(57)【要約】【課題】女性における高血圧症または低血圧症の遺伝子診断法の提供。【解決手段】マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、Ａｌａ２０Ｖａｌ多型におけるアラニンをコードするコドンを、女性における高血圧症のリスクファクターとして使用する。さらに、Ｃ（−１５６２）Ｔ多型におけるＴアレルおよびＡｒｇ６６８Ｇｌｎ多型におけるグルタミンをコードするコドンを、女性における低血圧症のリスクファクターとして使用する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子において、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第２０番目のアミノ酸残基をコードするコドンがアラニン残基をコードするコドンであることを同定しうる、女性における高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、
配列番号３で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号３中の第２０番目のアラニン残基をコードするコドンを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドの、配列番号３中の第２０番目のアラニン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子において、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第２０番目のアミノ酸残基をコードするコドンがアラニン残基をコードするコドンであることを同定しうる、女性における高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、
配列番号３で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、配列番号３中の第２０番目のアラニン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項６に記載のプライマーペア。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項６に記載のプライマーペア。
【請求項９】
マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子中のヌクレオチドを同定することにより、女性における高血圧症を予知または検出する方法であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項６〜８のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子において、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第２０番目のアミノ酸残基をコードするコドンがアラニン残基をコードするコドンであることを同定する工程を含んでなる、方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項６〜８のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、女性における高血圧症の予測または診断用キット。
【請求項１１】
マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、
前記変異を有してなるマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において第７７１番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、
前記変異を有してなるマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において第７７１番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１５に記載のプライマーペア。
【請求項１７】
マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の変異を検出することにより、女性における低血圧症を予知または検出する方法であって、
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項１５もしくは１６に記載のプライマーペアを用いて、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項１８】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項１５もしくは１６に記載のプライマーペアを含んでなる、女性における低血圧症の予測または診断用キット。
【請求項１９】
マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第６６８番目のアルギニン残基をコードするコドンのグルタミン残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、
配列番号３で表わされるアミノ酸配列において第６６８番目のアルギニン残基がグルタミン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において第７９０６番目のグアニン残基（Ｇ）がアデニン残基（Ａ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２で表わされるヌクレオチド配列において第２０２２番目のグアニン残基（Ｇ）がアデニン残基（Ａ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号３中の第６６８番目のアルギニン残基に対応するグルタミン残基をコードするコドンを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドの、配列番号３中の第６６８番目のアルギニン残基に対応するグルタミン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２４】
マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第６６８番目のアルギニン残基をコードするコドンのグルタミン残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、
