(57)【要約】【課題】新規なハスモンヨトウ核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）及びその包埋体、並びにハスモンヨトウに対し極めて効果的に生物的防除を行うことができる害虫防除資材を提供する。【解決手段】ＡタイプのＮＰＶは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩにて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められないものである。新規なＮＰＶであるＣタイプのＮＰＶは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩにて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められるとともに、４．７〜５．９ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片が認められないものである。包埋体は、前記ＮＰＶをハスモンヨトウ幼虫に接種した後の致死個体からなり、該ＮＰＶが高含有されている。害虫防除資材は、ＣタイプのＮＰＶを含有するもの、ＡタイプのＮＰＶのみからなるもの、又はＡ＋ＣタイプのＮＰＶからなるものである。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素にて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められること、及び４．７〜５．９ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片が認められないことを特徴とするハスモンヨトウ核多角体病ウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載のハスモンヨトウ核多角体病ウイルスを含有する包埋体。
【請求項３】
ハスモンヨトウ核多角体病ウイルスの包埋体であって、
前記ハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素にて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められないものであることを特徴とする包埋体。
【請求項４】
請求項１に記載のハスモンヨトウ核多角体病ウイルスを含有する害虫防除資材。
【請求項５】
特定のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスのみからなるウイルス成分を含有する害虫防除資材であって、
前記特定のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素にて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められないものであることを特徴とする害虫防除資材。
【請求項６】
第１のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスと、第２のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスとからなるウイルス成分を含有する害虫防除資材であって、
前記第１のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素にて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められないものであり、
前記第２のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素にて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められるとともに４．７〜５．９ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片が認められないものであることを特徴とする害虫防除資材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、野外圃場等で農産物の摂食被害を引き起こすハスモンヨトウ（スポドプテラ・リチュラ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）に対する強い殺虫能力を備えたハスモンヨトウ核多角体病ウイルス、該ウイルスの包埋体及び同ウイルスを含有する害虫防除資材に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、この種のウイルスとしては、数種類の昆虫の培養細胞株に対する感染能力、増殖特性、多角体蛋白質、ＤＮＡ制限酵素パターン及びＤＮＡハイブリダイゼーションの各特徴に基づいて４種類に分類された野生のハスモンヨトウ核多角体病ウイルスが知られている（非特許文献１参照）。