(57)【要約】【課題】体液中に存在する「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」を簡便、迅速、容易、高感度、高精度かつ安価に測定する方法を提供する。【解決手段】「抗ＣＲＰ抗体」を用いることを特徴とする、体液中の「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」の測定方法。本方法では、さらに「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いることが好ましく、「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」−「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」−「抗ＣＲＰ抗体」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを少なくとも含むことが好ましく、「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」と「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方が固相に固着されていることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
「抗ＣＲＰ抗体」を用いることを特徴とする、体液中の「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」の測定方法。
【請求項２】
さらに「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」−「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」−「抗ＣＲＰ抗体」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを少なくとも含む、請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」と「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方が固相に固着されていることを特徴とする、請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
以下の１〜３のステップを少なくとも含むことを特徴とする、請求項４に記載の測定方法。
（ステップ１）抗体Ａが固着された固相に体液を接触させ、「固相に固着された抗体Ａ」−「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」で示される第１複合体を形成させるステップ。
（ステップ２）ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、「固相に固着された抗体Ａ」−「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」−「抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ。
（ステップ３）ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検出するステップ。
ただし、抗体Ａは「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」及び「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ意味する。
【請求項６】
体液が、血液である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の測定方法を用いて、体液中の「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」を測定し、測定された「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法。
【請求項８】
疾患が、抗リン脂質抗体症候群、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化及び糖尿病からなる群から選ばれるものである、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
下記（Ａ）及び（Ｂ）の構成成分を少なくとも含むことを特徴とする、体液中の「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」の測定キット。
（Ａ）抗体Ａが固着された固相
（Ｂ）抗体Ｂ
ただし、抗体Ａは「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」及び「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ意味する。
【請求項１０】
疾患の検出に用いられることを特徴とする、請求項９に記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液中に存在する「酸化ＬＤＬとＣＲＰとの複合体」の測定方法、及びこれに用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書において用いる略号を以下に説明する。
ＡＰＳ：抗リン脂質抗体症候群
β2-GPI：β２−グリコプロテインＩ
β2-GPI-oxLDL複合体：oxLDLとβ2-GPIとの複合体
β2-GPI-oxLDL-CRP複合体：oxLDL、β2-GPI及びCRPの三者複合体
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＲＰ：Ｃ−反応性タンパク質
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＨＲＰ：ホースラディッシュ（西洋ワサビ）のペルオキシダーゼ
ＬＤＬ：低密度リポタンパク質（酸化されていないネイティブなもの）
ＯＤ：吸光度
ｏｘＬＤＬ：酸化ＬＤＬ
oxLDL-CRP複合体：oxLDLとCRPとの複合体
【０００３】
ＣＲＰは、肺炎球菌の細胞壁に存在するＣ多糖体のホスホコリンと結合する血清タンパク質で、急性期タンパク質（感染を含めた炎症性変化によって血中に増加するタンパク質群）の一種である。
