(57)【要約】【課題】蛋白質もしくはペプチドを活性・機能を保ったまま表面に固定化し、サンプルに含まれる生体分子もしくは生物分子集合体との相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを評価する方法、評価するための基板を提供する。【解決手段】複数の蛋白質もしくはペプチドを同一平面基板上に固定化し、該同一平面基板上に固定化された蛋白質もしくはペプチドと生体分子もしくは生物分子集合体を含有するサンプルとを同時にもしくは逐次的に接触させることにより、該サンプルに含まれる生体分子もしくは生物分子集合体と該蛋白質もしくは該ペプチドとの相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを測定することを特徴とする相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の蛋白質もしくはペプチドを同一平面基板上に固定化し、該同一平面基板上に固定化された蛋白質もしくはペプチドと生体分子もしくは生物分子集合体を含有するサンプルとを同時にもしくは逐次的に接触させることにより、該サンプルに含まれる生体分子もしくは生物分子集合体と該蛋白質もしくは該ペプチドとの相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを測定することを特徴とする相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。
【請求項２】
平面基板に固定化する複数の蛋白質もしくはペプチドがヒスチジンタグを有することを特徴とする請求項１記載の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。
【請求項３】
該基板が金薄膜を有する透明基板であることを特徴とする請求項１もしくは２記載の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。
【請求項４】
固定化した複数の蛋白質もしくはペプチドとサンプルに含まれる生体分子もしくは生物分子集合体の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを表面プラズモン共鳴で測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。
【請求項５】
表面プラズモン共鳴イメージング法によって相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを測定することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。
【請求項６】
ヒスチジンタグを有する複数の蛋白質もしくはペプチドが固定可能なように、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基を有するチオール化合物もしくはジスルフィド化合物が透明基板上の金薄膜に固定化されていることを特徴とする基板。
【請求項７】
ＮＴＡ基を有するチオール化合物もしくはジスルフィド化合物と、ＮＴＡ基を有さないチオール化合物もしくはジスルフィド化合物が混合して固定化されていることを特徴とする請求項６記載の基板。
【請求項８】
ＮＴＡ基を多く有する領域が、ＮＴＡ基をほとんど含まない領域に囲まれており、ＮＴＡ基を多く有する領域を、不連続に９つ以上有することを特徴とする請求項６もしくは７記載の基板。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の基板上に、ヒスチジンタグを有する複数の蛋白質もしくはペプチドがＮＴＡ−Ｎｉキレートによって固定されていることを特徴とするアレイ。
【請求項１０】
基板として請求項９記載のアレイを使用することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質間の相互作用を評価できるＫｉｎｅｔｉｃｓ解析方法および解析用基板に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、蛋白質もしくはペプチドの生体分子の機能を調べるあるいは、発現蛋白質を明らかにする手段として、蛋白質と生体分子間の相互作用を評価する試みがなされている。その一つとして蛋白質を基板表面に固定化し、固定化した部位にサンプルが結合するかどうかを評価する方法が知られている。結合の検出方法として蛍光やラジオアイソトープなどをラベルする方法が一般的であるが、リアルタイムでの測定は非常に煩雑になるため結合速度と解離速度、もしくは反応速度を求めるＫｉｎｅｔｉｃｓの測定には適さない。
【０００３】
