(57)【要約】【課題】非特異反応が抑制され、かつ短時間で簡便に目的物質を検出することを可能とする免疫測定法を提供する。【解決手段】免疫凝集反応において非特異反応を抑制するために、不溶性担体にブロッキング剤を添加する工程を短縮すことができれば、免疫測定法における非特異反応が抑制され、かつ短時間に簡便に測定できる。つまり、被測定物質に特異的に結合する蛋白質を、被測定物質には特異的に結合しない不活性な蛋白質とともに不溶性担体に固定化させることによる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質に特異的に結合する蛋白質を、被測定物質には特異的に結合しない不活性な蛋白質と同時に不溶性担体に固定させる工程を含むことを特徴とする免疫測定方法。
【請求項２】
被測定物質には特異的に結合しない不活性な蛋白質を含む水溶液に被測定物質に特異的に結合する蛋白質を混合し、不溶性担体に混合した各蛋白質を固定させる工程を含む免疫測定方法。
【請求項３】
不溶性担体が粒子状であって、該不溶性担体の重量を１とした場合に不活性な蛋白質の重量が１／２０００〜１である請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項４】
同時に固定させる被測定物質に特異的に結合する蛋白質および不活性蛋白質の重量比が、２：１〜１：１０である請求項１〜３のいずれか１に記載の測定方法。
【請求項５】
免疫測定方法が免疫凝集反応により行う請求項１〜４のいずれか１に記載の測定方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１に記載の測定方法に使用する被測定物質に特異的に結合する蛋白質および／または被測定物質には特異的に結合しない不活性な蛋白質を含む免疫測定用試薬。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１に記載の測定方法に使用する免疫測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、不溶性担体を用い免疫凝集反応により被測定物質を測定するための免疫測定試薬及び免疫測定法に関し、より詳細には、非特異反応が抑制され、短時間に測定可能な優れた免疫測定法及び免疫測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
体液中の微量成分などの測定法の１つとして、被測定物質である抗原または抗体に対応した抗体または抗原を不溶性担体に固定させ、被測定物質と抗体または抗原との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の程度を検出することにより、被測定物質を測定する免疫測定法が広く用いられている。このような免疫測定法としては、ラテックス凝集反応を利用したものや赤血球凝集反応を利用したものなどが知られている。
【０００３】
凝集の程度を検出する方法としては、肉眼で判定する方法と、反応液に光を照射し散乱光あるいは透過光を測定する方法とが用いられている。後者の方法、すなわち光学測定法は、試料中の抗原または抗体の定量に用いられている。
【０００４】
免疫凝集反応においてより高い感度を得るために、増感剤として、例えばポリエチレングリコールやデキストランなどの水溶性高分子を反応系に添加する方法が知られている。水溶性高分子の添加により、凝集反応が促進され、より短時間で反応を進行させることができる。しかしながら、水溶性高分子は、被測定物質である抗原または抗体を含まない陰性の検体に対しても凝集反応を引き起こすことがある。このような反応は、非特異反応と呼ばれ、誤った診断の原因となる。
【０００５】
非特異反応を減少させるために、上記被測定物質である抗原または抗体に対応した抗体または抗原を不溶性担体に固定させた後、ブロッキング剤として例えば血清アルブミンやゼラチン等の被測定物質には特異的に結合しない不活性な蛋白質を不溶性担体にさらに固定する方法が行われている。
【０００６】
しかしながら、上記被測定物質である抗原または抗体に対応した抗体または抗原を不溶性担体に固定させた後にブロッキング剤を添加するのでは、操作が煩雑であり、ブロッキングに時間を要し、その結果測定に要する時間が長くなるという欠点があった。
【０００７】
【特許文献】
