(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規なＶ領域アミノ酸配列を有する前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に反応するヒト化抗体、抗体断片および融合抗体、および該ヒト化抗体、抗体断片または融合抗体を用いた癌の診断薬および治療薬を提供する。【解決手段】本発明により、ＰＳＭＡに特異的に反応し、特定のアミノ酸配列を含むＨ鎖Ｖ領域とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域とからなるＨ鎖および特定のアミノ酸配列を含むＬ鎖Ｖ領域とヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域とからなるＬ鎖からなるヒト型キメラ抗体、その抗体断片、該キメラ抗体とインターロイキン２または抗癌剤アドリアマイシンとの融合抗体、該キメラ抗体またはその抗体断片を含む癌の診断薬、および該抗体、その抗体断片または該融合抗体を含む癌の治療薬が提供される。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に反応し、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）（ＶＨ）とヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）（ＣＨ）とからなるＨ鎖および配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域（ＶＬ）とヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（ＣＬ）とからなるＬ鎖からなるヒト型キメラ抗体またはその抗体断片。
【請求項２】
ヒト抗体のＣＨがＩｇＧ１クラスのＣＨであり、かつヒト抗体のＣＬがκクラスのＣＬである請求項１に記載のヒト型キメラ抗体またはその抗体断片。
【請求項３】
ヒト型キメラ抗体が、形質転換株ＫＭ２７７７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６９）が生産するヒト型キメラ抗体である、請求項２に記載のヒト型キメラ抗体またはその抗体断片。
【請求項４】
ＰＳＭＡに特異的に反応し、それぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨとヒト抗体のＣＨとからなるＨ鎖およびそれぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬとヒト抗体のＣＬとからなるＬ鎖からなるヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項５】
ＶＨが、それぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とヒト抗体のＶＨのフレームワーク領域（ＦＲ）とからなり、ＶＬが、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とヒト抗体のＶＬのＦＲとからなる、ヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項６】
ヒト抗体のＣＨがＩｇＧ１クラスのＣＨであり、かつヒト抗体のＣＬがκクラスのＣＬである請求項４または５に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項７】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項１１】
形質転換株がＫＭ２７７７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６９）である請求項１０に記載の形質転換株。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体またはその抗体断片を採取することを特徴とする該抗体またはその抗体断片の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片に、薬剤、高分子化合物、放射性同位元素および蛋白質からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質が結合した融合抗体。
【請求項１４】
抗体またはその抗体断片に結合した薬剤が抗癌剤または抗炎症剤である請求項１３に記載の融合抗体。
【請求項１５】
抗体またはその抗体断片に結合した蛋白質がサイトカインおよび毒素からなる群から選ばれる少なくとも１つの蛋白質である請求項１３に記載の融合抗体。
【請求項１６】
物質が抗体またはその抗体断片のＨ鎖に結合している請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の融合抗体。
【請求項１７】
物質が抗体またはその抗体断片のＬ鎖に結合している請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の融合抗体。
【請求項１８】
物質が抗体またはその抗体断片のＨ鎖およびＬ鎖に結合している請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の融合抗体。
【請求項１９】
蛋白質がヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）である請求項１３および１５〜１８のいずれか１項に記載の融合抗体。
【請求項２０】
融合抗体が、形質転換株ＫＭ２７７７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６９）が生産するヒト型キメラ抗体とｈＩＬ−２とからなる融合抗体である請求項１９に記載の融合抗体。
【請求項２１】
融合抗体が、形質転換株ＫＭ２８１２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９７０）が生産する融合抗体である請求項１９に記載の融合抗体。
【請求項２２】
抗体またはその抗体断片に結合した物質が蛋白質である請求項１３および１５〜２１のいずれか１項に記載の融合抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項２２に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項２５】
形質転換株がＫＭ２８１２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９７０）である請求項２４に記載の形質転換株。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に、抗体またはその抗体断片に結合した物質が蛋白質である請求項１３および１５〜２１のいずれか１項に融合抗体を生成蓄積させ、培養物から該融合抗体を採取することを特徴とする該融合抗体の製造方法。
【請求項２７】
抗癌剤がアドリアマイシンである、請求項１４および１６〜１８のいずれか１項に記載の融合抗体。
【請求項２８】
アドリアマイシンが結合している抗体が、形質転換株ＫＭ２７７７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６９）が生産するヒト型キメラ抗体である請求項２７に記載の融合抗体。
【請求項２９】
融合抗体が、形質転換株ＫＭ２７７７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６９）が生産するヒト型キメラ抗体のアミノ基に、下記式（Ｉ）で表されるアドリアマイシンを含む基が結合した融合抗体である請求項２８に記載の融合抗体。
【化１】
2004000045.tif 000018
（式中ｎは４０〜５０の整数を表す。）
【請求項３０】
アドリアマイシンのアミノ基と、末端の水酸基をカルボキシ基に変換したポリエチレングリコールとをジペプチドを介して結合させたアドリアマイシン結合リンカーを合成し、該リンカーの末端のカルボキシ基を活性エステル化し、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片のアミノ基と反応させる工程を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の融合抗体の製造方法。
【請求項３１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片および請求項１３〜２１および２７〜２９のいずれか１項に記載の融合抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する癌の治療薬。
【請求項３２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片を有効成分として含有する癌の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に反応するヒト化抗体（以下、抗ＰＳＭＡヒト化抗体と表記する）およびその抗体断片に関する。本発明はさらに、該抗体および抗体断片に由来する融合抗体に関する。本発明はさらに、該抗体、抗体断片および融合抗体をコードするＤＮＡに関する。本発明は、該ＤＮＡを含んでなる組換えベクター、および該組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株に関する。本発明はさらに、該形質転換株を用いた該抗体、抗体断片および融合抗体の製造方法、ならびに該抗体、抗体断片および融合抗体を有効成分として含有する癌の治療薬および癌の診断薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
前立腺癌は、米国において男性の癌死亡原因の第２位を占める癌であり、その効率的な診断法、効果的な治療法が求められている。
ＰＳＭＡは、マウス抗体７Ｅ１１．Ｃ５が認識する抗原として、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰより、その遺伝子がクローニングされた蛋白質であり、７５０アミノ酸から成る分子量約１１０ｋＤａのＩＩ型膜糖蛋白質であることが明らかとなっている（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　７，　９２７，　１９８７；　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，　５３，　２２７，　１９９３）。ＰＳＭＡをコードする遺伝子は、ヒト染色体１１ｐ１１−ｐ１２に位置しており、また、ＰＳＭＡと非常に相同性の高い遺伝子が染色体１１ｑ１４に存在している（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　３０，　１０５，　１９９５；　Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ，７２，　５８３，　１９９５；　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ．，　１４４３，　１１３，　１９９８）。ＰＳＭＡの発現は、前立腺上皮細胞に非常に限局しており、また、前立腺癌、特にホルモン不応答性増殖に伴う発現上昇が報告されている（Ｊ．　Ｕｒｏｌ．，　１５３，　３８２Ａ，　１９９５；　Ｕｒｏｌｏｇｙ，　４８，　３２６，　１９９６；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５７，　２３２１，　１９９７）。前立腺以外でのＰＳＭＡの発現に関しては、脳、顎下腺、小腸などで認められているが、そのレベルは低い（Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３，　８１，　１９９７；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５４，　１８０７，　１９９４；　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ，　６２，　５５２，　１９９５）。一方、最近では腫瘍新生血管におけるＰＳＭＡの発現も報告されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５７，　３６２９，　１９９７；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５９，　３１９２，　１９９９）。このようなＰＳＭＡの発現特性から、ＰＳＭＡは前立腺癌を始めとする癌の診断および治療のための有用な標的抗原と考えられている。ＰＳＭＡの機能に関しては、これまでの研究から、２つの酵素活性を有していることが明らかとなっている。１つは、葉酸加水分解酵素活性（Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　２，　１４４５，　１９９６）であり、もう１つは、カルボキシペプチダーゼ活性（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　９３，　７４９，　１９９６；　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．，　２８６，　１０２０，　１９９８）である。しかし、これらの酵素活性の前立腺における機能や前立腺癌における役割については未だ不明な点が多い。
【０００３】
ＰＳＭＡに対する抗体（以下、抗ＰＳＭＡ抗体と表記する）しては、上記の７Ｅ１１．Ｃ５を含めていくつかの報告がある。７Ｅ１１．Ｃ５は、ＰＳＭＡの細胞内ドメインのＮ末端から６残基を認識することが明らかとなっており（Ｕｒｏｌ．　Ｏｎｃｏｌ．，　１，　２９，　１９９５）、このため、生細胞との反応性が認められない（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５７，　３６２９，　１９９７）。その後、ＰＳＭＡの細胞外領域に特異的に反応する抗体が作製され、生細胞との反応性も確認されている（Ｐｒｏｓｔａｔｅ，　２８，　２６６，　１９９６；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５７，　３６２９，　１９９７；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５８，　４７８７，　１９９８；　Ｊ．　Ｕｒｏｌ．，　１６０，　２３９６，　１９９８）。ＰＳＭＡの細胞外領域に反応する最初の抗体としては、マウス抗体３Ｆ５．４Ｇ６が作製された（Ｐｒｏｓｔａｔｅ，　２８，　２６６，　１９９６）。さらに、Ｊ５９１、Ｊ５３３、Ｊ４１５、Ｅ９９もＰＳＭＡの細胞外領域の異なるエピトープを認識することが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５７，　３６２９，　１９９７）。ＰＥＱ２２６．５もＰＳＭＡの細胞外領域に対する抗体である（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５８，　４７８７，　１９９８）。さらに、３Ｅ１１、３Ｃ２、４Ｅ１０−１．１４、３Ｃ９、１Ｇ３もＰＳＭＡの細胞外領域に対する反応が確認されている（Ｊ．　Ｕｒｏｌ．，　１６０，　２３９６，　１９９８）。これらの細胞外領域に対する抗体は、いずれも連続するアミノ酸の一次配列（以下、リニアエピトープと表記する）を認識する抗体である。一般に、リニアエピトープを認識する抗体は、フローサイトメトリー解析の結果、生細胞に対するよりも死細胞により強く反応する傾向が認められている。一方、１Ｇ９、３Ｃ６、４Ｄ４は、ＰＳＭＡの細胞外領域の立体構造を認識する抗体である（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，　１９，　２４９，　２０００）。これらの抗体は、フローサイトメトリー解析の結果、生細胞と死細胞に対する同等の強い反応性が認められている。さらに、ヒト抗体産生マウスを用いることにより、ＰＳＭＡの細胞外領域の立体構造を認識する５種類のヒト抗体も作製された（Ｅｘｐ．　Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｒｕｇｓ，　１０，　５１１，　２００１）。
【０００４】
抗ＰＳＭＡ抗体の臨床応用に関しては、１１１Ｉ標識の７Ｅ１１．Ｃ５が再発性および転移性の前立腺癌の診断で用いられているが、上記のように７Ｅ１１．Ｃ５は、死細胞あるいはアポトーシスを起こした細胞にしか反応しないため、その感度には限界があった（Ｐｒｏｓｔａｔｅ，　３７，　２６１，　１９９８；　Ｃｌｉｎ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．，　２３，　６７２，　１９９８；　Ｊ．　Ｕｒｏｌ．，　１５９，　２０４１，　１９９８）。この欠点を補うため、現在では、ＰＳＭＡの細胞外領域を認識する抗体の臨床応用が検討されており、マウス抗体Ｊ５９１では、優れた前立腺癌特異的集積性が報告されている（Ｐｒｏｃ．　Ａｍｅｒ．　Ｓｏｃ．　Ｃｌｉｎ．　Ｏｎｃｏｌ．，　１９，　４７７ａ，　２０００）。また、Ｊ５９１に関しては、その治療効果を高める目的で、一本鎖抗体の作製やヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製も報告されている（Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，　１，　１２３，　１９９９；　Ｐｒｏｃ．　Ａｍｅｒ．　Ｓｏｃ．　Ｃｌｉｎ．　Ｏｎｃｏｌ．，　１９，　４７７ａ，　２０００）。さらに、ＰＳＭＡの細胞外領域を認識する抗体は、生細胞に結合した後、細胞内に取込まれることが示されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５８，　４０５５，　１９９８）。ＵＳ６１０７０９０、ＷＯ９９／４７５５４には、薬剤、毒素、放射同位元素と結合させたＰＳＭＡの細胞外領域を認識する抗体が記載されている。
【０００５】
マウスモノクローナル抗体２Ｃ９はヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを免疫原として得られたヒト前立腺癌に特異的に反応するモノクローナル抗体である（Ｊ．　Ａｉｃｈｉ　Ｍｅｄ．　Ｕｎｉｖ．　Ａｓｓｏｃ．，　２３，　６０９，　１９９５）。２Ｃ９は、免疫組織染色の結果、前立腺の腺細胞の腺腔側および腺腔内の分泌物と特異的に反応すること、また、前立腺癌のマーカーである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に対する抗体では反応しない未分化癌組織にも反応することから、ＰＳＡとは異なる前立腺特異抗原を認識することが示唆されていた（Ｊ．　Ａｉｃｈｉ　Ｍｅｄ．　Ｕｎｉｖ．　Ａｓｓｏｃ．，　２３，　６０９，　１９９５）。最近、ヒト前立腺由来のｍＲＮＡを用いた発現クローニング法による抗原遺伝子のクローニングおよび２Ｃ９固定化カラムを用いたヒト前立腺癌細胞株ライセートからの抗原蛋白質の精製を行った結果、２Ｃ９の認識抗原はＰＳＭＡであることが報告された（第９０回日本泌尿器科学会総会、２００２年）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なＶ領域アミノ酸配列を有するＰＳＭＡと特異的に反応するヒト化抗体、抗体断片および融合抗体を提供することを目的とする。さらに、該抗体、抗体断片および融合抗体を用いて癌などの疾患の診断薬、予防薬および治療薬として提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の（１）〜（３２）を提供する。
（１）前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に反応し、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）（ＶＨ）とヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）（ＣＨ）とからなるＨ鎖および配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域（ＶＬ）とヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（ＣＬ）とからなるＬ鎖からなるヒト型キメラ抗体またはその抗体断片。
（２）ヒト抗体のＣＨがＩｇＧ１クラスのＣＨであり、かつヒト抗体のＣＬがκクラスのＣＬである（１）に記載のヒト型キメラ抗体またはその抗体断片。
（３）ヒト型キメラ抗体が、形質転換株ＫＭ２７７７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６９）が生産するヒト型キメラ抗体である、（２）に記載のヒト型キメラ抗体またはその抗体断片。
【０００８】
