(57)【要約】【課題】本発明は、核酸の２本鎖構造の解消を測定する方法を提供する。また本発明は、上記測定方法を応用した測定キットを提供する。【解決手段】本発明の測定方法および測定キットは、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物で２本鎖核酸を染色した蛍光標識２本鎖核酸を調製し、蛍光標識２本鎖核酸と核酸の２本鎖構造を解消するタンパク質との反応によって生じる、上記２本鎖核酸の２重らせん構造解消に伴う蛍光強度の変化を測定することを特徴とするものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物により２本鎖核酸を染色して蛍光標識２本鎖核酸を作製し、（２）上記蛍光標識２本鎖核酸と核酸の２本鎖構造を解消するタンパク質とを反応させることにより、（３）上記蛍光標識核酸の２本鎖構造の解消に伴う蛍光強度の変化を測定することを特徴とする、核酸の２本鎖構造解消の測定方法
【請求項２】
上記色素化合物が、２本鎖核酸にインターカレートすることで蛍光を発することを特徴とする、請求項１に記載の測定方法
【請求項３】
上記蛍光強度の変化が、上記蛍光標識２本鎖核酸から色素化合物が解離することによって起こる蛍光強度の減少であることを特徴とする、請求項１、２に記載の測定方法
【請求項４】
上記２本鎖核酸が、ＤＮＡ、またはＲＮＡであることを特徴とする、請求項１〜３に記載の測定方法
【請求項５】
タンパク質による核酸の２本鎖構造の解消を測定することを目的とする、３〜３００  ｎＭの基質となる蛍光標識２本鎖核酸を測定系に含むことを特徴とする、請求項１〜４記載の測定方法を利用した測定キット
【請求項６】
上記核酸の２本鎖構造を解消するタンパク質が、２本鎖核酸のリン酸結合を分解する性質を有することを特徴とする、請求項５に記載の測定キット
【請求項７】
上記２本鎖核酸のリン酸結合を分解する性質を有するタンパク質が、エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする、請求項５、６に記載の測定キット
【請求項８】
上記２本鎖核酸のリン酸結合を分解する性質を有するタンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする、請求項５、６に記載の測定キット
【請求項９】
上記２本鎖核酸のリン酸結合を分解する性質を有するタンパク質が、基質となる蛍光標識２本鎖核酸に対してモル比で１／１，０００以上であることを特徴とする、請求項５〜８に記載の測定キット
【請求項１０】
上記核酸の２本鎖構造を解消するタンパク質が、２本鎖核酸を１本鎖に巻き戻す性質を有することを特徴とする、請求項５に記載の測定キット
【請求項１１】
上記２本鎖核酸を１本鎖に巻き戻す性質を有するタンパク質が、基質となる蛍光標識２本鎖核酸に対してモル比で１／２０，０００以上であることを特徴とする、請求項１０に記載の測定キット
【請求項１２】
上記２本鎖核酸を１本鎖に巻き戻す性質を有するタンパク質の作用により巻き戻された、１本鎖核酸同士の再結合を阻害するタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１０、１１に記載の測定キット
【請求項１３】
上記巻き戻された１本鎖核酸同士の再結合を阻害するタンパク質が、１本鎖核酸を特異的に分解する性質を有することを特徴とする、請求項１０〜１２に記載の測定キット
【請求項１４】
上記巻き戻された１本鎖核酸同士の再結合を阻害するタンパク質が、１本鎖核酸特異的結合性タンパク質であることを特徴とする、請求項１０〜１２に記載の測定キット
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質により引き起こされる核酸の２本鎖構造の解消を測定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
２本鎖核酸と反応する蛍光色素は主に核酸の定量に使用されており、一般的には電気泳動した後の核酸の検出に用いられている。また２本鎖核酸と反応する蛍光色素は、ポリメラーゼ  チェイン  リアクション（以下、ＰＣＲと言う）法を用いた標的核酸の定量にも用いられている。例えば、２本鎖核酸と反応する蛍光色素の存在下でＰＣＲを行い、各ＰＣＲサイクルごとに反応液の蛍光を測定して、その変化から標的核酸の初期量を決定する定量ＰＣＲ法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。この方法ではＰＣＲによる増幅産物が２本鎖ＤＮＡであることから、２本鎖核酸にインターカレーションすることにより蛍光特性が変化する色素を用いる。これをＰＣＲによる増幅操作前にあらかじめ反応溶液に添加しておき、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定してその立ち上がりサイクル等から標的核酸の初期量を決定するものである。
