(57)【要約】　　　（修正有）【課題】赤かび病菌の感染により植物体内に蓄積されるゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有するタンパク質。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を有するタンパク質
【請求項２】
ゼアラレノン類が、エストロゲン様活性を有する化合物である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
ゼアラレノン類が、ゼアラレノン、α−ゼアラレノール、β−ゼアラレノール、α−ゼアララノール、β−ゼアララノール、２，４−Ｏ−ジメチル−δ−ヒドロキシゼアラレノン、６−アミノ−ゼアラレノン、ゼアララノン及び６−アセチル−β−ゼアラレノールからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１又は２記載のタンパク質。
【請求項４】
毒性を抑制する作用が分解作用である、請求項１〜３のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５】
毒性を抑制する作用が、エストロゲン様活性を有しない化合物を生成するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６】
ｐＨ６〜１１で活性を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項７】
ｐＨ９〜１０．５で活性を有する、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を有するタンパク質
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部若しくは一部に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全部若しくは一部に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項１１】
ゼアラレノン類が、エストロゲン様活性を有する化合物である、請求項８〜１０のいずれか１項記載の遺伝子。
【請求項１２】
ゼアラレノン類が、ゼアラレノン、α−ゼアラレノール、β−ゼアラレノール、α−ゼアララノール、β−ゼアララノール、２，４−Ｏ−ジメチル−δ−ヒドロキシゼアラレノン、６−アミノ−ゼアラレノン、ゼアララノン及び６−アセチル−β−ゼアラレノールからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８〜１１のいずれか１項記載の遺伝子。
【請求項１３】
毒性を抑制する作用が分解作用である、請求項８〜１２のいずれか１項記載の遺伝子。
【請求項１４】
毒性を抑制する作用が、エストロゲン様活性を有しない化合物を生成するものである、請求項８〜１３のいずれか１項記載の遺伝子。
【請求項１５】
請求項８〜１４のいずれか１項記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１７】
大腸菌、酵母細胞及びイネ科植物細胞からなる群より選択される細胞に組換えベクターが導入された、請求項１６記載の形質転換体。
【請求項１８】
請求項１６又は１７記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
【請求項１９】
請求項１６又は１７記載の形質転換体を含有する解毒剤。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか１項記載のタンパク質を含有する解毒剤。
【請求項２１】
ゼアラレノン類に請求項１９又は２０記載の解毒剤を適用することを特徴とする、ゼアラレノン類の解毒方法。
【請求項２２】
請求項８〜１４のいずれか１項記載の遺伝子を含むトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイコトキシン汚染植物の浄化を行い得るタンパク質及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食糧の安定供給と環境保全は、今後の植物科学研究に課せられた重要な研究課題となっている。これに対し、近年では、組換え技術を用いて除草剤耐性や害虫耐性等の有用な形質を付与した様々な種類の組換え作物が作出されている。
【０００３】
植物の病気として、植物病原糸状菌（カビ）が感染することにより植物体が損傷され、収穫の大きな損失をも引き起こす、ムギ類赤かび病が知られている。赤かび病は、近年の温暖で湿潤な気候の変動によってその感染が広がっている。特に１９９０年代に入り、世界各地で大流行したムギ類赤かび病は、先進的集約農業の行われている北米においてさえ壊滅的打撃を免れることのできなかった難防除病害となった。このため、欧米では昨今、赤かび病が大きな問題として取り上げられ、国家規模での対策が講じられつつある。地球規模で安定した安全な食料供給を確保するためには、今後、赤かび病の脅威から重要穀物であるコムギを守ることは重要な問題である。
【０００４】
赤かび病は、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）菌というカビによって引き起こされる植物の病気であり、ムギ類、トウモロコシ、イネなどのイネ科植物に感染する。赤かび病菌としては、これまでにフザリウム　グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）をはじめ１７種以上のフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）菌が単離、報告されている（非特許文献１）。植物が赤かび病に侵されると、子実の収量、品質が大きく低下することにより経済的打撃を被ることに加え、穀粒中にマイコトキシン毒素が蓄積することから食品衛生上の問題も引き起こされる。このように赤かび病は食糧供給にとって二重の脅威をもたらすものである。
【０００５】
赤かび病菌の防除には、テブコナゾール等の農薬が使われるが、耐性菌の出現の可能性、手間とコストがかさむこと、散布時期のタイミングの難しさ、農薬の残留性特性などからあまり実用的ではない。そこで、赤かび病の抵抗性品種の育成に力が注がれてきた（非特許文献２）。商業品種に赤かび病抵抗性の形質を入れるためには、まず抵抗性を示す適当な野生種を見つけ出し、抵抗性の好ましい形質だけを商業品種に導入するために戻し交雑をくり返し、抵抗性でかつ収量と品質も保たれた子孫を選抜していくという育種が行われる。しかしこの古典的な方法には多くの時間がかかり、また抵抗性を打破する菌が出現するなどの問題も生じていた（非特許文献２）。
【０００６】
また、赤かび病菌の感染によって、マイコトキシンのトリコテセン系毒素が穀粒中に蓄積されることが知られている。トリコテセン系毒素は、タンパク合成阻害剤でもあり、菌が感染する際に病原性因子として感染力を増強する。トリコテセン系毒素の毒性を妨げる方法として、トリコテセン系毒素のタンパク質合成阻害活性をブロックする遺伝子（特許文献１）及びトリコテセン系毒素を細胞外に排出するポンプ作用性遺伝子（非特許文献３）が報告されている。しかしながらこのトリコテセン系毒素自体を不活化し得る遺伝子は未だ見つかっていない。
【０００７】
同様に、赤かび病菌の感染により、ゼアラレノンが、トウモロコシ、コムギ等の穀物作物の穀粒中に蓄積されることが知られている（非特許文献４）。ゼアラレノン［６−（１０−ヒドロキシ−６−オキソ−トランス−１−ウンデセニル）−β−レゾルシル酸ラクトン］は、赤かび病菌であるフザリウム属菌によって生産されるエストロゲン様活性を有するマイコトキシンである。フザリウム属菌が植物に感染すると、収穫前又は収穫後の穀物作物の穀粒中にゼアラレノンが生産され蓄積される（非特許文献４）。ゼアラレノンは、エストロゲン様活性を有し、それを摂取した人間や家畜に中毒症状や生殖障害を引き起こし得る環境ホルモン物質である（非特許文献５）。ゼアラレノン及びその代謝産物については、ヒトのエストロゲン受容体に結合すること（非特許文献６）及びｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒト乳がん細胞系ＭＣＦ−７の増殖を促進すること（非特許文献７）が報告されている。
【０００８】
赤かび病からの植物の保護においては、このような穀物のゼアラレノン汚染の問題を解決することは非常に重要である。しかしながら、ゼアラレノンの有効な解毒処理については、化学的手法、酵素的手法等のいずれにおいても有効な方法が未だ報告されていない。
【０００９】
【特許文献１】
特開２０００−３２９８５号公報
【非特許文献１】
Ｊ．　ＣｈｅｌＲｏｗｓｋｙ編，「フザリウム属菌のマイコトキシン、分類及び病原性（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ，　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ａｎｄ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ．，１９８９年発行，ｐ．１−３９
【非特許文献２】
監修：山田哲治　島本功　渡辺雄一郎，「分子レベルからみた植物の耐病性」，秀潤社，１９９７年発行，ｐ．９０−９７
【非特許文献３】
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，　ＮＪ著，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　ｇｅｎｅｒａｌ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，（１９９９），２６１，ｐ．９７７−９８４
【非特許文献４】
Ｐｉｔｔｅｔ，　Ａ．著，”Ｒｅｖｕｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅ”，フランス，Ｅｃｏｌｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅ　ｄｅ　Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，（１９９８），１４９，　ｐ．４７９−４９２
【非特許文献５】
Ｅｔｉｅｎｎｅ，　Ｍ　ａｎｄ　Ｊａｍｍａｌｉ，　Ｍ．著，（１９８２），”Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ａｎｉｍａｌ　ｓｃｉｅｎｃｅ”，５５，ｐ．１−１０
【非特許文献６】
Ｍｉｋｓｉｃｅｋ，　Ｒ．Ｊ．著，”Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｓｔｅｒｏｉｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ”，（１９９４），４９，ｐ．１３−１６０
【非特許文献７】
Ｍａｋｅｌａ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．著，”Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ”，（１９９４），１０２，ｐ．５７２−５７８
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、赤かび病菌の感染により植物体内に蓄積されるゼアラレノンを解毒するタンパク質をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ゼアラレノンを分解する活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］　以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を有するタンパク質
ここで［１］におけるタンパク質は、ゼアラレノン類がエストロゲン様活性を有する化合物であることを特徴とするものであり得る。ゼアラレノン類は、ゼアラレノン、α−ゼアラレノール、β−ゼアラレノール、α−ゼアララノール、β−ゼアララノール、２，４−Ｏ−ジメチル−δ−ヒドロキシゼアラレノン、６−アミノ−ゼアラレノン、ゼアララノン及び６−アセチル−β−ゼアラレノールからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。また［１］のタンパク質は、毒性を抑制する作用が分解作用であることを特徴とするものであり得る。毒性を抑制する作用は、エストロゲン様活性を有しない化合物を生成するものであってもよい。さらに［１］のタンパク質は、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ９〜１０．５で活性を有するものであり得る。
【００１３】
［２］　以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を有するタンパク質
【００１４】
［３］　以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部若しくは一部に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１５】
［４］　以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全部若しくは一部に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
ここで、［２］〜［４］における遺伝子は、ゼアラレノン類がエストロゲン様活性を有する化合物であることを特徴とするものであり得る。ゼアラレノン類は、ゼアラレノン、α−ゼアラレノール、β−ゼアラレノール、α−ゼアララノール、β−ゼアララノール、２，４−Ｏ−ジメチル−δ−ヒドロキシゼアラレノン、６−アミノ−ゼアラレノン、ゼアララノン及び６−アセチル−β−ゼアラレノールからなる群から選択される少なくとも１つであってよい。また［２］〜［４］における遺伝子は、毒性を抑制する作用が分解作用であることを特徴とするものであり得る。毒性を抑制する作用は、エストロゲン様活性を有しない化合物を生成するものであってよい。
