(57)【要約】【課題】アレルギー疾患治療剤から分離された新規な酵母を提供する。【解決手段】本発明は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７４９９で寄託した酵母または受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７４９９で寄託した酵母と同等の菌体的性質を有する酵母であり、また、同酵母を用いて発酵させて得られる発酵生成物であることを特徴とする。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７４９９で寄託した酵母または受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７４９９で寄託した酵母と同等の菌体的性質を有する酵母。
【請求項２】
請求項１記載の酵母を用いて発酵させて得られる発酵生成物。
【請求項３】
前記発酵生成物がアレルギー治療剤、健康食品、健康飲料のいずれかである請求項２記載の発酵生成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願は、２０００年６月１４日に日本に出願された特許出願番号２０００−１８４５４１号に基づき、優先権の利益を享受するものであって、その出願内容のすべてが引用により、本願明細書の一部として組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、アレルギー疾患、たとえば、喘息、アトピー性皮膚炎、結膜炎、鼻炎、食物アレルギーの治療剤及びその製造方法に関する。また、本発明は前記治療剤から分離された酵母に関する。
【０００３】
【従来の技術】
（背景技術）
人体には、体内に、細菌やウイルスなどの異物が侵入してきたときに、それらに立ち向かい、体を守るための生体防御機構である免疫システムが備わっている。アレルギー疾患はこの免疫システムが過剰に働くために起こるものである。近年、大気汚染、食生活の変化、肉体的あるいは精神的ストレスの増加、居住環境の変化による室内汚染などの環境の変化または人間の体質の変化によるものか、その原因は明確ではないがアレルギー疾患に罹る人が増加している。
【０００４】
このアレルギー疾患としては、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、たとえば、花粉症、食物アレルギーなどがある。
【０００５】
これらのアレルギー疾患の、消極的ではあるが、第一の治療は、アレルゲンを回避することである。家の中の埃やダニがアレルゲンである場合には、家の中を清潔にして、アレルゲンを取り除いたり、花粉がアレルゲンの場合には、花粉の飛ぶ季節には、外出をひかえたり、マスクをしたりして、アレルゲンを吸い込まないようにしたり、食物アレルギーの場合には、その食物を食べないことである。しかしながら、この消極的な治療法は、手間がかかり、また、患者の行動をひどく制限する。
【０００６】
また、喘息の治療としては、発作を止めるか、発作を予防する対症治療が行われており、アドレナリンなどの交感神経系の薬、副腎皮質ステロイドホルモン剤、テオフィリン系などの薬が使われている。しかしながら、喘息は、時に「死」に至る病であるが、未だ、完治するという治療法は無かった。
【０００７】
アトピー性皮膚炎は、乳幼児期には、そのかゆみのために患者だけでなく、その親をも悩ませるものであり、多くは成人する前に治るが、成人期まで続くと顔や胸、ひじやひざの内側などの皮膚が厚くなり、激しいかゆみが起こり、思春期の男女を悩ませる。この治療法としては、外用療法が主な方法であって、症状に応じて、副腎皮質ホルモン剤、抗ヒスタミン剤、その他の抗炎症剤を用いる。かゆみが強い場合には、抗ヒスタミン剤の内服が必要となる。
【０００８】
しかしながら、これらの療法は対症療法であって、アレルギー疾患を完治させるものではなく、また、薬を用いることによる副作用などもある。
【０００９】
アレルゲンが特定できるときは、減感作療法といって、そのエキスを、始めは極少量、皮下注射し、次第に量を増やすことにより、抵抗力をつける方法がある。しかしながら、この療法は、週に１〜２回定期的に注射するもので、長期間かかる上、人によっては、効果がないこともあり、また、人によっては、死に至ることもあるアナフラキーショックを引き起こすことがある。
【００１０】
また、喘息やアトピー性皮膚炎の治療には多くの民間薬もあるが、時にはかえって症状を重くすることがある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のようなアレルギー疾患の治療の現状に対して、アレルギー疾患を、副作用がなく、短期間の服用で、完治させることができる治療剤及びその製造方法を提供することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
（発明の開示）
本発明のアレルギー疾患治療剤は、松科植物の新芽と、水と、糖質とを混合し、これを自然発酵させて得られるもので、喘息やアトピー性皮膚炎のようなアレルギー疾患に有効な治療剤である。前記松科植物としては松属の植物が好ましく、また前記糖質としては砂糖が好ましい。
【００１３】
また、本発明のアレルギー疾患治療剤は、松葉の新芽と、水と、砂糖とを混合し、自然発酵させて得られるもので、喘息やアトピー性皮膚炎のようなアレルギー疾患に有効な治療剤である。
【００１４】
さらに、本発明は上記のアレルギー疾患治療剤の製造方法を包含し、このアレルギー疾患治療剤の製造方法は、（１）滅菌した水に糖質を溶解し、糖質を溶解した溶液を調製する工程と、（２）前記糖質を溶解した溶液に松科植物の新芽を加え、自然発酵させる工程とを含む。前記松科植物としては松属の植物が好ましく、また前記糖質としては砂糖が好ましい。
