(57)【要約】【課題】プローブ担体に試料を反応させた測定用試料に形成された核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド体の形成の有無を、固定化した核酸プローブの状態、例えば、配置位置のイメージングやその量的分析を正確に行うことができる測定用試料の分析方法を提供することにある。【解決手段】プローブ担体に試料を反応させた測定用試料に形成された核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド体の形成の有無を、標的核酸に標識したハロゲン原子を飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）によって測定することにより検出する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブの固定化領域の多数が担体上に各々が独立してマトリクス状に配置されたプローブ担体に、試料を反応させて得られた分析用試料を分析する方法において、
標識物質がハロゲン原子で標識され、前記プローブと前記標的物質の結合体の形成の有無を、該ハロゲン原子を飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）によって測定することにより検出ことを特徴とする分析用試料の分析方法。
【請求項２】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析が量的な分析である請求項１の分析方法。
【請求項３】
規定の数のハロゲン原子が前記標的物質に標識されている請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
一次イオンを、前記担体の分析対象領域の面積に対して相対的に小さな面積を有するスポットとして該分析対象領域全体に対して順次パルス照射して、該パルス照射によって発生する二次イオンを、それぞれのパルス照射ごとに飛行時間的に質量分析して画像化する請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項５】
一次イオンのパルス照射を、非連続的パターンに基づいて行い、得られたそれぞれの質量分析の結果を、一次イオンのパルス照射の非連続的パターンに基づいて再構成して画像化する請求項４の分析方法。
【請求項６】
非連続的パターンがランダムなパターンである請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
非連続的パターンが特定のプログラムされたパターンである請求項６の分析方法。
【請求項８】
ハロゲン原子がフッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子のいずれか１種である請求項１から７のいずれかに記載の分析方法。
【請求項９】
前記標的物質が標的核酸である請求項１〜８のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１０】
ハロゲン原子の既定の数が１から前記標的核酸のヌクレオチド数までのいずれかである請求項９に記載の分析方法。
【請求項１１】
ハロゲン原子の既定の数が１から５個である請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
ハロゲン原子が標的核酸のヌクレオチドの塩基に結合している請求項１から１１のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１３】
前記ハロゲン原子が標的核酸の、前記プローブが前記標的核酸とハイブリッドを形成する際に、該ハイブリッド形成を阻害しない位置に結合している請求項１２の分析方法。
【請求項１４】
前記ハロゲン原子がピリミジン塩基の５位またはプリン塩基の８位に結合している請求項１３の分析方法。
【請求項１５】
標的核酸が合成ＤＮＡであり、ハロゲン原子の該合成ＤＮＡへの導入を、該合成ＤＮＡをＤＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニットである２’‐デオキシリボヌクレオシド‐３’‐フォスフォロアミダイトを用いて行う請求項１４の分析方法。
【請求項１６】
前記ハロゲン原子を結合した合成ユニットが以下の構造式で示されるものである請求項１４のＤＮＡチップの分析方法。
【化１】
2004033038.tif 000010
（上記各式において、Ｘはハロゲン原子を、ＤＭＴＯはジメトキシトリチル基を、ｉＰｒはイソプロピル基を、ＣＮＥｔは２‐シアノエチルを表す。）
【請求項１７】
前記標的核酸が合成ＲＮＡであり、ハロゲン原子の該ＲＮＡへの導入を、該ＲＮＡをＲＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、リボヌクレオシド‐３’‐フォスフォロアミダイトを用いて行う請求項１４に記載の分析方法。
【請求項１８】
標的核酸が合成ＰＮＡであり、ハロゲン原子の該ＰＮＡへの導入を、該ＰＮＡをＰＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、核酸塩基結合ペプチドアナログを用いて行う請求項１４に記載の分析方法。
【請求項１９】
標的核酸がｃＤＮＡであり、ハロゲン原子の該ｃＤＮＡへの導入を、該ｃＤＮＡを逆転写酵素を用いて伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した２’‐デオキシリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いて行う請求項１４に記載の分析方法。
【請求項２０】
標的核酸がゲノムＤＮＡから誘導されたＤＮＡであり、ハロゲン原子の該ＤＮＡへの導入を、該ＤＮＡをＤＮＡポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した２’‐デオキシリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いて行う請求項１４の分析方法。
【請求項２１】
標的核酸がｃＲＮＡであり、ハロゲン原子の該ｃＲＮＡへの導入を、が該ｃＲＮＡをＲＮＡポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合したリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いて行う請求項１４の分析方法。
【請求項２２】
