(57)【要約】　　　（修正有）【課題】アンドロゲン受容体を過度発現する骨格筋芽細胞と、アンドロゲン受容体モジュレーターを同定し、特徴付けるためのスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞であって、前記アンドロゲン受容体が、特定配列から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である前記骨格筋芽細胞。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞であって、前記アンドロゲン受容体が、配列番号：１及び配列番号：２から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である前記骨格筋芽細胞。
【請求項２】
前記アンドロゲン受容体が配列番号：１及び配列番号：２から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である、請求項１記載の筋芽細胞。
【請求項３】
挿入されたポリヌクレオチド配列を含む形質転換哺乳動物骨格筋芽細胞であって、前記挿入ポリヌクレオチド配列が配列番号：１及び配列番号：２から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする前記筋芽細胞。
【請求項４】
前記挿入ポリヌクレオチド配列が配列番号：１及び配列番号：２から選択される、請求項３記載の筋芽細胞。
【請求項５】
筋芽細胞がネズミ骨格筋芽細胞である、請求項１〜４のいずれかに記載の筋芽細胞。
【請求項６】
Ｃ２ｈＡＲ５７細胞。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の細胞から選択される細胞を、アンドロゲン受容体をモジュレートする作用剤によって処理する工程；及び前記細胞に対する前記作用剤の効果を評価する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の細胞から選択される細胞を、アンドロゲン受容体をモジュレートする作用剤によって処理する工程；及び前記細胞の持続される増殖、前記細胞の分化、前記細胞のチミジン取り込みレベル、前記細胞が細胞周期のＧ０若しくはＧ１期のいずれにあるか、前記細胞が細胞周期のＧ２−Ｍ若しくはＳ期のいずれにあるか、前記細胞の筋管形成、前記細胞のタンパク質含量のレベル、前記細胞のＩＧＦ−ＩＩ発現のレベル、又は前記細胞のＩＧＦＢＰ４発現のレベルに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞を試験作用剤によって処理する工程；前記細胞の増殖に対する前記作用剤の効果を評価する工程；及び試験作用剤を下記のいずれかとして：作用剤が前記細胞の増殖を阻害する若しくは停止させるならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞の増殖を阻害せず、停止もさせないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法。
【請求項１０】
増殖の阻害又は停止を、前記細胞のチミジン取り込みを測定することを含む方法によって評価する、請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞を試験作用剤によって処理する工程；前記細胞の分化に対する前記作用剤の効果を評価する工程；及び試験作用剤を下記のいずれかとして：作用剤が前記細胞の分化を促進するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞の分化を促進しないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法。
【請求項１２】
アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞を試験作用剤とマイトジェンとによって処理する工程；前記マイトジェンを取り出す工程；前記マイトジェン取り出しの結果としての、前記細胞のアポトーシスに対する前記作用剤の効果を評価する工程；及び試験作用剤を下記のいずれかとして：作用剤が前記細胞のアポトーシスを阻害若しくは防止するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞のアポトーシスを阻害も防止もしないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法。
【請求項１３】
アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞をアンドロゲン受容体アゴニストと試験作用剤とによって処理する工程；及び前記細胞の持続される増殖、前記細胞の分化、前記細胞のチミジン取り込みレベル、前記細胞が細胞周期のＧ０若しくはＧ１期のいずれにあるか、前記細胞が細胞周期のＧ２−Ｍ若しくはＳ期のいずれにあるか、前記細胞の筋管形成、前記細胞のタンパク質含量のレベル、前記細胞のＩＧＦ−ＩＩ発現のレベル、又は前記細胞のＩＧＦＢＰ４発現のレベルに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含む前記スクリーニング方法。
【請求項１４】
アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞をマイトジェン、アンドロゲン受容体アゴニスト及び試験作用剤によって処理する工程；前記マイトジェンを取り出す工程；及び細胞のアポトーシスに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含む前記スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞、及びアンドロゲン受容体モジュレーターの同定及び特徴付けにおけるこのような筋芽細胞の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は一般に、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞、及びアンドロゲン受容体モジュレーターを同定し、特徴付けるためのスクリーニング方法に関する。
【０００３】
哺乳動物アンドロゲン受容体は核ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーである。例えばテストステロンとその活性代謝産物、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）のようなアンドロゲンは、アンドロゲン受容体と高アフィニティで結合する。動物モデルにおいて、睾丸摘出術によるテストステロン欠乏症が雄骨格からの骨の損失を生じること、及び外因性アンドロゲンの投与がこの損失を防止するか又は失われた骨量を修復することが述べられている（ＨｏｆｂａｕｅｒとＫｈｏｓｌａ（１９９９））。
【０００４】
ヒトでは、骨量及び循環アンドロゲンレベルが加齢によって減少する。骨粗しょう症とテストステロンレベル減少との相関関係が報告されている（Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９３））。高齢者のアンドロゲン補充が骨格に対して有益な効果を及ぼしうることも、研究が示唆している（Ｈｏｆｂａｕｅｒ等（２０００））。
【０００５】
米国特許第５，６１４，６２０号は、ヒトアンドロゲン受容体に関する３７１５塩基対ヌクレオチド配列と、７３４及び９１８アミノ酸残基の演繹された配列を開示している。米国特許第５，６１４，６２０号はまた、真核細胞及び原核細胞におけるクローン化ヒトアンドロゲン受容体遺伝子の発現を開示している。ヒトアンドロゲン受容体ｃＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ３４２３３とＧｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ２３２６３にも開示されている。
【０００６】
国際特許出願公開第ＷＯ０２／００７１６号は、安定に導入されたラットアンドロゲン受容体を有するＣ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞と、アンドロゲン受容体モジュレーターとしての化合物効力の評価における、機能的トランス活性化アッセイ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）による、これらの細胞の使用を開示している。
【０００７】
アンドロゲン受容体モジュレーターを同定し、特徴付けるための迅速で、費用のかからない、信頼できる方法が必要とされている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の１態様は、アンドロゲン受容体、好ましくはヒトアンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞を提供する。
【０００９】
本発明の他の態様は、ヒトアンドロゲン受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む挿入ポリヌクレオチドを含む形質転換哺乳動物骨格筋芽細胞、又は前記ポリヌクレオチド配列を含むその子孫細胞（ｐｒｏｇｅｎｙ　ｃｅｌｌ）を提供する。
【００１０】
本発明の筋芽細胞態様の好ましい実施態様では、前記アンドロゲン受容体は、配列番号：１及び配列番号：２から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件（ｈｉｇｈ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である。より好ましい実施態様では、前記アンドロゲン受容体は配列番号：１及び配列番号：２から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である。さらにより好ましい実施態様では、前記アンドロゲン受容体は、配列番号：３及び配列番号：４から選択されるポリペプチド配列である。
【００１１】
本発明の形質転換された哺乳動物骨格筋芽細胞態様の好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号：１及び配列番号：２から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする。より好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチド配列は配列番号：１及び配列番号：２から選択される。
【００１２】
本発明の筋芽細胞態様のさらなる好ましい実施態様では、前記筋芽細胞はネズミ骨格筋芽細胞である。より好ましい実施態様では、前記筋芽細胞はＣ２ネズミ骨格筋芽細胞系に由来する。
本発明のさらなる態様はＣ２ｈＡＲ５７細胞を提供する。
本発明の他の態様は、請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞から選択される細胞を、アンドロゲン受容体をモジュレートする作用剤によって処理する工程；及び前記細胞に対する前記作用剤の効果を評価する工程を含むスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、本発明の細胞をアンドロゲン受容体をモジュレートする作用剤によって処理する工程；及び前記細胞の持続される増殖、前記細胞の分化、前記細胞のチミジン取り込みレベル、前記細胞が細胞周期のＧ０若しくはＧ１期のいずれにあるか、前記細胞が細胞周期のＧ２−Ｍ若しくはＳ期のいずれにあるか、前記細胞の筋管形成、前記細胞のタンパク質含量のレベル、前記細胞のＩＧＦ−ＩＩ発現のレベル、又は前記細胞のＩＧＦＢＰ４発現のレベルに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含むスクリーニング方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の態様は、アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞を試験作用剤によって処理する工程；前記細胞の増殖に対する前記作用剤の効果を評価する工程；及び試験作用剤を下記のいずれかとして：作用剤が前記細胞の増殖を阻害若しくは防止するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞の増殖を阻害も防止もしないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法を提供する。
【００１５】
前記細胞の増殖に対する前記作用剤の効果を評価することを含む本発明のスクリーニング方法態様の好ましい実施態様では、前記細胞のチミジン取り込みを測定する方法によって、増殖の阻害又は停止が判定される。他の好ましい実施態様では、細胞が細胞周期のＧ０又はＧ１期のいずれにあるかを測定することを含む方法によって、増殖の阻害又は停止が判定される。さらなる好ましい実施態様では、細胞が細胞周期のＧ２−Ｍ又はＳ期のいずれにあるかを測定することを含む方法によって、増殖の阻害又は停止が判定される。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞を試験作用剤によって処理する工程；前記細胞の分化に対する前記作用剤の効果を評価する工程；及び試験作用剤を下記のいずれかとして：作用剤が前記細胞の分化を促進するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞の分化を促進しないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法を提供する。
【００１７】