配列番号３で表わされるアミノ酸配列において第６６８番目のアルギニン残基がグルタミン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記グルタミン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において第７９０６番目のグアニン残基（Ｇ）がアデニン残基（Ａ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項２４に記載のプライマーペア。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２で表わされるヌクレオチド配列において第２０２２番目のグアニン残基（Ｇ）がアデニン残基（Ａ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項２４に記載のプライマーペア。
【請求項２７】
マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子中の変異を検出することにより、女性における低血圧症を予知または検出する方法であって、
請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第６６８番目のアルギニン残基をコードするコドンのグルタミン残基をコードするコドンへの変異を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項２８】
請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、女性における低血圧症の予測または診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、高血圧症または低血圧症の遺伝子診断およびこれに用いるための核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
細胞外基質を分解する主要酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ９（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ９、以下「ＭＭＰ９］という）は、ゼラチナーゼＢおよび９２ｋＤａＩＶ型コラゲナーゼとしても知られており、胚発生、形態発生、組織リモデリングの際の細胞外マトリックス分解に関与している。
【０００３】
ＭＭＰ９はヒトの動脈硬化病変においてその発現が確認されており、そのため、動脈硬化の進展と関係があると考えられることが報告されている（非特許文献１：Ｇａｌｉｓ  Ｚ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅｓ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １９９４；９４：２４９３−２５０３；非特許文献２：Ｂｒｏｗｎ  Ｄ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ９２−ｋＤ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ：  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ａｎｇｉｎａ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １９９５；９１：２１２５−２１３１；非特許文献３：Ｚａｌｔｓｍａｎ  Ａ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｏｒｔａｓ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｆｅｄ  ｒａｂｂｉｔｓ：  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｌｅｓｉｏｎ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ，  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  １９９７；１３０：６１−７０）。また、ＭＭＰ９はプロテオグリカン、エラスチン、変性コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、およびＸＩ型コラーゲンに対して作用し、動脈硬化病変において同定されることが報告されている（非特許文献４：Ｗｉｌｈｅｌｍ  Ｓ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＶ４０−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ａ  ９２−ｋＤａ  ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８９；２６４：１７２１３−１７２２１）。さらに、ＭＭＰ９の発現は、種々の成長因子およびサイトカインによって誘導されるとともに、翻訳段階においても統御される（非特許文献５：Ｋｏｎｄａｐａｋａ  Ｓ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９  （ＭＭＰ−９）  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １９９７；７０：７２２−７２６）。
【０００４】
平滑筋細胞は、細胞外マトリックスの分解に必要な全てのＭＭＰを発現する能力を有している。正常な血管壁ではＭＭＰ２とＴＩＭＰを発現しているが、プラークにおいては、さらにＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９も発現し、プラーク構築の改変あるいは破綻に、ＭＭＰ９が深く関与していると考えられる。
【０００５】
近年、関連遺伝子中の多型と疾患との関係が注目されている。ＭＭＰ９については、そのプロモーター領域にＣ／Ｔの多型（Ｃ−１５６２Ｔ）が見出されている（非特許文献６：Ｚｈａｎｇ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  Ｂ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １９９９；９９：１７８８−１７９４）。この報告によれば、この多型は遺伝子の転写活性に影響を与え、Ｃ／Ｃ型では転写活性が低く、Ｃ／Ｔ型とＴ／Ｔ型では転写活性が高いことが判明しており、この遺伝子多型と動脈硬化の重篤度との間に関係があることが分かっている。また、この多型（Ｃ−１５６２Ｔ）が心血管病変と関連することも報告されている（非特許文献７：Ｐｏｌｌａｎｅｎ  Ｐ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｌｅｓｉｏｎ  ａｒｅａ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ９  ｇｅｎｅ  −ａｎ  Ａｕｔｏｐｓｙ  Ｓｔｕｄｙ，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００１；２１：１４４６−１４５０）。さらに、ＭＭＰ９遺伝子中の多型としては、第一エクソン中のＣ２４１９Ｔおよび第１２エクソン中のＧ７９０６Ａが知られている。
