(57)【要約】【課題】心不全の病態や進行を予測するための新しい指標を見出し、心不全の診断、治療または予防のための新たな方法を提供する。【解決手段】ヒト心不全患者心筋組織とヒト正常心筋組織との間で発現量が著しく変動している遺伝子を特定する。さらに、該遺伝子や該遺伝子がコードしている蛋白質を利用することにより、心不全の病態を予測し、診断や治療の改善を図る。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の、配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子、または配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現量により、該検体提供者の心不全の病態を予測する方法。
【請求項２】
以下の工程１）〜３）を含む、心不全の病態予測方法：
１）被験者および正常人から単離した血液または心筋細胞を含む各検体より、それぞれ全ＲＮＡを抽出する；
２）上記被験者由来の検体から抽出した全ＲＮＡと上記正常人由来の検体から抽出した全ＲＮＡの間における、配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子の発現量の相違を検出する；
３）上記各マーカー遺伝子の発現量の相違を解析し、被験者の心不全の病態を予測する。
【請求項３】
以下の工程１）〜３）を含む、心不全の病態予測方法：
１）単離された血液または心筋細胞を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する；
２）上記検体由来全ＲＮＡと正常心筋組織由来全ＲＮＡの間における、配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子の発現量の相違を検出する；
３）上記各マーカー遺伝子の発現量の相違を解析し、検体提供者の心不全の病態を予測する。
【請求項４】
心不全の病態予測用マーカー遺伝子の発現量が、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、およびメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか１の方法によって検出されることを特徴とする、請求項１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程１）〜３）を含む、心不全の病態予測方法：
１）被験者および正常人から単離した血液または心筋細胞を含む各検体中のポリペプチドをそれぞれ固相化する；
２）上記被験者由来の固相化ポリペプチドと上記正常人由来の固相化ポリペプチドにおける、配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現量を該マーカー蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）上記被験者由来の検体と上記正常人由来の検体の間における、各マーカー蛋白質の発現量の相違を解析し、被験者の心不全の病態を予測する。
【請求項６】
以下の工程１）〜３）を含む、心不全の病態予測方法：
１）単離された血液または心筋細胞を含む検体中のポリペプチドを固相化する；２）上記固相化ポリペプチドにおける、配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現量を該マーカー蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）上記検体とヒト正常心筋組織の間における、各マーカー蛋白質の発現量の相違を解析し、検体提供者の心不全の病態を予測する。
【請求項７】
心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現量が、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか１の方法によって検出されることを特徴とする、請求項１、５および６から選ばれるいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
以下のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる少なくとも１以上を含む、心不全の病態予測用キット。
ａ）配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
【請求項９】
配列番号５に示される塩基配列で特定される遺伝子、または配列番号２０に示されるアミノ酸配列で特定される蛋白質を含む、心不全の治療用組成物。
【請求項１０】
配列番号１〜４および配列番号６〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子のアンチセンス核酸、または配列番号１７〜１９および配列番号２１〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される蛋白質を特異的に認識、中和する抗体蛋白質を含む、心不全の治療用組成物。
【請求項１１】
配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子、または配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現を亢進または抑制させたときに現れる表現型の変化を、被験物質の存在下および非存在下で比較することによって、該被験物質の心不全の治療または予防剤としての効果を試験する方法。
【請求項１２】
表現型の変化が、心不全の病態予測用マーカー遺伝子の発現依存的に転写されるレポーター遺伝子の発現変化として検出されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト心不全病態を反映した培養細胞もしくはモデル動物において、配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子、または配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現量を、被験物質の存在下および非存在下で比較することによって、該被験物質の心不全の治療または予防剤としての効果を試験する方法。
【請求項１４】
心不全の病態予測用マーカー遺伝子または心不全の病態予測用マーカー蛋白質が、内在性の遺伝子または蛋白質である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
心不全の病態予測用マーカー遺伝子または心不全の病態予測用マーカー蛋白質が、外来性の遺伝子または蛋白質である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子を含有する組成物。
【請求項１７】
配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質を含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、心不全の病態予測方法に関する。より詳しくは、特定遺伝子またはその転写産物の発現プロファイルに基づき、心不全の病態を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
心不全は心筋症（例えば、拡張型心筋症、肥大型心筋症等）、虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞、狭心症等）、高血圧症（高血圧性心肥大等）等の様々な原因により心機能が低下した最終病態である。形態学的には、心室容積の拡張および心室壁厚の短縮といった心臓の器質的変化（リモデリング）が生じている。同時に、血液中および器質的変化を示した心筋組織において数種のマーカー蛋白質またはその遺伝子（心房性利尿ペプチド・ＡＮＰおよび脳性利尿ペプチド・ＢＮＰ等）の発現が亢進することが知られている。
【０００３】
これらのマーカー蛋白質やその遺伝子発現量は、患者が心不全であるか否か、またはその重症度を知る指標となりうる。しかしながら、従来のマーカー蛋白質やその遺伝子発現の亢進は、心不全の病態が進行した結果生じるものであり、様々な原因によって心機能が低下する過程を反映していない。つまり、心不全の個々の症例について、その病態を把握し、予後を予測するためには、様々な原因によって生じる変化を別個に検証する必要がある。
【０００４】
心不全の最近の治療法は、一次的にはアンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤と利尿剤の使用を指向している。しかし、ＡＣＥ阻害剤は心不全における生存を延長するが、これは最終段階である心不全に向けた進行を遅らせるためであり、ＡＣＥ阻害剤を投与されている患者の多くは、機能的に第ＩＩＩ級心不全を持っている。さらに、ＡＣＥ阻害剤は心不全患者の６０％以上では症状緩和ができず、心不全による死亡を約１５〜２０％しか減少させることができない。一方、ジゴキシンを除く筋変力作用陽性剤の長期的投与は、不整脈惹起、突然死のような、生命に関わる重大な副作用を伴う。他方、心移植による治療は、ドナー心臓の入手可能性により限定される。こうした従来療法の欠陥は、別の有効な治療的手法の必要性を示唆する。
【０００５】
Ｇ−タンパク質共役受容体：ＧＰＣＲ（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、７回膜貫通部位を持つレセプター蛋白質であり、様々な生理機能に関与していることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。ＧＰＣＲは数百ものファミリータンパク質が知られているが、種々の疾患の治療用薬剤がこのＧＰＣＲの活性に影響を与えることにより作用を発揮する。例えば、前立腺癌および乳癌、子宮平滑筋腫、子宮内膜症、性的早熟および非腫瘍性卵巣アンドロゲン過剰症候群を治療するために用いられてきたゴナドトロピン放出ホルモンのアゴニストアナログであるロイプロリド、ゴナドレリンおよびナファレリン（例えば、非特許文献２参照）、高血圧、狭心症および精神病を治療するために用いられてきた心臓のβ−アドレナリン作動性レセプターアンタゴニストであるプロプラノロール（例えば、非特許文献３および４参照）、気管支拡張剤として用いられてきた肺のβ２−アドレナリン作動性レセプターアゴニストであるメタプロテレノール（例えば、非特許文献５参照）、ならびに、潰瘍および特発性蕁麻疹を治療するために用いられてきたヒスタミン２レセプターアンタゴニストであるシメチジン（例えば、非特許文献６および７参照）がＧＰＣＲに作用するという。したがって、ＧＰＣＲは創薬標的として重要と考えられるが、心不全におけるＧＰＣＲ遺伝子の発現プロファイルを網羅的に解析したという報告はない。
【０００６】
【非特許文献１】
「ザ　イーエムビーオー　ジャーナル（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ）」　１９９９　；１８（７）：ｐ１７２３−１７２９
【非特許文献２】
「アメリカン　ファミリー　フィジシャン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）」　１９９２；４４：ｐ１７７７−１７８２
【非特許文献３】
「クリニカル　ファーマコキネティックス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）」　１９８７；１３：ｐ５１−６４，
【非特許文献４】
「ニューロサイコ−バイオロジー（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ）」　１９８６；１５：ｐ２０−２７
【非特許文献５】
「アンルズ　オブ　アレルギー（Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ）」　１９７３；３１：ｐ４６０−４６６
【非特許文献６】
「ニューイングランド　ジャーナル　オブ　メディシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」　１９８４；３１１：ｐ６８９−６９３
【非特許文献７】
「ディー　アイ　シー　ピー（ＤＩＣＰ）」　１９９１；２５：ｐ６０９−６１２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、心不全の病態や進行を予測するための新しい指標を提供し、これを利用することにより、心不全の診断、治療または予防の改善を図ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒト心不全患者心筋組織とヒト正常心筋組織との間で発現量が著しく変動している遺伝子は心不全の個々の病態を反映しうると考えた。そして、該遺伝子やその転写産物を利用することにより、心不全の病態を予測し、診断あるいは治療するための新たな方法を提供しうることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
（１）　配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子、または配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現量により、該検体提供者の心不全の病態を予測する方法。
（２）　心不全の病態予測用キット。
（３）　配列番号５に示される塩基配列で特定される遺伝子、または配列番号２０に示されるアミノ酸配列で特定される蛋白質を含む、心不全の治療用組成物。（４）　配列番号１〜４および配列番号６〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子のアンチセンス核酸、または配列番号１７〜１９および配列番号２１〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される蛋白質を特異的に認識、中和する抗体蛋白質を含む、心不全の治療用組成物。
（５）　配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子、または配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現を亢進または抑制させたときに現れる表現型の変化を、被験物質の存在下および非存在下で比較することによって、該被験物質の心不全の治療または予防剤としての効果を試験する方法。
（６）　配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子、または配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現量を、被験物質の存在下および非存在下で比較することによって、該被験物質の心不全の治療または予防剤としての効果を試験する方法。
（７）　配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子を含有する組成物。
（８）　配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質を含有する組成物。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．心不全の病態予測用マーカー遺伝子
本発明にかかる「心不全の病態予測用マーカー遺伝子」とは、ヒト心不全の病態を予測するための指標として用いられる遺伝子を意味する。該遺伝子は、具体的には、配列番号１〜１６の塩基配列から選ばれるいずれか１の塩基配列によって特定される遺伝子である。本発明は、この心不全の病態予測用マーカー遺伝子、および該マーカー遺伝子の心不全の病態予測、治療、または予防のための使用を提供する。なお、本明細書中において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡやｃＤＮＡも含むものとする。また、全長遺伝子のみならずＥＳＴも含むものとする。
【００１１】
１．１　マーカー遺伝子の特定方法
本発明の心不全の病態予測用マーカー遺伝子は、以下の工程１）および２）：１）ヒト心不全患者心筋組織およびヒト正常心筋組織由来の全ＲＮＡを調製する工程；
２）上記各全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを利用してヒト心不全患者心筋組織とヒト正常心筋組織の間で発現量が著しく異なる遺伝子を特定する工程；
を順次行うことによって、特定することができる。
以下、各工程について詳細に説明する。
【００１２】
工程１：全ＲＮＡの調製
本工程で用いられる「ヒト心不全患者心筋組織」としては、例えば、心筋生検、バチスタ手術、ドール手術、もしくは左心補助装置挿入により左心室心筋組織の摘出を受けた心不全患者由来の摘出心筋組織を用いることができる。なお、該心筋組織は適切なインフォームドコンセントに基づく契約により、供与を受けるものとする。
【００１３】
前記摘出組織は、全ＲＮＡ抽出のために摘出後直ちにその組織片をＲＮＡ抽出用溶媒に直接溶解することが好ましい。該抽出溶媒としては、例えば、フェノール等のリボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むものが好ましい。心筋組織から全ＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されず、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，　Ｎ．，　（１９８７）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１６２，　１５６−１５９）等を採用することができる。なかでも、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。
【００１４】
抽出された全ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いることが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず抽出した全ＲＮＡにビオチン化オリゴ（ｄＴ）プローブを加えてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出する。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させ、これを溶出して精製する方法も採用してもよい。溶出されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。
【００１５】
対照として用いられるヒト正常心筋組織由来の全ＲＮＡは、上記と同様に抽出、精製して調製することも可能であるが、市販のヒト正常心筋組織由来全ＲＮＡを好適に利用することができる。該市販品は、例えば、バイオチェイン社、クロンテック社、インビトロジェン社およびアンビオン社等、複数のメーカーから購入可能である。
【００１６】
工程２：遺伝子の発現量の解析
遺伝子の発現量は、工程１で得られた全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを適当な標識でラベルすることにより、そのシグナル強度として検出することができる。
【００１７】
以下に、遺伝子発現量の解析方法として、固相化試料を用いた解析方法と、その他のいくつかの解析方法について説明する。
【００１８】
（１）固相化試料を用いた解析方法
遺伝子発現量は、公知のヒト遺伝子が固定された固相化試料に上記標識プローブを、同じ条件で別個に、あるいは混合して同時にハイブリダイズさせることにより測定できる（Ｂｒｏｗｎ，　Ｐ．　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。前記標識プローブは、特定のｍＲＮＡクローンではなく、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものを用いる。プローブ作製のための出発材料としては、精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いることがより好ましい。以下に、各種固相化試料を用いた場合の解析方法について説明する。
【００１９】
ａ）遺伝子チップ：
本発明で用いられる遺伝子チップは、データベース上のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）配列、または全ＲＮＡ配列を基に合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドを固相化したものが好ましい。該遺伝子チップは、市販のもの（例えば、アフィメトリクス社製等）を用いてもよいし、公知の方法（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，　Ｒ．　Ｊ．　ｅｔａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、２０−２４）に基づき作製してもよい。
【００２０】
