(57)【要約】【課題】  腎細管細胞の生体外での生育手段の提供。【解決手段】  レチノール酸と、管形成を達成するための有効量の上皮増殖因子との存在下で、成体の腎細胞を３次元コラーゲンゲルで培養することを包含し、ここで管形成は、細管細胞の濃縮凝集体が管腔中心の回りに生成し、分極した上皮表現型を有する細胞と管腔境界に沿うタイトな結合複合体とで前記管腔が区切られるように行われるものである、腎細管細胞を生体外で生育させる方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノール酸と、管形成を達成するための有効量の上皮増殖因子との存在下で、成体の腎細胞を３次元コラーゲンゲルで培養することを包含し、ここで管形成は、細管細胞の濃縮凝集体が管腔中心の回りに生成し、分極した上皮表現型を有する細胞と管腔境界に沿うタイトな結合複合体とで前記管腔が区切られるように行われるものである、腎細管細胞を生体外で生育させる方法。
【請求項２】
培養の培地が、さらにウシ胎児血清、プロスタグランジン、ヒドロコルチゾン、トリヨードチロニン、セレン、線維芽細胞増殖因子、肝細胞成長因子、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される可溶性因子を含有するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
培養の培地が、さらにタイプＩコラーゲン、タイプＩＶコラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、フィブロネクチンおよびこれらの組み合わせから成る群より選択される不溶性因子を含有するものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
レチノール酸と、上皮増殖因子またはトタンスフォーミング成長因子−βのいずれかとの存在下で、成体の腎細胞を培養することを包含するプロセスによって調製される生体外腎細管組織系であって、管形成は、細管細胞の濃縮凝集体が管腔中心の回りに生成し、分極した上皮表現型を有する細胞と管腔境界に沿うタイトな結合複合体とで前記管腔が区切られるように行われる前記細胞の表現型形質転換である、生体外腎細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願はここに本明細書の一部として引用する米国特許出願第０７／８４４，７５８号の一部継続出願である。
本発明は生物学的要素および機械的要素の組み合わせで構成される装置、すなわち“バイオ人工(bioartificial) ”装置に関する。特に、本発明はバイオ人工濾過装置およびバイオ人工細管処理装置を含むバイオ人工腎臓に関する。
【背景技術】
【０００２】
末期腎疾患（ＥＳＲＤ: End Stage Renal Disorder）は、腎機能の急性的または慢性的いずれかの低下をともなう一般的な臨床症状である。この疾患の臨床的な症候は、糸球体の濾過率の減少および人体に生成された毒性代謝廃棄物を排出する腎臓の機能不全によって生じる。ＥＳＲＤの完全な治療は、統合された器官構造としての腎臓の濾過機能、再吸収機能、恒常性維持機能および内分泌機能の各機能の置換（取り替え）に依存することとなる。
【０００３】
腎臓の排出機能、つまり尿の生成は、腎臓の毛細血管のふさ状分岐である糸球体による血液の濾過に始まる。これらの毛細血管は腎臓の細管システムの始まりであるボーマン嚢(Bowman's Capsule)と呼ばれる周囲のカプセル中に陥入している。糸球体の構造は、循環系から毒性廃棄物を除去し、かつアルブミンのような重要な成分は全身循環中に保持するように、血液の効率的な限外濾過を行うようになっている（非特許文献１、２これらを共に本明細書の一部としてここに引用する）。
【０００４】
腎臓の調節機能、特に体液および電解質に関しては、糸球体に付属している細管部分によって行われる。糸球体濾過物の尿への変換を助けるすべてのプロセス、すなわち浸透、拡散ならびに活発な輸送は腎臓細管の中で行われる。糸球体から放出される限外濾過物は腎臓細管を通り、そこで体液および溶解物が再吸収され、最終的な尿中の種々の量の溶解物および水の分泌が精密に調節される。したがって、腎臓の機能単位は、濾過ユニット、糸球体、および調節ユニットである細管、で構成されている。これらが一体となって、ネフロンと呼ばれる腎臓の基本的な要素を構成する。
【０００５】
現在のところ、腎機能を支えるための長期生体外置換治療として唯一成功しているものは、血液透析および持続性腹膜透析（ＣＡＰＤ）である（非特許文献３、４）。ＥＳＲＤのための従来の血液透析は、多孔質または浸透性の壁または膜によって物理的に血液から分離された透析液を通して、または透析液に付加して患者の血液を循環させるという、ある程度腎臓の濾過機能を真似たものとなっている。このプロセスでは、血流から透析液中へ尿素のような微細分子の優先的な拡散が起こる。血液透析器のいくつかの例およびそれらの機能については特許文献１〜８に記述されており、これらをすべてここに本明細書の一部として引用する。
【０００６】
血液透析は血流から微細分子を充分に除去するが、大きな分子を選択的に除去したり、または保持したりする方法は確立されていない。さらに透析液は、生物学的に重要な物質（無機塩類およびグルコースなど）の濃度のバランスをとり、血液中に存在するこれらの物質が血液によって確実に保持されるようにするために、注意深くコントロールされなければならない。こうした重大な欠点の解決が強く求められている。
【０００７】
便利な中空繊維形状で、高い水浸透性および溶解物保持性能を有する人工膜の開発によって、拡散式血液濾過によるものではなく、対流式血液濾過をベースとしたＥＳＲＤ治療が促進された（非特許文献５、６これらはすべてここに本明細書の一部として引用する）。対流法による尿毒素の除去は拡散方式に比べていくつか明確な利点を有する。対流方式は糸球体のプロセスを真似たもので、濾過速度は同じままで、望ましい高分子量分子に対する許容度または通過を増加させることによって、すべて（ある特定の分子量遮断値まで）の望ましくない溶解物を除去するというものである。
【０００８】
透析は腎不全の予後治療を劇的に変化させたが、完全な置換治療法というわけではない。なぜならば、これは単に濾過機能（通常、間欠ベース）を提供するだけのものであり、腎臓の恒常性維持機能、調節機能、および内分泌機能を置換するものでないためである。さらに、透析機能は非生理学的な形であるため、透析に頼っているＥＳＲＤ患者は大きな医療上の問題を抱えたままである。米国において現在永続的な透析治療を受けているＥＳＲＤ患者数は約１９０，０００人で、新患の発生率は８〜９％である。腎臓のすべての機能を置換し、現在の透析治療よりも安価な、長期的置換治療法が望まれている。
【０００９】
移植可能なバイオ人工腎臓のような、よりよい長期的な腎臓置換治療の設計においては、腎組織の基本的な濾過および調節機能を開発しなければならない。そのような装置を目指して、ポリスルホン中空繊維の生体外使用によって臨床的にいくつかの進展が達成されており、人体における腎臓の限外濾過機能を数週間維持できるようになった（非特許文献７、８これら両方をここに本明細書の一部として引用する）。この装置の限界点は、中空繊維の開通性を維持するために必要とされる抗凝集性のために、患者の内外部位から出血するケースが増えること、時間の経過とともに繊維中のタンパク堆積のために濾過率が減少すること、ならびに限外濾過物（すなわち濾過装置によって血液から除去されるもので、かつ有用な生理学的物質を含んだもの）を置換するために大量の液体が必要なことなどである。
【００１０】
繊維導通路および濾過表面に内皮細胞を接種して使用することが、生体内における長期の適合性を改善する手段として示唆されている（非特許文献９、１０、１１これらをすべてここに本明細書の一部として引用する）。この点において、小径血管プロテーゼの内皮細胞の接種が、長期的に血小板堆積、血栓の形成を減らし、また移植片の開通性の低下を減らすことが実験的に示されている（シェパードら、前掲）。これらの構築物は濾過装置としてではなく、もっぱら血液導通として使用されている。
【００１１】
非浸透性の高分子中空繊維管腔表面に沿って集密性単層として生育した細胞から誘導された移植可能な内皮細胞システムもまた、細管機能の代替品の第１段階として説明されている（非特許文献１２、本明細書の一部としてここに引用する）。機能性腎組織の開発に最も重要なことは、幹細胞様の特性（すなわち自己再生の高い能力と規定された条件下で生理学的腎臓の正しい構造と機能成分を有する特定の細胞に分化する能力）を有する特定の細胞を成人腎臓から単離し、試験管内で生育させることである（非特許文献１３、１４、１５これらをすべてここに本明細書の一部として引用する）。最近、成体ほ乳類の腎臓から腎近位尿細管幹細胞または始原細胞を単離し、培養する方法が発表されている（非特許文献１６ここに本明細書の一部として引用する）。あるいは、腎近位尿細管幹細胞または始原細胞を、電磁式細胞選別法（非特許文献１７、１８、１９）、またはインテグリン類のような各種細胞表面の膜タンパクの密度に基づく細胞選別（非特許文献２０参照）によって単離することができるとされている。
【００１２】
高い自己再生能力を持ち、表現型的に、集合的かつ個別的に、コラーゲンゲル中で腎近位尿細管構造に分化する能力を有する腎近位尿細管細胞を選別する非血清含有の培養条件が確認されている。ｌａｃ−ｚ遺伝子を含むリコンビナントレトロウイルスによる細胞の標識付けおよび希釈分析によって、試験管内の細管形成は単一の遺伝子標識始原細胞のクローン拡大によって起きることが示された。したがって、近位細管細胞の母集団は成人腎臓中にあり、それらは比較的不活性の、緩やかに複製する状態で存在するが、重度の虚血または被毒障害を受けると、急激に増殖し、腎臓内膜の近位細管上皮細胞を再生するために分化しパターン形成する能力を潜在的に保持している。
【００１３】
これらの腎近位尿細管始原細胞の生体外の研究では、成長因子ＴＧＦ−βおよびＥＧＦがレチン酸と一緒になって、これら細胞の腎臓細管への分化を促進させることが示されている（非特許文献２１）。したがって、パターン形成と形態形成には成長因子とレチノイドの共同作用が必要になるものと考えられる。さらに、免疫蛍光顕微鏡の使用で、レチン酸がこれらの細胞中でのラミニンＡおよびＢ1 の連鎖生産を誘発すること、ならびに腎臓の細管形成においては精製した溶解性ラミニンがレチン酸に完全にとって代わることができることも示された（ヒュームスおよびシェスリンスキー、前掲）。レチン酸はモルフォゲンの１つとして、細胞外マトリックス分子の産生を調節することによりパターン形成および分化を促進するようである。
【００１４】
腎臓細管上皮細胞は、それらが派生する特定のネフロン部分の分化輸送機能を維持することが示されている（非特許文献２２、２３、２４、２５、２６、２７）。これらの文献をここに本明細書の一部として引用する。
【特許文献１】米国特許第３，３７０，７１０号
【特許文献２】米国特許第３，３７３，８７６号
【特許文献３】米国特許第３，５０５，６８６号
【特許文献４】米国特許第３，７０４，２２３号
