(57)【要約】【課題】酵素などの消化処理法を標準化することによって、特定の微生物と特異的に接着する糖鎖構造を有する糖ペプチドを調製することができるので、生産ロットによる反応性の違いが起こらない微生物の検出法を提供すること。【解決手段】微生物に対して特異的結合能を有する糖ペプチドを用いることを特徴とする微生物の検出法。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物に対して特異的結合能を有する糖ペプチドを用いることを特徴とする微生物の検出法。
【請求項２】
糖ペプチドが鳥類の卵由来、動物の組織由来、および動物の乳由来のものの中から選択される少なくとも１種である請求項１記載の微生物の検出法。
【請求項３】
糖ペプチドがオボムチン由来、オボムコイド由来、ラクトフェリン由来、およびカッパーカゼイン由来のものの中から選択される少なくとも１種である請求項１または２記載の微生物の検出法。
【請求項４】
糖ペプチドがオボムチン、オボムコイド、ラクトフェリン、およびカッパーカゼインから成る群から選択される少なくとも１種の消化物である請求項１〜３記載の微生物の検出法。
【請求項５】
微生物が大腸菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ、および黄色ブドウ球菌から選択される請求項１〜４記載の微生物の検出法。
【請求項６】
糖ペプチドを結合させた固相を用いる請求項１〜５記載の微生物の検出法。
【請求項７】
固相がマイクロプレート、合成樹脂粒子、磁気粒子、濾紙、および不織布から選択される請求項６記載の微生物の検出法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の微生物の検出や同定に有用な糖ペプチドを用いた微生物の検出法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、特定の微生物の検出や同定にあたっては、選択または非選択増菌培養後、鑑別用平板培地を用いた塗沫法、混釈法、液体培養法などが一般的に用いられている。
しかしながら、これらの培養法は、培地や器具類の滅菌が必要であり、また被検試料を培地に接種後、塗沫や混釈等の熟練を要する操作が必要であり、さらに、結果を得るのに数日間を要している。
【０００３】
このため、近年、特定の微生物を効率よく、また迅速に検査する方法として特定の微生物に対する特異的な抗体を用いる抗原抗体反応を利用した検出法や同定法が開発され、培養法の代わりに広く使われるようになってきた（例えば、特許文献１参照）。
しかしながら、抗体を用いた検出法や同定法には性能と安定性の確保に問題がある。抗体はタンパク質であるため、低温保存が必要であり、低温で保存したとしてもその有効期限は６ヶ月から１年間と短いものである。また、抗体は動物への免疫によって得られた抗血清を用いるため、動物の個体差などがあり、感度や特異性を一定に保つことが難しく、さらに生産ロットごとに反応性が変わる可能性がある上、作製までにはかなりの時間と費用がかかる。
【０００４】
一方、牛乳または鶏卵卵白由来のムチンを有効成分とするヘリコバクター・ピロリ定着阻害剤、ムチンと胃酸分泌抑制剤、およびムチンを含有する抗ヘリコバクター・ピロリ機能性食品や医療用食品が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
しかしながら、このヘリコバクター・ピロリ定着阻害剤は、牛乳由来のムチンや鶏卵卵白由来のムチンがヘリコバクター・ピロリの表層に局在している接着因子であるウレアーゼに特異的に結合することによって胃内に定着しているヘリコバクター・ピロリを排除しているに過ぎず、微生物の検出法に関しては、全く示唆されていない。
【０００５】
また、鶏卵卵黄由来のオリゴ糖、オリゴ糖結合タンパク質およびオリゴ糖結合ペプチドを含有する腸管感染症予防組成物が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
しかしながら、この組成物は、鶏卵由来のオリゴ糖タンパクをプロテアーゼで処理した糖ペプチドを用いて腸管感染症起因菌の宿主細胞への接着阻害作用により、感染症を予防するに止まり、同様に微生物の検出法に関しては、全く示唆されていない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平８−７５７４２号公報
【特許文献２】
特開２０００−２２９８６５号公報
【特許文献３】
特開２００２−１２１１３８号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来の課題に着目してなされたものであって、特定の微生物の検出や同定に有用な糖ペプチドを用いた微生物の検出法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、糖ペプチドの持つ糖鎖が特定の微生物と特異的に接着するという機能を利用することで、特定の微生物を検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明は、下記のような構成からなるものである。
（１）微生物に対して特異的結合能を有する糖ペプチドを用いることを特徴とする微生物の検出法。
（２）糖ペプチドが鳥類の卵由来、動物の組織由来、および動物の乳由来のものの中から選択される少なくとも１種である（１）記載の微生物の検出法。
（３）糖ペプチドがオボムチン由来、オボムコイド由来、ラクトフェリン由来、およびカッパーカゼイン由来のものの中から選択される少なくとも１種である（１）または（２）記載の微生物の検出法。
（４）糖ペプチドがオボムチン、オボムコイド、ラクトフェリン、およびカッパーカゼインから成る群から選択される少なくとも１種の消化物である（１）〜（３）記載の微生物の検出法。
（５）微生物が大腸菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ、および黄色ブドウ球菌から選択される（１）〜（４）記載の微生物の検出法。
（６）糖ペプチドを結合させた固相を用いる（１）〜（５）記載の微生物の検出法。