遺伝子チップによる解析は、常法にしたがって実施することができる。例えば、アフィメトリクス社製チップを用いる場合であれば、製品に添付されたプロトコールに従い、ビオチン標識したｃＲＮＡプローブを調製する。次いで、該プロトコールに従いハイブリダイゼーションを行い、蛍光標識したアビジンをビオチンに結合させ、その発光を検出、解析を行えばよい。
【００２１】
ｂ）アレイまたはメンブレンフィルター：
本発明で用いられるアレイまたはメンブレンフィルターは、ヒトの臓器組織、もしくは該臓器組織から単離または株化された細胞から得られた全ＲＮＡより作製されたｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物を固相化したものが好ましい。
【００２２】
固相化するｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物は、ヒトのＥＳＴデータベース等の配列情報をもとに作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものを用いる。このｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物は、予め、ヒト心不全患者心筋組織およびヒト正常心筋組織のそれぞれに由来する全ＲＮＡの間で発現量の異なる全ＲＮＡを、サブトラクション法（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　９３，　６０２５−６０３０）、ディファレンシャルディスプレイ法（Ｋａｔｏ，　Ｋ．　（１９９５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２３，　３６８５−３６９０）等を利用して選択されたものであってもよい。また、市販のアレイやフィルター（例えば、インテリジーン：宝酒造（株）社製、アトラスシステム：クローンテック社製等）を使用してもよいし、上記ｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物を市販のスポッター（例えば、ＧＭＳ４１７アレイヤー：宝酒造（株）社製等）を用いて固相化して作製してもよい。
【００２３】
アレイを用いた解析では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）で標識されたｄ−ＵＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製する。このとき、ヒト心不全患者心筋組織由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡとヒト正常心筋組織由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。蛍光シグナルは蛍光シグナル検出機を用いて検出、解析する。例えば、宝酒造（株）社の市販アレイであれば、同社のプロトコールに従い、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行い、蛍光シグナル検出機（例えば、ＧＭＳ４１８アレイスキャナー：宝酒造（株）社製等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。
【００２４】
メンブレンフィルターを用いた解析では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ）で標識されたｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行う。例えば、市販のフィルター製マイクロアレイである、アトラスシステム（クローンテック社製）を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クローンテック社製等）を用いて検出、解析を行う。
【００２５】
いずれの固相化試料を用いる場合も、同一ロットの固相化試料にヒト心不全患者心筋組織由来のプローブおよびヒト正常心筋組織由来のプローブをそれぞれハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーション条件は同じとする。前述したように、蛍光標識プローブの場合は、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることができる（Ｂｒｏｗｎ，　Ｐ．　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。
【００２６】
（２）その他の解析方法
上記以外の解析方法としては、例えば、サブトラクション法（Ｓｉｖｅ，　Ｈ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｊｏｈｎ，　Ｔ．　Ｓｔ．　（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１６，　１０９３７、Ｗａｎｇ，　Ｚ．，　ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ，　Ｄ．　Ｄ．　（１９９１）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．　８８，　１１５０５−１１５０９）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ，　Ｐ．，　ａｎｄ　Ｐａｒｄｅｅ，　Ａ．　Ｂ．　（１９９２）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７，　９６７−９７１、Ｌｉａｎｇ，　Ｐ．，　Ａｖｅｒｂｏｕｋｈ，　Ｌ．，Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ，　Ｋ．，　Ｓａｇｅｒ，　Ｒ．，　ａｎｄ　Ｐａｒｄｅｅ，　Ａ．　Ｂ．　（１９９２）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５２，　６９６６−６９６８）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（Ｊｏｈｎ，　Ｔ．　Ｓｔ．，　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ，　Ｒ．　Ｗ．　Ｃｅｌｌ　（１９７９）　１６，　４４３−４５２）、また、適当なプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション法（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．，　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　（１９８２）　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、ＲＴ−ＰＣＲ法、およびリアルタイムＰＣＲ法等を挙げることができる。以下、各解析方法について具体的に説明する。
【００２７】
ａ）サブトラクションクローニング法：
特定の細胞に特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡを取得し、該ｃＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより遺伝子をクローニングする方法である。サブトラクションの方法としては、全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを作製し、これと別の細胞から得られた全ＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ハイドロキシアパタイトカラムでハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社　（１９９３）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）や、ｃＤＮＡライブラリーをまず作製し、このライブラリーからヘルパーファージ等を用いて一本鎖ＤＮＡを調製し、この一本鎖ＤＮＡと別の細胞から得られた全ＲＮＡにビオチン標識したものとをハイブリダイズさせた後、アビジンを利用してハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖に戻してｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，　Ｙ．，　Ｎｉｓｈｉｎａ，　Ｙ．，　Ｎｏｚａｋｉ，　Ｍ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．　（１９９４）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３５５，　４−１０）等が挙げられる。
【００２８】
具体的には、まずヒト心不全患者心筋組織およびヒト正常心筋組織のそれぞれについてｍＲＮＡ（または全ＲＮＡ）を精製し、ヒト正常心筋組織から精製した全ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α−３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識することもできる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することによりＲＮＡのみを分解し一本鎖ｃＤＮＡを精製する。この一本鎖ｃＤＮＡと、ヒト心不全患者心筋組織から抽出したＲＮＡとを混合し、適当な条件下で静置すると、ヌクレオチド配列の相補性より安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する。すなわち、ヒト心不全患者心筋組織でも発現している全ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡはハイブリッドを形成するが、ヒト正常心筋組織に特異的に発現しているＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。次いで、ハイドロキシアパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと一本鎖ｃＤＮＡとを分離し、一本鎖ｃＤＮＡのみを精製する。このステップを繰り返すことで目的とした組織に特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。濃縮された特異的ｃＤＮＡは放射性同位元素等で標識されている場合は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用することができる。なお、この操作は市販のキット（例えば、ＰＣＲセレクトｃＤＮＡサブトラクションキット：クローンテック社製等）を利用して行うこともできる。
【００２９】
ｂ）ディファレンシャル・ディスプレイ法：
Ｌｉａｎｇらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９９２）　２５７，　９６７−９７１）に準じ、例えば、以下のように実施できる。まずヒト正常心筋組織およびヒト心不全患者心筋組織各々からｍＲＮＡ（または全ＲＮＡ）を抽出し、逆転写酵素を用いてこれを一本鎖ｃＤＮＡに変換する。次いで、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行う。プライマーとしては、例えば、ランダムプライマー（任意の配列からなる約１０〜１２ｍｅｒのプライマー）を用いることができる。あるいは、アンカードプライマー（ａｎｃｈｏｕｒｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ）およびアービトラリープライマー（ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｐｒｉｍｅｒ）各一種ずつを組み合わせて用いてもよい。アンカードプライマーとしては、オリゴｄ（Ｔ）ｎＶＸ［ｎ＝１１〜１２；Ｖ＝グアニン、アデニンまたはシトシン；Ｘ＝グアニン、アデニン、チミンまたはシトシン］からなるプライマーを用いることができる。また、アービトラリープライマーとしては、任意の配列からなる約１０ｍｅｒのランダムプライマーを用いることができる。このようなＰＣＲを、種々のプライマーを組み合わせて行うことで、より広い範囲の遺伝子群をスクリーニングすることが可能となる。続いて、得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動し、ゲル上に展開（ディスプレイ）される全ＲＮＡの発現パターン（フィンガープリント）を比較解析することにより、いずれかのヒト由来の心筋組織で特異的に発現している遺伝子を選択し、そのｃＤＮＡ断片を単離することができる。なお、この方法は、市販されているキット（例えば、ＲＮＡイメージ・キット：ジェンハンター社製等）を用いて行うこともできる。
【００３０】
ｃ）ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法：
目的の組織から精製した全ＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを、目的組織および対照組織の全ＲＮＡから合成した３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブでスクリーニングし、目的組織のプローブとのみハイブリダイズするクローンを選択する方法である。例えば、まずヒト正常心筋組織から精製した全ＲＮＡから常法に従いｃＤＮＡライブラリーを作製し、そのライブラリーから２組のレプリカフィルターを作製する。次に、ヒト正常心筋組織から精製した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α−３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識する。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することにより全ＲＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製する。同様に、ヒト心不全患者心筋組織から精製した全ＲＮＡを鋳型に３２Ｐで標識された一本鎖ｃＤＮＡを作製する。両標識ｃＤＮＡをそれぞれプローブとして、ヒト正常心筋組織ライブラリーから作製したフィルターとハイブリダイゼーションを行う。Ｘ線フィルムのオートラジオグラフィー像を比較し、ヒト正常心筋組織または心不全心筋組織由来ｃＤＮＡプローブの一方にのみハイブリダイズするクローンを選ぶことにより、ヒト正常心筋組織に特異的に発現する遺伝子（すなわち、ヒト心不全患者心筋組織において発現がないかまたは低下している遺伝子）、またはヒト心不全心筋組織に特異的に発現する遺伝子（ヒト心不全患者心筋組織において発現が亢進している遺伝子）をクローニングすることができる。
【００３１】
ｄ）クロスハイブリダイゼーション法：
ヒト正常心筋組織またはヒト心不全患者心筋組織のいずれかに由来するｃＤＮＡライブラリーに対して、適当なＤＮＡをプローブとして、ストリンジェンシーの低い条件でハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得る。得られた陽性クローンをプローブとして、ヒト正常心筋組織およびヒト心不全患者心筋組織のそれぞれに由来する全ＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行い、一方にのみ発現しているクローンを選択する。
【００３２】
こうして得られたｃＤＮＡをプローブとして、ヒト正常心筋組織またはヒト心不全患者心筋組織由来の全ＲＮＡに対してノーザンブロッティングを行うことにより、選択した遺伝子の全ＲＮＡが、ヒト正常心筋組織で特異的に発現していることを確認できる。かくして、ヒト正常心筋組織全ＲＮＡにおいて高発現している遺伝子のｃＤＮＡを単離・取得することができる。
【００３３】
ｅ）ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法
予め心不全との関連が予測される遺伝子について、該遺伝子が心不全の病態予測用マーカーになりうるか否かを検討したい場合、ＲＴ−ＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ）法は微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できる。
【００３４】
リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ）法では、５’端は蛍光色素（レポーター）で、３’端は蛍光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を定量する。
【００３５】
（３）評価・判定
上記解析の結果、ヒト心不全患者心筋組織由来の全ＲＮＡとヒト正常心筋組織由来の全ＲＮＡとの間で発現量が著しく異なる遺伝子をヒト心不全の病態予測用マーカー遺伝子として特定する。ここで、「著しく異なる」とは、両者の発現量が少なくとも２倍以上、好ましくは５倍以上異なることを意味する。
【００３６】
但し、遺伝子の特性によっては、上記とは異なった判定基準を適用する。例えば、Ｇ−タンパク質共役受容体：ＧＰＣＲ（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、７回膜貫通部位を持つレセプター蛋白質であり、種々の生理機能に関与していることが報告されている。そして、様々な疾患の治療用薬剤が、このＧＰＣＲの活性に影響を与えることにより作用する。したがって、ＧＰＣＲは創薬標的として重要と考えられ、ヒト心臓で発現、または心不全病態と関連して発現が変化するＧＰＣＲ遺伝子は心不全の治療に有用である可能性が高い。そこで、ＧＰＣＲについては、ヒト心不全患者心筋組織由来の全ＲＮＡとヒト正常心筋組織由来の全ＲＮＡとの間で発現量が有意に変化する遺伝子（例えば、心不全群と正常群の発現量の平均値に有意差がある（ｐ＜０．０５）遺伝子）と、心不全、正常を問わず、解析した心臓ＲＮＡサンプルの全てに共通して発現している遺伝子（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ　Ｇｅｎｅ　Ｃｈｉｐによって計測される遺伝子発現量の絶対値であるＡｖｅｒａｇｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅが５０以上である遺伝子）をマーカー遺伝子として特定する。
【００３７】
こうして、特定されたマーカー遺伝子としては、例えば、配列番号１〜１６のいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子を挙げることができる。該遺伝子に関する詳細な情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の遺伝子配列データベースから入手可能である。
【００３８】
なお、上記マーカー遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録情報は、本願の優先日である２００２年２月２８日および２００２年４月１５日の時点と、本願出願時の２００３年２月時点では若干の相違がある。そこで、それらの対応を図１にまとめた。
【００３９】
１．２　マーカー遺伝子の検定
上記のようにして特定されたマーカー遺伝子は、心筋由来の細胞で該遺伝子を高発現させ、ヒト心不全患者心筋組織と同様の表現型の変化が現れるか否か、あるいはヒト心不全患者心筋組織の表現型の変化が復帰するか否かを検定することができる。該検定は、例えば、以下のようにして実施できる。
【００４０】
まず、特定された遺伝子断片をプローブとして、ヒト心筋組織由来のｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡを、正常動物心筋組織に導入して高発現させ、その動物にヒト心不全患者心筋組織と同様の表現型が表れるか否かを検討する。
【００４１】
ｃＤＮＡを動物個体内で高発現させるためには、得られた完全長ｃＤＮＡをウイルスベクターに組み込み、動物に投与する方法が挙げられる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス、またはＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。具体的には、市販のキット（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット：宝酒造（株）社製等）を利用する方法を例示することができる。
【００４２】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。なかでも、ＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００４３】
