(57)【要約】【課題】新規蛋白質及びその製造方法【解決手段】破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質及びその製造法。この蛋白質は、ヒト胎児肺線維芽細胞より産生され、還元条件下約６０ＫＤ、非還元条件下約１２０ＫＤ　の分子量をもつ。この蛋白質は該細胞の培養液から単離精製することができる。また、遺伝子工学的に製造することができる。本発明では、遺伝子工学的に製造するためのｃＤＮＡ、あるいはこの蛋白質と特異的親和性を示す抗体、この抗体を用いる蛋白質の測定方法も含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号６の塩基配列で示されるｃＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
配列表配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡが発現されることにより得られる、破骨細分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質。
【請求項３】
配列表配列番号８３の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項４】
配列表配列番号８３の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項５】
配列表配列番号６２で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項６】
配列表配列番号８４の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項７】
配列表配列番号８４の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項８】
配列表配列番号６３で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項９】
配列表配列番号８５の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１０】
配列表配列番号８５の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項１１】
配列表配列番号６４で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項１２】
請配列表配列番号８６の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１３】
配列表配列番号８６の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項１４】
配列表配列番号６５で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項１５】
配列表配列番号８７の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１６】
配列表配列番号８７の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項１７】
配列表配列番号６６で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項１８】
配列表配列番号８８の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１９】
配列表配列番号８８の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項２０】
配列表配列番号６７で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項２１】
配列表配列番号８９の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項２２】
配列表配列番号８９の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項２３】
配列表配列番号６８で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項２４】
配列表配列番号９０の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項２５】
配列表配列番号９０の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項２６】
配列表配列番号６９で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項２７】
配列表配列番号９１の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項２８】
配列表配列番号９１の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項２９】
配列表配列番号７０で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項３０】
配列表配列番号９２の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項３１】
配列表配列番号９２の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項３２】
配列表配列番号７１で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項３３】
配列表配列番号９３の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項３４】
配列表配列番号９３の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項３５】
配列表配列番号７２で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項３６】
配列表配列番号９４の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項３７】
配列表配列番号９４の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項３８】
配列表配列番号７３で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項３９】
配列表配列番号９５の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項４０】
配列表配列番号９５の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項４１】
配列表配列番号７４で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項４２】
配列表配列番号９６の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項４３】
配列表配列番号９６の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項４４】
配列表配列番号７５で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項４５】
配列表配列番号９７の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項４６】
配列表配列番号９７の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項４７】
配列表配列番号７６で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項４８】
配列表配列番号９８の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項４９】
配列表配列番号９８の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項５０】
配列番号７７で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項５１】
配列表配列番号９９の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項５２】
配列表配列番号９９の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項５３】
配列表配列番号７８で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項５４】
配列表配列番号１００の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項５５】
配列表配列番号１００の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項５６】
配列表配列番号７９で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項５７】
配列表配列番号１０１の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項５８】
配列表配列番号１０１の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項５９】
配列表配列番号８０で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項６０】
配列表配列番号１０２の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項６１】
配列表配列番号１０２の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項６２】
配列表配列番号８１で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項６３】
配列表配列番号１０３の塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項６４】
配列表配列番号１０３の塩基配列で示されるｃＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質。
【請求項６５】
配列表配列番号８２で示されるアミノ酸配列をコードする
ｃＤＮＡ。
【請求項６６】
配列表配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項６７】
下記（１）乃至（４）のいずれか一つのｃＤＮＡが挿入されたベクター：
（１）　配列表配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ；
（２）　配列表配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ；
（３）　配列表配列番号６の塩基配列で示されるｃＤＮＡ；
（４）　形質転換大腸菌ｐＢＫ／０１Ｆ１０（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５２６７）が保有するベクターに挿入されたｃＤＮＡ。
【請求項６８】
形質転換大腸菌ｐＢＫ／０１Ｆ１０（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５２６７）が保有する、請求項６７記載のベクター。
【請求項６９】
請求項６７又は６８に記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項７０】
下記の工程（Ｉ）および（ＩＩ）を含むことからなる、次の理化学的性質（ａ）〜（ｄ）をもち、破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質の製造方法。
（ａ）　分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）；約６０ｋＤ（還元条件下）、約６０ｋＤ及び約１２０ｋＤ（非還元条件下）。
（ｂ）　親和性；　陽イオン交換体及びヘパリン親和性を有する。
（ｃ）　　熱安定性；　７０℃、１０分間又は５６℃、３０分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が低下し、９０℃、１０分間の過熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われる。
（ｄ）　アミノ酸配列；内部アミノ酸配列として配列表配列番号１〜３のアミノ酸配列をもつ。
（Ｉ）　請求項６９に記載の宿主細胞を培養する工程；
（ＩＩ）該培養液から、上記の理化学的性質（ａ）〜（ｄ）をもち、破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質を回収する工程。
【請求項７１】
請求項７０記載の方法により得られる次の理化学的性質（ａ）〜（ｄ）をもち、破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質。
（ａ）　分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）；約６０ｋＤ（還元条件下）、約６０ｋＤ及び約１２０ｋＤ（非還元条件下）。
（ｂ）　親和性；　陽イオン交換体及びヘパリン親和性を有する。
（ｃ）　　熱安定性；　７０℃、１０分間又は５６℃、３０分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が低下し、９０℃、１０分間の過熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われる。
（ｄ）　アミノ酸配列；内部アミノ酸配列として配列表配列番号１〜３のアミノ酸配列をもつ。
【請求項７２】
配列表配列番号９のアミノ酸番号第１番〜第３７３番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項７３】
配列表配列番号８の塩基番号第６４番〜１１８５番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項７４】
配列表配列番号１１のアミノ酸番号第１番〜第３４１番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項７５】
配列表配列番号１０の塩基番号第６４番〜１０８９番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項７６】
配列表配列番号１３のアミノ酸番号第１番〜第１３３番からなるアミノ酸で示される蛋白質。
【請求項７７】
配列表配列番号１２の塩基番号第６４番〜４６５番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項７８】
配列表配列番号１５のアミノ酸番号第１番〜第１２４番からなるアミノ酸で示される蛋白質。
【請求項７９】
配列表配列番号１４の塩基番号第６４番〜４３８番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項８０】
配列表配列番号６２のアミノ酸番号第１番〜第３８０番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項８１】
配列表配列番号８３の塩基番号第６４番〜１２０６番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項８２】
配列表配列番号６３のアミノ酸番号第１番〜第３８０番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項８３】
配列表配列番号８４の塩基番号第６４番〜１２０６番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項８４】
配列表配列番号６４のアミノ酸番号第１番〜第３８０番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項８５】
配列表配列番号８５の塩基番号第６４番〜１２０６番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項８６】
配列表配列番号６５のアミノ酸番号第１番〜第３８０番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項８７】
配列表配列番号８６の塩基番号第６４番〜１２０６番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項８８】
配列表配列番号６６のアミノ酸番号第１番〜第３８０番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項８９】
配列表配列番号８７の塩基番号第６４番〜１２０６番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項９０】
配列表配列番号６７のアミノ酸番号第１番〜第３３９番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項９１】
配列表配列番号８８の塩基番号第６４番〜１０８３番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項９２】
配列表配列番号６８のアミノ酸番号第１番〜第３３８番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項９３】
配列表配列番号８９の塩基番号第６４番〜１０８０番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項９４】
配列表配列番号６９のアミノ酸番号第１番〜第３４２番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項９５】
配列表配列番号９０の塩基番号第６４番〜１０９２番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項９６】
配列表配列番号７０のアミノ酸番号第１番〜第３３８番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項９７】
配列表配列番号９１の塩基番号第６４番〜１０８０番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項９８】
配列表配列番号７１のアミノ酸番号第１番〜第３０５番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項９９】
配列表配列番号９２の塩基番号第６４番〜９８１番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１００】
配列表配列番号７２のアミノ酸番号第１番〜第３０６番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１０１】
配列表配列番号９３の塩基番号第６４番〜９８４番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１０２】
配列表配列番号７３のアミノ酸番号第１番〜第３７８番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１０３】
配列表配列番号９４の塩基番号第６４番〜１２００番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１０４】
配列表配列番号７４のアミノ酸番号第１番〜第３３０番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１０５】
配列表配列番号９５の塩基番号第６４番〜１０５６番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１０６】
配列表配列番号７５のアミノ酸番号第１番〜第２５１番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１０７】
配列表配列番号９６の塩基番号第６４番〜８１９番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１０８】
配列表配列番号７６のアミノ酸番号第１番〜第１７６番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１０９】
配列表配列番号９７の塩基番号第６４番〜５９４番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１１０】
配列表配列番号７７のアミノ酸番号第１番〜第１２２番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１１１】
配列表配列番号９８の塩基番号第６４番〜４３２番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１１２】
配列表配列番号７８のアミノ酸番号第１番〜第８５番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１１３】
配列表配列番号９９の塩基番号第６４番〜３２１番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１１４】
配列表配列番号７９のアミノ酸番号第１番〜第３７２番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１１５】
配列表配列番号１００の塩基番号第６４番〜１１８２番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１１６】
配列表配列番号８０のアミノ酸番号第１番〜第３００番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１１７】
配列表配列番号１０１の塩基番号第６４番〜９６６番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１１８】
配列表配列番号８１のアミノ酸番号第１番〜第１６６番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１１９】
配列表配列番号１０２の塩基番号第６４番〜５６４番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１２０】
配列表配列番号８２のアミノ酸番号第１番〜第６３番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１２１】
