(57)【要約】【課題】核酸を高精製度で植物体から分離することができる簡便な抽出方法を行い得る試薬及びキットを提供する。【解決手段】植物組織からＤＮＡを抽出する際に用いるＤＮＡ溶出試薬であって、ｐＨ７〜９に緩衝された液からなり、アニオン性界面活性剤及び／又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤と、ポリエーテル系消泡剤とを含む植物ＤＮＡ溶出試薬；及び植物組織からＤＮＡを抽出する際に用いる植物ＤＮＡ抽出キットであって、前記ＤＮＡ溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含む植物ＤＮＡ抽出キット。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織からＤＮＡを抽出する際に用いるＤＮＡ溶出試薬であって、ｐＨ７〜９に緩衝された液からなり、アニオン性界面活性剤及び／又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤と、ポリエーテル系消泡剤とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ溶出試薬。
【請求項２】
前記界面活性剤が、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、リン酸ラウリル、カプリレート塩、コレート塩、スルフォン酸デカン塩及びこれらの混合物からなる群より選択されるアニオン性界面活性剤であり、前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコールビス四酢酸、８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン、８−ヒドロキニリン−５−スルフォン酸、１，１０−フェナントロリン、８−キノリノール、サリチル酸、これらの塩及びこれらの混合物からなる群より選択されるキレート剤であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ溶出試薬。
【請求項３】
植物組織からＤＮＡを抽出する際に用いる植物ＤＮＡ抽出キットであって、請求項１又は２記載のＤＮＡ溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ抽出キット。
【請求項４】
リセート分離用フィルタ、核酸結合性担体の洗浄液、核酸結合性担体から核酸を分離させる分離液、又はこれらの２種以上の組み合わせをさらに含むことを特徴とする請求項３記載の植物ＤＮＡ抽出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物材料から植物ＤＮＡを抽出、精製するための溶出試薬及び抽出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物からその核酸を抽出し精製することは、遺伝子工学等の研究において重要な工程の一つである。このような工程は、多くの場合、数多くの個体について行なわれることが求められるため、その工程はより単純なものであることが好ましい。さらに、このような工程は通常実験室において行なわれるものであるので、実験室において使い勝手がよいものが好ましい。
【０００３】
植物の核酸の抽出方法としては、これまでに数多くのものが知られている。例えば、特許文献１及び２には、核酸を核酸結合性固相担体に結合させてから分離する方法が開示されており、これらの方法ではＤＮＡ及びＲＮＡを効率的に抽出できる。しかしながらこれらの従来の核酸の抽出方法では、試料からの核酸の抽出割合が不充分であるため、さらに核酸の抽出割合が高い抽出方法が求められている。
【０００４】
【特許文献１】
特開平２−２８９５９６号公報
【特許文献２】
特開平１１−１６９１７０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、核酸を高精製度で植物体から分離することができる簡便な抽出方法を行い得る試薬及びキットを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々検討をおこなったところ、植物組織から核酸を溶出させるための試薬の組成を特定のものとし、これを、核酸結合性固相担体を用いる抽出方法に適用することにより、効率的に核酸を抽出しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明によれば、植物組織からＤＮＡを抽出する際に用いるＤＮＡ溶出試薬であって、ｐＨ７〜９に緩衝された液からなり、アニオン性界面活性剤及び／又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤と、ポリエーテル系消泡剤とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ溶出試薬が提供される。
【０００８】
また、本発明によれば、植物組織からＤＮＡを抽出する際に用いる植物ＤＮＡ抽出キットであって、前記ＤＮＡ溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ抽出キットが提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、ｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ７〜８に緩衝された液からなる。具体的にはトリス等の緩衝剤を含み、塩酸等によりこの範囲のｐＨに調整された液とすることができる。本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬中の前記緩衝剤の含有割合の下限値は、２０ｍＭ以上、より好ましくは３０ｍＭ以上とすることができる。上限値は特に限定されないが、通常は５００ｍＭ以下とすることができる。
