(57)【要約】【課題】非特異的な着色のない、安定なペルオキシダーゼ活性検出のための試験片の提供。【解決手段】有機ヒドロペルオキシド、色原体の存在下、フェノール誘導体を含有することを特徴とする、ペルオキシダーゼ活性物質を検出するための試験片。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機ヒドロペルオキシドと色原体の存在下、抗酸化活性を持つフェノール誘導体を含有することを特徴とする、ペルオキシダーゼ様活性物質を測定するための試験片。
【請求項２】
２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−エチルフェノール、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メトキシフェノール、２，２’−メチレンビス−（４−メチル−６−ｔ−ブチルフェノール、４，４’−チオビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール、４，４’−ブチリデンビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール）、ｎ−オクタデシル−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートおよびα−トコフェロールから選ばれる１種または２種以上の抗酸化活性を持つフェノール誘導体である請求項１の試験片。
【請求項３】
請求項１から２の試験片を用いるペルオキシダーゼ様活性物質を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中のペルオキシダーゼ様活性物質を測定するための試験片およびそれを用いたペルオキシダーゼ様活性物質を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿などの体液中の、ペルオキシダーゼ様活性の検出は種々の疾病の診断に従来から用いられてきた。ペルオキシダーゼ様活性を持つ物質としては、腎臓や尿路系疾患で尿中に漏出してくる血液由来のヘモグロビンや、心筋梗塞、横紋筋融解症や挫滅症候群で筋肉から漏出してくるミオグロビンが挙げられる。ペルオキシダーゼ様活性の検出の方法として、試料中に含まれるペルオキシダーゼ様触媒作用により過酸化物を分解し、その際発生する酸素が色原体を酸化呈色させるレドックス反応を利用した測定に必要な試薬を、乾燥した状態で安定化させた試験片を用いて、液状の検体と反応させるドライケミストリーシステムが汎用されている。
【０００３】
ペルオキシダーゼ様活性の測定のため用いられる過酸化物としては液体、固体のどちらでもでもよいが、熱安定性に優れたものが望ましい。そのような過酸化物として有機過酸化物のクメンヒドロペルオキシド（ＣＨＰ）、１，４−ジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオキシド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒドロペルオキシドが挙げられ、ＣＨＰが汎用される。また酸化により発色する色原体としては４−アミノアンチピリンやオルトフェニレンジアミン、３，３’−ジアミノベンチジン、３，  ３’，  ５，  ５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）あるいはそれらの塩が知られている。これらの中で発色安定性などからＴＭＢが良く用いられている。
【０００４】
この発色反応は酸化反応であるため、検体中のアスコルビン酸などの還元物質による反応の阻害がおこり得る。これを防ぐため、適当な酸化剤を試験片に添加することが行われている。そのような酸化剤としてヨウ素酸塩（特公平２−４８６１号公報）、テトラキス（Ｎ−ヒドロキシアルキル）エチレンジアミンの鉄錯体（特開平９−３２９５９８号広報）などを用いることが知られている。
【０００５】
試験片が保持される環境は、過酸化物質を分解する種々の因子、例えば紫外線などの光線、温度、湿度等の物理化学的要因や、環境中の酸素や試験片に坦持された酸化剤などの酸化還元性物質の存在により、試験片は作製中あるいは保存中に劣化し、着色や反応性の低下を起こすことがある。この試験片の劣化は、製品の品質のばらつき原因になるだけでなく、試験片の長期保存性の欠如や、さらに誤判定の要因ともなり、品質管理上の重大な問題点として指摘されている。
【０００６】
これらの問題点を解消するため、さまざまな安定剤の試験片への添加が検討されてきた。このような安定剤として、例えばリン酸トリモルホリドなどのリン酸アミド（例えば特許文献１）、グリセリルフォスフェートのようなリン化合物（例えば特許文献２）、ホウ酸イソプロパノールアミンのような２環式ホウ酸アミン化合物（例えば特許文献３）などが知られている。しかしこれらの安定剤は、ペルオキシダーゼ様活性を阻害したり、それ自身安定でなかったり、安定化の効果が充分でなく、安定な試験片を提供できなかった。
【特許文献１】
特公昭５８ー３６７９号公報
【特許文献２】
登録特許第２９２２００３号公報
【特許文献３】
登録特許第２９２８６４９号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
これらのことから、本発明は非特異的な着色のない、安定なペルオキシダーゼ様活性検出のための試験片を提供することを目的とする。