非特許文献１には、ＣＲＰがoxLDLに結合することが記載されている。しかし体液中に存在するoxLDL-CRP複合体を測定すること、及びその臨床的意義等については開示も示唆もない。
また特許文献１には、生体内に存在する「β2-GPI-oxLDL複合体」を測定すること、及びその臨床的意義等が記載されている。しかし、「oxLDL-CRP複合体」に関する開示も示唆もない。
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci., 99, p13043-13048 (2002)
【特許文献１】国際公開第９５／０９３６３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、体液中に存在するoxLDL-CRP複合体の測定方法、これを用いた疾患の検出方法及びこれらのキットに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、体液中に存在するoxLDL-CRP複合体の測定方法を検討した結果、抗CRP抗体を用いることによってoxLDL-CRP複合体を簡便、迅速、容易、高感度、高精度かつ安価に測定できることを見出し、この測定に用いるキットを提供するに至り本発明を完成した。
すなわち本発明は、「抗ＣＲＰ抗体」を用いることを特徴とする、体液中の「oxLDL-CRP複合体」の測定方法（以下、本発明測定方法という）を提供する。本発明測定方法は、さらに「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いることが好ましい。
また本発明測定方法は、「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」−「oxLDL-CRP複合体」−「抗ＣＲＰ抗体」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを少なくとも含むことが好ましい。
そして本発明測定方法は、「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」と「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方が固相に固着されているものを用いることが好ましい。
このサンドイッチ状複合体を形成させる具体的なステップは特に限定されないが、まず「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」と「ｏｘＬＤＬ−ＣＲＰ複合体」とを反応させてからこれに「抗ＣＲＰ抗体」を反応させてもよく、「ｏｘＬＤＬ−ＣＲＰ複合体」と「抗ＣＲＰ抗体」とを反応させてからこれに「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」を反応させてもよく、これら三者を同時に反応させてもよい。
なかでも本発明測定方法は、以下の１〜３のステップを少なくとも含むことが好ましい。
（ステップ１）抗体Ａが固着された固相に体液を接触させ、「固相に固着された抗体Ａ」−「oxLDL-CRP複合体」で示される第１複合体を形成させるステップ。
（ステップ２）ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、「固相に固着された抗体Ａ」−「oxLDL-CRP複合体」−「抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ。
（ステップ３）ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検出するステップ。
ただし、抗体Ａは「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」及び「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ意味する。
【０００６】
本発明測定方法で用いる体液は、血液（血清あるいは血漿）であることが好ましい。
また本発明は、本発明測定方法を用いて、体液中の「oxLDL-CRP複合体」を測定し、測定された「oxLDL-CRP複合体」と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法（以下、本発明検出方法という）を提供する。
本発明検出方法によって検出される疾患は、ＡＰＳ、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化及び糖尿病からなる群から選ばれるものであることが好ましい。
また本発明は、下記（Ａ）及び（Ｂ）の構成成分を少なくとも含むことを特徴とする、体液中の「oxLDL-CRP複合体」の測定キット（以下、本発明キットという）を提供する。
（Ａ）抗体Ａが固着された固相
（Ｂ）抗体Ｂ
ただし、抗体Ａは「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」及び「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ意味する。
本発明キットは、疾患の検出に用いられるものが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明測定方法によれば、体液中に存在するoxLDL-CRP複合体を、簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価に測定することができ、さらにこれによって本発明検出方法及び本発明キットが提供されることから極めて有用である。CRP-oxLDL複合体及びCRP-oxLDL-β2-GPI複合体が動脈硬化、糖尿病等の疾患のリスクファクターであることが示唆されたので、本発明検出方法は、oxLDL-CRP複合体を測定することで動脈硬化、糖尿病を含む種々の疾患を検出することができることから、極めて有用である。また本発明キットは、本発明測定方法及び本発明検出方法を、さらに簡便、迅速、かつ容易に実施することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明測定方法
本発明測定方法は、「抗ＣＲＰ抗体」を用いることを特徴とする、体液中の「oxLDL-CRP複合体」の測定方法である。
本明細書における「測定」との用語は、ある物質を定量的に測定することのみならず、定性的に検出すること（ある物質の存否を検出すること）をも含む概念である。
