(57)【要約】【課題】アミノ基転移反応によりα−ケト酸からアミノ酸を合成する方法において、目的のアミノ酸を高収率に得る方法を提供する。【解決手段】α−ケト酸（例；α−ケトグルタル酸）に、ω−アミノトランスフェラーゼ（例；超好熱菌パイロコッカス・フリオサス由来のω−アミノトランスフェラーゼのＮ末端から３０残基目のスレオニン残基をグルタミン酸に置換させた遺伝子工学的に基質特異性を改変させた酵素）の存在下、α，ω−ジアミノアルカン（例；１，５−ジアミノペンタン）を反応させ、Ｌ−アミノ酸（例；Ｌ−グルタミン酸）を得る。【選択図】　　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式［１］で示されるα−ケト酸もしくはそのエノール体、またはそれらの塩に、ω−アミノトランスフェラーゼの存在下、化学式［２］で示されるα，ω−ジアミノアルカンを反応させることを特徴とする、化学式［３］で表されるＬ−アミノ酸の製造方法。
【化１】
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【化２】
2004033163.tif 000010
【化３】
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（化学式［１］及び［３］において、Ｒは無置換または任意の置換基を有するアルキル基を示す。また化学式［２］において、ｎは自然数を表す。）
【請求項２】
化学式［２］で表されるα，ω−ジアミノアルカンがジアミノブタン又はジアミノペンタンである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
化学式［１］で表されるα−ケト酸がα−ケトグルタル酸である、請求項１又は２に記載のアミノ酸製造方法。
【請求項４】
超好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼを用いる、請求項１〜３いずれかに記載のアミノ酸の製造方法。
【請求項５】
超好熱菌パイロコッカス・フリオサス由来のω−アミノトランスフェラーゼを用いる、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
遺伝子工学的に基質特異性を改変された超好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼを用いる、請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
Ｎ末端から３０残基目のスレオニン残基をグルタミン酸に置換させたω−アミノトランスフェラーゼを用いる、請求項５または６いずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬や農薬の部分構造として有用なアミノ酸を簡便な方法で高収率に取得する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性非天然アミノ酸は近年医薬や農薬の合成中間体として需要が増してきており、種々の不斉合成法や光学分割法が検討されている。これらの中で酵素を触媒とする方法は酵素の高い光学特異性や位置特異性のため容易に純度の高い製品が得られるので特に注目されている。例えば、ヒダントイナーゼを触媒として５−置換ヒダントイン誘導体の光学特異的加水分解することによりＤ−ヒドロキシフェニルグリシン（ＷＯ９６／００２９６号公報）を取得する方法や、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン又は３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン（特開平５−２３６９７８号公報）を取得する方法、アミノ酸脱水素酵素によって３−置換−２−オキソプロピオン酸を還元的アミノ化してＬ−アミノ酸を得る方法（Ｈｕｍｍｅｌ，Ｗ．　＆　Ｋｕｌａ．，Ｍ．Ｒ．，（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４巻，１頁）、或いは同じく３−置換−２−オキソプロピオン酸を原料とするがアミノ酸アミノトランスフェラーゼ（以下ＡＴと略記する）を触媒としてＬ−チエニルアラニン（ＥＰ公開特許５８１２５０号公報）やホスホノスリシン（ＥＰ公開特許４７７９０２号公報）を合成する方法などが開示されている。
【０００３】
これらのうち、脱水素酵素を用いる場合には高価なＮＡＤＨが副原料として必要なのに対して、ＡＴを用いる方法は、原料のα−ケト酸の安価な合成法が考案された（特開昭６２−１１６５４１号公報）だけでなく、調味料や飼料として安価に大量生産されているグルタミン酸、アラニン、リジン、アスパラギン酸等の天然型アミノ酸を副原料に利用できるという大きな利点があるため、特に効果的な方法である。
