(57)【要約】【課題】ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素のαサブユニットとβサブユニットを含む酵素複合体を、エシェリヒア属細菌で大量発現させる。【解決手段】ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素のαサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入され、かつ、ｃｃｍ系（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）の発現が増強されたエシェリヒア属細菌を培養して、前記ＤＮＡを発現させ、グルコース脱水素酵素複合体を産生させ、これを採取することにより、グルコース脱水素酵素複合体を製造する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素のαサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌。
【請求項２】
αサブユニットをコードするＤＮＡがβサブユニットをコードするＤＮＡの上流に位置し、単一のプロモーターによってそれぞれの発現が制御される請求項１に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項３】
さらに、前記グルコース脱水素酵素のγサブユニットをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入された請求項１に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項４】
γサブユニットをコードするＤＮＡがαサブユニットをコードするＤＮＡの上流に位置する請求項３に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項５】
前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである請求項１〜４のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌を培養して、αサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを発現させ、グルコース脱水素酵素複合体を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）のグルコース脱水素酵素複合体を大量発現するエシェリヒア属細菌、及び酵素複合体の製造方法に関する。グルコース脱水素酵素は、酵素電極を用いたグルコースセンサ等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
グルコース脱水素酵素として、ブルクホルデリア属の微生物（ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）ＫＳ１株）が産生する酵素が知られている。同酵素は、触媒サブユニットであるαサブユニット、チトクロームＣであるβサブユニット、及びγサブユニットからなる複合体であり、熱安定性が高く、反応に溶存酸素の影響を受けにくい等の優れた性質を有している。同酵素のαサブユニット及びγサブユニットをコードするＤＮＡが単離され、βサブユニットをコードするＤＮＡの一部も単離された。また、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現に成功している（以上、特許文献１参照）。しかしながら、発現されたＧＤＨはβサブユニットを持たないものと考えられる。
【０００３】
ところで、エシェリヒア・コリのチトクローム成熟系として、ｃｃｍ系（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）が知られている。ｃｃｍ系は、エシェリヒア・コリにおいて、嫌気下、かつ、特殊な条件下で発現することが知られている（非特許文献１）。ｃｃｍ系をコードするオペロン（ｃｃｍＡＢＣＤＥＦＧＨ）のＤＮＡ配列は既に明らかになっている（非特許文献２、３）。さらに、ｃｃｍ系を発現するプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリにおいて、異種生物由来の共有結合型マルチヘムチトクロームを好気下で発現、生産させたことが報告されている（非特許文献４〜７）。
【０００４】
また、ｃｃｍオペロンを含むプラスミドとして、同オペロンをｐＡＣＹＣ１８４に挿入して得られたプラスミドｐＥＣ８６（非特許文献８）が知られている。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開第０２／３６７７９号パンフレット
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７７，  ４３２１−４３２６  （１９９５）
【非特許文献２】
Ｎａｔｕｒｅ  ４０９  （６８１９），  ５２９−５３３  （２００１）
【非特許文献３】
ＧｅｎｅＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｕ０００８  （１９９３）
【非特許文献４】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，    ２５１，  ７４４−７  （１９９８）
【非特許文献５】
Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４１１，  １１４−２０  （１９９９）
【非特許文献６】
Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４８１，  １８−２４  （２０００）
【非特許文献７】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ９，  ２０７４−８４  （２０００）
