(57)【要約】【課題】癌を早期に発見するための診断方法や治療方法等の評価に適する、遺伝子異常の検出に基づいたヒト由来の検体の癌化度評価方法を提供すること。【解決手段】本発明は、ヒト由来の検体の癌化度を評価する方法であって、（１）ヒト由来の検体に含まれる配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体におけるメチル化頻度をリアルタイムＰＣＲ法により測定する第一工程、及び（２）測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程を有することを特徴とする評価方法等に関する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）ヒト由来の検体に含まれる配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体におけるメチル化頻度をリアルタイムＰＣＲ法により測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。
【請求項２】
ヒト由来の検体が細胞であることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
ヒト由来の検体が組織であることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項４】
ヒト由来の検体が血液、血漿又は血清であることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項５】
ヒト由来の検体が乳房組織、乳腺組織又は乳腺上皮組織であって、かつ、癌が乳癌であることを特徴とする請求項３記載の評価方法。
【請求項６】
メチル化頻度が、当該ＤＮＡの塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項７】
ヒト由来の検体が血液、血漿又は血清であることを特徴とする請求項６記載の評価方法。
【請求項８】
ヒト由来の検体が乳房組織、乳腺組織又は乳腺上皮組織であって、かつ、癌が乳癌であることを特徴とする請求項６記載の評価方法。
【請求項９】
癌マーカーとしての、メチル化された配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体の使用。
【請求項１０】
癌マーカーが乳癌マーカーであることを特徴とする請求項９記載の使用。
【請求項１１】
リアルタイムＰＣＲ法によるメチル化頻度の測定が、検体から調製されたＤＮＡを非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、該ＤＮＡを鋳型として、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体中のシトシンのメチル化の有無を識別可能な一対のプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の量を、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体中のシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブを用いてリアルタイムに測定することによりなされることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項１２】
フォワードプライマーが配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーが配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、かつ、プローブが配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項１３】
フォワードプライマーが配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーが配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、かつ、プローブが配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項１４】
癌細胞の検出用キットであって、配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするキット。
【請求項１５】
癌細胞の検出用キットであって、配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト由来の検体の癌化度を評価する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌が遺伝子異常を原因とする疾病であること等が次第に明らかになりつつあるが、癌患者の死亡率は未だ高く、現在利用可能な診断方法や治療方法が必ずしも十分に満足できるものではないことを示している。癌を早期に発見し、発見された癌に対する有効な治療方法を選択し、さらに、治療後には癌再発の有無確認等のアフターケアを行うことは、臨床的に重要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、癌を早期に発見するための診断方法、癌に対する治療方法の有効性の評価、癌再発の有無確認等に適する、遺伝子異常の検出に基づいたヒト由来の検体の癌化度評価方法の開発が切望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、癌患者検体において特定なＤＮＡのメチル化頻度が健常者の検体と比較して有意に高いことを、リアルタイムＰＣＲ法を用いることにより見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．ヒト由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）ヒト由来の検体に含まれる配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体（以下、本ＤＮＡと記すこともある。）におけるメチル化頻度をリアルタイムＰＣＲ法により測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法（以下、本発明評価方法と記すこともある。）；
２．ヒト由来の検体が細胞であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
３．ヒト由来の検体が組織であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
