(57)【要約】【課題】短時間、かつ、簡単な操作で、ペプチドあるいはタンパク質にリン酸が結合しているか否かを判別するペプチドあるいはタンパク質の分析方法を提供すること。【解決手段】ペプチドあるいはタンパク質の赤外領域のスペクトルを測定し、１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］の領域におけるスペクトル形状あるいはピーク位置からペプチドあるいはタンパク質にリン酸が結合しているか否かを判別する。また、リン酸が結合したペプチドあるいはタンパク質のアミノ酸の種類を特定する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドあるいはタンパク質に結合するリン酸の分析方法であって、分光光度計で測定することにより得られるスペクトル形状あるいはピーク位置からペプチドあるいはタンパク質にリン酸が結合しているか否かを判別するペプチドあるいはタンパク質の分析方法。
【請求項２】
該分光光度計で測定する領域が赤外領域であることを特徴とする請求項１記載のペプチドあるいはタンパク質の分析方法。
【請求項３】
該スペクトル形状あるいはピーク位置が１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］の赤外領域であることを特徴とする請求項１記載のペプチドあるいはタンパク質の分析方法。
【請求項４】
該スペクトル形状あるいはピーク位置を測定する手段がフーリエ変換赤外分光光度計であることを特徴とする請求項１記載のペプチドあるいはタンパク質の分析方法。
【請求項５】
リン酸が結合したペプチドあるいはタンパク質のアミノ酸の種類に応じたスペクトル形状あるいはピーク位置からアミノ酸の種類を特定することを特徴とする請求項１記載のペプチドあるいはタンパク質の分析方法。
【請求項６】
リン酸が結合したペプチドあるいはタンパク質のアミノ酸がスレオニン、セリン、チロシンのいずれがリン酸化されているか特定できることを特徴とする請求項５記載のペプチドあるいはタンパク質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチドあるいはタンパク質の分析方法に関し、特にペプチドあるいはタンパク質にリン酸が結合しているか否かの判別方法とリン酸が結合しているアミノ酸の種類の特定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子（ＤＮＡ）情報に基づいて翻訳され生成するタンパク質は、翻訳終了後様々な生理的条件下で修飾（翻訳後修飾、Ｐｏｓｔ  ｔｒａｎｓｒａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を受けることで、その活性や機能が調節されている。現在までに最もよく知られているタンパク質の翻訳後修飾として、リン酸化（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）及び脱リン酸化（Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）が挙げられ、タンパク質の活性・不活性をコントロールする重要な反応であると考えられている。
【０００３】
リン酸化は、タンパク質の主要な翻訳後修飾（メチル化、アセチル化、グリコシル化等１００種類以上）の１つであり、真核細胞においては細胞内タンパク質の多くがリン酸化されている。タンパク質のリン酸化は瞬時かつ可逆的に起こり、主要な細胞内活性制御様式として、シグナル情報伝達の基本的な過程の１つとなっている。ここでいうリン酸化とはペプチドあるいはタンパク質を構成するアミノ酸において、特定のアミノ酸の残基にリン酸が結合することをいい、脱リン酸化はリン酸が結合したアミノ酸からリン酸が切断されることをいう。
【０００４】
リン酸化酵素（プロテインキナーゼ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）または脱リン酸化酵素（プロテインホスファターゼ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）は、細胞外部からの刺激を細胞内部に伝達し、これらの刺激に対する細胞の応答に関与し、代謝、増殖、分化、伝達、運動等多彩な細胞機能の調節を担っている。すなわち、リン酸化酵素または脱リン酸化酵素が細胞内シグナル情報伝達や細胞周期での中心的調節因子である一方で、様々なストレスや疾患でリン酸化の状態が変動することも知られており、リン酸化によるタンパク質の活性の異常が多くの慢性疾患や発癌に関与していると考えられている。したがって、リン酸化・脱リン酸化機構の解明が、生理的な調節機構の解明や新規創薬、疾患病態の分析にとって重要であることは疑いない。