前記細胞の分化に対する前記作用剤の効果を評価することを含む本発明のスクリーニング方法態様の好ましい実施態様では、前記細胞の筋管形成を測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。他の好ましい実施態様では、前記細胞のタンパク質含量レベルを測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。さらに他の好ましい実施態様では、前記細胞のＩＧＦ−ＩＩ発現レベルを測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。さらなる好ましい実施態様では、前記細胞のＩＧＦＢＰ４発現レベルを測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞を試験作用剤とマイトジェンによって処理する工程；前記マイトジェンを取り出す工程；前記マイトジェン取り出しの結果としてのアポトーシスに対する前記作用剤の効果を評価する工程；及び試験作用剤を下記のいずれかとして：作用剤が前記細胞のアポトーシスを阻害若しくは防止するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞のアポトーシスを阻害も防止もしないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記スクリーニング方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の態様は、アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞をアンドロゲン受容体アゴニストと試験作用剤とによって処理する工程；及び前記細胞の持続される増殖、前記細胞の分化、前記細胞のチミジン取り込みレベル、前記細胞が細胞周期のＧ０若しくはＧ１期のいずれにあるか、前記細胞が細胞周期のＧ２−Ｍ若しくはＳ期のいずれにあるか、前記細胞の筋管形成、前記細胞のタンパク質含量のレベル、前記細胞のＩＧＦ−ＩＩ発現のレベル、又は前記細胞のＩＧＦＢＰ４発現のレベルに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含む前記スクリーニング方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらに他の態様は、アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞をマイトジェン、アンドロゲン受容体アゴニスト及び試験作用剤によって処理する工程；前記マイトジェンを取り出す工程；及び細胞のアポトーシスに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含む前記スクリーニング方法を提供する。
アンドロゲン受容体アゴニストを同定する及び／又は特徴付けるための本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、アンドロゲン受容体をアゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｅ）ために充分な量の試験作用剤によって、本発明の細胞を処理する。
【００２１】
アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定する及び／又は特徴付けるための本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、本発明の細胞をアンドロゲン受容体をアゴナイズするために充分な量のアンドロゲン受容体アゴニストによって処理し、前記細胞をアンドロゲン受容体をアンタゴナイズする（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）ために充分な量の試験作用剤によって処理する。
【００２２】
本発明の細胞をマイトジェンによって処理する、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、細胞を有糸分裂又は細胞増殖を刺激するために充分な量の前記マイトジェンによって処理する。
【００２３】
本発明の細胞をマイトジェンによって処理してから、マイトジェンを取り出す本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、前記細胞の有糸分裂又は細胞増殖の速度を低下させるために充分な量だけ、前記マイトジェンを取り出す。
本発明のさらなる態様は、骨量の損失を特徴とする状態又は疾患の治療方法であって、本発明のスクリーニング方法によって同定された作用剤のアンドロゲン受容体アゴナイジング量（ａｎｄｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｇｏｎｉｚｉｎｇ　ａｍｏｕｎｔ）をそれを必要とする対象、好ましくはヒトに投与することを含む前記治療方法を提供する。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、筋肉量の損失と筋肉衰弱とを特徴とする状態又は疾患の治療方法であって、本発明のスクリーニング方法によって同定された作用剤のアンドロゲン受容体アゴナイジング量をそれを必要とする対象、好ましくはヒトに投与することを含む前記治療方法を提供する。
【００２５】
他に定義しない限り、本明細書で用いる技術的及び科学的用語の全ては、本発明が属する技術分野の通常に熟練した人によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に開示したものと同様な又は同等な、如何なる装置、物質及び方法を本発明を実施する又は試験するために用いることができるとしても、好ましい装置、物質及び方法を次に説明する。本明細書に挙げる全ての刊行物は、これらの刊行物中に報告され、本発明に関連して用いられうる細胞系、プロトコール、試薬及びベクターを説明し、開示するために引用される。本明細書における何物も、本発明が先行発明によるこのような開示に先んずる権利を与えられていないとの容認として、解釈されるべきではない。
【００２６】
“アゴニスト”は、アンドロゲン受容体を活性化するか又はアンドロゲン受容体の生物学的活性を強化する作用剤を意味する。“アンドロゲン受容体アゴニスト”なる用語は、“アンドロゲン”なる用語の同意語として用いられる。“アゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｅ）”という動詞は、アゴニストによるアンドロゲン受容体の活性化又はアンドロゲン受容体の生物学的活性の強化を意味する。より好ましくは、アゴニストは、１０，０００ｎＭ以下の濃度において、アンドロゲン受容体をＤＨＴの最大有効用量の少なくとも約１％、より好ましくは約５％、さらにより好ましくは約１０％、特により好ましくは約２５％だけ活性化する作用剤である。アゴニストは、アンドロゲン受容体と直接相互作用することによって又はアンドロゲン受容体が関与する生物学的経路の要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）に作用することによってアンドロゲン受容体の活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子又は任意の他の作用剤を包含しうる。ＤＨＴの最大有効用量は、それを超えた場合に、観察される反応の大きさを高めることができない用量である。最大有効用量が、反応の測定に用いられる方法及び、妥当な場合には、反応の測定に用いられる、細胞の種類及び／又はアンドロゲン受容体発現レベルを包含する多くの要因に依存することを、当業者は認識するであろう。
【００２７】
“アンタゴニスト”は、哺乳動物骨格筋細胞のアンドロゲン受容体の生物学的活性を阻害するか又は弱める作用剤を意味する。好ましくは、アンタゴニストは、１０，０００ｎＭ以下の濃度において、ＤＨＴの最大有効用量に暴露された哺乳動物骨格筋細胞のアンドロゲン受容体の生物学的活性を少なくとも約１％、より好ましくは約５％、さらにより好ましくは約１０％、特により好ましくは約２５％だけ阻害するか又は弱める作用剤である。“アンタゴナイズする（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）”という動詞は、アンタゴニストによるアンドロゲン受容体の生物学的活性の阻害又は弱化を意味する。アンタゴニストは、アンドロゲン受容体と直接相互作用することによって又はアンドロゲン受容体が関与する生物学的経路の要素に作用することによってアンドロゲン受容体の活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子又は任意の他の作用剤を包含しうる。アンタゴニストはまた、アゴニストがアンドロゲン受容体活性をモジュレートするのをブロック又は防止する作用剤を包含しうる。
【００２８】
“ハイブリダイゼーション”は、ポリヌクレオチド鎖が一定のハイブリダイゼーション条件下で塩基対合によって相補的鎖とアニールするプロセスを意味する。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高度なアイデンティティを共有することの表示である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、許容アニーリング状態下で形成され、“洗浄”工程（単数又は複数）後にハイブリダイズされた状態に留まる。洗浄工程（単数又は複数）はハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェント性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の決定において特に重要であり、条件がストリンジェントであればあるほど、非特異的結合、即ち、完全には適合しない核酸鎖対の間の結合は許容されなくなる。核酸配列のアニーリングのための許容条件は当業者によってルーチンに決定されることができ、複数のハイブリダイゼーション実験間で一致することができる、然るに、洗浄条件は所望のストリンジェント性に、それ故ハイブリダイゼーション特異性に達するように実験間で変えることができる。許容アニーリング条件は例えば６８℃において約６ｘＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び約１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡの存在下で生じる。
【００２９】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェント性は一部は、洗浄工程が実施される温度に関連して表現される。一般に、このような洗浄温度は、一定のイオン強度及びｐＨにおいて、特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃〜２０℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列の５０％が完全適合プローブにハイブリダイズする温度（一定のイオン強度及びｐＨ下）である。Ｔｍを算出するための式及び核酸ハイブリダイゼーションのための条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，１〜３巻，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹに見出されうる（２巻，９章参照）。
【００３０】
“高ストリンジェント条件”は、約０．２ｘＳＳＣ及び約０．１％ＳＤＳの存在下、６８℃、１時間の洗浄条件を包含する、本発明のポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを意味する。代替え的に、約６５℃、６０℃、５５℃又は４２℃の温度を用いることができる。ＳＤＳが約０．１％で存在するときに、ＳＳＣ濃度は約０．１〜２ｘＳＳＣまで変化することができる。典型的には、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするために、ブロッキング試薬が用いられる。このようなブロッキング試薬は、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌでの変性サケ精子ＤＮＡを包含する。例えばＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのためのような、特定の状況下で例えばホルムアミドのような有機溶媒を約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度で用いることもできる。これらの洗浄条件に関する有用な変化は当業者に容易に明らかであろう。特に高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化的類似性（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を示唆することができる。このような類似性はヌクレオチドとそれらにコードされるポリペプチドとの同様な役割りを強く暗示する。
【００３１】
“モジュレーター”は、アンドロゲン受容体アゴニスト又はアンドロゲン受容体アンタゴニストのいずれかである作用剤を意味する。
“マイトジェン”は、筋芽細胞の有糸分裂又は細胞増殖を刺激する作用剤を意味する。例えば、ウシ胎仔血清、塩基性線維芽細胞増殖因子及び上皮増殖因子（ＴＧＦ−αとしても知られる）が、筋芽細胞の有糸分裂又は細胞増殖を刺激するマイトジェンである。
【００３２】
“筋芽細胞”はミオサイト（ｍｙｏｃｙｔｅｓ）又は筋管を包含する１つ以上の分化筋細胞を生じる（即ち、筋形成）ことができる単核未分化細胞を意味し、天然に生ずるような、又は天然若しくは人為的突然変異、ＤＮＡ組換え、形質転換等によって変化されうるような細胞を包含する。
【００３３】
“過度発現する”又は“過度発現”は、少なくとも約２．２フェムトモルＤＨＴ／ｍｇタンパク質、好ましくは約５フェムトモルＤＨＴ／ｍｇタンパク質、より好ましくは少なくとも約１０フェムトモルＤＨＴ／ｍｇタンパク質を特異的に結合するために必要なレベルよりも高いレベルでアンドロゲン受容体を発現する哺乳動物骨格筋芽細胞又は筋芽細胞系を意味し、この場合、該筋芽細胞又は筋芽細胞系は生存能力があり、アンドロゲン受容体アゴニストに暴露されたときに筋形成機能（ｍｙｏｇｅｎｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を示す。筋形成機能は、例えば、筋芽細胞が高マイトジェン増殖培地から低マイトジェン縮合培地（ｆｕｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ）に切り替えられたときに、分化筋管の形成によって例示される。高マイトジェン増殖培地と低マイトジェン縮合培地の適当な調製は、以下の（課題を実施するための手段）及び（実施例）に述べる。
【００３４】
“特異的結合”又は“特異的に結合する”は、タンパク質又はペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子又は任意の天然若しくは合成結合組成物（ｎａｔｕｒａｌ　ｏｒ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）との間の相互作用を意味する。この相互作用は、結合分子によって認識される、特定構造のタンパク質、例えば、抗原決定基又はエピトープの存在に依存する。例えば、抗体がエピトープ“Ａ”に特異的である場合には、遊離の標識Ａ及び抗体を含有する反応におけるエピトープＡ含有ポリペプチドの存在又は遊離の非標識Ａの存在が、抗体と結合する標識Ａの量を減ずる。
【００３５】
