(57)【要約】【課題】細胞抽出液等の混合物にごく微量に含まれる特定の生体物質の回収操作を大幅に改善して簡便かつ迅速な処理を可能にする。【解決手段】金でポリマーの全表面を被覆した微粒子に、架橋分子を介して特定の生体物質に対するリガンド物質を固定して生体分子精製担体を形成し、特異的親和性物質をリガンド物質に結合させ、回収を行う。【効果】ごく微量な生体分子も損失することなく抽出回収できる。【選択図】図２
2004150841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面が貴金属に覆われるとともに、前記貴金属の表面には生体分子と結合する捕捉分子を結合させるための表面処理がなされた担体を用意する工程と、
前記貴金属の表面に前記捕捉分子を結合させる工程と、
その後、複数の前記担体を収めた容器に前記生体分子を含む試料を供給し、前記捕捉分子に前記生体分子を結合させる工程と、
複数の前記担体に前記補捉分子に結合された前記生体分子を解離または溶出させる溶液を供給する工程と、
前記生体分子を回収する工程とを有することを特徴とする生体物質精製方法。
【請求項２】
前記捕捉分子に前記生体分子を結合させる工程では、前記試料に電圧を印加して、前記生体分子を前記担体の近傍に電気的に誘導することを特徴とする請求項１に記載の生体物質精製方法。
【請求項３】
前記担体は磁性を有し、前記担体を磁界印加手段を用いて磁気的に搬送させる工程を更に有し、
前記生体分子を回収する工程では、前記搬送された前記担体に、前記補捉分子に結合された前記生体分子を解離または溶出させる溶液を供給し、前記生体分子を回収することを特徴とする請求項１に記載の生体物質精製方法。
【請求項４】
表面の全面が貴金属に覆われるとともに、前記貴金属の表面には生体分子と結合する捕捉分子を結合させるための表面処理がなされた、複数の担体を有し、
前記担体に結合させる前記捕捉物質により前記生体分子の回収がなされるものであることを特徴とする生体物質精製キット。
【請求項５】
前記貴金属の表面は、前記生体分子を捕捉する前記捕捉分子が結合されていることを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項６】
前記貴金属は、金、白金、銀、銅のいずれかであることを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項７】
前記担体は磁性体を含むことを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項８】
前記担体の直径は０．１μｍ以上１０μｍ以下であることを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項９】
前記担体の比重は、１．０より大きいことを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項１０】
前記表面処理は、前記貴金属の表面へのチオール化処理であることを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項１１】
前記表面処理は、末端に活性基を有するアルカンチオールを、前記貴金属の表面へ付加したチオール基を介して結合したものであることを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項１２】
前記磁性体を含む前記担体は、中心部にポリマーと、前記ポリマーの外側の周囲を覆う前記磁性体の層と、前記磁性体の外側の周囲を覆う前記貴金属の層とを具備する層構造を有し、
前記貴金属の層は、前記貴金属の層の表面に前記表面処理がなされたことを特徴とする請求項７に記載の生体物質精製キット。
【請求項１３】
内部に磁性体を有し、かつ表面は捕捉分子を結合した貴金属に覆われた担体を設置するカラムまたはチューブと、
前記カラムまたはチューブと連結した分析部と、
前記担体を前記カラム、またはチューブの内部で搬送する搬送手段と、
前記担体の近傍に生体分子を誘導させる電圧印加手段とを有し、
前記カラムまたはチューブは、複数の前記担体に前記生体分子を含む試料を供給し、前記捕捉分子に前記生体分子を結合させ、かつ複数の前記担体に前記補捉分子に結合された前記生体分子を解離または溶出させる溶液を供給し、前記生体分子を回収するものであって、
前記分析部は、前記回収された前記生体分子を分析することを特徴とする生体物質分析システム。
【請求項１４】
前記分析部は、前記回収された前記生体分子の分析を行う質量分析計であることを特徴とする請求項１５に記載の生体物質分析システム。
【請求項１５】
前記分析部は、前記回収された前記生体分子の分析を行う液体クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項１５に記載の生体物質分析システム。