【００１６】
［５］　　［２］〜［４］の遺伝子を含む組換えベクター。
【００１７】
［６］　　［５］の組換えベクターを含む形質転換体。
ここで、上記形質転換体は、大腸菌、酵母細胞及びイネ科植物細胞からなる群より選択される細胞に組換えベクターが導入されたものであり得る。
【００１８】
［７］　　［６］の形質転換体を培養し、得られる培養物からゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
【００１９】
［８］　　［６］の形質転換体を含有する解毒剤。
【００２０】
［９］　　［１］のタンパク質を含有する解毒剤。
【００２１】
［１０］　ゼアラレノン類に［８］又は［９］の解毒剤を適用することを特徴とする、ゼアラレノン類の解毒方法。
【００２２】
［１１］　［２］〜［４］の遺伝子を含むトランスジェニック植物。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　Ｌ．）の赤かび病に対する抵抗性は、大きく分けて以下のタイプＩ〜ＩＶの４種類に分類されている：
〔１〕タイプＩ：菌の侵入に対する抵抗性（開花特性、穂の形状等による）
〔２〕タイプＩＩ：侵入後の菌の進展（菌糸の伸長）に対する抵抗性
〔３〕タイプＩＩＩ：穀粒の部分で発揮される抵抗性（種子に対するカビによる損傷の低減）
〔４〕タイプＩＶ：マイコトキシン蓄積量の低減に基づく抵抗性。
【００２４】
これらの抵抗性は、それぞれが異なった多くの遺伝子に支配されていると考えられている。そこで、赤かび病抵抗性に関わる遺伝子の機能を人為的に調節することができれば、植物に赤かび病に対する抵抗性を付与することができると考えられた。
【００２５】
特に、タイプＩＶの抵抗性、すなわち感染植物のマイコトキシン蓄積量の低減に基づく抵抗性に関わる遺伝子は、植物個体を赤かび病から保護する上で有用であるだけでなく、該植物から生産される穀粒についての食品としての安全性を確保する上でも非常に有用であると考えられる。すなわち、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）菌の感染により穀粒中に蓄積されるマイコトキシン、例えばゼアラレノンを解毒することができる酵素をコードする遺伝子を単離・同定することができれば、赤かび病からの植物の保護において、非常に有用であろうと考えられた。本発明は、このような着想に基づいて完成されたものである。
【００２６】
本発明におけるゼアラレノンは、基本的に図７に示す化学式のものを指す。しかし、本発明におけるゼアラレノン解毒酵素は、図７に示す化学式のゼアラレノンそのもの以外の、その他のゼアラレノン類を基質とすることもできる。すなわち、本発明のゼアラレノン解毒酵素は、ゼアラレノン類を基質とした酵素反応により、該ゼアラレノン類の毒性を抑制する作用を示すタンパク質である。ゼアラレノン解毒酵素が基質とし得るゼアラレノン類としては、ゼアラレノンの他に、ゼアラレノン類縁体が含まれる。ゼアラレノン類縁体とは、１４個の炭素からなるラクトン環を有するゼララレノン骨格をもつ化合物を意味し、例えばα−ゼアラレノール、β−ゼアラレノール、α−ゼアララノール、β−ゼアララノール、２，４−Ｏ−ジメチル−δ−ヒドロキシゼアラレノン、６−アミノ−ゼアラレノン、ゼアララノン及び６−アセチル−β−ゼアラレノール等が挙げられる。ゼアラレノン解毒酵素が基質とし得るゼアラレノン類は、エストロゲン様活性を有する化合物であることが好ましい。以下、上記ゼアラレノン類を便宜上「ゼアラレノン」と称して説明する。
【００２７】
本発明において、「ゼアラレノン類の毒性」又は「ゼアラレノンの毒性」とは、ゼアラレノンが蓄積されることにより植物個体にもたらされる毒性、例えば細胞毒性、さらに、ゼアラレノンを摂取することによりヒト及び家畜を含む哺乳動物にもたらされる毒性、例えば環境ホルモン活性に基づく毒性、特にエストロゲン様活性に基づく毒性、より具体的には、例えば雌性生殖器の肥大化、乳腺の増大、死流産、胚発生阻害、胎子数の減少、繁殖障害、腔脱、直腸脱、催奇性、発ガン性等を意味する。本発明において「ゼアラレノン（類）の毒性を抑制する」とは、ゼアラレノンの作用により示される上記毒性の程度が軽減されること、好ましくは、上記毒性が検出不能になるか又は失われることを意味する。なお本発明における「解毒」とは「ゼアラレノンの毒性を抑制する」ことと同じ意味である。「ゼアラレノン（類）の毒性を抑制する作用」は、ゼアラレノン自体の化学構造を変化させることによりその毒性を上記のように抑制する作用を意味する。ゼアラレノンの毒性を抑制する作用は、具体的には、ゼアラレノンを分解又は切断することによるものであってよいし、ゼアラレノンに化学的な修飾を施すことによるものであってもよい。特に、ゼアラレノンの毒性を抑制する作用は、ゼアラレノンを基質としてエストロゲン様活性を有しない化合物を生成するものであり得る。本発明において、ゼアラレノンの毒性を抑制する作用は、好ましくはエストロゲン様活性を低下させる作用として測定されるものである。本発明における「エストロゲン様活性」とは、エストロゲン受容体に結合し、かつｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒト乳がん細胞系ＭＣＦ−７の増殖を促進することを意味する。このエストロゲン様活性は、例えば本明細書の実施例９に記載したような試験によって容易に測定することが可能である。
【００２８】
１．ゼアラレノン解毒酵素の単離
本発明では、分譲機関から入手できる多種多様な菌株に対し、ゼアラレノンを解毒する能力についてスクリーニングを行って、ゼアラレノン解毒酵素を保持する菌株を単離した。このスクリーニング対象とする細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞及び細菌細胞のいずれでもよいが、好ましくは真菌細胞である。分譲機関からの細胞株（例えば真菌株）の入手は、各分譲機関のカタログ番号に基づいて、当業者であれば容易に行うことができる。分譲機関としては、ＡＫＵ（Ｆａｃｕｌｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｙｏｔｏ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、ＨＵＴ（Ｆａｃｕｌｔｙ　ｏｆ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ）、ＩＡＭ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ＩＦＯ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）、ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＲＩＫＥＮ）等がある。また、分譲機関から入手できる各細胞株には培養条件等の情報が提供されており、それを参照することにより、当業者であれば該細胞株を容易に培養することができる。
【００２９】
ゼアラレノンを解毒する能力についてスクリーニングを行うために、限定するものではないが、例えば以下のような方法を用いることができる。入手した細胞を、各株毎に、ゼアラレノンを添加した培地（真菌では例えばＹＧ培地）中で当業者に公知の培養方法に従って培養する。次いで培養物を、例えばクロロホルムで抽出する。例えば、ゼアラレノン解毒作用として、ゼアラレノン分解能に関するスクリーニングを行う場合には、抽出物を以下のような薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析に供すればよい。そのＴＬＣ分析において、ゼアラレノン標準物と同程度の移動度のスポットが現れず、かつゼアラレノンと明らかに移動度の異なるスポットが現れるような菌株を、ゼアラレノンを解毒する能力を有する細胞（例えば菌株）の候補として選択することができる。
【００３０】
続いて、上記の通り選択された細胞から、ゼアラレノン解毒酵素の抽出及び精製を行う。細胞からの該酵素の抽出及び精製は、当業者には公知の任意の技術を用いて行うことができるが、例えば以下のようにカラム溶出分離とＴＬＣによる分析とによって行ってもよい。
【００３１】
まず、当該細胞株を、ゼアラレノンを添加した培地（真菌では例えばＹＧ培地）中で当業者に公知の培養方法に従って培養する。次いで培養細胞を回収し、該細胞を液体窒素等で破砕し、細胞破片を遠心分離によってスピンダウンさせて、上清を取得する。この上清を硫安分画し、得たタンパク質溶液を透析にかけて粗酵素液を得ることができる。この粗酵素液を、例えばＨｉＴｒａｐＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用して溶出させて分離し、さらなる精製を行うことができる。
【００３２】
得られた溶出分画は、それぞれｉｎ　ｖｉｔｒｏでのゼアラレノンに対する酵素反応試験に供し、その後ＴＬＣにてゼアラレノンに対する酵素反応活性を有するかどうかについて調べることができる。
【００３３】
例えばｉｎ　ｖｉｔｒｏでのゼアラレノン分解反応試験においては、それぞれの溶出分画にゼアラレノンを添加し、３７℃でインキュベートする。次いで、その各サンプルからゼアラレノン及び／又はその分解産物を抽出し、ＴＬＣにかける。ゼアラレノン分解酵素を含む画分では、ＴＬＣ上に、ゼアラレノンとは明らかに異なる移動度のスポットが検出される。なお、ゼアラレノン解毒酵素が、分解とは異なる様式でゼアラレノンの分子構造を変化させる酵素である場合にも、同様に、そのような酵素を含む溶出分画を用いて得たサンプルについて、ゼアラレノンとは明らかに異なる移動度のスポットが検出される。
【００３４】
この移動度の指標としては、一般にＲｆ値が用いられる。Ｒｆ値とは、試料を最初に塗布した展開原点から試料の発色スポットの中心までの距離（化合物の平均移動距離）を、展開原点から展開液の展開先端までの距離（展開液の最大移動距離）で割った値として定義される。このＲｆ値は、化合物と薄層クロマトグラフィーに塗布した吸着剤との親和性や、化合物の展開液への溶解性によって変化するが、一定の条件下では化合物の種類に固有の値を示すため、化合物の同定に有用である。
【００３５】
このようにして同定された、ゼアラレノン添加の際にゼアラレノンとは明らかに異なる移動度のスポットを検出し得る溶出分画を、さらなる精製工程にかける。さらなる精製工程としては、ゲル濾過カラムを用いるＦＰＬＣ分離、イオン交換カラムを用いるもの等が挙げられ、これらの様々なタンパク質精製工程を繰り返し行うことにより、所望のタンパク質を高純度で得ることができる。
【００３６】
２．ゼアラレノン解毒酵素遺伝子の単離
上記１で得たゼアラレノン解毒酵素をコードする遺伝子を単離するために、本発明ではまず、例えばゼアラレノン解毒酵素の部分アミノ酸配列を決定する。
【００３７】
アミノ酸配列決定のために、例えばリジルエンドペプチダーゼ（例えば、ＴＡＫＡＲＡ，　Ｋｙｏｔｏ，　ＪＡＰＡＮ）等のタンパク質分解酵素によって、精製したゼアラレノン解毒酵素をペプチド断片化する。その反応混合物を、ＨＰＬＣによってペプチド断片毎に分離する。このようなＨＰＬＣ操作は、通常は製造業者の説明書に従って行えばよい。次にＨＰＬＣにより分離されたペプチド断片、及び上記で精製したゼアラレノン解毒酵素そのものを、それぞれタンパク質シーケンサーにかけ、エドマン分解によるアミノ酸配列決定を行う。
【００３８】
次いで、ゼアラレノン解毒酵素をコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する。Ｎ末端のアミノ酸配列に基づく縮重した５’プライマーと、ペプチド断片より得られたアミノ酸配列に基づく縮重した３’プライマーとを、上記で決定した部分アミノ酸配列に基づいて設計する。プライマー設計の際に用いるペプチド断片は、上記のＨＰＬＣで分離されたいずれのものでもよいが、縮重パターンができるだけ少なくなるようなプライマー配列とすることが好ましい。
【００３９】
ＰＣＲ増幅をするために用いる鋳型としては、ゼアラレノンを解毒する能力を有する細胞由来のｃＤＮＡを用いる。このｃＤＮＡは、ゼアラレノン解毒能を有する細胞を培養し、その培養物から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを常法により抽出し、さらにＲＴ−ＰＣＲにより合成したものを用いることができる。そのようにして得たｃＤＮＡに対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行うことによって、ゼアラレノン解毒酵素をコードする遺伝子の部分ＤＮＡ断片を得ることができる。ＰＣＲ反応条件としては、例えば９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）及び７２℃（１分）を３０サイクル行えばよい。得られた増幅産物は、アガロースゲル電気泳動により、その増幅断片のサイズを確認する。
【００４０】
さらに、以上のようにして得たＰＣＲ増幅産物のうち適当なものを、例えば最もサイズの大きいものを選択し、適当なベクター中にクローニングし、ＤＮＡ配列決定に供する。ＤＮＡ配列決定は、常法により行うことができるが、例えばＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（Ｒ）　３７７　ＤＮＡシーケンサー、及びＡＢＩキット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用い、製造業者の提供するプロトコールに従って行ってもよい。
【００４１】
さらに、このゼアラレノン解毒酵素遺伝子の部分ＤＮＡ断片の５’端及び３’端のＤＮＡ領域の塩基配列を決定するために、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端高速増幅法；ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）を実施することができる。ＲＡＣＥにより増幅したＤＮＡ断片は、上記と同様にクローニングし、ＤＮＡ配列決定に供する。
