(57)【要約】【課題】低バックグランドを維持しつつ高感度化の図れる免疫学的検出試薬、該試薬を用いた検出方法及び該試薬の製造方法を提供すること。【解決手段】Ｆｃ部分を備えた抗体（１）と、抗体（１）と結合可能であり、Ｆｃ部分を備えた他の抗体（２）とが鎖状に連結された鎖状連結単位を含み、該鎖状連結単位の一方の末端単位には特定の抗体（又は特定の抗原）に対する結合部分を備えている鎖状連結抗体（１０）を含んでいる。このような鎖状連結抗体（１０）では特定の抗体（又は特定の抗原）に対する一つの結合部分（２ａ）と、その連鎖中に連結された抗体の数（重合度）に応じた数のＦｃ部分を含むので、この複合体は被検出物質としての抗原（又は抗体）単位当たりに多数のＦｃ部分を有することになり高感度化が図れる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ部分を備えた抗体と、該抗体に結合可能であり、Ｆｃ部分を備えた他の抗体とが鎖状に連結された鎖状連結単位を含み、該鎖状連結単位の一方の末端単位には特定の抗体（又は特定の抗原）に対する結合部分を備えている鎖状連結抗体を含むことを特徴とする免疫学的検出試薬。
【請求項２】
前記鎖状連結単位は、Ｆｃ部分を備えた抗体と、該抗体と結合可能であり、Ｆｃ部分を備えた他の抗体とが鎖状に交互に連結された鎖状交互連結体単位であることを特徴とする請求項１記載の免疫学的検出試薬。
【請求項３】
前記鎖状連結抗体の一方の末端単位には、一次抗体に対する結合部分を備えていることを特徴とする請求項１記載の免疫学的検出試薬。
【請求項４】
前記抗体は、ウサギ抗ヤギ抗体及びヤギ抗ウサギ抗体であることを特徴とする請求項１記載の免疫学的検出試薬。
【請求項５】
前記鎖状連結抗体の他の末端単位には、プロテインＧを介してＧＳＴが結合されていることを特徴とする請求項１記載の免疫学的検出試薬。
【請求項６】
前記プロテインＧと前記ＧＳＴとは架橋剤としてのグルタルアルデヒドにより架橋結合されていることを特徴とする請求項５記載の免疫学的検出試薬。
【請求項７】
検出対象である検体を請求項１記載の免疫学的検出試薬と反応させ、ついで、酵素標識物質を反応させることを特徴とする検出方法。
【請求項８】
検出対象である検体を一次抗体としてのヤギ抗ミオグロビン抗体と反応させた後、請求項１記載の免疫学的検出試薬と反応させ、ついで、酵素標識物質を反応させることを特徴とする検出方法。
【請求項９】
一時的な担体にＦｃ部分を備えた抗体を結合させる仮固定工程、前記仮固定された抗体に結合可能な他の抗体を結合させる重合工程を順次繰り返すことにより多数の抗体が順次鎖状に連結された鎖状連結単位を含み、該鎖状連結単位の一方の末端単位には特定の抗体（又は特定の抗原）に対する結合部分を備えている鎖状連結抗体を含む免疫学的検出試薬を製造することを特徴とする免疫学的検出試薬の製造方法。
【請求項１０】
前記鎖状連結担体は、前記担体と鎖状連結抗体との結合部分を切断又は解離し、前記担体と鎖状連結抗体とを分離する分離工程に付されることを特徴とする請求項９記載の免疫学的検出試薬の製造方法。
【請求項１１】
前記重合工程に付された抗体の未反応の抗体は、回収されて再利用が図られることを特徴とする請求項９記載の免疫学的検出試薬の製造方法。
【請求項１２】
前記担体は固体であることを特徴とする請求項９記載の免疫学的検出試薬の製造方法。
【請求項１３】
前記固体は、前記分離工程により分離された鎖状連結抗体とは比重差を有することにより、前記回収方法は遠心分離であることを特徴とする請求項１１記載の免疫学的検出試薬の製造方法。
【請求項１４】
前記一時的な担体は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂであることを特徴とする請求項９又は１３記載の免疫学的検出試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗原−抗体反応を利用して被検出物質である抗原（または抗体）を定量的に又は定性的に検出するための免疫学的検出試薬、該試薬を用いた検出方法及び該試薬の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、免疫組織化学、イムノブロット、ウエスタン・ブロティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）や酵素免疫検出法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ）  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）で代表される抗原抗体反応（ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｉｔｉｂｏｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用した検出法を一般的に免疫学的検出法とよび、「イムノアッセイ」という語も広義ではほぼ同義語として用いられている。このような抗原抗体反応は、結合反応の親和力が大で、しかも反応に特異性があるため、微量で多種類の物質が混在している生体試料中の特定物質を検出できる。そのため、このような免疫学的検出法は、医学、農学、農水産学など広くバイオサイエンスの分野で用いられるようになっている。
【０００３】