配列表配列番号１０３の塩基番号第６４番〜２５５番からなる塩基配列で示されるｃＤＮＡ。
【請求項１２２】
配列表配列番号４において一つ以上のアミノ酸が置換または欠失したアミノ酸配列からなる破骨細胞抑制因子変異体蛋白質。
【請求項１２３】
配列表の配列番号４又は５において第３８０番ロイシンより、１個以上２０４個以下から選択される整数個のアミノ酸が欠損してなるアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項１２４】
請求項２、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６６、７１、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２および１２３からなる群から選択される一つに記載の蛋白質を含有する骨粗鬆症の予防または治療剤。
【請求項１２５】
請求項２、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６６、７１、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２および１２３からなる群から選択される一つに記載の蛋白質を含有する骨量減少症の予防または治療剤。
【請求項１２６】
請求項２、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６６、７１、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２および１２３からなる群から選択される一つに記載の蛋白質を含有する骨代謝異常症の予防または治療剤。
【請求項１２７】
形質転換大腸菌ｐＢＫ／０１Ｆ１０（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５２６７）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、破骨細胞の分化及び／又は成熟を抑制する活性を示す新規な蛋白質、即ち破骨細胞形成抑制因子（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ；　ＯＣＩＦ）及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人の骨は絶えず吸収と再形成を繰り返しているが、この過程で中心的な働きをしている細胞が、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞である。これらの細胞が担当している、骨代謝の異常により発生する疾患の代表として、骨粗鬆症が挙げられる。この疾患は、骨芽細胞による骨形成を、破骨細胞による骨吸収が上回ることにより発生する疾患である。この疾患の発生メカニズムについては未だ完全には解明されていないが、この疾患は骨の疼痛を発生し、骨の脆弱化による骨折の原因となる疾患である。高齢人口の増加に伴い、骨折による寝たきり老人の発生の原因となるこの疾患は社会問題にもなっており、その治療薬の開発が急務となっている。このような骨代謝異常による骨量減少症は骨吸収の抑制、骨形成の促進、或いはこれらのバランスの改善により治療することが期待される。
【０００３】
骨形成は、骨形成を担当する細胞の増殖、分化、活性化を促進すること、或いは骨吸収を担当する細胞の増殖、分化、活性化を抑制することにより促進することが期待される。近年、このような活性を有する生理活性蛋白質（サイトカイン）への関心が高まり、精力的な研究が行われている。骨芽細胞の増殖或いは分化を促進するサイトカインとして、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　；　ＦＧＦ、非特許文献１）、インシュリン様増殖因子−Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ　ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−Ｉ　；ＩＧＦ−Ｉ、非特許文献２）、インシュリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ、非特許文献３）、アクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、非特許文献４）、トランスフォーミング増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−β、非特許文献５）、バスキュロトロピン（Ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｎ、非特許文献６）、及び異所骨形成因子ファミリー（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　；　ＢＭＰ　：　ＢＭＰ−２、非特許文献７，　ＯＰ−１、非特許文献８及び９）　等のサイトカインが報告されている。
【０００４】
一方、破骨細胞形成、即ち破骨細胞の分化及び／又は成熟を抑制するサイトカインとしては、トランスフォーミング増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−　β、非特許文献１０）やインターロイキン−４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４、非特許文献１１）　等が報告されている。又、破骨細胞による骨吸収を抑制するサイトカインとしては、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、非特許文献１２）、マクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；、非特許文献１３）、インターロイキン−４（非特許文献１４）、及びインターフェロン−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ、非特許文献１５）　等が報告されている。
【０００５】
これらのサイトカインは、その骨形成の促進や骨吸収の抑制作用による骨量減少症の改善剤となることが期待され、インシュリン様増殖因子−Ｉ　や異所骨形成因子ファミリーのサイトカイン等、上記のサイトカインの一部については骨代謝改善剤として臨床試験が実施されている。又、カルシトニンは、骨粗鬆症の治療薬、疼痛軽減薬として既に市販されている。
【０００６】
現在、骨に関わる疾患の治療及び治療期間の短縮を図る医薬品として、臨床では活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン製剤、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）又はカルシウム製剤等が使用されている。しかし、これらの薬剤を用いた治療法はその効果並びに治療結果において必ずしも満足できるものではなく、これらに代わる新しい治療薬の開発が望まれていた。前述したように、骨代謝は骨形成と骨吸収のバランスによって調節されており、破骨細胞の分化・成熟を抑制するサイトカインは、骨粗鬆症等の骨量減少症の治療薬となることが期待される。
【０００７】
【従来の技術】
【非特許文献１】Ｒｏｄａｎ　Ｓ．Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．　１２１，　ｐ１９１７，　１９８７
【非特許文献２】Ｈｏｃｋ　Ｊ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．　１２２，　ｐ２５４，　１９８８
【非特許文献３】ＭｃＣａｒｔｈｙ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．１２４，　ｐ３０１，　１９８９
【非特許文献４】Ｃｅｎｔｒｅｌｌａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　ｖｏｌ．　１１，　ｐ２５０，１９９１
【非特許文献５】Ｎｏｄａ　Ｍ．，　Ｔｈｅ　Ｂｏｎｅ，　ｖｏｌ．　２，　ｐ２９，　１９８８
【非特許文献６】Ｖａｒｏｎｉｑｕｅ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　ｖｏｌ．１９９，　ｐ３８０，１９９４
【非特許文献７】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　ｖｏｌ．　１１３，　ｐ６８２，　１９９１
【非特許文献８】Ｓａｍｐａｔｈ　Ｔ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　ｖｏｌ．　２６７，　ｐ２０５３２，　１９９２
【非特許文献９】Ｋｎｕｔｓｅｎ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　ｖｏｌ．１９４，　ｐ１３５２，　１９９３
【非特許文献１０】Ｃｈｅｎｕ　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　ｖｏｌ．８５，　ｐ５６８３，　１９８８
【非特許文献１１】Ｋａｓａｎｏ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｏｎｅ−Ｍｉｎｅｒ．，　ｖｏｌ．２１，　ｐ１７９，　１９９３
【非特許文献１２】Ｂｏｎｅ−Ｍｉｎｅｒ．，　ｖｏｌ．１７，　ｐ３４７，１９９２
【非特許文献１３】Ｈａｔｔｅｒｓｌｅｙ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｃｅｌｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　ｖｏｌ．１３７，　ｐ１９９，　１９８８
【非特許文献１４】Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　ｖｏｌ．　１７２，　ｐ１０３５，　１９９０
【非特許文献１５】Ｇｏｗｅｎ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．　Ｒｅｓ．，　ｖｏｌ．　１，　ｐ４６９，　１９８６
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこのような観点からなされたものであって、新規な破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ）及びその効率的な製造方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような現状に鑑み鋭意探索の結果、ヒト胎児肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ寄託−受託番号ＣＣＬ１８６）の培養液に破骨細胞形成抑制活性、即ち破骨細胞の分化・成熟を抑制する活性を有する蛋白質ＯＣＩＦを見出すに至った。
又、細胞培養の担体としてアルミナセラミック片を使用すると本発明の破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦを培地中に高濃度に蓄積せしめ、効率よく精製できることを見出した。
さらに、本発明者らは、前記培養液をイオン交換カラム、アフィニティーカラム及び逆相カラムで順次処理して吸着及び溶出をくり返すことによって前記蛋白質ＯＣＩＦを効率よく精製する方法を確立した。
【００１０】
次に本発明者らは、得られた天然型ＯＣＩＦ蛋白質のアミノ酸配列の情報に基づき、この蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功した。さらに本発明者らは、このｃＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法により破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質を生産する方法を確立するに至った。
【００１１】
本発明は、ヒト胎児肺線維芽細胞に由来し、還元条件下ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにおける分子量が約６０ｋＤ、非還元条件下ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにおける分子量が約６０ｋＤａ及び約　１２０ｋＤであり、陽イオン交換体及びヘパリンカラムに親和性を有し、７０℃、１０分間又は５６℃、３０分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟を抑制する活性が低下し、９０℃、１０分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われることを特徴とする蛋白質に関する。本発明の蛋白質ＯＣＩＦのアミノ酸配列は、既知の破骨細胞形成抑制因子とは明確に相違する。
【００１２】
また、本発明は、ヒト線維芽細胞を培養し、培養液をヘパリンカラム処理し、吸着画分を溶出し、この画分を陽イオン交換カラムにかけ吸着・溶出し、さらにアフィニティーカラム、逆相カラムによって精製して前記蛋白質を採取する、蛋白質ＯＣＩＦの製造方法に関する。本発明におけるカラム処理は、単に培養液等をヘパリンセファロースカラム等に流下させるものばかりではなく、バッチ法で培養液をヘパリンセファロース等と混合し、カラム処理した場合と同等の効果を奏するものも包含する。本発明で使用されるアフィニティーカラムは、ヘパリンカラム及びブルーカラムが挙げられる。ブルーカラムは、特に好ましくはシバクロンブルーカラムが挙げられる。このシバクロンブルーカラムの充填剤としては、親水性合成高分子を担体とし色素シバクロンブルーＦ３ＧＡを結合させたものが例示され、このカラムは通常ブルーカラムと呼ばれる。
さらに、本発明は、アルミナセラミック片を担体として使用して細胞培養を行なって効率よく前記蛋白質を製造する方法に関する。
【００１３】
本発明の蛋白質ＯＣＩＦは、ヒト線維芽細胞の培養液から効率良く且つ高収率で単離精製することができる。この原料からの本発明蛋白質ＯＣＩＦの単離、精製は、生物試料からの蛋白性物質の精製に汎用される通常の方法を用いて、目的とする蛋白質ＯＣＩＦの物理的、化学的性質を利用した各種の精製操作に従い実施することができる。この濃縮手段として限外濾過、凍結乾燥、及び塩析等の通常の生化学的処理手段が挙げられる。又、精製手段としては、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、調製用電気泳動等を用いた通常の蛋白性物質の精製に利用される各種の手法を組み合わせて用いることができる。特に好ましくは、原料として用いるヒト線維芽細胞としてヒト胎児肺線維細胞ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ　１８６）を用いることが望ましい。そして原料となるヒト胎児肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０の培養は、ヒト胎児肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０をアルミナセラミック片に付着させ、５％ウシ新生児血清を添加したＤＭＥＭ培地を培養液として用い、ローラーボトル中で一週間から１０日程度静置培養することにより得たものを使用するとよい。又、精製処理を実施する際に界面活性剤として０．１　％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）　を添加して精製を行うのが望ましい。
【００１４】
本発明の蛋白質ＯＣＩＦは、先ず培養液をヘパリンカラム（ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ、ファルマシア社）にかけ、２Ｍ　ＮａＣｌ　を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　緩衝液、ｐＨ７．５　で溶出させ、ヘパリン吸着性のＯＣＩＦ画分を得、この画分をＱ・陰イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ−Ｑ／ＦＦ　、ファルマシア社）にかけ、その非吸着画分を集めることにより、ヘパリン吸着性で塩基性のＯＣＩＦ画分として得ることができる。得られたＯＣＩＦ活性画分はＳ・陽イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ−Ｓ／ＨＰ　、ファルマシア社）、ヘパリンカラム（ヘパリン−５ＰＷ、トーソー社）、シバクロンブルーカラム（ブルー−５ＰＷ、トーソー社）、逆相カラム（ＢＵ−３００　Ｃ４　、パーキンエルマー社）にかけることにより単離・精製することができ、この物質は前述した性質によって特定される。
【００１５】
さらに、本発明は、このようにして得られた天然型ＯＣＩＦ蛋白質のアミノ酸配列に基づいてこの蛋白質をコードするｃＤＮＡをクローニングし、このｃＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法で破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質ＯＣＩＦを得る方法に関する。
【００１６】
即ち、本発明の方法に従って精製したＯＣＩＦ蛋白質をエンドプロテアーゼ
（例えばリシルエンドペプチダーゼ）で処理後、生ずるペプチドのアミノ酸配列を決定し、得られた内部アミノ酸配列をコードし得るオリゴヌクレオチドの混合物を作製する。
次に、作製したオリゴヌクレオチド混合物をプライマーとし、ＰＣＲ法（好ましくはＲＴ−ＰＣＲ法）を利用してＯＣＩＦｃＤＮＡ断片を取得する。このＯＣＩＦｃＤＮＡ断片をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーよりＯＣＩＦの全長ｃＤＮＡ　をクローニングする。得られたＯＣＩＦｃＤＮＡを発現ベクターに挿入してＯＣＩＦ発現プラスミドを作製し、これを各種の細胞又は菌株に導入して発現させることにより、組み換え型ＯＣＩＦを製造することができる。
【００１７】
本発明はまた、上述の活性を有する本発明ＯＣＩＦ蛋白質の類縁体（バリアント）である新規蛋白質　ＯＣＩＦ２，　ＯＣＩＦ３，　ＯＣＩＦ４，　ＯＣＩＦ５　に関する。
これらの類縁体は、ＩＭＲ−９０細胞のポリ（Ａ）＋　ＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡライブラリーをＯＣＩＦｃＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズすることによって得られる。これらのＯＣＩＦ類縁体のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、そのＯＣＩＦ類縁体発現ベクターを通常の宿主で発現し、常法で精製することにより、目的とする類縁体蛋白質を得ることができる。
【００１８】
又、本発明はＯＣＩＦ変異体に関する。
これらの変異体はＯＣＩＦの二量体形成に関与する可能性のあるＣｙｓ　残基をＳｅｒ
残基に置換したもの、又は天然型ＯＣＩＦに欠失変異を導入したものである。ＰＣＲ法或いは制限酵素による切断により、ＯＣＩＦｃＤＮＡに置換或いは欠失変異を導入する。このｃＤＮＡを適当な発現プロモーターを有したベクターに挿入し、哺乳動物細胞等の真核細胞にトランスフェクトし、この細胞を培養してその培養液から常法により精製することにより、目的とするＯＣＩＦ変異体が得られる。
【００１９】
又、本発明は抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体、及びそれを用いたＯＣＩＦの測定方法に関する。
抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体は、ＯＣＩＦを免疫原として常法により作製される。この時用いる抗原（免疫原）としては、ＩＭＲ−９０培養液より得られる天然型ＯＣＩＦ、及びＯＣＩＦｃＤＮＡを用いて微生物や真核細胞を宿主として生産された遺伝子組み換え型ＯＣＩＦ、あるいはＯＣＩＦのアミノ酸配列に基づいて設計した合成ペプチドや、ＯＣＩＦの加水分解部分ペプチドを用いることができる。これらの抗原を用いて、また必要ならば免疫アジュバントを併用して、適当な哺乳動物を免疫し、その血清から常法により精製することにより、抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体を得ることができる。得られた抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体をアイソトープや酵素で標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　やエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）　の測定系に使用することができる。この測定系を用いることにより、血液や腹水などの生体試料や細胞培養液などのＯＣＩＦ濃度を容易に測定することができる。
【００２０】
又、本発明は抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体、及びそれを用いたＯＣＩＦの測定方法に関する。
抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体は、ＯＣＩＦを免疫原として、常法により作成される。抗原としては、ＩＭＲ−９０培養液より得られる天然型ＯＣＩＦ、及びＯＣＩＦｃＤＮＡを用いて微生物や真核細胞を宿主として生産された遺伝子組み換え型ＯＣＩＦ、或いはＯＣＩＦのアミノ酸配列に基づいて設計した合成ペプチドや、ＯＣＩＦの加水分解部分ペプチドでもよい。これらの抗原を用いて哺乳動物を免疫するか、或いはインビトロ法により免疫した細胞を、哺乳動物の骨髄腫細胞　（ミエローマ）　などと融合させハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマよりＯＣＩＦを認識する抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養することにより目的とする抗体が得られる。ハイブリドーマの作製にあたっては、哺乳動物を使用する場合、マウスやラットなどの小動物を使用した例が一般的である。
免疫は、ＯＣＩＦを生理食塩水などにより適当な濃度に希釈し、この溶液を静脈内や腹腔内に投与し、これに必要に応じて免疫アジュバントを併用投与し、動物に２−２０日毎に２−５　回投与する。このようにして免疫された動物を、解剖し、脾臓を摘出し脾細胞を免疫細胞として使用する。
【００２１】
免疫細胞と細胞融合させるマウス由来のミエローマとしては、例えばＰ３／ｘ６３−Ａｇ８，　ｐ３−Ｕ１，　ＮＳ−１，　ＭＰＣ−１１，　ＳＰ−２／０，　ＦＯ，　Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．　６５３，　Ｓ１９４などが例示できる。