こうして、本発明のゼアラレノン解毒酵素遺伝子のコード領域全体の塩基配列を決定することができる。
【００４２】
３．本発明のゼアラレノン解毒酵素遺伝子
本発明の１つの実施形態として、上記１及び２の方法に従って単離され、配列決定されたゼアラレノン解毒酵素遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列を有していた。また、配列番号１の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、配列番号２に示す。この実施形態においては、配列番号１の塩基配列から推定されるアミノ酸配列とエドマン法により決定されたアミノ酸配列は一致していた。さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列を、公共データベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋ）において検索したところ、相当する配列は見出されなかったことから、このゼアラレノン解毒酵素は新規なものであると判断された。
【００４３】
さらに、このゼアラレノン解毒酵素遺伝子（配列番号１）は、その遺伝子産物（配列番号２）がゼアラレノンを分解してエストロゲン様活性を有しない分解産物を生成するゼアラレノン解毒酵素であることが確認された。その確認は、後述の７に示されるように、ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７を用いた系で行った。
【００４４】
したがって、本発明の１つの実施形態では、本発明のゼアラレノン解毒酵素遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡである。このＤＮＡは、例えば、配列番号１に基づいて設計されるプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅し、そのＤＮＡ増幅断片を常法により抽出・精製することにより取得することができる。
【００４５】
本発明のゼアラレノン解毒酵素遺伝子は、より一般的には、ゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有するタンパク質をコードするものである。
【００４６】
本発明のゼアラレノン解毒酵素遺伝子は、上記の配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに限定されるものではない。本発明の遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであってもよい。さらに本発明の遺伝子は、ゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有する限り、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであってもよい。
【００４７】
また、配列番号１に示される塩基配列又はその一部に相補的な配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、上記ゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有するタンパク質をコードするものも本発明の遺伝子に含まれる。同様に、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はその一部に相補的な配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、上記ゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有するタンパク質をコードするものも本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち９０％以上、好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡであって、ゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０℃〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらにハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃での条件である場合も、本発明における「ストリンジェントな条件」に含めることができる。
【００４８】
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー若しくはゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてｃＤＮＡライブラリー若しくはゲノムＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイズさせることによって、本発明の遺伝子を得ることができる。ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリー等が由来する生物は、特に限定されるものではないが、真菌類に属する生物であることが好ましい。
【００４９】
さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって、本発明の遺伝子の変異型であってゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を合成することもできる。また部位特異的突然変異誘発法等により、本発明の遺伝子の変異型であって、ゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有し、かつエストロゲン様活性を有しない分解産物を生成するタンパク質をコードする遺伝子を合成することもできる。さらに部位特異的突然変異誘発法等により、本発明の遺伝子の変異型であって、ゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有し、かつｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ９〜１０．５で活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を合成することもできる。
【００５０】
遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００５１】
４．組換えベクターの作製
上記３に記載した本発明の遺伝子は、続く操作のために、ベクター中にクローニングして組換えベクターを作製することが好ましい。
【００５２】
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のゼアラレノン解毒酵素遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。ゼアラレノン解毒酵素遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド　ＤＮＡ、ファージ　ＤＮＡ等が挙げられる。
【００５３】
プラスミド　ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００５４】
ベクターにゼアラレノン解毒酵素遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター　ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００５５】
ゼアラレノン解毒酵素遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるように、ベクターに組み込まれることが必要である。特に、本発明の組換えベクターは、宿主内で良好な活性を有するタンパク質として発現されるようにゼアラレノン解毒酵素遺伝子をベクターに組み込んだ、組換え発現ベクターとして作製することが好ましい。このために、本発明のベクターとしては、数多くの宿主生物に対応した市販の各種発現ベクターを用いることができる。それらの発現ベクターには、通常、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必須な各種エレメントの他、ベクターが細胞内に保持されていることを示す選択マーカーやベクター内に簡単に正しい向きで遺伝子を挿入するためのポリリンカー、エンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、分泌因子配列等の有用な配列が必要に応じて連結されている。組換え発現ベクターを用いて形質転換体を作製し、それを培養することによって組換えタンパク質を産生させる場合には、宿主生物に適合した分泌因子配列を含む発現ベクターを用いることにより、組換えタンパク質を培地中に分泌させることができる。この手法は、培養上清から直接組換えタンパク質を精製することができるため、有用である。さらに、この分泌因子配列は、培養上清への分泌後に、ベクターに組み込んだ遺伝子にコードされるタンパク質から、特定のプロテアーゼ等で特異的に切断して除去することができるものであってもよい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００５６】
以上のようなベクターに、ゼアラレノン解毒酵素遺伝子を、適切に発現されるような位置及び向きで連結する。
さらに、本発明の遺伝子は、相同組換え法により宿主生物ゲノムに直接導入することもできる。その場合には、本発明の遺伝子を組み込んだ適当なターゲティングベクターを作製する。このために使用可能なベクターとしては、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ等の公知のジーンターゲティング用ベクターを用いることができる。本明細書においては、このような本発明の遺伝子を組み込んだターゲティングベクターも、本発明の組換えベクターに包含されるものとする。
【００５７】
５．ゼアラレノン解毒酵素遺伝子の植物への導入
上記４に記載の通り作製した組換えベクターを植物に導入することにより、トランスジェニック植物を得ることができる。
【００５８】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞（例えばカルス）のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、赤かび病菌であるフザリウム属菌の感染により植物体内にゼアラレノンの蓄積が見られる植物であることが好ましい。限定するものではないが、本発明のゼアラレノン解毒酵素遺伝子を導入する植物としては、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライ麦、イネ等のイネ科植物が好ましい。形質転換に用いられる植物として、例えば以下のようなものが考えられる。
【００５９】
ナス科：ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｍｅｌｏｎｇｅｎａ　Ｌ．）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　Ｍｉｌｌ）、ピーマン（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍ　Ｌ．　ｖａｒ．　ａｎｇｕｌｏｓｕｍ　Ｍｉｌｌ．）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍ　Ｌ．）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　Ｌ．）
アブラナ科：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　Ｌ．）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ　Ｒｕｐｒ．）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　Ｌ．　ｖａｒ．　ｃａｐｉｔａｔａ　Ｌ．）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ　Ｌ．）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　Ｌ．，　Ｂ．　ｎａｐｕｓ　Ｌ．）
イネ科：トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　Ｌ．）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ．）
マメ科：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）、アズキ（Ｖｉｇｎａ　ａｎｇｕｌａｒｉｓ　Ｗｉｌｌｄ．）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｌ．）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ　ｆａｂａ　Ｌ．）
ウリ科：キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｓａｔｉｖｕｓ　Ｌ．）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ　Ｌ．）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｓｃｈｒａｄ．）、カボチャ（Ｃ．　ｍｏｓｃｈａｔａ　Ｄｕｃｈ．，　Ｃ．　ｍａｘｉｍａ　Ｄｕｃｈ．）
ヒルガオ科：サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ）
