(57)【要約】【課題】種子の休眠を維持する方法および休眠が維持された種子を提供する。【解決手段】種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持することによる、種子の休眠を維持する方法。
【請求項２】
ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子の機能を減少させることによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持する、請求項１に記載の種子の休眠を維持する方法。
【請求項３】
ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子を破壊することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持する、請求項１または２に記載の種子の休眠を維持する方法。
【請求項４】
Ｔ−ＤＮＡ領域を含むＴｉプラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを植物に感染させることによって上記ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子を破壊する、請求項３に記載の種子の休眠を維持する方法。
【請求項５】
ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子に対するアンチセンス遺伝子を導入することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持する、請求項１または２に記載の種子の休眠を維持する方法。
【請求項６】
ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡを導入することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持する、請求項１または２に記載の種子の休眠を維持する方法。
【請求項７】
種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持することによって休眠が維持された種子。
【請求項８】
ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子の機能を減少させることによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量が維持された、請求項７に記載の種子。
【請求項９】
ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子を破壊することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量が維持された、請求項７または８に記載の種子。
【請求項１０】
Ｔ−ＤＮＡ領域を含むＴｉプラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを植物に感染させることによって上記ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子が破壊された、請求項９に記載の種子。
【請求項１１】
ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子に対するアンチセンス遺伝子を導入することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量が維持された、請求項７または８に記載の種子。
【請求項１２】
ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡを導入することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量が維持された、請求項７または８に記載の種子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種子の休眠を維持する方法および休眠が維持された種子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の種子は、温度、水分条件、光などの生育に適した環境条件において発芽する。熱帯地域などの一年にわたり発芽に適した条件の地域では、種子の保存が困難である。従って、種子の発芽を制御する技術が望まれている。
【０００３】
アブシジン酸（以下、「ＡＢＡ」と呼ぶ）は、種子の休眠を促す植物ホルモンである。ＡＢＡの効果を制御することによって種子の発芽を制御する試みがなされている（非特許文献１および２）。例えば、ＡＢＡシグナル伝達に関与する植物のファルネシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊することによりＡＢＡの効果を制御し、強く発芽を抑制しうることが知られている。しかしこのような試みには、植物の成長の遅延、植物体の矮小化または種子の発芽不能といった問題点がある。
【０００４】
一方、ホスファチジン酸（以下、「ＰＡ」と呼ぶ）は、細胞膜を構成する基本構造のリン脂質の１つである。ＰＡは、動植物組織に広く分布する（非特許文献３）。また種子の発芽時にＰＡがＡＢＡのシグナル伝達に関与することが示されている（非特許文献４）。ＰＡがＡＢＡのシグナル伝達に関与する機構は、ＡＢＡによりＰＡを産生する代謝酵素のホスホリパーゼＤの活性化が起こり、その結果産生したＰＡが細胞内シグナル伝達経路を介してＡＢＡ誘導性遺伝子の発現応答を起こすというものである。この機構は、種子から抽出した細胞を用いた実験によって明らかにされた。
しかしながら、種子中のＰＡ量を制御することによって、種子の発芽を制御する方法はこれまで確立されていなかった。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｃｕｔｌｅｒ  Ｓ，  Ｇｈａｓｓｅｍｉａｎ  Ｍ，  Ｂｏｎｅｔｔａ  Ｄ，  Ｃｏｏｎｅｙ  Ｓ，  ＭｃＣｏｕｒｔ  Ｐ、シロイヌナズナにおいてアブシジン酸シグナル伝達に関与するタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ（Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、（米国）、１９９６年８月３０日、第２７３巻、ｐ．１２３９−１２４１
【非特許文献２】
