(57)【要約】【課題】リガンド結合タンパク質の効率のよい製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】タンパク質又はそのドメインと結合するリガンドを添加した無細胞タンパク質合成系で、前記タンパク質又はそのドメインを合成する。好ましい実施形態において、前記リガンドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質及びそれらの誘導体、アルカロイド、テルペン、低分子化合物、補酵素、低分子金属錯体、及び金属イオンからなる群から選ばれる物質であり、前記リガンド結合タンパク質又はそのリガンド結合ドメインが可溶性タンパク質として合成される。【選択図】　　　　　図１
2004105070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質又はそのドメインと結合するリガンドを添加した無細胞タンパク質合成系で、前記タンパク質又はそのドメインを合成することを特徴とするリガンド結合タンパク質又はそのリガンド結合ドメインの製造方法。
【請求項２】
前記リガンド結合タンパク質又はそのリガンド結合ドメインが可溶性タンパク質として合成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質及びそれらの誘導体、アルカロイド、テルペン、低分子化合物、補酵素、低分子金属錯体、及び金属イオンからなる群から選ばれる物質である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、機能が未知のタンパク質又はそのポリペプチドドメインである請求項１〜３何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が受容体、トランスポーター、ＤＮＡ結合タンパク質、タンパク質−タンパク質相互作用するタンパク質、細胞骨格に関連するタンパク質、酸化還元酵素、色素タンパク質又はそれらのリガンド結合ドメインである請求項１〜３何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
目的タンパク質と結合するリガンドをスクリーニングする方法であって、
候補リガンドを用意し、
前記候補リガンドの存在下及び非存在下において無細胞タンパク質合成系で前記目的タンパク質を合成し、
前記各条件下での前記目的タンパク質の合成率、及び／又は可溶化率を測定することを含み、
前記候補リガンドが前記目的タンパク質の合成率、及び／又は可溶化率を向上させる場合に前記候補リガンドが前記目的タンパク質と結合することを示唆する、スクリーニング方法。
【請求項７】
目的タンパク質と結合するリガンドをスクリーニングする方法であって、
候補リガンドを用意し、
前記候補リガンドの存在下及び非存在下において無細胞タンパク質合成系で前記目的タンパク質を合成し、
前記各条件下で合成される目的タンパク質の比活性、及び／又は高次構造の形成を評価することを含み、前記候補リガンドの存在によって前記目的タンパク質の比活性が向上又は低下する、及び／又は所望の高次構造を形成する場合に前記候補リガンドが前記目的タンパク質と結合することを示唆する、スクリーニング方法。
【請求項８】
前記目的タンパク質が、機能が未知のタンパク質又はそのポリペプチドドメインである請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記目的タンパク質が受容体、トランスポーター、ＤＮＡ結合タンパク質、タンパク質−タンパク質相互作用するタンパク質、細胞骨格に関連するタンパク質、酸化還元酵素、色素タンパク質又はそれらのリガンド結合ドメインである請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的タンパク質に結合するリガンドが、前記目的タンパク質の活性化剤である請求項６〜９何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的タンパク質に結合するリガンドが、前記目的タンパク質の阻害剤である請求項６〜９何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
目的リガンドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法であって、
候補タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製し、
前記目的リガンドの存在下及び非存在下において無細胞タンパク質合成系で前記ポリヌクレオチドから候補タンパク質を発現させ、
前記各条件下での候補タンパク質の発現率、及び／又は発現した候補タンパク質の可溶化率を測定することを含み、