また、ラット由来の細胞としてはＲ−２１０　などの細胞株を例示できる。ヒト型の抗体を生産する場合にはヒトＢリンパ球をインビトロ法により免疫し、ヒトミエローマ細胞やＥＢウイルスにより形質転換した細胞株を親株として使用することによりヒト型の抗体を生産するハイブリドーマを得ることができる。
【００２２】
免疫細胞とミエローマ細胞株の融合は公知の方法、例えばＫｏｅｈｌｅｒ　とＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法　（Ｋｏｅｈｌｅ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　ｖｏｌ．　２５６，　４９５−４９７，　１９７５）　、或いは電気パルス法などが挙げられる。免疫細胞とミエローマ細胞株は、細胞培養に用いられている培地　（ＦＢＳ不含）　に、通常行われている細胞数の比に混合し、ポリエチレングリコールを添加して融合処理を行い、ＨＡＴ選択培地で培養を行い融合細胞を選択することができる。
【００２３】
抗ＯＣＩＦ抗体生産株を選別するには、ＥＬＩＳＡ法、プラーク法、オクタロニー法、凝集法など、通常の抗体検出に使用されている方法を用いて選択することができる。このようにして選別されたハイブリドーマは、通常の培養方法により継代培養可能であり、必要に応じて凍結保存できる。ハイブリドーマを常法により培養するか、または哺乳動物の腹腔内に移植することにより、抗体を生産することができる。抗体は塩析、ゲル濾過やアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の方法により精製できる。
【００２４】
得られた抗体はＯＣＩＦに特異的に反応し、ＯＣＩＦの測定や精製に使用できる。ＯＣＩＦの測定に使用する場合は、抗体をアイソトープや酵素によりラベルすることにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　やエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）
の測定系に使用することができる。特に本発明により得られる抗体は、その抗原認識部位がそれぞれ異なっているので、サンドイッチイムノアッセイに使用することができるという特徴を有する。この測定系を用いることにより、血液や腹水などの生体試料や細胞培養液などのＯＣＩＦ濃度を容易に測定することができる。
【００２５】
ＯＣＩＦ活性は、久米川正好らの方法（蛋白質・核酸・酵素，　　Ｖｏｌ．３４，　ｐ９９９（１９８９））及びＴａｋａｈａｓｈｉ　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　の方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．１２２，　ｐ１３７３　　　（１９８８））に従い測定することができる。即ち、生後約１７日のマウス骨髄細胞を標的細胞として用い、活性型ビタミンＤ３（Ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ）　存在下での破骨細胞の形成抑制を、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性の誘導の抑制で試験することができる。
【００２６】
本発明の蛋白質である破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦは、骨粗鬆症等の骨量減少症、リウマチ又は変形性関節症等の骨代謝異常疾患、或いは多発性骨髄腫等の骨代謝異常疾患の治療及び改善を目的とした医薬組成物として、或いはこのような疾患の免疫学的診断を確立するための抗原として有用である。本発明の蛋白質は、製剤化して経口或いは非経口的に投与することができる。即ち、本発明の蛋白質を含む製剤は、破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦを有効成分として含む医薬組成物としてヒト及び動物に対して安全に投与されるものである。
【００２７】
医薬組成物の形態としては、注射用組成物、点滴用組成物、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤等が挙げられる。注射用組成物の場合は、本発明の破骨細胞形成抑制因子の薬理学的有効量及び製薬学的に許容しうる担体の混合物であり、その中にはアミノ酸、糖類、セルロース誘導体、及びその他の有機／無機化合物等の一般的に注射用組成物に添加される賦形剤／賦活剤を用いることもできる。又、本発明の破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦとこれらの賦形剤／賦活剤を用い注射剤を調製する場合は、必要に応じてｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加して常法によって各種注射剤とすることができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。しかしこれらは単に例示するのみであり、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
ヒト線維芽細胞ＩＭＲ−９０培養液の調製
ヒト胎児肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０　（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ１８６）は、ローラーボトル（４９０ｃｍ２、１１０　×１７１ｍｍ　、コーニング社）中で８０ｇのアルミナセラミック片（アルミナ９９．５％、東芝セラミック社）に付着させ培養した。培養には６０個のローラーボトルを使用し、ローラーボトル１個当たり５％子牛血清を添加した１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液添加ＤＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ社）５００ｍｌを用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で　７〜１０日間静置培養した。培養後培養液を回収し、新たな培地を添加することにより１回の培養で　３０１のＩＭＲ−９０培養液を得た。得られた培養液を試料１とした。
【００２９】
【実施例２】
破骨細胞形成抑制活性の測定法
本発明の蛋白性破骨細胞形成抑制因子の活性測定は久米川正好らの方法（蛋白質・核酸・酵素　Ｖｏｌ．３４　ｐ９９９（１９８９））　及びＴａｋａｈａｓｈｉ　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　の方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．１２２　ｐ１３７３　（１９８８））に従い測定した。即ち、生後約１７日のマウスより分離した骨髄細胞を用い、活性型ビタミンＤ３存在下での破骨細胞形成を酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性の誘導を指標として試験し、その抑制活性を測定することによって行った。即ち、９６ウェルマイクロプレートに２×１０−８Ｍ活性型ビタミンＤ３及び１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ社）で希釈したサンプル　１００μｌを入れ、生後約１７日のマウスから得た骨髄細胞３×１０５個を　１００μｌの１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地に懸濁させて播種し、５％ＣＯ２、３７℃、湿度１００％にて一週間培養した。培養３日目と５日目に、培養液　１６０μｌを廃棄し、１×１０−８Ｍ活性型ビタミンＤ３　及び１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地で希釈したサンプル１６０μｌを添加した。培養７日後にリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後エタノール／アセトン（１：１）溶液で細胞を室温にて１分間固定し、破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キット（Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　、カタログＮｏ．３８７−Ａ、シグマ社）を用いた染色で検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少をＯＣＩＦ活性とした。
【００３０】
【実施例３】
ＯＣＩＦの精製
ｉ）ヘパリン・セファロ−スＣＬ−６Ｂによる精製
約９０ｌのＩＭＲ−９０培養液（試料１）を、０．２２μｍ　のフィルター（親水性ミリディスク、２，０００ｃｍ２、ミリポア社）で濾過した後、３回に分けて　０．３Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌという）、ｐＨ７．５　で平衡化させたヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂ　カラム（５×４．１ｃｍ　、ゲル容量８０ｍｌ）にかけた。流速５００ｍｌ／ｈｒにて、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７．５　で洗浄した後、２Ｍ　ＮａＣｌ　を含む１０ｍＭ　　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　、　ｐＨ７．５で溶出を行い、ヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂ　吸着画分９００ｍｌ
を得、得られた画分を試料２とした。
【００３１】
ｉｉ）ＨｉＬｏａｄ−Ｑ／ＦＦによる精製
ヘパリン・セファロース吸着画分（試料２）を　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５　に対して透析した後、０．１　％になるようにＣＨＡＰＳを加え４℃で一晩放置したものを２回に分けて０．１　％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５　で平衡化した陰イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ−Ｑ／ＦＦ、２．６　×１０ｃｍ、ファルマシア社）にかけ、非吸着画分１０００ｍｌを得た。得られた画分を試料３とした。
【００３２】
ｉｉｉ）　ＨｉＬｏａｄ−Ｓ／ＨＰによる精製
ＨｉＬｏａｄ−Ｑ非吸着画分（試料３）を、０．１　％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５で平衡化した陽イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ−Ｓ／ＨＰ、２．６　×１０ｃｍ、ファルマシア社）にかけた。０．１　％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で洗浄した後、１００分間でＮａＣｌを１Ｍ　にする直線勾配、流速８ｍｌ／分にて溶出を行い、１２ｍｌ／フラクションにて分取を行った。フラクション１〜４０を１０フラクションづつ４つの画分にまとめ、それぞれ　１００μｌを用いてＯＣＩＦ活性を測定した。ＯＣＩＦ活性はフラクション１１〜３０に認められた（図１：図中、＋＋は破骨細胞形成が８０％以上抑制される活性を、＋は破骨細胞形成が３０〜８０％抑制される活性を、−は活性が検出されないことをそれぞれ示す）。より比活性の高いフラクション２１〜３０を試料４とした。
【００３３】
ｉｖ）　アフィニティーカラム（ヘパリン−５ＰＷ）による精製
１２０ｍｌ　の試料４を２４０ｍｌ　の０．１　％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で希釈した後、０．１　％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で平衡化したアフィニティーカラム（ヘパリン−５ＰＷ、０．８）へかけた。０．１　％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で洗浄した後、６０分間でＮａＣｌを２Ｍ　にする直線勾配、流速０．５ｍｌ／分にて溶出を行い、０．５ｍｌ／フラクションにて分取を行った。各フラクション５０μｌを用いてＯＣＩＦ活性を測定し、約０．７　〜１．３Ｍ　ＮａＣｌ　で溶出されるＯＣＩＦ活性画分１０ｍｌを得、試料５とした。
【００３４】
ｖ）アフィニティーカラム（ブルー−５ＰＷ）による精製
１０ｍｌの試料５を　１９０ｍｌの０．１％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で希釈した後、０．１％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で平衡化したアフィニティーカラム（ブルー−５ＰＷ、０．５×５．０ｃｍ、トーソー社）にかけた。０．１％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で洗浄した後、６０分間でＮａＣｌを２Ｍにする直線勾配、流速０．５ｍｌ／分にて溶出を行い、０．５ｍｌ／フラクションにて分取を行った。各フラクション２５μｌを用いてＯＣＩＦ活性を測定し、約１．０　〜１．６Ｍ　ＮａＣｌで溶出されるＯＣＩＦ活性フラクション４９〜７０を得た（図２図中、＋＋は破骨細胞形成が８０％以上抑制される活性を、＋は破骨細胞形成が３０〜８０％抑制される活性を示す）。
【００３５】
ｖｉ）　逆相カラムによる精製
得られたフラクション４９〜５０ｍｌに、１０μｌの２５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を加えた後、０．１％ＴＦＡを含む２５％アセトニトリルで平衡化した逆相カラム　　（ＢＵ−３００　、Ｃ４、２．１　×２２０ｍｍ　、パーキンエルマー社）にかけ、６０分間でアセトニトリルを５５％にする直線勾配、流速０．２ｍｌ／分にて溶出を行い、各ピークを分取した（図３）。各ピークフラクションの　１００μｌを用いてＯＣＩＦ活性を測定し、ピ−ク６及びピ−ク７に濃度依存的に活性を検出した。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2004000237.tif 000002
（表中、＋＋は破骨細胞形成が８０％以上抑制される活性を、＋は破骨細胞形成が３０〜８０％抑制される活性を、−は活性が検出されないことを示す。）
【００３７】
【実施例４】
ＯＣＩＦの分子量測定
ＯＣＩＦ活性の認められたピーク６及びピーク７各４０μｌを用い、還元条件下と非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。即ち、各ピークフラクション２０μｌづつを２本のチューブに分取し減圧濃縮した後、１ｍＭＥＤＴＡ、２．５　％ＳＤＳ、及び０．０１％ブロモフェノールブルーを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ８　１．５μｌで溶解し、それぞれを非還元条件下及び還元条件下（５％　２−メルカプトエタノール存在下）で３７℃で一晩放置後、それぞれの１μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に負荷した。電気泳動は１０−１５％アクリルアミドのグラジエントゲル（ファルマシア社）を使用し、電気泳動装置Ｐｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア社）を用いて行った。分子量マーカーとして、ホスホリラーゼｂ（９４ｋＤ）　、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤ）、オボアルブミン（４３ｋＤ）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０ｋＤ）、トリプシンインヒビター（２０．０ｋＤ）、α−ラクトアルブミン　（１４．４ｋＤ）　を用いた。電気泳動終了後、Ｐｈａｓｔ　Ｇｅｌ　Ｓｉｌｖｅｒ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ（ファルマシア社）を用いて銀染色を行った。結果を図４に示す。
その結果、ピーク６については還元条件下、非還元条件下で約６０ｋＤの蛋白質のバンドが検出された。又、ピーク７については、還元条件下で約６０ｋＤ、非還元条件下で約１２０ｋＤａの蛋白質のバンドが検出された。従って、ピーク７はピーク６の蛋白質のホモダイマーであると考えられる。
【００３８】
【実施例５】
ＯＣＩＦの熱安定性試験
ブルー５ＰＷフラクション５１〜５２を混合したサンプルから２０μｌずつを取り、１０ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２　３０μｌを加えた後、７０℃及び９０℃にて１０分間、又は５６℃にて３０分間熱処理を行った。このサンプルを用い、実施例２記載の方法に従いＯＣＩＦ活性を測定した。結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】ＯＣＩＦの熱安定性
2004000237.tif 000003
（表中、＋＋は破骨細胞形成が８０％以上抑制される活性を、＋は破骨細胞形成が３０〜８０％抑制される活性を、−は活性が検出されないことを示す。）
【００４０】
【実施例６】
内部アミノ酸配列の決定
ブルー−５ＰＷフラクション５１〜７０について、２フラクションづつを混合して１ｍｌとし、それぞれの試料に１０μｌの２５％ＴＦＡを加えた後、１ｍｌずつ１０回にわけて０．１％ＴＦＡを含む２５％アセトニトリルで平衡化した逆相カラム　（ＢＵ−３００、Ｃ４、２．１×２２０ｍｍ　、パーキンエルマー社）にかけ、６０分間でアセトニトリルを５５％にする直線勾配、流速　０．２　ｍｌ／分にて溶出を行い、ピーク６とピーク７を集めた。得られたピーク６とピーク７の一部について、それぞれプロテインシーケンサー（プロサイス、４９４　型、パーキンエルマー社）を用い、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行ったが、分析不能でありこれらの蛋白質のＮ末端はブロックされている可能性が示唆された。そこで、これらの蛋白質の内部アミノ酸配列を解析した。即ち、ピーク６とピーク７のそれぞれを遠心濃縮した後、それぞれに１００μｇ　ジチオスレイトール、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、７Ｍ塩酸グアニジン、及び１％ＣＨＡＰＳを含む　０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ８．５　５０μｌ　を加えて室温で４時間放置し還元した後、０．２μｌの４−ビニルピリジンを加え、室温暗所で一晩放置しピリジルエチル化した。これらのサンプルに１μｌの２５％ＴＦＡを加え、０．１％ＴＦＡを含む２０％アセトニトリルで平衡化した逆相カラム（ＢＵ−３００，　Ｃ４，　２．１×３０ｍｍ，　パーキンエルマー社）にかけ、３０分間でアセトニトリル濃度を５０％にする直線勾配、流速０．３　ｍｌ／　分で溶出を行い、還元ピリジルエチル化ＯＣＩＦサンプルを得た。還元ピリジルエチル化したサンプルのそれぞれを遠心濃縮し、８Ｍ尿素及び０．１％　Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ９　２５　μｌ　で溶解した後、７３μｌ　の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ９　で希釈し、０．０２μｇ　のＡＰ１（リシルエンドプロテアーゼ、和光純薬社）を加え、３７℃で１５時間反応させた。反応液に１μｌの２５％ＴＦＡを加え、０．１％ＴＦＡで平衡化した逆相カラム（ＲＰ−３００，　Ｃ８，　２．１×２２０ｍｍ　、パーキンエルマー社）にかけ、７０分間でアセトニトリル濃度を５０％にする直線勾配、流速０．２　ｍｌ／　分で溶出を行い、ペプチドフラグメントを得た（図５）。得られたペプチドフラグメント　（Ｐ１〜Ｐ３）について、プロテインシーケンサーを用いアミノ酸配列分析を行った。結果を配列表　配列番号１〜３に示す。
【００４１】
【実施例７】
ｃＤＮＡ配列の決定
ｉ）　ＩＭＲ−９０細胞からのポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ　の単離
ＩＭＲ−９０細胞のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ　は、ファストトラックｍＲＮＡアイソレーションキット（インヴィトロージェン社）を用い、そのマニュアルに準じて単離した。この方法により１Ｘ１０８個のＩＭＲ−９０細胞より約１０μｇ　のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを取得した。
【００４２】
ｉｉ）　ミックスプライマーの作製
先に得られたペプチド（配列表　配列番号２及び３）のアミノ酸配列をもとに、次の２種のミックスプライマーを合成した。即ち、ペプチドＰ２の６番目（Ｇｌｎ）から１２番目（Ｌｅｕ）　までのアミノ酸配列をコードしうるすべての塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの混合物（ミックスプライマー，Ｎｏ．２Ｆ）を合成した。又、ペプチドのＰ３　の６番目（Ｈｉｓ）　から１２番目（Ｌｙｓ）　までのアミノ酸配列をコードしうるすべての塩基配列に対する相補的オリゴヌクレオチドの混合物（ミックスプライマー，Ｎｏ．３Ｒ）を合成した。用いたミックスプライマーの塩基配列を、表３に示す。
【００４３】
【表３】
2004000237.tif 000004
【００４４】
ｉｉｉ）　ＯＣＩＦｃＤＮＡ断片のＰＣＲ　による増幅
実施例７−ｉ）で得たポリ（Ａ）＋ＲＮＡ、１Ｍｇを鋳型としてスーパースクリプトＩＩｃＤＮＡ合成キット（ギブコＢＲＬ社）　を用いて、同社のプロトコールに従って一本鎖ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡと実施例７−ｉｉ）　で示したプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、ＯＣＩＦｃＤＮＡ断片を取得した。以下に条件を示す。
【００４５】
2004000237.tif 000005
【００４６】
上記の溶液を微量遠心チューブ中で混合後、以下の条件でＰＣＲを行った。９５℃で３　分前処理後、９５℃３０秒、５０℃３０秒、７０℃２　分の３　段階の反応を３０回繰り返したのち、７０℃５分保温した。反応液の一部をアガロース電気泳動し約４００ｂｐ　の均一なＤＮＡ断片が得られたことを確認した。
【００４７】
【実施例８】
ＰＣＲ　により増幅されたＯＣＩＦｃＤＮＡ断片のクローニング及び塩基配列決定