【０００３】
また、２本鎖核酸の酵素的分解に関しては蛍光偏光法や蛍光エネルギー転移（以下、ＦＲＥＴと言う）を用いた手法が存在し、分子生物学的な研究分野などで広く用いられている。蛍光偏光法は、蛍光偏光度を測定し物質間の相互作用を解析する方法である。蛍光標識した２本鎖核酸は、酵素によって分解されると分子量が小さくなるため蛍光偏光度が減少する。この蛍光偏光度を測定すれば、酵素反応をリアルタイムに測定することが可能である。この蛍光偏光法を利用して酵素による核酸の分解の測定が行われているが、蛍光偏光を測定するためには特殊な測定機器が必要であり、一般的に利用できるものではない。
【０００４】
一方、ＦＲＥＴ現象とは、蛍光に関わる現象であって（例えば、非特許文献１、２参照）、１つの発蛍光団（エネルギー供与体）の蛍光スペクトルが他の発色団（エネルギー受容体）の励起スペクトルと重なる場合で、かつ両発蛍光団同士が近接する位置にある場合においては、エネルギー供与体の励起エネルギーの転移によりエネルギー受容体の蛍光発光を誘導し、さらにドナー自身からの蛍光強度は減少するという現象を意味する。ＦＲＥＴ現象のＤＮＡ分析に対する応用に関しては既にいくつかが提示されている（例えば、特許文献２、３参照）。このようにＦＲＥＴ現象は優れた点を有しているため、２本鎖核酸の高次構造の解析等に対して有望と考えられる。しかしながら、ＦＲＥＴ現象が起きるような長鎖の２本鎖核酸の調製は現状困難であり、かつ２本鎖核酸１分子で考えればこの方法はエンド  ポイント  アッセイとなり、速度論的解析には不向きと予想される。したがって、２本鎖核酸の高次構造の解析、特に核酸の２本鎖構造の解消に関する新規な測定方法が望まれている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平５−２３７０００号公報
【特許文献２】
特開平１１−５６３９８号公報
【特許文献３】
特開平１１−１７８６００
【非特許文献１】
Ｌ．  Ｓｔｒｙｅｒら：Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４７，  ８１９−８４６  （１９７８）
【非特許文献２】
Ｔａｙｌｏｒら：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｐａｒｔ  Ｂ．  ２２０−２４５  （１９８９），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のことから、本発明の課題は、タンパク質による核酸の２本鎖構造の解消を定量するための、迅速、簡便、かつ精度の高い方法であって、さらに反応速度論的な解析に好適な新規測定方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本研究者らは鋭意検討を重ねた結果、２本鎖核酸内にインターカレートした状態でのみ蛍光を発する色素化合物が、核酸の２本鎖構造の解消を測定する系に好適に利用できることを見い出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明の核酸の２本鎖構造解消の測定方法は、２本鎖核酸を２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物によって染色し、その蛍光標識２本鎖核酸と核酸の２本鎖構造を解消するタンパク質とを反応させ、蛍光標識２本鎖核酸の蛍光強度の減少を測定する。この蛍光強度の変化から、蛍光標識２本鎖核酸に対する、２本鎖構造が解消されて生じた１本鎖核酸の割合を求めることが可能となる。また、核酸の２本鎖構造の解消は、核酸の２本鎖構造を解消するタンパク質との反応に絶対的に依存するので、同時にそのタンパク質の反応性を直接評価することができ、かつ反応速度論的な解析も可能となる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる色素化合物は、２本鎖核酸にインターカレートすることで蛍光を発するものである。色素化合物と２本鎖核酸との反応とは、色素化合物が２本鎖核酸の安定な２重らせん構造の溝部内等に特異的に挿入されて結合することであり、その状態で色素化合物は励起光の照射によって蛍光を発するようになる。