(57)【要約】　　　（修正有）【課題】神経ペプチドの受容体としてのオーファンＧ‐蛋白質共役受容体ＭＲＧＸ２（およびその変異体）の同定、およびＭＲＧＸ２の調節物質として神経ペプチド（および構造的に関連した分子）の使用を提供する。【解決手段】新規神経ペプチド受容体の調節物質のスクリーニング法を提供する：（ａ）受容体ＭＲＧＸ２の試料と、コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰまたはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物から選択されたリガンドを接触させること；（ｂ）受容体ＭＲＧＸ２の同様の試料または前記試料を含む細胞から調製された膜と、（ａ）で使用されたリガンドおよび試験化合物または試験化合物の混合物の両方を接触させること；（ｃ）使用したリガンドの結合が影響を受けるか否かを調べるために（ａ）および（ｂ）の結果を比較すること。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体ＭＲＧＸ２のリガンドとしての、コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰまたはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物の使用。
【請求項２】
受容体ＭＲＧＸ２の調節物質としての、コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰまたはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物の使用。
【請求項３】
受容体ＭＲＧＸ２に機能的反応を引き起こすための、コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰまたはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物の使用。
【請求項４】
使用がコルチスタチンまたはソマトスタチンまたはＢａｍ１３−２２またはα‐ＭＳＨに属する、請求項１から３のいずれかひとつの使用。
【請求項５】
リガンドとしてコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰまたはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物を使用した、受容体ＭＲＧＸ２の調節物質である化合物のスクリーニングの方法。
【請求項６】
以下の段階を含むがそれらに限定されない、新規神経ペプチド受容体の調節物質である化合物のスクリーニングの方法：
（ａ）受容体ＭＲＧＸ２の試料と、コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰまたはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物から選択されたリガンドを接触させること；
（ｂ）受容体ＭＲＧＸ２の同様の試料または前記細胞から調製された膜と、段階（ａ）で使用されたリガンドおよび試験化合物または試験化合物の混合物の両方を接触させること；
（ｃ）使用したリガンドの結合が試験化合物または試験化合物の混合物の存在により影響を受けるか否かを調べるために（ａ）および（ｂ）の結果を比較すること。
【請求項７】
以下の段階を含むがそれらに限定されない、新規神経ペプチド受容体の調節物質である化合物のスクリーニングの方法：
（ａ）受容体ＭＲＧＸ２の試料と、結合した検出可能な標識を持つコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰまたはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物から選択されたリガンドを接触させること；
（ｂ）受容体ＭＲＧＸ２の同様の試料または前記細胞から調製された膜と、段階（ａ）で使用された標識リガンドおよび試験化合物または試験化合物の混合物の両方を接触させること；
（ｃ）使用したリガンドの結合が試験化合物または試験化合物の混合物の存在により影響を受けるか否かを調べるために（ａ）および（ｂ）において結合した標識の量を比較すること。
【請求項８】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１またはその変異体もしくは同族体を含む適切な発現ベクターを適切な宿主細胞に移入すること、および受容体の発現に適切な条件下で前記宿主細胞を培養することを含む、新規神経ペプチド受容体を発現するための方法。
【請求項９】
宿主細胞が哺乳動物細胞または昆虫細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
適切な細胞中でＭＲＧＸ２の発現をアップレギュレートすることを含む、新規神経ペプチド受容体を発現する方法。
【請求項１１】
ＭＲＧＸ２の試料が、請求項８、９もしくは１０のいずれか一つの方法により調製された細胞、天然にＭＲＧＸ２を発現する細胞、または前記細胞から調製された膜、もしくは前記細胞または膜から濃縮されたか、または調製されたＭＲＧＸ２蛋白質を含む、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
以下の段階を含む、新規神経ペプチド受容体のアゴニストのスクリーニングの方法：
（ａ）試験化合物または試験化合物の混合物を、ＭＲＧＸ２を発現する適切な細胞に添加すること、
（ｂ）機能的反応が見られるか否かを測定すること。
【請求項１３】
機能的反応が細胞内カルシウム濃度の一時的な上昇である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
機能的反応がマイクロフィジオメトリーにより測定された周囲培地の酸性化である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
機能的反応がサイクリックＡＭＰ反応要素に結合したレポーター遺伝子の活性化である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
以下の段階を含む、新規神経ペプチド受容体のアンタゴニストのスクリーニングの方法：
（ａ）試験化合物または試験化合物の混合物を、ＭＲＧＸ２を発現する適切な細胞に添加すること、
（ｂ）コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡ、サブスタンスＰ、もしくはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体または模倣物、または請求項１２から１５までのいずれかひとつの方法により同定されたアゴニストを添加すること；
（ｃ）機能的反応が見られるか否かを測定し、アゴニストに対する機能的反応を低下させる試験化合物としてアンタゴニストを同定すること。
【請求項１７】
ＭＲＧＸ２を発現する適切な細胞が天然にＭＲＧＸ２を発現する細胞、または請求項８、９もしくは１０のいずれか一つの方法により生み出された細胞である、請求項１２から１６までのいずれか一つの方法。
【請求項１８】
請求項５から７まで、または１２から１７までのいずれか一つの方法により同定された化合物。
【請求項１９】
請求項５から７まで、または１２から１７までのいずれか一つの方法を使用して同定された化合物、および適切な薬剤的に受容できるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項５から７まで、または１２から１７までのいずれか一つの方法を使用して、化合物が新規神経ペプチド受容体アゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを確認することを含む、医薬組成物を製造するための方法。
【請求項２１】
以下のことを含む、哺乳動物における新規神経ペプチド受容体‐媒介疾患を診断するための方法：
（ａ）ＭＲＧＸ２遺伝子発現のレベルを測定すること、または
（ｂ）患者試料におけるＭＲＧＸ２の神経ペプチド‐依存的活性を測定すること、および前記測定値を臨床的に正常な個体から求めたものと比較すること。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、たとえばコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡおよびサブスタンスＰであるがそれらに限定されない神経ペプチドの受容体としてのオーファンＧ‐蛋白質共役受容体ＭＲＧＸ２（およびその変異体）の同定、およびＭＲＧＸ２の調節物質としてのそのような神経ペプチド（および構造的に関連した分子）の使用に関する。また、それはＭＲＧＸ２のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｇ蛋白質共役受容体は広範囲のシグナル伝達経路に関与する、膜内在性蛋白質の大きなスーパーファミリーである。大部分のＧ蛋白質共役受容体は７回膜を貫通するヘリックスにより特徴付けられ、そのため７回膜貫通型受容体（７ＴＭｓ）とも呼ばれる。このファミリーには少なくとも数百のメンバーがあり、それらにはペプチド、生体アミン、脂質、神経伝達物質、ホルモン、ヌクレオチド、糖‐ヌクレオチド、サイトカインなどを含む、広範囲の異なる刺激に反応する受容体が含まれる。構造的には、このファミリーの受容体は細胞外アミノ末端ドメイン、７回膜貫通疎水性領域、３つは細胞外であり他の３つは細胞内である６ループ領域、および細胞内カルボキシ末端ドメインからなる。疎水性領域は、このファミリーの異なるメンバー間でかなりの相同性を示すが、ループ領域ならびにアミノおよびカルボキシ末端ドメインはかなり多様であり、密接に関連した受容体サブタイプ間でだけ高い相同性を示す。
【０００３】
配列相同性の分析を通して、このスーパーファミリーはファミリーおよびサブファミリーに下位分割することができる；たとえば、一般にペプチドリガンドを持つ受容体は、たとえば生理活性アミンまたは脂質などに反応するものよりペプチドリガンドに反応する他のＧＰＣＲｓにより大きな配列相同性を示す。
【０００４】
この受容体ファミリーの保存された構造および疎水性の特徴が、クローニング実験、たとえば変性ポリメラーゼ連鎖反応、または低いストリンジェンシーを利用したＧＰＣＲ配列由来のプローブによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、および配列データベースのバイオインフォマティックマイニングの両方により、このファミリーの多くのメンバーの同定およびクローニングを可能にしてきた。これらの受容体の多くについては、それらの天然のリガンドおよび機能がどのようなものであるか現在のところ明確ではない。これらの受容体は‘オーファン受容体’と呼ばれる。それらの配列の詳細な解析および既知のリガンドを持つＧＰＣＲｓの配列との比較により、オーファン受容体が反応すると思われるリガンドのクラスに関する仮説を立てることができる。
【０００５】
しかし、これらの予測はしばしばあいまいで、そのようなオーファン受容体が反応するであろうと考えられるリガンドを同定することは依然として困難である。これは主にＧＰＣＲｓの刺激が、異なるＧ蛋白質へのカップリングにより媒介される多数の異なる細胞内作用を導くことができるからである。そのようなＧ蛋白質は、ホスホリパーゼＣ、アデニル酸シクラーゼおよびイオンチャネルを含むシグナル伝達蛋白質のすべての範囲に作用し、それによって細胞内事象のカスケードを開始する。
【０００６】
Ｇ蛋白質はヘテロ三量体複合体で、α、およびβγ‐サブユニットを含む。少なくとも、２０のヒト遺伝子がＧＴＰ‐結合αサブユニットをコードすることが知られている。αサブユニットファミリーはそれらの相同性を基にして、４つのサブファミリーに分割される：
‐Ｇｓファミリーは、典型的には、共役する受容体にアゴニストが結合するとアデニル酸シクラーゼを刺激し、そして細胞内サイクリックＡＭＰを上昇させることができる。
‐Ｇｑα、Ｇ１１α、Ｇ１４α、Ｇ１６αを含むＧｑファミリーはホスホリパーゼＣを活性化させる。
‐Ｇ１２およびＧ１３は小分子量のＧ蛋白質のクラスおよびＮａ＋‐Ｈ＋交換を調節すると考えられる。
‐Ｇｉファミリーは、一般にアデニル酸シクラーゼの阻害を媒介する。αサブユニットの半分以上はＧｉファミリーのメンバーでありそして、至る所に発現され、そしてほとんど同一のＧｉ１α、Ｇｉ２αおよびＧｉ３α、ならびにたとえばＧｚα、Ｇｏαおよびトランスデューシンのような限定された発現をするいくつかを含む。
【０００７】
さらに、βサブユニットをコードする少なくとも５遺伝子、およびγサブユニットをコードする少なくとも１１遺伝子がある。
簡潔に述べると、Ｇ蛋白質を含むシグナル伝達カスケードの開始は、Ｇ蛋白質共役受容体（ＧＰＣＲ）へのアゴニストリガンドの結合を必要とする。このことが結果としてＧＰＣＲの立体配座を安定化し、コグネイトＧ蛋白質のＧαサブユニットのヌクレオチド結合ポケットからの結合ＧＤＰの解離速度を上昇させる。したがってＧＴＰの結合が可能になる。ＧＴＰが結合すると、Ｇ蛋白質はＧＴＰ‐ＧαおよびＧβγ部分に解離し、直接または別の方法で、細胞内シグナル伝達分子（たとえばサイクリックＡＭＰ）を生成するいくつかの酵素の活性、および一連のイオンチャネルの開口の可能性を調節することができる（Ｇｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．（１９８７）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６，６１４−６４９）。Ｇ蛋白質活性化に続き、内在性ＧＴＰアーゼ活性による結合ＧＴＰの加水分解が、効果器を調節する能力を停止させ、α‐ＧＤＰとβγを再会合させる。したがって、Ｇ蛋白質は受容体から効果器までシグナルを伝達する中継器として、およびシグナルの持続時間を調節する時計としての二重の役割を果たす。したがって、ＧＰＣＲがどのＧ蛋白質に共役するかに依存して、非常に異なる細胞内作用、たとえばアデニル酸シクラーゼの刺激または阻害、細胞内サイクリックＡＭＰ濃度の上昇または減少の誘導、イオンチャネルの開口などが結果として生じてもよい。
【０００８】
ＧＰＣＲの配列から、どのＧ蛋白質にそれが共役するかを予測することは困難であり、いくつかの場合は結果として起こる細胞内作用を測定することも困難である。さらに、クローニングされたＧＰＣＲｓの異種発現に使用される通常の宿主細胞は、あるＧ蛋白質だけしか発現しない：オーファンＧＰＣＲが共役するＧ蛋白質がこれらの細胞で発現されない場合、この受容体へのアゴニストの結合は測定可能な作用を持たず、そのような系におけるＧＰＣＲのアゴニスト（複数のアゴニスト）を見出す見込みはないであろう。
【０００９】
したがって、各種の異種Ｇ蛋白質を発現する分化した宿主細胞系統を設計し、多くの異なるＧＰＣＲｓに対して測定可能な反応をすることができる宿主細胞系統を樹立することが必要であった。また、Ｇα１５もしくはＧα１６のような、ホスホリパーゼＣ経路にいくつかのＧＰＣＲｓのクラスを共役させると考えられる、多様な相手をもつＧ蛋白質（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ，Ｓ＆Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２７０，１５１７５−１５１８０）、またはたとえばホスホリパーゼＣ経路のような同じ経路に多数の異なるＧＰＣＲｓを共役させるように設計されたキメラＧ蛋白質（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ＆Ｒｅｅｓ，Ｓ（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　２０，１１８−１２４）がある。これらのＧ蛋白質の一つを発現するように設計された宿主細胞系統は、それらの内因性Ｇαサブユニットだけを発現するものより各種ＧＰＣＲｓのアゴニストに対して測定可能な反応を示す見込みが大きい。
【００１０】
ＧＰＣＲｓは薬剤的介入のための重要な標的であり、機能が既知の多くのＧＰＣＲｓのアゴニストおよびアンタゴニストは疾患の治療に重要である。例としては、高血圧、アンギナおよび心臓疾患を治療するために使用されるβ１−アドレナリン受容体アンタゴニスト、精神分裂病の治療に使用されるドパミンＤ２アンタゴニスト、および喘息の治療に使用されるβ２−アドレナリン受容体アゴニストなどが挙げられるが、それらに限定されない。過去１５年間にわたり、ＧＰＣＲｓを標的にしたおよそ３５０の治療薬が市場に導入され、臨床的に処方された薬物の約３０％がＧＰＣＲｓのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能すると推測される。
【００１１】
したがって、オーファン受容体のなかに、以下のものを含むがそれらに限定されない疾患または機能障害の治療または予防に重要な役割を果たす、別の治療標的があると考えられる：睡眠障害、疼痛、癌、肥満、摂食障害、高血圧、低血圧、心臓疾患、尿失禁、喘息、慢性気管支炎、アンギナ、潰瘍、精神および神経疾患、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２を含むウイルス感染、他の感染、炎症状態、性的機能障害、泌尿生殖器疾患ならびに多くの他の疾患、病気または機能障害。したがって、それぞれのＧＰＣＲのリガンドおよび生理的機能を見出すことが明らかに非常に望ましい。
【００１２】
ＭＲＧＸ２はＤｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ（２００１）Ｃｅｌｌ　１０６，６１９−６３２に記載されたが、その配列は発行者のウェブサイト
【００１３】
【化１】
2004033211.tif 000002
上で利用可能な補足情報でだけ開示され、この受容体の特徴はこの刊行物に全く提示されていない。また、この受容体の配列は、たとえばＷＯ　０１／１９９８３，ＷＯ　０１／４８０１５、またはＷＯ　０１／１６１５９のようないくつかの特許出願中に開示される。しかし、知る限りでは、この受容体の内因性リガンドは現在まで開示されていない。
【００１４】
