(57)【要約】      （修正有）【課題】アルカン分解環境試料中で優占化する高アルカン分解能を有する細菌を計測することによって、当該環境試料のアルカン分解能を評価する。【解決手段】本発明は、環境試料中に存在する下記（１）〜（２）：（１）石油に由来する少なくとも１種のアルカンについて高分解能を有し；且つ（２）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓの１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に対して少なくとも９３％の相同性を持つ１６ＳｒＲＮＡを有するか、且つ／又はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓのｇｙｒＢの塩基配列に対して少なくとも８４％の相同性を持つｇｙｒＢＤＮＡを有する；の性質を有するアルカン分解細菌の菌数を測定することによって、該環境試料のアルカン分解能を評価する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境試料中に存在する下記（１）〜（２）の性質を有するアルカン分解細菌の菌数を測定することによって、該環境試料のアルカン分解能を評価する方法：
（１）石油に由来する少なくとも１種のアルカンについて高分解能を有し；且つ（２）配列番号１〜３のいずれか１つの塩基配列に対して少なくとも９３％の相同性を持つ１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するか、且つ／又は配列番号４〜１１のいずれか１つの塩基配列に対して少なくとも８４％の相同性を持つｇｙｒＢ  ＤＮＡを有する。
【請求項２】
前記（１）の性質は、炭素数１０〜３６を有する少なくとも１種の直鎖状ノルマルアルカンについて高分解能を有し、且つ／又は分岐鎖状アルカンのうちの少なくとも１種のプリスタン又はフィタンについて高分解能を有することである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号１２〜１９のいずれか１つの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を含む核酸を使用することによって、前記環境試料から、該配列番号１〜１１のいずれか１つの塩基配列の少なくとも一部分を検出することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
環境試料に由来するアルカン分解細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ及び／又はｇｙｒＢ  ＤＮＡを標的として、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのプライマー対を使用して定量的ＰＣＲ法を行い、それにより増幅された核酸の量を測定し、そして、該測定値に基づいて、該環境試料中に存在する前記一定の性質を有するアルカン分解細菌の菌数を求めることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号１２の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記環境試料が、石油類を含む環境試料である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
下記（ｅ）〜（ｌ）のいずれか１つの塩基配列を有するオリゴヌクレオチド：
（ｅ）配列番号１２の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｆ）配列番号１３の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｇ）配列番号１４の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｈ）配列番号１５の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；又は
（ｉ）配列番号１６の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｊ）配列番号１７の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｋ）配列番号１８の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；又は
（ｌ）配列番号１９の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列。
【請求項７】
下記（ｍ）〜（ｐ）のいずれかに記載の一組の塩基配列を有するプライマー対：
（ｍ）請求項６に記載の（ｅ）と（ｆ）の一組の塩基配列；
（ｎ）請求項６に記載の（ｇ）と（ｈ）の一組の塩基配列；
（ｏ）請求項６に記載の（ｉ）と（ｊ）の一組の塩基配列；又は
（ｐ）請求項６に記載の（ｋ）と（ｌ）の一組の塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境試料のアルカン分解能の評価法及びそのためのオリゴヌクレオチドに関し、より詳細には、石油類に汚染された環境の微生物浄化に有用な環境試料のアルカン分解能の評価法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
石油類による環境汚染は、船舶事故等による原油あるいは燃料油の流出による広域の海洋汚染が良く知られているが、陸上においてもパイプラインの破損や貯蔵タンクからの漏洩、汚染廃水の排出等により土壌、河川水、地下水などが汚染された例が数多く報告されている。諸外国では石油汚染が土壌・地下水汚染の大きな原因となっており、アメリカでは有機化合物による土壌・地下水汚染の約８０％が石油由来のものであることが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
近年、種々の有害物質による土壌、河川水、地下水などの環境汚染を浄化する技術が開発されてきた。微生物による浄化法は分解できる物質の種類や濃度が限定されるものの、常温・常圧の穏やかな条件下で、対象汚染物質を無害な化合物にまで分解できるため、他の浄化法と比較して低コストで浄化が可能な方法として注目されている。
【０００４】
微生物による浄化法としては、浄化対象の環境中に存在している土着の微生物群を利用する方法（バイオスティミュレーション）が用いられる。他方、土着の微生物群中に汚染物質分解菌が存在しない場合は浄化対象の環境中に分解菌を添加する方法（バイオオーグメンテーション）が用いられる。
【０００５】
一般に微生物による浄化法を適用する際には、対象とする汚染環境中から土壌や水などの試料を採取し、土着の微生物を利用するバイオスティミュレーションを前提とした分解実験（トリータビリティ試験）を行う。すなわち、採取した環境試料に適正量の栄養塩類や必要に応じて炭素源を添加し、実際の施工時に近い環境条件で培養し、土着微生物群による汚染物質の分解性を確認する。しかしながら、石油汚染浄化を対象としたトリータビリティ試験の場合、５〜６週間以上あるいは数ヶ月にも及ぶ試験期間を要していた。
【０００６】
