(57)【要約】【課題】耐冷性が強化されたイネ科植物体の作出。【解決手段】イネ科植物体において活性酸素消去系酵素遺伝子の発現を増強させることにより、耐冷性が強化されたイネ科植物体を提供する。【選択図】　図１
2004105136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性酸素消去系酵素遺伝子の発現を増強させることにより作製した耐冷性が強化されたイネ科植物体。
【請求項２】
イネ科植物がイネである請求項１に記載の植物体。
【請求項３】
活性酸素消去系酵素遺伝子がアスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子である請求項１に記載の植物体。
【請求項４】
アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子がクラミドモナス由来である請求項３に記載の植物体。
【請求項５】
アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子が、下記の何れかの塩基配列を有する請求項３に記載の植物体。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３２〜９９１からなる塩基配列；
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３２〜９９１からなる塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３２〜９９１からなる塩基配列もしくはその相補配列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項６】
アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子に葉緑体移行配列が付与されており、該遺伝子翻訳産物が葉緑体に局在することを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項７】
アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子にチラコイド膜近傍移行配列が付加されており、該遺伝子翻訳産物が葉緑体のチラコイド膜近傍に局在することを特徴とする請求項３〜６のいずれか一項に記載の植物体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性酸素消去系酵素遺伝子の発現を増強させることにより作製した耐冷性が強化されたイネ科植物体に関する。詳しくは、本発明はクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎｏｕｓ）由来アスコルビン酸パーオキシダーゼ（Ａｓｃｏｒｂａｔｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（以後、ＡＰＸと略することがある）遺伝子の導入により低温脱色耐性が強化されたイネ科植物に関するものである。本発明により、低温脱色の原因である葉緑体内の活性酸素が高効率に除去されるので、冷害時の遅延型冷害による被害が軽減でき、さらに直播栽培を安定化させることが可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
イネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）は熱帯原産の植物であり低温に弱く、寒冷地での稲作は古くから低温障害の問題に直面してきた。特に数年おきに遭遇する低温による被害はイネの生育の各時期において影響を及ぼしてきた。例えば平成５年の冷害は穂孕み期の低温による障害不稔からくる減収と、生育初期から長期間低温に曝されたため生育遅延がおきたことによる登熟不良と、いもち病による被害が相まって作柄を著しく低下させることとなった。これまでも各育成地での耐冷性品種の育種など冷害克服のための改善対策が取られてきたが、それらの諸施策だけでは十分に対処できないことが明らかになっていた。冷害の被害をできるだけ小さくするためにも、穂孕み期の低温耐性のみならず幼苗期の低温耐性の強化が求められている。
【０００３】
一方、稲作の現場では良質米の生産指向が強まるとともに、生産コストの低減が強く求められ、直播栽培技術の確立が急務となってきた。直播では施設費、労働費の節減、大型化が容易であるなどの利点がある反面、初期成育が不安定となりやすいという問題点がある。特に、幼苗期に遭遇する低温により葉身萎凋による葉枯れ、葉の黄化・白化等の被害が大きい。直播においても幼苗期の低温耐性の強化が求められている。
【０００４】
イネにおける幼苗期の低温障害は低温下での吸水阻害によると考えられる低温萎凋と、特に光照射下での低温暴露により葉や茎が黄化する低温脱色の２つに大別される。
耐冷性関連遺伝子の遺伝子導入によって植物の低温耐性を強化しようとする試みがいくつかなされている。例えば、浸透圧調節物質のプロリンを鍵酵素遺伝子の過剰発現あるいは分解系遺伝子の発現抑制によってアラビドプシスに蓄積させ低温耐性を強化した例（例えば、非特許文献１を参照。）、環境ストレス応答性遺伝子の発現調節に関わる転写制御因子ＤＲＥＢの過剰発現によってもアラビドプシスの低温ストレス耐性が強化された研究例（例えば、非特許文献２を参照。）もある。これらは、植物の低温ストレス化での萎凋障害を軽減するのに適した技術である。
【０００５】
一方、光照射下での低温暴露により葉や茎が黄化する低温脱色は、葉緑体中の光化学系ＩおよびＩＩ近傍で生じた活性酸素により生体膜の過酸化がおきるためであると考えられている。葉緑体内では、光合成系Ｉで常時活性酸素分子種の一つＯ２−・が生成している。Ｏ２−・は非常に短い時間で自発的に消滅するが、その間にも生体高分子を過酸化する可能性がある。本来、このような活性酸素による障害を防御する機構が植物の葉緑体内には存在しており、この経路の主要な機能としては、Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）（以後、ＳＯＤと略することがある）とＡＰＸによる活性酸素の消去があげられる。前者はチラコイド膜近傍で発生したＯ２−・を不均化しＨ２Ｏ２にする反応を触媒し、後者はそのＨ２Ｏ２を水と酸素に分解する反応を触媒する。光照射下で低温ストレスが植物に加わった場合、気孔が閉じられているために炭酸ガスの供給が十分ではなくなり、葉緑体内が還元力過剰の状態になる。この状態では、活性酸素消去系酵素による消去能力を超過するほど活性酸素が多量に発生するため、その結果膜および蛋白分子の過酸化が進行し葉緑体が破壊されると考えられている。ＢｏｗｌｅｒあるいはＧｕｐｔａ等は植物由来ＳＯＤ遺伝子の過剰発現により低温脱色障害が軽減できる可能性を示した（非特許文献３および４を参照。）。しかしながら、ＳＯＤ遺伝子の導入のみでは生成する過酸化水素が問題となる。この過酸化水素を消去する酵素遺伝子を植物に導入し、植物の低温脱色耐性が強化されることを示した例はなかった。
