(57)【要約】【課題】カルボニルストレス耐性能を有するトランスジェニック動物の提供。【解決手段】ヒトグリオキサラーゼ　ＩをコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック動物が提供された。本発明のトランスジェニック動物は、カルボニルストレス耐性能を有しており、カルボニルストレスに対する生体適応機構の解明やそれに基づく創薬デザインの検討に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトグリオキサラーゼＩ、またはヒトグリオキサラーゼＩと機能的に同等なタンパク質をコードする外来性のＤＮＡを発現するトランスジェニック非ヒト動物であるカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物。
【請求項２】
ヒトグリオキサラーゼＩをコードするＤＮＡが、配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域からなる請求項１に記載のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物。
【請求項３】
非ヒト動物がマウスである請求項１に記載のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物。
【請求項４】
非ヒト動物がラットである請求項１に記載のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物。
【請求項５】
ヒトグリオキサラーゼＩ、またはヒトグリオキサラーゼＩと機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡと、このＤＮＡを動物において発現させることができるプロモーターとを含むカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物作製用組換え遺伝子。
【請求項６】
次の工程を含む、カルボニルストレス耐性トランスジェニック動物の作製方法。
ａ）動物の受精卵に請求項５に記載の組換え遺伝子を導入する工程
ｂ）工程ａ）の受精卵から発生した初代トランスジェニック動物のうち導入した外来性遺伝子を保持した個体を選択する工程
【請求項７】
更に次の工程ｃ）及びｄ）を含む請求項６に記載のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物の作製方法。
ｃ）工程ｂ）で選択した個体と正常動物を交配させて外来性遺伝子をヘテロで保有するＦ１動物を得る工程
ｄ）工程ｃ）で得たＦ１動物同士を交配させて外来性遺伝子をホモで保有するＦ２動物を得る工程
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルボニルストレスに耐性を有するトランスジェニック動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内において、糖・脂質由来のカルボニル化合物が蓄積し、非酵素的生化学反応によるタンパク質修飾が亢進した状態をカルボニルストレスと呼ぶ（Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．，　５５：　３８９−３９９　（１９９９））。カルボニル化合物は、生体内におけるメイラード反応を通じて老化、糖尿病、あるいは動脈硬化などの成人病との関連性が指摘されている。メイラード反応とは、グルコースなどの還元糖と、タンパク質のアミノ基との間に生じる非酵素的な糖化反応である。１９１２年にメイラード（Ｍａｉｌｌａｒｄ）がタンパク質と還元糖の混合物を加熱すると褐色に着色する現象に注目して報告した（Ｍａｉｌｌａｒｄ　Ｌ．　Ｃ．，　Ｃｏｍｐｔ．Ｒｅｎｄ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．　７２：　５９９　（１９１２））。メイラード反応は、食品の加熱処理や貯蔵の間に生じる褐変化、芳香成分の生成、呈味、タンパク質変性などに関与していることから、食品化学の分野で研究が進められてきた。
【０００３】
ところが、１９６８年ヘモグロビンの微小画分であるグリコシルヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が生体内で同定され、さらにこれが糖尿病患者において増加することが判明した（文献１／Ｒａｈｂａｒ　Ｓ．，　Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ　２２：　２９６　（１９６８））。これを契機に生体内におけるメイラード反応の意義並びに糖尿病合併症、動脈硬化などの成人病の発症、あるいは老化の進行との関係が注目されるようになってきた。たとえば、アマドリ化合物以降の反応で生成するピラリン、あるいはペントシジンに代表される後期段階生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ、以下ＡＧＥｓと省略する）は、老化や糖尿病の指標になりうると考えられている。
【０００４】
実際に慢性腎不全の患者においては、高血糖の有無に関わらず血中や組織中に反応性の高いカルボニル化合物やＡＧＥｓが著しく蓄積している（文献２／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５１：　１１７０−１１８１　（１９９７）；　文献３／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　７：　１１９８−１２０６　（１９９６）；　文献４／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５５：　３８９−３９９　（１９９９）；　文献５／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，　９：　２３４９−２３５６　（１９９８））。これは腎不全においては、カルボニルストレスが存在しており、糖、あるいは脂質に由来するカルボニル化合物がタンパク質のアミノ基とメイラード反応を起こし、タンパク質を修飾するためであると考えられる（文献４／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５５：　３８９−３９９　（１９９９））。
【０００５】
近年、腎不全の合併症である透析アミロイドーシス、動脈硬化の発症進展におけるカルボニルストレスの関与が報告され（文献６／Ｍｉｙａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．　９２：　１２４３−１２５２　（１９９３）；　文献７／Ｍｉｙａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：　２３５３−２３５８　（１９９６）；　文献８／Ｍｉｙａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４３７：　２４−２８　（１９９８）；　文献９／Ｍｉｙａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４４５：　２０２−２０６　（１９９９））、腎不全におけるカルボニルストレスの病態生理学的意義が注目されている。
したがって、生体内において生成されるカルボニル化合物を除去することによってカルボニルストレス状態を改善することは、腎不全におけるＡＧＥｓの生成を抑制し、組織障害の軽減さらには合併症の進展の抑制につながると考えられる。
【０００６】
更に腹膜透析の場合、血中の老廃物は腹膜を通して腹膜透析液中に排泄される。高浸透圧の腹膜透析液（グルコース、イコデキストリンまたはアミノ酸等を含有する）は、腎不全患者の血中に蓄積した反応性の高いカルボニル化合物を、腹膜を介して腹腔内の腹膜透析液中に集める作用がある。そのため腹膜透析液中のカルボニル化合物濃度は上昇し、カルボニルストレスの状態がもたらされる。その結果、腹腔内のタンパク質がカルボニル修飾を受けて腹膜の機能が低下し、除水能の低下や腹膜硬化症の進展に関与すると考えられる（文献１０／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５８：　４２５−４３５　（２０００）；　文献１１／Ｉｎａｇｉ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４６３：　２６０−２６４　（１９９９）；　文献１２／Ｕｅｄａ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５８：２５１８−２５２４，２０００；　文献１３／Ｃｏｍｂｅｔ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１１：　７１７−７２８　（２０００））。
