(57)【要約】【課題】神経細胞死を特異的に抑制する神経防御ポリペプチドであるヒューマニン（ＨＮ）を制御または破壊するタンパク質を提供する。【解決手段】アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳およびマウスの睾丸、大腸から免疫ブロット法および免疫組織化学解析により検出されたＨＮペプチドの分析結果からイーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法によりＨＮ結合タンパクとしてＴＲＩＭ１１を同定した。ＴＲＩＭ１１は、Ｔｒｉｐａｒｔモチーフを有し、Ｅ３ユビキチンリガーゼのＲＩＮＧフィンガードメイン、Ｂボックスドメイン、コイルドーコイルドメイン、Ｂ３０．２ドメインから構成され、ユビキチンを介してタンパク分解系路を通して細胞内のＨＮ量を制御していることを明らかにした。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患原因遺伝子及びその変異体に起因する神経細胞死を抑制するポリペプチドを制御または破壊する作用を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
神経変性疾患がアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調１、脊髄小脳性運動失調２、脊髄小脳性運動失調６、脊髄小脳性運動失調７、マチャドージョセフ病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、クロイツフェルトヤコブ病、ゲルストマンーシュトロイスラー症候群、致死的家族性不眠症、家族性イギリス痴呆症、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病様疾患からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
神経変性疾患がアルツハイマー病であって、その原因となる変異を有する遺伝子がアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ），プレセニリン１（ＰＳ１）またはプレセニリン２（ＰＳ２）、の変異型をコードするものであることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
神経細胞死を抑制するポリペプチドがヒューマニン（ＨＮ）およびＨＮ変異体、又はＨＮ誘導体であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記蛋白質が三部モチーフ（ＴＲＩＭ）を有し、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）のＲＩＮＧフィンガードメイン、Ｂ−ｂｏｘ．ドメイン、Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインおよびＢ３０．２ドメインから構成されるタンパク質ファミリーで、神経防御ペプチドを制御、または破壊する作用を有することを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が三部モチーフ（ＴＲＩＭ）を有し、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）のＲＩＮＧフィンガードメイン、Ｂ−ｂｏｘ．ドメイン、Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインおよびＢ３０．２ドメインから構成されるタンパク質ファミリーで、その１１番目のメンバー（ＴＲＩＭ１１）であることを特徴とする請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
ＴＲＩＭ１１は、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）におけるリングフィンガーファミリーに属し、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の活性があることを特徴とする請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
ヒューマニン（ＨＮ）、あるいはＨＮ変異体、あるいはＨＮ誘導体に結合することを特徴とする請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
アミノ酸７６残基からなるタンパク質であるユビキチンを介し、ユビキチン・プロテアソーム経路を通してヒューマニン（ＨＮ）の量を制御することを特徴とする請求項８に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経細胞死を抑制する２４残基のアミノ酸からなる短鎖ペプチドヒューマニン（ＨＮ）に結合し、ＨＮを制御または破壊するタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，以後、ＡＤと略記する）は、認知機能の障害、神経細胞の萎縮・脱落、老人班（ＳｅｎｉｌｅＰｌａｑｕｅｓ）と呼ばれる細胞外沈着、神経原繊維変化などを特徴とする神経変性疾患の一つで、アミロイドβタンパク（Ａβ）の凝集沈着による神経毒性、タウタンパクの異常リン酸化による神経原繊維変化がその原因と言われていたが、直接の原因であるか、結果として現れた（例えば、非特許文献１）。また、ＡＤ治療薬に関してはあくまで対症療法であり、ＡＤ病態の進行を阻止することは期待できない。ＡＤ患者の脳内では神経伝達物質のアセチルコリンが低下しており、現在Ａｃｈエステラーゼ阻害剤が広く実用化されている。（例えば、非特許文献２および特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