４．ヒト由来の検体が血液、血漿又は血清であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
５．ヒト由来の検体が乳房組織、乳腺組織又は乳腺上皮組織であって、かつ、癌が乳癌であることを特徴とする前項３記載の評価方法；
６．メチル化頻度が、当該ＤＮＡの塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
７．ヒト由来の検体が血液、血漿又は血清であることを特徴とする前項６記載の評価方法；
８．ヒト由来の検体が乳房組織、乳腺組織又は乳腺上皮組織であって、かつ、癌が乳癌であることを特徴とする前項６記載の評価方法；
９．癌マーカーとしての、メチル化された配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体の使用；
１０．癌マーカーが乳癌マーカーであることを特徴とする前項９記載の使用；
１１．リアルタイムＰＣＲ法によるメチル化頻度の測定が、検体から調製されたＤＮＡを非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、該ＤＮＡを鋳型として、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体中のシトシンのメチル化の有無を識別可能な一対のプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の量を、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体中のシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブを用いてリアルタイムに測定することによりなされることを特徴とする前項１記載の評価方法；
１２．フォワードプライマーが配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーが配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、かつ、プローブが配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする前項１記載の評価方法；
１３．フォワードプライマーが配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーが配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、かつ、プローブが配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする前項１記載の評価方法；
１４．癌細胞の検出用キットであって、配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするキット；
１５．癌細胞の検出用キットであって、配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするキット；
等を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、癌マーカー（例えば、乳癌マーカー等）としての、メチル化された、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体の使用等に関連する発明である。
本発明において癌マーカーとして用いられる本ＤＮＡは、ヒト由来のＨｅｐａｒａｎ　ｓｕｌｆａｔｅ　Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ　３−Ｏ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−２遺伝子（以下、３ＯＳＴ−２遺伝子と記すこともある。）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，５１７０−５１８４（１９９９）］のプロモーター領域の一部の塩基配列を有するＤＮＡである。ヒト由来の３ＯＳＴ−２遺伝子の翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列を担うエクソンのうち最も５’上流側に位置するエクソン（以下、エクソン１と記す。）と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＨＵＡＣ００３６６１等に記載されている。Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＨＵＡＣ００３６６１に記載される塩基配列において、例えば、ヒト由来の３ＯＳＴ−２タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端に位置するメチオニンをコードするＡＴＧコドンは、塩基番号５８５１４〜５８５１６に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号５８５１４〜５８９９９に示されている。本発明において利用される配列番号１で示される塩基配列を有する本ＤＮＡは、このプロモーター領域に位置する塩基番号５８２５２〜５８４３２に示される塩基配列を有するＤＮＡである。本ＤＮＡには、上記の公知の塩基配列を有するＤＮＡのほか、等価体として、かかる塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有するＤＮＡも含まれる。
【０００６】
哺乳動物では、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する４種類の塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象がある。ヒト由来の、例えば、３ＯＳＴ−２遺伝子では、そのゲノムＤＮＡの一部のシトシンがメチル化されている。そして、ＤＮＡのメチル化修飾は、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、当該塩基配列をＣｐＧと記すこともある。）中のシトシンに限られる。シトシンにおいてメチル化される部位は、その５位である。細胞分裂に先立つＤＮＡ複製に際して、複製直後は鋳型鎖のＣｐＧ中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖のＣｐＧ中のシトシンもメチル化される。従って、ＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後も、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。
【０００７】
