(57)【要約】      （修正有）【課題】攪拌もしんとうもまた連続フローのようにポンプで反応溶液を循環させることなしに、ただ活性化反応溶液を、固相合成用レジンを充填した特殊なカラムに加え、自由落下で反応液を移動させるだけで所定のペプチドを合成しうる器具を提供する。【構成】本考案のカラムは、全長132mmのポリプロピレン製のチューブからなる。カラム本体１の先端の直径はΦ5.5で、直径は漸次減少し、先端から97mmの位置の直径がΦ3.5なるようなテーパ形状である。カラム本体内には、ポリアルキレン製のフィルター（細口径20μ）２が装填されており、該フィルター２の下流側に２本の突起３が備えてある。突起３は漏れ防止であるとともに、カラム受台の孔へ挿入したときの支持部材となる。【選択図】図１
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【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
テーパを有する細長形状のカラムであって、該カラム内に固相支持体や充填剤を装填し、該支持体の下流側に段差を設けてなる固相抽出・精製・合成用カラム。
【請求項２】
請求項１記載のカラムと、前記カラムを嵌合させる複数の孔を設けてなるカラム受台と、該カラム受台に設けられた減圧機構とを備えてなる固相抽出・固相充填剤を用いる分離精製・合成に用いる装置。
【請求項３】
カラム受台を蓋と容器本体で構成し、該蓋に複数孔を、容器本体に減圧機構を設けてなる請求項２記載の一括同時処理・固相合成装置。
【請求項４】
容器本体に透明窓を設けてなる請求項３記載の一括同時処理・固相合成装置。
【請求項５】
請求項１記載のカラムを、96ウエルマイクロタイタープレートに並列に並べてなる一括同時処理・固相合成装置。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、固相抽出・充填剤カラムを用いた分離精製・ペプチドや核酸を合成するための簡易な固相合成用カラム、及びそのカラムを用いた合成装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、ペプチドや核酸などは固相合成法装置で化学合成される。その場合、固相合成担体（通常ポリマービーズ＝レジン）と活性化したアシル成分の溶液とを混合し、固相担体にアシル成分を共有結合させる。アシル成分は通常過剰量を加え、効率よく固相担体のアミノ基をすべて当該アシル成分で結合させることで未反応のアミノ基をなくすことによって副反応による生成物の発生をおさえることができる。このため、通常合成反応では攪拌を十分にすることにより反応収率を上げることができる。このため効率よい攪拌機構は合成機のキーであり、このために多くの特許がなされている（特許文献１乃至３、非特許文献1乃至３）。
すでに広く知られているごとく、ペプチドの自動合成装置ではレジンのメカニカルな攪拌（しんとう、ボルテックッスミキシング、窒素などのガスバブリング、羽のような形状の物を用いる）と連続フロー合成と称するカラム内にレジンを詰めここに活性化したアシル成分溶液を流して反応を行う装置の２種が一般的であり、市販されてきた。
【特許文献１】特公平7-20546号
【特許文献２】特公平7-20980号
【特許文献３】実公平7-34910号
【非特許文献１】E. Atherton & R. C. Sheppard, Solid phase peptide synthesis, a practical approach, IRL Press, Oxford, UK  W.C. Chan & P. D. White, Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis Oxford, UK.
【非特許文献２】軒原清史他、島津評論  59巻No 1. 1993  ページ33〜43実用的多種品目自動ペプチド合成機PSSM-8の開発
【非特許文献３】K. Nokihara etal., American Laboratory 1994, 41-45, Large-scale continuous-flow peptide synthesis with solvent and acyl component recovery.