西本征央、「日本薬理学会誌」（Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．）、１２０，補冊１，ｐ．１１（２００２）
【０００４】
【非特許文献２】
鍋島、野田、亀井、「日本薬理学会誌」（Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．）、１２０，補冊１，ｐ．２４（２００２）
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−３５６４４０号公報
【０００６】
タンパク質のユビキチン化とそのユビキチン化されたタンパク質のプロテアソームによる分解系は、様々な細胞機能に非常に重要な働きをしている。ユビキチンは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）により活性化され、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）に結合した後、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）へと運ばれる。多くのタンパク質が、その特徴的構造であるＨＥＣＴドメイン或いはＲＩＮＧフィンガードメインを有する事によりＥ３として分類されている（Ｐｉｃｋａｒｔ，２００１）。
【０００７】
ＤＮＡ上の特徴的な短い配列であって、かつ一定の機能を持つ塩基配列を有するモチーフが三部からなるＴｒｉｐａｒｔｉｔｅモチーフ（以後、ＴＲＩＭという）、それはＲＢＣＣとも言われるが、そのモチーフを有するタンパク質ファミリーは、ＲＩＮＧフィンガードメイン、Ｂ−ｂｏｘ．ドメイン、そしてＣｏｉｌｄ−ｃｏｉｌドメインというユニークな構造で特徴づけられる（Ｓａｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｂｏｒｄｅｎ  １９９８；Ｒｅｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。このファミリーのメンバーは、細胞の発生や癌化を含む種々の細胞過程に関与している。また、ＴＲＩＭモチーフを有するアフリカツメガエルの核因子７（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａａｃｔｏｒ７）は、背と腹の形成に決定的な役割を果たすということが報告されている（Ｅｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＰＭＬ−ＰＲＡ・融合タンパクは、急性前骨髄球白血病を誘導するが、ＴＲＩＭ／ＲＢＣＣモチーフはＰＭＬにおいては、プロトオンコジーン機能を果たす事が知られている（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００８】
最近、データーベースにあるデータを組織的に収集することによりその生理的役割は明確ではないが、多くの新規なＴＲＩＭタンパクが同定され、報告されている（Ｒｅｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＴＲＩＭ／ＢＲＲＣモチーフにおいて、Ｂ−ｂｏｘとＣｏｉｌｄ−ｃｏｉｌドメインの両方がマルチタンパク複合体を形成するときのタンパク質間相互作用に関与している事が報告されている（Ｂｏｒｄｅｎ，１９９８，２０００）。また、そのＲＩＮＧフィンガードメインがタンパクのユビキチン化に関与している事も報告されている。
【０００９】
発明者らによって見出されたヒューマニン（Ｈｕｍａｎｉｎ、以後、ＮＨと略記する）は、アルツハイマー病（ＡＤ）に関連した侵害刺激であるＡＤ関連変異体遺伝子やアミロイドβタンパク（Ａβ）および抗アミロイド前駆体タンパク質抗体等による神経細胞死に拮抗する２４のアミノ酸ペプチドからなる新規神経細胞死抑制因子として同定された（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ，ｂ，ｃ）。また、ＨＮは、無血清培養による神経細胞死をも抑制する効果があることが報告されている（Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００１０】
ＨＮペプチドは、初代培養神経および神経細胞株におけるＡＤに関連した神経細胞死を特異的に抑制することが発明者らによって既に明らかにされている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ）。また、ＨＮペプチドは、ＥＲ−Ｇｏｌｇｉ分泌システムを介して分泌され、細胞外から細胞表面に存在するリセプターに結合し何らかのタイロシンカイネースが関与するシグナル経路を使って機能することが知られている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ）。ＨＮのｉｎ  ｖｉｖｏにおける影響としてスコポラミン処理による健忘症モデルマウスの記憶障害を回復させることが観察されている（Ｍａｍｉｙａ  ａｎｄ  Ｕｋａｉ，２００１）。
【００１１】
