(57)【要約】【課題】　環境汚染を調査するために処理しなければならない大量検体の迅速な測定等が可能であり、不都合を伴わずに生物学的影響評価が可能なダイオキシン類測定用形質転換体並びにそれを用いたダイオキシン類の検出方法、定量分析方法及びスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】　ＡｈＲ及びＡｒｎｔを恒常的に産生又は導入し、ダイオキシン類、ＡｈＲ及びＡｒｎｔを含む複合体の転写制御領域への結合を介して、レポータータンパクを産生するダイオキシン類測定用形質転換体である。　上記形質転換体を用いてダイオキシン類を検出する。レポータータンパク測定後にＧＣ−ＭＳ測定する。レポータータンパク発現量よりダイオキシン類濃度を測定する。ダイオキシン類検出方法又はダイオキシン類定量分析方法を用い、ダイオキシン類の生物学的作用量を評価しスクリーニングする。【選択図】　　　図１　
2004135662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　ダイオキシン類の存在によりレポータータンパクを産生するダイオキシン類測定用形質転換体であって、
　ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを恒常的に産生又は導入し、ダイオキシン類、ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを含む複合体の転写制御領域への結合を介して、レポータータンパクを産生することを特徴とするダイオキシン類測定用形質転換体。
【請求項２】
　上記レポータータンパクを発現させるベクターの転写制御領域が、チトクロムＰ４５０スーパーファミリー遺伝子転写制御領域及びＵＤＰグルクロノジルトランスフェラーゼ遺伝子転写制御領域の少なくとも一部のＤＮＡシスエレメント、又はダイオキシンレスポンスエレメント配列を１個又は複数個有する人工的なＤＮＡシスエレメントを含み、且つ当該人工的なＤＮＡシスエレメントが転写活性化の増幅のため転写活性化因子であるＳｐ１結合配列を含むＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項１に記載のダイオキシン類測定用形質転換体。
【請求項３】
　上記レポータータンパクが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパクから成る群より選ばれた少なくとも１種のタンパクであることを特徴とする請求項１又は２に記載のダイオキシン類測定用形質転換体。
【請求項４】
　上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターの恒常的な産生が、当該形質転換体自体でエンドジーナスに発現させて成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類測定用形質転換体。
【請求項５】
　上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターの恒常的な導入が、適宜なプロモーターの下流にダイオキシン受容体遺伝子及びダイオキシン受容体核トランスロケーター遺伝子を作動的に連結した組換えＤＮＡによって成されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類測定用形質転換体。
【請求項６】
　上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを発現している哺乳動物肝臓由来細胞株から得られた細胞を宿主とすることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類測定用形質転換体。
【請求項７】
　上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを発現している哺乳動物肝臓由来細胞株から得られた細胞が、ＨｅｐＧ２又はＨｅｐａ１であることを特徴とする請求項６に記載のダイオキシン類測定用形質転換体。
【請求項８】
　上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを発現していない哺乳動物由来細胞株から得られ、ダイオキシン受容体遺伝子及びダイオキシン受容体核トランスロケーター遺伝子を恒常的に発現するベクターを導入した細胞を宿主とすることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類測定用形質転換体。
【請求項９】
　上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを発現していない哺乳動物由来細胞株から得られた細胞が、ＣＯＳ−７又はＣＨＯであることを特徴とする請求項８に記載のダイオキシン類測定用形質転換体。
【請求項１０】
　請求項１〜９のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類測定用形質転換体を用いることを特徴とするダイオキシン類検出方法。
【請求項１１】
　ダイオキシン類、ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを含む複合体の形成を阻害する宿主内因子、又は該複合体のＤＮＡ結合活性若しくは該複合体の転写活性化作用を阻害する宿主内因子、の産生を抑制することを特徴とする請求項１０に記載のダイオキシン類検出方法。
【請求項１２】
　上記形質転換体に、熱ショックタンパク９０（ＨＳＰ−９０）遺伝子を欠失若しくは置換すること、又は上記形質転換体が、適宜なプロモーターの下流にＨＳＰ−９０遺伝子のアンチセンス遺伝子を作動的に連結した組換えＤＮＡを有し、該アンチセンス遺伝子の転写産物を産生すること、を特徴とする請求項１０又は１１に記載のダイオキシン類検出方法。
【請求項１３】
　上記複合体の形成を阻害する宿主内因子の産生を抑制する薬剤又は該宿主内因子の活性を阻害する薬剤を加えることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類検出方法。
【請求項１４】
　試料と該形質転換体とを接触させ、発現したレポータータンパクを測定することを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類検出方法。
【請求項１５】
　２，３，７，８−ＴＣＤＤ濃度が１００ｆＭ以上の試料について、ダイオキシン類濃度を濃度依存的に測定することを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類検出方法。
【請求項１６】
　請求項１０〜１５のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類検出方法を用いたダイオキシン類定量分析方法であって、
　レポータータンパクの測定後に、ＧＣ−ＭＳ測定を行うことを特徴とするダイオキシン類定量分析方法。
【請求項１７】
　請求項１０〜１５のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類検出方法を用いたダイオキシン類定量分析方法であって、
　発現したレポータータンパク量よりダイオキシン類濃度を測定することを特徴とするダイオキシン類定量分析方法。
【請求項１８】
　２，３，７，８−ＴＣＤＤ濃度が１００ｆＭ以上の試料について、ダイオキシン類濃度を濃度依存的に測定することを特徴とする請求項１６又は１７に記載のダイオキシン類定量分析方法。
【請求項１９】
　請求項１０〜１５のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類検出方法、又は請求項１６〜１８のいずれか１つの項に記載のダイオキシン類定量分析方法を用いたダイオキシン類スクリーニング方法であって、
