(57)【要約】【課題】抗癌剤のスクリーニング方法、該スクリーニング方法を用いることにより得られる抗癌剤などの提供。【効果】本発明のスクリーニング方法およびスクリーニング用キットを用いることにより得られる化合物は抗癌剤および変異導入促進剤として用いることができる。また、本発明で用いられる体細胞突然変異の検出方法を利用することにより、細胞内で効率的に変異が導入された変異タンパク質を作製することができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｃｙｔｉｄｉｎｅ　Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）タンパク質を産生する細胞を試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、および（２）（ｉ）該試験化合物の存在下で培養した細胞が産生する該ＡＩＤタンパク質のレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が産生する該ＡＩＤタンパク質のレベルを比較する工程、もしくは（ｉｉ）該試験化合物の存在下で培養した細胞中で転写された該ＡＩＤタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞中で転写された該ＡＩＤタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルとを比較する工程とを含む、抗癌作用を有する化合物またはその塩をスクリーニングする方法。
【請求項２】
（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質および該ＡＩＤタンパク質以外の他のタンパク質を産生する細胞であって、該細胞における該他のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写が、該ＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写のシグナルの程度に依存して起こるものであることを特徴とする細胞を、試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、および（２）該試験化合物の存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルを比較する工程とを含む、抗癌作用を有する化合物またはその塩をスクリーニングする方法。
【請求項３】
該他のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写が、該ＡＩＤ遺伝子の天然プロモーターの活性に制御されて起こるものであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
該細胞が、該タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする請求項１、請求項２または請求項３記載の方法。
【請求項５】
該細胞が、該タンパク質をコードする遺伝子および該他のタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする請求項２または請求項３記載の方法。
【請求項６】
該他のタンパク質が、レポータータンパク質であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
該他のタンパク質のレベルの比較が、該レポータータンパク質が発するシグナルのレベルの比較であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
該レポータータンパク質が、ルシフェラーゼもしくはグリーン・フルオレセント・プロテイン（ＧＦＰ）であることを特徴とする請求項６または請求項７記載の方法。
【請求項９】
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質を産生する細胞を含む、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１０】
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質および該ＡＩＤタンパク質以外の他のタンパク質を産生する細胞を含む、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１１】
請求項１または請求項２記載のスクリーニング方法、あるいは請求項９又は請求項１０記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗癌作用を有する化合物またはその塩。
【請求項１２】
請求項１１記載の化合物またはその塩を含んでなる抗癌剤。
【請求項１３】
癌がリンパ腫、白血病、前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌または大腸癌である請求項１２記載の抗癌剤。
【請求項１４】
体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）の頻度を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする方法であって、（１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクターを、該ＡＩＤタンパク質の基質遺伝子を導入した細胞に導入する工程、（２）試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件で前記細胞を培養する工程、（３）前記細胞において該試験化合物の存在下および非存在下の各々の場合での体細胞突然変異の頻度を比較する工程、を含むスクリーニング方法。
【請求項１５】
基質遺伝子が変異レポーター遺伝子であって、ＡＩＤタンパク質により正常レポーター遺伝子に変換される遺伝子である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
変異レポーター遺伝子が正常レポーター遺伝子中のチロシンコドンＴＡＣを終止コドンＴＡＧに変換した遺伝子である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
終止コドンＴＡＧがレポーター遺伝子中の体細胞突然変異ホットスポットに存在する請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子である、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
該ＡＩＤタンパク質の基質遺伝子を導入した細胞が非免疫細胞である請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
請求項１４記載のスクリーニング方法を用いることにより得られうる体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩。
【請求項２１】
体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物が体細胞突然変異の頻度を増大させる化合物である請求項２０記載の化合物またはその塩。
【請求項２２】
請求項２１記載の化合物またはその塩を含有してなる変異導入促進剤。
【請求項２３】
体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物が体細胞突然変異の頻度を減少させる化合物である請求項２０記載の化合物またはその塩。
【請求項２４】
請求項２３記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項２５】
癌の予防および／または治療剤である請求項２４記載の医薬。
【請求項２６】
癌がリンパ腫、白血病、前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌または大腸癌である請求項２５記載の医薬。
【請求項２７】
哺乳動物に対して、請求項２３記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防および／または治療方法。
【請求項２８】
癌の予防および／または治療剤を製造するための請求項２３記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項２９】
細胞内における変異タンパク質の作製方法であって、（１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクターを標的遺伝子を導入した細胞に導入する工程、（２）請求項２１記載の化合物またはその塩の存在下の条件、または非存在下の条件で、前記細胞を培養することにより、標的遺伝子産物を発現させる工程、を含む変異タンパク質の作製方法。
【請求項３０】
細胞内における変異タンパク質の作製キットであって、（１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクター、（２）標的遺伝子を導入する細胞、（３）請求項２１記載の化合物またはその塩、からなる作製キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｉｄｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ）遺伝子またはその産物を用いた抗癌剤および変異導入促進剤のスクリーニング方法、該スクリーニング方法を用いて得られる抗癌剤、変異導入促進剤などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