ＭＲＧＸ２は、マウスＭＲＧＡ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０４２１９１）によりＣＥＬＥＲＡデータベースを探索するＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ｈｉｄｄｅｎ　ｍａｒｋｏｖ　ｍｏｄｅｌｓを使用してＤｏｎｇ　ｅｔ　ａｌが同定した４つのヒト遺伝子のうちの一つである。ヒト受容体ファミリーは、６５％より多い高い配列相同性を共有し、系統発生的解析は明白なオーソログ対がないことを明確に示す（Ｄｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ（２００１）Ｃｅｌｌ　１０６，６１９−６３２の図１を参照されたい）。パブリックドメイン内では、後根受容体（Ｄｏｒｓａｌ　Ｒｏｏｔ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）ＤＲＲ１−６または感覚ニューロン感知受容体（Ｓｅｎｓｏｒｙ　Ｎｅｕｒｏｎｅ　Ｓｅｎｓｉｎｇ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）ＳＮＳＲ　１−６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号　ＡＦ４７４９８７，ＡＦ４７４９８８，ＡＦ４７４９８９、ＡＦ４７４９９０，ＡＦ４７４９９１、ＡＦ４７４９９２）のいずれかで呼ばれる多数の付加的な配列があり、ＭＲＧＸ２は記載されたこれらに付加的である。しかし、ＳＮＳＲ１−６配列から、６よりむしろ３の異なる遺伝子があるにすぎないということを証明することができる。このことは多数のバイオインフォマティック探索から結論された。第１に、ＣＥＬＥＲＡデータベースに対するＢＬＡＳＴを使用した探索は、ＳＮＳＲ１および２，ＳＮＳＲ３および４，ならびにＳＮＳＲ５および６はそれぞれ同じ遺伝子座に相当し、さらにＥＳＴデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃ）の探索は、それぞれ同一の３′および５′非翻訳領域を持つＳＮＳＲ１および２，ＳＮＳＲ３および４，ならびにＳＮＳＲ５および６由来のクローンを同定し、したがってこのデータはＳＮＳＲ受容体をコードする遺伝子は６よりむしろ３にすぎないことを支持する。さらに、現在の命名法に従って本発明者らがＭＲＧＸ５を再命名したファミリーｈＧＰＣＲ４５（ＡＢ０８３６２７）の別のメンバーは４１％同一であると同定された。
【００１５】
この受容体ファミリー内の配列多様性の意義について推測することは興味深いが、コグネイト内因性リガンドはこれからヒトゲノムから同定されなければならないこと、またはリガンド活性化の異なる性質がこのファミリーの機能的に同等の細胞型内での段階的な調節を可能にするという事実は理解できないかもしれない。驚くべきことに、すべてのヒト受容体は染色体１１に位置し、それはまた全ヒト嗅覚受容体遺伝子の５０％を含み（Ｇｌｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１１，６８５−７０２）、そして嗅覚受容体の機能的調節と証明されていないこのファミリー間には類似性があってもよい。
【００１６】
本発明によれば、この受容体を刺激するいくつかの神経ペプチドが同定されている。
最も高親和性のリガンドはコルチスタチン（ＣＳＴ）で、それはヒトにおいて１１４残基のプレプロペプチド由来の環状ペプチドである（Ｌｅｃｅａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４２，４９９）。前駆体の蛋白分解開裂により、少なくとも４ペプチド、すなわちｈＣＳＴ２１，ｈＣＳＴ３１，ｈＣＳＴ２９およびｈＣＳＴ１７を同定できることが示されている。配列解析は、受容体へのソマトスタチン（ＳＳＴ）の結合に必須であることが示されているモチーフＦＷＫＴを含めて、遺伝子構造およびペプチドレベルの両方においてＣＳＴがＳＳＴに密接に関連しているということを示している（Ｖｅｒｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ　２８０，５１２）。ＣＳＴおよびＳＳＴはともに、配列、構造および進化の関連性の異なる程度を有する、全体で約２０のより広い神経ペプチドファミリーのメンバーである；これらはオピオイド、バソプレッシン、オキシトシン、コルチコトロピン放出因子、ウロテンシンＩＩ、メラニン濃縮ホルモン、神経ペプチドＹ、その他を含む（Ｃｏｎｌｏｎ　ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ　６９，９５，Ｄａｒｌｉｓｏｎ　ｅｔ．ａｌ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　２２，８１）。また、ＳＳＴおよび類似体はウロテンシンＩＩ自体よりも低い濃度にもかかわらず、ＧＰＲ１４を活性化することができるということが示されている。しかし、ＣＳＴはＧＰＲ１４またはいずれの既知のオピオイド受容体にも結合しないということが示されている（Ｃｏｎｎｏｒ　ｅｔ　ａｌ（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　１２２，１５６７，Ｎｏｔｈａｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ（１９９９）Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１，３８３）。
【００１７】
ＣＳＴは、特異的ラット脳遺伝子を同定するためのサブトラクティブハイブリダイゼーション技術を使用して初めて同定された（Ｌｅｃｅａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　３８１，２４２）。同定された蛋白質は大脳皮質で主に発現されることから、プレコルチスタチンと命名された。ＣＳＴおよびＳＳＴの高い類似性にもかかわらず、それらは異なる遺伝子の生成物である（Ｌｅｃｅａｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４２，４９９）ことが示され、これらが初期の遺伝子複製事象のために出現することを暗示する。興味深いことに、ＣＳＴの染色体局在位置、１ｐ３６は神経芽細胞腫感受性遺伝子をコードする領域を含むことが示されている。ＣＳＴはマウス、ラットおよびヒトからクローニングされていて、種間に高い配列相同性がある：ペプチドレベルで、マウスとラット間では８６％、ヒトとラット間では７１％（Ｌｅｃｅａ．ｅｔ．ａｌ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４２，４９９）。興味深いことに、マウスではプロテアーゼ開裂部位を除去する遺伝的欠失のために、ただ一つの生理的に適切なペプチド（ｍＣＳＴ１４）だけが開裂される。
【００１８】
ＣＳＴはＥＳＴデータベースの解析により示されるように、ヒトの胎児心臓、胎児肺、前立腺、結腸および多くの腫瘍において発現される。マウスおよびラットのｉｎ　ｓｉｔｕでの証拠は、大脳皮質および海馬における発現、線条体および嗅球でのより弱いシグナル、視床下部、中脳、脊髄、視床または小脳における発現がないことを示す（Ｌｅｃｅａ．ｅｔ．ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　３８１，２４２；Ｌｅｃｅａ．ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，５８６８；Ｌｅｃｅａ．ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４２，４９９）。共局在の研究によれば、ＣＳＴがＳＳＴと類似して、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにおいてだけに発現されるが、完全には重複しないので、脳のニューロン集団はいずれか、または両方のスタチンを含む（Ｌｅｃｅａ　ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，５８６８）。
【００１９】
予想されるように、ＣＳＴの薬理学はＳＳＴに類似する。ＣＳＴは５つの既知のＳＳＴ受容体に高い親和性を有し、ＥＣ５０値はＳＳＴに匹敵する０．２５〜０．９ｎＭの範囲である（Ｆｕｈｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１８，１２８７；Ｏ’Ｄｏｗｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２８，８４）。ＣＳＴペプチドの発現解析は、これが概日周期および睡眠混乱により調節されていることを示し、睡眠調節物質としてのＣＳＴの機能を暗示している。これを支持する証拠は、ＣＳＴが皮質ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにより合成され、睡眠妨害中に増加（４倍）し、選択的に徐波睡眠を促進し、そして神経活性を低下させることを示す。さらに、ＣＳＴはそれ自体ＲＥＭ睡眠誘導物質であるアセチルコリンの作用を妨害する（Ｌｅｃｅａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｓｏｃ．ＮｅｕｒｏＳｃｉ．Ａｂｓｔｒ．２４　ｐ１４２９）。睡眠に対するＣＳＴの作用はＳＳＴ受容体へのＣＳＴの作用により完全に説明することはできず、ＣＳＴ特異的受容体が存在するかもしれないことを暗示する。これを支持する別の証拠は、ＳＳＴを投与した場合は運動性が亢進するのに比べ、ＣＳＴのＩＣＶ注入は運動性を低下させること、およびＲＥＭ睡眠に対するＣＳＴおよびＳＳＴの作用が逆であることも示す。
【００２０】
マウスではまた、ＣＳＴは訓練後の記憶処理を損なうことが示されていて、脳卒中に関連すると考えられる（Ｆｌｏｏｄ　Ｊ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ（１９９７）Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　７７５，２５０−２５２）。ヒトでは、最近の報告はＣＳＴが内分泌活性を有することを示唆し、ＧＨＲＨおよびグレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）と相互作用することが見出され、糖尿病および癌への予想される関連を提供する。
【００２１】
本発明者らの結果は、ＣＳＴがＭＲＧＸ２の内因性リガンドであることを示す：ＳＳＴ受容体とＭＲＧＸ２間に有意な配列相同性はないが、リガンド特異性を与える重要な残基は保存されているであろうということを推測することができる。このようなことは当技術分野で知られていないことではない。別の例としてはヒスタミンＨ２受容体とＨ３受容体間の約２５％の低い配列相同性が挙げられるが、それらは共に高親和性でヒスタミンを結合する。
【００２２】
代わりとなる高親和性のリガンドはソマトスタチン（ＳＳＴ）であり、それは多くの内分泌機能を持つ、１４アミノ酸（２８アミノ酸の形状もある）の環状ペプチドであり、多くのホルモンのように、より大きな前駆体蛋白質から開裂される。ソマトスタチンは成長ホルモンの下垂体分泌、グルカゴンおよびインスリンの膵臓分泌、および腸からのガストリンの分泌を阻害する。また、ソマトスタチンは神経伝達物質／神経調節物質としても作用する（一般的説明として、Ｓ．Ｊ．Ｈｏｃａｒｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１，１１４６−１１５４を参照されたい）。ソマトスタチンの生物学的作用は明らかに本来すべて阻害性であり、標的細胞の表面に結合すると引き起こされる。ソマトスタチンの既知の受容体は膜貫通蛋白質であり、そしてＧ蛋白質に共役している。ソマトスタチンが受容体に結合すると、受容体は立体配座の変化を受け、受容体の細胞質面でのＧ蛋白質との相互作用を促進すると考えられている。これはＧ蛋白質におけるＧＴＰ／ＧＤＰの結合または遊離を促進し、細胞内のいっそうの活性化およびシグナル伝達事象を導く。とりわけ、ソマトスタチンのそれ自体のＧ蛋白質共役受容体における結合は、サイクリックＡＭＰの産生に必要なアデニル酸シクラーゼ活性に対し負に共役している。したがって、これらのさらなるシグナル伝達事象は（たとえば、カルシウムイオンまたはサイクリックＡＭＰにより媒介されるような）、ＧＨＲＰ（成長ホルモン関連ペプチド）およびＧＨＲＨ（成長ホルモン関連ホルモン）がそのようなシグナル伝達事象がなければ細胞質貯蔵顆粒から成長ホルモンの細胞外分泌を引き起こすはずの機序を妨害するであろう。それについての一般的総説としては、Ｔｈｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｋｅｎｄｒｅｗ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｔｄ．１９９４，ｐ３８７を参照されたい。標的細胞へのソマトスタチンの作用は、少なくとも受容体の５クラス（ｓｓｔ１〜ｓｓｔ５）により媒介される。受容体はソマトスタチンに類似した親和性を有するかもしれないが、それらは異なる組織に異なって発現され、直接的または間接的に、異なる細胞内シグナル伝達成分とともに配置され相互作用する。受容体発現のこの組織特異性は、異なる標的細胞型におけるソマトスタチンの異なる作用の大部分を説明する。既知のソマトスタチン受容体は、たとえば下垂体前葉組織、他の脳組織、膵臓、肺、リンパ球上、および腸管の粘膜細胞上に見出される。
【００２３】
ＭＲＧＸ２受容体は、１３アミノ酸の内因性オピオイド受容体アゴニストである、ダイノルフィン‐Ａ（Ｄｙｎ　Ａ）への反応も示す。β‐エンドルフィンとは全く異なる性質を有するブタ下垂体由来のオピオイドペプチドが同定され、単離された１９７５年にＤｙｎ　Ａは発見された。このペプチドは、より低い見かけの分子量と、より高い塩基性を有することが見出された。また、それはモルモット回腸バイオアッセイにおいてβ‐エンドルフィンより持続的な作用を示した。別の興味ある発見は、この新規物質の生物学的活性が臭化シアン処理に完全に耐性であったことで、このことはメチオニン残基がその活性に全く必要でないことを示唆した。最後に、ペプチドは精製され、その１３Ｎ−末端残基の配列は微小配列決定法により決定された。この精製されたペプチドの生物学的活性は非常に興味深いものであった。ＧＰＩアッセイにおいて、それはこれまで知られたすべての他の天然に存在する内因性オピオイドペプチドの中で最も強力なもので、β‐エンドルフィンより５０倍強力、〔Ｌｅｕ〕‐エンケファリンより７００倍強力、そしてノルモルフィンより約２００倍強力であった。その並はずれた効力を示すために、その天然のペプチドはダイノルフィン（ｄｙｎは力を意味する）と命名された。
【００２４】
ダイノルフィンは鎮痛に関与することが報告されている；しかし、ＤｙｎＡの鎮痛作用に関する報告は特有であった。他のオピオイドペプチドと異なり、ＤｙｎＡおよび関連するペプチドはＩＣＶ（脳室内）に投与した場合、ラットｔａｉｌ　ｆｌｉｃｋ試験またはホットプレート試験のような熱を使用した加熱式鎮痛アッセイにおいて効果がないことが見出されている。しかし、足部ショックに対するフリンチ‐ジャンプ（ｆｌｉｎｃｈ‐ｊｕｍｐ）反応、脚圧（ｐａｗ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）試験またはｔａｉｌ　ｐｉｎｃｈ試験のような非加熱式および機械的鎮痛試験では、これらのペプチドは脳室内に適度の鎮痛作用を有することが報告されている。脊髄投与の報告も矛盾している。身もだえ（ｗｒｉｔｈｉｎｇ）試験では、ＤｙｎＡ（１−１３）および他のより小さなフラグメントは非常に強力であることが見出されていて、ナロキソンまたはノル‐ビナルトルフィミン（ｎｏｒＢＮＩ）の存在により、影響を受けなかった。このことは、脊髄の鎮痛が非オピオイド受容体により媒介されることを示す。ＤｙｎＡ（１−１３）の脊髄または脊髄上投与の結果得られる鎮痛は、抗侵害作用の評価を損なう非オピオイド作用（運動妨害、脊髄損傷および後脚麻痺）を伴う。ＤｙｎＡの運動作用は興奮性アミノ酸活性の予想される亢進のためであると考えられた。ＤｙｎＡ（１−１３）の運動作用における、オピオイド受容体よりむしろＮＭＤＡ受容体の関与には、興奮性アミノ酸の分泌を誘発することが知られている現象である局所虚血が伴った。これらの矛盾する発見にもかかわらず、ＤｙｎＡ（１−１３）およびＤｙｎＡ（１−１０）アミドは、癌患者の難治性疼痛の治療に首尾よく使用されて来た。したがって、ＤｙｎＡは初めに強力な内因性オピオイドペプチドとして記載されたが、その生理学的または病態生理学的機能は、ＤｙｎＡと非オピオイド受容体との相互作用にも依存すると提案された。
【００２５】
また、ＤｙｎＡは心血管機能を調節することが知られている。このことはＣＮＳおよび末梢レベルで共に観察可能であり、オピオイドおよび非オピオイド受容体の両方により媒介される。麻酔された動物におけるＤｙｎＡ（１−１３）およびＤｙｎＡ（１−１０）−ＮＨ２の静脈内投与は徐脈を伴った低血圧を引き起こし、両者の反応はともにナロキソンおよびκオピオイド受容体アンタゴニストであるＭＲ−２２６６により阻害されることが報告されている。しかし、意識のある動物ではＤｙｎＡ（１−１３）の静脈内投与は高血圧および徐脈を引き起こす。興味深いことに、これらの作用はＭＲ−２２６６により拮抗されないが、Ａｒｇ８−バソプレッシン（ＡＶＰ−Ｖ１）アンタゴニストｄ（Ｃｈ２０５Ｔｙｒ（Ｍｅ））ＡＶＰにより拮抗され、ＤｙｎＡとＡＶＰ−Ｖ１受容体との予想される相互作用を示唆する。まとめると、これらのデータは、ラットにおけるＤｙｎＡ（１−１３）の静脈内投与は動物の意識状態に依存して、降圧および昇圧作用を共に引き起こすことを示唆し、そしてこれらの作用は、それぞれオピオイドおよび非オピオイド受容体により媒介される可能性が高い。また、ダイノルフィンＡ関連ペプチドは神経末端からのノルエピネフリンの放出を調節することが示されている。さらに、ＤｙｎＡおよび関連ペプチドはそのうえ心臓にも多様な作用を引き起こす。また、いくつかの研究はＤｙｎＡおよびκオピオイド受容体が出血性ショックおよび虚血再潅流損傷に関与することを示唆している。ダイノルフィンＡおよび関連ペプチドが２つの逆の作用を誘発することに注目することは興味深い：１つは前シナプスまたは後シナプスオピオイド受容体刺激の結果引き起こされる低血圧で、シナプス神経末端からのノルエピネフリンの放出を阻害する；他はダイノルフィン特異的非オピオイド受容体の刺激によるノルエピネフリン取り込みの阻害により引き起こされる高血圧である。したがって、ダイノルフィンのＣＮＳ作用はオピオイドおよび非オピオイド受容体に関与する二重の機序により媒介されると結論することができる。しかし、ダイノルフィンによるオピオイドおよび非オピオイド受容体刺激の明確な機序はいまだに完全に解明されていない。
【００２６】
オピオイドによる宿主免疫系の調節は、このクラスの化合物の最も重要な生物学的活性の一つとして知られている。また、ＤｙｎＡはマウスの免疫系に予想される作用を有することが研究されている。ＤｙｎＡがマウスに投与された場合、用量依存的にマウス腹腔マクロファージの食作用の促進を示すことが観察されている。またその研究は、同じ実験で、ＤｙｎＡ（１−１３）およびＤｙｎＡ（６−１７）がＤｙｎＡより効果的ではないが、食作用を促進できることを示した。ナロキソンがＤｙｎＡにより誘発された食作用の促進を阻害せず、免疫調節作用を引き起こすためのおそらく他の受容体（非オピオイド）の関与を示唆していることに注目することは興味深い。
【００２７】
また、本発明者らはＭＲＧＸ２受容体がサブスタンスＰに反応を示すことを見出している。サブスタンスＰの発見は８０年前なので、それは平滑筋、たとえば膀胱、消化器系、および他の内部臓器の筋肉組織の収縮に役割を果たしていることが知られている。脳では、ニューロキニンとして知られる群の最も豊富なメンバーであるこのペプチドは神経調節物質‐ニューロン間のメッセージを伝達し、神経回路の全体的な反応性を調節する化合物として機能する。既知のサブスタンスＰ受容体は、ＮＫ１受容体としても既知のＧ蛋白質共役受容体である。
【００２８】