また、Ｃａｒｉｃａｓｏｌｅ等（２００２）は、ラットＨＮ、ラティンを発見した。ラティンの生化学的特性は、ＨＮと同様の広域スペクトルの神経保護作用に加えて興奮毒に対する神経細胞死をも抑制することが報告されている。この興奮毒に対する神経細胞保護作用は、ＨＮにはないことが明らかにされている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｃ）。ＨＮあるいはＨＮ様タンパクの発現は、ＡＤ患者脳の後頭葉で検出される。しかし、同年令のＡＤ患者でない人の脳からは検出されない。
【００１２】
ＨＮペプチドを特異的に認識する抗−ＨＮ抗体による免疫反応性は３週令マウスの睾丸や大腸にも検出されたが１２週令になると大腸での反応性はなくなり、睾丸にのみに検出された（Ｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。このように、ＨＮに付いて多くのインフォメーションが得られているが、ＨＮ生成の制御についてはほとんど知られていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
係る状況に鑑み、発明者らはＨＮ生成の制御機構を明らかにするための初めての試みとして、広く知られたスクリーニング法であるイーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニング法により、ＨＮと作用するタンパクを探索し、ＴＲＩＭ／ＢＲＲＣファミリーの１１番目のメンバー（以後、ＴＲＩＭ１１と略記する）がプロテオソーム分解経路を介してＨＮを制御または破壊すること、或いは、その可能性が最も高いことを見い出して課題を解決した。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
ＴＲＩＭ１１／ＲＢＣＣファミリーの１１番目のメンバーのＴＲＩＭ１１は、ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方でＨＮと特異的に結合すること、およびＨＮと結合するＴＲＩＭ１１の主な領域は、Ｂ３０．２ＤドメインであることがＴＲＩＭ１１からＢ３０．２Ｄドメインを除去するとＴＲＩＭ１１はＨＮと結合しなくなることから明らかにされた。しかしながら、Ｂ３０．２ドメインだけではＨＮと結合せず、Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインがその結合に必要であることも明かである。また、Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインはいくつかのＴＲＩＭファミリータンパクのホモ２量体化であると言う報告がある。これは、  ＴＲＩＭ１１のＣｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインによるホモ２量体化が、Ｂ３０．２ドメインのＨＮとの結合に必要であることを示唆するものである。
【００１５】
本発明は、ＴＲＩＭ１１の共発現が細胞内ＨＮレベルを大きく減少させることを発見したことで課題を解決した。ＴＲＩＭ１１は、ＲＩＮＧフィンガードメインをＮ末端に持ち、ＲＩＮＧフィンガードメインを含むタンパクはユビキチンＥ３リガーゼとして機能することが知られている。それ故、ＴＲＩＭ１１は、Ｅ３リガーゼとしてＨＮに作用し、その発現を減少させていると推測される。さらに、この結果を裏付けるものとして、プロテアソームインヒビターのラクタシスチンの処理でＨＮ発現レベルへの影響が阻止されることを明らかにした。また、ＴＲＩＭ１１のＲＩＮＧフィンガードメインを壊すと共発現しているＨＮタンパクの細胞内レベルを増加させ、それと一致してＲＩＮＧタイプＥ３であるタイロシンキナーゼ（ｃ−Ｃｂｌ）のＲＩＮＧフィンガードメインのはじめのシステインを含む部分欠損をさせるるか、あるいはシステイン残基を変異させるとＥＧＦレセプターのユビキチン化の欠陥となり、ＥＧＲＦをダウン・レギュレーションする結果となる。以上のことから、ＴＲＩＭ１１がＥ３リガーゼとして細胞内でＨＮ或いはＨＮを含むタンパクをターゲットとし、ＨＮ生成レベルを、プロテアソーム分解経路を介して制御していることを見出した。
【００１６】
ＴＲＩＭ１１ΔＮΔＢ３０をＨＮ融合タンパクと共導入するとＨＮ融合タンパクのレベルはかなり増大する。このＨＮレベルの増大は、ＨＮとＴＲＩＭ１１ΔＮ・ΔＢ３０  が結合しないからである。何故ならば、Ｂ３０．２ＢドメインがＨＮとの結合に必要なドメインだからである。ＴＲＩＭ１１ΔＮ・ΔＢ３０はＢ−ｂｏｘドメインとＣｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインを含み、Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインはホモ２量体化に関わると思われる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の神経細胞株の細胞死を抑制する神経防御ペプチドＨＮを制御または破壊する化合物のスクリーニング法および同定に関して図面を参照して詳細に説明する。
【００１８】
ＨＮをベイトとするイーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニング法により、全長ＴＲＩＭ１１  ｃＤＮＡがマウスｃＤＮＡライブラリーからＮＨに結合するタンパクとしてスクリーニングされた。全長のクローンは、２２６６ｂｐで、その配列は、データベースにあるものと同一であった（Ｇｅｎ−ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＭＮ−０５３１６８）。同じスクリーニングで分離された断片型クローンの中で最短クローンは、ＴＲＩＭ１１のＣ末端側の３８３アミノ酸配列をコードしていた。また、イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムでＨＮとＴＲＩＭ１１との結合は・・ｇａｌアッセイを含む他の幾つかのリポーターアッセイによっても確認された。ＴＲＩＭファミリーの他のメンバーであるＴＲＩＭ２やＴＲＩＭ６はこれ等のアッセイでは、ＨＮと結合しなかった（図１Ａ）。さらに、ＴＲＩＭ１１の全長とＮ末端欠損ＴＲＩＭ１１断片がＭＢＰ−ＨＮと共沈した（図１Ｂ）。この結果は、ＴＲＩＭ１１がＨＮに特異的に結合することを示している。
【００１９】
ＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡは、あらゆるマウス組織に発現している（図２Ａ）。主なバンドは、２．４ｋｂとして観察され、それはＴＲＩＭ１１  ｃＤＮＡのサイズと一致する。二本のマイナーバンド（４．１，１１ｋｂ）もＢ３０．２ドメインを含まない転写解読枠の領域に相当するプローブにより検出された。これら３つのバンドは、Ｅ１４マウス胎児脳、Ｅ１４初代培養大脳皮質神経、Ｆ１１神経細胞に同じプローブか、あるいはＢ３０．２ドメインと塩基配列３’側の翻訳されていない領域に特異的なプローブを用いて検出される（図２Ｂ）。
【００２０】
プロテアソーム分解系による細胞内ＨＮレベルの調節
抗ＨＮ抗体でＨＮ免疫反応性がＡＤ脳の後頭葉神経に既に検出されているので不死化神経細胞であるＦ１１にＨＮとＴＲＩＭ１１ｃＤＮＡの共導入を試みた。
Ｎ末端にＧＳＴを融合し、Ｃ末端にＦＬＡＧを融合したＨＮ（ＧＳＴ−ＨＮ−ＦＬＡＧ）の細胞内レベルは、ＴＲＩＭ１１を共導入すると大きく減少した（図３Ａ）。ＴＲＩＭ２と共導入してもＨＮと結合しないので、ＧＳＴ−ＨＮ−ＦＬＡＧの細胞内発現レベルには何の影響も認められなかった（図３Ｂ）。
【００２１】
ＲＩＮＧフィンガードメインは、Ｅ３ユビキチンリガーゼとしてその機能に関与しているのでプロテアソーム阻害剤を使ってＨＮ細胞内レベルへの影響を確かめた。その結果、２６Ｓプロテアソームの既によく知られた阻害剤であるラクタシスチンで処理すると、ＴＲＩＭ１１の共発現によるＧＳＴ−ＨＮ−ＦＬＡＧレベルの下降は、少しではあるが有意に回復を示した。ＴＲＩＭ１１の導入をしていない時には、同じ処理によってもＧＳＴ−ＨＮ−ＦＬＡＧの細胞内レベルには何の影響もなかった。また、細胞内ＴＲＩＭ１１のレベルは、ラクタシスチンの処理により容量依存的に増加した（図３Ａ）。ＧＳＴ−ＦＬＡＧの発現は、ＴＲＩＭ１１の共発現やラクタシスチンによっては影響されなかった（図３Ｂ）。さらに他のＨＮコンストラクト、Ｃ末端にＥＧＦＴを融合したＨＮ（ＨＮ−ＥＧＦＰ）も、ＴＲＩＭ１１を共発現下、ラクタシスチンの処理によりそのレベルが増加した。一方、ＥＧＦＰのみの発現は、ＴＲＩＭ１１を共発現しても、ラクタシスチンを処理しても影響されなかった（図３Ｃ）。これらの結果は、細胞内ＨＮレベルがＴＲＩＭ１１に関連したプロテオソーム分解系により、制御されていることを示すものである。
【００２２】
ＴＲＩＭ１１のＨＮ結合領域とＨＮ発現への影響
ＴＲＩＭ１１におけるＨＮ結合領域を同定するため、一連のＴＲＩＭ１１が欠損した変異体を作り、その相互作用を確認した。その結果、ＲＩＮＧフィンガードメインの２９アミノ酸残基を除いた欠損変異体はＨＮとの結合に影響はなかった（図４Ａ）。
【００２３】
Ｃｏｉｌｄ−ｃｏｉｌドメインとＢ３０．２ドメインからなるクローン（アミノ酸配列１２６−４６７；そのコンストラクトをＴＲＩＭ−Ｃｏｉｌ−Ｂ３０と名付ける）はＨＮと結合した。この結果は、もともとｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニングで得られたクローンであり納得できる。しかし、ＲＩＮＧフィンガーとＢ−ｂｏｘ（アミノ酸配列３０−１２８）からなるクローンは、ＨＮと結合しなかった。また、Ｂ３０．２ドメインが欠損したクローン（アミノ酸配列３０−２９２；ＴＲＩＭ１１・Ｎ・・Ｂ３０）は、ＴＲＩＭ１１とＨＮのもともとある結合を無効なものとした。一方、Ｂ３０．２ドメインのみのクローン（アミノ酸配列２２６−４６７；ＴＲＩＭ１１−Ｂ３０）は、ＨＮと結合しない。これは、Ｃｏｉｌｄ−ｃｏｉｌドメインとＢ３０．２ドメインの両方が、ＨＮとＴＲＩＭ１１の結合に必要であることを示すものである。また、以上の結果はＧＳＴ−ＨＮ−ＦＬＡＧとＴＲＩＭ１１Ｃｏｉｌｄ−ｃｏｉｌ＋Ｂ３０．２領域を共発現した細胞溶解物を用いＧＳＴプルダウン実験によって確認された。
【００２４】
部分的にＴＲＩＭ１１Ｔ断片をコードするこれらの欠損変異体は、全長ＴＲＩＭ１１と比べて細胞内ＨＮ発現レベルへの影響は少ない（図４Ｂ）。Ｎ末端２７残基を欠損させることによって（そのコンストラクトは、ＴＲＩＭ１１？Ｎと定義する）ＲＩＮＧフィンガードメインを破壊するとＨＮの発現レベルを少しだけ下げる結果となった。また、ＲＩＮＧフィンガードメインとＢ−ｂｏｘドメインの完全な欠損は、（ＴＲＩＭ１１−ｃｏｉｌ−Ｂ３０）ＨＮ発現レベルへの影響を消失させる結果となった。
【００２５】
【実施例】
以下に、実施例で本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００２６】
【実施例１】
イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニング
ＦＬＡＧ−ＨＮｃＤＮＡをｐＤＢＬｅｕ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）のＳｔｕ１サイトにサブクローニングし、バイトコンストラクトとして使用した。イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニングをマウス脳ｃＤＮＡライブラリー（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で実施した。Ｘ−ｇａｌ  アッセイを試薬会社のインストラクションに従いイーストクローンをＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐプレートに植え付け、３０℃で１８時間生育させた。一方でＹＡＰＤプレートにフィルターで複製しておく。フィルターを２４時間インキュベート後、液体窒素で凍らせ、Ｘ−ｇａｌを含むＺバッファーに浸し３７℃で２４時間インキュベートした。
【００２７】
【実施例２】
発現コンストラクトと試薬
ＦＬＡＧ−ＨＮのｃＤＮＡをマルトース結合タンパクと融合させるために、ｐＭＡＬ−ｐ２（ＮＥＢ）の？ｍｎＩサイトに、また、ＥＧＦＰ融合タンパクのためにｐＥＧＦＰ−Ｎ１のＥｃｏＲＩとＫｐｎＩサイトにサブクローニングした。ＧＳＰ融合タンパクには、ＨＮ−ＦＬＡＧｃＤＮＡをまずｐＧＥＸ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。そしてＧＳＴ遺伝子に融合したＨＮ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で増幅した。その時のプライマーとして、５’−ＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＴ−３’（塩基配列１）と、
５’−ＧＴＴＴＴＣＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＡＣ−３’（塩基配列２）、
を使用した。ＰＣＲで増幅された断片を、哺乳類発現プラズミドを作り出すためｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ａ  ベクターのＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩサイトにクローニングした。参照として、ＧＳＴ  ｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ａにクローニングしたものを作製した。次に、全長マウスＴＲＩＭ１１  ｃＤＮＡを発現させるために、ＰＣＲ増幅断片をプライマー、
５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＣ−３’（塩基配列３）、
５’−ＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＴＣ−３’（塩基配列４）、
を使用し、最長ＴＲＩＭ１１  ｃＤＮＡとにより、ＰＣＲで作製した。次にｐＥＦ４−Ｈｉｓ  ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶサイトにｐＰＣ８６（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）のＳａｌＩとＳｍａＩサイトに各々クローニングした。
【００２８】
イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  アッセイのためのＴＲＩＭ１１欠損変異体を以下の様にして作製した。ＴＲＩＭ１１（３０−４６７）とＴＲＩＭ１１（１２６−４６７）は、イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニング中に得られた。ＴＲＩＭ１１（３０−２９２），ＴＲＩＭ１１（３０−１２８）およびＴＲＩＭ１１（２６６−１２８）は、ＴＲＩＭ１１（３０−４６７）の部分を３０−２９２には、
５’−ＴＡＴＡＡＣＧＣＧＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＴ−３’（塩基配列５），
５’−ＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＴＡＴＧＴＣ−３’（塩基配列６），
３０−１２８には、
５’−ＣＴＧＣＡＧＣＧＧＴＣＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧ−３’（塩基配列７）、
また、２６６−４６７には、
５’−ＧＴＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＧＴＡ−３’（塩基配列８），
５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＴＣ−３’（塩基配列９）、
プライマーでそれぞれ増幅する事により得た。そのＰＣＲ断片をｐＰＣ８６のＳａｌＩとＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。哺乳類の発現に使うため、ＴＲＩＭ１１（３０−４６７）をｐｃＤＮＡ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩとＮｏｔＩサイトにクローニングした（ＴＲＩＭ１１・Ｎ）。ＴＲＩＭ１１・・・・・には、ｐＰＣ８６ベクターの・ＴＲＩＭ１１（３０−１２８）断片をｐＥＦ４−ＨｉｓベクターにＥｃｏＲＶとＮｏｔＩサイトを使ってクローニングした。ＴＲＩＭ１１−ｃｏｉｌ−Ｂ３０は、