また、培養細胞レベルでは、完全長ｃＤＮＡをヒト、マウス、ラット心筋組織由来の株化された細胞、ラット新生児心筋組織由来初代培養細胞、心筋組織細胞に分化誘導したマウスＥＳ細胞等へ導入し高発現させて、ヒト心不全患者心筋組織と同様の表現型の変化が表れるか否かを検討することができる。逆に、試験する遺伝子の全ＲＮＡ配列に対するアンチセンス核酸を、ヒト心不全患者心筋組織の病態を反映する表現型の変化が検出可能な細胞へ導入し、該表現型が改善されるか否かを検討する（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，　Ｅ．　ｅｄ．　（１９９１）　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ．　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．　Ｆｉｅｌｄ，Ａ．　Ｋ．　ａｎｄ　Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，　Ｊ．　（１９９５）　Ｅｘｐ．　Ｏｐｉｎ．ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｒｕｇｓ．　４，　７９９−８２１）こともできる。
【００４４】
完全長ｃＤＮＡを動物または細胞に導入するにあたっては、適当なプロモーターおよび形質発現に関わる配列を含むベクターに該ｃＤＮＡを組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換させる。脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１，　８５４−８６４）等が挙げられる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）等により細胞に導入することができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００４５】
また、遺伝子操作により、正常心筋組織において対象とする遺伝子が高発現するように、トランスジェニック動物を作製し、病態が出現するか否かを検討することも可能である。逆に、心不全心筋組織において試験する遺伝子を破壊したノックアウト動物を作製し、その病態が改善されるか否かを検討することも可能である。前記トランスジェニック動物は、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し発生させることにより得ることができ、その手順は公知の方法［発生工学実験マニュアル（野村達次　監修、勝木元也　編、１９８７年刊）、マウス胚の操作マニュアル（”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”　Ｂ．　Ｈｏｇａｎ，　Ｆ．　Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ　ａｎｄ　Ｅ．　Ｌａｃｙ著、山内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎　訳、１９８９年刊）、特公平５−４８０９３号公報等参照］に従えばよい。具体的には、例えば、マウスの場合であれば、まず雌マウスに排卵誘起剤を投与後、同系統の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるための、プロモーターやエンハンサー等の調節遺伝子は、導入された動物の細胞内で機能するものであれば特に限定されない。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩または帝王切開により出生させる。
【００４６】
こうして得られた動物が、導入遺伝子を保持していることを確認する方法としては、例えば：前記動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡをこれに特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅する方法、該ＤＮＡを数種の制限酵素で消化後ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜やナイロン膜等にブロッティングした後、標識した導入遺伝子の全部または一部をプローブとしてサザンブロット解析を行なう方法等、を挙げることができる。
【００４７】
一方、上記工程の結果、ヒト心不全患者心筋組織においてヒト正常心筋組織より発現量が著しく少ない（発現していない場合も含む）と判定された遺伝子断片の場合も、同様に、まず該遺伝子断片をプローブとして、ヒト心筋組織由来のｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡを取得する。
【００４８】
そして、この完全長ｃＤＮＡを心不全動物心筋組織に導入して高発現させ、その動物の表現型の変化が復帰するか否か（例えば、表現型の変化が疾患である場合は、症状が改善するか否か）を検討する。培養細胞レベルでは、完全長ｃＤＮＡをヒト正常心筋組織またはヒト心不全患者心筋組織から単離または株化された細胞へ導入し、高発現させることにより、表現型の変化を反映する現象が復帰するか否かを検討する。あるいは逆に、試験する遺伝子の全ＲＮＡ配列に対するアンチセンス配列を有する一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ（Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ、２００１年１月１５日、第１５巻、第２号、ｐ１８８−２００）を、正常心筋組織由来の細胞に導入し、心不全心筋組織と同様の表現型の変化が現れるか否かを検討する。なお、遺伝子導入は前述の方法に従って実施することができる。また、遺伝子操作により、ヒト心不全患者心筋組織で対象とする遺伝子が高発現するように、トランスジェニック動物を作製し、病態が改善されるか否かを検討することもできる。同様に、ヒト正常心筋組織において試験する遺伝子を破壊したノックアウト動物を作製し、その病態が出現するか否かを検討することもできる。
【００４９】
２．心不全の病態予測用マーカー蛋白質
本発明にかかる「心不全の病態予測用マーカー蛋白質」とは、ヒト心不全の病態を予測するための指標として用いられる蛋白質を意味し、本発明のマーカー遺伝子によってコードされる蛋白質である。該蛋白質は、具体的には、配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列によって特定されるポリペプチドからなる。本発明は、この心不全の病態予測用マーカー蛋白質、および該マーカー蛋白質の心不全の病態予測、治療または予防のための使用を提供する。なお、本明細書中において、「蛋白質」という言葉には、ポリペプチドのみならず、これに糖鎖等が付加されたものも含むものとする。
【００５０】
なお、上記マーカー蛋白質のＧｅｎＢａｎｋ登録情報は、本願の優先日である２００２年２月２８日および２００２年４月１５日の時点と、本願出願時の２００３年２月時点では若干の相違がある。そこで、それらの対応を図１にまとめた。
【００５１】
３．心不全の病態予測方法
本発明のマーカー遺伝子および本発明のマーカー蛋白質の発現量は、心不全の病態や予後を反映する。従って、検体中の該遺伝子または該蛋白質の発現量を定量することにより、心不全の病態を予測し、心不全の診断に利用することができる。なお、「検体」とは、被験者や臨床献体等から単離された、血液、体液、組織または排泄物等の試料を意味するが、本発明のマーカー遺伝子を利用した予測方法の場合は、心筋組織または心筋細胞が好ましい。また、本発明のマーカー蛋白質を利用した予測方法の場合は、血液または心筋組織が好ましく、血清または心筋組織細胞抽出液がより好ましい。
【００５２】
例えば、正常心筋組織に対する検体中のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白質の発現変動が、心不全患者由来心筋組織における発現変動と類似している場合、当該患者は心不全または心不全になる確率が高いと予測される。また、個々の患者について、該マーカー遺伝子やマーカー蛋白質の発現変動を経時的に観察すれば、該患者の予後を予測することができる。
【００５３】
３．１　マーカー遺伝子を利用した病態予測方法
本発明のマーカー遺伝子を利用した病態予測方法は、具体的には、以下の工程１）〜３）を含む：
１）単離された心筋組織または心筋細胞を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する；２）上記検体由来全ＲＮＡとヒト正常心筋組織由来全ＲＮＡの間における、本発明の各マーカー遺伝子の発現量の相違を検出する；
３）上記各マーカー遺伝子の発現量の相違を解析し、検体提供者の心不全の病態を予測する。
【００５４】
ここで、工程１における全ＲＮＡの抽出は、１．１に示した方法に従って実施することができ、抽出された全ＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが好ましい。また、工程２におけるマーカー遺伝子発現量の検出も、１．１に示した方法に従って実施することができるが、特に、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法を用いて実施することが簡便で好ましい。なお、「発現量の相違」は、検体とヒト正常心筋組織における遺伝子発現量を定量的に比較できる限り、発現量差であっても、発現量比であってもよい。
【００５５】
工程３における予測は、特定のマーカー遺伝子について個別に評価して行うことも可能であるが、複数のマーカー遺伝子について、その発現量の相違を総合的に評価して行うことが好ましい。
【００５６】
３．２　マーカー蛋白質を利用した病態予測方法
本発明のマーカー蛋白質を利用した病態予測方法は、具体的には、以下の工程１）〜３）を含む：
１）単離された血液または心筋細胞を含む検体中のポリペプチドを固相化する；２）上記固相化ポリペプチドにおける、本発明の各マーカー蛋白質の発現量を該マーカー蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）上記検体とヒト正常心筋組織の間における、各マーカー蛋白質の発現量の相違を解析し、心不全の病態を予測する。
【００５７】
前記予測方法の好適な態様として、抗体を利用した方法について説明する。まず、試料中のポリペプチドを９６穴プレートのウェル内底面やメンブレン等に固相化しておいてから、該マーカー蛋白質を特異的に認識する抗体を用いて検出する。９６穴プレートに固相化する方法としては、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）等が挙げられる。一方、メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミド電気泳動を経てメンブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロット法）か、または直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませるドットブロット法やスロットブロット法が挙げられる。
【００５８】
ｉ）試料の調製
試料としては、心不全または正常のヒト全血または血清または心筋組織細胞抽出液が好ましく、血清または心筋組織細胞抽出液がより好ましい。該全血、血清または心筋組織細胞抽出液は、必要に応じて高速遠心を行うことにより不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料は、例えば、回収した血清をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば、心筋組織細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合したものを用いる。ドット／スロットブロット用試料は、例えば、回収した心筋組織細胞抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用する等して、直接メンブレンへ吸着させたものを用いる。
【００６０】
ｉｉ）試料の固相化
上記のようにして得られた試料中のポリペプチドを特異的に検出するため、該ポリペプチドを固相化する。ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法に用いられる固相としては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【００６１】
電気泳動後のゲルからメンブレンにポリペプチドを移す、いわゆるブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｖｏｌｕｍｅ　２　ｅｄ　ｂｙ　Ｊ．　Ｅ．　Ｃｏｌｉｇａｎ，　Ａ．　Ｍ．　Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，　Ｄ．　Ｈ．　Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，　Ｅ．Ｍ．　Ｓｈｅｖａｃｈ，　Ｗ．　Ｓｔｒｏｂｅｒ）、セミドライ式ブロッティング法（上記ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｖｏｌｕｍｅ　２　参照）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材は市販のもの（例えば、バイオ・ドット（バイオラッド）等）を用いることができる。
【００６２】
一方、ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば、０．０５％　アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃〜室温で一晩、または３７℃で１〜３時間静置することにより、ウエル底面にポリペプチドを吸着させて固相化する。
【００６３】
ｉｉｉ）抗体
用いられる抗体は、本発明のマーカー蛋白質またはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体としては、例えば、前記ポリペプチドのいずれにも結合するが、他のいかなるマウスまたはヒト由来の蛋白質とも結合しないような抗体を挙げることができる。
【００６４】
前記抗体は、常法により（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、ｐ．３８９−３９７、１９９２）、抗原となる蛋白質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５−４９７，　１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，　Ｒ．　ｅｄ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐ．３６５−３６７，　１９８０，　Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎ．Ｙ．）に従って、本発明の蛋白質に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、これよりモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００６５】
抗体作製用の抗原としては、本発明のマーカー蛋白質またはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。なかでも、本発明のマーカー蛋白質のＮ末端に、キーホールリンペットヘモシアニンを担体として結合させたものが好ましい。
【００６６】
前記抗原ポリペプチドは、本発明のマーカー蛋白質を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、本発明のマーカー遺伝子の発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させればよい。
【００６７】
前記宿主細胞としては、原核細胞であれば、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。該ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与しうる配列を有するものが好ましい。
【００６８】
例えば、大腸菌であれば、Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株やベクターを使用できる。また、大腸菌で用いられるプロモーターとしては、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等を挙げることができ、いずれも好適に用いることができる。
【００６９】
また、枯草菌であれば、２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９５，　８７−９３）等が用いられるが、これに限定されるものではない。なお、ベクターに枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００７０】
真核細胞の宿主細胞としては、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が挙げられる。脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，　Ｌ．　Ａ．　（１９８０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ７７，　４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００７１】
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用できる。さらに、これは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１，　８５４−８６４）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を備えたものを好適に用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００７３】
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　：　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｐ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｐ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１，　３２７−３４１）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００７４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，　Ｔ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ，　（１９９２）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．ｉ：　３９１−３９６）等が宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，ｉ．　Ｍ．　ａｎｄ　Ｖ．Ｃ．　Ｅｍｅｒｙ　（１９９３）　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４２０３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ　Ｗａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３７９，　１６７−１７４）。
【００７５】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えば、パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈａｌｌ，　Ｂ．　Ｄ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５７，　３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０，　１−５）等を好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現させることも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，　Ｌ．　Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２８，
１２５−１３１）。
【００７６】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択できる。例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）等の培地に、必要に応じウシ胎児血清等の血清成分を添加したものを使用できる。