前記目的リガンドが前記候補タンパク質の発現率、及び／又は発現した候補タンパク質の可溶化率を向上させる場合に、前記候補タンパク質が前記目的リガンドと結合することを示唆するスクリーニング方法。
【請求項１３】
目的リガンドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法であって、
候補タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製し、
前記目的リガンドの存在下及び非存在下において無細胞タンパク質合成系で前記ポリヌクレオチドから候補タンパク質を発現させ、
前記各条件下で発現した候補タンパク質の比活性、及び／又は高次構造の形成を評価することを含み、
前記目的リガンドの添加によって前記候補タンパク質の比活性が向上又は低下する、及び／又は所望の高次構造を形成する場合に、前記候補タンパク質が前記目的リガンドと結合することを示唆するスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記目的リガンドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質及びそれらの誘導体、アルカロイド、テルペン、低分子化合物、補酵素、低分子金属錯体、及び金属イオンからなる群から選ばれる物質である請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記候補タンパク質が、機能が未知のタンパク質又はそのポリペプチドドメインである請求項１２又は１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無細胞タンパク質合成系によるリガンド結合タンパク質の製造方法に関し、詳しくは該リガンド結合タンパク質に結合するリガンドを添加した無細胞タンパク質合成系で、該リガンド結合タンパク質を製造する方法、及びその製造方法を用いたリガンドのスクリーニング方法並びにリガンド結合タンパク質のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトを含む多くの生物種のＤＮＡ塩基配列の解読が急速に進み、これら大量のゲノム配列情報から抽出される膨大な数の遺伝子について、個々の遺伝子にコードされるタンパク質の立体構造を体系的に解き明かし、構造と機能との関係を解明することが重要な課題となってきている。
【０００３】
この「構造ゲノム科学」において、構造解析の対象となるタンパク質のうち、重要なものとしては、転写因子や抗体、受容体タンパク質、細胞内のシグナル伝達に関与するタンパク質等のリガンド結合タンパク質が挙げられる。また、これらのタンパク質の構造決定や機能解析を行うことは、新規な医薬品開発等の上でも有用な情報をもたらす。
【０００４】
従来、このようなタンパク質を、可溶性で且つその正確な立体構造を形成した状態で発現させる方法としては、大腸菌や酵母、動物細胞、昆虫細胞等の細胞を用いた発現系が広く用いられている。しかしながら、上記リガンド結合タンパク質の中には、リガンドを結合した状態でのみ安定に存在し、あるいは正しい立体構造を形成するものがある。このようなタンパク質を発現させるため、生細胞の培養液等に適当な種類のリガンドを添加した場合、細胞への取り込み効率は一般的に低く、大量の発現には困難な面があった。また、タンパク質の立体構造形成（フォールディング）時にリガンドを必要とする場合、ないしはタンパク質のフォールディングの維持にリガンドを必要とする場合、リガンドが無い状態で合成したタンパク質にリガンドを追加しても、正常なフォールディングを形成させるという目的の達成は困難である。またタンパク質合成系として極めて有用な無細胞タンパク質合成系においては、リガンド結合タンパク質を可溶性でかつ正確な立体構造を形成した状態で発現させることはできなかった。
【０００５】
さらに、ゲノムの塩基配列の解析からこれまで未知であった多くのタンパク質の存在が推測され、これらの中には受容体等のリガンド結合タンパク質と類似するが、生体内におけるそれらの機能はもとより相互作用するリガンドさえ未知である、いわゆるオーファン受容体が数多く見出されている。このようなタンパク質の相互作用を解析する方法として、これまで、免疫沈澱法（例えば、非特許文献１参照）、ファージディスプレイ法（例えば、非特許文献２参照）、酵母のツーハイブリッド法（例えば、特許文献１、及び非特許文献３参照）、プロテインチップ法（例えば、特許文献２、及び３参照）等が報告されているが、リガンドがタンパク質の場合だけでなく低分子リガンドの場合などあらゆる場合に適用でき、且つ簡便な方法でリガンド結合タンパク質に結合するリガンドをスクリーニングする方法が望まれている。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５２８３１７３号明細書
【特許文献２】
特開２００１−２４２１１６号公報
【特許文献３】
米国特許第６３６５４１８号明細書
【非特許文献１】
