(57)【要約】【課題】軸先先端部にある神経成長円錐の舵取り機構内で働く、細胞内シグナル制御分子ＣＲＭＰ（ｃｏｌｌａｐｓｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の新規アイソフォーム、該アイソフォームをコードする遺伝子、これらの変異体、及び該新規アイソフォームに特異的に結合する抗体を提供すること。【解決手段】ニワトリ胚網膜内の非対称的発現分子のスクリーニングにより、ＣＲＭＰのＮ末端アイソフォームを取得した。本発明の新規Ｎ末端アイソフォームＣＲＭＰ１Ａ〜４Ａのアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号２、４、６及び８に示される。更にＣＲＭＰ１Ａ〜４Ａのアイソフォーム、該アイソフォームをコードする遺伝子を取得し、その変異体、更には該アイソフォームに特異的に結合する抗体を取得した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経成長円錐のシグナル制御分子ＣＲＭＰのＮ−末端変異体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号３に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号５に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号７に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項６】
配列表の配列番号９に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項７】
配列表の配列番号１１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項８】
配列表の配列番号１３に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項２〜８のいずれかに記載されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経成長円錐のシグナル制御機能を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、８，１０及び１２のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、８，１０及び１２のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経成長円錐のシグナル制御機能を有するポリペプチド
【請求項１１】
神経成長円錐のシグナル制御分子ＣＲＭＰのＮ−末端変異体ポリペプチド。
【請求項１２】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１３】
配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１４】
配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１６】
配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１７】
配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１８】
配列表の配列番号２、４、６、８、１０及び１２のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経成長円錐のシグナル制御機能を有するポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれか記載のポリペプチドに特異的にに結合する抗体。
【請求項２０】
抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経発生過程において、高度に特異的な神経回路網が形成される際に、正しい神経結合の相手を見つける上で重要な役割を果たしている、軸先先端部にある神経成長円錐の舵取り機構、すなわち、ガイダンス因子等からの細胞内シグナルを変換する、シグナル制御機能を有する分子ＣＲＭＰ（ｃｏｌｌａｐｓｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の新規アイソフォーム及び該アイソフォームの遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人間の脳は、無数の神経細胞から構成される複雑なネットワークから出来ている。発生時、神経上皮細胞が分裂して生み出された神経細胞の多くは、表層側へ放射状に移動する。ある決まった位置にたどり着いた神経細胞は、通常１本の軸索と複数の樹状突起を伸ばし始める。軸索と樹状突起は定められた神経細胞と接続するように伸長していく。その結果、正しいネットワークが形成され、高度な情報処理が可能になる。
【０００３】
神経細胞から構成される複雑なネットワークは、もとは神経管と呼ばれる１層の細胞から成るチューブから形成されたものである。神経管の膜の中では、神経上皮細胞が分裂して神経芽細胞とグリア細胞が作られると考えられている。その後、神経芽細胞は、発生期の他の細胞と同様にある決まった位置に移動する。定位置にたどり着いた神経芽細胞は通常１本の軸索と複数の樹状突起を伸ばし始める。樹状突起は木の枝のように複雑に分岐して、他の神経細胞からの情報を受け取る。軸索は情報を他の神経細胞に送り出す役割を担っている。換言すれば、樹状突起は入力を、軸索は出力を担うケーブルのようなものである。こうして神経細胞は樹状突起から軸索へのシグナルの流れを保証するために極性を確立する。
【０００４】
軸索と樹状突起はランダムな方向に伸長していくのではなく、どのような経路をたどってどの神経細胞と接続すべきか決められている。その結果、正しくネットワークが形成され、高度な情報処理が可能になる。最終目的地にたどり着いた軸索や樹状突起は標的神経細胞とシナプスを形成する。シナプスは一見安定な構造のように見えるが、神経発生の過程で脱落したり、新たに形成されたりするように、盛んに再構築が行われる。このように神経細胞は、発生・分化の過程あるいは成熟した後も、ダイナミックに形態変化することで脳を作っていくと考えられる。
【０００５】
神経組織の構築或いは再構築の過程において、正確な神経回路網を形成するためには、神経細胞が適切な場所に移動するだけでなく、標的細胞の正しい位置情報を感知して、軸索及び樹状突起を伸展させて到達させる必要がある。その結果、個々の神経細胞が特定の神経細胞と特異的なシナプスを形成し、機能的な神経回路網を形成することができる。伸長する軸索や樹状突起の先端には、成長円錐（ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｅ）と呼ばれる扇形状の特殊な構造がある。成長円錐は主として糸状仮足（ｆｉｌｏｐｏｄｉａ）と葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）と呼ばれるアクチンフィラメントに裏打ちされる膜構造で、糸状仮足が触手のように働き、神経突起の伸長方向を決定していると考えられている。
【０００６】
神経突起が伸長する際の道標として、近傍で働く種々の接触性分子と遠隔地から働く分泌される拡散性の分子があると考えられている。それぞれ、誘引性のものと反発性のものが存在している。これらのガイダンス因子は接触性誘引因子、接触性反発因子、拡散性誘引因子、拡散性反発因子の４つのカテゴリーに分類される（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４，　（１９９６）　１１２３−１１３３．）。拡散性の誘引因子としてはネトリン（ｎｅｔｒｉｎ）など、拡散性の反発因子としてはセマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）などがよく知られている。これらのガイダンス因子の研究は、現在急速に進んでおり、多くの研究報告がなされている。
【０００７】
近年、ガイダンス因子等からの細胞内シグナルを変換し、神経突起の伸長方向を決定していると考えられている軸先先端部にある神経成長円錐の、神経軸索誘導や伸展活性などにおける舵取り機構を果たしていると考えられている細胞内シグナル制御機能を有する分子ＣＲＭＰ（ｃｏｌｌａｐｓｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が見い出されている。ＣＲＭＰは、１９９５年から１９９６年にかけて世界の複数の研究室で見い出された細胞内タンパク質で、発生時期の哺乳類の脳、神経細胞に一過性に発現する。線虫のＣＲＭＰホモログの１つとしてＵＮＣ−３３があり、ｕｎｃ−３３変異体では種々の軸索の異常が認められることから、ＵＮＣ−３３は軸索伸長に必須と推定されている。
【０００８】
神経回路網形成における誘導シグナルや成長円錐の応答及びその舵取り機構の機能を持つＣＲＭＰについては、最近の研究成果により、序々にそれらの機能が明らかとなってきた。
まず、この分野の研究目的の一つとして、神経回路網の形成において、神経系統における複雑でありながら体系的に構成されたニューロン間の配線を確立する原理について明らかにすることが挙げられた。結合性のパターンに外見上の相違があるにも拘わらず、神経回路においては、正確な秩序を生み出す統一された原理があるに違いないと予測されてきた（Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１１，　（１９８８）　２８９−３２７．）。これらの原理の大部分は、個々の発達ニューロンが標的を見つけてそれらと共にシナップスをつくる基本的な機構に依存している。
【０００９】
成長軸索の運動性及び神経性の先端である成長円錐は、神経回路網形成の最初の段階において軸索を正しい方向に導き、標的を認識する役割を果たしている。つまり、それは環境を探索し、複数の誘導の合図を同時に検知し、それらの情報を統合し、方向づけた軸索成長に翻訳するのである（Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２２，（１９９９）　３５１−３８８．）。近年、短距離又は長距離で働く、誘引する又は反発するシグナルである細胞外誘導分子についても、それらの受容体と同様に広範囲に渡って詳細に解析されてきた（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４，　（１９９６）　１１２３−１１３３．）。これに対し、誘導シグナルを成長円錐の応答に変換する細胞内の一連の事象に関する知見は未だ断片的なものである（Ｎａｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　３，　（２００１）　Ｅ８１−Ｅ８８．）。
【００１０】
成長円錐の挙動は２つの主な細胞骨格構成要素、すなわち、繊維状アクチン（Ｆ−アクチン）及び微小管（ＭＴ）の動的な再構成に依存していることが広く受け入れられている。（Ｃｅｌｌ　８３，　（１９９５）　１７１−１７６．；　Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　４４，　（２０００）　９７−１１３．）。成長円錐の舵取りの間、誘導シグナルは最初にアクチンの動態に影響を及ぼし、アクチンが成長円錐の形及び運動性を決定する（Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　１１，　（２００１）　１０３−１１０．）。
動的不安定性の固有特性及び各種補助タンパク質を主な原因としてＭＴは細胞内の空間を探索するためにアクチンの豊富な末梢に及ぶまで連続的に伸長したり縮んだりする（Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１１５，　（１９９１）　３４５−３６３．；　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．１３，　（１９９７）　８３−１１７．）。成長円錐の方向転換、ＭＴはＦ−アクチンが蓄積する部位に向かって優先的に伸長し、その後は安定化され、これらの事象は新たな軸索の形成を誘発する（Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１２１，　（１９９３）　１３６９−１３８３．；　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．　１０９，　（１９９６）　２０３１−２０４０．）。従って、成長円錐内でＭＴを誘導する際にはＦ−アクチンが重要な役割を果たしており、ＭＴが正しい方向へ伸長することが舵取りの際の進路決定の基盤となっていると考えられる。しかし、これらの過程に利用される分子機構についてはまだ確認されていない。
【００１１】