実施例７−ｉｉｉ）で得られたＯＣＩＦｃＤＮＡ断片を、Ｍａｒｃｈｕｋ，　Ｄらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄＲｅｓ．，　Ｖｏｌ．１９，　ｐ１１５４，　１９９１）によってプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ−（ストラタジーン社）にＤＮＡライゲーションキット　Ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて挿入し、大腸菌　ＤＨ５α（ギブコＢＲＬ社）の形質転換を行った。得られた形質転換株を増殖させ、約　４００ｂｐのＯＣＩＦｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを常法に従い精製した。このプラスミドをｐＢＳＯＣＩＦと名付け、このプラスミドに挿入されているＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列をタックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＴａｑＤｙｅ　Ｄｅｏｘｙ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ；　パーキンエルマー社）を用いて決定した。このＯＣＩＦｃＤＮＡの大きさは、３９７　ｂｐであった。この塩基配列から予測される１３２　個のアミノ酸からなるアミノ酸配列中に、ミックスプライマーを設計するのに用いたＯＣＩＦの内部アミノ酸配列（配列表配列番号２及び３）をそれぞれＮ末側、Ｃ末側に見出すことができた。又、ＯＣＩＦの内部アミノ酸配列（配列番号１）を、この　１３２個のアミノ酸からなるアミノ酸配列中に見出すことができた。以上の結果より、クローニングした３９７　ｂｐのｃＤＮＡは、ＯＣＩＦｃＤＮＡ断片であることが確認された。
【００４８】
【実施例９】
　ＤＮＡプローブの作製
実施例８で作成された３９７ｂｐ　のＯＣＩＦｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを鋳型にして実施例７−ｉｉｉ）の条件でＰＣＲを行なうことにより、このＯＣＩＦｃＤＮＡ断片を増幅した。アガロース電気泳動により３９７ｂｐ　のＯＣＩＦｃＤＮＡ断片を分離後、ＱＩＡＥＸ　ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。このＤＮＡをメガプライムＤＮＡラベリングキット（アマシャム社）　を用いて　［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ　で標識し、全長のＯＣＩＦｃＤＮＡをスクリーニングするためのプローブとして用いた。
【００４９】
【実施例１０】
ｃＤＮＡライブラリーの作成
実施例７−ｉ）で得られたポリ（Ａ）＋ＲＮＡ　、２．５μｇを鋳型としてグレートレングスｃＤＮＡ合成キット（クロンテック社）　を用いて同社のプロトコールに従い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ　を用いてｃＤＮＡの合成、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ−Ｎｏｔ−Ｉアダプター付加、ｃＤＮＡサイズフラクショネーションを行いエタノール沈殿の後１０μｌのＴＥバッファーに溶解した。得られたアダプター付加ｃＤＮＡ、０．１μｇをＴ４ＤＮＡ　リガーゼを用いてあらかじめＥｃｏＲＩで切断した１μｇのλＺＡＰ　エクスプレスベクター（ストラタジーン社）に挿入した。このようにして得られたｃＤＮＡ組み換えファージＤＮＡ　溶液をギガパックゴールドＩＩ（ストラタジーン社）　を用いてインヴィトロパッケージング反応に供し、λＺＡＰ　エクスプレス組み換えファージを作成した。
【００５０】
【実施例１１】
組み換えファージのスクリーニング
実施例１０で得られた組み換えファージを３７℃で１５分間大腸菌　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’（ストラタジーン社）に感染させたのち、５０℃に加温した０．７　％の寒天を含むＮＺＹ　培地に添加し、ＮＺＹ　寒天培地プレートに流しこんだ。３７℃で一晩培養後、プラークの生じたプレート上にハイボンドＮ（アマシャム社）を約３０秒密着させた。このフィルターを常法に従いアルカリ変性の後、中和し、２ＸＳＳＣ　溶液に浸したのちＵＶクロスリンク（ストラタジーン社）　によりＤＮＡ　をフィルターに固定化した。得られたフィルターを１００　μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ　を含むハイブリダイゼーションバッファー（アマシャム社）に浸漬し６５℃で４　時間前処理した後、熱変性した上記ＤＮＡ　プローブ（２Ｘ１０５ｃｐｍ／ｍｌ）　を添加した上記バッファ−に移し替え６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。反応後フィルターを２ＸＳＳＣ　で２　回、０．１ＸＳＳＣ，０．１％　ＳＤＳ溶液で２回それぞれ６５℃で１０分間洗浄した。得られたいくつかの陽性クローンを、さらに２　回スクリーニングを行うことにより純化した。それらの中から約１．６ｋｂ　のインサートを持つものを以下に用いた。この純化したファージをλＯＣＩＦと名付けた。純化したλＯＣＩＦをλＺＡＰ　エクスプレスクローニングキット（ストラタジーン社）のプロトコールに従い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’　に感染させたのち、ヘルパーファージＥｘＡｓｓｉｓｔ（ストラタジーン社）　で多重感染を行い、その培養上清を大腸菌ＸＬＯＬＲ（ストラタジーン社）　に感染させたのちカナマイシン耐性株を拾うことによりｐＢＫＣＭＶ（ストラタジーン社）　に上述の１．６ｋｂ　のインサートが挿入されたプラスミドｐＢＫＯＣＩＦ　をもつ形質転換株を得た。この形質転換株はｐＢＫ／０１Ｆ１０　として、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５２６７（平成７年１０月２５日にＦＥＲＭ　Ｐ−１４９９８の原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託に移管）として寄託してある。このプラスミドをもつ形質転換株を増殖させ、常法によりプラスミドを精製した。
【００５１】
【実施例１２】
ＯＣＩＦの全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列の決定
実施例１１で得られたＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列をタックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット（パーキンエルマー社）　を用いて決定した。用いたプライマーはＴ３，　Ｔ７　プライマー（ストラタジーン社）及びＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列に基づいて設計された合成プライマーであり、その配列を配列表配列番号１６〜２９に示す。
決定されたＯＣＩＦの塩基配列を配列番号６に、その配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号５にそれぞれ示す。
【００５２】
【実施例１３】
２９３／ＥＢＮＡ細胞による組み換え型ＯＣＩＦの生産
ｉ）　ＯＣＩＦｃＤＮＡの発現プラスミドの作製
実施例１１で得られた約１．６ｋｂ　のＯＣＩＦｃＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＢＫＯＣＩＦ　を制限酵素ＢａｍＨＩ　及びＸｈｏＩで消化し、ＯＣＩＦｃＤＮＡを切り出し、アガロース電気泳動によって分離後、ＱＩＡＥＸ　ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。このＯＣＩＦｃＤＮＡを、あらかじめ制限酵素ＢａｍＨＩ　及びＸｈｏＩで消化しておいた発現プラスミドｐＣＥＰ４（インヴィトロージェン社）に、ライゲーションキット　Ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて挿入し、大腸菌ＤＨ５　α（ギブコＢＲＬ社）の形質転換を行った。得られた形質転換株を増殖させ、ＯＣＩＦｃＤＮＡが挿入された発現プラスミドｐＣＥＰＯＣＩＦをキアゲンカラム（キアゲン社）　を用いて精製した。ＯＣＩＦ発現プラスミドｐＣＥＰＯＣＩＦをエタノールによって沈澱させた後、無菌蒸留水に溶解し以下の操作に用いた。
【００５３】
ｉｉ）　　ＯＣＩＦｃＤＮＡのトランジエントな発現及びその活性の測定
実施例１３−ｉ）で得られたＯＣＩＦ発現プラスミドｐＣＥＰＯＣＩＦを用いて、以下に述べる方法で組み換えＯＣＩＦを発現させ、その活性を測定した。８×１０５個の２９３／ＥＢＮＡ細胞（インヴィトロージェン社）を６ウェルプレートの各ウェルに１０％牛胎児血清（ギブコＢＲＬ社）を含むＩＭＤＭ培地（ギブコＢＲＬ社）を用いて植え込み、翌日、培地を除いた後、無血清ＩＭＤＭ培地で細胞を洗った。トランスフェクション用試薬リポフェクタミン（ギブコＢＲＬ社）添付のプロトコールに従い、あらかじめＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ社）を用いて希釈しておいたｐＣＥＰＯＣＩＦとリポフェクタミンを混合した後、この混合液を各ウェルの細胞に加えた。用いたｐＣＥＰＯＣＩＦ及びリポフェクタミンの量はそれぞれ３μｇ及び１２μｌであった。３８時間後、培地を除き１ｍｌの新しいＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を加え、さらに３０時間後、培地を回収し、これをＯＣＩＦ活性測定用サンプルとした。ＯＣＩＦの活性測定は以下のようにして行った。生後約１７日のマウス骨髄細胞からの活性型ビタミンＤ３存在下での破骨細胞形成を酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性の誘導で試験し、その抑制活性を測定し、ＯＣＩＦの活性とした。すなわち、９６ウェルマイクロプレートに２×１０‐８Ｍ活性型ビタミンＤ３及び１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ社）で希釈したサンプル１００μｌ　を入れ、生後約１７日のマウス骨髄細胞３×１０５個を　１００μｌ　の１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地に懸濁させて播種し、５　％ＣＯ２、３７℃、湿度　１００％にて一週間培養した。培養３日目と５日目に、培養液１６０μｌ　を廃棄し、１×１０−８Ｍ活性型ビタミンＤ３及び１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地で希釈したサンプル１６０μｌを添加した。培養７日後にリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後エタノール／アセトン（１：１）溶液で細胞を室温にて１分間固定し、破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キット（Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　、カタログ　Ｎｏ．３８７−　Ａ、シグマ社）を用いた染色で検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少をＯＣＩＦ活性とした。その結果、表４に示すように、先にＩＭＲ−９０の培養液から得られた天然型ＯＣＩＦと同様の活性をこの培養液が有することが確認された。
【００５４】
【表４】
2004000237.tif 000006
（表中、＋＋は破骨細胞形成が８０％以上抑制される活性を、＋は破骨細胞形成が３０〜８０％抑制される活性を、−は活性が検出されないことを示す。）
【００５５】
ｉｉｉ）　２９３／ＥＢＮＡ細胞由来組み換え型ＯＣＩＦの精製
実施例１３−ｉｉ）に記載した２９３／ＥＢＮＡ細胞を大量培養して得た培養液１．８ｌに０．１　％になるようにＣＨＡＰＳを加え、０．２２μｍ　のフィルター（ステリベックスＧＳ、ミリポア社）で濾過した後、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で平衡化させた５０ｍｌのヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂカラム（２．６×１０ｃｍ、ファルマシア社）にかけた。０．１　％ＣＨＡＰＳを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で洗浄した後、１００　分間でＮａＣｌを２Ｍにする直線勾配、流速４ｍｌ／分にて溶出を行い、８ｍｌ／フラクションにて分取を行った。各フラクション１５０μｌを用いて実施例２の方法に従ってＯＣＩＦ活性を測定し、約　０．６〜１．２ＭＮａＣｌで溶出されるＯＣＩＦ活性画分　１１２ｍｌを得た。
【００５６】
得られたＯＣＩＦ活性画分　１１２ｍｌを０．１　％ＣＨＡＰＳを含む　１０ｍＭ　Ｔｒｉ　ｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５　で１０００ｍｌに希釈した後、０．１　％ＣＨＡＰＳを含む　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で平衡化させたアフィニティカラム（ヘパリン　−５ＰＷ，　０．８×７．５　ｃｍ、トーソー社）にかけた。０．１％ＣＨＡＰＳを含む　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５　で洗浄した後、６０分間でＮａＣｌを２Ｍにする直線勾配、流速０．５ｍｌ／分にて溶出を行い、０．５ｍｌ／フラクションにて分取を行った。
【００５７】
得られたフラクション各４μｌを用いて実施例４の方法に従って還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、フラクション３０〜３２には還元条件下で約６０ｋＤ、非還元条件下で約６０ｋＤと約　１２０ｋＤのＯＣＩＦバンドのみが検出されたので、フラクション３０〜３２を集め純化２９３／ＥＢＮＡ細胞由来組み換え型ＯＣＩＦ（　ｒＯＣＩＦ（Ｅ））　画分とした。ＢＳＡをスタンダードとして用いたローリー法による蛋白定量の結果、５３５μｇ／ｍｌのｒＯＣＩＦ（Ｅ）１．５ｍｌ　が得られたことが明らかになった。
【００５８】
【実施例１４】
ＣＨＯ細胞による組み換え型ＯＣＩＦの生産
ｉ）　ＯＣＩＦの発現プラスミドの作製
実施例１１で得られた約１．６ｋｂ　のＯＣＩＦｃＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＢＫＯＣＩＦ　を制限酵素ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶ　で消化し、約１．４ｋｂ　のＯＣＩＦｃＤＮＡ断片を切り出し、アガロース電気泳動によって分離後、ＱＩＡＥＸ　ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。又、発現ベクターｐｃＤＬ−ＳＲ　α２９６　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．８，　ｐｐ４６６−４７２，　１９８８）　を制限酵素ＰｓｔＩ及びＫｐｎＩで消化し、約３．４ｋｂ　の発現ベクターＤＮＡ　断片をアガロース電気泳動によって分離後、ＱＩＡＥＸゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。ＤＮＡブランティングキット（宝酒造社）を用いて、これらの精製したＯＣＩＦｃＤＮＡ断片と発現ベクターＤＮＡ断片の末端を平滑化した。次に、ライゲーションキット　Ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて、平滑化された発現ベクターＤＮＡ断片にＯＣＩＦｃＤＮＡ断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５α（ギブコＢＲＬ社）の形質転換を行い、ＯＣＩＦ発現プラスミドｐＳＲ　αＯＣＩＦをもつ形質転換株を得た。
【００５９】
ｉｉ）　発現プラスミドの調製
実施例１３−ｉ）で得られたＯＣＩＦ発現プラスミドｐＳＲ　αＯＣＩＦをもつ形質転換株及びＷＯ９２／０１０５３号公報に示されるマウスＤＨＦＲ遺伝子発現プラスミドｐＢＡｄＤＳＶ　をもつ形質転換株をそれぞれ常法を用いて増殖させ、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）　の方法に従いアルカリ法及びポリエチレングリコール法で処理し、塩化セシウム密度勾配遠心法により精製した。
【００６０】
ｉｉｉ）　ＣＨＯｄｈＦｒ−　細胞の蛋白質不含培地への馴化
１０％牛胎児血清（ギブコＢＲＬ社）を含むＩＭＤＭ培地（ギブコＢＲＬ社）で継代されていたＣＨＯｄｈＦｒ−　細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ９０９６）は、無血清培地　ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１（ＪＲＨバイオサイエンス社）で馴化後、さらに蛋白質不含培地ＥＸ−ＣＥＬＬ　ＰＦ　ＣＨＯ（ＪＲＨバイオサイエンス社）で馴化させた。
【００６１】
ｉｖ）　ＯＣＩＦ発現プラスミド及びＤＨＦＲ発現プラスミドのＣＨＯｄｈＦｒ−　細胞への導入
実施例１４−ｉｉ）　で調製したＯＣＩＦ発現プラスミド　ｐＳＲαＯＣＩＦ及びＤＨＦＲ発現プラスミドｐＢＡｄＤＳＶ　を用いて実施例１４−ｉｉｉ）で調製したＣＨＯｄｈＦｒ−　細胞を下記に示すエレクトロポレーション法により形質転換した。ｐＳＲ　αＯＣＩＦプラスミド　２００μｇとｐＢＡｄＤＳＶ　プラスミド２０μｇを無菌的に１０％牛胎児血清（ギブコＢＲＬ社）を含むＩＭＤＭ培地（ギブコＢＲＬ社）０．８ｍｌ　に溶解後、この０．８ｍｌ　を用いて　２×１０７個のＣＨＯｄｈＦｒ−　細胞を浮遊させた。この細胞浮遊液をキュベット（バイオラッド社）に入れ、ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いて、３６０Ｖ、９６０　μＦの条件でエレクトロポレーション法により形質転換を行った。１０ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ　ＰＦ　ＣＨＯ培地の入った浮遊細胞用Ｔフラスコ（住友ベークライト社）にエレクトロポレーション済の細胞浮遊液を移し、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。ＥＸ−ＣＥＬＬ　ＰＦ　ＣＨＯ培地を用いて５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルマイクロプレートにまき、約２週間培養した。ＥＸ−ＣＥＬＬ　ＰＦ　ＣＨＯ培地は核酸を含まず、この培地では親株のＣＨＯｄｈＦｒ−　は増殖できないので、ＤＨＦＲを発現する細胞株だけが選択されてくる。ＯＣＩＦ発現プラスミドをＤＨＦＲ発現プラスミドの１０倍量用いているので、ＤＨＦＲを発現する細胞株の大部分はＯＣＩＦを発現する。得られたＤＨＦＲを発現する細胞株から培養上清中のＯＣＩＦ活性の高い細胞株を、実施例２で示した測定法によってスクリーニングした。得られたＯＣＩＦ高生産株につきＥＸ−ＣＥＬＬ　ＰＦ　ＣＨＯ培地を用いて限界希釈法により細胞のクローニングを行い、得られたクローンについて培養上清中のＯＣＩＦ活性の高い細胞株をスクリーニングし、ＯＣＩＦ高生産クローン５５６１を得た。
【００６２】
ｖ）　組み換え型ＯＣＩＦの生産
組み換えＯＣＩＦ（ｒＯＣＩＦ）　の生産するため、ＥＸ−ＣＥＬＬ　３０１　培地３ｌに形質転換ＣＨＯ細胞（５５６１）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　となるように接種し、スピナーフラスコを用いて３７℃で４、５日培養した。細胞の濃度が約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　になったところで、約２．７ｌの培地を回収した。約２．７ｌのＥＸ−ＣＥＬＬ　３０１　培地を加え、培養を繰り返した。３基のスピナーフラスコを用い、約２０ｌ　の培養液を採取した。
【００６３】
ｖｉ）　ＣＨＯ細胞由来組み換え型ＯＣＩＦの精製
実施例１４−（ｖ）　で得られた培養液１ｌ　に０．１％になるようにＣＨＡＰＳを加え、０．２２μｍ　のフィルター（ステリベックスＧＳ、ミリポア社）で濾過した後、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で平衡化させた５０ｍｌのヘパリン・セファロースＦＦカラム（２．６×１０ｃｍ、ファルマシア社）にかけた。０．１％ＣＨＡＰＳを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５　で洗浄した後、１００　分間でＮａＣｌを２Ｍにする直線勾配、流速４ｍｌ／分にて溶出を行い、８ｍｌ／フラクションにて分取を行った。各フラクション　１５０μｌ　を用いて実施例２の方法に従ってＯＣＩＦ活性を測定し、約　０．６〜１．２Ｍで溶出されるＯＣＩＦ活性画分　１１２ｍｌを得た。
【００６４】
得られたＯＣＩＦ活性画分　１１２ｍｌを０．１　％ＣＨＡＰＳを含む　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５　で１２００ｍｌに希釈した後、０．１　％ＣＨＡＰＳを含む　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５で平衡化させたアフィニティカラム（ブルー　−５ＰＷ，　０．５×５ｃｍ　、トーソー社）にかけた。０．１　％ＣＨＡＰＳを含む　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５　で洗浄した後、９０分間でＮａＣｌを３Ｍにする直線勾配、流速０．５ｍｌ／分にて溶出を行い、０．５ｍｌ／フラクションにて分取を行った。
【００６５】
得られたフラクション各４μｌ　を用いて実施例４の方法に従って還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、フラクション３０〜３８には還元条件下で約６０ｋＤ、非還元条件下で約６０ｋＤと約　１２０ｋＤのＯＣＩＦバンドのみが検出されたので、フラクション３０〜３８を集め精製ＣＨＯ細胞由来組み換え型ＯＣＩＦ〔ｒＯＣＩＦ（Ｃ）〕画分とした。ＢＳＡをスタンダードとしたローリー法による蛋白定量の結果、１１３　μｇ／ｍｌのｒＯＣＩＦ（Ｃ）４．５ｍｌが得られたことが明らかになった。
【００６６】
【実施例１５】
組み換え型ＯＣＩＦのＮ末端構造解析
３μｇの精製ｒＯＣＩＦ（Ｅ）及びｒＯＣＩＦ（Ｃ）を、プロスピン（ＰｒｏＳｐｉｎ，パーキンエルマー社）　を用いてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に固定し、２０％メタノールで洗浄した後、プロテインシーケンサー（プロサイス、４９２　型、パーキンエルマー社）を用いてＮ末端アミノ酸配列分析を行った。結果を配列表配列番号７に示す。
