(57)【要約】【課題】本発明の課題は、生体に抗菌耐性の付与を行うことができる新たな遺伝子を提供することである。【解決手段】本発明により、ｃｄｆ１遺伝子、ｃｄｆ２遺伝子、ｃｄｆ３遺伝子、ｃｄｆ４遺伝子、ｃｄｆ５遺伝子、ｃｄｆ６遺伝子、ｃｄｆ７遺伝子及びｃｄｆ８遺伝子が提供された。また本発明により、上記遺伝子を用いて酵母の増殖を阻害する方法もまた提供された。本発明の遺伝子は細胞死（アポトーシス）を誘導する植物由来の遺伝子であり、例えば生体に抗菌耐性を付与する目的において有用である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す塩基配列からなることを特徴とする植物由来の遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基番号１−９５８で示される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ｂ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子。
（ｃ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−８３７で示される塩基配列からなることを特徴とする植物由来の遺伝子。
（ｂ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子。
（ｃ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号３に示す、塩基番号１−５０４で示される塩基配列からなることを特徴とする植物由来の遺伝子。
（ｂ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子。
（ｃ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号４に示す、塩基番号１−６５７で示される塩基配列からなることを特徴とする植物由来の遺伝子。
（ｂ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子。
（ｃ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基番号１−１４４６で示される塩基配列からなることを特徴とする植物由来の遺伝子。
（ｂ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子。
（ｃ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号６に示す、塩基番号１−１４４０で示される塩基配列からなることを特徴とする植物由来の遺伝子。
（ｂ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子。
（ｃ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
【請求項７】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基番号１−３９３で示される塩基配列からなることを特徴とする植物由来の遺伝子。
（ｂ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子。
（ｃ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
【請求項８】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号８に示す、塩基番号１−２０４３で示される塩基配列からなることを特徴とする植物由来の遺伝子。
（ｂ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子。
（ｃ）細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導する活性を有し、（ａ）の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか一つの請求項記載の遺伝子によって形質転換された、ヒトを除く生体、細胞、組織、器官又はその他の生体の一部。
【請求項１１】
植物に由来する、請求項１０記載の生体、細胞、組織、器官又はその他の生体の一部。
【請求項１２】
請求項１ないし８のいずれか一つの請求項記載の遺伝子によって、酵母の増殖を抑制する方法。
【請求項１３】
請求項１ないし８のいずれか一つの請求項記載の遺伝子によって、生体において抗菌耐性を付与する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞死（アポトーシス）を誘導することにより酵母の増殖を阻害する機能を有する遺伝子、および該遺伝子により酵母の増殖を阻害する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞死（アポトーシス）とは、細胞の生の特徴である細胞分裂（マイトーシス）と対立する概念であり、最も重要な細胞機能の一つであり、種々の生理的役割を担っている。その一つは、発生過程において又は成熟個体において余剰に用意された細胞や、老化した細胞などを除去することによって生体の統制を図る細胞制御的な役割である。もう一つは、生体にとって有害となる癌細胞やウイルスに感染した細胞を排除するといった生体防御的な役割である。