【非特許文献８】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，    ２５１，  ７４４−７  （１９９８）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、エシェリヒア・コリにおいて、前記グルコース脱水素酵素のαサブユニットのみを発現させた場合に比べて、αサブユニットとβサブユニットを同時に発現させた場合はその効率が低いことを見出している。本発明は、αサブユニットとβサブユニットを含む酵素複合体を、エシェリヒア属細菌で大量発現させる手段を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、エシェリヒア属細菌において、ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素複合体をコードするＤＮＡの発現が、同細菌のｃｃｍ系の発現を増強することによって高めることができることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素のαサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌。
（２）αサブユニットをコードするＤＮＡがβサブユニットをコードするＤＮＡの上流に位置し、単一のプロモーターによってそれぞれの発現が制御される（１）に記載のエシェリヒア属細菌。
（３）さらに、前記グルコース脱水素酵素のγサブユニットをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入された（１）に記載のエシェリヒア属細菌。
（４）γサブユニットをコードするＤＮＡがαサブユニットをコードするＤＮＡの上流に位置する（３）に記載のエシェリヒア属細菌。
（５）前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである（１）〜（４）のいずれかに記載のエシェリヒア属細菌。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のエシェリヒア属細菌を培養して、αサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを発現させ、グルコース脱水素酵素複合体を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素複合体の製造方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエシェリヒア属細菌は、ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素（以下、単に「ＧＤＨ」ともいう）のαサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡ（以下、各々「αサブユニット遺伝子」及び「βサブユニット遺伝子」ということがある）が発現可能な形態で導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌である。
【００１０】
前記エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。
また、前記ブルクホルデリア・セパシアとしては、ＫＳ１株、ＪＣＭ２８００株、ＪＣＭ２８０１株、又はＪ２３１５株等が挙げられる。ＫＳ１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０６として寄託されている。ＪＣＭ２８００株又はＪＣＭ２８０１株は、理化学研究所微生物系統保存施設（Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ＪＣＭ）から入手することができる。また、Ｊ２３１５株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ番号ＢＡＡ−２４５として、Ｔｈｅ  Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  （ＢＣＣＭＴＭ）に菌株番号ＬＮＧ  １６６５６として寄託されており、これらから入手することができる。
【００１１】
ＫＳ１株のＧＤＨ  αサブユニット遺伝子、及びβサブユニット遺伝子の一部を含む染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に示す（ＷＯ  ０２／３６７７９号パンフレット参照）。この塩基配列には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、５’末端側から２番目及び３番目のＯＲＦは、それぞれαサブユニット（配列番号２）、及びβサブユニット（配列番号３）をコードしている。また、１番目のＯＲＦはγサブユニット（配列番号２）をコードしていると推定される。また、配列番号９に、βサブユニット遺伝子全長を含む断片の塩基配列を示す。さらに、βサブユニットのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。配列番号１０において、アミノ酸番号１〜２２はシグナルペプチドであると推定される。尚、配列番号９及び１０において、第１番目のアミノ酸残基はＶａｌと記載されているが、Ｍｅｔである可能性が高く、また、翻訳後に脱落している可能性がある。
【００１２】
本発明に用いるαサブユニット遺伝子は、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子に限られず、コードされるポリペプチドがＧＤＨ活性を有する限り、配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。尚、配列番号３には、配列番号１の塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を示してあるが、Ｎ末端のメチオニン残基は、翻訳後に脱落している可能性がある。前記「１又は複数」とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。
【００１３】
また、βサブユニット遺伝子は、ＧＤＨのβサブユニットとして機能し得る限り、配列番号１０のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。前記「１又は複数」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。尚、ＧＤＨのβサブユニットとして機能するとは、ＧＤＨの酵素活性を損なわずにチトクロームＣとして機能することをいう。
【００１４】
αサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号１の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、αサブユニット遺伝子は、配列番号１の塩基配列の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１５】
また、βサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号９の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。またβサブユニット遺伝子は、配列番号９の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１６】
前記ストリンジェントな条件としては、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件、具体的には、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃が挙げられる。
【００１７】
αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって、取得することができる。ＰＣＲ用プライマーは、前記の塩基配列に基づいて化学合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡから取得することもできる。また、ブルクホルデリア・セパシアの他の菌株からも、同様にしてバリアントを取得することができる。
【００１８】
本発明においては、αサブユニット遺伝子はβサブユニット遺伝子の上流に位置し、単一のプロモーターによってそれぞれの発現が制御されることが好ましい。
また、αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子とともに、γサブユニットをコードするＤＮＡ（γサブユニット遺伝子）が発現可能な形態でエシェリヒア属細菌に導入されることが好ましい。その際、γサブユニット遺伝子は、αサブユニット遺伝子の上流に位置し、単一のプロモーターによって各サブユニット遺伝子の発現が制御されることが好ましい。
【００１９】
γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなＤＮＡ断片は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２、１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによって取得することができる（後記実施例参照）。
【００２０】
αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子（必要に応じてγサブユニット遺伝子）を含むＤＮＡ（以下、「ＧＤＨαβ遺伝子」という）を発現可能な形態でエシェリヒア属細菌に導入するには、ＧＤＨαβ遺伝子をエシェリヒア属細菌で機能するベクターに挿入し、得られた組換えベクターでエシェリヒア属細菌を形質転換すればよい。その際、ＧＤＨαβ遺伝子の上流にエシェリヒア属細菌で機能するプロモーターを配置することによって、同プロモーターの制御下でＧＤＨαβ遺伝子を発現させることができる。
【００２１】
前記エシェリヒア属細菌で機能するベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＢＲ１２２等が挙げられる。また、前記プロモーターとしては、例えばｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＰＬ、ｔｅｔ、ＰｈｏＡ等が挙げられる。また、プロモーターを含む発現ベクターの適当な部位に、ＧＤＨαβ遺伝子を挿入することによって、同遺伝子のベクターへの挿入とプロモーターの連結とを同じ工程で行うことができる。このような発現ベクターとしては、ｐＴｒｃ９９Ａ、  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＫＫ２２３−３等が挙げられる。
【００２２】
また、ＧＤＨαβ遺伝子は、発現可能な形態でエシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ中に組み込まれてもよい。
組換えベクターでエシェリヒア属細菌を形質転換するには、例えばカルシウム処理によるコンピテントセル法又はエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２３】
本発明のエシェリヒア属細菌は、上記のようにしてＧＤＨαβ遺伝子が導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌である。
ｃｃｍ系は、ｃｃｍオペロン（ｃｃｍＡＢＣＤＥＦＧＨ）によってコードされている。ｃｃｍオペロンは、例えば、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって、取得することができる。ＰＣＲ用プライマーは、報告されている塩基配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＥ００５４５２）に基づいて合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡから取得することもできる。また、他のエシェリヒア属細菌からも、同様にしてバリアントを取得することができる。
【００２４】
ｃｃｍオペロンとしては、前記の報告されている塩基配列を有するＤＮＡの他、同塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃｃｍ系をとして機能する酵素群をコードするＤＮＡであってもよい。
【００２５】
ｃｃｍ系は、嫌気下、かつ、特殊な条件下で発現することが知られている（非特許文献１）。本発明において、「ｃｃｍ系の発現が増強された」とは、エシェリヒア属細菌の野生株又は非改変株よりも発現量が高められたか、又は、嫌気下、かつ、特殊な条件下でなくても発現するように改変されたことをいう。嫌気下、かつ、特殊な条件下ではない条件としては、好気性条件下が挙げられる。
【００２６】
ｃｃｍ系の発現を増強するには、ｃｃｍオペロンの各遺伝子を、構成的に発現するプロモーター、又は発現制御が可能なプロモーターに連結し、得られた組換え遺伝子をエシェリヒア属細菌に導入すればよい。好適なプロモーター及びベクター、並びにエシェリヒア属細菌へのｃｃｍオペロンの導入は、前記ＧＤＨαβ遺伝子について記載したのと同様である。
