(57)【要約】【課題】精子形成過程における未分化幹細胞である精原細胞を大幅に増殖させる方法を提供する。【解決手段】非ヒト哺乳動物の精細管に、ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを導入するか、またはＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを導入した細胞と精原細胞とを供培養する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物の精細管に、ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを導入することを特徴とする精原細胞の増殖方法。
【請求項２】
ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを導入した細胞と精原細胞とを供培養することを特徴とする精原細胞の増殖方法。
【請求項３】
ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドが精細管に導入され、精細管内において増殖した精原細胞を有することを特徴とする非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
請求項３の非ヒト哺乳動物の精細管から単離された精原細胞。
【請求項５】
請求項２の方法によって増殖された精原細胞。
【請求項６】
請求項４または５の精原細胞の遺伝子が人為的に改変された遺伝子改変精原細胞。
【請求項７】
請求項６の遺伝子改変精原細胞を精細管に移植された非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
請求項７の非ヒト哺乳動物の子孫動物である遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
被験物質の雄性生殖能力に対する毒性または変異原性を試験する方法であって、請求項４または５の精原細胞に被験物質を接触させ、当該細胞の変化を試験することを特徴とする方法。
【請求項１０】
被験物質に接触させた精原細胞を非ヒト哺乳動物の精細管に移植し、動物個体内における精原細胞の変化を試験する請求項９方法。
【請求項１１】
精原細胞の増殖促進因子をスクリーニングする方法であって、ＧＤＮＦの産生および／または活性の促進に関連する候補物質を非ヒト哺乳動物の精細管に導入し、精原細胞を増殖させる候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
【請求項１２】
精原細胞の増殖促進因子をスクリーニングする方法であって、ＧＤＮＦの産生および／または活性の促進に関連する候補物質を細胞に導入し、この細胞と精原細胞とを供培養し、精原細胞を増殖させる候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
【請求項１３】
精原細胞の増殖抑制因子をスクリーニングする方法であって、ＧＤＮＦの産生および／または活性の抑制に関連する候補物質を非ヒト哺乳動物の精細管に導入し、精原細胞の増殖を抑制する候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
【請求項１４】
精原細胞の増殖抑制因子をスクリーニングする方法であって、ＧＤＮＦの産生および／または活性の抑制に関連する候補物質を細胞に導入し、この細胞と精原細胞とを供培養し、精原細胞の増殖を抑制する候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ＧＤＮＦ（Ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｕｅｒｏｔｒｉｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ：グリア細胞株由来神経栄養因子）の新規な機能を利用した精原細胞（未分化生殖幹細胞）のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖方法と、これらの方法によって増殖した精原細胞の利用発明に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
体細胞生物の雄性配偶子である精子は、始原生殖細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞を経て形成される。このような精子形成において、精原細胞から以降の過程は精巣（睾丸）の精細管内で行われることから、精原細胞が精子形成の開始段階の細胞（生殖幹細胞：ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）と位置づけられている。
【０００３】
幹細胞の自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）および分化の調節は、発生生物学および医学的応用研究の双方において活発に討議されている話題であり（例えば、非特許文献１−４）、特に哺乳類の生殖幹細胞（精原細胞）系は好適なモデルと考えられる（非特許文献３、５、６）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ，  Ｒ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１４，  ８８−９１．
【非特許文献２】
Ｄｏｎｏｖａｎ，  Ｐ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｇｅａｒｈａｒｔ，  Ｊ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１４，  ９１−９７．