【０００６】
さらに、イネでは穂孕み期の耐冷性とともに幼苗期の耐冷性が実用上重要であるが、遺伝子導入により耐冷性を強化した例としては、Ｃａ２＋−依存性プロテインキナーゼ（ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）遺伝子の過剰発現による西条らの研究例（非特許文献５を参照。）、ベタイン合成系遺伝子の過剰発現による坂本らの研究例（非特許文献６を参照。）がある。西条らの研究においては、過剰発現させたプロテインキナーゼ遺伝子産物の標的蛋白が必ずしも明らかではなく、このようなシグナル伝達は複数のストレスを受容して発生するシグナルが同一のシグナル伝達因子を経由する事も多く、イネ幼苗が被る低温条件によってはうまく機能しないことが考えられる。また、このようなプロテインキナーゼ遺伝子のシグナルの下流に葉緑体内の活性酸素消去系酵素遺伝子があるという報告はこれまでなく、低温による萎凋障害の軽減には役だっても、光障害の軽減には繋がらない可能性が高い。
また、坂本らの研究においてはコリンオキシダーゼを高発現させるため、分子状酸素に電子が受け渡された結果、活性酸素がコリンと等モル生じてしまう。これは、特に幼苗期の低温光障害にとっては好ましくない形質であり、活性酸素消去系の強化の方がはるかに効果が高いと考えられる。
しかし、これまで活性酸素消去系酵素遺伝子の導入によりイネやイネ科植物の低温脱色耐性を強化した例はなかった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｔ．　Ｎａｎｊｏ　ｅｔ　ａｌ．，　４６１（３），　２０５−２１０，　（１９９９）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．
【非特許文献２】
Ｍ．　Ｋａｓｕｇａ　ｅｔ　ａｌ．，　１７，　２８７−２９１，　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
【非特許文献３】
Ｃ．　Ｂｏｗｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１０（７），　１７２３−１７３２，　（１９９１）　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ
【非特許文献４】
Ａ．　Ｓ．　Ｇｕｐｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　９０，　１６２９−１６３３，　（１９９３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ
【非特許文献５】
Ｙ．　Ｓａｉｊｏ　ｅｔ　ａｌ．，　４２（１１），　１２２８−１２３３，　（２００１）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．
【非特許文献６】
Ａ．　Ｓａｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　３８（６），　１０１１−１０１９，　（１９９８）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、耐冷性が強化されたイネ科植物体を作製することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、イネ科植物体において活性酸素消去系酵素遺伝子の発現を増強させることにより、耐冷性を強化すること、また、葉緑体中の活性酸素分子種の一つである過酸化水素を消去するＡＰＸ遺伝子を過剰発現させることによりイネ科植物の低温脱色耐性を強化することに成功した。高等植物の葉緑体中のＡＰＸは不安定な酵素で、活性酸素が多量に生成してその消去のために基質のアスコルビン酸が欠乏すると速やかに失活することが明らかになっている。本願発明者らは大腸菌に塩耐性を与えるクラミドモナス由来遺伝子を新たに単離し、その一つが葉緑体型ＡＰＸであること、その酵素のアスコルビン酸欠乏時の失活に対する安定性が、高等植物のそれに比べて高いことを明らかにした（Ｔ．　Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　３７６（１），　８２−９０，　（２０００）　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．）。さらに、本発明者らはクラミドモナス由来の安定型ＡＰＸ遺伝子をイネ科植物に導入し葉緑体で発現させることによりイネの低温光障害耐性を強化することによりイネ科植物の低温脱色耐性を強化することに成功した。加えて、高等植物では選択的スプライシングによってストロマ型ＡＰＸにチラコイド膜近傍局在配列が付加されチラコイド膜型ＡＰＸが生成することが明らかにされているが、ストレス下での活性酸素消去にはこのチラコイド膜型ＡＰＸの方が効果が高いと考えられている。本発明者らは、さらに、クラミドモナスの安定型ＡＰＸ遺伝子にチラコイド膜近傍局在配列を付加し発現させることによりイネ科植物の低温脱色耐性を強化することに成功した。本発明はこのようにして達成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）　活性酸素消去系酵素遺伝子の発現を増強させることにより作製した耐冷性が強化されたイネ科植物体。
（２）　イネ科植物がイネである（１）に記載の植物体。
（３）　活性酸素消去系酵素遺伝子がアスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子である（１）に記載の植物体。
（４）　アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子がクラミドモナス由来である（３）に記載の植物体。
（５）　アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子が、下記の何れかの塩基配列を有する（３）に記載の植物体。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３２〜９９１からなる塩基配列；
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３２〜９９１からなる塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３２〜９９１からなる塩基配列もしくはその相補配列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（６）アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子に葉緑体移行配列が付与されており、該遺伝子翻訳産物が葉緑体に局在することを特徴とする（３）〜（５）のいずれかに記載の植物体。