Ｓｅｍａ３Ａシグナリングにおけるシグナル伝達分子としてのＣＲＭＰ６２（現在ＣＲＭＰ２と称す）が同定されて以来、発達神経系中で広く豊富に発現する細胞内タンパク質であるＣＲＭＰは成長円錐誘導機構の主要要素の有力候補である（Ｎａｔｕｒｅ　３７６，　（１９９５）　５０９−５１４．；レビューについてはＪ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　４１，　（１９９９）　１５８−１６４．）。興味深いことに、ＣＲＭＰは、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）の中の軸索成長に関連したタンパク質であるＵｎｃ−３３に相同性を有する、その変異は神経回路の形成における欠陥の偏在を生じ、非協調的な運動の原因となる（Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　１１１，　（１９８５）　１５８−１７０．；　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１３２，　（１９９２）　６７５−６８９．；　Ｎａｔｕｒｅ　３７６，　（１９９５）　５０９−５１４．）。いくつかのグループの研究を通して、その後、様々な種から多くのＣＲＭＰ６２に関連したタンパク質が発見され、個々のグループによって独立にＣＲＭＰ、ＴＯＡＤ（ｆｏｒ　ｔｕｒｎｅｄ　ｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、Ｕｌｉｐ（Ｕｎｃ−３３−ｌｉｋｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）又はＤＲＰ（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）と称された。
【００１２】
これまでに、脊椎動物においては５つの異なるＣＲＭＰ（ＴＯＡＤ／Ｕｌｉｐ／ＤＲＰ）遺伝子の特徴づけが行なわれている（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１６，　（１９９６）　６１９７−６２０７．；　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１５，　（１９９５）　６７５７−６７６６．；　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１６，　（１９９６）　６８８−７０１．；　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５４，　（１９９８）　１４−２４．；　Ｇｅｎｅ　１８０，　（１９９６）　１５７−１６３．；　Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　（２０００）　２７２９１−２７３０２．；　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　（２０００）　３７９５７−３７９６５．；　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４８０，　（２０００）　２８３−２８６．）。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、神経発生過程において、高度に特異的な神経回路網が形成される際に、正しい神経結合の相手を見つける上で重要な役割を果たしている、軸先先端部にある神経成長円錐の舵取り機構として働く、細胞内シグナル制御分子ＣＲＭＰ（ｃｏｌｌａｐｓｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の新規アイソフォーム、該アイソフォームをコードする遺伝子、該新規アイソフォーム及び該アイソフォームをコードする遺伝子の変異体、及び該新規アイソフォームに特異的に結合する抗体を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、よく研究されてきた領域特異的に構築された網膜視蓋投射地図の形成に寄与していると思われるニワトリ胚網膜内の非対称的発現分子のスクリーニングを行なった（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　Ｒｅｖ．　３２，　（２０００）　３４３−３７９．；　Ｎａｔｕｒｅ　３８２，　（１９９６）　６３２−６３５．；　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９３，　（２００１）　１１１−１１５．）。本発明者が、これまでに得られた分子の特徴づけから始めて同定した結果、最初に報告されたアイソフォーム（改名して、「ＣＲＭＰ−Ｂ」と呼ぶ）のＮ末端変異体であるＣＲＭＰ１〜４（「ＣＲＭＰ−Ａ」と呼ぶ）の新たなアイソフォームであることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明においては、該Ｎ末端変異体であるニワトリＣＲＭＰ１〜４のアイソフォーム、該アイソフォームをコードする遺伝子、及び、マウスＣＲＭＰ１Ａ及び４Ａをコードする遺伝子を取得し、その変異体、更には該アイソフォームに特異的に結合する抗体を取得した。
【００１５】
本発明において、本発明のアイソフォーム（ＣＲＭＰ−Ａ）と既に報告されたアイソフォーム（ＣＲＭＰ−Ｂ）の比較分析を行うことによってＣＲＭＰ−Ａ及びＣＲＭＰ−Ｂが対照的な作用、すなわち、細胞の極性を制御するための配向化及びランダム化によってＭＴのパターンを構成していることを明らかにした。
また、本発明においては、ＣＲＭＰのうち、特にＣＲＭＰ−ＡがＭＴを将来の移動方向及び／又は細胞の主軸に沿って再配列させるために一般的に利用されている分子素子の構成要素であって、それらの過程はＦ−アクチンの影響を受けていることや、軸索の誘導から結合性の精密化に至るまで、正確な神経回路網の発達における複数の局面で作用していることも明らかにした。
【００１６】
すなわち本発明は、神経成長円錐のシグナル制御分子ＣＲＭＰのＮ−末端変異体をコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項１）や、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項２）や、配列表の配列番号３に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項３）や、配列表の配列番号５に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項４）や、配列表の配列番号７に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項５）や、配列表の配列番号９に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項６）や、配列表の配列番号１１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項７）や、配列表の配列番号１３に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項８）や、請求項２〜８のいずれかに記載されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経成長円錐のシグナル制御機能を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項９）や、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ａ）配列表の配列番号２、４、６、８，１０及び１２のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、８，１０及び１２のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経成長円錐のシグナル制御機能を有するポリペプチド（請求項１０）からなる。
【００１７】
また本発明は、神経成長円錐のシグナル制御分子ＣＲＭＰのＮ−末端変異体ポリペプチド（請求項１１）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド（請求項１２）や、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド（請求項１３）や、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド（請求項１４）や、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド（請求項１５）や、配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド（請求項１６）や、配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド（請求項１７）や、配列表の配列番号２、４、６、８、１０及び１２のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経成長円錐のシグナル制御機能を有するポリペプチド（請求項１８）や、請求項１１〜１８のいずれか記載のポリペプチドに特異的にに結合する抗体（請求項１９）や、抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９記載の抗体（請求項２０）からなる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、神経発生過程において、正しい神経結合の相手を見つける上で重要な役割を果たしている神経成長円錐の舵取り機構として働く、細胞内シグナル制御分子ＣＲＭＰ（ｃｏｌｌａｐｓｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の新規Ｎ−末端アイソフォーム、該アイソフォームをコードする遺伝子を提供し、それらの機能を解明したことよりなる。更に、本発明は、該ＣＲＭＰアイソフォーム及び該アイソフォームをコードする遺伝子から誘導した変異体、及び該ＣＲＭＰで感さすることにより製造された、新規アイソフォームに特異的に結合する抗体を提供するものである。
【００１９】
本発明のニワトリ新規Ｎ−末端アイソフォームＣＲＭＰ１Ａ〜４Ａのアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号２（ＣＲＭＰ１Ａ）、配列番号４（ＣＲＭＰ２Ａ）、配列番号６（ＣＲＭＰ３Ａ）、及び配列番号８（ＣＲＭＰ４Ａ）に示され、マウス新規Ｎ−末端アイソフォームＣＲＭＰ１Ａ及び４Ａのアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号１０（マウスＣＲＭＰ１Ａ）、及び配列番号１２（マウスＣＲＭＰ４Ａ）に示される。なお、ＣＲＭＰ１Ｂ〜４Ｂのアミノ酸配列は、それぞれ図１５、図１７、図１９及び図２１に示される。本発明の新規Ｎ−末端アイソフォームＣＲＭＰ１Ａ〜４Ａをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、それぞれ配列表の配列番号１（ＣＲＭＰ１Ａの遺伝子）、配列番号３（ＣＲＭＰ２Ａの遺伝子）、配列番号５（ＣＲＭＰ３Ａの遺伝子）、及び配列番号７（ＣＲＭＰ４Ａの遺伝子）に示され、マウス新規Ｎ−末端アイソフォームＣＲＭＰ１Ａ及び４Ａをコードする遺伝子のＤＮＡ配列はそれぞれ配列表の配列番号９（マウスＣＲＭＰ１Ａの遺伝子）、及び配列番号１１（マウスＣＲＭＰ４Ａの遺伝子）に示される。なお、ＣＲＭＰ１Ｂ〜４Ｂをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、それぞれ図１４、図１６、図１８及び図２０に示される。ニワトリの該遺伝子のＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒｓ：ＡＦ３０１５４８，　ＡＦ３０１５５０，　ＡＦ２４９２９４及びＡＦ３０１５５３としてデータベース検索を行うことができる。また、マウスＣＲＭＰアイソフォームＣＲＭＰ１をコードするＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１３に示される。
【００２０】
本発明のニワトリＣＲＭＰ１Ａ〜４Ａ及びマウス１Ａ、４Ａをコードする遺伝子を取得するには、例えば、ニワトリやマウスの網膜ｃＤＮＡライブラリー等を用いて、常法によりスクリーニングすることにより取得することができる。また、本発明のＣＲＭＰポリペプチドを取得するには、スクリーニングにより取得したＤＮＡを、常法により、適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主に導入して発現させることにより、取得することができる。本発明において、本発明の新規アイソフォームに特異的に結合する抗体を取得するには、常法により、本発明のＣＲＭＰを用いて動物細胞を感さすることにより取得することができる。
【００２１】
更に、本発明は、配列表の配列番号２，４，６，８，１０及び１２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経成長円錐のシグナル制御機能を有するＣＲＭＰポリペプチド、及び該ＣＲＭＰをコードする遺伝子、更には、配列表の配列番号１、３、４及び７に示される塩基配列と、又はその一部の塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経成長円錐のシグナル制御機能を有するＣＲＭＰポリペプチドをコードするＤＮＡ、すなわちＣＲＭＰ１Ａ〜４Ａ及びその遺伝子の変異体を含むものであるが、該変異体を調製するための、種々のＤＮＡ配列の変異は、周知の遺伝子工学的遺伝子変異手段によって、行うことができる。
【００２２】
なお、上記本発明の変異体ＣＲＭＰに係わる塩基配列において、「塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２３】
以下に、本発明の新規ＣＲＭＰの取得、同定及びその機能の解明について、詳述する。
（新規ＣＲＭＰアイソフォームの同定）