（４）ＰＳＭＡに特異的に反応し、それぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨとヒト抗体のＣＨとからなるＨ鎖およびそれぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬとヒト抗体のＣＬとからなるＬ鎖からなるヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（５）ＶＨが、それぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とヒト抗体のＶＨのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、ＶＬが、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とヒト抗体のＶＬのＦＲからなる、ヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（６）ヒト抗体のＣＨがＩｇＧ１クラスのＣＨであり、かつヒト抗体のＣＬがκクラスのＣＬである（４）または（５）に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（７）抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗体断片。
【０００９】
（８）（１）〜（７）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
（９）（８）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（１０）（９）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１１）形質転換株がＫＭ２７７７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６９）である（１０）に記載の形質転換株。
（１２）（１０）または（１１）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）〜（７）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体またはその抗体断片を採取することを特徴とする該抗体またはその抗体断片の製造方法。
【００１０】
（１３）（１）〜（７）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片に、薬剤高分子化合物、放射性同位元素および蛋白質からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質が結合した融合抗体。
（１４）抗体またはその抗体断片に結合した薬剤が抗癌剤または抗炎症剤である（１３）に記載の融合抗体。
（１５）抗体またはその抗体断片に結合した蛋白質がサイトカインおよび毒素からなる群から選ばれる少なくとも１つの蛋白質である（１３）に記載の融合抗体。
（１６）物質が抗体またはその抗体断片のＨ鎖に結合している（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載の融合抗体。
（１７）物質が抗体またはその抗体断片のＬ鎖に結合している（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載の融合抗体。
（１８）物質が抗体またはその抗体断片のＨ鎖およびＬ鎖に結合している（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載の融合抗体。
（１９）蛋白質がヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）である（１３）および（１５）〜（１８）のいずれか１項に記載の融合抗体。
（２０）融合抗体が、形質転換株ＫＭ２７７７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６９）が生産するヒト型キメラ抗体とｈＩＬ−２とからなる融合抗体である（１９）に記載の融合抗体。
（２１）融合抗体が、形質転換株ＫＭ２８１２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９７０）が生産する融合抗体である（１９）に記載の融合抗体。
【００１１】
（２２）抗体またはその抗体断片に結合した物質が蛋白質である（１３）および（１５）〜（２１）のいずれか１項に記載の融合抗体をコードするＤＮＡ。
（２３）（２２）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（２４）（２３）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（２５）形質転換株がＫＭ２８１２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９７０）である（２４）に記載の形質転換株。
（２６）（２４）または（２５）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に、抗体またはその抗体断片に結合した物質が蛋白質である（１３）および（１５）〜（２１）のいずれか１項に融合抗体を生成蓄積させ、培養物から該融合抗体を採取することを特徴とする該融合抗体の製造方法。
【００１２】
（２７）抗癌剤がアドリアマイシンである、（１４）および（１６）〜（１８）のいずれか１項に記載の融合抗体。
（２８）アドリアマイシンが結合している抗体が、形質転換株ＫＭ２７７７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６９）が生産するヒト型キメラ抗体である（２７）に記載の融合抗体。
（２９）融合抗体が、形質転換株ＫＭ２７７７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９６９）が生産するヒト型キメラ抗体のアミノ基に、下記式（Ｉ）で表されるアドリアマイシンを含む基が結合した融合抗体である（２８）に記載の融合抗体。
【化２】
2004000045.tif 000002
（式中ｎは４０〜５０の整数を表す。）
（３０）アドリアマイシンのアミノ基と、末端の水酸基をカルボキシ基に変換したポリエチレングリコールとをジペプチドを介して結合させたアドリアマイシン結合リンカーを合成し、該リンカーの末端のカルボキシ基を活性エステル化し、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片のアミノ基と反応させる工程を含む、（２７）〜（２９）のいずれか１項に記載の融合抗体の製造方法。
【００１３】
（３１）（１）〜（７）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片およびおよび（１３）〜（２１）および（２７）〜（２９）のいずれか１項に記載の融合抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する癌の治療薬。
（３２）（１）〜（７）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片を有効成分として含有する癌の診断薬。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＳＭＡに特異的に反応する抗体（以下、抗ＰＳＭＡ抗体ともいう）としては、、ＰＳＭＡに特異的に反応するヒト化抗体を包含する。ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体等があげられる。本発明の抗ＰＳＭＡキメラ抗体としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＨとヒト抗体のＣＨとからなるＨ鎖、および配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬとヒト抗体のＣＬとからなるＬ鎖からなるヒト型キメラ抗体等があげられる。本発明の抗ＰＳＭＡヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、それぞれ配列番号７、８、９で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むＶＨとヒト抗体のＣＨとからなるＨ鎖およびそれぞれ配列番号１０、１１、１２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むＶＬとヒト抗体のＣＬとからなるＬ鎖からなるヒト型ＣＤＲ移植抗体等があげられる。
【００１５】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体を意味する。本発明のヒト型キメラ抗体は、ＰＳＭＡに特異的に反応するマウス抗体２Ｃ９を産生するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００１６】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００１７】
本発明のＰＳＭＡに特異的に反応するヒト型キメラ抗体の具体例としては、抗体のＶＨが配列番号４記載のアミノ酸配列、ヒト抗体のＣＨがｈＩｇＧ１サブクラスのアミノ酸配列から成り、抗体のＶＬが配列番号６記載のアミノ酸配列、ヒト抗体のＣＬがκクラスのアミノ酸配列からなる抗体ＫＭ２７７７があげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
【００１８】
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＰＳＭＡに特異的に反応するマウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００１９】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００２０】
本発明の抗体断片は、本発明の抗体の抗体断片であれば、いかなるものでも良い。
本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００２１】
本発明のＦａｂは、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００２２】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００２３】
本発明のＦａｂ’は、上記のＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００２４】
本発明のｓｃＦｖは、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
【００２５】
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
【００２６】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　７，６９７，　１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のｄｓＦｖは、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
【００２７】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
【００２８】
本発明の融合抗体は、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体およびその抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子化合物、蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた融合抗体を包含する。
本発明の融合抗体は、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体およびその抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖のＮ末端側あるいはＣ末端側、抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体および抗体断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子化合物、蛋白質などを化学的手法（抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４）により結合させることにより製造することができる。
【００２９】
また、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体およびその抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉなどがあげられ、例えば、クロラミンＴ法などにより抗体に結合させることができる。
【００３０】
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社、１９９６）、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社、１９８２）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
【００３１】
高分子化合物としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体および抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。高分子化合物、例えばＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基の修飾剤（特昭６１−１７８９２６）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特昭５６−２３５８７）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特開平２−１１７９２０）などがあげられる。
【００３２】
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン２（以下、ｈＩＬ−２と表記する）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＧＭ−ＣＳＦと表記する）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＭ−ＣＳＦと表記する）、ヒトインターロイキン１２（以下、ｈＩＬ−１２と表記する）などがあげられる。また、癌細胞を直接障害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。蛋白質との融合抗体については、抗体および抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
【００３３】
本発明の抗ＰＳＭＡ抗体およびそれらの抗体断片は、ＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　１４，　１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，　１９９６）およびフローサイトメトリー解析などにより、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＰＳＭＡに対する結合活性を評価することができる。
【００３４】
以下に、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体およびその抗体断片の作製方法および活性評価について説明する。
１．マウス抗体２Ｃ９の作製と２Ｃ９が認識する抗原の同定
（１）マウス抗体２Ｃ９の作製
マウスモノクローナル抗体２Ｃ９は、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰをＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫後、ハイブリドーマを作製し、培養上清中の抗体、あるいは、腹水より精製した抗体のヒト前立腺組織および前立腺癌に対する特異的な反応を確認し、確立した（Ｊ．　Ａｉｃｈｉ　Ｍｅｄ．　Ｕｎｉｖ．Ａｓｓｏｃ．，　２３，　６０９，　１９９５）。
【００３５】
（２）マウス抗体２Ｃ９が認識する抗原の同定
マウス抗体２Ｃ９が認識する抗原は、以下のようにして同定することができる。例えば、抗原が蛋白質の場合は、２Ｃ９が反応する組織あるいは細胞、例えばヒト前立腺組織または前立腺癌から作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーを適当な細胞に導入し、ｃＤＮＡ発現細胞ライブラリーを作製する。次いで、ｃＤＮＡ発現細胞ライブラリーから、２Ｃ９との反応性を指標に抗原発現細胞を単離し、細胞からｃＤＮＡを回収してその塩基配列を解析することで、抗原の同定を行うことができる。
また、適当な樹脂担体に２Ｃ９を固定化したカラムを用い、２Ｃ９が反応する組織あるいは細胞、例えばヒト前立腺組織または前立腺癌から調製したライセートから抗原を精製し、その構造解析を行うことによっても抗原の同定を行うことができる。
【００３６】
２．ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【００３７】
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）などがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
【００３８】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　３，　１３３，　１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０１，　１３０７，　１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，　２７，　２２３，　１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　７８，　１５２７，　１９８１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　４，　１７３，　１９９０）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０１，　１３０７，　１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１４９，　９６０，　１９８７）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，　４１，　４７９，　１９８５）とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，　３３，　７１７，　１９８３）などがあげられる。
【００３９】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　１６７，　２７１，　１９９４）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，　１７，　５５９，　１９９８）などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
【００４０】
（２）マウス抗体２Ｃ９のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
マウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得する。
マウス抗体２Ｃ９を産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーについて、マウスＩｇのＨ鎖、ＣＨまたはＶＨをコードするＤＮＡおよびマウスＩｇのＬ鎖、ＣＨまたはＣＬをコードするＤＮＡをプローブとして用いたハイブリダイゼーションを行ない、マウス抗体２Ｃ９のＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミド、およびマウス抗体２Ｃ９のＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
【００４１】
ハイブリドーマから全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５４，　３，　１９８７）、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８９）などがあげられる。また、ハイブリドーマからｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ　Ｐｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。
【００４２】
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８９；　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１−３４）、あるいは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ　ＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
