(57)【要約】【課題】癌遺伝子を用いた癌の検出方法、癌治療及び／又は予防効果を有する化合物のスクリーニング方法、及び癌治療及び／又は予防用医薬組成物を提供すること。【解決手段】ヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現を指標とした癌の検出方法、及び、ヒト・オキュロスパニンを特異的に認識し、癌細胞に対する細胞障害性活性を有する抗体を含む医薬組成物の提供等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト・オキュロスパニンと特異的に結合し、該蛋白質を発現している細胞に対し細胞障害活性を持つ抗体。
【請求項２】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び／又は配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と特異的に結合し、該蛋白質を発現している細胞に対し細胞傷害活性を持つ抗体。
【請求項３】
細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項５】
細胞傷害活性が補体依存性細胞性細胞傷害活性であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項６】
細胞傷害活性がアポトーシス誘導であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一つに記載の抗体。
【請求項８】
マウスハイブリドーマＯ３Ｂ８−２Ｃ９−４Ｆ３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６２７）から産生されることを特徴とする、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
ヒト化されていることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一つに記載の抗体。
【請求項１０】
完全ヒト抗体であることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一つに記載の抗体。
【請求項１１】
ＩｇＧ抗体であることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一つに記載の抗体。
【請求項１２】
下記の工程１）乃至４）を含む、癌の検出方法：
１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記のａ）又はｂ）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｂ）上記ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の癌を検出する工程。
【請求項１３】
下記の工程１）乃至３）を含む、癌の検出方法：
１）被験者より採取した検体における、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び／又は配列番号４に示されるアミノ酸配列から成る蛋白質の発現量を測定する工程；
２）正常人から採取した検体における、上記工程１）に記載の蛋白質の少なくともいずれか一つの発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の癌を検出する工程。
【請求項１４】
癌が皮膚癌であることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
癌がメラノーマであることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ又はランオン・アッセイであることを特徴とする、請求項１２、１４及び１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が検体由来の相補的ＤＮＡ群又は該ＤＮＡ群の各ＤＮＡの部分配列からなるＤＮＡで作製された遺伝子チップ又はアレイを用いることを特徴とする、請求項１２、１４及び１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
蛋白質の発現量の測定方法が、該蛋白質に特異的に結合する抗体又はリガンドを用いることを特徴とする、請求項１３乃至１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】
蛋白質の発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法又は固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）であることを特徴とする、請求項１３乃至１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
下記の１）乃至３）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含む癌の検出用キット：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが固定された固相化試料。
【請求項２１】
下記の１）及び２）の少なくとも一つを含む癌の検出用キット：
１）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び／又は配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
２）上記１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
【請求項２２】
癌が皮膚癌であることを特徴とする、請求項２０又は２１に記載のキット。
【請求項２３】
癌がメラノーマであることを特徴とする、請求項２０又は２１に記載のキット。
【請求項２４】
請求項１乃至１１に記載の抗体の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、癌の治療用医薬組成物。
【請求項２５】
配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列又は該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む癌の治療用医薬組成物。
【請求項２６】
癌が皮膚癌であることを特徴とする、請求項２４又は２５のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項２７】
癌がメラノーマであることを特徴とする、請求項２４又は２５のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療に用いることができる抗体、該抗体を有効成分として含有することを特徴とする癌治療用医薬組成物、癌の検出方法、癌の検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞は、細胞の種類に応じて固有な抗原蛋白質（以下、腫瘍関連抗原と記載することがある）を発現することが知られている。そこで、この腫瘍関連抗原をターゲットとして腫瘍に対する新たな治療方法を開発しようとする試みが検討されている。腫瘍関連抗原に対して特異的な抗原−抗体反応を示すモノクローナル抗体は、種々の生体免疫反応（抗体依存性細胞性細胞傷害活性(ADCC)、補体依存性細胞傷害活性(CDC)等）を誘導して癌細胞を攻撃し、細胞死を誘導する事が知られているので、腫瘍の治療に有用なモノクローナル抗体が開発されている。
【０００３】
しかしながら、腫瘍の治療に有用なモノクローナル抗体は、転移性乳癌、急性骨髄性白血病、難治性慢性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫など、幾つかの腫瘍種に限られたものが知られているだけであり、他の腫瘍の治療に用いることができる、モノクローナル抗体の取得が求められていた。
【０００４】
腫瘍の治療に有用なモノクローナル抗体を取得するためには、腫瘍細胞で特異的に発現している蛋白質を同定し、該蛋白質を抗原としたモノクローナル抗体を取得することが有用である。
【０００５】
ヒト・オキュロスパニン（human oculospanin）は、網膜色素上皮及び眼球脈絡膜で発現している遺伝子よりイクスプレスド・シークエンス・タグ（Expressed Sequence Tag: EST）クローンとして取得された蛋白質である(例えば、非特許文献１参照。)。ヒト・オキュロスパニン遺伝子は1068bpのオープン・リーディング・フレームを有し、ヒト・オキュロスパニンは３５５アミノ酸からなり、DNA配列から推定される分子量は、36.4kDaであるがヒト・オキュロスパニンと腫瘍との関係は明らかとはなっていない。
【０００６】
【非特許文献１】「モレキュラー・ビジョン（Molecular Vision）」、２００２年、第８巻、２−５−２２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、癌で特異的に発現する遺伝子を見出し、該遺伝子の発現を検出することによる癌の検出方法、該検出方法に用いる癌検出用キット、該遺伝子の発現産物に特異的に結合し、細胞障害活性を持つ抗体、該抗体を有効成分として含む癌の治療用医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者はヒト癌組織で特異的に発現する遺伝子を探索し、機能が不明であった、ヒト・オキュロスパニン（human oculospanin）遺伝子の発現量がメラノーマ細胞で顕著に増加していることを見出し、該遺伝子を用いた癌の検出方法、癌の検出用キット並びに、抗ヒト・オキュロスパニン抗体を含有する、癌治療用医薬組成物を提供し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（１）  ヒト・オキュロスパニンと特異的に結合し、該蛋白質を発現している細胞に対し細胞障害活性を持つ抗体、
（２）  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び／又は配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と特異的に結合し、該蛋白質を発現している細胞に対し細胞傷害活性を持つ抗体、
（３）  細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の抗体、
（４）  細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の抗体、
（５）  細胞傷害活性が補体依存性細胞性細胞傷害活性であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の抗体、
（６）  細胞傷害活性がアポトーシス誘導であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の抗体、
（７）  モノクローナル抗体であることを特徴とする、（１）乃至（６）のいずれか一つに記載の抗体、
（８）  マウスハイブリドーマＯ３Ｂ８−２Ｃ９−４Ｆ３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６２７）から産生されることを特徴とする、請求項７に記載の抗体。
（９）  ヒト化されていることを特徴とする、（１）乃至（８）のいずれか一つに記載の抗体、
（１０）  完全ヒト抗体であることを特徴とする、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載の抗体、
（１１）  ＩｇＧ抗体であることを特徴とする、（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載の抗体、
（１２）下記の工程１）乃至４）を含む、癌の検出方法：
１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記のａ）又はｂ）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｂ）上記ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の癌を検出する工程、
（１３）  下記の工程１）乃至３）を含む、癌の検出方法：
１）被験者より採取した検体における、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び／又は配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の発現量を測定する工程；
２）正常人から採取した検体における、上記工程１）に記載の蛋白質の少なくともいずれか一つの発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の癌を検出する工程、
（１４）  癌が皮膚癌であることを特徴とする、（１２）又は（１３）のいずれか一つに記載の方法、
（１５）  癌がメラノーマであることを特徴とする、（１２）又は（１３）のいずれか一つに記載の方法、
（１６）  ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ又はランオン・アッセイであることを特徴とする、（１２）、（１４）及び（１５）のいずれか一つに記載の方法、
（１７）  ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が検体由来の相補的ＤＮＡ群又は該ＤＮＡ群の各ＤＮＡの部分配列からなるＤＮＡで作製された遺伝子チップ又はアレイを用いることを特徴とする、（１２）、（１４）及び（１５）のいずれか一つに記載の方法、
（１８）  蛋白質の発現量の測定方法が、該蛋白質に特異的に結合する抗体又はリガンドを用いることを特徴とする、（１３）乃至（１５）のいずれか一つに記載の方法、
（１９）  蛋白質の発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法又は固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）であることを特徴とする、（１３）乃至（１５）のいずれか一つに記載の方法、
（２０）  下記の１）乃至３）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含む癌の検出用キット：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが固定された固相化試料。
（２１）  下記の１）及び２）の少なくとも一つを含む癌の検出用キット：
１）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び／又は配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
２）上記１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
（２２）  癌が皮膚癌であることを特徴とする、（２０）又は（２１）に記載のキット、
（２３）  癌がメラノーマであることを特徴とする、（２０）又は（２１）に記載のキット、
（２４）  （１）乃至（１１）に記載の抗体の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、癌の治療用医薬組成物、
（２５）  配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列又は該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む癌の治療用医薬組成物、
（２６）  癌が皮膚癌であることを特徴とする、（２４）又は（２５）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（２７）  癌がメラノーマであることを特徴とする、（２４）又は（２５）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
からなる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ヒト・オキュロスパニンがメラノーマで発現量が顕著に増加していることが見出され、該遺伝子を用いた癌の検出方法、癌の検出用キットが提供され、更に、オキュロスパニンに対する細胞傷害活性を有する抗体、該抗体を含む癌治療用医薬組成物が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書中において、癌治療効果を有する化合物とは、癌の増殖を抑制する活性、癌を縮小する活性を有する化合物をいう。なお、本明細書中においては、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれるものとする。したがって、本発明における「ヒト・オキュロスパニン遺伝子」には、ヒト・オキュロスパニンのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡが含まれる。本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。また、本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。また、本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。本明細書中において、「細胞の癌化」とは、細胞が接触阻止現象への感受性を喪失することや、足場非依存性増殖を示すこと等、細胞が異常な増殖を示すことをいい、このような異常な増殖を示す細胞を「癌細胞」という。本明細書においては、ヒト・オキュロスパニンが有する細胞の癌化活性等と同等の機能を有する蛋白質もヒト・オキュロスパニンという。なお本発明における癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅ）という語には癌遺伝子の他に癌原遺伝子、前癌遺伝子（Ｐｒｏｔｏ−Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）も含む。
【００１１】
本発明における、「細胞傷害」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことをいい、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷をいう。本発明における「細胞障害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことをいう。
【００１２】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ExpressHyb Hybridization Solution（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００１３】
１．ヒト・オキュロスパニン
（１）  ヒト・オキュロスパニン遺伝子の特異的発現の確認
ヒト・オキュロスパニン遺伝子は、ヒト各種細胞株群における遺伝子の発現量の解析の結果、他の組織に比べてメラニン細胞で有意に高い発現量を示し、さらに、正常なメラニン細胞に比べメラノーマにおいて有意に発現量が増加していることが本発明者らによって見出された。例えば、メラニン細胞、リンパ芽球、グリア細胞、上皮細胞の間でヒト・オキュロスパニンの発現量を比較すると、メラニン細胞で有意に発現量が高く、また、正常な皮膚細胞とメラノーマにおけるヒト・オキュロスパニンの発現量を比較すると、メラノーマにおいて顕著に発現量が高いことが、本発明者らによって見出された。したがって、ヒト・オキュロスパニンは細胞の癌化及び／又は癌細胞の増殖に関与していると考えられる。すなわち、ヒト・オキュロスパニンの各細胞、及び／又は各組織における発現量を測定することでヒト・オキュロスパニンの過剰発現に起因して発生する癌化及び／又は癌細胞、の増殖の状態を判定することができる。このような癌としては、例えば、皮膚癌、特にメラノーマを挙げることができるが、ヒト・オキュロスパニンの発現量が他の組織より有意に増殖している癌であれば皮膚癌以外の癌にも適用することができる。
【００１４】
ヒト・オキュロスパニン遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（Open Reading Frame: ORF）のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１に示されており、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示されている。ヒト・オキュロスパニンのｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋにHomo sapiens oculospanin (OCSP), mRNA（アクセッション番号：ＮＭ＿０３１９４５）として登録されており、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３にも示されており、ORFは配列番号３のヌクレオチド番号６５乃至１１２９に示されている。また、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒト・オキュロスパニンのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列は配列表の配列番号４に示されている。なお、ヒト・オキュロスパニンのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列からなり、ヒト・オキュロスパニンと同等の生物活性を有する蛋白質もヒト・オキュロスパニンに含まれる。
【００１５】
２．癌の検出方法
ヒト・オキュロスパニンは癌細胞、特にメラノーマで高い発現が認められるので細胞、特に皮膚細胞の癌化及び／又は癌細胞の増殖に関与していると考えられる。なお、「検体」とは、被験者や臨床検体等から得られた、血液、体液、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻、肺、骨、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ節、筋肉、脂肪組織等の組織又は排泄物等の試料を意味するが、本発明においては皮膚又はリンパ節がより好ましい。
【００１６】
（１）ヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を利用した癌の検出方法
ヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を利用した癌の検出方法は、具体的には、以下の工程１）乃至４）を含む方法である。
１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）に記載の全ＲＮＡ画分と上記工程２）に記載の全ＲＮＡ画分におけるヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を測定する工程；
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３)によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の癌を検出する工程。
以下、各工程を具体的に説明する。
【００１７】
ａ）  工程１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
検体から全ＲＮＡ画分を抽出するに際しては、適切な実験の倫理基準に適した方法で入手したヒト由来組織をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェノール等、リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するか又は、該組織の細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等の蛋白質分解酵素を用いて穏やかに組織から細胞を抽出するなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにＲＮＡ抽出工程に移行する。
【００１８】
ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski,P.  and  Sacchi,N., Anal.Biochem. (1987),162,156-159）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。また、市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えば、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン（株）製）、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製））等を試薬に添付のプロトコールに従って用いることもできる。
【００１９】
得られた全ＲＮＡ画分は、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いるのが好ましい。精製方法は特に限定されないが、例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。ただし、本発明の方法のためには、これらｍＲＮＡの精製工程は必須ではなく、検出対象のポリヌクレオチドの発現の検出が可能である限りにおいて、全ＲＮＡ画分をその後の工程に用いることもできる。
【００２０】
ｂ）  工程２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程：
本発明において、正常人とは、癌を有さない人を意味する。正常人であるか否かは、ヒト・オキュロスパニンの濃度を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かで判定することもできるし、ヒト・オキュロスパニンの発現量と、正常人の癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、被験者から採取した検体におけるヒト・オキュロスパニンの発現量を測定することによって被験者が、正常人であるか否かを判定することもできる。正常人よりの全ＲＮＡ画分の調製は、上記工程１）と同様に行うことができる。
【００２１】
ｃ）  工程３）上記工程１）に記載の全ＲＮＡ画分と上記工程２）に記載の全ＲＮＡ画分におけるヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を測定する工程：
ここで、ヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量は配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド又は、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの発現量で示される。
【００２２】
ヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量の測定方法として、固相化試料を用いた測定方法と、その他のいくつかの測定方法について説明する。
【００２３】
（ａ）  固相化試料を用いた測定方法
（ｉ）  固相化試料
固相化試料としては、例えば以下のものが挙げられる。
【００２４】
（イ）遺伝子チップ：
データベース上のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）配列又はｍＲＮＡ配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップを用いることができる。このような遺伝子チップとしてはアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製の遺伝子チップ(Lipshutz,R.J. et al., Nature  Genet. (1999)21,suppliment,20-24)を用いることができるが、これに限定されず、公知の方法に基づき作製してもよい。ヒト細胞由来のｍＲＮＡを解析する場合には、ヒト由来のものが好ましく、例えば、アフィメトリックス社製ヒトＵ９５セット又はＵ１３３セットを用いることができる。しかしながら、それらに限定されず、例えば近縁種の動物由来のものも使用可能である。
【００２５】
（ロ）ヒト、全ＲＮＡあるいは特定の組織から得た全ＲＮＡより作製されたｃＤＮＡ又はＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化された、アレイ又はメンブレンフィルター：
上記ｃＤＮＡ又はＲＴ−ＰＣＲ産物は、ヒトのＥＳＴデータベース等の配列情報を基に作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものである。このｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物は、あらかじめ腫瘍を有するヒトと腫瘍を有さないヒトの間で発現量の異なる全ＲＮＡを、サブトラクション法（Diatchenki,L,et al, Proc．Natl.Acad.Sci.USA, (1996)93,6025-6030）、ディファレンシャルディスプレイ法（Liang,P.,et alNucleic Acids Res. ,(1992) 23,3685-3690）などを利用して選択されたものであってもよい。また、アレイやフィルターは市販のもの（例えば、インテリジーン：タカラバイオ社製等）を使用してもよいし、上記ｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物を市販のスポッターで（例えば、ＧＭＳ４１７アレイヤー：タカラバイオ社製等）を用いて固相化することにより作製してもよい。
【００２６】
（ii）  プローブの作製と解析
標識プローブは、特定のｍＲＮＡクローンではなく、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものを用いる。プローブ作製のための出発材料としては精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いることが望ましい。以下に、各種固相化試料を用いた場合の、標識プローブの調製方法と検出、解析方法について説明する。
【００２７】
（イ）アフィメトリックス社製遺伝子チップ：
アフィメトリクス社製遺伝子チップに添付されたプロトコール（アフィメトリックス社発現解析技術マニュアル）に従ってビオチン標識したｃＲＮＡプローブを作製する。次いでアフィメトリックス社製遺伝子チップに添付のプロトコール（発現解析技術マニュアル）に従って、アフィメトリックス社製の解析装置（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００）を用いてハイブリダイゼーション及び解析を行い、アビジンによる発光を検出、解析を行う。
【００２８】
（ロ）アレイ：
逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、ｃＤＮＡの検出ができるようにｃＤＮＡを標識しておくことが必要であり、蛍光色素で標識する場合には、蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。このとき、メラノーマ細胞由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡと対照細胞由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。アレイとして例えば、タカラバイオ（株）社の市販アレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーション及び洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（タカラバイオ（株）社製）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。ただし、使用するアレイとしては市販のものに限定されず、自家製のもの、特別に作製したものでもよい。
【００２９】
（ハ）メンブレンフィルター：
逆転写酵素でポリ（Ａ）+ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、ｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行い、例えば、市販のフィルター製マイクロアレーである、アトラスシステム（クロンテック社製）を用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クロンテック社製等）を用いて検出、解析を行う。
【００３０】
前記（イ）乃至（ハ）のいずれに記載の方法も、同一ロットの固相化試料にヒト各組織由来のプローブをハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーション以外の条件は同じとする。蛍光標識プローブを用いる場合には、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることができる(Brown、P.O. et al. Nature  Genet., (1999)21, supplement, p.33−37)。
【００３１】
（ｂ）  その他の測定方法
上記以外の測定方法としてサブトラクションクローニング法（実験医学別冊  新  遺伝子工学ハンドブック、羊土社刊(1996) p.32-35参照）、ディファレンシャルディスプレイ法（基礎生化学実験法４  核酸・遺伝子実験  II.応用編、東京化学同人(2001), p125-128）、レポーター遺伝子を用いた方法（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター：プロメガ社製を使用。）やβ−ガラクトシダーゼ（例えば、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ：プロメガ社製を使用。）、分泌型アルカリホスファターゼ（例えば、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ：クロンテック社製を使用。）、緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ｐＥＧＦＰ−１：クロンテック社製を使用。））があるがこれらに限定されない。
工程４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３)によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の癌を検出する工程。  正常人由来の検体と被験者由来の検体との間でヒト・オキュロスパニンの発現量の差を解析し、ヒト・オキュロスパニンの発現量が有意に増加している検体では癌、特に皮膚癌、更にはメラノーマが存在する可能性が高いと判定することができ、癌を検出することができる。発現量が有意に増加しているとは、例えば、アフィメトリックス社の遺伝子チップを用いて、アフィメトリックス社のｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒ．３．０を用いて解析した場合、メラノーマ細胞由来の遺伝子のＡｖｅｒａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値が正常メラニン細胞に比べて有意に増加している場合をいう。
【００３２】
また、ヒト・オキュロスパニン遺伝子の濃度を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かを解析し正常人の値として決められている範囲を超えている場合には癌を有すると判定することで癌を検出することもできるし、ヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量と、正常人の癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、被験者から採取した検体におけるヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を測定することによって被験者が、正常人であるか否かを判定することもできる。
【００３３】
（３）  ヒト・オキュロスパニンの発現量（蛋白質の発現量）を利用した癌の検出方法
ヒト・オキュロスパニンの発現量を利用した癌の検出方法は、具体的には、以下の工程１）乃至３）を含む方法である。
１）被験者より採取した検体における、ヒト・オキュロスパニンの発現量を測定する工程：
２）正常人より採取した検体における、上記１）に記載の蛋白質の発現量を測定する工程：
３）上記工程１）で測定された蛋白質の発現量と上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の癌を検出する工程。
以下、各工程を具体的に説明する。
【００３４】
a)  工程１）被験者より採取した検体における、ヒト・オキュロスパニンの発現量を測定する工程：
（ａ）  検体より蛋白質測定用試料の調製
検体は、必要に応じて高速遠心を行うことにより、不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
【００３５】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例えば回収した、皮膚又はリンパ節をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば、皮膚又はリンパ節の抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製等）と混合する。ドット／スロットブロットの場合は、例えば回収した皮膚又はリンパ節の抽出液そのもの、又は緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させる。
【００３６】
（ｂ）  試料の固相化
上記のようにして得られた試料中の蛋白質を特異的に検出するためには、試料を免疫沈降法、リガンドの結合を利用した方法等によって、沈殿させ、固相化せずに検出することもできるし、そのまま検出する該試料を固相化することもできる。蛋白質を固相化する場合において、ウエスタンブロット法、ドットブロット法又はスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）又はポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【００３７】
ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で蛋白質の検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料又はその希釈液（例えば０．０５％  アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃乃至室温で一晩、又は３７℃で１乃至３時間静置することにより、ウェル内底面に蛋白質を吸着させて固相化する。
【００３８】
ヒト・オキュロスパニンに対する抗体は、常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、蛋白質１、p.389-397、1992参照。）、ヒト・オキュロスパニン又はヒト・オキュロスパニンのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975、Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p.365-367, 1980, Prenum Press, N.Y.）に従って、ヒト・オキュロスパニンに対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【００３９】
なお、抗原となるヒト・オキュロスパニンはヒト・オキュロスパニン遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、ヒト・オキュロスパニン遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したヒト・オキュロスパニンを精製すればよい。
【００４０】
（ｃ）  ヒト・オキュロスパニンの発現量の測定
ヒト・オキュロスパニンの発現量は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の発現量で示される。
【００４１】
発現量の測定は、上記抗ヒト・オキュロスパニン抗体を用いてウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法等公知の方法を用いて測定することができる。
【００４２】
b)  工程２）正常人より採取した検体における、上記１）に記載の蛋白質の発現量を測定する工程：
正常人より採取した検体におけるヒト・オキュロスパニンの発現量の測定は上記工程１）と同様の方法で行うことができる。
【００４３】
c)  工程３）上記工程１）で測定された蛋白質の発現量と上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の癌を検出する工程。
【００４４】
正常人由来の検体と被験者由来の検体との間でヒト・オキュロスパニンの発現量の差を解析し、ヒト・オキュロスパニンの発現量が有意に増加している検体では癌、特に皮膚癌、更にはメラノーマが存在する可能性が高いと判定することができ、癌を検出することができる。
【００４５】
また、ヒト・オキュロスパニンの濃度を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かを解析し正常人の値として決められている範囲を超えている場合には癌を有すると判定することで癌を検出することもできるし、ヒト・オキュロスパニンの発現量と、正常人の癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、被験者から採取した検体におけるヒト・オキュロスパニンの発現量を測定することによって被験者が、正常人であるか否かを判定することもできる。
【００４６】
３．ヒト・オキュロスパニン遺伝子及びヒト・オキュロスパニンの検定
ヒト・オキュロスパニン遺伝子及びヒト・オキュロスパニンは、ヒトの正常組織の間ではメラニン細胞で発現量が有意に増加しており、更に、正常なメラニン細胞に比べ、メラノーマで発現量が有意に増加している。
【００４７】
ヒト・オキュロスパニンの機能を調べる方法としては、まず、ヒト・オキュロスパニンを発現している細胞由来のヒトｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い、完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡをマウス又はヒト細胞に導入して高発現させ、細胞に影響が生じるか否かを検討する。
【００４８】
ｃＤＮＡを動物個体内で発現させるためには、得られた完全長ｃＤＮＡをウイルスベクターに組み込み、動物に投与する方法が挙げられる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のＤＮＡウイルス、又はＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が好ましい。
【００４９】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、なかでも、ＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００５０】
また、培養細胞に対して、完全長ｃＤＮＡをヒト、マウス、ラット等由来の筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、あるいは筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、皮膚細胞等へ導入し、高発現させ、各標的細胞の有する機能、具体的には、糖や脂質の産生や取り込み、あるいはグリコーゲンの蓄積等の糖脂質代謝を調節する機能、あるいは細胞の形態にどの様な影響が現れるかを検討することができる。逆に、試験する遺伝子の全ＲＮＡに対するアンチセンス核酸を、細胞に導入し、各標的細胞の機能や形態にどの様な影響が出るかを調べることもできる。
【００５１】
完全長ｃＤＮＡを動物又は細胞に導入するにあたっては、適当なプロモーター及び形質発現に関わる配列を含むベクターに該ｃＤＮＡを組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換させる。脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani,S. et al., Mol.Cell.Biol.,(1981)1, p.854-864）、レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ、ｐＬＮＳＸ、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）、コスミドベクターｐＡｘＣｗ（タカラバイオ社製）等が挙げられるが、これに限定されない。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman,H.and  Magnusson,G., Nucleic Acids Res. (1983) 11,p.1295-1308）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法(Graham,F.L.and van der Eb,A.J. Virology,(1973) 52, p.456-457)、及び電気パルス穿孔法(Neumann, E.et al., EMBO J.(1982) 1, p.841-845)などによりサルの細胞であるＣＯＳ細胞(Gluzman,Y. Cell(1981) 23,p.175-182,ATCC：ＣＲＬ−１６５０)やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub,G. and Chasin, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77, p.4126−4220）、ヒト胎児腎臓由来２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等に取り込ませることができるが、これらに限定されない。かくして所望の形質転換体を得ることができる。
【００５２】
また、遺伝子操作により、正常動物において、目的とする遺伝子が高発現するようにトランスジェニック動物を作製し、細胞の形態にどの様な影響が現れるかを検討することも可能である。逆に、メラノーマを有する動物において、対象とする遺伝子を破壊したノックアウト動物を作製し細胞の状態を判定することができる。
【００５３】
４．ヒト・オキュロスパニン遺伝子及び／又はヒト・オキュロスパニン検出用キット
ヒト・オキュロスパニン遺伝子及び／又はヒト・オキュロスパニンは、以下の１）乃至５）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含むキットを用いて検出することができる。
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
４）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
５）上記４）に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
【００５４】
前記１）記載のプライマーは、ヒト・オキュロスパニン遺伝子のヌクレオチド配列（配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列）に基づき市販のプライマー設計ソフト（たとえば、Wisconsin GCG package Version 10.2）を用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。このようなプライマーとしては例えば、配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためには配列表の配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号６に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの組合せを使用することができる。また、前記２）に記載のプローブは、ヒト・オキュロスパニンに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、１００乃至１５００塩基長、好ましくは３００乃至６００塩基長である。これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、また、リンカーを付加していてもよい。
