(57)【要約】【課題】高度の耐熱性及び幅広いｐＨ安定性を有し、食品変敗菌や口腔内感染症の原因菌にも有効で、食品の品質を向上させるほか、オーラルケア商品にも利用され、食品の変敗菌やオーラルケア商品に有効な新規な微生物から得られた抗菌物質を提供する。【解決手段】寄託番号、ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９９６号として寄託されているラクトコッカス　ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）に属する新規微生物及びこの微生物が産生する抗菌物質及び抗菌物質を含む培養物であり、この抗菌物質は３９及び３５のアミノ酸からなる２種のポリペプチドである。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号、ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９９６号として寄託されているラクトコッカス　ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）に属する新規微生物。
【請求項２】
寄託番号、ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９９６号として寄託されているラクトコッカス　ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）に属する新規微生物が産生する抗菌物質及び抗菌物質を含む培養物。
【請求項３】
抗菌物質が２種のペプチドからなり、その１方のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１であることを特徴とする請求項２記載の培養物。
【請求項４】
抗菌物質が２種のペプチドからなり、その他方のアミノ酸配列が、配列表の配列番号２であることを特徴とする請求項２記載の培養物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は乳酸菌、ラクトコッカス　ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）に属する新規な微生物、及びこれが産生する食品の変性、腐敗防止或いはオーラルケアに効果を有する抗菌物質を含有する培養物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、食品の保存方法としては添加物、熱、放射線、高圧処理などが行われている。近時、天然物志向、すなわち、より天然に近いもの或いは各々の食品素材本来の食感、味、香りに近い食品を求める消費者が増加している。その結果、食品の低塩化、低温殺菌化が進み、食品の保存が困難な状況となってきていることから、安全で品質に影響せず、しかも安価な食品保存方法の開発が望まれている。
【０００３】
一方、乳酸飲料、醤油、味噌、酒、漬物などの伝統的醗酵食品は保存性が高いことが知られているが、その原因の一つとして乳酸菌の働きが注目されている。近年の研究より乳酸菌はｐＨを低下させて雑菌の繁殖を抑制する他、ある種の乳酸菌は抗菌性ペプチドを産生することが判明している。この抗菌物質或いはこの種の乳酸菌の培養物を食品に添加することにより、温和な条件で食品の変成を防止することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
抗菌性ペプチドはヒトの消化酵素で分解されることから、安全な抗菌物質として期待されているが、その反面、耐熱性・ｐＨ安定性に問題があり、現実的に実用的な抗菌性ペプチドは少ない。
本発明者らは、耐熱性、ｐＨ安定性の高い抗菌性ペプチドを開発すべく、野菜等から抗菌性ペプチド産生能を有する乳酸菌の探索を行った。その結果、新規な抗菌性ペプチドを産生する乳酸菌を分離することに成功した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の構成は、寄託番号、ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９９６号として寄託されているラクトコッカス　ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）に属する新規微生物及びこの微生物が産生する抗菌物質及び抗菌物質を含む培養物であり、この抗菌物質は４０弱のアミノ酸からなる２種のポリペプチドである。
【０００６】
本発明にかかる菌が産生する抗菌性ペプチドはそのアミノ酸配列から新規物質であることが判明した。本物質は高度の耐熱性を有し、広いｐＨ領域で有効であり、特異な抗菌スペクトルを有する。食品に使用する場合には主に培養物を用いる。ここで、培養物とは培養液、培養液上清及び培養液精製物、更にこれを粉末化したものを包含する。培養物は抗菌物質を含有し、一定の力価を有する製品にして提供することができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の新規微生物はＦＥＲＭ　Ｐ−１８９９６号として寄託してあり、標準条件で培養して単球菌であり、グラム陽性、カタラーゼ陰性、非運動性、非胞子形成性であり、Ｌ−乳酸対糖収率９０％以上に達する。
本発明で得られる抗菌物質は１００℃、１０分間以上加熱しても抗菌活性が低下せず、耐熱性を有し、ｐＨ２〜１１の広い範囲で安定である。
【０００８】
【実施例】
実施例１（菌の諸性質）
菌の同定を行うため１６Ｓ　リボゾームＤＮＡの塩基配列の相同性解析及び糖の醗酵性（バイオメリックス社：ＡＰ１５０ＣＨＬキット使用）を確認した。その結果、ラクトコッカス・ラクティスと９９％一致したことなどから本菌はラクトコッカス・ラクティスに属することが判明した。しかし、１６Ｓ　リボゾームＤＮＡの相同性解析で１００％の相同性を示さなかったことと、本菌が産生する特殊な抗菌物質がこれまでに知られているラクトコッカス・ラクティスが産生する抗菌物質（ナイシン、ラクティシン４８１、ラクトストレプシン、ラクトコッシンＧ等）といずれも異なる性質を示すことから、本菌株は公知の菌とは異なる新規な菌株であると考えられる。
【０００９】
本菌の糖資化性について表１、表２に示した。資化性がある糖は＋、資化性がない糖は−とした。
【００１０】
【表１】
2004105118.tif 000002
【００１１】
【表２】
2004105118.tif 000003
【００１２】
実施例２（抗菌スペクトル）
（１）培養物の調製