従って、単独で存在する場合には励起光が照射されても蛍光を発しないか、発光しても微弱である。本発明で用いる色素化合物は、単独では蛍光を発せず２本鎖にインターカレートすることで発蛍光性となるものが望ましいが、蛍光色素単独での蛍光強度と２本鎖核酸にインターカレートした時の蛍光強度に大差が有る場合は適用可能である。したがって、本発明で用いる色素化合物について特に制限はなく、２本鎖にインターカレートして発蛍光性となるものは全て使用可能である。具体的には、フェナントリジウム  インターカレーター（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｉｕｍ）系、アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＤＤ）、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ）、または、ベンゾオキサゾリウム−４−ピリジニウム（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｉｕｍ−４−ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ，  ＰＯ）系、ベンゾチアゾリウム−４−ピリジニウム（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｕｍ−４−ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ，  ＢＯ）系、ベンゾオキサゾリウム−４−キノリニウム（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｉｕｍ−４−ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ，  ＹＯ）系、ベンゾチアゾリウム−４−キノリニウム（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｕｍ−４−ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ，  ＴＯ）系が好ましく使用可能である。さらに、本発明で用いる色素化合物は新たに合成する必要はなく、市販のＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎやＹＯＹＯ−１等の色素化合物が好適に使用可能である。
【００１０】
本発明における蛍光標識２本鎖核酸の蛍光強度の変化は、蛍光標識２本鎖核酸から色素化合物が解離することにより、蛍光標識２本鎖核酸の蛍光強度が減少することによって生じる。すなわち、蛍光標識した２本鎖核酸と核酸の２本鎖構造を解消するタンパク質とを反応させると、このタンパク質の作用により核酸の２重らせん構造が解消され、同時にその溝部内等に特異的に挿入されていた蛍光色素が解離する。解離した蛍光色素は、単独状態では励起光を照射しても蛍光を発しないか極めて微弱なので、蛍光色素の蛍光強度が減少することになる。以上のことから、蛍光強度の減少は核酸の２本鎖構造の解消と一元的に対応していると考えられる。また、本発明においては、蛍光強度の変化を測定する方法について特に制限はなく、汎用の蛍光プレートリーダーや蛍光分光光度計等で好適に測定することが可能である。
【００１１】
本発明における２本鎖核酸は、ＤＮＡとＲＮＡいずれも使用することができる。また、２本鎖を形成するものであれば短いオリゴヌクレオチドも使用可能である。したがって、２本鎖核酸を構成する核酸の種類については特に制限はなく、化学合成法、酵素反応法、天然の核酸から調製する方法、ＰＣＲにより調製する方法、あるいはプラスミドやファージのクローニング法により調製することが可能であり、そのための種々の公知方法が使用できる。さらに、本発明においては、２本鎖核酸の塩基配列は使用の目的に応じて自由に選択可能であり、特に制限されない。すなわち、本発明においては２本鎖核酸であることが唯一の制限であり、その配列がナンセンスであっても好適に使用することが可能である。
【００１２】
本発明における測定キットにおいては、基質となる蛍光標識２本鎖核酸の濃度は３〜３００  ｎＭ、測定値の定量性を考慮すると３０〜３００  ｎＭとすることが好ましい。
【００１３】
本発明の測定キットの測定対象となる核酸の２本鎖構造を解消するタンパク質は、２本鎖核酸のリン酸結合を分解する性質を有する、あるいは２本鎖核酸を１本鎖に巻き戻す性質を有するタンパク質である。このタンパク質は、上記性質を有するものであれば特に制限はない。したがって、本発明の測定キットを応用すれば、上記の性質を有する未知のタンパク質を発見できる可能性がある。
