(57)【要約】【課題】新規なハロペルオキシダーゼを単離し、抗菌活性のほか様々な生理活性を有するハロゲン化有機化合物の効率的に生産手段を提供する。【解決手段】シュードモナス・プチダが得られ、分子量約３０ｋＤａで、グリシン・セリンモチーフを持つハロペルオキシダーゼ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
【請求項４】
請求項３記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地で培養し、得られる培養物から請求項２記載のタンパク質を回収することを特徴とするハロペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項５】
過酸化水素の存在下、請求項３記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を有機化合物とともに培養することを特徴とするハロゲン化化合物又は酸化化合物の生産方法。
【請求項６】
過酸化水素の存在下、請求項２記載のタンパク質を有機化合物に作用させることを特徴とするハロゲン化化合物又は酸化化合物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なハロペルオキシダーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該酵素の製造方法及び該酵素によりハロゲン化化合物又は酸化化合物を生産する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ハロペルオキシダーゼは、過酸化水素に依存して、有機物質にハロゲンを導入する反応を触媒する酵素である。ハロペルオキシダーゼは、自然界に広く存在すると考えられ、自然界において有機物質にハロゲンを導入する反応の殆どはハロペルオキシダーゼによって起こることが知られている。
【０００３】
これまでに、細菌（非特許文献１及び２）、菌類（非特許文献３）、藻類（特許文献１）等の生物からハロペルオキシダーゼが単離され、機能解析が進められている。
【０００４】
細菌においては、クロラムフェニコール、ピロールニトリン等の有機ハロゲン抗生物質の生産菌にハロペルオキシダーゼが検出され、これらの抗生物質の生産にハロペルオキシダーゼが関与していると考えられている（Ｋ−Ｈ．  ｖａｎ  Ｐｅｅ，  ａｎｄ  Ｆ．  ｌｉｇｅｎｓ：  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  １７３，  ５  （１９８４））。また、海洋環境中には、ブロモフェノール類やハロゲン化テルペン類等多種類のハロゲン化合物が含まれているが、これらの物質の多くは、藻類がハロペルオキシダーゼを利用して生産していると考えられている。ハロゲン化合物は抗菌活性が強いため、藻類は、これらのハロゲン化合物を自己防衛物質や忌避物質として利用していると考えられるが、最近なってアレロパシー物質としての機能を有している可能性も見出されつつある。また、最近、ブロモメタンがウニやアワビ等の海洋性食動物幼生の着底、変態を誘起する現象も確認されている（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｋ．，  Ｋｕｒａｔａ．  Ｋ．，  Ｍａｒｕｚｏｉ，  Ｔ．，  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｍ．：  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉ．，  ６０，  ７９５−７９６  （１９９４））。細菌や菌類においては、農薬の分解にもハロペルオキシダーゼが関与していると考えられており、農薬耐性菌の出現や自然界で農薬の消長との関連が注目される（非特許文献１及び２）。
【０００５】
このように、ハロペルオキシダーゼは、自然界において、産業的にも利用可能な様々な生理活性を有する化合物の合成に関与しており、人工的な有用物質合成の分野への応用が期待されている酵素である。これまでに幾つかのハロペルオキシダーゼが単離され、研究されているが、ハロペルオキシダーゼの触媒作用を利用した工業的な物質生産は、未だ実用化には至っていない。ハロペルオキシダーゼが工業的に利用されるためには、さらに多くの種類のハロペルオキシダーゼが単離され、機能解析が行われる必要がある。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１０−２４８５８１号公報
【０００７】
【非特許文献１】
Ａｄｉｎｄａ  ｄｅ  ｓｃｈｒｉｊｖｅｒ，  Ｉｓｔｖａｎ  Ｎａｇｙ，  Ｇｅｅｒｔ  Ｓｃｈｏｏｆｓ，  Ｐａｕｌ  Ｐｒｏｏｓｔ，  Ｊｏｓ  Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ，  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ｐｅｅ，  ａｎｄ  Ｒｅｎｅ  ｄｅ  Ｍｏｔ，  Ｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｏｎｈｅｍｅ  ｈａｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｏｆ  Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＮＩ８６／２１．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６３：  １９１１−１９１６  （１９９７）．
【０００８】
【非特許文献２】