（７）アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子にチラコイド膜近傍移行配列が付加されており、該遺伝子翻訳産物が葉緑体のチラコイド膜近傍に局在することを特徴とする（３）〜（６）のいずれかに記載の植物体。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の植物体
本発明の植物体は、活性酸素消去系酵素遺伝子の発現を増強させることにより作製した耐冷性が強化されたイネ科植物体である。
「活性酵素消去系酵素遺伝子」としては、活性酵素種を消去する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されないが、アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、スーパーオキシドディスムターゼ遺伝子などが挙げられ、アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子が好ましい。なお、「活性酵素消去系酵素遺伝子」は、１種を用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。「発現の増強」は、目的植物と同じ／または異なる植物由来の活性酸素消去系酵素遺伝子を目的植物に導入・発現させることによって、目的の植物に元々存在する活性酸素消去系酵素遺伝子のコピー数を増加させることによっておこなうことができ、また目的植物と同じ／または異なる植物由来のより安定性の高い活性酸素消去系酵素遺伝子を目的植物に導入・発現させることによっても行うこともできる。また目的植物と同じ／または異なる植物由来のより比活性の高い活性酸素消去系酵素遺伝子を目的植物に導入・発現させることによっても行うこともできる。また目的の植物に元々存在しない活性酸素消去系酵素遺伝子を、目的植物に導入・発現させることによってもおこなうこともできる。さらに、目的の植物に元々存在する活性酸素消去系酵素遺伝子の発現を増強させることによっても行うこともできる。なお、「発現の増強」は、これらのうち、１種の方法を用いて行ってもよいし、複数の方法を組み合わせてもよい。
【００１１】
形質転換体イネ科植物の「耐冷性」が強化されているかどうかは以下の実施例において詳細に記載されている方法により検定することにより、確認することができる。簡単には形質転換体および非形質転換体から切り取った葉切片を吉田水耕液中に浮かべ４℃で強光下で３日間インキュベートし、葉の脱色度合いを比較することで明らかにすることができる。非形質転換体に比べ、形質転換体の脱色の程度が抑えられていれば「耐冷性」が強化されたということができる。
本発明に用いられるイネ科植物としては、活性酸素消去系酵素遺伝子の発現を増強することができるものであれば、特に限定されないが、イネが好ましく挙げられる。
【００１２】
本発明の好ましい一形態はＡＰＸ遺伝子の発現を増強させることにより作製した耐冷性が強化されたイネ科植物体である。ＡＰＸ遺伝子は目的の植物内で発現を増強させることが可能な限り、特に制限はないが、アスコルビン酸欠乏下でも安定なＡＰＸ酵素の遺伝子が特に好ましい。このような遺伝子としてアスコルビン酸欠乏下で安定であれば特に制限はないが、例えば、クラミドモナス由来のものが好ましく例示できる。クラミドモナス由来ＡＰＸ遺伝子として、例えば、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｗ８０）の葉緑体型遺伝子（ジェンバンクアクセッション番号　ＡＢ００９０８４）が特に好適に用いられる。この遺伝子は、例えば、該配列をもとに適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて、植物のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって得ることができる。
【００１３】
また、通常遺伝子においては、種、属、個体等の違いによって、１から複数の位置での１から複数個の塩基の欠失、付加または置換などの変異が当然存在する。本発明に用いることができる遺伝子には、コードするタンパク質のアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性が損なわれない範囲において、このような変異を含む遺伝子も含まれる。すなわち、本発明の別の好ましい一形態は、コードするタンパク質のアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性が損なわれない範囲において、配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３２〜９９１からなる塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列を有する遺伝子の発現を増強させることにより作製した耐冷性が強化されたイネ科植物体である。ここで「複数個」とは、具体的には２から４８０個、好ましくは、２から３８４個、より好ましくは２から１９２個である。
【００１４】
このような欠失、付加または置換されている塩基配列は、クラミドモナス　ｓｐ．Ｗ８０の葉緑体型ＡＰＸ遺伝子の配列をもとに適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて、他の生物のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって得ることができる他、例えば部位特異的変異法によって得ることができる。また、他の従来知られている変異処理によっても取得され得る。
【００１５】
上記のような変異を有する塩基配列を、目的の植物において発現させ、該植物のアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を調べることにより、本発明に用いることができる塩基配列が得られる。アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性は以下の実施例に詳細に示す方法に従って確認することができる。また、変異を有するＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号１に記載の塩基配列のうち少なくとも塩基番号３２〜９９１からなる塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらの一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明に用いられるＤＮＡが得られる。なお、ここでいう「一部」とはプローブとして使用するのに有効な長さのことである。また、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば、配列番号１に示す塩基配列のうち、少なくとも塩基番号３２〜９９１と約５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩条件でハイブリダイズする条件が挙げられる。なお、相同性はＢＬＡＳＴにより計算した場合である。