【０００６】
しかしながら、ＭＭＰ９遺伝子多型と血圧との関係に関しての報告はない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｇａｌｉｓ  Ｚ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １９９４；９４：２４９３−２５０３
【非特許文献２】
Ｂｒｏｗｎ  Ｄ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １９９５；９１：２１２５−２１３１
【非特許文献３】
Ｚａｌｔｓｍａｎ  Ａ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  １９９７；１３０：６１−７０
【非特許文献４】
Ｗｉｌｈｅｌｍ  Ｓ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８９；２６４：１７２１３−１７２２１
【非特許文献５】
Ｋｏｎｄａｐａｋａ  Ｓ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １９９７；７０：７２２−７２６
【非特許文献６】
Ｚｈａｎｇ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １９９９；９９：１７８８−１７９４
【非特許文献７】
Ｐｏｌｌａｎｅｎ  Ｐ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００１；２１：１４４６−１４５０
【０００８】
【発明の概要】
本発明者らは、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子上の、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第２０番目のアミノ酸残基をコードするコドンにおけるアラニン残基をコードするコドンとバリン残基をコードするコドンとの多型が、女性における高血圧症の診断に利用可能であるとの知見を得た。さらに、本発明者らは、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子上の、翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流におけるＣ／Ｔの一塩基多型が、女性における低血圧症の診断に利用可能であるとの知見を得た。さらに、本発明者らは、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子上の、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第６６８番目のアミノ酸残基をコードするコドンにおけるアルギニン残基をコードするコドンとグルタミン残基をコードするコドンとの多型が、女性における低血圧症の診断に利用可能であるとの知見を得た。本発明はこれら知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明は、高血圧症または低血圧症の遺伝子診断に用いるための核酸分子およびプライマーペアの提供を目的とする。
【００１０】
そして、本発明の第一の態様による核酸分子は、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子において、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第２０番目のアミノ酸残基をコードするコドンがアラニン残基をコードするコドンであることを同定しうる、女性における高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００１１】
さらに、本発明の第一の態様によるプライマーペアは、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子において、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第２０番目のアミノ酸残基をコードするコドンがアラニン残基をコードするコドンであることを同定しうる、女性における高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、配列番号３中の第２０番目のアラニン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。
【００１２】
さらに、本発明の第二の態様による核酸分子は、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、前記変異を有してなるマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００１３】
さらに、本発明の第二の態様によるプライマーペアは、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、前記変異を有してなるマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。
【００１４】
さらに、本発明の第三の態様による核酸分子は、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第６６８番目のアルギニン残基をコードするコドンのグルタミン残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において第６６８番目のアルギニン残基がグルタミン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００１５】
さらに、本発明の第三の態様によるプライマーペアは、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の第６６８番目のアルギニン残基をコードするコドンのグルタミン残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において第６６８番目のアルギニン残基がグルタミン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記グルタミン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。
【００１６】
