(57)【要約】【課題】放射線感受性を予測するための遺伝子マーカーおよびこれを用いて放射線感受性を予測する方法を提供する。【解決手段】本発明に係る遺伝子マーカーは放射線感受性を予測するための遺伝子マーカーであり、たとえばヒト染色体６ｑに由来する。とくに、この遺伝子マーカーはヒト染色体６ｑのフラグメントであるＴＡＫ１（トランスフォーミング成長因子ベータ活性化キナーゼ）遺伝子に由来する。たとえばこの遺伝子マーカーは、ＴＡＫ１遺伝子上の多形マーカーｒｓ２０５３４３もしくはｒｓ２２７３５６７からなる。【選択図】　　　図１
2004105054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線感受性を予測するための遺伝子マーカー。
【請求項２】
ヒト染色体６ｑに由来する請求項１記載の遺伝子マーカー。
【請求項３】
ＴＡＫ１（トランスフォーミング成長因子ベータ活性化キナーゼ）遺伝子に由来する請求項１もしくは２記載の遺伝子マーカー。
【請求項４】
ＴＡＫ１遺伝子上の多形マーカーｒｓ２０５３４３からなる請求項３記載の遺伝子マーカー。
ｒｓ２０５３４３：
５’
ｇｃａｇｔｃｃａｔｃ　ａｔａｔｇａａａｔｇ　ａａｇｇａａｔｔａａ　ａａｔｇｃａａａｔｇ　ｇｇｇａｃａｔｔａｔ　ｔｃａｔｔａｃｔｔｃ
ｃ／ｔ
ｔｇａｔｔａｔａａ　ｔｔｔｃａｔｇｇｇａ　ａｔａｇａｇａｔｇａ　ａａｇａａａａａｔｃ　ａａｇｔｃａａｔａｃ　ｔｃｔｔｃｃａａｔｃ　ｔ　３’（配列番号１）
【請求項５】
ＴＡＫ１遺伝子上の多形マーカーｒｓ２２７３５６７からなる請求項３記載の遺伝子マーカー。
ｒｓ２２７３５６７：
５’
ｔｔｔａａａａａａａ　ａａｔａｔａａｇａｃ　ａｃａｃａｃａａａａ　ａａｃｃｔｔｔｇａｃ　ａａｃｔｇａａａｃｔ　ａｃｃａｔｇｇｃｃａ
ａ／ｔ
ａａａｇｇｃｔｔａ　ｔａｔａｃａｔｔｔｔ　ｃａｃｔｃｔｔｃａｇ　ａｃｔｔｇｔａｇｔｔ　ｃｃｔｔｔｔｔａｃｃ　ｔｇｔｇｇｔｔｇｃｇ　ｇｃｇａｔｃｃｔａｇ　ｃｔｔｃｔａｔｔｔｃ　ａｇａ　３’　（配列番号２）
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の遺伝子マーカーの多形を利用して、対象者の塩基配列から放射線感受性を予測することを特徴とする放射線感受性の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子マーカーおよびこれを用いて放射線感受性を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
放射線に対する感受性にはかなりの個人差があると考えられる。したがって、治療目的で照射する場合等に簡易にそれを確認する手段があれば非常に有用である。このために、従来、照射治療しながら感受性を観察する方法、もしくは採取した少量の細胞に放射線を照射して感受性を観察する方法が採用されている。したがって、遺伝子レベルで放射線感受性を予測しうる遺伝子マーカーが望まれる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の課題を解決するために、放射線感受性を予測するための遺伝子マーカーおよびこれを用いて放射線感受性を予測する方法を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、放射線感受性を予測するための遺伝子マーカー、およびこの遺伝子マーカーの多形を利用して、対象者の塩基配列から放射線感受性を予測する方法にある。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る遺伝子マーカーは放射線感受性を予測するための遺伝子マーカーであり、たとえばヒト染色体６ｑに由来する遺伝子マーカーである。とくに、この遺伝子マーカーはヒト染色体６ｑのフラグメントであるＴＡＫ１（トランスフォーミング成長因子ベータ活性化キナーゼ）遺伝子に由来する。たとえばこの遺伝子マーカーは、ＴＡＫ１遺伝子上の多形マーカーｒｓ２０５３４３からなり、配列番号１に記載される塩基配列を有する。
【０００６】
ｒｓ２０５３４３：
５’