【００１６】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、目的の植物に導入し、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を以下の実施例で詳細に述べられる方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００１７】
＜２＞本発明に用いられるベクター
ＡＰＸ遺伝子をイネ科植物体に導入する方法としては、例えば、ＡＰＸ遺伝子を含むベクターを構築し、該ベクターでイネ科植物を形質転換する方法が挙げられる。
本発明に用いることができるベクターはＡＰＸ遺伝子をイネ植物中で発現することができるプロモーターとターミネーターをプラスミドベクターに組み込んだベクター、もしくは必要に応じてイントロンを有するプラスミドベクターに組み込んだベクターである。
【００１８】
本発明の好ましい一形態はＡＰＸ遺伝子をイネ科植物に導入し、葉緑体で発現させることによりイネの低温光障害耐性を強化することを特徴とする耐冷性、好ましくは低温脱色耐性を強化したイネ科植物体である。加えて、本発明の別の好ましい一形態はＡＰＸ遺伝子にチラコイド膜近傍局在配列を付加し、イネ科植物に遺伝子導入し発現させることを特徴とする耐冷性好ましくは低温脱色耐性を強化したイネ科植物体である。
【００１９】
ＡＰＸ遺伝子を適当な葉緑体移行配列と連結し、発現させることにより、該遺伝子発現産物を目的植物の葉緑体内で発現させることができる。または、元々葉緑体移行配列をもっている遺伝子を用いてもよい。または、元々葉緑体移行配列をもっている遺伝子を用いる場合であっても、より効率のよい移行配列と連結させて用いてもよい。クラミドモナス由来のＡＰＸ遺伝子を用いる場合、クラミドモナス由来のＡＰＸ遺伝子は、本来葉緑体移行配列を５’側末端にもっている遺伝子であるので、そのまま発現させることでも遺伝子産物をイネ科植物の葉緑体に移行させることができるが、特に好ましくはクラミドモナスＡＰＸ遺伝子の葉緑体移行配列をイネ科植物のグルタミン合成酵素遺伝子（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１３，　６１１　（１９８９））の葉緑体移行配列部分で置き換えることで、高効率にＡＰＸ遺伝子産物を葉緑体中に局在させることができる。
【００２０】
さらに葉緑体移行配列のついたＡＰＸ遺伝子にチラコイド膜近傍移行配列を連結させ、発現させることにより、該遺伝子産物を形質転換体植物の葉緑体チラコイド膜近傍に局在させることができる。または、元々チラコイド膜近傍移行配列をもっている遺伝子を用いてもよい。または、元々チラコイド膜近傍移行配列をもっている遺伝子を用いる場合であっても、より効率のよい移行配列と連結させて用いてもよい。クラミドモナス由来のストロマ型ＡＰＸ遺伝子を用いる場合、クラミドモナス由来のＡＰＸ遺伝子に、好ましくはタバコやほうれん草のチラコイド膜型ＡＰＸ遺伝子産物のｃ末側に存在するチラコイド膜近傍移行配列を付加したプラスミドをイネ科植物体に遺伝子導入し発現させることによって遺伝子産物を形質転換体植物の葉緑体チラコイド膜近傍に局在させることができる。
【００２１】
利用するプロモーターとしては、例えばＣａＭＶ３５Ｓ（ｐＢＩ２２１：ＥＭＢＯ．　Ｊ．，　６，　３９０１−３９０７　（１９８７））等のカリフラワーモザイクウイルス由来のプロモーター、ｒｂｃＳ（ｒｉｂｕｒｏｓｅ　１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、Ｃａｂ（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ａ／ｂ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４４，　１７４　（１９８９））等植物中で発現することが確認されたプロモーターがあげられる。ターミネーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、ＮＯＳ（ノパリン合成酵素）遺伝子由来のターミネーター等があげられる。また、プロモーターと構造遺伝子の間にイントロンを配するベクターも高発現ベクターとして利用でき、イントロンとしてはヒマＣａｔ（カタラーゼ遺伝子）の第一イントロン（Ａ．　Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，　６７６７−６７７０，　（１９９０））等があげられる。
【００２２】
＜３＞本発明のイネ科植物およびその製造法
以下本発明の植物を取得する方法を例示する。
本発明の植物体は、活性酸素消去系酵素遺伝子、好ましくはＡＰＸ遺伝子の発現を増強させることにより作製した耐冷性が強化されたイネ科植物体である。
本発明の植物体は、例えば、ＡＰＸ遺伝子を含むベクターを構築し、該ベクターでイネ科植物を形質転換し、ＡＰＸ遺伝子の発現を増強することにより、作製することができる。
また、本発明においては更に、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子等の選択マーカー遺伝子を使用するのが好ましい。選択マーカー遺伝子はＡＰＸ遺伝子と同一のベクター中に有するものを使用しても良いし、選択マーカー遺伝子を有するベクターとＡＰＸ遺伝子を有するベクターを併用しても良い。これらのベクターはイネ科植物を形質転換するのに用いられるベクターを用いることができる。
【００２３】
形質転換の方法としては、たとえば、イネ科植物由来のプロトプラストを液体培地に懸濁し、電気パルスを印加して当該ベクターを導入した後、イネ培養細胞を含有する培地で培養しコロニーを形成させ、該コロニーから植物体を再生させることができる（Ｋ．　Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　３３７，　２７４−２７６，　（１９８９）　Ｓｃｉｅｎｃｅ）。
