(57)【要約】    【課題】  選択率高くカルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造する方法を提供する。    【解決手段】  特定のカルボン酸もしくはそのエステルとジオールとを反応させてカルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造する方法において、該反応にPyrobaculum属に属する好熱性始原菌由来のエステル加水分解酵素を触媒として用いることを特徴とする。該方法によれば、カルボン酸としてアクリル酸などの不飽和カルボン酸から、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートなどの耐候性、耐擦傷性に優れる樹脂原料となるモノマーを簡便に製造することができる。しかも、該酵素は、耐溶剤性に優れるためモノマーを有機溶媒中に製造でき、反応液をモノマー溶液としてそのまま使用できる。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示すカルボン酸もしくはカルボン酸エステルと、式（２）で示すジオールとを反応させて式（３）で示すカルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造する方法において、該反応にPyrobaculum属に属する好熱性始原菌由来のエステル加水分解酵素を触媒として用いることを特徴とするカルボン酸ヒドロキシモノエステルの製造方法。
【化１】
2004261177.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子または１価の有機基を示し、Ｒ３は、２価の有機基を示す。）
【請求項２】
該エステル加水分解酵素が、配列番号１に示す遺伝子配列または配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のカルボン酸ヒドロキシモノエステルの製造方法。
【請求項３】
該カルボン酸が不飽和カルボン酸であることを特徴とする請求項１または２に記載のカルボン酸ヒドロキシモノエステルの製造方法。
【請求項４】
該ジオールが、炭素数２〜１２のアルカンジオールであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のカルボン酸ヒドロキシモノエステルの製造方法。
【請求項５】
式（１）で示すカルボン酸もしくはカルボン酸エステルと、式（２）で示すジオールとから式（３）で示すカルボン酸ヒドロキシモノエステルへの反応を触媒し、Pyrobaculum属に属する好熱性始原菌に由来する、カルボン酸ヒドロキシモノエステル製造用酵素。
【化２】
2004261177.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子または１価の有機基を示し、Ｒ３は、２価の有機基を示す。）
【請求項６】
該酵素が、配列番号１に示す遺伝子配列または配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項５に記載のカルボン酸ヒドロキシモノエステル製造用酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボン酸ヒドロキシモノエステルの製造方法および該反応に好ましく使用できるカルボン酸ヒドロキシモノエステル製造用酵素に関し、より詳細には、Pyrobaculum属に属する好熱性始原菌由来のエステル加水分解酵素を触媒として用いる、反応収率に優れるカルボン酸ヒドロキシモノエステルの製造方法、および該反応に好ましく使用できるPyrobaculum属に属する好熱性始原菌由来のカルボン酸ヒドロキシモノエステル製造用酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルボン酸ヒドロキシモノエステルを樹脂原料のモノマーとして使用すると、密着性、耐候性、耐擦傷性などに優れた機能を有する樹脂が得られる。例えば、ヒドロキシアルキルモノアクリレートやヒドロキシアルキルモノメタクリレートは分子内に二重結合と水酸基との二つの官能基を有するため、柔軟性や親水性を様々の程度で付与できる。また、カルボン酸ヒドロキシモノエステルは、水酸基を利用した反応や他の官能基の導入反応などが容易であるため、熱硬化性塗料、接着剤、粘着剤、紙加工処理剤、潤滑油添加剤、建築用シーラント、インク等の各種樹脂の改質剤としても広範な用途に利用できる。
【０００３】
カルボン酸ヒドロキシモノエステルは、従来から直接エステル化法、エステル交換法、生物学的方法などの種々の方法で製造されている。直接エステル化法とは、カルボン酸とジオールとを酸性触媒の存在下でエステル化させる方法である（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。例えば、特許文献１では、アクリル酸と１，４−ブタンジオールとを酸性触媒の存在下に反応させ、４−ヒドロキシブチル(メタ)アクリレートを製造する方法が開示され、該酸性触媒としてスルホン酸類、硫酸、酸性イオン交換樹脂などを使用している。
【０００４】
また、エステル交換法とは、カルボン酸エステルとジオールを触媒の存在下でエステル交換させる方法である（特許文献５、特許文献６）。例えば、特許文献５では、アクリル酸エステルとアルカンジオールとのエステル交換反応において、特定構造のジスタノキサン化合物を触媒として使用し、ヒドロキシアルキルモノアクリレートを製造する方法が開示されている。しかしながら、従来の直接エステル化法およびエステル交換法では目的とするカルボン酸モノエステルと同時に対応するカルボン酸ジエステルがかなりの割合で副生し、その後の目的物の分離および精製工程が必要となる。
【０００５】
これを解決するため、目的物の精製工程を含むカルボン酸ヒドロキシモノエステルの製造方法も多数存在する（特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０）。例えば、特許文献７には、特定構造のヒドロキシアルキルモノアクリレートと特定構造のヒドロキシアルキルジアクリレートとを含む混合物に、アルカンまたはイソアルカンを添加し、ヒドロキシアルキルジアクリレートをアルカン層に回収してヒドロキシアルキルモノアクリレート層を分離するヒドロキシアルキルモノアクリレートの精製方法であり、目的物の分離および精製工程の必要性を示すものである。
【０００６】
一般に、有機または無機の触媒化合物を使用すると精製工程が必要となる場合が多く、製造収率が低いこと、および工程数の増加と相まって、製品のコストが高くなる一因となる。また、精製工程で使用する大量の溶媒の処理工程も必要であり、廃液処理や環境への影響も懸念される。
【０００７】
また、目的とするカルボン酸ヒドロキシモノエステルを工業的に安価に生産する他の方法として、モノエステル選択性を向上させる方法がある。例えば、反応仕込み時のカルボン酸に対するジオールのモル比を非常に大きくすれば、該カルボン酸ジエステルの副生を少なくすることができる。しかし、この場合でもカルボン酸ジエステルの副生を全く制御することは不可能で、更に、反応終了後、反応系に多量に存在する未反応ジオールを効率よく目的物たるカルボン酸モノエステルと分離する必要がある。また、大量にジオールを使用するため反応濃度を高めることができず、生産性も低下する。
【０００８】
そこで、有機または無機の触媒化合物に代えて、一般に高い反応選択性（特異性）を持つ、微生物や酵素を用いた生物化学的反応によってカルボン酸モノエステルのみを選択的に合成する試みもなされてきた（特許文献１１）。該文献では、不飽和カルボン酸とジオールとから、アセトバクター属、シュードモナス属、キサントモナス属、グルコノバクター属、リゾビウム属、アグロバクテリウム属、コマモナス属から選ばれる１以上の微生物またはその菌体処理物を作用させて不飽和カルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造する方法が開示されている。しかし、該方法では、転化率が低すぎるため生産性が悪く、工業的な生産を行うには十分でない。
【０００９】
また、生物化学的反応によってカルボン酸モノエステルを合成する試みの一つとして、一旦カルボン酸ジエステルを合成してから、酵素を触媒とする加水分解反応によって選択的にカルボン酸モノエステルを得ようとする試みもなされている（特許文献１２、非特許文献１）。該文献１２に記載された方法では、微生物由来のリパーゼ、豚肝臓由来のエステラーゼ、膵臓由来のα−キモトリプシン、パンクレアチン、ムコール属、アスペルギルス属、リゾープス属、ペニシリウム属、グオトリクム属などに属する微生物を使用して、生物学的方法によってジエステルからモノエステルへの部分加水分解を行なっている。
【特許文献１】特開平４−６９３５３号公報
【特許文献２】特開平７−１２６２１４
【特許文献３】特開平８−１８８５５７号公報
【特許文献４】特開平１１−４３４６６号公報
【特許文献５】特開２０００−１２８８３１号公報
【特許文献６】特開２０００−１５９７２６号公報