　ダイオキシン類の生物学的作用量（毒性量）を包括的に評価することを特徴とするダイオキシン類スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、ダイオキシン類測定用形質転換体並びにそれを用いたダイオキシン類の検出方法、定量分析方法及びスクリーニング方法に係り、更に詳細には、ダイオキシン類の濃度の測定に有用なダイオキシン類測定用形質転換体並びに試料中のダイオキシン類の濃度を測定するためのダイオキシン類の検出方法、定量分析方法及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　ダイオキシン類とは、ダイオキシン様作用、即ちヒトや野生動物の内分泌作用を撹乱させ、ひいては生殖障害、悪性腫瘍等の誘導作用を有する化合物の総称である。具体的には、ジベンゾジオキシン、ジベンゾフラン、ＰＣＢの塩素化合物及び臭素化合物、更にはこれらの混合化合物等が含まれる。ダイオキシン類は、工業生産活動、ごみ焼却施設、自動車の排ガス、金属精錬、有機塩素系廃棄物等を通して自然環境に排出され、生体濃縮された後、食物連鎖により最終的にはヒトを含めた高等動物に対し、発ガン性、催奇形性等を示すことが知られている。
【０００３】
　従って、土壌、海水等の環境中、植物、魚介類等の生物体内又は人体に蓄積したダイオキシン類の濃度を精度良く測定することは、環境保全上及び健康上の安全性を確保する上で極めて重要である。同様に、新規及び既知の環境汚染物質がダイオキシン様作用を有するか否かを調べるためのダイオキシン類検出方法の確立も急務である。
【０００４】
　また、従来から、かかるダイオキシン類を検出したり、その濃度を測定する方法としては、ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメーター（ＧＣ−ＭＳ）等の大型分析機器を用いた個別成分定量方法が用いられていた（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】「ダイオキシン類に係る土壌調査測定マニュアル（Ｈ１２．１）」、環境省ホームページ、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｖ．ｇｏ．ｊｐ／ｃｈｅｍｉ／ｄｉｏｘｉｎ／ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍｌ＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　しかし、ＧＣ−ＭＳ法では、大量検体を迅速且つ一括に測定することが不可能で、サンプルを測定するたびにクリーンアップ作業が必要であり、ダイオキシン類濃度が濃い検体を測定した後はバンクグランド値が高値となり、多くの処理を含むクリーンアップ作業を繰り返さないと微量の検体の測定ができなくなるという不都合があった。
　従って、ＧＣ−ＭＳ法に供するサンプルについても、事前におおよそのダイオキシン濃度を知ることは重要であり、おおよそのダイオキシン濃度がわかればその濃度に基づいてサンプルの希釈操作を行うことにより上記問題点をクリアできる。そのため、ダイオキシン類の簡易検出法の確立が望まれているところである。
【０００６】
　更に、ＧＣ−ＭＳ法では、検体に含まれる物質個別の成分量はわかってもそれら複合物質がヒトを含めた生体に対しどのような影響を及ぼすかという生物学的な影響評価をすることが困難であるという問題点があった。
【０００７】
　本発明は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、ダイオキシン類による汚染や蓄積を詳細に調査するために処理しなければならない大量検体の迅速な測定等が可能であるとともに、不都合を伴わずに生物学的影響評価が可能なダイオキシン類測定用形質転換体並びにそれを用いたダイオキシン類の検出方法、定量分析方法及びスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ダイオキシン類の存在によりレポータータンパクを産生する所定の形質転換体を用いることにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
　即ち、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体は、ダイオキシン類の存在によりレポータータンパクを産生するダイオキシン類測定用形質転換体であって、
　ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを恒常的に産生又は導入し、ダイオキシン類、ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを含む複合体の転写制御領域への結合を介して、レポータータンパクを産生することを特徴とする。
【００１０】
　また、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体の好適形態は、上記レポータータンパクを発現させるベクターの転写制御領域が、チトクロムＰ４５０スーパーファミリー遺伝子転写制御領域及びＵＤＰグルクロノジルトランスフェラーゼ遺伝子転写制御領域の少なくとも一部のＤＮＡシスエレメント、又はダイオキシンレスポンスエレメント配列を１個又は複数個有する人工的なＤＮＡシスエレメントを含み、且つ当該人工的なＤＮＡシスエレメントが転写活性化の増幅のため転写活性化因子であるＳｐ１結合配列を含むＤＮＡ配列であることを特徴とする。
【００１１】
　更に、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体の他の好適形態は、上記レポータータンパクが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパクから成る群より選ばれた少なくとも１種のタンパクであることを特徴とする。
【００１２】
　更にまた、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体の更に他の好適形態は、上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターの恒常的な産生が、当該形質転換体自体でエンドジーナスに発現させて成されることを特徴とする。
【００１３】
　また、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体の他の好適形態は、上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターの恒常的な導入が、適宜なプロモーターの下流にダイオキシン受容体遺伝子及びダイオキシン受容体核トランスロケーター遺伝子を作動的に連結した組換えＤＮＡによって成されることを特徴とする。
【００１４】
　更に、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体の更に他の好適形態は、上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを発現している哺乳動物肝臓由来細胞株から得られた細胞を宿主とすることを特徴とする。
【００１５】
　更にまた、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体の他の好適形態は、上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを発現している哺乳動物肝臓由来細胞株から得られた細胞が、ＨｅｐＧ２又はＨｅｐａ１であることを特徴とする。
【００１６】
　また、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体の更に他の好適形態は、上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを発現していない哺乳動物由来細胞株から得られ、ダイオキシン受容体遺伝子及びダイオキシン受容体核トランスロケーター遺伝子を恒常的に発現するベクターを導入した細胞を宿主とすることを特徴とする。
【００１７】
　更に、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体の他の好適形態は、上記ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを発現していない哺乳動物由来細胞株から得られた細胞が、ＣＯＳ−７又はＣＨＯであることを特徴とする。
【００１８】
　また、本発明のダイオキシン類検出方法は、上記ダイオキシン類測定用形質転換体を用い、ダイオキシン類、ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを含む複合体の形成を阻害する宿主内因子、又は該複合体のＤＮＡ結合活性若しくは該複合体の転写活性化作用を阻害する宿主内因子、の産生を抑制することを特徴とする。
