(57)【要約】【課題】赤血球ゴースト，リポソーム，赤血球細胞を用いた生体膜安定化剤のスクリーニング方法や、かかるスクリーニング方法により生体膜安定化活性が認められたＮ−メチル−２，３−ビス（５−メチルー１Ｈ−インドール−３−イル）ピロール（ＭＳ４１）を有効成分とする生体膜安定化剤を提供すること。【解決手段】酵素，色素等の検知剤が封入された赤血球ゴースト又はリポソーム、あるいは赤血球の懸濁液に、アラメチシン、Ｂａｋ、又は過酸化水素等の脂質膜不安定化剤と被検物質とを添加・接触させ、赤血球ゴースト，リポソーム，赤血球の膜安定性の評価を行うことにより、生体膜安定化剤のスクリーニングを行う。かかるスクリーニング方法で生体膜安定化作用が確認されたＭＳ４１は生体膜安定化剤として、ネクローシスに起因する疾病の治療等に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検知剤が封入された赤血球ゴーストと脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させ、赤血球ゴーストの膜安定性の評価を行うことを特徴とする生体膜安定化剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
検知剤が封入された赤血球ゴーストの懸濁液に、脂質膜不安定化剤と被検物質とを添加することにより、検知剤が封入された赤血球ゴーストと脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させることを特徴とする請求項１記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
検知剤が封入された赤血球ゴーストが、赤血球を溶血することによりヘモグロビンを除去して赤血球ゴーストを調製し、該赤血球ゴーストの内部に検知剤を封入したものであることを特徴とする請求項１又は２記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
検知剤が封入されたリポソームと脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させ、リポソームの膜安定性の評価を行うことを特徴とする生体膜安定化剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
検知剤が封入されたリポソームの懸濁液に、脂質膜不安定化剤と被検物質とを添加することにより、検知剤が封入されたリポソームと脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させることを特徴とする請求項６記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
検知剤が、酵素，色素，蛍光物質，放射性物質から選ばれる群の１種又は２種以上の物質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
赤血球と脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させ、赤血球の膜安定性の評価を行うことを特徴とする生体膜安定化剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
赤血球の懸濁液に、脂質膜不安定化剤と被検物質とを添加することにより、赤血球と脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させることを特徴とする請求項４記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
脂質膜不安定化剤が、アラメチシン、Ｂａｋ、又は過酸化水素であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
Ｎ−メチル−２，３−ビス（５−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）ピロールを有効成分とすることを特徴とする生体膜安定化剤。
【請求項１１】
２−｛１−（３−アミノプロピル）−１Ｈ−インドール−３−イル｝−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−Ｎ−メチルマレイミドを有効成分とすることを特徴とする生体膜安定化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、赤血球ゴーストやリポソームを用いた生体膜安定化剤のスクリーニング方法や、かかるスクリーニング方法により生体膜安定化活性が認められたＮ−メチル−２，３−ビス（５−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）ピロール（以下「ＭＳ４１」という）、２−｛１−（３−アミノプロピル）−１Ｈ−インドール−３−イル｝−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−Ｎ−メチルマレイミド（以下「ＭＳ１」という）等を有効成分とする生体膜安定化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞死は、細胞の種類により様々な生理的な物質、例えばインターロイキンなどのサイトカイン、グルココルチコイドなどのホルモン、グルタミン酸やＮＭＤＡなどの神経興奮性アミノ酸、Ｆａｓリガンド、ＢａｘやＢａｋに代表されるような膜タンパク質などによって引き起こされることや、また逆に細胞によっては特定の成長因子などの欠損によっても引き起こされることが知られている。さらに種々の細胞に共通の細胞死誘発剤としては、過酸化水素などの活性酸素種発生剤、ＳＮＰなどのＮＯ発生剤、熱、放射線などが挙げられ、他にも細胞死の誘導活性をもつ化合物が数多く報告されている。最近の研究によると、細胞死シグナルの伝達系はその上流では多彩な情報伝達系が関与しているが、そのほとんどはミトコンドリアに収斂し、さらに下流では一連のシステインプロテアーゼであるカスパーゼやヌクレアーゼが活性化し、各種タンパク質や核酸の分解が起こることが明らかになってきている（Ｃｅｌｌ  ９１，  ４４３，  １９９７）。
