(57)【要約】【課題】プレート上に固定された細胞集団に含まれる個数を簡便に算出する方法およびシステムを提供すること。【解決手段】細胞を分析する方法であって、（ａ）表面プラズモン共鳴イメージングを用いてプレート上に固定された細胞に起因する反射光強度を測定する工程；および（ｂ）該反射光強度から、該細胞に関するパラメータを算出する工程、を包含する、方法。本発明はまた、細胞のパラメータを算出するためのシステムであって、該システムは、（ａ）該細胞を固定するためのプレート；および（ｂ）該プレートを観察するための表面プラズモン共鳴イメージング装置、を備える、システムも提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を分析する方法であって、
（ａ）表面プラズモン共鳴イメージングを用いてプレート上に固定された細胞に起因する反射光強度を測定する工程；および
（ｂ）該反射光強度から、該細胞に関するパラメータを算出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記パラメータは、細胞数、細胞の接着面積または細胞の大きさである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｂ）工程は、細胞に関する既知の標準曲線を用いて前記反射光強度を評価することにより前記細胞に関するパラメータを算出することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞について標準曲線を作成する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｂ）工程は、表面プラズモン共鳴イメージング装置で測定される反射光強度から接着細胞数に換算することを包含する、請求項１に記載する方法。
【請求項６】
前記（ｂ）工程は、表面プラズモン共鳴イメージング装置で測定される反射光強度から細胞の形態に関する情報を得ることを包含する、請求項１に記載する方法。
【請求項７】
前記表面プラズモン共鳴イメージングは、可視から近赤外の領域の波長をもつ面光源を利用して金属薄膜上に表面プラズモン共鳴を作り出すことを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記反射光強度は、薄膜表面に接着した細胞と媒体との屈折率の相違にもとづく反射光強度の強弱をＣＣＤカメラでイメージとして捉えたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プレートは、マイクロアレイである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記プレートは、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に有するガラス基板を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プレート上には前記細胞と特異的に結合する因子が０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プレートは、生体分子を配列固定したマイクロアレイであり、該生体分子は、ＣＤ抗原、細胞接着因子、細胞増殖因子レセプター、サイトカインレセプターまたは糖鎖を認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は同種または異種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞は、各種臓器の正常細胞、疾患をもつ細胞のような分化細胞ならびにそれらの前駆細胞、胚性幹細胞、胎児由来幹細胞、未分化細胞、樹立系細胞または遺伝子の改変された細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞のパラメータを算出するためのシステムであって、該システムは、
（ａ）該細胞を固定するためのプレート；および
（ｂ）該プレートを観察するための表面プラズモン共鳴イメージング装置、
を備える、システム。
【請求項１６】
前記プレートは、マイクロアレイである、請求項１４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面プラズモン共鳴法を使用して、細胞のパラメータを精確に測定する方法およびシステムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
さまざまな生体分子と細胞との相互作用をもとに細胞の表現形質を調べたり、生体分子の投与によって惹起される細胞の変化を調べることは、細胞生物学の中心的課題である。一般には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養された細胞を利用し、生体分子を添加することでその影響が調べられる。
【０００３】
近年、コンビナトリアルケミストリーの進歩によって、生理活性をもつ低分子薬物およびペプチドの候補薬物が網羅的に合成されたり、ゲノムならびにタンパク質に関する膨大なデータベースが構築されつつある。これらの情報は、新たな薬物を見出したり、複雑な分子ネットワークを理解するために役立つと予想されるが、実際の機能および作用が未知である場合が多く、今後、実験的に明らかにされなければならない。ところが、上記のような従来の手法では、取り扱う実験系が大きくなるため、膨大な種類の分子についてそれらの一つ一つと細胞との相互作用を網羅的に分析するには不向きであった。
【０００４】
生体分子と細胞との相互作用を調べる上でもっとも基本的な操作は、相互作用する細胞の数を数えたり、相互作用の結果として増殖した細胞の数を測定することである。従来から、細胞の計数は顕微鏡下で直接行ったり、均一な細胞分散液を調製した後、血球計数板を用いて行われてきた。また、放射活性をもつ物質の取り込み量からＤＮＡ含量を求め、細胞数を見積もることも行われてきた。これらは、細胞のカウンティングに時間がかかったり、染料および放射性物質で標識を行う必要があるなど、時間と手間がかかる方法である。このような意味で、多くの検体について、その数に関する情報を一挙に測定するには不向きであり、また、生きたまま、形態などの他の情報を同時に検出することはできなかった。例えば、生体分子と相互作用する細胞の数を計測するための種々の方法は、多種類の検体を同時に、かつ迅速に測定することが困難である。細胞のカウントに時間がかかったり、染料および放射性物質で標識を行う必要があるなど、手間と時間のかかる点が大きな問題点である。本発明は、生体分子を固定したマイクロアレイ基板を利用することによって、基板表面と相互作用した細胞を、生きたまま、あるいは固定などの操作を行った後、計数したり、それらの形態に関する情報を得るための装置システムを提供するものであり、この目的のため、表面プラズモン共鳴現象を利用することを特徴とする。
【０００５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、金属表面に生じた表面プラズモン（弾性波）と、全反射した電磁波によって発生するエバネッセント波（光波）との間で起こる相互作用である。プラズモン波とエバネッセント波の波数と波動ベクトルが近似的に一致する条件を与える光の入射角θにおいて共鳴が起こり、エバネッセント波が表面プラズモンの励起に使われるため反射光強度が低下する。表面プラズモン共鳴を得るためには、高屈折率媒体からなるプリズムを図１（Ａ）のように配置し（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置）、レーザー光およびＬＥＤ光を入射する方法がとられる。ここで、プリズムとは反対側の金属表面に接触する媒体の誘電率の変化によって、プラズモン波の波数が変化する。すなわち、金属表面上に物質が接近することによって、表面プラズモン共鳴を与える光の入射角がシフトする。このことを利用して、金属表面の物質による被覆をセンシングすることが可能となる。この測定法は、表面鉛直方向の分解能に優れており（０．１ｎｍのオーダー）、表面に存在する物質量をｎｇ〜ｐｇ／ｃｍ２のオーダーでリアルタイムに観測することが可能である。また、水媒体中で測定できることもタンパク質のような生体分子の挙動を調べる上で大きな利点である。これを利用した測定装置が生体分子間相互作用測定装置として開発され、タンパク質およびＤＮＡなどの相互作用の分析に応用されている。
