(57)【要約】【課題】軟骨型フィブロネクチンに特異的な結合性を有する物質を探索し、該物質を用いた軟骨型フィブロネクチンの検出方法、該方法を用いた腫瘍検出方法を提供する。【解決手段】少なくとも下記（１）及び（２）の工程を有する「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」、かかる検出方法による検出結果と軟骨腫瘍の存否を関連づける「腫瘍の検出方法」、軟骨型フィブロネクチンを特異的に認識する「抗軟骨型フィブロネクチンモノクローナル抗体」。（１）検体中の軟骨型フィブロネクチンとコンドロイチン硫酸Ｅとを接触させる工程；（２）前記接触により生じた「軟骨型フィブロネクチンとコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体」を検出する工程。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記（１）及び（２）の工程を有する「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
（１）検体中の軟骨型フィブロネクチンとコンドロイチン硫酸Ｅとを接触させる工程；
（２）前記接触により生じた「軟骨型フィブロネクチンとコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体」を検出する工程。
【請求項２】
「コンドロイチン硫酸Ｅ」が、固相に結合していることを特徴とする請求項１記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
【請求項３】
「コンドロイチン硫酸Ｅ」が、更にリン脂質と共有結合していることを特徴とする請求項１又は２記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」
【請求項４】
「検体」が「軟骨抽出液」であることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項記載の「軟骨型フィブロネクチン結合性物質の検出方法」。
【請求項５】
検体中の軟骨型フィブロネクチンを、コンドロイチン硫酸Ｅを用いて検出し、検出結果と軟骨腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする「軟骨腫瘍の検出方法」。
【請求項６】
検体が生体から取り出した軟骨組織であって、該軟骨組織を組織染色することで軟骨型フィブロネクチンの検出を行うことを特徴とする請求項５記載の「軟骨腫瘍の検出方法」。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、軟骨型フィブロネクチンの検出方法、軟骨型フィブロネクチンを検出して軟骨腫瘍を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本明細書中においては、「フィブロネクチン」を「ＦＮ」と、「グリコサミノグリカン」を「ＧＡＧ」と、「コンドロイチン硫酸」を「ＣＳ」と、「コンドロイチン硫酸Ｅ」を「ＣＳＥ」と略記する。
ＦＮは細胞接着を促進する因子の一つであり、血漿型ＦＮ、細胞型ＦＮ、軟骨型ＦＮなど数種類のＦＮが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。これらの構造的相違は、スプライシングの相違によることも知られている（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
一般にＦＮはヘパリンやヒアルロン酸などのＧＡＧ、コラーゲンなどに接着性を有することが知られていた。また軟骨型ＦＮがプロテオグリカンの１種であるデコリンに結合性を有することも知られていた（非特許文献５）。接着性において他の型のＦＮには特異性が低く、軟骨型ＦＮのみに高い特異性を示す物質はこれまでは知られていなかった。
【０００４】
ＦＮは５’末端から３’末端に向かって順にＩ−１（配列番号１５）、Ｉ−２（配列番号１７）、Ｉ−３（配列番号１９）、Ｉ−４（配列番号２１）、Ｉ−５（配列番号２３）、Ｉ−６（配列番号２５）、ＩＩ−１（配列番号２７）、ＩＩ−２（配列番号２９）、Ｉ−７（配列番号３１）、Ｉ−８（配列番号３３）、Ｉ−９（配列番号３５）、ＩＩＩ−１（配列番号３７）、ＩＩＩ−２（配列番号３９）、ＩＩＩ−３（配列番号４１）、ＩＩＩ−４（配列番号４３）、ＩＩＩ−５（配列番号４５）、ＩＩＩ−６（配列番号４７）、ＩＩＩ−７（配列番号４９）、ＥＤＢ（配列番号５１）、ＩＩＩ−８（配列番号５３）、ＩＩＩ−９（配列番号５５）、ＩＩＩ−１０（配列番号５７）、ＩＩＩ−１１（配列番号５９）、ＥＤＡ（配列番号６１）、ＩＩＩ−１２（配列番号６３）、ＩＩＩ−１３（配列番号６５）、ＩＩＩ−１４（配列番号６７）、ＩＩＩＣＳ（Ｖ領域：配列番号６９）、ＩＩＩ−１５（配列番号７１）、Ｉ−１０（配列番号７３）、Ｉ−１１（配列番号７５）、Ｉ−１２（配列番号７７）の各ドメインからなることが知られている（非特許文献６）。
【０００５】
【特許文献１】特開平４−８０２０１号公報
【特許文献２】特開平４−８０２０２号公報
【特許文献３】特開平９−３０９７９号公報
【非特許文献１】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５９，  ３９６２−３９７０  （１９８４）
【非特許文献２】Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８０（２），  ４９２−４９８  （１９７９）
【非特許文献３】Ｎｉｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２（１４），  ５８５３−５８６８  （１９８４）
【非特許文献４】ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ４（７），  １７５５−１７５９  （１９８５）