フィジキー・イー・エム（Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，　Ｅ．Ｍ．）、フィールズ・エス（Ｆｉｅｌｄｓ，　Ｓ．）、「マイクロバイオロジカル・レビュー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｒｅｖ．）」、１９９５年３月、第５９巻、ｐ．９４−１２３
【非特許文献２】
スミス・ジー・ピー（Ｓｍｉｔｈ，　Ｇ．Ｐ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、６月１４日、第２２８巻、ｐ．１３１５−１３１７
【非特許文献３】
フィールズ・エス（Ｆｉｅｌｄｓ，　Ｓ．）、ソング・オー（Ｓｏｎｇ，　Ｏ）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９８９年、第３４０巻、ｐ．２４５
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような問題点に鑑み、本発明は、リガンド結合タンパク質の効率のよい製造方法を提供することを課題とする。また、そのような製造方法を用いてリガンド結合タンパク質に結合するリガンドのスクリーニング方法を提供することを課題とする。さらに特定のリガンドに対して、これと結合する新規なリガンド結合タンパク質のスクリーニング方法を提供することも課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者等は種々の検討を行った結果、リガンド結合タンパク質に結合するリガンドの存在下において、無細胞タンパク質合成系を用いて該リガンド結合タンパク質を合成することにより、上記課題であるリガンドの取り込み効率や分解等の問題点が解消され、可溶性でかつ正しい立体構造を保った状態の所望のタンパク質やタンパク質ドメインが得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、第１の視点において、本発明の製造方法は、タンパク質又はそのドメインと結合するリガンドを添加した無細胞タンパク質合成系で、前記タンパク質又は前記ドメインを合成することを特徴とする。
【００１０】
好ましい実施形態において、前記リガンドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質及びそれらの誘導体、アルカロイド、テルペン、低分子化合物、補酵素、低分子金属錯体、及び金属イオンからなる群から選ばれる物質であり、前記リガンド結合タンパク質又はそのリガンド結合ドメインが可溶性タンパク質として合成されることを特徴とする。
【００１１】
本発明の第２の視点において、目的タンパク質と結合するリガンドをスクリーニングする方法であって、（ａ）候補リガンドを用意し、（ｂ）前記候補リガンドの存在下及び非存在下において無細胞タンパク質合成系で前記目的タンパク質を合成し、（ｃ）前記各条件下で合成された目的タンパク質の合成率、可溶化率、比活性及び高次構造の形成からなる群から選択される１又は２以上の性質を評価することを含み、前記候補リガンドの存在が前記目的タンパク質の合成率、及び／又は可溶化率を向上させ、前記目的タンパク質の比活性を向上若しくは低下させ、又は所望の高次構造を形成する場合に前記候補リガンドが前記目的タンパク質と結合することを示唆するスクリーニング方法が提供される。本発明において、リガンドと結合したタンパク質の合成率（合成量）が増加し、及び／又は可溶性が向上する理由は、おそらくリガンドと結合することによってタンパク質の立体構造が安定化し、分解が抑制されると共に、正確な立体構造が形成されることによってタンパク質の不溶化や凝集が抑制されるためであると推測される。
【００１２】
好ましい実施形態において、前記目的タンパク質は、機能が未知のタンパク質又はそのポリペプチドドメインであり、又は、受容体、トランスポーター、ＤＮＡ結合タンパク質、タンパク質−タンパク質相互作用するタンパク質、細胞骨格に関連するタンパク質、酸化還元酵素、色素タンパク質、若しくはそれらのリガンド結合ドメインであることを特徴とする。
【００１３】
一つの実施形態において、前記目的タンパク質に結合するリガンドは、前記目的タンパク質の活性化剤、又は阻害剤であることを特徴とする。
【００１４】
本発明の第３の視点において、目的リガンドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法であって、（ａ）候補タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製し、（ｂ）前記目的リガンドの存在下及び非存在下において無細胞タンパク質合成系で前記ポリヌクレオチドを発現させ、（ｃ）前記各条件下で発現した候補タンパク質の発現率、可溶化率、比活性及び高次構造形成からなる群から選択される１又は２以上の性質を評価することを含み、前記１又は２以上の性質が前記目的リガンドの添加によって向上若しくは低下し、又は所望の高次構造が形成される場合に、前記候補タンパク質が前記目的リガンドと結合することを示唆するスクリーニング方法が提供される。
