(57)【要約】      （修正有）【課題】特定配列で表されるアミノ酸を有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子多型を検定する方法等の提供。【解決手段】本発明の検定方法またはキットを用いて遺伝子多型を検定することにより、上記特定配列で表されるアミノ酸を有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子多型を検定することができ、該遺伝子またはその機能に関連する疾患（例、癌、肥満症、中枢疾患、内分泌疾患、代謝疾患など）の診断、またはその発症危険性の大きさの予測が可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子多型を検定する方法。
【請求項２】
遺伝子多型が、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位、３９６位、６４８位、７２３位、１０３１位および１０７１位の１または２以上の位置における多型である請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子多型が、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位におけるアデニンからチミンへの置換、３９６位におけるシトシンからグアニンへの置換、６４８位におけるシトシンからチミンへの置換、７２３位におけるシトシンからグアニンへの置換、１０３１位におけるアデニンからグアニンへの置換および１０７１位におけるチミンからシトシンへの置換の１または２以上の位置における置換である請求項１記載の方法。
【請求項４】
遺伝子多型が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位、２４１位および３４４位の１または２以上の位置において、アミノ酸置換を伴う多型である請求項１記載の方法。
【請求項５】
遺伝子多型が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、２４１位におけるセリンからアルギニンへの置換および３４４位におけるグルタミンからアルギニンへの置換の１または２以上のアミノ酸置換を伴う多型である請求項１記載の方法。
【請求項６】
遺伝子増幅法または遺伝子伸長法を用いて遺伝子多型を検定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子の増幅用プライマーおよび（ｉｉ）該遺伝子の野生型検出用プローブならびに多型検出用プローブを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
増幅用プライマーが配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：４で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：５で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：６で表される塩基配列を有するプローブである請求項７記載の方法。
【請求項９】
増幅用プライマーが配列番号：７で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：８で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：９で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：１０で表される塩基配列を有するプローブである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
増幅用プライマーが配列番号：１１で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：１２で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：１３で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：１４で表される塩基配列を有するプローブである請求項７記載の方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子またはその機能に関連する疾患の診断方法または発症危険性の大きさの予測方法。
【請求項１２】
疾患が、癌、肥満症、中枢疾患、内分泌疾患または代謝疾患である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子多型を検定するキット。
【請求項１４】
遺伝子多型が、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位、３９６位、６４８位、７２３位、１０３１位および１０７１位の１または２以上の位置における多型である、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
遺伝子多型が、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位におけるアデニンからチミンへの置換、３９６位におけるシトシンからグアニンへの置換、６４８位におけるシトシンからチミンへの置換、７２３位におけるシトシンからグアニンへの置換、１０３１位におけるアデニンからグアニンへの置換および１０７１位におけるチミンからシトシンへの置換の１または２以上の位置における置換である、請求項１３記載のキット。
【請求項１６】
遺伝子多型が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位、２４１位および３４４位の１または２以上の位置において、アミノ酸置換を伴う多型である請求項１３記載のキット。
【請求項１７】
遺伝子多型が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、２４１位におけるセリンからアルギニンへの置換および３４４位におけるグルタミンからアルギニンへの置換の１または２以上のアミノ酸置換を伴う多型である請求項１３記載のキット。
【請求項１８】
（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子の増幅用プライマーおよび（ｉｉ）該遺伝子の野生型検出用プローブならびに多型検出用プローブを含有することを特徴とする請求項１３記載のキット。
【請求項１９】
さらにＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸を含有する請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
増幅用プライマーが配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：４で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：５で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：６で表される塩基配列を有するプローブである請求項１８記載のキット。
【請求項２１】
増幅用プライマーが配列番号：７で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：８で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：９で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：１０で表される塩基配列を有するプローブである請求項１８記載のキット。
【請求項２２】
増幅用プライマーが配列番号：１１で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：１２で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：１３で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：１４で表される塩基配列を有するプローブである請求項１８記載のキット。
【請求項２３】
癌、肥満症、中枢疾患、内分泌疾患または代謝疾患の診断または発症危険性の大きさの予測のための請求項１３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子多型を検定する方法およびキットに関する。さらには、該遺伝子に関連する疾患（例、癌、肥満症、中枢疾患、内分泌疾患、代謝疾患など）の診断方法などにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子多型は、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られており、また、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は、臨床的に重要であり、現在、各種遺伝子において遺伝子多型が調べられている。一般的に、個体の遺伝子を通常の表現型を有している野生型配列の遺伝子と比較した場合に、両者の遺伝子が同一かまたは異なるか（すなわち、野生型配列と異なる多型配列の存在率）が、特定の疾患に対する罹患の危険性と相関することが知られている。
結腸癌細胞ＣＸ−１株由来のｃＤＮＡからクローニングされたＧ蛋白質結合型レセプタータンパク質であるＴＧＲ２３−１（配列番号：１）およびＴＧＲ２３−２（配列番号：１５）は、胃癌細胞、結腸癌細胞または結腸癌組織において高発現している（特許文献１
ＷＯ  ０２／３１１４５）。
【０００３】
【特許文献１】
ＷＯ  ０２／３１１４５号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
できるだけ早期に、できれば発症前に、罹患する疾患の危険性を正確に検定し、危険性の高い個体を特定し、できるだけ早期に適切な治療を施すことにより発症を予防しまたは軽度にとどめることが望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、（ｉ）ＴＧＲ２３−１またはＴＧＲ２３−２に対するリガンドの刺激により、ＴＧＲ２３−１またはＴＧＲ２３−２発現癌細胞の増殖に関与する細胞内シグナルが増幅し、癌の増殖が促進されること、（ｉｉ）ＴＧＲ２３−１またはＴＧＲ２３−２は中枢における摂食行動に関与する情報伝達を制御していること、（ｉｉｉ）ＴＧＲ２３−１をコードするＤＮＡの塩基配列には、６ヶ所の塩基置換が存在すること、（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）の塩基置換のうち、３ヶ所の置換は、その塩基が含まれるコドンがコードしているアミノ酸の置換を伴うこと、および（ｖ）上記（ｉｖ）のアミノ酸置換のうち、１０７位におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換は、レセプターのリガンドに対する親和性を高くし、レセプターを発現している細胞のリガンド応答性を上昇させることなどを見出した。
これより、上記（ｉｉｉ）の塩基置換および上記（ｉｖ）のアミノ酸置換などは、リガンドのレセプターへの応答性、レセプター細胞内シグナル伝達、レセプター発現量などに影響を与える可能性が予想され、これらの置換の存在が、ＴＧＲ２３−１またはＴＧＲ２３−２が関連する癌または肥満症などに罹患する危険性と相関性がある可能性が予想される。本発明者らは、遺伝子多型と疾患との、より正確な相関を検定する方法を検討し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、（１）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子多型を検定する方法、
（２）  遺伝子多型が、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位、３９６位、６４８位、７２３位、１０３１位および１０７１位の１または２以上の位置における多型である上記（１）記載の方法、
（２ａ）  遺伝子多型が、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位における多型である上記（１）記載の方法、
（３）  遺伝子多型が、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位におけるアデニンからチミンへの置換、３９６位におけるシトシンからグアニンへの置換、６４８位におけるシトシンからチミンへの置換、７２３位におけるシトシンからグアニンへの置換、１０３１位におけるアデニンからグアニンへの置換および１０７１位におけるチミンからシトシンへの置換の１または２以上の位置における置換である上記（１）記載の方法、
（４）  遺伝子多型が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位、２４１位および３４４位の１または２以上の位置において、アミノ酸置換を伴う多型である上記（１）記載の方法、
（４ａ）  遺伝子多型が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位において、アミノ酸置換を伴う多型である上記（１）記載の方法、
（５）  遺伝子多型が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、２４１位におけるセリンからアルギニンへの置換および３４４位におけるグルタミンからアルギニンへの置換の１または２以上のアミノ酸置換を伴う多型である上記（１）記載の方法、
（６）  遺伝子増幅法または遺伝子伸長法を用いて遺伝子多型を検定することを特徴とする上記（１）記載の方法、
（７）  （ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子の増幅用プライマーおよび（ｉｉ）該遺伝子の野生型検出用プローブならびに多型検出用プローブを用いることを特徴とする上記（１）記載の方法、
（７ａ）  プローブが標識されたプローブである上記（７）記載の方法、
（８）  増幅用プライマーが配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：４で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：５で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：６で表される塩基配列を有するプローブである上記（７）記載の方法、
（９）  増幅用プライマーが配列番号：７で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：８で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：９で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：１０で表される塩基配列を有するプローブである上記（７）記載の方法、
（１０）  増幅用プライマーが配列番号：１１で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：１２で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：１３で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：１４で表される塩基配列を有するプローブである上記（７）記載の方法、
（１１）  上記（１）記載の方法を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子またはその機能に関連する疾患の診断方法または発症危険性の大きさの予測方法、
（１２）  疾患が、癌、肥満症、中枢疾患、内分泌疾患または代謝疾患である上記（１１）記載の方法、
（１３）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子多型を検定するキット、
（１４）  遺伝子多型が、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位、３９６位、６４８位、７２３位、１０３１位および１０７１位の１または２以上の位置における多型である、上記（１３）記載のキット、
（１５）  遺伝子多型が、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位におけるアデニンからチミンへの置換、３９６位におけるシトシンからグアニンへの置換、６４８位におけるシトシンからチミンへの置換、７２３位におけるシトシンからグアニンへの置換、１０３１位におけるアデニンからグアニンへの置換および１０７１位におけるチミンからシトシンへの置換の１または２以上の位置における置換である、上記（１３）記載のキット、
（１６）  遺伝子多型が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位、２４１位および３４４位の１または２以上の位置において、アミノ酸置換を伴う多型である上記（１３）記載のキット、
（１７）  遺伝子多型が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、２４１位におけるセリンからアルギニンへの置換および３４４位におけるグルタミンからアルギニンへの置換の１または２以上のアミノ酸置換を伴う多型である上記（１３）記載のキット、
（１８）  （ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子の増幅用プライマーおよび（ｉｉ）該遺伝子の野生型検出用プローブならびに多型検出用プローブを含有することを特徴とする上記（１３）記載のキット、
（１９）  さらにＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸を含有する上記（１８）記載のキット、
（２０）  増幅用プライマーが配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：４で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：５で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：６で表される塩基配列を有するプローブである上記（１８）記載のキット、
（２１）  増幅用プライマーが配列番号：７で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：８で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが配列番号：９で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが配列番号：１０で表される塩基配列を有するプローブである上記（１８）記載のキット、
（２２）  増幅用プライマーが、配列番号：１１で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：１２で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが、配列番号：１３で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが、配列番号：１４で表される塩基配列を有するプローブである上記（１８）記載のキット、
（２３）  癌、肥満症、中枢疾患、内分泌疾患または代謝疾患の診断または発症危険性の大きさの予測のための上記（１３）記載のキットなどに関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
遺伝子多型とは、遺伝子中のある部位において、個体間で２種以上の塩基が存在することをいう。その中のひとつを野生型、野生型とは異なる塩基を有するものを多型という。多型は、エクソンまたはイントロンに存在していてもよく、好ましくは、エクソン内の存在である。
本明細書では、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子（以下、本発明の遺伝子と称することもある）の野生型として、配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡを有する遺伝子を例として挙げる。
本発明の遺伝子の多型としては、配列番号：２で表される塩基配列とは異なる塩基配列を含有するＤＮＡを含有する遺伝子が挙げられる。
上記の配列番号：２で表される塩基配列とは異なる塩基配列としては、（ｉ）該塩基配列中の１〜１００個（例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個）の塩基が欠失した塩基配列、（ｉｉ）  該塩基配列に１〜１００個（例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個）の塩基が付加した塩基配列、（ｉｉｉ）  該塩基配列に１〜１００個（例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個）の塩基が挿入された塩基配列、（ｉｖ）  該塩基配列中の１〜３０個（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜６個）の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、および  （ｖ）  上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせた塩基配列などが挙げられる。
具体的には、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位、３９６位、６４８位、７２３位、１０３１位および（または）１０７１位の塩基が置換された塩基配列が挙げられる。好ましくは３２０位、７２３位および（または）１０３１位の置換である。さらに好ましくは３２０位の置換である。
上記３２０位の置換としては、アデニンからチミンへの置換が好ましい。上記３９６位の置換としては、シトシンからグアニンへの置換が好ましい。上記６４８位の置換としては、シトシンからチミンへの置換が好ましい。上記７２３位の置換としては、シトシンからグアニンへの置換が好ましい。上記１０３１位の置換としては、アデニンからグアニンへの置換が好ましい。上記１０７１位の置換としては、チミンからシトシンへの置換が好ましい。
上記の配列番号：２で表される塩基配列とは異なる塩基配列としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸置換を伴うものが好ましく挙げられる。
上記配列番号：１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸置換としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位、２４１位および（または）３４４位の置換である。さらに好ましくは１０７位の置換である。上記１０７位の置換としては、アスパラギンからイソロイシンへの置換が好ましい。上記２４１位の置換としては、セリンからアルギニンへの置換が好ましい、上記３４４位の置換としては、グルタミンからアルギニンへの置換が好ましい。
【０００８】
本発明の遺伝子がコードするタンパク質（以下、ＴＧＲ２３と称することもある）に対するリガンド（以下、ＴＧＲ２３リガンドと称することもある）の投与により、ヌードマウスに移植した結腸癌細胞の増殖が促進される。これより、ＴＧＲ２３リガンドの刺激により、ＴＧＲ２３発現癌細胞の増殖に関与する細胞内シグナルが増幅し、癌の増殖が促進される。また、ＴＧＲ２３リガンドのラット脳室内投与により、ラットの摂食量が減少する。これより、ＴＧＲ２３は中枢における摂食行動に関与する情報伝達を制御する。従って、ＴＧＲ２３およびＴＧＲ２３リガンドは、例えば癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、拒食症、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの疾病に関連する。