“形質転換”は、外因性ＤＮＡがレシピエント細胞に侵入して、これを変化させるプロセスを表す。形質転換は、当該技術分野において、周知の種々な方法によって天然又は人為的条件下で生じることができ、場合に応じて、原核宿主細胞又は真核宿主細胞中に異種核酸配列を挿入するために、任意のこのような既知方法を用いることができる。形質転換方法は、例えば、形質転換される宿主細胞の種類に基づいて選択されることができ、非限定的に、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック（ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ）、リポフェクション及び粒子衝突（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を包含することができる。“形質転換”細胞は、挿入されたＤＮＡが自律複製プラスミドとして又は宿主染色体の一部として複製可能である、安定に形質転換された細胞、並びに挿入されたＤＮＡ若しくはＲＮＡを限られた期間発現する一時的形質転換細胞を包含する。
【００３６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一部は、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞に関する。生物学的に活性なアンドロゲン受容体を発現するために、アンドロゲン受容体をコードする適当なヌクレオチド配列を適当な発現ベクター中に挿入することができる。本願の開示に基づいて、当業者は適当な既知方法を用いて、アンドロゲン受容体をコードする配列と、転写及び翻訳調節要素とを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は例えばｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ手法、合成方法、及びｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝的組換えを包含する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（２００１）参照）。
【００３７】
アンドロゲン受容体の挿入コーディング配列の適当な宿主における転写及び翻訳調節のための要素は、該ベクター中及びアンドロゲン受容体をコードするポリヌクレオチド配列中に例えばエンハンサー、構成及び誘導プロモーター、並びに５’及び３’非翻訳領域のような調節配列を包含しうる。当業者が理解するように、このような要素はそれらの強度及び特異性において変化する。アンドロゲン受容体をコードする配列のより効果的な翻訳を達成するために、特異的な開始シグナルを用いることもできる。このようなシグナルはＡＴＧ開始コドンと、隣接配列、例えばＫｏｚａｋ配列を包含する。アンドロゲン受容体及びその開始コドンをコードする配列と上流の調節配列とが適当な発現ベクター中に挿入される本発明を実施するために、付加的な転写又は翻訳調節シグナルが必要とされることはない。しかし、コーディング配列又はそのフラグメントのみが挿入される場合には、イン−フレームＡＴＧ開始コドンを包含する外因性翻訳調節シグナルがベクターによって与えられるべきである。外因性翻訳要素と開始コドンとは種々な起源、天然と合成の両方であることができる。用いる特定の宿主細胞系のために適当なエンハンサーを含めることによって、発現効率を強化することができる（例えば、Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．等（１９９４）参照）。
【００３８】
好ましくは、本発明の細胞の調製に用いる発現ベクターは、プロモーター領域及び／又は、エンハンサー領域に動作的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合するプロモーター領域（即ち、エンハンサー−プロモーター）に動作的に結合する、アンドロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。プロモーター及びエンハンサー−プロモーターは、宿主細胞中の標的ペプチドの発現を推進しうるＤＮＡ分子の領域である。ｐＢＩ−ＥＧＦＰ　Ｔｅｔベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ．＃６１５４−１，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、それぞれＴｅｔ−ＯｆｆＴＭ及びＴｅｔ−ＯｎＴＭ遺伝子発現系におけるｔＴＡ及びｒｔＴＡ調節タンパク質に反応する二方向性プロモーターＰｂｉ−１を含有する。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭ及びＴｅｔ−ＯｆｆＴＭ系は、テトラサイクリン又はテトラサイクリン誘導体の種々な濃度を用いる遺伝子発現の調節を可能にする。
【００３９】
本発明の細胞の調製に用いる発現ベクターは、本願の開示に基づいて、当業者に周知の標準組換えＤＮＡクローニング手法によって調製することができる。このような発現ベクターを調製するための好ましい方法では、アンドロゲン受容体コーディング配列、好ましくは２５７７−ｂｐヒトアンドロゲン受容体コーディング配列（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ２３２６３）を含有するＤＮＡフラグメントを、図９に示すように、ｐＢＩ−ＥＧＦＰ　Ｔｅｔベクターの固有Ｐｖｕｌｌ部位にライゲートする。次に、得られた発現ベクターを大腸菌株ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で形質変換して、増殖させる。
【００４０】
宿主哺乳動物骨格筋芽細胞株を本発明の細胞の調製に用いることができることは、本願の開示に基づいて当業者によって理解されるであろう。非限定的にＬ６（ＹａｆｆｅとＳａｘｅｌ（１９７７））、Ｌ６Ｅ９（Ｂｅｎｏｆｆ，Ｓ．とＢ．Ｎ．Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ（１９７９））、Ｌ８（ＲｉｃｈｌｅｒとＹａｆｆｅ（１９７０））、Ｃ２Ｃ１２（以下参照）、ＭＭ１４（ＬｉｍとＨａｕｓｃｈｋａ（１９８４））、Ｇ７（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｃ．Ｎ．等（１９７７））、Ｇ８（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ、Ｃ．Ｎ．等（１９７７））、Ｓｏ１８（Ｄａｕｂａｓ，Ｐ．等（１９８８））、ＢＣ３Ｈ１（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．等（１９７４））、Ｈ９ｃ２（Ｋｉｍｅｓ，Ｂ．Ｗ．とＢ．Ｌ．Ｂｒａｎｄｔ（１９７６））、ＳＪＲＨ３０［ＲＭＳ１３］（Ｄｏｕｇｌａｓｓ等（１９８７））、及びＰ１９（ＭｃＢｕｒｎｅｙ，Ｍ．Ｗ．等（１９８２））を包含する哺乳動物骨格筋芽細胞系のいずれも本発明の細胞の調製に用いることができる。本発明の細胞の調製に用いるために好ましい哺乳動物骨格筋芽細胞は、ＹａｆｆｅとＳａｘｅｌ（１９７７）及びＢｌａｕ，Ｈ．Ｍ．，Ｇ．Ｋ．Ｐａｖｌａｔｈ等（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０（４７２７），７５８−７６６によって述べられているネズミ筋肉由来細胞系、Ｃ２Ｃ１２（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１７７２，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，Ｂ．Ｐａｔｅｒｓｏｎによって寄贈）からのものである。
【００４１】
哺乳動物骨格筋芽細胞系の調製及び使用は、当該技術分野に知られた方法に準じて、本願の記載に基づいて実施されうる。例えば、アンドロゲン受容体をコードする配列は、上記の好ましい方法によって調製される発現ベクターを用いて細胞系中に形質変換することができ、同ベクター上に又は別のベクター上に選択マーカー遺伝子を有する。形質転換方法は、非限定的に、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、及び粒子衝突を包含することができる。アンドロゲン受容体を過度発現する細胞系を生成するために、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ試薬（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用して、多重ＤＮＡ分子による逐次トランスフェクションを用いることが好ましい。
【００４２】
ベクターの導入後に、選択的培地に切り替える前に、富化培地中で例えば約１〜２日間のような適当な期間、細胞を増殖させることができる。選択マーカーの目的は、選択的作用剤に対する耐性を与えることであり、その存在は、導入された配列を上首尾に発現する細胞の増殖と回収を可能にする。本願の記載に基づいて当業者が理解するように、細胞種類に適当な組織培養手法を用いて、安定に形質転換された細胞の耐性クローンを増殖させることができる。
【００４３】
形質転換細胞系を回収するために、任意の適当な選択系（“選択マーカー”）を用いることができることは、本願の記載に基づいて、当業者によってさらに理解されるであろう。これらは、非限定的に、それぞれｔｋ−及びａｐｒ−細胞に用いるための単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ及びアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を包含する（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．等（１９７７）；Ｌｏｗｙ，Ｉ．等（１９８０）Ｃｅｌｌ　２２，８１７−８２３参照）。抗代謝物質（ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）、抗生物質及び除草剤耐性も選択の根拠として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）はメトトレキセートに対する耐性を与え；ｎｅｏはアミノグリコシド・ネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え；ａｌｓとｐａｔは、それぞれ、クロルスルフロンとホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．等（１９８０）；Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．等（１９８１）参照）。他の選択遺伝子、例えば、代謝産物のための細胞必要条件を変化させる、ｔｒｐＢとｈｉｓＤも述べられている（例えば、Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．等（１９８８）参照）。可視選択マーカー、例えば、アントシアニン、緑色蛍光タンパク質（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、βグルクロニダーゼとその基質β−グルクロニド、又はルシフェラーゼとその基質ルシフェリンを用いることができる。これらのマーカーは形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）の同定のみならず、特定のベクター系に帰因する一過性又は安定なタンパク質発現量の定量にも用いることができる（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．（１９９５）参照）。
【００４４】
選択マーカー遺伝子発現の有無は、場合に応じて、問題の遺伝子がさらに存在することを示唆するが、如何なるこのような場合にも、該遺伝子の存在と発現を確認することが望ましいと考えられる。例えば、アンドロゲン受容体をコードする配列を選択マーカー遺伝子配列内に挿入する場合に、アンドロゲン受容体をコードする配列を含有する形質転換哺乳動物骨格筋芽細胞を選択マーカー遺伝子機能の不存在によって同定することができる。或いは、選択マーカー遺伝子を単独プロモーターの制御下でアンドロゲン受容体をコードする配列と連結して配置することができる。本願の記載に基づいて当業者が理解するように、誘導又は選択に応じたマーカー遺伝子の発現は一般に、縦に並んだ遺伝子（ｔａｎｄｅｍ　ｇｅｎｅ）の発現をも示唆する。
【００４５】
アンドロゲン受容体をコードするヌクレオチド配列を含有し、アンドロゲン受容体ポリペプチドを過度発現する宿主哺乳動物骨格筋芽細胞は、本願の記載に基づいて、当業者に知られた多様な手段によって同定されうる。これらの手段は、非限定的に、ＤＮＡ−ＤＮＡ若しくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、並びにヌクレオチド若しくはアミノ酸配列の検出及び／又は定量のためのメンブラン−、溶液−及び／又はチップ−に基づくテクノロジーを包含するタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイ手法を包含する。このような方法及び手法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（２００１）に述べられている。
【００４６】
アンドロゲン受容体の過度発現を確認するための好ましい方法は、例えばＬｉａｏ，Ｓ．等（１９８４）に述べられているように、［３Ｈ］−ＤＨＴ競合結合アッセイの使用による。アンドロゲン受容体の発現を検出し、測定するための免疫学的方法も、本発明の実施に用いるために好ましい方法である。例えば、このような方法は特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体の使用を包含する。このような方法は当該技術分野において周知である。このような手法の例は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡｓ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を包含する。これらのアッセイ及びその他のアッセイは当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．等（１９９０）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．等（１９９７）；及びＰｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．（１９９８）参照）。
【００４７】
本発明の筋芽細胞の調製には、任意の哺乳動物アンドロゲン受容体を用いることができる。本発明に有用なアンドロゲン受容体は種々な哺乳動物種から単離することができる。ラット・アンドロゲン受容体はＧｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ２３２６４とＪＯ５４５４に並びにＣｈａｎｇ等（１９８８），３２４−３２６によって述べられている。マウス・アンドロゲン受容体はＧｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ３７８９０に並びにＧａｓｐａｒ等（１９９１）及びＨｅ等（１９９０）によって述べられている。ハムスター・アンドロゲン受容体はＳｈｉｂａ等（２００１）によって述べられている。イヌ・アンドロゲン受容体はＬｕ，Ｂ．，Ｓ．Ｓｍｏｃｋ等（２００１）に述べられている。ヒトアンドロゲン受容体はＧｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ３４２３３及びＧｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ２３２６３に述べられている。