核酸チップ上の核酸プローブがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）のいずれかである請求項１から２１のいずれかに記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の核酸プローブが担体上にマトリクス状に配置されたプローブ担体に試料を反応させて得られる分析用試料の飛行時間型二次イオン質量分析法を用いた分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップ等の核酸チップはゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの目的に利用されるようななってきており、また、それらの解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
【０００３】
核酸チップの作製方法にはいくつかの方法が知られている。ＤＮＡチップを例にとって説明すると、基板上にフォトリソグラフィーを用いてＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第５４０５７８３公報等）、あるいは、あらかじめ合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を基板上に供給し結合する方法（米国特許第５６０１９８０公報、特開平１１‐１８７９００号公報、Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２７０，　４６７，　１９９５等）が代表的なＤＮＡチップの作製法である。
【０００４】
一般的には、これらいずれかの方法によって核酸チップが作製され、このチップと、検出を目的とする核酸、いわゆる、標的核酸を含有する溶液とをハイブリダイゼーション条件においた後に、核酸チップ上の核酸プローブと標的核酸のハイブリッド形成の有無を何らかの手段によって検出することによって所望の目的が達成される。
【０００５】
その際、解析の信頼性、すなわち、定量性、再現性を保証するためには各マトリクスに存在するハイブリッドの量、つまり、密度を知ることが重要である。また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するかを知ること（イメージング）も、やはり、定量性、再現性の確保といった見地から重要である。さらに、特に後述するように、チップ作製のための基板に、マトリクスの位置を示すための物理的アドレスが存在しない場合に、例えば、インクジェット法によってプローブ溶液を微小な液滴として供給するような手法でチップを作製すると、物理的アドレスがないので、検出の手段によっては、チップのどの部分を分析しているのかわからないという問題をかかえることになる。そのような場合は、採用している検出手段そのものによるマトリクス位置の顕影化が必要になる。
【０００６】
これらの高感度な表面解析技術としては標的核酸をアイソトープラベルする方法が知られてはいるが、手法が煩雑、危険、特殊な施設、装置が必要等の理由で一般的ではない場合が多い。
【０００７】
別の方法としては標的核酸を蛍光標識する方法、すなわち、蛍光ハイブリダイゼーション法が考えられ、実際に一般的に用いられているが、蛍光色素の安定性、クエンチング、蛍光色素の基板表面への非特異的吸着等の問題があり、ハイブリッド体の定量的な把握には課題が残る場合がある。
【０００８】
他に、一般的な高感度表面分析手段としてはＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光）法を用いたＡＴＲ法、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）法等があるが、いずれも核酸チップ上でハイブリッド体の定量的分析、あるいは、イメージングには十分な感度を有しているとはいえない。特に、核酸チップの基板として一般的なガラスを用いる場合には、例えばＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）ではガラスに起因する吸収の影響、ＸＰＳではチャージアップの影響等があり、有効な分析手段とはいえない場合がある。
【０００９】
また、別の高感度表面分析手段としては、レーザー共鳴イオン化法（ＲＩＳ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によるＤＮＡの検出方法が米国特許第５８２１０６０公報に開示されている。これは試料表面から放出される注目元素のイオン化エネルギーに相当する波長のレーザービームを照射して当該元素をイオン化し検出するもので、試料表面から元素を放出させる手段としては、レーザービームを用いる方式、イオンを用いる方式が開示されているが、特定元素の検出しかできないという問題を持つ。
【００１０】
さらに他の高感度表面分析手段としては、動的二次イオン質量分析法（ｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ）があるが、この手法は二次イオンが生成する過程で有機化合物が小さいフラグメントイオン、または粒子にまで分解してしまうために質量スペクトルから得られる化学構造情報が乏しくなり、例えば、核酸関連物質のような有機物の分析には適していない。
【００１１】
これに対して、同じく二次イオン質量分析法の一手法として知られている、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法は、固体試料の最表面にどのような原子または分子が存在するかを調べるための分析方法であり、以下の様な特長を持つ。すなわち、１０９ａｔｏｍｓ／ｃｍ２（最表面１原子層の１／１０５に相当する量）の極微量成分の検出能があること、有機物、無機物のどちらにも適用できること、表面に存在するすべての元素や化合物を測定できること、試料表面に存在する物質からの二次イオンのイメージングが可能なことである。
【００１２】
以下、この方法の原理を簡単に説明する。高真空中で、高速のイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射すると、スパッタリング現象によって表面の構成成分が真空中に放出される。このとき発生する正または負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を電場によって一方向に収束し、一定距離だけ離れた位置で検出する。スパッタの際には、試料表面の組成に応じて様々な質量をもった二次イオンが発生するが、軽いイオンほど早く、反対に重いイオンほど遅い速度で飛行するため、二次イオンが発生してから検出されるまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。
