(57)【要約】【課題】有機性廃棄物の嫌気性消化において、易分解性であるグルコース、デンプン等が多量に併存する条件下においてもセルロースの分解効率を有効に向上させる。【解決手段】嫌気性微生物に対して、カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結されたセルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物。これらの組み換え微生物を添加して有機性廃棄物を嫌気的条件下に発酵させる有機性廃棄物の嫌気性消化方法。好ましくは、発酵を、有機性廃棄物を嫌気的条件下に水素発酵させる予備発酵と、この予備発酵液をメタン発酵液に添加し、嫌気的条件下に高効率のメタン発酵を行わせる本発酵との２段階で行う。【選択図】            図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性微生物に対して、カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結されたセルロース分解酵素遺伝子を導入したことを特徴とする組み換え微生物。
【請求項２】
前記セルロース分解酵素遺伝子が、以下の（１）〜（３）のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の組み換え微生物。
（１）中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ（  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｊｏｓｕｉ）由来のセルラーゼＢ遺伝子。
（２）中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ（  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｊｏｓｕｉ）由来のセルラーゼＤ遺伝子。
（３）中温性嫌気性細菌ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）由来のエンドグルカナーゼＩ遺伝子。
【請求項３】
前記嫌気性微生物がクロストリジウム・パラプトリフィカム（  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ  ）Ｍ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６３９０）であり、前記プロモーター領域が該Ｍ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の組み換え微生物。
【請求項４】
請求項１に記載の組み換え微生物を添加して有機性廃棄物を嫌気的条件下に発酵させることを特徴とする有機性廃棄物の嫌気性消化方法。
【請求項５】
前記組み換え微生物が、請求項２に記載の（１）〜（３）の各遺伝子をそれぞれカタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結された状態で導入した３種類の組み換え微生物から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求項４に記載の有機性廃棄物の嫌気性消化方法。
【請求項６】
前記有機性廃棄物に対して、更に、カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加することを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の有機性廃棄物の嫌気性消化方法。
【請求項７】
前記発酵を、以下の（Ａ）予備発酵工程及び（Ｂ）本発酵工程の２段階で行い、かつその際に、少なくとも一方の工程において、請求項１又は請求項２に記載の組み換え微生物及び請求項６に記載の嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物から選ばれる少なくとも１種の微生物を添加することを特徴とする請求項４〜請求項６のいずれかに記載の有機性廃棄物の嫌気性消化方法。
（Ａ）有機性廃棄物を嫌気的条件下に水素発酵させて、メタン発酵基質を豊富に含む予備発酵液を準備する予備発酵工程。
（Ｂ）前記予備発酵液の比較的少量を、予備発酵工程を経ていない多量のメタン発酵液に添加し、嫌気的条件下に高効率のメタン発酵を行わせる本発酵工程。
【請求項８】
前記（Ａ）予備発酵工程において請求項６に記載の嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物から選ばれる少なくとも１種の微生物を添加し、前記（Ｂ）本発酵工程において請求項１又は請求項２に記載の組み換え微生物から選ばれる少なくとも１種の微生物を添加することを特徴とする請求項７に記載の有機性廃棄物の嫌気性消化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は組み換え微生物及び有機性廃棄物の嫌気性消化方法に関し、更に詳しくは、嫌気性微生物に対してカタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結されたセルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物、及び、かかる組み換え微生物を用いて特にセルロースの分解効率を向上させた有機性廃棄物の嫌気性消化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
家庭等から排出される食品廃棄物、生ゴミ等の有機性廃棄物を処理するに当たり、水素発酵による水素ガス、メタン発酵によるメタンガス等のエネルギー源として有用なガスを回収できる点から、嫌気性消化方法が好ましく採用されており、各種の嫌気性消化方法やそのための処理システムが提案されている。
【０００３】
【特許文献１】特開平８−１８２９９８号公報
上記の特許文献１には、生物処理槽（メタン発酵槽）から採取した消化汚泥を含油培地で嫌気条件下で処理して嫌気性油脂分解菌を分離培養し、培養された嫌気性油脂分解菌を含油排水が投入されるメタン発酵槽で増殖させる、含油排水の油脂分解方法が開示されている。