例えば、固体表面にペプチドを固定化して蛋白相互作用を評価するアッセイ法が示されているが、主にラベル分子を用いるために、結合したかどうかを検出するのが目的となっている（例えば、特許文献１参照）。しかし、相互作用評価においては平衡状態における平衡定数だけでは十分ではなく、速度を評価するＫｉｎｅｔｉｃｓ測定が近年ますます重要となってきている。
【０００４】
リアルタイムでＫｉｎｅｔｉｃｓを測定する方法として表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いる方法が知られている。ＳＰＲは金属薄膜上の屈折率変化を検出する方法であり、物質が結合するとＳＰＲ共鳴角が変化する。しかし、通常のＳＰＲは一点のみを検出し、同時に複数点の検出をすることができない。従って、ＤＮＡチップのようにスクリーニングするのにはほとんど用いられていない。
【０００５】
米国特許では金属表面に生体分子アレイを作製し、ＳＰＲイメージング法によって複数点の相互作用解析を行う方法を開示しているが、結合の有無を確認するのを目的としており、結合速度と解離速度を求めるＫｉｎｅｔｉｃｓを求めるのが目的ではない（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
蛋白質やペプチドを表面に固定化する古典的な方法は、蛋白質やペプチドが有している官能基を用いる。代表的な手法として、表面にアシルアジド基、スクシンイミド基、エポキシ基、アルデヒド基を導入して蛋白質やペプチドのアミノ基と反応させる方法などが挙げられる。しかし、官能基は蛋白質やペプチドに多く存在し、蛋白質やペプチドの活性、機能を司る部位に存在する官能基を通して表面に固定化される場合もある。その場合、表面に固定化した段階で、蛋白・ペプチドとしての活性、機能を失い、相互作用解析を評価することはできない。
【０００７】
蛋白質やペプチドを活性・機能を保ったまま固定化する方法としてヒスチジンタグを有する蛋白質・ペプチドをニッケルキレートによって固定化する方法が提案されている。この方法は蛋白・ペプチドの活性、機能を保ったまま表面に固定化できる場合が多い。金属キレートによって（ポリ）ペプチドを表面に固定化しＳＰＲで相互作用を研究する方法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。しかし、ここでは（ポリ）ペプチドは一検体ずつ、チップを再生して使用する方法が用いられており、複数の蛋白質・ペプチドを同一表面上に固定化してＫｉｎｅｔｉｃｓを測定する概念は示されていない。
【０００８】
【特許文献１】
国際公開第００／５４０４６号パンフレット
【特許文献２】
米国特許第６１２７１２９号明細書
【特許文献３】
特表平１０−５０５９１０号公報
【０００９】
本発明はヒスチジンタグを有する蛋白質もしくはペプチドを活性・機能を保ったまま表面に固定化し、サンプルに含まれる生体分子もしくは生物分子集合体との相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの評価を可能にする。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、蛋白質もしくはペプチドを活性・機能を保ったまま表面に固定化し、サンプルに含まれる生体分子もしくは生物分子集合体との相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを評価する方法、評価するための基板を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．複数の蛋白質もしくはペプチドを同一平面基板上に固定化し、該同一平面基板上に固定化された蛋白質もしくはペプチドと生体分子もしくは生物分子集合体を含有するサンプルとを同時にもしくは逐次的に接触させることにより、該サンプルに含まれる生体分子もしくは生物分子集合体と該蛋白質もしくは該ペプチドとの相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを測定することを特徴とする相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。
２．平面基板に固定化する複数の蛋白質もしくはペプチドがヒスチジンタグを有することを特徴とする上記記載の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。
３．該基板が金薄膜を有する透明基板であることを特徴とする上記１もしくは２記載の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。
４．固定化した複数の蛋白質もしくはペプチドとサンプルに含まれる生体分子もしくは生物分子集合体の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを表面プラズモン共鳴で測定することを特徴とする上記１〜３のいずれかに記載の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。