【００１３】
従来のｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳでは、すでに述べたように、イオン化の際に有機化合物が小さいフラグメントイオンまたは粒子にまで分解してしまうため、質量スペクトルから得られる化学構造情報が乏しいのに対し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは一次イオン照射量が著しく少ないため、有機化合物は化学構造を保った状態でイオン化され、質量スペクトルから有機化合物の構造を知ることができる。固体試料表面の最も外側で発生した二次イオンのみが、真空中へ放出されるので、試料の最表面　（深さ数Å程度）の情報を得ることができる。
【００１４】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置には大きく分けてセクター型とリフレクトロン型のふたつのタイプがある。これらの方法の違いのひとつは被分析試料を固定するホルダの電気的な接地方法である。セクター型では装置の機構上、上記ホルダに数ｋＶの正または負の電圧を印加することで二次イオンを質量分析計に導いているのに対し、リフレクトロン型ではホルダは接地され、二次イオン引き出し電極に数ｋＶから数１０ｋＶの正または負の電圧を印加することで二次イオンを質量分析計に導いている。
【００１５】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では正の一次イオンが多用されるが、一次イオンの極性にかかわらず正の二次イオンと負の二次イオンが発生する。また、一次イオンの極性にかかわらず、一般的な測定条件では一次イオンの照射により二次電子が発生し、この二次電子の発生量が一次イオン量に比べて多量であるために、結果として被分析試料の表面は正に帯電し易く、この帯電電荷が過剰になると（いわゆるチャージアップ状態）測定に支障をきたすことになる。その際、装置構成を考えると、セクター型装置を用いて絶縁物の負の二次イオンを測定する場合に最も大きく正に帯電し得るといえる（発生した二次電子がすべて、上記の正電圧を印加した二次イオン引き出し電極に向かってしまうため）。
【００１６】
上記の正帯電を中和するため、セクター型、リフレクトロン型の両タイプとも帯電中和用のパルス型電子銃を装備することが多い。この電子銃による具体的な帯電中和方法とは、一次イオン（サブ〜数ｎｓｅｃパルス）照射、正または負の二次イオンの飛行時間計測の後、次の一次イオンパルスを照射するまでの間に、上記パルス型電子銃からの電子線を被分析試料に一定時間照射する、というものである。なお、上記電子線を被分析試料に照射する間は、セクタ型ーにおける試料ホルダへの電圧印加、および、リフレクトロン型における二次イオン引き出し電極への電圧印加はともに停止され、接地される。
【００１７】
この方法により、上記の正帯電は緩和され（若しくは解消し）、絶縁物の分析が可能となることが多いが、上記の説明と同様、セクタ型ー装置を使った絶縁物の測定で、負の二次イオンを測定する場合が最も大きく正に帯電し易いため、帯電中和のマージンはこの場合が最も狭い。いずれにしても、チャージアップを回避するには、試料ホルダが電気的に接地されているリフレクトロン型の装置を使う方が、セクター型装置を使うよりも（一般的には）有利である。特に被分析試料の導電率が低い場合（抵抗率が高い、もしくは、誘電率が高いと言い換えることができる）、例えば、ガラス等の場合にはリルレクトロン型の方が測定に適しているといえる。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
さて、リフレクトロン型であれ、セクター型であれ、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法はきわめて感度の高い分析方法であるために、チャージアップの影響が少ない、例えば、金基板上に単分子膜レベルで形成されたオリゴヌクレオチドを分析することが可能である（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　１２ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　９５１，　１９９９）。上記文献には、基板に固定化されたＤＮＡ、および、ＰＮＡのＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による分析結果が記載されており、それによれば、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によって検出されるフラグメントイオンとして、ＤＮＡプローブの場合にはリン酸バックボーン由来のＰＯ２−、とＰＯ３−イオン、塩基由来の（チミン−Ｈ）−イオンが、また、ＰＮＡプローブの場合には、やはり（チミン−Ｈ）−イオンがあげられている。
【００１９】
しかしながら、上述のＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を検出手段として、一般的に用いられている方法であるＤＮＡチップを標的用いてＤＮＡを検出することにより、所望の遺伝子情報を得ようとすると、
（１）ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法は表面近傍のごく薄い層のみが検出されること、
（２）プローブＤＮＡと標的ＤＮＡから生起するフラグメントイオン種が同一である、というふたつの理由により標的ＤＮＡのハイブリッドの有無を特異的に検出できないという問題を生ずることになる。
【００２０】
このような問題点を解決する手段としてＰＮＡ（ペプチド核酸）を固相に結合してプローブとし標的核酸とハイブリッドを形成させる方法がある（Ｊ．　Ｃ．　Ｆｅｌｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ：ＳＩＭＳ　ＸＩＩＩ国際会議；２００１年１１月１１日〜１６日、奈良）。この方法によれば、ペプチド核酸は塩基部分はＤＮＡと同じではあるが、リン酸バックボーンを持たないので、リン酸バックボーンによるフラグメントイオンが検出されれば、ＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリッド形成が確認されることになる。