【００５５】
上記３）に記載の固相化試料は、上記２）に記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料の作成方法については、既に「２．癌の検出方法」の項の「（１）ヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を利用した癌の検出方法」の項中の「（１）固相化試料を用いた測定方法」の項で説明した通りであり、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【００５６】
本発明のキットには、更に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物）及び緩衝液を含めることもできる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどが例示できる。緩衝液は使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて選ばれ、必要に応じてＭｇ２＋などが添加されている。
【００５７】
前記、４）及び５）に記載の抗体は上記「「２．癌の検出方法」の項の「（３）  ヒト・オキュロスパニンの発現量（蛋白質の発現量）を利用した癌の検出方法」の項や「５．抗ヒト・オキュロパニン抗体の製造」の項に記載した方法により作製することができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよい。
【００５８】
本発明のキットはヒト・オキュロスパニン遺伝子及び／又はヒト・オキュロスパニンの検出に用いることができ、癌の有無の判定や、癌の増殖を抑制する物質のスクリーニングにも用いることができる。
【００５９】
５．抗ヒト・オキュロパニン抗体の製造
（１）  抗原の調製
抗ヒト・オキュロパニン抗体を作製するための抗原としては、ヒト・オキュロパニン又はその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
【００６０】
ヒト・オキュロスパニンは、ヒトの腫瘍組織あるいは腫瘍細胞から直接精製して使用することができ、また、ヒト・オキュロパニンをｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ヒト・オキュロパニンを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってヒト・オキュロパニンを発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。ヒト・オキュロパニンのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、文献(Graeme Wistow, Steven L. Bernstein, M. Keith Wyatt, Robert N. Fariss, Amita Behal, Jeffrey W. Touchman, Gerard Bouffard, Don Smith, and Katherine Perterson (2002) Expressed sequence tag analysis of human RPE/choroids for the NEIBank Project:Over 6000 non-redundant transcripts, npvel and splice variants, Molecular Vision 8:2-5-220)に記載されており、GenBankにアクセッション番号ＮＭ＿０３１９４５で登録されており、また、そのＯＲＦは配列表の配列番号１にも記載されている。ヒト・オキュロスパニンのｃＤＮＡは例えば、ヒト・オキュロスパニンを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ヒト・オキュロスパニンｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）［Saiki, R. K., et al. (1988) Science 239, 487-49 参照］を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
【００６１】
ポリペプチドのイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）が挙げられるが、これに限定されない。ＲＴＳを用いる場合を例に挙げると、目的の遺伝子をＴ７プロモーターにより制御される発現ベクターにクローニングし、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏの反応系に添加すると、最初に鋳型ＤＮＡよりＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡが転写され、その後大腸菌溶解液中のリボソーム等により翻訳が行われ、目的のポリペプチドが反応液中に合成される(Biochemica, 1, 20-23 (2001), Biochemica, 2, 28-29 (2001)。
【００６２】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００６３】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、及びベクターがいずれも使用できる。
【００６４】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
【００６５】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００６６】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００６７】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００６８】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、及び電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）などによりＣＯＳ細胞、あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al. (1989) : “Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, NY）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００６９】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、又は細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【００７０】
上記培養により、形質転換体の細胞内又は細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組合せることにより容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大量に製造できる。
（２）  抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体の製造
ヒト・オキュロスパニンと特異的に結合する抗体の例として、ヒト・オキュロスパニンと特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
【００７１】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
【００７２】
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
【００７３】
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製したヒト・オキュロスパニン又はその一部を使用することができる。また、ヒト・オキュロスパニン発現組換え体細胞より調製した膜画分、又はヒト・オキュロスパニン発現組換え体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを抗原として使用することもできる。
【００７４】
（ｂ）抗体産生細胞の調製  工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウス及びラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統 Ａ、AKR 、BALB/c、BDP 、BA、CE、C3H 、57BL、C57BR 、C57L、DBA 、FL、HTH 、HT1 、LP、NZB 、NZW 、RF、R III、SJL 、SWR 、WB、129 等が、またラットの場合には、たとえば、Low 、Lewis 、Spraque 、Daweley 、ACI 、BN、Fischer等を用いることができる。これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ−ルスリバー、日本SLC、The Jackson Laboratories等実験動物飼育販売業者より入手することができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスでは BALB/c 系統が、ラットではlow 系統が被免疫動物として特に好ましい。また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５〜１２週齢、さらに好ましくは６〜８週齢である。
【００７５】
ヒト・オキュロスパニン又はこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology Vol.I. II. III.,Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987)、Kabat,E.A. and Mayer,M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois (1964) 等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。これらの免疫法のうち、この発明において好適な方法を具体的に示せば、たとえば以下のとおりである。すなわち、まず、抗原である膜蛋白画分、もしくは抗原を発現させた細胞を動物の皮内又は腹腔内に投与する。ただし、免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、前半は皮内投与を行い、後半又は最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることができる。抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数３〜６回、投与間隔２〜６週間が好ましく、投与回数３〜４回、投与間隔２〜４週間がさらに好ましい。投与回数を過度に増やすと抗原を浪費し、また投与間隔を広げすぎると動物の老化による細胞の低活性化を招くために好ましくない。また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、0.05〜5 ml、好ましくは 0.1〜0.5ml 程度とする。追加免疫は、以上の通りの抗原投与の１〜６週間後、好ましくは２〜４週間後、さらに好ましくは２〜３週間後に行う。この追加免疫の時期が６週間目より遅すぎるか、あるいは１週間目より早すぎると追加免疫の効果が少ない。なお、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等により異なるが、一般に、例えばマウスの場合には、0.05〜5 ml、好ましくは 0.1〜0.5 ml、さらに好ましくは 0.1〜0.2 ml程度とする。不必要の大量投与は免疫効果を低下させるだけでなく、被免疫動物にとっても好ましいものではない。
【００７６】
上記追加免疫から１〜１０日後、好ましくは２〜５日後、さらに好ましくは２〜３日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ球を無菌的に取り出す。なお、その際に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。  ここで用いられる抗体価の測定法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、及び操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法がより好適である。
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製又は部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。  これらの脾臓細胞又はリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法（例えば、Kohler et al., Nature, 256, 495, 1975; Kohler et al., Eur.J.Immnol., 6,511, 1977; Milstein et al., Nature, 266, 550, 1977; Walsh, Nature, 266, 495, 1977）に従って行うことができる。例えば、脾臓細胞の場合には、細胞を細切してステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
【００７７】
（ｃ）  骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）の調製
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ(Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のX63-Ag8(X63)、NS1-Ag4/1(NS1)、P3X63-Ag8.Ul(P3Ul)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等、ラット由来の210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、ヒト由来のU266AR(SKO-007)、GM1500・GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等である。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、American Type Culture Collection (ATCC)等から入手することができる。
【００７８】
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地] 、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle Medium；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％  ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０7以上の細胞数を確保しておく。
（ｄ）細胞融合  抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology Vol.I. II. III.,Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987)、Kabat,E.A. and Mayer,M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois (1964) 等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下のとおりである。すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量1500〜6000、好ましくは2000〜4000のポリエチレングリコール溶液中で、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１〜１０分間、好ましくは５〜８分間混合する。
【００７９】
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノブテリン・チミジン）選択法〔Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975); Milstein at al., Nature 266, 550 (1977)〕が用いられる。この方法は、アミノブテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノブテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
【００８０】
（ｆ）単一細胞クローンへの分割(クローニング)
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる〔例えばBarbara, B.M. and Stanley, M.S. ：Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco（1980）参照〕。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられる。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。この方法では、マイクロプレートにラット胎児由来繊維芽細胞株、あるいは正常マウス脾臓細胞、胸腺細胞、腹水細胞などのフィーダー(feeder)を接種しておく。一方、あらかじめハイブリドーマを０．２〜０．５個／０．２ｍｌになるように培地中で希釈し、この希釈したハイブリドーマの浮遊液を各ウェルに０．１ｍｌずつ入れ、一定期間毎（例えば３日毎）に約１／３の培地を新しいものに交換しながら２週間程度培養を続けることによってハイブリドーマのクローンを増殖させることができる。
【００８１】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株のひとつは、Ｏ３Ｂ８−２Ｃ９−４Ｆ３と命名され、独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターに２００４年２月１７日付けで、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６２７として寄託されている。
【００８２】
（ｇ）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
【００８３】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製又は部分精製したヒト・オキュロスパニン、もしくはヒト・オキュロスパニンを発現させた細胞をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗ヒト・オキュロスパニン抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。なお、このようなスクリーニングは、上記のようにハイブリドーマをクローニングした後で行ってもよいし、その前に行ってもよい。
【００８４】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中又は８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。
【００８５】
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（2,6,10,14-tetramethyl pentadecane）（プリスタン）等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。たとえば，ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、Ｔ細胞を不活性化した後、２０日後に１０6 〜１０7 個のハイブリドーマ・クローン細胞を血清を含まない培地中に浮遊（０．５ｍｌ）させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水にたまったところでマウスより腹水を採取する。この方法により、培養液中に比べて約１００倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
【００８６】
上記方法により得たモノクローナル抗体は、例えばWeir, D.M.:Handbook of Experimental Immunology Vol. Ｉ，II，III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) に記載されている方法で精製することができる。すなわち、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等である。これらの方法のうち、硫安塩析法を３〜４回、好ましくは３〜６回繰り返すことによって、モノクローナル抗体を精製することが可能である。しかしこの方法では精製モノクローナル抗体の収率が極めて低くなる。そのため、硫安分画法を１〜２回行った粗精製モノクローナル抗体について、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等から選ばれた少なくとも１種類、好ましくは２種類の方法を行うことによって、高純度に精製されたモノクローナル抗体を高収率で得ることができる。硫安塩析法と他法との組合せ及び順序としては、a)硫安塩析法−イオン交換クロマトグラフィー法−ゲル濾過法、b)硫安塩析法−イオン交換クロマトグラフィー法−アフィニティークロマトグラフィー法、c)硫安塩析法−ゲル濾過法−アフィニティークロマトグラフィー法等を例示することができるが、高純度でかつ高収率にモノクローナル抗体を得るためには、上記c)の組合せが特好ましい。
【００８７】
精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ  ＧIIキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、ヒト・オキュロスパンに対して高い抗原特異性を有する。
【００８８】
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ouchterlony）法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
【００８９】
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。  （３）ヒト化抗ヒト・オキュロスパニン抗体の作製
免疫グロブリンＧ（以下、単に「ＩｇＧ」という。）は、分子量約２３０００の軽ポリペプチド鎖（以下「軽鎖」という。）、分子量約５００００の重ポリペプチド鎖（以下「重鎖」という。）各２本ずつから構成される。重鎖、軽鎖とも約１１０残基からなる、アミノ酸配列が保存されている領域の繰り返し構造を持ち、これらはＩｇＧの３次元構造の基本単位（以下、「ドメイン」という。）を構成する。重鎖及び軽鎖は、それぞれ連続した４個、及び２個のドメインから構成されている。重鎖、軽鎖いずれにおいても、アミノ末端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間でのアミノ酸配列の変異が大きく、このドメインは可変ドメイン（variable domain : 以下、「Ｖドメイン」という。）と呼ばれる。ＩｇＧのアミノ末端においては、重鎖、軽鎖のＶドメインが相補的に会合し可変領域を形成している。これに対し、残余のドメインは、全体として定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な配列を有し、例えば、マウスＩｇＧの定常領域はヒトＩｇＧの定常領域とは異なっているので、マウスＩｇＧはヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、ヒト抗マウス抗体（Human Anti Mouse Antibody ：以下「ＨＡＭＡ」という。）応答が起こる（シュロッフら、Cancer Res., 45, 879-85 (1985)参照）。従って、マウス抗体はヒトに繰返し投与することはできない。このような抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持したままＨＡＭＡ応答を起こさないように抗体分子を修飾する必要がある。