またＭＲＧＸ２受容体は、１９８５年にＹａｎｇ　ｅｔ　ａｌ（（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ　８２，７７５７−７７６１）により、軟体動物神経ペプチドＦＭＲＦアミド（ＦＭＲＦａ）に対する抗体を使用してウシ脳から単離されたオクタペプチドである神経ペプチドＦＦ（ＮＰＦＦ）に反応する。ＦＭＲＦアミド様の免疫活性はラット脳、脊髄、および下垂体で観察され、無脊椎動物ペプチドのＦＭＲＦａファミリーの哺乳動物同族体の存在を示唆した。Ｎ−およびＣ−末端フェニルアラニンの名をとって名付けられたＮＰＦＦ（Ｆ８Ｆアミドとも呼ばれる）および第２の哺乳動物ペプチド、ＮＰＡＦ（Ａ１８Ｆアミドとも呼ばれる）の単離はＦＭＲＦａとＣ−末端の配列相同性を共有するペプチドの哺乳動物ファミリーの存在を確証した。分子クローニングは、ＮＰＦＦおよびＮＰＡＦが同じ遺伝子によりコードされ、共通の前駆体蛋白質から開裂されることを明らかにしている。ＮＰＦＦ様ペプチドの局在、放射リガンド結合、および機能の研究は、それらが神経調節ペプチドで、それらの作用はＧ蛋白質共役受容体により媒介されるらしいことを示唆する。ＮＰＦＦは“モルヒネ調節ペプチド”とも呼ばれ、モルヒネ鎮痛、耐性、および禁断症状に対して作用を持つオピオイド系の内因性調節物質である。ＮＰＦＦは、オピエート受容体とは異なる特異的、高親和性受容体において作用するＣＮＳの内因性“抗オピオイド”系を表すと考えられる。内因性ＮＰＦＦは、モルヒネ耐性に役割を果たすことが示唆されている；ＮＰＦＦのアゴニストはモルヒネ依存性動物に“モルヒネ禁断症候群”（すなわち、モルヒネ禁断症状の症状）を突然引き起こすが、アンタゴニストおよび抗ＮＰＦＦＩｇＧはモルヒネ感受性を回復させ、禁断症状の症状を改善する。ＮＰＦＦアンタゴニストはモルヒネ耐性の進行を阻害するための、およびオピエート中毒を治療するための治療薬として潜在的に有用であろう。
【００２９】
ＮＰＦＦは痛覚閾値の調節に関与することが示唆されていて、試験系および投与経路に依存して“抗オピエート”作用および鎮痛作用を共に示す。抗オピエートとして、ＮＰＦＦはモルヒネ‐およびストレス‐誘発鎮痛を阻害することが示されているが、抗ＮＰＦＦＩｇＧ（ＮＰＦＦの生物学的活性を阻害する）はこれら２つの現象を促進する。ＮＰＦＦアンタゴニストはモルヒネの鎮痛作用の促進に臨床的に有用で、耐性を発現せずにより低用量の使用を可能にするかもしれない。また、ＮＰＦＦアゴニストはいくつかのモデル系において鎮痛活性を示すかも知れない。ＮＰＦＦにより引き起こされた鎮痛は、一般にナロキソンに感受性で、それが内因性オピオイドペプチドの放出に媒介されることを示唆する。したがって、疼痛経路の調節におけるＮＰＦＦおよびオピオイド系の相互作用は複雑で複数の機序および作用部位が関与するかもしれない。ＮＰＦＦは神経系における発現パターンと一致して付加的な生物学的活性を有する。ラットＣＮＳにおけるＮＰＦＦペプチドの局在は、特異的抗体を使用して調べられた。ＮＰＦＦの最も高いレベルは、脊髄および下垂体後葉に見出される；下垂体ＮＰＦＦは視床下部に由来すると考えられる。脳では、免疫反応性細胞体が２つの主な細胞群に見出される：視床下部内側野（背内側と腹内側の間）および孤束核。免疫反応性線維は外側中隔核、扁桃核、視床下部、孤束核、腹側髄質、三叉神経複合体、および脊髄後角に観察される。この局在パターンは感覚プロセッシングおよびオピオイド系の調節におけるＮＰＦＦの役割に一致する。さらに、視床下部および他の辺縁系構造におけるその存在は、欲求および情動状態の調節における役割を促進することができる。末梢では、ＮＰＦＦ様免疫反応性（およびＮＰＦＦ結合）が心臓において観察されている。さらに、ＮＰＦＦの注入はラットにおいて血圧を上昇させる。これらの観察は、孤束核におけるＮＰＦＦとカテコールアミン作動性ニューロンの共局在と併せて、ＮＰＦＦが中枢および末梢心血管系の調節に関与することを示唆する。ＮＰＦＦペプチドがオピオイド系を調節する能力は、ＮＰＦＦがオピエート受容体と直接相互作用する可能性を高めた。しかし、チロシン置換ＮＰＦＦ類似体〔１２５Ｉ〕］Ｙ８Ｆａを使用した放射リガンド結合試験は、ＮＰＦＦがグアニンヌクレオチドによる阻害に感受性があるオピエート受容体とは異なる特異的高親和性結合部位を介して作用することを示す。
【００３０】
ＭＲＧＸ２受容体はＨＳ０２４（アセチル−Ｃｙｓ３，Ｎｌｅ４，Ａｒｇ５，Ｄ−Ｎａｌ７，Ｃｙｓ１１）−α−ＭＳＨ（３−１１）アミドに強力な反応を示し、α−ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）およびγ−ＭＳＨにも１μＭの濃度で反応する。α−ＭＳＨは末梢炎症細胞、グリア細胞のような脳の炎症細胞、および下行抗炎症神経経路を活性化するＣＮＳ受容体への直接作用により炎症の多くの形状を調節する。α−ＭＳＨの多様な作用は、それがＮＦκＢの阻害を含むいくつかの生化学的機序を介してその作用を調節することを示唆する（Ｌｉｐｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ（１９９９）Ａｎｎ　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８８５，１７３−１８２）。また、α−ＭＳＨはグラム陽性菌に対して抑制性の影響を示していて、慢性的および急性的に感染したヒト単球におけるＨＩＶ複製を減ずる（Ｃａｔａｎｉａ　ｅｔ　ａｌ（２０００）Ａｎｎ　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　９１７，２２７−２３１）。
【００３１】
ＨＳ０２４はメラノコルチン（ＭＣ）受容体ファミリーにおけるアンタゴニストとして使用のための新規環状α−ＭＳＨ類似体として合成された（Ｋａｓｋ　ｅｔ　ａｌ（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３９，５００６−５０１４）。ＭＣ１〜５受容体と呼ばれるＭＣ受容体の５クラスがある。ＨＳ０２４はＭＣ１，３，４および５受容体を発現する細胞においてα−ＭＳＨ誘発ｃＡＭＰ反応に拮抗することが示されているが、ＭＣ４受容体に対して２０倍の選択性および高親和性（Ｋｉ‐０．２９ｎＭ）を示す。本発明者らはＭＲＧＸ２においてＨＳ０２４がアゴニストとして作用することを示している。自由摂食ラットにおけるＨＳ０２４のＩ．ｃ．ｖ．投与は、食物摂取の用量依存的な増加を引き起こし、最大反応は投与量１ｎｍｏｌで見られた。この量を投与された数匹のラットはオプタラムス（ｏｐｔｈａｌａｍｕｓ）および連続横転行動を示した。環状α−ＭＳＨ類似体の高用量による食行動調節の失敗は、鎮静作用のためであることが示唆される。この作用は、とりわけ非ソマトスタチン受容体媒介機序によるコルチスタチンの睡眠誘導作用の証拠と関連付けて考えるとき、ＭＲＧＸ２との相互作用のためであると推測することは興味深い。
【００３２】
ウシ副腎髄質ペプチド２２（ＢＡＭ２２）およびその断片はＭＲＧＸ２においてアゴニストとして作用する。ＢＡＭ２２は２２アミノ酸ペプチドで、プロエンケファリンＡ前駆体の蛋白分解性開裂により生み出され、それぞれＥＣ５０が１３および１６ｎＭであるＳＮＳＲ３＆４（ＭＲＧＸ１）受容体の内因性リガンドとして同定されている（Ｌｅｍｂｒｏ　ｅｔ　ａｌ、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　５，２０１−２０９）。また、ＢＡＭ２２は高親和性で３つすべてのオピオイド受容体サブタイプに結合することが既知であり、オピオイド系薬物の作用と競合すること、およびそれらを模倣することができる。ＢＡＭ２２は脳、消化管組織、膵臓ランゲルハンス島および血漿にわたって分布する。ＢＡＭ８−２２は侵害反応を調節することが示されている。ＢＡＭ８−２２処理ラットは、亢進した接触反応屈筋反射、ならびに機械的および熱的感受性亢進の誘発を示した（Ｃａｏ　ｅｔ　ａｌ，１０ｔｈ　Ｗｏｒｌｄ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｐａｉｎ，Ａｕｇｕｓｔ　１７−２２，２００２）。侵害刺激における機能だけでなく、ＢＡＭ２２は反射性膀胱収縮の阻害、消化管通過（Ｐｏｒｒｅｃａ　ｅｔ　ａｌ（１９８５）Ａｄｖ．Ｐａｉｎ　Ｒｅｓ。Ｔｈｅｒ．）および自然発症高血圧の進行（Ｈｏｅｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ（１９８９）２（７）５４２−５４８）にも関与している。
【００３３】
ＭＲＧＸ２はコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，αＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡおよびサブスタンスＰにより活性化されるという発見、および後根神経節、血管平滑筋、脳、心臓、および炎症性細胞型におけるこの受容体の発現は、ＭＲＧＸ２がこれらのリガンドが生理的機能を発揮する機序に関与する受容体であることを示唆する。
【００３４】
この受容体の組織分布に関係して、リガンドの生物学的作用が同定される場合、この受容体のアゴニストおよびアンタゴニストはすべての型の睡眠障害、疼痛、脳卒中、記憶障害、糖尿病、癌、肥満、心血管障害、鬱病、性的機能不全、尿路および膀胱疾患、抗炎症処置、消化管疾患、および他の疾患の処置のための治療薬であろう。
【００３５】
【発明が解決しようとする課題】および
【課題を解決するための手段】
本発明の一態様は、神経ペプチド、好ましくはコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡおよびサブスタンスＰ、またはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物の、受容体ＭＲＧＸ２のリガンドとして、好ましくは調節物質として、さらにいっそう好ましくは受容体ＭＲＧＸ２のアゴニストとしての使用である。好ましくは、受容体ＭＲＧＸ２のリガンドとして、好ましくは調節物質として、さらにいっそう好ましくはアゴニストとして作用する神経ペプチドは、内部ジスルフィド結合を形成し、したがって環状神経ペプチドである神経ペプチドである。本発明の好ましい態様において、神経ペプチド、好ましくはコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰ、またはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物は、受容体ＭＲＧＸ２に機能的反応を引き起こすために使用される。好ましい態様は、ＭＲＧＸ２のリガンドとして、より好ましくはＭＲＧＸ２のアゴニストとしてのコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、または神経ペプチドＦＦの使用である。
【００３６】
本発明の別の態様は、以下のことを含む、新規神経ペプチド媒介過程を調節する化合物を同定するための方法である：ａ）試験化合物または複数の試験化合物の存在下、または非存在下で、神経ペプチド、好ましくは環状神経ペプチド、たとえばコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、または神経ペプチドＦＦとＭＲＧＸ２の試料を接触させること、ｂ）その生物学的作用を測定すること。典型的なアッセイにおいて、コルチスタチン、または他の神経ペプチドの一つが標準的に結合するＭＲＧＸ２上の同じ部位において試験化合物は結合し、作用を発揮するであろうが、当業者は必ずしもそうである必要がないことを認識するであろう。また、本発明の方法論をコルチスタチンまたは神経ペプチド結合部位から離れたＭＲＧＸ２上の部位に作用する化合物を同定するために使用してもよい。一態様において、方法は（ａ）試験化合物の存在下でＭＲＧＸ２をリガンド（コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰ、またはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物）と接触させること；および（ｂ）試験化合物の非存在下でＭＲＧＸ２に結合したリガンドの量を測定することを含み、その結果（ａ）および（ｂ）で測定された結合リガンドの量が異なる場合、ＭＲＧＸ２へのリガンド結合を調節する化合物が同定される。一具体例において、段階（ａ）で接触したＭＲＧＸ２は細胞表面上にある。別の具体例において、ＭＲＧＸ２は固体表面に固定化される。別の具体例において、固体表面は、マイクロタイターディッシュである。さらに別の具体例において、ＭＲＧＸ２は懸濁液として使用される膜標本である。
【００３７】
したがって、本発明の一態様は、リガンドとしてコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰ、またはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物を使用した、ＭＲＧＸ２のリガンド、好ましくは調節物質、さらにいっそう好ましくはアゴニストまたはアンタゴニストである化合物のスクリーニングの方法である。また、他の神経ペプチド、好ましくは他の環状神経ペプチド、またはそれらの類似体もしくは模倣物がＭＲＧＸ２のリガンドである化合物のスクリーニング法における使用のための適切なリガンドであることが見出されてもよい。また、このことは、ＭＲＧＸ２に結合する化合物のスクリーニングの方法を含む、以下に記載の本発明のすべての別の態様にわたる。
【００３８】
本発明の別の態様は、以下の段階を含むがそれらに限定されない、新規神経ペプチドのリガンド、好ましくは調節物質、さらに好ましくはアゴニストまたはアンタゴニストである化合物のスクリーニングの方法である：
（ａ）ＭＲＧＸ２の試料をコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰ、またはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物から選択されたリガンドと接触させること；
（ｂ）ＭＲＧＸ２の類似した試料を段階（ａ）と同じリガンドおよび試験化合物または試験化合物の混合物と接触させること；および
（ｃ）リガンドの結合が試験化合物または試験化合物の混合物の存在により変化するか否かを確認するために（ａ）および（ｂ）における結果を比較すること。
【００３９】
好ましくは、方法は以下の段階：
（ａ）試験化合物または試験化合物の混合物の存在下または非存在下で、ＭＲＧＸ２の試料を、結合した検出可能な標識を持つコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰ、またはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物から選択されたリガンドと接触させること；
（ｂ）結合した標識の量を測定すること、
を含むがそれらに限定されず、それによって、試験化合物または試験化合物の混合物の非存在下での結合標識の量と比較した、それらの存在下での結合標識の減少は、試験化合物の混合物中に存在する試験化合物または１以上の試験化合物が新規神経ペプチド受容体に結合することを示す。
【００４０】
本発明の別の態様は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１を含むヌクレオチド配列またはその変異体もしくは同族体によりコードされた受容体を調節する、好ましくは作動させるまたは阻害するためのコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰ、またはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物の使用である。
【００４１】
本発明の別の態様は、アッセイにおける新規神経ペプチド受容体、好ましくはコルチスタチン受容体、ソマトスタチン受容体、Ｂａｍ１３−２２受容体，α‐ＭＳＨ受容体、または神経ペプチドＦＦ受容体の使用であり、ここで上記受容体はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　２の蛋白質配列を含むか、またはその変異体もしくは同族体である。
【００４２】
本発明の別の態様は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１、またはその変異体もしくは同族体を含む適切な発現ベクターを適切な宿主細胞に移入すること、および受容体の発現に適切な条件下で上記宿主細胞を培養することを含む、新規神経ペプチド受容体、好ましくはコルチスタチン受容体、ソマトスタチン受容体、Ｂａｍ１３−２２受容体，α‐ＭＳＨ受容体、神経ペプチドＦＦ受容体、ダイノルフィンＡ受容体もしくはサブスタンスＰ受容体を発現する方法である。適切な宿主細胞は、大腸菌のような細菌、サッカロミセス‐セレビジエもしくはピチアパストリスのような酵母、または好ましくは昆虫細胞、またはより好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくは宿主細胞はヒト細胞である。本発明の別の態様は、適切な細胞にＭＲＧＸ２の発現をアップレギュレートすることを含む、神経ペプチド受容体を発現する方法である。これは、たとえば、特許ＥＰ４１１６７８におけるエリスロポイエチンの発現に使用された方法に類似するように、ＭＲＧＸ２遺伝子の前方に強力なプロモータを挿入することにより行うことができるが、ＭＲＧＸ２の発現をアップレギュレートする他の方法も予想される。したがって、上記方法におけるＭＲＧＸ２の試料が、天然にＭＲＧＸ２を発現する細胞、当技術分野で利用可能であるか、将来開発される各種手段によりＭＲＧＸ２の発現がアップレギュレートされる細胞、または、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１またはその変異体もしくは同族体を含む配列、またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　２の蛋白質配列をコードする配列を含む発現構築物によりトランスフェクトされている細胞に由来してもよい。
【００４３】
ＭＲＧＸ２の試料は、先に記載のように調製された細胞、または天然にＭＲＧＸ２を発現する細胞、またはＭＲＧＸ２を発現するいずれかの細胞から調製された膜、またはそのような細胞もしくは膜から濃縮もしくは精製されたＭＲＧＸ２蛋白質を含む。当業者は、ＭＲＧＸ２を濃縮または精製するために使用することができる方法について既知であり、それらの方法には、複雑な混合物からの蛋白質の分離に適した、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００４４】
本発明のさらに別の態様は、以下の段階を含むがそれらに限定されない新規神経ペプチド受容体のアゴニストのスクリーニングの方法である；
（ａ）ＭＲＧＸ２を発現する適切な細胞に試験化合物または試験化合物の混合物を添加すること、