【００２１】
しかしながら、ペプチド核酸は価格が高いため、ペプチド核酸をプローブとしたチップを用いる遺伝子情報の取得は高コストとなり実用的とはいえず、従来技術にはない、検出効率と定量的な検出が可能なフラグメントイオンを供出可能な標的核酸の標識方法が望まれていた。
【００２２】
このようなフラグメントイオンの供出方法として、特開昭６１‐１１６６５号公報には電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、高速ゲルろ過法により分子量分離した核酸断片に、Ｓ、Ｂｒ、Ｉ、等の非金属元素、または、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｈｇ等の金属元素を導入して、これらの元素を原子吸光分析法、プラズマ発行分析法、または、質量分析法によって同定する手段を設けた核酸塩基検出装置に関する記載があるが、質量分析装置に関する具体的な記載、また、特にハロゲン原子の核酸への導入方法に関しての記載はない。
【００２３】
一方、チップ上の核酸ハイブリッドの量的把握を別の観点からみると、実際に核酸プローブ領域として形成されているマトリクスそのものを分析する必要があるが、特開平１１−１８７９００号公報にひとつの例として記載されているＤＮＡチップの作製方法である、あらかじめ合成されたＤＮＡプローブの溶液をインクジェット法で基板表面へ吐出、結合せしめる場合、基板上でマトリクス（吐出されたＤＮＡが結合されたスポット）の位置を知る手段がない場合があり、そのような場合にはＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によって、スポットでのハイブリッド体をイメージングして、イメージングされたスポットにおけるフラグメントイオンの分析が為されることが望ましい。しかしながら、上記、特平１１−１８７９００号公報にはそのような記載がなく、また、特開昭６１‐１１６６５号公報には上述のように、質量分析法には言及があるが、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法にチップ上でのハイブリッドのイメージング方法と標的核酸の量的分析に関しては全く記載されていない。
【００２４】
さて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により核酸チップのイメージングと、核酸チップ上の核酸の量的分析を行おうとした際、スポットのサイズ、あるいは、検出の効率等を勘案すると、イメージングされるエリアの面積は、例えば、３００μｍ×３００μｍ以上が望ましいが、ＤＮＡチップの作製のための基板として、よく用いられるガラス等の比較的抵抗率の高い基板を用いて、３００μｍ×３００μｍの範囲を、一次イオンビーム直径を必要な解像度を得るための５μｍで、テレビの受像機のように一定の方向にビームを順次スキャン（ラスタースキャン）し、画像を得ようとすると、チャージアップの影響が大きく、良好な画像を得ることができないことになる。
【００２５】
本発明の目的は、プローブ担体に試料を反応させた測定用試料に形成された核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド体の形成の有無を、固定化した核酸プローブの状態、例えば、配置位置のイメージングやその量的分析を正確に行うことができる測定用試料の分析方法を提供することにある。
【００２６】
もっとも、本発明の方法は、互いに相手を認識して複合体を形成する物質であって、一方が担体に固定化され、他方にハロゲン原子が標識として導入可能なものであれば適用可能である。そのような物質の例としては、抗原、抗体、酵素等のタンパク質、また酵素と特異的に結合する基質等をあげることができる。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記、ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いて、比較的抵抗率の高い担体上の比較的面積の大きな部分での核酸プローブと標的核酸のハイブリッドのイメージングと、量的把握を行う際の課題を検討して結果、以下の発明を為すに至った。
【００２８】
本発明の測定用試料の分析方法は、プローブの固定化領域の多数が担体上に各々が独立してマトリクス状に配置されたプローブ担体に、試料を反応させて得られた分析用試料を分析する方法において、
標的物質がハロゲン原子で標識され、前記プローブと前記標的物質の結合体の形成の有無を、該ハロゲン原子を飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）によって測定することにより検出ことを特徴とする分析用試料の分析方法である。
【００２９】
本発明によれば、プローブ担体に試料を反応させた測定用試料に形成されたプローブと標的物質との結合体（核酸の場合は、核酸プローブと標的物質とのハイブリッド体）の形成の有無を、固定化したプローブの状態で、例えば、その配置位置のイメージングやその量的分析を正確に行うことができる測定用試料の分析方法を提供することができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いてハイブリッド体のイメージングと分析を行うにあたり、標的物質を、好ましくは既定の数のハロゲン原子で標識し、ハロゲン原子のフラグメントイオンをＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によって検出、分析することにより上記の目的を達成するものである。
【００３１】
ハロゲン原子はイオン化効率が比較的高いので、そのフラグメントイオンを用いての検出の感度の向上が期待できるとともに、一次イオン強度を低減することによりチャージアップの影響も、その分排除でき、後述する方法と合わせて、抵抗率の高い基板上での大面積のイメージングが可能となる。
【００３２】
また、既定の数のハロゲン原子で標識することにより、核酸に対して適用する場合には、上述した核酸固有のフラグメントイオンのみを検出する場合の問題点を解決し、より定量性の高い分析が可能となる。
【００３３】