【特許文献５】米国特許第３，８６４，２５９号
【特許文献６】米国特許第３，８８４，８０８号
【特許文献７】米国特許第４，１７６，０６９号
【特許文献８】米国特許第４，３５４，９３３号
【非特許文献１】ブレナーおよびヒュームス、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９７：１４８〜１５４、１９７７
【非特許文献２】ブレナーら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９８：８２６〜８３３、１９７８
【非特許文献３】イーグルハート、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：３６６〜３７１、１９９３
【非特許文献４】米国腎臓データシステム１９９１年次データ報告書抜粋、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８（５）補遺２：２１〜３０、１９９１年１１月
【非特許文献５】コルトンら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８５：３５５〜３７１、１９７５
【非特許文献６】ヘンダーソンら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８５：３７２〜３９１、１９７５
【非特許文献７】クレイマーら、Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ５５：１１２１〜１１２２、１９７７
【非特許文献８】ゴルパー、Ｔ．Ａ．Ａｍ．Ｊ．ＫｉｄｎｅｙＤｉｓｅａｓｅｓ  ６：３７３〜３８１、１９８６
【非特許文献９】シェパードら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９９：３１８〜３２５、１９８６
【非特許文献１０】キャドレッツら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１０４：７３６〜７４２、１９９２
【非特許文献１１】シュナイダーら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  １０３：４５６〜４６２、１９８８
【非特許文献１２】１２ＩｐおよびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ  １３：５８〜６５、１９８９
【非特許文献１３】ホールおよびワット、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０６：６１９〜６３３、１９８９
【非特許文献１４】ポッテンおよびロイフラー、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０：１００１〜１０２０、１９９０
【非特許文献１５】ガーリックら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９７（５）：８２４〜８２９、１９９１
【非特許文献１６】ヒュームスおよびシェスリンスキー、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１：８〜１５、１９９２
【非特許文献１７】ホワイトサイズら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：１４４〜１４８、１９８３
【非特許文献１８】パドマナバンら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７０：３４１〜３４８、１９８８
【非特許文献１９】スパングルードら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５８〜６２、１９８８
【非特許文献２０】ジョーンズら、Ｃｅｌｌ  ７３：７１３〜７２４、１９９３
【非特許文献２１】ヒュームスおよびシェスリンスキー、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２０１：８〜１５、１９９２
【非特許文献２２】バーグら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２４２：Ｃ２２９〜Ｃ２３３、１９８２
【非特許文献２３】スティールら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｃ１３６〜Ｃ１３９、１９８６
【非特許文献２４】アムスラーら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４５６：４２０〜４３５、１９８５
【非特許文献２５】ハステッドら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２５０：Ｃ２１４〜Ｃ２２１、１９８６
【非特許文献２６】ベロー−ロイスら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２５２：Ｆ８９９〜Ｆ９０９、１９８７
【非特許文献２７】ブラックバーンら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３３：５０８〜５１６、１９８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
腎臓機能を代替することができ、その結果長期の透析治療の必要を回避することができる移植可能なバイオ人工腎臓装置は、患者の余命を長くし、移動と融通性を増し、生活の質を高め、感染の危険性を減らし、そして治療コストを減らすことによる極めて大きな利益をＥＳＲＤ患者に与えることになろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって本発明の目的の１つは、急性の腎不全または慢性の末期腎疾患患者の腎機能を置換するためのバイオ人工装置を提供することにある。本発明の特定の実施態様においては、これらの装置は濾過装置と細管処理装置を含んでいる。これらの装置はすべて、単独または組み合わせて、生体外で（人体に取付け、または人体の血流に統合させて）使用することができ、また完全に生体内移植することも可能である。あるいはまた、濾過装置と、それに直列または並列に使用できるような細管処理装置とで構成されたバイオ人工腎臓も提供するものである。
【００１７】
これらの知見およびその他下記の知見に基づいて、本発明は（１）生体内で糸球体の機能を果たす移植可能なバイオ人工濾過装置、ならびに（２）生体内で腎臓細管の機能を果たす移植可能なバイオ人工細管処理装置を提供する。これら２つの装置は個別に、または互いに組み合わせて使用することができる。それらを互いに組み合わせて使用する場合、それら２つの装置は生体外または生体内でそれぞれ独立して使用することができる。
【００１８】
本発明のバイオ人工装置は中空繊維技術を腎臓細胞技術と組み合わせたものである。多孔質中空繊維は、分子交換相同体を毛細管膜を通して交換することができる膜である。ポアサイズは製造課程において調節することが可能である。単一の中空繊維またはそれらの束は、シェル（側胴）またはカートリッジの中に埋め込むことができる。これによって２つの空間、すなわち中空繊維中の管腔スペースと、シェル内で中空繊維の周囲のスペース、が提供される。これらの装置の中に接種される細胞の種類に応じて、種々の生物学的機能の再生が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明者らは、試験管内で増殖し、形態的に分化して細管構造になる能力を保持した細胞集団が成人腎臓の中に存在することを見出した。これらの細胞は高い自己再生能力を持ち、近位細管構造に表現型的に、集団的かつ個別的に分化する能力を保持している。本発明者らはこれら近位細管細胞を選択する無血清の培養条件を確認した。本発明者らは成長因子ＴＧＦ−β１とＥＧＦ、またはＴＧＦ−β１とＴＧＦが、レチノイド、レチン酸（ＲＡ）とともに、組織培養において腎近位尿細管始原細胞の細管形成を促進することを発見した。そして本発明者らは細管形成がＲＡおよびＥＧＦを含む三次元コラーゲンゲル中で誘発できることを見出した。
【００２０】
表皮成長因子およびレチン酸を含有する選択的な無血清の培養条件下で、成体ウサギの腎臓から単離された腎近位細管細胞集団を細胞培養において増殖することができる。これらの細胞は次の２つの重要な特性を有する：すなわち、（ｉ）三次元コラーゲンゲル中で培養した場合、細管構造に形態形成的に分化する能力、ならびに（ｉｉ）高い自己再生能力、である。リコンビナントレトロウイルスを使用した細胞系統分析により、試験管内血管形成は単一細胞のクローン拡大で起きることが示された。レチン酸（ＲＡ）および表皮成長因子（ＥＧＦ）が３つの理由で選択された。第１は、皮膚ケラチノサイトの組織培養に関する従前の研究において、幹細胞様の特性を持った細胞は未成熟末端分化を誘発する条件で培養すると細胞培養中に集積することが示唆されていること（ロジャースら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１０：１７６７〜１７７７、１９９０；パーキンソンら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３、５２５〜５３１、１９８２）である。第２は、ＲＡは組織培養において胎児幹細胞および腎近位細管細胞の有効な分化剤であることが示されていること（ヒュームスおよびシェスリンスキー、前掲；ロジャースら、前掲）である。第３は、現在解説されているものの中ではＥＧＦが腎近位細管細胞のマイトジェン（分裂促進剤）として最も可能性を有すること（ヒュームスら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．６４：５３８〜５４５、１９９１；パーキンソン、前掲）である。したがって、成長促進剤として可能性のあるＥＧＦと、分化剤ＲＡの組み合わせは、高い複製能力を有する細胞に正の選択圧力を加え、また末端分化をする細胞に対して負の選択圧力を加えることになるであろう。腎近位細管細胞の継代培養は従来は難しいものであったが、ＲＡおよびＥＧＦを含ませた培養条件ではこれらの細胞の２０回以上の継代培養が可能となっている。これらの細胞の継続的な培養にはＲＡおよびＥＧＦ両方を使用することが必要である。これらの腎臓細管細胞が形態的に分化し、かつ細管様構造のパターン形成をする能力は、成体ウサギ腎近位細管細胞を一次培養し、次いで数回ＲＡおよびＥＧＦによる選択圧力の条件下で継代培養することによって示すことができる。この選択的条件下で培養した腎臓細管細胞は次に単一の細胞調製品とするために、三次元コラーゲンゲル中に懸濁させ、無血清でＲＡおよびＥＧＦを添加したホルモン規定合成培地で７日から１４日間生育することによって得ることができる（適切な手法はヤングら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７６：３４０１〜３４０５、１９７９；ベネット、Ｎａｔｕｒｅ２８５：６５７〜６５９、１９８０；モンテサノら、Ｃｅｌｌ  ４２：４６７〜４７７、１９８５に記述されており、それらの内容をここに本明細書の一部として引用する）。これらの条件下でコラーゲンゲル中で培養した細胞は数日間内に、位相差顕微鏡写真（図１Ａ〜１Ｃ）で確認されているように、管腔細管状構造を形成する。この細胞の継代培養を繰り返すと、より明確な細管状構造化が促進される。コラーゲン調製品の半薄層部分では細胞クラスター（ふさ状）に細管状の特性が認められる。細胞はコラーゲンゲルの細胞単層に、中央の管腔を取り巻いて��状に整列した形に凝集する。薄層部分では管腔は、管腔先端境界に沿って明確な形の微じゅう毛と、タイトな結合複合体を持った極性化上皮細胞に囲まれている。細胞の単層はまた、コラーゲンゲルの表面に沿っても繁殖している。これら表面の細胞は先端境界に沿って培地中に突き出た広範囲の微じゅう毛を有している。タイトな結合複合体はまた、培地に露出した先端境界の近くの表面細胞の間にも存在する。ＥＧＦまたはＲＡのいずれか、あるいはＥＧＦとＲＡの両方が培地から取り除かれると、コラーゲンゲル中には細管様構造は形成されない。したがって、腎近位細管細胞が分化され、極性化された上皮細胞表現型を有する細管に試験管内でパターン形成するためには、ＥＧＦおよびＲＡの両方が生育培地中に存在しなければならない。