【非特許文献５】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  １１１７５−１１１８１  （２００３）
【非特許文献６】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ８，  ３１５−３２５
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
特に軟骨において存在する軟骨型ＦＮは、他のＦＮと比して繊維形成能などの点で異なる性質を有しており、軟骨型ＦＮのみを検出し、その局在を調べたり、或いはその発現量を測定することで、軟骨型ＦＮの機能の解明を進めることができると考えられる。しかし、軟骨型ＦＮのみに特異的に結合性を有する物質は知られておらず、そのような物質及びそれを用いた軟骨型フィブロネクチンの検出方法の探索が必要とされていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、軟骨型ＦＮに特異的に結合性を有する物質を鋭意探索した結果、驚くべきことにＧＡＧの１種であるＣＳＥが軟骨型ＦＮに特異的な結合性を示すこと、及び軟骨型ＦＮに特異的に結合性を有するモノクローナル抗体の作成に成功し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１）  少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を有する「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
（ａ）検体中の軟骨型フィブロネクチンとコンドロイチン硫酸Ｅとを接触させる工程；
（ｂ）前記接触により生じた「軟骨型フィブロネクチンとコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体」を検出する工程。
（２）  「コンドロイチン硫酸Ｅ」が、固相に結合していることを特徴とする請求項１記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
（３）  「コンドロイチン硫酸Ｅ」が、更にリン脂質と共有結合していることを特徴とする（１）又は（２）記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」
（４）  「検体」が「軟骨抽出液」であることを特徴とする（１）〜（３）いずれか記載の「軟骨型フィブロネクチン結合性物質の検出方法」。
（５）  検体中の軟骨型フィブロネクチンを、コンドロイチン硫酸Ｅを用いて検出し、検出結果と軟骨腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする「軟骨腫瘍の検出方法」。
（６）  検体が生体から取り出した軟骨組織であって、該軟骨組織を組織染色することで軟骨型フィブロネクチンの検出を行うことを特徴とする（５）記載の「軟骨腫瘍の検出方法」。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
【００１０】
（１）本発明軟骨型ＦＮ検出方法
本発明軟骨型ＦＮ検出方法は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を有する。
（ａ）検体中の軟骨型ＦＮとＣＳＥとを接触させる工程；
（ｂ）前記接触により生じた「軟骨型ＦＮとＣＳＥとの複合体」を検出する工程。
【００１１】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「検体」は、「軟骨抽出液」、生検によって得られる「軟骨組織」、医薬品、医療用具等を目的とする軟骨型ＦＮの製造の工程管理における「試作品又はサンプル」、「医薬品」等が例示され、特に「軟骨抽出液」が好ましい。ここで「軟骨抽出液」とは、軟骨から有機溶媒又は水性溶媒に溶解性を有する成分を抽出した溶液を指称する。
【００１２】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「軟骨型ＦＮ」とは、その遺伝子構造と結晶型ＦＮ、細胞型ＦＮなどの構造との対比によって知られている可変領域（ＥＤＡ、ＥＤＢ、及びＶ）と、ＩＩＩ−１５及びＩ−１０モジュールを欠失したＦＮであり、正常軟骨組織で発現しているＦＮを指す。かかる「軟骨型ＦＮ」は配列番号２記載のアミノ酸配列からなる。例えばこれを遺伝子組換的手法により発現させるためには配列番号１記載の塩基配列を含む核酸を、常法に従って発現ベクターなどに組み込んで組換えベクターを調製し、これを適当な宿主細胞に導入して組換体を得てそれを成育させることで行うことができる。
【００１３】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「ＣＳＥ」とは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基とＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基とがβ１，４グリコシド結合で結合した二糖がβ１，４グリコシド結合で連続した基本骨格を有する構造を有し、かかる基本骨格を構成するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基中、４位炭素原子及び６位炭素原子の大半が硫酸化されているＣＳをいう。かかるＧＡＧは、イカ軟骨に含まれているＣＳＥと呼ばれるＧＡＧと同等のＧＡＧを指称して本明細書中では使用する。
【００１４】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「ＣＳＥ」は、タンパク質や脂質などの物質と結合した状態であっても使用することができる。かかる「タンパク質」や「脂質」は、軟骨型ＦＮと結合したＣＳＥの検出を容易としたり、或いは後述の固相担体に対してＣＳＥを固定化することを容易とするものが好ましくは挙げられる。かかるタンパク質としては例えばアルブミンや酵素などが例示される。
【００１５】