【００９０】
Ｘ線結晶構造解析の結果によれば、一般に、このようなドメインは３本から５本のβ鎖からなる逆平行βシートが二層重なり合った長円筒状の構造をとる。可変領域では、重鎖、軽鎖のＶドメインそれぞれにつき各３個のループが集合し、抗原結合部位を形成する。この各ループは相補性決定領域（complementarity determining region：以下、「ＣＤＲ」という。）と呼ばれ、アミノ酸配列の変異が最も著しい。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、一般に、ＣＤＲの構造を保持する役割を有し、「フレームワーク」と呼ばれる。カバトらは、重鎖、軽鎖の可変領域の一次配列を多数収集し、配列の保存性に基づき、それぞれの一次配列をＣＤＲ及びフレームワークに分類した表を作成した（カバトら、SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No.91-3242, E.A. Kabatt et al. 参照）。また、各フレームワークは、アミノ酸配列が共通の特徴を有する複数のサブグループに分類された。さらに、ヒトとマウスの間で対応するフレームワークが存在することも見いだされた。
【００９１】
このようなＩｇＧの構造的特徴に関する研究から以下のヒト化抗体の作製法が考案された。
【００９２】
研究初期の段階では、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が提案された（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 参照）。しかし、そのようなキメラ抗体は、依然として、多くの非ヒトアミノ酸残基を含むので、特に長期間投与した場合にはＨＡＭＡ応答を誘導しうる（Begentら Br. J. Cancer, 62, 487, (1990) 参照）。
【００９３】
ヒトに対しＨＡＭＡ応答を発現する可能性のある、非ヒトほ乳動物由来のアミノ酸残基を更に少なくする方法として、ＣＤＲ部分のみをヒト由来の抗体に組み込む方法が提案された（Nature, 321, 522-525, (1986)参照）が、一般に、抗原に対する免疫グロブリン活性を保持するにはＣＤＲのみの移植では不十分であった。
【００９４】
一方、チョッチアらは、1987年、Ｘ線結晶構造解析データを用い、
(i) ＣＤＲのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位とＣＤＲ自体の構造を維持する部位とが存在し、ＣＤＲの取り得る三次元構造は、複数の典型的なパターン（カノニカル構造）に分類されること、
(ii)カノニカル構造のクラスは、ＣＤＲのみならずフレームワーク部分の特定の位置のアミノ酸の種類によって決定されること、を見いだした（ J. Mol. Biol., 196, 901-917, (1987)参照）。
【００９５】
この知見に基づき、ＣＤＲ移植法を用いる場合、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植する必要性が示唆された（特表平4-502408号参照）。
【００９６】
一般に、移植すべきＣＤＲを有する非ヒト哺乳動物由来の抗体は「ドナー」、ＣＤＲが移植される側のヒト抗体は「アクセプター」と定義されるが、本発明もこの定義に従うことにする。
【００９７】
ＣＤＲ移植法を実施する際に考慮すべき点は、可能な限りＣＤＲの構造を保存し、免疫グロブリン分子の活性を保持することにある。この目的を達成するため：
(i) アクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべきか；
(ii)ドナーのフレームワークからいずれのアミノ酸残基を選択すべきか
の２点に留意する必要がある。
【００９８】
クィーンらは、ドナーのフレームワークのアミノ酸残基が、以下の基準の少なくともひとつに該当する場合、ＣＤＲ配列とともにアクセプターに移植するデザインの方法を提唱した（特表平4-502408号参照）：
(a) アクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通である。
(b) 該アミノ酸がＣＤＲのひとつのすぐ近くである。
(c) 該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原と又はヒト化抗体のＣＤＲと相互作用することができると予想される。
【００９９】
本発明の抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡは、上記抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを調製し、該ｍＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡに変換してから、該抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ単離することにより得られる。
【０１００】
ｍＲＮＡの抽出にあたっては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法なども採用しうるが、グアニジン・チオシアネート・塩化セシウム法が好適である。細胞からのｍＲＮＡの調製は、まず全ＲＮＡを調製し、該全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースやオリゴ（ｄＴ）ラテックスビーズ等のポリ（Ａ）+ＲＮＡ精製用担体を用いて精製する方法、又は細胞ライセートから該担体を用いて直接精製する方法により実施できる。全ＲＮＡの調製方法としては、アルカリショ糖密度勾配遠心分離法［Dougherty, W. G. and Hiebert, E. (1980) Viology 101, 466-474参照］、グアニジンチオシアネート・フェノール法、グアニジンチオシアネート・トリフルオロセシウム法、フェノール・ＳＤＳ法等も採用し得るが、グアニジンチオシアネート及び塩化セシウムを用いる方法［Chirgwin, J. M., et al. (1979) Biochemistry 18, 5294- 5299参照］が好適である。
【０１０１】
上記のごとくして得られたポリ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応により一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成することができる。この方法としてはＳ１ヌクレアーゼ法［Efstratiadis, A., et al. (1976) Cel1 7, 279-288 参照］、グブラー−ホフマン法［Gubler, U. and Hoffman, B. J. (1983) Gene 25, 263-269 参照］、オカヤマ−バーグ法［Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 161-170 参照］等を採用し得るが、本発明においては、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）［Saiki, R. K., et al. (1988) Science 239, 487-49 参照］を行なう、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法が好適である。
【０１０２】
このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡをクローニングベクターに組み込み、得られた組換えベクターを大腸菌等の微生物に導入して形質転換させ、テトラサイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することができる。大腸菌の形質転換は、ハナハン法［Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580 参照］、すなわち塩化カルシウムや塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、該組換えＤＮＡベクターを加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしてブラスミドを用いる場合は、上記の薬剤耐性遺伝子を有することが必要である。また、プラスミド以外のクローニングベクター、例えばラムダ系のファージ等を用いることも可能である。
【０１０３】
上記により得られた形質転換株から、目的の抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体の各サブユニットをコードするｃＤＮＡを有する株を選択する方法としては、例えば以下に示す各種方法を採用できる。なお、上記ＲＴ−ＰＣＲ法により目的のｃＤＮＡを特異的に増幅した場合は、これらの操作を省略することが可能である。
【０１０４】
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法
目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されている場合、該アミノ酸配列の一部に対応するセンスストランドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これらを組合せてポリメラーゼ連鎖反応［Saiki, R. K., et al. (1988) Science 239, 487-49 参照］を行ない、目的の抗ヒト・オキュロスパニン抗体重鎖あるいは軽鎖サブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、例えば抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡより逆転写酵素反応にて合成したｃＤＮＡを用いることができる。
【０１０５】
このようにして調製したＤＮＡ断片は、市販のキット等を利用して直接プラスミドベクターに組み込むこともできるし、該断片を32Ｐ、35Ｓあるいはビオチン等で標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより目的のクローンを選択することもできる。
【０１０６】
例えば、本発明の抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体の各サブユニットの部分アミノ酸配列を調べる方法としては、電気泳動やカラムクロマトグラフィーなどの周知の方法を用いて各サブユニットを単離してから、自動プロテインシークエンサー（例えば、島津製作所（株）製 PPSQ-10）等を利用してそれぞれのサブユニットのＮ末端アミノ酸配列を解析する方法が好適である。
【０１０７】
上記のごとくして得られた目的の形質転換株より、抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体蛋白質の各サブユニットをコードするｃＤＮＡを採取する方法は、公知の方法［Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 参照］に従い実施できる。例えば細胞よりベクターＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡより目的とするサブユニットをコードするＤＮＡ領域を切り出すことにより行うことが可能である。
【０１０８】
（ｂ）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法
目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されている場合（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、目的蛋白質のどの領域のものでもよい）、該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合、コドン使用頻度を参考に推測されるヌクレオチド配列、又は考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列のいずれも採用でき、また後者の場合イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる）、これをプローブ（32Ｐ、35Ｓあるいはビオチン等で標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を選別する。
【０１０９】
このようにして得られるＤＮＡの配列の決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法［Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) in "Methods in Enzymology" 65, 499-576参照］やジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Messing, J. and Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276参照］等により実施することができる。
【０１１０】
また近年、蛍光色素を用いた自動塩基配列決定システムが普及している（例えばパーキンエルマージャパン社製シークエンスロボット"CATALYST 800"及びモデル373AＤＮＡシークエンサ一等）。
【０１１１】
こうしたシステムを利用することで、ＤＮＡヌクレオチド配列決定操作を能率よく、かつ安全に行うことも可能である。このようにして決定された本発明のＤＮＡの各ヌクレオチド配列、及び重鎖及び軽鎖の各Ｎ末端アミノ酸配列データから、本発明のモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の全アミノ酸配列を決定することができる。
【０１１２】
イムノグロブリンの重鎖及び軽鎖は、いずれも可変領域及び定常領域からなり、可変領域はさらに相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」と記す；重鎖・軽鎖ともに各３か所）及びそれらに隣接するフレームワーク領域（重鎖・軽鎖ともに各４か所）からなる。
【０１１３】
このうち、定常領域のアミノ酸配列は、抗原の種類に関係なく、イムノグロブリンサブクラスが同一である抗体間では共通である。一方、可変領域、特にＣＤＲのアミノ酸配列は各抗体に固有のものであるが、数多くの抗体のアミノ酸配列データを比較した研究によれば、ＣＤＲの位置やフレームワーク配列の長さは、同じサブグループに属する抗体サブユニットの間ではほぼ類似していることが知られている［Kabat, E. A., et al. (1991) in "Sequence of Proteins of Immunological Interest Vol.II": U.S. Department of Health and Human Services参照］。従って、例えば抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体の抗体の重鎖及び軽鎖の各アミノ酸配列とそれら公知のアミノ酸配列データとを比較することにより、各アミノ酸配列におけるＣＤＲやフレームワーク領域及び定常領域の位置を決定することができる。なお、ＦＲＨ1、すなわち重鎖の最もＮ末端側のフレームワーク領域の鎖長については、通常（３０アミノ酸）より短いことがあり、例えば、該フレームワーク領域が最小１８アミノ酸である例などが知られている［前出 Kabat et al. 参照］。このことから本発明の抗体においては、抗ヒト・オキュロスパニン抗体としての機能を損なわない限りにおいて、重鎖のＮ末端のフレームワーク領域の鎖長を１８アミノ酸以上３０アミノ酸以下とするが、好適には３０アミノ酸である。
【０１１４】
なお、上記のようにして決定された軽鎖又は重鎖のそれぞれのＣＤＲと同じアミノ酸配列、もしくはその中の連続した部分アミノ酸配列を有するペプチドを、人為的な修飾操作を施して該ＣＤＲが抗ヒト・オキュロスパニン抗体分子中で形成する立体構造に近付けることにより、単独でヒト・オキュロスパニンに対する結合活性を付与せしめることが可能である［例えば、米国特許第５３３１５７３号公報参照］。したがって、そのように修飾された、ＣＤＲと同じアミノ酸配列、もしくはその中の連続した部分アミノ酸配列を有するペプチドも、本発明の分子に包含される。
【０１１５】
アミノ酸配列中の任意の一つもしくは二つ以上のアミノ酸を欠失させた改変体を作製するにあたっては、カセット変異法［岸本利光、“新生化学実験講座２・核酸III   組換えＤＮＡ技術” 242-251参照］などに従うことができる。
【０１１６】
この様な各種のＤＮＡは、例えばフォスファイト・トリエステル法［Hunkapiller, M., et al. (1984) Nature 310, 105-111参照］等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体が公知であり、その選択も任意でよく、例えば使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定することも可能である。これらヌクレオチド配列コドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的変異導入法（サイトスペシフィック・ミュータジェネシス）［Mark, D.F., et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666参照］等に従うことができる。
【０１１７】
また、あるＤＮＡが本発明の抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡとハイブリダイズするか否かは、例えば、該ＤＮＡを、ランダムプライマー法［Feinberg, A.P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. biochem. 132, 6-13 参照］やニックトランスレーション法［Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning A laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 参照］等に従い［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ等で標識したプローブＤＮＡを用いて、以下に記載するような実験を行うことにより調べることができる。
【０１１８】
まず調べようとするＤＮＡを、例えばニトロセルロース膜やナイロン膜等に吸着させ、必要に応じてアルカリ変性等の処理を行ってから、加熱あるいは紫外線等により固相化させる。この膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸三ナトリウム溶液）と５％  デンハート溶液、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むプレハイブリダイゼーション溶液に浸し、５５℃で４時間以上保温してから、先に調製したプローブを同様のプレハイブリダイゼーション溶液に最終比活性１×１０6ｃｐｍ／ｍｌとなるように加え、６０℃で一晩保温する。その後、膜を室温下で６×ＳＳＣで５分間の洗浄する操作を数回繰り返し、さらに２×ＳＳＣで２０分間洗浄してから、オートラジオグラフィーを行う。
【０１１９】
上記のような方法を利用して、任意のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーから、本発明のヒト化抗ヒト・オキュロスパニン抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを単離することができる［Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning A laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 参照］。
【０１２０】
上記のごとくして得られる各ＤＮＡを、それぞれ発現ベクターに組み込むことにより、原核生物又は真核生物の宿主細胞に導入し、それらの宿主細胞で各遺伝子を発現させることが可能である。発現方法は上記「５．抗ヒト・オキュロスパニン抗体の製造」の項の「（１）抗原の調製」の項に記載した方法と同一の方法によって行うことができる。
【０１２１】
形質転換体の細胞内又は細胞外に生産される、抗ヒト・オキュロスパニン抗体蛋白質を含む画分は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種公知の蛋白質分離操作法により、分離・精製することができる。かかる方法としては、具体的には例えば通常の蛋白質沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種クロマトグラフィー、透析法、及びこれらの組合せ等を採用できる。
【０１２２】
抗ヒト・オキュロスパニンマウスモノクローナル抗体をヒト化するためには、決定されたＣＤＲ配列全体及びＦＲ配列の一部のアミノ酸残基をヒト抗体へ移植するように、可変領域のアミノ酸配列を設計する必要がある。この設計は、以下の方法に従う。
【０１２３】
従来、ヒト化のデザインを行う場合、アクセプターのサブグループの選択指針としては、a)天然のアミノ酸配列を有する公知のヒト抗体の重鎖、軽鎖の天然の組合せをそっくりそのまま用いる、
b)重鎖、軽鎖が属するサブグループとしての組合せは保存するが、重鎖、軽鎖としては、それぞれ異なるヒト抗体に由来し、ドナーの重鎖、軽鎖のアミノ酸配列と同一性が高いアミノ酸配列、又は、コンセンサス配列を用いる、
のいずれかが選択されている。本発明においても、上記の指針に従うことができるが、これらと異なる方法として、
c)サブグループの組合せを考慮することなく、ドナーのＦＲと最も同一性の高い重鎖、軽鎖のＦＲをヒト抗体の一次配列のライブラリーの中から選択する、
という方法を採用することも可能である。これらの選択法により、ドナー及びアクセプター間での、ＦＲ部分のアミノ酸の同一性を少なくとも７０％以上とすることが可能となる。この方法を採用することにより、ドナーより移植するアミノ酸残基の数をより少なくすることが可能となり、ＨＡＭＡ応答誘導を減少させることができる。
【０１２４】
また、抗体分子の一次配列より三次構造を予測する操作（以下、この操作を「分子モデリング」という）はその予測精度に限界があり、そのドナーが属するサブグループにおいて稀にしか出現しないアミノ酸残基の役割を十分に特定することができない。クィーンらの方法に従い、かかる位置においてドナー、アクセプターのいずれのアミノ酸残基を選択すべきかを判断することは一般に困難である。c)の選択法によれば、このような判断をする機会を著しく減少することができる。
【０１２５】
本発明者らは、ドナーのＣＤＲの構造及び機能を維持するために重要なドナーのＦＲ由来のアミノ酸を同定するための新規な方法を提供することによって、このヒト化の方法をさらに改良している。
【０１２６】
軽鎖、重鎖それぞれのヒトアクセプター分子が選択された後、ドナーのＦＲより移植するアミノ酸残基を選択する方法は、以下に記載する通りである。
【０１２７】
ドナーとアクセプターのアミノ酸配列を並べ、両者のＦＲの対応する位置でアミノ酸残基が異なっていた場合、どちらの残基を選択するべきかを決定する必要があるが、この選択においては、ドナー由来のＣＤＲの三次元構造を損なわないよう選択を行う必要がある。
【０１２８】
クィーンらは前述の特表平４−５０２４０８号において、ＦＲ上のアミノ酸残基が、以下の要件の少なくともひとつに該当する場合、ＣＤＲ配列とともにアクセプターに移植する方法を提唱した：
