(57)【要約】【課題】ＫＹ１遺伝子を植物に導入して高発現した際に、植物のストレス耐性を担っている機構を解明することが本発明の課題である。【解決手段】本発明により、ＫＹ１遺伝子を植物に導入することによって植物においてＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）合成酵素の酵素活性を上昇させる方法、及びＮＡＤ合成酵素の酵素活性が上昇していることを特徴とする形質転換植物が与えられた。本発明の方法は植物にストレス耐性を付与するのに有用である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＫ１遺伝子を植物に導入することにより、植物においてＮＡＤ合成酵素の酵素活性を上昇させる方法。
【請求項２】
前記植物のストレス耐性が上昇していることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＹＫ１遺伝子を植物に導入することにより、当該植物においてＮＡＤ合成酵素の酵素活性が上昇していることを特徴とする、形質転換植物。
【請求項４】
前記植物のストレス耐性が上昇していることを特徴とする、請求項３記載の形質転換植物。
【請求項５】
前記植物がイネである、請求項３又は請求項４記載の形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＹＫ１遺伝子を植物に導入することによって植物においてＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）合成酵素の酵素活性を上昇させる方法、及びＮＡＤ合成酵素の酵素活性が上昇していることを特徴とする形質転換植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トウモロコシのＨｍ１遺伝子はＮＡＤＰＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＨＣＴＲ）をコードし、北方斑点病菌の生産するＨＣ−ｔｏｘｉｎを還元することによって無毒化する。イネ葯ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡのランダムシークエンシングにより、ＨＣＴＲ遺伝子とアミノ酸レベルで７８％の相同性がある遺伝子（ＹＫ１遺伝子）がイネから単離された。単離したＹＫ１遺伝子は全長約１３００ｂｐであった。この遺伝子を高発現させた形質転換イネを作製したところ、種々のストレスに対する耐性が向上していた。即ち、この形質転換植物は、イネイモチ病に対する抵抗性を獲得したのみならず、紫外線処理、塩処理、冠水処理などにも耐性を示した。更に過酸化水素の処理に対しても耐性を示したことから、ＹＫ１遺伝子の産物は、活性酸素種（ＲＯＳ）を介したストレスに対しても植物に耐性を付与すると考えられている。（Ｈｉｒｏｆｕｍｉ  Ｕｃｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ９  ：  ２５−３１，  ２００２  ：  非特許文献１）。
【０００３】
しかし、上記の知見は現象論に留まっており、ＹＫ１遺伝子によるストレス耐性付与を担っている分子やストレス耐性が起こるメカニズムは判っていなかった。このメカニズムを解明することにより、植物にストレス耐性を与える新たな手段が提供される可能性がある。現在人口の増加から食糧増産が求められている中で、種々の環境ストレスに対して高い耐性を有する植物を作出することは、社会的に特に重要である。
【０００４】
【非特許文献１】
内宮博文ら（Ｈｉｒｏｆｕｍｉ  Ｕｃｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．），モレキュラー・ブリーディング（  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）  ９  ：  ２５−３１，  ２００２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
よって本発明の課題は、ＫＹ１遺伝子を植物に導入して高発現させた際に、ストレス耐性と関連している機構を解明することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明において、ＫＹ１遺伝子の導入がＮＡＤ代謝に及ぼす影響を検討したところ、ＫＹ１蛋白質が高発現したＫＹ１形質転換体において、ＮＡＤ合成酵素の活性が促進していることが示された。この知見はＮＡＤ合成酵素の活性促進が、ＫＹ１遺伝子によるストレス耐性を担っている可能性を示唆するものである。これまでＮＡＤ代謝を操作することにより植物のストレス抵抗性を変化させた例は知られていない。よって本発明は、植物に対してストレス耐性を付与するための新たな技術を提供するものである。なお、ＮＡＤ合成酵素とはデアミノ−ＮＡＤを基質として、そのカルボキシル基をアミド化することによりＮＡＤを合成する酵素であって、ＮＡＤ合成の幹線経路の最終段階を担っている（図１参照）。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ニコチンアミドヌクレオチド関連分子であるＮＡＤ＋，  ＮＡＤＰ＋は生体内で種々の酸化還元反応を触媒する脱水素酵素の補酵素である。これらの補酵素は細胞内で様々な代謝系を介して合成され、数百に及ぶ酸化還元反応を制御している。本発明者は、ＮＡＤ代謝を遺伝子工学的に制御することにより、ストレス耐性植物を分子育種することを目指して検討を行った。
【０００８】
ＹＫ１蛋白質は、生体内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ  →  ＮＡＤ（Ｐ）の反応を促進し、標的となる物質を還元する。この現象を詳細に検討するために本発明者らは、コントロールのイネとＫＹ１形質転換体であるイネから細胞抽出液を採取し、その細胞抽出液とＮＡＤの前躯体であるデアミノ−ＮＡＤを混合して反応させた。生成したＮＡＤの量を測定することで、ＮＡＤ合成酵素の活性を検討した。その結果、ＹＫ１蛋白質が高発現すると、上流にあるＮＡＤ合成酵素の活性も上昇するという知見が得られた。