【０００７】
加えて腹膜透析患者においては、腹膜透析液中に含まれるグルコースによって腹腔内がカルボニルストレス状態となっていることが、腹膜の免疫組織学的検討から証明された（文献１４／Ｙａｍａｄａ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　４２：　３５４−３６１　（１９９４）；　文献１５／Ｎａｋａｙａｍａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５１：　１８２−１８６　（１９９７）；　文献１０／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５８：　４２５−４３５　（２０００）；　文献１１／Ｉｎａｇｉ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４６３：２６０−２６４　（１９９９）；　文献１３／Ｃｏｍｂｅｔ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１１：　７１７−７２８　（２０００））。
【０００８】
また、腹膜透析液中のグルコースは、熱滅菌により、腹膜に障害を与える種々の反応性カルボニル化合物が生成する（文献１６／Ｎｉｌｓｓｏｎ−Ｔｈｏｒｅｌｌ　Ｃ．Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　１３：　２０８−２１３　（１９９３）；　文献１７／Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ　Ａ．Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．，　１５：　３４８−３５２　（１９９５）；　文献１８／Ｌｉｎｄｅｎ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　１８：　２９０−２９３　（１９９８））。このとき生成されるカルボニル化合物は、例えば、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、グリオキサール（ＧＯ）、３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）、ホルムアルデヒド、５−ヒドロキシメチルフルアルデヒド、アセトアルデヒド、あるいはフルフラール等である。これらのなかでジカルボニル化合物（ＧＯ、ＭＧＯ、及び３−ＤＧ）は、反応性が高いことから、タンパク質修飾に関与し（文献１９／Ｇｌｏｍｂ　Ｍ．Ａ．　ａｎｄ　Ｍｏｎｎｉｅｒ　Ｖ．Ｍ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７６：　１００１７−１００２５　（１９９５）；文献２０／Ｗｅｌｌｓ−Ｋｎｅｃｈｔ　Ｋ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４：　３７０２−３７０９　（１９９５））、ＡＧＥｓの腹膜中皮下及び血管への蓄積につながる（文献１５／Ｎａｋａｙａｍａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５１：　１８２−１８６　（１９９７）；　文献１０／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５８：　４２５−４３５　（２０００））。
【０００９】
また、腹膜の血管有効面積の亢進、除水機能不全、血管拡張、血管新生を増幅する因子と考えられる一酸化窒素合成酵素、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（文献２１／Ｎｅｕｆｅｌｄ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　１３：　９−２２　（１９９９））、及びＡＧＥｓであるＮε−カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）　（文献２２／Ａｈｍｅｄ　Ｍ．Ｕ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６１：　４８８９−４８９４　（１９８６））、及びペントシジン（文献２３／Ｓｅｌｌ　Ｄ．Ｒ．　ａｎｄ　Ｍｏｎｎｉｅｒ　Ｖ．Ｍ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６４：　２１５９７−２１６０２　（１９８９））の共局在化が長期間腹膜透析患者の腹膜の免疫組織学的検討により明らかにされた（文献１３／Ｃｏｍｂｅｔ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１１：　７１７−７２８　（２０００）；　文献１１／Ｉｎａｇｉ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４６３：　２６０−２６４　（１９９９））。
【００１０】
また、培養腹膜中皮細胞及び内皮細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏでＭＧＯに曝露することによりＶＥＧＦのｍＲＮＡ及びタンパク合成が増加する（文献１１／Ｉｎａｇｉ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ　４６３：　２６０−２６４　（１９９９））。さらに、培養中皮細胞のグルコース分解反応性カルボニル化合物（ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｃａｒｂｏｎｙｌ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）への曝露は、細胞の成長、生存能、及び炎症性サイトカイン放出を阻害する（文献２４／Ｗｉｔｏｗｓｋｉ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１２：　２４３４−２４４１　（２００１））。
【００１１】
そのため、腹膜透析液中の反応性カルボニル化合物を減少させるための方法が設計された（文献２５／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　６１：３７５−３８６，２００２）。例えば、カルボニル化合物の発生源であるグルコースに代えてイコデキストリン（ｉｃｏｄｅｘｔｒｉｎ）やアミノ酸を浸透圧物質として用いた透析液が提案されている。これらの新しいグルコースを含まない透析液（文献２６／Ｇａｒｃｉａ−Ｌｏｐｅｚ　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　２０（Ｓｕｐｐｌ５）：　Ｓ４８−Ｓ５６　（２０００）；　文献２７／Ｋｒｅｄｉｅｔ　Ｒ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　１７：　３５−４１　（１９９７）；　文献２８／Ｆａｌｌｅｒ　Ｂ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５６：　Ｓ８１−Ｓ８５　（１９９６））は、カルボニル化合物濃度が低く（文献１２／Ｕｅｄａ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５８：　２５１８−２５２４　（２０００）；　文献２９／Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ　Ｃ．Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　２０：　７９６−７９８　（２０００））、生体適合性の点で好ましい。新しいイコデキストリン及びアミノ酸透析液では明らかにＧＯ、ＭＧＯ、３−ＤＧ及び総カルボニル化合物レベルが熱滅菌グルコース透析液と比較して低い。