非常に多くの病原体による感染から防御するために、脊椎動物の免疫システムは体細胞のＤＮＡ変異を利用して、ゲノムにコードされる限られた情報量を増加させている。まず、胸腺および骨髄それぞれの分化の過程で、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えにより散在する２、３の生殖細胞胚型遺伝子断片（ｇｅｒｍｉｃ　ｓｅｇｍｅｎｔ）が再構成され、ＴおよびＢリンパ細胞の抗原受容体遺伝子の可変（Ｖ）エクソンが形成される。次に末梢において、成熟Ｂリンパ細胞の免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子が、３種類の遺伝的変化、すなわちＶ遺伝子における体細胞突然変異（ＳＨＭ）、遺伝子変換（ＧＣ）、および重鎖定常領域（ＣＨ）遺伝子におけるクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）により、さらに修飾される。抗原に対するＩｇの特異性と親和性は、抗原による選択と合わせて、非鋳型性ＳＨＭまたはＶ領域遺伝子における偽遺伝子を鋳型とするＧＣのいずれかにより増大する。一方、ＣＳＲはＣＨ遺伝子をＣμから他のＣＨ遺伝子に置き換え、それによりＩｇのイソタイプとエフェクター機能を変化させる。３種類のＤＮＡ変化の分子機構はいまだに研究されている。上記反応のうち、ＣＳＲについてＡＩＤ遺伝子が関与していることが判明している（特開２００１−２４５６６９参照）。
【０００３】
特開２００１−２４５６６９には、ＡＩＤタンパク質およびその断片、該タンパク質をコードするＤＮＡおよびその断片（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびプライマーＤＮＡ）、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された形質転換細胞、該タンパクもしくはその断片に反応性を有する抗体、該抗体を産生する細胞、ならびに該タンパクの産生、該タンパクをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写、もしくは該タンパクの酵素活性を調節する物質を同定する方法が開示されている。さらに、ＡＩＤタンパク質またはＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子の機能を制御することにより発症予防、病状の軽減、治療および／または対症療法効果が期待される疾患としては、例えば、先天的な免疫系の異常を伴う原発性免疫不全症候群、主としてＢリンパ球の欠損、減少あるいは機能異常により発症すると考えられている種々の免疫不全症（例えば、伴性無γグロブリン血症、成長ホルモン欠乏を伴う伴性無γグロブリン血症、ＩｇＭ高値を伴う免疫グロブリン欠乏症、選択的ＩｇＭ欠損症、選択的ＩｇＥ欠損症、免疫グロブリン重鎖遺伝子欠失変異症、κ鎖欠乏症、ＩｇＡ欠乏症、ＩｇＧサブクラス選択的欠乏症、ＣＶＩＤ（ｃｏｍｍｏｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、乳児一過性低γグロブリン血症、Ｒｏｓｅｎ症候群、重症複合免疫不全症（伴性、常染色体劣性）、ＡＤＡ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ）欠損症、ＰＮＰ（ｐｕｒｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）欠損症、ＭＨＣクラスＩＩ欠損症、細網異形成症、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ、ＤｉＧｅｏｒｇｅ症候群、染色体異常、家族性Ｉｇ異化過多症、高ＩｇＥ症候群、Ｇｉｔｌｉｎ症候群、Ｎｅｚｅｌｏｆ症候群、Ｇｏｏｄ症候群、骨異形成症、トランスコバランミン症候群、セクレタリービース症候群など）、後天的な原因により引き起こされた免疫系の傷害を伴う続発性免疫不全症候群（例えば、ＡＩＤＳなど）であり抗体産生不全を伴う種々の疾患および／または種々のアレルギー性疾患（例えば、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性腸炎、薬剤性アレルギー、食品アレルギー、アレルギー性じんましん、糸球体腎炎など）が挙げられている。しかし、ＡＩＤタンパク質またはＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子の機能と免疫関連疾患以外の疾患との関連については何ら示唆も開示もされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、ＡＩＤタンパク質またはＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子は全ての細胞において機能させることが可能であると考えられるので、ＡＩＤタンパク質またはＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子の機能を制御することにより、各種の機能不全に起因する疾患を予防および／または治療することが可能であると考えられる。したがって、ＡＩＤタンパク質またはＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子の機能のさらなる解明が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＡＩＤ遺伝子が体細胞突然変異に関与していることを解明し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明はＡＩＤ遺伝子またはその産物を用いた抗癌剤のスクリーニング方法、該スクリーニング方法を用いて得られる抗癌剤、細胞内での変異タンパク質作製方法および作製キットなどを提供する。
【０００６】
より具体的には、本発明は、
［１］　（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質を産生する細胞を試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、および（２）（ｉ）該試験化合物の存在下で培養した細胞が産生する該ＡＩＤタンパク質のレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が産生する該ＡＩＤタンパク質のレベルを比較する工程、もしくは（ｉｉ）該試験化合物の存在下で培養した細胞中で転写された該ＡＩＤタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞中で転写された該ＡＩＤタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルとを比較する工程とを含む、抗癌作用を有する化合物またはその塩をスクリーニングする方法、
［２］　（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質および該ＡＩＤタンパク質以外の他のタンパク質を産生する細胞であって、該細胞における該他のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写が、該ＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写のシグナルの程度に依存して起こるものであることを特徴とする細胞を、試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、および（２）該試験化合物の存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルを比較する工程とを含む、抗癌作用を有する化合物またはその塩をスクリーニングする方法。
［３］　　該他のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写が、該ＡＩＤ遺伝子の天然プロモーター活性に制御されて起こるものであることを特徴とする
上記［２］記載の方法。
［４］　該細胞が、該タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする上記［１］、［２］または［３］記載の方法、
［５］　該細胞が、該タンパク質をコードする遺伝子および該他のタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする上記［２］または［３］記載の方法、
［６］　該他のタンパク質が、レポータータンパク質であることを特徴とする上記［５］記載の方法、
［７］　該他のタンパク質のレベルの比較が、該レポータータンパク質が発するシグナルのレベルの比較であることを特徴とする上記［６］記載の方法、
［８］　該レポータータンパク質が、ルシフェラーゼもしくはＧＦＰであることを特徴とする上記［６］または［７］記載の方法、
［９］　配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質を産生する細胞を含む、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
［１０］　配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質および該ＡＩＤタンパク質以外の他のタンパク質を産生する細胞を含む、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
［１１］　上記［１］または［２］記載のスクリーニング方法、あるいは上記［９］または［１０］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗癌作用を有する化合物またはその塩、
［１２］　上記［１１］記載の化合物またはその塩を含んでなる抗癌剤、
［１３］　癌がリンパ腫、白血病、前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌または大腸癌である上記［１２］記載の抗癌剤、
［１４］　体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする方法であって、（１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクターを、該ＡＩＤタンパク質の基質遺伝子を導入した細胞に導入する工程、（２）試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件で前記細胞を培養する工程、（３）前記細胞において該試験化合物の存在下および非存在下の各々の場合での体細胞突然変異の頻度を比較する工程、を含むスクリーニング方法、
［１５］　基質遺伝子が変異レポーター遺伝子であって、ＡＩＤタンパク質により正常レポーター遺伝子に変換される遺伝子である上記［１４］記載の方法、
［１６］　変異レポーター遺伝子が正常レポーター遺伝子中のチロシンコドンＴＡＣを終止コドンＴＡＧに変換した遺伝子である上記［１５］記載の方法、
［１７］　終止コドンＴＡＧがレポーター遺伝子中の体細胞突然変異ホットスポットに存在する上記［１５］記載の方法、
