(57)【要約】【解決手段】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０Ａ由来のポリガラクツロナーゼ遺伝子を、大腸菌発現ベクター（例えば、ｐＱＥ８０Ｌ：Ｑｕｉａｇｅｎ社）に連結し、チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）及びグルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）の活性のない大腸菌株（例えば、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ株；Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入する。【効果】得られた形質転換体（例えば、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０７、ＦＥＲＭＰ−１９２０８）を培養することにより、活性のあるポリガラクツロナーゼを安価に生産できる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリガラクツロナーゼ。
【請求項２】
ポリガラクツロナーゼが３５〜４０ｋｄａの分子量を有し、３．５〜５．０の至適ｐＨ及び３０〜５０℃の間の至適温度を示すことを特徴とする請求項１に記載のポリガラクツロナーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡである請求項３に記載の遺伝子のＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号１に示すアミノ酸配列で２９３番目のアミノ酸セリンがグリシンに置換されたアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリガラクツロナーゼ。
【請求項６】
ポリガラクツロナーゼが３５〜４０ｋｄａの分子量を有し、３．５〜６．０の至適ｐＨ及び３０〜５５℃の間の至適温度を示すことを特徴とする請求項５に記載のポリガラクツロナーゼ。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号２に示す塩基配列で８７７番目の塩基アデニンがグアニンに置換された塩基配列を有するＤＮＡである請求項７に記載の遺伝子のＤＮＡ。
【請求項９】
請求項３、４の少なくともいずれか、あるいは、請求項７、８の少なくともいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを用いて、チオレドキシンレダクターゼ及びグルタチオンレダクターゼ活性を有しない大腸菌を形質転換してなる形質転換体。
【請求項１１】
形質転換体、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ・Ｗ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０７）。
【請求項１２】
形質転換体、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ・２９３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０８）。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の形質転換体を使用することを特徴とするポリガラクツロナーゼの製造方法。
【請求項１４】
請求項１、２、５、６のいずれか１項に記載のポリガラクツロナーゼ、または、請求項１３に記載の製造方法によって得られたポリガラクツロナーゼを使用することを特徴とするポリガラクツロン酸の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリガラクツロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ）の大腸菌による生産システムに関するものであって、ポリガラクツロナーゼ、対応するＤＮＡ配列、ベクター、形質転換された宿主、ポリガラクツロナーゼの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
既に酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のポリガラクツロナーゼ遺伝子はクローン化され遺伝子配列も判明している。しかし、これらの遺伝子配列にコードされているアミノ酸配列は、ポリガラクツロナーゼ活性を示さないことが報告されている。活性を有するポリガラクツロナーゼを生産する特殊な酵母とのＤＮＡの比較による研究から、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株をはじめとする多くの酵母が活性を有するポリガラクツロナーゼを生産しない理由として、ポリガラクツロナーゼのアミノ酸配列が３ヶ所異なるためであると報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
更に、ポリガラクツロナーゼ遣伝子配列を酵母に活性をもつポリガラクツロナーゼタンパク質の生産に成功した例は報告されているが、大腸菌に導入し、大腸菌に活性をもつポリガラクツロナーゼタンパク質の生産に成功した例は報告されていない。商品化されているポリガラクツロナーゼは、多くの場合、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属やＲｈｉｚｏｐｕｓ属から精製されたものであり、異なる宿主を用いて生産されたポリガラクツロナーゼは商品化されていない。
【０００４】
異なる宿主を用いたペクチン関連物質分解酵素の生産には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属が用いられている。例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ属のポリガラクツロナーゼをＢａｃｉｌｌｕｓ属に生産させ（例えば、特許文献１参照）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のペクチン酸リアーゼをＢａｃｉｌｌｕｓ属及び大腸菌で生産させ（例えば、特許文献２参照）、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属のポリメチルガラクツロナーゼをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに生産させたことが（例えば、特許文献３参照）、それぞれ報告されている。
【０００５】
大腸菌は、研究された生物種であり、遭伝子工学の手法によく用いられているため、遣伝子のクローニング、タンパク質の発現に最も好ましい系のひとつである。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、タンパク質の発現に適した宿主であるが、原核生物より増殖が遅い、培地が高い、発現するタンパク量が少ないなどの欠点がある。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属は、培地中にタンパク質を分泌する能力は高いものの、同時に培地中に目的タンパク質以外のものも分泌するなどの欠点があり、遺伝子操作、タンパク質発現の各種の技術も、大腸菌の系ほど発達していない。