【０００３】
細胞死は、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表層微絨毛の消失、細胞質の凝縮を特徴とし、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死であるアポトーシスと、細胞膜の化学的または物理的な損傷によって引き起こされる非生理学的細胞死であるネクローシスとに大別される。ネクローシスの形態学基準として、細胞膨張及び細胞融解、リソソームの漏洩並びに細胞膜の完全な形態の消失などが挙げられるが、ネクローシスにおける最も重大な事象の１つがミトコンドリアの膨潤（水腫性膨潤）であり、この膨潤は早期段階では可逆的であり、原因物質は除去されるかもしくは逆流する。しかし、ある時点を過ぎると細胞膨潤や原形質膜の崩壊によるタンパク質分解分解酵素等の細胞成分の放出など、アポトーシスとは異なる細胞死が起こる。ネクローシスは今日までほとんど研究の対象とならなかったが、近年、ＡＰ  Ｈａｌｅｓｔｒａｐ  （Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  Ｂｒｉｓｔｏｌ，  Ｕ．Ｋ．）、Ｍ  Ｃｒｏｍｐｔｏｎ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ）、ＪＬ  Ｌｅｍａｓｔｅｒｓ  （Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ）らは、ミトコンドリアのＰＴＰ（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ）が、脳梗塞や心筋梗塞の際にネクローシスを決定する際の鍵となるタンパク複合体であること、さらに細胞死は培養細胞による再現が可能であり、ラジカルとカルシウムイオンがＰＴＰをこじ開けることにより死に至ることを明らかにしている。
【０００４】
また、細胞死抑制剤として現在までに知られているものとしては、細胞の種類に応じて、各種成長因子、栄養因子、ホルモン等の生理的抑制剤、Ｎ−アセチルシステイン等の抗酸化剤、カスパーゼ類の修飾ペプチド型の阻害剤等が知られている。この中で、一部のペプチド性の成長因子や神経栄養因子等が化学療法後の造血細胞回復や神経変性疾患や外傷による神経細胞死を防ぐ治療に用いられている例はあるものの（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０，  ７９５１，  １９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６７，  ３６８，  １９９４、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９，  １１２４９，  １９９２）、抗酸化剤やカスパーゼ類の阻害剤は細胞レベルの実験に用いられるにとどまっている。
【０００５】
また、ミトコンドリアがアポトーシスシグナルの形質導入におけるきわめて重要な役割を果たし、このミトコンドリアのアポトーシス変化をＢｃｌ−２ファミリータンパク質が調節し、アポトーシス抑制機能を有するＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬがミトコンドリア膜電位（ΔΨ）ロス及びシトクロムｃリリースを阻害すること（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，  １４６８１−１４６８６，  １９９８、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８３，  １５３３−１５４４，  １９９６、Ｃｅｌｌ  ９１，  ６２７−６３７，  １９９７、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，  １４５５−１４５９）や、アポトーシス促進機能を有するＢａｘ及びＢａｋがミトコンドリア膜電位（ΔΨ）ロス及びシトクロムｃリリースを誘導すること（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，  ４９９７−５００２，  １９９８、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４３，  ２１７−２２４，  １９９８、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，  １４６８１−１４６８６，  １９９８）も知られている。最近では、アポトーシスを誘導する細胞表層受容体Ｆａｓ抗原、アポトーシス誘導に必須のプロテアーゼ（カスパーゼ）、アポトーシスを抑制するがん遺伝子ｂｃｌ−２遺伝子などが明らかにされている。このＢｃｌ−２に相同性を示す多数のタンパク質はＢｃｌ−２ファミリーと呼ばれ、Ｂｃｌ−２ファミリーには、Ｂｃｌ−２やＢｃｌ−ｘＬで代表されるアポトーシス抑制機能を有するメンバーと、ＢａｘやＢａｋで代表されるアポトーシス促進（又は誘導）機能を有するメンバーが存在することが知られている。