網膜視蓋投射マップを発達させる役割を果たす分子を体系的に同定するため、本発明者は、胎生８日目のニワトリ網膜中の非対称的発現分子について大規模なスクリーニングを行なった。これまでに得られた各種候補のうち、本発明者らはＣＲＭＰ３の新たなＮ末端変異体に注目した（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１６，　（１９９６）　６１９７−６２０７．；　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５４，　（１９９８）　１４−２４．）。予測された分子の大きさの順に、この変異体をＣＲＭＰ３Ａと命名し、最初のＣＲＭＰ３を仮にＣＲＭＰ３Ｂと改名した（命名法については下記を参照）（図１Ａ及び１Ｂ）。ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの研究を行なった結果、胎生８日目ではＣＲＭＰ３ＢではなくＣＲＭＰ３Ａが網膜内の鼻側頭軸に沿って非対称的に発現することが確認された。しかしながら、後期の段階ではＣＲＭＰ３Ａは均一に分布した（データには示されていない）。その発現パターンは網膜の成熟度に付随するため、ＣＲＭＰ３Ａが網膜視蓋投射地図のための細胞内位置コードであるとは考えにくい。
【００２４】
次に、本発明者は、胎生８日目のニワトリ網膜ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、他のＣＲＭＰがＣＲＭＰ３Ａに似た変異体を持つかどうかを調べ、ＣＲＭＰ１〜４の全てにおいてそのようなアイソフォームを同定した。本発明者は、それらをＣＲＭＰ１Ａ、２Ａ及び４Ａと命名し、前に特徴づけたアイソフォームをＣＲＭＰ１Ｂ、２Ｂ及び４Ｂと改名した（図１Ａ及び１Ｂ、並びに補足図Ｓ１）。また、胚ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、マウスＣＲＭＰ１Ａ（図２２、図２３）及び４Ａ（図２４、図２５）をコードするｃＤＮＡも単離した（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　（２０００）　３７９５７−３７９６５．）。Ｎ末端可変及びＣ末端コア領域の間の結合部は、ＣＲＭＰ１〜４の間で保存されている（図１Ａ及び１Ｂ、矢頭）。最近、本発明者や他の研究グループがネズミにおける第５番目のＣＲＭＰメンバー（ＣＲＭＰ５／ＣＲＡＭ／Ｕｌｉｐ６）について報告した（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　（２０００）　２７２９１−２７３０２．；　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　（２０００）　３７９５７−３７９６５．；　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４８０，　（２０００）　２８３−２８６．）。
【００２５】
本発明者らはまだニワトリＣＲＭＰ５を同定していないが、マウスＣＲＭＰ５のｃＤＮＡ及びゲノム分析を行なったところ、それがＡ−型アイソフォームを有さないことが示唆された。ノーザン・ブロット法及びｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの研究により、ＣＲＭＰ２Ａ及び１Ａが発達中のニワトリ神経系統において最もよく広範囲に発現するＡ−型ＣＲＭＰであることが判明したため、本発明者はその後の分析においては、特に前者を中心に研究を行った。
ＣＲＭＰのＣ末端領域中では高度に保存されているの対して、ＣＲＭＰ−ＡのＮ末端領域は互いに有意に異なり（２４〜４５％の同一性）、整列させたアミノ酸の位置３０〜５２において良く保存された配列がある（図１Ｂ）。Ｕｎｃ−３３は選択的スプライシングによって生じる、互いに重なり合うＮ末端領域の長さのみ異なる３つのアイソフォームとして存在することが既に報告されているが（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１３２，　（１９９２）　６７５−６８９．）、ニワトリＣＲＭＰ−Ａ及びＵｎｃ−３３の最長アイソフォーム間のＮ末端領域を比較した結果、１次構造レベルにおいて有意な相同関係は見られなかった。
【００２６】
（ＣＲＭＰ遺伝子のゲノム構成）
マウスＣＲＭＰ１ゲノムＤＮＡのシーケンス分析を行なった結果、ＣＲＭＰ１Ａ及び１Ｂの各Ｎ末端領域は単一のエクソンにコードされており（それぞれエクソン１Ａ及びエクソン１Ｂと命名）、エクソン１Ａはエクソン１Ｂの上流に位置することが分かった（図１Ｃ）。さらにデータベース検索を行い、ヒトＣＲＭＰ１〜４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒｓ：　ＡＣ００５２８９、　ＡＣ０１５７４３、　ＡＬ５１２６２２及びＡＣ００８７０１）もマウスＣＲＭＰ１遺伝子と同じ構造を共有することが明らかになった。ニワトリＣＲＭＰ遺伝子の分析が依然として必要とされているが、おそらく、ＣＲＭＰのＮ末端領域をコードする遺伝子構造は、脊椎動物において保存されており、各ＣＲＭＰ遺伝子座はＡ、ＢどちらかのＮ末端及び共通するＣ末端領域から成る２種類のアイソフォームを生成すると考えられる。
【００２７】
（発生期の神経系統におけるＣＲＭＰ−Ａの発現）
本発明者は、ニワトリＣＲＭＰ１Ａ又は２Ａに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体や、ＣＲＭＰ−３Ｂを除く全てのＣＲＭＰ−Ｂ又はＣＲＭＰ１〜４のアイソフォーム全てを認識するものを作製した（Ｎａｔｕｒｅ　３７６，　（１９９５）　５０９−５１４．；　Ｍｏｌ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　５４，　（１９９８）　２１９−２３６．）。胎生１４日目のニワトリ脳を免疫ブロット法で分析した結果、ＣＲＭＰ１Ａ及び２Ａの存在を確認することができた（図１Ｄ、レーン１及び２）。抗全ＣＲＭＰ−Ｂ抗体は、より小さい分子量の複数のバンドを検知し、抗全ＣＲＭＰ抗体は、ＣＲＭＰ−Ａ（主に１Ａ及び２Ａ）及びＣＲＭＰ−Ｂ（レーン３及び４）の両方を検知した。抗ＣＲＭＰ２モノクローナル抗体であるＣ４Ｇを用いて、ＣＲＭＰ２Ｂと同様にＣＲＭＰ２Ａも検知した（レーン５）（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　（２０００）　１７９１７−１７９２０．）。脳抽出液の免疫沈降を行なった結果、ＣＲＭＰ−Ｂが互いに結合するのと同じように、ＣＲＭＰ−Ａ及びＢは互いにヘテロ多量体の複合体を形成することが明らかになった（データには示されていない）（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　６９，　（１９９７）　２２６１−２２６９．；　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　（２０００）　３７９５７−３７９６５．）。
【００２８】
活性型のにあるＣＲＭＰが、多量体又は単量体のどちらとして存在するかについては、現在のところ不明である。
アイソフォームのＡ−型及びＢ−型の両方と反応する抗体と免疫沈降を行なうことにより、ＣＲＭＰが神経細胞体、神経突起及び成長円錐に局在することが既に分かっている（Ｎａｔｕｒｅ　３７６，　（１９９５）　５０９−５１４．；　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１５，　（１９９５）　６７５７−６７６６．；　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５４，　（１９９８）　１４−２４．；　Ｎａｔ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　４，　（２００１）　７８１−７８２．）。アイソフォームに特異的な抗体によって、ＣＲＭＰ−Ｂの分布パターンからＣＲＭＰ−Ａの分布パターンを識別することできた。しかしながら、ＣＲＭＰ−Ｂ（１Ｂ、２Ｂ及び４Ｂ）は、ほぼ同一のＮ末端配列を持つため、ＣＲＭＰ−Ｂ同士をそれらの中から識別することは不可能であった（図９）。従って、ＣＲＭＰ２ＡとＣＲＭＰ２Ｂの分布とを比較するため、本発明者らは、抗ＣＲＭＰ２Ａ及び抗全ＣＲＭＰ−Ｂポリクローナル抗体、抗ＣＲＭＰ２モノクローナル抗体を組み合わせて使用した免疫沈降を試みたが、これらは間接的にＣＲＭＰ２Ｂの分布を暗示するにとどまった。
【００２９】
胎生１０日目のニワトリ網膜を各種抗ＣＲＭＰ抗体と細胞体樹状投射マーカーとしての抗ＭＡＰ２抗体を用いて２重免疫染色した（Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１７，（１９９４）　２６７−３１０．）。本発明者は、出力ニューロンである網膜神経節細胞（ＲＧＣ）内におけるＣＲＭＰの分布に注目した。胎生１０日までには、ＲＧＣ軸索、細胞体及び樹状突起は明確な層（それぞれ、視神経繊維層［ＯＦＬ］、神経節細胞層［ＧＣＬ］及び内部網状層［ＩＰＬ］）に完全に分離されるため、インビボで単一種のニューロン内におけるタンパク質の局在化について容易に検査することができる。図２Ａ〜２Ｄに示すように、ＣＲＭＰ２Ａ−免疫応答性はＯＦＬにおいて最も強く、ＧＣＬ及びＩＰＬにおいてはかすかなレベルで検知され、ＣＲＭＰ２Ａが主にＲＧＣ軸索に対して局在化したことを示した。
【００３０】
より早い段階においては（〜胎生６日目）、ＣＲＭＰ２Ａは軸索と同様にＲＧＣ体に対しても有意に局在化した。正確な網膜視蓋投射地図が出現する後期の段階においては（〜胎生１５日目）、その発現は減少したが、検知し得るレベルを持続した。さらに、発達の間中、ＯＦＬにおけるＣＲＭＰ２Ａのシグナルは、ＣＲＭＰ１Ａのシグナルよりも強いものであった。抗全ＣＲＭＰ−Ｂ及び抗ＣＲＭＰ２抗体による染色を行なうことにより、ＣＲＭＰ２Ｂが網膜の全体にわたって普遍的に分布し、ＲＧＣ軸索、細胞及び樹状突起の中に存在することが分かった（図２Ｅ〜２Ｋ）。
様々な発達段階にあるニワトリ胚の全載及び切片について、さらに免疫染色分析を行なった結果、後根神経節（ＤＲＧ）の神経繊維や、頭蓋感覚ニューロン、嗅覚感覚ニューロン及び中枢神経系中のニューロンを含む様々なニューロンの軸索に対してＣＲＭＰ２Ａが局在することが分かった（図１０）。
【００３１】
（成長円錐中の細胞骨格とＣＲＭＰの結合）
軸索誘導におけるＣＲＭＰ−Ａ及びＢの役割を解明するため、本発明者らは免疫蛍光検査法を用いて成長円錐におけるその細胞内局在パターンについて研究した。単離した網膜ニューロンから伸長する軸索をＣＲＭＰ（参考写真：赤色）、アクチン（参考写真：青色）及びＭＴ（参考写真：緑色）と３重に標識した（図３Ａ〜Ｃ）。ＣＲＭＰ１Ａ、２Ａ及びＢは、類似した分布パターンを示した。軸索シャフト及び成長円錐でＣＲＭＰ免疫応答が点状に検知され、Ｆアクチン（特に蓄積部位において）又はＭＴ、あるいはその両方と共局在していた。
【００３２】
その後、本発明者らは、ＣＲＭＰがインビトロでＦ−アクチン及びＭＴと結合するかどうかについて調べるため、共沈降分析を行った。ニワトリ脳抽出物の超遠心分離機による上清中のＣＲＭＰは、ＭＴと共沈したが、Ｆ−アクチンの場合には有意なレベルの共沈は見られなかった（図３Ｄ、レーン１及び２、データには示されていない）。従来のＭＴ結合タンパク質（ＭＡＰＳ）及びＭＴ依存性モータータンパク質とは異なり、ＭＴを安定化させる薬物であるタキソールが存在するＭＴの沈殿物の中では、ＣＲＭＰはほとんど検知されなかった。これは、動的に成長したり縮んだりするＭＴとＣＲＭＰが優先的に結合することを示唆している（図３Ｄ、レーン３及び４）。これらの結果は、成長円錐の舵取りの間、ＣＲＭＰが細胞骨格、特にＭＴの再構成に関与していることを示す。
【００３３】
（ＣＲＭＰに誘導されるＭＴの再配置）
次に、本発明者は、ＣＲＭＰが非神経細胞における細胞骨格的構成に影響を与えることが可能であるかどうかについて実験を行なった。免疫ブロット分析を行なった結果、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）はニューロンと比べてかなり低いレベルでＣＲＭＰ２Ｂを内在的に発現し、同定されていないＣＲＭＰにおいてはかすかなレベルで発現し、ＣＲＭＰ２Ａにおいては検知可能なレベルでは発現しないことが示された（データに示されていない）。本発明者は、ＣＥＦにおけるＣＲＭＰ２Ａ又は２Ｂの過剰発現が、対照的な形態的変化を誘導することを発見した。ＣＲＭＰ２Ａ過剰発現細胞は細くなり、しばしば神経突起に似た細長い形に変形した。それに対し、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を発現する対照細胞と比較して、ＣＲＭＰ２Ｂ過剰発現細胞は、多様な末梢形態を持つ平らな形になった（図４Ａ）。
【００３４】
また、ＣＲＭＰ２Ａ又は２Ｂを過剰発現するＣＥＦにおけるＭＴ配列も、著明に影響を受けた。ＣＲＭＰ２Ａ過剰発現細胞におけるＭＴはかなりの配向化を見せ、それに対し、ＣＲＭＰ２Ｂ過剰発現細胞におけるＭＴは、大量の短いＭＴ断片の生産を伴い、ランダムにパターン化され、ＭＴにメッシュ状の外観を生じさせた（図４Ａ及び４Ｂ）。他方において、神経芽細胞腫細胞を用いた他のグループの研究と一致して、Ｆ−アクチンの全体的な構成は、影響を受けていないように思われた（図１１）（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　（２０００）　１７９１７−１７９２０．）。
