(57)【要約】【課題】アレルギー性鼻炎モデル動物の作製方法の提供。【解決手段】小動物にスギ花粉アレルゲンCry j 1を投与することを特徴とするアレルギー性鼻炎モデル動物の作製方法を提供する。本方法により得られるアレルギー性鼻炎モデル動物はin vivo評価型において優れており、アレルギー性鼻炎、特にスギ花粉症に伴う鼻炎の予防・治療のために用いられる物質のスクリーニングに有用かつ効率的に適用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
小動物にスギ花粉アレルゲンCry j 1を投与することを特徴とするアレルギー性鼻炎モデル動物の作製方法。
【請求項２】
小動物がマウスである請求項１記載の方法。
【請求項３】
マウスがB10.Sマウスである請求項２記載の方法。
【請求項４】
投与が鼻腔内投与である請求項１記載の方法。
【請求項５】
スギ花粉アレルゲンCry j 1が、水酸化アルミニウムに吸着させたスギ花粉アレルゲンCry j 1である請求項１記載の方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法で得られた動物。
【請求項７】
請求項６記載の動物に被験物質を投与し、アレルギー性鼻炎に対する効果を検定することを特徴とするアレルギー性鼻炎治療を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性鼻炎モデル動物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スギ花粉症は、スギ花粉をアレルゲンとする即時型アレルギー疾患である。鼻炎、結膜炎が主たる症状であり、死に至る病ではないので軽視されがちであるが、患者にとっては誠に不愉快な症状である。スギ花粉の飛散期には国民の1割以上、都市部においては2割以上がこのスギ花粉症にかかるといわれており、経済的損失も大きい。
スギ花粉症の治療には、抗ヒスタミン薬、ステロイド剤だけでなく、抗アレルギー剤も用いられているが、これらは全て対症薬である。また、スギ花粉アレルギー抽出液を繰り返し投与する減感作療法は、臨床的にアレルギー症状を改善する有効な治療法であるが、アレルゲン抽出液は患者のアレルゲン特異的IgE抗体と反応するB細胞エピトープを含んであるため、時としてアナフィラキシー等の副反応が問題となる。
そこで、新たなアレルギー性鼻炎治療剤が必要とされるが、その発見には、アレルギー性鼻炎モデル動物を用いたスクリーニングが重要であると考えられる。
アレルギー性鼻炎モデル動物に関する報告としては、例えば、特許文献１にはダニアレルゲンを抗原として点鼻投与することにより作製されたモデルマウスについての記載が、また、非特許文献１に、スギ花粉により誘発されるアレルギー性鼻炎をモルモットに発現させる方法についての記載がある。しかしながら、実験用小動物を用いたスギ花粉により誘発されるアレルギー性鼻炎モデルはない。
スギ花粉の主要抗原により免疫応答が惹起され、ヒトに類似したアレルギー病態を備えたモデル動物が、抗原特異的なアレルギーの治療法および治療薬開発の際の評価に、およびアレルギーの発症、緩解・治癒等の機構解明には必要となる。
小動物のなかでもマウスは、スギ花粉の主要抗原に対して、系統により異なるT細胞エピトープを有している。例えば、B10.S系マウスには、スギの主要抗原であるCry j 1中にT細胞エピトープが存在する。従って、主要抗原と小動物、特にマウスの系統の組み合わせを用いることで、抗原特異的免疫応答を効果的に誘導することができる。
【０００３】
【特許文献１】特開平7-8141号公報
【非特許文献１】Inflammation Research, 47巻、369-374頁、1998年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、アレルギー性鼻炎に対する予防・治療作用を有する化合物のスクリーニングにおいて有用なモデル動物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、新たなアレルギー性鼻炎治療剤の発見のためにアレルギー性鼻炎モデル動物を作製することを検討し、アレルゲン由来の抗原ペプチドを投与することにより効率的にアレルギー性鼻炎モデル動物を作製することを見出した。本発明者らはこの知見に基づきさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、
〔１〕小動物にスギ花粉アレルゲンCry j 1を投与することを特徴とするアレルギー性鼻炎モデル動物の作製方法、
〔２〕小動物がマウスである前記〔１〕記載の方法、
〔３〕マウスがB10.Sマウスである前記〔２〕記載の方法、
〔４〕投与が鼻腔内投与である前記〔１〕記載の方法、
〔５〕スギ花粉アレルゲンCry j 1が、水酸化アルミニウムに吸着させたスギ花粉アレルゲンCry j 1である前記〔１〕記載の方法、
〔６〕前記〔１〕記載の方法で得られた動物、