このような免疫学的検出法においては、例えば、図７に示すように、一次抗体（１ｓｔＡｂ）に対する抗体（二次抗体：２ｎｄＡｂ）とペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼなどの酵素を反応させた酵素−二次抗体複合体（コンジュゲート）を予め用意し、被検体としての抗原Ａｇをその抗原Ａｇに対する特異抗体としての一次抗体１ｓｔＡｂとの間で反応させて抗原・抗体複合体を形成させ、この抗原・抗体複合体を予め作製しておいた酵素−二次抗体複合体と反応させた後、例えば発色性基質などの酵素の作用を受けて化学反応を起こす基質を加えて発色または発光などを生起させ、それを指標にして抗原Ａｇの量または抗原Ａｇの局在性を検出している。
【０００４】
近年、免疫学的検出法が病理診断や鑑別上の重要性を増すとともに、疾患の予後や治療に対する指針の決定に重要な位置を占めるようになり、一層高感度の試薬の安価な提供が望まれるようになっている。
【０００５】
このような免疫学的検出の高感度化には、検出機器の開発に加えて、試薬の開発も活発である。このような試薬としては、二次抗体の改良が活発である。
【０００６】
例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥなどの抗体は、抗体単位のモノマーであり、それにコンジュゲートする酵素標識物質の数に制限がある。これらの抗体単位のオリゴマーを含むＩｇＡやＩｇＭではより多数の酵素標識物質との間で複合体を形成することができるが、ＩｇＭの場合でも高々ペンタマーであり、充分な高感度化を図ることができない。
【０００７】
これに対して、高分子ポリマーの幹に酵素標識物質を複合させた試薬が開発されて市販されている。例えば、ＤＡＫＯ社からＨＲＰ標識ポリマー結合二次抗体（商品名：Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、ＨＲＰ標識デキストラン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体）が市販され、また、ニチレイ社によりシンプルステインＭＡＸ−ＰＯ（Ｍｕｌｔｉ）（商品名）が市販されている。これらの試薬では、高分子に多数の酵素標識物質が複合されて、高感度化が図られている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの市販の試薬は価格が高いという問題点がある。また、これらの市販の試薬では、高感度化は図られるがこれに伴いバックグランドが増大するという課題もある。
【０００９】
そこで本発明は、低バックグランドを維持しつつ高感度化の図れる免疫学的検出試薬、該試薬を用いた検出方法及び該試薬の製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は、Ｆｃ部分を備えた抗体と、該抗体と結合可能であり、Ｆｃ部分を備えた他の抗体とが鎖状に連結された鎖状連結単位を含み、該鎖状連結単位の一方の末端単位には特定の抗体（又は特定の抗原）に対する結合部分を備えている鎖状連結抗体を含むことを特徴とする免疫学的検出試薬である。
【００１１】
このような鎖状連結抗体では特定の抗体（又は特定の抗原）に対する一つの結合部分と、その連鎖中に連結された抗体の数（以下、抗体の連結数又は単に重合度という。）に応じた数のＦｃ部分を含むので、鎖状連結抗体の一分子当たり一つの特定の抗体（又は特定の抗原）と結合して複合体を形成することが可能であり、このようにして得られた複合体では抗体の連結数（重合度）に対応した数のＦｃ部分を有することになる。
【００１２】
それ故、このような鎖状連結抗体を含む試薬によれば、一方の末端単位に被検出物質である抗原（又は抗体）と定量的に反応させて複合体を形成すれば、この複合体は被検出物質としての抗原（又は抗体）単位当たりに多数のＦｃ部分を有することになる。これにより、この発明の免疫学的検出試薬を用いれば重合度に応じて（重合度を高めれば高めるほど）高感度化が図れる。
【００１３】
また、このような鎖状連結抗体は見かけ上は高分子量であり、低分子量の不純物を実質的に含まなく入手することが容易であり、結果として非特異反応も極めて少なく、バックグランドを低く抑えることができる。
【００１４】
また、このような試薬は、例えば、一時的な担体にＦｃ部分を備えた抗体を結合させる仮固定工程、前記仮固定された抗体に結合可能な他の抗体を結合させる重合工程を順次繰り返すことにより得ることができる。
【００１５】
また、この一時的な担体は、適宜の手法により鎖状連結抗体との結合を切断又は解離させて担体と鎖状抗体とを分離させることにより試薬として利用できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明に係る免疫学的検出試薬は、Ｆｃ部分を備えた抗体と、該抗体に結合可能であり、Ｆｃ部分を備えた他の抗体とが鎖状に連結された鎖状連結単位を含み、該鎖状連結単位の一方の末端単位には特定の抗体（又は特定の抗原）に対する結合部分を備えている鎖状連結抗体を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明の試薬に用いられる抗体の由来は特には限定されない。一般的にウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、モルモット、マウス、ウマ、ロバ、ヒト、ウシなどに異なる抗原を免疫して得られた抗血清または抗体が用いられる。一般的な方法によって調製されたモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体などであってもよい。抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等が知られている。
【００１８】