ユリ科：ネギ（Ａｌｌｉｕｍ　ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ　Ｌ．）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ　ｃｅｐａ　Ｌ．）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　Ｒｏｔｔｌ．）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ　Ｌ．）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　Ｌ．）
シソ科：シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ　ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ　Ｂｒｉｔｔ．　ｖａｒ．　ｃｒｉｓｐａ）
キク科：キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）、シュンギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ　Ｌ．）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．　ｖａｒ．　ｃａｐｉｔａｔａ　Ｌ．）
バラ科：バラ（Ｒｏｓｅ　ｈｙｂｒｉｄａ　Ｈｏｒｔ．）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ　ｘ　ａｎａｎａｓｓａ　Ｄｕｃｈ．）
ミカン科：ミカン（Ｃｉｔｒａｓ　ｕｎｓｈｉｕ）、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ　ＤＣ．）
フトモモ科：ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｌｏｂｕｌｕｓ　Ｌａｂｉｌｌ）
ヤナギ科：ポプラ（Ｐｏｐｕｌａｓ　ｎｉｇｒａ　Ｌ．　ｖａｒ．　ｉｔａｌｉｃａ　Ｋｏｅｈｎｅ）
アカザ科：ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　Ｌ．）、テンサイ（Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｌ．）
リンドウ科：リンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｓｃａｂｒａ　Ｂｕｎｇｅ　ｖａｒ．　ｂｕｅｒｇｅｒｉ　Ｍａｘｉｍ．）
ナデシコ科：カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ　Ｌ．）
【００６０】
上記組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等によって植物中に導入することができる。例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入し、この菌株をイネのカルスに接種して感染させ、トランスジェニック植物を得ることができる。
【００６１】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【００６２】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。この際ターゲティングベクターを用いて、植物ゲノムに対し相同組換えを引き起こすことも可能であり得る。
【００６３】
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００６４】
遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、トランスジェニック植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、組換えベクターに挿入したｃＤＮＡ断片を増幅するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００６５】
以上記載の通りにして作製した本発明のゼアラレノン解毒酵素遺伝子を導入したトランスジェニック植物は、植物体内でゼアラレノン解毒酵素を生産することによって、赤かび病菌の感染により生産されるゼアラレノンの毒性を抑制することができる。
【００６６】
６．形質転換体の作製及び該形質転換体を用いたゼアラレノン解毒酵素の製造本発明では、本発明のゼアラレノン解毒酵素遺伝子を導入した形質転換体（形質転換細胞）を作製し、それを培養することによりゼアラレノン解毒酵素を製造することができる。本発明は、このような形質転換体及び該形質転換体を用いたゼアラレノン解毒酵素の製造方法にも関する。
【００６７】
形質転換には、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等、いずれを使用してもよい。本発明においては、特に大腸菌、酵母細胞又はイネ科植物細胞を使用することが好ましい。より詳細には、例えば、イネ科植物に対する赤かび病対策のためにはイネ科植物細胞を用いることが好ましい。ゼアラレノン解毒酵素の製造においては、大腸菌又は酵母細胞を使用することが好ましい。酵母細胞の発酵を利用した食品製造においては、酵母細胞を用いることが好ましい。
【００６８】
形質転換には、一般的に行われている手法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等を適用することができる。形質転換体の選択は、定法に従って行うことができるが、通常は使用した組換えベクターに組み込まれた選択マーカーを利用して行う。
【００６９】
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を添加してもよい。
【００７０】
プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００７１】
培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主生物に適した条件下で行われる。
【００７２】
培養後、ゼアラレノン解毒酵素が菌体内又は細胞内に生産される場合には菌体又は細胞を破砕する。一方、目的のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、上清を得る。得られた液中に、ゼアラレノン解毒酵素が含まれる。
【００７３】
本発明では、形質転換を行う代わりに、無細胞翻訳系を使用してゼアラレノン解毒酵素を生産することもできる。
【００７４】
「無細胞翻訳系」とは、宿主生物の細胞の構造を機械的に破壊して得た懸濁液に、翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を加え、試験管中などのｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。無細胞翻訳系としては、有利に使用可能なキットが市販されている。
【００７５】
生産されたゼアラレノン解毒酵素は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、上記培養物中（細胞破砕液、培養液、又はそれらの上清中）あるいは無細胞翻訳系の溶液中から単離精製することができる。しかしながら、場合により、例えば培養上清を限外濾過型フィルター等で濃縮したり、硫安分画後に透析にかけたりして得られた粗酵素液を、そのままゼアラレノン解毒処理に用いることもあり得る。
【００７６】
また本発明のゼアラレノン解毒酵素の１つの実施形態である、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質（ＺＨＤ１０１；実施例参照）は、ｐＨ９．５の高アルカリ環境で十分な活性を有していることが示された。また、ＺＨＤ１０１はｐＨ７．０でもある程度の活性を有し、一方ｐＨ４．５を下回るような低ｐＨにおいては不可逆的に失活することが分かった。このように、本発明のゼアラレノン解毒酵素は、１つの特徴として、至適ｐＨのアルカリ側への偏りを示す。すなわち、本発明のゼアラレノン解毒酵素は、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ９〜１０．５で活性を有するものである。
【００７７】
７．ゼアラレノン解毒酵素によるゼアラレノンの解毒
本発明のゼアラレノン解毒酵素、及び該ゼアラレノン解毒酵素遺伝子を含む細胞又はトランスジェニック植物を用いて、ゼアラレノンの毒性を抑制することができる。ゼアラレノンの毒性を抑制するためには、本発明のゼアラレノン解毒酵素を含む反応溶液又は該ゼアラレノン解毒酵素遺伝子を含む細胞の培養物を、ゼアラレノン又はゼアラレノンを含む溶液に対して直接適用してもよいし、ゼアラレノンが付着した材料（植物体、穀粒、果実、土壌又は天然若しくは人工基材等）に適用してもよい。ゼアラレノン解毒酵素遺伝子を含むトランスジェニック植物を使用する場合には、赤かび病感染の恐れがある地域で栽培することによりゼアラレノン汚染を低減させてもよいし、ゼアラレノンで汚染された土壌又は環境水（地下水、下水、雨水、河川水又は栽培用水等）にて栽培することにより、周囲環境に含有されるゼアラレノンの毒性を抑制してもよい。
【００７８】
本発明のゼアラレノン解毒酵素の活性の確認を行うためには、まずゼアラレノン解毒酵素遺伝子を有する形質転換体を培養し、その培養物から得た酵素液をゼアラレノンが含まれる溶液に添加する。これを例えば３７℃で一晩インキュベートすることによって酵素反応を進行させ、この反応物を例えばＴＬＣで分析したとき、ゼアラレノンが消費され、かつ移動度の異なる生成物が生じている結果を確認できた場合には、ゼアラレノン解毒酵素の活性が示されたと考えることができる。
【００７９】
また本発明のゼアラレノン解毒酵素遺伝子を有する形質転換体のゼアラレノン解毒活性の確認を行うためには、まずその形質転換体をゼアラレノン存在下で培養し、その培養物から抽出物を得る。そしてその抽出物について、例えばＴＬＣで分析したとき、ゼアラレノンが消費され、かつ移動度の異なる生成物が生じている結果を確認できた場合には、ゼアラレノン解毒酵素の活性が示されたと考えることができる。
【００８０】
本発明のゼアラレノン解毒酵素の触媒反応により、ゼアラレノンから生成される化合物は、ＮＭＲ分析及び質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ、ＥＩ−ＭＳ等）にかけることができる。これらの分析を行うことによって、該化合物の化学構造を決定することが可能である。これらの分析法は公知であり、ＮＭＲ測定機及び質量分析計の製造業者の説明書に従って実施することができる。ＮＭＲ分析及び質量分析の一般的な教科書としては、例えば「有機化学のためのスペクトル解析法　ＵＶ，　ＩＲ，　ＮＭＲ，　ＭＳの解説と演習」（Ｍ．Ｈｅｓｓｅ著　東京化学同人）等が挙げられる。
【００８１】
本発明のゼアラレノン解毒酵素の触媒反応により、ゼアラレノンから生成される化合物（ゼアラレノン由来解毒生成物と称する）について、エストロゲン様活性の測定を行うことができる。ゼアラレノン由来解毒生成物がエストロゲン様活性を有しないことが確認された場合、ゼアラレノン由来解毒生成物を生成させたゼアラレノン解毒酵素は、「ゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有する」と判断してよい。エストロゲン様活性の測定は、当業者が使用可能な様々な手法を用いることができるが、例えば、ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７に対する細胞増殖促進作用を指標として測定することができる。
【００８２】
ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７に対する細胞増殖促進作用の測定は、次のようにして行うことができる。まず、ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７を、例えばフェノールレッド、Ｌ−グルタミン（２　ｍＭ）、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地にて、５％ＣＯ２を含む加湿空気中で３７℃で培養する。培養した上記細胞は、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地中に１ウェル当たり例えば５×１０３細胞を接種する。これを３７℃で２０時間培養した後、培地を同種の培地に交換し、この培養物に、試験化合物とするゼアラレノン、ゼアラレノン由来解毒生成物、又は１７β−エストラジオールを様々な濃度で添加して、さらに１２０時間培養する。次いで、発色反応により細胞数を評価する。発色反応には、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムの一ナトリウム塩である、ＷＳＴ−８ＴＭ（Ｎａｋａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，　Ｋｙｏｔｏ）を使用することができる。そして最後に、各ウェルの吸光度（Ａ４５０）を、例えばＷａｌｌａｃ　１４２０マルチラベルカウンター（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定する。本発明では、限定するものではないが、既知のエストロゲンである１７β−エストラジオール　（０．１　ｎＭ）を対照として使用することができる。
【００８３】
