(57)【要約】      （修正有）【課題】年齢、唾液量に関係なく全ての人を検体対象とできるう蝕リスク検査方法を提供する。【解決手段】ＨＬＡ遺伝子群のクラスＩＩ型におけるＤＲＢ１の遺伝子型を同定し、予め確認してある、下記の式１から成るアミノ酸配列の合成タンパクを抗原とした場合に該抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価の大小から導き出されたう蝕リスクの高低に関わる遺伝子型と比較してう蝕のリスクを検査する。（式１）Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ａｌａ【効果】う触リスクの診断がより広く正確に行うことが可能であるため歯科診療に貢献する価値は非常に大なるものである。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ遺伝子群のクラスＩＩ型におけるＤＲＢ１＊の遺伝子型を同定することによりう蝕のリスクを検査することを特徴とするう蝕リスク検査方法。
【請求項２】
ＨＬＡ遺伝子群のクラスＩＩ型におけるＤＲＢ１＊の遺伝子型を同定し、予め確認してある、下記の式から成るアミノ酸配列の合成タンパクを抗原とした場合に該抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価の大小から導き出されたう蝕リスクの高低と比較する請求項１に記載のう蝕リスク検査方法。
【式１】
2004184266.tif 000003
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの遺伝子診断を利用してう蝕のリスクを判定する方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの口腔内に存在するミュータンス連鎖球菌の存在とう蝕の発生との間には密接な関係があることが知られており、例えば、Ａｎｄｅｒｓ  Ｔｈｙｌｓｔｒｕｐ  ａｎｄ  Ｏｌｅ  Ｆｅｊｅｒｓｋｏｖ，“Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｌｉｏｌｏｇｙ”（Ｄｅｎｍａｒｋ），  Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ社，  １９９６，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐ．４０５  など多くの研究が報告されている。ミュータンス連鎖球菌はヒトの唾液中に存在する菌種ではストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌス（以後、それぞれＳ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓと記す）の総称である。
【０００３】
唾液中に存在するミュータンス連鎖球菌の量が多いほど将来新たなう蝕が多く生じることから、唾液中のミュータンス連鎖球菌を簡易に定量する試みが数多く行われてきた。例えばＳ．ｍｕｔａｎｓに特異的に反応するモノクロ−ナル抗体を応用して定量しようとするものとして、特開平２−１７７８９８号公報や特開平１０−３６４００号公報で提案されている方法が、また簡易培養キットで増殖した菌体そのものを目視により定量するものとして米国特許５３７４５３８号公報で提案されている方法がある。しかし、唾液中のミュータンス連鎖球菌の量を測定することでう触のリスクを検査するには実際に口腔内にミュータンス連鎖球菌が存在することが必要であり、う蝕のリスクが高いと判断された時には既にう蝕になってしまっていることが多いという欠点があった。
【０００４】
一方、人によってミュータンス連鎖球菌の量の増加の仕方が異なっていることが解っており、この増加の仕方の差を予め知ることが可能となればミュータンス連鎖球菌の実際の増加や量と関係なくう触のリスクを知ることが可能となる。そこで、ミュータンス連鎖球菌の量を菌に感染する前にも測定できるう触リスクの検査方法として、特定の感染症に罹患しているか否かを判定するために用いる体内の特定の感染源に起因する抗体を調べることによる方法が注目されてきた。
【０００５】
ミュータンス連鎖球菌の一種であるＳ．ｍｕｔａｎｓの菌体表層物質の中で、分子量約１９万のＰＡｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｅｒｏｔｙｐｅ  Ｃ）と呼ばれるタンパク質抗原がミュータンス連鎖球菌の歯面への初期付着に関連があることがそれを抗原としたモノクローナル抗体を利用した研究から確認された。そして、ＰＡｃの中で純粋にミュータンス連鎖球菌の歯面への初期付着に関連がある部分を特定する研究が進められ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｒａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ”，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  （ＵＳＡ），  １９９１，  １４６，  ｐ．