【００２１】
このように、本発明者らはパターン形成と形態形成を誘発する成長因子とレチノイド間の連係した相互作用を明確にし；ひいては完全に分化された腎臓細管を産生するのに必要で、かつほ乳類器官の器官形成に重要である各種の誘発因子を初めて明確なものとした。
【００２２】
加えて、免疫蛍光顕微鏡を使用することにより、レチン酸がこれらの細胞中にラミニンＡおよびＢ1 連鎖の産生を誘発することを見出した。これは、レチン酸の代わりに精製した溶解性ラミニンもまた腎臓細管形成を誘発できることを示している。したがって、生合成がＥＧＦ、ＴＧＦ−β1 、ＴＧＦ−αまたはＲＡに依存する各種の不溶性因子も、パターン形成および分化を促進するモルフォゲンとして作用することができる。
【００２３】
さらに本発明者らは、内皮細胞および上皮細胞を半浸透性の重合中空繊維の管腔の中または外表面に接種して組織培養で生育させ、繊維表面に沿って単層を形成するためにコンフルエントとすることができることを見出した。これらの繊維は、従来報告されている細胞をライニングした導通路とは、細胞の種類と機能ならびに導通路の浸透性の両方の点で異なったものである。
【００２４】
濾過装置
本発明の濾過装置は血液を浄化する装置を含み、かつ外面または内面に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の層を被覆し、その層に上皮および／または内皮細胞のいずれかを集密的細胞単層として生育させたものか、または集密的細胞単層には生育させていない層を付着させた、単一の半浸透性中空繊維または半浸透性中空繊維の集合体のいずれかを適切に含んだものである。あるいは、これら細胞またはマトリックスを半浸透性中空繊維の重合構造の中または上に、直接製造工程で組み込む（以下に述べるように）ことにしてもよい。
【００２５】
本発明の濾過装置は、血液中から、および高い水浸透性を有する半浸透性の中空繊維の壁を通して、の水および溶解物の対流輸送によって血液の限外濾過を促進する。対流方式による血液の濾過はいくつかの明確な利点を有する：すなわち糸球体の毒素除去プロセスを模倣したもので、濾過速度は同じままで、望ましい高分子量溶解物に対する許容度を増し、ある特定の分子量カットオフ値までのすべての望ましくない溶解物を除去するものである。対流輸送は実際の濃度勾配とは無関係に、主として膜の水圧勾配に支配されて起こる。
【００２６】
本発明の実施態様において、図２Ａはハウジング１２で規定されたチャンバー１１の中に単一の中空繊維１０を含む濾過装置を示す。中空繊維１０は各種の細胞外マトリックス成分１３ａで内面を被覆され、その上には内皮および／または表皮細胞１３ｂを含んだ集密的細胞単層が生育されている。中空繊維１０の両端は中空繊維の内部コンパートメントに接近できるように平面に切り揃えられる。中空繊維１０は次に、公知の技法、たとえば植え込み用材料を用いて両端を植え込むことにより、ヘッダー１４に緊密に収められる。還流注入口１５および還流排出口１６はヘッダー１４の両端に連結される。ハウジングはさらに濾過物排出口１７と精巧に合体される。
【００２７】
代謝廃棄物のような望ましくない不純物を含む血液は、患者の動脈管腔から還流注入口１５に流れ込み、中空繊維１０を通過し、還流排出口１６を通って排出され、そこで静脈血液流に再吸収される。血液が繊維中を通過すると、濾過物は集密的細胞単層１３ｂ、細胞外マトリックス１３ａおよび中空繊維１０の壁を通り、収集チャンバー１１に流れる。濾過物は濾過物排出口１７を通して収集チャンバー１１から出る。
【００２８】
本実施態様の好ましい構成においては、濾過装置は自己内皮細胞の集密的細胞単層で内面を被覆された中空繊維を包含する。抗血液凝固剤が濾過装置の血液中に適当に導入される。抗血液凝固剤として適当なものは、ヒルジン、ヒルログおよび抗血液凝固作用を保持するそれらのフラグメントのような血栓阻害剤などである。現在まで約１２種類のヒルジン、ならびにヒルジンフラグメントおよびヒルログ化合物がある（マラガノアら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８６９２〜８６９８、１９８９；シャーフら、ＦＥＢＳ  ２５５；１０５〜１１０、１９８９；マラガノアら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：７０９５〜７１０１、１９９０）。本実施態様に有用なヒルジンフラグメントとして適切なものには、血小板凝集を阻止するヒルジンの触媒部位を含むフラグメント、ならびに凝血の活性化を阻止するフィブリノーゲン結合部位を含むものなどがある（マラガノアら、１９８９、前掲；マラガノアら、１９９０、前掲；ボーボンら、ＦＥＢＳ  ２９４：１６３〜１６６、１９９１）。
【００２９】
ヒルジンは潜在的な血栓抑制効果を有するので抗血液凝固剤として可能性を有するものである。これは吸血ヒル、Ｈｉｒｕｄｏ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓから単離された６４〜６６残基を含むポリペプチド鎖タンパクの一員である。ヒルジンの抗血栓作用はこのタンパクと酵素の間の堅固な複合体形成により、血栓作用を会離定数２０ｆＭで阻害することによるものである。その他類似の血栓阻害剤がその他のヒルからも単離されており、最も新しくはインディアンヒル、Ｈａｅｍａｄｉｐｓａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓからヘミジンが単離されている（スツルーベら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８５９０〜８５９５、１９９３）。ヒルジンおよびヘミジン両方のｃＤＮＡは入手されており、発現ベクターから産生されたリコンビナントタンパクは試験管内および生体内での抗血液凝固特性の可能性を示している（マラガノアら、１９８９、前掲；フェントン、Ｊ．Ｉｎ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｉ  ６：１１２１〜１１２９、１９９２；スツルーベら、前掲；カイザー、Ｂ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  １７：１３０〜１３６、１９９３）。
【００３０】
これらの抗血液凝固剤は、中空繊維の内部コンパートメントに連結された皮下注入口を通して外部投与により適当に導入することができる。あるいは、半浸透性繊維に固定化された抗血液凝固性化合物、好ましくはペプチドの層を内面に被覆することもできる。これら化合物はポリマーに吸収させるか、または従来の手法を用いてポリマーに共有結合させることができる（アンドレードら、Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．７９：１〜６３、１９８６；リンら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １３：９０５〜９１３、１９９２；ハッベルら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５６８〜５７２、１９９１）。共有結合されたペプチドは半浸透性繊維に対する内皮細胞の付着を増強する機能も果たすことになる（リンら、前掲；ハッベルら、前掲）。
【００３１】
あるいは、内皮細胞はこれらの化合物をコードする各種の遺伝子を形質移入することもできる（フリューゲルマンら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０：３４８〜３５４、１９９２；ダイチェックら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８０：１３４７〜１３５３、１９８９）。好ましい実施態様においては、繊維の内面にライニングされた内皮細胞はヒルジンまたはヒルログ化合物をコードしたｃＤＮＡが形質移入され、これら化合物をそれらの膜の外面に発現するか、またはこれら化合物を分泌する。オリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ連鎖反応技法により合成されたＤＮＡも入手することができ、これらのタイプの誘導物をコードする。これらオリゴヌクレオチドを形質移入したｃＤＮＡ安定遺伝子を、内皮層ライニングに沿って抗血液凝固剤の局所産生を誘発するのに使用することができる。これらオリゴヌクレオチドを含有するベクターとの安定遺伝子形質移入は従来の方法で行うことができる（サンブルックら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ、１９８９）。ＤＥＡＥデキストリンは（ダイチェックら、Ｂｌｏｏｄ  ７７：５３３〜５４１、１９９１；ジャクリッシュら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５４：２０７〜２１６、１９９３）に記述されているように、ヒルジンをコードしたＤＮＡの形質移入を改善するのに使用することができる。好ましくは、形質移入はリコンビナントレトロウイルスを使用して行う。ヒルジン、ヒルログ、またはヒルジンフラグメントが細胞から確実に分泌されるようにするために、好ましくは分泌および開裂に適する信号ペプチドまたは膜結合性ペプチドがベクターに組み込まれる。別の好ましい実施態様においては、濾過装置に非形質導入内皮細胞および形質移入内皮細胞の両方を含ませることができる。
【００３２】
本発明の濾過装置の別の実施態様を図２Ｂに示す。この濾過装置は、細胞外マトリックス材料１３ａで規定される単一の中空繊維１０を含むものである。中空繊維１０の片端は切り揃えられており、それにより中空繊維の管腔の連接端はヘッダー１４に取付けられた濾過物排出口１７に取付けることができる。中空繊維１０の反対端は密封される。
【００３３】