また「脂質」としては動物、植物、微生物等の天然物由来、または化学的もしくは酵素的に合成もしくは部分的に分解された複合脂質または単純脂質を使用することができ、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖の脂肪酸アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、セラミド等いずれも使用できる。特にホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシトール等のリン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好ましく、その中でも特に１級アミノ基を有するリン脂質が好ましい。脂質中のアシル基の鎖長及び不飽和度は特に限定されないが、炭素数６以上のものが好ましい。アシル基としては例えばパルミトイル（ヘキサデカノイル）またはステアロイル（オクタデカノイル）などが例示される。なお、このような「脂質」と「軟骨型ＦＮ結合性脂質結合ＧＡＧ」との結合はイオン結合、共有結合などが挙げられるが、特に共有結合がその強度の面から好ましい。
【００１６】
ＣＳＥと脂質との結合位置は特に限定されるものではないが、軟骨型フィブロネクチンを検出するという本発明の目的に照らすとそれらの結合を妨げる可能性が低い「ＣＳＥの末端部」が好ましく、特に反応のさせやすさの観点から「ＣＳＥの還元末端」への結合が好ましい。
【００１７】
特にＣＳＥと脂質とが共有結合した「脂質結合ＣＳＥ」の場合、ＣＳＥのカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホルミル基（ヘミアセタール基も含む）、水酸基若しくは１級アミノ基、又はＣＳＥに別途導入された前記基と、脂質のカルボキシル基、ホルミル基若しくは１級アミノ基、又は脂質に別途導入された前記基との間で形成される酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合又はアミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）によって共有結合したものが好ましい。
【００１８】
特に、ＣＳＥの還元末端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成されたＣＳＥのカルボキシル基（ラクトンを含む）と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、ＣＳＥのＧｌｃＡ残基のカルボキシル基と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、又はＣＳＥの還元末端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成されたＣＳＥのホルミル基と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成されたシッフ塩基を還元して形成されたアミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）により結合されたものが好ましい。
【００１９】
なお、上記共有結合に関与するアミノ基、カルボキシル基、ホルミル基（ヘミアセタール基を含む）、水酸基はグリコサミノグリカン又は脂質に元来存在するもの、これらに化学的処理を施すことによって形成されたもの、或いは上記官能基を末端に有するスペーサー化合物を、予めＣＳＥ又は脂質と反応させることによって別途導入されたもののいずれであってもよい。
【００２０】
特に好ましい脂質結合ＣＳＥである、脂質がＣＳＥの還元末端に共有結合した脂質結合ＣＳＥの製造法としては、例えば特開平４−８０２０１号、特開平４−８０２０２号及び特開平９−３０９７９号に開示された方法が挙げられ、より具体的には例えば以下のような方法が使用できる。
【００２１】
還元末端限定酸化法
この方法は、ＣＳＥの還元末端の糖残基であるＧｌｃＡ残基またはＧｌｃＮＡｃ残基を還元し、限定酸化（部分酸化）することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）させるとともに、該ＣＳＥの還元末端にホルミル基を形成させてアルデヒド化合物とし、このアルデヒド化合物のホルミル基と脂質の１級アミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させ、次いでシッフ塩基を還元し、アミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）を形成させて、ＣＳＥと脂質とを共有結合させる方法である。
【００２２】
ＣＳＥの還元末端の糖残基の還元は、ＣＳＥに対して５〜５０当量程度、好ましくは２５〜３０当量の還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、ホウ酸塩緩衝液等）中、通常１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃で行うことができる。
【００２３】
上記還元後、限定酸化を行ってＣＳＥの還元末端に特異的にホルミル基を有するアルデヒド化合物を製造する。限定酸化は、上記還元後のＣＳＥに対して１〜１０当量、好ましくは３〜６当量の酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム等の過ヨウ素酸アルカリ塩等）を用い、通常０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で行うことができる。
【００２４】