Ｚｈｅｎ−Ｍｉｎｇ  Ｐｅｉ，  Ｍａｊｉｄ  Ｇｈａｓｓｅｍｉａｎ，  Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｍ．  Ｋｗａｋ，  Ｐｅｔｅｒ  ＭｃＣｏｕｒｔ，  Ｊｕｌｉａｎ  Ｉ．  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ、孔辺細胞の陰イオンチャネルおよび植物の水損失のＡＢＡ調節におけるファルネシルトランスフェラーゼの役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  ＡＢＡ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｕａｒｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｗａｔｅｒ  Ｌｏｓｓ）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、（米国）、１９９８年１０月９日、第２８２巻、ｐ．２８７−２９０
【非特許文献３】
Ｍｕｎｎｉｋ  Ｔ、ホスファチジン酸：解明されてきた植物の脂質２次メッセンジャー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ：  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐｌａｎｔ  ｌｉｐｉｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）、「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、（オランダ）、２００１年５月１日、第６巻、第５号、ｐ．２２７−３３
【非特許文献４】
Ｒｉｔｃｈｉｅ  Ｓ，  Ｇｉｌｒｏｙ  Ｓ、オオムギアリューロンにおけるアブシジン酸シグナル伝達はホスホリパーゼＤ活性によって介在される（Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｒｌｅｙ  ａｌｅｕｒｏｎｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ」、（米国）、１９９８年３月３日、第９５巻、第５号、ｐ．２６９７−２７０２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、効率的に行うことのできる種子の休眠を維持する方法および休眠が維持された種子を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、植物において、ＰＡを脱リン酸化し、ＰＡを減少させるホスファチジン酸ホスファターゼ（以下、「ＰＡＰ」と呼ぶ）の遺伝子を破壊することにより種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持することで種子の休眠が維持されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持することによる、種子の休眠を維持する方法である。
【０００８】
さらに、本発明は、ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子の機能を減少させることによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持する、上記種子の休眠を維持する方法である。
【０００９】
さらに、本発明は、ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子を破壊することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持する、上記種子の休眠を維持する方法である。
【００１０】
さらに、本発明は、Ｔ−ＤＮＡ領域を含むＴｉプラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを植物に感染させることによって上記ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子を破壊する、上記種子の休眠を維持する方法である。
【００１１】
さらに、本発明は、ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子に対するアンチセンス遺伝子を導入することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持する、上記種子の休眠を維持する方法である。
【００１２】
さらに、本発明は、ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡを導入することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持する、上記種子の休眠を維持する方法である。
さらに、本発明は、種子中のホスファチジン酸の蓄積量を維持することによって休眠が維持された種子である。
【００１３】
さらに、本発明は、ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子の機能を減少させることによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量が維持された、上記種子である。
さらに、本発明は、ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子を破壊することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量が維持された、上記種子である。
【００１４】
さらに、本発明は、Ｔ−ＤＮＡ領域を含むＴｉプラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを植物に感染させることによって上記ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子が破壊された、上記種子である。
【００１５】
さらに、本発明は、ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子に対するアンチセンス遺伝子を導入することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量が維持された、上記種子である。
【００１６】
さらに、本発明は、ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡを導入することによって上記種子中のホスファチジン酸の蓄積量が維持された、上記種子である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る方法は、種子中のＰＡの蓄積量を維持することによる、種子の休眠を維持する方法である。種子の発芽過程において、種子でＰＡが一過的に産生されることを本発明者らは見出した。すなわち、発芽過程において、ＰＡ産生が亢進し、所定期間経過後、ＰＡが脱リン酸化され、種子中のＰＡ量が減少する。このＰＡの産生およびＰＡ量の減少の過程において、ＰＡ減少を防止し、ＰＡの蓄積量を維持することで、種子の休眠を維持することができる。「休眠が維持される」とは、ＰＡの蓄積量が維持された種子が野生株の種子と比較して、種子の休眠を促すＡＢＡに対し感受性が高まっていることを意味する。