【０００９】
ＴＧＲ２３リガンドとしては、例えば、配列番号：１または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩（以下、本発明のレセプターと称する場合がある）と結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩があげられ、結合の解離定数が、１ｎＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、さらに好ましくは１００ｐＭ以下、特に好ましくは８０ｐＭ以下、最も好ましくは５０ｐＭ以下であるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などが挙げられる。
ＴＧＲ２３リガンドとしては、好ましくは配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある）が挙げられる。該ポリペプチドとしては、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはこれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ、Ｍ１、ＣＴＬＬ−２、ＨＴ−２、ＷＥＨＩ−３、ＨＬ−６０、ＪＯＳＫ−１、Ｋ５６２、ＭＬ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ−１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＴＡＬＬ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、Ｈ９、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＥＬ、ＪＫ−１、ＣＭＫ、ＫＯ−８１２、ＭＥＧ−０１など）に由来するポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチドであってもよい。
【００１０】
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、（ｉ）  配列番号：４６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）  配列番号：４６で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）  配列番号：４６で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）  配列番号：４６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および  （ｖ）  上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などもあげられる。配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性、例えば、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、またはマイトジェン活性化タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）、摂食抑制活性、癌増殖活性などがあげられる。実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に（例、生理学的にまたは薬理学的に）同質であることを示す。
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５０または配列番号：５２で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
【００１１】
本発明のポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどの、本発明のレセプターと特異的に結合する能力を有するポリペプチドがあげられる。
また、本発明のポリペプチドは、後述の本発明のレセプターとの結合活性、本発明のレセプター発現細胞に対する上記細胞刺激活性などを有するポリペプチドのみならず、該結合活性または細胞刺激活性を有するポリペプチドの前駆体ポリペプチドをも包含する意味で用いられる。
該結合活性または細胞刺激活性を有するポリペプチドの前駆体ポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：４１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどがあげられる。
具体的には、配列番号：４１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４１で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
【００１２】
配列番号：４１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、（ｉ）  配列番号：４１で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）  配列番号：４１で表されるアミノ酸配列に１〜１００個（好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）  配列番号：４１で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：４１で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および  （ｖ）  上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１３】
ＴＧＲ２３としては、ＴＧＲ２３リガンドと結合活性を有し、ＴＧＲ２３リガンドによりＴＧＲ２３発現細胞の上記細胞刺激活性が観察されるレセプターなどがあげられる（以下、本発明のレセプターと称することもある。）。
具体例としては、配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩などがあげられる。該タンパク質は、バソトシンレセプター、メソトシンレセプター、イソトシンレセプターまたはオキシトシンレセプターにアミノ酸配列レベルで、約３２〜３６％程度の相同性が認められる７回膜貫通型レセプタータンパク質である。さらには、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ＷＯ  ０１／１８２０６）、配列番号：３４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ＷＯ  ０１／４８１８８）、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ＷＯ  ０１／４８０１５）、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（特開２００１−２４５６６６）なども、本発明のポリペプチドに対するレセプターとして用いられる。
本発明のレセプターは、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞〔例えば、網膜細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、白血球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞株（ＧＩ−１０１など）、結腸癌細胞株（ＣＸ−１、ＧＩ−１１２、ＣＯＬＯ  ２０５、ＬｏＶｏ、ＣＯＬＯ  ２０１、ＳＷ  ４０３、ＳＮＵ−Ｃ１、ＨＴ−２９、ＬＳ  １７４Ｔ、ＬＳ  １８０、ＳＫ−ＣＯ１など）、胃癌細胞株（ＫＡＴＯＩＩＩなど）、肺癌細胞株（ＬＸ−１、ＧＩ−１１７など）、卵巣癌細胞株（ＧＩ−１０２など）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３など）など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ、Ｍ１、ＣＴＬＬ−２、ＨＴ−２、ＷＥＨＩ−３、ＨＬ−６０、ＪＯＳＫ−１、Ｋ５６２、ＭＬ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ−１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＴＡＬＬ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、Ｈ９、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＥＬ、ＪＫ−１、ＣＭＫ、ＫＯ−８１２、ＭＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【００１４】
配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。具体的には、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、（１）（ｉ）  配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）  配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）  配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）  配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および
（ｖ）  上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列、および（２）（ｉ）  配列番号：１７または配列番号：１９で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）  配列番号：１７または配列番号：１９で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）  配列番号：１７または配列番号：１９で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）  配列番号：１７または配列番号：１９で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および（ｖ）  上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる。
【００１５】
本発明のレセプターの具体例としては、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｉ）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｖ）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｖ）配列番号：３２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｖｉ）配列番号：３６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｖｉｉ）配列番号：７２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｖｉｉｉ）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｘ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘ）配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｉ）配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが挙げられる。
【００１６】
本発明のレセプターの部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、好ましくは、本発明のポリペプチドに対する結合能を有する部分ペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含有する部分ペプチド等が用いられる。
具体的には、配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中、５０番目（Ｔｈｒ）〜３３５番目（Ｓｅｒ）で表される部分アミノ酸配列から選択される１または２以上の部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチドなどがあげられる。
【００１７】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドは、公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたもの、または酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドは、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや温血動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１８】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチド（それらのアミド体、それらの塩も含む）の合成には、通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、レセプター、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１９】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２０】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００２１】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチド、レセプターまたは部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチド、レセプターまたは部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望のポリペプチド、レセプターまたは部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２２】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはレセプターの部分ペプチドについては、レセプターを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法があげられる。
（ｉ）Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  および  Ｍ．Ａ．  Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス  （Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６６年）（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、  丸善（株）  （１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明  および榊原俊平、生化学実験講座  １、  タンパク質の化学ＩＶ、  ２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチド、レセプターまたは部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するもの（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）であればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
【００２３】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば（ｉ）配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７または配列番号：４９で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７または配列番号：４９で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号：４０で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または（ｉｖ）配列番号：４０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７または配列番号：４９で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７または配列番号：４９で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
配列番号：４０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号：４０で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００２４】
具体的には、（ｉ）  配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４３で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、（ｉｉ）  配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４５で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、（ｉｉｉ）  配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４７で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、（ｉｖ）  配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４９で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、  （ｖ）  配列番号：４１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４０で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
【００２５】
本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：１６で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：２または配列番号：１６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のレセプターと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：２または配列番号：１６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば、それぞれ配列番号：２または配列番号：１６で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。例えば、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：７３、配列番号：２９または配列番号：３１で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドで表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：３５で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：３９で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、（ｉｉ）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：１６で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：２７で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、（ｉｉｉ）配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：１８で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、（ｉｖ）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：２０で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、（ｖ）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：２２で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：２５で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：２６で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、（ｖｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：２４で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、（ｖｉｉ）配列番号：３２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：３３で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、（ｖｉｉｉ）配列番号：３６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：３７で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、（ｉｘ）配列番号：７２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：７３で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、（ｘ）配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：２９で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、（ｘｉ）配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：３１で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
【００２６】
