(57)【要約】【課題】水中の水不溶性懸濁微粒子を簡便に濃縮する方法と、下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子を安全、迅速、簡便に測定する方法を提供するる。【解決手段】水不溶性の高分子吸水ポリマーを水中に添加し、水分の一部を溶液重合によって得られた高分子吸水ポリマーに吸水させ、これを分離して水不溶性懸濁微粒子の濃度を高めること特徴とする水不溶性懸濁微粒子の濃縮方法、及び下水中のウイルス又は遺伝子を測定する方法であって、所定量の下水を採取して容器に入れること、容器中の下水に対して上記の高分子吸水ポリマーを添加して水分の一部を吸水させること、水分を吸水した高分子吸水ポリマーと濃縮下水を分離すること、分離された濃縮下水について、ＰＣＲ検査等によりウイルス又はこれに由来する遺伝子の量又は濃度を測定することを特徴とする測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中の水不溶性懸濁微粒子の濃縮法であって、水不溶性の溶液重合によって得られた高分子吸水ポリマーを水中に添加し、水分の一部を高分子吸水ポリマーに吸水させ、これを分離して水不溶性懸濁微粒子の濃度を高めることを特徴とする水不溶性懸濁微粒子の濃縮方法。
【請求項２】
水不溶性懸濁微粒子が、微生物、ウイルス又はこれらに由来する遺伝子である請求項１に記載の水不溶性懸濁微粒子の濃縮方法。
【請求項３】
下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子を測定する方法であって、所定量の下水を採取して容器に入れること、容器中の下水に対して水不溶性の溶液重合によって得られた高分子吸水ポリマーを添加して水分の一部を高分子吸水ポリマーに吸水させること、水分を吸水した高分子吸水ポリマーと濃縮下水を分離すること、分離された濃縮下水について、ＰＣＲ検査によりウイルス又はこれに由来する遺伝子の量又は濃度を測定することを特徴とする下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定方法。
【請求項４】
高分子吸水ポリマーが、ポリアクリル酸ナトリウム又はポリジメチルアミノプロピリアクリルアミドである請求項３に記載の下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定方法。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定に使用される高分子吸水ポリマーであって、吸水量が３０〜５００ｇ/ｇであることを特徴とする測定用の高分子吸水ポリマー。
【請求項６】
１６６メッシュより小さい粒径の粉末含有量が20％以下の粒状物である請求項５に記載の測定用の高分子吸水ポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水中の水不溶性懸濁微粒子の濃縮法であって、特に人畜に有害な微生物、ウイルス又はその遺伝子等を含む検水を採取現場で安全、迅速、簡便に濃縮する方法に関する。また、本発明は下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の濃度や量などを測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下水等の水中には、細菌やウイルスやこれらに由来する遺伝子が含まれており、その管理が必要であることが多い。また、感染症の原因となるウイルスについては、それが下水等の水中に入り込むことが多く、その濃度や量を測定することによりその感染症の流行の程度が予測できることが報告されている。
下水中のこれらの濃度や量を定期的に測定すれば、感染症の流行の程度が予測でき、適切な対策をとることができると期待されている。しかしながら、下水中のこれらの濃度や量は希薄又は少量であって、その分析や測定は困難である。
【０００３】
浄化槽汚泥、下水処理場汚泥、河底汚泥等には、細菌やウイルスやこれらに由来する遺伝子の集積が起こるため、この汚泥を採取して分析や測定を効果的に行うことができるが、汚泥が沈積するためには時間が必要なため、タイムリーな汚染調査ができないという欠点を有していた。
一方、下水道又は下水管を流れる下水を採取して遺伝子調査をすれば、タイムリーな汚染調査が可能となるが、上記のような問題があった。
【０００４】