【００７７】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した公知の分離操作法により、分離・精製することができる。該方法としては、例えば、タンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、を単独あるいは組合せて利用できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げれば、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。目的とするポリペプチドは、以上記載した方法を適宜組み合わせることにより、容易に高収率、高純度で製造できる。
【００７８】
上記のようにして得られる抗体は、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法等の各種免疫学的測定法や免疫組織染色等に用いることができる。
【００７９】
ｉｖ）検出
上記ｉｉｉ）記載の方法で得られる抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該一次抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
【００８０】
前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）が、各種市販されている。なお、ＲＩＡの場合はＩ１２５等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
【００８１】
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原であるポリペプチドの量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
【００８２】
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば、目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウエルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定し、定量することが好ましい。また上記３）において抗体作製に使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行い、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することも可能である。
【００８３】
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
【００８４】
ｖ）測定操作
ａ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば、５％　スキムミルク、０．０５〜０．１％　ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１〜１０％のウシ血清アルブミン、０．５〜３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６〜２４時間、または室温で１〜３時間である。
【００８５】
次に、メンブレンを０．０５〜０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記３）記載の方法で作製された抗体をブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に一定時間浸して、抗体をメンブレン上の抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合はブロッキング溶液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で４５分〜１時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【００８６】
ｂ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
まず、上記２）の方法で試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
【００８７】
次に、ウェル内を０．０５〜０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーションし、抗体を抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１〜３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【００８８】
例えば、本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは以下に記載する方法により実施することができる。まず、本発明のマーカー蛋白質の各アミノ酸配列より、親水性に富む領域をそれぞれ２箇所選択する。次に、各領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を上記４）記載のように標識しておく。標識しなかった方の抗体は、上記２）記載の方法に準じて９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【００８９】
ｖｉ）評価
以上に記載した方法で、心不全由来の試料と、正常心筋由来の試料との間で検出結果を比較し、その結果上記ｉｉｉ）記載の方法で作製された抗体が特異的に結合するポリペプチドの量を各マーカー蛋白質の発現量として、心不全の病態を予測することができる。なお、該予測は、特定のマーカー蛋白質について個別に評価して行うことも可能であるが、複数のマーカー蛋白質について、その発現量を総合的に評価して行うことが好ましい。
【００９０】
４．心不全の病態予測用キット
本発明は、また、本発明のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白質の発現を指標とした、心不全の病態予測方法に用いられるキットを提供する。
【００９１】
前記キットは、以下のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる少なくとも１以上を含む。
ａ）配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
【００９２】
前記ａ）記載のプライマーは、本発明のマーカー遺伝子の塩基配列（配列番号１〜１６）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。また、前記ｂ）記載のプローブは、本発明のマーカー遺伝子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、２０〜１５００塩基長程度のものが好ましい。具体的には、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、２０塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドか２本鎖ＤＮＡが好適に用いられる。また、マイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基長程度の２本鎖ＤＮＡ、または２０〜１００塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。一方、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ　Ｃｈｉｐシステムは２５塩基長程度の１本鎖オリゴがよい。これらは、特に本発明のマーカー遺伝子の３’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
【００９３】
前記ｃ）記載の固相化試料は、前記ｂ）記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料とその作製方法については、既に１．１で説明したが、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【００９４】
前記ｄ）およびｅ）記載の抗体は、３．２に記載した方法により作製することができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
【００９５】
本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、ラベル体の検出等、本発明にかかる心不全の病態予測方法に必要な試薬等を適宜含んでいてもよい。
【００９６】
５．心不全の治療用組成物
心不全患者心筋組織において正常心筋組織よりも発現が低下している本発明のマーカー遺伝子（例えば、配列番号５）は、該遺伝子の全オープンリーディングフレーム配列を、公知の方法に従い、心不全患者の心臓または他の組織に導入・発現させることにより、該遺伝子の発現不足による病態を治療することができる。同様の効果は、該遺伝子がコードする本発明のマーカー蛋白質を心不全患者に導入することによっても達成しうる。
【００９７】
また、心不全患者心筋組織において正常心筋組織よりも発現が増加している本発明のマーカー遺伝子（配列番号１〜４および配列番号６〜１６）は、アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ等の方法により該遺伝子の発現を抑制することにより、該遺伝子の発現過剰による病態を治療することができる。同様の効果は、該遺伝子がコードする本発明のマーカー蛋白質を特異的に認識・中和する抗体分子、該蛋白質のドミナントネガティブ体または該蛋白質の活性を特異的に阻害する物質等を、心不全患者に導入することによっても達成しうる。
【００９８】
５．１　遺伝子導入による心不全の治療
心不全患者心筋組織において正常心筋組織よりも発現が低下しているマーカー遺伝子の全オープンリーディングフレーム配列を組換えベクター（ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｖｅｃｔｏｒ）に挿入し、心筋細胞で発現させることにより、心不全患者における該遺伝子の発現低下を正常状態に回復させることができる。
【００９９】
ここで、使用されるベクター・プロモーター系は、ヒト心筋細胞に対する遺伝子導入が可能であるものが望ましい。例えば、ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクタ一等のウイルスベクターが挙げられる。ウイルス以外のベクターとしてはリン醸カルシウムと核酸の複合体、リボソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等も使用可能である。さらに、エレクトロポレーション、遺伝子銃等の方法も遺伝子導入に用いてもよい。
【０１００】
前記プロモーターは、心筋細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に限定されない。例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンドビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターが挙げられる。その他、シュードタイプのウィルスベクターを用いても良い。その一例としては、ＨＩＶの外皮蛋白質であるＥｎｖ蛋白質を、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮蛋白質であるＶＳＶ−Ｇ蛋白質に置換したシュードタイプウイルスベクターがある（Ｎａｌｄｉｎｉ　Ｌ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２　２６３（１９９６））。
【０１０１】
５．２　蛋白質投与による心不全の治療
心不全患者心筋組織において正常心筋組織よりも発現が低下しているマーカー遺伝子がコードする蛋白質を患者に投与することにより、心不全の治療を行うことができる。
【０１０２】
まず、前記遺伝子の全オープンリーディングフレーム配列を適当なベクター・プロモーター系に連結し、宿主細胞系に遺伝子導入して目的とする蛋白質を産生させ、抽出・精製して該遺伝子がコードする蛋白質を入手する。
【０１０３】
前記ベクターとしては、前項のベクター・プロモーター系で列挙したもののうち哺乳類、特にヒト細胞に遺伝子導入可能なベクターが挙げられる。同様に、使用可能なプロモータとしては、前項のベクター・プロモーター系で列挙したもののうち哺乳類、特にヒト細胞で遺伝子発現が可能なプロモータが挙げられる。また、Ｌａｃプロモーター等大腸菌宿主内で発現可能なプロモーターも使用できる。
【０１０４】
前記宿主細胞系としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、大腸菌、発育鶏卵等が挙げられる。さらに、遺伝子導入した宿主細胞系から産生された蛋白質を抽出する方法としては、例えば、細胞をホモジュナイズする方法、ＳＤＳ等の界面活性剤や酵素を用いて細胞膜を溶解させる方法、超音波処理、凍結・融解を繰り返す方法等が挙げられる。いずれの方法で得られた蛋白質も、常法により精製できる。例えば、超遠心や密度勾配遠心を利用した遠心分離、イオン交換カラムやアフィニティーカラム（例えば、前述の特異的な抗体を用いる）、逆相カラム等を利用したカラム分離、ポリアクリルアミドゲル等を用いたゲル分離等、一般的な生化学的手法が精製に利用できる。
【０１０５】
上記のようにして製造、精製された蛋白質は、公知の方法に従って、薬学的に許容される担体或いは希釈剤と混合され、薬学的に有用な組成物に製剤化することができる。前記薬学的組成物は、一または複数の治療的に有効な量の前記ポリペプチドを含んでなる。適当な担体、および希釈剤については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されている。
【０１０６】
前記蛋白質に関して、投与に適した剤型は特に限定はされないが、既に医薬として使用されている多くのヒト蛋白質を含む薬学的組成物と同様に注射剤として調製されることが好ましい。より具体的に言えば、ポリペプチドを、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤とする。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護材として添加して調製可能である。また，リボソーム等の封入体にポリペプチドを包埋させて投与することも可能である。
【０１０７】
５．３　遺伝子の発現抑制による心不全の治療
心不全患者心筋組織において正常心筋組織よりも発現が増加しているマーカー遺伝子の翻訳を、アンチセンス核酸、リボザイムまたはｓｉＲＮＡを用いて阻止し、心不全患者における該遺伝子の発現上昇を正常状態に回復させることができる。
【０１０８】
前記アンチセンス核酸は、前記遺伝子（ｍＲＮＡ分子）の少なくとも一部に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子として設計される（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９９０；　Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８　参照）。アンチセンス核酸は細胞中でｍＲＮＡとハイブリッド形成し、２本鎖分子を生じ、該ｍＲＮＡの翻訳を阻止することにより、転写産物である蛋白質の発現を妨害する。こうしたアンチセンス法は、従来より多数実施されている（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８；　Ｈａｍｂｏｒら，１９８８）。
【０１０９】
前記リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに似た方法で、他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。ＲＮＡのヌクレオチド配列を適当に修飾すれば、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を認識しかつ切断するＲＮＡ分子をつくることもできる（Ｃｅｃｈ，１９８８）。リボザイムは配列特異的であるため、特定な配列を有するｍＲＮＡのみを失活させることができる。リボザイムは、テトラヒメナ型、およびハンマーヘッド型の２種類が同定されている（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ　＆　Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８）。テトラヒメナ型リボザイムは４塩基配列を認識し、ハンマーヘッド型は１１〜１８塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、標的ｍＲＮＡ鎖に対する特異性は高いといわれている。従って、ハンマーヘッド型リボザイムは、特定のｍＲＮＡ鎖を失活するテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、特に１８塩基以上の認識配列を有するものがより好ましい。
【０１１０】
前記ＲＮＡｉ（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、ｍＲＮＡと相補的な配列を有するｓｉＲＮＡがｍＲＮＡと結合することにより細胞内に二本鎖ＲＮＡが生じ、配列特異的にｍＲＮＡが切断、不活性化される現象である。二本鎖ＲＮＡはＲＮａｓｅＩＩＩタイプのエンドヌクレアーゼ（Ｄｉｃｅｒ）によって細胞内で速やかに分断され、ｍＲＮＡの相補的配列部分に結合してＲＮＡプロセッシング複合体を形成する。該複合体はその塩基対の中央でＲＮＡを切断し、標的ｍＲＮＡを不活化する。
【０１１１】
６．心不全の治療または予防剤としての効果を試験する方法。
本発明はまた、本発明のマーカー遺伝子を利用することにより、多数の被検物質から、心不全の治療または予防剤としての可能性を有する物質を機能的に同定するための試験方法を提供する。該試験方法において、被験物質は　▲１▼本発明のマーカー遺伝子の発現を亢進または抑制させたときに現れる表現型の変化、あるいは、▲２▼ヒト心不全病態を反映した培養細胞またはモデル動物における該マーカー遺伝子やマーカー蛋白質の発現量、を指標として評価される。該マーカー遺伝子やマーカー蛋白質は、元々細胞中に存在する内在性のものを利用してもよいし、人為的に導入した外来性のものを利用してもよい。
以下、これらの試験方法について、具体的に説明する。
【０１１２】
６．１　レポーター遺伝子を指標とした方法
既知の心不全関連遺伝子（心不全の病態依存的に発現が促進される遺伝子）のプロモーター支配下に、該プロモーター活性の検出を可能にする遺伝子（以下「レポーター遺伝子」という）を組み込んだ発現プラスミドを作製する。次いで、（ｉ）上記レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明のマーカー遺伝子を哺乳類細胞で発現可能にした組換えベクターを同時トランスフェクションした群、
（ｉｉ）上記レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明のマーカー遺伝子を含まない上記組換えベクターを同時トランスフェクションした群、
の２つの細胞群を作製する。心不全の治療または予防剤としての可能性は、各群の細胞培養時に被検試料を添加し、上記各群の該レポーター遺伝子の発現量に差異が現れるか否かによって評価することができる。例えば、本発明のマーカー遺伝子によってコードされるマーカー蛋白質の産生が促進されるような条件下で、該レポーター遺伝子の発現を強く抑制する被験試料は、心不全の治療または予防剤として有用な可能性が高い。
【０１１３】
前記試験方法で用いられる動物細胞は、本発明のマーカー遺伝子を哺乳類細胞で発現可能にする組換えベクターをトランスフェクションした場合に、該レポーター遺伝子の発現量が亢進するものでなければならない。また、（ｉ）群における該レポーター遺伝子の発現量と（ｉｉ）群における発現量の差が大きいものほど好ましい。そのような細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞を挙げることができるが、これに限定されない。
【０１１４】
前記試験方法で用いられる、本発明のマーカー遺伝子を哺乳類細胞で発現させるためのベクターとしては、ｐＣＲ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。また、レポーター遺伝子の転写を開始させるためのプロモーターとしては、例えば、ヒト心不全において血中濃度の上昇する蛋白質（例えばＡＮＰ、ＢＮＰ）をコードする遺伝子のプロモーター領域等を挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
