(57)【要約】【課題】一過性に発現する遺伝子を含むいかなる遺伝子をもトラップすることが可能な遺伝子トラップシステムを提供する。【解決手段】バクテリオファージＰ１の遺伝子組み換え酵素Ｃｒｅ遺伝子を用いたトラップベクターにて遺伝子をトラップし、トラップした遺伝子の発現を別のレポーター遺伝子の構成的発現に変換する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をレポータベクターで形質転換する段階、前段階で得た組換え細胞を更にトラップベクターで形質転換する段階、前段階で得た細胞のうちレポータ活性を示さない細胞を選択する段階、前段階で選択した細胞を所定の条件に置く段階、及び前段階の細胞の中からレポータの活性を確認した細胞を選択する段階から成るシステムであって、前記レポータベクターが、その細胞で機能するプロモーター、１つめのＬｏｘＰ配列、薬剤耐性遺伝子、転写終結ＳＴＯＰ配列、二つめのＬｏｘＰ配列、及びレポーター遺伝子を順に連結したユニットを有し、前記トラップベクターが、スプライシングアクセプター、ＩＲＥＳ、核局在シグナルを付加したＣｒｅ、一つめのスプライシングドナー、構成的発現遺伝子プロモーター、薬剤耐性遺伝子、及び二つめのスプライシングドナーを順に連結したユニットを有する遺伝子トラップシステム。
【請求項２】
更に、前記選択された細胞のトラップベクターの近傍のＤＮＡをクローニングして塩基配列を得る段階を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記細胞がＥＳ細胞である請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
対象となる細胞で機能するプロモーター、１つめのＬｏｘＰ配列、薬剤耐性遺伝子、転写終結ＳＴＯＰ配列、二つめのＬｏｘＰ配列、及びレポーター遺伝子を順に連結したユニットを有するレポータベクター、及び、スプライシングアクセプター、ＩＲＥＳ、核局在シグナルを付加したＣｒｅ、一つめのスプライシングドナー、構成的発現遺伝子プロモーター、薬剤耐性遺伝子、及び二つめのスプライシングドナーを順に連結したユニットを有するトラップベクターから成る遺伝子トラップ用の１組のベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の１組のベクターにより形質転換された細胞又は該細胞を有する非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、所定の条件下で発現する遺伝子を探索する方法に関し、より詳細には、所定の条件下で一過性遺伝子発現をレポーター遺伝子の構成的発現として固定化する遺伝子トラップシステムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノム計画により、染色体のＤＮＡ塩基配列の全容がほぼ明らかとなったが、創薬分野、安全性試験分野に新局面を切り開くためには、生理機能に直結した機能遺伝子を網羅的に探索する必要がある。
従来より特定の細胞内で転写され機能する遺伝子（発現遺伝子）を網羅的に捕捉（トラップ）する方法として、エンハンサートラップ、プロモータートラップ、エクソントラップの３つの方法がある。しかしながら、これらの従来法では、トラップベクター自身にレポーター機能（遺伝子をトラップしたことを判定できる機能）が付加されていたため、構成的に安定して発現する遺伝子をトラップすることは可能であったが、細胞の分化・がん化など状態変化の過程で一過性に発現する遺伝子をトラップすることが不可能であった（非特許文献１）。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｎａｔｕｒｅ  １９９８  Ａｐｒ  ９；３９２（６６７６）：６０８−１１
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞の分化・がん化など状態変化の過程で一過性に発現する遺伝子を含むいかなる遺伝子をもトラップすることが可能な遺伝子トラップシステムを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明のシステムでは、バクテリオファージＰ１の遺伝子組み換え酵素Ｃｒｅ遺伝子を用いたトラップベクターにて遺伝子をトラップし、トラップした遺伝子の発現を別のレポーター遺伝子の構成的発現に変換する手法を採用した。その結果、従来法でトラップできる遺伝子に加えて、これまで不可能であった「細胞が生理状態を変化させるときに一過性に発現する遺伝子」を網羅的に探索可能となった。該システムによって、遺伝子発現の動的変化を捉えるデータベースを構築することができる。
