(57)【要約】【課題】アルカリ性条件、具体的には、例えば、ｐＨ８〜１１の条件下で、高濃度のフェルラ酸の存在下に、バニリンへの変換を行なうこと、高収量でバニリンを生産すること、バニリンの生産時における工程及びコストを低減させること等を可能にしうる、バニリンの製造方法を提供すること。【解決手段】フェルラ酸を資化する性質を有する好アルカリ性菌を用いて、フェルラ酸をバニリンに変換することを特徴とする、バニリンの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸を資化する性質を有する好アルカリ性菌を用いて、フェルラ酸をバニリンに変換することを特徴とする、バニリンの製造方法。
【請求項２】
（Ａ）フェルラ酸と、好アルカリ性菌とを接触させ、それにより、該フェルラ酸からバニリンに変換させた産物を得る工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた産物に含まれるバニリンと未反応のフェルラ酸とを、下記工程（Ｂ’）又は（Ｂ”）：
（Ｂ’）  水溶液又は有機溶媒に対するバニリンの溶解度と、水溶液又は有機溶媒に対するフェルラ酸の溶解度との差に基づき、該水溶液又は有機溶媒中にフェルラ酸又はバニリンを析出させ、該フェルラ酸とバニリンとを分離すること、又は
（Ｂ”）  カラムクロマトグラフィーにより、バニリンを分画すること
により、バニリンを回収する工程
を含む、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項３】
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で残った未反応のフェルラ酸を回収する工程をさらに含み、ここで、得られたフェルラ酸は、再度工程（Ａ）で用いられる、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
ｐＨ８〜１１の条件下、フェルラ酸と、好アルカリ性菌とを接触させる、請求項２又は３記載の製造方法。
【請求項５】
フェルラ酸と、好アルカリ性菌との接触時における反応系中の該フェルラ酸の初期濃度が、少なくとも１ｇ／Ｌである、請求項２〜４いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
フェルラ酸を、回分的に好アルカリ性菌と接触させる、請求項２〜５いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
フェルラ酸を、連続的に好アルカリ性菌と接触させる、請求項２〜５いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
好アルカリ性菌が、菌体ろ過膜、又は固定化担体に保持されたものである、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
好アルカリ性菌が、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物又はその変異株である、請求項１〜８いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物が、下記微生物学的性質：
2004267131.tif 000007
2004267131.tif 000008
を有するマイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株である、請求項１〜９いずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、好アルカリ性菌を用いて、フェルラ酸からバニリンに変換する、バニリンの製造方法に関する。より詳細には、アルカリ性条件下に、効率よく、フェルラ酸からバニリンを生産するバニリンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バニリンは、バニラビーンズに含まれ、いわゆるバニラ香を呈する化合物であり、食品、化粧品等に頻用されている重要な香料の１つである。
【０００３】
現在、前記バニリンは、化学合成法又は生物学的方法により得られている。前記化学合成法としては、例えば、オイゲノールを出発物質とし、イソオイゲノールを産生し、これを酸化してバニリンを得る方法（非特許文献１）、グアヤコールを出発物質とし、グリオキシル酸を産生し、これを酸化してバニリンを得る方法（非特許文献１）、サフロールを出発物質とし、該サフロールのメチレンジオキシ環を開環させ、メチル化し、水酸基を導入し、アルデヒド基を導入することにより、バニリンを得る方法（非特許文献１）、コニフェニルアルコールを出発物質とし、酸化して、バニリンを得る方法、パルプ廃液中のリグノバニリンを出発物質とし、酸化して、バニリンを得る方法（非特許文献１）、米サラダ油廃液中のγ−オリザノールを出発物質とし、該γ−オリザノールをアルカリ加水分解し、酸化してバニリンを得る方法（特許文献１）等が挙げられる。しかしながら、前記化学合成法によれば、副生成物が産生されるため、該副生成物の除去が困難であり、産物に他のにおいが混ざる場合があり、合成収率が低下し、製造工程が複雑であるという欠点がある。
【０００４】
