(57)【要約】【課題】Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の標的を狙った組み込みによる肝細胞癌を誘発するためのマウス・モデルの提供。【解決手段】本発明は、肝細胞癌のマウス・モデル、及び以下のステップ：ａ）　着目の外来性遺伝子を、標的部位に相同的な配列を担持する好適なベクター内に挿入して、組換えターゲッティング・ベクターを構築し；ｂ）　ステップａ）からのターゲッティング・ベクターを使って研究される動物のＥＳ細胞にトランスフェクトし、そして上記外来性遺伝子を特定の部位に組み込まれている標的ＥＳ細胞をスクリーニングし；ｃ）　ステップｂ）から得られた標的ＥＳ細胞を、上記動物の胞胚内に注入し、そして標的ＥＳ細胞を含む胚が発生するように上記胞胚を試験管内で培養し、そしてｄ）　ステップｃ）から生じた胚を、上記動物の子宮に移植し、それによって外来性遺伝子を安定して発現する子孫を生み出す、を含む動物モデルの構築方法を提供する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物モデルの構築方法であって、以下のステップ：
ａ）　着目の外来性遺伝子を、標的部位に相同的な配列を担持する好適なベクター内に挿入して、組換えターゲッティング・ベクターを構築し；
ｂ）　ステップａ）からのターゲッティング・ベクターを使って試験される動物のＥＳ細胞をトランスフェクトし、そして上記外来性遺伝子が特定の部位に組み込まれている標的とされたＥＳ細胞をスクリーニングし；
ｃ）　ステップｂ）から得られた標的とされたＥＳ細胞を、上記動物の胞胚内に注入し、そして標的とされたＥＳ細胞を含む胚が発生するように上記胞胚を試験管内で培養し；そして
ｄ）　ステップｃ）から生じた胚を、上記動物の子宮に移植し、それによって外来性遺伝子を安定して発現する子孫を作製する、
を含む上記構築方法。
【請求項２】
前記の着目の外来性遺伝子が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶなどから選ばれるウイルス遺伝子又は他の病因性微生物からの遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の着目の外来性遺伝子がＨＢＶ遺伝子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記の着目の外来性遺伝子がＨＢｓＡｇ遺伝子又はＨＢＶ　Ｘ遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ターゲッティング・ベクターが、着目の外来性遺伝子、標的部位の相同配列、陽性、及び陰性選択マーカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記の着目の外来性遺伝子を、マウスのｐ２１遺伝子座に挿入する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記の着目の外来性遺伝子を、マウスｐ２１遺伝子座の第２エクソン内に挿入する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
着目の外来性遺伝子を挿入された細胞ゲノム上のｐ２１遺伝子座を特徴とするマウス細胞。
【請求項１０】
同じ遺伝子型を有する胚性幹細胞又は体細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記の着目の外来性遺伝子が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶなどから選ばれるウイルス遺伝子又は他の病因性微生物からの遺伝子を含む、請求項９又は１０に記載の細胞。
【請求項１２】
要求項１に記載の方法により得られたトランスジェニック動物。
【請求項１３】
遺伝子ノックイン法により着目の外来性遺伝子を部位特異的に組み込まれたそのマウスの染色体を特徴とするトランスジェニック・マウス。
【請求項１４】
前記の着目の外来性遺伝子が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶなどから選ばれるウイルス遺伝子、好ましくはＨＢｓＡｇ遺伝子又はＨＢＶ　Ｘ遺伝子である、請求項１３に記載のトランスジェニック・マウス。
【請求項１５】
そのマウスのｐ２１遺伝子座内に部位特異的に挿入された着目の外来性遺伝子を特徴とする、請求項１３又は１４に記載のトランスジェニック・マウス。
【請求項１６】
そのマウスのｐ２１遺伝子座内に部位特異的に挿入されたＨＢｓＡｇ遺伝子を特徴とするトランスジェニック・マウスであって、上記着目の外来性遺伝子が安定して受け継がれ、そして発現されて、上記マウスが正常に分化し、そして一定期間の後に肝細胞癌に罹患する上記トランスジェニック・マウス。
【請求項１７】
肝細胞癌の病因、その早期診断及び治療の研究、並びに抗がん剤のスクリーニングにおける、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のトランスジェニック・マウスの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明は、トランスジェニック動物モデル及びそのようなモデルを構築する方法に関する。特に、本発明は、外来性遺伝子が安定的に発現される動物モデルを生み出すために、胚性幹（ＥＳ）細胞培養及び相同組換えにより着目の外来性遺伝子を動物ゲノムに組み込む方法、並びに上記方法によって得られた動物モデルに関する。
【０００２】
本発明の背景
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界規模の主な悪性腫瘍の１つであって、中国を含むアジア及び太平洋地域に特に分布する。１００万人以上の人が毎年ＨＣＣに変わり（１）、その５年間の生存率は、５％未満である。多数の病因的要素、特にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は、ＨＣＣの発生及び進行に関係している。ＨＢＶは、ＤＮＡウイルスに属し、それは環状の、不完全な２本鎖ＤＮＡを含み、そしてＲＮＡ中間体を介して複製し、完全長約３．２　ｋｂを持つ。ＨＢＶは、宿主ゲノム内に無作為に組み込まれることができて、ＨＢＶが組み込まれた宿主は、保菌者と呼ばれる。
【０００３】
前記保菌者は、症状のない慢性の感染の症状となるが、しかしＢ型肝炎の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の発現がある。世界中で少なくとも３億５千万人の人々が、ＨＢＶの慢性保菌者（２）であり、７５％超がアジア及び西太平洋に存在する　（３）と推定された。これらの保菌者の間で、少なくとも約２０％が、様々な程度の慢性肝炎と肝硬変を示し、かれらの一部は、原発性肝細胞癌に発達するかもしれない。臨床及び疫学的研究は、ＨＣＣに罹患するリスクがＨＢＶ慢性保菌者の間で４０〜５０％の高さに達することを示している。
【０００４】
肝細胞癌に関して、最良の臨床的アプローチは、初期段階での肝臓癌切除であり、よって、初期診断が非常に重要であるように思われる。しかし、できるだけ遅れることなくＨＣＣに発達する可能性のある保菌者を診断するために使用することができる血清又は肝臓中の分子マーカーは、まだ見つかっていない。ＨＢＶに誘発されたＨＣＣを引き起こす病理学及び分子機構のさらなる研究は、そのような肝臓癌の初期診断にとって大きな意味がある。
【０００５】
肝細胞癌の誘導及び進行は、異常な遺伝子発現又は突然変異、及びその間の相互作用に関連する複数の要素を伴った複雑な進行である。ＨＢＶ感染の後に、ＨＢＶ遺伝子発現産物と肝細胞タンパク質又は核酸の間の相互作用が、正常な遺伝子発現とシグナル伝達を妨げる可能性があり、それにより、肝細胞の異常な増殖と分化を導き、そして最終的には肝細胞癌をもたらす、癌原遺伝子の異常な発現、あるいは腫瘍抑圧遺伝子の機能上の不活化を引き起こすかもしれない。しかし、これまで、ＨＢＶの標的は不明確である。一般に、ＨＢＶは培養細胞にも普通の実験動物にも感染しないので（チンパンジーは唯一の感受性の実験動物である）、これがＨＢＶ疾病の発生の調査研究をある程度まで制限した。
【０００６】
トランスジェニック動物技術が、ＨＢＶ疾病の発生を調査するための新しいアプローチを提供する。Ｃｈｉｓａｒｉ（４）及びＢａｂｉｎｅｔ（５）らは、トランスジェニック技術を使い、１９８５年に首尾よく多数のＨＢＶトランスジェニックマウス・モデルを確立し、それ以来、そのようなマウス・モデルの研究が、ＨＢＶに誘発された肝細胞癌の病理学と分子機構の理解を大いに促進した。しかし、そのようなトランスジェニック・マウスは、慣習的なトランスジェニック技術によって開発されて、そしてそれらの外来性遺伝子は、染色体に無作為に組み込まれているので、しばしば発現型の相違をもたらし、そしてある程度、発現型解析を難しくしている。このように、ＨＢＶに誘発されたＨＣＣの分子機構に関する最終決定はまだ成されていない。ＨＢＶゲノム全体を組み込んだトランスジェニック・マウスの国内での報告が刊行されているが、今まで肝臓癌について成功したトランスジェニック・マウス・モデルについては報告されていない。
【０００７】
８０年代末以来、遺伝子ターゲッティング技術に基づく遺伝子ノックイン技術が開発されており、この技術は、相同組換え及びマウスＥＳ細胞培養の技術を外来性遺伝子をマウス・ゲノム上の特定の部位に組み込むために使用し、伝統的なトランスジェニック技術の無分別さをあらかじめ回避する。Ｄｅｎｇ（６）は、マウスが正常に発生して、そのｐ２１遺伝子が取り除かれた後に、肝臓で異常な表現型が存在しなかったことを発見した。しかも、ヒト遺伝子マッピングの実現は、生命科学のポストゲノム時代の幕開けをしるし、そしてプロテオミクスによる調査研究は、機能的ゲノミクスを研究する上で重要な道具になっている。
【０００８】
本発明の説明
本発明は、動物モデルを構築する方法に関し、以下のステップ：
ａ）　着目の外来性遺伝子を、標的部位に一致した配列を担持する好適なベクター内に挿入して、組換えターゲッティング・ベクターを構築し；
ｂ）　ステップａ）からの上記ターゲッティング・ベクターを使って研究されるべき動物のＥＳ細胞に形質移入し、そして上記外来性遺伝子が特定の部位に組み込まれている標的ＥＳ細胞をスクリーニングし；
ｃ）　ステップｂ）から得られた標的ＥＳ細胞を上記動物の胞胚に注入し、そして標的ＥＳ細胞を含む胚を生じるように試験管内で上記胞胚を培養し；そして
ｄ）　ステップｃ）から生じた胚を上記動物の子宮に移植し、それによって外来性遺伝子を安定して発現する子孫を作り上げる、
を含む。
【０００９】
第一の側面において、本発明は、ターゲッティング・トランスジェニック・ベクターの構築に関し、それは、以下のステップを含む：