３３２−６や、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｉ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  （ＵＳＡ），  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔｓ，  １９９２，  ６０，  ｐ．６２３−６２９や、Ｏｋａｈａｓｈｉ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （ＵＳＡ），  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９９３，  ３，  ｐ．２２１−２２８などにより、ＰＡｃ中のα螺旋構造を持つＡ領域（アミノ酸配列：２１６−４６４の部分）がＳ．ｍｕｔａｎｓよる歯面上のコロニー化と接着に強い影響があることが確認され、更に進んでこのＰＡｃのＡ領域の中でより重要な配列が何であるかに関してを本発明者の一人である泉福等が解明したのである（例えば、非特許文献１参照）。その後、ＰＡｃのＡ領域の中で抗原としてヒトの免疫系に強く作用する配列は、Ｙ−−−Ｌ−−Ｙ（ヒトのＢ細胞エピトープ）、及びＬ−−Ｖ−Ｋ−−Ａ（ヒトの様々なＨＬＡ−ＤＲ分子と反応する部位）であることが確認され（例えば、非特許文献２，３参照）、この結果から、ＰＡｃの以下の特定アミノ酸配列〔ＮＡＫＡＴＹＥＡＡＬＫＱＹＥＡＤＬＡＡＶＫＫＡＮＡＡ（ＰＡｃ（３６１−３８６）〕が導き出された。その詳細は下式の通りである。
【式２】
Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ａｌａ
【０００６】
その結果、本発明者等はアミノ酸配列としてＰＡｃ（３６１−３８６）を抗原とし、ミュータンス連鎖球菌の歯面への付着を防ぐ機能となっている口腔粘膜から分泌される分泌型免疫グロブリン抗体Ａ（ｓＩｇＡ）の抗体価を測定すれば、う触リスクの検査が正確に行えることを究明した。
【０００７】
しかし、唾液に分泌されるＰＡｃ（３６１−３８６）に対する分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価を測定することは、免疫機能が完成されていない６歳程度までの乳幼児では検査することができず、また個人の唾液の分泌量の違いから唾液の量が多いヒトと少ないヒトでは測定する分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価を正確に反映することができなかった。更に、唾液分泌量が極度に少ない口腔乾燥症の患者や唾液の分泌が衰えた老人等にも対応できない欠点があった。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｓｅｎｐｕｋｕ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．“Ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＰＡｃ  ｗｉｔｈｈｕｍａｎ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  （ＵＳＡ），  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔｓ，  １９９５，  ６３  ｐ．４６９５−４７０３
【非特許文献２】
Ｓｅｎｐｕｋｕ  ｅｔ  ａｌ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＰＡｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （ＤＲＢ１＊０８０２，  ＊１１０１，  ＊１４０１  ａｎｄ  ＊１４０５）”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｎｇｌａｎｄ），  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９９８，  ９５，  ｐ．３２２−３３０
【非特許文献３】
Ｓｅｎｐｕｋｕ  ｅｔ  ａｌ．“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＭｏＡｂｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ”Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （Ｅｎｇｌａｎｄ），  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２００１，  ５４，  ｐ．１０９−１１６
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、年齢，唾液量に関係なく全ての人を検体対象とできるう蝕リスク検査方法を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討をした結果、年齢，唾液量に関係無くう蝕リスクを検査するために主要組織適合性遺伝子複合体（以下単にＭＨＣと言うことがある）に着目した。ＭＨＣは全ての高等脊椎動物の細胞で発現されているが、ヒトでは白血球で最初に実証されたのでヒト白血球付随抗原（ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）又はヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）と呼ばれている（以下単にＨＬＡと呼ぶことがある）。このＨＬＡ遺伝子群は、免疫系に非常に重要な役割があり、非自己を認識する抗原として機能していることが知られている。