前記生物学的方法は、前記化学合成法の欠点である、副生成物の産生を低減し、製造工程を簡便化することができる。前記生物学的方法としては、ピクノポラス・シンナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）を用いて、ｐＨ２．５〜６．５の条件下、フェルラ酸からバニリンに変換する方法（特許文献２）、シュードノカルディア・アミコラトシス  スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  ）を用いて、１５ｇ／Ｌを超えないような量のフェルラ酸からバニリンに変換する方法（特許文献３）、バニリン前駆体の水性溶液を含む微生物変換混合物を、メルカプト化合物および同化可能な炭素源の存在下に、ｐＨ約３〜約７の条件下に、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、アスペルギルス・ナイジャー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ロードトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）等のフェルラ酸分解微生物と接触させ、初期濃度約０．０２５〜１．０％のバニリン前駆体からバニリンに変換する方法（特許文献４）等が挙げられる。
【０００５】
しかしながら、これらの生物学的方法においては、バニリンの製造時に、フェルラ酸を原料として用いた場合、フェルラ酸は中性付近では溶解度が非常に低いため、高濃度での仕込みが困難であり、フェルラ酸を原料とするバニリンの生合成における生産効率が低下するという欠点がある。すなわち、前記生物学的方法は、ランニングコストが高く、バニリンの収率が低く、生産効率が悪いという欠点がある。
【０００６】
【特許文献１】
特許第２００４８４０号公報
【特許文献２】
特開平７−８７９８７号公報
【特許文献３】
特開平９−２０６０６８号公報
【特許文献４】
特開平５−２４４６９５号公報
【非特許文献１】
「化粧品原料基準」第２版注解  １９８４年発行  薬事日報社  『バニリン』の項
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルカリ性条件、具体的には、例えば、ｐＨ８〜１１の条件下で、高濃度のフェルラ酸の存在下に、バニリンへの変換を行なうこと、高収量でバニリンを生産すること、バニリンの生産時における工程及びコストを低減させること等を可能にしうる、バニリンの製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、フェルラ酸を資化する性質を有する好アルカリ性菌を用いて、フェルラ酸をバニリンに変換することを特徴とする、バニリンの製造方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、アルカリ条件下に、フェルラ酸を炭素源として生育しうる好アルカリ性菌が存在し、かかる好アルカリ性菌より、バニリンを効率よく、かつ高収率で得ることができるという本発明者らの知見に基づく。したがって、本発明者らの知見により、高濃度のフェルラ酸の存在下、アルカリ性条件、具体的には、例えば、ｐＨ８〜１１の条件下に、効率よくバニリンに変換でき、低コストで、高収量でバニリンを生産することが可能なバニリンの製造方法が提供される。
【００１０】
本発明の製造方法は、フェルラ酸を資化する性質を有する好アルカリ性菌を用いて、フェルラ酸をバニリンに変換することを１つの大きな特徴とする。
【００１１】
前記フェルラ酸は、中性付近では溶解度が低く、アルカリ性条件下では非常に溶解しやすいという性質を有している。したがって、本発明の製造方法には、好アルカリ性菌が用いられるため、本発明の製造方法によれば、高濃度のフェルラ酸の存在下に、バニリンへの変換を行なうことができるという優れた効果を発揮する。
【００１２】
前記フェルラ酸は、米糠中にγ−オリザノールとして豊富に存在しており、バニリンと類似の構造を有する桂皮酸誘導体３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）    ２−プロペン酸である。本発明の製造方法に用いられるフェルラ酸は、供給源等に特に限定されるものではなく、米、小麦、大麦、トマト、アスパラガス等の種々の植物、ブタ等の動物等に含まれた天然物質であってもよく、化学的に合成された物質であってもよい。前記フェルラ酸は、例えば、特公平０６−１０４６４２号公報に記載のように、米サラダ油を製造する際の廃棄物（米糠ピッチ）をアルカリ性条件下に、加水分解することにより得られる。環境保全の観点から、好ましくは、米糠ピッチから抽出したフェルラ酸を用いることが望ましい。
【００１３】
本発明の製造方法としては、具体的には、
（Ａ）フェルラ酸と、好アルカリ性菌とを接触させ、それにより、該フェルラ酸からバニリンに変換させた変換産物を得る工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた産物に含まれるバニリンと未反応のフェルラ酸とを、下記工程Ｂ’）又はＢ”）：
Ｂ’）  水溶液又は有機溶媒に対するバニリンの溶解度と、水溶液又は有機溶媒に対するフェルラ酸の溶解度との差に基づき、該水溶液又は有機溶媒中にフェルラ酸又はバニリンを析出させ、該フェルラ酸とバニリンとを分離すること、又は
Ｂ”）  カラムクロマトグラフィーにより、バニリンを分画すること
により、バニリンを回収する工程
を含む方法が挙げられる。
【００１４】
前記工程（Ａ）は、例えば、反応槽等の内部で行なわれうる。
【００１５】
前記工程（Ａ）において、フェルラ酸は、アルカリ性溶液又は培養基に高濃度になるように溶解させる。
【００１６】