Ｎｏｂｕｙａ  Ｉｔｏｈ，  Ｔａｋａｆｕｍｉ  Ｋａｗａｎａｍｉ，  Ｊｉ−Ｑｕａｎ  Ｌｉｕ，  Ｔｏｈｒｕ  Ｄａｉｒｉ，  Ｍａｓａｏ  Ｍｉｙａｋｏｓｈｉ，  Ｃｈｉｇｕｓａ  Ｎｉｔｔａ，  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｏ  Ｋｉｍｏｔｏ，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏ２＋−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｒｏｍｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｅｓｔｅｒａｓｅ  （ｐｅｒｈｙｄｒｏｌａｓｅ）  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＩＦ−３  ｓｔｒａｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １５４５：  ５３−６６  （２００１）．
【０００９】
【非特許文献３】
Ｎｕｒｉｔ  Ｂａｒ−Ｎｕｎ，  Ｓｉｇａｌ  Ｓｈｃｏｌｎｉｃｋ，  ａｎｄ  Ａｌｆｒｅｄ  Ｍ．  Ｍａｙｅｒ，  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｖａｎａｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈａｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  ２１７：  １２１−１２４  （２００２）．
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、有用物質の生産、及びハロペルオキシダーゼを用いた有用物質生産の実用化研究に役立つ新規ハロペルオキシダーゼを提供することにある。さらに、本発明は、遺伝子工学的手法により、該ハロペルオキシダーゼを生産する方法を提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）から単離された核酸断片が、新規なハロペルオキシダーゼをコードする遺伝子であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（６）を提供するものである。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（３）（１）の遺伝子を含有する発現ベクター。
（４）（３）の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地で培養し、得られる培養物から（２）のタンパク質を回収することを特徴とするハロペルオキシダーゼの製造方法。
（５）過酸化水素の存在下、（３）の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を有機化合物とともに培養することを特徴とするハロゲン化化合物又は酸化化合物の生産方法。
（６）過酸化水素の存在下、（２）のタンパク質を有機化合物に作用させることを特徴とするハロゲン化化合物又は酸化化合物の生産方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ハロペルオキシダーゼをコードする遺伝子
本発明で提供されるハロペルオキシダーゼ遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするものである。
（ａ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００１４】
（ａ）のタンパク質は、シュードモナス・プチダ  ＡＴＣＣ１１１７２株又はＡＴＣＣ１２６３３株に存在するハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質はシュードモナス・プチダ  ＡＴＣＣ１１１７２株に存在するものであり、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質はシュードモナス・プチダ  ＡＴＣＣ１２６３３株に存在するものである。
【００１５】
（ｂ）のタンパク質は、（ａ）のタンパク質に、ハロペルオキシダーゼ活性を失わせない程度のアミノ酸変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０，  ６４８７−６５００，  １９８２）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、ハロペルオキシダーゼ活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは１０アミノ酸以内であり、更に好ましくは５アミノ酸以内である。
【００１６】
なお、ハロペルオキシダーゼ活性とは、過酸化水素の存在下において、有機化合物にハロゲンが導入される反応を触媒する作用のことをいう。この反応は、一般的には、以下の化学式で表すことができる。
ＡＨ  ＋  ＸＯＨ  →  ＡＸ  ＋  Ｈ２Ｏ
（式中、Ａは有機化合物、Ｘはハロゲン原子を表す）
【００１７】
本発明の遺伝子は、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列の情報に基づき、一般的な工学的手法により製造することができる。例えば、本発明の遺伝子は、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１１１７２株又はＡＴＣＣ１２６３３株から抽出したＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型とし、配列番号１又は２記載のアミノ酸配列に基づいて設計されたプライマーを用いて核酸増幅反応を行うことにより得ることができる。また、プライマーには、配列番号５及び６に記載された塩基配列の一部又は全部を用いることもできる。プライマーの長さは特に限定されないが、通常１０塩基以上であり、好ましくは１６〜５０塩基であり、更に好ましくは２０〜３０塩基である。