一方、この種のウイルスを用いた害虫防除資材としては、野外の圃場等で捕捉したハスモンヨトウ感染罹病虫からハスモンヨトウ核多角体病ウイルスを採取して人工的に増殖させたものが用いられている。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｓｕｓｕｍｕ  Ｍａｅｄａ，Ｙｕｋｕｏ  Ｍｕｋｏｈａｒａ  ａｎｄ  Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｋｏｎｄｏ、スポドプテラ・リチュラ核多角体病ウイルスの特徴的同定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、イギリス、１９９０年１１月、７１、ｐ．２６３１−２６３９。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記従来の害虫防除資材では、野外で捕捉したハスモンヨトウ感染罹病虫に含まれるウイルスがほぼそのまま利用されていたことから、ウイルスの種類や配合割合等が不確定であり、品質の変動が激しいうえ生物的防除効果が一定していなかった。このため、この害虫防除資材では、十分に高められた害虫防除効果が発揮されていたとは言い難い。
【０００５】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、感染成立後のハスモンヨトウ幼虫に対する高い感染拡大能力を容易に発揮することができる新規なハスモンヨトウ核多角体病ウイルス、その包埋体及び害虫防除資材を提供することにある。別の目的とするところは、ハスモンヨトウに対し極めて効果的に生物的防除を行うことができる害虫防除資材を容易に提供することができる包埋体を提供することにある。その他の目的とするところは、ハスモンヨトウに対し極めて効果的に生物的防除を行うことができる害虫防除資材を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明のハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素にて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められること、及び４．７〜５．９ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片が認められないことを特徴とするものである。
【０００７】
請求項２に記載の発明の包埋体は、請求項１に記載のハスモンヨトウ核多角体病ウイルスを含有するものである。
請求項３に記載の発明の包埋体は、ハスモンヨトウ核多角体病ウイルスの包埋体であって、前記ハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素にて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められないものであることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項４に記載の発明の害虫防除資材は、請求項１に記載のハスモンヨトウ核多角体病ウイルスを含有するものである。
請求項５に記載の発明の害虫防除資材は、特定のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスのみからなるウイルス成分を含有する害虫防除資材であって、前記特定のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素にて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められないものであることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項６に記載の発明の害虫防除資材は、第１のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスと、第２のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスとからなるウイルス成分を含有する害虫防除資材であって、前記第１のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素にて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められないものであり、前記第２のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素にて切断したとき、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片が認められるとともに４．７〜５．９ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片が認められないものであることを特徴とするものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
