(57)【要約】　　【課　題】　成長ホルモンの分泌を誘導する新規ペプチド系化合物を提供する。　　【解決手段】細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有し、少なくとも一つのアミノ酸が修飾アミノ酸及び／又は非アミノ酸化合物により置換されたことを特徴とするペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチドの少なくともひとつのアミノ酸が、修飾アミノ酸及び／又は非アミノ酸化合物により置換されていることを特徴とするペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
　（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は（ｂ）当該配列において少なくともアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む請求項１記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
　配列番号３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２２および２３記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する請求項２記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
　配列番号２５、２６、２９、３０、３１、３２、３４および３５記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する請求項２記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
　細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドの（ａ）構成アミノ酸が修飾されているか又はされていない、かつ（ｂ）少なくともひとつのアミノ酸が非アミノ酸化合物により置換されているか又はされていないペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
　配列番号２７、２８および３３記載のアミノ酸配列を有する請求項１又は５記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
　（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は（ｂ）当該配列において少なくともアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列を有し、かつアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む請求項５記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
　配列番号３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２２および２３記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する請求項７記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
　配列番号２５、２６、２９、３０、３１、３２、３４および３５記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する請求項７記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
　アミノ末端の１番目から４番目に至るまでのアミノ酸配列に相当する部分が、下記の式で表される請求項１又は５記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
　Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−
　　Ａ；アミノ酸、非アミノ酸化合物、又はなし、
　　Ｂ；アミノ酸、非アミノ酸化合物、又はなし、
　　（ただし、Ａ＋Ｂの分子鎖長がジペプチド相当長ある。）
　　Ｃ又はＤ；同一であっても異なっていてもよく、（ａ）修飾されたアミノ酸、（ｂ）疎水性側鎖を有するアミノ酸、又は（ｃ）塩基性側鎖を有するアミノ酸、
を表す。
【請求項１１】
　Ｃが、アミノ酸のα炭素に、（ａ）炭素数１以上のアルキレン基を介して又は介さず、エステル、エーテル、チオエーテル、アミドまたはジスルフィド結合を介して炭素数が１若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、又は（ｂ）炭素数１以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸であり、Ｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸であることを特徴とする請求項１０に記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
　配列番号２、３、９、１０、１１、１６、１７、２２、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列において、アミノ末端の１番目から４番目に至るまでのアミノ酸配列に相当する部分が請求項１０または１１に記載のペプチド系化合物であるペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１３】
　修飾されたアミノ酸がアミノ末端から３番目のアミノ酸である請求項１、２、３、５、７または８記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
　修飾されたアミノ酸におけるアミノ酸がセリン又はシステインであることを特徴とする請求項１３記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
　アミノ酸のα炭素に、（ａ）炭素数１以上のアルキレン基を介して又は介さず、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド又はカルバミド結合を介して炭素数が１若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、又は（ｂ）Ｈ又は炭素数１以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸を含有する請求項１、２、３、５、７または８記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１６】
　修飾アミノ酸が、アミノ酸のα炭素に、（ａ）炭素数１以上のアルキレン基を介して又は介さず、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、カルバミド又はチオカルバミド結合を介して炭素数が１若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、又は（ｂ）炭素数１以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入したアミノ酸である請求項１、２、４、５、６、７、９、１０または１２記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１７】
　エステル結合により修飾された修飾アミノ酸を有する請求項１、２、３、５、７または８記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１８】
　アミノ酸の側鎖の官能基がエステル結合を形成することにより修飾された修飾アミノ酸を有する請求項１、２、４、５、６、７、９、１０、１１または１２記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１９】
　アミノ酸の側鎖の水酸基に脂肪酸がエステル結合したアミノ酸を有する請求項１７記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２０】
　脂肪酸が、アミノ酸の側鎖の水酸基にエステル結合又はメルカプト基にチオエステル結合したアミノ酸を有する請求項１８記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２１】
　炭素数が２乃至３５である脂肪酸が結合したアミノ酸を有する請求項１９記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２２】
　脂肪酸が炭素数２乃至３５である請求項２０のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２３】
　炭素数が２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸が結合したアミノ酸を有する請求項２１記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２４】
　脂肪酸が炭素数２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸である請求項２２記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２５】
　結合した脂肪酸がオクタン酸（ｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である請求項２３記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２６】
　脂肪酸がオクタン酸（ｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である請求項２４記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２７】
　結合した脂肪酸がデカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である請求項２３記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２８】
　脂肪酸がデカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である請求項２４記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２９】
　請求項１乃至２８記載のペプチド系化合物のカルボキシル末端に、更に塩基性アミノ酸が結合していることを特徴とするペプチド系化合物。
【請求項３０】
　アミノ末端が炭素数１以上の飽和あるいは不飽和アルキル又はアシル基により修飾され及び／又はカルボキシル末端のカルボキシル基のＯＨがＯＺ又はＮＲ２Ｒ３（Ｚは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基、Ｒ２及びＲ３はＨ及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示す）であることを特徴とする請求項１，２，３，５，７，８，１３，１４，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７記載のペプチド系化合物。
【請求項３１】
　アミノ末端のアミノ基が、炭素数１以上の飽和あるいは不飽和アルキル基又はアシル基の導入により修飾され及び／又はカルボキシル末端のカルボキシル基のＯＨがＯＺ又はＮＲ２Ｒ３（Ｚは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基を示し、Ｒ２及びＲ３はＨ及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示す。）であることを特徴とする請求項１，２，４，５，６，７，９，１０，１１，１２，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，２９記載のペプチド系化合物。
【請求項３２】
　請求項３０または３１記載のペプチド系化合物のカルボキシル末端アミド誘導体に、更に塩基性基を導入したことを特徴とするペプチド系化合物。
【請求項３３】
　請求項１乃至３２項記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物。
【請求項３４】
　請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項３５】
　成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を含有することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項３６】
　ヒト以外の動物に適用するための請求項３３乃至３５記載の医薬組成物。
【請求項３７】
　請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を投与することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法。
【請求項３８】
　成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物を投与することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法。
【請求項３９】
　ヒト以外の動物に適用するための請求項３７又は３８記載の治療方法。
【請求項４０】
　請求項１乃至３２項記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、当該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列中に、少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドをコードする塩基配列を有する当該ＤＮＡ。
【請求項４１】
　塩基配列が、配列番号６、７、１４、１５、２０、２１、２４、３６、３７、３８および３９記載の塩基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列である請求項４０記載のＤＮＡ。
【請求項４２】
　塩基配列が、配列番号６、７、１４、１５、２０、２１、２４、３６、３７、３８および３９記載の塩基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列中、アミノ酸をコードしている塩基配列である請求項４０記載のＤＮＡ。
【請求項４３】
　請求項４０乃至４２記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項４４】
　請求項４３記載のベクターを含有する細胞。
【請求項４５】
　請求項４０乃至４２記載のＤＮＡを有するベクターを有し、且つ当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチド系化合物が、当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されたペプチド系化合物として産生することができる細胞。
【請求項４６】
　請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物に対する抗体。
【請求項４７】
　請求項４６記載の抗体を用いて請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物を検出することを特徴とする請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物のアッセイ方法。
【請求項４８】
　請求項４６記載の抗体を用いて請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物を検出することを特徴とする請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物の検出用キット。
【請求項４９】
　請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、請求項４０乃至４２項記載のＤＮＡを含有するベクターにより、当該ペプチド中の少なくともひとつのアミノ酸の側鎖を修飾することができる宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチド系化合物を採取することからなる請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物の製造方法。
【請求項５０】
　請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、請求項４０乃至４２記載のＤＮＡを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取後、任意のアミノ酸を化学的に修飾することを特徴とする請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物の製造方法。
【請求項５１】
　請求項１９乃至２８記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、脂肪酸をアミノ酸の側鎖の水酸基にエステル結合又はメルカプト基にチオエステル結合させる活性を有する細胞を用いることを特徴とする請求項１９乃至２８記載のペプチド系化合物の製造方法。
【請求項５２】
　配列番号８記載のアミノ酸配列中のセリンの側鎖の水酸基に脂肪酸をエステル結合させるセリンアシル化活性を有する細胞を用いることを特徴とする請求項１９乃至２８項記載のペプチド系化合物の製造方法。
【請求項５３】
　配列番号２８記載のアミノ酸配列中のトレオニンの側鎖の水酸基に脂肪酸をエステル結合させるアシル化活性を有する細胞を用いることを特徴とする請求項１９乃至２８記載のペプチド系化合物の製造方法。
【請求項５４】
　請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する少なくともひとつの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより、成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物。
【請求項５５】
　請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するベクターを、当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内の細胞に組み込むことにより、成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法。
【請求項５６】
　請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する、少なくともひとつの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物。
【請求項５７】
　請求項１乃至３２記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するベクターを、当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内の細胞に組み込むことにより、成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　　本発明は、ペプチド中のアミノ酸が修飾されていることを特徴とした、細胞内カルシウム濃度を上昇させる作用あるいは成長ホルモンの分泌誘導活性を有する新規ペプチドに関する。本願発明はまた、当該新規ペプチドの取得方法及び製造方法、該ペプチド及び該ペプチドの前駆体をコードする遺伝子、及び当該遺伝子を用いた該ペプチド及び該ペプチドの前駆体の製造方法に関する。さらに本願発明は、本願発明により開示された新規修飾ペプチドの構造類似体で、成長ホルモン分泌誘導化合物のレセプターに結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる作用あるいは成長ホルモンの分泌誘導活性を有するペプチド類縁体及びその製造方法に関する。本願発明はまた、該ペプチド若しくは該ペプチド類縁体を有効成分とする医薬用組成物、動物用成長促進剤、又は該ペプチドの抗体若しくはその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ、以下単にＧＨと略称する）は、下垂体前葉で合成されるタンパク質ホルモンで、骨の成長及び脂肪細胞や軟骨細胞の分化を間接的に促進し、その分泌は、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ；ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ）で促進され、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）で阻害される［Ｊ．　Ｋｅｎｄｒｅｗ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｄｓ．，　Ｔｈｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ．，　Ｌｏｎｄｏｎ，　１９９４），　ｐ．４６２］。ＧＨは単に成長を促すだけではなく、各種組織でのタンパク質合成の促進、貯蔵脂肪の移動の刺激及び筋肉中のグリコーゲン含量の上昇などの作用もあり、ＧＨ分泌の低下は小人症を、過剰分泌は巨人症又は末端肥大症を惹起する［八杉龍一ら編，岩波生物学辞典第４版（岩波書店，東京，１９９７），７５７頁］。
【０００３】
　ヒトＧＨが遺伝子組換え技術によって生産されるようになって以来、ＧＨは上記小人症の治療［Ｊ．Ｏ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１２，１８９（１９９１）］　だけでなく、他の疾患の治療にも用いられ、様々な効果が見いだされた［Ｊ．Ｏ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｏｒｍ．　Ｒｅｓ．　４２，　２３５　（１９９４）］。例えば、正常人での骨芽細胞及び骨再構成の活性化［Ｋ．Ｂｒｉｘｅｎ，ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．５，６０９（１９９０）］、ＧＨ欠乏症成人での筋肉量及び筋力の増強　［Ｒ．Ｃ．Ｃｕｎｅｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７０，６８８（１９９１）］、ＧＨ欠乏症成人での運動能力の向上［Ｒ．Ｃ．Ｃｕｎｅｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．　Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７０，６９５（１９９１）］、小児の重度火傷治癒［Ｄ．Ｎ．　Ｈｅｒｎｄｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２１２，４２４（１９９０）］、排卵誘発におけるゴナンドトロピンとの併用［Ｒ．Ｈｏｍｂｕｒｇ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｌｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（Ｏｘｆ）．３２，７８１（１９９０）］、プレドニゾン投与によるタンパク質代謝異常の予防［Ｆ．Ｆ．Ｈｏｒｂｅｒ　ａｎｄ　Ｍ．Ｗ．Ｈａｙｍｏｎｄ，　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６，２６５（１９９０）］、重度免疫不全症におけるＴ細胞「教育」の促進［Ｗ．Ｊ．Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，４４８１（１９９２）］、老人性の体重減少、脂肪組織拡大及び皮膚萎縮を抑制する効果［Ｄ．Ｒｕｄｍａｎ，ｅｔ　ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３，１（１９９０）］などがある。
【０００４】
　小児の成長促進、及び成人のＧＨ欠乏に伴う代謝や機能の欠損の正常化に、組換えＧＨの投与は効果的ではあるが、用量限定的な副作用があること、経口投与ができないこと及びコスト面で問題がある［Ｂ．Ａ．Ｌｅｆｋｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，ｉｎＧｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎ　Ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ　ｉｎ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｏｃｅ，　Ｂ．Ｂ．Ｂｅｒｃｕ　ａｎｄ　Ｒ．Ｆ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｅｄｓ．（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９８），ｐ．１０７−ｐ．１０８］。多くの成人患者は、過剰なナトリウムと体液の貯留によると思われる関節痛や手根管症候群のような副作用のため、ＧＨ投与を継続することができない［Ｅ．Ｃｏｒｐａｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１４，２０（１９９３）］。これらの副作用は、ＧＨ投与によるホルモン分泌の非生理的なパターンと関係しており、ＧＨの投与では正常なＧＨ分泌の拍動性（ｐｕｌｓａｔｉｌｉｔｙ）をまねることができない［Ｂ．Ａ．Ｌｅｆｋｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，　ｉｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎ　Ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ　ｉｎ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｏｃｅ，Ｂ．Ｂ．Ｂｅｒｃｕ　ａｎｄ　Ｒ．Ｆ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｅｄｓ．　（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９８），ｐ．１０７−ｐ．１０８］。
【０００５】
　生体内でのＧＨ分泌の拍動性は、基本的には視床下部由来の２つの制御因子の相互作用によって確立される、すなわちＧＨＲＨとソマトスタチンが下垂体に作用してＧＨ分泌を制御している［Ｇ．Ｓ．Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ　ａｎｄ　Ｎ．Ｌｉｎｇ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１５，１９５２（１９８４），Ｒ．Ｇ．Ｃｌａｒｋ　ａｎｄ　Ｉ．Ｃ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２２，２６７５（１９８８）］。正常なＧＨ分泌のパターンは昼夜で異なり、夜間に、より多くのＧＨがより頻繁に放出される。ＧＨの放出パルスの振幅は、種々のステロイド・ホルモン、神経伝達物質、ＧＨとインシュリン様成長因子によるフィードバック、栄養状態、睡眠及び運動によって、さらに調節される［Ｊ．Ｓ．Ｓｔｒｏｂｌ　ａｎｄ　Ｍ．Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｒｅｖ．４６，１（１９９４）］。
【０００６】
　上に記載したＧＨ投与に伴う副作用を克服するために、ＧＨ分泌誘導活性を有する化合物が数多く合成され、ＧＨ分泌誘導物質（ＧＨＳ；　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ）としてその構造活性相関、薬理学、臨床応用が精力的に研究された。まず、ＧＨＲＰ−６（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ）などのペプチドが合成され、ＧＨの欠損乃至は低下に起因する治療薬として開発された［Ｃ．Ｙ．Ｂｏｗｅｒｓ，ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１４，　１５３７−１５４５（１９８４）］。しかし、これらのペプチド化合物は静脈注射でしか効果を発揮できないので、経口投与可能な低分子量の非ペプチド系化合物が開発され［Ｒ．Ｇ．Ｓｍｉｔｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６０，　１６４０−１６４３（１９９３）］、第二相臨床試験の段階にまで進んでいるものもある［Ａ．Ａ．　Ｐａｔｃｈｅｔｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，７００１−７００５（１９９５）］。
【０００７】
　細胞における、レセプターのシグナル受容から機能発現に至るまでの一連の情報伝達をシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）というが、Ｇタンパク質と共役したシグナル伝達系は以下のような機構で進行する［八杉龍一ら編，岩波生物学辞典第４版（岩波書店，東京，１９９７），５５５−５５６頁］。このＧタンパク質共役系は細胞膜７回貫通型レセプターをもち、ｃＡＭＰをセカンドメッセンジャーとして産生するｃＡＭＰ系とイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）やジアシルグリセロール（ＤＧ）イノシトールリン脂質情報伝達系に分けられる。ｃＡＭＰはｃＡＭＰ依存性のキナーゼ（Ａキナーゼ）を活性化し、機能タンパク質のセリンやトレオニン残基のリン酸化を起こし、活性を修飾する。一方、ＩＰ３は小胞体上のＩＰ３受容体と結合し、カルシウムイオンの遊離を促し、ＤＧはＣキナーゼを活性化してホルモンなどの作用発現を促す。
【０００８】
　ＩＰ３やＤＧをセカンドメッセンジャーとするシグナル伝達系で、細胞内カルシウムイオン濃度が上昇する機構は以下の如くである［Ｊ．Ｋｅｎｄｒｅｗ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｄｓ．，　Ｔｈｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ．，　Ｌｏｎｄｏｎ，　１９９４），　ｐ．１３６−１３７］。レセプターへリガンドが結合すると、Ｇタンパク質を介してホスホリパーゼＣが活性化されて、ＰＩＰ２からＩＰ３が生成する。ＩＰ３は細胞内顆粒であるＥＲなどの小胞体に貯蔵されているカルシウムイオンを細胞質に放出させ、細胞質中のカルシウムイオン濃度が上昇する。ＩＰ３もしくはカルシウムイオンがさらに細胞質に存在すると、カルシウムは再び小胞体に取り込まれ、細胞質中のカルシウムイオン濃度は低下する。すなわち、レセプターへのリガンドの結合は、細胞質中のカルシウムイオン濃度の一過性の上昇をもたらす。
【０００９】
　ＧＨＳはＧＨＲＨによるＧＨの分泌及び細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇に協奏的に作用すること［Ｋ．　Ｃｈｅｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２４，　２７９１−２７９８（１９８９）］、及びＧＨＲＨのレセプターへの結合はｃＡＭＰをセカンドメッセンジャーとして産生するのに対して、ＧＨＳは細胞内カルシウムイオン濃度の上昇をもたらすことから、　ＧＨＳの作用機作はＧＨＲＨのそれとは異なることが示唆され［Ｊ．　Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ　ａｎｄ　Ｂ．　Ｈｉｌｌｅ，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３５，　１１００−１１０８（１９９４）．］、ＧＨＳはＧＨＲＨが結合するＧＨＲＨレセプターとは異なるレセプターに結合することが想定された。実際にＧＨＳが結合するレセプター遺伝子がクローニングされ、ノザン解析の結果からＧＨＳレセプター（ＧＨＳ−Ｒ）は視床下部及び脳下垂体で発現していること、及びブタとヒト由来のＧＨＳ−Ｒのアミノ酸配列が９０％以上の同一性を示すことがわかった［Ａ．Ｄ．　Ｈｏｗａｒｄ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３，　９７４−９７７（１９９６）］。しかし、ＧＨＳ−Ｒに結合する内在性のリガンドは単離されておらず、このＧＨＳ−Ｒはリガンドが不明なオーファン・レセプターであった。
【００１０】
　タンパク質のアミノ末端又はタンパク質を構成するアミノ酸残基の側鎖に、ミリスチン酸、ゲラニル酸、パルミトイル酸、又はファルネシル酸などの脂肪酸が結合することがあるが、これらの脂肪酸の役割はこれらの脂肪酸修飾タンパク質を細胞膜にアンカーリング（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）することにある［Ｊ．Ｋｅｎｄｒｅｗ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｄｓ．，　Ｔｈｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ．，　Ｌｏｎｄｏｎ，　１９９４），　ｐ．６１６］。これらの脂肪酸修飾タンパク質において、脂肪酸はシステイン残基にＳ−アシル結合で結合しており、本願発明によって開示された内在性のＧＨＳのようにセリン残基にＯ−アシル結合で脂肪酸が結合したアミノ酸、この脂肪酸修飾アミノ酸を含むタンパク質及びペプチドは全く知られていなかった。また、脂肪酸で修飾されたアミノ酸を含むペプチドが、いかなるレセプターのリガンドとして機能することも知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
　本発明を詳細に説明するに先立ち、用語を以下のように定義する。
　ペプチドとは、複数のアミノ酸がペプチド結合で連なった化合物のことをいう。ここでアミノ酸（又はアミノ酸残基とも表現する）とは、アミノ酸の一般式；ＮＨ２−ＣＨ（Ｒ’）−ＣＯＯＨにおいて、Ｒ’が天然に存在する置換基を有する天然アミノ酸の他、そのＤ，Ｌ−光学異性体等を含む。
【００１２】
　天然アミノ酸が修飾アミノ酸（又は修飾アミノ酸残基と表現する）で置換されている場合もある。修飾アミノ酸は、上記一般式の置換基Ｒ’がさらに修飾されたアミノ酸及びそのＤ，Ｌ−光学異性体ばかりではなく、例えば上記一般式の置換基Ｒ’において、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド、カルバミド又はチオカルバミド等を介して又は介さずに、様々な置換基が結合した非天然アミノ酸も含む。また、アミノ酸のアミノ基に低級アルキル基が置換されている非天然アミノ酸も含まれる。
【００１３】
　ペプチド類縁体とは、ペプチドにおいて少なくとも１つのアミノ酸が非アミノ酸化合物で置換された化合物のことをいい、従って当該置換化合物のペプチド類縁体への少なくとも１つの結合はペプチド結合ではない。
　また、これらペプチド及びペプチド類縁体のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端が修飾された化合物を誘導体とし、ペプチド、ペプチド類縁体及びそれらの誘導体を総称してペプチド系化合物とした。
【００１４】
　配列番号２記載のアミノ酸配列において少なくともアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列とは、以下に掲げる配列をいう。
Gly Ser Ser Phe、
Gly Ser Ser Phe Leu、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His、　又は、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln。
【００１５】
　ＧＨＳレセプターに結合して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させるか、又はＧＨ分泌を誘導する活性を有する内在性のリガンド、すなわち内在性ＧＨＳの発見及び利用方法が所望されていた。さらに、当該内在性ＧＨＳの構造類似体で、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させるか、又はＧＨ分泌誘導活性を有する化合物が望まれていた。また、当該内在性ＧＨＳ又はその構造類似化合物を含有し、ＧＨの拍動的な分泌を誘導することによってＧＨ投与による副作用のない医薬組成物あるいは動物の成長を促進するための組成物、及び当該組成物を用いた治療方法が所望されていた。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
　本願発明者らは、ＧＨＳレセプター（ＧＨＳ−Ｒ）へのリガンドの結合がイノシトールリン脂質をセカンドメッセンジャーとして細胞内カルシウムイオン濃度の一過性の上昇をもたらすことに着目し、ＧＨＳ−Ｒを発現させたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２）において細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性（Ｃａ上昇活性）を指標に、各種臓器又は組織の抽出物をスクリーニングした。その結果、ラット胃の抽出物に強いＣａ上昇活性があることを見いだし、当該抽出物より各種クロマトグラフィーを用いてＣａ上昇活性を有する物質を精製して、該物質が脂肪酸で修飾された分子量約３，０００の新規ペプチドであることを見いだした。さらに当該新規ペプチドが、下垂体前葉細胞からのＧＨの特異的な分泌を促進することを確認して、該新規ペプチドがＧＨＳ−Ｒの内在性のリガンド、すなわち内在性ＧＨ分泌誘導物質（内在性ＧＨＳ）であることを見出した。すなわち、本願発明の第一は、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性又はＧＨ分泌誘導活性を有し、構成アミノ酸残基が脂肪酸で修飾されていることを特徴とする内在性のＧＨ分泌誘導ペプチド、及び該ペプチドの取得方法である。
【００１７】
　本願発明者らは、該内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの構造を詳細に解析し、該ペプチドが配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであり、アミノ末端から３番目のセリン側鎖の水酸基が脂肪酸でアシル化されていることを見出した。またラットと同様、強いＣａ上昇活性が存在するヒト胃抽出物中からも、ラット由来のＧＨ分泌誘導ペプチドと同様の方法で精製及び構造解析を行った結果、ヒト由来の内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドも配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、アミノ末端から３番目のセリン側鎖の水酸基が脂肪酸でアシル化されていることがわかった。ラット及びヒト由来の内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドのアミノ酸配列を比較すると全体で８９％の高い同一性を示した。
【００１８】
　より詳しくは、ラットとヒトではアミノ末端から１０番目までのアミノ酸配列及び１３〜２８番目のアミノ酸配列は同一であるが、１１番目と１２番目のアミノ酸がラットでリジン、アラニンであり、ヒトでこれらがそれぞれアルギニン、バリンに置換されている点で相違している。ラット由来の内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドを各種プロテアーゼで切断し、精製したペプチド断片のＣａ上昇活性を測定した結果、アミノ末端から７番目までのアミノ酸配列からなるペプチドがＣａ上昇活性を有する最小のペプチドであった。
【００１９】
　さらに、化学合成したペプチドのＣａ上昇活性の測定などから、Ｃａ上昇活性発現に必須のコア配列は配列番号８に記載の４アミノ酸からなる配列であることがわかった。また、ラット以外のヒト、ブタ、ウシから分離した内在性ＧＨ分泌誘導ペプチド（２８アミノ酸）およびこれらのペプチドから１つグルタミンが欠失した内在性ＧＨ分泌誘導ペプチド（２７アミノ酸）のいずれにおいても、配列番号９に記載の１０アミノ酸からなる配列が保存されていた。
【００２０】
　すなわち、本願発明の第２は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、望ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列、より望ましくは配列番号９に記載のアミノ酸配列をＣａ上昇活性発現に必須のコア配列として含む脂肪酸修飾ペプチドである。
　なお、ニワトリ、ウナギ、カエルからも内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドが単離され、配列番号８に記載の４アミノ酸からなるコア配列を有していることがわかった。
【００２１】
　一方、カエルからもラットの内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドと非常に類似性の高い内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドが単離された。
　さらに、アフリカツメガエル、ニジマス、イヌからも内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドが単離された。なお、ニジマスからは、２３アミノ酸からなるグレリン−２３と、２０アミノ酸からなるグレリン−２０とが単離された。
　なお、ウナギのグレリン、ニジマスのグレリン−２３およびグレリン−２０のカルボキシル基末端のアミノ酸はアミド化されていた。
【００２２】
　また、アフリカツメガエルの内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドはアミノ末端から３番目のアミノ酸残基がトレオニンであったことから、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、望ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列、より望ましくは配列番号９に記載のアミノ酸配列のアミノ末端から３番目のアミノ酸残基セリンをトレオニンに変換したペプチドをＣａ上昇活性発現に必須のコア配列として含む脂肪酸修飾ペプチドにも関する。
【００２３】
　本願発明によって開示されたＧＨ分泌誘導活性をもつ内在性脂肪酸修飾ペプチド又は上記コア配列からなる脂肪酸修飾ペプチドは、Ｃａ上昇活性を有する化合物の設計指針も提供する。
　すなわち、本発明の第三は、当該脂肪酸修飾ペプチドの構造類似化合物を合成し、該構造類似化合物のＣａ上昇活性を確認することにより、Ｃａ上昇活性を有する新規化合物を取得することである。従って、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド又はペプチド類縁体において、構成アミノ酸が修飾アミノ酸又は非アミノ酸化合物で置換された化合物も本願発明に属することはいうまでもない。
【００２４】
　内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドをコードするｃＤＮＡを常法により取得した。配列番号４及び５に記載したアミノ酸配列に示された如く、ラット及びヒトのｃＤＮＡはいずれも１１７アミノ酸からなり、アミノ末端から２４番目ないし５１番目まで２８アミノ酸の配列がラット及びヒトの内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドのアミノ酸配列と各々一致した。すなわち、内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドは１１７アミノ酸からなる前駆体ペプチドとして合成され、アミノ末端側の２３アミノ酸からなるシグナルペプチドが切断を受け、さらにカルボキシル末端側の５６アミノ酸が切断除去されてＧＨ分泌誘導活性をもつ脂肪酸修飾ペプチドが生成することが明らかになった。また、ブタからも２８アミノ酸からなる内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡが見いだされた。
【００２５】
　さらに、ブタからも２７アミノ酸からなる内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡが見いだされた。
　また、ウシからも２７アミノ酸からなる内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡが部分的であるが見いだされた。
　またさらに、ウナギ、アフリカツメガエル、ニジマスからも内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡが見いだされた。なお、ニジマスからは、２３アミノ酸からなるグレリン−２３の前駆体をコードするｃＤＮＡと、２０アミノ酸からなるグレリン−２０の前駆体をコードするｃＤＮＡとが単離された。
【００２６】