【００１８】
本発明に係る方法の対象植物は、種子植物であればいずれのものであってよい。例えばイネ科、アブラナ科、ナス科、マメ科等に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
イネ科：イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）
アブラナ科：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）
ナス科：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）
マメ科：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）
【００１９】
一方、上記種子中のＰＡの蓄積量を維持する方法としては、種子中のＰＡの蓄積量を維持することができるものであればいずれのものであってよいが、ＰＡＰ遺伝子の機能を減少させることが好ましい。上記で説明したように、植物においてＰＡＰはＰＡを脱リン酸化し、ＰＡを減少させる酵素である。従って、「ＰＡＰ遺伝子の機能を減少させること」とは、ＰＡを脱リン酸化するＰＡＰの酵素としての能力を欠損させることを意味する。ＰＡを脱リン酸化するＰＡＰの能力を欠損させる方法としては、ＰＡＰがＰＡを脱リン酸化できなくするものであればいずれのものであってよく、遺伝子、ＲＮＡまたはタンパク質レベルのいずれのものであってよい。
【００２０】
遺伝子レベルでは、ＰＡＰ遺伝子の機能を減少させる方法として、植物においてＰＡＰ遺伝子を破壊することが挙げられる。ＰＡＰ遺伝子を破壊する方法としては、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドもしくはＲｉプラスミドを利用する方法が挙げられる。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、外来遺伝子を植物宿主に導入する。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成する。またアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）は、植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にＴｉプラスミド又はＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ＤＮＡ）と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。従って、アグロバクテリウム属の細菌を植物宿主に感染させると、植物ゲノム中にＴ−ＤＮＡを組込むことができる。これにより、植物ゲノム中のＰＡＰ遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された植物体が生じる。該植物体では、ＰＡＰ遺伝子が破壊され、ＰＡＰ遺伝子は発現されなくなる。
【００２１】
一方、薬剤耐性遺伝子を予めＴ−ＤＮＡに導入する。次いで、Ｔ−ＤＮＡが挿入された植物体を、薬剤耐性遺伝子に基づいて選択することができる。薬剤耐性遺伝子としては、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられるがこれに限定されるものではない。さらにＰＡＰ遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された植物体は、例えば植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行うことでスクリーニングすることができる。
【００２２】
アグロバクテリウムの感染の結果得られるクラウンゴールや毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能である。また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００２３】
さらにＰＡＰ遺伝子を破壊する方法としては、トランスポゾンを挿入する方法、中粒子線照射による遺伝子破壊、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）による遺伝子破壊などが挙げられる。
【００２４】
一方、ＲＮＡレベルでは、植物においてＰＡＰ遺伝子に対するアンチセンス遺伝子を導入する方法が挙げられる。「ＰＡＰ遺伝子に対するアンチセンス遺伝子」とは、ＰＡＰ遺伝子の全長または一部に対してアンチセンス配向にある遺伝子であって、その遺伝子から転写された転写産物とＰＡＰ遺伝子転写産物が特異的に対合して、ＰＡＰ遺伝子転写産物の翻訳を阻害することができるアンチセンス遺伝子を意味する。
【００２５】
植物を形質転換するための上記アンチセンス遺伝子を有する組換えベクターは、適当なベクターに上記アンチセンス遺伝子を挿入することにより得ることができる。適当なベクターとしては、Ｔ−ＤＮＡ内に挿入したアンチセンス遺伝子を植物ゲノムに組み込むことができるｐＢＩ１２１などが挙げられる。また該ベクター自体に複製能がない場合には、植物宿主の染色体に挿入することなどによって複製可能となるＤＮＡ断片であってもよい。
【００２６】
ベクターに上記アンチセンス遺伝子を挿入するには、まず適当な制限酵素で上記アンチセンス遺伝子を切断し、次いで適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が用いられる。またベクターと上記アンチセンス遺伝子のそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、ＰＣＲなどを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ法によって両者を連結する方法であってもよい。
【００２７】
上記組換えベクターを植物宿主中に導入することにより上記アンチセンス遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。本発明において形質転換の対象となる「植物」とは、植物全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部等）又は植物培養細胞のいずれをも意味する。
【００２８】
上記組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、上記で説明したアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等によって植物宿主中に導入することができる。
