(57)【要約】　　　（修正有）【課題】魚類の外性器形成に関与する遺伝子の提供。【解決手段】（ａ）特定のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は（ｂ）特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、生殖器形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子、および、前記遺伝子の発現レベルを解析し、得られる解析結果から被検物質の毒性を評価する方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０若しくは３２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０若しくは３２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、生殖器形成能を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０若しくは３２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０若しくは３２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、生殖器形成能を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、２５、２７、２９若しくは３１に示される塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、２５、２７、２９若しくは３１に示される塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、生殖器形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
前記遺伝子がカダヤシ又はメダカ由来のものである請求項２又は３記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から生殖器形成能を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項１記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項９】
被検物質に曝された魚類において、請求項２〜４のいずれかに記載の遺伝子の発現レベルを解析し、得られる解析結果から被検物質の毒性を評価する方法。
【請求項１０】
被検物質に曝された魚類において、請求項２〜４のいずれかに記載の遺伝子の発現レベルを解析し、得られる解析結果から環境汚染を評価する方法。
【請求項１１】
魚類がカダヤシ又はメダカである請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
被検物質が内分泌攪乱物質である請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
環境汚染が内分泌攪乱物質によるものである請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
被検物質に曝された魚類から生殖器組織を採取し、該組織と請求項８に記載の抗体とを反応させ、得られる反応結果から化学物質の毒性を評価する方法。
【請求項１５】
被検物質に曝された魚類から生殖器組織を採取し、該組織と請求項８に記載の抗体とを反応させ、得られる反応結果から環境汚染を評価する方法。
【請求項１６】
魚類がカダヤシ又はメダカである請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
被検物質が内分泌攪物質である請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
環境汚染が内分泌攪乱物質によるものである請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
請求項２〜４のいずれかに記載の遺伝子、該遺伝子増幅用プライマー及び／又は請求項８に記載の抗体を含む、化学物質の毒性評価又は環境汚染の評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、魚類の外性器形成に関与する遺伝子、及び該遺伝子を用いた、化学物質の毒性又は環境汚染の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、化学物質が原因と考えられている動物の生殖異常が世界各地で観察され、この異常は「内分泌攪乱物質」の作用ではないかと考えられている。例えば、アメリカ合衆国、フロリダ州のアポプカ湖における生殖異常に関する報告が最もよく知られている。調査報告によると、雄ワニのペニスが正常の１／４〜１／２の大きさに萎縮した個体が多数発見された。これらの生殖異常は、単に内分泌攪乱物質のみの作用として処理できる問題ではなく、生殖器官の発生・分化メカニズムを遺伝子レベルで解析すべき問題である。
【０００３】
ところで、カダヤシ（Ｇａｍｂｕｓｉａ　ａｆｆｉｎｉｓ）は北アメリカ原産で、東南アジアから蚊の幼虫であるボウフラの駆除のために日本に持ち込まれた移入魚であり、グッピーと同じカダヤシ科に属する卵胎生魚の一種として知られており、生息温度は１５〜３０℃と広く、汚染に強い。約４０日の妊娠期間の後に一度に１０から１００匹の稚魚を産む。出産時の稚魚の全長は７〜１０ｍｍに達し、すぐに旺盛な食欲を示すといった特徴を持つ。実験室ではメダカと同様、水温と光周期を調節することで、一年中いつでも稚魚を得ることができ、実験用魚類として研究に適している。
【０００４】
魚類の交接器には様々な型があるが、カダヤシの雄は尻鰭第３から第５鰭条が顕著に伸長して変形したゴノポディウム（ｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍ）と呼ばれる交接器をもっている。その構造は複雑で先端部には鉤や棘がある。
従来、本魚類において、この鰭の長さを単に測定することによって、河川の汚染の指標とする目的で注目されたことはあるが（Ａｒｃｈ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｃｏｎｔａｍ．　Ｔｏｘｉｃｏｌ　（例えば非特許文献１を参照））、本格的な実験動物としての応用はこれまでほとんどされておらず、環境汚染によって外性器の異常が生じるメカニズムは不明であった。このため、化学物質汚染、特に内分泌攪乱物質作用の科学的根拠に基づく評価に用いることができなかった。
【非特許文献１】
Ｊ．　Ｂａｔｔｙ，　Ｒ．　Ｌｉｍ　（１９９９）：　Ａｒｃｈ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｃｏｎｔａｍ．　Ｔｏｘｉｃｏｌ　　３６，　３０１−３０７
【非特許文献２】
Ｃａｒｌ　Ｊ　Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｈｅｌｎｅｒ　Ｇｒａｎｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２６，４８１７−４８２　６
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、魚類の外性器形成に関与する遺伝子を提供することを目的とする。また、本発明は、上記遺伝子を用いた化学物質の評価方法において、生殖器異常が発生するメカニズムを明らかにし、科学的に信頼できる評価方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために生殖器の形成に重要であると予想された遺伝子に注目し研究を行った。この結果、生殖器の形成に特に重要であると思われる遺伝子を新規にクローニングすることに成功した。この遺伝子を用いて魚類生殖器形成のメカニズムを解明するだけでなく、化学物質の毒性又は環境汚染を評価する方法を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０若しくは３２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０若しくは３２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、生殖器形成能を有するタンパク質
【０００８】
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０若しくは３２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０若しくは３２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、生殖器形成能を有するタンパク質
本発明の遺伝子としては、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
【０００９】
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、２５、２７、２９若しくは３１に示される塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、２５、２７、２９若しくは３１に示される塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、生殖器形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
本発明の遺伝子は、例えばカダヤシ又はメダカ由来のものである。
【００１０】
（３）前記（２）の遺伝子を含む組換えベクター。
（４）前記（３）のベクターを含む形質転換体。
（５）前記（４）の形質転換体を培養し、得られる培養物から生殖器形成能を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
【００１１】
（６）前記（１）のタンパク質に対する抗体。
（７）被検物質に曝された魚類において、前記（２）の遺伝子の発現レベルを解析し、得られる解析結果から被検物質の毒性を評価する方法、又は環境汚染（例えば内分泌攪乱物質によるもの）を評価する方法。
本発明の方法に使用される魚類としては、例えばカダヤシ又はメダカが挙げられる。また、被検物質としては、内分泌攪乱物質が挙げられる。
【００１２】
（８）被検物質に曝された魚類から生殖器組織を採取し、該組織と前記（６）の抗体とを反応させ、得られる反応結果から化学物質の毒性を評価する方法、又は環境汚染（例えば内分泌攪乱物質によるもの）を評価する方法。
魚類及び被検物質は、前記と同様である。
