(57)【要約】【課題】本発明は、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成を制御する遺伝子、並びにこれらを含むプラスミド、ならびに、そのプラスミドにより形質転換されてなる植物細胞、微生物もしくは植物体を提供することを課題とする。【解決手段】ユーカリＥＳＴデータベースを作製し、これを用いてマイクロアレイ解析によるユーカリあて材形成組織において特異的に発現する遺伝子の抽出を行った。その結果、通常の樹幹と比較して、ユーカリあて材において優位に発現が高い遺伝子群、低い遺伝子群、ほぼ発現に変化を認めない遺伝子群に大別された。ユーカリあて材において優位に発現が高い遺伝子群および低い遺伝子群は、細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成の制御に利用できると考えられる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載の植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が上昇するＤＮＡ。
（ａ）配列番号：１〜８６２のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡからコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質と５０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
植物のあて材形成組織において発現が上昇する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載の植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が減少するＤＮＡ。
（ａ）配列番号：８６３〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡからコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質と５０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
植物のあて材形成組織において発現が減少する、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
植物がユーカリである、請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡからコードされるアミノ酸配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡのプロモーターＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｃ）ＲＮＡｉ効果により、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｄ）共抑制効果により、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｅ）請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物に対してドミナントネガティブな形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜６、または８に記載のＤＮＡを有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載のプロモーターＤＮＡ、または請求項９に記載のベクターを含むプラスミドを保持する微生物。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターが導入された形質転換植物細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成を制御する遺伝子、並びにその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
世界の木材消費量は毎年増加傾向にあり、用途別にみると、薪炭用材の消費が過半数を占め、開発途上地域では今でも増加傾向を示している。製材、製紙用の木材チップなどの産業用材も、先進地域の消費量は若干の減少に転じたものの、開発途上国地域における消費量は増加している。先進地域では文明の発達とともに、森林の農地への転用や資材としての利用等により森林を大きく減少させてきたが、最近植林活動によってわずかながら増加している。しかし、開発途上地域では、かつては先進国の商業伐採により、近年は人口増加にともなって、生活燃料や農地の需要が拡大し、世界全体における森林面積が急激に減少しつづけている。こうしたことから、二酸化炭素固定化能の低下による地球温暖化などの問題が挙げられるようにもなってきた。これらの問題を解決しつつ、近年、産業的に製材、製紙用木材チップの安定供給などを目指した植林事業が世界各地で盛んに行われている。
【０００３】
人類は長い間森林資源（木質バイオマス）を、製紙、建築、飼料、燃料等の多岐にわたる産業分野で利用してきた。木質バイオマスを利用した産業は、将来的にも、持続的利用可能な資源を活用できるとして地球環境問題改善の観点から再認識されており、現行の化石資源に替わるカーボンソースの利用による循環型産業として期待されている。具体的事例を示すと、我が国の製紙会社では、原料である木質バイオマスの持続的かつ安定的確保達成のため、ユーカリ、アカシア等の熱帯早生樹を中心とした植林事業を精力的に進めている。その植林事業規模の例として、王子製紙では２０１０年度までに２０万ｈａの植林面積を目指し、オセアニア、東南アジアなどの環太平洋を中心に広い地域で行っている。このことは、事業レベルでの大規模植林を行うことによるバイオマスの工業利用、再生という循環型の物質生産（バイオマスのリサイクル）を他の産業分野に先駆けて進めていることに他ならない。
【０００４】
さらに、このような植林事業の進展にあわせ、樹木における木質バイオマス生産を人為的に制御することで、その本質である細胞壁成分（セルロース・ヘミセルロース・リグニン）の量並びに質を可変すること、さらに繊維形態（木繊維細胞の伸長）を自由に可変することが可能となれば、木質バイオマスの量的な増大並びに質的な改良が見込まれ、これによって将来のエネルギー利用や工業原料としての活用における用途の拡張が見込まれ、様々な分野で現在の化石原料に置き換わることが期待できる。
【０００５】
細胞壁やこれを主に構成するセルロースは、植物の形態維持に重要な役割を果たしている。しかしながら、セルロースの生合成機構については、世界中で長い研究期間を費やされており、また、ゲノムレベルでの樹木解析研究（非特許文献１）がなされているにもかかわらず、その詳細は依然として不明である。最近、ワタやシロイヌナズナにおいて、セルロースの基本骨格であるβ−１，４グルカンの結合を触媒すると考えられるグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子が報告された（例えば、非特許文献２）。また、ポプラを用いて維管束組織の発達段階差のマイクロアレイにより、木材の形成、特に細胞壁の２次壁合成に特有な遺伝子を解析した結果、その中には機知のセルロース合成酵素等が見出された（非特許文献３）。しかしながら、これまでのところ、セルロース生合成機構全体の調節等に関する研究は大きな進展が認められない（特許文献１）。
【０００６】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に記す。
【非特許文献１】ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ．  ２００２；３（１２）：ＲＥＶＩＥＷＳ１０３３．
【非特許文献２】Ｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２９，  ７９７−８０７，２００２．
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００１  Ｄｅｃ  ４；９８（２５）：１４７３２−７．
【特許文献１】特表２００２−５１０９６１
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
日本は、資源に乏しく現行においても石油、天然ガスなどの化石資源に依存している。今、新しい技術を持ってこの現状を変えていくためには、木質バイオマスとしての樹木のリサイクル活用こそが、その切り札となる。海外諸国においては、過去の林業に対する取り組み方に違いがあるものの、樹木バイオマスの有効活用に関する技術確立は、今世紀初頭における重要課題と位置づけられている。実際、米国では針葉樹のマツ、広葉樹のポプラ、カナダでは同じくトウヒ、ポプラが、北欧ではポプラがその対象樹種として、国家プロジェクトとしてゲノム科学的な解析により研究を開始している。昨今、食糧生産にかかる主要な作物種の遺伝子組換え関連の基盤技術については、欧米に先行されてしまっていることは周知である。これを教訓として、日本がかつての技術立国たるべく少なくとも諸外国と肩を並べ、地球規模での木質バイオマス活用による循環型物質生産を担うためにも、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成を制御する遺伝子を同定する必要性は非常に高い。