日本に生息する野生のハスモンヨトウ核多角体病ウイルス（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ  Ａ）、以下、ＮＰＶと記載する）は、以下に記載するＡ〜Ｃの３種類のタイプに分類される。これら３種類のＮＰＶは、ゲノムＤＮＡの制限酵素切断解析法にて解析したとき、それぞれ異なる電気泳動パターンで表されることによって分類される。即ち、これら３種類のＮＰＶは、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素で完全に切断した後にアガロースゲル電気泳動を行ったときの電気泳動パターンが図１に示されるように互いに異なっている。なお、前記図１に示される電気泳動パターンに見られる各染色バンドの長さと種類とを下記表１に示す。
【００１１】
【表１】
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図１及び表１に示すように、Ａタイプ（特定のタイプ又は第１のタイプ）のＮＰＶは、例えば、ａ〜ｚ（クローンＡ−１）、又はａ〜ｚ及びα（クローンＡ−９）の２６〜２７本前後の染色バンド（ＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡ断片）が明確に確認される電気泳動パターンを有している。このＮＰＶは、１６ｋｂｐ（本発明者らの測定によれば１５．４ｋｂｐ）より長いＤＮＡ断片が認められないことに最も大きな特徴がある。次に、このＮＰＶは、２．２〜３．４ｋｂのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）ことに大きな特徴がある。続いて、このＮＰＶは、８〜１２ｋｂｐのＤＮＡ断片が特に密に存在していることに特徴があり、最後に３．４〜１５．４ｋｂｐ及び１．０〜２．２ｋｂｐの２カ所にＤＮＡ断片の集中が認められることに特徴がある。
【００１２】
なお、前記及び以下の記載において、ＤＮＡ断片が認められない（検出できない）とは、前記電気泳動パターンにおいて、２ｋｂｐ以下の染色バンドが目視又はデンシトメータ等の定量装置にて確実に検出される条件で、該ＤＮＡ断片が目視又は前記定量装置にて検出できないことを意味する。また、このＡタイプに属するＮＰＶの電気泳動パターンには、例えば図１のクローンＡ−１とクローンＡ−９との間に見られるようなクローン間での若干の個体差が存在する。
【００１３】
ＢタイプのＮＰＶは、例えば、ａ〜ｙ（クローンＢ−１）又はａ〜ｚ（クローンＢ−９）の２５〜２６本前後の染色バンドが明確に確認される電気泳動パターンを有している。このＮＰＶは、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片（本発明者らの測定によれば約１９ｋｂｐ）が明確に認められることに最も大きな特徴があり、この特徴により前記ＡタイプのＮＰＶと容易に区別される。次に、このＮＰＶは、５．９〜６．９ｋｂｐのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）ことに大きな特徴があり、続いて２．６〜４．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）ことに特徴があり、続いて１．０〜１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）ことに特徴がある。最後に、このＮＰＶは、６．９〜１２．９ｋｂｐ、４．５〜５．９ｋｂｐ及び１．７〜２．６ｋｂｐの３カ所にＤＮＡ断片の集中が認められることに特徴がある。また、このＢタイプに属するＮＰＶの電気泳動パターンには、例えば図１に示されるクローンＢ−１とクローンＢ−９との間に見られるようなクローン間での若干の個体差が存在する。
【００１４】
Ｃタイプ（第２のタイプ）のＮＰＶは、本発明者らが今回初めて発見したウイルスであって、岐阜県内に生息するハスモンヨトウ罹病虫から単離されたものである。このＮＰＶは、例えば、ａ〜ｚ（クローンＣ−３）の２６本の染色バンドが明確に確認される電気泳動パターンを有している。このＮＰＶは、１６ｋｂｐより長いＤＮＡ断片（本発明者らの測定によれば約１９ｋｂｐ）が明確に認められることに最も大きな特徴があり、この特徴により前記ＡタイプのＮＰＶと容易に区別される。次に、このＮＰＶは、４．７〜６．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）ことに大きな特徴があり、続いて全体にＤＮＡ断片の長さが分散していることに特徴がある。即ち、このＣタイプのＮＰＶは、４．７〜５．９ｋｂｐのＤＮＡ断片が認められない（検出できない）という特徴により前記ＢタイプのＮＰＶと容易に区別される。また、このＣタイプに属するＮＰＶの電気泳動パターンにも、クローン間での若干の個体差が存在する。