【００１４】
また、上記２本鎖核酸のリン酸結合を分解する性質を有するタンパク質としては、エキソヌクレアーゼ活性、あるいはエンドヌクレアーゼ活性を有するものである。エキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、２本鎖核酸の末端のリン酸結合から順次分解して２本鎖核酸を１塩基単位まで分解する能力を有する酵素であり、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ等が挙げられ、本発明の測定キットにより好適に活性が測定できる。また、エンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、２本鎖核酸内部のリン酸結合をランダムに分解して２本鎖核酸を１塩基単位まで分解する能力を有する酵素であり、例えばＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌヌクレアーゼやデオキシリボヌクレアーゼＩ等が挙げられ、本測定キットにより好適に活性の測定が可能である。本発明の測定キットにおいては、これら２本鎖核酸のリン酸結合を分解する性質を有するタンパク質量は、基質となる蛍光標識２本鎖核酸に対してモル比で１／１，０００以上で適用可能であるが、測定値の定量性を考慮すると１／１００以上がより好ましく適用可能である。
【００１５】
さらに、本発明の２本鎖構造を解消するタンパク質は、２本鎖核酸を１本鎖の状態に巻き戻す性質を有する。該タンパク質は２本鎖核酸の末端から鎖と鎖の間に入り込んで塩基間の水素結合を切断し、１本鎖に解離させる。したがって、該タンパク質が２本鎖核酸の鎖間に入り込むことにより、２重らせん構造の解消がおこり蛍光強度に大きな変化が生じる。このような２本鎖核酸を巻き戻す性質を有するタンパク質としては、例えばＤＮＡヘリカーゼやＲＮＡヘリカーゼが挙げられ、本発明の測定キットで好適に活性を測定できる。ここで、２本鎖核酸を１本鎖の状態に巻き戻す性質を有するタンパク質量は、基質となる蛍光標識２本鎖核酸に対してモル比で１／２０，０００以上が適用可能であるが、測定値の定量性を考慮すると１／２，０００以上がより好ましく適用可能である。
【００１６】
また、本発明の測定キットは、２本鎖核酸を１本鎖に巻き戻す性質を有するタンパク質の作用により巻き戻された、１本鎖核酸同士の再結合を阻害するタンパク質を含むことを特徴とする。該タンパク質は、本系の簡便性、信頼性を向上させるため、測定中に解離した１本鎖核酸が再結合して色素化合物と反応しないように系中に添加するものである。この目的を可能とするタンパク質としては、（１）１本鎖核酸を特異的に分解する、または（２）１本鎖核酸と特異的に結合して２本鎖になることを阻害する、性質を有するものである。
【００１７】
すなわち、（１）の１本鎖核酸を特異的に分解する性質を有するタンパク質は、２本鎖核酸の状態では反応せず、２本鎖核酸が巻き戻されて１本鎖の部分が生じた時点で、その１本鎖核酸部分を特異的に認識して切断する特徴を有する。このようなタンパク質としては、２本鎖核酸を切断せず１本鎖核酸だけを認識して分解する特徴を有するものであれば特に制限はないが、例えばＳ１ヌクレアーゼが好適に使用可能である。ただし、測定キットとしてあらかじめこのようなヌクレアーゼを含む場合は、基質として平滑末端の２本鎖核酸が要求される。すなわち、２本鎖核酸を１本鎖に巻き戻すタンパク質は、平滑末端の２本鎖核酸を１本鎖の状態に巻き戻す性質を有することが要求される。これは、１本鎖核酸を特異的に分解する酵素を反応系に含む場合、非平滑末端があるとその１本鎖部分をも分解してしまうため、基質としては平滑末端の２本鎖核酸に限定されるためである。本発明の測定キットにおいては、（１）の性質を有するタンパク質量は、基質となる蛍光標識２本鎖核酸に対してモル比で１／１，０００倍以上含まれることを特徴とする。しかしながら、巻き戻された１本鎖核酸を充分に切断するためには、該基質に対してモル比で１／１００倍以上であることが好ましい。
【００１８】
一方、（２）の１本鎖特異的結合性タンパク質は生物由来のもので、１本鎖核酸に特異的に結合するため、立体障害的に１本鎖核酸同士の再結合を阻害する。