【０００４】
しかしながら、この酵素の触媒するアミノ基の転移反応は可逆反応であるため、十分な反応収率を得るためには、副原料のアミノ酸を原料に対して大過剰に添加して逆反応を抑制する必要があり、この過剰のアミノ酸は経済的に負担になるだけでなく産業廃棄物が大量に発生するなど生産上の問題点となっていた。
【０００５】
大過剰の副原料を利用することなく逆反応を抑制するために考案された方法として、副生成物の２−オキソグルタル酸にグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼとアスパラギン酸を作用させてグルタミン酸を再生し、さらにこの再生反応で生じた副生成物のオキザロ酢酸を非酵素的脱炭酸反応で非可逆的にピルビン酸に変換する方法が開示されている（ＥＰ公開特許４７７９０２号公報）。また、乳酸脱水素酵素とＮＡＤＨによって副生成物を２−ヒドロキシ酸に変換する方法（ＷＯ９１／０５８７０号公報）や４つの酵素の連携により副原料のアスパラギン酸から生じたオキザロ酢酸を、リンゴ酸、フマル酸を経てアスパラギン酸にリサイクルする方法（ＵＳ４８８０７３８号公報）等も開示されている。しかしながらこれらの反応は複数の酵素を利用するので酵素や副原料のコストの負担が大きく、複数の反応を同調させる必要があることなど必ずしも容易な方法ではなかった。
【０００６】
本発明者らは３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニンが中性ｐＨでは温度に依存することなく水に対する溶解度が低いのに対し、その原料となる３−（２−ナフチル）ピルビン酸は温度依存的に水に対する溶解度が向上することを見出し、耐熱性アミノトランスフェラーゼを用いて高温で反応を行なうことで３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニンを結晶として生成させ、容易に反応平衡を目的物生成に偏らせる方法を既に見出している（特開２００１−１４５４９９号公報）。この方法は同様の疎水性アミノ酸の合成に広く適用できることが期待されている。しかしながら、疎水性の低いアミノ酸の場合は簡単な方法で平衡を偏らせることができず、新規な方法が求められていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はアミノ基転移反応によりα−ケト酸からアミノ酸を合成する方法において、目的のアミノ酸を高収率に得る方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、超好熱性古細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ、日本農芸化学会２００２年度大会講演要旨集ｐ．３６−３７）由来のω−アミノトランスフェラーゼが、ジアミノブタンやジアミノペンタンに代表されるα、ω−ジアミノアルカンからα−ケト酸へのアミノ基転移反応を触媒してＬ−アミノ酸を生成するが、この際副生成物として生じるアミノアルデヒドは極めて不安定であるために反応液中に蓄積されずに分解してしまい、その結果として逆反応が実質的に抑制されて目的のアミノ酸が高収率に得られることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００９】
すなわち本発明は、化学式［１］で示されるα−ケト酸もしくはそのエノール体、またはそれらの塩に、ω−アミノトランスフェラーゼの存在下、化学式［２］で示されるα，ω−ジアミノアルカンを反応させることを特徴とする、化学式［３］で表されるＬ−アミノ酸の製造方法。
【００１０】
【化４】
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【化５】
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【化６】
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（化学式［１］及び［３］において、Ｒは無置換または任意の置換基を有するアルキル基を示す。また化学式［２］において、ｎは自然数を表す。）である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１１】
本発明で用いられるα−ケト酸は化学式［１］で示される。化学式［１］において、Ｒは無置換または任意の置換基を有するアルキル基を示す。ここでアルキル基としては特に限定はなく、例えば直鎖状、分枝状、環状のいずれでもよいが、好ましくは炭素数１−６の直鎖状または分枝状のアルキル基であり、更に好ましくはメチル基またはエチル基である。