【０００８】
本発明は、上記現状に鑑み、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成を制御する遺伝子、並びにこれらを含むプラスミド、ならびに、そのプラスミドにより形質転換されてなる植物細胞、微生物もしくは植物体を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、本課題を解決するためには、ゲノム科学的なアプローチによる、木質バイオマス形成を制御する遺伝子群の取得と、発現・機能に関する包括的な解析を行うべきとの結論にいたった。すなわち、特定の組織、とりわけ細胞壁形成が活発であることや、セルロースを特異的生合成するような時期において、目的の遺伝子群を網羅的に取得、解析する方法を用いることが望ましいとの結論にいたった。さらに、遺伝子工学技術を使用した改良遺伝子の人為的発現制御によって、人類が利用する上で有用な特性を植物に与える為には、新しい特性が適当な植物組織で選択的に発現される様々な組織に特異的な遺伝子群の同定が必要であるとの結論にいたった。
【００１０】
本研究の遂行に当たり、ユーカリにおける解析リソースの整備を行い、具体的には各種遺伝子ライブラリー、樹幹部、葉部、根部の各組織毎にＥＳＴデータベースを作製した。これに加え、モデル植物として世界中で広く活用されているシロイヌナズナについても、遺伝子ライブラリーや細胞壁生合成に関わる突然変異体を保有すると共に、これらの原因遺伝子については既に解析済みである。
【００１１】
本発明者は、作製したユーカリＥＳＴデータベースを用いて、マイクロアレイ解析によるユーカリあて材形成組織において特異的に発現する遺伝子の抽出を行った。その結果、通常の樹幹と比較して、ユーカリあて材において優位に発現が高い遺伝子群、低い遺伝子群、ほぼ発現に変化を認めない遺伝子群に大別された。ユーカリあて材において優位に発現が高い遺伝子群および低い遺伝子群は、細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成の制御に利用できると考えられる。特に、ユーカリあて材において優位に発現が高い遺伝子群については、細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成に関与しており、細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成の促進に利用できると考えられる。
【００１２】
本発明によって得られた細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成を制御する遺伝子群、並びにそれらを統括的に制御する技術については、その１つの成果として、これらの遺伝子群を用いて得られた遺伝子組換えユーカリ新品種の特性による、高セルロース、低リグニン、細胞壁の厚いもの、薄いもの、繊維長の長いもの、短いもの等様々な量的かつ質的な変化が期待される。
【００１３】
即ち、本発明は、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成を制御する遺伝子、並びにその利用に関し、以下の〔１〕〜〔１４〕を提供するものである。
〔１〕  以下の（ａ）または（ｂ）に記載の植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が上昇するＤＮＡ。
（ａ）配列番号：１〜８６２のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡからコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質と５０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔２〕  植物のあて材形成組織において発現が上昇する、〔１〕に記載のＤＮＡ。
〔３〕  以下の（ａ）または（ｂ）に記載の植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が減少するＤＮＡ。
（ａ）配列番号：８６３〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡからコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質と５０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔４〕  植物のあて材形成組織において発現が減少する、〔３〕に記載のＤＮＡ。
〔５〕  植物がユーカリである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＤＮＡ。
〔６〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡからコードされるアミノ酸配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔７〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡのプロモーターＤＮＡ。
〔８〕  以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｃ）ＲＮＡｉ効果により、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｄ）共抑制効果により、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｅ）〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物に対してドミナントネガティブな形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔９〕  〔１〕〜〔６〕、または〔８〕に記載のＤＮＡを有する組換えベクター。
〔１０〕  〔７〕に記載のプロモーターＤＮＡ、または〔９〕に記載のベクターを含むプラスミドを保持する微生物。
〔１１〕  〔９〕に記載のベクターが導入された形質転換植物細胞。
〔１２〕  〔１１〕に記載の形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物体。
〔１３〕  〔１２〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１４〕  〔１２〕または〔１３〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明者は、ユーカリのあて材形成組織において発現が増減するＤＮＡを見出した。植物のあて材形成組織では、細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成が行われていることが知られている（あて材の総説は、木材関連の専門書には必ず記載されているが、ユーカリについては、馬場らの論文（Ｍｏｋｕｚａｉ  Ｇａｋｋａｉｓｈｉ  ４２，７９５−７９８，１９９６）が化学的・組織学的性質に対する詳細なデータを記述している）。本発明は、以上の知見に基づき、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が増減するＤＮＡを提供するものである。
【００１５】
本発明における植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が増減するＤＮＡは、植物の細胞壁成分生合成と木繊維細胞形態形成の制御に利用できると考えられる。また、特に、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が上昇するＤＮＡは、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成に関与しており、細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成の促進に利用できると考えられる。一方、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が減少するＤＮＡは、細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成に関わる遺伝子を、基本的には何らかのシステムによって抑制することで、組織あるいは時期特異的発現の制御に関わる可能性が考えられる。従って、これらを人為的に減少に向かわせることにより、細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成の促進に利用できると考えられる。
【００１６】