また、環境試料に含まれる石油分解細菌を確認する、或いはその分解能を評価するためには、環境試料から石油分解細菌を分離して菌数やその種類を調査する必要がある。
【０００７】
従来、石油分解細菌の菌数測定方法としては、油を含む寒天培地（プレート）を用い、そこに形成されるコロニー数を計測する方法が一般的であった（非特許文献２）。更に石油分解細菌の種類を同定する場合、逐一、各コロニーから特定遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定するなどの手間を要する。
【０００８】
他方で、近年における分子生物学的解析手法の発達により、環境試料中の遺伝子を調べることで、より短期間で分解細菌の存在を把握する方法が開発されてきた（非特許文献３）。
【０００９】
【本発明が解決しようとする課題】
上記のような従来の菌数計測法では、細菌群を系統学的に属や種レベルで分類し、計測することはできない。特に、寒天培地上でコロニーを形成できる細菌は、全生菌のわずか１％程度であるため、正確な菌叢構造の把握は困難であり、コロニーの形成にも数日間を要するため、時間的にも不利な手法であった。
【００１０】
また、アルカン分解細菌が存在する環境試料中の核酸を調べるとしても、アルカン分解細菌のみを属や種レベルで分類して検出することは容易でなかった。すなわち、石油類はその構成成分が多岐にわたり且つ汚染サイトによりその汚染成分が大きく異なるという特徴があり（非特許文献４）、このため個々の石油構成成分にそれぞれ対応する分解細菌の割合も小さいうえに多種類にわたる可能性が高い。このような環境試料から一定の性質を有するアルカン分解細菌を選択的に検出し定量するには、その試料中でもそれら細菌の分子系統学的側面について十分な検討がなされなければならない。
【００１１】
結局、従来の分子生物学的解析手法では、微生物由来の遺伝子を短時間で一網打尽に検出できるが、アルカン分解細菌が生息するような複雑な微生物群集構造から一定の性質を有するアルカン分解細菌を検出する場合に直ちに有効であるとは言えない（非特許文献５）。
【００１２】
上述のような技術背景の中で、本発明者等は、高効率石油汚染浄化技術開発のために環境試料中の微生物群集構造と試料の石油分解能との関連を調査したところ、アルカン分解能が高かった土壌においてＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  属に近縁な或る一群の細菌群が優占化することを見出し、これら細菌群は石油に多く含まれるアルカンの分解に有効に作用することを発見した（非特許文献６）。
【００１３】
上記のようなアルカン分解細菌を特異的に検出・定量することができれば、バイオレメディエーションによる環境修復を高効率化でき、また、予め石油汚染試料についてアルカン分解能を迅速かつ確実に把握することが可能になると考えられた。
【００１４】
本発明の目的は、アルカン分解環境試料中で優占化する高アルカン分解能を有する細菌をその遺伝子情報等に基づいて検出し、その環境試料中に存在するアルカン分解細菌を計測することによって、当該環境試料のアルカン分解能を評価する方法等を提供することにある。
【００１５】
また本発明の更なる目的は、遺伝子工学的手法を用いてアルカン分解環境試料から所望のアルカン分解細菌を迅速、簡便、特異的且つ／又は定量的に検出することによる上記方法等を提供することにある。
【００１６】
【非特許文献１】
日本地盤環境浄化推進協議会監修、土壌・地下水汚染の実態とその対策，  オーム社出版，  ｐ２８，  ２０００
【非特許文献２】
Ｉｓｈｉｈａｒａ，  Ｍ．，  Ｓｕｇｉｕｒａ，  Ｋ．，  Ａｓａｕｍｉ，  Ｍ．，  Ｇｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｓａｓａｋｉ，  Ｅ．，  Ｈａｒａｙａｍａ，  Ｓ．，  １９９５，  Ｏｉｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｃｏｓｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｓｏｃｏｓｍｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ，  ｐ１０１−１１６，  ｅｄｕｔｅｄ  ｂｙ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．  Ｈｉｎｃｈｅｅ，  Ｆｒｅｄ  Ｊ．  Ｂｒｏｃｋｍａｎ，  Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｍ．  Ｖｏｇｌｅ．
【非特許文献３】
Ａｍａｎｎ，  Ｒ．  Ｉ．，  Ｌｕｄｗｉｇ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，  Ｋ．  Ｈ．  （１９９５）Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５９  ：  １４３−１６９
【非特許文献４】
Ｗａｎｇ，  Ｚ．，  Ｍ．  Ｆｉｎｇａｓ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｋｅｎ  ：  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｓｃｉ．，  ３２，  ３６７，  １９９４
【非特許文献５】
Ｋａｓａｉ，  Ｙ．，  Ｋｉｓｈｉｒａ，  Ｈ．，  Ｓｙｕｔｓｕｂｏ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｈａｒａｙａｍａ，  Ｓ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｒｉｎｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｂｅａｃｈｅｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｎａｋｈｏｄｋａ  ｔａｎｋｅｒ  ｏｉｌ−ｓｐｉｌｌ  ａｃｃｉｄｅｎｔ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ｖｏｌ．  ３（４），  ２４６−２５５，  ２００１
【非特許文献６】
珠坪  一晃，  輕部  真起子，  宮  晶子，  谷口  紳，  日本水環境学会年会講演集，  ２００２，  ｐ３９９
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、アルカン分解能の高い土壌中に優占化する幾つかの細菌群の発見に続き、それら細菌群の一定の特徴に着目することで、環境試料のアルカン分解能を効率的に評価できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１８】
すなわち、本発明は、環境試料中に存在する下記（１）〜（２）の性質を有するアルカン分解細菌の菌数を測定することによって、該環境試料のアルカン分解能を評価する方法を提供する。