【０００６】
上述の表面プラズモン共鳴分析装置を用いて、多種類の相互作用を同時に検出する目的で、同装置を改良したイメージング装置が開発された（非特許文献１〜３）。そこでは、図１（Ｂ）に示すように、均一平行光を試料に入射し、全反射した光をＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）カメラを用いて２次元画像として捉え、試料表面における局所的な誘電率の変化を画像情報として取得するものである。しかし、従来は、細胞を測定対象とする試みは行われていたものの、細胞に関するパラメータを得ることはできなかった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｗ．Ｈｉｃｋｅｌ，Ｄ．Ｋａｍｐ，ａｎｄ  Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３９，１８６，１９８９
【０００８】
【非特許文献２】
Ｗ．Ｈｉｃｋｅｌ  ａｎｄ  Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，６７，３５７２，１９９０
【０００９】
【非特許文献３】
Ｂ．Ｐ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｔ．Ｅ．Ｇｒｉｍｓｒｕｄ，Ｍ．Ｒ．Ｌｉｌｅｓ，Ｒ．Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｃｏｒｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，１−７，２００１
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明では、プレート上に固定された細胞集団に含まれる個数を簡便に算出する方法およびシステムを提供することを課題とする。また、特に、マイクロアレイ基板ならびに表面プラズモン共鳴イメージング装置を組み合わせた分析システムを考案し、多くの生体分子−細胞間相互作用に関する情報を一挙に測定することもまた、課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明では、表面プラズモン共鳴イメージング装置を用いてマイクロアレイ基板表面と相互作用する細胞の多点同時計数を行ったり、それらの形態評価を行うことによって、屈折率の挙動と、細胞の個数のなどの個々の細胞のパラメータが予想外に１：１対応することを見出したことによって達成された。細胞の計測に当たっては、生きた細胞を培養しながらでも観察できるような装置の工夫、ならびに画像データの正確性を高めるための光学系の仕様設定を行うことで、本分析システムの汎用性および有用性を高めるという効果が達成された。
【００１２】
生体分子をミクロスポット状に固定したマイクロアレイを作製し、これを用いることによって細胞とさまざまな生体分子との間の相互作用を同時に行わせ、かつ相互作用の結果として起こる細胞の捕捉、接着、形態変化を表面プラズモン共鳴イメージング装置を用いて一挙に分析することができる。
【００１３】
本発明ではまた、このような表面プラズモン共鳴イメージングの原理を応用することによって、マイクロアレイ基板と相互作用した細胞の数および形態に関する情報などのパラメータを得ることを可能とする。
【００１４】
したがって、本発明は、以下を提供する。
【００１５】
（１）  細胞を分析する方法であって、
（ａ）表面プラズモン共鳴イメージングを用いてプレート上に固定された細胞に起因する反射光強度を測定する工程；および
（ｂ）上記反射光強度から、上記細胞に関するパラメータを算出する工程、
を包含する、方法。
【００１６】
（２）  上記パラメータは、細胞数、細胞の接着面積または細胞の大きさである、請求項１に記載の方法。
【００１７】
（３）  上記（ｂ）工程は、細胞に関する既知の標準曲線を用いて上記反射光強度を評価することにより上記細胞に関するパラメータを算出することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【００１８】
（４）  上記細胞について標準曲線を作成する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【００１９】
（５）  上記（ｂ）工程は、表面プラズモン共鳴イメージング装置で測定される反射光強度から接着細胞数に換算することを包含する、請求項１に記載する方法。
【００２０】
（６）  上記（ｂ）工程は、表面プラズモン共鳴イメージング装置で測定される反射光強度から細胞の形態に関する情報を得ることを包含する、請求項１に記載する方法。
【００２１】
（７）  上記表面プラズモン共鳴イメージングは、可視から近赤外の領域の波長をもつ面光源を利用して金属薄膜上に表面プラズモン共鳴を作り出すことを包含する、請求項１に記載の方法。
【００２２】
（８）  上記反射光強度は、薄膜表面に接着した細胞と媒体との屈折率の相違にもとづく反射光強度の強弱をＣＣＤカメラでイメージとして捉えたものである、請求項１に記載の方法。
【００２３】
（９）  上記プレートは、マイクロアレイである、請求項１に記載の方法。
【００２４】
（１０）  上記プレートは、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に有するガラス基板を含む、請求項１に記載の方法。
【００２５】
（１１）  上記プレート上には上記細胞と特異的に結合する因子が０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている、請求項１に記載の方法。
【００２６】
（１２）  上記プレートは、生体分子を配列固定したマイクロアレイであり、上記生体分子は、ＣＤ抗原、細胞接着因子、細胞増殖因子レセプター、サイトカインレセプターまたは糖鎖を認識する、請求項１に記載の方法。
【００２７】
（１３）  上記細胞は同種または異種である、請求項１に記載の方法。
【００２８】
（１４）  上記細胞は、各種臓器の正常細胞、疾患をもつ細胞のような分化細胞ならびにそれらの前駆細胞、胚性幹細胞、胎児由来幹細胞、未分化細胞、樹立系細胞または遺伝子の改変された細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【００２９】
（１５）  細胞のパラメータを算出するためのシステムであって、上記システムは、
（ａ）上記細胞を固定するためのプレート；および
（ｂ）上記プレートを観察するための表面プラズモン共鳴イメージング装置、
を備える、システム。
【００３０】
（１６）  上記プレートは、マイクロアレイである、請求項１４に記載のシステム。
【００３１】
【発明の実施の形態】
（発明の要旨）
本発明は、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖類、低分子生理活性物質などの生体分子とさまざまな動物細胞との間に生じる相互作用について、多数の検体を同時に、かつ迅速に分析するための装置システムに関する。分析し得る検体の数は原理的には限度はないが、実際には、数十〜数千程度の検体を同時に分析する。本装置システムによる分析では、マイクロアレイと呼ばれる基板上の各スポットに異なる種類の生体分子をそれぞれ固定した後、それらのスポットと細胞とを接触させ、これによって生じた生体分子−細胞間相互作用の分析を行う。相互作用の様式は、物理化学的相互作用および／または生物学的相互作用にもとづく細胞の捕捉、細胞接着因子を介した細胞の接着とその後の伸展、生体分子の作用に基づく細胞の増殖・細胞死など、多くの現象を対象とすることが可能である。さらに詳しくは、本装置システムでは、スポット上の細胞の分析を行うため、表面プラズモン共鳴イメージングの原理を用いることを特徴とし、基板と相互作用した細胞を多点同時に計数したり、その形態に関する情報を取得することによって生体分子−細胞間相互作用を網羅的に分析することが可能である。本装置システムは、細胞生物学研究および生体材料開発におけるハイスループット分析手段として利用することができるのみならず、臨床検査および環境調査などにも応用が可能である。