【０００５】
これらの酵素はタンパク質にリン酸基を結合あるいは切断する働きがある。すなわち、リン酸化酵素ではタンパク質の特定の部位のアミノ酸に作用し、そのアミノ酸の残基にリン酸を結合することで、その機能を変える働きをしている。一方、脱リン酸化酵素はタンパク質の特定の部位でリン酸が結合したアミノ酸を標的にし、アミノ酸とリン酸の結合を切断し、当該アミノ酸本来の残基の状態にすることで、その機能を変える働きをしている。
【０００６】
リン酸化酵素によるタンパク質のリン酸化は、特定のアミノ酸に選択的に発生する。すなわち、タンパク質の合成に関与する２０のアミノ酸のなかで、スレオニン（Ｔ：Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、セリン（Ｓ：Ｓｅｒｉｎｅ）及びチロシン（Ｙ：Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）の３種類のアミノ酸の残基にリン酸が結合することで発生する。
【０００７】
タンパク質がリン酸化あるいは脱リン酸化反応を受けると、タンパク質を構成するアミノ酸残基の局所的な極性が変化し、その結果としてタンパク質の高次構造、機能及び活性度に変化が生じることになる。
【０００８】
例えば、中枢神経系の細胞内Ｃａ２＋シグナルの主要な担い手の一つであるＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（リン酸化酵素）では、自己のスレオニン残基がリン酸化されることによりＣａ２＋／カルモジュリン非依存性の活性化おこり、他の基質タンパク質をリン酸化することできるようになる。従って、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼがリン酸化しているか否かを判別することは中枢神経系活性化状態をモニターする場合は重要な指標となる。
【０００９】
こうしたことからリン酸化の有無を判別する方法が従来から種々開発されてきた。例えば、特許文献１では、質量分析装置を用いてペプチドのリン酸化の検出を行う技術が開示されている。また、特許文献２では、二次元電気泳動法によりリン酸化タンパク質の同定を行う技術が開示されている。さらには、非特許文献１では、リン酸化アミノ酸に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによりリン酸化タンパク質の検出技術が開示されている。一方、非特許文献２では、ペプチドあるいはタンパク質の分析方法として、紫外領域の波長（例えば２８０ｎｍ）の吸収を分光光度計で測定することにより、ペプチドあるいはタンパク質の定量を行う技術が開示されている。
【００１０】
【特許文献１】
特開２００２−２６７６７４号公報
【００１１】
【特許文献２】
特開２００２−３０６１９８号公報
【００１２】
【非特許文献１】
山肩葉子、「神経活動とＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ」、蛋白質核酸酵素、２００２年、第４７巻、第１号、ｐ５１−５７
【００１３】
【非特許文献２】
生化学実験講座１タンパク質の化学ＩＩ「２．タンパク質の定量」、東京化学同人、１９８１年、ｐ２３−２８
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記特許文献１中にはペプチドにリン酸が含まれていることを質量分析装置で検出する際、前処理としてフルオロ酢酸のような強酸と８時間〜２４時間反応させることが必要である。また、フルオロ酢酸のような強酸は人体に接触すれば生体組織が腐食するという物質であるため、取り扱いに注意を要する。加えて質量分析装置は高価な上、選任のオペレーターにより取り扱われているのが現実である。そのため、１サンプル測定に要する時間が長く、大量に処理できなく、選任のオペレーターをつけることのできない施設では実施不可能であるという問題が生じていた。
【００１５】
また、特許文献２に開示された技術では、目的のサンプルがリン酸化しているかを検出するためには、脱リン酸化酵素によりサンプルを脱リン酸化する必要が有る。その後、二次元電気泳動を脱リン酸化酵素反応前後のサンプルについて実施し、脱リン酸化酵素の反応前後で目的のサンプルが異なった位置に電気泳動されるかどうか比較することが必要である。二次元電気泳動はサンプルの状態及び電気泳動の微妙な条件の変動でタンパク質の電気泳動パターンが変化するため、サンプルの濃度やｐＨなどの状態を合わせることのほか、電気泳動のｐＨ、電圧・電流及び緩衝液のｐＨを常に同条件で実施することを要求され、操作に熟練を要すること、１回の二次元電気泳動に多数のサンプルを流すことができないという問題が生じていた。
【００１６】