本発明によれば、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子における多型部位のヌクレオチドを同定することにより、高血圧症または低血圧症の遺伝子診断が可能となる。
【００１７】
【発明の具体的説明】
マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）遺伝子は、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードしている。該遺伝子のヌクレオチド配列は、本発明において特に制限されるものではないが、そのゲノム配列は、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含んでなり、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡは、例えば、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１８】
ＭＭＰ９遺伝子は、これによりコードされる配列番号３のアミノ酸配列中の第２０番残基をコードするコドンにおいて、アラニン残基をコードするコドンとバリン残基をコードするコドンとの多型（以下「Ａｌａ２０Ｖａｌ多型」という）を有しており、このような多型としては、例えば、前記コドンの第２ヌクレオチド残基におけるシトシン残基（Ｃ）とチミン残基（Ｔ）との一塩基多型（以下「Ｃ２４１９Ｔ多型」という。ＮＣＢＩデータベース登録番号：ｒｓ１８０５０８８）が挙げられる。この一塩基多型の位置は、配列番号１では第２４１９ヌクレオチド残基に相当し、配列番号２では第７８ヌクレオチド残基に相当する。
【００１９】
また、ＭＭＰ９遺伝子は、Ｚｈａｎｇ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １９９９；９９：１７８８−１７９４に記載されているとおり、そのプロモーター領域中において、翻訳開始点に対して１５９０ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基におけるシトシン残基（Ｃ）とチミン残基（Ｔ）との一塩基多型（以下「Ｃ（−１５６２）Ｔ多型」という。）を有する。この一塩基多型の位置は、配列番号１では第７７１ヌクレオチド残基に相当する。
【００２０】
さらに、ＭＭＰ９遺伝子は、これによりコードされる配列番号３のアミノ酸配列中の第６６８番残基をコードするコドンにおいて、アルギニン残基をコードするコドンとグルタミン残基をコードするコドンとの多型（以下「Ａｒｇ６６８Ｇｌｎ多型」という）を有しており、このような多型としては、例えば、前記コドンの第２ヌクレオチド残基におけるグアニン残基（Ｇ）とアデニン残基（Ａ）との一塩基多型（以下「Ｇ７９０６Ａ多型」という。ＮＣＢＩデータベース登録番号：ｒｓ２２７４７５６）が挙げられる。この一塩基多型の位置は、配列番号１では第７９０６ヌクレオチド残基に相当し、配列番号２では第２０２２ヌクレオチド残基に相当する。
【００２１】
Ａｌａ２０Ｖａｌ多型におけるアラニンをコードするコドン、例えば、Ｃ２４１９Ｔ多型におけるＣアレル、特にＣＣ遺伝子型は、女性における高血圧症のリスクファクターとして使用できる。従って、これらを検出することにより、女性における高血圧症の予測または診断が可能となる。また、Ｃ（−１５６２）Ｔ多型におけるＴアレル、特にＴＴ遺伝子型、ならびにＡｒｇ６６８Ｇｌｎ多型におけるグルタミンをコードするコドン、例えば、Ｇ７９０６Ａ多型におけるＡアレル、特にＡＡ遺伝子型は、女性における低血圧症のリスクファクターとして使用できる。従って、これらを検出することにより、低血圧症の予測または診断が可能となる。上記の高血圧症および低血圧症は、好ましくは、それぞれ本態性の高血圧症および低血圧症である。また、上記のコドン、アレルおよび遺伝子型の検出はいずれも、ＭＭＰ９遺伝子上の上記多型部位におけるヌクレオチドの同定により行なうことができる。
【００２２】
本発明によれば、ＭＭＰ９遺伝子上の上記多型部位におけるヌクレオチドの同定に用いることのできる、女性における高血圧症または低血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子が提供される。
【００２３】
そして、本発明の第一の態様による核酸分子は、ＭＭＰ９遺伝子において、Ａｌａ２０Ｖａｌ多型部位のコドンがアラニン残基をコードするコドンであることを同定しうる、女性における高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号１または配列番号２で表されるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００２４】
本発明の第二の態様による核酸分子は、ＭＭＰ９遺伝子における、Ｃ（−１５６２）Ｔ多型部位でのシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、前記変異を有してなるＭＭＰ９遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において第７７１番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００２５】
本発明の第三の態様による核酸分子は、ＭＭＰ９遺伝子における、Ａｒｇ６６８Ｇｌｎ多型部位のアルギニン残基をコードするコドンのグルタミン残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において第６６８番目のアルギニン残基がグルタミン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において第７９０６番目のグアニン残基（Ｇ）がアデニン残基（Ａ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるもの、または配列番号２で表わされるヌクレオチド配列において第２０２２番目のグアニン残基（Ｇ）がアデニン残基（Ａ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００２６】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとされる。
【００２７】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２８】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、イントロンにハイブリダイズする部分だけでなく、エクソンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２９】