次に、本発明者らはＣＲＭＰ２Ａ及びＢが共存する細胞におけるＭＴのパターンについて研究を行なった。親ＣＥＦを、ウィルス性ＬＴＲによって発現されるＣＲＭＰ２Ａをコードする複製可能型レトロウィルスと前もって感染させ、配向化したＭＴパターンを確立した。強力なＣＭＶプロモーターで制御される形で、ＤＮＡコンストラクトとトランスフェクションを行なうことによってＣＲＭＰ２Ｂを過剰発現させるとＭＴ断片の生成を伴う、ランダム化したＭＴパターンが誘導された（図４Ｂ及び図１２）。それに比べて、ランダム化したＭＴパターンを最初に確立したＣＲＭＰ２Ｂ発現細胞において、ＣＲＭＰ２Ａを過剰発現させるとＭＴの再配向化を誘導した。これらのデータは、ＣＲＭＰ２Ａ及び２Ｂが共発現細胞においても対照的にＭＴパターンを制御し、過剰発現上のＣＲＭＰがその対照的なの作用を逆転させることができることを示している。
【００３５】
さらに、本発明者らは、ＦＬＡＧエピトープで標識したＮ末端のみで構成される、切断した形式のＣＲＭＰ２Ａの作用についても研究を行なった（２Ａ−Ｎ；図６Ａを参照のこと）。ＣＲＭＰ２Ａ発現細胞中で２Ａ−Ｎを過剰発現させると、ＭＴの配向化に関しては野生型細胞に似たＭＴパターンを誘導し、野生型細胞中で過剰発現させると、ＭＴパターンの誘導においてほとんど変化が無かった。しかし、いずれにしても、細胞の形が野生型のものに比べてはっきり区別できるようになり、ＣＲＭＰ２Ｂ過剰発現細胞の形にむしろ類似した（図４Ａ及び４Ｂ、ならびに補足図Ｓ４）。ＣＲＭＰ２Ａ発現細胞のＭＴパターンにおける表現型レスキューに基づき、本発明者らは２Ａ−ＮはＣＲＭＰ２Ａのドミナント−ネガティブ形式であると考えた。
【００３６】
（成長円錐におけるＣＲＭＰ２Ａの動的挙動イメージング）
次に、本発明者らは、成長円錐におけるＣＲＭＰの動的特性を視覚化し、それらを細胞骨格の再構成と関連づけることを試みた。完全長ＣＲＭＰ２Ａ又は２ＢをＣＦＰと融合させたキメラタンパク質のいくつかの形の機能的完全性について、繊維芽細胞評価アッセイシステムを用いて調べた。Ｎ末端可変領域及びＣ末端コア領域の間にＣＦＰが挿入されているＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰのみが、野生型ＣＲＭＰ２Ａに相当する作用を有し、それに対し、同じデザインのＣＲＭＰ２Ｂ−ＣＦＰ及びＮ末端又はＣ末端がＣＦＰに融合したＣＲＭＰ２Ａ及び２Ｂの全てが原作用を失った。
【００３７】
網膜移植片をＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰ及びβ−チューブリン−ＹＦＰ、又はＹＦＰ−アクチンをコードする発現コンストラクトを用いてエレクトロポレーションを行い、細胞外マトリックス混合物の基質上に培養した。網膜軸索は、現存する軸索に沿って伸長する傾向があり、束状化のため、又は軸索−軸索交叉点で異なる軸索を避けるため、しばしば方向転換する決定をする。そのため、他の軸索と接触したＲＧＣ軸索の成長円錐における蛍光タンパク質の局在化を微速度でイメージングした（ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰ及びβ−チューブリン−ＹＦＰの組み合わせについては６０の成長円錐及び８方向転換、ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰ及びＹＦＰ−アクチンの組み合わせについては４０の成長円錐及び５方向転換を観察した）。まず、本発明者らは、生存成長円錐におけるＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰの分布が、固定された試料におけるＣＲＭＰの分布とは若干異なることに注目した。おそらくは、成長円錐ＭＴの不安定性及び／又はＣＲＭＰ−ＭＴ相互作用の固定に対する不安定性によるものと思われる（図５Ａと図３Ｂとの比較）。
【００３８】
ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰシグナルの多くがβ−チューブリン−ＹＦＰを組み込んだＭＴと会合し、しばしばクラスターを形成したが、いつも明瞭な斑点が発生する訳ではなかった。これらのクラスターは、プラス端付近にあるＭＴの断片や、成長円錐運動の間中に末梢に蓄積したＭＴ（又はチューブリン）と一致した（図５Ａ、矢頭）。ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰの全体的な局在化は、ＹＦＰ−アクチンのそれとは完全には適合しなかったが、ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰクラスターは、ＹＦＰ−アクチンが蓄積する部位においても局在化した。方向転換の間、成長円錐は、アクチンが最も蓄積した部位に向かって移動方向を変え（Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１２３，（１９９３）　９３５−９４８．）、ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰクラスター（図５Ｂ、矢頭）は、将来の成長方向（上方向）に向かって移動するアクチンの活性が高い箇所と常に一致していた。そのため、ＣＲＭＰクラスターは、成長円錐内でＭＴ及びＦ−アクチンが動的に相互作用した部位に優先的に局在化したように見受けられた（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２１，　（２００１）　９７５７−９７６９．）。
【００３９】
（網膜視蓋マップ形成におけるＣＲＭＰ２Ａのドミナント−ネガティブ形式の効果）
最後に、本発明者らは、ＣＲＭＰ２Ａ及び２Ｂのインビボにおける機能について研究するため、複製可能型レトロウィルスベクターを用いて、ＲＧＣにおける様々な構成物を過剰発現させることでニワトリ網膜視蓋システムの発達におけるそれらの役割について研究した（図６Ａ）。卵内のＤＮＡエレクトロポレーション又は組換え型レトロウィルスの注入のいずれかの方法により、胎生１．５日目の胚の眼原基領域内に発現構成物を導入し、その両方が胎生１０日目までには、網膜における広いウィルス感染を同様のレベルで生じさせた（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　５１，　（１９９６）　１８５−２１８．；　Ｎａｔｕｒｅ　３８２，　（１９９６）　６３２−６３５．；　Ｄｅｖ．　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．４１，　（１９９９）　５９−７２．）。本発明者は完全長ＣＲＭＰ２Ａ（ｎ＝１７）又は２Ｂ（ｎ＝１３）を過剰発現させようと試みたが、いくつかの発達段階での観察の結果、網膜軸索突起パターンに有意な表現型が見られなかった。
【００４０】
これはおそらく、内因性ＣＲＭＰの発現レベルと比較してＬＴＲプロモーターによって行なわれた強制的な発現が比較的低いレベルであったためだと考えられる（データには示されていない）。その後、本発明者らはＧＦＰ（２Ａ−Ｎ−ＧＦＰ及び２Ｂ−Ｎ−ＧＦＰ）と融合したＮ末端可変領域から成る、切断された形のＣＲＭＰ２Ａ又は２Ｂの作用について研究を行なった（図６）。ＧＦＰ（ｎ＝１０）を用いてエレクトロポレーションを行なった対照網膜の場合のように、２Ｂ−Ｎ−ＧＦＰ（ｎ＝９）を用いてエレクトロポレーションを行なった胎生１０日目の網膜では、ＧＦＰ標識軸索が求心的に伸長し、その大部分が眼杯裂に達し、中心領域で見つかった成長円錐はほとんどなかった（図６Ｂ、ａ、ｂ及びｄ）。２Ａ−Ｎ−ＧＦＰでエレクトロポレーションを行なった網膜（ｎ＝１３）においては、標識した軸索の多くが正常な挙動を示したが、しかし、かなりの割合の軸索が眼杯裂に到達せず、成長円錐は網膜の広い範囲にとどまった（図６Ｂ、ｃ）。
【００４１】
視蓋中でＣＲＭＰ２Ａ（２Ａ−Ｎ）のドミナント−ネガティブ体を発現するＲＧＣの軸索突起を明確に視覚化するため、本発明者らは、ＧＡＰ−４３の膜固定領域を含む軸索トレーサーである、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）及びＧＡＰ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードする配列から成る発現カセット（ＩＧＧ）を用いた（図６Ａ）（Ｎａｔ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　３，　（２０００）　６８７−６９３．）。免疫組織化学分析を行なった結果、２Ａ−Ｎ−ＩＧＧウィルスに感染した網膜中で２Ａ−Ｎ及びＧＡＰ−ＧＦＰシグナルが同時に存在することが確認され、両者は、２つのシストロン伝達暗号から翻訳されている（データには示されていない）。対照ＩＧＧウィルスに感染させた胎生１０日目の胚においてＧＦＰ標識網膜軸索は、視蓋内の尾側の先端に向かって、比較的まっすぐ伸長した（ｎ＝５）（図６Ｃ、ａ及びｂ）。それに対して、２Ａ−Ｎ−ＩＧＧウィルスに感染した胚においては軌道が波状になり、多くの成長円錐がまだ吻側の先端付近に残った（ｎ＝７）（図６Ｃ、ｃ）。
【００４２】
しかしながら、胎生１２〜１４日目において、２Ａ−Ｎ−発現軸索は、見たところは視蓋に正常に投射し（ｎ＝１６）、投射パターンの発達の遅れを示唆した。胎生１５〜１６日目の２Ａ−Ｎ−ＩＧＧウィルスに感染した胚においては、対照胚（ｎ＝５）の場合と比較して、視蓋に向かって投射した網膜軸索のＧＦＰシグナルがほとんど検知できないレベルにまで著しく減少した（ｎ＝１２）（図６Ｃ、ｄ及びｅ）。１Ａ−Ｎ−ＩＧＧウィルスに感染させた胚（胎生１０日目、ｎ＝４；胎生１５〜１６日目、ｎ＝５）においても投射における同様の表現型を観察したが（データには示されていない）、しかし、２Ｂ−Ｎ−ＧＦＰ発現胚（胎生１５〜１６日目、ｎ＝４）においては観察できなかった（図１３）。さらに、本発明者らは胎生１４日目では、野生型軸索について記載したように、２Ａ−Ｎを発現したＲＧＣのＧＡＰ−ＧＦＰ標識軸索が視蓋の内部に侵入し、多数の軸索が既に網膜からの入力を受けるＡ／Ｂ（将来のＢ）やＳＧＦＳ（ｓｔｒａｔｕｍ　ｇｒｉｓｅｕｍ　ｅｔ　ｆｉｂｒｏｓｕｍ　ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｅ）のＤにさえ到達することを確認した（図６Ｄ）（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２１，　（１９９５）　１８９−２００．）。これらの観察により、２Ａ−Ｎを発現するＲＧＣの軸索は、視蓋中で粗い投射地図を一時的に形成することができるが、胎生１５〜１６日目には除去される可能性を提起した。
【００４３】
上記の可能性について確認するため、本発明者らは親油性の蛍光色素であるＤｉＩを用いて背側網膜を順行性に標識し、胎生１３〜１６日目の間に発達する網膜軸索神経地図について、単一軸索レベルでさらに分析を行なった。これらの実験において、本発明者らは２Ａ−Ｎだけをコードするウィルスの高力価株に網膜を感染させた（図６Ａ）。こうした株では、網膜への感染は通常普通に７０〜９５％の値に達する。ＡＰ−ウィルスに感染させた胎生１３〜１４日目の対照胚においては、未発達の投射を形成した。つまり、標識背側軸索の多くが、腹側（側面）視蓋中にある組織分布的に適当な標的領域を越え、正確な位置及び不正確な位置である側枝（ｎ＝１７）を形成したわけであり、これは網膜視蓋神経地図の通常発達についての記載と一致している（図７Ａ、７Ｄ及び７Ｆ）（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　９，　（１９８９）　３７７６−３７９５．）。同じ段階にある２Ａ−Ｎウィルスに感染した胚においては、対照胚と同様に、標識軸索軌道の大部分は網膜内の眼杯裂に達し、眼杯裂を越え、か又は正確に侵入することに失敗したのは少数だった（ｎ＝１８）（図７Ｂ及び７Ｃ）。
【００４４】
しかしながら、視蓋の中の突起パターンは、その対照物のものと比べて区別できないようであった（図７Ｅ及び７Ｇ）。この時期において、本発明者らは、対照胚の場合と同様に２Ａ−Ｎ発現胚においてもＤｉＩ標識網膜軸索の小規模な退化を時折観察したが、それは生理学的精製過程において不適切な枝、分枝、軸索シャフトを除去するための段階に相当すると思われる。というのは、ほとんどの場合において、これらの表現型を識別することができなかったためである（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　９，　（１９８９），　３７７６−３７９５．）。以上のことから、２Ａ−Ｎレトロウィルスを過剰発現させると、網膜軸索の伸長及び誘導の効率性や精度に影響を与えたが、ほとんどの軸索は、ほぼ正常な神経地図を形成した。
【００４５】
視神経投射地図は、胎生１５〜１６日目の頃にはほとんど成熟したものとみなされ（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　９，　（１９８９）　３７７６−３７９５．）、対照胚においては、腹側視蓋中の組織特異的に適切な位置で前シナプス性の樹枝状部を形成し、完成された投射パターンが認められた（ｎ＝１５）（図８Ａ、８Ｃ及び８Ｆ）。それに対し、２Ａ−Ｎウィルスに感染したほとんどの胚においては、標識軸索の大部分が視蓋及び網膜の両方において破壊され、これによりＧＦＰを標識化する方法に基づいた観察が確認された（２０胚中１８胚）（図８Ｂ、８Ｄ、８Ｅ、８Ｇ及び８Ｈ）。胎生１５日目では、軸索分解のレベルに表現型可変性があることに注目した。つまり、より兆候の弱いいくつかの胚においては、視蓋中で断片化した軸索及び明らかに普通の軸索のモザイクが観察され、また、網膜中では普通の軸索が観察された。よりひどい場合においては、視蓋中にＤｉＩシグナルは認められず、網膜中のＤｉＩ標識軸索の破片のみが残った。従って、これらの結果は、神経地図作成の完成が近い、胎生１４〜１５日目の間という、むしろ短時間で２Ａ−Ｎ−発現軸索の突起の分裂が起こることを示した（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　９，　（１９８９）　３７７６−３７９５．）。一時的であるにもかかわらず、ほとんどの２Ａ−Ｎ発現軸索が視蓋に投射することができるため、２Ａ−Ｎが網膜軸索に対して非特異的毒作用を示したとは考えにくい。