［１８］　レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子である、上記［１５］記載の方法、
［１９］　該ＡＩＤタンパク質の基質遺伝子を導入した細胞が非免疫細胞である上記［１４］記載の方法、
［２０］　上記［１４］記載のスクリーニング方法を用いることにより得られうる体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩、
［２１］　体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物が体細胞突然変異の頻度を増大させる化合物である上記［２０］記載の化合物またはその塩、
［２２］　上記［２１］記載の化合物またはその塩を含有してなる変異導入促進剤、
［２３］　体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物が体細胞突然変異の頻度を減少させる化合物である上記［２０］記載の化合物またはその塩、
［２４］　上記［２３］記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
［２５］　癌の予防および／または治療剤である上記［２４］記載の医薬、
［２６］　癌がリンパ腫、白血病、前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌または大腸癌である上記［２５］記載の医薬、
［２７］　哺乳動物に対して、上記［２３］記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防および／または治療方法、
［２８］　癌の予防および／または治療剤を製造するための上記［２３］記載の化合物またはその塩の使用、
［２９］　細胞内における変異タンパク質の作製方法であって、（１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクターを標的遺伝子を導入した細胞に導入する工程、（２）上記［２１］記載の化合物またはその塩の存在下の条件、または非存在下の条件で、前記細胞を培養することにより、標的遺伝子産物を発現させる工程、を含む変異タンパク質の作製方法、
［３０］　細胞内における変異タンパク質の作製キットであって、（１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクター、（２）標的遺伝子を導入する細胞、（３）上記［２１］記載の化合物またはその塩、からなる作製キットなどを提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
（Ａ）ＡＩＤタンパク質
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質は、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である。
ＡＩＤタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現は、胸腺以外の各種リンパ性組織（パイエル板、腸管膜リンパ節、腋窩リンパ節、脾臓、骨髄）で観察される。特に、リンパ節やパイエル板などの末梢リンパ器官で顕著な発現が見られる。一方、一次性リンパ器官での発現は該末梢リンパ器官での発現と比べそのレベルは低いものである。
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞〔例えば、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、白血球）またはこれら細胞の前駆細胞またはそれらの細胞が存在する組織（例えば、リンパ節、リンパ性組織（パイエル板、腸管膜リンパ節、腋窩リンパ節、脾臓、骨髄）など）または血球系の細胞もしくはその培養細胞に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質およびその他のタンパク質との融合タンパク質を含む遺伝子組換えタンパク質であってもよい。
【０００８】
本明細書において、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。
配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、シチジンデアミナーゼ活性が挙げられる。実質的に同質とは、その活性が性質的に同質であることを示す。したがって、シチジンデアミナーゼ活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
シチジンデアミナーゼ活性の測定は、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．）、第２７０巻、１４７６８−１４７７５頁（１９９５）に記載の方法にしたがって行なうことができる。
【０００９】
また、本発明で用いられるＡＩＤタンパク質としては、（１）配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜８０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜８０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などもあげられる。アミノ酸欠失または置換の位置は特に限定されない。
【００１０】
本明細書におけるＡＩＤタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるＡＩＤタンパク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質があげられる。
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質は、ＡＩＤタンパク質の部分ペプチドであってもよく、かかる部分ペプチドとしては、前記した本発明のＡＩＤタンパク質と同質の活性、例えばシチジンデアミナーゼ活性を有するものであれば何れのものであってもよい。
さらに、ＡＩＤタンパク質の部分ペプチドとしては、配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有する部分ペプチドが好ましい。
さらに、ＡＩＤタンパク質の部分ペプチドには、配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するタンパク質の部分ペプチドが用いられ、より具体的には、配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜８０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜８０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１または３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドなども含まれる。
また、ＡＩＤタンパク質の部分ペプチドのＣ末端は通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本タンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）（Ｒは前記と同義語を示す）であってもよい。
さらに、ＡＩＤタンパク質の部分ペプチドには、上記した部分ペプチドにおいて、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００１１】
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１２】
（Ｂ）ＡＩＤタンパク質またはその塩の製造法
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質またはその塩は、上記したヒトやその他の哺乳動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、ＡＩＤタンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、硫安沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１３】
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質もしくはそれらの塩の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニルーヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニルーＦｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α―アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質を取得する。
【００１４】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ，Ｎ，Ｎ‘−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、クロロホルム、トリフルオロエタノール、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジオキサン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチルあるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
原料のアミノ基の保護基としては例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーアミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。カルボキシル基の保護基としては、例えばアルキルエステル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどのエステル基）、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル、フェナシンエステル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが用いられる。