【請求項１６】
前記搬送手段は、前記カラムまたはチューブの外部に設けた磁界印加手段であることを特徴とする請求項１５に記載の生体物質分析システム。
【請求項１７】
前記電圧印加手段は、前記担体を収める容器の外に設置され、前記担体に間接的に接触する第１の電極と、前記カラムまたはチューブの内部の前記試料に接触する第２の電極と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電源とを有することを特徴とする請求項１５に記載の生体物質分析システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の生体分子を固定化して精製するための表面処理をした生体分子精製担体と、これを利用して蛋白質、核酸、抗体、ホルモン等の生体活性物質分子を高効率で精製する方法、精製用キットおよび精製された物質を分析する分析システムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生命現象は秩序正しく制御された生体反応の連鎖により成る。その素過程である生体分子−分子間相互作用に関わる個々の成分を回収したり、相互作用の過程を解析することは、生物科学のみならず医療応用等の分野においても重要な課題である。
【０００３】
特定の生体物質を回収する方法は分子間の特異的親和性（アフィニティ）を利用した生化学的な方法が一般的である。従来、細胞内のある特定の生体物質を回収するためには、親和性吸着担体を用いた免疫沈降法やアフィニティクロマトグラフィーが用いられてきた。従来の親和性吸着担体は粒径数十から数百μｍ程度の支持体に適当な長さのスペーサーを介してリガンドを結合したもので、支持体としてはアガロースゲル担体に代表される多孔性架橋多糖マトリックスがよく用いられている。このような形状の親和性吸着担体をバッチまたはカラムに封入し、固定化リガンドに特異的に結合する生体分子を回収する。
【０００４】
表面に分子を固定し、基板や担体に一定の機能を持たせようとする試みは比較的古くから行われていたが、Ａｌｌａｒａらによって、チオール基を有するアルキル鎖（アルカンチオール）が金と反応して直接共有結合を形成することが見出され、アルキル鎖末端に機能性官能基を導入することで、金表面にリガンドを高密度、高配向に固定できるようになった（非特許文献１等参照）。この原理により、基板上の金表面にアルキル鎖をスペーサーとしてリガンドを結合し、特定の分子との相互作用を電気的信号変化や、屈折率変化または振動数変化として検出できる。例えば、特開平１１−３２６１９３号公報に示されるように、平坦な基板上にポリスチレン等からなる微粒子を配列し、上から金を０．００５〜０．５μｍ蒸着すると粒子表面の一部分が金で被覆される。この金表面に任意にリガンドを前記の方法で固定し、特定の分子との相互作用を測定している（特許文献１）。
【非特許文献１】
Ｎｕｚｚｏ，  ＲＧ．  Ａｌｌａｒａ，  ＤＬ著「Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．」  １９８３年、１０５巻、  ４４８１頁）
【特許文献１】
特開平１１−３２６１９３号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来の親和性吸着担体を用いた免疫沈降法やアフィニティクロマトグラフィーでは、リガンドと生体物質の結合効率が低く結合に時間がかかっていた。さらに、一連の操作により失われる生体物質割合が高く、回収効率及び精製度が低かった。このため、特に出発材料にごく微量にしか含まれていない生体物質の回収には、非常に多量の出発材料が必要であった。
また従来の親和性吸着担体を用いて得たごく少量の生体分子を、質量分析計等により分析する試みも、現状では困難である。
粒子を用いた従来の技術として、表面の一部に金を蒸着された粒子を配列させ、金表面にリガンドを固定したものがある（特許文献１等）。しかし、この粒子はリガンドと特定物質の相互作用測定に用いられており、特定分子を回収するものではない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、表面を貴金属で被覆した担体にリガンドを固定化して生体分子を捕捉し、生体分子の回収及び、精製を行うものである。
【０００７】
本発明の担体は表面が貴金属で被覆されている。この貴金属とは、金、白金、銀、又は銅のいずれかである。本発明の担体は、アガロースの網目構造を有する従来の親和性吸着担体と異なり、平滑な貴金属で被覆されるために、失われる生体分子の量を低減でき、回収、および精製の効率を高めることができる。