本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：１６で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドの部分塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号：２または配列番号：１６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のレセプターと実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分塩基配列を有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
配列番号：２または配列番号：１６で表される塩基配列とハイブリダイズできるポリヌクレオチドは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
また、本発明のレセプターの部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしてより具体的には、配列番号：１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中、５０番目（Ｔｈｒ）〜３３５番目（Ｓｅｒ）で表される部分アミノ酸配列から選択される１または２以上の部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、またはこれらとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどがあげられる。
【００２７】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチド（以下、これらポリペプチドなどをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらポリペプチドなどを単に本発明のポリペプチドと略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の置換は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００２８】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがあげられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ  細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１３，  ２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００２９】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６，  ４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  １９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明のポリペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００３０】
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００３１】
配列番号：２で表される塩基配列の３２０位の塩基が置換された塩基配列としては、配列番号：１６、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：３１または配列番号：３７で表される塩基配列などが挙げられる。
配列番号：２で表される塩基配列の３９６位の塩基が置換された塩基配列としては、配列番号：２６で表される塩基配列などが挙げられる。
配列番号：２で表される塩基配列の６４８位の塩基が置換された塩基配列としては、配列番号：１６、配列番号：２５、配列番号：２９または配列番号：３１で表される塩基配列などが挙げられる。
配列番号：２で表される塩基配列の７２３位の塩基が置換された塩基配列としては、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２９または配列番号：３１で表される塩基配列などが挙げられる。
配列番号：２で表される塩基配列の１０３１位の塩基が置換された塩基配列としては、配列番号：１６、配列番号：２４、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１または配列番号：３３で表される塩基配列などが挙げられる。
配列番号：２で表される塩基配列の１０７１位の塩基が置換された塩基配列としては、配列番号：１６、配列番号：２４、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１または配列番号：３３で表される塩基配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列としては、配列番号：１５、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：３０または配列番号：３６で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列の２４１位のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列としては、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２８または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列の３４４位のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列としては、配列番号：１５、配列番号：２３、配列番号：２８、配列番号：３０または配列番号：３２で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
【００３２】
以下に、本発明の遺伝子の遺伝子多型を検定する方法について詳述する。
遺伝子多型を検出する方法としては、例えば、サザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法、ジデオキシ塩基配列決定法、ＤＮＡ増幅手法を組み合わせた検出法〔例、ＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ：  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法、ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（ＳＳＯ：  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＣＲ−ＳＳＯおよびドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法、ＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）法、ＡＳＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法など〕などが挙げられる。
検出対象となるＤＮＡは、本発明の遺伝子を含むＤＮＡであればいずれのものでもよく、全長ＤＮＡでも部分ＤＮＡでもよい。該ＤＮＡは、ヒトに由来するＤＮＡであればよく、例えば、血液、毛髪、生体材料組織、手術切除組織、細胞株などの生体試料から抽出することができる。
上記抽出方法は、公知の方法に従って行えばよく、例えば、自動核酸分離装置ＮＡ−１０００（倉敷紡績（株））、ゲノム抽出キット（キアゲン（株））を用いて行う。
遺伝子多型を検出する方法は、公知の遺伝子増幅法、遺伝子伸長法と組み合わせて行うと、より簡便で、容易で、感度および精度の高い検出が可能となる。本発明の遺伝子の遺伝子多型位置を含むＤＮＡ断片を、遺伝子増幅法または遺伝子伸長法により、増幅または伸長する。遺伝子伸長法を用いる場合は、あらかじめ、ＤＮＡ断片を増幅させておいてもよい。
遺伝子増幅法としては、例えば、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）、ＬＣＲ法（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＲ法（Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ）などが挙げられる。
遺伝子伸長法としては、例えば、ＡＲＭＳ法に準じた方法などが挙げられる。
塩基配列の解析は、例えば、塩基配列の配列決定法、ハイブリダイゼーション法、制限酵素利用法、電気泳動などを用いて行う。
【００３３】
本発明の遺伝子の遺伝子多型を検定する方法としては、例えば、本発明の遺伝子多型部位を含む遺伝子断片を増幅させる際に、標識（例、蛍光色素およびクェンチャーなどによって標識）した野生型検出用プローブおよび多型検出用プローブを用いて遺伝子多型を検定する方法などが挙げられる。
具体例としては、ヒト生体試料からＤＮＡを抽出し、本発明の遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片の増幅用に設計されたプライマー（増幅用プライマー）（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼおよび４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を用いて増幅する。増幅の際、野生型検出用プローブおよび多型検出用プローブを共存させる。該野生型検出用プローブおよび多型検出用プローブは、あらかじめ野生型および多型のそれぞれに特異的な蛍光色素およびクェンチャーにより標識しておく。この反応中に、プローブが、野生型ＤＮＡまたは多型ＤＮＡとハイブリダイズすることにより、プローブから蛍光色素が遊離し、野生型および多型のそれぞれに特異的な蛍光が検出される。これを利用して野生型か多型かを判定する。
増幅用プライマーは、試料となるＤＮＡ（センス鎖、アンチセンス鎖）を鋳型として、所望の多型部位を含む領域を有する部分ＤＮＡを増幅できるように設計する。ヒトＤＮＡに特異的であり、他の遺伝子と相同ではない（例、繰り返し配列ではない、パリンドローム配列ではない）ものが好ましい。
増幅用プライマーの塩基長は、例えは、約１５〜３５、好ましくは約２０〜３０である。増幅されるＤＮＡ領域は、プローブとの反応が容易に確認できる領域が好ましい。
増幅用プライマーとしては、配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：７で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：８で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：１１で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：１２で表される塩基配列を有するプライマーなどが好ましく用いられる。
増幅プライマーは、公知の方法で製造でき、例えば、ＤＮＡ自動合成機などを利用して合成する。
【００３４】
野生型検出用プローブおよび多型検出用プローブとしては、本発明の遺伝子の多型部位を含むものが好ましい。例えば、１０〜４０塩基、好ましくは１０〜２０塩基からなる塩基配列である。該プローブとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡが用いられる。
野生型検出用プローブとしては、配列番号：５で表される塩基配列を有するプローブ、多型検出用プローブとしては、配列番号：６で表される塩基配列を有するプローブが好ましい。
野生型検出用プローブとしては、配列番号：９で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブとしては、配列番号：１０で表される塩基配列を有するプローブが好ましい。
野生型検出用プローブとしては、配列番号：１３で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブとしては、配列番号：１４で表される塩基配列を有するプローブが好ましい。
野生型検出用プローブおよび多型検出用プローブは、公知の方法で製造、精製する。
野生型検出用プローブおよび多型検出用プローブは、それぞれに特異的な蛍光色素によって標識されるのが好ましい。例えば、ＶＩＣＴＭ、ＦＡＭＴＭ、クェンチャーなどで標識する。
【００３５】
好ましい具体例を以下に示す。
ヒト生体試料からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ断片を、増幅用プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を用いて増幅する。増幅の際、野生型検出用プローブおよび多型検出用プローブを共存させる。野生型検出用プローブは、５’末端をＶＩＣＴＭにより、また３’末端をクェンチャーにより標識しておく。多型検出用プローブは、５’末端をＦＡＭＴＭにより、また３’末端をクェンチャーにより標識しておく。増幅反応中に各プローブが野生型ＤＮＡまたは多型ＤＮＡとハイブリダイズすることにより各プローブから蛍光色素が遊離し、野生型または多型のそれぞれに特異的な蛍光が検出される。これを利用して野生型か多型かを検定する。
上記方法において、（１）増幅用プライマーが、配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：４で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが、配列番号：５で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが、配列番号：６で表される塩基配列を有するプローブである、配列番号：２で表される塩基配列の３２０位におけるアデニンからチミンへの置換を検出する方法、
（２）増幅用プライマーが、配列番号：７で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：８で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが、配列番号：９で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが、配列番号：１０で表される塩基配列を有するプローブである、配列番号：２で表される塩基配列の７２３位におけるシトシンからグアニンへの置換を検出する方法、
（３）増幅用プライマーが、配列番号：１１で表される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号：１２で表される塩基配列を有するプライマー、野生型検出用プローブが、配列番号：１３で表される塩基配列を有するプローブ、および多型検出用プローブが、配列番号：１４で表される塩基配列を有するプローブである、配列番号：２で表される塩基配列の１０３１位におけるアデニンからグアニンへの置換を検出する方法などが好ましい。
中でも好ましいのは、上記（１）の配列番号：２で表される塩基配列の３２０位におけるアデニンからチミンへの置換を検出する方法である。
【００３６】
本発明の遺伝子の遺伝子多型を検定するためのキットは、増幅用プライマー、野生型検出用プローブ、多型検出用プローブなどを含有してなるものである。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸などを含有していてもよい。
【００３７】
本発明の遺伝子の遺伝子多型を検定する方法または本発明の遺伝子の遺伝子多型を検定するためのキットを用いて、遺伝子多型を検定することにより、本発明の遺伝子またはその機能の関連する疾患〔例、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、拒食症、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）など〕などの危険にある素因を診断することができる。また、本発明の遺伝子に関連する疾患〔例、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、拒食症、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）など〕の発症する危険性（発症危険性）の大きさの予測方法も提供する。発症する危険性の大きさの予測とは、発症する可能性の他に、既に発症しかかっているヒトが将来的に、どのような症状を有するようになるかをも含めて予測することを意味する。
また、本発明の遺伝子の遺伝子多型を検定する方法または本発明の遺伝子の遺伝子多型を検定するためのキットを用いて、遺伝子多型を検定することにより、本発明の遺伝子の関連する疾患〔例、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、拒食症、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）など〕の治療に当り、有効な薬物の選択および投与する薬物の有効量の予測が可能になる。
【００３８】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ    ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ  ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ        ：アデニン
Ｔ        ：チミン
Ｇ        ：グアニン
Ｃ        ：シトシン
Ｉ  ：イノシン
Ｒ  ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ  ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ  ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ  ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ  ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ  ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ  ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ  ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ  ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ  ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしく
はチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ          ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ      ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ          ：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ          ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ        ：ジイソプロピルエチルアミン
ＢＳＡ          ：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳ      ：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニ
オ〕−１−プロパンスホナート
Ｇｌｙ又はＧ    ：グリシン
Ａｌａ又はＡ    ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ    ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ    ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ    ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ  ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ  ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ  ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ  ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ  ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ  ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ  ：リジン
Ａｒｇ又はＲ  ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ  ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ  ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ  ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ  ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ  ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ  ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ  ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ）    ：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ          ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｐｂｆ          ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン
−５−スルホニル
Ｃｌｔ          ：２−クロロトリチル
Ｂｕｔ            ：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ）    ：メチオニンスルフォキシド
ＰＡＭ          ：フェニルアセトアミドメチル
ＤＩＰＣＩ      ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル
ＨＯＡｔ        ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＰｙＡｏｐ      ：７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリスピロ
リジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェイト
ＤＩＰＣＤＩ    ：１，３−ジイソプロピルカルボジイミド
Ｎｌｅ          ：ノルロイシン（２−アミノヘキサン酸）
ＰＭＳＦ        ：フェニルメタンスルホニルフルオライド
Ｃｌ−Ｚ          ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ：
（４Ｓ，５Ｒ）−３−（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２，２，５−トリメチル−オキサゾリジン−４−カルボン酸
［（４Ｓ，５Ｒ）−３−（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２，２，５−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ  ）］