水中の細菌やウイルスやこれらに由来する遺伝子の濃縮方法としては、遠心分離法、ミリポアフィルターを使用する方法、電気泳動法を利用する方法などが知られている。
また、生物体より血液等を採取し、その中の蛋白質成分を分析・同定することは広く行われている。この際、予め試料より水分及び蛋白質以外の低分子成分を分離除去し、蛋白質成分の濃度を高めておくことによって分析の感度・精度を高めることも知られている。蛋白質成分の濃度を高める方法として、ポリアクリル酸ソーダ架橋物からなる吸水ポリマーを使用することも知られている（特許文献１）。
【０００５】
特許文献2は、溶媒中に溶解された標的化合物を含む液体サンプル中の標的化合物を吸収体に接触させることによって濃縮するための方法として、高吸水ポリマーの使用を開示するが、吸水樹脂は蛋白分子と水分子を選別する能力を持たないことから、蛋白質の濃縮の目的に適用することはできないとし、更に粉末状態の吸水樹脂を使用すると吸水後のゲルは被検液より濾別する必要があり、その操作は煩雑となるとしている。
【０００６】
非特許文献１は、河川、下水等の水環境中のウイルスとその測定法についての論文であり、PCR法やリアルタイムPCR法を開示する。また、ウイルスの濃縮法についてもガーゼパッドを用いる方法や、MF膜を用いる方法や、ウイルスよりも孔径の小さいUF膜を用いる方法や、ガラスパウダー法、セルロース凝集法などがあることを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平07-18883号公報
【特許文献２】特開2013-543110号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ウイルス  第66巻  第2号，pp.163-170，2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、水中の水不溶性懸濁微粒子を安全、迅速、簡便に濃縮する方法を提供すること、及び下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子を安全、迅速、簡便に測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、水中の水不溶性懸濁微粒子の濃縮法であって、特定の高分子吸水ポリマーを水中に添加し、水分の一部を高分子吸水ポリマーに吸水させ、これを分離して水不溶性懸濁微粒子の濃度を高めることが可能であることを見出し、本発明に至った。
【００１１】
本発明は、水中の水不溶性懸濁微粒子の濃縮法であって、水不溶性の溶液重合によって得られた高分子吸水ポリマーを水中に添加し、水分の一部を高分子吸水ポリマーに吸水させ、これを分離して水不溶性懸濁微粒子の濃度を高めることを特徴とする水不溶性懸濁微粒子の濃縮方法である。
【００１２】
上記水不溶性懸濁微粒子としては、細菌のような微生物、ウイルス又はこれらに由来する遺伝子が挙げられる。
【００１３】
また、本発明は、下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子を測定する方法であって、所定量の下水を採取して容器に入れること、容器中の下水に対して水不溶性の溶液重合によって得られた高分子吸水ポリマーを添加して水分の一部を高分子吸水ポリマーに吸水させること、水分を吸水した高分子吸水ポリマーと濃縮下水を分離すること、分離された濃縮下水について、ＰＣＲ検査によりウイルス又はこれに由来する遺伝子の量又は濃度を測定することを特徴とする下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定方法である。
【００１４】
上記水不溶性懸濁微粒子の濃縮方法又は下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定方法において、使用される高分子吸水ポリマーとしては、ポリアクリル酸ナトリウム又はポリジメチルアミノプロピリアクリルアミドが好ましく挙げられる。また、高分子吸水ポリマーは吸水量が３０〜５００ｇ/ｇであることが好ましい。
【００１５】
