(57)【要約】【課題】簡易に酵素活性を測定できる方法を提供するとともに、従来公知のバイオアッセイ方法に比べて少ないサンプル量で、より高感度でバイオアッセイできる方法を提供することを目的とする。【解決手段】一般式［Ｉ］【化１】2004000213.tif 000058［式中、Ａｒは、ベンゼン環等の芳香族炭素環基等を表し、Ｌは、−ＣＯＮＨ−等を表し、Ｄは、メチレン鎖等のスペーサーを表し、Ｅは、酵素の特異的基質となり得る基を含む基を表す。］で表される化合物とランタノイドイオンとからなるランタノイド錯体を酵素反応に用いることを特徴とする、時間分解蛍光測定法による酵素活性の測定方法を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
時間分解蛍光測定法による酵素活性の検出方法であって、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成するランタノイド錯体（Ａ１）であって、
該錯体を構成する配位子（Ｂ１）は、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ２）となるものであり、
又、ランタノイド錯体（Ａ１）は、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しておらず、
ｆ）酵素反応により変換された基（ｒ２）が生じると、変換された基（ｒ２）がランタノイドイオンへ配位してランタノイド錯体（Ａ３）となり、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ１）とランタノイド錯体（Ａ３）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、ランタノイド錯体（Ａ１）を用い、
２）ランタノイド錯体（Ａ１）は、更に水分子がランタノイドイオンに配位して、ランタノイド錯体（Ａ１ｂ）となっていてもよい状態で、
３）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、ランタノイド錯体（Ａ１又はＡ１ｂ）に対象となる酵素を反応させ、
４）基質となり得る基（ｒ１）は、酵素により変換されて変換された基（ｒ２）を有するランタノイド錯体（Ａ２又はＡ２ｂ）を生じ、
５）変換された基（ｒ２）は、ランタノイド錯体（Ａ２）の分子内でランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ３）となるか、又はランタノイド錯体（Ａ２ｂ）に水分子と交換して配位子置換してランタノイド錯体（Ａ３）となり、
６）励起光の照射によりランタノイド錯体（Ａ３）中のランタノイドイオンが発光し、
７）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定する、各工程を包含する酵素活性の検出方法。
【請求項２】
時間分解蛍光測定法による酵素活性の検出方法であって、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成するランタノイド錯体（Ａ４）であって、
該錯体を構成する配位子（Ｂ３）は、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ４）となるものであり、
又、ランタノイド錯体（Ａ４）は、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しており、
ｆ）酵素反応により変換された基（ｒ４）が生じると、変換された基（ｒ４）がランタノイドイオンから遊離してランタノイド錯体（Ａ６）となり、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ４）とランタノイド錯体（Ａ６）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、ランタノイド錯体（Ａ４）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、ランタノイド錯体（Ａ４）に対象となる酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素により変換されると変換された基（ｒ４）を有するランタノイド錯体（Ａ５）を生じ、
４）変換された基（ｒ４）は、ランタノイド錯体（Ａ５）のランタノイドイオンから遊離して、ランタノイド錯体（Ａ６）となり、
５）ランタノイド錯体（Ａ６）は、更に水がランタノイドイオンに配位して、ランタノイド錯体（Ａ６ｂ）となっていてもよい状態で、
６）励起光の照射によりランタノイド錯体（Ａ６又はＡ６ｂ）中のランタノイドイオンが発光し、
７）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定する、各工程を包含する酵素活性の検出方法。
【請求項３】
時間分解蛍光測定法による、酵素に阻害作用を有する候補化合物のスクリーニング方法であって、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成するランタノイド錯体（Ａ１）であって、
該錯体を構成する配位子（Ｂ１）は、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ２）となるものであり、
又、ランタノイド錯体（Ａ１）は、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しておらず、
ｆ）酵素反応により変換された基（ｒ２）が生じると、変換された基（ｒ２）がランタノイドイオンへ配位してランタノイド錯体（Ａ３）となるものであり、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ１）とランタノイド錯体（Ａ３）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、ランタノイド錯体（Ａ１）を用い、
２）ランタノイド錯体（Ａ１）は、更に水がランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ１ｂ）となっていてもよい状態で、
３）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、候補化合物の存在下、ランタノイド錯体（Ａ１又はＡ１ｂ）に前記酵素を反応させ、
４）特異的基質となり得る基（ｒ１）が酵素によって変換されると、酵素により変換された基（ｒ２）を有するランタノイド錯体（Ａ２又はＡ２ｂ）を生じ、
５）変換された基（ｒ２）は、ランタノイド錯体（Ａ２）の分子内でランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ３）となるか、若しくはランタノイド錯体（Ａ２ｂ）に水分子と配位子置換してランタノイド錯体（Ａ３）となり、又、特異的基質となり得る基（ｒ１）が変換されなければ、ランタノイド錯体（Ａ１又はＡ１ｂ）は変化せず、
６）励起光の照射により、ランタノイド錯体（Ａ３）又はランタノイド錯体（Ａ１若しくはＡ１ｂ）中のランタノイドイオンが発光し、
７）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、
８）候補化合物の存在下、酵素反応の進行を抑制する条件下で、前記工程１）から７）を行い、得られたランタノイドイオンの発光強度と前記７）での発光強度を比較する、各工程を包含する方法。
【請求項４】
時間分解蛍光測定法による、酵素に阻害作用を有する候補化合物のスクリーニング方法であって、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成するランタノイド錯体（Ａ４）であって、
該錯体を構成する配位子（Ｂ３）は、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ４）となるものであり、
又、ランタノイド錯体（Ａ３）は、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しており、
ｆ）酵素反応により変換された基（ｒ４）が生じると、変換された基（ｒ４）がランタノイドイオンから遊離してランタノイド錯体（Ａ６）となり、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ４）とランタノイド錯体（Ａ６）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、ランタノイド錯体（Ａ４）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、候補化合物の存在下、ランタノイド錯体（Ａ４）に前記酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ３）は酵素によって変換されると、変換された基（ｒ４）を有するランタノイド錯体（Ａ５）を生じ、
４）変換された基（ｒ４）は、ランタノイド錯体（Ａ５）のランタノイドイオンから遊離してランタノイド錯体（Ａ６）となり、又、特異的基質となり得る基（ｒ３）が変換されなければランタノイド錯体（Ａ４）は変化せず、
５）ランタノイド錯体（Ａ６）は、水分子がランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ６ｂ）となっていてもよく、
６）励起光の照射により、ランタノイド錯体（Ａ４）又はランタノイド錯体（Ａ６若しくはＡ６ｂ）中のランタノイドイオンが発光し、
７）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、
８）候補化合物の存在下、酵素反応の進行を抑制する条件下、前記工程１）から７）を行い、得られたランタノイドイオンの発光強度と前記７）での発光強度を比較する、各工程を包含する方法。
【請求項５】
時間分解蛍光測定法による酵素活性の検出方法であって、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成可能な配位子（Ｂ１）であって、該配位子（Ｂ１）は、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ２）となるものであり、
又、この配位子（Ｂ１）は、ランタノイド錯体（Ａ１）を形成した場合、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しておらず、
ｆ）一方、変換された基（ｒ２）を有する配位子がランタノイドイオンとともにランタノイド錯体（Ａ３）を形成した場合、変換された基（ｒ２）はランタノイドイオンに配位し、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ１）とランタノイド錯体（Ａ３）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、配位子（Ｂ１）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、配位子（Ｂ１）に対象となる酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素により変換されると、変換された基（ｒ２）を有する配位子（Ｂ２）を生じ、
４）配位子（Ｂ２）にランタノイドイオンを作用させると、配位子（Ｂ２）は、ランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ２）となり、次いでこの錯体は、３）で生じた変換された基（ｒ２）がランタノイドイオンに更に配位して、ランタノイド錯体（Ａ３）となり、
５）励起光の照射により、ランタノイド錯体（Ａ３）中のランタノイドイオンが発光し、
６）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定する、各工程を包含する酵素活性の検出方法。
【請求項６】
時間分解蛍光測定法による酵素活性の検出方法であって、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成可能な配位子（Ｂ３）であって、該配位子（Ｂ３）は、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ４）となるものであり、
又、この配位子（Ｂ３）は、ランタノイド錯体（Ａ４）を形成した場合、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しており、
ｆ）一方、変換された基（ｒ４）を有する配位子がランタノイドイオンともにランタノイド錯体（Ａ６）を形成した場合、変換された基（ｒ４）は、好ましくはランタノイドイオンに配位せず、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ４）とランタノイド錯体（Ａ６）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、配位子（Ｂ３）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、配位子（Ｂ３）に対象となる酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素により変換されると、変換された基（ｒ４）を有する配位子（Ｂ４）を生じ、
４）配位子（Ｂ４）にランタノイドイオンを作用させると、配位子（Ｂ４）は、変換された基（ｒ４）がランタノイドイオンに配位することのない状態でランタノイド錯体（Ａ６）となり、
５）ランタノイド錯体（Ａ６）は、水分子が配位してランタノイド錯体（Ａ６ｂ）となってもよく、
６）励起光の照射により、ランタノイド錯体（Ａ６又はＡ６ｂ）中のランタノイドイオンが発光し、
７）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定する、各工程を包含する酵素活性の検出方法。
【請求項７】
時間分解蛍光測定法による、酵素に阻害作用を有する候補化合物のスクリーニング方法であって、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成可能な配位子（Ｂ１）であって、該配位子（Ｂ１）は、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ２）となるものであり、
又、配位子（Ｂ１）は、ランタノイド錯体（Ａ１）を形成した場合、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応前は好ましくは錯体（Ａ１）においてランタノイドイオンに配位せず、
ｆ）一方、変換された基（ｒ２）を有する配位子がランタノイドイオンとともにランタノイド錯体（Ａ３）を形成した場合、変換された基（ｒ２）は、ランタノイドイオンに配位しており、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ１）とランタノイド錯体（Ａ３）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、配位子（Ｂ１）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、候補化合物の存在下、配位子（Ｂ１）に前記酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素によって変換されると、変換された基（ｒ２）を有する配位子（Ｂ２）を生じ、又、基質となり得る基（ｒ１）が変換されなければ配位子（Ｂ１）は変化せず、
４）上記３）にランタノイドイオンを作用させると、変換された基（ｒ２）を有する配位子（Ｂ２）は、ランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ２）となり、ついでこの錯体は上記２）の反応で変換された基（ｒ２）がランタノイドイオンに更に配位してランタノイド錯体（Ａ３）となり、一方、配位子（Ｂ１）がランタノイドイオンに配位すると、ランタノイド錯体（Ａ１）を形成し、更にこのランタノイド錯体（Ａ１）は、水分子が配位したランタノイド錯体（Ａ１ｂ）となってもよく、
５）上記４）に励起光を照射すると、ランタノイド錯体（Ａ３）又はランタノイド錯体（Ａ１若しくはＡ１ｂ）中のランタノイドイオンが発光し、
６）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、
７）候補化合物の存在下、酵素反応の進行を抑制する条件下、前記工程１）から６）を行い、得られたランタノイドイオンの発光強度と前記７）での発光強度を比較する、各工程を包含する方法。
【請求項８】
時間分解蛍光測定法による、酵素に阻害作用を有する候補化合物のスクリーニング方法であって、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成可能な配位子（Ｂ３）であって、該配位子（Ｂ３）は、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ４）となるものであり、
又、この配位子（Ｂ３）がランタノイド錯体（Ａ４）を形成した場合、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しており、
ｆ）変換された基（ｒ４）を有する配位子がランタノイドイオンとともに錯体（Ａ６）を形成する場合、変換された基（ｒ４）は、好ましくはランタノイド錯体（Ａ６）においてランタノイドイオンに配位せず、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ４）とランタノイド錯体（Ａ６）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する配位子（Ｂ３）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、候補化合物の存在下、該配位子（Ｂ３）に前記酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素により変換されれると、変換された基（ｒ４）を有する配位子（Ｂ４）を生じ、又、基質となり得る基（ｒ３）が変換されなければ、配位子（Ｂ３）は変化せず、
４）上記３）にランタノイドイオンを作用させると、配位子（Ｂ４）は、好ましくは変換された基（ｒ４）がランタノイドイオンに配位することのない状態でランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ６）となり、又、この錯体（Ａ６）は、更に水分子が配位してランタノイド錯体（Ａ６ｂ）となってもよく、一方、配位子（Ｂ３）は、特異的基質となり得る基（ｒ３）がランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ４）を生じ、
５）上記４）に励起光を照射することにより、ランタノイド錯体（Ａ６若しくはＡ６ｂ）、又はランタノイド錯体（Ａ４）中のランタノイドイオンが発光し、
６）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、