５’−ＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣ−３’（塩基配列１０）と、
５’−ＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＴＣ−３’（塩基配列１１）、
をプライマーとするＰＣＲで増幅されたものをＰＥＦ４−ＨｉｓのＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。ＴＲＩＭ１１（２６６−４６７）断片はｐＥＦ４−ＨｉｓベクターにＥｃｏＲＶとＮｏｔＩサイトを介してクローニングした。
（ＴＲＩＭ１１−Ｂ３０）。マウスＴＲＩＭ２ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ社）を使用して逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）でマウスＥ１６胎児脳のｔｏｔａｌ  ＲＮＡからプライマーとして、
５’−ＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＧＧＣＧＣＣＡＧ−３’（塩基配列１２）、
５’−ＡＴＣＡＧＴＴＡＣＴＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＴＡＧＡＣ−３’（塩基配列１３）、
を使用してＰＣＲ断片を得て、ｐＰＣ８６とｐＥＦ４−Ｈｉｓベクターの各々ＳａＩＩ−ＮｏｔＩサイトとＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩサイトにクローニングした。また、ヒトのＴＲＩＭ８ｃＤＮＡは正常ヒト海馬のｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ）からプライマーとして、
５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＧ−３’（塩基配列１４），
５’−ＡＣＴＡＧＴＴＡＧＣＴＣＧＴＣＡＣＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧ−３’（塩基配列１５）、
を使い、ＰＣＲで得たｐＰＣ８６にＳｍａＩとＸｂａＩサイトを使ってクローニングした。
【００２９】
【実施例３】
免疫ブロットアッセイ
タンパク試料を１０％ＳＤＳＰＡＧＥで処理してＰＶＤＦ膜の上に移動し、その後、ＰＶＤＦＰ膜を剥がし、処理済みタンパク試料を抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（１／５０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、あるいは抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２，１／５０００，ＳＩＧＭＡ）、あるいは抗ＭＢＰ抗体（１／５０００，ＮＥＢ）、あるいは抗アクチン抗体（１／２５００，ＳＩＧＭＡ）と反応させた。免疫反応性バンドをＨＲＰ結合抗マウス、あるいは抗ラビットＩｇＧ（１／５０００，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を反応させ、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により検出した。
【００３０】
【実施例４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイ
ＣＯＳ７細胞は１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ），抗生物質を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）で培養した。ＣＯＳ７  細胞（１ｘ１０６／１００ｍｍｄｉｓｈ）にプラズミド（５・ｇ）を無血清下でリポフェクション（１０？｜  ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ｔｏ  １０  ・｜ＰＬＵＳ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により導入した。３時間後、培養液を１０％ＦＢＳ  を含むＤＭＥＭに変換した。導入後４８時間細胞をＰＢＳで洗い、細胞溶解液［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ＣＨＡＰＳ］で溶解した。細胞溶解物を４℃で３０分インキュベートし、１００００ｘｇ，２０分遠心分離した。得られた上澄み液を結合実験に使った。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに発現したＭＢＰ融合タンパクをアミロース樹脂（ＮＥＢ）に結合させた。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄後、ＭＢＰ融合タンパク−樹脂複合体をＣＯＳ７細胞溶解物と１時間４℃でインキュベートした。３回細胞溶解液で洗浄後、樹脂上の結合物質をＳＤＳＰＡＧＥサンプルバッファーで分離し、免疫ブロット解析を実施した。
【００３１】
【実施例５】
ＴＲＩＭ１１とＨＮの共発現