【００１５】
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などが用いられる。またエーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾール基の保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシー２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えばＰｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においては例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのイ
ンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１６】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα―カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα―アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記のような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記の方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るためには、カルボキシ末端アミノ酸のα―カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。
【００１７】
本発明のＡＩＤタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＡＩＤタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち本発明のタンパク質を構成しうる部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼Ｍ．　ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
▲２▼ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）　（１９７５年）
▲４▼矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（
１９７７年）
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発　第１４巻　ペプチド合成、廣川書店
また反応終了後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明のＡＩＤタンパク質を単離精製することができる。上記方法で得られるタンパク質が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００１８】
（Ｃ）ＡＩＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、上記したタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、ＡＩＤタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性（例えば、シチジンデアミナーゼ活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００１９】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）３ｒｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ａｎｄ　Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
「該ハイストリンジェントな条件」とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００２０】
あるアミノ酸が置換、欠失、付加されたタンパク質は、それをコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）を作製することによっても製造することができる。そのようなポリヌクレオチドはＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法に基づく公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、あるいはＰＣＲにより製造することができる。
【００２１】
（Ｄ）組換えベクター
本発明で用いられるＡＩＤタンパク質をコードするＤＮＡを含有し、ＡＩＤ遺伝子を発現できる組換えベクターは、例えば、（イ）ＡＩＤタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当なベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞が宿主の場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、などが用いられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２２】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）、テトラサイクリン耐性遺伝子（以下、Ｔｅｔｒと略称する場合がある）等が挙げられる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ＡＩＤタンパク質のＮ端末側に付加することもできる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
【００２３】
（Ｅ）形質転換体
このようにして構築されたＡＩＤタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を宿主とする場合、具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕，ＤＨ５α〔Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，　Ｇｅｎｅ，　９６，　２３−２８（１９９０）〕，ＤＨ１０Ｂ〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），８７巻，４６４５−４６４９（１９９０）〕などを宿主として、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って形質転換を行う。
【００２４】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などを宿主として、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って形質転換を行う。
【００２５】
酵母が宿主である場合、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２６】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ　細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ），１３，　２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。また、昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，　４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２７】
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、ヒトＦＬ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ１２７細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。これらの中でもＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞などが好ましい。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法〔Ｇｒａｈａｍ　Ｆ．Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　Ａ．　　ジャーナル・ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　５２，　４５６−４６７　（１９７３）〕、ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法〔Ｓｏｍｐａｙｒａｃ　Ｌ．Ｍ．　ａｎｄ　Ｄａｎｎａ　Ｋ．Ｊ．　プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）　７８，　７５７５−７５７８　（１９８１）〕、リポフェクション法〔Ｍａｌｏｎｅ　Ｒ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．　プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）　８６，　６０７７−６０８１　（１９８９）〕，電気穿孔法〔Ｎｕｅｍａｎｎ　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ　Ｊ．）　１，　８４１−８４５　（１９８２）〕等が挙げられる。また、これらの原理を用いた市販の試薬等（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））を用いることもできる。