【考案の開示】
【考案が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の攪拌、しんとう、バブリングなどさせる装置では、例えば、バブリングにより試薬が固相合成用レジンを含む塊状物や膜状物を形成し、この塊状物などがバブリング時の圧により反応室を上昇して反応室外で壊れ、反応に関与する固相合成用レジンが散逸した。しかも、装置自体も大掛かりなものとなった。
考案者は鋭意研究の上、攪拌もしんとうもまた連続フローのようにポンプで反応溶液を循環させることなしに、ただ活性化反応溶液を、固相合成用レジンを充填した特殊なカラムに加え、自然落下で反応溶液を移動させるだけで所定のペプチドを合成しうる器具を開発した。省エネを実現でき、簡便であることから、少量多種品目の手動ペプチド合成に適している。反応溶液をただ単に添加することからきわめて多くの種類のペプチドを合成することができるため、ペプチドライブラリーの構築にとくに適している。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本考案は、上記課題を解決するため、テーパを有する細長形状のカラムであって、該カラム内に固相支持体や充填剤を装填し、該支持体の下流側に段差を設けてなる固相抽出・精製・合成用カラムを提供する。
本考案は、上記構成により、例えば、細いカラムに少量の固相支持体を充填し、活性化させたビルディングブロック溶液をカラム上方から添加し、自然落下によってペプチド結合生成反応が完結する装置となり、撹拌機能を持たない。
特別のバルブもなく単にカラム内を自然落下させることによって目的とする化合物が固相支持体上に形成される。
カラムは若干のテーパーを有する細長いもので、材質は各種有機溶媒に耐性であるポリプロピレンである。これは価格の点でも使い捨ての点でも好ましい。底部にポリアルキレン製のフィルターを有するが、フィルターの細口径は10-100ミクロンでよく、特に１０−３０ミクロンが好ましい。余り目が荒いと落下速度が早く合成効率は悪い。また粘ちょう性の反応溶液を用いるときはカラム底部を減圧にすることによって落下速度を早めることができる。落下速度は１秒間に一滴程度が好ましい。なお、固相担体の洗浄などの操作の場合は減圧などにより速度を早めることによって時間を短縮できる効率を上げることができる。
カラムの全長は、実験器具として立設できるように、例えば90〜150mm、望ましくは100〜15mmである。
【０００５】
本考案のカラムは、少量多種同時合成によるペプチドライブラリー構築に特に適している。合成中に保護ペプチドレジンがアグリゲーションを起こしたりし、反応収率が落ちる場合は、反応溶媒をDMSO（ジメチルスルホキサイド）：DMF（ジメチルホルムアミド）：NMP(Nメチルピロリドン)の混合溶媒を用いると反応効率が上がる。その混合比はたとえば１：２：２が好ましい。また反応溶液を４５℃程度の加温することでも反応効率があがる。これらは難ペプチド合成法として業界では広く知られている。
【０００６】
また、本考案は、複数のカラムを嵌合させる複数の孔を設けてなるカラム受台と、該カラム受台に設けられた減圧機構とを備えてなる固相抽出・固相充填剤を用いる分離精製・合成に用いる装置を提供する。
カラム受台は、例えば、アルマイト処理済のアルミ製の容器にて構成することができ、この容器は蓋と容器本体とからなる。蓋に複数の孔を設け、カラムを挿入する。容器本体に減圧機構を備える。さらに、容器本体に内部が見える透明窓をつけてもよい。孔は複数あれば特に限定されないが、多種品目同時合成、取り扱いなどの観点から４〜９６、好ましくは８〜９６である。
【０００７】
さらに、当該カラムを96本、市販の96ウエルマイクロタイタープレート状に並列に並べることによって、一括同時同一処理（例えば洗浄などの溶液を一括に加える）が行え、市販の深型96ウエルプレートを底部に配置することによって排出液を収集できる。この操作はたとえばクリーベイジ操作（固相担体からペプチドを切断する）の場合特に適している。これにより、合成物のカラムクラマト分離や洗浄作業が96本まで同時実施できる。
さらに、回収にHiPep社の96Well 対応Microtiter Plateの使用が可能、また市販のディープウエル等も使用できる。
固相抽出・充填剤カラムとして使用するときは、例えば、通常のLCの充填剤シリカゲルC18の他にアルミナ、珪藻土、スチレンジビニルベンゼン重合体、グラファイトカーボンなど抽出したいものによっていろいろ充填剤を選択することができる。
【考案を実施するための最良の形態】
【０００８】
本考案のカラム構成を図１に示す。図中１が中空円筒のカラム本体で、全長132mmのポリプロピレン製のチューブからなる。カラム本体１の先端の直径はΦ5.5で、直径は漸次減少し、先端から97mmの位置の直径がΦ3.5なるようなテーパ形状である。カラム本体１内には、ポリアルキレン製のフィルター（細口径20μ）２が装填されており、該フィルター２の下流側に２本の突起３が備えてある。突起３は漏れ防止であるとともに、後述するカラム受台の孔へ挿入したときの支持部材となる。