【０００３】
これまでに知られている細胞死を誘導する因子としては、動物細胞由来のＢａｘやＰＩＧ３を挙げることができる。ｐ５３は重要な癌抑制性の蛋白質であるが、ｐ５３が細胞に損傷を受けたＤＮＡの修復を促しても修復しきれないときには、ｐ５３はＢａｘやＰＩＧ３を誘導して細胞を殺してしまうことにより、生体にとって不都合な細胞を除去すると言われている。
【０００４】
植物由来の細胞死の制御に関連している知見として、Ｂａｘ  阻害因子−１（Ｂａｘ  Ｉｎｈｉｎｉｔｏｒ−１  ：  ＢＩ−Ｉ）のホモログがイネとシロイヌナズナにおいて存在することが知られており、酵母の実験系においてＢＩ−Ｉはアポト−シスを抑制することが本発明者らによって報告されている（非特許文献１）。また、シロイヌナズナのエチレン反応性因子結合蛋白質（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ：  ＡｔＥＢＰ）が、Ｂａｘによって誘導された細胞死を抑制することが、やはり本発明者らによって報告されている（非特許文献２）。更に本発明者らは、シロイヌナズナ由来の細胞死抑制遺伝子を３９個見出し、特許出願している（特許文献１）。
【０００５】
しかし、植物細胞由来の細胞死制御因子に関する知見はまだ十分であるとは言えない。また、上記において述べた知見は全て細胞死を抑制する遺伝子に関するものであるが、細胞死を促進する遺伝子はほとんど知られていない。本発明においては、スクリーニングの手法に酵母を用いることにより、細胞死を誘導する因子を単離することが可能となった。即ち本発明における遺伝子の採取は、細胞内での発現系を用いたレプリカ法によりスクリーニングを行った点に特徴がある。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−５８４９３号公報
【非特許文献１】
エム・カワイ他（Ｍ．Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ），フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ），  １９９９年，  ４６４巻，  ｐ１４３−１４７
【非特許文献２】
エル・パン他（Ｌ．Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ），フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ），  ２００１年，  ５０８巻，  ｐ３７５−３７８
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記の細胞死の性格を考えると、細胞死を誘導する作用を有する遺伝子を植物から採取することができたら、抗菌耐性の付与など種々の面において有用であると考える。よって、その様な新規な遺伝子を採取することが、これまで求められていた。そこで、本発明の課題は、細胞死を誘導する植物由来の遺伝子を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは植物のｃＤＮＡライブラリーから、酵母増殖阻害作用を指標として、細胞死を誘導する作用を有する遺伝子を単離した。つまり、シロイヌナズナのガラクトース誘導型ｃＤＮＡライブラリーを導入し、グルコース培地にて生きるコロニーをガラクトース培地にてレプリカし、死ぬクローンを同定した。その結果、配列表の配列番号１から８に記載した新規遺伝子を得た。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、配列表の配列番号１に示す、塩基番号１−９５８で示される塩基配列からなることを特徴とする、シロイヌナズナ由来のＣＤＦ１遺伝子である。ＣＤＦ１遺伝子は、細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導するという性質を有する。配列表の配列番号２に示される塩基配列からなることを特徴とする、シロイヌナズナ由来のＣＤＦ２遺伝子、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなることを特徴とするシロイヌナズナ由来のＣＤＦ３遺伝子、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなることを特徴とするシロイヌナズナ由来のＣＤＦ４遺伝子、配列表の配列番号５に示される塩基配列からなることを特徴とするシロイヌナズナ由来のＣＤＦ５遺伝子、配列表の配列番号６に示される塩基配列からなることを特徴とするシロイヌナズナ由来のＣＤＦ６遺伝子、配列表の配列番号７に示される塩基配列からなることを特徴とするシロイヌナズナ由来のＣＤＦ７遺伝子、配列表の配列番号８に示される塩基配列からなることを特徴とするシロイヌナズナ由来のＣＤＦ８遺伝子もまた同様に、細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導するという性質を有する。
【００１０】