前記工程（Ａ）において、フェルラ酸と、好アルカリ性菌との接触の際のｐＨ条件は、好アルカリ性菌の生育を良好にし、フェルラ酸の溶解度を向上させ、バニリンの生産量を向上させる観点から、ｐＨ８以上であり、ｐＨ８．８〜ｐＨ１１．０であることが好ましく、ｐＨ９．０〜１１．０であることがより好ましくは、ｐＨ９．０１〜ｐＨ１１．０であることがさらに好ましく、ｐＨ９．５〜ｐＨ１０．５であることがよりさらに好ましく、ｐＨ１０．０であることが特に好ましい。
【００１７】
前記アルカリ性溶液とは、ｐＨ８以上の溶液をいい、好ましくはｐＨ８．８〜ｐＨ１１．０、より好ましくは、ｐＨ９．０〜ｐＨ１１．０、さらに好ましくは、ｐＨ９．０１〜ｐＨ１１．０、よりさらに好ましくは、ｐＨ１０前後、特に、ｐＨ１０．０である溶液であればよい。前記アルカリ性溶液としては、例えば、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、グリシン−水酸化ナトリウム水溶液、トリス−塩酸水溶液等が挙げられ、アルカリ性条件下での緩衝能の観点から、好ましくは、炭酸ナトリウム水溶液である。
【００１８】
前記培養基の基本成分としては、例えば、アルカリ性基本培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ、炭酸ナトリウムでｐＨ１０．０に調整〕等が挙げられる。なお、前記アルカリ性基本培地において、エネルギー供給源、例えば、炭素源として、フェルラ酸、グルコース、グルコン酸、フェルラ酸からバニリンへの生合成の過程におけるバニリン前駆体化合物等を用いることができる。
【００１９】
本発明の製造方法においては、好アルカリ性菌を用いるため、フェルラ酸をより高濃度で溶解させ、用いることができる。そのため、フェルラ酸と、好アルカリ性菌との接触時における反応系中の該フェルラ酸の初期濃度は、任意に設定することができ、例えば、少なくとも１ｇ／Ｌ、好ましくは、少なくとも１０ｇ／Ｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも３０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは、少なくとも３５ｇ／Ｌ、少なくとも４０ｇ／Ｌであり、フェルラ酸を含有したアルカリ性溶液又は培養基の調製の容易性、好アルカリ性菌との接触の効率性等の観点から、４０ｇ／Ｌまでであることが望ましい。また、前記「高濃度」は、酸性〜中性条件では、溶解させることができないフェルラ酸の量であればよい。
【００２０】
また、前記工程（Ａ）において、接触の際の温度、具体的には、前記アルカリ性溶液又は培養基の温度は、前記好アルカリ性菌の良好な生育を得る観点から、２４℃〜３４℃、特に好ましくは、２８℃に維持することが望ましい。
【００２１】
また、細菌は、自然に増殖と死亡を繰り返すため、例えば、反応槽から流出しない限り利用することができる。したがって、前記好アルカリ性菌を反応槽から流出させずに該反応槽中保持させるため、休止菌体を用いる場合は、菌体ろ過膜、又は固定化担体に保持させることが望ましい。また、増殖菌体を用いる場合は、反応液と共に菌体を排出し、反応槽内の菌体濃度を一定に保てばよい。この場合には、菌体ろ過膜を用いてもよく、用いなくてもよい。
【００２２】
なお、前記「休止菌体」とは、酵素活性を維持した状態で細胞分裂を停止した状態にあるものをいう。また、前記「増殖菌体」とは、反応槽中で細胞分裂を繰り返す状態にあるものをいう。
【００２３】
前記菌体ろ過膜としては、限外ろ過膜等の菌体保持が可能な親水性の膜であればよく、なかでも、菌体を保持し、かつフェルラ酸からバニリンへの変換産物の回収を良好に行なう観点から、好ましくは、限外ろ過膜である。
【００２４】
また、前記固定化担体としては、例えば、ポリアクリルアミドゲル、コロジオン膜等が挙げられ、なかでも、菌体を保持し、かつフェルラ酸からバニリンへの変換産物の回収を良好に行なう観点から、好ましくは、ポリアクリルアミドゲルである。
【００２５】
前記工程（Ａ）においては、フェルラ酸を、▲１▼  回分的に好アルカリ性菌と接触させてもよく、▲２▼  連続的に好アルカリ性菌と接触させてもよい。前記▲１▼の場合、初期菌体量を任意に設定でき、特別な装置でなくても実施できるという利点がある。また、前記▲２▼の場合、一定濃度の生産物を長期にわたり連続的に得られるという利点がある。
【００２６】
前記▲１▼の場合、例えば、反応終了（バニリン濃度が最大になったとき）後、増殖菌体をバニリン及び未反応フェルラ酸と共に反応系外に取り出し、分離操作の前に予め菌体を遠心分離等により除去しておく。
【００２７】
前記▲２▼の場合、例えば、フェルラ酸を含有した培地を、連続的に反応槽に供給し、反応槽に保持した好アルカリ性菌により、常温・常圧の下で通気しながら、バニリンに変換する。
【００２８】
本明細書において、「回分的」とは、反応槽内での反応終了後に、菌体を含む全反応液を回収し、各回毎にフェルラ酸を含有した培地と菌体とを更新して反応を行なわせる操作をいう。
【００２９】
また、本明細書において、「連続的」とは、回分法のように、反応槽中にフェルラ酸の供給もバニリン溶液等の排出も行わないものではなく、反応槽中にアルカリ性溶液および培地を供給しつつ、反応液を排出することを意味し、必ずしもフェルラ酸の供給が一瞬足りともとぎれないことを意図するものではない。
【００３０】
ついで、バニリンを回収する。
【００３１】
前記（Ａ）で得られた変換産物には、生成したバニリンのみでなく、生成したバニリンと未反応のフェルラ酸とが存在する場合がある。その場合、前記工程（Ａ）で得られた産物に含まれるバニリンと未反応のフェルラ酸とを、下記工程（Ｂ’）又は（Ｂ”）：