【０００６】
ミトコンドリアにおける細胞死決定の分子機構に関しては、未だ完全には解明されていないが、最近の研究によると、ＰＴＰ複合体と呼ばれる蛋白質複合体が、内膜に分子量１５ｋＤａ以下の物質を通過させてしまうような巨大な非選択的なチャネル（ＰＴＰ）を形成することが、細胞死の決定的な役割を果たすことが明らかとなってきた（Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６０，  ６１９，  １９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，  １３０９，  １９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３４１，  ２３３，  １９９９）。ＰＴＰが開くと、ミトコンドリアの内膜の膜電位が消失し、細胞の生存に必要なエネルギー源であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の合成が不能となり、さらにミトコンドリアの膨化、外膜と内膜の間に存在していた下流のカスパーゼ等を活性化する種々のアポトーシス誘導因子（チトクロームｃ、ＡＩＦ、各種カスパーゼなど）の放出なども起こり、ＰＴＰが開くことが、まさに後戻りできない細胞死の決定段階と考えられている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，  １３０９，１９９８；  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２５６，  １９，  ２０００；  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２５６，  ５０，  ２０００）。
【０００７】
これまでに知られているＰＴＰ複合体を構成する主な蛋白質としては、内膜に存在するアデニンヌクレオチド交換蛋白質（ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ；ＡＮＴ）、外膜に存在する電位依存性陰イオンチャネル（ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ；ＶＤＡＣ）とベンゾジアゼピン受容体、そしてマトリックスに存在するシクロフィリンＤ（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  Ｄ）を挙げることができる。インビトロでのＰＴＰの抑制剤として、ＡＮＴに直接結合するボンクレキン酸（Ｊ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．  ５６，  ９７，  １９８０、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８４，  １１５５，  １９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，  ２０２７，  １９９８）、シクロフィリンＤと結合するシクロスポリンＡなど（Ｊ．  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．  １９，  ２９７，  １９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２５５，  ３５７，  １９８８）が知られているが、実際に細胞死抑制効果は十分ではない（Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２５６，  ５０，  ２０００）。ＰＴＰが開く直接の引きがねは、（１）ミトコンドリアマトリックス内カルシウム濃度の上昇、（２）ＰＴＰ複合体を構成する蛋白質の酸化、（３）膜電位の低下、ともいわれている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，  １３０９，  １９９８、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２５６，  １９，  ２０００、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２５６，  ５０，  ２０００）。抗酸化剤による細胞死抑制効果は（２）の抑制によるものが重要な一因であるととらえるができる。
【０００８】
ＶＡＤＣ（電位依存性陰イオンチャネル）はミトコンドリアの外層膜に豊富に存在する小さなタンパク質であり、プラナー脂質二重層に取りこまれてＶＡＤＣ−リポソームを形成した場合に大きな（２．６ｎｍ）電位依存性ポアを形成することが知られており（Ｊ．  Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．  １１１，  １０３−１１１，  １９８９）、またＶＤＡＣは、イオンや中間代謝物を含んだ様々な物質がミトコンドリアを出入りする際の経路として生理学的に機能していると考えられている。さらに、最近になってＰＴＰにより、Ｂａｘ及びＢａｋに依存する膜透過性の変化が媒介されることが明らかにされている（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，  １４６８１−１４６８６，  １９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，  ２０２７−２０３１，  １９９８）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、赤血球ゴースト，リポソーム，赤血球細胞を用いた生体膜安定化剤のスクリーニング方法や、かかるスクリーニング方法により生体膜安定化活性が認められたＭＳ４１を有効成分とする生体膜安定化剤を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