５．表面プラズモン共鳴イメージング法によって相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを測定することを特徴とする上記１〜４のいずれかに記載の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法。
６．ヒスチジンタグを有する複数の蛋白質もしくはペプチドが固定可能なように、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基を有するチオール化合物もしくはジスルフィド化合物が透明基板上の金薄膜に固定化されていることを特徴とする基板。
７．ＮＴＡ基を有するチオール化合物もしくはジスルフィド化合物と、ＮＴＡ基を有さないチオール化合物もしくはジスルフィド化合物が混合して固定化されていることを特徴とする上記６記載の基板。
８．ＮＴＡ基を多く有する領域が、ＮＴＡ基をほとんど含まない領域に囲まれており、ＮＴＡ基を多く有する領域を、不連続に９つ以上有することを特徴とする上記６もしくは７記載の基板。
９．上記６〜８のいずれかに記載の基板上に、ヒスチジンタグを有する複数の蛋白質もしくはペプチドがＮＴＡ−Ｎｉキレートによって固定されていることを特徴とするアレイ。
１０．基板として上記９記載のアレイを使用することを特徴とする上記１〜５のいずれかに記載の相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明は複数の蛋白質もしくはペプチドの相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを同時にもしくは逐次的に測定する方法と、測定に用いられる基板について開示している。
【００１３】
蛋白質もしくはペプチドの活性・機能を測定する方法として、蛋白質もしくはペプチドを基板上に固定化して、測定対象物質を含むサンプルとの相互作用を解析する方法が考えられている。特に結合や解離、反応などの速度を求めるＫｉｎｅｔｉｃｓ測定の重要性が最近ますます上がっている。
【００１４】
表面に固定化する方法として活性・機能が失われ難い方法であれば、特に限定するものではない。古典的にはアミンカップリング法などが挙げられるが、表面固定化により活性・機能が失われる場合がある。最近注目されている方法は蛋白質やペプチドにタグとなるアミノ酸配列あるいはペプチド・蛋白を導入し、タグを介して表面に固定化するものである。タグは発現した蛋白質を精製する手段として最近よく使われている。本発明では、タグを介して基板表面に固定することが好ましい。
【００１５】
タグとしてはヒスチジンタグや、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＴＡＰなどが挙げられるが、中でもヒスチジンタグは容易に蛋白質やペプチドに導入できるだけでなく、活性を保ったまま強固に固定化できる利点があり本発明の目的には好ましい。
【００１６】
ヒスチジンタグは蛋白質もしくはペプチド配列のＮ末端もしくはＣ末端に導入され、他のタグと合わせて導入されることもある。通常のヒスチジンタグはヒスチジンが６つ並んだ配列であり、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基−ニッケルとキレート結合する。
【００１７】
結合や解離などの速度を求めるＫｉｎｅｔｉｃｓ測定を行う手段としては、基板に固定化された蛋白質もしくはペプチドとサンプル中の生体分子もしくは生物分子集合体との結合・解離がリアルタイムで測定できうるものならば特に限定されるものではないが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）がリアルタイムかつラベルフリーで測定できるため好ましく、平面の反射像を撮影できるＳＰＲイメージング法がアレイ状に複数の蛋白もしくはペプチド固定化したチップを解析できるため、特に好ましい。
【００１８】
以下、ＳＰＲイメージング法による測定方法を例として挙げる。
ＳＰＲは光学的な検出方法であるため、測定に用いる基板は透明である必要がある。
また、表面プラズモン共鳴を励起するために、透明基板の片面には金属薄膜が形成されている。この金属薄膜は金であることが好ましい。金薄膜はＳＰＲ測定に適しているだけでなく、チオール化合物もしくはジスルフィド化合物が金−硫黄結合を利用して金（１，１，１）面に固定化可能である。金薄膜は蒸着によってクロムを１ｎｍ、金を４５ｎｍ積層させたものが表面厚みのムラがなく、金薄膜が剥がれ落ちにくいため好ましい。
【００１９】