【００１２】
アルキル基は、任意の置換基を有していてもよく、置換基としては特に限定されるものではないが、例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、低級アルコキシカルボニル基、フェニル基およびヒドロキシ基等があげられる。これらの中でもこのましくはカルボキシル基、水酸基、アミノ基、チオール基、スルホン基である。これらの置換基により、任意の位置が１〜３個置換されたアルキル基を例示することができる。化学式［１］で表されるα−ケト酸として特にα−ケトグルタル酸が好ましい。
【００１３】
本発明では、化学式［１］で示されるα−ケト酸もしくはそのエノール体、またはそれらの塩を反応の原料とする。これらの原料は、遊離の酸として用いても良いし、塩として用いることも出来る。塩として用いる場合にその対イオンにも特に限定はなく、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンなどの金属イオン、アンモニウムやアミン類などを自由に用いることが出来る。これら原料の製造法にも特に限定はなく、通常の有機合成方法や発酵生産法で得ることが出来る。
【００１４】
本発明で用いられるω−アミノトランスフェラーゼとしては特に限定はされないが、超好熱菌由来の酵素、とりわけ超好熱性古細菌由来の酵素が耐熱性が高く、リジンやオルニチンなどのω−アミノ基をα−ケト酸に転移させてＬ−アミノ酸を生じさせるだけでなく、α、ω−ジアミノアルカンにも作用するという特性を有するために好ましく用いられる。発明者らは既に、このようなω−アミノトランスフェラーゼの遺伝子の一つを超好熱性古細菌の一種、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から取得し、大腸菌での遺伝子発現に成功している（日本農芸化学会２００２年度大会講演要旨集ｐ．３６−３７）。さらに本発明者らは、ω−アミノトランスフェラーゼのＮ末端から３０番目のスレオニン残基をグルタミン酸に置換することにより、α，ω−ジアミノアルカンに対する酵素活性を著しく向上した変異体ω−アミノトランスフェラーゼＴ３０Ｅの取得に成功した。このような変異体酵素は更に好ましく利用できる。
【００１５】
ω−アミノトランスフェラーゼの利用の形態にも特に限定はなく、上述の酵素生産菌の培養液から遠心分離等の方法で回収した微生物菌体をそのまま利用する事も出来るし、微生物菌体を浸透圧ショックや超音波処理、フレンチプレス処理、或いはマントン・ゴーリン・ホモジナイザー処理等の既知の方法で破砕して得た菌体抽出液を用いることも出来る。さらには硫安塩析法、溶媒分画法、イオン交換や疎水相互作用を利用したカラムクロマトグラフィー法等既存の方法で抽出液から精製した酵素を利用する事も出来る。また、酵素遺伝子を、大腸菌、枯草菌または酵母等の大量培養に適した微生物に導入し、組換え体微生物を用いて大量発現させた物を用いる事も出来る。組換え体を用いる場合でも、微生物菌体をそのまま利用することも出来、或いは上記の方法で菌体を破砕・抽出したもの、さらには抽出液より通常の方法で精製した酵素を利用する事も出来る事は同様である。
【００１６】
本発明で用いるα，ω−ジアミノアルカンは、化学式［２］で示されるものである。式中ｎは自然数を示すが、好ましくはｎ＝１〜１０、更に好ましくはｎ＝４〜６である。α，ω−ジアミノアルカンとしては特に限定はないが、酵素が高い活性を示すことから１，４−ジアミノブタンや１，５−ジアミノペンタンが好ましく用いられる。特に変異体酵素Ｔ３０Ｅは後者のα，ω−ジアミノアルカンに対する活性が高く好ましく用いられる。
【００１７】
以上に説明した原料のα−ケト酸、もしくはそのエノール体、またはそれらの塩に、ω−アミノトランスフェラーゼの存在下、α，ω−ジアミノアルカンを反応させる。この時の温度は原料が十分に溶解する様に常温以上であれば特に限定はなく、水の常圧での沸点である１００℃を越えた温度で反応を行う場合は加圧密閉した状態で反応を行えば良いが、原料や酵素の安定性及び原料の溶解度からは好ましい温度は５０−１００℃程度である。また反応のｐＨにも特に限定はないが、原料を十分に溶解させて反応を行う目的からはｐＨ６以上である事が好ましい。また酵素はこのｐＨ領域で問題なく使用する事が出来るが、十分な活性を発現させる目的からより好ましくはｐＨ７−９である。
【００１８】
反応液に原料、副原料のα，ω−ジアミノアルカン、及び酵素を投入する順番にも特に制限はなく、すべてを同時に溶媒である水に添加する事も出来るし、原料をまず加熱して水に溶解した後に副原料、酵素を順次投入して反応を開始する事も出来る。
