(57)【要約】【課題】ヒト２２ｑ１１．２欠失症候群の診断薬及び診断方法を提供する。【解決手段】ヒトＤＧＣＲ８遺伝子を含む染色体ＤＮＡまたはヒトＤＧＣＲ８ｃＤＮＡを単離し、検査対象から抽出した染色体ＤＮＡに対し、サザン・ハイブリダイゼーションや定量的ＰＣＲを行う。ＤＧＣＲ８タンパク質を特異的に認識する抗体を作製し、検査対象から抽出したタンパク質に対し、ウエスタン・ブロットを行ってもよい。ヒト２２ｑ１１．２欠失症候群の患者の場合、正常の人で得られるシグナルの半分の強度のシグナルが得られる（ヘテロ接合の場合）か、全くシグナルは得られない（ホモ接合の場合）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
ストリンジェントな条件下で、
配列番号１または２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズする、以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド。
（ａ）  正常な人のゲノム中に２コピー検出され、
２２ｑ１１．２欠失症候群の患者のゲノム中に１コピー検出されるか、または検出されないポリヌクレオチド。
（ｂ）  正常な人のゲノムの両２２番染色体ＤＮＡとハイブリダイズし、２２ｑ１１．２欠失症候群の患者のゲノムの少なくとも一方の２２番染色体ＤＮＡとハイブリダイズしないポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列の一部から、または配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列の一部からなり、６〜３０塩基の長さを持つオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列の一部からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列の一部からなるオリゴヌクレオチドのペアであって、ＰＣＲによって、前記オリゴヌクレオチド・ペアに挟まれたＤＮＡ領域を増幅させることができるオリゴヌクレオチド・ペア。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項４に記載のオリゴヌクレオチド・ペアのいずれかを含む２２ｑ１１．２欠失症候群の診断薬。
【請求項６】
前記２２ｑ１１．２欠失症候群が、ディジョージ症候群ＤＧＳ、口蓋帆・心臓・顔症候群ＶＣＦＳ、及び円錐動脈幹異常顔貌症候群ＣＡＦＳからなるグループから選択される症候群であることを特徴とする請求項５に記載の２２ｑ１１．２欠失症候群の診断薬。
【請求項７】
請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項４に記載のオリゴヌクレオチド・ペアのいずれかを用いることを特徴とする２２ｑ１１．２欠失症候群の診断方法。
【請求項８】
前記２２ｑ１１．２欠失症候群が、ディジョージ症候群ＤＧＳ、口蓋帆・心臓・顔症候群ＶＣＦＳ、及び円錐動脈幹異常顔貌症候群ＣＡＦＳからなるグループから選択される症候群であることを特徴とする請求項７に記載の２２ｑ１１．２欠失症候群の診断方法。
【請求項９】
請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項４に記載のオリゴヌクレオチド・ペアのいずれかを含むＤＧＣＲ８遺伝子欠失症候群の診断薬。
【請求項１０】
請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項４に記載のオリゴヌクレオチド・ペアのいずれかを用いることを特徴とするＤＧＣＲ８遺伝子欠失症候群の診断方法。
【請求項１１】
請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項４に記載のオリゴヌクレオチド・ペアのいずれかを含む口蓋裂の診断薬。
【請求項１２】
請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項４に記載のオリゴヌクレオチド・ペアのいずれかを用いることを特徴とする口蓋裂の診断方法。
【請求項１３】
請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項４に記載のオリゴヌクレオチド・ペアのいずれかを含むことを特徴とする２２ｑ１１．２欠失症候群、ＤＧＣＲ８遺伝子欠失症候群または口蓋裂の診断キット。
【請求項１４】
配列番号３または４の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ストリンジェントな条件下で、
配列番号３または４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズし、
配列番号１または２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドともハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部であることを特徴とする配列番号１に記載のポリヌクレオチドを単離するためのヌクレオチドプローブ。
【請求項１７】
請求項１、２、１４、または１５に記載のポリヌクレオチドの全部または一部を有するベクター。