【特許文献７】特開昭５０−８３３２０号公報
【特許文献８】特開平８−５３３９２号公報
【特許文献９】特開平８−１８８５５７号公報
【特許文献１０】特開２０００−１５９７２７号公報
【特許文献１１】特開平７−０２３７９１号公報
【特許文献１２】特開昭６３−２３７７９１号公報
【非特許文献１】Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999, 63(4), 688-697
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記特許文献１２に記載された方法では、反応の転化率もモノエステル選択性も非常に高いが、一旦カルボン酸ジエステルを合成してから加水分解反応を行うため工程数が増え、工業的に安価に製造することができず不利である。また、反応が水溶液中で行われるため原料の溶解性が悪く、大量生産に向かないという欠点がある。
【００１１】
一般に、エステル加水分解酵素を工業的に利用するには、該酵素が温度・ｐＨ・有機溶剤・圧力等に対する安定性が高いことが望ましい。特に耐熱性が高いと反応温度を高くすることができ、反応速度を高めかつ反応中の該酵素の失活を軽減し、かつ反応中に副生するアルコールや水の除去が容易となる。また、耐溶剤性が高いと、エステル合成及びエステル交換反応においても種々の有機溶媒や基質が利用可能となるため、工業的な利用価値が高くなる。そこで、反応時間の短縮および反応効率の向上を図るうえで耐熱性及び耐溶剤性に優れたエステル加水分解酵素が切望されている。
【００１２】
特に、モノエステル選択性を高め、工業的に有利なカルボン酸ヒドロキシモノエステルを効率的に製造する方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らはパイロバクラム  カリディフォンティスＶＡ１(Pyrobaculum calidifontis VA1)に由来する遺伝子にコードされたエステル加水分解酵素が高い耐熱性、耐溶剤性を有することを見出し、かつ該酵素が、カルボン酸またはカルボン酸エステルとジオールとを原料としてカルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造する触媒活性をも有することを見出し、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、特定のカルボン酸もしくはそのエステルとジオールとを反応させて簡便にカルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造することができる。
【００１５】
本発明で使用するPyrobaculum属に属する好熱性始原菌由来のエステル加水分解酵素は、耐溶媒性にも優れるため、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートなどの有用な重合性モノマーを有機溶媒中に製造することができる。
【００１６】
しかも、該方法によれば、カルボン酸としてアクリル酸などの不飽和カルボン酸から、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートなどの耐候性、耐擦傷性に優れる樹脂原料となるモノマーを簡便に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の第一は、式（１）で示すカルボン酸もしくはカルボン酸エステルと、式（２）で示すジオールとを反応させて式（３）で示すカルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造する方法において、該反応にPyrobaculum属に属する好熱性始原菌由来のエステル加水分解酵素を触媒として用いることを特徴とするカルボン酸ヒドロキシモノエステルの製造方法である。
【００１８】
【化１】
2004261177.tif 000002
【００１９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子または１価の有機基を示し、Ｒ３は、２価の有機基を示す。）
本発明で使用するエステル加水分解酵素は、Pyrobaculum属に属する好熱性始原菌由来のエステル加水分解酵素であり、本来エステル加水分解活性を有するものである。しかしながら、該エステル加水分解酵素は、上記式（１）で示すカルボン酸またはそのエステルと、式（２）で示すジオールとを基質とする場合に、極めて選択率高くエステル合成反応を触媒してカルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造でき、カルボン酸ヒドロキシモノエステルの工業的生産性に優れることが判明した。本発明で使用するPyrobaculum属に属する好熱性始原菌由来のエステル加水分解酵素としては、上記式（１）で示すカルボン酸またはそのエステルと、式（２）で示すジオールとからカルボン酸ヒドロキシモノエステルへの反応を触媒できるものであれば広く使用することができる。このような酵素としては、パイロバクラム  カリディフォンティスＶＡ１(pyrobaculum calidifontis VA1)のエステル加水分解酵素遺伝子を大腸菌で保持されるプラスミドなどのベクターにクローン化し、このベクターを導入したエシェリキア  コリ(Escherichia coli)などの微生物を培養して得た生産物が例示できる。
【００２０】
具体的には、パイロバクラム  カリディフォンティス  ＶＡ１由来のエステル加水分解酵素遺伝子によりクローン化されたプラスミドを保持するエシェリキア  コリを培養し、遠心分離によって菌体を回収し、得られた菌体を常法に従って破砕、遠心分離することによって上清を得、この上清をカラムクロマトにより精製して得たクローン化したエステル加水分解酵素がある。
【００２１】
クローン化に用いるベクターは通常の組換えＤＮＡ実験に用いられるものであればどれも好適に用いることができるが、高発現型のベクターとしてｐＥＴ２１ａ、ｐＫＫ２２３−３などがより好ましい。
【００２２】
前記エシェリキア  コリの培養方法としては特に制限はないが、培養温度は、通常大腸菌などが増殖できる０〜４６度の範囲であることが好ましく、特に、該微生物の比増殖速度が増殖至適温度における比増殖速度の２０％以下となるように、培養温度を増殖至適温度よりも低温に調整することが好ましい。通常、微生物を培養する際には、微生物が最大の比増殖速度を得られるように増殖至適温度付近に培養温度を調整するのが一般的であるが、細菌の増殖にしたがって培地中の酸素が消費され、溶存酸素が枯渇し嫌気的醗酵によるエネルギー効率の低下が発生する。しかしながら、比増殖速度の２０％以下となるように培養温度を低温に調整すると培養中を通して好気的な環境が維持され、添加した栄養源に対して極めて高い最終細胞密度を確保することができる。特に、組換えタンパク質を製造する場合には、封入体の形成を抑制できるため好ましい。なお、「比増殖速度」とは、対数増殖期において得られるものをいう。また、「増殖至適温度」とは、ｐＨ、溶存酸素濃度などの培養温度以外の条件が、培養開始時に一定の場合に、微生物が最大の比増殖速度を得ることができる温度をいう。上記条件による培養によって酸素消費と栄養源消費のバランスに優れるため急激な溶存酸素の低下がなく、長期間にわたり好気的環境を維持できる。なお、温度調整のみでは溶存酸素濃度を０ｐｐｍ超に維持できない場合には、通気量の増加、攪拌速度の上昇、ジャーファーメンター内の気圧の向上などの手段によって溶存酸素量を増加させてもよい。
【００２３】
培養物から得られた酵素の精製方法は常法に従って行うことができるが、耐熱性の酵素であるため、菌体破砕物を遠心分離によって分離して上清を得た後、この上清を熱処理することによってホストであるエシェリキア  コリ由来のタンパクを変性させ、遠心分離によって変性したタンパクを除き、適宜濃縮、カラムクロマトなどの処理を行なうことによって精製酵素を得ることもできる。本発明では、上記方法で得られた精製した酵素以外にも、該酵素が含まれる態様として、菌体そのまま、菌体破砕上清、部分精製物を酵素源として用いてもよい。ホストとして用いるエシェリキア  コリとしては、Ｋ−１２株、Ｂ株由来の変異株などが好適に用いられるが、枯草菌、酵母などの遺伝子組換え菌を利用して生産することもできる。さらに、菌体内に生産させる以外にも、分泌型のホストベクターを用いることにより、培地中に分泌生産させることもできる。
【００２４】
上記パイロバクラム  カリディフォンティス  ＶＡ１由来のエステル加水分解酵素遺伝子は、配列番号１に示すＤＮＡ遺伝子配列または配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものであり、本発明では、上記エステル加水分解酵素として、配列番号１に示す遺伝子配列または配列番号２に示すアミノ酸配列を有することが好ましい。原核生物由来のエステル加水分解酵素は、Biochem, J., 343, 177, 1998に記載されているように、そのアミノ酸配列に従って８種類の族に分類されている。本発明で使用する上記酵素は上記配列番号１に示す遺伝子配列または配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものであり、該配列には、ＩＶ族に特徴的なアミノ酸配列、すなわち、活性セリンを含むペンタぺプチドであるＧＸＳＸＧに相当する１５５番目から１５９番目のアミノ酸からなるＧＤＳＡＧのペンタぺプチド、及び、それ以外の活性点として機能している２５４番目のアスパラギン酸と２８４番目のヒスチジン、及び、８３番目から８６番目に位置するＨＧＧＧとをが含まれている。