【００１８】
核酸増幅の手法についても、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を挙げることができる。
【００１９】
また、本発明の遺伝子は、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１１１７２株又はＡＴＣＣ１２６３３株のＤＮＡ又はｍＲＮＡより作製されたＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから得ることもできる。ライブラリーの作製は、市販のライブラリー作製キット等を使用した一般的な方法により行うことができる。
【００２０】
ライブラリーから本発明の遺伝子を単離するためのスクリーニング方法は、特に限定されず、従来知られた公知の方法によって行うことができる。例えば、配列番号１又は２記載のアミノ酸配列に基づいてプローブを作製し、プラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーションを行うことによって、本発明の遺伝子を含有するクローンを選択することができる。また本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた免疫化学的スクリーニングによっても、本発明の遺伝子を含有するクローンを選択することは可能である。本発明の遺伝子は、上記のスクリーニング法によって選択されたクローンからＤＮＡを抽出することによって得ることができる。
【００２１】
なお、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１１１７２株又はＡＴＣＣ１２６３３株は、ＡＴＣＣより入手することができる。
【００２２】
上記のような方法によって得られたＤＮＡ断片は、公知の方法に従って塩基配列を決定し、本発明の遺伝子であることを確認する。塩基配列決定方法としては、例えば、チェーンターミネーター法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ７４，  ５４６３−５４６７  （１９７７））、マキサム−ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６５，  ４９９  （１９８０））等が挙げられるが、市販のシークエンスキットを利用すれば簡便に行うことができる。
【００２３】
２．ハロペルオキシダーゼの製造法
本発明で提供されるハロペルオキシダーゼは、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１又は２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００２４】
本発明のハロペルオキシダーゼは、配列番号１又は２からなるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、培地で培養することによって得ることができる。発現ベクターの作製及び宿主細胞への導入は、公知の方法に従って行うことができる。
【００２５】
宿主細胞には、原核生物及び真核生物のいずれの細胞も用いることができる。例えば、原核生物の宿主細胞として一般的に用いられるものとしては、大腸菌や枯草菌等が挙げられる。また真核生物の細胞としては、例えば、酵母細胞等を挙げることができる。ただし、本発明に用いられる宿主細胞は、これらに限定されるものではない。
【００２６】
発現ベクターは、上述した本発明のハロペルオキシダーゼ遺伝子を含んでいる必要があり、その上流に遺伝子の発現を制御する配列を有していることが望ましい。更には、宿主細胞での複製を可能にする複製開始点を含んでいることが望ましい。遺伝子の発現を制御する配列としては、原核生物の場合、プロモーター、ＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）等が挙げられる。プロモーターは、原核生物の細胞内で機能するものであれば、どんなものでもよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合には、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。また、たとえば、酵母を宿主細胞とする場合には、ＡＤＨ１プロモーター、ｈＣＭＶプロモーター等を挙げることができるが、宿主細胞内で機能するものであれば、どのようなものでも用いることができる。
【００２７】
宿主細胞への発現ベクターの導入は、公知の方法で行うことができ、たとえば、塩化カルシウム法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等が挙げられる。
【００２８】
ハロペルオキシダーゼの製造は、発現ベクターを導入した宿主細胞を、宿主細胞が生育可能でかつハロペルオキシダーゼの誘導を可能とするような培地で培養することによって行う。この際、培養は液体培養で行うことが望ましい。培養した細胞を遠心分離等により回収し、細胞を破砕して粗抽出液を作製する。粗抽出液の作製には、超音波破砕、フレンチプレス等の物理的な方法によって細胞を破砕する方法の他、市販のタンパク質抽出試薬等も用いることができる。
【００２９】