１）アクセプターのヒトＦＲ領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通である；
２）該アミノ酸がＣＤＲのひとつのすぐ近くである；
３）該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原と又はヒト化抗体のＣＤＲと相互作用することができると予想される。
【０１２９】
ここで２）で示された残基はしばしば３）の性質を示すことより、本発明ではこの２）の要件を削除し、別に新たに２種の要件を設ける。すなわち、本発明では、ＣＤＲと共に移植すべきドナーのＦＲ上のアミノ酸残基については：
ａ）アクセプターのＦＲ中のアミノ酸がその位置において稀でありドナーの対応するアミノ酸が当該位置において普通であるか；
ｂ）該アミノ酸が三次元構造モデルにおいて、ＣＤＲの構成アミノ酸原子と抗原又は移植すべきＣＤＲループとの相互作用が予想されるか；
ｃ）当該位置がカノニカルクラス決定残基であるか；
ｄ）当該位置が重鎖と軽鎖の接触面を構成するか、
である場合に、ドナーのＦＲから当該アミノ酸残基を移植することにする。
【０１３０】
ａ）の要件では、前述したカバトの表に従い、同一サブクラスの抗体について当該位置で９０％以上の頻度で見いだされるアミノ酸を「普通」、１０％未満の頻度で見いだされるアミノ酸を「稀」と定義する。
【０１３１】
ｃ）の要件では、「当該位置がカノニカルクラス決定残基であるか」否かについては、前述したチョッチアの表に従い、一義的に決定することができる。
【０１３２】
ｂ）、ｄ）の要件については、予め抗体可変領域の分子モデリングが必要となる。分子モデリング用ソフトウェアとしては、市販のものならいずれのものも採用し得るが、好適には、ＡｂＭ（オックスフォード・モレキュラー・リミティッド社製）を使用することができる。
【０１３３】
分子モデリングの予測精度には一定の限界があるので、本発明においては、種々の抗体の可変領域のＸ線結晶解析の実験結果を参照することにより、分子モデリングから得られる構造予測の確からしさを２段階に区別する。
【０１３４】
本発明においては、ＡｂＭ等の分子モデリング用ソフトウェアによって構築されたところの可変領域の３次元構造において、２原子間の距離が、各々のファンデルワールス半径の和に０．５Åを加えた値より短いとき、当該２原子間はファンデルワールス接触していると推定した。主鎖及び側鎖のアミド窒素、カルボニル酸素など極性の原子間距離が平均の水素結合距離である２．９Åに０．５Å加えた距離より短い場合は、その間に水素結合が存在すると推定した。さらに、相反する電価を持つ原子間が、２．８５Åに０．５Å加えた距離より短い場合は、その間にイオン対が形成されているものと推定した。
【０１３５】
一方、種々の抗体の可変領域のＸ線結晶構造解析の実験結果から、サブグループと無関係に、高頻度にＣＤＲとの接触が見いだされるＦＲ上の位置として、軽鎖では、１、２、３、４、５、２３、３５、３６、４６、４８、４９、５８、６９、７１、８８番の位置、重鎖では、２、４、２７、２８、２９、３０、３６、３８、４６、４７、４８、４９、６６、６７、６９、７１、７３、７８、９２、９３、９４、１０３番の位置が特定される（数字はいずれも前出カバトらの文献において定義されるアミノ酸番号を表わす。以下において同じ）。分子モデリングと同じ基準を適用した場合、これらの位置のアミノ酸残基は、公知の抗体可変領域の３分の２においてＣＤＲのアミノ酸残基との接触が認められる。これらの知見に基づき、ｂ）の「該アミノ酸が三次元構造モデルにおいて、ＣＤＲの構成アミノ酸原子が抗原又は移植すべきＣＤＲループとの相互作用が予想される」とは、以下の要件を意味する。
【０１３６】
分子モデリングにおいて、ＦＲとＣＤＲとの接触の可能性が予見されたＦＲの位置が、Ｘ線結晶解析により実験的にＦＲとＣＤＲとの接触が高頻度に検出される位置のいずれかに一致する場合は、ドナーのアミノ酸残基の移植を優先する。
それ以外の場合は、この要件ｂ）は考慮しない。
【０１３７】
ｄ）の「当該位置が重鎖と軽鎖の接触面を構成する」とは、以下の要件を意味する。種々の抗体の可変領域のＸ線結晶解析の実験結果から、軽鎖においては、３６、３８、４３、４４、４６、４９、８７、９８番目のアミノ酸残基、重鎖においては、３７、３９、４５、４７、９１、１０３、１０４番目のアミノ酸残基が、高頻度に重鎖−軽鎖間接触をすることが認められている。分子モデリングにおいて、重鎖−軽鎖間接触の可能性が予見され、その位置が上述の位置のいずれかに一致する場合は、ドナーのアミノ酸残基の移植を優先する。それ以外の場合は、この要件ｄ）は考慮しない。
【０１３８】
本発明のヒト化抗ヒト・オキュロスパニン抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、以下に記載する方法で製造することができる。
【０１３９】
例えば、６０乃至７０ヌクレオチドの、該ＤＮＡの部分ヌクレオチド配列からなる複数のポリヌクレオチド断片を、センス側及びアンチセンス側において互い違いになるように化学合成し、その後各ポリヌクレオチド断片をアニーリングし、ＤＮＡリガーゼにより結合し、所望のヒト化抗ヒト・オキュロスパニン抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを有するＤＮＡを得ることができる。
【０１４０】
別の方法として、アクセプターの可変領域の全アミノ酸配列をコードするＤＮＡをヒトリンパ球より分離し、ＣＤＲをコードする領域に当業者に周知の方法でヌクレオチド置換を行うことにより、制限酵素切断配列を導入する。対応する制限酵素で該領域を切断した後、ドナーのＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を合成し、ＤＮＡリガーゼにより結合して、所望のヒト化抗ヒト・オキュロスパニン抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを得ることができる。
【０１４１】
さらに、本発明では、好適には以下に述べるオーバーラップ・エクステンション・ＰＣＲ法（ホルトンら、Gene, 77, 61-68, (1989) 参照）に従い、所望のヒト化抗ヒト・オキュロスパニン抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを得ることができる。
【０１４２】
すなわち、接続を所望する２種のアミノ酸配列をそれぞれコードする２種のＤＮＡを、便宜的に（Ａ）及び（Ｂ）とする。（Ａ）の５’側にアニールする２０乃至４０ヌクレオチドのセンスプライマー（以下、このプライマーを（Ｃ）とする。）及び（Ｂ）の３’側にアニールする２０乃至４０ヌクレオチドのアンチセンスプライマー（以下、このプライマーを（Ｄ）とする）を化学合成する。さらに、（Ａ）の３’側の２０乃至３０ヌクレオチドと（Ｂ）の５’側２０乃至３０ヌクレオチドを連結した、キメラ型のセンスプライマー（以下、このプライマーを（Ｅ）とする）及びこれに相補的なアンチセンスプライマー（以下、このプライマーを（Ｆ）とする）を合成する。（Ａ）を含む適当なベクターＤＮＡ
を基質にして、センスプライマー（Ｃ）及びキメラ型アンチセンスプライマー（Ｆ）を用いたＰＣＲを行うことにより、（Ａ）の３’末端に（Ｂ）の５’末端側２０乃至３０ヌクレオチドが付加したＤＮＡを得ることができる（この新たに得られたＤＮＡを（Ｇ）とする）。同様に、（Ｂ）を含む適当なベクターＤＮＡを基質にして、アンチセンスプライマー（Ｄ）及びキメラ型センスプライマー（Ｅ）を用いたＰＣＲを行うことにより、（Ｂ）の５’末端に（Ａ）の３’末端側２０乃至３０ヌクレオチドが付加したＤＮＡを得ることができる（この新たに得られたＤＮＡを（Ｈ）とする。）。このようにして得られた（Ｇ）と（Ｈ）は、（Ｇ）の３’側４０乃至６０ヌクレオチドと（Ｈ）の５’側４０乃至６０ヌクレオチドにおいて相補的なヌクレオチド配列を保持している。増幅された（Ｇ）及び（Ｈ）を混合してＰＣＲを行った場合、１回目の変性反応で（Ｇ）と（Ｈ）は１本鎖になり、その後のアニーリング反応で殆どのＤＮＡは元に戻るが、一部のＤＮＡについては相補的ヌクレオチド配列領域でアニーリングするヘテロＤＮＡ２本鎖を形成する。その後の伸長反応で、突出した１本鎖部分が修復され、（Ａ）と（Ｂ）が連結したキメラ型のＤＮＡ（以下、このＤＮＡを（Ｉ）とする。）を得ることができる。さらにこの（Ｉ）を基質として、センスプライマー（Ｃ）とアンチセンスプライマー（Ｄ）を用いＰＣＲを行うことにより、（Ｉ）を増幅することができる。本発明では、抗ヒトヒト・オキュロスパニンマウスモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域をコードするＤＮＡ及びヒト免疫グロブリンＩｇＧのＦＲ領域をコードするＤＮＡ、さらには、ヒト免疫グロブリンＩｇＧの分泌シグナルをコードするＤＮＡを、それぞれケース・バイ・ケースにより（Ａ）及び（Ｂ）として上記の連結反応を行うことができる。
【０１４３】
なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。これらヌクレオチド配列コドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したサイトスペシフィック・ミュータジェネシス（site specific mutagenesis ）（Mark, D. F., et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666参照）等に従うことができる。したがって、各プライマーを化学合成する際に、予め点突然変異を導入するように各プライマーを設計することにより、所望の抗ヒト・オキュロスパニン抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを得ることができる。
【０１４４】
このようにして得られた本発明の各ＤＮＡをそれぞれ発現ベクターに組み込むことにより、原核生物又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらベクターに適当なプロモーター及び形質発現に関わる配列を導入することにより、各々の宿主細胞において各遺伝子を発現させることが可能である。
【０１４５】
上記方法により、容易に高収率、高純度で組換え抗ヒト・オキュロスパニン抗体を製造できる。
【０１４６】
（４）抗ヒト・オキュロスパニン完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ヒト・オキュロスパニン完全ヒト抗体は、ヒト抗体のH鎖とL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Tomizuka, K.et al.,Nature Genetics, 16, p.133-143, 1997.; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., 26, p.3447-3448, 1998.; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p.69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000.等を参照。）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法(Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43(7), p.2301-8, 2002; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,1 (2), p.189-203, 2002; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, 109(3), p.427-431, 2002等参照。)によって取得することができる。
【０１４７】
このようにして作製される組換え抗ヒト・オキュロスパニン抗体がヒト・オキュロスパニンと特異的に結合することを確認する方法としては、例えば、マウス免疫時に抗体価の評価を行う場合と同様のＥＬＩＳＡ法が好適である。
【０１４８】
６．抗ヒト・オキュロスパニン抗体を含有する医薬
上述の「５．抗ヒト・オキュロパニン抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗ヒト・オキュロスパニン抗体の中から、ヒト・オキュロスパニンの生物活性を中和する抗体又はヒト・オキュロスパニンを発現する癌細胞を特異的に傷害する抗体を得ることができる。これらの抗体は、生体内でのヒト・オキュロスパニンの生物活性、即ち、細胞の癌化を阻害することから、医薬として、特に癌に対する治療剤として用いることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗ヒト・オキュロスパニン抗体によるヒト・オキュロスパニンの生物活性の中和活性は例えば、ヒト・オキュロスパニンを過剰発現している細胞における細胞の癌化の抑制活性で測定することができる。例えば、ヒト・オキュロスパニンを過剰発現しているマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３を培養し、培養系に種々の濃度で抗ヒト・オキュロスパニン抗体を添加し、フォーカス形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗ヒト・オキュロスパニン抗体による癌細胞の傷害活性は例えば、ヒト・オキュロスパニンを過剰発現している細胞に対して抗ヒト・オキュロスパニン抗体の示す抗体依存性細胞障害活性、補体依存性細胞障害活性又は補体依存性細胞性細胞障害活性で測定することができる。例えば、ヒト・オキュロスパニンを過剰発現している２９３Ｔ細胞を培養し、培養系に種々の濃度で抗ヒト・オキュロスパニン抗体を添加し、さらにマウス脾臓細胞を添加して適当時間培養後の、ヒト・オキュロスパニン過剰発現細胞に対する細胞死誘導率を測定することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ヒト・オキュロスパニン抗体の癌に対する治療効果は、例えば、ヒト・オキュロスパニンを過剰に発現しているトランスジェニック動物に同ヒト・オキュロスパニン抗体を投与し、癌細胞の変化を測定することができる。  このようにして得られたヒト・オキュロスパニンの生物活性を中和する抗体又はヒト・オキュロスパニンを発現する癌細胞を特異的に傷害する抗体は、医薬として特に癌の治療を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。癌の種類としては、皮膚癌や皮膚癌の一種であるメラノーマを好適に挙げることができるがこれらに限定されない。
【０１４９】
本発明は、治療に有効な量の抗ヒト・オキュロスパニン抗体と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。
【０１５０】
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
【０１５１】
本発明の医薬組成物は、ｐH、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、色、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、維持したり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素、トリス−塩酸（Tris-Hcl）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の当アルコール、懸濁剤、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルビテート20やポリソルビテート80等ポリソルビテート、トリトン（triton）、トロメタミン（tromethamine）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗ヒト・オキュロスパニン抗体の重量にたいして０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
【０１５２】
医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはｐH7.0−8.5のTrisバッファーやpH4.0-5.5の酢酸バッファーやそれらにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物は選択された組成で必要な純度で適当な薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。抗ヒト・オキュロスパニン抗体を含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
【０１５３】
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗ヒト・オキュロスパニン抗体のヒト・オキュロスパニンに対する親和性、即ち、ヒト・オキュロスパニンに対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。投与量は、ヒト型抗ヒト・オキュロスパニン抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜３０日間に１回投与すればよい。
【０１５４】
本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【０１５５】
７．直接相互作用する物質の探索
本発明の他の一つの態様としては、ヒト・オキュロスパニンの活動を抑制するような物質を得ることを目的とした、該蛋白質の立体構造をベースとしたドラッグデザインの手法を含む。このような手法は、ラショナルドラッグデザイン法として知られており、酵素活性などの機能や、リガンド、コファクター、又はＤＮＡへの結合などを効率よく阻害もしくは活性化させるような化合物の探索に利用されている。この例として、すでに上市されている抗ＨＩＶ剤であるプロテアーゼの阻害剤がよく知られている。本発明のヒト・オキュロスパニンの三次元構造解析においても、Ｘ―線結晶解析や核磁気共鳴法といった一般的によく知られている手法が利用できると考えられる。さらに、ヒト・オキュロスパニンの機能を抑制する物質の探索には、コンピュータードラッグデザイン（ＣＡＤＤ）を活用した設計も可能である。この例としては、慢性関節リウマチ治療の新たなゲノム新薬として期待されているＡＰ−１の働きを阻害する低分子化合物（国際特許出願公開ＷＯ９９／５８５１５号）などが知られている。このような方法により、ヒト・オキュロスパニンに直接結合するか、あるいはヒト・オキュロスパニンと他の因子との相互作用を阻害することにより、ヒト・オキュロスパニンの機能を抑制するような物質を得ることができる。
【０１５６】
さらに、他の一つの態様は、本発明のヒト・オキュロスパニンが会合するポリペプチド、すなわちヒト・オキュロスパニンのパートナー蛋白質に関する。すなわち、本発明は、ヒト・オキュロスパニンの活性を調節するパートナー蛋白質のスクリーニング方法に関する。
【０１５７】
このスクリーニング方法の一つの態様は、ヒト・オキュロスパニンに被験蛋白質試料を接触させ、ヒト・オキュロスパニンに結合する蛋白質を選択する工程を含む。このような方法としては、例えば、精製したヒト・オキュロスパニンを用いて、これに結合する蛋白質のアフィニティー精製を行う方法が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、ヒト・オキュロスパニンにヒスチジン６個よりなる配列をアフィニティータグとして融合したものを作製して、これを細胞の抽出液（予めニッケル−アガロースカラムにチャージして、このカラムを素通りした画分）と４℃で１２時間インキュベートし、次いで、この混合物に別途ニッケル−アガロース担体を加えて４℃で１時間インキュベートする。ニッケル−アガロース担体を洗浄バッファーで十分洗浄した後、１００ｍＭイミダゾールを加えることにより、ヒト・オキュロスパニンと特異的に結合する細胞抽出液中の蛋白質を溶出させて精製し、この構造を決定する。このようにして、ヒト・オキュロスパニンと直接結合する蛋白質、及びヒト・オキュロスパニンとの結合活性は持たないが、サブユニットとしてヒト・オキュロスパニンに直接結合する蛋白質と複合体を形成することにより間接的にヒト・オキュロスパニンに結合する蛋白質が精製できる［実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ５「転写因子研究法」ｐｐ２１５−２１９（羊土社刊）］。
【０１５８】
別の方法としては、ファーウエスタンブロット法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ７６−８１（羊土社刊）］や、酵母や哺乳類動物細胞を用いたツーハイブリッドシステム法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ６６−７５（羊土社刊）、「チェックメイト・マンマリアン・ツーハイブリッドシステム」（プロメガ社製）］によるクローニングも可能であるが、これらの方法に限定されない。
【０１５９】
このようにして、ヒト・オキュロスパニンと直接もしくは間接的に相互作用するパートナー蛋白質のｃＤＮＡが得られれば、ヒト・オキュロスパニンと該パートナー蛋白質との相互作用を阻害する物質の機能的スクリーニングに利用することができる。具体的には、例えば、ヒト・オキュロスパニンとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質を調製して、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビオチン化した該パートナー蛋白質をこの融合蛋白質と接触させ、該融合蛋白質との結合をストレプトアビジン化アルカリホスファターゼで検出する。ビオチン化した該パートナー蛋白質添加の際、被験物質も添加し、融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合を促進あるいは阻害する物質を選択する。この方法では、融合蛋白質に直接作用する物質又は該パートナー蛋白質に直接作用する物質が得られる。
【０１６０】
融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合が間接的であり、何らかの別の因子を介しているような場合には、例えば該因子を含むような細胞抽出液存在下で、同様に上記アッセイを行う。この場合には、該因子に対して作用するような物質も選択される可能性がある。
【０１６１】
また、得られたパートナー蛋白質が、ヒト・オキュロスパニンの機能を抑制する活性を有している場合には、既に記載したヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現ベクターを応用した試験方法に従って、抗癌剤、例えば、前立腺癌の治療剤として有用な候補物質のスクリーニングを行うことができる。また、得られたパートナー蛋白質が、ヒト・オキュロスパニンの機能を抑制する活性を有している場合には、このような抑制因子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、癌の遺伝子治療に用いることができる。
【０１６２】
そのようなポリヌクレオチドは、例えば同定された阻害因子のアミノ酸配列を解析し、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを合成してｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより取得できる。また、ヒト・オキュロスパニンの機能の阻害活性を有するぺプチドが、ランダムに合成された人工ペプチドライブラリー由来である場合は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを化学合成する。
【０１６３】
遺伝子治療においては、そのようにして得られた阻害因子をコードする遺伝子を、例えばウイルスベクターに組み込んで、該組換えウイルスベクターを有するウイルス（無毒化されたもの）を患者に感染させる。患者体内では抗癌因子が産生され、癌細胞の増殖抑制機能を有するので、癌の治療が可能となる。
【０１６４】
遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス,1994年4月号,20-45頁、実験医学増刊,12(15)(1994)、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」,羊土社（1996））のいずれの方法も適用することができる。