中空繊維１０の近くの動脈毛細管腔から漏出する限外濾過物は、中空繊維１０の壁を通過して中空繊維１０の管腔に入り、濾過物排出口１７から出てゆく。
【００３４】
濾過装置は好ましくは一緒に束ねられた多くの中空繊維で構成される（図３Ａ〜Ｂ）。この構成は中空繊維束との毛細管接続面として得られる表面積を改善することになる。実施態様の１つ（図３Ａ）においては、中空繊維１０は、およそ１００〜１０，０００本の中空繊維で、１〜１００ｃｍの程度の適当な長さで両端を、たとえば植え込み材料による植え込みにより固定した何本かの中空繊維を円筒状に整列させた形に組み立てられる。流体は毛細管腔から中空繊維１０を通り、繊維の壁を通して中空繊維の管腔に入り、濾過物排出口１７を通って出てゆく。
【００３５】
本発明の別の好ましい実施態様（図３Ｂ）においては、中空繊維は同じ長さの何本かの中空繊維を板状に束ね、およそ１００〜１０，０００本の中空繊維を、１〜１００ｃｍの程度の適当な長さで両端を、たとえば植え込み材料で固定した形に組み立てられる。束ねられた各繊維の片端は密封され、反対端は濾過物排出口と連結される。中空繊維１０の近くの動脈毛細管腔から漏出する限外濾過物は、中空繊維１０の壁を通過して中空繊維１０の管腔に入り、濾過物排出口から出てゆく。
【００３６】
本発明に有用な半浸透性の中空繊維は、生体適合性のある公知のポリマーからなるもので、ＣＵＰＲＯＰＨＡＮ（銅アンモニア法により再生されたセルロース、Ｅｎｋａより入手可能）、ＨＥＭＯＰＨＡＮ（生体適合性が改善された修飾ＣＵＰＲＯＰＨＡＮ、Ｅｎｋａより入手可能）ＣＵＰＲＡＭＭＯＮＩＵＭ  ＲＡＹＯＮ（ＣＵＰＲＯＰＨＡＮの一種、Ａｓａｈｉより入手可能）、ＢＩＯＭＥＭＢＲＡＮＥ（Ａｓａｈｉより入手可能  な銅アンモニアレーヨン）、鹸化セルロースアセテート（テイジンまたはＣＤＭｅｄｉｃａｌから入手可能な繊維）、セルロースアセテート（東洋紡（Ｎｉｐｒｏ）から入手可能な繊維）、セルロース（銅アンモニア修飾法により再生された、またはビスコース法により再生されたもの、テルモまたはＴｅｘｔｉｋｏｍｂｉｎａｔ（Ｐｉｒｎａ、ＧＤＲ）よりそれぞれ入手可能）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリスルホン、アクリル系コポリマー（アクリロニトリル−ＮＡ−メタリル−スルホネートコポリマー、Ｈｏｓｐａｌより入手可能）、ポリカーボネートコポリマー（ＧＡＭＢＲＯＮＥなど、Ｇａｍｂｒｏから入手可能）、ポリメチルメタクリレートコポリマー類（トーレから入手可能な繊維など）、およびエチレンビニルコポリマー（ＥＶＡＬ、クラレから入手可能なエチレン−ビニルコポリマー）などが挙げられる。好ましくはポリスルホン繊維が使用される。その他生体適合性のある適当な繊維がサレムおよびムハイス、Ｉｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第５章、第２版、ニッセンソンおよびファイン編、Ｈａｎｌｅｙ  ＆  Ｂｅｌｆｕｓ、Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９９３に開示されている。
【００３７】
これらの中空繊維は、限外濾過係数として測定される水伝導性が高くなければならない。好適には、限外濾過係数は２０ｍＬ／ｈｒ，Ｔｏｒｒ以上、好ましくは２０〜１００ｍＬ／ｈｒ，Ｔｏｒｒである。これらの中空繊維は好適には分子量カットオフ値または孔径が６０，０００ｇ／ｍｏｌかまたはそれ以下のものである。
【００３８】
中空繊維の内面および／または外面は、ＥＣＭ層を形成するために適当な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料、すなわちタイプＩコラーゲン、タイプＩＶコラーゲン、ラミニン、マトリゲル、プロテオグリカン（ヘパリン硫酸塩およびデルマタン硫酸塩）、フィブロネクチン、およびそれらの組み合わせなどで予備被覆される。図４は、内面がコラーゲンタイプＩの層でライニングされたポリスルホン中空繊維の光学顕微鏡写真の図解である。この図において繊維の外側輪郭は上部が不規則な線となっている。コラーゲン層は下部に、筋原繊維状の外観を呈して黒っぽく見えている。低倍率の検査（図示なし）では中空繊維の内面の全周が平滑なコラーゲン層となっているのが示されている。
【００３９】
中空繊維の表面にＥＣＭ層が確立された後、この層には内皮細胞が接種される。本発明では内皮細胞は公知の方法を用いて培養することができる。好適には、この内皮細胞は患者から単離された自己由来細胞である。採取された細胞は濾過装置に含まれる各中空繊維の中に接種される。この細胞は次いで、中空繊維の内面に沿って集密的細胞単層が確立されるまで、ＥＣＭ層上で培養される。繊維表面にこれらの細胞を接種するのに使用される有用な培養方法については、スコットら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０５：２６９〜２７３、１９９３；シュナイダーら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  １０３：４５６〜４６２、１９８８；キャドレッツら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １０４：７３６〜７４２、１  １９９２；シェパードら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９９：３１８〜３２６、１９８６；およびデメトリオら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３：１１９０〜１１９２、１９８６に記述されている。
【００４０】
半浸透性の中空繊維を濾過装置のチャンバー内に付着させるのに有用な好適な植え込み材料としては、ポリウレタン、シリコンまたは生体適合性のあるエラストマー性の物質などが挙げられる。
この装置のその他の要素は公知の生体適合性材料によって製作することができる。
【００４１】
この濾過装置は腹膜上に皮下移植するか、あるいは各種の組織（筋肉または腎臓など）内に移植するか、のいずれかにより好適に移植することができる。もしくは、この濾過装置は体外に設置することもできる。
次いで、部位指向の血管新生は適当な脈管形成因子および可溶性因子により促進可能である（図５参照）。脈管形成とは血管をその場に形成するものであり、血管細胞の秩序だった遊走、増殖、および分化が含まれる。内皮細胞増殖を直接的な方法で起こさせることによる脈管形成の開始は、酸性線維芽胞成長因子、塩基性線維芽胞成長因子、線維芽胞成長因子−５、肝細胞成長因子および血管内皮成長因子といったポリペプチドマイトジェン類の働きによるものと考えられる。これらのポリペプチドは試験管内での内皮細胞の、そして生体内での脈管形成のマイトジェンであることが示されている（トンプソンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１３４９、１９８８）。
【００４２】
本実施態様（前記の第２実施態様に相当）において、中空繊維は脈管形成因子により誘発された新生毛細管網により産生される限外濾過物を集める通路として働く。この方法はすべての毛細管ベッドに特有の限外濾過物を産生する性質に基づくものである。この濾過物（または濾出液）は組織間腔やリンパで構成される通常の生理的な部位よりもむしろ中空繊維網に集まる。濾過物の流れの方向は、毛細管から組織間腔を通って中空繊維の中に流れるが、これは中空繊維システムが外部排出および収集システムに連結された時、毛細管腔側と中空繊維側の液圧差が２０ｍｍＨｇ以上あるからである。可溶性および不溶性因子は脈管形成物質とともに中空繊維をとりまく部分に供給され、毛細管密度を維持し、増進する。
【００４３】
本発明に有用な好適な脈管形成因子には、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、肝細胞成長因子、血管内皮成長因子などがある。本発明に有用な好適な不溶性因子としては、コラーゲンゲルもしくはマトリゲルのような複合細胞外マトリックス類、またはラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンタイプＩおよびＩＶなどの精製細胞外マトリックス分子類などがある。
【００４４】
本発明に有用な好適な可溶性因子としては、線維芽胞成長因子のような成長プロモーター類、およびＴＧＦ−βなどの成長インヒビター類がある。
上に列記した因子の供給源は、中空繊維の内部コンパートメントに連結された皮下注入口を通してなんらかの形での外部投与とすることができる。
【００４５】
本発明の別の実施態様においては、中空繊維の展伸時に生きた細胞を中空繊維中に同時押し出しする。この方法はエビッシャーら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １１１：２６９〜２７５、１９９１に記述されており、これを本明細書の一部としてここに引用する。この方法はまた、合成繊維の紡糸口金装置で繊維を作る場合に、中空繊維の内面にＥＣＭ成分の層を確立、または共有的に結合させる方法にも応用することができる。そして、細胞はこのマトリックス材料上に押し出される（エビッシャーら、前掲；リンら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １２：９０５、１９９２）。このようにして、内面をＥＣＭ成分および細胞で層化した大量の中空繊維の生産が可能となる。これらの中空繊維は次いで、束ねられ、植え込まれ、そして両端を切り揃えられて、次に中空繊維カートリッジの植え込み端それぞれに付けられたヘッダーに連結された注入口および排出口を有するプラスチックケースにおさめられる。このカートリッジは次いで増殖させてコンフルエンシーとするためにバイオリアクターに入れられる。
【００４６】
細管処理装置
本発明の細管処理装置の第１の実施態様は、生きた腎臓細管細胞を内面に接種した単一の中空繊維を包含するものである。図６Ａは、中空繊維を包含する細管処理装置を示すが、これは各種の細胞外マトリックス成分２３ａおよび腎臓細管細胞２３ｂの集密的細胞単層で内面を被覆したものである。中空繊維２０はその両端がヘッダー２４に取付けられ、その一端には濾過物注入口２５、他端には尿排出口２６が含まれている。
【００４７】
濾過物は上記の濾過装置、またはその他公知の濾過装置から流れ出て、濾過物注入口２５を経て中空繊維の管腔２０に入り、尿排出口２６を通って出てゆく。流体は腎臓細管幹細胞または始原細胞由来の腎臓細管細胞を含む集密的細胞単層２３ｂによって濾過物から再吸収され、中空繊維壁を通して輸送され、最終的に全身循環系統に再吸収される。再吸収されなかった残りの流体は繊維管腔から流れ出て尿排出口２６を通して出てゆく。
【００４８】
本発明の細管処理装置の第２の実施態様は、生きた腎臓細管細胞を外表面に接種した単一の中空繊維を包含するものである。図６Ｂはハウジング２２で規定されるチャンバー２１を含む細管処理装置を示す。単一の中空繊維２０は外面を各種の細胞外マトリックス成分２３ａおよび腎臓細管細胞２３ｂの集密的細胞単層で被覆されている。この中空繊維２０はチャンバーの両端においてヘッダー２４に、たとえば植え込み材料によって取付けられる。中空繊維２０の一端は密封され、他端は切り揃えられて中空繊維の管腔が再吸収物排出口２７に取付けられるようになっている。このハウジングにはさらに濾過物注入口２５および尿排出口２６が組み込まれている。