ここで用いる「抗ＣＲＰ抗体」は、ＣＲＰに結合する抗体である限りにおいて特に限定されないが、ＣＲＰに特異的に結合する抗体であることが好ましい。この抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良い。モノクローナルな抗ＣＲＰ抗体、ポリクローナルな抗ＣＲＰ抗体ともに、ＣＲＰを抗原としてこれらの抗体の通常の作製方法に従って作製することができる。また、市販されている抗ＣＲＰ抗体をそのまま用いても良い。具体的には、プレートに固相化する場合には、抗ＣＲＰ抗体 PG-021（日本バイオテスト研究所）、検出用の標識抗体としては、抗ＣＲＰ抗体 A80-125P（Bethyl Laboratories Inc.）が例示される。
【０００９】
本発明測定方法は、抗ＣＲＰ抗体を用いて体液中の「oxLDL-CRP複合体」を測定する限りにおいて特に限定されないが、さらに「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いることが好ましい。
ここで用いることができる「抗ａｐｏＢ抗体」は、ａｐｏＢに結合する抗体である限りにおいて特に限定されないが、ａｐｏＢに特異的に結合する抗体であることが好ましい。本抗体も、ａｐｏＢを抗原として、抗体の通常の作製方法に従ってモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を作製することができる。また、市販されている抗ａｐｏＢ抗体をそのまま用いても良い。具体的にはN2E10（岡山大学大学院医歯学総合研究科細胞化学分野にて樹立し、同研究室から入手可能）、１Ｄ２（ヤマサ醤油株式会社製）等が例示される。
また、ここで用いることができる「抗β２−ＧＰＩ抗体」も、β２−ＧＰＩに結合する抗体である限りにおいて特に限定されないが、β２−ＧＰＩに特異的に結合する抗体であることが好ましい。本抗体も、β２−ＧＰＩを抗原として、抗体の通常の作製方法に従ってモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を作製することができる。また、市販されている抗β２−ＧＰＩ抗体をそのまま用いても良い。具体的にはWB-CAL-1（J. Immunol., 149, p1063-1068(1992)）、Cof-22及びCof-23（Blood, 87, p3262-3270(1996)）、EY2C9（Arthritis Rheum., 37, p1453-1461(1994)）等が例示される。
【００１０】
β２−ＧＰＩは、oxLDLに特異的に結合するがＬＤＬ（酸化されていないネイティブなもの）には結合しないことが知られている。そして体液中においては、oxLDLにβ２−ＧＰＩが結合した状態で存在していることが知られている。したがって、本発明測定方法、本発明検出方法及び本発明キットにおいて「抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いる場合には、体液中の「β2-GPI-oxLDL-CRP複合体」を測定することを意味する。
「ａｐｏＢ」はＬＤＬに存在するタンパク質である。従って、本発明測定法、本発明検出方法及び本発明キットにおいて「抗ａｐｏＢ抗体」を用いる場合には、体液中の「ｏｘＬＤＬ−ＣＲＰ複合体」を測定することになる。
本発明測定方法は、抗ＣＲＰ抗体を用いる限りにおいて、その具体的な方法も限定されない。具体的な方法の一例としては、例えば抗体を用いた免疫学的な測定手法（ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法、競合法、阻害法等）、イムノブロッティング、凝集法等）が例示される。
「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」をさらに用いる場合における具体的なステップも特に限定されないが、「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」−「oxLDL-CRP複合体」−「抗ＣＲＰ抗体」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを少なくとも含むことが好ましい。すなわち、本発明測定方法ではサンドイッチ法を用いることが好ましい。また前記の通り、「抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いる場合には、「抗β２−ＧＰＩ抗体」−「β2-GPI-oxLDL-CRP複合体」−「抗ＣＲＰ抗体」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを少なくとも含むこととなる。
【００１１】
そして本発明測定方法は、「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」と「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方が固相に固着されているものを用いることが好ましい。
これらの抗体を固着するために用いる固相は、抗体を固着させることができ、かつ、水、体液または測定反応液に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等を例示することができる。固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。
これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
これらの固相に上記の抗体を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法等、タンパク質や脂質の一般的な固着方法を利用することができる。
これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
物理的吸着法として具体的には、例えば、抗体を緩衝液等に溶解し、この溶液を固相（例えばマイクロプレート）に接触させることによって、抗体を固相に吸着させる方法を挙げることができる。
【００１２】
また、抗体を固着させた固相の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこに体液中の「oxLDL-CRP複合体」や他の分子種が固着すると正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、体液を固相と接触させる前にブロッキング物質を添加して抗体が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