【００１５】
これらＡ〜ＣタイプのＮＰＶはいずれも、宿主としてのハスモンヨトウに感染するウイルスであり、該宿主の生体内で増殖した後に宿主を死滅させる殺虫能力を有している。前記ハスモンヨトウは、大豆葉等を食い荒らす農作物の害虫である。このハスモンヨトウは、卵から幼虫、蛹、成虫と変態を繰り返すライフサイクルに従って成長する昆虫であり、幼虫の時期に最も大きな農業被害を引き起こす。前記幼虫としては、脱皮を重ねる毎に発育齢が１つずつ加齢するようになっており、１齢から６齢までの各ステージが存在する。このハスモンヨトウは、４齢以降の老齢幼虫に生育するに従ってＮＰＶ等の病原ウイルスに対する抵抗性が増大して感染されにくくなる。さらに、４齢以降では摂食量が急激に増加して農業被害を飛躍的に拡大させる。また、野外のハスモンヨトウは、休眠することなく活動するとともに、環境温度に依存しながら昆虫独自のライフサイクルを繰り返す。そのため、野外のハスモンヨトウは、発育齢が揃っている場合が極めて少なく、農業被害を軽減させるためには大量の害虫防除資材の散布が必要である。
【００１６】
また、このハスモンヨトウの近縁種としてはスポドプテラ・リトラリス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）が挙げられ、同じスポドプテラ属の昆虫としてはスポドプテラ・エクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）が挙げられる。Ａ〜ＣタイプのＮＰＶは、スポドプテラ・リトラリスに対する感染致死能力を備えている。また、Ａタイプ及びＢタイプのＮＰＶは、スポドプテラ・エクシグア及びスポドプテラ・フルギペルダ由来の培養細胞内にインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で多角体を形成させることが確認されている。
【００１７】
前記ＡタイプのＮＰＶは、Ｂタイプ及びＣタイプのＮＰＶと比べて、ハスモンヨトウ幼虫の体腔内に侵入しやすい性質、つまり感染が成立しやすい性質を有している。ＣタイプのＮＰＶは、ＡタイプのＮＰＶと比べて、ハスモンヨトウ幼虫の体腔内に若干侵入しにくいが、一旦幼虫の体腔内に侵入した後には該体腔内で著しく高い増殖能力を発揮する。
【００１８】
また、前記ＡタイプのＮＰＶは、Ｂタイプ及びＣタイプのＮＰＶと比べて、３齢以前のハスモンヨトウ幼虫（比較的免疫系の働きが弱い幼虫）に対する感染が著しく成立しやすいうえ、該幼虫に対して致死させる作用が最も強い。しかしながら、このＡタイプのＮＰＶでは、４齢以降の幼虫（比較的免疫系の働きが強い幼虫）に対して感染は成立しやすいと考えられるが、宿主体腔内の免疫系の働きによって排除されやすく、宿主を致死させる作用はＣタイプのＮＰＶと比べて若干弱まる。また、ＣタイプのＮＰＶは、感染成立後の増殖能力が格段に優れていることから、３齢及び４齢幼虫の宿主免疫系によって排除されるおそれが少なく、４齢幼虫を致死させる作用はＡタイプ及びＢタイプよりも優れている。
【００１９】
一方、前記ＡタイプのＮＰＶは、Ｂタイプ及びＣタイプのＮＰＶと比べて、宿主に対する感染の成立後は、該宿主の細胞内で多量のポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）蛋白質を発現して核内に多数の包埋体を形成させる能力に優れている。このＡタイプのＮＰＶは、ＣタイプのＮＰＶと比べて、宿主に対する感染の成立後は、該宿主の体細胞全体への感染の拡大作用は弱い。ＣタイプのＮＰＶは、ＡタイプのＮＰＶと比べて、宿主に対する感染の成立後、該宿主の細胞核内での包埋体の形成作用が弱い。このＣタイプのＮＰＶは、Ａタイプ及びＢタイプのＮＰＶと比べて、宿主に対する感染の成立後は、該宿主の体細胞全体に素早く感染を拡大させて宿主の摂食活動を始めとする活動全般を停止させる作用が顕著に高い。
【００２０】
特に、これら各タイプのＮＰＶは、前記各効果が著しく容易かつ効果的に高められることから、インビトロクローニング法によりクローニングされたものであるのが最も好ましい。前記インビトロクローニング法は、単層培養された昆虫由来の培養細胞に対してＮＰＶを感染させた後、プラーク法等の公知のクローニング技術を用いて単一のＮＰＶクローンを単離するものである。前記プラーク法としては、例えば、Ｈｉｎｋ  ａｎｄ  Ｖａｉｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２２，  Ｐ１５８−１７４，  １９８３）の方法が挙げられる。
【００２１】