【００４９】
濾過物は濾過物注入口２５に入り、尿排出口２６を通って出てゆく。いくらかの流体は集密的細胞単層２３ｂ中の腎臓細管細胞によって濾過物から再吸収され、中空繊維の管腔中へ輸送される。再吸収された流体は再吸収排出口２７を通して繊維から出て、全身循環系統に送り出される。
【００５０】
細管処理装置の第３の実施態様は、細胞外マトリックスおよび細胞のいずれも含ない、単一の半浸透性中空繊維を包含するものである。
この細管処理装置は好ましくは一緒に束ねられた多数の中空繊維で構成される。この構成は中空繊維束との毛細管接触面として得られる表面積を改善することになる。一実施態様においては、中空繊維は内面が腎臓細管細胞の集密的細胞単層で被覆される。中空繊維は何本か（およそ１００〜１０、０００本）の中空繊維で、１〜２０００ｃｍの程度の適当な長さで両端を（たとえば植え込み材料による植え込みによって）固定した板状の形に組み立てられる。各繊維の片端は濾過物注入口に取付けられ、反対端は尿排出口に取付けられる。
【００５１】
限外濾過物は中空繊維を通ってかつ腎臓細管細胞の上を通って濾過物注入口に流れ込む。細胞によって再吸収された流体は半浸透性繊維を通過して周りの組織に入る。吸収されなかった限外濾過物は尿排出口を通って出てゆく。
【００５２】
第２の好ましい実施態様において、中空繊維はその外面を腎臓細管幹細胞の集密的細胞単層で被覆される。中空繊維は同じ長さの、およそ１００〜１０，０００本の中空繊維で、１〜２０００ｃｍ程度の適当な長さで、好ましくは両端を、たとえば植え込み材料による植え込みにより固定した、何本かの中空繊維を円筒状に整列させた形に組み立てられる。各繊維の片端は密封され、他端は再吸収物排出口に取付けられる。この繊維は、血液濾過注入口および尿排出口を備えたハウジングにより規定されるチャンバーにおさめられる。
【００５３】
限外濾過物は血液濾過物注入口を通ってチャンバーに入り、腎臓細管細胞で被覆された繊維を通過する。細胞によって再吸収された流体は、半浸透性繊維を通過して繊維の管腔に入り、再吸収物排出口を通って出てゆく。吸収されなかった限外濾過物は尿排出口を通って出てゆく。
【００５４】
本発明の細管処理ユニット中の半浸透性中空繊維を構築するのに有用な好適な材料は、前述の濾過装置のものと同様である。腎近位細管再吸収は活性Ｎａ+ 輸送に基づくものであり、これはある程度の管腔の緊張性低下を起こし、等張性液体の再吸収を起こさせる経上皮的な浸透勾配をもたらす。近位細管再吸収は、高拡散性の水浸透性、低限外濾過率、および非常に低い分子量カットオフ値のポアサイズを有する膜システムをベースとするものである。好適な中空繊維細胞培養モジュールはＣｅｌｌｃｏ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）から市販品の入手が可能であり、これは高拡散性の水浸透性、低限外濾過係数、および分子量カットオフ値４，０００ダルトンのポアサイズを有するセルロース膜をベースとした中空繊維カートリッジを包含するものである。あるいは、濾過ユニットより大きい、または小さいポアサイズを有する半浸透性繊維を使用することもできる。好ましくは、ポアサイズ（または分子量カットオフ値）は約７０，０００ｇ／ｍｏｌ以下、つまり抗体の繊維への進入を防止するポアサイズである。細管処理ユニットの半浸透性繊維内の液圧は、好適には濾過ユニットの液圧より低く、好ましくは約１０ｍｍＨｇ以下である。細管処理装ユニット内の液圧は、濾過ユニットを細管処理ユニットに連結する導通路の長さ、サイズおよび内径を変えることにより適当に調節することができる。
【００５５】
細管処理装置に有用なこれら中空繊維には腎臓細管上皮細胞が接種される。中空繊維内で培養された細胞は、免疫的に有効な細胞が中空繊維に進入できないために、血流から免疫的に保護される。したがって、この構成においては移植細胞による拒絶は起こらない。
【００５６】
上皮腎臓始原細胞は、ヒュームスら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１：８〜１５；トーブら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４、１１４４０〜１１４４４；トーブら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏ．、１０６  １９１〜１９９；トーブら、Ｊ．Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ、１１、２０７〜２１６；トーブら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１０５、３６９〜３７８；トーブら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６、３３３８〜３３４２；トーブら、Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３７２、４０６〜４２１；トーブら、Ｊ．Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．、１５、６３〜７２；トーブら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１１４、１５３〜１６１；に記述されている従来の方法を用いて好適に採取し培養することができ、これらをすべて本明細書の一部として引用する。
【００５７】
培養された細胞は、種々のバイオマトリックス材料で予め被覆された水および可溶分浸透性膜に接種することができ、これらの細胞の分化されたベクトル輸送、代謝、および内分泌機能の発現が得られる。培養した始原細胞の免疫保護は、細管細胞の生存を支持する条件である限り、長期の機能的性能と同時にに達成される。中空繊維の内面に接種された培養細胞は中空繊維によって免疫保護される。中空繊維の外面に接種された培養細胞は装置のハウジングによって免疫保護される。図７はラミニンおよび腎臓上皮細胞の層で内面をライニングされたポリスルホン中空繊維の光学顕微鏡写真を示したものである。この図において、中空繊維の外側輪郭は上部が不規則な線となっている。コラーゲン層は下部に、筋原繊維状の外観を呈して黒っぽく見えている。高倍率で観察すると、中空繊維の内面の全周が分化した形態の平滑な腎臓上皮細胞層となっているのが判る。
【００５８】
腎近位尿細管始原細胞は、ヒュームスおよびシェスリンスキー、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１：８〜１５、１９９２に記述（ここに本明細書の一部として引用）されているように、それらをホルモン規定合成培地で培養することにより形態形成的な分化を誘発することができる。新しいデータでは腎近位細管始原細胞の分化は、三次元コラーゲンゲル中でＥＧＦおよびＲＡによって誘発できることが示されている。
【００５９】
ホルモン規定腎臓細胞培養は、表皮成長因子および全−ｔｒａｎｓレチン酸によって処理する。この処理によって、腎近位細管細胞の集密的細胞単層は、管腔を含んだ上皮細胞集合体に転換し、これらは極性化された上皮細胞表現型に分化された細胞に取り巻かれる。もしＥＣＭ層が存在しないか、または十分に発達していない場合、細管形成を促進するためにトランスフォーミング成長因子β1 を培養に適宜添加する。
【００６０】
必要な場合、トランスフォーミング成長因子−β1 を０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度、表皮成長因子を０．１ｎＭ〜１μＭの濃度範囲になるように、そして全−ｔｒａｎｓレチン酸を０．０１μＭ〜１００μＭの濃度範囲になるように適宜添加する。
【００６１】
可溶性因子を腎臓細管幹細胞培養に任意に添加することができる。好ましい可溶性因子としては、ウシ胎児血清、プロスタグランジン、ヒドロコルチゾン、トリヨードチロニン、セレン、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子−α、肝細胞成長因子、およびそれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。これら可溶性因子は好ましくは下記の濃度で添加される：ウシ胎児血清、生育培地の３〜２５％（容量／容量）；プロスタグランジンＥ1 、１〜１００ｎｇ／ｍｌ；トリヨードチロニン、０．１ｎＭ〜１μＭ；セレン、０．００１〜１．００μＭ；コレステロール、１．０ｎＭ〜０．１０μＭ；トランスフェリン、１〜５０μｇ／ｍｌ；トランスフォーミング成長因子−α、０．１ｎＭ〜１μＭ；インスリン、１〜５０μｇ／ｍｌ；ヒドロコルチゾン、１ｎｍ〜１μＭ；および肝細胞成長因子、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ。
【００６２】
不溶性因子を腎臓細管幹細胞培養に任意に添加することができる。好ましい不溶性因子としては、タイプＩコラーゲン、タイプＩＶコラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン類、フィブロネクチン、およびそれらの組み合わせのような種々の細胞外マトリックス分子が挙げられるが、これらに限定されない。これら不溶性因子は好ましくは下記の濃度で添加される：タイプＩコラーゲン、１〜５ｍｇ／ｍｌ、タイプＩＶコラーゲン、０．０１〜５ｍｇ／ｍｌ、ラミニン、１０〜１０００μｇ／ｍｌ、ヘパリン硫酸塩、１０〜１０００５ｇ／ｍｌ；およびヘパリン、１０〜１０００μｇ／ｍｌ。
【００６３】
本発明に基づく好適な濾過率は患者の必要に応じて異なるが、典型的には成人で濾過および細管処理装置を通る血液として１０〜１５ｍｌ／分である。この濾過率は透析支持を受けていない腎不全の臨床状態において生命と適合性があることが確認されている。この濾過率では１日当り１４〜１５リットルの濾過物が形成される。細管装置の再吸収割合は少なくとも出てくる濾過物量の５０％である。この濾過率は、細管処理装置の中空繊維の数または長さを増加させることによって調節することができる。
この細管処理装置は皮下または腹腔内のいずれかに好適に移植される。
【００６４】
バイオ人工腎臓