〔７〕前記〔６〕記載の動物に被験物質を投与し、アレルギー性鼻炎に対する効果を検定することを特徴とするアレルギー性鼻炎治療を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法等に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明で用いる「小動物」とは、例えば、マウス、ラット、モルモット等を意味し、小動物の週齢、体重等については、目的とするスクリーニングに適用可能である限り特に制限はない。
該「小動物」としては、マウスが好ましく、なかでもB10.Sマウスが好ましい。
【０００８】
本発明で用いる「スギ花粉アレルゲンCry j 1」とは、スギ花粉主要アレルゲンの一種である(Yasueda, H. et al.; J. Allergy Clin. Immunol. 71, 77-86, 1983)。また、小動物に投与される該「スギ花粉アレルゲンCry j 1」は、固形、粒状、粉末、ゲル状、液状、溶媒に懸濁または溶解、吸着剤に吸着させる、エアロゾル状にする等どのような形状をしていてもよい。なかでも吸着剤（例えば、水酸化アルミニウム(Al(OH)3)、ミョウバン（KAl(SO4)2・12H2O）、シリカゲル(SiO2・nH2O)）に吸着させたものが好ましく、とりわけ水酸化アルミニウムに吸着させたものを用いるのが好ましい。
【０００９】
本発明における「アレルギー性鼻炎モデル動物」は、麻酔もしくは非麻酔下でスギ花粉アレルゲンCry j 1を単回または特定の時間、日数を置いて複数回投与することにより作製される。投与方法は、腹腔内投与、鼻腔内投与等投与可能な方法であればいずれでもよいが、とりわけ鼻腔内投与が好ましい。
【００１０】
本発明における「アレルギー性鼻炎モデル動物」は、(1)血液中の免疫グロブリン・化学伝達物質・補体成分等の濃度や白血球相の測定、(2)好塩基球・組織肥満細胞のヒスタミン遊離能測定、(3)T細胞・B細胞の反応性試験、(4)白血球の遊離能測定試験、(5)鼻腔内洗浄液中の細胞相・化学伝達物質濃度測定、(6)抗原・アセチルコリンアナログ・ヒスタミン・ロイコトリエン等の吸入による鼻腔収縮反応惹起試験、(7)鼻粘膜等の抗原刺激によるアレルギー性炎症惹起試験等の検査試験に付される。
【００１１】
本発明における「アレルギー性鼻炎モデル動物」は、アレルギー性鼻炎（特にスギ花粉症）予防・治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングに有用かつ効率的に適用することができる。
例えば、約0.01〜約1,000 mg/kg （好ましくは、約0.01〜約100 mg/kg）の被験物質を本発明のアレルギー性鼻炎モデル動物に投与し、IgE抗体価およびくしゃみなどを指標にその被験物質の治療効果を調べることができる。
また、被験物質を本発明のアレルギー性鼻炎モデル動物に投与することにより、各種医薬物質の評価を行うことができる。
ここで被験物質とは、公知の合成化合物、ペプチド、タンパク質などのほかに、例えば温血哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清等が用いられる。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質は、そのままあるいは薬理学的に許容される単体を配合し、経口的または非経口的に投与することができる。
当該物質を錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等の経口製剤；注射剤、注入剤、点滴剤、坐剤等の非経口製剤；などの剤形に製造する方法としては、当該分野で一般的に用いられている公知の製造方法を適用することができる。また、前記の剤形に製造する場合には、必要に応じて、その剤形に製する際に製剤分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤等を適宜、適量含有させて製造することができる。更に、所望により、製剤分野において通常用いられる着色剤、保存剤、芳香剤、矯味剤、安定剤、粘稠剤等を適量添加することができる。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質は、単剤として優れたスギ花粉症の予防剤、治療剤として有効な作用を示すが、さらに他の医薬成分（以下、併用薬物と略記する）と併用（多剤併用）することもできる。
【００１４】