【非特許文献３】
Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１４，  ９１−１０４．
【非特許文献４】
Ｂｌａｕ，  Ｈ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｅｌｌ，  １０５，  ８２９−８４１．
【非特許文献５】
Ｏｈｔａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，  ２１２５−２１３１．
【非特許文献６】
Ｔａｄｏｋｏｒｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  １１３，  ２９−３９．
【非特許文献７】
Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ａｖａｒｂｏｃｋ，  Ｍ．  Ｒ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  １１３０３−１１３０７）
【非特許文献８】
Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９６，  ５５０４−５５０９．
【非特許文献９】
Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９７，  ８３４６−８３５１．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、精原細胞は発生生物学等の基礎研究分野や医学応用研究分野等において有用な研究材料であるが、精細管内における精原細胞の数量が極めて少量であることが研究の妨げとなっている（非特許文献７−９）。
【０００６】
この出願の発明は、従って、非ヒト哺乳動物の精原細胞を大量に増殖させる方法を提供することを第１の課題としている。
【０００７】
また、この出願の発明は、前記方法によって大量に増殖された精原細胞に関する各種利用発明を提供することを課題としてもいる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の発明（１）および（２）を提供する。
（１）    非ヒト哺乳動物の精細管に、ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを導入することを特徴とする精原細胞の増殖方法。
（２）    ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを導入した細胞と精原細胞とを供培養することを特徴とする精原細胞の増殖方法。
【０００９】
またこの出願は、前記発明（１）に関連する発明として、以下の発明（３）および（４）を提供する。
（３）    ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドが精細管に導入され、精細管内において増殖した精原細胞を有することを特徴とする非ヒト哺乳動物。
（４）    前記発明（２）の非ヒト哺乳動物の精細管から単離された精原細胞。
【００１０】
さらにこの出願は、前記発明（２）に関連して、以下の発明（５）を提供する。
（５）    前記発明（２）の方法によって増殖された精原細胞。
【００１１】
さらにまたこの出願は、前記発明（１）〜（５）に関連して、以下の発明（６）〜（１４）を提供する。
（６）    前記発明（４）または（５）の精原細胞の遺伝子が人為的に改変された遺伝子改変精原細胞。
（７）    前記発明（６）の遺伝子改変精原細胞を精細管に移植された非ヒト哺乳動物。
（８）    前記発明（７）の非ヒト哺乳動物の子孫動物である遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
（９）    被験物質の雄性生殖能力に対する毒性または変異原性を試験する方法であって、前記発明（４）または（５）の精原細胞に被験物質を接触させ、当該細胞の変化を試験することを特徴とする方法。
（１０）  被験物質に接触させた精原細胞を非ヒト哺乳動物の精細管に移植し、動物個体内における精原細胞の変化を試験する前記発明（９）の方法。
（１１）  精原細胞の増殖促進因子をスクリーニングする方法であって、ＧＤＮＦの産生および／または活性の促進に関連する候補物質を非ヒト哺乳動物の精細管に導入し、精原細胞を増殖させる候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
（１２）  精原細胞の増殖促進因子をスクリーニングする方法であって、ＧＤＮＦの産生および／または活性の促進に関連する候補物質を細胞に導入し、この細胞と精原細胞とを供培養し、精原細胞を増殖させる候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
（１３）  精原細胞の増殖抑制因子をスクリーニングする方法であって、ＧＤＮＦの産生および／または活性の抑制に関連する候補物質を非ヒト哺乳動物の精細管に導入し、精原細胞の増殖を抑制する候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
（１４）  精原細胞の増殖抑制因子をスクリーニングする方法であって、ＧＤＮＦの産生および／または活性の抑制に関連する候補物質を細胞に導入し、この細胞と精原細胞とを供培養し、精原細胞の増殖を抑制する候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
【００１２】