　従って、本願発明の第４は、内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡ及び当該ｃＤＮＡを用いたＣａ上昇活性を有する脂肪酸修飾ペプチド又はペプチド類縁体の原料となるペプチドの製造方法である。
【００２７】
　ラット胃抽出物から２８アミノ酸で構成される内在性ＧＨ分泌誘導ペプチド（グレリン）を精製する際に、マイナー画分として回収されるペプチドを解析したところ、グレリンの１３番目若しくは１４番目のグルタミンが１つ欠失した２７アミノ酸からなるペプチド（グレリン−２７）を見いだした。グレリン−２７は２８アミノ酸からなるグレリンと全く同様のＣａ上昇活性およびＧＨ分泌誘導活性を有しており、内在性のＧＨ分泌誘導ペプチドであるから、該グレリン−２７も本発明に属する。
【００２８】
　グレリンの１３番目および１４番目のグルタミンをコードしている塩基配列は、ｇｃａ　ｇｃａでありｍＲＮＡのスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）が起こるエクソンの末端の配列であり、異ったスプライシングが起こることにより、２つのグルタミンのコドンのうち１つが脱落したｃＤＮＡが生成する可能性が示唆された。実際にラット及びヒトのｃＤＮＡライブラリーを探索したところ、２７アミノ酸からなるグレリン−２７の前駆体ペプチドをコードするｃＤＮＡが見つかった。
【００２９】
　すなわち、ラットおよびヒトのグレリン−２７ペプチドは、配列番号１２又は１３に記載した１１６アミノ酸からなる前駆体ペプチドとして合成され、アミノ末端側の２３アミノ酸からなるシグナルペプチドが切断を受け、さらにカルボキシル末端側の５６アミノ酸が切断除去されて２７アミノ酸からなるＧＨ分泌誘導活性をもつ脂肪酸修飾ペプチドとして生成することが明らかになった。
【００３０】
　また、ブタおよびウシからもグレリン−２７ペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡが見いだされ、これらの動物においてもグレリン−２７およびその前駆体の存在が確認された。
　すなわち、配列番号１０，１１，１７および２２記載のアミノ酸配列からなるグレリン−２７ペプチド、及び配列番号１２、１３、１９および２３記載のアミノ酸配列を有するグレリン−２７前駆体ペプチド、並びに配列番号１４、１５、２１、および２４に記載の塩基配列を有する該前駆体ペプチドをコードするｃＤＮＡも本発明に属することはいうまでもない。
【００３１】
　本願発明で開示されたＣａ上昇活性を有する脂肪酸修飾ペプチド又はＣａ上昇活性を有するペプチド類縁体等のペプチド系化合物は、ＧＨの欠損又は低下に起因する疾患を治療するための医薬組成物も提供する。該医薬組成物はＧＨの投与が有効である全ての疾患に用いることができ、ＧＨの投与によって生じる様々な副作用を克服することができる。また、該医薬組成物は動物の成長促進剤などの動物用薬剤としても用いることができる。
【００３２】
　本発明に係るペプチド系化合物は脳室内投与および静脈内投与によって食欲増進作用があることから、食欲不振や拒食症を治療するための食欲増進剤として用いることができる。また、運動および胃酸分泌を促進する作用があることから、非潰瘍性消化不良、突発性軽症胃アトニー、機能性消化不良および逆流性食道炎等の胃機能性疾患の治療剤として用いることもできる。さらに、静脈内投与により骨髄、十二指腸および空腸において細胞増殖促進作用が認められたことから、腸管粘膜保護剤、経静脈栄養時の小腸粘膜障害予防剤及び骨粗鬆症治療剤として用いることもできる。
【００３３】
　本願発明で開示されたＣａ上昇活性を有する脂肪酸修飾ペプチドを抗原として調製された抗体、当該抗体を用いた内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの測定方法、及び該抗体を具備した測定キットも本願発明に属する。
　また、グレリンのアミノ末端側及びカルボキシル末端側のペプチドに対する抗体を作成し、前者が３位セリンを修飾している脂肪酸を特異的に認識することを利用して、脂肪酸で修飾されたグレリンと脂肪酸が脱離したグレリンとを分別定量することができるアッセイ方法、およびグレリンのアミノ末端側ペプチドに対する抗体とカルボキシル末端側のペプチドに対する抗体とを組み合わせた検査キットも本願発明に属する。
　すなわち本願発明は、アシル化セリンという新規修飾アミノ酸を有する新規ペプチドホルモンを提供し、又当該ペプチドの構造を基本骨格とするＣａ上昇活性有する化合物の新規設計指針をも提供する。
【００３４】
　さらに、本願発明によって開示された脂肪酸修飾ペプチド、ＧＨ放出ホルモン及びソマトスタチンによるＧＨ分泌誘導機構の解明は、単にＧＨ分泌誘導機構に限らず他のホルモン分泌制御機構にも敷衍することが示唆される。本願発明は、脂肪酸修飾ペプチドの循環器系および代謝系の制御因子としての多様な機能を開示するものであり、本願発明の効果は新しい生体制御機構の解明にも及ぶものである。
【００３５】
　具体的には本発明は
（１）細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチドの少なくともひとつのアミノ酸が、修飾アミノ酸及び／又は非アミノ酸化合物により置換されていることを特徴とするペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２）（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は（ｂ）当該配列において少なくともアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む前記（１）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（３）配列番号３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２２および２３記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記（２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（４）配列番号２５、２６、２９、３０、３１、３２、３４および３５記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記（２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（５）細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドの（ａ）構成アミノ酸が修飾されているか又はされていない、かつ（ｂ）少なくともひとつのアミノ酸が非アミノ酸化合物により置換されているか又はされていないペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（６）配列番号２７、２８および３３記載のアミノ酸配列を有する前記（１）又は（５）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（７）（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は（ｂ）当該配列において少なくともアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列を有し、かつアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む前記（５）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（８）配列番号３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２２および２３記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記（７）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（９）配列番号２５、２６、２９、３０、３１、３２、３４および３５記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記（７）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１０）アミノ末端の１番目から４番目に至るまでのアミノ酸配列に相当する部分が、下記の式で表される前記（１）又は（５）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
　Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−
　　Ａ；アミノ酸、非アミノ酸化合物、又はなし、
　　Ｂ；アミノ酸、非アミノ酸化合物、又はなし、
　　（ただし、Ａ＋Ｂの分子鎖長がジペプチド相当長ある、）
　　Ｃ又はＤ；同一であっても異なっていてもよく、（ａ）修飾されたアミノ酸、又は（ｂ）疎水性側鎖を有するアミノ酸、
を表す、
（１１）Ｃが、アミノ酸のα炭素に、（ａ）炭素数１以上のアルキレン基を介して又は介さず、エステル、エーテル、チオエーテル、アミドまたはジスルフィド結合を介して炭素数が１若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、又は（ｂ）炭素数１以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸であり、Ｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸であることを特徴とする前記（１０）に記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１２）配列番号２、３、９、１０、１１、１６、１７、２２、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列において、アミノ末端の１番目から４番目に至るまでのアミノ酸配列に相当する部分が前記（１０）または（１１）に記載のペプチド系化合物であるペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１３）修飾されたアミノ酸がアミノ末端から３番目のアミノ酸である前記（１）、（２）、（３）、（５）、（７）または（８）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１４）修飾されたアミノ酸におけるアミノ酸がセリン又はシステインであることを特徴とする前記（１３）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１５）アミノ酸のα炭素に、（ａ）炭素数１以上のアルキレン基を介して又は介さず、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド又はカルバミド結合を介して炭素数が１若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、又は（ｂ）Ｈ又は炭素数１以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸を含有する前記（１）、（２）、（３）、（５）、（７）または（８）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１６）修飾アミノ酸が、アミノ酸のα炭素に、（ａ）炭素数１以上のアルキレン基を介して又は介さず、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、カルバミド又はチオカルバミド結合を介して炭素数が１若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、又は（ｂ）炭素数１以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入したアミノ酸である前記（１）、（２）、（４）、（５）、（６）、（７）、（９）、（１０）または（１２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１７）エステル結合により修飾された修飾アミノ酸を有する前記（１、２、３、５、７または８記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１８）アミノ酸の側鎖の官能基がエステル結合を形成することにより修飾された修飾アミノ酸を有する前記（１）、（２）、（４）、（５）、（６）、（７）、（９）、（１０）、（１１）または（１２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１９）アミノ酸の側鎖の水酸基に脂肪酸がエステル結合したアミノ酸を有する前記（１７）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２０）脂肪酸が、アミノ酸の側鎖の水酸基にエステル結合又はメルカプト基にチオエステル結合したアミノ酸を有する前記（１８）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２１）炭素数が２乃至３５である脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前記（１９）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２２）脂肪酸が炭素数２乃至３５である前記（２０）のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２３）炭素数が２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前記（２１）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２４）脂肪酸が炭素数２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸である前記（２２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２５）結合した脂肪酸がオクタン酸（ｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（２３）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２６）脂肪酸がオクタン酸（ｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（２４）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２７）結合した脂肪酸がデカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（２３）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２８）脂肪酸がデカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（２４）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２９）前記（１）乃至（２８）記載のペプチド系化合物のカルボキシル末端に、更に塩基性アミノ酸が結合していることを特徴とするペプチド系化合物、
（３０）Ｎ末端が炭素数１以上の飽和あるいは不飽和アルキル又はアシル基により修飾され及び／又はＣ末端のカルボキシル基のＯＨがＯＺ又はＮＲ２Ｒ３（Ｚは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基、Ｒ２及びＲ３はＨ及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示す）であることを特徴とする前記（１），（２），（３），（５），（７），（８），（１３），（１４），（１５），（１７），（１９），（２１），（２３），（２５），（２７）項記載のペプチド系化合物、
（３１）アミノ末端のアミノ基が、炭素数１以上の飽和あるいは不飽和アルキル基又はアシル基の導入により修飾され及び／又はカルボキシル末端のカルボキシル基のＯＨがＯＺ又はＮＲ２Ｒ３（Ｚは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基を示し、Ｒ２及びＲ３はＨ及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示す、）であることを特徴とする前記（１），（２），（４），（５），（６），（７），（９），（１０），（１１），（１２），（１６），（１８），（２０），（２２），（２４），（２６），（２８），（２９）項記載のペプチド系化合物、
（３２）前記（３０）または（３１）記載のペプチド系化合物のカルボキシル末端アミド誘導体に、更に塩基性基を導入したことを特徴とするペプチド系化合物、
（３３）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物、
（３４）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための医薬組成物、
（３５）成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を含有することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための医薬組成物、
（３６）ヒト以外の動物に適用するための前記（３３）乃至（３５）記載の医薬組成物、
（３７）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を投与することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
（３８）成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物を投与することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法、
（３９）ヒト以外の動物に適用するための前記（３７）又は（３８）記載の治療方法、
（４０）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、当該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列中に、少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドをコードする塩基配列を有する当該ＤＮＡ、
（４１）塩基配列が、配列番号６、７、１４、１５、２０、２１、２４、３６、３７、３８および３９記載の塩基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列である前記（４０）記載のＤＮＡ、
（４２）塩基配列が、配列番号６、７、１４、１５、２０、２１、２４、３６、３７、３８および３９記載の塩基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列中、アミノ酸をコードしている塩基配列である前記（４０）記載のＤＮＡ、
（４３）前記（４０）乃至（４２）記載のＤＮＡを有するベクター、
（４４）前記（４３）記載のベクターを含有する細胞、
（４５）前記（４０）乃至（４２）記載のＤＮＡを有するベクターを有し、且つ当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチド系化合物が、当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されたペプチド系化合物として産生することができる細胞、
（４６）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物に対する抗体、
（４７）前記（４６）記載の抗体を用いて前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物を検出することを特徴とする前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物のアッセイ方法、
（４８）前記（４６）記載の抗体を用いて前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物を検出することを特徴とする前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物の検出用キット、
（４９）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、前記（４０）乃至（４２）記載のＤＮＡを含有するベクターにより、当該ペプチド中の少なくともひとつのアミノ酸の側鎖を修飾することができる宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチド系化合物を採取することからなる前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物の製造方法、
（５０）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、前記（４０）乃至（４２）記載のＤＮＡを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取後、任意のアミノ酸を化学的に修飾することを特徴とする前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物の製造方法、
（５１）前記（１９）乃至（２８）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、脂肪酸をアミノ酸の側鎖の水酸基にエステル結合又はメルカプト基にチオエステル結合させる活性を有する細胞を用いることを特徴とする前記（１９）乃至（２８）記載のペプチド系化合物の製造方法、
（５２）配列番号８記載のアミノ酸配列中のセリンの側鎖の水酸基に脂肪酸をエステル結合させるセリンアシル化活性を有する細胞を用いることを特徴とする前記（１９）乃至（２８）記載のペプチド系化合物の製造方法、
（５３）配列番号２８記載のアミノ酸配列中のトレオニンの側鎖の水酸基に脂肪酸をエステル結合させるアシル化活性を有する細胞を用いることを特徴とする前記（１９）乃至（２８）記載のペプチド系化合物の製造方法、
（５４）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する少なくともひとつの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより、成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、
（５５）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するベクターを、当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内の細胞に組み込むことにより、成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
（５６）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する、少なくともひとつの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、および
（５７）前記（１）乃至（３２）記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するベクターを、当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内の細胞に組み込むことにより、成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法、
に関する。
【００３６】
　また具体的には、本発明は、
（１）細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチドの少なくともひとつのアミノ酸が、修飾アミノ酸及び／又は非アミノ酸化合物により置換されていることを特徴とするペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２）（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は（ｂ）当該配列において少なくともアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む前記（１）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（３）配列番号３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２２、２３、２５及び２６記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記（２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（４）細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドの（ａ）構成アミノ酸が修飾されているか又はされていない、かつ（ｂ）少なくともひとつのアミノ酸が非アミノ酸化合物により置換されているか又はされていないペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（５）配列番号２７記載のアミノ酸配列を有する前記（１）又は（４）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（６）（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は（ｂ）当該配列において少なくともアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列を有し、かつアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む前記（４）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（７）配列番号３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２２、２３、２５及び２６記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記（６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（８）アミノ末端の１番目から４番目に至るまでのアミノ酸配列に相当する部分が、下記の式で表される前記（１）又は（４）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
　Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−
　　Ａ；アミノ酸、非アミノ酸化合物、又はなし、
　　Ｂ；アミノ酸、非アミノ酸化合物、又はなし、
　　（ただし、Ａ＋Ｂの分子鎖長がジペプチド相当長ある、）
　　Ｃ又はＤ；同一であっても異なっていてもよく、（ａ）修飾されたアミノ酸、（ｂ）疎水性側鎖を有するアミノ酸、又は（ｃ）塩基性側鎖を有するアミノ酸、
　　を表す、
（９）配列番号２、３、８、９、１０、１１、１６、１７、２２、２５及び２６記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列において、アミノ末端の１番目から４番目に至るまでのアミノ酸配列に相当する部分が前記（８）に記載のペプチド系化合物であるペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１０）修飾アミノ酸が、アミノ酸のα炭素に、（ａ）炭素数１以上のアルキレン基を介して又は介さず、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、カルバミド又はチオカルバミド結合を介して炭素数が１若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、又は（ｂ）炭素数１以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入したアミノ酸である前記（１）乃至（９）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１１）アミノ酸の側鎖の官能基がエステル結合を形成することにより修飾された修飾アミノ酸を有する前記（１）乃至（１０）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１２）アミノ酸の側鎖の水酸基又はメルカプト基に、脂肪酸がエステル結合したアミノ酸を有する前記（１１）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１３）脂肪酸が炭素数２乃至３５である前記（１２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１４）脂肪酸が炭素数２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸である前記（１２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１５）脂肪酸がオクタン酸（ｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（１２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１６）脂肪酸がデカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（１２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１７）アミノ末端のアミノ基が、炭素数１以上の飽和あるいは不飽和アルキル基又はアシル基の導入により修飾され及び／又はカルボキシル末端のカルボキシル基のＯＨがＯＺ又はＮＲ２Ｒ３（Ｚは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基を示し、Ｒ２及びＲ３はＨ及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示す、）であることを特徴とする前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物、
（１８）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物のカルボキシル末端に、更に塩基性アミノ酸が結合していることを特徴とするペプチド系化合物、
（１９）前記（１）乃至（１６）、又は（１８）記載のペプチド系化合物のカルボキシル末端アミド誘導体に、更に塩基性基を導入したことを特徴とするペプチド系化合物、
（２０）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物、
（２１）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための医薬組成物、
（２２）成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を含有することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための医薬組成物、
（２３）ヒト以外の動物に適用するための前記（２０）乃至（２２）記載の医薬組成物、
（２４）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を投与することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
（２５）成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物を投与することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法、
（２６）ヒト以外の動物に適用するための前記（２４）又は（２５）記載の治療方法、
（２７）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、当該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列中に、少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドをコードする塩基配列を有する当該ＤＮＡ、
（２８）塩基配列が、配列番号６、７、１４、１５、２０、２１および２４記載の塩基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列である前記（２７）記載のＤＮＡ、
（２９）塩基配列が、配列番号６、７、１４、１５、２０、２１および２４記載の塩基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列中、アミノ酸をコードしている塩基配列である前記（２７）記載のＤＮＡ、
（３０）前記（２７）乃至（２９）記載のＤＮＡを有するベクター、
（３１）前記（３０）記載のベクターを含有する細胞、
（３２）前記（２７）乃至（２９）記載のＤＮＡを有するベクターを有し、且つ当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチド系化合物が、当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されたペプチド系化合物として産生することができる細胞、
（３３）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物に対する抗体、
（３４）前記（３３）記載の抗体を用いて前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物を検出することを特徴とする前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物のアッセイ方法、
（３５）前記（３３）記載の抗体を用いて前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物を検出することを特徴とする前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物の検出用キット、
（３６）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、前記（２７）乃至（２９）記載のＤＮＡを含有するベクターにより、当該ペプチド中の少なくともひとつのアミノ酸の側鎖を修飾することができる宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチド系化合物を採取することからなる前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物の製造方法、
（３７）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、前記（２７）乃至（２９）記載のＤＮＡを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取後、任意のアミノ酸を化学的に修飾することを特徴とする前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物の製造方法、
（３８）前記（１２）乃至（１６）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、アミノ酸の側鎖の水酸基又はメルカプト基に、脂肪酸をエステル結合させる活性を有する細胞を用いることを特徴とする前記（１２）乃至（１６）記載のペプチド系化合物の製造方法、
（３９）配列番号８記載のアミノ酸配列中のセリンの側鎖の水酸基に脂肪酸をエステル結合させるセリンアシル化活性を有する細胞を用いることを特徴とする前記（１２）乃至（１６）記載のペプチド系化合物の製造方法、
（４０）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する少なくともひとつの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより、成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、
（４１）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するベクターを、当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内の細胞に組み込むことにより、成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
（４２）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する、少なくともひとつの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、および、
（４３）前記（１）乃至（１９）記載のペプチド系化合物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するベクターを、当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内の細胞に組み込むことにより、成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法、
にも関する。
【００３７】
　また、具体的には、本発明は
（１）細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有し、少なくともひとつのアミノ酸が、修飾アミノ酸及び／又は非アミノ酸化合物により置換されたことを特徴とするペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２）配列番号２記載のアミノ酸配列、又は当該配列において少なくともアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列を有し、かつアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む前記（１）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（３）配列番号３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２２および２３記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記（２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（４）細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有し、（ａ）構成アミノ酸が修飾されているか又はされていない、かつ（ｂ）少なくともひとつのアミノ酸が非アミノ酸化合物により置換されているか又はされていないペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（５）配列番号２記載のアミノ酸配列、又は当該配列において少なくともアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列を有し、かつアミノ末端から４番目乃至１０番目までのアミノ酸配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む前記（４）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（６）配列番号３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２２および２３記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記（４）乃至（５）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（７）修飾されたアミノ酸がアミノ末端から３番目のアミノ酸である前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（８）修飾されたアミノ酸におけるアミノ酸がセリン又はシステインであることを特徴とする前記（７）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（９）アミノ酸のα炭素に、（ａ）炭素数１以上のアルキレン基を介して又は介さず、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド又はカルバミド結合を介して炭素数が１若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、又は（ｂ）Ｈ又は炭素数１以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸を含有する前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１０）エステル結合により修飾された修飾アミノ酸を有する前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１１）脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前記（１０）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１２）炭素数が２乃至３５である脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前記（１１）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１３）炭素数が２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前記（１２）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１４）結合した脂肪酸がオクタン酸（ｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（１３）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１５）結合した脂肪酸がデカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（１３）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１６）アミノ末端が炭素数１以上の飽和あるいは不飽和アルキル又はアシル基により修飾され及び／又はカルボキシル末端のカルボキシル基のＯＨがＯＺ又はＮＲ２Ｒ３（Ｚは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基、Ｒ２及びＲ３はＨ及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示す）であることを特徴とする前記（１）乃至（１５）項記載のペプチド系化合物、
（１７）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物、
（１８）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための医薬組成物、
（１９）成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を含有することからなる当該疾患を治療するための医薬組成物、
（２０）ヒト以外の動物に適用するための前記（１７）乃至（１９）記載の医薬組成物、
（２１）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を投与することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
（２２）成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物を投与することからなる当該疾患の治療方法、
（２３）ヒト以外の動物に適用するための前記（２１）乃至（２２）記載の治療方法、
（２４）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物に係るＤＮＡであって、当該ＤＮＡの塩基配列中に、少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドをコードする塩基配列を有する当該ＤＮＡ、
（２５）配列番号６、７、１４、１５、２０、２１および２４記載の塩基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列を有する前記（２４）記載のＤＮＡ、
（２６）配列番号６、７、１４、１５、２０、２１および２４記載の塩基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列のうち、アミノ酸をコードしている部分の配列を有する前記（２４）記載のＤＮＡ、
（２７）前記（２４）乃至（２６）記載のＤＮＡを有するベクター、