実施形態の包埋体は、インビトロクローニング法によりクローニングされた単一のＮＰＶクローンを感染源として、ハスモンヨトウ幼虫の生体内に接種した後、その幼虫の生体内で前記ＮＰＶを大量に増殖させることによって得られるものであり、前記ＮＰＶの単一クローンが大量に含有されている。この包埋体としては、前記ＮＰＶが高含有されたハスモンヨトウの死虫、又は該死虫の破砕物を濾過した濾過物の形態で用いられる。なお、前記感染源を幼虫の生体内に接種する際には、経口感染又は体腔内に注入する方法が採用されるが、包埋体を効率的に得るためには体腔内に注入する方法が好適に用いられる。
【００２２】
実施形態の害虫防除資材（農薬）は、ハスモンヨトウに対する生物的防除を行うことにより、ハスモンヨトウの摂食活動による農業被害を抑えるために用いられるものである。この害虫防除資材は、ハスモンヨトウに対する生物的防除を行う有効成分としてウイルスからなる成分（ウイルス成分）が含有されている。なお、この害虫防除資材中には、必要に応じて、ウイルス以外の成分（非ウイルス成分）も同時に含有されていても構わない。前記ウイルス成分としては、上記ＮＰＶの単一クローン、複数のクローン又は複数のタイプのＮＰＶが用いられる。この害虫防除資材は、大量のＮＰＶを容易に取り扱うことができるうえ保存性及び散布後の残留性に優れていることから、前記包埋体を含有させるのが好ましく、ＮＰＶの単一クローンからなる包埋体を１種類又は複数種類含有させるのが最も好ましい。また、前記非ウイルス成分としては、ハスモンヨトウ幼虫に対する経口感染の成立を増進させるための経口感染増進剤（スチルベン系の蛍光漂白剤等）や展着剤、紫外線によるＮＰＶの不活化を防ぐための添加剤等が挙げられる。
【００２３】
前記ウイルス成分としてＡタイプのＮＰＶのみを含有する害虫防除資材は、複数のタイプのＮＰＶが含有されている害虫防除資材と比較して、ハスモンヨトウ幼虫、特に３齢以前の幼虫に対する致死能力（致死率）が飛躍的に向上している。ウイルス成分としてＣタイプのＮＰＶを含有する害虫防除資材は、前記Ａタイプ及び／又はＢタイプのＮＰＶからなるウイルス成分を含有する害虫防除資材と比較して、発育齢が不揃いなハスモンヨトウ幼虫集団全体に対してその活動を鈍化させやすくなっており、農作物の摂食被害を容易に抑える働きがある。
【００２４】
一方、ウイルス成分としてＡタイプ及びＣタイプのＮＰＶを含有する害虫防除資材（Ｂタイプは含有されていても構わない）は、前記両タイプの利点をともに発揮する。即ち、この害虫防除資材は、ＡタイプのＮＰＶがハスモンヨトウ幼虫に対する感染の成立を促進させた後、ＣタイプのＮＰＶが同幼虫の生体内での感染の拡大を促進させる。前記ＣタイプのＮＰＶによる感染の拡大は、前記ＡタイプのＮＰＶの感染によって極めて容易となる。また、ウイルス成分としてＡタイプ及びＣタイプのＮＰＶのみを含有する害虫防除資材（Ｂタイプは含有されていない）は、前記両タイプの利点を最も効果的に発揮する。
【００２５】
上記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・  実施形態のＣタイプのＮＰＶは、本発明者らの鋭意研究の結果、今回新たに発見されたタイプの野生のＮＰＶである。このＮＰＶは、上記非特許文献１に開示されているような公知のウイルスとは異なるゲノムＤＮＡを持ったものであるうえ、それら公知のウイルスとは異なる性質を有している。特に、このＮＰＶは、感染成立後のハスモンヨトウ幼虫に対する高い感染拡大能力を備えていることから、該幼虫の生物的防除に有用である。即ち、このＮＰＶは、前記感染拡大能力によって、ハスモンヨトウに対し極めて迅速にその摂食活動を停止させることから、農業被害を容易かつ効果的に抑えることができる。さらに、このＮＰＶは、３齢以前の幼虫ばかりでなく、４齢ハスモンヨトウ幼虫に対しても致死効果が高いことから、野外圃場等において発育齢の不揃いなハスモンヨトウ幼虫集団に対する致死率を容易に高めることができ、害虫防除資材として利用したときの生物的防除効果を容易に高めることができる。
【００２６】
・  ＡタイプのＮＰＶのみからなるウイルス成分を含有する害虫防除資材は、３齢以前の幼虫に対する致死率が顕著に高いＡタイプのＮＰＶのみから構成されていることから、該ＮＰＶによる感染致死能力が著しくシャープに発揮され、ハスモンヨトウの生物的防除（特に完全駆除）に極めて高い効果を発揮する。またこのとき、他のタイプのＮＰＶが感染することにより瀕死状態ではあるが致死を免れ得る害虫の個体数を減らす効果も発揮され得る。
【００２７】
・  Ａタイプ及びＣタイプのＮＰＶからなるウイルス成分を含有する害虫防除資材は、前記両タイプの利点をともに発揮する画期的な生物的防除を行うことができる。この害虫防除資材は、散布後速やかにＣタイプのＮＰＶによるハスモンヨトウ幼虫の摂食活動を停止させるとともに、所定期間経過後にはＡタイプのＮＰＶによってハスモンヨトウの完全駆除をほぼ達成することができ、農業被害を著しく効果的に抑えることが容易である。なお、この害虫防除資材中のＣタイプのＮＰＶは、害虫の摂食活動の早期停止が主目的であることから、ＡタイプのＮＰＶと等量又はそれ以下の濃度比（個包埋体／ｍｌ）で配合されているのが好ましいが、特に限定されるものではない。