本発明の遺伝子は、後述の実施例に記載した方法により取得することが可能であり、また合成によっても取得することが可能である。最も一般的には本発明の遺伝子は、植物体からｍＲＮＡを調製し、次にｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡライブラリーから目的の遺伝子をスクリーニングすることができる。このスクリーニングに用いるプローブの構造は、配列表の配列番号１−８に記載した遺伝子配列から、適宜選択して設計することができる。
【００１１】
また、スクリーニングをするｃＤＮＡライブラリーは、シロイヌナズナ又は他の適当な植物から作製することができる。下記の実施例において使用しているシロイヌナズナは最も好適な植物であるが、それに限定されるものではなく、細胞死を誘導する遺伝子を発現することが知られている各種の植物をこの目的で使用することができる。植物体からｍＲＮＡを抽出し、これを鋳型と逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化したものを市販のファージベクターあるいはクローニングベクター等にクローニングし、大腸菌などに形質転換することによってｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。
【００１２】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。そのような欠失、置換若しくは付加などの改変を受けた遺伝子は、実質的に同じ細胞死誘導作用を有するペプチドをコードするものと考えられる。
【００１３】
即ち、配列表の配列番号１に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子である。その様な遺伝子も、細胞に導入されたときに該細胞の細胞死を誘導するという上述したＣＤＦ１遺伝子の特徴を有する限り、本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子は、ストリンジュントな条件下でＣＤＦ１遺伝子とハイブリダイズする。また、ＣＤＦ２遺伝子、ＣＤＦ３遺伝子、ＣＤＦ４遺伝子、ＣＤＦ５遺伝子、ＣＤＦ６遺伝子、ＣＤＦ７遺伝子ＣＤＦ８遺伝子においても、「欠失、置換若しくは付加された遺伝子」とは同様の意味を有する。
【００１４】
また、本発明の植物遺伝子を利用して、一般的な遺伝子組み換え技術に従って取得された、組み換えた細胞死誘導蛋白質もまた本発明の範囲内である。本発明の遺伝子の発現を可能とする発現ベクターを作製し、これを宿主細胞に形質導入することによって、組み換えた細胞死誘導蛋白質を取得することができる。その様な組み換え蛋白質を製造する方法は、本技術分野において良く知られている公知技術であるが、その代表的な例として、大腸菌を宿主細胞として用いて該大腸菌に組み換え蛋白質を製造させる方法を挙げることができる。
【００１５】
この様にして製造された蛋白質を、その物理的性質・化学的性質を利用して、例えば種々のクロマトグラフィーの手法を用いて分離・精製することが可能である。得られた蛋白質を抗原として使用して、更に抗体を作製することも可能である。またその様な抗体を利用することにより、ウエスタンブロッティング法などを用いて、生体における本発明の遺伝子の発現を解析することが可能である。
【００１６】
ＣＤＦ１遺伝子ないしＣＤＦ８遺伝子のいずれか一つの遺伝子によって形質転換された、ヒトを除く生体、細胞、組織、器官又はその他の生体の一部もまた、本発明の範囲内である。ここでいう生体には動物（ヒトを除く）、植物、酵母、細菌、真菌、原生生物など種々の生物の生体が含有され、特にその範囲を限定するものではない。
【００１７】
なお、本発明では遺伝子が細胞死を誘導する効果を酵母細胞の生育抑制で確認したが、細胞死の機構は種を超えて共通であることから、本発明の細胞死を誘導する遺伝子は、動物、植物、酵母、細菌、真菌、原生生物など種々の細胞の細胞死を誘導することができると思われる。
【００１８】
また、本発明の遺伝子は、病原微生物の繁殖防止に有用であり、また、植物へ遺伝子導入することにより、病害抵抗性を植物に容易に付与することが可能である。ＣＤＦ１遺伝子ないしＣＤＦ８遺伝子のいずれか一つの遺伝子によって酵母の増殖を抑制する方法、生体において抗菌耐性を付与する方法もまた本発明の範囲内である。その場合に、本発明の遺伝子は植物由来であるために、本発明の遺伝子と導入する対象として植物を用いることは特に好ましい。病害抵抗性の付与などを目的として、本発明の遺伝子を導入する植物の例としては、ユリ、イネ、トウモロコシ、アスパラガス、コムギ等の単子葉植物、またシロイヌナズナ、タバコ、ニンジン、ダイズ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。中でもイネやコムギに本発明の遺伝子を導入することは、食糧の増産という意味で大きな意義があると思われる。
【００１９】