具体的には、イネへの遺伝子導入は例えば次のようにして行うことができる。ササニシキの種子を２，４−Ｄを２μｇ／ｍｌ含む培地上でインキュベートしカルスを誘導する。得られたカルスから懸濁培養細胞を作出し、それを４％セルラーゼ、０．５％ペクトリアーゼを含む酵素液で処理しプロトプラストを得ることができる。プロトプラストをハイグロマイシン耐性遺伝子ベクターおよびＡＰＸ遺伝子を含むベクターＤＮＡをそれぞれ６０μｇ／ｍｌ含む電気穿孔法用低電解質バッファーに懸濁し、Ｋａｒｔｅｌ社製キュベット（電極間距離４ｍｍ用）に入れて、初期電圧１ＫＶ／ｃｍ、電気容量１０００μＦ、τ＝　３０ｍｓｅｃの電気条件で電気穿孔法による遺伝子導入を行う。遺伝子導入処理を行ったプロトプラストは氷上で３０分さらにインキュベートした後、低融点アガロースを０．８％含むＲ２Ｐ培地に包埋し、寒天片ごとＲ２Ｐ液体培地に浮かべて培養するアガロースビーズ法で、２８℃の培養室で振とう培養を行う。培養中、Ｒ２Ｐ液体培地にはイネの培養細胞（Ｏｃ細胞）を入れて保護培養するが、培養を始めて３日目に保護培養用の細胞を除去し、７日目にハイグロマイシンを３０μｇ／ｍｌ含む液体培地に寒天片ごと細胞を移し選抜を開始する。選抜開始後７日目に寒天片をハイグロマイシンを３０μｇ／ｍｌ含むＲ２ＳＡ選抜寒天培地に移し培養を続けることでハイグロマイシン耐性カルスを得ることができる。
【００２４】
形質転換細胞もしくは形質転換植物に遺伝子が組み込まれていることは、これらからＤＮＡを、例えばＭｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２１１，　２７，　（１９８８）に準じた方法で単離し、ＰＣＲ法（Ａｍ．　Ｊ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．，　３７，　１７２，　（１９８５））もしくはサザン法（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　９８，　５０５，　（１９８０））により確認できる。また形質転換細胞が植物ゲノムに組み込まれたクラミドモナスＡＰＸ遺伝子を発現していることは、例えばＡＰＸ遺伝子の配列またはその一部をプローブとしたノーザン法（Ｐ．　Ｔｈｏｍａｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　７７，　５２０１，　（１９８０））、導入した遺伝子産物（クラミドモナスＡＰＸタンパク質）に対する特異的抗血清を用いたウェスタン法（Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　７６，　４３５０，　（１９７９））により明らかにできる。導入した遺伝子の翻訳産物であるＡＰＸタンパク質の酵素活性は、以下実施例に詳細に記載する、Ｚｉｌｉｎｓｋａｓ等の方法（Ｒ．　Ｍｉｔｔｌｅｒ，　ａｎｄ　Ｂ．　Ａ．　Ｚｉｌｉｎｓｋａｓ，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２１２，　５４０−５４６　（１９９３））により測定できる。形質転換イネの葉緑体中の活性酸素除去能力が強化されているかどうかは、形質転換体および非形質転換体から切り取った葉切片をパラコート［メチルビオロゲン（Ｍｅｔｈｙｌｖｉｏｌｏｇｅｎ）］を含む吉田水耕液中に浮かべ強光下でインキュベートし、クロロフィル蛍光測定装置（Ｗａｌｔｚ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて光合成系ＩＩ活性の経時的変化を測定し、比較することで明らかにすることができる。非形質転換体に比べ、形質転換体のＦｖ／Ｆｍの低下の程度が抑えられていれば「活性酸素除去能力」が強化されたということができる。形質転換体イネの低温脱色耐性が強化されているかどうかは前記のとおり形質転換体および非形質転換体から切り取った葉切片を吉田水耕液中に浮かべ４℃で強光下で３日間インキュベートし、葉の脱色度合いを比較することで明らかにすることができる。非形質転換体に比べ、形質転換体の脱色の程度が抑えられていれば「耐冷性」が強化されたということができる。
【００２５】
Ｆｖ／Ｆｍの計算方法について説明する。植物の光合成は明反応と暗反応からなりたっている。明反応では、２つの活性中心光合成系ＩＩおよび光合成系Ｉを電子が光エネルギーにより励起されながら運ばれる間に、チラコイド膜をはさんで水素イオン濃度勾配が形成され、そのエネルギーを用いて暗反応に用いるＡＴＰやＮＡＤＰＨなどの高エネルギー化合物が生産される。
【００２６】
光合成系のうち明反応の状態は光合成系ＩＩの活性中心Ｐ６８０から出る蛍光量の増減と光合成系Ｉの活性中心Ｐ７００の赤外光吸収を調べることで非破壊的に知ることができる。特に光合成系ＩＩからでる蛍光はアンテナ色素が受けた光エネルギー強度、電子伝達系の電子の流れやすさ（暗反応の状態）により大きく変化する。例えば、暗黒条件に適応した植物は、暗反応に関わる酵素群は不活化されており電子の流れるスピードは最も遅くなる。一方光合成ＩＩ活性中心は集光性複合体（Ｌｉｇｈｔ　ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ）と最も良く複合体を形成して活性型となっている。また、強光に対する適応経路であるキサントフィルサイクル（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌ　ｃｙｃｌｅ）も不活化しており熱としての光エネルギーの放出も最小の状態になっている。従って暗黒条件に適応した植物の葉を明所に移したとき、最大量の蛍光が放出される。この状態の葉から放出される蛍光を測定するとき、励起光に対して最大の蛍光Ｆｍが記録される。植物の葉からは主にクロロフィルａから自家蛍光が常時出ており、励起光をあてない状態でもＦ０値として一定の値を示す。そこで、Ｆｍ値からＦ０値を引いた値をＦｖ値とし、光合成活性の指標Ｆｖ／Ｆｍ値（相対値）を求めるとほぼ一定の０．７〜０．８の値を示す。
【００２７】
ついで、光照射下で光合成系が動き始めると、水素イオン濃度勾配が形成され、その度合いに応じてキサントフィルサイクルが働きはじめ熱としての光エネルギー放出が始まる。また、葉緑体内が還元状態になるに応じておもにリン酸化により光合成ＩＩ活性中心と集光性複合体の乖離がおき活性型光合成系ＩＩ活性中心の数は減少する。さらに暗反応の諸酵素が活性化されて電子の流れがスムーズになるため、葉の放出する蛍光の量Ｆｍ’は一時減少する。Ｆｖ／Ｆｍ値も減少する。
【００２８】
植物が光障害を受けて、活性酸素などにより光合成系がダメージを受ける（多くは酸化による蛋白の分解）と、光合成に参加できる活性中心の数自体が減少していく。ストレスが著しいと、この減少は不可逆的でストレスがない状態になっても、元の数には戻らなくなる。このとき蛍光を観察すると、非ストレス時よりも蛍光の減少速度が速く、ストレスがない状態になったとき暗黒条件で適応させても最大蛍光Ｆｍはもはや出なくなる。
【００２９】
光障害を軽減する遺伝子操作を行った植物と非形質転換体のクロロフィル蛍光を比較すると、障害の軽減効果を、ストレス時の蛍光相対値Ｆｖ／Ｆｍの落ち方の差、およびストレス付加をやめたときに蛍光相対値の回復度合いの差として検定できる。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて更に具体的に本発明を説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