【０００４】
【特許文献２】特開２００２−２７３４９０号公報
上記の特許文献２には、有機性廃棄物を液状廃棄物と有機性汚泥とに分離し、有機性汚泥を嫌気性消化発酵槽に導入してメタン発酵させる嫌気性消化方法に関し、セルロース分の少ない易分解性物質を最初に投入してメタンガス化菌の活性を増大させることにより、有機性廃棄物の処理能力を低下させることなく嫌気性消化の立ち上げを迅速化する方法が開示されている。
【０００５】
【発明の解決しようとする課題】
有機性廃棄物の嫌気性消化においては、生ゴミ等に含まれる有機物の内、炭水化物は低分子の有機酸やアルコール類に分解され、タンパク質は有機酸を経てアミン、アンモニアに分解される（消化発酵）。このような消化発酵により生成した低分子有機酸は、メタン発酵（狭義のメタン発酵を言う。以下同じ）によりメタンと炭酸ガスに分解される。このような嫌気性消化を行う菌叢は、有機物から水素や低分子の有機酸等を生産する水素生産菌と、これらを最終的にメタン、炭酸ガス等にまで分解するメタン生産菌との複雑なミクロフローラからなる。
【０００６】
このミクロフローラ中のセルロース分解菌、換言すれば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ等セルロース分解酵素を分泌して有機性廃棄物中のセルロースを分解（低分子化）する菌は、水素生産菌の一種にカテゴリー分けすることが可能であるが、通常の嫌気性消化菌叢においては次のような問題があった。
【０００７】
即ち、生ゴミ等の有機性廃棄物は、難分解性であるセルロースと共に、易分解性であるグルコース、デンプン等の多量に含んでいる。この場合、「カタボライト抑制」として知られる現象が見られる。つまり、セルロース分解菌は易分解性のグルコース、デンプン等をまず分解し、これらが枯渇した後に初めてセルロース分解酵素を生産する性質を持つ。
【０００８】
このため、もともと難分解性であるセルロースの分解が一層遅延し、ひいては有機性廃棄物の嫌気性消化全体の効率が悪化すると言う問題があった。このような問題を解決するため、例えば、生ゴミを予め細かく粉砕したり、アルカリ処理に供したり、所定の酵素を添加したりする等と言う対策が取られているが、効率面やコスト面で必ずしも満足できるものではなかった。
【０００９】
そこで本発明は、有機性廃棄物の嫌気性消化において、易分解性であるグルコース、デンプン等が多量に併存する条件下においてもセルロースの分解効率を有効に向上させることを、解決すべき課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明（請求項１に記載の発明）の構成は、嫌気性微生物に対して、カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結されたセルロース分解酵素遺伝子を導入した、組み換え微生物である。
【００１１】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明（請求項２に記載の発明）の構成は、前記第１発明に係るセルロース分解酵素遺伝子が、以下の（１）〜（３）のいずれかである、組み換え微生物である。
（１）中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ（  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｊｏｓｕｉ）由来のセルラーゼＢ遺伝子。
（２）中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ（  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｊｏｓｕｉ）由来のセルラーゼＤ遺伝子。
（３）中温性嫌気性細菌ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）由来のエンドグルカナーゼＩ遺伝子。
【００１２】
上記（１）のセルラーゼＢ遺伝子の塩基配列をセルラーゼＢのアミノ酸配列と共に配列表の配列番号１に、上記（２）のセルラーゼＤ遺伝子の塩基配列をセルラーゼＤのアミノ酸配列と共に配列表の配列番号２に、上記（３）のエンドグルカナーゼＩ遺伝子の塩基配列をエンドグルカナーゼＩのアミノ酸配列と共に配列表の配列番号３に、それぞれ示す。
【００１３】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明（請求項３に記載の発明）の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る嫌気性微生物がクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株であり、前記プロモーター領域が該Ｍ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域である、組み換え微生物である。
【００１４】
なお、上記Ｍ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を、そのアミノ酸配列と共に配列表の配列番号４に示す。なお、配列番号４の塩基配列中には、前記のプロモーター領域（塩基番号１〜４６５）も含まれている。
【００１５】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明（請求項４に記載の発明）の構成は、第１発明に係る組み換え微生物を添加して有機性廃棄物を嫌気的条件下に発酵させる、有機性廃棄物の嫌気性消化方法である。
【００１６】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明（請求項５に記載の発明）の構成は、前記第４発明に係る組み換え微生物が、第２発明に係る（１）〜（３）の各遺伝子をそれぞれカタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結された状態で導入した３種類の組み換え微生物から選ばれる１種又は２種以上である、有機性廃棄物の嫌気性消化方法である。