【００３２】
（詳細な説明）
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００３３】
（用語および一般技術）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および一般的技術を説明する。
【００３４】
（基板／プレート／チップ／アレイ）
本明細書において使用される「プレート」とは、抗体のような分子が固定され得る平面状の支持体をいう。本発明では、プレートは、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面にもつガラス基板を基材であることが好ましい。
【００３５】
本明細書において使用される「基板」とは、本発明のチップまたはアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。したがって、基板はプレートの概念に包含される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
【００３６】
プレートおよび基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。
【００３７】
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。チップとしては、例えば、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３８】
本明細書において「アレイ」とは、１以上（例えば、１０００以上）の生体分子（例えば、ＤＮＡ、抗体のようなタンパク質）が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望の抗体のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる抗体を少なくとも１０２個、より好ましくは少なくとも１０３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０４個、さらにより好ましくは少なくとも１０５個を含む。これらの抗体は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される抗体は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の抗体が固定され得る。
【００３９】
基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の生体分子（例えば、抗体のようなタンパク質）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、１０８個の生体分子を超える生体分子が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、生体分子（例えば、抗体のようなタンパク質）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。本発明では、細胞と特異的に結合する因子は、通常、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている。
【００４０】
アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、生体分子の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある生体分子のスポットをある基板またはプレートに作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。生体分子は、例えば、ＣＤ抗原、細胞接着因子、細胞増殖因子レセプター、サイトカインレセプターまたは糖鎖を認識することができるものであり得る。
【００４１】
本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。
【００４２】
各々のアドレスを定める大きさは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、分析物の量および／または利用可能な試薬、微粒子の大きさおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。
【００４３】
アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。
【００４４】
マイクロアレイについては、秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」、Ｍ．Ｆ．Ｔｅｍｐｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，  ７（１５），  ８１５−８２２（２００２）に広く概説されている。
【００４５】
マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ  Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。
【００４６】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００４７】
マイクロアレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法などの種々の方法を用いることが可能であるが、望ましくは、アルカンチオール単分子膜のマイクロパターン化表面を利用する方法である。この場合、まず、片面に金薄膜を蒸着したガラス基板に、メチル基、フルオロメチル基のような疎水性官能基をもつアルカンチオールの単分子膜を形成させる。この単分子膜に、直径数μｍから１ｍｍ程度の多数の光透過性スポットを配列させたフォトマスクを重ね、紫外線を照射する。これによって、照射部のアルカンチオールをスポット状に分解除去することができる。次に、露出した金スポット内にカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、イミド基、酸クロライド、エポキシ基、イソシアネート基などの反応性官能基をもつアルカンチオールの単分子膜を形成させる。スポット内に導入された反応性官能基を使って、次にタンパク質、ＤＮＡ、多糖類、ペプチド、合成薬物などの被検物質を化学的に固定化する。例えば、カルボキシル基含有スポットの場合には、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性エステルに変換した後、微量の生体分子含有溶液を各スポットに滴下することで、固定化を行うことができる。スポット周囲に形成させた疎水性の単分子膜は、溶液の拡散を抑えるために有効である。スポット周囲のバックグラウンド領域と細胞との非特異的な相互作用を抑えるため、ウシ血清アルブミンのような不活性タンパク質、ポリエチレングリコールのような親水性高分子でブロッキングを行う。
【００４８】