【００１５】
また、本発明のアレルギー疾患治療剤の製造方法は、（１）滅菌した水に砂糖を溶解し、砂糖を溶解した溶液を調製する工程と、（２）前記砂糖を溶解した溶液に松葉の新芽を加え、自然発酵させる工程とを含むことを特徴とする。
【００１６】
前記の自然発酵としては、嫌気的な条件下、１０〜７０℃、好ましくは２０〜６０℃で、３〜９ヶ月、好ましくは４〜８ヶ月程度行うことが好ましい。
【００１７】
より具体的なアレルギー疾患治療剤の製造方法としては、（１）熱湯に砂糖を溶解し、周囲温度まで冷却させた砂糖水溶液を調製する工程と、（２）前記砂糖水溶液に、水洗した松葉の新芽を加え、容器に入れて密封し、自然発酵させる工程とを含むものであり、この自然発酵は、密閉した容器を直射日光の当たる場所で初冬頃まで行うことが好ましい。
【００１８】
また、本発明は、松科植物の新芽と、水と、糖質とを混合し、自然発酵させて得られる健康食品をも意図するものであり、この健康食品は松葉の新芽と、水と、砂糖とを混合し、自然発酵させて得られたものであることが好ましい。
【００１９】
さらに、本発明は、上記の自然発酵を行った発酵産物、すなわちアレルギー疾患治療剤から分離された新規な酵母を包含する。この酵母は、平成１３年（２００１）３月１２日に、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（旧名称：経済産業省技術総合研究所生命工学工業技術研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｓｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、茨城県つくば市東１−１−３、２００１月４月１日をもって、名称が変更されている）に、ハルイサンＡ−３として寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７４９９で特定される酵母であり、また、この寄託された酵母と同等の菌体的性質を有する一連の酵母が本発明に含まれるものである。さらに、本発明においては、前記の酵母を用いて発酵させて得られた発酵生成物が対象となり、この発酵生成物としては、例えば、アレルギー治療剤のような医薬品、健康食品、健康飲料や、化粧品の原料などがある。ここで、健康食品および健康飲料とは、体質を改善し、健康を維持することを目的に使用するサプリメントなどの食品および飲料を意味するものである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明のアレルギー疾患治療剤は、松科植物の新芽と、水と、糖質とを混合し、自然発酵させて得られるものである。
【００２１】
本発明で使用できる松科植物としては、いわゆるモミ（Ａｂｉｅｓ　ｆｉｒｍａ　Ｓｉｅｂ．　＆　Ｚｕｃｃ．）、ウラジオモミ（Ａｂｉｅｓ　ｈｏｍｏｌｅｐｉｓ　Ｓｉｅｂ．　＆　Ｚｕｃｃ．）、オオシラビソ（Ａｂｉｅｓ　ｍａｒｉｅｓｉｉ　Ｍ．Ｔ．　Ｍａｓｔ．）、アオドドマツ（Ａｂｉｅｓ　ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ　（Ｆｒｉｅｄｒ．　Ｓｃｈｍｉｄｔ）　Ｍ．Ｔ．　Ｍａｓｔ．　ｖａｒ　ｍａｒｉｅ）、トドマツ（Ａｂｉｅｓ　ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ　（Ｆｒｉｅｄｒ．　Ｓｃｈｍｉｄｔ）　Ｍ．Ｔ．　Ｍａｓｔ．）、シラベ（Ａｂｉｅｓ　ｖｅｉｔｃｈｉｉ　Ｌｉｎｄｌ．）、ヒマラヤスギ（Ｃｅｄｒｕｓ　ｄｅｏｄａｒａ　（Ｒｏｘｂ．　ｅｘ　Ｄ．　Ｄｏｎ）　Ｇ．　Ｄｏｎ）、グイマツ（Ｌａｒｉｘ　ｇｍｅｌｉｎｉ（Ｒｕｐｒ．）　Ｋｕｚｅｎｅｖａ）、カラマツ（Ｌａｒｉｘ　ｋａｅｍｐｆｅｒｉ（Ｌａｍｂ．）　Ｃａｒｒｉｅｒｅ）、ドイツトウヒ（Ｐｉｃｅａ　ａｂｉｅｓ　（Ｌ．）　Ｋａｒｓｔ．）、アカエゾマツ（Ｐｉｃｅａ　ｇｌｅｈｎｉｉ　（Ｆｒｉｅｄｒ．　Ｓｃｈｍｉｄｔ）　Ｍ．Ｔ．　Ｍａｓｔｅｒｓ）、トウヒ（Ｐｉｃｅａ　ｊｅｚｏｅｎｓｉｓ　（Ｓｉｅｂ．　＆　Ｚｕｃｃ．）　Ｃａｒｒｉｅｒｅ　ｖａｒ．　ｈｏｎｄｏｅｎｓｉｓ）、エゾマツ（Ｐｉｃｅａ　ｊｅｚｏｅｎｓｉｓ　（Ｓｉｅｂ．　＆　Ｚｕｃｃ．）　Ｃａｒｒｉｅｒｅ）、ヤツガタケトウヒ（Ｐｉｃｅａ　ｋｏｙａｍａｅ　Ｓｈｉｒａｓａｗａ）、ハリモミ（Ｐｉｃｅａ　ｐｏｌｉｔａ　（Ｓｉｅｂ．　＆　Ｚｕｃｃ．）　Ｃａｒｒｉｅｒｅ）、アイグロマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｘ　ｄｅｎｓｉ−ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ　Ｕｙｅｋｉ）、アカマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ　Ｓｉｅｂ．　＆　Ｚｕｃｃ．）、タギョウショウ（Ｐｉｎｕｓ　ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ　Ｓｉｅｂ．　＆　Ｚｕｃｃ．　ｃｖ．　Ｕｍｂｒａｃｕｌｉｆｅｒａ）、チョウセンゴヨウ（Ｐｉｎｕｓ　ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ　Ｓｉｅｂ．＆　Ｚｕｃｃ．）、ダイオウショウ（Ｐｉｎｕｓ　ｐａｌｕｓｔｒｉｓ　Ｍｉｌｌ．）、ヒメコマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ　Ｓｉｅｂ．　＆　Ｚｕｃｃ．　ｖａｒ．　ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ）、キタゴヨウ（Ｐｉｎｕｓ　ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ　Ｓｉｅｂ．　＆　Ｚｕｃｃ．　Ｖａｒ．　ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌａ　（Ｍａｙｒ）Ｈｅｎｒｙ）、ハイマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｐｕｍｉｌａ　（Ｐａｌｌ．）　Ｒｅｇｅｌ）、リギダマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｒｉｇｉｄａ　Ｍｉｌｌ．）、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｓｔｒｏｂｕｓ　Ｌ．）、ヨーロッパアカマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　Ｌ．）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓｔｅａｄａ　Ｌ．）、クロマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ　Ｐａｒｌ．）、トガサワラ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｊａｐｏｎｉｃａ　（Ｓｈｉｒａｓ．）　Ｂｅｉｓｓｎ．）、コメツガ（Ｔｓｕｇａ　ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉａ　（Ｍａｘｉｍ．）　Ｍ．Ｔ．　Ｍａｓｔ．）、ツガ（Ｔｓｕｇａ　ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ　Ｃａｒｒｉｅｒｅ）などが例示される。この中でも松属の植物である、アイグロマツ、アカマツ、タギョウショウ、チョウセンゴヨウ、ダイオウショウ、ヒメコマツ、キタゴヨウ、ハイマツ、リギダマツ、ストローブマツ、ヨーロッパアカマツ、テーダマツ、クロマツが好ましく、特に、アカマツ、ダギョウショウ、チョウセンゴヨウ、ダイオウショウ、ハイマツ、クロマツなどは一般に育成されている松であり、入手の容易さの面からも好ましいものである。
【００２２】
また、本発明の使用する糖質としては、ショ糖、転化糖、麦芽糖のようなものが例示される。これらのうちショ糖が入手の容易さの点で好ましいが、使用するショ糖としては、白砂糖、黒砂糖、三温糖、甜菜糖、きび砂糖などいずれの砂糖でも使用できるが、白砂糖が好ましい。
【００２３】
使用する水は、予め滅菌したものを用い、雑菌の繁殖を防止することが好ましく、滅菌方法としては、一般に行われる公知の方法が使用でき、例えば、煮沸などのような方法によって行うことができる。
【００２４】
本発明のアレルギー疾患治療剤は、上記の滅菌した水を用いて糖質を溶解した水溶液に、松科植物の新芽を加え、これを自然発酵することにより得られるが、水溶液に加える松科植物の新芽は、いかなる種類の松科植物から採取した新芽でもよいが、特に、松属の植物から採取した新芽が好ましい。採取の時期は、松科植物の花が咲きおわったときが好ましく、この時期に採取した新芽がアレルギー疾患治療剤としての有効性がもっとも高く好ましいものである。松の場合でいえば、その土地の気候にもよるが、一般に４月上旬〜６月下旬頃に、枝の先端に赤みがかった雌花が咲き、新枝の周りに黄色の雄花が咲くので、これらの花が咲き終わった後に、枝の先端部にある新芽を採取して用いることが好ましい。
【００２５】
発酵に用いる原液の調製は、水約１リットルに対して、糖質を約０．５ｋｇの割合で溶解し、得られた溶液に対して松科植物の新芽約２５本の割合で添加する。この場合、糖質は完全に溶解している必要はなく、未溶解のまま液中に存在していても差し支えない。また、発酵させる原液には、上記の割合で松葉の新芽のような松科植物の新芽を含んでいればよく、新芽以外の葉や花を含むものであっても差し支えない。
【００２６】
自然発酵は、嫌気的な条件下で行い、１０〜７０℃、好ましくは２０〜６０℃で、３〜９ヶ月、好ましくは４〜８ヶ月程度静置して発酵を行う。嫌気的な条件としては、例えば、密閉した遮光容器に充填するなどの方法が採用され、この密閉した容器を直射日光の当たる場所に、初冬頃まで載置することにより達成される。自然発酵の期間が経過した後、容器を開封して、松科植物の新芽などの固形物を取り除くことにより、本発明のアレルギー疾患治療剤が得られる。なお、上記の初冬頃は、新芽の採取時期、すなわち仕込み時期との兼ね合いであり、製造する地方で開花時期が４月上旬から５月初旬で、花が咲き終わり新芽を採取する時期を５月中旬から６月初旬とすれば、発酵終了の時期が初冬（１１月中旬）となるが、あくまでも１つの目安であり、任意に変更することができる。
【００２７】
本発明のアレルギー疾患治療剤は、アレルギー疾患、特に喘息やアトピー性皮膚炎に有効であるが、作用機序から考慮すると、これら以外にも、薬物によるアナフィラキシーショック、アレルギー性鼻炎、急性蕁麻疹、花粉症、食物アレルギーなどのアレルギーＩ型の疾患、自己免疫性溶血性貧血、薬物アレルギーによる溶血や血小板減少などのアレルギーＩＩ型の疾患、血清病、ＳＥＬ、急性腎炎、多発性動脈炎などのアレルギーＩＩＩ型の疾患、および、接触性皮膚炎、アレルギー性脳炎などのアレルギーＩＶ型疾患の改善、治療にも有効であると考えられる。
【００２８】
本発明のアレルギー疾患治療剤は、自然発酵により得られた発酵産物をそのまま用いるものであるが、これに、甘味料や着香剤などを添加し、飲みやすいものに仕立てもよく、長期保存などのため、保存剤などの各種添加剤を添加してもよい。
【００２９】