【００２９】
例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧５００〜１６００Ｖ、２５〜１０００μＦ、２０〜３０ｍｓｅｃの条件で処理し、上記組換えベクターを植物宿主に導入する。
【００３０】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物全体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、またはプロトプラストを調製して使用してもよい。次いで遺伝子導入装置（例えばＢｉｏ−Ｒａｄ社のＰＤＳ−１０００／Ｈｅ等）を用いて、調製した試料を処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は１０００〜１８００ｐｓｉ程度の圧力、５〜６ｃｍ程度の距離で行う。
【００３１】
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、上記アンチセンス遺伝子を植物宿主に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に上記アンチセンス遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、上記アンチセンス遺伝子を植物宿主に導入することができる。
【００３２】
上記アンチセンス遺伝子を植物細胞に導入した場合、該植物細胞を植物体に再生させることができる。再生方法としては、カルス状の植物細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、ＬＳ培地、ＭＳ培地などが例示される。
【００３３】
一方、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって、上記アンチセンス遺伝子が植物宿主に組み込まれたか否かの確認を行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。次いで、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして１本のバンドとして増幅産物を検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法を採用してもよい。
【００３４】
さらにＲＮＡレベルでは、植物においてＰＡＰ遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡを導入する方法が挙げられる。具体的には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭ）３５Ｓプロモーターの制御下に、ＰＡＰ遺伝子の特定の４００塩基対程度の遺伝子についてセンスとアンチセンスのＤＮＡを連結したコンストラクトをｐＢＩ１２１などのベクターに組み込む。これをアグロバクテリウム法により植物細胞の植物ゲノムに導入する。植物細胞内で、ＣａＭ３５Ｓプロモーターにより過剰に発現されたＰＡＰ遺伝子領域のセンス−アンチセンスｍＲＮＡは、２本鎖ＲＮＡを形成し、選択的に分解を受ける。しかしながら、その際植物本来のＰＡＰ遺伝子のｍＲＮＡも同時に分解され、結果的にＰＡＰ遺伝子の発現が抑制される。この方法はＲＮＡの干渉作用を利用したものでＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）と呼ばれている。
【００３５】
以上で説明した本発明に係る種子の休眠を維持する方法によって得られた植物を自家受粉させ、結実させることで本発明に係る休眠が維持された種子を得ることができる。
【００３６】
本発明に係る種子は、ＰＡＰ遺伝子の機能が減少されている。従って、種子の発芽過程において産生されたＰＡは、本発明に係る種子中ではＰＡＰによって脱リン酸化されない。本発明に係る種子中ではＰＡの蓄積量が維持され、休眠を維持できる。従って、本発明により、熱帯地域などの一年にわたり発芽に適した条件においても発芽を防止し、長期に亘って保存できる種子が得られる。
【００３７】
一方、上記で説明したように、ＡＢＡの効果を制御することによって種子の発芽を制御する試みには、植物の成長の遅延、植物体の矮小化または種子の発芽不能といった問題点がある。しかしながら、本発明に係る種子が発芽し、生育した植物において、生長の早さ、大きさ、種子の収量などに関して、野生株と比較して有意な差は見られない。従って、植物、特に作物に本発明を適用しても生産性に悪影響を及ぼさないという利点がある。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３９】
〔実施例１〕
シロイヌナズナにおけるＰＡＰ遺伝子の破壊
シロイヌナズナをモデル植物として、ＰＡＰ遺伝子破壊株を作製した。なおシロイヌナズナのＰＡＰ遺伝子は、ＡｔＰＡＰ２と呼ばれる。シロイヌナズナには、さらにＡｔＰＡＰ２のアイソマー、ＡｔＰＡＰ１が存在する。このようなアイソマーもまたＡｔＰＡＰ２と同様の効果を示す。
【００４０】
ハイグロマイシン耐性遺伝子を有するＴ−ＤＮＡを含むＴｉプラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスをシロイヌナズナに感染させることによって、Ｔ−ＤＮＡをシロイヌナズナのゲノムに導入した。その中でＰＡＰ２遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された植物体（以下、「ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株」と呼ぶ）をＰＣＲ法によりスクリーニングし、１系統を得た。
【００４１】
図１は、得られたＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株におけるＡｔＰＡＰ２遺伝子の構造を示す。ＡｔＰＡＰ２遺伝子の第７エキソンにＴ−ＤＮＡの挿入が存在した。また該ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株の発現解析の結果、ＡｔＰＡＰ２の発現が見られないことから、ＡｔＰＡＰ２遺伝子が破壊されることを確認した。
【００４２】
〔実施例２〕
ＡｔＰＡＰ２の種子における発現