【００１７】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明（請求項６に記載の発明）の構成は、前記第４発明又は第５発明に係る有機性廃棄物に対して、更に、カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加する、有機性廃棄物の嫌気性消化方法である。
【００１８】
上記「ヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物」として、クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株を例示できる。上記「ヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性組み換え微生物」とは、適宜な嫌気性微生物に対してカタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと導入した組み換え体を言う。上記のＭ株に対して、適宜なベクター等を用いて、更にヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと導入した組み換え体も、「ヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性組み換え微生物」に該当する。
【００１９】
なお、上記した「カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子」の一例として、クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株に由来するヒドロゲナーゼ遺伝子を例示できる。そのヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を、そのアミノ酸配列と共に配列表の配列番号４に示す。配列番号４の塩基配列中には、前記のプロモーター領域（塩基番号１〜４６５）も含まれている。
【００２０】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明（請求項７に記載の発明）の構成は、前記第４発明〜第６発明のいずれかに係る発酵を、以下の（Ａ）予備発酵工程及び（Ｂ）本発酵工程の２段階で行い、かつその際に、少なくとも一方の工程において、第１発明又は第２発明に係る組み換え微生物及び第６発明に係る嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物から選ばれる少なくとも１種の微生物を添加する、有機性廃棄物の嫌気性消化方法である。
（Ａ）有機性廃棄物を嫌気的条件下に水素発酵させて、メタン発酵基質を豊富に含む予備発酵液を準備する予備発酵工程。
（Ｂ）前記予備発酵液の比較的少量を、予備発酵工程を経ていない多量のメタン発酵液に添加し、嫌気的条件下に高効率のメタン発酵を行わせる本発酵工程。
【００２１】
上記の第７発明において、「水素発酵」と「メタン発酵」は次のように区別される。即ち、通常の嫌気的発酵を行う菌叢の存在下において、発酵液量に対して１０湿重量％以上の生ゴミを添加すると、相対的に水素を多く生成する発酵が起こり、本発明ではこれを「水素発酵」と呼ぶ。又、通常の嫌気的発酵を行う菌叢の存在下において、発酵液量に対して１０湿重量％未満（例えば４〜５湿重量％程度）の生ゴミを添加すると、相対的にメタンガスを多く生成する発酵が起こり、本発明ではこれを「メタン発酵」と呼ぶ。従って、「メタン発酵液」とは、発酵液量に対して１０湿重量％未満の有機性廃棄物を含む発酵液を言う。
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明（請求項８に記載の発明）の構成は、前記第７発明に係る（Ａ）予備発酵工程において第６発明に係る嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物から選ばれる少なくとも１種の微生物を添加し、前記（Ｂ）本発酵工程において第１発明又は第２発明に係る組み換え微生物から選ばれる少なくとも１種の微生物を添加する、有機性廃棄物の嫌気性消化方法である。
【００２２】
【発明の作用・効果】
（第１発明の作用・効果）
ある遺伝子の発現がカタボライト抑制を受けるか否かは、主として当該遺伝子のプロモーター領域の如何によると考えられる。従って、セルロース分解酵素遺伝子を、カタボライト抑制を受けないことが確認されている遺伝子のプロモーター領域と連結して宿主微生物に導入すれば、その組み換え微生物において、カタボライト抑制を受けることなくセルロース分解酵素遺伝子を発現させ、セルロース分解能力を発揮させることができる。
【００２３】
（第２発明の作用・効果）
上記第１発明の組み換え微生物に導入されるセルロース分解酵素遺伝子の種類は任意であるが、例えば、（１）クロストリジウム・ジョウスイ由来のセルラーゼＢ遺伝子、（２）クロストリジウム・ジョウスイ由来のセルラーゼＤ遺伝子、（３）ルミノコッカス・アルブス由来のエンドグルカナーゼＩ遺伝子等を好ましく例示することができる。
【００２４】
（第３発明の作用・効果）
上記第１発明の組み換えの対象となる嫌気性微生物、及びプロモーター領域の種類は任意であるが、例えば、プロモーター領域としてはクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を好ましく例示することができる。又、その際、上記クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株由来のプロモーター領域を用いることから、宿主微生物としては当該Ｍ株が特に好適である。
【００２５】
（第４発明の作用・効果）
第４発明によれば、前記第１発明に係る組み換え微生物を添加して有機性廃棄物を嫌気的条件下に発酵させるので、有機性廃棄物中にセルロースと共にグルコースやデンプンを多量に含んでいても、セルロース分解菌はカタボライト抑制を受けない。
【００２６】