【００１５】
好ましい実施形態において、前記目的リガンドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質及びそれらの誘導体、アルカロイド、テルペン、低分子化合物、補酵素、低分子金属錯体、補酵素及び金属イオンからなる群から選ばれる物質であり、前記タンパク質が機能が未知のタンパク質又はそのポリペプチドドメインであることを特徴とする。さらに本発明は薬理活性のあるリガンドや創薬ターゲットとして公知であるタンパク質をリガンドとすることによって、新規創薬ターゲットをスクリーニングする方法を提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
（リガンド結合タンパク質）
生体内におけるタンパク質は、ほとんどが複合体として代謝経路やシグナル伝達経路などにおいて他のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいは低分子化合物や低分子金属錯体などの特定のリガンドと相互作用することによりその機能を発現することが知られている。例えば、種々の抗原に対する特異抗体、受容体、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）、金属結合タンパク質、リン酸化タンパク質、特定の基質に対する酵素タンパク質、酵素に対するインヒビタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質などである。本発明の実施形態において、低分子化合物とは、例えば、天然有機化合物、合成有機化合物などの分子量１０００以下の化合物をいう。また、低分子金属錯体、あるいは金属錯体とは、例えば、ポルフィリン金属錯体、フタロシアニン金属錯体等をいう。
【００１７】
特に、医薬品の開発ターゲットとして、低分子リガンドと結合するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、トランスポーター、イオンチャネルなどが重要であり、アドレナリン受容体、アセチルコリン受容体、ヒスタミン受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、グルタミン酸受容体、セロトニントランスポーター、エストロゲン受容体、Ｃａ２＋チャネル、Ｎａ＋チャネル、Ｃｌ−チャネルなどが挙げられる。膜貫通ドメインを１個だけ有する成長ホルモン受容体ファミリーではリガンドタンパク質の結合によって、細胞外で二量体化した受容体の構造変化が生じて膜貫通ドメインの相対的な構造変化が生じ、これが細胞内ドメインの構造変化をもたらす。膜貫通ドメインを７回有し、細胞内ドメインにＧタンパク質が結合するＧＰＣＲでは、リガンドの結合によって膜貫通ドメインが大きく変化してこのドメインを結ぶループ構造に大きな変化をもたらしＧタンパク質の活性を引き起こすことが知られている。
【００１８】
金属を結合するタンパク質には生体内の鉄の量を調整するトランスフェリンやフェリチン、亜鉛などの重金属を結合するメタロチオネインなどある。また、酵素の中には活性発現や構造の安定化に金属イオンを必要とする金属酵素も多い。本発明の１つの実施形態においてリガンドとして使用する金属種は、たとえ低濃度であっても反応系に溶解していれば良く、例えば、カルシウム、カドミウム、亜鉛、鉄等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
さらにＤＮＡ結合タンパク質としては、染色体ＤＮＡに比較的強く結合し染色体の高次構造の保持に関与するもの（例えば、ヒストン）や、二本鎖ＤＮＡに結合し遺伝子の発現、調節に関与するもの（例えば、転写因子）、二本鎖あるいは一本鎖ＤＮＡに結合し、切断、修復等を行う酵素活性を有するもの（例えば、制限酵素）、一本鎖ＤＮＡに結合し複製、修復、組換え、あるいは一部の遺伝子の発現調節に関与するもの（例えば、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）、ＤＮＡの構造やトポロジー変化を触媒するもの（例えば、ＤＮＡヘリカーゼ）などがある。
【００２０】