（９）前記（２）の遺伝子、該遺伝子増幅用プライマー及び／又は前記（６）の抗体を含む、化学物質の毒性評価又は環境汚染の評価用キット。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明者は、一般に普及しているカダヤシ又はメダカの稚魚から得た全ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法又はＲＡＣＥ法によって遺伝子増幅し、当該遺伝子をコードするＤＮＡ断片又は該ＤＮＡ断片を有するクローンを選択した。プライマーは、ゼブラフィッシュから予想される配列を用いて設計した。その後、遺伝子の発現をｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｙｚａｔｉｏｎ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって解析することにより、当該遺伝子の発現レベルを測定する方法を確立した。
【００１４】
更に、化学物質の影響を調べるために、評価対象となる化学物質の存在下でカダヤシを飼育し、カダヤシの交接器の長さの測定と、当該遺伝子の発現レベルの解析を行うことにより、両者間の関係を明らかにすることに成功した。これにより、環境汚染や化学物質が有する毒性（内分泌攪乱物質作用の強度）など、科学的根拠に基づく評価を発明するに至った。
【００１５】
重要な遺伝子として、アンドロジェンレセプター（ＡＲ）遺伝子、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）遺伝子、ディスタルレス（Ｄｌｘ）遺伝子、ＦＧＦ遺伝子、Ｈｏｘ遺伝子のうち少なくとも１つが挙げられ、生殖器組織としては交接器（ゴノポディウム）が挙げられる。
【００１６】
１．遺伝子のクローニング
（１）　ｃＤＮＡライブラリーの作製及びスクリーニング
ｍＲＮＡの供給源としては、カダヤシ（Ｇａｍｂｕｓｉａ　ａｆｆｉｎｉｓ）又はメダカ（Ｃｙｐｒｉｎｏｄｏｎｉｄａｅ）の生殖器組織が挙げられる。
ｍＲＮＡの調製は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、上記組織を、グアジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得る。全ＲＮＡを得るための市販のキットを使用することもできる。キットとしては、例えばＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ　−ＭＡＧ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔなどのＯｌｉｇｏｔｅｘシリーズキット（タカラバイオ社）が挙げられる。
【００１７】
このようにして得られたＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行いｃＤＮＡを合成する。ＲＴ−ＰＣＲは、当分野で周知技術であり、市販のキット（ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＴＭＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ）を使用することもできる。
このようにして得られたｃＤＮＡをプラスミド等の適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。また、プラスミド以外のクローニングベクター、例えばλファージ等を用いることもできる。
（２）　ＲＡＣＥ法
一方、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）法は、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に解っているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡの末端までの未知領域をクローニングする方法であり、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。未知領域がｍＲＮＡの上流（５’側）にある場合を５’ＲＡＣＥ、下流（３’側）にある場合を３’ＲＡＣＥという。ＲＡＣＥ法も当分野において周知であり、市販のキット、例えばＧＥＮＥ　ＲＡＣＥＲ（インビトロジェン社製）、ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（クロンテック社製）などを使用することができる。
【００１８】
（３）　塩基配列の決定
得られたクローン又はＤＮＡ断片について塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定は、公知の任意の手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えば日立蛍光式ＤＮＡシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。
本発明においてクローニングされた遺伝子と塩基配列との関係、及び各遺伝子によりコードされるタンパク質とアミノ酸配列との関係を表１に示す。
【００１９】
【表１】
2004000124.tif 000002
【００２０】
本発明においては、上記配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０又は３２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が生殖器形成能、特に外性器形成能を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個、好ましくは１個又は数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０又は３２に示すアミノ酸配列の１個又は数個、例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０又は３２に示すアミノ酸配列の１個又は数個、例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２、４、６、８、１０、２６、２８、３０又は３２に示すアミノ酸配列の１個又は数個、例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００２１】
従って、上記変異が導入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子も、生殖器形成能を有する限り本発明の遺伝子に含まれる。「生殖器形成能」とは、　発生の過程において性ホルモンなどの影響下で適切な生殖器の形態形成を誘導可能な機能を意味し、本発明においては、特に外性器形成能を指す。
【００２２】
また、本発明は、上記配列番号１、３、５、７、９、２５、２７、２９又は３１に示す塩基配列からなるＤＮＡである。但し、配列番号１、３、５、７、９、２５、２７、２９又は３１に示す塩基配列のうち、その一部、例えばアミノ酸への翻訳領域（下記）のＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。
配列番号１：２２〜６９３番
配列番号３：２４〜５４２番
配列番号５：２５〜５２２番
配列番号７：２２〜３０３番
配列番号９：２７〜１４０番
配列番号２５：１３３〜２３９７番
配列番号２７：２１〜５３０番
配列番号２９：２５〜５１９番
配列番号３１：２５〜３９０番
「一部」とは、本発明のタンパク質が生殖器形成能を保持する領域（例えば上記アミノ酸への翻訳領域）をコードする部分をいう。
さらに、上記配列番号１、３、５、７、９、２５、２７、２９若しくは３１に示す塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、塩（ナトリウム）濃度が１５０〜９００ｍＭであり、温度が５５〜７５℃、好ましくは塩（ナトリウム）濃度が２５０〜４５０ｍＭであり、温度が６８℃での条件をいう。
【００２３】
なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法や　Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のｃＤＮＡないしゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２４】
２．組換えベクター及び形質転換体の作製
（１）　組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド　ＤＮＡ、ファージ　ＤＮＡ等が挙げられる。
【００２５】
プラスミド　ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなど、任意に選択することができる。また、ファージＤＮＡ、ウイルスベクターなどを用いることもできる。
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター　ＤＮＡの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する。また、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２６】
（２）　形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア属、バチルス属等の細菌、サッカロミセス、シゾサッカロミセス等の酵母、動物細胞、昆虫細胞が挙げられる。
【００２７】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。
【００２８】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００２９】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００３０】
動物細胞を宿主とする場合は、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
【００３１】
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００３２】
３．本発明のタンパク質の生産
本発明のタンパク質は、本発明の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、又は該アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸に前記変異が導入されたアミノ酸配列を有し、かつ生殖器形成能を有するものである。
【００３３】
本発明のタンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００３４】
大腸菌や酵母菌等を宿主とする形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