７）候補化合物の存在下、酵素反応の進行を抑制する条件下、前記工程１）から６）を行い、得られたランタノイドイオンの発光強度と前記７）での発光強度を比較する、各工程を包含する方法。
【請求項９】
ランタノイド錯体（Ａ１）が、一般式［Ｉ］から［Ｖ］で表される化合物からなる群から選択される化合物とランタノイドイオンとを混合して得られるものである請求項１に記載の方法。
【化１】
2004000213.tif 000049
［式中、Ａｒは、芳香族炭素環基又は芳香族複素環基を表し、
Ｘ１は、水素原子又はＡｒを表し、
Ｌは、−ＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＯ−を表し、
Ｄは、スペーサーを表し、
Ｅは、酵素の特異的基質となり得る基を含む基を表し、
Ｒ１及びＲ２は、水素原子を表すか、又はＲ１、Ｒ２及びＹ１がいっしょになってそれらが結合する炭素原子とともにベンゼン環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、各々同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。但し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうち２つ以上が同時に炭素数１〜６のアルキル基となることはなく、且つＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が同時に水素原子となることもなく、
Ｙ１は、式（Ｊ−１）、（Ｊ−２）及び（Ｊ−３）
【化２】
2004000213.tif 000050
からなる群から選択される基を表すか、又はＹ１、Ｒ１及びＲ２がいっしょになってそれらが結合する炭素原子とともにベンゼン環を形成し、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、各々同一又は異なって、−ＯＨ又は−ＮＨＡｒを表し、但し、Ｚ１からＺ４のうち、２つ以上が同時に−ＮＨＡｒとなることはなく、且つＺ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４が、同時に−ＯＨとなることもなく、
Ｇは、式（Ｋ−１）、（Ｋ−２）及び（Ｋ−３）
【化３】
2004000213.tif 000051
からなる群から選択される基を表す。］
【請求項１０】
時間分解蛍光測定法による酵素活性の検出方法であって、酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下、一般式（Ｉ−２）
【化４】
2004000213.tif 000052
［式中、Ｗは、下記の置換基
【化５】
2004000213.tif 000053
（式中、Ｋはリジンを、Ａはアラニンを、Ｐはプロリンを、Ｌはロイシンを、Ｓはセリンを表し、Ｒは、低級アルキル基を表す。）からなる群から選択される基を表し、Ａｒは、芳香族炭素環基又は芳香族複素環基を表す。］で表される化合物の存在下、前記酵素を用いて酵素反応を行い、酵素反応の際の発光強度を時間分解蛍光測定法により測定することを特徴とする、酵素活性の検出方法。
【請求項１１】
時間分解蛍光測定法による酵素に阻害作用を有する候補化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下、一般式（Ｉ−２）
【化６】
2004000213.tif 000054
［式中、Ｗ及びＡｒは、請求項１０に記載のものと同義である。］で表される化合物及び候補化合物の存在下、酵素反応を行い、酵素反応の際の発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、一方、
ｂ）酵素反応の進行を抑制する条件下、一般式（Ｉ−２）で表されるランタノイド錯体及び候補化合物の存在下、酵素反応を行い、酵素反応の際の発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、
ｃ）工程ａ）及び工程ｂ）で得られた発光強度を比較することを特徴とする、酵素に阻害作用を有する候補化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
一般式（Ｉ−１）
【化７】
2004000213.tif 000055
［式中、Ｗ及びＡｒは、請求項１０に記載のものと同義である。］で表される化合物。
【請求項１３】
一般式（Ｉ−１）
【化８】
2004000213.tif 000056
［式中、Ｗ及びＡｒは、請求項１０に記載のものと同義である。］で表される化合物と、ランタノイドイオンとからなるランタノイド錯体。
【請求項１４】
ランタノイド錯体が一般式（Ｉ−２）
【化９】
2004000213.tif 000057
［式中、Ｗ及びＡｒは、請求項１０に記載のものと同義である。］で表されるものである、請求項１３に記載のランタノイド錯体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、農薬等の分野で有用な酵素活性の測定方法及びそれを用いた該酵素の阻害活性を有する候補化合物のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、ランタノイド錯体の配位子交換に伴う発光強度の変化を測定することにより酵素活性の有無の測定を行う方法、及びこの方法を候補化合物の存在下で行い、発光強度の変化により候補化合物が酵素活性を阻害するか否かを評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ランタノイドイオンは、β−ジケトン、クラウンエーテル、ジエチレントリアミンペンタ酢酸等と６〜８配位座が占有された錯体を形成する。特に、ランタノイドイオンとクラウンエーテル又はジエチレントリアミンペンタ酢酸とは、１：１の等モルにより、８配位座が占有された錯体（以下、「８配座錯体」という。又、１：１の等モルにより７配位座が占有された錯体を、「７配座錯体」という。）を形成する。これらのランタノイド錯体は、化学的に安定構造を有し、発光特性を有することが知られており、各種発光材料としての開発が行われている。又、最近ではこの発光特性を応用して、これらの錯体を酵素活性測定手段に用いる技術も検討されている。
【０００３】
近年、コンビナトリアルケミストリーの手法で数多くの化合物が短期間で合成できる環境が整い、それにともなって合成した数多くの化合物を素早くバイオアッセイする方法（例えばハイ　スループット　スクリーニング）も種々検討されている。従来は、高感度に検出する手法としてラジオイムノアッセイ（以下、「ＲＩ」という。）法が用いられてきた。しかしながら、ＲＩ法は、操作性の問題、副生するラジオアイソトープ廃液の処理の問題等を有し、更にはその価格等の点で問題を有していた。そこで、ランタノイド錯体の発光を用いた時間分解蛍光測定法が注目されてきている。
【０００４】
ランタノイド錯体を用いた酵素活性の測定方法は、種々のものが開示されている。例えば、特開平２−５０４１０９号は、ランタノイド錯体を用いた酵素活性の評価方法が開示されている。ここでの酵素活性の評価方法は、酵素反応により生じた生成物が配位子となって共存するランタノイドイオンとともに溶液中でランタノイド錯体を形成し、その結果生じる発光を測定するものである（特許文献１）。
【０００５】
又、特表平１０−５０５８２０号には、キノロンを増感剤として用いたランタノイド錯体、これを用いた検出ラベル、及びこの検出ラベルを適用した同一分子上の２つの距離を測定する方法が開示されている（特許文献２）。しかしながら特表平１０−５０５８２０号の方法についても溶液中で初めてランタノイド錯体を形成するものであり、又、この方法は検出ラベルとしてのランタノイド錯体についてのものであり、本発明のような酵素活性の測定を目的とするものではない。
【０００６】
更に、国際公開公報ＷＯ９１／８４９０号では、本発明に係るランタノイド錯体と類似の錯体を酵素活性の測定に使用している。しかしながら、ＷＯ９１／８４９０号に記載の錯体は、酵素の特的基質の活性部位とランタノイド錯体とがスペーサーを介せずに直接結合しており、酵素反応することにより新たに錯体が形成され発光が起きるものであり、本発明の配位子交換をメカニズムとする発光とは基本的に異なるものである（特許文献３）。
【０００７】
又、ランタノイド錯体を用いたＴＲＡＣＥ法（ｔｉｍｅ　ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｃｒｙｐｔａｔｅ　ｅｍｍｉｓｉｏｎ）では、検出にＥｕ−クリプテートとアロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）の２種類の発光物質により標識された化合物を用いる。標識体として生成物に対する特異的抗体や受容体、アビジン等のタンパク質が選択される。この方法では、特異的抗体や受容体等のタンパク質をＥｕ−クリプテートにより高分子を標識する際に、時間、手間、コスト等がかかる上、これらのタンパク質はロットの違いにより活性が異なることがあり、再現性の面で問題を生じることもある。（例えば非特許文献１）
【０００８】
【特許文献１】
特開平２−５０４１０９号
【特許文献２】
特表平１０−５０５８２０号
【特許文献３】
国際公開第９１／８４９０号パンフレット
【非特許文献１】
Ｊ．　Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、３巻、９１頁、１９９８年
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、抗体やＲＩを用いることなく、簡易に、より安定した酵素活性検出方法を提供するとともに、従来公知のバイオアッセイ方法に比べて少ないサンプル量で、より高感度でバイオアッセイできる方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
ランタノイド錯体に励起光を照射すると、ランタノイド錯体中の芳香族炭化水素又は複素環からなる光増感部位が励起され、励起エネルギーがランタノイドイオンに移動し、ランタノイドイオンが発光する。この際、ランタノイドイオンに水分子が配位していると、ランタノイドイオンの励起エネルギーは水分子のＯ−Ｈ伸縮振動を介して消失し、発光強度が低下するか又は発光しないことが知られている（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、１４巻、３８４頁、１９８１年）。
【００１１】
一方、従来公知の発光性のランタノイド錯体であって、ランタノイドと配位子とが１：１（モル）の錯体を形成するものは、いずれも該錯体の８つ以上の配位座が占有された状態である。このことは、「ランタノイドと配位子とが１：１（モル）の錯体を形成した場合、ランタノイドイオンが発光するのは、該錯体の８つ以上の配位座が水分子以外のエネルギーが消失しない配位子で占有された錯体である必要がある」ことを示唆している。
【００１２】
そこで発明者らは、ランタノイドイオンに配位子及び水分子が配位して８つ以上の配位座が占有されている錯体において、配位している水分子を水分子以外の他の配位原子と交換して配位させ、ランタノイドイオンに配位している水分子を除去できれば、このランタノイド錯体中のランタノイドイオンが発光するのではないかと考えた。よって、錯体が酵素反応の前後でランタノイドイオンへの配位能が変化する基を有する場合、酵素反応前に錯体が７配座が占有された状態であっても、或いは７配座が占有された錯体に更に水が配位して８配座となっている状態であっても、酵素反応で生じた配位子が、水と比べてランタノイドイオンへの配位力が強く、配位している水分子に代わってランタノイドイオンに配位して８配位座を形成できるようになれば、新たに得られた８配座の錯体が発光することが想定される。
【００１３】
発明者らは、この想定をもとに種々研究を行い、構造中に酵素の特異的基質を有し、そして水分子が配位した特定構造のランタノイド錯体に対して酵素反応を施すことにより、該ランタノイド錯体の分子内で配位子交換が起こり、ランタノイドイオンの発光強度が増加することを見いだした。引き続く研究でこの技術は前記酵素の活性を阻害する化合物のスクリーニングにも適用できることを見いだし、かかる知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は、時間分解蛍光測定法による酵素活性の検出方法であって、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成するランタノイド錯体（Ａ１）であって、
該錯体を構成する配位子（Ｂ１）は、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ２）となるものであり、
又、ランタノイド錯体（Ａ１）は、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しておらず、
ｆ）酵素反応により変換された基（ｒ２）が生じると、変換された基（ｒ２）がランタノイドイオンへ配位してランタノイド錯体（Ａ３）となり、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ１）とランタノイド錯体（Ａ３）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、ランタノイド錯体（Ａ１）を用い、
２）ランタノイド錯体（Ａ１）は、更に水分子がランタノイドイオンに配位して、ランタノイド錯体（Ａ１ｂ）となっていてもよい状態で、
３）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、ランタノイド錯体（Ａ１又はＡ１ｂ）に対象となる酵素を反応させ、
４）基質となり得る基（ｒ１）は、酵素により変換されると、変換された基（ｒ２）を有するランタノイド錯体（Ａ２又はＡ２ｂ）を生じ、
５）変換された基（ｒ２）は、ランタノイド錯体（Ａ２）の分子内でランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ３）となるか、又はランタノイド錯体（Ａ２ｂ）に水分子と交換して配位子置換してランタノイド錯体（Ａ３）となり、
６）励起光の照射によりランタノイド錯体（Ａ３）中のランタノイドイオンが発光し、
７）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定する、各工程を包含する酵素活性の検出方法、に関する。
【００１５】
又、本発明は、上記検出方法を用いた、酵素に阻害活性を有する候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【００１６】
更に本発明は、一般式（Ｉ−１）
【化１０】
2004000213.tif 000002
［式中、Ｗは、下記の群
【化１１】
2004000213.tif 000003
（式中、Ｋはリジンを、Ａはアラニンを、Ｐはプロリンを、Ｌはロイシンを、Ｓはセリンを表し、Ｒは、低級アルキル基を表す。）から選択される置換基を表し、Ａｒは、芳香族炭素環基又は芳香族複素環基を表す。］で表される化合物を提供する。
【００１７】
更に、本発明は、一般式（１−１）で表される化合物とランタノイドイオンとからなるランタノイド錯体を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いる時間分解蛍光測定法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ）とは、以下の方法である。
【００１９】
Ｅｕ、Ｎｄ等を代表とするランタノイド（Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅｓ）原子は、特定の条件下で発光を発し、例えば現在よく用いられているＥｕ錯体は励起光３４０ｎｍを受けて６１５ｎｍの発光を発する。励起光と発光との波長の差（ストークスシフト）が大きく、発光が長波長であることから、この発光は励起光の影響を受けにくく、また発光寿命が非常に長いため発光測定を励起光の照射後一定の時間が経ってから行うことが可能であり、この際共存物質の発光が消滅するという利点を有す。この方法を時間分解蛍光測定法という。
【００２０】
本発明において、「酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件」とは、対象とする酵素がその特異的基質と反応できる条件、即ち、ｐＨ、温度、イオン強度を、該酵素が反応できるように調整し、又、活性発現に必要な補酵素を適切な量含み、該酵素に特異的に反応する基質を適切な濃度に設定した条件のことであり、個々の酵素の種類によって異なる。
【００２１】
本発明において、「酵素反応の進行を抑制する条件」とは、対象とする酵素がその特異的基質と反応できない条件であれば特に限定されないが、例えば、「酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件」に、酵素反応を止めるストップバッファーを添加することにより生じさせることができる。ストップバッファーとしては、例えば、酵素を失活させ、且つ、発光特性に影響を及ぼさない化合物溶液、例えば、界面活性剤溶液を用いることが可能であり、具体的には、０．０１〜０．１重量％のトリトン溶液、０．０１〜０．１重量％のトゥイーン溶液等が例示される。
【００２２】
本発明が対象とする酵素としては、例えばリン酸化酵素（ＯＨ基からリン酸エステルへ変換）、リン酸エステル分解酵素（リン酸エステルを分解してＯＨ基に変換）、硫酸エステル化酵素（ＯＨ基から硫酸エステルへ変換）、硫酸エステル分解酵素（硫酸エステルを分解してＯＨ基に変換）、カルボキシエステル化酵素（カルボン酸からカルボン酸エステル、又はＯＨ基からカルボン酸エステルに変換）、エステル分解酵素（カルボン酸エステルからカルボン酸に変換）、アミド化酵素（カルボキシル基からアミド基、アミノ基からアミド基に変換）、アミド基分解酵素（アミド基からカルボキシル基又はアミノ基に変換）、アミノ化酵素（アミノ基の生成）、酸化酵素（ＯＨ基の消失）、カルボキシル化酵素（カルボン酸の生成）、脱炭酸酵素（カルボン酸の消失）、還元酵素（ＯＨ基、ＳＨ基の生成）等が挙げられる。
【００２３】
なかでも酵素反応の前後で発光強度の変化が大きいものである、リン酸化酵素、リン酸エステル分解酵素、硫酸エステル化酵素、硫酸エステル分解酵素、カルボキシル化酵素（カルボン酸の生成）、アミド化酵素、アミド加水分解酵素、脱炭酸酵素（カルボン酸の消失）等が好ましく、より好ましくはリン酸化酵素、リン酸エステル分解酵素、硫酸エステル化酵素、硫酸エステル分解酵素、アミド加水分解酵素（カルボン酸の生成）、脱炭酸酵素（カルボン酸の消失）等が推奨される。
【００２４】
本発明において「候補化合物」とは、酵素の阻害薬又は作動薬となり得る候補化合物のことであるが、ここでは特に特定の医薬品を開発する場合の化合物ライブラリーのなかから阻害活性を有する化合物をスクリーニング（一次スクリーニング）する際の、対象とする化合物ライブラリーに含まれる化合物群のことであり、本発明のスクリーニング方法は、この一次スクリーニングに用いることが可能である。この候補化合物は、更にインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で阻害するか否かを確認する試験（二次スクリーニング）を行うことができる。