本発明の担体は直径が０．１μｍ以上１０μｍ以下のものを用いる。直径が０．１μｍを下回る場合には粒子が細かすぎて実験操作が困難である一方、１０μｍを上回る場合には特に生体分子を補捉した担体をさらなる解析に用いるときに制約が生じ得る。よって上記の範囲は、本発明の担体として適当である
本発明の担体に比重が１．０より大きいものを用いた場合には、遠心分離が通常の担体と比較して短時間で行うことができる。さらに、免疫沈降法の際に分離と洗浄とを繰り返すことも容易になり、結果として非特異的吸着を低減することが可能である。
本発明の担体に磁性体層が導入されている場合には、該担体を磁気的に操作することができる。この担体を用いて混合物からリガンドと結合する特定の生体分子を回収する場合には、担体と混合物とを混合した後に磁界を印加することにより、リガンドが生体分子を補捉した担体を磁気分離することができる。また、磁気分離は遠心分離と比較してより短時間により確実に分離できるため、磁気分離と洗浄とを容易に繰り返して共ざつ物の排除を行い、結果として非特異的吸着を低減化できる。
本発明の担体に結合するリガンドは、貴金属で被覆された担体の表面に直接結合するか、または適当な長さのスペーサーを介して結合する。スペーサーとして、貴金属で被覆された担体の表面にチオール基を有するアルキル鎖を高密度に共有結合させた場合、スペーサーであるアルキル鎖先端に結合したリガンドが高密度、高配向するため、生体分子の結合効率を上げることができる。リガンド物質によっては、直接微粒子表面に結合した場合に立体障害のために特定の生体物質との結合が妨げられる可能性が考えられ、このような場合には適当な長さのスペーサーを任意に選択して結合させてもよい。スペーサーの種類としては種々の化学修飾が可能なアミノ基、カルボキシル基またはヒドロキシル基を有するアルカンチオールがよい。
【０００８】
本発明においてリガンドとなりうる物質は、生体において細胞内外で他の物質と相互作用、親和性を有する物質であることが望ましい。例えば特定の生体物質を認識する抗原ならびに抗体、酵素、相補的な配列を有する核酸、細胞膜表面に存在する受容体、その活性部分およびそれに対する生体物質、糖ならびに糖タンパク質などである。これらの中から目的に応じて任意に選択することができる。本発明の担体が導電性を有する場合には、生体分子を含む試料に該担体を添加して電圧を一定方向に印加すると生体分子の濃度が部分的に高まり、リガンドへの補捉の効率を高めることができる。またリガンドに生体分子を補捉させ、洗浄して非特異的吸着を除いた後、緩衝液を添加して電圧を一定方向に印加することにより、リガンドからの生体分子の分離および回収を高効率で行うことができる。また、本発明は、担体を用いて生体分子を回収し、回収された生体分子を分析する生体物質分析システムを提供する。分析のための分析部としては、質量分析計、または液体クロマトグラフィー等を用いる。
本発明の担体を用いることにより、生体物質の回収ならびに精製を簡便かつ確実に行うことができる。また本発明の担体を用いれば、特定の生体物質の分離および回収が可能となるだけでなく、リガンドに既知の物質を固定しこれと相互作用する物質の探索することにより、未知の物質の網羅的な探索も簡便に行うことができる。さらに、リガンドに性質未知物質を固定し、これと相互作用する既知物質を網羅的に検索することにより、未知物質の性質を簡便かつ確実に推測することもできる。
なお、本発明において回収とは、試料より任意の生体物質を集めることを言う。また、精製とは、試料より任意の生体物質の純度および濃度を高めるべく集めることをいう。また、溶出とは、担体を用いて、試料より１種類もしくは多種類の任意の生体物質を取り分けることをいう。また、分離とは、混合物をある成分を含む部分と含まない部分とに分けることをいう。また、本発明における容器とは、本発明の微粒子を設置するものであって、試験管、カラム、チューブ、または微量遠心チューブ等を指す。
【０００９】
【発明の実施の形態】次に本発明を実施例に基づいて具体的に述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００１０】
以下、スペーサーの結合について述べる。特開平２００２−１６６２２８号公報記載の方法により、粒径が均一で、機械的強度を有するエチレン性不飽和基を有する単量体からなるポリマーを基材とする微粒子を得た（特許文献２）。またこの微粒子の表面全面を金で被覆することにより、この微粒子に導電性を負荷すること、及び表面全面をスペーサーの結合等に利用することが可能となった。微粒子の構造の模式図を図１に示す。微粒子は直径は０．１μｍ以上１０μｍ以下のものを用いる。この直径の微粒子を用いる理由として、０．１μｍを下回る場合には粒子が細かすぎる為に実験操作に困難を伴い、１０μｍを上回る場合には、質量分析計等を用いたその後の解析において装置上の制約を受けることによる。実際にはまず、直径３μｍの微粒子を用い以下の処理により微粒子表面にスペーサーを結合した。１００ｍｇの微粒子を１．