(57)【要約】【課題】マイクロアレイ上に試料溶液を接触させる際に、試料溶液の展開性を向上させた被覆体を提供すること。【解決手段】固相基板上に液体を保持する際に液層の厚みを一定に保持し、かつ、液体の蒸発を防止するために基板上に設置する被覆体であって、前記被覆体表面に前記液体との濡れ性向上の手段を施した被覆体であり、好ましくは濡れ性向上の手段が、被覆体の表面を粗面にすること、被覆体の表面に微細な溝状構造が設けること、被覆体の表面の親水化すること等である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相基板上に液体を保持する際に液層の厚みを一定に保持し、かつ、液体の蒸発を防止するために基板上に設置する被覆体であって、前記被覆体表面に前記液体との濡れ性向上の手段を施したことを特徴とする被覆体。
【請求項２】
被覆体が透明性を有し、基板上に展開する液体の状態を目視で確認可能な請求項１記載の被覆体。
【請求項３】
液体との濡れ性向上の手段が被覆体の表面を粗面にしたことである請求項１または２記載の被覆体。
【請求項４】
液体との濡れ性向上の手段が被覆体の表面に微細な溝状構造を設けたことである請求項１〜３いずれか記載の被覆体。
【請求項５】
被覆体の素材がプラスチックである請求項１〜４いずれか記載の被覆体。
【請求項６】
プラスチックが環状ポリオレフィン、ポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネート、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸メチル共重合体、スチレン−アクリロニトリル共重合体、ポリ−４−メチルペンテン−１、ポリプロピレンのいずれかである請求項５記載の被覆体。
【請求項７】
プラスチックが環状ポリオレフィンである請求項５記載の被覆体。
【請求項８】
液体との濡れ性向上の手段が、被覆体の表面の親水化を含む請求項１〜７いずれか記載の被覆体。
【請求項９】
親水化の手段が被覆体の表面の酸化処理を含む請求項８記載の被覆体。
【請求項１０】
酸化処理が、低圧気体雰囲気下でのプラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射処理、火炎処理、薬剤処理のうち少なくとも一つである請求項９記載の被覆体。
【請求項１１】
親水化の手段が被覆体の表面へのグラフト重合を含む請求項８記載の被覆体。
【請求項１２】
親水化の手段が表面への親水性物質のコーティングを含む請求項８記載の被覆体。
【請求項１３】
基板表面と被覆体表面の間隙を一定に保つ手段としてスペーサーが設けてある請求項１〜１２いずれか記載の被覆体。
【請求項１４】
生理活性物質が固定化されている基板表面に生理活性物質を含む液体を接触させる際に、請求項１〜１３いずれか記載の被覆体を用いて前記液体を前記基板上に保持することを特徴とする被覆体の使用方法。
【請求項１５】
生理活性物質が固定化されている基板表面に請求項１〜１３いずれか記載の被覆体を前記基板表面に被せたのちに、前記基板と前記被覆体との間隙に生理活性物質を含む液体を流入させることを特徴とする被覆体の使用方法。
【請求項１６】
生理活性物質が核酸である請求項１４または１５記載の被覆体の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイクロアレイ上に試料溶液を接触させる際に、該溶液を基板上に保持する目的で使用するカバーガラス様の被覆体およびその使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロアレイは、固相基板表面に生理活性物質を固定化したデバイスである。例えば核酸マイクロアレイの場合、核酸がプラスチックやガラスなどの固相基板上に固定されている。核酸マイクロアレイの使用形態は、細胞などの検体から抽出、増幅した核酸を含む溶液をマイクロアレイ上に展開し、所定時間反応させる。マイクロアレイ上に固定された核酸と試料溶液中の核酸が、塩基配列の相同性に対応してハイブリダイゼーション反応を生じ、この反応率を蛍光色素や放射性同位体などの標識物によって定量化することにより、試料溶液に含まれる核酸の配列に関する情報を得ることができる。
【０００３】
一般的に生理活性物質の反応は液相反応であるため、マイクロアレイ上に固定された生理活性物質と試料を反応させるためには、試料を溶液状態でマイクロアレイ表面に接触させ、一定時間保持する必要がある。この操作では、試料溶液とマイクロアレイ表面が全面にわたって均一に接触することが重要となる。均一な接触とは、液層の厚みが一定であり、気泡などが含まれていないことである。また、反応中の試料溶液の蒸発を防ぐことも重要となる。試料溶液とマイクロアレイの接触が不均一であったり、試料溶液の一部が蒸発したりすると、マイクロアレイ上の位置によって反応効率に差異が生じてしまい、得られたデータの信頼性が低くなる。
【０００４】