【００４３】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　５，　５８，　１９９２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ。，　１７，　９４９４，　１９８９）、λｚａｐ　ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｉ，　４９，　１９８５）、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３　１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　３，　２８０，１９８３）およびｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３，　１９８５）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
【００４４】
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’（Ｊ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，　２３，　２７１，　１９９２）、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　５９，　１７７，　１９６８）、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２２，　７７８，　１９８３）、ＮＭ５２２（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１６６，　１，　１９８３）、Ｋ８０２（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１６，　１１８，　１９６６）およびＪＭ１０５（Ｇｅｎｅ，３８，　２７５，　１９８５）などが用いられる。
【００４５】
ｃＤＮＡライブラリーからのマウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　３ｒｄ　ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）により選択することができる。
【００４６】
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７（アプライドバイオシステムズ社製）等のＤＮＡシークエンサーを用いて解析することにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
適当なプライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と表記する；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　３ｒｄ　ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　１９８７−２００１）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
【００４７】
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，　１９９１）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄＨｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，　１９９１）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，　１９９１）と比較することによって見出すことができる。
さらに、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどに対してＢＬＡＳＴ法（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　４０３，１９９０）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
【００４８】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、マウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、マウス抗体２Ｃ９ののＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれ、マウス抗体２Ｃ９のＶＨの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡ、マウス抗体２Ｃ９のＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、マウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、５’末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを増幅し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【００４９】
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，　１９９１）などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、マウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
【００５０】
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列にマウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，　１９９１）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
【００５１】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
【００５２】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，　９，　２６６，　１９９１）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，　９，　２６６，　１９９１）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１１２，　５３５，　１９７７）あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　７，　１５０１，　１９９４）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
【００５３】
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて上記２（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【００５４】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、上記２（４）および２（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、上記２（４）および２（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。
【００５５】
（７）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記２（３）および２（６）に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　ＣＲＣ　ｐｒｅｓｓ，　２８３，　１９９１）。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　ＣＲＣ　ｐｒｅｓｓ，　２８３，　１９９１）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８４，　７４１３，　１９８７）などがあげられる。
【００５６】
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　１４，　１９８８；　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，　１９９６）などにより測定できる。
【００５７】
（８）ヒト化抗体の安定発現
上記２（３）および２（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　３，　１３３，　１９９０）などがあげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと表記する）遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　７７，　４２１６，　１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と表記する）などがあげられる。
【００５８】
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８　ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
【００５９】
ヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｈａｐｔｅｒ８，　１９８８；　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，　１９９６）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などを組合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，　２２７，　６８０，　１９７０）やウエスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　１２，　１９８８；　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，　１９９６）などで測定することができる。
【００６０】
（９）ヒト化抗体の活性評価
培養上清中あるいは精製した抗ＰＳＭＡヒト化抗体のＰＳＭＡに対する結合活性は、ＥＬＩＳＡ法およびフローサイトメトリー解析などにより測定することができる。また、ＰＳＭＡ陽性培養癌細胞株に対する細胞障害活性は、補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）、抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）などを測定し、評価することができる。さらに、ＰＳＭＡ陽性癌細胞株のマウスなどの動物への移植系を用いて抗体の癌細胞への集積性、抗腫瘍活性などを評価することができる。
【００６１】
３．抗体断片の作製
本発明の抗体断片は、上記２に記載の抗ＰＳＭＡヒト化抗体を元に遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。該抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
【００６２】
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，　ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，　１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，　ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　１９９５）。
【００６３】
また、Ｆａｂは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを組み込むことにより該Ｖ領域を含むＦａｂを発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４０，１０４１，　１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ，　Ｗ．　Ｈ．　Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　１９９２）。
【００６４】
（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，　ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９５）。また、下記３（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢで処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ，　１９９６）。
【００６５】
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、上記３（２）に記載のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを組み込むことにより該Ｖ領域を含むＦａｂ’を発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，　１０，１６３，　１９９２）などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラムなどを用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ，　１９９６）。
【００６６】
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを組み込むことにより該Ｖ領域を含むＳｃＦｖを発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，　５，　４８，　１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ，　１９９６）。
【００６７】
（５）ｄｉａｂｏｄｙの作製
ｄｉａｂｏｄｙは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶＨとＶＬをリンカーがコードするアミノ酸残基が８残基以下となるように連結したＤＮＡを作製し、ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターにクローニングし、ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを作製することができる。
【００６８】
ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターとしては、ｄｉａｂｏｄｙのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，　５，　４８，　１９９４）などがあげられる。ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にｄｉａｂｏｄｙを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｉａｂｏｄｙとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ，　１９９６）。
【００６９】
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて作製することができる。まず、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、システイン置換変異を導入したＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　７，　６９７，　１９９４）などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　７，　６９７，　１９９４）。
【００７０】
（７）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＣＤＲペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　７，　６９７，　１９９４）。
【００７１】
（８）抗体断片の活性評価
精製した抗体断片のＰＳＭＡに対する結合活性は、ＥＬＩＳＡ法およびフローサイトメトリー解析などにより測定することができる。さらに、ＰＳＭＡ陽性の癌細胞株のマウスなどの動物への移植系を用いて抗体断片の癌細胞への集積性、抗腫瘍活性などを評価することができる。
【００７２】
４．抗体および抗体断片とサイトカインとの融合抗体の作製
（１）抗体および抗体断片とサイトカインとの融合抗体をコードする遺伝子の構築
サイトカインをコードする遺伝子を適当な合成ＤＮＡを介して、抗体または抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖をコードする遺伝子の５’末端あるいは３’末端に連結することにより、抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体をコードする遺伝子を構築することができる。また、サイトカインをコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅する際に、増幅用プライマーの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入し、抗体または抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖をコードする遺伝子の５’末端あるいは３’末端に連結することにより、抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体をコードする遺伝子を構築することができる。サイトカインをコードする遺伝子は、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡのいずれも用いることができる。構築した抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体をコードする遺伝子については、上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の配列であることを確認する。
【００７３】
（２）抗体および抗体断片とサイトカインとの融合抗体の発現ベクターの構築
上記２（３）、２（６）および３に記載の抗体または抗体断片発現ベクター上の抗体または抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖をコードする遺伝子の一部またはすべてを、上記４（１）に記載の抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体をコードする遺伝子と置換することによって、抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体の発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト型キメラ抗体のＨ鎖のＣ末端にサイトカインが融合した融合抗体を作製する場合は、上記４（１）において、ヒト型キメラ抗体のＨ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の３’末端にサイトカインをコードする遺伝子を連結してヒト型キメラ抗体のＨ鎖Ｃ領域とサイトカインとの融合抗体をコードする遺伝子を構築し、該遺伝子と上記２（３）に記載のヒト型キメラ抗体発現ベクター上のヒト型キメラ抗体のＨ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子を置換することにより、発現ベクターを作製することができる。
【００７４】
（３）抗体および抗体断片とサイトカインとの融合抗体の安定発現
上記４（２）に記載の抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体の発現ベクターを用いて上記２（８）に記載した方法に従い、抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体の安定発現を行うことにより、抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体を安定に発現する形質転換株を得、その培養上清から抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体を精製し、その分子量などを解析することができる。
【００７５】
（４）抗体および抗体断片とサイトカインとの融合抗体の活性評価
精製した抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体の活性のうち、抗体または抗体断片部分の活性、すなわち抗原との結合活性、培養癌細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法およびフローサイトメトリー解析などにより測定できる。また、抗原陽性培養癌細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性などを測定し、評価することができる。一方、サイトカイン部分の活性は、例えば、該サイトカインに対して濃度依存的な増殖を示す培養細胞株の増殖を指標に評価することができる（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　９１，　９６２６，　１９９４）。