タンパク質−タンパク質相互作用するタンパク質としては、例えば、上述した受容体等に結合したリガンドのシグナルを細胞内に伝えるための種々のタンパク質が挙げられる。膜受容体によるシグナル伝達において、特に重要なもののひとつにＧタンパク質がある。Ｇタンパク質は３つのポリペプチド、すなわち、ＧＴＰに結合しこれを加水分解するαサブユニット、非共有結合で強固に結合した２量体を形成するβ、γサブユニットからなる。ＧＤＰがαサブユニットに結合すると、αサブユニットはβγ複合体に結合して不活性の３量体を形成し、受容体のＣ末端側に結合する。リガンドが受容体に結合すると、受容体の細胞質内ドメインの構造が変化する。続いてＧＤＰ結合αサブユニットの構造も変化し、ＧＤＰ親和性が低下してαサブユニットの活性部位からＧＤＰが解離する。ＧＴＰの細胞内濃度はＧＤＰの約１０倍もあるので、ＧＴＰはこの活性部位にすばやく結合する。ＧＴＰが結合したαサブユニットは、活性化構造をとって、受容体及びβγ複合体のいずれからも解離し、他のエフェクター分子を活性化して受容体からの情報を細胞内に伝えることが知られている。Ｇタンパク質によって活性化されるエフェクター分子としては、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、及びβ−アドレナリン作動性レセプターキナーゼ（βＡＲＫ）等がある。
【００２１】
タンパク質−タンパク質相互作用するタンパク質としては細胞内シグナル伝達機構に関与するタンパク質も挙げられる。細胞内シグナル伝達機構では、１）セリン／トレオニンキナーゼ、チロシンキナーゼ、セリン／トレオニンホスファターゼ、チロシンホスファターゼ、２）セカンドメッセンジャー、３）αβγサブユニット型Ｇタンパク質、４）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質などが基本因子となり、これら基本因子は基本的には上流のシグナルを受けて活性型になり、下流にシグナルを伝達した後に不活性型に戻るということを繰り返しながらシグナルを伝達している。これらに関与するタンパク質を例示すれば、セリン／トレオニンキナーゼとしてＡキナーゼやＣキナーゼ、チロシンキナーゼとして上皮増殖因子受容体やＳｒｃファミリーメンバー、セリン／トレオニンホスファターゼとしてホスファターゼ１、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、チロシンホスファターゼとしてＣＤ４５やＬＡＲ等がある。またαβγサブユニット型Ｇタンパク質としては受容体とアデニル酸シクラーゼやホスホリパーゼＣと連結するＧｓ、Ｇｑなどがあり、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質としてはＲａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｂｎなどがある。
【００２２】
細胞骨格に関連するタンパク質としては、微小管を形成するチューブリン、アクチンフィラメントを形成するアクチンや中間径フィラメントを形成するビメンチン、ケラチン、ラミン等が挙げられる。これらのタンパク質は、ＡＴＰやＧＴＰ等と結合し、自ら、又は他のタンパク質と会合して細胞骨格を形成し、細胞自身が形を変えたり、移動したり、細胞質中でオルガネラ（細胞内小器官）を移動させたり、Ｍ期に染色体を分離したりする。
【００２３】
酸化還元酵素としては、例えば、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）や酸素添加酵素（オキシゲナーゼ）などがあり、ＮＡＤやＮＡＤＰ等の補酵素、キノン類、シトクロム類などと相互作用する。色素タンパク質としては、例えば、視色素を構成するオプシン、植物色素タンパク質フィトクロム、フォトトロピン、光合成関連の集光性色素タンパク質フィコシアニン等があり、補欠分子族であるそれぞれの色素と種々の結合様式（配位結合、イオン結合、水素結合等）で相互作用する。
【００２４】
（発現用ポリヌクレオチドの構築）
上記リガンド結合タンパク質又はそのリガンド結合ドメインを、これと結合するリガンドを含む無細胞タンパク質合成系で発現させる。無細胞タンパク質合成系で発現させるためのポリヌクレオチドは、従来より公知の任意の方法で調製することができ、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでも良い。また、蛍光物質などによる標識、メチル化、キャップ構造の付加、ヌクレオチドアナログなどにより置換されていても良い。
【００２５】
ＤＮＡの場合には通常二本鎖であるが、環状二本鎖でも直鎖状二本鎖でもいずれでも良く、これらは無細胞タンパク質合成系で転写及び翻訳される。これらは当業者に周知であって大腸菌等を宿主とする従来の組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。あるいは、宿主細胞を形質転換することなくＰＣＲ等の試験管内でのＤＮＡ増幅技術によって調製することもできる。ＲＮＡの場合には、通常一本鎖のｍＲＮＡとして用いられ、無細胞タンパク質合成系で翻訳される。これらの技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　１９８９；　Ｄ．　Ｎ　Ｇｌｏｖｅｒ　（ｅｄ．），　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉａｎｄ　ＩＩ，　１９８５；　Ｍ．　Ｊ．　Ｇａｉｔ　（ｅｄ．），　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　１９８４等に記載されている。