【００１１】
前述のＰＡｃ（３６１−３８６）に対する抗体を分泌させる機構は、もちろん免疫系遺伝子に関連しているため、唾液中に分泌される分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価の違いはヒトの分泌型免疫グロブリン抗体Ａの分泌に関連する特定の遺伝子型により決定されている。従って、個人の遺伝子型を特定することによるう蝕のリスク検査は可能であり、う蝕のリスクの高低、つまりは唾液中に分泌される分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価の大小によるヒトの遺伝子型を予め特定しておけば、遺伝子を同定するだけで全てのヒトを対象可能なう蝕リスク検査方法とすることが可能であることを究明して本発明を完成したのである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
即ち本発明は、ＨＬＡ遺伝子群のクラスＩＩ型におけるＤＲ座のＤＲＢ１＊の遺伝子型を同定することによりう蝕のリスクを検査することを特徴とするう蝕リスク検査方法であり、より詳しくはＨＬＡ遺伝子群のクラスＩＩ型におけるＤＲＢ１＊の遺伝子型を同定し、予め確認してある、下記の式から成るアミノ酸配列の合成タンパクを抗原とした場合に該抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価の大小から導き出されたう蝕リスクの高低と比較するう蝕リスク検査方法である。
【式３】
Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ａｌａ
【００１３】
ＨＬＡ遺伝子群にはクラスＩ型とクラスＩＩ型とがあり、全体の分子構造は酷似している。両者とも、膜貫通型のヘテロ二量体で細胞外に出たアミノ酸末端ドメインにＴ細胞に提示する抗原が結合する。クラスＩＩ型はＢ細胞や抗原提示細胞等の限られた細胞に存在し、Ｔ細胞を通じてＢ細胞による抗体産生を促進する機構等がある。本発明では特にＨＬＡ遺伝子群のクラスＩＩ型の遺伝子群を利用するのである。クラスＩＩ型のＨＬＡは、ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＱ，ＤＰ等の種類があることが知られており、更にα１、α２、β１、β２の４つのドメインから構成されている。ＨＬＡは第６染色体短腕上のＨＬＡ遺伝子により規定されており、高度の多型性がある。特にクラスＩＩ型のＤＲ遺伝子のβ鎖（ＤＲＢ１，ＤＲＢ３，ＤＲＢ４，ＤＲＢ５）はより多型性に富むことが知られており、近年、各種疾病とこれらの多型性遺伝子型とに相関があることが知られている。
【００１４】
本発明に係るう蝕リスク検査方法は、先ず被験者の細胞を採取し、そのＤＮＡを抽出して第６染色体短腕上のＨＬＡ遺伝子群を特定する。特定されたＨＬＡ遺伝子群と予め調査により作製されたＰＡｃ（３６１−３８６）に対する唾液中に分泌される分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価の高かった（又は低かった）ＨＬＡ遺伝子群との比較によりう蝕リスクを評価するのである。
【００１５】
ＨＬＡ遺伝子群はヒトの全ての細胞に存在するため、サンプルとしてはヒトのどの部位の細胞を用いてもよい。その中でも歯科医の診療室で簡便にう蝕リスクを調べるためには、最も採取し易いサンプルであるヒトの口腔粘膜細胞を用いることが好ましい。口腔粘膜細胞の採取はスプーンで掻くなどの方法で採取すればよい。
【００１６】
採取した細胞からのＤＮＡの抽出方法としては、動物細胞からＤＮＡを抽出する一般的な方法が使用可能である。例えば、フェノールクロロホルム法が好ましく各種市販のキットを利用できる。
【００１７】
遺伝子型の特定方法としては、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）や、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＣＲ−ＳＳＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｉｎｇ）等が利用できる。しかし、本発明に係るう蝕リスク検査方法で用いられる遺伝子の特定法は、上記以外にも適切な方法があれば何れも使用可能である。
【００１８】