【００７６】
抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体は、例えば、ＰＳＭＡを発現している培養ヒト癌細胞株を移植したマウスに投与することで、その抗腫瘍効果を評価することができ、また、抗体または抗体断片単独、サイトカイン単独あるいは抗体または抗体断片とサイトカインの同時投与と比較することにより、生体内におけるより強い抗腫瘍効果を評価することができる（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，　４２，　８８，　１９９６）。
【００７７】
５．抗体および抗体断片と抗癌剤との融合抗体の作製
（１）抗体および抗体断片と抗癌剤との融合抗体の作製
抗体および抗体断片と抗癌剤との融合抗体は、抗癌剤を共有結合などを介して化学的に結合させ、作製することができる。例えば、抗癌剤をＰＥＧとジペプチドよりなるリンカーと結合させた後にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル化し、抗体または抗体断片のアミノ基と反応させ、融合抗体を作製することができる（Ｊ．　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ，　６９，　２７，　２０００）。
【００７８】
（２）抗体および抗体断片と抗癌剤との融合抗体の活性評価
作製した抗体または抗体断片と抗癌剤との融合抗体の活性のうち、抗体または抗体断片部分の活性、すなわち抗原との結合活性、培養癌細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法およびフローサイトメトリー解析などにより測定できる。また、抗原陽性培養癌細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性などを測定し、評価することができる。一方、抗癌剤の活性は、培養癌細胞株の増殖抑制活性を指標に評価することができる（Ｊ．　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ，　６９，　２７，　２０００）。
【００７９】
抗体または抗体断片と抗癌剤との融合抗体は、例えば、ＰＳＭＡを発現している培養ヒト癌細胞株を移植したマウスに投与することで、その抗腫瘍効果を評価することができ、また、抗体または抗体断片単独、抗癌剤単独あるいは抗体または抗体断片と抗癌剤の同時投与と比較することにより、生体内におけるより強い抗腫瘍効果を評価することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２６１，　２１２，　１９９３）。
【００８０】
６．本発明の抗体を用いたＰＳＭＡの検出および定量法
本発明のヒト化抗体、抗体断片および融合抗体を用いて、ＰＳＭＡを免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ、放射性物質標識免疫法（以下、ＲＩＡと表記する）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法など）、サンドイッチＥＬＩＳＡ（単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック、１９８７；続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８６）などがあげられる。
【００８１】
蛍光抗体法とは、分離した細胞あるいは組織などに、本発明の抗体あるいはその抗体断片を反応させ、さらにフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと表記する）などの蛍光物質で標識した抗Ｉｇ抗体あるいは抗体断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
ＲＩＡとは、分離した細胞あるいは組織のライセート、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明の抗体あるいはその抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗Ｉｇ抗体あるいは抗体断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
【００８２】
免疫組織染色法、免疫細胞染色法とは、分離した細胞あるいは組織などに、本発明の抗体あるいはその抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗Ｉｇ抗体あるいは抗体断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
サンドイッチＥＬＩＳＡとは、本発明の抗体あるいはその抗体断片で、抗原認識部位の異なる２種類の抗体あるいはその抗体断片のうち、あらかじめ一方の抗体あるいはその抗体断片はＥＬＩＳＡプレートに吸着させ、もう一方の抗体あるいはその抗体断片はＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておき、抗体あるいはその抗体断片吸着プレートに、分離した細胞あるいは組織のライセート、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などを反応させた後、標識した抗体あるいはその抗体断片を反応させ、標識物質に応じた反応を行う方法である。
【００８３】
７．本発明の抗体を用いたＰＳＭＡ陽性の癌の診断および治療
ＰＳＭＡの発現は、前立腺上皮細胞に限局しており、また、前立腺癌、特にホルモン不応答性増殖に伴う発現上昇が報告されている。本発明の抗ＰＳＭＡヒト化抗体およびその抗体断片は、ＰＳＭＡと特異的に結合するため、前立腺癌等のＰＳＭＡ陽性の癌の診断に有用である。
【００８４】
ＰＳＭＡ陽性の癌の診断方法としては、本発明の抗ＰＳＭＡヒト化抗体およびその抗体断片を用いて、被験者の細胞、組織あるいは血清中に存在するＰＳＭＡを上記６に記載した方法で免疫学的に検出および定量する方法があげられる。複数の健常人の細胞、組織あるいは血清中のＰＳＭＡを同様にして測定し、健常人の検体のＰＳＭＡの量の範囲と比較して被験者の検体のＰＳＭＡの量が増加している場合には、ＰＳＭＡ陽性の癌であると診断できる。
【００８５】
本発明の抗ＰＳＭＡヒト化抗体、その抗体断片、および融合抗体は、ＰＳＭＡと特異的に結合し、かつＡＤＣＣ活性などの細胞障害活性を示すため、ＰＳＭＡ陽性の癌の治療に有用である。また、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内において強い抗腫瘍効果を示し、かつ免疫原性を示さず、反復投与が可能であり、その効果が長期間にわたり持続することが期待されるので、治療薬としてヒトに投与するのに適している。
【００８６】
さらに、本発明の抗体または抗体断片とサイトカインとの融合抗体は、融合させたサイトカイン部分の活性により、癌の近傍で免疫担当細胞を活性化できることから、抗体または抗体断片単独、サイトカイン単独あるいは抗体または抗体断片とサイトカインの同時投与などに比べ、より強い抗腫瘍効果が期待され、また、サイトカインの全身投与に比べ、副作用の低減が期待される。
【００８７】
同様に、本発明の抗体または抗体断片と抗癌剤との融合抗体は、融合させた抗癌剤の活性により、癌細胞特異的な増殖抑制を発揮できることから、抗体または抗体断片単独、抗癌剤単独あるいは抗体または抗体断片と抗癌剤の同時投与などに比べ、より強い抗腫瘍効果が期待され、また、抗癌剤の全身投与に比べ、副作用の低減が期待される。
【００８８】
本発明の抗ＰＳＭＡヒト化抗体、その抗体断片、および融合抗体は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【００８９】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
【００９０】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
【００９１】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体、抗体断片、および融合抗体そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体、抗体断片、および融合抗体を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
【００９２】
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該抗体、抗体断片、、および融合抗体、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【００９３】
以下に、本発明の実施例を示すが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【００９４】
【実施例】
実施例１　抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９の認識抗原の同定
（１）発現クローニング法による抗原の同定
（１−１）ヒト前立腺由来ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト前立腺由来ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の４μｇより、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を用いて両端に制限酵素Ｓｆｉ　Ｉリンカー配列を有するｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にて分画し、第１表に示したように６種類のサイズに分けてＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲルから回収した。
【００９５】
【表１】
2004000045.tif 000003
【００９６】
Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．　２から６の各ｃＤＮＡ断片を制限酵素Ｓｆｉ　Ｉで処理したプラスミドｐＡＭｏ（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６８，　２２７８２，　１９９３）の０．５μｇと連結後、ウルトラフリー−ＭＣ（ＵＦＣ３　ＬＴＫ００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮し、大腸菌ＭＣ１０６１Ａにエレクトロポレーション法により導入した。形質転換大腸菌を回収し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地４５０ｍＬで培養後、ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌よりプラスミドを回収し、ｃＤＮＡライブラリーとした。
【００９７】
（１−２）動物細胞を用いた発現クローニング
実施例１（１−１）で作製したｃＤＮＡライブラリーのうち、Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．２、３、４の各ｃＤＮＡ断片から作製したもの、および５と６の各ｃＤＮＡ断片から作製したものを混合したものの計４種類について、ＤＮＡ濃度が１μｇ／μＬとなるように希釈し、その各１６μＬをエレクトロポレーション用の０．４ｃｍ幅キュベットに分注した。Ｋ−ＰＢＳ（５．１ｇ　ＫＣｌ，　０．０８ｇ　ＮａＣｌ，　０．５７５ｇ　Ｎａ２ＨＰＯ４，０．４０５ｇ　ＭｇＣｌ２／５００ｍＬ　Ｈ２Ｏ）を用いて８．０×１０６細胞／ｍＬとなるように懸濁したＮａｍａｌｗａ　ＫＪＭ−１細胞（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１，　１５１，　１９８８）の０．８ｍＬを各キュベットに加え、混合後、０．３ｋＶ、５００μＦの条件でＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてプラスミドの導入を行った。室温で３０分間放置した後、キュベットより細胞を回収し、４０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（ＩＰＴＳＧ）培地（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　５，　Ｓ１７，　１９９１）を分注した細胞培養フラスコに懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。２４時間後、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む４０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（ＩＰＴＳＧ）培地を添加し、薬剤耐性株の増殖を誘導した。
【００９８】
各ｃＤＮＡライブラリーの導入により得られた薬剤耐性細胞の１．０〜２．０×１０７細胞を回収し、３％ウシ血清（以下、ＦＢＳと表記する）を含むＰＢＳ（以下、３％ＦＢＳ−ＰＢＳと表記する）で２回洗浄した後、１０μｇ／ｍＬのマウス抗体２Ｃ９を含む３％ＦＢＳ−ＰＢＳの１００μＬで懸濁し、氷中で３０〜６０分間反応させた。反応後、３％ＦＢＳ−ＰＢＳで３回洗浄し、１ｍＬの３％ＦＢＳ−ＰＢＳで懸濁した抗マウスＩｇＧ１抗体を固定化したマグネティックビーズ（Ｄｙｎａｌ社製）を加え、１０分毎に攪拌しながら、３０〜６０分間反応させた。反応後、Ｄｙｎａｌ　ＭＰＣ−１磁石（Ｄｙｎａｌ社製）を用いてビーズの付着した細胞を回収し、３％ＦＢＳ−ＰＢＳで３回洗浄した。その結果、Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．２のｃＤＮＡライブラリーを導入した場合にのみ、ビーズの付着した細胞が回収された。
【００９９】
回収された細胞の２．０×１０６細胞よりＨｉｒｔ法（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　８，　２８３７，　１９８８）によりプラスミドを調製し、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）にエレクトロポレーション法により導入した。得られた複数の形質転換大腸菌のシングルコロニーより各プラスミドを調製し、含まれるｃＤＮＡの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。
【０１００】
その結果、４ｋｂの大きさの同一のｃＤＮＡを含むプラスミドが得られた。そのうちの１つのプラスミドｐＡＭｏｆａ２−１−２に含まれていたｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとしてデータベースの検索を行った結果、得られたｃＤＮＡは、ヒトＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡとマウスＮＰＤＣ−１のヒト相同物をコードするｃＤＮＡが繋がったものであることが明らかとなった。マウスＮＰＤＣ−１は、神経細胞特異的な発現が報告されており（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ，　９２，　１５６０，　１９９５）、一方、ヒトＰＳＭＡは、正常前立腺および前立腺癌組織での発現が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５４，　１８０７，　１９９４）ことから、マウス抗体２Ｃ９の認識抗原は、ＰＳＭＡであることが示唆された。
【０１０１】
そこで、得られたヒトＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡのみをプラスミドｐＡＭｏにクローニングし、プラスミドｐＡＭｏＰＳＭＡを構築し、Ｎａｍａｌｗａ　ＫＪＭ−１細胞に導入してＧ４１８耐性細胞を得た。薬剤耐性細胞の５．０×１０５細胞を回収し、４％健常人ヒト血清を含むＰＢＳと反応させた後に、１０μｇ／ｍＬのマウス抗体２Ｃ９あるいはヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するマウス抗体ＫＭ１５４８（特開２０００−８３５９５６）と氷中で３０分間反応させた。反応後、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する）を含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）で３回洗浄し、１５００倍希釈したＲ−フィコエリスリン（ＲＰＥ）標識抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）と氷中で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリー解析を行った。その結果、図１に示すように、マウス抗体２Ｃ９との特異的な反応性が確認された。以上の結果より、マウス抗体２Ｃ９の認識抗原はヒトＰＳＭＡであり、また、マウス抗体２Ｃ９はＰＳＭＡの細胞外領域と反応することが明らかとなった。
【０１０２】
（２）ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰライセートからの抗原の精製とその解析
マウス抗体２Ｃ９あるいは陰性対照としてヒトＣＣケモカイン受容体５に対するマウス抗体ＫＭ２０９０の各８ｍｇを用いて、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　ＩｇＧ　Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）の使用説明書に従い、抗体固定化カラムを作製した。ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰの５×１０７細胞を２ｍＬのＰＢＳにて懸濁し、凍結およびソニケーションによる融解を３回繰り返した後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収した。上清に２ｍＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加した後、全量をＫＭ２０９０固定化カラムに通した。非吸着画分を回収し、さらに、マウス抗体２Ｃ９固定化カラムに通し、カラムの５倍量の１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄後、８ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン（ｐＨ２．８）で溶出を行い、１ｍＬずつ分取した（Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．１〜８）。
【０１０３】
次に、各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。図２には、Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．２〜５の２０μＬの非還元条件下での電気泳動結果を示した。その結果、Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．３および４において約１４０ｋＤａと約９０ｋＤａのバンドが検出された。約１４０ｋＤａのバンドは、抗体由来と考えられたため、約９０ｋＤａのバンドが目的抗原であると推察し、約９０ｋＤａの蛋白質のＮ末端アミノ酸配列の解析をプロテインシークエンサーＰｒｏｃｉｓｅ　４９２ｃＬＣ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。その結果、配列番号１および２で示したアミノ酸配列が得られ、データベースＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ検索を行った結果、ＰＳＭＡのアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｑ０４６０９）の一部と完全に一致することが明らかとなった。以上の結果から、マウス抗体２Ｃ９が認識する抗原は、ＰＳＭＡであることが示唆された。本結果は、上記実施例１（１）の発現クローニング法による抗原の同定によって得られた結果と一致した。
【０１０４】
実施例２　　ＰＳＭＡ発現ヒト前立腺癌細胞株の作製
ＰＳＭＡ陰性のヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　ＣＲＬ−１４３５）を用いて、ＰＳＭＡを細胞膜上に発現する形質転換細胞株を以下のようにして作製した。
【０１０５】
（１）ＰＳＭＡ発現ベクターの構築
上記実施例１（１−２）で得られたプラスミドｐＡＭｏｆａ２−１−２の３μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）およびＳｓｐＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、ＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡを含む約２．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｐＩ断片を約０．５μｇ回収した。