ｒＯＣＩＦ（Ｅ）と　ｒＯＣＩＦ（Ｃ）　のＮ末端アミノ酸は、配列表配列番号５に記載したアミノ酸配列の翻訳開始点　Ｍｅｔから２２番目の　Ｇｌｕで、Ｍｅｔ　から　Ｇｌｎまでの２１アミノ酸はシグナルペプチドであることが明らかになった。又、ＩＭＲ−９０培養液から精製し得られた天然型ＯＣＩＦのＮ末端アミノ酸配列が分析不能であったのは、Ｎ末端のＧｌｕ　が培養中又は精製中にピログルタミン酸に変換したためと考えられた。
【００６７】
【実施例１６】
組み換え型（ｒ）ＯＣＩＦ及び天然型（ｎ）ＯＣＩＦの生物活性
ｉ）　マウス骨髄細胞系での、ビタミンＤ３で誘導される破骨細胞形成の抑制
９６ウェルマイクロプレートに、２×１０‐８Ｍ活性型ビタミンＤ３及び１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ社）で２５０ｎｇ／ｍｌから連続的に二分の一希釈した精製ｒＯＣＩＦ（Ｅ）及び　ｎＯＣＩＦ　１００μｌ　を入れた。このウェルに生後約１７日のマウス骨髄細胞３×１０５個を　１００μｌ　の１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地に懸濁させて播種し、５％　ＣＯ２、３７℃、湿度　１００％にて一週間培養した。培養７日後に、実施例２の方法に従って酸性ホスファターゼ活性測定キット（Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　、カタログＮｏ．３８７−Ａ，シグマ社）を用いた染色を行い破骨細胞形成を検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少をＯＣＩＦ活性とした。酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少率は、染色した細胞の色素を可溶化し、その吸光度を測定することにより算出した。即ち、細胞を固定し染色した各ウェルに０．１Ｎ水酸化ナトリウム−ジメチルスルフォキシド混合液（１：１）　１００μｌ　を加えよく振盪した。色素を十分に溶解させた後、マイクロプレートリーダー（イムノリーダーＮＪ−２０００、インターメッド社）を用い、測定波長　５９０ｎｍ、対照波長　４９０ｎｍにて吸光度を測定した。又、吸光度を測定する際のブランクウェルとして、ビタミンＤ３未添加のウェルを用いた。結果は、ＯＣＩＦ未添加のウェルでの吸光度値を　１００とした百分率値で表し、表５に示す。
ｎＯＣＩＦと同様にｒＯＣＩＦ（Ｅ）にも、１６ｎｇ／ｍｌ　以上の濃度で用量依存的な破骨細胞形成抑制活性が見られた。
【００６８】
【表５】
2004000237.tif 000007
【００６９】
ｉｉ）　ストローマ細胞とマウス脾臓細胞の共培養系でのビタミンＤ３で誘導される破骨細胞形成の抑制
ビタミンＤ３　で誘導されるストローマ細胞とマウス脾臓細胞の共培養系での破骨細胞形成の試験は、宇田川らの方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２５，　ｐ１８０５−１８１３，１９８９）　に従って行った。即ち、９６ウェルマイクロプレートに２×１０‐８Ｍ活性型ビタミンＤ３、２×１０‐７でデキサメサゾン及び１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ社）で、連続的に希釈した精製　ｒＯＣＩＦ（Ｅ）、　ｒＯＣＩＦ（Ｃ）　及びｎＯＣＩＦ１００μｌを入れた。このウェルにマウス骨髄由来ストローマ細胞株ＳＴ２細胞　（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ−ＲＣＢ０２２４）　５×１０３個と生後約８週間の　ｄｄｙマウス脾臓細胞１×１０５個を　１００μｌ　の１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地に懸濁させて播種し、５％ＣＯ２、３７℃、湿度　１００％にて５日間培養した。培養５日後にリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後、エタノール／アセトン（１：１）溶液で細胞を室温にて１分間固定し、破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キット（Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ、カタログＮｏ．３８７−Ａ，　シグマ社）を用いた染色で検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少をＯＣＩＦ活性とした。又、酸性ホスファターゼ活性陽性細胞数の減少率は実施例１６−ｉ）に記載した方法に従って染色された細胞の色素を溶解させて算出した。ｒＯＣＩＦ（Ｅ）とｒＯＣＩＦ（Ｃ）を用いて試験した結果を表６に、ｒＯＣＩＦ（Ｅ）とｎＯＣＩＦ　を用いて試験した結果を表７に、それぞれ示す。
ｎＯＣＩＦと同様にｒＯＣＩＦ（Ｅ）及びｒＯＣＩＦ（Ｃ）についても、６〜１６ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で容量依存的な破骨細胞形成抑制活性が見られた。
【００７０】
【表６】
2004000237.tif 000008
【００７１】
2004000237.tif 000009
【００７２】
ｉｉｉ）　ＰＴＨで誘導される破骨細胞形成の抑制
ＰＴＨで誘導される破骨細胞形成の試験は、高橋らの方法　（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　　Ｖｏｌ．１２２，　ｐ１３７３−１３８２，　１９８８）に従って行った。即ち、９６ウェルマイクロプレートに２×１０‐８ＭＰＴＨ及び１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ギブコ社）で、１２５ｎｇ／ｍｌから連続的に希釈したｎＯＣＩＦ及び精製ｒＯＣＩＦ（Ｅ）　１００μｌ　を入れた。このウェルに生後約１７日のマウス骨髄細胞３×１０５個を１００μｌの１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地に懸濁させて播種し、５％　ＣＯ２、３７℃、湿度１００　％にて５日間培養した。培養５日後にリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後エタノール／アセトン（１：１）溶液で細胞を室温にて１分間固定し、破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キット（Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　、カタログ　Ｎｏ．３８７−Ａ，シグマ社）を用いた染色で検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少をＯＣＩＦ活性とした。又、酸性ホスファターゼ活性陽性細胞数の減少率は実施例１６−ｉ）に記載した方法に従って染色された細胞の色素を溶解させて算出した。結果を表８に示す。
ｎＯＣＩＦ　と同様にｒＯＣＩＦ（Ｅ）についても、１６ｎｇ／ｍｌ　以上の濃度で容量依存的な破骨細胞形成抑制活性が見られた。
【００７３】
【表８】
2004000237.tif 000010
【００７４】
ｉｖ）　ＩＬ−１１で誘導される破骨細胞形成の抑制
ＩＬ−１１　で誘導される破骨細胞形成の試験は、田村らの方法　（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．９０，　ｐ１１９２４−１１９２８，　１９９３）に従って行った。即ち、９６ウェルマイクロプレートに　２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−１１及び１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ社製）で希釈したｎＯＣＩＦ　及び精製ｒＯＣＩＦ（Ｅ）　１００μｌ　を入れた。このウェルにマウス新生児頭蓋骨由来前脂肪細胞株　ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６　細胞（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ−ＲＣＢ１１２７）５×１０３個と生後約８週間の　ｄｄｙマウス脾臓細胞１×１０５個を　１００μｌの１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地に懸濁させて播種し、５％　ＣＯ２、３７℃、湿度１００　％にて５日間培養した。培養５日後にリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後エタノール／アセトン（１：１）溶液で細胞を室温にて１分間固定し、破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キット（Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　、カタログ　Ｎｏ．３８７−Ａ，　シグマ社）を用いた染色で検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞数を計測し、その減少をＯＣＩＦ活性とした。結果を表９に示す。
ｎＯＣＩＦ　及びｒＯＣＩＦ（Ｅ）とも、２ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で容量依存的にＩＬ−１１　で誘導される破骨細胞形成を抑制する活性が見られた。
【００７５】
【表９】
2004000237.tif 000011
【００７６】
このように種々の標的細胞を用いた破骨細胞形成の試験系において、ＯＣＩＦはビタミンＤ３、ＰＴＨ、及びＩＬ−１１　等の破骨細胞形成誘導因子による破骨細胞の形成をほぼ同じ濃度で抑制することが明らかになった。従って、ＯＣＩＦはこのような様々な骨吸収促進物質で誘導される異なるタイプの骨量減少症の治療に、効果的に使用出来る可能性が示唆された。
【００７７】
【実施例１７】
モノマー型及びダイマー型ＯＣＩＦサンプルの調製
ｒＯＣＩＦ（Ｅ）及びｒＯＣＩＦ（Ｃ）それぞれ　１００μｇを含むサンプルに、１／１００容量の２５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を加えた後、０．１％ＴＦＡを含む３０％アセトニトリルで平衡化した逆相カラム（ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ、２．０×２５０ｍｍ、ワイエムシー社）にかけ、５０分間でアセトニトリルを５５％にする直線勾配、流速０．２ｍｌ／分にて溶出を行い、各ＯＣＩＦピークを分取した。得られたピーク画分を凍結乾燥することにより、モノマー型ＯＣＩＦ及びダイマー型ＯＣＩＦを得た。
【００７８】
【実施例１８】
組み換え型ＯＣＩＦの分子量測定
実施例３−ｖｉ）　の方法で逆相カラムを用いて精製したモノマー型及びダイマー型ｎＯＣＩＦと実施例１７記載の方法で精製したモノマー型及びダイマー型ｒＯＣＩＦ約１μｇを含むサンプルを減圧濃縮した。これらのサンプルにつき、実施例４の方法でＳＤＳ処理、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動、及び銀染色を行った。非還元条件下及び還元条件下で電気泳動した結果を、図６及び図７にそれぞれ示す。
【００７９】
その結果、非還元条件下では、何れのモノマー型サンプルでも６０ｋＤの蛋白質バンドが検出され、又、何れのダイマー型サンプルでも　１２０ｋＤの蛋白質バンドが検出された。又、還元条件下では何れのサンプルでも約６０ｋＤの蛋白質バンドのみが検出された。従って、ＩＭＲ−９０細胞由来　ｎＯＣＩＦ、２９３／ＥＢＮＡ細胞由来組み換え型ＯＣＩＦ、及びＣＨＯ細胞由来組み換え型ＯＣＩＦの各々のモノマー型とダイマー型の分子量はほぼ同一であることが示された。
【００８０】
【実施例１９】
ＩＭＲ−９０細胞由来天然型ＯＣＩＦと組み換え型ＯＣＩＦのＮ−結合型糖鎖の除去と分子量測定
実施例３−ｖｉ）　の方法で逆相カラムを用いて精製したモノマー型及びダイマー型ｎＯＣＩＦと実施例１７記載の方法で精製したモノマー型及びダイマー型ｒＯＣＩＦの各々を約５μｇ含むサンプルを減圧濃縮した。これらのサンプルに１００ｍＭ　２−メルカプトエタノールを加えた５０ｍＭリン塩緩衝液、ｐＨ８．６，　９．５μｌ　を加えて溶解させ、更に２５０Ｕ／ｍｌ　Ｎ−グリカナーゼ溶液（生化学工業社）０．５　μｌ　を加え３７℃で一日放置した。これらのサンプルに２ｍＭ　ＭＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ、及び０．０２％ブロモフェノールブルーを含む　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ８．０，　１０μｌ　を加え、１００　℃で５分間加熱した。これらのサンプルの１μｌ　を実施例４の方法でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動した後、銀染色した。結果を図８に示す。
【００８１】
その結果、Ｎ−グリカナーゼ処理によりＮ−結合糖鎖を除去したＯＣＩＦ蛋白質の還元条件下での分子量は、いずれも約４０ｋＤであることが示された。糖鎖除去の処理を行っていないＩＭＲ−９０細胞由来ｎＯＣＩＦ，２９３／ＥＢＮＡ細胞由来ｒＯＣＩＦ、及びＣＨＯ細胞由来ｒＯＣＩＦの各々の還元条件下での分子量はいずれも約６０ｋＤであることから、これらのＯＣＩＦはその分子内にＮ−結合糖鎖を含有する糖蛋白質であることが明らかになった。
【００８２】
【実施例２０】
ＯＣＩＦ類縁体（バリアント）ｃＤＮＡのクローニング及び塩基配列の決定
実施例１０及び１１で示したように、純化したいくつかの陽性ファージのひとつからｐＢＫＣＭＶ（ストラータジーン社）にＯＣＩＦ　ｃＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＢＫＯＣＩＦ　を持つ形質転換株を得たが、その際、他のいくつかの陽性ファージからも長さの異なるインサートが挿入されたプラスミドを持つ形質転換株が得られた。これらのプラスミドを持つ形質転換株を増殖させ、常法によりプラスミドを精製した。これらのインサートＤＮＡ　の塩基配列をタックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット（パーキンエルマー社）を用いて決定した。用いたプライマーはＴ３，Ｔ７プライマー（ストラータジーン社）及びＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列に基づいて設計された合成プライマーを用いた。オリジナルタイプのＯＣＩＦ以外に、ＯＣＩＦバリアントは全部で４種類（ＯＣＩＦ２，　３，　４，　５）　存在した。決定されたＯＣＩＦ２ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号８にその配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号９に示す。決定されたＯＣＩＦ３　ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１０にその配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１１　に示す。決定されたＯＣＩＦ４　ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１２にその配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１３に示す。決定されたＯＣＩＦ５　ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１４にその配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１５に示す。これらのＯＣＩＦバリアントの構造の特徴を、図９〜１２及び以下の記載をもって、簡単に説明する。
【００８３】
ＯＣＩＦ２
ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列（配列番号６）の　２６５番目のグアニンから２８５　番目のグアニンまでの２１ｂｐの欠失があり、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の６８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）から７４番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までの７アミノ酸の欠失がある。
【００８４】
ＯＣＩＦ３
ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列（配列番号６）の９番目のシチジンがグアニンに変換していて、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の−１９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）がリジン（Ｌｙｓ）に変わっている。但し、これはシグナル配列の中のアミノ酸置換であり、分泌されるＯＣＩＦ３には影響しないと思われる。
ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列（配列番号６）の８７２番目のグアニンから９８８番目のグアニンまでの　１１７ｂｐの欠失があり、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の　２７０番目のスレオニン（Ｔｈｒ）から３０８　番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの３９アミノ酸の欠失がある。
【００８５】
ＯＣＩＦ４
ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列（配列番号６）の９番目のシチジンがグアニンに変換していて、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の−１９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）がリジン（Ｌｙｓ）に変わっている。又、２２番目のグアニンがチミジンに変換していて、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の−１４番目のアラニン（Ａｌａ）がセリン（Ｓｅｒ）に変わっている。但し、これらはシグナル配列の中のアミノ酸置換であり、分泌されるＯＣＩＦ４には影響しないと思われる。
ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列（配列番号６）の　４００番目と　４０１番目の間に約　４ｋｂのイントロン２の挿入があり、オープンリーリングフレームがその中で止まる。アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の　１１２番目のアラニン（Ａｌａ）の後に２１アミノ酸からなる新規なアミノ酸配列が付加されている。
【００８６】
ＯＣＩＦ５
ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列（配列番号６）の９番目のシチジンがグアニンに変換していて、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の−１９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）がリジン（Ｌｙｓ）に変わっている。但し、これはシグナル配列の中のアミノ酸置換であり、分泌されるＯＣＩＦ５には影響しないと思われる。
ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列（配列番号６）の４００番目と４０１番目の間に約１．８　ｋｂのイントロン２の後半部分の挿入があり、オープンリーリングフレームがその中で止まる。アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の　１１２番目のアラニン（Ａｌａ）の後に１２アミノ酸からなる新規なアミノ酸配列が付加されている。
【００８７】
【実施例２１】
ＯＣＩＦ類縁体（バリアント）の生産
ｉ）　ＯＣＩＦバリアントｃＤＮＡの発現プラスミドの作製
実施例２０で得られたＯＣＩＦバリアントｃＤＮＡのうち、ＯＣＩＦ　２，　３　のｃＤＮＡがそれぞれ挿入されたプラスミドｐＢＫＯＣＩＦ２、ｐＢＫＯＣＩＦ３を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造社）で消化し、ＯＣＩＦ　２及び３　のｃＤＮＡをそれぞれ切り出し、アガロース電気泳動によって分離後、ＱＩＡＥＸ　ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。これらのＯＣＩＦ　２及び３　のｃＤＮＡを、あらかじめ制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ　（宝酒造社）で消化しておいた発現プラスミドｐＣＥＰ４（インヴィトロージェン社）　に、ライゲーションキット　Ｖｅｒ．２（宝酒造社）　を用いて挿入し、大腸菌　ＤＨ５α（ギブコＢＲＬ社）の形質転換を行った。
又、実施例２０で得られたＯＣＩＦバリアントｃＤＮＡのうち、ＯＣＩＦ４　のｃＤＮＡをが挿入されたプラスミドｐＢＫＯＣＩＦ４を制限酵素ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ（宝酒造社）で消化し、アガロース電気泳動によって分離後、ＱＩＡＥＸ　ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。この　ＯＣＩＦ４のｃＤＮＡを、あらかじめ制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ　（宝酒造社）で消化しておいた発現プラスミドｐＣＥＰ４（インヴィトロージェン社）　に、ライゲーションキット　Ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて挿入し、大腸菌ＤＨ５α（ギブコＢＲＬ社）の形質転換を行った。
【００８８】