【０００９】
ＹＫ１蛋白質はＮＡＤＨ  の変換を高めるため、その基質であるＮＡＤ合成そのものを上昇させる。すなわちＹＫ１蛋白質はＮＡＤとＮＡＤＨのサイクル反応を促進させることにより、ポンプアップ効果により上流の基質合成酵素の１つであるＮＡＤ合成酵素の活性化を促している。図１にＮＡＤ合成系と、本発明により示されたＹＫ１蛋白質の発現によるストレス耐性の機構を示す。
【００１０】
本発明はＹＫ１遺伝子を植物へ導入することにより、ＮＡＤ合成酵素の活性化を介して、ストレス耐性が高い植物を作成する技術を提供するものである。これにより、植物において耐病性や耐塩性、耐酸化ストレスが増強して作物の増産にもつながるものと思われる。
【００１１】
なお、下記の実施例においては形質転換する植物としてイネを用いている。本発明の遺伝子を導入する対象の植物の例としてイネは特に好ましいが、それに限定されるものではなく、他の種々の植物を用いることができる。その様な例として、ユリ、トウモロコシ、アスパラガス、コムギ等の単子葉植物、シロイヌナズナ、タバコ、ニンジン、ダイズ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。中でも、イネ、コムギ、トウモロコシなどの主要植物を用いることは、食糧の増産という意味で特に大きな意義があると思われる。
【００１２】
上記の形質転換植物の作製方法としては、本技術分野において知られている通常の方法を用いる事ができる。本発明の遺伝子の上流に、本発明の遺伝子の効率的な発現を可能とするプロモーターを連結してベクターに挿入することにより、植物体内での発現系を構築することができる。使用できるプロモーターの具体例としては、例えば下記の実施例で使用しているユビキチンプロモーターや、汎用されているカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。また、ここで使用するベクターとしては、プラスミドベクターが好適であり、使用できるベクターの具体例としては、例えば汎用されているｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１２２やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００１３】
そのようにベクターを、例えばアグロバクテリウム菌に導入して、カルス又は幼植物に感染させることにより、形質転換植物を作製する事が可能であり、更に、そのような形質転換植物に由来する種子を得る事が可能である。本発明の植物遺伝子を植物に導入する形質転換法はアグロバクテリウム法に限定されるものではなく、パーティクルガン法、電気穿孔法等の方法を用いる事も可能である。
以下、本発見を実施例により更に説明するが、これら実施例のみによって限定されるものではない。
【実施例】
【００１４】
（ＫＹ１遺伝子を導入したＫＹ１形質転換体の作製）
ＫＹ１遺伝子を導入した形質転換植物を作製した。イネに導入するための発現ベクターとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つｐＢＩ１２１を用いてトウモロコシユビキチンプロモーターの下流にＫＹ１遺伝子を接続し、その後にアグロバテリウム法により、ＫＹ１遺伝子をイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．  ｃｖ  日本晴）胚盤由来カルスに導入した。なお、ＫＹ１遺伝子の配列については、Ｈｉｒｏｆｕｍｉ  Ｕｃｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ９  ：  ２５−３１，  ２００２に記載されている。コントロールとＫＹ１形質転換体から細胞抽出液を調製し、以下の検討に用いた。
【００１５】
（ＹＫ１高発現イネにおけるニコチンアミド補酵素量の測定）
コントロールとＫＹ１形質転換体において、ニコチンアミド補酵素量（ＮＡＤＰとＮＡＤＰＨの総量：ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）と称する）を測定したところ、コントロールイネに比べてＹＫ１高発現イネにおいて有意に増加していた。ＮＡＤ（Ｈ）の量の測定を行い、そこから求めたコントロールとＫＹ１形質転換体における量比を図２に示す。この結果は、ＹＫ１を過剰に発現したことにより、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの需要が増し、それに伴って供給を増やすために全体的にニコチンアミドの量が増えたことによると考えられる。材料としては発芽後７日目の植物個体を用いた。
【００１６】
（ＮＡＤ合成酵素活性の測定）
コントロールとＫＹ１形質転換体において、ＮＡＤ合成酵素の酵素活性を測定した（図３）。イネ細胞抽出液とＮＡＤの前駆体であるデアミノ−ＮＡＤを混合して反応させ、生成したＮＡＤの量を測定することでＮＡＤ合成酵素活性を比較した。その結果、形質転換イネにおけるＮＡＤ合成酵素活性の上昇が認められた。従って、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）依存的代謝系がストレス耐性と密接に関係することが示された。
【００１７】
【発明の効果】
本発明により、ＹＫ１遺伝子を植物に導入することによって植物においてＮＡＤ合成酵素の酵素活性を上昇させる方法、及びＮＡＤ合成酵素の酵素活性が上昇していることを特徴とする形質転換植物が与えられた。本発明の方法は、植物にストレス耐性を付与するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明によりＮＡＤ合成酵素が活性化して植物にストレス耐性を付与するメカニズムを示す模式図である。
【図２】図２は、ＹＫ１高発現イネとコントロールのイネにおけるＮＡＤ（Ｈ）量の比を示すグラフである。
【図３】図３は、ＹＫ１高発現イネとコントロールのイネにおけるＮＡＤ合成酵素の活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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