ブロッキングの方法として具体的には、例えばブロッキング物質（血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン等）を添加して、３７℃程度で３０分〜２時間保存するか、常温（１５〜２５℃）で１〜２時間保存する方法を挙げることができる。
【００１３】
そして「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」と「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方が固着された固相を用いる場合には、以下の１〜３のステップを少なくとも含むことが好ましい。
（ステップ１）抗体Ａが固着された固相に体液を接触させ、「固相に固着された抗体Ａ」−「oxLDL-CRP複合体」で示される第１複合体を形成させるステップ。
（ステップ２）ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、「固相に固着された抗体Ａ」−「oxLDL-CRP複合体」−「抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ。
（ステップ３）ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検出するステップ。
ここで、抗体Ａは「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」及び「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ意味する。すなわち、ステップ１において「抗ａｐｏＢ抗体」、「抗β２−ＧＰＩ抗体」又は「抗ａｐｏＢ抗体と抗β２−ＧＰＩ抗体の両方」が固着された固相を用いる場合には、ステップ２において「抗ＣＲＰ抗体」を接触させることになる。逆にステップ１において「抗ＣＲＰ抗体」が固着された固相を用いる場合には、ステップ３において、「抗ａｐｏＢ抗体」、「抗β２−ＧＰＩ抗体」又は「抗ａｐｏＢ抗体と抗β２−ＧＰＩ抗体の両方」を接触させることになる。
ここで「抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いる場合には、「固相に固着された抗体Ａ」−「β2-GPI-oxLDL-CRP複合体」−「抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させることになる。
「接触」の方法は、「固相に固着された抗体Ａ」の分子と「oxLDL-CRP複合体」の分子、及び、「oxLDL-CRP複合体」の分子と「抗体Ｂ」の分子とが相互に接触する限りにおいて特に限定されない。
また「接触」の後、分子間の結合をできるだけ完全なものとするために、インキュベートすることが好ましい。インキュベート時の温度は、「oxLDL-CRP複合体」と抗体Ａや抗体Ｂとの抗原抗体反応が阻害されない限りにおいて特に限定されないが、例えば０℃〜３７℃程度が例示される。インキュベートの時間も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。一般にインキュベート時間が長いほど、前記の結合をより完全に形成させることができる。
【００１４】
また、ステップ１と２の間、ステップ２と３の間に、適宜洗浄する操作を入れることが好ましい。
ステップ３における「ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体の検出」も、「固相に固着された抗体Ａ」−「oxLDL-CRP複合体」−「抗体Ｂ」からなるサンドイッチ状複合体を検出しうる限りにおいて特に限定されないが、当該サンドイッチ状複合体の開放端に存在する「抗体Ｂ」（固相に固着されていない「抗体Ｂ」）を検出することによって行うことが好ましい。
そのために、ステップ２において接触させる「抗体Ｂ」自体が標識物質で標識されていることが、検出が容易となることから好ましい。
「抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いた場合には、「固相に固着された抗体Ａ」−「β2-GPI-oxLDL-CRP複合体」−「抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を検出することになる。
また、「抗体Ｂ」として標識されていないものを用いる場合には、「『抗体Ｂ』に結合する物質」であって標識物質で標識されたものを用いてもよい。「『抗体Ｂ』に結合する物質」としては、例えば「抗体Ｂ」（免疫グロブリン）が由来する動物又はクラス等に応じた、その免疫グロブリンに特異的に結合する抗体等が例示される。例えば「抗体Ｂ」がマウス由来のIgG1である場合には、「『抗体Ｂ』に結合する物質」として抗マウスIgG1抗体を用いることができる。
この標識物質を検出することによって、ステップ２で形成された「固相に固着された抗体Ａ」−「oxLDL-CRP複合体」（「抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いた場合には、「β2-GPI-oxLDL-CRP複合体」）−「抗体Ｂ」からなるサンドイッチ状複合体中に存在する「抗体Ｂ」を検出することができる。すなわち、当該サンドイッチ状複合体が検出されることとなる。
【００１５】
このような標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）など）、化学発光物質（ルミノールなど）、ビオチン、アビジン（ストレプトアビジンを含む）等が挙げられるが、通常タンパク質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等〔「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、１９８７年発行参照〕等から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法（Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, 57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照）、またフルオレセインイソチオシアネートを使用する場合は特公昭６３−１７８４３号公報記載の方法等から適宜選択できる。
