(57)【要約】【解決すべき課題】動物胚における遺伝的な異常を早い段階で検出するための手段を提供し、動物胚の効率的なスクリーニング技術を提供すること。【課題の解決手段】ドナー細胞において特異的に発現し、正常胚においては発現しない遺伝子に着目し、これをマーカーにすればより簡便に遺伝子発現の異常を判定することができることを見出し本発明を完成した。本発明によると、胚の正常性を早期に確認する事ができ、動物胚作製技術の優劣の指標とすることができる。また、本発明の方法により、遺伝子レベルにおいて正常であるとスクリーニングされた胚、又はスクリーニングによって正常な核移植胚の作製が保証された技術を用いて作製された再構築胚を借腹に移植すれば、動物胚作製技術の開発における効率の向上、及び実験に供試する卵子や借腹などに用いる雌動物個体自体の削減にもつながる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物胚において遺伝子の発現を分析する段階、又は核移植胚において使用したドナー細胞に特異的な遺伝子の発現を分析する段階を含むことを特徴とする、胚の遺伝子レベルでの正常性のスクリーニング方法。
【請求項２】
核移植に用いるドナー細胞の候補である細胞株の遺伝子発現を検出することによって、又は該細胞株の遺伝子発現量を定量比較することによって、（核の）ドナー細胞として適した細胞株を選択し、決定することを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
ＰＣＲ法により遺伝子を増幅することによって、該当する遺伝子の検出の有無又は検出量が判定される請求項１又は２の方法。
【請求項４】
対象動物が、哺乳動物又はその遺伝子改変動物から選ばれる請求項１〜３の何れか一に記載の方法；
【請求項５】
核を提供するドナー細胞が以下のいずれかから選ばれる請求項１〜３の何れか一に記載の方法；
１）請求項４に記載の対象動物種の体細胞
２）遺伝子組換えを施した培養体細胞
３）ＥＳ細胞
４）ＥＧ細胞
【請求項６】
ドナー細胞が、ブタ卵丘細胞、胎仔繊維芽細胞、又は遺伝子組換えしたブタ卵丘細胞もしくは胎仔繊維芽細胞である請求項１〜３の何れか一に記載の方法。
【請求項７】
核移植の受容体となるレシピエント細胞が以下のいずれかから選ばれる請求項１〜４の何れか一に記載の方法；
１）未受精卵
２）ＥＳ細胞
３）ＥＧ細胞
【請求項８】
動物胚が、以下のいずれかから選ばれる請求項１〜７の何れか一に記載の方法；
１）核移植胚
２）体外培養胚
３）体外成熟卵に精子細胞を導入して得られる胚
４）他体外成熟卵を使用する胚
【請求項９】
以下の工程を含む動物胚を再構築するためのスクリーニング方法；
１）レシピエント細胞の同時活性化は行わずに第２減数分裂の分裂中期で停止した除核レシピエント細胞質内に二倍体核を移植する段階
２）胚が出生に至ることが可能となる十分な期間にわたって核をレシピエント細胞質と接触した状態に保つ段階
３）正しい倍数性を維持しながら再構築胚を活性化する段階
４）胚から得た生物試料におけるドナー細胞に特異的な遺伝子の発現を分析することによって動物胚の遺伝子レベルでの正常性に関してスクリーニングすることを含む胚の培養を行う段階
【請求項１０】
分析される遺伝子が、リポプロテインリパーゼ（以下ＬＰＬ）である請求項１〜９の何れか一に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか一に記載の方法を使用する動物胚の最適培養条件の検討方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０の何れか一に記載の方法によって作製された動物胚。
【請求項１３】
請求項１２において作成された動物胚から調製された生物試料。
【請求項１４】
請求項１〜１１の何れか一に記載の方法に使用する試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、動物胚における発生異常に関するスクリーニング方法、および該スクリーニング法を取り入れた、体外培養下にある動物胚を操作するための方法に関する。また、本発明は、細胞培養環境又は核移植に代表される体外操作プロトコールが動物胚の発生異常を誘発するか否かの検討における該スクリーニング方法の使用に関する。
【０００２】
【従来技術】