【００４６】
［ＣＲＭＰ機能の考察］
（成長円錐舵取りにおけるＣＲＭＰの役割）
ＣＲＭＰ６２の最初の同定以来、セマフォリン誘導成長円錐の崩壊におけるシグナルメディエータの有力候補として、ＣＲＭＰは注目されて来た（Ｎａｔｕｒｅ　３７６（１９９５）　５０９−５１４．）。その後の研究により、ＣＲＭＰは進化においてよく保存され、セマフォリンに対して非感受性のニューロンを含む発達神経系統において広く発現することが分かり、ＣＲＭＰが成長円錐シグナリングにおける一般的で不可欠な細胞内の構成要素であるという提言を導いた（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　４１，　（１９９９）１５８−１６４．）。それらの完全な機能は理解し難かったが、これまでの研究は、ＣＲＭＰの役割がＭＴパターンの調整に関係していることを示している。注目すべき一例として、Ｕｎｃ−３３の機能喪失線虫変異株は、ニューロン中のＭＴの構成において異常を示した（Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　１１１，　（１９８５）　１５８−１７０．）。しかしながら、ＣＲＭＰには明白なＭＴ結合領域が無いことを主な理由として、ＣＲＭＰは簡単にＭＡＰとはみなされていない。従って、ＭＴパターンの構成におけるそれらの機能には、いくらかあいまいさがあった。
【００４７】
本論文では、脊椎動物に保存されたゲノム構成により、ＣＲＭＰ１〜４の新たなＮ末端変異体であるＣＲＭＰ−Ａについて報告し、最初に特徴付けたアイソフォームをＣＲＭＰ−Ｂと改名した。ＣＲＭＰアイソフォームの両タイプが、成長円錐内のＦ−アクチン及びＭＴと部分的に共局在し、インビトロでＭＴと結合しており、これはＣＲＭＰが、タウタンパク質等の典型的なＭＡＰの特性とは識別可能な特性を持つＭＴ結合タンパク質であることを示唆している（例えば、図３Ｄを参照のこと）。さらに、繊維芽細胞中のＣＲＭＰ２Ａ及び２Ｂを過剰発現させると、それぞれが、配向化及びランダム化したＭＴパターンを誘導し、明らかにアクチンの全体的な構成に影響を与えなかった。ＣＲＭＰ２Ａ及び２Ｂはそれらの共存下で対照的にＭＴ配列を構成することができるため、誘導合図に応答する成長円錐において、これらＣＲＭＰの作用のバランスを制御する上流レギュレータが、もし存在するのであれば、ＭＴパターンが反対方向へ向かうように作用することができるであろう。
【００４８】
ＣＲＭＰが、ＭＴの再配列において教示的な役割を果たすかどうかを検討するため、本発明者らは、ＣＲＭＰ２Ａの分布を生存成長円錐中のアクチン及びＭＴの再配列と一緒にイメージングした。ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰはクラスターを形成し、それらの細胞内局在パターンは動的に変化したが、ＭＴ断片の部分や成長円錐方向転換の間に局所的に蓄積したアクチンに同時に存在し続けた。方向づけた軸索の成長及び分枝化にとって、Ｆ−アクチン及びＭＴの間の親密で動的な相互作用は、不可欠であることが分かった（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２１，　（２００１）　９７５７−９７６９．）。従って、Ｆ−アクチンとＭＴの相互作用が生じる部位で局在化するＣＲＭＰ２Ａクラスターは、ＭＴを将来の成長の将来方向へと誘導する可能性がある。ＣＲＭＰ２Ａ、１Ａ及びＢは、成長円錐細胞骨格の場合と似た共局在パターンを示したため、ＣＲＭＰ−Ａ及びＢは、ＭＴの再配列を協調的に方向づけているものと思われる。最近、ＣＲＭＰ２Ｂは、チューブリン二量体及びＭＴに直接結合し、インビトロでＭＴのアセンブリーを誘導する作用を有することが分かった（Ｎ．　Ｉｎａｇａｋｉ　ａｎｄ　Ｋ．　Ｋａｉｂｕｃｈｉ、私信）。アクチン蓄積部位に局在するＣＲＭＰクラスターが、ＭＴの重合の基礎としても作用することが考えられる。
【００４９】
（発達中の細胞極性の確立におけるＣＲＭＰの役割）
ＭＴは、樹状突起においてはランダムにパターン化され、それに対し、軸索においては終端にプラス端とが向いている（Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１７，　（１９９４）　２６７−３１０．）。ニワトリ発達ニューロンを免疫染色すると、樹状突起においてはほとんどＣＲＭＰ−Ｂのみが存在し、軸索においてはＣＲＭＰ−Ａ及びＢが共存することが分かった。さらに、繊維芽細胞においては、ＣＲＭＰ２Ｂだけを過剰発現させるとランダム化したＭＴパターンを誘導し、それに対し、ＣＲＭＰ２Ａを過剰発現させると、ＣＲＭＰ２Ｂが存在下でも配向化したＭＴパターンを誘導することができた。従って、ニューロンの中のＭＴパターンは、ＭＴ構成を制御するために、ＣＲＭＰの局在化及びその活動と関連していると考えられる。ＣＲＭＰ−Ａ及びＢは、軸索の伸長の前でも、分裂後のニューロンにおいて既に高レベルで発現しているため（Ｊ．　Ｃｏｍｐ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　３５５，　（１９９５）　３６９−３７９．）、ＣＲＭＰは、ＭＴパターンを構成することにより、ニューロンの極性の確立における重要な役割を担っていると考えられる。
【００５０】
最近の研究により、ＣＲＭＰ２Ｂを過剰発現させると、ラット海馬ニューロン中の樹状突起からの軸索形成を伴う、無軌道の複数の軸索形成を誘導することが分かった（Ｎａｔ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　４，　（２００１）　７８１−７８２．）。表現型についての説明のひとつとして、ＣＲＭＰ２Ｂは、細胞体及び樹状突起中でＭＴの激しいランダム化を誘導し、その後ＣＲＭＰ２Ａの異常分布及びその樹状突起への輸送を誘発し、無軌道の軸索生成に導くことが挙げられる。いずれにしても、ＣＲＭＰ−Ａ及びＢの間の量的及び／又は質的なバランスは、ニューロン形態の確立に貢献しているものと思われる。
これらのルールは、一般的に細胞極性発達の基礎となる共通機構にさらに拡大する可能性がある。ＣＲＭＰは当初、発達中の神経系においてのみ発現すると報告されていたが、その後の分析により、ニューロンの場合に比べてより低いレベルではあるが、ＣＲＭＰが多くの非神経組織においても発現することが明らかになった。
【００５１】
本発明者らは、繊維芽細胞以外にも、ニワトリ胚内の各種上皮細胞やＭＤＣＫ細胞（モデル上皮細胞株）が、ＣＲＭＰ−Ａ及びＢを発現することを発見した。最も注目すべきなのは、ＣＲＭＰ２Ａ及びＣＲＭＰ−Ｂが、神経管が閉じる前の神経上皮細胞において、有意なレベルで発現することである（Ｍｏｌ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　５７，　（１９９８）　２０１−２１０．；　Ｊ．　Ｙ．−Ｋ．　ａｎｄ　Ｍ．　Ｎ．、未発表の観察）。神経板が神経管を形成するために上に湾曲すると、神経上皮細胞に動的な細胞骨格の再構成が生じるが、その間に、ＣＲＭＰ２Ａの発現がレベルが上昇する間に、ＣＲＭＰ２Ａを過剰発現する繊維芽細胞と同じように、細胞の伸長に貢献するものであると予想されてきた近軸のＭＴを形成すると共に細くなって伸長した（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０９，　（１９９０）　２４３−２７０．）。神経上皮細胞の形態形成の基礎となる詳細な分子機構についてはよく分かっていないが、ＣＲＭＰ２Ａ及びＣＲＭＰ−Ｂも、ＭＴを再構成することでこれらの過程に関与している可能性がある。従って、本発明者は、ＣＲＭＰが、成長円錐舵取りの場合と同様に、細胞分極においても利用される、ＭＴガイド機構の分子構成物であると推定する。
【００５２】
（神経回路の精製におけるＣＲＭＰ−Ａの役割）
ＲＧＣ中でＣＲＭＰ２Ａがドミナント−ネガティブ形式で過剰発現すると、網膜視蓋マップの確立において特筆すべき表現型が生じた。つまり、おおまかに作成したマップを非常に正確な領域特異的の成熟パターンに微調整する際に、２Ａ−Ｎ−発現ＲＧＣ軸索は、極短期間（胎生１４〜１５日目）で破壊されたのである（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　９，　（１９８９）　３７７６−３７９５．；　Ｄｅｖ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　１１７，　（１９９９）　１９９−２１１．）。この知見により、成長円錐の舵取りにおける場合と同様にニューロン結合性の精密化においても、ＣＲＭＰ２Ａが不可欠な役割を演じているのがわかった。しかし、２Ａ−Ｎの過剰発現によって一見正常な投射が破壊される機構は、現在のところ不明である。２Ａ−Ｎ発現軸索突起の異常は、これまで報告のあった、網膜及び／又は視蓋における領域特異的に発現する分子群の異所性発現に起因する表現型とは異なっている。そうした表現型においては、マップの作成が完了した後でも、投射の異常は続いていた（例えば、Ｎａｔｕｒｅ　３８２，　（１９９６）　６３２−６３５．；　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９３，　（２００１）　１１１−１１５．を参照のこと）。したがって、投射地図破壊が、異なる場所へ軸索突起が投射したことだけに起因するものだとは考えにくい。
【００５３】
最近、周知のナトリウムチャネル遮断薬であるテトロドキシンを眼内注入すると、２Ａ−Ｎ−発現軸索の分解が防止されるという結果が本発明者らによって得られた。それらは完全ではないにしてもかなり成熟したシナプス前分枝を、視蓋中の適切と見受けられる位置に形成しており、それらはＡＰウィルス感染コントロール胚におけるものと類似していた（Ｊ．　Ｙ．−Ｋ．　ａｎｄ　Ｍ．　Ｎ．未公開データ）。このことから、軸索の分解はニューロンの活動に左右されること、マップ精密化のプロセスがニューロンの活動及びＣＲＭＰ２Ａに依存性又は非依存性の機構からなることが示唆される。自発的ニューロンの活動の波は、胎生１３−１８日目に網膜のＲＧＣ層で生じることが知られており、網膜部位マップの形成に関与している（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１８，　（１９９８）　８８３９−８８５２．）ため、及び、２Ａ−Ｎ−発現ＲＧＣ軸索が一時的にシナプス分枝を形成できるため、こうした軸索がシナプス後視蓋ニューロンをその興奮後に刺激して、逆に、シナプス強度を調節するため及び／又は軸索の再構築や生存を導くために、退化シグナルを受け取ることになった、ということが考えられる。
【００５４】
成長円錐の舵取り及び細胞分極についての本発明者らのデータから推測すると、ＣＲＭＰ２Ａは、ＭＴパターンの再構成を介して適切な逆行性シグナルを受容する部位において、前シナプス前構造物を選択的に安定化すると思われ、そのプロセスも一種の細胞極性化と考えられる。２Ａ−Ｎの過剰発現は内在性ＣＲＭＰ２Ａの機能を混乱させ、それにより、シナプス前構造物の適切な構造的機能的改変を目的としたそれらへの逆行性シグナルの伝達ができなくなり、最終的に網膜軸索が分解する場合ことが考えられる。さらに、ニューロンの活動の遮断によって２Ａ−Ｎ発現軸索の分解を阻止することは、これらの軸索が、活性依存的に受容した逆行性シグナルを「分解シグナル」と読み間違えたということさえ暗示している。しかし、もちろん、付近の軸索間の競合に基づく他の機構が関与している可能性もある（Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２２，　（１９９９）　３８９−４４２．）。
総合的に考えて、ＣＲＭＰがＭＴパターンを構成する分子機構は、個体発生論における動的形態形成の主要な原動力の一つであり、神経回路網の形成及び最終的には並外れて精密な神経結合性を実現するのに広く利用されることが、本発明者らの結果により示唆される。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実験手法］
（動物）
ホワイトレグホンの卵を地元業者から入手して３７．５℃でインキュベーションし、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ　ａｎｄ　Ｈａｍｉｌｔｏｎ　（Ｊ．　Ｍｏｒｐｈｏｌ．　１９５１）らの方法に基づいて発生段階を決定した。
【００５６】
（ニワトリＣＲＭＰのｃＤＮＡクローニング）
胎生８日目の網膜中で鼻側頭軸及び／又は背腹軸に沿って非対称的に分布した分子の大規模ＲＬＣＳスクリーニング（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｌａｎｄｍａｒｋ　ｃＤＮＡ　ｓｃａｎｎｉｎｇ）において、ＣＲＭＰ３Ａを最初に同定した（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２４，　（１９９６）　２８９−２９４．；　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９３，　（２００１）　１１１−１１５．）。続いて、ハイブリダイゼーションプローブとしてＣＲＭＰ３Ａを用いた胎生８日目の網膜ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、ＣＲＭＰ１〜４の他のＡ型又はＢ型アイソフォームをコードするｃＤＮＡを単離し、両方の鎖の配列をＰＲＩＳＭ　３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。