さらには、非特許文献１に開示されている方法は、目的のタンパク質を含むサンプルをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いタンパク質の分子量ごとにゲル上で分離する。ついで、この分離したゲルを荷電法によりニトロセルロース等のメンブレンに転写し、その後転写したメンブレン上で抗原抗体反応を展開する手法である。この方法ではリン酸化アミノ酸に反応する抗体の特異性及び感度がポイントとなる。この点に関しては、一部のリン酸化アミノ酸に特異的な抗体はすでに市販化されているものの、複数のアミノ酸がリン酸化されているようなタンパク質の場合、目的のアミノ酸がリン酸化されているかを検出するには、当該アミノ酸がリン酸化された場合のみに特異的に反応する抗体が必要となり、生体内に存在する多数のタンパク質を検出するにはその分だけ、特異的な抗体を取り揃えなければならないという問題点が生じる。また、この方法も一度に検出できるサンプル数が限定されるため、多数のサンプルを処理できないという問題点も生じていた。
【００１７】
加えて、上述の従来技術に基づく検出方法では、スレオニン、セリンあるいはチロシンというリン酸化される可能性のあるアミノ酸の中でどのアミノ酸がリン酸化されているのかについて、測定結果から判別できないという共通の問題点を生じていた。
【００１８】
また、非特許文献２に開示されている方法は、ペプチドあるいはタンパク質を構成するアミノ酸であるトリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンの最大吸収が紫外領域（２８０ｎｍ近傍）にある点に着目した方法である。この方法では、ペプチドあるいはタンパク質に含まれる上記アミノ酸の量により値が変動するため、正確な定量とはいえないが、簡単、かつ、迅速な定量法として普及している。しかし、分光光度計を利用したペプチドあるいはタンパク質の分析方法は、上記定量法のように紫外領域で利用されているにすぎなかった。さらには、上記定量法のように分光光度計による測定は、簡便法との位置づけであり、リン酸がペプチドあるいはタンパク質に結合しているか否かを判別するような感度と正確さを要求される分析では検討することさえ行われなかった。
【００１９】
以上のことからペプチドあるいはタンパク質のリン酸化に関しては、熟練した一部の研究者が個々の研究テーマで必要が生じた場合のみ上述した種々の方法を用いて行われていたに過ぎなかった。そのため病気の診断・治療にリン酸化の検出は有用な情報であるものの、その情報の蓄積がままならず、進まなかったのが現状だった。
【００２０】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、短時間、かつ、簡単な操作で、ペプチドあるいはタンパク質にリン酸が結合しているか否かを判別するペプチドあるいはタンパク質の分析方法を提供することを課題としている。
【００２１】
また、本発明は、ペプチドあるいはタンパク質のアミノ酸の種類を特定することを判別するペプチドあるいはタンパク質の分析方法を提供することを課題としている。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者達は、鋭意研究を重ねた結果、ペプチドあるいはタンパク質のスペクトルを測定することにより、ペプチドあるいはタンパク質に結合するリン酸の有無の判別が可能になることを見いだした。
【００２３】
また、ペプチドあるいはタンパク質のスペクトルを測定する領域は赤外領域であり、赤外領域のスペクトルはフーリエ変換赤外分光光度計を用いて測定することが好適であることを見いだした。さらには、該赤外領域の中でも１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］の領域におけるスペクトル形状やピーク位置がペプチドあるいはタンパク質にリン酸が結合しているか否かを判別するのにより好適であることを見いだした。
【００２４】
すなわち、本発明によれば、ペプチドあるいはタンパク質に結合するリン酸の分析方法であって、分光光度計で測定することにより得られるスペクトル形状あるいはピーク位置からペプチドあるいはタンパク質にリン酸が結合しているか否かを判別するペプチドあるいはタンパク質の分析方法が提供される。
【００２５】
ここで、本発明に係わる分光光度計は、透過光による透過光スペクトル測定あるいは任意の波長を照射することにより得られる吸収光スペクトル測定ができる装置をいう。また、本発明に係わるスペクトルの形状とは、測定領域における透過光あるいは吸収光の値を曲線で表したものであって、山、谷、肩等のようなピークの形状やピーク幅の広がり、他のピークとの比較による相対的なピークの高さ、複数のピークからなるものを総称したものをいう。また、ピーク位置とは、一つの山あるいは谷からなるスペクトル形状において、最も高い位置あるいは最も低い位置をいう。本発明の、スペクトル形状あるいはピーク位置とは、どちらか一方を二者択一して判別することも、両方を勘案して総合的に判別することも可能であることをいう。