標識物質の検出は、用いた標識物質に応じて当業者が適宜検出方法を選択することができる。例えば、標識物質としてペルオキシダーゼを使用した場合には、当該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン、o-フェニレンジアミン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定することにより検出を行うことができる。また、蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００１６】
本発明測定方法において用いる体液も特に限定されないが、血液であることが好ましい。本明細書における「血液」との用語は、血清及び血漿を含む概念として用いる。血液をそのまま用いてもよく、これを希釈したものや、サンプル中のoxLDL-CRP複合体に影響を与えない限りにおいて血液を加工したものであってもよい。
【００１７】
＜２＞本発明検出方法
本発明検出方法は、本発明測定方法を用いて、体液中の「oxLDL-CRP複合体」を測定し、測定された「oxLDL-CRP複合体」と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法である。
本発明検出方法においては、まず本発明測定方法によって検体中の「oxLDL-CRP複合体」を測定する。本発明測定方法についての説明は前記の通りである。
ここで用いる「体液」は、疾患の検出対象となる動物由来のものである限りにおいて特に限定されない。「体液」に関するその他の説明は、前記の「＜１＞本発明測定方法」における説明と同様である。なお本発明検出方法においても、「抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いた場合には、「β2-GPI-oxLDL-CRP複合体」を検出することになる。
本発明検出方法においては、次いで、本発明測定方法を用いて測定された、体液中の「oxLDL-CRP複合体」（「抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いた場合には、「β2-GPI-oxLDL-CRP複合体」）と疾患とを関連づけることによって疾患を検出する。
前記の通り、本明細書における「測定」との用語は、定量的な測定のみならず、定性的な検出（存否の検出）をも含む概念である。したがって、ここにいう「測定された『oxLDL-CRP複合体』」は、体液中の当該複合体の「量」（定量的な測定結果）であっても「存否」（定性的な測定結果）であってもよい。また「量」については、濃度既知のスタンダードを用いて作成した検量線や関係式等から求めた量（実測値）であっても良く、健常動物（疾患に罹患していない動物）に対する比（相対値）であっても良い。
そして、「oxLDL-CRP複合体」の量はある種の疾患によって増加しうる。この場合において、体液中の当該複合体量が健常人のそれに比して多い場合には、「疾患に罹患している」もしくは「疾患に罹患している可能性が高い」と関連づけることができる。体液中の当該複合体量が健常人のそれと同等であれば、「疾患に罹患していない」もしくは「疾患に罹患している可能性は低い」と関連づけることができる。
【００１８】
また本発明検出方法は、疾患への罹患の有無のみでなく、罹患の程度の検出も含まれる。例えば、ある個人の体液中の当該複合体量を定期的に測定し、当該複合体量が増加傾向にある場合には「疾患が進行している」もしくは「疾患が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。逆に、測定された当該複合体量が減少傾向にある場合には、「疾患が改善方向にある」もしくは「疾患が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また測定された当該複合体量に変化がない場合には、「疾患の程度（または健常性）に変化がない」もしくは「疾患の程度（または健常性）に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。
本発明検出方法によって検出される「疾患」は、ＡＰＳ、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化（脳梗塞、心筋梗塞など）及び糖尿病からなる群から選ばれるものが好ましい。
【００１９】
＜３＞本発明キット
本発明キットは、下記（Ａ）及び（Ｂ）の構成成分を少なくとも含むことを特徴とする、体液中の「oxLDL-CRP複合体」の測定キットである。
（Ａ）抗体Ａが固着された固相
（Ｂ）抗体Ｂ
ここで、抗体Ａは「抗ａｐｏＢ抗体及び／又は抗β２−ＧＰＩ抗体」及び「抗ＣＲＰ抗体」のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ意味する。すなわち、構成成分（Ａ）として「抗ａｐｏＢ抗体」、「抗β２−ＧＰＩ抗体」又は「抗ａｐｏＢ抗体と抗β２−ＧＰＩ抗体の両方」が固着された固相を用いる場合には、構成成分（Ｂ）として「抗ＣＲＰ抗体」を用いることができる。逆に構成成分（Ａ）として「抗ＣＲＰ抗体」が固着された固相を用いる場合には、構成成分（Ｂ）として「抗ａｐｏＢ抗体」、「抗β２−ＧＰＩ抗体」又は「抗ａｐｏＢ抗体と抗β２−ＧＰＩ抗体の両方」を用いることができる。なお本キットにおいても、「抗β２−ＧＰＩ抗体」を用いた場合には、「β2-GPI-oxLDL-CRP複合体」を測定することになる。
【００２０】
なお、抗体Ｂは標識物質で標識されているものが好ましい。用いることができる標識物質等の説明は、「＜１＞本発明測定方法」における説明と同様である。
本発明キットは、上記の（Ａ）及び（Ｂ）を構成成分として含んでいる限りにおいて特に限定されず、さらに他の構成成分を含んでいてもよい。
本発明キットに加えうる他の構成成分としては、標識物質の検出試薬、「抗体Ｂを認識する抗体」、「抗体Ｂを認識する抗体」を標識する試薬等を例示することができる。これらの構成成分の他に、ブロッキング物質、洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等を含んでいてもよい。
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明測定方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