【０１０６】
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の３μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）およびＨｉｎｃＩＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約２．９５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片を約２．１μｇ回収した。
次に、上記で得られたＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡを含む約２．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｐＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片０．１μｇを全量１０μＬの滅菌水に加え、ＴａＫａＲａ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造社製）を形質転換した。形質転換株のクローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＳＰＳＭＡを得た。
【０１０７】
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳＰＳＭＡの３μｇを制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）およびＫｐｎＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、ＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡを含む約２．６ｋｂのＳｍａＩ−ＫｐｎＩ断片を約１．０μｇ回収した。
次に、発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）の３μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で処理し、ＴａＫａＲａ　ＤＮＡ　Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化処理を行い、さらに、制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約９．３ｋｂの平滑末端−ＫｐｎＩ断片を約２．０μｇ回収した。
【０１０８】
次に、上記で得られたＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡを含む約２．６ｋｂのＳｍａＩ−ＫｐｎＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３の平滑末端−ＫｐｎＩ断片０．１μｇを全量１０μＬの滅菌水に加え、ＴａＫａＲａ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製した結果、図３に示したＰＳＭＡ発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＰＳＭＡ１２を得た。
【０１０９】
（２）ＰＳＭＡ発現ヒト前立腺癌細胞株の作製
上記実施例２（１）で得られたＰＳＭＡ発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＰＳＭＡ１２を制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、１０μｇを４×１０６細胞のヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１４３５）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，　１３３，　１９９０）により導入後、４０ｍＬのＲＰＭＩ（１０）培地〔ＦＢＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）〕に懸濁し、９６ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、６日間培養した後、Ｇ４１８を０．２ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。
【０１１０】
Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより細胞を回収し、ＰＳＭＡの発現を実施例２（３）に示す抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９およびネガティブコントロールであるＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ−１に対するマウス抗体ＫＭ１７５０（ＷＯ９９／６００２５）を用いたフローサイトメトリーにより解析し、マウス抗体２Ｃ９と特異的に反応する細胞をＰＳＭＡ発現形質転換株として選択した。その結果、ＰＳＭＡ発現形質転換株として９６０−７を得た。図４には、マウス抗体２Ｃ９ならびにＫＭ１７５０の９６０−７に対する反応性をフローサイトメトリーにより解析した結果を示した。９６０−７については、２回の限界希釈法による単一細胞化（以下、クローン化と表記する）を行い、最終的にＰＳＭＡ発現ＰＣ−３細胞クローンとして９−７−１１を得た。
【０１１１】
（３）ＰＳＭＡ発現細胞のフローサイトメトリー解析
各細胞の２〜５×１０５細胞を、１０μｇ／ｍＬのマウス抗体２Ｃ９またはネガティブコントロールである抗Ｆｌｔ−１抗体ＫＭ１７５０を含む５０μＬのＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳを用いて３回遠心分離して洗浄した後、ＦＩＴＣで標識された抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＫＰＬ社製）をＢＳＡ−ＰＢＳで３０倍希釈した溶液を５０μＬ添加して懸濁後、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳを用いて３回遠心分離して洗浄した後、１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ　Ｅｌｉｔｅ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて解析を行った。
【０１１２】
実施例３　ヒト型キメラ抗体の作製
（１）マウス抗体２Ｃ９のＶ領域をコードするｃＤＮＡの単離と解析
（１−１）マウス抗体２Ｃ９産生ハイブリドーマからのｍＲＮＡの調製
マウス抗体２Ｃ９産生ハイブリドーマの５×１０７細胞より、ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ｍＲＮＡを調製した。
【０１１３】
（１−２）マウス抗体２Ｃ９のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記実施例３（１−１）で取得したｍＲＮＡの５μｇから、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプター配列を有するｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡの全量を２０μＬの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧクラス抗体のＨ鎖をコードするｃＤＮＡの長さに対応する約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片とκクラスのＬ鎖をコードするｃＤＮＡの長さに対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてそれぞれ約１．０μｇ回収した。
【０１１４】
次に、λＺＡＰＩＩ　Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ　ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、各々の約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇおよび約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇと、キットに添付されている制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、Ｃａｌｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで末端を脱リン酸化したλＺＡＰＩＩベクターの１μｇを、添付の使用説明書に従い、連結した。連結後の各々の反応液のうち２．５μＬをＧｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ　Ｇｏｌｄ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、ライブラリーを作製した。マウス抗体２Ｃ９のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリー（約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片をベクターに連結したライブラリー）として１．２５×１０６個、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブラリー（約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片を連結したベクターに連結したライブラリー）として３．５×１０５個のファージクローンを取得した。
【０１１５】
次に、各々のファージを常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　３ｒｄ　ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）に従い、ナイロンメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄＮ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）上に固定した。
（１−３）マウス抗体２Ｃ９のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡのクローニング
上記実施例３（１−２）で作製したＨ鎖ｃＤＮＡライブラリー、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブリーを固定したナイロンメンブレンフィルターを、Ｈ鎖ｃＤＮＡライブラリーはマウスＣγ１をコードするｃＤＮＡの断片（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１４６，　２０１０　１９９１）、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブラリーはマウスＣκをコードするｃＤＮＡの断片（Ｃｅｌｌ，　２２，　１９７，　１９８０）をプローブとしてハイブリダイゼーションを行ない、プローブに強く結合したファージクローンをＨ鎖ｃＤＮＡライブラリー、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブラリーから各１０クローンずつ取得した。プローブの標識、ハイブリダイゼーションおよびクローンの検出はＥＣＬ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って行なった。
【０１１６】
次に、λＺＡＰＩＩ　Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ　ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の使用説明書に従い、ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長の機能的なＨ鎖のｃＤＮＡを含むプラスミドｐ２Ｃ９Ｈ１およびＬ鎖のｃＤＮＡを含むプラスミドｐ２Ｃ９Ｌ１３を得た。
【０１１７】
（１−４）マウス抗体２Ｃ９のＶ領域のアミノ酸配列の解析
得られたマウス抗体２Ｃ９のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を既知の抗体の配列データ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，　１９９１）との比較および精製したマウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬのＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含むマウス抗体２Ｃ９のＨ鎖およびＬ鎖をコードする完全長ｃＤＮＡであり、Ｈ鎖については、ｃＤＮＡの開始コドンから５４塩基がコードする１８アミノ酸が、Ｌ鎖についてはｃＤＮＡの開始コドンから６６塩基がコードする２２アミノ酸が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
【０１１８】
プラスミドｐ２Ｃ９Ｈ１に含まれていたＨ鎖ｃＤＮＡのうち分泌シグナル配列およびＶＨをコードする領域の全塩基配列を配列番号３に、それから推定されたマウス抗体２Ｃ９のＶＨのアミノ酸配列を配列番号４に、プラスミドｐ２Ｃ９Ｌ１３に含まれていたＬ鎖ｃＤＮＡのうち分泌シグナル配列およびＶＬをコードする領域の全塩基配列を配列番号５に、それから推定されたマウス抗体２Ｃ９のＶＬのアミノ酸配列を配列番号６に示した。なお、配列番号４および６に記載したアミノ酸配列にそれぞれ対応する塩基配列は、配列番号３および５に記載したもの以外に無数に存在するが、それらはすべてマウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬをそれぞれコードするＤＮＡに包含される。
【０１１９】
次に、マウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ　Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ　１０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース［ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ　（Ｒｅｌｅａｓｅ　３９．０）、ＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｒｅｌｅａｓｅ　６５．０）］をＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　２１５，　４０３，　１９９０）により検索した。その結果、ＶＨおよびＶＬともに完全に一致する配列は認められず、マウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬは新規なアミノ酸配列を有することが確認された。
【０１２０】
また、マウス抗体２Ｃ９のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。ＶＨのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列を配列番号７、８および９に、ＶＬのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列を配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示した。
【０１２１】
（２）抗ＰＳＭＡヒト型キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（２−１）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒト抗体のＩｇＧ１クラスのＣＨおよびヒト抗体のκクラスのＣＬを有するヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）と実施例３（１−３）で得られたマウス抗体２Ｃ９のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドを用いて抗ＰＳＭＡヒト型キメラ抗体（以下、抗ＰＳＭＡキメラ抗体と表記する）発現ベクターを以下のようにして構築した。
【０１２２】
まず、マウス抗体２Ｃ９の分泌シグナル配列およびＶＨ、分泌シグナル配列およびＶＬをコードするＤＮＡを、分泌シグナル配列、ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を変化させずに発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３に挿入するため、ＰＣＲによって再構築した。プライマーとして、分泌シグナル配列およびＶＨをコードするＤＮＡ用に配列番号１３と１４の塩基配列を有する合成ＤＮＡを、分泌シグナル配列およびＶＬをコードするＤＮＡ用に配列番号１５と１６の塩基配列を有する合成ＤＮＡを設計した。それぞれの合成ＤＮＡは５’末端にｐＫＡＮＴＥＸ９３へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、実施例３（１−３）で得られたプラスミドｐ２Ｃ９Ｈ１の４０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｎｏ．１（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、２．５単位のＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）、０．５μｍｏｌ／Ｌの配列番号１３と１４に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）を用いて、９４℃にて３０秒間、５８℃にて３０秒間、７４℃にて６０秒間のサイクルを２５サイクル、その後、７２℃にて１０分間反応させた。同様に、実施例３（１−３）で得られたプラスミドｐ２Ｃ９Ｌ１３の４５ｎｇを５０μＬのＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｎｏ．１（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、２．５単位のＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）、０．５μｍｏｌ／Ｌの配列番号１５と１６に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、上記と同様の方法でＰＣＲを行なった。
【０１２３】
それぞれの反応液４５μＬをＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の使用説明書に従い、精製後、分泌シグナル配列およびＶＨをコードするＤＮＡについては、制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）およびＡｐａＩ（宝酒造社製）で処理し、分泌シグナル配列およびＶＬをコードするＤＮＡについては、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約０．５ｋｂの分泌シグナル配列およびＶＨをコードするＤＮＡを含むＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片、約０．４５ｋｂの分泌シグナル配列およびＶＬをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片をそれぞれ約０．２μｇ回収した。
【０１２４】
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の３μｇを制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）およびＡｐａＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約２．９５ｋｂのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片を約２．１μｇ回収した。また、特開平１０−２５７８９３に記載のプラスミドｐＢＳＬ３の３μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約２．９５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約２．１μｇ回収した。
【０１２５】