（２８）前記（２７）記載のベクターを含有する細胞、
（２９）前記（２４）乃至（２６）記載のＤＮＡを有するベクターを有し、且つ当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチド系化合物が、当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されたペプチド系化合物として産生することができる細胞、
（３０）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物に対する抗体、
（３１）前記（３０）記載の抗体を用いて前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物を同定することを特徴とする当該ペプチド系化合物のアッセイ方法、
（３２）前記（３０）記載の抗体を用いて前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物を検出することを特徴とする当該ペプチド系化合物の検出用キット、
（３３）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、前記（２４）乃至（２６）記載のＤＮＡを含有するベクターにより、当該ペプチド中の少なくともひとつのアミノ酸の側鎖を修飾することができる宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチド系化合物を採取することからなる当該方法、
（３４）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、前記（２４）乃至（２６）記載のＤＮＡを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取後、任意のアミノ酸を化学的に修飾することを特徴とする当該方法、
（３５）前記（１１）乃至（１５）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、配列番号８記載のアミノ酸配列中のセリン残基に脂肪酸が結合したペプチドとして産生することができる細胞を用いることを特徴とする製造方法、
（３６）前記（４）乃至（６）記載のペプチド系化合物をコードするＤＮＡを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取することを特徴とする、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチド系化合物の製造方法、
（３７）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物をコードするＤＮＡを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する少なくともひとつの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより、成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、
（３８）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物をコードするＤＮＡを有するベクターを、当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内の細胞に組み込むことにより、成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
（３９）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物をコードするＤＮＡを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する、少なくともひとつの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、および、
（４０）前記（１）乃至（１６）記載のペプチド系化合物をコードするＤＮＡを有するベクターを、当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内の細胞に組み込むことにより、成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法、
にも関する。
【００３８】
　また、具体的には、本発明は、
（１）細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有し、少なくともひとつのアミノ酸が、修飾アミノ酸及び／又は非アミノ酸化合物により置換されたことを特徴とするペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する前記（１）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（３）配列番号２記載のアミノ酸配列、又は当該配列中の　アミノ末端から７番目のアミノ酸迄の配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する前記（１）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（４）配列番号３記載のアミノ酸配列、又は当該配列中のアミノ末端から７番目のアミノ酸迄の配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する前記（１）記載のペプチド類縁体又はそれらの誘導体並びにそれらの薬学的に許容される塩、
（５）配列番号４記載のアミノ酸配列、又は当該配列中の　アミノ末端から２８番目のアミノ酸迄のアミノ酸以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する前記（３）記載のペプチド系化合物の前駆体ペプチド系化合物、
（６）配列番号５記載のアミノ酸配列、又は当該配列中のアミノ末端から２８番目のアミノ酸迄のアミノ酸以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する前記（４）記載のペプチド系化合物の前駆体ペプチド系化合物、
（７）細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（８）細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有し、少なくともひとつのアミノ酸が非アミノ酸化合物により置換された前記（７）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（９）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する前記（７）乃至（８）記載のペプチド系化合物又はそれらの誘導体並びにそれらの薬学的に許容される塩、
（１０）配列番号２記載のアミノ酸配列、又は当該配列中の　アミノ末端から７番目のアミノ酸迄の配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する前記（７）乃至（８）記載のペプチド系化合物又はそれらの誘導体並びにそれらの薬学的に許容される塩、
（１１）配列番号３記載のアミノ酸配列、又は当該配列中の　アミノ末端から７番目のアミノ酸迄の配列以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する前記（７）乃至（８）記載のペプチド系化合物又はそれらの誘導体並びにそれらの薬学的に許容される塩、
（１２）配列番号４記載のアミノ酸配列、又は当該配列中の　アミノ末端から２８番目のアミノ酸迄のアミノ酸以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する前記（１０）記載のペプチド系化合物の前駆体ペプチド系化合物、
（１３）配列番号５記載のアミノ酸配列、又は当該配列中のアミノ末端から２８番目のアミノ酸迄のアミノ酸以外の部分において、少なくともひとつのアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する前記（１１）記載のペプチド系化合物の前駆体ペプチド系化合物、
（１４）修飾されたアミノ酸がアミノ末端から３番目アミノ酸である前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１５）修飾されたアミノ酸におけるアミノ酸がセリン又はシステインであることを特徴とする前記（１４）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１６）修飾アミノ酸における修飾が、アミノ酸のα炭素において、（ａ）炭素数１以上のアルキル鎖を介して又は介さず、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド又はカルバミドからなる群から選択される結合様式で結合する炭素数が１若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、又は（ｂ）Ｈ又は炭素数１以上の飽和若くは不飽和アルキル鎖を示す前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１７）エステル結合により修飾された修飾アミノ酸を有する前記（１）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１８）脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前記（１７）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（１９）炭素数が２乃至３５である脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前記（１８）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２０）結合した脂肪酸がカプリル酸（ｃａｐｒｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（１８）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２１）結合した脂肪酸がカプリン酸（ｃａｐｒｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（１８）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２２）　結合した脂肪酸がラウリン酸（ｌａｕｒｉｃ　ａｃｉｄ）、又はそのモノエン脂肪酸若しくはそのポリエン脂肪酸である前記（１８）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
（２３）アミノ末端が炭素数１以上の飽和あるいは不飽和アルキル又はアシル基により修飾され及び／又はカルボキシル末端がＯＺ又はＮＲ２Ｒ３（Ｚは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基、Ｒ２及びＲ３はＨ及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示す）により修飾されたことを特徴とする前記（１）乃至（２２）項記載のペプチド系化合物、
（２４）前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための医薬組成物、
（２５）成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を含有することからなる当該疾患を治療するための医薬組成物、
（２６）ヒト以外の動物に適用するための前記（２４）乃至（２５）記載の医薬組成物、
（２７）前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を投与することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
（２８）成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物を投与することからなる当該疾患の治療方法、
（２９）ヒト以外の動物に適用するための前記（２７）乃至（２８）記載の治療方法、
（３０）前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物に係るＤＮＡであって、当該ＤＮＡ配列中に、少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する当該ＤＮＡ、
（３１）配列番号６記載のＤＮＡ配列を有する前記（３０）記載のｃ　ＤＮＡ（ＮＣＲ含む）
（３２）配列番号６記載のＤＮＡ配列における３１　番目から３８１番目までのＤＮＡ配列を有する前記（３０）記載のｃ　ＤＮＡ（ＮＣＲ含まない）、
（３３）配列番号７記載のＤＮＡ配列を有する前記（３０）記載のｃ　ＤＮＡ（ＮＣＲ含む）、
（３４）配列番号７記載のＤＮＡ配列における３４番目から３８５番目までのＤＮＡ配列を有する前記（３０）記載のｃ　ＤＮＡ（ＮＣＲ含まない）、
（３５）　前記（３０）乃至（３４）記載のＤＮＡを有するベクター、
（３６）前記（３５）記載のベクターを含有する細胞、
（３７）前記（３０）乃至（３４）記載のＤＮＡを有するベクターを有し、且つ当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチド系化合物が、当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチド系化合物として産生することができる細胞、
（３８）前記（１）乃至（２３）記載のペプチド系化合物に対する抗体、
（３９）前記（３８）記載の抗体を用いて前記（１）乃至（２３）記載のペプチド系化合物を同定することを特徴とする当該ペプチド系化合物のアッセイ方法、
（４０）前記（３８）記載の抗体を用いて前記（１）乃至（２３）記載のペプチド系化合物を検出することを特徴とする当該ペプチド系化合物の検出用キット、
（４１）前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、前記（３０）記載のＤＮＡを含有するベクターにより、当該ペプチド中の少なくともひとつのアミノ酸の側鎖を修飾することができる宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチド系化合物を採取することからなる当該方法、
（４２）前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、前記（３０）記載のＤＮＡを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取後、任意のアミノ酸を化学的に修飾することを特徴とする当該方法、
（４３）前記（１８）乃至（２２）記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え技術を用いて製造する方法において、配列番号１記載のアミノ酸配列中のセリン残基に脂肪酸が結合したペプチドとして産生することができる細胞を用いることを特徴とする製造方法、
（４４）前記（７）乃至（１３）記載のペプチド系化合物をコードするＤＮＡを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取することを特徴とする、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチド系化合物の製造方法、
（４５）前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物をコードするＤＮＡを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する、少なくともひとつの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、
（４６）前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物をコードするＤＮＡを有するベクターを、当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内の細胞に組み込むことにより、成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有することをペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
（４７）前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物をコードするＤＮＡを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する、少なくともひとつの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、および、
（４８）前記（１）乃至（６）記載のペプチド系化合物をコードするＤＮＡを有するベクターを、当該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内の細胞に組み込むことにより、成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有することをペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法、
にも関する。
【００３９】
　本発明において、アミノ酸とはＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、天然アミノ酸、合成アミノ酸等あらゆるアミノ酸を含む。
　本発明において修飾アミノ酸とは、上記アミノ酸の任意の基が化学修飾されているアミノ酸を意味する。特に、α−アミノ酸におけるα炭素が化学修飾されている修飾アミノ酸が好ましい。すなわち、修飾アミノ酸は、α−アミノ酸を式（１）
【化１】
2004000251.tif 000002
で表したとき、Ｒ’、Ｒ’’はＨ又は任意の置換基でよくて、要するに天然アミノ酸を化学修飾したものならどのようなものでもよい。なお、Ｒ’、Ｒ’’のいずれか一方はＨでもよい。
　Ｒ’、Ｒ’’で示される置換基としては、天然のアミノ酸に存在する置換基を、天然のアミノ酸又はそれに対応するＤ−アミノ酸に存在しない置換分で置き換えたアミノ酸を修飾アミノ酸と称す。
【００４０】
　そのような置換分として、例えば天然に存在するアミノ酸が側鎖に−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ−又は−ＮＨ２を含む場合、これらをアシル化して形成される基が好適な例として挙げられる。
　そのためのアシル基としては、例えば有機カルボン酸、有機スルホン酸、有機リン酸化合物から水酸基を除去して形成される基が挙げられる。
【００４１】
　有機カルボン酸としてはより具体的には、脂肪酸が挙げられ、その炭素数は好ましくは２〜３５、より好ましくは６〜１８、最も好ましくは８〜１６である。そのような脂肪酸としては、具体的には、オクタン酸（好ましくは、カプリル酸）、デカン酸（好ましくは、カプリン酸）、ドデカン酸（好ましくは、ラウリル酸）、それらのモノエン又はポリエン脂肪酸等が挙げられる。
　有機スルホン酸または有機リン酸化合物についても、その炭素数は２〜３５のものが好ましい。
【００４２】
　又、さらに修飾アミノ酸は上記のＲ’又は／及びＲ’’で示される基を例えば式
【化２】
2004000251.tif 000003
で置き換えたアミノ酸であってもよい。さらにＰは−ＣＯ−でもよい。
　さらに、Ｐは−Ｓ−Ｓ−、又は−ＮＨ−ＣＳ−であってもよい。又上記全ての−ＮＨ−において、ＨがＣ１〜３５の飽和又は不飽和アルキル基、Ｃ６〜２０のアリール基、Ｃ７〜１３のアラルキル基で置換されていてもよい。
【００４３】
　α−アミノ酸を上記式（１）で表した場合に、Ｒ’又はＲ’’を上記の−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ−Ｑで置き換えた修飾アミノ酸は好ましい実施の態様である。特にアミノ酸がセリンのα炭素に上記の式の−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ−Ｑで示される置換基が結合した式
【化３】
2004000251.tif 000004
（式中、ｎ、ＰまたはＱは上記定義に同じ。）
で示される修飾セリンが好ましい。
【００４４】
　炭素数１以上のアルキル基を介して又は介さずエステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド又はカルバミドからなる群から結合様式についてさらに説明する。
　例えば、アミノ酸がセリン、トレオニン、チロシン又はオキシプロリンである場合は、そのアミノ酸は側鎖に水酸基を有する。アミノ酸がシステインである場合は、そのアミノ酸は側鎖にメルカプト基を有する。アミノ酸がリジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリン又はオキシプロリンである場合は、側鎖にアミノ基又はイミノ基を有する。
【００４５】
　これらの水酸基、メルカプト基、アミノ基、イミノ基は化学修飾されていてもよい。すなわち水酸基又はメルカプト基はエーテル化、エステル化、チオエーテルか又はチオエステル化されていてもよい。イミノ基はイミノエーテル化、イミノチオエーテル化、アルキル化されていてもよい。アミノ基はアミド化、チオアミド化又はカルバミド化されていてもよい。
　また、メルカプト基はジスルフィド化されていてもよく、イミノ基はアミド化、又はチオアミド化されていてもよく、アミノ基はアルキル化又はチオカルバミド化されていてもよい。
【００４６】
　そのように化学修飾された水酸基又はメルカプト基は例えば式
【化４】
2004000251.tif 000005
で表わすことができ、アミド化又はチオアミド化されたアミノ基又はイミノ基は
【化５】
2004000251.tif 000006
で表わすことができ、エーテル化された水酸基又はメルカプト基は式、
【化６】
2004000251.tif 000007
で表わすことができ、イミノエーテル化又はイミノチオエーテル化されたイミノ基としては式
【化７】
2004000251.tif 000008
で表わすことができ、アルキル化されたアミノ基として式
【化８】
2004000251.tif 000009
で表すことができ、アルキル化されたイミノ基として式
【化９】
2004000251.tif 000010
で表わすことができ、カルバミド化又はチオカルバミド化されたイミノ基として式
【化１０】
2004000251.tif 000011
で表わすことができ、ジスルフィド化されたメルカプト基は、式
―Ｓ―Ｓ―Ｚ８
で表わすことができる。
【００４７】
　上記式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７及びＺ８は本発明の精神に反しない限り、どのような化学修飾のための置換基であってもよいが、医薬品分野で常用されるあるいはペプチドのための化学修飾のための置換基が特許文献上又は学術文献上もよく知られているので、本発明においてもそのような自体公知の修飾のための置換基を採用することができ、かつ化学修飾はそのような従来公知の方法に従って行われてよい。
【００４８】
　上記式において、Ｚ１は水素原子又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基であってよく、かかるアルキル基は飽和であってもよく、不飽和であってもよい。炭素数は通常はＣ１−５０、好ましくはＣ６−２０である。
　Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７又はＺ８は水素原子又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基であってよく、かかるアルキル基は飽和又は不飽和であってよい。炭素数は通常Ｃ１−１０、好ましくはＣ１−６である。
【００４９】
　かかるＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７又はＺ８で表されるアルキル基は、例えば、水酸基、アミノ基、ハロゲン、ニトロ、Ｃ１−３のアルコキシ基等通常ペプチドの化学修飾に使われる置換基で置換されていてもよい。
【００５０】
　上記において、
【化１１】
2004000251.tif 000012
の残基である場合は、脂肪酸が結合したアミノ酸の一例である。その場合の脂肪酸としては、例えばカプリル酸、カプリン酸、ララリン酸、酪酸、カプロン酸、ウンデシル酸、パルミチン酸、デカン酸、ノナデカン酸、ベヘン酸、モンタン酸、若しくはラクセン酸などの飽和脂肪酸、例えばアクリル酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、若しくはアアテアロール酸などの不飽和脂肪酸が挙げられる。不飽和脂肪酸はモノエンであってもよいし、ポリエンであってもよい。
【００５１】
　又さらに、修飾アミノ酸はα−アミノ酸の炭素にα炭素に結合する、ペプチド結合を構成するカルボキシル基とアミノ基以外の基を水素原子又は飽和又は不飽和アルキル基で置換することにより形成されるα−アミノ酸であってもよい。
　又さらに、本発明において修飾アミノ酸は、アミノ酸のアミノ基に炭素数１乃至６の飽和又は不飽和アルキル基で置換することにより形成されるアミノ酸であってもよい。
　本発明における非天然アミノ酸としては、アミノ基とカルボキシル基を分子の両端に有するものであって、例えば、ＮＨ２−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＯＯＨ　、ＮＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ、又はＮＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯＯＨ　等が挙げられる。これらはいずれも、分子鎖長がジペプチド相当長であるが、分子鎖長がペプチド相当長のものも当然含まれる。
【００５２】
　また、本発明における非アミノ酸化合物としては、例えば、ＮＨ２−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＨ３、ＣＨ３−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯＯＨ、ＣＨ３−ＣＨ（Ｒ）−ＣＨ３（いずれも、分子鎖長がペプチド相当長）、又はＮＨ２−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＨ３、ＮＨ２−（ＣＨ２）３ＣＨ（Ｒ）−ＣＨ３　（いずれも、分子鎖長がジペプチド相当長）等も含まれる。
　ここで、Ｒは、天然アミノ酸の側鎖又は上述した修飾アミノ酸のα炭素の置換基を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
　ＧＨＳレセプター（ＧＨＳ−Ｒ）の内在性リガンドとなるペプチドについては、ＧＨＳ−Ｒを発現している細胞に各種臓器又は組織の抽出物を添加し、細胞内カルシウムイオン濃度を測定することにより、当該内在性リガンドの臓器・組織間での分布を知ることができる。
　ＧＨＳ−Ｒを発現している細胞としては、恒常的にＧＨＳ−Ｒを発現していることが知られている視床下部及び脳下垂体、及びそれらの組織由来の細胞株があるが、ＧＨＳ−Ｒ遺伝子を適当な細胞、例えばＣＨＯ細胞に導入・発現させた形質転換細胞が望ましい。
【００５４】
　本願発明の内在性ＧＨＳペプチドにおいては、該ペプチドが発現している視床下部及び脳下垂体ではなく、消化器系の臓器である胃の抽出物に強いＣａ上昇活性が認められた。従って、目的のオーファン・レセプターの内在性リガンドを見いだすためには、該レセプターが発現している組織・臓器ばかりではなく、他の組織・臓器も広く探索することが必要である。
【００５５】
　細胞内カルシウムイオン濃度の測定法は公知の方法が利用できるが、望ましくは、カルシウムイオン濃度変化によるＦｌｕｏ−４　ＡＭ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社）の蛍光強度の変化を利用したＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）がよい。
　Ｃａ上昇活性が確認された組織・臓器の抽出物から、目的の内在性ＧＨＳペプチドを生成するためには、公知の精製方法を用いることができる。
【００５６】
　ペプチドの精製法としては、各種分画法による分画後、ゲル濾過、イオン交換及び逆相クロマトグラフィーを、単独又は組み合わせて用いるが有効であるが、必ずしも該クロマトグラフィーによる精製にこだわる必要はなく、ペプチドの精製に有効である手段は何でも利用可能である。
【００５７】
　また、組織・臓器よりペプチドを単離・精製する際には、組織・臓器に存在するプロテアーゼの作用による目的ペプチドの分解を防止するために、組織・臓器を沸騰水中で熱処理することによりプロテアーゼを失活させることが望ましい。熱処理し組織・臓器を氷冷除去することも、目的ペプチドの抽出・精製に効果がある。
　精製されたＣａ上昇活性を有するペプチドが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏでＧＨ分泌誘導活性を確認するためには、公知の方法を利用することができる。
　例えばｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、ＧＨを分泌してＧＨＳ−Ｒの発現も確認されている脳下垂体細胞に添加して、細胞培養液中に分泌されるＧＨを、抗ＧＨ抗体を用いたラジオイムノアッセイによって測定することができる。また上記ラジオイムノアッセイ法において、抗ＧＨ抗体の代わりに他のホルモンに対する抗体を用いれば、該ホルモンの分泌量も測定できる。
【００５８】
　ｉｎ　ｖｉｖｏでのＧＨ分泌誘導活性を確認するためには、Ｃａ上昇活性を有するペプチドを動物の末梢静脈に注射した後の血清中のＧＨ濃度を測定すればよい。
　精製されたペプチドの構造解析には、公知の方法が使用可能である。
　ペプチドのアミノ酸配列を決定するためには、エドマン分解法によりカルボキシル末端より逐次アミノ酸残基を遊離して、該遊離アミノ酸を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってアミノ酸を同定する方法、及び該方法を自動化したアミノ酸シーケンサーによる方法がある。
【００５９】
　また、ＧＣ−ＭＡＳＳによってイオン化したフラグメントの分子量を測定することにより、アミノ酸配列を決定する方法もある。
　本願発明の１つである修飾アミノ酸を含有するペプチドの場合は、上記アミノ酸配列を決定する際に修飾アミノ酸が「未知アミノ酸」と同定される。
【００６０】
　この場合、当該修飾ペプチドをアミノ酸単位に分解後、修飾アミノ酸を分離・精製して、常用される化合物構造決定法によって修飾アミノ酸を構造決定し、ペプチド全体の構造を知ることができる。また、修飾ペプチドをコードするｃＤＮＡから得られる該ペプチドのアミノ酸配列を有するペプチドを化学合成し、当該合成非修飾ペプチドと修飾ペプチドの分子量や物性等から修飾基の構造を推定する方法もある。
【００６１】
　構造決定されたペプチド中での、Ｃａ上昇活性に必要な部分のアミノ酸配列（コア配列）は、該ペプチドをプロテアーゼで切断して生成するペプチド断片のＣａ上昇活性を測定することによって明らかにされる。
　用いられるプロテアーゼは、切断するペプチドのアミノ酸配列に特異性の高いプロテアーゼを用いてよいが、特異性が低くても部分分解の条件で反応させることにより該ペプチドから様々なペプチド断片が調製できる。
【００６２】
　このようにして調製されたペプチド断片のＣａ上昇活性を測定することにより、Ｃａ上昇活性に必須のコア配列を知ることができる。
　内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドは、アミノ末端から３番目のセリンが脂肪酸によりアシル化されているが、内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドのアミノ酸配列の一部をもったペプチド断片および当該ペプチド断片のセリンの側鎖に脂肪酸がエステル結合した脂肪酸修飾ペプチドは化学的に合成することもできる。
【００６３】
　該合成ペプチド断片により内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドについて詳細に解析できる。同時に、種々の脂肪酸で修飾したペプチド断片を比較することにより、Ｃａ上昇活性に必要な脂肪酸の種類を決めることができる。
　例えばアフリカツメガエルなど種によっては、内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドは、アミノ末端から３番目アミノ酸残基がセリンではなくトレオニンであり、かかるトレオニンが脂肪酸によりアシル化されているが、かかるペプチド系化合物についても合成することもでき、該化合物を詳細に解析できる。
【００６４】
　また、脊椎動物におけるＧＨ分泌誘導活性を有するペプチドのアミノ酸配列を比較することにより、脊椎動物で広く保存されている領域を見いだし、該領域のアミノ酸配列からＧＨ分泌誘導活性に必須のコア配列を見いだすことができる。
　内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドのアミノ酸配列から推定される塩基配列を持つＤＮＡを化学合成し、該ＤＮＡをプローブとして該ペプチドが発現している細胞のｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、当該ペプチドをコードするｃＤＮＡを取得することができる。
【００６５】
　しかし、アミノ酸に対応するコドンは縮重しており、ペプチドのアミノ酸配列から推定される塩基配列が多くなり、このような多種類の塩基配列からる合成ＤＮＡをプローブとしたスクリーニグが困難になることがある。
　そのような場合で、当該ペプチドのアミノ酸配列と一致する配列が、配列データベースにおいて公開された発現ＤＮＡ断片（ＥＳＴ；　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）の塩基配列から想定されるアミノ酸配列にある場合は、該ＥＳＴの塩基配列の一部からなるＤＮＡを合成して、上記ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いることもできる。
【００６６】
　また、ｃＤＮＡからゲノムＤＮＡを取得することは、常用される方法で行うことができる。
　このようにして取得されたｃＤＮＡの塩基配列から、内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列が明らかにされる。
　当該アミノ酸配列を解析することにより、シグナルペプチド、内在性ＧＨ分泌誘導ペプチド及びその他のペプチド部分、及びこれらのペプチドの切断点が明らかになり、内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの生成機構が明らかになる。
【００６７】
　なお、本願発明の１つである内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの一部のアミノ酸配列、当該ペプチドの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列が、国際出願公開ＷＯ　９８／４２８４０において開示されているが、該出願で開示されたペプチドはモチリン（ｍｏｔｉｌｉｎ）様活性を有する１４アミノ酸からなるペプチドであり、本願発明で開示されたＣａ濃度上昇活性やＧＨ分泌誘導活性については記載がない。
　本願発明に係るペプチド系化合物とは、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有し、次式（２）で示される構造において、少なくとも１つアミノ酸が修飾アミノ酸で置換されているペプチド、又は少なくとも１つのアミノ酸が非アミノ酸で置換されたペプチド類縁体、及びそれらのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端が修飾されたペプチド誘導体をいう。
【００６８】
　本発明において、上記のペプチド、ペプチド類縁体及びペプチド誘導体をペプチド系化合物と総称する。
　また、当該ペプチド系化合物において、複数のアミノ酸が修飾アミノ酸及び／又は非アミノ酸で置換されてもよい。本発明においては、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、通常アミノ末端から１〜１０番目、好ましくはアミノ末端から１〜４又は１〜５番目のアミノ酸の１又は複数が修飾アミノ酸及び／又は非アミノ酸で置換されているのが好適である。中でも、１〜５番目のアミノ酸が修飾アミノ酸及び／又は非アミノ酸で置換されているのが好適である。
　また、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、アミノ末端から１〜４番目以外の部分で、好ましくは１〜６番目以外の部分で、より好ましくは１〜１０番目以外の部分でのアミノ酸の１又は複数が欠失又は付加されていてもよい。
【００６９】
　本発明のペプチド系化合物は好ましくは細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び生体内で成長ホルモンの分泌を誘導するペプチドであって、少なくとも一つのアミノ酸が修飾アミノ酸及び／又は非アミノ酸化合物により置換された化合物である。
　すなわち、本発明におけるペプチド系化合物は、細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性又は／及び生体内成長ホルモン分泌誘導作用を有し、ペプチド鎖においてアミノ酸が修飾アミノ酸又は／及び非アミノ酸化合物で置換されたペプチド系化合物である。
【００７０】
　そのような化合物の具体例として配列番号１、２又は３が示すペプチドにおいて第３番目のアミノ酸Ｓｅｒの水酸基がアシル化された化合物、配列番号４又は５が示すペプチドにおいて第２５番目アミノ酸Ｓｅｒの水酸基がアシル化された化合物又はその薬理学的に許容される塩が挙げられる。
　また、他の具体例としては、配列番号１０、１１、１６又は１７が示すペプチドにおいて第３番目のアミノ酸Ｓｅｒの水酸基がアシル化された化合物又はその薬理学的に許容される塩が挙げられる。
【００７１】
　さらに他の具体例としては、配列番号２２、２５、２６又は２７が示すペプチドにおいて第３番目のアミノ酸Ｓｅｒの水酸基がアシル化された化合物又はその薬理学的に許容される塩が挙げられる。
　またさらに他の具体例としては、配列番号２９、３０又は３１が示すペプチドにおいて第３番目のアミノ酸Ｓｅｒの水酸基がアシル化された化合物又はその薬理学的に許容される塩が挙げられる。
　また、配列番号２８が示すペプチドにおいて第３番目のアミノ酸Ｔｈｒの水酸基がアシル化された化合物又はその薬理学的に許容される塩が挙げられる。
【００７２】
　本発明におけるアシル化によって水酸基に導入されるアシル基は例えば有機カルボン酸、有機スルホン酸、有機リン酸化合物から水酸基を除去して形成される基である。
　有機カルボン酸としてはより具体的には、脂肪酸が挙げられ、その炭素数は好ましくは２〜３５程度、より好ましくは６〜１８程度、最も好ましくは８〜１６程度である。そのような脂肪酸としては、具体的には、オクタン酸（好ましくは、カプリル酸）、デカン酸（好ましくは、カプリン酸）、ドデカン酸（好ましくは、ラウリル酸）、それらのモノエン又はポリエン脂肪酸等が挙げられる。
　有機スルホン酸、有機リン酸化合物として、その炭素数が２〜３５程度のものが好ましい。
【００７３】
　第３番目のＳｅｒの水酸基がアシル化されている配列番号１のアミノ酸配列を含む、いかなるペプチド系化合物又はその薬理学的に許容される塩も本発明における好ましい実施の態様である。
　すなわち、本願発明の第２は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、望ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列、より望ましくは配列番号９に記載のアミノ酸配列において第３番目のＳｅｒの水酸基がアシル化されている脂肪酸修飾ペプチド含む、いかなるペプチド系化合物又はその薬理学的に許容される塩も本発明における好ましい実施の態様である。
【００７４】
　また、配列番号８に記載のアミノ酸配列、望ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列、より望ましくは配列番号９に記載のアミノ酸配列のアミノ末端から３番目のアミノ酸残基セリンをトレオニンに変換したアミノ酸配列において第３番目のＴｈｒの水酸基がアシル化されている脂肪酸修飾ペプチド含む、いかなるペプチド系化合物又はその薬理学的に許容される塩も本発明における好ましい実施の態様である。
【００７５】
　さらに又、本発明の好ましい実施の態様は下記一般式（２）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩である。
　　　　　Ｘ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−Ｙ　　　　（２）
〔式中、Ｘは、アミノ末端アミノ酸のアミノ基の水素原子に相当する部分で、Ｈ又は炭素数が１又は複数の飽和又は不飽和アルキル又はアシル基を表す。Ｙはカルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基の水酸基に相当する部分で、ＯＨ、ＯＺ又はＮＲ６Ｒ７（Ｚは薬理学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖もしくは非分枝鎖アルキル基を表し、Ｒ６又はＲ７はＨ又は低級の分枝鎖もしくは非分枝鎖アルキル基を表し、Ｒ６とＲ７とは同一又は異なっていてもよい。）を表す。〕
【００７６】
　ここで、ＡＡ１は、式
【化１２】
2004000251.tif 000013
（式中、ｎは１又は２を表し、Ｒ１とＲ１’は、同一であっても異なっていてもよく、水素又は置換基を表す。）
で表される。
　ただし、ｎが２のときは、その二つの置換基、Ｒ１は同一であってもよいし異なっていてもよい。又、Ｒ１’についても同様である。
【００７７】
　置換基の具体例としては、（１）炭素数１以上のアルキル鎖を介し又は介せず、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド又はカルバミドからなる群から選択される結合様式で結合する炭素数１以上の飽和もしくは不飽和アルキル鎖、（２）Ｈ又は炭素数１以上の飽和もしくは不飽和アルキル鎖、又は（３）天然アミノ酸の側鎖等が挙げられる。
　また、炭素数１以上のアルキル鎖を介し又は介せず、ジスルフィド又はチオカルバミド結合で結合する炭素数１以上の飽和もしくは不飽和アルキル鎖であってもよい。
【００７８】
　ＡＡ２は、式
【化１３】
2004000251.tif 000014
（式中、Ｒ１とＲ１’は前記と同意義。Ｒ２は、Ｈ又は炭素数１乃至６の飽和或いは不飽和アルキル基を表す。）
又は、−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ１）−ＣＨ２−、或いは−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ１）−ＣＯ−（Ｒ１は前記と同意義）を表す。
【００７９】
　ＡＡ３は、式
【化１４】
2004000251.tif 000015
（式中、ｍは１以上の整数を表し、Ｒ１、Ｒ１’又はＲ２は、前記と同意義。）
ただし、ｍが２以上の整数のときは、その二つの置換基、Ｒ１は同一であってもよいし異なっていてもよい。又Ｒ１’Ｒ２についても同様である。
【００８０】
　Ｘで示される炭素数が１以上の飽和又は不飽和アルキルとしては具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−デシル、ビニル、プロパニル又はヘキセニル等のＣ１−２０のアルキルが好ましい。
　Ｘで示されるアシルとしては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、若しくはベンゾイル等のＣ１−１０カルボン酸アシル；又はベンゼンスルホニルナフタレンスルホニル等のＣ７−１３のスルホン酸アシルが挙げられる。
【００８１】
　Ｒ１又はＲ１’で示される基は例えば式（２）
【化１５】
2004000251.tif 000016
−ＮＨ−ＣＯ−又は−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−を表し、ＱはＨ又は上記したＸで
示されるＣ１−２０のアルキルを表す。）
で示される基が好ましい。さらにＰは−ＣＯ−でもよい。
　さらに、Ｐは−Ｓ−Ｓ−、又は−ＮＨ−ＣＳ−であってもよい。また、上記全ての−ＮＨ−において、ＨがＣ１〜３５の飽和又は不飽和アルキル基、Ｃ６〜２０のアリール基で、Ｃ７〜１３のアラルキル基で置換されていてもよい。
【００８２】
　より好ましくは、Ｐは
【化１６】
2004000251.tif 000017
　また、Ｒ１又はＲ１’で示される基は、Ｐを介さずに−（ＣＨ２）ｎにＱが結合している基であってもよい。
　Ｚ、Ｒ６又はＲ７で示される低級のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ｎ−ペンチル又はｎ−ヘキシル等のＣ１−６のアルキルが好ましい。
【００８３】
　次に、本願発明に係るペプチド化合物の好ましい態様を以下に示す。