担体上に固定されるプローブは、特定の標的物質を認識してこれと結合体を形成し得るものであり、核酸の場合は、核酸プローブが相補配列を有することにより標的核酸に対して特異的に結合可能なものである。担体への核酸プローブの固定化には公知の方法が利用でき、担体上に固定化されるプローブの一例としては、標的核酸とハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドなどからなる核酸プローブの一部に必要に応じてリンカーを介して担体との結合部を有するもので、担体との結合部において担体表面に連結された構造を有するものを挙げることができる。なお、このような構成の場合における担体と結合部の核酸プローブの分子内での位置は、所望とするハイブリダイゼーション反応を損なわない範囲内において特に限定されない。
【００３４】
本発明におけるプローブ担体は、プローブを固定化した独立領域、例えばドット状スポットの多数を所定の間隔をおいてマトリクス状などの配置で配列したもので、この形態には、プローブ・アレイ、マイクロチップ、核酸チップなどが含まれる。
【００３５】
一方、プローブは担体表面に結合可能な構造を有しており、担体上へのプローブの固定がこの結合可能な構造を介して行われていることが望ましい。その際、プローブが有する担体表面に結合可能な構造は、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、酸ハライド化物（ハロホルミル基；−ＣＯＸ）、ハライド化物（−Ｘ）、アジリジン、マレイミド基、スクシイミド基、イソチオシアネート基、スルフォニルクロリド基（−ＳＯ２Ｃｌ）、アルデヒド基（ホルミル基；−ＣＨＯ）、ヒドラジン及びヨウ化アセトアミドなどの有機官能基の少なくとも１種を導入する処理により形成されたものであることが好ましい。また、プローブ側の担体への結合に必要な構造に応じて、担体の表面に必要とされる処理、例えばチオール基用のマレイミド基、アミノ基用のエポキシ基、アルデヒド基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基などを担体表面に形成する処理を施すことで共有結合によるプローブの固定が可能となる。なお、プローブは安定性を考えると、基板表面に共有結合によって結合されていることが望ましい。
【００３６】
プローブと標的物質との組合せとしては、核酸プローブと標的核酸との組合せや、抗原、抗体、酵素等のタンパク質、また酵素と特異的に結合する基質等から選択される結合体を形成し得る組合せをあげることができる。
【００３７】
本発明で用いる核酸プローブは特に限定されるものではないが、標的核酸を認識し得るものであればよいが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）のいずれかであることが望ましく、これらの少なくとも１種からなる核酸プローブを担体に固定化することができる。
【００３８】
本発明で用いる標的核酸としては、後述のハロゲン原子による標識方法を勘案するとＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）のいずれかであることが望ましく、これらの少なくとも１種からなる標的核酸を含む試料を分析対象とすることができる。標的核酸としては合成の核酸でも動物、人、植物、微生物などの天然由来のものでもよい。
【００３９】
本発明では測定用試料（試料と反応させた後に必要な処理を行ったプローブ担体：以下代表として主に「核酸チップ」で説明する）のイメージング方法として、一次イオンを、核酸チップ表面の特定の面積を有する部分に対して、該面積に対して相対的に小さな面積を有するスポットとしてパルス的に順次照射して、該パルス照射によって発生する二次イオンを、それぞれのパルス照射ごとに飛行時間的に質量分析する方法を用いるが、その際、チャージアップの影響を排除する方法として、一次イオンのパルス照射を、非連続的パターンに基づいて行い、得られたそれぞれの質量分析の結果を、一次パルス非連続の照射のパターンに基づいて再構成して画像化することが極めて有効で望ましい形態である。
【００４０】
その場合、非連続的パターンとして、ランダムなパターン、あるいは、特定のプログラムに従った非連続的なパターンを例としてあげることができる。
【００４１】
連続パターンと非連続パターンを簡単なモデルで説明すると、以下のようになる。
【００４２】
図２に、照射における連続的パターン（１）と非連続パターン（２）の例を示す。この場合、例えば、矩形のエリアを５×５個のスポットで一次イオンパルスを照射するとすると、図２の（１）のように、ひとつのスポットから隣接するスポットに順次全てのスポットを照射するパターンが連続的パターンであり、ひとつのスポットを照射し、次ぎに、すくなくとも隣接しないスポットを順次、全てのスポットを照射する図（２）パターンが非連続的パターンである。
【００４３】
非連続的パターンを乱数に基づいてランダムに形成することも場合によっては可能であるが、その場合には隣接したスポットを連続して照射する可能性もあるので、そのような場合にはあらかじめ、望ましい特定のプログラムにしたがった非連続パターンを形成しておけば良い。望ましいパターンとしては、上述のように、隣接したスポットを連続して照射しない、あるいは、隣接した行、列に存在するスポットを連続して照射しないなどのアルゴリズムが適宜採用できる。
【００４４】
この場合、例えば、矩形のエリアを５×５個のスポットで一次イオンパルスを照射するとすると、上左図のように、ひとつのスポットから隣接するスポットに順次全てのスポットを照射するパターンが連続的パターンであり、ひとつのスポットを照射し、次ぎに、すくなくとも隣接しないスポットを順次、全てのスポットを照射する上右図パターンが非連続的パターンである。
【００４５】
非連続的パターンを乱数に基づいてランダムに形成することも場合によっては可能であるが、その場合には隣接したスポットを連続して照射する可能性もあるので、そのような場合にはあらかじめ、望ましい特定のプログラムにしたがった非連続パターンを形成しておけば良い。望ましいパターンとしては、上述のように、隣接したスポットを連続して照射しない、あるいは、隣接した行、列に存在するスポットを連続して照射しないなどのアルゴリズムが適宜採用できる。
【００４６】
ハロゲン原子の標識の数に関しては特に限定されず、標識の位置、標識方法も、それが可能であり、後のプローブと標的物質との結合体の形成（核酸の場合はハイブリッド体の形成（ハイブリダイゼーション））を阻害しければ、いかような方法も可能であるが、実際には、ひとつのヌクレオチドに対し一個所の標識が現実的であり、その意味では、ハロゲン原子の既定の数は１から上記標的核酸のヌクレオチド数までのいずれかであることが望ましく、核酸が合成オリゴヌクレオチドの場合には、標識の手間、コスト、また、ハロゲン原子のイオン化効率の高さ等を勘案して１から５個であれば、さらに望ましいといえる。また、ＰＣＲ法のように酵素伸長反応を用いて標識の導入を図ろうとする場合、標識が蛍光色素のように比較的大きな場合には立体障害等により標識導入数に限りがあるが、標識がハロゲン原子であれば、例えば、一種類の塩基（例えばアデニン）を全て標識することが可能であるので、標識数を定量的に把握できるとともに、感度、標識導入方法の点からも望ましいといえる。