【０００６】
本発明は、細胞をレポータベクターで形質転換する第１段階、前段階で得た組換え細胞を更にトラップベクターで形質転換する第２段階、前段階で得た細胞のうちレポータ活性を示さない細胞を選択する第３段階、前段階で選択した細胞を所定の条件に置く第４段階、及び前段階の細胞の中からレポータの活性を確認した細胞を選択する第５段階から成るシステムであって、前記レポータベクターが、その細胞で機能するプロモーター、１つめのＬｏｘＰ配列、薬剤耐性遺伝子、転写終結ＳＴＯＰ配列、二つめのＬｏｘＰ配列、及びレポーター遺伝子を順に連結したユニットを有し、前記トラップベクターが、スプライシングアクセプター（ＳＡ）、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）、核局在シグナルを付加したＣｒｅ（ｎｌ−Ｃｒｅ）、一つめのスプライシングドナー（ＳＤ）、構成的発現遺伝子プロモーター、薬剤耐性遺伝子、及び二つめのスプライシングドナー（ＳＤ）を順に連結したユニットを有する遺伝子トラップシステムである。
本システムは、更に、前記第５段階で選択された細胞のトラップベクターの近傍のＤＮＡをクローニングして塩基配列を得る第６段階を含んでもよい。
【０００７】
また、本発明は、対象となる細胞で機能するプロモーター、１つめのＬｏｘＰ配列、薬剤耐性遺伝子、転写終結ＳＴＯＰ配列、二つめのＬｏｘＰ配列、及びレポーター遺伝子を順に連結したユニットを有するレポータベクター、及び、スプライシングアクセプター（ＳＡ）、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）、核局在シグナルを付加したＣｒｅ（ｎｌ−Ｃｒｅ）、一つめのスプライシングドナー（ＳＤ）、構成的発現遺伝子プロモーター、薬剤耐性遺伝子、及び二つめのスプライシングドナー（ＳＤ）を順に連結したユニットを有するトラップベクターから成る遺伝子トラップ用の１組のベクターである。
本発明は更に、この１組のベクターにより形質転換された細胞又は該細胞を有する非ヒト動物である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のシステムは、トラップベクターとレポータベクターの２要素を有する。
（１）トラップベクター：ｐＭＩＥ
このトラップベクターの基本ユニットを図１に示す。この基本ユニットは構造的に大きく２つのユニットに分かれる。
前半部分は、スプライシングアクセプター（ＳＡ）、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）、核局在シグナルを付加したＣｒｅ（ｎｌ−Ｃｒｅ）、一つめのスプライシングドナー（ＳＤ）を順に連結したユニットである。
後半部分は、構成的発現遺伝子プロモーター（ＰＧＫ遺伝子プロモーターなど）、薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏなど）、二つめのスプライシングドナー（ＳＤ）の順に連結したユニットである。
なおこれらのユニットの各構成要素の間に機能的に影響のないＤＮＡ配列が挿入されていてもよい。
【０００９】
ＳＡ（スプライシングアクセプター）は、遺伝子の転写後制御のスプライシング（イントロンを切り出しアミノ酸をコードする部分を繋ぎ合わせるステップ）に必要なイントロンの下流側のシグナル配列である。
ＳＤ（スプライシングドナー）は、ＳＡ同様「スプライシング制御シス因子」でイントロン上流側の機能的配列である。
ＩＲＥＳは、たんぱく質合成を開始するためのリボソーム複合体の形成部位又は進入部位である。ＩＲＥＳは、ヒト脳心筋炎ウィルスの遺伝子の一部であり、市販されているベクターから相当部分をＰＣＲで増幅、単離したものを用いてもよい。
Ｃｒｅは、遺伝子組替え酵素である。
ＰＧＫ遺伝子プロモーターは、染色体の組み込み部位（トラップした場所）に影響されにくいハウスキーピング遺伝子のプロモーターである。