本発明キットを用いたoxLDL-CRP複合体の測定は、本発明測定方法に従って行うことができる。
また本発明キットは、疾患の検出に用いられるものが好ましい。本発明キットを用いて検出される「疾患」は、ＡＰＳ、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化（脳梗塞、心筋梗塞など）及び糖尿病からなる群から選ばれるものが好ましい。本発明キットを用いた疾患の検出は、本発明検出方法に従って行うことができる。
ここで用いる「体液」は、疾患の検出対象となる動物由来のものである限りにおいて特に限定されない。「体液」に関するその他の説明は、前記の「＜１＞本発明測定方法」における説明と同様である。
【実施例１】
【００２１】
以下、本発明を実施例及び参考例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
１．本実施例及び参考例で用いた材料や方法、その略号等
・「ＨＢＳ」（Hepes緩衝生理食塩水）の組成は、10mM Hepes、150 mM NaCl（pH7.4）とした。
・「溶液Ａ」の組成は、2mM CaCl2と1mM MgCl2を含むＨＢＳとした。
・「Ｔ−ＨＢＳ」の組成は、0.05％Tween 20を含むＨＢＳとした。
・「WB-CAL-1」（IgG2a,κ）は、抗β2-GPI自己抗体である。抗リン脂質抗体症候群モデルマウス（NZW x BXSBマウス）由来の抗体であり、遊離のβ2-GPIには反応せず、酸化LDLと複合体を形成したβ2-GPIに反応性を示す抗体である。（J. Immunol., 149, p1063-1068(1992)）
・「N2E10」（IgG2a,κ）は、抗ヒトapoB抗体である。マウス由来のモノクローナル抗体である。岡山大学大学院医歯学総合研究科細胞化学分野にてハイブリドーマを樹立し、同研究室から入手可能である。なお、本抗体は「2E10」とも称されるが、ヒト由来の未処理の（ネイティブな）LDLを抗原としてマウスを免疫して得られたので、本明細書では頭に「N」を付して「N2E10」と表記する。
・「抗ＣＲＰ抗体」（品番PG-021；IgG）は、抗ヒトＣＲＰ抗体である。ヤギ由来の抗体である。日本バイオテスト研究所製のものを用いた。
・「ＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体」は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識したヤギ由来の抗ヒトＣＲＰ抗体である。Bethyl Laboratories Inc.製のものを用いた。
・「ＣＲＰ」は、Chemicon International社製のものを用いた。
・「Immulon 2HB」は、Dynex社製の96ウエルマイクロタイタープレートであり、ELISAプレートとして使用した。
・「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水である。
・「Ｔ−ＰＢＳ」は、0.05% Tween 20含有PBSである。
・「Ｓ−ＰＢＳ」は、0.5%スキムミルク、10 mM  MgCl2を含有するＰＢＳである。
２．oxLDLとCRPとの複合体の測定（抗apoB抗体を用いる方法）
【００２２】
（１）サンプルの調製
ＨＢＳと溶液Ａの２種類の溶媒を用いて以下のサンプルを調製した（したがって、１つのサンプルあたり、溶媒が異なる２種類の溶液が調製された）。溶媒として用いたＨＢＳ及び溶液Ａは、いずれも0.22μmのフィルターで滅菌したものを用いた。
・CRPを100μg/ml（最終濃度、以下同じ）含有する溶液
・β2-GPIとCRPとを各100μg/ml含有する溶液
・健常ヒト血漿から超遠心法により調製したLDL（ネイティブなLDL；比重1.019＜d＜1.063）を100μg/ml含有する溶液
・LDLとCRPとを各100μg/ml含有する溶液
・LDLを、5μMのCuSO4存在下、37℃で12時間酸化して得られたoxLDLを100μg/ml含有する溶液
・oxLDLとCRPとを各100μg/ml含有する溶液
・β2-GPIとoxLDLとを各100μg/ml含有する溶液を、37℃で16時間インキュベートすることにより得られたoxLDL-β2-GPI複合体
・oxLDL-β2-GPI複合体を50μg/ml、CRPを100μg/ml含有する溶液
・β2-GPIとoxLDLとCRPとを、各100μg/ml含有する溶液
これらそれぞれを密封し、37℃で20時間インキュベートすることによってサンプルを調製した。
【００２３】
（２）ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、以下の手順に従って行った。
(a)ELISAプレート（Immulon 2HB）に、8μg/mlの抗ヒトapoB抗体N2E10（HBSで希釈）を50μl /ウエル添加し、密閉して4℃で一晩放置することによって、N2E10をプレートの各ウェルに固着させた。
(b)その後、0.05％Tween 20を含むHBS（又はT-HBS）を200μl/ウエル添加して洗浄する操作を３回繰り返した。
(c)2％ BSAを含有するHBSを200μl/ウエル添加して、室温で１時間静置した。
(d)前記の（１）で調製したサンプルのうち、溶液Ａ中でインキュベートしたものについては、CRPまたはLDLの最終濃度を1μg/mlとなるように溶液Ａで希釈した。また、Ca2+を含まないHBS中でインキュベートしたものについてもHBSを用いて同様に希釈した。また、1μg/mlから更に２倍系列で希釈したサンプルも同時に調製した。希釈されたこれらのサンプルを、N2E10が固着されたELISAプレートに100μl/ウエル添加した。その後、27℃で２時間静置した。
(e)溶液Ａで希釈したサンプルを入れたウエルについては0.05％Tween20を含む溶液Ａを用い、HBSで希釈したサンプルを入れたウエルについてはT-HBSを用いて、ウエルを３回洗浄した。
(f)1mg/mlのHRP標識抗CRP抗体を、溶液ＡまたはHBSでそれぞれ１万倍希釈して100μl/ウエルで添加して、室温で１時間静置した。
(g)上記の(e)と同様にして、ウエルを３回洗浄した。
(h)o-フェニレンジアミン4 mgを、0.1M クエン酸緩衝液（pH5.0） 10mlで溶解し、30％ 過酸化水素水を10μl加えて混和したものを100μl/ウエル加えて室温で15分静置することにより発色させた。