通常の受精、着床、出産は、受精卵（精子の卵子内への陥入）の卵割（２〜４ｃｅｌｌ、８〜１６ｃｅｌｌ、桑実胚）から胚盤胞への着床にいたり出産となる。体細胞核移植技術では、単離、培養された又は遺伝子組換えなどがされたドナー細胞核を除核した未受精卵に移植し、適当な培養後に活性化を誘起し、クローン胚を発生させて得られた胚を借腹に移植し、着床、そして出産を経てクローン動物の作出が行われる（特許文献１）。
【０００３】
しかし、これまでのクローン動物の作出における問題点は、個体の作出効率が低い、特に着床以後の発生率、すなわち着床・出産率が低いというようなものであった。これらは胚の遺伝子の発現異常が引き起こす発生異常によるものがほとんどであった。動物種によって異なるが、代表的な例として、ウシやマウスで顕著に起こる胎仔の肥大異常（ＬＯＳ＝Ｌａｒｇｅ  Ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、巨大子症候群）が挙げられる（特許文献１）。
【０００４】
原因の大きなものとして不完全な初期化が推定される。ドナー細胞の核は、除核未受精卵の卵細胞質内に移植することによって、全ての遺伝子がリセットされた状態に戻る（初期化）。初期化が成功すると、胚の発生が正常に進行し、着床・出産に至るが、初期化が不完全だと、胚の遺伝子の発現異常が起こり、発育・着床不全などを起こして発生を停止して死に至るのである。
【０００５】
核移植技術の開発においては効率向上が望まれているが、これまで核移植技術の優劣の指標である核移植胚（クローン胚）の正常性の判定方法は不十分であった。従来、核移植胚の正常性の指標としては、胚の体外培養成績（分割率、生存率、胚盤胞形成率、胚盤胞の細胞数など）に依存してきた。しかし、核移植胚の発生異常は着床以後に起こることが多く、借腹に移植しなければ、胚の個体への発生能は判定できない。体外培養では着床以前（胚盤胞まで）までしか発生を進めることができないため、体外培養成績による判定は明確な差が現れず、核移植技術の優劣が判定できないことが多い。
【０００６】
【先行文献】
【特許文献１】特表２００２−５２５６１８号
【０００７】
【解決すべき課題】
本発明の課題は、動物胚における遺伝的な異常を早い段階で検出するための手段を提供し、動物胚の効率的なスクリーニング技術を提供しようとするものである。
【０００８】
【課題の解決手段】
本発明者は、ドナー細胞において特異的に発現し、正常胚においては発現しない遺伝子に着目し、これをマーカーにすればより簡便に遺伝子発現の異常を判定できることを見出し本発明を完成した。本発明によると、胚の正常性を早期に確認する事ができ、動物胚作製技術の優劣の指標とすることができる。本発明の方法により、遺伝子レベルにおいて正常であるとスクリーニングされた胚、又はスクリーニングによって正常な核移植胚の作製が保証された技術を用いて作製された再構築胚を借腹に移植すれば、動物胚作製技術の開発における効率の向上、及び実験に供試する卵子や借腹などに用いる雌動物個体自体の削減にもつながる。
【０００９】
すなわち本発明は、以下からなる；
１．動物胚において遺伝子の発現を分析する段階、又は核移植胚において使用したドナー細胞に特異的な遺伝子の発現を分析する段階を含むことを特徴とする、胚の遺伝子レベルでの正常性のスクリーニング方法、
２．核移植に用いるドナー細胞の候補である細胞株の遺伝子発現を検出することによって、又は該細胞株の遺伝子発現量を定量比較することによって、核のドナー細胞として適した細胞株を選択し、決定することを特徴とする前項１の方法、
３．ＰＣＲ法により遺伝子を増幅することによって、該当する遺伝子の検出の有無又は検出量が判定される前項１又は２の方法、
４．対象動物が、哺乳動物又はその遺伝子改変動物から選ばれる前項１〜３の何れか一に記載の方法、
５．核を提供するドナー細胞が以下のいずれかから選ばれる前項１〜３の何れか一に記載の方法；
１）前項４に記載の対象動物種の体細胞
２）遺伝子組換えを施した培養体細胞
３）ＥＳ細胞
４）ＥＧ細胞、
６．ドナー細胞が、ブタ卵丘細胞、胎仔繊維芽細胞、又は遺伝子組換えしたブタ卵丘細胞もしくは胎仔繊維芽細胞である前項１〜３の何れか一に記載の方法、
７．核移植の受容体となるレシピエント細胞が以下のいずれかから選ばれる前項１〜４の何れか一に記載の方法；
１）未受精卵
２）ＥＳ細胞
３）ＥＧ細胞、
８．動物胚が、以下のいずれかから選ばれる前項１〜７の何れか一に記載の方法；
１）核移植胚
２）体外培養胚
３）体外成熟卵に精子細胞を導入して得られる胚
４）他体外成熟卵を使用する胚、