【００１２】
また、マルチ−コンパートメントバッグシステム（文献３０／Ｔｏｐｌｅｙ　Ｎ．，　Ｐｅｒｉａｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　１７：　４２−４７　（１９９７）；　文献３１／Ｊｏｒｒｅｓ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉａｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　１７（Ｓｕｐｐｌ２）：　Ｓ４２−Ｓ４６　（１９９７））に充填された透析液のカルボニル化合物濃度は、通常の熱滅菌並びにその後の貯蔵にもかかわらず非常に低く（文献３２／Ｌａｇｅ　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉａｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　２０（Ｓｕｐｐｌ５）：　Ｓ２８−Ｓ３２　（２０００）；　文献３３／Ｔａｕｅｒ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．　２８０：　１４０８−１４１４　（２００１））、その臨床的な有用性が研究者らにより確認されている（文献３４／Ｃａｐｅｌｌｉ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｄｖ．Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．　１５：　２３８−２４２　（１９９９）；　文献３５／Ｒｉｐｐｅ　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５９：　３４８−３５７　（２００１）；　文献３６／Ｊｏｎｅｓ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５９：　１５２９−２５３８　（２００１））。
【００１３】
グルコースを含まない透析液に代わる方法としてＡＧＥｓ形成を阻害することが知られている化合物を利用した方法が挙げられる。アミノグアニジン（文献３７／Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２：　１６２９−１６３２　（１９８６））、及びＯＰＢ−９１９５（文献９／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４４５：　２０２−２０６　（１９９９）；　文献３８／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１１：　１７１９−１７２５　（２０００））等の化合物は、カルボニル化合物をトラップすることによりタンパク質修飾を妨げる（文献９／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４４５：　２０２−２０６　（１９９９）；　文献５／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　９：　２３４９−２３５６　（１９９８））。実際、ＯＰＢ−９１９５またはアミノグアニジンの市販のグルコース透析液への添加によりＧＯ、ＭＧＯ及び３−ＤＧレベルが劇的に減少し、ＡＧＥｓのペントシジン及びＣＭＬ生成が減少する（文献３８／Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１１：　１７１９−１７２５　（２０００））。
【００１４】
このように、カルボニルストレスを抑制して腎不全におけるＡＧＥｓの生成に由来する組織障害を軽減し、さらに合併症の進展を抑制するための様々な手段の開発が試みられている。そして、かかるカルボニルストレス抑制に関する研究開発を促進するためには、環境ストレス（生活環境、食生活など）に起因するカルボニルストレスに対する耐性を有し、生体適応機構の解明やそれに基づく創薬デザインを検討でき得るモデル動物が必須である。
【００１５】
【文献１】Ｒａｈｂａｒ　Ｓ．，　Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ　２２：　２９６　（１９６８）
【文献２】Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５１：　１１７０−１１８１　（１９９７）
【文献３】Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　７：　１１９８−１２０６　（１９９６）
【文献４】Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５５：　３８９−３９９　（１９９９）
【文献５】Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，　９：　２３４９−２３５６　（１９９８）
【文献６】Ｍｉｙａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．　９２：　１２４３−１２５２　（１９９３）
【文献７】Ｍｉｙａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：　２３５３−２３５８　（１９９６）
【文献８】Ｍｉｙａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４３７：　２４−２８　（１９９８）
【文献９】Ｍｉｙａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４４５：　２０２−２０６　（１９９９）
【文献１０】Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５８：　４２５−４３５　（２０００）
【文献１１】Ｉｎａｇｉ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４６３：　２６０−２６４　（１９９９）
【文献１２】Ｕｅｄａ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５８：２５１８−２５２４，２０００
【文献１３】Ｃｏｍｂｅｔ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１１：　７１７−７２８　（２０００）
【文献１４】Ｙａｍａｄａ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　４２：　３５４−３６１　（１９９４）
【文献１５】Ｎａｋａｙａｍａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５１：　１８２−１８６　（１９９７）
【文献１６】Ｎｉｌｓｓｏｎ−Ｔｈｏｒｅｌｌ　Ｃ．Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　１３：　２０８−２１３　（１９９３）
【文献１７】Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ　Ａ．Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．，　１５：　３４８−３５２　（１９９５）
【文献１８】Ｌｉｎｄｅｎ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　１８：　２９０−２９３　（１９９８）
【文献１９】Ｇｌｏｍｂ　Ｍ．Ａ．　ａｎｄ　Ｍｏｎｎｉｅｒ　Ｖ．Ｍ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７６：　１００１７−１００２５　（１９９５）
【文献２０】Ｗｅｌｌｓ−Ｋｎｅｃｈｔ　Ｋ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４：　３７０２−３７０９　（１９９５）
【文献２１】Ｎｅｕｆｅｌｄ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　１３：　９−２２　（１９９９）