また本発明は、上記下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定に使用される高分子吸水ポリマーであって、吸水量が３０〜５００ｇ/ｇであることを特徴とする測定用の高分子吸水ポリマーである。この測定用の高分子吸水ポリマーは、１６６メッシュより小さい粒径の粉末含有量が20％以下である粒状物であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の水不溶性懸濁微粒子の濃縮方法又は下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定方法によれば、安全、迅速、簡便、且つ正確に測定することが可能となる。特に、ウイルスによる感染症の流行をいち早く検知でき、効果的な対策を進めるための有力な指標を与えることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定方法では、本発明の水不溶性懸濁微粒子の濃縮方法を工程中に含むので、濃縮方法又は濃縮工程で使用される高分子吸水ポリマーは共通する。
【００１８】
本発明で使用する高分子吸水ポリマーとしては、ポリアクリル酸塩系、ポリビニルアルコール系、ポリアクリルアミド系、ポリオキシエチレン系、ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド系などが使用できるが、ポリアクリル酸塩系又はポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド系の高分子吸水ポリマーが好ましい。
高分子吸水ポリマーの製造方法としては、水溶液などの溶液中で行う溶液重合や、懸濁重合が一般的であるが、溶液重合の場合は、重合物を乾燥、破砕又は粉砕、分級や表面架橋などを経て製品とされる。本発明で使用する高分子吸水ポリマーは、溶液重合で得られたポリマーである。
【００１９】
高分子吸水ポリマーの吸水量は、脱イオン水に対して２０ｇ/ｇ以上であることがよく、３０〜５００ｇ/ｇであることが好ましい。食塩水に対しては、０．５wt％食塩水のとき、１０ｇ/ｇ以上であることがよく、１５〜１００ｇ/ｇであることが好ましい。
吸水量が過大であるものは、吸水後の樹脂表面に水中の遺伝子片等の微小粒子が吸着し易く、回収し難くなるため好ましくない。また、水を吸水させた後のポリマー表面のｐHは５．５〜７．５であることが好ましい。
本明細書において、高分子吸水ポリマーの吸水量というときは、特段の断りがない限り高分子吸水ポリマー１ｇに対する脱イオン水の吸水量（ｇ）をいう。
【００２０】
高分子吸水ポリマーがポリアクリル酸塩系である場合は、粉砕法で製造された不定形の粒子状のものが好ましく、懸濁重合法で製造した球状のものは、吸水時に水中の遺伝子等の微小粒子をその表面に吸着しやすく好ましくない。また、高分子吸水ポリマーの粉末を造粒成型したものは、吸水時に水中の遺伝子等の微小粒子を粒界に取込みながら吸水膨潤するため、本発明での使用には不適である。同様に、高分子吸水ポリマーの表面を非吸水性樹脂等でコーティングして吸水性能を調整した高分子吸水ポリマーも、吸水膨潤時に水中の遺伝子等の微小粒子を粒表面に吸着し易いためするため、本発明での使用には好ましくない。
適当な高分子吸水ポリマーは、水溶液重合法等により重合し、乾燥、粉砕又は破砕、分級して得られるものである。粉砕又は破砕品については、必要により表面架橋処理を行ってもよい。
【００２１】
高分子吸水ポリマーは、水不溶性で、一定粒径以上の微粒懸濁物は可及的に吸収しないことがよく、ウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定方法に使用する場合は、５０nm以上の微粒懸濁物を吸収しないことがよい。微粒懸濁物の吸収試験は、例えば、粒子の大きさが知られている着色剤を分散させた懸濁液に高分子吸水ポリマーを漬けることにより評価できる。高分子吸水ポリマーは、粉末状、粒子状、塊状等であることができるが嵩比重０．５〜０．７の粒子状であることがよい。
高分子吸水ポリマーは、後工程での固液分離のし易さを考慮した場合、その吸水前の粒度分布はその90％以上が、１８メッシュのフルイを通過し、１７０メッシュのフルイ上にとどまることが好ましく、より好ましくは、２０メッシュを通過し、１００メッシュ上にとどまることが好ましい。高分子吸水ポリマーの粒度が１６６メッシュのフルイを通過するものを２０重量％以上含む粉末状のものは、後工程での固液分離が困難となるため、推奨できない。平均粒径（D50）は１５０〜７１０μmの範囲がよい。
【００２２】