【００１９】
　更に、本発明のダイオキシン類検出方法の好適形態は、上記形質転換体に、熱ショックタンパク９０（ＨＳＰ−９０）遺伝子を欠失若しくは置換すること、又は上記形質転換体が、適宜なプロモーターの下流にＨＳＰ−９０遺伝子のアンチセンス遺伝子を作動的に連結した組換えＤＮＡを有し、該アンチセンス遺伝子の転写産物を産生すること、を特徴とする。
【００２０】
　更にまた、本発明のダイオキシン類検出方法の他の好適形態は、上記複合体の形成を阻害する宿主内因子の産生を抑制する薬剤又は該宿主内因子の活性を阻害する薬剤を加えることを特徴とする。
【００２１】
　また、本発明のダイオキシン類検出方法の更に他の好適形態は、試料と該形質転換体とを接触させ、発現したレポータータンパクを測定することを特徴とする。
【００２２】
　更に、本発明のダイオキシン類検出方法の他の好適形態は、２，３，７，８−ＴＣＤＤ濃度が１００ｆＭ以上の試料について、ダイオキシン類濃度を濃度依存的に測定することを特徴とする。
【００２３】
　また、本発明のダイオキシン類定量分析方法は、上記ダイオキシン類検出方法を用い、レポータータンパクの測定後に、ＧＣ−ＭＳ測定を行うことを特徴とする。
【００２４】
　更に、本発明の他のダイオキシン類定量分析方法は、上記ダイオキシン類検出方法を用い、発現したレポータータンパク量よりダイオキシン類濃度を測定することを特徴とする。
【００２５】
　更にまた、本発明のダイオキシン類定量分析方法の好適形態は、２，３，７，８−ＴＣＤＤ濃度が１００ｆＭ以上の試料について、ダイオキシン類濃度を濃度依存的に測定することを特徴とする。
【００２６】
　また、本発明のダイオキシン類スクリーニング方法は、上記ダイオキシン類検出方法を用い、ダイオキシン類の生物学的作用量（毒性量）を包括的に評価することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
　本発明によれば、ダイオキシン類の存在によりレポータータンパクを産生する所定の形質転換体を用いることとしたため、ダイオキシン類による汚染や蓄積を詳細に調査するために処理しなければならない大量検体の迅速な測定等が可能であるとともに、不都合を伴わずに生物学的影響評価が可能なダイオキシン類測定用形質転換体並びにそれを用いたダイオキシン類の検出方法、定量分析方法及びスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
　以下、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体について詳細に説明する。
【００２９】
　本発明のダイオキシン類測定用形質転換体は、ダイオキシン類の存在によりレポータータンパクを産生する。これより、この産生されたレポータータンパクの濃度を測定して、試料中のダイオキシン類の濃度を調べることができる。また、レポータータンパクの産生の有無を調べることにより、被験物質がダイオキシン様作用を有するか否か及びその程度を調べることができる。
　従って、従来の方法では、ダイオキシン類の個別成分のみの分析データしか得られなかったが、本発明によりヒトを含めた生物への生体毒性影響を直接評価できるという利点がある。
【００３０】
　また、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体は、ダイオキシン受容体（以下、「ＡｈＲ」と記載する。）及びダイオキシン受容体核トランスロケーター（以下、「Ａｒｎｔ」と記載する。）を恒常的に産生又は導入し、ダイオキシン類、ＡｈＲ及びＡｒｎｔを含む複合体（以下、「ダイオキシン類複合体」と記載する。）の転写制御領域への結合を介して、レポータータンパクを産生する。
　ここで、「ダイオキシン受容体（ＡｈＲ）」とは、ダイオキシン類と特異的に結合する機能を有するタンパクをいい、具体的には、アリルハイドロカーボンレセプターと同一のものである。また、「ダイオキシン受容体核トランスロケーター（Ａｒｎｔ）」とは、ダイオキシン類及びＡｈＲの複合体と結合して、ダイオキシン類複合体の核内への移行と安定化を促進する機能を有するタンパクをいい、具体的にはアリルハイドロカーボンレセプターヌクレアトランスロケーターと同一のものである。
　なお、上記ＡｈＲ又はＡｒｎｔのアミノ酸配列、その遺伝子の塩基配列は（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　２４２．５１２−５１８）等により周知である。また、上記ＡｈＲ又はＡｒｎｔと、アミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、且つ上記ＡｈＲ又はＡｒｎｔと同様の機能を有するタンパクを用いることもできる。更に、上記「ＡｈＲ遺伝子」又は「Ａｒｎｔ遺伝子」としては、ＡｈＲ遺伝子又はＡｒｎｔ遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つその産物が上記ＡｈＲ及びＡｒｎｔと同様な機能を有するタンパクである遺伝子配列を用いることもできる。
【００３１】
　上記形質転換体では、ＡｈＲ及びＡｒｎｔが恒常的に産生又は導入される。かかるＡｈＲ及びＡｒｎｔは、例えば、当該形質転換体においてエンドジーナス（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現させることで産生できる。また、パーマネント又はトランジェントに導入したＡｈＲ及びＡｒｎｔ発現ベクターにより制御できる。
　ここで、上記形質転換体にＡｈＲ及びＡｒｎｔをパーマネントに発現させる方法としては、例えば、導入するＡｈＲ及びＡｒｎｔ発現ベクターにハイグロマイシンなどの薬剤選択性を有する遺伝子を作動的に結合させ、形質転換体に導入後、所定の薬剤により上記形質転換体を選択させる方法などが挙げられる。このとき、更に適宜なプロモーターの下流にＡｈＲ遺伝子及びＡｒｎｔ遺伝子を作動的に連結した組換えＤＮＡを用いる。
　一方、ダイオキシン応答性ベクターとしては、ダイオキシンに応答する転写制御領域の下流にレポータータンパク遺伝子を作動的に連結した組換えＤＮＡを用いることができる。
　更に、レポータータンパク遺伝子は、パーマネント又はトランジェントに導入できる。ここで、上記形質転換体にダイオキシン応答性ベクターをパーマネントに発現させる方法としては、例えば、当該ベクターにネオマイシンなどの薬剤選択性を有する遺伝子を作動的に結合させ、形質転換体に導入後、Ｇ４１８などの薬剤により上記形質転換体を選択させる方法などが挙げられる。
　なお、これらＡｈＲ及びＡｒｎｔを恒常的に産生又は導入する方法は、任意に組合わせて採用することができる。
　ここで、「パーマネント」とは、導入した発現ベクターが形質転換体のゲノムにインテグレートされ、細胞分裂を繰り返してもその形質を遺伝的に失うことのないようにすることであり、「トランジェント」とは、導入した発現ベクターが形質転換体のゲノムにインテグレートされることなしに、細胞分裂のたびに消失していくことである。
【００３２】
　具体的には、図１に示すように、適宜なプロモーター５の下流にＡｈＲ遺伝子６及びＡｒｎｔ遺伝子７を作動的に連結した組換えＤＮＡ、並びにダイオキシン応答性遺伝子の転写制御領域３の下流にレポータータンパク遺伝子４を作動的に連結した組換えＤＮＡを有する。この形質転換体１１は、ＡｈＲ及びＡｒｎｔを恒常的に過剰に産生し、ダイオキシン類が存在すると、ダイオキシン類複合体を形成する。かかるダイオキシン類複合体は核２内へ移行し、転写制御領域３へ結合することにより転写活性化因子として機能し、基本転写因子やエンハンサーとの協調作用により、レポータータンパク遺伝子４の転写、ひいてはレポータータンパクの合成を増大させる。
　なお、上記「適宜なプロモーター」とは、下流の遺伝子を恒常的に過剰に発現させる機能を備えたプロモーターをいい、具体的には、例えばサイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＢＶプロモーター、ＨＩＶプロモーター及びＨＴＬＶ−１プロモーター等の当業者に周知のプロモーターが挙げられる。
【００３３】