次に、上記ＰＣＲにより得られたマウス抗体２Ｃ９の分泌シグナル配列およびＶＨをコードするＤＮＡを含むＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇを全量１０μＬの滅菌水に加え、ＴａＫａＲａ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて連結した。また、ＰＣＲにより得られたマウス抗体２Ｃ９の分泌シグナル配列およびＶＬをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢＳＬ３のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇを全量１０μＬの滅菌水に加え、ＴａＫａＲａ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７７（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を決定した。こうして目的の塩基配列を有する図５に示したプラスミドｐ２Ｃ９ＶＨおよびｐ２Ｃ９ＶＬを得た。
【０１２６】
次に、上記で得られたプラスミドｐ２Ｃ９ＶＬの３μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約０．４５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の３μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約１２．７５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約２．０μｇ回収した。
【０１２７】
次に、上記で得られたプラスミドｐ２Ｃ９ＶＬのマウス抗体２Ｃ９の分泌シグナル配列およびＶＬをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇを全量１０μＬの滅菌水に加え、ＴａＫａＲａ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を決定した。その結果、図６に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９Ｌを得た。
【０１２８】
次に、上記で得られたプラスミドｐ２Ｃ９ＶＨの３μｇを制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）およびＡｐａＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約０．５ｋｂのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９Ｌの３μｇを制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）およびＡｐａＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約１３．２０ｋｂのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片を約２．０μｇ回収した。
【０１２９】
次に、上記で得られたプラスミドｐ２Ｃ９ＶＨのマウス抗体２Ｃ９の分泌シグナル配列およびＶＨをコードするＤＮＡを含むＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９ＬのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇを全量１０μＬの滅菌水に加え、ＴａＫａＲａ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を決定した。その結果、図６に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９を得た。
【０１３０】
（２−２）抗ＰＳＭＡキメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
実施例３（２−１）で得られた抗ＰＳＭＡキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９を用いて抗ＰＳＭＡキメラ抗体の動物細胞での発現を以下のようにして行った。
【０１３１】
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９を制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、１０μｇを４×１０６細胞のラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　３，　１３３，　１９９０）により導入後、４０ｍＬのＨ−ＳＦＭ（ＧＦ５）［ダイゴＧＦ２１（日本製薬社製）を５％含むＨ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＰＳＭＡキメラ抗体の濃度を実施例３（２−３）に示す定量ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１３２】
培養上清中に抗ＰＳＭＡキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ｄｈｆｒの阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＨ−ＳＦＭ（ＧＦ５）に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェル培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。
【０１３３】
形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ＰＳＭＡキメラ抗体の濃度を実施例３（２−３）に示す定量ＥＬＩＳＡにより測定した。培養上清中に抗ＰＳＭＡキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎｍｏｌ／Ｌ、２００ｎｍｏｌ／Ｌと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＨ−ＳＦＭ（ＧＦ５）で増殖可能かつ、抗ＰＳＭＡキメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法によるクローン化を行い、抗ＰＳＭＡキメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞クローンＫＭ２７７７を得た。なお、ＫＭ２７７７は平成１４年３月１９日付で、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番１号　中央第６）にＦＥＲＭ−ＢＰ７９６９として寄託されている。
【０１３４】
（２−３）抗ＰＳＭＡキメラ抗体の定量（定量ＥＬＩＳＡ）
抗ヒトＩｇκ鎖抗体（ＺＹＭＥＤ社製）をＰＢＳにて２００倍希釈し、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルに５０μＬずつ分注し、４℃で１２時間反応させた。反応後、溶液を捨て、ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清、精製したキメラ抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に３０％過酸化水素溶液を１μＬ／ｍＬの割合で添加した溶液〕を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
【０１３５】
（２−４）抗ＰＳＭＡキメラ抗体の培養上清からの精製
実施例３（２−２）で得られた抗ＰＳＭＡキメラ抗体を発現する形質転換細胞クローンＫＭ２７７７をＨ−ＳＦＭ（ＧＦ５）に１〜２×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１００ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で５〜７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約３ＬよりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７を精製し、約２５ｍｇの精製蛋白質を取得した。得られた抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７の約４μｇを、公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，　２２７，　６８０，　１９７０）に従って電気泳動し、分子量および精製度を調べた。その結果を図７に示した。
【０１３６】
図７に示したように、精製した抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７は、非還元条件下では分子量が約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄのバンドが認められた。これらの分子量は、ＩｇＧクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　１４，　１９８８；　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，　１９９６）と一致し、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。また、精製した抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所社製）を用いて解析した結果、マウス抗体２Ｃ９のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列と一致することを確認した。
【０１３７】
実施例４　抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７の活性評価
（１）ヒト前立腺癌細胞株の膜成分に対する結合活性
（１−１）ヒト前立腺癌細胞株の膜成分の単離
ＰＳＭＡ陽性ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７４０）の３×１０８細胞を回収し、７ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ、２５０ｍｍｏｌ／ＬＳｕｃｒｏｓｅ、ｐＨ７．４）を加え、ホモゲナイザーを用いて細胞を破砕し、氷上で５分間放置した。１０，０００ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収し、さらに、１００，０００ｇで１時間遠心分離した。沈殿画分を回収し、０．７ｍＬの溶解緩衝液を添加して良く懸濁し、膜成分とした。単離した膜成分については、その一部を１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を加えて可溶化し、ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて蛋白質濃度の定量を行った結果、４．１ｍｇ／ｍＬであった。
【０１３８】
（１−２）ヒト前立腺癌細胞株の膜成分に対する結合活性の測定
上記実施例４（１−１）で単離した膜成分をＰＢＳを用いて蛋白質濃度として１０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルに５０μＬずつ分注し、４℃で１２時間反応させた。反応後、溶液を捨て、ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、精製抗体〔抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９および抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７、陰性対照として抗Ｆｌｔ−１マウス抗体ＫＭ１７５０（ＷＯ９９／６００２５）および抗Ｆｌｔ−１ヒト型キメラ抗体ＫＭ２５５０（ＷＯ９９／６００２５）〕の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、マウス抗体の場合には、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体溶液（Ｚｙｍｅｄ社製）を、キメラ抗体の場合には、３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。図８には、抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７、抗Ｆｌｔ−１マウス抗体ＫＭ１７５０および抗Ｆｌｔ−１ヒト型キメラ抗体ＫＭ２５５０の膜成分に対する結合活性を測定した結果を示した。その結果、抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９および抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７は、ＰＳＭＡ陽性ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰの膜成分に特異的に反応し、その活性は、検出のための二次抗体が異なるため、直接比較することはできないが、ほぼ同等であることが示唆された。
【０１３９】
（２）ヒト前立腺癌細胞株との反応性
（２−１）抗体のビオチン標識
抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９および抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７、陰性対照として抗Ｆｌｔ−１抗体ＫＭ１７５０（ＷＯ９９／６００２５）および抗Ｆｌｔ−１ヒト型キメラ抗体ＫＭ２５５０（ＷＯ９９／６００２５）のビオチン標識は、以下のようにして行った。
【０１４０】
１ｍｇ／ｍＬの抗体溶液の１ｍＬに０．２５ｍＬの０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．２）および０．２５ｍＬの１ｍｇ／ｍＬのＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ溶液（ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え、緩やかに攪拌しながら、室温にて３時間反応させた。反応後、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて透析を行った。
【０１４１】
（２−２）ヒト前立腺癌細胞株との反応性の測定
ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７４０）およびＰＣ−３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１４３５）の２×１０５細胞を、上記実施例４（２−１）で作製した各種ビオチン標識抗体をＢＳＡ−ＰＢＳにて１０μｇ／ｍＬに希釈した溶液の５０μＬで懸濁し、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳを用いて３回遠心分離して洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）をＢＳＡ−ＰＢＳで１０倍希釈した溶液を５０μＬ添加して懸濁後、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳを用いて３回遠心分離して洗浄した後、１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ　Ｅｌｉｔｅ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて解析を行った。その結果を図９に示した。図９に示したように、ビオチン標識マウス抗体２Ｃ９およびキメラ抗体ＫＭ２７７７は、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞に特異的に反応し、一方、ＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３細胞には反応せず、ＰＳＭＡ特異的な反応が確認された。また、その反応性は、マウス抗体とキメラ抗体でほとんど同等であったことから、キメラ抗体ＫＭ２７７７はマウス抗体２Ｃ９の結合活性および結合特異性を保持していることが明らかとなった。
【０１４２】
さらに、実施例２（２）で作製したＰＳＭＡ発現ＰＣ−３細胞９−７−１１の２×１０５細胞を、抗Ｆｌｔ−１キメラ抗体ＫＭ２５５０あるいは抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７をＢＳＡ−ＰＢＳにて１０μｇ／ｍＬに希釈した溶液の１００μＬで懸濁し、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳを用いて３回遠心分離して洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（和光純薬社製）をＢＳＡ−ＰＢＳで２０倍希釈した溶液を５０μＬ添加して懸濁後、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳを用いて３回遠心分離して洗浄した後、１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ　Ｅｌｉｔｅ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて解析を行った。その結果を図１０に示した。図１０に示したように、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７は、ＰＳＭＡ発現ＰＣ−３細胞９−７−１１と特異的な反応を示した。
【０１４３】
（３）ヒト前立腺癌細胞株に対するｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
ヒト前立腺癌細胞株に対する各種抗体のｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞障害活性としてのＡＤＣＣ活性は、以下のようにして測定した。
【０１４４】
（３−１）標的細胞溶液の調製
ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７４０）、ＰＣ−３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１４３５）あるいは実施例２（２）で作製したＰＳＭＡ発現ＰＣ−３細胞９−７−１１の１×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ加えて、３７℃で１時間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ（１０）培地を用いて懸濁および遠心分離操作を３回行い、洗浄し、ＲＰＭＩ（１０）培地に再懸濁して４℃で３０分間氷上に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ（１０）培地を５ｍＬ加え、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
【０１４５】
（３−２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ　ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、ＲＰＭＩ（１０）培地を用いて２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
【０１４６】
（３−３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記実施例４（３−１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで上記実施例４（３−２）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。さらに、各種抗体の培地による希釈溶液を加えて全量を２００μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、ヒトエフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、ヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
ＡＤＣＣ活性（％）＝［（検体上清中の５１Ｃｒ量−自然解離５１Ｃｒ量）／（全解離５１Ｃｒ量−自然解離５１Ｃｒ量）］×１００
【０１４７】
図１１には、各種抗体のＡＤＣＣ活性測定結果を示した。その結果、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７は、ＰＳＭＡ陽性ヒト前立腺細胞株に特異的に高いＡＤＣＣ活性を示すこと、マウス抗体２Ｃ９ではほとんどＡＤＣＣ活性が認められなかったことから、キメラ抗体化によりヒトエフェクター細胞を介したＡＤＣＣ活性の増強が達成されたことが確認された。
【０１４８】
実施例５　　ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の作製
抗ＰＳＭＡキメラ抗体とサイトカインとの融合抗体の具体例として、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７とｈＩＬ−２の融合抗体であるＫＭ２７７７−ｈＩＬ−２を以下のようにして作製した。
【０１４９】