（ｂ）機能的反応が見られるか否かを測定すること。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、機能的反応はＦｌｕｏ−３もしくはＩｎｄｏ−１のような蛍光色素を使用することにより、または当業者に既知の他の手段により測定された細胞内カルシウムの一時的上昇である；本発明の別の好ましい態様において、機能的反応はマイクロフィジオメトリーにより測定される、細胞周辺培地の酸性化速度の上昇により測定されるような、細胞の呼吸速度の上昇である。本発明のさらに別の好ましい態様において、機能的反応はたとえばレポーター遺伝子生成物の上昇した活性により測定されるような、細胞内のサイクリックＡＭＰ濃度の上昇または減少であり、ここでレポーター遺伝子のコーディング領域は少なくとも１サイクリックＡＭＰ反応要素を含むプロモータに機能的に結合する。細胞内のサイクリックＡＭＰ濃度の変化を測定するための他の方法は当業者に公知である。本発明の別の好ましい態様において、細胞はＭＲＧＸ２およびＧＦＰ‐β‐アレスチン複合体を共発現させるプラスミドまたは複数のプラスミドによりトランスフェクトされ、そして受容体のアゴニストは細胞表面上の蛍光のクラスタ化、すなわちＧＦＰ‐β‐アレスチン複合体を観察することにより同定される。ＭＲＧＸ２の発現に適切な細胞は、天然にＭＲＧＸ２を発現する細胞、ＭＲＧＸ２の発現が先に記載のようにアップレギュレートされている細胞、または、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１またはその変異体もしくは同族体を含む配列、またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　２の蛋白質配列をコードする配列を含む発現構築物によるトランスフェクションによりＭＲＧＸ２が発現されている細胞から選択される。
【００４６】
本発明は以下の段階を含むがそれらに限定されない新規神経ペプチド受容体のアンタゴニストのスクリーニングの方法である：
（ａ）試験化合物または試験化合物の混合物を、ＭＲＧＸ２を発現する適切な細胞に添加すること、
（ｂ）コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，αＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰ、またはそれらの類似体もしくは模倣物、または先に記載の方法により同定されたアゴニストを添加すること、
（ｃ）機能的反応が見られるか否かを測定し、アゴニストへの機能的反応を低下させる試験化合物のようなアンタゴニストを同定すること。
【００４７】
ＭＲＧＸ２を発現する適切な細胞は、天然にＭＲＧＸ２を発現する細胞、ＭＲＧＸ２の発現が先に記載のようにアップレギュレートされている細胞、または、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１またはその変異体もしくは同族体を含む配列、またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　２の蛋白質配列をコードする配列を含む発現構築物によるトランスフェクションによりＭＲＧＸ２が発現されている細胞から選択される。この方法において使用することができる機能的反応の例は先に記載される。
【００４８】
本発明の別の態様は、本発明の方法のいずれかにより同定された化合物、および本発明の方法のいずれかにより同定された化合物を含む医薬組成物である。
本発明の別の態様は、本発明の方法のいずれか一つを使用して、化合物が新規神経ペプチド受容体のアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを確認し、上記化合物を薬剤的に受容できるキャリアと混合することを含む、医薬組成物を製造するための方法である。
【００４９】
したがって、本発明はとりわけ、神経ペプチド関連疾患、好ましくは先にＭＲＧＸ２と呼ばれたこの神経ペプチド受容体に関連する疾患、たとえば、すべての型の睡眠障害、疼痛、脳卒中、記憶障害、糖尿病、癌、肥満、心血管障害、鬱病、性的機能不全、尿路および膀胱疾患、抗炎症処置、消化管疾患、および他の疾患の処置における有用な化合物のスクリーニングの方法に関する。
【００５０】
また、本発明はそのような化合物（たとえば、アゴニストまたはアンタゴニスト）の生物学的活性をさらに特徴付けるためのアッセイおよび結果として得られるそれらの有用性を提供する。いくつかの化合物は、たとえばＭＲＧＸ２を活性化すると同定された神経ペプチドのような神経ペプチドが関与する疾患および状態、たとえば、すべての型の睡眠障害、疼痛、脳卒中、記憶障害、糖尿病、癌、肥満、心血管障害、鬱病、性的機能不全、尿路および膀胱疾患、抗炎症処置、消化管疾患、および他の疾患の治療および予防に有用であろう。
【００５１】
本発明の別の態様は、患者試料におけるＭＲＧＸ２遺伝子発現またはＭＲＧＸ２蛋白質のレベルを測定することを含む、哺乳動物の新規神経ペプチド受容体関連疾患を検出するための方法で、測定されたレベルが臨床的に正常な個体で見出されたレベルと異なる場合、新規神経ペプチド受容体／ＭＲＧＸ２関連疾患が検出される。また、たとえば特異的にＭＲＧＸ２を認識する抗体（以下を参照されたい）を含むか、またはＭＲＧＸ２ｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ、もしくはＭＲＧＸ２ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡのＰＣＲを基にした検出に適したプライマーのような、ＭＲＧＸ２ｍＲＮＡを測定するための手段を含む、ＭＲＧＸ２を測定するためのキットが提供される。
【００５２】
例として、ＭＲＧＸ２のレベルは酵素様免疫吸着法（ＥＬＩＳＡｓ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫細胞化学、ウェスタンブロット法のようなイムノアッセイ、または当業者によく知られた他の方法により測定することができる。ＭＲＧＸ２ＲＮＡレベルはハイブリダイゼーションアッセイ法（たとえば、ノーザンブロット法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）により検出してもよく、ＭＲＧＸ２活性は先に記載のようにｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏで結合活性を測定することによりアッセイしてもよい。ＭＲＧＸ２核酸の転位、欠失、および点突然変異は、サザンブロット法、ＦＩＳＨ、ＲＥＬＰ分析、ＳＳＣＰ、好ましくは少なくとも大部分のＭＲＧＸ２遺伝子に及ぶフラグメントを生み出すプライマーを使用したＰＣＲ、患者から得られたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの配列決定などにより検出することができる。
【００５３】
たとえば転写を変化させる、スプライシング事象、または翻訳を妨害することによりＭＲＧＸ２遺伝子活性を変化させる化合物も本発明の方法を使用して同定することができる。また、ＭＲＧＸ２へのアゴニスト結合の結果シグナル伝達を調節する化合物は本発明の方法により検出することが可能であり、本発明の範囲内であるということを認めるべきである。
【００５４】
【発明の実施の形態】
明確にするために、“新規神経ペプチド受容体”という用語は、コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，αＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡ、サブスタンスＰのような神経ペプチドの受容体を表す。理論に束縛されることなしに、この受容体を活性化すると同定された神経ペプチドはすべて環状神経ペプチドであり、すなわちそれらは内部ジスルフィド架橋を形成する。
【００５５】
本明細書において、“同族体”または“変異体”という用語は、ＳＥＱ　ＩＤＮＯｓ　１および２で特定されたアミノ酸配列およびヌクレオチド配列と、ある程度相同性を有する実体を表す。相同配列は、特定の配列に少なくとも７５、８５、もしくは９０％同一、好ましくは少なくとも９５もしくは９８％同一であり得るアミノ酸配列、または特定の配列に少なくとも７５、８５、もしくは９０％同一、好ましくは少なくとも９５もしくは９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと見なされる。そのような配列相同性／同一性は、公的な、もしくは市販のバイオインフォマティックスソフトウェア、たとえばＢｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２）、またはＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２，３８７；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）に含まれるプログラム、たとえばＢｅｓｔｆｉｔまたはＧａｐにより、容易に評価することができる。
【００５６】
本明細書において、“類似体”という用語は参照作用物質、たとえばコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，αＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡまたはサブスタンスＰに構造が類似したいずれかの物質に関連し、少なくともあるアッセイ条件下で、通例類似した生物学的作用を及ぼす。
【００５７】
本明細書で使用される“模倣物”という用語は、参照作用物質、たとえばコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，αＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡまたはサブスタンスＰと同じ質的な活性を有するいずれかの物質（ペプチド、ポリペプチド、抗体または他の有機化学物質を含むがそれらに限定されない）に関連する。
【００５８】
“受容体／酵素の調節物質”という用語は、個々の受容体／酵素に結合し、それに作用を及ぼすいずれかの物質を表す。
“受容体のアゴニスト”という用語は個々の受容体を刺激することができる物質を表す。
【００５９】
“受容体のアンタゴニスト”という用語はアゴニストによる個々の受容体の刺激を阻害することができる物質を表す。
“機能的反応”という用語は、たとえば細胞において受容体の刺激が導くような、反応を表す。Ｇ蛋白質共役受容体の場合、これは、たとえばサイクリックＡＭＰ濃度の変化、細胞内カルシウム濃度の一時的上昇、またはイオンチャネルの開口を包含することができる。
【００６０】
“レポーター遺伝子”という用語は、都合よく測定することができる蛋白質をコードする遺伝子を表す。好ましくは、レポーター遺伝子として使用される遺伝子は使用する細胞に天然に発現されない。例としては、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはβ‐ラクタマーゼが挙げられる。一般に、レポーター遺伝子はプロモータ、または基本のプロモータに結合した反応要素またはいくつかの反応要素の後に挿入され、刺激性シグナルに基づいてレポーター遺伝子は翻訳され、そして対応する酵素活性が上昇し、それは容易に測定可能である。
【００６１】
“化合物”という用語は、小有機分子、ペプチド、蛋白質、糖蛋白質またはリポ蛋白質のような修飾された蛋白質、抗体またはそのフラグメント、ＤＮＡもしくはＲＮＡのような核酸、または修飾された骨格を持つオリゴヌクレオチドのような修飾された核酸を含むがそれらに限定されない、いずれかの化学的実体を表す。
【００６２】
本発明の方法は、たとえば、コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡもしくはサブスタンスＰ、またはこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体もしくは模倣物のような神経ペプチドの相互作用を調節する、小有機分子、またはペプチドもしくは蛋白質のような化合物を同定するために使用してもよい。したがって、本発明に従ってスクリーニングすることができる物質は抗体およびそのフラグメントも含む。たとえば、ＭＲＧＸ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合し、そして天然のリガンドにより引き起こされる活性を阻害する（すなわちアンタゴニスト）か、または天然のリガンドにより引き起こされる活性を模倣する（すなわちアゴニスト）ペプチド様有機化合物もスクリーニングすることができる。さらに、ＭＲＧＸ２のＥＣＤ（またはその部分）が共有結合する有機化合物、ペプチド、抗体またはそのフラグメントが同様にＭＲＧＸ２リガンドに結合し、そして“中和”してもよい。そのような複合試薬のスクリーニングも本発明の実施の範囲内である。
【００６３】
スクリーニングに使用することができる化合物は、ペプチド、たとえば任意のペプチドライブラリー；（たとえばＬａｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５４，８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５４，８４−８６を参照されたい）、およびＤ−および／またはＬ−立体配置アミノ酸からなるコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリーのメンバーを含むがそれらに限定されない可溶性ペプチド、ホスホペプチド（任意か、または部分的に変性した、有向ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含むが、それらに限定されない；たとえばＳｏｎｇｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ　７２，７６７−７７８を参照されたい）、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、ならびにＦａｂ，Ｆ（ａｂ′）２およびＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、およびそれらのエピトープ結合フラグメントを含むがそれらに限定されない）、および小有機または無機分子を含むがそれらに限定されない。
【００６４】
本発明の一態様において、ペプチドライブラリーは本発明の方法においてスクリーニングをするために使用できる試験化合物の供与源として使用してもよい。多様なライブラリー、たとえば任意の、またはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーは、ＭＲＧＸ２受容体に特異的に結合する分子をスクリーニングすることができる。たとえば、化学的に合成されたライブラリー、組換え体（たとえば、ファージディスプレイライブラリー）、およびｉｎ　ｖｉｔｒｏでの翻訳を基礎にしたライブラリーのような、使用することができる多くのライブラリーが当技術分野で既知である。
【００６５】
化学的に合成されたライブラリーの例は、Ｆｏｄｏｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１，７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ　３５４、８４−８６；Ｌａｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ　３５４、８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１２，７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐ　ｅｔａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７，１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０，１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１，１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３，４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１，１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ　９０，１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９３／２０２４２号；およびＢｒｅｎｎｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｒｎｅｒ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，５３８１−５３８３に記載される。
【００６６】
ファージディスプレイライブラリーの例は、Ｓｃｏｔｔ＆Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，４０４−４０６；Ｃｈｉｓｔｉａｎ，ｅｔａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７１１−７１８；Ｌｅｎｓｔｒａ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２，１４９−１５７；Ｋａｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ　１２８，５９−６５；およびＰＣＴ公開公報第ＷＯ９４／１８３１８号、１９９４年８月１８日発行に記載される。
【００６７】
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（Ｂｕｎｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１，４７０８−４７１２を参照されたい）を使用のために適合することができる。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，９３６７−９３７１）も使用することができる。ペプチドのアミド官能基が過メチル化され、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリーを形成している、使用することができるライブラリーの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１，１１１３８−１１１４２に記載される。
【００６８】
各種の一般的に知られている方法のいずれかにより、ライブラリーのスクリーニングを行うことができる。たとえば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する、以下の参考文献を参照されたい：Ｐａｒｍｌｅｙ＆Ｓｍｉｔｈ（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１，２１５−２１８；Ｓｃｏｔｔ＆Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３，４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，５３９３−５３９７；Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ　７６，９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１，５７７−５８０；Ｂｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５５，５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５５，８５０−８５２；すべてＬａｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．の米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号；Ｒｅｂａｒ＆Ｐａｂｏ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３，６７１−６７３；およびＰＣＴ公開公報第ＷＯ９４／１８３１８号。