【００２６】
また、本発明によれば、リン酸が結合したペプチドあるいはタンパク質のアミノ酸の種類に応じたスペクトル形状あるいはピーク位置からアミノ酸の種類を特定することを特徴とするペプチドあるいはタンパク質の分析方法が提供される。
【００２７】
ここでいう、アミノ酸の種類を特定することとは、ペプチドあるいはタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸の中で、どのアミノ酸がリン酸化されたのかを判別することをいい、特にリン酸化される可能性があるアミノ酸のスレオニン、セリンあるいはチロシンのすべてがリン酸化されているのか、いずれかがリン酸化されているのかを特定することをいう。
【００２８】
このように本発明を用いることにより、目的のペプチドあるいはタンパク質がリン酸化されているか否かが、煩雑で熟練を要する操作を経ずに判別できるため、病気の診断・治療につながる知見の蓄積を大いに期待できる。すなわち、従来からタンパク質の翻訳後修飾に関する基礎の研究者に加え、種々の病気の診断・発症メカニズムの研究者も利用されるとともに、新規治療薬のスクリーニングと関連するタンパク質を網羅的に解析するプロテオーム解析や、一度に大量のサンプルをスクリーニングするハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）解析にも有用な技術となる。その結果、新しい診断法や新薬開発へのつながりが期待される。
【００２９】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施の形態について説明する。ペプチドあるいはタンパク質がリン酸化されているか否かを判別するために分光光度計で測定する波長の領域は、アミノ酸にリン酸が結合することによりスペクトル形状が変動する領域及び変動しない領域両方を測定できる８００乃至２，０００［ｃｍ−１］の領域を測定することが好ましい。
【００３０】
本発明では、上記８００乃至２，０００［ｃｍ−１］の領域のスペクトルを測定するが、アミノ酸にリン酸が結合することによりスペクトル形状が変動する領域である１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］のスペクトル形状あるいはピーク位置から判別するのが好ましい。より好ましくは１，０１５乃至１，０８５［ｃｍ−１］の領域であり、さらにより好ましくは１，０２５乃至１，０７５［ｃｍ−１］の領域である。
【００３１】
また、本発明は、上記赤外領域を含んだ領域のスペクトルを測定するが、測定装置は上記赤外領域を測定できるものであれば限定されない。好ましくは赤外分光光度計である。より好ましくは、フーリエ変換赤外分光光度計である。さらにより好ましくは、顕微鏡が付設された顕微フーリエ変換赤外分光光度計である。顕微フーリエ変換赤外分光光度計は赤外光用レンズを用いて赤外光を絞り込むことで微小領域（空間分解能１０μｍΦ）の赤外測定が行えることから、微量サンプルで測定可能である。
【００３２】
本発明は、リン酸が結合しているアミノ酸の種類も判別することができる。特にリン酸と結合できるスレオニン、セリン及びチロシンという３種のアミノ酸がリン酸と結合しているか否かを判別することができるスペクトルの領域は１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］である。この領域でスレオニン、セリン及びチロシンがリン酸化している場合には、それぞれのアミノ酸特有のスペクトル形状が生じ、このスペクトル形状を比較分析することでリン酸化されたアミノ酸の種別まで判別可能となる。
【００３３】
本発明に係るペプチドあるいはタンパク質に結合するリン酸の分析方法で見出されるリン酸が結合したアミノ酸に由来する赤外吸収スペクトルピークは、主に１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］で観測されるＯ＝Ｐ−Ｏ−伸縮振動と、１，０３０［ｃｍ−１］付近に幅狭く観測されるＰ−ＯＨ変角振動によるものと考えられる。両振動がアミノ酸の種類により差が生じ、どのアミノ酸がリン酸化されたのかを判別できるようになったと考えられる。
【００３４】
【実施例】
以下に具体例を挙げて説明するが、本発明のペプチドあるいはタンパク質に結合するリン酸の分析方法により判別可能なペプチド及びタンパク質の種類は具体例に限定されない。
【００３５】