【００４８】
本発明の筋芽細胞の調製に用いられる哺乳動物アンドロゲン受容体は、アンドロゲン受容体が本発明の細胞中で発現され、アンドロゲン受容体モジュレーターに暴露されたときに、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ２３２６３に述べられるヒトアンドロゲン受容体と実質的に同様に本発明の細胞において生物学的に機能する限り、それをコードするアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の長さ又はアイデンティティに関して変化しうる。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、アンドロゲン受容体コーディング配列、好ましくはヒトアンドロゲン受容体コーディング配列（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ２３２６３）を含有する発現ベクターを用いて、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞を結果として得る、本願の開示に基づいて、当業者に知られた方法で形質転換される宿主細胞として、ネズミ筋肉由来細胞系、Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１７７２）を用いて、本発明の筋芽細胞が本願の開示に基づいて、当業者に知られた方法に従って調製される。本発明の好ましい細胞は、Ｃ２ｈＡＲ５７と表示される細胞系の細胞である。
【００５０】
本発明の細胞は、アンドロゲン受容体のモジュレーターである作用剤の同定のために特に有用である。このような同定に用いられる方法は、細胞の増殖のレベル及び／若しくは速度、細胞の分化のレベル及び／若しくは速度、並びに／又は細胞のアポトーシスのレベル及び／若しくは速度を包含する、このような細胞における変化の検出に基づく。それ故、好ましくは、このような細胞を１５％ウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ　Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｌａｂａｓａｓ，ＣＡ）と１０ｐＭ塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）とを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の高マイトジェン増殖培地中で増殖させることによって、細胞を増殖する未分化状態に維持することが特に有用である。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法の１実施態様では、本発明の細胞の増殖速度に対する効果を用いて、可能なアンドロゲン受容体モジュレーター（“試験作用剤”）を同定し、及び／又は特徴付けることができる。この実施態様は、アンドロゲン受容体アゴニストの存在下では本発明の細胞がそれらの増殖レベルを減ずるという観察に基づく。好ましい実施態様では、チミジン、好ましくは放射能標識チミジン、より好ましくは［３Ｈ］−チミジンの取り込みを用いて、アンドロゲン受容体アゴニストを同定し、特徴付ける。この方法は、本発明のアンドロゲン受容体を過度発現する、活性に増殖する骨格筋芽細胞を増殖培地中の試験作用剤に、例えば約４８時間のような、適当な期間暴露させ、次に、培養培地中の放射能標識チミジン（好ましくは、［３Ｈ］−チミジン，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に、例えば約２時間のような、適当な期間暴露させることを含む。チミジン取り込みは、培養培地を除去し、次に氷冷リン酸塩緩衝化生理食塩水によって、続いて５％トリクロロ酢酸によって洗浄することによって停止する。次に、細胞を溶解させる。次に、溶解物の放射能を測定して、細胞中に取り込まれた放射能標識チミジンの度合いを知る。試験作用剤が、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、チミジン取り込み速度を検出可能に低下させる場合には、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような減少は対照よりも少なくとも約３０％低く、より好ましくは、対照よりも少なくとも約５０％低い。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、上記のような、本発明の細胞中の放射能標識チミジンの取り込みを測定するための方法を、アンドロゲン受容体モジュレーターを特徴付けるためにも用いることができる。このことは、アンドロゲン受容体アゴニストが［３Ｈ］−チミジン取り込みを阻害する度合いがアンドロゲン受容体に対する該アゴニストの既知アフィニティに一致するという観察に基づく。この効果は、図４に示すように、天然アンドロゲン受容体アゴニスト、テストステロン及びＤＨＴに関して、並びに例えばオキサンドロロン及びスタノゾロールのような合成アンドロゲン受容体アゴニストに関して明らかにされている。アンドロゲン受容体アゴニストは上述したチミジン取り込み方法を用いて試験することができ、結果を他のアンドロゲン受容体アゴニストの既知効果と比較することができる。これらの結果を用いて、既知アンドロゲン受容体アゴニストと比較して、試験作用剤のアンドロゲン受容体に対する相対的アフィニティを予測することができる。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、細胞周期のＧ０及びＧ１期にある細胞の割合の増加及び／又は複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ）（Ｓ）及び複製後（ｐｏｓｔ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ）（Ｇ２／Ｍ）期にある細胞の画分の同時減少を用いて、試験作用剤による細胞増殖の阻害を評価する。Ｇ０／Ｇ１において、細胞ＤＮＡの量は染色体の二倍体含量（２Ｎ）に対応する。Ｓ期中に、染色体複製がＤＮＡ含量を２Ｎから４Ｎに高め、Ｇ２／Ｍ（細胞分割の前）における細胞の染色体含量は４Ｎである。
【００５４】
好ましい定量的（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＤＮＡステインはヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，製品　ｎｏ．Ｐ−３５６６，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）である。他の有用な定量的ＤＮＡステインは蛍光核酸ステインを包含する。当業者が本願の開示に基づいて理解するように、非限定的にチアゾール・オレンジ、エチジウム・ホモダイマー、臭化エチジウム、ＨＯＥＣＨＳＴ３３２５８及びＤＡＰＩを包含する、多様な、適当な核酸ステインが当該技術分野に知られている。核酸ステインは、例えばフェナントリジン及びアクリジンのようなインターカレーティング・ダイ、例えば臭化エチジウム及びヨウ化プロピジウム；例えばＤＡＰＩ及びＨｏｅｃｈｓｔダイのような副溝結合剤（ｍｉｎｏｒ−ｇｒｏｏｖｅ　ｂｉｎｄｅｒ）；又はこれらの２つのカテゴリーのいずれにも属さないダイ、例えばアクリジン・オレンジ、７−ＡＡＤ及びヒドロキシスチルバアミジンでありうる。シアニン・ダイは、それらの高いモル吸光性、非常に低い固有蛍光、核酸への結合時の大きい蛍光強化、核酸に対する中程度から非常に高いまでのアフィニティに基づいて選択されるダイであり、他のバイオポリマーを殆ど又は全く染色しない。幾つかの核酸ステインは細胞不浸透性であり、他のステインは細胞浸透性ステインである。細胞浸透性ステインは染色前の細胞の浸透性化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を必要としない。典型的な細胞浸透性ダイはシアニン・ダイ（ＳＹＴＯ核酸ステイン）、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、及びエチジウムホモダイマーである。
【００５５】
他の利用可能なダイはインターカレーター　７−アミノアクチノマイシンＤとアクチノマイシンＤ、マルチカラー・ヒドロキシスチルバアミジン、長波長ＬＤＳ７５１及びＮｅｕｒｔｒａｃｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｎｉｓｓｌ　Ｓｔａｉｎｓを包含する。他の定量的ＤＮＡステインは塩基類似体５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）である。その他の有用な核酸ステインは国際特許出願公開ＷＯ９３／０６４８２（米国特許第５，５８２，９７７号として発行）とＷＯ９４／２４２１３（米国特許第５，４３６，１３４号として発行）、及び米国特許第５，３２１，１３０号；第５，４１０，０３０号；第５，４３６，１３４号；及び第５，４３７，９８０号に述べられている。
【００５６】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は細胞集団に少なくとも約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも約０．１〜約１０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で加えることができる。該細胞を任意に暗所において室温で約１分間〜約２時間、好ましくは約１０分間〜１時間、最も好ましくは約１５〜約３０分間インキュベートすることができる。インキュベーションは氷上において少なくとも約１分間、好ましくは少なくとも約５分間、最も好ましくは少なくとも約１５分間行なうこともできる。
【００５７】
一般に、細胞を定量的ＤＮＡステインによって、細胞中のＤＮＡの検出及び定量を可能にするために充分な量及び時間で染色する。特定の細胞種類及び検出方法に適した染色手段は、当該技術分野に知られた方法によって、例えば如何なる条件が細胞の適当な染色を可能にするかを知るためのように、幾つかのＤＮＡステイン、濃度及びインキュベーション時間を用いてアッセイを実施することによって決定することができる。
【００５８】
ＤＮＡ含量に関する細胞の染色に付随して、染色体ＤＮＡ以外の核酸（例えば、ＲＮＡ）の染色を防止する作用剤による細胞の処理を行なうことができる。例示的な実施態様では、ＲＮＡを分解する作用剤、例えばＲＮアーゼによって細胞を処理する。例えば、ＲＮアーゼ（ＢＤ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を約１００〜５００μｇ／ｍｌで加えることができる。一般に、他の核酸の染色よりも染色体ＤＮＡの優先的な染色を可能にするために充分な濃度及び時間で、染色体ＤＮＡ以外の核酸の染色を防止する作用剤を用いて、細胞をインキュベートする。適当な条件は当該技術分野の方法によって、例えば、用いる方法に適した条件を知るためのように、種々な作用剤を種々な条件下で用いてアッセイを実施することによって決定することができる。
【００５９】
染色された細胞を分析するための好ましい方法は、マルチ−パラメータ（又はカラー）ディスプレイを用いた、フローサイトメトリー又はレーザー走査サイトメトリーによる方法である。フローサイトメトリーは、本明細書でさらに説明する、当該技術分野において知られた蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって行なうことができる。用いることができる、典型的なＦＡＣＳ装置はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）と、Ｃｏｕｌｔｅｒフローサイトメーター（Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌａ．，ＵＳＡ）ＥＰＩＣＳ　Ｅｌｉｔｅ（登録商標）を包含する。定量はＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、ＷｉｎＬｉｓｔ（ＶｅｒｉｔｙＳｏｆｔｗａｒｅ　Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｃ．Ｔｏｐｓｈａｍ，Ｍａｉｎｅ）、Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅソフトウェア（Ｐｈｏｅｎｉｘ　Ｆｌｏｗ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）ソフトウェアを用いて行なうことができる。フローサイトメーターは各細胞に関連した発光性物質量及び他のパラメーターを測定して、例えばヒストグラム、ドットプロット又は画分表（ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｔａｂｌｅ）の形式で出力を提供する。流体含有細胞が光源を、典型的に１つずつ、通過するにつれて、これらの細胞は種々な波長の光に暴露される。サイトメーターによって検出される各粒子は“イベント”と呼ばれる。イベントが入射光の一部を伝達するか又は散乱させる程度は、イベントの特徴、例えば関連発光性物質の尺度を与える。例えば、イベントは自発的に発光することができる、又は該イベントに導入された蛍光物質によって生じる蛍光を発光することができる。発光又は反射光の強度はサイトメーターによって測定され、記憶される。
【００６０】
細胞周期のＧ０及びＧ１期にある細胞の割合の増加及び／又は複製（Ｓ）及び複製後（Ｇ２／Ｍ）期にある細胞の画分の同時減少を用いて、細胞増殖の阻害を評価する本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、Ｋｒｉｓｈａｎ，Ａ．（１９７５）に従ってヨウ化プロピジウムによって染色した後にフローサイトメトリーによって、細胞周期の各期の細胞のパーセンテージを知ることができる。この方法によると、細胞を高マイトジェン増殖培地に低密度でプレーティングして（ｐｌａｔｅｄ）、試験化合物によって約２４時間〜約４８時間処理する。次に、トリプシン化によって細胞を回収して、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸塩緩衝化生理食塩水（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中７０％エタノール中に−２０℃において少なくとも２時間再懸濁させる。次に、細胞を低速度遠心分離を用いてペレット化して、リボヌクレアーゼＡとヨウ化プロピジウムとを含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水中に再懸濁させる。細胞をリボヌクレアーゼＡとヨウ化プロピジウムとによって室温において約３０分間処理する。Ｇ０及びＧ１期の細胞対Ｓ、Ｇ２及びＭ期の細胞の定量は、例えば、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ　発光波長）とＭｏｄｆｉｔＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）とを装備したＦＡＣＳｃａｎＴＭフローサイトメーターのような、フローサイトメーターを用いて行なうことができる。