【００３９】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ＴＧＲ２３−１（ヒトＴＧＲ２３−１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ＴＧＲ２３−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。（５’末端にＶＩＣＴＭを、３’末端にＴａｑＭａｎＲＭＧＢプローブに用いられるクェンチャーを標識した。）
〔配列番号：６〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。（５’末端にＶＩＣＴＭを、３’末端にＴａｑＭａｎＲＭＧＢプローブに用いられるクェンチャーを標識した。）
〔配列番号：７〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。（５’末端にＶＩＣＴＭを、３’末端にＴａｑＭａｎＲＭＧＢプローブに用いられるクェンチャーを標識した。）
〔配列番号：１０〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。（５’末端にＦＡＭＴＭを、３’末端にＴａｑＭａｎＲＭＧＢプローブに用いられるクェンチャーを標識した。〕。
〔配列番号：１１〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。（５’末端にＶＩＣＴＭを、３’末端にＴａｑＭａｎＲＭＧＢプローブに用いられるクェンチャーを標識した。〕。
〔配列番号：１４〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。（５’末端にＦＡＭＴＭを、３’末端にＴａｑＭａｎＲＭＧＢプローブに用いられるクェンチャーを標識した。〕。
〔配列番号：１５〕
ＴＧＲ２３−２（ヒトＴＧＲ２３−２）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ＴＧＲ２３−２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ＴＧＲ２３−１Ａ（ヒトＴＧＲ２３−１Ａ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＡをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
ＴＧＲ２３−１Ｂ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＢをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
ヒト結腸癌細胞ＬＳ  １７４Ｔ由来ＴＧＲ２３−１Ｃ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
ヒト結腸癌細胞ＬＳ  １７４Ｔ由来ＴＧＲ２３−１ＣをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
ヒト結腸癌細胞ＬＳ  １８０由来ＴＧＲ２３−１Ｄ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｄ）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：２４〕
ヒト結腸癌細胞ＬＳ  １８０由来ＴＧＲ２３−１ＤをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
ヒト胃癌細胞ＫＡＴＯＩＩＩ由来ＴＧＲ２３−１Ｃ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
ヒト視床下部由来ＴＧＲ２３−１ＣをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
ＴＧＲ２３−２（ヒトＴＧＲ２３−２）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
ＴＧＲ２３−１Ｅ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｅ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２９〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＥをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
ＴＧＲ２３−１Ｆ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｆ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３１〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＦをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示す。（ＷＯ  ０１／１８２０６）
〔配列番号：３３〕
配列番号：３２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
【００４０】
〔配列番号：３４〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示す。（ＷＯ  ０１／４８１８８）
〔配列番号：３５〕
配列番号：３４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示す。（ＷＯ  ０１／４８０１５）
〔配列番号：３７〕
配列番号：３６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示す。（特開２００１−２４５６６６）
〔配列番号：３９〕
配列番号：３８で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド前駆体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４２〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４３〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１５）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４５〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１５）をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１４）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４７〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１４）をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４９〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：５０〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１６）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５１〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１６）をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：５２〕
［Ｎｌｅ１０，Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５３〕
以下の参考例１６などにおけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
以下の参考例１６などにおけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
以下の参考例１および参考例６におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５６〕
以下の参考例１および参考例６におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：５７〕
以下の参考例２、参考例７、参考例１７、参考例２５および参考例２８で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５８〕
以下の参考例２、参考例７、参考例１７、参考例２５および参考例２８で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
以下の参考例２、参考例７、参考例１７、参考例２５および参考例２８で使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：６０〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＡをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＡをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６２〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＣをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６３〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＣをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６４〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＤをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６５〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＤをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６６〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＢをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６７〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＢをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６８〕
実施例３９においてヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡを増幅するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６９〕
実施例３９においてヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡを増幅するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７０〕
参考例２７および参考例２８で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：７１〕
参考例２７および参考例２８で用いられたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【００４１】
後述の参考例２２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ｈＴＧＲ２３−１Ａは、２００２年６月２７日から茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０９２として寄託されている。
後述の参考例２３で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ｈＴＧＲ２３−１Ｂは、２００２年６月２７日から茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０９３として寄託されている。
後述の参考例２２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ｈＴＧＲ２３−１Ｃは、２００２年６月２７日から茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０９４として寄託されている。
後述の参考例２２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ｈＴＧＲ２３−１Ｄは、２００２年６月２７日から茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０９５として寄託されている。
【００４２】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
以下で取得されたヒトＴＧＲ２３−１、ヒトＴＧＲ２３−２、ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１ＤをヒトＴＧＲ２３と略すこともある。ヒトＴＧＲ２３には、上記タンパク質の変異体も含まれることもある。また、これらヒトＴＧＲ２３をコードする遺伝子をヒトＴＧＲ２３遺伝子と称することもある。
【００４３】
実施例１
ヒトＴＧＲ２３をコードする遺伝子の遺伝子多型の同定
ＴａｑＭａｎＲ法を利用して、ヒトＴＧＲ２３をコードする遺伝子に存在する３個の１塩基多型（ＳＮＰ）の同定を、ヒトゲノムＤＮＡに対して行なった。これら３個のＳＮＰは、配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡの３２０位におけるアデニンからチミンへの置換、７２３位におけるシトシンからグアニンへの置換および１０３１位におけるアデニンからグアニンへの置換であり、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１０７位におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、２４１位におけるセリンからアルギニンへの置換および３４４位におけるグルタミンからアルギニンへの置換のアミノ酸置換をもたらす。
３種類のＳＮＰ同定用のプローブとプライマーセットは、これら３個のＳＮＰをそれぞれ含むヒトゲノムＤＮＡ塩基配列を基にして、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＡｓｓａｙ−ｂｙ−ＤｅｓｉｇｎＳＭ  Ｓｅｒｖｉｃｅにより合成した。  ３２０位におけるＳＮＰの同定用４０倍アッセイミックスは、各３６μＭの２種のＰＣＲプライマー（配列番号：３および配列番号：４）および各８μＭの２種のプローブ（配列番号：５および配列番号：６）を含む。
７２３位におけるＳＮＰの同定用４０倍アッセイミックスは、各３６μＭの２種のＰＣＲプライマー（配列番号：７および配列番号：８）および各８μＭの２種のプローブ（配列番号：９および配列番号：１０）を含む。
１０３１位におけるＳＮＰの同定用４０倍アッセイミックスは、各３６μＭの２種のＰＣＲプライマー（配列番号：１１および配列番号：１２）および各８μＭの２種のプローブ（配列番号：１３および配列番号：１４）を含む。
ヒトゲノムＤＮＡ  ２０検体のＴＧＲ２３遺伝子の３２０位、７２３位および１０３１位のアリルタイプを、ＴａｑＭａｎＲ法により決定した。ここで用いたヒトゲノムＤＮＡは、ＤＣＡ（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｃｃｅｓｓ）によりインフォームドコンセントが確認された健常白人の全血液から調製した。１ウェルのＰＣＲ反応液の組成は、１２．５μｌのＴａｑＭａｎＲＰＣＲ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．６２５μｌのＳＮＰ同定用４０倍アッセイミックス、１μｌのヒトゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）および１０．８７５μｌの蒸留水からなる。ＳＮＰ同定のためのＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐＲＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、５０℃で２分間の保温の後、９５℃で１５秒と５８℃で１分間のサイクルを４０回繰り返す条件で行なった。反応ウェルの蛍光の測定とアリルタイプの解析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＲ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なった。
ＴａｑＭａｎＲＳＮＰ同定法により決定したヒトゲノムＤＮＡ  ２０検体のＴＧＲ２３遺伝子の３２０位、７２３位および１０３１位のアリルタイプを、表１に示す。
【００４４】
【表１】
2004275071.tif 000002
【００４５】
参考例１
ＴＧＲ２３−２発現（以下、ヒトＴＧＲ２３−２を、単にＴＧＲ２３−２と称することもある）ＣＨＯ細胞の作成
ＷＯ  ０２／３１１４５号公報の実施例１で得られたプラスミドｐＴＢ２１７４を鋳型とし、Ｓａｌ  Ｉ認識配列を付加したプライマー１（配列番号：５５）およびＳｐｅ  Ｉ認識配列を付加したプライマー２（配列番号：５６）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記プラスミド１０  ｎｇを鋳型として使用し、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）２．５  Ｕ、プライマー１（配列番号：５５）およびプライマー２（配列番号：５６）を各１．０μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および反応液に２  Ｘ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（宝酒造）を２５μｌ加え、５０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・６０秒の後、９５℃・６０秒、５５℃・６０秒、７２℃・７０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・１０分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応産物をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（インビトロジェン社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）へサブクローニングした。これをＥ．  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（インビトロジェン社）に導入し、ｐＴＢ２１７４に含まれるＴＧＲ２３−２のｃＤＮＡを持つクローンをカナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。ここで得られた、５’側および３’側にＳａｌ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉがそれぞれ認識する配列を付加したＴＧＲ２３−２が導入されたプラスミドによって形質転換されたＥ．  ｃｏｌｉのクローンよりＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素Ｓａｌ  Ｉ  およびＳｐｅ  Ｉで切断してインサート部分を切り出した。インサートＤＮＡは電気泳動後、アガロースゲルより切り出し、次にＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて回収した。このインサートＤＮＡをＳａｌ  Ｉ  およびＳｐｅ  Ｉで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  Ｖｏｌ．  １２１９，  ｐｐ．  ２５１−２５９（１９９４）記載のｐＡＫＫＯ１．１１Ｈと同一のベクタープラスミド）に加え、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いてライゲーションを行ない、蛋白発現用プラスミドｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−２を構築した。このｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−２で形質転換したＥ．  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いてｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−２のプラスミドＤＮＡを調製した。ハムスターＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ｗｉｔｈ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １２５７１）でファルコンディッシュ（径３．５  ｃｍ）に１  ｘ  １０５個播種し、５％  ＣＯ２インキュベーターで３７℃一晩培養した。上記発現プラスミドｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−２  ＤＮＡ  ２μｇをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＦｕＧＥＮＥ  ６  （Ｒｏｃｈｅ社）を用い、添付説明書記載の方法に従ってトランスフェクトし、１８時間培養後新鮮な増殖培地に交換した。さら��１０時間培養を続けたのち、トランスフェクトした細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理により集め、選択培地（１０％  透析牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １２５６１））を用いて平底９６穴プレート１０枚に播種した。３〜４日ごとに選択培地を交換しながら培養を続け、２〜３週間後にコロニー状に増殖してきたＤＨＦＲ＋  細胞クローンを７９個取得した。
【００４６】
参考例２
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞株のＴＧＲ２３−２発現量の定量
参考例１で得たＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞株７９クローンを、９６ウェルプレートに培養し、ＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５０〜２００  ｎｇを  ＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  （ＰＥバイオシステムズ社）を用いて、逆転写反応を行なった。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５〜２０  ｎｇ相当の逆転写産物、または後に述べるようにして作製した標準ｃＤＮＡ、１ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズ社）、プライマー（配列番号：５７）およびプライマー（配列番号：５８）各５００  ｎＭ、およびＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：５９；Ｆａｍ−ａｃｃｔｇｇｔｔｔｇ  ｃｃｇａｇｔｇｇｔｃ  ｃｇｃｔａｔｔｔ−Ｔａｍｒａ；配列中、Ｆａｍは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔａｍｒａは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  をそれぞれ示す）  １００  ｎＭを含む反応混合液２５μｌについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分で処理後、９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。