このようにして、ＡＩＤタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、動物細胞を用いて、本発明で用いられるタンパク質を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択することができる。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行うことにより該ＡＩＤタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｆｈｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒと共に該ＡＩＤタンパク質をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を該ＡＩＤタンパク質が発現可能な条件下で培養し、該ＡＩＤタンパク質を生成、蓄積せしめることによって、該ＡＩＤタンパク質またはその塩を製造することができる。
各種宿主について適当な培地、培養条件などについては公知である（特に、ＷＯ　００／１４２２７号公報第２４頁第２４行〜第２６頁第８行、ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報段落［００９０］〜［００９６］参照）。
【００２８】
上記培養物から該ＡＩＤタンパク質を分離精製するには、例えば下記の方法により行うことができる。
該ＡＩＤタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により該ＡＩＤタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下ＴＭと略称する場合がある）などの界面活性剤が含まれていても良い。
培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清あるいは抽出液中に含まれる該ＡＩＤタンパク質の精製は公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの主に分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られる該ＡＩＤタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお組換え体が産生する該ＡＩＤタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、トロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００２９】
本発明は、上記のようにして得られるＡＩＤタンパク質またはＡＩＤ遺伝子を用いる、［１］抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、［２］抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、［３］抗癌作用を有する化合物またはその塩、［４］体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、［５］体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩、［６］癌の予防および／または治療剤、〔７〕変異導入促進剤［８］癌の予防および／または治療方法、［９］細胞内における変異タンパク質の作製方法および作製キットなどを提供する。
以下、各実施態様について具体的に説明する。
【００３０】
［１］抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明の一態様は、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法に関する。即ち、ＡＩＤタンパク質またはＡＩＤ遺伝子の機能を制御することにより抗癌作用を示す化合物をスクリーニングする方法である。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法の第１の態様は、（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質を産生する細胞を試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、および（２）（ｉ）該試験化合物の存在下で培養した細胞が産生する該ＡＩＤタンパク質のレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が産生する該ＡＩＤタンパク質のレベルを比較する工程、もしくは（ｉｉ）該試験化合物の存在下で培養した細胞中で転写された該ＡＩＤタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞中で転写された該ＡＩＤタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルとを比較する工程とを含む。
【００３２】
また本発明のスクリーニング方法の別の態様は、（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質および該ＡＩＤタンパク質以外の他のタンパク質を産生する細胞であって、該細胞における該他のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写が、該ＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写のシグナルの程度に依存して起こるものであることを特徴とする細胞を、試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、および（２）該試験化合物の存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルを比較する工程とを含む。
好ましくは、（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＡＩＤタンパク質および該ＡＩＤタンパク質以外の他のタンパク質を産生する細胞であって、該細胞における該他のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写が該ＡＩＤ遺伝子の天然プロモーター活性に制御されて起こるものであることを特徴とする細胞を、試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、および（２）該試験化合物の存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルを比較する工程とを含む。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞としては、本発明で用いられるＡＩＤタンパク質を産生し得る細胞であればどのような細胞をも利用し得る。例えば、天然の細胞（特に好ましくはマウスまたはヒト由来の天然細胞）、本発明で用いられるＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞、本発明で用いられるＡＩＤタンパク質をコードするｍＲＮＡが導入された細胞などが挙げられる。該遺伝子組換え細胞の調製に用いられる宿主細胞としては、例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、マウスミエローマ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞等を用いることができるが、本発明においては特に、マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞が好ましい。
【００３４】
本発明の方法には、いわゆるレポーター遺伝子アッセイが包含される。レポータータンパク質としては、ホタルもしくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、またはクラゲ由来のＧＦＰなどが好ましい。レポーター遺伝子アッセイは、例えば、次のような方法で行うことができる。まず、（１）ＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子とレポータータンパク質をコードする遺伝子、あるいはレポータータンパク質をコードする遺伝子のみを、該ＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写のシグナルに依存して該レポータータンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写が起こるように（好ましくは、該ＡＩＤ遺伝子の天然プロモーター活性の制御下に該レポータータンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写が起こるように）、挿入した発現ベクターで、遺伝子組換えタンパクの製造で一般的に使用される細胞を形質転換して遺伝子組換え細胞を作製する。次に、（２）得られた形質転換細胞に、試験化合物を接触させる。そして、（３）該試験化合物の作用に依存して発現される該標的タンパク質のレベルを、該標的タンパク質の発現と同時に発現される該レポータータンパク質が発する蛍光の量を測定することにより、該化合物が、標的タンパク質をコードする遺伝子の発現に影響を与えるか否かを分析する（例えば、米国特許第５，４３６，１２８号及び米国特許第５，４０１，６２９号参照）。
【００３５】
また、前記アッセイを用いた試験化合物のスクリーニングは、マニュアル作業でも可能であるが、ロボットを用いて自動で行うこともできる。いわゆるハイスループットスクリーニング（Ｈｉｇｈ　Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）（組織培養工学，　Ｖｏｌ．２３，　Ｎｏ．１３，　ｐ．５２１−５２４；米国特許第５，６７０，１１３号）によれば、より迅速かつ簡便に行うことができる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００３６】
［２］抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット
本発明の別の態様によれば、ＡＩＤタンパク質を産生する細胞を含む、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キットが提供される。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のようなものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（１）ＡＩＤタンパク質を産生する細胞
ＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子を発現させた細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（２）洗浄用緩衝液
生理的な塩濃度およびｐＨを有する緩衝液（例えばＨａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製））。孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
２．スクリーニング法
（１）ＡＩＤタンパク質を産生する細胞を細胞培養用液体培地（例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ（ギブコ社製）にウシ胎仔血清を１０％添加したもの）に懸濁させ２４穴プレートに１〜５×１０５個／穴ずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％Ａｉｒで２４時間培養する。
（２）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を各穴に５μｌずつ加えた後、３７℃、５％ＣＯ２、９５％Ａｉｒで２４〜７２時間培養する。
（３）培地を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。
（４）細胞内容物を抽出し、ＡＩＤタンパク質の抗原量あるいは活性、もしくはｍＲＮＡ量を測定し、条件の違いによる測定結果を比較する。
【００３７】
本発明のキットに含まれる細胞としては、ヒトまたはその他の哺乳動物に由来するＡＩＤを産生しうる全ての細胞を用いることができる。なかでも、マウスＣＨ１２Ｆ３−２細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、ＩＭ−９細胞、Ｒａｊｉ細胞、マウスミエローマ細胞等が好ましく、とりわけマウスＣＨ１２Ｆ３−２細胞が好ましい。本発明では、ＡＩＤ遺伝子を発現する天然に存在する細胞であっても、ＡＩＤ遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞（好ましくは、ＡＩＤの天然プロモーターを含有する遺伝子組換え細胞）であってもかまわない。また別の態様では、ＡＩＤ遺伝子および他のタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞（好ましくは、ＡＩＤの天然プロモーターを含有する遺伝子組換え細胞）が用いられる。
【００３８】
本発明で用いられる細胞に含有される他のタンパク質は、レポータータンパク質であることが望ましい。レポータータンパク質としては、本発明で用いられる細胞において発現できる遺伝子であればいずれの遺伝子であってもよいが、ホタルもしくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ遺伝子、またはクラゲ由来のＧＦＰ遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチル転移酵素）遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、β―ガラクトシダーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子などが好ましいが、本発明においては感度よく発現を検出できるため、ルシフェラーゼ遺伝子が、また他の基質等の試薬を使うことなく、直接的に発現が確認できるＧＦＰ遺伝子が好ましく用いられる。
【００３９】
別の態様では、本発明のスクリーニング用キットとして、次のような試薬が含まれる。
１．スクリーニング用試薬
（１）ＡＩＤの天然プロモーターを含有し、ＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子および該ＡＩＤタンパク質以外の他のタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞株
（２）洗浄用緩衝液
生理的な塩濃度およびｐＨを有する緩衝液（例えばＨａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製））。孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
２．スクリーニング法
（１）ＡＩＤの天然プロモーターを含有し、ＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子および該ＡＩＤタンパク質以外の他のタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞を細胞培養用液体培地（例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ（ギブコ社製）にウシ胎仔血清を１０％添加したもの）に懸濁させ２４穴プレートに１〜５×１０５個／穴ずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％Ａｉｒで２４時間培養する。
（２）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を各穴に５μｌずつ加えた後、３７℃、５％ＣＯ２、９５％Ａｉｒで２４〜７２時間培養する。
（３）必要であれば培地を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。
（４）必要であれば細胞内容物を抽出し、該ＡＩＤタンパク質以外の他のタンパク質の抗原量あるいは活性、もしくはｍＲＮＡ量を測定し、条件の違いによる測定結果を比較する。
【００４０】
［３］抗癌作用を有する化合物またはその塩、及びそれを含有する抗癌剤
上記スクリーニング方法により得られる化合物は、ＡＩＤタンパク質が細胞の癌化を起こす体細胞突然変異に関与していることが解明されたので、抗癌剤として極めて有用である。
したがって、このようにして得られる化合物は、癌の予防および／または治療剤として用いることができる。ここで、癌としては、リンパ腫、白血病、前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌などが挙げられる。該化合物を癌の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
【００４１】
［４］体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法
体細胞突然変異は、（１）ＡＩＤタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターをレポーター遺伝子を導入した細胞に導入し、（２）前記細胞を適当な条件で培養し、（３）前記細胞からゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡを調製し、ＰＣＲ法を用いてレポーター遺伝子領域を増幅し、（４）前記ＰＣＲ増幅産物を適当なベクターにサブクローニングした後に、その塩基配列を決定することにより検出することができる。この体細胞突然変異の検出方法を利用して、体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングを行うことができる。
【００４２】
すなわち、本発明の別の態様によれば、体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする方法であって、（１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクターをレポーター遺伝子を導入した細胞に導入する工程、（２）試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件で前記細胞を培養する工程、（３）前記細胞からゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡを調製し、ＰＣＲ法を用いてレポーター遺伝子領域を増幅する工程、（４）前記ＰＣＲ増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び（５）該試験化合物の存在下および非存在下の各々の場合での体細胞突然変異の頻度を比較する工程、を含むスクリーニング方法が提供される。
【００４３】
また本発明では、（１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクターを変異レポーター遺伝子を導入した細胞に導入する工程、（２）試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件で前記細胞を培養する工程の後、（３）該試験化合物の存在下および非存在下の各々の場合での正常化したレポーター遺伝子の発現を比較する工程、を含むスクリーニング方法が提供される。
【００４４】
このスクリーニング方法で用いられるレポーター遺伝子としては、本発明で用いられる細胞において発現できる遺伝子であればいずれの遺伝子であってもよいが、例えばＧＦＰ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ホタルもしくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、ヒト成長ホルモン遺伝子等が好ましい。本発明では、他の基質等の試薬を使うことなく直接発現が確認できるという理由から、ＧＦＰ遺伝子を特に用いる。具体的には、ＧＦＰ遺伝子中の体細胞突然変異ホットスポットのチロシンコドンＴＡＣを終止コドンＴＡＧに置換し、未成熟な不活性ペプチドを産生する変異ＧＦＰ遺伝子を用い、体細胞突然変異により終止コドンが本来のアミノ酸（チロシン）に置換され、活性型のＧＦＰタンパク質が産生される。
前記レポーター遺伝子を導入する細胞としては、ヒトまたはその他の哺乳動物に由来する全ての細胞を用いることができる。なかでもＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、マウスミエローマ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞等が好ましく、とりわけマウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞が好ましい。