（１）ＡＡ１の好ましい態様；（ア）アミノ酸又はペプチド。例えば、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ又は−ＮＨ−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＯ−（２アミノ酸残基間のペプチド結合部分が−（ＣＨ２）２−である場合）等が挙げられる。（イ）一級アミン。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２−（２アミノ酸残基間のペプチド結合部分が−（ＣＨ２）２−である場合）、−ＮＨ−（ＣＨ２）３ＣＨ（Ｒ１）ＣＨ２−（２アミノ酸残基間のペプチド結合部分が−（ＣＨ２）２−である場合）〔Ｒ１は前記と同意義。〕、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２−等が挙げられる。
【００８４】
　また、（ア）アミノ酸又はペプチドとして、ＮＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ、又はＮＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯＯＨも挙げられる。
（２）ＡＡ２の好ましい態様；（ア）アミノ酸。例えば、Ｓｅｒ、ｈｏｍｏＳｅｒ、Ｃｙｓ、ｈｏｍｏＣｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ｈｏｍｏＬｅｕ、Ｉｌｅ、ｈｏｍｏＩｌｅ、オルニチン、アミノアジピン酸、メチオニン、エチオニン、ブチオニン、又はＳ−メチルシステイン等が挙げられるが、特にＳｅｒが好ましい。（イ）アミノ酸残基以外の構造；−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ１）−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ１）−ＣＨ２−等が挙げられる（Ｒ１は前記と同意義。）。
【００８５】
　特に、（ａ）疎水性側鎖を有するロイシン、バリン、ノルロイシン、ホモロイシン、ホモイソロイシン、ナフチルアラニン類、トリプトファン、フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン等、あるいは、これらのＮ−メチルアミノ酸が好ましい。また（ｂ）側鎖にアシル基、アルキル基、アルケニル基あるいはアラルキル基で修飾が可能な官能基を有する、セリン、ホモセリン、トレオニン、システイン、ホモシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アジピン酸、リジン、オルニチンなど、およびこれらのＮ−メチルアミノ酸が好ましい。
【００８６】
　これら（ｂ）のアミノ酸側鎖に、エステル、アミド、ジスルフィド、エーテル、チオエーテル、チオエステル，カルバミドまたはチオカルバミド結合を介し、アシル基、アルキル基、アルケニル基あるいはアラルキル基が結合する。また、アミノ酸のα炭素にアルキル、アラルキル基が結合してもよい。
【００８７】
　（３）ＡＡ３の好ましい態様；アミノ酸又はペプチド。例えば、Ｐｈｅ又は配列番号２又は３記載のアミノ酸配列においてアミノ末端から４番目のＰｈｅから２８番目のＡｒｇまでのアミノ酸配列を有するペプチド若くは当該配列のカルボキシル末端側のアミノ酸が、配列番号２又は３記載のアミノ酸配列においてアミノ末端から５番目のＬｅｕまで１つずつ欠失したペプチド。
例えば、
Phe Leu、
Phe Leu Ser、
Phe Leu Ser Pro、
Phe Leu Ser Pro Glu、
Phe Leu Ser Pro Glu His、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala Lys、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala Lys Leu、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala Lys Leu Gln、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala Lys Leu Gln Pro、　又は、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg、
がＡＡ３の例として挙げられる。
【００８８】
　又さらに、ＡＡ３の例示において、アミノ酸はＬ−アミノ酸でもＤ−アミノ酸でもよいことはいうまでもない。又、ＡＡ３の上記例示において、例えば１〜数個のアミノ酸（好ましくはアミノ酸配列の約３分の１程度まで）は、非天然アミノ酸又は非アミノ酸単位、例えば
　　　−ＮＨ−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−
　　　−ＮＨ−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＯ−
　　　−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２−
　　　−ＮＨ−（ＣＨ２）３ＣＨ（Ｒ１）ＣＨ２−
　　　−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ１）−ＣＯ−、又は
　　　−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ１）−ＣＨ２−
（上記式中Ｒ１は前記と同意義）
で置き換えられてもよい。上記式で示される基がＡＡ３に複数個あり、しかもＲ１で示される基が複数個ある時、それらは同一又は異なる。
　又、さらに、ＡＡ３の例示における各アミノ酸のいずれも上記Ｒ１で示される置換基を有してよい。ＡＡ３で示される基において、Ｒ１が複数個存在する時は、それらは同一であっても異なっていてもよい。
【００８９】
　以下にペプチドを構成するアミノ酸が側鎖に水酸基、メルカプト基、イミノ基又はアミノ基を有する場合の当該側鎖の好ましい例を示す。なお、以下のＲ８は炭素数１以上の飽和又は不飽和アルキル鎖を示す。かかるアルキル鎖はＸで示される上記のアルキル鎖と同意義でよい。
【００９０】
ア）Ｓｅｒの側鎖；−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｒ８又は−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ８、
イ）ｈｏｍｏＳｅｒの側鎖；−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｒ８又は−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ８、
ウ）Ｃｙｓの側鎖；−ＣＨ２−Ｓ−ＣＯ−Ｒ８又は−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ８、
エ）ｈｏｍｏＣｙｓの側鎖；−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＯ−Ｒ８又は−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ８、
オ）Ａｓｐの側鎖；−ＣＨ２−ＣＯＯ−Ｒ８又は−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ８、
カ）Ｇｌｕの側鎖；−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ−Ｒ８又は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ８
キ）Ｌｙｓの側鎖；−（ＣＨ２）４−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ８、
ク）アミノアジピン酸の側鎖；−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ−Ｒ８又は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ８、
ケ）オルニチンの側鎖；−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ８
コ）側鎖がアルキル鎖のアミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ホモロイシン、Ｉｌｅ、ホモイソロイシン、Ｓ−メチルシステイン、メチオニン、エチオニン、又はブチオニン等についても同様にアルキル基が上記のように式（２）で示される修飾されたアルキル基であってよい。
【００９１】
　又、さらに本発明は、配列番号２又は３のアミノ酸配列において、アミノ末端から１３、１４又は１５番目までのアミノ酸からなる部分ペプチドを含有する細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤もしくはＧＨ分泌誘導剤も、好ましい実施の態様として含むものである。この場合の部分ペプチドを構成する各アミノ酸単位は必ずしも化学修飾されている必要はない。
【００９２】
　さらに又、本発明の好ましい実施の態様は下記のペプチド系化合物である。
　なお、グレリン誘導体とは天然型グレリンの化学構造を一部改変したペプチド系化合物のことをいい、短鎖グレリンとは２７ないし２８アミノ酸からなる天然型グレリンの一部のアミノ酸が欠失して、２７ないし２８よりも少ないアミノ酸からなるペプチドのことをいう。また、ｎ位のアミノ酸残基とはアミノ末端からｎ番目のアミノ酸残基のことを示す。
　グレリン、あるいはその短鎖グレリン誘導体のアミノ末端アミノ酸は、該アミノ酸のαアミノ基が保護されていなければ、いずれのアミノ酸（天然型グレリンではアミノ末端アミノ酸はグリシン）でもよく、またＤ−体、Ｌ−体のいずれでもよいが、好ましくは、アラニン、バリン、アミノイソブタン酸などが好適である。
【００９３】
　２位残基は、いずれのアミノ酸（天然型グレリンではセリン）でもよいが、好ましくは小さな側鎖を有するアラニン、セリン、ヒスチジン、ノルバリンあるいは非アミノ酸化合物等が好適である。
　１位と２位残基は、アミノ酸２残基に相当するδ−アミノ酸、例えば実施例で示した５−アミノペンタン酸や、５−アミノ−５−ジメチルペンタン酸、２、５−ジアミノペンタン酸等であってもよい。
【００９４】
　３位と４位に選ばれるアミノ酸残基は、Ｄ−体、Ｌ−体いずれでもよく、Ｄ−あるいはＬ−Ｎ−メチルアミノ酸であってもよく、これらのいずれの組み合わせであってもよい。中でも、３位がＬ−体、または３位、４位ともＬ−体の組み合わせが好ましい。
　３位と４位に選ばれるアミノ酸残基の立体配置は、１位および２位のアミノ酸配列により適宜選択できる。即ち、天然のグレリンの１位と２位のアミノ酸配列、Ｇｌｙ−Ｓｅｒは３位と４位ともにＬ−体であることが好ましいが、他のアミノ酸配列、例えば、Ａｉｂ−Ｈｉｓ等のの場合は３、４位がともにＤ−体であってもよい。また、１、２位が２残基相当長のδ−アミノ酸、例えばアミノペンタン酸である場合は、３、４位はＬ−体，　Ｄ−体のいずれであってもよい。
【００９５】
　３位と４位に選ばれるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｄ−体あるいはＬ−体のロイシン、バリン、ノルロイシン、ホモロイシン、ホモイソロイシン、ナフチルアラニン類、トリプトファン、フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、およびこれらのＤ−、あるいはＬ−Ｎ−メチルアミノ酸が好適である。
　特に、３位と４位に選ばれるアミノ酸残基は、上記疎水性アミノ酸の中でも、例えば、ナフチルアラニン類、トリプトファン、フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニンなどの芳香族の疎水性アミノ酸がより好ましい。
【００９６】
　また、３位と４位に選ばれるアミノ酸残基としては、リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性アミノ酸も好ましい。なかでもリジンが好ましい。
これら塩基性アミノ酸により、グレリン分子が塩基性となり、Ｃａ上昇活性がより向上する。
　３位と４位に選ばれるアミノ酸残基は、側鎖にアシル基（アルカニル基、アルケノニル基もしくはアリールアルカニル基など）、アルキル基、またはアラルキル基で修飾が可能な官能基を有する、セリン、ホモセリン、トレオニン、システイン、ホモシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アジピン酸、リジン、オルニチンなどが好適である。
【００９７】
　これらの側鎖に反応性を有するアミノ酸は、Ｄ−体またはＬ−体のいずれでもよく、対応するＤ−あるいはＬ−Ｎ−メチルアミノ酸であってもよいが、中でも、３位がＬ−体、または３位、４位ともＬ−体の組み合わせが好ましい。
　また、アミノ酸側鎖に、カルバメイト、チオカルバメイト、エステル、アミド、ジスルフィド、エーテル、チオエーテルもしくはチオエステル結合等を介し、アシル基、例えばアラカニル基（炭素数が２〜３５、好ましくは６〜１８、より好ましくは８〜１２）、アルケノニル基（炭素数が２〜３５、好ましくは６〜１８、より好ましくは８〜１２）、アリールアルカニル基（ベンゾイル、フェナセチル、フェニルブチリル、ナフトイル、ナフチルアセチルもしくはナフチルプロピオニル基など）；アルキル基（炭素数が２〜３５、好ましくは６〜１８、より好ましくは８〜１２）；または、アラルキル基（ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチル、ナフチルメチル基等）が結合していてもよい。また、結合を介さずに、３位と４位のα炭素に上記のアルキル基、アラルキル基が結合してもよい。
【００９８】
　３位と４位に選ばれるアミノ酸残基の組み合わせとしては、３位のアミノ酸残基が疎水性の側鎖を有し、４位のアミノ酸剤が疎水性アミノ酸であることが好ましい。
　疎水性の側鎖を有する３位のアミノ酸残基としては、アミノ酸のα炭素に、（ａ）炭素数１以上のアルキレン基を介して又は介さず、エステル、エーテル、チオエーテル、アミドまたはジスルフィド結合を介して炭素数が１若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、又は（ｂ）炭素数１以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸が好ましい。特に、アミノ酸のα炭素に炭素数１以上の飽和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸がより好ましい。
　４位アミノ酸のカルボキシル基が、アミド、メチルアミドもしくはエチルアミド等のアルキルアミド、またはベンジルアミド、アダマンタンアミドもしくはアダマンタンアルキルアミド等のアラルキルアミドであってもよい。
【００９９】
　また、アルキルアミド、あるいはアラルキルアミドに、アミノ基またはグアニジド基などの塩基性基を結合してもよい。かかる塩基性基としては、例えば、−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＮＨＣＨ３，−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＣＯＮＨＣＨ２Ｐｈ−ＮＨ２などが挙げられる。
　４位アミノ酸のカルボキシル基に、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸を付加してもよく、これら塩基性アミノ酸はＤ−体、Ｌ−体もしくはラセミ体、またはＤ−もしくはＬ−Ｎ−メチルアミノ酸のいずれであってもよい。
　これらのアミノ酸のカルボキシル基は、上述のように、アルキルアミドまたはアラルキルアミドであってよい。さらに、アルキルアミドあるいはアラルキルアミドに、アミノ基、グアニジド基など塩基性基を結合してもよい。かかる塩基性基としては、上述のものなどが挙げられる。
【０１００】
　５位以降のアミノ酸配列は、ヒトグレリン、ラットグレリンの５位ロイシンを基点に２８位まで、いずれの長さの配列が４位のアミノ酸に付加してもよい。
好ましくはグレリン（１−５）、グレリン（１−６），グレリン（１−７），グレリン（１−８），グレリン（１−９），グレリン（１−１０）、グレリン（１−１１）が挙げられる。なお、グレリン（ｍ−ｎ）とは、グレリンのアミノ末端からｍ番目よりｎ番目までのアミノ酸配列を有するペプチドを示す。とくに、グレリン（１−５）がより好ましい。
【０１０１】
　そのカルボキシル末端は、上述のようなアルキルアミド、またはアラルキルアミドであるのが好ましい。
　また、アルキルアミドまたはアラルキルアミドに、さらにアミノ基またはグアニジド基などの塩基性基を結合させてもよい。かかる塩基性基としては、上述のものなどが挙げられる。
【０１０２】
　また、５位以降から２８位までのいずれかのアミノ酸配列をグレリン（１−４）カルボキシル末端部に付加したカルボキシル末端部欠損グレリン誘導体のカルボキシル末端アミノ酸にアルギニン、リジン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸を付加してもよい。
　これら塩基性アミノ酸はＤ−体、Ｌ−体もしくはラセミ体、又はＤ−もしくはＬ−Ｎ−メチルアミノ酸であってもよい。
　また、これらの塩基性アミノ酸のカルボキシル基が、上述のようにアルキルアミド、またはアラルキルアミドであってもよい。アルキルアミドまたはアラルキルアミドは、さらにアミノ基またはグアニジド基などの塩基性基を結合してもよい。かかる塩基性基としては、上述のものなどが挙げられる。
【０１０３】
　とくに好ましい態様としては、グレリン（１−５）、グレリン（１−６），グレリン（１−７）のカルボキシル末端アミノ酸は、Ｄ−体、Ｌ−体、又は対応するＤ−もしくはＬ−Ｎ−メチルアミノ酸である場合が挙げられる。
　また、５，６，７位の残基にアルギニン、リジン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸を付加してもよく、これらのアミノ酸はＤ−体、Ｌ−体あるいはラセミ体、又はＤ−、あるいはＬ−Ｎ−メチルアミノ酸であってもよい。
　また、これらの塩基性アミノ酸のカルボキシル基が、上述のようなアルキルアミド、またはアラルキルアミドであってもよい。アルキルアミドまたはアラルキルアミドに、さらにアミノ基またはグアニジド基などの塩基性基を結合してもよい。かかる塩基性基としては、例えば、上述のものなどが挙げられる。
【０１０４】
　本発明に係るペプチド化合物は、上記のように、カルボキシル末端がアルキルアミドまたはアラルキルアミドである場合、該アルキル基またはアラルキル基にさらにアミノ基が結合しているアミド誘導体であってもよく、本発明における好ましい態様の一つである。具体的には、例えば、カルボキシル末端がアミノエチルアミドである場合があげられる。
　上記のように、カルボキシル末端がアミド体またはアミド誘導体である本発明に係るペプチド系化合物は、生体内でカルボキシペプチダーゼ類による酵素分解に抵抗することからも有用な化合物である。
　同様に、Ｎ−メチルアミノ酸を含む本発明に係るペプチド系化合物も酵素抵抗性を有する点で有用な化合物である。
【０１０５】
　本発明に係るペプチド系化合物は常法により得ることができる。例えば、既に上述のように天然の原料から単離されるか、又は組換えＤＮＡ技術及び／または化学的合成によって製造することができる。更にアミノ酸残基に修飾（例えば、アシル化）が必要な場合は自体公知の手段に従って修飾反応を施すことができる。
　本発明に係るペプチド系化合物は、より具体的には本願発明に係るペプチドをコードするＤＮＡを有する発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、当該培養物から目的のペプチドを採取することにより本発明に係るペプチド系化合物を得ることもできる。
【０１０６】
　当該宿主細胞を選択することにより、当該細胞内において目的のペプチドにアシル化等の修飾がされた化合物を得ることができる。また、当該ペプチドが修飾されていない場合は、所望により公知の手段に従ってアシル化等の修飾反応を行えばよい。アシル化反応にはリパーゼ等の酵素を用いることもできる。
【０１０７】
　遺伝子を組み込むベクターとしては、例えば大腸菌のベクター（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌のベクター（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母のベクター（ＹＥｐ型、ＹＲｐ型、ＹＩｐ型）、又は動物細胞のベクター（レトロウィルス、ワクシニアウィルス等）等が挙げられるが、その他のものであっても、宿主細胞内で安定に目的遺伝子を保持できるものであれば、いずれをも用いることができる。当該ベクターは、適当な宿主細胞に導入される。目的の遺伝子をプラスミドに組み込む方法や宿主細胞への導入方法としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）に記載された方法が利用できる。
　上記プラスミドにおいて目的のペプチド遺伝子を発現させるために、当該遺伝子の上流にはプロモーターを機能するように接続させる。
【０１０８】
　本願発明において用いられるプロモーターとしては、目的遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、形質転換する宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の場合はｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター，ｌｐｐプロモーター、λＰＬプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター等を用いることができ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の場合はＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター等を用いることができ、酵母の場合はＧＡＰプロモーター，ＰＨＯ５プロモーター、ＡＤＨプロモーター等を用いることができ、動物細胞の場合は、ＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルス由来プロモーター等を用いることができる。　
【０１０９】
　上記のようにして得られた目的遺伝子を含有するベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等）、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞等）等を用いることができる。培養時の培地としては液体培地が適当であり、当該培地中には培養する形質転換細胞の生育に必要な炭素源、窒素源等が含まれることが特に好ましい。所望によりビタミン類、成長促進因子、血清などを添加することができる。
【０１１０】
　脂肪酸修飾ペプチドを直接製造するためには、該ペプチドの前駆体ポリペプチドを適切な位置で切断できるプロセッシング・プロテアーゼ活性を有し、当該ペプチド中のセリン残基をアシル化できる活性を有する細胞が望ましい。このようなプロセッシング・プロテアーゼ活性およびセリンアシル化活性を有する宿主細胞は、当該前駆体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞がＣａ上昇活性又はＧＨ分泌誘導活性を有する脂肪酸修飾ペプチドを産生することを確認することにより、選抜できる。
【０１１１】
　培養後、培養物から本発明に係るペプチドを常法により分離精製する。例えば、培養菌体又は細胞から目的物質を抽出するには、培養後、菌体又は細胞を集め、これをタンパク質変性剤（塩酸グアニジンなど）を含む緩衝液に懸濁し、超音波などにより菌体又は細胞を破砕した後、遠心分離を行う。次に上清から目的物質を精製するには、目的物質の分子量、溶解度、荷電（等電点）、親和性等を考慮して、ゲル濾過、限外濾過、透析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、各種クロマトグラフィーなどの分離精製方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【０１１２】
　本発明に係るペプチド化合物は常法により化学合成することができる。例えば、保護基の付いたアミノ酸を液相法及び／又は固相法により縮合、ペプチド鎖を延長させ、酸で全保護基を除去し、得られた粗生成物を上記の精製方法で精製することにより得られる。アシル化酵素又はアシル基転移酵素で選択的に目的位置にあるアミノ酸の側鎖をアシル化することもできる。
【０１１３】
　ペプチドの製造法は従来既に種々の方法が充分に確立されていて、本発明のペプチド系化合物の製造もそのような自体公知の方法に従って容易に製造できる。例えば古典的なペプチド合成法に従ってもよいし、固相法に従ってもよい。
【０１１４】
　以下に、組換えＤＮＡ技術と化学合成を併用した本発明に係るペプチド化合物の製法について例を挙げて述べる。
　アミノ末端部ペプチドの活性エステル、例えば、（１）Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｕ）−Ｓｅｒ（Ｒ１０）−Ｏｓｕ、（２）Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｕ）−Ｓｅｒ（Ｒ１０）−Ｐｈｅ−Ｏｓｕ、又は（３）Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｕ）−Ｓｅｒ（Ｒ１０）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｏｓｕを化学合成し、各々、組換えＤＮＡ技術により生産したカルボキシル末端部ペプチドである（４）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ、（５）ＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ、又は（６）ＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲとを結合、即ち、（１）と（４）、（２）と（５）及び（３）と（６）を結合させて、２８個のアミノ酸からなるペプチド化合物を得る。より具体的には、ＸＸＸＸＺＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲを大腸菌で発現させ、Ｂｏｃ２（Ｏ）でアミノ基を保護し、Ｂｏｃ−ＸＸＸＸＺＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫ（Ｂｏｃ）ＥＳＫ（Ｂｏｃ）Ｋ（Ｂｏｃ）ＰＰＡＫ（Ｂｏｃ）ＬＱＰＲを得る。次にアミノ酸Ｚのカルボキシル末端に選択的な酵素で切り出し、ＮＨ２−ＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫ（Ｂｏｃ）ＥＳＫ（Ｂｏｃ）Ｋ（Ｂｏｃ）ＰＰＡＫ（Ｂｏｃ）ＬＱＰＲに変換する。この化合物とＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｕ）−Ｓｅｒ（Ｒ１０）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｏｓｕを中性から弱アルカリ水溶液中で混合し、得られるＢｏｃＧｌｙＳｅｒ（Ｂｕ）Ｓｅｒ（Ｒ１０）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫ（Ｂｏｃ）ＥＳＫ（Ｂｏｃ）Ｋ（Ｂｏｃ）ＰＰＡＫ（Ｂｏｃ）ＬＱＰＲをトリフルオロ酢酸処理すれば目的物が得られる。
【０１１５】
　上記アミノ酸の一文字標記は、１９９７年１２月１０日、株式会社ニュートンプレス発行の「細胞の分子生物学第３版」の記載に従った。
　また、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニルを表し、ＯｓｕはＮ−ヒドロキシサクシンイミドの水酸基の水素が脱離したものを表し、Ｂｕはブチル基を表し、Ｒ１０は上述した本発明に係る修飾アミノ酸の置換基を表す。
【０１１６】
　本願発明のペプチド系化合物の塩としては薬学的に許容される塩が好ましく、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
　無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
【０１１７】
　有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
　無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。
【０１１８】
　有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
　塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
【０１１９】
　これらの塩の中でもナトリウム塩、カリウム塩が最も好ましい。　
　本願発明のペプチド系化合物又はその薬理学的に許容しうる塩は毒性が低く、ＧＨ分泌誘導作用を有し、そのままもしくは自体公知の薬理学的に許容しうる担体、賦形剤、増量剤などと混合して哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対して用いることができる。投与量は成人に静脈注射する場合１日０．０１〜５ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．０４〜１．５ｍｇ／ｋｇである。この量を１日１回〜３回投与するのが望ましい。本願発明のペプチド系化合物は、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの固形製剤；又はシロップ剤、注射剤などの液状製剤として経口又は非経口的に投与することができる。　
【０１２０】
　薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。
　また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【０１２１】
　賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
　結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１２２】
　崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
　溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
【０１２３】
　溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【０１２４】
　懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
　等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。
【０１２５】
　緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
　無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
　防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
【０１２６】
　抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
　上記医薬組成物は、ＧＨの投与による効果と同等以上の効果をもたらし、ＧＨの投与によって起こる様々な副作用も低減できる。
【０１２７】
　当該医薬組成物の適用可能な疾患又はその効果は、ＧＨ欠損又は低下が関係するものとして、例えば、小人症、正常人での骨芽細胞及び骨再構成の活性化、ＧＨ欠乏症成人での筋肉量及び筋力の増強　、ＧＨ欠乏症成人での運動能力の向上、小児の重度火傷治癒、排卵誘発におけるゴナンドトロピンとの併用、プレドニゾン投与によるタンパク質代謝異常の予防、重度免疫不全症におけるＴ細胞「教育」の促進、老人性の体重減少、脂肪組織拡大及び皮膚萎縮を抑制する効果などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
　また、ＧＨ欠損又は低下と直接関係しない疾患又は効果としては、例えば実施例７に記載したように、当該医薬組成物は拍動量の増加効果があるから、心不全等の心疾患の治療に効果がある。
　当該医薬組成物の効果はヒトには限らない。すなわち、動物の成長促進、食肉中の脂身の低減等、ＧＨ投与と同等以上の効果がある。
【０１２９】
　また、例えば実施例１３に記載したように、本発明に係る医薬組成物は脳室内投与および静脈内投与によって食欲増進作用があることから、食欲不振や拒食症を治療するための食欲増進剤として用いることもできる。
【０１３０】
　さらに、例えば実施例１４に記載したように、本発明に係る医薬組成物は胃運動および胃酸分泌を促進する作用があることから、非潰瘍性消化不良、突発性軽症胃アトニー、機能性消化不良および逆流性食道炎等の胃機能性疾患の治療剤として用いることもできる。
　加えて、例えば実施例１５に記載したように、本発明に係る医薬組成物は静脈内投与により、骨髄、十二指腸および空腸において細胞増殖促進作用が認められたことから、腸管粘膜保護剤、経静脈栄養時の小腸粘膜障害予防剤及び骨粗鬆症治療剤として用いることができる
【０１３１】
　また上記医薬組成物は以下のような疾患の治療又は身体状態の改善に効果がある。
　例えば、高齢者における成長ホルモン放出の刺激処置、糖質コルチコイドの異化副作用の予防、オステオポローシスの予防と治療、免疫系の刺激、損傷治癒の促進、骨折修復の促進、成長遅滞の治療、成長遅滞に起因する腎不全もしくは機能不全の治療、成長ホルモン欠損児童を含む生理学的不足状態および慢性疾患に関連した不足状態の治療、肥満および肥満に関連した成長遅滞の治療、プラーダー−ヴィリ症候群およびターナー症候群に関連した成長遅滞の治療、火傷患者の回復の促進および入院の削減、子宮内発育遅滞、骨格形成異常、高コルチコイド症およびクッシング症候群の治療、拍動性成長ホルモン放出の誘導、ストレス患者における成長ホルモンの代用、骨軟骨形成異常、ヌーナン症候群、精神分裂病、うつ病、アルツハイマー病、遅延損傷治癒および心理社会的剥奪の治療、肺機能不全および呼吸器依存症の治療、大手術後のタンパク質異化反応の減衰、癌やエイズ（ＡＩＤＳ）のような慢性疾患によるタンパク損失および悪液質の減少、膵島細胞症を含む高インスリン血症の治療、排卵誘発のためのアジュバント療法、胸腺の発育を刺激するためおよび加齢に伴う胸腺機能の衰退を防ぐため、免疫抑制患者の治療、筋肉強度、運動性の向上、高齢者における皮膚の厚さ、代謝恒常性、腎恒常性の維持、骨芽細胞、骨再造形および軟骨成長の刺激等が挙げられる。
【０１３２】
　また動物においても以下のような効果が期待される。例えば、動物の成長の速度増加、動物の乳生産もしくは獣毛生産増加、ペット動物における免疫系の刺激、ペット動物における高齢疾患の治療、家畜の成長促進並びにヒツジにおける増毛などが挙げられる。
【０１３３】
　本願発明によるＣａ上昇活性又はＧＨ分泌誘導活性を有する脂肪酸修飾ペプチドを抗原とする抗体は、公知の方法により取得できる。当該抗体は、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体のいずれでもよく、それらの取得についても公知の方法が利用できる。また、これらの抗体を用いた脂肪酸修飾ペプチドの測定方法および当該測定法を利用した測定キットの作成も公知の方法が利用できる。
　また、実施例１７に記載したように、グレリンのアミノ末端側及びカルボキシル末端側のペプチドに対する抗体を作成し、前者が３位セリンを修飾している脂肪酸を特異的に認識することを利用して、脂肪酸で修飾されたグレリンと脂肪酸が脱離したグレリンを分別定量することに用いることもできる。
【０１３４】
　該グレリンのアミノ末端側に対する抗体またはカルボキシル末端側のペプチドに対する抗体は、公知の方法により取得でき、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体のいずれでもよい。
【０１３５】
　同様にして、アミノ末端の３番目に修飾アミノ酸を有する本発明に係るペプチド系化合物またはその薬理学的に許容される塩において、３位のアミノ酸残基の側鎖、好ましくは脂肪酸を特異的に認識し、アミノ末端側のペプチドに結合する抗体を作ることもできる。さらに、同様にして、本発明に係るペプチド系化合物またはその薬理学的に許容される塩において修飾アミノ酸を有するペプチドに特異的に結合する抗体を作ることもできる。
【０１３６】
　上記のように、修飾アミノ酸の側鎖を特異的に認識する抗体と、修飾アミノ酸または／および非アミノ酸化合物以外のアミノ酸またはそれらを含まないペプチドを認識する抗体、好ましくは本発明に係るペプチド系化合物またはその薬理学的に許容される塩のカルボキシル末端側のペプチドに対する抗体とを組み合わせてなる検査キットも本発明に含まれる。
【０１３７】
　また、該検査キットを用いて、修飾アミノ酸、好ましくはアシル化されたアミノ酸を有する本発明に係るペプチド系化合物またはその薬理学的に許容される塩と、修飾アミノ酸を有しない本発明に係るペプチド系化合物またはその薬理学的に許容される塩とを分離検出するアッセイ方法も本発明に含まれる。
【０１３８】
　上記アッセイ方法または検査キットについて、具体的態様を以下に述べる。ただし、本発明は以下の態様に限られない。
　すなわち、上記アッセイ方法としては、例えば（ｉ）本発明のペプチド系化合物等に対する抗体と、被検液中の被検物質と標識化された本発明のペプチド系化合物等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のペプチド系化合物等の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明に係るペプチド系化合物等の定量法、および（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性または／および不溶化担体上に捕捉されなかった標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法が挙げられる。上記（ｉ）および（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質等のアミノ末端側を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質等のカルボキシル末端側に反応する抗体であることが好ましい。
【０１３９】
　また、本発明のペプチド系化合物等のアッセイ方法として、該化合物に対するモノクローナル抗体（以下、抗タンパク質抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。
　これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
【０１４０】
　上記抗体を用いる本発明のペプチド系化合物等の定量法は、　特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【０１４１】
　本発明にかかるアッセイ方法のうち標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。
　放射性同位元素としては、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈまたは１４Ｃなどが用いられる。
【０１４２】
　上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。
【０１４３】
　蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。
　発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
　さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【０１４４】
　以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法は特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）に依った。
【実施例１】
【０１４５】
ＧＨＳ−Ｒ発現細胞株の作製とＣａ上昇活性の測定
　ＧＨ分泌誘導因子（ＧＨＳ）がＧＨＳレセプター（ＧＨＳ−Ｒ）に結合することによって生ずる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇（Ｃａ上昇活性）をアッセイするために、以下のようにしてラットＧＨＳ−Ｒを発現している細胞株を作製した。ラットＧＨＳ−Ｒの全長ｃＤＮＡは、ラット脳由来のｃＤＮＡを鋳型にして、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼチェインリアクション）によって取得した。公知のラットＧＨＳ−Ｒの塩基配列［Ｋ．Ｋ．Ｍｃｋｅｅ，ｅｔ　ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１，４１５−４２３（１９９７）．］から、以下の塩基配列からなるセンスおよびアンチセンスプライマーを合成した。
センスプライマー：　　　　5’-ATGTGGAACGCGACCCCCAGCGA-3’
アンチセンスプライマー：　5’-ACCCCCAATTGTTTCCAGACCCAT-3’
【０１４６】
　増幅されたｃＤＮＡをベクターｐｃＤＮＡＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）につなぎ、発現ベクターＧＨＳＲ−ｐｃＤＮＡＩＩＩを作製した。当該発現ベクターでＣＨＯ細胞を形質転換し、ＧＨＳ−Ｒを安定に発現している形質転換細胞を１μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地で選択した。選択された細胞株ＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２は、１０−１０〜１０−９ＭのＧＨＲＰ−６（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ）に応答した。細胞内カルシウムイオン濃度の変化（Ｃａ上昇活性）は、ＦＬＩＰＲシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ社）で測定した。測定前に、４　ｘ　１０４のＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞を壁面が黒い９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に植え、１２〜１５時間培養した。細胞を４μＭの蛍光色素Ｆｌｕｏ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社）と１時間保持し、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（〔Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ〕−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ−〔２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〕）と２．５ｍＭ　プロベネシドを含むＨａｎｋ’ｓ　ＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で４回洗浄し、試料を添加して蛍光の変化を測定することによって、Ｃａ上昇活性をアッセイした。
【実施例２】
【０１４７】
内在性ＧＨ分泌誘導ペプチドの精製
　実施例１に記載した　ＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞用いて、ラット由来の各種組織・臓器について、Ｃａ上昇活性を調査した結果、ラット胃由来のペプチド抽出物が０．５ｍｇ相当でも強いＣａ上昇活性を有することがわかった。そこで、数種類のクロマトグラフィーを用いて、ラット胃抽出物から以下の方法でＣａ上昇活性を有するペプチドを精製した。
【０１４８】