このような抗体は、ＨＲＰ−ＰｒｏｔｅｉｎＧなどの酵素標識コンジュゲートとの結合部位であるＦｃ部位及び他の抗体との抗原抗体反応による結合部位を備えていることが必要である。これにより、Ｆｃ部位を備えた状態で鎖状に連結されて鎖状連結抗体を形成する。
【００１９】
このような抗体の具体例としては、例えば、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体などが例示される。
【００２０】
この鎖状連結抗体の一方の末端には、特定の抗原（又は抗体）に対しての結合部位を残存させている。
【００２１】
これにより、この末端の抗原（又は抗体）に対する結合部位を利用して、特定の抗原又は抗体と免疫学的に反応させることにより、特定の抗原又は抗体を認識させる試薬として使用することができる。
【００２２】
その後、Ｆｃ部分を利用して酵素標識コンジュゲート（酵素標識物質）と反応させるなどして特定の抗原又は抗体（検体）を検出させることができる。
【００２３】
本発明の試薬と反応させる酵素標識コンジュゲートの一例としては、ＨＲＰ−ｐｒｏｔｅｉｎＧやＨＲＰ−ｐｒｏｔｅｉｎＡ、ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、ＡＬＰ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａなどが例示されるが、これに限定されない。
【００２４】
ここで、この特定の抗原又は抗体として例えば、一次抗体を用いれば、この一次抗体を認識させる二次抗体試薬として使用することができる。このような二次抗体試薬は、酵素免疫検出法において広く利用されている。それらの二次抗体試薬の代替として使用できる。
【００２５】
このような手法は、例えば酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの免疫化学アッセイ技術、ＥＩＡ、免疫組織化学手法、細胞化学手法、例えばサザン及びノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティグなどへの応用が期待される。また、種々の検出装置と組み合わせれば、各種のバイオセンサーとしての利用も期待される。
【００２６】
本発明の試薬において検出可能な抗原（又は抗体）としては特には制限はない。例えば、腫瘍マーカー（ＣＲＰ，ＡＦＰ，ＣＥＡ，ＰＯＡ等）、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ等）、ホルモン（インシュリン等）及び薬物が挙げられる。
【００２７】
このような鎖状連結抗体では特定の抗体（又は特定の抗原）に対する一つの結合部分と、その連鎖中に連結された抗体の数（以下、抗体の連結数又は単に重合度という。）に応じた数のＦｃ部分を含むので、鎖状連結抗体の一分子当たり一つの特定の抗体（又は特定の抗原）と結合して複合体を形成することが可能であり、このようにして得られた複合体では抗体の連結数（重合度）に対応した数のＦｃ部分を有することになる。
【００２８】
それ故、このような鎖状連結抗体を含む試薬によれば、一方の末端単位に被検出物質である抗原（又は抗体）と定量的に反応させて複合体を形成すれば、この複合体は被検出物質としての抗原（又は抗体）単位当たりに多数のＦｃ部分を有することになる。これにより、この発明の免疫学的検出試薬を用いれば重合度に応じて（重合度を高めれば高めるほど）高感度化が図れる。
【００２９】
すなわち、本発明に従って製造した試薬は、免疫組織化学又は細胞化学手順を利用する組織中又は細胞中の抗原又は抗体の検出等の検出感度の増強に用いることができる。
【００３０】
また、このような鎖状連結抗体は見かけ上は高分子量であり、低分子量の不純物を実質的に含まなく入手することが容易であり、結果として非特異反応も極めて少なく、抗原抗体反応を利用した免疫学的検出法に用いればバックグランドを低く抑えることができる。
【００３１】
本発明に係る製造方法に従えば、例えば、抗体としてウサギ抗ヤギ抗体（抗体Ｉ）及びヤギ抗ウサギ抗体（抗体ＩＩ）の２種類を用い、抗体Ｉと抗体ＩＩを逐次反応させることにより、抗体Ｉと抗体ＩＩとが交互に鎖状に連なった鎖状交互連結体を形成することができる。このような鎖状交互連結体では、抗体の種類を増やすことなく、連結体の長さを調製できるので、非特異反応も少なく、かつ、高重合度の鎖状連結抗体を経済的に製造することが可能である。
【００３２】
また、例えば、前記抗体としてウサギ抗ヤギ抗体（抗体Ｉ）、ヤギ抗マウス抗体（抗体ＩＩ）、マウス抗ウサギ抗体の３種類を用い、抗体Ｉ、抗体ＩＩ、抗体ＩＩＩを逐次反応させることにより、抗体Ｉ、抗体ＩＩ、抗体ＩＩＩが順次に鎖状に連なった３元の鎖状交互連結体を形成することもできる。このような３元の鎖状交互連結体でも２元の鎖状交互連結体と実質的に同等の作用効果を奏すると思われる。
【００３３】
すなわち、本発明においては、抗体の連鎖の種類には無関係に高感度化を図ることができるが、経済的に試薬を調製するには、用いる原材料の種類を少なくすることがよい。この観点から、鎖状連結抗体は鎖状交互連結体であることが好ましい。
【００３４】
本発明において、このような鎖状連結抗体の製造法は特には制限されないが、例えば、一時的な担体を用いて製造することが好ましい。
【００３５】
以下、本発明に従う免疫学的検出試薬の一時的な担体として、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを用いて製造した例について説明する。
【００３６】
このＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂは微粒子状の固形物として市販され、この分野で常法として用いられる各種の洗浄液又は処理操作液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等）に比べて比重が大きいので、遠心により反応生成物と未反応物との分離操作が容易であるという特徴を備えている。
【００３７】
また、このＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＢはＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（グルタチオン−Ｓ−トランスファラーゼ；以下、ＧＳＴと略称する。）と比較的強く結合可能であるが、この結合は還元型ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ（ＧＳＨ）ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、緩衝液ＩＩという。）中で結合を解離することができる。この発明の好ましい態様では、このＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂのこの特異的な性質を利用して、このＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを一時的な担体として用いることにより本発明に係る鎖状連結抗体を含む免疫試薬を調製している。
【００３８】
すなわち、微粒子状のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＢをＧＳＴを介してＰｒｏｔｅｉｎＧなどにより抗体の一端を一時的に固定させて、その固定された抗体に他の抗体を逐次反応により結合させて連鎖を伸ばした後に、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂの結合を解離させることにより抗体が所望の連結数で鎖状に結合（又は重合）された鎖状連結抗体を得ることができる。各反応工程では、緩衝液（洗浄液）により反応物を洗浄して遠心操作により上清を取り除く操作を繰り返すことにより反応生成物を精製することが容易に行える。
【００３９】
また、この場合、反応に寄与しなかった未反応物は上清から回収されて再利用することができるので、試薬の製造に無駄部分がなく、廉価に提供することができる。
【００４０】
なお、ＧＳＴとＰｒｏｔｅｉｎＧなどの抗体と特異的に反応するタンパク質との結合はグルタルアルデヒドなどのジアルデヒド類やトリレン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート類を用いることにより共有結合により強固な結合を簡易に行える。
【００４１】
このような一時的な担体としてＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに代えて、例えば、ニッケルキレートが担持された担体（ニッケルキレート担体）を一時的な担体として用いることができる。この場合には、ＧＳＴの代わりにヒスチジンタグ融合タンパクが封鎖に用いられる。
【００４２】
いずれにしても、この一時的な担体は、粒子状であるとか、比重が異なるとか、固体状であることなどにより、未反応物との分離が容易なのがよく、かつ、微粒子状、ゲル状などとして反応媒体（反応溶液中）に分散できるなどして、反応性を維持できるものがよい。
【００４３】
以下、このようにＧＳＴにより幇助されて製造できる免疫化学検出高感度試薬（ＧＳＴ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｈａｒｂｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）と命名し、以下、Ｇａｃｃｈａｎと略記して説明する。
【００４４】
図１の網掛け部（枠内）にその一例を示すように、この発明に係るＧａｃｃｈａｎ（符号１０）は、Ｆｃ部分を備えた抗体Ｉ（２ｎｄＡｂ；ａｎｔｉ−１ｓｔ  Ａｂ）（符号１）と、Ｆｃ部分を備えた他の抗体ＩＩ（ａｎｔｉ−２ｎｄ  Ａｂ）（符号２）とが抗原抗体反応などの免疫学的反応により鎖状に連結（重合）された鎖状連結体であり、この実施の態様では、それらの抗体Ｉ（符号１）と抗体ＩＩ（符号２）とが交互に連結された鎖状交互連結体を形成している。
【００４５】
この鎖状交互連結体の一方の末端単位（符号２ａ）には、一次抗体（１ｓｔ  Ａｂ）（符号３）との結合サイトを備え、他方の末端の重合単位（抗体単位）にＰｒｏｔｅｉｎＧを介してＧＳＴが結合されている。
【００４６】
このようなＧａｃｃｈａｎ（符号１０）は、図２のＳ１〜Ｓ８の各工程を逐次実施することにより得ることができる。
【００４７】
Ｓ１では、Ｇａｃｃｈａｎを製造するための一時的な担体（符号４）として、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂが選択されて使用される。
【００４８】
この担体４は、ＧＳＴと反応され、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＢのＧＳＨ末端にＧＳＴが吸着されたＧＳＴ複合体（符号５）を生成させる。このＧＳＴ複合体（符号５）はトリス緩衝液（またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）などの複合体を解離しない洗浄液及び遠心操作を繰り返すことにより精製され、洗浄液を回収することにより反応に供しなかったＧＳＴを回収することができる。以下の各工程（Ｓ２〜Ｓ８）においても同様な操作により精製が行われ、反応に供しなかった未反応物は実質的に除去され、また回収に供することができる。