【００４７】
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子を挙げることができ、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法ではフッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子の各フラグメントイオンが検出可能である。これらの４種のハロゲン原子は、例えば以下に記載される方法により核酸プローブに導入可能である。
【００４８】
プローブ担体の各マトリクスの標的物質である核酸を、それぞれ別のハロゲン原子によって標識しても良い。
【００４９】
なお、標的物質の含有が未知である試料については、試料に対してハロゲン原子による標識処理を行って、これをプローブと反応させることで、試料中にプローブが認識し得る標的物質が存在する場合、これらの結合体が形成されるので、この結合体を標識したハロゲン原子を用いて検出することが可能となる。
【００５０】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法ではフッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子の各フラグメントイオンが検出可能であり、また、後述の方法によれば、標的核酸にも、上記４種のハロゲン原子を導入可能なので、本発明には、これらのハロゲン原子が利用できる。
【００５１】
ハロゲン原子の標的核酸への導入方法についても、特に限定されないが、よく知られている例としては、ハロゲン原子を標的核酸のヌクレオチドの塩基に結合させる方法をあげることができ、本発明でも、この方法を好適に用いることができる。その際、ハロゲン原子が標的核酸の、該標的核酸が核酸プローブとハイブリッドを形成する際に、該ハイブリッド形成を阻害しない位置に結合していることが望ましい。そのような位置は、ピリミジン塩基の５位、プリン塩基の８位である。ただし、標的核酸の全てのヌクレオチド塩基のハロゲン原子がこの位置に結合していることは必ずしも必須ではない。
【００５２】
ハロゲン原子の標的核酸へのより具体的な方法としては、標的核酸が合成ＤＮＡの場合、ＤＮＡをＤＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、以下に構造式で示す２’‐デオキシリボヌクレオシド‐３’‐フォスフォロアミダイトを用いる方法を例としてあげることができる。
【００５３】
【化２】
2004033038.tif 000002
（上記各式において、Ｘはハロゲン原子を、ＤＭＴＯはジメトキシトリチル基を、ｉＰｒはイソプロピル基を、ＣＮＥｔは２‐シアノエチルを表す。）
また、核酸プローブが合成ＲＮＡの場合には、ＲＮＡをＲＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、リボヌクレオシド‐３’‐フォスフォロアミダイトを用いればよく、そのような合成ユニットの例として、以下に構造式の化合物をあげることができる。
【００５４】
【化３】
2004033038.tif 000003
（上記式において、Ｘはハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）を、ＤＭＴＯはジメトキシトリチルを、ｉＰｒはイソプロピルを、ＣＮＥｔは２‐シアノエチルを、Ｍｅはメチルを、ＴＢＤＭＳはｔ−ブチルジメトキシシリルをそれぞれ表す。）
さらに、核酸プローブが合成ＰＮＡの場合では、ＰＮＡをＰＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、核酸塩基結合ペプチドアナログを用いれば好適である。
【００５５】
また、標的核酸がｃＤＮＡの場合には、ｃＤＮＡを逆転写酵素によって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した２’‐デオキシリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いる方法がハロゲン原子導入法の例としてあげることができる。
【００５６】
標的核酸がゲノムＤＮＡから誘導されたＤＮＡの場合には、ハロゲン原子の該ＤＮＡへの導入が該ＤＮＡをＤＮＡポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した２’‐デオキシリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いる方法を例としてあげることができ、標的核酸がｃＲＮＡの場合には、ハロゲン原子の該ｃＲＮＡへの導入が該ｃＲＮＡをＲＮＡポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合したリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いて行うことができる。
【００５７】
上記の各伸展反応にはＰＣＲ反応、またはＲＴ‐ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）反応を用いることも可能である。
【００５８】
本発明で用いる核酸チップの核酸プローブ種は特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド等を用いることができる。
【００５９】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。
【００６０】
実施例１　（核酸プローブチップの作製）
特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法に準じて核酸プローブチップを作製した。
【００６１】
（１）基板洗浄
２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、そのまま次工程に供した。
【００６２】
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン　ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液に上記（１）で得た基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