【００４５】
細胞に導入されるＡＩＤ遺伝子および変異レポーター遺伝子は化学薬剤応答性のプロモーターならびにトランスアクチベーターと共に機能することが望ましい。化学薬剤としては、例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン等があげられるが、本発明においては目的タンパク質の発現量を任意に制御できるという理由から、テトラサイクリンが好ましく用いられる。
Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ、テトラサイクリンプロモーターで発現制御されたＡＩＤ遺伝子および変異レポーター遺伝子を導入したＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、通常はテトラサイクリン含有の（または不含の）培地中でＡＩＤタンパク質の発現をＯＦＦにして培養する。
ＡＩＤ活性を評価したい場合、例えば体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする場合にはテトラサイクリン不含の（または含有の）培地に置換し、ＡＩＤタンパク質の発現をＯＮにする。この条件下では、変異レポーター遺伝子に導入された終止コドンＴＡＧがＡＩＤタンパク質の有する活性により本来のアミノ酸（チロシン）をコードするコドンＴＡＣに置換され、その結果として活性型のＧＦＰタンパク質が産生される。本発明では、細胞中でのＧＦＰ遺伝子の発現は、ＦＡＣＳ　ＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌ　Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析する。この際、死細胞は解析より削除される。すなわち、生細胞のみを選択し、その細胞中で産生されるＧＦＰ遺伝子産物が発する蛍光を測定することにより、細胞中でのＧＦＰ遺伝子の発現が確認される。
【００４６】
上記のようにＧＦＰ遺伝子の発現を解析した後、公知の方法、例えばモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）３ｒｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ａｎｄ　Ｄ．Ｗ．　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）に記載の方法を用いてゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡを細胞より調製する。これらを鋳型としてＧＦＰ遺伝子配列を含有するＤＮＡ断片を適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する。ＰＣＲ増幅産物を例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ）のような適当なベクターにサブクローニングし、その塩基配列を解析することもできる。
【００４７】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００４８】
［５］体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩、及びそれを含有する医薬
上記スクリーニング方法を用いて得られうる化合物またはその塩は、体細胞突然変異の頻度を変化させる作用を有する化合物である。具体的には、（１）体細胞突然変異の頻度を低下させる効果を有する化合物、（２）体細胞突然変異の頻度を増大させる効果を有する化合物である。該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
体細胞突然変異の頻度を増大させる効果を有する化合物は、例えば、変異導入促進剤として有用である。変異導入促進剤は、ＡＩＤタンパク質を発現する細胞内でより効率的に標的タンパク質の変異体を作製するために用いられる。ＡＩＤおよび変異導入促進剤を用いて作製された該変異標的タンパク質は、該標的タンパク質の機能修飾、該標的タンパク質の構造―活性相関の解明、変異標的タンパク質を用いた医薬の開発等に用いることができる。
また、体細胞突然変異の頻度を低下させる効果を有する化合物は、例えば、癌、アレルギー（例えば、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性腸炎、薬剤性アレルギー、食品アレルギー、アレルギー性じんましん、糸球体腎炎など）、自己免疫疾患等の予防および治療のための医薬として有用である。
【００４９】
［６］　本発明の化合物／医薬の製剤化、投与方法、投与量など
本発明のスクリーニング方法などによって得られる化合物を、上記癌などの予防及び／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
上記化合物（活性成分）が、製薬学的に許容できる塩を形成できるときは、そのような塩を形成していてもよい。そのような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
上記化合物又はその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、上記活性化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００５０】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００５１】
また、上記予防及び／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
本発明の活性成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性である。例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【００５２】
［７］　細胞内における変異タンパク質の作製方法および作製キット
本発明はまた、細胞内における変異タンパク質の効率的な作製方法ならびに作製キットを提供する。すなわち、本発明は（１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクターを標的遺伝子を導入した細胞に導入する工程、（２）体細胞突然変異の頻度を増大させる化合物またはその塩の存在下の条件、または非存在下の条件で、前記細胞を培養することにより、標的遺伝子産物を発現させる工程、を含む変異タンパク質の作製方法、ならびに（１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクター、（２）標的遺伝子を導入する細胞、（３）体細胞突然変異の頻度を増大させる化合物またはその塩、からなる作製キットを提供する。
【００５３】
標的遺伝子は、本発明において用いられる細胞で発現することのできる遺伝子であればいずれの遺伝子であってもよい。
標的遺伝子への変異の導入は、上記のように体細胞突然変異の頻度を増大させる化合物またはその塩の存在下で行うこともできるし、あるいは前記化合物またはその塩の非存在下で、ＡＩＤ遺伝子（またはＡＩＤタンパク質）が本来有する機能のみを利用して行うこともできる。
標的遺伝子への変異が導入されたかどうかは、該標的遺伝子の塩基配列の解析により、または該遺伝子産物の有する機能（例えば、酵素活性）の解析により確認することができる。塩基配列を確認する場合、細胞より公知の方法にてゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡを回収し、標的遺伝子を含む領域をＰＣＲ法にて増幅する。得られた増幅産物をサブクローニングし、その塩基配列を解析する。
本発明の変異導入促進剤、および上記の方法／キットを用いて作製された変異標的タンパク質は、該標的タンパク質の機能修飾、該標的タンパク質の構造―活性相関の解明、変異標的タンパク質を用いた医薬の開発等に用いることができる。
【００５４】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などの略号表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである（ＷＯ　００／１４２２７号公報第６３頁第１１行〜第６４頁第２７行、ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報段落［０１３７］参照））。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００５５】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
本発明で用いられるマウス由来ＡＩＤタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるＡＩＤタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
本発明で用いられるヒト由来ＡＩＤタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるＡＩＤタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例２で用いたプライマーＣＭＶＰＦの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例２で用いたプライマーＴｅｔＧＦＰＲの塩基配列を示す。
【００５６】
【実施例】
以下に実施例および参考例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５７】
実施例１