【００３５】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３６】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、例えば３７℃で６〜２４時間行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３７】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を培地に添加してもよい。
【００３８】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【００３９】
培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００４０】
４．生殖器形成能を有するタンパク質に対する抗体
本発明において「抗体」とは、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれをも意味し、これら抗体の断片（例えばＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）も含まれる。
【００４１】
（１）ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして調製したタンパク質を抗原として用いて動物を免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、マウスの場合、１μｇ〜１０ｍｇであり、アジュバントの有無によって適宜調節する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられる。
【００４２】
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）に投与する。投与部位は静脈内、皮下又は腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、１〜１０回の免疫を行う。そして、最終免疫後に抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ）等により行うことができる。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４３】
（２）モノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体は、通常は、本発明のタンパク質に結合し得る抗体分子全体を意味するが、タンパク質との結合能を有する限り、その断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片）であってもよい。
本発明のモノクローナル抗体は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このようなモノクローナル抗体の製造法は当該分野で周知である。
【００４４】
（ｉ）　抗体産生細胞の採取
前記のようにして調製したタンパク質を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。免疫方法は、前記と同様である。そして、最終免疫後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００４５】
（ｉｉ）　細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株は、例えば　Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−Ｉなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００４６】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００４７】
（ｉｉｉ）　ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００４８】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって行われる。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００４９】
（ｉｖ）　モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％　ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
腹水形成法の場合は、例えばミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。
【００５０】
上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００５１】
５．毒性の評価又は環境汚染の評価
（１）遺伝子発現の検出
本発明においては、毒性の評価又は環境汚染の評価の対象となる被検物質（化学物質）が曝された環境中の被検動物において、本発明の遺伝子の発現の有無を測定することにより、被検物質の毒性を評価し、又は環境汚染の有無を評価することができる。
【００５２】
本発明において検出の対象となる遺伝子は、生殖器組織に発現する遺伝子であれば特に限定されるものではない。例えば、アンドロジェンレセプター（ＡＲ）遺伝子、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）遺伝子、ディスタルレス（Ｄｌｘ）遺伝子、ＦＧＦ遺伝子、Ｈｏｘ遺伝子のうち少なくとも１つが挙げられる。生殖器組織としては交接器（ゴノポディウム）が挙げられる。
【００５３】
本発明では、魚類（カダヤシ又はメダカ）が存在する水槽中に化学物質を存在させて、その化学物質がその生殖器組織の発生及び分化に与える影響を検定する（モニターする）ことができる。すなわち、生殖器組織に発現する遺伝子発現の異常を指標として、化学物質がどの程度の毒性を有するかを知ることができる。その結果、本発明の方法は、薬物等の化学物質の催奇形性試験に利用し、当該化学物質のスクリーニングに利用することが可能である。魚類の生殖器（交接器）には様々な型があるが、カダヤシの雄は尻鰭第３から第５鰭条が顕著に伸長して変形したゴノポディウム（ｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍ）と呼ばれる交接器をもっている。そこで、本発明ではゴノポディウムを使用することが好ましい。
【００５４】
化学物質としては、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる内分泌撹乱物質など（例えばダイオキシン、ビスフェノールＡ等）のほか、有機物質（ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ））、金属（有機スズ、有機水銀）、癌誘発剤（例えばメチルコラントレン）、性ホルモン（アンドロジェン等）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
上記化学物質を水槽に単位量（１ｍｌ）あたり約０．５〜１ｍｇ程度存在させ、カダヤシを飼育する。そして、飼育中の適当な時期において前記遺伝子の発現を検出する。
遺伝子発現の検出結果から化学物質の毒性を検定するには、以下の判断基準に従う。
【００５６】
すなわち、異常と判定される基準と同様の遺伝子発現を示した場合は、対象の化学物質は毒性があると判断される。例えば、用いたプローブにより検出される遺伝子発現パターンが変化した場合は、被検物質は有毒、又は毒性が高いと判断する。一方、発現が正常と判定される基準と同様の遺伝子発現を示した場合は、毒性はない又は低いと判断することができる。例えば、試験群における遺伝子発現パターンを対照群のパターンと比較（オーバーレイ）して、有意な変化が認められない場合は、毒性なし又は低いと判断する。
【００５７】
本発明では、魚類の生殖器における発現遺伝子の解析は、遺伝子発現分析により行う。遺伝子発現の検出は、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎキット：日本ジーン社製等）、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｋａｒａ　ＲＮＡ　ＲＴ−ＰＣＲ用キット：宝酒造社製等）、ノーザンブロッティング等の手法が用いられる。
【００５８】
評価対象となる化学物質を適宜希釈し、上記の方法でカダヤシ又はメダカを飼育した後、生殖器から採取したＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを行って本発明の遺伝子を増幅し、その発現量を測定することも可能である。
但し、本発明では上記手法に限定されるものではない。これらの手法は、当業者にとって公知である。
この結果、化学物質を暴露しない場合に比べ、遺伝子の発現量が有意に高い場合は、評価対象とした化学物質は内分泌撹乱作用を有すると考えられる。
【００５９】
上記遺伝子発現の検出に使用されるオリゴヌクレオチドはプローブとして使用される。各遺伝子の発現を検出する場合は、プローブとしてそれぞれの遺伝子の全長配列若しくは部分配列、又はこれらの配列に非翻訳領域の配列を付加したもののいずれをも用いることもできる。また、これらの遺伝子は単独で、又は２種以上を適宜組み合わせて使用される。ヌクレオチド配列は、検出の目的とする遺伝子の種類に応じて適宜設計及び合成することができる。また、例えば当該遺伝子がサブクローニングされたプラスミドを切断してテンプレートとし、アンチセンスＲＮＡを合成してプローブとすることもできる。
【００６０】
（２）生殖器伸長のｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏ比較検討
生殖器の伸長をｉｎ　ｖｉｖｏで観察するには、実体顕微鏡下に、外性器長の観察により所定の発生ステージであることを確認する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで観察するには、被検物質に曝された魚類から生殖器組織を採取し、該組織と前記抗体とを反応させて免疫組織染色等を行い、その結果から化学物質の毒性を評価する。免疫組織染色法は当分野において周知である。
本発明では、上記内分泌撹乱物質に曝されたときの遺伝子発現が相関関係を有することから、このデータを被検物質の毒性や、環境汚染の評価に利用することができる。
【００６１】
すなわち、被検物質を含む水性環境（水槽）内で魚類（カダヤシ、メダカ等）を飼育し、生殖器の長さを測定する。被検物質を含まない水槽内で魚類を飼育したときの結果（対照群）と比較して、生殖器の長さが異なる場合は、被検物質が毒性を有すると判断することができる。生殖器の長さが長くなるか短くなるかは化学物質によって異なるため、生殖器の伸長の態様と化学物質との関係をまとめておいてもよい。一方、生殖器の長さが正常と比べて同等の場合は、被検物質は無害又は毒性が小さいと判定することができる。
