(57)【要約】【課題】工業的に効率よく安全に無細胞タンパク質合成用胚芽を選別する方法及び合成効率の高い無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物を効率よく安全に製造する方法を提供すること。【解決手段】胚芽及び胚乳粉砕物を含む植物種子粉砕物を輸送路１上に配置し、振動源２から、輸送現象を示す振動を該輸送路に与えることによって、前記植物種子粉砕物中から該胚芽を選別する。選別された胚芽を洗浄、微粉砕して抽出し、無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物を得る。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚芽及び胚乳粉砕物を含む植物種子粉砕物から胚芽を選別する無細胞タンパク質合成用胚芽の選別方法であって、振動による輸送現象を利用する装置を用いて胚芽を選別することを特徴とする方法。
【請求項２】
胚芽及び胚乳粉砕物を含む植物種子粉砕物から、無細胞タンパク質合成用胚芽を選別するための方法であって、輸送路上に前記植物種子粉砕物を配置し、輸送現象を示す振動を該輸送路に与えることによって、前記植物種子粉砕物中から該胚芽を選別することを特徴とする方法。
【請求項３】
輸送路が、振動フィーダの一部として構成されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
輸送路が少なくとも植物種子粉砕物を輸送するトラフであって、該トラフには、輸送現象を示す振動を与えるための振動源が接続されている、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
トラフが、中心線平均粗さ０．１μｍ〜５．０μｍ、最大粗さ２．０μｍ〜４．０μｍの表面粗さの底面を少なくとも有する平底型トラフである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
０度〜２０度の傾斜をつけたトラフ上に粗胚芽画分を供給し、振動数５０Ｈｚ〜１２０Ｈｚ、振幅０．１ｍｍ〜５．０ｍｍ、振動角２０度〜６０度でトラフを振動させることにより胚芽を選別することを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
輸送現象を示す振動を発する振動源が、電磁式振動機である、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
植物種子が、コムギ又はオオムギの種子である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
植物種子の粉砕、胚芽の選別、洗浄、微粉砕及び抽出工程を含む無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法であって、胚芽の選別を振動による輸送現象を利用する装置を用いて行うことを特徴とする、無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法。
【請求項１０】
植物種子の粉砕、胚芽の選別、洗浄、微粉砕及び抽出工程を含む無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法であって、
前記胚芽の選別工程において、輸送路上に植物種子粉砕物を配置し、輸送現象を示す振動を該輸送路に与えることによって、前記植物種子粉砕物から該胚芽を選別することを特徴とする、無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法。
【請求項１１】
輸送路が、振動フィーダの一部として構成されている、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
輸送路が少なくとも植物種子粉砕物を輸送するトラフであって、該トラフには、輸送現象を示す振動を与えるための振動源が接続されている、請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
トラフが、中心線平均粗さ０．１μｍ〜５．０μｍ、最大粗さ２．０μｍ〜４．０μｍの表面粗さの底面を少なくとも有する平底型トラフである、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
０度〜２０度の傾斜をつけたトラフ上に粗胚芽画分を供給し、振動数５０Ｈｚ〜１２０Ｈｚ、振幅０．１ｍｍ〜５．０ｍｍ、振動角２０度〜６０度でトラフを振動させることにより胚芽を選別することを特徴とする、請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
輸送現象を示す振動を発する振動源が、電磁式振動機である、請求項１０〜１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