（７）固相がマイクロプレート、合成樹脂粒子、磁気粒子、濾紙、および不織布から選択される（６）記載の微生物の検出法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明に使用する糖ペプチドは、特定の微生物に特異的結合能を有する限り、公知の糖ペプチドの中から適宜選択することができる。
このような糖ペプチドとしては、鳥類の卵由来、動物の組織由来、および動物の乳由来のものの中から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００１１】
本発明においては、これら由来のオボムチン、オボムコイド、ラクトフェリン、およびカッパーカゼインから成る群から選択される少なくとも一種が好適なものとして用いられる。
このオボムチン由来およびオボムコイド由来としては、特に限定されるものではなく、鳥類、例えば、鶏、ウズラ、アヒル、七面鳥などの卵が挙げられる。また、ラクトフェリンおよびカッパーカゼインは、動物、例えば、ウシ、ヤギなどの乳由来のものが好適に用いられる。
【００１２】
更に好適なものとしては、上記オボムチン、オボムコイド、ラクトフェリン、およびカッパーカゼインから成る群から選択される少なくとも一種の消化物が挙げられる。
本発明においては、特に特異的結合能の高い糖ペプチドは、オボムチン、オボムコイド、ラクトフェリン、およびカッパーカゼインを消化処理することによって調製することができる。この消化処理法としては、特に限定されるものではなく、使用目的に応じて酵素、例えば、プロテアーゼによる処理やアルカリによる消化処理が好適なものとして挙げられる。
【００１３】
糖ペプチドの持つ糖鎖の微生物に対する特異性は、オボムチン、オボムコイド、ラクトフェリン、カッパーカゼインの種類や消化処理法によって異なる
例えば、卵由来オボムチンをアクチナーゼで消化処理することによって得られる糖ペプチドは、腸炎ビブリオや大腸菌Ｏ１５７に特異的結合能を有し、牛乳由来カッパーカゼインを消化処理して得られるグリコマクロペプチドは、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラおよび黄色ブドウ球菌に特異的結合能を有する。
【００１４】
このようにして得られた糖ペプチドは、検査目的に応じて固相、例えば、マイクロプレート、合成樹脂粒子、磁気粒子、濾紙、不織布などに常法により結合させて用いることができる。
例えば、ビオチン化した被検微生物を糖ペプチドを結合させたマイクロプレートと反応させることで特定の微生物を同定することができる。試料中の微生物は、試料が液状であれば糖ペプチドを結合させた濾紙や不織布などで試料を濾過することで捕獲や検出をすることができる。また、濾過できない試料は、糖ペプチドを結合した磁気粒子を混合し、回収することで目的微生物を捕獲し、そのまま通常の培養試験に供試することができる。
【００１５】
【発明の効果】
本発明は、酵素などの消化処理法を標準化することによって、特定の微生物と特異的に接着する糖鎖構造を有する糖ペプチドを調製することができるので、生産ロットによる反応性の違いが起こらない微生物の検出法を提供することができる。さらに、本発明の微生物の検出法は、特定の微生物に対する特異的結合能を有する糖ペプチドを用いることにより、従来の免疫反応を利用した検出法に比べて検出感度に優れている。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
オボムチン由来糖ペプチドを用いた特定菌の鑑別試験
１．オボムチン由来糖ペプチドの調製
新鮮な鶏卵（産卵後２４時間以内）の卵白から、常法によりオボムチンを単離した。このオボムチンを出発物質として、以下のようにして糖ペプチドを調製した。
オボムチン２００ｍｇおよびアクチナーゼＥ８ｍｇを１０ｍＭのリン酸緩衝液  （ｐＨ  ８．４）４０ｍＬに溶解し、３７℃で反応させた。反応開始４、８、２０時間後にアクチナーゼＥ８ｍｇを追加して加え、２４時間反応させた後、１００℃で５分間加熱して反応を停止させた。
以上の処理により得られた試料を蒸留水で透析した後、凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を蒸留水に再溶解し、４℃で遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分間）をした後、上清をゲルろ過した。このゲルろ過は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムを用い、移動相は蒸留水で流速１ｍＬ／分の条件で行った。分光光度計（日立  Ｕ２０００）を用いて、タンパク質は２８０ｎｍの吸光度により検出し、糖はフェノール硫酸法による４９０ｎｍの吸光度により検出した。
【００１８】
２．オボムチン由来糖ペプチドを用いた試薬の調製
オボムチン由来糖ペプチドを１００ｍＭ濃度となるように、０．１Ｍの炭酸−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．６）に溶解後、順次２倍希釈し、１００μＬづつ９６ウエルイムノプレートに分注し、４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、１％のＢＳＡ／ＰＢＳを２００μＬづつ９６ウエルプレートに分注し、室温で２時間ブロッキングした。
対照例としてゼラチン加水分解物  （Ｔｙｐｅ  Ａ；  平均分子量約９，０００）を１００ｍＭ濃度となるように、０．１Ｍの炭酸−炭酸ナトリウム緩衝液  （ｐＨ  ９．６）  に溶解後、順次２倍希釈し、１００μＬづつ分注し、４℃で一晩インキュベートし、同様にブロッキングした。
また、ブランクとして０．１Ｍの炭酸−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．６）を１００μＬづつ分注し、同様にブロッキングした。
【００１９】
３．菌体のビオチン化
代表的な食中毒菌として、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを用いた。まず、それぞれの菌体をＰＢＳ（−）  に懸濁し、６６０ｎｍの吸光度の値が１．０となるように調整し、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを用いてビオチン化菌体とした。