【００２５】
本発明においてランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成することが可能な配位子とは、配位子の分子内に７又は８個のランタノイドイオンに配位可能な置換基を有し、これらの７又は８個の配位可能な置換基が１つのランタノイドイオンに配位することにより７又は８の配位座が占有された錯体を形成する配位子をいう。又、ランタノイドイオンに配位可能な置換基とは、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、カルボキシエステル（ＣＯＯＲ：Ｒは、低級アルキル基を表す。）、アミノ基（一級、二級、三級）、水酸基、カルボニル基、アミド基由来のＣＯ基、ＳＨ基、チオカルボニル基等が例示される。
【００２６】
本発明において、「光増感部位」とは、励起三重項状態のエネルギー準位がランタノイドイオンの共鳴準位より高い性質を有するものであれば特に限定されない。即ち、励起光を照射された配位子のうち適当な電子軌道（π）を有する光増感部位がエネルギーを吸収し、一重項基底状態から第一の励起一重項状態における振動レベルにまで励起される。次いで、光増感部位内において項間交差による励起一重項状態から三重項状態にエネルギー遷移が行われる。この励起三重項状態のエネルギーが、同一分子内に存在するランタノイドイオンに遷移されランタノイドイオンが励起される。従って、光増感部位としては、この条件を満たす芳香族炭素環基又は芳香族複素環基等の置換基であれば差し支えなく、具体的には芳香族炭素環基としてフェニル基、ナフチル基が例示され、芳香族複素環基としてピロリル基、フリル基、チエニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾイソチアゾリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、クマリニル基等が例示される。
【００２７】
本発明において、「低級アルキル基」としては、炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が例示され、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、イソヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１，２，２−トリメチルプロピル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１−エチル−１−メチルプロピル基等が例示される。
【００２８】
本発明において「酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）」、及び酵素により「変換された基（ｒ２）」としては、いずれも本発明が対象とする酵素に親和性を有するものであり、「酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）」が該酵素により変換されて「変換された基（ｒ２）」となり、そのようなものとしては、（ｒ１／ｒ２）の順に、
・−ＯＨ／−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−（ＯＨ）２、
・−ＯＨ／−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨ、
・−ＣＯＯＲ／ＣＯＯＨ、
・−ＣＯＮＨＲ／−ＣＯＯＨ、
・−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’／−Ｃ（ＯＨ）−Ｒ’、
・−ＣＨ３／−ＣＨ２−ＯＨ、
・−ＣＨ３／−ＣＯＯＨ、等が例示される。ここで、Ｒ及びＲ’は、低級アルキル基を表す。以下において特に記さない限り同様である。
【００２９】
又、「酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）」、及び酵素により「変換された基（ｒ４）」としては、いずれも本発明が対象とする酵素に親和性を有するものであり、「酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）」が該酵素により変換されて「変換された基（ｒ４）」となり、そのようなものとしては、（ｒ３／ｒ４）の順に
・−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−（ＯＨ）２／−ＯＨ、
・−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨ／−ＯＨ、
・−ＣＯＯＨ／−ＣＯＯＲ、
・−ＣＯＯＨ／−ＣＯＮＨＲ、
・−ＯＨ／−ＯＣＯＲ、等が例示される。
【００３０】
本発明において「スペーサー」としては、配位子と酵素の特異的基質となり得る基とを結合する役割を有し、ランタノイドイオンへの配位能のないものであれば差し支えなく、例えば直鎖状アルキレン基、直鎖状オキシアルキレン基、フェニル環、ナフチル環等の芳香環、又はシクロペンチル環、シクロヘキシル環等の脂環族環を有するアルキレン基等が例示される。
【００３１】
ランタノイド錯体（Ａ１）及び配位子（Ｂ１）
本発明で用いられるランタノイド錯体（Ａ１）としては、ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成するランタノイド錯体であって、該錯体を構成する配位子（Ｂ１）は、分子内に
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ２）となるものである。
【００３２】
又、ランタノイド錯体（Ａ１）は、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応前は好ましくはランタノイドイオンに配位しておらず、
ｆ）酵素反応により変換された基（ｒ２）が生じると、変換された基（ｒ２）がランタノイドイオンへ配位してランタノイド錯体（Ａ３）となり、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ１）とランタノイド錯体（Ａ３）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、ランタノイド錯体（Ａ１）であれば特に限定されない。
【００３３】
このランタノイド錯体（Ａ１）は、前記酵素を用いて酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で該酵素を用いた酵素反応を行うことにより、ランタノイド錯体（Ａ２）へと変換される。この際に、特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素により変換されて変換された基（ｒ２）となる。
【００３４】
本発明で用いられるランタノイド錯体（Ａ１）は、特異的基質となり得る基（ｒ１）がランタノイドイオンに配位していない７配座以下の、より好ましくは７配座のランタノイド錯体であり、例えば配位子（Ｂ１）とランタノイドイオンとを、好ましくは溶媒中で混合することにより得ることができる。
【００３５】
又、配位子（Ｂ１）は、ランタノイドイオンに配位可能な置換基として、カルボキシル基を２個以上７個以下含むことが推奨される。
【００３６】
配位子（Ｂ１）においてランタノイドイオンに配位可能な置換基としてカルボキシル基等の酸性官能基を選ぶことにより、ランタノイドイオンと配位子との配位力がより高くなるため、酵素活性の検出感度を顕著に上昇させると考えられる。
【００３７】
より具体的な配位子（Ｂ１）としては、例えば一般式［Ｉ］から［Ｖ］で表される化合物からなる群から選択されるものが例示される。
【化１２】
2004000213.tif 000004
［式中、Ａｒは、芳香族炭素環基又は芳香族複素環基を表し、
Ｘ１は、水素原子又はＡｒを表し、
Ｌは、−ＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＯ−を表し、
Ｄは、スペーサーを表し、
Ｅは、酵素の特異的基質となり得る基を含む基を表し、
Ｒ１及びＲ２は、水素原子を表すか、又はＲ１、Ｒ２及びＹ１がいっしょになってそれらが結合する炭素原子とともにベンゼン環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、各々同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。但し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうち２つ以上が同時に炭素数１〜６のアルキル基となることはなく、且つＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が同時に水素原子となることもない。
Ｙ１は、式（Ｊ−１）、（Ｊ−２）及び（Ｊ−３）
【化１３】
2004000213.tif 000005
からなる群から選択される基を表すか、又はＹ１、Ｒ１及びＲ２がいっしょになってそれらが結合する炭素原子とともにベンゼン環を形成する。
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、同一又は異なって、−ＯＨ又は−ＮＨＡｒを表す。但し、Ｚ１からＺ４のうち、２つ以上が同時に−ＮＨＡｒとなることはなく、且つＺ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４が同時に−ＯＨとなることもない。
Ｇは、式（Ｋ−１）、（Ｋ−２）及び（Ｋ−３）
【化１４】
2004000213.tif 000006
からなる群から選択される基を表す。］
【００３８】
式中、Ｄはスペーサーを表し、例えば、
１）−（ＣＨ２）ｍ−、［ｍ＝２〜１０］、
２）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｍ−、［ｍ＝２〜１０］、
３）−（ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−、［ｍ＝２〜１０］、
４）−（ＣＨ２）ｍ−Ｐｈ−、［ｍ＝１〜１０］、
５）−（ＣＨ２）ｍ−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−、［ｍ＝１〜１０］等が例示され、なかでも、
・−（ＣＨ２）ｍ−、［ｍ＝２〜１０］、
・−（ＣＨ２）ｍ−Ｐｈ−、［ｍ＝１〜１０］等が好ましく、特に
・−（ＣＨ２）ｍ−、［ｍ＝１〜６］、又は
・−（ＣＨ２）ｍ−Ｐｈ−、［ｍ＝１〜６］が推奨される。
【００３９】
本発明の方法におけるスペーサーの存在は非常に重要である。スペーサーを介せず配位子に酵素の特異的基質となり得る基が直接結合している場合、特異的基質となり得る基が酵素の活性部位に接近しににく、更には酵素反応後の特異的基質となり得る基が分子内でランタノイドイオンに配位しにくく、分子内で配位子交換を起こすことが困難となる。
【００４０】
尚、本発明に係る配位子は、分子間の配位子交換により複数の配位子により８つ以上の配位座が占有されたランタノイド錯体を形成しても発光するが、測定に必要な発光強度を得るためには配位子の濃度を高く設定する必要がある。結果的に分子間での配位子交換では、酵素の検出感度が大幅に低下してしまう。
【００４１】
一般式（Ｉ）から（Ｖ）においてＡｒは光増感部として作用し、具体的なＡｒとしては、芳香族炭素環基又は芳香族複素環基が例示され、例えば芳香族炭素環基としては、フェニル基、ナフチル基等が例示され、芳香族複素環基としては、ピロリル基、フリル基、チエニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾイソチアゾリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、クマリニル基等が例示され、これらの置換基は、低級アルキル基、低級アルキルカルボニル基、オキソ基、アミノ基、低級アルキルオキシ基、低級アルキルオキシカルボニル基、低級アルキルアミノ基、オキソ基等の置換基を有していてもよい。
【００４２】
Ｅとしては、酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）を含む基を表し、例えば１又は２以上のアミノ酸残基、若しくは１又は２以上の糖残基等が例示され、又、特異的基質となり得る基（ｒ１）としては、例えば、
１）−ＯＨ、
２）−ＣＯＯＲ、
３）−ＣＯＮＨＲ’、
４）−ＣＨ３、等が例示される。
【００４３】
具体的なＥとしては、
１）ＯＨ含有基として
・セリンを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・スレオニンを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・チロシンを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・アミノ糖含有ペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）
（これらのペプチド中、ＯＨ含有アミノ酸の配列位置は限定されない）、
・単糖（グルコース、フルクトース、リボース、デオキシリボース、）を含有する基、
・Ｎ末端側から−ＫＡＰＬＳＰＫＫＡＫ、
・Ｎ末端側から−ＫＡＰＬＳ、等が例示される。
ここでアミノ酸の略号は、Ｋ：リジン、Ａ：アラニン、Ｐ：プロリン、Ｌ：ロイシン、Ｓ：セリン、を表す。
【００４４】
２）カルボキシルエステル基含有基として、
・アスパラギン酸エステルを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・グルタミン酸エステルを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・γ−アミノ酪酸エステルを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・γ−アミノ酪酸エステルを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、等が例示される。尚、エステル基を構成するアルコール成分としては、特に限定されず、例えば炭素数１〜２０のアルキル基、アルケニル基等が例示される。
【００４５】
３）アミド基含有基としては、
・アスパラギンを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・グルタミンを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・アスパラギン酸アミド含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・グルタミン酸アミドを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・ε−アミド性のリジンを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・アルギニンを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、等が例示される。
【００４６】
４）メチル基含有基として
・アラニン含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、等が例示される。
５）その他の基
・メチオニンを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）、
・システインを含有するペプチド（アミノ酸配列で１〜１０個程度）等が例示される。
【００４７】
一般式［Ｉ］から［Ｖ］で表される化合物において、より具体的には以下の構造のものが例示される。これらの化合物は、従来公知のものを誘導体化することりより調製可能であり、例えば、後述する製造例又は製造例と公知技術とを組み合わせた方法等により製造できる。
【００４８】
ａ）一般式［Ｉ］で表される化合物
一般式［Ｉ］で表される化合物としてより具体的には、一般式（Ｉ−１）で表される化合物が例示される。
【００４９】
【化１５】
2004000213.tif 000007
アミノ酸の略号は、Ｋ：リジン、Ａ：アラニン、Ｐ：プロリン、Ｌ：ロイシン、Ｓ：セリン、を表す。又、Ｒは、低級アルキル基を表し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等が推奨される。
【００５０】
一般式（Ｉ−１）で表される化合物において、Ａｒとして好ましくはチエニル基、キノリニル基、クマリニル基、１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル等が推奨される。
【００５１】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えばＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１７巻、８１３２〜８１３８頁（１９９５年）を参考に容易に製造可能であるが、具体的な製造方法を製造法１に示す。
製造法１
【化１６】
2004000213.tif 000008
［式中、Ｒａは、ベンジル基、メトキシベンジル基等の置換基を有していてもよい低級アルキル基を表し、Ｘは、ハロゲン原子等の脱離基を表し、Ｅｐは、酵素の特異的基質となり得る基を含む基であって、必要に応じて酵素の特異的基質となり得る基が保護基により保護されたものを表し、Ａｒ、Ｄ及びＥは、前記に同じである。］
【００５２】
（工程１−ａ）
本工程は、化合物１と化合物２とを反応させて、化合物３を製造する方法である。化合物２としては、２−ハロゲン化酢酸アルキルエステルが例示され、該アルキル基としては、芳香環を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、１，１−ジメチルエチル基、ベンジル基、置換ベンジル基等が挙げられ、特に１，１−ジメチルエチルが推奨される。Ｘは、ハロゲンを表し、好ましくはブロム原子が推奨される。用いる化合物２の量としては、１当量の化合物１に対し通常１．８〜２．０当量が例示される。反応溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン（以下、「ＴＨＦ」という。）、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」という。）、Ｎ−メチルピロリジノン、Ｎ−エチルピロリジノン、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」という。）等、又はそれらの混合溶媒が例示され、なかでもジクロロメタンが推奨される。かくして得られる化合物３は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、結晶化、溶媒抽出、再沈殿、クロマトグラフィー等により単離精製するか又は単離精製することなく次工程に付すことができる。