【００１９】
原料と副原料の量比にも特に制限はないが、十分な反応の変換率が得られ、かつ経済的問題や廃棄物処理の問題の生じない範囲で任意に選定される。
【００２０】
このようにして、化学式［３］で表されるＬ−アミノ酸が得られる。式中Ｒは、化学式［１］と同様である。得られたＬ−アミノ酸はそのまま工業原料や医薬合成原料として利用出来るが、再結晶化やシリカゲル或いは活性炭を充填したカラムクロマトグラフィー等の公知の方法でさらに精製して利用することもできる。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される物ではない。
【００２２】
実施例１　遺伝子への変異導入
変異導入されたＤＮＡ断片は次の手順により作製した。まず鋳型となる遺伝子を含むＤＮＡとしては、特願２００１−３５９７７０号で報告したプラスミドｐＰＦＯＡＴ３の調製法に従った。
【００２３】
即ち、市販の培地（商品名；マリンブロス２２１６、Ｄｉｆｃｏ社製）を１リットル容のメジュームビンに３７．４ｇ取り、純水１リットルを加えて溶解し、更に少量のリサズリンを酸化還元指示薬として加えて１２０℃で２０分間加圧滅菌した。滅菌後、薬サジ一杯分の元素硫黄粉末を加え、窒素雰囲気下で密栓して９７℃に加熱した。この溶液に２％の２−メルカプトエタノールをリサズリンの赤色が消失するまで滴下し、さらにパイロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８株を植菌して９７℃で一晩培養を行なった。
【００２４】
培養終了後、室温まで培養液を冷却し、残存する元素硫黄及び硫黄酸化物の沈殿を培養液を傾斜させて分離、除去し、８０００回転、２０分の遠心分離により微生物菌体を回収した。
【００２５】
このようにして得られた菌体の一部を１ｍｌのＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。これに１０％ＳＤＳを０．１ｍｌ加えて室温に１０分間静置し、溶菌させた。
【００２６】
これに水相と等容のフェノール−クロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）を加えて穏やかに攪拌し、遠心操作によって水相を回収した。この操作を３回繰り返した後、水相と等容のクロロフォルムによる抽出を行なった。得られた水相に２．５容のエタノールを加え、室温で１０分間静置した後、遠心によって核酸を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、再度遠心して核酸をペレットとして回収し、これを４００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解した。
【００２７】
この溶液に１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（あらかじめＤＮａｓｅを熱処理により除去）を最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように２μｌ加え、３７℃で１時間保温した。これに２０％ＰＥＧ６０００／２．５ＭＮａＣｌを２４０μｌ加えてから０℃で２時間静置した。これを４℃で遠心し、ペレットを７０％エタノールで洗浄して再度遠心した。得られたペレットを乾固させた後４００μｌのＴＥ緩衝液に溶解してＤＮＡ標品とした。これにより１４０μｇのＤＮＡが回収された。
【００２８】
このようにして得られた染色体ＤＮＡを鋳型として特定の配列をもつＤＮＡを以下の手順により増幅した。まずプライマーとしては、増幅させようとするＤＮＡ配列に相当する配列を２０ないし２５塩基含み、かつその５’側に適当な制限酵素認識配列と、さらにその５’側に１ないし３塩基の余分な配列を持つように設計した。この余分な配列は制限酵素が効率的に働くことを助けるものであり、その配列と長さは用いる制限酵素によって異なる。ＳａｃＩについてはＡＴＣＣなる４塩基、ＰｓｔＩについてはＡＡよりなる２塩基が付加することにより制限酵素が十分に切断活性をもつことが知られているので（ＮＥＢ社カタログ）、これを用いることにした。すなわち下記のような配列番号１及び２よりなるＤＮＡ配列をプライマーとすることに決定し、これらのオリゴヌクレオチドを常法により合成した。
【００２９】
配列番号１　５’ＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡ３’
（下線部は、ＳａｃＩの認識部位を示す）
配列番号２　５’ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＡＡＴＴＴＡＴ３’
（下線部は、ＰｓｔＩの認識部位を示す）。
【００３０】
ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）を用い、以下の手順で行なった。すなわち１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液（宝酒造製）を１０μｌ、各２．５ｍＭになるように調製されたｄＮＴＰ混合溶液を８μｌ、鋳型となる染色体ＤＮＡ標品を３５０ｎｇ、上記プライマーＤＮＡを各々１００ｐｍｏｌ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ加えて、全量を１００μｌとした。Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを用いて、＜９４℃、２０秒−６０℃、６０秒−７２℃、１２０秒＞のサイクルを３０回繰り返し、その後７２℃、１０分の伸長反応を行なって終了させた。その一部を１．０％アガロースで分析することにより、約１４００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることが観察された。この反応によって得られたＤＮＡ量は約１０μｇであった。
【００３１】
このようにして得られたＤＮＡを常法に従いフェノール−クロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）抽出で除蛋白し、次いでクロロフォルムによる抽出を行なった。エタノール沈殿により回収したＤＮＡのうち５μｇに６ＵのＳａｃＩと６ＵのＰｓｔＩによる酵素消化を各々３７℃で９０分間行なった。一方、５μｇのプラスミドｐＵＫ０２−Ａ３（特開平３−１５５７８８号参照）ＤＮＡを用いて、これを同様に６ＵのＳａｃＩと６ＵのＰｓｔＩで各々３７℃で２時間酵素消化を行なった。こうして得られた両方の酵素消化物を１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。
【００３２】
次に前記ｐＵＫ０２−Ａ３由来の４ｋｂｐ断片とＰＣＲ産物の１．４ｋｂｐ断片を等モル混合し、ライゲーション反応に供した。これにより図１に示したプラスミドｐＰＦＯＡＴ３が得られた。図中、Ａ３／ｌａｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒは大腸菌Ｔ３ファージＡ３プロモーターと大腸菌ｌａｃオペレーターとの融合プロモーターを、ＳａｃＩは制限酵素ＳａｃＩの切断部位を、ＥｃｏＲＩは制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位を、ＰｓｔＩは制限酵素ＰｓｔＩの切断部位を、ω−ＡＴはパイロコッカス・フリオサスのω−アミノ酸アミノトランスファラーゼがコードされている領域を、ｒｒｎＢ　Ｔ１Ｔ２は大腸菌ｒｒｎＢオペロンの転写終結シグナルを、Ａｍｐはアンピシリン耐性の遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製開始部位を、そしてｌａｃＩｑは大腸菌のｌａｃリプレッサーバリアントの遺伝子をそれぞれ示す。
【００３３】
次にプライマーとしては２４塩基の長さからなる配列番号３、２４塩基の長さからなる配列番号４、２７塩基の長さからなる変異導入用の配列番号５、配列番号５と相補鎖を形成する変異導入用の配列番号６を用い、配列番号３と６、配列番号４と５の組合わせで１回目のＰＣＲ反応を行なった。配列番号５および６には制限酵素Ｓａｕ３ＡＩによる認識配列を削除し、それによって変異導入の確認ができるようにした。
【００３４】
配列番号３　５’ＣＡＡＡＣＣＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＡＴＧＡ３’
配列番号４　５’ＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣ３’
配列番号５　５’ＧＣＡＡＣＴＡＣＣＧＡＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＴＧＡＧ３’
配列番号６　５’ＣＴＣＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＧＧＴＡＧＴＴＧＣ３’
（下線部は変異部を示す）。
【００３５】