本発明による核酸分子は、ＭＭＰ９遺伝子における多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、それぞれの多型部位を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００３０】
従って、本発明の第一の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、Ａｌａ２０Ｖａｌ多型部位のコドンを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。本発明の第二の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、Ｃ（−１５６２）Ｔ多型部位のヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。本発明の第三の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、Ａｒｇ６６８Ｇｌｎ多型部位のコドンを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００３１】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。
【００３２】
また、本発明による核酸分子は、ＭＭＰ９遺伝子における多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、多型部位を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００３３】
従って、本発明の第一の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、Ａｌａ２０Ｖａｌ多型部位のコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。本発明の第二の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、Ｃ（−１５６２）Ｔ多型部位のヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。本発明の第三の態様による核酸分子は、前記ポリヌクレオチドの、Ａｒｇ６６８Ｇｌｎ多型部位のコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００３４】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。
【００３５】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、ＭＭＰ９遺伝子上の多型部位のヌクレオチドを同定する上で好ましいものである。
【００３６】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。よって、本発明によれば、ＭＭＰ９遺伝子上の上記多型部位におけるヌクレオチドの同定に用いることのできる、女性における高血圧症または低血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアが提供される。
【００３７】
そして、本発明の第一の態様によるプライマーペアは、ＭＭＰ９遺伝子において、Ａｌａ２０Ｖａｌ多型部位のコドンがアラニン残基をコードするコドンであることを同定しうる、女性における高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、Ａｌａ２０Ｖａｌ多型部位のコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号１または配列番号２で表されるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００３８】
本発明の第二の態様によるプライマーペアは、ＭＭＰ９遺伝子における、Ｃ（−１５６２）Ｔ多型部位でのシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、前記変異を有してなるＭＭＰ９遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドの、Ｃ（−１５６２）Ｔ多型部位のヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において第７７１番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００３９】
本発明の第三の態様によるプライマーペアは、ＭＭＰ９遺伝子における、Ａｒｇ６６８Ｇｌｎ多型部位のアルギニン残基をコードするコドンのグルタミン残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性における低血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において第６６８番目のアルギニン残基がグルタミン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記グルタミン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において第７９０６番目のグアニン残基（Ｇ）がアデニン残基（Ａ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるもの、または配列番号２で表わされるヌクレオチド配列において第２０２２番目のグアニン残基（Ｇ）がアデニン残基（Ａ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００４０】
このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００４１】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、ＭＭＰ９遺伝子における上記多型部位のヌクレオチドを同定することができ、これにより、女性における高血圧症または低血圧症を予知または検出することができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いる、女性における高血圧症または低血圧症を予知または検出する方法（予測または診断する方法）が提供される。
【００４２】
そして、本発明の第一の態様による方法は、ＭＭＰ９遺伝子中のヌクレオチドを同定することにより、女性における高血圧症を予知または検出する方法であって、本発明の第一の態様による核酸分子、および／または本発明の第一の態様によるプライマーペアを用いて、ＭＭＰ９遺伝子において、Ａｌａ２０Ｖａｌ多型部位のコドンがアラニン残基をコードするコドンであることを同定する工程を含んでなるものである。この方法では、好ましくはＣ２４１９Ｔ多型におけるＣアレルが検出され、より好ましくはＣＣ遺伝子型が検出される。