【００１０】
ｐＬｏｘｐｎｅｏ（７）を最初のターゲッティング・ベクターとして使用し；ｐ２１遺伝子第２エクソンの側方に位置する約８　ｋｂのゲノムＤＮＡセグメントを、ターゲッティング・ベクターの相同配列として使用した。外来性遺伝子（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶなどからのウイルス性遺伝子、例えばＨＢｓＡｇ、ＨＢＸなど）を、ｐ２１遺伝子の第２エクソンに挿入した。続いて前記要素を、ターゲッティング・トランスジェニック・ベクター中に組み合わせ、上記ベクターは、以下の：１）標的部位の相同配列、ここで、上記標的部位は、肝細胞内で転写及び発現されるｐ２１遺伝子座又は他の遺伝子座である；２）外来性遺伝子、陽性選択マーカー（ｎｅｏ）、及び陰性選択マーカー（ｔｋ）を含む。前記外来性遺伝子は、ＨＢＶゲノム全体、個々のＨＢＶ遺伝子であるか、又は他の病因性微生物のゲノム全体かその個々の遺伝子であるかもしれない。前記陽性選択マーカーは、ｎｅｏ遺伝子又は他の陽性選択マーカー、例えばハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）、キサンチン／グアニン・ホスホトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）などである。陰性選択マーカーは、ｔｋ遺伝子であるか、又は他の陰性選択マーカー、例えば単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、チミジンキナーゼなどである。
【００１１】
第２の側面において、本発明は、以下のプロトコールを使った、標的ＥＳ細胞の製造に関する：
【００１２】
前記ターゲッティング・ベクターを線状にし、次に電気穿孔法によりＥＳ細胞中に形質移入した。続いて、トランスフェクトしたＥＳ細胞を、新しい細胞培養培地と混合し、これらのＥＳ細胞を、フィーダー細胞が集密状態まで成長していたプレートに広げた。２４時間後に、培地を、ＥＳ細胞のスクリーニングのための、Ｇ４１８とガンシクロビルを含む選択培地に変更し、それ以来毎日新しい選択培地に変えた。トランスフェクトの７日後に、細胞クローンをスクリーニングした。具体的に言うと、ＥＳクローンの単細胞懸濁液として分散させ、次に各々のＥＳクローンからの単細胞懸濁液を２つの等量のアリコートに分けて、フィーダー細胞を含む２枚の９６ウェル・プレート上にそれぞれ移した。前記２枚のプレートについて、各々のクローンの位置及び順序は同じものだった。毎日の新しいＥＳ細胞培地へ培地交換、そして２〜３日間の培養に続き、１枚のプレートが冷凍し、もう一方をトリプシン処理し、その中のＥＳクローンを２４ウェル・プレートに移し、その培地の色が黄色くなるまでフィーダー細胞培地中で培養した。溶解緩衝液を各々のウェルに添加し、次に溶解した細胞懸濁液をエッペンドルフ管に移した。ＥＳ細胞から抽出しＴＥ溶液に、完全に溶かした後に、ゲノムＤＮＡを、それぞれ、ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化し、そして得られた消化物を、ターゲッティング・ベクターの５’末端に配置したプローブを使ったサザンブロットに供した。ＢｇｌＩＩによる消化に関して、野生型ｐ２１対立遺伝子にあたる約８　ｋｂの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的ｐ２１対立遺伝子にあたるこの陽性バンドは９　ｋｂに移動した。後者は、相同組換えの後の本来のＢｇｌＩＩ部位の削除とｎｅｏ遺伝子による他のＢｇｌＩＩ部位の導入から生じる。ＥｃｏＲＩによる消化に関して、野生型ｐ２１対立遺伝子にあたる約７．７　ｋｂの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的ｐ２１対立遺伝子にあたるこの陽性バンドは約２２　ｋｂに移動した。後者は、相同組換えの後の本来のＥｃｏＲＩ部位の削除から生じる。変更された陽性バンド位置を有するＥＳ細胞は、外来性遺伝子を含有している細胞だった。
第３の側面において、本発明は、標的ＥＳ細胞を含むトランスジェニック動物の製造方法に関し、それは以下の通り説明される：
【００１３】
最初に、興奮していない４〜５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５　ＩＵの性腺刺激ホルモンを腹腔内に注射した。先の性腺刺激ホルモン注射の４８時間以内に、これらのマウスに５　ＩＵのヒト絨毛膜性腺刺激ホルモンを腹腔内に注射してそれらに過剰排卵させ、次に繁殖用の雄マウスの檻に移し、それらと交尾させた。３．５日後、子宮の胞胚を回収した。一方、注入されるＥＳ細胞を数日前に解凍し、そして注入の日の朝に培地を新しいＥＳ培地に変えた。１〜２時間後、この細胞をトリプシンにより処理し、得られた単細胞をＢｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ−３培地中に懸濁液として保存し、次に注入用ピペットにより１２〜１５個の小さくて、丸いＥＳ細胞を吸い、顕微鏡下でインジェクションポンプを突き通して、ＥＳ細胞を連続して胞胚腔に入れる。次に、注入された胞胚を、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ−３培地を補った溶滴中で培養し、それによって移植する胚を得ることができた。第二に、計量後、偽妊娠している雌マウスに麻酔を腹腔内に注射し、そして切開した。解剖顕微鏡下、トランスファーピペットを使って、移植される胚をそれらの子宮内にゆっくりと産みつけ、その後、それらの子宮及び腸間膜を腹腔内に戻し、切開が閉じた。
【００１４】
前記操作がうまくいっていれば、仔マウスが１７日後に生まれる。高度キメラ・マウスが得られた場合には、数日後にそれらの毛皮の色からそれを推論することができる。高度キメラ・マウスを選択し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交尾させた場合、無垢の茶色の毛皮をもつトランスジェニックされた子孫が産まれる。
【００１５】
第４の側面において、本発明は、ＨＢｓＡｇ遺伝子を含むトランスジェニック・マウスの表現型の分析に関し、それは以下のとおり説明される：
１５日齢のマウスから尾の先端の約０．５ｃｍの部分を切断し、エッペンドルフ管に移し、そこに溶解緩衝液を添加し、細胞溶解液を作製し、次に、高度に濃縮した塩を添加し、タンパク質を沈澱させた。ＤＮＡを含む上清を、遠心分離によって回収し、そしてエタノールによって沈澱させた後に、ゲノムＤＮＡを得ることができた。このＤＮＡを後の使用のためにＴＥ溶液中に再溶解した。
【００１６】
子孫マウスの異なる遺伝子型を同定するために、鋳型としてゲノムＤＮＡを使い、そして何組かのプライマーを使うことによってＰＣＲを実施した。野生型ｐ２１対立遺伝子を確認するためにプライマー１（５’−ＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣ−３’）及びプライマー２（５’−ＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣ−３’）を使用し、４３６ｂｐのバンドが野生型及びヘテロ接合性マウスから増幅されうる。ｎｅｏ遺伝子上のプライマー３（５’−ＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＴＣ−３’）及びプライマー４（５’−ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣ−３’）を、ｎｅｏ遺伝子を含む標的対立遺伝子を同定するために使用した。ＨＢｓＡｇ遺伝子を同定するためにプライマー５（５’−ＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＧＡＡＣＡＴＧＧ−３’）及びプライマー６（５’−ＧＧＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＡＣＧＴＴＴＧＧ−３’）を使用した。
【００１７】
マウス尾ゲノムＤＮＡを、それぞれＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化し、得られた消化物を、ターゲッティング・ベクターの５’末端の外側に配置されたプローブを使ったサザンブロットに供した。ＢｇｌＩＩによる消化に関して、野生型ｐ２１対立遺伝子にあたる約８　ｋｂの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的ｐ２１対立遺伝子にあたるこの陽性バンドは９　ｋｂに移動した。後者は、相同組換えの後の本来のＢｇｌＩＩ部位の削除とｎｅｏ遺伝子による他のＢｇｌＩＩ部位の導入から生じる。ＥｃｏＲＩによる消化に関して、野生型ｐ２１対立遺伝子にあたる約７．７　ｋｂの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的ｐ２１対立遺伝子にあたるこの陽性バンドは約２２　ｋｂに移動した。後者は、相同組換えの後の本来のＥｃｏＲＩ部位の削除から生じる。
【００１８】
全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ剤を使ってマウス組織から抽出し、そしてノーザンブロット分析を実施した。要するに、ホルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動法を実施するために２０μｇの全ＲＮＡを必要とし、次に、このＲＮＡを、キャピラリー・トランスファーによって前記ゲルからニトロセルロース膜に移し、ＨＢｓＡｇ遺伝子由来のプローブとハイブリダイズさせた。結果は、ＨＢｓＡｇ遺伝子がトランスジェニック・マウスの肝臓及び脾臓で発現されたことを示した。
【００１９】
ＨＢｓＡｇ遺伝子の発現を、ワンステップＨＢｓＡｇ　ＥＬＩＳＡキットを使ってアッセイした。両マウスの血清及び肝臓ホモジネートを準備したが、しかしトランスジェニック・マウスについて、ＨＢｓＡｇが血清中に分泌されないで、肝臓ホモジネート中のみに存在したことが分かった。
【００２０】
ヘテロ接合性及びホモ接合性トランスジェニック・マウスの成長及び発達は正常だった。肝臓において、リンパ球浸潤と脂肪変性が１年後に観察され；増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）染色が肝細胞が過剰増殖の状態にあることを示した。１５ヶ月齢のヘテロ接合性マウスが、高分化型肝細胞癌に向かって進行を始めて、１７ヶ月齢以上のトランスジェニック雄マウスの７５％が上記症状に冒された。明らかなアポトーシスは観察されなかった。
【００２１】