【文献２２】Ａｈｍｅｄ　Ｍ．Ｕ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６１：　４８８９−４８９４　（１９８６）
【文献２３】Ｓｅｌｌ　Ｄ．Ｒ．　ａｎｄ　Ｍｏｎｎｉｅｒ　Ｖ．Ｍ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６４：　２１５９７−２１６０２　（１９８９）
【文献２４】Ｗｉｔｏｗｓｋｉ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１２：　２４３４−２４４１　（２００１）
【文献２５】Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　６１：３７５−３８６，（２００２）
【文献２６】Ｇａｒｃｉａ−Ｌｏｐｅｚ　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　２０（Ｓｕｐｐｌ５）：　Ｓ４８−Ｓ５６　（２０００）
【文献２７】Ｋｒｅｄｉｅｔ　Ｒ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　１７：　３５−４１　（１９９７）
【文献２８】Ｆａｌｌｅｒ　Ｂ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５６：　Ｓ８１−Ｓ８５　（１９９６）
【文献２９】Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ　Ｃ．Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　２０：　７９６−７９８　（２０００）
【文献３０】Ｔｏｐｌｅｙ　Ｎ．，　Ｐｅｒｉａｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　１７：　４２−４７　（１９９７）
【文献３１】Ｊｏｒｒｅｓ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉａｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　１７（Ｓｕｐｐｌ２）：　Ｓ４２−Ｓ４６　（１９９７）
【文献３２】Ｌａｇｅ　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｒｉａｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ．　２０（Ｓｕｐｐｌ５）：　Ｓ２８−Ｓ３２　（２０００）
【文献３３】Ｔａｕｅｒ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．　２８０：　１４０８−１４１４　（２００１）
【文献３４】Ｃａｐｅｌｌｉ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｄｖ．Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．　１５：　２３８−２４２　（１９９９）
【文献３５】Ｒｉｐｐｅ　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５９：　３４８−３５７　（２００１）
【文献３６】Ｊｏｎｅｓ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５９：　１５２９−２５３８　（２００１）
【文献３７】Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２：　１６２９−１６３２　（１９８６）
【文献３８】Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１１：　１７１９−１７２５　（２０００）
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、カルボニルストレスに耐性を有するトランスジェニック動物に関する。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、以前にカルボニルストレスの抑制に関する研究の一環として、グリオキサラーゼ系と呼ばれる解毒反応系に着目し、グリオキサラーゼＩ活性を備える酵素、及びカルボニル化合物還元剤を有効成分とするカルボニルストレス改善剤を開発した（ＷＯ　０１／４５７３３）。グリオキサラーゼ系は、グリオキサラーゼＩ（ラクトイルＧＳＨリアーゼ）及びグリオキサラーゼＩＩ（ヒドロキシアシルＧＳＨヒドラーゼ）の２つの酵素から成る解毒反応系である。この解毒反応により、解糖系で産生される生体に有毒なカルボニル化合物であるＭＧＯがグルタチオン（ＧＳＨ）の存在下で乳酸に転換される（Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｋ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．　２４：　３１−４４　（１９８５））。
【００１８】
グリオキサラーゼＩ活性を備える酵素としては、次のような由来の酵素が公知である。
哺乳動物の組織（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．９０，５３６−５４１，１９８２，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．９０，５４２−５４６，１９８２）
酵母（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．８５，２７５−２７６，１９７８，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８３，２３−３０，１９７９）
細菌（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４１，９９３−９９９，１９８６）
ヒト（Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６８，１１２１７−１１２２１，１９９３）
また、これらのグリオキサラーゼＩを精製する方法も公知である。
【００１９】
ラット肝臓細胞由来のグリオキサラーゼＩは、分子量４６，０００で、２３，０００のサブユニットからなる２量体である。酵母由来のものは分子量３２，０００の単量体からなる（Ｍａｒｍｓｔａｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，　１８３：　２３−３０　（１９７９））。シュードモナス菌由来のグリオキサラーゼＩは動物細胞由来のものに近いが、分子量２０，０００からなる単量体と報告されている（Ｒｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．　１４１：　９９３−９９９　（１９８６））。
【００２０】
ヒト由来のグリオキサラーゼＩには３種のアイソザイムが存在する（Ａｒｏｎｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９２：　２９０−３９３　（１９７９））。しかしこれらのアイソザイムは、分子量、アミノ酸組成、抗原性などに大きな違いはなく、イオン交換クロマトグラフィーにより分離できることから、電気的な性質が異なるだけと考えられている。従ってこれら３種のアイソマーは２つの対立遺伝子に由来する２種のモノマーのホモダイマーならびにヘテロダイマーと考えられる（Ｋｏｍｐｆ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍａｎｇｅｎｅｔｉｋ　２７：　１４１−１４３　（１９７５））。
【００２１】
シュードモナス菌由来のグリオキサラーゼＩについては、これをコードする遺伝子がクローン化され、その全塩基配列が決定されている（Ｒｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　５２：　２２４３−２２４６　（１９８８））。また、ヒト由来グリオキサラーゼＩについても、そのアミノ酸組成及び遺伝子配列が開示されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６８：　１１２１７−１１２２１　（１９９３））。