【問題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、フェノール誘導体を含有する試験片が非特異的な着色もなく、安定なペルオキシダーゼ様活性検出に用いる事ができることを見出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、
１．  有機ヒドロペルオキシドと色原体の存在下、抗酸化活性を持つフェノール誘導体を含有することを特徴とする、ペルオキシダーゼ様活性物質を測定するための試験片、
２．２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−エチルフェノール、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メトキシフェノール、２，２’−メチレンビス−（４−メチル−６−ｔ−ブチルフェノール）、４，４’−チオビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール、４，４’−ブチリデンビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール）、ｎ−オクタデシル−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートおよびα−トコフェロールから選ばれる１種または２種以上の抗酸化活性を持つフェノール誘導体である１の試験片、
３．１から２の試験片を用いるペルオキシダーゼ様活性物質を測定する方法、
を提供する。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のフェノール誘導体は、抗酸化活性を持ち、空気中の酸素あるいは試験片中の有機ヒドロペルオキシド、ヨウ素酸塩等の酸化剤などによる色原体の酸化を防ぎ、着色を抑制する効果がある。さらに、ペルオキシダーゼ様活性を阻害せず、それ自体安定である。
このような抗酸化作用を持つフェノール誘導体として、ケルセチン、アントシアニジン、カテキンなどの植物由来のフラボノイドやポリフェノール類、トコフェロール類、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＴＨ）、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−エチルフェノール、４，４’−チオビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール）、４，４’−ブチリデンビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール）、ｎ−オクタデシル−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート、２，２’−メチレンビス−（４−メチル−６−ｔ−ブチルフェノール）、２，２’−メチレンビス−（４−エチル−６−ｔ−ブチルフェノール）、１，１，３−トリス（２−メチル−４−ヒドロキシ−５−ｔ−ブチルフェニル）ブタン、テトラキス〔メチレン−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート〕メタン、トリエチレングリコールビス〔３−（３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）プロピオネート〕、が挙げられる。なかでも、２，  ６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，  ６−ジ−ｔ−ブチル−４−メトキシフェノール、４，４’−チオビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール、４，４’−ブチリデンビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール）、ｎ−オクタデシル−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートあるいはα−トコフェロールが好ましく、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，  ６−ジ−ｔ−ブチル−４−メトキシフェノール、α−トコフェロールが特に好ましい。これらのフェノール誘導体は１種または数種の併用ができ、浸漬液中で０．０５％〜５％の割合で使用される。
これらのフェノール誘導体は、食品等に含まれる抗酸化剤、あるいはポリマー等に添加する酸化防止剤などとして知られているが、色原体の着色を防ぎ、ペルオキシダーゼ様活性の測定に使用され得ることはこれまで知られていなかった。
【０００９】
試験片に坦持させる試薬として、色原体、過酸化物に加えて可溶化剤、増感剤、湿潤剤や緩衝剤などを用いても良い。また有機ヒドロペルオキシドの溶媒への溶解性を高めるためシクロデキストリンを使用しても良い。増感剤としては、キノリン誘導体、ベンゾキノリン誘導体、ベンゾチアゾール誘導体、ピリジン誘導体等があり、特に固体で揮発性のない３−アミノキノリンや２−アミノベンゾチアゾール塩酸塩が好ましい。また含浸液のｐＨが４〜７になるように、リン酸塩、クエン酸塩、フタル酸塩、コハク酸塩等の緩衝剤を用いた緩衝液を用いることができ、特にクエン酸塩が好ましい。さらに試料の試験片中への浸透を促進し、酸化呈色指示薬が酸化によって生ずるラジカルカチオンを安定化させるための湿潤剤として、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤を用いることもできる。
【００１０】