本発明のアレルギー疾患治療剤を適用するには、一般に大人の場合、１日に２〜３回、各々、約３０〜５０ミリリットルを服用させる。また、小人の場合には、大人の半量を服用させる。また、本発明のアレルギー疾患治療剤は、毒性もなくまた変異原性もなく安全なものであるので、前記の服用量を超える量を用いても何ら問題はない。
【００３０】
本発明の自然発酵により得られた発酵産物は、アレルギー疾患治療剤としてばかりでなく健康食品または健康飲料としても使用することができる。健康食品または健康飲料とは、治療を主目的とするものではないが、体質を改善し、健康状態を維持するために使用するものである。この場合、消費者の嗜好を考慮し、上記の甘味料や着香剤などを添加し、食しやすく、飲みやすく、かつ嗜好に適合するものに仕上げることが好ましい。
【００３１】
さらに、本発明は、上記の発酵産物から分離された酵母を包含するものである。この酵母は次のようにして分離されたものである。
【００３２】
本発明のアレルギー疾患治療剤である発酵産物を用いて、ＧＰＬＰ寒天平板培養法により平板上に培養し、培養平板上に優勢に生育している集落を釣菌し、分離酵母を得た。分離酵母について形態観察および性状試験を行い、文献（Ｋｕｒｔｚｍａｎ，　Ｃ．　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，「Ｔｈｅ　ｙｅａｓｔｓ，　Ａ　Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　Ｓｔｕｄｙ」４版（１９９８）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂ．Ｖ．；Ｂａｒｎｅｔｔ，　Ｊ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，「Ｙｅａｓｔｓ：Ｃｈａｒａｃｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」３版（２０００）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、これらの文献は引用により本願明細書の一部として組み込まれる）を参考にして同定した。なお、発酵産物中の酵母数は１．４×１０５／ｇであった。分離酵母の性状試験結果を表１に、分離酵母の子嚢胞子の一例を図１に示した。
【００３３】
【表１】
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以上の結果によれば、分離酵母は形態上および性状上チゴサッカロミセス　ビスポラス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）と同定される。このチゴサッカロミセス　ビスポラスは子嚢菌酵母の一属で、それぞれ独立した細胞間で接合し、球形〜楕円形の子嚢胞子を１〜４個形成するものである。また、チゴサッカロミセスビスポラスは、耐浸透圧性の酵母で発酵食品、清涼飲料水などから分離されるものである。
【００３４】
一方、分離された酵母に対する、対象株とのＤＮＡ相同性試験を行ったところ、次のような結果が得られた。すなわち、江崎孝行ら、日本細菌学会誌、４５巻、８５１頁（１９９０）、および高橋正明ら、東京農業大学アイソトープセンター研究報告、７号、６９頁（１９９３）（これらの文献は引用により本願明細書の一部として組み込まれる）に従い、対象株としてチゴサッカロミセス　ビスポラス　ＩＦＯ　１１３１およびチゴサッカロミセス　バイリー　ＩＦＯ　１０９８（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｂａｉｌｉｉ　ＩＦＯ　１０９８）を用いて、得られた酵母とのＤＮＡ相同性試験を、マイクロプレートを用いたフォトビオチン標識法により、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験を行った。なお、ＤＮＡの調製は、Ｊａｈｎｋｅ，　Ｋ．−Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｒａｎｓ．　Ｂｒ．　ｍｙｃｏｌ．　Ｓｏｃ．，　Ｖｏｌ，８７，　ｐｐ．１７５−１９１　（１９８６）（この文献は引用により本願明細書の一部として組み込まれる）に従い調製した。結果を表２に示した。
【００３５】
【表２】
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上記の対象株との相同性試験の結果によれば、本発明の酵母は、形態上および性状上チゴサッカロミセス　ビスポラスと同定されるが、ＤＮＡの配列自体はチゴサッカロミセス　ビスポラスよりもむしろチゴサッカロミセス　バイリーに近いものであり、いずれの対象株とも相違する新種の株であることが理解される。出願人は、このチゴサッカロミセス属に属すると推定される新種の酵母を「ハルイサンＡ−３」と命名した。なお、この新種の酵母「ハルイサンＡ−３」が新種の株ではなく新種の種あるいは属であるか否かは、現時点では明確ではない。しかしながら、出願人は、分離され「ハルイサンＡ−３」と命名された新種の酵母を、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に従い、２００１年３月１２日に、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７４９９として、新名称：独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（旧名称：経済産業省技術総合研究所生命工学工業技術研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｓｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地３）に寄託した。なお、上記寄託機関は、２００１年４月１日をもって独立行政法人化され、独立行政法人産業技術総合研究所と改編されたことにより、２００１年４月１日に名称が変更されたものである。