【００２０】
４．  オボムチン由来糖ペプチドを用いた特定菌の鑑別
調製したマイクロプレートをＰＢＳで３回洗浄後、ビオチン化菌体／ＰＢＳ懸濁液を１００μＬづつ分注し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、６０℃で１５分間プレートを乾燥した。乾燥したプレートを自然冷却後、１％のＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを１００μＬづつ分注し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、０．１％のｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム／ジエタノールアミン−塩酸緩衝液  （ｐＨ  ９．８）を１００μＬづつ分注し、室温で１時間インキュベートした。５ＭのＮａＯＨ溶液で酵素反応を停止した後、マイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、菌体に対する結合能を調べた
【００２１】
５．結果
（Ａ）Ｓ．  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  、（Ｂ）Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  、（Ｃ）Ｃ．  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、（Ｄ）Ａ．  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  、（Ｅ）Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  、（Ｆ）Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  、（Ｇ）Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  に対する結果を、それぞれ図１〜図７に示す。横軸は固相のペプチド量、縦軸は吸光度を表す。
（Ａ）Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  、（Ｂ）Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、（Ｃ）Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  、（Ｄ）Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  、（Ｅ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対しては、固相のオボムチン由来糖ペプチドの濃度が増加しても、Ａ４０５ｎｍの値はほぼ０であり、対照例として用いたゼラチン加水分解物のものとほぼ同様であった。
これに対し、（Ｆ）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  、（Ｇ）Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓに対しては、固相のオボムチン由来糖ペプチド濃度が増加するにつれ、Ａ４０５ｎｍの値が増加したことから、オボムチン由来糖ペプチドがＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７およびＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓと特異的に結合したと考えられ、カットオフ値を０．５と設定することで他の菌との鑑別をすることができた。尚、（Ｇ）Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓは、ペプチド濃度５０ｍＭまでは、吸光度の上昇が見られるが、それ以上高濃度になると、逆に吸光度が減少する。
【００２２】
実施例２
牛乳由来グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）を用いた菌体との結合能測定
１．牛乳から常法によってＧＭＰを得た。
【００２３】
２．ＧＭＰを用いた試薬の調製
牛乳由来ＧＭＰを０．５ｍＭ濃度となるように、０．１Ｍの炭酸−炭酸ナトリウム緩衝液  （ｐＨ  ９．６）  に溶解後、順次２倍希釈し、１００μＬづつ９６ウエルイムノプレートに分注し、４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、１％のＢＳＡ／ＰＢＳを２００μＬづつ９６ウエルプレートに分注し、室温で２時間ブロッキングした。
対照例としてゼラチン加水分解物  （ＴｙｐｅＡ：平均分子量約９，０００）  を０．５ｍＭ濃度となるように、０．１Ｍの炭酸−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．６）に溶解後、順次２倍希釈し、１００μＬづつ分注し、４℃で一晩インキュベートし、同様にブロッキングした。また、ブランクとして０．１Ｍの炭酸−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．６）を１００μＬづつ分注し、同様にブロッキングした。
【００２４】
３．菌体のビオチン化
供試菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを用いた。まず、それぞれの菌体をＰＢＳ（−）に懸濁し、６６０ｎｍの吸光度の値が１．０となるように調整し、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを用いてビオチン化菌体とした。
【００２５】
４．牛乳由来ＧＭＰを用いた特定菌の鑑別