９．以下の工程を含む動物胚を再構築するためのスクリーニング方法；
１）レシピエント細胞の同時活性化は行わずに第２減数分裂の分裂中期で停止した除核レシピエント細胞質内に二倍体核を移植する段階
２）胚が出生に至ることが可能となる十分な期間にわたって核をレシピエント細胞質と接触した状態に保つ段階
３）正しい倍数性を維持しながら再構築胚を活性化する段階
４）胚から得た生物試料におけるドナー細胞に特異的な遺伝子の発現を分析することによって動物胚の遺伝子レベルでの正常性に関してスクリーニングすることを含む胚の培養を行う段階、
１０．分析される遺伝子が、リポプロテインリパーゼ（以下ＬＰＬ）である前項１〜９の何れか一に記載の方法、
１１．前項１〜１０の何れか一に記載の方法を使用する動物胚の最適培養条件の検討方法、
１２．前項１〜１０の何れか一に記載の方法によって作製された動物胚、
１３．前項１２において作成された動物胚から調製された生物試料、及び
１４．前項１〜１１の何れか一に記載の方法に使用する試薬キット。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の動物胚作製技術において対象とする動物は、広くクローン技術が適用される分野で利用可能な動物、特に哺乳動物又はその遺伝子改変動物である。好適な例としては例えばブタが例示され、その他の好適な動物としては、遺伝子組換えされた、例えばトランスジェニック、ノックアウト、ノックイン等のブタが例示される。その他、有蹄動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等が例示される。さらに、マウスもしくは上記有蹄動物の遺伝子改変動物、特にトランスジェニック動物等が好適に例示される。
【００１１】
本発明で動物胚とは、核移植胚をも含めた広義の意味で使用する。核移植胚の例示としては、ブタ核移植胚が、好適な例である。また、遺伝子組換えブタ核移植胚も同様に例示される。その他、有蹄動物であるウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等や、マウス等の哺乳動物の核移植胚、及びこれら哺乳動物の遺伝子組換え核移植胚も例示される。そして、体外培養胚、体外成熟卵に精子細胞を導入して得られる胚、及び他体外成熟卵を使用する胚等も好適に例示される。
【００１２】
「動物胚において遺伝子の発現を分析する段階を含む」とは、核移植以外の体外操作例えば卵の体外成熟、体外培養、精子細胞の導入を含む系の動物胚での遺伝子の発現を分析することを意味する。例えば体外成熟卵を電気刺激等の活性化処理をし、その胚を１５〜３０時間体外培養し、その発生胚を回収して遺伝子の発現を確認する。
【００１３】
「核移植胚において使用したドナー細胞に特異的な遺伝子の発現を分析する段階を含む」とは、ドナー細胞から核を取り出し、レシピエント細胞に核を導入し、その後レシピエント細胞においてドナー細胞に特異的な遺伝子の発現の有無を確認する。
【００１４】
核の供給源となるドナー細胞の好適な例は、ブタ卵丘細胞、胎仔繊維芽細胞、及び遺伝子組換えを施したブタ卵丘細胞、胎仔繊維芽細胞などがあげられる。その他、有蹄動物であるウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等や、マウス等の哺乳動物種の体細胞、遺伝子組換えを施した培養体細胞、遺伝子組換え個体から採取した体細胞、核移植に使用可能な全ての細胞、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞等が例示される。
【００１５】
核が導入されるレシピエント細胞の好適な例は、除核未受精卵、「マウス、ウシ、サル、及びブタ」など由来のＥＳ細胞、マウス及びブタなど由来のＥＧ細胞が好適に例示される。
【００１６】
本発明において核移植技術は、既にブタ等で十分に確立されている卵細胞質内核注入法及び電気融合法が利用できる。電気融合法では、除核未受精卵（レシピエント細胞）の囲卵腔（透明帯と卵細胞質の間）にドナー細胞を移植し、電気パルスで融合させた後、約２時間後に活性化刺激（電気刺激によるものが多い）を与える。この方法は、従来から、家畜（例えばヒツジ、ウシ、ヤギ等）で広く用いられている技術である。卵細胞質内核注入法は、ピエゾマイクロマニュピレーターという実験装置を使用して、核（細胞）を除核未受精卵の細胞質内に直接注入（マイクロインジェクション）し、約２時間後に電気的活性化刺激を与える方法であり、マウスで開発された技術である。活性化を行っていない未受精卵のようなレシピエント細胞質内には初期化因子が存在しており、このような細胞質にドナー核を一定時間曝すことによって、初期化が促される。