【００４３】
本発明の第二の態様による方法は、ＭＭＰ９遺伝子の変異を検出することにより、女性における低血圧症を予知または検出する方法であって、本発明の第二の態様による核酸分子、および／または本発明の第二の態様によるプライマーペアを用いて、ＭＭＰ９遺伝子における、Ｃ（−１５６２）Ｔ多型部位でのシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出する工程を含んでなるものである。この方法では、好ましくはＣ（−１５６２）Ｔ多型におけるＴＴ遺伝子型が検出される。
【００４４】
本発明の第三の態様による方法は、ＭＭＰ９遺伝子中の変異を検出することにより、女性における低血圧症を予知または検出する方法であって、本発明の第三の態様による核酸分子、および／または本発明の第三の態様によるプライマーペアを用いて、ＭＭＰ９遺伝子における、Ａｒｇ６６８Ｇｌｎ多型部位のアルギニン残基をコードするコドンのグルタミン残基をコードするコドンへの変異を検出する工程を含んでなるものである。この方法では、好ましくはＧ７９０６Ａ多型におけるＡアレルが検出され、より好ましくはＡＡ遺伝子型が検出される。
【００４５】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、ＭＭＰ９遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中において上記各多型部位のヌクレオチドを同定する工程を含んでなる、女性における高血圧症または低血圧症の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。
【００４６】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、ＭＭＰ９遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸増幅法およびこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。
【００４７】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００４８】
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とにより上記各多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマーを用いて核酸増幅法を行ない、同プライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
【００４９】
Ｃ（−１５６２）Ｔ多型用：
フォワード：５’−ＴＣＡＴＴＧＧＴＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＴＡＧＡＡＣＴＴＣ−３’（配列番号４）；
リバース：５’−ＴＧＧＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号５）。
【００５０】
Ａｌａ２０Ｖａｌ多型用：
フォワード：５’−ＴＧＧＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号６）；
リバース：５’−ＴＴＣＡＧＡＴＡＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣ−３’（配列番号７）。
【００５１】
Ａｒｇ６６８Ｇｌｎ多型用：
フォワード：５’−ＧＣＧＧＧＣＡＣＧＣＧＧＧＣＴＡＧＧＡＡＡ−３’（配列番号８）；
リバース：５’−ＧＡＴＣＴＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＡＴＴ−３’（配列番号９）。
【００５２】
本発明による予測法または診断法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを多型部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記多型にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。
【００５３】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等によるＭＭＰ９遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドの同定にプローブとして用いることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、女性における高血圧症または低血圧症の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ＭＭＰ９遺伝子における上記各多型にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００５４】
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ＭＭＰ９遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）を参照することができる。
【００５５】
ＭＭＰ９遺伝子における上記各多型が一塩基多型である場合において、該一塩基多型部位のヌクレオチドを同定するためには、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００５６】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５７】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５８】
ＭＭＰ９遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００５９】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法においては、上記各多型部位のヌクレオチドを含む領域に対して、両アレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができるため特に制限されないが、例えば、以下のようなヌクレオチド配列とすることができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭ、ＶＩＣ、およびＴＥＴのいずれかの組合せを用いる。
【００６０】
（１）Ｃ（−１５６２）Ｔ多型用
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｔアレル用：ＦＡＭ−ＡＴＴＡＴＡＧＧＣＡＴＧＣＧＣＣＡＣ−ＭＧＢ（配列番号１０）、