【００３６】
本発明の分離された新種の酵母は、松科植物の新芽とともにアレルギー疾患治療剤としての有効性に大きく寄与しているものと考えられ、極めて有用な酵母である。
【００３７】
次に、本発明のアレルギー疾患治療剤を例をあげて詳しく説明するが、本発明は以下の例示により限定されるものではない。
【００３８】
本発明のアレルギー疾患の治療剤は、例えば、次のようにして製造することができる。
【００３９】
クロマツ、アカマツ、カラマツの松葉の新芽を、松に花が咲き終わった頃（福島県では、５月中旬〜６月初旬）に、採取し、採取した松葉の新芽をよく水洗する。熱湯に、白砂糖を加えて溶解させ、室温付近まで冷ました砂糖水と水洗した松葉の新芽とを容器、たとえば、プラスチック製容器にいれて、密封して、初冬頃（福島県では、１１月中旬頃）まで、直射日光の当たる場所に載置することにより、自然発酵させることにより製造する。初冬頃に容器を開封し、松葉を取り除くと、本発明のアレルギー疾患の治療剤が得られる。
【００４０】
使用した砂糖水は、水約２リットルに対して、約１Ｋｇの白砂糖の割合で用い、松葉は、約５０本の割合で用いた。
【００４１】
上記のようにして、約２リットルの水に１Ｋｇの白砂糖、約５０本の松葉の新芽を用いて製造したところ、約１．２リットル（仕込んだ砂糖水の約６０％）の白色の濁りを有する液状のアレルギー疾患治療剤が得られた。この治療剤について、含有成分を分析すると、表３に示すような結果が得られた。
【００４２】
【表３】
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この分析は、主に食品一般に関する上記検査項目についてのみに行われたものであり、本発明のアレルギー疾患治療剤には、これら以外の成分が存在している可能性がある。したがって、どの成分がアレルギー疾患の治療剤として特に有効であるかは、特定することができないが、アレルギー疾患治療剤としての薬効を奏するものであった。
【００４３】
次に、上記のようにして製造した複数の本発明のアレルギー疾患治療剤について、治療剤中に含有されるカビ数、酵母数、一般細菌数（生菌数）について調べた。カビ数および酵母数については、ＧＰＬＰ寒天平板培養法で行い、一般細菌数（生菌数）については、抗真菌剤添加ＳＣＤＬＰ寒天平板培養法で、酒石酸を用いて培地のｐＨを３．５に調整したものと、培地を調整しないものとの２とおりの試験を行い測定した。得られた結果を表４に示した。
【００４４】
【表４】
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上記の結果によれば、本発明のアレルギー疾患治療剤中には、カビの発生は認められず、また一般細菌（生菌数）も極めて少ないことがわかる。また、酵母は発酵産物のロットにより若干のバラツキはあるが、発酵産物中には１０２〜１０５個／ｇのオーダーで酵母が存在していることがわかる。この発酵産物中に存在する酵母が寄託した新種の酵母に該当するものである。
【００４５】
次に、本発明のアレルギー疾患治療剤の経口毒性について検討した。本発明のアレルギー疾患治療剤の原液およびこれに蜂蜜（１０重量％）を加えたものを用いて、これらの被験物質をそれぞれ２０００ｍｇ／ｋｇ投与する群と、対照群として注射用水を投与する群（投与量０ｍｇ／ｋｇ）とについて、１群雌雄各５例のＳＤ系［Ｃｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳ］ラットに経口胃ゾンデを取り付けたディスポーザブルシリンジ（１ｍＬ容量）を用いて強制経口投与し、その後１５日間（投与日を含む）の観察期間を設け、毒性徴候および概略の致死量について検討した。
【００４６】
試験期間を通じて対照群を含む、本発明のアレルギー疾患治療剤およびこれに蜂蜜を加えたものの２０００ｍｇ／ｋｇｏｕｙ投与群の雌雄に死亡は認められなかった。また、一般状態、体重および剖検においても被験物質投与に起因する変化は認められなかった。以上の結果から、本試験条件下における本発明のアレルギー疾患治療剤の概略の致死量は雌雄ともに２０００ｍｇ／ｋｇ以上であると結論された。
【００４７】
次に、本発明のアレルギー疾患治療剤の変異原性について検討した。本発明のアレルギー疾患治療剤の変異原性について、Ａｍｅｓらの変法（Ｍａｒｏｎ，Ｄ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，「Ｒｅｖｉｓｅｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ」、Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ．，　Ｖｏｌ．１１３，　ｐｐ．１７３‐２１５　（１９８３）、この文献は引用により本願明細書の一部として組み込まれる）に準拠したプレート法を用い、ネズミチフス菌のヒスチジン要求性であるＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７株および大腸菌のトリプトファン要求性であるＷＰ２ｕｖｒＡ株にそれぞれ処置し、その変異原性を代謝活性化による場合とよらない場合との双方で検討した。
【００４８】