【００２５】
該エステル加水分解酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Sambrook. J., and D. W. Russell. 2001, Molecular cloning: a laboratory manual,3rd ed,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Habor,N.Yに記載の方法による）にかけて分子量を測定すると、約３４，０００であった。また、該エステル加水分解酵素の上記ＰＮＰＣ法におけるｐＨの影響を評価するため、各種ｐＨのバッファーを使用してｐＨを変更し、その後に遊離するｐ−ニトロフェノキシド及びｐ−ニトロフェノールを吸光度３４８ｎｍで測定したところ、該酵素はｐＨ７で最大活性を示した。
【００２６】
なお、本明細書において、エステル加水分解反応とは、カルボン酸エステルが水と反応してカルボン酸を生成する反応をいう。なお、本発明で使用するエステル加水分解酵素とは、エステルの加水分解反応を触媒するものであれば何ら制限されるものではない。後述のＰＮＰＣ法で、基質である脂肪酸エステルを加水分解したときに生じるカルボン酸またはアルコールの量を測定した場合に、基質である脂肪族エステルに対して活性値が１００Ｕ／ｍｇ以上であることが好ましい。
【００２７】
また、耐熱性とは、酵素を一定温度で２時間保温処理を行った後の活性の残存率が、処理前の活性の５０％以上ある温度をいう。耐熱温度は、６０℃以上であることが好ましく、８０℃以上であることが特に好ましい。反応温度を高くすることができ、反応速度を高めかつ反応中の該酵素の失活を軽減し、かつ反応中に副生するアルコールや水の除去が容易となるため、工業的生産性に優れるからである。上記エステル加水分解酵素は、温度を変化させて上記ＰＮＰＣ法で活性値を評価した場合に９０℃で最大活性を示した。
【００２８】
また、耐溶剤性とは、２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝溶液中に種々の有機溶剤を加え、有機溶剤の濃度を８０体積％に調整した混合溶媒に、酵素を３０℃で１時間静置させた後の活性の残存率が、処理前の活性の８０％以上ある場合、その時に用いた有機溶剤に対して耐溶剤性があるとする。該酵素を２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝溶液（ｐＨ８．０）中、０．２０５ｍｇ／ｍｌの濃度で、１００℃に一定時間放置した後ＰＮＰＣ法により酵素活性を測定したところ、該酵素は１００℃で２時間加熱しても、活性の低下は全く見られなかった。
【００２９】
本発明では、上記エステル加水分解酵素を、上記式（１）で示す化合物と上記式（２）で示すジオールとから上記式（３）で示すカルボン酸ヒドロキシモノエステルへ交換する反応の触媒として使用する点に特徴がある。該エステル加水分解酵素は本来耐溶媒性に優れるため、有機溶媒中でカルボン酸もしくはそのエステルまたはカルボン酸ジエステルと、ジオールとを反応させてカルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造することができ、反応溶媒をそのまま次工程の製造原料として使用できること、該酵素が耐熱性に優れるため、エステル合成及びエステル交換反応においても種々の有機溶媒や基質が利用可能となるため、工業的な利用価値が高くなり、耐熱性が高いため反応温度を高くすることができ、反応速度を高めかつ反応中の該酵素の失活を軽減でき、有利だからである。
【００３０】
本発明のカルボン酸ヒドロキシモノエステルの製造方法において、反応原料たる式（１）で示すカルボン酸またはそのエステルにおいて、Ｒ１およびＲ２は、水素原子または１価の有機基であれば特に限定されないが、１価の有機基としては、直鎖または分岐、環を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基などが好適に用いられる。該有機基は、任意の位置に１個以上の置換基を有していてもよい。置換基としてはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フッ素、塩素、ヨウ素などのハロゲン基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシ基、アシロキシ基、スルフォニル基、アミノ基、ニトリル基、ニトロ基、アジド基、などが挙げられる。
【００３１】
Ｒ１は、水素原子または直鎖または分岐、環を有していてもよい炭素数1〜１０のアルキル基、炭素数1〜１０のアルケニル基、炭素数1〜１０のアルキニル基、アリール基であることが好ましい。炭素数1〜１０のアルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、イソペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、エチルヘキシル、ノナニル、デカニル、シクロペンチル、シクロへキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどが挙げられる。炭素数1〜１０のアルケニル基としては、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタンジエニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、１−エチルビニル、１−メチル−１−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、２−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、２−エチル−２−プロペニル、１−メチル−１−ブテニル、１−メチル−２−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、１−プロピル−１−ビニル、１−イソプロピル−１−ビニル、１，２−ジメチル−１−プロペニル、１，２−ジメチル−２−プロペニル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、１，３−ペンタンジエニル、２，４−ペンタンジエニル、１−メチル−１，３−ブタンジエニル、２，４−へキサンジエニル、１，３−オクタンジエニルなどが挙げられる。また、炭素数1〜１０のアルキニル基の例としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル、２−メチル−３−ブチニル、１−メチル−２−ブチニル、１−メチル−３−ブチニル、１，１−ジメチル−２−プロピニル、１−エチル−２−プロピニル、４−メチル−ヘキセニルなどが挙げられる。また、アリール基の例としては、フェニル、ベンジル、ナフチルなどが挙げられる。
【００３２】
特には、式（１）で示すカルボン酸またはカルボン酸エステルとして、下記式（４）で示す不飽和カルボン酸または不飽和カルボン酸エステルであることが好ましい。
【００３３】
【化２】
2004261177.tif 000003
【００３４】
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は、それぞれ水素原子または１価の有機基を示し、Ｒ２は、式（１）における定義と同じである。）
ここに式（４）のＲ４、Ｒ５、Ｒ６としては、それぞれ独立して、水素原子または１価の有機基であれば特に限定されないが、１価の有機基としては、直鎖または分岐、環を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基などが好適に用いられる。該有機基は、任意の位置に１個以上の置換基を有していてもよい。置換基としてはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フッ素、塩素、ヨウ素などのハロゲン基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシ基、アシロキシ基、スルフォニル基、アミノ基、ニトリル基、ニトロ基、アジド基、などが挙げられる。
【００３５】