【００６１】
試験作用剤が、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、細胞周期のＧ０及びＧ１期の細胞の割合を検出可能に増加させ、及び／又は細胞周期のＳ及びＧ２／Ｍ期の細胞の割合を減少させる場合には、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、Ｇ０及びＧ１期の細胞の増加は対照に比べて少なくとも約５％、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約１０％である。好ましくは、Ｓ及びＧ２／Ｍ期の細胞の減少は対照に比べて少なくとも約５％、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約１０％である。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、本発明の細胞に対する筋芽細胞分化の効果を用いて、アンドロゲン受容体モジュレーターを同定することができる。この実施態様は、本発明の細胞がアンドロゲン受容体アゴニストによって処理されたときに細胞分化のそれらのレベルを促進するという観察に基づいている。好ましい実施態様では、本発明の細胞を用いて、分化した筋管形成のレベル及び速度に対する試験作用剤の効果を決定する。本発明の細胞が高マイトジェン増殖培地中で増殖するときに、それらは小さい付着単核細胞として出現する。しかし、培地を２％ウマ血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地の低マイトジェン融合培地（ｆｕｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に切り替えると、単核筋芽細胞の大部分が融合して、細長い多核筋管を形成する。本発明の細胞を例えばＤＨＴのようなアンドロゲン受容体アゴニストに暴露させると、アンドロゲン受容体アゴニストの無い場合よりも迅速に筋管が形成されることが観察された。アンドロゲン受容体を過度発現しない骨格筋芽細胞も、培地を融合培地に切り替えるときに、筋管を形成するが、筋管形成の速度も程度も例えばＤＨＴのようなアンドロゲン受容体アゴニストの添加によって目に見えるほどに影響されない。本発明の細胞に対するアンドロゲン受容体アゴニストの効果を図３に示す。本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、実施例４に述べる方法に従ってスクリーニング・アッセイを行なう。試験作用剤は、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、筋管形成速度を検出可能に増加させる場合には、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、総タンパク質含量に対する効果を利用して、本発明の細胞に対する試験作用剤の効果を評価する。この実施態様は、アンドロゲン受容体アゴニストの存在下での本発明の細胞の培養が細胞中のタンパク質含量の蓄積を促進するという観察に基づく。このスクリーニング方法の好ましい実施方法では、本発明の細胞を最初に高マイトジェン増殖培地中で約２４時間増殖させる。次に、培地を、１５％チャーコール−デキストラン処理ウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ　Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と１０ｐＭ塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）とを有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地の無ステロイド増殖培地と交換する。約３８時間後に、培地を、試験作用剤を含有する上記融合培地と交換して、細胞を該作用剤に少なくとも約４８時間暴露させ、次に、少なくとも５０％集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達するために必要に応じて、付加的期間暴露させる。次に、培地を、試験作用剤を含有する融合培地に３日間まで交換する。細胞の溶解、超音波処理及び遠心分離によって調製された細胞抽出物のタンパク質濃度を、例えばＢｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）に述べられたＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ　ダイ結合方法のような、任意の適当な方法によって測定することができる。好ましい実施態様では、実施例５に述べる方法に従ってスクリーニング・アッセイを実施する。試験作用剤がアンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、総タンパク質含量を検出可能に増加させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような増加は対照に比べて少なくとも約２０％、より好ましくは対照に比べて少なくとも約５０％である。
【００６４】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、試験作用剤を本発明の細胞の細胞死又はアポトーシスに対するその効果に基づいて評価することができる（Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｏ．（２００１）；Ａｒｅｎｄｓ，Ａ．Ｊ．，Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．（１９９１）；及びＷｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．等（１９８０）参照）。何らかの特定の理論又はメカニズムに縛られることを望む訳ではないが、アンドロゲン受容体アゴニストが筋芽細胞分化を強化するメカニズムはマイトジェン取り出し後のプログラム化細胞死又はアポトーシスの発生率を減ずることによると、提案される。この実施態様は、マイトジェン取り出し後に、アンドロゲン受容体アゴニストによって処理された本発明の細胞が、本発明の未処理細胞に比べて、アポトーシスのレベル減少を示すという観察に基づく。マイトジェン取り出し後に、あるパーセンテージの前付着細胞（ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ）が培養皿から剥離して、アポトーシスを受けるように思われる。アポトーシスを受ける細胞の顕著な特徴は、ゲル電気泳動、Ｒｏｓｌ，Ｆ．（１９９２）によって分析されたときに、ヌクレオソーム内フラグメント化（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって特徴的なラダーリング効果を生じるＤＮＡフラグメント化のパターンである。付着細胞に対比した非付着細胞におけるアポトーシスは、非付着細胞に対比した付着細胞のＤＮＡサンプルの電気泳動によって確認することができる（図７参照）。スクリーニング方法の実施態様の実施では、本発明の細胞を上記高マイトジェン増殖培地において試験作用剤と共に適当な期間、好ましくは約４日間培養する。培地を、試験作用剤を含有する上述したような融合培地に変えて、細胞をさらに約２４時間増殖させる。穏やかな洗浄を繰り返して、非付着細胞を回収して、溶解させる。付着細胞をトリプシン化によって回収して、次に溶解させる。例えば、Ｂｌｉｎ，Ｎ．及びＤ．Ｓｔａｆｆｏｒｄ（１９７６）におけるような、当該技術分野において周知の手段に従って総ＤＮＡを単離する。ＤＮＡ収率は２６０ｎｍにおけるＵＶ分光法によって測定することができる。本発明の細胞のアポトーシスの減少は、本発明の付着細胞中のＤＮＡ量に比べた、アンドロゲン受容体アゴニストによって処理した本発明非付着細胞のＤＮＡの割合の減少によって明らかになる。好ましい実施態様では、実施例７に述べる方法を用いる。試験作用剤がアンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、非付着細胞のパーセンテージを検出可能に減少させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。
【００６５】
本発明の他のスクリーニング方法では、試験作用剤を例えばＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩのような、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦｓ）の発現に対するその効果に基づいて評価することができる。ＩＧＦｓが筋管への筋芽細胞の分化に重要な役割を果たすことは周知である（Ｆｌｏｒｉｎｉ，Ｊ．，Ｄ．Ｅｗｔｏｎ等（１９９６）；Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ，Ｓ．，Ｒ．Ｌａｊａｒａ等（１９８９）；及びＴｏｌｌｅｆｓｅｎ，Ｓ．，Ｊ．Ｓａｄｏｗ等（１９８９）参照）。スクリーニング方法の実施では、本発明の細胞を増殖する筋芽細胞として試験作用剤を含む高マイトジェン増殖培地中に少なくとも２日間維持して、これらを高密度（＞７０％集密度）に達しさせる。細胞が高密度に達したときに、細胞を直ちに回収することができるか、又は好ましくは、試験作用剤を含む融合培地に約１〜２日間切り替えることができる。次に、細胞を回収して、総ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造者が薦める標準方法に従って単離する。２０μｇ（ＵＶ分光法によって測定されるＲＮＡの濃度に基づいて）を含有するサンプルをホルムアルデヒド含有アガロースゲル上での電気泳動によって分離する。分離済みサンプルをＤｕｒａｌｏｎ−ＵＶＴＭナイロン・メンブラン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に５ｘＳＳＰＥ中での毛管ブロッティングによって移し、ラットＩＧＦ−ＩＩプローブによって調べる。この方法におけるプローブとしては、任意の哺乳動物ＩＧＦ−ＩＩ　ｃＤＮＡ又はＲＮＡを用いることができる。好ましくは、前記プローブはマウスＩＧＦ−ＩＩｃＤＮＡ又はＲＮＡの対応領域に＞９０％同じの配列相同性を有する。ＩＧＦ−ＩＩプローブはラット胚総ＲＮＡを鋳型として、５’−ＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧＧ−３’をフォワードプライマーとして、５’−ＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＴＡＣＴＡＣＡＴＴＧＣ−３’をリバースプライマーとして用いることができ、続いて、トリス−ボレート−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）バッファー中１％アガロースゲル上でのＤＮＡフラグメントの電気泳動分離を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、ゲルスライスから５６２−塩基対生成物を回収することができる。Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．及びＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８３）と、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．及びＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８４）によるランダムプライマー伸長によって、二本鎖３２Ｐ標識プローブを合成することができる。プローブを煮沸によって変性させて、約１〜２ｘ１０６ｄｐｍ／ｍｌハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ）の濃度において用いる。ハイブリダイゼーションを４２℃において少なくとも約２４時間行なって、次に、メンブランを中程度のストリンジェント条件（即ち、０．３ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５５℃）下で洗浄する。ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ　Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍを用いた、ＯｐｔｉＱｕａｎｔＴＭ，バージョン３．１５ソフトウェア（���ａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）によるリン光イメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）によってハイブリダイゼーション・シグナルを検出して、定量する。次に、試験作用剤によって処理した細胞におけるＩＧＦ−ＩＩ発現を、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない非処理対照サンプルにおけるＩＧＦ−ＩＩ発現と比較する。試験作用剤が対照サンプルに比べてＩＧＦ−ＩＩ発現レベルを検出可能に増加させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような増加は対象に比べて少なくとも約２倍の増加、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約３倍の増加である。