【請求項１８】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号５または６のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号５または６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドの持つエピトープを有するポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号５または６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリクローナル抗体を用いた２２ｑ１１．２欠失症候群の診断薬。
【請求項２１】
請求項１９に記載のポリクローナル抗体を用いた２２ｑ１１．２欠失症候群の診断方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載のポリクローナル抗体を含むことを特徴とする２２ｑ１１．２欠失症候群の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト２２ｑ１１．２欠失症候群の診断薬及び診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ディジョージ症候群（ＤＧＳ；ＤｉＧｅｏｒｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、口蓋帆・心臓・顔症候群（ＶＣＦＳ；ｖｅｌｏｃａｒｄｉｏｆａｃｉａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、及び円錐動脈幹異常顔貌症候群（ＣＡＦＳ；ｃｏｎｏｔｒｕｎｃａｌ  ａｎｏｍａｌｙ  ｆａｃｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、ほとんどの症例で、２２番染色体の一方において２２ｑ１１．２の位置に欠失を有するため、２２ｑ１１．２欠失症候群と総称されている（例えば、非特許文献１参照）。具体的には、３Ｍｂの欠失（このＤＮＡ領域を、以下、本明細書では３Ｍｂ欠失領域と呼ぶ）を有する患者が９０％、その３Ｍｂ欠失領域に含まれる１．５Ｍｂの欠失（このＤＮＡ領域を、以下、本明細書では１．５Ｍｂ欠失領域と呼ぶ）を有する患者が７％存在する。これらの疾患に共通な症状として、心臓奇形、口蓋裂、副甲状腺形成不全による低カルシウム血症、特有の顔貌が生じる。ＤＧＳに特有の症状として、胸腺形成不全や非形成による免疫不全が生じることもある。
【０００３】
【非特許文献１】
「ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、
（イギリス）、２０００年、９巻、１６号、ｐ．２４２１−２４２６
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
２２ｑ１１．２欠失症候群は、染色体の一部を欠失する遺伝病であり、遺伝子診断を導入することにより、着床前診断・出生前診断・新生児診断などを含む２２ｑ１１．２欠失症候群の診断が可能になる。
そこで、本発明は、ヒト２２ｑ１１．２欠失症候群の診断薬及び診断方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒト２２番染色体長腕の塩基配列を決定し、新規遺伝子の同定をするなかで、染色体２２ｑ１１．２領域中１．５Ｍｂ欠失領域に含まれ、同欠失領域内のＴ１０遺伝子とＨＴＦ９ｃ遺伝子の間に位置するヒトＤＧＣＲ８遺伝子を単離した。次いで、ヒトＤＧＣＲ８遺伝子のエキソン部分のＤＮＡ断片をプローブとし、ヒト及びマウスｃＤＮＡを単離した。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法を用いて、マウス胚におけるマウスＤＧＣＲ８遺伝子の発現を調べたところ、１２．５日胚で、大動脈や肺動脈などの血管壁と口蓋突起にシグナルが検出された。１４日胚では、上顎及び胸部に強いシグナルが検出され、成体では、胸腺に強いシグナルが検出された。この発現パターンは、抗体を用いた免疫組織染色法によっても確認された。ＤＧＣＲ８遺伝子が発現している組織は、ヒト２２ｑ１１．２欠失症候群の発症部位と高い相関を示し、この遺伝子の欠失がヒト２２ｑ１１．２欠失症候群の症状の全部あるいは一部の原因であることが強く示唆された。このようにして、本発明が完成に至った。
【０００６】
本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１または２の塩基配列からなる。
【０００７】
また、ストリンジェントな条件下で、配列番号１または２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズする、以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドであってもよい。
（ａ）  正常な人のゲノム中に２コピー検出され、２２ｑ１１．２欠失症候群の患者のゲノム中に１コピー検出されるか、または検出されないポリヌクレオチド。
（ｂ）  正常な人のゲノムの両２２番染色体ＤＮＡとハイブリダイズし、２２ｑ１１．２欠失症候群の患者のゲノムの少なくとも一方の２２番染色体ＤＮＡとハイブリダイズしないポリヌクレオチド。構造上は、例えば、遺伝子多型、クローニングの際のエラー、あるいは人為的変異導入等により、配列番号１の塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失するか、置換するか、または付加されたポリヌクレオチドであることが考えられる。また、他の構造上の特徴を持つ例として、配列番号１のポリヌクレオチドや配列番号１の塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失するか、置換するか、または付加されたポリヌクレオチドの一部からなるポリヌクレオチド、またはそれらのポリヌクレオチドに不特定な塩基配列のポリヌクレオチドが付加されたポリヌクレオチドが挙げられる。