上記の形質転換植物の作製方法としては、本技術分野において知られている通常の方法を用いる事ができる。本発明の遺伝子の上流に、本発明の遺伝子の効率的な発現を可能とするプロモーターを連結してベクターに挿入することにより、植物体内での発現系を構築することができる。使用できるプロモーターの具体例としては、例えば汎用されているカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターやユビキチンプロモーターを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。また、ここで使用するベクターとしては、プラスミドベクターが好適であり、使用できるベクターの具体例としては、例えば汎用されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＢＲ３２２やｐＵＣベクター等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００２０】
そのようにベクターを、例えばアグロバクテリウム菌に導入して、カルス又は幼植物に感染させることにより、形質転換植物を作製する事が可能であり、更に、そのような形質転換植物に由来する種子を得る事が可能である。本発明の植物遺伝子を植物に導入する形質転換法はアグロバクテリウム法に限定されるものではなく、パーティクルガン法、電気穿孔法等の方法を用いる事も可能である。
【００２１】
更なる応用としては、動物細胞へ導入してアポトーシスを誘導することにより種々の疾患を治療することもまた可能であると思われる。より具体的には、細胞の適切な死を引き起こすことによって癌細胞を死滅させる効果を有する可能性があり、癌治療に有効な因子として更なる応用を行うことが考えられる。
【００２２】
また、本発明の遺伝子を雄性不稔系統の育種に用いることができる。多くの作物は、一つの個体あるいは一つの花に雌雄の生殖器官が接して存在するため、個体内で受精を行う「自殖」が行われている。しかし育種の上では、望ましい形質を持つ個体同士を人工的に交配する必要がある。そこで今回得られたような細胞死を誘導する因子を花粉特異的なプロモーターに連結して植物内で働かせる事により、花粉を産生しない植物個体（雄性不稔系統）を得ることが可能になる。これにより、自殖を防いで望んだ植物個体同士の交配が可能となり、雄性不稔を利用した育種が可能となる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
（実施例１）
（酵母の増殖を阻害する遺伝子の単離）
ガラクトース誘導性プロモーターにシロイヌナズナのｃＤＮＡを連結した酵母用発現ベクタ−ライブラリーより、酵母の増殖を阻害する植物遺伝子の探索を行った。
【００２４】
（１）酵母へのシロイヌナズナｃＤＮＡの導入
野生型酵母（Ｗ３０３株およびＢＦ２６４−１５Ｄａｕ株）にガラクトース誘導性プロモーターに連結されたシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーを導入した。方法としては、酢酸リチウム法を用いた。
【００２５】
ＹＰＤ液体培地に植菌した野生型酵母を３０℃で一晩培養し、遠心し菌体を回収した。ＬＡ液（０．１  Ｍ  酢酸リチウム／１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  −ＨＣｌ／１  ｍＭ  ＥＤＴＡ）に菌体を懸濁し、キャリアーＤＮＡ  とともにシロイヌナズナｃＤＮＡ発現ベクター、ポリエチレングリコール液を加え、３０℃で３０分培養した。約１０分の１量のＤＭＳＯ液を加えた後、４２℃５分インキュベートし、その後ＹＰＤ培地で３０℃１時間培養した。遠心して菌体を回収し、適量をグルコースを含むＳＤ−Ｕｒａ固体培地上に播き、３０℃２日間静置培養した。
【００２６】
（２）酵母の増殖を阻害する遺伝子のスクリーニング
酵母の増殖を阻害するシロイヌナズナ遺伝子をスクリーニングするため、固体培地上に現れたコロニーのレプリカを取り、グルコースを含むＳＤ−Ｕｒａプレート及びガラクトースを含むＳＤ−Ｕｒａプレート上で３０℃２日間培養を行った。ｃＤＮＡライブラリーはガラクトースにより発現が誘導されるため、２日後、グルコースプレート上でコロニーを形成するが、ガラクトースプレート上でコロニーを形成しない酵母株を選択した。
【００２７】
（３）遺伝子の単離と塩基配列の解析
ガラクトース培地上で死滅し、グルコース培地上で生存する酵母株に含まれるシロイヌナズナｃＤＮＡを単離するため、グルコース培地に植菌し３０℃１日培養後、プラスミドＤＮＡを単離した。酵母からのプラスミドの単離は以下の様におこなった。
【００２８】
酵母を１晩培養した培養液を集菌し、ＳＴＥＳ溶液（０．５  Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．２  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６，  ０．０１  Ｍ  ＥＤＴＡ，  ０．１  ％  ＳＤＳ）に懸濁した。ガラスビーズ（シグマ社製）を加え激しく攪拌して菌体を破砕したのち遠心し、上澄みを新しいチューブに回収した。除タンパク質のためフェノール／クロロホルムを加え遠心して上清を回収した後、本溶液をＤＮＡ液として大腸菌の形質転換に使用した。
【００２９】