５ｍｌの微量遠心チューブに取り分け、３７％過酸化水素水１ｍｌを加えて１０分間激しく攪拌した後に遠心し、上清である過酸化水素水を分離した。エタノール１ｍｌを加えて攪拌後遠心して上清を除くことで洗浄し、同様の洗浄作業を数回繰り返した。真空下で十分乾燥させた後に、エタノールに１００μｍｏｌ／ｌのＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐａｎｅｔｅ）を溶かした溶液を１．５ｍｌ加え、室温で４時間緩やかに攪拌した。攪拌した後に遠心て上清を分離した。エタノール１．５ｍｌを加えて攪拌後遠心して上清を除くことで洗浄し、同様の洗浄作業を数回繰り返した。洗浄後、真空下で十分に乾燥させた。より長いスペーサーの結合のためにはＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐａｎｅｔｅ）の代わりにＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ）を用いればよい。また今回は１００μｍｏｌ／ｌの濃度を用いたが、１０μｍｏｌ／ｌから１００ｍｏｌ／ｌの範囲の溶液を用いても良い。
【００１１】
続いて、担体へのリガンドの結合について述べる。スペーサーを結合した上記微粒子を試験管にとり、１ｍＭのＨＣｌを用いて表面を軽く洗浄した。その後結合溶液（２００  ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌ；  ｐＨ  ８．３）にて適当な濃度に希釈したリガンド溶液を添加し、室温にて３０分振とうした。磁気分離により上清を除いた後、洗浄溶液Ａ（５００  ｍＭ  Ｍｏｎｏｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌ；  ｐＨ  ８．３）にて洗浄した。次に洗浄溶液Ｂ（１００  ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ，  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ  ４．０）で洗浄した後、再び洗浄溶液Ａで洗浄を行った。その後洗浄溶液Ａを添加して室温で６０分振とうすることによりブロッキング操作を行った。磁気分離により上清を完全に除き、洗浄溶液Ｂにて微粒子を洗浄した。引き続いて洗浄溶液Ａを添加して微粒子を洗浄後、磁気分離により上清を完全に除き、リン酸溶液（ＰＢＳ）を添加してアフィニティー実験に用いるまで４℃に保存した。
（実施例１）
本発明の担体を用いて、免疫沈降法によってハイブリドーマ培養上清よりマウスＩｇＧを回収する例を以下に示す。
【００１２】
マウスＩｇＧを産生するクローン化ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清（アイエスジャパン）を含むＲＰＭ１６４０培地（アイエスジャパン）にて細胞濃度が２  ｘ  １０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上になるまで増殖させた。１０００回転で５分間室温にて遠心分離（０５ＰＲ−２２；日立）して沈殿を除いた後、上清を以降の実験に用いた。リガンドとして牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテインＡおよびプロテインＧ（以上アマシャムバイオサイエンス）を固定した微粒子を入れた試験管にハイブリドーマの培養上清を添加し、ゆっくりと攪拌しながら４℃にて１２０分反応した。磁気分離により上清を除き、終濃度０．０５％の割合でＴｗｅｅｎ２０を含むトリス溶液（ＴＢＳ）にて５回以上洗浄した。その後０．１Ｍグリシン溶液（ｐＨ３．０）を添加してリガンドに結合したマウスＩｇＧを解離した。マウスＩｇＧを含むグリシン溶液はｐＨ９．０の１Ｍのトリス溶液にてｐＨ７．０付近に調整し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用サンプル溶液（６２．５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ５％    ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ，  ２．５％  ＳＤＳ，  ０．００１２５％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ，  ｐＨ６．８）を添加して９５℃以上で５分間加熱してＳＤＳ−ＰＡＧＥ用とした。これを用いてＳＤＳ―ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロース膜（アトー社）に転写してパーオキシデースにて修飾した抗マウスＩｇＧ抗体にて標識し、化学発光試薬（ピアス社）にて発光、Ｘ線フィルムに感光させて可視化した。その結果、図５に示した様にマウスＩｇＧとの親和性が高いといわれているプロテインＧを固定化した微粒子を用いた場合にＩｇＧとの結合を示す強いシグナルがみられ、本発明が生体物質の混合物からの分離濃縮に極めて有用であることが明らかとなった。