【００６２】
６．キット
本発明の遺伝子、タンパク質及び抗体は、それぞれ単独で、又は適宜組み合わせて、さらに適当な緩衝液等を含めて毒性検定又は環境汚染評価のためのキットとすることができる。
【００６３】
本発明のキットは、本発明の遺伝子を増幅することができるプライマーを含むものである。このようなプライマーとしては、例えば、上流側プライマーとして以下のプライマー１〜２、下流側プライマーとして以下のプライマー３〜４のいずれかが挙げられる。
【００６４】
プライマー１：５’−ＣＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＣＧＡＧＣＣＴ−３’（配列番号１１）
プライマー２：５’−ＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧ−３’（配列番号１２）
プライマー３：５’−ＡＧＡＴＧＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１３）
プライマー４：５’−ＧＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴ−３’（配列番号１４）
【００６５】
キットには、これらのプライマーのすべてを含んでもよく、一部でもよい。一部の場合は、プライマー１とプライマー３、プライマー２とプライマー４の組み合わせが好ましい。
プローブとしては、前記と同様である。
また、本発明は、遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより増幅させることを特徴とするものであるため、本発明のキットには、緩衝液（例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．３），　１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　５０ｍＭ　ＫＣｌ等）、逆転写酵素、オリゴｄ（Ｔ）プライマー、ＤＮＡポリメラーゼなどを含めることもできる。
７．微生物の寄託
本発明のカダヤシＡＲ遺伝子のうち「産物２」（後述）の配列を保有するプラスミド（名称：ＡＲ−２）は、平成１４年１０月１８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）にＦＥＲＭ　Ｐ−１９０７７として寄託されている。
【００６６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
［実施例１］　カダヤシのアンドロジェンレセプター（ＡＲ）遺伝子（部分配列）のクローニング
カダヤシの稚魚から抽出した３００ｎｇ／μｌの濃度のＲＮＡ１μｌ、超純水１μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌのそれぞれのプライマー各１．５μｌを用意し、計５μｌを反応混合物として準備した。この混合物を７０℃で１０分間反応させた後、直ちに氷冷した。その後、２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ１２．５μｌ、ＲＴ−ｔａｑ０．５μｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ４２μｌ、超純水５μｌの計２０μｌを加えた後、下記に記載するプログラムで遺伝子増幅を行った。（ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＴＭＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００６７】
プライマー（センス）ＡＲＦ：５’−ＣＴＣＡＣＣＴＧＹＧＧＨＡＧＣＴＧＣＡＡ−３’（配列番号１５）
プライマー（アンチセンス）ＡＲＲ：５’−ＧＡＡＧＡＧＮＡＧＣＡＲＤＧＣＹＴＴＣＡ−３’（配列番号１６）▲１▼　５０℃　３０分
▲２▼　９４℃　２分
▲３▼　９５℃　１分
▲４▼　５２℃　３０秒
▲５▼　７０℃　２分
▲６▼　（９５℃　１５秒、５２℃　３０秒、７０℃　２分）×３４サイクル
▲７▼　７０℃　３分
▲８▼　４℃で冷却
【００６８】
次に、この操作で得られたＰＣＲ産物の配列確認を行うため、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。ＰＣＡ産物を電気泳動し、バンドの増加が認められたバンドをゲルから回収し（Ｔａｋａｒａ　ＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭＶｅｒ．２を使用）、下記の要領でＬｉｇａｔｉｏｎを行った。
【００６９】
ベクターとして、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（３．０ｋｂｐ）１．２８×１０−２ｐｍｏｌとゲルから回収したＤＮＡ３．８３×１０−２ｐｍｏｌ、２×Ｒａｐｉｄ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ２．５μｌ、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　１μｌを計５μｌ用意し、８℃で一晩反応させた。その後、反応液４μｌを５０μｌの大腸菌株（ＪＭ１０９）に入れ、氷冷で３０分、４２℃で９０秒、氷冷で２分それぞれインキュベートし、形質転換を行った。ＳＯＣ　Ｂｒｏｔｈを３００μｌ添加し、３７℃で１時間培養した後、菌液をＬＢ／アンピシリン　Ｐｌａｔｅへまき、３７℃で一晩培養させた。得られたコロニーを１２個選んでＳＯＣ　Ｂｒｏｔｈ中にて少量培養し、ＤＮＡを調製した。制限酵素（ＥｃｏＲＩ）処理によりｉｎｓｅｒｔ　ＤＮＡの確認を行った後、ｓｅｑｕｅｎｃｅ反応により塩基配列を決定した。このＤＮＡの塩基配列の確認を行ったところ、６７１ｂｐ（翻訳領域）の塩基配列を得た（図１、配列番号１）。配列番号１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００７０】
［実施例２］　カダヤシのソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）遺伝子のクローニングカダヤシの稚魚から抽出した３００ｎｇ／μｌの濃度のＲＮＡ１μｌ、超純水１μｌ、プライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ各１．５μｌを用意し、計５μｌを反応混合物として準備した。この混合物を７０℃で１０分間反応させた後、直ちに氷冷した。その後、２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　１２．５μｌ、ＲＴ−ｔａｑ　０．５μｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ４　２μｌ、超純水５μｌの計２０μｌを加えた後、下記に記載するプログラムで遺伝子増幅を行った。（ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＴＭＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００７１】
プライマー（センス）ＳＨＨＦ：５’−ＣＴＧＡＣＮＣＣＴＮＴＮＧＣＣＴＡＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号１７）
プライマー（アンチセンス）ＳＨＨＲ：５’−ＧＣＣＡＧＣＡＣＮＹＮＧＴＣＮＣＣＧＧ−３’（配列番号１８）▲１▼　５０℃　３０分
▲２▼　９４℃　２分
▲３▼　９５℃　１分
▲４▼　５５℃　３０秒
▲５▼　７０℃　２分
▲６▼　（９５℃　１５秒、５５℃　３０秒、７０℃　２分）×３４サイクル
▲７▼　７０℃　３分
▲８▼　４℃で冷却
【００７２】
次に、この操作で得られたＰＣＲ産物の配列確認を行うため、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。方法は実施例１と同様に行った。このＤＮＡの塩基配列の確認を行ったところ、５２１ｂｐ（翻訳領域）の塩基配列を得た（図２、配列番号３）。配列番号３によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００７３】
［実施例３］カダヤシのディスタルレス（Ｄｌｘ）遺伝子のクローニング
カダヤシの稚魚から抽出した３００ｎｇ／μｌの濃度のＲＮＡ１μｌ、超純水１μｌ、プライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ各１．５μｌを用意し、計５μｌを反応混合物として準備した。この混合物を７０℃で１０分間反応させた後、直ちに氷冷した。その後、２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ１２．５μｌ、ＲＴ−ｔａｑ０．５μｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ４２μｌ、超純水５μｌの計２０μｌを加えた後、下記に記載するプログラムで遺伝子増幅を行った。（ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＴＭＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００７４】
プライマー（センス）ＤＬＸＦ：５’−ＧＣＹＡＣＳＧＡＹＴＣＹＧＲＣＴＡＹＴＡＣＡＧ−３’（配列番号１９）
プライマー（アンチセンス）ＤＬＸＲ：５’−ＴＧＶＧＧＮＧＡＧＴＴＲＣＡＮＧＣＣＡＴ−３’（配列番号２０）▲１▼　５０℃　３０分
▲２▼　９４℃　２分
▲３▼　９５℃　１分
▲４▼　５６℃　３０秒
▲５▼　７０℃　２分
▲６▼　（９５℃　１５秒、５６℃　３０秒、７０℃　２分）×３４サイクル
▲７▼　７０℃　３分
▲８▼　４℃で冷却
【００７５】
次に、この操作で得られたＰＣＲ産物の配列確認を行うため、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。方法は実施例１と同様に行った。このＤＮＡの塩基配列の確認を行ったところ、４９９ｂｐ（翻訳領域）の塩基配列を得た（図３、配列番号５）。配列番号５によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００７６】
［実施例４］カダヤシのＦＧＦ遺伝子のクローニング
カダヤシの稚魚から抽出した３００ｎｇ／μｌの濃度のＲＮＡ１μｌ、超純水１μｌ、プライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ各１．５μｌを用意し、計５μｌを反応混合物として準備した。この混合物を７０℃で１０分間反応させた後、直ちに氷冷した。その後、２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ１２．５μｌ、ＲＴ−ｔａｑ０．５μｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ４２μｌ、超純水５μｌの計２０μｌを加えた後、下記に記載するプログラムで遺伝子増幅を行った。（ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＴＭＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００７７】