特に、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６としては、水素原子または直鎖または分岐、環を有していてもよい炭素数1〜５のアルキル基、炭素数1〜５のアルケニル基、炭素数1〜５のアルキニル基、アリール基であることが好ましい。炭素数1〜５のアルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、イソペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、シクロペンチルなどが挙げられる。炭素数1〜５のアルケニル基の例としては、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタンジエニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、１−エチルビニル、１−メチル−１−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、２−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、２−エチル−２−プロペニル、１−メチル−１−ブテニル、１−メチル−２−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、１−プロピル−１−ビニル、１−イソプロピル−１−ビニル、１，２−ジメチル−１−プロペニル、１，２−ジメチル−２−プロペニル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、１，３−ペンタンジエニル、２，４−ペンタンジエニル、１−メチル−１，３−ブタンジエニル、などが挙げられる。また、炭素数1〜５のアルキニル基の例としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル、２−メチル−３−ブチニル、１−メチル−２−ブチニル、１−メチル−３−ブチニル、１，１−ジメチル−２−プロピニル、１−エチル−２−プロピニルなどが挙げられる。更に、アリール基の例としては、フェニル、ベンジル、ナフチル、などが挙げられる。
【００３６】
一方、上記式（１）中のＲ２は、炭素数1〜５のアルキル基、炭素数1〜５のアルケニル基、炭素数1〜５のアルキニル基、アリール基であることが好ましく、これらは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フッ素、塩素、ヨウ素などのハロゲン基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシ基、アシロキシ基、スルフォニル基、アミノ基、ニトリル基、ニトロ基、アジド基などの置換基を有していてもよい。炭素数1〜５のアルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、イソペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、シクロペンチルなどが挙げられる。炭素数1〜５のアルケニル基の例としては、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタンジエニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、１−エチルビニル、１−メチル−１−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、２−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、２−エチル−２−プロペニル、１−メチル−１−ブテニル、１−メチル−２−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、１−プロピル−１−ビニル、１−イソプロピル−１−ビニル、１，２−ジメチル−１−プロペニル、１，２−ジメチル−２−プロペニル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、１，３−ペンタンジエニル、２，４−ペンタンジエニル、１−メチル−１，３−ブタンジエニル、などが挙げられる。また、炭素数1〜５のアルキニル基の例としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル、２−メチル−３−ブチニル、１−メチル−２−ブチニル、１−メチル−３−ブチニル、１，１−ジメチル−２−プロピニル、１−エチル−２−プロピニルなどが挙げられる。更に、アリール基の例としては、フェニル、ベンジル、ナフチル、などが挙げられ、置換基を有するアルキル基としては、−Ｒ７−Ｏ−ＣＯ−Ｒ８がある。なお、Ｒ７は後記するＲ３のいずれかの２価の有機基であり、Ｒ８はＲ２のいずれかの1価の有機基である。本発明においてＲ２としては、原料の入手の容易さおよび官能基部位で副反応が起らないことから、水素原子や、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどの炭素数１〜５のアルキル基が好ましい。また、原料の入手の容易さからビニル、イソプロペニルなどの炭素数１〜５のアルケニル基も好ましい。アルケニル基としては、エステル交換反応が起ったとき、はずれたアルコールがケト−エノール互変異性によりアルデヒドもしくはケトンに変換することで平衡を移動させ、反応が進み易くなることから、１位に二重結合を持つアルケニル基が好��しい。
【００３７】
本発明では、上記式（１）で示すカルボン酸またはカルボン酸エステルとして、上記式（４）の、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６が水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルケニル基であることが好ましく、Ｒ４とＲ５とが共に水素原子であり、Ｒ６が水素原子またはメチルであるアクリル酸やアクリル酸エステル、またはメタクリル酸やメタクリル酸エステル、特に、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ビニル、（メタ）アクリル酸イソプロペニルであることが最も好ましい。その他の化合物として、式（１）で示される酢酸イソプロプロペニル、酪酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酢酸ビニルなども好ましい。このような不飽和カルボン酸を使用すると、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレートなどの、耐熱性、密着性、耐候性、耐擦傷性に優れる機能の樹脂原料のモノマーが容易に製造できるからである。
【００３８】
なお、Ｒ２が−Ｒ７−Ｏ−ＣＯ−Ｒ８である下記式（５）で示すカルボン酸エステルを使用すると、ジオールと反応してカルボン酸ヒドロキシモノエステルが生成する。この際、Ｒ７がＲ３と同一であり、Ｒ１とＲ８とが同一の場合には、２モルのカルボン酸ヒドロキシモノエステルが生成できて好ましい。
【００３９】
【化３】
2004261177.tif 000004
【００４０】
次に、式（２）で示すジオールでは、Ｒ３は、２価の有機基であれば特に限定されない。エチレン、トリエチレン、テトラエチレンなどのアルキレン；プロペニレン、ビニレンなどのアルケニレン；アルキニレン；エチリデン、イソプロピリデンなどのアルキリデン；アルキリジン；置換基を有していてもよいアリールなどが好適である。中でも、Ｒ３は、炭素数２〜１２のアルキレン、特には炭素数３〜８のアルキレンであることが好ましい。式（２）で示すジオールとしては、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、２，３−ブタンジオールや１，４−ブタンジオールなどのブタンジオール、１，６−へキサンジオールなどのヘキサンジオール、１，２−プロパンジオールや１，３−プロパンジオールなどのプロパンジオール、１，３−ペンタンジオールや１，５−ペンタンジオールなどのペンタンジオール、１，５−ヘプタンジオールや１，７−ヘプタンジオールなどのヘプタンジオール、１，８−オクタンジオールや１，５−オクタンジオールなどのオクタンジオール、シクロヘキサンジメタノール、シクロへキサンジオール、カテコール、レゾルシノールなどのジオールなどが挙げられ、より好ましくは、１，４−ブタンジオール、１，６−へキサンジオール、１，３−プロパンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，７−ヘプタンジオール、１，８−オクタンジオール、シクロヘキサンジメタノール、シクロへキサンジオールなどである。
【００４１】