その結果、難分解性であるセルロースが順調にオリゴ糖化・単糖化され、生成したグルコース等が更に水素生産菌やメタン生産菌により最終生成物（目的生成物）である水素ガス、メタンガス等に迅速に分解されるため、有機性廃棄物の嫌気性消化全体の効率も向上する。
【００２７】
なお、水分が多く液体状態の有機性廃棄物であれば、そのまま発酵槽中で発酵させれば、嫌気的条件下の発酵となる。水分の不足した有機性廃棄物であれば、発酵槽中で水に浸漬した状態として発酵させれば、嫌気的条件下の発酵となる。嫌気的条件を特に徹底させたい場合には、例えば、発酵槽中の空気を窒素ガス等で置換すれば良い。
【００２８】
（第５発明の作用・効果）
有機性廃棄物に添加する組み換え微生物としては、第２発明の（１）〜（３）に列挙したセルロース分解酵素遺伝子をそれぞれカタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結された状態で導入した組み換え微生物３種の内の１種又は２種以上が、特に好ましい。
【００２９】
（第６発明の作用・効果）
有機性廃棄物に添加する組み換え微生物として、上記３種の組み換え微生物の内の１種又は２種以上に加えて、カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を更に用いると、有機性廃棄物全体の消化促進に一層有効である。
【００３０】
（第７発明の作用・効果）
前記したように、有機性廃棄物の嫌気性消化は、全体的には、水素生産菌とメタン生産菌を主体とする菌叢によって行われる。そして水素生産菌はメタン生産菌よりも格段に生育が速いため、一般的には水素生産菌叢が優勢となってｐＨが極度に低下し、好適なｐＨが中性付近であるメタン生産菌叢の活動が抑制される傾向がある。この点に関しては、第７発明のように、嫌気的条件下での有機性廃棄物の発酵を、前記（Ａ）の予備発酵工程と、（Ｂ）の本発酵工程との２段階で行うことが好ましい。
【００３１】
（Ａ）の予備発酵工程においては、前記したように発酵液に対して所定量以上の有機性廃棄物を添加することにより、水素発酵を行わせる。この水素発酵によれば、メタン生産菌の活動は抑制されるが、メタン発酵の基質である低分子有機酸等（特に、酢酸が好ましい）が豊富に蓄積される。次に（Ｂ）の本発酵工程として、上記（Ａ）に係る比較的少量の予備発酵液を予備発酵工程を経ていない多量の本発酵液（有機性廃棄物量が発酵液量に対して１０湿重量％未満とされたメタン発酵液である）に添加すると、嫌気的条件下に高効率のメタン発酵が行われる。その理由は必ずしも明確ではないが、本発酵液に対して、メタン発酵の基質である低分子有機酸等が予備発酵液によって豊富に供給される点が関係していると考えられる。
【００３２】
そして、（Ａ）の予備発酵工程、及び／又は（Ｂ）の本発酵工程において前記したような各種の組み換え微生物等を添加することにより、有機性廃棄物の嫌気性消化が一層強力に行われる。
【００３３】
（第８発明の作用・効果）
発酵液に添加する微生物としては、（Ａ）の予備発酵工程においてヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加し、（Ｂ）の本発酵工程においてセルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物の１種以上、とりわけ３種全部を添加することが、特に好ましい。
【００３４】
【発明の実施の形態】
次に、第１発明〜第８発明の実施の形態について説明する。以下において単に「本発明」と言うときは、第１発明〜第８発明を一括して指している。
【００３５】
〔セルロース分解酵素遺伝子〕
本発明で宿主微生物に導入するセルロース分解酵素遺伝子の種類は任意である。好ましくは、（１）中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ由来のセルラーゼＢ遺伝子、（２）中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ由来のセルラーゼＤ遺伝子、（３）中温性嫌気性細菌ルミノコッカス・アルブス由来のエンドグルカナーゼＩ遺伝子のいずれかを導入する。
【００３６】
なお、クロストリジウム・ジョウスイの菌株は、ＦＥＲＭ  Ｐ−９６８４として産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３７】
〔プロモーター領域〕
宿主微生物にセルロース分解酵素遺伝子と連結して導入されるプロモーター領域は、カタボライト抑制を受けないことが確認されている遺伝子のプロモーター領域である限りにおいて限定されないが、好ましくはクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域である。
【００３８】
このＭ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域は、配列表の配列番号４の塩基配列中における塩基番号１〜４６５の領域に相当し、カタボライト抑制を受けずにヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を強く促進するプロモーター領域であることが確認されている。セルロース分解酵素遺伝子をこのプロモーター領域に連結しておくと、セルロース分解酵素遺伝子の転写が促進され、セルロース分解酵素遺伝子の発現がカタボライト抑制を受けることなく強化される。
【００３９】
〔組み換え微生物〕
本発明の組み換え微生物は、宿主である嫌気性微生物に対してセルロース分解酵素遺伝子を導入したものであり、かつ、そのセルロース分解酵素遺伝子がカタボライト抑制を受けないことが確認されている遺伝子のプロモーター領域と連結されて導入されているものである。
【００４０】
宿主である嫌気性微生物は適宜に選ばれるが、例えば嫌気性細菌が好ましい。特に好ましい宿主の一例として、クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株が挙げられる。このＭ株は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６３９０として、産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００４１】