被覆体としてはプレパラート作製用のカバーガラスを用いることが多い。液層の厚みを一定に保つためのスペーサーを設けたカバーガラスも使用されている。しかしながら、カバーガラスは薄いために非常に割れ易く、取り扱いが比較的煩雑なため、割れにくいプラスチック製の被覆体が注目されている。しかしながら、プラスチック表面は一般的に疎水性であることが多く、試料溶液との濡れ性が低いために溶液の均一な展開が困難である。すなわち、マイクロアレイ上に被覆体を被せ、間隙に試料溶液を流し込む際に、試料溶液が被覆体表面をスムーズに濡らすことができない。このため、試料溶液との濡れ性が高く、マイクロアレイ上への試料溶液の展開性を向上した被覆体が求められていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マイクロアレイ上に試料溶液を接触させる際に用いる被覆体であり、試料溶液の展開性を向上させた被覆体を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）固相基板上に液体を保持する際に液層の厚みを一定に保持し、かつ、液体の蒸発を防止するために基板上に設置する被覆体であって、前記被覆体表面に前記液体との濡れ性向上の手段を施したことを特徴とする被覆体、
（２）被覆体が透明性を有し、基板上に展開する液体の状態を目視で確認可能な（１）記載の被覆体、
（３）液体との濡れ性向上の手段が被覆体の表面を粗面にしたことである（１）または（２）記載の被覆体、
（４）液体との濡れ性向上の手段が被覆体の表面に微細な溝状構造を設けたことである（１）〜（３）いずれか記載の被覆体、
（５）被覆体の素材がプラスチックである（１）〜（４）いずれか記載の被覆体、
（６）プラスチックが環状ポリオレフィン、ポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネート、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸メチル共重合体、スチレン−アクリロニトリル共重合体、ポリ−４−メチルペンテン−１、ポリプロピレンのいずれかである（５）記載の被覆体、
（７）プラスチックが環状ポリオレフィンである（５）記載の被覆体、
（８）液体との濡れ性向上の手段が、被覆体の表面の親水化を含む（１）〜（７）いずれか記載の被覆体、
（９）親水化の手段が被覆体の表面の酸化処理を含む（８）記載の被覆体、
（１０）酸化処理が、低圧気体雰囲気下でのプラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射処理、火炎処理、薬剤処理のうち少なくとも一つである（９）記載の被覆体、
（１１）親水化の手段が表面へのグラフト重合を含む（８）記載の被覆体、
（１２）親水化の手段が表面への親水性物質のコーティングを含む（８）記載の被覆体、
（１３）基板表面と被覆体表面の間隙を一定に保つ手段としてスペーサーが設けてある（１）〜（１２）いずれか記載の被覆体、
（１４）生理活性物質が固定化されている基板表面に生理活性物質を含む液体を接触させる際に、（１）〜（１３）いずれかを記載の被覆体を用いて前記液体を前記基板上に保持することを特徴とする被覆体の使用方法、
（１５）生理活性物質が固定化されている基板表面に（１）〜（１３）いずれか記載の被覆体を前記基板表面に被せたのちに、前記基板と前記被覆体との間隙に生理活性物質を含む液体を流入させることを特徴とする被覆体の使用方法、
（１６）生理活性物質が核酸である（１４）または（１５）記載の被覆体の使用方法、
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
核酸マイクロアレイを用いた遺伝子解析、遺伝子同定などの評価における信頼性を左右する要素として、ハイブリダイゼーション反応の均一性が挙げられる。ハイブリダイゼーション反応を均一に行うためには、マイクロアレイ表面と試料溶液との接触が、アレイ全面にわたって均一であることが重要である。すなわち、試料溶液の厚みが一定であること、反応中に試料溶液が乾燥しないこと、試料溶液層に気泡が混入しないことが重要である。
【０００８】
ハイブリダイゼーション反応の際には、試料溶液の上に被覆体を被せる方法が一般的に行われている。被覆体としては、プレパラート用のカバーガラスが一般的であるが、試料溶液の厚みを一定に保つためにスペーサーを設けたカバーガラスも使用されている。しかしながら、ガラス製の被覆体は非常に割れ易いため、取り扱いが比較的煩雑である。ゆえに、割れにくいプラスチック製の被覆体のメリットは大きい。
【０００９】
（基板の素材）
プラスチックの素材としては、ハイブリダイゼーション反応時の温度で変形せず、溶媒や緩衝液に耐性があり、吸水性が低いものが好ましい。また、試料溶液の厚みを一定に保つため、素材は自重で変形しない程度の剛性を有することが好ましい。さらに、試料溶液をマイクロアレイ上に展開する際に、溶液の状態を目視で確認可能なことが好ましく、被覆体の素材は透明あるいは半透明であることが好ましい。これらの条件を満たす素材として、環状ポリオレフィン、ポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネート、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸メチル共重合体、スチレン−アクリロニトリル共重合体、ポリ−４−メチルペンテン−１などを用いることができる。耐熱性、吸水性の観点から、環状ポリオレフィンが特に好ましい。環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した重合体をさす。