本発明微生物をＭＲＳ　ｂｒｏｔｈ（ＯＸＯＩＤ社製）に接種して３０℃・１８時間培養し、１００００　ｒｐｍ、２０分間遠心分離を行い、菌体を除去した後の上清を抗菌性の培養物として使用した。
（２）試験方法及び結果
ＭＲＳ　ａｇａｒ（ＯＸＯＩＤ社製）の平板培地上に供試菌株を１％接種したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｉ　ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ社製）を分注して重層した平板培地を作成した。上記培養液上清を２の１乗、２乗、３乗と順次２の乗数倍希釈して１０μｌずつ重層平板培地上に滴下し、供試菌株の最適温度にて培養を行い、生育阻止円が見られたものを抗菌活性ありと判定した。試験結果を表３に示した。抗菌活性があるものを＋、ないものを−とした。
【００１３】
【表３】
2004105118.tif 000004
【００１４】
表３より、本発明培養物は、食品の変敗や口腔内感染症の原因であるストレプトコッカス属に効果があるほか、ラクトコッカス・ラクティスに特異的に有効であることから心内膜炎やウシ乳房炎の治療に利用できることが判明した。
また、抗菌物質ナイシンを産生するラクトコッカス、ラクティスにも抗菌活性を示したことから、交叉免疫がないことが判明した。このことより、本発明抗菌物質はナイシンとは異なる作用機作をもつことが考えられる。
【００１５】
実施例３（耐熱性試験）
培養液上清を加熱処理し、抗菌活性の有無について確認を行った。
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＡＴＣＣ　１９４３５Ｔ　を用い、実施例２の試験方法に準じて上清の活性について検討した。その結果、１００℃、１０分間加熱した上清は未加熱の上清と同等の抗菌活性を示した。この事実より、本発明の抗菌物質は熱に対して非常に安定であることが判明した。
【００１６】
実施例４（ｐＨ安定性試験）
培養液上清を塩酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ２〜１１に調整し、抗菌活性の有無について確認を行った。
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＡＴＣＣ　１９４３５Ｔ　を用い、実施例２の試験方法に準じて上清の活性について検討した。その結果、ｐＨ２から１１の領域で抗菌活性を発現した。この結果より、本発明培養物は幅広いｐＨ範囲で安定して使用できることが判明した。
【００１７】
実施例５（酵素分解性試験）
培養液の上清に下記要領で酵素を添加し、３０℃及び３７℃で６時間反応させた後、抗菌活性の有無を確認した。
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＡＴＣＣ　１９４３５Ｔ　を用い、実施例２の抗菌スペクトルの試験方法に準じて上清の活性について検討した。α−キモトリプシン及びトリプシンは３０℃で試験を行い、フィチン、アクチナーゼＥ、パパイン及びプロティナーゼＫは３７℃で試験を行った。その結果すべての酵素処理試料が活性を失っていた。酵素を添加しないコントロールは３０℃、３７℃共に活性であった。この事実より、本発明培養物中の抗菌物質は蛋白質或いはペプチドの構造を有するものと判断することができた。
【００１８】
実施例６（抗菌ペプチドの配列決定）
抗菌物質の同定のために培養上清から抗菌ペプチドの精製を行った。すなわち、培養液上清に対し３倍量のアセトンを加えて蛋白質を変成・沈殿させた後、真空乾燥によりアセトンを除去し沈殿物を得た。抗菌物質を含むタンパク沈殿物をリン酸緩衝液で希釈した後、陽イオン交換樹脂（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｌｏｓｅ）に通して粗精製を行い、更に高活性の画分を逆相ＨＰＬＣにかけたところ、２つの活性画分が得られた。
そこで２つの活性画分の抗菌物質をα、βとし、各々の分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ（　Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　社製）にて測定したところ、抗菌物質αは４，２６１Ｄａ　、抗菌物質βは４，０１９Ｄａ　であることが判明した。更にエドマン分解により各抗菌物質のアミノ酸配列を確認したところ抗菌物質αは配列表の配列番号１、抗菌物質βは配列表の配列番号２に示す通りの配列が決定した。
【００１９】
２種類の抗菌物質α、βについて抗菌ペプチドの相同性を検討した結果、ラクトコッカス・ラクティス　ＬＭＧ　２０８１が産生するラクトコッシンＧ−α、β（Ｊｏｎ　Ｎｉｓｓｅｎ−Ｍｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　，Ｖｏｌ．　１７４，　Ｐ．５６８６−５６９２，　Ｓｅｐｔ．　１９９２）及びエンテロコッカス・ファエカリス　ＢＦＥ　１０７１が産生するエンテロシン１０７１Ａ、１０７１Ｂ（Ｅ．Ｂａｌｌｉａ　ｅｔ　ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．６６，　ｐ．１２９８−１３０４，　Ａｐｒ．　２０００）　に近いものの、本抗菌ペプチドはいずれの分子量、アミノ酸配列とも一致せず、新規物質であることが判明した。本抗菌物質と既知物質の相違部分を表４及び表５に示した。
【００２０】
【表４】
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【００２１】
【表５】
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【００２２】
【発明の効果】
本発明の新規抗菌ペプチドは、高度の耐熱性及び幅広いｐＨ安定性を有し、食品変敗菌や口腔内感染症の原因菌にも抗菌効果を示す。このことより、本発明菌産生物は食品の品質を向上させるほか、オーラルケア商品にも利用される。また、乳酸菌由来の抗菌ペプチドの多くは他の抗菌成分との併用による強力な日もち向上剤の開発も期待できる。
更に心内膜炎やウシ乳房炎などの治療にも有効であり、医薬品としても利用できる。本発明の抗菌ペプチドは乳酸菌由来であることから安全性が高く、現代の消費者ニーズに適合した食品、オーラルケア商品、医薬品の提供を可能にする。
【配列表】
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