ラットＥ１３初代培養神経とマウスニューロブラストーマＮＴＧ１８のハイブリッド細胞であるＦ１１細胞を１８％ＦＢＳ、抗生物質を含むＨａｍ’ｓＦ１２（Ｓｉｇｍａ社）培養液で培養し、Ｆ１１細胞（１．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／６０ｍｍ  ｄｉｓｈ）にプラズミドをリポフェクション（１．２ｇのＴＲＩＭプラズミドと０．８・ｇのＥＧＦＰ、  あるいはＧＳＴプラズミドと４・｜のＰＬＵＳ試薬）により無血清下で導入した。３時間後、培養液に１８％のＦＢＳを補足した。プラズミドを導入後、４２時間で細胞をラクタシスチン（Ｓｉｇｍａ社）と６時間反応させた。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，キレート剤（５ｍＭ  ＥＤＴＡ），界面活性剤（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００），及びプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ社）を含む細胞溶解液で溶解した。１００００ｘｇ，１０分間の条件で遠心分離した後、上澄み液を免疫ブロット分析した。
【００３２】
【実施例６】
Ｎｏｒｔｈａｎブロット分析
ｍＲＮＡをマウスＥ１４初代培養神経、マウスＥ１４脳、およびＦ１１細胞からＩＳＯＧＥＮ（Ｔｏｙｏｂｏ社）とＯｌｉｇｏｔｅｘ  ｄＴ３０＜ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ分離キット（Ｔａｋａｒａ社）により分離した。他のマウス組織のｍＲＮＡサンプルはＯｒｉＧｅｎｅ社から購入した。各ｍＲＮＡ  ２？ｇを１％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｂ，Ｐｏｌｅ社）に移した。ＴＲＩＭ１１  ｃＤＮＡ断片を［Ｐ３２］ｄＣＴＰでＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ    ｒａｎｄｏｍラベリングシステム（ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、メーカーの指示に従い標識した。ブロットを放射線標識したプローブによりＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  ハイブリダイゼーション溶液中（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でハイブリダイズさせた。メーカー指示に従い、２段階の洗浄後、膜をＸ線フィルムに−８０℃で露出させた。
【００３３】
【発明の効果】
本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する神経細胞株の細胞死を抑制する２４アミノ酸ペプチドからなるヒューマニン（ＨＮ）を制御または破戒する化合物であるＴＲＩＭ１１の機能を初めて同定したものである。ＴＲＩＭ１１は、ＨＮと結合し、そしてＨＮを分解する。ＨＮは、ＡＤに関連する損傷を抑制する２４アミノ酸からなる短鎖ペプチドである。それ故、ＨＮはＡＤの明らかな新規療法達成のターゲットである。この発明は、細胞内で合成されたＨＮのレベルがＴＲＩＭ１１により、プロテアソーム経路を介して完全に制御されていることを示したもので、ＴＲＩＭ１１を薬理学的に抑制することは内在性ＨＮとＨＮを含むタンパクの過剰発現を導くことができ、それは、もう一つのＡＤ療法を達成すると言う効果がある。
【００３４】
【配列表】
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【配列表フリーテキスト】
配列番号１：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号２：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号３：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号４：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号５：人工的に合成されたプライマー配列
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配列番号１３：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号１４：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号１５：人工的に合成されたプライマー配列
【図面の簡単な説明】
【図１】イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイによるｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用（Ａ）とプルダウンアッセイによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ相互作用（Ｂ）を示す図である。
【図２】ＴＲＩＭ１１をプローブとしたマウス組織ｍＲＮＡのノーダンブロット分析（Ａ）とＴＲＩＭ１１をプローブとした初代培養Ｅ１４マウス胎児の大脳皮質神経、Ｅ１４マウス胎児脳とＦ１１神経細胞のノーダンブロット分析（Ｂ）を示す図である。
【図３】ＨＮとＴＲＩＭ１１の細胞内レベルに対するプロテアソーム阻害剤の影響を示す図（Ａ，Ｂ，Ｃ）である。
【図４】ＨＮ発現レベルに対するＴＲＩＭ欠陥変異体の影響を示す図（Ａａ，Ａｂ，Ｂ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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