【００５３】
（工程１−ｂ）
本工程は、塩基の存在下、化合物３と化合物４とを反応させ、化合物５を製造する方法である。用いる化合物３の量としては、１当量の化合物４に対し１．０〜２．０当量が例示される。又、塩基としては、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等が例示され、なかでも炭酸カリウムが推奨され、その使用量としては１当量の化合物４に対し１．０〜１．５当量が例示される。反応溶媒としては、ＴＨＦ、ジクロロメタン、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリジノン、Ｎ−エチルピロリジノン、ＤＭＳＯ等、又はそれらの混合溶媒が例示され、特にＤＭＦが推奨される。かくして得られる化合物５は、公知の分離精製手段、例えば濃縮、減圧濃縮、結晶化、溶媒抽出、再沈殿、クロマトグラフィー等により単離精製するか又は単離精製することなく次工程に付すことができる。
【００５４】
尚、化合物４は、製造法Ａにより調製することができる。
製造法Ａ
【化１７】
2004000213.tif 000009
［式中、Ｘ’は、脱離基を表す。Ｘは、ハロゲンを表す。］
【００５５】
この方法は、塩基の存在下、芳香族アミン（Ａｒ−ＮＨ２）と２位に脱離基（Ｘ’）を持つアセチルハライドとを反応させて化合物４を製造する方法である。ここで、Ｘ’は、ハロゲン原子等の脱離基を表す。アセチルハライドの使用量としては、芳香族アミン１当量に対して通常１〜２当量が例示される。塩基としては、例えばｎ−ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、カリウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジド等が例示され、なかでもｎ−ブチルリチウムが推奨される。塩基の使用量としては、１当量の芳香族アミンに対し１〜３当量が例示される。反応溶媒としては、例えばＴＨＦ、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリジノン、Ｎ−エチルピロリジノン、ＤＭＳＯ等、又はそれらの混合溶媒が例示され、特にＴＨＦが推奨される。
【００５６】
（工程１−ｃ）
本工程は、塩基の存在下、上記工程１−ｂで得られた化合物５と下記の化合物６とを反応させたのち、脱保護を行って一般式［Ｉ］で表される化合物を製造する方法である。化合物６においてＸ’’は脱離基を示し、例えば水酸基、ハロゲン原子等が例示される。具体的な塩基としては、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等が例示され、特に炭酸カリウムが推奨される。又、塩基の使用量としては、特に限定されず、例えば１当量の化合物５に対して２〜１０当量が例示され、化合物６の使用量としては、１当量の化合物５に対し１．５〜５当量が例示される。又、反応溶媒としては、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジメトキシエタン等が例示される。反応時間は、通常１〜２４時間が例示され、又、反応温度は、室温から１２０℃が例示される。
【００５７】
一方、脱保護は、２，２，２−トリフルオロ酢酸、塩酸等の強酸を用いて行うことが可能であり、なかでも２，２，２−トリフルオロ酢酸が推奨される。脱保護における反応時間は、通常１〜２４時間が例示され、又、反応温度は、室温から８０℃が例示される。得られた一般式［Ｉ］で表される化合物は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、結晶化、溶媒抽出、再沈殿、クロマトグラフィー等により単離精製してもよい。
【００５８】
尚、化合物６は、製造法Ｂにより調製することができる。
製造法Ｂ
【化１８】
2004000213.tif 000010
［式中、Ｘ’’、Ｄ及びＥｐは、前記に同じである。］
本工程は、カルボン酸（Ｘ−Ｄ−ＣＯＯＨ）と、アミン（ＮＨ２−Ｅｐ）との反応であり、文献記載の方法（例えば、ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫他、丸善社出版、１９８３年、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｖｏｌ．６、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ社出版、１９９１年）、それに準じた方法又はこれらと従来公知の方法とを組み合わせることにより行うことができる。
【００５９】
即ち、アミド化は、当業者に周知の縮合剤を用いて行うか、或いは当業者に利用可能なエステル活性化方法、混合酸無水物法、酸クロリド法、カルボジイミド法等により行うことができる。このようなアミド形成試薬としては、例えば、ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（以下、「ＨＡＴＵ」という。）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、「ＤＣＣ」という。）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリルエチル）カルボジイミド、カルボニルジイミダゾール（以下、「ＣＤＩ」という。）、ジフェニルリン酸アジド、塩化２−クロロ−１，３−ジメチル−２−イミダゾリウム、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（以下、「ＰｙＢｏｐ」という。）、ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（以下、「ＰｙＢｒｏｐ」という。）、シアノリン酸ジエチル、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（以下「ＷＳＣ・ＨＣｌ」ということがある。）等が挙げられる。前記カルボン酸又はその反応性誘導体の使用量としては、使用する化合物又は溶媒の種類、その他の反応条件により異なるが、アミン１当量に対して０．５〜１当量が例示され、好ましくは０．５〜０．８当量が推奨される。また、アミド形成試薬の使用量としては、使用する化合物及び溶媒の種類、その他の反応条件により異なるが、カルボン酸又はその反応性誘導体１当量に対して１〜５当量が例示され、好ましくは１〜３当量が推奨される。ここで反応性誘導体としては、有機化学の分野において通常用いられる活性エステル誘導体、活性アミド誘導体等が挙げられる。反応溶媒としては、例えば、塩化メチレン、クロロホルム、ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ＤＭＦ、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、トルエン等が挙げられる。反応時間としては、１〜１２時間が例示される。かくして得られる化合物６は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、結晶化、溶媒抽出、再沈殿、クロマトグラフィー等により単離精製するか又は単離精製することなく次工程に付すことができる。
【００６０】
一方、一般式［Ｉ］で表される化合物は、固相反応を用いることによる製造法２によっても製造することができる。
【００６１】
製造法２
【化１９】
2004000213.tif 000011
［式中、Ｒ”は、芳香環を有していてもよい低級アルキル基を表し、ＳＲは固相担体を表し、Ａｒ、Ｄ、Ｒａ、Ｘ及びＥｐは、前記に同じである。］
【００６２】
（工程２−ａ）
本工程は、塩基の存在下、化合物５と末端に脱離基を持つ脂肪族又は芳香族カルボン酸エステルである化合物７を反応させ、続いてエステルを加水分解することによって化合物８を製造する方法である。用いられる塩基としては、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等が例示され、なかでも炭酸ナトリウムが推奨される。化合物７の使用量としては、１当量の化合物５に対して、通常１．５〜５０当量が例示される。反応溶媒としては、ＤＭＦ、ＴＨＦ、トルエン、ベンゼン等、又はこれらの混合溶媒が例示される。反応時間は、通常１〜２４時間が例示され、又、反応温度は、通常、室温から１２０℃が例示される。
【００６３】
又、エステルの加水分解は、塩基を用いて行うことが可能であり、塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等の水溶液が例示され、なかでも水酸化ナトリウム水溶液が推奨される。反応溶媒としては、ＴＨＦ、メタノール、エタノール等、又はこれらの混合溶媒が例示され、又、反応時間としては、１〜２４時間が例示される。
【００６４】
（工程２−ｂ）
本工程は、化合物８と、酵素の特異的基質の反応部位を含む基Ｅが担持された固相担体９とを反応させて、化合物１０を製造する方法である。
【００６５】
具体的には、本反応は、前記のアミド形成反応により行われ、なかでもカルボジイミド法における塩化２−クロロ−１，３−ジメチル−２−イミダゾリウムが推奨される。
【００６６】
化合物８の使用量としては、用いられる化合物又は溶媒の種類、その他の反応条件により異なるが、１当量の固相担体９に対して、通常１．５〜５当量が例示され、好ましくは２〜５当量が推奨される。又、アミド形成試薬の使用量としては、用いられる化合物又は溶媒の種類、その他の反応条件により異なるが、１当量の固相担体９に対して、１．１〜５当量が例示され、好ましくは２〜５当量が推奨される。
【００６７】
反応溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルム、ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ＤＭＦ、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、トルエン等が例示され、反応時間としては、通常１〜２０時間が例示される。得られた固相担体９は、例えば、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、塩化メチレン、クロロホルム等、又はこれらの混合溶媒で洗浄することにより過剰な試薬等を除去することができる。
【００６８】
尚、固相担体としては、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂等が例示される。
【００６９】
（工程２−ｃ）
本工程は、化合物１０を酸で処理して、生成物を固相担体から遊離させると同時に、Ｅｐ中に含まれる保護基を脱保護をさせることによって、一般式［Ｉ］で表される化合物を製造する方法である。
【００７０】
酸で処理する方法としては、例えば化合物１０を有機酸含有不活性溶媒中で攪拌することによって行う。当該有機酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」という。）等が例示され、また、当該不活性溶媒としては、水、塩化メチレン等が例示される。不活性溶媒中の有機酸の容積比率としては、通常５〜１００％が例示され、好ましくは９０〜９５％が推奨される。更に、脱保護を完結させるために、４０〜７０℃にて０．５〜２時間、好ましくは１〜２時間撹拌してもよい。
【００７１】
ｂ）一般式［ＩＩ］で表される化合物
一般式［ＩＩ］で表される化合物は、例えば下記のものが例示され、米国特許第５８５９２１５号を参考に容易に製造可能である。
【化２０】
2004000213.tif 000012
［式中、Ａｒ、Ｂ、Ｄ及びＥは、前記に同じである。］
【００７２】
ｃ）一般式［ＩＩＩ］で表される化合物
一般式［ＩＩＩ］で表される化合物は、例えば以下のものが例示され、特表昭６４−５００４５８号、特表平１０−５０５８２０号を参考に製造可能である。
【化２１】
2004000213.tif 000013
［式中、Ａｒ、Ｂ、Ｄ及びＥは、前記に同じである。］
【００７３】
ｄ）一般式［ＩＶ］で表される化合物
一般式［ＩＶ］で表される化合物は、例えば特表昭６４−５００４５８号、ＷＯ９１／８４９０号、ＷＯ８７／０７９５５号、ＡＣＣＯＵＮＴ　ｏｆ　ＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＲＥＳＥＡＣＨ、１７巻、２０２頁（１９８４年）等を参考に容易に製造可能である。具体的な化合物としては、例えば以下のものが例示される。
【化２２】
2004000213.tif 000014
［式中、Ａｒ、Ｂ、Ｄ及びＥは、前記に同じである。］
【００７４】
ｆ）一般式［Ｖ］で表される化合物
一般式［Ｖ］で表される化合物としては、例えば以下のものが例示される。
【化２３】
2004000213.tif 000015
［式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ａｒ、Ｂ、Ｄ及びＥは、前記に同じである。］
【００７５】
ランタノイド錯体（Ａ１）の製造方法
本発明で用いるランタノイド錯体（Ａ１）は、分子内に７つ以下の配位可能な置換基を有する化合物、例えば一般式［Ｉ］から［Ｖ］で表される化合物とランタノイドイオンとを混合して調製することができる。このランタノイドイオンは、ランタノイド金属酸化物、ランタノイド金属水酸化物、ランタノイド金属アルコキシド、ランタノイド金属アミド及びランタノイド金属塩からなる群から選ばれる少なくとも１種のランタノイド金属化合物由来のものであり、例えば一般式［Ｉ］から［Ｖ］で表される化合物とランタノイド金属化合物とを溶媒中で混合することにより目的とする錯体が得られる。
【００７６】
本発明で用いるランタノイド錯体（Ａ１）の具体的な製造方法は以下の通りである。即ち、一般式［Ｉ］から［Ｖ］で表される化合物を溶媒に溶かし、ランタノイド金属化合物の水溶液（溶解する程度の水）又は粉末を加え、０〜１００℃の温度下、１時間〜１００時間程度撹拌する。次いで得られた生成物を晶析、液−液抽出、又はＨＰＬＣ等の精製手段を行うことによりランタノイド錯体を得ることができる。更に、クロロホルム、メタノール等の溶媒を用いて再結晶を行っても差し支えない。
【００７７】
本発明に用いるランタノイド金属化合物としては、ランタノイド金属酸化物、ランタノイド金属塩等が例示される。ランタノイド金属酸化物としては、３価であるＭ２Ｏ３（Ｍはランタノイド原子を示す。）が例示される。ランタノイド金属水酸化物としてはＭ（ＯＨ）３が例示され；ランタノイド金属塩としてはＭｎ＋（Ｚ）ｎ（Ｚは、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、フッ素イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、酢酸イオン等のモノカルボン酸イオン、シュウ酸イオン、コハク酸イオン等のジカルボン酸イオン、クエン酸等のトリカルボン酸イオン、リン酸イオン等の陰イオンが例示される。
【００７８】
本発明に用いるランタノイドイオンとしては、Ｅｕ３＋、Ｔｍ３＋、Ｅｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｔｍ３＋、Ｙｂ３＋、Ｃｅ３＋、Ｓｍ３＋等が例示され、好ましくはＥｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋等が推奨される。特に、これらのランタノイドイオンは、長寿命の発光が得られる点で優れている。
【００７９】
ランタノイド錯体を調製するに際し用いられるランタノイド金属化合物の量としては、一般式［Ｉ］から［Ｖ］で表される化合物１当量に対し１．０５〜１０当量が例示され、好ましくは１．０５〜２当量が推奨される。
【００８０】
本発明のランタノイド錯体を製造するに際し用いる溶媒としては、特に限定されず、いずれの溶媒でも用いることが可能であり、具体的にはプロトン性溶媒、非プロトン性溶媒が挙げられる。プロトン性溶媒としては、水（例えば０．１Ｍトリメチルアンモニウムアセテート溶液）、メタノール、エタノール等のアルコール性溶媒等が例示され、又、非プロトン性溶媒としてはアセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、クロロホルム、塩化メチレン等のハロゲン系溶媒、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等の１種若しくは２種以上が例示される。これらの溶媒の中でもアセトン、０．１Ｍトリメチルアンモニウムアセテート水溶液等が推奨される。
【００８１】
具体的なランタノイド錯体（Ａ１）としては、例えば一般式（Ｉ−１）
【化２４】
2004000213.tif 000016
［式中、Ｗ及びＡｒは、前記に同じである。］で表される化合物と、ランタノイドイオンとからなる錯体が例示される。
【００８２】
ランタノイドイオンとして好ましくは、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋等が推奨され、特にＥｕ３＋が挙げられる。
【００８３】
上記のランタノイド錯体（Ａ１）は、通常、７配座以下の状態であるが、水分子が１分子配位して８配座の状態のランタノイド錯体（Ａ１ｂ）として、又は該錯体の水和物（Ａ１ｂ）として単離されることがある。一方、錯体の形態によっては水分子が配位していない形で単離される場合もあるが、水溶液中では水が配位して８〜９の配位座が占有されたランタノイド錯体（Ａ１ｂ）を形成する。７配座のランタノイド錯体［以下、一般式（Ｉ−２）で表す］とランタノイド錯体（Ａ１ｂ）との関係を次式に示す。
【００８４】
【化２５】
2004000213.tif 000017
［式中、Ｗ及びＡｒは、前記に同じである。］
【００８５】
水が配位したランタノイド錯体（Ａ１ｂ）に励起光を照射すると、（例えばＥｕ錯体であれば３４０ｎｍの光を照射すると）、ランタノイドイオンは励起されるが、励起エネルギーが、配位している水分子のＯ−Ｈ振動により熱エネルギーとして消失してしまう。従って、励起エネルギーを発光エネルギーとすることができず、発光強度がほとんどないか、非常に弱いものである。
【００８６】
尚、単離したランタノイド錯体が水を含有するかどうかについては、例えば示差熱分析（ＤＳＣ）、発光寿命等により測定することが可能である。
【００８７】
ランタノイド錯体（Ａ１）からランタノイド錯体（Ａ３）への酵素反応
酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、７配座のランタノイド錯体（Ａ１）又は更に水分子が配位したランタノイド錯体（Ａ１ｂ）を、本発明が対象とする酵素により酵素反応させると、ランタノイド錯体中の酵素の基質となり得る基（ｒ１）が酵素により変換されて、変換された基（ｒ２）を有するランタノイド錯体（Ａ２）又はその水和物（Ａ２ｂ）が得られる。
【００８８】
ランタノイド錯体（Ａ３）において、変換された基（ｒ２）としては、例えば、