（１）ベクター構築用ＤＮＡ断片の合成
クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｗ８０）の葉緑体型遺伝子配列をもとに、プライマー１　ＡＰＸ５ＢＡＭ３６　：　ＧＣＣ　ＣＡＴ　ＧＧＣ　ＣＧＧ　ＡＴＣ　ＣＡＡ　ＧＧＣ　ＣＴＣ　ＣＧＣ　ＣＧＣ　ＧＡＣ　ＡＣＴ（配列番号３）、プライマー２　ＡＰＸ３ＢＡＭ３６　：　ＣＴＣ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＣＧＡ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＣＡＡＡＣＧ　ＴＣＧ　ＡＧＣ　ＣＣＡ（配列番号４）、プライマー３　ＡＰＸ３ＳＴＯＰＳＡＣ３６　：　Ｇ　ＡＧ　ＧＴＧ　ＣＴＴ　ＡＧＧ　ＡＴＣ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＡＣＧ　ＴＣＧ　ＡＧＣ　ＣＣＡ（配列番号５）、プライマー４　ＳＴＵＣＫ５ＢＡＭ　：　ＡＴＣ　ＴＡＡ　ＣＡＡ　ＧＧＧ　ＡＴＣ　ＣＡＧ　ＡＴＣ　ＡＧＡ　ＧＣＴ　ＴＴＣ　ＧＧＡ　ＴＴＣ（配列番号６）、プライマー５　ＳＴＵＣＫ３ＳＴＯＰＳＡＣ　：　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＧＣＴ　ＣＴＣ　Ａ　ＡＴ　ＴＴＣ　ＣＣＧ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＡＴＧ（配列番号７）の　５種類のプライマーを合成し（それぞれのプライマーのＡＰＸ遺伝子上の位置は図１の通り。）、Ｔｍを４７〜５４℃の範囲で設定し、正しいＡＰＸ断片を得るために特にＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて、大腸菌発現用プラスミドｐＥＴ／Ｃ（Ｔ．　Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　３７６（１），　８２−９０，　（２０００）　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．）を鋳型として２５〜３５サイクル　ＰＣＲ増幅反応を行った。プライマー１，２、１，３の組み合わせで約９００ｂｐのＡＰＸ遺伝子断片を得た（図１ａ，ｂ：断片Ａおよび断片Ｂ）。プライマー４，５ではＴｍを５０℃に設定し２５サイクル反応を行うことで、約１５０ｂｐのチラコイド膜近傍局在配列（以後、ｓｔｕｃｋと略することがある）の遺伝子断片を得た（図１ｂ：断片Ｃ）。
【００３１】
（２）葉緑体ストロマ用発現カセットへのＡＰＸ遺伝子断片の組込み
ストロマ移行配列付きの発現カセットｐＨＳＧ／３５ＳＩ／ｃｈｌ／／Ｎｏｓ（Ｈ．　Ｈｏｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　４３，　１０３−１１１，　（２０００）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．）と断片Ａをそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断した後、Ｔａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーションを行った。ライゲーション反応産物を用いて大腸菌を形質転換し、発現ベクターｐＨＳＧ／３５ＳＩ／ｃｈｌ／ｃｌＡＰＸ／Ｎｏｓ（以後ｐＡＰＸと略する）を得た（図１ａ）。ｐＨＳＧ／３５ＳＩ／ｃｈｌ／／Ｎｏｓ　と断片ＣをＢａｍＨＩ−ＳａｃＩで切断した後ライゲーションを行い、中間ベクターｐＨＳＧ／３５ＳＩ／ｃｈｌ／ｓｔｕｃｋ／Ｎｏｓを得た。この中間ベクターと断片ＢをＢａｍＨＩで切断し、ライゲーションして多数の候補クローンを得た。選られたクローンについて、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｈｅＩ（ＡＰＸ内部に切断部位を持つ）で切断し正しい切れ方（１．３Ｋｂ＋３．１Ｋｂ）をするものを選抜し、発現ベクターｐＨＳＧ／３５ＳＩ／ｃｈｌ／ｃｌＡＰＸ／ｓｔｕｃｋ／Ｎｏｓ（以後ｐＡＰＸｓｔと略する）を得た（図１ｂ）。
【００３２】
（３）作製したベクターのイネへの導入
ササニシキの種子を２，４−Ｄを２μｇ／ｍｌ含む培地上でインキュベートしカルス誘導を行った。得られたカルスから懸濁培養細胞を作出し、それを４％セルラーゼ、０．５％ペクトリアーゼを含む酵素液で処理しプロトプラストを得た。プロトプラストをハイグロマイシン耐性遺伝子ベクターおよび各ベクターＤＮＡ（ｐＡＰＸまたはｐＡＰＸｓｔ）をそれぞれ６０μｇ／ｍｌ含む電気穿孔法用低電解質バッファーに懸濁し、Ｋａｒｔｅｌ社製キュベット（電極間距離４ｍｍ用）に入れて、初期電圧１ＫＶ／ｃｍ、電気容量１０００μＦ、τ＝　３０ｍｓｅｃの電気条件で電気穿孔法による遺伝子導入を行った。遺伝子導入処理を行ったプロトプラストは氷上で３０分さらにインキュベートした後、低融点アガロースを０．８％含むＲ２Ｐ培地に包埋し、寒天片ごとＲ２Ｐ液体培地に浮かべて培養するアガロースビーズ法で、２８℃の培養室で振とう培養を行った。培養中、Ｒ２Ｐ液体培地にはイネの培養細胞（Ｏｃ細胞）を入れて保護培養した。培養を始めて３日目に保護培養用の細胞を除去し、７日目にハイグロマイシンを３０μｇ／ｍｌ含む液体培地に寒天片ごと細胞を移し選抜を開始した。選抜開始後７日目に寒天片をハイグロマイシンを３０μｇ／ｍｌ含むＲ２ＳＡ寒天培地に移し選抜ハイグロマイシン（Ｈｙｇ）耐性カルスを多数得た。
【００３３】
（４）形質転換カルスのＰＣＲによる選抜
Ｈｙｇ耐性カルスからゲノムＤＮＡを抽出し、プライマー６：ＡＣＡＣＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＣＣＡ（配列番号８）、プライマー７：ＡＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣ（配列番号９）の組合せでＰＣＲを行ったところ形質転換体を検出できた。ベクターｐＡＰＸｓｔを導入した形質転換体に関しては、特にチラコイド膜近傍局在配列の存在を確認するために、ポジティブであったクローンについて、プライマー６（前出）、プライマー８：ＡＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＡＧＡＧＧＣ（配列番号１０）の組み合わせでＰＣＲを行ったところ、プラスミドと同位置にバンドが確認できた。ＰＣＲによって、ｐＡＰＸについては１２系統、ｐＡＰＸｓｔについては３８系統の形質転換体カルスを選抜した。
【００３４】
（５）サザン分析による遺伝子導入の確認