【００６９】
試験することが可能で、本明細書に記載の方法により同定された化合物には以下のいずれかの市販の化合物を挙げることができるが、それらに限定されない：Ａｌｄｒｉｃｈ（１００１　Ｗｅｓｔ　Ｓｔ．Ｐａｕｌ　Ａｖｅ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ５３２３３）、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１４５０８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ　６３１７８）、Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｅ　ＡＧ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓｔｒａｓｓｅ　２５，ＣＨ−９４７１　Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｌａｎｄ（Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．９８０　Ｓｏｕｔｈ　２ｎＤ　Ｓｔｒｅｅｔ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ　１１７７９））、Ｅａｓｔｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ　４３１，Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ，ＴＮ　３７６６２）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ（Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ　Ｓｔｒａｓｓｅ　１１６，Ｄ−６８２９８　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｔａｋａｓａｇｏ（４　Ｖｏｌｖｏ　Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｌｅｉｇｈ，ＮＪ　０７６４７）、ＳＳＴ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（６３５　Ｂｒｉｇｈｔｏｎ　Ｒｏａｄ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ　０７０１２）、Ｆｅｒｒｏ（１１１　Ｗｅｓｔ　Ｉｒｅｎｅ　Ｒｏａｄ，Ｚａｃｈａｒｙ，ＬＡ　７０７９１）、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ　Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ　Ｄ−３０９１８，Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＰＧ　ＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＩｎｃ．，Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏｎｅ　ＰＰＧ　Ｐｌａｃｅ，３４ｔｈ　Ｆｌｏｏｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ　１５２７２）。さらに、微生物、真菌、植物または動物抽出物を含むどのような種類の天然物も本発明の方法を使用してスクリーニングしてもよい。
【００７０】
さらに、小分子試験化合物を含む、多様な試験化合物のライブラリーを使用してもよい。たとえば、ライブラリーはＳｐｅｃｓ　ａｎｄ　ＢｉｏＳｐｅｃｓ　Ｂ．Ｖ．（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｏｎｔｒａｃｔ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｏｌｇｏｐｒｕｄｎｙ，Ｍｏｓｃｏｗ　Ｒｅｇｉｏｎ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ　ＵＳＡ　Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓｄ　Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ　ＰＬ３４　ＯＨＷ，Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ａｎｄ　Ａｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）から購入してもよい。
【００７１】
さらにその上、以下のものを含むが、それらに限定されない当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリーを利用することができる：生物学的ライブラリー；空間アドレサブル並列固相または液相ライブラリー；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法；“１ビーズ　１化合物”ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリー研究方法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の４種の研究方法はペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．１２，１４５）。小分子試験化合物を含む試験化合物のコンビナトリアルライブラリーを利用してもよく、そしてたとえば、Ｅｉｃｈｌｅｒ＆Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ　１，１７４−１８０；Ｄｏｌｌｅ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｄｒｉｖｅｒｓ．２，２２３−２３６；およびＬａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．１２，１４５−１６７に開示されたように作製してもよい。
【００７２】
当技術分野における分子ライブラリーの合成方法の例は、たとえば以下に挙げたものの中に見出すことができる：ＤｅＷｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０，６９０９；Ｅｒｂ　ｅｔａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１，１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８；Ｃｈｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１，１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０５９；Ｃａｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；およびＧａｌｌｏｐ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３．
化合物のライブラリーは溶液中（たとえば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３，４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６４，５５５−５５６）、細菌類（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号；および第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，１８６５−１８６９）もしくはファージ（Ｓｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７，６３７８−６３８２；およびＦｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，３０１−３１０）上に提示されてもよい。
【００７３】
ライブラリーのスクリーニングは各種のよく知られた方法のいずれかにより行うことができる。たとえば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参考文献を参照されたい：Ｐａｒｍｌｅｙ＆Ｓｍｉｔｈ（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１，２１５−２１８；Ｓｃｏｔｔ＆Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓ　ｅｔ　ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３，４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，５３９３−５３９７；Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ　７６，９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１，５７７−５８０；Ｂｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５５，５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５５，８５０−８５２；すべてＬａｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．の米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９、および米国特許第５，１９８，３４６号；Ｒｅｂａｒ＆Ｐａｂｏ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３，６７１−６７３；およびＰＣＴ公開公報第ＷＯ９４／１８３１８号。
【００７４】
たとえば、コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡまたはサブスタンスＰとＭＲＧＸ２との相互作用を調節することができるコンピュータモデリングおよび検索技術は、化合物、またはすでに同定された化合物の改良を可能にする。そのような化合物または組成物が同定されている場合、活性部位または領域が同定される。そのような活性部位は一般にリガンド結合部位であろう。活性部位は、当技術分野で既知の方法を使用して以下のものから同定することができる：たとえば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または適切な化合物または組成物とその天然のリガンドとの複合体の研究から。後者の場合、化学的またはＸ線結晶学的方法を使用して、複合体を形成したリガンドが見出される因子上で活性部位を見出すことにより、リガンドを見出すことができる。
【００７５】
次に、活性部位（一般に結合部位）の３次元幾何学的構造が決定される。これは、完全な分子構造を決定することができる、Ｘ線結晶学を含む既知の方法により行うことができる。一方、固相または液相ＮＭＲをある分子内距離を測定するために使用することができる。いずれか他の実験的構造決定法が部分的、または完全な幾何学的構造を得るために使用することができる。幾何学的構造は、天然または合成の複合体リガンドと共に決定してもよく、そうすることにより決定された活性部位の構造の正確さを増すことができる。
【００７６】
不完全、または不十分に正確な構造が決定される場合、コンピュータを基にした数学的モデリングを使用して構造を完成させるか、または正確さを増すことができる。蛋白質または核酸のような特定のバイオポリマーに特異的なパラメータで表されたモデル、分子の運動を計算することに基づいた分子運動力学モデル、熱集合体に基づいた統計力学モデル、または組合せモデルを含む、いずれかの承認されたモデルを使用することができる。モデルの多くの型では、構成原子および群間の力を表す標準分子力場が必要で、それらは物理化学で既知の力場から選択することができる。不完全か、または正確さが劣る実験的構造は、これらのモデリング系により計算された、完全でより正確な構造を束縛するものとなる可能性がある。
【００７７】
最後に、実験的、モデリングのいずれか、または組合せのいずれかにより活性（結合）部位の構造が決定されていれば、それらの分子構造に関する情報に沿った化合物を含むデータベースを検索することにより、候補調節化合物を同定することができる。そのような探索が、決定された活性（結合）部位に適合し、活性部位を定義する群と相互作用する構造を有する化合物を探し出す。そのような探索は手動式であってもよいが、好ましくはコンピュータを使用する。この探索から見出されたこれらの化合物は、潜在的な新規神経ペプチド受容体調節化合物である。
【００７８】
あるいは、これらの方法はすでに知られた調節化合物またはリガンドから改良された調節化合物を同定するために使用することができる。既知の化合物の組成は修飾されてもよく、そして修飾の構造的効果は、先に記載の新規組成物に適用された実験的およびコンピュータモデリング法を使用して確定することができる。次に、改良された適合または相互作用が結果として生じることを確定するために、変化した構造を化合物の活性（結合）部位に比較する。このようにして、たとえば側基を変化させることによる組成物の系統的変化は、修飾された調節化合物または、改良された特異性または活性のリガンドを得るために素早く評価することができる。
【００７９】
ＭＲＧＸ２、またはコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡ、サブスタンスＰ、およびこれらの神経ペプチドのいずれか一つの類似体または模倣物のいずれかの活性（結合）部位の同定に基づいて調節化合物を同定するために有用である別の実験的およびコンピュータモデリング法は当業者には明らかであろう。
【００８０】
分子モデリング系の例としては、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラムがある（Ｐｏｌｙｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化、および分子動力学関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフモデリングおよび解析を行う。ＱＵＡＮＴＡはおたがいの相互作用構築、修飾、視覚化、および分子の挙動の解析を可能にする。
【００８１】
多数の論文が特異的蛋白質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングについて総説し、たとえばＲｏｔｉｖｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｆｅｎｎｉｃａ　９７，１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ（１９８８）Ｎｅｗ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ　５４−５７；Ｍｃｋｉｎａｌｙ　ａｎｄ　Ｒｏｓｓｍａｎｎ（１９８９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９，１１１−１２２；Ｐｅｒｒｙ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　ｐｐ．１８９−１９３　Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８９）；Ｌｅｗｉｓ　ａｎｄ　Ｄｅａｎ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６，１２５−１４０ａｎｄ１４１−１６２）；および核酸成分のモデル受容体に関したＡｓｋｅｗ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，１０８２−１０９０がある。化学物質をスクリーニングし、図式で表す他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）のような会社から得ることができる。これらは主に特定の蛋白質に特異的な薬物への適用のために設計されるが、それらは一度ＤＮＡまたはＲＮＡの領域が同定されれば、それらの領域に特異的な薬物の設計に適合することができる。
【００８２】
ＭＲＧＸ２蛋白質、ポリペプチドおよびペプチドフラグメント、ＭＲＧＸ２の変異した、切断された、または欠失した形状および／またはＭＲＧＸ２融合蛋白質は以下のものを含むがそれらに限定されない、多様な用途のために製造することができる：診断用アッセイにおける試薬としての抗体の産生、神経ペプチド関連疾患の治療における薬剤的試薬として使用できる化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬としての、神経ペプチド関連疾患の調節に関与する他の細胞遺伝子生成物の同定。さらに、ＭＲＧＸ２とそれが結合してもよいコルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，α‐ＭＳＨ、神経ペプチドＦＦ、ダイノルフィンＡ、もしくはサブスタンスＰ、またはいずれか他の神経ペプチドとの相互作用から得られた情報に基づいて、ｉｎ　ｖｉｖｏ治療的用途のための、ＭＲＧＸ２受容体分子への循環神経ペプチドの正常な結合を阻害する、ＭＲＧＸ２のペプチドフラグメントを得ることができる。
【００８３】
ＭＲＧＸ２ペプチド、ポリペプチド、および融合蛋白質は、組換えＤＮＡ技術により製造することができる。たとえば、ＭＲＧＸ２受容体の４つの細胞外ドメインの１以上をコードするヌクレオチド配列はＭＲＧＸ２の可溶性細胞外ドメインをコードするように合成するか、またはクローニングして、一緒に連結することができる。４つの細胞外ループの１以上をコードするＤＮＡ配列は直接、またはペプチドスペーサをコードするリンカーオリゴヌクレオチドを介して一緒に連結することができる。そのようなリンカーはフレキシブルで、グリシンに富むアミノ酸配列をコードしてもよく、それによって一緒に並んだドメインがＭＲＧＸ２リガンドを結合できる立体配座をとることが可能になる。あるいは、細胞外ループ内に個々のドメインをコードするヌクレオチド配列を、ＭＲＧＸ２ペプチド発現のために使用することができる。