また試験片は通常、上記試薬を吸収性担体に含浸し、プラスチック等の支持体に貼付し作製される。この吸収性担体としては、濾紙が多用されるが、綿、不繊布、ガラス繊維等も使用可能であり、さらにゼラチン、合成樹脂等の有機ポリマーに試薬組成物を含有させ、支持体に固着して用いても良い。支持体としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエステル等のプラスチック片あるいはシートからなる基体が使用可能である。
【００１１】
このようにして得られた試験片を、尿のような液体試料に浸し、直ちに引き上げる。そして一定時間後の呈色を、あらかじめ作成しておいた標準の色調表と肉眼で比較することにより、試料の定性あるいは半定量試験を行う。あるいは測定装置を用いて反射率などを光学的に測定し、検量線にあてはめて濃度を求める定量試験を行うことも可能である。
【００１２】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１３】
実施例１．２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノールを用いた試験片
３ＭＭ濾紙（ワットマン社製）を第１浸漬液に含浸し、６０℃で６０分乾燥し、更に第２浸漬液に含浸し、５０℃で２０分乾燥した。
第１浸漬液
ＣＨＰ                                                                  １．５ｇ
β−シクロデキストリン                                      ７ｇ
２−アミノベンゾチアゾール塩酸塩                  １ｇ
ラウリル硫酸ナトリウム                                      １ｇ
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）                                ５０ｍｌ
エタノール                                                            ３０ｍｌ
蒸留水                                                          全量１００ｍｌ
第２浸漬液
２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール              １ｇ
ＴＭＢ                                                                      １ｇ
ポリビニルピロリドンＫ−３０                                  ２ｇ
クロロホルム                                              全量１００ｍｌ
乾燥した濾紙を５ｍｍ×５ｍｍに裁断し、５ｍｍ×８０ｍｍのポリ塩化ビニル支持体に両面テープで接着し試験片を作製した。
【００１４】
実施例２．酸化剤を添加した試験片
第１浸漬液にヨウ素酸カリウム１ｇを添加すること以外は、実施例１と同様の方法で試験紙を作製した。
比較例１．フェノール誘導体を用いない試験片
第２浸漬液の２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノールを添加しないこと以外は、実施例１と同様の方法で試験片を作製した。
これらの試験片の作製直後の色調を観察し、着色の有無を確認した。また、血液を蒸留水にて１００万倍の稀釈液を作製し、試験片を、血液の１００万倍稀釈液に浸漬し直ちに引き上げ、過剰の浸漬液を除き、３０秒後の色調の変化を標準色調と比較することによる感度試験を行った。
2004290135.tif 000002
比較例では作製直後に青色に着色し、使用できなかった。これに対して２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノールを用いた本発明の試験片は、ヨウ素酸カリウムの有無に関わらず、作製直後の着色もなく、充分な感度を有していた。
【００１５】
実施例３．各種フェノール誘導体を用いた試験片
実施例１の第２浸漬液の２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール１ｇを下記の各フェノール誘導体１ｇに替えた以外は実施例１と同様の方法で試験片を作製した。
１  ２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−エチルフェノール
２  ４，４’−チオビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール
３  ４，４’−ブチリデンビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール）
４  ｎ−オクタデシル−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート
５  ＤＬ−α−トコフェロール
各フェノール誘導体を用いて作製した試験片の、作製直後の非特異的な着色の確認と、血液の１００万倍稀釈液による感度試験を行った。
2004290135.tif 000003
各フェノール誘導体を用いた試験片は、それぞれ作製直後の着色もなく、また充分な感度を有していた。
【発明の効果】
本発明のペルオキシダーゼ様活性検出用の試験片は、有機ヒドロペルオキシド、色原体、及びフェノール誘導体を含み、酸化による非特異的着色やバックグラウンドの上昇を抑えることができる。