（実施例２）
本発明の担体を用いて、免疫沈降法によってＨｅＬａ細胞中の蛋白質複合体プロテオソームを回収する例を以下に示す。
ヒト子宮けい癌由来細胞株ＨｅＬａをＤＭＥＭ培地［ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（シグマ社）、１００  ｕｇ／ｍｌカナマイシン（ギブコ社）、１０  ％ウシ胎児血清（シグマ社）、ＮＥＡＡ；ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社）］を含む直径１００ｍｍのディッシュ（ファルコン社）に播種し、７０  ％程度コンフルエントになったところで細胞をトリプシン処理して回収した。ここに２００μｌの細胞溶解溶液（２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５  ％  ｄｅｏｘｉｃｈｏｌａｔｅ、０．１  ％  ＳＤＳ；  ｐＨ  ７．５）を加えて細胞を懸濁し、氷上に静置して２０分置いた後に遠心分離して（１５，０００回転  ｘ  ３０分、  ４  ℃）上清を細胞破砕液として実験に用いた。リガンドとしてウサギ由来の抗プロテアソーム抗体、プロテアソーム１９Ｓ複合体のＳ７サブユニットを認識するＰＡ−９６９、プロテアソーム１９Ｓ複合体のＳ８サブユニットを認識するＰＡ−９７０（共にアフィニティバイオリージェンツ社）を前述の方法で微粒子に固定した。ここに細胞破砕液を加え、マイクロチューブミキサを用いて４℃で１時間攪拌して抗体と破砕液中のプロテアソームとの結合を促した。磁気分離して上清を完全に除いた後、細胞溶解溶液にて３回洗浄した。最後に遠心分離（１５，０００回転  ｘ  １分、  ４  ℃）して上清を除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル溶液（６２．５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ５％    ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ，  ２．５％  ＳＤＳ，  ０．００１２５％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ，  ｐＨ６．８）を添加して９０℃で３分間加熱して微粒子に結合している蛋白質を溶出した。試料を氷冷後、遠心（１５，０００回転  ｘ  ５分）でビーズを除き、ウエスタンブロッテイングを行って結果を分析した。
【００１３】
ウエスタンブロッティングには１次抗体としてプロテアソーム１９Ｓ複合体のＳ２サブユニットを認識するＰＡ−９６４抗体（アフィニティバイオリージェンツ社）２次抗体にはアルカリフォスファターゼを結合した抗ウサギＩｇＧ抗体（プロメガ社）を５０００倍希釈して用いた。仮にＡ、Ｂ、Ｃの蛋白質が蛋白質複合体を形成しているとすると、抗Ａ抗体と抗Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った場合、蛋白質ＣはＡならびにＢと一緒に沈降するので、得られた免疫沈降画分を用いて抗Ｃ抗体を１次抗体としてウエスタンブロッティングを行うと、蛋白質Ｃのシグナルが抗Ａならびに抗Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った画分で検出されるはずである。これを作業仮説として実験を行った結果、ＰＡ９６９、ＰＡ−９７０抗体を用いて免疫沈降を行って得た蛋白質画分で１次抗体としてＰＡ−９６４を用いてウエスタンブロットを行ったところシグナルが得られ、  ＰＡ−９６４が認識する１９Ｓ複合体のＳ２サブユニットは他の抗体が認識する１９Ｓ複合体のＳ７およびＳ８サブユニットと蛋白質複合体を形成していることを示唆している。上述した実施例１と同様に本発明の担体を用いれば、リガンドに生体物質を固定して、蛋白質複合体のような機能分子の集合体の回収を簡便かつ迅速に行うことができる。
（実施例３）
本発明の担体を用いて、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって腹水からマウスＩｇＧを精製する例を以下に示す。
【００１４】