プライマー（センス）ＦＧＦＦ：５’−ＣＡＧＣＡＴＧＴＧＡＧＹＧＡＧＣＡＲＡＧ−３’（配列番号２１）
プライマー（アンチセンス）ＦＧＦＲ：５’−ＡＲＮＧＣＮＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＹＴＣ−３’（配列番号２２）▲１▼　５０℃　３０分
▲２▼　９４℃　２分
▲３▼　９５℃　１分
▲４▼　５５℃　３０秒
▲５▼　７０℃　２分
▲６▼　（９５℃　１５秒、５５℃　３０秒、７０℃　２分）×３４サイクル
▲７▼　７０℃　３分
▲８▼　４℃で冷却
【００７８】
次に、この操作で得られたＰＣＲ産物の配列確認を行うため、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。方法は実施例１と同様に行った。このＤＮＡの塩基配列の確認を行ったところ、２８３ｂｐ（翻訳領域）の塩基配列を得た（図４、配列番号７）。配列番号７によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００７９】
［実施例５］カダヤシのＨｏｘ遺伝子のクローニング
カダヤシの稚魚から抽出した３００ｎｇ／μｌの濃度のＲＮＡ１μｌ、超純水１μｌ、プライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ各１．５μｌを用意し、計５μｌを反応混合物として準備した。この混合物を７０℃で１０分間反応させた後、直ちに氷冷した。その後、２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ１２．５μｌ、ＲＴ−ｔａｑ０．５μｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ４２μｌ、超純水５μｌの計２０μｌを加えた後、下記に記載するプログラムで遺伝子増幅を行った。（ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＴＭＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００８０】
プライマー（センス）：５’−ＧＹＡＧＲＡＡＧＡＡＧＭＧＳＧＴＫＣＣＹＴＡＣＡＣ−３’（配列番号２３）
プライマー（アンチセンス）：５’−ＴＴＳＡＣＣＣＫＹＣＫＧＴＴＹＴＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号２４）▲１▼　５０℃　３０分
▲２▼　９４℃　２分
▲３▼　９５℃　１分
▲４▼　５０℃　３０秒
▲５▼　７０℃　２分
▲６▼　（９５℃　１５秒、５０℃　３０秒、７０℃　２分）×３４サイクル
▲７▼　７０℃　３分
▲８▼　４℃で冷却
【００８１】
次に、この操作で得られたＰＣＲ産物の配列確認を行うため、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。方法は実施例１と同様に行った。このＤＮＡの塩基配列の確認を行ったところ、１１６ｂｐ（翻訳領域）の塩基配列を得た（図５、配列番号９）。配列番号９によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
［実施例６］　カダヤシのアンドロジェンレセプター（ＡＲ）遺伝子（全長）のクローニング
実施例１において決定したカダヤシＡＲ遺伝子の部分配列情報、及びＲＡＣＥ用キットＧＥＮＥ　ＲＡＣＥＲ　（インビトロジェン社製）を用いて、ＲＡＣＥを行なった。
本実施例におけるＲＡＣＥ法の概要を以下に示す。まず、図６に示すように、キットに添付の３’プライマーと、実施例１でクローニングしたＤＮＡの塩基配列に基づいて設計した遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ−Ｆ１）とを用いてＰＣＲを行なう。ここで増幅された増幅産物を産物１とする。次に、ＧＳＰ−Ｆ１と配列が一部重複するようにＧＳＰ−Ｒ２を作製し、これとキットに添付の５’プライマーとを用いてＰＣＲを行なう（増幅産物を産物２とする）。そして、産物２の配列を決定した後、その配列に基づいてＧＳＰ−Ｒ３を設計し、これとキットに添付の５’プライマーとを用いてＰＣＲを行う（増幅産物を産物３とする）。産物１と産物２、産物２と産物３とは、それぞれ重複領域があるため、産物１から産物３まで全長の配列を決定することができる。
以下、具体的に説明する。
１．ｍＲＮＡの精製（ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ＭＡＧ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｆｒｏｍ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ），ＴａＫａＲａを使用）
孵化後のカダヤシの稚魚から抽出した全ＲＮＡ　２５０μｇ／１５０μｌ、２×Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　１５０μｌ、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ＭＡＧ　３０μｌを混合し、７０℃で３分間加熱し、ＲＮＡを変性させた。その後、１０分間室温に放置し、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ＭＡＧに　ｍＲＮＡ　を結合させた。Ｍａｇｎｅｔ　ｓｔａｎｄにチューブをセットして２分間放置し、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ＭＡＧを吸い込まないように上清を除去した。Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　３５０μｌでＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ＭＡＧを懸濁し、再度ｓｔａｎｄにチューブをセットして２分間放置、上清を除去する操作を２回行った。続いて７０℃のＤＥＰＣ水で同様の操作を３回行ってｍＲＮＡを含む上清を回収した。ｍＲＮＡ溶液に等量のクロロホルムを添加、混合し、１５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して得られた上清に１／１０倍量の３Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．５）、２．５倍量のエタノールを添加し、−２０℃で２時間以上放置してエタノール沈殿を行った。１５，０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離を行い上清を捨て、得られた沈殿に７０％エタノール２００μｌを加えて更に１５，０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を捨て、室温で１０分放置して沈殿を乾燥させ、１５μｌのＤＥＰＣ水に溶解しカダヤシｍＲＮＡ溶液を得た。
２．ＲＡＣＥ法による目的ｃＤＮＡ末端の増幅（Ｇｅｎｅ　Ｒａｃｅｒ　ｋｉｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　Ｆ，　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを使用）
（１）　脱リン酸化反応
１．の操作で精製したｍＲＮＡ　２５０ｎｇ相当量、１０×ＣＩＰ　ｂｕｆｆｅｒ　１μｌ、ＲｎａｓｅＯｕｔ（４０Ｕ／μｌ）　１μｌ、ＣＩＰ（１０Ｕ／μｌ）　１μｌにＤＥＰＣ水を加え計１０μｌとし、よく混和して５０℃で１時間インキュベートした。氷冷した後、９０μｌのＤＥＰＣ水と１００μｌのｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを加え、よく混和し、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を得た。上清に１０ｍｇ／ｍｌのｍｕｓｓｅｌ　ｇｌｙｃｏｇｅｎ　２μｌ、３Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．２）１０μｌ、９５％エタノール２２０μｌを加えて混和し、ドライアイスで１０分間冷却した。４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、得られた沈殿に７０％エタノールを５００μｌ加え４℃、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心した。エタノールを除去し、沈殿を室温で１〜２分間空気乾燥させた後、７μｌのＤＥＰＣ水を加え溶解させた。
（２）キャップ構造の除去
（１）で得られたＲＮＡ溶液７μｌ、１０×ＴＡＰ　ｂｕｆｆｅｒ　１μｌ、ＲＮａｓｅ　Ｏｕｔ　１μｌ、ＴＡＰ（０．５Ｕ／μｌ）１μｌ、計１０μｌを混合し、３７℃で１時間インキュベートした後氷冷した。９０μｌのＤＥＰＣ水と１００μｌのｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを加え、よく混和し、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を得た。上清に１０ｍｇ／ｍｌのｍｕｓｓｅｌ　ｇｌｙｃｏｇｅｎ　２μｌ、３Ｍ　ｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．２）１０μｌ、９５％エタノール２２０μｌを加え混和し、ドライアイスで１０分間冷却した。４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた沈殿に７０％エタノールを５００μｌ加え４℃、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。得られた沈殿を室温で１〜２分間空気乾燥させた後、７μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。
（３）ｌｉｇａｔｉｏｎ反応