ｇｃａｇｔｃｃａｔｃ　ａｔａｔｇａａａｔｇ　ａａｇｇａａｔｔａａ　ａａｔｇｃａａａｔｇ　ｇｇｇａｃａｔｔａｔ　ｔｃａｔｔａｃｔｔｃ
ｃ／ｔ
ｔｇａｔｔａｔａａ　ｔｔｔｃａｔｇｇｇａ　ａｔａｇａｇａｔｇａ　ａａｇａａａａａｔｃ　ａａｇｔｃａａｔａｃ　ｔｃｔｔｃｃａａｔｃ　ｔ　３’（配列番号１）
さらに、たとえば、この遺伝子マーカーは、ＴＡＫ１遺伝子上の多形マーカーｒｓ２２７３５６７からなり、配列番号２に記載される塩基配列を有する。
ｒｓ２２７３５６７：
５’
ｔｔｔａａａａａａａ　ａａｔａｔａａｇａｃ　ａｃａｃａｃａａａａ　ａａｃｃｔｔｔｇａｃ　ａａｃｔｇａａａｃｔ　ａｃｃａｔｇｇｃｃａ
ａ／ｔ
ａａａｇｇｃｔｔａ　ｔａｔａｃａｔｔｔｔ　ｃａｃｔｃｔｔｃａｇ　ａｃｔｔｇｔａｇｔｔ　ｃｃｔｔｔｔｔａｃｃ　ｔｇｔｇｇｔｔｇｃｇ　ｇｃｇａｔｃｃｔａｇ　ｃｔｔｃｔａｔｔｔｃ　ａｇａ　３’　（配列番号２）
これらのｒｓ２０５３４３およびｒｓ２２７３５６７は、図１に示されるように８１４１２ｂｐのＴＡＫ１遺伝子上に存在する。
【０００７】
さらに、本発明に係る遺伝子マーカーはたとえばＴＡＫ１遺伝子の５’もしくは３’側に隣接する約１００ｋｂｐの配列に見出しうる。
【０００８】
本発明においては、このような遺伝子マーカーの多形を利用して、対象者の塩基配列から放射線感受性を予測しうる。
【０００９】
このような予測は次のようにして行われる。たとえば、ｒｓ２０５３４３において、対象者のＤＮＡを鋳型として、配列番号１に記載される塩基配列中の　ｃａｔｇｇｇａａｔａｇａｇａｔｇａａａ（配列番号３）（７４から９２番目）で示されるプライマーおよび　ｔｇｃａａａｔｇｇｇｇａｃａｔｔａｔｔｃ（配列番号４）（３３から５２番目）で示されるプライマー（相補鎖）を用いて、ＰＣＲ法により増幅し、ｇｇｇｇａｃａｔｔａ　ｔｔｃａｔｔａｃｔｔ　ｃ（４１から６０番目）（配列番号５）で示されるタイピングプライマーを用いて対象者が６１番目（ｃ／ｔ）にｃの配列を持つか、ｔの配列を持つかを検出する。ここで対象者がどの配列を持つかにより放射線感受性を予測しうる。すなわち、ｔの配列を持つ人はｃの配列を持つ人より放射線に対して抵抗性が大きいと判断されうる。
【００１０】
さらに、たとえばｒｓ２２７３５６７において、対象者のＤＮＡを鋳型として、配列番号２に記載される塩基配列中の　ｃｃｔｔｔｇａｃａａｃｔｇａａａｃｔａｃｃ（配列番号６）（３３から５３番目）で示されるプライマーおよびｃｃｔｔｔｔｔａｃｃｔｇｔｇｇｔｔｇｃｇ（配列番号７）（１０１から１２０番目）で示されるプライマー（相補鎖）を用いて、ＰＣＲ法により増幅し、ａａａｇｇｃｔｔａｔａｔａｃａｔｔｔｔｃａｃｔ（６２から８４番目）（配列番号８）で示されるタイピングプライマーを用いて対象者が６１番目（ａ／ｔ）にａの配列を持つか、ｔの配列を持つかを検出する。ここで、ｔの配列を持つ人はａの配列を持つ人より放射線に対して抵抗性が大きいと判断されうる。
【００１１】
上記の方法で使用されたリンカーは上述のものに限定されず、標的となる一本鎖ＤＮＡに特異的に結合し、ポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を開始できるようにする通常１５〜２５塩基長の短いヌクレオチドであれば特に制限されない。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００１３】
実施例１
放射線感受性を予測する遺伝子マーカー（ｒｓ２０５３４３，　ｒｓ２２７３５６７）の使用
１）　最終濃度１．５ｍｇ／ｍｌ　ＥＤＴＡを加え、凍結溶解したヒト血液からＤＮＡを抽出した。白血球を遠心処理により濃縮し、０．２％ＮａＣｌで洗浄を繰り返した。白血球を最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ／トリス緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、９０℃，１０分インキュベート、撹拌５分処理を５サイクル繰り返してタンパク質を分解後、酢酸カリウム、イソプロパノールを加える事によってＤＮＡを析出させた。遠心によってＤＮＡを回収し、１０　ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解した。ＤＮＡ濃度を１０μｇ／ｍｌに合わせて保存し、使用時に１０　ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを用いて２．５μｇ／ｍｌに希釈した。