ＡｔＰＡＰ２の種子における発現を確認するために、ＡｔＰＡＰ２遺伝子の代わりにβグルクロニダーゼ遺伝子（以下、「ＧＵＳ」と呼ぶ）をＡｔＰＡＰ２遺伝子のプロモーター約１．５Ｋｂｐに連結させたコンストラクトを植物導入用のｐＢＩ１０１ベクターに挿入し、アグロバクテリウム法によりシロイヌナズナに導入した。安定に導入遺伝子がゲノムに組み込まれた植物体を、ｐＢＩ１０１に存在するカナマイシン耐性遺伝子を指標に選択した。選択したＧＵＳ形質転換植物体に由来する種子をＸ−ｇｌｕｃ基質液（２ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）  、５０ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ  ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２％  ＤＭＳＯ、０．５ｍＭ  フェロシアン化カリウム）に浸漬し、３７℃、６時間保温し、ＦＡＡ  （５％  ホルムアルデヒド、５％  酢酸、２０％  エタノール）で固定し、種皮をはがした。
【００４３】
図２は、種子におけるＧＵＳの発現を示す。左側の種子は野生株に由来し、右側の種子はＧＵＳ形質転換植物体に由来する。ＧＵＳ形質転換植物体に由来する種子全体にＧＵＳが発現していることが判る。従って、シロイヌナズナでは、通常ＡｔＰＡＰ２が種子において発現していることが示された。
【００４４】
〔実施例３〕
ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子のＡＢＡに対する発芽率
種子の休眠を促す植物ホルモンＡＢＡの存在下でのＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子の発芽率を野生株に由来する種子と比較した。ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する乾燥種子および野生株に由来する乾燥種子を１％次亜塩素酸ナトリウムで１０分間洗浄した後、次いで様々な濃度のＡＢＡおよび１％ショ糖を含むＧｍ寒天培地に播種し、４℃の暗所下で７２時間保温した。次にこれらの種子を２２℃に維持された培養機に移し、１６時間明期／８時間暗期で４８時間培養した後、発芽率を測定した。
【００４５】
図３は、ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子のＡＢＡに対する発芽率の結果を示す。実線はＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子を示し、点線は野生株に由来する種子を示す。ＡＢＡの存在下ではＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子の発芽率は野生株に由来する種子よりも低下したことが判る。従って、ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子は野生株に由来する種子よりも休眠が深いことが示された。
【００４６】
〔実施例４〕
ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子のＡＢＡに対する感受性
ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子のＡＢＡに対する感受性を調べた。０．６μＭ  ＡＢＡおよび１％ショ糖を含むＧｍ寒天培地に、野生株に由来する種子およびＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子を播種し、８日間生育させた。なお対照として、ＡＢＡを含まないＧｍ寒天培地に、野生株に由来する種子およびＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子を上記と同様に播種した。
【００４７】
図４は、野生株に由来する種子およびＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子を８日間生育した後の植物体の写真を示す。ＡＢＡを含むＧｍ寒天培地では、ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子は、野生株に由来する種子と比較して発芽が抑制されていることが判る。
【００４８】
〔実施例５〕
ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子における発芽時のＰＡ蓄積
ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子における発芽時のＰＡ蓄積を調べた。１％ショ糖を含むＧｍ液体培地に、等重量の野生株に由来する種子およびＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子を浸し、４℃の暗所下で７２時間保温した。次いでそれぞれの種子を小型遠心管４本に等分し、室温に移動した直後を０時間とし、０、１２、２４、４８時間後の種子を破砕し脂質を抽出した。いずれの処理区に関しても処理終了の１２時間前に、放射性３２Ｐ無機リン酸により一律１２時間標識した。抽出した脂質を薄層クロマトグラフィーにスポットし、酢酸エチル：イソオクタン：ギ酸：水（１３：２：３：１０）を混合した上層の有機層で展開しＰＡの放射能をＢＡＳ２５００放射能解析装置により測定した。
【００４９】
図５は、ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子中のＰＡ蓄積量を示す。野生株に由来する種子およびＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子において、ともに室温に移動後１２時間でＰＡ蓄積量がピークに達しているが、４８時間にわたりＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子のＰＡ蓄積量が、野生株に由来する種子に比べて有意に高いことが判る。
【００５０】
【発明の効果】
本発明により、休眠が維持された種子を効率的に得ることができる種子の休眠を維持する方法が提供される。従って、本発明により、熱帯地域などの一年にわたり発芽に適した条件においても保存できる種子が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株におけるＡｔＰＡＰ２遺伝子の構造を示す。
【図２】図２は、ＧＵＳの形質転換植物体に由来する種子におけるＧＵＳの発現を示す。
【図３】図３は、ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子のＡＢＡに対する発芽率の結果を示す。
【図４】図４は、野生株に由来する種子およびＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子を８日間生育した後の植物体の写真を示す。
【図５】図５は、ＡｔＰＡＰ２遺伝子破壊株に由来する種子における発芽時のＰＡ蓄積量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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