試験の用量としては、３１２．５、６２５、１２５０、２５００および５０００μｇ／ｐｌａｔｅで行った。この結果、各試験菌株の被験物質群の復帰変異コロニー数は、代謝活性化系の有無にかかわらず、用量依存性ならびに陰性対照群の２倍以上の増加を認めなかった。また、生育阻害および被験物質の沈澱は認められなかった。結果を図２および３に示した。図２は、塩基対置換型菌株（ＴＡ１００：□、ＴＡ１５３５：○、ＷＰ２ｕｖｒＡ：△）を用いた場合の結果が示してある。図中、Ａは代謝活性化によらない場合であり、Ｂは代謝活性化による場合で、Ｓ９ｍｉｘが添加された場合の結果がそれぞれ示してある。図３は、フレームシフト型菌株（ＴＡ９８：□、ＴＡ１５３７：○）を用いた場合の結果が示してある。図中、Ａは代謝活性化によらない場合であり、Ｂは代謝活性化による場合で、Ｓ９ｍｉｘが添加された場合の結果がそれぞれ示してある。なお、陰性対照物質としては、被験物質の調製時に溶媒として用いた注射用蒸留水を使用した。また、陽性対照物質としては、２−（２−Ｆｕｒｙｌ）−３−（５−ｎｉｔｒｏ−２−ｆｕｒｙｌ）ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＡＦ−２）、２−Ａｍｉｎｏａｎｔｈｒａｃｅｎｅ（２−ＡＡ）、Ｓｏｄｉｕｍ　ａｚｉｄｅ（ＳＡ）、および、９−Ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ（９−ＡＡ）の各化合物を使用した。ＡＦ−２、９ＡＡ、２−ＡＡはＤＭＳＯで、ＳＡは注射用蒸留水でそれぞれ溶解し、菌株および代謝活性化によらない場合、代謝活性化による場合に応じて、それぞれ使用した。
【００４９】
以上の結果から、この試験条件下における本発明のアレルギー疾患治療剤の変異原性は陰性と判断された。
【００５０】
次に、本発明のアレルギー疾患治療剤の薬理作用について検討した。抗アレルギー作用の一つである抗喘息作用を調べる方法として、モルモット摘出気管を用いた平滑筋収縮に対する作用を調べた。また、アトピー性皮膚炎の改善作用を調べる方法として、アレルギー性接触皮膚炎モデルの一つであるマウス耳浮腫厚測定試験（ｅａｒ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｔｅｓｔ）を行った。
【００５１】
１．モルモット摘出気管を用いた平滑筋収縮試験
５週齢のＨａｒｔｌｅｙ系雄モルモット（クリーン）２２匹を入手し、１週間の検疫期間を含む予備飼育を行い、その期間に異常の認められなかった２０匹を本試験に用い、次のようにして平滑筋収縮試験試験を行った。
【００５２】
本発明のアレルギー疾患治療剤は、注射用水で所定の濃度に希釈して用いた。アレルギー誘導物質として用いた卵白アルブミン（ＯＶＡ）は生理食塩液で溶解した。モルモットの感作投与では、ＯＶＡとフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）とを等量混和して投与検体とした。
【００５３】
１−１）感作法
以下に示す４群を設定した。
【００５４】
【表５】
2004000242.tif 000008
感作のためのＯＶＡあるいは生理食塩液の投与は、週２回、２週間、計４回皮下投与により行った。被験物質である本発明のアレルギー疾患治療剤（発酵産物）あるいは注射用水の投与は気管摘出日３日前から前日までの３日間経口投与により行った。
【００５５】
最終感作投与の１１日後から５日間にわたって、各群１例の動物から気管を摘出し、平滑筋収縮試験を行った。さらに、気管摘出時に開腹して下大静脈より採血して血清を得、血清中抗ＯＶＡ　ＩｇＧ抗体価を測定し、感作成立を確認するとともに本発明のアレルギー疾患治療剤の経口投与の影響についても調べた。
【００５６】
１−２）摘出気管を用いた平滑筋収縮試験
体重５２０．７〜６８１．５の動物に、ベントバルビタールナトリウム３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し、麻酔した。開胸して気管を摘出し、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ液中で連鎖標本を作製した。９５％Ｏ２−５％ＣＯ２混合ガスを通気した３７℃　Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ液中で、負荷０．５ｇにおける気管標本の張力変位を変位トランスジューサ（４５３４７、日本電気三栄）により等張性に測定し、記録器（ＲＥＣＴＩ‐ＨＯＲＩＺ−８Ｋ、日本電気三栄）により記録した。はじめにアセチルコリン１０−４Ｍによって収縮を誘発し、この収縮を１００％とした。ＯＶＡ０．１〜１０００ｎｇ／ｍＬ、ヒスタミン１０−８〜１０−３Ｍおよびアセチルコリン１０−５〜１０−４Ｍの誘発収縮に対する本発明のアレルギー疾患治療剤の経口投与による影響を比較した。また、本発明のアレルギー疾患治療剤をｏｒｇａｎ　ｂａｔｈへ直接適用（最終濃度：０．０２％、１０分間インキュベーション）し、その影響について検討した。
【００５７】
１−３）抗−ＯＶＡ　ＩｇＧ抗体価の測定
ＯＶＡを固相化したマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）をブロックエース（大日本製薬（株））でブロッキングしたものを用いた。
【００５８】
血清を１０、１０２、１０３、１０４倍にＢＰＳ−Ｔｗｅｅｎで希釈し、それらをＮ＝２で１００μＬずつウェルに添加した。
【００５９】
室温で２時間反応させた後、ＢＰＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。次にブロックエース１０倍希釈液（０．０５％　ＮａＮ３添加）で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗モルモットＩｇＧを各ウェルに１００μＬずつ添加し、室温で２時間反応させた。