【０１６５】
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに、阻害因子あるいはその変異体をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【０１６６】
また遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するインビボ（in vivo）法及びヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボ（ex vivo）法がある（日経サイエンス,1994年4月号,20-45頁、月刊薬事,36(1),23-48（1994）、実験医学増刊, 12 (15)(1994)）。
【０１６７】
例えば、該遺伝子治療剤がインビボ法により投与される場合は、疾患、症状等に応じ、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等、適当な投与経路により投与される。またインビボ法により投与する場合は、該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソーム又は膜融合リポソーム（センダイウイルス−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【０１６８】
配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列は、いわゆるアンチセンス治療に用いることができる。アンチセンス分子は、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列の一部に相補的な、通常１５乃至３０ｍｅｒからなるＤＮＡ、もしくはそのホスホロチオエート、メチルホスホネート又はモルフォリノ誘導体などの安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体として用いられ得る。そのようなアンチセンス分子を、微量注入、リポソームカプセル化により、あるいはアンチセンス配列を有するベクターを利用して発現させるなど、本発明の技術分野において周知の方法で、細胞に導入することができる。このようなアンチセンス療法は、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列がコードする蛋白質の活性が増加しすぎることによって引き起こされる病気の治療に有用である。
【０１６９】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造され得る。このような担体と製造方法の例は、Applied Antisense Oligonucleotide Technology（1998 Wiley−Liss、Inc．）に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤は、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【０１７０】
本発明の化合物を患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Mannino et al.,Biotechniques,1988,6,682;Blume and Cevc,Biochem.et Biophys.Acta,1990,1029,91;Lappalainen et al.,Antiviral Res.,1994,23,119;Chonn and Cullis,Current Op.Biotech.,1995,6,698 ）。
【０１７１】
０．２−０．４ μｍのサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Fraley et al.,Trends Biochem.Sci.,1981,6,77 ）。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８の炭素原子、特に１６−１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４−１８の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【０１７２】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスの蛋白質コート（Morishita et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),1993,90,8474 ）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又は蛋白質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げる事ができる。標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ ；Ｆ （ａｂ'）2 ）、であり得る。２ 種又はそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【０１７３】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１mg（好適には、３０mg）、上限２０００mg（好適には、１５００mg）を、注射の場合には、１回当り下限０．１mg（好適には、５mg）、上限１０００mg（好適には、５００mg）を皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。
【実施例】
【０１７４】
以下、実施例を示してこの発明を詳細かつ具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」（Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T.著, Cold SpringHarbor Laboratory Pressより1989年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。 
【０１７５】
実施例１  癌細胞で特異的に発現している遺伝子の選別
配列表の配列番号１と部分的に重複するヌクレオチド配列を有するＥＳＴプローブ（Affimetrix Genechip HG-133 probe 223795＿at：アフィメトリクス社製）について、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社製のデータベース（GeneExpress Software System Release 1.4.2）を用いて発現プロファイル解析を行った。
【０１７６】
各種細胞株内でのヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を比較した結果、メラニン細胞（メラノサイト：melanocyte）８例は、他の細胞株群、すなわち血球系細胞サンプル１２例、グリア細胞株サンプル６例、上皮系細胞サンプル６２例と比較して有意に高く転写されていた（順にＰ値＜０．０００１、＝０．０００７、＜０．０００１  図１上パネル）
次に組織由来サンプルでのヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を比較した。健常人皮膚サンプル66例、及びメラノーマサンプル33例について転写量を比較したところ、メラノーマサンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＜０．０００１：図１下パネル）。また、健常人皮膚サンプル66例と、メラノーマサンプルのうち、皮膚組織由来サンプル１２例を比較したところ、メラノーマサンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＝０．０００７：図２上パネル）。
【０１７７】
一方、健常人皮膚サンプル66例と、メラノーマサンプルのうち、リンパ節組織由来サンプル１２例を比較したところ、メラノーマサンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＝０．０００３：図２下パネル）。
さらに、健常人リンパ節由来サンプル１３例と、メラノーマサンプルのうち、リンパ節組織由来サンプル１２例を比較したところ、メラノーマサンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＝０．００１１：図３パネル）。
【０１７８】
実施例２  ヒト・オキュロスパニン遺伝子の取得と発現プラスミドの構築
ａ）ＰＣＲ反応
ヒト・オキュロスパニンｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして
5’-CACCATGGAGGAGGGGGAGAGGAGCCC−3’（プライマー１：配列表の配列番号５）
及び、
5’-GCCCCGGGCGGGTTTGGCAGCGG-3’(プライマー２：配列表の配列番号６)
の配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。なお、プライマー１はヒト・オキュロスパニン遺伝子の開始コドン上流にＫｏｚａｋ配列として４塩基、CACCを付加したオリゴヌクレオチドであり、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至２３からなるヌクレオチド配列の５’側に４塩基配列（CACC）付加した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。このCACC配列は、クローニングベクターｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯへの組み込みの際にベクター３’末端と相補鎖を形成するため、遺伝子の方向性を保持したベクターへの組み込みを可能としている。プライマー２は配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０４３乃至１０６５からなるヌクレオチド配列の相補鎖からなるオリゴヌクレオチドである。
ＰＣＲ反応はＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社製）を添付プロトコールに従って用いて行った。具体的には、得られたファーストストランドｃＤＮＡ  ０．１μｌに１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度の合成プライマー１と合成プライマー２をそれぞれ１．５μｌ、１０Ｘ  Ｐｆｘ  Ａｍｐｌｉｆａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを１．５μｌ、、５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を１μｌ、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．５μｌ、１０Ｘ  ＰＣＲｘ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １０μｌ、滅菌精製水２８．９μｌを添加し、５０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＰＣ−２００  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（エムジェーリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製）により行った。まず９４℃で２分加熱した後、引き続き９４℃で３０秒、６５℃で２分の温度サイクルを５回、続いて９４℃で３０秒、６０℃で４０秒、６８℃で１分２０秒の温度サイクルを５回、続いて９４℃で３０秒、５５℃で４０秒、６８℃で１分２０秒の温度サイクルを５回、続いて９４℃で３０秒、５０℃で４０秒、６８℃で１分２０秒の温度サイクルを３５回繰り返し、最後に６８℃で１０分間保温してから、４℃に保存した。目的ｃＤＮＡは、反応物を１．５％のアガロースゲルで電気泳動し、ＮＭ＿０３１９４５  ｃＤＮＡ（１０６９ｂｐ）の増幅を確認後、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．  ＵＶ−Ｆｒｅｅ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）をその添付プロトコールに従って用いることによりアガロースゲルよりＤＮＡを精製した。精製されたｃＤＮＡの濃度は、１Ｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５（Ｋｏｄａｋ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＥＤＡＳ２９０：コダック社製）を用い、１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（インビトロジェン社製）を濃度標準物にして測定した。
【０１７９】
ｂ）ヒト・オキュロスパニン  ｃＤＮＡのｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへのクローニング
ｐＥＮＴＲ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ  （インビトロジェン社製）を添付プロトコールに従って用い、実施例２ａ）によって得られたＮＭ＿０３１９４５  ｃＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。ＮＭ＿０３１９４５  ｃＤＮＡを、キット付属の反応バッファー中でＴｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅを結合させてあるｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターと混合し室温で３０分間インキュベートした。得られた反応物を用いて大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果カナマイシン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、１ｍｌの５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む液体ＴＢ培地中で３７℃で一晩培養し、Ｍｏｎｔａｇｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ９６  Ｋｉｔ（ミリポア社製）を利用することによりプラスミドＤＮＡを単離精製した。得られたプラスミドＤＮＡについて、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔをその添付プロトコールに従って用いることにより反応を行った後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社製）によりヌクレオチド配列解析を行い、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＯ．ＮＭ＿０３１９４５  に示されるヌクレオチド配列のＯｐｅｎ  ＲｅａｄｉｎｇＦｒａｍｅを有するｃＤＮＡ（配列表の配列番号１）が、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに組み込まれていることを確認した。
【０１８０】
次に発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１/ＤＥＳＴ４０（インビトロジェン社製）へＧＡＴＥＷＡＹＴＭシステムを用いて遺伝子の乗せ替えを行った。すなわち、ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅＴＭ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（インビトロジェン社製）４μｌ、ＬＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ-ＮＭ＿０３１９４５  ０．３μｇ、ｐｃＤＮＡ３．１/ＤＥＳＴ４０  ０．３μｇをＴＥバッファーで２０μｌに調製し、２５℃で１時間反応させる。反応後、２μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加え、３７℃にて１０分間反応させる。得られた反応物を用いて大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、１００ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で３７℃で一晩培養し、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭＡＸＩ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を利用することによりプラスミドＤＮＡ（pcDNA3.1-DEST40-NM＿031945）を単離精製した。
実施例３  ヒト・オキュロスパニン遺伝子の細胞への導入と発現されたヒト・オキュロスパニン遺伝子産物の確認、及び免疫原としてのヒト・オキュロスパニン発現細胞の膜画分の調製
ａ）プラスミドpcDNA3.1-DEST40-NM＿031945のＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクション
実施例２によって得られたプラスミドpcDNA3.1-DEST40-NM＿031945をＮＩＨ３Ｔ３細胞に以下のようにトランスフェクションした。ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションは（株）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてリポフェクションにより行った。すなわち、まずＮＩＨ３Ｔ３細胞を６穴プレートにてセミコンフルエントになるまで増殖させた。細胞を抗生物質の入っていない、１０％  ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで一度洗浄したのち、２００μｌの抗生物質の入っていない、１０％  ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭを加えた。次に１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中に無血清培地（ＤＭＥＭ）１００μｌと、上記方法にて回収したプラスミドＤＮＡ（pcDNA3.1-DEST40-NM＿031945）２μｇを加え、混合した。別の１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中に無血清培地（ＤＭＥＭ）９６μｌと、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ  ４μｌを加え、混合した。ＤＮＡ溶液とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ溶液を混合し、室温にて２０分間放置した。その後、ＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合液を細胞に加え、３７℃、５％  ＣＯ２下で培養した。４時間後  １０％  ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ  １ｍｌを細胞に加え、３７℃、５％  ＣＯ２下で一晩培養した。
【０１８１】
ｂ）プラスミドpcDNA3.1-DEST40-NM＿031945のＮＩＨ３Ｔ３細胞での発現の確認
このようにして得られた細胞培養物を回収した。ｃＤＮＡを含まないネガティブコントロール又はpcDNA3.1-DEST40-NM＿031945でトランスフェクトして得たＮＩＨ３Ｔ３細胞をＰＢＳ（−）緩衝液（（株）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で洗浄した。細胞をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用の２−メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液（バイオラッド社製）に溶解し、１２．５％  ポリアクリルアミドゲル（e  パジェル  Ｅ−Ｔ１２．５Ｌ  アトー（株）社製）を用いて、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０１８２】
電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルからバンドを転写緩衝液（１９２ｍＭ  グリシン、２０％  メタノール、２５ｍＭ  トリス）中でゲルメンブレン転写装置（マリソル社製、ＮＰ７５１３）を用いて４℃、１２０分、２００ｍＡの条件でＰｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  Ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）メンブレン（ミリポア社製）に転写した。
【０１８３】
転写後のＰＶＤＦメンブレンについて、抗Ｖ５タグ抗体（（株）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いたウエスタンブロット解析を行った。すなわち、まずＰＶＤＦメンブレンをブロックエース((株)雪印製)にて、ブロッキング（室温で３０分間を１回）した後、プラスチックバッグ（商品名ハイブリバック、コスモバイオ（株）社製）に入れ、抗Ｖ５タグ抗体（１０００倍希釈）、ブロックエース  ５ｍｌ添加して室温で１時間振とうした。１時間後、メンブレンを取り出し０．０５％のツイーン２０を含むＰＢＳ（以下「０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ」という）で洗浄した（室温で１５分間を１回、次いで５分間を２回）その後、メンブレンを新しいプラスチックバッグに移し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャム・ファルマシア社製）を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５０００倍に希釈した溶液３０ｍｌを入れ、を室温で１時間振とうした。１時間後、メンブレンを取り出し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１５分間×１回、次いで５分間×４回洗浄した。洗浄後、メンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて、抗Ｖ５タグ抗体が結合するバンドの検出を行った（メンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液に１分間浸した後、Ｘ線フィルムを感光させた（１分間））。その結果、抗Ｖ５タグ抗体により、pcDNA3.1-DEST40-NM＿031945プラスミドＤＮＡを導入して得られたＮＩＨ３Ｔ３細胞に特異的なバンドが検出された（図４）。
【０１８４】
ｃ）  プラスミドpcDNA3.1-DEST40-NM＿031945のＢＡＬＢ−３Ｔ３細胞へのトランスフェクション