１７β−エストラジオールを試験化合物として添加すると、何も添加しない対照と比較して、細胞数が平均約２５０％増大することがわかっている。ゼアラレノンを添加した場合には、１７β−エストラジオールと同程度の細胞数を示す。本発明においては、試験化合物を添加しない場合の細胞数（Ａ）に対する、試験化合物を添加する場合の細胞数（Ｂ）の比率（［（Ｂ）／（Ａ）］×１００（％）；本発明ではこの値を細胞増殖促進比率と称する）が０％〜１５０％、好ましくは８０％〜１２０％であれば、その試験化合物に関して細胞増殖促進作用がみられないものとする。そして本発明においては、該試験化合物について、細胞増殖促進作用がみられないことはエストロゲン様活性を有しないものと判断することができる。したがって、上記のゼアラレノン由来解毒生成物を試験化合物として添加する場合に、細胞増殖促進作用がみられなければ、該ゼアラレノン由来解毒生成物はエストロゲン様活性を有しない化合物である。このようにしてゼアラレノン由来解毒生成物がエストロゲン様活性を有しないことが確認されれば、該ゼアラレノン由来解毒生成物を生成したゼアラレノン解毒酵素は、ゼアラレノンを基質としてエストロゲン様活性を有しない化合物を生成できることが示される。すなわち、ゼアラレノン由来解毒生成物がエストロゲン様活性を有しないことを確認することによって、本発明のゼアラレノン解毒酵素について、ゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有するタンパク質であることを確認することができる。但し、本発明のゼアラレノン解毒酵素がゼアラレノンの毒性を抑制する作用を有することの判定は、ゼアラレノン由来解毒生成物がエストロゲン様活性を有しないことの確認によるものだけに限定されるものではない。
【００８４】
【実施例】
［実施例１］ゼアラレノン分解能を有する微生物の単離
（１）スクリーニング対象菌株
抗生物質単離株２０９種及び３１種の微生物菌株を、ＩＦＯ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）又はＪＣＭ（Ｊａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，　ＲＩＫＥＮ）の各分譲機関から入手した。これらの各菌株に対し、ゼアラレノン分解能についてランダムスクリーニングを行った。
【００８５】
（２）ゼアラレノン分解能に関する微生物菌株のスクリーニング
１００　ｐｐｍのゼアラレノン（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＩ）を含有する１００ｍｌのＹＧ培地（０．５％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　２％　ｇｌｕｃｏｓｅ，　ｐＨ　７．０）に各菌株を接種し、室温で１週間にわたり培養した。この培養物を６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して培養上清を分離し、この培養上清をクロロホルムで抽出した。この抽出液を濃縮してＴＬＣプレートにのせ、溶媒としてクロロホルム：アセトン　８０：２０を用いて展開槽にて展開した。このＴＬＣプレートについて、ＵＶランプ（ＵＶ　２５４ｎｍ）下で検出を行った。その結果、ＩＦＯ７０６３株について、ゼアラレノンの分解産物とみられるスポットを検出することができた。本スクリーニングにおけるＩＦＯ７０６３株についてのＴＬＣのデータを図１に示す。図１のレーン３には、対照として、ゼアラレノン（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＩ）を標準サンプルとして適用して得た、ゼアラレノンのスポットが示されている。またレーン２には、陰性対照として、バッファーにゼアラレノン（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＩ）を添加してインキュベートしたものを適用して得た、ゼアラレノンのスポットが示されている。そしてレーン１では、ＩＦＯ７０６３株の培養上清から抽出したサンプルを適用したところ、ゼアラレノンの分解産物とみられるスポットが検出された。該レーン１には、レーン２及び３に示されたゼアラレノンのスポットと同程度の移動度のスポットは示されておらず、代わりに該スポットよりも移動度が小さいスポットが示されている。レーン２及び３に示されたゼアラレノンのＲｆ値はおよそ０．８であるのに対し、レーン１に示された物質のＲｆ値はおよそ０．２であった。レーン１に、移動度がより小さいスポットのみが示されたことは、レーン１に対応するＩＦＯ７０６３株の培養上清が有する加水分解活性によって、ゼアラレノンの分子構造が変化したことを意味する。従って、レーン１に対応するＩＦＯ７０６３株の培養上清にはゼアラレノン分解酵素が含まれる可能性がある。
【００８６】
このようなＴＬＣの結果に基づき、ＩＦＯ７０６３株をゼアラレノン分解能を有する菌株の候補として同定した。このＩＦＯ７０６３株は、ＩＦＯ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）から分譲されたものであり、クロノスタキス・ロゼア（Ｃｌｏｎｏｓｔａｃｈｙｓ　ｒｏｓｅａ）に分類される。ＩＦＯ生物資源データベースにはこの菌についてより詳細な情報が示されており、その情報に基づけば、この菌株は例えば、２４℃にてポテトスクロース寒天培地（ＰＳＡ培地；ポテト　２００ｇ、スクロース　２０ｇ、蒸留水１Ｌ、寒天　２０ｇ，　ｐＨ　５．６）の培養条件にて培養することができる。
【００８７】
［実施例２］ＩＦＯ７０６３株からのゼアラレノン分解酵素の抽出及び精製
（１）ゼアラレノン分解酵素の抽出及び精製
クロノスタキス・ロゼア（Ｃｌｏｎｏｓｔａｃｈｙｓ　ｒｏｓｅａ）ＩＦＯ７０６３株を、１００　ｐｐｍのゼアラレノン（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＩ）を含有するＹＧ培地（０．５％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　２％　ｇｌｕｃｏｓｅ，　ｐＨ　７．０）１００ｍｌ中で、室温で１週間にわたり培養した。その後、該培養物を２５　ｐｐｍのゼアラレノンを含有する上記ＹＧ培地１Ｌに植え継ぎ、室温で１週間にわたり培養した。細胞を濾過により回収し、それを液体窒素で破砕し、さらに超音波破砕処理した。次に細胞破片を５，０００×ｇによってスピンダウンし、硫酸アンモニウムを４０〜６０％の飽和度で上清に添加した。１０，０００×ｇで１時間にわたる遠心分離によって得られた沈殿物を、４℃で１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）に対して透析した。次いで透析したサンプルをＨｉＴｒａｐＱカラムに適用し、ＮａＣｌの線形濃度勾配（０〜１Ｍ、５ｍｌ／分、２０分）を示すような１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）によって溶出した。
【００８８】
ここで得られた溶出分画を、それぞれｉｎ　ｖｉｔｒｏでのゼアラレノン加水分解試験に供し、その後ＴＬＣにてゼアラレノンに対する加水分解活性について調べた。ゼアラレノン加水分解試験は、各溶出分画にゼアラレノン２５μｇを加えて３７℃にて一晩インキュベートして行った（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　９．５），総容量１００μｌ）。次いでその反応液からクロロホルムによる抽出を行い、その抽出物の一部を採取し、ＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ，シリカゲル　６０　Ｆ２５４）にチャージし、溶媒としてクロロホルム：アセトン　８０：２０（体積比）を用いて展開槽にて展開した。このＴＬＣプレートについて、ＵＶランプ（ＵＶ　２５４ｎｍ）下で検出を行った。その結果、ゼアラレノンの分解産物とみられるスポットを検出することができた溶出分画を選択することができた。ゼアラレノンの分解産物とみられるスポットの検出結果は、図１と同様であった。対照としてゼアラレノン（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＩ）を標準サンプルとして適用した結果、ゼアラレノンのスポットが観察された。陰性対照としては、バッファーにゼアラレノン（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＩ）２５μｇを添加して３７℃で一晩インキュベートしたサンプルを適用した結果、ゼアラレノンのスポットが観察された。しかし、溶出分画サンプルを用いた場合には、対照及び陰性対照における前記のゼアラレノンのスポットと同程度の移動度のスポットは認められず、代わりに、ゼアラレノンよりも移動度が小さいスポットが観察された。従って、溶出分画に含まれるタンパク質は、ゼアラレノン分解酵素であり得る。なお触媒性分画とは異なる溶出分画を用いたサンプルを適用した場合には、ゼアラレノンと同じ移動度のスポットのみが示された。このようにして同定されたゼアラレノン分解酵素を含み得る溶出分画（触媒性分画）を、酵素のさらなる精製のために、次のＦＰＬＣ分離に供した。
【００８９】
該触媒性分画をＦＰＬＣ（ＡＫＴＡエクスプローラ，　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，　ＵＫ）によってさらに分離した。ＦＰＬＣ分離においては、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５　ＨＲ　１０／３０，　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に該溶出分画を適用し、０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）によって溶出した。このＦＰＬＣによって得られるこれらの溶出分画についても、上述のＴＬＣに供して、さらに触媒性分画を選択した。このＦＰＬＣから得られる溶出分画を用いたＴＬＣにおいても、上記と同様の結果が得られた。
【００９０】
さらに、選択した触媒性分画を、イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ，　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に適用し、続いてＮａＣｌの線形濃度勾配（０〜０．５Ｍ）を有する１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）により、流速０．４ｍｌ／分にて５０分間にわたり溶出した。このイオン交換カラムＭｏｎｏＱを使用した精製工程は、２回繰り返した。触媒性分画の上記ＴＬＣによる選択は１回目のＭｏｎｏＱ精製工程の後にも行い、選択された溶出分画を次の２回目のＭｏｎｏＱ精製工程に供してさらなる精製タンパク質を得た。そしてこの２回目のＭｏｎｏＱ精製工程により得られた精製タンパク質を、ゼアラレノン分解酵素として以後の実験に用いた。またこのタンパク質を、ＺＨＤ１０１と命名した。
【００９１】
［実施例３］ゼアラレノン分解酵素の部分アミノ酸配列決定
実施例２に従って精製したＺＨＤ１０１を、リジルエンドペプチダーゼ（ＴＡＫＡＲＡ，　Ｋｙｏｔｏ，　ＪＡＰＡＮ）によって２Ｍ尿素を添加して３７℃で１時間かけて消化した。その反応混合物を、逆相カラムであるＶＰ３０４−１２５１（Ｓｅｎｓｈｕ　Ｋａｇａｋｕ，　Ｔｏｋｙｏ，　ＪＡＰＡＮ）を用いるＨＰＬＣによってペプチド断片毎に分離した。該ＨＰＬＣは以下の条件で実施した：流速は１ｍｌ／分、６０分間にわたる濃度勾配としてＢを０％〜６０％（Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ：０．０８％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）。なおペプチドの検出は２２５ｎｍで行った。
【００９２】
ＨＰＬＣの結果、７つの主ピーク（ｐ−１２、ｐ−１８、ｐ−２４．５、ｐ−３２．５、ｐ−３４．５、ｐ−３６．５、ｐ−３９）が現れた（図２）。そこで、これらの７つの主ピークの各々を、１２分、１８分、２４．５分、３２．５分、３４．５分、３６．５分、３９分に溶出させ、手作業で回収した。これらのペプチド及び全体タンパク質について、製造業者の説明書に従って自動タンパク質シーケンサーＰｒｏｃｉｓｅ　ＨＴ　４９２（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）を使用して、エドマン分解によるアミノ酸配列決定を行った。
【００９３】
［実施例４］ゼアラレノン分解酵素遺伝子の単離
クロノスタキス・ロゼア（Ｃｌｏｎｏｓｔａｃｈｙｓ　ｒｏｓｅａ）ＩＦＯ７０６３株を、１００　ｐｐｍのゼアラレノン（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＩ）を含有するＹＧ培地（０．５％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　２％　ｇｌｕｃｏｓｅ，　ｐＨ　７．０）１００ｍｌ中で、室温で１週間にわたり培養した。この培養物から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ　ＧｍｂＨ，　Ｈｉｌｄｅｎ　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、精製した。この全ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ用Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｒｌａｎｄｓ）を用いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行ってｃＤＮＡを合成した。
【００９４】
次に、実施例３で決定したＺＨＤ１０１の部分アミノ酸配列に基づき、本発明のＺＨＤ１０１をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計した。５’プライマーとしては、Ｎ末端のアミノ酸配列に基づく４種の５’プライマー、３’プライマーとしては、実施例３のＨＰＬＣで得たピークｐ−３２．５及びＰ−３４．５に相当するペプチドのそれぞれのアミノ酸配列に基づく８種の３’プライマー（図３）を設計し、化学合成した。これらの４種の５’プライマー及び８種の３’プライマーを組み合わせた３２通りのプライマー対を別個に用い、上記で作製したｃＤＮＡを鋳型として、以下の条件に従ってＰＣＲ増幅を実施した：９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）及び７２℃（１分）を３０サイクル。得られた増幅産物は、アガロースゲル電気泳動により、その増幅断片のサイズを確認した。