ＤＮＡマイクロアレイ、プロテインチップなどを使った分析技術の進歩を見ても明らかなように、マイクロアレイは、一枚の基板上で多数の検体に対してハイスループット分析が可能であるため、きわめて有効な分析手段である。本発明は、このようなマイクロアレイの考え方を、多種類の生体分子−細胞間相互作用を迅速に計測するために応用する。この場合、きわめて多くの検体を同時に分析したり、分析に必要な生体分子および細胞の量をできる限り少なくするためには、マイクロアレイの集積化が重要である。しかし一方で、マイクロアレイ上の細胞に関する情報を取得する場合、ある程度以上の細胞数からなる集団を対象とした測定を行わない限り、誤差の大きいデータしか得ることができない。このような観点から、マイクロアレイを構成する各スポットの大きさは、少なくとも数十〜数千個程度の細胞が相互作用することのできる大きさであることが望ましく、例えば、円形のスポットの場合、その直径はおおよそ数μｍから１ｍｍ程度である。
【００４９】
マイクロアレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法などの種々の方法を用いることが可能であるが、望ましくは、アルカンチオール単分子膜のマイクロパターン化表面を利用する方法である。
【００５０】
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルライブラリ化合物など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。
【００５１】
（細胞）
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位または単細胞生物の全体であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物、あるいは細菌細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５２】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。
【００５３】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
【００５４】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。本発明では、測定の際に細胞は単離されていることが好ましい。
【００５５】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。本発明では、樹立された細胞を用いることは、性質が一定しており、反射光強度との線形性の算出の際の係数を特定することが容易であり、かつ変動しにくいことから好ましい。また、測定対象として、樹立された幹細胞を使用することは、宿主から新たに幹細胞を採取するという工程を回避することができるので好ましい。
【００５６】
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。
【００５７】
本明細書において「細胞のパラメータ」とは、細胞の形状、性質などを特定する種々の要素を言う。そのようなパラメータとしては、例えば、細胞の大きさ、個数、密度、形状（球状、線維状など）、内部状態（分化状態など）、細胞表面の状態（マーカーの発現など）、細胞の接着面積などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明のパラメータとして重要なものとしては、例えば、細胞の大きさおよび個数がある。本発明の方法では、反射光強度からそのような細胞の大きさおよび集団における個数を精確に対応付けて算出することができることが予想外に見出されており、従って、その後の目視などによる細胞の計数工程が不要となった。
【００５８】
本発明のパラメータのうち、例えば、形状などの二次的情報もまた、本発明の方法において反射光強度から推定することができる。そのような方法としては、例えば、細胞の接着に伴う伸展・扁平化を反射光強度の増大から読み取る方法が挙げられるがそれに限定されない。例示的な方法として、例えば、フィブロネクチンまたはコラーゲンなどの細胞接着を促す生体分子を表面に固定したスポット上に細胞を初期接着させ、培地存在下で培養しながら経時的にＳＰＲ反射光強度を計測する方法が挙げられるがそれに限定されない。細胞の接着が進行するにつれて、細胞が伸展し、扁平化したり、突起を伸ばすが、それによって個々の細胞の基板表面への接触面積が増大するため、ＳＰＲ反射光強度の上昇として検出される。これによって、細胞接着過程の詳細なリアルタイム分析を行ったり、細胞接着に及ぼすマトリクス分子の影響を詳細に調べることが可能となる。
【００５９】
本明細書において「標準曲線」とは、反射光強度と細胞のパラメータ（好ましくは細胞個数）との関係を線形的に表したものをいう。そのような標準曲線は、反射光強度を複数測定し、それに対応する細胞のパラメータを算出する（例えば、個数を計数する）し、それらを相関付ける（例えば、グラフにプロットする）ことによって作成することができる。そのような曲線の作成は、手動で行ってもよく、コンピュータなどに行わせてもよい。あるいは、本発明の方法において、そのような情報が既知の場合は、単に標準曲線を提供するだけでよい。そのような標準曲線を提供することによって、反射光強度から細胞数または形状に関する情報へと換算することができる。
【００６０】
（表面プラズモン共鳴）
本明細書において用いられる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法は、上述のように、当該分野において慣用される測定方法である。ＳＰＲは、光透過性媒体上に設けられた金属薄膜における光の全反射条件で生じる光−表面プラズモン波の相互作用を利用するもので、その測定原理は以下の通りである。
【００６１】
表面プラズモン波は、金属と絶縁体間の界面に生じる電磁波である。金属と絶縁体の界面近傍の屈折率（あるいは、誘電率）とその厚さにより決められた共鳴条件を満たすことにより、そのような表面プラズモン波を光学的に引き起こすことができる。まず、金属薄膜を有する光透過性媒体において、光透過性媒体面で全反射が起きるように偏光した光を入射する。このとき、金属薄膜と光透過性媒体の界面において光の入射角を変数とする波数のエバネッセント波（光波）が生じる。一方、金属薄膜上では光のトンネル効果により表面プラズモン波が生じる。金属薄膜の両面で生じたエバネッセント波と表面プラズモン波の波数が一致したときに表面プラズモン共鳴が起こり、入射した光のエネルギーの一部が表面プラズモン波の励起エネルギーに用いられる。
【００６２】
エネルギー保存則より、金属薄膜面で反射した光強度は、入射光強度と表面プラズモン波の励起で失われた光強度の差となる。従って、反射光強度の入射角依存性を測定することにより、表面プラズモン共鳴が観測できる。この共鳴条件は、入射光の波長、入射角、光透過性媒体と金属薄膜の複素誘電率、および金属薄膜上に設けたセンサ感応膜の複素誘電率などで規定される。膜における細胞の付着反応により複素誘電率が変化すれば共鳴条件が変わり、波長一定の条件では表面プラズモン共鳴が起きる光の入射角が変化する。これを求めることにより、細胞の状態を求めることができる。
【００６３】
表面プラズモン波は金属薄膜上約数１００ｎｍの領域に生じることから、誘電率変化をもたらす基質と細胞との生物化学的な反応は、この領域の中で起きる必要がある。従って、生体物質を固定した感応膜は極めて薄い膜で十分である。さらに、表面プラズモン共鳴では金属薄膜近傍のみを測定することができるので、着色した試料および懸濁した試料でも影響を受けることなく測定することができる。表面プラズモン共鳴を利用して、これまでにタンパク質の抗原検出センサなどが実用化されている（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ社のＢＩＡｃｏｒｅ）。当業者は、そのような市販の装置を用いて表面プラズモン共鳴測定を行うこともでき、適宜所望のものを製造してもよい。
【００６４】
表面プラズモンとは、上述のように、金属表面上に存在する電子の粗密波であるということができ、この速度は表面に他の物質が接触することで制限される。そこで、プリズムを介して入射した光により金属表面にエバネッセント波を生起させ、表面プラズモン波と共鳴するような入社光角度を求め、これによりプラズモン波の速度を見積もることができる。プラズモン波の速度変化から表面に存在する物質量を知ることが可能となるといわれてきた。