上記に記載の方法でリガンドとしてプロテインＧを固定した本発明の担体を図６に示す様にカラム（図６、０６０１）に充填し、アフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。手順の模式図を図７に示す。マウス腹水を回収し、硫安沈殿を行ってＩｇＧ画分を粗精製した後、脱塩カラム（ＰＤ−１０；アマシャムバイオサイエンス社）を用いて結合溶液（２００ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）への溶液交換を行った。次に孔径０．４５μｍのディスクフィルタ（ミリポア社）を通して溶液中の粒子を除き、試料とした。この試料を、３〜５倍体積の結合溶液（流速１滴／秒）を送液して平衡化したカラムに流速０．５滴／秒にて添加した後、更に５から１０倍体積容量の結合溶液を送液して非特異的吸着成分を洗浄した。ＩｇＧの溶出は５倍体積容量の溶出溶液（０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０）を送液（流速１滴／秒）して行った。溶出液は変成を防ぐために直ちに中和溶液（１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を添加してｐＨを中性付近に調整した。こうして得た精製ＩｇＧ画分を用いてＳＤＳ―ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを行って検定を行った結果、マウスＩｇＧが精製され、本発明が生体物質の混合物からの精製に有用であることがわかった。
（実施例４）
本発明の担体を用いた精製方法に、電圧印加を併用する方法の例を以下に示す。
【００１５】
本発明の担体に対し、電圧印加によりリガンドと生体物質との結合効率を高めて結合時間が短縮できる。原理の模式図を図４に示す。目的タンパク質分子を含む細胞粗抽出液の中に、目的のタンパク質と結合する分子を固定した本発明の担体を導入する。担体である微粒子は細胞粗抽出液の中でお互いに接触した状態にする。微粒子は、重力または磁界等によって移動させておく。図４（ａ１）、（ａ２）に磁界によって移動させる場合の模式図、（ｂ１）、（ｂ２）に重力によって移動させる場合の模式図を示す。容器を介して設置された電極１、４０１と、  抽出液内の微粒子の移動した方向とは反対側の方向の所定の位置に設置されたもう一方の電極２、４０２との間で電圧を印加し、抽出液に電圧を印加する。これにより、電極間で生体物質が電気的に泳動して微粒子の近傍に誘導されて収集される為、微粒子に結合したリガンドと生体物質の相互作用の割合が高まる。例えば、１．５ｍｌの微量遠心チューブ内に細胞粗抽出液と担体を入れて静置することにより、担体は自然沈降して底面にお互いに接触した状態で存在する。微量遠心チューブの底面には、予め電極を設置しておくと担体はお互いに接触を保ちながらその一部の担体が電極に接触する。もう一方の電極をチューブの液面に接触させて、底面が陰極、上面が陽極となるようにして８Ｖ／ｃｍ（１Ｖ／ｃｍから２０Ｖ／ｃｍ）の電圧を印加する。なお本実施例においては、結合溶液や溶出溶液などはリガンドと結合させる生体物質の種類に応じて選択する。また、電極の向きも試料によって任意に変更することができる。実際に、図８に示す様に従来６０分間以上かかっていたリガンドと生体物質との結合効率が試料への電圧印加で生体物質を微粒子の近傍に収集させることにより高まることから、本発明にかかる装置を用いることにより３分から５分で結合が終了し、その有効性が示された。
（実施例５）
本発明の担体並びに実施例４に述べた方法を、質量分析計を分析部とする生体物質の分析システムに適用した例を以下に示す。図９に示す様に担体を質量分析計の直前に直結したカラムまたは内径の細いチューブに充填した後、質量分析計に適合する溶液を用いてその内部を平衡化する。その後、リガンドと結合する物質を含む溶液を送液し、実施例４に示した方法で電圧を印加してリガンドと生体物質の結合微粒子の形成を誘導する。その後、電磁石、または永久磁石等の磁界により質量分析計の試料入り口までリガンド−生体物質結合微粒子を搬送し、装置直前で生体物質を溶出、分離する。これにより質量分析計に導入される生体物質の濃度が高められ、高い測定感度が得られる。これまで、質量分析計による測定では、測定対象となる生体物質の濃度が低くて微量な場合は検出限界以下となっていたが、本発明によりこの問題を克服できる。
（実施例６）
本発明の担体並びに実施例４に示した方法に述べた方法を、高速液体カラムクロマトグラフィーを分析部とする生体物質の分析システムに適用した例を以下に示す。図１０に示す様に担体を高速液体カラムクロマトグラフィーの直前に直結したカラムまたは内径の細いチューブに充填した後、適合する溶液を用いてその内部を平衡化する。その後、リガンドと結合する物質を含む溶液を送液し、実施例４に示した方法で電圧を印加してリガンドと生体物質の結合微粒子の形成を誘導する。その後、電磁石、または永久磁石等の磁界により試料入り口までリガンド−生体物質結合微粒子を搬送し、装置の直前で生体物質を溶出、分離する。これにより高速液体カラムクロマトグラフィーにかかる生体物質の濃度が高められ、高い分離能並びに測定感度が得られる。また、高速液体カラムクロマトグラフィーで分離される各フラクションに含まれる特定の生体物質はしばしば希釈され、場合によっては失活が問題となっていたが、実施例４に示した方法を分離後に適用し、その濃度を濃縮することにより、問題を克服できる。
