵素活性を持つペプチドの選択は、呈色反応などを指標として行う。また、ペプチド単独では、酵素活性が発現しない場合があるので、通常ファージのタンパク質等と融合した状態で活性を調べる。具体的な方法としては、以下に示すような方法を例示できる。
【００２３】
酵素を認識する抗体等の認識部位を認識するペプチドを提示するファージをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、このペプチドを含む融合タンパク質をゲル上に展開する。その後、この融合タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、膜を発色基質溶液に浸漬することにより、酵素活性を持ったペプチドを検出する。
【００２４】
（Ｂ）ペプチド
本発明のペプチドは、上述した本発明のペプチドの製造方法により、製造され得るペプチドであり、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すものである。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつオキシダーゼ活性を持つペプチド
【００２５】
（ｂ）のペプチドにおける欠失等されたアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常は７個以下であり、好ましくは５個以下であり、更に好ましくは２個以下である。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕　抗セルロプラスミン抗体の抗原結合部位を認識するペプチドの選択
セルロプラスミンに対するモノクローナル抗体を作製し、これらの中からセルロプラスミンのオキシダーゼ活性部位を認識するものを選択した。酵素活性部位を認識する抗体の選択は、酵素と抗体を反応させ、酵素活性の消失をみることにより行った。このようにして作製したモノクローナル抗体を抗原として、以下に示すバイオパニングを行った。
【００２７】
上記モノクローナル抗体１００μｇ／ｍｌを１００μｌポリスチレンのチューブ（ＮＵＮＣ社製）に加え、４℃で一昼夜放置し、固相化した。ＰＢＳで洗浄後５％のスキムミルク／ＰＢＳ溶液を５００μｌ加え、さらに一昼夜放置した。再度ＰＢＳで洗浄し、ランダムペプチドライブラリー１００μｌを添加した。ランダムペプチドライブラリーは、ＮＥＢ社の♯８１２０　Ｐｈ　Ｄ．１２ｋｉｔを用いた。このライブラリーでは、１２アミノ酸残基からなる約１０１２種類のペプチドがファージのコートタンパク質ＰＩＩＩと融合した状態で提示される。室温にて一時間放置した後、０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（以下「Ｔｗｅｅｎ　２０」という）含有ＰＢＳで１０回洗浄した。その後、５％のスキムミルク／ＰＢＳ溶液を５００μｌ加え、室温で１時間放置した。さらに０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳで２０回洗浄した。その後、セルロプラスミン溶液１００μｇ／ｍｌを１００μｌ添加し、室温で１時間放置した。１時間後、チューブ内の溶液を回収し、この溶出画分（４００μｌ）を添加した培地中で大腸菌ＥＲ２３５７株を培養した。３７℃で４時間培養後、培養上清（ファージ溶液）を遠心分離した。ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液にて濃縮操作を行い、得られたファージを１００μｌのＰＢＳ溶液に懸濁した。上述したランダムペプチドライブラリーの添加からＰＢＳ溶液への懸濁までの一連の操作を繰り返し行った。以上の操作で得られた溶出画分を、ファージ数が１０６−１０８になるようにＬＢ培地で希釈した後、１００倍希釈した大腸菌ＥＲ２５３７とともにソフトアガーに懸濁しＩＰＴＧ，Ｘ−ｇａｌ　プレートに播種した。
【００２８】
〔実施例２〕　抗セルロプラスミンモノクローナル抗体に親和性を示すクローンのスクリーニング
ＩＰＴＧ，Ｘ−ｇａｌ　プレートから得られたコロニー１００株を２ｍｌのＬＢ培地中で３７℃で４時間培養した。培養後、上清を遠心分離した。抗セルロプラスミンモノクローナル抗体溶液（２０μｇ／ｍｌ）を１００μｌづつ９６穴プレートに分注した後、３０℃で２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳ溶液で洗浄した後、２％スキムミルク含有ＰＢＳを３００μｌ添加し、再び０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳ溶液で洗浄した後、培養上清を１００μｌづつ添加した。３０℃で２時間静置後、再び０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０　含有ＰＢＳ溶液で洗浄した。マウス抗Ｍ１３ファージ抗体ペルオキシダーゼ標識物（ファルマシア社製）を２０００倍希釈し、１００μｌづつ分注した。陽性のクローンを確認し、培養、増幅した後ＰＥＧ／ＮａＣｌにより濃縮した。
【００２９】
〔実施例３〕　酵素活性を有するペプチドのスクリーニング
濃縮したファージにＳＤＳ−ＰＡＧＥ様のサンプルバッファーを加え、１００℃で３分煮沸した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ファージの構成成分を分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をＰＢＳで洗浄した後、発色基質溶液を加え浸漬し、室温にて静置した。発色基質溶液は、ジアミノベンジジン１０ｍｇを１０ｍｌの精製水に溶解し、これに１ｍｌの酢酸バッファー（ｐＨ　４．５）を加えた後、過酸化水素水を１２．５μｌ加えて調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に、酵素活性の検出試験（発色試験）の結果を図２にそれぞれ示す。図中の１〜５のレーンは抗セルロプラスミンモノクローナル抗体に親和性を示したクローン由来のペプチドをサンプルとしており、６〜９のレーンはセルロプラスミン以外の酵素を認識するペプチドをサンプルとしており、レーン１０はファージの宿主として用いた大腸菌の溶菌液をサンプルとしている。
【００３０】
図２に示すように、レーン５において酵素活性を示すバンド（矢印）が検出された。
【００３１】
〔実施例４〕　ペプチドのアミノ酸配列の解析
実施例３で酵素活性が確認されたクローンの培養上清中に含まれるＤＮＡを、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ　Ｍ１３システムにより精製した。得られたＤＮＡをエタノール沈殿し、配列解析の鋳型とした。ＡＢＩ社製３７００シークエンサーで配列を解析し、酵素活性が確認されたクローンの提示していたペプチドのアミノ酸配列を決定した。このペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に、また、このペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１にそれぞれ示す。
【００３２】
【発明の効果】
本発明は、酵素活性を持つペプチド及びタンパク質の創製方法として有用である。また、酵素の活性の解析、並びに酵素の特異性、活性及び耐熱性などの改良にも有用である。
【００３３】
【配列表】
2004033118.tif 000002
2004033118.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】酵素活性の検出試験の結果を示す図である。
【図１】
2004033118.tif 000004
【図２】
2004033118.tif 000005