植物種子が、コムギ又はオオムギの種子である、請求項９〜１５のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質合成用胚芽の選別方法及び無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法に関し、更に詳しくは、合成効率の高い無細胞タンパク質合成用胚芽抽出液を効率よく製造するための胚芽の選別方法及び胚芽抽出物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内でおこなわれているタンパク質の合成反応は、まず遺伝情報をもつＤＮＡからその情報がｍＲＮＡに転写され、そしてリボソームがそのｍＲＮＡの情報を翻訳して、タンパク質を合成するという工程で進行している。現在、この細胞内におけるタンパク質合成を試験管等の生体外で行う方法としては、例えばリボソームを生物体から抽出し、このリボソームを含有する抽出物を用いて試験管内でタンパク質を合成せしめる無細胞タンパク質合成法の研究が盛んに行われている（例えば、特許文献１〜５等）。これらの方法には、リボソームの原料として、大腸菌、胚芽、家兎網状赤血球などが用いられてきた。
【０００３】
無細胞タンパク質合成法は、ペプチド合成反応速度と翻訳反応の正確性において生細胞に匹敵する性能を保持し、かつ目的とするタンパク質を複雑な精製工程を実施することなく得ることができる有用な方法である。そのため、該合成法をより有用に産業上に適用するため、合成効率の向上に関するいくつかの発明が開示されてきた。しかし、産業上の有用性向上のためには、合成効率の向上のみならず、合成系に使用する各種の物質を安定に高品質を保持して大量に供給することが必要である。
【０００４】
従来、無細胞系におけるタンパク質の合成効率低下現象については、主に次の三つの原因が考えられている。すなわち、（１）生物体からの細胞液抽出操作に伴うタンパク質合成因子の活性低下、（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成反応中に、タンパク質合成に関与する種々因子の活性や基質濃度の低下、（３）上記（１）と（２）で生じる結果が複合した翻訳活性の低下、等である。
【０００５】
スピリン（Ａ．　Ｓ．　Ｓｐｉｒｉｎ）らは、従来の方法で調製した無細胞タンパク合成系に、原料であるアミノ酸とＡＴＰ、ＧＴＰを限外ろ過膜を介して連続的に供給することによって（連続式無細胞系）、反応時間を２０時間以上にわたって持続させることに成功し、従来の２０倍を越えるタンパク質合成収量を達成したと報告している（Ａ．　Ｓ．　Ｓｐｉｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８），　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４２，　１１６２−１１６４）。また、横山らは、濃縮した大腸菌抽出液を含む反応液を透析膜を用いる連続式無細胞合成を試み、ＣＡＴやＲａｓなど比較的小分子のタンパク質を反応系１ｍｌ当たり３〜５ｍｇの高収量で合成することに成功している（木川ら、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）。
【０００６】
これらの成果は、上記（２）の基質濃度の低下が無細胞系におけるタンパク質合成効率低下現象の一因であることを示している。言い換えると、アミノ酸やエネルギー源の低下を防ぐ（反応中の基質濃度低下には混在するそれら基質の代謝酵素群も関与すると考えられる）と同時に、ＡＭＰやＧＭＰなどの代謝産物の蓄積を排除することによってタンパク質合成効率が上昇したものと説明できる。
【０００７】
一方、ヒマ種子に含まれる細胞毒素タンパク質であるライシンのリボソーム不活性化機構の研究から、植物の産生している一群の抗ウイルスタンパク質がライシンＡ鎖と同一のＲＮＡ　Ｎ−グリコシダーゼであることが判明している（Ｙ．　Ｅｎｄｏ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　９５４，　２２４−２２６）。この酵素は、リボソームに作用し、そのＲＮＡ（大腸菌では２３Ｓ　ｒＲＮＡ、真核生物では２８Ｓ　ｒＲＮＡ）のペプチド鎖伸長因子が結合する特定部位に存在する１個のＮ−グリコシド結合の加水分解反応を触媒するリボソーム不活性化酵素（ＲＩＰ）で、この反応の結果、リボソームは１分子のアデニンの解離によってぺプチド鎖伸長機能を消失する（Ｙ．　Ｅｎｄｏ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　，　ＴＩＢＳ，　１７，　２６６−２６９）。コムギ種子の胚乳にはトリチンと名付けられたＲＮＡ　Ｎ−グリコシダーゼが大量に存在している（Ｗ．　Ｋ．Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１８，　２６１５−２６２１）。また、抗菌物質として単離されたチオニンと呼ばれるタンパク質がムギをはじめ植物界に広く分布することが知られていたが、最近コムギチオニンが胚乳に局在すること、このタンパク質が翻訳開始反応を阻害することによって、タンパク質合成を強く阻害することが明らかにされた（Ｊ．　Ｂｒｕｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９４）　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２１９，　４２５−４３３，　Ｐ．　Ｈｕｇｈｅｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　１１４，　１５６８）。更に、小麦種子の胚乳には、ＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素やタンパク質分解酵素等が高濃度に含まれている。
【０００８】