図１のカラムを固相合成装置として構成した例を図２に示す。
図２において、２１が９６（８×１２）穴の孔２５を設けてなるアルミ製（アルマイト処理済）の８角形の蓋で、２２が該蓋２１と嵌合する容器本体である。容器本体には複数の透明窓２３が設けてあり、内部の状態が監視できる。また、容器本体２２には開閉弁２４を備えた配管が備えてあり、その配管は図示しない減圧ポンプと接続している。合成に際しては、図２（ｄ）に示すようにピペット２６により試薬などを導入する。
なお、図２（ａ）〜（c）は、カラム１を１９本、孔２５に立設させた図で、図２（a）は蓋２１を外した図、（ｂ）は蓋２１と容器本体２２を組み立てた時の斜視図、（ｃ）は蓋２１と容器本体２２を組み立てた時の正面図である。
【実施例】
【０００９】
図２の固相合成装置を用いて以下のペプチドを合成した。
[合成例：トリペプチド  Tyr-His-Tyrの合成］：
カラムに5ｍｇの固相合成用レジンFmoc-Try(tBu)-Wang Resin(ノヴァバイオケム、スイス)を装填し、DMFで膨潤させた。ついで2％DBU  2％ピペリジンを1.2ｍL添加し約1分でカラム内を通過させた。当該操作を２回繰り返した。次にカラム内の樹脂をDMF1.2ｍLで５回洗浄した。
別途試験管内にFmoc-His(Trt)-OH  HOBt  PyBOP をそれぞれ 19.53mg  4.81mg  16.39mgずつ秤量し、DMF123μLに溶解した後NMM  47.3μLを添加し、軽く３０秒間ボルテックスミキサーで混合活性化した後カラムに添加した。自然落下によって全液が落下するまで放置し、カラムを同じくＤＭＦ1.2 mLで５回洗浄した。
【００１０】
次に2％DBU2％ピペリジンを1.2 ｍL添加し、約1分でカラム内を通過させた。カラムを同じくＤＭＦ1.2 mLで５回洗浄した後、Fmoc-Try(tBu)-OH HOBt  PyBOP をそれぞれ14.48 mg、16.39 mg、4.82 mgずつ秤量し、DMF 123 μLに溶解した後NMM 47.3 ｍL  を添加、軽く３０ 秒間ボルテックスミキサーで混合活性化した後カラムに添加した。自然落下によって全液が落下するまで放置し、カラムを同様にDMF 1.2 mLで５回洗浄した。
次に2％ DBU, 2％ピペリジンを1.2 ｍL添加し約1分でカラム内を通過させた。カラムを同じくＤＭＦ1.2 mLで５回洗浄した後、レジンをジクロルメタン、ついでターシャリブチルメチルエーテル各々1.2 mLで５回洗浄した。カラムごとレジンを減圧で乾燥した後、カラムを上記減圧ボックスにのせ、氷冷したクリーベイジカクテル（ 5 % 水, 5 %トリイソプロピルシラン入りトリフルオロ酢酸）を添加した。全体を少し揺らした後90分放置した。この間自然落下を防ぐために減圧ボックスを0.1気圧程度に加圧しておくのがこのましい。このため圧抜きとして96の穴の一カ所にはレジンのないカラムを装填した。
【００１１】
90分後減圧ボックスをダイアフラムポンプなどで減圧にして減圧ボックス内部に装填したタイタープレート内にカラム内のカクテルを集めた。レジンを少量のカクテルで洗い、洗い液を同じタイタープレートにあつめた。量の多いときはプレート内のカクテルを窒素気流の吹きつけなどで濃縮し、ここにジエチルエーテルを添加して目的とするペプチドを沈殿させる。沈殿は遠心によってプレートの底部にあつめ上清を除く。沈殿を同じくジエチルエーテルで５回洗浄した後沈殿を0.01N HCl 50％アセトニトリルで溶解し、凍結乾燥して目的とする粗ペプチドを収量約100 %で得た。
得られた粗ペプチドはHPLC質量分析装置で検定確認したところ高純度であった。
下記にそのクロマトグラムと主ピークの質量分析の結果を図３、４に示す。
分析条件は、次の通りである。
分析LCMS Data (iontrap Mass spec/positive mode)    Sequence: YHY
分析条件：カラムSynProPepRPC18 (4.6 id x 150 mm)
0.01N HCl/アセトニトリル  99/1−69/31 (30 min), 検出UV 210 nm
主ピーク  質量Found M+H  482.2  理論値M＝ 481.5（LCMS Data(iontrap Mass spec/positive mode)）であった。
【００１２】
つぎに、当該トリペプチドのライブラリーを構築するためそれぞれ１位２位３位をF,H,P,W,R,K,A,等で置換したトリペプチド群を９５種同時に合成した。合成操作は半日で完了した。一夜乾燥させた後上記と同様にクリーベイジを行い、95種のトリペプチドを得た。
その一部を以下に記す。
AB96(RT15/10)を用いたトリペプチドの同時合成
原料レジンは全て配列のC末端アミノ酸誘導体（Fmoc側鎖保護付きの）Wangレジン（スイスノヴァバイオケム社製）である。これら3.15マイクロモルを秤量し、当該反応用のチューブに充填した（表１）。  
【表１】