　新鮮なラットの胃４０ｇを、混在するプロテアーゼを失活するために、５倍量の沸騰水中で５分間煮沸した。冷却後、煮沸した試料を１Ｍ　ＡｃＯＨ−２０ｍＭ　ＨＣｌに調整し、ポリトロン・ミキサーを用いてペプチドを抽出した。抽出液を１１，０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、上清をエバポレーターで約４０ｍｌに濃縮した。濃縮液にアセトンを６６％になるように添加して、アセトン沈殿を行い、生じた沈殿を除去した後、上清のアセトンを蒸発させた。上清を、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化した１０ｇのＳｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ１８　カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に加え、１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡで洗浄後、６０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡで溶出した。溶出液の溶媒を蒸発後、凍結乾燥を行った。試料を１Ｍ　ＡｃＯＨに溶解して、１Ｍ　ＡｃＯＨで平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５（Ｈ＋型）に吸着させた。１Ｍ　ＡｃＯＨ、２Ｍピリジンおよび２Ｍ　ピリジン−ＡｃＯＨ（ｐＨ　５．０）で段階的に溶出することによって、ＳＰ−Ｉ、ＳＰ−ＩＩおよびＳＰ−ＩＩＩの３つの画分を、それぞれ得た。ＳＰ−ＩＩＩ画分をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０ゲル濾過カラムに掛け、各々の画分の一部についてＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞を用いたＣａ上昇活性のアッセイを行った。Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０カラムクロマトグラフィーの結果を図１ａに示したが、分子量約３，０００に相当する活性画分（図１ａ中、フラクション４３−４８）を、ＴＳＫ　ＣＭ−２ＳＷカラム（４．６　ｘ　２５０ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ社製）を用いｐＨ６．４で、ＣＭ−イオン交換によるＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分画した。ＣＭ−ＨＰＬＣでの活性画分を、同一カラムを用い、ｐＨ４．８で二次ＣＭ−ＨＰＬＣで分画した（図１ｂ）。活性画分（図１ｂ中、溶出時間５５−５６分）を、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ　Ｃ−１８カラム（３．９　ｘ　１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた逆相ＨＰＬＣで単一にまで精製した。４０ｇのラットから１６μｇのＣａ上昇活性を有するペプチドを精製し、グレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）と命名した。
【実施例３】
【０１４９】
グレリンの構造解析
　精製したラット由来のグレリンのアミノ酸配列をペプチド・シーケンサー（ＡＢＩ　４９４、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ社）で決定した。グレリンは、Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｘａａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ（Ｘａａは未同定アミノ酸）の配列からなる２８アミノ酸残基で構成されるペプチドであった。ＸａａはラットｃＤＮＡの塩基配列からＳｅｒであり、当該ペプチドにおいてはＳｅｒが何らかの修飾を受けていることがわかった。
【０１５０】
　そこで、アミノ末端から３番目のセリンが修飾されていない非修飾グレリンをペプチド合成機（ＡＢＩ　４３３Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で化学合成した。非修飾合成グレリンの逆相ＨＰＬＣでの溶出時間は、天然型グレリンと大きく異なっていた（図２ａ）ので、非修飾合成グレリンは天然型グレリンよりも著しく親水性であることがわかった。
　以上の結果から、天然型グレリンのアミノ末端から３番目のセリン（セリン３）は疎水性の残基で修飾されていることがわかった。
【０１５１】
　セリン３の修飾基を明らかにするために、精製したグレリンを電子スプレーイオン化マス分析機（ＥＳＩ−ＭＳ）分析した。観測された天然型グレリンの分子量（３３１４．９±０．７）は、ｃＤＮＡの塩基配列から得られた非修飾グレリンペプチドの分子量（３１８８．５）よりも１２６大きかった。以上の結果から、天然型グレリンはセリン３の水酸基がｎ−オクタノイル（Ｃ８：０）脂肪酸で修飾されているとわかった。
【０１５２】
　このことを確認するために、ｎ−オクタノイル（Ｃ８：０）グレリンペプチドを化学合成して、逆相ＨＰＬＣでの溶出時間を調べた。ｎ−オクタノイル（Ｃ８：０）ペプチドの化学合成は、セリン３の水酸基以外の全ての官能基を保護したペプチドをペプチド合成機（ＡＢＩ　４３３Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＦｍｏｃ固相法で合成し、セリン３の水酸基を４−（ジメチルアミノ）ピリジンの存在下で、ｎ−オクタン酸とエチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドでアシル化して合成した。合成したｎ−オクタノイルペプチドは精製した天然型グレリンと同一の溶出時間であった（図２ａ）。さらに、合成ｎ−オクタノイルペプチドおよび天然型グレリンをキモトリプシン処理によって得られる、アミノ末端から４番目までのペプチド断片（Ｇｌｙ　１−　Ｐｈｅ　４）は、逆相ＨＰＬＣで同一の溶出時間を示した。
　以上の結果から、ラット由来の天然型グレリンは配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、セリン３の水酸基がｎ−オクタン酸（カプリル酸）でアシル化された構造（図２ｃ）であると結論された。
【０１５３】
　また、ヒトグレリンをヒト胃抽出物から精製し、その構造が配列番号３に記載したアミノ酸配列を有し、アミノ末端から３番目のセリン側鎖の水酸基がｎ−オクタン酸（カプリル酸）でアシル化された構造であることがわかった（図４ａ）。
　なお、上記ラット及びヒト由来のグレリンの構造は、図１ｂ中の活性画分のうち最初のピーク画分（溶出時間５５−５６分）精製したものの構造であるが、図１ｂの他の活性画分についても精製後、上記と同様の方法で構造解析を行った結果、セリン３を修飾している脂肪酸はカプリル酸（Ｃ８：０）以外に、カプリル酸のモノエン酸（Ｃ８：１）、カプリン酸（Ｃ１０：０）およびそのモノエン酸（Ｃ１０：１）、およびラウリル酸（Ｃ１２：０）およびそのモノエン酸（Ｃ１２：１）があることがわかった。
【０１５４】
　また、ニワトリ、ウナギ及びカエルのグレリンを実施例２と同様にして胃抽出物から精製し、さらに実施例３と同様にして構造解析した。その構造は、ニワトリのグレリンは配列番号２５に記載したアミノ酸配列、ウナギのグレリンは配列番号２６に記載したアミノ酸配列、カエルのグレリンは配列番号２７に記載したアミノ酸配列を有し、いずれもアミノ末端から３番目のセリン側鎖の水酸基がｎ−オクタン酸（カプリル酸）でアシル化された構造であることがわかった。
【０１５５】
　さらに、アフリカツメガエル、ニジマス及びイヌのグレリンを実施例２と同様にして胃抽出物から精製し、さらに実施例３と同様にして構造解析した。
　その構造は、アフリカツメガエルのグレリンは配列番号２８に記載したアミノ酸配列、ニジマスのグレリンは配列番号２９および３０に記載したアミノ酸配列、イヌのグレリンは配列番号３１に記載したアミノ酸配列を有し、いずれもアミノ末端から３番目のセリン側鎖またはトレオニン側鎖の水酸基がｎ−オクタン酸（カプリル酸）でアシル化された構造であることがわかった。
　なお、ニジマスからは、配列番号２９に記載した２３アミノ酸残基からなるグレリン−２３と、配列番号３０に記載した２０アミノ酸残基からなるグレリン−２３とが得られた。
【実施例４】
【０１５６】
グレリンのＣａ上昇活性
　天然型グレリンおよびｎ−オクタノイル修飾合成グレリンはＣａ上昇活性を有していたが、非修飾合成グレリンはＣａ上昇活性を顕著には示さなかった（図２ｂ）。また、ｎ−オクタン酸又はｎ−オクタン酸と非修飾合成グレリンの混合物はＣａ上昇活性を顕著には示さなかったことから、天然型グレリンのｎ−オクタン酸基はＣａ上昇活性に重要なの構造であることがわかった。以後、グレリンとは［Ｏ−ｎ−オクタノイル−セリン３］−グレリン（図２ｃ）のことを示す。
【０１５７】
　グレリンは、ＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞において、ＧＨＲＰ−６よりも高い細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性（Ｃａ上昇活性）を示したが、ＧＨＲＨ（ＧＨ放出ホルモン、図３ａではＧＲＦ）はＣａ上昇活性を示さなかった（図３ｂ）。グレリンのＣａ上昇活性は１０−１１Ｍから認められ、ＥＣ５０は２．５ｎＭであった。ＧＨＳ−Ｒの特異的アンタゴニストである［Ｄ−Ｌｙｓ　３］−ＧＨＲＰ−６［Ｒ．Ｇ．Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６０，１６４０−１６４３（１９９３）］１０−４Ｍの存在下で、グレリンによるＣａ上昇活性は抑制され、高濃度のグレリンで、アンタゴニスト非存在下でのＣａ　上昇活性に回復する（図３ｂ）。以上の結果は、グレリンのＣａ上昇活性がＧＨＳ−Ｒの特異的アンタゴニストによって拮抗的に阻害されることを示している。
【実施例５】
【０１５８】
グレリン前駆体ｃＤＮＡとその各種臓器での発現
　グレリンのアミノ酸配列は公知のいかなるペプチドのアミノ酸配列とも相同性を示さなかったが、ＧｅｎＢａｎｋデータベースをホモロジー検索したところ、ラットＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）配列の１つ（ＧｅｎＢａｎｋ　受理番号ＡＩ５４９１７２）に同一の配列が認められた。このＥＳＴ配列を基に以下のＰＣＲプライマーを合成した。
センスプライマー：　　　　 5’-TTGAGCCCAGAGCACCAGAAA-3’
アンチセンスプライマー：　 5’-AGTTGCAGAGGAGGCAGAAGCT-3’
【０１５９】
　ラット胃由来のｃＤＮＡを鋳型に上記の２つプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、１サイクルが９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を、３５サイクル行った。増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして、ラット胃ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。約２　ｘ　１０５の組換えファージをスクリーニングして、ラット由来グレリンをコードする全長ｃＤＮＡを取得した。
【０１６０】
　ラットグレリンｃＤＮＡは、配列番号６に記載した５０１塩基からなり、１１７アミノ酸（図４ａ）からなるグレリン前駆体（ｐｒｅｐｒｏ−ｇｈｒｅｌｉｎ）をコードしていた。グレリン前駆体のアミノ末端の２３アミノ酸残基はシグナルペプチドの性質を備えていた。グレリンはグリシン２４から始まり、成熟型グレリンの最後の２つのアミノ酸（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）は、プロテアーゼによる切断を受ける配列であった。
【０１６１】
　ラットグレリンｃＤＮＡを用いて、低ストリンジェント条件でヒト胃ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、全長ヒトグレリンｃＤＮＡを取得した。ヒト胃ｃＤＮＡライブラリーは、ヒト胃ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から、ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて作製した。取得した全長ヒトグレリンｃＤＮＡは、配列番号７に記載した５１１塩基からなり、１１７アミノ酸（図４ａ）からなるヒトグレリン前駆体（ｐｒｅｐｒｏ−ｇｈｒｅｌｉｎ）をコードしていた。ラットおよびヒト由来のグレリン前駆体のアミノ酸配列は、８２．９％の同一性を示し、グレリンは生物種間で高度に保存されていることが判明した。
【０１６２】
　グレリンの組織間分布を知るために、ラットの種々の組織から単離されたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを解析した（図４ｂ）。ラット組織のノザーンブロット解析によって、０．６２ｋｂのグレリン前駆体ｍＲＮＡが胃に認められた。心室（Ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）にも２本のかすかなバンドが認められたが、これらは６．２ｋｂおよび１．２ｋｂのｍＲＮＡで、胃でのｍＲＮＡよりも大きく、胃とは異なったｍＲＮＡのスプライシングが推定された。以上の結果からグレリンの主な発現部位は胃であることがわかった。
【実施例６】
【０１６３】
グレリンの下垂体ホルモン分泌への効果
　グレリンがＧＨ分泌誘導活性を有しているかをｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏで調べた。まずｉｎ　ｖｉｔｒｏでのアッセイとして、下垂体前葉の初期培養細胞へのグレリンの効果を調べた。４週令の雄ＳＤラットから下垂体前葉を採取し、コラゲナーゼ処理で分散させた後、細胞を集め、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）と抗生物質を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）培地で２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地に懸濁して、下垂体前葉初期培養細胞を調製した。５　ｘ　１０４の細胞を、ポリ−Ｄ−リジンでコートした９６穴の細胞培養プレートに植え、３〜４日培養した。培養液を０．１ｍｌの試料を含有するＤＭＥＭ培地と交換し、３７℃で１５分間保持した。培養液の一部を採取して、ラジオイムノアッセイによって、培養液中の各種下垂体ホルモンの濃度を測定した。下垂体ホルモンのうち、ＧＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＰＲＬ、ＴＳＨはＢｉｏｔｒａｋ／Ａｍｅｒｓｈａｍ社製のキットを用い、ＡＣＴＨはＰｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製の高感度ＥＩＡキットを用いた。
【０１６４】
　グレリンを下垂体前葉初期培養細胞に添加すると細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が認められ、非修飾合成グレリンでも弱いながらもＣａ上昇活性が認められた（図５ａ）。この結果は、グレリン及び非修飾合成グレリンが下垂体細胞に直接作用することを示している。次に、下垂体前葉初期培養細胞を用いてグレリンがＧＨ分泌誘導活性を調べたところ、１０−６Ｍのグレリンの添加により、培養液中のＧＨ濃度だけが濃度依存的に増加し、他の下垂体ホルモン（ＦＳＨ、ＬＨ、ＰＲＬ、ＴＳＨ）の濃度増加は認められなかった（図５ｂ）。
【０１６５】
　グレリンのＧＨ分泌誘導活性をｉｎ　ｖｉｖｏで調べた。合成グレリン１０μｇを雄ラット（２５０ｇ）の静脈に注射後、６０分まで経時的に血液を採取して、血漿中の下垂体ホルモンの濃度を上記ラジオイムノアッセイによって測定した。下垂体ホルモンの内、ＧＨだけが血液中に放出され、グレリンの静脈注射後５〜１０分で最高値に達した。この結果から、胃から血液中に放出されたグレリンが下垂体前葉細胞に作用し、血液中にＧＨを放出することがわかり、グレリンが未同定だった特異的な内在性ＧＨ分泌誘導物質であることが確認された。
【実施例７】
【０１６６】
ラットでの心拍出量増加　
　麻酔下ラットを用いて心血管系に及ぼすグレリン急性投与の効果を調べた。体重２２０−２５０ｇのＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（ケアリー）を用い、心血管系に及ぼすグレリン急性投与の効果を検討するためラットを無作為に４群（１０，１，０．５，０．２μｇ投与群）に分けた。グレリンは生理食塩水で希釈し、ラット１匹あたりの投与量を、１０、１、０．５、０．２μｇに調整して、心拍出量測定のため右総頚静脈に挿入したインジェクションチューブ（ＰＥ５０）から１２０μｌ　急性投与した。
【０１６７】
　動力学的指標として全身血圧、心拍出量を測定し、さらに末梢血管抵抗値を算出した。ラットをペントバルビタールで麻酔後、背位に固定した。平均血圧測定のために、右大腿動脈にヘパリンで満たしたポリエチレンカニューレ（ＰＥ５０）を挿入した。心拍出量の測定は熱希釈式心拍出量計（ＣＡＲＤＩＯＴＨＥＲ　Ｍ５００Ｒ）を用いて測定した。右総頚静脈に生理食塩水で満たしたインジェクションチューブ（ＰＥ５０）を挿入し、右心室内で留置した。右総頚動脈からマイクロカテーテルを挿入し、大動脈起始部に留置した。注入液は室温（２５℃）の生理食塩水１００μｌを用いた。熱希釈式心拍出量計のＭＥＡＳＵＲＥスイッチを押すと同時に注入液（生理食塩水１００μｌ）を注入し、心拍出量を測定した。測定は５回行いその平均値を心拍出量とした。平均血圧および心泊出量は、グレリン投与前、投与後１、５、１５、３０分の値を測定した。末梢血管抵抗は平均血圧を心拍出量で除して算出した。
【０１６８】
【表１】
2004000251.tif 000018
　表中、ＳＥＭは平均値の標準誤差（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｅｒｒｏｒ　Ｈｅａｎｓ）を表す。
【０１６９】
【表２】
2004000251.tif 000019
　表中、ＳＥＭは平均値の標準誤差（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｅｒｒｏｒ　Ｈｅａｎｓ）を表す。
【０１７０】
　グレリン１μｇ投与群（表１）及びグレリン１０μｇ投与群（表２）おいて、投与後１分及び５分で、心拍出量の増加が認められた
【実施例８】
【０１７１】
各種起源からのグレリンおよびグレリン−２７の単離
　ラット胃抽出物から実施例２に記載した方法でＣａ上昇活性を指標にグレリンを精製した。二次ＣＭ−ＨＰＬＣでの活性画分（図１ｂ中、溶出時間５９分）を、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ　Ｃ−１８カラム（３．９　ｘ　１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた逆相ＨＰＬＣで単一にまで精製した。この画分を電子スプレーイオン化マス分析機（ＥＳＩ−ＭＳ）分析した結果、分子量（３１８７．２±０．９）のピークが観測されたが、この値は２８アミノ酸からなりオクタン酸（Ｃ８）修飾された天然型グレリンよりも約１２６小さかった。このペプチドのアミノ酸配列をペプチド・シーケンサー（ＡＢＩ　４９４、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ社）で決定したところ、Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｘａａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ（Ｘａａは未同定アミノ酸）の配列からなる２７アミノ酸残基で構成されるペプチドであった。すなわち、２８アミノ酸で構成されるグレリンのアミノ末端から１３番目又は１４番目のグルタミンが１つ欠失したアミン酸配列からなっていた。このペプチドのＣａ上昇活性は、実施例９に示すように２８アミノ酸のグレリンと同様であることから、グレリン−２７と命名した。ヒトの胃抽出物からも、ラットの場合と同様にヒト・グレリン−２７を単離し、配列番号１１記載のアミノ酸配列からなることを確認した。なお、上記二次ＣＭ−ＨＰＬＣで６４−６５分にあるピーク画分を精製し、電子スプレーイオン化マス分析機（ＥＳＩ−ＭＳ）分析した結果、分子量（３３４１．４±０．９）のピークが観測された。この脂肪酸修飾ペプチドは２８アミノ酸からなることから、グレリン（２８アミノ酸）のアミノ末端から３番目のセリンがデカン酸（Ｃ１０）で修飾されたものであることがわかった。
【０１７２】
　グレリン２７前駆体をコードするｃＤＮＡを、実施例５で作成したラット胃ｃＤＮＡライブラリーから、実施例５で作成したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブとした、プラークハイブリダイゼーションでクローニングした。ｃＤＮＡの塩基配列を決定し、グレリン−２７前駆体をコードすることを確認した。得られたグレリン−２７前駆体ｃＤＮＡは、配列番号１４記載の塩基配列からなり、配列番号１２記載のアミノ酸配列を有する１１６アミノ酸からなるグレリン−２７前駆体をコードしていた。また、上記と全く同様の方法でヒト・グレリン−２７前駆体ｃＤＮＡをクローニングし、配列番号１５記載の塩基配列からなり、配列番号１３記載のアミノ酸配列を有する１１６アミノ酸からなるヒト・グレリン−２７前駆体をコードしていることがわかった。
【０１７３】
　ブタ由来のグレリンおよびグレリン−２７の前駆体をコードするｃＤＮＡを、ブタｃＤＮＡライブラリーから実施例５に記載の方法によって、実施例５に記載のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブとしたプラークハイブリダイゼーションでクローニングした。得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定し、ブタ・グレリン前駆体又はブタ・グレリン−２７前駆体をコードしていることを確認した。得られたブタ・グレリン前駆体ｃＤＮＡは、配列番号２０記載の塩基配列からなり、配列番号１８記載のアミノ酸配列を有する１１８アミノ酸からなるグレリン前駆体をコードしていた。また、ブタ・グレリン−２７前駆体ｃＤＮＡは、配列番号２１記載の塩基配列からなり、配列番号１９記載のアミノ酸配列を有する１１７アミノ酸からなるグレリン−２７前駆体をコードしていた。従って、ブタ・グレリン（２８アミノ酸）及びブタ・グレリン−２７（２７アミノ酸）は、各々、配列番号１６および１７記載のアミノ酸配列からなっている。
【０１７４】
　ウナギ、アフリカツメガエルまたはニジマス由来のグレリンの前駆体をコードするｃＤＮＡを、各種のｃＤＮＡライブラリーから実施例５に記載の方法によって、実施例５に記載のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブとしたプラークハイブリダイゼーションでクローニングした。得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定し、グレリン前駆体をコードしていることを確認した。
【０１７５】
　得られたウナギ・グレリン前駆体ｃＤＮＡは、配列番号３６記載の塩基配列からなり、アフリカツメガエル・グレリン前駆体ｃＤＮＡは、配列番号３７記載の塩基配列からなり、ニジマス・グレリン前駆体ｃＤＮＡは、配列番号３８または３９記載の塩基配列からなっていた。
　なお、ニジマスからは、配列番号３８に記載したグレリン−２３前駆体をコードするｃＤＮＡと、配列番号３９に記載したグレリン−２０前駆体をコードするｃＤＮＡとが得られた。
【０１７６】
　上記ｃＤＮＡの塩基配列から、ウナギ・グレリン前駆体は、配列番号３２記載のアミノ酸配列を有し、アフリカツメガエル・グレリン前駆体は配列番号３３記載のアミノ酸配列を有し、ニジマス・グレリン前駆体は配列番号３４または３５記載のアミノ酸配列を有することがわかった。
　なお、ニジマスからは、配列番号３４に記載したグレリン−２３前駆体のアミノ酸配列と、配列番号３５に記載したグレリン−２０前駆体のアミノ酸配列とがわかった。
【０１７７】
　ウシ・グレリン前駆体ｃＤＮＡはＰＣＲ法によってクローニングした。すなわち、ラット、ヒトおよびブタ由来のグレリン及びグレリン−２７で保存されているアミノ酸配列を基に設計した塩基配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして、ウシ胃ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片は配列番号２４記載の塩基配列を有しており、配列番号２３記載のウシ・グレリン−２７前駆体の一部をコードしていた。従ってウシ・グレリン−２７は配列番号２２記載のアミノ酸配列を有している。また、ウシ胃ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とする上記ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片中には、グレリン（２８アミノ酸）前駆体をコードするＤＮＡはなかった。
【０１７８】
　ラット、ヒトおよびブタ由来のグレリン、及びラット、ヒト、ブタおよびウシ由来のグレリン−２７のアミノ酸は、非常によく似ており、特にアミノ末端から１０番目までのアミノ酸配列は、上記７種のグレリンで完全に一致していた。
【実施例９】
【０１７９】
各種グレリン誘導体の活性比較
　ラットおよびヒト由来のグレリンを各種プロテアーゼによる部分分解したペプチド断片、又は化学合成したペプチドのＣａ上昇活性を比較することにより、Ｃａ上昇活性に必要なコア・アミノ酸配列および修飾脂肪酸の鎖長の最適値を求めた。Ｃａ上昇活性は最大値の５０％の活性を示すグレリンの濃度（ＥＣ５０，ｎＭ）で表した。従って、ＥＣ５０の値が低い程、活性が高いことになる。
【０１８０】
【表３】
2004000251.tif 000020
【０１８１】
　グレリンのＣａ上昇活性は、アミノ末端側に存在する。アミノ末端から４番目のアミノ酸までのペプチドで十分なＣａ上昇活性はあるが、アミノ末端から１０番目のアミノ酸までのペプチドであれば、天然型グレリンに近い、強いＣａ上昇活性がある。また修飾脂肪酸の鎖長について、Ｃ：２（アセチル基）であっても十分活性はあるが、Ｃ：８（オクタノイル基）でＣａ上昇活性が最高になり、その後脂肪酸の炭素数がＣ：１０（デカノイル基）、Ｃ：１６と増加しても強いＣａ上昇活性は変化しない。すなわち、アミノ末端から３番目のセリンを修飾している脂肪酸は、炭素数８以上であればＣａ上昇活性が最も強くなる。
【実施例１０】
【０１８２】
各種グレリン誘導体化合物の合成
（１）ペプチド誘導体合成
　Ｆｍｏｃ−ＤＳｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）およびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）以外のアミノ酸誘導体と合成試薬をパーキンエルマー社、ノバビオケム社あるいは渡辺化学株式会社より購入した。ペプチド鎖の延長は主にパーキンエルマー社製アプライドバイオシステム４３３Ａ　合成機を使用し、Ｂｏｃ法、あるいはＦｍｏｃ法にて保護ペプチド誘導体−樹脂を構築した。Ｂｏｃ法にて得られた保護ペプチド樹脂は、ｐ−クレゾール存在下、無水弗化水素（ＨＦ）で脱保護してペプチドを遊離させ、精製に供した。Ｆｍｏｃ法で得られた保護ペプチド樹脂はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、あるいは種々のスカベンジャーを含む希釈ＴＦＡで脱保護し、遊離したペプチドを精製に供した。精製は、Ｃ４あるいはＣ１８を用いた逆相ＨＰＬＣにて実施した。精製品は、逆相ＨＰＬＣにてその純度を確認し、アミノ酸組成分析および質量分析にて構造を確認した。
【０１８３】
　本発明品のペプチドは通常のペプチド合成法によって製造される。例えば、「生化学実験講座１タンパク質の化学」第４巻の第２章、第３章（東京化学同人）、あるいは「続医薬品の開発１４ペプチド合成」（廣川書店）等の成書に記載されている方法によって製造が可能である。従って、本発明品のペプチドの代表的な合成例を以下に示した。具体的には、アシル化ペプチドの合成例とアルキル化ペプチドの合成例を示した。また、ヒト由来のグレリン（以下、ｈＧｈｒｅｌｉｎと略すこともある）あるいはラット由来のグレリン（以下、ｒＧｈｒｅｌｉｎと略すこともある）をトリプシン、あるいはキモトリプシン、あるいは両酵素を順番に作用させて、以下のグレリン断片（１９．Ｇｈｒｅｌｉｎ（１６−２８）、２０．ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−１５）、２１．ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−１５）、２３．ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−１１）、２４．ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−１１）、２５．Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−１０）、２６．Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−９）、２７．Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−８）、３０．Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−４））を調製し、分析用ＨＰＬＣで単離したものを活性測定に供した。４１．［Ｎ−Ａｃｅｔｙ］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−１０）は、常法に従いＧｈｒｅｌｉｎ（１−１０）をＮ−アセチルサクシンイミド処理して調製した。化合物番号２．ｒａｔ　Ｇｈｒｅｌｉｎは天然物を使用、１０．［Ｓｅｒ３（Ｂｕｔｙｒｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ、１１．［Ｓｅｒ３（Ｈｅｘａｎｏｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ、１２．［Ｓｅｒ３（Ｄｅｃａｎｏｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ、１３．［Ｓｅｒ３（Ｌａｕｒｏｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ、１４．［Ｓｅｒ３（Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎは、化合物１ｈＧｈｒｅｌｉｎの合成に用いたのと同様の方法で合成し、活性測定に供した。
【０１８４】
　　〔主な略号〕
ＨＭＰ樹脂；４−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｏｘｙｍｅｔｈｙｌ樹脂
Ｆｍｏｃアミド樹脂；４−（２’，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ−Ｆｍｏｃ−
ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔａｍｉｄｏ−ｅｔｈｙｌ樹脂
ＰＡＭ樹脂；ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｏａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ樹脂
ＨＢＴＵ；２−（１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−
ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ　Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ＴＢＴＵ；２−（１Ｈ−ｂｅｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−
ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ　ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ
ＨＯＢｔ；１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ
ＤＣＣ；ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ
ＤＩＰＣＩ；ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ
ＴＦＡ；ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ
ＤＩＰＥＡ；ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ
ＴＩＰＳ；ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ
Ｆｍｏｃ；ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ
Ｂｏｃ；ｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ
Ｔｒｔ；ｔｒｉｔｙｌ
Ｂｕｔ；ｔ−ｂｕｔｙｌ
Ｐｍｃ；２，２，５，７，８−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ−６−
ｓｕｌｆｏｎｙｌ
Ｐｒｌ；ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ
ＰｈＰｒｌ；ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｏｎｙｌ
Ｂｚｌ；ｂｅｎｚｙｌ
Ｂｏｍ；ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ
Ｔｏｓ；ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ
Ｃｌ−Ｚ；２−ｃｈｌｏｒｏ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ
Ｐｉｓ；２−ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｐｒｏｐｙｌ
Ｍｔｔ；４−ｍｅｔｈｙｌｔｒｉｔｙｌ
ＤＭＦ；Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ
ＮＭＰ；Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ
ＤＭＡＰ；４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ
ＨＯＳｕ；Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｉｍｉｄｅ
Ａｄｏｄ；２−ａｍｉｎｏｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ
Ａｉｂ；　２−ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　
Ａｐｅ；５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ
Ｃｈａ；ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｌａｎｉｎｅ　
Ｄａｐ；２，　３−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　ａｃｉｄ
Ｎａｌ；ｎａｐｈｔｙｌａｌａｎｉｎｅ
Ｎｌｅ；ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ
【０１８５】
　　〔合成に使用した保護アミノ酸〕
Ｆｍｏｃ法：
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，　Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，　Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ），　Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ），　Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ），　Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ），　Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），　Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ），　Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），　Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，　Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，　Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，　Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，　Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，　Ｆｍｏｃ−ＤＰｈｅ，　Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎ−Ｃ８Ｈ１７），　Ｆｍｏｃ−ＤＳｅｒ（ｎ−Ｃ８Ｈ１７），　Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｎ−Ｃ８Ｈ１７），Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＰｉｓ），　Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），　Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｏｃｔａｎｏｙｌ），　Ｆｍｏｃ−２−ＬＮａｌ，Ｆｍｏｃ−２−ＤＮａｌ，　Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ，　Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ），　Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ，　Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｃ７Ｈ１５）
Ｂｏｃ法：
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，　Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），　Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ａｃ），　Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｒｌ），　Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ），　Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ），　Ｂｏｃ−Ｇｌｎ，　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ），　Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ，　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ，　Ｂｏｃ−Ａｌａ，　Ｂｏｃ−Ｖａｌ，　Ｂｏｃ−Ｐｈｅ，　Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ｎ−Ｃ８Ｈ１７），Ｂｏｃ−Ａｐｅ　Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｎ−Ｃ８Ｈ１７）
【０１８６】
　　〔使用した機器〕
（ａ）分析用ＨＰＬＣシステム
機器；島津ＬＣ−１０Ａシステム
カラム；ＹＭＣ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（４．６ｍｍφ　ｘ　１５０ｍｍ）
カラム温度；４０℃
溶出液；０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル濃度を２０分間で０％から５０％に直線的に変化させた。
流速；１ｍＬ／分
検出；ＵＶ（２１０ｎｍ）
注入量；１０〜１００μｌ
【０１８７】
（ｂ）分取用ＨＰＬＣシステム
機器；Ｗａｔｅｒｓ　６００　Ｍｕｌｔｉｓｏｌｖｅｎｔ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ
カラム；ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−Ａ（５μｍ，　２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）
　　　　ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（５μｍ，Ｃ４，１０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）
　　　　ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（５μｍ，Ｃ４，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）
　　　　ＹＭＣ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（４．６ｍｍφ　ｘ　１５０ｍｍ）
溶出液；０．１％トリフルオロ酢酸中、適宜アセトニトリル濃度を直線的に変化させた。
流速；１０ｍＬ／分（内径２０ｍｍカラム用）、３ｍＬ／分（内径１０ｍｍカラム用）、１ｍＬ／分（内径４．６ｍｍカラム用）
検出；２１０ｎｍ，　２６０ｎｍ
注入；１０〜２０００μｌ、２０００μＬ以上はポンプにより注入した。
【０１８８】
（ｃ）質量分析機
機器；フィニガンＭＡＴ　ＴＳＱ７００
イオン源；ＥＳＩ
検出イオンモード；ｐｏｓｉｔｉｖｅ
スプレー電圧；４．５ｋＶ
キャピラリー温度；２５０℃
移動相；０．２％酢酸・メタノール混液（１：１）
流速；０．２ｍＬ／分
スキャン範囲；ｍ／ｚ３００〜１，５００
【０１８９】
（ｄ）アミノ酸配列分析
機器；パーキンエルマー社製　アプライドバイオシステム　４７７Ａ、４９２型シークエンサー
（ｅ）アミノ酸組成分析
機器；日立製作所製　Ｌ−８５００型アミノ酸分析機計
試料；とくに記載のないものは、封管中、６Ｍ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解した。
【０１９０】
（２）アシルセリンまたはアシルトレオニンを有する誘導体の合成例（Ｆｍｏｃ法、カルボキシル末端カルボン酸）
　化合物１　ｈＧｈｒｅｌｉｎ：ＧＳＳ（ＣＯ−Ｃ７Ｈ１５）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＨＭＰ−樹脂（ＡＢＩ社製、４０３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を２０％ピペラジンで２０分間処理したのち、順次ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによるＦｍｏｃ−アミノ酸導入とピペラジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂を構築した。最後にＤＣＣ／ＨＯＢｔにてＢｏｃ−Ｇｌｙを導入したのち、得られた保護ペプチド樹脂　（１．３ｇ）を１％ＴＦＡ−５％ＴＩＰＳ−塩化メチレン溶液（１５ｍＬ）で３０分間処理した。ペプチド樹脂をろ取し、塩化メチレン（３０ｍＬ）で数回洗浄した後、５％ＤＩＥＡ（１０ｍＬ）、ついで塩化メチレン（３０ｍＬ）で洗浄した。得られた脱Ｔｒｔペプチド樹脂（約１．３ｇ）をＮＭＰ（１０ｍＬ）に膨潤させ、ＤＭＡＰ（６１．１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）存在下、オクタン酸（１４４．２ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１２６．２ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を加え８時間反応させた。樹脂をろ取し、ＮＭＰ、塩化メチレンで洗浄し減圧下乾燥して、３位セリン側鎖がオクタノイル化された保護ペプチド樹脂　約１．２ｇを得た。このものに、８８％ＴＦＡ−５％フェノール−２％ＴＩＰＳ−５％Ｈ２Ｏからなる脱保護試薬（１０ｍＬ）を加え、室温で２時間攪拌した。樹脂をろ去し、ろ液を濃縮後、残さにエーテルを加え沈殿とした。沈殿をろ取、乾燥し、粗ペプチド約５５０ｍｇを得た。本品２００ｍｇを水１０ｍＬに溶かし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（Ｃ４，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から５４％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、１２０ｍｇの目的物を得た。
【０１９１】
（３）アシルセリンまたはアシルトレオニンを有する誘導体の合成例（Ｆｍｏｃ法、カルボキシル末端アミド体）
　化合物３　Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−９）−ＮＨ２；ＧＳＳ（ＣＯ−Ｃ７Ｈ１５）ＦＬＳＰＥＨ−ＮＨ２