従来、無細胞タンパク質合成用のコムギ胚芽の調製は、エリクソンとブローベルらの方法（非特許文献１）によって行われていたが、この方法では、トリチンやチオニン、さらにはＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素、タンパク質分解酵素等の、タンパク質合成効率を低下させる種々の阻害物質を含む胚乳の混入が不可避であった。
そこで、上記（１）の改善手段として、特許文献６には、無細胞タンパク質合成系において、細胞破壊に伴って誘発される活性阻害因子であって、核酸合成及び／又はタンパク質合成の活性を阻害する因子である活性阻害因子の活性化を抑制することにより、反応効率を上昇させたタンパク質の合成方法が記載されている。この公報では、活性阻害因子の活性化を抑制する方法として、それをタンパク質合成系から除去する手段、タンパク質合成系内でその活性化を阻害する手段が例示されているが、一般にタンパク質合成系から活性阻害因子を選択的に除去することが困難であることから、特異的阻害剤を使用する手段を推奨している。具体的には、コムギ胚芽に存在するトリチンと呼ばれる阻害因子を抗トリチン抗体によって抑制している。
【０００９】
また、特許文献７には、コムギ種子の胚乳に局在するタンパク質合成反応を阻害する上記の様な内因性の特異的阻害物質を、機械的処理、化学的処理により排除することが記載されている。この方法では、胚乳を含まない胚芽を得るために、水溶液中での超音波処理による胚芽の洗浄を行っている。
植物種子から無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を得る方法としては、通常、植物種子を粉砕し、篩、重液選別、目視等により種皮、胚乳画分を取り除いて粗胚芽画分を取得した後に、さらに上記のような洗浄により胚乳成分を除去し、得られた胚芽を微粉砕、抽出分離する方法が行われている。
【００１０】
このうち、重液選別は、液体中に植物胚芽粉砕物を入れ、比重の違いを利用して種皮や胚乳画分を取り除き、粗胚芽画分を取得する工程である。液体としては、通常、四塩化炭素とシクロヘキサンとの混合溶液が用いられているが、これらの溶媒は、環境面及び健康面から、使用することは好ましくない。従って、重液選別を用いない新規且つ有用な胚芽画分の選別方法の開発が望まれていた。
【００１１】
【特許文献１】
特開平６−９８７９０号公報
【特許文献２】
特開平６−２２５７８３号公報
【特許文献３】
特開平７−１９４号公報
【特許文献４】
特開平９−２９１号公報
【特許文献５】
特開平７−１４７９９２号公報
【特許文献６】
特開平７−２０３９８４号公報
【特許文献７】
特開２０００−２３６８９６号公報
【特許文献８】
国際公開公報ＷＯ　０２／０９５３７７号
【非特許文献１】
Ａ．　Ｈ．　Ｅｒｉｋｓｏｎ　ａｎｄ　Ｇ．　Ｂｌｏｂｅｌ（１９８３），　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　９６，　３８−５０）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、工業的に効率よく安全に無細胞タンパク質合成用胚芽を選別する方法及び合成効率の高い無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物を効率よく安全に製造する方法の提供を目的としてなされたものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、従来の重液選別に替えて振動フィーダーを用い、輸送路上に植物種子の粉砕物を配置し、該輸送路に振動を作用させることによって、該輸送路上の粉砕物全体から胚芽を短時間で大量に安全に分別、取得でき、これにより無細胞タンパク質合成用の細胞抽出物が効率的に安全に製造可能なことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は以下の特徴を有するものである。
〔１〕胚芽及び胚乳粉砕物を含む植物種子粉砕物から胚芽を選別する無細胞タンパク質合成用胚芽の選別方法であって、振動による輸送現象を利用する装置を用いて胚芽を選別することを特徴とする方法。
〔２〕胚芽及び胚乳粉砕物を含む植物種子粉砕物から、無細胞タンパク質合成用胚芽を選別するための方法であって、輸送路上に前記植物種子粉砕物を配置し、輸送現象を示す振動を該輸送路に与えることによって、前記植物種子粉砕物中から該胚芽を選別することを特徴とする方法。
〔３〕輸送路が、振動フィーダの一部として構成されている、上記〔２〕に記載の方法。
〔４〕輸送路が少なくとも植物種子粉砕物を輸送するトラフであって、該トラフには、輸送現象を示す振動を与えるための振動源が接続されている、上記〔２〕または〔３〕に記載の方法。
〔５〕トラフが、中心線平均粗さ０．１μｍ〜５．０μｍ、最大粗さ２．０μｍ〜４．０μｍの表面粗さの底面を少なくとも有する平底型トラフである、上記〔４〕に記載の方法。
〔６〕０度〜２０度の傾斜をつけたトラフ上に粗胚芽画分を供給し、振動数５０Ｈｚ〜１２０Ｈｚ、振幅０．１ｍｍ〜５．０ｍｍ、振動角２０度〜６０度でトラフを振動させることにより胚芽を選別することを特徴とする、上記〔４〕または〔５〕に記載の方法。
〔７〕輸送現象を示す振動を発する振動源が、電磁式振動機である、上記〔２〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕植物種子が、コムギ又はオオムギの種子である、上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
【００１５】