Ｃアレル用：ＶＩＣ−ＴＡＴＡＧＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＣ−ＭＧＢ（配列番号１１）；
プライマー：
フォワード：ＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＡＴ（配列番号１２）、
リバース：ＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＣＧＴＡＧＴＧＡＡＡＣＣ（配列番号１３）；
【００６１】
（２）Ｃ２４１９Ｔ多型用
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｃアレル用：ＦＡＭ−ＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号１４）、
Ｔアレル用：ＴＥＴ−ＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号１５）；
プライマー：
フォワード：ＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＡ（配列番号１６）、
リバース：ＣＣＣＣＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＧＴＧＴＴＴＧＣ（配列番号１７）；
【００６２】
（３）Ｇ７９０６Ａ多型用
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｇアレル用：ＦＡＭ−ＣＣＣＴＣＡＣＣＴＣＧＧＴＡＣ−ＭＧＢ（配列番号１８）、
Ａアレル用：ＶＩＣ−ＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＡＣＴＧ−ＭＧＢ（配列番号１９）；
プライマー：
フォワード：ＧＴＣＴＣＡＣＧＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号２０）、
リバース：ＴＧＧＡＣＡＣＧＣＡＣＧＡＣＧＴＣＴＴ（配列番号２１）；
【００６３】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型が容易に決定される。
【００６４】
本発明による予知法、検出法、予測法および診断法において、Ａｌａ２０Ｖａｌ多型におけるアラニンをコードするコドン、例えば、Ｃ２４１９Ｔ多型におけるＣアレル、特にＣＣ遺伝子型が検出されたサンプルは、高血圧症、特に本態性高血圧症を有するものと、あるいは将来においてその可能性があるものと診断することができる。また、Ｃ（−１５６２）Ｔ多型におけるＴアレル、特にＴＴ遺伝子型、ならびにＡｒｇ６６８Ｇｌｎ多型におけるグルタミンをコードするコドン、例えば、Ｇ７９０６Ａ多型におけるＡアレル、特にＡＡ遺伝子型が検出されたサンプルは、低血圧症、特に本態性低血圧症を有するものと、あるいは将来においてその可能性があるものと診断することができる。本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００６５】
以上のような高血圧症または低血圧症の予知、検出、予測および診断のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、ＭＭＰ９遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００６６】
【実施例】
例１：ＭＭＰ９遺伝子中の多型と血圧との関係
以下の解析においては、吹田市一般住民より性年齢階層別に無作為抽出された、男性１８０２名、女性１９７１名の計３７７３名を対象にした（平均年齢±標準偏差：５９．８±１１．８）。
【００６７】
まず、被験者全員について、血圧を３回計測した。１回目は触診による血圧計測とし、２および３回目は水銀血圧計を用いての計測とした。
【００６８】
次いで、被験者４６人について、ＭＭＰ９遺伝子をダイレクト・シークエンスした。これにより同定された一塩基多型のうち、プロモーター領域中に存在するかまたはアミノ酸変異を伴い、かつアレル頻度が５％以上となるものとして、プロモーター領域中のＣ／Ｔ多型（Ｃ（−１５６２）Ｔ多型）、第１エクソン内のＣ／Ｔ多型（Ｃ２４１９Ｔ多型、ｄｂＳＮＰ：１８０５０８８）、第６エクソン内のＡ／Ｇ多型（Ａ５０２０Ｇ多型、ｄｂＳＮＰ：２６６４５３８）、および第１２エクソン内のＧ／Ａ多型（Ｇ７９０６Ａ多型、ｄｂＳＮＰ：ｒｓ２２７４７５６）を遺伝子解析用に選択した。なお、第１０エクソン内のＧ／Ｃ多型（Ｇ７２０１Ｃ多型、ｄｂＳＮＰ：ｒｓ２２５０８８９）も候補に挙がったが、これは第６エクソンＡ／Ｇ多型と連鎖不平衡を示すため、解析の対象とはしなかった。
【００６９】
上記のように選択された多型に関し、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法によるタイピングを行なった。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は、ＴａｑＭａｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて行なった。このＴａｑＭａｎシステムにおいては、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ）、１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、下記のＴａｑＭａｎプローブ、および下記のプライマーを含む全１２．５μｌの反応溶液を９６ウェルプレート上に調製し、９５℃で１０分間の反応の後、９２℃で１５秒間−下記アニーリング温度で１分間の反応を３５サイクルまたは４０サイクル行なった。ＰＣＲ産物の蛍光は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。また、Ｇ７９０６Ａ多型については、３８４ウェルプレートを用いるタイピングも行なったが、その場合には、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ）、６ｎｇのゲノムＤＮＡ、下記のＴａｑＭａｎプローブ、および下記のプライマーを含む全７．５μｌの反応溶液を調製し、９５℃で１０分間の反応の後、９２℃で１５秒間−６０℃で１分間の反応を４０サイクル行なった。ＰＣＲ産物の蛍光は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。
【００７０】
（１）Ｃ（−１５６２）Ｔ多型用条件
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｔアレル用：ＦＡＭ−ＡＴＴＡＴＡＧＧＣＡＴＧＣＧＣＣＡＣ−ＭＧＢ（配列番号１０）（２３１ｎＭ）、
Ｃアレル用：ＶＩＣ−ＴＡＴＡＧＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＣ−ＭＧＢ（配列番号１１）（２０９ｎＭ）；