第５の側面において、本発明は、ＨＢＶ遺伝子の誘発された肝細胞癌モデル・マウスとしてのトランスジェニック・マウスの使用に関し、それは、以下の研究を含む：
【００２２】
最初に、全ＲＮＡを、異なる月齢で、野生型又はＨＢＶトランスジェニック・ホモ接合性マウスの肝臓から抽出し、そして疾患発生の分子機構について予備研究を行うために、肝細胞癌の発生に関与するかもしれない遺伝子を発見するために、ノーザンブロットにより遺伝子発現パターンを分析した。第２に、月齢の異なる野生型又はＨＢＶトランスジェニック・ホモ接合性マウスの血清又は肝臓からタンパク質を抽出し、その後２次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動に供した。示差的に発現されたタンパク質を見つけるために比較分析を実施し、次に、肝細胞癌の誘導の早期現象及び分子機構の集中的な研究、又は肝細胞癌の診断又は治療のための標的分子のスクリーニングのために、これらのタンパク質をペプチド質量フィンガープリント・プロフィールの分析を通して同定した。最後に、異なる月齢で、ＨＢＶ遺伝子によって誘発された肝細胞癌を生じたマウス及び野生型マウスに、静脈内注射、腹腔内注射、又は経口投与により、薬剤を与えた。尾静脈血を採取し、そして先の調査研究から見つけていた肝細胞癌に関連した初期の分子を、治療計画及び薬効を評価するために観察した。１８ヶ月齢超のマウスからの肝臓組織学的分析を実施し、治療薬の効果を評価しもした。
【００２３】
遺伝子ノックイン法の利点を利用して、発明者は、相同組換え及びＥＳ細胞培養の手段により、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子をマウスＥＳ細胞ゲノム上の特定の部位に組み込んだ。安定してＨＢｓＡｇ遺伝子を発現するトランスジェニック・マウスを、マイクロインジェクションと胚移植を通して得た。そのようなトランスジェニック・マウスは、肝臓でＢ型肝炎表面抗原を発現し、ヘテロ接合性マウス、及びホモ接合性マウスの両方で正常に発達した。肝臓において、リンパ球浸潤と脂肪変性が１年後に観察され；増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）染色は、肝細胞が過剰増殖の状態にあることを示した。１５ヶ月齢のヘテロ接合性マウスが、高分化型肝細胞癌に向かって進行を始めて（図７）、１７ヶ月齢以上のトランスジェニック雄マウスの７５％が上記症状に冒された。明らかなアポトーシスは観察されなかった。そのようなＨＢＶ遺伝子に誘発された肝細胞癌モデル・マウスは、肝細胞癌の早期現象及び誘導の分子機構の集中的な研究を行うために、肝細胞癌の初期段階の診断又は治療のための標的分子のスクリーニングのために、そして中国の伝統的な薬物と西洋の薬物の治療計画及び効果を比較するために使用することができる。
【００２４】
文脈中で言及された文献を、それらの本質について本明細書中に援用する。
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されない。
【００２５】
実施例１
ＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するターゲッティング・ベクターの構築
ＨＢＶ　ｃＤＮＡを含むｐＡＤＲ−１（８）を、ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩにより消化した。完全長のＨＢｓＡｇ遺伝子を含む２．２　ｋｂの断片を単離し、ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏのＢａｍＨＩ部位に挿入して、ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏ−ｓ１を得た。相同配列の短い腕としての、ｐ２１遺伝子座の第２エクソンの上流の、２．０　ｋｂのＸｈｏＩ（埋め込み）−ＮｏｔＩ（クローン・ベクターから）断片を、ｐＬｏｘｐｎｅｏ−ｓ１のＨｐａＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に挿入して、ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏ−ｓ２を得た。ｐ２１遺伝子座の第２エクソンの下流の、６．０　ｋｂのＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ベクターｐＨＳＧ３９７にクローンし、ＨｉｎｄＩＩＩ（埋め込み）及びＥｃｏＲＩ部位を作り出した。最後に、相同配列の長い腕としての断片を、ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏ−ｓ２のＡｓｐ７１８Ｉ（埋め込み）とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入して（図１）、ＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するターゲッティング・ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏ−ＨＢｓＡｇを産生した。
【００２６】
実施例２
ＨＢＶ　Ｘ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するターゲッティング・ベクターの構築
ＨＢＶ　ｃＤＮＡを含むｐＡＤＲ−１を、ＸｂａＩとＢａｍＨＩにより消化した。ＨＢＸ遺伝子５’末端及びＸ遺伝子５’の側方に位置する部分を含む１．１５　ｋｂの断片を単離し、ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏに挿入して、ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏ−Ｘ１を得た。ＨＢＶ　ｃＤＮＡを含むｐＡＤＲ−１を、ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで消化した。ＨＢＸ遺伝子の３’末端を含む０．５８　ｋｂの断片を単離し、ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏ−Ｘ１に挿入して、全ＨＢＸ遺伝子及びその５’末端の側方に位置する部分を含むベクターｐＬｏｘｐｎｅｏ−Ｘ２を得た。相同配列の短い腕としての、ｐ２１遺伝子座の第２エクソンの上流の、２．０　ｋｂのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を、前記ベクターのＸｈｏＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に挿入して、ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏ−Ｘ３を得た。ｐ２１遺伝子座の第２エクソンの下流の、６．０　ｋｂのＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ベクターｐＨＳＧ３９７にクローンし、ＨｉｎｄＩＩＩ（埋め込み）及びＥｃｏＲＩ部位を作り出した。最後に、相同配列の長い腕としての断片を、ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏ−Ｘ３のＡｓｐ７１８Ｉ（埋め込み）とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入して（図２）、ＨＢＸ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するターゲッティング・ベクターｐＬｏｘｐｎｅｏ−ＨＢＸを産生した。
【００２７】
実施例３
ＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウス胚性幹細胞の産生
１）　フィーダー細胞であるマウス初期胚線維芽細胞の準備
１．妊娠後１４日目のマウスを屠殺し、腹腔を開き、胚と一緒に子宮を取り出した。ＰＢＳ中で胚を子宮から切取り、次に、無菌の１００　ｍｍペトリ皿に置いた。
２．卵黄嚢、羊膜、及び胎盤を取り除き、そして胚を新しいＰＢＳで２回洗浄した。
３．胚の頭部及び内臓を複数の鉗子によって取り除き、マウス胎仔を、無菌のはさみにより小片（ｌ〜３　ｍｍ３）にカットし、次にＰＢＳが実質的に無色透明になるまでＰＢＳで洗浄した。
【００２８】
４．上記組織小片をＰＢＳを含む１５　ｍｌ遠沈管に移し、２分間１０００ｒｐｍで遠心分離する。
５．上清を捨て、そして５　ｍｌの０．２５％トリプシンを残渣に添加し、３７℃で３０分間処理し、次に１０％のウシ胎仔血清を補ったＤＭＥＭ培地を添加し、ピペットによる吸い上げと吐き出しを繰返した。
６．管を２分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。
７．上清を捨てた。フィーダー細胞培地を加えた後、細胞を１５０　ｍｍペトリ皿に移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター中、３７℃で２〜３日間培養した。通常、胚性線維芽細胞は３日でペトリ皿を覆う。
【００２９】
８．１つのペトリ皿の胚性線維芽細胞を、３つのペトリ皿の中に分配し、３日後に１０％のＤＭＳＯを加えたフィーダー細胞培地を使って冷凍した。この細胞が、マウス初期胚性線維芽細胞であった。
【００３０】
２）　マウス初期胚性線維芽細胞の処理
マウス初期胚性線維芽細胞は、それらが培養されたＥＳ細胞を超えて増殖することなくＥＳ細胞の成長を支援することができるように、それらの成長を止めるためにそれらをフィーダー細胞として使用する前にマイトマイシンＣで処理する必要がある。
【００３１】
１．マウス初期胚性線維芽細胞の管を速やかに４０℃の水浴で解凍し、次に細胞を、２　ｍｌの培地を含む遠沈管に移し、２分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。
２．上清を捨てた。フィーダー細胞培地を加えた後、細胞を２つの１００　ｍｍペトリ皿に移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター中、３７℃でインキュベートした。
３．３日後に、細胞をトリプシン処理し、次に、６つの１５０　ｍｍペトリ皿に移し、３７℃で３日間インキュベートした。
【００３２】
４．細胞を６つの１５０　ｍｍペトリ皿から１２の１５０　ｍｍペトリ皿に移し、３７℃で３〜４日間インキュベートした。
５．細胞を１２の１５０　ｍｍペトリ皿から４０の１５０　ｍｍペトリ皿に移し、３７℃で３〜４日間インキュベートした。
６．３．３　ｍｌのＰＢＳをマイトマイシンＣ（２ｍｇ）のバイアルに加えて、マイトマイシンＣの３つのバイアルを合計１０　ｍｌにまとめた。各々のペトリ皿に１０　μｇ／ｍｌの終濃度まで０．２５　ｍｌのマイトマイシンＣを添加し、そして３７℃で２〜３時間インキュベートした。