すなわちこの出願の発明者らは、マウス精巣の精細管にポリヌクレオチド（遺伝子ｃＤＮＡ）を微量注入して電気穿孔法により当該ｃＤＮＡをセルトリ細胞に取り込ませると、ｃＤＮＡは１年余りの長期にわたって安定して細胞内に存在し、これがコードする遺伝子産物を発現し続けることを既に報告している（Ｙｏｍｏｇｉｄａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ６７，  ７１２−７１７）。発明者らはさらに、ＧＤＮＦタンパク質（グリア細胞株由来神経栄養因子）それ自体を培養細胞に添加し、この培養細胞と精原細胞とを供培養すると、精原細胞の増殖が一過性に促進することを示唆する知見を得ている（Ｔａｄｏｋｏｒｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  １１３，  ２９−３９）。
【００１３】
そこでこの出願の発明者らは、前記と同様の方法によってＧＤＮＦｃＤＮＡを精細管に導入してセルトリ細胞に取り込ませた結果、以下の新規な知見を得た：
（ａ）    ＧＤＮＦタンパク質がセルトリ細胞で安定に発現し、その刺激によって、正常な動物の精原細胞に比較して、約１０００倍にもなる膨大な未分化生殖幹細胞（精原細胞）が増殖すること；
（ｂ）    増殖した精原細胞は、正常な精子形成に向かう細胞分化が障害を受けていること；および
（ｃ）    増殖した精原細胞は、正常な環境下（正常な動物の精細管への移植）では精子形成能を回復し、正常な精子へと分化すること。
【００１４】
前記発明（１）〜（５）は、以上のとおりの新規な知見に基づいて完成された。
【００１５】
また、発明（６）〜（１４）は、発明（１）〜（５）を必須とする利用発明であって、それぞれ以下の産業上の有用性を有している。
（ｉ）    遺伝子改変動物の作出
外来遺伝子を体細胞ゲノムに安定導入した動物個体（トランスジェニック動物）や、体細胞ゲノムの特定遺伝子を機能欠損させた動物個体（ノックアウト動物）は、医学生物学研究における不可欠の実験系であるばかりか、有用家畜の作出や生物製剤の生産等においても極めて重要な手段となっている。しかしながら、従来のトランスジェニック動物やノックアウト動物の作出方法は、かなりの技術的熟練を要し、時間的にも経済的にも多くの制約を必要とした。特に遺伝子改変の対象材料となる受精卵やＥＳ細胞を多量に入手することは容易ではなかった。
【００１６】
前記発明（６）〜（８）は、大量に増殖させた精原細胞を利用することによって、簡便かつ安価に作出することのできる遺伝子改変動物と、そのための材料を提供する。
（ｉｉ）  生殖障害因子の検定方法
日本をはじめとした欧米先進諸国では全夫婦の約１０％が何らかの形態の不妊問題を経験していることが知られており、これらの約半数が男性側の因子に起因している可能性がある。男性不妊の原因の一部として示唆されているのは、内分泌障害、染色体異常を含む遺伝的因子、環境因子、停留精巣や精索静脈瘤を含む奇形などであるが（Ｒｕｂｉｏ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００１；  １０：  ２０８４−２０９２；  Ｌｅｅ  ＰＡ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ  Ｕｒｏｌ．，  １６４（５），  １６９７−１７０１）、実際の原因の大半は不十分な精子形成や精子欠失である。そして、このような精子形成不全や精子欠失の原因の一つとして、環境内の内分泌攪乱物質（ｅｎｄｏｃｒｉｏｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒｓ）の存在が指摘されている。しかしながら、そのような内分泌攪乱物質に対する高精度の検定は極めて困難であった。
【００１７】
さらに、医薬品、化学薬品、化学品、化学物質等に関する従来の「生殖に及ぼす影響」の試験は、実験動物個体を用いた催奇性を指標とする試験にほとんどが依存している。しかしながら、このような動物実験による催奇性試験の場合には、多大な時間、手間、費用を要するといった問題を有している。また、催奇個体の発生原因として様々な要因の介在が想定されるため、精子形成の不全や精子欠失に対する被験物質の作用を特定することが困難であった。
【００１８】
従って、内分泌攪乱物質や化学物質等の精子形成不全や精子欠失の原因となる因子（生殖障害因子）を簡便かつ高精度に特定するための新しい手段が待望されている。
【００１９】
発明（９）および（１０）は、精子形成における未分化幹細胞であって、生殖障害因子の影響を最も顕著に反映する精原細胞が大量に利用可能となることによって実現された発明であり、生殖障害因子を検定するための全く新しい手段を提供する。
（ｉｉｉ）    不妊治療薬および避妊薬の有効成分のスクリーニング
欧米先進諸国における不妊と、一方で開発途上国における人口増大はそれぞれ深刻な問題であり、有効かつ安全な不妊治療薬および避妊薬の開発が望まれている。
【００２０】
前記のとおり、ＧＤＮＦタンパク質の精細管における過剰発現、あるいはＧＤＮＦを過剰発現する細胞との供培養によって精原細胞が爆発的に増殖することから、ＧＤＮＦの産生および／または活性の促進物質を特定することができれば、精原細胞の増殖不全による不妊症治療薬の開発に新たな途が拓ける。
【００２１】
一方、ＧＤＮＦタンパク質の過剰発現は精原細胞の精子への分化を抑制することから、ＧＤＮＦ活性の促進物質は精子形成を抑制することを作用機序とする避妊薬の有効成分としても有望である。
【００２２】
さらに、ＧＤＮＦ活性の抑制物質は、精原細胞の増殖を抑制することによって避妊薬の有効成分となり、あるいは精子形成を促進することによって不妊治療薬の有効成分となり得る。
【００２３】
前記発明（１１）〜（１４）は、以上のとおりの不妊治療薬および避妊薬の有効成分を特定するためのスクリーニング方法を提供する。
【００２４】
以下、この出願の実施形態を詳しく説明する。なお、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５）等に記載されている。