〔９〕植物種子の粉砕、胚芽の選別、洗浄、微粉砕及び抽出工程を含む無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法であって、胚芽の選別を振動による輸送現象を利用する装置を用いて行うことを特徴とする、無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法。
〔１０〕植物種子の粉砕、胚芽の選別、洗浄、微粉砕及び抽出工程を含む無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法であって、
前記胚芽の選別工程において、輸送路上に植物種子粉砕物を配置し、輸送現象を示す振動を該輸送路に与えることによって、前記植物種子粉砕物から該胚芽を選別することを特徴とする、無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法。
〔１１〕輸送路が、振動フィーダの一部として構成されている、上記〔１０〕に記載の製造方法。
〔１２〕輸送路が少なくとも植物種子粉砕物を輸送するトラフであって、該トラフには、輸送現象を示す振動を与えるための振動源が接続されている、上記〔１０〕または〔１１〕に記載の製造方法。
〔１３〕トラフが、中心線平均粗さ０．１μｍ〜５．０μｍ、最大粗さ２．０μｍ〜４．０μｍの表面粗さの底面を少なくとも有する平底型トラフである、上記〔１２〕に記載の製造方法。
〔１４〕０度〜２０度の傾斜をつけたトラフ上に粗胚芽画分を供給し、振動数５０Ｈｚ〜１２０Ｈｚ、振幅０．１ｍｍ〜５．０ｍｍ、振動角２０度〜６０度でトラフを振動させることにより胚芽を選別することを特徴とする、上記〔１２〕または〔１３〕に記載の製造方法。
〔１５〕輸送現象を示す振動を発する振動源が、電磁式振動機である、上記〔１０〕〜〔１４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１６〕植物種子が、コムギ又はオオムギの種子である、上記〔９〕〜〔１５〕のいずれかに記載の製造方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明に使用することができる植物種子としては、通常、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物から選択される植物の種子が挙げられる。これらの中でも、本発明に好適な植物種子として、コムギ又はオオムギが挙げられ、特に好適なものとしてコムギが挙げられる。
本発明においては、植物種子から無傷の胚芽を主成分とする胚芽画分を取得する。ここで、無傷の胚芽とは、少なくとも発芽能を有する胚芽を意味し、胚芽画分とは、無傷の胚芽を主要成分とするものであり、これを用いて無細胞タンパク質合成に使用しうる細胞抽出物が調製可能なものを意味する。植物種子に含まれる胚芽の量は少なく、種子から胚芽を効率的に取得するためには、胚芽以外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まず、植物種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。植物種子に加える力は、植物種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。
【００１７】
通常は、公知の粉砕装置を用いて、植物種子を粉砕することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。
植物種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことかできるが、例えばピンミル、ハンマーミル等、被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの粉砕装置を用いることが好ましい。粉砕の程度は、使用する植物種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すればよい。例えばコムギ種子の場合は、通常、最大長さ４ｍｍ以下、好ましくは最大長さ２ｍｍ以下の大きさに粉砕する。また、乾式粉砕が好ましい。
【００１８】
次いで、得られた植物種子粉砕物から、通常公知の分級装置、例えば、篩を用いて粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギ種子の場合、通常、メッシュサイズ０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．７ｍｍ〜１．４ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。
【００１９】
本発明においては、従来の重液選別に替えて、輸送路上に前記植物種子粉砕物を配置し、該輸送路に輸送現象を示す振動を与えて選別を行う。前記振動を輸送路に与えることによって、該胚芽の集団を前記植物種子粉砕物の集団中から相対的に移動させて分別することができる。これによって、粗胚芽画分から胚芽をより多く含有する粗胚芽画分を選別することができる。
【００２０】
粗胚芽画分に含まれる胚芽と、種皮、胚乳粉砕物等とは、形状、比重、摩擦係数等が異なっているため、振動を与えるとそれぞれ異なった挙動を示す。この挙動の違いを利用して、胚芽と、種皮、胚乳粉砕物等とを選別することが可能である。