測定するサンプルは、ペプチドであれば数個のアミノ酸からなるオリゴペプチドから数十以上のアミノ酸からなるポリペプチドであっても構わない。またアミノ酸が数百結合したタンパク質であっても構わない。例えば、８個のアミノ酸が結合したオリゴペプチドであっても、約６００個のアミノ酸が結合したタンパク質でも本発明によりリン酸化されているか否かの分析が可能である。
【００３６】
測定するサンプルの量は、多いほど好ましいが。例えば、１．２μｇ以上が好ましい。さらに好ましくは２．４μｇ以上であり、より好ましくは６μｇ以上である。もっとも好ましくは１２μｇ以上である。
【００３７】
測定するサンプルは緩衝液で溶解して用いるが、緩衝液は酢酸緩衝液のように分子量が小さいものが好ましい。リン酸緩衝液、グリシン緩衝液のように測定するサンプルに含有されている成分からなる緩衝液を用いなければ、酢酸緩衝液に限定されず、使用できる。
【００３８】
本発明では、溶解したサンプルは赤外分光光度計で検出可能なように透過板に塗布される。塗布板は赤外分光光度計で一般的に使用されているのであれば良い。例えば、材質がフッ化バリウム（ＢａＦ２）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、ダイヤモンドなどの赤外透過性光学結晶板が使用できる。サンプルの塗布は１回でもかまわないし、何回でも重ねて塗布しても構わない。重ねて塗布する場合は、１回の塗布の後サンプルが乾燥を確認した上で行うのが好ましい。
【００３９】
赤外吸収スペクトルを測定する場合は、稀少な試料の場合は、量を少なくするため、赤外透過面積が小さく、かつ、円や正方形のような均一な形状でサンプルに照射され測定する方が好ましい。例えば、１００μｍ  Ｘ  １００μｍの正方形で透過して測定する方法である。
【００４０】
［実施例１］
サンプルは、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼの自己リン酸化部位を含む配列を合成した。すなわち、９ｍｅｒのペプチド（Ｃ０２０５９Ｂ、配列番号２：Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ）の６番目のスレオニン残基にリン酸基が導入されたものを用い、合成した。比較対照用としてスレオニン残基にリン酸基が導入されていない非リン酸化ペプチド（Ｃ０２０５９Ａ、配列番号１：Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ）を用いた。なお、ペプチドはペプチド合成機を用いて合成し、リン酸化ペプチドはペプチド合成後に質量分析計（マススペクトル）でリン酸基が導入されていることを確認した。
【００４１】
逆浸透圧ろ過を施した超純水５ｍｌとメタノール５ｍｌと酢酸１０μｌとを加えて調製した酢酸緩衝液５００μｌに、サンプル１ｍｇを溶解することによりサンプル調製を行った。
【００４２】
調製したサンプルは、直径１３ｍｍ、厚さ１ｍｍの材質がフッ化バリウム（ＢａＦ２）の赤外透過性光学結晶板（Ｓ．Ｔ．ＪＡＰＡＮ  ＩＮＣ）に２μｌずつ３回、すなわち、１点に合計６μｌ分を塗布した。塗布は、一回の塗布後、そのサンプルが乾燥するまで放置し、乾燥後次の塗布を行った。
【００４３】
顕微フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ−ＩＲ、ＨＯＲＩＢＡ製  ＦＴ−５２０）により塗布したサンプルの赤外吸収スペクトルを測定した。ＦＴ−ＩＲは赤外透過面積が１００μｍ  Ｘ  １００μｍの正方形で、透過法により測定を行った。測定結果を図１に示す。
【００４４】
図１に示すように、スレオニンがリン酸化されているサンプルＣ０２０５９Ｂには、１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］領域にピークをもつスペクトルが得られた。一方、スレオニンがリン酸化されていないサンプルＣ０２０５９Ａにおいては、１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］領域にピークを持たないスペクトルが得られ、両者は明確に判別できた。
【００４５】
［実施例２］
Ｃ０２０５９Ｂ（配列番号２）のペプチドをサンプルとして、サンプルの濃度を変えて、顕微ＦＴ−ＩＲ法による測定限界の検証を行った。実施例１でのサンプル濃度をコントロール（１００％）として、酢酸緩衝液で２倍希釈、５倍希釈、１０倍希釈及び１００倍希釈したものを調製し、実施例１と同一の条件で測定を行った。測定結果を図２に示す。
【００４６】
図２に示すように、少なくともサンプル量がコントロールに対し１／１０量存在すれば１．２μｇ以上（１０倍希釈）のサンプルが存在すれば、リン酸化アミノ酸を検出することが可能であることが判明した。
【００４７】