ＮＴＡ基を導入する方法はＮＴＡ基を有するチオール化合物もしくはジスルフィド化合物をエタノールに溶解し、金表面を浸漬し、チオール化合物もしくはジスルフィド化合物の自己組織化表面を形成させる方法が好ましい。ＮＴＡ基は立体的に大きく、立体障害があるため、ＮＴＡ基を有するチオール化合物もしくはジスルフィド化合物とＮＴＡ基を有さないチオール化合物もしくはジスルフィド化合物を混合してエタノールに溶解し、金表面に結合させる方法が特に好ましい。ＮＴＡ基を有さないチオール化合物もしくはジスルフィド化合物としては、サンプル中に含まれる物質の非特異的吸着を抑制するため、非イオン性物質が好ましい。例えば、ＯＨ基を有するアルカンチオールやポリエチレングリコールを有するアルカンチオールなどが挙げられる。ただし、非イオン性アルカンチオールもしくは非イオン性ジスルフィドはＮＴＡ基を有するチオール化合物もしくはジスルフィド化合物とアルカン鎖の長さが同等にすることが好ましい。どちらかが長いと、長い方の化合物の疎水性ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ力が強く、両者が混じった自己組織化表面が得られない場合があるためである。
【００２０】
こうして得られた表面はＮＴＡ基以外のイオン性官能基を実質的に有さないため、正しいＫｉｎｅｔｉｃｓを得ることができる。もし、ＮＴＡ基以外のイオン性官能基を実質的に有するならば、サンプル中の測定対象のイオン的結合力あるいは反発力がＫｉｎｅｔｉｃｓに影響を与え、正しいデータが得られないことがある。なお、ここで言う実質的に有さない、有するとは、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ測定に深刻な影響を与える程度に有さないか有するか（目安として有効数字２桁）であり、絶対量として有するか有さないかで決定されるものではない。
【００２１】
また、ＮＴＡ基を有するチオール化合物もしくはジスルフィド化合物と非イオン性チオール化合物もしくはジスルフィド化合物を混合して表面に固定化することで、ＮＴＡ基を有するチオール化合物もしくはジスルフィド化合物が形成する自己組織化表面の欠陥部分を非イオン性物質が吸着してブロックするため、非特異的吸着を抑制することができる。
【００２２】
複数の蛋白質もしくはペプチドの相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを測定するために基板はアレイ状にするのが好ましい。全面にＮＴＡ基を導入し、複数の蛋白質もしくはペプチドをスポッティングする方法も可能であるが、蛋白が固定化されていないバックグラウンド部のＮＴＡ基へのイオン性非特異的吸着があるため好ましくない。そこで、ＮＴＡ基が導入されている領域が、ＮＴＡ基をほとんど含まない領域に囲まれているアレイが特に好ましい。アレイを作製する方法は特に限定されるものではないが、フォトリソグラフィー法やスタンプ法によって可能である。
【００２３】
本発明では複数の蛋白質もしくはペプチドの相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓを測定するため、基板にはＮＴＡ基が導入された領域を、不連続に９つ以上有するのが好ましい。多くの蛋白質もしくはペプチドを同時にもしくは逐次的にＫｉｎｅｔｉｃｓ測定できるからである。不連続な領域の数の上限は特に定めるものではないが、実用面からは２５００以下である。
【００２４】
こうして得られた基板に蛋白質もしくはペプチドを固定化し、この基板上に生体分子もしくは生物分子集合体を含有するサンプルとを同時にもしくは逐次的に接触させながら、ＳＰＲイメージング法よる観察を行う。この方法により、蛋白質もしくはペプチドが固定化された部位の反射光強度をリアルタイムで解析することにより、正確なＫｉｎｅｔｉｃｓを評価することができる。
【００２５】
基板上に生体分子もしくは生物分子集合体を含有するサンプルとを同時にもしくは逐次的に接触させる方法としては、基板にサンプル液が接触できる状態であればその接触方法を特に限定するものではないが、ＳＰＲイメージング法よる観察の容易さから考慮すると、基板上にサンプル液が流れ込む流路を備えたフローセルを用い、洗浄用緩衝液、各種サンプルなどの接触液を切り替え、その変化をリアルタイムで観察できるようにしたものが好ましい。
【００２６】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２７】
［実施例］