【０００８】
ここで、ゲノムとは、ヒトの細胞が持つ２４種類、４６本の染色体に含まれるＤＮＡ上のすべての遺伝情報を意味する。
【０００９】
また、ハイブリダイゼーションの際のストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）な条件とは、５ｘＳＳＣの塩濃度において約６５℃以上でハイブリダイズさせることと同じストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の条件をいう。実際上、ホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に加えるか、あるいはハイブリダイゼーション溶液中の塩濃度を変えることによって、二本鎖ＤＮＡの変性温度Ｔｍを調節し、ハイブリダイゼーションの温度を変えても良い。即ち、ホルムアミドを１％添加することにより約０．５℃だけＴｍは下がるので、例えば、５０％ホルムアミド存在下で５ｘＳＳＣの塩濃度では、ストリンジェントな条件は約４０℃以上となる。また、塩濃度を約二分の一にするとＴｍは約１０℃上がるので、例えば、２ｘＳＳＣの塩濃度では、ストリンジェントな条件は約５５℃以上となる。
【００１０】
さらに、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、上記塩基配列または上記塩基配列に相補的な塩基配列の一部からなり、６〜３０塩基の長さを持つ。このオリゴヌクレオチドは、例えば、２２ｑ１１．２欠失を検出する際、ハイブリダイゼーション用のプローブともなりうるし、ＰＣＲ用のプライマーにもなりうる。
【００１１】
また、本発明に係るオリゴヌクレオチド・ペアは、上記塩基配列の一部からなるオリゴヌクレオチドと上記塩基配列に相補的な塩基配列の一部からなるオリゴヌクレオチドのペアであって、このオリゴヌクレオチド・ペアを用いたＰＣＲによって、このオリゴヌクレオチド・ペアに挟まれたＤＮＡ領域を増幅させることができる。
【００１２】
さらに本発明に係る２２ｑ１１．２欠失症候群の診断薬は、上記ポリヌクレオチド、上記オリゴヌクレオチド、または上記オリゴヌクレオチド・ペアを含むことを特徴としてもよい。
【００１３】
さらに、本発明に係る２２ｑ１１．２欠失症候群の診断方法は、上記ポリヌクレオチド、上記オリゴヌクレオチド、または上記オリゴヌクレオチド・ペアを用いることを特徴としてもよい。ここで、２２ｑ１１．２欠失症候群とは、染色体の２２ｑ１１．２の領域を全部または一部欠失することにより、心臓奇形、口蓋裂、副甲状腺形成不全による低カルシウム血症、特有の顔貌などの症状が生じる症候群のことである。上述したように３Ｍｂ欠失領域または１．５Ｍｂ欠失領域を欠失する場合が全体のそれぞれ９０％または７％を占める。
【００１４】
また、この２２ｑ１１．２欠失症候群が、ディジョージ症候群ＤＧＳ、口蓋帆・心臓・顔症候群ＶＣＦＳ、及び円錐動脈幹異常顔貌症候群ＣＡＦＳからなるグループから選択される症候群であることを特徴としてもよい。
【００１５】
さらに本発明に係るＤＧＣＲ８機能欠損症候群の診断薬は、上記ポリヌクレオチド、上記オリゴヌクレオチド、または上記オリゴヌクレオチド・ペアを含むことを特徴としてもよい。また、本発明に係るＤＧＣＲ８機能欠損症候群の診断方法は、上記ポリヌクレオチド、上記オリゴヌクレオチド、または上記オリゴヌクレオチド・ペアを用いることを特徴としてもよい。ここで、ＤＧＣＲ８機能欠損症候群とは、ＤＧＣＲ８遺伝子内に変異が起きることにより、ＤＧＣＲ８の機能が欠損し、心臓奇形、口蓋裂、副甲状腺形成不全による低カルシウム血症、特有の顔貌などの症状が全部または一部生じる症候群のことを指す。この変異は、欠失に限らず、点突然変異や挿入などに因るものでも良い。なお、ＤＧＣＲ８遺伝子とは、構造的には、ＤＧＣＲ８タンパク質をコードしている翻訳領域及び非翻訳領域を含むエキソンと、それらに介在するイントロンとを含む転写領域、及びこの転写領域の発現の制御に関わる制御領域を含むＤＮＡの領域を意味する。
【００１６】
さらに、本発明に係る口蓋裂の診断薬は、上記ポリヌクレオチド、上記オリゴヌクレオチド、または上記オリゴヌクレオチド・ペアを含むことを特徴としても良い。また、本発明に係る口蓋裂の診断方法は、上記ポリヌクレオチド、上記オリゴヌクレオチド、または上記オリゴヌクレオチド・ペアを用いることを特徴としてもよい。
【００１７】
さらに、本発明に係る他のポリヌクレオチドは、配列番号３または４の塩基配列からなる。また、ストリンジェントな条件下で、配列番号３または４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズし、配列番号１または２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドともハイブリダイズすることができるものでもよい。
【００１８】
さらに、本発明に係るヌクレオチドプローブは、これらのポリヌクレオチドを含み、配列番号１に記載のポリヌクレオチドを単離するためのものである。
【００１９】
さらに、本発明に係るベクターは、配列番号１、２、１４、または１５の全部または一部のポリヌクレオチドを有する。
【００２０】