細胞死を抑制することができる細胞死抑制物質は、細胞死に起因する多くの疾病等の有効な治療または症状の進行、悪化を停止もしくは抑制する医薬となり得ると考え、ビスインドリルピロール誘導体等をはじめとして数多くの化合物について細胞死抑制効果について鋭意検討した。その結果、いくつかの細胞死抑制効果を有する物質を見出したが、中でもＭＳ４１が顕著な細胞死抑制効果を有することがわかった（ＷＯ００／４７５７５号公報）。そこで、かかるＭＳ４１の細胞死抑制効果の作用機序について鋭意研究したところ、該化合物がイオントランスポーターであるアラメチシン、細胞死を誘導する膜タンパク質であるＢａｋ、及び過酸化水素による脂質膜（リポソーム）や細胞膜（赤血球や赤血球ゴースト）の不安定化を抑制することを見い出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１１】
すなわち本発明は、検知剤が封入された赤血球ゴーストと脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させ、赤血球ゴーストの膜安定性の評価を行うことを特徴とする生体膜安定化剤のスクリーニング方法（請求項１）や、検知剤が封入された赤血球ゴーストの懸濁液に、脂質膜不安定化剤と被検物質とを添加することにより、検知剤が封入された赤血球ゴーストと脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させることを特徴とする請求項１記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法（請求項２）や、検知剤が封入された赤血球ゴーストが、赤血球を溶血することによりヘモグロビンを除去して赤血球ゴーストを調製し、該赤血球ゴーストの内部に検知剤を封入したものであることを特徴とする請求項１又は２記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法（請求項３）や、検知剤が封入されたリポソームと脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させ、リポソームの膜安定性の評価を行うことを特徴とする生体膜安定化剤のスクリーニング方法（請求項４）や、検知剤が封入されたリポソームの懸濁液に、脂質膜不安定化剤と被検物質とを添加することにより、検知剤が封入されたリポソームと脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させることを特徴とする請求項６記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法（請求項５）や、検知剤が、酵素，色素，蛍光物質，放射性物質から選ばれる群の１種又は２種以上の物質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法（請求項６）や、赤血球と脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させ、赤血球の膜安定性の評価を行うことを特徴とする生体膜安定化剤のスクリーニング方法（請求項７）や、赤血球の懸濁液に、脂質膜不安定化剤と被検物質とを添加することにより、赤血球と脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させることを特徴とする請求項４記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法（請求項８）や、脂質膜不安定化剤が、アラメチシン、Ｂａｋ、又は過酸化水素であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の生体膜安定化剤のスクリーニング方法（請求項９）に関する。
【００１２】
また本発明は、Ｎ−メチル−２，３−ビス（５−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）ピロールを有効成分とすることを特徴とする生体膜安定化剤（請求項１０）や、２−｛１−（３−アミノプロピル）−１Ｈ−インドール−３−イル｝−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−Ｎ−メチルマレイミドを有効成分とすることを特徴とする生体膜安定化剤（請求項１１）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の生体膜安定化剤のスクリーニング方法としては、検知剤が封入された赤血球ゴーストと脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させ、赤血球ゴーストの膜安定性の評価を行う方法や、検知剤が封入されたリポソームと脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させ、リポソームの膜安定性の評価を行う方法や、赤血球と脂質膜不安定化剤と被検物質とを接触させ、赤血球の膜安定性の評価を行う方法であれば特に制限されるものではなく、ここで生体膜とは、細胞膜，ミトコンドリア膜，核膜，小胞体膜，ゴルジ体膜等の生細胞に存在する脂質を含む膜構造体をいう。