粗抽出液からのハロペルオキシダーゼの精製は、一般的なタンパク質精製法により、行うことができる。たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ−クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法やこれらと塩析、限外ろ過、透析等を組み合わせた方法が挙げられる。このような精製法の例としては、次のようなものが挙げられる。イオン交換クロマトグラフィーでハロペルオキシダーゼの活性画分を回収した後、限外ろ過処理によって活性化区分を濃縮し、さらにゲルろ過クロマトグラフィーを行って活性画分を回収する。この方法により、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法で単一のバンドとなるまで精製することができる。ただし、本発明の精製方法はこれに限定されるものではない。なお、本発明のハロペルオキシダーゼの分子量は約３０  ＫＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）であり、精製されたタンパク質が本発明のハロペルオキシダーゼであるかどうかは、分子量とハロペルオキシダーゼ活性の有無によって確認することができる。
【００３０】
ハロペルオキシダーゼの活性測定は、過酸化水素、ハロゲンイオンの存在下において、適当な基質を添加し、ハロゲン化された基質の濃度を測定することにより行うことができる。たとえば、フェノールレッド、クロロジメドン等を基質として用いることにより、ハロゲン化による吸光度の変化によって簡便にハロペルオキシダーゼの活性を測定することができる。
【００３１】
３．ハロペルオキシダーゼによるハロゲン化化合物又は酸化化合物の生産
本発明のハロペルオキシダーゼ（以下、本ハロペルオキシダーゼという）は、触媒として使用することにより、ハロゲン化化合物や酸化化合物を生産することが可能である（以下、本生産法という）。ハロゲン化化合物や酸化化合物の生産方法としては、本ハロペルオキシダーゼ遺伝子を含む発現ベクターを導入した宿主細胞によって生産する方法と精製したハロペルオキシダーゼによって生産する方法が挙げられる。
【００３２】
本生産法の基質となる化合物は、既知のハロペルオキシダーゼの基質として知られているいずれの化合物でもよい。本生産法によれば、例えば、アルケンからエポキシドを、アルキンからハロゲン化ケトンを、シクロプロパンからハロヒドリンを、さらに、アルケン及びアルキンからジハロゲン化生成物を生産することができる。さらに、本ハロペルオキシダーゼは、その酸化能力を利用し、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼの代替とすることも可能である。
【００３３】
本ハロペルオキシダーゼを発現させた宿主を用いて、本生産法を行う場合には、本ハロペルオキシダーゼを発現させた宿主を、ハロニウムアニオンの存在下において、適当な基質とともに培養すればよい。
【００３４】
また、本ハロペルオキシダーゼをファージ表面又は細胞表層に発現させることにより、ファージディスプレイや細胞ディスプレイ等のディスプレイ系で基質と反応させることもできる。ファージディスプレイ系では、ファージの表面タンパク質をコードする遺伝子と本ハロペルオキシダーゼ遺伝子を連結し、ファージの表面タンパク質と本ハロペルオキシダーゼとが融合タンパク質となるように、ファージに導入すればよい。ファージディスプレイに使用するファージは、本ハロペルオキシダーゼをディスプレイできるファージであればよく、Ｍ１３ファージ等を例示することができる。細胞ディスプレイ系では、細胞表層に発現し得るタンパク質をコードする遺伝子と本ハロペルオキシダーゼ遺伝子を連結し、細胞表層に発現し得るタンパク質と本ハロペルオキシダーゼとが融合タンパク質として発現するよう宿主細胞に導入すればよい。細胞表層に発現し得るタンパク質としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＰｒｏｔｅｉｎＡ、バチルス属細菌のＳ−ｌａｙｅｒ、ＣｏｔＢ、大腸菌の細胞壁結合蛋白質、酵母の接着蛋白質であるα−アグルチニン（ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、細菌べん毛等を例示することができる。また、細胞ディスプレイ系に使用可能な宿主としては、大腸菌、黄色ブドウ球菌、酵母等を例示することができる。
【００３５】
本ハロペルオキシダーゼをディスプレイしたファージ又は細胞は、適当な担体に固定化し、基質と接触させることにより、本生産法を行うことができる。また、本ハロペルオキシダーゼディスプレイ細胞を本生産法において基質とともに培養することにより、細胞外にハロゲン化化合物や酸化化合物を蓄積させることができる。
【００３６】
精製した本ハロペルオキシダーゼを用いて、本生産法を行う場合には、過酸化水素存在下において（あるいは、過酸化水素及びハロニウムアニオンの存在下において）、本ハロペルオキシダーゼを有機化合物に作用させればよい。反応温度は、ハロゲン化反応や酸化反応が起こり得る温度であれば特に限定されないが、１０〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは２０〜４０℃であり、最も好ましくは３０〜４０℃である。また、反応時のｐＨは、ハロゲン化反応や酸化反応が起こり得るｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨ３〜９が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜８であり、最も好ましくはｐＨ５〜７である。
【００３７】