　また、上記ダイオキシン応答性遺伝子の転写制御領域としては、チトクロムＰ４５０スーパーファミリー遺伝子転写制御領域及びＵＤＰグルクロノジルトランスフェラーゼ遺伝子転写制御領域の少なくとも一部のＤＮＡシスエレメント、又はダイオキシンレスポンスエレメント配列を１個又は複数個有する人工的なＤＮＡシスエレメント（ジェノビオティックレスポンスエレメント、ＸＲＥ）を含むものを用いることができる。
　これらは、一個又は適当なスペーサー配列を挟んだ複数個の配列等を含んでいればよい。また、上記人工的なＤＮＡシスエレメントは、転写活性化の増幅のため転写活性化因子であるＳｐ１結合配列を含むＤＮＡ配列であることがよい。
　かかるチトクロムＰ４５０スーパーファミリー遺伝子転写制御領域は、哺乳動物由来のものを用いることがより好ましい。この転写制御領域のダイオキシン類に対する特異性は生物間で差があるため、非特異的な転写促進が少なく、ダイオキシン類に対してのみ応答する哺乳動物由来の転写制御領域を選択したものである。これらの転写制御領域の配列は、例えばＪＢＣ　１９９３　６５７８−８０等により周知である。また、本発明においては、上記の転写制御領域の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ同様な機能を有する配列を用いることもできる。
【００３４】
　更に、レポータータンパクには、その産生を濃度依存的に検出できるようなタンパクを用いることができ、例えば簡便に測定できるタンパクを用いることが望ましい。具体的には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ又は緑色蛍光タンパク、及びこれらの任意の組合せに係るタンパクを用いることができ、この場合は濃度依存的で微量の検出が容易になるので好ましい。なお、上記レポータータンパクのアミノ酸配列、その遺伝子の塩基配列は既に周知である。
【００３５】
　更にまた、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体では、上記のレポータータンパクと、アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、且つ上記のレポータータンパクと同様の機能を有するタンパクを用いることもできる。また、「レポータータンパク遺伝子」としては、上記のレポータータンパク遺伝子の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つその産物が上記のレポータータンパクと同様な機能を有するタンパクである遺伝子配列を用いることもできる。
【００３６】
　また、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体は、上記ＡｈＲ及びＡｒｎｔを発現している哺乳動物肝臓由来細胞株から得られた細胞、又は上記ＡｈＲ及びＡｒｎｔを発現しない哺乳動物由来細胞株から得られ、ＡｈＲ遺伝子及びＡｒｎｔ遺伝子を恒常的に発現するベクターを導入した細胞を宿主とすることができる。なお、遺伝子発現ベクターの概略図を図２に示す。
　上記ＡｈＲ及びＡｒｎｔを発現している哺乳動物肝臓由来細胞株から得られた細胞としては、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）又はＨｅｐａ１（マウス肝癌細胞株）を用いることができる。また、本来的に、ＡｈＲ及びＡｒｎｔを発現していない他の細胞を用いることもできる。この場合はＡｈＲ及びＡｒｎｔを作動的に連結したＤＮＡの形質転換体とする必要がある。
　上記ＡｈＲ及びＡｒｎｔを発現しない哺乳動物由来細胞株から得られた細胞としては、ＣＯＳ−７（サル腎癌細胞株）又はＣＨＯ（チャイニーズハムスターオバリー細胞株）を用いることができる。この場合はダイオキシン類の存在とは無関係な非特異的なレポータータンパク遺伝子の発現を防ぐことにより、低濃度のダイオキシン類の精確な測定及び被験物質の微弱なダイオキシン様作用の検出が可能になる。
【００３７】
　更に、本発明のダイオキシン類測定用形質転換体は、宿主に、レポータータンパク遺伝子並びにＡｈＲ遺伝子及びＡｒｎｔ遺伝子、これらの遺伝子が発現可能な態様にて導入することにより製造できる。
　具体的には、適宜なプロモーターの下流にＡｈＲ遺伝子及びＡｒｎｔ遺伝子を作動的に、言い換えればこれらの遺伝子が発現可能な態様にて連結した組換えＤＮＡ、並びにダイオキシン応答性転写制御領域の下流にレポータータンパク遺伝子を同じくダイオキシン類複合体に特異的に作動するように連結した組換えＤＮＡを宿主に共にトランジェント又はパーマネントに導入できる。
【００３８】
　なお、ＡｈＲ遺伝子、Ａｒｎｔ遺伝子及びレポータータンパク遺伝子、転写制御領域、プロモーターは、例えばＤＮＡ合成機を用いることにより、又は適宜なプローブ又はＰＣＲ法又はＲＴ−ＰＣＲ法を用いてクローニングすることにより、常法により入手することができる。
　また、上記組換えＤＮＡは、例えばプラスミド、ファージ、ファージミド等のベクターに組み込まれ、このベクターは常法にて宿主に導入される。
【００３９】
　次に、本発明のダイオキシン類検出方法、ダイオキシン類定量分析方法及びダイオキシン類スクリーニング方法について詳細に説明する。
　かかるダイオキシン類検出方法及びダイオキシン類定量分析方法は、試料と上述のダイオキシン類測定用形質転換体とを接触させ、発現したレポータータンパクを測定することを特徴とする。具体的には、例えば以下のように行われる。
　まず、試料又は被験物質と形質転換体を接触させる。即ち、形質転換体を、２×１０４〜１×１０５細胞／ｍｌに調製し、測定用２４穴プレートのウェルに、１ｍｌずつ播く。形質転換体を播いた各ウェルに、トランジェント細胞の場合は、レポータータンパク発現ベクター及び／又はＡｈＲ及びＡｒｎｔ発現ベクターをトランスフェクション後、パーマネント細胞の場合は直接、試料若しくは被験物質を添加する。各試料若しくは被験物質は、必要に応じて、抽出、溶解等の操作に付され、更に適宜に希釈されてから、添加される。通常、各試料若しくは被験物質の数段階の希釈溶液について、同時に測定を行う。
【００４０】
　適宜な時間、例えば６〜４８時間、インキュベーションを行った後、産生されたレポータータンパクの量、濃度等を、用いたレポータータンパクの種類により、例えば蛍光強度、酵素活性及び発光量等の常法による測定値を指標として判断する。
　ダイオキシン類を検出する場合は、既知の特定のダイオキシン類について得た結果を基準として、ダイオキシン様作用の有無及びその程度を決定できる。また、このとき、ダイオキシン類の生物学的作用量（毒性量）を包括的に評価することにより、ダイオキシン類をスクリーニングすることができる。これより、ダイオキシン類の個別的な成分量を測定できるだけのＧＣ−ＭＳ法などと異なり、簡易に生物学的な影響が評価できる。なお、この場合でも、ダイオキシン濃度を大まかに予測することはできる。よって、上記レポータータンパクの測定後にＧＣ−ＭＳ測定を行うときは、高濃度ダイオキシン類のＧＣ−ＭＳのアプライにより発生する煩雑なクリーンアップ作業の省力化につながる。
　一方、試料中のダイオキシン類の定量分析を行う場合（ダイオキシン類濃度測定）は、レポータータンパク量（代表的には蛍光強度、酵素活性及び発光量など）を測定し、対象となるダイオキシン類を既知の濃度で測定したレポータータンパク量と比較して濃度を決定できる。
【００４１】
　また、本発明のダイオキシン類検出方法及びダイオキシン類定量分析方法では、２，３，７，８−ＴＣＤＤ濃度が１００ｆＭ以上の試料について、ダイオキシン類濃度を濃度依存的に測定することができる。
　これより、従来方法に比べてダイオキシン類の検出や定量分析を迅速に行うことができる。また、低コスト且つ少量の試料でダイオキシン類の検出や定量分析を行い得る。
【００４２】
　更に、本発明のダイオキシン類検出方法では、ダイオキシン類、ＡｈＲ及びＡｒｎｔを含む複合体の形成を阻害する宿主内因子、又は該複合体のＤＮＡ結合活性若しくは該複合体の転写活性化作用を阻害する宿主内因子、の産生を抑制することが好適である。これより、ダイオキシン類をより感度良く検出できる。
　例えば、上記形質転換体に、熱ショックタンパク９０（ＨＳＰ−９０）遺伝子を欠失若しくは置換すること、又は上記形質転換体が、適宜なプロモーターの下流にＨＳＰ−９０遺伝子のアンチセンス遺伝子を作動的に連結した組換えＤＮＡを有し、該アンチセンス遺伝子の転写産物を産生すること、ができる。