さらに、本発明に係るポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドである。（ａ）配列番号５または６のアミノ酸配列からなるポリペプチド。（ｂ）配列番号５または６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失するか、置換するか、または付加されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドの持つエピトープを有するポリペプチド。
【００２１】
さらに、本発明に係るポリクローナル抗体は、配列番号５または６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識する。
【００２２】
さらに、本発明に係る２２ｑ１１．２欠失症候群の診断薬は、上記ポリクローナル抗体を含む。また、本発明に係る２２ｑ１１．２欠失症候群の診断方法は、上記ポリクローナル抗体を用いる。また、本発明に係る２２ｑ１１．２欠失症候群の診断キットは、上記ポリクローナル抗体を含むことを特徴とする。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００２４】
なお、  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ＆  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ  （Ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）、Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｂｒｅｎｔ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｊ．Ｇ．  Ｓｅｉｄｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｋ．  Ｓｔｒｕｈｌ  （Ｅｄ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集は、当業者が当然に参考にするものであり、そこに記載の方法は当業者であれば容易に実施できると考えられる。そこで、本明細書の実施の形態及び実施例に特に詳細な説明をしていない場合、これら標準的なプロトコールに記載の方法や、あるいはそれを修飾、若しくは改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合、当業者は通常それらに添付のプロトコールを用いるため、特に説明が無い場合は、添付のプロトコールを用いるものとする。
【００２５】
また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。当業者であれば、本明細書で開示されている本発明の意図並びに技術的範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができる。
【００２６】
＜ＤＧＣＲ８遺伝子の同定とｃＤＮＡの単離＞
本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列からなる。本発明者らは、ヒト２２番染色体長腕の全塩基配列を決定し、新規遺伝子の同定をするなかで、染色体２２ｑ１１．２領域中にあり、同領域内のＴ１０遺伝子とＨＴＦ９ｃ遺伝子の間に位置するＤＧＣＲ８遺伝子を同定した。この遺伝子を含む染色体ＤＮＡ（配列番号１）で、エキソンイントロン構造を予測し、配列番号１のエキソン領域に相補的なＰＣＲプライマー・ペアを作製し、ＰＣＲによってＤＧＣＲ８遺伝子ｃＤＮＡの一部を増幅させて得られたプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ＤＧＣＲ８ｃＤＮＡを単離し、塩基配列を決定した（配列番号２）。
【００２７】
なお、ｃＤＮＡを得るには、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする代わりに、ＲＡＣＥ法によって、ＤＮＡを伸張させても良い。また、ｃＤＮＡを化学合成しても良い。
【００２８】
＜マウスＤＧＣＲ８遺伝子＞
発明者らはヒトＤＧＣＲ８ｃＤＮＡの一部をプローブとして、マウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、マウスＤＧＣＲ８ｃＤＮＡ（配列番号：４）を得たので、逆に、マウスＤＧＣＲ８ｃＤＮＡの全部または一部は、ヒトＤＧＣＲ８ｃＤＮＡを単離するためにヒトＤＧＣＲ８ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして用いることができる。マウスｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ストリンジェントな条件で行われたので、ヒトＤＧＣＲ８ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングも同条件でよい。
【００２９】
なお、マウスＤＧＣＲ８遺伝子を含む染色体ＤＮＡ（配列番号：３）を用いても、同様にヒトＤＧＣＲ８ｃＤＮＡの単離は可能である。
【００３０】
＜ＤＧＣＲ８タンパク質を特異的に認識する抗体の作製＞
ヒトとマウスのＤＧＣＲ８タンパク質のアミノ酸配列（ヒト、配列番号５；マウス、配列番号６）の共通部分に属するオリゴペプチドを合成し、そのオリゴペプチドを抗原にして、マウス、ラット、ウサギなどを用いて、ポリクローナル抗体を作製する。