ＰＣＲ反応の条件はＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）を用い、以下の手順で行なった。すなわち１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液（宝酒造製）を１０μｌ、各２．５ｍＭになるように調製されたｄＮＴＰ混合溶液を８μｌ、鋳型となるプラスミドＤＮＡ標品を１ｎｇ、上記プライマーＤＮＡを各々１００ｐｍｏｌ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ加えて、全量を１００μｌとした。Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを用いて、＜９４℃、２０秒−５５℃、６０秒−７２℃、１２０秒＞のサイクルを３０回繰り返し、その後７２℃、１０分の伸長反応を行なって終了させた。その一部を１．０％アガロースで分析することにより、それぞれ約１５０ｂｐと１４００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることが観察された。
【００３６】
得られたＤＮＡを常法に従いフェノール−クロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）抽出で除蛋白し、エタノール沈殿により回収した。デシケーター内で３分間減圧乾燥後、４０μｌのＴＥ溶液に溶解し、半量を１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。次に精製した両ＤＮＡ断片１０μｌと配列番号３および配列番号４のプライマーを用いて、先のＰＣＲと同条件（プラスミドＤＮＡは除く）で反応させた。その一部を１．０％アガロースで分析することにより、約１５００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることが観察された。得られたＤＮＡを同様にフェノール−クロロフォルム（１０ｍＭトリス−塩酸で飽和）抽出で除蛋白、エタノール沈殿による回収、デシケーター内で３分間減圧乾燥後、４０μｌのＴＥ溶液に溶解した。得られたＤＮＡの半量を４０Ｕの制限酵素ＳａｃＩと４０Ｕの制限酵素ＰｓｔＩで３７℃、２時間酵素消化を行ない、１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。
【００３７】
実施例２　発現ベクターへの導入と組換え大腸菌の作製
実施例１で得られたＤＮＡの半量を４０Ｕの制限酵素ＳａｃＩと４０Ｕの制限酵素ＰｓｔＩで３７℃、２時間酵素消化を行ない、１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。一方プラスミドｐＰＦＯＡＴ３を同様に制限酵素ＳａｃＩとＰｓｔＩにより酵素消化を行なった。こうして得られた両方の酵素消化物を１．０％アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出して各ＤＮＡ断片を精製した。
【００３８】
次に前記ｐＰＦＯＡＴ３由来の約４ｋｂｐ断片と変異導入された１．５ｋｂｐ断片を等モル混合し、ライゲーション反応に供した。反応物を常法に従って大腸菌ＭＣ４１００に導入した。形質転換菌は５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む寒天培地で選択し、生じたコロニーの内４個を常法によってプラスミドを抽出した。得られたプラスミドを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ消化し分析した結果、３個のプラスミドに変異の導入が確認された。得られた変異体をＴ３０Ｅと呼び、以下の実験に供した。
【００３９】
実施例３　変異体酵素Ｔ３０Ｅの調製
実施例２で得られた変異体Ｔ３０Ｅを２００ｍｌ容のバッフル付き３角フラスコを用い５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）４０ｍｌで３７℃、１４時間振とう培養を行なった。この培養液３０ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ４Ｙ培地（１％バクトトリプトン、２％バクトイーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）３リットルに植菌し、５リットル容の発酵槽を用いて３０℃で２０時間好気的培養を行なった。この培養物を常法に従って菌体を集めると４６ｇであった。集めた菌体を２３０ｍｌの５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で洗浄後、同じ緩衝液２５０ｍｌで再度懸濁し、超音波で菌体の破砕をなった。この菌体破砕物にピリドキサールリン酸を１ｍＭの濃度になるよう加え、７０℃の湯浴にて３０分間浸し熱処理を行なった。
【００４０】