薬剤耐性遺伝子は、哺乳動物細胞が感受性を示す薬剤作用を打ち消す作用をもつ蛋白質の遺伝子であれば何でもよい。Ｎｅｏ耐性遺伝子は最も汎用されている。
この基本ユニットを適当なベクターに導入する。ベクターとしては、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＩＩ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等を用いてもよい。
【００１０】
トラップベクターは、機能的に以下の特徴を有する。
前半ユニットのスプライシングアクセプターにより、遺伝子のプロモータートラップに加えて５’（上流側）エクソントラップが可能となる。
ＩＲＥＳによりトラップした遺伝子の中ほどのトラップした場合も、メッセンジャーＲＮＡのキャップ構造を必要とする翻訳開始機構に依存しないＣｒｅ遺伝子の翻訳が保証されている。
後半ユニットの薬剤耐性遺伝子は、下流にスプラシングドナーを付加されてはいるがポリＡ付加シグナルを持たない。このため、細胞の薬剤耐性を選別指標に遺伝子の３’エクソントラップとポリＡ付加シグナルトラップを可能となる。また、トラップＥＳ細胞クローンより抽出したＲＮＡより、薬剤耐性遺伝子の配列をプライマーとし３’ＲＡＣＥによりトラップした遺伝子の一部を増幅し迅速に同定することを可能とする。
トラップベクター内にポリＡ付加シグナルを含まないことは、低バックグランドでのスクリーニングを可能とする。また、トラップＥＳ細胞クローンより抽出したＲＮＡより、３’ＲＡＣＥによりトラップした遺伝子の塩基配列の一部分を増幅し、同定可能とする。
【００１１】
（２）レポーターベクター：ｐＲＭＩＥ
このレポーターベクターは、図２に示すように、対象となる細胞で機能するプロモーター、１つめのＬｏｘＰ配列、薬剤耐性遺伝子、転写終結ＳＴＯＰ配列、二つめのＬｏｘＰ配列、及びレポーター遺伝子を順に連結したユニットを有する。なおこれらのユニットの各構成要素の間に機能的に影響のないＤＮＡ配列が挿入されていてもよい。
転写終結ＳＴＯＰ配列は、ストップコドンを含む遺伝子（ｃＤＮＡ）やポリＡ付加シグナルでもよい。市販品ベクターの一部を流用してよく、これらはポリＡ付加シグナルや翻訳停止コドンを含んでいる。
この基本ユニットを適当なベクターに導入する。ベクターとしては、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＩＩ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等を用いてもよい。
【００１２】
本発明の方法は、以下の段階から成る：
第１段階：この段階では、上記レポーターベクターを検査対象の細胞株、例えば、分化や細胞のがん化など２つ状態を変化し得る細胞株、に組み込んで細胞株を樹立する。対象となる細胞はいかなる細胞でもよいが、特に、胚性幹細胞ＥＳ細胞に用いる場合、以下の三重の利点を発揮する。
ＥＳ細胞が多様な細胞型に分化する条件下で一過性に発現する細胞分化の鍵となる遺伝子の探索が可能である。
トラップされた遺伝子は、通常、機能異常（欠損又は低下）を来たすため、トラップＥＳ細胞クローンを用いて突然変異動物の作製することが可能である。
本発明におけるトラップベクターの構造から、Ｃｒｅ遺伝子がトラップされた遺伝子の発現にとって代わるため、トラップＥＳ細胞クローンを用いて作製された動物は「Ｃｒｅ動物」（組織・細胞型特異的に遺伝子組み換えを行うのに必要な動物）として活用することが可能である。
【００１３】
第２段階：この段階では前段階で得た組換え細胞に上記トラップベクターを導入する。
第３段階：前段階で得た細胞のうちレポーター活性を示さない細胞を選択する。
第４段階：前段階で得た細胞を所定の条件に置く。細胞をこのような条件に置くことにより発現する、特に一過性に発現する遺伝子を調べることができる。
第５段階：前段階の細胞の中からレポータの活性を確認した細胞を選択する。この段階ではレポータ遺伝子の性質に応じた適当な方法によりその活性を確認すればよい。
第６段階：前段階で選択された細胞のトラップベクターの近傍のＤＮＡをクローニングして塩基配列を得る。この段階も常法により行えばよい。なお第５段階で選択された細胞のみの取得を目的とする場合には、この段階は省略してもよい。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１  トラップベクターの構築