【００４９】
ついで、Ｓ２では、Ｓ１で得られたＧＳＴ複合体（符号５）に架橋剤としてのグルタルアルデヒドを反応させ、ＧＳＴ中のアミノ末端にグルタルアルデヒドを結合させる。
【００５０】
ついで、Ｓ３では、グルタルアルデヒドにＰｒｏｔｅｉｎＧを反応させ、グルタルアルデヒド末端にＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇを結合させる。
【００５１】
Ｓ４では、抗体Ｉ（符号１）を反応させてＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇに抗体Ｉ（符号１）を結合させる。
【００５２】
ついで、Ｓ５で抗体ＩＩ（符号２）を反応させて末端の抗体Ｉ（符号１）単位に抗体（符号２）ＩＩを結合させる（重合工程）。
【００５３】
Ｓ６では再び抗体Ｉ（符号１）を加えて反応させて末端の抗体ＩＩ（符号２）単位に抗体Ｉ（符号１）を結合させる（重合工程）。
【００５４】
Ｓ７ではＳ５及びＳ６の重合工程を交互に繰り返すことにより、抗体Ｉ（符号１）と抗体ＩＩ（符号２）とが直鎖状に交互に連なったＧａｃｃｈａｎ前駆体（符号６）が得られる。この重合工程は、抗体Ｉ（符号１）と抗体ＩＩ（符号２）との結合数（重合度）が所望の値となった場合に終了する。
【００５５】
Ｓ８：Ｓ７で所望の重合度となったＧａｃｃｈａｎ前駆体（符号７）を緩衝液ＩＩで処理することにより一時的な担体（符号４）としてのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを切り離しＧａｃｃｈａｎ（符号１０）を生成する。得られたＧａｃｃｈａｎを濾過によりＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂと分離することによりＧａｃｃｈａｎ（緩衝液ＩＩ中）を得る。
【００５６】
このようにして得られたＧａｃｃｈａｎは、貯蔵中でも安定であるので、アッセイ試薬又はキットの形態でも商品化が可能である。また、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂと分離することにより得られたＧａｃｃｈａｎ（緩衝液ＩＩ中）が例示されているが、その他に、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂとの複合体の形で提供することもできる。この場合には使用に際して、使用者が緩衝液ＩＩで処理することによりＧａｃｃｈａｎ（緩衝液ＩＩ中）を生成することができる。
【００５７】
このようにして得られたＧａｃｃｈａｎは、そのまま、二次抗体試薬の代替として利用することができる。この場合に、Ｇａｃｃｈａｎと反応させる試薬としてＨＲＰ−ＰｒｏｔｅｉｎＧに限らず、例えば、ＨＲＰ、ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ及びウレアーゼなどの酵素との複合体であってもよい。好ましい具体例としては、例えば、ＨＰＲ−ＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ，ＡＬＰ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａなどが例示される。
【００５８】
また、Ｇａｃｃｈａｎ作成時の使用最終抗体が直接、被検体を検出可能で有れば一次抗体を介在させないで直接被検体を検出させることもできる。
【００５９】
なお、以下の説明では、Ｇａｃｃｈａｎの末尾に重合工程（Ｓ５及びＳ６）に付した工程数を付して重合度を標記する場合がある。例えば、Ｇａｃｃｈａｎ１０は、Ｓ５，Ｓ６の各重合工程を合計１０回行って得られたＧａｃｃｈａｎ、即ち、重合度が１０であるＧａｃｃｈａｎを示している。
【００６０】
また、最終反応がヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体であるＧａｃｃｈａｎをＧａｃｃｈａｎ（抗ウサギ抗体）と略称し、最終反応がウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体であるＧａｃｃｈａｎをＧａｃｃｈａｎ（抗ヤギ抗体）と略称して説明する。
【００６１】
【実施例】
以下、本発明の効果を実施例により詳細に説明するが本発明はこの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例は断りの無い限り常温で行っている。
［Ｇａｃｃｈａｎの調製例１］
以下に、このＧａｃｃｈａｎの調製例１を順次説明する。
１  グルタチオン−Ｓ−トランスファラーゼ（ＧＳＴ）の培養と精製
ＧＳＴは、常法に従い、以下の操作により前培養、本培養を行った後、吸着剤としてのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（商品名：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて精製した。
【００６２】
ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）でトランスフォームした大腸菌ＪＭ１０９をＳＢ培地（１％ボリペプトンＳ、０．５％イーストエキス、１％ＮａＣｌ（ｐＨ７．０））中３７℃で一晩培養し、前培養液を得た。ついで、前培養で用いたと同じＳＢ培地に１０質量％の前培養液を添加し、３７℃で３時間培養後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノサイド）を最終濃度が１ｍＭとなるように加えて３７℃で４時間本培養を行い本培養液を得た。