・−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−（ＯＨ）２、
・−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨ、
・−ＣＯＯＨ、
・−Ｃ（ＯＨ）−Ｒ’、
・−ＣＨ２−ＯＨ等が例示される。ここでＲ’は、炭素数１〜６の低級アルキル基を表す。
【００８９】
酵素反応により得られたランタノイド錯体（Ａ２）又はその水和物（Ａ２ｂ）における変換された基（ｒ２）は、水分子と比べてランタノイドイオンへの配位能が高く、変換された基（ｒ２）がランタノイドイオンに配位して、或いはランタノイド錯体（Ａ２ｂ）に水分子と配位子交換して配位して、８配座のランタノイド錯体（Ａ３）となる。
【００９０】
本反応が対象とする酵素として好ましくは、リン酸化酵素、硫酸化酵素、エステル加水分解酵素、アミド分解酵素、エステル化酵素、アミノ化酵素等が例示され、より好ましくはリン酸化酵素、硫酸化酵素、エステル加水分解酵素が推奨される。
【００９１】
より好ましい具体的な酵素としては、セリンスレオニンキナーゼ類（ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ｃＡＰＫ−α、ｃＧＭＫ−α、ＰＫＣ類、ＭＡＩＩＫ類）、チロシンキナーゼ類（ＺＡＰ―７０、ｅｒｂＢ２、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、ＥＧＦレセプター、Ｓｒｃ　Ｎ１、Ｓｒｃ　Ｎ２、Ｉｎｓｕｌｉｎレセプター、Ｈ−ｒａｓ　１／ｐ２１）、アセチルトランスフェラーゼ等が例示される。
【００９２】
酵素反応は、ランタノイド錯体（Ａ１）又は水和物（Ａ１ｂ）を反応基質として、例えば反応溶液中、所定の酵素の存在下、反応させることにより行う。
【００９３】
反応溶媒としては、特に限定されず、通常の酵素反応で用いられている水溶液が使用可能であり、例えばトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）バッファー、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）バッファー等が例示され、好ましくはこれらのバッファーのｐＨが中性から弱塩基性（ｐＨ＝６．８〜８．２）領域のものが推奨される。
【００９４】
又、酵素が失活しない範囲内で必要に応じて水と可溶性の有機溶媒を併用することも可能である。そのような有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ等が例示される。
【００９５】
基質濃度としては、用いる基質の種類、酵素等の種類により異なるが、例えば、０．１〜２０μＭが例示され、好ましくは０．１〜５μＭが推奨される。
【００９６】
酵素量としては、用いる酵素、基質等の種類により異なるが、例えば０．０１〜１０μｇ／ｗｅｌｌが例示され、好ましくは０．１〜１．０μｇ／ｗｅｌｌ程度が推奨される。尚、１ｗｅｌｌは、１０〜１００μｌである。
【００９７】
反応温度としては、用いる酵素、基質等の種類により異なるが、例えば２０〜７０℃が例示され、好ましくは２５〜４０℃が推奨される。
【００９８】
反応時間としては、用いる酵素、基質等の種類により異なるが、例えば１０分〜２４時間が例示され、好ましくは１０分〜２時間が推奨される。
【００９９】
更に、酵素の種類に応じて５０〜２００μＭのＡＴＰ、０．１〜１０ｍＭのマグネシウムイオン、０．１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ、１〜５００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１〜５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム、０．１〜１０ｍＭの硫酸ナトリウム、０．１〜１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）等を反応系に添加することができる。
【０１００】
ここで、先にも述べたように配位子にスペーサー（Ｄ）を介せず酵素の特異的基質の反応部位（ｒ１又はｒ２）が結合している場合、特異的基質の反応部位（ｒ１又はｒ２）が酵素の活性部位に接近できず、結果として酵素反応の基質となることが困難となる。
【０１０１】
本発明で酵素の特異的基質の反応部位が酵素反応の前後で構造が変化する場合、ランタノイド錯体（Ａ１）において、酵素反応前の特異的基質の反応部位（ｒ１）は、ランタノイドイオンへの配位力が水分子と同等であるか又は水分子より配位力が弱く、近傍に大量に存在する水分子の配位が優先し、反応部位（ｒ１）は、水分子と錯体交換を起こさない。一方、酵素反応後に生じた活性化された基質（ｒ２）は、ランタノイドイオンへの配位力が水分子と比べて格段に強く、水分子と配位子交換することによりランタノイド錯体（Ａ２ｂ）に配位して、或いはランタノイドイオンに直接配位して、８配座のランタノイド錯体（Ａ３）となり、発光強度に変化を生じ、発光強度が増大する。特に、変換された基（ｒ２）が、負電荷を有する場合、電気的作用により配位することがあり、ランタノイドイオンに対してより強い配位力となる。
【０１０２】
リン酸化酵素によるリン酸エステル化反応を例にとって、反応式３を用いて錯体の変化の状態を示す。下記の式中、Ｅｕ錯体は、７配座錯体であり、リン酸化酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）である水酸基がスペーサーを介して配位子に結合している。更にこの錯体は、水分子が配位した８配座錯体（Ａ１ｂ）となっている。この場合励起光を照射しても発光しないか、発光強度が弱いものである。この錯体に対しリン酸化酵素を反応させると、１級の水酸基がリン酸化された部分を有するランタノイド錯体（Ａ２ｂ）が得られる。リン酸エステルとなった水酸基（ｒ２）は、アニオン性を有しており、又、ランタノイドイオンに対し１級の水酸基より強い結合力を有しており、８配座錯体（Ａ２ｂ）中の水分子と配位子交換することにより、配位子交換が起こった８配座のランタノイド錯体（Ａ３）となる。ランタノイド錯体（Ａ３）は、励起光を照射すると、Ｅｕイオンが励起され発光する。
【０１０３】
【化２６】
2004000213.tif 000018
【０１０４】
ランタノイド錯体（Ａ４）及び配位子（Ｂ３）
本発明で用いられるランタノイド錯体（Ａ４）は、８配座以上の錯体であり、ランタノイドイオンと配位子（Ｂ３）とが１：１（モル比）で錯体を形成するものであり、ランタノイドイオンと配位子（Ｂ３）とを、好ましくは水溶液中で混合することにより得られる。
【０１０５】
又、配位子（Ｂ３）としては、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）を有しており、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ４）となる、特徴を有するものが使用される。
【０１０６】
又、ランタノイド錯体（Ａ４）は、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応前は配位に参加しており、
ｆ）変換された基（ｒ４）が生じると、変換された基（ｒ４）がランタノイドイオンから遊離して、７つ以下の配位座が１つの配位子によって占有されたランタノイド錯体（Ａ６）となるものであり、
ｇ）８つ以上の配位座が１つの配位子によって占有されたランタノイド錯体（Ａ４）に励起光を照射すると発光し、
ｈ）７つ以下の配位座が１つの配位子によって占有されたランタノイド錯体（Ａ６）に励起光を照射しても、発光しないか発光が弱いものである、特徴を有する。
【０１０７】
この８配座以上のランタノイド錯体（Ａ４）は、本発明が対象とする酵素により、前記ランタノイド錯体（Ａ１）を酵素反応することにより得ることができ、又、ランタノイド錯体（Ａ１）を構成し得る配位子（Ｂ１）を、本発明が対象とする酵素により酵素反応し、得られた配位子（Ｂ４）とランタノイドイオンとを混合することにより得ることができる。
【０１０８】
ランタノイド錯体（Ａ４）を構成し得る配位子（Ｂ３）
本発明で用いる８配座以上のランタノイド錯体（Ａ４）を構成可能な配位子（Ｂ３）において光増感部位としては、配位子（Ｂ１）に記載のものと同じであり、又、特異的基質となり得る基（ｒ３）及び変換された基（ｒ４）としては、ｒ３／ｒ４の順に
・−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−（ＯＨ）２／−ＯＨ、
・−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨ／−ＯＨ、
・−ＣＯＯＨ／−ＣＯＯＲ、
・−ＣＯＯＨ／−ＣＯＮＨＲ、
・−ＯＨ／−ＯＣＯＲ等が例示される。（Ｒは、低級アルキル基を表す。）
【０１０９】
又、配位子（Ｂ３）は、好ましくはランタノイドイオンに配位可能な置換基としてカルボキシル基を２個以上７個以下含むことが推奨される。
【０１１０】
具体的な配位子（Ｂ３）としては、例えば下記の構造のものが例示される。
【化２７】
2004000213.tif 000019
［式中、Ａｒ、Ｄ、Ｌは、前記に同じである。Ｅ’−ｒ３は、Ｅを表す。ｒ３は、酵素の特異的基質となり得る基を表す。］
【０１１１】
又、配位子（Ｂ３）とランタノイドイオンとから得られるランタノイド錯体（Ａ４）としては、下記の構造のものが例示される。
【０１１２】
【化２８】
2004000213.tif 000020
【０１１３】
又、７配座以下のランタノイド錯体を形成し得る配位子（Ｂ１）を、本発明が対象とする酵素により酵素反応を行うことにより、８配座以上のランタノイド錯体を形成し得る配位子（Ｂ３）とすることができる。一方、７配座以下のランタノイド錯体を形成し得る配位子（Ｂ１）の製造方法に準じて別途合成することも可能である。
【０１１４】
ランタノイド錯体（Ａ４）からランタノイド錯体（Ａ６）への酵素反応
この反応は、反応式３に記載の反応の逆反応に相当する。即ち、ランタノイド錯体（Ａ４）中の酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）は、前記酵素により、又は前記酵素と逆反応を促進させる酵素により反応させることにより、変換された基（ｒ４）となり、その結果、７配座以下のランタノイド錯体（Ａ６）を得る。
【０１１５】
本反応が対象とする酵素としては、例えば、リン酸エステル加水分解酵素、硫酸エステル加水分解酵素、アミド分解酵素、カルボキシエステル加水分解酵素、酸化酵素、脱炭酸酵素等が例示され、好ましくはリン酸エステル加水分解酵素が推奨され、より好ましい酵素としては、ホスホプロテインホスファターゼ類、ホスホリパーゼ等が例示される。
【０１１６】
この場合においては、酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、８配座以上のランタノイド錯体（Ａ４）に酵素を反応させると、基質となり得る基（ｒ３）は、酵素により変換されて、変換された基（ｒ４）を有する生成物（Ａ５）を生じる。
【０１１７】
ランタノイド錯体中の変換された基（ｒ４）は、ランタノイドイオンから直ちにはずれて、７配座以下のランタノイド錯体（Ａ６）となり、更にこの錯体（Ａ６）は、水和物（Ａ６ｂ）となることもある。
【０１１８】
ここで、基質となり得る基（ｒ３）は、前記置換基（ｒ２）と同一の置換基であり、又、変換された基（ｒ４）は、置換基（ｒ１）と同一の置換基である。又、８配座以上のランタノイド錯体（Ａ４）は、ランタノイド錯体（Ａ３）と同じものであり、７配座以下のランタノイド錯体（Ａ６）は、ランタノイド錯体（Ａ１）と同じものである。
【０１１９】
基質となり得る基（ｒ３）及び変換された基（ｒ４）として好ましくは、（ｒ３／ｒ４の順に）
・−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−（ＯＨ）２／−ＯＨ、
・−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨ／−ＯＨ、
・−ＣＯＯＨ／ＣＯＯＲ、等が例示される。
【０１２０】
リン酸エステル分解酵素による加水分解反応における錯体の変化につき反応式４に示す。式中、Ｅｕ錯体（Ａ４）は、８配座錯体であり、リン酸エステル分解酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）であるリン酸エステルがスペーサーを介して配位子に結合している。この錯体に励起光を照射すると高い発光強度を示す。この錯体（Ａ４）に対しリン酸エステル分解酵素を反応させると、リン酸エステルが分解して１級の水酸基を有するランタノイド錯体（Ａ５）が得られる。生じた水酸基（ｒ４）は、又、ランタノイドイオンに対し水分子と比べて配位力が同等又は弱く、ランタノイドイオンから遊離して７配座である錯体（Ａ６）となる。ランタノイド錯体（Ａ６）は、励起光を照射しても、８配座の錯体（Ａ４）と比べて発光強度が弱い。
【０１２１】
【化２９】
2004000213.tif 000021
【０１２２】
この反応において各ランタノイド錯体（Ａ４、又はＡ６若しくはＡ６ｂ）の発光強度を測定すれば、８配座のランタノイド錯体（Ａ４）は発光強度が高く、一方、７配座のランタノイド錯体（Ａ６若しくはＡ６ｂ）は、発光強度が低いかほとんどなく、発光強度が減少することがわかる。
【０１２３】
時間分解蛍光測定法による発光強度の測定
本発明では、時間分解蛍光測定法により、発光強度を測定する。前記のごとく、本発明にかかるランタノイド錯体を用いた場合の時間分解蛍光測定は、励起光と発光との波長の差（ストークスシフト）が大きく、発光が長波長であり、励起光の照射後一定時間後に発光を測定することで共存物質の発光を抑制できる利点を有す。
【０１２４】
本発明においてランタノイド錯体に照射する励起光は、光増感部位を励起させるために照射し、その波長としては、ランタノイドイオンが発光できる波長であれば特に限定されず、３２０〜３６０ｎｍの波長が例示でき、特にランタノイドイオンの発光が最大となるような波長、例えば、Ｅｕイオンであれば３４０ｎｍ付近の波長が好ましい。一方、励起光により励起されたランタノイドイオンが発光する波長は、ランタノイドイオンの種類及び配位子の種類により異なる。各々の励起波長と発光波長としては、例えば表１に記載のものが例示される。
【０１２５】
【表１】
2004000213.tif 000022
【０１２６】
時間分解蛍光測定に用いる機器としては特に限定されず、例えば、マルチラベルカウンタ：ＤＥＬＦＩＡ　１２３４ＦＬＵＯＲＯＭＥＴＥＲ、ＡＲＶＯｓｘ（いずれもｗａｌｌａｃ．ｖｅｌｔｈｏｌｄ社製）、Ｕｌｔｒａ（テカン社製）、Ａｎａｌｙｓｔ（ＬＪＬ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等が例示される。
【０１２７】
時間分解蛍光測定における遅延時間（ｄｅｌａｙ　ｔｉｍｅ）としては、特に限定されず、例えば５０〜２５０μｓｅｃが例示される。
【０１２８】
時間分解蛍光測定における測定回数（ｃｙｃｌｅ　ｔｉｍｅ）としては、特に限定されず、例えば５００〜２５００回が例示される。
【０１２９】
酵素活性の検出方法
本発明の７配座以下のランタノイド錯体（Ａ１）から８配座以上のランタノイド錯体（Ａ３）への構造変換は、酵素活性に依存しており、酵素活性が高ければ（Ａ１）から（Ａ３）への変換率は高く、酵素活性が低ければ変換率は低い。一方、７配座以下のランタノイド錯体（Ａ１）から８配座以上のランタノイド錯体（Ａ３）への変換率を発光強度の変化で判断すると、発光強度の変化が大きければランタノイド錯体（Ａ１）からランタノイド錯体（Ａ３）への変換率が高く、従って酵素活性が高いことを示す。
【０１３０】
従って、この発光強度の変化を検出することにより酵素活性の検出を行うことができる。
【０１３１】
候補化合物のスクリーニング方法
本発明では、ランタノイド錯体を用いた酵素活性の測定することにより、該酵素に拮抗する候補化合物のスクリーニングを行うことが可能である。即ち、所定量の酵素を加えて候補化合物及びランタノイド錯体の存在下で酵素反応を行う場合、候補化合物が酵素反応を阻害すれば、７配座以下のランタノイド錯体（Ａ１）又は水和物（Ａ１ｂ）は、８配座のランタノイド錯体（Ａ３）へとは変換されず、その結果発光強度もほとんど変化しない。一方、候補化合物が酵素反応を阻害しなければ、７配座以下のランタノイド錯体（Ａ１）又は水和物（Ａ１ｂ）は、８配座のランタノイド錯体（Ａ３）へと変換され、その結果、発光強度も大きく変化する。即ち、発光強度の変化と、候補化合物の阻害活性とはパラレルな関係にあり、候補化合物の阻害活性が高ければ発光強度の変化は小さく、一方、候補化合物の阻害活性が低ければ発光強度の変化は大きい。
【０１３２】
本発明で用いられる候補化合物のスクリーニングの対象化合物としては、例えばコンビナトリアルケミストリーにより合成可能な化合物ライブラリーのなかから選択される。
【０１３３】
即ち、時間分解蛍光測定法による酵素に阻害作用を有する候補化合物のスクリーニング方法であって、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成するランタノイド錯体（Ａ１）であって、該錯体を構成する配位子（Ｂ１）は、分子内に
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ２）となるものであり、
又、ランタノイド錯体（Ａ１）は、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応前は好ましくはランタノイドイオンに配位しておらず、
ｆ）酵素反応により変換された基（ｒ２）が生じると、変換された基（ｒ２）がランタノイドイオンへ配位してランタノイド錯体（Ａ３）となるものであり、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ１）とランタノイド錯体（Ａ３）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、ランタノイド錯体（Ａ１）を用い、
２）ランタノイド錯体（Ａ１）は、更に水がランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ１ｂ）となっていてもよい状態で、
３）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、候補化合物の存在下、ランタノイド錯体（Ａ１又はＡ１ｂ）に前記酵素を反応させ、
４）特異的基質となり得る基（ｒ１）が酵素によって変換されれると、酵素により変換された基（ｒ２）を有するランタノイド錯体（Ａ２又はＡ２ｂ）を生じ、
５）変換された基（ｒ２）は、ランタノイド錯体（Ａ２）の分子内でランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ３）となるか、若しくはランタノイド錯体（Ａ２ｂ）に水分子と配位子置換してランタノイド錯体（Ａ３）となり、又、特異的基質となり得る基（ｒ１）が変換されなければ、ランタノイド錯体（Ａ１又はＡ１ｂ）は変化せず、