（Ｂ’）  水溶液又は有機溶媒に対するバニリンの溶解度と、水溶液又は有機溶媒に対するフェルラ酸の溶解度との差に基づき、該水溶液又は有機溶媒中にフェルラ酸又はバニリンを析出させ、該フェルラ酸とバニリンとを分離すること、又は
（Ｂ”）  カラムクロマトグラフィーにより、バニリンを分画すること
により、バニリンを回収する〔工程（Ｂ）という〕。
【００３２】
前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ｂ’）により、前記変換産物からバニリンを回収する場合、以下の（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）反応溶液を反応槽から取り出して、中性から酸性に調整することにより、析出してくるフェルラ酸を除去すること、又は
（ｂ）酢酸エチルやエタノールのような有機溶媒、あるいは有機溶媒と水との混液に溶解して、その溶解度の違いにより、両化合物を分離すること
が望ましい。
【００３３】
また、前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ｂ”）により、前記変換産物からバニリンを回収する場合、前記変換産物からバニリンを回収するには、擬似移動層分離などの連続カラムクロマトグラフィー分離により、バニリンを回収することができる。なお、前記工程（Ａ）を連続的に行なう場合には、反応生産物の濃度を一定に保つ観点から、反応槽内の菌体の濃度のバランスが崩れないよう、反応槽内と取り出した溶液の菌体濃度が等しくなるよう採取することが望ましい。また、バニリンの分離を行なう前に、予め菌体を遠心分離等により菌体を除去しておくことが望ましい。
【００３４】
また、前記工程（Ｂ）においては、同時に未反応のフェルラ酸も分離されうる。資源の再利用という観点と、バニリンへの反応効率を向上させるという観点から、分離されたフェルラ酸は回収し、再びアルカリ性に調整して、供給濃度を調節した上で反応槽へ返送することが好ましい。すなわち、工程（Ｂ）の後、前記工程（Ｂ）で残った未反応のフェルラ酸を回収する〔工程（Ｃ）〕。ここで、得られたフェルラ酸は、再度、前記工程（Ａ）で用いられる。
【００３５】
本発明の製造方法に用いられる好アルカリ性菌は、フェルラ酸を資化する性質を有し、アルカリ性条件、具体的には、ｐＨ８．５〜１１．０、好ましくは、ｐＨ９．０〜１１．０、より好ましくは、ｐＨ９．５〜１０．５に生育する微生物であればよい。かかる微生物は、例えば、アルカリ性の土壌、温泉、河川水等から単離されうる。
【００３６】
本発明の製造方法に用いられる好アルカリ性菌としては、具体的には、前記マイクロコッカス属に属する微生物又はその変異株等が挙げられる。
【００３７】
本発明の製造方法に用いられるマイクロコッカス属に属する微生物としては、マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株又はその変異株等が挙げられる。かかるマイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株は、カビや担子菌等に比べ、生育速度が大きく、バニリンの生産速度を高めることができるという優れた効果を発揮する。
【００３８】
前記マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株は、アルカリ性泉により単離された好アルカリ性菌であるが、本発明の製造方法に用いられる微生物は、単離源により特に限定されるものでない。前記マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株は、下記微生物学的性質：
2004267131.tif 000002
2004267131.tif 000003
を有する。また、前記マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、マイクロコッカス・リリエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｌａｅ）、アルスロバクター・ニコチナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉｎａｅ）及びマイクロコッカス  ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）のそれぞれの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と、９６．１７％、９６．４３％及び９６．０２％と高い相同性を示す。
【００３９】
本発明の製造方法において、前記マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株は、下記一般式：
【００４０】
【化１】
2004267131.tif 000004
【００４１】
に示されるように、フェルラ酸を炭素源として利用する過程で、フェルラ酸からフェルロイル−ＣｏＡに変換し、バニリンを産生する。
【００４２】