植物において細胞壁成分生合成と木繊維細胞形態形成を制御することは、工業や農業の分野において、様々な重要な意義を有する。例えば、植物の細胞璧成分の改変は、セルロース・ヘミセルロース含量を高めることによるパルプ等の優良繊維原材料供給や、有用な農作物および飼料作物の消化吸収効率の向上などをもたらし、経済性や収益性の点で有意義である。また、細胞壁成分である多糖の構造変化により、新たな産業的価値を有する原材料植物の作出をもたらすことも可能である。さらに細胞形態の改変は、パルプ等繊維原材料の繊維特性の向上などの点で有意義である。
【００１７】
また、本発明の植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が増減するＤＮＡは、細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成が行われている細胞や組織を同定するための特異的マーカーとしても利用できる。
【００１８】
本発明のＤＮＡの由来する植物としては、特に制限はなく、例えば、穀類、野菜、果樹等の有用農作物（飼料作物を含む）、パルプ等の繊維原材料植物、観葉植物等の鑑賞用植物等が挙げられる。該植物としては特に制限はなく、ユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スギ、ヒノキ、タケ、イチイ、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ジャガイモ、タバコ、サトウダイコン、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、ヒマワリ、ワタ、オレンジ、ブドウ、モモ、ナシ、リンゴ、トマト、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ニンジン、カボチャ、キュウリ、メロン、パセリ、ラン、キク、ユリ、サフラン等を例示することができる。
【００１９】
本発明のＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。このうち配列番号：１〜８６２のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡは、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が上昇するＤＮＡである。また、配列番号：８６３〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡは、植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において発現が減少するＤＮＡである。
【００２０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、０．１ｘＳＳＣ溶液中にて、６０℃、一晩放置の条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が挙げられる。このような条件において、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡが単離できる。
【００２１】
具体的には、植物より、ＤＮＡを抽出し、遺伝子ライブラリーを構築し、同様の条件によりスクリーニングを行うか、もしくは、抽出したＤＮＡに対して、６０ｍｅｒの配列（配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列）より、任意の２０ｍｅｒ程度の配列をプライマーに用いて、劉らによって確立されたＴＡＩＬ−ＰＣＲ法により、連続する近傍配列を容易に取得できる。
【００２２】
また、本発明は、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質と５０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。このようなＤＮＡは、当業者においては、一般的に公知の方法により単離することが可能である。例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  ＥＭ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １９７５，  ９８，  ５０３．）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，  ＲＫ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８５，  ２３０，  １３５０．、Ｓａｉｋｉ，  ＲＫ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８，  ２３９，  ４８７．）を利用する方法が挙げられる。すなわち、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡもしくはその一部をプローブとして、また、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、植物から配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。
【００２３】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できると期待される。こうして単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからコードされるアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列の同一性を指す。このようなＤＮＡには、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡの縮重変異体も含まれる。
【００２４】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｉ．  ＵＳＡ，  １９９０，  ８７，  ２２６４−２２６８．、Ｋａｒｌｉｎ，  Ｓ．  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ＳＦ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｉ．  ＵＳＡ，  １９９３，  ９０，  ５８７３．）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ＳＦ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １９９０，  ２１５，  ４０３．）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００２５】
また、本発明のＤＮＡには、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからコードされるアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列からなるタンパク質と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。
【００２６】
上記のＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた方法としては、例えば、ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ，  Ｗ．  ＆  Ｆｒｉｔｚ，  ＨＪ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １９８７，  １５４，  ３５０．）により変異を導入する方法が挙げられる。
【００２７】
タンパク質におけるアミノ酸の改変は、通常、全アミノ酸の５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。アミノ酸の改変は、例えば、変異や置換であれば「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」や「ＥｘＳｉｔｅ  ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて行うことが可能であり、また、欠失であれば「Ｑｕａｎｔｕｍ  ｌｅａｐ  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いて行うことが可能である。
【００２８】
また、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）があり、このような縮重変異ＤＮＡも本発明に含まれる。
【００２９】