特定されたＨＬＡ遺伝子群と予め調査により作製されたＰＡｃ（３６１−３８６）に対する唾液中に分泌される分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価の高かった（又は低かった）ＨＬＡ遺伝子群との比較によりう蝕リスクを評価する。例えば、現在確認されている遺伝子型において、う蝕リスクが高い、即ち、分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価が低い遺伝子型としては、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０８０３、ＤＲＢ１＊１３０２、ＤＲＢ１＊１５０２、ＤＲＢ１＊０４１０を二量体の一方に持つ場合が、またう蝕リスクが低い、即ち、分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価が高い遺伝子型としては、ＤＲＢ１＊０４０３、ＤＲＢ１＊０４０６、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０８０２、ＤＲＢ１＊０９０１、ＤＲＢ１＊１２０２、ＤＲＢ１＊１４０１、ＤＲＢ１＊１４０５、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ１＊１６０２を二量体の一方に持つ場合が確認されている。なお、今後の研究によって全ての二量体の組合せが解明されれば、より正確な評価で行うことができるようになる。
【００１９】
本発明に利用するＰＡｃ（３６１−３８６）を得るためには、このアミノ酸配列を得ることができる手法であれば特に限定されないが、一般的にはアミノ酸シンセサイザーを用いるのが便利である。
【００２０】
本発明に係るう蝕リスク検査方法で利用する分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価の測定方法は、ミュータンス連鎖球菌に対する抗体価測定法の一つである酵素抗体法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ；以下ＥＬＩＳＡと記す）を用いても十分実用可能な感度が得られるが、抗原抗体反応で得られる測定値の感度向上のために一般的に用いられる技術、例えば、唾液中の分泌型免疫グロブリンＡを一旦ビオチン化抗ヒト免疫グロブリンなどと反応させ定量時の測定感度を増すこともでき、一般的な抗原抗体反応に基づく手法がそのまま応用できる。その他に、イムノクロマト，イムノコンセントレ−ション，ラテックス凝集法などがいずれも好適に使用できる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明に係るう蝕リスク検査方法の実施例を示し具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、特に記述がない限り操作は室温で行い、ｐＨは２０〜２５℃における値を示す。タンパク量は２８０ｎｍの吸光度からその濃度を算出した。
【００２２】
＜実施例１＞
＜細胞の採取方法＞
スワブ（製品名：Ｃ．Ｅ．Ｐ．スワブ，ライフテックオリエンタル株式会社製）を使って口腔内の頬の一部を擦って口腔粘膜細胞を採取した。採取後直ぐにＤＮＡの抽出作業を行った。
【００２３】
＜口腔粘膜細胞からのＤＮＡ抽出＞
採取した口腔粘膜細胞は、５００μＬのＤＮＡｚｏｌ試薬（ライフテックオリエンタル株式会社製）が添加してある１．５ｍＬチューブに添加した後、ホモジナイズしてエタノール沈澱・洗浄を行い、ＤＮＡを抽出した。吸光度Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍでＤＮＡ濃度を、Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍ／Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍで抽出純度を確認した。抽出したＤＮＡはＴＥバッファー〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１０ｍＭ，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）：１ｍＭ，ｐＨ８．０〕に懸濁し、以下の操作を行った。
【００２４】
＜ＤＲＢ１＊遺伝子型の決定＞
Ｔｒｅｊａｕｔ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．の“ＰＣＲ−ＲＦＬＰ  ｔｙｐｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｓ  ｎｅｗ  ＨＬＡ−ＤＲＢ１  ａｌｌｅｌｅｓ  ：  ＤＲＢ１＊１３０２２，  ＤＲＢ１＊１３３６  ａｎｄ  ＤＲＢ１＊１４３５”（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２８，  ４４１−４４７）に順じて以下のＰＣＲ−ＲＦＬＰを用いて行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
上記精製ＤＮＡ                    ：１００〜５００ｎｇ
ＭｇＣｌ２                          ：１．５ｍＭ
ｄＮＴＰｓ                        ：４０μＭ
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）  ：３重量％
下記のプライマー                  ：５０ｐＭ
ＡｍｐｌｉＴａｑ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）：１  ｕｎｉｔ