【００３３】
７．各々のペトリ皿に対し、培地を捨て、そして細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３　ｍｌの０．２５％トリプシンで処理した。１０分後、５　ｍｌのフィーダー細胞培地を添加し、反応を終わらせた。
８．全てのペトリ皿からの細胞を５０　ｍｌ遠沈管中に集めた。これらの管を２分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００３４】
９．４０　ｍｌの寒剤（１５％のＦＣＳ、１０％のＤＭＳＯ、７５％のＤＭＥＭ）をこの細胞に加えた。ピペットによる吸い上げと吐き出しを繰返した後に、細胞を素速く４０本の小サイズの管に分け、−８０℃で保存した。こうして用意したフィーダー細胞は、通常、各々の解凍された小サイズ管につき９０　ｍｍペトリ皿３〜４枚を覆うことができる。
【００３５】
６００　ｍｌのフィーダー細胞培地の調整は、以下の処方を参照することができる：
５００　ｍｌ　ＤＭＥＭ
６　ｍｌ　Ｌ−グルタミン
６　ｍｌ非必須アミノ酸溶液（１０　ｍＭ）
６　ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン溶液
（５，０００　ユニットのペニシリン、５　ｍｇのストレプトマイシン／１００　ｍｌ）４　μｌメルカプトエタノール
９０　ｍｌウシ胎仔血清
【００３６】
次に、フィーダー細胞培地をろ過し、４℃で保存した。１０００　ｕ／ｍｌのＬＩＦをこの培地に加えた後に、培地をＥＳ細胞の培養に使用することができる。
【００３７】
３）　ＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するターゲッティング・ベクターを使った電気穿孔法によるＥＳ細胞のトランスフェクト
【００３８】
１．トランスフェクトを、蘇生したＥＳ細胞をパッサージした後２日目（３６時間目）に実施した。
２．トランスフェクトの２時間前に培地を新しい培地に変えた。
３．培地は捨て、次にペトリ皿をＰＢＳで２回洗浄した。
４．１．５　ｍｌの０．２５％トリプシンを各々の１００　ｍｍペトリ皿に３７℃で５分間加えておいた。
【００３９】
５．３．５　ｍｌのＥＳ細胞培地を加え、ピペットによる吸い上げと吐き出しを２０回行った。血球計算チャンバーを使って細胞数を数えた。各々のターゲッティング・ベクターについて、約２×１０７細胞／トランスフェクトを通常必要とした。
６．ＥＳ細胞懸濁を２分間１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨てた。細胞を１０　ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。
７．細胞懸濁液を２分間１０００ｒｐｍで再度遠心分離し、そして細胞を、細胞密度が２×１０７細胞／ｍｌ超なるようにＰＢＳ中に再懸濁した。
【００４０】
８．４５　μｇの実施例１の線状ターゲッティング・ベクターを１　ｍｌの細胞懸濁液と混ぜ、そして電気穿孔法用キュベット中に設置した。このキュベットを５分間室温に置いた。
９．Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｏｒ（６００　Ｖ、２５　μＦ）を放電させた。上記キュベットを取り除き、そして１分間室温に置いた。
１０．電気穿孔法キュベット中の細胞を、７　ｍｌの新しいＥＳ細胞培地と混合し、そしてフィーダー細胞で覆われた４つのペトリ皿（１００　ｍｍ）に分配した。
【００４１】
１１．４０　μｌの非トランスフェクト細胞を対照として１００　ｍｍペトリ皿に置いた。
１２．２４時間後、ＥＳ細胞をスクリーニングするために、Ｇ４１８（２８０　μｇ／ｍｌ）及びガンシクロビル（２　μＭ）を含む選択培地に培地を交換し、以後、毎日新しい選択培地に交換した。
１３．個々のクローンを、トランスフェクト後７日目から通常は選別した。
【００４２】
４）　陽性ＥＳクローンの選別
１．７−８日の間選択培地中で培養し、そして培地を捨てた後に、トランスフェクトしたＥＳ細胞を１回ＰＢＳで洗い、そして１０　ｍｌのＰＢＳに変えた。
２．２００　μｌマイクロピペッタを２０　μｌに合わせ、そして顕微鏡下でそのチップを使って陽性ＥＳクローンを選択した。
【００４３】
３．個々のクローンを空の９６ウェル・プレートに移した。各々の１００　ｍｍペトリ皿について、１枚で通常３０〜５０のクローンを選別することができる。
４．５０　μｌの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を各々のウェルに加え、３７℃で３〜５分間反応させた。
【００４４】
５．各々のウェル中に、１００　μｌのＥＳ細胞培地を加え、マイクロピペッタのチップを用いてピペットによる吸い上げと吐き出しを繰り返しＥＳクローンを単細胞の懸濁液にした、ここで、上記マイクロピペッタは、１００　μｌの８チャネルのものであり、８０　μｌに調整した。それぞれ各々のＥＳクローンからの単細胞懸濁液を、２つのアリコートに分け、そしてフィーダー細胞を伴う２枚の９６ウェル・プレートに再び蒔いた。２枚のプレートについて、各々のクローンの配置と順序は同じものだった。毎日の新しいＥＳ細胞培地への培地の変更、そして２〜３日間の培養に続いて、１枚のプレートを凍結させ、もう一方をトリプシン処理して、その中のＥＳクローンを２４ウェル・プレートに移し、培地の色が黄色に変化するまでフィーダー細胞培地を用いて培養した。
【００４５】
５）　陽性ＥＳクローンの凍結
１．前記培地を捨て、そして１００　μｌのＰＢＳを添加した。
２．ＰＢＳを捨てた後で、ＰＢＳで薄めた０．１２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液５０　μｌを加えて、３７℃で３〜５分間反応させた。
【００４６】
３．１００　μｌの寒剤（１５％のＤＭＳＯ、２０％のウシ胎仔血清、６５％のＤＭＥＭ）を加えた。
４．８チャネルのマイクロピペッタを用いて、細胞を少なくとも１０回ピペットにより吸い上げ、そして吐き出した。９６ウェル・プレートを封着膜により封じて、ビニール袋で閉じて、そして上記プレートと上記ビニール袋の表面に印をつけた。
【００４７】
５．凍結速度を落とすために、まず、前記プレートをフォーム・ボックスの中に置き、そして−８０℃で冷凍した。
６）　ＥＳクローンからのゲノムＤＮＡの製造
１．ＥＳ細胞を１２ウェル・プレート又は２４ウェル・プレートで培養した。ゲノムＤＮＡを抽出するためにＥＳ細胞を使用するために、ＬＩＦを培地に加える必要はない。
【００４８】
２．４００　μｌの細胞溶解緩衝液（０．５％のＳＤＳ、０．１　Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１　Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０２　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ　ｐＨ７．６、プロテアーゼ　Ｋ、１００　μｇ／ｍｌ）を各々のウェルに加え、そしてこのプレートを５分間室温に置いた。各々のウェルの内容物をエッペンドルフ管に移した。
【００４９】
３．管を５０℃で２時間維持した。
４．２００　μｌの飽和ＮａＣｌ（６　Ｍ）は加えた。
５．エッペンドルフ管をボール紙の箱に置き、２００回激しく振とうした。
６．エッペンドルフ管を１０分間氷上に置いた。
７．前記管を室温下、１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。
８．各々の管に、５００　μｌの上清をきれいなエッペンドルフ管に移し、続いて０．８　ｍｌのエタノールを加えて、混ぜた。
【００５０】
９．前記管を、５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を捨てた。
１０．各々の管をひっくり返して置き、室温で乾燥させた。ＤＮＡを５０〜１００　μｌのＴＥ中に再懸濁して、完全に溶けるま（２４〜４８時間）で３７℃で静置した。ＤＮＡをＰＣＲ又はサザン・ハイブリダイゼーション分析のために使用することができる。
７）　サザンブロットによるＨＢｓＡｇ遺伝子標的を狙った組み込みを含有するマウス胚性幹細胞の同定
【００５１】
Ｇ４１８／ＦＩＡＵ二重抵抗性クローンから抽出した後に、それぞれＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩによりゲノムＤＮＡを消化して、得られた消化物を、ターゲッティング・ベクターの外側５’末端に配置されたプローブを使ってサザンブロットに共した。ＢｇｌＩＩによる消化に関して、野生型ｐ２１対立遺伝子にあたる約８　ｋｂの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的ｐ２１対立遺伝子にあたるこの陽性バンドは９　ｋｂに移動した。後者は、相同組換えの後の本来のＢｇｌＩＩ部位の削除とｎｅｏ遺伝子による他のＢｇｌＩＩ部位の導入から生じる。ＥｃｏＲＩによる消化に関して、野生型ｐ２１対立遺伝子にあたる約７．７　ｋｂの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的ｐ２１対立遺伝子にあたるこの陽性バンドは約２２　ｋｂ（図３）に移動した。
【００５２】
実施例４
ＨＢＶ　Ｘ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウス胚性幹細胞の製造
実施例３に記載したそれと同じ方法で、ＨＢＶ　Ｘ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウス胚性幹細胞を得れることができる。
【００５３】
実施例５
ＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスの製造
１）　ドナー胞胚の製造
胞胚の数は、多くの要因、例えばマウス系統、全身的な健康状態、適応、過剰排卵する能力、及び実験する季節などに依存する。より多くの胞胚を得るためにか、又はマウスの数が限られているとき、興奮していないマウスを、一般に腹腔内にホルモンを注射し、それらにより多くの卵を排卵させる、すなわち、過剰排卵させる。過剰排卵させられるマウスは、通常、青年期にある３〜５週齢であり、そして特定の年齢は、マウスの系統により変わるかもしれない、例えば雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの最も好適な年は、２５日齢である。
【００５４】
過剰排卵マウスからの胞胚の製造：