【００６６】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、試験作用剤をＩＧＦＢＰ’ｓとして知られるファミリーのタンパク質のいずれか、好ましくはＩＧＦＢＰ４の発現に対するその効果に基づいて評価することができる。ＩＧＦｓの生物学的活性はＩＧＦＢＰ’ｓとして知られるファミリーの高アフィニティ結合タンパク質によってモジュレートされる。ＩＧＦＢＰ４が筋芽細胞におけるＩＧＦ−Ｉの作用を阻害することは判明している（ＭｃＣｕｓｋｅｒ，Ｒ．とＤ．Ｃｌｅｍｍｏｎｓ（１９９４））。骨格筋ＩＧＦＢＰ４　ＲＮＡレベルはアンドロゲン受容体アゴニスト、テストステロンによってＩＧＦ−Ｉとは反対の方法で調節される（Ｕｒｂａｎ，Ｒ．，Ｙ．Ｂｏｎｄｅｎｂｕｒｇ等（１９８６））。スクリーニング方法の実施では、本発明の細胞を増殖させ、ＩＧＦ発現の測定方法と実質的に同じ方法で、ＲＮＡを単離し、分離して、ブロットする。任意のＩＧＦＢＰをこのスクリーニング方法のためのプローブとして用いることができる。プローブがＩＧＦＢＰ４であることが好ましい。ラットＩＧＦＢＰ４のコーディング領域からの４６９ｂｐフラグメントを、鋳型としてラット骨格筋ポリＡ＋ＲＮＡを用い、フォワードプライマーとして５’−ＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧ−３’を用い、リバースプライマーとして５’−ＣＣＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧ−３’を用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によってプローブとして調製することができる。該プローブの変性及びハイブリダイゼーションと、ハイブリダイゼーション・シグナルの検出とはＩＧＦ発現の測定方法と実質的に同じ方法で行なうことができる。次に、試験作用剤によって処理した細胞におけるＩＧＦＢＰ４発現をアンドロゲン受容体アゴニストを含有しない非処理対照サンプルにおけるＩＧＦＢＰ４発現と比較する。試験作用剤が対照サンプルに比べて、ＩＧＦＢＰ４発現レベルを検出可能に減少させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような減少は対照に比べて少なくとも約５０％、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約７０％である。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法における活性に関して試験し、及び／又は特徴付けすべき試験作用剤を、好ましくは、約０．００１ｎＭ〜約１０，０００ｎＭの範囲である濃度範囲において試験する。
【００６８】
本発明のスクリーニング方法がアンドロゲン受容体アゴニストの同定及び／又は特徴付けに、並びにアンドロゲン受容体アンタゴニストである作用剤の同定及び／又は特徴付けに使用可能であることは、この開示に基づいて、当業者に明らかであろう。例えば、本発明の方法のいずれも、可能なアンドロゲン受容体アンタゴニスト活性を有する作用剤を試験するために既知アンドロゲン受容体アゴニストと共に用いることができる。スクリーニング方法の実施において期待される陽性結果の減少は、未知作用剤がアンドロゲン受容体アンタゴニストであることを示唆しうる。例えば、上述したような、本発明の細胞におけるチミジン取り込みに基づく本発明のスクリーニング方法では、アンドロゲン受容体アゴニストによって生じるチミジン取り込み阻害効果を、アンタゴニストが抑制する。
【００６９】
本明細書に引用した、全ての特許、出願、刊行物及び資料、例えば、パンフレット又は技術公報（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｂｕｌｌｅｔｉｎ）の開示はそれらの全体において本明細書に援用される。
【００７０】
当業者は、実施例、図面、配列一覧表及び特許請求の範囲を包含する本願の記載を用いて、本発明をその完全な程度まで利用することができると考えられる。以下の実施例は本発明の実施の単なる例示と見なされるべきであり、この開示の残りの部分を如何なる意味でも少しでも限定するものと見なすべきではない。
【００７１】
【実施例】
実施例
実施例１は、ヒトアンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物細胞系の調製を提供する。実施例２は、［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイにおいてアンドロゲン受容体を過度発現する筋芽細胞系の細胞増殖に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例３は、アンドロゲン受容体を過度発現する細胞における筋芽細胞分化に対するアンドロゲンの効果を細胞周期における変化に従って例示する。実施例４は、筋管形成に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例５はｉｎｖｉｔｒｏ筋形成中のタンパク質蓄積に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例６は、アンドロゲン受容体を過度発現する筋芽細胞におけるＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦＢＰ４遺伝子発現に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例７は、アポトーシスに対するアンドロゲン処理の効果を例示する。
【００７２】
実施例１
ヒトアンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物細胞
Ａ．発現ベクターの調製
哺乳動物細胞におけるヒトアンドロゲン受容体の発現を可能にするプラスミドを標準組換えＤＮＡクローニング手法によって生成した。ヒトアンドロゲン受容体のための２５７７−ｂｐヒトアンドロゲン受容体コーディング配列（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ２３２６３）を含有するＤＮＡフラグメントをｐＢＩ−ＥＧＦＰ　Ｔｅｔベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ．＃６１５４−１，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）の固有Ｐｖｕｌｌ部位中にライゲートした。得られた発現ベクターを大腸菌株ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に形質転換して、増幅させた。得られたクローンを、クローニング結合（ｃｌｏｎｉｎｇ　ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）を包含する領域の制限マッピングとＤＮＡ塩基配列決定とに基づいて、選択して、それらが発現のための適当な部位及びオリエンテーションで完全なヒトアンドロゲン受容体コーディング配列を含有することを発見した。
【００７３】
Ｂ．細胞の調製
ヒトアンドロゲン受容体含有発現ベクターを包含する全てのプラスミドＤＮＡをマウス筋肉由来Ｃ２Ｃ１２細胞（ＹａｆｆｅとＳａｘｅｌ（１９７７）；ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１７７２）中に、トランスフェクション試薬、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者の薦める方法及び条件に従って導入した。Ｃ２Ｃ１２細胞に最初にＴｅｔ−ＯｎＴＭベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造者の指示に従い、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭを用いてトランスフェクトして、逆テトラサイクリン調節トランス作用因子タンパク質を発現する細胞系を生成した。得られた細胞を１５％ウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ　Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と１０ｐＭ塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）とを補充した、１．５ｇ／Ｌグルコース含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ−ＬＧ，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から成る高マイトジェン増殖培地中で増殖させた。得られたクローン（抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を有する）の幾つかを、それらがＴＲＥ２−Ｌｕｃレポーター遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）の発現をテトラサイクリン依存的に調節することができるかに関して評価した。１つの高応答クローンに対して、選択ベクターとしてのヒトアンドロゲン受容体含有発現ベクタープラスｐＴＫ−ｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）による第２ラウンドのトランスフェクションを行なった。得られたトランスフェクト済み細胞プールを４１４〜５１７Ｕ／ｍｌヒグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下での増殖に関して選択した。
【００７４】
Ｃ．ヒトアンドロゲン受容体の発現の確認
ヒグロマイシン耐性プールを高レベルのヒトアンドロゲン受容体ｍＲＮＡを有するクローンに関してＮｏｒｔｈｅｒｎブロット分析によってスクリーニングすることによって、“Ｃ２ｈＡＲ５７”と表示される細胞系を同定した。５０〜７０％集密度培養からＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造者のプロトコールに従って、総ＲＮＡを単離した。２０μｇの総ＲＮＡを含有するサンプルをホルムアルデヒド含有アガロースゲル上での電気泳動によって分離し、Ｄｕｒａｌｏｎ−ＵＶＴＭナイロンメンブラン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に５ｘＳＳＰＥ中での毛管ブロッティングによって移し、全イヌアンドロゲン受容体タンパク質コーディング領域に及ぶ３２Ｐ標識ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズさせた（Ｌｕ，Ｂ．，Ｓ．Ｓｍｏｃｋ等（２００１））。ハイブリダイゼーション後に、５５℃において０．３ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中でブロットを洗浄して、ストリンジェント性を緩和した。アンドロゲン受容体転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）をリン光イメージング（ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ　Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって検出した。Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロット分析において、３．０−ｋｂハイブリダイジング帯がＣ２ｈＡＲ５７細胞からのＲＮＡ中では検出されたが、Ｃ２Ｃ１２細胞では検出されなかったので、Ｃ２ｈＡＲ５７中でのアンドロゲン受容体発現が確認された。
【００７５】
Ｄ．アンドロゲン受容体の過度発現の確認
結合バッファー（５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７．２、１．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＮａＦ、１０ｍＭ　Ｎａ２ＭｏＯ４、１０％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌバシトラシン、及び１ｍＭ　Ｐｅｆａｂｌｏｃ；７．５μｌ／ｃｍ２）中でのＣ２ｈＡＲ５７細胞の超音波処理によって、細胞抽出物を調製した。該抽出物を遠心分離して（１０，０００ｘｇ、１０分間、４℃）、得られた上清を液体窒素中で凍結させ、−８０℃において貯蔵した。解凍時に、該抽出物を結合バッファーによって希釈して、１０ｍｇ／ｍｌの総タンパク質を得た。１０μｌの細胞抽出物と、１ｎＭの［１，２，４，５，６，７−３Ｈ（Ｎ）］−５α−アンドロスタン−１７β−オール−３−オン（［３Ｈ］−ＤＨＴ，１１０キューリー／ｍＭ，Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）プラス０、０．５、１、２、４、８、１６、３２、６４又は２０００ｎＭ非標識ＤＨＴを含有する０．２ｍｌの量で、結合反応を４℃において１時間行なった。アンドロゲン受容体−リガンド複合体を４℃において１時間かけて形成させてから、ヒドロキシルアパタイト含有９６穴プレート式フィルター（９６−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ　ｆｏｒｍａｔ　ｆｉｌｔｅｒｓ）（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に捕捉した。プレートを結合バッファーによって３回洗浄して、結合した放射能をシンチレーション計数によって定量した。表Ｉと図１における結果は、Ｃ２ｈＡＲ抽出物への［３Ｈ］−ＤＨＴの結合が特異的であることを示す。図１の挿入図に示す、結合データの飽和可能なＳｃａｔｃｈａｒｄ分析は、単一クラスの結合部位及び１．１５ｎＭの解離定数（Ｋｄ＝−１／勾配）による１１．４フェムトモル／ｍｇタンパク質の受容体アバンダンス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ）と一致した。Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット分析の説明に関しては、Ｈｕｌｍｅ，Ｅ．Ｃ．ｅ．（１９９２）６９頁を参照のこと。これとは対照的に、トランスフェクトされないＣ２Ｃ１２細胞からの細胞抽出物への［３Ｈ］−ＤＨＴの特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ）は実証することはできなかったので、これは、このアッセイの検出下限である、２．２フェムトモルのアンドロゲン受容体／ｍｇタンパク質より小さいと推定される。
【００７６】
表Ｉ．Ｃ２ｈＡＲ抽出物への［３Ｈ］−ＤＨＴの結合
【表１】
2004000156.tif 000002
【００７７】