【００３１】
また、オリゴペプチドではなく、大腸菌などで発現させた比較的長いアミノ酸配列を持つタンパク質を抗原にしてポリクローナル抗体を作製してもよい。その場合、ヒトとマウスのＤＧＣＲ８タンパク質のアミノ酸配列は９０％以上の相同性があるため、一方のタンパク質に対して作られたポリクローナル抗体は、多くのエピトープを認識するため、もう一方のタンパク質とも交差反応すると考えられる。
【００３２】
＜２２ｑ１１．２欠失症候群患者の同定＞
このようにして得られたＤＧＣＲ８遺伝子ｃＤＮＡの全長、あるいは一部分をプローブとし、診断対象となる人の口腔内の粘膜や血液などから、染色体ＤＮＡを抽出し、サザン・ハイブリダイゼーションを行う。
【００３３】
診断対象は、出生後に限らず、出生前の卵、胚、胎児などとすることにより、着床前診断を含んだ出生前診断を行うこともできる。例えば、着床前診断は、体外受精した卵の４割球期あるいは８割球期に一つの割球を除去し、そこから染色体ＤＮＡを抽出して診断した後、正常卵を体内に戻すことにより行われる。また妊娠１５〜１８週になると、母親の羊水内にはがれ落ちた胎児組織から染色体ＤＮＡを抽出して、胎児の出生前診断をすることができる。
【００３４】
２２ｑ１１．２欠失症候群患者では、染色体上のＤＧＣＲ８遺伝子を含む２２ｑ１１．２領域が少なくとも一方の２２番染色体で欠失している。従って、正常な人と患者の染色体ＤＮＡ一定量に対してハイブリダイゼーションを行うと、２２ｑ１１．２領域を１コピーしか有しない（ヘテロ接合）か、または全く有しない（ホモ接合）２２ｑ１１．２欠失症候群患者の染色体ＤＮＡにおいては、２２ｑ１１．２領域を２コピー有する正常な人の染色体ＤＮＡに対して、約半分の強度のシグナルが検出される（ヘテロ接合の場合）か、全くシグナルは検出されない（ホモ接合の場合）。この定量は、例えば、プローブをラジオアイソトープでラベルし、ハイブリダイゼーション後、メンブレンをイメージングプレート（フジフィルム社）で露光し、ＦＬＡ３０００やＢＡＳ２０００（ともにフジフィルム社）等のイメージングアナライザーで像を得て、測定及び解析することにより行う。また、Ｘ線フィルムに露光して得られたシグナルをデンシトメーターで測ることにより行ってもよい。
【００３５】
両者の染色体ＤＮＡを等量で用いてサザン・ハイブリダイゼーションをする代わりに、インターナル・コントロールとして、両者で検出可能な他の遺伝子に対するプローブも混ぜておき、その遺伝子に対して得られたシグナルの強度に対し、ＤＧＣＲ８ｃＤＮＡ由来のプローブで得られたシグナルの強度の比を求めると、２２ｑ１１．２欠失症候群患者の染色体ＤＮＡのシグナルは、正常な人の染色体ＤＮＡのシグナルに対し、約半分になる（ヘテロ接合の場合）か、ゼロになる（ホモ接合の場合）。
【００３６】
また、定量ＰＣＲ法を用いても、２２ｑ１１．２欠失症候群患者の同定は可能である。配列番号１の塩基配列及び配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列の一部を有し、６〜３０塩基の長さであって、ＰＣＲによって、これらのオリゴヌクレオチドに挟まれたＤＮＡ領域を増幅させることができるオリゴヌクレオチド・ペアを作製する。２２ｑ１１．２欠失症候群患者の染色体ＤＮＡと正常な人の染色体ＤＮＡに対し、等量の染色体ＤＮＡを用い、定量ＰＣＲを行うと、２２ｑ１１．２欠失症候群患者のシグナルは正常な人のシグナルの半分になる（ヘテロ接合の場合）か、全くシグナルは検出されない（ホモ接合の場合）。定量ＰＣＲとしては、例えば、インターナル・コントロールを設けてサイクル回数を制限して行うＰＣＲ法などがあるが、リアルタイム定量ＰＣＲ法がもっとも好ましい。
【００３７】
また、以上のようにゲノムにおいてＤＧＣＲ８遺伝子を含む２２ｑ１１．２領域の欠失の有無を検出するのではなく、ＦＩＳＨ法などにより、２２番染色体上のＤＧＣＲ８遺伝子の有無を直接検出しても良い。
【００３８】
また、検査対象の細胞から、タンパク質を抽出し、ＤＧＣＲ８タンパク質に対する抗体を用いたウエスタン・ブロットを行い、ＤＧＣＲ８タンパク質の量を比較することによって、診断することもできる。用いる抗体は、ヒトＤＧＣＲ８タンパク質に対する抗体が望ましいが、マウスＤＧＣＲ８タンパク質に対するポリクローナル抗体でも構わない。また、ノーザン・ハイブリダイゼーションで発現量を比較することもできる。この場合、正常のほぼ半分の発現量で、２２ｑ１１．２欠失症候群が生じると予測される。
【００３９】
なお、本実施例では、本来の２２番染色体上のＤＧＣＲ８遺伝子を含む２２ｑ１１．２領域の欠失の有無によって生じる２２ｑ１１．２欠失症候群の検査方法を記載した。しかし、実際上、２２番染色体上のＤＧＣＲ８遺伝子を含む２２ｑ１１．２領域の一方が欠失しても、染色体転座などにより、ＤＧＣＲ８遺伝子を含む２２ｑ１１．２領域が２コピーあれば、症状が生じないと考えられるが、以上の検出方法は、そのような個体も正常と判定するため、その場合でも、症状の有無と検査結果は一致する。
【００４０】
さらに、以上の方法を組み合わせることにより、２２ｑ１１．２欠失症候群の検査を、より確実なものにすることができる。
【００４１】
＜ＤＧＣＲ８機能欠損症候群患者の同定＞
ＤＧＣＲ８機能欠損症候群が、ＤＧＣＲ８遺伝子の欠失によって起きる場合、２２ｑ１１．２欠失症候群患者の同定の場合と同様にして、ヒトＤＧＣＲ８ｃＤＮＡの全長、あるいは一部分をプローブとし、一定量の染色体ＤＮＡに対してサザン・ハイブリダイゼーションを行うことにより、ＤＧＣＲ８機能欠損症候群患者を同定できる。
【００４２】