より具体的には、輸送路上に植物種子粉砕物を配置し、該輸送路に特定の振動を与えることによって、植物種子粉砕物中から目的の胚芽だけを選択的に移動させて分別することができる。また、加える振動によっては、目的の胚芽だけをその場に残して、それ以外の粉砕物を移動させることや、植物種子粉砕物全体を移動させながら移動速度の差異によって植物種子粉砕物中から目的の胚芽だけを分離選別することなども可能である。
【００２１】
さらには、輸送路を傾斜路とし、輸送路の下り方向に作用する重力と、上り方向に作用する振動とを組合わせることによって、より複雑な種々の輸送現象（または移送現象）を発現させることが可能となる。
本発明を実施するには、振動による輸送現象を利用する装置が利用可能である。該装置は、輸送路上の粉粒体に、該輸送路上を移動するための推進力となる振動を与え得るものであればよい。
輸送路は、振動を加えることによって、その上に配置された植物種子粉砕物および／または目的の胚芽に輸送現象が生じるものであればよく、板状物、管状物、塊状物、他の構造物の一部分であってもよい。好ましい輸送路としてはトラフが挙げられる。
例えば、図１に示すように、少なくとも種子粉砕物（粗胚芽画分）を輸送するトラフ（輸送路）１を有し、かつ輸送現象を示す振動を与えるための振動源２が該トラフに振動を与えることができるように接続された装置を用いることができる。ここでいう接続は、トラフと振動源とを直接的に接触させて行う接続のみならず、磁気的な吸引力などを利用して振動を伝える非接触的な接続であってもよい。また、スプリングによりトラフを斜め上下方向に振動させることのできる装置が好ましい。
また、輸送現象を示す振動、および該振動を発生する振動源として、公知のパーツフィーダや振動フィーダにおいて推進力として用いられている送り振動、およびそのための振動機を利用してもよい。
【００２２】
通常、トラフとしては、平底型の直線的トラフを用いることか好ましい。平底型トラフの路面（少なくとも底面）の表面粗さとしては、通常、中心線平均粗さ（中央平均粗さ）が０．１μｍ〜５．０μｍ、また最大粗さが２．０μｍ〜４．０μｍが好ましい。
通常、トラフ上に粗胚芽画分を供給し、振動源及びスプリングによりトラフを斜め上下方向に振動させ、トラフ上の粗胚芽画分に対して斜め上方（通常、スプリングに対して直角方向）の加速度を繰り返し与えることにより、粗胚芽画分中の胚芽と、種皮、胚乳粉砕物等とを選別する。例えば、０度〜２０度の傾斜をつけたトラフ上に粗胚芽画分を供給し、振動数５０Ｈｚ〜１２０Ｈｚ、振幅０．１ｍｍ〜５．０ｍｍ、振動角２０度〜６０度でトラフを振動させることにより、粗胚芽画分中の胚芽と、種皮、胚乳粉砕物等とを選別することができる。粗胚芽画分は、選別方法に応じて、トラフ中央部付近やトラフ下方部付近に適宜供給することができる。
【００２３】
選別方法としては、例えば、粗胚芽画分をトラフの中央部付近に供給し、トラフの振動により上方へ進むものと下へ落ちるものを分別することにより胚芽を回収する態様が挙げられる。
振動の選択によって、胚芽がトラフ上を上方へ進み、胚乳粉砕物等が下へ転がり落ちたりすべり落ちたりする傾向を付与することが可能である。その場合、落ちる速度の早いものやトラフ上に残ったもの（通常、種皮、胚乳粉砕物等）をハケなどによって回収してもよい。また、粗胚芽画分をトラフの下部に供給し、前方へ進むもの（通常、胚芽）を回収してもよい。これらの操作は、複数回繰り返してもよい。また、好ましくはトラフ供給前に粗胚芽画分を液体で湿らせた後、乾操させるとよい。この場合の液体は特に限定されない。これにより種皮付きの胚乳粉砕物の種皮が丸まって転がりやすくなるため、転がり落ちる不純物量が増え、製品中の胚芽純度が上がる。
【００２４】
振動源としては例えば、ウェイト付きの振動モータ、板バネによる電磁式振動機などを採用することができる。輸送路に該振動源を接続した装置としては、例えば一般に振動フィーダーとして知られている装置を用いることができる。
以上のようにして得られたより多くの胚芽を含有する粗胚芽画分は、さらに胚芽含有率の高い胚芽画分を得るために、目視による選別、本発明者等が先に提案した色彩選別機（特願２００１−１４９２７４号明細書）若しくは形状選別機（特願２００２−０４３７０４号明細書）等による選別工程（これらの選別機は、上記特許文献８に詳細に記載されている）に供しても良い。これにより胚芽の純度を更に向上させることができる。
【００２５】
このようにして得られた胚芽画分には、胚乳成分が付着している場合があるため、通常、胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。
洗浄処理としては、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下に冷却した水又は水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまて洗浄することが好ましい。また、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下で、界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、例えば０．５％程度の濃度で使用することができる。水又は水溶液による洗浄処理及び界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。
【００２６】
かくして、胚乳成分が除去された胚芽画分を取得することができる。胚芽画分中に胚乳成分が含まれていないことは、前記した通り、リボソームがトリチンによって実質的に脱アデニン化されないことから確認できる。また、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、上記特許文献７に記載の方法により算出されるリボソームの脱アデニン化率が、７％未満、好ましくは１％以下、より好ましくは０．１％以下、最も好ましくは脱アデニン化率が検出限界以下になっていることをいう。