得られたアルデヒド化合物と１級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質等）とを反応させてシッフ塩基を形成させる反応は、水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）又は適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）に上記アルデヒド化合物を溶解した溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、通常１５〜６０℃の温度で反応させることができる。この反応時又は反応終了後に適当な還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩等）を作用させてシッフ塩基を還元することができる。
【００２５】
なお、脂質結合ＣＳＥを製造する際に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサー化合物（例えば、エチレンジアミン等のアルキレンジアミン、又はリジン等のアミノ酸等）と上記アルデヒド化合物とを反応させて、アミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）を形成させ、次いで上記スペーサー化合物の他方の官能基（例えばアミノ基）と反応し得る官能基（例えば、カルボキシル基）を有する脂質（例えば、モノアシルグリセロールコハク酸エステル等のモノアシルグリセロールジカルボン酸エステル）と反応させてもよい。
【００２６】
還元末端ラクトン化法
この方法は、ＣＳＥの還元末端の糖残基であるガラクトース残基、ウロン酸残基又はヘキソサミン残基を酸化することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）させて該ＣＳＥの還元末端にカルボキシル基を形成させて、次いでラクトン形成反応に付すことによって該ＣＳＥの還元末端をラクトン構造とし、このラクトンと脂質の１級アミノ基とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させることによって、ＣＳＥと脂質とを共有結合させる方法である。
【００２７】
ＣＳＥの還元末端の糖残基の酸化は、ＣＳＥに対して２〜２０当量程度、好ましくは５〜１５当量程度の酸化剤（ヨウ素、臭素等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、リン酸塩緩衝液等）中、通常０〜４０℃、好ましくは１５〜３０℃で行うことができる。
【００２８】
上記酸化反応後、強酸性陽イオン交換樹脂、例えばダウエックス５０（商品名；ダウケミカル社製）、アンバーライトＩＲ−１２０（商品名；オルガノ社製）及び／又は酸（塩酸、硫酸等の無機酸、または酢酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸の酸無水物）で処理することによって、ＣＳＥの還元末端が特異的にラクトン化されたラクトン化合物を製造することができる。
【００２９】
得られたラクトン化合物と１級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質）との反応は、適当な水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）又は適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）にラクトン化合物を溶解した溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、５〜８０℃、好ましくは３０〜６０℃の温度で反応させればよい。
【００３０】
なお、還元末端限定酸化法の場合と同様に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサー化合物と上記ラクトン化合物とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させ、スペーサー化合物の他方の官能基と脂質の官能基（例えばカルボキシル基）とを反応させてもよい。
【００３１】
ヘミアセタール法
糖鎖の還元末端糖は、環状構造と開環構造の平衡状態にあり、開環構造ではアルデヒド基が生じ、そこにアミノ基を有する脂質を加えるとシッフ塩基が形成される。この反応も平衡反応であり、その割合は反応条件により大きく変わる。ここに選択的還元剤を添加するとシッフ塩基が還元（水素付加）され、アミノアルキル型結合体が形成されることも基づく方法である。
【００３２】
具体的には、ＣＳＥがナトリウム塩等のアルカリ金属塩である場合等、以下の方法で有機溶媒溶解性塩とすることができる。すなわち、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ１２、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ４（いずれも室町化学社製）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ−５０（いずれもオルガノ社製）、Ｄｕｏｌｉｔｅ  ２２５、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｃ２６Ｃ（いずれもダイアプロシム社製）、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ  ７０、Ｃｈｅｌｅｘ  １００、ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８（いずれもバイオラド社製）、ＳＥ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ワットマン社製）等のＨ＋型の陽イオン交換樹脂に通して脱陽イオン化して遊離型とし、ただちにテトラブチルアンモニウム等の有機アミンあるいはその水溶液を添加し、ｐＨを弱酸性から中性に調整する。この溶液を減圧濃縮し、室温で約３日間凍結乾燥して有機溶媒溶解性のＣＳＥ有機アミン塩乾燥粉末を得ることができる。
【００３３】