［実施例３］
スレオニン残基リン酸化ペプチドであるＣ０２０５９Ｂ（配列番号２）と、スレオニンの代わりにセリンを導入し、セリンにリン酸基を導入したリン酸化ペプチドであるＣ０２０１４Ｂ（配列番号４：Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ）及びスレオニンの代わりにチロシンを導入し、チロシンにリン酸基を導入したリン酸化ペプチドであるＣ０２０１４Ｄ（配列番号６：Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ）をサンプルとして、実施例１の条件にて顕微ＦＴ−ＩＲの測定を行った。また、比較対照にセリン導入非リン酸化ペプチド（Ｃ０２０１４Ａ、配列番号３：Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ）及びチロシン導入非リン酸化ペプチド（Ｃ０２０１４Ｃ、配列番号５：Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ）を用いた。Ｃ０２０１４Ｂ（配列番号４）及びＣ０２０１４Ａ（配列番号３）についての測定結果を図３、Ｃ０２０１４Ｄ（配列番号６）及びＣ０２０１４Ｃ（配列番号５）についての測定結果を図４に示す。
【００４８】
Ｃ０２０５９Ｂ（配列番号２）、Ｃ０２０１４Ｂ（配列番号４）及びＣ０２０１４Ｄ（配列番号６）の３ペプチドのアミノ酸配列はリン酸化アミノ酸のみ異なっており、他のアミノ酸の種類及び配列は同じである。したがって、この３ペプチドの間で、顕微ＦＴ−ＩＲの測定結果が異なれば、その差がリン酸化されたアミノ酸の違いであると推定できる。
【００４９】
図１、３、４を比較検討したところ、リン酸化ペプチドはいずれも１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］でリン酸化特有のピークを観測したが、スレオニン（図１）、セリン（図３）及びチロシン（図４）に示すように当該領域のスペクトル形状がそれぞれ異なっており、スペクトル形状を比較することで、どのアミノ酸がリン酸化されているかまで判別できることがわかった。また比較対照のリン酸化されていないアミノ酸を測定した結果、スレオニン、セリン、チロシンといずれのアミノ酸の場合でも１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］の領域にピークをもつスペクトルは得られなかった（図１、３、４）。
【００５０】
［実施例４］
タンパク質として牛血清アルブミン（シグマ・アルドリッチ製）を用いて測定した。タンパク質も実施例１の条件で顕微ＦＴ−ＩＲ測定したが、図５に示すように１，０００乃至１，１００［ｃｍ−１］の領域ではスペクトルにピークが得られないため、この領域に注目すればタンパク質においてもリン酸化の有無を検出可能であることがわかった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明は、ペプチドあるいはタンパク質のアミノ酸がリン酸化されているか否かを判別できる新規でかつ簡便な方法である。また、どのアミノ酸がリン酸化されているかをも判別できる。その結果、煩雑で熟練を要する操作を経ずに、プロテオーム解析や、ハイスループットスクリーニング解析で利用可能となり、病気の診断・治療に有用な情報が蓄積され、その情報をもとに新しい診断法や新薬開発が期待される。
【００５２】
【配列表】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法で測定した結果であって、スレオニンがリン酸化されたペプチド（Ｃ０２０５９Ｂ、配列番号２）と非リン酸化ペプチド（Ｃ０２０５９Ａ、配列番号１）の赤外吸収スペクトル図である。
【図２】本発明の方法で測定した結果であって、スレオニンがリン酸化されたペプチド（Ｃ０２０５９Ｂ、配列番号２）の濃度を変化させたときの各濃度での赤外吸収スペクトル図である。
【図３】本発明の方法で測定した結果であって、セリンがリン酸化されたペプチド（Ｃ０２０１４Ｂ、配列番号４）と、導入したセリンが非リン酸化ペプチド（Ｃ０２０１４Ａ、配列番号３）の赤外吸収スペクトル図である。
【図４】本発明の方法で測定した結果であって、チロシンがリン酸化されたペプチド（Ｃ０２０１４Ｄ、配列番号６）と、導入したチロシンが非リン酸化ペプチド（Ｃ０２０１４Ｃ、配列番号５）の赤外吸収スペクトル図である。
【図５】本発明の方法で測定した結果であって、非リン酸化牛血清アルブミンの赤外吸収スペクトル図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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