したがって、本測定キットの基質として平滑末端２本鎖核酸を用いる場合は特に問題は生じない。また、非平滑末端２本鎖核酸を用いたとしても、（２）のタンパク質は非平滑末端の１本鎖部分のみと結合し、２本鎖部分に対しては反応性を持たない。したがって、本測定キットの対象である２本鎖核酸を巻き戻すタンパク質が、基質の１本鎖部分と（２）のタンパク質が結合した状態に対して非感受性であれば、好適にその活性を測定することが可能である。本発明の測定キットにおいては、この１本鎖特異的結合性タンパク質量は基質である２本鎖核酸に対してモル比で１０倍以上系中に含まれることが望ましい。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例にしたがって詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【００２０】（実施例１）
２本鎖核酸の調製
天然の核酸を鋳型としてＰＣＲにより、配列表の配列１に示す全長５００  ｂｐの２本鎖核酸を合成した。ＰＣＲは以下に示すＰＣＲミックスを、変性９４  ℃（５分間）、６０  ℃（３０秒間）、７２  ℃（１分間）を３０サイクル行い、最後に７２  ℃（５分間）で反応させた。ＰＣＲミックスの組成は、  １０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ  ０．５μｌ、２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ８μｌ（以上はＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ＴａｑキットＲＲ００１Ａ、タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８プラスミド０．５μｌ、プライマー（１）２μｌ、プライマー（２）２μｌ、滅菌水７１μｌ、である。ここで、反応用２本鎖核酸調製用のプライマー（２０  ｍｅｒ）として、それぞれ配列２および３に示す以下の配列のオリゴヌクレオチドを用いた。
プライマー（１）：５’−  ｃｃａｇｔｔｔｇｇａ  ａｃａａｇａｇｔｃｃ  −３’  （配列２）
プライマー（２）：５’−  ｃｃｃａａｃｔｔａａ  ｔｃｇｃｃｔｔｇｃａ  −３’  （配列３）
調製した２本鎖核酸はエタノール沈殿させて乾燥後、滅菌水に溶解した。これを、アガロースゲル電気泳動により２本鎖であることと濃度を確認した後、以下の実施例に用いた。
【００２１】（実施例２）
蛍光色素による２本鎖核酸の染色
上記の２本鎖核酸を、２本鎖核酸に反応して発蛍光性となるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｆ０５１３、タカラバイオ社製）で染色し、蛍光標識２本鎖核酸を調製した。９６穴プレートの１ウエルに、必要量の２本鎖核酸と１０，０００倍に希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ  ８．０、２０  ｍＭ  ＮａＣｌ、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１  ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５０  μｇ／ｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎを含む）中で混合し遮光状態で室温に３０分放置して、２本鎖核酸を染色した。
【００２２】（実施例３）
蛍光標識２本鎖核酸の確認
上記の方法で得られた３０〜３００  ｎｇの蛍光標識２本鎖核酸を波長４８５  ｎｍの光で励起し、５２７  ｎｍの蛍光強度を蛍光プレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＣＦ、大日本製薬株式会社製）を用いて測定した。その結果を図１に示した。蛍光標識した２本鎖核酸の量に比例してＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの蛍光スペクトルが増加していることから、２本鎖核酸の２重らせん構造の溝部内にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉが結合した蛍光標識２本鎖核酸が得られたものと判断した。
【００２３】（実施例４）
測定キットを用いたヌクレアーゼの活性測定
実施例１〜３で製法を確立した蛍光標識２本鎖核酸を用い、２本鎖核酸のリン酸結合を末端から分解する性質を有するエキソヌクレアーゼの活性を測定した。