　なお、宿主細胞によっては、ダイオキシン類複合体の形成やダイオキシンレスポンスエレメントへの結合を阻害する因子を産生するものがあり、かかる因子はダイオキシン類濃度の測定及びダイオキシン類のスクリーニングの感度を阻害し得る。従って、上記複合体の形成やダイオキシンレスポンスエレメントへの結合を阻害する宿主内因子の産生を抑制する薬剤又は該宿主内因子の活性を阻害する薬剤を加えることが好適であり、この場合は測定及びスクリーニングの感度を担保することができる。
【００４３】
　以上のように、本発明のダイオキシン類検出方法及びダイオキシン類定量分析方法では、ダイオキシン類の種類に応じ、１００ｆＭオーダー以上の広範な濃度範囲にわたって、単一の測定系を用いて測定できる。
【実施例】
【００４４】
　以下、本発明を実施例を用いて更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
　まず、レポータータンパク遺伝子発現ベクター、ＡｈＲ遺伝子及びＡｒｎｔ遺伝子発現ベクターを下記のように製造した。
【００４６】
ｉ）レポータータンパク遺伝子発現ベクターの作製
　手法は全てＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ法に準拠して行なった。ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３　Ｂａｓｉｃ　ｖｅｃｔｏｒ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．社製）を制限酵素　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで切断して、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子全長１．７ｋｂｐ断片をＴＳＫ　ｇｅｌ　ＤＮＡ　ＮＰＲカラム（４．６×７５ｍｍ：ＴＯＳＯＨ社製）で精製を行った。
　一方、緑色蛍光蛋白プロモーターレスベクターｐＥＧＦＰ−１　ｖｅｃｔｏｒ（ＣＬＯＮＴＥＣ　Ｌａｂ．Ｉｎｃ．社製）も同様に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで切断して、ＧＦＰ全長領域を取り除いたベクター領域を得た。なお、このベクターには、薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏ遺伝子）が組み込んである。この両者をＲａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いてライゲーションを行ない、大腸菌ＪＭ　１０９コンピテント細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．社製）でトランスフォームした。ＬＢ／Ｋａｎ（カナマイシン）プレートで選択し、コロニーを得た。いくつかのコロニーをＬＢ／Ｋａｎ液体培地中で培養し、ハーベスト後、Ｗｉｚａｒｄ　Ｐｕｒｅ　Ｆｅｃｔｉｏｎ　プラスミドＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．社製）を用いて精製を行なった。ベクターへのＤＮＡ領域の挿入は制限酵素切断後、１．２％アガロースゲルで電気泳動を行ない確認した。得られたベクターを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断して、ベクター領域を得た。
【００４７】
　このベクターにウサギＣＹＰ１Ａ１遺伝子転写制御領域又はＸＲＥ配列を含む２本鎖オリゴマーＢｇｌＩＩリンカー配列付き（Ｘ１、Ｘ４、Ｘ４Ｓ２）を挿入した。ウサギ肝臓のＣＹＰ１Ａ１遺伝子の転写制御領域をＰＣＲ法を用いてクローニングし、そのＤＮＡ塩基配列を決定した。この目的のために、ウサギゲノムを常法により調製し、これを鋳型にしてＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃４５秒で３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をゲルで分離精製し、Ｔベクターにクローニングし、そのＤＮＡ塩基配列を確認した。
　また、ＸＲＥ配列は以下のように製造した。
　ダイオキシン応答性シスエレメント、ＸＲＥ配列を１つ、２つ、４つをもつ合成オリゴマーを作製した（それぞれ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４と表す）。更に、ＸＲＥと協同作用によりレポーターベクターの転写活性化をエンハンスするＳｐ１結合サイトをＸＲＥ配列の前後に組み込んだ合成オリゴマーも同時に作製した（それぞれＸ１Ｓ１、Ｘ４Ｓ２と表す）。合成されたセンス鎖オリゴマーとアンチセンス鎖オリゴマーはアニ−リング処理を行ない、２本鎖ＤＮＡを試作した。センス鎖オリゴマーとアンチセンス鎖オリゴマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した後に、１５ｍｉｎボイルして、氷上に置いた。センス鎖オリゴマーとアンチ鎖センスオリゴマーをそれぞれ１μｌ取り、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１０μｌ　５Ｍ　ＮａＣｌ溶液１μｌ、ホルムアミド２０μｌを加え、最終的に１００μｌになるように超純水で調整し、再び１５ｍｉｎボイルし、室温になるまでそのまま放置し冷やした。
【００４８】
　上記作製したＣＹＰ１Ａ１転写制御領域又はＸＲＥを含む合成ＤＮＡ配列をＲａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて上記ＢｇｌＩＩ切断したベクターとライゲーションを行ない、大腸菌ＪＭ　１０９コンピテント細胞でトランスフォームした。ＬＢ／Ｋａｎプレートで選択し、コロニーを得た。いくつかのコロニーをＬＢ／Ｋａｎ液体培地中で培養し、ハーベスト後、Ｗｉｚａｒｄ　Ｐｕｒｅ　Ｆｅｃｔｉｏｎ　プラスミドＤＮＡ精製キットを用いて精製を行なった。ベクターへのＤＮＡ領域の挿入は制限酵素切断後、１．２％アガロースゲルで電気泳動を行ない確認した。得られたレポーターベクターは、哺乳動物細胞に導入するためにＷｉｚａｒｄ　Ｐｕｒｅ　Ｆｅｃｔｉｏｎ　プラスミドＤＮＡ精製キットを用いてトランスフェクショングレードで大量に調整した。
【００４９】
　次に、ＧＦＰレポーター遺伝子ベクター構築のために、緑色蛍光蛋白プロモーターレスベクターｐＥＧＦＰ−１　ｖｅｃｔｏｒ　を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断しリニアにした。このベクターにウサギＣＹＰ１Ａ１遺伝子転写制御領域又はＸＲＥ配列を含む２本鎖オリゴマー（Ｘ４Ｓ２）を挿入した。この両者をＲａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いてライゲーションを行ない、大腸菌ＪＭ　１０９コンピテント細胞でトランスフォームした。ＬＢ／Ｋａｎプレートで選択し、コロニーを得た。いくつかのコロニーをＬＢ／Ｋａｎ液体培地中で培養し、ハーベスト後、Ｗｉｚａｒｄ　Ｐｕｒｅ　Ｆｅｃｔｉｏｎ　プラスミドＤＮＡ精製キットを用いて精製を行なった。ベクターへのＤＮＡ領域の挿入は制限酵素切断後、１．２％アガロースゲルで電気泳動を行ない確認した。
【００５０】
ｉｉ）ＡｈＲ遺伝子及びＡｒｎｔ遺伝子発現ベクターの作製