【００９５】
その結果、Ｎ２（５’プライマー）と３４．５−２（３’プライマー）の組み合わせによって得られた増幅断片が最も大きく、約８００ｂｐであった。一方Ｎ１〜４（５’プライマー）と３２．５−１〜３２．５−３（３’プライマー）の組み合わせによって得られた増幅断片は約５５０ｂｐであった。本実施例ではＮ２（５’プライマー）と３４．５−２（３’プライマー）の組み合わせによって得られた約８００ｂｐの断片についてＤＮＡ塩基配列決定を行った。まず、この約８００ｂｐのＰＣＲ増幅産物を、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）中にライゲーションした。この組換えベクターを用いてヒートショック法により、大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ，　Ｏｓａｋａ，　ＪＡＰＡＮ）を形質転換した。この形質転換体を適宜培養して得た培養物から、組換えベクターをプラスミド精製キット（ＭＯＢＩＯ，　Ｓｏｌａｎａ　Ｂｅａｃｈ，　ＣＡ）により精製した。
【００９６】
ＤＮＡ配列決定には、解析用ソフトウェアＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｖ．３．４．　（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を組み込んだＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（Ｒ）　３７７　ＤＮＡシーケンサー、及びＡＢＩキット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用い、製造業者の提供するプロトコールに従って上記組換えベクターをサンプルとして用いて常法により行った。
【００９７】
ｚｈｄ１０１の５’端及び３’端のＤＮＡ領域の塩基配列を決定するために、ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ）を用いてＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端高速増幅；ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）を実施した。手順は全て、製造業者の提供するプロトコールに従って実施した。本実施例では、５’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲ反応及び３’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲ反応において、以下のプライマーを設計し、化学合成して用いた。
プライマー１：５’−ＧＧＧ　ＣＴＴ　ＣＣＣ　ＡＣＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣ　ＣＴＣ　ＣＡＧ　ＡＴＣ　ＣＴＴ　ＡＡＣ−３’（５’−ＲＡＣＥの第１ＰＣＲ用）（配列番号１５）
プライマー２：５’−ＣＴＣ　ＣＧＡ　ＧＣＣ　ＴＣＣ　ＡＧＡ　ＣＡＣ　ＧＴＣ　ＧＴＴ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＴＡＣ−３’（５’−ＲＡＣＥのネスティッドＰＣＲ用）（配列番号１６）
プライマー３：５’−ＡＣＣ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣ　ＧＡＡ　ＧＡＣ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＡＴＣ　ＴＣＡ　ＡＡＧ−３’（３’−ＲＡＣＥの第１ＰＣＲ用）（配列番号１７）
プライマー４：５’−ＧＴＡ　ＡＴＧ　ＴＴＧ　ＡＡＣ　ＧＡＣ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＧＧＣ　ＴＣＧ　ＧＡＧ−３’（３’−ＲＡＣＥのネスティッドＰＣＲ用）（配列番号１８）
【００９８】
増幅ＤＮＡ断片については、上記と同様にしてＤＮＡ塩基配列決定を行った。このようにして得られたｚｈｄ１０１全体の塩基配列を配列番号１に示す。また配列番号１によってコードされる推定上のアミノ酸配列を配列番号２に示す。この配列番号２に示されるアミノ酸配列は、実施例３で決定された断片化されたＺＨＤ１０１ペプチドの部分アミノ酸配列と完全に一致した。配列番号２に示されるアミノ酸配列は２６４個のアミノ酸からなり、その分子量は２８，７５１　Ｄａと算出された。
【００９９】
さらに、ＮＣＢＩのインターネットサイトのＢＬＡＳＴＰプログラムを利用して、タンパク質データベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋ）に対する相同性検索を行った。この検索により、本発明のＺＨＤ１０１は新規なタンパク質であることが判明した。本発明者らはまた、保存ドメインデータベース（ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴ）に対して、可能性上の触媒部位の検索を行った。この結果、ＺＨＤ１０１は、４×ｅ−１１のＥ値（Ｏｌｌｉｓ，ら　（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．　５，　１９７−２２１）でα／β加水分解酵素フォールドとの間で高い相同性を有していた。
【０１００】
［実施例５］組換えベクターの作製及び形質転換体の作製
ｚｈｄ１０１のコード領域全体を含むＤＮＡ断片を得るために、５’プライマー（５’−ＧＣＣ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＣＧＣ　ＡＣＴ　ＣＧＣ　ＡＧＣ　ＡＣＡ　ＡＴＣ−３’（配列番号１９）；ＮｄｅＩ部位に下線を付した）及び３’プライマー（５’−ＴＣＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＡＧＣ　ＴＡＴ　ＣＧＴ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＴＧ−３’（配列番号２０）；ＢａｍＨＩ部位に下線を付した）を使用し、実施例４の（１）で調製した全ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。ＲＴ−ＰＣＲには、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｒｌａｎｄｓ）を製造業者の説明書に従って用いて、ｃＤＮＡを合成した。この増幅産物をｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター中にライゲーションした。
【０１０１】
続いてそれらのプラスミドをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動による分離によってｚｈｄ１０１断片を得た。次にｚｈｄ１０１断片を、予めＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し精製したｐＥＴ１２ａベクター中に挿入した。このライゲーション産物をＤＨ５α中へと形質転換し、そのコロニーをアンピシリン耐性により選択して形質転換体を得た。この形質転換体を適宜培養して得た培養物から、プラスミド精製キット（ＭＯ　ＢＩＯ，　Ｓｏｌａｎａ　Ｂｅａｃｈ，　ＣＡ）により精製した組換えベクターを、ＤＮＡ塩基配列決定に供して、ｚｈｄ１０１の塩基配列を確認した。これにより正しい塩基配列が確認されたｚｈｄ１０１を組み込んだプラスミド（ｐＥＴ１２−ｚｈｄ１０１）を用いて、ＤＥ３（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換し、アンピシリン耐性により形質転換体を選択した。該形質転換体から上記と同様にして組換え発現ベクターを得た。
【０１０２】
［実施例６］形質転換体を用いたゼアラレノン分解酵素の製造
実施例５で作製した組換え発現ベクターを含むＤＥ３（ＴＯＹＯＢＯ）の形質転換体の単一コロニーをサイクルグロー培地（フナコシ社製）に接種し、ＯＤ６００が０．６に達するまで３７℃で数時間培養した。組換えタンパク質を誘導するために、１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し、細胞培養物を室温で一晩培養した。翌日、細胞をスピンダウンさせ、それらを超音波破砕処理した。そして、組換えＺＨＤ１０１がＤＥ３で発現されることを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。その結果を図４に示す。
【０１０３】
図４には、１２．５％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに次のサンプルを適用して得たＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。レーン１は野生型ＤＥ３のホモジェネートサンプルであり、レーン２はｐＥＴ１２−ｚｈｄ１０１を有するＤＥ３（形質転換体）のホモジェネートサンプル（すなわち、粗組換えＺＨＤ１０１）であり、レーン３は形質転換体のホモジェネートの沈殿サンプルであり、レーン４は形質転換体のホモジェネートの可溶性分画であり、レーン５は実施例２で得たＩＦＯ７０６３株から直接に抽出精製したＺＨＤ１０１である。図４に示される通り、形質転換体では野生型で発現の見られないタンパク質が発現しており（レーン１及び２）、形質転換体で発現している該タンパク質は培養上清にも分泌されており（レーン４）、さらに形質転換体で発現している該タンパク質はＩＦＯ７０６３株から直接に抽出精製したＺＨＤ１０１と同等の分子量を有していること（レーン５）から、形質転換体ではＺＨＤ１０１と同じ該タンパク質を発現し分泌していることが示された。なおこのＺＨＤ１０１の分子量は、およそ３０ｋＤであった。
【０１０４】
また、形質転換体に由来する粗組換えＺＨＤ１０１について、加水分解活性をＴＬＣで検出した。野生型ＤＥ３のホモジェネート、そしてｐＥＴ１２−ｚｈｄ１０１を有するＤＥ３（形質転換体）のホモジェネート１０μｌに、ゼアラレノンをそれぞれ添加してＨ２０でフィルアップして各１００μｌとし（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　９．５））、３７℃で４時間インキュベートした。この反応混合物を上記と同様にクロロホルムで抽出し、ＴＬＣプレート（シリカゲル　６０　Ｆ２５４）に適用した。その結果を図５に示した。
【０１０５】
図５は、レーン１には野生型ＤＥ３のホモジェネートをゼアラレノンと処理したもの、レーン２にはｐＥＴ１２−ｚｈｄ１０１を有するＤＥ３（形質転換体）のホモジェネートをゼアラレノンと処理したもの、レーン３にはゼアラレノン標準物を適用したＴＬＣの結果を示す。ＴＬＣは、反応処理液からクロロホルムによる抽出を行い、抽出物の一部を採取し、ＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ，シリカゲル　６０　Ｆ２５４）にチャージし、溶媒としてクロロホルム：アセトン　８０：２０（体積比）を用いて展開槽にて展開した。このＴＬＣプレートについて、ＵＶランプ（ＵＶ　２５４ｎｍ）下で検出を行った。この図５の結果は、図１の結果と同様であった。従って組換えＺＨＤ１０１は、ＩＦＯ７０６３株から直接単離したＺＨＤ１０１と同じ、ゼアラレノン分解活性を有することを確認することができた。
【０１０６】
なお、このＺＨＤ１０１の至適ｐＨは、アルカリ側に偏っていることが分かった。すなわち、上記のＺＨＤ１０１の加水分解活性の分析においてゼアラレノンを添加した後の酵素反応条件は高アルカリ性のｐＨ　９．５であるが、ＺＨＤ１０１は酵素活性を十分発揮していた。このようにＺＨＤ１０１の至適活性はｐＨ　９〜１０．５であるが、ｐＨ　７．０でもある程度の活性が示された。ＺＨＤ１０１はまた、ｐＨ　４．５を下回るような低ｐＨにおいては不可逆的に失活することが分かった。この不可逆的な失活は、次のような実験により確認された。まず、１Ｍのリン酸バッファーを１／１０量添加したＺＨＤ１０１含有硫安画分をｐＨ　４．５及びｐＨ　５．５に調整し、それらを３０分間氷上に置いた。これらのサンプルを、それぞれクロマトチャンバー内ですみやかに１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）に対して透析し、続いてゼアラレノンに対するｉｎ　ｖｉｔｒｏ加水分解試験（ｐＨ　９．５）に供してＴＬＣにて分析したところ、ｐＨ　５．５に調整したサンプルはゼアラレノン分解活性を示すが、ｐＨ　４．５に調整したサンプルはゼアラレノン分解活性を示さないことが分かった。つまり、ｐＨ　４．５の条件下に置かれたＺＨＤ１０１は、その後に至適ｐＨ下にて反応させてもその酵素活性を示さないことから、ｐＨ　４．５の条件下で不可逆的に失活されることが判明した。
【０１０７】
［実施例７］ゼアラレノン分解酵素によるゼアラレノン誘導体の分解
ゼアラレノン誘導体であるα，β−ゼアラレノール（α，β−ｚｅａｒａｒｅｎｏｌ；α−ゼアラレノール又はβ−ゼアラレノールを表す）を、ＺＨＤ１０１（上記ＩＦＯ７０６３株に由来する硫安分画４０〜６０％のタンパク質を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　７．５）で透析したもの）にそれぞれ添加して３７℃で一晩インキュベートした（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　９．５），総容量１００μｌ）。その反応液をクロロホルムで抽出し、上記と同様にＴＬＣをおこなった（図６）。対照としてα，β−ゼアラレノールの標準物（図６のレーン３及び６）、及び陰性対照としてバッファーにα，β−ゼアラレノールを添加してインキュベートしたもの（図６のレーン２及び５）を用いた。その結果、ＺＨＤ１０１処理により、対照及び陰性対照に見られるα，β−ゼアラレノールのスポットは、ＵＶ（２５４ｎｍ）下では完全に喪失し、分解産物を検出することができなかった（図６のレーン１及び４）。この結果より、分解物は、ＵＶ下でＴＬＣプレート上に検出されなかったか、水溶性が高くてクロロホルムで抽出不可能であったことが推察できる。基質が完全になくなっていることから、ゼアラレノン誘導体であるα，β−ゼアラレノールについても、ＺＨＤ１０１はおそらく分解を引き起こしたと考えられた。