【００６０】
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後フォスファターゼ基質キット（ＫＬＰ）を用いて発色させ、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度をオートマチックプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）で測定した。
【００６１】
２ウェルの吸光度の平均値を求め、ＩＶ群の血清の吸光度の平均値＋３ＳＤ（標準偏差）以上の吸光度を示したものを陽性と判定した。
【００６２】
１−４）結果
モルモット摘出気管を用いた平滑筋収縮試験では、動物の途中死亡はなく、彼験物質の投与に起因したと考えられる一般状態の変化は認められなかった。
【００６３】
ＯＶＡを感作投与し、本発明のアレルギー疾患治療剤を投与したＩ群と、ＯＶＡ感作のみのＩＩ群の間に、摘出気管標本におけるＯＶＡ、ヒスタミンおよびアセチルコリン誘発収縮に差は認められなかった。また、ＯＶＡで感作せず、本発明のアレルギー疾患治療剤を投与したＩＩＩ群と、無処置群であるＩＶ群との間にも、ヒスタミンおよびアセチルコルン誘発収縮に差は認められなかった。なお、このＩＩＩ群とＩＶ群ではＯＶＡ誘発収縮は認められなかった。
【００６４】
しかしながら、ＩＩ群でのＯＶＡ誘発収縮は、本発明のアレルギー疾患治療剤をｏｒｇａｎ　ｂａｔｈに適用する（ｂａｔｈ内濃度：０．０２％）ことにより抑制傾向が認められた（ＯＶＡ１０ｎｇ／ｍＬでｐ＜０．０５、図４参照）。ヒスタミンおよびアセチルコリン誘発収縮に対しては、全群で本発明のアレルギー疾患治療剤は影響なし〜抑制傾向を示した（例えば、ＩＩＩ群では、ヒスタミン１０−６Ｍでｐ＜０．０５）。
【００６５】
血清中の抗−ＯＶＡ　ＩｇＧ抗体価は、ＩＶ群の吸光度の平均＋３ＳＤ（標準偏差）は０．２４３であった。これに対し、ＯＶＡを感作投与したＩ群およびＩＩ群の１０４倍希釈血清の平均吸光度は、それぞれ１．４６５および１．４８８となりＯＶＡの感作成立が確認された。Ｉ群とＩＩ群の吸光度に有意な差はなく本発明のアレルギー疾患治療剤の投与による影響は認められなかった。
【００６６】
２．マウスを用いた耳浮腫厚測定試験（ｅａｒ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｔｅｓｔ）
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ系雄マウス（ＢＡＬＢ／ｃ　ＡｎＮＣｒｊ，　ＳＰＦ）１８匹を入手し、１週間の検疫期間を含む予備飼育を行い、その期間に異常の認められなかった１５匹を本試験に使用し、次のようにして耳浮腫厚測定試験（ｅａｒ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｔｅｓｔ）を行った。
【００６７】
被験物質である本発明のアレルギー疾患治療剤は、注射用水で所定の濃度に希釈して用いた。アレルギー誘導物質として用いた１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ）は、アセトン：オリブ油＝４：１混液に溶解して用いた。
【００６８】
２−１）感作法
以下に示す３群を設定した。
【００６９】
【表６】
2004000242.tif 000009
アセトン：オリブ油混液に溶解した０．１％ＤＮＣＢあるいはアセトン：オリブ油混液は、４日間連続塗布し、その１２日後にオリブ油に溶解した１％ＤＮＣＢあるいはオリブ油を皮下投与した。
【００７０】
最終感作投与の１３日後に耳浮腫厚測定試験（ｅａｒ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｔｅｓｔ）を実施した。本発明のアレルギー疾患治療剤（発酵産物）あるいは注射用水の投与は、惹起日の３日前から前日までの３日間経口投与により行った。
【００７１】
２−２）耳浮腫厚測定試験（ｅａｒ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｔｅｓｔ）
感作投与終了１３日後に動物の左耳に１％ＤＮＣＢ、右耳にアセトン・オリブ油を２０μＬ塗布して惹起した。２４時間後および４８時間後に左右の耳の厚さをダイアルシックネスゲージ（三豊製作所）で２回ずつ測定した。２回測定の平均値をもとめ、個体毎に左右の耳厚差をもとめた。さらに、群毎に平均値および標準偏差をもとめ、群間の差の検定を行った。
【００７２】
２回の測定値の差が０．１ｍｍ以上の場合再測定を行い、近い値２つを選んで平均値を求めた。
【００７３】
２−３）結果
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスを用いた耳浮腫厚測定試験（ｅａｒ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｔｅｓｔ）では、動物の途中死亡はなく、彼験物質の投与に起因したと考えられる一般状態の変化は認められなかった。
【００７４】
ＤＮＣＢ惹起後２４時間の測定においてＤＮＣＢを感作し、本発明のアレルギー疾患治療剤を投与したＩ群では、ＤＮＣＢ感作のみのＩＩ群に比べＤＮＣＢ惹起による耳介の肥厚反応が有意に抑制された（ｐ＜０．０５、図５参照）。ＤＮＣＢ惹起後４８時間における反応では、Ｉ群とＩＩ群の間に差は認められなかった。対照群であるアセトン・オリブ油で感作し、本発明のアレルギー疾患治療剤を投与したＩＩＩ群では、ＤＮＣＢ惹起による耳介の肥厚はほとんど認められなかった。
【００７５】