Ｇｅｎｅ　Ｒａｃｅｒ　ＲＮＡ　Ｏｌｉｇｏ　（配列番号４３）（０．２５μｇ）に、（２）で得られたＲＮＡ溶液７μｌを加えよく溶かし、６５℃で５分間インキュベートしＲＮＡの２次構造を変性させた。２分間氷冷した後遠心し、１０×Ｌｉｇａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ　ＡＴＰ、ＲＮａｓｅ　Ｏｕｔ、Ｔ４　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（５　Ｕ／μｌ）を各１μｌ加え、１０μｌの溶液とし、３７℃で１時間インキュベートした。遠心、氷冷後、９０μｌのＤＥＰＣ水と１００μｌのｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを加え、よく混和し、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を得た。上清に１０ｍｇ／ｍｌのｍｕｓｓｅｌ　ｇｌｙｃｏｇｅｎ　２μｌ、３Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．２）１０μｌ、９５％エタノール２２０μｌを加え混和した。４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、得られた沈殿に７０％エタノールを５００μｌ加え４℃、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心し、室温で１〜２分間空気乾燥させた。１０μｌのＤＥＰＣ水を加え溶解させた。
（４）逆転写反応
（３）で得られたＲＮＡ　溶液１０μｌに５０μＭ　Ｇｅｎｅ　Ｒａｃｅｒ　Ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４４）とｄＮＴＰ　ｍｉｘ（１０ｍＭ　ｅａｃｈ）を各１μｌずつ加え、６５℃で５分間インキュベートしＲＮＡの２次構造を変性させた。２分間氷冷した後遠心し、５×Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　４μｌ、０．１Ｍ　ＤＴＴ　２μｌ、ＲＮａｓｅ　Ｏｕｔ　１μｌ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＲＴ（２００
Ｕ／μｌ）　１μｌを加え、計２０μｌの溶液とした。よく混和した後、４２℃で５０分間反応後、７０℃で１５分間インキュベートして酵素を失活させた。２分間氷冷後、１５，０００ｒｐｍで遠心し、ＲＮａｓｅ　Ｈ　１μｌを加え、３７℃で２０分間インキュベートしてＤＮＡに結合しているＲＮＡを分解した。得られた逆転写産物をＰＣＲ反応に用いた。
（５）ｃＤＮＡの増幅
３’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲ
反応液として表２に示すものを準備し、計５０μｌの反応混合物とした。この混合物を表３に示すプログラムでＴｏｕｃｈｄｏｗｎ　ＰＣＲ法により遺伝子増幅を行った。
Ｇｅｎｅ　Ｒａｃｅｒ　３’　Ｐｒｉｍｅｒ（アンチセンス）：５’−ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧ−３’（配列番号３３）
ＧＳＰ−Ｆ１（センス）：５’−ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＧＣＣＡＧＡＡＧＴＡ−３’　（配列番号３４）
【表２】
2004000124.tif 000003
【表３】
2004000124.tif 000004
上記ＰＣＲにより得られた増幅産物を産物１とした。５’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲ反応液として表４に示すものを準備し、計５０μｌの反応混合物とした。この混合物を表５に示すプログラムでＴｏｕｃｈｄｏｗｎ　ＰＣＲ法により遺伝子増幅を行った。
Ｇｅｎｅ　Ｒａｃｅｒ　５’　Ｐｒｉｍｅｒ（センス）：５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’　（配列番号３５）
ＧＳＰ−Ｒ２（アンチセンス）：５’−ＣＣＡＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＡ−３’　（配列番号３６）
ＧＳＰ−Ｒ３（アンチセンス）：５’−ＣＣＧＴＣＧＡＡＧＴＧＴＧＡＧＣＧＴＡＣＴＧＧＡＣ−３’　（配列番号３７）
【表４】
2004000124.tif 000005
【表５】
2004000124.tif 000006
ＧＳＰ−Ｒ２と５’プライマーとの組合せにより増幅された産物を産物２とし、ＧＳＰ−Ｒ３と５’プライマーとの組合せにより増幅された産物を産物３とする。なお、ＧＳＰ−Ｒ３は、予め産物２の配列を決定した上で、５’プライマーの配列と産物２の配列とがそれぞれ一部重複するように設計したものである。
３．ＰＣＲ産物のクローニングと配列解析
次に、この操作で得られたＰＣＲ産物の配列確認を行うため、ＰＣＲ産物を電気泳動し、増加が認められたバンドをゲルから回収し（ＴａＫａＲａ　ＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭＶｅｒ．２を使用）、下記の要領でサブクローニングした。
▲１▼　プライマーＧＳＰ−Ｆ１から得た産物（産物１）及びプライマーＧＳＰ−Ｒ２から得た産物（産物２）：ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用
ゲルから回収したＰＣＲ産物３μｌ、Ｓａｌｔ　ＳｏｌｕｔｉｏｎとＨ２Ｏ各１μｌ、計５μｌを用意し、ＴＯＰＯ　ｖｅｃｔｏｒ　１μｌを加えて穏やかに混合し、２２℃で３０分間反応した。その後、反応液２μｌをコンピテントセル（ＤＨ５α）へ混合し、氷冷で３０分放置した後、４２℃で３０秒、氷冷で２分間インキュベートし、形質転換を行った。ＳＯＣ　ｍｅｄｉｕｍを２５０μｌ添加し、３７℃で１時間培養した後、菌液をＬＢ／アンピシリン　Ｐｌａｔｅへまき、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを１２個選んでＬＢ　Ｂｒｏｔｈ中にて少量培養し、ＤＮＡを調製した。制限酵素（ＥｃｏＲＩ）処理によりｉｎｓｅｒｔ　ＤＮＡの確認を行った後、ｓｅｑｕｅｎｃｅ反応により塩基配列を決定した。
▲２▼　プライマーＧＳＰ−Ｒ３から得た産物（産物３）：ｐＧＥＭ　ＥＡＳＹ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｉ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を使用
ベクターとして、ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ（３．０ｋｂｐ）１．２８×１０−２ｐｍｏｌとゲルから回収したＤＮＡ３．８３×１０−２ｐｍｏｌ、２×Ｒａｐｉｄ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ２．５μｌ、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　１μｌを計５μｌ用意し、８℃で一晩反応させた。その後、反応液４μｌを５０μｌのコンピテントセル（ＪＭ１０９）に入れ、氷冷で３０分放置した後、４２℃で９０秒、氷冷で２分間インキュベートし、形質転換を行った。ＬＢ　Ｂｒｏｔｈを３００μｌ添加し、３７℃で１時間培養した後、菌液をＬＢ／アンピシリン　Ｐｌａｔｅへまき、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを１２個選んでＬＢ　Ｂｒｏｔｈ中にて少量培養し、ＤＮＡを調製した。制限酵素（ＥｃｏＲＩ）処理によりｉｎｓｅｒｔ　ＤＮＡの確認を行った後、ｓｅｑｕｅｎｃｅ反応により塩基配列を決定した。
以上の操作により得られた３つの部分配列より、５’側に１３２ｂｐ、３’側に１，０３４ｂｐの非翻訳領域を含む全長３，４３４ｂｐの塩基配列を得た。（図７、配列番号２５）
［実施例７］メダカアンドロジェンレセプター（ＡＲ）遺伝子のクローニング
メダカの稚魚から抽出した３００ｎｇ／μｌの濃度のＲＮＡ１μｌ、超純水１μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌのそれぞれのプライマー各１．５μｌを用意し、計５μｌを反応混合物として準備した。この混合物を７０℃で１０分間反応させた後、直ちに氷冷した。その後、２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ１２．５μｌ、ＲＴ−ｔａｑ０．５μｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ４２μｌ、超純水５μｌの計２０μｌを加えた後、下記に記載するプログラムで遺伝子増幅を行った。（ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＴＭＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
プライマー（センス）：５’−ＧＧＭＧＣＮＣＧＢＡＡＧＣＴＢＡＡＧＡＡ−３’（配列番号３８）
プライマー（アンチセンス）：５’−ＧＡＡＧＡＧＮＡＧＣＡＲＤＧＣＹＴＴＣＡ−３’（配列番号３９）
▲１▼　５０℃　３０分
▲２▼　９４℃　２分
▲３▼　９５℃　１分
▲４▼　５２℃　３０秒
▲５▼　７０℃　２分
▲６▼　（９５℃　１５秒、５２℃　３０秒、７０℃　２分）×３５サイクル
▲７▼　７０℃　３分
▲８▼　４℃で冷却
次に、この操作で得られたＰＣＲ産物の配列確認を行うため、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。ＰＣＲ産物を電気泳動し、増加が認められた目的鎖長のバンドをゲルから回収し（Ｔａｋａｒａ　ＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭＶｅｒ．２を使用）、下記の要領でＬｉｇａｔｉｏｎを行った。
ベクターとして、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（３．０ｋｂｐ）１．２８×１０−２ｐｍｏｌとゲルから回収したＤＮＡ３．８３×１０−２ｐｍｏｌ、２×Ｒａｐｉｄ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ２．５μｌ、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　１μｌを計５μｌ用意し、８℃で一晩反応させた。その後、反応液４μｌを５０μｌの大腸菌株（ＪＭ１０９）に入れ、氷冷で３０分、４２℃で９０秒、氷冷で２分それぞれインキュベートし、形質転換を行った。ＳＯＣ　Ｂｒｏｔｈを３００μｌ添加し、３７℃で１時間培養した後、菌液をＬＢ／アンピシリン　Ｐｌａｔｅへまき、３７℃で一晩培養させた。得られたコロニーを１２個選んでＳＯＣ　Ｂｒｏｔｈ中にて少量培養し、ＤＮＡを調製した。制限酵素（ＥｃｏＲＩ）処理によりｉｎｓｅｒｔ　ＤＮＡの確認を行った後、ｓｅｑｕｅｎｃｅ反応により塩基配列を決定した。このＤＮＡの塩基配列の確認を行ったところ、５１２ｂｐの塩基配列を得た（図８、配列番号２７）。
［実施例８］　メダカディスタルレス（Ｄｌｘ５）遺伝子のクローニング