調製したマイクロプレートをＰＢＳで３回洗浄後、ビオチン化菌体／ＰＢＳ懸濁液を１００μＬづつ分注し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、６０℃で１５分間プレートを乾燥した。乾燥したプレートを自然冷却後、１％のＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを１００μＬづつ分注し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、０．１％のｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム／ジエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ  ９．８）を１００μＬづつ分注し、室温で１時間インキュベートした。５ＭのＮａＯＨ溶液で酵素反応を停止した後、マイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、菌体に対する結合能を調べた。
【００２６】
５．結果
（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７、（Ｂ）Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、（Ｃ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、（Ｄ）Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、（Ｅ）Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、（Ｆ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する結果を、それぞれ図８〜図１３に示す。横軸は固相のペプチド量、縦軸は吸光度を表す。
（Ｄ）Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、（Ｅ）Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、（Ｆ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対しては、固相のＧＭＰの濃度が増加しても、Ａ４０５ｎｍの値はほぼ０であり、対照例として用いたゼラチン加水分解物のものとほぼ同様であった。
これに対し、（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７、（Ｂ）Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、（Ｃ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対しては、固相のＧＭＰ濃度が増加するにつれ、Ａ４０５ｎｍの値が増加したことから、ＧＭＰが、（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７、（Ｂ）Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、（Ｃ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓと特異的に結合したと考えられ、カットオフ値を０．５と設定することで他の菌との鑑別をすることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】オボムチン由来糖ペプチドに対するＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの吸着を示すグラフである。
【図２】オボムチン由来糖ペプチドに対するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの吸着を示すグラフである。
【図３】オボムチン由来糖ペプチドに対するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの吸着を示すグラフである。
【図４】オボムチン由来糖ペプチドに対するＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａの吸着を示すグラフである。
【図５】オボムチン由来糖ペプチドに対するＳ．ａｕｒｅｕｓの吸着を示すグラフである。
【図６】オボムチン由来糖ペプチドに対するＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７の吸着を示すグラフである。
【図７】オボムチン由来糖ペプチドに対するＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの吸着を示すグラフである。
【図８】牛乳由来ＧＭＰに対するＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７の吸着を示すグラフである。
【図９】牛乳由来ＧＭＰに対するＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの吸着を示すグラフである。
【図１０】牛乳由来ＧＭＰに対するＳ．ａｕｒｅｕｓの吸着を示すグラフである。
【図１１】牛乳由来ＧＭＰに対するＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの吸着を示すグラフである。
【図１２】牛乳由来ＧＭＰに対するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの吸着を示すグラフである。
【図１３】牛乳由来ＧＭＰに対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの吸着を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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