前記マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株は、例えば、以下の手法に従って単離することができる。高いアルカリ性（ｐＨ９．８）を示す泉源であることが知られている山口県の俵山温泉から、試料をサンプリングする。ついで、試料を、０．２重量％  フェルラ酸を含有したアルカリ性基本培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ、炭酸ナトリウムでｐＨ１０．０に調整〕に懸濁し、２８℃で振盪培養する。振盪培養により、フェルラ酸を資化して生育する微生物について、フェルラ酸を炭素源として含有する前記アルカリ性基本培地を用いて集積培養する。ついで、集積した培養液を、０．２重量％  フェルラ酸を含有した寒天固体培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ、寒天  １５ｇ、炭酸ナトリウムでｐＨ１０．０に調整〕に塗布し、培養することにより、単一コロニーを形成させる。ついで、得られた菌から、グラム陽性の非運動性球菌であり、二連菌、四連菌、小塊状等を示すフラゾリドン抵抗性、黄色色素を産生し、グルコースの発酵性を示さず、硝酸還元能が陽性であることを指標として、マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株を得ることができる。また、得られた菌が、マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株であることは、前記微生物学的性質を調べることにより、確認できる。
【００４３】
なお、前記マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株は、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＴＡ１と命名・表示され、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター〔日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）〕に、寄託されている〔手続日（寄託申請書類発送日）：２００３年３月７日、寄託日：２００３年３月１０日、寄託番号未着〕。
【００４４】
本発明の製造方法には、前記マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株の他、アルカリ性条件下に生育可能であり、かつフェルラ酸からバニリンへの変換を行なうマイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株由来の変異株を用いることもできる。前記変異株は、慣用の突然変異誘発剤、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等でマイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株を処理し、ついで、０．２重量％  フェルラ酸を炭素源として含有した寒天固体培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ    ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ、寒天  １５ｇ、炭酸ナトリウムでｐＨ１０．０に調整〕に塗布し、培養することにより、生育してきた菌として得ることができる。
【００４５】
本発明の製造方法は、それぞれの工程を行なうに適した製造装置により、効率よく実施できる。かかる製造装置としては、例えば、
１）フェルラ酸を貯留するためのフェルラ酸貯留手段と、
２）好アルカリ性菌を内部に保持する反応手段と、
３）バニリンとフェルラ酸とを分離するための手段であり、かつバニリンを回収するための手段を有する分離手段と、
４）空気貯留手段と
を備えた装置であり、
ここで、前記フェルラ酸貯留手段と反応手段とが、フェルラ酸貯留手段から反応手段にフェルラ酸を供給するためのフェルラ酸移送経路を介して連結され、
前記反応手段と分離手段とが、該反応手段内で生じた反応混合物を分離手段に移送するための反応混合物移送経路を介して連結され、かつ該分離手段内で分離された未反応のフェルラ酸を反応手段に移送するための未反応フェルラ酸移送経路を介して連結され、
前記空気貯留手段と反応手段とが、空気貯留手段から反応手段に空気を供給するための空気供給経路を介して連結された製造装置（連続反応槽型の製造装置）等が挙げられる。
【００４６】
前記製造装置の一例として、連続反応槽型の製造装置の概略を図１に示し、かかる図に基づき、説明する。
【００４７】
反応槽５〔前記反応手段〕には、菌体保持膜４〔前記菌体ろ過膜〕により、好アルカリ性菌の休止菌体又は増殖菌体が一定濃度に保持されている。前記反応槽５〔前記反応手段〕には、フェルラ酸を流入させる系とバニリンを含有した反応混合物を回収する系とが備えられている。さらに、反応槽５〔前記反応手段〕には、エアコンプレッサー９から、エアフィルター８を介し、さらに水リザーバー７を介した空気供給経路が備えられている。
【００４８】
前記「フェルラ酸のアルカリ性溶液を流入させる系」は、フェルラ酸製造プラント１で得られたフェルラ酸を貯留する基質リザーバー２〔前記フェルラ酸貯留手段〕から、該反応槽５〔前記反応手段〕中へのフェルラ酸供給量又は該反応槽５〔前記反応手段〕中の液量を感知しうるレベルゲージ３の制御下に作動するモーター等が配設されたフェルラ酸移送経路を介して、前記反応槽５〔前記反応手段〕に連結された系である。また、前記「バニリンを含有した反応混合物を回収する系」は、反応槽５〔前記反応手段〕から、反応混合物をバニリン／フェルラ酸分離槽６〔分離手段〕に移送するための反応混合物移送経路を介して、該バニリン／フェルラ酸分離槽６〔分離手段〕に連結された系である。なお、前記バニリン／フェルラ酸分離槽６〔分離手段〕は、該バニリン／フェルラ酸分離槽６〔分離手段〕内で得られた未反応のフェルラ酸を反応手段に移送するための未反応フェルラ酸移送経路を介して、反応槽５〔前記反応手段〕に連結されている。