【００６５】
２階調化もまた重要な考慮点である。基板表面に接着した細胞に関する情報を得る場合には、画像の２階調化も重要な考慮点である。基板に結合した１個の細胞に基づくシグナルは、細胞の鉛直方向の情報、すなわち、細胞内を構成する物質の屈折率とその分布、ならびに、厚さの情報の総体を反映したものとなる。細胞の個数または形態をデジタル化されたＳＰＲ画像データから求めようとする場合には、個々の細胞の情報が基板に対して水平に均一化されていることが必要である。このため、細胞の結合によって表綿プラズモン共鳴の生起する入射光強度が大きくシフトするよう、すなわち、ＳＰＲ角度付近で固定された光学系を用いて測定したとき、反射光強度が大幅に変化するよう、光源の波長、プリズムの屈折率、金薄膜の厚さなどが適正化されねばならない。
【００６６】
実際には、表面プラズモン共鳴角よりわずかに小さな角度で光を入射させ、そのときの反射光強度を求めることによって、物質の付着に基づく表面プラズモン共鳴角の変化を知ることができる。表面プラズモン共鳴角の変化は、入射角度における反射光強度であり、付着物の表面占有率、屈折率、形状、層構造によって変動する。検出器の線形性（リニアリティー）（反射光強度−電気信号）、および反射光−角度スペクトルの形状（用いる光源の波長、金属膜の厚さなどによって大きく異なる）にも影響される。
【００６７】
ある一定の領域に接着した細胞の数と、平均反射光強度との間の関係は、以上の種々のパラメータに左右されることが理解される。ある入射角における反射光強度を測定する場合を考えるとき、基板に接着した細胞と、反射光強度との間の関係を規定するには、以下のような条件を考慮する必要がある。
（１）細胞１個の占有面積が細胞によらず一定とみなすことができるかどうか。（２）細胞接着表面の粗さ（ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ）を無視することができるかどうか。
（３）反射光スペクトルの形状が顕著に変わらないかどうか。
（４）細胞の微細構造（細胞膜、細胞質、核、細胞内小器官）、それらの屈折率の綜合的な結果として、一個の細胞接着が２階調化が可能なほどの大きな、かつ、一定の角度変化を与えるかどうか。
（５）二次元平面の解像度が細胞数と反射光強度との間に線形成を与える程度に高いかどうか。
などである。
【００６８】
これらの条件を考慮するとき、装置およびプレート（例えば、マイクロアレイ）の特質に大きく影響されることから、基板に接着した細胞と、反射光強度との間の関係は、正の相関があることまではわかったとしても、例えば、線形性があるかどうかは不明で、むしろ、不定の関係があることが予測される。
【００６９】
本発明では、理論に束縛されないが、上述の種々の条件を考慮すると、予想外に基板に接着した細胞と、反射光強度との間の関係に線形性があることがわかった。従って、本発明の方法では、反射光強度を測定するだけで、細胞の情報が１：１の関係で精確に測定され得る。
【００７０】
表面プラズモン共鳴イメージングは、可視光から近赤外線（５２０ｎｍ〜３３９０ｎｍの波長の光）の領域を波長を有する面光源を利用することができる。好ましくは、８００ｎｍ〜１２００ｎｍの波長の光を利用することが有利であり得る。そのような波長を利用することで、金属薄膜上に表面プラズモン共鳴を有利に作り出すことができるからである。
【００７１】
本明細書において「反射光強度」は、薄膜表面に接着した細胞と媒体との屈折率の相違にもとづく反射光強度の強弱をＣＣＤカメラでイメージとして捉えることができるが、反射光強度の捕捉はそれに限定されない。
【００７２】
表面プラズモン共鳴イメージング装置は、図２に示すような構成の装置を用いる。生きた細胞を培養しながらでも観察できるように水平型試料台をもち、細胞へのダメージの少ない白色光を光源として用いることを特徴とする。画像データの正確性を高めるためには、近赤外領域の光を検出できるＣＣＤカメラを用いることが有効である。測定には、マイクロアレイおよびプリズムをＫｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置し、マイクロアレイ裏面からプラズモン共鳴角より約０．３〜０．５度鋭角度で均一平行光を入射する。この場合、レーザー光源、ＬＥＤ光源、ＬＳＥＤ光源、ハロゲンランプ、水銀アークランプ、ＬＤ光源などさまざまな光源を用いることができるが、レーザー光のようにコーヒレント性の高い光を用いる場合、光路の各部分において回折の起こらないように注意を要する。２次元画像の取得には、ＣＣＤカメラを使用するが、この際、干渉フィルターなどを利用して９００ｎｍ程度の波長をもつ近赤外光のみを検出できるような光学系ならびに検出系とすることで、表面プラズモン共鳴イメージの感度を向上させる。
【００７３】
生体分子と細胞との相互作用を調べるには、まず、対象となる細胞を細胞培養用培地およびリン酸緩衝液などの適当な媒体に浮遊させ、これをマイクロアレイ上に滴下する。生体分子−細胞間の相互作用を行わせた後、相互作用していない細胞を洗浄により除去する。このようにして得たマイクロアレイを表面プラズモン共鳴イメージング装置に取り付け、アレイ表面の誘電率変化に対応した２次元画像を取得する。生体分子と細胞の間に相互作用が生じ、細胞が接着した領域では、図３に示すように、反射光度の高い領域として観測され、逆に細胞の存在しない領域は暗色を示す。結果として、細胞付着の有無が２階調化された画像データとして得られる。これは、細胞の接着によって、図４に示すように表面プラズモン共鳴スペクトルが大きくシフト高角度側にシフトすることから説明される。すなわち、光の入射角を表面プラズモン共鳴角近傍に固定して計測を行った場合、細胞の非存在下では表面プラズモン共鳴によって低い反射光強度を与えるが、細胞が接着することによって同角度における反射光強度は著しく増大する。その結果、細胞の存在する部分とそうでない部分に対応して、二値化されたような二次元イメージが得られことになる。このようにして得られた２次元画像をデジタル化された情報としてコンピュータに取り込み、適当なソフトウエアを用いて、各スポット内の単位面積あたりの平均明度を求めることにより、細胞接着数の指標を得ることが可能となる。
【００７４】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。
【００７５】
１つの局面において、本発明は、細胞を分析する方法を提供する。この方法は、（ａ）表面プラズモン共鳴イメージングを用いてプレート上に固定された細胞に起因する反射光強度を測定する工程；および（ｂ）該反射光強度から、該細胞に関するパラメータを算出する工程、を包含する。表面プラズモン共鳴イメージングは、当該分野において周知の技法を用いて操作することができる。プレートへの細胞の固定は、直接行ってもよく、あるいは、結合性の因子（例えば、抗体、リガンド、低分子、糖鎖など）をプレートに予め結合させておくことによって行うこともできる。反射光強度の測定もまた、当該分野において周知の手法を用いて行うことができる。そのような手法は、本明細書において上述されており、かつ、例えば、”Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ”，  Ｊ．Ｄａｖｉｅｓ，ｅｄ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９６；”Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｓｅｎｓｏｒｓ”，Ｅ．Ｇｉｚｅｌｉ，Ｃ．Ｒ．Ｌｏｗｅ  ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂ．Ｐ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｇ．Ｆｒｕｔｏｓ，Ｊ．Ｍ．Ｂｒｏｃｋｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｃｏｒｎ．，Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  ｆｉｌｍｓ，１．Ａｎｇｌｅ  ｓｈｉｆｔ  ａｎｄ  ＳＰＲ  ｉｍａｔｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７１，３９２８−３９３４（１９９９）などに詳細に記載されている。