得られた形質転換大腸菌を用い、プラスミドの増幅、抽出後、塩基配列の決定を行った。塩基配列決定にはプラスミドに含まれる配列をプライマーとしてＣＥＱ  ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ  （ＢＥＣＫＭＡＮ社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、未反応物質をエタノール沈澱により除去したのち塩基配列の決定をおこなった。
【００３０】
本遺伝子をｃｄｆ１  （ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｄｅｆｅｃｔ  ｆａｃｔｏｒ−１）と名付け、得られた塩基配列を配列表の配列番号１と図１に示す。また、シロイヌナズナゲノム中に部分的に類似の相同遺伝子が存在し、これをｃｄｆ２と命名した。遺伝子情報を元にｃＤＮＡをＰＣＲ法によって単離し、得られたクローンの塩基配列を配列表の配列番号２と図２に示す。また同様のスクリーニングにより得られたｃＤＮＡ断片をｃｄｆ３  からｃｄｆ８と名付け、その配列をそれぞれ配列表の配列番号３から８、図３から８に示す。
【００３１】
（実施例２）
（ｃｄｆ遺伝子の酵母に対する生育阻害効果）
塩基配列が決定されたｃｄｆ１プラスミドを再度、酵母内に導入し、酵母に対する生育阻害効果の確認をおこなった。
【００３２】
ガラクトース誘導性プロモーターにｃｄｆ１を連結した発現ベクターであるｃｄｆ１プラスミド（ｐＴＳ−ｃｄｆ１）を構築して大腸菌内で増幅した後に、酢酸リチウム法により野生型酵母に形質転換した。方法は実施例１で述べたとおりである。得られた形質転換酵母のコロニーをグルコース及びガラクトースを含む培地上にストリークし、３０℃２日間静置培養した。得られた形質転換酵母はグルコース（Ｇｌｕ）培地上では正常に生育するが、ガラクトース（Ｇａｌ）を含む培地上では、図９のｐＴＳ−ｃｄｆ１において見られるように、ｃｄｆ１タンパク質の発現により生育が阻害された（図９）。この生育阻害はｃｄｆ１遺伝子の下流にタグとしてＧＦＰ  （Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を連結した場合も同様に検出された（ｐＴＳ−ｃｄｆ１−ＧＦＰＰ）。なお、図９において、ｐＴＳは空ベクターを、ｐＴＳ−Ｂａｘはポジティブコントロールのベクターを、ｐＴＳ−ｃｄｆ１はｃｄｆ１を連結したベクターを、ｐＴＳ−ｃｄｆ１−ＧＦＰはＧＦＰタグを付加したｃｄｆ１のベクターを、それぞれ示す。
【００３３】
（実施例３）
ガラクトースプロモーターの下流にｃｄｆ−３、及びｃｄｆ−４を連結した遺伝子発現ベクタ−及び、ネガティブコントロールとして空ベクタ−、ポジティブコントロールとしてアポトーシス促進遺伝子である動物のＢａｘ遺伝子を連結したベクタ−を野生型酵母に酢酸リチウム法により導入し、ガラクトースを含む固体培地上でコロニーを得た。これらの菌株をグルコースを含む液体培地中で対数増殖期まで培養した後、遠心分離して菌株を回収し、それぞれの遺伝子発現を誘導するため、ガラクトースを含む液体培地に再懸濁した。３０℃で４８時間培養した後、適量をガラクトースを含む固体培地上に塗布し、さらに３０℃で２日間静置培養をおこなった。現れたコロニーの数をカウントし、個々の遺伝子発現が酵母のコロニー形成に与える影響を確定した。グラフではガラクトース培地に懸濁した直後の酵母液から形成されるコロニー数を１として、相対値で示した。
【００３４】
その結果、ｃｄｆ−３，  ｃｄｆ−４は動物のアポトーシス促進遺伝子であるＢａｘとほぼ同等のコロニー形成阻害効果を示した（図１０）。植物からこのような作用を持つ因子が単離された例は無い。なお、図１０においてカラム１はベクターコントロールの酵母を、カラム２はＢａｘを導入した酵母を、カラム３はｃｄｆ−３を導入した酵母を、カラム４はｃｄｆ−４を導入した酵母をそれぞれ示す。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、新規遺伝子であるｃｄｆ１遺伝子、ｃｄｆ２遺伝子、ｃｄｆ３遺伝子、ｃｄｆ４遺伝子、ｃｄｆ５遺伝子、ｃｄｆ６遺伝子、ｃｄｆ７遺伝子及びｃｄｆ８遺伝子が与えられた。また本発明により、上記遺伝子を用いて酵母の増殖を阻害する方法もまた与えられた。本発明の遺伝子は細胞死（アポトーシス）を誘導することにより酵母の増殖を阻害する機能を有し、例えば生体に抗菌耐性を付与する目的において有用である。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｃｄｆ１の塩基配列を示す図である。
【図２】図２は、ｃｄｆ２の塩基配列を示す図である。
【図３】図３は、ｃｄｆ３の塩基配列を示す図である。
【図４】図４は、ｃｄｆ４の塩基配列を示す図である。
【図５】図５は、ｃｄｆ５の塩基配列を示す図である。
【図６】図６は、ｃｄｆ６の塩基配列を示す図である。
【図７】図７は、ｃｄｆ７の塩基配列を示す図である。
【図８】図８は、ｃｄｆ８の塩基配列を示す図である。
【図９】図９は、ｃｄｆ１遺伝子による酵母の生育阻害を示す図である。
【図１０】図１０は、ｃｄｆ３及びｃｄｆ４遺伝子による酵母のコロニー形成阻害率を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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