本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなどが含まれる。ゲノムＤＮＡは、例えば、文献（Ｒｏｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｉｃｈ，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８５，  ５，  ６９．）記載の方法に従って調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡの塩基配列（例えば、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列）を基に作製したプライマーを用いてＰＣＲ（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８８，  ２３９，  ４８７．）を行うことにより調製することが可能である。また、ｃＤＮＡであれば、常法（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）により植物からｍＲＮＡを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。また、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡは、常法によりゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば本発明のＤＮＡの塩基配列（例えば、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列）を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによっても調製することが可能である。なお、得られたＤＮＡの塩基配列は、例えば「シークエンサーＭｏｄｅｌ３７３」（ＡＢＩ社製）を利用することにより容易に決定することが可能である。
【００３０】
また、本発明は、本発明のＤＮＡのプロモーターＤＮＡを提供する。このようなプロモーターＤＮＡとしては、本発明によって得られた植物、特に樹木の細胞壁形成において特異的におよび／またはセルロース生合成時において特異的に発現する遺伝子に連なるプロモーターＤＮＡが挙げられる。ここで、「プロモーターＤＮＡ」とは、ＤＮＡを鋳型としたｍＲＮＡの合成（転写）の開始に必要な特定塩基配列を含むＤＮＡを意味し、これには自然界に存在するＤＮＡの他、組換えなどの人工的な改変操作により作成されたＤＮＡが含まれる。
【００３１】
本発明のプロモーターは、例えば、以下のようにして製造し、利用することができる。目的とするユーカリ植物の組織よりＤＮＡを抽出し精製する。ＤＮＡの調製に際しては、各種の方法を用いることができ、市販のキット、例えば、ＩＳＯＰＬＡＮＴキット（ニッポンジーン社製）などを用いることが可能である。
【００３２】
得られたＤＮＡを材料として、本発明者が既に単離に成功しているユーカリｃＤＮＡの塩基配列を基に、任意の２箇所よりオリゴヌクレオチドを作製し、これをプライマーに用いたＰＣＲ法により、選んだユーカリｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡを簡単に製造することが可能である。該遺伝子の上流域ＤＮＡは、該遺伝子の塩基配列を基に作成したオリゴヌクレオチドプライマーを利用するＰＣＲ法（Ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法やアンカーＰＣＲ法・ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法（島本功ら監修、「新版植物のＰＣＲ実験プロトコール」（植物細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ７）秀潤社１９９７年７月発行）、あるいは該遺伝子のＤＮＡ配列をプローブに用いるハイブリダイゼ−ション法により、単離することが可能である。
【００３３】
ユーカリのＤＮＡには、ゲノムＤＮＡライブラリーを利用することも可能である。ゲノムＤＮＡライブラリーは、ユーカリから抽出したＤＮＡをλＤＮＡ由来の各種ベクターの他、コスミドベクター、ＴＡＣベクター（Ｌｉｕら（１９９９）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ９６  ：ｐ６５３５）などのクローニングベクターに挿入し、大腸菌を形質転換して得られる。
【００３４】
ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングには、ハイブリダイゼーション技術を用いることができる。プローブには、本発明者が既に単離に成功しているユーカリｃＤＮＡの配列を用いることができる。このプローブを用いて上記のゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、該遺伝子と相同なＤＮＡ配列が含まれるクローンを単離する。制限酵素切断地図の作成や、塩基配列の決定などを行い、クローン化されたＤＮＡの構造を明らかにし、該遺伝子の上流に存在する配列を特定する。この上流配列はＴＡＴＡボックス配列を含み、少なくとも数百ｂｐから数ｋｂｐの大きさのものであることが望ましい。この配列を適当な制限酵素によって切り出し、必要に応じて他のプラスミドベクター等にサブクローニングする。
【００３５】
上記の配列のプロモーター活性については、以下のようにして解析することが可能である。例えば、ｐＢＩ１０１などレポーター遺伝子を含むベクターを用い、そのレポーター遺伝子の上流に上記の配列を連結するようにサブクローニングする。ｐＢＩ１０１ベクターにはレポーター遺伝子として、大腸菌のβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が使用されている。この遺伝子産物は基質として５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−β−Ｄ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｘ−ｇｌｕｃ）を用いると、これを分解して青色の沈澱物であるｉｎｄｉｇｏｔｉｎを生ずるため、遺伝子発現を組織レベルでモニターすることが可能である。また、基質として４−ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄｅ（４ＭＵＧ）を用いると、遺伝子産物の働きによって生じる蛍光によって遺伝子発現を定量することが可能である。なお、レポーター遺伝子としては、ＧＵＳ遺伝子の他にクロラムフェニコール  アセチルトランスフェラーゼ遺伝子や、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオロセインプロテイン遺伝子なども利用が可能である。
【００３６】
上記のようにして作成されたキメラ遺伝子構築物は、例えば、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナなどの植物に導入してその機能を解析することが可能である。ｐＢＩ１０１をベクターとして用いた場合は、キメラ遺伝子を含む組換えプラスミドを、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＭＰ９０株にエレクトロポレーション法を用いて導入し、得られた形質転換菌を、例えば、フローラルディップ法（島本功ら監修、「モデル植物の実験プロトコール」（植物細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４）秀潤社１９９６年４月発行）によりシロイヌナズナ植物体に感染させる。感染処理した植物より得られた種子を、用いたベクターに基づいてカナマイシンなどの薬剤を含む培地に播種し、遺伝子導入により薬剤耐性となった形質転換植物体を得る。この形質転換植物体を用いてレポーターＧＵＳ遺伝子の発現について解析する。本発明のプロモーターまたはそれを含む発現ベクターは、以下のようにして利用することが可能である。本発明のプロモーターの下流に目的の遺伝子、例えば、ある種の浸透圧ストレス応答に関わる遺伝子を連結したキメラ遺伝子を、例えば、ｐＢＩ１０１ベクターに挿入し発現ベクターを構築する。このベクターをアグロバクテリウムを介して、例えば、タバコ植物体に導入する。得られた形質転換植物においては、本発明のプロモーターの働きにより、該遺伝子が浸透圧ストレス環境下の根に発現し、塩害や乾燥地域であっても生育が可能となるものと期待される。この場合、３５Ｓプロモーターのように不要な組織においても発現する現象がないため、他の好ましくない形質が現れないことが期待される。
【００３７】
本発明のプロモーターで制御可能な遺伝子としては、上述した特定の遺伝子に限定されない。また、本発明のプロモーターに他の発現制御配列を連結して本発明のプロモーターの機能を改変することも可能である。このような発現制御配列としては、エンハンサー配列やレプレッサー配列、インスレーター配列などが挙げられる。本発明のプロモーターには、機能特性として、樹幹特異的ならびに細胞壁生合成にかかる遺伝子の発現を制御する幾つかのシスエレメント配列が含まれる。本発明のプロモーターに含まれるシスエレメント配列の利用を目的として、他のプロモーターに本発明のプロモーターの一部を挿入連結し、そのプロモーターの機能を改変することも可能である。
【００３８】