【０００６】
特定のタンバク質生産のためには、遺伝子工学の技術を用いて適当な宿主に生産させることが一般的である。各種の宿主がそのために開発されているが、大腸菌はコスト面において最も優れた宿主の一つである。多くの場合には大腸菌のタンパク質生産システムの利用が試みられるが、実際のタンパク質生産の目的を達成できないことがある。ポリガラクツロナーゼもそのようなタンパク質の一つである。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｇｏｇｎｉｅｓ，Ｓ．，Ｇａｉｎｖｏｒｓ，Ａ．，Ａｉｇｌｅ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂｅｌａｒｇｉ．Ａ．（１９９９）、Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｅｎｄｏｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ−Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  （ＰＧＬ１）：Ｙｅａｓｔ，１５，１１−１２。
【０００８】
【特許文献１】
特表平５−５００３０９号公報
【０００９】
【特許文献２】
特開２０００−２６２２９２号公報
【００１０】
【特許文献３】
特開平１０−３１３８５８号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ペクチンは、高等植物の細胞間物質の主要な構成成分であり、広範かつ大量に天然に存在する物質である。ポリガラクツロナーゼは、果汁の清澄化・ろ過性改善、収量向上、野菜果実のピューレ製造、ワインのろ過向上剤、又生化学用の商品として販売されている。またセルロース精製法にも利用方法が提案されている（特開平６−２２０７７２）など、その安価な製造、各種ポリガラクツロナーゼのコレクション数の増加は、食品工業界・生化学試薬業界・製紙業界において、重要な課題である。
【００１２】
市販されているポリガラクツロナーゼは、他の必要でない酵素も混入しており、高い純度のものは、生化学用の試薬として入手できるものの高価である。安価なポリガラクツロナーゼの製造は、食品工業界において重要な課題であり、更に高い純度を達成することは、生化学試薬業界にとって重要な課題である。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ポリガラクツロナーゼ遺伝子を大腸菌で発現せしめる条件について各種試験、検討した結果、該遺伝子を組み込むための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクター、及び、得られた組換えベクターを用いて形質転換する宿主の重要性に着目した。そして、更に鋭意研究の結果、既に活性がないと報告されている酵母のポリガラクツロナーゼ遺伝子（配列番号２：図３、図４）から活性を有するポリガラクツロナーゼタンパク質を生産させることに成功した。
【００１４】
活性を有するポリガラクツロナーゼを大腸菌に生産させる場合、宿主として用いられる大腸菌は、チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）とグルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）の活性のない株が適している（例えば、ＯｒｉｇａｍｉＢ（Ｎｏｖａｇｅｎ（株））。また、ベクターとしては発現が制御できる機能を有していることが好ましい。大腸菌発現ベクターとしては、例えばプラスミドｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社）が好適例として挙げられ、そのＳｐｈＩ―ＨｉｎｄＩＩＩサイトに上記ポリガラクツロナーゼ遺伝子の構造遺伝子、それを含有するＤＮＡ断片、又は構造遺伝子のＤＮＡ断片等を挿入、連結し、得られた組換えベクターを宿主に導入すればよい。
【００１５】
これにより、従来より安価にポリガラクツロナーゼタンパク質を得ることが可能となる。
【００１６】
生産されたポリガラクツロナーゼは、３．５〜５．０の至適ｐＨ、及び３０〜５０℃の間の至適温度を示した。その分子量は３５〜４０ｋｄａであり、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列（部分アミノ酸配列）を含むものであった。
【００１７】
また、配列番号１（図１、２）に示す部分アミノ酸配列で２９３番目のアミノ酸セリン（Ｓ）がグリシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号３）を含むポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子を、上記と同様に大腸菌に生産させたところ、３．６〜６．０の至適ｐＨ、及び３０〜５５℃の間の至適温度を示し、分子量３５〜４０ｋｄａのポリガラクツロナーゼ（そのアミノ酸配列を配列番号３に示す）を得ることも可能となった。なお、前者のポリガラクツロナーゼを同Ｗ、後者のポリガラクツロナーゼを同２９３ということもある。
【００１８】
したがって本発明は、配列番号１に示す部分アミノ酸配列を含むポリガラクツロナーゼＷ、及び／又は配列番号１に示す部分アミノ酸配列で２９３番目のアミノ酸Ｓｅｒ（図２において囲まれたＳ）がＧｌｙに置換されたアミノ酸配列（配列番号３）を含むポリガラクツロナーゼ２９３を安価に提供するものである。
【００１９】
また、本発明は、これらのポリガラクツロナーゼタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡも新たに構築し、これらを提供するものであって、配列番号１、３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡは、その塩基配列を配列番号２（図３、図４）及び配列番号４にそれぞれ示した。なお、配列番号４は、配列番号２において、８７７番目の塩基アデニン（図４において囲まれたＡ）をグアニンに置換したものである。
【００２０】
本発明に係るポリガラクツロナーゼ遺伝子は、配列番号１、３のアミノ酸配列で示される酵素タンパク質をコードする遺伝子（ポリガラクツロナーゼ構造遺伝子）のほか、該アミノ酸配列を部分配列として含むタンパク質、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し且つ該酵素活性を有するタンパク質等をコードする遺伝子も広く包含するものであるので、配列番号２、４に示す塩基配列を有するＤＮＡのほか、上記した各種タンパク質に対応する塩基配列を有するＤＮＡ断片も包含される。したがって、本発明に係るポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡは、ポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ構築物ということもあり、例えば、配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、約３５ｋｄａの分子量（ＳＤＳ電気泳動法による）を有するポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ構築物も本発明に包含されるものである。