【００６３】
ついで、得られた本培養液を、２，５００ｒｐｍ、４℃、１０分間の条件で遠心処理を行い大腸菌ＪＭ１０９を回収した。ついで、この回収した大腸菌ＪＭ１０９を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、この緩衝液を緩衝液Ｉという。）を加えて同様の遠心操作を行って洗浄した。
【００６４】
得られた大腸菌ＪＭ１０９を緩衝液Ｉで懸濁した状態で、超音波破砕機で３０秒１０回の処理を行い、破砕物中にＧＳＴを遊離させた。ついで、この破砕物を２，５００ｒｐｍ、４℃、１０分間の条件で遠心を行った後、得られた上清をメンブレンフィルター（孔径０．４５μｍ）でさらに濾過した。
【００６５】
ついで、得られた濾過液に吸着剤としての過剰量のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（商品名：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を加えて一晩回転させながら４℃で保温することにより、ＧＳＴをＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（商品名：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に充分に吸着させた後、２，５００ｒｐｍ、４℃、５分間の条件で遠心処理を行うことによりＧＳＴが吸着されたＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを回収した。ついで、このＧＳＴ吸着回収物を１０倍量の緩衝液Ｉ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。
【００６６】
回収物を同量の緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）及び２０ｍＭ  ＧＳＨ（還元型グルタチオン））（以下、この緩衝液を緩衝液ＩＩという。）で処理して回収物からＧＳＴを溶出させた。得られた溶出液をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用い  て透析処理することによりＰＢＳを媒体としたＧＳＴ精製液を得た。
【００６７】
得られたＧＳＴ精製液はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる蛋白質の分子量及びＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）による蛋白量の検出により目的とするＧＳＴ精製液が得られていることが確認された。認められた分子量は約２６，０００であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でＧＳＴ以外のバンドは認められなかった。
２  Ｇａｃｃｈａｎの調製
Ｇａｃｃｈａｎは、模式的に説明した図２のＳ１〜Ｓ８で示す各工程を逐次行うことにより調製した。各反応は全て室温で試験管を回転させながら行われ、各反応終了毎に反応液はＰＢＳを用いた洗浄処理及びそれに続く遠心分離と上清除去処理（５回）により過剰量に添加された未反応物が除去された。
【００６８】
一時的な担体１としての６００μＬ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ベッドボリューム２００μＬ）に、上述により得られたＧＳＴ精製液（２００μｇ／ＰＢＳ  ５００μＬ）を加えて２時間反応させてＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ中のＧＳＨ末端にＧＳＴが吸着されたＧＳＴ複合体を生成させる。
【００６９】
得られたＧＳＴ複合体に架橋剤としてのグルタルアルデヒドを最終濃度が２．５％になるように逐次加えて１時間反応させ、ＧＳＴ中のアミノ末端をグルタルアルデヒドと反応させる。
【００７０】
ＰｒｏｔｅｉｎＧ（２０μｇ／ＰＢＳ  ５００μＬ）を加え１時間反応し、グルタルアルデヒドのアルデヒド末端にＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇを結合させる。
【００７１】
過剰量のヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（希釈倍率１：１００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を加えて２時間反応させてＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇにヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させる。
【００７２】
過剰量のウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（希釈倍率１：１００；Ｃａｐｐｅｌ社製）を加え２時間反応させて、末端のヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体単位にウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体を結合させる。
【００７３】