また、本発明は、植物の細胞壁成分生合成並びに木繊維細胞形態形成を制御するタンパク質をコードするＤＮＡの発現を抑制するためのＤＮＡを提供する。内在性遺伝子の発現を抑制するためのＤＮＡの好ましい態様としては、本発明のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、本発明のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、ＲＮＡｉ効果または共抑制効果により、本発明のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ、本発明のＤＮＡの転写産物に対してドミナントネガティブな形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等を例示することができる。上記「内在性遺伝子の発現抑制」には、遺伝子の転写の抑制、および／または該遺伝子からコードされるタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、該遺伝子の発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【００３９】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ｅｃｋｅｒ，  ＪＲ．  ＆  Ｄａｖｉｓ，  ＲＷ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９８６，  ８３，  ５３７２．）。その後、タバコやペチュニアにおいてもアンチセンスＲＮＡの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ＡＲ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８８，  ３３３，  ８６６．）、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００４０】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上，  新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，  日本生化学会編，  東京化学同人，  １９９３，  ３１９−３４７．）。
【００４１】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００４２】
また、内在性遺伝子の発現の抑制は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１  ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，  蛋白質核酸酵素，  １９９０，  ３５，  ２１９１．）。
【００４３】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，  １９８８，  ２２８，  ２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，  １９８８，  ２３９，  ２８５．、小泉誠および大塚栄子，  蛋白質核酸酵素，  １９９０，  ３５，  ２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９８９，  １７，  ７０５９．）。例えば、植物の細胞壁成分生合成並びに木繊維細胞形態形成を制御するタンパク質をコードするＤＮＡのコード領域中には、標的となり得る部位が複数存在する。
【００４４】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，  ＪＭ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８６，  ３２３，  ３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ，  Ｙ．  ＆  Ｓａｓａｋｉ，  Ｎ．，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９９１，  １９，  ６７５１．、菊池洋，  化学と生物，  １９９２，  ３０，  １１２．）。
【００４５】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，  １９９０，  ３，  ７３３．、Ｄｚｉａｎｏｔｔ，  ＡＭ．  ＆  Ｂｕｊａｒｓｋｉ，  ＪＪ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９８９，  ８６，  ４８２３．、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ，  ＣＡ．  ＆  Ｃｅｃｈ，  ＴＲ．，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９９１，  １９，  ３８７５．、Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９９１，  １９，  ５１２５．）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  １９９２，  １８６，  １２７１．）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４６】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ；ＲＮＡｉ）によっても行うことができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ＲＮＡｉの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖ＲＮＡが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。ＲＮＡｉは植物においても効果を奏することが知られている（Ｃｈｕａｎｇ，  ＣＦ．  ＆  Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，  ＥＭ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ２０００，  ９７，  ４９８５．）。例えば、植物体における植物の細胞壁成分生合成並びに木繊維細胞形態形成を制御するタンパク質をコードするＤＮＡの発現をＲＮＡｉにより抑制するためには、配列番号：１〜１７３１のいずれかに記載の塩基配列、または、これらと類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを目的の植物へ導入すればよい。ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００４７】
内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部はＲＮＡｉの機構と重複していると考えられている。共抑制も植物において観察される（Ｓｍｙｔｈ，  ＤＲ．，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，  １９９７，  ７，  Ｒ７９３．、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，  Ｒ．，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，  １９９６，  ６，  ８１０．）。例えば、植物体における細胞壁成分生合成並びに木繊維細胞形態形成を制御するタンパク質をコードするＤＮＡが共抑制された植物体を得るためには、該ＤＮＡ、または、これらと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００４８】
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子がコードするタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子を、植物へ形質転換することによっても達成することができる。「ドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子」とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことを指す。
【００４９】
また、本発明は、上記ＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。本発明のベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、ｐＵＣ誘導体などの大腸菌で増幅可能なベクター、ｐＢＩ１０１（クロンテック社）などのように大腸菌とアグロバクテリウムの双方で増幅可能なシャトルベクターなどが挙げられる。また、植物ウイルス、例えば、カリフラワーモザイクウイルスをベクターとして利用することもできる。
【００５０】
本発明のベクターは、例えば、ベクターの所定の部分に本発明のプロモーターＤＮＡや所望の遺伝子を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターＤＮＡを結合あるいは挿入して得ることができる。なお、プロモーターをベクターに挿入する方法は、通常の遺伝子をベクターに挿入する方法に従う。この組換えベクターのプロモーターに所望の遺伝子を機能的に接続することで遺伝子発現用の発現ベクターを得ることができる。