【００２２】
一方、最近、生体内におけるカルボニル化合物の消去・代謝系の仕組みが明らかになってきた。カルボニル化合物の消去には、いくつかの酵素や酵素経路の関与が報告されている。アルドース還元酵素、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、あるいはグリオキサラーゼ経路等はこれに含まれる。これらのカルボニル化合物消去系の活性低下は、同時に多数のカルボニル化合物の上昇につながる。ＧＳＨ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどのレドックス補酵素は、これらの経路の活性にとって重要な要素である（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ　Ｐ．　Ｊ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ　３：　１４９−１６６，　１９９６）。ＭＧＯ、ＧＯなどのカルボニル化合物は、ＧＳＨのチオール基と非酵素的に反応し、結果的にグリオキサラーゼにより代謝される。ＮＡＤ（Ｐ）ＨはＧＳＨ還元酵素を活性化し、ＧＳＨレベルを上昇させる。すなわち細胞内レドックス機構の不均衡によるＧＳＨ、及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下によりカルボニル化合物消去系が阻害され、ＡＧＥｓの蓄積につながる。実際に糖尿病患者の血液中ＧＳＨレベルは低下しており、カルボニル化合物であるＭＧＯのレベルは上昇していることが報告されている。
【００２３】
本発明者らは、ＭＧＯ　はＧＳＨによってトラップされるが、更に、グリオキサラーゼＩ存在下で、より速やかに消去されることを見出した。また、ＧＳＨ及びグリオキサラーゼＩ存在下においては、腹膜透析液中のＭＧＯ以外のカルボニル化合物、例えばＧＯ、３−ＤＧも速やかに消去されることを確認した（ＷＯ　０１／４５７３３）。
【００２４】
そこで、本発明者らは、カルボニルストレスに対する生体適応機構の解明やそれに基づく創薬デザインの検討に有用な、カルボニルストレス耐性を有するトランスジェニック動物を開発するにあたり、このグリオキサラーゼＩとそれをコードするＤＮＡに着目した。本発明者らは、グリオキサラーゼＩをコードするＤＮＡの導入によって作製されたトランスジェニックマウスの組織が、各種のカルボニル化合物を消去することを確認した。すなわち、グリオキサラーゼＩトランスジェニックマウスの心臓組織は、野生型に比べ、ＧＯ及びＭＧＯ溶液中のＧＯ及びＭＧＯ濃度を有意に低下させた。
この観察結果に基づいて、グリオキサラーゼＩをコードするＤＮＡの導入によって、カルボニルストレスに対する生体適応機構の解明やそれに基づく創薬デザインの検討に有用な、カルボニルストレス耐性を有するトランスジェニック動物を作製できることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のカルボニルストレス耐性モデル動物、このモデル動物の作製方法と用途に関する。すなわち本発明は、以下のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物に関する。
〔１〕ヒトグリオキサラーゼＩ、またはヒトグリオキサラーゼＩと機能的に同等なタンパク質をコードする外来性のＤＮＡを発現するトランスジェニック非ヒト動物であるカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物。
〔２〕ヒトグリオキサラーゼＩをコードするＤＮＡが、配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域からなる〔１〕に記載のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物。
〔３〕非ヒト動物がマウスである〔１〕に記載のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物。
〔４〕非ヒト動物がラットである〔１〕に記載のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物。
〔５〕ヒトグリオキサラーゼＩ、またはヒトグリオキサラーゼＩと機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡと、このＤＮＡを動物において発現させることができるプロモーターとを含むカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物作製用組換え遺伝子。
〔６〕次の工程を含む、カルボニルストレス耐性トランスジェニック動物の作製方法。
ａ）動物の受精卵に〔５〕に記載の組み換え遺伝子を導入する工程
ｂ）工程ａ）の受精卵から発生した初代トランスジェニック動物のうち導入した外来性遺伝子を保持した個体を選択する工程
〔７〕更に次の工程ｃ）及びｄ）を含む〔６〕に記載のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物の作製方法。
ｃ）工程ｂ）で選択した個体と正常動物を交配させて外来性遺伝子をヘテロで保有するＦ１動物を得る工程
ｄ）工程ｃ）で得たＦ１動物同士を交配させて外来性遺伝子をホモで保有するＦ２動物を得る工程
【００２５】
本発明において、ヒトグリオキサラーゼＩとは、配列番号：１に示す塩基配列を持つＤＮＡによってコードされるタンパク質である。そのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。本発明のトランスジェニック動物は、ヒトグリオキサラーゼＩのみならず、ヒトグリオキサラーゼＩと生物学的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを導入したものであることができる。このようなタンパク質としては、たとえば他の種におけるグリオキサラーゼＩのホモログを示すことができる。グリオキサラーゼＩのホモログには、たとえば酵母由来、ラット、シュードモナス菌由来のものなどが明らかにされている。
【００２６】
また、一般に、真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子で知られているように多形現象を示すことが多い。この多形現象によって、アミノ酸配列に１個あるいはそれ以上のアミノ酸の置換を生じても、通常タンパク質の活性は維持される。また一般に、１個または数個のアミノ酸の改変では、タンパク質の活性は維持される場合が多いことが知られている。従って、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を人工的に改変したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、該タンパク質がカルボニルストレス耐性をもたらす限り、すべて本発明に利用することができる。以下、ヒト、酵母、ラット、あるいはマウスに由来するグリオキサラーゼＩと、その生物学的に同等な機能を有するタンパク質を総称してグリオキサラーゼ類と記載する。なおグリオキサラーゼ類としてマウスに由来するグリオキサラーゼＩをコードするＤＮＡをマウスに導入する場合であっても、人為的に導入したマウスに由来するＤＮＡは外来性のＤＮＡである。しかしながら、本発明によるトランスジェニック動物をカルボニルストレス耐性のモデル動物として、ヒトにおける治療剤に有用な化合物のスクリーニングを行うには、ヒトグリオキサラーゼＩのＤＮＡを用いるのが有利である。トランスジェニック動物の体内でヒトグリオキサラーゼＩに対する影響を、より忠実に反映できる可能性が期待できるためである。
【００２７】
また、アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる（Ｇｒａｎｔｈａｍ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　９：　ｒ４３　（１９８１））。従って、コドンの縮重を考慮して、ＤＮＡを適宜改変したものもまた本発明のＤＮＡに含まれる。さらに、これら核酸配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的変位導入法（ＭａｒｋＤ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．　８１：　５６６２　（１９８４））等に従うことができる。