【００１４】
本発明の生体膜安定化剤のスクリーニング方法における、検知剤が封入された赤血球ゴースト，検知剤が封入されたリポソーム又は赤血球と、脂質膜不安定化剤と被検物質との３物質を接触させる方法としては、接触順序等特に制限されないが、検知剤が封入された赤血球ゴーストの懸濁液，検知剤が封入されたリポソームの懸濁液又は赤血球の懸濁液に、脂質膜不安定化剤と被検物質とを添加することにより、これら３物質を接触させる方法が好ましい。
【００１５】
本発明の生体膜安定化剤のスクリーニング方法に用いられる脂質膜不安定化剤としては、赤血球ゴースト，リポソーム又は赤血球の脂質膜（細胞膜）を不安定化し、膜に損傷（破損・破断・破壊）を与え、内容物の漏洩等を生じさせる物質であれば特に制限されるものではなく、具体的には、アラメチシン等のイオントランスポーター、バクテリア感染時に作用するＰｏｒｉｎに属するＢａｄ，Ｂａｋ等のＢｃｌ２ファミリーに所属するタンパク質等の細胞死を誘導する膜タンパク質、過酸化水素等の活性酸素種発生剤などを挙げることができる。そして、これら脂質膜不安定化剤は単独又は２種以上併用して用いることができる。
【００１６】
本発明の赤血球ゴーストやリポソームを用いる生体膜安定化剤のスクリーニング方法に用いられる検知剤としては、トリプシン，アルカリフォスファターゼ，ペルオキシダーゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ，アルコール脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ペニシリナーゼ，ウレアーゼ，ルシフェラーゼ，アセチルコリンエステラーゼ等の酵素や、Ｐ−ニトロアニリン等の色素や、Ｎ−メチルアントラニル酸，フルオレスセインイソチオシアネート，フィコビリタンパク，希土類金属キレート，ダンシルクロライド，テトラメチルローダミンイソチオシアネート，カルセイン，ジクロロフルオセイン等の蛍光物質、３Ｈ，１４Ｃ，１２５Ｉ等の放射性同位体を含む放射性物質の他、ビオチン，アビジン又は化学発光物質を挙げることができる。これらの内、放射性物質及び蛍光物質は、それ自体単独で検知することができるが、酵素等は、それ自体単独で検知することができず、少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存して種々の基質が用いられる。例えば、酵素がトリプシンの場合には、ペプチジル−ｐＮＡ基質（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐＮＡ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）アッセイ法、又はペプチジル−ＭＣＡ基質（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ＭＣＡ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）アッセイ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ８０，  ３４１−３６１，  １９８１）が用いられる。
【００１７】
上記検知剤が封入された赤血球ゴーストは、全血をリン酸バッファー（ＰＢＳ）で複数回洗浄して血漿タンパク質等を除去し、回収した赤血球細胞に、例えばＮａ−リン酸バッファー（ｐＨ８．０）を加えて溶血させてヘモグロビンを除去し、遠心分離（例えば、２２０００×ｇで１０分）により赤血球膜（赤血球ゴースト）を回収し、上記バッファーで洗浄して赤血球ゴースト表面に付着しているヘモグロビンを除去した後、酵素，色素等の検知剤を添加したＰＢＳを加え、例えば３７℃で１時間インキュベーションして膜を閉じ、検知剤を封入し、ＰＢＳで洗浄して赤血球ゴースト表面に付着している検知剤を除去することにより、調製することができる。
【００１８】
上記検知剤が封入されたリポソームは、例えば、卵黄レシチン，大豆レシチン，フォスファチジルコリン，フォスファチジルエタノールアミン，フォスファチジルセリン，フォスファチジルイノシトール，スフィンゴミエリン，１，２−ｄオレオイル−Ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（ＤＯＰＣ）などのリン脂質に、酵素，色素等の検知剤を添加したＰＢＳを加え、ホモジナイズした後、超音波処理し、その後ゲル濾過クロマトグラフィーを行うことにより、余剰の検知剤をリポソームと分離し、リポソーム画分を懸濁液として回収することにより調製することができる。
【００１９】
赤血球細胞は、例えば、全血をＰＢＳで複数回洗浄（遠心分離は１０００ｒｐｍで５分）して血漿タンパク質等を除去し、回収することにより調製することができる。
【００２０】