【０１０８】
［実施例８］ゼアラレノン分解酵素によりゼアラレノンから生成される分解産物の単離及び特性解析
ＺＨＤ１０１を用いた上記の加水分解試験によって得られたゼアラレノン分解産物の粗抽出物をＴＬＣに供し、プレコートシリカゲル６０　Ｆ２５４プレート（０．２５　ｍｍ厚、２０×２０　ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ）を用いて、展開液としてクロロホルム：アセトン　８０：２０　（体積比）を用いて展開した。該ＴＬＣプレートのスポットは、ＵＶ（２５４　ｎｍ）下で検出した。
【０１０９】
これによって精製された分解産物を、ＮＭＲ分析にかけた。ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ　ＥＣＰ−５００分光器により、アセトン−ｄ６において１３Ｃ　ＮＭＲを１２５　ＭＨｚで、１Ｈ　ＮＭＲを５００　ＭＨｚで測定した。
【０１１０】
２９．８　ｐｐｍでのアセトン−ｄ６及び２．０４　ｐｐｍでのアセトン−ｄ５を、それぞれ１３Ｃ及び１Ｈ　ＮＭＲの内部標準として用いた。化学シフトはδ値で記録した。１３Ｃ　ＮＭＲシグナルの多重度はＤＥＰＴで決定した。２Ｄ　ＮＭＲスペクトル（ＰＦＧ−ＤＱＦＣＯＳＹ、ＰＦＧ−ＨＭＱＣ及びＰＦＧ−ＨＭＢＣ）はＪＥＯＬ　ＥＣＰ−５００にて、ＪＥＯＬ標準パルスシークエンスにより測定し、収集したデータはＪＥＯＬ標準ソフトウェアで処理した。ＦＡＢ−ＭＳスペクトルはＪＥＯＬ　ＪＭＳＨＸ−１１０質量分析計でグリセロールマトリックスを用いて、またＥＩ−ＭＳスペクトルはＪＭＳ−ＳＸ１０２質量分析計で、それぞれ測定した。
【０１１１】
以下はＦＡＢ−ＭＳスペクトル、ＥＩ−ＭＳスペクトル及びＮＭＲスペクトルの測定結果である。
ＦＡＢ−ＭＳ　（ｍ／ｚ：　ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：　２９３　（Ｍ＋Ｈ）＋
ＥＩ−ＭＳ：　２９２　（Ｍ＋，　８％），　２７４　（Ｍ＋−Ｈ２Ｏ，　２４％），　１６２　（１００％），　１６１　（８６％），　１１２　（３０％）．
１Ｈ−ＮＭＲ　（５００　ＭＨｚ，アセトン−ｄ６，δ　ｐｐｍ）；　８．１２　（２Ｈ，　ｂｒ　ｓ，　２−ＯＨ及び　４−ＯＨ），　６．３８　（２Ｈ，　ｄ，　２．０　Ｈｚ，　Ｈ−１及び　Ｈ−５），　６．２５　（１Ｈ，　ｄ，　１６．５　Ｈｚ，　Ｈ−１’），　６．１３　（１Ｈ，　ｄｄｄ，　６．８，　７．１，　１６．５　Ｈｚ，　Ｈ−２’），　６．０３　（１Ｈ，　ｄ，　２．０　Ｈｚ，　Ｈ−３），　３．６９　（１Ｈ，　ｍ，　Ｈ−１０’），　３．４１　（１Ｈ，　ｂｒ　ｄ，　３．８　Ｈｚ，　１０’−ＯＨ），　２．４８　（２Ｈ，　ｔ，　７．２　Ｈｚ，　Ｈ−５’），　２．４３　（２Ｈ，　ｔ，　７．１　Ｈｚ，　Ｈ−７’），　２．１７　（２Ｈ，　ｍ，　Ｈ−３’），　１．７０　（２Ｈ，　ｍ，　Ｈ−４’），　１．５８　（２Ｈ，　ｍ，　Ｈ−８’），　１．３７　（２Ｈ，　ｍ，　Ｈ−９’），　１．１０　（３Ｈ，　ｄ，　６．２　Ｈｚ，　Ｈ−１１’）．
１３Ｃ−ＮＭＲ　（１２５　ＭＨｚ，アセトン−ｄ６，δ　ｐｐｍ）；　２１０．４７　（ｓ，　Ｃ−６’），　１５９．４９　（ｓ，　Ｃ−２ａｎｄ　Ｃ−４），　１４０．７３　（ｓ，　Ｃ−６），　１３１．５３　（ｄ，　Ｃ−１’），　１３０．５６　（ｄ，　Ｃ−２’），　１０５．４９　（ｄ，　Ｃ−１及び　Ｃ−５），　１０２．４２　（ｄ，　Ｃ−３），　６７．３４　（ｄ，　Ｃ−１０’），　４３．１１　（ｔ，　Ｃ−７’），　４２．１５　（ｔ，　Ｃ−５’），　３９．６５　（ｔ，　Ｃ−９’），　３３．００　（ｔ，　Ｃ−３’），　２４．０９　（ｔ，　Ｃ−４’），　２４．０３　（ｑ，　Ｃ−１１’），　２０．９３　（ｔ，　Ｃ−８’）。
【０１１２】
上記の質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ及びＥＩ−ＭＳ）並びにＮＭＲスペクトルにより、上記のゼアラレノン分解産物の分子式をＣ１７Ｈ２４Ｏ４と決定した。１Ｈ　ＮＭＲスペクトルにおいてゼアラレノンと比較した場合に特徴的なピークであるδ　６．３８　（ｄ）、３．６９　（ｍ）及び　３．４１　（ｂｒ　ｄ）は、Ｃ−１０’、Ｃ−１及び　１０’−ＯＨに割り当てられる。このことは、ゼアラレノンにおけるエステル結合が加水分解され、続いて脱炭酸されたことを意味する。Ｃ’−１における幾何構造は、高い結合定数（Ｊ＝１６．５　Ｈｚ）に基づいてＥコンホメーションと決定した。１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルによって、１個のケトン、３個のｓｐ２４価炭素原子、１個のｓｐ２メチン炭素原子及び１個のメチル炭素を含む１７個の炭素原子が、上記のゼアラレノン分解産物に存在することが確認された。ＰＦＧ−ＤＱＦＣＯＳＹ及び　ＰＦＧ−ＨＭＱＣのデータから、それぞれプロトンスピンネットワーク及び全ての一重結合性１Ｈ−１３Ｃの結合を確認した。ＰＦＧ−ＨＭＢＣスペクトルにおいて観察される長距離結合は、上記のゼアラレノン分解産物において、ケトン基（δ　２１０．４７）がＣ−６’に位置すること、及びゼアラレノンの開環及びＣ−１２’でのカルボキシル基の欠失が生ずることを示している。このことは、Ｃ−１　（ｄ，δ　１０５．４９）及び　Ｃ−１０’　（ｄ，δ　６７．３４）における化学シフト及び多重性によっても支持された。以上の解析に基づき、上記のゼアラレノン分解産物の全体構造は、１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−１０−ヒドロキシ−１−ウンデセン−６’−オンと決定された。この化学構造は図７に示した。この分析結果より、本発明のゼアラレノン分解酵素ＺＨＤ１０１によってゼアラレノンが分解されてゼアラレノン分解産物が生成することが分かり、その反応を化学式によって記載した（図７）。
【０１１３】
［実施例９］ゼアラレノン分解産物のエストロゲン様活性
上記実施例に従って得られたゼアラレノン分解産物について、エストロゲン様活性の測定を行った。エストロゲン様活性は、ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７に対する細胞増殖促進作用として測定した。
【０１１４】
まず、ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７を、フェノールレッド、Ｌ−グルタミン（２　ｍＭ）、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）にて、５％ＣＯ２を含む加湿空気中で３７℃で培養した。本実験に用いたＦＣＳは、デキストラン処理チャコールで処理した。培養した上記細胞は、１０％チャコール分解ＦＣＳを含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地中、９６ウェルプレートにて１ウェル当たり５×１０３細胞を接種した。これを３７℃で２０時間培養した後、培地を同種の培地に交換した。この培養物に、試験化合物とするゼアラレノン、ゼアラレノン分解産物、又は１７β−エストラジオールを様々な濃度で添加し、さらに１２０時間培養した。次いで、次の発色反応により細胞数を評価した。発色反応としては、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムの一ナトリウム塩である、ＷＳＴ−８ＴＭ（Ｎａｋａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，　Ｋｙｏｔｏ）を培養物に添加し、培養細胞を３７℃でさらに４時間培養した。各ウェルの吸光度（Ａ４５０）を、Ｗａｌｌａｃ　１４２０マルチラベルカウンター（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。本実施例では、既知のエストロゲンである１７β−エストラジオール　（０．１　ｎＭ）を対照として使用した。１７β−エストラジオールを試験化合物として添加した場合、何も添加しない対照と比較して、細胞数が平均約２５０％増大する。本発明に係るゼアラレノン（化学式：図７）は、１７β−エストラジオールと同程度の細胞数を示すことから、１７β−エストラジオールと同程度の細胞増殖促進作用すなわちエストロゲン様活性を有する。一方、本発明のゼアラレノン分解産物（化学式：図７）は、ゼアラレノンの１０００倍高い濃度であっても、細胞数をほとんど増加させず、細胞増殖促進作用はみられなかった（図８）。すなわち、本発明のゼアラレノン分解産物は、エストロゲン様活性を示さない。従って、本発明のゼアラレノン分解酵素ＺＨＤ１０１は、ゼアラレノンを分解して、エストロゲン様活性を示さない分解産物とすることにより、ゼアラレノンのエストロゲン様活性を喪失させ、すなわちゼアラレノンの毒性を抑制することができることが示された。
【０１１５】
［実施例１０］ｚｈｄ１０１遺伝子導入用ベクターの構築
ｚｈｄ１０１のＤＮＡ配列（配列番号１）に基づき、ＧＦＰ−ｚｈｄ−５’プライマー（５’−ＡＴＧ　ＣＧＣ　ＡＣＴ　ＣＧＣ　ＡＧＣ　ＡＣＡ　ＡＴＣ　ＴＣＧ−３’（配列番号２１））及びＧＦＰ−ｚｈｄ−３’プライマー（５’−ＴＧＴ　ＡＣＣ　ＧＴＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＴＧＣ　ＴＴＣ　ＴＧＣ−３’（配列番号２２））を設計して、化学合成した。これらのプライマーとＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）とを使用し、実施例５で作製した、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）中にｚｈｄ１０１を組み込んだ組換えプラスミドを鋳型として用いるＰＣＲ増幅を行って、ｚｈｄ１０１遺伝子全体を含むＤＮＡ断片を作製した。ここで用いたＰＣＲ条件は以下の通りである：９４℃で３０秒、５７℃で１分、７２℃で１分を１サイクルとして３０サイクル。またこれとは別に、ｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢｓｒＧ　Ｉ−Ｎｏｔ　Ｉ間に合成リンカー（５’−ＧＴＡ　ＣＡＧ　ＧＣＣ　ＣＧＧ　ＧＣＣ　ＧＣ−３’（配列番号２３）、５’−ＧＧＣ　ＣＧＣ　ＧＧＣ　ＣＣＧ　ＧＧＣ　ＧＴ−３’（配列番号２４））を挿入し、ｐＥＧＦＰ−Ｓｒｆ　Ｉを作成しておいた。得られたＰＣＲ産物は、ｅｇｆｐ遺伝子の下流に組み込むためにｐＥＧＦＰ−ＳｒｆＩベクターのＳｒｆ　Ｉサイトへライゲーションして、ｐＥＧＦＰ−ｚｈｄ１０１クローンを作製した。さらに、ｐＥＧＦＰ−ｚｈｄ１０１クローンから切り出したＮｃｏ　Ｉ−Ｎｏｔ　Ｉ断片（本明細書では「ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１」と呼ぶ）を、Ａｃｔ　Ｉプロモーターを含むｐＷｈｅａｔベクター（ｐＤＭ３０２（Ｇｅｎｅｓ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｓｙｓｔ．，　７２，　６３−６９，　１９９７）のＰｓｔ　Ｉ−Ｓｍａ　Ｉ間をＴｒｉ１０１（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７３，　１６５４−１６６１，　１９９８）で置き換え、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−ＢｓｔＸＩ間を削除しＮｃｏ　Ｉサイトを作出したベクター）のＮｃｏ　Ｉ−Ｎｏｔ　Ｉ部位中にライゲーションして、遺伝子導入用組換えベクターであるｐＷｈｅａｔ−ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１を構築した。図９にベクター構築工程の概略図を示した。
【０１１６】
［実施例１１］パーティクルガンを用いた穀類へのｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１遺伝子の導入
実施例１０で得た組換えベクターｐＷｈｅａｔ−ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１を、選抜マーカーのビアラフォス耐性遺伝子ｂａｒと共に、以下のような手順によってモデル単子葉植物イネの完熟胚由来カルスに導入した。
【０１１７】
イネ完熟種子胚（完熟胚とも称する）は４０　％次亜塩素酸で滅菌・洗浄後、７０　ｐｐｍカナマイシン、７０　ｐｐｍセフォタキシム及び２　ｐｐｍ　２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含むＬＳ培地（カルス誘導培地）（ＬＳ培地：　ＬＩＮＳＭＡＩＥＲ　ＳＫＯＯＧ　Ｍｅｄｉｕｍ　１，　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移植し、６〜７日間培養してカルスを誘導した。カルスを２　ｐｐｍ　２，４−Ｄ及び０．４　Ｍマンニトールを含むＬＳ培地におき、パーティクルガンを用いて、それぞれ金粒子へコーティングしたｐＷｈｅａｔ−ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１及びｂａｒ遺伝子を導入した。遺伝子導入を行ったカルスは翌日、２　ｐｐｍ　２，４−Ｄ及び５　ｐｐｍビアラフォス含有ＬＳ培地（選抜培地）に移植し、その後２週間ごとに新鮮な選抜培地に継代した。そして、蛍光顕微鏡下で、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）により蛍光を呈し、選択的に増殖してきたカルスを、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１遺伝子が導入された形質転換体として判断した（図１０）。約２．５〜３ヶ月増殖させた後、増殖した選抜カルスを１　ｍｇ／ｍｌ　ＮＡＡ（α−ナフタリン酢酸ナトリウム）、２　ｍｇ／ｍｌ　ＢＡ（ベンジルアデニン）及び３０　ｇ／ｌソルビトールを含むＬＳ培地（再分化培地）に移植した。再分化植物を５　ｐｐｍビアラフォス含有ＬＳ培地（選抜発根培地）に移植した２〜３週間後馴化し、再生体を得た（図１１）。