ＰＣＲで遺伝子導入が確認できた形質転換体カルスについて、ベクターの発現カセット全長が導入されているか確認するためにサザン分析を行った。ＡＰＸ遺伝子ｃＤＮＡ全長をプローブとし、ＡＰＸｓｔ形質転換体植物のサザン分析を行った。定法に従って抽出したゲノムＤＮＡは制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｎｈｅ　Ｉで切断しゲノム中に挿入されたコピー数がわかるようにした。例えば図２のように、ｐＡＰＸＳｔベクター形質転換体植物には、ＡＰＸ遺伝子が導入されていることがわかった。
【００３５】
（６）ノザン分析によるクラミドモナスＡＰＸ遺伝子発現の確認
導入したクラミドモナスＡＰＸ遺伝子からの転写を調べるためにノザン分析を行った。ｐＡＰＸ、ｐＡＰＸｓｔ形質転換体植物から定法に従ってトータル　ＲＮＡを抽出し、３０μｇずつ電気泳動した後ナイロンメンブレンにブロッティングした。プライマー６，７で増やしたＡＰＸ遺伝子断片をプローブとしノザン分析を行った。ベクターｐＡＰＸを導入した形質転換体植物で１．２ｋｂの　ＡＰＸ遺伝子転写産物が確認できた。また、ｐＡＰＸｓｔを遺伝子導入した形質転換体においても１．４ｋｂの転写産物が確認できた。遺伝子の発現量は、導入遺伝子のコピー数と良い相関があった（図３）。
【００３６】
（７）ウェスタン分析によるＡＰＸ遺伝子の翻訳レベルでの発現確認
クラミドモナスＡＰＸ特異的抗体（（Ｔ．　Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　３７６（１），　８２−９０，　（２０００）Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．））を用いて、ウェスタン分析により翻訳レベルの遺伝子発現確認を行った。カルス１００ｍｇに、氷上で、２〜３倍量の抽出バッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．８，　１％ＳＤＳ，　プロテアーゼインヒビターカクテル）を加えて磨砕し、４℃、１５０００ｒｐｍで５〜１０分遠心分離し上清（Ｓ）とペレットを得た。ペレットには５０〜１００μｌの可溶化バッファー（抽出バッファー＋０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加え懸濁し、４℃、１５０００ｒｐｍで５−１０分再度遠心分離し、上清を膜画分サンプル（Ｐ）とした。得られたサンプルのＳ画分とＰ画分を用いて定法に従いウェスタン分析を行った。植物体からの蛋白抽出は定法に従って行い、ｐＡＰＸｓｔ形質転換体は上清と沈殿画分を分析に用いた。抗クラミドモナス抗体を１次抗体としウェスタン分析を行ったところ、転写レベルで遺伝子発現が確認できた系統全てで翻訳レベルの遺伝子発現が確認できた（図４）。この発現量は転写量と良い相関があった。また、上清と沈殿画分の遺伝子発現量を比較したところ、沈殿膜画分の方がバンドが濃く、チラコイド膜近傍局在配列によりＡＰＸ遺伝子翻訳産物がチラコイド膜に局在していることが明らかになった。
【００３７】
（８）活性染色による翻訳産物の活性確認
氷上で、１００〜２００ｍｇのカルスに、２〜３倍量の抽出バッファー（１００ｍＭ　Ｎａ−Ｐ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　アスコルビン酸、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、プロテアーゼインヒビターカクテル）を加えて磨砕し、４℃、１５０００ｒｐｍで５分遠心し上清を得た。ネイティブアクリルアミドゲルゲル（ＳＤＳを含まない。濃縮ゲル５％、分離ゲル１２．５％）を作成し、２ｍＭのアスコルビン酸を含む泳動バッファー（Ｔｒｉｓ　６ｇ／ｌ，グリシン　２８ｇ／ｌ）で４℃で３０分プレランした。その後、６０〜８０μｇのサンプル（同じセットのレーンを２つ作った）を載せ、３〜４時間泳動した。泳動終了後、同じサンプルのセットが泳動されたゲルを半分に切断し、半分は定法に従ってメンブレンにブロッティングし、以後ウェスタン分析に用いた。もう半分のゲルは、２ｍＭのアスコルビン酸を含む５０ｍＭ　Ｎａ−Ｐバッファー（ｐＨ７．０）に浸し３０分インキュベートした後、２ｍＭのＨ２Ｏ２と４ｍＭのアスコルビン酸を含む５０ｍＭ　Ｎａ−Ｐバッファー（ｐＨ７．０）に漬けて２０分インキュベートした後、２８ｍＭ　ＴＥＭＥＤと２．４５ｍＭ　ＮＢＴを含む５０ｍＭ　Ｎａ−Ｐバッファー（ｐＨ７．８）に漬けて３〜５分反応させた。活性染色において、形質転換体ＡＰＸｓｔ８、ＡＰＸｓｔ２７では、内生のＡＰＸ由来と考えられるバンド以外に導入遺伝子由来ＡＰＸ活性と考えられるバンドが検出された。このバンドはウェスタン分析のメンブレン（並行して泳動したゲルから転写したもの）上で、抗クラミドモナスＡＰＸ抗体と反応するバンドの位置と一致した（図５ａ）。このことから、形質転換体カルスの細胞内では活性のあるクラミドモナス型ＡＰＸが発現していることが明らかになった。植物体からの蛋白を抽出し行った活性染色においても、内生のＡＰＸ由来と考えられるバンド以外に、導入したクラミドモナスＡＰＸ遺伝子由来バンドが検出できた（図５ｂ）。このバンドの濃さは活性の強さを示していると考えられるが、翻訳産物の量と良い相関があった。
【００３８】
（９）形質転換体カルスからの当代植物体再生および次世代植物体の作出
ＰＣＲで選抜して得た１２系統のｐＡＰＸカルスから６系統の植物体が得られた。これらを鉢上げし、組換え温室で生育させ４系統についてＴ１世代の種子を得た。ＰＣＲで選抜して得た３８系統のｐＡＰＸｓｔカルスの遺伝子発現を調べたところ、１８系統がウェスタン分析ポジティブであった。このうち８系統から形質転換体が再生した。形質転換体は組換え温室内で鉢上げし生育させ、Ｔ１世代の種子を得た。その種子を発芽させＴ１形質転換体植物を育成した。
【００３９】
（１０）形質転換体当代植物でのＡＰＸ活性測定
Ｚｉｌｉｎｓｋａｓ等の方法に従って０．５ｍＭ　アスコルビン酸，　１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む５０ｍＭ　Ｋ−Ｐバッファーで形質転換体植物から蛋白を抽出し、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む５０ｍＭ　Ｋ−Ｐバッファーに０．５ｍＭのアスコルビン酸を加えた透析液と加えていない透析液を用い、３時間以上透析を行った。透析した抽出液の蛋白量を測定し２００μｇ、４００μｇ（煮沸して失活させたサンプルも作製した）相当を含む蛋白抽出液１ｍｌを用いて活性測定を行った。活性測定は終濃度で０．５ｍＭ　アスコルビン酸，　１ｍＭ　ＰＭＳＦ，　０．１ｍＭ過酸化水素を含む５０ｍＭ　Ｋ−Ｐ　バッファーで行った。反応は過酸化水素の添加で開始し、アスコルビン酸のΔ２９０吸収の単位時間あたりの減少を測定した。蛋白量が倍になると活性も倍になること、サンプルを煮沸すると活性が失われることから、この系で正しくＡＰＸ活性が測定できていると考えられた。形質転換体ではコントロールの約５倍総ＡＰＸ活性が増加していた（図６）。