【００２５】
【発明の実施の形態】
発明（１）は、非ヒト哺乳動物の精細管に、ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを導入することを特徴とする精原細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖方法である。
【００２６】
「非ヒト哺乳動物」としては、マウス、ラット、ネコ、イヌ等の一般的な実験動物のほか、ブタ、ウシ、ウマ等の家畜動物等を対象とすることができるが、これらに限定されるものではなく、精原細胞の増殖が求められるあらゆる種類の哺乳動物を対象とすることができる。
【００２７】
「ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチド」は、全ての動物種に存在するＧＤＮＦタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ、ＲＮＡ等を意味する。例えば、ヒトＧＤＮＦ  ｃＤＡＮ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，  Ｓ．  （１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８，  ５２３３：  Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｌ１９０６３）、マウスＧＤＮＦ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｕ６６１９６）等が公知であり、これらの既知配列に基づいて作成したプローブＤＮＡを用いて、ヒトおよびマウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、それぞれのＧＤＮＦ  ｃＤＮＡを取得することができる。また、この既知配列に基づいて作成したプライマーセットを用い、哺乳動物細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても目的とするｃＤＮＡを得ることができる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００２８】
得られたｃＤＮＡは、適当な発現ベクターに組み替え、文献（Ｙｏｍｏｇｉｄａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ６７，  ７１２−７１７）の記載に従って動物の精巣の精細管に導入し、電気穿孔法によりセルトリ細胞細胞に導入することができる。
【００２９】
セルトリ細胞に導入（トランスフェクション）されたＧＤＮＦ  ｃＤＮＡは細胞内で長期にわたってＧＤＮＦタンパク質を安定に発現し、このタンパク質が精原細胞を刺激してその増殖を著しく増加させる。具体的には、ＧＤＮＦタンパク質を過剰発現していない正常な動物に比較して、約５００〜１，０００倍の精原細胞を有する動物個体が得られる（発明（３））。またこのような動物の精原細胞は、精子への分化能を著しく低下させているため、長期間（約１年間）にわたって増殖した精原細胞を保有する。そして、このような発明（３）の動物からは、通常の方法によって、大量に増殖した精原細胞（発明（４））を単離することができる。
【００３０】
発明（２）の方法は、ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを導入した細胞と精原細胞とを供培養することによって精原細胞を大幅に増殖させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。細胞は、例えば精原細胞と同一動物種由来のセルトリ細胞やその他の体細胞、あるいはそれらの培養細胞株等を使用することができる。そして、例えばＧＤＮＦ  ｃＤＮＡの発現ベクターを通常の方法（例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など）によって細胞に導入し、この遺伝子導入細胞と精原細胞とを供培養する。培養条件は、通常の動物細胞の培養と同一とすることができる。この方法によって、細胞から過剰発現するＧＤＮＦタンパク質が精原細胞を刺激し、精原細胞は培養条件化において通常の約５００〜１，０００倍に増殖する。
【００３１】
以上のとおりに発明（３）の動物から単離された精原細胞（発明（４））と、発明（２）の方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖された精原細胞（発明（５）は、正常な精原細胞と同様に培養条件下で保存することができ、また培養条件下で各種の試験を行うことや、培養条件下でその遺伝子を改変するなどすることができる。
【００３２】
発明（６）は、前記発明（４）または（５）の精原細胞の遺伝子が人為的に改変された遺伝子改変精原細胞である。この場合の遺伝子改変は、具体的には、精原細胞のゲノムＤＮＡに外来遺伝子を導入する改変（トランスジェニック）、および精原細胞のゲノムＤＮＡの任意遺伝子を機能欠損する改変（遺伝子ノックアウト）である。
【００３３】
このような遺伝子改変は、通常のトランスジェニック動物やノックアウト動物の作出技術（例えば、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｌ．  ＵＳＡ  ７７；７３８０−７３８４，  １９８０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２，  １９８９等）におけるトランスジェニックベクターやターゲッティングベクターを精原細胞に導入することによって行うことができる。ベクターの導入は、例えば生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等を用いて行うことができる（例えば、Ｎａｇａｎｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＦＥＢＳ，  ５２４，  １１１−１１５）。また、目的とする遺伝子改変を伴う精原細胞の選択は、例えばベクターに選択マーカー（例えば薬剤耐性遺伝子等）を付加する方法等により行うことができる。