本発明の水不溶性懸濁微粒子の濃縮方法における水不溶性懸濁微粒子としては、細菌のような微生物、ウイルス又はこれらに由来する遺伝子又は遺伝子の断片があり、遺伝子としてはRNA又はDNAがある。
下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定方法におけるウイルス又はこれに由来する遺伝子としては、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、ノロウイルス等や、これらの遺伝子又は遺伝子の断片がある。
【００２３】
水不溶性懸濁微粒子を含む水又は水溶液としては、上記微粒子を含む水又は水溶液があり、具体的には下水、河川水、湖沼水、海水等がある。
下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の測定方法における下水としては、家庭廃水を流す下水管を流れる下水又は下水貯留槽の下水などがある。比較的広域のウイルス調査をする場合は、いくつかの支流の下水管が集合する本管又はその貯留槽の下水であることが適する。
【００２４】
下水の採取は、一定地点で、定期的に採取することが好ましい。容器は５００〜２０００mＬ程度がよい。容器に下水を入れた後、容器中の下水に対して高分子吸水ポリマーを添加して水分の一部を高分子吸水ポリマーに吸水させる。すなわち、一部は、例えば上記量を採取した場合、５〜１００ｍLは吸水させずに水分として残すことがよい。水分を吸水した高分子吸水ポリマーは固体状であるので、濃縮下水との分離は容易である。したがって、下水採取現場で、高分子吸水ポリマーを使用する濃縮を行い、試料としての濃縮下水だけを、分析装置のある試験室に送ることができる。
【００２５】
分離された濃縮下水は、懸濁微粒子濃度が増加した状態になっている。ウイルス等の懸濁微粒子の一部は、高分子吸水ポリマーの表面に付着したり、内部に取り込まれたりすることが考えられるが、これを洗浄等により、濃縮下水に戻してもよい。しかし、洗浄等をすると、濃度が低下するので、ウイルス等の絶対量を測定する必要がある場合を除き、分離された濃縮下水のまま次の工程に付すことが好ましい。いずれにしても、いくつかの検量線を用意することにより、分離された濃縮下水をそのまま次の工程に付したとしても、正確な遺伝子の量又は濃度を測定することが可能である。
【００２６】
濃縮下水中のウイルス又はこれに由来する遺伝子の量又は濃度の測定は、ウイルスの特徴的な遺伝子やたんぱく質を検出、測定又は増殖測定するなどの公知の測定方法が採用できるが、ＰＣＲ検査が適する。ＰＣＲ検査には、ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法等がある。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を、実施例によって具体的に説明するが、これらによって限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
模擬試験体として、ツバキ科植物のチャノキの枝葉を市販の磨砕機スーパーマスコロイダーMKCA6II（増幸産業株式会社製）を用いて数μｍサイズ以下に粉砕後、凍結真空乾燥を行い、植物体の遺伝子及び遺伝子片を含む粉体を作成し、これを模擬試験体とした。
高分子吸水性ポリマーとしてアクリル酸重合体部分ナトリウム塩架橋物からなる高吸水性樹脂TAISAP-BC388SDA（台湾塑膠工業有限公司社製）を使用した。この高分子吸水性ポリマーについて、純水に対する吸水量は６６７ｇ/ｇであり、０．５％NaCl溶液（ｐH６．０）に対する吸水量は６５ｇ/ｇであった。
水道水１０００ｍＬ中に、模擬試験体２００ｍｇを添加、混合して、試料水を作成した。高分子吸水性ポリマー２ｇを、目開き６０メッシュのステンレス網製袋状の１L容器に入れ、これを試料水に５分間浸漬させて、吸水後、高分子吸水性ポリマーの入ったステンレス網製袋を引上げたところ、試料水は４２０ｍLに濃縮されていた。
【００２９】
実施例２
高分子吸水性ポリマーを３ｇ使用した他は、実施例１と同様な実験を行ったところ、試料水は２０１ｍLに濃縮されていた。
【００３０】
実施例３
高分子吸水性ポリマーを４ｇ使用した他は、実施例１と同様な実験を行ったところ、試料水は３４ｍLに濃縮されていた。
【００３１】
実施例４