【００２７】
ｃｃｍオペロンを含むプラスミドとして、同オペロンがｐＡＣＹＣ１８４に挿入して得られたｐＥＣ８６が挙げられる。同オペロンは、ｔｅｔプロモーターの制御下で構成的に発現する。また、エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上のｃｃｍオペロンをＰＣＲ等によりクローニングし、適当なプロモーターの支配下に挿入したプラスミドを作製することもできる。
【００２８】
また、エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上のｃｃｍオペロンのプロモーターを、適当なプロモーターに置換することによっても、同オペロンの発現を増強することができる。
【００２９】
本発明のエシェリヒア属細菌を培養して、αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子を発現させ、これらの発現産物としてＧＤＨ酵素複合体を産生させ、これを採取することにより、ＧＤＨ複合体を効率よく製造することができる。ここで、「ＧＤＨ複合体」とは、好ましくは各サブユニットが会合して多量体タンパク質を形成しているものをいうが、遊離した各サブユニットの混合物も含まれる。
【００３０】
エシェリヒア属細菌の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３１】
培地の栄養源としては、エシェリヒア属細菌の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３２】
培養温度は、エシェリヒア属細菌が生育し、ＧＤＨ複合体を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨ複合体が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は１２〜７２時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＧＤＨ複合体を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００３３】
ＧＤＨ複合体は、培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨ複合体が培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ複合体を含有する溶液とエシェリヒア属細菌菌体と分離した後に利用される。ＧＤＨ複合体が菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加して各サブユニットを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３４】
上記のようにして得られたＧＤＨ複合体含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって精製を行うことにより、精製されたＧＤＨ複合体を得ることができる。カラムクロマイトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。
【００３５】
尚、ＧＤＨはαサブユニット単独でも酵素活性を示す。したがって、本発明のエシェリヒア属細菌又はＧＤＨ複合体から、αサブユニットのみを単離、精製して使用することもできる。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】ブルクホルデリア・セパシア  ＫＳ１株ＧＤＨ  βサブユニットをコードする遺伝子の単離
＜１＞ブルクホルデリア・セパシア  ＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットの検索
Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ  のブルクホルデリア・セパシアＪ２３１５株ゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）を用いて、ＫＳ１株由来ＧＤＨのβサブユニット遺伝子を検索した。すでに明らかにされているＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットのＮ末端配列（配列番号５）を参考に、アセトバクターＳｐ．、グルコノバクターＳｐ．由来のアルコール脱水素酵素（Ｔａｍａｋｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １０８８（２）：２９２−３００  （１９９１）、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５６，  ３０４−３１０  （１９９２）、Ｔａｋｅｍｕｒａ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７５，６８５７−６６  （１９９３）、Ｋｏｎｄｏ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ６３，１１３１−８  （１９９７））、エルビニアｓｐ．、シュードモナスｓｐ．由来のグルコン酸脱水素酵素（Ｙｕｍ  ＤＹ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ，１７９，６５６６−７２，（１９９７）、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，８５，１１７３−８１  （１９７９））、グルコノバイターｓｐ．由来のソルビトール脱水素酵素（Ｃｈｏｉ，  Ｅ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  １２５，  ４５−５０  （１９９５））、エルビニアｓｐ．、パントエアｓｐ．由来の２−ケトグルコン酸脱水素酵素（Ｐｕｊｏｌ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ，１８２，２２３０−７，（２０００））のチトクロムｃサブユニットとホモロジーの高いアミノ酸配列（配列番号６）をデザインした。
【００３７】