【００２８】
更に、配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとハイブリダイズすることができ、かつそのＤＮＡによってコードされるタンパク質がカルボニルストレス耐性をもたらす限り、そのＤＮＡは本発明によるＤＮＡに含まれる。ストリンジェントな条件下で特定配列にハイブリダイズすることができる配列は、特定配列がコードするタンパク質と類似した活性を持つものが多いと考えられる。ストリンジェントな条件とは、通常「１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、３７℃」程度、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しい条件として「０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、５５℃」程度を示すことができる。加えて、本発明におけるグリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡは、トランスジェニック動物にカルボニルストレス耐性をもたらす限り、その断片であることができる。
【００２９】
本発明によるカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物は、公知のトランスジェニック動物の作製方法によって得ることができる。トランスジェニック動物は、たとえば「発生工学実験マニュアル」（野村達次監修、勝木元也編、講談社、１９８９年）や、「新生化学実験講座・動物実験法」（日本生化学学会編、東京化学同人、１９９１年）などに従って作製される。以下に、一般的なトランスジェニック動物の作製プロトコールについて述べる。
【００３０】
本発明においてトランスジェニック動物の作成に用いられるグリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡは、本明細書に開示した塩基配列に基づいて公知の方法により得ることができる。たとえば、本明細書で示したＤＮＡ配列に基づいて作製した合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、公知の手法で作製されたヒト細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、グリオキサラーゼ類をコードするｃＤＮＡの単離が可能である。またこのｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号：１に示した塩基配列に基づいて設定したプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、グリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡを増幅することができる。増幅生成物は、公知の方法に基づいてクローニングする。
【００３１】
グリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡは、この遺伝子を導入すべき動物の細胞において発現可能なプロモーターに連結した組み換え遺伝子コンストラクトとするのが有利である。本発明の組み換え遺伝子コンストラクトは、適当な宿主を利用してクローニング可能なベクターに、前記グリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡと、その上流にプロモーターとを挿入し、クローニングすることによって構築することができる。本発明に利用することができるプロモーターとしては、マウスやラットなど、幅広い脊椎動物で外来遺伝子の発現を誘導できるニワトリβアクチン・プロモーターを示すことができる。
【００３２】
また、外来遺伝子の発現を増強するために、エンハンサーを組み合わせることができる。たとえば、ＣＭＶに由来するエンハンサーは、哺乳動物における外来遺伝子の発現を増強することが知られている。
これらの遺伝子から構成される組み換え遺伝子コンストラクトの構築にあたり、エンハンサーとプロモーターを備え、更にその下流に外来遺伝子挿入用のマルチクローニングサイトを配置したベクターを用いることができる。このような構造を持つベクターは、たとえばｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ　Ｈ，　Ｙａｍａｍｕｒａ　Ｋ　ａｎｄ　Ｍｉｙａｚａｋｉ　Ｊ　（１９９１）　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｖｅｃｔｏｒ．　Ｇｅｎｅ　１０８，１９３−２００．）等をもとに実施例に示すような方法によって構築することができる。このベクターは、マルチクローニングサイトの下流にウサギβグロビン・ターミネーターが配置されており、挿入された外来遺伝子の発現効率の向上に貢献する。
【００３３】
適当な制限酵素によって前記ベクターから切り出した組み換え遺伝子コンストラクトは、十分に精製されトランスジェニック動物の作成に用いられる。トランスジェニック動物は、未受精卵、受精卵、精子及びその始原細胞を含む胚芽細胞などに、前記コンストラクトを導入することによって作成される。コンストラクトを導入する細胞としては、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階、より具体的には単細胞あるいは受精卵細胞の段階で、通常８細胞期以前のものが利用される。コンストラクトの導入方法としては、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が公知である。さらに、こうして得られた形質転換細胞を上述の胚芽細胞と融合させることによりトランスジェニック動物を作成することもできる。
【００３４】
コンストラクトを導入する細胞は、トランスジェニック動物の作成が可能なあらゆる非ヒト脊椎動物に由来する細胞であることができる。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、あるいはネコ等の細胞を利用することができる。たとえばマウスにおいては、排卵誘発剤を投与したメスのマウスに正常なオスのマウスを交配させることにより、コンストラクトの導入が可能な受精卵を回収することができる。マウス受精卵では、一般に雄性前核へのマイクロインジェクションによりコンストラクトが導入される。コンストラクトを導入した細胞は、体外での一晩程度の培養の後、導入に成功したと思われるものが代理母の卵管に移植され、トランスジェニックキメラ動物が誕生する。代理母には、精管を切断したオスと交配させて偽妊娠状態としたメスが利用される。
【００３５】
生まれたトランスジェニックキメラ動物は、その体細胞の遺伝子を解析することによって、ゲノムに外来遺伝子（グリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡ）が組み込まれていることを確認した上で、Ｆ１動物の誕生のために正常な動物と交配させる。このとき、望ましくは、より多くのコピー数を持つ個体を選択するようにする。一般にコンストラクトとして導入した外来性のＤＮＡは、ゲノムの同一の部分に複数コピーが直列に組み込まれる。通常はこの組み込みコピー数が多いほど、多量の遺伝子発現につながり、より明瞭な発現型が期待できるためである。体細胞ゲノムにおいて、外来遺伝子（グリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡ）が正しい方向で組み込まれていることは、コンストラクトに特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって確認することができる。また、ドットブロット法によって、コピー数の相対的な比較が可能である。
【００３６】