次いでＣＳＥの有機溶媒溶解性塩と１級アミノ基を有する脂質とを、該ＣＳＥの有機溶媒溶解性塩および該脂質の双方を溶解しうる極性有機溶媒中、無水条件下、還元剤の存在下において反応させ、該ＣＳＥの還元末端糖アルデヒド基と該脂質の１級アミノ基とのアミノアルキル型結合を形成させることにより脂質結合ＣＳＥを合成する。具体的には、例えば上記の有機アミン塩乾燥粉末に無水極性有機溶媒を溶解し、その溶液をホスファチジルエタノールアミン等脂質の無水極性有機溶媒溶液に添加する。得られた混合液を窒素雰囲気下、２０〜１２０℃で１〜２４時間撹拌後、還元剤を加え更に２０〜１２０℃で１〜２４時間撹拌を続ける。上記還元剤を更に約２４時間おきに２回添加し、２０〜１２０℃で１〜７２時間反応させ、シッフ塩基形成、還元アミノ化反応を完結させる。
【００３４】
ただし、脂質がＣＳＥの還元末端に共有結合した脂質結合ＣＳＥの製造方法はこれらの方法に限定されるものではなく、ＣＳＥの還元末端に脂質を結合しうる方法であれば他の任意の方法によっても製造することができる。
【００３５】
ＣＳＥの末端以外に脂質を導入する方法としては、例えばＣＳＥのＧｌｃＡ残基のカルボキシル基と脂質の１級アミノ基とを反応させて、酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させる方法が挙げられる。
【００３６】
上記反応に際し、縮合剤（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等）を用いて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させるか、或いはＧｌｃＡ残基のカルボキシル基を該縮合剤の存在下、活性化剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等）と反応させて活性エステルとした後、該脂質と反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させることができる。
【００３７】
なお、上記反応においてはＣＳＥのＧｌｃＡ残基を有機溶媒に溶解可能な塩（トリエチルアミン、トリブチルアミン等のアミンの塩等）とし、反応を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン等）中で行うことが好ましい。
【００３８】
このような「ＣＳＥ」は何にも結合していない可溶性の状態で本発明軟骨型ＦＮ検出方法に用いることも可能であるが、固相に結合していることが好ましい。かかる「固相」としては例えばプレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲルなどが例示される。その中でも特にプレート及びビーズが好ましくは例示され、殊にプレートが取扱の簡便性から好ましい。
【００３９】
上述の「軟骨型ＦＮ結合性脂質結合ＧＡＧ」と「固相」との結合は、共有結合、イオン結合、物理的吸着などが挙げられ特に限定はされないが、その中でも単なる物理的吸着で十分な結合の強度を得られるため好ましい。
【００４０】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「軟骨型ＦＮ結合性物質」と検体中の軟骨型ＦＮとの接触は、検体が液体の場合には、反応容器中において検体と「軟骨型ＦＮ結合性物質」を混合し、軟骨型ＦＮとＣＳＥが相互作用できる方法、態様であれば順序、具体的方法は限定されない。例えば反応容器に入れた「軟骨型ＦＮ結合性物質」又は「軟骨型ＦＮ結合性物質」が固相化されたプレートに検体を添加、或いは反応容器に「軟骨型ＦＮ結合性物質」及び検体を同時に添加してなされる。また検体が固体の場合には、固相に固着していない「軟骨型ＦＮ結合性物質」を検体に加えて接触がなされることが好ましい。なお、かかる接触を保つ時間は、前記軟骨型ＦＮ結合性物質と検体中の軟骨型ＦＮとが結合して複合体を形成するのに十分な時間であれば特に限定はされないが、数秒〜数時間、好ましくは５分以上１０時間以内であり、最も好ましくは３０分〜８時間である。また、接触を行う温度条件は、０〜４０℃、４〜３８℃が好ましく、２０〜３７℃が最も好ましい。更に、反応を行うｐＨ条件は、６．０〜８．０は好ましく、特に６．５〜７．５が好ましい。
【００４１】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「軟骨型ＦＮとＣＳＥとの複合体」の検出方法は、複合体に含まれるＣＳＥ又は軟骨型ＦＮを特異的に検出することによりなされる。例えば、ＣＳＥを特異的に検出するためには、予めＣＳＥを標識物質（例えば放射能、蛍光物質、特異的結合対（ビオチン等）、酵素など）でラベルしておき、かかる標識物質を検出することによって行うことも可能である。標識物質として放射能を用いる場合には、オートラジオグラフィー等を行うことでＣＳＥを検出することができ、また標識物質として特異的結合対のビオチンを用いる場合には、ビオチンに結合するアビジンを持ちいてビオチンと結合したＣＳＥを検出することができる。また、標識物質として酵素を使用する例としては、例えばＣＳＥにペルオキシダーゼなどを結合しておき、その酵素反応を用いて基質（３，３’−ジアミノベンチジン（以下「ＤＡＢ」と略記する）やｏ−フェニレンジアミンなど）を分解して発色基質を生じさせて検出を行うことも可能である。かかる二次抗体を使用する検出方法が簡便で且つ常法に従って行うことができるため好ましい。
【００４２】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法の具体的な例としては、例えば下記が挙げられる。
組織染色の手法を用いる場合には、検体として生検によって得られた軟骨組織を用いる。かかる軟骨組織を公知の手法を用いてパラフィン切片などとし、かかる切片に予め放射能標識を行なったＣＳＥを用いてパラフィン切片上に存在する軟骨型ＦＮと反応させる。その後、切片を洗浄した後、かかる切片上の放射能をオートラジオグラフィーで検出することができる。すなわち放射能が認められた切片は、軟骨型ＦＮが存在している切片であると判断される。オートラジオグラフィーにおけるドットの数、濃淡などを対比することで、軟骨型ＦＮの定量を行うことも可能である。