【００２６】
無細胞タンパク質合成系での転写、翻訳に必要な配列としては、例えばＴ７プロモーター等の強力なプロモーター、リボソーム結合部位、Ｔ７ターミネーター等の配列の他に、発現した融合タンパク質の精製を効率的に行うためＧＳＴなどの融合タンパク質の配列あるいはヒスチジンなどのタグ配列を付加することもできる。
【００２７】
目的とするリガンド結合タンパク質又はそのリガンド結合ドメインは、単独でも、他のタンパク質との融合タンパク質としても、あるいはタグを付加したタンパク質としても発現させることができる。他のタンパク質としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、又はプロテインＧ等が用いられる。タグとしては、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ　ｔａｇ）、又はＦｌａｇ　ｔａｇ等が使用される。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、上記リガンド結合タンパク質又はそのリガンド結合ドメインは、チオレドキシンとの融合タンパク質として発現させることができる。本形態に用いられるチオレドキシンは大腸菌のチオレドキシン（Ｌｕｎｎ，　Ｃ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５９，　１０４６９−１０４７４　（１９８４））のみでなく、哺乳類のチオレドキシン（Ｗｏｌｌｍａｎ，　Ｅ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３，　１５５０６−１５５１２　（１９８８））、酵母のチオレドキシン、プロテインジスルフィドイソメラーゼのチオレドキシンドメイン（Ｅｄｍａｎ，　Ｊ．Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３１７，　２６７−２７０　（１９８５））及びこれらのポリペプチドにおいて１又は複数のアミノ酸が欠失、付加又は置換され且つジスルフィド結合の形成を触媒しうるポリペプチド等も使用可能である。
【００２９】
目的とするリガンド結合タンパク質をチオレドキシンとの融合タンパク質として発現させるためには種々の方法を用いることができ、例えば、該リガンド結合タンパク質のＮ末端側やＣ末端側でチオレドキシンと融合させて、或はタンパク質を構成するドメインの間にチオレドキシン配列を挿入して融合タンパク質を発現させることができる。チオレドキシン配列の近傍にマルチクローニング部位を有するプラスミドベクターは目的とするリガンド結合タンパク質の遺伝子を挿入して無細胞タンパク質合成系での鋳型ＤＮＡを作成するために好ましく用いられる。また、融合タンパク質から目的とするリガンド結合タンパク質のみを限定的に切り出して単離するため、チオレドキシンとの境界領域にエンテロキナーゼなどのプロテアーゼによって切断される特異的な配列を挿入しておくことが特に好ましい。
【００３０】
（無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成）
上記のように調製したポリヌクレオチドを無細胞タンパク質合成系で発現させる。本発明における無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系であり、このような合成系として、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボゾーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系、又はＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む系の何れでも良い。ＤＮＡを鋳型として用いる場合には、ＰＣＲ等の試験管内での増幅反応により、従来必要とされたクローニングという煩雑な操作を経ることなく、多数の鋳型ＤＮＡを同時並行的に迅速に調製することができる。
【００３１】