【００４０】
（１１）形質転換体植物後代での遺伝子発現解析
当代で遺伝子発現が確認できた５系統のｐＡＰＸｓｔ組換え植物体について４系統では種子が得られたので、それらを順次発芽させ後代での遺伝子発現を解析した。定法に従ってＡＰＸｓｔ８９系統後代植物体のウェスタン分析を行った。系統ＡＰＸｓｔ８９の分離後代Ｔ１世代においても、翻訳レベルの遺伝子発現が確認できた（図７）。このことから導入したＡＰＸ遺伝子は安定に次世代に遺伝しうることが明らかになった。
【００４１】
（１２）ＡＰＸ遺伝子導入植物体のパラコート耐性
ＡＰＸ遺伝子導入により形質転換体イネのアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を最大で５倍強化することに成功したが、その活性の強化により葉緑体内の活性酸素除去能が向上しているかどうかパラコート（メチルビオロゲン）耐性を調べた。温度２６℃、湿度５５％、光強度６００μｍｏｌＥ（昼１４時間、夜１０時間）の組換え温室で生育させたイネから最上位の展開葉を切り出した。切り出した葉の中央部（下端の５ｃｍ部分は用いない）から長さ８ｍｍ×幅８〜１０ｍｍの葉切片を切り出し吉田氏水耕液に浮かべた。０、０．１、０．５、１、２、５、１０μＭ（この濃度条件のいずれかを採用）メチルビオロゲンを含む吉田氏水耕液（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含む。）を入れた２４穴ディッシュに入れ１０分間脱気処理を行った。葉切片を入れたディッシュを温度２６℃、光強度１２００μｍｏｌＥ（常に明条件）のインキュベーターに移し、定期的にＰＡＭ（Ｗａｌｔｚ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＦｖ／Ｆｍ値を測定し、活性酸素発生に伴う障害の度合いを調べた。また、２〜３日後に葉切片の写真を撮り、脱色の度合いを記録した。ＰＡＭによる障害度合いの測定：当代植物（８９はウェスタン＋、１０３はウェスタン−）について調べたところ、１０　μＭ処理区では遺伝子発現のある系統の方が、障害の程度が有意に少なかった（図８ａ）。遺伝子発現の強い８９の後代に関して、遺伝子発現のある個体とない個体に分離していることが見いだされていたが、それらを比較した結果遺伝子発現のある個体はない個体よりも活性酸素障害の度合いが有意に軽減されていた（図８ｂ）。また、パラコート処理３日後に葉の脱色度合いを観察したところＡＰＸ遺伝子導入により、葉の脱色（葉緑体の崩壊）が軽減されることが明らかになった（図９）。以上のパラコート耐性検定は当代・後代ともに２回以上繰り返し検定を行ったが、再現性良く遺伝子導入の効果を検証することができた。
【００４２】
（１３）ＡＰＸ遺伝子導入植物体の耐冷性検定
ウェスタン分析で遺伝子発現がある個体（ＡＰＸｓｔ１０３とＡＰＸｓｔ１０６）と発現のない個体（ＡＰＸｓｔ７６とＡＰＸｓｔ８９）を２個体ずつ用意し、最上位から２番目の葉をサンプリングした。各葉の中央部から幅１．２ｃｍ、長さ１．５ｃｍの葉切片を８枚ずつ切り出した。葉切片を１２枚ずつ１０ｃｍ径のディッシュ（水耕液を含ませたキムタオルを敷く）に挟み込み、氷上で１２００μｍｏｌ　Ｅの光を照射しながら４℃でインキュベートした。
低温強光照射条件を保ったまま、３日間インキュベートした葉切片では、遺伝子発現が強い個体のものが緑色をよりよく保っていた（図１０）。このことから、クラミドモナスＡＰＸ遺伝子をイネに遺伝子導入し、葉緑体チラコイド膜近傍に局在させて発現させることにより、イネの低温脱色耐性が強化できることが明らかになった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明により、イネ科植物体において活性酸素消去系酵素遺伝子の発現を増強させることにより、耐冷性が強化されたイネ科植物体が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ベクターの構築の模式図である。図１Ａは、ｐＨＳＧ／３５ＳＩ／ｃｈｌ／ｃｌＡＰＸ／Ｎｏｓ（ｐＡＰＸ）の構築を示す。図１Ｂは、ｐＨＳＧ／３５ＳＩ／ｃｈｌ／ｃｌＡＰＸ／ｓｔｕｃｋ／Ｎｏｓ（ｐＡＰＸｓｔ）の構築を示す。
【図２】図２は、ＡＰＸ遺伝子導入イネ植物体のサザン分析の結果を示す図（写真）である。コントロールは、　非形質転換体、２７，７５，７６，７７，７８，８９は、形質転換体。
【図３】図３は、ＡＰＸ遺伝子導入イネ植物体のノザン分析の結果を示す図（写真）である。図３Ａは、ｐＡＰＸ導入個体における結果である。コントロールは非形質転換体、３，８，１３，１７は形質転換体。図３Ｂは、ｐＡＰＸｓｔ導入個体における結果である。コントロールは非形質転換体、２７，７５，７６，７７，７８，８９は形質転換体。
【図４】図４は、ＡＰＸ遺伝子導入イネ植物体のウェスタン分析の結果を示す図（写真）である。ペレットはペレット画分、上清は上清画分。コントロールは非形質転換体、７５，７６，７７，７８は形質転換体。
【図５】図５は、ＡＰＸ遺伝子導入イネの翻訳レベルの発現確認の結果を示す図（写真）である。図５Ａは活性染色とウェスタン分析の比較を示す図である。ＳＡＳは非形質転換体、ＡＰＸｓｔ８，ＡＰＸｓｔ２１，ＡＰＸｓｔ２７は形質転換体。図５Ｂは形質転換体植物の活性染色分析の結果を示す図である。コントロールは非形質転換体、７６，８９は形質転換体。
【図６】図６は、ＡＰＸ遺伝子導入イネ植物体のＡＰＸ活性測定の結果を示す図である。
【図７】図７は、ＡＰＸ遺伝子導入イネ植物体の後代（Ｔ１）のウェスタン分析の結果を示す図（写真）である。コントロールは非形質転換体、Ｍは分子量マーカー、ＡＰＸｓｔ８９　　１〜５は形質転換体。
【図８】図８は、ＡＰＸ遺伝子導入植物体のパラコート耐性（Ｆｖ／Ｆｍ値の変化）の検定結果を示す図である。図８Ａは当代（Ｔ０）植物の比較（８９は遺伝子発現あり、１０３は遺伝子発現なし）。図８Ｂは分離後代の比較（８９−３３は遺伝子発現あり、８９−３９は遺伝子発現なし）。
【図９】図９は、ＡＰＸ遺伝子導入イネ植物体のパラコート耐性の検定結果を示す図（写真）である。分離後代（Ｔ１）葉切片を用いたパラコート（メチルビオロゲン）耐性検定。８９−３３は遺伝子発現あり、８９−３９は遺伝子発現なし。メチルビオロゲン処理は０，　５，　１０　ｍＭの３条件。
【図１０】図１０は、ＡＰＸ遺伝子導入イネ植物体の低温脱色耐性の検定結果を示す図（写真）である。１２００μｍｏｌＥの光を照射しながら、葉切片を４℃で３日間低温処理した。ＡＰＸｓｔ１０３およびＡＰＸｓｔ１０６は非形質転換体、ＡＰＸｓｔ７６およびＡＰＸｓｔ８９は形質転換体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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