この交配の結果誕生するＦ１動物の中で、体細胞に外来遺伝子（グリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡ）を備えるものは、ヘテロザイゴート（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）ながら生殖細胞に外来遺伝子（グリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡ）を伝えることができるトランスジェニック動物である。したがって、Ｆ１動物の中から体細胞に外来遺伝子（グリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡ）を保持するものを選び、これらを両親とするＦ２動物を誕生させることができれば、外来遺伝子（グリオキサラーゼ類をコードするＤＮＡ）をホモで保持するホモザイゴート動物（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ
ａｎｉｍａｌ）がＦ２動物として得られる。
【００３７】
本発明のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物には、外来性のグリオキサラーゼ類のＤＮＡを発現するものである限り、これらトランスジェニック動物のいずれの世代であっても、利用することができる。たとえば、グリオキサラーゼ類のＤＮＡをヘテロで保持するトランスジェニック動物であっても、この外来性のグリオキサラーゼ類が発現すれば、カルボニルストレス耐性トランスジェニック動物として有用である。
【００３８】
トランスジェニック動物がカルボニルストレス耐性を呈していることは、次のような指標を観察することによって確認することができる。たとえば、トランスジェニック動物の臓器組織のライセートとカルボニル化合物溶液をｉｎ　ｖｉｔｒｏでインキュベーションし、カルボニル化合物の濃度変化を観察し、その増減によってカルボニルストレス耐性を確認することができる。
【００３９】
本発明のカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物のカルボニル化合物消去効果は、トランスジェニック動物の組織とカルボニル化合物溶液のインキュベーションにより確認することができる。カルボニル化合物としては、ＧＯ、ＭＧＯ、及び３ＤＧ等を指標とすることができる。
【００４０】
これらのカルボニル化合物は、実施例に示すように逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を用いて容易に測定することができる（Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　５８：　４２５−４３５　（２０００））。あるいは、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）を酸性下でカルボニル化合物と反応させ、生成する発色生成物を３６０ｎｍにおける吸光度で測定することもできる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００４１】
カルボニルストレス耐性トランスジェニック動物は、投与された毒性を有する種々のカルボニル化合物を迅速に消去する能力を有している。従って、本発明のトランスジェニック動物は、カルボニルストレスを抑制して腎不全におけるＡＧＥｓの生成に由来する組織障害を軽減し、さらに合併症の進展を抑制するための様々な手段の開発のための、環境ストレス（生活環境、食生活など）に起因するカルボニルストレスに対する耐性を有し、生体適応機構の解明やそれに基づく創薬デザインを検討でき得るモデル動物として有用である。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
［実施例１］組み換え遺伝子コンストラクト
ヒトグリオキサラーゼＩ　ｃＤＮＡは、相模中央化学研究所（神奈川、日本）より供給を受けた。ヒトグリオキサラーゼＩ　ｃＤＮＡ導入遺伝子コンストラクトを構築するために、このｃＤＮＡをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いてｐＢｓＣＡＧ−２のＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。なお、ｐＢｓＣＡＧ−２は、ｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　１０８：　１９３−２００　（１９９１）、ＣＭＶエンハンサー及びニワトリβアクチン・プロモーター及びウサギβグロビン・ターミネーターを持つ）のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社）のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ部位に組込み作製された。グリオキサラーゼＩを含むｐＢｓＣＡＧ−２を制限酵素Ｋｐｎ　Ｉ及びＳａｃ　Ｉにより切断し、グリオキサラーゼＩ　ｃＤＮＡを含む断片を回収、精製し、トランスジェニックマウスの作製に使用した（図１）。
【００４３】
［実施例２］トランスジェニックマウスの作製
インジェクションの３日前夕方にＰＭＳＧ（妊馬血清ゴナトロピン）を８−２０週齡の雌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に腹腔投与し、その２日後の夕方にｈＣＧ（ヒト胎盤性ゴナトロピン）を腹腔投与した。これにつづき、８−２０週齡の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を１匹ずつゲージに入れ交配を開始した。交配の翌日の午前中に膣栓の検査を行い、膣栓が確認できた雌マウスを頚椎脱臼により屠殺後、輸卵管を単離し、ヒアルロニターゼ添加したＷｈｉｔｔｅｎ培養液に移した。実体顕微鏡下で卵を排出させ、受精卵の分離・洗浄を行った。
【００４４】
微分干渉装置（ノマルスキー装置）付きの倒立顕微鏡に、マニピュレータを組み合わせたシステムを用い、穴あきスライドグラス上の培養液滴に５−３０個の受精卵を移動し、一つの受精卵あたり約２，０００コピーの上記で調製したＤＮＡ断片を含む２　ｐＬのＤＮＡ溶液を雄性前核にマイクロインジェクションした。ＤＮＡ注入が終了した卵は、卵管に移植するまで培養した。移植部位は胚の発生段階で異なり、１−２細胞期の胚は卵管内へ、８細胞期−胚盤胞期の胚は子宮内へ移植した。
【００４５】
胚移植操作に先立ち、レシピエントメスの黄体の活性化処理を行い、偽妊娠を誘起させた。すなわち、発情前期のメスを精管結紮したオスと不妊交尾させた。移植胚の出産予定日は、レシピエントメスの膣栓のついた日を第１日とし、第２０日目として計算した。卵管内へ移植する場合は、１細胞期及び２細胞期の胚とも、ネンブタール麻酔下で偽妊娠一日目のレシピエントマウスの卵管内に実体顕微鏡下で移植した。片側卵管あたり１０個程度の胚を移植した。子宮内に移植する場合は、体外培養によって桑実胚期から胚盤胞期まで発生させた胚を、ネンブタール麻酔下の偽妊娠を誘起しておいたレシピエントマウスの子宮内に移植した。レシピエントマウスの偽妊娠日齢は胚の日齢よりも１日若く計算した。外見から胎仔の数を判断し、胎仔の数が５匹以上と予想された場合は自然分娩、４匹以下ならば帝王切開を行った。生まれたマウスは、生後３−４週の間に親から離し、雌雄を分けて飼育した。
【００４６】
［実施例３］トランスジェニックマウスの選択
生後４週齡以降に尾の一部を切断し、キット（Ｑｉａｇｅｎ　ＤＮｅａｓｙ　ｔｉｓｓｕｅ　ｋｉｔ；　Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。これを鋳型にして、導入遺伝子断片のＰＣＲによる増幅を行った。増幅には、サイトメガロウイルスエンハンサープライマー（図１のＰｒ　１）（センス：５’−ＧＴＣ　ＧＡＣ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＴＡＴ　ＴＧＡ　ＣＴＡ　Ｇ−３’／配列番号：３、アンチセンス：５’−ＣＣＡ　ＴＡＡ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＧＴＡ　ＣＴＧ−３’／配列番号：４）及びヒトグリオキサラーゼＩ遺伝子とベクターの３’−ｊｕｎｃｔｉｏｎを含む断片のためのプライマー（図１のＰｒ　２）（センス：５’−ＧＴＡ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＣＣＴ　ＣＣＧ　ＴＴＣ　ＣＴＴ　ＧＧＧ−３’／配列番号：５、アンチセンス：５’−ＴＣＧ　ＡＧＧ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　Ｇ−３’／配列番号：６）を用いて、ＰＣＲによる増幅産物が得られる個体を選別した。得られたＦ０世代６個体（雄３個体、雌３個体）を、正常個体（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ　Ｊｃｌ）と交配させＦ１世代を得た。