【０１１８】
［実施例１２］形質転換イネにおけるＥＧＦＰ：：ＺＨＤ１０１の発現
ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１遺伝子を導入して得られたイネ再生体においてＥＧＦＰ：：ＺＨＤ１０１タンパク質が発現しているかを、ウェスタンブロット分析で試験した。
【０１１９】
再生体の葉０．１　ｇを液体窒素中で粉砕し、抽出バッファー１００μｌを加えよく混和した。これを遠心分離（１５，０００　ｒｐｍ、５　ｍｉｎ）して上清を回収し、粗タンパク質とした。得られた粗タンパク質を１レーン当たり２０μｇ、１０　％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用し電気泳動した。泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し抗ｇｆｐ抗体によりＧＦＰ：：ＺＨＤ１０１融合タンパク質を検出した。その結果を図１２に示した。レーン１は野生型イネ葉より抽出したサンプル、レーン２は再生体Ｎｏ　１４、レーン３は再生体Ｎｏ　５４、レーン４は再生体Ｎｏ　６８、レーン５は再生体Ｎｏ　７１、レーン６は再生体Ｎｏ　７６、レーン７は再生体Ｎｏ　７９、レーン８は再生体Ｎｏ　７９、レーン９は組み換えＥＧＦＰ：：ＺＨＤ１０１である。再生体Ｎｏ　１４、Ｎｏ　５４、Ｎｏ　６８，Ｎｏ　７６及びＮｏ　７９において、野生型では見られないタンパク質が検出された。またこのタンパク質は、組み換えＥＧＦＰ：：ＺＨＤ１０１と同じ分子量であった。これらの結果から、再生体５個体（Ｎｏ　１４、Ｎｏ　５４、Ｎｏ　６８，Ｎｏ　７６及びＮｏ　７９）でＥＧＦＰ：：ＺＨＤ１０１タンパク質が発現していることが示された。
【０１２０】
［実施例１３］ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１を導入した懸濁培養細胞によるゼアラレノン分解
イネのｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１導入懸濁培養細胞を用いて、以下の手順でゼアラレノン分解試験をおこなった。
【０１２１】
ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１導入懸濁培養細胞は、実施例１１で作製したｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１が導入されたカルスを、２　ｐｐｍ　２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含むＬＳ液体培地に移植することにより調製した。また、イネの野生型懸濁培養細胞も同様に、２　ｐｐｍ　２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含むＬＳ液体培地に野生型カルスを移植することにより、調製した。次いで、このようにして調製したｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１導入懸濁培養細胞と野生型懸濁培養細胞のそれぞれについて、約５０　ｍｇの懸濁培養細胞を、ゼアラレノンを７５０μｇ添加した５０　ｐｐｍゼアラレノン含有ＬＳ培地１５　ｍｌ中に加え、２６℃で振とう培養した。
【０１２２】
培養開始から３日後、上記のそれぞれの培地からゼアラレノンを含む抽出物をクロロホルムで抽出し、その培地抽出物をＴＬＣプレートにのせてクロロホルム：アセトン（８０：２０）で展開し、ＵＶ下で検出を行った。また、ゼアラレノン含有ＬＳ培地及びゼアラレノン非含有ＬＳ培地のそれぞれから同様に抽出した抽出物を対照として用いた。このＴＬＣ分析の結果を、図１３に示す。レーン１はゼアラレノン標準物、レーン２はｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１導入細胞を培養したゼアラレノン含有ＬＳ培地からの抽出物、レーン３は野生型細胞を培養したゼアラレノン含有ＬＳ培地からの抽出物、レーン４はゼアラレノン含有ＬＳ培地からの抽出物、レーン５はゼアラレノン非含有ＬＳ培地からの抽出物を示している。野生型細胞を培養した培地及びゼアラレノン含有ＬＳ培地からの抽出物においては、ゼアラレノン標準物の移動度と同じスポットが検出されたことから、培地中にゼアラレノンが残存することが示された。一方、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１導入細胞を培養した培地からの抽出物では、ゼアラレノンを示すスポットが消失しており、培地中のゼアラレノンが分解されたことが示唆された。
【０１２３】
そこで次に、残存するゼアラレノンの量を調べるため、培養開始から６日後のゼアラレノンの定量を行った。残存するゼアラレノン量は、培地中に存在する量と、細胞表面に付着している量及び細胞内に取り込まれた量との合計量と考えられるため、培地中のゼアラレノン量と細胞が含有するゼアラレノン量との両方について定量を行った。また、培地中のゼアラレノンが分解されていることを確認する目的で、培養開始から３日後の培地からの抽出物についてもゼアラレノンを定量した。さらに、対照として、培養開始から６日後の、細胞を含まないゼアラレノン含有ＬＳ培地からの抽出物についてもゼアラレノンを定量した。以上のゼアラレノンの定量には、ＲＩＤＡＳＣＲＥＥＮ　ＦＡＳＴ　Ｚｅａｒａｌｅｎｏｎ（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒ）を使用説明書に従って使用した。
【０１２４】
このようにして定量された、培養開始から６日後のゼアラレノン量を表１に示す。
【表１】
2004000130.tif 000002
【０１２５】
表１における残存ゼアラレノン量は、培地中のゼアラレノン量と細胞が含有するゼアラレノン量との合計値として算出した。ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１導入細胞及び野生型細胞の培養培地における残存ゼアラレノン量は、それぞれ６．４１μｇ及び２６０．８５μｇであった。また、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１導入細胞の培養培地における残存ゼアラレノン量は、培養開始時のゼアラレノン量７５０μｇの約１／１１７であり、野生型細胞の培養培地における残存ゼアラレノン量の約１／４０であった。なお、ゼアラレノン含有ＬＳ培地中の残存ゼアラレノン量も５２．５μｇまで減少したが、これは６日間の培養でゼアラレノンが析出した結果であり、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１導入細胞及び野生型細胞の培養培地についてはこの析出現象は観察されなかった。
【０１２６】
さらに、上記結果に基づく培地中のゼアラレノン量の変化を、図１４に示す。図１４に示される通り、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１導入細胞の培養培地における培地中のゼアラレノン量は、培養開始時の７５０μｇ、培養開始から３日後の２９．５μｇ、６日後の０．７６μｇというように経時的に減少した。従って、培地中のゼアラレノンが培養期間中に分解されたことが確認された。
【０１２７】
これらのデータから、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１遺伝子を導入した形質転換細胞が、培地中のゼアラレノンを強力に分解できることが示された。この結果は、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１を導入したトランスジェニックイネ植物体が、ゼアラレノンの分解能を持つことを示す。
【０１２８】
【発明の効果】
本発明のタンパク質を用いれば、ゼアラレノンの毒性を有利に抑制することができる。また本発明の遺伝子は、該タンパク質を発現させるために用いることができる。さらに、本発明の遺伝子を導入した形質転換体及びトランスジェニック植物は、周囲環境中に含まれるゼアラレノンを効率的に分解し解毒する目的で、有利に使用することができる。
【０１２９】
【配列表】
2004000130.tif 000003
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【０１３０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３〜２４は合成ＤＮＡである。
配列番号３〜１４のｎは、ａ、ｔ、ｃ又はｇである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＩＦＯ７０６３株由来の培養上清のゼアラレノンに対する加水分解活性を検出したＴＬＣのデータを示す。レーン１、培養上清サンプル；レーン２、陰性対照；レーン３、ゼアラレノン標準サンプル。
【図２】図２は、リジルエンドペプチダーゼによりペプチド断片化したＺＨＤ１０１ののＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図３】図３は、アミノ酸配列に基づきＺＨＤ１０１の部分ＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲプライマーセットを示す。
【図４】図４は、大腸菌ＤＥ３中でＴ７転写／発現系により発現させた組換えＺＨＤ１０１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レーン１は野生型ＤＥ３のホモジェネートサンプル、レーン２はｐＥＴ１２−ｚｈｄ１０１を有するＤＥ３（形質転換体）のホモジェネートサンプル、レーン３は形質転換体のホモジェネートの沈殿サンプル、レーン４は形質転換体のホモジェネートの可溶性分画、レーン５はＩＦＯ７０６３株から直接に抽出精製したＺＨＤ１０１、レーン６は分子量マーカーである。
【図５】図５は、組換え発現されたＺＨＤ１０１のＴＬＣの結果を示す。レーン１は野生型ＤＥ３のホモジェネートをゼアラレノンと処理したもの、レーン２はｐＥＴ１２−ｚｈｄ１０１を有するＤＥ３（形質転換体）のホモジェネートをゼアラレノンと処理したもの、レーン３はゼアラレノン標準物である。
【図６】図６は、ＺＨＤ１０１のα−ゼアラレール、β−ゼアラレールに対する加水分解活性を検出したＴＬＣのデータを示す。レーン１、ＺＨＤ１０１処理α−ゼアラレールサンプル；レーン２、α−ゼアラレールに対する陰性対照；レーン３、α−ゼアラレール標準物、レーン４、ＺＨＤ１０１処理β−ゼアラレールサンプル；レーン５、β−ゼアラレールに対する陰性対照；レーン６、β−ゼアラレール標準物。
【図７】図７は、ゼアラレノンがゼアラレノン分解酵素ＺＨＤ１０１によって分解されてゼアラレノン分解産物が生成することを化学式を用いて示している。
【図８】図８は、ゼアラレノン及びゼアラレノン分解産物のヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７に対する細胞増殖促進作用を示す。添加したゼアラレノン（●）又はゼアラレノン分解産物（■）の濃度に対する、３７℃で１２０時間のインキュベート後の細胞数を示している。結果は平均値±Ｓ．Ｄ．で示す。
【図９】図９は、ｚｈｄ１０１遺伝子導入用ベクターｐＷｈｅａｔ−ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１の構築工程を示す概略図である。
【図１０】図１０は、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１遺伝子が導入された形質転換体（トランスジェニックカルス）の蛍光顕微鏡下での観察写真である。
【図１１】図１１は、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１遺伝子を導入したイネ再生体の写真である。
【図１２】図１２は、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１遺伝子を導入したトランスジェニック個体のウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。最も左側は分子量マーカー、レーン１は野生型イネ葉より抽出したサンプル、レーン２は再生体Ｎｏ　１４、レーン３は再生体Ｎｏ　５４、レーン４は再生体Ｎｏ　６８、レーン５は再生体Ｎｏ　７１、レーン６は再生体Ｎｏ　７６、レーン７は再生体Ｎｏ　７９、レーン８は再生体Ｎｏ　７９、レーン９は組み換えＥＧＦＰ：：ＺＨＤ１０１タンパク質の結果を示す。
【図１３】図１３は、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１遺伝子導入懸濁培養細胞を培養した培地からの抽出物のＴＬＣ分析の結果を示す写真である。レーン１はゼアラレノン標準物、レーン２は遺伝子導入細胞を培養したゼアラレノン含有培養培地からの抽出物、レーン３は野生型細胞を培養したゼアラレノン含有培養培地からの抽出物、レーン４はゼアラレノン含有ＬＳ培地からの抽出物、レーン５はＬＳ培地のみからの抽出物の結果を示す。
【図１４】図１４は、培養期間における培地中のゼアラレノン量の変化を示すグラフである。グラフ中、「◆」「◇」「×」は、ｅｇｆｐ：：ｚｈｄ１０１導入懸濁培養細胞の培養培地についてのゼアラレノン量、「●」「□」「■」は、野生型懸濁培養細胞の培養培地についてのゼアラレノン量、▲は、細胞不含のゼアラレノン含有培地のゼアラレノン量を示す。◆及び●は培地中のゼアラレノン量、◇及び□は細胞が含有するゼアラレノン量、×及び■は残存ゼアラレノン量を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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