【００７６】
ここで、好ましくは、本発明において算出される細胞のパラメータは、細胞数、細胞の接着面積または細胞の大きさでありえる。本発明では、反射光強度と細胞数とが予想外に線形性をもって相関付けられたことから、単に反射光強度を測定するだけで、細胞数を算出することができるという格別の効果が達成された。これは、従来では不可能であり、従来は、わざわざ細胞数を計数するという工程を欠かすことができなかった。従って、本発明は、そのような煩雑な工程を省略することができたという効果も奏する。
【００７７】
そのような線形性は、以下のような関係で示すことができる。
Ｄ（Ｄ＝細胞密度＝細胞数／単位面積）＝ｋＲ（Ｒ＝ＳＰＲ反射光強度）
ここで、係数ｋ（ｃｍ２／細胞）は、細胞の種類、状態などによって変動し、例えば、リンパ球の場合、０．１〜０．２であり得、神経細胞の場合、０．３〜０．４であり得、ストローマ細胞の場合、２〜４であり得る。この係数は、調製された細胞が一定の性質あるいは調製方法が同様である場合、一定の数値となる。従って、反射光強度を求めるだけで、細胞の密度および個数を算出することができる。また、係数はあくまでも例示であり、これらの値は、細胞の状態のみならず、装置の仕様、測定条件などによって大きく変動し得る。そのような変動は、当業者が理解する範囲内にあり、これらを考慮して適切に係数を決定することができる。
【００７８】
この係数ｋを分析することにより、細胞の形状を同定することも可能である。例えば、形状（例えば、大きさ）が既知の細胞についての標準曲線が判明している場合に、未知の細胞の標準曲線を分析し係数ｋを同定することにより、未知細胞の大きさを同定することも可能である。例えば、第一の細胞について、
Ｄ＝ｋ１Ｒ
という関係が判明しており、その大きさがｓ１であることが判明している場合、第二の細胞について
Ｄ＝ｋ２Ｒ
という関係が明らかになった場合、その大きさｓ２は、
ｓ２＝（ｋ２×ｓ１）／ｋ１
で求めることができる。
【００７９】
好ましい実施形態において、本発明の方法における上記（ｂ）工程は、細胞に関する既知の標準曲線を提供して、前記反射光強度と比較することにより前記細胞に関するパラメータを算出することを包含する。標準曲線が既知のものを用いることにより、細胞のパラメータを即座に判定することができる。そのような既知の標準曲線が使える代表例としては、使用する細胞が正常な場合などがある。あるいは、（ｂ）工程は、前記細胞について標準曲線を作成することを包含していてもよい。このような手法は、標準曲線が入手できない場合、あるいは再度標準曲線を作成する必要がある場合に有利であり得る。より好ましくは、毎日細胞の状態を、標準曲線を作成して確認することが有利であり、かつ、より精確な結果が得られ得る。異なる細胞間の相対値の場合は標準曲線を作成する必要はない場合もある。
【００８０】
好ましい実施形態において、本発明の方法における（ｂ）工程は、表面プラズモン共鳴イメージング装置で測定される反射光強度から接着細胞数に換算することを包含する。このような換算は、いったん標準曲線が得られたなら、自動的に反射光強度から行うことができる。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明の方法における（ｂ）工程は、表面プラズモン共鳴イメージング装置で測定される反射光強度から細胞の形態に関する情報を得ることを包含する。このような換算は、いったん標準曲線が得られたなら、自動的に反射光強度から行うことができる。そのような方法としては、大きさを求める方法を適用することができる。ある一定の予測範囲の形態変化に関しては、大きさからの類推が可能であるからである。
【００８２】
好ましい実施形態において、表面プラズモン共鳴イメージングは、可視から近赤外の領域の波長をもつ面光源を利用して金属薄膜上に表面プラズモン共鳴を作り出すことを包含する。ここで、好ましくは、可視から近赤外の領域の波長は、５２０ｎｍ〜３３９０ｎｍの波長、より好ましくは８００ｎｍ〜１２００ｎｍの波長を有する。このような波長が有利なのは、反射光強度の入射角依存性が顕著であるため、金属（金など）表面への物質の付着による反射光強度の変化が大きいため、感度の高い測定が可能となるからである。
【００８３】
別の好ましい実施形態において、反射光強度は、薄膜表面に接着した細胞と媒体との屈折率の相違にもとづく反射光強度の強弱をＣＣＤカメラでイメージとして捉えたものであってもよい。このようなイメージとして捕らえることによって、コンピュータ画像としての処理を行うことができ、自動化処理が達成される。ＣＣＤカメラのイメージとしてそのような反射光強度を捕らえることは、当該分野において周知であり、例えば、Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，Ｍ．Ｌｉｌｅｙ，Ｄ．Ｐｉｓｃｅｖｉｃ，Ｊ．Ｓｐｉｎｋｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｔａｒｌｏｖ，Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｒｆａｃｅｓ、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３４，２３１−２５１（１９９７）；Ｂ．Ｐ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ａ．Ｇ．Ｆｒｕｔｏｓ，Ｊ．Ｍ．Ｂｒｏｃｋｍａｎ．，Ｒ．Ｍ．Ｃｏｒｎ，Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  ｆｉｌｍｓ，１．Ａｎｇｌｅ  ｓｈｉｆｔ  ａｎｄ  ＳＰＲ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．，７１，３９２８−３９３４（１９９９）などに詳細に記載されている。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明において使用されるプレートは、マイクロアレイである。そのようなマイクロアレイの製造法および使用法は、本明細書において上述したように公知であり、当業者は容易に実施することができる。
【００８５】
好ましい実施形態において、本発明において使用されるプレートは、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面にもつガラス基板を含んでいてもよい。そのようなガラス基板の使用方法および製造方法は、当該分野において周知であり、本明細書において上述したとおりである。
好ましくは、プレート上には前記細胞と特異的に結合する因子が０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されていることが有利であり得る。このように配列固定されていることにより、後の情報処理が容易となるからである。
【００８６】
好ましくは、プレートは、生体分子を配列固定したマイクロアレイであり、ここで、この生体分子は、ＣＤ抗原、細胞接着因子、細胞増殖因子レセプター、サイトカインレセプターまたは糖鎖を認識する。そのような認識する生体分子としては、例えば、抗体、リガンド、レセプター、特定の核酸配列などがあるがそれらに限定されない。好ましくは、抗体であり、より好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００８７】
本明細書において測定される細胞は同種または異種である。同種であることが好ましい。すなわち、均一な細胞集団が測定対象であることにより、細胞の個数および状態の測定がより精確なものとすることができる。ただし、異種のものが混じっていたとしても、種々の目的で本発明を利用することができる。