【００８４】
各種の宿主発現ベクター系は、そのようなポリペプチドを産生するためのＭＲＧＸ２の適切な領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるために使用してもよい。得られたペプチドまたはポリペプチドが可溶性誘導体（たとえば、細胞外ドメインに対応するペプチド；切断されているか、または欠失し、ここでは膜貫通へリックスおよび／または細胞ドメインが欠失する）である場合、ペプチドまたはポリペプチドは培地から回収することができる。ポリペプチドまたは蛋白質が分泌されない場合、ＭＲＧＸ２生成物は宿主細胞自体から回収することができる。
【００８５】
また、宿主発現ベクター系はｉｎ　ｓｉｔｕで、すなわち細胞膜に固定されてＭＲＧＸ２または機能的対応物を発現するように操作された宿主細胞を包含する。
【００８６】
そのような発現系由来のＭＲＧＸ２の精製または濃縮は、適切な界面活性剤および脂質ミセルならびに当業者に既知の方法を使用して行うことができる。しかし、ＭＲＧＸ２の構造的および機能的特徴を保持するためでなく、たとえば、薬物スクリーニングアッセイにおいて、生物学的活性を評価するために重要である状況において、そのように設計された宿主細胞自体を使用することができる。
【００８７】
本発明の目的のために使用することができる宿主発現ベクター系は以下の微生物を含むがそれらに限定されない：たとえば、ＭＲＧＸ２ヌクレオチド配列を含む組換体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（たとえば大腸菌、枯草菌）；ＭＲＧＸ２ヌクレオチド配列を含む組換え体酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（たとえばサッカロミセス属、ピチア属）；ＭＲＧＸ２ヌクレオチド配列を含む組換え体ウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ＭＲＧＸ２ヌクレオチド配列を含む組換え体ウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、または組換え体プラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系；哺乳動物細胞のゲノム（たとえば、メタロチオネインプロモータ）からか、もしくは哺乳動物ウイルス（たとえばアデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイル７．５Ｋプロモータ）から由来のプロモータを含む組換え体発現構築物を持つ哺乳動物細胞系（たとえばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）。
【００８８】
細菌系では、好都合にも、多数の発現ベクターは発現されるＭＲＧＸ２遺伝子生成物の意図した使用に依存して選択することができる。たとえば、ＭＲＧＸ２蛋白質の医薬組成物の製造のためか、またはＭＲＧＸ２蛋白質に対する抗体を作製するために大量のそのような蛋白質を製造することになっているとき、たとえば容易に精製できる融合蛋白質生成物の高レベルの発現を意図するベクターが所望されるであろう。そのようなベクターとしては以下のベクターを含むが、それらに限定されない：大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ　Ｊ．２，１７９１）、ここで、ＭＲＧＸ２コーディング領域はｌａｃＺコーディング領域を持つ骨組み中のベクターに個々に結合してもよく、その結果融合蛋白質が生成される；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３，３１０１−３１０９；Ｖａｎ　Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，５５０３−５５０９）など。また、ｐＧＥＸベクターはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質として、異種蛋白質を発現させるために使用することができる。一般に、そのような融合蛋白質は可溶性で、グルタチオン‐アガロースビーズへの吸着、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターはトロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ開裂部位を含むように設計され、その結果クローニングされた標的遺伝子がＧＳＴ部分から遊離することができる。
【００８９】
あるいは、いずれかの融合蛋白質は発現している融合蛋白質に特異的な抗体を使用して、容易に精製することができる。たとえば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらにより記載された系では、ヒト細胞系に発現された非変性融合蛋白質が容易に精製できる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８，８９７２−８９７６）。この系では、興味のある遺伝子はワクシニア組換え体プラスミドにサブクローニングし、その結果遺伝子のオープンリーディングフレームは６ヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合される。組換え体ワクシニアウイルスに感染した細胞の抽出物はＮｉ２＋・ニトリロ酢酸‐アガロースカラムにのせ、ヒスチジン標識蛋白質はイミダゾール‐含有バッファーにより選択的に溶出される。
【００９０】
昆虫系では、異種遺伝子を発現させるためのベクターとしてオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。ウイルスはスポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。ＭＲＧＸ２コーディング配列は、非必須領域（たとえば、ポリヘドリン遺伝子）にそれぞれクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモータ（たとえば、ポリヘドリンプロモータ）の制御下においてもよい。ＭＲＧＸ２遺伝子コーディング配列の首尾よい挿入により、結果としてポリヘドリン遺伝子の不活性化、および非閉塞性組換え体ウイルスの産生が見られるであろう（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされた蛋白質被覆を欠如したウイルス）。組換え体ウイルスはその後挿入された遺伝子が発現される細胞を感染させるために使用される（たとえば、Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｏｌ．４６，５８４；Ｓｍｉｔｈ，米国特許第４，２１５，０５１号を参照されたい）。
【００９１】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスを基礎にした発現系を使用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、興味のあるＭＲＧＸ２ヌクレオチド配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、すなわち後期プロモータおよび３分リーダー配列に結合してもよい。その後このキメラ遺伝子は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、結果として生存可能で、感染宿主にＭＲＧＸ２遺伝子生成物を発現することができる組換え体ウイルスを生じるであろう（たとえば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１，３６５５−３６５９を参照されたい）。また、特異的開始シグナルが挿入されたＭＲＧＸ２ヌクレオチド配列の効果的な翻訳に必要であってもよい。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。全ＭＲＧＸ２遺伝子またはｃＤＮＡがそれ自体の開始コドンおよび隣接配列を含み、適切な発現ベクターに挿入される場合、付加的な翻訳制御シグナルは必要ないであろう。しかし、ＭＲＧＸ２コーディング配列の一部だけが挿入される場合、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは全挿入物の翻訳を確実にするために所望するコーディング配列のリーディングフレームとともにフレーム中になくてはならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは多様な起源、天然および合成の両方であってもよい。発現の効率は適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどの包含により促進することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３，５１６−５４４を参照されたい）。
【００９２】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望する具体的な様式で遺伝子生成物を修飾および処理する宿主細胞系統が選択されてもよい。蛋白質生成物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）および処理（たとえば開裂）が蛋白質の機能に重要であってもよい。異なる宿主細胞は蛋白質および遺伝子生成物の翻訳後処理および修飾に特徴的で特有の機序を有する。発現された異種蛋白質の正しい修飾および処理を確実にするために、適切な細胞系統または宿主系を選択することができる。したがって、遺伝子生成物の一次転写物、グリコシル化、およびリン酸化の適切な処理のための細胞構造を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、３Ｔ３およびＷＩ３８細胞系統を含むが、それらに限定されない。
【００９３】
組換え体蛋白質の長期、高収率の産生には、安定した発現が好ましい。たとえば、先に記載のＭＲＧＸ２配列を安定して発現する細胞系統が設計されてもよい。ウイルス起源の複製を含む発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞は適切な発現制御要素（たとえば、プロモータ、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーにより制御されたＤＮＡにより形質転換することができる。異種ＤＮＡの導入後、操作された細胞は強化培地で１〜２日間生育させてもよく、その後選択的培地に交換する。組換え体プラスミドの選択可能なマーカーは、選択に耐性を与え、細胞はそれらの染色体の中にプラスミドを安定して組み込み、成長して細胞増殖巣を形成し、次にクローニングされて、細胞系統に発展してもよい。好都合には、この方法はＭＲＧＸ２遺伝子生成物を発現する細胞系統を操作するために使用することができる。そのように操作された細胞系統は、ＭＲＧＸ２遺伝子生成物の内因性活性を変化させる化合物のスクリーニングおよび評価にとりわけ有用であってもよい。
【００９４】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ　１１，２２３）、ヒポキサンチン‐グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（１９６２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　４８，２０２６）を含む多数の選択系を使用することができるが、それらに限定されず、そしてアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子はそれぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｔ−細胞にそれぞれ使用することができる。また、抗代謝産物耐性は以下の遺伝子の選択の基礎として使用することができる：メトトレキセートに耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７，３５６７；Ｏ′Ｈａｒｅ，ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８，１５２７）；ミコフェノール酸に耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ（１９８１）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８，２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ　ｅｔ　ａｌ。（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）；およびヒグロマイシンに耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ｇｅｎｅ
３０，１４７）。
【００９５】
また、哺乳動物細胞におけるＭＲＧＸ２発現はＭＲＧＸ２の発現をアップレギュレートすることにより達成することができる。これはたとえば、エプスタイン‐バーウイルスによるＢ−リンパ球またはＢ−リンパ球由来細胞系統の感染により達成することができる（Ｂｉｒｋｅｎｂａｃｈ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ（１９９３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，２２０９−２２２０を参照されたい）か、または本発明の方法を使用することにより、ＭＲＧＸ２発現を同様にアップレギュレートする他の物質が同定されてもよい。また、ＭＲＧＸ２発現のアップレギュレーションは、たとえばヒトエリスロポイエチンのためのヨーロッパ特許第４１１，６７８号に記載のように、組換え手段により達成することができる。Ａｔｈｅｒｓｙｓにより開発され、たとえば特許出願ＷＯ９９／１５６５０またはＷＯ００／４９１６２に記載の系のような他の方法が利用可能である。
【００９６】
ＭＲＧＸ２の１以上のエピトープ、もしくはＭＲＧＸ２の保存された変異体のエピトープ、またはＭＲＧＸ２のペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体も本発明に包含される。そのような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ），ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗‐Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含むが、それらに限定されない。
【００９７】
本発明の抗体はたとえば、生物学的試料におけるＭＲＧＸ２の検出に使用してもよく、したがって、診断または予後判定技術の一部として使用してもよく、それによって患者の異常なＭＲＧＸ２の量を試験することができる。ＭＲＧＸ２の変異体の形状を特異的に認識する抗体は診断または予後判定技術の一部としてとりわけ有用であろう。また、そのような抗体は、たとえばＭＲＧＸ２遺伝子生成物の発現および／または活性に対する試験化合物の作用の評価のための、先に記載の化合物スクリーニングスキームとともに使用してもよい。さらに、そのような抗体は、たとえば患者への導入の前に正常および／または操作されたＭＲＧＸ２発現細胞を評価するための遺伝子治療技術とともに使用することができる。そのような抗体はさらに異常なＭＲＧＸ２活性の阻害のための方法として使用してもよい。したがって、そのような抗体は神経ペプチド関連疾患治療法の一部として使用してもよい。
【００９８】
抗体の産生のために、各種宿主動物はＭＲＧＸ２、ＭＲＧＸ２ペプチド（たとえば、細胞外ループまたは細胞外ドメインに対応するもの）、切断されたＭＲＧＸ２ポリペプチド（膜貫通ドメインまたは細胞外ドメインのような、１以上のドメインが欠失しているＭＲＧＸ２）、ＭＲＧＸ２の機能的等価物またはＭＲＧＸ２の変異体により免疫することができる。そのような宿主動物は少し名を挙げただけでも、ウサギ、マウス、ハムスターおよびラットを含むことができるがそれらに限定されない。以下のものを含む各種アジュバントを宿主の種に依存して免疫反応を増大させるために使用してもよく、それらにはフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム‐パルヴムのような潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、それらに限定されない。ポリクローナル抗体は免疫処理された動物の血清に由来した抗体分子の異種集団である。
【００９９】
モノクローナル抗体は特定の抗原に対する抗体の同質の集団であり、それらは培養継代細胞系統による抗体分子の産生を提供するいずれかの技術により得ることができる。これらにはＫｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術、（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ　２５６，４９５−４９７および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４，７２；Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０，２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ‐ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅｔ　ａｌ．（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ７７−９６）が挙げられるが、それらに限定されない。そのような抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含むいずれかのイムノグロブリンクラス、およびそれらのいずれかのサブクラスを含んでいてもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏで培養することができる。ｉｎ　ｖｉｖｏで高力価ｍＡｂｓが産生されることは、これを現在の好ましい産生方法にする。
【０１００】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子遺伝子をスプライシングすることによる“キメラ抗体”（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１，６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３１２，６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４５２−４５４）の産生のために開発された技術が使用可能である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、たとえばマウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリン不変域由来の可変域を有するようなものである。