【００１７】
本発明では、以下のような工程をを含む評価系が提供される。
本発明は、動物胚を再構築するためのスクリーニング方法であって、その最初の工程は、除核未受精卵の同時活性化は行わずに第２減数分裂の分裂中期で停止したレシピエント細胞である除核未受精卵内に二倍体核を移植する段階である。この工程では、活性化を行わずに、ドナー細胞からの核を移植することのみが行われる。活性化を行わないことにより細胞周期をＭＩＩ期のままで維持し、初期化因子の存在する卵細胞質内に核を一定時間さらすことが可能になる。次の工程は、胚が出生に至ることが可能となる十分な期間にわたってドナー細胞からの核をレシピエントの細胞質と接触した状態に保つ段階である。これによって、卵細胞質に曝されたドナー核は、核のリモデリング（核膜崩壊及び早期染色体凝集）を起こし、各遺伝子機能のリセットが達成される（核の初期化）。この時間は、約１〜２時間程度である。次の工程は、正しい倍数性を維持しながら再構築した胚を活性化する段階であり、通常電気刺激によって行われる。次に、核移植胚から得た生物試料におけるドナー細胞に特異的な遺伝子の発現を分析することによって動物胚の正常性に関してスクリーニングすることを含む胚の培養を行う段階である。
本発明の特徴部分はこの工程であり、特に再構築胚からの試料をもとにドナー細胞に特異的な遺伝子発現の分析を行うのである。ここで、発現の分析は、選択された特異的遺伝子のｍＲＮＡの産生状況を検出、さらに定量することによって行われる。ｍＲＮＡの検出は、ＲＴ−ＰＣＲ法として公知であり、ＰＣＲの約３０〜５０サイクル程度で、十分な発現が検出できる。発現量の定量には、いくつかの方法があるが、代表的な方法として、リアルタイム（ＲＴ−）ＰＣＲ法が公知であり、検量線を設定することによって絶対定量ができる。
【００１８】
本発明で分析される遺伝子は、好適な酵素としてリポプロテインリパーゼ（以下ＬＰＬ）をコードするものが選択され、プライマー配列も公知の技術に準じて配列表１及び２に示した塩基配列が用いられた。その他、適当な候補遺伝子としては、ＬＨ−Ｒ、ＡＤＤ１などが例示され、各配列の特徴に応じたプライマーの選定によって同様に分析される（配列表３〜８）。本発明の系においては、核の初期化が完全にされることが正常な核移植胚の調製に必要であり、当該選択された遺伝子の発現が全く検出されないことは、核移植胚の初期化が達成されたこと、及び遺伝子の発現が正常であることを示すものである。
【００１９】
上記のように遺伝子の発現の有無によって初期化が達成された胚（遺伝子発現において正常な胚）であるかどうかの判定を可能としたことから、より早期に核移植技術の完全性の確認を可能とする優れた技術である。
【００２０】
本発明の方法によってスクリーニングされた胚、又は本発明のスクリーニング工程を組み入れた方法によって作製された胚は、核ドナー細胞の供給源として用いることができる。胚をさらにＥＳ細胞又はＥＳ細胞様細胞などの細胞株を作製するための細胞の供給源として利用することもできる。このような胚に由来する動物細胞又は細胞系を細胞移植療法に用いることも可能である。したがって、本発明のさらなる局面においては、動物細胞を患者に投与することを含む治療方法であって、その細胞が上記の方法に従ってスクリーニングされた胚、又はこのようなスクリーニングの段階を組み入れた方法に従って作製された胚から作製されたものである方法が提供される。本発明のこの局面は、細胞移植療法などの医学におけるこの種の細胞の使用、および同じく移植用の細胞又は組織片の作製におけるこの種の胚に由来する細胞の使用にも適用される。細胞を例えば心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、角膜、神経（例えば、脳、中枢神経系、脊髄など）、皮膚などの組織へと組織化させることもでき、又は細胞が血液細胞（例えば、血球すなわち赤血球、白血球など）もしくは造血幹細胞もしくは他の幹細胞（骨髄など）であってもよい。例えば、遺伝子改変の前に患者から細胞を採取してその後に戻すような自家移植片を作製することもできる。しかし、本発明の方法は、同族移植片（同系移植片）、同種移植片および／又は異種移植片の作製における胚のスクリーニングにも有用である。これらの方法には、医学的欠陥を補正するために細胞が遺伝的に改変される状況を含む、患者への治療的移植のための胚性細胞の体外における各種幹細胞、組織細胞への分化誘導が含まれる。この種の用途には、糖尿病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、ＡＩＤＳなどの疾患、又は罹患した個体の細胞もしくは臓器における機能喪失を特徴とする罹病状態の治療が含まれる。