【００２７】
以上のようにして得られた胚芽を、微粉砕及び抽出処理することにより胚芽抽出物を得る。胚芽抽出物を得る方法としては、従来公知の方法が挙げられる。例えば、液体窒素で凍結した胚芽を微粉砕し、抽出溶媒を加えて攪拌した後、胚芽抽出物含有液を遠心分離等により回収し、ゲルろ過等により精製する。あるいは、本発明者等が先に提案した、胚芽を衝撃または切断により粉砕し、抽出溶媒を加えて攪拌した後、胚芽抽出物を遠心分離により回収し、ゲルろ過等により精製する方法（特願２００２−０２３１３９号明細書）、胚芽を抽出溶媒の存存下に粉砕した後、ゲルろ過により精製する方法（特願２００２−０２３１３８号明細書）等も用いることができる。
【００２８】
抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及びチオール基の酸化防止剤のうちの１以上を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液や、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを採用すればよい。
【００２９】
ゲルろ過としては、例えば予め溶液（例：ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトール又はＬ型アミノ酸を含む溶媒等）で平衡化しておいたゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを採用すればよい。
【００３０】
ゲルろ過後の胚芽抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を排除しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることかあるので、これを阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入する可能性のある微生物が排除可能なサイズであれば特に限定されないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターか適当である。ちなみに、小さな部類の枯草菌の胞子サイズは０．５μｍ×ｌμｍであることから、０．２０マイクロメーターのフィルター（例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＭｉｎｉｓａｒｔＴＭ等）を用いるのが胞子の除去にも有効である。ろ過に際して、先ずポアサイズが大きめのフィルターを用い、次に混入する可能性のある微生物が排除可能なポアサイズのフィルターを用いてろ過するのが好ましい。
【００３１】
本発明の方法によれば、原料細胞自身が含有する又は保持するタンパク質合成機能を抑制する物質を実質的に含まない無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を調製することができる。「原料細胞自身が含有する又は保持するタンパク質合成機能を抑制する物質を実質的に含まない」とは、調製された無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質合成において、タンパク質合成能が実質的に抑制されないことをいう。当該抽出物を使用することで、タンパク質を効率的に合成できる。ここで、「タンパク質合成機能を抑制する物質」としては、リボソームに作用してその機能を抑制する物質（例えばトリチン）、翻訳反応開始を阻害する物質（例えばチオニン）、基質濃度を低下させる物質（例えばＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素）、生成したタンパク質を不安定化する物質（例えばタンパク質分解酵素）等が挙げられる。
【００３２】
無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成は、上記のようにして得られた胚芽抽出物を使用する点を除き、従来と同様の方法で行うことができる。この方法は、公知のバッチ法であってもよいし、前記したスピリンらの連続式無細胞系タンパク質合成システムのようなアミノ酸、エネルギー源の連続供給系であってもよい。
【００３３】
バッチ法ではタンパク質合成を長時間行うと反応が停止することがあるが、後者のアミノ酸、エネルギー源の連続供給系を使用すると、反応を長時間維持させることができ、更なる効率化が可能となる。
また、連続供給系でタンパク質を合成する場合には、透析法を使用することもできる。例えば、本発明の胚芽抽出物を透析内液に、エネルギー源やアミノ酸を含む混合液を透析外液に用いた限外濾過膜透析系では、タンパク質を連続的に大量調製することが可能である。透析法においては、透析膜を介してエネルギー源やアミノ酸などの合成基質が透析内液に供給され、反応副生物等が透析外液へ排除される。透析膜は、それ自体公知の通常用いられるものを使用することができる。透析膜の分子量限界は、合成するタンパク質の分子量に応じて、適当なものを用いれば良い。
【００３４】
ここで、エネルギー源としては、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）、クレアチンリン酸等が挙げられ、アミノ酸としては２０種類のＬ型アミノ酸が挙げられる。