上記アミノ酸配列を指標として、前記ブルクホルデリア・セパシアＪ２３１５株のデーターベースからＢＬＡＳＴを用いてホモロジーの高いアミノ酸配列をコードしている遺伝子配列を検索した。つぎに、得られた５つの配列に対して、ＫＳ１株ＧＤＨαサブユニットのＣ末端配列とのホモロジーを検索した結果、２つの遺伝子断片から翻訳されるアミノ酸配列が高いホモロジー（＞９０％）を示した。各遺伝子断片は２００〜５００ｂｐと短かったので、これらの配列に対して相同性の高い配列を、Ｂｌａｓｔを用いてブルクホルデリア・セパシアＪ２３１５株のゲノムデーターベースから検索し、各断片をつなぎ合わせた。その結果、３１１０ｂｐの断片を得た。得られた塩基配列にはＧＤＨのＣ末端と思われるＯＲＦと１２７５ｂｐからなるチトクロームｃ構造遺伝子と思われるＯＲＦが存在した。得られたＪ２３１５株の塩基配列と既にクローニングされているＫＳ１株αサブユニット塩基配列を比較した結果、αサブユニット下流にはＪ２３１５株チトクロームｃのシグナルペプチドをコードする塩基配列に相同性の高い塩基配列が含まれていた。
以上のことから、すでにクローニングされているブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨ遺伝子（配列番号１、ＷＯ  ０２／３６７７９号パンフレット参照）の三番目のＯＲＦ（配列番号１の塩基番号２３８６以降）は、β−サブユニットをコードしていると推定された。また、精製されたβ−サブユニットのＮ末端におけるアミノ酸配列と、配列番号１中の塩基番号２４５２〜２４６６の塩基配列によって翻訳される５アミノ酸残基が一致したことからも、前記ＯＲＦはβサブユニットをコードしていると考えられた。
【００３８】
＜２＞インバースＰＣＲ法を用いたβサブユニット構造遺伝子の増幅
（１）菌体の培養及びゲノムの抽出
ＫＳ１株を５ｍｌの完全培地（０．５％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ  、０．３％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  、０．５％  ＮａＣｌ）を用いて３７℃で一晩振とう培養した。得られた菌体からＧｅｎｎｏｍｉｃＰｒｅｐＴＭ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてゲノムを抽出した。方法は付属のマニュアルに従った。得られたゲノムに対してフェノール／クロロホルム処理を行い、エタノール沈殿させた後、精製水に溶解した。
【００３９】
（２）ゲノム断片の環状化
ＫＳ１株より抽出したゲノムを、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、エタノール沈殿によってゲノム断片を回収した。制限酵素消化したゲノム１μｇをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて１６℃で一晩ライゲーション反応を行った。
【００４０】
（３）ＰＣＲ
ＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットのＮ末端シグナル配列領域の塩基配列からデザインしたフォワードプライマー（ＥＦ１配列番号７）５０ｐｍｏｌ，  リバースプライマー（ＥＲ１配列番号８）５０ｐｍｏｌ（プライマーはいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に依託合成）、ＬＡＴａｑ（宝バイオ（株））  ０．５ｍｌ、ｄＮＴＰ溶液  ８μｌ，  １０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌに精製水を全量５０μｌとなるように加え、プログラムテンプコントロールシステム  ＰＣ−８０１（ＡＳＴＥＣ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応は、以下の条件で行った。９４℃  ５分、９８℃  ２０秒、６２℃  ３０秒を３０サイクルの後、７２℃  ６分、７２℃  １０分。
【００４１】
ＳｍａＩで制限酵素消化したゲノムをテンプレートとした場合において、約２．１ｋｂｐの大きさの断片がアガロース電気泳動で確認された。
【００４２】
＜３＞ＰＣＲ増幅断片のシークエンシング
（１）ＴＡクローニング
前記のインバースＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、バンドを切り出し、Ｇｅｎｅ  ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ＫＩＴ（Ｂｉｏ１０１  ｉｎｃ．）を用いて精製した。この断片を、ｐＧＥＭＲ−Ｔ  ａｎｄ  ｐＧＥＭＲ−Ｔ  ＥＡＳＹ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒにライゲーションした。ライゲーションを行ったベクターでエシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン  ５０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ  ４０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ  ０．１μＭを含むＬ寒天培地を用いて一晩培養した。出現したコロニーから白色のコロニーを選択し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ培地で一晩培養して、菌体からプラスドをアルカリ法により抽出した。
【００４３】
（２）シークエンスサンプルの調製
得られたプラスミドをＲＮａｓｅ処理し、これに０．６倍量の２０％  ＰＥＧ６０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加え、氷上に１時間放置した。その後１５０００ｒ．ｐ．ｍ、４℃で１５分間遠心分離し、ペレットを得た。これを７０％エタノールで洗浄し、ペレットを真空乾燥させた。これを精製水に溶解した。
【００４４】
（３）ＤＮＡ塩基配列の解析
（２）で得られたプラスミドの挿入断片の塩基配列を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｚｅｒ  （  ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ  Ａｐｐｌｉｓｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。ベクターのマルチクローニングサイトからＭ１３プライマーを用いて挿入断片の一部の配列を決定した結果、これまでに解析されているβサブユニットＮ末端を含む塩基配列が確認された。この配列を手がかりにプライマーを順次作製して用い、挿入断片の塩基配列を決定した。結果を配列番号９に示す。また、この塩基配列に含まれるＯＲＦがコードするアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００４５】