本発明のバイオ人工腎臓の４つの実施態様が図８に示されているが、これらは前記の濾過装置と、それに直列に続く前記の細管処理装置を包含する。また、バイオ人工腎臓は、対流輸送に基づいて連続動静脈血液濾過（ＣＡＶＨ）を行う装置のような従来型の濾過装置（サレムおよびムハイス、前掲；マシアスら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．ＸＶＩＩＩ：４５１〜４５８、１９９１；“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ”、第１版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ−Ｃｒｏｆｔｓ、Ｅａｓｔ  Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、１９８４；“Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｙ”、第２版、Ｈａｎｌｅｙ  ＆  Ｂｅｌｆｕｓ、Ｉｎｃ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９９３）と、それに直列に続く前記の細管処理装置を包含する。濾過装置中に形成された濾過物は直接細管処理装置に流れ、そこで生体的に有用な代謝基質および無機塩類は濾過物から除去され、全身循環系統に再吸収される。濾過装置からの濾過物が細管処理装置によって処理された後、最終的な流体（尿）は、個体からの尿排泄の天然の通路を維持するために、患者の尿管に挿入されたチューブによって細管装置から集められる。あるいは、尿はカテーテルによって集めることもできる。
【００６５】
本発明の第５のバイオ人工腎臓の実施態様が図８Ｅに示されているが、これは円筒整列状に束ねられた複数の２つのタイプの半浸透性中空繊維で構成された単一の装置を含むものである。この中空繊維はハウジング２２で規定されるチャンバー２１の中に収められる。中空繊維は、公知の方法、たとえば植え込み用材料を用いて前記繊維の両端を植え込むことにより、ヘッダー２４ａおよび２４ｂに緊密に収められる。還流注入口２５および還流排出口２７はヘッダーの両端に連結される。ハウジングはさらに尿排出口２６と精巧に合体される。
【００６６】
中空繊維１０の第１のタイプは内面を種々の細胞外マトリックス成分１３ａ、ならびに内皮および／または上皮細胞１３ｂ（好ましくは内皮細胞が使用される）の集密的細胞単層によって被覆されたものである。このタイプの中空繊維の両端は切り揃えられて中空繊維の内部コンパートメントへのアクセスする。片端は還流注入口２５に取付けられ、他端は還流排出口２７に取付けられる。
【００６７】
中空繊維２８の２番目のタイプはその外面を種々の細胞外マトリックス成分２３ａおよび腎臓細管細胞２３ｂの集密的細胞単層によって被覆されたものである。このタイプの中空繊維の片端は２９で密封され、一方他端は切り揃えられて中空繊維の内部コンパートメントへアクセスする。中空繊維の管腔へのアクセス部は還流排出口２７に取付けられる。
【００６８】
患者の動脈管腔から流れる代謝廃棄物のような望ましくない不純物を含む血液は、第１のタイプの中空繊維を通って還流注入口に入り、そして還流排出口を通って出てゆくが、そこで静脈血流中に再吸収される。第１のタイプの繊維中を血液が通過する場合、濾過物は集密的細胞単層および中空繊維を通って拡散し、収集チャンバー内に集まる。この濾過物は次に、第２のタイプの中空繊維の表面上に存在し、チャンバー内で濾過物と接触する腎臓細管細胞によって積極的に再吸収される。再吸収されなかった濾過物は尿排出口を通って収集チャンバーから出てゆく。
【００６９】
この濾過装置は皮下または腹腔の近くに好適に移植される。この装置により形成される濾過物は、同じく皮下または腹腔の近くに好適に移植された細管装置へ直接流れる。好ましくは両方の装置を腹腔に移植する。この構成によれば、濾過物が腎臓細管細胞の集密的細胞単層にライニングされた中空繊維網の内部コンパートメントに入ることができる。再吸収物は腹腔に入り、全身循環系統に再吸収される。この細管装置により処理された最終的流体、すなわち尿、は個体からの尿排泄の天然の通路を維持するため、患者の尿管に挿入されたチューブによって集められる。
【００７０】
本発明を一般的に説明したが、以下に提示する特定の実施例を参照することによりさらに理解を深めることができる。ただしこれらの実施例は特記しない限り、本発明を限定するものではなく、説明の目的に供するためのものである。
【実施例】
【００７１】
実施例１．成体ほ乳類の腎臓から単離された単一細胞からの細管形成
【００７２】
細胞培養
成体ウサギの腎近位細管細胞を、本研究所がすでに報告した方法（７、８）により、一次培養で生育した。これらの細胞は３５ｍｍのコーニング培養皿で、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリンを含む無血清のホルモン規定ダルベッコ修飾イーグル（ＤＭＥ）ハムＦ−１２培地（１：１、ｖ／ｖ）中で培養した。一旦コンフルエントになった後、培養物に継代培養のための処理をした。培養物は１．０μＭの全−ｔｒａｎｓレチン酸（Ｓｉｇｍａから入手可能）および１０ｎＭリコンビナントヒト表皮成長因子（Ａｍｇｅｎから入手可能）によって、継代培養に先立ち２４時間処理した。細胞皿をトリプシンにより３７℃で４分間、続いて０．１％大豆トリプシンインヒビターにより処理した。次いで細胞を除去し、遠心分離によりペレット化し、その時点で種々の量の培養液を加え、適当な細胞希釈液を調製した。１回培養後、細胞を表皮成長因子（ＥＧＦ）およびレチン酸（ＲＡ）を含む培地中で、コンフルエントになるまで培養した。この方法により細胞は、三次元コラーゲンゲル中への分散または懸濁用、あるいは細胞の継続的な継代培養のいずれかのためにいつでも採取できる状態となった。
【００７３】
コラーゲンへの細胞の懸濁
コラーゲンタイプＩ（ＶＩＴＲＯＧＥＮ１００、Ｃｅｌｌｔｒｉｘ  Ｌａｂｓから入手可能）を１０×リン酸緩衝生理食塩水と混合し、ｐＨを７．４に調節した。細胞（５×１０5 ）を２５０ｕｌの培地に懸濁し、ゲル化する前に７５０ｕｌのコラーゲン中に均一に分散した。得られた混合物（２５０ｕｌ）の分割量を冷却したアノセル−１０の細胞培養インサート中に入れ、無ＣＯ2 で４５〜６０分間、３７℃に設定した。ゲル化後、適当な培養液を加え、細胞を７〜２１日間培養した。コラーゲンを１．８ｍｇ/ｍｌ使用した時に最良の結果が得られた。
【００７４】
リコンビナントレトロウイルス
大腸菌ｌａｃ−Ｚ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）をコードさせた高力価の複製欠陥レトロウイルスを構築し、これによりプロウイルスの系統分析のための簡便な検定ができるようにした。パッケージ細胞系統ＡＺ−５の詳細。要約すると、レトロウイルスベクターｐ−ｍＬａｃ  Ｚを環境栄養性レトロウイルスパッケージング細胞株φ−ｃｒｅに形質転換した。２５のクローンが単離され、β−ガラクトシダーゼ活性を色素産生基質５−ブロモ−４−クロロ−３−ウンドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）染色により検出する方法により、ｐ−ｍＬａｃ  Ｚウイルス生産のためのスクリーニングを行い；最もウイルス生産性の高い細胞種φ−ｃｒｉｐを得た。両栄養性ウイルスを産生するクローンを単離し、最も力価の高いクローン（ＡＺ−５）を選定した。ＡＺ−５ウイルスは１０6 のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）／ｍＬの力価を有し、複製能力のあるウイルスを含まないことが感受性プロウイルス・レスキュー分析により確認された。このウイルスを採取するために、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中の１０ｃｍプレートに、ＡＺ−５細胞を接種（５×１０5 細胞／プレート）した。接種２４時間後に培地を変え、さらに２４時間後にウイルスを含む上澄み液を採取し、０．４５ｕのフィルターを通して濾過した。腎臓遠位細管細胞を一次培養および２ないし３回継代培養して調製した。準コンフルエントな条件下で腎臓細管細胞を、リコンビナントレトロウイルスの無希釈または希釈ストックに、ポリブレン（８ｕｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間曝露した。形質導入後、培養液を取り除き、ＪＲＡおよびＥＧＦを添加した無血清のホルモン規定合成培地に入れ替えた。次いで細胞をコンフルエンシーに増殖させ、培養皿から取り出し、コラーゲンゲル中に１０〜１４日間懸濁した。
【００７５】
組織学的処理
コラーゲンゲル培養物をその場で、グルタルアルデヒドおよびソレンセンの緩衝液（ｐＨ７．２、３１０ｍＯｓｍ）で固定した。半薄層および薄層部分を当研究所の報告した標準手法により調製した。薄層部分をＺｅｉｓｓ９−Ｓ２電子顕微鏡で検査した。コラーゲンゲルをＸ−ｇａｌ染色用に処理するために、ゲルを０．５％グルタルアルデヒド中に２時間固定し、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 を含むＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含む溶液で２４時間、３７℃でインキュベートした。次いでゲルを１０分間ＰＢＳで２回洗浄し、次いで２％グルタルアルデヒドを加えて２４時間保持した。ゲルをパラフィン中に埋め込み、切り分けて光学顕微鏡写真を撮るための処理を行った。
【００７６】
実施例２．標的血管形成をベースとした濾過処理プロトタイプ
第１の再生濾過装置は、現在臨床設備として連続動静脈血液濾過に使用されている市販のＡＭＩＣＯＮ（登録商標）ダイアフィルター・ミニフィルターを使用して構築した。この装置は、高い限外濾過係数を有するポリスルホン繊維で構成されている（ナトリウム、ビタミンＢ−１２、およびイヌリンに対する篩係数が０．９５以上で、分子量カットオフ値約５０，０００のもの、したがってアルブミンに対する篩係数は約０．２）。このポリスルホン中空繊維を医療用グレードのシリコンゴムに植え込み、各種の注排口が取付けられたアクリルケースに収容した。
【００７７】
この濾過装置は次のようにして組み立てた。カートリッジのプラスチックケースを取り除き、次いで中空繊維を適当なカートリッジ形状に保つために、市販のゼラチン誘導物（ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標））で製作した型の中でコラーゲンタイプＩのケースに入れ、種々の濃度の血管形成誘導因子（最初はＦＧＦ−酸性およびＦＧＦ−塩基性）を加えた。滅菌した後、血液注入口にキャップをはめ、それにより血管形成物質を中空繊維の中へ注入するための、中空繊維中を通る単一のチャネルを提供し、また細胞外マトリックス中に通路を作り、新生血管からの形質導入された濾過物を集め、半浸透性中空繊維の中へ導く。
【００７８】
次に濾過装置を成体ウサギの皮下に移植した。単一の収集口を、皮下に設置された注入口へ皮下で連通しているチューブに連結した。５ｍｌ分割量のＦＧＦ−塩基性（１０ｎｇ/ｍｌ）の毎日の注入は、注入口を通して１４日間投与し、その時点で排出チューブからの収集を開始した。収集のために、検体動物は緩やかな制限設備に入れ、排出口から分岐を取り、収集瓶に排出するチューブにつないだ。４時間にわたり、１時間ごとに流体収集を行い、次いでその流体のＢＵＮ、クレアチニン、電解質およびアルブミン含有量を分析し、その組成が血液の限外濾過物と同じであるかどうかを調べた。収集用カテーテルを設置するとすぐに流体の自然な流れが起きた。最初の４時間の収集で、この流れの容量は２４ｍｌであった。この時間内に大量の損失が起きるので、この動物からの大量の血液奪取を防止するために収集を中止した。液体流からの最後の６０分間の流体を分析し、以下の結果を得た。４時間目の流体収集物の電解質の検査で次のような濃度が示された：Ｎａ+ ＝１３８ｍＥｑ／Ｌ、Ｋ+ ＝４．０ｍＥｑ／Ｌ、Ｃｌ- ＝１０７ｍＥｑ／Ｌ、合計ＣＯ2 ＝１７ｍＥｑ／Ｌ、クレアチニン＝１．１ｇ／ｄｌ、ＢＵＮ  ２０ｍｇ／ｄｌ、およびグルコース４１ｍｇ／ｄｌ。これらの値は正常な健康ウサギの血漿レベルと同じであった。流体のタンパク電気泳動において、図９に示したようにサイズ選択性バリヤー機能が認められた。