米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のクローニング用ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（−）のＸｂａＩ−ＳａｌＩ間に、スプライシングアクセプター（ＳＡ）、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）、核局在シグナルを付加したＣｒｅ（ｎｌ−Ｃｒｅ）、スプライシングドナー（ＳＤ）、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏなど）、スプライシングドナー（ＳＤ）の順に連結したトラップベクター（ｐＭＩＥ−ｎｌＣｒｅ、図１）を作製した。
スプライシングアクセプターとして、リアノジン受容体２型遺伝子の第２エクソンのアクセプター部位（約５０塩基対のＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片、米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社の市販ゲノミックライブラリー「ＬａｍｄａＦＩＸＩＩ」より単離・精製したもの、配列番号１）を用いた。
ＩＲＥＳとしては、市販のｐＣＩＴＥ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）より相当部分を配列番号２及び配列番号３に示すプライマーを用いてＰＣＲ法にて増幅した断片を用いた。
【００１５】
Ｃｒｅ遺伝子には、遺伝子組み換えＣｒｅたんぱくが細胞核内で機能することを考慮し、その翻訳開始点をコードする配列の上流にＳＶ４０ウイルスＴ抗原の核局在シグナル（配列番号４）を付加した遺伝子（ｎｌ−Ｃｒｅ）を用いた。
ＰＧＫ  プロモーターは、組み込み部位の転写制御に影響を与えないマウスのフォスフォグリセロカイネース遺伝子のプロモーターを用いた。
スプライシングドナーとしては、ｐＯＧ４４（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ  Ｓ，  Ｆｏｘ  ＤＴ，  Ｗａｈｌ  ＧＭ（１９９１），  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１（４９９９）  １３５１−１３５５  ）の合成イントロンより、ＸｂａＩ−ＳａｃＩＩ断片をＰＣＲ法にて増幅した断片を用いた（配列番号５）。
細胞導入前にトラップベクターのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（−）部分を切り離すために、合成オリゴマー（配列番号６）を用いて、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（−）のＳｐｅＩをＰｍｅＩに変換した。
【００１６】
実施例２  レポーターベクター（ｐＲＭＩＥ−ｎｌＬａｃＺ）の構築
レポーターベクターｐＲＭＩＥ−ｎｌＬａｃＺは、クローニング用ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（−）のＮｏｔＩ−ＳａｌＩ間に、すべてのタイプの細胞で機能するＣＡＧプロモーター、１つめのＬｏｘＰ配列、ピューロマイシン耐性（Ｐａｃ）遺伝子、転写終結ＳＴＯＰ配列、二つめのＬｏｘＰ配列、大腸菌べータガラクトシダーゼ遺伝子、ポリＡ付加シグナルの順に挿入・連結して作製した（図３）。
ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウィルスのエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ウサギβグロビンのエクソンからなる合成プロモーターである。ＳＴＯＰ配列は、ｐＢＳ３０２（ＧＥＮＥＢＡＮＫ番号Ｕ５１２２３）由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａＭＨＩ断片（約１．３ＫＢ））である。
大腸菌べータガラクトシダーゼ遺伝子には、核局在シグナルを付加したものを用いた。