【００３４】
以上の方法によって遺伝子改変された精原細胞を、動物の精細管に通常の方法で移植することによって、発明（７）の非ヒト哺乳動物が得られる。なお、この発明の方法によって増殖された精原細胞の高増殖能と低分化能は可逆的であり、これを放射線照射や薬剤処理等により内在性の精細胞を除去した動物の精巣に移植すると、精原細胞の増殖は抑制され、精子へと分化し、動物は移植後約２ヶ月で生殖能力を獲得する。従って、遺伝子改変精原細胞を移植された動物個体は正常な生殖能を有しており、雌性動物と交配させることによって、改変遺伝子を２倍体染色体の一方に有する初代のヘテロ接合体動物が得られ、このヘテロ接合体同士を交配することによってホモ接合体動物が得られる。この発明の遺伝子改変動物には、初代ヘテロ接合体動物、ヘテロ接合体同士を交配して得られるホモ接合体動物、それらの子孫動物、またはそれらの胎児が含まれる。
【００３５】
発明（９）は、被験物質の雄性生殖能力に対する毒性または変異原性を試験する方法であって、前記発明（４）または（５）の精原細胞に被験物質を接触させ、当該細胞の変化を試験することを特徴とする方法である。
【００３６】
この発明（９）において、「毒性または変異原性」とは、精子形成過程に障害を及ぼす作用、または形成された精子の機能（生殖機能）に対して障害を及ぼす作用等を言う。また、検査対象となる物質は、内分泌攪乱物質として候補に挙げられている公知の物質、開発途上の新薬や環境汚染の被疑化学品等である。さらに、「精原細胞の変化」とは、例えば、細胞の形態、細胞増殖の程度、代謝活性、遺伝子の発現、遺伝子の変異等である。この場合の遺伝子としては、精子形成に関わる遺伝子等を対象とすることができ、例えば、この出願の発明者らによって報告されている以下の文献（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｎｄｒｏｌ．  ２０：  ３６１−３６６，  １９９７；  Ｇｅｎｅ  ２０４：  １５９−１６３，  １９９７；  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６：１３８−１４２，  １９９７；  Ｍａｍｍａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  ８：  ８７３−８７４，  １９９７；  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｔ．  ７８：  １０３−１０４，  １９９７；  Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：  ６０７−６１１，  １９９７；  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １９７：  ６７−７６，  １９９８；  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ  ５８：  ２６１−２６５，  １９９８；  Ｇｅｎｅ  ２３７：  １９３−１９９，  １９９９；  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：  １７０４９−１７０５７，  １９９９；  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４５６：  ３１５−３２１，  １９９９；  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５７：  ９４−１０１，  １９９９；  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ６２：  １６９４−１７０１，  ２０００；  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ６３：  ９９３−９９９，  ２０００；  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ５：２６５−２７６，  ２０００；  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ６３：  １６０１−１６０９，  ２０００；  Ｇｅｎｅ  ２６７：  ４９−５４，  ２００１；  Ｍｏｌ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．  ７：  ２１１−２１８，  ２００１）等に記載された遺伝子を対象として検査をすることができる。
【００３７】
具体的な手続きとしては、第１には、培養条件下の精原細胞に対して候補物質を接触させ、培養条件下の細胞の変化を観察する。
【００３８】
第２の態様としては、被験物質に接触させた精原細胞を非ヒト哺乳動物の精細管に移植し、動物個体内における精原細胞の変化を試験する（発明（１０）の方法）。この場合、精原細胞それ自体の変化だけでなく、例えば精原細胞から分化した精子の変化、動物個体を雌性動物と交配させた場合の妊よう性、あるいはそれによって出生した子孫動物の変化等を検査対象とすることもできる。
【００３９】