（１）石油に由来する少なくとも１種のアルカンについて高分解能を有し；且つ（２）配列番号１〜３のいずれか１つの塩基配列に対して少なくとも９３％の相同性を持つ１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するか、且つ／又は配列番号４〜１１のいずれか１つの塩基配列に対して少なくとも８４％の相同性を持つｇｙｒＢ  ＤＮＡを有する。
【００１９】
前記（１）の性質は、炭素数１０〜３６を有する少なくとも１種の直鎖状ノルマルアルカンについて高分解能を有し、且つ／又は分岐鎖状アルカンのうちの少なくとも１種のプリスタン又はフィタンについて高分解能を有する評価法が好ましい。
【００２０】
特に、配列番号１２〜１９のいずれか１つの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を含む核酸を使用することによって、前記環境試料から、該配列番号１〜１１のいずれか１つの塩基配列の少なくとも一部分を検出する評価法が好ましい。
【００２１】
本評価法の一態様は、環境試料に由来するアルカン分解細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ及び／又はｇｙｒＢ  ＤＮＡを標的として、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのプライマー対を使用して定量的ＰＣＲ法を行い、それにより増幅された核酸の量を測定し、そして、該測定値に基づいて、該環境試料中に存在する前記一定の性質を有するアルカン分解細菌の菌数を求めることを含む方法である。
（ａ）配列番号１２の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【００２２】
本評価法において、前記環境試料が、石油類を含む環境試料であることが好ましい。
また、本発明は、下記（ｅ）〜（ｌ）のいずれか１つの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
（ｅ）配列番号１２の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｆ）配列番号１３の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｇ）配列番号１４の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｈ）配列番号１５の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；又は
（ｉ）配列番号１６の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｊ）配列番号１７の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｋ）配列番号１８の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；又は
（ｌ）配列番号１９の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列。
【００２３】
また、プライマーとして好ましい本発明のオリゴヌクレオチドは、下記（ｍ）〜（ｐ）のいずれかに記載の一組の塩基配列を有するプライマー対である。
（ｍ）上記（ｅ）と（ｆ）の一組の塩基配列；
（ｎ）上記（ｇ）と（ｈ）の一組の塩基配列；
（ｏ）上記（ｉ）と（ｊ）の一組の塩基配列；又は
（ｐ）上記（ｋ）と（ｌ）の一組の塩基配列。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明による環境試料のアルカン分解能の評価方法
アルカン分解細菌の発見
上述のように本発明者等は、数種類の履歴の異なる土壌を用いたラボスケールの石油の分解実験を行って、環境試料に生息する微生物群集の構造と試料の石油分解能との関連を調査した結果、アルカン分解能が高かった土壌から、そこに優占化していたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  属に近縁な細菌群を分離した。
分離された細菌のアルカン分解能
それら細菌群の石油分解特性を評価するために、原油を用いた石油分解実験（原油濃度１  ｍｇ／ｍｌ，  温度２８℃、２週間振とう培養）を行い、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）により、原油に含まれる主要アルカン類の分解の様相を調査した。その結果、それら細菌群は、原油初期濃度を１００％としたときに、炭素数１０〜３６の直鎖状ノルマルアルカンについては、成分ごとに少なくとも７０％以上の分解能を有し、さらには原油に多く含まれると考えられる分岐鎖状アルカンの一種であるプリスタンあるいはフィタンについても分解能を有した。これらの細菌群は、アルカン成分の総量としては、９０％以上のアルカン分解率を示し、非常に高いアルカン分解能を持っていることが分かった。
【００２５】
本発明は、石油分解処理に利用される石油含有環境試料に存在する上記高アルカン分解能を有する細菌群の菌数を測定し、その環境試料のアルカン分解能を評価することに向けられている。
分離されたアルカン分解細菌の分子系統学的側面
上記高アルカン分解細菌群を分子系統学的側面から定義するために、それらのうち代表的な株について１６Ｓ  ｒＤＮＡ  （１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子）及びｇｙｒＢ  ＤＮＡ（ジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子）の各塩基配列（それぞれ配列番号１〜３及び配列番号４〜１１に記載される）を決定した。それら塩基配列は、遺伝子解析ソフトｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．  １９９４．  ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  ２２．  ４６７３−４６８０）を用いて系統解析に供された。その系統解析の結果に基づき系統樹が作成された。
【００２６】
図１は１６Ｓ  ｒＤＮＡ情報解析に基づく系統樹を示し、図２はｇｙｒＢ  ＤＮＡ情報解析に基づく系統樹を示す。
図１に示されるように、１６Ｓ  ｒＤＮＡの解析によると各アルカン分解細菌は３つのクラスター（群集）▲１▼〜▲３▼に分類された。図１中のクラスター▲１▼において、Ｍ−１株、Ｍ−５株、Ｍ−１３株、Ｍ−１６株、Ｋ−１株およびＫ−９株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、すべての菌株が１５１１塩基の同一の塩基配列を有していた。それらクラスター▲１▼の株は、最も近縁な細菌と考えられるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ６７−ＢＥＮ００１  （ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ０４４０９６）の１６Ｓ  ｒＤＮＡの１４７４塩基との間で１４７４塩基が同一であり、１００％の相同性を示した。図１中のクラスター▲２▼において、Ｍ−１５株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは１５１１塩基からなり、最も近縁な細菌と考えられるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｓ９  （ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ２６０７１３）の１６Ｓ  ｒＤＮＡの１４７３塩基との間で１４７１塩基が同一であり、９９％の相同性を示した。そして、図１中のクラスター▲３▼において、Ｍ−６株およびＭ−１４株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは同一の１５１４塩基からなり、最も近縁な細菌と考えられるＷｉｌｌｉａｍｓｉａ  ｍｕｒａｌｅ  （ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｙ１７３８４）の１６Ｓ  ｒＤＮＡの１４６５塩基との間で１４６５塩基が同一であり、１００％の相同性を示した。