その他にも、絶対嫌気性細菌では、Ｃ．  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ  、Ｍｅｇａｓｏｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＬＣ１、Ｃ．  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍΔＨ等が例示され、更に、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｇａｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｆ  、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｎｏｒｗａｙ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ２７７７４  等が例示される。
【００４２】
通性嫌気性細菌では、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  Ｓ５０３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００  等が例示される。好気性細菌では、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  Ｈ−１６、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｏｐａｃａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ等が例示される。
【００４３】
組み換え微生物の作製に当たり、カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結されたセルロース分解酵素遺伝子は、そのまま宿主微生物に導入することもできるし、宿主微生物との適合性を考慮した適宜なベクターに組み込んで導入することもできる。これらの遺伝子又は組み換えベクターの宿主微生物への導入に当たり、公知の各種の遺伝子導入法、例えばカルシウム処理法、遺伝子注入（トランスフェクション）法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法等を任意に利用することができる。
【００４４】
上記の組み換えベクターには、上記プロモーター領域の他、ターミネーター領域、抗生物質耐性遺伝子等の選抜用の各種マーカー遺伝子等を含ませることができる。ベクターの好ましい具体例として、プラスミドベクターである  ｐＪＩＲ７５１、  ｐＪＩＲ７５０、ｐＪＩＲ４１８  等を挙げることができる。
【００４５】
〔組み換え微生物の好適な実施形態〕
今回、組み換え微生物の好ましい実施形態として、クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株にセルロース分解酵素遺伝子を導入するためのシャトルベクターを開発し、このシャトルベクターによって所定のプロモーター領域とセルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物を作製した。
【００４６】
即ち、プラスミドベクターである  ｐＪＩＲ７５１のマルチクローニング部位を改変し、制限酵素部位  ＥｃｏＲ１、ＢａｍＨ１  、Ｓａｌ１、  Ｘｈｏ１  、ＢｓｓＨＩ１、  ＨｉｎｄＩＩＩの順へ置換した。これをプラスミド  ｐＪＩＲ７５１−Ｍと呼ぶ。そして上記Ｍ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を  ＰＣＲ法で増幅した後に、  ｐＪＩＲ７５１−Ｍの制限酵素部位  ＢａｍＨ１−Ｓａｌ１  間に連結させた。これを  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏと呼ぶ。
【００４７】
更に、このように構築した  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏの制限酵素部位  Ｘｈｏ１−ＢｓｓＨＩ１間に、前記第２発明に係る３種類のセルロース分解酵素遺伝子（セルラーゼＢ遺伝子、セルラーゼＤ遺伝子、エンドグルカナーゼＩ遺伝子）を  ＰＣＲ法で増幅した後に挿入した。そして、エレクトロポレーション法によって、これらをそれぞれ別個のクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株に導入した。
【００４８】
〔有機性廃棄物の嫌気性消化方法〕
有機性廃棄物の嫌気性消化は、その有機性廃棄物を特に好気的な条件に置かない限り、自然に行うことができる。水分が多く液体状態の有機性廃棄物であれば、そのまま発酵槽中で発酵させれば嫌気的条件下の発酵となる。水分の不足した有機性廃棄物であれば、発酵槽中で水に浸漬した状態として発酵させれば、嫌気的条件下の発酵となる。嫌気的条件を特に徹底させたい場合には、例えば、発酵槽中の空気を窒素ガス等で置換すれば良い。
【００４９】
嫌気的なメタン発酵を行うには、一般的には３７°Ｃ程度で行う中温発酵法と、５５°Ｃ程度で行う高温発酵法が知られている。本発明の有機性廃棄物の嫌気性消化は中温発酵法で行っても良いし、高温発酵法で行っても良い。但し、組み換え微生物の宿主としてクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株を用いる場合、その生育至適温度が３７°Ｃ程度であるため中温発酵法が適当であるが、２０〜４５°Ｃ程度の温度域での発酵も可能である。
【００５０】
本発明に係る有機性廃棄物の嫌気性消化方法において、用いる有機性廃棄物の種類は限定されない。例えば、家庭、レストラン、ホテルの厨房等から排出される各種食材を含む生ゴミ、各種の農産廃棄物（例えば、稲わら等のセルロース系物質を含む廃棄物）、河川の土手等での刈草で発生する植物性廃棄物等が限定なく含まれる。
【００５１】