実施例３で得た濃縮試料水３４ｍLを凍結乾燥して残存物の重量を測定したところ、１８０ｍｇであった。当初の試料水中の固形物は２００ｍｇであることから、濃縮試料水からの固形物の回収率は９０．０％であった。また、実施例３で得た濃縮試料水３４ｍL中の固形物濃度は、５２９４ｍｇ／Lと計算され、当初の２６．５倍に濃縮されていた。
【００３２】
実施例５
水道水９９ｍL中にセイコーエプソン株式会社製インクジェットプリンター用染料タイプインキ、マゼンタ色（ICM70L；染料分子径１〜２nm）を１ｍL添加して試料水と作成した。
この試料水中に、実施例１で使用したと同じ高分子吸水性ポリマー２ｇを添加混合し、５分間吸水後、目開き６０メッシュのステンレス網製フルイでろ過して、ろ液の水量を測定したところ、２２ｍLであった。フルイ上に残った吸水後の高分子吸水性ポリマーについて観察したところ、内部に着色は認められず、試料水に含まれる染料分子はその大部分がろ液側に含まれることが認められた。ウイルス又はこれに由来する遺伝子の大きさは、１０nm程度以上であるから、これらは同様にろ液側に含まれることになる。
【００３３】
実施例６
高分子吸水性ポリマーとして、アクリル酸重合体部分ナトリウム塩架橋物からなる高吸水性樹脂サンフレッシュST500D8(三洋化成工業株式会社)２ｇを添加混合した他は、実施例５と同様な実験を行った。
ろ液の水量は４ｍLであった。フルイ上に残った吸水後の高分子吸水性ポリマーは、表面に極わずかの着色が認められたが、内部にほとんど着色は認められず、試料水に含まれる染料分子はその大部分がろ液側に含まれることが認められた。
【００３４】
実施例７
高分子吸水性ポリマーとしてアクリル酸重合体部分ナトリウム塩架橋物からなる高吸水性樹脂サンフレッシュSN-0484(三洋化成工業株式会社)２ｇを添加混合した他は、実施例５と同様な実験を行った。
ろ液の水量は１４ｍLであった。フルイ上に残った吸水後の高分子吸水性ポリマーは、表面にやや着色が認められたが、内部にほとんど着色は認められず、試料水に含まれる染料分子はその大部分がろ液側に含まれることが認められた。
【００３５】
実施例８
高分子吸水性ポリマーとしてアクリル酸重合体部分ナトリウム塩架橋物からなる高吸水性樹脂TAISAP-SK273（台湾塑膠工業有限公司社製）２ｇを添加混合した他は、実施例５と同様な実験を行った。
ろ液の水量は２０ｍLであったが、操作中にフルイの目詰まりが頻繁に発生し、固液分離作業は困難であった。この時、フルイ上に残った吸水後の高分子吸水性ポリマーは、表面にやや着色が認められたが、内部にほとんど着色は認められず、試料水に含まれる染料分子はその大部分がろ液側に含まれることが認められた。
【００３６】
比較例１
高分子吸水性ポリマーとしてアクリル酸重合体部分ナトリウム塩架橋物からなる高吸水性樹脂アクアキープ（住友精化株式会社製）２ｇを添加混合した他は、実施例５と同様な実験を行った。
ろ液の水量は１４ｍLであった。フルイ上に残った吸水後の高分子吸水性ポリマーは、表面に着色が認められ、試料水に含まれる染料分子の一部が高分子吸水性ポリマーの表面に吸着されることが認められた。
【００３７】
比較例２
高分子吸水性ポリマーとしてアクリル酸重合体部分ナトリウム塩架橋物からなる高吸水性樹脂アクアキープ（住友精化株式会社製）の粉末造粒加工品２ｇを添加混合した他は、実施例５と同様な実験を行った。
ろ液の水量は３０ｍLであった。この時、フルイ上に残った吸水後の高分子吸水性ポリマーは、内部に着色が認められ、試料水に含まれる染料分子の一部が高分子吸水性ポリマーの内部に取込まれることが認められた。
【００３８】
高分子吸水性ポリマーの性状及び結果を表1に示す。
製法において破砕型は、水溶液重合で得られたアクリル酸重合体部分ナトリウム塩架橋物を乾燥、破砕及び分級処理して得られた吸水ポリマーである。
粒度＜166は、166メッシュのフルイを通過する割合（ｗｔ％）である。
吸水量の単位はｇ/ｇである。
吸着性は、吸水ポリマーに吸着された染料の量であり、記号の意味は次のとおりである。
◎；殆どなし、〇；少ない（表面吸着あり）、△；やや多い（表面吸着）、
×；多い（表面吸着）、Ｚ；非常に多い（内部取込み）
【００３９】
【表１】
2022003311.tif 000002
【００４０】
懸濁重合法で製造した吸水ポリマーは、吸水前の粒子が突起を有する形状になっているため、その突起の間に染料の吸着が観察された。破砕タイプのものでも、表面を樹脂加工したものは吸着量が多くなることが認められた。