【０１０１】
あるいは、１本鎖抗体の産生に記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２，４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３３４，５４４−５４６）がＭＲＧＸ２遺伝子生成物に対する１本鎖抗体を産生するように適合してもよい。１本鎖抗体はＦｖ領域の重および軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋により繋ぎ、結果として１本鎖ポリペプチドを生じることにより形成される。
【０１０２】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは既知の方法により産生することができる。たとえば、そのようなフラグメントは抗体分子のペプシン消化により産生することができるＦ（ａｂ′）２フラグメント、およびＦ（ａｂ′）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによるか、または抗体分子のパパイン消化により産生することができるＦａｂフラグメントを含むが、それらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーは所望する特異性を持つモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速で容易に同定できるように構築されてもよい（Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−１２８１）。
【０１０３】
次にＭＲＧＸ２に対する抗体は、当業者に既知の技術を使用してＭＲＧＸ２を“模倣する”抗イディオタイプ抗体を産生するために使用されてもよい（たとえば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ＆Ｂｏｎａ（１９９３）ＦＡＳＥＢ　Ｊ　７，４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，２４２９−２４３８を参照されたい）。たとえば、ＭＲＧＸ２細胞内ドメインに結合し、ＭＲＧＸ２への神経ペプチドの結合を競合的に阻害する抗体は、細胞外ドメインを“模倣”し、したがって神経ペプチドに結合し、中和する抗イディオタイプを産生するために使用することができる。そのような中和する抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントは、天然のリガンドを中和し、神経ペプチド関連疾患、たとえばすべての型の睡眠障害、疼痛、脳卒中、記憶障害、糖尿病、癌、肥満、心血管障害、鬱病、性的機能障害、尿路および膀胱障害、抗炎症治療、消化器障害、およびその他の障害を中和するための治療計画に使用することができる。
【０１０４】
あるいは、ＭＲＧＸ２活性のアゴニストとして作用することができるＭＲＧＸ２の抗体が作られてもよい。そのような抗体はＭＲＧＸ２に結合し、受容体のシグナル伝達活性を活性化するであろう。さらに、ＭＲＧＸ２活性のアンタゴニストとして作用する抗体、すなわち、ＭＲＧＸ２受容体の活性化を阻害する抗体は神経ペプチド関連疾患、たとえばすべての型の睡眠障害、疼痛、脳卒中、記憶障害、糖尿病、癌、肥満、心血管障害、鬱病、性的機能障害、尿路および膀胱障害、抗炎症治療、消化器障害、およびその他の障害の治療にとりわけ有用であろう。
【０１０５】
可溶性ＭＲＧＸ２細胞外ドメインまたは融合蛋白質、たとえば融合Ｉｇ分子を発現する遺伝子工学的に操作された細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏで投与することが可能であり、それらは可溶性分子の供給物を送達する“バイオリアクター”として機能することができる。そのような可溶性ＭＲＧＸ２ポリペプチドおよび融合蛋白質は、適切な濃度で発現された場合、ＭＲＧＸ２の天然のリガンドを中和するか、または“ぬぐい取り”、したがってＭＲＧＸ２活性の阻害剤として作用すべきであり、したがって神経ペプチド関連疾患、たとえばすべての型の睡眠障害、疼痛、脳卒中、記憶障害、糖尿病、癌、肥満、心血管障害、鬱病、性的機能障害、尿路および膀胱障害、抗炎症治療、消化器障害、およびその他の障害を治療するために使用することができる。
【０１０６】
本発明の化合物、すなわちＭＲＧＸ２受容体の調節物質はたとえばすべての型の睡眠障害、疼痛、脳卒中、記憶障害、糖尿病、癌、肥満、心血管障害、鬱病、性的機能障害、尿路および膀胱障害、抗炎症治療、消化器障害、およびその他の障害のような状態を治療するために使用することができる。
【０１０７】
そのような化合物の毒性および治療的有効性は細胞培養または実験動物における標準薬剤学的方法、たとえばＬＤ５０（集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療的有効量）の測定により測定することができる。毒性および治療効果間の用量比は、治療指数であり、そしてＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を表す化合物は使用されてもよいが、そのような化合物を病気に冒された組織部位に向ける送達系を設計するためには注意を払い、非感染細胞への潜在的損傷を最小にし、それによって副作用を軽減しなければならない。
【０１０８】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータはヒトにおける使用のための投与量の範囲を決定するために使用することができる。そのような投与量は、好ましくは毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤型および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法において使用されるいずれの化合物に対しても、治療的有効量は初めに細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度を得るために動物モデルにおいて定めてもよい。そのような情報はヒトにおいてより正確な有効量を決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、たとえば高性能液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１０９】
本発明に従った用途のための医薬組成物は１以上の生理的に受容できるキャリアまたは賦形剤を使用して慣用の方法で製剤することができる。
したがって、化合物ならびにそれらの生理的に受容できる塩および溶媒和物は、吸入もしくはガス注入（口または鼻のいずれかを通して）または経口、舌下、非経口もしくは直腸投与による投与のための製剤とすることができる。
【０１１０】
経口投与では、医薬組成物はたとえば結合剤（たとえば予めゲル化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシメチルセルロース）；増量剤（たとえばラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（たとえばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）のような薬剤的に受容できる賦形剤とともに慣用の手段により、たとえば錠剤またはカプセル剤の形状をとってもよい。錠剤は当技術分野で既知の方法により被覆されてもよい。経口投与のための液体製剤は、たとえば溶液、シロップまたは懸濁液の形状をとってもよいか、またはそれらは水または他の適切なベヒクルと組成するために使用前に乾燥製品として提示されてもよい。そのような液体製剤は、懸濁化剤（たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（たとえばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性ベヒクル（たとえばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および保存剤（たとえばメチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）のような薬剤的に受容できる添加物とともに慣用の手段で製造することができる。また、製剤は適宜バッファー塩、香味剤、着色および甘味剤を含んでいてもよい。
【０１１１】
経口投与のための製剤は適切には、活性化合物が制御された放出をするように製剤してもよい。舌下投与では、組成物は慣用の様式で製剤された錠剤またはトローチ剤の形状をとることができる。
【０１１２】
吸入投与では、本発明に記載の使用のための化合物は好都合には、適切な噴射剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロトリフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体の使用により、加圧パックからのエーロゾルスプレー提示またはネブライザーの形状で送達される。加圧エーロゾルの場合、投与量単位は計量された量を送達するためのバルブを提供することにより測定される。吸入器または注入器において使用のためのたとえばゼラチンのようなカプセルまたは薬莢は化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤を含むように製剤することができる。
【０１１３】
化合物は注入、たとえばボーラス注入または持続注入により、非経口的に投与するために製剤されてもよい。注入のための製剤は単位投与量の形状、たとえばアンプルまたは多重用量容器中に付加された保存剤と共に提示されてもよい。化合物は油性または水性ベヒクル中で懸濁液、溶液または乳濁液のような形状をとってもよく、懸濁化、安定化および／または分散剤のような処方剤を含んでいてもよい。あるいは、活性成分は使用の前に適切なベヒクル、たとえば滅菌発熱性物質除去蒸留水とともに組成するために粉末の形状であってもよい。
【０１１４】
また、化合物はたとえばココアバターまたは他のグリセリドのような慣用の坐剤基剤を含む坐剤または停留浣腸剤のような直腸組成物中に製剤されてもよい。先に記載の製剤の他に、化合物はデポー製剤として製剤してもよい。そのような長期作用型製剤は植え込みにより（たとえば皮下または筋肉内）または筋肉内注入により投与することができる。したがって、たとえば適切なポリマーもしくは疎水性材料（たとえば受容できる油中の乳濁液として）もしくはイオン交換樹脂と共に、またはかろうじて溶解する誘導体、たとえばかろうじて溶解する塩として製剤してもよい。
【０１１５】
組成物は所望するならば、活性成分を含む１以上の単位剤形を含むことができるパックまたはディスペンサー装置中に提示されてもよい。パックはブリスターパックのような金属またはプラスチックホイルを含んでいてもよい。パックまたはディスペンサー装置は投与のための説明書が添付されていてもよい。
【０１１６】
【実施例】
以下の実施例は当業者に公知の標準実験室手順を使用して行われるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（２００１）ａｎｄ　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔａｌ．，Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈＥｄ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参考にすることができる。ＰＣＲはＵＳ−Ａ−４６８３１９５、ＵＳ−Ａ−４８００１９５およびＵＳ−Ａ−４９６５１８８に記載される。
【０１１７】
実施例は説明のためであって、本発明を制限することを意図しない。それらは使用することができる方法の代表的なものであるが当業者に既知の他の手順も使用することができる。以下の配列リストおよび図面を参照とする。
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：受容体ＭＲＧＸ２のｃＤＮＡ配列。
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：受容体ＭＲＧＸ２のペプチド配列。
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：受容体ＭＲＧＸ２ｃＤＮＡをクローニングするためのフォワードプライマー。
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：受容体ＭＲＧＸ２ｃＤＮＡをクローニングするためのリバースプライマー。
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：ＭＲＧＸ２の組織分布研究のためのフォワードプライマー。
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：ＭＲＧＸ２の組織分布研究のためのリバースプライマー。
【０１１８】
図１：いくつかの神経ペプチドに対するＭＲＧＸ２の用量反応曲線
図２：いくつかの神経ペプチドに対するＭＲＧＸ２の用量反応曲線
実施例１：受容体ＭＲＧＸ２のバイオインフォマティックス解析
バイオインフォマティックス解析はＭＲＧＸ２配列に対して行われた。
【０１１９】
（ａ）蛋白質データベースに対するＢｌａｓｔ
最も近い蛋白質適合物を同定するために、受容体ＭＲＧＸ２の配列はＢｌａｓｔアルゴリズムを使用してＳｗｉｓｓｐｒｏｔに関して検索された（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６，２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ　ｅｔ　ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５，３３８９−３４０２））。この場合、トップヒットは未知の機能のＧＰＣＲファミリーのメンバーであるＰ１２５２６：ラットＭＡＳプロトオンコジーンに対してであった。
【０１２０】
これらの結果は受容体ＭＲＧＸ２がＧＰＣＲファミリーのメンバーであることを裏付ける。
（ｂ）非冗長ヒトＧＰＣＲデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索
受容体ＭＲＧＸ２は、この受容体のためのアゴニストのクラスを同定するためにＧｅｎｂａｎｋおよびＤｅｒｗｅｎｔ　Ｇｅｎｅｓｅｑデータベース（特許出願および特許由来の配列を含む）由来の配列を主に含む、非冗長ヒトＧＰＣＲデータベースと比較して検索した。上位１０ヒットを以下に示す：
フルネーム　　　　　　　　　　　　　　　　　％ＩＤ　　画分　　　Ｅ値
後根受容体Ｍ４ＤＲＲ２（ｇｅｎｅｓｅｑｐ）　　　　　６５％　　　　２１５／３２９　　ｅ−１１５
後根受容体Ｍ３ＤＲＲ３（ｇｅｎｅｓｅｑｐ）　　　　　６４％　　　　２１２／３２９　　ｅ−１１３
後根受容体Ｍ６ＤＲＲ６（ｇｅｎｅｓｅｑｐ）　　　　　６２％　　　　２０５／３２９　　ｅ−１０７
後根受容体Ｍ１ＤＲＲ１（ｇｅｎｅｓｅｑｐ）　　　　　６２％　　　　２０５／３２９　　ｅ−１０６
後根受容体Ｍ５ＤＲＲ５（ｇｅｎｅｓｅｑｐ）　　　　　６２％　　　　２０４／３２５　　ｅ−１０５
後根受容体Ｍ２ＤＲＲ２（ｇｅｎｅｓｅｑｐ）　　　　　６１％　　　　２０１／３２９　　ｅ−１０３
Ｇ‐蛋白質共役受容体Ｒ９７２２２（ｇｅｎｅｓｅｑｐ）３７％　　　　１０７／２８６　　２ｅ−４３
ＭＡＳプロト‐オンコジーン　　　　　　　　　３６％　　　　１１３／３１２　　２ｅ−４３
ＭＡＳ関連Ｇ‐蛋白質共役受容体ＭＲＧ．　　　３５％　　　　　　９９／２８２　　　　７ｅ−３９
胸大動脈Ｇ‐蛋白質共役受容体　　　　　　　　３５％　　　　　　９９／２８２　　　　３ｅ−３８
（ｇｅｎｅｓｅｑｐ）（フラグメント）
実施例２：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による受容体ＭＲＧＸ２をコードするｍＲＮＡの組織分布
使用したプライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー
【０１２１】
【化２】
2004033211.tif 000003
リバースプライマー
【０１２２】
【化３】
2004033211.tif 000004
ＰＣＲ条件：９４℃‐１分間。その後９４℃‐３０秒間、５５℃‐３０秒間、７２℃‐１分間を３０サイクル。最後のサイクル＝７２℃‐１０分間。
【０１２３】
鋳型として、各種組織由来の市販のｃＤＮＡが使用された。受容体は後根神経節、血管平滑筋、脳、肝臓、心臓、膵臓、胸腺、白血球および精巣で発現されることが見出されたが、この方法では肺、骨格筋、腎臓、前立腺、卵巣、小腸、結腸、および胎盤では見出されなかった。
【０１２４】
実施例３：哺乳動物細胞系統における受容体ＭＲＧＸ２のクローニングおよび一時的発現
受容体ＭＲＧＸ２をコードするｃＤＮＡは鋳型として脳ＤＮＡを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られた。ＰＣＲプライマーはＡＴＧスタートコドンおよびストップコドン周辺に設計され、コーディング領域のみを増幅させ、いずれの５′または３′非翻訳領域も排除した。使用されたプライマーはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯｓ３および４で示したものと同じであった。
ＭＲＧＸ２フォワードプライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）
【０１２５】
【化４】
2004033211.tif 000005
ＭＲＧＸ２リバースプライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）
【０１２６】
【化５】
2004033211.tif 000006
ＰＣＲ混合物：
ＭＲＧＸ２プライマー　　　　　　　　　　　　　　１μｌ（１０μＭ貯蔵物）
ヒト脳ｃＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ（４００ｎｇ）
ｄＮＴＰｓ（キット毎の濃度）　　　　　　　　　　１μｌ
白金Ｔａｑ高適合度ポリメラーゼ（ＬＴＩ，Ｉｎｃ．）　０．５μｌ
１０ｘ増幅バッファー（ＰＣＲキット由来）　　　　５μｌ
ＭｇＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．５μｌ
ｄＨ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３９μｌ
ＰＣＲサイクル：
（１）９４℃　２分間
（２）９４℃　３０秒間
（３）５４℃　３０秒間
（４）６８℃　２分間
ステップ（２）から（４）まではさらに２７サイクル繰り返された。
（５）６８℃　１５分間
（６）４℃　浸漬