本発明において、これらの有機性廃棄物は上記の組み換え微生物を添加したもとで嫌気的条件下での発酵に供される。組み換え微生物としては、前記第２発明に係る（１）〜（３）の各遺伝子をそれぞれ導入した３種類の組み換え微生物の１種又は２種以上、特に３種全部を一緒に添加することが好ましい。有機性廃棄物に対して、更に、カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加することが、とりわけ好ましい。
【００５２】
有機性廃棄物を嫌気的条件下に発酵させるに当たり、添加する組み換え微生物等は別にしても、通常は有機性廃棄物自体が一応の嫌気的発酵を行い得る菌叢を伴っている。但し、メタン発酵性能の良い適当な菌叢を別途準備し、有機性廃棄物に対して添加することも、好ましい。
【００５３】
〔２段階式嫌気性消化方法〕
有機性廃棄物の嫌気性消化を、以下の（Ａ）予備発酵工程及び（Ｂ）本発酵工程の２段階で行うことが、特に好ましい。その際、添加すべき前記第１発明、第２発明又は第６発明に係る組み換え微生物等の１種以上が、（Ａ），（Ｂ）の少なくとも一方の工程において添加される。特に好ましくは、（Ａ）予備発酵工程においてヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加し、（Ｂ）本発酵工程においてセルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物の１種以上（より好ましくは３種類の全部）を添加する。
【００５４】
（Ａ）有機性廃棄物を、発酵液に対して１０湿重量％以上添加することにより、嫌気的条件下に主に水素発酵させて、メタン発酵基質を豊富に含む予備発酵液を準備する予備発酵工程。
【００５５】
（Ｂ）比較的少量の予備発酵液を、予備発酵工程を経ていない多量のメタン発酵液に添加し、嫌気的条件下に高効率のメタン発酵を行わせる本発酵工程。
【００５６】
予備発酵工程を切り上げるべき時期は、例えば予備発酵工程における水素発酵に伴う水素ガス等の発生量、蓄積される有機酸の濃度等に基づき、適宜に判定することができる。予備発酵液の本発酵工程への投入量は、相対的に少量であれば良いが、予めラボスケールの実験を行って本発酵工程でのメタン発酵状況を把握し、これに基づいて予備発酵液の投入量を決定しても良い。
【００５７】
【実施例】
〔実施例１：メタン発酵菌叢及び生ゴミ試料の調製〕
メタン発酵菌叢の菌叢としては、本発明に係る組み換え微生物が安定して維持、定着される限りにおいて、水田土壌、海底汚泥、既存のメタン発酵槽の菌叢等を任意に使用できるが、今回は、三重県鈴鹿市在住の石田氏が所有するメタン発酵菌叢を用いた。
【００５８】
生ゴミ試料として、家庭から排出される炭水化物性（穀類、野菜等）、タンパク質性（魚肉、畜肉等）及び脂質性の残飯や調理屑等が混在する通常の生ゴミを採集した。そして、これらを市販のディスポーザーを用いて粉砕した後、遠心分離（１００００×ｇ、１０分）して得た固形物を用いた。
【００５９】
〔実施例２：メタン発酵条件の探索〕
まず、以下のようにして、組み換え微生物を添加しない条件で、生ゴミからのメタン発酵の良好な条件を探った。
【００６０】
通常の嫌気性発酵液１０００ｍＬに対して生ゴミ１００ｇ（湿重量）を添加し、予備発酵工程としての水素発酵を行わせて、予備発酵液を調製した。次いで、この予備発酵液を、１０湿重量％以下の生ゴミを投入したメタン発酵液１０００ｍＬに対して、図１に示す投入パターンに従って間欠的に投入した。
【００６１】
即ち、図１は横軸に上記のメタン発酵開始後の経過時間を示すが、図の矢印１で示す第１期間中は、馴致期間として、４８時間当たり１度ずつ、１０〜５０ｍＬの範囲内で徐々に増量させながら、所定液量のメタン発酵液の上清を抜き取り、かつ同量の予備発酵液を投入した。次に、図の矢印２で示す第２期間中は、４８時間当たり１度ずつ、メタン発酵液の上清１００ｍＬを抜き取り、かつ同量の予備発酵液を投入した。図の矢印３で示す第３期間中は、４８時間当たり１度ずつ、メタン発酵液の上清１５０ｍＬを抜き取り、かつ同量の予備発酵液を投入した。図の矢印４で示す第４期間中は、４８時間当たり１度ずつ、メタン発酵液の上清２００ｍＬを抜き取り、かつ同量の予備発酵液を投入した。
【００６２】
図１は、縦軸にメタン発酵液全体からの１時間当たりの総ガス発生量を示す。総ガス発生量を示すグラフが上下に大きく変動しているのは、上記の予備発酵液の間欠投入の影響であると考えられる。総ガス発生量は、（株）シナガワ製の湿式ガスメーター  Ｗ−ＮＫ  Ｄａ−０．５Ａ  で測定した。又、そのガス組成をガスクロマトグラフィー等によって調べたが、メタンガス、水素ガス、二酸化炭素等が含まれていた。
【００６３】
図１によれば、総ガス発生量は第２期間中に最高値を記録し、その後の第３期間や第４期間と大差がない。従って、メタン発酵液に対する予備発酵液の投入量が概ね「１００〜２００ｍＬ／Ｌ／４８時間」である場合に、最も活発なガス発生（メタン発酵）を期待できることが分かった。
【００６４】
〔実施例３：組み換え微生物の作出〕
（実施例３−１：プラスミドの構築と遺伝子導入）
基本的遺伝子操作はＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８２）に従って行った。宿主には、クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株を用いた。遺伝子導入用ベクターは、オーストラリア・モナッシュ大学（Ｍｏｎａｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）  のジュリアン・ルード（Ｊｕｒｉａｎ  Ｉ．  Ｒｕｄｅ）より提供されたシャトルベクターである  ｐＪＩＲ７５１を用いた。これはエリスロマイシン耐性遺伝子を含み、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの間で有効なシャトルベクターである。
【００６５】