特開２０００−４６８２８号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、非特異反応が抑制され、かつ短時間で簡便に目的物質を検出することを可能とする免疫測定法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、不溶性担体にブロッキング剤を添加する工程を短縮すことができれば、免疫測定法における非特異反応が抑制され、かつ短時間に簡便に免疫測定ができることに着目し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、
１．被測定物質に特異的に結合する蛋白質を、被測定物質には特異的に結合しない不活性な蛋白質と同時に不溶性担体に固定させる工程を含むことを特徴とする免疫測定方法、
２．被測定物質には特異的に結合しない不活性な蛋白質を含む水溶液に被測定物質に特異的に結合する蛋白質を混合し、不溶性担体に混合した各蛋白質を固定させる工程を含む免疫測定方法、
３．不溶性担体が粒子状であって、該不溶性担体の重量を１とした場合に不活性な蛋白質の重量が１／２０００〜１である前項１または２に記載の測定方法、
４．同時に固定させる被測定物質に特異的に結合する蛋白質および不活性蛋白質の重量比が、２：１〜１：１０である前項１〜３のいずれか１に記載の測定方法、
５．免疫測定方法が免疫凝集反応により行う前項１〜４のいずれか１に記載の測定方法、
６．前項１〜５のいずれか１に記載の測定方法に使用する被測定物質に特異的に結合する蛋白質および／または被測定物質には特異的に結合しない不活性な蛋白質を含む免疫測定用試薬、
７．前項１〜５のいずれか１に記載の測定方法に使用する免疫測定用試薬キット、からなる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明において、被測定物質に特異的に結合する蛋白質とは、被検物質に対して生物学的または物理学的に結合能力を有する蛋白質であれば良く、特に限定されないが、例えば被検物質が抗原である場合にはその抗体、被検物質が抗原である場合にはその抗体のように免疫学的親和性に基づき結合する対の蛋白質が挙げられる（以下、単に「特異蛋白質」という場合もある。）。一方、被測定物質には特異的に結合しない不活性な蛋白質とは、例えば被測定物質に免疫学的に結合しない蛋白質をいい、いいかえれば被測定物質に対して免疫学的に不活性な蛋白質をいう（以下、単に「不活性蛋白質」という場合もある。）。
【００１２】
本発明により測定される測定対象物質は、一般に抗原抗体反応を利用して測定され得る生理活性物質である限り特に限定されず、例えば、蛋白質、脂質などが挙げられ、より詳細には、各種抗原、抗体、レセプターまたは酵素などが挙げられる。さらに具体的には、各種ウイルス（ＨＴＬＶ−１，ＨＩＶ，ＨＣＶ，ＨＢｓ，ＨＢｅ）抗原または抗体、ＣＲＰ、ヒトフィブリノーゲン、ＦＤＰ、リウマチ因子、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、抗ストレプトリジンＯ抗体、梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、抗体などが例示される。
【００１３】
本発明の不溶性担体としては、抗体または抗原を担持し得る適宜の不溶性担体を用いることができる。このような不溶性担体の例としては、有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球及び細胞膜片などが挙げられる。有機高分子粉末としては、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストランなどが例示でき、好ましくはラテックス懸濁液がよい。ラテックスとしては、例えばポリスチレン、ポリスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリルニトリル−ブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等が挙げられる。用いるラテックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度あるいは測定機器によって０．０５〜１．０μｍのものが適宜選択される。無機物質粉末としては、シリカ、アルミナ、あるいは金、チタン、鉄、ニッケル等の金属片などが例示される。
【００１４】