【００１０】
（濡れ性の向上）
プラスチック表面は一般的に疎水性であり、試料溶液との濡れ性が低いために溶液の均一な展開が困難である。すなわち、マイクロアレイ上に被覆体を被せ、間隙に試料溶液を流し込む際に、試料溶液が被覆体表面をスムーズに濡らすことができない。このため、プラスチック製の被覆体の作製にあたっては、その表面の濡れ性を向上させる手段をとることが有効である。
プラスチック表面の濡れ性を向上させる手段としては、表面の酸化処理、親水性モノマーのグラフト重合、親水性物質のコーティング、表面の粗面化、表面の微細加工などが挙げられる。酸化処理としては、プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射、火炎処理、薬剤処理などの方法を用いることが好ましい。これらの濡れ性向上の手段は、２つまたはそれ以上を併用することもできる。以下にそれぞれの濡れ性向上手段について記載する。
【００１１】
（プラズマ処理）
プラズマ処理は、低圧の気体に電場をかけた際に生じるプラズマを利用した表面処理であり、気体の種類に応じて種々の官能基の導入が可能である。気体の種類としては、空気、酸素、二酸化炭素、窒素、水素、アンモニアなどを用いることができるが、空気あるいは酸素が好ましく、酸素がより好ましい。酸素雰囲気下でのプラズマ処理により、プラスチック表面には酸素原子を含む官能基（−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＣＨＯなど）が導入される。これらの官能基が導入されると、プラスチック表面は親水化される。表面の親水化により試料溶液との濡れ性を向上することができる。
【００１２】
（コロナ放電処理）
コロナ放電処理は、大気圧付近で行うプラズマ処理であり、雰囲気の気体の種類によって種々の官能基の導入が可能である。気体の種類としては、空気、酸素、二酸化炭素、窒素、水素、アンモニアなどを用いることができるが、空気あるいは酸素が好ましく、酸素がより好ましい。酸素雰囲気下でのプラズマ処理により、プラスチック表面には酸素原子を含む官能基（−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＣＨＯなど）が導入される。これらの官能基が導入されると、プラスチック表面は親水化される。表面の親水化により試料溶液との濡れ性を向上することができる。
【００１３】
（紫外線照射）
酸素存在下で水銀灯などからプラスチック表面に紫外線を照射すると、オゾンの生成と分解により生じた原子状酸素などの酸化作用により、プラスチック表面に含酸素基が導入される。これによりプラスチック表面の濡れ性を向上することができる。
【００１４】
（火炎処理）
火炎処理は、天然ガスなどの燃料と空気または酸素を混合、完全燃焼状態でプラスチック表面に吹き付け、表面を酸化する手法である。酸化処理によりプラスチック表面に極性基が導入し、表面の濡れ性を向上することができる。
【００１５】
（薬剤処理）
酸化力の強い薬剤にプラスチック表面を暴露することにより、表面が酸化されて極性基が導入し、濡れ性を向上することができる。薬品処理としては、クロム酸混液（重クロム酸塩と濃硫酸の混合物）処理、次亜塩素酸ソーダと塩酸の混合液による処理、塩素酸塩と硫酸の混合液による処理、硫酸処理、臭素化処理、ナトリウム処理、硫黄処理、アミン処理などを好適に利用可能である。
【００１６】
（グラフト重合）
プラスチック表面に放射線、光、熱などのエネルギーを加えると、プラスチック表面近傍の高分子鎖の切断が生じ、ラジカルが発生する。この場合、エネルギーの高分子鎖への伝達効率を高めるため、反応系に増感剤などを添加してもよい。ラジカル化したプラスチック表面に重合性物質（モノマー）を接触させると、重合連鎖反応が生じ、プラスチック表面に新たな高分子鎖が導入される。モノマーとして親水性モノマーを使用することによりプラスチック表面に親水性高分子鎖を導入することが可能であり、表面は親水化される。これにより表面の濡れ性を向上することができる。親水性モノマーとしては、アクリル酸およびその誘導体、メタクリル酸およびその誘導体、アクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレートなどを用いることができる。
【００１７】
（親水性物質のコーティング）
親水性の物質をプラスチック表面に塗布、吸着、成膜することにより表面を親水化することができる。親水性物質としては、親水性高分子、親水性のシランカップリング剤などが好ましい。シランカップリング剤はプラスチック表面に強固な薄膜を形成することから、特に好ましい。
【００１８】
（表面の粗面化）