メダカの稚魚から抽出した３００ｎｇ／μｌの濃度のＲＮＡ１μｌ、超純水１μｌ、プライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ各１．５μｌを用意し、計５μｌを反応混合物として準備した。この混合物を７０℃で１０分間反応させた後、直ちに氷冷した。その後、２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ１２．５μｌ、ＲＴ−ｔａｑ０．５μｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ４２μｌ、超純水５μｌの計２０μｌを加えた後、下記に記載するプログラムで遺伝子増幅を行った。（ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＴＭＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
プライマー（センス）：５’−　ＧＣＹＡＣＳＧＡＹＴＣＹＧＲＣＴＡＹＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４０）
プライマー（アンチセンス）：５’−ＴＧＶＧＧＮＧＡＧＴＴＲＣＡＮＧＣＣＡＴ−３’（配列番号４１）
▲１▼　５０℃　３０分
▲２▼　９４℃　２分
▲３▼　９５℃　１分
▲４▼　５６℃　３０秒
▲５▼　７０℃　２分
▲６▼　（９５℃　１５秒、５６℃　３０秒、７０℃　２分）×３４サイクル
▲７▼　７０℃　３分
▲８▼　４℃で冷却
次に、この操作で得られたＰＣＲ産物の配列確認を行うため、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。方法は実施例１と同様に行った。このＤＮＡの塩基配列の確認を行ったところ、４９６ｂｐの塩基配列を得た（図９、配列番号２９）。
［実施例９］　メダカディスタルレス（Ｄｌｘ３）遺伝子のクローニング
メダカの稚魚から抽出した３００ｎｇ／μｌの濃度のＲＮＡ１μｌ、超純水１μｌ、プライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ各１．５μｌを用意し、計５μｌを反応混合物として準備した。この混合物を７０℃で１０分間反応させた後、直ちに氷冷した。その後、２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ１２．５μｌ、ＲＴ−ｔａｑ０．５μｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ４２μｌ、超純水５μｌの計２０μｌを加えた後、下記に記載するプログラムで遺伝子増幅を行った。（ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＴＭＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
プライマー（センス）：５’−　ＧＣＹＡＣＳＧＡＹＴＣＹＧＲＣＴＡＹＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４０）
プライマー（アンチセンス）：５’−ＴＣＡＣＣＴＧＢＧＴＣＴＧＢＧＴＳＡＧＴＣＣ　−３’（配列番号４２）▲１▼　５０℃　３０分
▲２▼　９４℃　２分
▲３▼　９５℃　１分
▲４▼　５８℃　３０秒
▲５▼　７０℃　２分
▲６▼　（９５℃　１５秒、５８℃　３０秒、７０℃　２分）×３４サイクル
▲７▼　７０℃　３分
▲８▼　４℃で冷却
次に、この操作で得られたＰＣＲ産物の配列確認を行うため、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。方法は実施例１と同様に行った。このＤＮＡの塩基配列の確認を行ったところ、３６７ｂｐの塩基配列を得た（図１０、配列番号３１）。
【００８２】
［実施例１０］　Ｗｈｏｌｅ　ｍｏｕｎｔ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる各遺伝子の発現解析
試料の作製
本発明の遺伝子発現が、実際に化学物質により影響を受けるのかを調べるために、アンドロジェンの存在下でカダヤシを飼育し、ｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍの主要部分を構成する尻びれの長さを測定したところ、第３鰭条が肥大し、第３、４、５鰭条が顕著に伸長した（図１１）。図１１において、パネルＡ−Ｃはアンドロジェン不存在下で飼育したときの結果であり（対照）、パネルＤ−Ｆはアンドロジェン存在下で飼育したときの結果である。ｄ６、ｄ１０、ｄ１７は、孵化稚魚にアンドロジェンを投与した後、それぞれ６日目、１０日目、１７日目の鰭である。
この現象を遺伝子レベルで解明するために、各遺伝子の発現レベルの解析を行った。試験した遺伝子は、カダヤシＡＲ遺伝子（部分配列、配列番号１）、カダヤシＳｈｈ遺伝子（配列番号３）、カダヤシＤｌｘ遺伝子（配列番号５）、カダヤシＦＧＦ８遺伝子（配列番号７）及びカダヤシＨｏｘａ−１３遺伝子（配列番号９）である。
【００８３】
組織を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で４℃、一晩固定した。ＰＢＳで１５分×２回洗浄し、５０％ＰＢＳ／ＭｅＯＨで１５分、１００％ＭｅＯＨで１５分×２回脱水した後、透過性を上げるため、−２０℃で３０分放置した。（この時点で−２０℃保存可）
組織へのＲＮＡ　Ｐｒｏｂｅの透過性を上げるため、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（５０μｇ／ｍｌ）　ｉｎ　ＰＢＴで１０分〜３５分室温で反応させた。２ｍｇ／ｍｌのｇｌｙｃｉｎ／ＰＢＴで２回洗浄して反応を停止した。４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで２０分室温で反応させて再固定し、ＰＢＴで５分×５回室温で洗浄した。
【００８４】
Ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ５０％　ホルムアミド，　５×ＳＳＣ，　０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０，　５０μｇ／ｍｌ　ヘパリン，　５００μｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡ（ｐＨ６．０　ｗｉｔｈ　ｃｉｔｒｉｃ　ａｃｉｄ）を作製し、６０℃で１時間ゆっくりと振盪させた。
【００８５】
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
ＤＩＧで標識したＲＮＡ　ＰｒｏｂｅとＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを混合し、８０℃で２分、氷冷で２分間前処理した後、試料に添加し、６０℃で一晩、ゆっくり振盪しながら反応させた。
【００８６】
洗浄
以下の要領で洗浄操作を行った。
７５％　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ，　２５％　２×ＳＳＣで振盪させながら６０℃で１０分
５０％　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ，　５０％　２×ＳＳＣで振盪させながら６０℃で１０分
２５％　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ，　７５％　２×ＳＳＣで振盪させながら６０℃で１０分
０．２×ＳＳＣで振盪させながら５５℃で３０分×２回
７５％０．２×ＳＳＣ，　２５％ＰＢＴで振盪させながら室温で５分
５０％０．２×ＳＳＣ，　５０％ＰＢＴで振盪させながら室温で５分
２５％０．２×ＳＳＣ，　７５％ＰＢＴで振盪させながら室温で５分
【００８７】
抗ＤＩＧ抗体の作製
Ａｎｔｉ　ＤＩＧ−ＡＰ−Ｆａｂ・ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　５μｌ　に２％　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｒｅｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社），　５％ＦＢＳ，　０．１Ｍ　ｍａｌｅｉｃ　ａｃｉｄ，　０．１５Ｍ　ＮａＣｌより調製したＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え５００μｌとし、色々なｓｔａｇｅの胚を加え、ゆっくり振盪させながら４℃で一晩反応させたものを４℃で保存し、うち０．１ｍｌをＭＡＢ（０．１Ｍ　Ｍａｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｐＨ７．５と０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）１．９ｍｌで希釈し、最終濃度１／２０００のＰｒｅｓｏｒｂｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙとした。
【００８８】
抗体反応・発色
５％ＰＢＳ　ｉｎ　ＰＢＴで振盪させながら室温で１時間反応した後、上述の抗体中で、ゆっくり振盪させながら４℃で一晩反応させたのち、ＰＢＴで２０分×６回、室温で洗浄した。更に、ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｅｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ９．５，　５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１００ｍＭ　ＮａＣｌ，　０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０，　０．４８ｍｇ／ｍｌのレバミゾール）で５分×３回洗浄した。ＢＭ　Ｐｕｒｐｌｅ　ＡＰ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇに置き換え、室温で発色反応を行った。ＰＢＴで洗浄して反応を停止した。
【００８９】
以上の検討により、Ｗｈｏｌｅ　ｍｏｕｎｔ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる各遺伝子の発現解析では、ＡＲ遺伝子（部分配列：配列番号１）の発現については、尻びれ鰭条先端部の間葉と上皮に発現しており（図１２Ａ）、この部分における強いホルモン作用を媒介している可能性を示唆した。Ｓｈｈ遺伝子の発現については、伸長中の尻びれ鰭条上皮基底層に発現が認められた（図１２Ｂ）。
【００９０】
図１２は、ｅｔｈｙｎｙｌｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＥＴ）　を飼育水中に投与（１０ｎｇ／ｍｌ）１０日目のときのｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍにおける遺伝子発現を示す。　Ａ）　ＡＲ，　　Ｂ）　Ｓｈｈ、　下の図は切片（厚さ１０ミクロン）を示す。