ところで、上記のＭ株において、ベクター  ｐＪＩＲ７５１を用いて異種微生物由来の遺伝子を発現させるためには、発現を制御するプロモーターをＭ株由来のものに変更しておきたい。又、発明の目的からして、このベクター  ｐＪＩＲ７５１に、カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域を設定しておきたい。この目的のプロモーターとして、上記Ｍ株由来の前記ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を用いた。
【００６６】
このプロモーター部分を、配列番号５に示す塩基配列の合成ｆｗｄ．プライマー及び配列番号６に示す塩基配列の合成ｒｅｖ．プライマーを用いて鋳型ＤＮＡから  ＰＣＲ法にて増幅し、得られた約４００塩基対の塩基配列を確認後、これを  ｐＪＩＲ７５１のマルチクローニングサイトを目的に沿って変更した  ｐＪＩＲ７５１−Ｍの  ＢａｍＨ１−Ｓａｌ１  部位に連結することにより、図２に示すように  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏを構築した。
【００６７】
次に、宿主に導入する構造遺伝子として、前記中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ由来のセルラーゼＢ遺伝子及びセルラーゼＤ遺伝子、中温性嫌気性細菌ルミノコッカス・アルブス由来のエンドグルカナーゼＩ遺伝子を、それぞれ用いた。
【００６８】
セルラーゼＢ遺伝子については配列番号７に示す塩基配列の合成ｆｗｄ．プライマー及び配列番号８に示す塩基配列の合成ｒｅｖ．プライマーを、セルラーゼＤ遺伝子については配列番号９に示す塩基配列の合成ｆｗｄ．プライマー及び配列番号１０に示す塩基配列の合成ｒｅｖ．プライマーを、エンドグルカナーゼＩ遺伝子については配列番号１１に示す塩基配列の合成ｆｗｄ．プライマー及び配列番号１２に示す塩基配列の合成ｒｅｖ．プライマーを、それぞれ用いて各々の鋳型となる染色体ＤＮＡから  ＰＣＲ法にて増幅させた。
【００６９】
得られた３種のＤＮＡ断片を別個に  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏの  Ｘｈｏ１−ＢｓｓＨ１  部位にそれぞれ連結し、セルラーゼＢ遺伝子を発現可能な  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｃｅｌＢ  、セルラーゼＤ遺伝子を発現可能な  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｃｅｌＤ  、エンドグルカナーゼＩ遺伝子を発現可能な  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｅｇＩの各プラスミドを、図３に示すように、構築した。
【００７０】
これらの各プラスミドを、それぞれ、宿主微生物としての前記Ｍ株と共に適宜な媒体液中に懸濁させて冷却し、別途に予め冷却しておいた幅０．１ｃｍのジーンパルサー用キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  社製）に移し、同社製のジーンパルサーを用いて、４００Ω、０．５ｋＶ、２５μＦの条件でエレクトロポレーション法による遺伝子導入を行った。その際のパルス電圧の周波数と印加時間は、上記ジーンパルサーに組み込まれた設定に従った。
【００７１】
（実施例３−２：セルラーゼ活性の確認）
得られた３種類の組み換え微生物をそれぞれＧＳ培地（炭素源：１％  Ｎ−アセチルグルコサミン）にて純粋培養し、それらの培養上清について、公知文献である「Ｓａｋｋａ，  Ｋ．，  Ｓｈｉｍａｎｕｋｉ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｋ．  （１９９１）  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ０ｆ  ｃｅｌＣ３０７  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ｃ３０７  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｓｔｒａｉｎ  Ｆ１．Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５５，  ３４７−３５０」を参照して、ＤＮＰ法により活性の確認を行った。その結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】
2004261144.tif 000003
なお、表１中において、セルラーゼＤ遺伝子を導入した組み換え微生物が殆ど活性を示していないが、セルラーゼには種々の作用機構のものが存在し、その内セルラーゼＤは、セルラーゼＢやエンドグルカナーゼＩに比較して、ＤＮＰ法による活性確認に用いたカルボキシメチルセルロースに対して活性を示し難いことが知られている。詳細は述べないが、これとは別に活性染色法による活性の確認も行っており、その結果では、セルラーゼＤ遺伝子を導入した組み換え微生物は、他の２種の組み換え微生物と同様にセルラーゼ活性が確認されている。
【００７３】
以上のように、３種類の組み換え微生物のいずれもが、グルコースのアナログとしてのＮ−アセチルグルコサミンの存在下でセルラーゼ活性を発現した。従って、これらの組み換え微生物は、カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結されたセルロース分解酵素遺伝子を導入したことにより、易分解性であるグルコース、デンプン等が併存する条件下においても、セルロースの分解効率を有効に向上させ得ることが確認された。
【００７４】
〔実施例４：組み換え微生物の添加によるメタン発酵の促進〕
（実施例４−１：予備発酵工程としての水素発酵）
第１の水素発酵槽を準備した。この水素発酵槽においては通常のメタン発酵液１００ｍＬに対して、生ゴミ３０ｇと、上記３種の組み換え微生物をそれぞれ純粋培養したＧＳ培地の各１０ｍＬと、前記第６発明に係る「カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物」としてのクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株とを添加し、更に水道水を加えて、全量を２００ｍＬに調整した。これを３７°Ｃで２晩培養し、予備発酵工程としての水素発酵を行わせた。