この構造によって、Ｃｒｅたんぱく質があると、ＬｏｘＰ配列間で組換えが起こりＳＴＯＰ配列が切り出され、下流域のべータガラクトシダーゼ遺伝子の転写がおこる。
【００１７】
実施例３  ＥＳ細胞へのレポーターベクターの導入とレポーター細胞の選別
ＥＳ細胞としてはＲＷ４（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。細胞培養及びターゲティングの操作は基本的に既報に記載の方法（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．，  １２２（１１），  ３５８７−９５  （１９９６））に従った。
５０００万個のＥＳ細胞とＮｏｔＩとＳａｌＩで切断した５０μｇのレポーターベクターを０．８ｍ１の緩衝液中で混ぜ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＧｅｎｅ  Ｐｕ１ｓｅｒ（４００Ｖ，２５μＦ，電極幅０．４ｃｍ）を用いた電気パルス法により細胞にＤＮＡを導入した。電気パルスをかけた後、細胞を、１０ｃｍシャーレの底面に単層培養したフィーダー細胞上に培養した。フィーダー細胞としては、胎生期１２．５日めの胎児の線維芽細胞を０．１ｍｇ／ｍ１のマイトマイシンＣで２時間処理し不活性化して分裂停止状態にした細胞を用いた。培養開始２４時間後、６０時間後、９６時間後に、抗生物質ピューロマイシンを１．３３μｇ／ｍ１の濃度で添加・１２時間培養・洗浄・正常培地培養の操作を反復することによって、レポーターベクターを染色体に取り込んだピューロマイシン耐性ＥＳ細胞クローンの選別を行った。
【００１８】
培養開始７目後、ピューロマイシン耐性のコロニー約２００クローンを９６穴プレートに移し、さらに培養を続け、十分に増殖したところで、３枚の９６穴プレートに分けた。さらに増殖させ、１枚は零下８５度冷凍庫で保存用に、１枚はそのままベータガラクトシダーゼ活性検出用に、もう１枚はＣｒｅ発現ベクターｐＢＳＣＡＧＣｒｅ導入後にベータガラクトシダーゼ活性検出用に使用した。
レポーター細胞における大腸菌べータガラクトシダーゼ遺伝子は、上流の２つのＬｏｘＰ配列にはさまれているピューロマイシン遺伝子とＳＴＯＰ配列のためサイレントであり、たんぱく質への翻訳はされず、従って、Ｃｒｅ非発現レポーター細胞では大腸菌べータガラクトシダーゼ活性は検出されない。Ｃｒｅ発現ベクター導入後にのみベータガラクトシダーゼ活性を示す細胞クローンのうち数クローンを選別し遺伝子トラップ用のレポーターＥＳ細胞として増殖して凍結保存した。Ｃｒｅ強制発現ベクターｐＢＳＣＡＧＣｒｅの細胞への導入は、Ｒｏｓｃｈ社のＦｕｇｅｎｅキットを用いて行った。
【００１９】
実施例４  レポーターＥＳ細胞への遺伝子トラップベクター導入と遺伝子トラップが起こった細胞候補の選別
この段階における各工程の現象を表す模式図を図４に示す。
レポーターＥＳ細胞５０００万個に、ＰｍｅＩとＳａｌＩでリニアに切断したｐＭＩＥトラップベクター５０μｇをＢｉｏ−Ｒａｄ社のＧｅｎｅ  Ｐｕ１ｓｅｒ（４００Ｖ，２５μＦ，電極幅０．４ｃｍ）を用いた電気パルス法によって導入した。遺伝子導入２４時間後に、抗生剤Ｇ４１８を１６０μｇ力価／ｍ１の濃度で添加し、選別を開始した。培養開始後７目めに、Ｇ４１８耐性のコロニー約２００クローンを９６穴プレートに移し、さらに培養を続け、十分に増殖させた。
この段階で、各細胞クローンのＧ４１８耐性は、トラップベクターがＮｅｏ遺伝子下流に付加した２番目のスプライシングドナーを介してある遺伝子のエクソンを捕らえたか、あるいは直接にポリＡ付加シグナルを捕らえ、Ｎｅｏ遺伝子から安定して転写・翻訳が起こっていることを保証するものである。
【００２０】
次に、１枚につき３枚の９６穴プレートに分けレプリカを作製した。さらに増殖させ、１枚（図４左）は零下８５度冷凍庫で保存用に、１枚（図４中）はそのままベータガラクトシダーゼ活性検出用に、もう１枚（図４右）は分化誘導後にベータガラクトシダーゼ活性検出用に使用した。
【００２１】
次に、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化誘導とＬａｃＺ染色を、既報に記載の方法（Ｇａｊｏｖｉｃ  Ｓ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４２（１），  １３８−１４３  （１９９８））に従って行った。