さらに、間接免疫蛍光を用いて、アンドロゲン受容体発現を確認した。Ｃ２ｈＡＲ５７細胞をポリ−Ｄ−リシン被覆ガラス・チャンバ・スライド（ｇｌａｓｓ　ｃｈａｍｂｅｒ　ｓｌｉｄｅｓ）（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）上で培養し、１００ｎＭ　ＤＨＴによって２時間処理し、次に、リン酸塩緩衝化生理食塩水によってすすぎ洗いして、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中２％パラホルムアルデヒドを用いて室温において１５分間固定した。以後の工程も室温において行なった。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を用いて、細胞を１０分間浸透性化してから、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に５％正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を含有するブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で２０分間インキュベートした。ポリクローナル・ウサギ抗アンドロゲン受容体抗血清（ＰＡ１−１１１，Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ）をブロッキング溶液中４μｇ／ｍｌの濃度においてスライド上で１時間インキュベートし、続いてＣｙ３−複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗ウサギ免疫グロブリンＧ（１：５０００，Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）も１時間インキュベートした。Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＢＨ−２蛍光顕微鏡上でローダミン・フィルターによって免疫蛍光を可視化した（図２Ｂ、２Ｄ及び２Ｆ参照）。さらに、同じフィールドを位相差照明下でも撮影した（図２Ａ、２Ｃ及び２Ｅ参照）。アンドロゲン受容体免疫蛍光が大部分のＣ２ｈＡＲ５７細胞において、主として細胞核に局在して検出された。一次抗体を省略した場合には、免疫蛍光は存在しなかった。上記手段を用いたＤＨＴ処理Ｃ２Ｃ１２細胞では、暴露時間を増加した場合にさえも、核蛍光は殆ど見られなかった。
【００７８】
したがって、実施例１は、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋筋芽細胞の調製を例示する。
【００７９】
Ｅ．Ｃ２ｈＡＲ５７細胞の寄託
細胞系、Ｃ２ｈＡＲ５７はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　ＡＴＣＣに寄託され、Ｐａｔｅｎｔ　Ｄｅｐｏｓｉｔ　Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ、ＰＴＡ−４１２６を与えられた。寄託された細胞系は、特許手続きのための微生物寄託についての国際的認識に基づくブタペスト条約下での寄託のために、２００２年３月６日にＡＴＣＣによって受理された。このように寄託された細胞系の公衆への利用可能性に対する全ての制限は、特許の付与時に、適切な場合には、決定的に除去される。
【００８０】
実施例２
本発明の筋細胞を用いた［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイ
実施例１によって調製したＣ２ｈＡＲ５７細胞を９６穴組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に１０００細胞／穴で、１５％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｅｍｉｎｉ　Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いてプレーティングして、５％ＣＯ２／９５％空気中、３７℃において一晩インキュベートした。翌日、培地を、試験作用剤、ＤＨＴ、オキサンドロロン、テストステロン、スタノゾロール、２−ヒドロキシフルタミド、１７β−エストラジオール及びプロゲステロンを含有する培地と交換した。試験作用剤に４８時間暴露させた後に、０．１μＣｉ［３Ｈ］−チミジン（８２Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）／穴を含有する培地を加え、インキュベーションを３７℃においてさらに２時間続けた。培養培地を吸引して、氷冷リン酸塩緩衝化生理食塩水によって、続いて５％トリクロロ酢酸によって洗浄することによって、アッセイを終了させた。次に、０．３Ｎ　ＮａＯＨ（７５μｌ／穴）を加え、続いて、ＮａＯＨを中和するために０．３Ｎ　ＨＣｌ（７５μｌ／穴）を加えることによって、細胞を溶解した。５０μｌアリコート中の放射能を、ＴｏｐＣｏｕｎｔＴＭシンチレーション・カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた９６穴プレート（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中での液体シンチレーション計数によって測定した。天然アンドロゲン（テストステロン及びＤＨＴ）並びに合成アンドロゲン（オキサンドロロン及びスタノゾロール）が全て、Ｃ２ｈＡＲ５７細胞による［３Ｈ］−チミジン取り込みに対して用量依存性の阻害効果を示した（図４参照）。１μＭまでの濃度はＣ２Ｃ１２細胞に殆ど効果を及ぼさなかった（図５参照）。［３Ｈ］−チミジン取り込みの阻害に対するこれら４種類のアンドロゲンの効力順序（ｒａｎｋ　ｏｒｄｅｒ　ｐｏｔｅｎｃｙ）は、アンドロゲン受容体に対するそれらの既知アフィニティと一致した（ＤＨＴ、スタノゾロール、テストステロン及びオキサンドロロンに関してＩＣ５０は、それぞれ、３．５ｎＭ、４．４ｎＭ、８．６ｎＭ及び２８．４ｎＭである）。さらに、０．１ｎＭ　ＤＨＴによる阻害を、アンドロゲン・アンタゴニスト２−ヒドロキシフルタミドの同時添加によって完全に逆転させることができた（図６参照）。
【００８１】
したがって、実施例２は、［３Ｈ］−チミジン取り込みレベルの変化によって例証されるような、細胞増殖レベルの変化を用いて、アンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用を実証する。
【００８２】
実施例３
本発明の筋細胞の細胞周期の変化のアッセイ
細胞周期の各期におけるＣ２ｈＡＲ５７細胞のパーセンテージを、Ｋｒｉｓｈａｎ，Ａ．（１９７５）に従ったヨウ化プロピジウムによる染色後のフローサイトメトリーによって測定した。実施例１によって調製したＣ２ｈＡＲ５７細胞を高マイトジェン増殖培地に低密度でプレーティングした。１００ｎＭ　ＤＨＴ又はビヒクルによる２４時間及び４８時間の処理（これらの時間中に、細胞が３０％集密度を越えることは決してなかった）後に、細胞をトリプシン化によって回収し、リン酸塩緩衝化生理食塩水中の７０％エタノール中に−２０℃において少なくとも２時間再懸濁させた。各細胞サンプルを低速度遠心分離によってペレット化して、１００μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡと２０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含有する０．５ｍｌリン酸塩緩衝化生理食塩水中に室温において３０分間再懸濁させた。正常前方／側方分散比率（ｆｏｒｗａｒｄ／ｓｉｄｅ　ｓｃａｔｔｅｒ　ｒａｔｉｏ）を示す細胞をそれらのヨウ化プロピジウム蛍光の分析のために選択し、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ　発光波長）とＭｏｄｆｉｔＴＭソフトウェア（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とを装備したＦＡＣＳｃａｎＴＭフローサイトメーターを用いて、１０４イベント／サンプルを記録した。１００ｎＭ　ＤＨＴによる２４時間又は４８時間のＣ２ｈＡＲ５７細胞の処理はＧ０−Ｇ１画分を高めた（以下の表ＩＩ参照）。Ｓ及びＧ２−Ｍ画分の同時減少が２４時間目に観察され（ｐ＜０．０５）、４８時間後に同じ方向の傾向が観察された（ｐ＜０．１）。細胞周期の各期におけるＣ２Ｃ１２細胞の画分はビヒクル処理Ｃ２ｈＡＲ５７培養の場合と同様であり、１００ｎＭ　ＤＨＴによって影響されなかった。
【００８３】
したがって、細胞の増殖レベルの変化の測定によってアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用の実証において、実施例３は実施例２に一致し、このような変化は細胞周期のＧ０−Ｇ１、Ｇ２−Ｍ及びＳ期にある細胞レベルによって判定される。
【００８４】
表ＩＩ．ヨウ化プロピジウム染色のフローサイトメトリー分析による細胞周期の一定の期における細胞のパーセンテージ
数値は反復培養（Ｎ＝４又は５）の平均値＋ＳＥＭである。★Ｐ＜０．１、★★Ｐ＜０．０５、★★★Ｐ＜０．００５（ビヒクルに対比して）
【表２】
2004000156.tif 000003
【００８５】
実施例４
本発明の筋細胞における筋管形成のアッセイ
実施例１によって調製したＣ２ｈＡＲ５７細胞を高マイトジェン増殖培地において５０〜７０％集密度に達しさせて、次に、培地を２％ウマ血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（“融合培地”）に切り替えた。融合培地を毎日交換した。高マイトジェン増殖培地中の低密度のＣ２ｈＡＲ５７細胞は小さい付着単核細胞として出現した。融合培地への切り替えの３日間以内に、単核筋芽細胞の大部分は融合して、細長い多核筋管を形成した。１００ｎＭ　ＤＨＴに暴露させたＣ２ｈＡＲ５７の培養では外因性アンドロゲンの不存在下で培養したものに比べて、より迅速に筋管が形成された。このことは、図３に示すように、融合培地中では１、２又は３日間後の培養物中で容易に観察される。これとは対照的に、Ｃ２Ｃ１２の培養物では、筋管形成の速度も程度もＤＨＴの添加によって可視的に影響されなかった。
【００８６】
したがって、実施例４は、筋管形成の速度の変化によって例証されるような、細胞の分化レベルの変化によってアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用を実証する。
【００８７】
実施例５
分化する筋管中のタンパク質含量のアッセイ
手段Ａ−融合培地中で３日間。Ｃ２ｈＡＲ５７細胞を１２穴組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において高マイトジェン増殖培地中４ｘ１０４細胞／穴でプレーティングした。２４時間後に、培地を無ステロイド増殖培地（１５％チャーコール−デキストラン処理ウシ胎仔血清＋１０ｐＭ塩基性線維芽細胞増殖因子を含むＤＭＥＭ）と交換した。３８時間後に、ビヒクル（０．１％ジメチルスルホキシド）又はＤＨＴ（１０−１２〜１０−６Ｍ）を加えた。少なくとも４８時間後に、培養物が５０％集密度を越えるまでに達したときに、培地を前記と同じ濃度のＤＨＴを含む融合培地に切り替えた。融合培地での３日間後の培養物から、上記実施例２で述べたような、結合バッファー（０．１２５ｍｌ／ｃｍ２）中での溶解、超音波処理及び遠心分離によって細胞抽出物を調製した。上清画分中でのＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅダイ結合方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−５４）によって、タンパク質濃度を測定した。表ＩＩＩに示すように、ＤＨＴによって処理された分化するＣ２ｈＡＲ５７培養物では、７１％までの総タンパク質含量の用量関連増加が見られたが、同様に処理されたＣ２Ｃ１２培養物では一貫した変化（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｃｈａｎｇｅ）は存在しなかった。全体として、Ｃ２ｈＡＲ５７培養物中の低いタンパク質含量は、これらの培養物が融合培地に切り替えられた時点でのこれらの培養物の低い密度を反映する。
【００８８】
表ＩＩＩ．融合培地での３日間後のタンパク質含量（μｇ）／穴（手段Ａ）
括弧内の数値はビヒクルとのパーセンテージ差である。
【表３】
2004000156.tif 000004
【００８９】
手段Ｂ−融合培地中で２４時間。完全血清＋ビヒクル（０．１％ジメチルスルホキシド）又はＤＨＴ（１０−１２〜１０−６Ｍ）を含有する高マイトジェン増殖培地中で低密度において、Ｃ２ｈＡＲ５７細胞を４８時間培養してから、トリプシン化して、前記と同じ濃度のＤＨＴを含む１２穴組織培養プレートに５ｘ１０５細胞／穴において再プレーティングした（ｒｅｐｌａｔｅｄ）。再プレーティング（０日目）後１日目に、タンパク質測定のために１セットの培養物から細胞抽出物を調製し、控えのセットを融合培地に切り替えて、ＤＨＴ処理を続けた。融合培地における２４時間（０日目）後の培養物の第２セットから細胞抽出物を調製した。１日目の平均タンパク質含量から０日目の各処理に関する平均タンパク質含量を控除することによって、タンパク質含量の変化を算出した。ビヒクルによって処理した分化する培養物はタンパク質の正味損失を示した、この正味損失は、表ＩＶに示すように、増加する濃度のＤＨＴによって処理した培養物では軽減され、逆転さえした。
【００９０】
表ＩＶ．融合培地における２４時間中のＣ２ｈＡＲ５７培養物のタンパク質含量の正味変化（手段Ｂ）
【表４】
2004000156.tif 000005
【００９１】
したがって、実施例５は、細胞分化レベルの変化を用いてアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用の実証において、実施例４と一致する、この場合このような変化は細胞中のタンパク質含量のレベルに従って測定される。
【００９２】
実施例６