上記全てを混和し、合計５０μＬに調整した。
【００２５】
プライマーには、
ＤＲ３（５’ｃａｃｇｔｔｔｃｔｔｇｇａｇｔａｃｔｃ  ３’）  （Ｈｏｒｎｅ  ＆  Ｋｅｏｗｎ  ，１９９３）
ＡｍｐＢ（５’ｃｃｇｃｔｇｃａｃｔｇｔｇａａｇｃｔｃｔ  ３’）  （Ｋｉｍｕｒａ  ＆  Ｓａｓａｚｕｋｉ，  １９９２）
をＤＲＢ１＊０３，０８，１１，１２，１３，１４に用いた。増幅後はエクソン２から２６６ｂｐの増幅断片を得ることができる。なお、ＤＲＢ１＊１１２２，１４１０に関しては、５’側のプライマーＤＲ３に代えてＤＲ４−ｌｉｋｅを使用し、同様にＤＲＢ１＊１１３０にはＤＲ４−ｌｉｋｅを使用した（Ｍａｒｓｈ，  Ｓ．Ｇ．Ｅ．，  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｒｅｇｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １９９８，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ：  ５１，  ４６７−５０７参照）。
【００２６】
調整したサンプルをサーマルサイクラー（商品名：ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  サーマルサイクラー，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて特定遺伝子配列を増幅させた。サーマルサイクラーのプログラムは、９５℃で２分の後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０回繰り返し行い、その後、７２℃で１０分の操作を行った。この増幅配列の確認には、上記ＰＣＲ産物５μＬを２％、１×ＴＡＥ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：０．０４Ｍ、アセテート：０．０４Ｍ、ＥＤＴＡ：０．００１Ｍ）に０．２μｇ／ｍＬのエチレンブロマイドを含むアガロースゲルを電気泳動装置（製品名：ミューピッド２，コスモバイオ社製）を用いて電気泳動させた。電気泳動産物はＵＶ−トランスイルミネーター（フナコシ製）を用いて増幅産物を確認した。
【００２７】
＜制限酵素処理＞
電気泳動後、制限酵素処理を行った。即ち、ＢｓｅＲＩ（４ｕｎｉｔ），ＢｓａＪＩ（３ｕｎｉｔ），ＲｓａＩ（５ｕｎｉｔ），  Ｓａｕ９６Ｉ（５ｕｎｉｔ）（全て、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いた。制限酵素処理は、ＰＣＲ産物１０μＬに１×緩衝液（酵素と一緒に提供されている）を用いて上記酵素、精製水を使用して３７℃で一晩処理した。但し、ＢｓａＪＩのみ、６０℃一晩の処理で行った。前記制限処理サンプルは１×ＴＢＥ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：０．０８９Ｍ、ホウ素：０．０８９Ｍ、ＥＤＴＡ：０．０２Ｍ）で調整した１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて５００Ｖで１時間の条件で電気泳動を行った。電気泳動にはサイズマーカーとして、１００ｂｐＤＮＡ（宝酒造社製）を１レーンに流し、電気泳動産物の確認に使用した。電気泳動後、ゲルをガラス版から外し、０．８μｇ／ｍＬエチジウムブロマイドを１×ＴＢＥに溶解したものに数時間浸漬することで染色した。ゲルの確認はＵＶ−トランスイルミナーター（フナコシ社製）とゲル撮影機（商品名：フナロイドカメラＦＲ６０００，フナコシ社製）を用いて写真を撮影し確認した。
【００２８】
＜ＤＲＢ１配列の決定＞
ＤＲＢ１遺伝子型の決定は前述の方法に順じた。
【００２９】
＜ＥＬＩＳＡによる唾液分泌抗体の測定＞
（１）ＰＡｃ（３６１−３８６）の合成
ＰＡｃ（３６１−３８６）のアミノ酸配列を持つペプチドをステップワイスの固相ペプチド合成法から得た。合成器には、Ｍｏｄｅｌ  ３５０  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（製品名：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ社製）を使用し、ＴＳＫ−ＧＥＬカラム（３０×１）を用いた逆相の高速液体クロマトグラフィー法（１０〜４５％アセトニトリルをカラムとし、グラジエントに０．１％ＴＦＡを使用）にて合成ペプチドの確認を行った。最終精製度は９５％以上であった。
【００３０】
（２）唾液分泌抗体の測定
Ａ）抗体の固相化
前記の方法で合成したＰＡｃ（３６１−３８６）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、９６穴マイクロプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ社製）の各ｗｅｌｌに１００μＬになるように添加した。これを４℃で一晩静置しＰＡｃ（３６１−３８６）とｗｅｌｌとを結合させた。
【００３１】
Ｂ）ブロッキング