１．興奮していない４〜５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのマウス（１２．５〜１４　ｇ）を選択し、１日目の午後２：３０に、５　ＩＵの妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ、ＳＩＧＭＡ）を腹腔内に注射した。
２．３日目の正午前、すなわち先のＰＭＳＧ注射の４８時間以内に、雌マウスに５　ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ、ＳＩＧＭＡ）を腹腔内に注射して、過剰排卵させ、そして繁殖用の雄マウスの檻に移して、それらと交尾させた。
【００５５】
３．４日目の午前９：００前に、膣栓の存在を確認した。膣栓のあるマウスをドナー雌マウスとして使用し、そして他の檻に移し、その日を０．５日目と指定した。同日午後２：３０に、興奮した白色雌クンミン・マウス（約２４〜３０ｇ）を選択し、精管結紮した（ｓｐｅｒｍａｄｕｃｔｕｓ−ｄｅｌｉｇａｔｅｄ）雄マウスとつがわせる。
【００５６】
４．５日目の午前９：００前に、膣栓の存在を確認した。膣栓のあるマウスをアクセプター雌マウスとして使用し、他の檻に移した。
５．７日目、すなわち、交尾後４日目に、胞胚をドナー雌マウスの子宮から採集した。
【００５７】
胞胚の採集及び培養：
１．脱臼によってドナー雌マウスを屠殺した後に、それらの腹部は７０％のアルコールで殺菌した。腹部の真ん中の線で水平の切開した。
２．皮膚を切り開き、その切開の外側に引っ張り、そして腹腔を持ち上げ、そして切り開いて、十分に腹腔を露出させた。
【００５８】
３．内臓組織を腹膜の上に持ち上げ、子宮を見つけ、次に子宮を、両卵管が子宮端に結合する場所で慎重に摘出して、６０　ｍｍの無菌のペトリ皿に置いた。
４．卵管と子宮端を、それぞれ子宮の頭部及び子宮の尾部から取り除き、別々の遮るもののない分かれた子宮にした。
【００５９】
５．十分なＢｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ培地ＢＭＯＣ−３（ＧＥＢＣＯＢＲＬ）を、５　ｍｌの使い捨ての注射器中に吸い込んだ。５ゲージの針を装着した後、この注射器を、解剖顕微鏡下で子宮腔に挿入し、次に注射器プラグを押して、様々な方向で子宮腔をフラッシュした。フラッシング中、子宮はわずかしか使われずに、そしてマウスの胚は皿の底に速やかに沈んだ。
【００６０】
６．各々の水滴が２００　μｌの、数個の培地を３５　ｍｍのペトリ皿中に滴らせて、次に鉱物油（ＳＩＧＭＡ、Ｍ−３５１６）で覆った。
７．胚を、解剖顕微鏡下、フラッシング・ピペットを使って採集し、そして培養微小滴に移し、次に５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター中で３７℃で２時間インキュベートした。
【００６１】
２）　胞胚のマイクロインジェクション
ＥＳ細胞のマイクロインジェクションを、深さと堅さの効果により、位相差顕微鏡又は微分干渉顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を使用すべきである。耐震プラットフォーム上の、少なくとも低倍率対物レンズと２００×の倍率までの高倍率対物レンズ、及びさらに３７℃の定温対象ステージを備えている、極微操作装置（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）がより好ましい。
【００６２】
マイクロインジェクションのためのピペットの準備：
ＥＳ細胞を胞胚内に注入する前に、胞胚を移すためのトランスファー・ピペット、マイクロインジェクション中の胞胚を固定するためのホールディング・ピペット、及び胞胚内に細胞を注入するインジェクション・ピペットを含む胞胚操作のための様々な種類のピペットが、必要である。
【００６３】
針作製用バーナー（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ、ＭＦ−９００）を使ったマイクロインジェクションのためのホールディング・ピペットの準備：
１．細いガラス毛細管（Ｎｉｋｏｎ、Ｇ−１）を、小さい炎の上で約２〜３ｃｍの長さの細い針に引き伸ばした。
【００６４】
２．ガラス毛細管を、ガラス球になるように、針作製用バーナーのフィラメント上で溶かした。用意した針を固定して、フィラメントと水平になるように調整した。フィラメントを加熱し、次にガラス球を近づけ、そして接触させてガラス針をその６０〜９０　μｍの直径にする。
【００６５】
３．フィラメントの加熱を止めた後、それは冷えて収縮するので、針が分割され、鋭くないホールディング・ピペットを形成した。
４．次に１２〜２０　ｍｍの中間口径をもち、針先を丸くするために、再びフィラメントを加熱し、針先をそれに近づけた。
５．針を、針先から１ｃｍ離れたところで加熱し、３０°の角度で曲げた、このため針先は、顕微操作視野で水平である。
【００６６】
針作製用バーナーを使ったインジェクション・ピペットの準備：
１．ガラス毛細管を、長さ約１ｃｍの細い針に引き伸ばした。
２．前記の針を、針作成用バーナーを使って、１２〜１５　μｍの内径で分割させた、その内径は、ＥＳ細胞を押しつぶすことなく、ちょうど１つのＥＳ細胞を保持することができる。
【００６７】
３．針を針先からわずかに離れたところで曲げ、３０°の角度をつけた、これにより顕微操作視野で針先は水平である。
トランスファー・ピペットの準備は、ホールディング・ピペットのそれと類似していたが、トランスファー・ピペットの内径が胞胚のそれの１〜１．５倍（約１１０〜１３０　μｍ）であるというところに唯一の相違があり、よって胞胚が容易にそこを出入りできる。前記針の長さは、培地、泡、及び特定の数の胞胚を保持するために約２〜３　ｃｍである。
【００６８】
胞胚注入の操作手順：
１．パラフィン油で満たした後、皿、ホールディング・ピペットの針管、及びインジェクション・ピペットのそれを、顕微鏡の微調整を通して同じ焦点水平面に合わせた。
２．注入するＥＳ細胞を、注入の数日前に解凍した。培地を、注入日の朝に新しいＥＳ培地に変えた。１〜２時間後、細胞を、トリプシン処理して単細胞懸濁液を用意し、次にＢｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ−３培地に浸した。
【００６９】
３．膨らんだモルファ（ｍｏｒｐｈａ）、はっきりした辺縁、より大きな胞胚腔をもつ約１０個の胞胚を、３５　ｍｍペトリ皿から選び、ホールディング・ピペット及びインジェクション・ピペットを取り付けたインジェクション・チャンバーに移して、次に上記チャンバー内にフラッシュ・ピペットを使って数個のＥＳ細胞を吸い込んで移した。
４．１０×の倍率下、インジェクション・ピペットを使って１２〜１５個の小さくて、丸いＥＳ細胞を吸った。
５．４０×の倍率下、ホールディング・ピペットを、胞胚の一方の側面に付け、次にインジェクション・ピペットを、胞胚の中心のそれと同じ水平面に合わせた。
【００７０】
６．インジェクション・ピペットの操作棒を、インジェクション・ピペットが速やかに胞胚の壁を抜けて胞胚腔の中に貫通するように動かし、次にインジェクション・ポンプを押して、ＥＳ細胞を胞胚腔に連続して入れ、最後に慎重に引き抜いた。
７．その後注入した胞胚を顕微操作視野の反対側に置き、次の胞胚の注入を続けた。
８．１０×の倍率下、全ての注入した胞胚を、フラッシング・ピペットを使ってより大きな皿に吸って移し、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ−３培地を加えた滴で培養して、最後に印をつけた。
【００７１】
残りは類推により推定され、注入すべき胞胚の数は、胞胚の状態とその日のアクセプター・マウスの数に基づき決定された。ホールディング・ピペット及びインジェクション・ピペットは、塞がれたか又はすぐに詰まるときのみ変えた。マイクロインジェクション・チャンバーの滴を、注入の数時間後か、又は培地のｐＨが変わったときに新しくした。
【００７２】
３）　子宮内への胞胚の移植
１．アクセプター雌マウスを計量し、それらの体重に従って麻酔剤（アベルチン）を腹腔内注射して、背中の毛を剃った。
２．トランスファー・ピペットを、口で制御する管と接続し、次に培地、泡、培地、泡、注入された胞胚、泡、そして多少の培地を順番に吸った。
【００７３】
３．各々のアクセプター・マウスの背中を７５％のアルコールで殺菌して、次に最初の腰椎近くの右側に１　ｃｍの水平の切開をした。右側の卵巣及びその脂肪体が腹膜を通して見ることができるまで、皮膚を切開の外側に引っ張った。腹膜の３　ｍｍ開口を、先のとがった鉗子を使って裂いた。
４．脂肪体を左手で固定すると、子宮を見ることができた。小サイズの止血鉗子を使って脂肪体は固定した。
【００７４】
５．子宮壁を、子宮と卵管の間の接点から２　ｍｍ離れた場所で、左手の先のとがった鉗子でクランプし、一方で、４ゲージの針先とトランスファー・ピペットを右手に保持した。解剖顕微鏡下で針先を使って、先のとがった鉗子に近く、そして血管から離れた場所で開口部を開け、次にトランスファー・ピペットの最前部をその中に慎重に挿入し、そして胞胚をゆっくりと子宮内に吹き出した。
【００７５】
６．子宮及び腸間膜を、腹腔に戻し、その後切開を閉じた。
前述の操作がうまくいっていれば、仔マウスが１７日後に生まれて、高度のキメラ・マウスが得られている場合には、数日後にそれらの毛皮の色から推論できる。高度のキメラ・マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交尾させるために選択したとき、無垢の茶色の毛皮をもつトランスジェニック子孫が産まれる。
【００７６】
実施例６
ＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスの同定
１）　マウス・ゲノムＤＮＡの準備
１．尾の先端約０．５ｃｍの部分を１５日齢のマウスから切断し、次にエッペンドルフ管に移した。
２．各々の管に、４００　μｌの溶解緩衝液（０．５％のＳＤＳ、Ｏ．１　Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５　Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ　ｐＨ８．Ｏ、プロテアーゼＫ、２００　μｇ／ｍｌ）を加え、尾の先端を溶解させた。
【００７７】
３．この管を一晩５０℃でインキュベートした。
４．２００　μｌの飽和ＮａＣｌ（６Ｍ）を各々の管に加えた。
５．エッペンドルフ管をボール紙の箱に置き、２００回激しく振とうした。
６．エッペンドルフ管を１０分間氷上に置いた。
７．前記管を室温下、１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。
８．各々の管について、５００　μｌの上清をきれいなエッペンドルフ管に移し、続いて０．８　ｍｌのエタノールを加えて、混ぜた。