例えば、ＤＧＣＲ８遺伝子の欠失が完全な欠失であれば、ＤＧＣＲ８機能欠損症候群患者の染色体ＤＮＡに対しては、正常な人の染色体ＤＮＡに対して約半分の濃さのシグナルが検出される（ヘテロ接合の場合）か、全くシグナルは検出されない（ホモ接合の場合）。欠失が部分的なものであれば、ＤＧＣＲ８機能欠損症候群患者の染色体ＤＮＡに対しては、レストリクション・フラグメント・レングス・ポリモルフィズム（ＲＦＬＰ；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が生じ、シグナルとして異なる長さのバンドが検出される。また、２２ｑ１１．２欠失症候群患者の同定の場合と同様にして、定量ＰＣＲ法によっても、ＤＧＣＲ８遺伝子の欠失を同定できる。ＤＧＣＲ８遺伝子の欠失が完全な欠失であれば、ＤＧＣＲ８機能欠損症候群患者の染色体ＤＮＡに対しては、正常な人の染色体ＤＮＡに対して約半分の濃さのシグナルが検出される（ヘテロ接合の場合）か、全くシグナルは検出されない（ホモ接合の場合）。ＤＧＣＲ８遺伝子の欠失が部分的な欠失であれば、欠失の場所により、断片が増幅しない（どちらか一方、あるいは両方のプライマーがハイブリダイズするＤＮＡ領域が欠失している場合）か、正常と異なる長さの断片が増幅される（プライマーがハイブリダイズするＤＮＡ領域は残っている場合）ので、正常な人の染色体ＤＮＡに対するシグナルとは異なったパターンの結果が得られる。
【００４３】
ＤＧＣＲ８機能欠損症候群は、点突然変異や微小な欠失など微小変異によっても生じると考えられ、その場合は、ＰＣＲによりＤＧＣＲ８遺伝子を増幅させて、増幅断片の塩基配列を定法に従って決定し、得られた塩基配列を野生型ＤＧＣＲ８遺伝子と比較することによって、ＤＧＣＲ８遺伝子に生じた変異を検出し、ＤＧＣＲ８機能欠損症候群の診断を行う。
【００４４】
また、検査対象の細胞から、タンパク質を抽出し、ＤＧＣＲ８タンパク質に対する抗体を用いたウエスタン・ブロットを行い、ＤＧＣＲ８タンパク質の量を比較することによって、診断することもできる。用いる抗体は、ヒトＤＧＣＲ８タンパク質に対する抗体が望ましいが、マウスＤＧＣＲ８タンパク質に対するポリクローナル抗体でも構わない。また、ノーザン・ハイブリダイゼーションで発現量を比較することもできる。
【００４５】
なお、本実施例では、本来の２２番染色体上のＤＧＣＲ８遺伝子の欠失の有無によって生じるＤＧＣＲ８機能欠損症候群の検査方法を記載した。しかし、実際上、２２番染色体上のＤＧＣＲ８遺伝子の一方が欠失しても、染色体転座などにより、ＤＧＣＲ８遺伝子が２コピーあれば、症状が生じないと考えられるが、以上の検出方法は、そのような個体も正常と判定するため、その場合でも、症状の有無と検査結果は一致する。
【００４６】
さらに、以上の方法を組み合わせることにより、ＤＧＣＲ８機能欠損症候群の検査を、より確実なものにすることができる。
【００４７】
＜口蓋裂の診断＞
口蓋裂の患者から得られた染色体ＤＮＡあるいは、出生前の胎児の染色体ＤＮＡを用いて、サザン・ハイブリダイゼーションあるいはＰＣＲ等によって、ＤＧＣＲ８遺伝子の変異を検出することにより、口蓋裂を診断できる。具体的な方法は、ＤＧＣＲ８機能欠損症候群と同様なので、ここでは説明を省略する。
【００４８】
【実施例】
＜ヒトＤＧＣＲ８遺伝子を含む染色体ＤＮＡの単離と塩基配列の決定＞
発明者らは、ショットガン配列決定の戦略により、ヒト２２番染色体の全塩基配列を決定した。ディジョージ症候群及びＣＡＦＳ症候群の欠失領域を含む２２ｑ１１．２の染色体領域で、ＧＥＮＳＣＡＮ（ｈｔｔｐ：／／２０２．４１．１０．１４６／）、ＧＲＡＩＬ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｐｂｉｏ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／）、ＭＺＥＦ（ｈｔｔｐ：／／ａｒｇｏｎ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｆｉｎｄｅｒ／）のプログラムによって、エキソン予測を行った。２２ｑ１１．２の染色体領域内で、Ｔ１０遺伝子とＨＴＦ９ｃ遺伝子の間に位置する遺伝子を同定し、ＤＧＣＲ８遺伝子と名付けた。
【００４９】
＜ヒト及びマウスＤＧＣＲ８ｃＤＮＡの単離と塩基配列の決定＞
ヒトＤＧＣＲ８ｃＤＮＡをクローニングするため、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の脳ｃＤＮＡライブラリーに対し、予測されたエキソン中に存在するｈＦ１プライマーとｈＲ１プライマーのペア（ｈ１ペア）を用いて、９４℃２分間変性処理をした後、９５℃１５秒−５８℃１０秒−７２℃３０秒を３０サイクルし、７２℃５分間伸張処理をする条件でＰＣＲを行い、また、エキソン中に存在するｈＦ２プライマーとｈＲ２プライマーのペア（ｈ２ペア）を用い、９４℃２分間変性処理をした後、９５℃１５秒−５６℃２秒−７４℃５秒を３０サイクルし、７２℃５分間伸張処理する条件でＰＣＲを行い、ヒトＤＧＣＲ８ｃＤＮＡを増幅させた。なお、ＰＣＲポリメラーゼは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−またはＫＯＤ  ＤａｓｈＲ（両方とも、東洋紡社）を用いた。以下にプライマーの配列を示す。
【００５０】
ｈＦ１：  ５’−  ＴＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＴＣＧＧＴＧＡＧ  −３’      ［配列番号：７］
ｈＲ１：  ５’−  ＣＣＴＡＣＣＣＣＧＴＣＡＣＣＡＡＣＡＣＴＣ  −３’      ［配列番号：８］