２）　ＤＮＡの増幅は５μｌ中、２．５ｎｇ　ＤＮＡ，　プライマー１、２、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ　（Ｑｉａｇｅｎ　ＧｍｂＨ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む標準的な溶液中で行った。反応は９５度１５分の熱処理後、９５℃２０秒、５６℃３０秒、７２℃６０秒のサイクルを４５回繰り返し、最終的に７２℃５分処理して終了した。
ｒｓ２０５３４３
プライマー１　　５’−ｔｇｃａａａｔｇｇｇｇａｃａｔｔａｔｔｃ−３’　　（配列番号４）
プライマー２　　５’−ｔｔｔｃａｔｃｔｃｔａｔｔｃｃｃａｔｇ−３’　　　（配列番号９）
ｒｓ２２７３５６７
プライマー３　　５’−ｃｃｔｔｔｇａｃａａｃｔｇａａａｃｔａｃｃ−３’　（配列番号６）
プライマー４　　５’−ｃｇｃａａｃｃａｃａｇｇｔａａａａａｇｇ−３’　（配列番号１０）
３）　ｒｓ２０５３４３：　ＤＮＡの増幅産物にタイピング用プライマー　（５’−ｇｇｇｇａｃａｔｔａｔｔｃａｔｔａｃｔｔｃ−３’）　（配列番号１１）、ｄｄＡＴＰ，　ｄｄＣＴＰ、ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ　（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｎｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，　ＵＫ）を含む溶液を加え、９０℃２分の熱処理後９４℃５秒、４０℃５秒、７２℃２秒のサイクルを４０回繰り返した。タイピングプライマーの次にシトシンが取り込まれたかチミンが取り込まれたかを質量分析計により測定することによって多形部位の配列を検出した。
【００１４】
ｒｓ２２７３５６７：ＤＮＡの増幅産物にタイピング用プライマー　（５’−ａｇｔｇａａａａｔｇｔａｔａｔａａｇｃｃｔｔｔ−３’）　（配列番号１２）、ｄｄＴＴＰ、ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ　（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｎｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，　ＵＫ）を含む溶液を加え、９０℃２分の熱処理後９４℃５秒、４０℃５秒、７２℃２秒のサイクルを４０回繰り返した。タイピングプライマーの次にアデニンが取り込まれたかチミンが取り込まれたかを質量分析計により測定することによって多形部位の配列を検出した（配列は表示の相補鎖になっていることに注意）。
４）対象者４５人について、上述の多形部位の配列を検出した。その結果は、次のとおりであった。
【００１５】
2004105054.tif 000003
ｔの配列を持ついずれの３３人もｃもしくはａの配列を持つ人よりも放射線に対する抵抗性が強かった。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、放射線感受性を予測するための遺伝子マーカーおよびこれを用いて放射線感受性を予測する方法を提供しうる。
【００１７】
【配列表】
2004105054.tif 000004
2004105054.tif 000005
2004105054.tif 000006
2004105054.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】多形マーカーｒｓ２０５３４３およびｒｓ２２７３５６７のＴＡＫ１遺伝子上の位置を示す。
【図１】
2004105054.tif 000008