６）励起光の照射により、ランタノイド錯体（Ａ３）又はランタノイド錯体（Ａ１若しくはＡ１ｂ）中のランタノイドイオンが発光し、
７）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、
８）候補化合物の存在下、酵素反応の進行を抑制する条件下で、前記工程１）から７）を行い、得られたランタノイドイオンの発光強度と前記７）での発光強度を比較する、各工程により行うことができる。
【０１３４】
ここで、阻害活性の有無の判断の方法としては、以下のごとく行うことができる。即ち、候補化合物の非存在下で酵素反応を行った場合の発光強度ｍ１と、特定の候補化合物の存在下での酵素反応を行った場合の発光強度ｍ２とを比べ、ｍ２／ｍ１＝１であれば当該候補化合物はこの酵素を全く阻害しないこととなり、ｍ２／ｍ１＝０であれば当該候補化合物はこの酵素を１００％阻害することとなる。
【０１３５】
一方、上記スクリーニング方法は、ランタノイド錯体（Ａ４）からランタノイド錯体（Ａ６）への酵素反応における、酵素に阻害作用を有する候補化合物のスクリーニング方法にも適用可能である。この場合においても酵素反応の反応条件は、前記記載のものが適用可能である。
【０１３６】
具体的な方法としては、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成するランタノイド錯体（Ａ４）であって、該錯体を構成する配位子（Ｂ３）は、分子内にａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ４）となるものであり、
又、ランタノイド錯体（Ａ３）は、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しており、
ｆ）酵素反応により変換された基（ｒ４）が生じると、変換された基（ｒ４）がランタノイドイオンから遊離してランタノイド錯体（Ａ６）となり、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ４）とランタノイド錯体（Ａ６）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、ランタノイド錯体（Ａ４）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、候補化合物の存在下、ランタノイド錯体（Ａ４）に前記酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ３）は酵素によって変換されれると、変換された基（ｒ４）を有するランタノイド錯体（Ａ５）を生じ、
４）変換された基（ｒ４）は、ランタノイドイオンから遊離してランタノイド錯体（Ａ６）となり、又、特異的基質となり得る基（ｒ３）が変換されなければランタノイド錯体（Ａ４）は変化せず、
５）ランタノイド錯体（Ａ６）は、水分子がランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ６ｂ）となっていてもよく、
６）励起光の照射により、ランタノイド錯体（Ａ４）又はランタノイド錯体（Ａ６若しくはＡ６ｂ）中のランタノイドイオンが発光し、
７）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、
８）候補化合物の存在下、酵素反応の進行を抑制する条件下、前記工程１）から７）を行い、得られたランタノイドイオンの発光強度と前記７）での発光強度を比較する、各工程により行うことができる。
【０１３７】
配位子（Ｂ１）から配位子（Ｂ２）への酵素反応への応用
本発明の酵素活性の検出方法は、ランタノイド錯体のみでなく錯体形成前の配位子に対しても適用可能である。
【０１３８】
即ち、錯体形成前の配位子（Ｂ１）を、酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で酵素反応を行い、酵素反応後の混合物（Ｂ１及び／又はＢ２を含む）とランタノイドイオンとを錯体形成反応させ、得られた錯体混合物の発光強度を測定することにより、酵素活性の検出をすることができる。
【０１３９】
ここで配位子（Ｂ１）としては、例えば一般式［Ｉ］から［Ｖ］で表される化合物が例示できる。
【０１４０】
配位子（Ｂ１）を本発明に係る酵素反応をすることにより得られる変換された基（ｒ２）を有する配位子（Ｂ２）は、水溶液中でランタノイドイオンとともに８配座のランタノイド錯体（Ａ３）を形成し、この錯体（Ａ３）は、励起光の照射により発光する。
【０１４１】
即ち、具体的な酵素活性の検出方法としては、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成可能な配位子（Ｂ１）であって、該配位子は、分子内に
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ２）となるものであり、
又、配位子（Ｂ１）は、ランタノイド錯体（Ａ１）を形成した場合、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応前は好ましくは錯体（Ａ１）においてランタノイドイオンに配位せず、
ｆ）一方、変換された基（ｒ２）を有する配位子がランタノイドイオンとともにランタノイド錯体（Ａ３）を形成した場合、変換された基（ｒ２）は、ランタノイドイオンに配位しており、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ１）とランタノイド錯体（Ａ３）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、配位子（Ｂ１）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、候補化合物の存在下、配位子（Ｂ１）に前記酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素によって変換されると変換された基（ｒ２）を有する配位子（Ｂ２）を生じ、又、基質となり得る基（ｒ１）が変換されなければ配位子（Ｂ１）は変化せず、
４）上記３）にランタノイドイオンを作用させると、変換された基（ｒ２）を有する配位子（Ｂ２）は、ランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ２）となり、ついでこの錯体は上記２）の反応で変換された基（ｒ２）がランタノイドイオンに更に配位してランタノイド錯体（Ａ３）となり、一方、配位子（Ｂ１）がランタノイドイオンに配位すると、ランタノイド錯体（Ａ１）を形成し、更にこのランタノイド錯体（Ａ１）は、水分子が配位したランタノイド錯体（Ａ１ｂ）となってもよく、
５）上記４）に励起光を照射すると、ランタノイド錯体（Ａ３）又はランタノイド錯体（Ａ１若しくはＡ１ｂ）中のランタノイドイオンが発光し、
６）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、
７）候補化合物の存在下、酵素反応の進行を抑制する条件下、前記工程１）から６）を行い、得られたランタノイドイオンの発光強度と前記７）での発光強度を比較する、各工程により行うことができる。
【０１４２】
ここで、酵素の種類、酵素反応における各種反応条件等は、前記のものが適用できる。
【０１４３】
又、酵素反応後の反応液へのランタノイドイオンの添加量としては、例えば、反応の際使用する配位子１モルに対し、ランタノイドイオンを１．０〜２．５モルモル、好ましくは１．１〜１．５モル程度加えればよい。
【０１４４】
イオン種としては、特に限定されず、前記記載の３価のランタノイド金属塩由来のものが適用できる。
【０１４５】
ランタノイドイオン添加後、錯体形成に必要な適当な時間、例えば１０〜３０分程度経過後に発光強度を測定することにより、その発光強度をもって酵素活性の指標とすることができる。この反応につき、反応式５に示す。
【０１４６】
【化３０】
2004000213.tif 000023
【０１４７】
尚、ａ）ランタノイド錯体を用いて酵素反応を行う場合と、ｂ）配位子の段階で酵素反応を行い反応終了後ランタノイド錯体を形成する場合、における相違点は、ａ）が酵素の至適ｐＨで反応を行い、任意のｐＨに於いて測定できるのに対し、ｂ）は反応終了後、錯形成をより効率的に行うため、中性以上、好ましくは弱塩基性以上のｐＨにすればよい。一方、ランタノイド錯体（Ａ１又はＡ４）が反応溶媒に溶解しにくいものである場合は、配位子の段階で酵素反応を行い、その後、ランタノイド錯体とすることができる。
【０１４８】
配位子（Ｂ３）から配位子（Ｂ４）への酵素反応への応用
更に、本発明は、配位子（Ｂ１）から配位子（Ｂ２）への酵素反応の逆方向への反応においても酵素活性の測定を行うことができる。
【０１４９】
即ち、この方法は、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成可能な配位子（Ｂ３）であって、該配位子（Ｂ３）は、分子内に、
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ４）となるものであり、
又、この配位子（Ｂ３）は、ランタノイド錯体（Ａ４）を形成した場合、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しており、
ｆ）一方、変換された基（ｒ４）を有する配位子がランタノイドイオンともにランタノイド錯体（Ａ６）を形成した場合、変換された基（ｒ４）は、好ましくはランタノイドイオンに配位せず、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ４）とランタノイド錯体（Ａ６）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、配位子（Ｂ３）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、配位子（Ｂ３）に前記酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素により変換されると、変換された基（ｒ４）を有する配位子（Ｂ４）を生じ、
４）配位子（Ｂ４）にランタノイドイオンを作用させると、配位子（Ｂ４）は、変換された基（ｒ４）が好ましくはランタノイドイオンに配位することのない状態でランタノイド錯体（Ａ６）となり、
５）ランタノイド錯体（Ａ６）は、水分子が配位してランタノイド錯体（Ａ６ｂ）となってもよく、
６）励起光の照射により、ランタノイド錯体（Ａ６又はＡ６ｂ）中のランタノイドイオンが発光し、
７）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定する、各工程による。
【０１５０】
ここで、配位子（Ｂ３）から配位子（Ｂ１）への酵素反応の条件としては、前記のものが適用可能であり、又、酵素反応後のランタノイド錯体の形成についても前記の条件が適用できる。
【０１５１】
この反応につき、反応式６に示す。
【化３１】
2004000213.tif 000024
【０１５２】
配位子を用いた候補化合物のスクリーニング方法
本発明では、候補化合物の存在下で配位子に対して酵素反応を施し、得られた反応混合物をランタノイド錯体形成反応させ、次いで発光強度を測定することにより酵素阻害活性を有する候補化合物のスクリーニング方法とすることができる。即ち、配位子（Ｂ１）から配位子（Ｂ２）への酵素反応、又は配位子（Ｂ３）から配位子（Ｂ４）への酵素反応を、各々の酵素の阻害活性を有する候補化合物の存在下で行う場合、候補化合物が各々の酵素反応を阻害すれば反応は進行せず、一方、候補化合物が各々の酵素反応を阻害しなければ反応が進行する。その後、この反応溶液にランタノイドイオンを添加することにより、ランタノイド錯体を形成する。この錯体に励起光を照射すると、反応状況に応じてランタノイド錯体が発光する。
【０１５３】
具体的には、配位子（Ｂ１）から配位子（Ｂ２）への反応において、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成可能な配位子（Ｂ１）であって、該配位子は、分子内に
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ１）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応により変換されると変換された基（ｒ２）となるものであり、
又、配位子（Ｂ１）は、ランタノイド錯体（Ａ１）を形成した場合、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素反応前は好ましくは錯体（Ａ１）においてランタノイドイオンに配位せず、
ｆ）一方、変換された基（ｒ２）を有する配位子がランタノイドイオンとともにランタノイド錯体（Ａ３）を形成した場合、変換された基（ｒ２）は、ランタノイドイオンに配位しており、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ１）とランタノイド錯体（Ａ３）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する、配位子（Ｂ１）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、候補化合物の存在下、配位子（Ｂ１）に前記酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ１）は、酵素によって変換されれると、変換された基（ｒ２）を有する配位子（Ｂ２）を生じ、又、基質となり得る基（ｒ１）が変換されなければ配位子（Ｂ１）は変化せず、
４）上記３）にランタノイドイオンを作用させると、変換された基（ｒ２）を有する配位子（Ｂ２）は、ランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ２）となり、ついでこの錯体は上記２）の反応で変換された基（ｒ２）がランタノイドイオンに更に配位して、ランタノイド錯体（Ａ３）となり、一方、配位子（Ｂ１）がランタノイドイオンに配位すると、ランタノイド錯体（Ａ１）を形成し、更にこのランタノイド錯体（Ａ１）は、水分子が配位したランタノイド錯体（Ａ１ｂ）となってもよく、
５）上記４）に励起光を照射すると、ランタノイド錯体（Ａ３）又はランタノイド錯体（Ａ１若しくはＡ１ｂ）中のランタノイドイオンが発光し、
６）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、
７）候補化合物の存在下、酵素反応の進行を抑制する条件下、前記工程１）から６）を行い、得られたランタノイドイオンの発光強度と前記７）での発光強度を比較する、各工程を包含する方法である。
【０１５４】
一方、配位子（Ｂ３）から配位子（Ｂ４）への反応においては、
１）ランタノイドイオンと配位子とが１：１（モル比）で錯体を形成可能な配位子（Ｂ３）であって、該配位子は、分子内に
ａ）光増感部位を有し、
ｂ）前記酵素の特異的基質となり得る基（ｒ３）を有し、
ｃ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、スペーサーを介して配位子に結合しており、
ｄ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応により変換さると変換された基（ｒ４）となるものであり、
又、この配位子（Ｂ３）がランタノイド錯体（Ａ４）を形成した場合、
ｅ）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素反応前はランタノイドイオンに配位しており、
ｆ）変換された基（ｒ４）を有する配位子がランタノイドイオンとともに錯体（Ａ６）を形成する場合、変換された基（ｒ４）は、好ましくはランタノイド錯体（Ａ６）においてランタノイドイオンに配位せず、
ｇ）ランタノイド錯体（Ａ４）とランタノイド錯体（Ａ６）とは、励起光照射による発光強度が異なる特徴を有する配位子（Ｂ３）を用い、
２）酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で、候補化合物の存在下、該配位子（Ｂ３）に前記酵素を反応させ、
３）特異的基質となり得る基（ｒ３）は、酵素により変換されると、変換された基（ｒ４）を有する配位子（Ｂ４）を生じ、又、基質となり得る基（ｒ３）が変換されなければ、配位子（Ｂ３）は変化せず、
４）上記３）にランタノイドイオンを作用させると、配位子（Ｂ４）は、好ましくは変換された基（ｒ４）がランタノイドイオンに配位することのない状態でランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ６）となり、又、この錯体（Ａ６）は、更に水分子が配位してランタノイド錯体（Ａ６ｂ）となってもよく、一方、配位子（Ｂ３）は、特異的基質となり得る基（ｒ３）がランタノイドイオンに配位してランタノイド錯体（Ａ４）を生じ、
５）上記４）に励起光を照射することにより、ランタノイド錯体（Ａ６若しくはＡ６ｂ）又はランタノイド錯体（Ａ４）中のランタノイドイオンが発光し、
６）前記発光強度を時間分解蛍光測定法により測定し、
７）候補化合物の存在下、酵素反応の進行を抑制する条件下、前記工程１）から６）を行い、得られたランタノイドイオンの発光強度と前記７）での発光強度を比較する、各工程を包含する方法である。
【０１５５】
酵素反応の条件としては、前記記載のものが適用可能であり、又、酵素反応後のランタノイド錯体の形成条件も前記のものが適用できる。
【０１５６】
即ち、本発明のランタノイド錯体を、特定酵素、特にリン酸化酵素、硫酸化酵素等の、特異的基質として作用させることにより、従来公知のランタノイド錯体と比べて酵素反応の前後での発光強度の変化が大きく異なることから、従来公知のランタノイド錯体と比べてより少ない基質量で酵素活性の測定が可能となった。更に、このランタノイド錯体は、前記特定酵素に阻害活性を有する候補化合物のスクリーニングする際にも利用することができる。
【０１５７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、時間分解蛍光測定は、マルチラベルカウンタ：ＡＲＶＯｓｘ（ｗａｌｌａｃ　ｖｅｌｔｈｏｌｄ社製）を用いて、以下のパラメーターにより行った。
【０１５８】
Ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｆｉｌｔｅｒ　ｎａｍｅ　　Ｄ６１５　（Ｅｕｒｏｐｉｕｍ）
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ　ｆｉｌｔｅｒ　ｎａｍｅ　Ｄ３４０
Ｄｅｌａｙ　ｔｉｍｅ　　　　　　　５０　ｍｓｅｃ．
Ｗｉｎｄｏｗ　ｔｉｍｅ　　　　　　２３５０　ｍｓｅｃ．
Ｃｙｃｌｅ　　　　　　　　　６５００　ｍｓｅｃ．
Ｓｅｃｏｎｄ　ｗｉｎｄｏｗ　ｄｅｌａｙ　ｔｉｍｅ　０　ｍｓｅｃ．
Ｆｌａｓｈ　ｅｎｅｒｇｙ　ａｒｅａ　　　　Ｌｏｗ
Ｆｌａｓｈ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　Ｎｏ
【０１５９】