生じた沈殿物を遠心分離により除去し、上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムを８０％飽和濃度になるようゆっくり添加し、生じた沈殿を遠心分離により回収した。この沈殿物を２０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に溶解し、８０℃の湯浴にて２０分間浸し生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を回収した。得られた上清を分画分子量１２０００〜１４０００の膜にて一晩透析（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６））を行ない、市販のゲル（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ、商品名、東ソー（株）製）により分画を行ない、ＳＤＳ−ポリクリルアミドゲル電気泳動による分析にて分子量約５２０００を示す、ほぼ単一な成分の画分を回収した。回収した画分に等量のアセトンを０℃にてゆっくり加え、そのまま２時間放置後、遠心分離にて沈殿を回収し、２ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に溶解し、以降の実験に使用した。
【００４１】
実施例４　グルタミン酸の合成
反応液として５０ｍＭの１，５−ジアミノペンタン二塩酸塩、２５０ｍＭのα−ケトグルタル酸、及び０．２５Ｕ／ｍｌのＴ３０Ｅを含む水溶液を調製し、７０℃に昇温することで酵素反応を開始した。酵素反応の追跡は、グルタミン酸の生成をグルタミン酸定量キット（ヤマサ製）で、また副原料の１，５−ジアミノペンタンの残存量をイオンクロマトグラフィーで定量することによって行なった。なお、イオンクロマトグラフィーの条件は以下の通りである。
カラム　　　ＴＳＫ−ｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＩＣ−Ｃａｔｉｏｎ（東ソー社製）
溶離液　　　３ｍＭ　ＨＮＯ３
流速　　　　　１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度　　４０℃
検出器　　　ＣＭ−８０２０（東ソー社製）。
【００４２】
結果を図２に示す。図中、黒丸は１，５−ジアミノペンタンの残存率の、白丸はグルタミン酸の生成率の、それぞれ反応時間による経時変化を示す。グルタミン酸の生成と１，５−ジアミノペンタンの減少はほぼ平行して進行し、最終的に使用した原料当たり８０％の高収率でグルタミン酸を得られることが確認された。なお、反応開始直後から２２時間反応後までの反応液のイオンクロマトグラフィーのパターンからは、副原料の１，５−ジアミノペンタンは検出されるものの、１，５−ジアミノペンタンから脱アミノ化反応で生成する５−アミノペンタナールに相当するピークは全く観察されなかった。また反応液中の成分について、更にＴＬＣおよびガスクロマトグラフィーによる検出を試みた。しかしながらいずれの分析によっても、生成物のグルタミン酸、原料のα−ケトグルタル酸、及び副原料の１、５−ジアミノペンタンを除いて顕著な化合物は検出されなかった。アミノアルデヒドが化学的に不安定な化合物であることはよく知られていることであり、従って生成物５−アミノペンタナールは生成とほぼ同時に分解して消失するため検出されないものと考えられた。
【００４３】
本反応系では、１，５−ジアミノペンタンからα−ケト酸へのアミノ基転移により目的物アミノ酸の生成は良好に進行するが、この際に生成物５−アミノペンタナールは生成とほぼ同時に分解して消失する。従って逆反応である目的物アミノ酸から５−アミノペンタナールへのアミノ基転移は実質的に進行しない。
【００４４】
【発明の効果】
本発明はアミノ基転移反応によりα−ケト酸もしくはそのエノール体、またはそれらの塩からアミノ酸を合成する方法において、α，ω−ジアミノアルカンをアミノ基供与体として用いることで副生成物として生じるアミノアルデヒドを速やかに分解消失せしめ、目的物のアミノ酸からアミノアルデヒドへの逆アミノ基転移を抑制し、目的のアミノ酸を高収率に得ることが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＰＦＯＡＴ３を示す図である。
【図２】実施例４で測定した、グルタミン酸の生成率と１，５−ジアミノペンタンの残存率の経時変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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