本発明は、また、上記のスクリーニング方法により生体膜安定化作用が確認されたＭＳ４１，ＭＳ１（２−〔１−（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ〕−３−（１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）等を有効成分とする生体膜安定化剤に関する。かかる生体膜安定化剤は、ミトコンドリアの内膜の透過性の亢進によって引き起こされる細胞死であるネクローシスを抑制することで疾患に関連する死のみを抑制し得る可能性が大きく、生理的なアポトーシスを抑制しないため、神経変性疾患、循環器系疾患、肝炎、腎疾患、炎症性皮膚疾患、放射線障害、ウイルス性疾患、プリオン病、臓器等の移植時の機能不全等の各種疾病の予防・治療が可能となる点で有用である。
【００２１】
【実施例】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［リポソームの調製及びトリプシン放出量の測定によるＭＳ４１の生体膜安定化作用の解析］
卵黄由来のホスファチジルコリン（ＰＣ；シグマ社製）３ｍｇ、コレステロール（ＣＬ；シグマ社製）１ｍｇ、及び酵素として０．２５％のトリプシン（ワシントン社製）を含むＰＢＳ溶液５０μｌの混合物をホモジナイズし、１０秒間超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ；ブロンソン社製）を施してリポソームを作製した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラム（ファルマシア社製）にてゲル濾過クロマトグラフィーを行うことにより、余剰の酵素をリポソームと分離し、リポソーム画分を懸濁液として回収した。次に得られたリポソーム懸濁液をＰＢＳでアッセイに使用できる濃度に希釈し、イオントランスポーターであるアラメチシン（シグマ社製）をそれぞれ０．５０μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌを添加した群をコントロール（ｖｅｈｉｃｌｅ）群（○−○）とし、アラメチシンにＭＳ４１を１０μＭ添加した群をＭＳ４１群（●−●）とし、アラメチシンによる脂質膜の不安定化に伴って引き起こされる膜外へのトリプシン漏出に対するＭＳ４１の影響を、トリプシンの合成基質であるペプチジル−ＭＣＡ基質（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ＭＣＡ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）５０ＵＭを用いて解析した（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ８０，  ３４１−３６１，  １９８１）。なお、各群ともｎ＝３で実験を行った。結果を図１に示す。図１より、アラメチシン添加量が５．０μｇ／ｍｌでは、コントロール群とほぼ同程度であったが、アラメチシン添加量が２．５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、０．５０μｇ／ｍｌの条件下ではコントロール群と比較してＭＳ４１群ではトリプシンの漏出が漸次減少し、ＭＳ４１がイオントランスポーターであるアラメチシンによる脂質膜の不安定化を抑制することがわかった。
【００２２】
実施例２［赤血球ゴーストの調製及びトリプシン放出量の測定によるＭＳ４１の生体膜安定化作用の解析］
ヒトの静脈血を採血し、常法にしたがって赤血球を調製した後、氷冷した５Ｐ８バッファー（５ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，  ｐＨ８．０）で溶血させて赤血球中のヘモグロビンを除去し、再度Ｎａ−リン酸バッファーで洗浄した。さらに、酵素（トリプシン）０．２５％を添加したＰＢＳを加えることにより赤血球ゴースト内部に酵素（トリプシン）を封入後、ＰＢＳで余分な酵素（トリプシン）を除去した赤血球ゴーストをＰＢＳ又はＤＭＥＭ培地で希釈し、赤血球ゴースト懸濁液とした。次に、得られた５％赤血球ゴースト懸濁液の培地中にアラメチシン１０μｇ／ｍｌ存在下でＭＳを加えない群（コントロール群）、２μＭのＭＳ１を添加した群、０．２μＭのＭＳ１を添加した群、２μＭのＭＳ４１を添加した群及び０．２μＭのＭＳ４１を添加した群の計５群（各群ともｎ＝３）に分け、脂質膜の不安定化に伴って引き起こされるトリプシン放出に対するアラメチシンの添加量とＭＳの影響を解析した。結果を図２に示す。なお、トリプシン放出量はペプチジル−ＭＣＡ基質（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ＭＣＡ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）アッセイ法を用いて測定した。その結果、ＭＳ１及びＭＳ４１を添加した群では、コントロール群と比較してトリプシン放出量を抑制すること、さらに、ＭＳ１とＭＳ４１は共に濃度依存的にトリプシン放出量の抑制に関与することが明らかになり、ＭＳがイオントランスポーターであるアラメチシンによる赤血球細胞膜の不安定化を抑制することが示された。
【００２３】
実施例３［赤血球細胞の生存数に対するＭＳ４１とアラメチシンの影響］