【００４３】
また、ＥＬＩＳＡ的手法を用いる場合には、検体として生検によって得られた軟骨組織からの抽出液を用いることができる。例えば脂質結合ＣＳＥを固着させたマイクロプレートに、検体を分注し、一定時間インキュベートする。その後マイクロプレートを洗浄し、マウス抗軟骨型ＦｎＩｇＧ抗体とインキュベートし、更にプレートを洗浄した後に西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたウサギ抗マウスＩｇＧ抗体などをプレートに分注して反応させる。プレートを洗浄した後、ＤＡＢ溶液などの発色基質溶液と反応させて検出を行う。すなわちＤＡＢ溶液での反応後に発色が認められた検体には、軟骨型ＦＮが存在していたと判断される。ＤＡＢ溶液による反応後の発色度合いを対比することで、軟骨型ＦＮの定量を行うことも可能である。
【００４４】
（２）本発明腫瘍検出方法
本発明腫瘍検出方法は、検体中の軟骨型ＦＮを検出し、その結果と腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする「軟骨腫瘍の検出方法」である。
【００４５】
本発明腫瘍検出方法は、軟骨の腫瘍化に伴い軟骨性ＦＮの量が減少することに基づく発明である。本発明腫瘍検出方法における「軟骨型ＦＮの検出」は、上述の本発明軟骨型ＦＮ検出方法を用いて行うことができる。したがって本発明腫瘍検出方法で用いる検体は、軟骨由来の検体であることが好ましい。軟骨由来の検体とは、例えば生検によって得られた軟骨組織、かかる軟骨組織からの抽出液などが挙げられ、いずれも本発明腫瘍検出方法に使用することが可能である。本発明腫瘍検出方法においては、操作の簡便性の観点から、生検によって得られる軟骨組織を検体として用い、免疫染色の手法を用いて検出を行うことが好ましい。
【００４６】
本発明腫瘍検出方法における腫瘍の有無と上記検出結果の関連づけは、検出結果が健常軟骨組織における軟骨型ＦＮ量と比して検体における軟骨型ＦＮ量が減少していることを示した場合に、かかる検体には腫瘍が存在するとして関連づけることが好ましく、より好ましくは、検体において実質的に軟骨型ＦＮが検出されなかった場合に、かかる検体には腫瘍が存在するとして関連づけを行う。
【００４７】
（３）本発明製造方法
本発明製造方法は、軟骨型ＦＮを含む試料を、固相上に固着したＣＳＥと接触させて、固相上に固着した「軟骨型ＦＮとＣＳＥとの複合体」を形成させ、かかる複合体を形成した固相を分離し、その後複合体から軟骨型ＦＮを単離することを特徴とする軟骨型ＦＮの製造方法である。
【００４８】
本発明製造方法における「試料」とは、軟骨型ＦＮを含むものである液体である限りにおいて特に限定はされない。かかる「試料」の例としては、例えば軟骨抽出液、組換軟骨ＦＮを発現する組換体の生育物（組換体の培養上清、組換体の抽出液、組換体の排泄物など）などが例示される。その中でも特に組換体の生育物が好ましい。
【００４９】
上述の組換体は例えば次のようにして調製することができる。
すなわち、配列番号１３及び配列番号１４記載のプライマー配列を用いて、ヒト由来の軟骨細胞から常法に従って調製した全ＲＮＡを鋳型として逆転写ポリメラーゼ  チェイン  リアクション法（ＲＴ−ＰＣＲ法）により軟骨型ＦＮの部分配列を増幅し、かかる増幅産物を例えばＴＡクローニングなどでクローン化することができる。そしてこのクローンを適当な制限酵素で消化して切り出した後、例えばＪ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １３９（１９９７），  ２９５−３０７に記載されたｐＡ１ＦＮＣ（血漿型ＦＮをコードする発現ベクター）の相同領域と常法で置換し、軟骨型ＦＮを発現する発現ベクターを調製する。そして、かかる組換ベクターをベクターが適当に働く宿主細胞に感染、組み込み、組換体を調製することができる。
【００５０】
上記「宿主細胞」として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。宿主細胞として真核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「真核細胞用の発現ベクター」を選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「原核細胞用の発現ベクター」を選択する。
【００５１】
本発明製造方法における「固相」とは、本発明軟骨型ＦＮ検出方法で記載した固相と同様であるが、本発明製造方法をバッチ法（静的吸着）で行う場合にはプレート及びビーズが例示され、またカラム法（動的吸着）で行うためにはゲルが挙げられる。これらの固相を利用することが軟骨型ＦＮの大量製造が容易となるため好ましい。
【００５２】
本発明製造方法における「ＣＳＥの固相上への固着」は、タンパク質や脂質などと結合したＣＳＥを使用してなされる。そしてかかるＣＳＥと固相との固着は、製造工程における軟骨型ＦＮの損失を最小限とするために、より強力な固着手段で固着されていることが好ましい。このような固着手段としては化学結合、その中でも特に共有結合が挙げられる。
【００５３】
本発明製造方法における「ＣＳＥと軟骨型ＦＮとの接触」は例えば下記が挙げられる。すなわちバッチ法において、例えばプレートを固相として使用した場合には、ＣＳＥが固着したプレートに上記試料を添加する方法が挙げられる。また、ビーズを固相として使用した場合には、ＣＳＥが固着したビーズを、反応容器に予め添加しておき、かかる容器に上記試料を添加して接触させる方法、反応容器に予め上記試料を添加しておき、かかる容器にＣＳＥが固着したビーズを添加する方法、及び反応容器にＣＳＥが固着したビーズと上記試料とを同時に添加する方法が例示される。このような方法で接触がなされた場合には、ＣＳＥに軟骨型ＦＮが結合して複合体を形成するのに十分な時間、接触状態を保つ必要がある。かかる時間としては例えば１０秒以上１２０時間以下、好ましくは１０分〜４８時間、より好ましくは３０分〜２０時間が例示される。また、接触を行う温度条件は、０〜４０℃、１〜２４℃が好ましく、４℃〜２０℃が最も好ましい。更に、反応を行うｐＨ条件は、６．０〜８．０が好ましく、特に６．５〜７．５が好ましい。なお、かかるバッチ法を用いる場合には、上記複合体を形成させた後、既存の固液分離手段を用いて固相を単離する必要がある。