【００２１】
本発明は、動物胚において遺伝子の発現の分析のために使用する、又は動物胚又は胚から得た試料における使用したドナー細胞に特異的な遺伝子の発現の分析のために使用する試薬キットも対象とする。このようなキットは、動物胚又は核移植胚に関して、胚培養環境の検査又は検討のために用いてもよい。
【００２２】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、「ドナー細胞において特異的に発現し、正常胚においては発現しない遺伝子に着目し、これをマーカーにして遺伝子発現の異常を判定することを含む動物胚のスクリーニングに関する」限り、全て本発明に包含される。
【００２３】
実施例１
（各種（ドナー）細胞における遺伝子発現の分析）
（１）方法
核移植胚のドナー細胞として代表的な細胞である卵丘細胞、胎仔繊維芽細胞、ドナー細胞としての利用価値が潜在的に高いとされている前駆脂肪細胞、及び脂肪細胞における特異的な遺伝子発現を分析した。
ブタ由来の各細胞株を液体窒素で急速に凍結−融解処理、さらにＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて細胞膜を破壊し、ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ：Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。次にＱｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒでＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、各遺伝子の発現を検出した。
遺伝子は、ｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅとしてβアクチンをコードする遺伝子、各細胞において特異的に発現している遺伝子として、ＬＰＬ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｐａｓｅ＝リポプロテイン・リパーゼ）、ＡＤＤ１（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  １）、及びＬＨ−Ｒ（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ＝黄体ホルモン・レセプター）をコードする各遺伝子を選択した。なお、ｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅとは、細胞の生存に必須なタンパク質（構成タンパク質やエネルギー代謝の酵素など）をコードしている遺伝子であって、  全ての細胞で常に発現しており、発現量は異なる。遺伝子発現（ｍＲＮＡ）の定量などを行う際に、ｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅの発現量を基準にすることは一般的である。
各遺伝子及びプライマーの塩基配列はブタの配列として決定されており公知である。全ての実験では、下記のものを使用した。
2004275074.tif 000002
ＲＴ−ＰＣＲ条件：
５０℃：３０分、９５℃：１５分（ＲＴ）、９４℃：５分、４０サイクル｛９４℃：１分、Ａｔ：１分、７２℃：１分｝、７２℃７分（ＰＣＲ）
（２）結果
【表１】
2004275074.tif 000003
ブタ卵丘細胞において、ＬＰＬ、ＡＤＤ１、及びＬＨ−Ｒの各遺伝子が、胎仔繊維芽細胞、前駆脂肪細胞、及び脂肪細胞において、ＬＰＬ及びＡＤＤ１の各遺伝子がそれぞれ特異的に発現していることが示された。
（３）効果
ブタ卵丘細胞において、ＬＰＬ、ＡＤＤ１、及びＬＨ−Ｒの各遺伝子が、胎仔繊維芽細胞、前駆脂肪細胞、及び脂肪細胞において、ＬＰＬ及びＡＤＤ１の各遺伝子が、それぞれの細胞をドナー細胞に用いて作製した核移植胚のスクリーニングを行うマーカー遺伝子として有用であることが確認できた。