アンドロゲン受容体を過度発現する細胞におけるＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦＢＰ４遺伝子発現のアッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞及びＣ２ｈＡＲ５７細胞を、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）又は１００ｎＭ　ＤＨＴを含む高マイトジェン増殖培地中に４日間増殖する筋芽細胞の培養物として維持し、次に、高密度（＞７０％集密度）に達しさせてから、融合培地に切り替えた。分化の誘導の直前に、０日目サンプルを回収した。融合培地における１日、２日、３日又は５日間（ビヒクル又はＤＨＴの添加を続けながら）後に、追加のサンプルを回収した。Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）を用いて、総ＲＮＡを単離し、ＵＶ分光法によってＲＮＡ濃度を測定した。２０μｇの総ＲＮＡを含有するサンプルをホルムアルデヒド含有アガロースゲル上での電気泳動によって分離して、５ｘＳＳＰＥ中での毛管ブロッティングによってＤｕｒａｌｏｎ−ＵＶＴＭナイロン・メンブラン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に移し、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦ−ＩＩ及び１８ＳリボソームＲＮＡに関して連続的に検査した。鋳型としてラット骨格筋ポリＡ＋　ＲＮＡを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって、プローブとして用いるＤＮＡフラグメントを形成した。フォワードプライマー、５’−ＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧ−３’と、リバースプライマー、５’−ＣＣＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧ−３’とを用いて、ラットＩＧＦＢＰ４のコーディング領域からの４６９−ｂｐフラグメントを増幅させた。フォワードプライマー、５’−ＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧＧ−３’と、リバースプライマー、５’−ＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＴＡＣＴＡＣＡＴＴＧＣ−３’とを用いて、ラットＩＧＦ−ＩＩコーディング領域の大部分を包含する５６２−塩基対フラグメントを増幅させた（ｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位にクローン化された、Ｓｏａｒｅｓ，Ｍ．，Ｄ．Ｉｓｈｉｉ等（１９８５）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３（４），１１１９−１１３４に開示された５６２ｂｐ部分ラットＩＧＦ−ＩＩ配列参照）。フォワードプライマー、５’−ＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＣ−３’と、リバースプライマー、５’−ＡＴＣＴＧＡＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＡとを用いて、１８ＳｒＲＮＡをコーディングする遺伝子からの６７４−ｂｐフラグメントを増幅させた。ランダムプライマー伸長によって、二本鎖３２Ｐ標識プローブを合成した（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．とＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８３）及びＦｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．とＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８４）参照）。プローブを煮沸によって変性させて、１〜２ｘ１０６ｄｐｍ／ｍｌハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ）の濃度において用いた。４２℃における少なくとも２４時間のハイブリダイゼーション後に、メンブランを０．３ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによって５５℃において洗浄して、ストリンジェント性を緩和した。ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ　Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍを用いた、ＯｐｔｉＱｕａｎｔＴＭ，バージョン３．１５ソフトウェア���Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によるリン光イメージングによってハイブリダイゼーション・シグナルを検出して、定量した。連続的な検査の間に、メンブランを５ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８、０．２ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム及び０．１ｘＤｅｎｈａｒｄ溶液から成る溶液中で７０℃において１〜３時間インキュベートすることによって、ストリップした。イメージング・プレートをＩＧＦＢＰ４ハイブリダイゼーションとＩＧＦ−ＩＩハイブリダイゼーションとに、それぞれ、４２時間と９０分間暴露した。１８Ｓシグナルを用いて、他のプローブの各々からのハイブリダイゼーション・シグナルを標準化した。
【００９３】
図８はＮｏｒｔｈｅｒｎブロット分析の結果を示す。ＤＨＴはＣ２ｈＡＲ５７細胞中での４遺伝子全ての発現をＣ２Ｃ１２細胞中に比べて大きく修正した。ＤＨＴ処理はＩＧＦＢＰ４とＩＧＦ−ＩＩ　ＲＮＡのレベルに相反する変化を生じて、２．６−ｋｂ　ＩＧＦＢＰ４転写体のアバンダンスを減じるが、４．２−ｋｂ　ＩＧＦ−ＩＩ転写体を刺激した。融合培地（ＦＭ）における０〜２日間後のＤＨＴによるＩＧＦＢＰ４抑制の大きさは、Ｃ２ｈＡＲ５７細胞では７５％、８６％及び７０％であったが、Ｃ２Ｃ１２細胞では２０％、５１％及び４４％に過ぎなかった。同じ時点において、ＤＨＴはＤＨＴ処理Ｃ２ｈＡＲ５７においてＩＧＦ−ＩＩ転写体を１０．２Ｘ、３．６Ｘ及び２Ｘ増加させたが、Ｃ２Ｃ１２では０．８Ｘ、１．５Ｘ及び１．０Ｘ増加させたに過ぎなかった。
【００９４】
したがって、実施例６は、細胞の分化のレベルの変化を用いてアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用の実証において、実施例４及び５と一致する、この場合、このような変化はＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦＢＰ４発現レベルによって測定される。
【００９５】
実施例７
本発明の筋細胞におけるアポトーシスの分析
実施例１によって調製されたＣ２ｈＡＲ５７と、Ｃ２Ｃ１２細胞との並行培養物を１００ｍｍ直径円形組織培養皿（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）において１００ｎＭ　ＤＨＴ又はビヒクルを含む高マイトジェン増殖培地中で４日間培養してから、融合培地（前記と同様にＤＨＴ又はビヒクルを含む）に切り替えた。全ての培養物はマイトジェン取り出しの時点において約８０％集密度であった。融合培地における２４時間後に、非付着細胞を含有する培地を遠心分離管に移した。次に、皿をリン酸塩緩衝化生理食塩水によってすすぎ洗いして、トリプシン化によって付着細胞を回収した。遠心分離によって細胞ペレットを回収して、５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム中で溶解した。総ＤＮＡを付着細胞画分と非付着細胞画分の両方から標準手段によって単離した（Ｂｌｉｎ，Ｎ．とＤ．Ｓｔａｆｆｏｒｄ（１９７６）参照）。５皿のプールからのＤＮＡ収量を２６０ｎｍにおけるＵＶ分光法によって測定した。１０μｇ　ＤＮＡに相当するアリコートをＴＢＥバッファー中の１％アガロースゲル上での電気泳動によって分析し、ＵＶトランスイルミネーション（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）による臭化エチジウム蛍光によって可視化した。
【００９６】
各細胞系及び処理からのＤＮＡの収量を表Ｖに要約する。ＤＨＴ処理Ｃ２ｈＡＲ５７培養物の非付着画分中のＤＮＡ割合（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はビヒクル処理Ｃ２ｈＡＲ５７培養物中に見られる該割合よりも顕著に小さかった。ＤＨＴ処理は、Ｃ２Ｃ１２細胞系における非付着細胞の割合を感知できるほどには変えなかった。各サンプル中のＤＮＡを、図７に示すように、アガロースゲル電気泳動によって定性的に評価した。両方のＣ２ｈＡＲ５７培養物の非付着細胞画分からのＤＮＡは、アポトーシスを経験した細胞の特色であるような、１８０ｂｐの倍数（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ）でフラグメントの明確なラダーを示した。臭化エチジウム蛍光の相対強度に基づくと、ビヒクル処理Ｃ２ｈＡＲ５７サンプル中ではＤＨＴ処理サンプル中よりも大きい割合のＤＮＡがフラグメント化したように見えた。これとは対照的に、付着細胞画分の全てと非付着Ｃ２Ｃ１２細胞画分とにおけるＤＮＡは主として高分子量（＞１０ｋｂ）であり、明確なフラグメント化は見られなかった。したがって、マイトジェン取り出し後２４時間中に、或るパーセンテージのＣ２ｈＡＲ５７細胞が培養皿から分離して、アポトーシスを受けたように思われ、ＤＨＴ処理がアポトーシス細胞の発生を約７５％減少した。同じような量のＤＮＡがＣ２Ｃ１２培養物の非付着画分から回収されたが、このＤＮＡはフラグメント化せず、このことは、これらの細胞がアポトーシスではないことを実証した；その上、いずれの細胞画分のＤＮＡの収量にも質にもＤＨＴの効果は無かった。
【００９７】
表Ｖ．融合培地における２４時間後の細胞培養物から回収された総ＤＮＡ
【表５】
2004000156.tif 000006
【００９８】
したがって、実施例７は、マイトジェン取り出し後の細胞のアポトーシスレベルの変化によってアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用を実証する。
【００９９】
参考文献
【表６】
2004000156.tif 000007
【表７】
2004000156.tif 000008
【表８】
2004000156.tif 000009
【０１００】
略号
“ＤＨＴ”はジヒドロテストステロンを意味する。
“ＤＮＡ”はデオキシリボ核酸を意味する。
“ｃＤＮＡ”は相補的ＤＮＡを意味する。
“ｎｍ”はナノメートルを意味する。
“ｎＭ”はナノモルを意味する。
“ＲＮＡ”はリボ核酸を意味する。
“ｍＲＮＡ”はメッセンジャーＲＮＡを意味する。
“ＵＶ”は紫外線を意味する。
“ＳＤＳ”はドデシル硫酸ナトリウムを意味する。
“ＳＳＣ”は生理食塩水塩類クエン酸塩（ｓａｌｉｎｅ　ｓａｌｉｎｅ　ｃｉｔｒａｔｅ）を意味する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｃ２ｈＡＲ５７細胞からの細胞抽出物に対する［３Ｈ］−ＤＨＴの特異性を示す。
【図２】図２Ｂと２Ｄは、それぞれ、Ｃ２Ｃ１２細胞とＣ２ｈＡＲ５７細胞の免疫蛍光顕微鏡写真であり、一次抗体としてのウサギ抗アンドロゲン受容体抗血清（ＰＡ１−１１１）と、二次抗体としてのＣｙ−３−複合抗ウサギ免疫グロブリンとの結合度を示す。図２Ｆは、二次Ｃｙ−３−抗ウサギ免疫グロブリンのみによって処理したＣ２ｈＡＲ５７細胞の免疫蛍光顕微鏡写真である。図２Ａ、２Ｃ及び２Ｅは、それぞれ、２Ｂ、２Ｄ及び２Ｆに対応する位相差照明顕微鏡写真である。
【図３】図３は、Ｃ２Ｃ１２細胞及びＣ２ｈＡＲ５７細胞における筋管形成に対するＤＨＴの効果を示す。
【図４Ａ】図４は、Ｃ２ｈＡＲ５７細胞への［３Ｈ］−チミジン取り込みに対する４種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図４ＡはＤＨＴの効果を示す。
【図４Ｂ】図４は、Ｃ２ｈＡＲ５７細胞への［３Ｈ］−チミジン取り込みに対する４種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図４Ｂはオキサンドロロンの効果を示す。
【図４Ｃ】図４は、Ｃ２ｈＡＲ５７細胞への［３Ｈ］−チミジン取り込みに対する４種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図４Ｃはテストステロンの効果を示す。
【図４Ｄ】図４は、Ｃ２ｈＡＲ５７細胞への［３Ｈ］−チミジン取り込みに対する４種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図４Ｄはスタノゾロールの効果を示す。
【図５】図５は、Ｃ２Ｃ１２細胞への［３Ｈ］−チミジン取り込みに対する２種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。
【図６】図６は、Ｃ２ｈＡＲ５７細胞への［３Ｈ］−チミジン取り込みに対するアンドロゲン受容体アンタゴニスト、２−ヒドロキシフルタミドの効果を示す。
【図７】図７は、Ｃ２Ｃ１２細胞及びＣ２ｈＡＲ５７細胞における細胞アポトーシスに対するＤＨＴの効果を示す。
【図８Ａ】図８は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロット分析に基づいた、Ｃ２Ｃ１２細胞及びＣ２ｈＡＲ５７細胞におけるＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦＢＰ４発現に対するＤＨＴの効果を示す。図８ＡはＣ２Ｃ１２細胞におけるＩＧＦＢＰ４発現に対するＤＨＴの効果を示す。
【図８Ｂ】図８は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロット分析に基づいた、Ｃ２Ｃ１２細胞及びＣ２ｈＡＲ５７細胞におけるＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦＢＰ４発現に対するＤＨＴの効果を示す。図８ＢはＣ２Ｃ１２細胞におけるＩＧＦ−ＩＩ発現に対するＤＨＴの効果を示す。
【図８Ｃ】図８は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロット分析に基づいた、Ｃ２Ｃ１２細胞及びＣ２ｈＡＲ５７細胞におけるＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦＢＰ４発現に対するＤＨＴの効果を示す。図８ＣはＣ２ｈＡＲ５７細胞におけるＩＧＦＢＰ４発現に対するＤＨＴの効果を示す。
【図８Ｄ】図８は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロット分析に基づいた、Ｃ２Ｃ１２細胞及びＣ２ｈＡＲ５７細胞におけるＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦＢＰ４発現に対するＤＨＴの効果を示す。図８ＤはＣ２ｈＡＲ５７細胞におけるＩＧＦ−ＩＩ発現に対するＤＨＴの効果を示す。
【図９】図９は、挿入されたヒトアンドロゲン受容体を示すｐＢＩ−ＥＧＦＰ発現ベクターのマップである。
【図１】
2004000156.tif 000036
【図２】
2004000156.tif 000037
【図３】
2004000156.tif 000038
【図４Ａ】
2004000156.tif 000039
【図４Ｂ】
2004000156.tif 000040
【図４Ｃ】
2004000156.tif 000041
【図４Ｄ】
2004000156.tif 000042
【図５】
2004000156.tif 000043
【図６】
2004000156.tif 000044
【図７】
2004000156.tif 000045
【図８Ａ】
2004000156.tif 000046
【図８Ｂ】
2004000156.tif 000047
【図８Ｃ】
2004000156.tif 000048
【図８Ｄ】
2004000156.tif 000049
【図９】
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