以上のように、モルモット摘出気管を用いた試験では、本発明のアレルギー疾患治療剤の経口投与による影響は認められなかった。一方、本発明のアレルギー疾患治療剤をｏｒｇａｎ　ｂａｔｈに直接適用した場合には、ＯＶＡ、ヒスタミン、アセチルコリンのすべての刺激に対して、全体的に収縮反応が抑制される傾向が認められた。この結果から本発明のアレルギー疾患治療剤は、細胞膜に直接作用して膜を安定化させる作用を有する可能性が考えられる。
【００７６】
また、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスを用いた耳浮腫厚測定試験（ｅａｒ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｔｅｓｔ）では、ＤＮＣＢ惹起後２４時間の測定で、本発明のアレルギー疾患治療剤投与群の反応が有意に抑制された。本発明のアレルギー疾患治療剤の投与は惹起の３日前〜前日までの３日間行ったことから、今回認められた抑制は、感作成立の抑制ではなく、惹起による感作リンパ球から炎症性細胞へのシグナル伝達および炎症反応の抑制によるものと考えられる。
【００７７】
このように、本発明のアレルギー疾患治療剤は、細胞膜の安定化作用などによってヒスタミン等の炎症性物質の遊離を抑制し、抗アレルギー作用を示すことがわかる。
【００７８】
【実施例】
次に、本発明のアレルギー疾患治療剤を用いた、具体的な治療例を記載する。
【００７９】
例１．喘息の治療
７歳の喘息の男児に、朝晩、２回、各約３０〜５０ミリリットルの本発明のアレルギー疾患治療剤を服用させたところ、１ヵ月位服用後、前よりは症状が軽くなり、３ヵ月を過ぎるころには、非常に良くなった。
【００８０】
例２．喘息の治療
６５歳の喘息で朝晩咳き込み苦しんでいた男性に、朝晩２回、各約３０〜５０ミリリットルの本発明のアレルギー疾患治療剤を約２週間服用させたところ、朝晩の咳込みがなくなった。
【００８１】
例３．アトピー性皮膚炎の治療
アトピー性皮膚炎の２人の成人女性に、朝晩、２回、各約３０〜５０ミリリットルの本発明のアレルギー疾患治療剤を服用させたところ、両人共、２週間位服用後、症状が改善した。
【００８２】
例４．アトピー性皮膚炎の治療
幼児期よりアトピー性皮膚炎で苦しんでおり、本治療剤の服用前には、首、腕の関節及び膝の裏の３ヵ所に炎症があった、２１歳の女性に、毎日２〜３回、各約３０〜５０ミリリットルの本発明のアレルギー疾患治療剤を服用させたところ、先ず、膝の裏の炎症が治まって、地肌が見えるようになり、３週目には首の部分の傷もなくなり、次いで左腕の部分の炎症が治まり、２ヵ月後には右腕の部分の炎症も治まり、きれいな肌を取り戻すことができた。
【００８３】
このように、多くの人に服用させた結果、アレルギー疾患の治療に効果があることが分かった。喘息やアトピー性皮膚炎の場合、２週間位から症状が軽くなり、３ヵ月位で症状がなくなり、再発することがなかった。
【００８４】
【発明の効果】
（産業上の利用可能性）
本発明のアレルギー疾患治療剤は、従来のアレルギー治療剤と比べて、アレルギー疾患、特に喘息およびアトピー性皮膚炎を、短期間の服用で、副作用もなく、完治させることができるものであり、極めて有用なアレルギー疾患治療剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のアレルギー疾患治療剤（発酵産物）から分離された分離酵母の子嚢胞子の一例を示す顕微鏡写真（微分干渉、×２４００）である。培地は、マルトエキス寒天培地を使用した。
【図２】図２は、本発明のアレルギー疾患治療剤の変異原性のスクリーニング試験結果を示すグラフであり、塩基対置換型菌株（ＴＡ１００：□、ＴＡ１５３５：○、ＷＰ２ｕｖｒＡ：△）を用いた場合の結果が示してある。また、図中、Ａは代謝活性化によらない場合（−Ｓ９）であり、Ｂは代謝活性化による場合（＋Ｓ９）の結果がそれぞれ示してある。
【図３】図３は、本発明のアレルギー疾患治療剤の変異原性のスクリーニング試験結果を示すグラフであり、フレームシフト型菌株（ＴＡ９８：□、ＴＡ１５３７：○）を用いた場合の結果が示してある。また、図中、Ａは代謝活性化によらない場合（−Ｓ９）であり、Ｂは代謝活性化による場合（＋Ｓ９）の結果がそれぞれ示してある。
【図４】図４は、本発明のアレルギー疾患治療剤の薬効を示すグラフであり、本発明のアレルギー疾患治療剤をｏｒｇａｎ　ｂａｔｈに適用した場合の、卵白アルブミン（ＯＶＡ）で感作したモルモットの摘出気管の収縮率を、ＯＶＡの量に対して測定した結果が示されている。図中、ＡはＩ群における結果を示し、ＢはＩＩ群における結果を示している。また、○は対照（注射用水）であり、●は本発明のアレルギー疾患治療剤を０．０２％添加した結果である。なお、＊はｐ＜０．０５で対照に比べ有意であったことを示している。
【図５】図５は、本発明のアレルギー疾患治療剤の薬効を示すグラフであり、マウスの耳浮腫厚測定試験（ｅａｒ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｔｅｓｔ）結果を示している。図中、Ｉ群は１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ）と本発明のアレルギー疾患治療剤（ＨＡＲと略記）とを投与した場合であり、ＩＩ群はＤＮＣＢと注射用水（ＤＷ）とを投与した場合であり、ＩＩＩ群はアセトン−オリブ油混液（４：１）と本発明のアレルギー疾患治療剤（ＨＡＲと略記）とを投与した場合である。図中、＊＊はｐ＜０．０１でＩＩＩ群に対して有意であったこと、および、＃はｐ＜０．０５でＩＩ群に対して有意であったことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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