【００２８】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜ＮＰＶのクローニング及び同定＞
ＮＰＶのクローニングには、農林水産省、大学及び公立試験場等で保存されていた株（岐阜県以外の日本各地で採取されたもの）、並びに岐阜県内の圃場で採集した野外ハスモンヨトウ感染罹病虫より分離した病原ウイルスからなる１８種類のサンプルを用いた。これら各サンプルは、通常複数種類のＮＰＶクローンが混在していることから、Ｈｉｎｋ  ａｎｄ  Ｖａｉｌのプラーク法を取り入れたインビトロクローニング法を用いて単一のクローンとなるように分離（クローニング）した。
【００２９】
即ち、まず、１×１０６個のＴＵＡＴ−ＳｐＬｉ−２２１細胞を直径３５ｍｍの培養シャーレで単層培養した。なお、前記ＴＵＡＴ−ＳｐＬｉ−２２１細胞は、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＩＰＬ−４１培地（Ｗｅｉｓｓら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，  １７，  Ｐ４９５−５０２，  １９８１）にて２８℃で培養された。次に、前記培養シャーレ内の培養液を取り除いた後、上記各サンプル（サンプル液）を１シャーレあたり４００ｍｌ加え、室温で１時間攪拌しサンプル液中のＮＰＶを昆虫細胞に吸着させた。その後、前記培養シャーレ内のサンプル液を取り除き、０．７５％のアガロースと１０％のＦＢＳとを含むＩＰＬ−４１培地を３ｍｌ重層した。５日後、生じたプラークをパスツールピペットで採取して少量のＩＰＬ−４１培地に懸濁させた。以上の操作を３回繰り返すことにより、２２８個のＮＰＶクローンがクローニングされた。
【００３０】
これらＮＰＶクローンからＬａｖｉｎａら（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，  ２０，  Ｐ３９−４７，  ２００１）の方法によりゲノムＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩによって制限酵素処理した後にアガロースゲル電気泳動を行ったところ、３３種類の遺伝子型に分類された。その一部を図１に示す。これら３３種類の遺伝子型は、その電気泳動パターンの特徴から大きく３種類のタイプ（Ａ〜Ｃタイプ）に分類され得ることが判明し、日本国内には少なくとも３タイプのＮＰＶが存在することが明らかになった。
【００３１】
前記Ａタイプは、その電気泳動パターンより、Ｃｈｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，４６，Ｐ２８９−２９５，１９８５）の報告にある、主に地中海沿岸地域に分布する近縁種のスポドプテラ・リトラリス核多角体病ウイルスと極めて高い類似性があることが判明した。前記Ｂタイプは、その電気泳動パターンより、非特許文献１及びＬａｖｉｎａら（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，  ２０，  Ｐ３９−４７，  ２００１）の報告にある、アジアで分離報告されたＮＰＶと極めて高い類似性があることが判明した。一方、前記Ｃタイプは、これまで報告されているＮＰＶの電気泳動パターンとは全く異なる新しいタイプのウイルスであることが判明した。また、このＣタイプのクローンは、岐阜県内の罹病虫からのみ分離された。そして、Ａタイプに属するクローンをＡ−１〜Ａ−２０、Ｂタイプに属するクローンをＢ−１〜Ｂ−１０、Ｃタイプに属するクローンをＣ−１〜Ｃ−３と命名した。
【００３２】
＜包埋体の作製＞
前記３３種類のＮＰＶのクローンは、ゲノム変異の可能性を最小限に止めるため、前記培養細胞系にて最小限の回数で小規模に増殖させた後、該細胞を含む培養液を３，０００ｒｐｍで遠心分離して沈澱を回収し、少量の水に懸濁させた。この懸濁液を人工飼料に加え、４齢程度のハスモンヨトウ幼虫に食下し、感染致死した個体を回収した。さらに、前記致死個体をホモゲナイズし、１００メッシュ程度のナイロンメッシュにより濾過して頭部や体毛等の大きな夾雑物を取り除いた後、３，０００ｒｐｍの遠心上清を得ることにより粗精製した後、少量の界面活性剤（０．０２％程度のＴｗｅｅｎ  ８０）を含む滅菌水に懸濁することによって包埋体を得た。最後に、前記包埋体の濃度（個包埋体／ｍｌ）を、顕微鏡を用いて血球計算盤によりカウントした。
【００３３】
＜ＮＰＶクローンの殺虫能力の比較１＞