　Ｆｍｏｃ−アミド樹脂（ＡＢＩ社製、４０３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を２０％ピペラジンで２０分間処理したのち、順次ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによるＦｍｏｃ−アミノ酸導入とピペラジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−樹脂を構築した。最後にＤＣＣ／ＨＯＢｔにてＢｏｃ−Ｇｌｙを導入したのち、得られた保護ペプチド樹脂（約５５０ｍｇ）を１％ＴＦＡ−５％ＴＩＰＳ−塩化メチレン溶液（１０ｍＬ）で３０分間処理した。ペプチド樹脂をろ取し、塩化メチレン（３０ｍＬ）で数回洗浄した後、５％ＤＩＥＡ（１０ｍＬ）、ついで塩化メチレン（３０ｍＬ）で洗浄した。得られた脱Ｔｒｔペプチド樹脂（約７５０ｍｇ）をＮＭＰ（１０ｍＬ）に膨潤させ、ＤＭＡＰ（６１．１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）存在下、オクタン酸（１４４．２ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１２６．２ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え４時間反応させた。樹脂をろ取し、ＮＭＰ、塩化メチレンで洗浄し減圧下乾燥して、３位セリン側鎖がオクタノイル化された保護ペプチド樹脂　約８００ｍｇを得た。このものに、ＴＦＡ（１０ｍＬ）を加え、室温で３０分間攪拌した。樹脂をろ去し、ろ液を濃縮後、残さにエーテルを加え沈殿とした。沈殿をろ取、乾燥し、粗ペプチド２５０ｍｇを得た。本品約２００ｍｇを３０％酢酸水１０ｍＬに溶かし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（Ｃ４，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から５４％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、１５０ｍｇの目的物を得た。
【０１９２】
（４）アシルセリンまたはアシルトレオニンを有する誘導体の合成例（Ｂｏｃ法）
　化合物９　［Ｓｅｒ３（Ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）；ＧＳＳ（ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ３）ＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｐａｍレジン（０．７５ｇ，０．５ｍｍｏｌ）より、保護ラットグレリン樹脂（４−２８）をＢｏｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙで構築後、その半量１．４ｇに、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ３）−ＯＨ，　Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを縮合した。得られた樹脂１．５ｇをＨＦ：ｐ−クレゾール（８．５ｍＬ：１．５ｍＬ）で０℃、一時間処理後、ＨＦを減圧下留去した。残さにエーテルを加え６７１ｍｇの粗ペプチドを得た。このものを５０％酢酸（ＡｃＯＨ）に溶かし、分取用カラムＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−Ａ（５μｍ，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、１０ｍＬ／ｍｉｎで０．１％ＴＦＡを含む溶液でアセトニトリル濃度を７５分間で０から９５％まで変化させて溶出した。目的物を含む画分を凍結乾燥して粗ペプチドを１３５．８ｍｇ得た。この一部０．５ｍｇをＹＭＣ−Ａ−３０２カラム（Ｃ１８，４．６ｍｍ　ｘ１５０ｍｍ）に添加し、流速１　ｍＬ／ｍｉｎでアセト二トリル濃度を１５％から１９％まで変化させて溶出した。この精製操作を繰り返し、目的とする画分を合わせ目的物０．４１ｍｇを得た。
【０１９３】
　以下のアシルセリンまたはアシルトレオニンを有するペプチド誘導体は、上記化合物３または化合物９の製造方法と同様にして製造した。
　以下にアシルセリンまたはアシルトレオニンを有するペプチド誘導体の質量分析、アミノ酸組成分析結果をまとめた。
【０１９４】
　化合物１．　ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　３３７１．０（理論値３３７０．９），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；３．５３（４），　Ｇｌｘ；５．９１（６），　Ｇｌｙ；１．０２（１），　Ａｌａ；１．００（１），　Ｖａｌ；０．９６（１），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；１．０６（１），　Ｌｙｓ；３．９０（４），　Ｈｉｓ；０．９７（１），　Ａｒｇ；２．８７（３），　Ｐｒｏ；３．８７（４）
　化合物３．　Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−９）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；１０８５．７（理論値１０８５．２），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．４５（３），　Ｇｌｘ；０．９８（１），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；０．９９（１），　Ｈｉｓ；１．０８（１），　Ｐｒｏ；０．９７（１）
　化合物４．　［Ｓｅｒ２（Ｏｃｔａｎｏｙｌ），Ｓｅｒ３］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−９）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；１０８５．８（理論値１０８５．２），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．４６（３），　Ｇｌｘ；０．９８（１），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ｈｉｓ；１．０９（１），　Ｐｒｏ；０．９７（１）
【０１９５】
　化合物５．　［Ｓｅｒ２（Ｏｃｔａｎｏｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−９）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；１２１１．７（理論値１２１１．４），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．４８（３），　Ｇｌｘ；１．００（１），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｈｉｓ；１．１１（１），　Ｐｒｏ；０．９８（１）
　化合物８．　［Ｓｅｒ３（Ａｃｅｔｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　３２３１．０（理論値３２３０．７），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；３．５０（４），　Ｇｌｘ；５．９０（６），　Ｇｌｙ；０．９８（１），　Ａｌａ；２．００（２），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ｌｙｓ；４．９７（５），　Ｈｉｓ；０．９９（１），　Ａｒｇ；１．９９（２），　Ｐｒｏ；３．９９（４）
　化合物９．　［Ｓｅｒ３（Ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　３２４５．０（理論値３２４２．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；３．４２（４），　Ｇｌｘ；５．９３（６），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ａｌａ；２．００（２），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；１．１０（１），　Ｌｙｓ；４．９７（５），　Ｈｉｓ；０．９９（１），　Ａｒｇ；１．９９（２），　Ｐｒｏ；３．８３（４）
【０１９６】
　化合物１５．　［Ｓｅｒ３（３−Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　３３７７．０（理論値３３７６．９），　アミノ酸酸組成比：Ｓｅｒ；３．０６（４），　Ｇｌｘ；５．９２（６），　Ｇｌｙ；０．９３（１），　Ａｌａ；０．９８（１），　Ｖａｌ；０．９９（１），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；１．１３（１），　Ｌｙｓ；４．０３　（４），　Ｈｉｓ；１．０８（１），　Ａｒｇ；３．００（３），　Ｐｒｏ；３．７６（４）
　化合物１６．　［Ｓｅｒ３（３−Ｏｃｔｅｎｏｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　３３６９．０（理論値３３６８．９），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；３．５９（４），　Ｇｌｘ；５．９１（６），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ａｌａ；１．０２（１），　Ｖａｌ；０．９９（１），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；１．１５（１），　Ｌｙｓ；３．９７（４），　Ｈｉｓ；０．９８（１），　Ａｒｇ；２．９３（３），　Ｐｒｏ；３．８８（４）　
　化合物２８．Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−８）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］　９４８．５（理論値９４８．１），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．４５（３），　Ｇｌｘ；０．９７（１），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｐｒｏ；０．９７（１）
【０１９７】
　化合物２９．Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］８１９．６（理論値８１９．０），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．５２（３），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０２（１），　Ｐｒｏ；１．０９（１）
　化合物３０．Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−６）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；７２２．４（理論値７２１．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．４７（３），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．００（１）
　化合物３１．Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−５）
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］６３６．５（理論値６３５．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．７８（２），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０２（１）
　化合物３２．Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−５）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］６３５．４（理論値６３４．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．６７（２），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０１（１），　
【０１９８】
　化合物３３−２．　Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−４）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］５２２．２（理論値５２１．６），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．６５（２），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ｐｈｅ；１
　化合物３４．　Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−３）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］３７５．２（理論値３７４．４），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．６６（２），　Ｇｌｙ；１
　化合物３５．　［Ｌｙｓ８］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−８）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］９４７．９（理論値９４７．１），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．７０（３），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｌｙｓ；０．９９（１），　Ｐｒｏ；１．００（１）
　化合物３６．　［Ａｒｇ８］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−８）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］９７５．８（理論値９７５．２），アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．７０（３），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ａｒｇ；０．９９（１），　Ｐｒｏ；１．００（１）
【０１９９】
　化合物３７．　［Ｌｙｓ６］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−６）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］７６３．６（理論値７６２．９），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．８０（２），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ｌｙｓ；１．００（１）
　化合物３８．　［Ｌｙｓ５］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−５）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］６５０．５（理論値６４９．８），アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．７９（２），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ｐｈｅ；１，　Ｌｙｓ；０．９９（１）
　化合物３９．　［ＤＰｈｅ４，　Ｌｙｓ５］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−５）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］６５０．５（理論値６４９．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．７９（２），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ｐｈｅ；１，　Ｌｙｓ；０．９９（１）
　化合物４０．　［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−７）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］７７４．７（理論値７７４．０），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．８０（２），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ｐｒｏ；１．００（１）
【０２００】
　化合物４３．　［Ｎ−Ｇｌｙｃｙｌ］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−７）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；７３２．７（理論値７３１．９），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．８０（２），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ｐｒｏ；１．００（１）
　化合物４４．　［Ｌｅｕ２］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；８４５．７（理論値８４５．１），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．８０（２），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；１．０２（１），　Ｐｒｏ；　０．９９（１）
　化合物４５．　［Ｈｉｓ２］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；８６９．７（理論値８６９．０），　プロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃，　２時間加水分解後のアミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．０２（２），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｈｉｓ；０．９５（１），　Ｐｒｏ；０．９９（１）
【０２０１】
　化合物４６．　［Ｌｙｓ２］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；８６０．７（理論値８６０．１），　プロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃，　２時間加水分解後のアミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．０４（２），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｌｙｓ；１．００（１），　Ｐｒｏ；１．００（１）
　化合物４７．　［Ｇｌｙ２］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；７８９．５（理論値７８８．９），　プロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃，　２時間加水分解後のアミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．１４（２），　Ｇｌｙ；２．０１（２），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｐｒｏ；１．００（１）
　化合物５９．　［Ｔｈｒ３（Ｏｃｔａｎｏｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３３８４．０（理論値３３８４．９）　アミノ酸組成比  ：Ａｌａ；１．０２（１），　Ａｒｇ；２．９９（３），　Ｇｌｘ；５．９１（６），　Ｇｌｙ；１．０２（１），　Ｈｉｓ；１．００（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；４．０５（４），　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｐｒｏ；４．０６（４），　Ｓｅｒ；２．６６（３），　Ｔｈｒ；０．９４（１），　Ｖａｌ；０．９６（１）
【０２０２】
　化合物６０．　［Ｌｅｕ２，　Ｔｈｒ３（Ｏｃｔａｎｏｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３４１０．０（理論値３４１１．０）　アミノ酸組成比  ：Ａｌａ；１．０１（１），　Ａｒｇ；２．９５（３），　Ｇｌｘ；５．９２（６），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ｈｉｓ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；３（３），　Ｌｙｓ；４．０２（４），　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ｐｒｏ；４．００（４），　Ｓｅｒ；１．８１（２），　Ｔｈｒ；０．９６（１），　Ｖａｌ；０．９７（１）
　化合物６９．　［Ｓｅｒ３（４−Ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３３４３．０（理論値３３４２．９）　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．００（１），　Ａｒｇ；２．９７（３），　Ｇｌｘ；５．８６（６），　Ｇｌｙ；１．０２（１），　Ｈｉｓ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；２，　Ｌｙｓ；４．００（４），　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ｐｒｏ；３．９９（４），　Ｓｅｒ；３．５４（４），　Ｖａｌ；０．９８（１）
　化合物７５．　［Ｌｙｓ７］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ　
ＥＳＩ−ＭＳ　　［Ｍ＋Ｈ］；８５０．５（理論値８５０．０），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．６７（３），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｌｙｓ；１．００（１）　
【０２０３】
（５）アミノ末端アシル化誘導体の合成例
　化合物６．［Ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ，　Ｓｅｒ３］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−９）−ａｍｉｄｅ；Ｃ７Ｈ１５ＣＯ−ＧＳＳＦＬＳＰＥＨ−ＮＨ２
　Ｆｍｏｃ−アミド樹脂（ＡＢＩ社製、４０３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を２０％ピペラジンで２０分間処理したのち、順次ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによるＦｍｏｃ−アミノ酸導入とピペラジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−樹脂を構築した。ピペラジン処理後、得られたペプチド樹脂（５５０　ｍｇ）をＮＭＰで洗浄し、ＨＯＢｔ（１３５．１ｍｇ，１ｍｍｏｌ）存在下、ＤＩＰＣＩ（１２６．２ｍｇ，１ｍｍｏｌ）とオクタン酸（１４４．２ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を加え４時間反応させた。樹脂をろ取し、ＮＭＰ、塩化メチレンで洗浄し減圧下乾燥して、アミノ末端Ｇｌｙアミノ基がオクタノイル化された保護ペプチド樹脂　約６００ｍｇを得た。ＴＦＡ（１０ｍＬ）で脱保護し（３０分間処理）、粗ペプチド２００ｍｇを得た。全量をＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（５μｍ，Ｃ４，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から５４％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍＬ）で溶出させた。約１８０ｍｇの目的物を得た。
　測定値　ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；１０８５．６（理論値１０８５．２）、アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．４７（３），　Ｇｌｘ；０．９８（１），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０２（１），　Ｈｉｓ；１．０９（１），　Ｐｒｏ；０．９６（１）
【０２０４】
（６）側鎖アルキルセリンを含む誘導体の合成例
　化合物５０．［Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ；
ＧＳＳ（Ｃ８Ｈ１７）ＦＬＳＰ−ＮＨ２
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）
　氷冷下、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（１２．３ｇ，５３．９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３００ｍｌ）溶液に水素化ナトリウム（３．１９ｇ，１３３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌した。この中に、ヨウ化オクタン（１１．０ｍｌ，６０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。氷冷下、反応液に水（４０ｍｌ）を滴下した後、溶媒を減圧留去した。得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ゲル；Ｍｅｒｃｋ社製Ａｒｔ９３８５、溶出溶媒；ジクロロメタン：メタノール：酢酸＝１２０：１０：１）に付して精製し、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）を淡黄色油状物として６．８８ｇ（収率３６．２％）得た。このＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）（６．８８ｇ，２１．７ｍｍｏｌ）に氷冷下、トリフルオロ酢酸（１２０ｍｌ）を加え、室温で０．５時間攪拌した。トリフルオロ酢酸を減圧留去した後、得られた残査をジエチルエーテル（１２０ｍｌ）に溶解し、４Ｎ塩酸−ジオキサン（２２ｍｌ）を加え、氷冷下、１時間攪拌した。析出した結晶をろ取し、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）・ＨＣｌを無色結晶として５．２３ｇ（収率９６．３％）得た。このＨ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）・ＨＣｌ（２．５４ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）の１０　％炭酸水素ナトリウム（５０ｍｌ）懸濁液にトリエチルアミン（１．４０ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）を加えた後、この中にＦｍｏｃ−ＯＳｕ（５．００ｇ，１４．８ｍｍｏｌ）の１，２−ジメトキシエタン（２０ｍｌ）溶液を１０分間かけて滴下し、室温で１６時間攪拌した。不溶物をろ過し、ろ液にジクロロメタンを加え有機層を分離した後、１３％食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ゲル；富士シリシア社製ＢＷ−３００、溶出溶媒；ジクロロメタン：メタノール＝９３：７）に付して精製し、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）を無色結晶として２．７５ｇ（収率６２．６％）得た。Ｒｆ＝０．４５（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９：１，Ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０Ｆ２５４，ＭＥＲＣＫ）Ｆｍｏｃ−ＤＳｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）：Ｒｆ＝０．４５（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９：１，Ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０Ｆ２５４，　ＭＥＲＣＫ）
【０２０５】
　Ｆｍｏｃ−アミド樹脂（ＡＢＩ社製、４００ｍｇ，０．２５　ｍｍｏｌ）を２０％ピペラジンで２０分間処理したのち、順次ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによるＦｍｏｃ−アミノ酸導入とピペラジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｐｒｏ樹脂を構築した。最後にＤＣＣ／ＨＯＢｔにてＢｏｃ−Ｇｌｙを導入したのち、得られた保護ペプチド樹脂　から２５０ｍｇをとりＴＦＡ（１０ｍＬ）で３０分間処理した。樹脂をろ去し、ろ液を濃縮後、残さにエーテルを加え沈殿とし粗ペプチド約１２０ｍｇを得た。本品を５％ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）に溶かし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−Ａ（５μｍ，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から６０％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、４０ｍｇの目的物を得た。
【０２０６】
　化合物８４．　［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）−ｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ；Ｈ−Ａｐｅ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｐｈ
　オキシム樹脂（２３０ｍｇ／０．２５ｍｍｏｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）をグラスフィルター付反応容器に入れ、予め塩化メチレン（ＤＣＭ）に溶かし、ＭｇＳＯ４で乾燥したＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ・Ｈ２Ｏ（１９０ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１６０ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、およびＤＣＭ　５ｍＬを加え、終夜振盪した。適量のＤＣＭ、ＤＣＭ／ＥｔＯＨ＝１：１、ＤＣＭで順次数回ずつ洗浄した。Ｌｅｕ導入後は、（１）２５％　ＴＦＡ／ＤＣＭ　１０ｍＬを加え３０分振盪した後、ＤＣＭ、イソプロピルアルコール（ｉＰｒＯＨ）、ＤＣＭ、ＤＭＦでそれぞれ数回洗浄する、（２）三角フラスコ中でＢｏｃアミノ酸０．７５ｍｍｏｌ（３当量）、ＴＢＴＵ　０．７５ｍｍｏｌ（３当量）、ＨＯＢｔ　０．７５ｍｍｏｌ（３当量）をＤＭＦ　５ｍＬに溶解し、ＤＩＰＥＡ　１．２５ｍｍｏｌ（５当量）を加え攪拌したものを反応容器に入れ１時間振盪する、という操作を繰り返し、順次アミノ酸を縮合した。最終的にＢｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｏｘｉｍｅ樹脂３７０ｍｇを得た。ＤＭＦ約５ｍＬ中に懸濁させ、ベンジルアミン塩酸塩（１８０ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１７３μＬ，　１．２５ｍｍｏｌ）、酢酸７２μＬ（１．２５ｍｍｏｌ）を加え攪拌した。２４時間後、樹脂を濾去し、濾液を減圧留去し、１Ｎ　ＨＣｌ　１０ｍＬでＢｏｃ保護体を析出させた。水洗、乾燥後、ＴＦＡ５ｍＬを加え３０分反応させ脱Ｂｏｃを行った。ＴＦＡを減圧留去し、エーテル（Ｅｔ２Ｏ）で沈殿させ、目的物［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）−ｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ　１１０ｍｇを得た。同様の方法で化合物８２、８３、８５を合成した。
【０２０７】
　以下のアルキルセリンを有するペプチド誘導体は、化合物８２〜８５を除き、上記化合物５０の製造方法と同様にして製造した。
　以下にアルキルセリンを有するペプチド誘導体の質量分析、アミノ酸組成分析結果をまとめた。
【０２０８】
　化合物１７．［Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
　ＥＳＩ−ＭＳ；３３５７．０（理論値；３３５６．９）、アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．９２（３＋１），　Ｇｌｘ；５．９４（６），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ａｌａ；０．９８（１），　Ｖａｌ；０．９９（１），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；１．１３（１），　Ｌｙｓ；　４．０４（４），　Ｈｉｓ；１．０９（１），　Ａｒｇ；３．０１（３），　Ｐｒｏ；３．８９（４）
　化合物５０．　［Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
　ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；８０５．５（理論値８０５．０）、プロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃，　２時間加水分解後のアミノ酸組成比：Ｓｅｒ；　０．８６（２＋１），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０６（１），　Ｐｒｏ；０．９５（１）
【０２０９】
　化合物５１．［Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ），　ＤＰｈｅ４］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
　ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；８０５．４（理論値８０５．０）、プロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃，　２時間加水分解後のアミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．９７（２＋１），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０５（１），　Ｐｒｏ；１．１６（１）
　化合物５２．［ＤＳｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
　ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；８０５．４（理論値８０５．０）、プロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃，　２時間加水分解後のアミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．５１（２＋１），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｐｒｏ；１．００（１）
【０２１０】
　化合物５３．［ＤＳｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ），ＤＰｈｅ４］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
　ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；８０５．５（理論値８０５．０）、プロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃，　２時間加水分解後のアミノ酸組成比：Ｓｅｒ；１．５１（２＋１），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｐｒｏ；１．０１（１）
　化合物６７．　［Ｓｅｒ３（Ｂｚｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３３３５．０（理論値３３３４．８）　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．００（１），　Ａｒｇ；２．９６（３），　Ｇｌｘ；５．９２（６），　Ｇｌｙ；１．００　（１），　Ｈｉｓ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；４．００（４），　Ｐｈｅ；１．０２（１），　Ｐｒｏ；４．０８（４），　Ｓｅｒ；３．５８（４），　Ｖａｌ；０．９８（１）
【０２１１】
　化合物７６．　［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，　Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ），　Ｌｙｓ５］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；５９１．５（理論値５９０．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．４５（１），　Ｐｈｅ；１　，Ｌｙｓ；１．００（１）
化合物７７．　［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，ＤＳｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ），ＤＰｈｅ４，　Ｌｙｓ５］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；５９１．５（理論値５９０．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．４５（１），　Ｐｈｅ；１，　Ｌｙｓ；１．０１（１）
　化合物７８．　［Ａｉｂ１，　Ｈｉｓ２，Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ），Ｌｙｓ５］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−５）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；７１４．６（理論値７１３．９），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．４５（１），　Ｐｈｅ；１，　Ｈｉｓ；１．０１（１），　Ｌｙｓ；１．００（１）
【０２１２】
　化合物７９．　［Ａｉｂ１，Ｈｉｓ２，ＤＳｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ），ＤＰｈｅ４，Ｌｙｓ５］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−５）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；７１４．５（理論値７１３．９），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．４４（１），　Ｐｈｅ；１，　Ｈｉｓ；１．００（１），　Ｌｙｓ；１．０１（１）
　化合物８１．　［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）−ａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；５７６．５（理論値５７５．８），アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．４９（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；０．９９（１）
　化合物８２．　［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，　Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；５９０．６（理論値５８９．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．４９（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；０．９９（１）
【０２１３】
　化合物８３．　［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，　Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）−ｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；６０４．３（理論値６０３．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．５０（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；０．９９（１）
　化合物８４．　［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，　Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）−ｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；６６６．５（理論値６６５．９），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．４６（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；０．９８（１）
化合物８５．　［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，　Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；６１９．６（理論値６１８．９），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．４７（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；０．９９（１）
【０２１４】
（７）側鎖アルキルシステインを含む誘導体の合成例
　化合物４８．　　［Ｃｙｓ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ＮＨ２；ＧＳＣ（Ｃ８Ｈ１７）ＦＬＳＰ−ＮＨ２
　Ｆｍｏｃ−アミド樹脂（ＡＢＩ社製、４０３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を２０％ピペラジンで２０分間処理したのち、順次ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによるＦｍｏｃ−アミノ酸導入とピペラジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｃｙｓ（Ｃ８Ｈ１７）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｐｒｏ樹脂を構築した。最後にＤＣＣ／ＨＯＢｔにてＢｏｃ−Ｇｌｙを導入したのち、得られた保護ペプチド樹脂　（５５０ｍｇ）を　ＴＦＡ（１０　ｍＬ）で３０分間処理しした。樹脂をろ去し、ろ液を濃縮後、残さにエーテルを加え沈殿とし粗ペプチド１２０　ｍｇを得た。本品を５％酢酸（ＡｃＯＨ）１０ｍＬに溶かし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−Ａ（５μｍ，　２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から６０％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、４４ｍｇの目的物を得た。
【０２１５】
　化合物６８．［Ｃｙｓ３（Ｔｒｔ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ；ＧＳＣ（Ｃ−Ｐｈ３）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
　Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＨＭＰ−樹脂（ＡＢＩ社製、４０３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を２０％ピペラジンで２０分間処理したのち、順次ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによるＦｍｏｃ−アミノ酸導入とピペラジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＨＭＰ樹脂を構築した。最後にＤＣＣ／ＨＯＢｔにてＢｏｃ−Ｇｌｙを導入したのち、得られた保護ペフチド樹脂（１．４ｇ）を得た。このうち４００ｍｇにＴＦＡ（１５ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。ろ過して樹脂を除き、ろ液を濃縮した後、エーテルを加え沈殿とした。約９０ｍｇを水４０ｍＬに溶かし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（Ｃ４，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から５４％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、６０ｍｇの目的物を得た。
【０２１６】
　以下のアルキルシステインを有するペプチド誘導体は、上記化合物４８または化合物６８の製造方法と同様にして製造した。
　以下にアルキルシステインを有するペプチド誘導体の質量分析、アミノ酸組成分析結果をまとめた。
【０２１７】
　化合物１８．　［Ｃｙｓ３（Ｏｃｔｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ
　ＥＳＩ−ＭＳ；３３１７．０（理論値；３３１６．９）、アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；２．６９（３），　Ｇｌｘ；５．９０（６），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ａｌａ；１．９９（２），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；１．０２（１），　Ｌｙｓ；４．９７（５），　Ｈｉｓ；０．９９　（１），　Ａｒｇ；１．９８（２），　Ｐｒｏ；３．８７（４）
　化合物４８．　［Ｃｙｓ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
　ＥＳＩ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］；８２１．７（理論値８２１．１）、プロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃、２時間加水分解後アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．６０（２），　Ｇｌｙ；１．０８（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０６（１），　Ｐｒｏ；０．９６（１）
【０２１８】
　化合物４９．　［Ｃｙｓ３（Ｏｃｔｙｌ），ＤＰｈｅ４］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）−ａｍｉｄｅ
　ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；８２１．６（理論値８２１．１）、プロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃、２時間加水分解後のアミノ酸組成比：Ｓｅｒ；０．５８（２），　Ｇｌｙ；１．０２（１），　Ｌｅｕ；１，　Ｐｈｅ；１．０６（１），　Ｐｒｏ；０．９７（１）
　化合物６８．　［Ｃｙｓ３（Ｔｒｔ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　３５０３．０（理論値３５０３．１），　アミノ酸酸組成比：Ｓｅｒ；２．４２（３），　Ｇｌｘ；５．７７（６），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ａｌａ；１．０１　（１），　Ｖａｌ；０．９４（１），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；０．９９（１），　Ｌｙｓ；３．９４　（４），　Ｈｉｓ；０．９９（１），　Ａｒｇ；２．９２（３），　Ｐｒｏ；３．８１（４）
【０２１９】
（８）Ｎ−メチルアミノ酸を含むペプチド誘導体の合成例
　化合物８６．　［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ），ＭｅＰｈｅ４，ＭｅＬｅｕ５］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）−ａｍｉｄｅ；ＮＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＯ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）−ＭｅＰｈｅ−ＭｅＬｅｕ−ＮＨ２
　Ｆｍｏｃ−アミド樹脂（０．４０ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）をグラスフィルター付反応容器に入れ、２０％ピペリジン／ＮＭＰ　１５ｍＬを加え２０分振盪し、Ｆｍｏｃ基を除去した。その後、ＮＭＰ　１５ｍＬ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＬｅｕ−ＯＨ　１．０ｍｍｏｌ（４当量）、ＴＢＴＵ　１．０ｍｍｏｌ（４当量）、ＨＯＢｔ　１．０ｍｍｏｌ（４当量）、ＤＩＰＥＡ　１．０ｍｍｏｌ（４当量）を加え１時間振盪し、Ｆｍｏｃ−ＭｅＬｅｕを縮合した。その後、２０％　ピペリジンによるＦｍｏｃ基の除去とＤＩＰＥＡ　２．２５ｍｍｏｌ（９当量）存在下、Ｂｒｏｍｏ−ｔｒｉｓ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（３当量）によるＦｍｏｃ−アミノ酸縮合（３当量）を繰り返し、ペプチド鎖を延長した。縮合反応の終了を、少量の樹脂をＴＦＡで脱保護し、ＨＰＬＣおよび質量分析（ＭＳ）により確認した。Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−Ｓｅｒ（Ｏ−Ｃ８Ｈ１７）−ＭｅＰｈｅ−ＭｅＬｅｕ−樹脂を得た後、これをＴＦＡで３０分処理して切り出しおよび脱保護を行い、ＴＦＡを減圧留去、エーテル（Ｅｔ２Ｏ）で洗浄し、ＮＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＯ−Ｓｅｒ（Ｃ８Ｈ１７）−ＭｅＰｈｅ−ＭｅＬｅｕ−ＮＨ２　１２０ｍｇを得た。これをＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ（Ｃ１８，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から５４％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、７０ｍｇの目的物を得た。本誘導体をプロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃、２時間加水分解して、アミノ酸分析機上で検出されたアミノペンタン酸のピーク面積を、アミノペンタン酸１０ｎｍｏｌに対応する面積比からペプチド量を定量した。
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；６０４．５（理論値６０３．８）、プロピオン酸・塩酸（５０／５０）で１５０℃、２時間加水分解後の検出アミノ酸：Ｓｅｒ、Ａｐｅ
【０２２０】
　（９）混合ジスルフィド誘導体の合成
　化合物５７．　［Ｃｙｓ３（Ｓ−Ｈｅｐｔｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ；ＧＳＣ（Ｓ−Ｃ７Ｈ１５）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
　化合物５８の化合物３の製造方法に従った合成で得られた保護ぺプチド−ＨＭＰ樹脂（１ｇ）に８８％ＴＦＡ−５％フェノール−２％ＴＩＰＳ−５％Ｈ２Ｏからなる脱保護試薬（１５ｍＬ）を加え、室温で２時間攪拌した。樹脂をろ去し、ろ液を濃縮後、残さにエーテルを加え、粗［Ｃｙｓ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ粉末を約５５０ｍｇを得た。これをＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ（Ｃ１８，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％　トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から５４％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、３００ｍｇの［Ｃｙｓ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）を得た。そのうち４０ｍｇ（１１．４μｍｏｌ）を水（２０ｍＬ）に溶解し、４，４’−ジチオジピリジン（７．５ｍｇ、３４．２μｍｏｌ）のアセトニトリル溶液１ｍＬを加え、１時間放置した。反応終了を確認した後、反応液をクロロホルムで数回洗浄し、過剰の４，４’−ジチオジピリジンとピリドン誘導体を除いた。［チオピリジルＣｙｓ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）を含む水層（１０ｍＬ）を５％ＮＨ３水でｐＨを７．４として、１−ペプタンチオール（４．５ｍｇ、３４．２μｍｏｌ）のアセトニトリル溶液２ｍＬを加えた。１時間後、反応液をＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ（Ｃ１８，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から５４％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取、凍結乾燥して１５ｍｇの目的物を得た。
【０２２１】
化合物５７．　［Ｃｙｓ３（Ｓ−Ｈｅｐｔｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　３３９１．０（理論値３３９１．０），アミノ酸酸組成比：Ｓｅｒ；２．７６（３），　Ｇｌｘ；５．８１（６），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ａｌａ；１．０１（１），　Ｖａｌ；０．９５（１），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；０．９９（１），　Ｌｙｓ；３．９５　（４），　Ｈｉｓ；０．９９（１），　Ａｒｇ；２．９３（３），　Ｐｒｏ；３．８４（４）
【０２２２】
（１０）３位側鎖にアミド、逆方向のエステルを有する誘導体の合成例
　化合物５５．　［Ａｓｐ３（ＮＨ−Ｈｅｐｔｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ；ＧＳＤ（ＮＨ−Ｃ７Ｈ１５）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
　Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＨＭＰ−樹脂（ＡＢＩ社製、４０３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を２０％ピペラジンで２０分間処理したのち、順次ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによるＦｍｏｃ−アミノ酸導入とピペラジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ａｓｐ（ＯＰｉｓ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＨＭＰ樹脂を構築した。最後にＤＣＣ／ＨＯＢｔにてＢｏｃ−Ｇｌｙを導入したのち、得られた保護ペプチド樹脂（１．３ｇ）を４％ＴＦＡ−塩化メチレン溶液（１５ｍＬ）で１５分間処理した。ペプチド樹脂をろ取し、塩化メチレン（３０ｍＬ）で数回洗浄した後、４％　ＤＩＥＡ（１０ｍＬ）、ついで塩化メチレン（３０ｍＬ）で洗浄した。
　得られた脱Ｐｉｓペプチド樹脂（約１．３ｇ）をＮＭＰ（１０ｍＬ）に膨潤させ、水溶性カルボジイミド塩酸塩（１９１．７ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１３５．２ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）、ｎ−ペプチルアミン（１１５．２ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を加え、８時間反応させた。
【０２２３】
　樹脂をろ取し、ＮＭＰ、塩化メチレンで洗浄し減圧下乾燥して、３位Ａｓｐ側鎖がヘプチルアミド化された保護ペプチド樹脂　約１．２ｇを得た。このものに、８８％ＴＦＡ−５％フェノール−２％ＴＩＰＳ−５％Ｈ２Ｏからなる脱保護試薬（１０ｍＬ）を加え、室温で２時間攪拌した。樹脂をろ去し、ろ液を濃縮後、残さにエーテルを加え沈殿とした。沈殿をろ取、乾燥し、粗ペプチド約５５０ｍｇを得た。
　本品２００ｍｇを水１０ｍＬに溶かし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（Ｃ４，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から５４％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、１２０ｍｇの目的物を得た。
【０２２４】
　化合物６１．［Ｌｙｓ３（Ｏｃｔａｎｏｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ；
ＧＳＫ（ＣＯ−Ｃ７Ｈ１５）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＨＭＰ−樹脂（ＡＢＩ社製、４０３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を２０％ピペラジンで２０分間処理したのち、順次ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによるＦｍｏｃ−アミノ酸導入とピペラジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返しＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＨＭＰ樹脂を構築した。約３００ｍｇの保護ペプチド樹脂を１％ＴＦＡ−５％ＴＩＰＳ−塩化メチレン溶液（１５ｍＬ）で６０分間処理した。
【０２２５】
　ペプチド樹脂をろ取し、塩化メチレン（３０ｍＬ）で数回洗浄した後、１０％ＤＩＥＡ（１０ｍＬ）、ついで塩化メチレン（３０ｍＬ）で洗浄した。得られた脱Ｍｔｔペプチド樹脂（約３００ｍｇ）をＮＭＰ（２ｍＬ）に膨潤させ、ＨＯＢｔ（３４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）存在下、オクタン酸（４０μｌ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（５２ｍｇ，０．２５　ｍｍｏｌ）を加え一晩反応させた。
　樹脂をろ取し、ＮＭＰ、塩化メチレンで洗浄し減圧下乾燥して、３位リジン側鎖がオクタノイル化された保護ペプチド樹脂約３００ｍｇを得た。このものに、８８％ＴＦＡ−５％フェノール−２％ＴＩＰＳ−５％Ｈ２Ｏからなる脱保護試薬（５ｍＬ）を加え、室温で２時間攪拌した。樹脂をろ去し、ろ液を濃縮後、残さにエーテルを加え沈殿とした。沈殿をろ取、乾燥し、粗ペプチド約２３４ｍｇを得た。
【０２２６】
　本品を酢酸６ｍＬに溶かし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ（５μｍ，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から６０％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、１００ｍｇのパウダーを得た。この物を２ｍｌの５０％酢酸の溶かし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（５μｍ，Ｃ４，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）　に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から６０％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、５２ｍｇのパウダーを得た。
【０２２７】
　以下の化合物は、上記化合物５５または化合物６１の製造方法と同様にして製造した。
　その他、Ｆｍｏｃ常法で合成したペプチド誘導体の質量分析、アミノ酸組成分析結果をまとめた。
　化合物５４．［Ａｓｐ３（Ｏ−Ｈｅｐｔｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）
ＥＳＩ−ＭＳ　３３７１．０（理論値３３７０．９），　アミノ酸酸組成比：Ａｓｘ；０．９９（１），　Ｓｅｒ；２．７０（３），　Ｇｌｘ；５．８７（６），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ａｌａ；１．０１（１），　Ｖａｌ；０．９４（１），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｌｙｓ；４．０２（４），　Ｈｉｓ；１．００（１），　Ａｒｇ；２．９８（３），　Ｐｒｏ；３．８４（４）
　化合物５５．［Ａｓｐ３（ＮＨ−Ｈｅｐｔｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）
ＥＳＩ−ＭＳ　３３７０．０（理論値３３６９．９），　アミノ酸酸組成比：Ａｓｘ；０．８８（１），　Ｓｅｒ；２．９５（３），　Ｇｌｘ；５．９７（６），　Ｇｌｙ；１．２１（１），　Ａｌａ；１．０３（１），Ｖａｌ；０．９８（１），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｌｙｓ；３．９４（４），　Ｈｉｓ；０．９２（１），　Ａｒｇ；２．９１（３），　Ｐｒｏ；３．９９（４）
【０２２８】
　化合物５６．　［Ｄａｐ３（Ｏｃｔａｎｏｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３３７０．０（理論値３３６９．９）　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．０２（１），　Ａｒｇ；２．９４（３），　Ｇｌｘ；５．９４（６），　Ｇｌｙ；１．００（１），Ｈｉｓ；０．９１（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；３．９３（４），　Ｐｈｅ；０．９９（１），　Ｐｒｏ；４．０１（４），　Ｓｅｒ；２．８８（３），　Ｖａｌ；０．９８（１），Ｄａｐ；Ｎ．Ｄ．
　化合物５８．　［Ａｄｏｄ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）　
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３３５５．０（理論値３３５５．０）　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．０１（１），　Ａｒｇ；２．９１（３），　Ｇｌｘ；５．９５（６），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ｈｉｓ；０．９１（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；３．９４（４），　Ｐｈｅ；０．９９（１），　Ｐｒｏ；４．０２（４），　Ｓｅｒ；２．８８（３），　Ｖａｌ；０．９６（１）
【０２２９】
　化合物６１．　［Ｌｙｓ３（Ｏｃｔａｎｏｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３４１２．０（理論値３４１２．０）　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．０５（１），　Ａｒｇ；３．０５（３），　Ｇｌｘ；６．０２（６），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｈｉｓ；１．００（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；５．１１（５），　Ｐｈｅ；０．９７（１），　Ｐｒｏ；４．２０（４），　Ｓｅｒ；２．６８（３），　Ｖａｌ；　１．００（１）
　化合物６２．　［Ｔｒｐ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３３４３．０（理論値３３４３．９），　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．００（１），　Ａｒｇ；３．０３（３），　Ｇｌｘ；５．９４（６），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ｈｉｓ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；４．００（４），　Ｐｈｅ；０．９９（１），　Ｐｒｏ；３．９６（４），　Ｓｅｒ；２．６０（３），　Ｔｒｐ；Ｎ．Ｄ．，Ｖａｌ；０．９８（１）
　化合物６３．［Ｐｈｅ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３３０５．０（理論値３３０４．８），　アミノ酸組成比：Ａｌａ；０．９９（１），　Ａｒｇ；２．９６（３），　Ｇｌｘ；５．８６（６），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｈｉｓ；１．００（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；３．９８（４），　Ｐｈｅ；２．０１（２），　Ｐｒｏ；３．９９（４），　Ｓｅｒ；２．６７（３），　Ｖａｌ；０．９８（１）
【０２３０】
　化合物６４．　［Ｃｈａ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３４１１．０（理論値３４１０．９），　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．０２（１），　Ａｒｇ；３．０１（３），　Ｇｌｘ；５．９２（６），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ｈｉｓ＋Ｃｈａ；２．０１（１＋１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；４．０２（４），　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ｐｒｏ；４．０３（４），　Ｓｅｒ；２．７２（３），　Ｖａｌ；　０．９７（１）
　化合物６５．　［２−ＬＮａｌ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３３５４．０（理論値３３５４．９），　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．００（１），　Ａｒｇ；２．９５（３），　Ｇｌｘ；５．８７（６），　Ｇｌｙ；１．０２（１），　Ｈｉｓ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；３．９８（４），　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ｐｒｏ；３．９４（４），　Ｓｅｒ；２．７３（３），　Ｖａｌ；０．９７（１），　Ｎａｌ；Ｎ．Ｄ．（１）
　化合物６６．　［２−ＤＮａｌ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３３５５．０（理論値３３５４．９），　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．０２（１），　Ａｒｇ；２．９５（３），　Ｇｌｘ；５．９６（６），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｈｉｓ；０．９２（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；３．９４（４），　Ｐｈｅ；０．９９（１），　Ｐｒｏ；４．０２（４），　Ｓｅｒ；２．９１（３），　Ｖａｌ；０．９８　（１），　Ｎａｌ；Ｎ．Ｄ．（２）
【０２３１】
　化合物７０．［Ｌｅｕ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３２７０．０（理論値３２７０．８），　アミノ酸組成比：Ａｌａ；０．９９（１），　Ａｒｇ；２．９５（３），　Ｇｌｘ；５．８８（６），　Ｇｌｙ；１．０１（１），　Ｈｉｓ；１．００（１），　Ｌｅｕ；　３（３），　Ｌｙｓ；３．９６（４），　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｐｒｏ；３．８９（４），　Ｓｅｒ；２．６５（３），　Ｖａｌ；０．９７（１）
　化合物７１．［Ｉｌｅ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３２７０．０（理論値３２７０．８），　アミノ酸組成比：Ａｌａ；０．９８（１），　Ａｒｇ；２．９６（３），　Ｇｌｘ；５．８７（６），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ｈｉｓ；１．０１（１），　Ｉｌｅ；０．９８（１），　Ｌｅｕ；２　２），　Ｌｙｓ；３．９７（４），　Ｐｈｅ；１．００（１），　Ｐｒｏ；３．９７（４），　Ｓｅｒ；２．６５（３），　Ｖａｌ；０．９８（１）
　化合物７２．　［Ｌｙｓ３（Ｏｃｔａｎｏｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３２８６．０（理論値３２８５．８），　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．０２（１），　Ａｒｇ；２．９４（３），　Ｇｌｘ；５．９５（６），　Ｇｌｙ；０．９９（１），　Ｈｉｓ；０．９２（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；４．９２（５），　Ｐｈｅ；０．９９（１），　Ｐｒｏ；４．０２（４），　Ｓｅｒ；２．９１（４），　Ｖａｌ；０．９９（１）
【０２３２】
　化合物７３．［Ｎｌｅ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３２７０．０（理論値３２７０．８），　アミノ酸組成比：Ａｌａ；１．０１（１），　Ａｒｇ；２．９８（３），　Ｇｌｘ；５．９２（６），　Ｇｌｙ；１．０２（１），　Ｈｉｓ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；４．０１（４），　Ｐｈｅ；１．０１（１），　Ｐｒｏ；４．０１（４），　Ｓｅｒ；２．７１（３），　Ｖａｌ；０．９８　（１），　Ｎｌｅ；　Ｎ．Ｄ．（１）
　化合物７４．　［Ｖａｌ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　Ｍ；３２５６．０（理論値３２５６．８），　アミノ酸組成比 ：Ａｌａ；０．９８（１），　Ａｒｇ；２．９６（３），　Ｇｌｘ；５．８４（６），　Ｇｌｙ；１．００（１），　Ｈｉｓ；１．０１（１），　Ｌｅｕ；２（２），　Ｌｙｓ；３．９７（４），　Ｐｈｅ；０．９９（１），　Ｐｒｏ；３．９４（４），　Ｓｅｒ；２．６４（３），　Ｖａｌ；１．９７（２）
　化合物８０．　［Ａｉｂ１，Ｈｉｓ２，ＤＮａｌ３，ＤＰｈｅ４，Ｌｙｓ５］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−５）−ａｍｉｄｅ；　Ｉｐａｍｏｒｅｌｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］；７１２．５（理論値７１１．９），アミノ酸組成比：Ｐｈｅ；１，　Ｈｉｓ；１．００（１），　Ｌｙｓ；１．００（１）
【実施例１１】
【０２３３】
グレリン誘導体ペプチド系化合物の活性比較
　実施例１０において合成したグレリン誘導体ペプチド系化合物および天然型グレリンペプチドについて、実施例１に示した方法によってＣａ上昇活性を測定した。
【０２３４】
（１）３位セリン側鎖の修飾
　ア．　オクタノイル基の位置
　グレリンの著しい構造上の特徴は３位セリン水酸基のオクタノイル基である。まず、オクタノイル化されるセリンの位置が３位であることが活性発現に有利であるかどうかを調べた。ラットＧＳＨレセプターを発現させたＣＨＯ細胞を用い、細胞内カルシウム上昇作用を指標とした。
　そのＥＣ５０値が５．４ｎＭに保持された短鎖グレリン誘導体であるグレリン（１−９）アミドをもとに、［セリン２（オクタノイル），セリン３］−グレリン（１−９）アミド、［セリン２（オクタノイル）］−グレリン（１−９）アミド、および［Ｎα−オクタノイル，セリン３］−グレリン（１−９）アミドを合成し、細胞内カルシウム上昇活性を検討した。
　結果を表４にまとめた。
【０２３５】
【表４】
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　ヒトグレリンのオクタノイル基を３位から２位セリンに移すと活性は約１／２００に低下した（ＥＣ５０＝１，１００ｎＭ）。
　２位と３位の両方にオクタノイル基を有する誘導体も同様に活性が低下した（ＥＣ５０＝１，４００　ｎＭ）。
　また、アミノ末端アミノ基のみをＮ−オクタノイル化すると活性は比較的弱くなった（ＥＣ５０＞１０，０００ｎＭ）。
　これらの結果から、オクタノイル基で修飾されたアミノ酸の位置はグレリン分子において３位が特に好ましいことが判明した。
【０２３６】
　イ．　脂肪酸鎖長
　ラットグレリン３位セリン側鎖のオクタノイル基を除去したデス−オクタノイル体の細胞内カルシウム上昇活性はオクタノイル体の２．６ｎＭから３，５００ｎＭに低下することから、３位セリン側鎖のオクタノイル基は活性発現に極めて重要な役割を果たしていることは明らかである。
　そこで、種々の飽和脂肪酸を用い、ラットグレリンにおけるセリン側鎖アシル基の炭素数と活性の関係を調べた。即ち、アセチル基（ＣＨ３ＣＯ−）、プロピオニル基（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、ブチリル基（ＣＨ３（ＣＨ２）２ＣＯ−）、ヘキサノイル基（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯ−）、デカノイル基（ＣＨ３（ＣＨ２）８ＣＯ−）、ラウロイル基（ＣＨ３（ＣＨ２）　１０ＣＯ−）、及びパルミトイル基（ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯ−）で３位セリン水酸基をアシル化したグレリン誘導体の細胞内カルシウム上昇活性を求めた。
　結果を表５にまとめた。
【０２３７】
【表５】
2004000251.tif 000022
【０２３８】
　脂肪酸鎖長の活性への影響は、アセチル基（Ｃ２）でＥＣ５０値が７８０ｎＭ、ブタノイル基（Ｃ４）でＥＣ５０値が２８０ｎＭと次第に顕著となり、ヘキサノイル基（Ｃ７）でＥＣ５０値が１６ｎＭとＣａ上昇活性がさらに上昇し、オクタノイル基（グレリン）でＥＣ５０値が１．５ｎＭとＣａ上昇活性がピークに達した。デカノイル基（Ｃ１０）でもＥＣ５０が１．７ｎＭとＣａ上昇活性はグレリンと同等に保持され、さらにラウロイル基（Ｃ１２）でＥＣ５０値が２．４ｎＭ、パルミトイル基（Ｃ１６）でもＥＣ５０値が６．５ｎＭと脂肪酸鎖長を延ばしてもＣａ上昇活性が保持された。
【０２３９】
　ウ．　種々のアシル基置換
　飽和脂肪酸に替え、３−フェニルプロピオン酸（ＨＯ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｐｈ）を芳香族脂肪酸の代表例として３位セリン水酸基にエステル結合させたヒトグレリン誘導体、および不飽和脂肪酸の代表例として３−オクテン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２　ＣＯＯＨ）、分枝状脂肪酸の代表例として４−メチルペンタン酸（（ＣＨ３）２ＣＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）をエステル結合させたヒトグレリン誘導体を作成し活性を評価した。
【０２４０】
　エ．　アルキル基への置換
　化学的に不安定なエステル結合をより安定なエーテル、チオエーテル結合などに変換すれば化学的に安定なグレリン誘導体の作成が可能である。しかしながら、活性が保持されることが前提であることは言うまでもない。
　そこで、ヒトグレリンの３位セリンをオクチル（Ｃ８Ｈ１７）化したヒトグレリンのエーテル誘導体、およびラットグレリンの３位セリンをシステインに置換し、同様にオクチル化したラットグレリンのチオエーテル体の活性を調べた。
　また、ヒトグレリンの３位セリンをベンジル化（−ＣＨ２Ｐｈ）した誘導体、およびヒトグレリンの３位セリンをシステインに置換しトリチル化（−Ｃ（Ｐｈ）３）した誘導体を作成した。
　結果を表６にまとめた。なお、ヒトグレリンの３位セリンをベンジル化（−ＣＨ２Ｐｈ）した誘導体、およびヒトグレリンの３位セリンをシステインに置換しトリチル化（−Ｃ（Ｐｈ）３）した誘導体のＣａ上昇活性については、表１３に化合物６７、６８として結果を記載した。また、４−メチルペンタン酸（（ＣＨ３）２ＣＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）を３位セリン水酸基にエステル結合させたヒトグレリン誘導体のＣａ上昇活性についても、表１３に化合物６９として結果を記載した。
【０２４１】
【表６】
2004000251.tif 000023
【０２４２】
　不飽和脂肪酸である３−オクテノイル基を３位のセリンの側鎖に導入しても、オクタノイル基と同等のＣａ上昇活性（ＥＣ５０＝１．７ｎＭ）であった。
　興味深いことにフェニルプロピオニル基の導入でも、ＥＣ５０＝１．４ｎＭとＣａ上昇活性が保持され、また、分枝状脂肪酸でＣ６に相当する４−メチルペンタノイル基を導入しても、ＥＣ５０値が４．４ｎＭであり、Ｃａ上昇活性が保持された（表１３、化合物６９）ことより、３位セリン側鎖のアシル基は必ずしも直鎖アルカノイル基である必要がないことが明らかになった。
【０２４３】
　さらに、化学的安定性が期待できる３位セリンあるいはシステインをオクチル化したエーテルおよびチオエーテル体のＥＣ５０値が、それぞれ１．２ｎＭ、５．４ｎＭに保持されたことより、３位アミノ酸残基側鎖は必ずしもアシル基である必要はないことが明らかになった。
　また、３位をＳｅｒ（Ｂｚｌ）〔ヒトグレリンの３位セリンをベンジル化（−ＣＨ２Ｐｈ）した誘導体〕、あるいはＣｙｓ（Ｔｒｔ）〔ヒトグレリンの３位セリンをシステインに置換しトリチル化（−Ｃ（Ｐｈ）３）した誘導体〕に置換したグレリンも、ＥＣ５０値がそれぞれ７．６ｎＭ、２０ｎＭであり、Ｃａ上昇活性が保持された（表１３、化合物６７、６８）。
【０２４４】
（２）活性領域の検索
　カルボキシル末端部を含むグレリン（１６−２８）に細胞内Ｃａ上昇活性が比較的低い（ＥＣ５０＞１０，０００ｎＭ）こと、一方で、アミノ末端部を含むヒトグレリン（１−１５）とラットヒトグレリン（１−１５）のＥＣ５０値がそれぞれ７．０ｎＭ、８．６ｎＭと細胞内Ｃａ上昇活性が保持されたことから、グレリンの活性部位はアミノ末端部分に存在することが明らかとなった（表７）。
【０２４５】
【表７】
2004000251.tif 000024
【０２４６】
　また、グレリン（１−１５）において、ヒト型とラット型の活性がほぼ同等であることから、１１位と１２位のアミノ酸残基（ヒトでは−アルギニル−バリル−、ラットでは−リジル−アラニル−）はこれらのアミノ酸に限られない。
　このようなヒトグレリン、あるいはラットグレリンで得られた構造活性相関の結果は、それぞれラットグレリンあるいはヒトグレリンに適用できる。
　また、１４位のグルタミンを除去した［デス−グルタミン１４］−ラットグレリンに、ラットグレリンと等しいＣａ上昇活性（ＥＣ５０＝１．５ｎＭ）が認められたことより、グレリン分子の中央部のアミノ酸が欠損していてもよい。
【０２４７】
　（３）ペプチド鎖長とカルボキシル末端への塩基性基の導入
　活性が比較的強くみられたグレリン（１−１５）をもとに、適宜カルボキシル末端側アミノ酸残基を欠損させた誘導体を作成し活性を評価した。
　カルボキシル末端がカルボン酸である短鎖誘導体とカルボキシル末端がアミド化された短鎖誘導体の活性を表８に示した。
【０２４８】
【表８】
2004000251.tif 000025
【０２４９】
　グレリン（１−３）アミドのＣａ上昇活性は比較的低かった（ＥＣ５０＞１０，０００ｎＭ）。フェニルアラニンを延ばしたグレリン（１−４）ではＥＣ５０値が４８０ｎＭ、そのカルボキシル末端アミド体が１６０ｎＭとＣａ上昇活性が顕著となった。
　さらにロイシンアミドを付加したグレリン（１−５）アミド体の活性は、（１−４）アミド体のさらに約２６倍上昇し（ＥＣ５０＝６．２ｎＭ）、天然品と同レベルのＣａ上昇活性を示した。
　最も強いＣａ上昇活性は、グレリン（１−７）アミド体においてみられ、そのＥＣ５０値は２．６ｎＭと天然品とほぼ同等であった。
【０２５０】
　以上の結果から、グレリン活性発現のために必須な構造的要因はアミノ末端部４残基の配列に集約されるが、５位にロイシンなどの残基が付加されることで、グレリン受容体への親和性、あるいはシグナルトランスダクションが劇的に向上するため、５位にロイシンなどの残基が付加されることが好ましい。
　また、上記結果から明らかなように、カルボキシル末端カルボン酸をアミド化することによりＣａ上昇活性が上昇する傾向がみられた。
【０２５１】
　例えば、グレリン（１−９）では、アミド化することでＥＣ５０値が３８ｎＭから５．４　ｎＭとＣａ上昇活性が約７倍、グレリン（１−４）ではＥＣ５０値が４８０ｎＭから１６０　ｎＭとＣａ上昇活性が約３倍に上昇した。また、グレリン（１−９）アミドの９位塩基性残基ヒスチジン残基を除去したグレリン（１−８）アミドでは、ＥＣ５０値が５．４ｎＭから１３ｎＭとなりＣａ上昇活性が低下し、一方で、酸性アミノ酸である８位グルタミン酸を除去したグレリン（１−７）アミドでは、逆にＥＣ５０値が１３ｎＭから２．６ｎＭとなりＣａ上昇活性が上昇した。
　アミド化の効果の一つはカルボン酸の負電荷の中和であり、上記の結果は、短鎖誘導体においてカルボキシル末端アミノ酸の塩基性が活性上昇に大きく寄与することを示すものである。
　この結果を踏まえ、高い活性が得られたグレリン（１−７）アミドを中心に、カルボキシル末端部に塩基性を付与した誘導体を作成し、活性を調べた。
　結果を表９に示した。
【０２５２】
【表９】
2004000251.tif 000026
【０２５３】
　グレリン（１−５）のカルボキシル末端部にリジンを導入した［リジン６］−グレリン（１−６）アミドのＥＣ５０値は、４．８ｎＭから１２ｎＭとなり、Ｃａ上昇活性は若干低下したが、グレリン（１−４）では、カルボキシル末端にリジンを付加することで、ＥＣ５０値が４８０ｎＭから１０ｎＭとなり、Ｃａ上昇活性が約５０倍上昇した。また、グレリン（１−７）のカルボキシル末端部にアルギニンあるいはリジンを付加したアミド誘導体の活性は、グレリン（１−７）アミド（ＥＣ５０＝２．６ｎＭ）と比べ、いずれも１．１ｎＭと極めて強い細胞内カルシウム上昇活性を示した。
　以上、ほとんどのケースにおいて、カルボキシル末端部における酸性のマスキングおよび塩基性基を導入することで、活性が上昇することが明らかになった。
【０２５４】
（４）アミノ末端グリシンと２位セリン残基
　活性が認められたグレリン（１−７）アミド（ＥＣ５０＝２．６ｎＭ）〔表８　化合物２９〕、あるいはグレリン（１−９）アミド（ＥＣ５０＝５．４ｎＭ）〔表４　化合物３〕をもとに、アミノ末端グリシンと２位セリンの活性への影響を調べた。
　結果を表１０にまとめた。
【０２５５】
【表１０】
2004000251.tif 000027
【０２５６】
　アミノ末端のアミノ基をブロックしたＮα−アセチル−グレリン（１−１０）の活性が比較的弱くなった。（ＥＣ５０＞１０，０００ｎＭ）。また前述したように、［Ｎα−オクタノイル，セリン３］−グレリン（１−９）アミド（表１　化合物６）の活性も比較的弱くなったことから（ＥＣ５０＞１０，０００　ｎＭ）、アミノ末端のアミノ基がブロックされていないことがＣａ上昇活性発現において好ましい。
【０２５７】
　一方で、アミノ末端のグリシンと２位セリンを、２残基長に相当する５−アミノ−ｎペンタン酸（ＮＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＯ−）で置換した、Ｎα−アミノペンタノイル−グレリン（３−７）アミドのＣａ上昇活性はほぼ保持されたこと（ＥＣ５０＝３．４ｎＭ）、および２位セリンを欠損させた［Ｎα−グリシル］−グレリン（３−７）アミドのＣａ上昇活性が低下すること（ＥＣ５０＝３８０ｎＭ）、アミノ末端にチロシン残基を付与した［Ｎ−チロシル］−ラットグレリンのＣａ上昇活性がに低下すること（ＥＣ５０＝１２０ｎＭ）などから、より強い活性を得るために好ましいアミノ末端アミノ基の位置は、３位のオクタノイルセリン残基からアミノ酸残基で２残基相当分、アミノ末端方向に存在することが好ましい。
　また、グレリン（１−７）アミドにおいて、２位セリンをロイシン、グリシン、ヒスチジン、リジンに置換した誘導体のＥＣ５０値は、それぞれ４２ｎＭ、７８ｎＭ、３５ｎＭ、２４ｎＭとなり、グレリン（１−７）アミドと比べ、Ｃａ上昇活性がやや低下した。
【０２５８】
　本結果から２位セリン残基−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＯ−がアミノペンタン酸の部分構造−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−に置き換えることができることから、少なくとも２位セリン残基はグレリンアミノ末端のアミノ基を３位オクタノイル基から一定の距離を保つスペーサー的な役割を果たしている。また、５−アミノペンタン酸の置換で活性が保持されたのは、アルキルアミン構造の導入によってアミノ末端の塩基性が上昇したからでもある。
　以上まとめると、アミノ末端部のグリシン残基はそのアミノ基をもって、グレリン分子のアミノ末端に塩基性を与え、グレリンの活性を発現せしめていると考えられるため、アミノ末端部のアミノ基はブロックされていないことが好ましい。
【０２５９】
　また２位セリン残基はアミノ末端アミノ基を３位オクタノイル基から一定の距離を保つスペーサー的な役割を果たしていると考えられるため、比較的嵩の小さい側鎖を有するアミノ酸や非アミノ酸化合物で置き換えてもよい。即ち、グレリン分子においてアミノ末端アミノ基を基点にオクタノイル基の位置が規定されており、この位置関係がグレリン活性構造の一部を形成している。
　すなわち、２位アミノ酸側鎖は嵩高い構造よりは、むしろセリン、アラニン、ノルバリンのように、側鎖が比較的小さく、近隣残基の自由度を束縛しないアミノ酸残基が好ましい。加えて、Ｎα−アミノペンタノイルーグレリン（３−７）アミドのＣａ上昇活性が、ほぼ保持された（ＥＣ５０＝３．４ｎＭ）ことから、２位セリンは非アミノ酸化合物に置換可能である。
【０２６０】
　（５）３位、および４位アミノ酸残基の光学活性
　グレリン（１−７）アミドの構造をもとに、３位セリンと４位フェニルアラニンをそれぞれＬ−体からＤ−体に変換した誘導体を作成し、３位と４位アミノ酸の光学活性の活性に及ぼす影響を検討した。具体的には、良好な活性が保持された［セリン３（オクチル）］−グレリン（１−７）アミド（ＥＣ５０＝５．８ｎＭ）〔表１１　化合物５０〕、あるいは［システイン３（オクチル）］−グレリン（１−７）アミド（ＥＣ５０＝７．４ｎＭ）〔表１１　化合物４８〕をもとに３位セリンと４位フェニルアラニンを、それぞれ対応するＬ−体、Ｄ−体に置き換えた誘導体を作成した。
　結果を表１１にまとめた。　該結果より、３位と４位のアミノ酸はともにＬ−体であることが好ましい。
【表１１】
2004000251.tif 000028
【０２６１】
　（６）３位側鎖の結合様式
　３位の側鎖鎖長がグレリン鎖長（−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｃ７Ｈ１５）と同じになるように、本来のエステル結合を、逆方向のエステル（化合物番号５４）、アミド（化合物番号５５，５６）、ジスルフィド（化合物番号５７）、メチレン（化合物番号５８）に置換した誘導体を作成した。あわせて、β炭素上に立体障害をもつエステル誘導体（化合物番号５９、６０）、メチレンが３ユニット分延びた形のアミド誘導体（化合物番号６１）を作成した。結果を表１２にまとめた。
【０２６２】
【表１２】
2004000251.tif 000029
　３位側鎖をすべてメチレン基に置きかえた化合物５８の活性が最も強く、ＥＣ５０値は１　ｎＭ以下であった。その他、結合の種類によって活性の高低は多少みられるものの、３位アミノ酸側鎖に結合様式は活性に大きな影響を与えないことが確認された。
【０２６３】
　（７）３位側鎖の疎水性
　３位のＳｅｒ（Ｏｃｔａｎｏｙｌ）基を、天然アミノ酸を中心に、疎水性アミノ酸で置換した誘導体を作成し、それらの活性を調べた。結果を表１３にまとめた。
【０２６４】
【表１３】
2004000251.tif 000030
【０２６５】