ＢＡＬＢ−３Ｔ３細胞（American Type Culture Collection No. ＣＣＬ-１６３ ）を、１０％  ウシ血清（ギブコ社製）（以下「ＣＳ」という）を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という：日水製薬（株）社製）を入れた細胞培養用フラトレイ（培養面積５００ｃｍ2；住友ベークライト（株）社製）3枚中でセミコンフルエントになるまで３７℃、５％  炭酸ガス下で培養した後、pcDNA3.1-DEST40-NM＿031945をＢＡＬＢ−３Ｔ３細胞にトランスフェクションした。ＢＡＬＢ−３Ｔ３細胞へのトランスフェクションは（株）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒＴＭ  ２  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてリポフェクションにより行った。すなわち、細胞を無血清培地（ＤＭＥＭ）で一度洗浄したのち、５００ｍｌの無血清培地（ＤＭＥＭ）を加えた。次に５０ｍｌファルコンチューブ中にＮｅｗ  ＤＮＡ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ６ｍｌと、上記方法にて回収したプラスミドＤＮＡ（pcDNA3.1-DEST40-NM＿031945）２４０μｇを加え、混合した。別の５０ｍｌファルコンチューブ中に無血清培地（ＤＭＥＭ）４．８ｍｌと、ＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒＴＭ  ２  Ｒｅａｇｅｎｔ  １２００μｌを加え、混合した。ＤＮＡ溶液とＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒＴＭ  ２溶液を混合し、室温にて２０分間放置した。その後、ＤＮＡ−ＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒＴＭ  ２混合液を細胞に加え（４ｍｌ/トレイ）、３７℃、５％  ＣＯ２下で培養した。４時間後  ２０％  ウシ血清を含むＤＭＥＭ  ５０ｍｌ/トレイを細胞に加え、３７℃、５％  ＣＯ２下で一晩培養した。
【０１８５】
ｄ）細胞膜画分の調製
上記の方法にて培養した細胞をＰＢＳ（−）緩衝液（（株）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で洗浄する。セルスクレーパー(住友ベークライト（株）社製)を用いて細胞を回収し、５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ８．０  ７ｍｌに懸濁する。４℃にて３０分間細胞溶液を放置する。Ｄｏｕｎｃｅ  Ｔｙｐｅ  Ｂ  ホモジェナイザー（３０ストローク）にて細胞を破砕する。１０００Ｇで１０分間遠心し、上清を回収する。上清を７８０００Ｇ  １００分間、超遠心分離機(日立（株）製)にて遠心し、沈殿を回収する。ショ糖密度勾配により、膜画分を濃縮する。すなわち、沈殿を５７％ショ糖  ０.２５Ｍ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．０  ３ｍＬに溶解する。超遠心用チューブに移しかえ、その細胞溶液の上へ３７．２％５７％ショ糖  ０.２５Ｍ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．０  ３ｍＬ、０．２５Ｍ５７％ショ糖  ０.２５Ｍ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．０  １．５ｍＬを重層する。超遠心分離機にて、７５５００Ｇ  １６時間遠心する。チューブ中の溶液を上方より１ｍＬずつ回収する。各フラクションに１０ｍＬの５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ８．０を加え、７８０００Ｇ  １時間超遠心し、沈殿を回収する。沈殿に５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ８．０  ５００μｌを加え、Ｄｏｕｎｃｅ  Ｔｙｐｅ  Ｂ  ホモジェナイザー（１０ストローク）にて細胞溶液を均一化する。発現確認の項で述べたウエスタンブロッティング法により、細胞膜画分を同定し、免疫原とする。
【０１８６】
実施例４  マウスの免疫及び細胞融合
（４−１）  免疫
実施例３で得られたヒト・オキュロスパニン発現細胞の膜画分溶液  １ｍｌ（全蛋白質量; １００μｇ）を４〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウス雌（日本エスエルシー社より購入）腹腔内に投与した。２週間後、同様の膜画分溶液（２０μｇ蛋白質／マウス）を腹腔内に投与し追加免疫する。
【０１８７】
（４−２）  細胞融合
追加免疫３日後のマウスより脾臓を摘出し、これを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）、３５０ｍｇ／ｍｌ  炭酸水素ナトリウム、０．０５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、３００μｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミン酸を含む無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（１０．４ｇ／リットル  ＲＰＭＩ１６４０「ニッスイ」（１）：日水製薬（株）社製）（以下「無血清ＲＰＭＩ培地」という）１０ｍｌ中に入れ、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社製）上でスパーテルを用いてつぶす。メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心して脾臓細胞を沈澱させた後、この脾臓細胞を無血清ＲＰＭＩ培地で２回洗浄してから、無血清ＲＰＭＩ培地に懸濁して細胞数を測定する。
【０１８８】
一方、１０％  ＦＣＳ（ギブコ・ビーアールエル社製）を含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）（以下「血清入りＡＳＦ培地」という）にて、３７℃、５％  炭酸ガス存在下で細胞濃度が１×１０8細胞／ｍｌを越えないように培養したミエローマ細胞  ＮＳ１（American Type Culture Collection TIB-18 ）を同様に無血清ＲＰＭＩ培地で洗浄し、無血清ＲＰＭＩ培地に懸濁して細胞数を測定する。
【０１８９】
３×１０7個相当のＮＳ１細胞懸濁液と、３×１０8個相当の脾臓細胞懸濁液を混合し、遠心後、上清を完全に除去する。以下の細胞融合の操作は、ペレットの入ったプラスチック遠沈管を温水を入れたビーカー中で３７℃に保温しながら実施する。このぺレットに、５０％（ｗ／ｖ）  ポリエチレングリコール  １５００（ベーリンガー・マンハイム社製）１ｍｌを、ピペットの先でぺレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＲＰＭＩ培地１ｍｌを２回に分けてゆっくり添加し、さらに７ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地を添加する。遠心後、上清を除去し、１０％  ＦＣＳを含むヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地（以下「ＨＡＴ培地」という；ベーリンガー・マンハイム社製）１０ｍｌを、ピペットの先でゆっくり撹拌しながら添加する。さらに１０％  ＦＣＳを含むＨＡＴ培地  ２０ｍｌを添加した後に、細胞培養用９６穴マイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガス下で培養する。７〜８日後、培地が黄色味を帯びたウェルには新しいＨＡＴ培地を１００μｌ／ウェルずつ加えた。このようにして得られた融合細胞を、以下に記載する限界希釈法によるスクリーニングに供する。
【０１９０】
（４−３）  限界希釈
４〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウス雌（日本エスエルシー社より購入）より胸腺を摘出後、メッシュ（セルストレイナー；ファルコン社製）上でスパーテルを用いてつぶし、メッシュを通過した細胞を１０％  ＦＣＳを含むヒポキサンチン・チミジン培地（以下「ＨＴ培地」という；ベーリンガー・マンハイム社製）で２回洗浄する。マウス１匹分の胸腺細胞を１０％  ＦＣＳを含むＨＴ培地  ３０ｍｌに懸濁したものをフィーダー細胞液とした。上記（４−２）で得られた融合細胞を含む培養液を、細胞密度に応じてフィーダー細胞液で１０乃至１００倍に希釈し、さらに融合細胞の密度が５細胞／ｍｌ、１細胞／ｍｌ、０．５細胞／ｍｌとなるように、フィーダー細胞液で段階希釈する。このようにして調製した各試料を、細胞培養用９６穴マイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガス下で５日間培養する。
【０１９１】
（４−４）  選別
（４−４−１）細胞ＥＬＩＳＡ
ヒト・オキュロスパニン発現細胞の維持培養は、RPMI1640（インビトロジェン社製）に10%牛胎児血清（Moregate Biotech社製）、20mM HEPES（シグマ社製）、55μM ２ーメルカプトエタノール（インビトロジェン社製）を添加した培地（培地）にて、37℃、5%CO2下で行う。対数増殖期にあるヒト・オキュロスパニン発現細胞を2×104cells／cm2で細胞培養用フラスコへまきこみ、3日間培養する。このように調製したヒト・オキュロスパニン発現細胞を全て50mlチューブへ移し、HITACHI himac CF8DLで1000rpm、5分間遠心分離する（遠心分離条件1）。上清を除き、培地でヒト・オキュロスパニン発現細胞を懸濁後、0.4%トリパンブルー溶液（シグマ社製）を使用し、生細胞数を計測する。培地でヒト・オキュロスパニン発現細胞を生細胞107cells/mlに調製し、96穴Ｕ底プレートに100μl/wellずつ分注する。96穴Ｕ底プレートをHITACHI himac CF8DLで15000rpm、1分間遠心分離し（遠心分離条件2）、上清を200μlチップで抜き取った。96穴Ｕ底プレートの側面をたたいてヒト・オキュロスパニン発現細胞を懸濁後、氷中で冷やした培地で10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/mlの濃度に調製したハイブリドーマ培養上清を100μl/wellずつ添加する。15分毎に96穴Ｕ底プレートをプレートミキサー（フジレビオ社製）で攪拌しながら、4℃で1.5時間反応させる。反応終了後、96穴Ｕ底プレートを遠心分離条件2で遠心分離し、上清を200μlチップで抜き取る。PBS(-)（日水製薬社製）に5%牛胎児血清を添加した溶液（PBS-5%FBS）を200μl/wellずつ添加し、プレートミキサーで攪拌後、遠心分離条件2で遠心分離し、上清を200μlチップで抜き取る。以上の操作をこのあと2回行う。96穴Ｕ底プレートの側面をたたいてヒト・オキュロスパニン発現細胞を懸濁後、氷中で冷やしたPBS-5%FBSで500倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories社製）を100μl/wellずつ添加し、15分毎に96穴Ｕ底プレートをプレートミキサーで攪拌しながら、4℃で1.5時間反応させる。反応終了後、96穴Ｕ底プレートを遠心分離条件2で遠心分離し、上清を200μlチップで抜き取った。PBS-5%FBSを200μl/wellずつ添加し、プレートミキサーで攪拌後、遠心分離条件2で遠心分離し、上清を200μlチップで抜き取る。以上の操作をこのあと2回行る。96穴Ｕ底プレートの側面をたたいてヒト・オキュロスパニン発現細胞を懸濁後、室温にしたペルオキシダーゼ用発色基質（ナカライテスク社製）を100μl/wellずつ添加し、プレートミキサーで10分間攪拌する。遠心分離条件2で遠心分離後、上清50μl/wellを96穴平底プレートへ移し、プレートリーダー（1420 ARVO マルチラベルカウンター、パーキンエルマー社製）で405nmの吸収を測定する。
【０１９２】
（４−４−２）フローサイトメーター
実施例３で取得したヒト・オキュロスパニン発現細胞を、１０％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、５％炭酸ガス下で培養し増殖させてから、１×１０7細胞／ｍｌに調製した細胞懸濁液を、Ｕ字底９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に５０μｌ／ウェルずつ分注し、遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）する。上清を除去し、上記（４−３）で培養する融合細胞の培養上清を５０μｌ／ウェル加えて撹拌した後、氷上で１時間静置してから、遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）して上清を除去する。ペレットを１００μｌ／ウェルのフローサイトメトリー用緩衝液（５％  ＦＣＳ、０．０４％（ｗ／ｖ）  アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で２回洗浄した後、５００倍希釈したフルオレッセイン−５−イソチオシアネート（Fluorescein-5-isothiocyanate；以下「ＦＩＴＣ」という）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体ＩｇＧ画分（オルガノン・テクニカ社製）５０μｌを二次抗体として加え、氷上で１時間静置する。遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）して上清を除去してから、ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液１００μｌ／ウェルで２回洗浄後、３．７％  ホルマリン溶液  ５０μｌを添加し、氷上で１０分静置することにより細胞を固定する。遠心分離（９０×ｇ、４℃、１０分）して上清を除去してから、再度フローサイトメトリー用緩衝液１００μｌ／ウェルで洗浄し、ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液１００μｌ／ウェルに懸濁したものをフローサイトメトリー用試料とする。各試料中の細胞のＦＩＴＣ蛍光強度をフローサイトメーター（エピックス・エリート；コールター社製）で測定する（励起波長：４８８ｎｍ、検出波長：５３０ｎｍ）。その結果、融合細胞培養上清を添加しなかったヒト・オキュロスパニン発現細胞（ＦＩＴＣ蛍光強度約０．３）よりも明らかに高値（約１００−１０００）のＦＩＴＣ蛍光強度を示した試料に対応する融合細胞を選別する。
【０１９３】
（４−５）  クローニング
上記（４−４）で選別される細胞群について、上記（４−３）から（４−４）の一連の工程を５回繰り返すことにより、ヒト・オキュロスパニン発現細胞と結合するが導入前の細胞と結合しない単一な抗体を産生するハイブリドーマを数クローン得る。
【０１９４】
実施例５  ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体の精製
実施例４で作出されるマウス−マウスハイブリドーマを、１０％  ＦＣＳを含むＡＳＦ培地  １リットル中で、３７℃、５％  炭酸ガス下で培養し、１×１０6細胞／ｍｌとなるまで増殖させる。培養液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、２分間）し、上清を捨て、沈澱した細胞を無血清ＡＳＦ培地で１回洗浄後、無血清ＡＳＦ培地１リットルに再懸濁し、３７℃、５％  炭酸ガス下で４８時間培養する。この培養液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、２分間）し、上清を回収して透析チューブ（排除限界分子量１２０００−１４０００；ギブコ・ビーアールエル社製）に入れ、１０倍量の１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析する。この透析チューブ内液からのＩｇＧの粗精製を、高速液体クロマトグラフィー装置（ＦＰＬＣシステム；ファルマシア社製）を用いて以下に記載する条件で行う：
カラム：  ＤＥＡＥ−セファロース  ＣＬ−６Ｂカラム（カラムサイズ１０ｍｌ；ファルマシア製）；
溶媒：  １０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）
流速：  １ｍｌ／分；
溶出：  １Ｍ  塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０−５０％、１８０分）。
溶出液を５ｍｌずつ分画し、各分画中の抗ヒト・オキュロスパニン抗体価を、ヒト・オキュロスパニン蛋白質を用いたＥＬＩＳＡ法により検定する。まず、実施例３で調製するヒト・オキュロスパニン発現細胞より調製した膜画分溶液をＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート中に１００μｌ／ウェル入れ、３７℃で１時間保温した後、この溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  １００μｌ／ウェルで３回洗浄する。次に２％  ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ  １００μｌ／ウェルを入れて３７℃で１時間保温する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  １００μｌ／ウェルで３回洗浄した後に、各溶出分画  １００μｌを入れて３７℃で１時間保温する。さらに、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  １００μｌ／ウェルで３回洗浄した後に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（アマシャム社製）１００μｌ／ウェルを添加して３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  １００μｌ／ウェルで３回洗浄する。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（バイオラッド社製）１００μｌ／ウェルを入れて５分間静置した後、マイクロプレートリーダーで各ウェルの４１５ｎｍの吸光度を測定する。
【０１９５】
その結果、吸光度の大きかった分画を集め、抗体アフィニティー精製用カラム（ハイトラップ・プロテインＧカラム、カラム体積  ５ｍｌ；ファルマシア社製）２本に供与する。カラム内を２５ｍｌ／カラムの平衡化緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））にて洗浄した後に、１５ｍｌ／カラムの溶出緩衝液（０．１Ｍ  グリシン−塩酸（ｐＨ２．７））にて抗体を溶出する。それぞれの溶出液は、１．１２５ｍｌの１Ｍ  トリス−塩酸（ｐＨ９．０）を入れた試験管内に受け、溶出終了後ただちに遠心管型限外濾過器（セントリプレップ１０；グレースジャパン（株）製）の上部に入れて、３０００×ｇ、４℃で２時間遠心した。濾過器下部に回収された濾液を除去後、上部に１５ｍｌのＰＢＳを加えて、再び３０００×ｇ、４℃で２時間遠心する操作を５回繰り返す。ただし５回目の遠心は濾過器上部内の液量が０．５ｍｌになるまで行い、この濾過器上部に残った液を抗ヒト・オキュロスパニン抗体試料とする。
【０１９６】
実施例６  細胞傷害活性
生物活性の指標として、抗体依存性細胞傷害活性を測定する。
【０１９７】
ヒト・オキュロスパニン発現細胞（実施例３）をトリパンブルー染色法で計数後、１０％ウシ胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製、以下ＲＰＭＩ培地）で１×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。２．５μｌのｂｉｓ（ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅ−６，６’’−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＡＴＤＡ標識試薬、パーキンエルマー社製）を添加後よく攪拌し、３７℃、５％二酸化炭素存在下３０分間、途中５分間隔で転倒混和しながらインキュベートする。ＲＰＭＩ培地１０ｍｌを添加して攪拌後１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、この洗浄操作をさらに２回繰り返す。このようにして得られたＢＡＴＤＡ標識ヒト・オキュロスパニン発現細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍｌに再懸濁し、あらかじめＲＰＭＩ１６４０培地で１μｇ／ｍｌに調製した精製マウス抗ヒト・オキュロスパニン抗体  もしくは  ハイブリドーマ培養上清を添加して４℃に３０分間静置した９６穴丸底マイクロプレートに５０μl（５ｘ１０３ｃｅｌｌｓ）ずつ播種して４℃でさらに３０分間静置する。陰性コントロールウェルには精製マウス抗ヒト・オキュロスパニン抗体  もしくは  ハイブリドーマ上清の代りにＲＰＭＩ１６４０培地を添加する。
【０１９８】
エフェクター細胞は以下のように調製する。あらかじめ１００ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（シグマ社製）存在下で３日間培養したＪ７７４Ａ．１細胞（大日本製薬）をトリパンブルー染色法で計数後、ＲＰＭＩ培地で１×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製する。先の９６穴丸底マイクロプレートに１００μl（１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ）ずつ播種してプレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心し、３７℃、５％二酸化炭素存在下４時間インキュベートする。陽性コントロールウェルには、ＢＡＴＤＡ標識ヒト・オキュロスパニン発現細胞を完全に殺傷するためエフェクター細胞の代りに１％ＴｒｉｏｎＸ−１００を添加する。４時間のインキュベート後、各ウェルから２０μｌの培養上清を採取して９６穴白色プレートに移し、ユーロピウム溶液（パーキンエルマー社製）２００μlを添加する。室温で１５分間振とう後、時間分解蛍光を測定する。
各ウェルの細胞死誘導率は以下の計算式より算出する。細胞死誘導率（％）＝（各テストウェルのカウント−陰性コントロールウェルのカウント）／（陽性コントロールウェルのカウント−陰性コントロールウェルのカウント）ｘ１００
ＲＰＭＩ１６４０培地のみのコントロールと比較し、精製マウス抗ヒト・オキュロスパニン抗体若しくはハイブリドーマ上清の添加により、ヒト・オキュロスパニン発現細胞への細胞死の誘導が認められる。
【０１９９】
実施例７  免疫原及び抗体検出系抗原としてのヒト・オキュロスパニン発現細胞及びその膜画分の調製
ａ）プラスミドpEF-DEST51- NM_031945の構築
ｐＥＮＴＲ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ  （インビトロジェン社製）を添付プロトコールに従って用い、実施例２ａ）によって得られたＮＭ＿０３１９４５  ｃＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。ＮＭ＿０３１９４５  ｃＤＮＡを、キット付属の反応バッファー中でＴｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅを結合させてあるｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターと混合し室温で３０分間インキュベートした。得られた反応物を用いて大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果カナマイシン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、１ｍｌの５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む液体ＴＢ培地中で３７℃で一晩培養し、Ｍｏｎｔａｇｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ９６  Ｋｉｔ（ミリポア社製）を利用することによりプラスミドＤＮＡを単離精製した。得られたプラスミドＤＮＡについて、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔをその添付プロトコールに従って用いることにより反応を行った後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社製）によりヌクレオチド配列解析を行い、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＯ．ＮＭ＿０３１９４５  に示されるヌクレオチド配列のＯｐｅｎ  ＲｅａｄｉｎｇＦｒａｍｅを有するｃＤＮＡ（配列表の配列番号１）が、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに組み込まれていることを確認した。