【００５１】
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８５，  ３１３，  ８１０．）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  １９９１，  ３，  １１５５．）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９３，  ２３，  ５６７．）などが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  １９９６，  ３０，  ３８７．）やタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター（Ｏｈｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  １９９０，  ２，  ９５．）、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．，  １９９３，  ２４０，１．）、高温によって誘導されるイネの「ｈｓｐ８０」遺伝子と「ｈｓｐ７２」遺伝子のプロモーター（Ｖａｎ  Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔａ，  １９９４，  １９３，  ５７．）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「ｒａｂ１６」遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９０，  ８７，  １４０６．）、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １９８９，  ８，  ６５１．）、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９８７，  ８４，  ６６２４．）などが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「ｒａｂ１６」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００５２】
また、本発明のＤＮＡの導入により形質転換した細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００５３】
また、本発明は、本発明のベクターが導入された形質転換植物細胞を提供する。本発明のベクターが導入される細胞としては特に制限はなく、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ジャガイモ、タバコ、サトウダイコン、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、ヒマワリ、ワタ、オレンジ、ブドウ、モモ、ナシ、リンゴ、トマト、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ニンジン、カボチャ、キュウリ、メロン、パセリ、ラン、キク、ユリ、サフラン、などの植物の細胞が挙げられるが、ユーカリ、マツ、アカシヤ、ポプラ、スギ、ヒノキ、タケ、イチイなどの樹木が望ましい。また、本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
【００５４】
上記発現ベクターを宿主植物細胞中に導入するために、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換方法のほかに、プロトプラストへの直接導入（プロトプラストに電気パルス処理してＤＮＡを植物細胞へ導入するエレクトロポレーション法や、リポソームなどとプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法など）、パーティクルガン法などが挙げられる。
【００５５】
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって該組換え体から切り出し、植物体に接種することによって、これらの目的遺伝子を植物体に導入することができる（Ｈｏｈｎら（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｕｍｏｒｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐｐ５４９、米国特許第４，４０７，９５６号明細書）。植物細胞や植物体へのベクター導入の手法は、これらのみに限定されず、その他の可能性も含まれる。
【００５６】
プロトプラストへの直接導入では、必要とされるベクターに制限はない。例えば、ｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になることもある。例えば、ＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、ＴｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも右の端の配列、大抵は両側の端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。
【００５７】
アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき遺伝子を、特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクターの中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列と相同な領域をもつため、相同的組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴｉまたはＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含まれている必要がある。通常ＴｉまたはＲｉプラスミドにｖｉｒ領域が含まれており、その働きにより、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００５８】
一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００５９】
なお、このようにして得られた中間ベクターまたはバイナリーベクター、及びこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。
【００６０】
また、本発明は、上記の形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、および該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。このような形質転換植物体は、細胞壁成分や細胞形態形成が改変された有用な形質転換植物体である。本発明における細胞壁成分の改変としては、特に制限されるものではなく、例えば、高セルロース、低リグニン、細胞壁の厚いもの、薄いもの、繊維長の長いもの、短いもの等様々な量的かつ質的な変化が挙げられる。また、細胞形態の改変としては、細胞伸長の変化、細胞の大きさの変化（体積の量的変化）などが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
本発明における形質転換植物体は、例えば、細胞壁合成量増大による植物の成長量の増加、繊維細胞形態の変化、農作物の有用成分の増加などの新たな価値を有する植物として有用である。また、細胞壁合成制御による新素材の開発、飼料作物の消化吸収効率の増加、繊維細胞形態の変化などの新たな価値を有する植物として有用である。
【００６２】
本発明において「形質転換植物体」とは、上述した形質転換植物細胞を有する植物体であり、例えば、上記形質転換細胞から再生された形質転換植物体がこれに含まれる。形質転換された植物細胞から個体を再生する方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネではＦｕｊｉｍｕｒａら（Ｆｕｊｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔ．，  ２，７４，１９９５）の方法、トウモロコシでは、Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７，  ５８１，１９８９）の方法、ジャガイモでは、Ｖｉｓｓｅｒら（Ｖｉｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ７８，  ５８９，  １９８９）の方法、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，  １２，  ７，  １９９２）ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１−１２７０２５）が挙げられる。これらの方法により作出された形質転換植物体またはその繁殖媒体（例えば種子、塊茎、切穂など）から得た形質転換植物体は本発明の対象である。