本発明評価方法の第一工程において「メチル化頻度」とは、例えば、調査対象となるＣｐＧ中のシトシンのメチル化の有無を複数のハプロイドについて調べたときの、当該シトシンがメチル化されているハプロイドの割合で表される。より具体的には、後述するメチル化特異的リアルタイムＰＣＲにより求めた元々検体中に存在したメチル化されていたＤＮＡ量と非メチル化特異的リアルタイムＰＣＲにより求めた元々検体中に存在したメチル化されていないＤＮＡ量とを加え総計ＤＮＡ量とし、元々検体中に存在したメチル化されていたＤＮＡ量を総計ＤＮＡ量で除した割合で表される。また、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲにより求めた元々検体中に存在したメチル化されていたＤＮＡ量で表されることもある。
【０００８】
本発明評価方法の第一工程におけるヒト由来の検体としては、例えば、乳癌細胞等の癌細胞若しくはそれを含む組織、及び、乳癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる可能性のある、細胞、それを含む組織（ここでの組織とは、血液、血漿、血清、リンパ液等の体液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料をあげることができる。具体的には、例えば、癌が乳癌である場合、被験者から採取された乳房組織、乳腺組織又は乳腺上皮組織等をあげることができる。ヒト由来の検体が血液である場合には、例えば、定期健康診断や簡便な検査等で採取される血液試料をあげることもできる。
これらの生体試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる生体試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された生体試料を検体として用いてもよい。
【０００９】
本発明評価方法の第一工程において、ヒト由来の検体に含まれる配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体におけるメチル化頻度を測定する方法としては、リアルタイムＰＣＲ法を用いる。
【００１０】
リアルタイムＰＣＲ法とは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を用いて、ＰＣＲでの増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法である。例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ（以下、本プローブと記すこともある。）等のプローブを用いてＰＣＲ反応産物をリアルタイムでモニターし、カイネティックス分析を行うことにより、例えば、遺伝子量に関して２倍程度の差異をも検出する等の高精度の定量が可能なＰＣＲ法である。当該リアルタイムＰＣＲ法のための装置及びキットもすでに市販されている。
【００１１】
まずヒト由来の検体から、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出する。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清の中に含まれる遊離ＤＮＡ（乳癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡの混入を避けて乳癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができる。
次いで、抽出されたＤＮＡを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、例えば、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体中の解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプライマー及びプローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、得られる増幅産物の量により、検体中に含まれていた本ＤＮＡのメチル化頻度を調べる。
ここで使用するプライマー及びプローブを設計する領域としては、ヒト由来の３ＯＳＴ−２遺伝子のエクソン１の５’上流に位置するプロモーター領域の一部の塩基配列をあげることができ、具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＨＵＡＣ００３６６１に記載される塩基配列の塩基番号５８２５２〜５８４３２で示される塩基配列に相当する。）である。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、乳癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））を示す。
【００１２】
非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）等を用いることができる。因みに、原理的には、非メチル化シトシンを修飾する試薬の代わりに、メチル化シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いてもよい。
【００１３】
抽出されたＤＮＡを非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させるには、例えば、まず当該ＤＮＡをアルカリ溶液（ｐＨ９〜１４）で変性した後、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（溶液中の濃度：例えば、終濃度３Ｍ）等で約１０時間〜約１６時間（一晩）程度、５５℃で処理する。反応を促進するため、９５℃での変性と、５５℃での反応を１０−２０回繰り返すこともできる。この場合、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化されているシトシンはウラシルに変換されず、シトシンのままである。
次いで、例えば、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡを鋳型とし、かつ、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列［メチル化されているシトシン（ＣｐＧ中のシトシン）はシトシンのままであり、メチル化されていないシトシン（ＣｐＧ中に含まれてないシトシンも含む）はウラシルとなった塩基配列］とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対のメチル化特異的プライマーならびにプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ（以下、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲとも記すこともある。）を行う。あるいは、例えば、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡを鋳型とし、かつ、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対の非メチル化特異的プライマー及びプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ（以下、非メチル化特異的リアルタイムＰＣＲとも記すこともある。）を行う。