又、実施例２０で得られたＯＣＩＦバリアントｃＤＮＡのうち、ＯＣＩＦ５　のｃＤＮＡをが挿入されたプラスミドｐＢＫＯＣＩＦ５を制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ（宝酒造社）で消化し、ＯＣＩＦ５ｃＤＮＡ　のコーディング領域の５’領域を切り出し、アガロース電気泳動によって分離後、ＱＩＡＥＸ　ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。実施例１３‐ｉ）で得られたＯＣＩＦ発現プラスミドｐＣＥＰＯＣＩＦを制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ（宝酒造社）で消化し、ＯＣＩＦｃＤＮＡのコーディング領域の５’領域を取り除き、ｐＣＥＰプラスミドとＯＣＩＦｃＤＮＡの３’領域を含んだＤＮＡ断片ｐＣＥＰＯＣＩＦ−３’　をアガロース電気泳動によって分離後、ＱＩＡＥＸ　ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。この　ＯＣＩＦ５　ｃＤＮＡ　のＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片をｐＣＥＰＯＣＩＦ−３’　にライゲーションキット　Ｖｅｒ．２（宝酒造社）　を用いて挿入し、大腸菌ＤＨ５α（ギブコＢＲＬ社）の形質転換を行った。
得られた形質転換株を増殖させ、ＯＣＩＦ２，　３，　４，　５のｃＤＮＡが挿入された発現プラスミドｐＣＥＰＯＣＩＦ　２，　３，　４，　５　を、キアゲンカラム（キアゲン社）　を用いて精製した。ＯＣＩＦバリアント発現プラスミドをエタノールによって沈澱させた後、無菌蒸留水に溶解し以下の操作に用いた。
【００８９】
ｉｉ）　ＯＣＩＦバリアントｃＤＮＡのトランジエントな発現及びその活性の測定
実施例２１−ｉ）で得られたＯＣＩＦバリアント発現プラスミドｐＣＥＰＯＣＩＦ　２，　３，　４，　５　を用いて、実施例１３−ｉｉ）　で述べた方法でＯＣＩＦバリアントをトランジエントに発現させ、それらの活性を調べた。その結果、これらのＯＣＩＦバリアントに弱い活性を認めた。
【００９０】
【実施例２２】
ＯＣＩＦ変異体の作製
ｉ）　ＯＣＩＦ変異体ｃＤＮＡサブクローニング用プラスミドベクターの作製
実施例１１記載のプラスミドベクター５μｇ　を、制限酵素ＢａｍＨＩ　及びＸｈｏＩ（宝酒造社）で切断した。切断したＤＮＡを調製用アガロースゲル電気泳動に供した。ＯＣＩＦｃＤＮＡ全長を含む約　１．６キロベースペア（ｋｂ）のＤＮＡ断片を単離し、ＱＩＡＥＸ　ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）により精製し、２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解したＤＮＡ溶液１を得た。次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ＋（ストラータジーン社）３μｇ　を制限酵素ＢａｍＨＩ　及びＸｈｏＩ（宝酒造社）で切断した。切断したＤＮＡを調製用アガロースゲル電気泳動に供した。約３．０　ｋｂのＤＮＡ断片を単離し、ＱＩＡＥＸ　ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）により精製し、２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解したＤＮＡ溶液２を得た。１μｌ　のＤＮＡ溶液２と４μｌ　のＤＮＡ溶液１を混合し、５μｌ　のＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液（宝酒造社）を添加し混合後、１６℃で３０分間保温し、ライゲーション反応を行った。尚、以下のライゲーション反応は全て１６℃３０分の保温条件で行った。
【００９１】
このライゲーション反応液を用い、以下の条件で大腸菌の形質転換を行った。尚、以後大腸菌の形質転換は以下の条件で行った。このライゲーション反応液５μｌ　と大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞（ギブコＢＲＬ社）１００　μｌ　とを１５ｍｌ用滅菌チューブ（岩城ガラス社）中で混合し、氷水中３０分放置した。４２℃４５秒保温後、２５０　μｌ　のＬ培地　（１％トリプトン、０．５　％イーストエキストラクト、１％　ＮａＣｌ）を添加し攪拌しながら３７℃で培養した。５０μｌ　の菌液を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｍｌのＬ寒天培地上にスプレッドした。３７℃で一晩培養し、生育してきたコロニー６種を２ｍｌのＬアンピシリン液体培地でさらに一晩培養し、各株が持つプラスミドの構造を調べた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ＋のＢａｍＨＩ　ＸｈｏＩ切断部位にＯＣＩＦｃＤＮＡ全長を含む約１．６ｋｂ　のＤＮＡ断片が挿入された構造を持つプラスミド（以後　ｐＳＫ＋−ＯＣＩＦ　と呼ぶ）を得た。
【００９２】
ｉｉ）　ＣｙｓをＳｅｒに置換した変異体の作製
（１）　変異の導入
配列表配列番号４に記載のアミノ酸配列中、１７４，　１８１，　２５６，　２９８及び３７９　番のＣｙｓ残基を　Ｓｅｒ残基に置換した変異体を作製した。１７４ＣｙｓをＳｅｒ　に置換した変異体をＯＣＩＦ−Ｃ１９Ｓ　、１８１ＣｙｓをＳｅｒ　に置換した変異体をＯＣＩＦ−Ｃ２０Ｓ　、２５６Ｃｙｓを　Ｓｅｒに置換した変異体をＯＣＩＦ−Ｃ２１Ｓ　、２９８ＣｙｓをＳｅｒ　に置換した変異体をＯＣＩＦ−Ｃ２２Ｓ　、３７９Ｃｙｓを　Ｓｅｒに置換した変異体をＯＣＩＦ−Ｃ２３Ｓ２と、それぞれ名付けた。変異体作製のためにまず、各Ｃｙｓ　残基をコードする塩基配列をＳｅｒ　残基をコードする塩基配列に置換した。変異導入は二段階のＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）　により行った。以後、二段階ＰＣＲ反応と呼ぶ。第一段階は２つのＰＣＲ反応より成る（ＰＣＲ１及びＰＣＲ２）。
【００９３】
2004000237.tif 000012
【００９４】
ＰＣＲ２反応液
2004000237.tif 000013
【００９５】
各変異導入時には、プライマーの種類だけを変え、他の反応組成は同一とした。各反応で用いたプライマーを表１０に、その配列を配列表配列番号２０、２３、２７、３０〜４０に示す。ＰＣＲ１反応液及びＰＣＲ２反応液をそれぞれ別の微量遠心チューブに入れ混合後、以下の条件でＰＣＲを行った。９７℃で３分処理後、９５℃１分、５５℃１分、７２℃３分の３段階の反応を２５回繰り返したのち、７０℃５分保温した。反応液の一部をアガロース電気泳動に供し、目的の長さのＤＮＡ断片が合成されていることを確認した。第一段階ＰＣＲ反応終了後、アミコンマイクロコン（アミコン社）により反応液からプライマーを除去し、滅菌蒸留水により最終液量を５０μｌ　に調製し、得られたＤＮＡ断片を用いさらに第２段階ＰＣＲ反応（ＰＣＲ３）を行った。
【００９６】
2004000237.tif 000014
【００９７】
【表１０】
2004000237.tif 000015
【００９８】
上記の溶液を微量遠心チューブに入れ混合後、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２と同一の条件でＰＣＲを行った。反応液の一部をアガロース（１％或いは１．５　％）電気泳動に供し、目的の長さのＤＮＡ断片が合成されていることを確認した。ＰＣＲにより得られたＤＮＡをエタノールにより沈殿させ、真空中で乾燥させ、４０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した。Ｃ１９Ｓ変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ａ、Ｃ２０Ｓ変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ｂ、Ｃ２１Ｓ変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ｃ、Ｃ２２Ｓ変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ｄ、Ｃ２３Ｓ変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ｅと名付けた。
【００９９】
溶液Ａ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩ（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約４００ｂｐ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液３）。次に、２μｇ　のｐＳＫ＋−ＯＣＩＦを制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩ（宝酒造社）により切断し、調製用電気泳動により約４．２ｋｂ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液４）。２μｌ　のＤＮＡ溶液３と３μｌ　のＤＮＡ溶液４を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液５μｌ　を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−Ｃ１９Ｓ　と名付けた。
【０１００】
溶液Ｂ２０μｌ　中のＣ２０Ｓ変異ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩ（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約４００ｂｐ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌの蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液５）。２μｌ　のＤＮＡ溶液５と３μｌ　のＤＮＡ溶液４を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液５μｌ　を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−Ｃ２０Ｓ　と名付けた。
【０１０１】
溶液Ｃ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩ（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約　４００ｂｐのＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液６）。２μｌ　のＤＮＡ溶液６と３μｌ　のＤＮＡ溶液４を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液５μｌ　を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−Ｃ２１Ｓ　と名付けた。
【０１０２】
溶液Ｄ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢｓｔＰＩ（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約６００ｂｐ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌの蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液７）。次に、２μｇのｐＳＫ＋−ＯＣＩＦ　を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢｓｔＰＩ　（宝酒造社）により切断し、調製用電気泳動により約４．０ｋｂ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌの蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液８）。２μｌ　のＤＮＡ溶液７と３μｌ　のＤＮＡ溶液８を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液５μｌ　を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−Ｃ２２Ｓ　と名付けた。
【０１０３】
溶液Ｅ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩ　及びＥｃｏＲＶ　（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約１２０ｂｐ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液９）。次に、２μｇ　のｐＳＫ＋−ＯＣＩＦ　を制限酵素ＢｓｔＥＩＩ及びＥｃｏＲＶ　（宝酒造社）により切断し、調製用電気泳動により約４．５ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液１０）。２μｌのＤＮＡ溶液９と３μｌ　のＤＮＡ溶液１０を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液５μｌ　を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−Ｃ２３Ｓ　と名付けた。
【０１０４】
（２）　変異体発現ベクターの構築
得られた目的のプラスミドＤＮＡ（ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−Ｃ１９Ｓ，　ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−Ｃ２０Ｓ　ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−Ｃ２１Ｓ，ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−Ｃ２２Ｓ，ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−Ｃ２３Ｓ）を制限酵素ＢａｍＨＩ　及びＸｈｏＩ（宝酒造社）で切断し、ＯＣＩＦｃＤＮＡ全長を含む約１．６ｋｂ　のＤＮＡ断片（目的の変異も含む）　を分離・精製し、滅菌蒸留水２０μｌ　に溶解した。それぞれＣ１９ＳＤＮＡ　溶液、Ｃ２０ＳＤＮＡ　溶液、Ｃ２１ＳＤＮＡ　溶液、Ｃ２２ＳＤＮＡ　溶液、Ｃ２３ＳＤＮＡ　溶液と名付けた。次に、発現ベクターｐＣＥＰ４（インヴィトロージェン社）５μｇ　を制限酵素ＢａｍＨＩ　及びＸｈｏＩ（宝酒造社）で切断し、約１０　ｋｂ　のＤＮＡを分離・精製し滅菌蒸留水４０μｌ　に溶解した（ｐＣＥＰ４ＤＮＡ溶液）。ｐＣＥＰ４ＤＮＡ溶液１μｌ　と各６μｌ　のＣ１９ＳＤＮＡ　溶液、Ｃ２０ＳＤＮＡ　溶液、Ｃ２１ＳＤＮＡ溶液、Ｃ２２ＳＤＮＡ　溶液、Ｃ２３ＳＤＮＡ　溶液を別々に混合し、各混合液に７μｌ　のＤＮＡライゲーションキット　Ｖｅｒ．２　Ｉ液を添加し、ライゲーション反応を行った。反応終了後、７μｌ　の反応液を用い、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞液１００ｍｌ　を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ｐＣＥＰ４のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ部位に約１．６ｋｂ　の各ＤＮＡ断片が挿入された目的の構造のプラスミドＤＮＡを持つ株計５種を選びだし、それぞれ、ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−Ｃ１９Ｓ，　ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−Ｃ２０Ｓ，ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−Ｃ２１Ｓ，ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−Ｃ２２Ｓ，ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−Ｃ２３Ｓ　と名付けた。
【０１０５】
ｉｉ）　ドメイン欠失変異体の作製
（１）　ドメイン欠失変異の導入
配列番号４に記載したアミノ酸中、２番のＴｙｒ　から４２番のＡｌａ　まで、４３番のＰｒｏから８４番の　Ｃｙｓまで、８５番のＧｌｕ　から　１２２番のＬｙｓ　まで、１２３番のＡｒｇ　から　１６４番の　Ｃｙｓまで、１７７番のＡｓｐ　から　２５１番のＧｌｎ　まで、２５３番のＩｌｅ　から３２６　番のＨｉｓ　までを、それぞれ欠失させた変異体を作製した。２番のＴｈｒ　から４２番のＡｌａまでを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＤＣＲ１　、４３番のＰｒｏ　から８４番の　Ｃｙｓまでを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＤＣＲ２　、８５番のＧｌｕ　から１２２番のＬｙｓ　までを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＤＣＲ３　、１２３　番のＡｒｇ　から１６４番のＣｙｓまでを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＤＣＲ４、１７７番のＡｓｐから２５１番のＧｌｎ　までを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＤＤＤ１、２５３番Ｉｌｅ　から　３２６番のＨｉｓ　までを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＤＤＤ２　と、それぞれ名付けた。ドメイン欠失変異の導入も、実施例２２−ｉｉ）　に記載の二段階ＰＣＲ法によって行った。各変異導入反応時に用いたプライマーを表１１に、その配列を配列表配列番号１９、２５、４０〜５３、及び５４に示す。
【０１０６】
【表１１】
2004000237.tif 000016
【０１０７】
ＰＣＲにより得られたＤＮＡをエタノールにより沈殿させ真空中で乾燥させ、４０μｌの滅菌蒸留水に溶解した。　ＤＣＲ１変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ｆ、ＤＣＲ２変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ｇ、ＤＣＲ３変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ｈ、ＤＣＲ４変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ｉ、ＤＤＤ１変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ｊ、ＤＤＤ２変異ＤＮＡ断片を含む溶液を溶液Ｋと名付けた。
【０１０８】
溶液Ｆ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約５００ｂｐ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液１１）。次に、２μｇ　のｐＳＫ＋−ＯＣＩＦ　を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（宝酒造社）により切断し、調製用電気泳動により約４．０ｋｂ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液１２）。２μｌ　のＤＮＡ溶液１１と３μｌのＤＮＡ溶液１２を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液５μｌ　を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により、ＯＣＩＦｃＤＮＡに目的の変異の導入されたプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ１と名付けた。
【０１０９】
溶液Ｇ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約５００ｂｐ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液１３）。２μｌ　のＤＮＡ溶液１３と３μｌ　のＤＮＡ溶液１２を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液を５μｌ　添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ２　と名付けた。
【０１１０】
溶液Ｈ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約５００ｂｐ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液１４）。２μｌ　のＤＮＡ溶液１４と３μｌ　のＤＮＡ溶液１２を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液を５μｌ　添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により、ＯＣＩＦｃＤＮＡに目的の変異の導入されたプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ３　と名付けた。
【０１１１】
溶液Ｉ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｐｈＩ（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約９００ｂｐ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液１５）。次に、２μｇ　のｐＳＫ＋−ＯＣＩＦ　を制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｐｈＩ（宝酒造社）により切断し、調製用電気泳動により約３．６ｋｂ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液１６）。２μｌのＤＮＡ溶液１５と３μｌのＤＮＡ溶液１６を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液５μｌ　を添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ４　と名付けた。
【０１１２】
溶液Ｊ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩ　及びＮｄｅＩ（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約　４００ｂｐのＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌの滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液１７）。２μｌのＤＮＡ溶液１７と３μｌ　のＤＮＡ溶液８を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液を５μｌ　添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＤＤ１　と名付けた。