【００２４】
実施例２
（ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲの検出感度の検討）
（１）方法
実験系は、核移植胚の遺伝子発現を個別に検出するＳｉｎｇｌｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（＝単一の胚）  ＲＴ−ＰＣＲを用いた。一般的に、細胞１個に含まれている全ＲＮＡ量は５０ｐｇ以下、卵１個に含まれている全ＲＮＡ量は５００〜１０００ｐｇであることから、単為発生胚（２０時間培養：１ｃｅｌｌ）、単一の卵丘細胞から抽出したＲＮＡ、及び卵丘細胞株から抽出したＲＮＡを、各２５〜１０００ｐｇの量になるように段階希釈したサンプルを用いて、ＲＴ−ＰＣＲの検出感度の確認を行った。単為発生胚は、体外成熟卵を電気刺激により活性化して作製し、２０時間培養した後に回収して使用した。
各サンプルは液体窒素で急速に凍結−融解処理し、さらにＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて細胞膜（胚では透明帯）を破壊し、その後ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ：Ｑｉａｇｅｎ社）およびグリコーゲン（共沈剤：核酸と結合しやすいため、ＤＮＡあるいはＲＮＡの回収率を向上する）を用いて、ＲＮＡを抽出した。次にＱｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒでＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、各遺伝子の発現を検出した。遺伝子は、単為発生胚においてはβアクチン及びＡＤＤ１、卵丘細胞においてはβアクチン及びＬＰＬの発現を確認した。ＰＣＲのサイクル数は５０とした。これらの抽出方法およびＲＴ−ＰＣＲ条件は複数検討した。体外成熟卵から抽出したＲＮＡを用いることによって、βアクチン部位をＲＴ−ＰＣＲにより増幅して、電気泳動を行い、増幅産物がより多い（ゲル上のバンドが最も濃い）方法を選択・決定した。
ＲＴ−ＰＣＲ条件：
５０℃：３０分、９５℃：１５分（ＲＴ）、９４℃：５分、５０サイクル｛９４℃：１分、Ａｔ：１分、７２℃：１分｝、７２℃７分（ＰＣＲ）
（２）結果
・単為発生胚（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｅｍｂｒｙｏ）
βアクチン：３５／３５    ＡＤＤ１：２７／３０
・単一の卵丘細胞（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ）
βアクチン：１０／１０    ＬＰＬ：０／１０
・卵丘細胞株
βアクチン：全て検出  ＬＰＬ：９／１０（２００ｐｇ）  １４／１５（１５０ｐｇ）  ９／１４（１００ｐｇ）
（３）効果
単一の卵丘細胞でＬＰＬ以外は、ほぼ全て検出が可能であった。ＲＮＡ段階希釈サンプルでは、ＬＰＬの場合、１５０〜２００ｐｇが検出限界であり、これは細胞ならば数個、卵又は胚ならば１個以下の量に相当する。ｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ（βアクチン）を基準とした場合は、単一の胚又は単一の細胞からｍＲＮＡの検出が可能である。またＬＰＬなど、特定の遺伝子をマーカーとした場合には、単一の胚からｍＲＮＡの検出が可能である。このことは、ドナー細胞核の遺伝子が核移植胚において活動しているときに、その遺伝子発現を検出できることを意味する。
【００２５】
実施例３
〔単為発生胚（正常胚）における遺伝子発現の検討〕
（１）方法
体外成熟卵を電気刺激により活性化して作製し、２０時間体外培養した単為発生胚を回収してＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによって、βアクチン、ＬＰＬ、ＡＤＤ１、及びＬＨ−Ｒの各遺伝子の発現を検出した。ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲの方法は前記と同様である。（２）結果
【表２】
2004275074.tif 000004
（３）効果
培養２０時間後の正常胚において、ＬＰＬ及びＬＨ−Ｒの各遺伝子の発現は検出されず、ＡＤＤ１の遺伝子発現は検出されることを示している。
【００２６】
実施例４
（卵丘細胞をドナー細胞に用いて作製した核移植胚における遺伝子発現の検討）