【００１０】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、アニオン性界面活性剤及び／又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤を含む。前記界面活性剤としては、具体的には例えばラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、リン酸ラウリル、カプリレート塩、コレート塩、スルフォン酸デカン塩、及びこれらの混合物等を挙げることができる。前記界面活性剤の含有割合は、植物ＤＮＡ溶出試薬全量に対して０．１〜１０％とすることができる。
【００１１】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、ポリエーテル系消泡剤を含む。前記ポリエーテル系化合物としては、例えばオキシエチレン、オキシプロピレン等の重合単位を持つ重合体又はその誘導体を挙げることができる。
【００１２】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、必要に応じてキレート剤を含むことができる。前記キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコールビス四酢酸、８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン、８−ヒドロキニリン−５−スルフォン酸、１，１０−フェナントロリン、８−キノリノール、サリチル酸、これらの塩及びこれらの混合物等を挙げることができる。本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬中の前記キレート剤の含有割合は、１０〜５０ｍＭ、好ましくは２０〜３０ｍＭとすることができる。
【００１３】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬の調製方法は、特に限定されず、上記各成分を水に溶解することにより調製することができる。
【００１４】
本発明の植物ＤＮＡ抽出キットは、前記ＤＮＡ溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含む。
【００１５】
前記核酸吸着液は、カオトロピック物質として、グアニジンの塩（チオシアン酸塩、塩酸塩等）、並びにＳＣＮ−及びＩ−の塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）等を含むことができる。前記核酸吸着液中の前記カオトロピック物質の含有割合は、１Ｍ〜２０Ｍ、好ましくは５〜１５Ｍとすることができる。
【００１６】
前記核酸吸着液は、さらに、ｐＨを一定とするための緩衝剤を含むことができる。当該緩衝剤としては、酢酸ナトリウム緩衝剤等を挙げることができる。
【００１７】
前記核酸結合性担体は、通常固相の担体とすることができ、好ましくは細胞の溶解液を容易に接触させることができる磁性粒子等の粒子、フィルタ、反応容器等の形状とすることができる。前記担体の材質は、カオトロピック物質の存在下でＤＮＡを吸着することができるものであれば特に限定されないが、核酸吸着能を有するものであれば特に限定されないが、シリカ、又は他の物質上にシリカを結合させたもの等を好ましく挙げることができる。
【００１８】
本発明の植物ＤＮＡ抽出キットは、前記試薬、吸着液及び担体に加え、任意に、リセート分離用フィルタ、核酸結合性担体の洗浄液、核酸結合性担体から核酸を分離させる分離液又はこれらの２種以上の組み合わせをさらに含むことができる。前記リセート分離用フィルタは特に限定されず、現在商業的に入手可能なリセートのクリーニング用のフィルタ等を挙げることができる。前記核酸結合性担体の洗浄液は、固相からのＤＮＡの溶出を促進せずに他の物質を担体から洗い落とすことができる物質であれば特に限定されず、４０〜８０％、好ましくは約７０％エタノール等のアルコール等を含む水溶液を挙げることができる。前記分離液は、前記核酸結合性担体に結合したＤＮＡを核酸結合性担体から分離しうる液体であり、水又は適当なｐＨの緩衝液を適宜用いることができる。具体的には例えば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、含１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を挙げることができる。
【００１９】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬又は本発明の植物ＤＮＡ抽出キットによる植物ＤＮＡの抽出は、具体的には例えば、前記植物ＤＮＡ溶出試薬を植物組織に混合して植物組織中の細胞を溶解させ、細胞溶解液を得る工程（ａ）と；前記細胞溶解液に、前記カオトロピック物質を含む核酸吸着液を混合し、混合液を得る工程（ｂ）と；前記混合液を、必要に応じて前記リセート分離用フィルタに通す工程（ｂ’）と；前記混合液を前記核酸結合性担体に接触させて、前記担体にＤＮＡを結合させる工程（ｃ）と；前記核酸結合性担体上のＤＮＡを、前記洗浄液を用いて洗浄する工程（ｄ）と；前記核酸結合性担体からＤＮＡを分離する工程（ｅ）とを含む方法により行なうことができる。
【００２０】
前記工程（ａ）における前記ＤＮＡ溶出試薬と植物組織との添加割合は、特に限定されないが、例えば５０ｍｇの植物組織に対し、５０〜２５０μｌの割合とすることができる。
【００２１】
前記工程（ａ）は、適当なチューブ等の容器に、前記ＤＮＡ溶出試薬と植物組織とを入れ、さらに破砕球を入れて振とうすることにより行なうことができる。前記破砕球としては、セラミック、タングステン、ステンレス、ジルコニア等の球状又は歪んだ球状のビーズ等を用いることができる。破砕球の寸法は特に限定されないが、例えば内径５ｍｍ程度のチューブ中で破砕を行なう場合、直径４ｍｍ程度の破砕球１個を入れて行なうことができる。
【００２２】
特に前記工程（ａ）は、添加するＤＮＡ溶出試薬の一部を先に植物組織と混合し、破砕球等により破砕し、それからＤＮＡ溶出試薬の残りを添加することにより行なうことができる。具体的には例えば、約１００μｌのＤＮＡ溶出試薬と植物組織とをチューブ等の容器に入れ、振とうを行なってから、さらに約１００μｌのＤＮＡ溶出試薬を混合することができる。このように、先に比較的少量の溶出試薬によって、より短時間の破砕操作で、ＤＮＡに物理的な切断をもたらさずに、効率的に破砕を行なうことができる。