過剰量のヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（希釈倍率１：１００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を加えて２時間反応させて末端のウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体単位にヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させる。
【００７４】
ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体及びヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた重合反応を交互に繰り返すことにより、所望の重合度（重合度１０及び４０）を備えた抗体が直鎖状に連なったＧａｃｃｈａｎ前駆体を作製する。
【００７５】
得られたＧａｃｃｈａｎ前駆体を緩衝液ＩＩで処理することにより一時的な担体１としてのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを切り離しＧａｃｃｈａｎを生成する。得られたＧａｃｃｈａｎを遠心によりＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂと分離することにより上清よりＧａｃｃｈａｎ（緩衝液ＩＩ中）を得る。
［検出例１］ウエスタンブロット法による検出
対照例として組換え型ミオグロビン（Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ社製）を標準試料としたウェスタンブロット法に従って本発明の効果を詳述する。
【００７６】
まず、組換え型ミオグロビン（Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ社製）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル電気泳動：１５％ゲル使用）により分離後、分離された組換え型ミオグロビンをセミドライ法によりニトロセルロース膜（Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉ社製）に電気的（４３ｍＡ）に１時間かけて転写した。ついで、この転写ニトロセルロース膜を５％スキムミルク中で４℃で一晩放置することによりブロットをブロッキングした、
一次抗体としてのヤギ抗ミオグロビン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と３時間反応させ、その後、二次抗体としてのウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（希釈倍率１：１０００；Ｃａｐｐｅｌ社製）と１時間、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）とＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇの複合体であるＨＲＰ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（希釈倍率１：１０００；Ｚｙｍｅｄ社製）と１時間反応させた後、発色基質としてＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて発色させた。
【００７７】
ついで、二次抗体としてのウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体に代えて本発明に従うＧａｃｃｈａｎ１０（抗ヤギ抗体）及びＧａｃｃｈａｎ４０（抗ヤギ抗体）をそれぞれ用いた以外は、対照例と同様にしてＧａｃｃｈａｎ（希釈倍率１：１０００）と１時間、ＨＲＰ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（希釈倍率１：１０００；Ｚｙｍｅｄ社製）と１時間反応させた後、発色基質としてＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて発色させた。
【００７８】
ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ（Ｖｅｒ．１．６２ｆ１）によりバンド強度を数値化し、対照例と比較して結果を図３に示し、また、ミオグロビンを対象としたＧａｃｃｈａｎ４０の詳細な実験結果を図４に示した。
【００７９】
図３から、３種の二次抗体の中ではＧａｃｃｈａｎ４０（抗ヤギ抗体）を用いた時にのみ０．１μｇのミオグロビンが検出可能であった。また、Ｇａｃｃｈａｎ１０とＧａｃｃｈａｎ４０との対比から、検出感度はＧａｃｃｈａｎの生成反応サイクル数（抗体連鎖の数：重合度）に依存することが明らかとなった。また、図４から、Ｇａｃｃｈａｎ４０では、０．０３μｇのミオグロビンの検出が可能であった。これにより、検出感度を上げるには重合度を高めることが有用であることが理解される。
【００８０】
さらに市販のＨＲＰ標識ポリマー結合二次抗体てあるＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＨＲＰ標識デキストラン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ＤＡＫＯ社製）とＧａｃｃｈａｎ４０（抗ヤギ抗体）を比較したところ、図５に示すように、ほぼ同程度の検出感度が得られた。
［検出例２］酵素免疫側定法：ＥＬＩＳＡ法による検出