【００７５】
上記とは別に、第２の水素発酵槽を準備した。この水素発酵槽においては通常のメタン発酵液１００ｍＬに対して生ゴミ３０ｇを添加し、更に水道水を加えて全量を２００ｍＬに調整した。これを３７°Ｃで２晩培養し、予備発酵工程としての水素発酵を行わせた。
【００７６】
両者の水素発酵槽において生成するガスを分析したところ、詳しいデータは示さないが、第１の水素発酵槽においては、第２の水素発酵槽に比較して、水素発生量が数％向上することが認められた。この点は、第１の水素発酵槽にクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株を添加した結果である、と考えられる。
【００７７】
一方、両者の水素発酵槽における固形残差（生ゴミ）の減少量には大きな差異が認められなかった。従って水素発酵の状態においては、セルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物が必ずしも有効に機能していないと考えられる。但し、下記の実施例４−２の結果から、これがカタボライト抑制によるものとは考えられない。よって、セルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物は、水素発酵槽に添加するのではなく、下記のメタン発酵液に添加する方が効率的である、とも考えられる。
【００７８】
又、水素発酵によって生成する各種の低分子有機酸はメタン発酵における良好な基質となるが、酢酸が特にメタン変換率が高く、好ましいと一般的に言われている。そして第１の水素発酵槽において生成した有機酸を分析したところ、酢酸の生成率が高かった。
【００７９】
（実施例４−２：組み換え微生物の添加によるメタン発酵への影響）
前記実施例２における、「メタン発酵液に対する予備発酵液の投入量が１００〜２００ｍＬ／Ｌ／４８時間である場合に最も活発なメタン発酵を期待できる」と言う知見に基づき、上記の予備発酵液の所定量を、本発酵液としてのメタン発酵液に投入した。
【００８０】
即ち、それぞれ１０湿重量％以下の生ゴミを添加した１０００ｍＬの通常のメタン発酵液を収容した２基のメタン発酵槽を準備した。そして、第１のメタン発酵槽には上記第１の水素発酵槽中の予備発酵液の全量を添加し、第２のメタン発酵槽には上記第２の水素発酵槽中の予備発酵液の全量を添加した。
【００８１】
そして第１及び第２のメタン発酵槽を３７°Ｃに維持し、それぞれメタン発酵を行わせて、実施例２と同様の方法で、経時的に総ガス発生量とメタンガス発生量とを測定した。それらの測定結果を図４及び図５に示す。
【００８２】
図４において、●でプロットする「改良前」とは第２のメタン発酵槽における成績を示し、▲でプロットする「組換え菌添加」とは第１のメタン発酵槽における成績を示す。両メタン発酵槽間に有意な総ガス発生量の差異が認められた。
【００８３】
図５において、「改良前」とは第２のメタン発酵槽における成績を示し、「組換え体」とは第１のメタン発酵槽における成績を示す。図５の下片における数字の表記は、予備発酵液添加後におけるメタン発酵の経過時間を示し、例えば図５の下片の左端に、縦方向に沿って「５」、「４」、「８」の数字が並んでいるのは、「５４８時間経過後」を意味する。図５によれば、両メタン発酵槽間に有意なメタンガス発生量の差異が認められた。
【００８４】
更に両メタン発酵槽における固形残差（生ゴミ）の分解率を分析したところ、メタン発酵開始後１２００時間経過時点において、第２のメタン発酵槽では約８０％であり、第１のメタン発酵槽では９０％以上であった。
【００８５】
（実施例４の評価）
▲１▼カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結された状態でセルラーゼ遺伝子を導入した組み換え微生物を添加して、有機性廃棄物を嫌気的条件下に発酵させることの効果が確認された。
【００８６】
▲２▼その際、更に、カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加することの効果が確認された。
【００８７】
▲３▼これらの発酵を、（Ａ）有機性廃棄物を嫌気的条件下に水素発酵させて、メタン発酵基質を豊富に含む予備発酵液を準備する予備発酵工程と、（Ｂ）予備発酵液の比較的少量を、予備発酵工程を経ていない多量のメタン発酵液に添加し、嫌気的条件下に高効率のメタン発酵を行わせる本発酵工程とに分けて行い、上記の組み換え微生物等をその少なくとも一方の工程において添加することの、特に好ましい効果が確認された。
【００８８】
▲４▼上記の（Ａ）予備発酵工程において上記ヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物等を添加し、（Ｂ）本発酵工程において上記のセルラーゼ遺伝子を導入した組み換え微生物を添加することの、とりわけ好ましい効果が確認された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における本発酵液への予備発酵液の投入パターンを示す図である。
【図２】実施例における  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏの構築を示す図である。
【図３】実施例における  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｃｅｌＢ  、  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｃｅｌＤ  、及び  ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｅｇＩの構築を示す図である。
【図４】実施例における総ガス発生量の推移を示す図である。
【図５】実施例におけるメタンガス発生量の推移を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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