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム１ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，  Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量２０００のスクシンイミド基末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ，Ｓｈｅａｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させ、ＰＥＧを表面に固定化した。水晶上にクロムでパターンを描いたフォトマスクを基板上に置き、Ｏｒｉｅｌ社製１０００Ｗキセノンアークランプにて一時間照射してパターン化を行った。フォトマスクのパターンは５００μｍ×５００μｍの四角形が１００個並んだものである。照射後、ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、４７５μＭ  Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（同仁化学研究所製）、２５μＭ  メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）のエタノール溶液に５時間浸漬し、光を照射した部分にＤｉｔｈｉｏｂｉｓとメルカプトエタノールを混合して固定化した。Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓは両末端にＮＴＡ基を有するジスルフィドであり、構造式を図１に示す。こうして得られたバイオチップは固定化部位にＮＴＡ基を有し、バックグラウンドは親水性高分子であるポリエチレングリコールが固定化されている。
【００２８】
このバイオチップを２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）のリン酸緩衝液溶液に一時間浸漬し、ＮＴＡ−Ｎｉキレートを形成させたのち、Ｍｙｃペプチドを導入したヒスチジン付き蛋白（ＨｉｓＴＡＰＭｙｃ）とＦｌａｇペプチドを導入したヒスチジン付き蛋白（ＨｉｓＴＡＰＦｌａｇ）を発現させた大腸菌細胞破砕液を１００倍に希釈して固定化部位に０．１μＬずつスポッティングした。ここで用いた蛋白はＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９９，１７，１０３０−１０３２に記載されたＴＡＰであり、ＴＡＰにヒスチジンタグとＭｙｃもしくはＦｌａｇペプチドを導入した。ＨｉｓＴＡＰＭｙｃとＨｉｓＴＡＰＦｌａｇを図２に示すパターンでスポッティングし、３０分後ＳＰＲイメージング機器（ＳＰＲＩｍａｇｅｒ：ＧＷＣ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットした。観察は図９に概略を示したフローセルにセットし、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の緩衝液中で実施した。０．１μｇ／ｍｌの抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を先にフローセル内に流し、緩衝液を流したあと、０．１μｇ／ｍｌの抗Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を流した。緩衝液、サンプルの流速は１００μｌ／ｍｉｎで観察を実施した。図３にＨｉｓＴＡＰＭｙｃを固定化した部位のシグナル変化を示す。抗Ｆｌａｇ抗体によるシグナルの増加はみられず、抗Ｍｙｃ抗体によってのみシグナルが増加している。すなわち、非特異的吸着がないことを示しており、非常に良好である。この場合におけるＨｉｓＴＡＰＭｙｃに対する抗Ｍｙｃ抗体、ＨｉｓＴＡＰＦｌａｇに対する抗Ｆｌａｇ抗体のアフィニティカーブを重ね合わせた図を図４に示す。このカーブから得られるＫｉｎｅｔｉｃｓデータを表１に示す。この結果からＦｌａｇの方が５倍速く吸着し、２倍速く脱離するＫｉｎｅｔｉｃｓ挙動が明らかにできた。
また、抗Ｆｌａｇ抗体を流す前後の写真を撮影し、前後の画像の差をとった結果を図５に示す。抗Ｆｌａｇ抗体がＦｌａｇペプチドに選択的に結合しているのを観察することができた。
【００２９】
［比較例１］
実施例と同様に、金蒸着透明基板上に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させＰＥＧを固定化し、フォトマスクを用いて紫外線照射によるパターン化を行った。パターン化基板を５００μＭ  Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓのエタノール溶液に５時間浸漬し、光を照射した部分にＤｉｔｈｉｏｂｉｓを固定化した。このチップを２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）のリン酸緩衝液溶液に一時間浸漬したのち、ＨｉｓＴＡＰＭｙｃとＨｉｓＴＡＰＦｌａｇを発現させた大腸菌細胞破砕液を１００倍に希釈して固定化部位に０．１μＬずつスポッティングし、ＳＰＲイメージング機器にセットした。０．１μｇ／ｍｌの抗Ｆｌａｇ抗体を先にフローセル内に流し、緩衝液を流したあと、０．１μｇ／ｍｌの抗Ｍｙｃ抗体を流した。その場合のＨｉｓＴＡＰＭｙｃを固定化した部分のシグナル変化を図６に示す。Ｍｙｃの固定化部位に対して抗Ｆｌａｇ抗体が非特異的に吸着する傾向がみられた。この表面では正しいＫｉｎｅｔｉｃｓデータは観察できない。