９６穴プレートの１ウエルに、実施例１で調製した２本鎖核酸  ３  ｎＭと１０，０００倍に希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩをエクソヌクレアーゼＩＩＩ用の市販反応緩衝液（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩ  ２１７０Ａ、タカラバイオ社製）中で混合した。これを遮光状態で室に５分間放置して蛍光標識２本鎖核酸を形成させ測定キットとした。このウエルに３０  ｐＭのエクソヌクレアーゼＩＩＩを加え、３７  ℃で３０分間反応させた。波長４８５  ｎｍで励起し５２７  ｎｍの蛍光強度を蛍光プレートリーダーを用いて３０秒毎に６０回測定し、その結果を図２に示した。図２から、時間の経過に伴いエキソヌクレアーゼＩＩＩによって末端から２重らせん構造が解消され、蛍光色素の解離による蛍光強度の減少が認められた。すなわち、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる２本鎖核酸の分解が示され、エキソヌクレアーゼＩＩＩに代表される２本鎖核酸を分解する酵素群の測定において、本測定方法および測定キットの有効性が明らかとなった。
【００２４】（実施例５）
ヌクレアーゼ添加測定キットによるヘリカーゼの活性測定
解離した１本鎖核酸を特異的に分解する性質を有するヌクレアーゼを添加した測定系を構築し、ヘリカーゼの活性を測定した。９６穴プレートの１ウエルに、実施例１で調製した２本鎖核酸３  ｎＭと１０，０００倍に希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ  ８．０、２０  ｍＭ  ＮａＣｌ、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１  ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５０  μｇ／ｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎを含む）中で混合し、遮光状態で室温に５分間放置して蛍光標識２本鎖核酸を形成させた。この反応液に３０  ｐＭのＳ１ヌクレアーゼを添加して測定キットとした。次いで、このウエルに１２  ｎＭのＤＮＡヘリカーゼＩＩを加えて３７  ℃で２分間放置した後、５  ｍＭになるようにＡＴＰを加えて３７  ℃で３０分間反応させた。波長４８５  ｎｍで励起し５２７  ｎｍの蛍光強度を３０秒毎に６０回測定した。その結果を図３に示した。反応の経過に伴い、ＤＮＡヘリカーゼＩＩが２本鎖を１本鎖に巻き戻すことで２重らせん構造が解消され、蛍光色素の２本鎖核酸からの解離による蛍光強度の減少が認められた。すなわち、ＤＮＡヘリカーゼＩＩによる２本鎖の巻き戻しにより１本鎖ＤＮＡが生成されていることが示され、さらに添加したＳ１ヌクレアーゼも巻き戻し反応には干渉せずに、１本鎖核酸の再結合を有効に阻害していることが示された。以上のことから、ヘリカーゼに代表される２本鎖核酸を巻き戻すタイプの酵素群の測定においても、本測定方法および測定キットの有効性が明らかとなった。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素的な反応における核酸の２本鎖構造の解消を測定することが可能である。したがって、本発明による測定方法および測定キットは、スクリーニングやタンパク質精製過程における活性測定に好適に利用することができる。また、蛍光標識２本鎖核酸等と、核酸の２本鎖構造を解消するタンパク質を混合するのみで蛍光強度が大きく変化するため、簡便、かつ高感度なタンパク質による核酸の２本鎖構造の解消の測定に好適である。
【００２６】
【配列表】
2004290151.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光標識２本鎖核酸３〜３００  ｎｇの、波長４８５  ｎｍで励起した時の５２７  ｎｍにおける各濃度の蛍光強度を示した図である。蛍光標識２本鎖核酸の量に依存して蛍光強度が上昇することを示している。
【図２】蛍光標識２本鎖核酸をエキソヌクレアーゼＩＩＩで処理した場合の、波長４８５  ｎｍで励起した時の５２７  ｎｍにおける蛍光強度の変化を示した図である。酵素反応の進行に伴い、蛍光強度が減少することを示している。
【図３】Ｓ１ヌクレアーゼを含む測定系中で蛍光標識２本鎖核酸をＤＮＡヘリカーゼＩＩで処理した場合の、波長４８５  ｎｍで励起した時の５２７  ｎｍにおける蛍光強度の変化を示した図である。酵素反応の進行に伴い、蛍光強度が継続的に減少していることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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