【００２３】
前記工程（ｂ）において、前記核酸吸着液の添加量は、特に限定されないが植物組織５０ｍｇに対し、１５０〜２５０μｌの割合とすることができる。前記工程（ｂ）終了後、得られた混合液は、一旦遠心分離し上澄のみを取ってから次の操作に供することが好ましい。
【００２４】
前記工程（ｂ’）において、前記混合液をリセート分離用フィルタに通す操作は、特に限定されないが、底部がフィルタとなったウェルの形状を有するものなどの通常のフィルタに前記混合液を入れ、遠心することにより行なうことができる。
【００２５】
また、前記工程（ｃ）において、前記混合液を前記核酸結合性担体に接触させる操作は、特に限定されないが、前記分離用フィルタを通過した前記混合液をそのまま、核酸結合性担体のフィルタに通過させることにより行うことができる。
【００２６】
前記工程（ｄ）において、前記核酸結合性担体上のＤＮＡを、前記洗浄液を用いて洗浄する操作は、特に限定されないが、例えば前記洗浄液を、５０ｍｇの植物組織に対し５０〜２５０μｌ程度核酸結合性担体のフィルタに通過させることにより行うことができる。
【００２７】
前記工程（ｅ）において、前記核酸結合性担体から前記ＤＮＡを分離する操作は、前記分離液を前記核酸結合性担体のフィルタに通し、通過した液をＤＮＡ溶液として回収することにより行なうことができる。ここで得られたＤＮＡ溶液は、そのまま、ＰＣＲテンプレート等として用いることができる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬、植物ＤＮＡ抽出キット及び植物ＤＮＡの抽出方法は、特定の組成の溶出試薬を採用することにより、ＤＮＡを簡便且つ効率的に抽出することができる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００３０】
【実施例１及び比較例１】
表１に示す組成の植物ＤＮＡ溶出試薬１（実施例１）及び２（比較例１）、並びに表２に示す核酸吸着液１を、各成分を蒸留水に溶解することにより調製した。
【００３１】
【表１】
2004290028.tif 000002
【００３２】
【表２】
2004290028.tif 000003
【００３３】
【実施例２】
実施例１にて調製した溶出試薬１及び核酸吸着液１を用いて、以下の手順（ａ）〜（ｅ）により、表３及び表４に示す各種の植物試料について、ＤＮＡの抽出を行なった。
【００３４】
（ａ）シロイヌナズナ（コロンビア野生型）成熟植物個体普通葉  ５０ｍｇとジルコニアビーズ（直径４ｍｍ）一つを、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｓ  （Ｑｉａｇｅｎ社製、商品番号１９５６０）の各チューブに入れた。２００μｌの溶出試薬１を、各チューブに加え、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ  Ｃａｐｓ  （Ｑｉａｇｅｎ社製、商品番号１９５６６）で蓋をし、ミキサーミル（Ｑｉａｇｅｎ社製、商品名ＭＭ３００、商品番号８５１００）で、３０  １／ｓにて１．５分間撹拌した。植物試料が完全に粉砕されるまで、この撹拌を最大４回繰返し、細胞溶解液を得た。
【００３５】
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞溶解液に、核酸吸着液１を２００μｌ添加し、手で激しく撹拌し、遠心機（商品名ＣＦ１６ＲＸ、日立製作所製、スイングバケットローターＴ５Ｓ３２を備える）を用い、４８００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みを得、混合液とした。
【００３６】
（ｃ）リセートのクリーニング用のフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品名ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＮＡ）を、核酸結合性担体フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品名ＭｕｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＦＢ）上に、遠心分離用アダプタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品番号ＭＡＣＦ  ０９６  ０４）を用いてセットし、フロースルーコレクションプレート上に置いた。（ｂ）で得た上澄み２００μｌをクリーニング用フィルタの各ウェル上に置き、２分間１００ｒｐｍで遠心し、リセートをフィルタに通した。
【００３７】
（ｄ）クリーニング用フィルタを取り除き、核酸結合性担体フィルタの各ウェル上に２００μｌの７０％エタノール水溶液を加え、１５００ｒｐｍで２分間遠心し、フィルタを通過した液を廃棄した。
【００３８】
（ｅ）核酸結合性担体フィルタの各ウェルに、６０℃に加温した５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）を加え、１分間放置した。核酸結合性担体フィルタを９６ウェルＶボトムプレートに、遠心アダプタを用いて取り付け、２０００ｒｐｍで１分間遠心し、Ｖボトムプレート中に、植物ＤＮＡ抽出物溶液を得た。
【００３９】
得られた植物ＤＮＡ抽出物溶液について、ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）を測定し、収量（μｇ）を求め、また、核酸の純度の指標であるＯＤ２６０／２８０を測定した。測定はそれぞれ４検体について行ない、平均を求めた。結果を表３に示す。
【００４０】
【比較例２】
溶出試薬として比較例１にて調製した溶出試薬２を用いた他は、実施例２と同様にして、ＤＮＡの抽出を行なった。結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
2004290028.tif 000004
【００４２】
表３に示す通り、ＤＮＡの収量、品質ともに実施例２の方が比較例２より好成績であり、収量は約３４％向上した。