【００７９】
集められた流体および血清中のタンパクの比較電気泳動において、アルブミンおよびトランスフェリン、５０〜７５，０００ＭＷのタンパクの存在が示されたが、それ以上大きなＭＷのタンパクは収集された流体中には認められなかった。これについては、ポリスルホン中空繊維の酸化エチレンによる滅菌が繊維のポアサイズを変えてしまい、試験管内試験中にアルブミン流出が起きることが発見されるまで理由が判らなかった。
【００８０】
したがって、第２の再生濾過装置は、高い水浸透特性を有し、かつ分子量カットオフ値２０，０００ダルトンのＦＲＥＳＥＮＩＵＳ  Ｆ８０ポリスルホン中空繊維を使用して組み立てた。このデザインでは、長さ１０ｃｍの両端を植え込んだ約１００本の中空繊維を１枚の板状に組み立てた（図３Ｂ）。そして、一端は中空繊維の内部コンパートメントにアクセスできるように切り揃えた。シリコンチューブのヘッダーは植え込まれた中空繊維の切断面に緊密に合うように組み立てられ；排出口をヘッダーに取付け；排出口から注入口までをプラスチックチューブで連結した。
【００８１】
従前と同様、ＦＢＦ−塩基性を２週間投与した後、収集口から分岐を取った。自然な流体の流れが起き、１時間ごとのサンプル収集を５時間行った。４時間での流体収集量の合計は７ｍｌで、最後の３回の収集量は１時間当り１から１．４ｍｌであった。最後の５時間目に収集された流体中の溶解物の含有量は、Ｎａ+ ＝１４５ｍＥｑ／Ｌ、Ｋ+ ＝４．４ｍＥｑ／Ｌ、Ｃｌ- ＝１０８ｍＥｑ／Ｌ、合計ＣＯ2 ＝１７ｍＥｑ／Ｌ、クレアチニン＝１．０ｍｇ／ｄｌ、ＢＵＮ＝１７ｍｇ／ｄｌであり、これらの値は同時に採取したウサギ血清の値と同じであった。収集された流体のタンパク含有量は２００ｍｇ／ｄｌであったが、タンパク電気泳動ではアルブミンだけであり、その他の大きなタンパク成分は含まれていなかった（図９）。とりわけ重要なことは、同時に採取したこのウサギの血清の合計タンパク濃度が４．９ｍｇ／ｄｌで、アルブミン濃度は３．４ｍｇ／ｄｌであったことである。
【００８２】
実施例３．濾過装置が目的とする血管形成
効率を高めた各種の濾過装置が考えられる。その特徴とするところは以下の通りである：血管形成因子の継続した生成を伴う新生血管形成密度の増加、血管形成因子を結合する機能、またより効率的な血管形成に関する形態形成を促進する機能の両方を有する各種細胞外マトリックス構成要素、動物の各種部位への本装置の移植−体内の各種毛細血管網は異なる限外濾過係数（腎臓＞腹腔＞皮膚＞筋肉）を有するので、この移植によっても新生血管の限外濾過特性を向上できる。初期濾過装置の移植に関する予備調査によれば、ＦＧＦ−ｂの外因的投与を２週間中断すると、中空繊維装置の回りの毛細血管の内方成長が退行するために自発的濾過は停止した。従って、遺伝子移入により中空繊維網内に目的とする継続的な血管形成を促進する方法を開発すべく研究を行った。繊維細胞成長因子（ＦＧＦ）−５とレトロウイルスパッケージング細胞株φ−ｃｒｉｐ用の完全長のコード化配列とを含んだレトロウイルスベクターｐ−ｍＬａｃＺを利用して、両栄養性で複製欠陥のあるリコンビナント・レトロウイルスを作成した。ＦＧＦ−５を選んだ理由はいくつかある。ＦＧＦ−酸性やＦＧＦ−塩基性と異なり、ＦＧＦ−５は予期されたタンパク配列中に疎水性Ｎ−末端を有する。従って、ＦＧＦ−５を古典的な分泌経路を介して分泌できる。ＦＧＦ−５はまた間充織細胞の分裂を促進し、血管形成能力を有する。従って、作成したレトロウイルスベクターｐ−ｍＦＧＦ５を用いて、ウサギ腎近位細管の始原細胞にベクターを形質導入し、３次元コラーゲンゲルに接種し、規定培地において更に７日間成長させた。この後、コラーゲンゲルを７〜９日目のひなの胚の漿尿膜（ＣＡＭ）に移植し、更に７日間成長させた。ＣＡＭ生物検定は各種化合物や細胞に対する血管形成応答を評価・定量する古典的な手法である。ＦＧＦ−５遺伝子を含むリコンビナント・レトロウイルスを形質導入された腎細管細胞を移植することによって、形質導入細胞を含むコラーゲンゲル内への毛細管成長が促進された。非形質導入細胞を含んだコラーゲンゲルには血管形成は観察されなかった。
【００８３】
このデータは、ｐ−ｍＦＧＦ５を形質導入するためにウサギの腎糸球体上皮細胞を本プランが結果的に利用できることを示しており、ＦＧＦ−５を継続的に放出して中空繊維束の回りの毛細管網の形成を促進・維持するために中空繊維の内部表面に沿った形質導入細胞の接種・集密的な生育によって本プランの実行が可能となる。近位細管よりもむしろ糸球体の上皮細胞を使用する。その理由は本試作装置の液移動方向がベクトル的に正しいからである。腎糸球体における通常のベクトル的濾過の液移動は、生体内では毛細管の内腔から発生し、糸球体細胞間および糸球体の集合（ボーマン）空間に向かって行われる。形質導入された糸球体上皮細胞の利用は、この毛細管の内腔からの生理的経路、組織間腔、中空繊維膜、糸球体上皮細胞、および中空繊維集合空間を模倣することになるであろう。糸球体上皮細胞間の結合複合体は十分に漏洩性を有しており、高度な液対流で液体を移動させる。これに対し、タイトな結合複合体を有する腎近位細管細胞の使用は、対流液の流れの大きな妨げとなるので、本発明では使用すべきではない。
【００８４】
実施例４．ウサギ内皮細胞へのヒルジンの遺伝子移入
ヒルジン突然変異株ＨＶ−２（ジョンソンら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  １５：３０２〜３１５、１９８９）をコードする完全長のｃＤＮＡを、二重非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して構築した。このＰＣＲにおいては、１４塩基が短くオーバラップした長さが７６〜８９塩基の４つの隣接するオリゴヌクレオチドをＰＣＲ混合物におけるプライマーとして使用した（サンヅゥーら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：１４〜１６、１９９２）。このｃＤＮＡの構築において、形質導入された細胞からのヒルジンの分泌を確実にするため、ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）の信号配列はヒルジン遺伝子のフレーム５’に組み込んだ。またウサギおよびヒト遺伝子配列データにおけるコドンの使用を最適にするようにタンパクコード化配列を選  択し（ワダら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：１９８１〜１９８６、１９９２）、更に、レトロウイルスベクターへの移入を容易にするために、ｖＷＦ信号ペプチドとヒルジンＨＶ−２をコードするｃＤＮＡの、適当な制限酵素で切断された部位５’と３’とを導入した。構築したｃＤＮＡの配列は、ジデオキシチェーンターミネーション反応を利用した二方向クローニングによって、所望の配列であることを確認した。モロニーマウスの白血病腫瘍ウイルスに由来するレトロウイルスベクターｐＭＦＧ（ドラノフら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：６４６０〜６４６４、１９８８）およびパッケージング細胞株（ダノス  Ｏ．およびＲ．Ｃ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：６４６０〜６４６４、１９８８）であるφｃｒｉｐを利用して、必要な遺伝子配列を有する両栄養性の複製欠陥のあるリコンビナント・レトロウイルスを構築した。β−ガラクトシダーゼとφ−ｃｒｉｐ細胞株をコードするｌａｃＺ遺伝子を含むベクターｐＭＦＧから構築したリコンビナント・レトロウイルスを、無希釈力価１０6ＣＦＵ／ｍｌで利用した予備調査によれば、組織培養されたウサギ大動脈の内皮細胞において３０％を越える形質導入効率がみられた。これは、このリコンビナント・レトロウイルスを用いた必要とするｃＤＮＡの内皮細胞への遺伝子移入が制限的なものでないことを示唆している。このレトロウイルスを利用した内皮細胞へのヒルジン遺伝子移入の効率と、組織培養の上清に分泌されたヒルジンの活性度の測定値を用いた遺伝子移入の効率を評価するための実験を現在継続中である。
【００８５】
実施例５．内皮細胞の積層化に基づく濾過のプロトタイプ
内皮細胞培養は周知の方法を用いて行うことができる。マトリゲル（Matrigel）と重ね合わせた２４のウエル・クラスタ・プレート型ウエルが使用できる。ウサギに麻酔しその腹腔を開く。ウサギから腹部大動脈を長さ２ｃｍ切り取り、ヘパリンを５０単位／ｍｌ含むＰＢＳ中で３回濯ぐ。その血管から周外膜脂肪と結合組織を注意深く取り除く。次にその大動脈を厚さ２ｍＭ未満の輪状に切る。次いで、これらの大動脈輪サンプルをマトリゲル上のウエルの底に置き、湿気を十分保たせるに足る量の培地で覆う。これに適した培地にはＲＰＭＩ−１６４０、１０％ウシ胎児血清、適切なペニシリン／ストレプトマイシン添加５０ｕｇ／ｍｌの内皮細胞成長補助剤（ＥＣＧＳ）がある。内皮細胞は大動脈輪外植片から延びるマトリゲル上の単層として成長する。４〜８日後、その外植片を取り除き、内皮細胞をコンフルエントに達せしめる。いったんコンフルエントになったら、ディスパース（Dispase ）を２％含むカルシウム−マグネシウムを非含有ＨＢＳＳで処理することによって継代培養用の内皮細胞を集める。分化特性を保持するために、内皮細胞は６連続継代培養以下のものを利用する。
【００８６】
採取した細胞は次にバイオリアクタ内の単一の中空繊維に植えつける。この中空繊維はＡＭＩＣＯＮ（登録商標）製のポリスルホン中空繊維またはＦＲＥＳＥＮＩＵＳ製のポリスルホン中空繊維で、限外濾過係数は２０ｍＬ／ｈｒ，Ｔｏｒｒを越え、分子のカットオフ値は６０，０００ｇ／ｍｏｌ以下である。先に詳述した中空繊維バイオリアクタに対する取付けは、中空繊維内の液圧を増加させるための可変抵抗クランプを灌流出口管に沿って付加することにより達成される。系内の液圧を測定するために、この調整クランプの近傍に圧力計を接続する。永久上皮細胞株を有する中空繊維の植えつけに関する先の報告は、植えつけ後数日以内にコンフルエントとなることを示していた。いったんコンフルエントにになると、水透過性と濾液からのアルブミンの排除を放射性標識イヌリンおよび放射性標識アルブミンを用いて測定できる。
【００８７】