（実施例７）
本発明の他の実施例を図１１に示す。反応試験管、例えばポリスチレン並びにポリプロピレン製の１．５ｍｌ容量の微量遠心チューブの内部底面の一部を金で被覆した後、その表面に上記の方法によりスペーサーとリガンドを固定する。ここに特定の生体物質を含む混合物を滴下して、一定時間静置した後、ピペッティングで溶液を除く。緩衝液を滴下、ピペッティングを数回繰り返して非特異的吸着物質を充分洗浄した後、特定の生体物質のみを分離、回収する。特異的吸着担体として各種微粒子を用いた場合には、遠心や磁気分離操作が作業工程全般を通じて不可欠であったが、本発明にかかる方法を用いれば当該操作を行わずに済むため、簡便で作業時間の短縮と試料のロスを回避する効果もあり、これまで困難であった極微量試料の取り扱いに極めて有効である。尚、本発明の目的は、以下の構成によっても達成される。１．内壁の一部が貴金属に覆われた容器を有し、前記貴金属の表面は、生体分子と結合する捕捉分子を結合させるための表面処理がなされたものであることを特徴とする生体物質精製キット。２．前記貴金属の表面は、前記生体分子を捕捉する前記捕捉分子が結合されていることを特徴とする生体物質精製キット。
【特許文献２】
特開平２００２−１６６２２８号公報
【００１６】
【発明の効果】
本発明の構成により、リガンドと生体物質等との結合効率を高めて、その結合速度を高めることができる。さらに、精製などの操作中における精製分子等の損失割合を減少させ、生体分子等の回収効率及び精製度を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に用いた金微粒子の模式的断面図。
【図２】本発明の生体分子精製担体の模式的断面図。
【図３】本発明に用いた金微粒子に結合可能なスペーサーの種類。
【図４】本発明の生体分子精製担体を含む緩衝液に通電し、リガンドと特定の生体物質の結合効率をあげるための装置の略図。（ａ１）微粒子が磁界によって移動した場合の通電しない状態。（ａ２）微粒子が磁界によって移動した場合の通電した状態。（ｂ１）微粒子が重力によって移動した場合の通電しない状態。（ｂ２）微粒子が重力によって移動した場合の通電した状態。
【図５】本発明の生体分子精製担体にプロテインＧを固定化し、ハイブリドーマ培養上清よりマウスＩｇＧを精製した結果例。ＡはＩｇＧをグリシン溶液にて溶出、解離したフラクションに含まれるマウスＩｇＧを抗マウスＩｇＧ抗体で標識したウエスタンブロットの結果例。Ｂはその後の微粒子に残ったＩｇＧをＳＤＳを含む溶液で溶出して得たフラクションのウエスタンブロットの結果例。
【図６】本発明の生体分子精製担体をカラムに封入した場合の略図。
【図７】本発明にかかる生体分子精製担体による蛋白質の分離方法を示す略図。
【図８】電圧印加の場合のリガンドと生体物質との結合割合と、リガンドとの結合反応時間との関係を示す図。縦軸はリガンドと生体物質の混合液を一定時間氷上にて静置し、反応が飽和するまで静置して得た場合を１とした場合。横軸は静置した時間。
【図９】本発明にかかる生体分子精製担体を用いた質量分析計への試料の搬送方法を示す略図。
【図１０】本発明にかかる生体分子精製担体を用いた高速液体クロマトグラフィーに供する試料並びに分離後の試料の濃縮方法を示す略図。
【図１１】本発明の微量反応チューブの略図。
【符号の説明】
０１０１：金属表面、０１０２：磁性体、０１０３：ポリマー、０２０１：生体分子、０２０２：リガンド、０２０３：スペーサー、０２０４：金属表面、０３０１：金属表面、０３０２：ヒドロキシル基を有するアルカナンチオール、０３０３：カルボキシル基を有するアルカンチオール、０３０４：アミノ基を有するアルカンチオール、０４０１：電極１、０４０２：電極２、０４０３：リガンドを結合した微粒子、０４０４：生体分子、０４０５：磁界印加手段、０６０１：カラム、０６０２：リガンドを結合した微粒子、０６０３：ストッパー、０７０１：組織または細胞、０７０２：リガンドを結合した微粒子、０７０３：特定の生体分子、０７０４：特定の生体分子以外のきょう雑分子、０９０１：リガンドを結合した微粒子、０９０２：磁界印加手段、０９０３：特定の生体分子、０９０４：電極、１００１：リガンドを結合した微粒子、１００２：磁界印加手段、１００３：特定の生体分子、１００４：電極、１１０１：チューブ、１１０２：金コーティング。
【図１】
2004150841.tif 000003
【図２】
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【図３】