【００４９】
前記反応槽５〔前記反応手段〕には、前記基質リザーバー２〔前記フェルラ酸貯留手段〕から、例えば、フェルラ酸のアルカリ性溶液が供給され、前記菌体保持膜４〔前記菌体ろ過膜〕の上部に好アルカリ性菌の休止菌体又は増殖菌体により、該フェルラ酸が、バニリンに変換される。
【００５０】
ついで、前記反応槽５〔前記反応手段〕において、菌体保持膜４〔前記菌体ろ過膜〕の下部からは、反応混合物が、バニリン／フェルラ酸分離槽６〔分離手段〕に移送され、バニリンとフェルラ酸とに分離される。前記バニリン／フェルラ酸分離槽６〔分離手段〕においては、水溶液又は有機溶媒に対するバニリンの溶解度とフェルラ酸の溶解度との差に基づき、該水溶液又は有機溶媒中にフェルラ酸又はバニリンを析出させ、該フェルラ酸とバニリンとを分離する手段、又はカラムクロマトグラフィーが内設されている。
【００５１】
また、好アルカリ性菌の増殖菌体を用いる場合は、菌体保持膜４〔菌体ろ過膜〕を用いる必要はなく、菌体と共に反応混合物が回収される。
【００５２】
さらに、バニリン／フェルラ酸分離槽６〔分離手段〕で得られた未反応のフェルラ酸は、前記反応槽５〔前記反応手段〕に移送される。
【００５３】
前記製造装置は、本発明の製造方法に用いられるものであるため、前記反応槽５〔前記反応手段〕内、及び基質リザーバー２〔前記フェルラ酸貯留手段〕内は、アルカリ性条件下に維持される。
【００５４】
【実施例】
以下に、本発明を、実施例等により詳細に説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００５５】
実施例１
土壌、河川水等をスクリーニング用の試料としてサンプリングし、得られた土壌試料又は河川水を、０．２重量％  フェルラ酸を炭素源として含有する各種培地に添加し、種々の条件で培養した。それにより、フェルラ酸を炭素源として資化し、生育する菌をスクリーニングした。
【００５６】
その結果、高いアルカリ性（ｐＨ９．８）を示す泉源であることが知られている山口県の俵山温泉からサンプリングされた試料において、０．２重量％  フェルラ酸を含有したアルカリ性基本培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ、炭酸ナトリウムでｐＨ１０．０に調整〕で、２８℃で振盪培養した場合、フェルラ酸を資化して生育する微生物が存在することが示された。
【００５７】
前記俵山温泉からサンプリングされた試料について、０．２重量％  フェルラ酸を含有した前記アルカリ性基本培地を用い、集積培養を繰り返した。集積した培養液を、０．２重量％  フェルラ酸を含有した寒天固体培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ、寒天  １５ｇ、炭酸ナトリウムでｐＨ１０．０に調整〕に塗布し、培養することにより、単一コロニーを形成させた。得られた数株の中から、最も生育が良好であった株をＴＡ１株として得た。
【００５８】
ついで、得られたＴＡ１株について、種々の微生物学的性質を検討した。その結果、ＴＡ１株は、
2004267131.tif 000005
2004267131.tif 000006
等の微生物学的性質を示した。
【００５９】
また、ＴＡ１株は、グラム陽性の非運動性球菌であり、二連菌、四連菌、小塊状等を示すフラゾリドン抵抗性の菌群であるため、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌であることが推定された。
【００６０】
また、ＴＡ１株は、黄色色素を産生し、グルコースの発酵性を示さないため、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓであることも考えられた。
【００６１】
しかしながら、ＴＡ１株は、酵素活性、糖の発酵性などで極めて低い活性を示し、硝酸還元能が陽性であることが特徴的である。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓは、硝酸還元能が陰性であるため、この点で、ＴＡ１株が属する菌群を特定することができなかった。
【００６２】
さらに、ＴＡ１株について、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づき、菌株の同定も行なった。
【００６３】
その結果、ＴＡ１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、マイクロコッカス・リリエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｌａｅ）、アルスロバクター・ニコチナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉｎａｅ）及びマイクロコッカス  ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）のそれぞれの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と高い相同性を示した。具体的には、前記ＴＡ１株とマイクロコッカス・リリエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｌａｅ）との間で、９６．１７％、前記ＴＡ１株とアルスロバクター・ニコチナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉｎａｅ）の間で、９６．４３％、前記ＴＡ１株とマイクロコッカス  ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）との間で、９６．０２％であった。