メチル化特異的プライマー及びプローブを用いるリアルタイムＰＣＲの場合（前者）には、解析対象とするシトシンがメチル化されているＤＮＡからＤＮＡが増幅され検出される。一方、非メチル化特異的プライマー及びプローブを用いるリアルタイムＰＣＲの場合（後者）には、解析対象とするシトシンがメチル化されていないＤＮＡからＤＮＡが増幅され検出される。これらの増幅産物の量により、元々検体中に含まれていたメチル化されていたＤＮＡ量及びメチル化されていなかったＤＮＡ量を求める。次に、以下の式（メチル化されていたＤＮＡ量）／［（メチル化されていたＤＮＡ量）＋（メチル化されていなかったＤＮＡ量）］を用いて、メチル化されていたＤＮＡの割合、すなわち、メチル化頻度を算出することができる。また、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲのみを実施して、得られたＤＮＡ量（すなわち、元々検体中に含まれていたメチル化されていたＤＮＡ量）の絶対量をメチル化頻度として用いてもよい。
【００１４】
ここで、プライマー及びプローブとしては、メチル化を受けていないシトシンがウラシルに変換され、かつ、メチル化を受けているシトシンはウラシルに変換されないことを考慮して、メチル化を受けているシトシンを含む塩基配列に特異的なプライマー（メチル化特異的プライマー）およびプローブ（メチル化特異的プローブ）を設計し、また、メチル化を受けていないシトシンを含む塩基配列に特異的なプライマー（非メチル化特異的プライマー）及びプローブ（非メチル化特異的プローブ）を設計する。重亜硫酸塩処理により化学的に変換され相補的ではなくなったＤＮＡ鎖を基に設計することから、元来二本鎖であったＤＮＡのそれぞれの鎖を基に、それぞれからメチル化特異的プライマー、プローブと非メチル化特異的プライマー及びプローブを作製することもできる。かかるプライマーは、メチル、非メチルの特異性を高めるために、プライマーの３’末端近傍にＣｐＧ中のシトシンを含むように設計することが好ましい。
【００１５】
より具体的には、本ＤＮＡの場合、プライマーは、例えば、本ＤＮＡの塩基配列内に存在するＣｐＧ中のシトシンを１以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することができる。例えば、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１、９、２０、３０、５２、６３、７１、８０、１００、１２１、１３０、１３３、１４２、１４６、１５１、１５３、１５９、１６７、１７２又は１７４で示されるシトシンを１以上含む塩基配列を基に設計することができる。さらに具体的には、以下のプライマーが好ましい。
＜メチル化特異的プライマー＞
Ｍ１（フォワードプライマー）：５’−ＣＧＧＴＴＧＴＴＣＧＧＡＧＴＴＴＴＡＴＣ−３’（配列番号２）
Ｍ２（リバースプライマー）　：５’−ＧＴＡＡＣＧＣＴＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＣＧ−３’（配列番号３）
＜非メチル化特異的プライマー＞
Ｕ１（フォワードプライマー）：５’−ＴＧＧＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴ−３’（配列番号４）
Ｕ２（リバースプライマー）　：５’−ＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡ−３’（配列番号５）
【００１６】
本発明におけるプローブとしては、例えば、オリゴヌクレオチドに後述するレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とが結合したものをあげることができる。プローブ上の、本ＤＮＡからの増幅産物とハイブリダイズする領域の塩基配列は、例えば、本ＤＮＡの塩基配列内に存在するＣｐＧ中のシトシンを１以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することができる。例えば、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１、９、２０、３０、５２、６３、７１、８０、１００、１２１、１３０、１３３、１４２、１４６、１５１、１５３、１５９、１６７、１７２又は１７４で示されるシトシンを１以上含む塩基配列を基に設計することができる。具体的には、増幅産物とハイブリダイズする領域の塩基配列として以下の塩基配列を有するプローブが好ましい。
＜メチル化特異的プローブ＞
ＭＰ：５’−ＣＣＣＧＡＡＡＡＣＡＡＣＧＡＣＴＣＣＴＣＧＡＡ−３’（配列番号６）
＜非メチル化特異的プローブ＞
ＵＰ：５’−ＴＣＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＣＡＡＡＡ−３’（配列番号７）
尚、鋳型となるＤＮＡおよび増幅産物において、プローブがハイブリダイズする領域と、上記フォワードプライマー又はリバースプライマーがアニールする領域とが、互いに重複することがないように、プライマーとプローブの組み合わせを選択する必要がある。また、上記フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて得られる増幅産物を、上記プローブで検出可能とするために、増幅産物においてプローブがハイブリダイズする領域が、上記フォワードプライマーおよびリバースプライマーがそれぞれアニールする領域の間にあるように、プライマーとプローブの組み合わせを選択する。
【００１７】