上記レポーター遺伝子は、宿主細胞が本試験方法の一連の過程において産生し得る他のいかなるタンパク質とも特異的に区別可能な、レポーター蛋白質をコードするものであればよい。好ましくは、形質転換前の細胞が該レポーター蛋白質と同一または類似のタンパク質をコードする遺伝子を持たないようなものがよい。例えば、レポーター蛋白質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、レポーター遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるレポーター遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば、該レポーター遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。より好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子としては、例えば、以下のタンパク質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【０１１６】
ａ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：
クロラムフェニコールにアセチル基を付加する酵素で、いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出することができる。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとして、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
【０１１７】
ｂ）ホタルルシフェラーゼ：
ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量できる。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
【０１１８】
ｃ）β−ガラクトシダーゼ：
呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている。
【０１１９】
ｄ）分泌型アルカリホスファターゼ：
呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている。
【０１２０】
ｅ）緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）：
酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
【０１２１】
本発明の試験方法において、培養細胞株に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）、リポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　５７０７−５７１７，　Ｓｕｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ　（１９８４）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４，　１６４１−１６４３）等を挙げることができるが、これらに限定されず、本発明の属する技術分野において汎用される任意の方法を採用することができる。ただし、培養細胞株がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いることが必要である。
【０１２２】
かくして、本発明のマーカー遺伝子の発現ベクターと、レポーター発現ベクターを同時トランスフェクションした細胞を培養すると、該マーカー遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、該被験物質の心不全の治療または予防剤としての効果が評価できる。ここで、「レポーター遺伝子の発現が可能な条件」とは、細胞が生存して、タンパク質の生産が可能な条件であればよい。好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）で、４〜６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６〜３８℃（最も好適には３７℃）で２〜３日間（最も好適には２日間）培養する。
【０１２３】
以上のような、一過的な遺伝子導入法を利用した試験方法とは別に、レポーター遺伝子、および本発明のマーカー遺伝子の発現ベクターで、宿主細胞を二重に形質転換した細胞を利用した試験方法も採択可能である。この場合には、ｐＩＮＤ（インビトロジェン社製）やｐＴｅｔ−Ｏｎ（クロンテック社製）等の発現ベクターを利用して、本発明のマーカー遺伝子の発現を誘導する条件下で該レポーター遺伝子の発現が促進されるような細胞株を樹立することが必要となる。かかる形質転換細胞の作出においては、導入される遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれるなどして、宿主細胞の継代を重ねても安定的に保持されることが望ましい。そのように形質転換された細胞を選択するために、導入遺伝子に抗生物質耐性等の選択マーカー（例えば、ネオマイシン（またはＧ４１８）耐性遺伝子ｎｅｏ等）を連結してトランスフェクションしたり、もしくは別個に調製した該選択マーカーと導入遺伝子とを同時トランスフェクションすることが好ましい。その後は、該選択マーカーの特性を利用することにより、安定的に形質転換された細胞を選択することができる。
【０１２４】
こうして得られた細胞株を、本発明のマーカー遺伝子の発現が誘導される条件下におくと、該マーカー遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、該被験物質の心不全の治療または予防剤としての効果が評価できる。すなわち、本発明のマーカー遺伝子の発現が促進されるような誘導条件下で、該レポーター遺伝子の発現を強く抑制する被験試料は、心不全の治療や予防剤として有用な物質であると考えられる。
【０１２５】
６．２　培養細胞における表現型の変化を指標とした方法
心筋組織由来の細胞、または他の筋肉由来細胞、心筋に分化誘導したＥＳ細胞・幹細胞等のこれに類する細胞に、本発明のマーカー遺伝子を強制発現させるか、本発明のマーカー蛋白質を外部から作用させる。こうして現れる、心不全につながると考えられる表現型の変化を確認し、その変化を指標として、心不全の治療または予防剤として有用な物質として評価することができる。なお、表現型の変化としては、例えば、ＡＮＰやＢＮＰをコードする遺伝子等の既知の心不全病態関連遺伝子の発現変動、細胞の形態変化、総蛋白質の変化等を挙げることができる。具体的には、本試験方法は、１．２のマーカー遺伝子の検定や３．の病態予測方法で説明した方法にしたがって実施することができる。
【０１２６】
６．３　トランスジェニック動物における表現型の変化を指標とした方法
本発明のマーカー遺伝子を導入したトランスジェニック動物（例えば、マウス等）を作製し、心筋特異的発現プロモーターを利用して心筋組織特異的に発現させることにより、ヒト心不全に類似した変化が現れれば、該動物を利用して心不全の治療や予防に有用な物質を探索することができる。あるいは、本発明のマーカー遺伝子に対するリボザイムやＲＮＡｉを動物に導入して、ヒト心不全に類似した変化が惹起できれば、該動物を利用して、心不全の治療や予防に有用な物質を探索することができる。なお、本発明のマーカー遺伝子はヒト由来の遺伝子であるため、前記トランスジェニック動物の作製にあたっては、例えばマウスであれば、該遺伝子のマウスオーソログを取得してこれを導入することになる。
【０１２７】
前記試験は、該遺伝子によってコードされるマーカー蛋白質やその抗体を直接動物に導入することによっても、行うことができる。具体的には、本試験方法は、１．２のマーカー遺伝子の検定や３．の病態予測方法で説明した方法にしたがって実施することができる。
【０１２８】
６．４　心不全病態モデル培養細胞におけるマーカー発現量を指標とした方法
心不全における心筋細胞の表現型の変化を、心筋由来細胞株（Ｈ９Ｃ２等、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４４６、骨格筋由来細胞（Ｌ６　ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４５８、Ｃ２Ｃ１２　　ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７７２）、心筋初代培養細胞等を用いて再現する。具体的には、１）アンジオテンシン、エンドセリン（ペプチド研究所製）等の神経液性因子の投与により、これらの因子の慢性的過剰によって生じる変化を再現、２）細胞を低酸素条件（１％以下）で培養することにより、虚血による心筋細胞の傷害を再現（アネロパックケンキｆｏｒ　Ｃｅｌｌ、三菱ガス化学株式会社製）、３）細胞をシリコン膜状で培養し、機械的に伸展させることにより、血圧負荷による細胞に対するストレスを再現する（培養細胞伸展システム　ストレッチＮ−３００、スカラッテック製）等の方法が挙げられる。このようにして得られた細胞を用い、１．１および３．２に記載した方法にしたがい、本発明のマーカー遺伝子、マーカー蛋白質の発現変動を確認し、この変動を指標として、心不全の治療または予防剤として有用な物質を評価することができる。
【０１２９】
６．５　心不全病態モデル動物におけるマーカー発現量を指標とした方法
各種の心不全モデル動物も利用可能である。該モデル動物としては、例えば、ダール食塩感受性ラット（日本ＳＬＣ、日本クレア）（Ｉｎｏｋｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．　１９９４；２６７：Ｈ２４７１−Ｈ２４８２，　Ｄｏｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．　２０００；１８：１１１−１２０）による高血圧負荷慢性心不全モデル、心筋症ハムスター（ＢＩＯ　ＢＲＥＥＤＥＲＳ、日本クレア）（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　１９９４Ｓｅｐ；９４（３）：１０５９−６８，　Ｂａｊｕｓｚ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ．　Ｈｅａｒｔ．　Ｊ．１９６９；７７：　６８６−６９６）等の自然発症モデルや、イヌにおけるＰａｃｉｎｇ心不全モデル（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１９８６；７４：　１０７５−１０８４）、冠動脈部分狭窄心不全モデル（Ｈａｒｒｉｓ，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１９５０；１：　１３１８−１３２８）、マウスにおける大動脈部分狭窄による圧負荷心不全モデル（Ｈｏｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１９９３；８７［ｓｕｐｐｌｅ　ＶＩＩ］：　ＶＩＩ−１４−ＶＩＩ−２１）等を用いることができる。これらのモデル動物の心筋組織を用い、１．１および３．２に記載した方法にしたがい、本発明のマーカー遺伝子、マーカー蛋白質の発現変動を確認し、この変動を指標として、心不全の治療または予防剤として有用な物質を評価することができる。
【０１３０】
なお、本発明のマーカー遺伝子およびマーカー蛋白質はヒト由来の配列であるため、前記細胞株、初代培養のうちヒト以外の動物に由来するもの、および各種心不全モデルの使用においては、例えば、マウスであれば、該遺伝子、蛋白質のマウスオーソログを取得し、これを用いることになる。
【０１３１】
７．心不全の治療または予防効果試験用キット
前記「心不全の治療または予防剤としての効果を試験する方法」のうち、６．４および６．５記載の方法は、本発明のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白質の発現量を指標として被験物質を評価する。したがって、該試験は、心不全の病態予測方法同様、以下のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる少なくとも１以上を含むキットを用いて実施することができる。
【０１３２】
ａ）配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
【０１３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【０１３４】
実施例１：ヒト心不全患者心筋組織からの全ＲＮＡの抽出
バチスタ手術により摘出されたヒト心不全患者左心室心筋組織片（６例、葉山ハートセンターより入手）は、摘出後ＲＮＡ　ｌａｔｅｒ　Ｒｅａｇｅｎｔ（アンビオン製）中に保存した。各組織片の重量を測定し、組織片０．３ｇに対し３ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社製）を加え、超高速ホモジナイザー（ポリトロン。キネマティカ社製）を用いて室温でホモジナイズを行った（目盛８で１分間）。これを室温で５分間静置した後、０．６ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間激しく転倒混和した。再び室温で３分間静置してから、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心後、上層を回収し、２．４ｍｌのリボヌクレアーゼ不含イソプロピルアルコールを加えて混和した。これを室温で１０分間静置後、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を除去してリボヌクレアーゼ不含７０％エタノールを加えた。これを１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去して、沈殿を乾燥させたのちに、リボヌクレアーゼ・デオキシリボヌクレアーゼ不含蒸留水（インビトロジェン社製）に溶解することにより、全ＲＮＡを得た。この全ＲＮＡ試料は、使用時まで−８０℃に保存した。
【０１３５】
実施例２：チップによる解析
＜試験方法＞
チップ（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｕ９５Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ：アフィメトリクス社製）による解析は、アフィメトリクス社の発現解析技術マニュアル（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ）に従って、以下のように行った。
ａ）ｃＤＮＡの合成
上記実施例１記載の方法で得られた全ＲＮＡ、およびヒト正常心筋組織由来全ＲＮＡ（バイオチェイン社製）各５μｇを出発材料として、上記マニュアルの記載に従ってｃＤＮＡの合成および精製を行った。
ｂ）ｃＲＮＡの合成
上記ａ）で得られたｃＤＮＡ　１μｇを鋳型として、上記マニュアルの記載に従ってｃＲＮＡの作製を行った（反応条件は３７℃、４．５時間とした）。この操作で得られたｃＲＮＡ　１０μｇを断片化し、プローブ溶液に加えた。
ｃ）プローブ溶液の作製
上記マニュアルの記載に従い、プローブ溶液を調製した。
ｄ）ハイブリダイゼーションおよび染色、スキャニング
上記ｃ）で得られたプローブ溶液をチップにハイブリダイゼーションさせた後、洗浄、染色、スキャニング操作を上記マニュアルの記載に従って行った。
ｅ）解析
上記ｄ）のスキャニングで得られたデータを、アフィメトリクス社製解析ソフトウェア　マイクロアレイスイート　Ｖｅｒ．４により解析し、ヒト正常心筋組織のデータを基準にしてヒト心不全患者左心室心筋で得られたデータと比較検討した。そして、２例以上の心不全サンプルにおいて、Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｇｅ値（遺伝子発現変動を示す値）が２以上（遺伝子発現が２倍以上上昇したことを示す）または−２以下（遺伝子発現量が１／２以下に低下したことを示す）である遺伝子を選択した。
【０１３６】
＜結果＞
心不全患者左心室心筋でヒト正常心筋組織よりも高発現している４種の遺伝子が見出され、そのＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒは表１のとおりであった。また、心不全患者左心室心筋でヒト正常心筋組織よりも発現が低下している遺伝子として１種の遺伝子が見出され、そのＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒは表２のとおりであった。
【０１３７】
【表１】
2004000155.tif 000002
【０１３８】
【表２】
2004000155.tif 000003
【０１３９】
実施例３：ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ法）による発現量の解析
＜試験方法＞
実施例２で得られたヒト心不全患者左心室心筋でヒト正常心筋組織よりも高発現していた遺伝子、および発現が低下していた遺伝子の発現変動をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲで測定した。
【０１４０】
ａ）材料
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲで用いるプライマーは、アマシャム・ファルマシア社またはインビトロジェン社に発注して作製した。また、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲに用いるプローブとして、その５’末端にレポーター色素Ｆａｍ、３’末端にレポーター消光体のＴａｍｕｒａを結合したオリゴヌクレオチドを合成した（ＴａｑＭａｎ　フルオレセント・プローブ：アプライドバイオシステムズジャパン社製）。また各遺伝子の発現量の標準化をはかるために、ヒトＧＡＰＤＨ（ＴａｑＭａｎ　Ｈｕｍａｎ　ＧＡＰＤＨ：アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いた。
【０１４１】
ｂ）ＰＣＲ反応
これらの材料を用いて、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法による、上記ｅ）で得られた遺伝子の発現量の定量を行った。ＰＣＲ反応は９６穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）中で行った。反応溶液の組成は１ウェル中、実施例１の方法で得られた全ＲＮＡ　５０ｎｇ、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用プライマー（１０μＭ）を正方向側、逆方向側ともに０．５μｌ（最終濃度１００ｎＭ）、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用プローブを任意量（最終濃度１００ｎＭ）、ＰＣＲ増幅用混合液（ＴａｑＭａｎ　Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ・ＲＴ−ＰＣＲ・マスター・ミックス：アプライドバイオシステムズジャパン社製）２５μｌ、超純水任意量、全量で５０μｌとした。この際、検量線作成用ＲＮＡ溶液は原液濃度を便宜的に「５００」とし、以降２倍希釈を繰り返して濃度「２５０」、「１２５」、「６２．５」、「３１．３」、「１５．６」、「７．８」の溶液について同様に反応液を調製した。ＰＣＲ反応はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器（ＡＢＩ７７００：アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて行った。反応は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の反応を４０回繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定した。
【０１４２】
ｃ）発現量の算出
各サイクル毎のレポーター色素の発光量からＧＡＰＤＨ、実施例２で得られた遺伝子の増幅曲線を作成した。検量線作成用ＲＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸にサイクル数をとった検量線を作成し、各発現定量用サンプルについてはその対数増幅期において任意に設定した一定の発光量を超えたサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。実施例２で得られた遺伝子の発現量は同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨの発現量の値で補正を行った。
【０１４３】
＜結果＞
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより検出されたヒト心不全患者左心室心筋、およびヒト正常心筋組織における発現量の変動は、実施例２で得られたチップ解析による該遺伝子の発現量の変動と一致した。