本発明のカルボン酸ヒドロキシモノエステルの製造方法では、反応に溶媒を使用しても使用しなくてもよい。溶媒を使用する場合、該酵素は、耐溶剤性に優れるため広範囲の溶媒の中から選択することができる。このような溶媒としては、水，アセトニトリルおよびベンゾニトリルなどのニトリル類；アセトン、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、シクロペンタノンおよびシクロヘキサノンなどのケトン類；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、パーフルオロヘキサンおよびパーフルオロオクタンなどのハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、アニソールおよびクロルベンゼンなどの芳香族炭化水素類；ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンおよびデカンなどの炭化水素類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジフェニルエーテル、ベンジルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、１，２−ジメトキシエタンおよびシクロペンチルメチルエーテルなどのエーテル類；Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの極性溶媒などがある。これらの溶媒は単一で用いてもよく、２種類以上を併用してもよく、２種類以上を併用する場合には、溶媒が均一に溶解していても、二相分離するなど不均一であってもよい。本発明では、特に耐溶剤性に優れる酵素を使用することで、目的物たる式（３）で示すカルボン酸ヒドロキシモノエステルを有機溶媒中に製造することができ、これらが重合性モノマーとして使用される場合には該溶液に重合開始剤を添加することで対応する重合体、樹脂を含む溶液を得る事ができ、有用性が高い。このようなモノマーや重合体を含有する溶液は、そのまま塗料やインキ、コーティング剤などとしても使用することもできる。その一方、反応液の蒸留、分留、抽出、乾燥などの公知の方法によって、カルボン酸ヒドロキシモノエステルを取り出すことができる。また、純度の高い産物とするために更に精製工程が施されてもよい。この際の精製方法としては、特に制限されず公知の方法が使用できる。例えば、洗浄、溶媒抽出、シリカゲルやアルミナなどによるカラムクロマトグラフィー、蒸留、再結晶などの公知の方法が使用できる。
【００４２】
本発明における原料化合物の配合量は、一般には、式（１）で示すカルボン酸またはカルボン酸エステル１モルに対して、式（２）で示すジオールの反応量は、化学量論的には１モルである。しかしながら反応効率を考慮して、式（１）で示す化合物１モルに対する式（２）で示すジオールの使用量は、１〜１０モル、より好ましくは１〜５モル、特に好ましくは１〜３モルである。１モルを下回るとカルボン酸またはそのエステルの転化率が低下する場合がある。一方、１０モルを超えると過剰のジオールを分離する必要が生じ、不利となる。ただし、ジオールを原料化合物であると同時に溶媒としても使用する場合には、式（１）で示す化合物１モルに対する式（２）で示すジオールの添加量は１０モルを超えてもよく、好ましくは１〜５０モル、より好ましくは１〜３０モルである。
【００４３】
上記酵素は、凍結乾燥したものを粉砕してそのまま粉末で使用してもよいし、いずれか既知の方法で固定化して使用してもよい。当該技術分野のいずれかの既知の方法、例えばＫ．Mosbach(編者);Methods in Enzymology,44、“Immobilized Enzymes”(Academic Press,New York,1976)に記載の方法により固定化することができる。酵素の固定化に利用できる方法は、細胞均質化物の架橋法、不溶性の無機もしくほ有機担体への共有結合法、ゲル中ヘの包括法及びイオン交換樹脂もしくは他の吸着剤への吸着法が含有される。また、Macrae A.R.及びHammond R.C.(1985)、Biotechnology and Genetic Engineering Reviews,3,193に開示されているような、粒状の担体上への被覆法も使用することができる。固定化方法は、好ましくは粒状の多孔質樹脂を使用する。より好ましい固定化方法は、無機担体を用い、そして好ましくはエステラーゼを吸着または共有結合により該担体へ付着せしめる方法である。固定化の担体としては特に限定されるものではないが、極性が低くかつ残官能基などの活性点の少ない担体が好ましい。例えば、α−アルミナやシリコンカーバイドなどが挙げられる。シリカゲルやセライト、カオリナイト、珪藻土、活性炭なども好適であり、極性が低くかつ残官能基などの活性点の少ないものが好ましい。なお、上記エステル加水分解酵素は、ポリエチレングリコールや脂質分子で修飾することで、有機溶剤への親和性を増大させ、有機溶剤中に溶解もしくは微分散させて使用してもよい。その他、かかる担体及び固定化技術は、K.Mosbach(編者);Methods in Enzymology,44,“Immobilized Enzymes“(Academic Press,New York,1976)に開示されている方法を好適に用いる事ができる。
【００４４】
上記エステル加水分解酵素を触媒として用いたカルボン酸ヒドロキシモノエステルの反応条件としては、原料が式（１）で示す化合物中のＲ２が水素原子以外の１価の有機基であるカルボン酸エステル類である場合には、反応温度は０℃〜１２０℃、好ましくは２０℃〜１００℃、より好ましくは２５℃〜９０℃である。また、原料が式（１）で示す化合物中のＲ２が水素原子であるカルボン酸類である場合には、反応温度は０℃〜１２０℃、好ましくは４０℃〜１２０℃、より好ましくは５０℃〜１１０℃である。１２０℃以上では該酵素の失活が激しく、０℃以下では害酵素の活性が非常に低く実用的でない。
【００４５】
また、溶媒として水を用いる場合には、ｐＨ領域としてはｐＨ３．５から９であり、好ましくはｐＨ５から９であり、より好ましくはｐＨ６から８であり、ｐＨ６．５〜７．５が最も好ましい。なお、アルカリ金属の水酸化物、リン酸塩、スルホン酸塩、クエン酸塩などを添加してｐＨがアルカリ領域に属する場合には、上記式（１）で示すカルボン酸は、含まれる−ＣＯＯＨの少なくとも一部が−ＣＯＯＭ（Ｍはアルカリ金属）に変化すると考えられる。しかしながら、本発明で使用する上記酵素は、このように添加物の使用または原料化合物の精製度その他の条件によって式（１）で示すカルボン酸にカルボン酸塩が含まれる場合であっても、上記式（２）で示すジオールと反応させて式（３）で示すカルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造することができる。また圧力は、加圧下、常圧下、または減圧下のいずれの圧力下で行ってもよいが好ましくは、常圧下もしくは減圧下で行われる。
【００４６】
なお、原料の副生物であるカルボン酸ジエステルの副生を抑え原料効率を高めるため、副生すると予想されるカルボン酸ジエステルを予め適当量添加しておいてもよい。
【００４７】
本発明では、更に使用する酵素の活性を阻害しない範囲で、金属塩を含有するｐＨ調整剤、他の化合物を添加することができる。このような添加剤は、使用する原料化合物によって適宜選択することができ、例えば式（１）で示す化合物が（メタ）アクリル酸エステルである場合には、原料化合物および生成化合物が重合性基を有するため、重合防止剤などを添加してもよい。
【００４８】
本発明のエステル加水分解酵素を触媒として用いた、式（１）で示される化学反応方法としては、回分式かまたは連続式のいずれかにより実施することができる。回分反応器中では、原料化合物および必要に応じて配合される溶媒を、必要量の上記エステル加水分解酵素と共に機械的に攪拌させる。反応時間は、酵素量および所望の転化率に応じて適宜選択すればよい。固定化エステル加水分解酵素を用いれば、反応終了時に回収しそして再利用することができ、それによって工程の経済性を改善することができる。一方、連続方法では、固定化エステル加水分解酵素を保持する反応器を通して、その融点以上で基質を流し、または基質を有機溶媒に溶かした溶液を流せば、連続的にカルボン酸ヒドロキシモノエステルを製造することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明の実施例により具体的に説明する。
【００５０】
なお、以下において酵素を用いる反応は、アドバンストケムテック製のパーソナル有機合成装置「ラボメイト」を用いて行った。
【００５１】
また、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析は次の条件で行った。
【００５２】
カラム  名称：島津製作所製ＣＢＰ−１０−Ｍ２５−０２５
膜厚：０．２５μｍ、長さ：２５．０ｍ、内径：０．２２ｍｍ
温度プログラム：４０℃にて２ｍｉｎ保持、４０→２５０℃（２０℃／ｍｉｎ）、２５０℃にて５ｍｉｎ保持
（参考例１）
発現プラスミドの構築
パイロバクラム  カリディフォンティスのゲノムＤＮＡを、Ｓａｕ３ＡＩを用いて部分的に消化し、プラスミドｐＵＣ１１８／ＢａｍＨＩ  ＢＡＰにライゲーションさせた。エシェリキア  コリ  ＤＨ５αをプラスミドライブラリーを用いて形質転換し、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地に広げて培養した。続いて形質転換体コロニーを、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ、トリブチリンを０．１％含むＬＢ寒天培地にレプリカした。コロニーが確認できるまで３７℃でインキュベートした後、さらに６０℃でインキュべートした。コロニー周辺に大きなクリアーゾーンを形成する形質転換体を選び、それらのプラスミドを分離した。