発明（１１）は、精原細胞の増殖促進因子をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｖｏ方法である。前記のとおり、精細管に導入されたＧＤＮＦタンパク質は精原細胞を著しく増殖させることから、このＧＤＮＦタンパク質の活性に正の作用を有する物質はＧＤＮＦタンパク質と同様に精原細胞の増殖促進因子として機能するものと見なすことができる。そのような物質の候補としては、例えば、ＧＤＮＦ受容体に直接またはそのシグナル伝達の過程に関与する天然の因子（タンパク質等）、もしくはそれらをコードするポリヌクレオチド、あるいはそれらと類似の働きをする化合物等である。さらに具体的には、ＧＤＮＦタンパク質の一部分を構成するペプチドまたはペプチド誘導体、ＧＤＮＦレセプターであるＧＦＲアルファー１と親和性を有する化合物、ＧＤＮＦコレセプターＲｅｔの活性化に働く因子、Ｒｅｔのシグナル伝達の下流に位置し、精原細胞特異的シグナル伝達に関与する因子、その機能を修飾する物質等である。
【００４０】
発明（１２）の方法は、精原細胞の増殖促進因子をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。前記発明（２）の方法と同様の細胞に、前記発明（１１）と同様の候補物質を接触させ、あるいは候補物質をコードするポリヌクレオチド等をトランスフェクションして精原細胞と供培養し、精原細胞の増殖を促進させる物質を特定する。
【００４１】
なお、これらの発明（１１）および（１２）において、精原細胞に対する候補物質の増殖促進効果は、ＧＤＮＦタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで過剰発現させた場合の精原細胞増殖の程度を正のコントロールとして判定することができる。例えば、ＧＤＮＦを過剰発現させた場合の精原細胞増殖の程度と比較して、４０％、好ましは３０％、さらに好ましくは２０％程度の相違で精原細胞を増殖させる候補物質を、目的の物質として特定することができる。
【００４２】
発明（１３）は精原細胞の増殖抑制因子をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｖｏ方法であり、発明（１４）はｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である。候補物質として、例えば前記発明（１１）および（１２）における候補物質に対する拮抗物質等を対象として、それぞれ発明（１１）および（１２）と同様にして行うことができる。
【００４３】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例に限定されるものではない。
【００４４】
【実施例】
１．方法
１−１．ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔
未分化の精原細胞に対する直接的なＧＤＮＦの影響を検討するため、ＥＧＦＰリポーター遺伝子をもつヒトＧＤＮＦの発現ベクターを、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法（Ｙｏｍｏｇｉｄａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ６７，  ７１２−７１７）を用いて１２日齢のＣ５７ＢＬ／６マウス精巣のセルトリ細胞内へトランスフェクトした。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔は、３種類の環状形発現ベクター：ｐＣＸＮ−ＥＧＦＰ（Ｏｋａｂｅ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  ＦＥＢＳ，  ４０７，  ３１３−３１９）、ヒトＧＤＮＦ発現ベクター（Ｍｅｎｇ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８７，  １４８９−１４９３）、および対照としてインサートｃＤＮＡを含まないベクターを使用して行った。注入用のすべてのベクターＤＮＡは、０．０４％のトリパンブルーを含む１  ｍｇ／ｍｌ濃度のＴＥ緩衝液中に溶解した。色素の色によって容易にチェック可能なＤＮＡ溶液を用いて精細管を８０％以上満たし、文献（Ｙｏｍｏｇｉｄａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ６７，  ７１２−７１７）の記載に従って一対のピンセット型電極を用いた電気パルス発生器によりベクターＤＮＡを導入した。
１−２．組織学的分析
ＥＧＦＰ標識された細胞を含む精巣を、蛍光立体顕微鏡を用いて、ＵＶの励起光下で観察した。精巣は４％パラホルムアルデヒドで固定し、メタクリル酸グリコール中に包埋し、厚さ５μｍの切片に切断し、蛍光顕微鏡下で観察した。ＧＦＰ蛍光を撮影した後、同じ切片をヘマトキシリンで染色し、光学顕微鏡下で観察した。
【００４６】
免疫組織化学用には、マウス精巣をブアン液または４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンまたはメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）樹脂中に包埋した。切片（５μｍ）からパラフィンまたはＭＭＡ樹脂を除去した後、ＴＲＡ９８ラットモノクローナル抗体（Ｔａｎａｋａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｎｄｒｏｌ．，  ２０，  ３６１−３６６）（１：５００）、抗ｃ−ｋｉｔ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，  Ｉｎｃ．）（１：１００）、抗ＧＦＲα−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，  Ｉｎｃ．）（１：５０）、および抗ＰＣＮＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，  Ｉｎｃ．）（１：４００）とともに、４℃において８または４８時間インキュベートした。シグナルは、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ラットＩｇＧ、またはアビジン／ビオチン結合ＨＲＰ複合体を、ジアミノベンジジンまたはストレプトアビジン、Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＲ  ５６８結合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともに用いて検出した。