【０１４４】
実施例４：ＧＰＣＲ遺伝子発現量の解析
＜試験方法＞
実施例２において得られたヒト正常心筋組織および心不全患者左心室心筋の発現量解析データより、ＧＰＣＲ遺伝子のデータを抽出し、実施例２とは異なる基準で心不全の病態予測用マーカー遺伝子を選択した。すなわち、正常心筋組織と心不全患者左心室心筋で発現量に差があるもの、または全サンプルにおいてＡｖｅｒａｇｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ　Ｇｅｎｅ　Ｃｈｉｐによって計測される遺伝子発現量の絶対値）が５０以上であるものを選択した。ＧＰＣＲ遺伝子データの抽出には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｎｅｔ　Ａｆｆｙｘのプローブのアノテーション情報を利用した。
【０１４５】
＜結果＞
正常心筋組織と心不全患者左心室心筋組織で発現量に差がある、または全サンプルにおいてＡｖｅｒａｇｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値が５０以上であるＧＰＣＲ遺伝子は１１種あり、そのＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒは表３のとおりであった。
【０１４６】
【表３】
2004000155.tif 000004
【０１４７】
【発明の効果】
本発明のマーカー遺伝子や該遺伝子がコードしている蛋白質は、心不全の病態や進行を予測するための新しい指標となりうる。従って、該遺伝子や蛋白質を利用することにより、心不全の診断、治療または予防の改善が可能となる。
【０１４８】
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞　ＳＡＮＫＹＯ　ＣＯＭＰＡＮＹ，　ＬＩＭＩＴＥＤ
＜１２０＞　Ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ　ｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｆａｉｌｕｒｅ　ａｎｄ
ｕｓｅｓ　ｔｈｅｒｅｏｆ
＜１３０＞　２００２１９３ＳＵ
＜１４０＞
＜１４１＞
＜１５０＞　ＪＰ　２００２−０５４３８８
＜１５１＞　２００２−０２−２８
＜１５０＞　ＪＰ　２００２−１１２２２８
＜１５１＞　２００２−０４−１５
＜１６０＞　３１
＜１７０＞　ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｖｅｒ．　２．１
＜２１０＞　１
＜２１１＞　１４７８
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜２２０＞
＜２２３＞　Ｉｎｖｅｎｔｏｒ：　Ｋｉｔａｋａｚｅ，　Ｍａｓａｆｕｍｉ；　Ｔａｋａｓｈｉｍａ，　Ｓｅｉｊｉ；　Ａｓａｋｕｒａ，　Ｍａｓａｎｏｒｉ；Ｉｓｏｍｕｒａ，　Ｔａｄａｓｈｉ；　Ｆｕｒｕｋａｗａ，　Ｈｉｄｅｈｉｋｏ；　Ｋｏｉｓｈｉ，　Ｒｙｕｔａ；　Ｎａｋａｍａｒｕ，　Ｋｅｎｊｉ＜４００＞　１
ｇｃｇｇｇｃｇａｃａ　ｃｇａｇｇｇｃｃｇｃ　ｇｇｔｇｃａｇｔｇｔ　ｃｃｇａｃｃｃｇａｇ　ａｇｔｔｇｃｇｇｃｃ　ｔｇａｇｔｃａｃｃｇ　６０　　　　ｇｃｃｃｃｇｃｃｃｔ　ｃｃｇｇａｇｃｃｇｇ　ａｃｇｃｔｃｃｇｇｇ　ａｇｇｃｃｃｇｇｇａ　ｇｃｇｇｃａｇｔｇｇ　ａａｃｃｇａｃｔｃｃ　１２０　　　ｃａｇａａｃｔｃｃｇ　ｇａｃｇｔｇｔｇｃｇ　ｇｃｇｃａｇｔｇａｇ　ｔｃｇｃａｇｃｃａｔ　ｇｔｔｃｃｔｇｇｔｔ　ａａｃｔｃｇｔｔｃｔ　１８０　　　ｔｇａａｇｇｇｃｇｇ　ｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃ　ｇｇｃｇｇｇｇｇａｇ　ｇｃｇｇｇｇｇｃｃｔ　ｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃ　ｃｔｇｇｇａａａｔｇ　２４０　　　ｔｇｃｔｔｇｇａｇｇ　ｃｃｔｇａｔｃａｇｃ　ｇｇｇｇｃｃｇｇｇｇ　ｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇ　ｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃ　ｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇ　３００　　　ｇｔｇｇｔｇｇａｇｇ　ｃｇｇｃｇｇｔｇｇｃ　ｇｇｔｇｇａａｃｇｇ　ｃｃａｔｇｃｇｃａｔ　ｃｃｔａｇｇｃｇｇａ　ｇｔｃａｔｃａｇｃｇ　３６０　　　ｃｃａｔｃａｇｃｇａ　ｇｇｃｇｇｃｔｇｃｇ　ｃａｇｔａｃａａｃｃ　ｃｇｇａｇｃｃｃｃｃ　ｇｃｃｃｃｃａｃｇｃ　ａｃａｃａｔｔａｃｔ　４２０　　　ｃｃａａｃａｔｔｇａ　ｇｇｃｃａａｃｇａｇ　ａｇｔｇａｇｇａｇｇ　ｔｃｃｇｇｃａｇｔｔ　ｃｃｇｇａｇａｃｔｃ　ｔｔｔｇｃｃｃａｇｃ　４８０　　　ｔｇｇｃｔｇｇａｇａ　ｔｇａｃａｔｇｇａｇ　ｇｔｃａｇｃｇｃｃａ　ｃａｇａａｃｔｃａｔ　ｇａａｃａｔｔｃｔｃ　ａａｔａａｇｇｔｔｇ　５４０　　　ｔｇａｃａｃｇａｃａ　ｃｃｃｔｇａｔｃｔｇ　ａａｇａｃｔｇａｔｇ　ｇｔｔｔｔｇｇｃａｔ　ｔｇａｃａｃａｔｇｔ　ｃｇｃａｇｃａｔｇｇ　６００　　　ｔｇｇｃｃｇｔｇａｔ　ｇｇａｔａｇｃｇａｃ　ａｃｃａｃａｇｇｃａ　ａｇｃｔｇｇｇｃｔｔ　ｔｇａｇｇａａｔｔｃ　ａａｇｔａｃｔｔｇｔ　６６０　　　ｇｇａａｃａａｃａｔ　ｃａａａａｇｇｔｇｇ　ｃａｇｇｃｃａｔａｔ　ａｃａａａｃａｇｔｔ　ｃｇａｃａｃｔｇａｃ　ｃｇａｔｃａｇｇｇａ　７２０　　　ｃｃａｔｔｔｇｃａｇ　ｔａｇｔｇａａｃｔｃ　ｃｃａｇｇｔｇｃｃｔ　ｔｔｇａｇｇｃａｇｃ　ａｇｇｇｔｔｃｃａｃ　ｃｔｇａａｔｇａｇｃ　７８０　　　ａｔｃｔｃｔａｔａａ　ｃａｔｇａｔｃａｔｃ　ｃｇａｃｇｃｔａｃｔ　ｃａｇａｔｇａａａｇ　ｔｇｇｇａａｃａｔｇ　ｇａｔｔｔｔｇａｃａ　８４０　　　ａｃｔｔｃａｔｃａｇ　ｃｔｇｃｔｔｇｇｔｃ　ａｇｇｃｔｇｇａｃｇ　ｃｃａｔｇｔｔｃｃｇ　ｔｇｃｃｔｔｃａａａ　ｔｃｔｃｔｔｇａｃａ　９００　　　ａａｇａｔｇｇｃａｃ　ｔｇｇａｃａａａｔｃ　ｃａｇｇｔｇａａｃａ　ｔｃｃａｇｇａｇｔｇ　ｇｃｔｇｃａｇｃｔｇ　ａｃｔａｔｇｔａｔｔ　９６０　　　ｃｃｔｇａａｃｔｇｇ　ａｇｃｃｃｃａｇａｃ　ｃｃｇｃｃｃｃｃｔｃ　ａｃｃｇｃｃｔｔｇｃ　ｔａｔａｇｇａｇｔｃ　ａｃｃｔｇｇａｇｃｃ　１０２０　　ｔｃｇｇｔｃｔｃｔｃ　ｃｃａｇｇｇｃｃｇａ　ｔｃｃｔｇｔｃｔｇｃ　ａｇｔｃａｃａｔｃｔ　ｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃ　ｔｇｃｔｇａｃｃｃａ　１０８０　　ｃａａｇｃｔｔｔｔｇ　ｔｔｃｔｃｔｃａｇｔ　ａｃｔｔｇｔｔａｃｃ　ｃａｇｃｔｔｃｔｃａ　ａｃａｔｃｃａｇｇｇ　ｃｃｃａａｔｔｔｇｃ　１１４０　　ｃｃｔｇｃｃｔｇｇａ　ｇｔｔｃｃｃｃｃｔｇ　ｇｃｔｃｔａｇｇａｃ　ａｃｔｃｔａａｃａａ　ｇｃｔｃｔｇｔｃｃａ　ｃｇｇｇｔｃｔｃｃｃ　１２００　　ｃａｔｔｃｃｃａｃｃ　ａｇｇｃｃｃｔｇｃａ　ｃａｃａｃｃｃａｃｔ　ｃｃｇｔａａｃｃｔｃ　ｔｃｃｃｃｔｇｔａｃ　ｃｔｇｔｇｃｃａａｇ　１２６０　　ｃｃｔａｇｃａｃｔｔ　ｇｔｇａｔｇｃｃｔｃ　ｃａｔｇｃｃｃｃｇａ　ｇｇｇｃｃｔｃｔｃｔ　ｃａｇｔｔｃｔｇｇｇ　ａｇｇａｔｇａｃｔｃ　１３２０　　ｃａｇｔｃｃｃｔｇｃ　ａｃｇｃｃｃｔｇｇｃ　ａｃａｃｃｃｔｔｃａ　ｃｇｇｔｔｇｃｔａｃ　ｃｃａｇｇｃｇｇｃｃ　ａａｇｃｔｃｃａｇａ　１３８０　　ｃｃｇｔｇｃｃａｇａ　ｃｃｃａｇｇｔｇｃｃ　ｃｃａｇｔｇｃｃｔｔ　ｔｇｔｃｔａｔａｔｔ　ｃｔｇｃｔｃｃｃａｇ　ｃｃｔｇｃｃａｇｇｃ　１４４０　　ｃａｇｇａｇｇａａａ　ｔａａａｃａｔｇｃｃ　ｃｃａｇｔｔｇｃｔｇ　ａｔｃｔｃｔａａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４７８　　＜２１０＞　２
＜２１１＞　１２４６
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　２
ｃｔｇｃｃｃｃａｔｇ　ｃａｇｃｃｃｔｇａｇ　ｃｃｃｃａｃａｇｃａ　ａｇｔｃｔｇｃｃａｔ　ｇｇｇｃｃｇｃｇｇｇ　ｇｃｃｃｇｔｇｔｃｃ　６０　　　　ｃｃｔｃｇｇａｇｇｃ　ｃｃｃｇｇｇｇｇｃａ　ｇｇｃｇｔｃｇａｇｃ　ｇｃｃｇｃｔｇｇｃｔ　ｔｇｇａｇｃｃｇｃｇ　ｃｔｇｇｔｃｇｃｃｃ　１２０　　　ｔｇｔｇｃｃｔｃｃｔ　ｃｃｃｃｇｃｇｃｔｇ　ｇｔｇｃｔｇｃｔｇｇ　ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ　ｇｇｃｃｃｃｇｇｃｇ　ｇｔｇｃｃｇｇｃｃｔ　１８０　　　ｇｇａｇｃｇｃａｇｃ　ｇｃａｇｇｇａｇａｃ　ｇｔｃｇｃｔｇｃｇｃ　ｔｇｇｇｃｃｔｃｔｃ　ｇｇｃｇｇｔｃｃｃｃ　ｃｃｃａｃｃｃｇｇｇ　２４０　　　ｔｃｃｃｇｇｇｃｃｃ　ａｃｔｇｇｃｃｃｃｃ　ｃｇｃａｇａｃｇｃｃ　ｇｃｔａｃａｃｇｃｔ　ｇａｃｔｃｃａｇｃｃ　ａｇｇｃｔｇｃｇｃｔ　３００　　　ｇｇｇａｃｃａｃｔｔ　ｃａａｃｃｔｃａｃｃ　ｔａｃａｇｇａｔｃｃ　ｔｃｔｃｃｔｔｃｃｃ　ｇｃｇｇａａｃｃｔｇ　ｃｔｇａｇｃｃｃｇｃ　３６０　　　ｇｇｇａｇａｃｇｃｇ　ｇｃｇｇｇｃｃｃｔａ　ｇｃｔｇｃｃｇｃｃｔ　ｔｃｃｇｃａｔｇｔｇ　ｇａｇｃｇａｃｇｔｇ　ｔｃｃｃｃｃｔｔｃａ　４２０　　　ｇｃｔｔｃｃｇｃｇａ　ｇｇｔｇｇｃｃｃｃｃ　ｇａｇｃａｇｃｃｃａ　ｇｃｇａｃｃｔｃｃｇ　ｇａｔａｇｇｃｔｔｃ　ｔａｃｃｃｇａｔｃａ　４８０　　　ａｃｃａｃａｃｇｇａ　ｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃ　ｔｃｃｇｃｇｃｔｇｃ　ａｃｃａｃｔｇｃｔｔ　ｃｇａｃｇｇｃｃｃｃ　ａｃｇｇｇｇｇａｇｃ　５４０　　　ｔｇｇｃｃｃａｃｇｃ　ｃｔｔｃｔｔｃｃｃｃ　ｃｃｇｃａｃｇｇｃｇ　ｇｃａｔｃｃａｃｔｔ　ｃｇａｃｇａｃａｇｃ　ｇａｇｔａｃｔｇｇｇ　６００　　　ｔｃｃｔｇｇｇｃｃｃ　ｃａｃｇｃｇｃｔａｃ　ａｇｃｔｇｇａａｇａ　ａａｇｇｃｇｔｇｔｇ　ｇｃｔｃａｃｇｇａｃ　ｃｔｇｇｔｇｃａｃｇ　６６０　　　ｔｇｇｃｇｇｃｃｃａ　ｃｇａｇａｔｃｇｇｃ　ｃａｃｇｃｇｃｔｇｇ　ｇｃｃｔｇａｔｇｃａ　ｃｔｃａｃａａｃａｃ　ｇｇｃｃｇｇｇｃｇｃ　７２０　　　ｔｃａｔｇｃａｃｃｔ　ｇａａｃｇｃｃａｃｇ　ｃｔｇｃｇｃｇｇｃｔ　ｇｇａａｇｇｃｇｔｔ　ｇｔｃｃｃａｇｇａｃ　ｇａｇｃｔｇｔｇｇｇ　７８０　　　ｇｇｃｔｇｃａｃｃｇ　ｇｃｔｃｔａｃｇｇａ　ｔｇｃｃｔｃｇａｃａ　ｇｇｃｔｇｔｔｃｇｔ　ｇｔｇｃｇｃｇｔｃｃ　ｔｇｇｇｃｇｃｇｇａ　８４０　　　ｇｇｇｇｃｔｔｃｔｇ　ｃｇａｃｇｃｔｃｇｃ　ｃｇｇｃｇｇｃｔｃａ　ｔｇａａｇａｇｇｃｔ　ｃｔｇｃｃｃｃａｇｃ　ａｇｃｔｇｃｇａｃｔ　９００　　　ｔｃｔｇｃｔａｃｇａ　ａｔｔｃｃｃｃｔｔｃ　ｃｃｃａｃｇｇｔｇｇ　ｃｃａｃｃａｃｃｃｃ　ａｃｃｇｃｃｃｃｃｃ　ａｇｇａｃｃａａａａ　９６０　　　ｃｃａｇｇｃｔｇｇｔ　ｇｃｃｃｇａｇｇｇｃ　ａｇｇａａｃｇｔｇａ　ｃｃｔｔｃｃｇｃｔｇ　ｃｇｇｃｃａｇａａｇ　ａｔｃｃｔｃｃａｃａ　１０２０　　ａｇａａａｇｇｇａａ　ａｇｔｇｔａｃｔｇｇ　ｔａｃａａｇｇａｃｃ　ａｇｇａｇｃｃｃｃｔ　ｇｇａｇｔｔｃｔｃｃ　ｔａｃｃｃｃｇｇｃｔ　１０８０　　ａｃｃｔｇｇｃｃｃｔ　ｇｇｇｃｇａｇｇｃｇ　ｃａｃｃｔｇａｇｃａ　ｔｃａｔｃｇｃｃａａ　ｃｇｃｃｇｔｃａａｔ　ｇａｇｇｇｃａｃｃｔ　１１４０　　ａｃａｃｃｔｇｃｇｔ　ｇｇｔｇｃｇｃｃｇｃ　ｃａｇｃａｇｃｇｃｇ　ｔｇｃｔｇａｃｃａｃ　ｃｔａｃｔｃｃｔｇｇ　ｃｇａｇｔｃｃｇｔｇ　１２００　　ｔｇｃｇｇｇｇｃｔｇ　ａｇｃｃｃｇｇｃｔｇ　ａｔａａａｇｃａｃｔ　ｔｔｃｔｃｔｃｔｇａ　ａａａａａａ　　　　　　　　　　　　　　　　１２４６　　＜２１０＞　３
＜２１１＞　２９４７
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　３
ｃｔｃｃｃｇｃｃａｃ　ｃｔｃｃｇｃｃａｃｃ　ａｔｇｃｔｇｃｔｃｃ　ｃｃｃａｇｃｔｃｔｇ　ｃｔｇｇｃｔｇｃｃｇ　ｃｔｇｃｔｃｇｃｔｇ　６０　　　　ｇｇｃｔｇｃｔｃｃｃ　ｇｃｃｇｇｔｇｃｃｃ　ｇｃｔｃａｇａａｇｔ　ｔｃｔｃｇｇｃｇｃｔ　ｃａｃｇｔｔｔｔｔｇ　ａｇａｇｔｇｇａｔｃ　１２０　　　ａａｇａｔａａａｇａ　ｃａａｇｇａｔｔｇｔ　ａｇｃｔｔｇｇａｃｔ　ｇｔｇｃｇｇｇｔｔｃ　ｇｃｃｃｃａｇａａａ　ｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇ　１８０　　　ｃａｔｃｔｇａｃｇｇ　ａａｇｇａｃｃｔｔｃ　ｃｔｔｔｃｃｃｇｔｔ　ｇｔｇａａｔｔｔｃａ　ａｃｇｔｇｃｃａａｇ　ｔｇｃａａａｇａｔｃ　２４０　　　ｃｃｃａｇｃｔａｇａ　ｇａｔｔｇｃａｔａｔ　ｃｇａｇｇａａａｃｔ　ｇｃａａａｇａｃｇｔ　ｇｔｃｃａｇｇｔｇｔ　ｇｔｇｇｃｃｇａａａ　３００　　　ｇｇａａｇｔａｔａｃ　ｃｃａｇｇａｇｃａａ　ｇｃｃｃｇｇａａｇｇ　ａｇｔｔｔｃａｇｃａ　ａｇｔｇｔｔｃａｔｔ　ｃｃｔｇａｇｔｇｃａ　３６０　　　ａｔｇａｃｇａｃｇｇ　ｃａｃｃｔａｃａｇｔ　ｃａｇｇｔｃｃａｇｔ　ｇｔｃａｃａｇｃｔａ　ｃａｃｇｇｇａｔａｃ　ｔｇｃｔｇｇｔｇｃｇ　４２０　　　ｔｃａｃｇｃｃｃａａ　ｃｇｇｇａｇｇｃｃｃ　ａｔｃａｇｃｇｇｃａ　ｃｔｇｃｃｇｔｇｇｃ　ｃｃａｃａａｇａｃｇ　ｃｃｃｃｇｇｔｇｃｃ　４８０　　　ｃｇｇｇｔｔｃｃｇｔ　ａａａｔｇａａａａｇ　ｔｔａｃｃｃｃａａｃ　ｇｃｇａａｇｇｃａｃ　ａｇｇａａａａａｃａ　ｇｔｃｔｃｃｔｔｇｃ　５４０　　　ａａａｔｃｔｔｔｔｃ　ｃｇｔｔｃｔｇａａｔ　ｔｃａｇａｔｇａｔｇ　ｃｃｇｃａｇｃｔｃｃ　ａｇｃｇｔｔｇｇａｇ　ａｃｔｃａｇｃｃｔｃ　６００　　　ａａｇｇａｇａｔｇａ　ａｇａａｇａｔａｔｔ　ｇｃａｔｃａｃｇｔｔ　ａｃｃｃｔａｃｃｃｔ　ｔｔｇｇａｃｔｇａａ　ｃａｇｇｔｔａａａａ　６６０　　　ｇｔｃｇｇｃａｇａａ　ｃａａａａｃｃａａｔ　ａａｇａａｔｔｃａｇ　ｔｇｔｃａｔｃｃｔｇ　ｔｇａｃｃａａｇａｇ　ｃａｃｃａｇｔｃｔｇ　７２０　　　ｃｃｃｔｇｇａｇｇａ　ａｇｃｃａａｇｃａｇ　ｃｃｃａａｇａａｃｇ　ａｃａａｔｇｔｇｇｔ　ｇａｔｃｃｃｔｇａｇ　ｔｇｔｇｃｇｃａｃｇ　７８０　　　ｇｃｇｇｃｃｔｃｔａ　ｃａａｇｃｃａｇｔｇ　ｃａｇｔｇｃｃａｃｃ　ｃｃｔｃｃａｃｇｇｇ　ｇｔａｃｔｇｃｔｇｇ　ｔｇｃｇｔｃｃｔｇｇ　８４０　　　ｔｇｇａｃａｃｇｇｇ　ｇｃｇｃｃｃｃａｔｔ　ｃｃｃｇｇｃａｃａｔ　ｃｃａｃａａｇｇｔａ　ｃｇａｇｃａｇｃｃｇ　ａａａｔｇｔｇａｃａ　９００　　　ａｃａｃｇｇｃｃａｇ　ｇｇｃｃｃａｃｃｃａ　ｇｃｃａａａｇｃｃｃ　ｇｇｇａｃｃｔｇｔａ　ｃａａｇｇｇｃｃｇｃ　ｃａｇｃｔａｃａａｇ　９６０　　　ｇｔｔｇｔｃｃｇｇｇ　ｔｇｃｃａａａａａｇ　ｃａｔｇａｇｔｔｔｃ　ｔｇａｃｃａｇｃｇｔ　ｔｃｔｇｇａｃｇｃｇ　ｃｔｇｔｃｃａｃｇｇ　１０２０　　ａｃａｔｇｇｔｃｃａ　ｃｇｃｃｇｃｃｔｃｃ　ｇａｃｃｃｃｔｃｃｔ　ｃｃｔｃｇｔｃａｇｇ　ｃａｇｇｃｔｃｔｃａ　ｇａａｃｃｃｇａｃｃ　１０８０　　ｃｃａｇｃｃａｔａｃ　ｃｃｔａｇａｇｇａｇ　ｃｇｇｇｔｇｇｔｇｃ　ａｃｔｇｇｔａｃｔｔ　ｃａａａｃｔａｃｔｇ　ｇａｔａａａａａｃｔ　１１４０　　ｃｃａｇｃｇｇａｇａ　ｃａｔｃｇｇｃａａａ　ａａｇｇａａａｔｃａ　ａａｃｃｃｔｔｃａａ　ｇａｇｇｔｔｃｃｔｔ　ｃｇｃａａａａａａｔ　１２００　　ｃａａａｇｃｃｃａａ　ａａａａｔｇｔｇｔｇ　ａａｇａａｇｔｔｔｇ　ｔｔｇａａｔａｃｔｇ　ｔｇａｃｇｔｇａａｔ　ａａｔｇａｃａａａｔ　１２６０　　ｃｃａｔｃｔｃｃｇｔ　ａｃａａｇａａｃｔｇ　ａｔｇｇｇｃｔｇｃｃ　ｔｇｇｇｃｇｔｇｇｃ　ｇａａａｇａｇｇａｃ　ｇｇｃａａａｇｃｇｇ　１３２０　　ａｃａｃｃａａｇａａ　ａｃｇｃｃａｃａｃｃ　ｃｃｃａｇａｇｇｔｃ　ａｔｇｃｔｇａａａｇ　ｔａｃｇｔｃｔａａｔ　ａｇａｃａｇｃｃａａ　１３８０　　ｇｇａａａｃａａｇｇ　ａｔａａａｔｇｇｃｔ　ｃａｔａｃｃｃｃｇａ　ａｇｇｃａｇｔｔｃｃ　ｔａｇａｃａｃａｔｇ　ｇｇａａａｔｔｔｃｃ　１４４０　　ｃｔｃａｃｃａａａｇ　ａｇｃａａｔｔａａｇ　ａａａａｃａａａａａ　ｃａｇａａａｃａｃａ　ｔａｇｔａｔｔｔｇｃ　ａｃｔｔｔｇｔａｃｔ　１５００　　ｔｔａａａｔｇｔａａ　ａｔｔｃａｃｔｔｔｇ　ｔａｇａａａｔｇａｇ　ｃｔａｔｔｔａａａｃ　ａｇａｃｔｇｔｔｔｔ　ａａｔｃｔｇｔｇａａ　１５６０　　ａａｔｇｇａｇａｇｃ　ｔｇｇｃｔｔｃａｇａ　ａａａｔｔａａｔｃａ　ｃａｔａｃａａｔｇｔ　ａｔｇｔｇｔｃｃｔｃ　ｔｔｔｔｇａｃｃｔｔ　１６２０　　ｇｇａａａｔｃｔｇｔ　ａｔｇｔｇｇｔｇｇａ　ｇａａｇｔａｔｔｔｇ　ａａｔｇｃａｔｔｔａ　ｇｇｃｔｔａａｔｔｔ　ｃｔｔｃｇｃｃｔｔｃ　１６８０　　ｃａｃａｔｇｔｔａａ　ｃａｇｔａｇａｇｃｔ　ｃｔａｔｇｃａｃｔｃ　ｃｇｇｃｔｇｃａａｔ　ｃｇｔａｔｇｇｃｔｔ　ｔｃｔｃｔａａｃｃｃ　１７４０　　ｃｔｇｃａｇｔｃａｃ　ｔｔｃｃａｇａｔｇｃ　ｃｔｇｔｇｃｔｔａｃ　ａｇｃａｔｔｇｔｇｇ　ａａｔｃａｔｇｔｔｇ　ｇａａｇｃｔｃｃａｃ　１８００　　ａｔｇｔｃｃａｔｇｇ　ａａｇｔｔｔｇｔｇａ　ｔｇｔａｃｇｇｃｃｇ　ａｃｃｃｔａｃａｇｇ　ｃａｇｔｔａａｃａｔ　ｇｃａｔｇｇｇｃｔｇ　１８６０　　ｇｔｔｔｇｔｔｔｃｔ　ｔｇｇｇａｔｔｔｔｃ　ｔｔｔｔａｇｔｔｔｇ　ｔｃｔｔｇｔｔｔｔｇ　ｃｔｔｔｃｃａｇａｇ　ａｔｃｔｔｇｃｔｃａ　１９２０　　ｔａｃａａｔｇａａｔ　ｃａｃｇｃａａｃｃａ　ｃｔａａａｇｃｔａｔ　ｃｃａｇｔｔａａｇｔ　ｇｃａｇｇｔａｇｔｔ　ｃｃｃｃｔｇｇａｇｇ　１９８０　　ａａａｔａａｔａｔｔ　ｔｔｃａａａｃｔｇｔ　ｃｇｔｔｇｇｔｇｔｇ　ａｔａｃｔｔｔｇｇｃ　ｔｃａａａｇｇａｔｃ　ｔｔｔｇｃｔｔｔｔｃ　２０４０　　ｃａｔｔｔｔａａｇｃ　ｔｔｃｔｇｔｔｔｔｇ　ａｇｔｔｔｔｇｃｃｃ　ｔｇｇｇｇｃｔｔｇａ　ａｔｇａｇｔｃｃｃａ　ｇａｇａｇｔｃｇｔｔ　２１００　　ｃｃｇａｔｇｇｔｇｇ　ｇａｇｇｃｔｇｃｃｔ　ａｇｇａｇｇｃａｇｔ　ａａａｔｃｃａｇｔｃ　ａｃａｇｔｇｃｃｔｇ　ｇｇａｇｇｇｇｃｃｃ　２１６０　　ａｔｃｃｔｔｃｃａａ　ａａｔｇｔａａａｔｃ　ｃａｇｔｃｇｃｇｇｔ　ｇｔｇａｃｃｇａｇｃ　ｔｇｇｃｔａａｃａｇ　ｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃ　２２２０　　ｃｔｇｇｔｔｔｔｃｃ　ｔｃｃｔａｃａｃａｔ　ｇｇａｃａｔｔａｔｔ　ｃｔｃｃｔｇａｔｃｃ　ｔｃｃｔａｃｃｔｇｇ　ｔｃｃａｃｃｃｃａｇ　２２８０　　ｇｇｃｔａｃｃｇｇａ　ａｇｇｔａａａａｔｃ　ｔｔｃａｃｃｔｇａａ　ｃｃａａｔｔａｔｇａ　ｇｃａｇｔｃｔｃｃｔ　ｔａｃｔｇａａｇｇｔ　２３４０　　ａｃａｇｃｃｇｇａｔ　ａｃｇｔｇｇｔｇｃｃ　ｃｃｃｇｇｇｇｃｔｇ　ｇｔｇｔｔｇｇｃａｇ　ｃｃｇｇｇｇｇｇａｇ　ｇｔｇｃｃｔｇａｇｇ　２４００　　ｇｔｃｃｃｃａｃｇｇ　ｔｔｃｃｔｔｔｃｔｇ　ｃｔｔｔｔｃｔｇａａ　ｔｇｃａｔｃａａｇｇ　ｇｔａｃｇａｇａａｃ　ｔｔｇｃｃａａｔｇｇ　２４６０　　ｇａａａｔｔｃａｔｃ　ｃｇａｇｔｇｇｃａｃ　ｔｇｇｃａｇａｇａａ　ｇｇａｔａｇｇａｇｔ　ｇｇａａｔｇｃｃｃａ　ｃａｃａｇｔｇａｃｃ　２５２０　　ａａｃａｇａａｃｔｇ　ｇｔｃｔｇｃｇｔｇｃ　ａｔａａｃｃａｇｃｔ　ｇｃｃａｃｃｃｔｃａ　ｇｇｃｃｔｇｇｇｃｃ　ｃｃａｇａｇｃｔｃａ　２５８０　　ｇｇｇｃａｃｃｃａｇ　ｔｇｔｃｔｔａａｇｇ　ａａｃｃａｔｔｔｇｇ　ａｇｇａｃａｇｔｃｔ　ｇａｇａｇｃａｇｇａ　ａｃｔｔｃａａｇｃｔ　２６４０　　ｇｔｇａｔｔｃｔａｔ　ｃｔｃｇｇｃｔｃａｇ　ａｃｔｔｔｔｇｇｔｔ　ｇｇａａａａａｇａｔ　ｃｔｔｃａｔｇｇｃｃ　ｃｃａａａｔｃｃｃｃ　２７００　　ｔｇａｇａｃａｔｇｃ　ｃｔｔｇｔａｇａａｔ　ｇａｔｔｔｔｇｔｇａ　ｔｇｔｔｇｔｇａｔｇ　ｃｔｔｇｔｇｇａｇｃ　ａｔｃｇｃｇｔａａｇ　２７６０　　ｇｃｔｔｃｔｔｇｃｔ　ｔａｔｔｔａａａｃｔ　ｇｔｇｃａａｇｇｔａ　ａａａａｔｃａａｇｃ　ｃｔｔｔｇｇａｇｃｃ　ａｃａｇａａｃｃａｇ　２８２０　　ｃｔｃａａｇｔａｃａ　ｔｇｃｃａａｔｇｔｔ　ｇｔｔｔａａｇａａａ　ｃａｇｔｔａｔｇａｔ　ｃｃｔａａａｃｔｔｔ　ｔｔｇｇａｔａａｔｃ　２８８０　　ｔｔｔｔａｔａｔｔｔ　ｃｔｇａｃｃｔｔｔｇ　ａａｔｔｔａａｔｃａ　ｔｔｇｔｔｃｔｔａｇ　ａｔｔａａａａｔａａ　ａａｔａｔｇｃｔａｔ　２９４０　　ｔｇａａａｃｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２９４７　　＜２１０＞　４
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＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　４
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＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１１＞　１２４５