上記レポーター蛍光色素の励起光は、クエンチャーにより吸収されている間は測定されず、増幅産物へのハイブリダイズによりプローブに構造等の変化が生じてクエンチャーにより吸収されなくなると当該励起光が測定されるようになる。例えば、ＴａｑＭａｎ（Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓの登録商標）法で用いられるプローブは、レポーター蛍光色素がクエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである。レポーター蛍光色素としては、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販のリアルタイムＰＣＲ用検出キットに含まれているのでそれを用いることもできる。レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、通常、プローブの一端（好ましくは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエンチャー蛍光色素が結合される。尚、オリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えば、Ｎｏｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８４）　Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２：３３８７−３４０３、Ｉｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９０）　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１１２：１２５３−１２５４等に記載されている。
【００１８】
リアルタイムＰＣＲにおける反応液としては、例えば、鋳型とするＤＮＡを５０ｎｇと、上記フォワードプライマー、リバースプライマーを終濃度で、それぞれ２００ｎＭと、上記プローブを終濃度で１００ｎＭと、ｄＮＴＰを終濃度で２００μＭと、ＭｇＣｌ２を終濃度で４ｍＭと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを　１．５Ｕと、１０×緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　８．３、５００ｍＭ　ＫＣｌ）を５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとした反応液をあげることができる。尚、プライマー及びプローブの組み合わせについては、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲの場合には、メチル化特異的プライマーとメチル化特異的プローブとを組み合わせて使用し、非メチル化特異的リアルタイムＰＣＲの場合には、非メチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プローブとを組み合わせて使用する。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、９５℃にて３分間保温した後、９５℃にて１５秒間次いで６０℃にて６０秒間を１サイクルとする保温を５５サイクル行う条件があげられる。このような反応を行い、反応液からの蛍光強度をリアルタイムに測定する。このリアルタイムＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販されているので、このような市販の装置及びキットを用いて行なうことができる。
【００１９】
反応では、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。もし、ＤＮＡがメチル化特異的プライマーと相補的な領域を有していれば（例えば、メチル化特異的プライマーとアニールする領域に含まれるシトシン部分が、全てメチル化されていたＤＮＡが元々検体中に存在していれば）、メチル化特異的プライマーによりＤＮＡが増幅される。さらに、増幅されたＤＮＡがメチル化特異的プローブと相補的な領域を有していれば（例えば、増幅されたＤＮＡにおいてメチル化特異的プローブとハイブリダイズする領域に含まれるシトシン部分が、全てメチル化されていたＤＮＡが元々検体中に存在していれば）、メチル化特異的プローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズする。次いで、例えば、ＴａｑＭａｎ（Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓの登録商標）法によるリアルタイムＰＣＲでは、メチル化特異的プローブが一本鎖ＤＮＡに完全にハイブリダイズした状態で、当該一本鎖ＤＮＡを鋳型とする伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により、当該一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしていたメチル化特異的プローブが５’末端側から加水分解される。この分解の結果、メチル化特異的プローブに結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とが分離され、クエンチャー蛍光色素に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されていたレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一方、検体中に上記ＤＮＡが存在しない場合には、ＤＮＡの増幅が起きず、メチル化特異的プローブはＤＮＡにハイブリダイズせず、従ってメチル化特異的プローブがＤＮＡポリメラーゼによって加水分解されることもない。このため、レポーター蛍光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍光強度を測定することにより、検体中に存在しているメチル化された本ＤＮＡを定量することが可能である。メチル化されていない本ＤＮＡを定量する場合には、上記で使用した、メチル化特異的プライマー及びプローブの代わりに、非メチル化特異的プライマー及びプローブを用いることにより、メチル化されていない本ＤＮＡを定量することが可能である。
【００２０】
本発明評価方法では、蛍光強度をリアルタイムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣＲ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル数を過ぎると検出下限を超え、急激に増加する。そして、検体中に目的とするＤＮＡ量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイクルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるか等を調べることにより、検体中の目的とするＤＮＡを定量することができる。より具体的には、例えば、１０８個の目的とするＤＮＡが含まれていたとしても急激な増加が起こりえない例えば１０サイクル目までの蛍光強度のブレの標準偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値を超えるサイクル数を調べることにより、検体中のメチル化された本ＤＮＡを正確に定量することができる。即ち、検体中のメチル化された本ＤＮＡの数の常用対数を横軸に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べることにより検体中のメチル化された本ＤＮＡを定量することができる。従って、本発明評価方法によれば、従来のＰＣＲのように、ＰＣＲ後に反応液の電気泳動を行なってＤＮＡの増幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。またプライマーの他にプローブを同時に用いると、ノイズを低く抑えることが可能となり、高年齢者由来の検体にも精度よく適用可能である。