　３位にトリプトファン、シクロヘキシルアラニン、ナフチルアラニンのような芳香族性の疎水性アミノ酸を有する誘導体のＥＣ５０値は、それぞれ３１ｎＭ，１９ｎＭ，８．２ｎＭであり、Ｃａ上昇活性は保持された。意外にもフェニルアラニンを３位に導入すると幾分Ｃａ上昇活性は低かったが、疎水性を上昇させたＳｅｒ（Ｂｚｌ），Ｃｙｓ（Ｔｒｉｔｙｌ）を３位に導入しても、同様にＣａ上昇活性は保持されたことから、３位側鎖の疎水性は活性発現により好ましいことが確認された。
【０２６６】
　一方、３位にロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリンのような脂肪族性の疎水性アミノ酸を導入すると、芳香族性アミノ酸を導入した場合と比べ、幾分低目ではあるが、全般にＣａ上昇活性は保持された。ノルロイシンを３位に有する化合物７３の活性がＥＣ５０＝２，８００ｎＭであるのに対し、ノルロイシン側鎖にアミノ基が付加した６−アミノ−ノルロイシン（リジン；化合物７２）の活性はＥＣ５０値が１２０ｎＭと上昇していることは、前述したカルボキシル基末端において塩基性であることが好ましいのと同様に、３位側鎖においても塩基性の付与が好ましいことが確認された。
【０２６７】
　（８）短鎖グレリン誘導体
　グレリンの活性はアミノ末端部１−４で顕著に発現し、５位にロイシンを付加することで増強されること、３位アミノ酸残基は疎水性側鎖を有するものが好適であること、塩基性残基の導入が活性を上昇させること、及び１位と２位のアミノ酸残基はδ―アミノ酸などの２残基相当長の非アミノ酸化合物で置換されうることなどの結果から、表１４または表１５の化合物番号７６から８７に示すように、アミノ末端部（１−５）配列を基本にした種々の短鎖グレリン誘導体を作成してそれらの活性を調べた。結果を表１４または表１５にまとめた。
　なお化合物８０は既知である（Ｉｐａｍｏｒｅｒｉｎ；Ｋ．Ｒａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１３９巻、５５２〜５６１ページ、１９９８年）。
【０２６８】
【表１４】
2004000251.tif 000031
【０２６９】
　既知である化合物８０のＣａ上昇活性が２．５ｎＭと高かったことから、化合物８０における３位の２−Ｄ−ナフチルアラニンをＤ−オクチルセリンに置換した化合物７９の活性を調べたところ、ＥＣ５０値は３８ｎＭであり、活性は保持された。１位と２位のアミノ酸構造が異なるが、化合物７９と同様にＤ−オクチルセリンとＤ−フェニルアラニンを３位と４位に有する化合物７７の活性が１，６００ｎＭに低下したことを併せて考えると、１位と２位に対応するアミノ酸の配列または構造が、活性発現に重要な３位と４位のアミノ酸側鎖の立体配置にも影響を与えている。
【０２７０】
　即ち、１，２位をアミノペンタン酸に置換した場合、３位の２−Ｄ−ナフチルアラニンと４位Ｄ−フェニルアラニンを、それぞれ対応するＬ−アミノ酸に置換しても活性は３４　ｎＭに保持された（化合物７８）ことなどから、グレリンの１位と２位のアミノ酸配列、Ｇｌｙ−Ｓｅｒは３位と４位にＬ−立体配置を要求するが、他のアミノ酸配列、例えば、Ａｉｂ−Ｈｉｓ等の導入により３，４位がＤ−立体配置でも活性が顕著となる。または、１，２位にアミノペンタン酸を導入することで３，４位はＬ−，Ｄ−いずれの立体配置でも活性発現がみられることが確認された。
【０２７１】
【表１５】
2004000251.tif 000032
【０２７２】
　グレリンのアミノ末端部（１−５）配列を基本にした［Ｎ−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ，Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（３−５）を用い、カルボキシル基末端部の構造活性相関を調べた。５位ロイシンのカルボキシル基末端をアミド、メチルアミド、エチルアミド、ベンジルアミドで修飾したところ、活性は保持されたが、ＥＣ５０の値がそれぞれ、１１ｎＭ，１２ｎＭ，２２ｎＭ，９８ｎＭと次第に低下する傾向が見られた。一方、エチルアミドをアミノエチルアミドとすることで、ＥＣ５０が３．５ｎＭと活性は上昇したことより、グレリン分子においてカルボキシル基末端部に塩基性を付与することが好ましいことがわかった。
　これら種々のカルボキシル末端アミド誘導体は、生体内でカルボキシペプチダーゼ類による酵素分解に抵抗することからも有用な化合物である。同様に、Ｎ−メチルアミノ酸を含む化合物８６（ＥＣ５０＝８６ｎＭ）も酵素抵抗性を有する点で有用な化合物である。
【実施例１２】
【０２７３】
ラットにおけるグレリン誘導体のＧＨ放出活性
（１）ラットにおける各種長鎖グレリン誘導体のＧＨ放出活性
　ネンブタール麻酔下のＩＧＳ−ＳＤ系ラット（約７週齢）に化合物１７；［Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎを１８ｎｍｏｌ／ｋｇ、化合物１８；［Ｃｙｓ３（Ｏｃｔｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎを３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、化合物６５；［２−ＬＮａｌ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎを１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、あるいは化合物１５；［Ｓｅｒ３（３−Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｎｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎを１８ｎｍｏｌ／ｋｇを急速静脈内投与した（各ｎ＝３）。投与１５分後に血漿を採取し、ＧＨ濃度をラジオイムノアッセイ法（Ｂｉｏｔｒａｋ／Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にて測定した。コントロールとして、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−生理食塩液、とそれぞれ６ｎｍｏｌ／ｋｇのｒＧｈｒｅｌｉｎ、ｈＧｈｒｅｌｉｎ、８０ｎｍｏｌ／ｋｇのＩｐａｍｏｒｅｌｉｎ（化合物８０）を投与し、投与後１５分の血漿中ＧＨ濃度を比較した（各ｎ＝３）。
　結果を表１３に示した。化合物１７；［Ｓｅｒ３（Ｏｃｔｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ、化合物１８；［Ｃｙｓ３（Ｏｃｔｙｌ）］−ｒＧｈｒｅｌｉｎおよび化合物１５；［Ｓｅｒ３（３−ＰｈＰｒｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎはいずれも強いＧＨ放出活性を示し、［２−ＬＮａｌ３］−ｈＧｈｒｅｌｉｎのＧＨ放出活性も細胞内Ｃａ上昇活性と良い相関が見られた。
【０２７４】
【表１６】
2004000251.tif 000033
【０２７５】
　（２）［Ｃｙｓ３（Ｏｃｔｙｌ）］−ｒａｔ　Ｇｈｒｅｉｎ投与による血漿中ＧＨ濃度推移
　ネンブタール麻酔下のＷｉｓｔａｒ系ラット雄（約２６０〜２８０ｇ）に、化合物１８；［Ｃｙｓ（Ｏｃｔｙｌ）］−ｒａｔ　Ｇｈｒｅｌｉｎを５μｇ／ｈｅａｄ静脈内投与したときの、血中に放出されるＧＨを測定した。コントロールとして生理食塩水、およびｒａｔ　Ｇｈｒｅｌｉｎ（５μｇ／ｈｅａｄ）を投与し、本品と比較した。
　表１７〜１９に示すように、［Ｃｙｓ３（Ｏｃｔｙｌ）］−ｒａｔ　ＧｈｒｅｉｎのＧＨ分泌促進活性は、分泌されたＧＨのＣｍａｘが天然型ラットグレリンと同等（ともに約１，１００ｎｇ／ｍｌ）であり、さらに分泌時間を延長させる傾向を示した。本品の細胞内Ｃａ上昇活性はＥＣ５０値で５．４ｎＭであった。
【０２７６】
【表１７】
2004000251.tif 000034
【０２７７】
【表１８】
2004000251.tif 000035
【０２７８】
【表１９】
2004000251.tif 000036
【実施例１３】
【０２７９】
グレリンの食欲増進作用
（１）脳室内投与による食欲増進作用
　各種濃度のラットグレリンを溶解した生理食塩水を、体重が３００ｇから３２５ｇの雄ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラット（一群は１６から２０頭）に、朝８時４５分に脳室内投与した。対照は、グレリンを含まない生理食塩水を脳室内投与した。投与後は自由に摂餌させ、投与後２時間の摂餌量を測定した。図６に示すように、５０ｐｍｏｌの脳室内投与で摂餌量の増加が認められ、２００ｐｍｏｌおよび５００ｐｍｏｌでは投与量依存的に摂餌量の増加が認められたが、２ｎｍｏｌの投与では摂餌量の増加は低下した。通常ラットは夜間に摂餌するから、朝は満腹で殆ど摂餌しないが（図６で対照とした生理食塩水を参照）、グレリンの脳室内投与によって食餌量が増加したことは、グレリンに食欲増進作用があることを示している。
【０２８０】
（２）静脈内投与による食欲増進作用
　９ヶ月齢、雌の　ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）系ラット（５頭）および　ウィスター　系ラット（４頭）に、ラットグレリン５０μｇ／ｋｇを尾静脈内投与し、投与後２時間の摂餌量を測定した（夕方１６：００〜１９：００に評価）。表２０に示したように、別の日の同時刻、同一個体について調べたラットグレリン非投与時の摂餌量に比べて、グレリンの静脈内投与によって、摂餌量が明らかに増加した。すなわち、グレリンの静脈内投与によっても、食欲増進作用があることが示された。
【０２８１】
【表２０】
2004000251.tif 000037
【実施例１４】
【０２８２】
グレリンによる胃機能の亢進
　グレリン投与による、胃機能への効果を調べるために以下のような実験を行った。雄性のＳＤ系ラット（体重２００〜２８０ｇ、７〜８週齢）を実験の２０時間以上前から絶食して用いた。ラットはウレタン（１．２５ｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により麻酔し、加温パッドおよび加温ライトを用いて保温した。気管内カニューレを挿管し、さらに食道を絹糸にて結紮して、下記の胃酸分泌あるいは胃運動測定用の手術を施した。覚醒下の実験は、エーテル吸入による軽度麻酔下に下記の胃酸分泌あるいは胃運動測定用の手術を施した。
【０２８３】
　ウレタン麻酔下での胃酸分泌の実験は、Ｏｈｎｏらの方法［Ｏｈｎｏ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３，４２９−４３９（１９８７）］に従って手術を行った。つまり、仰臥位に腹部を正中切開し、胃および十二指腸を露出させた。ポリエチレンチューブを前胃部から挿管し急性胃瘻を作製した。もう１本のポリエチレンチューブを十二指腸部の切開により胃内に挿入し、幽門部周囲を結紮して固定した。胃内をリザーバー内でｐＨ７．０に調整し、３７℃に加温した生理食塩水で灌流した。流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。ｐＨ固定装置（Ｈｉｒａｎｕｍａ，Ｃｏｍｉｔｉｔｅ−８）と１００ｍＭのＮａＯＨ液を用いて灌流液がｐＨ７．０になるように滴定した。基礎胃酸分泌量が安定していることを確認した後、被験薬を静脈内投与し、胃酸分泌速度を５分間隔で測定した。各群４例の動物を用いた。
【０２８４】
　覚醒下の実験では、エーテル吸入による軽度麻酔下に同様の手術を施した後に、側腹部に小切開を加えて灌流用チューブを体外に導出した。露出した胃および十二指腸を腹腔内に収め、切開部を縫合し、ボールマン型のラット用固定ケージ内に動物を伏臥位に拘束し、麻酔から覚醒したことを確認して実験に供した。なお、食道を結紮したが、気管カニューレは挿入しなかった。
【０２８５】
　ウレタン麻酔下での胃運動測定実験は、Ｔａｋｅｕｃｈｉ　＆　Ｎｏｂｕｈａｒａの方法［Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．ａｎｄ　Ｎｏｂｕｈａｒａ，Ｙ．，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　３０，１１８１−１１８８（１９８５）］に従って、ミニチュアバルーン法を用いた。すなわち、水を充填したバルーンと支持用カテーテルを前胃部切開にて胃の中に挿入した。胃の腺部分に横たわるように固定し、カテーテルの一端を圧トランス・デューサー（日本光電株式会社製、ＬＰＵ−０．１−３５０−０−ＩＩ）に接続した。胃運動が安定していることを確認した後、被験薬を６０分間隔で累積的に静脈内投与した。胃運動は２０ｃｍＨ２Ｏ以上の振幅を持つ収縮運動の胃内圧振幅と収縮反応数を１０分間隔で測定した。各群４例の動物を用いた。覚醒下の実験では、エーテル吸入による軽度麻酔下に同様の手術を施した後に切開部を縫合し、ボールマン型のラット用固定ケージ内に動物を伏臥位に拘束し、麻酔から覚醒したことを確認して実験に供した。
【０２８６】
　ラットグレリンおよびヒスタミン２塩酸塩は生理食塩水に溶解し、尾静脈内に１ｍｌ／ｋｇの容量で投与した。グレリンの作用に迷走神経活動が関与するか否かを調べるために、グレリンの投与３０分前に硫酸アトロピンを皮下投与するか、あるいは頚部迷走神経束を両側性に切断した。さらにグレリンの作用におけるヒスタミンＨ２受容体の関与を調べるためには、グレリンの投与３０分前にファモチジン（ガスター（登録商標）、山之内製薬株式会社製）を皮下投与した。結果は平均値±標準誤差値で表した。統計学的解析はＤｕｎｎｅｔｔの多重比較法を用いて行った。Ｐ値＜０．０５を統計学的有意と判定した。
　図７Ａおよび表２１に示すように、ウレタン麻酔下においてラットグレリンを０．８〜２０μｇ／ｋｇの用量で静脈内投与すると、用量依存的に胃酸分泌が促進した。
【０２８７】
　麻酔下では、グレリン投与前には胃の自発運動はほとんど認められない。その状態でラットグレリンを０．８〜２０μｇ／ｋｇの用量で静脈内投与すると、図８Ａ、Ｂおよび表２１に示すように、胃運動の振幅及び頻度ともに亢進した。これらの反応はラットグレリンの投与後、速やかに認められた。２０μｇ／ｋｇの投与時は、胃酸分泌は増大し、２０分以内に最大値に達した後、投与後９０分までには徐々に減衰した。ラットグレリンの２０μｇ／ｋｇによる胃酸分泌促進作用の最大反応の大きさは、図７Ａ、Ｂに示すように、ヒスタミン３ｍｇ／ｋｇを静脈内投与したときに惹起される反応にほぼ匹敵するものであった。胃運動の振幅に対する亢進作用は、各用量とも１０分以内に最大反応に達し、２０μｇ／ｋｇ投与時は５０分後までに徐々に減衰した。
【０２８８】
　さらに、表２１に示すように、ラットグレリンの２０μｇ／ｋｇ投与で惹起される胃酸分泌促進作用はアトロピンあるは両側頚部迷走神経切除術の前処置によってほぼ完全に抑制され、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬であるファモチジンを１ｍｇ／ｋｇ皮下投与する前処置では全く影響されなかった。また、ラットグレリン投与で惹起される胃運動亢進作用もアトロピンあるは両側頚部迷走神経切除術の前処置によって完全に抑制された。このことから、グレリンの胃機能亢進作用は、ヒスタミン系機序によるものではなく、迷走神経系を活性化すことによるものであることが確認された。
【０２８９】
　一方、覚醒下ラットにおいても、上記ウレタン麻酔下と同様に、ラットグレリン（４および２０μｇ／ｋｇ）を静脈内投与すると胃酸分泌が促進した。また、覚醒下ラットでは麻酔下に比べて被験薬投与前から胃の自発運動が発生しており、その状態にラットグレリンを０．８〜２０μｇ／ｋｇの用量で静脈内投与しても、胃運動は振幅および頻度ともに亢進した。以上の結果から、ウレタン麻酔下及び覚醒下のいずれにおいても、グレリンの静脈内投与によって胃酸分泌の促進および胃運動の亢進が起こることが確かめられた。
【０２９０】
【表２１】
2004000251.tif 000038
【実施例１５】
【０２９１】
グレリンおよびグレリン誘導体の細胞増殖促進作用
　グレリン投与による細胞増殖促進作用を調べるために以下の実験を行った。ラットグレリンあるいはチオエーテル型ラットグレリン（化合物１８［Ｃｙｓ３（ｏｃｔｙｌ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ）２０μｇ／ｋｇをウィスター系雄性ラット（７．５週齢）の尾静脈内に投与した。投与１７時間後に３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を尾静脈内投与し、その１時間後に十二指腸、空腸および骨髄を摘出した。これら組織中のＤＮＡ画分への　３Ｈ−チミジンの取込み量を測定し、グレリンおよびグレリン誘導体の細胞増殖促進作用を調べた。組織を細切後にポリトロンホモジェナイザーでホモジェネートし、その遠心上清をトリクロロ酢酸で沈澱させ、ＤＮＡ画分を取得した。ＤＮＡ画分の放射能を液体シンチレーションカウンターにて測定した。
【０２９２】
　表２２に示すように、ラットグレリンあるいはチオエーテル型ラットグレリンの静脈内投与により、これらの組織中あるいは臓器中のＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取込みが促進したことから、グレリンは十二指腸、空腸および骨髄での細胞増殖促進作用を示すことが確認された。
【０２９３】
　グレリン静脈内投与後の細胞増殖促進作用のタイムコースは、ＧＨＲＨ（成長ホルモン放出ホルモン）投与によるものと同様であり、グレリンの細胞増殖促進作用は主に下垂体から分泌されるＧＨ（成長ホルモン）を介するものと考えられた。ＧＨ分泌調節を生理的な因子であるグレリンに担わせることは生体調節にとって無理がなく、ＧＨで問題となっている副作用も少ないと考えられた。
【０２９４】
【表２２】
2004000251.tif 000039
　数値は比較例（生理食塩水投与群）の３例の平均値を基準とした時の放射能の取り込み量の比率（％）で示した。
【実施例１６】
【０２９５】
抗グレリン抗体によるグレリンの定量
　ラットグレリンのアミノ末端側およびカルボキシル末端側のペプチドを抗原として作成された抗体を用い、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって各種生体組織中のグレリンを定量した。
　［Ｃ−Ｃｙｓ］−ラットグレリン［１−１１］（ラットグレリンのアミノ末端側の１から１１番目までのアミノ酸配列を有するペプチドのカルボキシル末端にシステインが結合したペプチド）および［Ｃ−Ｃｙｓ］−ラットグレリン［１３−２８］（ラットグレリンのアミノ末端側の１３から２８番目までのアミノ酸配列を有するペプチドのカルボキシル末端にシステインが結合したペプチド）を抗原として、ウサギを免役してＮ端側抗体（抗［Ｃ−Ｃｙｓ］−ラットグレリン［１−１１］抗体）とＣ端側抗体（抗［Ｃ−Ｃｙｓ］−ラットグレリン［１３−２８］抗体）を作成した。
【０２９６】
　図９ａに示すように、放射能標識したラットグレリンとＮ端側抗体の結合において、ラットグレリンのＩＣ５０（半阻害量）は、反応液あたり３．１ｆｍｏｌであった。このＮ端側抗体は、化学合成したヒトグレリンおよびラットグレリンと１００％交差反応性を示したが、３位のセリンがｎ−ヘキサノイル基で修飾されたｎ−ヘキサノイル・ラットグレリンおよび３位のセリンがｎ−デカノイルで修飾されたｎ−デカノイル・ラットグレリンとは、各々、０．３％および２０％しか交差反応性を示さなかった。また、Ｎ端側抗体は脂肪酸を脱離したグレリンとは全く反応しなかった。
【０２９７】
　ラットグレリン（２８アミノ酸）、ヒトグレリン（２８アミノ酸）およびヒトやラットなどから見出されたグレリン−２７（２７アミノ酸からなるグレリン）に対して、Ｎ端側抗体は同等の親和性を示した。従って、Ｎ端側抗体は３位セリンがｎ−オクタノイル基で修飾された天然型グレリンを特異的に認識することが確認された。
【０２９８】
　図９ｂに示すように、放射能標識したラットグレリンのＣ端側抗体に対する結合において、ｎ−オクタノイル基で修飾された天然型ラットグレリンおよびｎ−オクタノイル基が脱離したラットグレリンのＩＣ５０は、反応液あたり４４ｆｍｏｌで同等であった。すなわち、脂肪酸修飾されたグレリンにも脂肪酸が脱離したグレリンにも同等の親和性を示すことが確認された。
【０２９９】
　以上の結果を基に、生体内各組織に存在するグレリンについて、Ｎ端側抗体によって３位セリンがｎ−オクタノイル基で修飾されたグレリンを定量し、Ｃ端側抗体によって脂肪酸修飾されたグレリンおよび脂肪酸が脱離したグレリンの両方を定量することができることが判った。
　表２３は、実際に生体各組織の脂肪酸修飾されたグレリンの含量、および脂肪酸修飾されたグレリンと脂肪酸が脱離したグレリン両方の含量を調べた結果である。
【０３００】
【表２３】
2004000251.tif 000040
【０３０１】
　表中、Ｃ−ＲＩＡは、Ｃ端側抗体を用いたラジオイムノアッセイ法による定量結果を表し、Ｎ−ＲＩＡは、Ｎ端側抗体を用いたラジオイムノアッセイ法による定量結果を表す。
また、表中の数値は、「値±標準偏差」を表す。
【実施例１７】
【０３０２】
半合成法によるｒａｔＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）の製造
合成スキーム
　ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）と　Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）を、それぞれ遺伝子工学的手法と化学合成法によって調製し、両Ｇｈｒｅｌｉｎ断片からｒＧｈｒｅｌｉｎを製造した例を示す。
【０３０３】
　具体的には、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ９７Ｓ　とｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）の間にＶ８プロテアーゼとＫｅｘＩＩプロテアーゼの切断部位を有するアミノ酸配列（−ＱＦＥ−ＳＲＨＲＲ−）を有する融合蛋白質、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ９７Ｓ−（ＱＦＥ−ＳＲＨＲＲ）−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）を大腸菌で発現させた。本融合タンパク質をＶ８プロテアーゼ処理し、ＳＲＨＲＲ−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）を切り出した。次に、ＳＲＨＲＲ−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）の全アミノ基をＢｏｃ基で保護した後、ＫｅｘＩＩプロテアーゼ処理し、新たに６位Ｓｅｒのアミノ末端アミノ基が遊離した［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１１，１６，１９，２０，２４］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）を得た。本保護断片と化学合成法で得られた［Ｎα−Ｂｏｃ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−５）−ＯＳｕとをフラグメント縮合し、得られた［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１１，１６，１９，２０，２４］−ｒＧｈｒｅｌｉｎを酸処理することでｒＧｈｒｅｌｉｎを製造した。
【０３０４】
　本実施例ではｒＧｈｒｅｌｉｎの半合成例を示したが、ヒト型も本方法で合成できる。
　また、本実施例ではフラグメント縮合を（１−５）と（６−２８）で実施したが、例えば化学合成したアミノ末部断片（１−２），（１−３）、あるいは（１−７）と、それぞれ２８位から３位までの随意の長さを有するＧｈｒｅｌｉｎのカルボキシル末部断片との融合蛋白質を遺伝子工学的に作成したカルボキシル末部断片（３−２８）、（４−２８）、あるいは（８−２８）との縮合などが可能である。化学合成の工数を軽減する場合、（１−２）と（３−２８）あるいは（１−３）と（４−２８）での縮合が有利である。また、縮合によるラセミ化を完全に防止する観点からは７位Ｐｒｏを利用した（１−７）と（８−２８）の縮合が特に好ましい。
【０３０５】
　発現ベクターｐＧ９７ｓ　ｒＧＲの構築とＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）融合蛋白質の発現
　ｒａｔ　ＧｈｒｅｌｉｎのｃＤＮＡ遺伝子配列に基づき、アミノ酸配列ＱＦＥ−ＳＲＨＲＲをプレプロ領域に持つｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）のＤＮＡ断片を、全合成オリゴマーを用いてアニ−リング法により得た。
　このＤＮＡ断片をｐＧ９７ＳｎＰＰＨ３４（特開平９−２９６０００）に挿入するため、まずｐＧ９７ＳｎＰＰＨ３４をＳａｌＩおよびＳｍａＩ処理により、ヒト副甲状腺ホルモン前駆体遺伝子を欠失させた。このものをアルカリホスファターゼ処理後、先にＳａｌＩ処理、ｋｉｎａｓｅ処理を施したｒＧｈｒｅｌｉｎ誘導体遺伝子断片とＴ４リガーゼにより連結させた。連結したプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、プラスミドｐＧ９７ｓ　ｒＧＲを得た。
【０３０６】
　得られたｐＧ９７ｓ　ｒＧＲを大腸菌Ｍ２５（ｏｍｐＴ）株に形質転換を行い、得られた形質転換株を２００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｌｏｔｈ液体培地（１．２％トリプトン、２．４％酵母エキス、０．４％グルコース）３本に接種し、３７℃で振盪培養した。菌体濃度がＯＤ６６０＝０．８になった時点でイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度２ｍＭになるように添加し、ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）融合蛋白質を発現させた。さらに４時間培養後、遠心分離し、菌体を回収した。ラットＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）融合蛋白質の構成を以下に示す。
【０３０７】
　ラットＧｈｒｅｌｉｎ６−２８融合蛋白質：（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ−９７Ｓ）−ＱＦＥ−ＳＲＨＲＲ−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）
　ｒＧｈｒｅｌｉｎ６−２８融合蛋白質のプロセッシングと［ＳＲＨＲＲ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）の精製
　得られた菌体２０ｍｌをＴＥバッファーに懸濁後、Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓにて菌体破砕した。その後、３０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離で封入体を回収し、１０ｍｌ　ＴＥバッファー、脱イオン水で再度懸濁し、遠心分離することで封入体を洗浄した。ＯＤ６６０の値が５０．０になるように封入体を脱イオン水で希釈し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を終濃度５０ｍＭになるように加え、尿素（終濃度３．５Ｍ）により封入体を溶解させた。３０℃に保温した本溶液に、ｒＶ８プロテアーゼ誘導体Ｖ８Ｄ５（以下Ｖ８Ｄ５と記す）（特開平９−４７２９１）を終濃度１０μｇ／ｍｌになるよう添加し、３０℃で２０分酵素処理を行った。３％酢酸（ＡｃＯＨ）を添加して反応を停止させた。
【０３０８】
　切り出された［ＳＲＨＲＲ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）を含むＶ８Ｄ５酵素反応停止液に１．５倍量の脱イオン水を加え、５Ｎ　ＮａＯＨを用いてｐＨ５．０に調整し、βガラクトシダーゼ誘導体断片を沈殿、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して除去した。
　［ＳＲＨＲＲ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）を含む上清を、０．１％ＴＦＡで平衡化したＴＳＫ−ＯＤＳ　８０Ｔｓカラム（粒径２０mｍ、５０ｍｍＩ．Ｄ．　ｘ　１００ｍｍ、ＴＯＳＯＨ社製）に添加した。バッファーＡ［０．８ｍｌ／ｍｉｎ、１％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ］１００％からバッファーＢ［５０％アセトニトリル、０．０９５％ＴＦＡ］１００％の濃度勾配を５カラム容量で完了するプログラムで溶出を行った。目的ペプチド［ＳＲＨＲＲ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）を含む画分を分取した（約５０ｍｇ）。
【０３０９】
　［Ｂｏｃ−ＳＲＨＲＲ］−［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１１，１６，１９，２０，２４］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）の調製
　約５０ｍｇ（１５μｍｏｌ）の［ＳＲＨＲＲ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）を含む５０％アセトニトリル水溶液に、二炭酸ジ−ｔ−ブチルを６当量モル（１９．２ｍｇ，　６　ｘ　１５μｍｏｌ）加え、トリエチルアミンにてｐＨ９に調整し、室温で１５分放置した。反応液に終濃度０．５％になるように酢酸を添加し、アセトニトリルを留去した後、０．１％ＴＦＡを含む１０％アセトニトリルで平衡化したＥＭＰＯＲＥ−Ｏｃｔｙｌ（Ｃ８）ＨＤ　４ｍｍ／１ｍｌ　ｃａｒｔｒｉｄｇｅに添加し、平衡化液で洗浄後、０．０９５％　ＴＦＡを含む９０％アセトニトリルで［Ｂｏｃ−ＳＲＨＲＲ］−［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１１，１６，１９，２０，２４］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）を溶出した。アセトニトリルを留去し、約３０　ｍｇの目的物を含む溶液を６ｍＬ得た。
　質量分析の結果、Ｂｏｃ化前（測定分子量＝３３９６、理論上分子量＝３３９８）に比べＢｏｃ化後では分子量が５００多くなったもの（測定分子量３３９５）と、６００多くなったもの（測定分子量＝３９９５）の２種類が主に見られた。
【０３１０】
　Ｋｅｘ２プロテアーゼによる［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１１，１６，１９，２０，２４］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）の切り出しと精製
　得られた［Ｂｏｃ−ＳＲＨＲＲ］−［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１１，１６，１９，２０，２４］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）水溶液（３０ｍｇ，６ｍＬ）に塩化カルシウム溶液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．２をそれぞれ終濃度０．３ｍＭ、２０ｍＭになるように添加した。Ｋｅｘ２プロテアーゼ（特開平１０−２２９８８４）溶液を１ｘ１０５ｕｎｉｔ／ｍｌになるように添加後、３０℃、６０分間プロテアーゼ処理した。
　ＨＰＬＣ上、［Ｂｏｃ−ＳＲＨＲＲ］−［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１１，１６，１９，２０，２４］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）のピークが消失し、［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１１，１６，１９，２０，２４］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）のピークがより疎水性側に現われ、Ｂｏｃ−ＳＲＨＲＲに対応する親水性のピークが観察された。
【０３１１】
　原料消失を確認後、反応液を酢酸水でｐＨ３．５に調整し、１％酢酸を含む１．０％アセトニトリルで平衡化した逆相クロマトカラムＯＤＳ−８０Ｔｓ（１．６６ｃｃカラム容積、粒径２０ｕｍ，ＴＯＳＯＨ社製）に添加した。平衡化液で５カラム容積で洗浄後、１％酢酸を含む１．０％アセトニトリルから９０．０％アセトニトリルへの濃度勾配を５カラム容積にて完了するプログラムを行い、［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１１，１６，１９，２０，２４］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）を溶出させた。主画分を凍結乾燥し、目的とする保護ペプチドを６．２ｍｇ得た。
【０３１２】
　フラグメント縮合と脱保護
　Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−５）（１９０ｍｇ，０．０３０１ｍｍｏｌ，化合物３１）のトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）溶液（６．００ｍｌ）にトリエチルアミン（５１．０μｌ，　０．３６６ｍｍｏｌ）、二炭酸ジ−ｔ−ブチル（７８．０ｍｇ，０．０３５６ｍｍｏｌ）のＴＦＥ溶液（４．００ｍｌ）を加え、室温で１３時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、得られた残査にエーテル（２０．０ｍｌ）を加え、［Ｎα−Ｂｏｃ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−５）を１８０．５ｍｇ得た。
【０３１３】
　次に、［Ｎα−Ｂｏｃ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−５）（２２．０ｍｇ，０．０３０１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．００ｍｌ）溶液にＨＯＳｕ（５．２０ｍｇ，０．０４５２ｍｍｏｌ）を加えた後、−３０℃浴中ＤＩＰＣＩ（７．３０μｌ，０．０４６６ｍｍｏｌ）を加えた。−３０℃浴で１時間、室温で１８時間攪拌した後、溶媒を減圧下留去し、得られた残査をエーテルで粉末とし、［Ｎα−Ｂｏｃ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−５）のサクシンイミドエステル体［Ｎα−Ｂｏｃ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−５）−ＯＳｕを１４．１ｍｇ得た。　
【０３１４】
　次に、リコンビナント法により調製した［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１１，１６，１９，２０，２４］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（６−２８）（６．１０ｍｇ，２．１８μｍｏｌ）のＤＭＦ（０．６ｍｌ）溶液に、［Ｎα−Ｂｏｃ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−５）−ＯＳｕ（３．３ｍｇ，３．９６　μｍｏｌ）、トリエチルアミン（２．５μｌ，１７．９μｍｏｌ）を加え室温で２４時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、得られた残査に氷冷下、直接ＴＦＡ（２．００ｍｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌した。ＴＦＡを減圧下留去した後、残査にエーテルを加えｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）を含む粗ペプチド６．２ｍｇを得た。
【０３１５】
　本品を５％　酢酸（ＡｃＯＨ）２ｍｌに溶かし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−Ａ（５μｍ，２０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から９５％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後凍結乾燥し、更にＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ　（Ｃ４，１０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル７．５％から２１．３％までの３０分間直線グラジエント（流速：４．７ｍｌ／ｍｉｎ）で溶出させた。
【０３１６】
　目的画分を分取後、凍結乾燥し、更にＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（Ｃ４，１０ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル７．５％か２１．３％までの３０分間直線グラジエント（流速：４．７ｍｌ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）を２．１ｍｇ得た。ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）を２．１ｍｇ得た。このものは、分析用ＨＰＬＣにおいて標準品のｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）と保持時間が一致し、細胞内カルシウム上昇活性はＥＣ５０＝１．５ｎＭと天然品と同等であった。
　ＥＳＩ−ＭＳ　３３１５．０（理論値３３１４．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；３．７４（４），　Ｇｌｘ；５．６９（６），　Ｇｌｙ；１．１８（１），　Ａｌａ；２．０５（２），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；０．９８（１），　Ｌｙｓ；４．９８（５），　Ｈｉｓ；１．０３（１），　Ａｒｇ；１．９６（２），　Ｐｒｏ；４．０１（４）
【０３１７】
　化合物８７　［Ｄｌｅｕ５］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）
　また、［Ｎα−Ｂｏｃ］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−５）のサクシンイミドエステル化、あるいはフラグメント縮合時の副反応物として、［Ｄｌｅｕ５］−ｒＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）が０．８ｍｇ得られた。このものの細胞内カルシウム上昇活性はＥＣ５０＝２２０ｎＭであった。
　ＥＳＩ−ＭＳ　３３１５．０（理論値３３１４．８），　アミノ酸組成比：Ｓｅｒ；３．８０（４），　Ｇｌｘ；５．９２（６），　Ｇｌｙ；１．２３（１），　Ａｌａ；２．０７（２），　Ｌｅｕ；２，　Ｐｈｅ；０．９７（１），　Ｌｙｓ；４．９２（５），　Ｈｉｓ；１．０２（１），　Ａｒｇ；１．９７（２），　Ｐｒｏ；４．１１（４）
Ｄ２Ｏ／ＤＣｌ加水分解後のロイシンのＧＣ−ＭＳ分析：Ｌ−Ｌｅｕ；　１．１７（１），　Ｄ−Ｌｅｕ；０．８３（１）
【産業上の利用可能性】
【０３１８】
　本発明の新ペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩は、人又は動物に投与することによってＧＨの分泌を誘導し、実質的な副作用を伴うことなく、小児の成長促進及び成人のＧＨ欠乏により代謝機能の欠損を改善する医薬として、そしてその抗体はＧＨ欠乏により疾病の診断にさらには学術分野の研究ツールとして優れた作用効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０３１９】
【図１】は、グレリンのラット胃抽出物からの精製を示す図で、ＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の上昇による蛍光強度の変化は黒棒で示してある。ａは、４０ｇラット胃より調製したＳＰ−ＩＩＩ画分のＳｅｐａｈｄｅｘ　Ｇ−５０（ｆｉｎｅ）によるゲル濾過の結果を示す図で、活性画分が分子量約３，０００ダルトンであることを示している。ｂは、２回目のＣＭ−イオン交換ＨＰＬＣの結果を示す図で、５５〜５６分に溶出される活性画分は、逆相ＨＰＬＣでさらに精製した。
【図２】は、グレリンにおけるｎ−オクタノイル修飾を同定したことを示す。ａは、天然型グレリン（上段）、及び合成グレリンと合成脱アシル化グレリン（下段）、各々２μｇを逆相ＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。ｂは、天然型グレリン（実線）、合成グレリン（小破線）及び合成脱アシル化グレリン（大破線）による、ＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の変化を示す図である。
【図３】は、グレリンのＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞に対する特異的な相互作用を示す図で、図中、矢印で示した点で試料を添加した。ａは、グレリン、ＧＨＲＰ−６およびＧＲＦ（ＧＨＲＨ）によるＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の変化を示した図である。ｂは、ＧＨＳ−Ｒの特異的阻害剤である［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＲＰ−６を添加（○）あるいは非添加（●）時の、グレリンによるＣＨＯ−ＧＨＳＲ６２細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の変化を示した図で、ＧＲＦ（ＧＨＲＨ）による細胞内カルシウムイオン濃度の変化（黒三角）も示してある。
【図４】は、ラットおよびヒト由来のグレリン前駆体のアミノ酸配列、およびこれら前駆体の各種組織での発現を調べた結果を示す図である。ａは、ラットおよびヒト由来のグレリン前駆体のアミノ酸配列を比較した図で、図中、同一アミノ酸は網掛け、点線はシグナルペプチド、黒三角はシグナルペプチドの切断点、三角はカルボキシル末端側の切断点、ボックスは成熟型グレリン部分、＊はｎ−オクタン酸による修飾を示す。ｂは、ラット各種組織におけるグレリンの発現をノザンブロットによって解析した結果を示す図である。
【図５】は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏにおけるグレリンの下垂体ホルモン分泌に及ぼす効果を示す図である。ａは、ラット下垂体初期培養細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の変化による蛍光強度の変化を示した図で、実線はグレリン、破線は脱アシル化グレリンを添加した場合を示す。ｂは、グレリンによる下垂体ホルモンの分泌を示す図で、図中、黒棒はグレリン添加時、白棒はグレリン非添加時の下垂体ホルモン濃度を示す。ｃは、雄ラットにグレリンを静脈注射した後の血漿中の下垂体ホルモン濃度の経時変化を示す図である。図ｂおよび図ｃ中で、ＧＨは成長ホルモン、ＡＣＴＨはアドレノコルティコトロピン、ＦＳＨはフォリクル、ＬＨはルテナイジングホルモン、ＰＲＬはプロラクチン、ＴＳＨはチロイド促進ホルモンを表す。
【図６】は、グレリンを脳室内投与した時の食用増進を示す図で、グレリン投与後２時間の摂餌量（平均値±標準誤差）で示してある。ａはグレリンの効果についての誤差範囲が０．０００１未満であることを示している。
【図７】は、ウレタン麻酔ラットでの薬剤投与による胃酸分泌への効果を示す図で、Ａはラットグレリン（ｒＧｈｒｅｌｉｎ）、Ｂはヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）を投与した場合の結果である。各シンボルは４例のラットにおける平均値を表し、標準誤差をエラーバーで示した。対照として生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を投与した。矢印の時点で薬剤（Ｄｒｕｇ）を投与した。
【図８】は、ウレタン麻酔ラットでの胃運動に及ぼすラットグレリンの作用を示す図で、Ａは生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）およびラットグレリン（ｒＧｈｒｅｌｉｎ）を投与したときの典型的な胃運動波形を示し、Ｂは４例のラットにおける平均値を標準誤差値とともに示した図である。矢印の時点で薬剤（Ｄｒｕｇ）を投与した。
【図９】は、ラジオイムノアッセイの標準曲線および抗体の交差反応性を示す図で、ａは１２５Ｉで標識したラットグレリンのＮ端側抗体への結合の各種グレリンによる阻害を示す図であり、ｂは１２５Ｉで標識したラットグレリンのＣ端側抗体への結合の各種グレリンによる阻害を示す図である。グラフの横軸は、各種グレリンの反応チューブあたりの添加量を示し、縦軸は各種グレリン非存在下でのラットグレリンの結合量（Ｂ０）に対する各種グレリン存在下での結合量（Ｂ）の百分率（％）で示した。図中のシンボルは、ラットグレリン（○）、ヒトグレリン（●）、ラットグレリン−２７（□）、［Ｓｅｒ３（ｄｅｃａｎｏｙｌ）］−ラットグレリン（◇）、［Ｓｅｒ３（ｈｅｘａｎｏｙｌ）］−ラットグレリン（△）および脱脂肪酸ラットグレリン（黒塗り▽）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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