ブタ体外成熟卵由来の卵丘細胞をドナー細胞核としてピエゾマイクロマニュピレーターを用いて、卵細胞質内注入法（下記に示した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）の４種の方法）により、核移植を行い、再構築胚（核移植胚）を作製した（図２）。各方法の条件は以下である。
（ａ）ｐｒｅ：除核未受精卵に卵丘細胞核を卵細胞質内に注入し、２時間後に活性化を行い、再構築胚を作製した。
（ｂ）ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ：除核未受精卵に卵丘細胞核を卵細胞質内に注入し、同時に（３０分以内）活性化を行い、再構築胚を作製した。
（ｃ）ｐｅｒｉ：除核未受精卵に活性化を行い、２時間後に卵丘細胞核を卵細胞質内に注入し、再構築胚を作製した。
（ｄ）ｌａｔｅ：除核未受精卵に活性化を行い、５時間後に卵丘細胞核を卵細胞質内に注入し、再構築胚を作製した。
（ａ）ｐｒｅ：ＮＴ（核移植）２時間後に活性化
（ｂ）ｉｍｍｅ：ＮＴと同時（３０分以内）に活性化
（ｃ）ｐｅｒｉ：活性化の２時間後にＮＴ
（ｄ）ｌａｔｅ：活性化の５時間後にＮＴ
核移植後、２０時間体外培養した、それぞれの再構築胚を回収してＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによって、βアクチン、ＬＰＬ、ＡＤＤ１、及びＬＨ−Ｒの各遺伝子の発現を検出した。ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲの方法は前記と同様である。
（２）結果
【表３】
2004275074.tif 000005
・有意差水準１０％で有意差あり
ＬＰＬ：ｐｒｅ  ＶＳ．  ｌａｔｅ、ｐｅｒｉ  ＶＳ．  ｌａｔｅ
・有意差水準５％で有意差あり
ＬＰＬ：ｉｍｍｅ  ＶＳ．  ｌａｔｅ
（３）効果
ＬＰＬの発現では、ｌａｔｅの方法において、その他の方法（ｐｒｅ、ｉｍｍｅ、ｐｅｒｉ）に比較して発現異常胚が有意に多く検出された（ｌａｔｅ：２１．６％（８／３７）、ｐｒｅ：５．７  ％（２／３５）、ｉｍｍｅ：０％（０／２４）、ｐｅｒｉ：４％（１／２５）、有意水準１０％）。核移植では、活性化を行っていない除核未受精卵の細胞質に、ドナー細胞核を、一定時間曝すことによって、核の初期化が起こり正常な発生が進む。その結果、４種の方法で作製した胚はより正常な順にｐｒｅ、ｉｍｍｅ、ｐｅｒｉ、ｌａｔｅである。体外培養成績については、ｐｒｅ、ｉｍｍｅ、ｐｅｒｉの方法では胚盤胞が得られ、胚盤胞形成率において有意な差は得られなかった。ｌａｔｅの方法では、体外培養を行うと全ての胚が発生を停止してしまった。ｌａｔｅの方法において、ＬＰＬの発現異常を起こす胚が有意に多かったことは、核の初期化が不十分であることを示し、これは体外培養成績の結果と一致する。
【００２７】
実施例５
（卵丘細胞をドナー細胞に用いて作製した核移植胚と単為発生胚の遺伝子発現量の相対比較）
（１）方法
単為発生胚及び卵丘細胞をドナー細胞として用いて作製した核移植胚（ｐｒｅ、ｉｍｍｅ、ｐｅｒｉ、ｌａｔｅ）において得られたβアクチン及びＡＤＤ１の結果について、各遺伝子発現量の相対比較を行った。ＲＴ−ＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物をそれぞれ２％アガロースゲルで電気泳動し、画像解析ソフトＭｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｓｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）によって各バンドの強度を検出・数値化し、ＰＣＲ産物量を算出した。バンドの強度は各ゲルにおいて泳動したポジティブコントロール（ブタ卵丘細胞ＲＮＡ）のバンドの強度を基準として相対化を行った。βアクチン及びＡＤＤ１の各ＰＣＲ産物量、およびその相対量（ＡＤＤ／βアクチン）をＡＮＯＶＡによって解析し、Ｔｕｋｅｙ法を用いて多重比較を行い、それぞれの胚における遺伝子発現量の相対比較とした。
（２）結果
【表４】
2004275074.tif 000006
・有意差水準５％で有意差あり
2004275074.tif 000007
ＡＤＤ１／βアクチン：有意差なし
（３）効果