【００２１】
以上の方法を用いて、ヒト由来の検体に含まれる配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体におけるメチル化頻度を測定する。測定されたメチル化頻度と、例えば、乳癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常なヒト由来の検体に含まれる配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体におけるメチル化頻度（対照）とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する。仮に、ヒト由来の検体に含まれる配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体におけるメチル化頻度が対照と比較して高ければ（配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体が対照と比較の上で高メチル化状態であれば）、当該検体の癌化度が対照と比較の上で高いと判定することができる。
ここで「癌化度」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様である。具体的には、例えば、ヒト由来の検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味する。また、例えば、ヒト由来の検体が組織である場合には当該組織又は当該検体の起源である個体における癌細胞の存在量等を意味している。因みに、例えば、ヒト由来の検体が血液、血漿、血清である場合には「癌化度」を当該検体の起源である個体が癌を有している可能性の度合いとしても考えてもよい。
【００２２】
本発明評価方法における配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体におけるメチル化頻度を測定するためのリアルタイムＰＣＲ法で使用し得るプライマー及びプローブは、乳癌細胞等の癌細胞の検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これらプライマー及びプローブを試薬として含有する乳癌細胞等の癌細胞の検出用キットも提供しており、本発明評価方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットのような形態での使用も含むものである。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
実施例１　（早期乳癌患者の血液における配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体のメチル化状態の確認試験）
ステージＩ及びＩＩの乳癌患者３０名並びに健常者３５名から血漿２ｍＬを得た（インフォームドコンセント実施済）。血漿２ｍＬ中のＤＮＡをＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出した。抽出により得られたＤＮＡ全量を、Ｃｌａｒｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　２２，　２９９０−２９９７，　１９９４；　Ｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　９３，　９８２１−９８２６，　１９９６に記載される方法に準じて亜硫酸水素ナトリウム処理した。即ち、上記のＤＮＡをＴＥバッファーに溶解して１５μｌのゲノムＤＮＡ溶液を調製し、これに６Ｍ水酸化ナトリウムを約２μｌ加えた後、当該混合物を３７℃で１５分間放置した。放置された混合物に、１０ｍＭヒドロキノン（Ｓｉｇｍａ）９μｌと３．６Ｎ亜硫酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）１２０μｌとを加えた後、これを９５℃３０秒、５０℃で１５分を１サイクルとする保温を１５サイクル行った。インキュベートされた液からＷｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　ｃｌｅａｎ−ｕｐ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡの溶液（約５０μｌのＴＥバッファー溶液）に５μｌの６Ｍ水酸化ナトリウムを加えた後、当該混合物を室温で５分間放置した。次いで、放置された混合物をエタノール沈澱することにより沈澱（ＤＮＡ）を回収した。回収された沈澱を１０μｌのＴＥバッファーに懸濁した。
【００２５】
得られたＤＮＡを鋳型とし、以下に示すメチル化特異的プライマーＭ１とＭ２、および５’末端がレポーター蛍光色素であるＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）で標識され３’末端がクエンチャー蛍光色素であるＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）で標識されたメチル化特異的プローブＭＰを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。この場合、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１〜１７２のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後の塩基配列に相当する１７２ｂｐのＤＮＡが増幅される。すなわち、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１、９、２０、６３、７１、８０、１５３、１５９、１６７及び１７２で示されるシトシンが全てメチル化されている本ＤＮＡから１７２ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅される。
＜メチル化特異的プライマー＞
Ｍ１（フォワードプライマー）：５’−ＣＧＧＴＴＧＴＴＣＧＧＡＧＴＴＴＴＡＴＣ−３’（配列番号２）
Ｍ２（リバースプライマー）　：５’−ＧＴＡＡＣＧＣＴＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＣＧ−３’（配列番号３）