【００５７】
（マウスＣＲＭＰ１遺伝子のゲノム分析）
ニワトリＣＲＭＰ３Ａ及び３Ｂと相互作用するタンパク質を同定するため、胎生１７日目のマウス胚ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の酵母二重ハイブリッドスクリーニングを行った（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　（２０００）　３７９５７−３７９６５．）。相互会合により、ＣＲＭＰをコードする多くのｃＤＮＡを単離した。その中には、ＣＲＭＰ１Ａ及び４Ａのマウス相同分子種も含まれていた。マウスＣＲＭＰ１Ａの５’−領域（ヌクレオチド残基−２０５〜＋５７３）をカバーするｃＤＮＡ断片を、ゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）スクリーニングのプローブとして使用した。ＣＲＭＰ１Ａ及び１Ｂの最初のコーディングエキソンをともに含む陽性クローンをＤＮＡ塩基配列決定分析（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）にかけた。ｃＤＮＡ及びゲノム断片の配列の位置を調節し、ニワトリＣＲＭＰ１Ａのアミノ酸配列と比較して、エキソン１Ａにある開始コドンを同定した。しかし、転写開始部位は決定されなかった。
【００５８】
（抗ＣＲＭＰ抗体）
ニワトリＣＲＭＰ１Ａの残基１〜１３（ＭＡＥＲＫＲＮＷＮＫＥＤＤ）、ＣＲＭＰ２Ａの残基１〜１５（ＭＡＥＫＫＱＳＧＲＱＧＥＥＥＥ）、ＣＲＭＰ１Ｂ／２Ｂ／４Ｂの残基１〜１７（ＭＳＹＱＧＫＫＮＩＰＲＩＴＳＤＲＬ）、及びＣＲＭＰ３Ｂの残基３０〜４８（ＳＦＹＡＤＩＹＶＥＤＧＬＩＫＱＩＧＥＮ）に相当する合成ペプチド（Ｓａｗａｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で免疫して、ウサギの体内で抗血清を作り上げた。作製したポリクローナル抗体は、それぞれ抗ＣＲＭＰ１Ａ抗体、抗ＣＲＭＰ２Ａ抗体、＃Ｎ１７、及び＃３０〜４８と称され、アフィニティー精製が行われた。Ｎ末端領域における他のＣＲＭＰ−Ｂとは実質的に異なるニワトリＣＲＭＰ３Ｂは、＃Ｎ１７によって認識されないことが本発明者により確認された。＃３０〜４８は両タイプのＣＲＭＰ１〜４に反応した。これは、その抗原性配列がＣＲＭＰ１〜４の間でよく保存されているからである（図１Ｄ及び補足図Ｓ１）。＃Ｎ１７及び＃３０〜４８をそれぞれ抗全ＣＲＭＰ−Ｂ抗体及び抗全ＣＲＭＰ抗体として使用した。マウス抗ＣＲＭＰ２モノクローナル抗体であるＣ４Ｇは、Ｙａｓｕｏ　Ｉｈａｒａ氏及びＹｏｎｇｊｕｎ　Ｇｕ氏より供与して頂いた。
【００５９】
（細胞培養）
胎生６日目のニワトリ胚から神経網膜を単離し、トリプシンで消化し、ガラス表面を前もってポリ−Ｌ−リジン及びラミニンでコーティングしたガラス底の皿（Ｉｗａｋｉ社製）に置いた。１０％のウシ胎仔血清及び２％のニワトリ血清を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地でニューロンを１〜２日培養した。免疫染色のため、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）及び０．３Ｍのスクロースを添加したＰＢＳを直接添加して、ニューロンを室温で固定した。
ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を胎生１０日目の胚の胴体から調製し、文献（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　５１，　（１９９６）　１８５−２１８．）の通りに継代した。
【００６０】
（繊維芽細胞を用いた形態学的分析）
ＣＲＭＰ２Ａ、２Ｂ、２Ａ−Ｎ及びＡＰをコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びトリ複製可能型レトロウィルスベクターのＲＣＡＳＢＰ（Ｂ）にサブクローンした（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６１，　（１９８７）　３００４−３０１２．；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　５１，　（１９９６）　１８５−２１８．）。試薬を加えたリポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＣＥＦを一過性トランスフェクションした。トランスフェクションの３６時間後、メタノール又は４％のＰＦＡでＣＥＦを固定し、免疫蛍光法を行った。
【００６１】
（免疫蛍光法）
胎生１０日目の胚の眼球を４％のＰＦＡで固定し、水平方向の凍結切片にした。０．１％のトリトンＸ−１００を含むＰＢＳを用いてかかる切片を透過性にし、遮断液（５％のスキムミルクを含むＰＢＳ）、一次抗体（抗ＣＲＭＰウサギ抗血清及びマウス抗ＭＡＰ２モノクローナル抗体（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ社製））並びにＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４標識抗ウサギ二次抗体及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識抗マウス二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）で続けてインキュベーションした。＃Ｎ１７で免疫染色するため、エピトープのアンマスキングには、染色反応前にクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ６．０；ＤＡＫＯ社製）中でマイクロ波を照射する必要があった。
【００６２】
ＣＲＭＰ、アクチン及びＭＴを用いて、網膜移植片培養物を三重に標識した。ＭＴを視覚化するための一次抗体は、抗βチューブリン抗体（ＴＵＢ２．１；　Ｓｉｇｍａ社製）又は抗βチューブリン抗体（ＹＬ１／２；　Ｈａｒｌａｎ　Ｓｅｒａ−Ｌａｂ社製）だった。これら２つの抗体は、網膜成長円錐及びＣＥＦにおいて、まったく同一のＭＴパターンを染色しており、そのため、本研究において同様に使用された。アクチンフィラメントをＡｌｅｘａ　４８８標識ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）で、又はマウス抗アクチンモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製；マイクロ波照射後、ファロイジンはＦ−アクチンに結合しない）で標識した。視覚化のため、かかる移植片をＡｌｅｘａ　５４６、Ａｌｅｘａ　４８８、及びＡｌｅｘａ　６３３標識抗ＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）でインキュベーションした。ＡＰ（マウス抗ＡＰモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）入り）、ＣＲＭＰ、又はＦＬＡＧタグ（マウス抗ＦＬＡＧ　Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）入り）、及びＭＴ又はアクチンで、ＣＥＦを標識した。視覚化のため、Ａｌｅｘａ　５９４、Ａｌｅｘａ　４８８標識抗ＩｇＧ二次抗体又はＡｌｅｘａ　４８８標識ファロイジンを使用した。Ｑ５５０ＦＷ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ社製）で、蛍光イメージを得た。
【００６３】
（ＭＴペレット形成分析：ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ　ａｓｓａｙ）
胎生１８〜２０日目のニワトリの全脳を、プロテアーゼ阻害剤及び２００ｎＭのオカダ酸を添加したＰＥＭ緩衝液（１００ｍＭのＫ−ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．８）、２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＧＴＰ）中でホモジナイズし、１００，０００×ｇで３０分間超遠心分離した後、その上澄液を回収した。ＣＲＭＰのＭＴに対する会合が、イオン強度に高い感受性を有することに気付いた。かかる上澄液に２０μＭのサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、１０μＭのタキソール（Ｓｉｇｍａ社製）の存在下あるいは非存在下において３７℃で３０分間インキュベーションし、その後１０μＭのタキソールを添加したＰＥＭ緩衝液中で、等量の１５％のスクロース緩衝液上に層化し、上記のとおり遠心分離した。同量の上澄液とペレット断片をイムノブロット分析にかけた。
【００６４】
［ＣＲＭＰ動態のライブイメージング］
（ＣＲＭＰ２Ａ―ＣＦＰコンストラクト）
鋳型としてＣＲＭＰ２Ａの完全長ｃＤＮＡを使用し、制限部位を含む特異的プライマーを用いたＰＣＲで、ＣＲＭＰ２ＡのＣ末端領域（ＣＲＭＰ２−Ｃ；１１８〜６７６アミノ酸残基）をコードするｃＤＮＡ断片を増幅して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ誘導体のＳＬＡＸ１５にサブクローンした。その後ｐＥＣＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から増幅したＥＣＦＰｃＤＮＡをサブクローンしたＣＲＭＰ２−Ｃのインフレーム上流に挿入した。続いて、ＣＲＭＰ２ＡのＮ末端領域（ＣＲＭＰ２Ａ−Ｎ；１〜１１７残基）をコードする、ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡをＥＣＦＰ−［ＣＲＭＰ２−Ｃ］のインフレーム上流に挿入し、ＳＬＡＸ１５中でＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰを作製した。配列の同一性を確認した後、ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰ　ＤＮＡ断片をＭｉｗに挿入した（Ｄｅｖ．　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．　４１，　（１９９９）　５９−７２．）。
【００６５】
（エレクトロポレーション及び微速度イメージング）
胎生６日目のニワトリ胚の神経網膜を文献（Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　９５，　（１９８３）　５６−６４．）記載の通りに調製した。かかる網膜を、コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ社製）でコーティングした黒のニトロセルロースフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）上に平らに広げた。小さな改良は施したものの基本的には文献（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　１２９，　（２００２）　８３−９３．）記載の通りに、エレクトロポレーションを行った。すなわち、５平方ｍｍの陽極を埋め込んだペトリ皿にのりづけしたシリコンゴムのディスク上にかかる網膜を載せた。Ｃａ２＋及びＭｇ２＋（〜５０μｌ）を含んだハンクス緩衝液で稀釈した０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液をかかる網膜上にオーバーレイし、同サイズの陰極を陽極の上に設置した。ＣＵＹ２１　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｎｅｐａ　Ｇｅｎｅ社製）を用いて、２０ボルトで５０ミリ秒のＤＣパルスを５回行った。使用した発現コンストラクトはＭｉｗ中のＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰ、ｐＹＦＰ−アクチン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びＭｉｗ中のβ−チューブリン−ＹＦＰであった。エレクトロポレーションを行った網膜を幅０．３ｍｍに切り刻み、ガラス表面をＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）でコーティングしたガラス底の皿（Ｉｗａｋｉ社製）に移した。
【００６６】
３６〜７２時間のインキュベーションの後、Ｑ５５０ＦＷイメージングシステムを備えたＬｅｉｃａ　ＤＭＩＲＥ２倒立蛍光顕微鏡（ＨＣＸ　ＰＬ　ＡＰＯ　１００×　１．４０　ＮＡ　ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ；　Ｌｅｉｃａ社製）を使用して、３５℃（成長円錐の運動性を低下させるため）でイメージング分析を行った。内在性ＣＲＭＰ２Ａの機能がＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰの過剰発現によって混乱する可能性を退けるため、及びその動的分布を視覚化するため、検知可能な最低限の蛍光を有する成長円錐を選択した。ニュートラル・デンシティ・フィルタを備えた冷却ＣＣＤカメラ（Ｃｏｏｌ　ＳＮＡＰ−ＨＱ、Ｒｏｐｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、１００〜４００ｍｓｅｃの露出で、生存軸索のビンド（２×２）イメージを２分ごとに連続的（ＣＦＰ、ＹＦＰ、及びＤＩＣ）に得た。網膜成長円錐が低酸素条件に感受性をもつことが判明したため、オキシラーゼ又は窒素ガス循環システムは使用できなかった。得られたイメージを、ＱＦｌｕｏｒｏ（Ｌｅｉｃａ社製）及びＰｈｏｔｏｓｈｏｐ　５．０（Ａｄｏｂｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）ソフトウェアで処理した。