　この目的のために、ウサギ肝臓よりｍＲＮＡの調整を行った。約２ｇのウサギ肝臓を摘出後、冷ＰＢＳで軽く洗浄後、ドライアイスで凍らせ直ちにポッター型ホモジェナイザーで破砕した。すぐに５ｍｌの４Ｍグアニジンチオシアネート液（２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ　２メルカプトエタノールを含む）を入れ組織を完全にバラバラにした。これを滅菌チューブに入れ、５００μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）、５ｍｌのＴｒｉｓ飽和フェノールを加え静かに転倒混和した。更に１ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（４９：１）を加え、約１０秒激しく撹拌した。氷中に約１５分靜置した後、１２０００回転、２０分冷却遠心した。層が乱れないようにその上層を別の滅菌チューブに取り、これに５ｍｌのイソプロパノールを加え転倒混和後、−２０℃に１時間放置冷却した。その後、１２０００回転、２０分遠心分離し、その上層を静かにピペットで取り除き、沈殿を得た。この沈殿にもう一度１ｍｌの４Ｍグアニジンチオシアネート液を加え、良く溶かした後、１００μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）、１ｍｌのＴｒｉｓ飽和フェノールを添加し、良く撹拌した後、１２０００回転、２０分冷却遠心をした。この上層を別の滅菌チューブに取り、２ｍｌのエタノールを加え、−２０℃に１時間放置冷却した。その後、１２０００回転、２０分遠心分離し、その上層を静かにピペットで取り除き、沈殿を得た。この沈殿を１ｍｌのＴＥ−ＳＤＳ液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）に十分縣濁し、１００μｌ　２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）、２ｍｌ　エタノールを加え使用するまで−２０℃に保存、全ＲＮＡを調整した。
　この全ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）を鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ法によりウサギＡｈＲ遺伝子及びＡｒｎｔ遺伝子全長をクローニングした。
　ＲＴ反応には、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をプライマーとして使用し、４２℃　３０ｍｉｎ反応した。また、両遺伝子を増幅するためのプライマーはＤＤＢＪのＤＮＡデータベースにより入手した情報に基づき合成した。これらの遺伝子の全長は約２．３−２．５Ｋｂｐあるので、ＰＣＲ法によるクローニングの際には、それぞれ２つの部分にわけて増幅した。用いたプライマーはそれぞれ以下の通りである。
・ウサギＡｈＲ用プライマー：
　ＡｈＲ１センス５’−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＡＣＡ−３’と、ＡｈＲ１アンチセンス５’−ＴＴＴＴＡＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧＴＣＣＡＴ−３’、
　ＡｈＲ２センス５’−ＴＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＴＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣ−３’と、ＡｈＲ２アンチセンス５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＧＣＣＧＧＡ−３’；
・ウサギＡｒｎｔ用プライマー：
　Ａｒｎｔ１センス５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＴＧＣＴＡＡＣ−３’と、Ａｒｎｔ１アンチセンス５’−ＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＴＡＴＡＧＣＣＴ−３’、
　Ａｒｎｔ２センス５’−ＡＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ−３と、Ａｒｎｔ２アンチセンス５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧ−３’；
【００５１】
　ＰＣＲ反応の条件は９４℃　３０ｓｅｃ、５２℃　３０ｓｅｃ、７２℃　４５ｓｅｃで３０〜３５回行った。それぞれのＰＣＲ産物をゲルで分離精製後、Ｔベクターにクローニングした。その後そのＰＣＲ産物を制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等）で切り出して、ライゲーション反応することによりそれらを連結し各々の全長クローンを得た。得られたクローンにつき、そのＤＮＡ塩基配列を確認した。
　更に、得られたウサギＡｈＲ遺伝子及びＡｒｎｔ遺伝子を真核生物由来の細胞株で強制的に発現できる様に、サイトメガロウイルスプロモーターを持った発現べクターに組み込んだ。ベクターは、ｐｃＤＮＡ　３．１／Ｈｙｇｒｏ（−）　ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏ　ｇｅｎｅ社製）を用いた（以下「ｐｃＤＮＡ」と略す）。なお、このベクターには、薬剤耐性マーカーとしてハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が組み込まれている。ｐｃＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ−ＸｈｏＩで切断して、ベクター領域を得た。また、ウサギＡｒｎｔ遺伝子全長を含む約２．２８ｋｂｐの領域を得た。この両者をＲａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いてライゲーションを行ない、大腸菌ＪＭ　１０９コンピテント細胞でトランスフォームした。ＬＢ／Ａｍｐプレートで選択し、コロニーを得た。いくつかのコロニーをＬＢ／Ａｍｐ液体培地中で培養し、ハーベスト後、Ｗｉｚａｒｄ　Ｐｕｒｅ　Ｆｅｃｔｉｏｎ　プラスミドＤＮＡ精製キットを用いて精製を行なった。ベクターへのＤＮＡ領域の挿入は制限酵素切断後、１．２％アガロースゲルで電気泳動を行ない確認する。こうして得られたｐｃＤＮＡ−Ａｒｎｔを制限酵素ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ベクター領域を得た。また、ウサギＡｈＲ遺伝子全長を含む約２．４４ｋｂｐの領域を得た。先程と同様に、この両者をＲａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いてライゲーションを行ない、大腸菌ＪＭ　１０９コンピテント細胞でトランスフォームした。ＬＢ／Ａｍｐプレートで選択し、コロニーを得た。いくつかのコロニーをＬＢ／Ａｍｐ液体培地中で培養し、ハーベスト後、Ｗｉｚａｒｄ　Ｐｕｒｅ　Ｆｅｃｔｉｏｎ　プラスミドＤＮＡ精製キットを用いて精製を行なった。ベクターへのＤＮＡ領域の挿入は制限酵素切断後、１．２％アガロースゲルで電気泳動を行ない確認した。
【００５２】
（実施例１：トランジェント細胞の実験例）
　細胞培養は１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地又は１０％ＦＣＳ−αＭＥＭ培地で継代培養した。用いた細胞株は、分化型ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、マウス肝癌細胞株Ｈｅｐａ１及びチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯで、これらは、ＡｈＲとＡｒｎｔを発現している肝癌細胞株及びダイオキシン受容体低発現性細胞株である。これらは理研細胞バンク等から入手した。
【００５３】
　各細胞は、２４穴培養プレートに５０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（１．０×１０４／ｗｅｌｌ）になるようにまいて、一晩培養した。翌日培地を取り除いて、無血清培地で２回洗浄した。その後、トランスフェクション用のＬＩＰＯＦＥＣＴ　ＡＭＩＮＥ　ＰＬＵＳ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）とダイオキシン感受性プロモーターを持ちレポーター遺伝子としてルシフェラーゼを持ったベクター１．０μｇを混合した後に細胞に処理した。なお、導入するレポーター遺伝子ベクターには、トランスフェクション効率を補正するための内部標準のコントロールとして、０．２μｇのウミシイタケ由来ルシフェラーゼ発現プラスミドを添加している。トランスフェクション３時間後に、各ウエルにＴＣＤＤ等のダイオキシン様物質を添加し、経時的にＤＵＡＬ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ルミノメーターで測定を行った。
【００５４】