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ジメチルホルムアミド(DMF)：ジクロルメタン(DCM)＝1:1で膨潤させ、一夜放置してからペプチド固相合成反応に供した。アシル成分の導入（カップリング）開始前に、レジンをDMFで５回洗浄し、次に脱Fmoc反応を行った。すなわち、2%  DBU  2%  ピペリジンのDMF溶液1.2mLをカラムに添加し減圧で吸引した。本操作を２回繰り返した後、DMF1.2mL  で５回吸引しながら洗浄した。
アシル成分（アミノ酸誘導体、スイスノヴァバイオケム社製）は  各々31.5マイクロモル（10倍等量）を用いた。各アミノ酸誘導体は下記量（表２）を秤量し、1本あたり30μlのDMFに溶解しマイクロプレートに入れた。
【表２】
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【００１３】
カップリング試薬としてPyBOP（スイスノヴァバイオケム社製）、HOBｔ（スイスノヴァバイオケム社製）を用いた。すなわちPyBOP 16.4  [mg/coupling]を秤量 用事DMF30マイクロリットル相当に溶解した。HOBt・H2O  0.50  [mmol/mL  DMF]の濃度とし 63.0  [micro-L/coupling]  を使用した。NMM（N-メチルモルフォリン）1.00  [mmol/mL DMF]  とし、毎カップリングごとに 47.3  [micro-L/coupling]  添加して活性化した。なお一括合成では各ステップごとに（20反応の場合20本分を）まとめて秤量し溶解して分注して用いた。
【００１４】
アミノ酸の導入：アミノ酸溶液にPyBOP溶液、HOBt溶液、NMM溶液を加え、攪拌して活性化し、2.5分後、レジンを充填したカラムに添加し、自然落下で放置した。約10分自然落下で放置した後、DMF数滴を添加、さらにDMF 1.2 mLで5回軽い減圧下で洗浄した。脱Fmoc反応は同じく2%  DBU  2%  ピペリジンのDMF溶液を用いた。以下これまでの操作の繰り返しでペプチド鎖を伸長させた。最後に脱Ｆｍｏｃ、ついでレジンを良く洗浄した。洗浄はDMFに次いでジクロルメタンで５回、メタノールで５回、ｔブチルメチルエーテルで５回行い、レジンをデシケータ中オイルポンプによる減圧でレジンをカラムに充填したまま乾燥させた。定法に従い、保護ペプチドをレジンから切り離し同時に側鎖保護機を除去する操作を行った。用いたクリーベイジカクテルはペプチドのアミノ酸配列によって表３のごとく、Ａ，Ｂ，Ｃの３種類を用いた。
A  TFA:H2O:TIS=90:5:5  90分
B TFA:anisole:EDT+2-methylindol=94:3:3  90分
C TFA:H2O:thioanisole:EDT:EMS:Phenol=82:5:5:3:2:3  6時間
用いたカクテルの量はカラムあたり200マイクロリットルである。カクテル投入時カラム全体を軽く指でたたいてから放置した。窒素ガスを詰めた風船を減圧容器のノズルに取り付け微加圧として自然落下をできるだけ緩慢にした。所定の時間経過後カラムを減圧にしてペプチドが溶解しているカクテルを取り出し、レジンを150マイクロリットルのカクテルでとも洗いするため添加し同じく減圧で濾過し、先のカクテルと併せた。カクテルにジエチルエーテルを投入し沈殿を遠心分離し、減圧乾燥した後、得られた粗ペプチドを10 mM塩酸40%アセトニトリルで溶解し凍結乾燥して粗ペプチドを得た（表３）。
【００１５】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００１６】
本考案によれば、攪拌もしんとうもまた連続フローのようにポンプで反応溶液を循環させることなしに、ただ活性化反応溶液を、固相合成用レジンを充填した特殊なカラムに加え、自然落下で反応溶液を移動させるだけで所定のペプチドを合成できる。これにより、省エネを実現でき、簡便であることから、少量多種品目の手動ペプチド合成に適している。反応溶液をただ単に添加することからきわめて多くの種類のペプチドを合成することができるため、ペプチドライブラリーの構築に特に適している。さらに、固相抽出や分離精製など化合物ライブラリーを中心とした多種同時一括処理に適している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本考案に係るカラムの構成図
【図２】図１のカラムを装着し固相合成装置
【図３】得られた粗ペプチドのクロマトグラム
【図４】得られた粗ペプチドの主ピークの質量分析
【符号の説明】
【００１８】
１：カラム本体
２：ポリアルキレン製のフィルター
３：突起
２１：蓋
２２：容器本体
２３：透明窓
２４：開閉弁
２５：孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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