上記９６穴プレートの１枚（図４中）について、４％パラホルムアルデヒドで固定しＬａｃＺ染色を行い、ＬａｃＺ陽性細胞の有無をたしかめた。図４中において、Ａ印はＬａｃＺ陽性を示したものを表す。
【００２２】
次に、  上記９６穴プレートの別の１枚（図４右）について、フィーダー細胞上で十分に増殖させた後、かるくトリプシン処理をし、非コート培養皿で培養し、胚様体を形成させて４日間、０．００１ｍＭレチノイン酸を含むＤＭＥＭ培養液（５％牛胎児血清）で培養した。後、ゼラチンコートした培養皿に移し４日間培養した。胚葉体は、培養皿の表面に付着しその構造を崩しながら神経をはじめ様々な細胞型に分化する。その後、４％パラホルムアルデヒドで固定しＬａｃＺ染色を行い、ＬａｃＺ陽性細胞の有無をたしかめた。培養皿に付着した細胞の一部がＬａｃＺ活性陽性であることを確認した。図４右において、Ａ印とＢ印はＬａｃＺ陽性を示したものを表す。
【００２３】
上記２枚にプレート（図４中と右）において、分化誘導後にのみＬａｃＺ陽性を示す細胞（即ち、図４右のＢ印）の写真を図５に示す。この細胞では、トラップベクターのＣｒｅ遺伝子がＥＳ細胞の分化過程又は分化誘導後に発現する遺伝子がトラップされたことを示している。
【００２４】
実施例５  ＲＴ−ＰＣＲによるトラップした遺伝子の同定
基本的に、既報に記載の方法（Ｆｒｏｈｍａｎ  Ｍ．Ａ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５（２３）：８９９８−９００２  （１９８８））に従った。
本トラップベクターのＰＧＫプロモーターは構成的転写活性を有するため、抗生物質Ｇ４１８耐性の細胞中には、細胞の分化・未分化に関係なく、Ｎｅｏ遺伝子の転写物が存在する。また、本トラップベクターの特性上、Ｎｅｏ配列とポリＡ配列の間にはトラップされた遺伝子由来の配列が存在する。従って、大量培養可能な未分化ＥＳ細胞トラップクローンよりＲＮＡを抽出し、Ｎｅｏ遺伝子転写物のポリＡ配列とＮｅｏ遺伝子配列間をＰＣＲによって増幅することによってトラップした遺伝子を同定・解析できる。
【００２５】
トリゾールキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＥＳ細胞トラップクローンよりＲＮＡを抽出した。これを鋳型とし、ｄＴ１７アダプタープライマー（配列番号７）を用いて逆転写反応を行ないｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成は、Ｐｒｏｍｅｇａ社のｃＤＮＡ合成キットを用いて行なった。合成したｃＤＮＡの一部を、アダプタープライマー（配列番号８）とＮｅｏ遺伝子の配列の一部であるプライマー（ＮＥＯ第一プライマー、配列番号９）用いて第一段階めのＰＣＲ反応を行なった。さらに、増幅効率と純度を高めるため、第二段階めのＰＣＲを、アダプタープライマー（配列番号１０）と第一プライマーの下流の配列からなるＮＥＯ第二プライマー（配列番号１１）を用いて行なった。
以上によって、同定された遺伝子は、新規配列（ここでは示さない。）を有する遺伝子であり、システムが機能しうることが確認された。
【００２６】
【配列表】
2004275037.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【図１】トラップベクターの基本ユニットを示す図である。
【図２】レポーターベクターの基本ユニットを示す図である。
【図３】実施例２で構築したレポーターベクターの基本ユニットを示す図である。
【図４】実施例４における各工程の現象を表す模式図を示す図である。Ａ印とＢ印はＬａｃＺ陽性を示したものを表し、Ｂ印の細胞では、トラップベクターのＣｒｅ遺伝子がＥＳ細胞の分化過程で発現する遺伝子がトラップされたことを示す。
【図５】分化誘導後にのみＬａｃＺ陽性を示す細胞の写真を示す図である。細胞塊の中心部（矢印）にＬａｃＺ陽性の細胞集団が認められる。色は濃い青色である。この細胞は、図４右のＢ印のものに相当する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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