【００６３】
本発明は、植物、特に樹木の細胞壁形成において特異的におよび／またはセルロース生合成時において特異的に発現する遺伝子、或いはこれらの相同体、或いはこれらの遺伝子に連なるプロモーター領域を有する発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を得て、該形質転換細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産する工程を含む。
【００６４】
形質転換植物体から植物種子を得る工程とは、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる工程を指す。また、種子から植物体を生産する工程とは、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する工程をいう。
【００６５】
なお、形質転換植物体中の導入された外来ＤＮＡまたは核酸の存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中の核酸の塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのＤＮＡまたは核酸の抽出は、公知のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に準じて実施することができる。
【００６６】
植物体中に存在する本発明のＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出した核酸を鋳型として増幅反応を行う。また、本発明のＤＮＡの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を、例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画されて、そのＤＮＡ断片が本発明のＤＮＡに対応することを確認することが可能である。
【００６７】
一旦、染色体内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００６８】
本発明における形質転換植物体をクローン植林により大規模に育成することによって、セルロースを核にしたバイオマスの安定的供給が可能となる。現在、化石資源は工業生産において、原材料や燃料（エネルギー）として大量に使われている。特にエネルギー代替については、木質バイオマスを直接燃焼する（薪利用）ことが発展途上国で日常的に行われているが、これをさらに利用しやすい形態（アルコール：エチルアルコール）に変換することにより有効な対応が可能であると考えられる。実際、エタノールはブラジルなどでサトウキビの絞り汁等に由来する廃糖蜜からアルコール発酵により生産され、自動車燃料として用いられており、アメリカ、ＥＵにおいてもサツマイモやトウモロコシのデンプンをいったん加水分解させブドウ糖にしてからアルコール発酵を行っている事例が増えている。アメリカでは１９９９年８月、「２０１０年までにバイオマスのエネルギー活用を一次エネルギー全体の１０％に高める」と発表し、その目的のひとつが、バイオマスから精製したエタノールをガソリンに混ぜて使う方法である。具体的事例としては、トウモロコシを原料とするｇａｓｏｈｏｌ（ガソリンへのエタノールのブレンド割合が１０％）というエタノール燃料であり、コーンベルト地帯を中心とする２０州で使用され、米国の自動車燃料全体の約１％を占めており、砂糖キビの採れる特定の州ではガソリンの４０％のシェアを占めており、アメリカ国内自動車全メーカーがｇａｓｏｈｏｌを燃料として保証し、具体的にはゼネラルモーター社やクライスラー社はこの利用を推奨している。ＥＵでは２０１０年に１９９０年レベルの８％の温室効果ガス削減をめざし、再生可能エネルギーのシェアを全エネルギーの１２％にする計画が進行しており、自動車代替燃料については、２００５年までに化石燃料の５％をバイオ燃料（生物資源由来の燃料）で代替するという目標を設定している。ＥＵのエネルギー利用計画をみると、太陽電池（貢献度１％）、風力発電（同１９％）、バイオマス・コージェネ（同８０％）となっており、バイオマスに大きな期待が寄せられている。また、２０１５年にはエネルギー用のバイオ作物の栽培が、土地の最大利用面積を占める見込みとなっている。しかしながら、一方では食料増産の観点から、今後穀類やイモ類を大量に工業原料向けに消費することには限界がある。従って、本発明により例えば、セルロース含量が高いユーカリを大量に育成できれば、これから得られるリグノセルロースを原料に、酸加水分解あるいは酵素分解（セルラーゼ）工程によりグルコースを得、次いでアルコール発酵によりエタノールを大量に生産することが可能であり、このような工程の基礎技術は既に確立されている。さらに、グルコースを原料に生分解性プラスチック（ポリ乳酸）を生産する技術は既に確立されており、イモ類のデンプンを用いて工業生産規模での実用化が進展している。しかしながら、将来的には食糧である穀類に替わり、樹木由来のバイオマスが主流になることが予想される。尚、リグニンについても、実用化に関しては今後技術的な課題を克服する必要があるものの、プラスチックや接着剤などの用途が見込まれている。また、エネルギーの観点から述べると、リグニンは製紙産業のパルプ製造工程で化学的に分解され廃液（黒液と呼ばれる）中に含まれるが、廃液中より必要な薬品を抽出した後に、工場内の燃料として活用しており、別の言い方をすると既に燃料の一部を木質バイオマスに依存していることに他ならない。
【００６９】
本発明において木質バイオマスを安定的にかつ大規模に育成し、植林による循環を行うことによって、従来の原料としての活用に加え、バイオマス変換による石油代替エネルギー、さらにはセルロースあるいはヘミセルロースから新規なプラスチックを創出する（こちらも技術的には可能）ことも充分考えられる。さらに、木質バイオマスの普及は、エネルギーセキュリティや環境問題の解決策になると同時に、農林業を始め新たな産業の開発や就労機会の創出にもつながる。
【００７０】
【実施例】
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実験手法に関しては、特に記載のない限り、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、農村文化社（１９８９年））や、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）」などの実験書に従った。
【００７１】
（実施例１）ユーカリＥＳＴデータベースの作製
（１）ユーカリからのＲＮＡ抽出
抽出の対象となるユーカリ組織については、幹の肥大成長部（２次壁肥厚帯；形成層に富む組織）、葉、根とし、傾斜刺激、塩溶液暴露によるストレス付与等様々な状況からの遺伝子発現を想定している。抽出の基本的な方法は、日尾野らの方法（特願平６−２１９１８７）に記載の方法である。下記にはその実施例として、水耕栽培によるユーカリの根を材料に用いたＲＮＡの抽出方法を詳細に説明する。
【００７２】
２ヶ月間生育したユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）幼植物体を水耕培養槽に移植した。水耕栽培はＨｏａｇｌａｎｄ−Ａｒｎｏｎらの培養液を用いて行った。水耕培養液の組成は、５．０ｍＭ  ＫＮＯ３、３．０ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、２．０ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、２．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、４７μＭ  Ｈ３ＢＯ３、９．０μＭ  ＭｎＣｌ２、３６μＭ  ＦｅＳＯ４、３．１μＭ  ＺｎＳＯ４、０．１６μＭ  ＣｕＳＯ４、７５ｎＭ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４であり、脱塩水を用いて調製し、ｐＨは毎日０．１ＭのＮａＯＨあるいはＫＯＨで６．０に調整した。更に、１週間毎に培養液すべてを交換した。ストレス処理を行う場合は、この培養液に栽培１日目以降４日目まで最終濃度が順次５０，１００，２００，３００ｍＭになるようにＮａＣｌを添加した培養液をストレス処理区、ＮａＣｌ無添加培養液をコントロールとした。４日目に根１０ｇを小片にし、液体窒素中で磨砕した。これを５０ｍｌ遠心チューブ（ＮＵＮＣ社製）に移し、ガラスビーズを１０ｇ加えた後、ホモジナイザーで５分間摩砕した。これにジチオスレイトール（１ｍｇ／ｍｌ）を含むメタノール溶液を用いて上清に着色が認められなくなるまで（３回程度）摩砕試料の溶媒抽出を繰り返した。抽出終了後、試料を凍結乾燥させた。この凍結乾燥試料を２５ｍｌのｐＨ９  １００ｍＭ  ＣＨＥＳ  緩衝液（使用直前に２０ミリグラムのジチオスレイトール、１０ｍＭバナジルリボヌクレオシド化合物溶液を添加）と混合し６５℃で３０分間保温した。保温終了後の試料溶液中に、５Ｍ塩化ナトリウム溶液及び１０％ＣＴＡＢ溶液を添加した。