非リンパ系細胞における高頻度突然変異（ＨＭ）を試験するために、テトラサイクリン応答性（ｔｅｔ−ｏｆｆ）トランスアクチベーターと、誘導性テトラサイクリン（ｔｅｔ）プロモーターにより転写される変異ＧＦＰ配列をもつｐＩプラスミド（ジャーナル・オブ・イムノロジ−、第１６６巻、５０５１−５０５７頁（２００１））をトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞株を作製した。トランスフェクションは、リポフェクタミン試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用い、添付のマニュアルにしたがって行った。変異ＧＦＰは未成熟なペプチドを産生するように、遺伝子中に存在するＲＧＹＷ［Ｒはプリン（Ａ／Ｇ）；Ｙはピリミジン（Ｃ／Ｔ）；ＷはＡ／Ｔ］ＳＨＭホットスポットに終止コドン（ＴＡＧ）を有し、この変異ＧＦＰを有するｐＩプラスミドはマウスのプレＢ細胞株およびＣＨ１２Ｆ３−２Ｂリンパ腫細胞株においてＳＨＭをアッセイするのに有用であることが示されている（Ｊ．　Ｂａｃｈｌ　ｅｔ　ａｌ．　ジャーナル・イムノロジー　（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　１６６，　５０５１−５０５７　（２００１））。ＡＩＤはレトロウイルス感染により、ＮＩＨ３Ｔ３−ｐＩ細胞１９クローンに導入され、サザンブロット解析により、それぞれが１から４コピーのｐＩを含有することが明らかとなった。有意な数のＧＦＰ＋細胞（１〜１．８％）がテトラサイクリン非存在下で１０日間培養したＡＩＤ感染ＮＩＨ３Ｔ３−ｐＩ細胞で検出され、一方ｍｏｃｋ感染またはシチジンデアミナーゼモチーフのほとんどを欠失するＡＩＤの機能欠失型変異体（ＡＩＤｍ−１）の感染ではＧＦＰ＋細胞は全く生じなかった。これらの結果を図２に示す。すなわち、図２はＦＡＣＳによるＧＦＰ発現の解析結果を示す。また、ｐＩプラスミドを１コピーもつＮＩＨ３Ｔ３−ｐＩ＃１９クローンに由来するソートしたＧＦＰ＋細胞において得られた２７個のＧＦＰ配列の全てにおいて未成熟な終止コドンは全てチロシンコドン（ＴＡＣ）に復帰していること、すなわちＧ→Ｃ変異を起こしていることを確認した。
【００５８】
ＧＦＰ＋細胞の出現頻度はＡＩＤウイルスの感染量に依存して増加し、ＡＩＤｍ−１ウイルスでは増加しなかった。またＧＦＰ＋細胞の出現頻度は、培地中のテトラサイクリン濃度の減少に伴い増加した。ＧＦＰ＋細胞の出現頻度に並行して、ＧＦＰ基質における突然変異はＡＩＤウイルス量ならびに転写誘導レベル依存的に増加した。以上の結果を図３および図４に示す。図５に示すように、ＧＦＰ＋細胞はＡＩＤ発現３日後に現れ始め、１０日で最大レベル（０．９２±０．１４％）に達した。１０から２０日でＧＦＰ＋細胞の頻度は徐々に減少したが、２０日でのＧＦＰ配列中の変異率（６．５×１０−３変異／ｂｐ）は１０日での変異率（４．５×１０−３変異／ｂｐ）より僅かに高く、追加の変異がＧＦＰ基質に蓄積しつづけたことを示している。
【００５９】
実施例２
全体的な変異頻度を評価するために、以下のような実験を行った。すなわち、テトラサイクリン非存在下で１０日間培養したＡＩＤ発現ウイルスを感染させたＮＩＨ３Ｔ３−ｐＩ細胞の全ＤＮＡを公知の方法を用いて調製した。この全ＤＮＡを鋳型として、プライマーＣＭＶＰＦ（配列番号：５）およびプライマーＴｅｔＧＦＰＲ（配列番号：６）を用いて、ＧＦＰ遺伝子を含む断片をＰＣＲ法にて増幅させた。増幅は、９４℃−３０秒、５７℃−３０秒、７２℃−１分を３０サイクルの条件で行った。ＰＣＲ増幅後、その産物にＡを付加し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）にサブクローニングした。ＰＣＲ産物のうちランダムに拾った２４個のクローンについて、そのＧＦＰ配列を決定した。コントロールとして、テトラサイクリン存在下の実験、ＡＩＤｍ−１発現ウイルスを感染させたＮＩＨ３Ｔ３−ｐＩ細胞を用いた実験を行った。ＡＩＤ発現ウィルス感染細胞株では少数の欠失と重複を含む、かなりの数の変異（４．５×１０−３変異／ｂｐ）がＧＦＰ配列２４個中２２個で観察された。この結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
１日あたり１回の分裂と考えると、おおよその変異率は４．５×１０−４変異／ｂｐ／世代であり、ＩｇのＳＨＭにおける変異率（１×１０−４〜１×１０−３変異／ｂｐ／世代）と一致する。対照的に、テトラサイクリン存在下で培養したＡＩＤ感染細胞株の２３個のＧＦＰ配列では３個の変異が見出されただけであった。培養時のテトラサイクリンの存在にかかわらず、ＡＩＤｍ−１感染細胞では変異は検出されなかった。転写される遺伝子全てがそのような高頻度の変異を蓄積するとは考えられない。すなわち、あるびまん性大細胞型Ｂリンパ腫においてＶ遺伝子の場合と比較して２桁低レベルの変異を蓄積するｃ−ｍｙｃ遺伝子はＡＩＤ誘導性変異ＮＩＨ３Ｔ３細胞を蓄積しなかった。
ＩｇにおけるＳＨＭの特性として、時として欠失あるいは重複を伴う多くの点突然変異、トランスバージョンよりもトランジション、ＲＧＹＷ／ＷＲＣＹモチーフへのターゲティングがあげられる。ＧＦＰ配列５３クローンの２４７個の変異についてその分布を解析し、その結果を図６および図７に示した。図６に示したように、点突然変異は統計的にＲＧＹＷ／ＷＲＣＹモチーフ（白抜き文字で示した）に偏っており、また図７に示したように、トランジション変異はトランスバージョンよりも優位であった。これらの結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
以前、ＣＳＲジャンクションはコンピュータで予測される一本鎖ＤＮＡのステム−ループ構造周辺に選択的に分布することを示した。ＤＮＡのそのような二次構造もまた、ＳＨＭの標的であるＶ遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）周辺で認められる。図６に示したように、ＡＩＤ誘導性変異はまた二次構造に偏っていた。興味深いことに、ＡＩＤ誘導性置換はＧ／Ｃ塩基対に偏っており、２４７個の変異のうち３個だけがＡ／Ｔ塩基対で生じていた。ヒトおよびマウスの生体内では、Ｂ細胞のＶ遺伝子でのＳＨＭにおける変異した塩基について、Ｇ／Ｃ塩基対へのそのような強い偏りは示されなかったが、類似した偏りはＡＩＤをトランスフェクトしたハイブリドーマ、マウスのプレＢ細胞系、ヒトのバーキットリンパ腫株、ミスマッチ修復欠損マウスのＢ細胞およびＸＲＣＣ２／３欠損ニワトリのＢ細胞リンパ腫株のＶ遺伝子におけるＳＨＭで報告された。ヌクレオチドの偏りの違いは、比較的誤りがちなＤＮＡポリメラーゼまたは特異的なＤＮＡ修復タンパク質の量の違いによるものと考えられる。点突然変異に加え、１８個の欠失と２個の重複についてはＩｇにおけるＳＨＭの特性と矛盾することなく観察された。
【００６４】
以上の結果から、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＡＩＤ誘導性ＨＭは、ＩｇにおけるＳＨＭと共通の性質、すなわち（ａ）ＡＩＤが必要である、（ｂ）標的遺伝子の転写に依存する、（ｃ）特異的なモチーフに偏った変異である、（ｄ）時折、欠失および重複をもつ、（ｅ）変異率が高い、という性質を有する。これらの性質はまた、ＬＰＳで刺激されたＢ細胞のＳμ領域におけるＨＭとも共通する。これらの結果は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＨＭがＢ細胞のＶおよびＳμ配列におけるＨＭと同一の分子機構を用いていることを示唆し、ＡＩＤが非リンパ細胞の活発に転写される遺伝子におけるＨＭに必要な唯一のＢ細胞特異的な因子であることを示している。同一細胞系でＣＳＲがＡＩＤにより誘導されるという以前の観察と合わせると、転写される遺伝子において、ＣＳＲおよびＨＭを完了するために必要な、ＡＩＤ以外の全てのトランスに作用する因子が非リンパ細胞で定量的に発現することが予想される。
【００６５】
ＡＩＤの欠損は、ＣＳＲを誘導したときに脾臓Ｂ細胞のＩｇＣＨ座において、ＤＮＡ二重鎖切断修復に関与するγ−Ｈ２ＡＸとＮＢＳ１の蓄積が認められるが、ＡＩＤの欠損により、その蓄積は完全に消失するので、ＡＩＤはＣＳＲの切断段階に関与していると考えられる。ＣＳＲが他のＣＨ対立遺伝子で起きる際に、ＨＭが胚型Ｓμ領域で誘導されるので、ＡＩＤはＣＳＲとＨＭにおいて、特にＤＮＡ切断段階において同様の役割を果たしていると思われる。
すなわち、細胞、特に非免疫細胞において、ＡＩＤタンパク質またはＡＩＤタンパク質をコードする遺伝子、あるいはこれに類似のタンパク質またはこれをコードする遺伝子が機能することにより、（１）ＤＮＡ鎖に切断が入る。（２）これを修復する際に誤りがちな修復がなされ、ＤＮＡ上に変異が蓄積する。（３）変異の蓄積が癌化への引き金となることが考えられる。これらのタンパク質またはその遺伝子の機能を制御することは、癌の予防および／または治療、あるいはその診断を可能にするものと考えられる。
【００６６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明では体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物のスクリーニング方法およびスクリーニング用キットが提供される。これらのスクリーニング方法およびスクリーニング用キットを用いることにより得られる化合物は抗癌剤として用いることができる。また、本発明で用いられる体細胞突然変異の検出方法を利用することにより、細胞内で効率的に変異が導入された変異タンパク質を作製することができる。
【００６７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｔｅｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）下のＧＦＰ基質（ｐＩ）を示す。ＴＲＥ、ＰｍｉｎＣＭＶ、ＴＡＴＡはそれぞれ、テトラサイクリン応答性因子、最小ＣＭＶプロモーター、ＴＡＴＡボックスを表す。ＣＭＶＰＦおよびＴｅｔＧＦＰＲはＰＣＲ増幅およびシーケンシングのためのプライマーである。
【図２】ＦＡＣＳによるＧＦＰ発現の解析結果を示す。
【図３】ＡＩＤ誘導性ＨＭのＡＩＤ感染量依存性を示す。
【図４】テトラサイクリン濃度の変化に伴う培養１０日目におけるＧＦＰ＋細胞と変異の頻度を示す。
【図５】ＨＭの経時変化の解析結果を示す。
【図６】ＧＦＰ基質上の変異の分布を示す。配列を決定した５３個のＧＦＰクローンから得られた２４７個の点突然変異、１８個の欠失（両方向の矢印）および２個の重複（太い下線）をＧＦＰ基質の配列上にマップしたものを示す。開始コドン、変異終止コドン、元来の終止コドンをアスタリスクで示した。
【図７】Ｇ／Ｃ塩基対への変異の偏りとトランジション置換の優位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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