【００２７】
上記のような１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析から、それらアルカン分解細菌株間は、１６Ｓ  ｒＤＮＡについて、互いに少なくとも９３％の相同性を持つ集団であることが分かった。
また、各クラスターに位置する菌株とクラスター外の最も近縁な細菌との間には、概ね次のような関係にある。すなわち、クラスター▲１▼の代表株Ｍ−１３は、クラスター▲１▼以外の最も近縁なクラスターの代表株Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｓ９との間で９７％未満の相同性、クラスター▲２▼の代表株Ｍ−１５は、クラスター▲２▼以外の最も近縁なクラスターの代表株Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ６７−ＢＥＮ００１との間で９８％未満の相同性、そして、クラスター▲３▼の代表株Ｍ−１４は、クラスター▲３▼以外の最も近縁なクラスターの代表株Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉとの間で９６％未満の相同性が示される。
【００２８】
他方、ｇｙｒＢ  ＤＮＡの解析結果について図２に示されるように、それらアルカン分解細菌株間は、３つのクラスター▲４▼〜▲６▼に分類された。図２中のクラスター▲４▼において、Ｍ−１株、Ｋ−１株、Ｋ−９株、Ｍ−５株、およびＭ−１６株のｇｙｒＢ  ＤＮＡはすべて同一の１２３６塩基からなり、またＭ−１３株については、１２３９塩基のｇｙｒＢ  ＤＮＡからなっており、このクラスターに含まれる菌株は、９９％以内の相同性を示した。クラスター▲４▼の菌株についてＭＢＩＣ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈ  （ｈｔｔｐ：／／ｓｅａｓｑｕｉｒｔ．ｍｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｉｃ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐａｇｅ＝ｂｌａｓｔ）により相同性検索をしたところ、最も近縁な細菌と考えられるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＢＩＣ０１３３７  （ＩＣＢ  ｎｕｍｂｅｒ  ｇｙ１０２６４）のｇｙｒＢ  ＤＮＡの１２３２塩基のうち１２１６塩基が同一であり、９８％の相同性を示した。クラスター▲５▼においては、Ｍ−６株およびＭ−１４株はそれぞれ１１００塩基および１１０１塩基からなり、これらの菌株の相同性は９９％以内であった。クラスター▲５▼の菌株についてＭＢＩＣ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈにより相同性検索をしたところ、最も近縁な細菌と考えられるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＢＩＣ０１３３７  （ＩＣＢ  ｎｕｍｂｅｒ  ｇｙ１０２６４）のｇｙｒＢ  ＤＮＡの５３９塩基のうち４５４塩基が同一であり、８４％の相同性を示した。さらに、クラスター▲６▼においては、Ｍ−１５株が１２０７塩基からなり、ＭＢＩＣ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈにより相同性検索をしたところ、最も近縁な細菌と考えられるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＢＩＣ０１４５２  （ＩＣＢ  ｎｕｍｂｅｒ  ｇｙ１１１５８）のｇｙｒＢ  ＤＮＡの８２２塩基のうち７２９塩基が同一であり、８８％の相同性を示した。
【００２９】
上記のようなｇｙｒＢ  ＤＮＡ解析から、それらアルカン分解細菌株間は、ｇｙｒＢ  ＤＮＡについて、互いに少なくとも８４％の相同性を持つ集団であることが分かった。
以上説明した系統学的側面から、本明細書で定義される検出対象の「アルカン分解細菌」とは、所望のアルカン分解細菌の代表株であるＭ−１株、Ｍ−５株、Ｍ−６株、Ｍ−１３株、Ｍ−１４株、Ｍ−１５株、Ｍ−１６及びＫ−１株に加えて、系統学的にそれらのいずれか１株と同じグループに属し且つそれらと同等の性質を持つ同種類縁のアルカン分解細菌を含む概念として定義される。
【００３０】
より具体的には、配列番号１〜３の一部ないし全部の塩基配列と少なくとも９３％の相同性、好ましくは少なくとも９６〜９９％の相同性がある１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するアルカン分解細菌群（すなわち、クラスター▲１▼を代表する配列番号１の塩基配列と少なくとも９７％の相同性、クラスター▲２▼を代表する配列番号３の塩基配列と少なくとも９８％の相同性、及び／又はクラスター▲３▼を代表する配列番号２の塩基配列と少なくとも９６％の相同性がある１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するアルカン分解細菌群）であり、且つ／又は、配列番号４〜１１の一部ないし全部の塩基配列と少なくとも８４％の相同性、好ましくは少なくとも８８〜９９％の相同性があるｇｙｒＢ  ＤＮＡを有するアルカン分解細菌群（すなわち、クラスター▲４▼を代表する配列番号４〜８の塩基配列と少なくとも９８％の相同性、クラスター▲５▼を代表する配列番号１０の塩基配列と少なくとも８４％の相同性、及び／又はクラスター▲６▼を代表する配列番号１１の塩基配列と少なくとも８８％の相同性があるｇｙｒＢ  ＤＮＡを有するアルカン分解細菌群）であると定義される。
本発明による環境試料のアルカン分解能についての評価法
本発明者等の検討によれば、環境試料のアルカン分解能は、石油含有環境試料中で優占化する細菌群の当該環境試料中の存在量（典型的には、細菌の細胞数である）に相関する。すなわち、環境試料のアルカン分解能の評価法であって、環境試料中に存在するそれら高アルカン分解能を有する細菌群を検出、定量することを含む評価法を提供する。
【００３１】
そのような評価法は、好ましく高いアルカン分解能を持つ細菌群としての菌学的特徴と、それら細菌群の分子系統学的特徴とを特定することによって、当該環境試料から目的のアルカン分解細菌をほぼ網羅的に且つほぼ特異的に検出することに依拠する。