又、発光強度の測定は、特に記さない限り１ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％トゥイーン溶液下で測定した。
【０１６０】
参考例１
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ビス（１，１―ジメチルエチル）エステルの合成
【０１６１】
【化３２】
2004000213.tif 000025
【０１６２】
市販の１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（３．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、ｔｅｒｔ−ブチル　２−ブロモアセテート（５．３ｍｌ、３６ｍｍｏｌ）を加え、反応液を１．５時間攪拌した。減圧下溶媒を留去して得られる残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ　Ｃ−２００、溶出溶媒；クロロホルム−メタノール（５：１））により精製して、表題化合物を得た（４．５ｇ、収率５６％）。
【０１６３】
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ　ｐｐｍ：１．４４（ｓ，１８Ｈ），２．９１（ｓ，８Ｈ），３．０１（ｓ，８Ｈ）、３．３４（ｓ，４Ｈ）
【０１６４】
参考例２
１−ブロモ−２−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エタンの合成
【０１６５】
【化３３】
2004000213.tif 000026
【０１６６】
市販の７−アミノ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン（９５０ｍｇ、５．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦに懸濁し、ｎ−ブチルリチウム（１．４６Ｍ　ｎ−ペンタン溶液、４．１ｍｌ、６．１ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間攪拌した。続いて、２−ブロモ酢酸ブロミド（０．７２ｍｌ、８．３ｍｌ）を滴下し、更に室温で１時間攪拌した。析出している白色結晶を濾取、水洗浄後、減圧下乾燥し、表題化合物を得た（１．４ｇ、収率８７％）。
【０１６７】
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ　ｐｐｍ：２．３７（ｓ，３Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），６．２５（ｓ，１Ｈ），７．２９（ｄｄ，Ｊ＝８．７、１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），１０．５９（ｓ，１Ｈ）、１１．５２（ｓ、１Ｈ）
【０１６８】
参考例３
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ビス（１，１―ジメチルエチル）エステルの合成
【０１６９】
【化３４】
2004000213.tif 000027
【０１７０】
参考例１で得られた化合物（１．９ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）及び参考例２で得られた化合物（１．４ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、これに炭酸カリウム（１．３２ｇ、９．５２ｍｍｏｌ）を室温で加え、室温で２０時間攪拌した。減圧下溶媒を留去して得られる残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ　Ｃ−２００　溶出溶媒；クロロホルム−メタノール（５：１））により精製して、表題化合物を得た（０．７５ｇ、収率２６％）。
【０１７１】
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）δ　ｐｐｍ：１．４７（ｓ，９Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），２．７６（ｂｒ，２Ｈ），２．８４（ｂｒ，２Ｈ），３．０５（ｂｒ，２Ｈ），３．１９（ｂｒ，２Ｈ），３．３６（ｓ，８Ｈ），３．３７−３．４８（ｍ，４Ｈ），３．６０（ｓ，２Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝８．７、１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ）ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）：（Ｍ＋Ｈ）＋＝６１５．４
【０１７２】
参考例４
１−ブロモ−［１−（１，１―ジメチルエチルオキシカルボニル）−２−（１，１―ジメチルエチルオキシ）エチル］アミノ−６−オキソヘキサンの合成
【０１７３】
【化３５】
2004000213.tif 000028
【０１７４】
Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（２１７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４５２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍｌ、２．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、これに６−ブロモヘキサン酸（１９５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を室温で加え、室温で６時間攪拌した。減圧下溶媒を留去して得られる残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＷａｋｏｇｅｌＣ−２００、溶出溶媒；ヘキサン−酢酸エチル（１０：１））により精製して、表題化合物を得た（４６ｍｇ、収率１２％）。
【０１７５】
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ　ｐｐｍ：１．１８（ｓ，９Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ），１．４５−１．５８（ｍ，２Ｈ），１．６６−１．７７（ｍ，２Ｈ），１．８６−１．９５（ｍ，２Ｈ），２．２６−２．３４（ｍ，２Ｈ），３．４２（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），３．５４（ｄｄ，Ｊ＝８．８、３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８０（ｄｄ，Ｊ＝８．８、３．４Ｈｚ，１Ｈ），３４．６３（ｄｔ，Ｊ＝８．８、３．４Ｈｚ，１Ｈ），６．２８（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ）
【０１７６】
参考例５
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−［１−（１，１―ジメチルエチルオキシカルボニル）−２−（１，１―ジメチルエチルオキシ）エチル］アミノ−６−オキソヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ビス（１，１―ジメチルエチル）エステルの合成
【０１７７】
【化３６】
2004000213.tif 000029
参考例３で得られた化合物（２０ｍｇ、０．０３２６ｍｍｏｌ）及び参考例４で得られた化合物（４６ｍｇ、０．０９７８ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、これに炭酸ナトリウム（２８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加え、１２０℃で１．５時間攪拌した。減圧下溶媒を留去して得られる残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ，２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥して表題化合物を得た（６．５ｍｇ、収率２１％）。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）：（Ｍ＋Ｈ）＋＝９２８．５
【０１７８】
参考例６
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル）アミノ−６−オキソヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッドの合成
【０１７９】
【化３７】
2004000213.tif 000030
参考例５で得られた化合物（６．５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を９０％ＴＦＡを含む水に溶解し、６０℃で１時間攪拌した。減圧下溶媒を留去して得られる残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ，２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、目的物を含む溶出液を凍結乾燥し、表題化合物を得た（２．３ｍｇ、収率４６％）。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）：（Ｍ＋Ｈ）＋＝７０４．２３
【０１８０】
製造例１
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル）アミノ−６−オキソヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ユーロピウムキレートの合成
【０１８１】
【化３８】
2004000213.tif 000031
参考例６で得られた化合物（２．３ｍｇ、０．００３３ｍｍｏｌ）及びＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（２４ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を、ｐＨ＝５に調整した０．１Ｍトリメチルアンモニウムアセテート水溶液（１ｍｌ）に溶解し、５０℃で１７０時間攪拌した。反応混合液をそのまま（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ，２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥し、表題化合物を得た（１．４ｍｇ、収率３０％）。
発光強度：２．３８ｘ１０６ｃｏｕｎｔ（５μＭ水溶液）
【０１８２】
参考例７
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−［１−カルボキシ−２−（１，１―ジメチルエチルオキシ）エチル］アミノ−６−オキソヘキシル−１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ビス（１，１−ジメチルエチル）エステルの合成
【０１８３】
【化３９】
2004000213.tif 000032
参考例４において、Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕの代わりにＨ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＭｅを用いる他は参考例４と同様の反応を行い、１−ブロモ−［１−（メチルオキシカルボニル）−２−（１，１―ジメチルエチルオキシ）エチル］アミノ−６−オキソヘキサンを得た。次いで、この化合物と参考例３で得られた化合物とを、参考例５に記載の反応に準じて１２０℃で２０時間反応を行った。得られた反応液を参考例５に記載の精製方法に準じて精製し、表題化合物を得た。
【０１８４】
参考例８
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−（１−メトキシカルボニル−２Ｓ−ヒドロキシエチル）アミノ−６−オキソヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッドの合成
【０１８５】
【化４０】
2004000213.tif 000033
参考例７で得られた化合物（９ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）をベンゼン−メタノール混合溶媒（４ｍｌ：１ｍｌ）に溶解し、トリメチルシリルジアゾメタン（２Ｍヘキサン溶液、０．５ｍｌ）を加え、反応混合液を室温で１時間撹拌した。減圧下溶媒を留去して、参考例７で得られた化合物に対応するメチルエステルを得た（９ｍｇ、収率１００％）。
【０１８６】
このメチルエステル（９ｍｇ、０．０１ｍｍｌ）を、１０％の水を含むＴＦＡ（５ｍｌ）に溶解し、反応混合液を６０℃で０．５時間撹拌した。減圧下溶媒を留去して得られる残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ，２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥して表題化合物を得た（２．０ｍｇ、収率２８％）。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）：（Ｍ＋Ｈ）＋＝７１８．３
【０１８７】
製造例２
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−（１−メトキシカルボニル−２Ｓ−ヒドロキシエチル）アミノ−６−オキソヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ユーロピウムキレートの合成
【化４１】
2004000213.tif 000034
参考例８で得られた化合物を用い、製造例１に準じて反応を行い、表題化合物を得た。
発光強度：４．１３ｘ１０６ｃｏｕｎｔ（５μＭバッファー溶液）
【０１８８】
参考例９
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−（６−メトキシカルボニル）ヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ビス（１，１―ジメチルエチル）エステルの合成
【０１８９】
【化４２】
2004000213.tif 000035
参考例３で得られた化合物（０．４ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）及びメチル　６−ブロモ−ｎ−ヘキサノエート（０．６２ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、これに炭酸ナトリウム（０．５６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、１２０℃で２時間攪拌した。減圧下溶媒を留去して得られる残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ、２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥し、表題化合物を得た（０．１ｇ、収率２１％）。
【０１９０】
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）：（Ｍ＋Ｈ）＋＝７４３．４
【０１９１】
参考例１０
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−（６−カルボキシ）ヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ビス（１，１−ジメチルエチル）エステルの合成
【０１９２】
【化４３】
2004000213.tif 000036
【０１９３】
参考例９で得られた化合物（１００ｍｇ、０．１３４ｍｍｏｌ）をメタノール（１ｍｌ）に溶解し、この反応液に２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５ｍｌ）を加えて、反応混合液を室温で２時間撹拌した。減圧下メタノールを留去して得られる残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ，２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥し、表題化合物を得た（１４ｍｇ、収率１４％）。
【０１９４】
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）：（Ｍ＋Ｈ）＋＝７２９．４
【０１９５】
参考例１１
【化４４】
2004000213.tif 000037
市販のＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｎ）ＯＨ）−ＯＨ（５００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、シクロヘキサノン（３ｍｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル−２，２，２−トリクロロアセトイミデート（６５５ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合液を１００℃で２時間撹拌した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ　Ｃ−２００、溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（５：１））により精製して、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｎ）ＯＨ）−ＯｔＢｕを得た（０．５５ｇ、収率１００％）。得られた化合物（４００ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３２ｍｌ）に溶解し、ピペリジン（８ｍｌ）を加え、反応混合液を室温で１時間撹拌した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ、２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、次いで凍結乾燥してＦｍｏｃ基を除去した表題化合物を得た（９ｍｇ、収率４％）。
【０１９６】
参考例１２
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−［１−カルボキシ−２Ｓ−（ジヒドロキシホスフィニルオキシ）エチル］アミノ−６−オキソヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッドの合成