【００６３】
次いでＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った石英基板をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のスクシイミド基を反応させた。この段階で基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
【００６４】
（３）プローブＤＮＡの合成
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して配列番号：１の一本鎖核酸（ｄＴの４０量体）を合成した。なお配列番号：１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
【００６５】
配列番号：１
５’　ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　　３’
【００６６】
（４）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
上記配列番号：１の一本鎖ＤＮＡを８μＭの濃度でグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及び、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液に溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キヤノン）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン）を数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドを上記石英基板上へ吐出可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に上記ＤＮＡ溶液を数１００μｌ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板を装着して、ここにスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は４ｐｌ／ｄｒｏｐｌｅｔで、スポッティングの範囲は基板の中央部に１０ｍｍ×１０ｍｍの範囲に２００ｄｐｉすなわち１２７μｍのピッチで吐出した。この条件ではスポッティングされたドットの直径は約５０μｍであった。
【００６７】
スポッティング終了後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を純水で洗浄し、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０、以下溶液Ａ）中で保存した。
【００６８】
実施例２（ハイブリダイゼーション、および、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによるイメージング、分析）
（１）モデル標的核酸の合成
配列番号：２
５’　Ａ（Ｂｒ）Ａ（Ｂｒ）Ａ（Ｂｒ）Ａ（Ｂｒ）Ａ（Ｂｒ）ＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　　３’
【００６９】
【化４】
2004033038.tif 000004
【００７０】
あらかじめ５個の臭素原子で修飾したモデル標識核酸（配列番号：２、ｄＡの４０量体）を合成した（ベックス）。５’側の５個のヌクレオチドは上図に構造をしめした、８−ブロモ‐３’‐デオキシアデノシンフォスフォロアミダイトを用いて、自動合成機での合成時に導入した。脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。なお、配列中のＡ（Ｂｒ）が臭素標識デオキシアデノシンをしめしている。また、標識位置であるアデニンの８位はハイブリダイゼーションを阻害しない位置であることが知られている。
【００７１】
（２）ブロッキング、および、ハイブリダイゼーション
実施例１で作製したチップを２％牛胸腺アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液Ａ中に室温下、３時間浸漬し、チップ表面をブロッキング（核酸等の非特異的吸着を目的とする）した後、上記配列番号：２のモデル標的核酸を５０ｎＭの濃度で溶解した溶液Ａに浸漬し、４５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行った。次いで、純水（室温）でリンスした後、窒素ガスを吹き付けて乾燥し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳの分析まで真空デシケーター中で保存した。
【００７２】
（３）ＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析
ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップのイメージング、および、分析をＩＯＮ　ＴＯＦ社製ＴＯＦ−ＳＩＭＳ　ＩＶを用いて行った。
【００７３】
以下に装置条件をまとめた。
＜一次イオン＞
一次イオン：２５ｋＶ　Ｇａ＋、ランダムスキャンモード
一次イオンのパルス周波数：２．５ｋＨｚ（４００μｓｅｃ　／　ｓｈｏｔ）
一次イオンパルス幅：１ｎｓ
一次イオンビーム直径：５μｍ
＜二次イオン＞一次イオンの照射パターンについて再構成しイメージング
二次イオン検出モード：ｎｅｇａｔｉｖｅ
測定領域：３００μｍ×３００μｍ
二次イオンｉｍａｇｅのｐｉｘｅｌ数：１２８×１２８
積算回数：２５６
【００７４】
（４）結果
図１に（２）でハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをＴＯＦ−ＳＩＭＳ　ＩＶ型装置で上記条件に基づき分析し、得られたデータから臭素イオンについてイメージングを行った結果を示す。図１−１、１−２は、それぞれ、７９Ｂｒ−イオン、８１Ｂｒ−イオンに由来するものである。
【００７５】
【表１】
2004033038.tif 000005
表１は図１から各１個のスポットのカウント数を示したものである。図１、および、表１からＤＮＡチップ上で核酸プローブとハイブリッドを形成した臭素標識標的ＤＮＡのスポットの標識物質である臭素によるイメージングと、量的な把握が可能であることがわかる。