【００５４】
一方、カラム法においては、軟骨型ＦＮ結合性物質が固着したゲル又はビーズをカラムに充填し、かかるカラムに試料を通筒することで、試料中の軟骨型ＦＮを固相に結合させて複合体をすることができる。
【００５５】
上記手法により形成された複合体から軟骨型ＦＮを溶出させる方法としては、複合体を高濃度の塩の水溶液（例えば４ｍｏｌ／ｌの尿素を含むリン酸緩衝液など）などに浸漬し、十分に撹拌し、液相を回収することで軟骨型ＦＮのみを容易に単離することが可能となる。
【００５６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
（調製１）軟骨型ＦＮを含む検体の調製
ヒト肋軟骨から全ＲＮＡを常法に従って抽出し、これを鋳型としてプライマーとして配列番号１３及び１４の塩基配列を使用した逆転写ポリメラーゼチェインリアクション法（ＲＴ−ＰＣＲ法）によってＦＮのＩＩＩ−１２からＩ−１２モジュールをコードするｃＤＮＡ（ＩＩＩＣＳ領域とＣ領域を欠失している）を調製した。ついで、ＴＡクローニングにてこれをクローン化した（ｒＦＮ／Ｏ）。このクローンを制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ及びＮｄｅ  Ｉで処理したあと、血漿型ＦＮ発現ベクターｐＡｌＦＮＣ（Ｍａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９７  １３９  ２９５−３０７）の相同領域と常法に従って置換し、軟骨型ＦＮ発現ベクターを調製した。
上記ｒＦＮ／Ｏと同様の手法で以下のクローンを含むベクターを調製した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
注：ｒＦＮ／Ｃｍの合成にはＪ．  Ｃ．  Ｓ．，  １０８，  ９０７−９１５記載のプライマーを使用した。
【００５９】
各ＦＮ発現ベクター（４μｇ）と、ジヒドロ葉酸還元酵素発現ベクター（０．４μｇ）を、αＭＥＭ（ギブコ社製、核酸含有）中で６センチ培養皿を用いて培養したハムスター卵巣上皮由来培養細胞株ＣＨＯＤＧ４４細胞に、リン酸カルシウム法を利用して導入し、３５℃、二酸化炭素濃度３．５％で１２時間培養した。次いで、培地を交換し、３７℃、二酸化炭素濃度５％で２４時間培養した。さらに、核酸非含有で、１０ｎｍｏｌ／ｌメソトレキセートを添加した培地に交換し、適宜培養系を拡大しつつ２週間培養した。
【００６０】
次に、形成されたコロニーをピックアップし、最も多くＦＮを発現しているものを選択し、１週間、血清濃度１％で大量培養した。回収した培養上清は、４℃、１０，０００ｒｐｍで遠心して不溶物を除き、ＴＦＴシステム（ファルマシア社製）で２０分の１の体積に濃縮後、マウス抗ハムスターＦＮ抗体３Ｃ１２カラムに通して内在性のハムスターＦＮを除去した。さらに、マウス抗ヒトＦＮ抗体１１９Ａカラムによって各ＦＮをアフィニティー精製した。
【００６１】
（調製２）生検により得られた軟骨組織の処理
生検により得られた軟骨組織は、１０％緩衝ホルマリン（和光純薬工業株式会社製）に２４時間浸して組織を固定した後、組織脱水溶液（和光純薬工業株式会社製）に２時間ずつ、７回浸して脱脂脱水した。次いで、キシレン（和光純薬工業株式会社製）に２時間ずつ３回浸した後、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）に７２時間ずつ３回浸して脱灰し、ティッシュプレップＴ５８０（フィッシャーサイエンティフィック社製）に２時間ずつ４回浸透し、パラフィン包埋した。
脱灰を除く全ての操作は、全てティッシュティックＶＩＰ−Ｍ１５００（サクラ社製）により行った。
【００６２】
実施例１
ＣＳＡ（クジラ軟骨由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量約１５，０００）、ＣＳＢ（ニワトリ鶏冠由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量約３２，０００）、ＣＳＣ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量約２０，０００）、ＣＳＤ（ブタ皮由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量約２０，０００）ＣＳＥ（イカ軟骨由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量約１００，０００）、ヒアルロン酸（ＨＡ：ニワトリ鶏冠由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量２３，０００）、ヘパリン（Ｈｅｐ：ウシ腸管由来：和光純薬工業株式会社製：重量平均分子量約１０，０００）をそれぞれ１００ｍｇを使用し、特開平９−３０９７９号公報記載の方法に従って、ホスファチジルエタノールアミン（以下「ＰＥ」とも略記する）結合体２０ｍｇを調製し（ＣＳＡ−ＰＥ、ＣＳＢ−ＰＥ、ＣＳＣ−ＰＥ、ＣＳＤ−ＰＥ、ＣＳＥ−ＰＥ、ＨＡ−ＰＥ、及びＨｅｐ−ＰＥ）、これを２０μｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝生理的食塩水（以下「ＰＢＳ」と略記する）に溶解し、何れかのＧＡＧ−ＰＥを含むＰＢＳを調製した。かかるＰＢＳを９６穴マルチプレートに一穴あたり５０μｌで分注し、４℃で１０時間静置した。溶液を廃棄した後、加熱処理により変性させた牛血清アルブミンを３％（ｗ／ｖ）で含むＰＢＳを一穴あたり２００μｌで分注し、２４℃で３時間静置した。
【００６３】
その後、溶液を廃棄した後、調製１で調製した各ＦＮをそれぞれ３０ｎｍｏｌ／ｌで含むＰＢＳを一穴あたり５０μｌで添加し、４℃で静置した。