【０１１３】
溶液Ｋ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩ　及びＮｄｅＩ（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約４００ｂｐのＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌの滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液１８）。２μｌのＤＮＡ溶液１８と３μｌのＤＮＡ溶液８を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液を５μｌ添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＤＤ２　と名付けた。
【０１１４】
（２）　変異体発現ベクターの構築
得られた目的のプラスミドＤＮＡ（ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ１，　ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ２，ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＸＲ３，ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ４，ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＤＤ１，ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＤＤＤ２）を制限酵素ＢａｍＨＩ　及びＸｈｏＩ（宝酒造社）で切断しＯＣＩＦｃＤＮＡ全長を含む約１．４−１．５　ｋｂのＤＮＡ断片（目的の変異も含む）を分離・精製し、滅菌蒸留水２０μｌ　に溶解した。それぞれをＤＣＲ１ＤＮＡ溶液、ＤＣＲ２ＤＮＡ　溶液、ＤＣＲ３ＤＮＡ　溶液、ＤＣＲ４ＤＮＡ　溶液、ＤＤＤ１ＤＮＡ　溶液、ＤＤＤ２ＤＮＡ　溶液と名付けた。実施例２２−ｉｉ）　に記載のｐＣＥＰ４　ＤＮＡ　溶液１μｌ　と各６μｌ　のＤＣＲ１ＤＮＡ　溶液、ＤＣＲ２ＤＮＡ　溶液、ＤＣＲ３ＤＮＡ　溶液、ＤＣＲ４ＤＮＡ　溶液、ＤＤＤ１ＤＮＡ　溶液、ＤＤＤ２ＤＮＡ溶液を別々に混合し、各混合液に７μｌ　のＤＮＡライゲーションバッファーを添加し、ライゲーション反応を行った。反応終了後、７μｌ　の反応液を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞からｐＣＥＰ４ＢａｍＨＩ　ＸｈｏＩ部位に各１．４−１．５ｋｂ　断片が挿入された構造のプラスミドＤＮＡを持つ株計６種を選びだした。目的の構造を持つプラスミドをそれぞれｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ１　、ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ２　、ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ３　、ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＤＣＲ４　、ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＤＤＤ１　、ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＤＤＤ２　と名付けた。
【０１１５】
ｉｉｉ）　Ｃ末端ドメイン欠失変異体の作製
（１）　Ｃ末端ドメイン欠失変異の導入
配列番号４に記載したアミノ酸中、３７９　番の　Ｃｙｓと３８０　番のＬｅｕ　、３３１番のＳｅｒから３８０番のＬｅｕ　まで、２５２番のＡｓｐから３８０番のＬｅｕ　まで、１７７番のＡｓｐ　から　３８０番のＬｅｕ　まで、１２３　番のＡｒｇ　から　３８０番のＬｅｕ　まで、８６番のＣｙｓから３８０番のＬｅｕ　までを、それぞれ欠失させた変異体を作製した。３７９番のＣｙｓと３８０　番のＬｅｕ　を欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＣＬ、３３１番のＳｅｒから３８０番のＬｅｕ　までを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＣＣ　、２５２番のＡｓｐ　から　３８０番のＬｅｕ　までを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＣＤＤ２、１７７番のＡｓｐ　から３８０番のＬｅｕ　までを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＣＤＤ１、１２３番のＡｒｇ　から３８０番のＬｅｕ　までを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＣＣＲ４　、８６番の　Ｃｙｓから　３８０番のＬｅｕ　までを欠失させた変異体をＯＣＩＦ−ＣＣＲ３　と、それぞれ名付けた。
【０１１６】
変異体ＯＣＩＦ−ＣＬ　の作製用の変異導入は、実施例２２−ｉｉ）　に記載の二段階ＰＣＲ法によって行った。変異導入反応時に用いたプライマーを表１２に、その塩基配列を配列表配列番号２３、４０、５５及び５６に示す。ＰＣＲにより得られたＤＮＡをエタノールにより沈殿させ、真空中で乾燥させ、４０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した　（溶液Ｌ）。
【０１１７】
溶液Ｌ２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩ　及びＥｃｏＲＶ　（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約１００ｂｐ　のＤＮＡ断片を分離・精製し２０μｌの滅菌蒸留水に溶解した（ＤＮＡ溶液１９）。次に、２μｌ　のＤＮＡ溶液９と３μｌの実施例２２−ｉｉ）　記載のＤＮＡ溶液１０を混合し、さらにＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液を５μｌ　添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＣＬと名付けた。変異体ＯＣＩＦ−ＣＣ　、変異体ＯＣＩＦ−ＣＤＤ２　、変異体ＯＣＩＦ−ＣＤＤ１　、変異体をＯＣＩＦ−ＣＣＲ４　、変異体ＯＣＩＦ−ＣＣＲ３　作製用の変異導入には、一段階のＰＣＲ法を用いた。以下に反応条件を示す。
【０１１８】
2004000237.tif 000017
【０１１９】
【表１２】
2004000237.tif 000018
【０１２０】
各変異導入時には、プライマーの種類だけを変え、他の反応組成は同一とした。
各反応での変異導入用プライマーを表１３に、その配列を配列表配列番号５７〜６１に示す。ＰＣＲ反応液を微量遠心チューブに入れ混合後、以下の条件でＰＣＲを行った。９７℃で３分処理後、９５℃３０秒、５０℃３０秒、７０℃３分の３段階の反応を２５回繰り返したのち、７０℃５分保温した。反応液の一部をアガロース電気泳動に供し、目的の長さのＤＮＡ断片が合成されていることを確認した。反応液からアミコン・マイクロコンによりプライマーを除去し、ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ真空中で乾燥させ、４０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した。各変異ＤＮＡ断片を含む溶液２０μｌ　中のＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ　によりＤＮＡを切断した。酵素切断終了後、ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ真空中で乾燥させ、２０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した。溶液をそれぞれＣＣＤＮＡ　溶液、ＣＤＤ２ＤＮＡ　溶液、ＣＤＤ１ＤＮＡ　溶液、ＣＣＲ４ＤＮＡ　溶液、ＣＣＲ３ＤＮＡ　溶液と名付けた。
【０１２１】
【表１３】
2004000237.tif 000019
【０１２２】
（２）　変異体発現ベクターの構築
ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＣＬ　を制限酵素ＢａｍＨＩ　及びＸｈｏＩ（宝酒造社）で切断し、ＯＣＩＦｃＤＮＡを含む約１．５　ｋｂのＤＮＡ断片（目的の変異も含む）を分離・精製し、滅菌蒸留水２０μｌに溶解した（ＣＬＤＮＡ　溶液）。実施例２２−ｉｉ）　に記載のｐＣＥＰ４　ＤＮＡ　溶液１μｌ　と各６μｌ　のＣＬＤＮＡ　溶液、ＣＣＤＮＡ　溶液、ＣＤＤ２ＤＮＡ　溶液、ＣＤＤ１ＤＮＡ　溶液、ＣＣＲ４ＤＮＡ　溶液、ＣＣＲ３ＤＮＡ　溶液を別々に混合し、７μｌ　のＤＮＡライゲーションキット　Ｖｅｒ．２　Ｉ液を添加し、ライゲーション反応を行った。反応終了後、７μｌ　の反応液を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から目的の変異を持つＯＣＩＦ　ｃＤＮＡ断片がｐＣＥＰ４　のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入された構造のプラスミドＤＮＡを持つ株計６種を選びだした。目的の構造を持つプラスミドをそれぞれ、ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＣＬ，　ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＣＣ，ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＣＤＤ２，ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＣＤＤ１，ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＣＣＲ４，ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＣＣＲ３と名付けた。
【０１２３】
ｉｖ）　Ｃ末端欠失変異体の作製
（１）　Ｃ末端欠失変異の導入
配列番号４に記載したアミノ酸中、３７１　番Ｇｌｎ　から　３８０番Ｌｅｕ　までを欠失させＬｅｕ−Ｖａｌ　の２残基を付加した変異体（ＯＣＩＦ−ＣＢｓｔ）、２９８番　Ｃｙｓから　３８０番Ｌｅｕまでを欠失させＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　の残基を付加した変異体（ＯＣＩＦ−ＣＳｐｈ）、１６７番Ａｓｎから　３８０番Ｌｅｕ　までを欠失させた変異体（ＯＣＩＦ−ＣＢｓｐ）、６２番　Ｃｙｓから　３８０番Ｌｅｕまでを欠失させＬｅｕ−Ｖａｌ　の２残基を付加した変異体（ＯＣＩＦ−ＣＰｓｔ）を作製した。各２μｇ　のｐＳＫ＋−ＯＣＩＦ　を制限酵素ＢｓｔＰＩ　、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ（宝酒造社）、及びＢｓｐＥＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社）で切断し、フェノール処理、エタノール沈殿によりＤＮＡを精製し、１０μｌ　の滅菌蒸留水に溶解した。各２μｌ　の溶液を用いＤＮＡブランティングキット（宝酒造社）により各ＤＮＡの末端を平滑化した（最終容量５μｌ）。この反応液に、アンバーコドンを含むＸｂａＩリンカー（５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧ−３’）１μｇ（１μｌ）と、６μｌ　のＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２　Ｉ液を添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液６μｌ　を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、ＤＮＡ構造の解析により目的のプラスミドＤＮＡを持つ株を選びだした。ＤＮＡ構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドＤＮＡをｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＣＢｓｔ、ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＣＳｐｈ、ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＣＢｓｐ　、ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＣＰｓｔ　と名付けた。
【０１２４】
（２）　変異体発現ベクターの構築
得られたプラスミドＤＮＡ（ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＣＢｓｔ、ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＣＳｐｈ、ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＣＢｓｐ、ｐＳＫ−ＯＣＩＦ−ＣＰｓｔ）を制限酵素ＢａｍＨＩ　及びＸｈｏＩ（宝酒造社）で切断し、ＯＣＩＦｃＤＮＡ全長を含む約１．５　キロベースペア（ｋｂ）のＤＮＡ断片（目的の変異も含む）を分離・精製し、滅菌蒸留水２０μｌ　に溶解した（それぞれＣＢｓｔＤＮＡ　溶液、ＣＳｐｈＤＮＡ　溶液、ＣＢｓｐＤＮＡ　溶液、ＣＰｓｔＤＮＡ　溶液と名付けた）。
実施例２２−ｉｉ）に記載のｐＣＥＰ４　ＤＮＡ　溶液１μｌ　と各６μｌ　のＣＢｓｔＤＮＡ　溶液、ＣＳｐｈＤＮＡ　溶液、ＣＢｓｐＤＮＡ　溶液、ＣＰｓｔＤＮＡ　溶液を別々に混合し、各混合液に７μｌ　のＤＮＡライゲーションキット　Ｖｅｒ．２　Ｉ液を添加し、ライゲーション反応を行った。反応終了後、７μｌ　の反応液を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から目的の変異を持つＯＣＩＦｃＤＮＡ断片がｐＣＥＰ４　のＸｈｏＩ　ＢａｍＨＩ部位間に挿入された構造のプラスミドＤＮＡを持つ株計５種を選びだした。目的の構造を持つプラスミドをそれぞれ、ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＣＢｓｔ，　ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＣＳｐｈ，ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＣＢｓｐ，ｐＣＥＰ４−ＯＣＩＦ−ＣＰｓｔと名付けた。
【０１２５】
ｖ）　変異体発現ベクターの調製
変異体発現ベクターを持つ大腸菌（計２１種類）を増殖させ、各種変異体発現ベクターをキアゲンカラム（キアゲン社）を用いて精製した。各発現ベクターはエタノールによって沈殿させた後、滅菌蒸留水に溶解し以下の操作に用いた。
【０１２６】
ｖｉ）　変異体ｃＤＮＡのトランジェントな発現及びその活性の測定
実施例２２−ｖ）で精製した各種ＯＣＩＦ変異体発現プラスミドを用い、実施例１３の方法に従いＯＣＩＦ変異体を発現させた。以下に変更した点のみを記する。ＤＮＡ導入には２４ウェルプレートを用いた。２×１０５個の２９３／ＥＢＮＡ細胞を１０％牛胎児血清を含むＩＭＤＭ培地を用いて各ウェルに植え込んだ。ＤＮＡ導入の際用いた変異体発現ベクターとリポフェクタミンの量は、それぞれ１μｇ　及び４μｌ　であった。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ社）で希釈し最終容量を０．５ｍｌ　とした。変異体発現ベクターとリポフェクタミンの混合液を細胞に添加し、２４時間３７℃で　ＣＯ２インキュベーター中で培養した後混合液を除去し、０．５ｍｌ　のＥｘ−ｃｅｌｌ　３０１　培地（ＪＳＲ社）を加え、さらに４８時間３７℃で　ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培地を回収し、これを変異体活性測定用サンプルとした。得られた各変異体の塩基配列を配列表配列番号８３〜１０３　に、その配列から推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号６２〜８２に、それぞれ示す。ＯＣＩＦの活性測定は実施例１３に従った。また、実施例２４に記
載のＥＩＡ法により、ＯＣＩＦの抗原量を定量した。表１４に未改変ＯＣＩＦと比較した抗原量当たりの活性を示す。
【０１２７】
【表１４】
2004000237.tif 000020
【０１２８】
ｖｉ）　ウェスタンブロッティング解析
活性測定に用いたサンプルの１０μｌ　をウェスタンブロット解析に供した。サンプル１０μｌ　に１０μｌ　のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌブロムフェノール　ブルー（ｐＨ　６．８））を加え、１００　℃で３分煮沸し非還元状態で１０％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行った。泳動終了後、セミドライブロッティング装置（バイオラッド社）によりＰＶＤＦメンブレン（ＰｒｏＢｌｏｔｔＲ、パーキンエルマー社）に蛋白質をブロッティングした。そのメンブレンをブロッキング後、実施例２４に記載のＥＩＡ用西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗ＯＣＩＦ抗体とともに、３７℃で２時間保温した。
洗浄後ＥＣＬシステム（アマシャム社）により抗ＯＣＩＦ抗体に結合する蛋白質を検出した。ＯＣＩＦでは、約１２０　キロダルトン（ｋＤ）及び６０ｋＤのバンドが検出された。
一方、ＯＣＩＦ−Ｃ２３Ｓ　、ＯＣＩＦ−ＣＬ　、ＯＣＩＦ−ＣＣ　では、ほとんど６０ｋＤのバンドのみが検出された。また、ＯＣＩＦ−ＣＤＤ２　及びＯＣＩＦ−ＣＤＤ１　ではそれぞれ約４０−５０ｋＤ及び３０−４０ｋＤ　のバンドが主要なバンドとして検出された。以上の結果より、ＯＣＩＦでは、配列表配列番号４のアミノ酸配列にける　３７９番目のＣｙｓ残基が二量体形成に係わっていること、単量体でも活性を保持していること、及び１７７　番Ａｓｐ
から　３８０番Ｌｅｕ　までの残基を欠失させても活性を保持してることが明らかとなった。
【０１２９】
【実施例２３】
ヒトＯＣＩＦゲノムＤＮＡの分離
Ｉ）　ヒトゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ヒト胎盤の染色体ＤＮＡとλＦＩＸ　ＩＩベクターを用いて作製されたゲノム・ライブラリーをストラタジーン社から購入し、これをＯＣＩＦｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングした。スクリーニングは、基本的にはゲノム・ライブラリーに添付されているプロトコールに従って実施したが、ファージ、大腸菌、ＤＮＡを扱う一般的方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　に従って行った。
購入したゲノムＤＮＡライブラリーのタイターを検定したのち、１×１０６　ｐｆｕのファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＡに感染させ、２０枚のプレート（９×１３ｃｍ）　にプレート当たり９ｍｌのトップ・アガロースとともに蒔いた。プレートを一夜３７℃でインキュベートしたのち、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜（アマシャム社）をアガープレート上に乗せてファージを転写した。ファージの転写したナイロン膜を１．５Ｍ　ＮａＣｌ／０．５Ｍ　ＮａＯＨ溶液で湿らせた濾紙上に１分間乗せ、その後１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と１．５Ｍ　ＮａＣｌ／０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．５）でそれぞれ１分ずつ処理して中和したのち、最後に２ＸＳＳＣで湿らせた濾紙の上に移した。その後、このナイロン膜にストラタリンカー（ストラタジーン社）を用いて１２００マイクロジュールのＵＶ　を照射することによってファージＤＮＡを膜に固定した。次に、このナイロン膜をラピッドハイブリダイゼーション・バッファー（アマシャム社）に浸漬してプレハイブリダイゼーションを行った。１時間のプレハイブリダイゼーションの後、３２Ｐ標識したＯＣＩＦｃＤＮＡを加え、６５℃にて一夜ハイブリダイゼーションを行った。このｃＤＮＡプローブは、実施例１１で得られた１．６ｋｂ　のＯＣＩＦｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＫＯＣＩＦを、制限酵素ＢａｍＨＩ　及びＸｈｏＩを用いて切断し、ＯＣＩＦｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって単離したのち、このＯＣＩＦｃＤＮＡをメガプライムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム社）を用いて３２Ｐで標識することによって作製した。標識は、ラベリングシステムに添付されたプロトコールに従って行った。
【０１３０】
ハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーション・バッファー１ｍｌ当たりおよそ５×１０５ｃｐｍのプローブを使用した。ハイブリダイゼーションの後、ナイロン膜を室温にて２ＸＳＳＣで５分間洗浄し、その後６５℃において０．５　ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４回、それぞれ２０分ずつ洗浄した。４回目の洗浄ののちナイロン膜を乾燥させ、富士フィルム社製Ｘ腺フィルム、スーパーＨＲ−Ｈと増感スクリーンとを用いて−８０℃にてオートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラム上に６個のシグナルが検出されたので、それぞれのシグナルに相当するアガープレート上の位置からトップ・アガロースを切り出し、１％のクロロホルムを添加した０．５ｍｌ　のＳＭバッファーにそれぞれ浸漬して一夜放置し、ファージを抽出した。それぞれのファージ抽出液をＳＭバッファーで１０００倍に希釈し、その中から１μｌ　と２０μｌ　を取り、再び上記大腸菌に感染させ、トップ・アガロースとともに上記の方法でアガープレートに蒔いた。ファージをナイロン膜に転写後、上記の方法でプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄、乾燥、オートラジオグラフィーを行った。このファージ純化の操作を当初オートラジオグラフィーで検出された６個のシグナル全部について行い、アガープレート上のすべてのファージプラークがｃＤＮＡプローブとハイブリダイズするまで繰り返した。純化されたファージのプラークを切り出し、１％クロロホルムを含むＳＭバッファー０．５ｍｌ　に浸漬し、４℃で保存した。こうして得られた６種の純化ファージを、それぞれλＯＩＦ３，λＯＩＦ８，　λＯＩＦ９，　λＯＩＦ１１，λＯＩＦ１２，λＯＩＦ１７　と名付けた。