参考例１１で得られた化合物（９ｍｇ、０．０２７２ｍｍｏｌ）及び参考例１０で得られた化合物（１３．５ｍｇ、０．０１８５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解し、ＷＳＣ　ＨＣｌ（７．１ｍｇ）、ＨＯＢｔ　Ｈ２Ｏ（５．８ｍｇ）を加え、反応混合液を室温で１７時間撹拌した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ、２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥して４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−［１−（１，１―ジメチルエチルオキシカルボニル）−２Ｓ−（ヒドロキシ−Ｏ−ベンジルオキシホスフィニルオキシ）エチル］アミノ−６−オキソヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ビス（１，１―ジメチルエチル）エステルを得た（５．３ｍｇ、収率２７％）。
【０１９７】
この縮合化合物（５．３ｍｇ）を、１０％の水を含むＴＦＡ（５ｍｌ）に溶解し、反応混合液を６０℃で０．５時間撹拌した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ、２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥して表題化合物を得た（５．４ｍｇ、収率１００％）。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）：（Ｍ＋Ｈ）＋＝７８４．７
【０１９８】
製造例３
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−［１−カルボキシ−２Ｓ−（ジヒドロキシホスフィニルオキシ）エチル］アミノ−６−オキソヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ユーロピウムキレートの合成
【０１９９】
【化４５】
2004000213.tif 000038
【０２００】
参考例１２で得られた化合物を用いて製造例１と同様の方法により反応を行い、表題化合物を得た。
発光強度：１０．７２ｘ１０６ｃｏｕｎｔ（５μＭバッファー溶液）
【０２０１】
参考例１３
一般式（Ｓ）
【化４６】
2004000213.tif 000039
［式中、ＳＲ’は、固相樹脂を表す。］で表されるレジンの合成
【０２０２】
市販のＮｏｖａＳｙｎ　ＴＧＲ樹脂（０．２１ｍｍｏｌ／ｇ）０．１ｇを用いて、４当量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、４当量のＨＡＴＵ、８当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを用い、室温で１５時間反応させることによりアミノ酸カップリングを行った。引き続き２０％ピペリジン含有ＤＭＦを用い、室温で０．５時間反応させることにより脱Ｆｍｏｃ化反応を行った。次いで、同様の操作を繰り返してアミノ酸を延長した。即ち、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｓｙ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２を用いて、順次Ｆｍｏｃアミノ酸の縮合及び脱Ｆｍｏｃ化を繰り返してアミノ酸残基を延長した。最後の段階であるＦｍｏｃ−Ｌｓｙ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２を縮合後、２０％ピペリジン含有ＤＭＦを用いて脱Ｆｍｏｃ化を行い、更に乾燥させて一般式（Ｓ）で表されるレジンを得た。
【０２０３】
参考例１４
【化４７】
2004000213.tif 000040
【０２０４】
参考例１０で得られた化合物（１４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１１．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０１ｍｌ、０．０６ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、これに参考例１３で得られたレジン（７８ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を室温で加え、１８時間攪拌した。レジンをＤＭＦ（２ｍｌｘ３）、メタノール（２ｍｌｘ３）、ジクロロメタン（２ｍｌｘ３）の順で洗浄した。得られたレジンを９０％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ（２ｍｌ）で６０℃で１時間処理した後、レジンをろ過してのぞき、減圧下濾液を留去して得られる残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ、２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥し、表題化合物を得た（８．６ｍｇ、収率５０％）。
【０２０５】
製造例４
【化４８】
2004000213.tif 000041
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル）アミノ−６−オキソヘキシル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッドの代わりに参考例１１で得られた化合物を用いる他は製造例１と同様の方法により反応を行い、表題化合物を得た。
発光強度：６．８９ｘ１０４ｃｏｕｎｔ（５μＭバッファー溶液）
【０２０６】
参考例１５
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−［４−（メトキシカルボニルメチル）フェニル］メチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ビス（１，１−ジメチルエチル）エステルの合成
【化４９】
2004000213.tif 000042
参考例３で得られた化合物（０．０５ｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）及びメチル　４−（ブロモメチル）フェニルアセテート（０．０５９ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、これに炭酸カリウム（０．１ｇ、０．７ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間攪拌した。減圧下溶媒を留去して得られる残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ、２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥し、表題化合物を得た（０．０３６ｇ、収率５７％）。
【０２０７】
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）：（Ｍ＋Ｈ）＋＝７７７
【０２０８】
参考例１６
４−［２−［（１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−オキソ−７−キノリニル）アミノ］−２−オキソ］エチル−１０−［４−（カルボキシメチル）フェニル］メチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジアセティックアシッド　ビス（１，１−ジメチルエチル）エステルの合成
【化５０】
2004000213.tif 000043
【０２０９】
参考例１５で得られた化合物（３５．８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）をメタノール（１ｍｌ）に溶解し、この反応液に２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５ｍｌ）を加えて、反応混合液を室温で２．５時間撹拌した。減圧下メタノールを留去して得られる残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ，２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥し、表題化合物を得た（３３．３ｍｇ、収率９５％）。
【０２１０】
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）：（Ｍ＋Ｈ）＋＝７６３
【０２１１】
参考例１７
配位子の作成
【化５１】
2004000213.tif 000044
【０２１２】
参考例１６で得られた化合物（１６．６ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８．４ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．００７８ｍｌ、０．０４７ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、これに参考例１３で得られたレジン（６０ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）を室温で加え、１８時間攪拌した。レジンをＤＭＦ（２ｍｌｘ３）、メタノール（２ｍｌｘ３）、ジクロロメタン（２ｍｌｘ３）の順で洗浄した。得られたレジンを９０％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ（２ｍｌ）で６０℃で１時間処理した後、レジンをろ過して除去し、減圧下濾液を留去して得られる残渣を、（Ａ）０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び（Ｂ）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルからなる溶媒系の直線状勾配を用いたＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ、ｓ−５ｍｍ、２ｘ２５ｃｍ）、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの逆相クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥し、表題化合物を得た（６．９ｍｇ、収率４０％）。
【０２１３】
製造例５
錯体の調製
【化５２】
2004000213.tif 000045
参考例６で得られた化合物の代わりに参考例１７で得られた化合物を用いる他は製造例１と同様の方法により反応を行い、表題化合物を得た。
発光強度：１．５０ｘ１０５ｃｏｕｎｔ（１μＭバッファー溶液）
【０２１４】
試験例
製造例１及び試験例３で得られたユーロピウム錯体の各種濃度（０．１Ｍ−ＴＢＳバッファー溶液中）での発光強度を表２に示す。尚、発光強度の測定は、マルチラベルカウンタ：ＡＲＶＯｓｘ（ｄｅｌａｙ　ｔｉｍｅ　４００μｓ）を用いた６１５ｎｍの波長を測定することにより行った。
【０２１５】
【表２】
2004000213.tif 000046
【０２１６】
製造例３の化合物は、製造例１の化合物を基質とし、酵素（例えばＣＤＫ４等のリン酸エステル化酵素）を用いて、酵素と酵素に特異的に反応する基質とが反応する条件下で反応させることにより得られるものであり、低濃度においてもリン酸エステル化前後での化合物の発光強度が大きく異なることがわかる。従って、本発明の方法により、リン酸エステル化酵素等の酵素反応の検出が可能となった。
【０２１７】
酵素反応の測定
１）１０ＸＲバッファーの調製
２００ｍＭ　トリス・塩酸（ｐＨ７．４）
１００ｍＭ　塩化マグネシウム
４５ｍＭ　２−メルカプトエタノール
１００ｍＭ　ＥＧＴＡ
１Ｍ−トリス・塩酸（ｐＨ７．４）及び２００ｍＭ−ＥＧＴＡ（ｐＨ７．４）を各々調製し、所定の濃度になる割合で混合し、２−メルカプトエタノール溶液及び塩化マグネシウム溶液を加えてメスアップした。
【０２１８】
２）ストップバッファー
０．１重量％トリトンＸ−１００及び１０ｍＭのＥＧＴＡを０．１Ｍリン酸ナトリウムに溶解させてストップバッファーとした。
【０２１９】
３）ＣＤＫ溶液の調製
まずＣｄｋ４のｃＤＮＡをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質発現用ベクターに組み込み、バキュロウイルスを作製した。それを昆虫細胞Ｓｆ９に感染させ、ＧＳＴ融合ＣＤＫ４を高発現させた。その細胞を回収して可溶化した後、グルタチオンセファロースカラムを行った後プレシージョンプロテアーゼ（アマシャムファルマシアバイオテック社製品）によりＧＳＴを切断した。この様にして得た溶液中には、サイクリンＤ２−ＣＤＫ４複合体及びＣＤＫ４単独が存在するため、複合体のみを精製する目的で陰イオン交換カラム（溶出液：０．２Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）、０．１Ｍ塩化マグネシウム、４５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１０ｍＭＥＧＴＡ、０−０．５Ｍ塩化ナトリウム直線勾配；０．２Ｍ濃度で溶出する）を行うことによりサイクリンＤ２−ＣＤＫ４複合体溶液（０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌ）を得、サイクリンＤ２−ＣＤＫ４酵素液とした。
【０２２０】
得られたサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４酵素液、バッファーＡ及びイオン交換水を１：１：２（重量比）の比により混合し、酵素液とした。
【０２２１】
バッファーＡの組成：２００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、４５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１００ｍＭ　Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−４酢酸の各濃度に調製した。
【０２２２】
４）基質溶液の調製
対象とするランタノイド錯体を、純水を用いて５ｍＭ濃度となるように調製し、この溶液を適宜希釈して以下で用いた種々の希釈溶液とした。
【０２２３】
実施例１
コーニングＢｌａｃｋ　ｈａｌｆ　９６ウエルプレートにＤＭＳＯ１．１μｌずつ手動で添加（ｎ＝４）し、ポジティブコントロールのウエルには反応後、ネガティブコントロールのウエルには反応開始前にストップバッファーを添加した。１−４列及び５−８列のウエルをそれぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして用いた。
【０２２４】
酵素反応条件
総容量：２０μｌ
ＡＴＰ濃度：５０μｌ
Ｍｇ濃度：１０ｍＭ
２−ＭＥ濃度：４．５ｍＭ
ＥＧＴＡ濃度：１０ｍＭ
製造例４の化合物濃度：０．０５，０．１，１．０，２．０，５．０，１０，２０（μＭ）
【０２２５】
操作手順
１）１０μｌの製造例４の化合物溶液及び５μｌの酵素液を各々のウエルに添加する。又、ネガティブコントロールには、ストップバッファー１０μｌを添加する。
２）５μｌのＡＴＰ溶液を各々のウエルに添加して、酵素反応を開始させる。
３）３７℃、１時間攪拌後、ポジティブコントロールに１０μｌのストップバッファーを添加して酵素反応を終結させる。
４）マルチラベルカウンタ：ＡＲＶＯｓｘを用いて各々のウエルの６１５ｎｍの発光強度を測定する。
【０２２６】
上記方法により得られた結果を表３に示す。
【０２２７】
【表３】
2004000213.tif 000047
【０２２８】
上記の結果より、製造例４の錯体をｃｄｋ４を用いて酵素反応することにより、６１５ｎｍにおける発光強度が酵素反応前と比べて増加することが判明した。
【０２２９】
実施例２
コーニングＢｌａｃｋ　ｈａｌｆ　９６ウエルプレートの各々のウエルにＤＭＳＯ及び６０ｎＭ、６００ｎＭ、１μＭ、６μＭ、１０μＭの各濃度のフラボピリドールのＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを２．５μＭずつ手動で添加した（ｎ＝２）。ネガティブコントロールのウエル以外には反応後に、又、ネガティブコントロールのウエルには反応開始前にストップバッファーを添加した。
【０２３０】
酵素反応条件
総容量：５０μｌ
ＡＴＰ濃度：５０μＭ
Ｍｇ濃度：１０ｍＭ
２−ＭＥ濃度：４．５ｍＭ
ＥＧＴＡ濃度：１０ｍＭ
製造例４の化合物濃度：１０μＭ
フラボピリドール濃度：３、３０、５０、３００、５００ｎＭ（最終濃度）
【０２３１】
酵素液の調整
ｃｄｋ４溶液　１ｍｌ、１０ｘＲバッファー１ｍｌ及び純水４ｍｌを混合し酵素液として用いた。
【０２３２】
操作手順
１）５０μＭの製造例４の化合物溶液を各々のウエルに１０μｌずつ添加する。２）ＣＤＫ４溶液を３０μｌずつ各々のウエルに添加する。
３）１０μｌの２５０μＭ　ＡＴＰ溶液を各々のウエルに添加して、酵素反応を開始させる。
４）３７℃で１時間攪拌後、３０μｌのストップバッファーを添加して酵素反応を終結させる。
５）マルチラベルカウンタ：ＡＲＶＯｓｘを用いて各々のウエルの６１５ｎｍの発光強度を、上記条件にて測定する。
【０２３３】
ここでは、基質である製造例４の錯体の濃度を１０ｍＭに固定し、ｃｄｋ４の阻害剤であるフラボピリドールの濃度を種々変化させた際の６１５ｎｍの発光のカウントについて検討した。図１は、６１５ｎｍの発光のカウント（Ｙ軸）を阻害剤の濃度（Ｘ軸）に対してプロットしたものである。この図は、フラボピリドールの濃度依存的に６１５ｎｍの発光強度が減少していくことを示している。
【０２３４】
実施例３
製造例５の化合物を用いて、該化合物濃度を３５μＭとした他は実施例２と同様の方法により酵素反応を行った。その結果を表４に示した。
【表４】
2004000213.tif 000048
【０２３５】
以上、表３及び図１の結果より、製造例４の錯体を用い特定酵素（ここではｃｄｋ４）による酵素を行うと（実施例２）、反応の前後で反応液の６１５ｎｍの発光強度が変化し、又、その変化はｃｄｋ４の阻害剤の存在により減弱することが示された。又、表４の結果より、製造例５の化合物のような基質を用いても実施例２と同様に酵素活性が測定可能である。従って、本発明の方法に係るランタノイド錯体を用いることにより酵素活性を検出することが可能である。又、酵素に拮抗作用を有する候補化合物をスクリーニングする場合にも有用である。
【０２３６】
【発明の効果】
本発明を採用することにより、抗体やラジオアイソトープを用いることなく、より高感度で簡易に酵素活性を測定できることとなった。更に、この方法をハイスループットスクリーニング方法に適用することにより、従来のバイオアッセイ方法に比べて少ないサンプル量で、より高感度で候補化合物をスクリーニングすることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】阻害剤濃度（Ｘ軸）と発光強度である発光アカウント（Ｙ軸）の関係を示す図である。
【図１】
2004000213.tif 000059