１０時間静置した後、ＢＳＡを０．１％（ｗ／ｖ）で含むＰＢＳ（以下かかる組成のＰＢＳを特に「洗浄液」と記載する）で３回洗浄し、その後、マウス抗ヒトＦＮＩｇＧモノクローナル抗体１３６Ｈを１／３０００倍にＰＢＳで希釈した溶液を一穴あたり５０μｌ添加し、２４℃で１時間静置した。その後洗浄液で３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）を１／３０００倍にＰＢＳで希釈した溶液を一穴あたり５０μｌで添加して、２４℃で１時間静置した。その後更に洗浄液で４回洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミンを１００μｇ／ｍｌで含む０．００３％過酸化水素水で発色を常法により行い、４９０ｎｍの吸光度を測定した（図１）。
【００６４】
その結果、軟骨型ＦＮのみが、コンドロイチン硫酸Ｅに強い結合性を示すことが明かとなった。
【００６５】
実施例２：腫瘍組織における軟骨型ＦＮの量の変化
パラフィン包埋した各軟骨組織は、４μｍの厚さで切片とした。作成した切片は、キシレン（和光純薬工業株式会社製）に１０分ずつ３回浸し、次いで１００％エタノールに３回、９０％、８０％、７０％エタノールに１回ずつ各２分浸し、脱パラフィンを行った。
【００６６】
蒸留水で洗浄後、５００μｇ／ｍｌで牛睾丸由来ヒアルロニダーゼ（和光純薬工業株式会社製）を含む酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを含む）を室温で３０分各切片に対して反応させ、ヒアルロン酸の分解を行った後、ＰＢＳで３回洗浄、ついで５００μｇ／ｍｌでプロテアーゼ（シグマ社製）を含むＰＢＳを室温で３０分反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、０．３％でヤギ血清（ベクタステイン社製）を含むＰＢＳで室温下１時間ブロッキングし、適宜希釈したマウス抗ヒトＦＮ抗体１３６Ｈを添加し、４℃、１２時間反応させた。さらにＰＢＳで洗浄後、１％過酸化水素水に室温下２０分反応させて内因性ペルオキシダーゼ処理を行い、さらに洗浄後、ビオチン結合抗マウスＩｇＧ抗体（ベクタステイン社製）、ヤギ血清をそれぞれ１μｇ／ｍｌ、０．３％で含むＰＢＳを室温下１時間反応させた。洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ベクタステイン社製）を適量含むＰＢＳにて室温、３０分反応させ、洗浄後、２００μｇ／ｍｌでジアミノベンジジン（ナカライテスク社製）を含む３７℃、５０ｍｍｏｌ／ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．６）に浸し、かかる水溶液に過酸化水素水を添加し、反応させた。約１０分後、蒸留水で洗浄して反応を停止し、次いで、７０％、８０％、９０％エタノールに２分ずつ各１回浸し、１００％エタノールに２分ずつ３回浸して脱水、さらにキシレンに１０分ずつ３回浸し、ＥＵＫＩＴＴ液（Ｏ．ＫＩＮＤＬＡＲ社製）でマウントし、スライドガラスを作成、顕微鏡で観察した。
【００６７】
その結果、正常軟骨組織では５Ｂ８による染色が認められたが、軟骨腫瘍ではその染色が全く認められなかった。一方、１３６Ｈによる染色では、共に広範囲に染色が認められ、特に軟骨腫瘍では、より強い染色像が認められた。
【００６８】
同様に、１４Ｃ標識ＣＳＥを使用してオートラジオグラフィーにより組織中の軟骨型ＦＮの量を検出することも可能である。
【００６９】
実施例３
生検によって得られた正常、あるいは腫瘍化したヒト軟骨を、４ｍｏｌ／ｌ尿素及び各種プロテアーゼインヒビターを含む５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液に軟骨湿重量１０ｍｇあたり０．１ｍｌの割合で、４８時間ごとに３回浸すことで軟骨からＦＮを抽出した。次に、かかる緩衝液をＰＢＳに対して透析し、ゼラチンカラムに添着して洗浄した後、４ｍｏｌ／ｌ尿素で溶出、得られたフラクションを再度ＰＢＳに対して透析することで各軟骨組織中のＦＮをアフィニティー精製する。
【００７０】
次に、ゼラチンを２．５ｎｇ／ｗｅｌｌでコートした９６穴マルチプレートに各軟骨から抽出したＦＮを１０ｎｍｏｌ／ｌの濃度で５０μｌずつ添加し、４℃で１２時間反応させる。次いで、１４Ｃ標識ＣＳＥを１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ｗｅｌｌで添加して室温下、１時間反応させ、２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで３回洗浄後、オートラジオグラフィーに供し、正常軟骨組織におけるオートラジオグラフィーと対比することができる。
【００７１】
【配列表】
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【００７２】
【発明の効果】
本発明によりＣＳＥを用いた軟骨型フィブロネクチンの検出方法、該方法を用いた腫瘍検出方法が提供される。
【００７３】
【図面の簡単な説明】
【図１】各種脂質結合ＧＡＧと様々な構造のＦＮとの結合性を示す図である。図中、白いバーはｒＦＮ／ＯのＧＡＧへの結合性を示し、左下から右上に向かう斜線のバーはｒＦＮ／ＣｍのＧＡＧへの結合性を示し、横縞のバーはｒＦＮ／ＣのＧＡＧへの結合性を示し、左上から右下へ向かう斜線のバーはｒＦＮ／ＡＣのＧＡＧへの結合性を示し、黒塗りのバーはｒＦＮ／ＢＣのＧＡＧへの結合性を示し、市松模様のバーはｒＦＮ／ＢＡＣのＧＡＧへの結合性を示す。また、図中ＣＳＡはコンドロイチン硫酸Ａを示し、ＣＳＢはコンドロイチン硫酸Ｂを示し、ＣＳＣはコンドロイチン硫酸Ｃを示し、ＣＳＤはコンドロイチン硫酸Ｄを示し、ＣＳＥはコンドロイチン硫酸Ｅを示し、ＨＡはヒアルロン酸を示し、ＨＳはヘパラン硫酸を示し、Ｈｅｐはヘパリンを示す。
【図１】
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