各タイプから任意のクローンとしてＡ−１、Ａ−９、Ｂ−１、Ｂ−９及びＣ−３を選び、昆虫生体を用いて殺虫能力を比較した。即ち、まず、これら各クローンを５×１０６個包埋体／ｍｌの濃度に調整した後にその希釈系列を作製し、Ｈｕｇｈｅｓ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ３７，  Ｐ１５４−１５９，  １９８１）のドロップレットフィーディング法により累代飼育した３齢ハスモンヨトウ幼虫３０匹ずつに経口接種して感染させた。感染１４日後までの死亡個体数をカウントし、各クローンについて、全個体数に対する累積死亡個体数の割合である累積死亡率（％）を求めた。そして、同じ試験を複数回行い、累積死亡率のデータをもとにＦｉｎｎｅｙ（Ｐｒｏｂｉｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＫ，Ｐ３３３）のプロビット法により、５０％のハスモンヨトウ個体を致死させる半致死濃度（ＬＣ５０値）を算出した。
【００３４】
その結果、Ａ−１、Ａ−９、Ｂ−１、Ｂ−９及びＣ−３のＬＣ５０値は、それぞれ７．０×１０４、４．４×１０４、１．９×１０６、１．８×１０６及び７．３×１０５個包埋体／ｍｌであった。従って、インビトロクローニング法によってクローニングされたＡタイプのＮＰＶクローン（Ａ−１及びＡ−９）は、Ｂ及びＣタイプのＮＰＶと比べて１０倍以上高い致死能力があることが判明した。また、ＣタイプのＮＰＶはＢタイプのＮＰＶよりも高い致死能力があることも判明した。
【００３５】
＜ＮＰＶクローンの増殖能力の比較１＞
前記各クローンについて、昆虫生体を用いて増殖能力を比較した。即ち、まず、各クローンを前記ドロップレットフィーディング法により累代飼育した４齢ハスモンヨトウ幼虫に経口接種して感染させた。感染２４，４８，７２，９６及び１２０時間後にハスモンヨトウから体液を採取し、該体液に含まれるＮＰＶの出芽ウイルスの濃度（タイター）をプラーク法によりカウントし、図２に示した。その結果、ＡタイプのＮＰＶの感染極初期（１〜２日）における増殖能力が突出して高いことが確認された。また、ＣタイプのＮＰＶは、感染３日以降ではＡ及びＢタイプと比べて、出芽ウイルスタイターが１０３〜１０４倍程度高くなっていることが示され、その後も昆虫が致死に至るまで該タイターの濃度が継続的に維持されていたことも示された。
【００３６】
＜ＮＰＶクローンの増殖能力及び殺虫能力の比較２＞
前記各クローンを累代飼育した４齢幼虫に１００ＰＦＵ／個体となるように注射により体腔内に注入し、７２時間後にハスモンヨトウから体液を採取し、該体液に含まれるＮＰＶの出芽ウイルス濃度（タイター）をプラーク法によりカウントした。その結果、Ａ−１、Ａ−９、Ｂ−１、Ｂ−９及びＣ−３の出芽ウイルス濃度は、それぞれ２．９×１０５、７．８×１０５、２．７×１０５、１．１×１０５及び２．５×１０８ＰＦＵ／ｍｌであった。従って、４齢幼虫に対する１００ＰＦＵ／個体という極めて少量のウイルスを注入することにより、全てのＮＰＶクローンの増殖が認められた。さらに、ＣタイプのＮＰＶは他のタイプに比べ１０３倍程高いウイルス量が検出された。
【００３７】
また、同条件でＮＰＶを注射されたハスモンヨトウの死亡個体数をカウントし、累積死亡率（％）を求めて図３に示した。図３の結果より、ＣタイプのＮＰＶは、他のタイプのＮＰＶと比べて１日以上も早くハスモンヨトウを致死させたことが示された。さらに、このＣタイプのＮＰＶでは、注入３日後から宿主の摂食停止が観察され、高い食害軽減効果が発揮され得ることが示された。また、Ａ〜Ｃの全てのタイプのＮＰＶにおいて、該ウイルスの注入量が極めて少量であっても、体腔内へ直接注入することにより、８日程度の短い期間でほぼ全ての個体を死滅させることが可能であることも示された。この結果は、上記ＮＰＶクローンの殺虫能力の比較１において、経口感染で致死に至らなかった個体は、感染を免れていたためであったと考えられる。
【００３８】
＜ＮＰＶクローンミックスの殺虫能力＞
Ａ−１及びＣ−３のＮＰＶクローン、又はＡ−９及びＣ−３のＮＰＶクローンを同濃度となるように混合したＮＰＶクローンミックスを作製した後、５×１０６個包埋体／ｍｌの濃度に調整した。また、Ａ−１、Ａ−９又はＣ−３のＮＰＶクローンをそれぞれ５×１０６個包埋体／ｍｌの濃度に調整した。次に、これらＮＰＶクローンを、上記ドロップレットフィーディング法により累代飼育した３齢ハスモンヨトウ幼虫に経口接種して感染させた。感染後２４時間毎にハスモンヨトウの死亡個体数をカウントし、累積死亡率（％）を求め、図４に示した。また、同じ試験を図５に示される各クローンについて行った結果を図５に示した。
【００３９】
図４より、Ａ＋ＣタイプのＮＰＶクローンミックスの累積死亡率の経時変化は、Ａタイプ又はＢタイプのクローン単独に比べて、感染後早期に死亡する個体の割合が顕著に高くなった。また、Ｃタイプ単独を経口感染させた場合の累積死亡率は、感染後１４日経っても５０％程度であったが、前記Ａ＋ＣタイプのＮＰＶクローンミックスでは感染１０日前後でほぼ全個体が死亡していたことが示された。一方、図５ではいずれも２週間経過しても累積死亡率が５０％以下と低かったことが示された。従って、ＡタイプとＣタイプとからなるＮＰＶクローンミックスが害虫防除に著しく適していることが示された。
【００４０】
＜野外圃場模擬試験＞