（１）ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（１−１）ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体発現ベクターの構築
上記実施例３（２−１）で得られた抗ＰＳＭＡキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９の３μｇを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）およびＮｒｕＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約１２．７ｋｂのＡｐａＩ−ＮｒｕＩ断片を約２．０μｇ回収した。次にプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ８７１−ｈＩＬ２（ＷＯ０１／２３４３２）の３μｇを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）およびＮｒｕＩ（宝酒造社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、約１．４５ｋｂのＡｐａＩ−ＮｒｕＩ断片を約０．３μｇ回収した。
【０１５０】
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３のＡｐａＩ−ＮｒｕＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ８７１−ｈＩＬ２のＡｐａＩ−ＮｒｕＩ断片０．１μｇを全量１０μＬの滅菌水に加え、ＴａＫａＲａ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製した結果、図１２に示したｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９−ｈＩＬ２を得た。
【０１５１】
（１−２）ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
実施例５（１−１）で得られたｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９−ｈＩＬ２を用いてｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の動物細胞での発現を以下のようにして行った。
【０１５２】
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９−ｈＩＬ２を制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、１０μｇを４×１０６細胞のラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　３，　１３３，　１９９０）により導入後、４０ｍＬのＨ−ＳＦＭ（ＧＦ５）に懸濁し、９６ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中のｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の濃度を実施例３（２−３）に示す定量ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１５３】
培養上清中にｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ｄｈｆｒの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＨ−ＳＦＭ（ＧＦ５）に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェル培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中のｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の濃度を実施例３（２−３）に示す定量ＥＬＩＳＡにより測定した。培養上清中にｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎｍｏｌ／Ｌ、２００ｎｍｏｌ／Ｌと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＨ−ＳＦＭ（ＧＦ５）で増殖可能かつ、ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法によるクローン化を行い、ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞クローンＫＭ２８１２を得た。なお、ＫＭ２８１２は平成１４年３月１９日付で、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番１号　中央第６）にＦＥＲＭ−ＢＰ７９７０として寄託されている。
【０１５４】
（１−３）ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の培養上清からの精製
実施例５（１−２）で得られたｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体を発現する形質転換細胞クローンＫＭ２８１２をＨ−ＳＦＭ（ＧＦ５）に１〜２×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１０００ｍＬのＳｉＣｕｌｔｕｒｅ　ＣＥＬＬ　ＢＡＧ（ＡＶＥＣＯＲ社製）に８００ｍＬ播種した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で６日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約８００ｍＬよりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２を精製し、約２０ｍｇの精製蛋白質を取得した。
【０１５５】
得られたｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２および抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７の約４μｇを、公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，　２２７，　６８０，　１９７０）に従って電気泳動し、分子量および精製度を調べた。その結果を図１３に示した。図１３に示したように、精製したｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２は、非還元条件下では分子量は約１８０Ｋｄであり、還元条件下では約６５Ｋｄと約２５Ｋｄの２本バンドが認められた。これらの分子量は、抗体Ｈ鎖とｈＩＬ−２およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（６４Ｋｄと２４Ｋｄ、分子全体：１７６Ｋｄ）とほぼ一致し、抗体分子へのｈＩＬ−２の融合が確認された。
【０１５６】
実施例６　　ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２の活性評価
（１）ヒト前立腺癌細胞株の膜成分に対する結合活性
上記実施例４（１−１）で単離した膜成分をＰＢＳを用いて蛋白質濃度として１０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルに５０μＬずつ分注し、４℃で１２時間反応させた。反応後、溶液を捨て、ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、精製抗体（抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７およびｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２）の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。図１４には、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７およびｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２の膜成分に対する結合活性を測定した結果を示した。その結果、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７およびｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２は、ＰＳＭＡ陽性ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰの膜成分に特異的に反応し、その活性はほぼ同等であることが確認された。
【０１５７】
（２）ヒト前立腺癌細胞株との反応性
ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７４０）およびＰＣ−３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１４３５）の２×１０５細胞を、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７およびｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２をＢＳＡ−ＰＢＳにて１０μｇ／ｍＬに希釈した溶液の５０μＬで懸濁し、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳを用いて３回遠心分離して洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（和光純薬社製）をＢＳＡ−ＰＢＳで２０倍希釈した溶液を５０μＬ添加して懸濁後、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳを用いて３回遠心分離して洗浄した後、１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ　Ｅｌｉｔｅ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて解析を行った。その結果を図１５に示した。図１５に示したように、ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２は、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７と同様に、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞と特異的な反応を示し、一方、ＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３細胞とは反応しなかった。
【０１５８】
（３）ｈＩＬ−２活性の評価
ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２のｈＩＬ−２としての活性を以下に示す方法に従い、測定した。ｈＩＬ−２に対して濃度依存的な増殖を示すマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ２１４）を２×１０５細胞／ｍＬの濃度でＲＰＭＩ（１０）培地に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に５０μＬずつ分注した。各ウェルにｈＩＬ−２（ＰＥＰＲＯ　ＴＥＣＨ社製）あるいはｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２をＲＰＭＩ（１０）培地で各種濃度に希釈した溶液の５０μＬを加え、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で２７時間培養した。培養後、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を１０μＬずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で３時間培養後にＯＤ４５０を測定し、生細胞数を測定した。その結果を図１６に示した。図１６に示したように、ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２は、ｈＩＬ−２と同程度のＣＴＬＬ−２細胞の増殖支持活性を示した。以上の結果は、ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２のｈＩＬ−２としての活性は、抗体との融合後も保持されていることを示している。
【０１５９】
（４）ヒト前立腺癌細胞株に対するｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞障害活性
ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２のｈＩＬ−２によるヒトリンパ球の活性化とそれに伴う細胞障害活性の増強をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価するため、ヒト前立腺癌細胞株に対する細胞障害活性を以下のようにして測定した。
【０１６０】
（４−１）標的細胞溶液の調製
実施例４（３−１）に記載の方法に従い、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７４０）を放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４で放射標識し、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
【０１６１】
（４−２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
実施例４（３−２）に記載の方法に従い、健常人静脈血５０ｍＬより単核球画分を分離し、１×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
【０１６２】
（４−３）ヒトエフェクター細胞の活性化
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記実施例６（４−２）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を５０μＬ（５×１０４細胞／ウェル）添加した。さらに、各種抗体の培地による希釈溶液を加えて全量を１００μＬとし、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７２時間静置した。
【０１６３】
（４−４）細胞障害活性の測定
７２時間後のプレートの各ウェルに上記実施例６（４−１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を添加した（エフェクター細胞と標的細胞の比は５：１となる）。さらに、各種抗体の培地による希釈溶液を抗体濃度を保つように５０μＬずつ添加して３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、ヒトエフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、ヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。細胞障害活性は次式により求めた。
細胞障害活性（％）＝［（検体上清中の５１Ｃｒ量−自然解離５１Ｃｒ量）／（全解離５１Ｃｒ量−自然解離５１Ｃｒ量）］×１００
【０１６４】
図１７には、各種抗体の細胞障害活性の測定結果を示した。その結果、ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２は、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７に比べ、高い細胞障害活性を示すことが明らかとなった。この結果は、ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２は、ｈＩＬ−２によりヒトリンパ球を活性化でき、それにより細胞障害活性が増強されていることを示している。
【０１６５】
実施例７　アドリアマイシン結合抗ＰＳＭＡキメラ抗体の調製
参考例１で作製したアドリアマイシン（以下、ＡＤＭと表記する）結合リンカー２０ｍｇ（６．７μｍｏｌ）を塩化メチレン１ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．９ｍｇ（１６μｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド３．４ｍｇ（１６μｍｏｌ）を含有する塩化メチレン溶液０．２ｍＬを添加し、氷冷下３０分間、室温１．５時間攪拌した。反応液をろ過後、得られた濾液を濃縮乾燥、ジエチルエーテルを用いたトリチレーションを行い、活性化ＡＤＭ結合リンカーを１３．７ｍｇ（収率６６％）取得した。得られた活性化ＡＤＭ結合リンカーのＮＭＲスペクトルは以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，　３００ＭＨｚ）δ　ｐｐｍ　：　０．８０−０．９２　（ｍ，　４Ｈ），　１．２３−１．３５　（ｍ，　２Ｈ），　１．２９（ｄ，　Ｊ　＝６．９　Ｈｚ，　３Ｈ），　１．９３−２．２０　（ｍ，　３Ｈ），　２．５５　（ｄｄ，　Ｊ　＝　５．９，　５．９　Ｈｚ，　２Ｈ），２．８２−２．９６　（ｍ，　４Ｈ），　２．８４　（ｂｒ　ｓ，　２Ｈ），　２．９１　（ｔ，　Ｊ　＝　６．６　Ｈｚ，　２Ｈ），　３．００−３．１０（ｍ，　１Ｈ），　３．３９−３．９０　（ｍ，　４ｎＨ），　３．８６　（ｔ，　Ｊ　＝　６．５　Ｈｚ，　２Ｈ），　４．０１−４．１３　（ｍ，　３Ｈ），　４．１０　（ｓ，　３Ｈ），　４．４５　（ｍ，　１Ｈ），　４．６９−４．８０　（ｍ，　２Ｈ），　５．３１　（ｂｒ　ｓ，　１Ｈ），　５．５１（ｍ，　１Ｈ），　７．４１　（ｄ，　Ｊ　＝８．５　Ｈｚ，　１Ｈ），　７．７９（ｔ，　Ｊ　＝　８．１　Ｈｚ，　１Ｈ），　８．０６　（ｄ，　Ｊ　＝７．７　Ｈｚ，　１Ｈ），　１３．２９　（ｓ，　１Ｈ），　１３．９７　（ｓ，　１Ｈ）
【０１６６】
次に、ＰＢＳに溶解した抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７（１．０ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍＬ）に上記で得られた活性化ＡＤＭ結合リンカーを抗体１分子当たり７．５当量添加し、４℃で２０時間攪拌した。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で５倍希釈した。ＳＰ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）２ｍＬのカラムを用い、０、０．５および１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムのステップワイズ溶出で精製した。ＡＤＭ結合リンカーの結合したＫＭ２７７７を含む画分（０．８ｍＬ、濃度３４６μｇ／ｍＬ）を回収し、２８０μｇ（収率１７％）のアドリアマイシン結合抗ＰＳＭＡキメラ抗体（以下、ＡＤＭ−ＫＭ２７７７と表記する）を取得した。得られたＡＤＭ−ＫＭ２７７７の抗体１分子当たりに結合したＡＤＭ量をＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄらの方法（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５０，　６６００，　１９９０）に準じて測定した。その結果、抗体１分子あたりのＡＤＭ量は平均２．５分子であった。
【０１６７】
実施例８　　ＡＤＭ−ＫＭ２７７７の活性評価
（１）ヒト前立腺癌細胞株との反応性
ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７４０）およびＰＣ−３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１４３５）の２×１０５細胞を、ＡＤＭ−ＫＭ２７７７および抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７をそれぞれＢＳＡ−ＰＢＳにて１０μｇ／ｍＬに希釈した溶液の５０μＬで懸濁し、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳを用いて３回遠心分離して洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（和光純薬社製）をＢＳＡ−ＰＢＳで２０倍希釈した溶液を５０μＬ添加して懸濁後、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳを用いて３回遠心分離して洗浄した後、１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ　Ｅｌｉｔｅ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて解析を行った。その結果を図１８に示した。図１８に示したように、ＡＤＭ−ＫＭ２７７７は、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７と同様に、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞と特異的な反応を示し、一方、ＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３細胞とは反応しなかった。また、反応性の強さも同等であったことから、ＡＤＭ−ＫＭ２７７７は、ＡＤＭの結合後もＫＭ２７７７と同等の結合活性を保持していることが明らかとなった。