この際、添加後の試料溶液中における塩化ナトリウム濃度は１．４Ｍ、ＣＴＡＢ濃度は１％（ｗ／ｖ）となるようにした。試料溶液をよく混合した後６５℃で１０分間保温した後、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（＝２４：１）溶液を添加し、緩やかに、かつ充分に混合した。混合後、遠心操作により上清を回収した。上清に対し、５５％容のイソプロパノールを添加し、１時間氷冷した。遠心操作により沈殿を得、これを水に溶解させた後、フェノール抽出を行った。フェノール抽出後の上清に１０％容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液および６０％容のイソプロパノールを添加し、よく混合した後、遠心操作により沈殿を回収した。沈殿を滅菌水にて溶解した後、終濃度３Ｍとなるように１２Ｍ  塩化リチウム溶液を添加し、よく混合した後、１時間氷冷した。遠心操作によりＲＮＡ沈殿を回収し、洗浄、乾燥を経て、最終的に水１００μＬに溶解させ、ｔｏｔａｌＲＮＡ画分を得た。この結果、ストレス処理区の根、コントロールの根から、それぞれ６１０μｇの全ＲＮＡを得ることが出来た。全ＲＮＡ画分からのｍＲＮＡの精製はＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＩＩＩ  ＆ＩＶキット（Ｃａｔ．＃  Ｚ５３００＆  Ｚ５３１０  プロメガ社製  ＵＳＡ）を用いた。この結果、６１０μｇのｔｏｔａｌＲＮＡからストレス処理区サンプルからは１．３μｇ、コントロールサンプルからは１．８μｇのｍＲＮＡを得た。
【００７３】
（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築
（１）で示した方法により得られた各種組織、状況由来のユーカリｍＲＮＡを、クロンテック社のＳｍａｒｔ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成し、最終的にファージミドライブラリーとした。こうして作成されたゲノムＤＮＡライブラリーは、各々が１×１０６ｐｆｕ以上の独立のクローンからなるものであった。尚、ライブラリーの増幅は作製した一部に対して行い、クローンの解析には増幅をかけずに供した。
【００７４】
（３）ｃＤＮＡクローンの解読とデータベース構築
各組織由来のユーカリファージミドｃＤＮＡライブラリーより、クローンをランダムに選抜し、プラスミドを精製後、アマシャム社のダイターミネーターシークエンスキットによる酵素反応を経て、同社の大規模高速シーケンサーを用いて、塩基配列データの取得を行った。
【００７５】
データ解析は、プラスミド由来の既知配列を削除した後、解析ソフトウェアにより、クラスタリング操作により相同配列の抽出を行った。その後、遺伝子情報データベースの１つである米国・ＧｅｎＢａｎｋの全データベースとの比較検索により、おおよその機能予測（アノテーション）をおこなった。
【００７６】
最終的なデータベースの規模については表１の通りである。
【表１】
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【００７７】
（実施例２）ユーカリあて材形成組織において特異的に発現する遺伝子の抽出
（１）ユーカリ樹幹特異的オリゴマイクロアレイの作製
表１に示すユーカリＥＳＴデータベースより、ＯＪＩ００１ならびにＯＪＩ００５よりクラスター内の重複配列を除いた全配列を対象に、ユーカリオリゴマイクロアレイの作製を行った。なお、実際の作製は、アジレントテクノロジー社（日本国内代理店は、横河アナリティカルシステムズ）に委託した。詳細については下記ホームページに記述されている。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｃａｇ／ｃｏｕｎｔｒｙ／ＪＰ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＰＣｏｌ４９４．ｈｔｍ
【００７８】
このようにして作製したユーカリオリゴマイクロアレイは、８４００個のオリゴＤＮＡを収録しており、ユーカリ樹幹部で発現を認める遺伝子の大部分を網羅可能である。
【００７９】
（２）マイクロアレイ解析によるユーカリあて材形成組織において特異的に発現する遺伝子の抽出
細胞壁構成の主要成分であるセルロース生合成については、特に広葉樹において、外的な傾斜刺激により、細胞壁中のセルロース含量が約２倍に増加する組織形成を行うことが知られており、このような組織に対し、上述のゲノム科学的解析を行うことで、細胞壁形成時において、特にセルロース生合成を担う一連の遺伝子を総括的に捉えることが可能となる。加えて、ＥＳＴデータを用いたマイクロアレイ解析による遺伝子発現解析を組み合わせることにより、各構成遺伝子の発現差を捉えることも可能である。
【００８０】
上述の外的傾斜刺激による特異的現象については、古くから引っ張りあて材として知られる。広葉樹のあて材とは、外的傾斜刺激を受けた場合、樹幹が重力方向の変化を感知し形成される特殊な二次木部である。これを通常材と比較すると、細胞壁成分については、セルロースが増大し、リグニン、ヘミセルロースが減少する。また、形態的観察では、導管分布密度が通常材の半分に減少、細胞壁中のミクロフィブリル傾角が細胞長軸方向に対しほぼ並行には移行する。さらに繊維長は約２０％の増加が認められた。詳細は不明であるが、傾斜に対し、既に伸長成長の終わった幹を重力に対して正しい位置に戻そうとする成長応力が発生しているものと考えられている。傾斜を継続していくとやがては、主幹に代わって枝の１つが新たに垂直に伸長、肥大成長を行う。しかしながら、傾斜に対して起きあがろうとする期間には、傾斜上部の組織に、セルロース含量が極めて高くなる組織が形成され、樹幹断面を観察すると、視覚的にも通常の材組織とは異なる半透明状の組織が容易に認められる。あて材の総説は、木材関連の専門書には必ず記載されているが、ユーカリについては、馬場らの論文（Ｍｏｋｕｚａｉ  Ｇａｋｋａｉｓｈｉ  ４２，７９５−７９８，１９９６）が化学的・組織学的性質に対する詳細なデータを記述している。
【００８１】
本発明者は、実施例１に示したＲＮＡ抽出方法に従って、ユーカリ、カマルドレンシス種のクローン系統（ＣＰＴ１）を材料に全ＲＮＡを抽出した。この際、通常の植物体およびあて材を用いた。あて材は、通直に生育している樹幹を人為的に約４５度に引っ張り傾斜させることによって、樹幹上部に特異的な組織が形成される。通常個体とあて材から得られた全ＲＮＡから、プロメガ社製のＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにより、ｍＲＮＡを精製した。このようにして得られた２種のｍＲＮＡを各々２種の蛍光色素（ｃｙ３．ｃｙ５）により標識し、オリゴマイクロアレイ解析におけるプローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行った（図１）。標識を含むハイブリダイゼーションの方法はアジレントテクノロジーより提示の解析プロトコルに従った。
【００８２】
その結果、通常の樹幹と比較して、ユーカリあて材において優位に発現が高い遺伝子群、低い遺伝子群、ほぼ発現に変化を認めない遺伝子群に大別された。特に、ユーカリあて材において優位に発現が高い遺伝子群については、細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成に関与していると考えられる。具体的には、あて材に特徴的である、高セルロース、低リグニン量といった形質の発現に直接的に関与していると考えられる。
【００８３】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡを利用することにより、樹木における木質バイオマス生産を人為的に制御し、特にはその本質である細胞壁成分（セルロース・ヘミセルロース・リグニン）の量並びに質を可変すること、さらに繊維形態（木繊維細胞の伸長）を自由に可変することが可能となった。即ち、木質バイオマスの量的な増大並びに質的な改良が見込まれ、これによって将来のエネルギー利用や工業原料としての活用における用途の拡張が見込まれ、様々な分野で現在の化石原料に置き換わることが期待できる。
【００８４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ユーカリのあて材における主要遺伝子群の発現強度を示す図である。ユーカリあて材、および通常材より抽出した２種のｍＲＮＡを各々２種の蛍光色素（ｃｙ３．ｃｙ５）により標識し、オリゴマイクロアレイ解析におけるプローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行い、蛍光強度をスキャンして得られた画像を、ロゼッタ社製の解析ソフトウェア（Ｌｕｍｉｎａｔｏｒ  Ｖｅｒ．１．０）にて解析し、反復実験すべてを統計的信頼度９９．９％にて統合し、ユーカリのあて材における主要遺伝子群の発現相対強度を表した。図中、＋（赤）は発現上昇が有意に認められるもの、＋（緑）は発現減少が有意に認められるもの、＋（青）は発現に変化が認められないものを示す。
【図１】
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