【０２００】
次に発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１/ＤＥＳＴ４０（インビトロジェン社製）へＧＡＴＥＷＡＹＴＭシステムを用いて遺伝子の乗せ替えを行った。すなわち、ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅＴＭ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（インビトロジェン社製）４μｌ、ＬＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ-ＮＭ＿０３１９４５  ０．３μｇ、ｐｃＤＮＡ３．１/ＤＥＳＴ４０  ０．３μｇをＴＥバッファーで２０μｌに調製し、２５℃で１時間反応させる。反応後、２μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加え、３７℃にて１０分間反応させる。得られた反応物を用いて大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、１００ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で３７℃で一晩培養し、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭＡＸＩ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を利用することによりプラスミドＤＮＡ（pcDNA3.1-DEST40-NM_031945）を単離精製した。
【０２０１】
同様に発現用ベクターｐＥＦ/ＤＥＳＴ５１（インビトロジェン社製）へＧＡＴＥＷＡＹＴＭシステムを用いて遺伝子の乗せ替えを行った。すなわち、ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅＴＭ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（インビトロジェン社製）４μｌ、ＬＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ-ＮＭ＿０３１９４５  ０．３μｇ、ｐＥＦ/ＤＥＳＴ５１  ０．３μｇをＴＥバッファーで２０μｌに調製し、２５℃で１時間反応させる。反応後、２μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加え、３７℃にて１０分間反応させる。得られた反応物を用いて大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、１００ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で３７℃で一晩培養し、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭＡＸＩ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を利用することによりプラスミドＤＮＡ（pEF-DEST51- NM_031945）を単離精製した。
【０２０２】
ｂ）  プラスミドpEF-DEST51- NM_031945のＢＡＬＢ−３Ｔ３細胞及び２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション
ＢＡＬＢ−３Ｔ３細胞（理研clone A31）を、１０％  ウシ血清（GIBCO製）（以下「ＢＳ」という）を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という：SIGMA社製）を入れた細胞培養用150mmDish（培養面積148ｃｍ2；IWAKI社製）330枚中でセミコンフルエントになるまで３７℃、５％  炭酸ガス下で培養した後、pEF-DEST51- NM_031945をＢＡＬＢ−３Ｔ３細胞にトランスフェクションした。ＢＡＬＢ−３Ｔ３細胞へのトランスフェクションは（株）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒＴＭ  ２  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてリポフェクションにより行った。すなわち、細胞を無血清培地（ＤＭＥＭ）で一度洗浄したのち、20ｍｌの無血清培地（ＤＭＥＭ）を加えた。次に５０ｍｌファルコンチューブ中にＮｅｗ  ＤＮＡ  Ｄｉｌｕｅｎｔを0.6ｍｌと、上記方法にて回収したプラスミドＤＮＡ（pEF-DEST51- NM_031945）24μｇを加え、混合した。別の５０ｍｌファルコンチューブ中に無血清培地（Opti-MEM I;GIBCO社製）0.35  ｍｌと、ＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒＴＭ  ２  Ｒｅａｇｅｎｔ  84μｌを加え、混合した。ＤＮＡ溶液とＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒＴＭ  ２溶液を混合し、室温にて２０分間放置した。その後、ＤＮＡ−ＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒＴＭ  ２混合液を細胞に加え（1ｍｌ/dish）、３７℃、５％  ＣＯ２下で培養した。3時間後  10％  ウシ血清を含むＤＭＥＭ  20ｍｌ/dishに培地交換して、３７℃、５％  ＣＯ２下で一晩培養した。
【０２０３】
また、プラスミドｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１−ＮＭ＿０３１９４５を２９３Ｔ細胞に以下のように導入した。２９３Ｔ細胞への導入は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。２９３Ｔ細胞を２．５×１０５個／９．２ｃｍ２の密度でまき込み、３７℃、５％炭酸ガス下で一晩培養した。５ｍｌポリプロピレン製チューブで、１０μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００試薬と２５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を混合し、室温で５分間反応させた。別の５ｍｌポリプロピレン製チューブで、４μｇのプラスミドｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１−ＮＭ＿０３１９４５と２５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍを混合した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ溶液とＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分間反応させた。一晩培養した２９３Ｔ細胞の培養上清を除き、２ｍｌ／９．２ｃｍ２の割合で抗生物質が入っていない１０％ウシ胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ社）を添加した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ―ＤＮＡ混合液を２９３Ｔ細胞へ添加し、３７℃、５％炭酸ガス下で２日間晩培養した。
【０２０４】
ｃ）細胞膜画分の調製（10L分）
上記の方法にて培養した細胞をＰＢＳ（−）緩衝液（大日本製薬（株）製）で洗浄した。セルスクレーパー(IWAKI社製)を用いて細胞を回収し、５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ7.4 230ｍｌに懸濁した。４℃にて３０分間細胞溶液を放置した。Ｄｏｕｎｃｅ  Ｔｙｐｅ  Ｂ  ホモジェナイザー（50ストローク）にて細胞を破砕した。１０００Ｇで１０分間、遠心分離機（KUBOTA製）にて遠心し、上清を回収した。
【０２０５】
上清を７８０００Ｇ  １００分間、超遠心分離機(BECKMAN製)にて遠心し、沈殿を回収した。沈殿に57％スクロース in Tris Bufferを14ml加え、重層し、78000G、16時間、4℃でショ糖密度勾配にて遠心し、上層の膜画分を回収した。膜画分に5mM Trisバッファー pH7.4 55mlを加え、78000G、60分、4℃で遠心し、沈殿を回収した。沈殿に５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ7.4  1500μｌを加え、Ｄｏｕｎｃｅ  Ｔｙｐｅ  Ｂ  ホモジェナイザー（１０ストローク）にて細胞溶液を均一化した。発現確認の項で述べたウエスタンブロッティング法により、細胞膜画分を同定した。
【０２０６】
実施例８  マウスの免疫及び細胞融合
ａ）  免疫
実施例７で得られたヒト・オキュロスパニン遺伝子発現細胞1×107cellを5週令のＢＡＬＢ／ｃマウス雌（日本エスエルシーより購入）腹腔内に投与した。2,4,6,8週間後、同様のヒト・オキュロスパニン遺伝子発現細胞（1×107cell／マウス）を腹腔内に投与し追加免疫した。
【０２０７】
ｂ）  細胞融合
追加免疫4日後のマウスより脾臓を摘出し、これを10ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ7.4）、0.02ｍｇ／ｍｌ  炭酸水素ナトリウム、300μg/ml  L-グルタミン酸を含む無血清MEM培地（イーグルMEM培地「ニッスイ」（１）：日水製薬（株）社製9.4g/L）（以下「無血清MEM培地」という）10ｍｌ中に入れ、21G’の注射針とピンセットを使い脾臓細胞を扱き出した。この細胞懸濁液を遠心して脾臓細胞を沈澱させた後、この脾臓細胞を無血清MEM培地で２回洗浄してから、無血清MEM培地に懸濁して細胞数を測定した。
【０２０８】
一方、１5％  ＦＢＳ（GIBCO社製）、306μg/mlグルタミン酸、0.05mM  β-メルカプトエタノールを含むミエローマ増殖培地（以下「ME培地」という）にて、３７℃、7％  炭酸ガス存在下で細胞濃度が1×106細胞／ｍｌを越えないように培養したミエローマ細胞SP2/0を同様に無血清MEM培地で洗浄し、無血清MEM培地に懸濁して細胞数を測定した。
【０２０９】
脾臓細胞の1/5個相当のSP2/0細胞懸濁液と、全脾臓細胞懸濁液を混合し、遠心後、上清を完全に除去した。以下の細胞融合の操作は、ペレットの入ったプラスチック遠沈管を室温で実施した。このぺレットに、40％（ｗ／ｖ）  ポリエチレングリコール4000（Merck  社製）1ｍｌを、遠心管を振りながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清MEM培地9ｍｌを3回に分けてゆっくり添加した。遠心後、上清を除去し、20％  ＦＢＳを含むヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地（以下「ＨＡＴ培地」という；SIGMA社製）2.5×106cells/ｍｌになるように、ピペットの先でゆっくり撹拌しながら添加した。細胞培養用９６穴マイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃、7％炭酸ガス下で培養した。1日後、HAT培地を全wellに100μl添加し、その後も２、３日毎に交換した。このようにして得られた融合細胞を、以下に記載する限界希釈法によるスクリーニングに供した。
【０２１０】
ｃ）  限界希釈
上記ｂ）で得られた融合細胞を含む培養液を、HT培地（2nd cloning以降はHY培地）で細胞の密度が1cell/well（10cells/ml）、5 cells/well(50cells/ml)となるように段階希釈した。こうして調整した各試料をあらかじめ100μlのHY培地を各wellに分注しておいた96wellプレートに、100μl/wellずつ分注し、37℃、7％炭酸ガス下で10日間培養した。
【０２１１】
ｄ）  選別
ｄ−１）ＥＬＩＳＡ
実施例７で取得した細胞膜画分を1μg/mlで50μl/wellずつ96穴EIAプレート(COSTAR社製)へ分注した。1日間4度で放置後、プレート内の抗原液をよく振り捨て、PBS(-)に1％BSAを添加した溶液を80μl/well添加し、プレートシールをし、使用時まで4℃で保存した。使用時に室温に戻し、0.1% Tween20入りPBS(PBS-T)を通したSerawasher(Bio-Tec社製)でプレートを3回洗浄した。一次抗体として細胞融合後10-12日経過した細胞培養上清50μlを加え、室温で一時間静置した。一次抗体反応終了後、PBS-Tで3回洗浄し、PBS-Tに0.5%BSAを添加した溶液（抗体希釈液）で5000倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG抗体（BIO SOURCE社製）を50μｌ/wellずつ添加し、室温で一時間静置した。二次抗体反応終了後、室温に戻したアルカリホスファターゼ用発色基質p-ニトロフェニルリン酸2Na6H2O（pNPP、和光純薬工業社製）を1mg/ml濃度でpNPPBuffer（97ml/lジエタノールアミン、0.1g/l MgCl2・6H2O PH9.8）に溶解し、100μl/well加えた。プレートリーダー（ナルジェンクインターナショナル社製）で405nm、630nmの吸光度を測定した。
【０２１２】
ｄ−２）フローサイトメーター
実施例７で取得したHEK293培養細胞を、１０％  ＦＢＳを含むDMEM培地中で、３７℃、５％炭酸ガス下で培養し増殖させ、トランスフェクション後24時間培養してから、2×107  細胞／ｍｌに調製した細胞懸濁液を、Ｖ字底９６穴マイクロプレート（Corning社製）に50μｌ／ウェルずつ分注し、遠心分離（1000  ×ｇ、20℃、5分）した。上清を除去し、上記ｃ）で培養する融合細胞の培養上清を50μｌ／ウェル加えて撹拌した後、氷上で0.75時間静置してから、遠心分離（1000×ｇ、20℃、5分）して上清を除去した。ペレットを150μｌ／ウェルのフローサイトメトリー用緩衝液（５％  ＦＢＳを含むMEM）で２回洗浄した後、33倍希釈したフルオレッセイン−５−イソチオシアネート（Fluorescein-5-isothiocyanate；以下「ＦＩＴＣ」という）標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体ＩｇＧ画分（和光純薬工業社製）100μｌを二次抗体として加え、氷上で0.75時間静置した。遠心分離（1000×ｇ、20℃、5分）して上清を除去してから、ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液150μｌ／ウェルで2回洗浄し、ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液500μｌ／ウェルに懸濁したものをフローサイトメトリー用試料とした。各試料中の細胞のＦＩＴＣ蛍光強度をフローサイトメーター（FC500；BECKMAN社製）で測定した（励起波長：４８８ｎｍ、検出波長：５３０ｎｍ）。その結果、融合細胞培養上清を添加しなかったHEK293 transient発現細胞よりも高値のＦＩＴＣ蛍光強度を示した試料に対応する融合細胞を選別した。
【０２１３】
ｅ）  クローニング
上記ｄ）で選別される細胞群について、上記ｃ）からｄ）の一連の工程を2回繰り返すことにより、HEK293 transient発現細胞と結合するが抗ヒト・オキュロスパニン発現プラスミド導入前の細胞と結合しない単一な抗体を産生するハイブリドーマを数クローン得た。このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株のひとつは、Ｏ３Ｂ８−２Ｃ９−４Ｆ３と命名され、独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターに２００４年２月１７日付けで、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６２７として寄託されている。
【０２１４】
実施例９  抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体の精製
実施例８で作製されたマウス−マウスハイブリドーマを、1×106cells/mlとなるようHY培地に懸濁し、37℃、7% CO2下で3日間静置した。こうして得られた培養液を遠心分離（1600rpm、5min）し、上清を回収してIgGの粗精製を以下の条件で行った。
結合バッファー：pH7.0  （20mM Na2HPO4・12H2O, 20mM Na2HPO4・2H2O）
溶出バッファー：pH3.0 100mM グリシン-HCl
中和バッファー：pH9.0 1M Tris-HCl
ProteinG担体（Amersiam Biosciences社製を必要量分取し、エタノール除去後、超純水で2回wash、結合バッファーで1回wash後、結合バッファーを加えて、50％ゲルスラリーとした。ハイブリドーマ上清にProteinGゲルスラリーを加え、一昼夜4℃でrotate後、結合バッファーで3回洗浄した。洗浄後、溶出バッファーを加え、抗体を溶出させた。溶出液は溶出バッファーの1/10量の中和バッファーを入れたチューブ内に受けた。溶出液はサンプルチューブ型限外濾過器（amicon Ultrafree-MC:Millipore社製の上部に入れて、5000×g、4℃、20分間で遠心し、濾過器下部に回収されたろ液を除去しつつ、濾過器上部の液量が50μlを下回らないよう溶出液を添加した。溶出液を全て添加した後、PBS(-)を溶出液の3倍分のvolumeを加え、Buffer交換し、この濾過器上部に残った液を抗抗ヒト・オキュロスパニン抗体試料とした。
【０２１５】
実施例１０  細胞傷害活性
生物活性の指標として、抗体依存性細胞傷害活性を測定した。実施例７で作製されたヒト・オキュロスパニン発現細胞をトリパンブルー染色法で計数後、１０％ウシ胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製、以下ＲＰＭＩ培地）で８×１０５  ｃｅｌｌｓ／０．４ｍｌに調製した。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ−５１（クロム酸ナトリウム、アマシャムバイオサイエンス社製）４０μｌを添加後、３７℃、５％二酸化炭素存在下、２時間インキュベートした。ＲＰＭＩ培地８ｍｌを添加して攪拌後１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、この洗浄操作をさらに２回繰り返した。このようにして得られたＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１標識ヒト・オキュロスパニン発現細胞をＲＰＭＩ培地４ｍｌに再懸濁し、あらかじめＲＰＭＩ培地で５μｇ／ｍｌに調製した精製マウス抗ヒト・オキュロスパニン抗体５０μlを添加した９６穴丸底マイクロプレートに５０μl（１×１０４  ｃｅｌｌｓ）ずつ播種して４℃で３０分間静置した。陰性コントロールウェル  もしくは  バックグラウンド測定用ウェルには精製マウス抗ヒト・オキュロスパニン抗体の代りにＲＰＭＩ培地を添加した。
【０２１６】
エフェクター細胞は以下のように調製した。すなわちＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（メス・７週齢）より定法に従って脾臓細胞を採取し、トリパンブルー染色法で計数後ＲＰＭＩ培地で１．５×１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。先の９６穴丸底マイクロプレートに１００μl（１．５×１０６  ｃｅｌｌｓ）ずつ播種してプレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心し、３７℃、５％二酸化炭素存在下４時間インキュベートした。陽性コントロールウェルには、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ−５１標識ヒト・オキュロスパニン発現細胞を完全に殺傷するためエフェクター細胞の代りに２％ＴｒｉｏｎＸ−１００を添加した。バックグラウンド測定用ウェルにはエフェクター細胞の代りにＲＰＭＩ培地を添加した。４時間のインキュベート後、各ウェルから５０μlの培養上清を採取して９６穴ルーマプレート（パーキンエルマー社製）に移した。５０℃で一晩乾燥させ、各ウェルのＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１量をマイクロプレートシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＴＸ、パーキンエルマー社製）で測定した。
【０２１７】
各ウェルの細胞死誘導率は以下の計算式より算出した。細胞死誘導率（％）＝（各テストウェルのカウント−バックグラウンド測定用ウェルのカウント）／（陽性コントロールウェルのカウント−バックグラウンド測定用ウェルのカウント）×１００
陰性コントロールと比較し、精製マウス抗ヒト・オキュロスパニン抗体の添加により、ヒト・オキュロスパニン発現細胞への細胞死の誘導が認められた（図５）。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】上：各種細胞株内でのヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を示す図。下：健常人皮膚サンプルとメラノーマサンプルにおけるヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を示す図。
【図２】上：健常人皮膚サンプルと皮膚組織由来メラノーマサンプルにおけるヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を示す図。下：健常人皮膚サンプルとリンパ節組織由来メラノーマサンプルにおけるヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を示す図。
【図３】健常人リンパ節由来サンプルとリンパ節組織由来メラノーマサンプルにおけるヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を示す図。
【図４】ヒト・オキュロスパニン遺伝子産物のＮＩＨ３Ｔ３細胞での発現を示す図。
【図５】ヒト・オキュロスパニン発現細胞を用いた抗ヒト・オキュロスパニン抗体による抗体依存性細胞傷害活性を示す図。
【配列表フリーテキスト】
【０２１９】
配列番号５：ヒト・オキュロスパニン増幅用ＰＣＲセンスプライマー
【図１】
2004290187.tif 000002
【図２】
2004290187.tif 000003
【図３】
2004290187.tif 000004
【図４】
2004290187.tif 000005
【図５】
2004290187.tif 000006
【配列表】
2004290187000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月24日(2004.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株のひとつは、Ｏ３Ｂ８−２Ｃ９−４Ｆ３と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００４年２月１７日付けで、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６２７として寄託されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
ｅ）  クローニング
上記ｄ）で選別される細胞群について、上記ｃ）からｄ）の一連の工程を2回繰り返すことにより、HEK293 transient発現細胞と結合するが抗ヒト・オキュロスパニン発現プラスミド導入前の細胞と結合しない単一な抗体を産生するハイブリドーマを数クローン得た。このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株のひとつは、Ｏ３Ｂ８−２Ｃ９−４Ｆ３と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００４年２月１７日付けで、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６２７として寄託されている。