プライマー：
フォワード：ＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＡＴ（配列番号１２）（８００ｎＭ）、
リバース：ＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＣＧＴＡＧＴＧＡＡＡＣＣ（配列番号１３）（８００ｎＭ）；
アニーリング温度：６４℃；
サイクル数：３５サイクル。
【００７１】
（２）Ｃ２４１９Ｔ多型用条件
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｃアレル用：ＦＡＭ−ＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号１４）（５０ｎＭ）、
Ｔアレル用：ＴＥＴ−ＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号１５）（１５８ｎＭ）；
プライマー：
フォワード：ＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＡ（配列番号１６）（４００ｎＭ）、
リバース：ＣＣＣＣＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＧＴＧＴＴＴＧＣ（配列番号１７）（４００ｎＭ）；
アニーリング温度：６４℃；
サイクル数：４０サイクル。
【００７２】
（３）Ａ５０２０Ｇ多型用条件
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｇアレル用：ＦＡＭ−ＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＡＣＣＣＧＧＧＡＣＧＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２２）（７６．８ｎＭ）、
Ａアレル用：ＴＥＴ−ＡＣＴＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＴＧＣＴＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２３）（４８ｎＭ）；
プライマー：
フォワード：ＧＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡＴ（配列番号２４）（４００ｎＭ）、
リバース：ＡＧＴＡＧＧＡＴＴＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＡ（配列番号２５）（４００ｎＭ）；
アニーリング温度：６２℃；
サイクル数：４０サイクル。
【００７３】
（４）Ｇ７９０６Ａ多型用条件
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｇアレル用：ＦＡＭ−ＣＣＣＴＣＡＣＣＴＣＧＧＴＡＣ−ＭＧＢ（配列番号１８）（２３４ｎＭ）、
Ａアレル用：ＶＩＣ−ＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＡＣＴＧ−ＭＧＢ（配列番号１９）（９０ｎＭ）；
プライマー：
フォワード：ＧＴＣＴＣＡＣＧＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号２０）（８００ｎＭ）、
リバース：ＴＧＧＡＣＡＣＧＣＡＣＧＡＣＧＴＣＴＴ（配列番号２１）（８００ｎＭ）；
アニーリング温度：６０℃；
サイクル数：４０サイクル。
【００７４】
上記の血圧測定およびタイピングの結果に基づき、統計学的分析として、断面研究および症例対照研究を行なった。断面研究では、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による多変量解析を用いて血圧と遺伝子多型との関連を解析した。その際に、性、年齢、ＢＭＩ、喫煙、飲酒、降圧薬服用の有無、現病歴（糖尿病、高脂血症）を調整因子として用いた。
【００７５】
プロモーター領域のＣ／Ｔ多型（Ｃ（−１５６２）Ｔ）については、男性１４６６名および女性１６３５名の計３１０１名を解析した。断面研究の結果を下記の表１に示す。断面研究では、女性の収縮期血圧（ＴＴ型：１２１．８±２．７ｍｍＨｇ、ＴＣ型：１３０．５±０．８ｍｍＨｇ、ＣＣ型：１２８．９±０．５ｍｍＨｇ、トレンドＰ＝０．００６）、および女性の拡張期血圧（ＴＴ型：７５．７±１．５ｍｍＨｇ、ＴＣ型：７９．７±０．５ｍｍＨｇ、ＣＣ型：７９．２±０．３ｍｍＨｇ、トレンドＰ＝０．０３５）において、ＴＴ型がＴＣ型およびＣＣ型よりも有意に低かった。
【００７６】
【表１】
2004275007.tif 000002
【００７７】
第１エクソン内のＣ／Ｔ多型（Ｃ２４１９Ｔ）については、男性１１３５名および女性１２１６名の計２３５１名を解析した。断面研究の結果を下記の表２に示す。断面研究では、女性の収縮期血圧（ＴＴ型：１２９．０±０．５ｍｍＨｇ、ＴＣ型：１２９．４±１．４ｍｍＨｇ、ＣＣ型：１４０．０±５．４ｍｍＨｇ、ＴＴ型とＣＣ型とでＰ＝０．０４）、男女を合わせた拡張期血圧（ＴＴ型：８０．６±０．２ｍｍＨｇ、ＴＣ型：８０．３±０．６ｍｍＨｇ、ＣＣ型：８５．６±２．５ｍｍＨｇ、ＴＴ型とＣＣ型とでＰ＝０．０３）において、ＣＣ型がＴＴ型およびＴＣ型よりも有意に高かった。
【００７８】
【表２】
2004275007.tif 000003
【００７９】
第６エクソン内のＡ／Ｇ多型（Ａ５０２０Ｇ）については、男性１２１１名および女性１３４２名の計２５５３名を解析した。断面研究の結果を下記の表３に示す。この多型については、断面研究および症例対照研究のいずれにおいても血圧との関連がみられなかった。
【００８０】
【表３】
2004275007.tif 000004
【００８１】
第１２エクソン内のＧ／Ａ多型（Ｇ７９０６Ａ）については、男性１５５１名および女性１６９６名の計３２４７名を解析した。断面研究の結果を下記の表４に示す。断面研究では、女性の収縮期血圧（ＡＡ型：１２２．８±２．４ｍｍＨｇ、ＡＧ型：１２９．４±０．９ｍｍＨｇ、ＧＧ型：１２８．６±０．５ｍｍＨｇ、トレンドＰ＝０．０３２）および女性の脈圧（ＡＡ型：４５．８±１．７ｍｍＨｇ、ＡＧ型：５０．４±０．６ｍｍＨｇ、ＧＧ型：４９．３±０．４ｍｍＨｇ、トレンドＰ＝０．０１９）において、ＡＡ型がＡＧ型およびＧＧ型よりも有意に低かった。
【００８２】
【表４】
2004275007.tif 000005
【００８３】
以上の結果から、ＭＭＰ９のプロモーター領域Ｃ／Ｔ多型（Ｃ（−１５６２）Ｔ）、第１エクソンＣ／Ｔ多型（Ｃ２４１９Ｔ）、第１２エクソンＧ／Ａ多型（Ｇ７９０６Ａ）は、日本人女性の血圧と有意に関連する遺伝子多型マーカーになりうることが示された。
【００８４】
【配列表】
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