【００７８】
９．この管を５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離して、上清を捨てた。
１０．各々の管をひっくり返って置き、室温で乾燥させた。ＤＮＡを、５０〜１００　μｌのＴＥ中に再懸濁し、完全に溶けるまで（２４〜４８時間）３７℃で静置した。このＤＮＡをＰＣＲ又はノザン・ハイブリダイゼーションのために使用することができる。
【００７９】
２）　マウス遺伝子型のＰＣＲ同定
野生型ｐ２１対立遺伝子を確認するためにプライマー１（５’−ＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣ−３’）及びプライマー２（５’−ＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣ−３’）を使用し、４３６ｂｐのバンドが野生型及びヘテロ接合性マウスから増幅されうる。ｎｅｏ遺伝子上のプライマー３（５’−ＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＴＣ−３’）及びプライマー４（５’−ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣ−３’）を、ｎｅｏ遺伝子を含む標的対立遺伝子を同定するために使用した。ＨＢｓＡｇ遺伝子を同定するためにプライマー５（５’−ＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＧＡＡＣＡＴＧＧ−３’）及びプライマー６（５’−ＧＧＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＡＣＧＴＴＴＧＧ−３’）を使用した（図４）。
【００８０】
３）　サザンブロット・ハイブリダイゼーションを用いたＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウスの同定
抽出したマウス尾ゲノムＤＮＡを、それぞれＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化し、得られた消化物を、ターゲッティング・ベクターの５’末端の外側に配置されたプローブを使ったサザンブロットに供した。ＢｇｌＩＩによる消化に関して、野生型ｐ２１対立遺伝子にあたる約８　ｋｂの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的ｐ２１対立遺伝子にあたるこの陽性バンドは９　ｋｂに移動した。後者は、相同組換えの後の本来のＢｇｌＩＩ部位の削除とｎｅｏ遺伝子による他のＢｇｌＩＩ部位の導入から生じる。ＥｃｏＲＩによる消化に関して、野生型ｐ２１対立遺伝子にあたる約７．７　ｋｂの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的ｐ２１対立遺伝子にあたる変異後のＨＢｓＡｇ遺伝子を含む上記バンドは約２２　ｋｂに移動した（図５）。
【００８１】
４）　組織からの全ＲＮＡの抽出
１．２　ｍｌのＴｒｉｚｏｌを加えた後に、１００　ｍｇのマウス組織（肝臓、脾臓、腎臓など）をホモジナイザーにより均質化し、次に５分の間室温で静置した。
２．０．４　ｍｌのクロロホルムを加えた。管をきっちりと閉じて、１５秒間激しく振とうし、そして２〜３分間静置し、次に２〜８℃で１５分間１０，０００〜１２，０００ｇで遠心分離した。
【００８２】
３．水性上層を、新しい遠沈管に移し、次に１　ｍｌのイソプロパノールを加え、そして混ぜた。この管を、室温に１０分間置き、続いて２〜８℃で１０分間１０，０００〜１２，０００ｇで遠心分離した。
４．上清を捨てた。次にペレットを、少なくとも２　ｍｌの７５％のエタノールの添加により洗浄し、２〜８℃で５分間わずか７５００ｇの速度で遠心分離した。
【００８３】
５．上清を捨てた。ＲＮＡペレットを５〜１０分間風乾して、次にピペッティングの繰り返しにより５００　μｌのＲＮａｓｅ不含水中に溶かした。
６．このＲＮＡを５５〜６０℃で１０分間維持し、次に−７０℃で保存した。
５）　ノーザン・ハイブリダイゼーションを用いたＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウスの同定
【００８４】
１．１．５ｇのアガロースを１１７．２　ｍｌのＤＥＰＣ処理水中に溶かし、次に７０℃に冷却し、３．５　μｌの１０　ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム（ＥＢ）、３０　ｍｌの５×ＭＯＰＳ（０．１　ｍｏｌ／ｌ　ＭＯＰＳ　（ｐＨ７．０）、４０　ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム、５　ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））、及び２．８　ｍｌの４０％ホルムアルデヒド溶液を加えた。
２．２０　μｇのＲＮＡに、３倍量の添加液（６．７　ｍｌのホルムアミド、２．２　ｍｌの４０％ホルムアルデヒド、１３２０　μｌの１０×ＭＯＰＳ、２０　μｌの２０　ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）を加え、６０℃で１０分間加熱し、そして氷水で急速に冷やし、次にサンプルを添加した。
【００８５】
３．電気泳動装置を電源に接続した。１２０〜１６０ｖの電圧をゲルに適用して、そしてブロモフェノールブルーが、添加したウェルの８ｃｍ先まで移動するまで２〜３時間の泳動した。この間、両極性の電気泳動緩衝液を３０分間ごとにかき混ぜた。
４．このゲルを、各回につき１５分間、２０×ＳＳＣに２回浸した。
５．ＲＮＡを、２０×ＳＳＣを使ってゲルからニトロセルロース膜に移して、次にこの膜を５分間２×ＳＳＣで洗浄した。
【００８６】
６．ＵＶ（１２００　μＷ／ｃｍ２）下で２分間の架橋後、この膜を８０℃で４５分間焼いた。
７．Ｐｒｏｍｅｇａ社製のプライマーＡ標識システム（Ｃａｔ．　Ｎｏ．　Ｕ１１００）を使ってプローブを標識した。要するに、標識されるＤＮＡ断片を、９５〜１００℃で２分間ボイルし、次に、氷水により急冷した。以下の溶液を１．５　ｍｌの遠沈管中で混ぜた：
【表１】
2004000226.tif 000002
【００８７】
次にヌクレアーゼを含まない水を５０　μｌの量まで加え、そして混ぜた。室温で１時間静置し、そして２分間ボイルし、次にこの管を氷水で急冷し、次にＥＤＴＡを終濃度２０　ｍＭまで加えて反応を終了させた。
【００８８】
８．前記膜を５分間６×ＳＳＣに浸して、次にプレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．１％のＳＤＳ、１００　μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）中、６５℃で２時間インキュベートした。標識したプローブをプレハイブリダイゼーション溶液中に加えた後、ハイブリダイゼーションを６５℃で１８時間超続けた。
９．前記の膜を、１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、室温で２０分間、次に０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６５℃で３回、各回につき２０分間洗浄した。
【００８９】
１０．この膜をかるく乾かして、次に−７０℃でＸ線フィルムに露光した。
１１．このフィルムを現像した。
結果を図６に示した。
【００９０】
６）　ＥＬＩＳＡを用いたＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウスの同定
ＨＢｓＡｇのためのワンステップＥＬＩＳＡキットを北京のＳｉｈｕａｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入して、そして以下のステップを使用した：
【００９１】
１、サンプルの添加：
マイクロタイタープレートをコートした。各々のプレートに、２つのウェルを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として設定し、次に１滴の対照溶液（５０　μｌ）を各々の４つのウェルに加えた。１つのウェルを（全ての薬剤を加えない）ブランク対照として設定した。５０　μｌの試験サンプルを他のウェルに加えた。次に１滴の抗ＨＢｓ−ＨＲＰ（５０　μｌ）を各々のウェルに加えた。前記プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。
【００９２】
２、プレートの洗浄：
各々のウェルの液体を捨て、次にこのウェルを３倍希釈した洗浄緩衝液を使って５回洗い、そして軽くたたいて乾かした。
【００９３】
３、発色：
１滴の色素原溶液Ａと１滴の色素原溶液Ｂを各々のウェルに加え、次にプレートを３７℃で１５分間インキュベートして、発色させた。
【００９４】
４、反応停止：
１滴の停止緩衝液を加え反応を停止させた。
５、結果の表示：
ブランク・ウェルを４５０ｎｍの波長で計測して、次に各々のウェルのＯＤ値を読み取り、結果を以下の式に従って計算した：
Ｓ／Ｎ＝試験血清のＯＤ値／陰性対照の平均のＯＤ値、Ｓ／Ｎ≧２．１の場合、試験血清は陽性であるとみなし、Ｓ／Ｎ＜２．１の場合、試験血清は陰性であるとみなした。陰性対照のＯＤ４５０＜０．０５である場合、そのとき、０．０５を前記の式に取り入れ；ＯＤ４５０≧０．０５の場合、そのとき、実効値を前記の式に取り入れた。結果は以下の通りだった：
【表２】
2004000226.tif 000003
【表３】
2004000226.tif 000004
【００９５】
実施例７
ＨＢＶ　Ｘ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスの同定
１）　ＰＣＲによるマウスの遺伝子型の同定
野生型ｐ２１対立遺伝子を同定するために、プライマー１（５’−ＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣ−３’）及びプライマー２（５’−ＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣ−３１）を使用し、そして４３６ｂｐのバンドが野生型及びヘテロ接合性マウスから増幅されることができた。ｎｅｏ遺伝子を含む標的対立遺伝子を同定するために、ｎｅｏ遺伝子上のプライマー３（５’−ＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＴＣ−３’）及びプライマー４（５’−ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣ−３’）を使用した。ＨＢＸ遺伝子を確認するために、プライマー７（５’−ＴＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣ−３’）及びプライマー８（５’−ＴＣＧＧＴＣＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＧＡＧＡＧＴＣ−３’）を使用した。