【００４７】
動物は、水の自由摂取の条件下、代謝ケージで飼育した。尿蛋白量を測定するための２４時間尿は屠殺の１日前に、血液サンプルは屠殺時に採取した。器官のサンプルは４％の中性緩衝ホルムアルデヒドで固定化され、パラフィン包埋し、４μｍに裁断後、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）またはＰＡＳ染色を施した。野生型またはヘテログリオキサラーゼ　ＩトランスジェニックＦ１マウスの組織（５０ｍｇ）は、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含有する１ｍＬのＮａＰＢ（ｐＨ７．０）でホモジナイズされ、４℃で２０，０００ｇ×２０分間、遠心分離し、上清をイムノブロットによるグリオキサラーゼ　Ｉ分析、グリオキサラーゼ　Ｉ活性、及びカルボニル化合物抑制の評価のための組織抽出液として使用した。
【００４８】
［実施例４］イムノブロット分析
トランスジェニックマウスで高発現されたヒトグリオキサラーゼ　Ｉ遺伝子産物（約２４　ｋＤａ）を抗ヒトグリオキサラーゼ　Ｉ抗体を用いた組織ホモジネートのイムノブロット分析により確認した。組織から抽出された３０μｇのタンパク質を５分間煮沸して変性し、アクリルアミドグラジエントゲル（４−２０％）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂ．）に転写した。メンブレンを０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０及び２％のウシ血清アルブミンを含有するＴｒｉｓ緩衝液（ＴＢＳ）で４℃にて一晩ブロッキングした後、ウサギ抗ヒトグリオキサラーゼ　Ｉ　ＩｇＧ（１μｇ／ｍＬ）（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，　１１８２：　３１１−３１６　（１９９３））を４℃にて一晩インキュベートした。メンブレンを０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含有するＴＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２（Ｃａｐｐｅｌ）とインキュベートし、ニトロブルーテトラゾリウム及びＸリン酸溶液（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂ．）を用いて発色した。対照として１０％の赤血球懸濁液を用い、基準化には抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用した。結果を図２に示す。ヒトグリオキサラーゼ　Ｉトランスジェニックマウスから抽出された腎及び心臓組織は野生型に比べ有意に高いグリオキサラーゼ　Ｉ発現を示した（レーン４、５、７、８）。また、グリオキサラーゼ　Ｉの発現は、検査したすべての組織において増大していた。
【００４９】
［実施例５］トランスジェニックマウス組織中のグリオキサラーゼ　Ｉ活性
トランスジェニックマウス組織中のグリオキサラーゼ　Ｉ活性は、２５℃で２分間によるＳ−Ｄ−ラクトイルＧＳＨの生成による２４０ｎｍの吸光度の増加の検出（ＭｃＬｅｌｌａｎ　Ａｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｃｈ　Ａｇｅｉｎｇ　Ｄｅｖ．　４８：　６３−７１　（１９８９））により測定した。結果を表１に示す。トランスジェニックマウスの２種のラインから得られた心臓、肝臓、及び腎臓組織のタンパク質抽出物のグリオキサラーゼ　Ｉ活性は、野生型に比べて有意に高かった。
【００５０】
【表１】
2004105055.tif 000002
【００５１】
［実施例６］トランスジェニックマウス組織のカルボニル化合物消去能
グリオキサラーゼ　Ｉトランスジェニックマウス（ラインＡ）の心臓由来タンパク質抽出液とＧＯ、またはＭＧＯ溶液（１００μＭ）を３７℃、１時間インキュベートし、ＧＯ及びＭＧＯ濃度の変化を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した（Ｍｉｙａｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１１：　１７１９−１７２５　（２０００））。結果を図３に示す。トランスジェニックマウス由来の心臓組織抽出液は、野生型に比べて、ＧＯ及びＭＧＯ濃度を有意に減少させた。また、この低下は、添加したＧＳＨの量に依存していた。
【００５２】
［実施例７］トランスジェニックラット
実施例１乃至３の記載に準じ、グリオキサラーゼ　Ｉトランスジェニックラットを作製した。実施例４及び実施例５の実験方法に準じ、得られたトランスジェニックラットの心臓、腎臓及び腹膜組織のタンパク質抽出液におけるグリオキサラーゼ　Ｉ発現を確認した。結果を図４乃至図６に示す。いずれの組織においても、グリオキサラーゼ　Ｉ活性は野生型に比べて有意に高かった。
また、実施例６の実験方法に準じ、トランスジェニックラット心臓組織のカルボニル化合物消去能を検討した。結果を図７及び図８に示す。トランスジェニックラット由来の心臓組織タンパク質抽出液は、野生型に比べて、ＧＯ（図７Ａ）及びＭＧＯ濃度（図７Ｂ）を有意に減少させた。また、この低下は、添加したＧＳＨの量に依存していた。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によりヒトグリオキサラーゼ　Ｉ遺伝子の導入によるカルボニルストレス耐性トランスジェニック動物が提供された。本発明のトランスジェニック動物を用いて、カルボニルストレスに対する生体適応機構の解明やそれに基づく創薬デザインが可能になる。
【００５４】
【配列表】
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【００５５】
【図面の簡単な説明】
【図１】グリオキサラーゼ　Ｉ導入遺伝子コンストラクトから切り出し抽出された卵へのマイクロインジェクションに用いたＤＮＡ断片の構造を示す図。
【図２】グリオキサラーゼ　Ｉ遺伝子産物のイムノブロット分析を示す図。レーン１：１０％マウス赤血球懸濁液（対照）、レーン２：１０％ヒト赤血球懸濁液（対照）、レーン３：野生型マウス腎臓、レーン４及び５：Ｆ１　グリオキサラーゼ　Ｉトランスジェニックマウス（ラインＡ及びＢ）腎臓、レーン６：野生型マウス心臓、レーン７及び８：Ｆ１　グリオキサラーゼ　Ｉトランスジェニックマウス（ラインＡ及びＢ）心臓。
【図３】トランスジェニックマウス組織中のカルボニル化合物消去能を示す図。野生型マウスの心臓由来組織タンパク質抽出液（最終グリオキサラーゼ　Ｉ活性：０．４ｕｎｉｔ／ｍＬ）及びヒトグリオキサラーゼ　Ｉトランスジェニックマウスの心臓由来組織タンパク質抽出液（ラインＡ：最終グリオキサラーゼ　Ｉ活性：１１．６ｕｎｉｔ／ｍＬ）を１００μＭのＧＯまたはＭＧＯと３７℃で１時間インキュベートし、キノキサリン誘導体化後、ＨＰＬＣ分析した。ＧＳＨを含有しない反応混合物を対照とした。クローズドバーは野生型マウス、オープンバーはグリオキサラーゼ　Ｉトランスジェニックマウスの組織を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４】トランスジェニックラット心臓組織由来タンパク質抽出液のグリオキサラーゼ　Ｉ活性を示す図。
【図５】トランスジェニックラット腎臓組織由来タンパク質抽出液のグリオキサラーゼ　Ｉ活性を示す図。
【図６】トランスジェニックラット腹膜組織由来タンパク質抽出液のグリオキサラーゼ　Ｉ活性を示す図。
【図７】トランスジェニックラット心臓組織由来タンパク質抽出液のＧＯ消去能（Ａ）及びＭＧＯ消去能（Ｂ）を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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