合成されたタンパク質は、それ自体既知の方法により反応系から分離・精製することができる。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１：小麦粗胚芽画分の回収（１）
北海道産チホク小麦を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製、Ｒｏｔｏｒ　Ｓｐｅｅｄ　Ｍｉｌｌ　ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ　１４型）に添加し、回転数７０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。この破砕処理を４回繰り返して行った。篩で発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ：０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を回収した後、トウミを用いてふすま（種皮）を風力選別した。残った胚芽と胚乳の混合粒子を、電磁フィーダー（神鋼電機株式会社製、Ｆ−２１２）に３ｇ供給し、周波数６０Ｈｚ、振幅０．３５ｍｍ、振動角３０度、トラフの傾斜５度、トラフの中心線平均粗さ０．２μｍ、トラフの最大粗さ４．０μｍの条件で３分間運転し、前方と後方に分かれた粒子のうち前方側の粒子を取り出した。目視によりその粒子群から胚芽を選別回収し、その重量を測定した。
その結果、供給した粒子の胚芽の重量割合は２３％であったのに対して、回収した粒子の胚芽の重量割合は４７％になった。
【００３６】
実施例２：小麦粗胚芽画分の回収（２）
北海道産チホク小麦を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製、Ｒｏｔｏｒ　Ｓｐｅｅｄ　Ｍｉｌｌ　ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ　１４型）に添加し、回転数７０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。この破砕処理を４回繰り返して行った。篩で発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ：０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を回収した後、トウミを用いてふすま（種皮）を風力選別した。残った胚芽と胚乳の混合粒子を、電磁フィーダー（神鋼電機株式会社製、Ｆ−２１２）を用いて以下のように３回選別を行った。
【００３７】
電磁フィーダー（神鋼電機株式会社製、Ｆ−２１２）に混合粒子を３ｇ供給し、周波数６０Ｈｚ、振幅０．２５ｍｍ、振動角３０度、トラフの傾斜１０度、トラフの中心線平均粗さ０．２μｍ、トラフの最大粗さ４．０μｍの条件で６分間運転し、前方と後方に分かれた粒子のうち前方側の粒子を取り出した。目視によりその粒子群から胚芽を選別回収し、その重量を測定した。
【００３８】
その結果、供給した粒子の胚芽の重量割合は２２％であったのに対して、回収した粒子の胚芽の重量割合は３１％になった。
次いで、回収した粒子２ｇを電磁フィーダー（神鋼電機株式会社製、Ｆ−２１２）に供給し、周波数６０Ｈｚ、振幅０．２２ｍｍ、振動角３０度、トラフの傾斜１０度、トラフの中心線平均粗さ０．２μｍ、トラフの最大粗さ２．１μｍの条件で５分運転し、前方と後方に分かれた粒子のうち前方側の粒子を取り出した。目視によりその粒子群から胚芽を選別回収し、その重量を測定すると、回収した粒子の胚芽の重量割合は４５％になった。
【００３９】
さらに、回収した粒子１．１ｇを電磁フィーダー（神鋼電機株式会社製、Ｆ−２１２）に供給し、周波数６０Ｈｚ、振幅０．３８ｍｍ、振動角３０度、トラフの傾斜１０度、トラフの中心線平均粗さ０．１μｍ、トラフの最大粗さ２．１μｍの条件で６分運転し、前方と後方に分かれた粒子のうち前方側の粒子を取り出した。目視によりその粒子群から胚芽を選別回収し、その重量を測定した。その結果、回収した粒子の胚芽の重量割合は５４％になった。
【００４０】
実施例３：小麦粗胚芽画分の回収（３）
北海道産チホク小麦を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製、Ｒｏｔｏｒ　Ｓｐｅｅｄ　Ｍｉｌｌ　ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ　１４型）に添加し、回転数７０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。この破砕処理を４回繰り返して行った。篩で発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ：０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を回収した後、トウミを用いてふすま（種皮）を風力選別した。残った胚芽と胚乳の混合粒子を、エタノールを噴霧し、湿らせた後、室温で乾燥したものと未処理のものをそれぞれ電磁フィーダー（神鋼電機株式会社製、ＭＦ−１５Ｂ）に１０ｇ供給し、周波数６０Ｈｚ、振幅０．１１ｍｍ、振動角２０度、トラフの傾斜１０度、トラフの中心線平均粗さ０．１〜０．５μｍの条件で１０分間運転し、前方と後方に分かれた粒子のうち前方側の粒子を取り出した。目視によりその粒子群から胚芽を選別回収し、その重量を測定し比較した。その結果、供給した粒子の胚芽の重量割合は１０％であったのに対して、回収した粒子の胚芽の重量割合は、未処理のものは１７％に、エタノール処理をしたものは４０％になった。