【００９６】
２）　サザンブロットによるＨＢＸ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウスの同定
抽出したマウス尾ゲノムＤＮＡを、それぞれＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩにより消化し、得られた消化物を、ターゲッティング・ベクターの５’末端の外側に配置されたプローブを使ったサザン・ハイブリダイゼーションに共した。ＢｇｌＩＩによる消化に関して、野生型ｐ２１対立遺伝子にあたる約８　ｋｂの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的ｐ２１対立遺伝子にあたるこの陽性バンドは９　ｋｂに移動した。後者は、相同組換えの後の本来のＢｇｌＩＩ部位の削除とｎｅｏ遺伝子による他のＢｇｌＩＩ部位の導入から生じる。ＥｃｏＲＩによる消化に関して、野生型ｐ２１対立遺伝子にあたる約７．７　ｋｂの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的ｐ２１対立遺伝子にあたる変異後のＨＢＸ遺伝子を含む上記バンドは約２２　ｋｂに移動した。
【００９７】
３）　ノーザンブロットによるＨＢＸ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウスの同定
ＨＢＶ　ｃＤＮＡを含むｐＡＤＲ−１のＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩ消化産物から抽出した５８０ｂｐ断片を、ノーザン・ハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用した。結果は、ＨＢＸ遺伝子がマウスの肝臓及び腎臓で発現されていたことを示した。
【００９８】
実施例８
ＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスの表現型分析
１）　ヘマトキシリン及びエオジン染色
１、固定
組織を中性ホルムアルデヒド溶液（１００　ｍｌの４０％ホルムアルデヒド、９００　ｍｌの水、４　ｇのリン酸２ナトリウム、６．５　ｇのリン酸二水素ナトリウム）中で２０時間にわたり固定した。
【００９９】
２、乾燥
７０％エタノール１５分間
８０％エタノール１５分間
９０％エタノール１５分間
９５％エタノール１５分間
無水のアルコール１５分間
無水のアルコール１５分間
キシレン１５分間
キシレン１５分間
【０１００】
３、包埋
乾燥した組織を、加工されたパラフィン（すなわち、融解され、そして６０℃で一晩寝かせた）の中に移し、そして２時間浸した、この期間の間にパラフィンを２度交換した。次に、組織を予熱した包埋枠組み中に移し、続いて融解パラフィンを速やかに注ぎ入れ、その間に、暖めた鉗子を使って組織の位置を調節した。次に、底板を上に置き、その上にいくらかの融解パラフィンを注ぎ、そしてその中の泡を慎重に取り除いた。それを室温に置き、融解パラフィンを凝固させた。
【０１０１】
４、切片のカッティング
塊状パラフィンを好適なサイズにし、刃を１０°の角度に合わせた回転式ミクロトーム（ＭＩＣＲＯＭ　ＨＭ３４０Ｅ）で切った。形成されワックス−チップをきれいなアルミニウム・ホイルに移し、外科用のかみそりの刃を使って好適なサイズに切り、そしてそれぞれスライドに移した。サンプルが水面に浮かぶまで、適切な量の水を加えて、次に前記スライドを、約４０℃のスライド乾燥機のプラットフォーム上に置き、そしてサンプルが広がるまで慎重に水を捨てた。前記スライドを、検体ボックス中にまとめ、３７℃で一晩乾燥させた。
【０１０２】
５、ヘマトキシリン及びエオジン染色
キシレン１５分間；
キシレン１５分間；
無水アルコール１５分間；
９５％エタノール５分間；
７０％エタノール５分間；
水５分間；
【０１０３】
ハリス・ヘマトキシリン染色溶液（２．５　ｇのヘマトキシリン、２５　ｍｌの無水アルコール、５０　ｇのカリミョウバン、１．２５　ｇの酸化第二水銀、２０　ｍｌの氷酢酸、５００ｍｌの水）５分間；
流水による洗浄、５〜１０分間；
７０％エタノール−塩酸（２００　ｍｌの７０％エタノール＋１０滴の塩酸）１５〜３０秒間；
７０％エタノール−水酸化アンモニウム（２００　ｍｌの７０％エタノール＋１０滴の水酸化アンモニウム）１分；
水５分間；
【０１０４】
次に、脱色の程度を顕微鏡下で観察した。細胞質が灰色であるか又は透明ならば、次のステップを実行した。細胞質がまだ青ければ、前述のステップを繰り返した。
７０％エタノール３分間；
エオジンＹ染色溶液（０．５　ｇのエオジンＹ、５　ｍｌの水中に溶解した５０　ｍｇのブリリアント・レッドＢ、５０　ｍｌの水、２　ｍｌの氷酢酸、３９０　ｍｌの９５％エタノール）１分間；
９５％エタノール５分間；
無水アルコール５分間；
キシレン５分間；
キシレン５分間；
【０１０５】
６．中性ゴムによるスライドの封入
結果を図７に示した。
２）　免疫組織化学的分析
１．パラフィン切片を用意し、規定どおりに水に対してろうを取り除いた。
２．このスライドを、３％の過酸化水素中、１０分間室温でインキュベートし、内性のペルオキシダーゼを不活性化した。
【０１０６】
３．このスライドを蒸留水により２分間×３回洗浄し、次に０．０１　Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を含む容器中に移した。この容器を、電子レンジにより前記緩衝液が１０〜１５分間９２〜９８℃の温度になるまで加熱し、次に室温で１０〜２０分冷まして抗原を復元した。このスライドを５分間ＰＢＳ中に浸した。
【０１０７】
４．次に、前記スライドを５〜１０％の正常ヤギ血清（ＰＢＳで希釈）によりブロックし、１０分間室温インキュベートし、その後血清を捨て、好適な割合に希釈した一次抗体（１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈）を添加し、３７℃で１〜２時間又は４℃で一晩インキュベートした。
【０１０８】
５．このスライドを、各回５分間、ＰＢＳにより３回洗浄した。
６．次に、このスライドに好適な割合に希釈したビオチン標識二次抗体（ＰＢＳで希釈）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１０９】
７．このスライドを、各回５分間、ＰＢＳにより３回洗浄した。
８．次に、このスライドに好適な割合に希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＢＳで希釈）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１１０】
９．このスライドを、各回５分間、ＰＢＳにより３回洗浄した。
１０．色素原物質を使って色を発色させた。
１１．このスライドを水で十分に洗い、対比染色し、封入した。
結果を図８に示した。
【０１１１】
３）　マウス血清中のα−フェトプロテインの分析
マウス血清中のα−フェトプロテインの含量を、ヒト血清α−フェトプロテイン（α−ＡＦＰ）に対する定量的なＥＬＩＳＡキットを使って測定した。手順は以下のとおりであった：
【０１１２】
１．血清を、血液サンプルから分離し、４℃で保存し、冷凍と解凍の繰り返しを避けた。
２．サンプルを以下の比率で加えた：
【表４】
2004000226.tif 000005
混合し、次に３７℃で２０分間インキュベートした。各々の実験において、１つのウェルをブランクとして設定した。
【０１１３】
３．各々のウェルについて、まず、その中の液体を捨て、第２に、蒸留水をその中に再び満たし、次に１０秒後に捨てた。このステップを３〜４回繰り返した。
４．１滴の色素原物質Ａ（５０　μｌ）、１滴の色素原物質Ｂを添加し、そして十分に混ぜ、次に色素形成のために３７℃で１５分間静置した。
【０１１４】
５．１滴の停止溶液（５０　μｌ）を加えた。ブランク・ウェルを使ってゼロを計測した後に、４５０ｎｍの波長で各々のウェルのＯＤ値を読み取った。
６．横座標として標準の異なる濃度の対数、縦座標として対応するＯＤ値を使った、標準曲線をプロットした。プロットした標準曲線の線状回帰方程式に基づき、サンプルの濃度を、その試験したＯＤ値によって計算することができた。前記方程式は、以下のとおりである：
ｌｏｇＯＤ＝Ｂｌｏｇ［濃度］＋Ａ
２ヶ月齢マウスの比較結果を図９に示した。
【０１１５】
４）　アポトーシスの検出
Ｏｎｃｏｒ社製のＡｐｏｐＴａｑ（Ｉｎ　ｓｉｔｕアポトーシス検出キット）を、アポトーシス検出のために使用し、手順は以下のとおりだった：
１．パラフィン切片を水に対して脱ろう化し、各回５分間、２回ＰＢＳ中に浸した。
２．組織の用意
組織を、ＰＢＳで希釈したプロテアーゼＫ（２０　μｇ／ｍｌ）により室温で１５分間（６０　μｌ／５ｃｍ２）処理し、次に純水で、各回２分間、２回洗浄した。
【０１１６】
３．内性のペルオキシダーゼを不活化する。
前記組織を、ＰＢＳに希釈した３％Ｈ２Ｏ２により５分間室温で処理し、次に純水で、各回５分間、２回洗浄した。
４．サンプルの平衡化
不必要な液体を慎重に捨てた。７５　μｌの平衡緩衝液を直接的にサンプル上に加え、次に少なくとも１０秒間室温でインキュベートした。
【０１１７】
５．ＴｄＴａｓｅの取り込み
不必要な液体を慎重に捨てた。ＴｄＴａｓｅ作用溶液（７７　μｌの反応緩衝液＋３３　μｌのＴｄＴａｓｅ）を直接的に加えて、次に３７℃で１時間インキュベートした。
６．反応停止
サンプルに停止緩衝液を添加し、１５秒間撹拌し、次に続けて室温で１０分間インキュベートした。
【０１１８】
７．抗ジゴキシン−複合体の添加
サンプルを、各回１分間、３回ＰＢＳにより洗浄した。不必要な液体を慎重に捨てた後に、サンプルを、室温に暖めた抗ジゴキシン・ペルオキシダーゼ複合体で覆った。次に３０分間室温でインキュベートした。
８．色の発色
サンプルを、各回２分間、４回ＰＢＳで洗浄した。色素形成のためにＤＡＢを使用した。
【０１１９】
９．水を使った反応の停止。
サンプルを、各回１分間、３回純水で洗浄し、その後純水中で５分間継続した。
１０．対比染色
０．５％のメチルグリーン（１００　ｍｌの０．１　Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中に溶かした０．５　ｇメチルグリーン）を１０分間室温での対比染色に使用した。次にサンプルを３回純水で洗浄し、最初の２回については、それぞれ１０回水に浸し、３回目は、撹拌することなく、３０秒間水に浸した。最後に、前記の手順を使って、サンプルを１００％のｎ−ブタノール中で３回洗浄した。