前記の方法で固相化したマイクロプレートをマイクロプレートウオッシャー（製品名：Ｍｏｄｅｌ  １５７５，バイオラット社製）を用いＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｐＨ７．４）に０．１重量％の中性界面活性剤（商品名：ＴＷＥＥＮ２０，ＳＩＧＭＡ社製）を含有させた液（以下、ＰＢＳＴと言う）にて３回洗浄を行う。洗浄後、１％スキムミルク含有ＰＢＳをｗｅｌｌ当たり２００μＬ注入し１時間３７℃でブロッキングを行った。ブロッキング後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、余計なブロッキング剤を洗浄した。
【００３２】
Ｃ）唾液の調整
パラフィンワックスを３分間噛むことにより分泌される刺激唾液を検体とした。唾液検体は回収後、測定開始まで氷中保存した。実験には、唾液を０．５％スキムミルク含有ＰＢＳＴで２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４倍に希釈したものを作製し、上記のプレートに各１００μＬ添加した。添加後、３７℃で１時間静置した後、ＰＢＳＴで洗浄した。
【００３３】
Ｄ）標識抗体
アルカリフォスファターゼ標識された抗ヒトＩｇＡ抗体（商品名：Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ−ＩｇＡ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を０．５重量％スキムミルク含有ＰＢＳＴにて０．３μｇ／ｍＬに調整し、各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、１時間３７℃で反応させた。
【００３４】
Ｅ）発色
ＰＢＳＴにて洗浄後、アルカリフォスファターゼの発色基質であるＰ−ニトロフェノールリン酸二ナトリウム６水和物０．１重量％含有ジエタノールアミンバッファーを各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、３７℃で３０分間静置した後、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表１に示す。なお、ジエタノールアミンバッファーは以下の処方で調整した。
ジエタノールアミン      ４８．５ｍＬ
ＭｇＣＬ２・６Ｈ２Ｏ      ５０．０ｍｇ
Ｎａ３Ｎ                １００ｍｇ
Ｈ２Ｏ                  ４００ｍｍＬ
最終ｐＨ９．８に調整後、水を加えて５００ｍＬとした。
【００３５】
５人の被験者（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）の唾液中の免疫グロブリンＡのＰＡｃ（３６１−３８６）に対する抗体価をＥＬＩＳＡで計測し、その結果を図１に示した。その結果、抗体価が高いグループ（この場合はＡ，Ｃ，Ｅ）と低いグループ（この場合はＢ，Ｄ）の２つのグループに分けた。なお、口腔内の実際のミュータンス連鎖球菌の量と抗体価の高低によるグループ間においてう触リスク検査方法の精度は確認されている。
【００３６】
前述の被験者（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）の口腔粘膜細胞から前述の方法により各人のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊遺伝子型を同定し、唾液中の分泌型免疫グロブリンＡのＰＡｃ（３６１−３８６）に対する抗体価との関係を確認しておく。その結果を表１に示す。このような条件の設定により予め複数の被験者をサンプルとして前述の抗体価が高いグループ（Ａ，Ｃ，Ｅ）と低いグループ（Ｂ，Ｄ）の２つのグループにそれぞれに対応する遺伝子型を確認しておく。なお、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊遺伝子型と抗体価に相関があることは確認されている。
【００３７】
【表１】
2004184266.tif 000002
【００３８】
実際のう蝕リスクの検査方法は、前述のように予め確認してあるＰＡｃ（３６１−３８６）を抗原とした場合にその抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価の大小から導き出されたう蝕リスクの高低に関する遺伝子型と、被験者から同定された遺伝子型を比較しう蝕リスクを導き出すのである。
【００３９】
【発明の効果】
以上に詳述したように本発明に係るう触リスク検査方法は、遺伝子から診断できるため従来の免疫的な方法と比較して年齢、唾液量に関係なく全ての人を検体対象とできるう蝕リスク検査方法であり、本発明方法によりう蝕リスクの診断がより広く正確に行うことが可能であるため歯科医療に貢献する価値は非常に大なるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】５人の被験者（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）の唾液中の免疫グロブリンＡのＰＡｃ（３６１−３８６）に対する抗体価をＥＬＩＳＡで計測した結果を示す図である。
【図１】
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