【０１３１】
ＩＩ）　制限酵素消化及びサザンブロット・ハイブリダイゼーションによるヒトＯＣＩＦゲノムＤＮＡクローンの分析
純化された６種のファージのＤＮＡを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌに書かれた方法に従ってプレートリシス法によって精製した。これらのＤＮＡを制限酵素によって消化し、得られたフラグメントをアガロース電気泳動によって分離した。またアガロース・ゲルで分離されたフラグメントを、一般的な方法でナイロン膜に転移させたのち、ＯＣＩＦｃＤＮＡをプローブとしてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行った。これらの分析の結果、それぞれ純化された６種のファージは異なったクローンであることが判明した。制限酵素消化によって得られたＤＮＡフラグメントのうち、ＯＣＩＦｃＤＮＡとハイブリダイズするものについては、プラスミドベクターにサブクローンした後に下記の方法で塩基配列の分析を行った。
【０１３２】
ｉｉｉ）　ゲノムＤＮＡクローンから制限酵素消化によって得られたＤＮＡフラグメントのプラスミド・ベクターへのサブクローニングと塩基配列の決定
λＯＩＦ８　ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ　とＮｏｔＩによって消化し、生じたフラグメントを０．７％アガロースゲルに供与して分離した。５．８ｋｂ　のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩフラグメントをＱＩＡＥＸＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて添付されたプロトコールに従ってゲルから抽出した。このフラグメントを、前もってＥｃｏＲＩ　とＮｏｔＩによって切断しておいたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋　ベクター（ストラタジーン社）とＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ　Ｔ４Ｌｉｇａｓｅ（ファルマシア社）を用いて添付のプロトコールに従ってライゲーションした。得られたリコンビナント・プラスミドを、コンピテントＤＨ５α大腸菌（アマシャム社）に導入した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するアガロースプレート上に蒔いてプラスミドを有する大腸菌を選択した。以上のようにして作製された５．８ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩフラグメントを有するリコンビナント・プラスミドを、ｐＢＳＧ８−５．８　と命名した。次に、ｐＢＳＧ８−５．８　を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ　で消化して生ずる０．９　ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで分離し、上記の方法にしたがって抽出した後、ＨｉｎｄＩＩＩ　で前もって切断しておいたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ−（ストラタジーン社）に挿入して、上記の方法に従ってクローニングした。この０．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ　フラグメントを有するリコンビナント・プラスミドを、ｐＢＳ８Ｈ０．９と命名した。一方、λＯＩＦ１１のＤＮＡをＥｃｏＲＩを用いて消化して生ずる６ｋｂ、３．６ｋｂ、及び２．６ｋｂのフラグメントをそれぞれ単離したのち、上記と同様の方法に従ってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋ベクターに挿入してクローニングした。こうして作製した６ｋｂ、３．６　ｋｂ、及び２．６ｋｂ　のＥｃｏＲＩ　フラグメントを有するリコンビナント・プラスミドを、それぞれｐＢＳＧ１１−６、ｐＢＳＧ１１−３．６、ｐＢＳＧ１１−２．６と命名した。
【０１３３】
さらに、ｐＢＳＧ１１−６を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ　によって消化することによって生ずる、２．２ｋｂ、１．１ｋｂ、１．０５ｋｂの３種のフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ−のＨｉｎｄＩＩＩ　サイトに挿入してクローニングした。これら２．２ｋｂ　、１．１ｋｂ　、１．０５　ｋｂ　のＨｉｎｄＩＩＩ　フラグメントを有するリコンビナント・プラスミドを、それぞれｐＢＳ６Ｈ２．２、ｐＢＳ６Ｈ１．１、ｐＢＳ６Ｈ１．０５　と命名した。ゲノムＤＮＡの塩基配列の分析には、ＡＢＩ　Ｄｙｅｄｅｏｘｙ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（パーキンエルマー社）と３７３　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社）を使用した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　に書かれた方法に従ってｐＢＳＧ８−５．８　、ｐＢＳ８Ｈ０．９、ｐＢＳＧ１１−６、ｐＢＳＧ１１−３．６、ｐＢＳＧ１１−２．６、ｐＢＳ６Ｈ２．２、ｐＢＳ６Ｈ１．１、ｐＢＳ６Ｈ１．０５　を調製し、塩基配列決定用の鋳型として用いた。ヒトＯＣＩＦゲノムＤＮＡの塩基配列を配列表配列番号１０４　及び１０５　に示す。エクソン１とエクソン２の間に介在する塩基の配列は必ずしも全部は決定されておらず、配列表配列番号１０４　及び１０５　に示された塩基配列の間に、およそ１７ｋｂのヌクレオチドが介在することが確認されている。
【０１３４】
【実施例２４】
ＥＩＡによるＯＣＩＦの定量
ｉ）　ウサギ抗ＯＣＩＦ抗体の調製
雄性日本白色ウサギ（体重２．５　〜３．０ｋｇ　、北山ラベス社より入手）３羽に、ｒＯＣＩＦ２００　μｇ／ｍｌをフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社）と等量混合してエマルジョンとしたものを、１回１ｍｌずつ皮下免疫した。免疫は１週間隔で合計６回行い、最終免疫後１０日目に全採血を行った。分離した血清から抗体を以下の様に精製した。即ち、ＰＢＳにて２倍希釈した抗血清に最終濃度４０ｗ／ｖ　％となるように硫酸アンモニウムを添加して４℃１時間放置後、８０００×ｇで２０分間遠心分離を行い、沈殿を得た。沈殿を少量のＰＢＳに溶解し、ＰＢＳに対して４℃で透析した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　カラム（ファルマシア社）に負荷した。ＰＢＳにて洗浄後、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）　にて吸着した免疫グロブリンＧを溶出し、直ちに１．５　Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．７）　で中性ｐＨとした。溶出蛋白質画分をＰＢＳに対して透析後、２８０ｎｍ　における吸光度を測定し、その濃度を決定した（Ｅ１％１３．５）。西洋ワサビパーオキシダーゼ標識した抗ＯＣＩＦ抗体は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキット（ピアス社）を用いて作製した。即ち、１ｍｇの精製抗体に８０μｇのＮ−スクシンイミド−Ｓ−アセチルチオ酢酸を添加し、室温で３０分間反応させた。これに５ｍｇのヒドロキシルアミンを添加して脱アセチル化した後、修飾された抗体をポリアクリルアミド脱塩カラムにて分画した。蛋白質画分を１ｍｇのマレイミド活性化パーオキシダーゼと混合し、室温で１時間反応させ酵素標識抗体を得た。
【０１３５】
ｉｉ）　サンドイッチＥＩＡによるＯＣＩＦの定量
９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ　Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ，　Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに、１００μｌ　のウサギ抗ＯＣＩＦ抗体（２μｇ／ｍｌ、５０ｍＭ　炭酸緩衝液（ｐＨ９．６））を添加し４℃にて一晩静置して、抗体を固相化した。ＰＢＳにて調製した２５％ブロックエース（雪印乳業社）を３００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で１時間放置してブロッキングした後、検体（１００μｌ／ウェル）を添加し室温で２時間反応させた。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）にて３回洗浄した後、１００００　倍希釈した西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗ＯＣＩＦ抗体を　１００μｌ　ずつ添加し室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴにて３回洗浄した後、１００μｌ　の酵素基質溶液（ＴＭＢ、ＳｃｙＴｅｋ社）を加え室温で発色させた後、反応を停止した。　４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（イムノリーダー　ＮＪ２０００、日本インターメッド社）を用いて測定し、精製した組み換えＯＣＩＦを標準とした検量線から、検体のＯＣＩＦ濃度を定量した。ＯＣＩＦの検量線を図１３に示す。
【０１３６】
【実施例２５】
抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体
ｉ）　ヒトＯＣＩＦ抗体産生ハイブリドーマの調製
ヒト線維芽細胞ＩＭＲ−９０を培養し、その培養液から実施例１１記載の方法でＯＣＩＦを精製した。精製ＯＣＩＦを１０μｇ／１００μｌ　の濃度になるようにＰＢＳに溶解し、この溶液を２週間おきにＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与し免疫した。初回及び２回目の免疫においては、等量のフロインド完全アジュバントの混合物を投与した。最終の免疫から３日目に脾臓を摘出し、Ｂリンパ球を分離し、マウスミエローマ細胞Ｐ３ｘ６３−ＡＧ８．６５３　とを通常用いられているポリエチレングリコール法により細胞融合させた。ついで融合細胞を選択するためにＨＡＴ培地で培養を行うことにより、ハイブリドーマ細胞をセレクションした。次に、セレクションされた細胞がＯＣＩＦ特異的抗体を産生しているか否かを確認するために、０．１Ｍ　重曹溶液に溶解したＯＣＩＦ溶液　（１０μｇ／ｍｌ）１００μｌ　を、９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社）　に加えて作製したソリッドフェーズＥＬＩＳＡを用いて、ハイブリドーマ培養液中のＯＣＩＦ特異的抗体の測定を行った。抗体生産が認められたハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングを３−５回繰り返し行い、その都度上記ＥＬＩＳＡにより抗体産生量をチェックした。得られた抗体生産株の中から、抗体生産量の高いクローンを選別した。
【０１３７】
ｉｉ）　モノクローナル抗体の生産　
実施例２５−ｉ）で得た抗体生産株を、それぞれ１　×１０６を予めプリスタン　（アルドリッチケミカル社）　を接種しておいたＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内に移植した。移植２週間後、蓄積した腹水を採取し、本発明のモノクローナル抗体を含む腹水を得た。この腹水より、アフィゲルプロテインＡセファロース（　バイオラッド社製）　を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製抗体を得た。即ち、腹水を等量のバインディングバッファー（バイオラッド社）　で希釈し、プロテインＡカラムに負荷した後、充分量の同バッファーで洗浄した。ＩｇＧの溶出は、エリューションバッファー（バイオラッド社）で行った。得られた溶出液を水で透析した後、凍結乾燥を行った。得られた精製抗体をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより純度検定を行ったところ、分子量約１５０，０００　の位置に均一なバンドを認めた。
【０１３８】
ｉｉｉ）　ＯＣＩＦに対して高親和性を有するモノクローナル抗体の選択
実施例２５−ｉｉ）　で得た抗体をＰＢＳに溶解し、ローリー法により蛋白定量を行った。ついで、各抗体を蛋白濃度が一定になるようにＰＢＳに溶解し、この溶液を段階希釈法により希釈した。実施例２５−ｉｉ）　に記載のソリッドフェーズＥＬＩＳＡを用いて、高い希釈段階までＯＣＩＦと反応するモノクローナル抗体を選別した。その結果、Ａ１Ｇ５、Ｅ３Ｈ８、及びＤ２Ｆ４の３種の抗体が得られた。
【０１３９】
ｉｖ）　抗体のサブクラスの検定
実施例２５−ｉｉｉ）で選択した本発明の抗体のクラス及びサブクラスを、イムノグロブリンクラス及びサブクラス分析キット　（アマシャム社）　を用いて検定した。検定は、キットに指示されているプロトコールに従って実施した。結果を表１５に示す。Ｅ３Ｈ８、Ａ１Ｇ５、及びＤ２Ｆ４は、それぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ　であった。
【０１４０】
【表１５】
2004000237.tif 000021
【０１４１】
ｖ）　ＯＣＩＦのＥＬＩＳＡによる測定方法
実施例２５−ｉｖ）　で得たＡ１Ｇ５、Ｅ３Ｈ８、及びＤ２Ｆ４の３種のモノクローナル抗体を、それぞれ固相抗体と標識抗体とした。それぞれの組み合わせにより、サンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。抗体の標識は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキット（ピアス社）を用いて行った。各々の抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｍ　重曹溶液に溶解し、９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ　社）の各ウエル当たり　１００μｌづつそれぞれ分注し、室温で一晩放置した。次いで、各々のプレートを１／２　濃度のブロックエース　（雪印乳業社）　でブロックし、０．１　％のＴｗｅｅｎ２０　を含むＰＢＳ（洗浄バッファー）で３回洗浄した。各濃度のＯＣＩＦを第一次反応バッファー（１／２．５濃度のブロックエース及び０．１　％Ｔｗｅｅｎ２０　を含む０．２Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ　７．４）で調製した。
【０１４２】
調製した各濃度のＯＣＩＦ溶液　１００μｌ　づつ各ウエルに加え、３７℃で３時間放置し、次いで洗浄バッファーで３回洗浄した。標識抗体の希釈には、第二次反応バッファー　（１／４　濃度のブロックエース及び　０．１％の　Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ　７．４）　を用いた。各標識抗体を第２次反応バッファーで４００　倍に希釈し、その各々　１００μｌ　づつを各ウエルにそれぞれ添加した。各々のプレートを３７℃で２時間放置し、次いで３回洗浄した後、基質溶液（０．４ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミン塩酸、０．００６　％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸バッファー、ｐＨ　４．５）　１００　μｌ　を各ウエルに添加した。３７℃で１５分間暗室に放置した後、６Ｎ硫酸５０μｌ　を各ウエルに添加することにより酵素反応を停止させ、イムノリーダー　（ＮＪ２０００，日本インターメッド社）を用いて　４９２ｎｍの吸光度を測定した。３種の抗体をそれぞれ固相抗体或いは標識抗体としたいずれの組み合わせにおいても良好な測定結果が得られ、３種の抗体はそれぞれＯＣＩＦの異なるエピトープを認識することを認めた。代表例として、Ａ１Ｇ５を固相抗体としＥ３Ｈ８を標識抗体としたときの検量線を図１４に示す。
【０１４３】
ｖｉ）　ヒト血清中のＯＣＩＦの測定
健常人５名の血清中のＯＣＩＦを実施例２５−（ｖ）　の図１４のＥＬＩＳＡ系で測定した。即ち、Ａ１Ｇ５を実施例２５−（ｖ）　と同様にイムノプレートに固相化し、各ウエルに第１次反応バッファーを５０μｌ　加え、次いで各ヒト血清５０μｌ　を加えて３７℃で３時間放置した。洗浄バッファーで３回洗浄した後、第２次反応バッファーで４００　倍に希釈したＥ３Ｈ８の標識抗体１００　μｌ　を各ウエルに加えて、３７℃で２時間放置した。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄後、上記基質溶液　１００μｌ　を各ウエルに添加し、３７℃で１５分間反応させた。各ウエルに６Ｎ硫酸５０μｌ　づつ添加して酵素反応を停止させ、イムノリーダーで４９２ｎｍ　の吸光度を測定した。既知量のＯＣＩＦを含む第１次反応バッファーについても同様に操作し、図１４に示すようなＯＣＩＦの検量線を作成し、血清試料の吸光度から血清中のＯＣＩＦ量を求めた。結果を表１６に示す。
【０１４４】
【表１６】
2004000237.tif 000022
【０１４５】
【実施例２６】
骨粗鬆症に対する治療効果
神経切除による不動性の骨萎縮モデルに対するＯＣＩＦの治療効果を確認した。
Ｆｉｓｃｈｅｒ　系雄ラットを用い、６週齢（体重約１２０ｇ）で左上腕神経叢を切除することにより、左前肢の不動化を惹起して骨萎縮モデルを作成した。ＯＣＩＦは０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０　を含むＰＢＳ（−）で調整し、翌日から５μｇ／ｋｇ及び５０μｇ／ｋｇの用量で１２時間間隔で１日２回、２週間連日静脈内投与した。正常群には偽手術を施し、対照群には０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０　を含むＰＢＳ（−）を同様に投与した。投与終了後、左上腕を摘出し骨強度を測定した。結果を図１５に示す。
この結果、正常群に比べ対照群では骨強度の低下が観察されたが、ＯＣＩＦ５０μｇ／ｋｇ投与群において改善が認められた。
【０１４６】
【発明の効果】
本発明により、新規な破骨細胞形成抑制活性を有する蛋白質及びその効率的な製造方法が提供される。本発明の蛋白質は破骨細胞形成抑制活性を有し、骨粗鬆症等各種の骨量減少性疾患の治療剤として或いはこれらの疾患の免疫学的診断のための抗原等として利用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｉＬｏａｄ−Ｑ／ＦＦ　非吸着画分粗精製製品（試料３）をＨｉＬｏａｄ−Ｓ／ＨＰ　カラムにかけた時の溶出プロファイルを示す。
【図２】ヘパリン−５ＰＷ粗精製製品　（試料５）をブルー−５ＰＷカラムにかけた時の溶出プロファイルを示す。
【図３】ブルー−５ＰＷ溶出フラクション４９〜５０を逆相カラムにかけた時の溶出プロファイルを示す。
【図４】最終精製品の還元条件下と非還元条件下におけるＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果を示す。
【符号の説明】
レーン１、４；分子量マーカー
レーン２、５；ピーク６
レーン３、６；ピーク７
【図５】還元ピリジルエチル化後、リシルエンドプロテアーゼ処理したピーク７を逆相カラムにかけた時の溶出プロファイルを示す。
【図６】天然（ｎ）　及び組み換え型（ｒ）　ＯＣＩＦの、非還元条件下におけるＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果を示す。又、（Ｅ）　は２９３／ＥＢＮＡ細胞で生産したものを、（Ｃ）　はＣＨＯ細胞で生産したものをそれぞれ示す。
【符号の説明】
レーン１；分子量マーカー
レーン２；モノマー型ｎＯＣＩＦ
レーン３；ダイマー型ｎＯＣＩＦ
レーン４；モノマー型ｒＯＣＩＦ（Ｅ）
レーン５；ダイマー型ｒＯＣＩＦ（Ｅ）
レーン６；モノマー型ｒＯＣＩＦ（Ｃ）
レーン７；ダイマー型ｒＯＣＩＦ（Ｃ）
【図７】天然型（ｎ）及び組み換え型（ｒ）ＯＣＩＦの、還元条件下におけるＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果を示す。又、（Ｅ）は２９３／ＥＢＮＡ細胞で生産したものを、（Ｃ）　ＣＨＯ細胞で生産したものをそれぞれ示す。
【符号の説明】
レーン８；分子量マーカー
レーン９；モノマー型ｎＯＣＩＦ
レーン１０；ダイマー型ｎＯＣＩＦ
レーン１１；モノマー型ｒＯＣＩＦ（Ｅ）
レーン１２；ダイマー型ｒＯＣＩＦ（Ｅ）
レーン１３；モノマー型ｒＯＣＩＦ（Ｃ）
レーン１４；ダイマー型ｒＯＣＩＦ（Ｃ）
【図８】Ｎ−結合型糖鎖を除去した天然型（ｎ）　及び組み換え型（ｒ）　ＯＣＩＦの、還元条件下におけるＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果を示す。又、（Ｅ）　は２９３／ＥＢＮＡ細胞で生産したものを、（Ｃ）　はＣＨＯ細胞で生産したものをそれぞれ示す。
【符合の説明】
レーン１５；分子量マーカー
レーン１６；モノマー型ｎＯＣＩＦ
レーン１７；ダイマー型ｎＯＣＩＦ
レーン１８；モノマー型ｒＯＣＩＦ（Ｅ）
レーン１９；ダイマー型ｒＯＣＩＦ（Ｅ）
レーン２０；モノマー型ｒＯＣＩＦ（Ｃ）
レーン２１；ダイマー型ｒＯＣＩＦ（Ｃ）
【図９】ＯＣＩＦとＯＣＩＦ２の、アミノ酸配列の比較を示す。
【図１０】ＯＣＩＦとＯＣＩＦ３の、アミノ酸配列の比較を示す。
【図１１】ＯＣＩＦとＯＣＩＦ４の、アミノ酸配列の比較を示す。
【図１２】ＯＣＩＦとＯＣＩＦ５の、アミノ酸配列の比較を示す。
【図１３】抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体を用いた時の、ＯＣＩＦの検量線を示す。
【図１４】抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体を用いた時の、ＯＣＩＦの検量線を示す。
【図１５】ＯＣＩＦの骨粗鬆症に対する治療効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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