βサブユニットは、全部で４２５個のアミノ酸残基から構成されており、すでに得られているＮ末端アミノ酸配列と比較して、そのうち２２残基はシグナルペプチドであると考えらる。アミノ酸配列から計算される分子量は４５，２７６Ｄａであり、シグナルペプチドを除いた分子量４２，７３１Ｄａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求められたＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットの分子量４３ｋＤａとほぼ同等の値であった。βサブユニットのアミノ酸配列中には、チトクロームｃにおいてヘムとの結合モチーフ（配列番号１１）が３ヶ所に確認された。このＯＲＦはαサブユニット構造遺伝子のＯＲＦのすぐ下流に位置し、開始コドンの上流にＳＤ配列と思われる配列が存在した。
【００４６】
得られたアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴによるホモロジー検索を行ったところ、ラルストニア・ソアナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のオキシドレダクターゼ脱水素酵素のチトクロムｃサブユニットと６５％、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）由来のソルビトール脱水素酵素のチトクロムｃサブユニットと４８％、エルビニア・シプリペディイ（Ｅｒｉｗｉｎｉａ  ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｉ）由来のグルコン酸脱水素酵素のチトクロームｃサブユニットと４４％、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）由来２−ケト−グルコン酸脱水素酵素のチトクロームｃサブユニットとアミノ酸レベルて４６．４％と、全体にわたって高い相同性を示していた。またこれらのチトクロームｃのアミノ酸配列中には、ヘム結合モチーフ（配列番号１１）配列が保存されていた。
尚、ＫＳ１株のＧＤＨβサブユニット構造遺伝子は、Ｊ２３１５株のＧＤＨβサブユニット構造遺伝子と、塩基配列レベルで９２．０％、アミノ酸レベルで９２．２％の相同性を有している。
【００４７】
【実施例２】エシェリヒア・コリへのＧＤＨαβ遺伝子の導入及びｃｃｍ系の増強
＜１＞ブルクホルデリア・セパシア  ＫＳ１株からの染色体ＤＮＡの調製
ブルクホルデリア・セパシア  ＫＳ１株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をＴＬ液体倍地（ポリペプトン  １０ｇ、酵母抽出液  １ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ２ｇ、グルコース  ５ｇ；１Ｌ、ｐＨ  ７．２）を用いて、３４℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機により回収した。この菌体を１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【００４８】
＜２＞ＧＤＨαβ遺伝子の調製
前記染色体ＤＮＡを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、ＧＤＨのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【００４９】
＜フォワードプライマー：ｃＦ１＞
５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１２）
＜リバースプライマー：ＧＤＨｂＵ１＞
５’−ＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号１３）
【００５０】
増幅した断片のＣ末端側を平滑末端化した後、Ｎ末端側をＮｃｏＩで消化し、同様に処理したｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にライゲーションした。得られた組換えベクターでＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転換体を液体のＬＢ培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片を解析したところ、約３．８ｋｂの挿入断片が確認された。本プラスミドをｐＴｒｃ９９Ａγαβと命名した。本プラスミド中のＧＤＨαβ遺伝子は、ｔｒｃプロモーターによって制御される。ｐＴｒｃ９９Ａγαβは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
【００５１】
＜３＞ｃｃｍ系プラスミドの調製
ｐＴｒｃ９９ＡγαβをＥｃｏＴ２２１で消化した後に末端を平滑化した。次にＮｏｔＩで消化して、アガロースゲル電気泳動により短いＤＮＡ断片を分離、回収した。このＤＮＡ断片をＳｃａＩとＮｏｔＩで消化したｐＢＢＲ１２２（ＭｏＢｉＴｅｃ社）に挿入して、ｐＢＢＧＤＨγαβを作製した。
【００５２】
Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をＬＢ培地（ポリペプトン  １０ｇ、酵母エキス  ５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ；１Ｌ、ｐＨ７．０）を用いて３７℃で一夜振盪培養した。増殖した菌体を遠心分離により回収した。この菌体を１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくい取り、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバッファーに溶解させ、ＪＭ１０９染色体ＤＮＡ溶液とした。
【００５３】