ｌａｔｅ及びｐｅｒｉにおいて、βアクチンの発現量が他に比べて有意に低かった。このことより、ｌａｔｅ又はｐｅｒｉによって作製された再構築胚には基礎代謝が低下している胚が多く含まれている。ＡＤＤ１／βアクチンにおいて有意差は見られなかったが、ｌａｔｅにおいて標準偏差が０．８１と高く、ばらつきの多さが示された。このことより、ｌａｔｅによって作製された再構築胚において、ＡＤＤ１の相対発現量にばらつきがあり、ＡＤＤ１の相対発現量が異常な胚が含まれている。図３及び図４に電気泳動図を示した。
【００２８】
実施例６
（胎仔繊維芽細胞をドナー細胞に用いて作製した核移植胚における遺伝子発現の検討）
（１）方法
ブタ胎仔由来の繊維芽細胞をドナー細胞核として電気融合法により核移植胚を作製した。電気融合が成功した胚及び失敗した胚について、それぞれ核移植直後２０分以内、１時間後、及び２時間後に回収して（図５）、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによりβアクチン、ＬＰＬ、及びＡＤＤ１の各遺伝子の発現を検出した。ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲの方法は前記と同様である。
（２）結果
【表５】
2004275074.tif 000008
（３）効果
ＬＰＬの発現検出の結果は、特に傾向は見られなかった。
【００２９】
実施例７
（胎仔繊維芽細胞をドナー細胞に用いて作製した核移植胚の遺伝子発現量の相対比較）
（１）方法
胎仔繊維芽細胞をドナー細胞に用いて作製した核移植胚において得られたβアクチン及びＡＤＤ１の結果について前記と同様の方法でβアクチン及びＡＤＤ１の各ＰＣＲ産物量、およびその相対量（ＡＤＤ１／βアクチン）をＡＮＯＶＡによって解析し、Ｔｕｋｅｙ法を用いて多重比較を行い、それぞれの胚における遺伝子発現量の相対比較をおこなった。ただし融合失敗−直後の系はサンプル数が少ないため、多重比較からは除外した。
（２）結果
【表６】
2004275074.tif 000009
・有意差水準５％で有意差あり
βアクチン：有意差なし
2004275074.tif 000010
（３）効果
電気融合が成功し、再構築が達成された胚では１時間後にＡＤＤ１の発現量の低下が示された。一方電気融合が失敗した胚では、１時間後にＡＤＤ１の過剰発現が示された。ＡＤＤ１／βアクチンにおいても同様の結果が示された。電気融合が失敗した胚は、核移植および再構築が達成されていないため、正常な発生が進まなかった。当然、体外培養しても胚盤胞は得られない。一方、電気融合が成功した胚を体外培養すると胚盤胞が得られる。実際、電気融合の方法によるクローン個体の作出例がヒツジ、ウシ、ブタなどの動物種で多数報告されている。電気融合が失敗した胚においてＡＤＤ１の発現異常が起こったことは、体外培養成績やクローン個体作出の結果と一致する。
【発明の効果】
本発明は、核移植初期胚の遺伝子発現異常を検出し、胚の正常性を判定することによって、核移植方法の優劣を正確かつ簡便に判定できる方法である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＰＬ電気泳動ゲル写真を示す。図中左から各以下を示す。
Ｍ：１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒ
１：単為発生胚（ＬＰＬ−）
２：単為発生胚（ＬＰＬ＋）
３：卵丘細胞（ポジティブ・コントロール）
４：ｎｏ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（ネガティブ・コントロール）
【図２】電気刺激による活性化のタイミングを示す。
【図３】βアクチン電気泳動ゲル写真を示す。図中左から各以下を示す。
Ｍ：１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒ
１、２：核移植胚（βアクチン＋）
３：卵丘細胞（ポジティブ・コントロール）
【図４】ＡＤＤ１電気泳動ゲル写真を示す。図中左から各以下を示す。
Ｍ：１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒ
１、２：核移植胚（ＡＤＤ１＋）
３：卵丘細胞（ポジティブ・コントロール）
【図５】胚サンプルの回収時期を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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