【００７６】
実施例３　　（ゲノム由来の臭素標識標的ＤＮＡのイメージング、分析）
（１）ゲノム由来の標的ＤＮＡ検出用核酸チップの作製
Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．　１８，　４３８，　２０００にはヒト口腔扁平上皮癌のふたつのセルライン、ＨＳＣ４とＨＳＣ５のゲノムＤＮＡのエキソン７の変異を検出するためのオリゴヌクレオチドチップの作製と、このチップを用いての、上記エキソンから誘導された蛍光標識ＤＮＡの検出に関して記載されている。
【００７７】
本実施例では上記方法に準じて、オリゴヌクレオチドチップを作製し、標識を蛍光から臭素に替えてＤＮＡを合成し、さらに、このＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行った。
【００７８】
以下に具体的な手順について述べる。
・ＤＮＡプローブの合成とチップの作製
配列番号：３
５’　ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ　　３’
【００７９】
上記ＨＳＣ４のエキソン７の塩基配列の一部（コドンＮｏ．２４８を含む部分）に相補的な塩基配列を有し、５’末端に基板への結合のためのチオール基を担持した、配列番号：３のＤＮＡを実施例１と同様に合成し、また、このＤＮＡを用いて実施例１と同様にしてＤＮＡチップを作製した。
【００８０】
（２）ゲノム由来の臭素標識ＤＮＡの合成
配列番号：４
Ｅ７Ｓ　：　５’　−　ＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＧＣＣＴ−　３’　（ｅｘｏｎ　７，　ｓｅｎｓｅ）
配列番号：５
Ｅ７Ａ　：　５’　−　ＴＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＣ−　３’　（ｅｘｏｎ　７，　ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）
【００８１】
【化５】
2004033038.tif 000006
【００８２】
まず、配列番号：４、５のＰＣＲプライマー（ＨＳＣ４、ＨＳＣ５に共通：ベックスに合成依頼）を用いて、ＨＳＣ４のゲノムからエキソン７の部分をＰＣＲ反応で合成した。すなわち、２０ｎｇのゲノムＤＮＡと各０．４μＭのセンス、アンチセンスプライマーを含む５０μｌのＰＣＲミクスチャーを９４℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４５ｓｅｃ）のサイクルを４０回繰り返してＰＣＲ増幅を行った。得られる鎖長は１７１ヌクレオチドと設計されている。
【００８３】
次に、上記増幅産物の一部を鋳型として、０．２μＭのセンスプライマー（配列番号：４）と、上図に構造を示した臭素標識ヌクレオチドの一種である、５‐ブロモ‐２’‐デオキシウリジン三リン酸（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を１０μＭで用いてｓｓＰＣＲ（一本鎖ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲサイクルは９６℃（３０ｓｅｃ）、５０℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４ｍｉｎ）、２５サイクルである。なお、得られた臭素標識一本鎖ＤＮＡはゲルろ過によって精製した。
【００８４】
（３）ブロッキング、および、ハイブリダイゼーション
（１）で作製したチップを実施例１と同様な方法よりブロッキングした後、純水でリンスし、以下のハイブリダイゼーションに用いた。（２）で合成したゲノム由来のＤＮＡ　を１０ｎＭの濃度で溶解した、２０％ホルムアミドを含む６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ　ＮａＣｌ、６０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ　ＥＤＴＡ）中にブロッキングをほどこしたチップを浸漬し、８０℃で１０ｍｉｎ加熱し、ついで、４５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行ない、その後、２×ＳＳＰＥを用いて５５℃で洗いの操作を加えた。つぎに、純水（室温）で軽くリンスし、窒素ガスを吹き付けて乾燥した後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析まで真空デシケーター中で保存した。
【００８５】
（４）ＴＯＦ−ＳＩＭＳによるイメージング、分析
実施例２と同様な条件でハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップのＴＯＦ−ＳＩＭＳでのイメージング、および、分析を行った。
数値データのみを表２に示した。
【００８６】
【表２】
2004033038.tif 000007
表２からゲノムから誘導し、かつ、臭素ラベルをほどこした標的ＤＮＡの、ＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションがＴＯＦ−ＳＩＭＳよって量的に把握が可能であることがわかる。
【００８７】
なお、本実施例とほぼ同様の方法によりｍＲＮＡから誘導したｃＤＮＡのハロゲン原子による標識とＴＯＦ−ＳＩＭＳによるイメージング、および、分析も可能である。
【００８８】
【発明の効果】
本発明により、飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて、核酸チップ上でハイブリッドを形成したハロゲン標識標的核酸のハロゲン原子を分析することにより、標的核酸のイメージングを行うと同時に、量的把握が可能となった。
【００８９】
【配列表】
2004033038.tif 000008
2004033038.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２のイメージング結果を示す図であり、（１−１）は配列番号：１、７９Ｂｒ−イオンでの結果を、（１−２）は配列番号：１、８１Ｂｒ−イオンでの結果をそれぞれ示す。
【図２】イメージング用の一次イオン照射におけるスポットの連続照射（１）と非連続照射（２）について説明するための図であり、（２）における番号は照射スポットの照射順を示す。
【図１】
2004033038.tif 000011
【図２】
2004033038.tif 000012