(i)1M 硫酸を100μl/ウエル添加することによって反応を停止させ、490 nmの吸光度を測定した。
【００２４】
CRPまたはLDLの最終濃度を1μg/ml希釈させたサンプルについて、固着させた抗apoB抗体と、HRP標識抗CRP抗体とで検出した結果（oxLDLとCRPとの複合体）を検出した結果を表１に示す。
【表１】
2004271502.tif 000002
【００２５】
1μg/mlから更に２倍系列で希釈したものについて同様に検出した結果を図１にそれぞれ示す。図１中の、黒く塗りつぶされたマークはＣａ2+（2mＭ）存在下、白抜きのマークは非存在下でインキュベートしたものであることを示す。また図１中の三角印はoxLDLとCRPとを含有する溶液における結果を、丸印はoxLDL-β2-GPI複合体とCRPとを含有する溶液における結果を、四角印はβ2-GPIとoxLDLとCRPとを含有する溶液における結果をそれぞれ示す。
その結果、37℃、20時間のインキュベーションによって、Ca2+依存的に、CRP-oxLDL複合体、あるいはCRP-oxLDL-β2-GPI複合体が形成されることが示された。生体内においてこのような複合体が存在すれば、この測定系により検出可能と考えられる。
【００２６】
３．oxLDLとCRPとの複合体の測定（抗β2-GPI抗体を用いる方法）
サンプルの調製は、上記の２．（１）と同様に行った。ＥＬＩＳＡは、上記の２．（２）における(a)のステップを以下の通り行った以外は、上記２．（２）と同様に行った。
ELISAプレート（Immulon 2HB）に、8μg/mlのWB-CAL-1（β2-GPIに対する抗体；HBSで希釈）を50μl /ウエル添加し、密閉して4℃で一晩放置することによって、WB-CAL-1をプレートに固着させた。
CRPまたはLDLの最終濃度を1μg/ml希釈させたサンプルについて、固着させた抗β2-GPI抗体と、HRP標識抗CRP抗体とで検出した結果（β2-GPIとoxLDLとCRPとの複合体）を検出した結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
2004271502.tif 000003
【００２８】
1μg/mlから更に２倍系列で希釈したものについて同様に検出した結果を図２にそれぞれ示す。図２中の記号の意味は、図１と同様である。
その結果、37℃  20時間のインキュベーションによって、Ca2+依存的に、CRP-oxLDL-β2-GPI複合体が形成されることが示された。生体内においてこのような複合体が存在すれば、この測定系により検出可能と考えられる。
４．oxLDL-β2-GPI複合体の測定（参考例：固相化抗β2-GPI抗体と抗apoB抗体を用いる方法）
ＥＬＩＳＡプレート（Immulon 2HB）の各ウエルにマウスモノクローナル抗β2-GPI抗体（WB-CAL-1）、8 μg/mlをPBS, pH7.4で調製したものを、50 μl/ウェルずつ加え、4 ℃で一晩静置し、WB-CAL-1をプレートに固着させた。
その後、0.05% Tween 20含有PBS（T-PBS）を200 μl/ウェルずつ加え3回洗い、1%スキムミルクを含有するPBS（ブロッキング液）を200 μl/ウェル加え、室温で1時間静置した。
ブロッキング液を捨てた後、0.5%スキムミルク、10 mM  MgCl2含有PBS（S-PBS）で、適宜希釈した被検検体を、50 μl/ウェルずつ上記のWB-CAL-1を固着したプレート入れ、27℃で2時間静置し、T-PBSでウエルを3回洗浄した。
次いで、ビオチン化マウスモノクローナル抗apoB抗体（N2E10）をS-PBSで0.2  μg/mlに希釈し、100 μl/ウェル入れ、室温で1時間静置した。T-PBSでウエルを3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ストレプトアビジン（vector #SA-504, 1mg/ml）をS-PBSで1,500倍希釈したものを100 μl/ウェル入れ、室温で30分静置した。洗浄の後、o-フェニレンジアミン4 mgを0.1 Mクエン酸緩衝液、pH5.0、10 mlで溶解し、30%過酸化水素水10 μlを加えて混和したものを100 μl/ウェル入れ発色させ、490 nmの吸光度を測定した。
【００２９】
５．患者及び健常人血清中のCRP-oxLDL複合体及びCRP-oxLDL-β2-GPI複合体の測定
（１）測定
糖尿病患者138例及び健常人28例の血清（原液）中の高感度CRP（hsCRP）を、「N-ラテックス   CRP」（デイドベーリング株式会社）を用いた高感度ＣＲＰ測定法によってCRP量（mg/dl）を測定した（対照１：図３（Ａ））。一方、100倍希釈した上記血清中のoxLDL-β2-GPI複合体（対照２：図３（Ｂ））、CRP-oxLDL複合体（実施例：図３（Ｃ））、及びCRP-oxLDL-β2-GPI複合体（実施例：図３（Ｄ））をそれぞれの上記の４．、２．、３．の方法で測定した。
なお、図３（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）において、測定値は単位（U）で表し、それぞれ、吸光度に基づいて算出した。
【００３０】
（２）測定結果の相関
上記（１）において測定した測定値間の相関を求め、糖尿病患者の結果については図４（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）に、健常人の結果については図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（D）に、それぞれ示した。
（３）考察
図３、４、５は、健常人（２８例）、糖尿病患者（１３８例）について血清中hsCRP（高感度CRP）、oxLDL-β2-GPI複合体、CRP-oxLDL複合体、及びCRP-oxLDL-β2-GPI複合体の測定を行い、臨床的解析を行った結果である。
これらの３つの図に示すとおり、健常人群に比し、糖尿病患者群では血清中hsCRP、oxLDL-β2-GPI複合体、CRP-oxLDL複合体、及びCRP-oxLDL-β2-GPI複合体の何れについても高値を示す症例が認められた。なお、hsCRPとは高感度測定系で測定できる微量変化型のCRPで、急性炎症期に肝臓から合成されるCRPとは区別されている。マクロファージや血管内皮細胞が産生するとの考えもある。