2004150841.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2004150841.tif 000008
【図７】
2004150841.tif 000009
【図８】
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【図９】
2004150841.tif 000011
【図１０】
2004150841.tif 000012
【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月9日(2002.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面が貴金属に覆われるとともに、前記貴金属の表面には生体分子と結合する捕捉分子を結合させるための表面処理がなされた担体を用意する工程と、
前記貴金属の表面に前記捕捉分子を結合させる工程と、
その後、複数の前記担体を収めた容器に前記生体分子を含む試料を供給し、前記捕捉分子に前記生体分子を結合させる工程と、
複数の前記担体に前記補足分子に結合された前記生体分子を解離または溶出させる溶液を供給する工程と、
前記生体分子を回収する工程とを有することを特徴とする生体物質精製方法。
【請求項２】
前記捕捉分子に前記生体分子を結合させる工程では、前記試料に電圧を印加して、前記生体分子を前記担体の近傍に電気的に誘導することを特徴とする請求項１に記載の生体物質精製方法。
【請求項３】
前記担体は磁性を有し、前記担体を磁界印加手段を用いて磁気的に搬送させる工程を更に有し、
前記生体分子を回収する工程では、前記搬送された前記担体に、前記捕捉分子に結合された前記生体分子を解離または溶出させる溶液を供給し、前記生体分子を回収することを特徴とする請求項１に記載の生体物質精製方法。
【請求項４】
表面の全面が貴金属に覆われるとともに、前記貴金属の表面には生体分子と結合する捕捉分子を結合させるための表面処理がなされた、複数の担体を有し、
前記担体に結合させる前記捕捉物質により前記生体分子の回収がなされるものであることを特徴とする生体物質精製キット。
【請求項５】
前記貴金属の表面は、前記生体分子を捕捉する前記捕捉分子が結合されていることを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項６】
前記貴金属は、金、白金、銀、銅のいずれかであることを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項７】
前記担体は磁性体を含むことを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項８】
前記担体の直径は０．１μｍ以上１０μｍ以下であることを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項９】
前記表面処理は、末端に活性基を有するアルカンチオールを、前記貴金属の表面へ付加したチオール基を介して結合したものであることを特徴とする請求項４に記載の生体物質精製キット。
【請求項１０】
前記磁性体を含む前記担体は、中心部にポリマーと、前記ポリマーの外側の周囲を覆う前記磁性体の層と、前記磁性体の外側の周囲を覆う前記貴金属の層とを具備する層構造を有し、
前記貴金属の層は、前記貴金属の層の表面に前記表面処理がなされたことを特徴とする請求項７に記載の生体物質精製キット。
【請求項１１】
内部に磁性体を有し、かつ表面は捕捉分子を結合した貴金属に覆われた担体を設置するカラムまたはチューブと、
前記カラムまたはチューブと連結した分析部と、
前記担体を前記カラム、またはチューブの内部で搬送する搬送手段と、
前記担体の近傍に生体分子を誘導させる電圧印加手段とを有し、
前記カラムまたはチューブは、複数の前記担体に前記生体分子を含む試料を供給し、前記捕捉分子に前記生体分子を結合させ、かつ複数の前記担体に前記捕捉分子に結合された前記生体分子を解離または溶出させる溶液を供給し、前記生体分子を回収するものであって、
前記分析部は、前記回収された前記生体分子を分析することを特徴とする生体物質分析システム。
【請求項１２】
前記搬送手段は、前記カラムまたはチューブの外部に設けた磁界印加手段であることを特徴とする請求項１１に記載の生体物質分析システム。
【請求項１３】
前記電圧印加手段は、前記担体を収める容器の外に設置され、前記担体に間接的に接触する第１の電極と、前記カラムまたはチューブの内部の前記試料に接触する第２の電極と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電源とを有することを特徴とする請求項１１に記載の生体物質分析システム。