【００８８】
好ましい実施形態において、本発明が測定対象とする細胞は、各種臓器の正常細胞、疾患をもつ細胞のような分化細胞ならびにそれらの前駆細胞、胚性幹細胞、胎児由来幹細胞、未分化細胞、樹立系細胞または遺伝子の改変された細胞を含む。そのような細胞は、目的に応じて当業者が適宜選択または調製することができる。
【００８９】
本発明はまた、別の局面において、細胞のパラメータを算出するためのシステムを提供する。このシステムは、（ａ）該細胞を固定するためのプレート；および（ｂ）該プレートを観察するための表面プラズモン共鳴イメージング装置、を備える。プレートおよび鏡面プラズモン共鳴イメージングの装置は、本明細書において上述したようなものを当業者が適宜選択し、組み合わせて使用することができる。
【００９０】
好ましくは、本発明のシステムにおいて用いられるプレートは、マイクロアレイであり得る。マイクロアレイの製造方法および使用方法は、上述したとおりである。
【００９１】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００９２】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００９３】
【実施例】
以下、実施例を示してこの発明についてさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下に使用した抗体などの試薬は、特に言及する場合を除き、以下のように入手した。以下の試薬は、代理店（和研薬（株）（京都、日本））から入手した：アルカンチオール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、抗体（藤沢薬品工業、大阪、日本；ベックマン・コールター（株）、東京、日本；（株）ニチレイ、東京、日本）、その他の試薬：和光純薬（大阪、日本）。
【００９４】
（実施例１）
片面に金薄膜を蒸着したガラス基板に、末端にメチル基をもつアルカンチオール  （ｎ−ヘキサデシルメルカプタン）の単分子膜を形成させた。この単分子膜に、直径１ｍｍのスポットを５×５のマトリックス状に配置したフォトマスクを重ね、紫外線を照射した。これにより、照射部のアルカンチオールをスポット状に分解除去した。次に、露出した金スポット内にカルボキシル基をもつアルカンチオール（１１−メルカプトウンデカン酸）の単分子膜を形成させた。スポット表面のカルボキシルをＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性エステルに変換した後、約１００ｎｌの０．１ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ９０モノクローナル抗体溶液を各スポットに滴下することで、抗体の固定化を行った。スポット周囲のバックグラウンド領域への細胞接着を抑えるため、ウシ血清アルブミンによるブロッキングを行った。
【００９５】
ラット副腎皮質褐色細胞腫由来ＰＣ−１２細胞を血清含有培地に浮遊させ、その０．２ｍｌを抗体固定化基板上に滴下した。これを３７℃および５％ＣＯ２の雰囲気下に静置することで、細胞を接着させた。３０分後、抗体アレイをリン酸緩衝液で洗浄し、非接着細胞を除去した。その後、スポットに接着した細胞をグルタルアルデヒド溶液を用いて固定した。
【００９６】
各スポットに接着した細胞数を計測するため、基板のＳＰＲイメージを取得し、各スポットの反射光強度を測定した。観察のさい、抗体スポット以外の領域（バックグラウンド領域）の反射光強度が１００，０００となるように設定した。
【００９７】
図５に、ＰＣ−１２細胞の接着した基板のＳＰＲ像を示す。細胞の接着した領域は、ＳＰＲ像において明るい領域として観察された。各スポット中心部の矩形領域を反射光強度を測定した結果、平均値は１６２，４９０であった。また、細胞接着の不均一性の指標とするため、標準偏差を求めた結果、１１，５１１であった。
【００９８】
（実施例２）
実施例１とは異なる細胞ならびに固定化分子の組み合わせについて、接着細胞密度ならびにその不均一性の試験を行った。すなわち、細胞にはマウス頭蓋骨由来ストローマ細胞ＰＡ６を用い、固定化分子としてフィブロネクチンを用いた。基板の作成ならびに細胞接着は、実施例１と同様に行ったが、スポット内のアルカンチオール単分子膜のモル組成を１１−メルカプトウンデカン酸：ｎ−１１−メルカプトウンデカノール  ＝  １：９とした。また、細胞を接着させるさいの基板−細胞接触時間を２．５時間とした。
【００９９】
図６に、ＰＡ６細胞の接着した基板のＳＰＲ像を示す。この場合にも、細胞の接着した領域は、ＳＰＲ像において明るい領域として観察された。各スポット中心部の矩形領域を反射光強度を測定した結果、平均値は２１４．３８８であった。また、標準偏差を求めた結果、２３．５９０であり、ＰＣ−１２細胞の接着試験の結果と比較して大きな値を示した。この例が示すように、ＳＰＲイメージング装置を用いることによって、各スポットへの細胞接着のバラツキを簡便に評価することが可能である。
【０１００】
（実施例３）
実施例１と同様に、抗ＣＤ９０抗体固定化アレイ上へのＰＣ−１２細胞の接着をＳＰＲイメージング装置を用いて評価した。この際、スポット内のアルカンチオール単分子膜の組成を１１−メルカプトウンデカン酸：ｎ−１１−メルカプトウンデカノール  ＝  ０：１０〜１０：０まで変化させ、また固定化に用いる抗体溶液の濃度も０．０１μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの間で変化させた。
【０１０１】
接着した細胞密度は、スポット内のカルボキシル基密度および固定化反応における抗体濃度によって変化した（図７）。カルボキシル基含有量が０％の場合にも高濃度の抗体溶液を用いた場合には細胞の接着がみられたことから、非特異的に吸着した抗体の存在することがわかる。この結果が示すように、ＳＰＲイメージングによる細胞接着評価を行うことによって、基板作成条件の検討を迅速に行うことが可能である。
【０１０２】
（実施例４）
実施例１と同様の方法で、抗体アレイを作製した。このさい、抗体には、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＨＬＡ−ＤＲの合計２２種類の白血球表面抗原に対するモノクローナル抗体を用い、また、コントロールとしてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを用いた。
【０１０３】
細胞には、造血器種用細胞株であるＣＣＲＦ−ＣＥＭ（Ｔ細胞系急性リンパ腫）およびＲａｍｏｓ（Ｂ細胞系バーキットリンパ腫）を用いた（いずれも（財）ヒューマンサイエンス財団より分譲）。それぞれの細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡならびに１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧを含むリン酸緩衝溶液に分散させ、接着試験に供した。細胞懸濁液４００μｌを基板表面に滴下し、ＣＯ２インキュベータ内に静置することで、細胞を接着させた。３０分後、基板をリン酸緩衝溶液で軽く洗浄することで、浮遊する細胞を洗い流し、基板に接着した細胞を２％グルタルアルデヒド溶液を用いて固定した。
【０１０４】
表面プラズモン観察では、バックグラウンドの反射強度を１００，０００に設定し、各スポット内の１０ピクセル×１０ピクセルの領域について反射強度を測定した。細胞の接着した抗体アレイのＳＰＲイメージならびに反射光強度の測定値を図８および図９に示す。
【０１０５】