また、精製酵素を使用した場合の本生産法は、溶液中にて行うことができるほか、精製した本ハロペルオキシダーゼを適当な担体に固定化し、基質と接触させることによっても行うことができる。本ハロペルオキシダーゼを固定化できる担体は、特に限定されないが、例えば、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、セルロース、キトサン、セファロース、デキストラン、ポリピニルアルコール、エチレン・酢酸ビニル共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる複合担体等が挙げられる。また、担体表面には、ハロペルオキシダーゼの固定化反応に用い得る官能基が存在することが好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、アミド基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基等が挙げられる。
【００３８】
上記担体へのハロペルオキシダーゼの固定化においては、蛋白質の立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させ、さらには非特異的吸着を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換した適当な有機分子を用いることができる。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
〔実施例１〕  ハロペルオキシダーゼ遺伝子のクローニング
シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１１１７２およびＡＴＣＣ１２６３３をＬＢ（１％  トリプロトン、０．５％  イーストイクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ）培地で培養後（３０℃，  １８時間）、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｐｕｒｅｇｅｎ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｇｅｎｔｒａ社製）。このゲノムＤＮＡを基に、配列番号５（５’−ＡＣＡＧＧＡＧＡＣＣＧＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＡＣＧＴＣＡＣ−３’）と配列番号６（５’−ＴＣＡＡＣＴＡＣＧＡＡＴＧＡＡＣＧＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＣ−３’）のプライマーを用いてハロペルオキシダーゼがコードされるＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅した。反応液はＤＮＡポリメラーゼＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０  ｕｎｉｔ、添付ポリメラーゼ用緩衝液５μｌ、２５  ｍＭ  ＭｇＳＯ４を２μｌ、２  ｍＭ  ｄＮＴＰを５μｌ、１０    ｐｍｏｌ／μｌの配列番号５のプライマーを１．５μｌ、１０  ｐｍｏｌ／μｌの配列番号６のプライマーを１．５  μｌ、ゲノムＤＮＡをそれぞれ１００  ｎｇ添加し、最後に水で調製し合計５０μｌとした。反応は９４℃で３０秒、４３℃で２秒、７４℃で１分を１サイクルとし、これを５サイクル行い、引き続き、９５℃で３０秒、５０℃で２秒、７４℃で１分を１サイクルとし、これを２５サイクル行った。
【００４１】
増幅の確認は２％のアガロース電気泳動を行った。想定される長さ（約０．９  Ｋｂ）のＤＮＡをアガロースゲルから切出・精製（Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｇ、Ｑｉａｇｅｎ社製）した。この精製ＤＮＡをそれぞれ、制限酵素Ｈｉｎｃ  ＩＩ処理のｐＵＣ１１９クローニングベクター（宝酒造社製）にライゲーション（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）した。シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１１１７２由来のＤＮＡフラグメントが挿入されたベクターをｐＨＰＯ１１１７２、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３のものをｐＨＰＯ１２６３３とした。これらのベクターを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造社製）を形質転換した。
【００４２】
〔実施例２〕  ハロペルオキシダーゼの遺伝子配列の解析
形質転換された大腸菌からプラスミド（ｐＨＰＯ１１１７２、ｐＨＰＯ１２６３３）を定法により調製（ＱＩＡｐｒｅｐ，  Ｑｉａｇｅｎ社製）し、ＤＮＡ塩基配列を決定した。塩基配列は、配列番号７のプライマー（５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ−３’）と配列番号８のプライマー（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）を使用し、テェーンターミネーター法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｉｔｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  アプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動シークエンサー  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１１１７２からクローニングしたハロペルオキシダーゼのＤＮＡ配列を配列番号３、アミノ酸配列を配列番号１に示す。同様にＡＴＣＣ１２６３３からクローニングしたハロペルオキシダーゼのＤＮＡ配列を配列番号４、アミノ酸配列を配列番号２に示す。いずれも２７６のアミノ酸から成ることが推定でき、細菌型ハロペルオキシダーゼに特有なグリシン・セリンモチーフ（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｇｌｙ：９５番グリシンから９９番目グリシン間）および活性部位を構成するセリン（９７番）、アスパラギン酸（２２７番）、ヒスチジン（２５６番）の３アミノ酸を確認することができた。また、配列番号３と４のＤＮＡ配列は報告されているシュードモナス・プチダＩＦ−３株のハロペルオキシダーゼ（非特許文献２）のそれと８７％同一であり、配列番号３と４の間は９７％の同一性を示した。アミノ酸配列では、配列番号１と２は非特許文献２のハロペルオキシダーゼに対して９３％同一であり、配列番号１と２の間は９８％の同一性を示した。