【００５３】
ゲノムＤＮＡは、一般的な方法(Sambrook.J.,and D.W.Russell. 2001. Molecular cloning:a laboratory manual,3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Habor,N.Y)により精製した。プラスミドＭｉｎｉ−ｋｉｔｓ及びＭｉｄｉ−ｋｉｔｓ(QIAGEN,Hilden,Germany)を用いて、プテスミドＤＮＡの精製を行った。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭｋｉｔとＭｏｄｅｌ  ３１０キャピラリーＤＮＡシ−ケンサー(Perkin-Elmer Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)を用いて、ＤＮＡ配列を分析した。配列データの解析はＤＮＡＳＩＳソフトウェア（目立ソフトウェアエンジニアリング製）を用いて行った。
【００５４】
ＮｄｅＩ及び、ＢａｍＨＩに対する制限酵素位を含む二種類のプライマーｅｓｔ−５’（５’−ＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＡＧＧ−３’）（配列番号３）とｅｓｔ−３’（５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣ−３’）（配列番号４）を用いて、本酵素遺伝子の増幅を行った。パイロバクラム  カリディフオンテイスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡製）をＤＮＡポリメラーゼとして、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＮｄｅＩとＢａｍＨＩにより消化したＰＣＲ生成物をｐＥＴ−２ｌａ−ｄ（＋）に挿入し、エシェリキア  コリ  ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬに導入した。
【００５５】
（参考例２）
菌の培養
参考例１にて構築した形質転換体をＬＢ培地にて、３７℃で培養した。ＯＤ６６０が０．４に達したところで、遺伝子発現を促進するために、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えた。８時間の培養後、菌体を回収した。
【００５６】
（参考例３）
参考例２で回収した菌体を２０ｍＭトリス緩衝溶液中に分散させ、音波処理と遠心分離（１００００×ｇ  ４℃  ２０分）により抽出物を得た。上澄みを８０℃で２０分間インキュベートし、遠心分離（１６０００×ｇ、４℃、２０分）によりホスト菌体の変性タンパク質を除去した。上澄みをＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、２０μＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑアニオン交換カラム（６ｍｌ）にアプライし、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を含む０−０．５Ｍ  Ｎａｃｌグラジエントより溶出した。エステラーゼ活性を有する画分を、U1trafree-4 Centrifugal Filter Unit Biomax-10(Millipore,Bedford, MA, USA)を用いて濃縮した。試料を、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ  １０／３０ゲル浦過カラムにより精製し、エステラーゼ活性を有する画分を精製酵素とした。この酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ  ２７０(Perkin-Elmer App1ied Biosystems)により決定した。またタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質分析システム(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用い、牛血清アルブミンを標準物質として決定した。
【００５７】
こうして得られた酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によりその分子量を調べた。その分子量は約３４，０００であった。
【００５８】
（参考例４）
パイロバクラム・カリディフォンティス由来エステラーゼ遺伝子組み換え体の培養
パイロバクラム・カリディフォンティス由来のエステラーゼ組換え大腸菌を表１に示す培地にアンピシリン１００ｐｐｍを含む培地３ｍｌを入れた試験管1本に接種して３７℃で８時間培養後、表１に示す培地にアンピシリン１００ｐｐｍを添加した培地１００ｍｌを入れた坂口フラスコ1本に接種し、３７℃で一夜振盪培養した。次に、表２に示す培地にアンピシリン１００ｐｐｍと、ＩＰＴＧ１ｍＭを添加した培地１００ｍｌを入れた坂口フラスコ１０本にそれぞれ３ｍｌずつ接種し、３７℃で１２時間振盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体を２００ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に懸濁後、ビーズミルで破砕した。破砕物を遠心分離にかけて上清を回収し、８０℃、２０分の熱処理をした。この処理物を遠心分離にかけ、上清を回収した。この粗酵素液を限外濾過膜を用いて１００ｍｌまで濃縮した後、凍結乾燥にかけた。凍結乾燥後、約１．６ｇのパイロバクラム・カリディフォンティス由来の粗酵素粉末が得られた。
【００５９】
【表１】
2004261177.tif 000005
【００６０】
【表２】
2004261177.tif 000006
【００６１】
（参考例５）
パイロバクラム・カリディフォンティス由来のエステラーゼ組換え大腸菌を上記表１に示す培地にアンピシリン１００ｐｐｍを含む培地３ｍｌを入れた試験管1本に接種して３７℃で８時間培養後、表１に示す培地にアンピシリン１００ｐｐｍを添加した培地１００ｍｌを入れた坂口フラスコ1本に接種し、１７℃で２４時間振盪培養した。１７℃での培養時の比増殖速度は、３７℃で培養した場合の増殖速度の１０％である。次に上記表２に示す培地にアンピシリン１００ｐｐｍと、ＩＰＴＧ１ｍＭを添加した培地１００ｍｌを入れた坂口フラスコ１０本にそれぞれ３ｍｌずつ接種し、１７℃で１２０時間振盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体を４００ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に懸濁後、ビーズミルで破砕した。破砕物を遠心分離にかけて上清を回収し、８０℃、２０分の熱処理をした。この処理物を遠心分離にかけ、上清を回収した。この粗酵素液を限外濾過膜を用いて１００ｍｌまで濃縮した後、凍結乾燥にかけた。凍結乾燥後、約３．２ｇのパイロバクラム・カリディフォンティス由来の粗酵素粉末が得られた。
【００６２】
（参考例６）
参考例４で得た酵素のエステル加水分解能を評価した。
【００６３】
１ｍＭのＰＮＰＣを基質として用い、アセトニトリルを１％含む５０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．１）を７０℃で３分間プレインキュベートし、その後、参考例４で得た酵素を０．５１μｇ加え反応を開始させ、遊離のｐ−ニトロフェノールを吸光度４０５ｎｍにより測定した。
【００６４】
その結果、７０℃で１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位（Ｕ）と定義すると、カプロン酸ｐ−ニトロフェニルに対する活性値は２，５００Ｕ／ｍｇであった。
【００６５】
（参考例７）
１００ｍｌのバイアル管に５．０ｇのα−アルミナ粒子（サンゴバン（株）製；商品名「ＳＡ５１３９」）と参考例５で得た凍結乾燥する前の濃縮酵素水溶液２０ｍｌとを加え、１時間室温で攪拌させた。ろ過により分離したα−アルミナ粒子を４０℃で３時間乾燥させ、５．２ｇの固定化酵素を得た。
【００６６】
（参考例８）
１００ｍｌのバイアル管に５．０ｇのシリコンカーバイド粒子（サンゴバン（株）製；商品名「ＳＣ５２１２６」）と参考例５で得た凍結乾燥する前の濃縮酵素水溶液２０ｍｌを加え、１時間室温で攪拌させた。ろ過により分離したシリコンカーバイド粒子を４０℃で３時間乾燥させ、５．２ｇの固定化酵素を得た。
【００６７】
（実施例１）
２０ｍｌのバイアル管にアクリル酸ビニル１．０ｍｍｏｌ、および１，４−ブタンジオール１．０ｍｍｏｌを加え、更にトルエン１０．０ｍｌを加え攪拌し溶解させた。この溶液に参考例４で得た酵素１００ｍｇを粉末のまま加え、４０℃５３時間で攪拌した。