【００６４】
しかしながら、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）は、桿菌−球菌の生活環を示すため、ＴＡ１株とは異なるものであると考えられ、また、マイクロコッカス・リリエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｌａｅ）は、色素非生産性であるため、ＴＡ１株とは異なるものであると考えられた。
【００６５】
したがって、以上の点から、前記ＴＡ１株は、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する新規菌株であることが考えられた。そこで、前記ＴＡ１株を、マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．  ＴＡ１）と命名した。
【００６６】
実施例２
マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株について、フェルラ酸を炭素源とした菌体増殖に対する初期培養ｐＨの影響を調べた。
【００６７】
マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株を、０．２重量％  フェルラ酸を含有したアルカリ性基本培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ、炭酸ナトリウムでｐＨ１０．０に調整〕  ０．１Ｌ中、２８℃で、４８時間、振盪培養した。得られた培養物を、以下の操作における種菌（３×１０１０細胞相当量）として用いた。
【００６８】
また、０．２重量％  フェルラ酸を含有したアルカリ性基本培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ〕に、１０重量％  炭酸ナトリウム水溶液を添加して、中性からアルカリ性までの種々のｐＨの培地を調製した。
【００６９】
得られた各培地（０．１Ｌ）に、前記種菌を接種し、２８℃で振盪培養し、培地のｐＨの変動、培養液中の菌体量及びフェルラ酸濃度の減少について、タイムコースを測定した。なお、培養液中の菌体量は、ＯＤ６１０  における吸光度（濁度）を測定することにより評価した。また、フェルラ酸濃度は、高速液体クロマトグラフィーで測定した。結果を図２に示す。
【００７０】
図２に示すように、培地の初期ｐＨが、ｐＨ８．５の場合及びｐＨ１０．０の場合、初期ｐＨが中性（ｐＨ７．０）である場合と比較して、培地中のフェルラ酸濃度の減少が速く、マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株によるフェルラ酸の利用率が高いことがわかる。また、増殖は、培地の初期ｐＨが、ｐＨ８．５及びｐＨ１０の場合、初期ｐＨが中性（ｐＨ７．０）の場合と比較して、顕著に早いことがわかる。
【００７１】
したがって、マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株は、アルカリ性条件下において、フェルラ酸を効率よく利用し、かつ生育が良好であることがわかる。
【００７２】
実施例３
フェルラ酸を培養基として用い、フェルラ酸からのバニリン生産に対する初期フェルラ酸濃度の影響を調べた。
【００７３】
マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株を、０．２重量％  フェルラ酸を含有したアルカリ性基本培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ、炭酸ナトリウムでｐＨ１０．０に調整〕  ０．１Ｌ中、２８℃で、４８時間、振盪培養した。得られた培養物を、以下の操作における種菌（３×１０１０細胞相当量）として用いた。
【００７４】
前記アルカリ性基本培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ〕に、１２ｇ／Ｌとなるようにフェルラ酸を添加して、溶解させ、炭酸ナトリウム水溶液を添加することにより、ｐＨ１０．０の培地（０．１Ｌ）を作製した。
【００７５】
得られた培地に、種菌を添加し、２８℃で振盪培養し、培地中の菌体量、フェルラ酸濃度及びバニリン濃度を測定した。なお、培養液中の菌体量は、ＯＤ６１０  における吸光度を測定することにより評価した。また、フェルラ酸濃度は、高速液体クロマトグラフィーで測定した。バニリン濃度は、高速液体クロマトグラフィーで測定した。
【００７６】
その結果、図３に示されるように、従来行なわれていた中性ｐＨでの微生物変換の場合に比べて、フェルラ酸濃度を高濃度（１２ｇ／Ｌ）で添加したときは、培養開始後２０時間を経過しても、バニリン濃度が極大値とはならずに増加し続け、１００時間を超えた時点で、バニリンが、最大収率で得られることがわかる。
【００７７】
また、フェルラ酸濃度が、低濃度（２ｇ／Ｌ）である場合に比べ、フェルラ酸濃度が、高濃度（１２ｇ／Ｌ）である場合、バニリン生産量がより多くなった。
【００７８】
したがって、マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株を用いたフェルラ酸からのバニリンの製造によれば、基質となるフェルラ酸の添加量を増やすことにより、より増産することができることがわかる。