【００３２】
第１に、本発明の評価法の検出対象である細菌は、上述のアルカン分解能力の側面から見た次の性質（１）を有する：
（１）石油に由来する少なくとも１種のアルカンについて高分解能を有し、好ましくは、炭素数１０〜３６を有する少なくとも１種の直鎖状ノルマルアルカンについて高分解能を有し、且つ／又は分岐鎖状アルカンのうちの少なくとも１種のプリスタン又はフィタンについて高分解能を有する。
【００３３】
本明細書内で言及される「アルカン分解能が高い」或いは「高分解能を有する」とは、原油初期濃度を１００％としたときに、炭素数１０〜３６の直鎖状ノルマルアルカンについては、成分ごとに少なくとも７０％以上の分解能を有し、且つ／又は分岐鎖状アルカンのプリスタンあるいはフィタンについても分解能を有し、アルカン成分の総量としては、９０％程度の分解率を示すと定義される。
【００３４】
第２に、本発明の評価法の検出対象である細菌は、上述のアルカン分解細菌の分解能力に加えて、分子系統学的側面から見た次の性質（２）をも有する：
（２）配列番号１〜３の一部ないし全部の塩基配列に対して、少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９６〜９９％の相同性を持つ１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するか、且つ／又は、配列番号４〜１１の一部ないし全部の塩基配列に対して、少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８８〜９９％の相同性を持つｇｙｒＢ  ＤＮＡを有する。
【００３５】
このように１６Ｓ  ｒＤＮＡ及びｇｙｒＢ  ＤＮＡについての分子系統学的特徴を利用することで、複雑な微生物群構造を持つ石油含有環境試料の中から高アルカン分解能を有する目的の細菌群を確実且つ効率的に検出することができる。
【００３６】
本評価法のより好ましい一態様は、上記（１）及び（２）の性質を有するアルカン分解細菌の菌数を定量的に検出し、その定量値が、当該環境試料のアルカン分解能に対応する基礎データを提供するものである。すなわち、上述のようにして得られたアルカン分解細菌についての菌数定量値は、石油で汚染された試料等における当該環境試料のアルカン分解能を表す基礎データとして位置づけることができる。この種の基礎データは、石油浄化効果が期待される当該環境試料の処理プロセスの管理や診断に使用できる。
【００３７】
このように本評価法は、従来において時間と手間がかかっていた環境試料のアルカン分解能についての評価を迅速且つ簡易に達成できるだけでなく、処理系の効率化や制御が容易ではないそれら微生物による浄化処理プロセスの管理に役立つ。
遺伝子工学的手法を用いた評価法
アルカン分解細菌の分子系統学的側面によれば、アルカン分解細菌に普遍的に存在し且つ保存性の高いコンセンサス配列を見出し得る遺伝子配列としては、１６Ｓ  ｒＤＮＡや  ｇｙｒＢ  ＤＮＡ  が挙げられる。これらは特異性の高い核酸を設計するのに好適であり、それらの遺伝子情報についての系統解析結果を基に、アルカン分解細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡやｇｙｒＢ  ＤＮＡのそれぞれの共通配列領域を標的として、検出対象の細菌群の特異的な検出を可能とするＰＣＲプライマーやハイブリダイゼーションプローブ等を設計することができる。
【００３８】
そのような遺伝子工学的手法を用いた本評価法は、検出対象である所望のアルカン分解細菌の系統学的特徴である上記項目（２）と対応するように、同項目（２）で特定される標的核酸と適宜にハイブリダイズできるプローブ又はプライマーが使用される。
【００３９】
その好ましい一態様は、配列番号１〜１１のいずれか１つの塩基配列の少なくとも一部、好ましくは少なくとも２０塩基程度、より好ましくは少なくとも１５塩基程度からなる部分塩基配列（それらと実質的に相同な塩基配列を有する配列でもよい）からなるオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを使用することによって、環境試料から、該配列番号１〜１１のいずれか１つの塩基配列の少なくとも一部分を検出することを手段とする。
【００４０】
典型的なオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーには、配列番号１２〜１９に列挙された塩基配列又はそれらと実質的に相同な配列を有する核酸である。上記のように好ましいプローブ又はプライマーは、当該技術分野に関する常法ないし経験則に従い、例えば、本明細書に開示された配列番号１〜１９の各塩基配列情報に基づいて、目的のアルカン分解細菌に特徴的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド部分を選択して使用するか、又はそのような特異的配列をデザインすることによって作製できる。
【００４１】
より具体的には、目的のアルカン分解細菌の核酸配列間で実質的に相同な塩基（その特異性に求められる包括的範囲を考慮して選択する）であるが、他の区別したい微生物とは異なっている塩基（その特異性に求められる排他的範囲を考慮して選択する）を基にＰＣＲプライマー等を設計する。それらプライマー又はプローブは合成オリゴヌクレオチドでもよいし、また長鎖のプローブならば、配列番号１〜１１のいずれかの塩基配列を有する単離核酸から調製されるｃＤＮＡプローブ等であってもよい。
【００４２】
上記態様の本評価法によれば、それら有用なオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを使用して、目的とするアルカン分解細菌由来の標的核酸群の存在を特異的に検出できるので、環境試料に存在するアルカン分解細菌由来のそれら遺伝子のコピー数や標的細菌の細胞数を定量することができる。
【００４３】
或る環境試料ついて、上記のような特異的な検出によりアルカン分解細菌の菌数を計測し、培養試料中の有用アルカン分解細菌のオーダーレベルでの増殖が確認できれば、そのような環境試料のアルカン分解能は高く、バイオレメディエーション等の浄化技術の適用が可能であると判断できる。
定量的ＰＣＲ法
遺伝子工学的手法が使用される本評価法において、定量的検出が望まれるなら定量的ＰＣＲ法を使用するとよい。定量的ＰＣＲ法では、アルカン分解細菌に特異的な遺伝子のＤＮＡ配列を基に特異性の高いＰＣＲプライマーを設計し、使用する。
【００４４】
定量的ＰＣＲ法としては、競合的ＰＣＲ法（中山広樹、細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド３、秀潤社、１９９６）、カイネティックスを利用する方法（中山広樹、細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド３、秀潤社、１９９６）、Ｔａｑ  Ｍａｎ  ＰＣＲ法（磯野一宏、臨床病理、４５、ｐ２１８、１９９７）、ライトサイクラーを用いる方法（磯野一宏、臨床病理、４５、ｐ２１８、１９９７）等が挙げられる。また特異性の高いＰＣＲプライマーを設計するために使うことができる遺伝子としては、１６Ｓ  ｒＤＮＡや  ｇｙｒＢ  ＤＮＡが挙げられる。
【００４５】