【００６８】
得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は１００％、４−ヒドロキシブチルアクリレート（以下、４ＨＢＡと略す）の１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９０％であった。以下、実施例および比較例における結果を表３、表４に示す。
【００６９】
なお、転化率および選択率は、以下に従った。
【００７０】
【数１】
2004261177.tif 000007
【００７１】
【数２】
2004261177.tif 000008
【００７２】
（実施例２）
反応温度を３０℃にする他は実施例１と同様に反応を行い、３０℃で６８時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は９２％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９４％であった。
【００７３】
（実施例３）
反応温度を５０℃にする他は実施例１と同様に反応を行い、５０℃で７５時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は９１％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９４％であった。
【００７４】
（実施例４）
反応温度を７０℃にする他は実施例１と同様に反応を行い、７０℃で７５時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は４９％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９６％であった。
【００７５】
（実施例５）
ジオールとして１，３−プロパンジオールを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で５３時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は１００％、３−ヒドロキシプロピルアクリレート（以下、３ＨＰＡと略す）の１，３−プロパンジオールジアクリレートに対する選択率は８９％であった。
【００７６】
（実施例６）
ジオールとして１，６−ヘキサンジオールを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で６７時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は７４％、６−ヒドロキシヘキシルアクリレート（以下、６ＨＨＡと略す）の１，６−ヘキサンジオールジアクリレートに対する選択率は９５％であった。
【００７７】
（実施例７）
ジオールとして１，８−オクタンジオールを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で１４３時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は８２％、８−ヒドロキシオクチルアクリレート（以下、８ＨＯＡと略す）の１，８−オクタンジオールジアクリレートに対する選択率は９５％であった。
【００７８】
（実施例８）
原料エステルとしてメタクリル酸ビニルを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で６６時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、メタクリル酸ビニル基準の転化率は７７％、４−ヒドロキシブチルメタクリレートの１，４−ブタンジオールジメタクリレートに対する選択率は９９％であった。
【００７９】
（実施例９）
原料エステルとしてメタクリル酸ビニルを、ジオールとして１，３−プロパンジオールを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で６６時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、メタクリル酸ビニル基準の転化率は８１％、３−ヒドロキシプロピルメタクリレートの１，３−プロパンジオールジメタクリレートに対する選択率は９９％であった。
【００８０】
（実施例１０）
原料エステルとして酢酸イソプロペニルを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で２８時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、酢酸イソプロペニル基準の転化率は９６％、４−ヒドロキシブチルアセテートの１，４−ブタンジオールジアセテートに対する選択率は９２％であった。
【００８１】
（実施例１１）
原料エステルとして酢酸ビニルを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で２８時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、酢酸ビニル基準の転化率は９９％、４−ヒドロキシブチルアセテートの１，４−ブタンジオールジアセテートに対する選択率は９４％であった。
【００８２】
（実施例１２）
原料エステルとしてプロピオン酸ビニルを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で４２時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、プロピオン酸ビニル基準の転化率は９８％、４−ヒドロキシブチルプロピオネートの１，４−ブタンジオールジプロピオネートに対する選択率は９１％であった。
【００８３】
（実施例１３）
原料エステルとして酪酸ビニルを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で６６時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、酪酸ビニル基準の転化率は８７％、４−ヒドロキシブチルブチレートの１，４−ブタンジオールジブチレートに対する選択率は９６％であった。
【００８４】
（実施例１４）
反応溶媒としてイソプロピルエーテルを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で９２時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は７１％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９４％であった。
【００８５】
（実施例１５）
アクリル酸ビニル０．０９８９ｇ（１．０１ｍｍｏｌ）、および１，４−ブタンジオール０．１３５ｇ（１．５０ｍｍｏｌ）を使用する他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で３０時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は９６％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９７％であった。
【００８６】
（実施例１６）
２０ｍｌのバイアル管にアクリル酸ビニル１．０ｍｍｏｌ、および１，４−ブタンジオール１．０ｍｍｏｌを加え、更にトルエン１０．０ｍｌを加え攪拌し溶解させた。この溶液に参考例５で得た酵素１００ｍｇを粉末のまま加え、４０℃で５時間攪拌した。
【００８７】
得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は９９％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９４％であった。
【００８８】
（実施例１７）
反応温度を３０℃にした以外は実施例１６と同様に反応を行い、３０℃で８時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は９４％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９５％であった。
【００８９】
（実施例１８）
反応温度を５０℃にした以外は実施例１６と同様に反応を行い、５０℃で８時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は９６％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９４％であった。
【００９０】
（実施例１９）
原料エステルとしてメタクリル酸ビニルを用いる以外は実施例１６と同様に反応を行い、４０℃で６時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は９８％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジメタクリレートに対する選択率は９２％であった。
【００９１】