この理由としてＤｉｔｈｉｏｂｉｓ単独では自己組織化表面に欠陥があり、金が露出している部分に抗Ｆｌａｇ抗体が吸着していることが考えられる。実施例ではメルカプトエタノールと混合して固定化しており、Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓの欠陥部分をメルカプトエタノールが埋め、非特異的吸着を抑制していると推察される。
【００３０】
［比較例２］
実施例と同様に、金蒸着透明基板上に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させＰＥＧを固定化し、フォトマスクを用いて紫外線照射によるパターン化を行った。パターン化基板を７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ（７−ＣＨＴ、同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に５時間浸漬し、光を照射した部分に７−ＣＨＴの自己組織化表面を形成させた。次に０．２Ｍ水溶性カルボジイミド（ナカライテスク社製）、０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）をリン酸緩衝液に溶解させ、１５分間反応させ、７−ＣＨＴのカルボキシル基を活性化させた。すぐに１ｍＭのＡＢ−ＮＴＡ（同仁化学研究所製）を３０分反応させ、ＮＴＡ基を固定化部位に導入した。未反応のスクシンイミド基は１Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ８．５）を１０分間反応させブロッキングした。
【００３１】
このチップを２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）のリン酸緩衝液溶液に一時間浸漬したのち、ＨｉｓＴＡＰＭｙｃとＨｉｓＴＡＰＦｌａｇを発現させた大腸菌細胞破砕液を１００倍に希釈して固定化部位に０．１μＬずつスポッティングし、ＳＰＲイメージング機器にセットした。０．１μｇ／ｍｌの抗Ｆｌａｇ抗体を先にフローセル内に流し、緩衝液を流したあと、０．１μｇ／ｍｌの抗Ｍｙｃ抗体を流した。その場合のＨｉｓＴＡＰＭｙｃを固定化した部分のシグナル変化を図７に示す。Ｍｙｃの固定化部位に対して抗Ｆｌａｇ抗体が少しだけ非特異的に吸着する傾向がみられた。比較例１よりは良好であるものの、実施例に比べると劣る。この場合におけるＨｉｓＴＡＰＭｙｃに対する抗Ｍｙｃ抗体、ＨｉｓＴＡＰＦｌａｇに対する抗Ｆｌａｇ抗体のアフィニティカーブを重ね合わせた図を図８に示す。この結果ではＫｉｎｅｔｉｃｓ挙動の差を明確にすることができなかった。
この理由として、ＡＢ−ＮＴＡを固定化する土台となる７−ＣＨＴが陰性荷電を有していることが挙げられる。７−ＣＨＴが有するカルボキシル基はすべてＡＢ−ＮＴＡと反応するわけではなく、高密度にカルボキシル基が残っていると考えられる。残ったカルボキシル基とサンプル中の物質がイオン的な相互作用をもつために、Ｋｉｎｅｔｉｃｓデータに影響を与えていると推察できる。実施例の場合、ＮＴＡ基は直接金表面に固定化されるため、イオン的作用がＫｉｎｅｔｉｃｓに与える影響は小さい。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
【発明の効果】
本発明により、蛋白質もしくはペプチドを活性・機能を保ったまま表面に固定化し、サンプルに含まれる生体分子もしくは生物分子集合体との相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの評価を可能にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓの構造式
【図２】ＨｉｓＴＡＰＭｙｃとＨｉｓＴＡＰＦｌａｇを固定化したパターン
【図３】ＨｉｓＴＡＰＭｙｃを固定化した部位のシグナル変化（実施例）
【図４】抗Ｍｙｃ抗体、抗Ｆｌａｇ抗体のアフィニティカーブ（実施例）
【図５】抗Ｆｌａｇ抗体を流す前後の像の差
【図６】ＨｉｓＴＡＰＭｙｃを固定化した部位のシグナル変化（比較例１）
【図７】ＨｉｓＴＡＰＭｙｃを固定化した部位のシグナル変化（比較例２）
【図８】抗Ｍｙｃ抗体、抗Ｆｌａｇ抗体のアフィニティカーブ（比較例２）
【図９】実施例で用いたフローセルの概略図（断面）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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