標準ｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＢ２１７４の２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を算出し、正確なコピー数を算出した後、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で希釈し、２コピーから２ｘ１０６コピーの標準ｃＤＮＡ溶液を調製した。また、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ用プローブおよびプライマーはＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０）（ＰＥバイオシステムズ社）により設計した。
発現量はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、標準ｃＤＮＡの初期濃度の対数値を横軸にとり、標準曲線を作成した。標準曲線より各逆転写産物の初期濃度を算出し、各クローンのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ当たりのＴＧＲ２３−２遺伝子発現量を求めた。その結果、ＴＧＲ２３−２の発現が高かったＣＨＯ細胞株２１個を選択し２４ウェルプレートに培養した。これらの細胞について、ＴＧＲ２３−２の発現量を再検した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した後、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮａｓｅ処理をした。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、上記と同様に逆転写反応し、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法で各クローンのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ当たりのＴＧＲ２３−２遺伝子発現量を求めた。その結果、ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞株クローン５３と５８が高い発現量を示すことがわかった。
以後の参考例では、これら２つのクローンの発現細胞を用いた。
【００４７】
参考例３
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ産生促進／抑制活性の測定
参考例１で作製し、参考例２で選択したＣＨＯ／ＴＧＲ２３−２細胞を２４穴プレートに７  ｘ  １０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養した。細胞を０．２  ｍＭ  ３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％  ＢＳＡと２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むαＭＥＭ培地（ｐＨ  ７．５）で洗浄した（以下、０．２  ｍＭ  ３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％  ＢＳＡと２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むαＭＥＭ培地（ｐＨ  ７．５）を反応用バッファーと記す）。その後０．５  ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに０．２５  ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、試料と２μＭフォルスコリンを含む０．２５  ｍｌの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で３０分間反応させた。反応液を除き、ｃＡＭＰ  ＥＩＡキット（アプライドバイオシステム）付属の細胞溶解液を０．５  ｍｌ添加して細胞内のｃＡＭＰを抽出した。抽出液中のｃＡＭＰ量は、同キットを用いて定量した。この測定値をもとにして、産生促進／抑制活性を以下に示した式で計算し、％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌで表した。試料添加群の活性はそれぞれのプレート毎に設置した対照の値を用いて算出した。
％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＝  （Ｘ−Ｃ）／（Ｔ−Ｃ）ｘ１００
Ｘ：試料添加群のｃＡＭＰ量
Ｔ：正対照（試料無添加、フォルスコリン刺激あり）の３  ｗｅｌｌのｃＡＭＰ量の平均値
Ｃ：負対照（試料無添加、フォルスコリン刺激なし）の２  ｗｅｌｌのｃＡＭＰ量の平均値
【００４８】
参考例４
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞を用いたアラキドン酸代謝産物遊離促進活性の測定
参考例１で作製し、参考例２で選択したＣＨＯ／ＴＧＲ２３−２細胞を２４穴プレートに５  ｘ  １０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。培地を除去し、０．５μＣｉ／ｍｌ  ［３Ｈ］−アラキドン酸と１０％  透析ＦＢＳと２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳと０．５％  ＢＳＡを添加したαＭＥＭ培地（ｐＨ  ７．４）を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、培養器で１６時間保温した。［３Ｈ］−アラキドン酸を含む培養液を除き、２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳと０．５％  ＢＳＡを添加したαＭＥＭ培地（ｐＨ  ７．４）を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、培養器で４時間保温した。培養液を除き、０．０５％  ＢＳＡと２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  を添加したハンクス氏液（ｐＨ  ７．４）を用い、７５０μｌ／ｗｅｌｌで２回洗浄した（以下、０．０５％  ＢＳＡと２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  を添加したハンクス氏液（ｐＨ  ７．４）を反応用バッファーと記す）。洗浄後、７５０μｌ／ｗｅｌｌの反応用バッファーを細胞に加え、培養器で４０分間保温した。反応用バッファーを除き、新たに２５０μｌの反応用バッファーを添加した後、試料と２５０μｌの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で４０分間反応させた。反応後、上清３５０μｌを分取し、液体シンチレーターを３  ｍｌ加えて放射活性を測定した。この測定値をもとにしてアラキドン酸代謝産物遊離促進活性を以下に示した式で計算し、％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌで表した。試料添加群の活性はそれぞれのプレート毎に設置した対照の値を用いて算出した。
％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＝  （Ｘ／Ｃ）ｘ１００
Ｘ：試料添加群の放射活性
Ｃ：対照（試料無添加）の４  ｗｅｌｌの放射活性の平均値
【００４９】
参考例５
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内Ｃａ２＋放出促進活性の測定
細胞内Ｃａ２＋放出促進活性はＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。参考例１で作製し、参考例２で選択したＣＨＯ／ＴＧＲ２３−２細胞を９６穴プレートに３  ｘ  １０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。２．５  ｍＭプロベネシドと２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクス氏液（ｐＨ  ７．４）（以下、２．５  ｍＭプロベネシドと２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクス氏液（ｐＨ  ７．４）を洗浄用バッファーと記す）１０  ｍｌにＦｌｕｏ  ３−ＡＭ  １バイアル分を添加し、ローディングバッファーを作成した。培養プレートの培養液を除き、ローディングバッファーを１００μｌ／ｗｅｌｌ添加して培養器で６０分間保温した。培養プレートのローディングバッファーを除き、洗浄用バッファーで洗浄してから、ＦＬＩＰＲの所定の位置に設置した。試料は凍結乾燥品にサンプルバッファー（洗浄用バッファーにＢＳＡを２  ｍｇ／ｍｌ、ＣＨＡＰＳを１  ｍｇ／ｍｌ添加したもの）を添加し、攪拌後、超音波処理を３０分間行なってから９６穴サンプルプレートに移し替えた。このサンプルプレートも設置し、測定を行なった。細胞内Ｃａ２＋放出促進活性は、試料添加によって惹起された蛍光強度の増加として計測した。
【００５０】
参考例６
ＴＧＲ２３−１（以下、ヒトＴＧＲ２３−１を、単にＴＧＲ２３−１と称することもある）発現ＣＨＯ細胞の作成
ＷＯ  ０２／３１１４５号公報の実施例１で得られたプラスミドｐＴＢ２１７３を鋳型とし、Ｓａｌ  Ｉ認識配列を付加したプライマー１（配列番号：５５）およびＳｐｅ  Ｉ認識配列を付加したプライマー２（配列番号：５６）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記プラスミド１０  ｎｇを鋳型として使用し、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）２．５  Ｕ、プライマー１（配列番号：５５）およびプライマー２（配列番号：５６）を各１．０μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および反応液に２  Ｘ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（宝酒造）を２５μｌ加え、５０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・６０秒の後、９５℃・６０秒、５５℃・６０秒、７２℃・７０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・１０分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応産物をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（インビトロジェン社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）へサブクローニングした。これをＥ．  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（インビトロジェン社）に導入し、ｐＴＢ２１７３に含まれるＴＧＲ２３−１のｃＤＮＡを持つクローンを、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。ここで得られた、５’側および３’側にＳａｌ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉがそれぞれ認識する配列を付加したＴＧＲ２３−１が導入されたプラスミドによって形質転換されたＥ．  ｃｏｌｉのクローンよりＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素Ｓａｌ  Ｉ  およびＳｐｅ  Ｉで切断してインサート部分を切り出した。インサートＤＮＡは電気泳動後、アガロースゲルより切り出し、次にＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて回収した。このインサートＤＮＡをＳａｌ  Ｉ  およびＳｐｅ  Ｉで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｈｉｎｕｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  Ｖｏｌ．  １２１９，  ｐｐ．  ２５１−２５９  （１９９４）記載のｐＡＫＫＯ１．１１Ｈと同一のベクタープラスミド）に加え、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いてライゲーションを行ない、蛋白質発現用プラスミドｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１を構築した。このｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１で形質転換したＥ．  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いてｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１のプラスミドＤＮＡを調製した。
ハムスターＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ｗｉｔｈ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １２５７１）でファルコンディッシュ（径３．５  ｃｍ）に１  ｘ  １０５  個播種し、５％  ＣＯ２インキュベーターで３７℃一晩培養した。上記発現プラスミドｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１  ＤＮＡ  ２μｇをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＦｕＧＥＮＥ  ６  （Ｒｏｃｈｅ社）を用い、添付説明書記載の方法に従ってトランスフェクトし、１８時間培養後、新鮮な増殖培地に交換した。さらに１０時間培養を続けたのち、トランスフェクトした細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理により集め、選択培地（１０％  透析牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １２５６１））を用いて平底９６穴プレート１０枚に播種した。３〜４日ごとに選択培地を交換しながら培養を続け、２〜３週間後にコロニー状に増殖してきたＤＨＦＲ＋  細胞クローンを８１個取得した。
【００５１】
参考例７
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いたＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株のＴＧＲ２３−１発現量の定量
参考例６で得たＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株８１クローンを、９６ウェルプレートに培養し、ＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５０〜２００  ｎｇを  ＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  （ＰＥバイオシステムズ社）を用いて、逆転写反応を行なった。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５〜２０  ｎｇ相当の逆転写産物、または後に述べるようにして作製した標準ｃＤＮＡ、１ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズ社）、プライマー（配列番号：５７）およびプライマー（配列番号：５８）各５００  ｎＭ、およびＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：５９；Ｆａｍ−ａｃｃｔｇｇｔｔｔｇ  ｃｃｇａｇｔｇｇｔｃ  ｃｇｃｔａｔｔｔ−Ｔａｍｒａ；配列中、Ｆａｍは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔａｍｒａは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  をそれぞれ示す）１００  ｎＭを含む反応混合液２５μｌについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分で処理後、９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。
標準ｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＢ２１７４の２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を算出し、正確なコピー数を算出した後、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で希釈し、２コピーから２ｘ１０６コピーの標準ｃＤＮＡ溶液を調製した。また、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ用プローブおよびプライマーはＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  （Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０）（ＰＥバイオシステムズ社）により設計した。
発現量はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、標準ｃＤＮＡの初期濃度の対数値を横軸にとり、標準曲線を作成した。標準曲線より各逆転写産物の初期濃度を算出し、各クローンのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ当たりのＴＧＲ２３−１遺伝子発現量を求めた。その結果、ＴＧＲ２３−１の発現が高かったＣＨＯ細胞株１１個を選択し２４ウェルプレートに培養した。これらの細胞について、ＴＧＲ２３−１の発現量を再検した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した後、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮａｓｅ処理をした。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、上記と同様に逆転写反応し、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法で各クローンのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ当たりのＴＧＲ２３−１遺伝子発現量を求めた。その結果、ＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株クローン４９および５２が高い発現量を示すことがわかった。
以後の参考例では、これら２つのクローンの発現細胞を用いた。
【００５２】
参考例８
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）：（配列番号：４８）の製造
市販のＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂を、ペプチド合成機ＡＣＴ９０の反応槽に入れ、ＤＣＭで膨潤後ＴＦＡでＢｏｃを除去し、ＤＩＥＡで中和した。この樹脂をＮＭＰに懸濁し、ＨＯＢｔ−ＤＩＰＣＩでＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）を縮合した。反応後ニンヒドリンテストで遊離のアミノ基の有無を調べ、ニンヒドリンテストがプラスの時には同じアミノ酸を再度縮合した。再縮合後においてもニンヒドリンテストがプラスの時には無水酢酸でアセチル化した。このサイクルを繰り返しＢｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＬ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）を配列順に縮合し、所望の保護ペプチド樹脂０．２４ｇを得た。この樹脂をｐ−クレゾール１．５  ｍｌとともにフッ化水素約１５  ｍｌ中、０℃で６０分攪拌した後フッ化水素を減圧留去し、残留物にジエチルエーテルを加えて濾過した。濾過物に水と酢酸を加えペプチドを抽出し、樹脂と分離した。抽出液を濃縮し５０％酢酸で充填したセファデックス（商標）Ｇ−２５カラム（２．０  ｘ  ８０  ｃｍ）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集め凍結乾燥した。その一部（４５  ｍｇ）をＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ（商標）ＲＰ−１８を充填した逆相クロマトカラム（２．６  ｘ  ６０  ｃｍ）に付け、０．１％  ＴＦＡ水  ２００ｍｌで洗浄、０．１％  ＴＦＡ  水  ３００ｍｌと０．１％  ＴＦＡ含有  ２５％  アセトニトリル水  ３００ｍｌを用いた線型勾配溶出を行い、主要画分を集め凍結乾燥し目的とするペプチド１２．７  ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：分子量ＭＷ  ２１８８．０（理論値  ２１８７．５）
ＨＰＬＣ溶出時間  １０．６分
カラム条件：
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ  ５Ｃ１８Ｔ  ４．６  ｘ  １００ｍｍ
溶離液：Ａ液−０．１％  ＴＦＡ水、Ｂ液−０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い  Ａ／Ｂ  ：  ９５／５〜４５／５５へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：１．０  ｍｌ  ／  分
【００５３】
参考例９
ＦＬＩＰＲを用いたヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定
参考例８で得られたヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度で、参考例５に記載した方法に従って、ＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に投与し、細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性をＦＬＩＰＲを用いて測定したところ、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は、濃度依存的にＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇を促進した。結果を図１および図２に示す。
これより、配列番号：４８で表されるアミノ配列を有するポリペプチド〔ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）〕が、ＴＧＲ２３−１およびＴＧＲ２３−２に対する細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を有することが明らかである。