（実施例２０）
原料エステルとしてアクリル酸メチルを用いる以外は実施例１６と同様に反応を行い、４０℃で９４時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸メチル基準の転化率は８３％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９１％であった。
【００９２】
（実施例２１）
原料エステルとしてアクリル酸エチルを用いる以外は実施例１６と同様に反応を行い、４０℃で７６時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸エチル基準の転化率は８８％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９３％であった。
【００９３】
（実施例２２）
原料エステルとしてアクリル酸ブチルを用いる以外は実施例１６と同様に反応を行い、４０℃で７６時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸メチル基準の転化率は９２％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９１％であった。
【００９４】
（実施例２３）
ジオールとしてジエチレングリコールを用いる以外は実施例１６と同様に反応を行い、４０℃で８７時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は９１％、４ＨＢＡのジエチレングリコールジアクリレートに対する選択率は９２％であった。
【００９５】
（実施例２４）
２０ｍｌのバイアル管にアクリル酸ビニル０．４９１２ｇ（５．０ｍｍｏｌ）、および１，４−ブタンジオール１０．１０１９ｇ（１１２．１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液に参考例５で得た酵素１００ｍｇを粉末のまま加え、４０℃で１０７時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は８７％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は８９％であった。
【００９６】
（実施例２５）
２０ｍｌのバイアル管にアクリル酸ビニル４．９０８１ｇ（５０．０ｍｍｏｌ）、および１，４−ブタンジオール４．５４２７ｇ（５０．４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液に参考例５で得た酵素１，０１６ｍｇを粉末のまま加え、４０℃で１２１時間攪拌した。
【００９７】
得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は８５％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９４％であった。
【００９８】
（実施例２６）
２０ｍｌのバイアル管にアクリル酸４．２ｍｍｏｌ、および１，４−ブタンジオール１００．０ｍｍｏｌを加えて攪拌した。この溶液に参考例５で得た酵素５００ｍｇを粉末のまま加え、１００℃で９２時間攪拌した。
【００９９】
得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸基準の転化率は８２％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９１％であった。
【０１００】
（実施例２７）
反応温度を９０℃にする以外は実施例２６と同様に反応を行い、９０℃で１２６時間攪拌した。
【０１０１】
得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸基準の転化率は７８％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は８８％であった。
【０１０２】
（実施例２８）
反応温度を７０℃にする以外は実施例２６と同様に反応を行い、７０℃で１９３時間攪拌した。
【０１０３】
得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸基準の転化率は８１％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は８３％であった。
【０１０４】
（実施例２９）
アクリル酸４．０１３４ｇ（５５．７ｍｍｏｌ）、および１，４−ブタンジオール５．６１８１ｇ（６２．３ｍｍｏｌ）を用いる以外は実施例２６と同様に反応を行い、１００℃で１０８時間攪拌した。
【０１０５】
得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸基準の転化率は７７％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は８４％であった。
【０１０６】
（実施例３０）
参考例７で得た固定化酵素を使用する以外は実施例２６と同様に反応を行い、１００℃で９２時間攪拌した。
【０１０７】
得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸基準の転化率は７８％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は９３％であった。
【０１０８】
（実施例３１）
参考例８で得た固定化酵素を使用する以外は実施例２６と同様に反応を行い、１００℃で９２時間攪拌した。
【０１０９】
得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸基準の転化率は８０％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は８９％であった。
【０１１０】
（比較例１）
１００ｍｌの三口フラスコにアクリル酸ビニル１．０１ｇ（１０．３ｍｍｏｌ）、および１，４−ブタンジオール０．９２ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）を加え、更にトルエン１００．０ｍｌを加え攪拌し溶解させた。この溶液にｐ−トルエンスルホン酸１２０ｍｇを加え、１１０℃で１４時間還流、攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は１００％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は４１％であった。
【０１１１】
（比較例２）
触媒として酵素リパーゼＰＳ（天野エンザイム社製）を用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で７２時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は１００％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は６６％であった。
【０１１２】
（比較例３）
触媒として酵素リパーゼＰＳ（天野エンザイム社製）を、反応溶媒としてイソプロピルエーテルを用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で７２時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は９４％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は６５％であった。
【０１１３】
（比較例４）
触媒としてＮＯＶＯＺＹＭ４３５（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）を用いる他は実施例１と同様に反応を行い、４０℃で７時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、アクリル酸ビニル基準の転化率は１００％、４ＨＢＡの１，４−ブタンジオールジアクリレートに対する選択率は６３％であった。
【０１１４】
（比較例５）
触媒を添加しない他は実施例１と同様に反応を行い、７０℃で４２時間攪拌した。得られた反応生成液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、４ＨＢＡの生成も１，４−ブタンジオールジアクリレートの生成も見られなかった。
【０１１５】
【表３】
2004261177.tif 000009
【０１１６】
【表４】
2004261177.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明は、Pyrobaculum属に属する好熱性始原菌由来のエステル加水分解酵素を用いて特定のカルボン酸もしくはそのエステルとジオールとを反応させて４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートなどの有用な重合性モノマーを有機溶媒中に製造することができる。
【配列表】
2004261177000001.app