この発現は鰭条の伸長が最も顕著であるｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍ形成鰭条から発現が開始し、その後、全鰭条に広がった。その後、ｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍにおける発現は維持され、鰭条の伸長が続くが、他の鰭条における発現は減少し、それに伴い鰭条の伸長も抑制された。Ｄｌｘ遺伝子の発現は鰭条先端の間葉および上皮で発現が認められた。ＦＧＦ８遺伝子の発現については、鰭の先端上皮に発現が認められた。Ｈｏｘａ−１３遺伝子の発現については、鰭条先端の間葉及び上皮に認められた。Ｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍ形成期には、まず尻びれの全ての鰭条が伸長し、その後、ｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍを形成する鰭条以外の鰭条では、Ｓｈｈ遺伝子ＡＲ遺伝子、Ｄｌｘ遺伝子などの発現が低下して伸長が停止するが、Ｈｏｘａ−１３遺伝子の発現も同様の発現を示した。Ｈｏｘａ−１３遺伝子は、鰭条形成パターニングに関わっていると考えられた。
【００９１】
［実施例１１］ＲＴ−ＰＣＲ法による各遺伝子の発現レベルの解析
ｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍ形成はアンドロジェン投与により誘導されることが明らかとなった（図１１）。この結果、約１週間で鰭条の伸長が顕著となるので、アンドロジェン投与１日、３日、７日において、ｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍからＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＡＲ遺伝子及びｓｈｈ遺伝子において発現解析を行った。
【００９２】
アンドロジェン投与１日、３日、７日の孵化稚魚各２０匹の尻びれから抽出した１００ｎｇ／μｌのＲＮＡ１μｌ、超純水２μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌのそれぞれのプライマー各１μｌを用意し、計５μｌを反応混合物として準備した。この混合物を７０℃で１０分間反応させた後、４℃で２分間放置した。その後、２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ１２．５μｌ、ＲＴ−ｔａｑ０．５μｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ４２μｌ、超純水５μｌの計２０μｌを加えた後、下記に記載するプログラムで遺伝子増幅を行った。（ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＴＭＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００９３】
（１）　ＡＲ遺伝子の解析方法
（１−１）使用するプライマー
プライマー１（センス）：５’−ＣＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＣＧＡＧＣＣＴ−３’（配列番号１１）
プライマー３（アンチセンス）：５’−ＡＧＡＴＧＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１３）
（１−２）ＲＴ−ＰＣＲプログラム
▲１▼　５０℃　３０分
▲２▼　９４℃　２分
▲３▼　９５℃　１分
▲４▼　５８℃　３０秒
▲５▼　７０℃　２分
▲６▼　（９５℃　１５秒、５８℃　３０秒、７０℃　２分）×３４サイクル
▲７▼　７０℃　３分
▲８▼　４℃で冷却
【００９４】
（２）　Ｓｈｈ遺伝子の解析方法
（２−１）使用するプライマー
プライマー２（センス）：５’−ＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧ−３’（配列番号１２）
プライマー４（アンチセンス）：５’−ＧＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴ−３’（配列番号１４）
（２−２）ＲＴ−ＰＣＲプログラム
▲１▼　５０℃　３０分
▲２▼　９４℃　２分
▲３▼　９５℃　１分
▲４▼　５９℃　３０秒
▲５▼　７０℃　２分
▲６▼　（９５℃　１５秒、５９℃　３０秒、７０℃　２分）×３４サイクル
▲７▼　７０℃　３分
▲８▼　４℃で冷却
【００９５】
次に、ＰＣＲ産物５μｌを１％ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌで１００Ｖ、３０分の条件で電気泳動した。その結果、ＡＲ遺伝子及びＳｈｈ遺伝子について、アンドロジェン投与７日で増加が認められた（図１３）。図１３は、ｅｔｈｙｎｙｌｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＥＴ）　を飼育水中に投与し（０．５ｎｇ／ｍｌ）、７日目のｇｏｎｏｐｏｄｉｕｍにおける遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにて測定した結果である。　Ｃは無投与、ＥＴは投与のしたときの結果を示す。ＥＦ１ａｌｐｈａは、コントロールを示す。
【００９６】
【発明の効果】
本発明により、魚類を用いた化学物質の評価方法において、魚類生殖器形成のメカニズムが解明されるだけでなく、化学物質の毒性又は環境汚染を科学的に評価できる方法が提供される。
【００９７】
【配列表】
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【００９８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１５：合成ＤＮＡ。
配列番号１６：合成ＤＮＡ。
配列番号１６：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：７）。
配列番号１７：合成ＤＮＡ。
配列番号１７：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：６）。
配列番号１７：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：１０）。
配列番号１７：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：１２）。
配列番号１８：合成ＤＮＡ。
配列番号１８：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：９）。
配列番号１８：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：１１）。
配列番号１８：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：１５）。
配列番号１９：合成ＤＮＡ。
配列番号２０：合成ＤＮＡ。
配列番号２０：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：６）。
配列番号２０：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：１５）。
配列番号２１：合成ＤＮＡ。
配列番号２２：合成ＤＮＡ。
配列番号２２：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：３）。
配列番号２２：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：６）。
配列番号２３：合成ＤＮＡ。
配列番号２４：合成ＤＮＡ。
配列番号３３：合成ＤＮＡ。
配列番号３４：合成ＤＮＡ。
配列番号３５：合成ＤＮＡ。
配列番号３６：合成ＤＮＡ。
配列番号３７：合成ＤＮＡ。
配列番号３８：合成ＤＮＡ。
配列番号３８：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：６）。
配列番号３９：合成ＤＮＡ。
配列番号３９：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：７）。
配列番号４０：合成ＤＮＡ。
配列番号４１：合成ＤＮＡ。
配列番号４１：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：６）。
配列番号４１：ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：１５）。
配列番号４２：合成ＤＮＡ。
配列番号４３：合成ＲＮＡ。
配列番号４４：合成ＤＮＡ。
【図面の簡単な説明】
【図１】カダヤシのアンドロジェンレセプター遺伝子（７１１ｂｐ）の塩基配列を示す図である。プライマー部分は太字で示す。
配列の前半部に施した枠囲みの領域１：ＤＢＤ（ＤＮＡ　結合ドメイン）
下線部：Ｄ領域（ＡＲの核内移行に重要な配列（ＮＳＬ）が存在する）
配列の後半部に施した枠囲みの領域２：ＬＢＤ（リガンド結合ドメイン）
【図２】カダヤシのソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）遺伝子（５５９ｂｐ）の塩基配列を示す図である。プライマー部分を太字で示す。
【図３】カダヤシのディスタレス（Ｄｌｘ）遺伝子（５４２ｂｐ）の塩基配列を示す図である。プライマー部分を太字で示す。
【図４】カダヤシのＦＧＦ遺伝子（３２３ｂｐ）の塩基配列を示す図である。プライマー部分を太字で示す。
【図５】カダヤシのＨｏｘ遺伝子（１６３ｂｐ）の塩基配列を示す図である。プライマー部分を太字で示す。
【図６】ＲＡＣＥ法によるカダヤシの全長ＡＲ遺伝子のクローニング工程を示す図である。
【図７】カダヤシの全長ＡＲ遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図８】メダカのＡＲ遺伝子の塩基配列を示す図である。プライマー部分を太字で示す。
【図９】メダカのＤｌｘ５遺伝子の塩基配列を示す図である。プライマー部分を太字で示す。
【図１０】メダカのＤｌｘ３遺伝子の塩基配列を示す図である。プライマー部分を太字で示す。
【図１１】カダヤシにおけるゴノポディウム形成（鰭条の伸長）を示す写真である。
【図１２】カダヤシの鰭におけるＡＲ遺伝子及びＳｈｈ遺伝子の発現を示す写真である。
【図１３】カダヤシのＡＲ遺伝子及びＳｈｈ遺伝子の発現を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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