　細胞をＰＢＳで１回洗浄後、Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　を５００μｌ加えて、室温で１５分ゆっくりと振とうさせた。このうち２０μｌを取り、ホタルルシフェラーゼ基質（ＬＡＲＩＩ）１００μｌと反応させて、すぐにホタルルシフェラーゼの発光を、Ｔｕｒｎｅｒ　Ｄｅｓｉｇｎｓ　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　ＴＤ−２０で測定した。次に、内部標準であるウミシイタケ由来のルシフェラーゼの基質（Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ　Ｒｅａｇｅｎｔ）１００μｌを加えて、発光量を測定した。ルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ活性値を一定にしたときのホタルルシフェラーゼ発光量を算出した。
【００５５】
　図３に、代表例としてＨｅｐａ１細胞を用いて、２，３，７，８−ＴＤＣＣを測定した結果を示す。２，３，７，８−ＴＤＣＣは本測定方法で検出可能であり、１００ｆＭ〜５ｐＭの間で濃度依存曲線が得られた。また、１０ｐＭと２，３，７，８−ＴＤＣＣの濃度が高くなると、細胞毒性のためと思われる細胞増殖能の低下と細胞死のためルシフェラーゼ活性の低下が認められた。
【００５６】
　また、レポーター遺伝子としてＧＦＰを持ったベクターを上記と同様の方法でＨｅｐａ１細胞株にトランジェントに導入し、ダイオキシン活性物質を処理した後、細胞株を蛍光顕微鏡で観察し、写真撮影した。ダイオキシン様活性をもつ３−メチルコランスレン１０μΜを処理し、４８時間後に蛍光顕微鏡写真を撮ったところ、３−メチルコランスレン処理した細胞株のみに、レポーター遺伝子ＧＦＰの発現が認められた。この様子を図４に示す。
【００５７】
　また、転写制御領域として、人工的なＤＮＡシスエレメントを持ったレポーター遺伝子ベクターをマウス肝癌細胞株（Ｈｅｐａ１）にトランジェントに導入した。ネガティブコントロールベクター（ｐＧＬ３　Ｎｅｇａｔｉｖｅ）、ポジティブコントロールベクター（ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＳＶ４０のプロモーターとエンハンサーを持っている）及び作製した合成ＤＮＡ配列を持ったベクター（Ｘ１、Ｘ４、Ｘ４Ｓ２）を導入したレポーター遺伝子ベクターをトランスフェクトし、１０μＭ　３−メチルコランスレン処理後、２４時間、４８時間後にルシフェラーゼの発現量を調べた。この結果として、表１に３−メチルコランスレン処理と未処理のルシフェラーゼ活性をその比で表した。また、表２に合成した各ダイオキシン応答性のＤＮＡの塩基配列を示す。
【００５８】
【表１】
2004135662.tif 000003
【００５９】
【表２】
2004135662.tif 000004
【００６０】
　ネガティブコントロールベクター及びポジティブコントロールベクターをトランスフェクトした細胞株では、３−メチルコランスレンに対して発現誘導はかからなかった。一方、合成ＤＮＡ配列を持ったベクター（Ｘ４Ｓ２）を導入した細胞株では、３−メチルコランスレンに対して発現誘導され、処理後２４時間後で約４．８倍、４８時間後で約７．２倍のレポーター遺伝子の誘導が認められた。しかし、Ｓｐ１結合サイトを持たない合成ＤＮＡ配列Ｘ１、Ｘ４を持ったベクターを導入した細胞株では、ダイオキシン活性物質に対し顕著な誘導はかからなかった。この結果、ダイオキシン誘導体処理による標的遺伝子の転写活性化はダイオキシン応答性のコア配列ＸＲＥのみでは非常に弱く、転写因子Ｓｐ１との協同作用により大きく誘導されることが分かった。
【００６１】
　そこで、ダイオキシン応答性が認められた合成ＤＮＡ配列（Ｘ４Ｓ２）又はウサギＣＹＰ１Ａ１遺伝子転写制御領域をもつルシフェラーゼ遺伝子ベクターを、種々の細胞株にトランジェントにトランスフェクトして、ダイオキシン様活性物質を処理し応答能を調べた。レポーター遺伝子ベクターのみをトランスフェクトした細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐａ１、ＣＨＯ）に１０μＭ　３−メチルコランスレンを処理し、経時的にルシフェラーゼの酵素活性を測定したところ、ＨｅｐＧ２細胞株においては、Ｈｅｐａ１細胞株に比べ、その発現量は約１／４程度であった。また、ＣＨＯ細胞株においては、ほとんど発現が認められなかった。
　この結果より、内在的にＡｈＲ及びＡｒｎｔを発現しているＨｅｐＧ２及びＨｅｐａ１細胞株において程度の差こそあれ、レポーター遺伝子プロモーターはダイオキシン様活性を有する３−メチルコランスレンに応答することが示された。
【００６２】
（実施例２）
ｉ）パーマネント細胞の取得方法
　細胞培養は、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地又は１０％ＦＣＳ−αＭＥＭ培地で継代培養した。用いた細胞株は、分化型ヒト肝癌細胞株　ＨｅｐＧ２、マウス肝癌細胞株Ｈｅｐａ１及びチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯで、理研細胞バンク等から入手した。これらの細胞のうちＡｈＲとＡｒｎｔを発現している肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐａ１細胞）と非発現性細胞株（ＣＨＯ細胞）にＡｈＲ及びＡｒｎｔ遺伝子発現ベクターをトランスフェクトした。小型ｄｉｓｈに５０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになる様に細胞株を増殖させた後、無血清培地で３回洗った。その後、トランスフェクション用のリポアミンと数μｇのベクター（ＡｈＲ及びＡｒｎｔ遺伝子発現ベクター）を混ぜ、細胞にトランスフェクトした。細胞がｃｏｎｆｌｕｅｎｔになったら継代し、常に増殖期の状態に保った。３〜４日後に、数百μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを添加してをセレクションをかけた。約２〜３週間後に、十数個のコロニーが得られたので、これをそれぞれのシャーレに単離し、培養と継代をくりかえした。
【００６３】
　更に、ＡｈＲ及びＡｒｎｔ遺伝子発現ベクターをトランスフェクトした細胞又はしなかった細胞に、レポーター遺伝子発現ベクター（ルシフェラーゼ遺伝子）をトランスフェクトし、数百μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加して、Ｎｅｏ遺伝子耐性の細胞株を選択した。Ｎｅｏ遺伝子耐性の細胞株を数十クローンずつ選択した。これらの細胞をそれぞれ培養した。
　得られた細胞株のＡｈＲ及びＡｒｎｔ遺伝子の発現レベルをノザンブロット法で確認した。各種クローン化細胞株からＲＮＡを調製し、変性アガロースゲルにアプライした。泳動後、ナイロンメンブレンにトランスファーし、４２℃でプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションを行った。プローブはそれぞれの遺伝子全長フラグメントをラベルして使用した。ハイブリダイゼーション後、４２℃で２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで３回、室温で０．２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで洗浄後、バンドを検出した。
【００６４】
　また、導入したレポーター遺伝子のコピー数をサザンブロット法により調べた。この目的のために、培養細胞からＤＮＡを調製した。各１０μｌのゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動した。ゲルをナイロンメンブレンにトランスファー後、６５℃でプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションを行った。プローブはそれぞれの遺伝子全長フラグメントをラベルして使用した。ハイブリダイゼーション後、６５℃で２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで３回、室温で０．２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで洗浄後、バンドを検出した。組み込んだ遺伝子を長期間安定的に発現している細胞を株を選択した。