また、図４に示すとおり、hsCRP、CRP-oxLDL複合体、及びCRP-oxLDL-β2-GPI複合体の測定値間に有意な相関が認められた。一方、oxLDL-β2-GPI複合体は、hsCRP及び何れのCRP-oxLDL複合体とも相関を示さなかった。
【００３１】
この実験結果から、以下のことが考察される。
糖尿病患者では、何らかの酸化ストレスにより産生したoxLDLは血中に恒常的に循環しているβ2-GPIとCa非依存的に結合し複合体を形成する。一方、oxLDLとは別の機序で産生したCRPは、Ca依存的にoxLDLと複合体を形成する。血中のCa濃度では、上記の２種類の複合体形成に関与する両反応が互いに影響を受けず進行する。酸化ストレスが原因で生じるoxLDLとhsCRPの何れも動脈硬化のリスクファクターとして知られているが、本発明により、これら両者とβ2-GPIは複合体を形成することが明らかになった。
従って、CRP-oxLDL複合体あるいはCRP-oxLDL-β2-GPI複合体がhsCRP、oxLDLといった異なる２種類の既知リスクファクターを包括する、動脈硬化の新しいリスクファクターとなり得る。
また、現在、hsCRPの測定は主に抗CRP抗体を固相化したビーズを用いるラテックス凝集法が用いられている。ところが動脈硬化・糖尿病患者の血清は高脂血症のため、「乳び」していることが多く、「乳び」が測定系に影響を及ぼすことが知られている。この「乳び」を除去するための遠心や除去剤を使用した、サンプルの前処理を行うことがある。ところが、この除去によってLDLが減少することも報告されている。本発明測定方法は前処理を行わずに測定できるため、前処理によるLDLの消失に伴う偽陰性を排除できる可能性が高い。
【００３２】
以上の結果から、標準的な方法の一例として、以下の方法を例示することができる。
(a) ELISAプレートに、8μg/ml濃度の抗apoBモノクローナル抗体（HBSで希釈）又は8μg/mlの抗β2-GPIモノクローナル抗体（HBSで希釈）を50μl /ウエルで添加し、密閉して4℃で一晩放置することによって、抗体を固着させる。
(b) 0.05％Tween 20を含むHBS（又はT-HBS）を200μl/ウエル添加して３回洗浄する。
(c) 2％ BSAを含有するHBSを200μl/ウエル添加して、室温で１時間静置する。
(d) 血清を溶液Ａで100倍希釈して、ELISAプレートに100μl/ウエル添加する。また、別途標準曲線用としてβ2-GPI-oxLDL複合体とCRPとを溶液Ａ中で予め37℃でインキュベートしたものを溶液Ａで適宜系列的に希釈して、ELISAプレートに100μl/ウエルずつ添加する。いずれも、27℃で２時間静置する。
(e) T-HBSでウエルを３回洗浄する。
(f) 1mg/mlのHRP標識抗CRP抗体を、溶液Ａで１万倍希釈して、100μl/ウエルで添加し、室温で１時間静置する。
(g) T-HBSでウエルを３回洗浄する。
(h) o-フェニレンジアミン4 mgを、0.1M クエン酸緩衝液（pH5.0） 10mlで溶解し、30％ 過酸化水素水を10μl加えて混和したものを100μl/ウエル加えて室温で15分静置することにより発色させる。
(i) 1M 硫酸を100μl/ウエル添加することによって反応を停止させ、490 nmの吸光度を測定する。
【００３３】
４．本発明キットの作成
（１）下記の構成からなる本発明キットを作成した。
１．９６ウェルのイムノプレート  １枚
２．抗β2-GPI抗体（WB-CAL-1）  １本
３．ＨＲＰ標識した抗ヒトCRP抗体
４．ｏ−フェニレンジアミン溶液  １本
５．過酸化水素水  １本
６．反応停止液（１Ｎ  ＨＣｌ）  １本
７．β2-GPI-oxLDL-CRP（スタンダード）
（２）下記の構成からなる本発明キットを作成した。
１．  ９６ウェルのイムノプレート  １枚
２．抗apoB抗体（N2E10）  １本
３．ＨＲＰ標識した抗CRP抗体
４．ｏ−フェニレンジアミン溶液  １本
５．過酸化水素水  １本
６．反応停止液（１Ｎ  ＨＣｌ）  １本
７．oxLDL-CRP（スタンダード）
【産業上の利用の可能性】
【００３４】
本発明検出方法は、oxLDL-CRP複合体を測定することで動脈硬化、糖尿病を含む種々の疾患を検出することができることから、極めて有用である。また本発明キットは、本発明測定方法及び本発明検出方法を、さらに簡便、迅速、かつ容易に実施することができ、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、oxLDL-CRP複合体を、固着させた抗apoB抗体とHRP標識抗CRP抗体とを用いたサンドイッチ法で検出した結果を示す。
【図２】図２は、oxLDL-CRP複合体を、固着させた抗β2-GPI抗体とHRP標識抗CRP抗体とを用いたサンドイッチ法で検出した結果を示す。
【図３】図３は、各測定法により、糖尿病患者血清（DM）及び健常人血清（Normal）を測定した結果を示し、（Ａ）は高感度ＣＲＰ測定法によるCRP量の測定結果を、（Ｂ）は方法４によるoxLDL-β2-GPI複合体の測定結果を、（Ｃ）は方法２によるCRP-oxLDL複合体の測定結果を、（Ｄ）は方法３によるCRP-oxLDL-β2-GPI複合体を示す。また、各図中、点線の横線は、それぞれの測定系でのカットオフ値（健常人の測定値の平均＋３ＳＤ）を示す。
【図４】図４は、図３の測定結果の中、患者血清の測定結果について、各測定法間の相関を示し、（Ａ）はCRP測定値とoxLDL-β2-GPI複合体の測定値との間の相関を、（Ｂ）はCRP測定値とCRP-oxLDL複合体の測定値との間の相関を、（Ｃ）はCRP測定値とCRP-oxLDL-β2-GPI複合体の測定値との間の相関を、（Ｄ）はCRP-oxLDL複合体の測定値とCRP-oxLDL-β2-GPI複合体の測定値との間の相関を、それぞれ示す。
【図５】図５は、図３の測定結果の中、健常人血清の測定結果について、各測定法間の相関を示し、（Ａ）はCRP測定値とoxLDL-β2-GPI複合体の測定値との間の相関を、（Ｂ）はCRP測定値とCRP-oxLDL複合体の測定値との間の相関を、（Ｃ）はCRP測定値とCRP-oxLDL-β2-GPI複合体の測定値との間の相関を、（Ｄ）はCRP-oxLDL複合体の測定値とCRP-oxLDL-β2-GPI複合体の測定値との間の相関を、それぞれ示す。
【図１】
2004271502.tif 000004
【図２】
2004271502.tif 000005
【図３】
2004271502.tif 000006
【図４】
2004271502.tif 000007
【図５】
2004271502.tif 000008