ＪＭ１０９染色体ＤＮＡを鋳型として、以下に配列を示すオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによりｃｃｍ系遺伝子をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【００５４】
＜フォワードプライマー：ＥＣｃｃｍＤ１＞
５’−  ＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴ  −３’（配列番号１４）
＜リバースプライマー：ＥＣｃｃｍＵ１＞
５’−  ＴＴＡＴＴＴＡＣＴＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣＡＡＡＴＧＴＴＧ  −３’（配列番号１５）
【００５５】
増幅した末端を平滑化した後、Ｎ末端側をＮｃｏＩで消化した。この断片をＡＣＣＩで消化、平滑末端化した後、ＮｃｏＩで消化したｐＢＢＧＤＨγαβとライゲーションしてｐＢＢＪＭｃｃｍを作製した。尚、ｐＢＢＧＤＨγαβをＮｃｏＩで消化することにより、ＧＤＨαβ遺伝子は削除されている。
【００５６】
＜４＞ＧＤＨαβ遺伝子及びｃｃｍ系のエシェリヒア・コリへの導入
Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９をｐＴｒｃ９９Ａγαβ及びｐＢＢＪＭｃｃｍで形質転換し、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａγαβ，ｐＢＢＪＭｃｃｍを得た。また、コントロールとしてｐＴｒｃ９９ＡγαβでＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換したＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａγαβを得た。
これらの形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンと５０μｇ／ｍｌカナマイシン（ＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａγαβ，ｐＢＢＪＭｃｃｍ）、または５０μｇ／ｍｌアンピシリン（ＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａγαβ）を含む１０ｍＬの２×ＹＴ培地で３４℃、１夜振盪培養した。また、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株を１０ｍＬの完全培地で１夜振盪培養した。培養液の一部から遠心分離により各菌体を回収し、遠心分離前の液量になるように１％コール酸ナトリウムを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加えた後に超音波により細胞を破砕した。次に、破砕液を遠心分離した上清中のＧＤＨ活性を測定した。
【００５７】
ＧＤＨ活性は次の操作にて測定した。４７ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ６．０、２０ｍＭ  グルコース、２ｍＭフェナジンメトサルフェート、０．１ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノールを、３７℃で予め加温した後にサンプルを加えて反応を開始し、３７℃に保ち、６００ｎｍの吸光度変化を測定して求めた。ＧＤＨ活性は、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールの分子吸光係数４．７６ｍＭ／ｃｍを用いて、酵素１単位（Ｕ）は１分毎に１μモルの２，６−ジクロロフェノールインドフェノールが酸化される量と定義して求めた。
結果は、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａγαβ、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａγαβ，ｐＢＢＪＭｃｃｍのＧＤＨ活性は、それぞれ、０．３Ｕ／ｍＬ、１．４Ｕ／ｍＬ、３２Ｕ／ｍＬであった。すなわち、  ＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９ＡγαβにはＧＤＨ活性がほとんど認められず、野生株であるブルクホルデリア・セパシアＫＳ１にはＧＤＨ活性がわずかであったが、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａγαβ，ｐＢＢＪＭｃｃｍでは非常に高いＧＤＨ活性が認められた。尚、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａγαβ，  ｐＢＢＪＭｃｃｍからＧＤＨ複合体を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、ＫＳ１株から精製したＧＤＨ複合体と同様の泳動パターンを示すことが確認できた（図１）。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素のαサブユニットとβサブユニットを含む酵素複合体を、エシェリヒア属細菌で大量発現させることができる。
【００５９】
【課題を解決するための手段】
【配列表】
2004290001.tif 000003
2004290001.tif 000004
2004290001.tif 000005
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2004290001.tif 000021
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【図面の簡単な説明】
【図１】ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株及びエシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａγαβ，ｐＢＢＪＭｃｃｍから精製されたＧＤＨ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図（写真）。
レーン１：マーカー
レーン２：ＫＳ１株から精製したＧＤＨ
レーン３：ＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａγαβ、ｐＢＢＪＭｃｃｍから精製したＧＤＨ
【図１】
2004290001.tif 000023