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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ｃｇｔｃｃｔｃｃｃｔ　ｔｃｔｔｃｔｃｔｔｇ　ｃａｇａｇｃｃｔｇａ　ｃｇｃａｃｃｃｃａｇ　ｇｇｃｔｇｃｃｇｃｃ　ａｔｇｇａｇｃｃｃｃ　６０　　　　ｔｇｔｔｃｃｃａｇｃ　ｃｔｃｃａｃｇｃｃｃ　ａｇｃｔｇｇａａｃｇ　ｃｃｔｃｃｔｃｃｃｃ　ｇｇｇｇｇｃｔｇｃｃ　ｔｃｔｇｇａｇｇｃｇ　１２０　　　ｇｔｇａｃａａｃａｇ　ｇａｃｇｃｔｇｇｔｇ　ｇｇｇｃｃｇｇｃｇｃ　ｃｃｔｃｇｇｃａｇｇ　ｇｇｃｃｃｇｇｇｃｇ　ｇｔｇｃｔｇｇｔｇｃ　１８０　　　ｃｃｇｔｇｃｔｇｔａ　ｃｃｔｇｃｔｇｇｔｇ　ｔｇｔｇｃｇｇｃｃｇ　ｇｇｃｔｇｇｇｃｇｇ　ｇａａｃａｃｇｃｔｇ　ｇｔｃａｔｃｔａｃｇ　２４０　　　ｔｇｇｔｇｃｔｇｃｇ　ｃｔｔｃｇｃｃａａｇ　ａｔｇａａｇａｃｃｇ　ｔｃａｃｃａａｃａｔ　ｃｔａｃａｔｔｃｔｃ　ａａｃｃｔｇｇｃａｇ　３００　　　ｔｇｇｃｃｇａｃｇｔ　ｃｃｔｇｔａｃａｔｇ　ｃｔｇｇｇｇｃｔｇｃ　ｃｔｔｔｃｃｔｇｇｃ　ｃａｃｇｃａｇａａｃ　ｇｃｃｇｃｇｔｃｃｔ　３６０　　　ｔｃｔｇｇｃｃｃｔｔ　ｃｇｇｃｃｃｃｇｔｃ　ｃｔｇｔｇｃｃｇｃｃ　ｔｇｇｔｃａｔｇａｃ　ｇｃｔｇｇａｃｇｇｃ　ｇｔｃａａｃｃａｇｔ　４２０　　　ｔｃａｃｃａｇｔｇｔ　ｃｔｔｃｔｇｃｃｔｇ　ａｃａｇｔｃａｔｇａ　ｇｃｇｔｇｇａｃｃｇ　ｃｔａｃｃｔｇｇｃａ　ｇｔｇｇｔｇｃａｃｃ　４８０　　　ｃｇｃｔｇａｇｃｔｃ　ｇｇｃｃｃｇｃｔｇｇ　ｃｇｃｃｇｃｃｃｇｃ　ｇｔｇｔｇｇｃｃａａ　ｇｃｔｇｇｃｇａｇｃ　ｇｃｃｇｃｇｇｃｃｔ　５４０　　　ｇｇｇｔｃｃｔｇｔｃ　ｔｃｔｇｔｇｃａｔｇ　ｔｃｇｃｔｇｃｃｇｃ　ｔｃｃｔｇｇｔｇｔｔ　ｃｇｃｇｇａｃｇｔｇ　ｃａｇｇａｇｇｇｃｇ　６００　　　ｇｔａｃｃｔｇｃａａ　ｃｇｃｃａｇｃｔｇｇ　ｃｃｇｇａｇｃｃｃｇ　ｔｇｇｇｇｃｔｇｔｇ　ｇｇｇｃｇｃｃｇｔｃ　ｔｔｃａｔｃａｔｃｔ　６６０　　　ａｃａｃｇｇｃｃｇｔ　ｇｃｔｇｇｇｃｔｔｃ　ｔｔｃｇｃｇｃｃｇｃ　ｔｇｃｔｇｇｔｃａｔ　ｃｔｇｃｃｔｇｔｇｃ　ｔａｃｃｔｇｃｔｃａ　７２０　　　ｔｃｇｔｇｇｔｇａａ　ｇｇｔｇａｇｇｇｃｇ　ｇｃｇｇｇｃｇｔｇｃ　ｇｃｇｔｇｇｇｃｔｇ　ｃｇｔｇｃｇｇｃｇｇ　ｃｇｃｔｃｇｇａｇｃ　７８０　　　ｇｇａａｇｇｔｇａｃ　ｇｃｇｃａｔｇｇｔｇ　ｔｔｇｇｔｇｇｔｇｇ　ｔｇｃｔｇｇｔｇｔｔ　ｔｇｃｇｇｇａｔｇｔ　ｔｇｇｃｔｇｃｃｃｔ　８４０　　　ｔｃｔｔｃａｃｃｇｔ　ｃａａｃａｔｃｇｔｃ　ａａｃｃｔｇｇｃｃｇ　ｔｇｇｃｇｃｔｇｃｃ　ｃｃａｇｇａｇｃｃｃ　ｇｃｃｔｃｃｇｃｃｇ　９００　　　ｇｃｃｔｃｔａｃｔｔ　ｃｔｔｃｇｔｇｇｔｃ　ａｔｃｃｔｃｔｃｃｔ　ａｃｇｃｃａａｃａｇ　ｃｔｇｔｇｃｃａａｃ　ｃｃｃｇｔｃｃｔｃｔ　９６０　　　ａｃｇｇｃｔｔｃｃｔ　ｃｔｃｔｇａｃａａｃ　ｔｔｃｃｇｃｃａｇａ　ｇｃｔｔｃｃａｇａａ　ｇｇｔｔｃｔｇｔｇｃ　ｃｔｃｃｇｃａａｇｇ　１０２０　　ｇｃｔｃｔｇｇｔｇｃ　ｃａａｇｇａｃｇｃｔ　ｇａｃｇｃｃａｃｇｇ　ａｇｃｃｇｃｇｔｃｃ　ａｇａｃａｇｇａｔｃ　ｃｇｇｃａｇｃａｇｃ　１０８０　　ａｇｇａｇｇｃｃａｃ　ｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇ　ｃａｃｃｇｃｇｃｃｇ　ｃａｇｃｃａａｃｇｇ　ｇｃｔｔａｔｇｃａｇ　ａｃｃａｇｃａａｇｃ　１１４０　　ｔｇｔｇａｇａｇｔｇ　ｃａｇｇｃｇｇｇｇｇ　ｇｔｇｇｇｃｇｇｃｃ　ｃｃｇｔｇｔｃａｃｃ　ｃｃｃａｇｇａｇｃｇ　ｇａｇｇｔｔｇｃａｃ　１２００　　ｔｇｃｇｇｔｇａｃｃ　ｃｃｃａｃｃｃａｔｇ　ａｃｃｔｇｃｃａｇｔ　ｃａｇｇａｔｇｃｔｃ　ｃｃｃｇｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　１２４５　　＜２１０＞　８
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＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　８
ｇａａｔｔｃｔｇｇｇ　ｎｔｔａｇｇｃｇａｔ　ｔｃｔｇｇｇｔｔａｇ　ｃａｇｇｃｔｔｇｇｇ　ｃｃｃａａｇｔｇｃｔ　ｃｇａｇｔｇｃｔｇｇ　６０　　　　ｇｇｔｔｇａｇｔｔｇ　ｇａｔｇａｃｃｃｇｇ　ｃｇａａｇｇｇｔａａ　ｇｃａｔｔｃｃｔｇｃ　ａｇｇｇａｃｃｃｇａ　ｇｇｃｃｃｔｇｇｗｇ　１２０　　　ｇｇａｃｔｇａｔｇｇ　ｔｃａｔｃｔｇｃｇｇ　ｔｔａａｇｃｃｇｇｃ　ａｇｇａｇｇｃｇｔｃ　ｔｇｇｇｇｃａｇｇｇ　ａｃｃｃａｇｇｇｇｔ　１８０　　　ｃｃｇａａｃａｇｃａ　ｇｇａｇｇｔｇｔｃｃ　ａａｔｔｔａｇｇａａ　ｔｃｃａｇｇｔａｔｃ　ｃａｇｇｃａｇｇａｇ　ｇｃａｇａｇｔｃａｇ　２４０　　　ｇｃｃｃａａａａｔｃ　ｃａｇｇｔｇｔｃｃｇ　ｇｇｃａｇａａｇｇａ　ｇｇｃａｔｃｔｇａｃ　ｔｃａｇｇｇａｔｃｃ　ａｇｔｃｔｔｃｃａｇ　３００　　　ｃａｇｇｇｇｇｇｔｃ　ｔｇｃｃｃａｇａｇａ　ｃｃｔａｇａｇａｔｔ　ｃａｇｇｃｇｇａａａ　ｇａａｇｇｇｔｃｃａ　ｇｃｃａｇｇａａｃａ　３６０　　　ｇａａｇｔｃｔｇｇｇ　ａｇｇｇｔｇｇｇｇｇ　ｇｔｇｇｇｇｇｇｃｔ　ｇａｇｔｔｃｃｃａｇ　ｇｔｇｔｔａｃｃｇｃ　ｇｇｇａｇｔｇｃｇｇ　４２０　　　ｇｇｔｇａｔｇｇｃｔ　ｇｇｃｇｇｇａｇｃｔ　ｔｃａｃｇｃｇｃａｔ　ｔｃｃｃｔｇｇｇｇｇ　ｃｇｇａｇｔｃｔａａ　ｇｇｃｔｇｇｃａｇｔ　４８０　　　ａｃｔｇａａａａｔｃ　ｇｔｇａｇｇｇｇｔｃ　ｔｇｇｇａｇｃｃｔｃ　ａｇｇｃａｃｇａｇｃ　ｔａｇｃａｔｃａｔｃ　ａｔｃｔｃｔｇａｔｇ　５４０　　　ｇｇａｇｇｇａｇｃｇ　ｇａｇｃｔｇｃｔｃａ　ｇｔｃｔｃｃｃｔｇａ　ｔｇｇｇｇｔａｇａｔ　ｇｔｔｔｃｃｃｔａｃ　ｃｃｃａａｔｃｔｔｇ　６００　　　ａｇｃｃｔｔｃｇｇｇ　ｇｇｃａｔｃｃｃｃｔ　ｇｇａｔｃｃｔａｔｇ　ｇｃｃｃｔｃｔｔｃｃ　ａｃｔｔａｔａｇｔａ　ｃｃｃｃｔｔｃｔｔｃ　６６０　　　ｔｇｔｃｔｃｔｃｃｔ　ｃｔｇｇｔｃａｃａｃ　ａｃｇｔｇｇｇａａａ　ａａｇａｇａｃｃｔｇ　ｃａｇｇａｃｃｔａｇ　ｇａｃａｇｇｇａｔｃ　７２０　　　ｃｃｃａｇｇａａｇａ　ｇａｃｃｃｃｔｇｔｔ　ｔａｇａｇｇｃｃｔｇ　ｇｇｇｇｃａｔｔｇｇ　ａｇｇｇｇａｃａｇｃ　ｇｇｔａｔｃｃｔｇｇ　７８０　　　ｇａａｇａｇｃｃｃｃ　ａｇｇｇｃａｔｇａａ　ｔｇｔｇｇｇｇａｔａ　ａｇｇｃａｔｔｇｇｇ　ａｃｔｃｔａｔｃａｇ　ｇｔａｔｃｃｔｇａｇ　８４０　　　ｇａｇａｇａｃｔｃｃ　ｃａｃｃａｃｇｔａｔ　ｃｃｔｇａｇａａｇｃ　ａｃｃｔｃａｃｃｃｃ　ｃｔｃｃａｇａｃｃｃ　ｃａａｃｔｃｃｃａｔ　９００　　　ｃａｃｃｃａｇｃｔｔ　ｇｇｔｃａｇｃｔｔｃ　ｔｃａｃａａｇｇｃｃ　ｔｔｔｃｔｃｃｔｇｃ　ａｇｇｔａｃｃａｔｇ　ａｔｇｔｇｇｇｇｔｇ　９６０　　　ｃａｇｇｃａｇｃｃｃ　ｔｃｔｇｇｃｃｔｇｇ　ｃｔｃｔｃａｇｃｔｇ　ｇｃｔｃａｇｇｃａａ　ｃｇｔｇａａｔｇｔａ　ａｇｃａｇｃｇｔｇｇ　１０２０　　ｇｃｃｃａｇｃａｇａ　ｇｇｇｇｃｃｃａｃａ　ｇｇｔｃｃａｇｃｃｇ　ｃａｃｃａｃｔｇｃｃ　ｃｔｃｇｃｃｔａａｇ　ｇｃｃｔｇｇｇａｔｇ　１０８０　　ｔｇｇｔｇｃｔｃｔｇ　ｃａｔｃｔｃａｇｇｃ　ａｃｃｃｔｇｇｔｇｔ　ｃｃｔｇｃｇａｇａａ　ｔｇｃｇｃｔａｇｔｇ　ｇｔｇｇｃｃａｔｃａ　１１４０　　ｔｃｇｔｇｇｇｃａｃ　ｔｃｃｔｇｃｃｔｔｃ　ｃｇｔｇｃｃｃｃｃａ　ｔｇｔｔｃｃｔｇｃｔ　ｇｇｔｇｇｇｃａｇｃ　ｃｔｇｇｃｃｇｔｇｇ　１２００　　ｃａｇａｃｃｔｇｃｔ　ｇｇｃａｇｇｃｃｔｇ　ｇｇｃｃｔｇｇｔｃｃ　ｔｇｃａｃｔｔｔｇｃ　ｔｇｃｔｇｔｃｔｔｃ　ｔｇｃａｔｃｇｇｃｔ　１２６０　　ｃａｇｃｇｇａｇａｔ　ｇａｇｃｃｔｇｇｔｇ　ｃｔｇｇｔｔｇｇｃｇ　ｔｇｃｔｇｇｃａａｔ　ｇｇｃｃｔｔｔａｃｃ　ｇｃｃａｇｃａｔｃｇ　１３２０　　ｇｃａｇｔｃｔａｃｔ　ｇｇｃｃａｔｃａｃｔ　ｇｔｃｇａｃｃｇｃｔ　ａｃｃｔｔｔｃｔｃｔ　ｇｔａｃａａｔｇｃｃ　ｃｔｃａｃｃｔａｃｔ　１３８０　　ａｔｔｃａｇａｇａｃ　ａａｃａｇｔｇａｃａ　ｃｇｇａｃｃｔａｔｇ　ｔｇａｔｇｃｔｇｇｃ　ｃｔｔａｇｔｇｔｇｇ　ｇｇａｇｇｔｇｃｃｃ　１４４０　　ｔｇｇｇｃｃｔｇｇｇ　ｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔ　ｇｔｇｃｔｇｇｃｃｔ　ｇｇａａｃｔｇｃｃｔ　ｇｇａｔｇｇｃｃｔｇ　ａｃｃａｃａｔｇｔｇ　１５００　　ｇｃｇｔｇｇｔｔｔａ　ｔｃｃａｃｔｃｔｃｃ　ａａｇａａｃｃａｔｃ　ｔｇｇｔａｇｔｔｃｔ　ｇｇｃｃａｔｔｇｃｃ　ｔｔｃｔｔｃａｔｇｇ　１５６０　　ｔｇｔｔｔｇｇｃａｔ　ｃａｔｇｃｔｇｃａｇ　ｃｔｃｔａｃｇｃｃｃ　ａａａｔｃｔｇｃｃｇ　ｃａｔｃｇｔｃｔｇｃ　ｃｇｃｃａｔｇｃｃｃ　１６２０　　ａｇｃａｇａｔｔｇｃ　ｃｃｔｔｃａｇｃｇｇ　ｃａｃｃｔｇｃｔｇｃ　ｃｔｇｃｃｔｃｃｃａ　ｃｔａｔｇｔｇｇｃｃ　ａｃｃｃｇｃａａｇｇ　１６８０　　ｇｃａｔｔｇｃｃａｃ　ａｃｔｇｇｃｃｇｔｇ　ｇｔｇｃｔｔｇｇａｇ　ｃｃｔｔｔｇｃｃｇｃ　ｃｔｇｃｔｇｇｔｔｇ　ｃｃｃｔｔｃａｃｔｇ　１７４０　　ｔｃｔａｃｔｇｃｃｔ　ｇｃｔｇｇｇｔｇａｔ　ｇｃｃｃａｃｔｃｔｃ　ｃａｃｃｔｃｔｃｔａ　ｃａｃｃｔａｔｃｔｔ　ａｃｃｔｔｇｃｔｃｃ　１８００　　ｃｔｇｃｃａｃｃｔａ　ｃａａｃｔｃｃａｔｇ　ａｔｃａａｃｃｃｔａ　ｔｃａｔｃｔａｃｇｃ　ｃｔｔｃｃｇｃａａｃ　ｃａｇｇａｔｇｔｇｃ　１８６０　　ａｇａａａｇｔｇｃｔ　ｇｔｇｇｇｃｔｇｔｃ　ｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔ　ｇｔｔｃｃｔｃｔｔｃ　ｃａａｇａｔｃｃｃｃ　ｔｔｃｃｇａｔｃｃｃ　１９２０　　ｇｃｔｃｃｃｃｃａｇ　ｔｇａｔｇｔｃｔａｇ　ｃｔｇａｇｔｃｔｔｃ　ａｔｇａｃｃｃｔｔｃ　ａａｃｃｃｔｇａｔｔ　ａｃｔａｃａｇａａｔ　１９８０　　ｔｃｃａｇａａｔｇｔ　ｔａｇｇｃｔｃｔｃｃ　ａｇｇｇｃｔｔｃｔｔ　ｔｃｃａａａｃｃｃｃ　ｃａｇｃｔｃｃａｃａ　ｃｃｃｃｃｃａｇａｃ　２０４０　　ｃｃａｇｃｔｇｇｔｔ　ｃｔｇｇａｇｔｔｃｔ　ａｇｇａｃａｔｔｇｇ　ｇｔｇｔｔｔｃａａｇ　ｇｔｔｃｔｇｔｔｃａ　ｇａｔｃｃｃｔａｔｇ　２１００　　ｇｇｇｇｃｃｃａｇｃ　ｔｇｇｃｔｃｃａｃｇ　ｇｔｔｃｃａｇａａｔ　ｇｔｔｃａｇｇｔｇｇ　ｔｃａｇｔｇｔｔｃｔ　ａｃｔｃａｇａａａｔ　２１６０　　ｇｔｃｔｃａｃａｇｃ　ｃｃａｇｃｔｇｇｇｔ　ｔｇｃａａｔｔｃｃａ　ｇａａｔｇｃｔｇｇｇ　ａｇｔｔｔｔａｃａｇ　ｔｇｃｃａｔｔｃｃａ　２２２０　　ａｇｔｃｃｃａｇａｔ　ｇｔｃｃｃｔｃｔｔｃ　ｃｃｃｃａａａｃｔｔ　ｇａｃｃｔｔｇａｃｃ　ａｔｇｔｃａｃｔｔｔ　ａｃｇｔｔｔｇａａｔ　２２８０　　ｔｔｃｔｇａｇｃｔａ　ａａｇａｇｔｃａｇａ　ｇａｇａｔｔａｇｔｃ　ａｃａｔａｇｔｔｇｃ　ｃｔａａａｔａｇｇａ　ｇａｇａｇａａａｇａ　２３４０　　ｔｔａｔａｔａｔｇｃ　ａｃａｔａｔａｃａａ　ａｇａｃａｇｔｇｔｃ　ｔａｔｔｔａｔｇａｔ　ｔｇａｔｔｔａｔｔｔ　ａｔｔｔａｔａａａｔ　２４００　　ｔｔａｃｔｔａｔｇｇ　ｇｔｇｇｔａａｇｇｇ　ｇｃａａａａａａｇａ　ｇｇｃｃｃａｃａｃｃ　ｔｔｇａｔａｔｃｃａ　ｇｇｃｃａｔａｃｃａ　２４６０　　ｇｇｇｔａｔｃｃｃｔ　ｔｇｔｃｃｃｔｔｃａ　ｃｃｃｃｃａｔｔｔｃ　ｔｒａｃｃｔｃａｇｔ　ｔｃｃｔｇｇａｇｇｇ　ｇｇｇａａａｇｇｇｔ　２５２０　　ｇａａａｇａｇａａａ　ｃｃａｃｇｔａｔｔｔ　ｔｇｔｔａｔｔａｔｔ　ｔｔｇｇａｔｔａｔｔ　ｔｔｔｔａｔｃｇａａ　ｇａｇａｔｃａｔａｇ　２５８０　　ａａａｃｃａｇａｇｃ　ｃｔｔｃｔｃｃｃｃａ　ｇｇｃｃｔｇｃｃｃｔ　ｃｃｔｃｇｇｇｔｔｔ　ｇｇａａｇｇｇｇａａ　ｃａｃａｃｃａｇｃｃ　２６４０　　ｔｃｔｇｇｔｔｔｔｔ　ｔａｔｔｔｔｔｔｔａ　ａｇａａｇｃｃａｔｃ　ａｃｃｔｇａｇｃａａ　ｃｃａａａａａｔｔｃ　ｃｔｃｔｇｃｇｃｔｇ　２７００　　ｇｇｇｔｃｃｇａｃｔ　ｇｃｃｃｔｃｔｇｇｔ　ｇｇｃｃａｔｔｔｇｇ　ｇｇａａａａｃｔｇｃ　ａｇｃｃｃｇｇｃｃａ　ｇｇｃａｇｃｔｇｇｇ　２７６０　　ａｃｃａｇａａｔｇｃ　ａａｃｃｃｃａｇｃｔ　ｃｃａｃｔｃｃａｇｃ　ｃｔｇｇｃｇｔｃｃａ　ｇｇｇｃｃａｃａｇｃ　ｃａｔｇｇｃｃｔｇｇ　２８２０　　ｇｇｇｃｃａａｇｃｃ　ｔｃａｃｃｃｔｇｃｇ　ｇｔｇｃｃｃｔａａａ　ｇｇａｇｇｇｇｇｇｇ　ｃａｃｇａｇｃｃａａ　ｃａｃｃｃｃａｃｃｃ　２８８０　　ｃｔｃｔｇｃｃａａｃ　ｃｇｇｇｇｔａｔｇｇ　ｃｃｃｃｃａｇｔｇｃ　ａｔｔｃｃｃｔｇｔｔ　ｃｃｃｇｔｃｔｃｃａ　ａｃｃｃａａｃｔｃａ　２９４０　　ａｔａａａａａａｔｇ　ａｔｔｔｔｇｔｃａｔ　ａａａｔａｔｇｔｔｔ　ｃｃｃｔａｔｇｔｇｔ　ｇｔｇｔｇｇａｇｇｇ　ｔａｔｇｇａｇｔｇｇ　３０００　　ｇｇｃｃｔｇａｔｇｇ　ｇｇｇａｔｇｇｃｃｔ　ｇｇａａｔｇａｇａｇ　ｇｇｔｃａａｇｃｃａ　ｇｇｃｃｔｇｇｒｇｇ　ｇｃｃｔｇｔｔｇｇｇ　３０６０　　ｇｇａｔｃｔｇｇｇｇ　ａｇｃｔｇｇａｃａｇ　ａｇｇｇｔｇｇａｇｇ　ｇｔｇｇｃｔｇｇｃａ　ｇｇｔｇａｃｔｃｃｔ　ｔｃｔｃａｇａｔｇｔ　３１２０　　ｃａｇｔｇｃｃｃｃｔ　ｃｔｇｃｔｃａｇａｃ　ｃｔｇｇｇｃａｃｔｇ　ａｃｔｇｇｃａａｇｇ　ａｃｃｔｔａｃｃｔｃ　ｃｔｃｃｔｇｇｔｇａ　３１８０　　ｃａｇｇａａｃｃｔｇ　ｇｇｔｇｃｔｔｇｇｃ　ｔｃｔｔｃｃｔｇｇｇ　ｔｃａａｇｇａｔｇｃ　ｔｃａｃａｔｃｃｔｇ　ｃｃｃａｃａｃｃｇｇ　３２４０　　ｃｃａｃｔｇｔｇｇｇ　ｇｃｔｔａｇａｃａｔ　ｇａｔｇａａｔａｔｇ　ｃｔｃａａａｇｃａｔ　ｇｔｃａｇｔｔｔｃｃ　ｔｔａａｔａａｔａａ　３３００　　ｔａｇｇｔｃｃｔａｃ　ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ　ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ　ｔｔｔｇａｇａｃａｇ　ａｇｔｃｔｃｇｃｔｃ　ｔｇｔｃｃｃｃｃａｇ　３３６０　　ｇｃｔｇｇａｇｔｇｃ　ａｇｔｇｇｃｇｔｇａ　ｔｃｔｃｇｇｃｔｃａ　ｃｔｇｃａａｇｃｔｃ　ｃａｃｃｔｃｃｃｇｇ　ｇｔｔｃａｃｇｃｃａ　３４２０　　ｔｔｃｔｃｃｔｇｃｃ　ｔｃａｇｃｃｔｃｃｃ　ｇａｇｔａｇｃｔｇｇ　ｇａｃｙａｃａｇｇｃ　ｇｃｃｃａｃｃａｔｃ　ａｃｇｃｃｃｇｇｃｔ　３４８０　　ａａｔｔｔｔｔｔｔｔ　ｇｔａｙｔｔｔｔａｇ　ｔａｇａｇａｃｇｇｇ　ｇｔｔｔｃａｃｔｇｔ　ｇｔａａｇｃｃａｇｇ　ａｔｇｇｔｃｔｃｇａ　３５４０　　ｔｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３５４２　　＜２１０＞　９
＜２１１＞　１０８３
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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ａｔｇｇａｃｃｃａｇ　ａａｇａａａｃｔｔｃ　ａｇｔｔｔａｔｔｔｇ　ｇａｔｔａｔｔａｃｔ　ａｔｇｃｔａｃｇａｇ　ｃｃｃａａａｃｔｃｔ　６０　　　　ｇａｃａｔｃａｇｇｇ　ａｇａｃｃｃａｃｔｃ　ｃｃａｔｇｔｔｃｃｔ　ｔａｃａｃｃｔｃｔｇ　ｔｃｔｔｃｃｔｔｃｃ　ａｇｔｃｔｔｔｔａｃ　１２０　　　ａｃａｇｃｔｇｔｇｔ　ｔｃｃｔｇａｃｔｇｇ　ａｇｔｇｃｔｇｇｇｇ　ａａｃｃｔｔｇｔｔｃ　ｔｃａｔｇｇｇａｇｃ　ｇｔｔｇｃａｔｔｔｃ　１８０　　　ａａａｃｃｃｇｇｃａ　ｇｃｃｇａａｇａｃｔ　ｇａｔｃｇａｃａｔｃ　ｔｔｔａｔｃａｔｃａ　ａｔｃｔｇｇｃｔｇｃ　ｃｔｃｔｇａｃｔｔｃ　２４０　　　ａｔｔｔｔｔｃｔｔｇ　ｔｃａｃａｔｔｇｃｃ　ｔｃｔｃｔｇｇｇｔｇ　ｇａｔａａａｇａａｇ　ｃａｔｃｔｃｔａｇｇ　ａｃｔｇｔｇｇａｇｇ　３００　　　ａｃｇｇｇｃｔｃｃｔ　ｔｃｃｔｇｔｇｃａａ　ａｇｇｇａｇｃｔｃｃ　ｔａｃａｔｇａｔｃｔ　ｃｃｇｔｃａａｔａｔ　ｇｃａｃｔｇｃａｇｔ　３６０　　　ｇｔｃｃｔｃｃｔｇｃ　ｔｃａｃｔｔｇｃａｔ　ｇａｇｔｇｔｔｇａｃ　ｃｇｃｔａｃｃｔｇｇ　ｃｃａｔｔｇｔｇｔｇ　ｇｃｃａｇｔｃｇｔａ　４２０　　　ｔｃｃａｇｇａａａｔ　ｔｃａｇａａｇｇａｃ　ａｇａｃｔｇｔｇｃａ　ｔａｔｇｔａｇｔｃｔ　ｇｔｇｃｃａｇｃａｔ　ｃｔｇｇｔｔｔａｔｃ　４８０　　　ｔｃｃｔｇｃｃｔｇｃ　ｔｇｇｇｇｔｔｇｃｃ　ｔａｃｔｃｔｔｃｔｇ　ｔｃｃａｇｇｇａｇｃ　ｔｃａｃｇｃｔｇａｔ　ｔｇａｔｇａｔａａｇ　５４０　　　ｃｃａｔａｃｔｇｔｇ　ｃａｇａｇａａａａａ　ｇｇｃａａｃｔｃｃａ　ａｔｔａａａｃｔｃａ　ｔａｔｇｇｔｃｃｃｔ　ｇｇｔｇｇｃｃｔｔａ　６００　　　ａｔｔｔｔｃａｃｃｔ　ｔｔｔｔｔｇｔｃｃｃ　ｔｔｔｇｔｔｇａｇｃ　ａｔｔｇｔｇａｃｃｔ　ｇｃｔａｃｔｇｔｔｇ　ｃａｔｔｇｃａａｇｇ　６６０　　　ａａｇｃｔｇｔｇｔｇ　ｃｃｃａｔｔａｃｃａ　ｇｃａａｔｃａｇｇａ　ａａｇｃａｃａａｃａ　ａａａａｇｃｔｇａａ　ｇａａａｔｃｔａｔａ　７２０　　　ａａｇａｔｃａｔｃｔ　ｔｔａｔｔｇｔｃｇｔ　ｇｇｃａｇｃｃｔｔｔ　ｃｔｔｇｔｃｔｃｃｔ　ｇｇｃｔｇｃｃｃｔｔ　ｃａａｔａｃｔｔｔｃ　７８０　　　ａａｇｔｔｃｃｔｇｇ　ｃｃａｔｔｇｔｃｔｃ　ｔｇｇｇｔｔｇｃｇｇ　ｃａａｇａａｃａｃｔ　ａｔｔｔａｃｃｃｔｃ　ａｇｃｔａｔｔｃｔｔ　８４０　　　ｃａｇｃｔｔｇｇｔａ　ｔｇｇａｇｇｔｇａｇ　ｔｇｇａｃｃｃｔｔｇ　ｇｃａｔｔｔｇｃｃａ　ａｃａｇｃｔｇｔｇｔ　ｃａａｃｃｃｔｔｔｃ　９００　　　ａｔｔｔａｃｔａｔａ　ｔｃｔｔｃｇａｃａｇ　ｃｔａｃａｔｃｃｇｃ　ｃｇｇｇｃｃａｔｔｇ　ｔｃｃａｃｔｇｃｔｔ　ｇｔｇｃｃｃｔｔｇｃ　９６０　　　ｃｔｇａａａａａｃｔ　ａｔｇａｃｔｔｔｇｇ　ｇａｇｔａｇｃａｃｔ　ｇａｇａｃａｔｃａｇ　ａｔａｇｔｃａｃｃｔ　ｃａｃｔａａｇｇｃｔ　１０２０　　ｃｔｃｔｃｃａｃｃｔ　ｔｃａｔｔｃａｔｇｃ　ａｇａａｇａｔｔｔｔ　ｇｃｃａｇｇａｇｇａ　ｇｇａａｇａｇｇｔｃ　ｔｇｔｇｔｃａｃｔｃ　１０８０　　ｔａａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０８３　　＜２１０＞　１０
＜２１１＞　９３０
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　１０
ａｔｇａａｔｇｇｃａ　ｃｃｔａｃａａｃａｃ　ｃｔｇｔｇｇｃｔｃｃ　ａｇｃｇａｃｃｔｃａ　ｃｃｔｇｇｃｃｃｃｃ　ａｇｃｇａｔｃａａｇ　６０　　　　ｃｔｇｇｇｃｔｔｃｔ　ａｃｇｃｃｔａｃｔｔ　ｇｇｇｃｇｔｃｃｔｇ　ｃｔｇｇｔｇｃｔａｇ　ｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔ　ｃａａｃａｇｃｃｔｇ　１２０　　　ｇｃｇｃｔｃｔｇｇｇ　ｔｇｔｔｃｔｇｃｔｇ　ｃｃｇｃａｔｇｃａｇ　ｃａｇｔｇｇａｃｇｇ　ａｇａｃｃｃｇｃａｔ　ｃｔａｃａｔｇａｃｃ　１８０　　　ａａｃｃｔｇｇｃｇｇ　ｔｇｇｃｃｇａｃｃｔ　ｃｔｇｃｃｔｇｃｔｇ　ｔｇｃａｃｃｔｔｇｃ　ｃｃｔｔｃｇｔｇｃｔ　ｇｃａｃｔｃｃｃｔｇ　２４０　　　ｃｇａｇａｃａｃｃｔ　ｃａｇａｃａｃｇｃｃ　ｇｃｔｇｔｇｃｃａｇ　ｃｔｃｔｃｃｃａｇｇ　ｇｃａｔｃｔａｃｃｔ　ｇａｃｃａａｃａｇｇ　３００　　　ｔａｃａｔｇａｇｃａ　ｔｃａｇｃｃｔｇｇｔ　ｃａｃｇｇｃｃａｔｃ　ｇｃｃｇｔｇｇａｃｃ　ｇｃｔａｔｇｔｇｇｃ　ｃｇｔｇｃｇｇｃａｃ　３６０　　　ｃｃｇｃｔｇｃｇｔｇ　ｃｃｃｇｃｇｇｇｃｔ　ｇｃｇｇｔｃｃｃｃｃ　ａｇｇｃａｇｇｃｔｇ　ｃｇｇｃｃｇｔｇｔｇ　ｃｇｃｇｇｔｃｃｔｃ　４２０　　　ｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇ　ｔｃａｔｃｇｇｃｔｃ　ｃｃｔｇｇｔｇｇｃｔ　ｃｇｃｔｇｇｃｔｃｃ　ｔｇｇｇｇａｔｔｃａ　ｇｇａｇｇｇｃｇｇｃ　４８０　　　ｔｔｃｔｇｃｔｔｃａ　ｇｇａｇｃａｃｃｃｇ　ｇｃａｃａａｔｔｔｃ　ａａｃｔｃｃａｔｇｃ　ｇｇｔｔｃｃｃｇｃｔ　ｇｃｔｇｇｇａｔｔｃ　５４０　　　ｔａｃｃｔｇｃｃｃｃ　ｔｇｇｃｃｇｔｇｇｔ　ｇｇｔｃｔｔｃｔｇｃ　ｔｃｃｃｔｇａａｇｇ　ｔｇｇｔｇａｃｔｇｃ　ｃｃｔｇｇｃｃｃａｇ　６００　　　ａｇｇｃｃａｃｃｃａ　ｃｃｇａｃｇｔｇｇｇ　ｇｃａｇｇｃａｇａｇ　ｇｃｃａｃｃｃｇｃａ　ａｇｇｃｔｇｃｃｃｇ　ｃａｔｇｇｔｃｔｇｇ　６６０　　　ｇｃｃａａｃｃｔｃｃ　ｔｇｇｔｇｔｔｃｇｔ　ｇｇｔｃｔｇｃｔｔｃ　ｃｔｇｃｃｃｃｔｇｃ　ａｃｇｔｇｇｇｇｃｔ　ｇａｃａｇｔｇｃｇｃ　７２０　　　ｃｔｃｇｃａｇｔｇｇ　ｇｃｔｇｇａａｃｇｃ　ｃｔｇｔｇｃｃｃｔｃ　ｃｔｇｇａｇａｃｇａ　ｔｃｃｇｔｃｇｃｇｃ　ｃｃｔｇｔａｃａｔａ　７８０　　　ａｃｃａｇｃａａｇｃ　ｔｃｔｃａｇａｔｇｃ　ｃａａｃｔｇｃｔｇｃ　ｃｔｇｇａｃｇｃｃａ　ｔｃｔｇｃｔａｃｔａ　ｃｔａｃａｔｇｇｃｃ　８４０　　　ａａｇｇａｇｔｔｃｃ　ａｇｇａｇｇｃｇｔｃ　ｔｇｃａｃｔｇｇｃｃ　ｇｔｇｇｃｔｃｃｃｃ　ｇｔｇｃｔａａｇｇｃ　ｃｃａｃａａａａｇｃ　９００　　　ｃａｇｇａｃｔｃｔｃ　ｔｇｔｇｃｇｔｇａｃ　ｃｃｔｃｇｃｃｔａａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９３０　　　＜２１０＞　１１
＜２１１＞　１６３８
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　１１
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＜２１１＞　１１７６
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　１２
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＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　１３
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＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１１＞　２７５３
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　１６