１−３．生殖細胞移植およびコロニー形成アッセイ
文献（Ｏｈｔａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，  ２１２５−２１３１）の記載に従い、ＥＧＦＰトランスジェニックマウスに実験的停留精巣症を生後２ヶ月の時点で行い、手術の２ヵ月後、これらのマウスの人工的に誘導された停留精巣症の精巣に、ｈＧＤＮＦ  ｃＤＮＡを上述のように電気穿孔した。対照マウスは無処理とした。４週間後、マウスの精巣を分析した。さらに、精巣細胞（１ｘ１０４）を、文献（Ｏｈｔａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｄｅｖｅｌｏｐ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，  ４２，  １０５−１１２）の記載に従い、ブスルファンにより内在性の生殖細胞が除去されたレシピエントマウス精巣の精細管内に移植した。グリーン蛍光コロニーを数えるため、移植された精巣を移植の８週間後に蛍光顕微鏡下で観察した。
２．結果
電気穿孔の４週間後、ノーザンブロット法（図１ａ）ならびにウェスタンブロット分析法（図１ｂ）により、導入遺伝子の豊富な発現が検出された。精巣のセルトリ細胞内へのｃＤＮＡの効率的なトランスフェクションが、ＥＧＦＰ蛍光により励起光下で容易に検出された（図１ｃ）。発現ベクターのコトランスフェクションもまた、ＥＧＦＰの蛍光により検出され得ることが期待された。対照としてＥＧＦＰリポーター遺伝子のみを用いて電気穿孔した精巣の横断面では、正常な精子形成を伴う蛍光ポジティブなセルトリ細胞が観察された（図１ｄ、左）。対照的に、ＧＤＮＦ  ｃＤＮＡをトランスフェクトした精巣において、蛍光のあるセルトリ細胞と会合した多数の未分化な精原細胞のクラスターを同定することができた。この細胞クラスターは精細管の内腔に向けて積み重なり、いくつかのＡ型精原細胞は、蛍光ポジティブなセルトリ細胞近くの細管の壁に沿って観察された（図１ｄ、右）。精子形成は、精細管の様々な場所において妨げられた（図１ｄ、２Ａ）。蛍光セルトリ細胞をもたない少数の精細管が正常な精子形成を行なっていたことから（図１ｄ右、星印）、セルトリ細胞内へ電気穿孔されたｈＧＤＮＦは、生殖細胞分化の妨害を誘導するための原因因子であると想定される。
【００４７】
ｈＧＤＮＦによって引き起こされる精細管内の未分化精原細胞の増加を確認するため、未分化精原細胞の細胞表面上のＧＤＮＦ受容体、ＧＦＲ−α１およびｒｅｔ（Ｔａｄｏｋｏｒｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  １１３，  ２９−３９）の発現を調べた。クラスターを形成した全ての細胞と、精細管壁に沿った一列に続く精原細胞は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）（図２ｈ）とともに、双方の受容体を発現していた（図２ｆ〜ｇ）。これらの結果は、ＧＤＮＦ刺激によりそれらの細胞が活発に増殖したが、その分化は損なわれ、その結果トランスフェクトされた精巣のサイズがより小さくなったことを示している（図１ｃ）。
【００４８】
増殖中の細胞は、形態学的にはＡ型精原細胞として分類された（図２ａ）。実際に、クラスター内のすべての細胞は、生殖細胞特異モノクローナル抗体、ＴＲＡ９８（Ｔａｎａｋａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｎｄｒｏｌ．，  ２０，  ３６１−３６６）により確認され（図２ａ）、細胞クラスターの周辺を除き、ほとんどすべての細胞がｃ−ｋｉｔ受容体陰性の幹細胞表現型（Ｏｈｔａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，  ２１２５−２１３１；Ｔａｄｏｋｏｒｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  １１３，  ２９−３９）を示した（図２ｄ）。クラスターを形成した未分化精原細胞の周辺に局在した細胞の一部は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞に分化する傾向があった。睾丸の横断面の顕微鏡観察では、精上皮腫性の腫瘍細胞（Ｍｅｎｇ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６１，  ３６２７−３２７１）を増殖するＧＤＮＦトランスジェニックマウス（Ｍｅｎｇ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８７，  １４８９−１４９３）のそれと類似してはいたが、クラスターを形成した細胞は全く異なっていた。それらは、ｈＧＤＮＦトランスジェニックマウスでは精子形成能をもたない移植可能な精巣腫瘍細胞であった（Ｍｅｎｇ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８７，  １４８９−１４９３；  Ｍｅｎｇ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６１，  ３６２７−３２７１；  Ｃｒｅｅｍｅｒｓ，  Ｌ．  