例えば、ＰＣＲ法を使用してアルカン分解細菌を検出、定量するに際しては、上述のとおりアルカン分解細菌代表株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列（典型的には配列番号１〜３）、及び／又はアルカン分解細菌代表株の  ｇｙｒＢ  ＤＮＡの塩基配列（典型的には配列番号４〜１１）の少なくとも一部を特異的に増幅できる一対のＰＣＲプライマーを設計し、使用するとよい。
【００４６】
定量的ＰＣＲ法の一般的手順は、次の通りである。環境試料に由来する核酸試料を鋳型としてプライマーを接触させ、一連のポリメラーゼ連鎖反応条件下で断続的な増幅反応を繰り返す。このときの増幅反応条件は、当該技術分野において技術常識ないし経験則に従って適宜設定するとよい。その結果、使用した３’側プライマーと５’側プライマーとの間の、特定の断片長の核酸領域が特異的に増幅される。増幅された核酸は、例えば、その断片長を電気泳動法によって確認するか、或いはその断片に特異的なプローブ等を用いるなどして、それが目的核酸であることを確認できる。増幅される核酸の量は、被検試料中の菌数とほぼ相関しているので、その増幅核酸の定量値に基づいて菌数を求めることができる。競合的ＰＣＲ法によれば、例えば、目的核酸と共にこれとは断片長が異なる既知濃度の核酸を増幅させる競合的増幅反応を行い、既知量の核酸の増幅度を指標にして目的核酸の量を知ることができる。
【００４７】
定量的ＰＣＲ法に使用できる好適なプライマー核酸の例としては、▲１▼配列番号１２と配列番号１３、▲２▼配列番号１４と配列番号１５、▲３▼配列番号１６と配列番号１７、又は▲４▼配列番号１８と配列番号１９にそれぞれ記載される一組のオリゴヌクレオチドプライマー対がある。
【００４８】
ハイブリダイゼーション法
環境試料から抽出した核酸試料（ＤＮＡ又はＲＮＡ）をメンブレンフィルター上にブロッティングし、そのメンブレンフィルター上で上述のようなアルカン分解細菌に特異的な塩基配列を有するプローブをハイブリダイゼーションさせる方法（メンブレンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション）によっても、目的のアルカン分解細菌を検出、定量することができる（Ａｍａｎｎ，  Ｒ．Ｉ．，  Ｂｉｎｄｅｒ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｏｌｓｏｎ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，  Ｓ．Ｗ．，  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｔａｈｌ，  Ｄ．Ａ．  （１９９０）  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｗｉｔｈ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｍｉｘｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６：１９１９−１９２５）。
【００４９】
そのようなプローブの設計においても、特異性が高く好適に使用できる標的核酸としては、上述の通りアルカン分解細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡやｇｙｒＢ  ＤＮＡが挙げられる。例えば、上述のように配列番号１〜３のいずれかの１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基情報を基にして、当該技術分野の常法ないし経験則に従って、アルカン分解細菌群に好ましく特異的なオリゴヌクレオチドを選択するか又は設計するとよい。
【００５０】
次にＦＩＳＨプローブを用いたハイブリダイゼーション法の一態様を示す。先ず、アルカン分解細菌に特異的なオリゴヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレオチドを蛍光色素あるいは放射性同位元素、又はジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等の化学発光物質で標識する。
【００５１】
その標識プローブを、アルカン分解細菌が存在し得る被検試料と混合し、適切な温度、塩濃度条件下でのハイブリダイゼーション処置を行い、標識プローブと標的核酸とのハイブリッドを形成させる。次いで、ハイブリッドを形成しなかった標識プローブ等を洗い出し、ハイブリッドを形成している標識プローブを含む細胞のみからのシグナルを検出する。
【００５２】
ハイブリッド形成プローブの具体的な検出・定量方法としては、標識シグナルを蛍光顕微鏡で検出する方法や、フローサイトメトリーを用いる方法等が挙げられる。またｉｎ  ｓｉｔｕ試料であれば、標識の化学発光等を可視的に捕らえて試料中の標的核酸の分布を見て菌数を計測できるし、定量的に評価可能なシグナルであれば、そのシグナルレベルを比較して標的核酸の量、つまり菌数を定量することができる。
【００５３】
本明細書内で言及される「菌数の計測」又は「菌数の測定」とは、試料内のコロニー形成等の生菌数計測によるような直接的な計測に限らず、上述したように試料中の菌数によって変動する核酸量を定量することによる間接的な菌数の推定をも含む概念である。
【００５４】
本明細書においてプローブ又はプライマーに関して使用される「塩基配列が実質的に相同である」或いは「塩基配列が実質的に相補的である」という表現は、当該核酸がプローブ又はＰＣＲプライマー等として機能し得る程度の断片長と相同性を有していることを意味する。
【００５５】
なお、プローブ又はプライマーは、使用目的や条件によっては必ずしも１００％の相同性を有している部位から設計する必要はなく、例えば、目的とする領域のプライマーの５’末端付近で数塩基が異なっていてもよい。プローブに関しては、その塩基長に依存するほか、温度、塩濃度等を検討することによって適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせることができ、またＰＣＲプローブに関しては、例えばアニーリング温度等を検討することによって目的ＤＮＡ断片を適宜増幅させることができる。すなわち、完全に相同な配列部位を使用し且つ特異性が高くなるハイブリダイズ条件又はＰＣＲ条件を選択すれば、より特異性の高い検出・定量が可能となり、その反面、特異性の低い条件が許容されるなら数塩基異なる配列も使用可能である。
【００５６】
また、プローブ又はプライマーとして実質的に相同或いは相補的であるか否かは、例えば、インターネット上に公開されている上記のプローブチェックプログラム（Ｔｈｅ  ＲＤＰ−ＩＩ：Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，  Ｍａｉｄａｋ  ＢＬ，  Ｃｏｌｅ  ＪＲ，  Ｌｉｌｂｕｒｎ  ＴＧ，  Ｐａｒｋｅｒ  ＣＴ  Ｊｒ，  Ｓａｘｍａｎ  ＰＲ，  Ｆａｒｒｉｓ  ＲＪ，  Ｇａｒｒｉｔｙ  ＧＭ，  Ｏｌｓｅｎ  ＧＪ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＴＭ，  Ｔｉｅｄｊｅ  ＪＭ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００１  Ｊａｎ  １；２９（１）：１７３−４）によって行うことができる。