【００７９】
実施例４
前記実施例３におけるフェルラ酸からのバニリンの製造において、グルコースを添加することにより、該グルコースが、バニリンの製造に及ぼす影響を検討した。
【００８０】
マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株を、０．２重量％  フェルラ酸を含有したアルカリ性基本培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ、炭酸ナトリウムでｐＨ１０．０に調整〕  ０．１Ｌ中、２８℃で、４８時間、振盪培養した。得られた培養物を、以下の操作における種菌（３×１０１０細胞相当量）として用いた。
【００８１】
前記アルカリ性基本培地〔培地１リットル（Ｌ）あたりの組成：（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４      １．０ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４    １．０ｇ、ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３  ・６Ｈ２  Ｏ  ０．０２ｇ、酵母エキス  １．０ｇ〕に、フェルラ酸を、１２ｇ／  Ｌ、グルコースを４ｇ／Ｌとなるように添加し、溶解させ、炭酸ナトリウム水溶液を添加することにより、ｐＨ１０．０の培地（０．１Ｌ）を作製した。
【００８２】
得られた培地に、種菌を添加し、２８℃で振盪培養し、培地中の菌体量、フェルラ酸濃度及びバニリン濃度を測定した。なお、培養液中の菌体量は、ＯＤ６１０  における吸光度を測定することにより評価した。また、フェルラ酸濃度は、高速液体クロマトグラフィーで測定した。バニリン濃度は、高速液体クロマトグラフィーで測定した。
【００８３】
その結果、図４に示されるように、グルコース存在下では、グルコース非存在下に比べ、バニリン生産量が１０％程度上昇した。これは、グルコースの添加により、代謝過程におけるエネルギー的な問題点が補なわれていることによると考えられる。
【００８４】
【発明の効果】
本発明のバニリンの製造方法によれば、高濃度のフェルラ酸の存在下に、バニリンへの変換を行なうことができ、高収量でバニリンを生産し、バニリンの生産時における工程及びコストを低減させること等を可能にしうるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、連続反応槽型の製造装置の概略を示す図である。
【図２】図２は、マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株について、フェルラ酸を炭素源とした菌体増殖に対する初期培養ｐＨの影響を調べた結果を示す図である。図中、×印は、ｐＨ、白丸は、フェルラ酸濃度、白四角は、濁度を示す。
【図３】図３は、マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株について、フェルラ酸からのバニリン生産に対する初期フェルラ酸濃度の影響を調べた結果を示す図である。図中、黒四角は、バニリン濃度、白丸は、フェルラ酸濃度、黒四角は、濁度を示す。
【図４】図４は、マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株について、フェルラ酸からのバニリン生産に対するグルコースの影響を調べた結果を示す図である。図中、黒四角は、バニリン濃度、白丸は、フェルラ酸濃度、黒四角は、濁度を示す。
【符号の説明】
１  フェルラ酸製造プラント
２  基質リザーバー
３  レベルゲージ
４  菌体保持膜
５  反応槽
６  バニリン／フェルラ酸分離槽
７  水リザーバー
８  エアフィルター
９  エアコンプレッサー
【図１】
2004267131.tif 000009
【図２】
2004267131.tif 000010
【図３】
2004267131.tif 000011
【図４】
2004267131.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月14日(2003.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
なお、前記マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株は、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＴＡ１と命名・表示され、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター〔日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）〕に、寄託されている〔手続日（寄託申請書類発送日）：２００３年３月７日、寄託日：２００３年３月１０日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２４７〕。
【上申】
上記マイクロコッカス・スピーシーズ  ＴＡ１株（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＴＡ１）は、本願明細書の段落番号００３８に記載の性質により特定されており、かつ出願時に既に寄託手続していたものであることを上申いたします。
したがって、前記補正は、未着であった受託番号が付与されたことに伴い、受託番号を特定するものであり、何ら新規事項の追加に該当するものではありません。