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ６６，  １５７９−１５８４）が、それとは異なり、トランスフェクトされたｈＧＤＮＦのセルトリ細胞からの分泌により増殖の刺激された正常な精原細胞であるはずである。この点を確認するため、生殖細胞の運命を蛍光により容易に追跡し、またそれらをブスルファン処理されたマウス精巣（Ｏｈｔａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｄｅｖｅｌｏｐ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，  ４２，  １０５−１１２）の精細管内に移植することを目的として、ＥＧＦＰ標識された精原細胞をＥＧＦＰトランスジェニックマウスの精巣から調製した。移植の１０週間後、生殖幹細胞（精原細胞）の増殖は、ドナー精巣の精細管における生殖細胞のグリーン蛍光により検出可能であり（図３ａ）、完全な精子形成を行うグリーンの生殖細胞の観察が可能であった（図３ｂ〜ｃ）。生殖幹細胞の集団の増大を概算するため、ｈＧＤＮＦを用いて電気穿孔されたＥＧＦＰトランスジェニックマウスの停留精巣症の精巣に由来する増殖性精原細胞の半定量的コロニー形成検定を行なった。停留精巣症の精巣においては、熱ショックストレスのため未分化の精原細胞のみが生き残ることから（Ｔａｄｏｋｏｒｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  １１３，  ２９−３９）、生殖幹細胞の含有量は正常な成体マウスの精巣におけるよりもずっと高いことが知られている。ｈＧＤＮＦ発現ベクターの電気穿孔の４週間後、電気穿孔された停留精巣症の精巣の細管内に、多くのグリーンの細胞クラスターを観察した（図３ｄ，ｅ）。ｈＧＤＮＦを電気穿孔された停留精���症マウスからの精巣細胞（主として精原細胞と、もしあったとしても少しの体細胞）の回収は、対照よりも約３倍多かった（表１）。コロニー形成および精子形成から判定された、精細管内へ移植された精巣細胞の幹細胞活性は、対照の停留精巣症マウスの精巣のそれよりも約６．６倍高かった。これらの結果は、停留精巣症の精巣内へのｈＧＤＮＦのトランスフェクションにより、生殖幹細胞が約２０倍増えたこと、すなわち、生殖幹細胞の含有量は正常な精巣よりも停留精巣症の精巣において２５〜５０倍高いことが知られていることから、生殖幹細胞の含有量は正常な精巣におけるよりも約５００〜１０００倍多いことを示している。
【００４９】
【表１】
2004275006.tif 000002
【００５０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、精子形成過程における未分化幹細胞である精原細胞を大幅に増殖させることが可能となる。大量の精原細胞は、発生生物学等の基礎研究分野や医学研究分野にとっての有用な研究材料としてのみならず、各種の遺伝子改変動物の作出や、生殖障害因子等の検定のための材料、新規の不妊治療薬や不妊薬を開発するための被験材料としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】導入遺伝子の発現とその効果を示す。導入遺伝子は、転写産物（ａ：ノーザン分析）およびタンパク質（ｂ：ウェスタン分析）を精巣において安定に発現した。（ｃ）は電気穿孔後４週間のトランスフェクトされた精巣の低倍率での蛍光立体顕微鏡像である。（ｄ）は励起光下のトランスフェクトされた精巣の横断面（上）と、ヘマトキシリンによる対比染色（下）の像である。トランスフェクトされたセルトリ細胞は、蛍光ポジティブ細胞として検出された。ｈＧＤＮＦ  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた精巣では、クラスター（矢印）を形成し、一列に並んだ未分化の精原細胞（矢尻）と、正常な精子形成を支えている蛍光細胞のない数本の管（星印）が同定された。縮尺線は、１ｍｍ（ｃ）、１００μｍ（ｄ）である。
【図２】増殖した細胞の形態学的および免疫組織化学的分析の結果を示す。（ａ）は、ヘマトキシリンエオシン（ＨＥ）で染色された、ｈＧＤＮＦ  ｃＤＮＡの電気穿孔４週間後の精巣（ヘマトキシリンエオシン染色）の横断面像である。（ｂ）は、抗体ＴＲＡ９８による免疫染色、（ｃ）は抗ｃ−ｋｉｔ抗体による免疫染色の結果である。（ｂ）はヘマトキシリン、（ｃ）はメチルグリーンで対比染色されている。また（ｄ）は（ｃ）の拡大図である。矢印はライデッヒ細胞を示し、矢尻は少数のｃ−ｋｉｔポジティブな生殖細胞を示した。さらに、（ｅ）は（ａ）の拡大図であり、（ｆ）は抗ｒｅｔ抗体、（ｇ）は抗ＧＦＲ−α１抗体での免疫染色（メチルグリーンで対比染色）の結果、（ｈ）は抗ＰＣＮＡ抗体による免疫染色の結果である。縮尺線は１００μｍを示す。
【図３】増殖した精原細胞の移植分析の結果を示す。（ａ）は、ＥＧＦＰ標識された精巣細胞の移植１０週間後の精巣の低倍率での蛍光立体顕微鏡像である。（ｂ）は励起光下、（ｃ）はヘマトキシリンにより対比染色された精巣の横断面である。移植されたグリーンの生殖細胞は完全な精子形成を示した。（ｄ）は、半定量的なコロニー形成検定のために調製した、ｈＧＤＮＦをトランスフェクトした停留精巣症の精巣であり、（ｅ）は無処理の対照である。縮尺線は１ｍｍ（ａ）、１００μｍ（ｂ〜ｅ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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