一定流量のもとで抵抗クランプを調整しながら中空繊維内の圧力を一定量ずつ増加する。各調整が終了するごとに、管腔内から浴区画に移動するイヌリンとアルブミンの各一定時採取量を測定し、内皮細胞で内面を覆われた中空繊維の透過特性を評価する。本装置がいったん機能するようになれば、実験により各種ＥＣＭ成分の単層内皮の透過機能に与える影響を調査する。中空繊維の内部表面は、タイプＩコラーゲン、タイプＩＶコラーゲン、ラミニン、マトリゲル等の各種の細胞外マトリックス成分で予め被覆しておく。次に、異なるマトリックス成分を利用するこれらの構成のおのおのについて、単一中空繊維バイオリアクタを用いてイヌリンおよびアルブミン浄化機能を調べる。このようにして、各種細胞外マトリックス成分の水浸透性に対する影響をイヌリン・クリアランスにより評価し、アルブミン排除を測定できる。また、走査電子顕微鏡検査および透過電子顕微鏡検査の両方により、内皮細胞のライニング単層に沿った小孔の存在を評価する。
【００８８】
更に、多数の束状になった中空繊維（各中空繊維は細胞外マトリックス材上に成長した内皮細胞のコンフルエントな単層を含んでいる）が生成され、生体内試験に十分使用できる大きさの濾過装置となる。生体内試験を行うには、本濾過装置を高流量特性を有する動静脈系に取り付けて、体圧下で濾過機能の有効性を判定する。また次に、これら生体内または生体外濾過系内での血液凝固についても試験することができる。
【００８９】
実施例６．細管処理装置のプロトタイプ
細管処理装置の開発は、上記した腎近位細管始原細胞に対する細胞培養の方法に左右されるものであるとともに、中空繊維の内表面に沿ってこれらの細胞をコンフルエントに生育させ、機能的輸送試験を行うために用いる単一中空繊維バイオリアクタの入手容易性にも依存する。哺乳類成体組織から腎近位細管始原細胞を生育・選択するための方法は米国特許第０７／８４４，７５８号に記載されており、その内容を本明細書の一部としてここに引用する。成体ウサギの腎近位尿細管細胞は初代培養で生育させる（ガーリックら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９７（５）：８２４〜８２９、１９９１；ヒュームスら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６２：Ｆ５４０〜Ｆ５４５、１９９２）。一旦コンフルエントになったら、培養液を１．０ｕＭの全ｔｒａｎｓレチノール酸と１０ｎＭの上皮増殖因子で２４時間処理後、継代培養に付す。次いで細胞プレートをトリプシンで３７℃、４分間処理し、さらに０．１％のダイズトリプシン阻害剤で処理する。細胞を取り出し、遠心分離でペレット化するが、この時に、各種量の培地を加えて細胞を適切に希釈する。一旦継代したら、細胞を上皮増殖因子とレチノール酸を含有する培地中でコンフルエンシーになるまで生育させる。このようにして細胞は継代後随時採取して、さらに継代培養を続けるかあるいは接種試験において使用する。これまでのデータから、連続継代培養の後に行うこのような選択的生育によって、次に記す２つの重要な特性を有する腎近位細管始原細胞の富化集団を得ることができることが判明している：即ち、３次元コラーゲンゲル中で生育させると形態形成的に分化して細管構造を達成する能力と、リコンビナントレトロウイルスを用いる細胞系統分析で見いだされる高度な自己再生能力である。
【００９０】
上記の細胞を前に詳述した単一の中空繊維バイオリアクタ中で使用するにあたっては、単一の中空繊維に各種マトリックス成分（タイプＩコラーゲン、タイプＩＶコラーゲン、ラミニン、マトリゲルなど）を積層し、これに腎近位細管始原細胞を接種する。バイオリアクタで５〜７日生育後、腎始原細胞はバイオリアクタの内表面に沿ってコンフルエントに生育する。この繊維を入力側でハーバードポンプに結合するとともに出力側で収集バイアルに結合して試験管内試験系を作成した（図１０参照）。この単一パス灌流系を用いると、分化した近位細管機能を特徴付けている各種輸送機能を放射性物質によって評価することができる。ナトリウムと水の輸送はイヌリンで評価できる。グルコースとアミノ酸再吸収についての分化した輸送特性は放射性標識したグルコースおよびアラニンで測定できる。単層の有機酸分泌能はパラアミノ馬尿酸塩で評価できる。これらの輸送機能を試験するためには、単一のパス灌流回路を１ｍｌ／ｈｒより小さい各種流速で用いる。放射性標識したイヌリンは、ナトリウムと水の灌流中空繊維による再吸収量を測定するために１０μＣｉ／ｍｌの濃度で容積マーカーとして使用するが、これは、腎臓学の文献に古くから記載されている単離近位細管セグメントの微細灌流に用いられてきた方法と同様に行われる（バーグら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１０（６）：１２９３〜１２９８、１９６６；チューンとバーグ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２１（２）：５８０〜５８５、１９７１；ラビトとカリシュ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（４）：２５４３〜２５４７、１９８３；チューンら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１７（４）：１０５７〜１０６３、１９６９；バーグら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３１（２）：６２７３〜６３７、１９７６）。アミノ酸輸送は、１ｕＣｉ／ｍｌの濃度の放射線標識アラニンを用い、全灌流物濃度＝０．５ｍＭアラニンで測定する。同様に、グルコース輸送は、１ｕＣｉ／ｍｌの濃度の放射線標識グルコースを用い、全灌流物濃度＝０．５ｍＭグルコースで測定する。グルコース輸送の特異性は、グルコース輸送の特異的阻害剤であるフロリジンを１×１０-5Ｍ濃度で添加して評価する。細管のパラアミノ馬尿酸塩（ＰＡＨ）分泌速度は、約２００ｕＣｉ／ｍＭの特異活性を有する浴に２．４×１０-5ＭのＰＡＨを添加して評価する。収集した灌流物中の放射性標識ＰＡＨの測定によって、分泌がこの灌流回路に沿って浴から内腔に向くものであることが判る。この単一の中空繊維バイオリアクタを用いると、単層の選択的輸送特性に及ぼすＥＣＭ成分の影響を上記のようにして評価できる。一旦、分化輸送機能に関する最適生育条件とマトリックスの条件が同定されると、この上皮単層の輸送特性を細管の長さと中空繊維径との相関について評価することができ、その結果、束ねた中空繊維の装置が生体内において機能するために要求される最も有効な構成を決定できる。加えて、中空繊維の大きな束を単一の装置に組み込み、これを上で詳述した濾過処理プロトタイプに直列に配置して大きな効率的かつ有効な細管処理装置を構築してもよい。
【００９１】
実施例７．腎細管細胞を接種した中空繊維の機能的ベクトル輸送
バイオリアクタ中で細胞を生育させるために用いる中空繊維カートリッジが商業的に入手可能なので、輸送機能の試験は単一の中空繊維によってではなく、中空繊維の束によって行った。この点に関し、最近の実験で腎細管細胞を接種した中空繊維ユニットにおける機能的ベクトル輸送が示されている。アミコン社のＶｉｔａｆｉｂｅｒカートリッジを用いて、その中空繊維の内面をラミニンでライニングした。腎細管細胞の接種は、濃度１０5 ／ｍｌで毛細管内空間に対し３０分間隔で４回、カートリッジを９０°回転させて細胞注入することによって行った。接種されたカートリッジを図３に示すバイオリアクタの灌流系に連結した。ここで、毛細管外空間はＥＧＦとＲＡを含む培地で満たして灌流せずに蓋をし、毛細管内の空間は同様の培地で４〜５ｍｌ／ｈｒの速度で灌流した。培養の培地は、毛細管内であれ外であれ共に２〜３日おきに交換し、生育の為の適切な代謝基質を維持した。この灌流の設定は、生体内の条件をシミュレートすると共に中空繊維の内表面に沿った細胞の付着を促進するために、中空繊維内の管孔内の液圧が毛細管外空間と比較して常に僅かに高くあるように選択した。７日間生育させた後、ＥＧＦの含有されない培地に交換し、非活動状態を高めた。
【００９２】
短時間の実験研究には、毛細管外の培地を交換して４ｇｍ／ｄｌのアルブミンを含有させ腎細管細胞の基底表面上の腫脹圧を増加させる一方、内腔の灌流培地の比較的無タンパクの性質はそのままとした。最初の実験が丁度完了したとき、中空繊維系中への管孔内灌流を開始し、一方、毛細管外空間を収集バイアルに連結して正味容積フラックスを測定した。正味容積フラックスの発生は、細管内空間から毛細管外空間へと上皮ライニングを横断する液圧および腫脹圧の差が好ましいものであることによる。２０ｍｌ／ｈｒの灌流速度（約１０〜１５ｎｌ／分／ｍｍ）では、毛細管外空間から収集された容積は、３０分の収集時間にわたって灌流速度で１５％〜２５％変化したが、これはこのバイオリアクタ系が管孔空間から毛細管外空間への定量的な正味再吸収フラックスを測定することができることを示している。ポリスルホン繊維は水圧伝導性が高いため、再吸収物フラックスのどの成分が（浸透圧や腫脹圧の差でなく）経上皮水圧差からもたらされているのかは現在のところ不明である。上皮単層を横断して塩と水の流れに関する浸透圧の差を提供する活性Ｎａ+ 輸送の影響を決定するために、ウワバイン（０．１ｍＭ）が本系での正味再吸収フラックスに与える影響を現在試験中である。
【００９３】
本発明を詳細に記述してきたが、本技術分野における当業者にとっては、ここに記載した本発明の精神あるいは範囲から逸脱することなく、多くの変更や修正が可能であることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＥＧＦおよびＲＡ含有の一次培養（ＴＧＦ−βは含有せず）により生体外で生育させた、成体ウサギ腎近位尿細管細胞の位相差顕微鏡写真である。図１Ａは三次元コラーゲンゲル上の細胞の単層を示す。図１Ｂは細管細胞の集合体を示す。図１Ｃは長く分岐した細管構造を示す。
【図２】単一の中空繊維で構成された濾過装置の２つの実施態様（２Ａ、２Ｂ）の図解である。
【図３】中空繊維の束で構成された濾過装置の２つの実施態様（３Ａ、３Ｂ）の写真である。
【図４】内面に沿ってタイプＩコラーゲンの層を接種したポリスルホン中空繊維の光学顕微鏡写真である。
【図５】中空繊維束の血管浸潤を図解して表したものである。
【図６】内面（６Ａ）および外面（６Ｂ）それぞれに分化した腎臓細管細胞を接種した中空繊維で構成された細管細胞処理装置の図解である。
【図７Ａ】内面に上皮細胞を接種した中空繊維の断面写真である。
【図７Ｂ】内面にラミニンの層と、分化した形態の腎臓細管細胞を、内表面に沿って接種したポリスルホン中空繊維の電子顕微鏡写真である。
【図８】濾過装置とこれに直列に接続された細管処理装置を包含する人工バイオ腎臓（８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ）の図解である。
【図８Ｅ】濾過装置とそれに並列の細管処理装置を包含する人工バイオ腎臓の図解である。
【図９】ウサギ血清タンパク（上）、最初の濾過装置からの濾過物（中）、および二次再生濾過装置からの濾過物（下）の電気泳動図である。
【図１０】単一中空繊維還流試験管内試験装置の構成である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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