本発明の測定方法は、例えばラテックス凝集反応や血液凝集反応などの従来より公知の各種凝集法を用いることができる。
【００１５】
次に、例えばラテックス凝集反応試薬を用いた抗原抗体反応による免疫測定法の詳細を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。まず、当該免疫測定を行う場合に、ラテックス粒子に特異蛋白質を感作させることが必要である。そして、非特異反応抑制のために、ラテックス粒子を不活性蛋白質でコーティングすることが必要である。本発明の主な特徴点は、ラテックス粒子への特異蛋白質の感作および不活性蛋白質のコーティングを同時に行うことである。便宜上、本出願の明細書では不溶性担体（ここではラテックス粒子）への「感作」および「コーティング」を「固定」という。
【００１６】
ラテックス粒子に特異蛋白質および不活性蛋白質を固定するために、特異蛋白質と不活性蛋白質を含む溶液を調製する必要がある。両蛋白質の混合溶液の調製方法は、特に限定されないが、例えば不活性蛋白質を含む溶液を調製し、次に特異蛋白質を加え手調製することができる。また、特異蛋白質を含む溶液と不活性蛋白質を含む溶液を各々調製しておき、それらを混合することによっても調製することができる。活性蛋白質および不活性蛋白質を含む溶液を、ラテックス粒子と接触させ、活性蛋白質および不活性蛋白質を同時に固定する。該固定は、公知の方法に従い、物理的な方法または化学的な方法により行うことができる。
【００１７】
上記活性蛋白質と不活性な蛋白質の濃度および割合は、測定対象物または特異的に結合する蛋白質の分子量、単体か結合物かなどの物質の性質、その他物理的あるいは化学的な性質により異なる、それらの性質にしたがって、最適な条件を選定することができる。具体的には、例えば特異蛋白質と不活性蛋白質の比は、２：１〜１：１０、好ましくは１：１〜１：３の間で選択することができる。また、担体の重量を１とした場合の不活性蛋白質の重量は、１／２０００〜１、好ましくは１／１０００〜１／１００の間で選択することができる。従来、いわゆる特異蛋白質を固定した後に、ブロッキング剤として不活性蛋白質を固定する場合は過剰量の不活性蛋白質を加えル必要があったが、本発明の方法では不活性蛋白質の量を少なくして活性蛋白質と混合し、不溶性担体に固定することができる。
【００１８】
検体、上記固定すみラテックス粒子および緩衝液を混合し、適切な条件下におくと、ラテックス粒子上の特異蛋白質に被測定物質が特異的に結合し、ラテックス粒子どうしが凝集する。生じた凝集の程度を光学的に観察もしくは目視観察することにより、被測定物質を測定することができる。例えば不溶性担体の凝集の程度を光学的に検出する方法では、散乱光強度、吸光度または透過光強度を光学機器で測定することにより被測定物質が測定される。測定波長は、特に限定されず、３００〜２４００ｎｍの波長を用いることができる。
【００１９】
測定方法については、公知の方法に従って、用いられる不溶性担体の大きさもしくは濃度、反応時間を設定することにより、散乱光強度、吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を測定することにより行われ、これらの方法を２種以上併用してもよい。
【００２０】
本発明は、上記測定方法に使用する試薬、具体的には特異的蛋白質および／または不活性蛋白質を含む溶液からなる固定用試薬、ラテックス粒子等の不溶性担体に特異蛋白質および不活性蛋白質を固定したラテックス試薬、さらに検体や特異的蛋白質および／または不活性蛋白質の各種溶解液などの試薬も含まれる。さらに、これらの試薬のうち２つ以上を組合せて使用する試薬キットにも及ぶ。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明の内容を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２２】
（実施例１）同時感作法
陽性検体（検体１および２：市販の陽性パネル血清）および陰性検体（検体３〜１０：ゼラチン凝集法により陰性と判断された検体）について、ラテックス凝集法によるＨＴＬＶ−１検出試薬を用いて検討した。
【００２３】
グリシン緩衝液８５０μｌに各種ＨＴＬＶ−１抗原（ｐ１９、ｇｐ４６およびｐ２１）を合計９μｇとなるように混入し、さらに各濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１００μｌ加え、ｐＨ２．０としたものを不溶性担体への固定用試薬とした。