【００４１】
実施例４：小麦胚芽の純化
実施例１と同様の方法で粗胚芽画分を回収し、次に、ベルト式色彩選別機ＢＬＭ−３００Ｋ（製造元：株式会社安西製作所、販売元：株式会社安西総業）を用いて、色彩の違いを利用して粗胚芽画分から胚芽を選別した。この色彩選別機は、粗胚芽画分に光を照射する手段、粗胚芽画分からの反射光及び／又は透過光を検出する手段、検出値と基準値とを比較する手段、基準値より外れたもの又は基準値内のものを選別排除する手段を有する装置である。
色彩選別機のベルト上に粗胚芽画分を１０００乃至５０００粒／ｍ２となるように供給し、ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反射光を検出した。ベルトの搬送速度は、５０ｍ／分とした。受光センサーとして、モノクロのＣＣＤラインセンサー（２０４８画素）を用いた。
まず、胚芽より色の黒い成分（種皮等）を排除するために、ベージュ色のベルトを取り付け、胚芽の輝度と種皮の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。次いで、胚乳を選別するために、濃緑色のベルトに取り替えて胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。吸引は、搬送ベルト上方約１ｃｍ位置に設置した吸引ノズル３０個（長さ１ｃｍ当たり吸引ノズル１個並べたもの）を用いて行った。
この方法を繰り返すことにより胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで胚芽を選別し、胚芽を純化した。
【００４２】
実施例５：小麦胚芽抽出物の調製
実施例４で得られた小麦胚芽５０ｇを４℃の蒸留水中に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次に、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄して胚乳分を除去した小麦胚芽を得た。
【００４３】
次いで、以下の操作を４℃で行い、小麦胚芽抽出物を得た。まず洗浄した小麦胚芽を抽出溶媒（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、塩化カルシウム４ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）１００ｍｌとともにワーリングブレンダーに入れ、回転数５０００乃至２００００ｒｐｍで３０秒粉砕した。ブレンダー内壁に付着した胚芽等をかき落とした後再び５０００乃至２００００ｒｐｍで３０秒破砕する作業を２回行った。
【００４４】
得られた抽出液と粉砕胚芽の混合物を遠心管に移し３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取した。これをさらに３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取する操作を５回繰り返し濁りのない上清を得た。これをあらかじめ溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ及びジチオスレイトール４ｍＭ）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られた液を３００００ｇ、１２分間の遠心をかけ上清を採取し、これを小麦胚芽抽出物とした。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が８０〜１５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）になるように調製した。
【００４５】
実施例６：小麦胚芽抽出物を用いる無細胞タンパク質合成
実施例５で得られた小麦胚芽抽出物を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０になるように抽出溶媒で濃度調整し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の合成をＥｎｄｏ，　Ｙ．　ｅｔ．　ａｌ．，　ＰＮＡＳ，　Ｊａｎｕａｒｙ　１８，２０００／ｖｏｌ．９７／ｎｏ．２／５５９−５６４に記載の方法に準じて行った。ＧＦＰの合成量は、Ｔｕｒｎｅｒ　Ｄｅｓｉｇｎｓ社製のＴＤ−３６０　Ｍｉｎｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて、４９０ｎｍの励起波長で５１０ｎｍの蛍光強度から定量した。反応液の蛍光強度は、２４時間後に約２３７６００、４８時間後に２２５５００であり、ＧＦＰが合成されていることが確認できた。
【００４６】
【発明の効果】
本発明によれば、環境面及び健康面から使用が好ましくない溶媒を使うことなく、効率的に大量に胚芽を選別することができるので、タンパク質の無細胞系での大量調製、たとえば、進化分子工学の分野での新しい酵素や抗体の大量調製に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の振動による輸送現象を利用する装置の一例を模式的に示した図である。
【符号の説明】
１　輸送路（トラフ）
２　振動源
３　スプリング
【図１】
2004000188.tif 000003