【００６７】
（網膜視蓋のマッピング分析）
ＧＦＰ又はＦＬＡＧエピトープでＣ末端を標識したＣＲＭＰ２Ａ（２Ａ−Ｎ）及びＣＲＭＰ２Ｂ（２Ｂ−Ｎ；ＭＳＹＱＧＫＫＮＩＰＲＩＴ）欠失変異株を、ＲＣＡＳＢＰ（Ｂ）にサブクローンした。２Ａ−Ｎの下流にＩＧＧカセットを挿入したレトロウィルスプラスミドも作製した。ステージ８の胚の前脳に対して卵内でエレクトロポレーションを行った（Ｄｅｖ．　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．　４１，　（１９９９）　５９−７２．）。又は、ステージ１１の胚の眼胞にレトロウィルス株を注入した（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　５１，（１９９６）　１８５−２１８．）。ＧＦＰ標識の実験で、胚を適切な発生段階で取り出し、４％のＰＦＡで固定した。抗ＧＦＰポリクローナル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）での染色により、いくつかのサンプルではにおいてはそのＧＦＰシグナルが増させた、全載の網膜及び視蓋をＭＺ　ＦＬ　ＩＩＩ（Ｌｅｉｃａ社製）及び、ＳＭＺ１５００（Ｎｉｋｏｎ社製）ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ解剖顕微鏡、Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社製）、ＬＳＭ５１０走査型共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製）又はＱ５５０ＦＷシステムで観察した。網膜軸索突起の高感度追跡のため、ＤｉＩ　ｃｒｙｓｔａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）を胎生１２〜１５日目で背側網膜に載せ、網膜軸索の小数を標識した。さらに、最長２４時間のインキュベーションを行った後、網膜及び視蓋を移して固定し（胎生１３〜１６日目）、全載標本の写真を撮影した。
【００６８】
［図の説明］
図１．ＣＲＭＰアイソフォームの２つの型（参照；参考写真１）
（Ａ）ニワトリＣＲＭＰ−Ａ及びＢの概略図。青及び赤の部分は、それぞれＣＲＭＰ１〜４のＡ型及びＢ型アイソフォームのＮ末端可変領域を示し、白の部分は、両方で共有するＣ末端コア領域を示す。図の上にあるのは、Ｎ末端配列のアミノ酸残基番号である。（Ａ）及び（Ｂ）の矢頭は、可変領域とコア領域の結合部位を示す。
（Ｂ）ＣＲＭＰ−Ａの可変領域の配置（Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ　ｓｏｆｔｗａｒｅ）。コア領域も部分的に示されている。よく保存されているサブ領域に下線を引いてある。ニワトリＣＲＭＰ−Ｂの配置は、補足図Ｓ１に示す。
（Ｃ）マウスＣＲＭＰ１Ａ及び１Ｂの、第一タンパク質コーディングエキソン（エキソン１Ａ及びエキソン１Ｂ、長方形）を含む７．６ｋｂのＢａｍＨＩゲノム断片の概略的な制限地図。翻訳開始地点及び関連する制限部位が示されている。
（Ｄ）図示した各種抗ＣＲＭＰ抗体を使用した胎生１４日目のニワトリの脳のイムノブロットである。かかる抗体の多くは複数のバンドを検知しており、それはおそらくＣＲＭＰの多様なリン酸化型が存在するためと考えられる。
【００６９】
図２．胚の網膜におけるＣＲＭＰの分布パターン（参照；参考写真２）
Ｅ１０のニワトリ眼球の水平切片を各種抗ＣＲＭＰ抗体（赤；Ａ、Ｅ及びＩ）、及び抗ＭＡＰ２（緑；Ｄ及びＨ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で免疫染色し、細胞核を視覚化した（青；Ｂ、Ｆ及びＪ）。ＯＮＬは外部核層、ＯＰＬは外部網状層、ＩＮＬは内部核層、ＩＰＬは内部網状層、ＧＣＬは神経節細胞層、ＯＦＬは視神経繊維層である（イメージＤの右側に図示）。網膜のこの発生段階では、ＭＡＰ２シグナルはＧＣＬ中及びＩＰＬ内部に限定されている（Ｄ及びＨ）。（Ｃ）、（Ｇ）及び（Ｋ）は、組み合わせたイメージである。
（Ａ−Ｄ）抗ＣＲＭＰ２Ａ抗体による染色の様子を示す。ＣＲＭＰ２Ａ−免疫反応性は、大部分がＯＦＬに限定されており、ＧＣＬ及びＩＰＬにおいては、ごくわずかしか検出されなかった。（Ｅ−Ｈ）抗全ＣＲＭＰ−Ｂ抗体による染色した様子を示す。ＣＲＭＰ−Ｂが網膜全体に分布しており、これにより、ＣＲＭＰ−ＢがＲＧＣ軸索と樹状細胞の両方に存在していることが解った。
（Ｉ−Ｋ）抗ＣＲＭＰ２モノクローナル抗体による染色の様子を示す。かかる抗体は、ＣＲＭＰ２Ａ及び２Ｂのコア領域に局在する共通のエピトープに反応する。全体として、ＣＲＭＰ２Ａ／２Ｂは網膜全体に分布しており、これにより、ＣＲＭＰ２ＢがＲＧＣ軸索と樹状細胞の両方に存在していることがわかった。スケールバーは５０μｍである。
【００７０】
図３．成長円錐におけるＣＲＭＰのＦ−アクチン及びＭＴとの部分的共局在（参照；参考写真３）
（Ａ−Ｃ）抗ＣＲＭＰ１Ａ抗体（Ａ）、抗ＣＲＭＰ２Ａ抗体（Ｂ）、及び抗全ＣＲＭＰ−Ｂ抗体（Ｃ）による成長円錐の免疫染色。網膜軸索は、アクチン及びＭＴで同時に染色されていた。ＣＲＭＰ−Ａ及びＣＲＭＰ−Ｂは、部分的にＦ−アクチン及びＭＴと共局在していた。スケールバーは５μｍである。
（Ｄ）ニワトリ胚脳抽出物を用いたＭＴペレット形成分析のイムノブロット。アクチンアセンブリーがサイトカラシンＢにより抑制される条件下において、１０μＭのタキソールの存在下（レーン３及び４）あるいは非存在下（レーン１及び２）で、ＭＴを脳抽出物の高速上澄液中で重合した後、沈降させ、上澄液（Ｓ）（レーン１及び３）及び沈殿物（Ｐ）（レーン２及び４）を回収した。抗全ＣＲＭＰ抗体でかかるブロットを調べた。理由は不明だが、上澄液中に含まれるＣＲＭＰの総量及び反応における沈殿物の総量には、かなりのばらつきが見られた。
【００７１】
図４．ＣＲＭＰの過剰発現が、繊維芽細胞における形態及びＭＴパターンに及ぼす作用（参照；参考写真４）
（Ａ）野生型のＣＥＦにｐｃＤＮＡＩ−ＡＰ（ｐｃＡＰ）（ａ−ｄ）、ｐｃＣＲＭＰ２Ａ（ｅ−ｈ）、又はｐｃＣＲＭＰ２Ｂ（ｉ−ｌ）をトランスフェクションし、ＣＲＭＰ２Ａ−レトロウィルス過剰発現ＣＥＦにｐｃＣＲＭＰ２Ａ−Ｎ（ｍ−ｐ）をトランスフェクションし、免疫蛍光にかけた。下記の抗体で細胞を染色した。抗ＡＰ抗体（ａ）、抗ＣＲＭＰ２Ａ抗体（ｅ）、抗ＣＲＭＰ２モノクローナル抗体（ｉ）、及び抗ＦＬＡＧ抗体（ｍ）、赤；抗−β−チューブリン抗体（ｂ、ｆ、ｊ、及びｎ）、緑。ボックス部分の組み合わせたイメージ（ｃ、ｇ、ｋ及びｏ）及び高倍率での図（ｄ、ｈ、ｌ及びｐ）も示した。（ａ−ｄ）コントロールの細胞におけるＭＴパターンである。（ｅ−ｈ）ＣＲＭＰ２ＡはＭＴの配向化だけではなく細胞の伸長をも誘導し、細胞の先端（もっとも顕著なのは前面の先端）に集中する傾向があった（矢頭で示す）。（ｉ−ｌ）大量の短いＭＴ断片が産生され、ＭＴの網状パターンを形成した。（ｍ−ｐ）ＣＲＭＰ２Ａ−Ｎの過剰発現により、ＣＲＭＰ２Ａ発現細胞のＭＴパターンにおける表現型が救出された。しかし、かかる細胞は多極性形状を示しており、野生型とは異なっていた。スケールバーは２０μｍ（ａ、ｅ、ｉ及びｍ）及び５μｍ（ｐ）を示す。
（Ｂ）ＭＴパターンの定量分析を示す図である。各コンストラクトをトランスフェクションした細胞の蛍光イメージを任意に写真に撮影し、２つの独立指標、配向化（斜線のカラムで示す）及び断片化（斜線のカラム）について、各細胞のＭＴパターンを採点した（ｎ＞７０）。１０を越えるＭＴが同一方向に沿って平行に並んでいるＭＴパターン又は無数のＭＴが密集して並んでいるＭＴパターンを配置されたものとみなし、短い断片が限りなく形成されているＭＴパターンを断片化されたものとみなした（［Ａ、ｉ−ｋ］の左の細胞にて示す）。
【００７２】
図５．成長円錐方向転換中におけるＣＲＭＰ２Ａの動的挙動の微速度分析（参照；参考写真５）
ＧＦＰ誘導体融合タンパク質をコードする発現コンストラクトの２つの組み合わせで、網膜移植片のエレクトロポレーションを行った。右へ前進してから方向転換して上方へ向かった（０分後）蛍光網膜成長円錐をイメージした。左のイメージは、観察した成長円錐の大部分を示し、その後の微速度イメージ（ボックス部分）を拡大して、ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰクラスターの動的挙動を視覚化した。
（Ａ）ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰ（赤く仮染色）及びβ−チューブリン−ＹＦＰ（緑）の動力学を示す図である。ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰは、ＭＴ（又はチューブリン）も局所的に集中している成長円錐末梢において、及びＭＴプラスエンド付近で、蛍光クラスター（矢頭で示す）を形成していた。
（Ｂ）ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰ（赤）及びＹＦＰ−アクチン（緑）の動力学を示す図である。方向転換中、ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰクラスター（矢頭）は、上方に向かうアクチンを限局的に蓄積しながら移動した。スケールバーは５μｍを示す。
【００７３】
図６．ＣＲＭＰ欠失変異株が網膜視蓋システムに及ぼす作用の、ＧＦＰを利用した視覚化（参照；参考写真６）
（Ａ）インビボでの機能分析にコンストラクトを使用した。
（Ｂ）２Ａ−Ｎ−ＧＦＰ発現軸索の伸長遅滞を示す図である。（ａ）右目の概略図である。ＯＦは眼杯裂。（ｂ、ｃ及びｄ）ＧＦＰ（ｂ）、２Ａ−Ｎ−ＧＦＰ（ｃ）、及び２Ｂ−Ｎ−ＧＦＰ（ｄ）のレトロウィルス発現コンストラクトでエレクトロポレーションした胎生１０日目の網膜の中央領域（［ａ］のボックス部分に相当）の写真イメージを表す。ＧＦＰ標識軸索の成長円錐及び／又は遠心端を矢頭で示している。
（Ｃ）視蓋中のＧＦＰ標識網膜軸索の検出を示す図である。（ａ）左の視蓋の概略図である。ｔｇは被蓋を表す。（ｂ及びｃ）ＩＧＧ（ｂ）及び２Ａ−Ｎ−ＩＧＧ（ｃ）のウィルスを感染させた胎生１０日目の胚の吻側視蓋（［ａ］のボックス部分に相当）の写真イメージを示す図である。（ｄ及びｅ）ＩＧＧ（ｄ）及び２Ａ−Ｎ−ＩＧＧ（ｅ）のウィルスを感染させた胎生１５日目の胚における吻側視蓋の全景を示す。これらは同じ露出時間にて撮影したものである。ＯＴは視索、Ｒは吻側を表す。
（Ｄ）網膜中の制限領域を２Ａ−Ｎ−ＩＧＧウィルスに感染させた胎生１４日目の胚における網膜視蓋突起の分析を表す。（ａ）右網膜（上）及び左網膜の背側（下）の概略図である。ＧＦＰ標識腹側網膜軸索（緑）が背側視蓋へ伸びており、未熟な軸索を形成している（楕円）。Ｎは鼻側、Ｔは則頭側、Ｄは背側、Ｖは腹側を表す。（ｂ−ｄ）視蓋（［ａ、下］の点線で切片化）のビブラトーム横断切片（厚さ１３０μｍ）の顕微鏡写真を示す図である。視神経繊維層（ＳＯ；視蓋表面）が上、吻側が左である。（ｂ）ＧＦＰシグナルをイメージ化したものである。（ｃ）層状構造を示すためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色したものである。（ｄ）（ｂ）と（ｃ）を組み合わせたイメージを表す。（ｅ及びｆ）ＧＦＰ（ｅ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ｆ）のシグナルを示す、（ａ、下、楕円）に概略的に図示した分枝の高倍率での図。視蓋板の位置は、文献記載の方法による（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　１２１，　（１９９５）　１８９−２００．）。（ｇ）（ｅ）のボックス部分の共焦点イメージである。これにより椎弓板（ｌａｍｉｎａ）Ｄにおける分枝を確認した。スケールバーは５０μｍ（Ｂ及びＤ、ｇ）、２０μｍ（Ｃ、ｂ及びｃ）；２００μｍ（Ｄ、ｄ）；１００μｍ（Ｄ、ｆ）を示す。
【００７４】
図７．ＣＲＭＰ２Ａ欠失変異株を発現する胎生１３〜１４日目の胚における網膜視蓋突起パターン（参照；参考写真７）
この段階では、視蓋中の突起パターンは、対照ＡＰに感染させた胚と２Ａ−Ｎウィルスに感染させた胚との間で区別がつきにくかった。網膜軸索の多くが、組織分布的に適確な標的領域を越え、尾側の先端にさえ到達した。
（Ａ及びＢ）ＡＰ（Ａ）及び２Ａ−Ｎ（Ｂ）ウィルスに感染させた平らに載せた網膜におけるＤｉＩ標識の軸索軌道の概略図。ＤｉＩ結晶配置（閉じた円（●））の位置及び標識軸索の経路を描写した。（Ｂ）において、網膜軸索のいくつかが眼杯裂を通過した（ボックス部分）。（Ｂ）における側頭側を通って迂回した標識背側軸索の少数は、野生型胚にも時々見られることがあり、従って、２Ａ−Ｎ過剰発現による影響ではないであろう。ｎは鼻側、ｔは側頭側、ｄは背側、ｖは腹側を表す。
（Ｃ）（Ｂ）におけるボックス部分の実像。眼杯裂を越えた軸索が、網膜内樹枝状部を形成した（矢頭）。
（Ｄ）（Ａ）に図解したＡＰウィルスに感染した網膜の軸索突起パターン。ｒは吻側、ｃは尾側、ｍは内側、ｌは側面、ｏｔは視索を表す。
（Ｅ）（Ｂ）に図解した２Ａ−Ｎウィルスに感染した網膜の軸索突起パターンを示している。
（Ｆ）（Ｄ）に示した尾側視蓋の高倍率での図である。
（Ｇ）（Ｅ）に示した尾側視蓋の高倍率での図である。