ヒトの静脈より採血し、常法にしたがって調製した５％赤血球を終濃度０．５％に調整した。アラメチシン及びＭＳ４１非存在下２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養した赤血球細胞群（コントロール群）、培地中にアラメチシン２０μｇ／ｍｌ存在下で、ＭＳ４１をそれぞれ０μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ添加した培地中の０．５％赤血球細胞群の計５群に分け、３時間培養を行った。そのときの赤血球細胞を光学顕微鏡（オリンパス社製）で観察し、生存している細胞数を測定することにより、赤血球細胞におけるＭＳ４１の細胞膜の不安定化に起因する細胞死抑制作用を調べた。結果を図３に示す。その結果、アラメチシンのみを添加した培地中の細胞では、生存細胞数がコントロール群の約２５％にまで減少するが、ＭＳ４１を添加することにより、濃度依存的に生存細胞数が増加することが確認された。したがって、ＭＳ４１が、イオントランスポーターであるアラメチシンによって引き起こされるによる細胞膜の破綻を抑制することが示された。
【００２４】
実施例４［赤血球細胞の生存数に対するＭＳ４１、アラメチシ及びＢａｋの影響］
実施例３と同様の方法で調製した赤血球細胞を終濃度０．５％に調整した。アラメチシン、Ｂａｋ及びＭＳ４１非存在下２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養した赤血球細胞群（コントロール群）、培地中にアラメチシン１０μｇ／ｍｌ及びＢａｋ１５０μｇ／ｍｌ存在下で、ＭＳ４１をそれぞれ０μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ添加した培地中の赤血球細胞群の計５群に分け、３時間培養を行った。そのときの赤血球細胞を光学顕微鏡（オリンパス社製）で観察し、生存している細胞数を測定することにより、赤血球細胞におけるＭＳ４１の細胞膜の不安定化に起因する細胞死抑制作用を調べた。結果を図４に示す。その結果、アラメチシンとＢａｋとを添加した培地中の細胞では、細胞数がコントロール群の約１５％にまで減少するが、ＭＳ４１を添加することにより、細胞数がコントロール群とほほ同程度まで回復することが確認された。したがって、ＭＳ４１が、アラメチシン及び細胞死を誘導する膜タンパク質であるＢａｋによる細胞膜の破綻を抑制することが示された。
【００２５】
実施例５［赤血球細胞における過酸化水素とＭＳ４１の影響］
実施例３と同様の方法で調製した０．５％赤血球細胞を、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ培地で２４時間の培養を行った後、顕微鏡により赤血球細胞の観察を行った。図５に、無処理の培地中の赤血球細胞（コントロール：上段）、過酸化水素３００μＭを添加した培地中の細胞（中段）、及び３００μＭ過酸化水素及び５μＭ  ＭＳ４１を添加した培地中の細胞（下段）の状態をそれぞれ示した。その結果、未処理の培地中の赤血球細胞では正常に細胞の生存が見られるが、活性酸素種発生剤である過酸化水素を添加した培地中の赤血球細胞では細胞膜の不安定化に起因する細胞死が観察された。しかし、過酸化水素とＭＳ４１を添加した培地中の細胞はコントロールと同様の状態を示した。したがって、ミトコンドリア膜上に存在するｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｉｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ（ＰＴＰ）複合体が関与するミトコンドリアからのカルシウム放出を促進する化合物であるＭＳ４１が、赤血球細胞における細胞膜の不安定化に起因する細胞死抑制剤として有効であることが示唆された。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の生体膜安定化剤のスクリーニング方法によると、ネクローシスに起因する疾病等の治療薬として有用と考えられる生体膜安定化剤を簡便かつ効率的にスクリーニングすることができる。また、かかる生体膜安定化剤のスクリーニング方法により生体膜安定化作用が確認されたＭＳ４１，ＭＳ１等を有効成分とする生体膜安定化剤は、ネクローシスに起因する疾病の予防・治療薬として有用である可能性が大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】リポソームを用いたトリプシン放出量の測定において、ＭＳ４１がイオントランスポーターであるアラメチシンによる細胞膜の破壊を抑制することを示す図である。（縦軸：コントロール群のトリプシン放出量に対する相対値、横軸：アラメチシン濃度（μｇ／ｍｌ））
【図２】赤血球ゴーストを用いたトリプシン放出量の測定において、ＭＳ４１がイオントランスポーターであるアラメチシンによる細胞膜の破壊に対して濃度依存的に抑制することを示す図である。（縦軸：コントロール群のトリプシン放出量に対する相対値）
【図３】赤血球細胞の生存数がイオントランスポーターであるアラメチシンによる細胞膜の破壊により激減し、ＭＳ４１の添加により濃度依存的に回復することを示す図である。（縦軸：コントロール群のトリプシン放出量に対する相対値）
【図４】赤血球細胞の生存数がイオントランスポーターであるアラメチシン及び細胞死を促進するタンパク質であるＢａｋによる細胞膜の破壊により激減し、ＭＳ４１の添加により濃度依存的に回復することを示す図である。（縦軸：コントロール群の生存細胞数に対する相対値）
【図５】上段：無処理培地中の赤血球細胞を示す図である（コントロール）。
中段：培地中に過酸化水素を添加した後の赤血球細胞の状態を示す図である。
下段：培地中に過酸化水素及びＭＳ４１を添加した後の赤血球細胞の状態を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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