ＣＣＲＦ−ＣＥＭでは、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７１の各スポットに多くの細胞が接着し、ＣＤ２１のスポットに軽度な接着がみられた。一方、Ｒａｍｏｓでは、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７１の各スポットに多くの細胞が接着し、ＣＤ２１、ＨＬＡ−ＤＲのスポットには軽度な接着がみられた。ＲａｍｏｓのＣＤ７スポットでは、細胞接着がほとんど認められないにもかかわらず、ＳＰＲ反射光強度が比較的高い値を示した。また、ＲａｍｏｓのＨＬＡ−ＤＲのスポットには細胞の軽度な接着がみられたが、ＳＰＲ反射強度は比較的低かった。これらの結果からわかるように、細胞密度が低い場合には、ＳＰＲイメージングによる測定誤差が大きいようであり、注意を要する。
【０１０６】
２種類の細胞株の各抗体スポットへの接着プロファイは、Ｔ細胞系急性リンパ腫ならびにＢ細胞系バーキットリンパ腫に発現することが知られている表面マーカーのプロファイルにほぼ一致した。
以上の結果は、マイクロアレイならびに表面プラズモン共鳴イメージング装置を組み合わせた本発明の方法を用いることによって、多種類の抗体と細胞との相互作用を迅速に調べることが可能であることを示す。また、この例でもわかるように、細胞免疫診断のような臨床検査への応用も可能である。
【０１０７】
（実施例５）
ＰＣ−１２、ＰＡ６、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の接着細胞数とＳＰＲ反射光強度の関係を図１０に示す。いずれの場合にも、細胞数と反射強度の間には相関関係が認められ、それらの相関係数は、それぞれ、直線関係が認められた。ただし、直線の傾きは細胞によって大きく異なっていた。図１１に示すように、著しく伸展したＰＡ６細胞では、直線の傾きが大きく、細胞の広がり方がＰＣ−１２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭと軽度になるにつれて直線の傾きは小さくなった。
【０１０８】
（実施例６：胚性幹（ＥＳ）細胞での実証）
（胚性幹（ＥＳ）細胞の調製）
ゼラチンをコーティングした細胞培養皿上で、１％  ＦＢＳ、１０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）、ブラストサイジン、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、ピルビン酸を含むＧＭＥＭ培地を用いて培養されたマウスＥＳ細胞（ＥＢ５）を、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養皿より剥がす。これを無血清含有培地に５ｘ１０６細胞／ｍＬとなるように浮遊させ、その０．２ｍＬを抗体固定化基板上に滴下し、アレイを調製した。
【０１０９】
（結果）
このアレイを使用して同様の測定ができるかどうかを確かめたところ、上記白血病細胞と同様に予想外に線形性を保ちながら測定することができることが判明した。
【０１１０】
（実施例６：マウスインスリノーマ細胞での実証）
マウスインスリノーマ（ＭＩＮ６）（膵ベータ細胞様のインスリン産生細胞株）
１０％ウシ胎児血清およびグルコース、２−メルカプトエタノール、炭酸ナトリウム、硫酸ストレプトマイシン、ペニシリンを含むＤＭＥＭ培地にて培養したＭＩＮ６細胞を、０．１％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養器材より剥がした。これを無血清含有培地に５ｘ１０６細胞／ｍＬとなるように浮遊させ、その０．２ｍＬを抗体固定化基板上に滴下し、アレイを調製した。
【０１１１】
（結果）
このアレイを使用して同様の測定ができるかどうかを確かめたところ、上記白血病細胞と同様に予想外に線形性を保ちながら測定することができることが判明した。
【０１１２】
以上のように、ＳＰＲ反射強度測定によって細胞の伸展の程度を評価することが可能である。
【０１１３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【０１１４】
【発明の効果】
以上、詳しく説明した通り、本発明によって、多種類の生体分子と細胞との相互作用を迅速にしかも網羅的に解析することが可能となる。これにより、例えば、細胞表面に発現したマーカータンパク質の種類および頻度を調べることによって、細胞の表現形、分化段階、病態を知ることが可能であり、細胞生物学のみならず臨床検査においても有用な分析システムとなる。また、本手法は、生体分子との相互作用にとどまらず、人工物表面および環境汚染物質のような場合にも適用が可能である。
【０１１５】
臨床検査の現場において、白血球の免疫形質タイピングに代表されるように、フローサイトメトリーを用いた免疫学的検査が、その他の病理学的検査と併せて診断のための重要な手段となっている。ところが、この場合においても、検査を行う者の経験的な判断によるところが大きい上に、最適な分析条件を検体ごとに決定しておく必要がある。また、著しい細胞形態の変化を伴うような場合にみられる細胞間の比較の難しさ、標識抗体を使用しなければならない点、蛍光強度の定量的な比較が難しいこと、正確な診断を行うために指標とすべき抗原の種類が多数に上る場合が多く、経済的にも不利であるなど、種々の問題を抱えている。本発明の方法は、たとえば、白血病の分類を行う上で、定量的な分析結果を簡便に得るための有効な手段となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）表面プラズモン共鳴を得るためのプリズムならびに金属薄膜の配置。（ｂ）表面プラズモン共鳴イメージングを行うための均一平行光の入射。１．媒体、２．金属薄膜、３．プリズム、４．入射光、５．入射角、６．エバネッセント波のポテンシャル、７．表面プラズモン波、８．反射波、９．均一平行光、１０．細胞。
【図２】本発明で用いる例示的表面プラズモン共鳴イメージング装置の概略。１．光源、２．レンズ、３．ピンホール、４．偏向板、５．プリズム、６．マイクロアレイ、７．フローセル、８．回転ステージ、９．干渉フィルター、１０．ＣＣＤカメラ、１１．パーソナルコンピュータ。
【図３】マイクロアレイ上のスポットに細胞が接着した場合の表面プラズモン共鳴イメージの一例。
【図４】基板表面に細胞が接着したときにみられる表面プラズモン共鳴スペクトルのシフトの例示。（ａ）細胞非存在下、（ｂ）細胞存在下。
【図５】すべてのスポットに同一の条件で抗ＣＤ９０モノクローナル抗体を固定化し、ＰＣ−１２細胞と相互作用させたときのマイクロアレイの表面プラズモン共鳴イメージの例示。
【図６】すべてのスポットに同一の条件でフィブロネクチンを固定化し、ＰＡ６細胞と相互作用させたときのマイクロアレイの表面プラズモン共鳴イメージの例示。
【図７】各々異なる条件で抗ＣＤ９０モノクローナル抗体を固定化し、ＰＣ−１２細胞と相互作用させたときのマイクロアレイの表面プラズモン共鳴イメージの例示。
【図８】各種のＣＤ抗原に対する抗体を固定化したマイクロアレイと２種類の白血病モデル細胞を相互作用させたときの表面プラズモン共鳴イメージの例示。（ａ）抗体の配置、（ｂ）急性リンパ性白血病細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞）、（ｃ）Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（Ｒａｍｏｓ細胞）。
【図９】各種のＣＤ抗原に対する抗体を固定化したマイクロアレイと２種類の白血病モデル細胞を相互作用させたときの表面プラズモン共鳴イメージから得られた反射光強度のヒストグラムの例示。各カラムで左側のバーは、急性リンパ性白血病細胞であり、右側のバーはＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞である。
【図１０】ＰＣ−１２細胞、ＰＡ６細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の接着細胞数とＳＰＲ反射光強度の関係ならびにそれらの細胞が接着した代表的なスポットの光学顕微鏡写真の例示。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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