【０１２０】
１１．スライドの封入
サンプルを、各回２分間、３回キシレンに浸し、次に中性ゴムにより封入した。結果は、アポトーシスが１５ヶ月齢のトランスジェニック・マウスでも野生型マウスでも検出されないわけではないことが明らかであることを示した。
【０１２１】
実施例９
ＨＢｓＡｇ遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウス血清プロテオミクスの調査研究
１）　肝臓組織からのタンパク質の用意
１．肝臓組織をサンプルとして摘出した；
２．液体窒素下、乳鉢を使ってサンプルは粉末化した。サンプル１ｇにつき０．５ｍｌの溶解緩衝液（５　Ｍ尿素、２　Ｍチオ尿素、２％のＳＢ−３０、２％のＣＨＡＰＳ、１％のＤＴＴ、プロテアーゼ・インヒビターの混合物）を加えた後、サンプルを組織ホモジナイザーで３０秒間均質化した；
【０１２２】
３．組織懸濁液を１５℃で１０分間１０，０００ｇで遠心分離した；
４．その上清を４℃で４５分間１５０，０００ｇで超遠心分離した；
５．次に、上部に浮いている脂質層を慎重に避けて、得られた上清を取り出し、再び６℃で５０分間４０，０００ｇで遠心分離した；
【０１２３】
６．得られた上清を取り出した。ブラッドフォード法に従ってそのタンパク質濃度を測定した後に、前記上清をアリコートの状態で−７５℃で保存した。
【０１２４】
２）　マウス血清の用意
それぞれ３ヶ月齢の野生型マウス及びトランスジェニックホモ接合性マウスからの血液を、３０分間室温で静置し、次に３５００ｇで３０分間遠心分離した。上層の血清を取り出し、そしてそのタンパク質濃度をＰＩＥＲＣＥ社製のＢＣＡＴＭ−タンパク質アッセイ・キット（Ｃａｔ．　Ｎｏ．　２３２２６）を使って測定し、各々の血清をアリコートの状態で−７５℃で保存した。
【０１２５】
３）　血清及び肝臓組織のプロテオミクス分析
１、等電点分離法
ゲル内再水和作法を使うことによって、２５０　μｇのタンパク質を含む血清又は組織抽出物に、３５０　μｌの終量までサンプル再水和作用溶液（８　ｍｏｌ／ｌの尿素、２％のＣＨＡＰＳ、微量のブロモフェノールブルー）、そこに還元剤ＤＴＴを、２０　ｍｍｏｌ／ｌの終濃度まで加え、０．５％の終濃度までＩＰＧ緩衝液を加えた。ＩＰＧ乾燥ゲル（ｐＨ３〜１０、Ｌ，１８ｃｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、前記溶液中に置き、以下の指標下、等電点分離法を実行した：
【表５】
2004000226.tif 000006
【０１２６】
２、平衡
等電点分離法の後に、前記ＩＰＧゲルを１０　ｍｌのＳＤＳ平衡緩和液（５０　ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−Ｃｌ　ｐＨ８．８、６　ｍｏｌ／ｌの尿素、３０％のグリセロール（Ｖ／Ｖ）、２％のＳＤＳ（Ｖ／Ｖ）、微量のブロモフェノールブルー）中に置き、次に振とう機により各回１０分間、２回振とうする、前記の初回について、平衡緩衝液は１ＯＯ　ｍｇのＤＴＴを含み、前記２回目について、平衡緩衝液は２５０　ｍｇのヨードアセトアミドを含む。
【０１２７】
３、２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ垂直電気泳動
ＩＰＧゲルのサイズに従い、２００×２００×１　ｍｍ３のサイズを有する１個の１２．５％の同質のゲルを用意した。平衡されたＩＰＧゲルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に転写し、続いて電気泳動緩衝液（２５　ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ、２５０　ｍｍｏｌ／ｌのグリシン　ｐＨ８．３、０．１％のＳＤＳ）によって用意された、微量のブロモフェノールブルーを含む０．５％のアガロースを用いて遮蔽した。１４〜１５℃で、まず、ゲルにつき１２０　ｍＡの定電流を４０分間流し、次にガラスプレートの下縁から１　ｍｍ手前までブロモフェノールブルーが移動するまで３０　ｍＡに上げた。電気泳動ゲルを、メタノール：酢酸：水（３：３：４）中で固定し、クーマシーブリリアントブルー染色溶液（メタノール：水：酢酸＝４．５：４．５：１によって調整した０．２５％のクーマシーブリリアントブルーＲ２５０）により４時間以上染色した。次に、７％酢酸−１０％エタノールを使って脱色した。
【０１２８】
４、２−Ｄゲル電気泳動結果の分析
Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製の画像分析ソフトウェアであるＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２Ｄ　Ｅｌｉｔｅ３．０１を使うことによって電気泳動結果を分析した。
【０１２９】
５、酵素消化及びＰＡＧＥからの示差的なタンパク質の抽出
２Ｄゲルから明らかな相違をもつタンパク質のドットを選び、次にかみそりの刃により染色された縁に沿って切り落とし、管に移し、５０％のアセトニトリル（クロマトグラフィー・グレード）、５０　ｍＭの重炭酸アンモニウムを含む溶液で脱色し、遠心分離し、そして真空下で乾燥させた。８〜１０　μｌの０．０１　ｇ／Ｌトリプシン溶液を各々の管に添加し、３７℃で２０時間インキュベートした。前記トリプシンは、ボーリンガー社製であり、（修飾された、配列決定用グレード）、そしてその溶液は、２５　ｍｍｏｌ／Ｌの重炭酸アンモニウム溶液を使って用意された。１２０　μｌの１５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｆｌｕｋａ社）を添加し、そして４０℃で１時間インキュベートした。上清を取り出し、次に１２０　μｌの２．５％ＴＦＡ、５０％ＡＣＮ溶液を加え、そして３０℃で１時間インキュベートし、最後に合わせて、凍結乾燥した。
【０１３０】
６、示差的なタンパク質のペプチド質量フィンガープリンティング（ＰＭＦ）分析
１０　μｌの０．５％トリフルオロ酢酸中にペプチド混合物を溶解し、続いて凍結乾燥した。１　μｌの溶解したペプチド混合物又は脱塩抽出物を、ドットに対して得、１μｌの、０．１％のトリフルオロ酢酸／５０％のアセトニトリル中に溶解されている飽和１−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸溶液をマトリックスとし、次に室温で乾燥させた。Ｂｒｕｋｅｒ社製のＲＥＦＬＥＸ　ＩＩＩマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を使うことによって、タンパク質を３３７　ｎｍのレーザー長で検出した。
【０１３１】
７．データベース検索を通してのタンパク質の予備的な同定
タンパク質等電点、分子量及びペプチド・フィンガープリンティングの特徴の範囲、並びに他の指標の入力データに従って、それらの指標に合致するタンパク質が、データベース検索プログラムの利点を受け入れるタンパク質データベース内で検索されることができる。ウェブ上のタンパク質データベース検索プログラムは、以下の通りである：ＥｘＰＡＳｙ分子生物学サーバーによって提供されたＰｅｐｔＩｄｅｎｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、及びＵＣＳＦ質量分析施設により提供されたＭＳ−Ｆｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｈｔｍｌｕｃｓｉ３．０ｍｓｆｉｔ．ｈｔｍ）。
【０１３２】
【化１】
2004000226.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】ターゲッティング・ベクターの構築を説明し、上記ベクターは、トランスジェニック・マウス・ゲノム上の特定の部位にＨＢｓＡｇ遺伝子を組み込むために使用される。
【図２】ターゲッティング・ベクターの構築を説明し、上記ベクターは、トランスジェニック・マウス・ゲノム上の特定の部位にＨＢｓＡｇ遺伝子を組み込むために使用される。
【図３】ターゲッティング・ベクターの構築を説明し、上記ベクターは、トランスジェニック・マウス・ゲノム上の特定の部位にＨＢｓＡｇ遺伝子を組み込むために使用される。
【図４】ターゲッティング・ベクターの構築を説明し、上記ベクターは、トランスジェニック・マウス・ゲノム上の特定の部位にＨＢｓＡｇ遺伝子を組み込むために使用される。
【図５】ターゲッティング・ベクターの構築を説明し、上記ベクターは、トランスジェニック・マウス・ゲノム上の特定の部位にＨＢＶ　Ｘ遺伝子を組み込むために使用される。
【図６】ターゲッティング・ベクターの構築を説明し、上記ベクターは、トランスジェニック・マウス・ゲノム上の特定の部位にＨＢＶ　Ｘ遺伝子を組み込むために使用される。
【図７】ターゲッティング・ベクターの構築を説明し、上記ベクターは、トランスジェニック・マウス・ゲノム上の特定の部位にＨＢＶ　Ｘ遺伝子を組み込むために使用される。
【図８】ターゲッティング・ベクターの構築を説明し、上記ベクターは、トランスジェニック・マウス・ゲノム上の特定の部位にＨＢＶ　Ｘ遺伝子を組み込むために使用される。
【図９】ＨＢｓＡｇの標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスからの胚性幹細胞のサザンブロット・スクリーニングを示す。
【図１０】ＨＢｓＡｇの標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスのＰＣＲ同定を示す。
【図１１】ＨＢｓＡｇの標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスのサザンブロット同定を示す。
【図１２】ＨＢｓＡｇの標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスのノーザンブロット分析を示す。
【図１３】１５ヶ月齢マウスからの肝臓組織のヘマトキシリン及びエオジン染色像を示す。
【図１４】１５ヶ月齢マウスからの肝臓組織のＰＣＮＡ染色像を示す。
【図１５】２ヶ月齢マウスにおける血清α−フェトプロテインの試験結果を示す。
【図１６】示差的な発現遺伝子のノーザンブロット分析を示す。
【図１７】示差的な発現遺伝子のノーザンブロット分析を示す。
【図１８】示差的な発現遺伝子のノーザンブロット分析を示す。
【図１９】示差的な発現遺伝子のノーザンブロット分析を示す。
【図２０】肝臓タンパク質の２次元（２−Ｄ）電気泳動に続く、ゲル走査像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【外国語明細書】
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