【０１６８】
（２）細胞増殖阻害活性の評価
ＡＤＭ−ＫＭ２７７７のヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７４０）およびＰＣ−３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１４３５）に対する細胞増殖阻害活性は以下のようにして測定した。各細胞をＲＰＭＩ（１０）培地で１×１０５細胞／ｍＬに調製し、９６ウェル培養用プレートに５０μＬ／ウェルで分注した。さらに、ＲＰＭＩ（１０）培地で各種濃度に希釈した抗体溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で９６時間培養した。培養後、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を１０μＬ／ウェルで分注し、さらに、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４時間培養した後に、ＯＤ４５０をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
【０１６９】
図１９Ａには、ＬＮＣａＰ細胞を用いた結果を、図１９Ｂには、ＰＣ−３細胞を用いた結果を示した。その結果、ＡＤＭ−ＫＭ２７７７は、細胞増殖阻害活性を示し、その活性は、ＰＳＭＡ陽性癌細胞であるＬＮＣａＰの方がＰＳＭＡ陰性細胞より強いものであった。以上の結果は、ＡＤＭ−ＫＭ２７７７がＰＳＭＡ陽性癌細胞に対し、抗原依存的な細胞増殖阻害活性の増強作用を有することを示している。
【０１７０】
実施例９　　ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２のｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
（１）ＰＳＭＡ陽性ヒト前立腺癌細胞株移植ＳＣＩＤマウス（進行期モデル）での評価
５週齢の雄性ＳＣＩＤマウス（Ｆｏｘ　ＣＨＡＳＥ　Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ　Ｊｃｌ、日本クレア社製）４０匹の腹腔内に抗アシアロＧＭ１抗血清（和光純薬社製）を５０μＬ／匹で投与した。２日後、ＰＳＭＡ陽性ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７４０）の１×１０７細胞を、ＲＰＭＩ（１０）培地とマトリジェル（ＢＤ　ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ　ＭＡＴＲＩＸ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の等量混合液２００μＬに懸濁し、マウスの右側腹側部皮下に移植した。移植１９日後、腫瘍体積が１７７〜１７８ｍｍ３のマウスを選択し、各群５匹で２群に分類した。腫瘍体積は腫瘍の短径と長径をｍｍ単位でノギスを用いて測定し、下式にて算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（短径）２×長径×０．５
２群に対し、それぞれコントロールの生理食塩水またはＫＭ２８１２を尾静脈より投与した。ＫＭ２８１２の投与量は８４μｇ（４６７ｎｍｏｌ）／日とした。
【０１７１】
ＫＭ２８１２は生理食塩水で２００μＬに希釈し、移植２０日後より５日間連続で投与した。抗腫瘍効果の判定は各群の腫瘍体積、および腫瘍移植後５６日目の評価終了時における腫瘍の完全退縮が見られたマウスの割合で判定した。図２０には、経日的に腫瘍体積を測定した結果を示した。図２０に示したように、ＫＭ２８１２にはコントロール群と比較して腫瘍増殖抑制効果が認められた。また腫瘍移植後５６日目における腫瘍の完全退縮が見られたマウスの割合を第２表に示す。
【０１７２】
【表２】
2004000045.tif 000004
【０１７３】
第２表に示したように、ＫＭ２８１２はコントロール群と比較して腫瘍の完全退縮に至ったマウスの割合が高かった。以上より、ＫＭ２８１２は本マウス坦癌モデルにおいて、抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。
【０１７４】
（２）ＰＳＭＡ発現ヒト前立腺癌細胞株９−７−１１移植ヌードマウス（初期モデル）での評価
６週齢の雄性ヌードマウス（日本クレア社製）の２２匹の右側腹側部皮下に、実施例２（２）で得られたＰＳＭＡ発現ＰＣ−３細胞９−７−１１の５×１０６細胞をＲＰＭＩ（１０）培地の２００μＬに懸濁し、移植した。第３表に示す２群を設定し、移植当日よりコントロールのヒトＩｇＧ（ウェルファイド社製）またはＫＭ２８１２を生理食塩水で２００μＬに希釈し、１日１回、５日間連続で尾静脈より投与した。
【０１７５】
抗腫瘍効果は各群の腫瘍体積、および移植２５日目と評価終了時の４９日目における腫瘍の完全退縮（２０ｍｍ３未満の痕跡を含む）が見られたマウスの割合で判定した。腫瘍体積は腫瘍の短径と長径をｍｍ単位でノギスを用いて測定し、下式にて算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（短径）２×長径×０．５
図２１には、経日的に腫瘍体積を測定した結果を示した。図２１に示したように、ＫＭ２８１２はコントロール群と比較して腫瘍増殖抑制効果が認められた。また腫瘍移植後２５、４９日目における腫瘍の完全退縮が見られたマウスの割合を第３表に示した。
【０１７６】
【表３】
2004000045.tif 000005
【０１７７】
第３表に示したように、ＫＭ２８１２はコントロール群と比較して腫瘍の完全退縮に至ったマウスの割合が高かった。以上より、ＫＭ２８１２は本マウス坦癌モデルにおいて、抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。
【０１７８】
参考例１　アドリアマイシン結合リンカーの調製
ＷＯ９６／３５４５１に記載の方法に準じてＰＥＧにジペプチドが結合したリンカーを調製し、アドリアマイシンと縮合させた。この際、ＰＥＧ（平均分子量約：２，０００、日本油脂株式会社製）は、特開２０００−２０４１５３に記載の方法に準じて末端の水酸基をカルボキシル基に変換して使用した。また、ジペプチドにはグリシル−プロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を用いた。作製したＡＤＭ結合リンカーの構造を図２２に示す。
【０１７９】
【発明の効果】
本発明により、ヒト前立腺癌に特異的に反応する抗体、その抗体断片、および融合抗体が提供される。本発明の抗体は、酵素免疫抗体法および免疫組織染色におけるＰＳＭＡの定量、検出に有効である。本発明の抗体は、前立腺癌などのＰＳＭＡ陽性の癌および血中ＰＳＭＡ濃度の上昇を伴う疾患の診断および治療に有用である。
【０１８０】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：あらゆるアミノ酸
配列番号２：あらゆるアミノ酸
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
【０１８１】
【配列表】
2004000045.tif 000006
2004000045.tif 000007
2004000045.tif 000008
2004000045.tif 000009
2004000045.tif 000010
2004000045.tif 000011
2004000045.tif 000012
2004000045.tif 000013
2004000045.tif 000014
2004000045.tif 000015
2004000045.tif 000016
2004000045.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９および抗ＶＥＧＦマウス抗体ＫＭ１５４８の、プラスミドｐＡＭｏＰＳＭＡを導入したＮａｍａｌｗａ　ＫＪＭ−１細胞との反応性を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す。横軸が蛍光強度、縦軸が細胞数を示す。
【図２】図２はマウス抗体２Ｃ９カラムにより精製された蛋白質の非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。レーンＭ１が高分子量マーカー、Ｍ２が低分子量マーカー、レーン１がＦｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．２、レーン２がＦｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．３、レーン３がＦｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．４、レーン４がＦｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ．５の各２０μＬの泳動パターンをそれぞれ示す。矢印が目的抗原と考えられる蛋白質を示す。
【図３】図３はプラスミドｐＫＡＮＴＥＸＰＳＭＡ１２の造成工程を示した図である。
【図４】図４は、抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９および抗Ｆｌｔ−１マウス抗体ＫＭ１７５０の、ＰＳＭＡ発現ＰＣ−３細胞株９６０−７との反応性をフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す。実線が２Ｃ９、点線がＫＭ１７５０の結果を示す。横軸が蛍光強度、縦軸が細胞数を示す。
【図５】図５はプラスミドｐ２Ｃ９ＶＨおよびｐ２Ｃ９ＶＬの造成工程を示した図である。
【図６】図６はプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９の造成工程を示した図である。
【図７】図７は精製した抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンＭ１が高分子量マーカー、レーンＭ２が低分子量マーカー、レーン１がＫＭ２７７７の泳動パターンをそれぞれ示す。
【図８】図８は精製した抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９および抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７のヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰの膜成分に対する結合活性を測定した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が結合活性（ＯＤ４１５）を示す。○がマウス抗体２Ｃ９、●がキメラ抗体ＫＭ２７７７、□がコントロールマウス抗体ＫＭ１７５０、黒い四角がコントロールキメラ抗体ＫＭ２５５０の反応性をそれぞれ示す。
【図９】図９はビオチン標識した抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９、抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７、抗Ｆｌｔ−１マウス抗体ＫＭ１７５０および抗Ｆｌｔ−１キメラ抗体ＫＭ２５５０のヒト前立腺癌細胞株との反応性をフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す。横軸が蛍光強度、縦軸が細胞数を示す。Ａがヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、Ｂがヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３の結果を示す。
【図１０】図１０は抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７および抗Ｆｌｔ−１キメラ抗体ＫＭ２５５０のＰＳＭＡ発現ＰＣ−３細胞９−７−１１との反応性をフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す。実線がＫＭ２７７７、点線がＫＭ２５５０の結果を示す。横軸が蛍光強度、縦軸が細胞数を示す。
【図１１】図１１は精製した抗ＰＳＭＡマウス抗体２Ｃ９および抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７のヒト前立腺癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を測定した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が細胞障害活性（％）を示す。斜線を引いたバーがマウス抗体２Ｃ９、黒いバーがキメラ抗体ＫＭ２７７７、白いバーがコントロールキメラ抗体ＫＭ２５５０の活性をそれぞれ示す。Ａがヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、Ｂがヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３、ＣがＰＳＭＡ発現ＰＣ−３細胞９−７−１１の結果を示す。
【図１２】図１２はプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｃ９−ｈＩＬ２の造成工程を示した図である。
【図１３】図１３は精製したｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンＭ１が高分子量マーカー、レーンＭ２が低分子量マーカー、レーン１がｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２、レーン２が抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７の泳動パターンをそれぞれ示す。
【図１４】図１４は精製したｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２および抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７のヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰの膜成分に対する結合活性を測定した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が結合活性（ＯＤ４１５）を示す。●がｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２、○がキメラ抗体ＫＭ２７７７の反応性をそれぞれ示す。
【図１５】図１５は抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７、ｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２、および抗Ｆｌｔ−１キメラ抗体ＫＭ２５５０のヒト前立腺癌細胞株との反応性をフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す。実線がＫＭ２７７７、粗い点線がＫＭ２８１２、細かい点線がＫＭ２５５０の結果を示す。横軸が蛍光強度、縦軸が細胞数を示す。Ａがヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、Ｂがヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３の結果を示す。
【図１６】図１６は精製したｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２およびｈＩＬ−２のｈＩＬ−２依存性細胞ＣＴＬＬ−２に対する増殖支持活性を各蛋白質濃度を変化させて測定した図である。横軸がｈＩＬ−２換算濃度（ｐＭ）、縦軸が細胞増殖（ＯＤ４５０）を示す。●がｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２、○がｈＩＬ−２の活性をそれぞれ示す。
【図１７】図１７は精製したｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２および抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７のヒトエフェクター細胞の活性化とそれに伴う細胞障害活性を測定した図である。横軸が抗体濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）、縦軸が細胞障害活性（％）を示す。黒いバーがｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２、白いバーが抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７、斜線を引いたバーがコントロールキメラ抗体ＫＭ２５５０の活性をそれぞれ示す。
【図１８】図１８は抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２７７７、アドリアマイシン結合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＡＤＭ−ＫＭ２７７７および抗Ｆｌｔ−１キメラ抗体ＫＭ２５５０のヒト前立腺癌細胞株との反応性をフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す。実線がＫＭ２７７７、粗い点線がＡＤＭ−ＫＭ２７７７、細かい点線がＫＭ２５５０の結果を示す。横軸が蛍光強度、縦軸が細胞数を示す。Ａがヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、Ｂがヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３の結果を示す。
【図１９】図１９は精製したＡＤＭ−ＫＭ２７７７のヒト前立腺癌細胞株に対する細胞増殖阻害活性を測定した図である。横軸がＡＤＭ−ＫＭ２７７７の濃度（μｍｏｌ／Ｌ）、縦軸が細胞増殖（ＯＤ４５０）を示す。点線はＡＤＭ−ＫＭ２７７７非添加時の細胞増殖（ＯＤ４５０）を示す。ＡがＰＳＭＡ陽性ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、ＢがＰＳＭＡ陰性ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３の結果を示す。
【図２０】図２０はＰＳＭＡ陽性ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを移植したＳＣＩＤマウスに対する精製したｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２の抗腫瘍効果を測定した図である。横軸が腫瘍移植後の経過日数、縦軸が腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。黒い四角がコントロール（生理食塩水）、○がｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２の投与の結果をそれぞれ示す。
【図２１】図２１はＰＳＭＡ発現ヒト前立腺癌細胞株９−７−１１を移植したヌードマウスに対する精製したｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２の抗腫瘍効果を測定した図である。横軸が腫瘍移植後の経過日数、縦軸が腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。黒い四角がコントロール（ヒトＩｇＧ）、○がｈＩＬ−２融合抗ＰＳＭＡキメラ抗体ＫＭ２８１２の投与の結果をそれぞれ示す。
【図２２】図２２はＡＤＭリンカーの構造を示す。
【図１】
2004000045.tif 000019
【図２】
2004000045.tif 000020
【図３】
2004000045.tif 000021
【図４】
2004000045.tif 000022
【図５】
2004000045.tif 000023
【図６】
2004000045.tif 000024
【図７】
2004000045.tif 000025
【図８】
2004000045.tif 000026
【図９】
2004000045.tif 000027
【図１０】
2004000045.tif 000028
【図１１】
2004000045.tif 000029
【図１２】
2004000045.tif 000030
【図１３】
2004000045.tif 000031
【図１４】
2004000045.tif 000032
【図１５】
2004000045.tif 000033
【図１６】
2004000045.tif 000034
【図１７】
2004000045.tif 000035
【図１８】
2004000045.tif 000036
【図１９】
2004000045.tif 000037
【図２０】
2004000045.tif 000038
【図２１】
2004000045.tif 000039
【図２２】
2004000045.tif 000040