９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに０〜０．３μｇ／ｍＬの濃度のリトコール酸（ＬＣＡ）−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）結合体を加えて４℃で一夜放置することにより吸着させた。洗浄後、ＢＳＡ（１％）を加えてブロッキングした後、標準又は被検抗原としての抗ＬＣＡモノクローナル抗体を加えて、室温で１時間反応させた。洗浄後に一次抗体としてのウサギ抗マウス抗体（希釈倍率１：１０００；Ｚｙｍｅｄ社製）と１時時反応させてこれを被検体とした。
【００８１】
ついで、この被検体にＧａｃｃｈａｎ４０（抗ウサギ抗体）と１時間反応後、ＨＲＰ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（希釈倍率１：１０００；Ｚｙｍｅｄ社製）と１時間反応させた。ＨＲＰ活性は基質としてオルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を用いて、４９２ｎｍの吸光度（ＯＤ）を検出した。
【００８２】
結果を図６に示すが、ＬＣＡ−ＢＳＡの０．０１〜１μｇ／ｍＬを検出することが可能であった。
【００８３】
比較のために、市販の標識ポリマー結合二次抗体である、ＨＲＰ標識デキストラン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（商品名：Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、ＤＡＫＯ社製）及びＨＲＰ標識アミノ酸ポリマー結合抗ウサギＩｇＧ抗体（商品名：シンプルステインＭＡＸ−ＰＯ（Ｍｕｌｔｉ）、ニチレイ社製）と比較検討した。
【００８４】
同様にして一次抗体としてのウサギ抗マウス抗体（希釈倍率１：１０００；Ｚｙｍｅｄ社製）と反応させて得られた被検体を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商品名、ＤＡＫＯ社製）と１時間反応させたもの、及びシンプルステインＭＡＸ−ＰＯ（Ｍｕｌｔｉ）（商品名、ニチレイ社製）と１時間反応させたものを同様にしてＨＲＰ活性をオルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を用いて発色させて、４９２ｎｍの吸光度（ＯＤ）を検出し、結果を併せて図６に示した。
【００８５】
この図６により、本発明に従うＧａｃｃｈａｎ４０（抗ウサギ抗体）は、固相吸着低分子検出における二次抗体の代替品としてその検出感度が極めて高感度で有ることがわかる。
【００８６】
また、本発明に従うＧａｃｃｈａｎ４０（抗ウサギ抗体）は、市販の固相吸着低分子検出における他の二次抗体と比較してバックグラウンドが低いことがわかる。これにより、本発明に従うＧａｃｃｈａｎでは、非特異的吸着反応が起こり難いことが示された。
【００８７】
以上の説明により、次のことが理解される。
１）  鎖状抗体中の多数のＦｃ部分に酵素群標識Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇを結合させることにより、抗原検出を高め検出感度を上昇させることができる。
２）Ｇａｃｃｈａｎ作成時の抗体反応サイクル数を増加させることにより、抗体数（重合度）を増加させ検出感度を増強させることができる。
３）Ｇａｃｃｈａｎ作成時の使用最終抗体を種々変更することにより、特異的に検出可能な一次抗体の種類を変えることができる。
４）Ｇａｃｃｈａｎ作成時の使用抗体は再利用が可能であることから、コストを抑えることができる。
５）Ｇａｃｃｈａｎは抗体とプロテインＧとの反応であるために、内因性のビオチンとの反応が避けられないＡＢＣ法に比べてバックグランドを低くすることができる。
６）Ｇａｃｃｈａｎはイムノブロット法や酵素免疫検出法（ＥＬＩＳＡ法）などの免疫化学検出法において使用可能である。
【００８８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に従えば、低バックグランドを維持しつつ高感度化の図れる免疫学的検出試薬、該試薬を用いた抗原（又は抗体）の検出方法及び該試薬の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る免疫学的検出試薬による検出のメカニズムを模式的に説明する図である。
【図２】本発明に係る免疫学的試薬の製造方法を工程に従って説明する図である。
【図３】ウエスタンブロット法のミオグロビン検出感度に及ぼす使用２抗体の影響を表す検出結果であり、図（Ａ）は、ミオグロビンのウエスタンブロットであり、図（Ｂ）はウエスタンブロットの相対的バンド強度である。
【図４】ウエスタンブロット法のミオグロビン検出感度を表す検出結果であり、図（Ａ）は、ミオグロビンのウエスタンブロットであり、図（Ｂ）はウエスタンブロットの相対的バンド強度である。
【図５】ウエスタンブロット法のミオグロビン検出感度に及ぼす使用２抗体の影響を表す検出結果であり、図（Ａ）は、ミオグロビンのウエスタンブロットであり、図（Ｂ）はウエスタンブロットの相対的バンド強度である。
【図６】ＬＣＡ検出ＥＬＩＳＡ法の検出感度に及ぼす使用２次抗体の影響を表す検出結果の図である。
【図７】従来の免疫学的検出試薬による検出のメカニズムを模式的に説明する図である。
【符号の説明】
１：抗体Ｉ
２：抗体ＩＩ
３：一次抗体
４：一時的な担体
５：ＧＳＴ複合体
６：Ｇａｃｃｈａｎ前駆体
１０：鎖状連結体（Ｇａｃｃｈａｎ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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