【００５７】
【実施例】
〔実施例１〕
アルカン分解細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的にしたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、１５種類の菌株から抽出したＤＮＡを鋳型としＰＣＲ法を行い、各プライマーの有効性を確かめた。
【００５８】
使用した菌株は、アルカン分解細菌９株（Ｍ−１株、Ｍ−５株、Ｍ−６株、Ｍ−１３株、Ｍ−１４株、Ｍ−１５株、Ｍ−１６株、Ｋ−１株、Ｋ−９株）およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ２７１、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ＡＴＣＣ１３２６０、  Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ  ｍｕｒａｌｅ  ＪＣＭ１０６７６、  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｕｓ  ＪＣＭ１００８７、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＢＩＣ０１３３７、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ０１４５２の６株である。
【００５９】
ここでのＰＣＲ条件と、使用したオリゴヌクレオチドプライマー対は、下記の通りである。
ＰＣＲ条件：  １  ｓｔｅｐ  （１  ｃｙｃｌｅ）  ９４℃−１０ｍｉｎ；  ２  ｓｔｅｐ  （３０  ｃｙｃｌｅｓ）  ９４℃−３０  ｓｅｃ，  ６５℃−３０  ｓｅｃ，  ７２℃−１ｍｉｎ；３  ｓｔｅｐ  （１  ｃｙｃｌｅ）  ７２℃−１０  ｍｉｎ
プライマー対▲１▼
５’プライマー：Ｒｈｏ１６Ｓ４Ｆ（配列番号１２；配列番号１の塩基番号１７２〜２０３に相当する）及び
３’プライマー：Ｒｈｏ１６Ｓ４Ｒ（配列番号１３；配列番号１の塩基番号５７６〜６０２に相当する）。
プライマー対▲２▼
５’プライマー：Ｒｈｏ１６Ｓ５Ｆ（配列番号１４；配列番号３の塩基番号１７１〜２０２に相当する）及び
３’プライマー：Ｒｈｏ１６Ｓ５Ｒ（配列番号１５；配列番号３の塩基番号５７７〜５９６に相当する）。
プライマー対▲３▼
５’プライマー：Ｒｈｏ１６Ｓ２Ｆ（配列番号１６；配列番号２の塩基番号１７４〜２００に相当する）及び
３’プライマー：Ｒｈｏ１６Ｓ２Ｒ（配列番号１７；配列番号２の塩基番号５７０〜５９６に相当する）。
【００６０】
上記各ＰＣＲ法の結果は、次の通りである。
プライマー対▲１▼を用いたＰＣＲ法の結果、期待されたサイズの４３１塩基のＤＮＡがＭ−１株、Ｍ−５株、Ｍ−１３株、Ｍ−１６株、Ｋ−１株、Ｋ−９株およびＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ＡＴＣＣ１３２６０においてのみ増幅され、このプライマーの有効性が示された。
【００６１】
また、プライマー対▲２▼を用いたＰＣＲの結果、期待されたサイズの４２６塩基のＤＮＡがＭ−１５株においてのみ増幅され、このプライマーの有効性が示された。
さらに、プライマー対▲３▼を用いたＰＣＲの結果、期待されたサイズの４２３塩基のＤＮＡがＭ−６株、Ｍ−１４株およびＷｉｌｌｉａｍｓｉａ  ｍｕｒａｌｅ  ＪＣＭ１０６７６においてのみ増幅され、このプライマーの有効性が示された。
【００６２】
〔実施例２〕
アルカン分解細菌のｇｙｒＢ  ＤＮＡを標的にしたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、１５種類の菌株から抽出したＤＮＡを鋳型としＰＣＲ法を行い、各プライマーの有効性を確かめた。
【００６３】
ＰＣＲ条件と、使用したオリゴヌクレオチドプライマー対は下記の通りである。
ＰＣＲ条件：  １  ｓｔｅｐ  （１  ｃｙｃｌｅ）  ９４℃−１０ｍｉｎ；２  ｓｔｅｐ  （３０  ｃｙｃｌｅｓ）  ９４℃−３０  ｓｅｃ，  ６５℃−３０  ｓｅｃ，  ７２℃−１ｍｉｎ；３  ｓｔｅｐ  （１  ｃｙｃｌｅ）  ７２℃−１０  ｍｉｎ
プライマー対▲４▼
５’プライマー：Ｒｈｏｇｙｒ３Ｆ（配列番号１８；配列番号４の塩基番号３５７〜３７９に相当する）及び
３’プライマー：Ｒｈｏｇｙｒ１Ｒ（配列番号１９；配列番号４の塩基番号６２０〜６３７に相当する）
使用した菌株は、アルカン分解細菌９株（Ｍ−１株、Ｍ−５株、Ｍ−６株、Ｍ−１３株、Ｍ−１４株、Ｍ−１５株、Ｍ−１６株、Ｋ−１株、Ｋ−９株）およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ２７１、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ＡＴＣＣ１３２６０、  Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ  ｍｕｒａｌｅ  ＪＣＭ１０６７６、  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｕｓ  ＪＣＭ１００８７、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＢＩＣ０１３３７、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ０１４５２の６株である。
【００６４】
上記ＰＣＲ法の結果、期待されたサイズの２８０塩基のＤＮＡがＭ−１株、Ｍ−５株、Ｍ−１３株、Ｍ−１６株、Ｋ−１株、Ｋ−９株およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＢＩＣ０１３３７においてのみ増幅され、このプライマーの有効性が示された。
【００６５】
〔実施例３〕
履歴の異なる５種の石油汚染土壌（Ｉ〜Ｖ）について、土壌２  ｇに滅菌水を１０  ｍＬ、無機栄養塩（窒素源として塩化アンモニウム  ３５  ｍｇ／Ｌ、リン源としてリン酸水素二ナトリウム１０  ｍｇ／Ｌ）、さらに炭素源として熱処理し軽質分を除去した原油（以下、Ｗ．  ｏｉｌとする）を１０  ｍｇ加えたバイオスティミュレーション条件下で、２８℃で２週間振とう培養（１２０  ｒｐｍ）し、石油分解実験を行った。培養終了後、ＧＣ−ＭＳ分析によって石油主要構成成分の分解様相を調査し、上記土壌の石油分解特性を評価した。
【００６６】
図３はＧＣ−ＭＳの分析の結果を示す。この結果から、土壌Ｉおよび土壌Ｖにおいて、直鎖状ノルマルアルカンおよび分岐鎖状アルカンの分解率が非常によく、高いアルカン分解能を持つことがわかった。
【００６７】
次いで、上記培養終了後の各試料から全ＤＮＡを抽出し、それらＤＮＡ抽出物を鋳型にして、下記のプライマー対▲１▼〜▲４▼をそれぞれ使用してＰＣＲを行った。
▲１▼Ｒｈｏ１６Ｓ４Ｆ（配列番号１２）とＲｈｏ１６Ｓ４Ｒ（配列番号１３）
▲２▼Ｒｈｏ１６Ｓ５Ｆ（配列番号１４）とＲｈｏ１６Ｓ５Ｒ（配列番号１５）
▲３▼Ｒｈｏ１６Ｓ２Ｆ（配列番号１６）とＲｈｏ１６Ｓ２Ｒ（配列番号１７）