ｈＦ２：  ５’−  ＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡＴＣＧＧＧＡＡＡＴＧ  −３’      ［配列番号：９］
ｈＲ２：  ５’−  ＣＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＴＣＴＴＣＴ  −３’  ［配列番号：１０］
増幅されたＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングし、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ  シークエンサーを用いて、塩基配列を決定した。
【００５１】
上記プライマー・ペアによって増幅されたＤＮＡ断片をプローブにし、ヒト胎児心臓ｃＤＮＡファージライブラリー及びマウス７日胚ｃＤＮＡファージライブラリーを、ストリンジェントな条件でスクリーニングした。それぞれ、ポジティブなファージクローンを単離し、そこからファージＤＮＡを単離した。ＰＣＲで挿入ＤＮＡを増幅させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−ＫＳ（−）（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングし、ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。
【００５２】
＜ＤＧＣＲ８遺伝子の発現パターン  Ｉ．ノーザン・ハイブリダイゼーション＞
まず、ノーザン・ハイブリダイゼーションで、ヒト及びマウスのＤＧＣＲ８遺伝子の発現を調べた。
ヒトＤＮＡプローブは、上記ｈ１ペアを用いてＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を用いた。これは、エキソン１からエキソン２にわたるＤＮＡに対応する。
【００５３】
一方、マウスＤＮＡプローブは、マウス７日胚のｃＤＮＡライブラリーに対し、ｍＦ１プライマー及びｍＲ１プライマーのプライマー・ペアを用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いて、９５℃１０秒−５８℃２秒−７２℃１５秒を３０サイクル後７２℃５分間処理する条件でＰＣＲを行うことにより、増幅したＤＮＡを用いた。このＤＮＡはエキソン４からエキソン６の部分に対応する。以下にプライマーの配列を示す。
【００５４】
ｍＦ１：  ５’−  ＡＧＡＧＧＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡ  −３’      ［配列番号：１１］
ｍＲ１：  ５’−  ＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＣＧＧＴＴＧＡＡＣＴＧＡ  −３’    ［配列番号：１２］
ヒトあるいはマウスの成体及び胎児組織から調製されたＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）  ｂｌｏｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に対し、それぞれ、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルした上記プローブを用いて、ストリンジェントな条件でノーザン・ハイブリダイゼーションを行った。
【００５５】
ヒトＲＮＡに対しては、１．５ｋｂ、３．５ｋｂ、４．５ｋｂの長さの転写物が検出された。４．５ｋｂは、調べた全ての成体の組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、胆嚢、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、大腸、末梢血白血球、胃、甲状腺、脊椎、リンパ節、気管、骨髄、副腎）及び胎児の組織（脳、肝臓、肺、骨格筋、心臓、腎臓、皮膚、小腸）で検出されたが、１．５ｋｂと３．５ｋｂの転写物は成体の精巣でのみ検出された。
【００５６】
マウスでは、１１日胚、１５日胚、１７日胚、及び成体各組織（心臓、脳、胆嚢、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣）で、３．５ｋｂと４．５ｋｂの転写物が検出されたが、６日胚では、４．５ｋｂ転写物しか検出されなかった。
【００５７】
＜ＤＧＣＲ８遺伝子の発現パターン  ＩＩ．ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション＞
ディゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルされたアンチセンス・リボプローブは、エキソン１１からエキソン１４に対応するｃＤＮＡ領域（塩基番号２３３６〜３１８５）がｐＴ７Ｔ３Ｄ−Ｐａｃにクローニングされたベクターを鋳型にし、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  Ｔ３／Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）  を用いて、Ｔ３、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系によって合成した。
【００５８】