プラスチック表面を粗面化することにより、液体との濡れ性をコントロールすることができる。表面を粗面化する方法は乾式法と湿式法に大別される。乾式法として、機械的な粗面化、プラズマ接触処理、イオンビーム処理、エキシマレーザー処理等を利用することができる。機械的な粗面化とは、物理的な力を付加して表面に微小な凹凸を付与する方法である。具体的には、金型形状の転写、砥粒等による研磨、サンドペーパーや布などによるスクラッチング、粒子の吹き付けなどを利用することができる。表面の粗さを高度に制御する必要がある場合、プラズマ接触処理、イオンビーム処理、エキシマレーザー処理等を利用することができる。湿式法には、薬剤処理、溶剤処理等がある。具体的には、酸、アルカリ、材料の良溶媒を用いた処理で表面の一部を溶解させ、粗面化を実現することができる。
【００１９】
上述の粗面化法のうち、製造の容易性の観点から、機械的な粗面化が好ましい。その中でも、金型形状の転写による方法がより好ましい。金型の形状を転写する手段として、射出成形、圧縮成形、押出成形、エンボス加工等を利用することができる。
粗面化した被覆体の表面粗さは、中心線平均粗さ（Ｒａ値）が０．００１〜１０μｍであることが好ましく、０．００５〜１μｍであることがより好ましく、は０．０５〜０．１μｍであることがさらに好ましい。
上記のような手段で粗面化を施した被覆体表面に対して、さらに酸化処理、グラフト重合、コーティングなどの親水化処理を施すことも可能である。
【００２０】
（表面の微細加工）
プラスチック表面に微細な溝を設けることにより、試料溶液との濡れ性を高めることができる。微細な溝を設ける方法として、射出成形、圧縮成形、押出成形、エンボス加工等による金型形状の転写、切削加工、レーザー加工、リソグラフィなどの方法を利用することができる。製造の容易性の観点から、金型形状の転写が好ましい。溝の幅および深さは、０．１〜５００μｍが好ましく、１〜２００μｍがより好ましく、１０〜２００μｍがさらに好ましい。
微細な溝を設けた被覆体表面に対して、さらに酸化処理、グラフト重合、コーティングなどの親水化処理を施すことも可能である。
【００２１】
（被覆体の形状）
マイクロアレイ基板が平面である場合、試料溶液の厚みを一定に保つため、被覆体の形状は平面であることが好ましい。さらに、被覆体表面とマイクロアレイ表面との間隙を一定に保つため、図１〜３に示すように被覆体の周縁部あるいはその一部にスペーサーを設けることが好ましい。スペーサーの厚み（被覆体とマイクロアレイの間隙）は、５〜１００μｍが好ましく、５〜５０μｍがより好ましく、１０〜３０μｍが最も好ましい。
【００２２】
【実施例】
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。
（実施例１）
飽和環状ポリオレフィンを材料として、射出成形法により被覆体を作製した。被覆体の形状は長方形の平滑な板状であり、図２のように長辺側の縁に下駄の歯状のスペーサーを設けたものであった。この被覆体に酸素雰囲気下のプラズマ処理を施し、表面に親水性官能基を導入した。
【００２３】
（実施例２）
実施例１と同様の形状であり、表面全体にシボ加工（すりガラス状の微細な凹凸）を施した被覆体を、射出成形法により作製した。
【００２４】
（比較例１）
実施例１と同様の形状の被覆体を射出成形法により作製し、そのまま用いた。
【００２５】
（比較例２）
市販のガラス製被覆体を入手し、そのまま用いた。ガラス製被覆体の形状は、平板状のガラスの四隅にスペーサーが設置されたものであった。
【００２６】
（評価１）
実施例、及び比較例の被覆体表面の水との接触角を測定した。結果を表１に示す。
（評価２）
実施例、及び比較例の被覆体をマイクロアレイ用基板上に設置し、基板と被覆体の間隙に、ピペットを用いてハイブリダイゼーション反応用緩衝液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸３ナトリウム、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液）を流し込んだ。緩衝液の展開性、および、被覆体と基板との間の気泡の有無を目視により評価した。結果を表１に示す。
評価１の結果より、プラズマ処理、表面の粗面化が濡れ性向上に有効であることが示された。評価２は実際のマイクロアレイの使用形態を模した評価であり、本発明の被覆体により試料溶液の展開性が向上したことが示された。
【００２７】
【表１】
2004286702.tif 000003
【００２８】
【発明の効果】
本発明により、マイクロアレイ上に試料溶液を接触させる際に、試料溶液の展開性を向上させた被覆体の作製が可能となった。試料溶液の展開性向上により、マイクロアレイを用いた評価の信頼性向上が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の被覆体の形状の一例を示す概略図。
【図２】本発明の被覆体の形状の他の一例を示す概略図。
【図３】本発明の被覆体の形状の更に他の一例を示す概略図。
【符号の説明】
１：平面部
２：肉厚部（スペーサー）、斜線で表示
【図１】
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【図２】
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【図３】
2004286702.tif 000006