このような併用薬物としては、例えば、ケミカルメディエーター遊離抑制剤（例えば、クロモグリク酸ナトリウム（インタール）、トラニラスト（リザベン）、アンレキサノクス（ソルファ）、ペミロラストカリウム（アレギサール）等）、ケミカルメディエーター受容体拮抗薬（例えば、(1)d-マレイン酸クロルフェニラミン（ポララミン）、フマル酸クレマスチン（タベジール）、フマル酸ケトチフェン（ザジデン）、塩酸アゼラスチン（アゼプチン）、オキサトミド（セルテクト）、メキタジン（ゼスラン、ニポラジン）、フマル酸エメダスチン（ダレン、レミカット）、塩酸セチリジン（ジルテック）、塩酸レボカバスチン（リボスチン）、塩酸フェキソフェナジン（アレグラ）、塩酸オロパタジン（アレロック）等の抗ヒスタミン薬、(2)ラマトロバン（バイナス）等のトロンボキサンA2拮抗薬、(3)プランルカスト水和物（オノン）等のロイコトリエン拮抗薬等）、Th2サイトカイン抑制薬（例えば、トシル酸スプラタスト（アイピーディー）等）、ステロイド薬（例えば、(1)プロピオン酸ベクロメタゾン（ベコナーゼ、アルデシン、リノコート）、フルニソリド（シナクリン）、プロピオン酸フルチカゾン（フルナーゼ）等の局所ステロイド薬、(2)セレスタミン（マレイン酸クロルフェニラミン配合剤）等の経口ステロイド薬等）、自律神経作用薬（例えば、(1)硝酸ナファゾリン（プリビナ）、硝酸テトラヒドロゾリン（ナーベル）、塩酸オキシメタゾリン（ナシビン）、塩酸トラマゾリン（トーク）等のα刺激薬、(2)臭化イプラトロピウム（アトロベント）、臭化フルトピウム（フルブロン）等の抗コリン薬等）、生物製剤（例えば、ノイロトロピン、アストレメジン、MSアンチゲン等）等が挙げられる。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質と併用薬物との併用に際しては、本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質と併用薬物の投与時期は限定されず、本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質と併用薬物とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬物の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択することができる。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質と併用薬物の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質と併用薬物とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、(1)本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質と併用薬物とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、(2) 本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質と併用薬物とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の同一投与経路での同時投与、(3) 本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質と併用薬物とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、(4)本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質と併用薬物とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の異なる投与経路での同時投与、(5) 本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質と併用薬物とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）などが挙げられる。以下、これらの投与形態をまとめて、本発明の併用剤と略記する。
【００１７】
本発明の併用剤は、毒性が低く、例えば、本発明のスクリーニング方法でアレルギー性鼻炎の改善効果を有することが判定される被験物質または（および）上記併用薬物を自体公知の方法に従って、薬理学的に許容される担体と混合して医薬組成物、例えば、凍結乾燥注射剤、溶液注射剤、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、液剤、坐剤、徐放剤等として、経口的又は非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に安全に投与することができる。
【００１８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
実施例１  マウスへのCry j 1 の感作および追加感作
1. 感作マウスの作製
（水酸化アルミニウムゲルの作製）
0.5N 水酸化ナトリウム水溶液と0.5N 硫酸アルミニウムを用いてAllergology International、46巻、261-267頁、1997年に記載の方法で水酸化アルミニウムゲルを作製した。
（感作）
6週齢のB10.Sマウス（♀）14匹に上記の水酸化アルミニウムゲル（水酸化アルミニウム0.1 mg相当）に吸着させたCry j 1 (1 μg)を1日2回、7日間連続して両鼻腔に投与した。
（追加感作）
追加感作は、1週間に1回、2μLのPBSに溶解させたCry j 1 (2 μg)を両鼻腔に投与することで行った（図１）。