【００４３】
〔実施例３〕  ハロペルオキシダーゼの培養・精製
シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１１１７２のハロペルオキシダーゼは、ｐＨＰＯ１１１７２プラスミドにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株より精製した。培養（３０℃）は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製）を含む１．６  ＬのＬＢ培地で行い、対数増殖期に達したところで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．２  ｍＭとなるように添加し、引き続き培養した（３０℃、１６時間）。培養終了後、遠心分離操作（１０，０００×ｇ、１５  ｍｉｎ）により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）により粗抽出液（４８  ｍｌ、総蛋白質量４７．３  ｍｇ）を調製した。この粗抽出液を、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１  ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液（以下「ＴＨＧ緩衝液」と略す。）で１０倍に希釈し、ＴＨＧ緩衝液で平衡化されたイオン交換カラムＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ（２１．５  ｍｍ  ＩＤ×１５  ｃｍ、東ソー社製）に添加した（流速、５．０  ｍｌ／ｍｉｎ）。洗浄後、ＴＨＧ緩衝液系を用いたＮａＣｌのリニアグラジエントによりハロペルオキシダーゼを溶出させ（流速、５．０  ｍｌ／ｍｉｎ）、活性画分（活性測定は実施例４の方法に従っておこなった。）を集めた（３５  ｍｌ、総蛋白質量３．２  ｍｇ）。次いで、限外ろ過膜処理（Ｂｉｏｍａｘ−１０、ミリポア社製）により活性画分を濃縮し（８．０  ｍｌ）、５０  ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したゲルろ過カラムＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（２１．５  ｍｍＩＤ×３０  ｃｍ）に添加した（流速、５．０  ｍｌ／ｍｉｎ）。活性画分を集め、精製ハロペルオキシダーゼとした（１５  ｍｌ、総蛋白質量２．３  ｍｇ）。図１の通り、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動において均一にまで精製することができ、分子量約３０  ｋＤａを示した。
【００４４】
〔実施例４〕  ハロペルオキシダーゼの活性測定１
０．５  ｍｍｏｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、１０  μｍｏｌの過酸化水素、２０  μｍｏｌの臭化カリウム、１  μｍｏｌのフェノールレッドからなる反応液１．０  ｍｌに、実施例３で調製した酵素溶液を加え、３７℃で反応させた。ハロペルオキシダーゼ活性により、フェノールレッドのブロモ化が起こりブロモフェノールブルーの青紫色を確認することができた。図２の通り、時間の経過とともにブロモフェノールブルーの生成（５９５  ｎｍの吸光度）を確認することができた。
【００４５】
〔実施例５〕  ハロペルオキシダーゼの活性測定２
０．１５  ｍｍｏｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、１５  μｍｏｌの過酸化水素、３０  μｍｏｌの臭化カリウム（あるいは塩化カリウム）、９０    ｎｍｏｌのクロロジメドン（２−クロロ−５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン、アルドリッチ社製、カタログ番号２８，６７２−９）らなる反応液１．５  ｍｌに、実施例３で調製した酵素溶液を加え、３７℃で反応させた。ハロペルオキシダーゼ活性にともなうクロロジメドンのハロゲン化による分解が起こった。図３の通り、時間の経過とともにクロロジメドンの２９０  ｎｍの吸光度が減少し、クロロジメドンの分解を確認することができた。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、有機物をハロゲン化する反応を触媒する新規なハロペルオキシダーゼが提供される。ハロゲン化有機物には、抗菌活性のほか様々な生理活性を有するものがあり、医薬品原料等の新規有用物質の開発に利用することができる。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ハロペルオキシダーゼの精製過程を示す電気泳動像である。
【図２】ハロペルオキシダーゼのブロモ化反応（ブロモフェノールブルーの生成）を示す図である。
【図３】ハロペルオキシダーゼのハロゲン化反応（クロロジメドンの分解）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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