【００５４】
参考例１０
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性の測定
参考例８に記載した方法で製造したヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度で参考例３に記載した方法でＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に投与し、細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を測定した。結果を図３に示す。
明らかにヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は濃度依存的にＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生を促進した。
また、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度でＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に投与し、上記と同様の測定をフォルスコリン無添加の条件下で実施した。ただし、産生促進活性は以下に示した式で計算し、％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌで表した。
％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＝  Ｘ／Ｃ  ｘ  １００
Ｘ：試料添加群のｃＡＭＰ量
Ｃ：対照（試料無添加、フォルスコリン刺激なし）の２  ｗｅｌｌのｃＡＭＰ量の平均値結果を、図４に示した。明らかに、フォルスコリン無添加の条件下において、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は濃度依存的にＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生を促進した。
【００５５】
参考例１１
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞のアラキドン酸代謝産物遊離促進活性の測定
参考例８に記載した方法で製造したヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度で参考例４に記載した方法でＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に投与し、アラキドン酸代謝産物遊離促進活性を測定した。結果を図５に示す。
明らかにヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は濃度依存的にＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞のアラキドン酸代謝産物遊離を促進した。
【００５６】
参考例１２
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性の測定
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する  ［３５Ｓ］−Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅの結合促進活性を以下の方法により測定した。最初に膜画分の調整法を記載する。８  ｘ  １０７個のＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に２０  ｍｌのホモジネートバッファー（１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ  ７．３）、５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５２  ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、８μｇ／ｍｌ  Ｅ６４、２０μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）添加し、ポリトロン（１２，０００  ｒｐｍ、３０秒  ｘ  ３回）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（１，０００  ｇ、１５分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｔｙｐｅ  ３０ローター、３０，０００  ｒｐｍ、１時間）し、得られた沈殿物をＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分とした。
ＧＴＰγＳ結合活性の測定は以下の通りである。ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分を膜希釈緩衝液（５０  ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０３％  ＮａＮ３、０．１％  ＢＳＡ、１μＭ  ＧＤＰ）で希釈して、タンパク質濃度３０  ｍｇ／ｍｌのアッセイ用細胞膜画分溶液をつくる。アッセイ用膜画分溶液２００μｌに、５０  ｎＭの濃度の［３５Ｓ］−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＥＮ社）を２μｌと試料を添加し、この混合液を２５℃で一時間保温した。混合液をフィルター濾過し、さらにフィルターを洗浄用バッファー（５０  ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０３％  ＮａＮ３、０．１％  ＢＳＡ）１．５ｍｌで２回洗浄した後、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
参考例８に記載した方法で製造したヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度で上に記載した方法でＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞より調製した膜画分に投与し、ＧＴＰγＳ結合活性を測定した。結果を図６に示した。明らかにヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は濃度依存的にＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞より調製した膜画分のＧＴＰγＳ結合活性を促進した。
【００５７】
参考例１３
［Ｎｌｅ１０，  Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）（配列番号：５２）の製造
市販のＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂をペプチド合成機ＡＣＴ９０の反応槽に入れてＤＣＭで膨潤した後、ＴＦＡでＢｏｃを除去し、ＤＩＥＡで中和した。この樹脂をＮＭＰに懸濁し、ＨＯＢｔ−ＤＩＰＣＩでＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）を縮合した。反応後ニンヒドリンテストで遊離のアミノ基の有無を調べ、ニンヒドリンテストがプラスの時には同じアミノ酸を再度縮合した。再縮合後においてもニンヒドリンテストがプラスの時には無水酢酸でアセチル化した。このサイクルを繰り返し、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｎｌｅ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）を配列順に縮合して所望の保護ペプチド樹脂０．１４  ｇを得た。この樹脂をｐ−クレゾール２．０  ｍｌとともにフッ化水素約１５  ｍｌ中、０℃で６０分攪拌した後、フッ化水素を減圧留去し、残留物にジエチルエーテルを加えて濾過した。濾過物に水と酢酸を加えペプチドを抽出し、樹脂と分離した。抽出液を濃縮し、５０％酢酸で充填したセファデックス（登録商標）Ｇ−２５カラム（２．０  ｘ  ８０  ｃｍ）に付して同溶媒で展開し、主要画分を集めて凍結乾燥した。その一部（１０．３  ｍｇ）をＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ（登録商標）ＲＰ−１８を充填した逆相クロマトカラム（２．６  ｘ  ６０  ｃｍ）に付けて０．１％  ＴＦＡ水２００  ｍｌで洗浄し、０．１％  ＴＦＡ水３００  ｍｌと０．１％  ＴＦＡ含有２５％アセトニトリル水３００  ｍｌを用いた線型勾配溶出を行ない、主要画分を集め凍結乾燥し目的とするペプチド３．９６  ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｍ＋  ２１８６．１  （理論値  ２１８５．５）
ＨＰＬＣ溶出時間：１０．４分
カラム条件
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８ＨＧ  （４．６  ｘ  １００  ｍｍ）
溶離液：Ａ液：  ０．１％  ＴＦＡ−水、Ｂ液：  ０．１％  ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：  ９５／５〜５５／４５へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：１．０  ｍｌ／分
【００５８】
参考例１４
ラクトパーオキシダーゼ法を用いた［Ｎｌｅ１０，  １２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の作製
ＤＭＳＯ  １０μｌに溶かした［Ｎｌｅ１０，  Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）（配列番号：５２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）１  ｎｍｏｌを０．１  Ｍ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ  ７）に溶かした０．０００３％過酸化水素水１０μｌ、０．１  Ｍ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ  ７）に溶かしたラクトパーオキシダーゼ  （シグマ社）  １０μｇ／ｍｌを１０μｌおよび［１２５Ｉ］ＮａＩ  ３７  ＭＢｑ（パーキンエルマーライフサイエンス社）１０μｌと混合して室温で１５分間反応させた後、生成した［Ｎｌｅ１０，  １２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を以下の条件のＨＰＬＣにより分取した。
用いたカラムは、ＯＤＳ−８０ＴＭ  （４．６  ｍｍ  ｘ  １５  ｃｍ）（トーソー社）、溶出液Ａとして１０％アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ、溶出液Ｂとして６０％アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡを用い、５−５  （２  ｍｉｎ）、５−２９  （４０  ｍｉｎ）  ％Ｂ／Ａ＋Ｂのグラディエント溶出法を行なった。流速は１  ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃、検出は２２０ｎｍとした。このＨＰＬＣ条件では、［Ｎｌｅ１０，  １２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は２４分付近に溶出した。
【００５９】
参考例１５
［Ｎｌｅ１０，  １２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を用いたレセプター結合実験
参考例１４に記載した方法によって作製した［Ｎｌｅ１０，  １２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）および参考例１２に記載した方法によってＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞から調製したＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の代わりにＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞を用いることにより参考例１２に記載した方法と同様の方法によって調製したＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いてレセプター結合実験を行なった。
ＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分をアッセイ用バッファー（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＢＳＡ、０．５  ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、４μｇ／ｍｌ  Ｅ−６４、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、ｐＨ  ７．４）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（Ｆａｌｃｏｎ  ２０５３）に２００μｌずつ分注した。最大結合量を測定するために２μｌのＤＭＳＯと１０  ｎＭの［Ｎｌｅ１０，  １２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）２μｌを膜画分溶液に添加した。また、非特異的結合を測定するために１μＭ  ［Ｎｌｅ１０，  Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のＤＭＳＯ溶液２μｌと１０  ｎＭの［Ｎｌｅ１０，  １２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）２μｌを膜画分溶液に添加した。２５℃で９０分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（ＧＦ−Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過した。ろ過後、γ−カウンターを用いて濾紙上に残った放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を引いて特異的結合量を見積もった。膜画分の濃度を変化させると膜画分の濃度に依存した［Ｎｌｅ１０，  １２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の特異的な結合が認められた。被験試料のＴＧＲ２３−１レセプターあるいはＴＧＲ２３−２レセプターに対する結合阻害活性（阻害率（％））は、最大結合量（ＴＢ）から被検試料および［Ｎｌｅ１０，  １２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を加えたときに濾紙上に残った放射活性（Ｘ）を減じた値の特異的結合量（ＳＢ）に対する比率（（ＴＢ−Ｘ）／ＳＢ  ｘ  １００  （％））で示される。
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞から調製した膜画分について膜画分濃度を１μｇ／ｍｌに設定して阻害率からヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出したところ、ＩＣ５０値は１０５  ｐＭであった。
種々の濃度におけるヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の結合阻害活性を、図７に示す。
【００６０】
参考例１６
ヒト結腸癌細胞ＣＯＬＯ  ２０５由来のＴＧＲ２３遺伝子のクローニング
ＡＴＣＣより入手したＣＯＬＯ  ２０５細胞を７５  ｃｍ２フラスコに培養し、増殖した細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡ画分を調製した。ＣＯＬＯ  ２０５細胞のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ０．５μｇを鋳型に、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  −α−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、添付のマニュアルにしたがってランダムプライマーを用いて逆転写を行ない、ｃＤＮＡを作製した。作製したＣＯＬＯ  ２０５細胞のｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列番号：５３）およびプライマー２（配列番号：５４）を用いてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応の液量は５０μｌとし、組成は、鋳型としてｃＤＮＡ調製液を１２．５  ｎｇ  ｍＲＮＡ相当分、プライマー各０．２μＭ、ｄＮＴＰ  ０．２ｍ  Ｍ、ＧＣ−Ｍｅｌｔ  ０．５Ｍ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（クロンテック社）１／５０  ｖｏｌｕｍｅおよび５倍濃縮Ｂｕｆｆｅｒ  １／５  ｖｏｌｕｍｅとした。反応は、９６℃で２分保温した後、９６℃・３０秒、５４℃・３０秒、７２℃・１分のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃で１０分保温して行なった。得られた反応液を用い、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１へ導入した。生じた形質転換体からＱＩＡｗｅｌｌ  ８  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。
その結果、配列番号：１８で表される塩基配列および配列番号：２０で表される塩基配列がそれぞれ得られた。
配列番号：１８および配列番号：２０の塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在した。この翻訳枠から翻訳される蛋白のアミノ酸配列を配列番号：１７および配列番号：１９にそれぞれ示す。配列番号：１７および配列番号：１９で表されるアミノ酸配列を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をＴＧＲ２３−１ＡおよびＴＧＲ２３−１Ｂとそれぞれ命名した。
配列番号：１８で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列の（ＴＧＲ２３−１）の第７２３番目のＣがＧに置換されている。
配列番号：２０で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列（ＴＧＲ２３−１）の第３２０番目のＡがＴに、第７２３番目のＣがＧにそれぞれ置換されている。配列番号：１７で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列（ＴＧＲ２３−１）の第２４１番目のＳｅｒがＡｒｇに置換されている。
配列番号：１９で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列（ＴＧＲ２３−１）の第１０７番目のＡｓｎがＩｌｅに、第２４１番目のＳｅｒがＡｒｇにそれぞれ置換されている。
【００６１】
参考例１７
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いたヒト結腸癌細胞株およびヒト胃癌細胞株のヒトＴＧＲ２３遺伝子発現量の定量
ヒト結腸癌細胞株ＤＬＤ−１、ＨＣＴ  １１６、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、ＣＯＬＯ  ２０１、ＣＯＬＯ  ２０５、ＬｏＶｏ、ＳＷ  ４０３、ＳＷ  ４８、ＳＷ  ９４８、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ−２９、ＳＫ−ＣＯ−１、Ｔ８４、ＳＮＵ−Ｃ１はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手した。ヒト結腸癌細胞株ＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ、ＨＣＴ−１５、ＬＳ  １７４Ｔ、ＬＳ  １８０、ＳＷ  ４８０、ＳＷ  １１１６、ＳＷ  １４１７、ＷｉＤｒおよびヒト胃癌細胞株ＡＧＳ、ＫＡＴＯＩＩＩは大日本製薬社より入手した。各々の細胞を７５  ｃｍ２フラスコに培養し、増殖した細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡ画分を調製した。各々の細胞のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ０．５μｇを鋳型に、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ−α−  （ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、添付のマニュアルにしたがってランダムプライマーを用いて逆転写を行ない、ｃＤＮＡを作製した。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２５  ｎｇ相当の逆転写産物、または後に述べるようにして作製した標準ｃＤＮＡ、１ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズ社）、プライマー（配列番号：５７）およびプライマー（配列番号：５８）各５００  ｎＭ、およびＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：５９；Ｆａｍ−ａｃｃｔｇｇｔｔｔｇ  ｃｃｇａｇｔｇｇｔｃ  ｃｇｃｔａｔｔｔ−Ｔａｍｒａ；配列中、Ｆａｍは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔａｍｒａは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  をそれぞれ示す）  １００  ｎＭを含む反応混合液２５μｌについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分で処理後、９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。
標準ｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＢ２１７４の２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を算出し、正確なコピー数を算出した後、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で希釈し、１コピーから１ｘ１０６コピーの標準ｃＤＮＡ溶液を調製した。また、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ用プローブおよびプライマーはＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  （Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０）（ＰＥバイオシステムズ社）により設計した。