スケールバーは５ｍｍ（Ａ及びＢ）；０．５ｍｍ（Ｃ、Ｆ及びＧ）；１ｍｍ（Ｄ及びＥ）を示す。
【００７５】
図８．ＣＲＭＰ２Ａ欠失変異株を発現する胎生１５〜１６日目の胚における網膜視蓋突起パターン（参照；参考写真８）
（Ａ及びＢ）ＡＰ（Ａ）及び２Ａ−Ｎ（Ｂ）ウィルスに感染させた網膜におけるＤｉＩ標識の軸索軌道の概略図である。
（Ｃ）（Ａ）におけるボックス部分の実像を示す図である。
（Ｄ及びＥ）強烈な軸索分解を示す、（Ｂ）におけるボックス部分の実像を示す図である。
（Ｆ）（Ａ）に図解した、ＡＰにウィルス感染させた網膜の軸索突起パターンを表す。軸索は、適確な標的領域でよく焦点を合わせた、ほとんど成熟した樹枝状部となった。
（Ｇ）（Ｂ）に図解した、２Ａ−Ｎウィルスに感染させた網膜の軸索突起の崩壊。
（Ｈ）（Ｇ）におけるボックス部分をより拡大したもの。スケールバーは、５ｍｍ（Ａ及びＢ）；２５μｍ（Ｃ、Ｄ及びＥ）；１ｍｍ（Ｆ及びＧ）；２５０μｍ（Ｈ）を示す。
【００７６】
図９．ニワトリＣＲＭＰ−Ｂの配置（参照；参考写真９）
３つ以上の配列における同一のアミノ酸を、濃い斜線のボックス中のボールド体で示し、相同的なアミノ酸を薄い斜線のボックスで示した（Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。可変及びコア領域の間の結合部を矢頭で印した。単離したＣＲＭＰ２Ｂのタンパク質配列は、コドン４９０でグルタミン酸塩からグリシン酸へ置換した１つのアミノ酸以外、文献に報告のあるＣＲＭＰ６２と同じである（Ｎａｔｕｒｅ　３７６，　（１９９５）　５０９−５１４．）。その後の機能分析では、最初にＣＲＭＰ２ＢとしてＣＲＭＰ６２を使用したが、本発明のＣＲＭＰ２ＢとＣＲＭＰ６２には機能的な違いは見られなかった。
【００７７】
図１０．各種末梢ニューロンの軸索におけるＣＲＭＰ２Ａの分布（参照；参考写真１０）
胎生４日目のニワトリ胚を、抗ＣＲＭＰ２Ａ（Ａ−Ｃ）又は抗ニューロフィラメント（ＮＦ）（Ｄ）抗体で全載免疫染色し、色彩基質としてジアミノベンジジンを使用して検出を行なった。
（Ａ及びＢ）ＣＲＭＰ２Ａ免疫応答を、頭蓋神経及びＤＲＧの軸索（Ａ）ならびに嗅覚ニューロン（Ｂ）中から検知した。
（Ｃ）ＤＲＧの成長遠心性神経繊維の高倍率での図（［Ａ］におけるボックス部分）である。シグナルは、繊維の遠心端で最も強かった。
（Ｄ）ＤＲＧの遠心性神経繊維は、抗ＮＦ抗体でも検知された。
【００７８】
図１１．ＣＲＭＰを過剰発現する繊維芽細胞のＦ−アクチンパターン（参照；参考写真１１）
ｐｃＡＰ（ａ−ｄ）、ｐｃＣＲＭＰ２Ａ（ｅ−ｈ）又はｐｃＣＲＭＰ２Ｂ（ｉ−ｌ）を用いて野生型ＣＥＦをトランスフェクションし、免疫蛍光法にかけた。細胞を次の抗体で標識した：抗ＡＰ抗体（ａ）及び抗ＣＲＭＰ２モノクローナル抗体（ｅ及びｉ）は赤色、ならびにＡｌｅｘａ　４８８複合のファロイジン（ｂ、ｆ及びｊ）は緑色である。組み合わせたイメージ（ｃ、ｇ及びｋ）及び高倍率での図（ｄ、ｈ及びｌ）も示した。細胞の形が激変したが、Ｆ−アクチンの全体的な構成は、ＣＲＭＰの過剰発現による影響を受けなかったことに注目して頂きたい。成長円錐のように、ＣＲＭＰは成長円錐の場合と同様、繊維芽細胞の末梢における全部ではないが多くのアクチン蓄積部位に優先的に集中した（矢頭）。スケールバーは２０μｍ（ａ、ｅ及びｉ）；１０μｍ（ｄ、ｈ及びｌ）を示す。
【００７９】
図１２．ＣＲＭＰを過剰発現する繊維芽細胞のＭＴパターン（参照；参考写真１２）
野生型ＣＥＦをｐｃＡＰ（ａ−ｄ）又はｐｃ２Ａ−Ｎ（ｅ−ｈ）を用いてトランスフェクションし、ＣＲＭＰ２Ａレトロウィルス過剰発現ＣＥＦをｐｃＡＰ（ｉ−ｌ）又はｐｃＣＲＭＰ２Ｂ（ｍ−ｐ）を用いてトランスフェクションし、ＣＲＭＰ２Ｂレトロウィルス過剰発現ＣＥＦをｐｃＡＰ（ｑ−ｔ）又はｐｃＣＲＭＰ２Ａ（ｕ−ｘ）を用いてトランスフェクションし、免疫蛍光法にかけた。細胞を、次の抗体を用いて標識した：抗ＡＰ抗体（ａ、ｉ及びｑ）、抗ＦＬＡＧ抗体（ｅ）、抗全ＣＲＭＰ−Ｂ抗体（ｍ）及び抗ＣＲＭＰ２Ａ抗体（ｕ）は赤色；抗βチューブリン抗体（ｂ、ｆ、ｊ、ｎ、ｒ及びｖ）は緑色である。組み合わせたイメージ（ｃ、ｇ、ｋ、ｏ、ｓ及びｗ）及び高倍率での図（ｄ、ｈ、ｌ、ｐ、ｔ及びｘ）も示した。（ａ−ｈ）野生型細胞における２Ａ−Ｎ過剰発現さえもが、ＭＴパターンにおいて変化の少ない、いくらか平らな形態を誘導した（図４Ｂを参照のこと）。（ｉ−ｐ）ＣＲＭＰ２Ｂの過剰発現は、ＣＲＭＰ２Ａの影響を克服し、ＭＴの再配置を誘導した。（ｑ−ｘ）ＣＲＭＰ２Ａの過剰発現は、ＣＲＭＰ２Ｂの影響を克服し、ＭＴのランダム化を誘導した。スケールバーは、２０μｍ（ａ、ｅ、ｉ、ｍ、ｑ及びｕ）；１０μｍ（ｄ、ｈ、ｌ、ｐ、ｔ及びｘ）を示す。
【００８０】
図１３．視蓋中の切断した形のＣＲＭＰ２のＧＦＰ融合で標識化した網膜軸索の視覚化（参照；参考写真１３）
同じ露出時間で撮影した、ＧＦＰ（Ａ及びＢ）、２Ａ−Ｎ−ＧＦＰ（Ｃ及びＤ）及び２Ｂ−Ｎ−ＧＦＰ（Ｅ及びＦ）を用いてエレクトロポレーションにかけた胎生１５日目胚中の腹側蓋の全景（Ａ、Ｃ及びＥ）及び高倍率での図（吻側領域；Ｂ、Ｄ及びＦ）である。ＧＡＰ−ＧＦＰ（図６Ｃを参照のこと）、２Ｂ−Ｎ−ＧＦＰ及び２Ａ−Ｎ−ＧＦＰ（胎生１５日目の前、図６Ｂを参照のこと）と比べて、ＧＦＰは下の方の網膜軸索には有効に輸送されなかった。ｒは吻側、ｃは尾側、ｌは側面、ｍは内側、ｔｇは被蓋を指す。
【００８１】
【発明の効果】
本発明は、神経発生過程において、特異的な神経回路網が形成される際に、正しい神経結合の相手を見つける上で重要な役割を果たしている神経成長円錐の舵取り機構として働く、細胞内シグナル制御分子ＣＲＭＰ（ｃｏｌｌａｐｓｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の新規アイソフォーム、及び該アイソフォームをコードする遺伝子を提供し、その機能を明らかにした。また、本発明は、該新規アイソフォーム及び該アイソフォームをコードする遺伝子の変異体、及び該新規アイソフォームに特異的に結合する抗体を提供した。
【００８２】
【配列表】
2004000094.tif 000002
2004000094.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＣＲＭＰアイソフォームの２つの型について、（Ａ）は、ニワトリＣＲＭＰ−Ａ及びＢの概略図を、（Ｂ）は、ＣＲＭＰ−Ａの可変領域の配置を、（Ｃ）は、マウスＣＲＭＰ１Ａ及び１Ｂの、第一タンパク質コーディングエキソン（エキソン１Ａ及びエキソン１Ｂ、長方形）を含む７．６ｋｂのＢａｍＨＩゲノム断片の概略的な制限地図を、（Ｄ）は、図示した各種抗ＣＲＭＰ抗体を使用した胎生１４日目のニワトリの脳のイムノブロットを、示す図である。
【図２】本発明の実施例における胚の網膜におけるＣＲＭＰの分布パターンについて、（Ａ−Ｄ）は、抗ＣＲＭＰ２Ａ抗体による染色の様子を、（Ｅ−Ｈ）は、抗全ＣＲＭＰ−Ｂ抗体による染色した様子を、（Ｉ−Ｋ）は、抗ＣＲＭＰ２モノクローナル抗体による染色の様子を、示す図である。
【図３】本発明の実施例において、成長円錐におけるＣＲＭＰのＦ−アクチン及びＭＴとの部分的共局在について、（Ａ−Ｃ）は、抗ＣＲＭＰ１Ａ抗体（Ａ）、抗ＣＲＭＰ２Ａ抗体（Ｂ）、及び抗全ＣＲＭＰ−Ｂ抗体（Ｃ）による成長円錐の免疫染色を、（Ｄ）は、ニワトリ胚脳抽出物を用いたＭＴペレット形成分析のイムノブロットを、示す図である。
【図４】本発明の実施例において、ＣＲＭＰの過剰発現が、繊維芽細胞における形態及びＭＴパターンに及ぼす作用について、（Ａ）は、野生型のＣＥＦにｐｃＤＮＡＩ−ＡＰ（ｐｃＡＰ）（ａ−ｄ）、ｐｃＣＲＭＰ２Ａ（ｅ−ｈ）、又はｐｃＣＲＭＰ２Ｂ（ｉ−ｌ）をトランスフェクションし、ＣＲＭＰ２Ａ−レトロウィルス過剰発現ＣＥＦにｐｃＣＲＭＰ２Ａ−Ｎ（ｍ−ｐ）をトランスフェクションし、免疫蛍光染色にかけた写真を、（Ｂ）は、ＭＴパターンの定量分析を、示す図である。
【図５】本発明の実施例において、成長円錐方向転換中におけるＣＲＭＰ２Ａの動的挙動の微速度分析について、（Ａ）は、ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰ及びβ−チューブリン−ＹＦＰの動力学を、（Ｂ）は、ＣＲＭＰ２Ａ−ＣＦＰ及びＹＦＰ−アクチンの動力学を、示す図である。
【図６】本発明の実施例において、ＣＲＭＰ欠失変異株が網膜視蓋システムに及ぼす作用の、ＧＦＰを利用した視覚化について、（Ａ）は、インビボでの機能分析にコンストラクトを使用した、（Ｂ）は、２Ａ−Ｎ−ＧＦＰ発現軸索の伸長遅滞を、（Ｃ）は、視蓋中のＧＦＰ標識網膜軸索の検出を、（Ｄ）は、網膜中の制限領域を２Ａ−Ｎ−ＩＧＧウィルスに感染させた胎生１４日目の胚における網膜視蓋突起の分析を、示す図である。
【図７】本発明の実施例において、ＣＲＭＰ２Ａ欠失変異株を発現する胎生１３〜１４日目の胚における網膜視蓋突起パターンについて、（Ａ及びＢ）は、ＡＰ（Ａ）及び２Ａ−Ｎ（Ｂ）ウィルスに感染させた平らに載せた網膜におけるＤｉＩ標識の軸索軌道の概略図を、（Ｃ）は、（Ｂ）におけるボックス部分の実像を、（Ｄ）は、（Ａ）に図解したＡＰウィルスに感染した網膜の軸索突起パターンを、（Ｅ）は、（Ｂ）に図解した２Ａ−Ｎウィルスに感染した網膜の軸索突起パターンを、（Ｆ）は、（Ｄ）に示した尾側視蓋の高倍率での図を、（Ｇ）は、（Ｅ）に示した尾側視蓋の高倍率での図を、示す図である。
【図８】本発明の実施例において、ＣＲＭＰ２Ａ欠失変異株を発現する胎生１５〜１６日目の胚における網膜視蓋突起パターンについて、（Ａ及びＢ）は、ＡＰ（Ａ）及び２Ａ−Ｎ（Ｂ）ウィルスに感染させた網膜におけるＤｉＩ標識の軸索軌道の概略図を、（Ｃ）は、（Ａ）におけるボックス部分の実像を示す図を、（Ｄ及びＥ）は、強烈な軸索分解を示す、（Ｂ）におけるボックス部分の実像を示す図を、（Ｆ）は、（Ａ）に図解した、ＡＰにウィルス感染させた網膜の軸索突起パターンを、（Ｇ）は、（Ｂ）に図解した、２Ａ−Ｎウィルスに感染させた網膜の軸索突起の崩壊を、（Ｈ）は、（Ｇ）におけるボックス部分をより拡大したものを示す図である。
【図９】本発明の実施例において、ニワトリＣＲＭＰ−Ｂの配置について、示す図である。
【図１０】本発明の実施例において、各種末梢ニューロンの軸索におけるＣＲＭＰ２Ａの分布について、（Ａ及びＢ）は、ＣＲＭＰ２Ａ免疫応答を、（Ｃ）は、ＤＲＧの成長遠心性神経繊維の高倍率での図を、（Ｄ）は、ＤＲＧの遠心性神経繊維を、抗ＮＦ抗体で検知した写真を、示す図である。
【図１１】本発明の実施例において、ＣＲＭＰを過剰発現する繊維芽細胞のＦ−アクチンパターンについて、ｐｃＡＰ（ａ−ｄ）、ｐｃＣＲＭＰ２Ａ（ｅ−ｈ）又はｐｃＣＲＭＰ２Ｂ（ｉ−ｌ）を用いて野生型ＣＥＦをトランスフェクションし、免疫蛍光法にかけた写真を示す図である。
【図１２】本発明の実施例において、ＣＲＭＰを過剰発現する繊維芽細胞のＭＴパターンについて、野生型ＣＥＦをｐｃＡＰ（ａ−ｄ）又はｐｃ２Ａ−Ｎ（ｅ−ｈ）を用いてトランスフェクションし、ＣＲＭＰ２Ａレトロウィルス過剰発現ＣＥＦをｐｃＡＰ（ｉ−ｌ）又はｐｃＣＲＭＰ２Ｂ（ｍ−ｐ）を用いてトランスフェクションし、ＣＲＭＰ２Ｂレトロウィルス過剰発現ＣＥＦをｐｃＡＰ（ｑ−ｔ）又はｐｃＣＲＭＰ２Ａ（ｕ−ｘ）を用いてトランスフェクションし、免疫蛍光法にかけた写真を示す図である。
【図１３】本発明の実施例において、視蓋中の切断した形のＣＲＭＰ２のＧＦＰ融合で標識化した網膜軸索の視覚化について、同じ露出時間で撮影した、ＧＦＰ（Ａ及びＢ）、２Ａ−Ｎ−ＧＦＰ（Ｃ及びＤ）及び２Ｂ−Ｎ−ＧＦＰ（Ｅ及びＦ）を用いてエレクトロポレーションにかけた胎生１５日目胚中の腹側蓋の全景（Ａ、Ｃ及びＥ）及び高倍率での図（吻側領域；Ｂ、Ｄ及びＦ）を示す。
【図１４】最初に報告されたＣＲＭＰのアイソフォームＣＲＭＰ１Ｂの塩基配列を示す図である。
【図１５】最初に報告されたＣＲＭＰのアイソフォームＣＲＭＰ１Ｂのアミノ酸配列を示す図である。
【図１６】最初に報告されたＣＲＭＰのアイソフォームＣＲＭＰ２Ｂの塩基配列を示す図である。
【図１７】最初に報告されたＣＲＭＰのアイソフォームＣＲＭＰ２Ｂのアミノ酸配列を示す図である。
【図１８】最初に報告されたＣＲＭＰのアイソフォームＣＲＭＰ３Ｂの塩基配列を示す図である。
【図１９】最初に報告されたＣＲＭＰのアイソフォームＣＲＭＰ３Ｂのアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】最初に報告されたＣＲＭＰのアイソフォームＣＲＭＰ４Ｂの塩基配列を示す図である。
【図２１】最初に報告されたＣＲＭＰのアイソフォームＣＲＭＰ４Ｂのアミノ酸配列を示す図である。
【図面】
【図１】2004000094.tif 000051
【図２】2004000094.tif 000052
【図３】2004000094.tif 000053
【図４】2004000094.tif 000054
【図５】2004000094.tif 000055
【図６】2004000094.tif 000056
【図７】2004000094.tif 000057
【図８】2004000094.tif 000058
【図９】2004000094.tif 000059
【図１０】2004000094.tif 000060
【図１１】2004000094.tif 000061
【図１２】2004000094.tif 000062
【図１３】2004000094.tif 000063
【図１４】2004000094.tif 000064
【図１５】2004000094.tif 000065
【図１６】2004000094.tif 000066
【図１７】2004000094.tif 000067
【図１８】2004000094.tif 000068
【図１９】2004000094.tif 000069
【図２０】2004000094.tif 000070
【図２１】2004000094.tif 000071