次にＰＣＲ生成物は取り扱い説明書に従って、適切な哺乳動物細胞発現ベクター、たとえばｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入された。挿入されたｃＤＮＡはたとえば制限部位ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩを使用してｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクターから容易に除去し、標準分子生物学的技術を使用し、そしてフラグメントを繋ぐＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して、同じ酵素により消化された異なる発現ベクター、たとえばｐｃＤＮＡ４ＨＩＳｍａｘＢに連結させることができた（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．，編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに従って）。ベクターｐｃＤＮＡ４ＨＩＳｍａｘＢは標準ｐｃＤＮＡ３．１ベクター以上に遺伝子転写レベルをアップレギュレートする要素を含むため、使用される。
【０１２７】
内因性受容体（たとえばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ‐Ｋ１）の少ない数を発現するように選択され、そしてＧα１５／Ｇｑｉ‐５を安定発現するように操作された適切な宿主細胞系統は、取り扱い説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　Ｐｌｕｓ（登録商標）試薬を使用して、適切な哺乳動物細胞発現ベクター中で受容体ＭＲＧＸ２をコードするｃＤＮＡ７．５μｇ、またはベクターのみにより一時的にトランスフェクトされた。細胞がリガンド結合アッセイまたはマイクロフィジオメトリー用に意図された場合、それらはトランスフェクション後２４〜７２時間インキュベートされた。マイクロタイタープレートを基礎にしたアッセイを意図する場合、細胞はトランスフェクション後２４時間トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＬＴ１）を使用してフラスコから離され、たとえば態様が黒い、ポリ‐Ｄ‐リジン処理、９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に５ｘ１０４細胞／ウェル密度で接種された。プレートはウェルの底に細胞が接着するように一晩放置した。
【０１２８】
実施例４：受容体ＭＲＧＸ２の高レベルを発現する安定細胞系統の操作
適切な宿主細胞系統、たとえばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞（所望するＧ蛋白質を潜在的に発現するように操作された）は、受容体ＭＲＧＸ２をコードするｃＤＮＡ（好ましくはどのような５′または３′非翻訳領域もない）を含み、選択可能なマーカー、たとえばネオマイシン耐性遺伝子を含む適切な哺乳動物細胞発現ベクターにより実施例３に記載のようにトランスフェクトされる。トランスフェクション後、増殖培地にたとえば４００〜８００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を添加し、それによってネオマイシン耐性遺伝子を含むベクターを取り込まなかったすべての細胞を殺す、選択圧が適用される。選択３〜４週間後、個々のクローンは採取され、別の分析のために増殖させる。個々のクローンは受容体ＭＲＧＸ２ｃＤＮＡ配列から設計された標識プローブを使用して、たとえばノーザンブロット法により分析することができる。
【０１２９】
実施例５：リガンド結合アッセイ
実施例３に記載のように一時的トランスフェクション後２４〜７２時間か、または実施例４に記載のように操作された、受容体ＭＲＧＸ２を発現する細胞は、剥がすことにより採取し、氷冷アッセイバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．４）２０ｍｌ中に再懸濁し、ホモジェナイズし、そして得られた懸濁液は２０，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離する。上清はデカンテーションし、ペレットはアッセイバッファー３ｍｌに再懸濁し、そして再ホモジェナイズする（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．４）。蛋白質濃度は、取り扱い説明書に従って、Ｂｒａｄｆｏｒｄのアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）により測定する。
【０１３０】
次に２００μｇ蛋白質を含むこの膜標本のアリコートは、高比活性に放射標識された、各種潜在的なリガンドと共に約２時間室温または３０℃でインキュベートする（それぞれのリガンドに対する至適条件、イオン濃度、インキュベーション時間および温度が決定される必要がある）。インキュベーションを停止するために、試料はＷａｌｌａｃ　Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｓ（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｓ結合を減らすためにアッセイバッファー中のＰＥＩ（ポリエチレンイミン；Ｓｉｇｍａ）の０．３％（ｖ／ｖ）溶液中に予め（１時間）浸清してある）上でのＢｒａｎｄｅｌｌセルハーベスター（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使用して迅速に濾過する。直ちに、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｓ／ウェルはウェル毎に２ｍｌのアッセイバッファーで４回、迅速に継続して洗浄した。Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｓは電子レンジで乾燥し、Ｗａｌｌａｃ　Ｍｅｌｔｉｌｅｘヒートシーラーを使用して、Ｍｅｌｔｉｌｅｘシンチラント（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）をＦｉｌｔｅｒｍａｔｓ上で溶かした。Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｓ上に結合した放射能はＷａｌｌａｃベータプレートシンチレーションカウンターを使用して測定する。
【０１３１】
特異的結合は結合した総放射能から過剰な非標識リガンドの存在下で測定された放射能を引いた差として定義する。また、Ｍｏｃｋトランスフェクションされた細胞は宿主細胞が内因性に使用されたリガンドの受容体を発現するか否かを判断するために評価する。
【０１３２】
実施例６：細胞内カルシウム動員を測定するための機能アッセイ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ（登録商標））技術を各種潜在的ＧＰＣＲアゴニストによる受容体ＭＲＧＸ２の活性化を検出するための手段として使用した。
【０１３３】
細胞は実施例３に記載のようにトランスフェクトされた。細胞はトランスフェクション後２４時間トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＬＴ１）を使用してフラスコから離され、態様が黒い、ポリ‐Ｄ‐リジン処理、９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に５ｘ１０４細胞／ウェル密度で接種された。プレートは細胞がウェルの底に接着するように一晩放置した。培地を細胞から除去し、１００μｌの温かい（３７℃）色素負荷溶液（プレート毎に２０μｌ　ＤＭＳＯ中５０μｇ　Ｆｌｕｏ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ＋ＤＭＳＯ中２０％　プルロン酸、１ｘプロベネシド（１００ｘプロベネシド‐０．７１ｇ　プロベネシドは５ｍｌ　１Ｍ　ＮａＯＨおよび５ｍｌ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した；プロベネシド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）はアニオン輸送蛋白質の活性を阻害し、従って色素負荷を改善する）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの調製Ｅａｇｌｅ培地　１１ｍｌに添加）と交換した。次にプレートを３７℃で１時間インキュベートした。その後、ウェル毎に２５０μｌの洗浄バッファー（５ｍｌ　１００ｘ　プロベネシド保存液＋４９５ｍｌＰＢＳ、ｐＨ７．４）で４回洗浄した。プレートはＦＬＩＰＲ（登録商標）計器内での処理３０分前に３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターに戻した。ＦＬＩＰＲ（登録商標）処理はすべての試料の２分間の蛍光の読みとりを伴い；この間に蛍光基線が１０秒間測定された。次に化合物（すなわち、潜在的ＧＰＣＲアゴニスト）の所望する量を自動的にウェルに移し、残りの時間蛍光を継続的にモニターした。すべての化合物は洗浄バッファーで希釈した。
【０１３４】
受容体に対してアゴニストとして作用できる化合物は、細胞中で蛍光の、従って細胞内カルシウムの一時的上昇を引き起こすようなものによって同定された。最も望ましい反応を引き起こす神経ペプチドの用量反応曲線を図１および図２に示す。予備ＥＣ５０データは表１に示す：
表１：受容体ＭＲＧＸ２の予備ＥＣ５０データ
【０１３５】
【表１】
2004033211.tif 000007
実施例７：マイクロフィジオメトリーを使用した機能アッセイ
大部分の受容体におけるアゴニズムは刺激に反応するために細胞に特別なエネルギーを要求するであろう。エネルギーを発生するために代謝活性が上昇し、周囲の培地の小さいが測定可能な酸性化が見られるであろう。この小さいｐＨ変化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより開発されたＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ　ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒを使用して測定することができる。
【０１３６】
実施例３または４に記載のように作製された受容体ＭＲＧＸ２を発現する細胞は、非酵素的細胞解離液（Ｓｉｇｍａ）により丁寧に採取し、生理的バッファーで洗浄し、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒアッセイカップ中の低緩衝能の培地に接種し、単層として接着させる；あるいは取り扱い説明書に従ってアガロース捕捉法を使用することにより高細胞密度を得ることができる。次にカップをＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ中に置き、細胞上に低緩衝培地を丁寧に注ぎ１時間平衡化させる。次に潜在的アゴニストの所望する量を含む低緩衝培地を細胞上に丁寧に注ぎ、細胞の酸性化速度を継続してモニターした。発現された受容体のアゴニストは、個々の宿主細胞系統ではなく、トランスフェクトされた細胞における代謝速度を上昇させる物質として同定される。
【０１３７】
実施例８：組織抽出物および体液のスクリーニング
実施例７のマイクロフィジオメトリーアッセイは組織抽出物および体液中のアゴニストを同定するために使用することもできる。実施例７のように細胞上に単離された物質を注ぐかわりに、組織抽出物または体液を使用することができる；反応が得られる場合、抽出物または体液はカラムクロマトグラフィー、または当技術分野で既知の他の分離技術を使用して分離し、通常複数の分離サイクルおよび画分の試験で作用を引き起こす物質を同定することができる。このようにして、それまで未知のオーファン受容体に対するアゴニストを見出すことができる。
【０１３８】
実施例９：ＣＲＥルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞は約８０％コンフルエントになるまで培養し、その時点で製造業者により助言されたように脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ　Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、それらはプラスミドｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（ＣＲＥ−ルシフェラーゼ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびオーファン受容体を含むプラスミド構築物により共トランスフェクトされる。細胞はトランスフェクション後２４時間培養し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの調製Ｅａｇｌｅ培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足）中に回収し、白い９６ウェル組織培養プレート中に１００μｌアリコート（５ｘ１０４細胞）として接種する。さらに２４時間培養後、化合物はトリプレットウェルに２０μｌの容積で添加し、そしてプレートは最低５時間インキュベーションするために放置する。次に増殖培地を除去し、細胞をＧｌｏ溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で溶解し、その後ＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを添加する。発現されたルシフェラーゼレベルはＴｅｃａｎ　Ｕｌｔｒａ（登録商標）Ｒｅａｄｅｒ（ウェルごとに１秒）上で定量する。実験が薬物媒介用量反応作用を測定するために計画される場合、対照用量反応が常に包含される。化合物に対して得られたデータはその実験において測定された対象値に関して正規化する。すべての実験は３から４回、別々に行い、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を測定する。ＩＣ５０値および見かけの効力は、平均正規化データにより４パラメータロジスティック曲線（Ｌａｂｓｔａｔｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ）に合わせることにより計算する。アンタゴニストでは、ｐＡ２値はＳｃｈｉｌｄ分析により決定する（Ａｒｕｎｌａｓｋｓｈａｎａ，Ｏ．ａｎｄ　Ｓｃｈｉｌｄ，Ｈ．Ｏ．（１９５９）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４．４８−５８）。
【０１３９】
実施例１０：β‐ラクタマーゼアッセイ
レポーター遺伝子β‐ラクタマーゼのコーディング領域に機能的に結合したサイクリックＡＭＰ反応要素（ＣＲＥ）、およびレポーター遺伝子β‐ラクタマーゼのコーディング領域に結合した、活性化されたＴ細胞プロモータＮＦ−ＡＴの核因子（Ｆｌａｎａｇａｎ　ｅｔ　ａｌ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５２，８０３−８０７）を安定して含むように操作されたＣＨＯ細胞系統（ＣＨＯ−ＣＲＥ−ＮＦＡＴ−ＢＬＡ）は、哺乳動物細胞に発現させるプロモーターに機能的に結合した受容体ＭＲＧＸ２をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド、たとえばｐｃＤＮＡ３．１により実施例４に記載のように安定してトランスフェクトされ、受容体ＭＲＧＸ２の安定発現のために選択される。
【０１４０】
次に受容体ＭＲＧＸ２を発現するＣＨＯ−ＣＲＥ−ＮＦＡＴ−ＢＬＡ細胞は９６ウェルプレートにウェル毎に４ｘ１０３細胞を接種し、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）中、３７℃で６０時間インキュベートする。次に培地を除去し、各ウェルに９０μｌの飢餓培地（高グルコース、０．１ｍＭ　非必須アミノ酸、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓバッファーを含み、血清または抗生物質を含まないＤＭＥＭ）が各ウェルに添加され、細胞は一晩インキュベートされる。次にウェル毎に、１％の透析したウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で調製されたコルチスタチン、ソマトスタチン、α‐ＭＳＨ、Ｂａｍ２２，ダイノルフィンＡ、サブスタンスＰ、または神経ペプチドＦＦのような神経ペプチドリガンド（または陽性対照として１μＭ　イオノマイシン）を１０μｌ添加することにより、細胞は刺激される。次に３７℃／５％ＣＯ２で５時間インキュベーション後、ウェル毎に６ｘ色素溶液（ＡｕｒｏｒａのＣＣＦ２　Ｌｏａｄｉｎｇ　ｋｉｔ，カタログ番号００　１００　０１２は溶液Ａ−Ｄを含む；６ｘ色素溶液を作製するために、取り扱い説明書に従って３６μｌ　溶液Ａ（ＣＣＦ２−ＡＭ）、１８０μｌ　溶液Ｂ、２．８ｍｌ　溶液Ｃおよび２２５μｌ　溶液Ｄを混合する）を２０μｌ添加し、そしてプレートは室温で１時間、暗所で振動台上で（４０回／分　振動）インキュベートする。次に蛍光はＣｙｔｏｆｌｕｏｒ　４０００（ＰｒｅＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、４０５ｎｍの励起波長を使用し、４５０ｎｍおよび５３０ｎｍの波長における発光を測定することにより、測定する。
【０１４１】
リガンドが受容体を刺激し、反応が細胞中のｃＡＭＰ濃度またはカルシウム濃度のいずれかを変化させるとき、β‐ラクタマーゼが細胞中で発現されるであろう。色素は青（クマリン）および緑（フルオレセイン）成分からなり、それらはβ‐ラクタムリンカー基に結合する。４０５ｎｍで励起されると、蛍光エネルギー転移が非開裂分子内で起こり、発光波長は緑（約５３０ｎｍ）であろう。リンカーがβ‐ラクタマーゼにより開裂すると、エネルギー転位は起こらず、結果として４５０ｎｍで測定される、青の蛍光が見られる。青対緑の蛍光の比を測定することは受容体刺激の指標を与えるであろう。この比はアゴニスト依存的で、受容体に対してアゴニストを分類するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＬＩＰＲを使用したカルシウム動員アッセイにより測定した、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、ダイノルフィンＡ、およびノシセプチンに対する受容体ＭＲＧＸ２の用量反応曲線。
【図２】コルチスタチン、ソマトスタチン、Ｂａｍ１３−２２，ＮＰＡＦ、およびＮ９６４２に対する受容体ＭＲＧＸ２の用量反応曲線。
【図１】
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【図２】
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【外国語明細書】
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