粒径０．８μｍのラテックス粒子懸濁液５０μｌ（ラテックス粒子５ｍｇ含む）に、上記不溶性担体への固定用試薬９５０μｌを加え、３７℃で１時間静置した。その後、ラテックス粒子を１％ＢＳＡで洗浄し、各種ＨＴＬＶ−１抗原およびＢＳＡをラテックス粒子に固定した。
【００２４】
測定は、シスメックス社製自動測定装置（ＰＡＭＩＡ−５０）を用い、ＳｙｓｍｅｘＪｏｕｒｎａｌ　Ｖｏｌ．２０　Ｎｏ．１，　ｐ７７−８６（１９９７）に記載の方法に従い行った。反応プレートのウェルに、ラテックス凝集反応用緩衝液を８０μｌ、検体を１０μｌおよび上記調製したラテックス粒子を含む溶液を１０μｌを添加し、４５℃で反応させた。反応を開始して約１５分後に１９μｌの反応混合物を装置のチャンバ内の９５０μｌのシース液に加えて５１倍に稀釈した。稀釈により凝集反応を停止させ、その後、ＰＡＭＩＡ−５０装置により凝集度を求めた。
【００２５】
（比較例１）
各種ＨＴＬＶ−１抗原のラテックス粒子への固定の後にＢＳＡをラテックス粒子へ固定した以外は、実施例１と同じ条件で反応させ、測定を行った。
【００２６】
その結果を図１〜図３に示した。図１に示すように、ＨＴＬＶ−１陽性検体の場合はＢＳＡの添加量に伴い、反応性が増加した。一方、図２に示すようにＨＴＬＶ−１陰性検体の場合はＢＳＡの添加量に伴い、反応性が低下傾向を示し、非特異反応が抑制されたことが示唆された。図３では、ＨＴＬＶ−１陰性検体について測定したものであるが、ＢＳＡ濃度が２０μｇ／ｍｌで最も反応性が低下した。
以上の結果により、不活性蛋白質であるＢＳＡの添加量の違いにより、測定値も異なる傾向を示すため、各測定試料の性質により、至適添加濃度を決定することができることがわかった。
【００２７】
（実施例２）同時感作法
実施例１に記載の方法と同様にラテックス粒子凝集法を用いて検討を行った。各種ＨＴＬＶ−１抗原（ｐ１９、ｇｐ４６およびｐ２１）および２０μｇのＢＳＡを実施例１と同様にラテックス粒子（粒子重量５ｍｇ）に感作し、全血を検体として用いて実施例１と同様に反応および測定を行った。測定値から、カットオフインデックス（ＣＯＩ）値を算出して求めた。ＣＯＩ値は、式１に示す計算式により求めた。
【００２８】
【式１】
2004117068.tif 000002
【００２９】
（比較例２）従来法
各種ＨＴＬＶ−１抗原のラテックス粒子への固定の後にＢＳＡをラテックス粒子へ固定した以外は、実施例２と同じ条件で反応および測定を行い、ＣＯＩ値を求めた。
【００３０】
その結果、従来法では高いＣＯＩ値を示したが、本発明の特異蛋白質（各種ＨＴＬＶ−１抗原）および不活性蛋白質であるＢＳＡを同時に固定する方法ではＣＯＩ値が低下する傾向が認められた。
【００３１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の免疫測定方法は、すなわち特異蛋白質を不活性蛋白質とともに不溶性担体に固定させる工程を含む測定方法は、測定対象物が陽性検体の場合には、より高い測定活性を示し、陰性検体の場合には活性を抑制した値を示すことが判った。このことより、特異蛋白質を不溶性担体に固定したのち、さらに不活性蛋白質を固定して測定する方法に比べ、測定に要する総合時間が短縮され、簡便に感度良く免疫測定を行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＴＬＶ−１陽性検体の場合の測定結果を示す図である。（実施例１および比較例１）
【図２】ＨＴＬＶ−１陰性検体の場合の測定結果を示す図である。（実施例１および比較例１）
【図３】ＨＴＬＶ−１陰性検体の場合の測定結果を示す図である。（実施例１および比較例１）
【図４】ＣＯＩの変化を示す図である。（実施例２および比較例２）
【符号の説明】
１　　ＨＴＬＶ−１陽性検体　１
２　　ＨＴＬＶ−１陽性検体　２
３　　ＨＴＬＶ−１陰性検体　３
４　　ＨＴＬＶ−１陰性検体　４
５　　ＨＴＬＶ−１陰性検体　５
６　　ＨＴＬＶ−１陰性検体　６
７　　ＨＴＬＶ−１陰性検体　７
８　　ＨＴＬＶ−１陰性検体　８
９　　ＨＴＬＶ−１陰性検体　９
１０　　ＨＴＬＶ−１陰性検体１０
【図１】
2004117068.tif 000003
【図２】
2004117068.tif 000004
【図３】
2004117068.tif 000005
【図４】
2004117068.tif 000006