ｇｔｃｇｇｇｇｇｃａ　ｇｃａｇｃａａｇａｔ　ｇｃｇａａｇｃｇａｇ　ｃｃｇｔａｃａｇａｔ　ｃｃｃｇｇｇｃｔｃｔ　ｃｃｇａａｃｇｃａａ　６０　　　　ｃｔｔｃｇｃｃｃｔｇ　ｃｔｔｇａｇｃｇａｇ　ｇｃｔｇｃｇｇｔｔｔ　ｃｃｇａｇｇｃｃｃｔ　ｃｔｃｃａｇｃｃａａ　ｇｇａａａａｇｃｔａ　１２０　　　ｃａｃａａａａａｇｃ　ｃｔｇｇａｔｃａｃｔ　ｃａｔｃｇａａｃｃａ　ｃｃｃｃｔｇａａｇｃ　ｃａｇｔｇａａｇｇｃ　ｔｃｔｃｔｃｇｃｃｔ　１８０　　　ｃｇｃｃｃｔｃｔａｇ　ｃｇｔｔｃｇｔｃｔｇ　ｇａｇｔａｇｃｇｃｃ　ａｃｃｃｃｇｇｃｔｔ　ｃｃｔｇｇｇｇａｃａ　ｃａｇｇｇｔｔｇｇｃ　２４０　　　ａｃｃａｔｇｇｇｇｃ　ｃｃａｃｃａｇｃｇｔ　ｃｃｃｇｃｔｇｇｔｃ　ａａｇｇｃｃｃａｃｃ　ｇｃａｇｃｔｃｇｇｔ　ｃｔｃｔｇａｃｔａｃ　３００　　　ｇｔｃａａｃｔａｔｇ　ａｔａｔｃａｔｃｇｔ　ｃｃｇｇｃａｔｔａｃ　ａａｃｔａｃａｃｇｇ　ｇａａａｇｃｔｇａａ　ｔａｔｃａｇｃｇｃｇ　３６０　　　ｇａｃａａｇｇａｇａ　ａｃａｇｃａｔｔａａ　ａｃｔｇａｃｃｔｃｇ　ｇｔｇｇｔｇｔｔｃａ　ｔｔｃｔｃａｔｃｔｇ　ｃｔｇｃｔｔｔａｔｃ　４２０　　　ａｔｃｃｔｇｇａｇａ　ａｃａｔｃｔｔｔｇｔ　ｃｔｔｇｃｔｇａｃｃ　ａｔｔｔｇｇａａａａ　ｃｃａａｇａａａｔｔ　ｃｃａｃｃｇａｃｃｃ　４８０　　　ａｔｇｔａｃｔａｔｔ　ｔｔａｔｔｇｇｃａａ　ｔｃｔｇｇｃｃｃｔｃ　ｔｃａｇａｃｃｔｇｔ　ｔｇｇｃａｇｇａｇｔ　ａｇｃｃｔａｃａｃａ　５４０　　　ｇｃｔａａｃｃｔｇｃ　ｔｃｔｔｇｔｃｔｇｇ　ｇｇｃｃａｃｃａｃｃ　ｔａｃａａｇｃｔｃａ　ｃｔｃｃｃｇｃｃｃａ　ｇｔｇｇｔｔｔｃｔｇ　６００　　　ｃｇｇｇａａｇｇｇａ　ｇｔａｔｇｔｔｔｇｔ　ｇｇｃｃｃｔｇｔｃａ　ｇｃｃｔｃｃｇｔｇｔ　ｔｃａｇｔｃｔｃｃｔ　ｃｇｃｃａｔｃｇｃｃ　６６０　　　ａｔｔｇａｇｃｇｃｔ　ａｔａｔｃａｃａａｔ　ｇｃｔｇａａａａｔｇ　ａａａｃｔｃｃａｃａ　ａｃｇｇｇａｇｃａａ　ｔａａｃｔｔｃｃｇｃ　７２０　　　ｃｔｃｔｔｃｃｔｇｃ　ｔａａｔｃａｇｃｇｃ　ｃｔｇｃｔｇｇｇｔｃ　ａｔｃｔｃｃｃｔｃａ　ｔｃｃｔｇｇｇｔｇｇ　ｃｃｔｇｃｃｔａｔｃ　７８０　　　ａｔｇｇｇｃｔｇｇａ　ａｃｔｇｃａｔｃａｇ　ｔｇｃｇｃｔｇｔｃｃ　ａｇｃｔｇｃｔｃｃａ　ｃｃｇｔｇｃｔｇｃｃ　ｇｃｔｃｔａｃｃａｃ　８４０　　　ａａｇｃａｃｔａｔａ　ｔｃｃｔｃｔｔｃｔｇ　ｃａｃｃａｃｇｇｔｃ　ｔｔｃａｃｔｃｔｇｃ　ｔｔｃｔｇｃｔｃｔｃ　ｃａｔｃｇｔｃａｔｔ　９００　　　ｃｔｇｔａｃｔｇｃａ　ｇａａｔｃｔａｃｔｃ　ｃｔｔｇｇｔｃａｇｇ　ａｃｔｃｇｇａｇｃｃ　ｇｃｃｇｃｃｔｇａｃ　ｇｔｔｃｃｇｃａａｇ　９６０　　　ａａｃａｔｔｔｃｃａ　ａｇｇｃｃａｇｃｃｇ　ｃａｇｃｔｃｔｇａｇ　ａａｇｔｃｇｃｔｇｇ　ｃｇｃｔｇｃｔｃａａ　ｇａｃｃｇｔａａｔｔ　１０２０　　ａｔｃｇｔｃｃｔｇａ　ｇｃｇｔｃｔｔｃａｔ　ｃｇｃｃｔｇｃｔｇｇ　ｇｃａｃｃｇｃｔｃｔ　ｔｃａｔｃｃｔｇｃｔ　ｃｃｔｇｃｔｇｇａｔ　１０８０　　ｇｔｇｇｇｃｔｇｃａ　ａｇｇｔｇａａｇａｃ　ｃｔｇｔｇａｃａｔｃ　ｃｔｃｔｔｃａｇａｇ　ｃｇｇａｇｔａｃｔｔ　ｃｃｔｇｇｔｇｔｔａ　１１４０　　ｇｃｔｇｔｇｃｔｃａ　ａｃｔｃｃｇｇｃａｃ　ｃａａｃｃｃｃａｔｃ　ａｔｔｔａｃａｃｔｃ　ｔｇａｃｃａａｃａａ　ｇｇａｇａｔｇｃｇｔ　１２００　　ｃｇｇｇｃｃｔｔｃａ　ｔｃｃｇｇａｔｃａｔ　ｇｔｃｃｔｇｃｔｇｃ　ａａｇｔｇｃｃｃｇａ　ｇｃｇｇａｇａｃｔｃ　ｔｇｃｔｇｇｃａａａ　１２６０　　ｔｔｃａａｇｃｇａｃ　ｃｃａｔｃａｔｃｇｃ　ｃｇｇｃａｔｇｇａａ　ｔｔｃａｇｃｃｇｃａ　ｇｃａａａｔｃｇｇａ　ｃａａｔｔｃｃｔｃｃ　１３２０　　ｃａｃｃｃｃｃａｇａ　ａａｇａｃｇａａｇｇ　ｇｇａｃａａｃｃｃａ　ｇａｇａｃｃａｔｔａ　ｔｇｔｃｔｔｃｔｇｇ　ａａａｃｇｔｃａａｃ　１３８０　　ｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔ　ａｇａａｃｔｇｇａａ　ｇｃｔｇｔｃｃａｃｃ　ｃａｃｃｇｇａａｇｃ　ｇｃｔｃｔｔｔａｃｔ　ｔｇｇｔｃｇｃｔｇｇ　１４４０　　ｃｃａｃｃｃｃａｇｔ　ｇｔｔｔｇｇａａａａ　ａａａｔｃｔｃｔｇｇ　ｇｃｔｔｃｇａｃｔｇ　ｃｔｇｃｃａｇｇｇａ　ｇｇａｇｃｔｇｃｔｇ　１５００　　ｃａａｇｃｃａｇａｇ　ｇｇａｇｇａａｇｇｇ　ｇｇａｇａａｔａｃｇ　ａａｃａｇｃｃｔｇｇ　ｔｇｇｔｇｔｃｇｇｇ　ｔｇｔｔｇｇｔｇｇｇ　１５６０　　ｔａｇａｇｔｔａｇｔ　ｔｃｃｔｇｔｇａａｃ　ａａｔｇｃａｃｔｇｇ　ｇａａｇｇｇｔｇｇａ　ｇａｔｃａｇｇｔｃｃ　ｃｇｇｃｃｔｇｇａａ　１６２０　　ｔａｔａｔａｔｔｃｔ　ａｃｃｃｃｃｃｔｇｇ　ａｇｃｔｔｔｇａｔｔ　ｔｔｇｃａｃｔｇａｇ　ｃｃａａａｇｇｔｃｔ　ａｇｃａｔｔｇｔｃａ　１６８０　　ａｇｃｔｃｃｔａａａ　ｇｇｇｔｔｃａｔｔｔ　ｇｇｃｃｃｃｔｃｃｔ　ｃａａａｇａｃｔａａ　ｔｇｔｃｃｃｃａｔｇ　ｔｇａａａｇｃｇｔｃ　１７４０　　ｔｃｔｔｔｇｔｃｔｇ　ｇａｇｃｔｔｔｇａｇ　ｇａｇａｔｇｔｔｔｔ　ｃｃｔｔｃａｃｔｔｔ　ａｇｔｔｔｃａａａｃ　ｃｃａａｇｔｇａｇｔ　１８００　　ｇｔｇｔｇｃａｃｔｔ　ｃｔｇｃｔｔｃｔｔｔ　ａｇｇｇａｔｇｃｃｃ　ｔｇｔａｃａｔｃｃｃ　ａｃａｃｃｃｃａｃｃ　ｃｔｃｃｃｔｔｃｃｃ　１８６０　　ｔｔｃａｔａｃｃｃｃ　ｔｃｃｔｃａａｃｇｔ　ｔｃｔｔｔｔａｃｔｔ　ｔａｔａｃｔｔｔａａ　ｃｔａｃｃｔｇａｇａ　ｇｔｔａｔｃａｇａｇ　１９２０　　ｃｔｇｇｇｇｔｔｇｔ　ｇｇａａｔｇａｔｃｇ　ａｔｃａｔｃｔａｔａ　ｇｃａａａｔａｇｇｃ　ｔａｔｇｔｔｇａｇｔ　ａｃｇｔａｇｇｃｔｇ　１９８０　　ｔｇｇｇａａｇａｔｇ　ａａｇａｔｇｇｔｔｔ　ｇｇａｇｇｔｇｔａａ　ａａｃａａｔｇｔｃｃ　ｔｔｃｇｃｔｇａｇｇ　ｃｃａａａｇｔｔｔｃ　２０４０　　ｃａｔｇｔａａｇｃｇ　ｇｇａｔｃｃｇｔｔｔ　ｔｔｔｇｇａａｔｔｔ　ｇｇｔｔｇａａｇｔｃ　ａｃｔｔｔｇａｔｔｔ　ｃｔｔｔａａａａａａ　２１００　　ｃａｔｃｔｔｔｔｃａ　ａｔｇａａａｔｇｔｇ　ｔｔａｃｃａｔｔｔｃ　ａｔａｔｃｃａｔｔｇ　ａａｇｃｃｇａａａｔ　ｃｔｇｃａｔａａｇｇ　２１６０　　ａａｇｃｃｃａｃｔｔ　ｔａｔｃｔａａａｔｇ　ａｔａｔｔａｇｃｃａ　ｇｇａｔｃｃｔｔｇｇ　ｔｇｔｃｃｔａｇｇａ　ｇａａａｃａｇａｃａ　２２２０　　ａｇｃａａａａｃａａ　ａｇｔｇａａａａｃｃ　ｇａａｔｇｇａｔｔａ　ａｃｔｔｔｔｇｃａａ　ａｃｃａａｇｇｇａｇ　ａｔｔｔｃｔｔａｇｃ　２２８０　　ａａａｔｇａｇｔｃｔ　ａａｃａａａｔａｔｇ　ａｃａｔｃｃｇｔｃｔ　ｔｔｃｃｃａｃｔｔｔ　ｔｇｔｔｇａｔｇｔｔ　ｔａｔｔｔｃａｇａａ　２３４０　　ｔｃｔｔｇｔｇｔｇａ　ｔｔｃａｔｔｔｃａａ　ｇｃａａｃａａｃａｔ　ｇｔｔｇｔａｔｔｔｔ　ｇｔｔｇｔｇｔｔａａ　ａａｇｔａｃｔｔｔｔ　２４００　　ｃｔｔｇａｔｔｔｔｔ　ｇａａｔｇｔａｔｔｔ　ｇｔｔｔｃａｇｇａａ　ｇａａｇｔｃａｔｔｔ　ｔａｔｇｇａｔｔｔｔ　ｔｃｔａａｃｃｃｇｔ　２４６０　　ｇｔｔａａｃｔｔｔｔ　ｃｔａｇａａｔｃｃａ　ｃｃｃｔｃｔｔｇｔｇ　ｃｃｃｔｔａａｇｃａ　ｔｔａｃｔｔｔａａｃ　ｔｇｇｔａｇｇｇａａ　２５２０　　ｃｇｃｃａｇａａｃｔ　ｔｔｔａａｇｔｃｃａ　ｇｃｔａｔｔｃａｔｔ　ａｇａｔａｇｔａａｔ　ｔｇａａｇａｔａｔｇ　ｔａｔａａａｔａｔｔ　２５８０　　ａｃａａａｇａａｔａ　ａａａａｔａｔａｔｔ　ａｃｔｇｔｃｔｃｔｔ　ｔａｇｔａｔｇｇｔｔ　ｔｔｃａｇｔｇｃａａ　ｔｔａａａｃｃｇａｇ　２６４０　　ａｇａｔｇｔｃｔｔｇ　ｔｔｔｔｔｔｔａａａ　ａａｇａａｔａｇｔａ　ｔｔｔａａｔａｇｇｔ　ｔｔｃｔｇａｃｔｔｔ　ｔｇｔｇｇａｔｃａｔ　２７００　　ｔｔｔｇｃａｃａｔａ　ｇｃｔｔｔａｔｃａａ　ｃｔｔｔｔａａａｃａ　ｔｔａａｔａａａｃｔ　ｇａｔｔｔｔｔｔｔａ　ａａｇ　　　　　　　　２７５３　　＜２１０＞　１７
＜２１１＞　２６８
＜２１２＞　ＰＲＴ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　１７
Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ
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＜２１２＞　ＰＲＴ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｒｐ
３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　１２５　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　１４５　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　１８０　　　　　　　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ
１９５　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０５　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　２１０　　　　　　　　　　　　　　　　　２１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　２２５　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　　　　　　　　　　　　　　　　　２４０Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０　　　　　　　　　　　　　　　　　２５５　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５　　　　　　　　　　　　　　　　　２７０　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　２７５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０　　　　　　　　　　　　　　　　　２８５　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　２９０　　　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　３０５　　　　　　　　　　　　　　　　　３１０　　　　　　　　　　　　　　　　　３１５　　　　　　　　　　　　　　　　　３２０Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　３２５　　　　　　　　　　　　　　　　　３３０　　　　　　　　　　　　　　　　　３３５　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　３４０　　　　　　　　　　　　　　　　　３４５　　　　　　　　　　　　　　　　　３５０
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Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｙｒ
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Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ
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Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　２２５　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　　　　　　　　　　　　　　　　　２４０Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０　　　　　　　　　　　　　　　　　２５５　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５　　　　　　　　　　　　　　　　　２７０　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　２７５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０　　　　　　　　　　　　　　　　　２８５　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　２９０　　　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　３０５　　　　　　　　　　　　　　　　　３１０　　　　　　　　　　　　　　　　　３１５　　　　　　　　　　　　　　　　　３２０Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　３２５　　　　　　　　　　　　　　　　　３３０　　　　　　　　　　　　　　　　　３３５　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｒｇ　３４０　　　　　　　　　　　　　　　　　３４５　　　　　　　　　　　　　　　　　３５０　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ
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＜４００＞　２８
Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ
３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　１２５　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　１４５　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　１８０　　　　　　　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０
Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　１９５　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０５　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　２１０　　　　　　　　　　　　　　　　　２１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　２２５　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　　　　　　　　　　　　　　　　　２４０Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０　　　　　　　　　　　　　　　　　２５５　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５　　　　　　　　　　　　　　　　　２７０　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　２７５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０　　　　　　　　　　　　　　　　　２８５　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　２９０　　　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　３０５　　　　　　　　　　　　　　　　　３１０　　　　　　　　　　　　　　　　　３１５　　　　　　　　　　　　　　　　　３２０Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　３２５　　　　　　　　　　　　　　　　　３３０　　　　　　　　　　　　　　　　　３３５　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ
３４０　　　　　　　　　　　　　　　　　３４５　　　　　　　　　　　　　　　　　３５０　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　３５５　　　　　　　　　　　　　　　　　３６０　　　　　　　　　　　　　　　　　３６５　＜２１０＞　２９
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＜２１２＞　ＰＲＴ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０
Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　１２５　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　１４５　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　１８０　　　　　　　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　１９５　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０５　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　２１０　　　　　　　　　　　　　　　　　２１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
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＜２１２＞　ＰＲＴ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　１２５　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ
１４５　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　１８０　　　　　　　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　１９５　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０５　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　２１０　　　　　　　　　　　　　　　　　２１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　２２５　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　　　　　　　　　　　　　　　　　２４０Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０　　　　　　　　　　　　　　　　　２５５　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５　　　　　　　　　　　　　　　　　２７０　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　２７５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０　　　　　　　　　　　　　　　　　２８５　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　２９０　　　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ
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＜２１２＞　ＰＲＴ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ
３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　１２５　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　１４５　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　１８０　　　　　　　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ
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Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　３５５　　　　　　　　　　　　　　　　　３６０　　　　　　　　　　　　　　　　　３６５　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　３７０　　　　　　　　　　　　　　　　　３７５　　　　　　　　　　　　　　　　　３８０
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、各マーカー遺伝子およびマーカー蛋白質のＧｅｎＢａｎｋ　登録情報の新旧対応を示す。
【図１】
2004000155.tif 000005