様々な発生段階のマウス胚を４％ホルムアミドで固定し、前処理として、３７℃で１５〜３０分間、２０〜３０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで処理した。処理時間は、マウス胚の大きさによって、適当な時間を選択した。前処理後、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、２％  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ロシュ社）、０．１％トリトンＸ−１００、１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、１μｇ／ｍｌ  イーストｔＲＮＡを含む溶液中に、前処理したマウス胚を入れ、７０℃で２時間処理することにより、プレハイブリダイゼーションを行った。その後、プレハイブリダイゼーションと同じ溶液中に、ＤＩＧでラベルした０．５μｇ／ｍｌの濃度のリボプローブを加えたハイブリダイゼーション溶液にマウス胚を入れ、７０℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行った。ＫＴＢＴバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ、０．１％  トリトンＸ−１００、２ｍＭ  レバミゾール）でマウス胚を洗った後、基質にＮＢＴ／ＢＣＩＰを用い、１時間室温で発色させ、０．１％トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）含有ＰＢＳでマウス胚を５回洗うことによって反応を止めた。その後、５０％グリセロール／０．１％トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）含有ＰＢＳで透徹した。
【００５９】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の組織切片は、凍結切片を用い、ホールマウントと同じプローブを用い、定法に従ってハイブリダイゼーションを行った。
【００６０】
ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションでは、マウスＤＧＣＲ８遺伝子の発現は、１１日胚で口蓋前駆体を含んだ咽頭弓第１領域で検出された他、肢芽や神経上皮でも発現が検出された。１３．５日胚から１４．０日胚にかけては、甲状腺前駆体や口蓋に、発現が限局されるようになった。
【００６１】
組織切片を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、１２．５日胚で、口蓋棚の周囲の管構造の間充織細胞及び大動脈や肺動脈の血管でＤＧＣＲ８遺伝子の発現が検出された。また、成体では、胸腺の髄質で発現が検出された。
【００６２】
＜ポリクローナル抗体の作製＞
ヒトＤＧＣＲ８タンパク質のアミノ酸配列中、以下のオリゴペプチドＡｂ１、Ａｂ２を合成し、  Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ  （ＫＬＨ）と結合  （ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させた。
Ａｂ１：  ＡＤＫＫＤＥＥＮＥＬＤＱＥＫ    ［配列番号：１３］
Ａｂ２：  ＫＬＱＥＥＭＫＲＬＡＥＥＲＥ    ［配列番号：１４］
ＦＣＡをアジュバンドとし、オリゴペプチド０．３ｍｇを２週毎にウサギに５回皮下注射し、最終回より一週間後に全採血を行い、抗血清を得た。
【００６３】
一方、ヒトＤＧＣＲ８タンパク質のアミノ酸配列の一部である、以下のポリペプチドＡｂ３を大腸菌の発現ベクターｐＧＥＸ６Ｐ−２（アマシャムバイオサイエンス社）にクローニングし、ＧＳＴ結合タンパク質として大腸菌内で発現させた。
【００６４】
Ａｂ３：ＰＬＰＤＧＷＩＭＴＦＨＮＳＧＶＰＶＹＬＨＲＥＳＲＶＶＴＷＳＲＰＹＦＬＧＴＧＳＩＲＫＨＤＰＰＬＳＳＩＰＣＬＨＹＫＫＭＫＤＮＥＥＲＥＱＳＳＤＬＴＰＳＧＤＶＳＰ  ［配列番号：１５］
１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む抽出用試薬Ｂ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社）中で、大腸菌を超音波破砕し、分取した可溶性画分をグルタチオン・セファロース  ４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製されたＧＳＴ結合Ａｂ３ペプチドを  ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  プロテアーゼ（アマシャムバイオサイエンス社）で４℃にて一晩反応することにより、ＧＳＴタグを分離させた。再度グルタチオン・セファロース  ４Ｂを用いて、ＧＳＴタグを除去し、Ａｂ３ペプチドを精製した。最終精製されたＡｂ３ペプチドを、オリゴペプチドと同様にウサギに免役し、抗血清を得た。
【００６５】
こうして得られたポリクローナル抗体を用いて、マウス凍結切片に対し、組織化学的染色を行ったところ、  検出されたＤＧＣＲ８の発現は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションの結果と一致した。
【００６６】
【発明の効果】
本発明によって、ヒト２２ｑ１１．２欠失症候群の診断薬及び診断方法を提供することが可能になる。
【００６７】
【配列表】
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