【００２１】
このようにして得たＤＮＡ又はＤＮＡ構築物は、常法にしたがって、大腸菌発現ベクターに連結し（例えば、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ等のＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結し）、得られた組換えベクターを大腸菌宿主に導入して形質転換して、形質転換体を得、これを培養し、培養物を回収することにより、ポリガラクツロナーゼを得ることができる。本発明で製造されたポリガラクツロナーゼは、活性型であるので、ポリガラクツロン酸を分解することができる。
【００２２】
本発明にしたがい、ポリガラクツロナーゼＷを宿主大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ株に導入した形質転換体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＯｒｉｇａｍｉＢ・Ｗと命名して、Ｗの記号表示にて独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０７として寄託し、またポリガラクツロナーゼ２９３を導入した形質転換体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ・２９３と命名し、２９３の記号表示にて同センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０８として寄託した。
【００２３】
【発明の実施の形態】
上記したように、本発明を実施するには、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する実験室酵母Ｘ２１８０Ａよりポリガラクツロナーゼ遺伝子を得、これを大腸菌発現ベクターにタンパク質発現するように連結する。このポリガラクツロナーゼ発現が可能となった組み換えＤＮＡを大腸菌に形質転換し、大腸菌に生産させる。使用する大腸菌発現ベクターに、特異的アフィニティーカラムに吸着するアミノ酸配列がポリガラクツロナーゼタンパク質に融合可能なものを使用することで、大腸菌で生産させたポリガラクツロナーゼタンパク質を容易に精製できる。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２４】
【実施例１】
（ポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現系の構成（１））
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属するＸ２１８０ＡよりＧｅｎとる君（宝酒造）を用いてゲノムＤＮＡを精製する。このゲノムＤＮＡをｐｒｉｍｅｒ  １（配列番号５：図５）とｐｒｉｍｅｒ  ２（配列番号６：図６）を用いてＰＣＲ法にて増幅する。
【００２５】
（ＰＣＲ条件）
９５℃          １分
５９℃          １分
７２℃          １．５分
サイクル数      ２５回
【００２６】
増幅したＤＮＡ断片（ポリガラクツロナーゼ構造遺伝子：配列番号２）を制限酵素ＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に制限酵素ＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ（株））に連結する。ポリガラクツロナーゼ構造遺伝子を含むｐＱＥ８０Ｌ（組換えベクターｐＱＥ８０Ｌ／Ｗ）を、ＯｒｉｇａｍｉＢ（Ｎｏｖａｇｅｎ（株））に導入する。形質転換されたＯｒｉｇａｍｉＢ：形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ・Ｗ（Ｗ：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０７）をＬ−ｂｒｏｔｈに接種し、増幅させた後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように添加し、タンパク生産のための培養を続ける。その後、遠心集菌し、ＢａｇＢａｓｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ（株））でタンパク質を抽出し、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ（株））を用いて精製を行い、下記表１の至適ｐＨ及び温度を有するポリガラクツロナーゼＷを得た。
【００２７】
2004290003.tif 000002
【００２８】
【実施例２】
（ポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現系の構成（２））
上記実施例と同様にして、ただし、ポリガラクツロナーゼ遺伝子として配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡ、組換えベクターｐＱＥ８０Ｌ／２９３を用い、そして形質転換体、Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ・２９３（２９３：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０８）を用いて、アミノ酸配列の２９３番目のセリンがグリシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号３）を有するポリガラクツロナーゼ２９３を得た。その至適ｐＨ及び至適温度を下記表２に示す。
【００２９】
2004290003.tif 000003
【００３０】
【発明の効果】
酵母等天然に存在するポリガラクツロナーゼ遺伝子をそのまま通常の大腸菌に導入しても発現しなかったのであるが、本発明によってはじめて、ポリガラクツロナーゼの大腸菌（Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ）による生産が可能となり、活性を有するポリガラクツロナーゼを低コストで大量に生産することが可能となった。
【００３１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｘ２１８０のポリガラクツロナーゼのアミノ酸配列を示す。アンダーラインはプライマー１、２に相当する部分（クローニング用に導入された制限酵素部位は除く）を示す。
【図２】同上続きを示す。囲まれた文字は２９３番目のセリン（Ｓ）を示す。
【図３】Ｘ２１８０のポリガラクツロナーゼ遺伝子の塩基配列を示す。アンダーラインはプライマー１、２に相当する部分（クローニング用に導入された制限酵素部位は除く）を示す。
【図４】同上続きを示す。囲まれた文字は、８７７番目のアデニンを示し、これをグアニンにかえることによってアミノ酸配列の２９３番目のセリンはグリシンに置き換わる。
【図５】プライマー１を示す。
【図６】プライマー２を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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