2. 非感作マウスの作製
対照動物として、感作を行わず、2μLのPBSの投与を行ったマウスを作製した（図１）。
【００２０】
実施例２  血中抗体の測定
追加感作時の血中抗体価を測定するため、追加感作の第2〜第20回目の前日に、エーテル麻酔下で、感作マウスおよび非感作マウスの眼窩から採血を行い、得られた血清中のCry j 1 特異的IgE抗体価をELISA法により測定した。以下にELISA法のプロトコールを示す。
なお、各略語は以下を意味する。
PBS (pH 7.2-7.4): リン酸緩衝生理食塩水（Phosphonate Buffered Saline）（塩化ナトリウム (80.0 g)、リン酸水素二ナトリウム (11.6 g)、リン酸二水素カリウム (2.0 g)および塩化カリウム (2.0 g)に水を加え、10 Lにした緩衝液）
PBS/Tween: 0.05% Tween 20含有PBS
FBS: Fetal Bovine Serum（ウシ胎児血清）
Av-HRP: Avidin-Horse Radish Peroxydase
TMB: 3,3',5'-Trimethylbenzidine
【００２１】
（１）Cry j 1 コーティング
PBS(pH 7.2-7.4)で2μg/mL に希釈したCry j 1をプレートに100μL/wellとなるように添加した。プレートをCry j 1溶液で覆われるように振盪させ、4℃で一夜培養した。プレートをPBS/Tween (PBS, Tween-20, 0.05 %)で3回洗浄（200 μL のPBS/Tween をプレートに添加し、1 分放置後、バッファーを除去し（3回繰り返し）、さらに過剰のバッファーを紙で除去）した。
（２）ブロッキング
プレートをブロッキングバッファー(10% FBS含有PBS)(200μL/well)でブロック後、プレートをカバーし、室温で2時間培養した。プレートをPBS/Tween (PBS (pH 7.2-7.4), Tween-20, 0.05 %)で3回洗浄した。
（３）標準物質および被験物（血清）の添加
カラム1は、コントロール (Cry j 1：100μL/well)を前記ブロッキングバッファーで2倍希釈系列したもの、残りのカラムは血清を種々の濃度に希釈したものをそれぞれ添加した(Cry j 1：100μL/well)。プレートをカバーし4℃で一夜培養し、PBS/Tween (PBS (pH 7.2-7.4), Tween-20, 0.05 %)で3回洗浄した。
（４）培養およびAb の検出
ビオチン化ラット抗マウスIgE (R35-118, PharMingen)をブロッキングバッファー(10% FBS含有PBS)で希釈(2μg/mL)しプレートに添加(100μL/well)した。プレートをカバーし室温で1時間培養後、PBS/Tween (PBS (pH 7.2-7.4), Tween-20, 0.05 %)で6回洗浄した。
（５）アビジン化HRP (Av-HRP) の添加
アビジン化HRPをブロッキングバッファー(10% FBS含有PBS)で1000倍希釈し、プレートに添加(100μL/well)した。プレートをカバーし室温で30分培養後、PBS/Tween (PBS (pH 7.2-7.4), Tween-20, 0.05 %)で6回洗浄した。
（６）基質の添加および反応
TMB (50μL/well) を添加し、室温で30分ないし1時間の一定時間培養した。1M H2SO4 (50μL/well) を添加し、呈色反応を終止した。450 nm (OD)を測定することにより、Cry j 1 特異的IgE抗体価を測定した。
得られた血清中のCry j 1 特異的IgE抗体価を図２に示す。
【００２２】
図２に示すように、実施例１でCry j 1に感作させたマウスは、血清中にCry j 1 特異的IgE抗体価を高く維持することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明の作製方法により得られるアレルギー性鼻炎モデル動物は、in vivo評価系において優れており、アレルギー性鼻炎、特にスギ花粉症に伴う鼻炎の予防・治療のために用いられる物質のスクリーニングに有用かつ効率的に適用することが可能である。また、本発明のアレルギー性鼻炎モデル動物を用いることにより、病態に伴い発現が変動する遺伝子の同定や動態の解明、タンパク発現変動の解析、遺伝子導入によるアレルギー性鼻炎治療効果の検討などの、アレルギー性鼻炎の病態メカニズムの解明を目的とした病態生理学的研究を、短期間で効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Cry j 1 感作マウスおよびCry j 1 非感作マウスの作製プロトコールを示す図である。
【図２】血清中のCry j 1 特異的IgE抗体価（平均値）を示す図である。縦軸はCry j 1特異的IgE抗体価を、横軸は追加感作の回数を示す。
【図１】
2004275184.tif 000002
【図２】
2004275184.tif 000003