＜メチル化特異的プローブ＞
ＭＰ：５’−ＣＣＣＧＡＡＡＡＣＡＡＣＧＡＣＴＣＣＴＣＧＡＡ−３’（配列番号６）
【００２６】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡを１μＬと、上記プライマーを終濃度で、それぞれ２００ｎＭと、上記プローブを終濃度で１００ｎＭと、ｄＮＴＰを終濃度で２００μＭと、ＭｇＣｌ２を終濃度で４ｍＭと、Ｐｌａｔｉｎｕｍ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｌａｔｉｎｕｍはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの登録商標）を　１．５Ｕと、１０×緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　８．３、５００ｍＭ　ＫＣｌ）を５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて３分間保温した後、９５℃にて１５秒間次いで６０℃にて６０秒間を１サイクルとする保温を５５サイクル行う条件でリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲの装置としては、ｉＣｙｃｌｅｒ　ｉＱ　Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用した。尚、メチル化特異的ＰＣＲ用プライマー及びメチル化特異的プローブが、メチル化された本ＤＮＡのみ特異的に増幅することを確認するため、ヒト由来の正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）から通常の方法でゲノムＤＮＡ（１：ネガティブコントロール）を抽出し、この一部をメチル化酵素ＳｓｓＩ（ＮＥＢ社）により処理しゲノムＤＮＡの−ＣｐＧ−全てをメチル化した（２：ポジティブコントロール）。この無処理のゲノムＤＮＡ（１：ネガティブコントロール）及びメチル化処理したＤＮＡ（２：ポジティブコントロール）を、上記と同様、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理に供し、得られたＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲを行った。その結果、無処理のＤＮＡでは、増幅産物は得られず、メチル化処理したＤＮＡでのみ増幅産物が得られた。この事実により、メチル化特異的ＰＣＲ用プライマー及びメチル化特異的プローブが、メチル化処理したＤＮＡのみ特異的に増幅することを確認した。また、メチル化処理したＤＮＡ（２：ポジティブコントロール）を用いて検量線を作成した。即ち、まず、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し得られたＰＣＲ産物を精製した。ＰＣＲ反応溶液中の分子の重量を吸光高度計により計測し、ＰＣＲ産物の予測分子量から、溶液中の分子数を算出した。その分子数をもとに、鋳型となるＰＣＲ産物を１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００又は１００，０００，０００コピー含んだＰＣＲ反応溶液を調製し、これを用いて蛍光モニター下、リアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲにおいてＰＣＲ反応溶液からの蛍光強度が閾値を超えるサイクル数を調べ、当該ＰＣＲ反応溶液中のＤＮＡ数（メチル化された本ＤＮＡの数）の常用対数を横軸に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとり、検量線を作成した。この検量線を作成した後、検体のリアルタイムＰＣＲを行い、蛍光強度が閾値を越えるサイクル数を求めた。得られた結果から、検量線を用いて、メチル化された本ＤＮＡの量を算出した。
【００２７】
乳癌患者由来の検体（血漿）に含まれる配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はその等価体におけるメチル化頻度（メチル化された本ＤＮＡの量）を調べた結果を表１及び表２に示した。表１及び表２に示すように、乳癌患者３０名のうち９名（３０％）でメチル化された本ＤＮＡを定量することができた。また、健常者においては、３５名中１名でしかメチル化された本ＤＮＡを定量することができず、その量は、５５．３コピー／０．２ｍＬ血漿相当量であった。即ち、検体中に含まれる本ＤＮＡがメチル化されていれば（メチル化特異的リアルタイムＰＣＲにおいて増幅産物が得られれば）、検体の起源である個体が乳癌を有している可能性が高いという結果が得られた。また、これら乳癌患者においては、腫瘍マーカーであるＣＥＡ（５ｎｇ／ｍＬ以下で正常値）及びＣＡ１５−３（２８Ｕ／ｍＬ以下で正常値）が測定されており、ＣＥＡについては、２例でのみ擬陽性を示し、ＣＡ１５−３については、全員陰性であった。従って、本発明評価方法が、現在一般的に用いられる腫瘍マーカーよりも高感度である可能性が示唆された。
【００２８】
【表１】
2004135655.tif 000002
【表２】
2004135655.tif 000003
【００２９】
以上の結果から、検体に含まれる本ＤＮＡがメチル化されていれば（メチル化特異的リアルタイムＰＣＲにおいて増幅産物が得られれば）、被検者が乳癌を有している可能性が高いことが示された。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、ヒト由来の検体の癌化度を評価する方法等が提供可能となる。
【００３１】
［配列表フリーテキスト］
配列番号２
リアルタイムＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
リアルタイムＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
リアルタイムＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
リアルタイムＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
リアルタイムＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号７
リアルタイムＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
【００３２】
【配列表】
2004135655.tif 000004
2004135655.tif 000005
2004135655.tif 000006
2004135655.tif 000007