発現量はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、標準ｃＤＮＡの初期濃度の対数値を横軸にとり、標準曲線を作成した。標準曲線より各逆転写産物の初期濃度を算出し、各クローンのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２５  ｎｇ当たりのヒトＴＧＲ２３遺伝子発現量を求めた。さらに各々のサンプルのＧＡＰＤＨ発現量をＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥバイオシステムズ社）を用いて同様のＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法により求め、ヒトＴＧＲ２３遺伝子発現量の補正を行なった。
その結果、ＧＡＰＤＨに対するヒトＴＧＲ２３の発現量は、ＤＬＤ−１では０．００００２２％，  ＨＣＴ  １１６では０．００１３％，  ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭでは０．００１７％，  ＣＯＬＯ  ２０１では１．０％，  ＣＯＬＯ  ２０５では３．７％，  ＬｏＶｏでは０．０３１％，  ＳＷ  ４０３では０．９５％，  ＳＷ  ４８では０．０００３１％，  ＳＷ  ９４８では０．０００１％，  Ｃａｃｏ−２では０．０００１％，  ＨＴ−２９では０．０３４％，  ＳＫ−ＣＯ−１では０．５１％，  Ｔ８４では０．００２７％、ＳＮＵ−Ｃ１では０．２６％、ＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲでは０．０００１％，  ＨＣＴ−１５では０．０００１％，  ＬＳ  １７４Ｔでは１．０％，  ＬＳ  １８０では０．８５％，  ＳＷ  ４８０では０．０００１％，  ＳＷ  １１１６では０．００１８％，  ＳＷ  １４１７では０．００５５％，  ＷｉＤｒでは０．０００８２％、ＡＧＳでは０．０００２％，  ＫＡＴＯＩＩＩでは１．２％であった。
これによりヒトＴＧＲ２３は、結腸癌細胞であるＣＯＬＯ  ２０１、ＣＯＬＯ  ２０５、ＬｏＶｏ、ＳＷ  ４０３、ＨＴ−２９、ＳＫ−ＣＯ−１、ＳＮＵ−Ｃ１、ＬＳ  １７４Ｔ、ＬＳ  １８０および胃癌細胞であるＫＡＴＯＩＩＩにおいて特に発現が亢進していることがわかった。
ヒトＴＧＲ２３の癌細胞株における発現量のグラフを図８に示す。
なお、ヒト結腸癌由来癌細胞株ＣＯＬＯ２０５は既にそのＴＧＲ２３の発現量を測定し、高い発現を示すことを認めている。β−アクチンに対する発現量は２．１％であった。
【００６２】
参考例１８
ヒト結腸癌細胞ＬＳ  １７４Ｔ，  ＬＳ  １８０，  ＳＷ  ４０３、およびヒト胃癌細胞ＫＡＴＯＩＩＩ由来のヒトＴＧＲ２３遺伝子のクローニング
大日本製薬社より入手したＬＳ  １７４Ｔ細胞を７５  ｃｍ２フラスコに培養し、増殖した細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡ画分を調製した。ＬＳ  １７４Ｔ細胞のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ０．５μｇを鋳型に、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ−α−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、添付のマニュアルにしたがってランダムプライマーを用いて逆転写を行ない、ｃＤＮＡを作製した。作製したＬＳ  １７４Ｔ細胞のｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列番号：５３）およびプライマー２（配列番号：５４）を用いてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応の液量は５０μｌとし、組成は、鋳型としてｃＤＮＡ調製液を１２．５  ｎｇ  ｍＲＮＡ相当分、プライマー各０．２μＭ、ｄＮＴＰ  ０．２ｍ  Ｍ、ＧＣ−Ｍｅｌｔ  ０．５Ｍ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（クロンテック社）１／５０  ｖｏｌｕｍｅおよび５倍濃縮Ｂｕｆｆｅｒ  １／５  ｖｏｌｕｍｅとした。反応は、９６℃で２分保温した後、９６℃・３０秒、５４℃・３０秒、７２℃・１分のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃で１０分保温して行なった。得られたＰＣＲ反応液を電気泳動後、目的のバンドをＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。得られた反応液をＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１へ導入した。生じた形質転換体からＱＩＡｗｅｌｌ  ８  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。
その結果、配列番号：２で表される塩基配列および配列番号：２２で表される塩基配列がそれぞれ得られた。配列番号：２２で表される塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在した。この翻訳枠から翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２１に示す。
配列番号：２２で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列（ＴＧＲ２３−１）の第３２０番目のＡがＴに置換されている。
配列番号：２１で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列（ＴＧＲ２３−１）の第１０７番目のＡｓｎがＩｌｅに置換されている。
配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃと命名した。
ＡＴＣＣより入手したＳＷ  ４０３細胞についても同様にしてヒトＴＧＲ２３遺伝子のクローニングを行ない、配列を解読したところ、配列番号：２で表される塩基配列が得られた。
大日本製薬社より入手したＬＳ  １８０細胞とＫＡＴＯＩＩＩ細胞についても同様にしてヒトＴＧＲ２３遺伝子のクローニングを行ない、配列を解読したところ、ＬＳ  １８０細胞からは配列番号：２４で表される塩基配列が、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞からは配列番号：２５で表される塩基配列がそれぞれ得られた。なおＰＣＲ反応の組成は、鋳型としてｃＤＮＡ調製液を１２．５  ｎｇ  ｍＲＮＡ相当分、プライマー各０．２μＭ、ｄＮＴＰ  ０．２ｍ  Ｍ、ＭｇＣｌ２２ｍＭ、Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）１．２５ｕｎｉｔｓおよび１０倍濃縮Ｂｕｆｆｅｒ  １／１０  ｖｏｌｕｍｅとした。
配列番号：２４で表される塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在し、この翻訳枠から翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２３に示す。
配列番号：２５で表される塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在し、この翻訳枠から翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２１に示す。
配列番号：２４で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列（ＴＧＲ２３−１）の第１０３１番目のＡがＧに、第１０７１番目のＴがＣにそれぞれ置換されている。配列番号：２５で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列（ＴＧＲ２３−１）の第３２０番目のＡがＴに、第６４８番目のＣがＴにそれぞれ置換されている。配列番号：２３で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列（ＴＧＲ２３−１）の第３４４番目のＧｌｎがＡｒｇに置換されている。
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を、ヒトＴＧＲ２３−１Ｄと命名した。
【００６３】
参考例１９
ヒト視床下部のＴＧＲ２３遺伝子のクローニング
ヒト視床下部Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型とし、プライマー１（配列番号：５３）およびプライマー２（配列番号：５４）を用いてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応の液量は５０μｌとし、組成は、ｃＤＮＡ溶液を  １／１０  ｖｏｌｕｍｅ、プライマー各０．２μＭ、ｄＮＴＰ  ０．２ｍ  Ｍ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）１．２５ｕｎｉｔｓおよび１０倍濃縮Ｂｕｆｆｅｒ  １／１０  ｖｏｌｕｍｅとした。反応は、９６℃で２分保温した後、９６℃・３０秒、５４℃・３０秒、７２℃・１分のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃で１０分保温して行なった。得られたＰＣＲ反応液を電気泳動後、目的のバンドをＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。得られた反応液をＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１へ導入した。生じた形質転換体からＱＩＡｗｅｌｌ  ８  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。
その結果、配列番号：２、配列番号：１６、配列番号：２４、配列番号：２６および配列番号：２７で表される５種類の塩基配列がそれぞれ得られた。
配列番号：２６で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列の第３２０番目のＡがＴに、第３９６番目のＣがＧにそれぞれ置換されている。
配列番号：２７で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列の第３２０番目のＡがＴに、第１０３１番目のＡがＧに、第１０７１番目のＴがＣにそれぞれ置換されている。
配列番号：２、配列番号：１６、配列番号：２４、配列番号：２６および配列番号：２７の塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在した。この翻訳枠から翻訳されるタンパク質は、それぞれ、この順にヒトＴＧＲ２３−１（配列番号：１）、ヒトＴＧＲ２３−２（配列番号：１５）、ヒトＴＧＲ２３−１Ｄ（配列番号：２３）、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ（配列番号：２１）およびヒトＴＧＲ２３−２（配列番号：１５）である。
【００６４】
参考例２０
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のラット側脳室内投与による摂餌量に及ぼす影響を検討した。
ラットは、照明時間を８時から２０時、室温２５℃において飼育した。８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（手術時体重２６０〜２８０ｇ）をペントバルビタール５０  ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与にて麻酔し、ラット脳定位固定装置に固定した。切歯用バーはインターオーラルラインから３．３  ｍｍ低くした。頭蓋骨を露出し、側脳室にガイドカニューレＡＧ−８（内径０．４  ｍｍ、外径０．５  ｍｍ、エイコム）を埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開けた。また、その周囲３箇所にアンカービスを埋めた。ステンレス製ガイドカニューレ、ＡＧ−８を、その先端が側脳室の上部に位置するように挿入した。定位座標は、ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ（１９９８）のアトラスに従い、ブレグマより、ＡＰ：  −０．８  ｍｍ、Ｌ：１．５  ｍｍ、Ｈ：−４．５ｍｍとした。ガイドカニューレは歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミーカニューレ、ＡＤ−８（外径  ０．３５  ｍｍ、エイコム社）を挿入し、キャプナット（エイコム社）で固定した。術後、ラットは個別のケージで飼育し、粉末飼料へ１週間馴化させた。
ガイドカニューレを埋め込んでから約１週間飼育して術後の回復および粉末飼料への馴化を待ち、ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミーカニューレを取り外し、代わりにＰＴＦＥ（ポリ四フッ化エチレン）チューブ（長さ５０  ｃｍ、内径０．１  ｍｍ、外径０．３５  ｍｍ、エイコム社）につないだステンレス製マイクロインジェクションカニューレＡＭＩ−９（内径０．１７  ｍｍ、外径０．３５  ｍｍ、エイコム社）を挿入した。マイクロインジェクションカニューレの長さは、その先端１  ｍｍがガイドカニューレから露出するように調節しておいた。ＰＴＦＥチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、大塚蒸留水、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を溶解させた蒸留水を５μｌ／分の流速で計１０μｌ（１０  ｎｍｏｌ／ｒａｔ）を側脳室に注入した。注入終了後２分待ってからマイクロインジェクションカニューレを取り外し、再びダミーカニューレをキャップナットで固定した。注入は、１９時から２０時の間に行ない、その後の摂餌量を摂餌量測定措置Ｆｅｅｄ−Ｓｃａｌｅ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ社）を用いて３０分毎に投与４時間後まで経時的に測定した。
結果を図９に示す。これより、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）投与群は対象群に比し、投与１．５および２時間後において有意（ｐ＜０．０５）な摂餌量の減少が認められた。
【００６５】
参考例２１
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のヒト結腸癌細胞株ＬＳ  １７４Ｔのヌードマウスでの腫瘍増殖に及ぼす影響を検討した。
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ  （ＰＢＳ）に溶解したＬＳ  １７４Ｔを４  ｘ  １０６  ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｍｏｕｓｅの割合で雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ−ｎｕ，  ６週齢）の左腹部皮下に投与した。投与３時間後に、大塚蒸留水に２  ｍＭ濃度に溶解したヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）または大塚蒸留水１００μｌをＭＩＣＲＯ−ＯＳＭＯＴＩＣ  ＰＵＭＰ（ａｌｚａ社、ｍｏｄｅｌ  １００２）に充填し、エーテル麻酔下でマウス背部皮下に埋め込んだ（各群  ｎ＝１０）。この日より、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は、４８  ｎｍｏｌ／ｄａｙで１４日間持続的に放出されることになる。投与３日後より腫瘍のスケールを測定し、腫瘍体積は（長径）ｘ（短径）２／２で算出した。
結果を図１０に示す。これより、投与１１日目から２０日目まで、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）投与群においてＬＳ  １７４Ｔの腫瘍体積の増大傾向が観察された。
【００６６】
参考例２２
ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ベクターの構築
ヒトＴＧＲ２３−１Ａ（配列番号：１７）、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ（配列番号：２１）およびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ（配列番号：２３）をコードするＤＮＡをＱｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてヒトＴＧＲ２３−１のＤＮＡより調製した。ヒトＴＧＲ２３−１のＤＮＡに以下のようにしてＰＣＲ法により部位特異的変異を導入した。ＰＣＲ反応液は、５  ｎｇの参考例６に記載のｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１、２  ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．４μＭの変異導入用フォワードプライマーおよび変異導入用リバースプライマー〔ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ａ作製用フォワードプライマー（配列番号：６０）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ａ作製用リバースプライマー（配列番号：６１）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｃ作製用フォワードプライマー（配列番号：６２）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｃ作製用リバースプライマー（配列番号：６３）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｄ作製用フォワードプライマー（配列番号：６４）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｄ作製用リバースプライマー（配列番号：６５）〕、２．５  ｕｎｉｔのｐｆｕポリメラーゼにキットに添付のＰＣＲ反応用バッファーを加え、全容量を５０μｌとした。この反応液を、９５℃で３０秒間保温し、その後９５℃・３０秒、５５℃・６０秒、６８℃・１４分を１２回繰り返す反応に供した。ＰＣＲ反応の後、鋳型ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１を分解するため、１μｌのＤｐｎ  Ｉ  （１０  ｕｎｉｔ／μｌ）を反応液に添加し、３７℃で１時間保温した。コンピーテント細胞であるＴＯＰ１０  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１μｌのＤｐｎ  Ｉ反応液でヒートショック法により形質転換した。これらの形質転換大腸菌からプラスミドＤＮＡをＱＩＡｗｅｌｌ  ８  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて取得した。塩基配列の決定のための反応は、ＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、次に、各ＤＮＡの塩基配列をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析して変異が導入されていることを確認した。ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ベクターは、動物細胞発現ベクターであるｐＡＫＫＯのＳａｌ  ＩサイトとＳｐｅ  Ｉサイトに、変異の導入が確認されたヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１Ｄをライゲーションすることにより構築した。ＤＮＡ配列解析から変異の導入が確認されたプラスミドＤＮＡをＳａｌ  ＩとＳｐｅ  Ｉで消化し、ＤＮＡ溶液を１．５％  アガロースゲルで電気泳動して５’末端に  Ｓａｌ  Ｉ切断端を、また３’末端にＳｐｅ  Ｉ切断端を持つヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１ＤのＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲルからＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収した。このＤＮＡ断片をｐＡＫＫＯのＳａｌ  ＩとＳｐｅ  ＩサイトにＴａｋａｒａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２  （Ｔａｋａｒ��）  を用いて結合させた。コンピーテント細胞である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ）をライゲーション反応液により形質転換して形質転換体を作製し、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ａ、大腸菌ＤＨ５（／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｃおよび大腸菌ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｄと命名した。
【００６７】
参考例２３
ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現ベクターの構築
ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ（配列番号：１９）をコードするＤＮＡをＱｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて調製した。ヒトＴＧＲ２３−１ＣのＤＮＡに以下のようにしてＰＣＲ法により部位特異的変異を導入した。ＰＣＲ反応液は、５  ｎｇのｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｃ（参考例２２で得られたプラスミド）、２  ｍＭのｄＮＴＰｓ、  ０．４μＭの変異導入用フォワードプライマーと変異導入用リバースプライマー〔ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｂ作製用フォワードプライマー（配列番号：６６）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｂ作製用リバースプライマー（配列番号：６７）〕、２．５  ｕｎｉｔのｐｆｕポリメラーゼにキットに添付のＰＣＲ反応用バッファーを加え、全容量を５０μｌとした。この反応液を、９５℃で３０秒間保温し、その後９５℃・３０秒、５５℃・６０秒、６８℃・１４分を１２回繰り返す反応に供した。ＰＣＲ反応の後、鋳型ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｃを分解するため、１μｌのＤｐｎ  Ｉ  （１０  ｕｎｉｔ／μｌ）を反応液に添加し、３７℃で１時間保温した。コンピーテント細胞であるＴＯＰ１０  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１μｌのＤｐｎ  Ｉ反応液でヒートショック法により形質転換した。これらの形質転換大腸菌からプラスミドＤＮＡをＱＩＡｗｅｌｌ  ８  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて取得した。塩基配列の決定のための反応はＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、次に、ヒトＴＧＲ２３−１ＢのＤＮＡの塩基配列をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析して変異が導入されていることを確認した。
ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現ベクターは、動物細胞発現ベクターであるｐＡＫＫＯのＳａｌ  ＩサイトとＳｐｅ  Ｉサイトに、変異の導入が確認されたヒトＴＧＲ２３−１Ｂをライゲーションすることにより構築した。ＤＮＡ配列解析から変異の導入が確認されたプラスミドＤＮＡをＳａｌ  ＩとＳｐｅ  Ｉで消化し、ＤＮＡ溶液を１．５％  アガロースゲルで電気泳動して５’末端に  Ｓａｌ  Ｉ切断端を、また３’末端にＳｐｅ  Ｉ切断端を持つＴＧＲ２３−１Ｂ  ＤＮＡ断片をアガロースゲルからＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収した。このＤＮＡ断片をｐＡＫＫＯのＳａｌ  ＩとＳｐｅ  ＩサイトにＴａｋａｒａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２  （タカラ）を用いて結合させた。コンピーテント細胞である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をライゲーション反応液により形質転換して形質転換体を作製し、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｂと命名した。
【００６８】
参考例２４
ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞株の作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｂ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１ＣおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｄを培養し、これら大腸菌体からＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。これらのプラスミドＤＮＡをＥｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて添付のプロトコールに従ってＣＨＯ  ｄｈｆｒ−細胞に導入した。２μｇのプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬との混合液を４８時間前に１  ｘ  １０６個のＣＨＯ  ｄｈｆｒ−細胞を播種した直径１０ｃｍシャーレに添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるヒトＴＧＲ２３−１Ａ発現細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ発現細胞およびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現細胞のコロニーを、それぞれ最大で４０個選択した。
【００６９】
参考例２５
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いたヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞株における導入遺伝子発現量の測定
参考例２４で作製したヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣまたはヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞株をそれぞれ２５  ｃｍ２フラスコに培養し、増殖した細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成反応液は、０．５μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、２５  ｐｍｏｌのランダムノナマー（Ｔａｋａｒａ）、１  ｍＭのｄＮＴＰｓ、１μｌのＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  （Ｔｏｙｏｂｏ）およびキットに付属の反応バッファーからなり、全容量は２０μｌである。逆転写反応はサーマルサイクラー（Ｔａｋａｒａ）を用いて、３０℃・１０分、次に４２℃・６０分、最後に９９℃・５分の条件で行なった。
標準ヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡは、全長ヒトＴＧＲ２３−２のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅ＤＮＡを精製することにより調製した。ＰＣＲ反応液は、１０  ｎｇのｐＴＢ２１７４、１μＭの合成ＤＮＡフォワードプライマー（配列番号：６８）、１μＭの合成ＤＮＡリバースプライマー（配列番号：６９）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２．５  ＵのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および２  （  ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒＩ  （ＴａＫａＲａ）  ２５μｌからなり、全容量を５０μｌとした。増幅のための反応はサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９５℃・６０秒の加熱の後、９５℃・６０秒、５５℃・６０秒、７２℃・７０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・１０分間保温した。ＰＣＲ増幅ＤＮＡはアガロースゲルにて電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収した。該ＰＣＲ反応産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  に導入し、ＴＧＲ２３−２のｃＤＮＡを持つ形質転換体をカナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。ここで得られたヒトＴＧＲ２３−２のｃＤＮＡを持つ大腸菌よりＱｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてプラスミドを回収し、２６０  ｎｍの吸収から計算されたＤＮＡ量とＤＮＡ塩基組成からこのＤＮＡ溶液に含まれるヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡのコピー数を算出した。ＤＮＡコピー数が明らかとなったヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡを標準ヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡとして、定量を目的としたＴａｑＭａｎ  ＰＣＲに用いた。
ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣまたはヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現細胞株の導入遺伝子発現コピー数をＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法により決定した。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応液は、２μｌの逆転写ｃＤＮＡ溶液または１μｌの各種濃度の標準ヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡ、０．２μＭの合成ＤＮＡフォワードプライマー（配列番号：５７）、０．２μＭの合成ＤＮＡリバースプライマー（配列番号：５８）、０．２μＭのＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：５９）とＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなり、全容量は２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、５０℃・２分、９５℃・１０分で保温し、次に９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣまたはヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現細胞株の導入遺伝子発現量はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、種々の標準ヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡのコピー数の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。標準曲線から逆転写ｃＤＮＡに含まれる導入遺伝子の発現コピー数を算出し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １ｎｇ当たりの導入遺伝子発現量を決定した。ヒトＴＧＲ２３−１Ａ遺伝子高発現細胞株としてクローンＮｏ．  ６０を、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ遺伝子高発現細胞株としてクローンＮｏ．  ５９を、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ遺伝子高発現細胞株としてクローンＮｏ．  ９を、ヒトＴＧＲ２３−１Ｄ遺伝子高発現細胞株としてクローンＮｏ．  １２をそれぞれ選択した。
【００７０】
参考例２６
ＦＬＩＰＲを用いたヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣまたはヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度で参考例５に記載した方法にしたがって、ヒトＴＧＲ２３−１Ａ発現ＣＨＯ細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現ＣＨＯ細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ発現ＣＨＯ細胞およびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞にそれぞれ投与し、細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性をＦＬＩＰＲを用いて測定した。結果を図１１、図１２、図１３および図１４に示す。
明らかに、ヒトＴＧＲ２３−１Ａ発現ＣＨＯ細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現ＣＨＯ細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ発現ＣＨＯ細胞およびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞は、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）に応答し、またこのリガンド濃度依存的な細胞内カルシウム量の上昇を示した。
【００７１】
参考例２７
ＴＧＲ２３遺伝子発現の抑制による、ヒト結腸癌細胞株のアポトーシス誘発検討
ＡＴＣＣより購入したヒト結腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＲＰＭＩ−１６４０培地（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有）に牛胎仔血清（ＡＴＣＣ）を１０％加えた培地で懸濁し、１ウェル当たり４０００個の細胞密度で９６穴コラーゲンタイプＩコートプレート（ＩＷＡＫＩ社）に播種した。同様にＡＴＣＣより購入したヒト結腸癌細胞株ＬＳ１７４ＴをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＥａｒｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地に牛胎仔血清（ＡＴＣＣ）を１０％加えた培地で懸濁し、１ウェル当たり３０００個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。ヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ  １１６（ＡＴＣＣ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＤ−ＭＥＭ培地（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有）に牛胎仔血清（ＡＴＣＣ）を１０％加えた培地で懸濁し、１ウェル当たり３０００個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
ＴＧＲ２３遺伝子の翻訳領域配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：７０）を設計後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して導入実験に用いた（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチドと略する）。コントロールとしては、配列番号：７０で示される塩基配列のリバース配列（配列番号：７１）を同様にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、コントロールオリゴヌクレオチドと略する）。
具体的には、ＣＯＬＯ２０５はＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で１６７倍に希釈したＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを加え、混合したオリゴヌクレオチド溶液を、１ウェル当たり６５μＬの割合でプレートに添加した。オリゴヌクレオチドの終濃度は２００ｎＭとなるよう調製した。ＬＳ１７４ＴはＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３２倍に希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを１：１で加え、混合したオリゴヌクレオチド溶液を、１ウェル当たり５０μＬの割合でプレートに添加した。オリゴヌクレオチドの終濃度は３３ｎＭとなるよう調製した。ＨＣＴ  １１６はＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で５倍に希釈したＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを３：８で加え、混合したオリゴヌクレオチド溶液を、１ウェル当たり４０μＬの割合でプレートに添加した。オリゴヌクレオチドの終濃度は５２０ｎＭとなるよう調製した。
上記の条件で更に３日間培養した後、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて添付プロトコールに従い、上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：７０）は陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：７１）に比べてＣＯＬＯ２０５、ＬＳ１７４Ｔでそれぞれ約１．６倍、約１．３倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（ＣＯＬＯ２０５ではＰ≦０．０５、ＬＳ１７４ＴではＰ≦０．０１）を示した（表２および表３）。また、ＴＧＲ２３を発現していないＨＣＴ  １１６では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べて有意なアポトーシス誘導活性を示さなかった（表４）。
【００７２】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【００７３】
参考例２８
アンチセンスオリゴヌクレオチド投与によるＴＧＲ２３遺伝子の発現量低下の検討参考例２７で用いたヒト結腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５およびＬＳ１７４Ｔを参考例２７と同様の培地に懸濁し、１ウェル当たりＣＯＬＯ２０５は２４，０００個の細胞密度で２４穴コラーゲンタイプＩコートプレート（ＩＷＡＫＩ社）に、ＬＳ１７４Ｔは１８，０００個の細胞密度で２４穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、参考例２７の方法に準じて、参考例２７で使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロールオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。但し、オリゴヌクレオチド溶液の添加量は１ウェル当たり、ＣＯＬＯ２０５は３９０μＬ、ＬＳ１７４Ｔは３００μＬとした。トランスフェクション後、５％炭酸ガス気流中、３７℃で２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ここで得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。次に、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡにして１．５ｎｇ〜３ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、２種類のプライマー（配列番号：５７および配列番号：５８）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したプローブ（配列番号：５９）を１００ｎＭになるように加え、ＴＧＲ２３遺伝子の発現コピー数を測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒、６０℃１分のサイクルを４０回繰り返した。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロールオリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合にはＴＧＲ２３遺伝子発現量はｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １ｎｇ当りＣＯＬＯ２０５では６２０コピー、ＬＳ１７４Ｔでは２９０コピーであったのに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド投与群ではＣＯＬＯ２０５で２１０コピー、ＬＳ１７４Ｔでは１５０コピーであり統計学的に有意（ＣＯＬＯ２０５ではＰ≦０．０１、ＬＳ１７４ＴではＰ≦０．０５）な発現量低下が認められた。一方、陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド投与群ではＣＯＬＯ２０５で５９０コピー、ＬＳ１７４Ｔでは２８０コピーであり非トランスフェクション群と比べて統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。
この結果より、ＴＧＲ２３遺伝子発現量の低下により、ヒト結腸癌細胞株のアポトーシスが誘発されたことが示された。
【００７４】
【発明の効果】
本発明の遺伝子多型を検定方法またはキットを使用して、遺伝子多型を検定することにより、該遺伝子またはその機能に関連する疾患（例、癌、肥満症、中枢疾患、内分泌疾患、代謝疾患など）の診断、またはその発症危険性の大きさの予測が可能となり、上記疾患の治療に当り、有効な薬物の選択および投与する薬物の有効量の予測も可能になる。
【００７５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図２】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図３】種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のフォルスコリン刺激したＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を示す。図中、−○−はＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞および−□−はＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性をそれぞれ示す。
【図４】種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のフォルスコリン無添加の条件下におけるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を示す。図中、−○−はＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞および−□−はＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性をそれぞれ示す。
【図５】種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対するアラキドン酸代謝物遊離活性を示す。図中、−○−はＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞および−□−はＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対するアラキドン酸代謝物遊離活性をそれぞれ示す。
【図６】種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す。
【図７】ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いた、［Ｎｌｅ１０，１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）に対するヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の結合阻害活性を示す。
【図８】ヒトＴＧＲ２３の癌細胞における発現量のグラフである。
【図９】ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）または蒸留水をラット側脳室内に投与後４時間までの３０分ごとの摂餌量の経時的変動を示す。図中、−●−はヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）投与群を、−○−は蒸留水投与群を示す。値は平均値±標準誤差  （ｎ＝８）  で示す。＊は蒸留水投与群に対して有意な（ｐ＜０．０５）差であることを示す。
【図１０】ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）または蒸留水をＭＩＣＲＯ−ＯＳＭＯＴＩＣ  ＰＵＭＰを用いて持続投与した際のヌードマウスでのＬＳ１７４Ｔの腫瘍サイズ経時的変動を示す。図中、−●−はヒトＴＧＲ２３  −２リガンド（１−２０）投与群を、−○−は蒸留水投与群を示す。値は平均値±標準誤差  （ｎ＝１０）を示す。
【図１１】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるヒトＴＧＲ２３−１Ａ発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図１２】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図１３】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるヒトＴＧＲ２３−１Ｃ発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図１４】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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