野外圃場の大豆に対する各ＮＰＶクローンの殺虫特性は、ポット栽培された大豆葉を用いたバイオアッセイにより条件を単純化して予想確認できる。まず、図６及び図７に示される各ＮＰＶクローンを１０６、１０６．５、１０７又は１０７．２個包埋体／ｍｌの濃度となるように調整した。なお、図６及び図７の凡例中の括弧内に示される数値は、前記濃度の対数値を表している。次に、ガラス温室にて５０日間ポット栽培された大豆から葉を採取し、前記各ＮＰＶクローンの溶液（０．０３％の展着剤を含む）に浸漬させて風乾した。続いて、累代飼育した３齢又は４齢ハスモンヨトウ幼虫に前記大豆葉を３日間摂食させた後、清浄な人工飼料インセクタＬＦ（日本農産工業社製）を与えて、プラスチックカップ内にて個別飼育した。飼育（感染）開始後からハスモンヨトウの死亡個体数をカウントし、累積死亡率（％）を求めた。３齢ハスモンヨトウ幼虫とともに飼育した結果を図６に示し、４齢ハスモンヨトウ幼虫とともに飼育した結果を図７に示す。また、前記個別飼育開始から６日目の累積死亡率を棒グラフにまとめたものを図８に示す。
【００４１】
その結果、ＮＰＶクローン１０７．２個包埋体／ｍｌ以下の濃度において、最終的な累積死亡率に関してはＣタイプよりもＡタイプの方が高いが、致死に至るまでの時間ではＡタイプよりもＣタイプの方が早いことが分かる。特に、ＣタイプのＮＰＶは、４齢ハスモンヨトウ幼虫を感染致死させる能力がＡタイプと比べて顕著に高く、４齢の幼虫に対しても有効な害虫防除資材として利用できることが示された。従って、全ての個体に感染が成立する条件又は同じ致死率を引き起こす濃度では、Ａタイプに比べＣタイプによる致死時間の減少が見込まれる。さらに、その効果は３齢に比べ４齢でより顕著に高められ、食害の高くなる４齢以降での有効性が確かめられた。
【００４２】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・  前記ハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは単一クローンからなることを特徴とする請求項３に記載の包埋体。前記ウイルス成分は単一クローンからなることを特徴とする請求項５に記載の害虫防除資材。前記ウイルス成分は、第１のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスの単一クローンと、第２のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスの単一クローンとからなることを特徴とする請求項６に記載の害虫防除資材。
【００４３】
・  前記ハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、インビトロクローニング法によりクローニングされたものであることを特徴とする請求項３に記載の包埋体。前記ハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、インビトロクローニング法によりクローニングされたものであることを特徴とする請求項５に記載の害虫防除資材。前記第１のタイプのハスモンヨトウ核多角体病ウイルスは、インビトロクローニング法によりクローニングされたものであることを特徴とする請求項６に記載の害虫防除資材。
【００４４】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１に記載の発明のハスモンヨトウ核多角体病ウイルスによれば、感染成立後のハスモンヨトウ幼虫に対する高い感染拡大能力を容易に発揮することができる。
【００４５】
請求項２に記載の発明の包埋体によれば、感染成立後のハスモンヨトウ幼虫に対する高い感染拡大能力を容易に発揮することができる。請求項３に記載の発明の包埋体によれば、ハスモンヨトウに対し極めて効果的に生物的防除を行うことができる害虫防除資材を容易に提供することができる。
【００４６】
請求項４に記載の発明の害虫防除資材によれば、感染成立後のハスモンヨトウ幼虫に対する高い感染拡大能力を容易に発揮することができる。請求項５及び請求項６に記載の発明の害虫防除資材によれば、ハスモンヨトウに対し極めて効果的に生物的防除を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ切断した電気泳動パターンを示す。
【図２】実施例の増殖能力の比較１の試験結果を示すグラフ。
【図３】実施例の殺虫能力の比較２の試験結果を示すグラフ。
【図４】実施例のクローンミックスの殺虫能力の試験結果を示すグラフ。
【図５】実施例のクローンミックスの殺虫能力の試験結果を示すグラフ。
【図６】実施例の３齢幼虫に対する野外圃場模擬試験結果を示すグラフ。
【図７】実施例の４齢幼虫に対する野外圃場模擬試験結果を示すグラフ。
【図８】実施例の野外圃場模擬試験における６日目の累積死亡率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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