【００６５】
ｉｉ）パーマネント細胞を使った実験例
　ダイオキシン感受性細胞株であるＨｅｐａ１樹立細胞株のクローン（ｃｌｏｎｅ１−５、ｃｌｏｎｅ２−４）につき、ダイオキシン活性物質（２，３，７，８−ＴＤＣＣ）をＤＭＳＯ溶液で段階希釈した溶液で処理し、レポーター遺伝子の発現量を調べた。具体的には、２，３，７，８−ＴＤＣＣに対する応答性をルシフェラーゼアッセイにより検討した。樹立されたＨｅｐａ１細胞株は、０．０２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＰＢＳにより、フラスコ底面からの剥離を行い、遠心分離（１０００ｒｐｍ，１０ｍｏｎ，４℃）後に所定の細胞数（１．０Ｘ１０４／ｗｅｌｌ）を１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭにて２４穴培養プレートに播いた。３７℃で一晩培養後、各ウエルに、以下の所定濃度になる様にダイオキシン類を添加した。０〜１０ｐＭ　２，３，７，８−ＴＣＤＤを添加し、培養４８時間後、細胞が発現しているルシフェラーゼ活性を測定した。アッセイには、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用した。まず、２，３，７，８−ＴＣＤＤを含んだ培養液を吸引除去し、ＰＢＳにて残存するＦＣＳ等を除去する目的で３回洗浄した。次いで、キット付属のＰａｓｓｉｖｅ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒを１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１５分、培養プレートを振とうさせた。この細胞ｌｙｓａｔｅ　２０μｌに対して、ホタルルシフェラーゼ基質溶液１００μｌを混合し、直ちにルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ，ＴＤ−２０）にて測定した。
【００６６】
　図５に示すように、樹立されたＨｅｐａ１パーマネント株（ｃｌｏｎｅ１−５、ｃｌｏｎｅ２−４）において２，３，７，８−ＴＣＤＤを測定したところ、本測定法で検出可能で、濃度依存曲線が得られた。
　２，３，７，８−ＴＣＤＤでは１００ｆＭから１０ｐＭまでの範囲で検出、測定可能であり、それ以上２，３，７，８−ＴＣＤＤの濃度が高くなると、細胞毒性のためと思われる細胞増殖能の低下のため、ルシフェラーゼ活性の低下が認められた。
【００６７】
（実施例３：ＧＣ−ＭＳ法との比較）
　本発明のダイオキシン類検出方法の測定値と従来法のＧＣ−ＭＳ法の測定値を算出して相関を調べた。
　試料としては、環境試料、生体試料及び食品等いろいろ考えられるが、現在問題になっている土壌及び焼却灰に含まれるダイオキシンの測定を行った。まず、土壌６検体、焼却灰６検体の合計１２検体を用意し、各試料について、図６に示すように、環境省のマニュアルに従った方法で抽出及びクリーンアップを行った。その後、得られた試料の一部は高感度ＧＣ−ＭＳ法で測定し、一部は更にＤＭＳＯに転溶後緩衝液で希釈しレポーター遺伝子アッセイ法で測定した。
【００６８】
　ここで、本発明のダイオキシン類検出方法（レポーター遺伝子アッセイ法）における細胞の調製方法を下記に示す。
　まず、ダイオキシン高感度応答性遺伝子としてＣＹＰ１Ａ１遺伝子転写制御領域を用い、また、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とし、Ｇ４１８を薬剤耐性遺伝子にもつ発現ベクターに組み込んだ。これをマウス肝癌細胞Ｈｅｐａ−１細胞に遺伝子導入し、Ｇ４１８により選択培養された樹立細胞株（ｃｌｏｎｅ２−Ｂ−４）を得た。
　この細胞株を、１ｗｅｌｌあたり１×１０４個／５０μＬになるように１０％ＦＣＳ添加ダルベッコ改変ＭＥＭで細胞濃度を調製し、９６穴組織培養プレートに播いた。３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養し、翌日濃度検量線用として２，３，７，８−ＴＣＤＤを、０，０．１，１，１０，１００，１０００ｐｇ／ｍｌに１０％ＦＣＳ添加ダルベッコ改変ＭＥＭで濃度調製し、これを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。また、検体はいくつかの希釈系列を取り、同様に５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加したものも作製した。これを更に一晩３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。翌日、ルシフェラーゼ活性測定試薬（Ｓｔｅａｄｙ　Ｇｌｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ社）を各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加し、室温で１０分間静置後、ルミノメーター（ＯｒｉｏｎＩＩ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）にて測定した。測定はいずれも３重検体測定（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）において行った。測定後のルシフェラーゼ活性値から、２，３，７，８−ＴＣＤＤにおける検量線を描き、１ｇあたりのＴＥＱダイオキシン濃度として算出した。
【００６９】
　図７に示すように、高感度ＧＣ−ＭＳ法の測定値はトータルのダイオキシン濃度を１ｇ当たりのＴＥＱ値で表示し、レポーター遺伝子アッセイ法の測定値は、２，３，７，８−ＴＣＤＤの標準品をもとに、トータルのダイオキシン濃度を１ｇ当たりのＴＥＱ値で表示した。
　このグラフより、相関係数Ｒ２＝０．９８と非常に高い相関を示すことがわかった。また、近似曲線はｙ＝０．４６ｘ＋８．４とほぼＧＣ−ＭＳで測定した値と同等の成績を示した。これらのことから、本発明のダイオキシン類検出方法は、公定法であるＧＣ−ＭＳに代わる簡便なダイオキシン類一括検出方法として十分に実用化できることが証明された。
【００７０】
　以上、本発明を実施例により詳細に説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形が可能である。
　例えば、本発明では、２，３，７，８−ＴＣＤＤの他、ＰＣＤＤ、ＰＣＤＦ、ＰＣＢ、３−メチルコランスレン及びベンツピレンなどのダイオキシン様活性物質においても検出測定濃度に違いはあるものの好適に検出、定量分析及びスクリーニングできることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明のダイオキシン類測定用形質転換体の一例を示す模式概念図である。
【図２】発現検出用ベクター、ダイオキシン受容体、核トランスロケーター遺伝子発現ベクターを示す模式概念図である。
【図３】レポーター遺伝子アッセイ（トランジェント）による２，３，７，８−ＴＣＤＤの検量曲線を示すグラフである。
【図４】ダイオキシン様活性物質（３−メチルコランスレン）処理により緑色蛍光タンパクを発現している細胞株を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】レポーター遺伝子アッセイ（パーマネント）による２，３，７，８−ＴＣＤＤの検量曲線を示すグラフである。
【図６】実施例３で用いた試料の抽出及びクリーンアップ方法を示すフロー図である。
【図７】ＧＣ−ＭＳ法とレポーター遺伝子アッセイ法の測定値を比較したグラフである。
【符号の説明】
【００７２】
　１…細胞
　２…核
　３…ダイオキシン応答性転写制御領域
　４…レポータータンパク遺伝子
　５…プロモーター
　６…ダイオキシン受容体遺伝子
　７…ダイオキシン受容体核トランスロケーター遺伝子
　８…ダイオキシン受容体遺伝子のｍＲＮＡ
　９…ダイオキシン受容体核トランスロケーター遺伝子のｍＲＮＡ
　１０…レポータータンパク遺伝子のｍＲＮＡ
　１１…形質転換体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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