▲４▼Ｒｈｏｇｙｒ３Ｆ（配列番号１８）とＲｈｏｇｙｒ１Ｒ（配列番号１９）
それらＰＣＲの結果は下記の通りである。
【００６８】
１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的としたプライマー対▲１▼を用いた結果、アルカン分解能の高かった土壌Ｉ及び土壌Ｖの培養体から抽出したＤＮＡにおいて、期待されたサイズの４３１塩基のＤＮＡが検出された。
【００６９】
また、１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的としたプライマー対▲２▼を用いたＰＣＲの結果、アルカン分解能の高かった土壌Ｉの培養体のみから抽出したＤＮＡにおいて、期待されたサイズの４２６塩基のＤＮＡが検出された。
【００７０】
さらに、１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的としたプライマー対▲３▼を用いてＰＣＲを行った結果からも、アルカン分解能の高かった土壌Ｉ及び土壌Ｖの培養体から抽出したＤＮＡにおいて、期待されたサイズの４２３塩基のＤＮＡが検出された。
【００７１】
一方、ｇｙｒＢ  ＤＮＡを標的としたプライマー対▲４▼を用いてＰＣＲを行った結果においても、アルカン分解能の高かった土壌Ｉ及び土壌Ｖの培養体からから抽出したＤＮＡにおいて、期待されたサイズの２８０塩基のＤＮＡが検出された。
【００７２】
次に、上記のプライマー対▲１▼〜▲４▼で、遺伝子の増幅が確認された土壌、即ち高アルカン分解能を持つアルカン分解細菌を含む土壌Ｉ及び土壌Ｖとそれらの培養体から抽出したＤＮＡを鋳型にして競合的ＰＣＲを行った。
【００７３】
図４は、土壌Ｉの競合的ＰＣＲの結果を示し、図５は土壌Ｖの競合的ＰＣＲの結果を示す。
【００７４】
上記競合的ＰＣＲ法により、培養実験前後のアルカン分解細菌由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡおよびｇｙｒＢ  ＤＮＡのコピー数を定量した。競合的ＰＣＲ法によるＤＮＡの検出限界は、１０３〜１０４  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであった。
【００７５】
土壌Ｉにおいて、プライマー対▲１▼を用いた結果、１６Ｓ  ｒＤＮＡのコピー数は、元の土壌で２．６×１０４  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであったが、培養後の１６Ｓ  ｒＤＮＡのコピー数は、６．５×１０６  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであり、おおよそ２から３オーダーの増加が確認された。また、プライマー対▲２▼を用いた結果、土壌の１６Ｓ  ｒＤＮＡのコピー数は１０３  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ−ＤＮＡ  以下であったが、培養後においても、５．６×１０３  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであり、菌数はほとんど増加していなかった。さらに、プライマー対▲３▼を用いた結果、１６Ｓ  ｒＤＮＡのコピー数は、土壌で１０３  ｃｏｐｉｅｓ  ／μｇ  −ＤＮＡ  以下であったが、培養後の１６Ｓ  ｒＤＮＡのコピー数は、１．２５×１０５  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであり、おおよそ２から３オーダーの増加が確認された。一方、プライマー対▲４▼を用いた結果、土壌のｇｙｒＢ  ＤＮＡのコピー数は、１．２×１０４  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであったが、培養後のｇｙｒＢ  ＤＮＡのコピー数は、４．０×１０６  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであり、おおよそ２から３オーダーの増加が確認された。
【００７６】
土壌Ｖにおいては、プライマー対▲１▼を用いた結果、１６Ｓ  ｒＤＮＡのコピー数は、土壌で３．７×１０４  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであったが、培養後の１６Ｓ  ｒＤＮＡのコピー数は、３．１×１０６  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであり、おおよそ２オーダーの増加が確認された。また、プライマー対▲３▼を用いた結果、１６Ｓ  ｒＤＮＡのコピー数は、土壌で１０３  ｃｏｐｉｅｓ  ／μｇ  −ＤＮＡ  以下であったが、培養後においても、１．１×１０３  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであり、菌数はほとんど増加していなかった。一方、プライマー対▲４▼を用いた結果、土壌のｇｙｒＢ  ＤＮＡのコピー数は、３．２×１０４  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであったが、培養後のｇｙｒＢ  ＤＮＡのコピー数は、３．１×１０６  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ  −ＤＮＡであり、おおよそ２から３オーダーの増加が確認された。
【００７７】
上記の結果は、試料中に１０３〜１０４  ｃｏｐｉｅｓ  ／  μｇ−ＤＮＡ程度のアルカン分解細菌が存在していることを示し、このように石油系炭化水素を用いた培養実験により２〜３オーダーの菌数（コピー数）までの増加が見られるなら、バイオスティミュレーション法を用いたアルカン汚染の浄化を効率的に行うことができるという一例を示している。また換言すれば、上記のプライマー対▲１▼〜▲４▼を用いたＰＣＲにより、遺伝子の増幅が確認されなければ（土壌ＩＩ，  ＩＩＩ，  ＩＶ）バイオスティミュレーションによるアルカン分解効果は比較的低いといえる。
【００７８】
【発明の効果】
本発明によれば、環境中に生息する高いアルカン分解能を持つ細菌群をその遺伝子情報に基づいて検出し、迅速かつ簡便に環境試料中に存在するアルカン分解細菌を計測し、試料のアルカン浄化能力を評価することで、バイオレメディエーションにおけるアルカンを対象とした浄化を効率的に行うことができる。
【００７９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アルカン分解細菌のもつ１６Ｓ  ｒＤＮＡの系統分子生物学的位置を示す図である。
【図２】アルカン分解細菌のもつｇｙｒＢ  ＤＮＡの系統分子生物学的位置を示す図である。
【図３】土壌Ｉ〜Ｖのアルカン分解特性についてのＧＣ−ＭＳ分析結果を示す図である。
【図４】実施例のプライマー対を用いた土壌Ｉ中のアルカン分解細菌の菌数を定量した結果を示す図である。
【図５】実施例のプライマー対を用いた土壌Ｖ中のアルカン分解細菌の菌数を定量した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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