上記細胞抽出液としては、リボゾーム、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に必要な成分を含む真核細胞又は原核細胞の抽出液が使用可能である。前記真核細胞及び原核細胞としては従来公知のものが何れも使用可能であり、具体的に例示すれば、大腸菌、好熱性細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母などが挙げられ、特に大腸菌由来のもの（例えば大腸菌Ｓ３０細胞抽出液）又は高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のものが高い合成量を得る点において望ましい。該大腸菌Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌Ａ１９（ｒｎａ，　ｍｅｔ），　ＢＬ２１，　ＢＬ２１　ｓｔａｒ，　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ株等から公知の方法（Ｐｒａｔｔ，　Ｊ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　−ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，　（１９８４），　ｐｐ．１７９−２０９，　Ｈｅｎｅｓ，　Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，　Ｓ．Ｊ．編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　　Ｏｘｆｏｒｄ参照）に従って調製できるし、あるいはＰｒｏｍｅｇａ社やＮｏｖａｇｅｎ社から市販されるものを使用してもよい。無細胞タンパク質合成系の組成や合成方法については種々の方法が開発されているが、例えば、本発明者らにより改良された透析法を用いる高効率合成系は、特開２０００−１７５６９５号公報に詳細に説明されており、必要に応じその内容は本願に引用をもって援用される。
【００３２】
本発明の方法においては、上記無細胞タンパク質合成系にタンパク質又はそのドメインと結合するリガンドを添加する。このリガンドは、発現させようとするタンパク質又はそのドメインによって異なるが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質及びそれらの誘導体、アルカロイド、テルペン、低分子化合物、補酵素、低分子金属錯体、及び金属イオンからなる群から選ばれる何れか一種又は二種以上のリガンドである。リガンドの添加量としては、合成系における理論的タンパク質合成量の１〜１０倍等量を、１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０００μＭの濃度で添加する。
【００３３】
無細胞タンパク質発現系で発現したタンパク質又はそのドメインの合成率は種々の方法によって測定することができる。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は最も一般的な分析方法である。還元条件下でＳＤＳによってタンパク質を処理するとタンパク質は完全に変性し、ポリペプチドに解離する。ポリペプチドは還元条件下、重量比で約１．４倍量のＳＤＳと結合し、ＳＤＳ複合体を形成する。形成されたＳＤＳ複合体は、過剰のドデシル硫酸イオンの負電荷により、一定の電場内を一定の速度で移動する。従って、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動すれば分子ふるい作用により分子量に基づいてタンパク質を分離することができ、目的のタンパク質を分子量を指標として検出することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、１種類のｐＨの緩衝液を用いる連続緩衝液系と、複数のｐＨの緩衝液を用いる不連続緩衝液系とがある。また、分離するタンパク質の種類によって、低ＢＩＳ濃度ゲル電気泳動、濃度勾配ゲル電気泳動、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどを用いることができる。分離されたタンパク質は一般的にはクーマシーブルーなどの色素により染色して定量することができる。銀染色法はクーマシーブルー染色の２０〜１００倍の感度でタンパク質を同定することができる。あるいは、市販されているＳＹＰＲＯ　ＲｕｂｙやＳＹＰＲＯ　Ｏｒａｎｇｅなどの蛍光試薬を用いてゲル上で感度よく検出できる（Ｐａｔｔｏｎ，　Ｗ．Ｆ．　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，　２１，　１１２３−１１４４　（２０００））。またタンパク質を放射能標識すればオートラジオグラフィーやフルオログラフィーによって検出することができる。
【００３４】
（目的タンパク質と結合するリガンドのスクリーニング方法）
受容体の中には、その本来のリガンドが未だ知られていない、いわゆる「オーファン受容体」と呼ばれるものも存在する。本発明においては、このような目的タンパク質の候補リガンドを用意し、前記候補リガンドの存在下及び非存在下において無細胞タンパク質合成系で前記目的タンパク質を合成し、前記各条件下で合成された目的タンパク質の合成率、可溶化率、比活性及び／又は高次構造形成の評価を行うことを含み、前記候補リガンドの存在が、前記目的タンパク質の合成率、可溶化率を向上させ、比活性を向上若しくは低下させ、及び／又は前記目的タンパク質の所望の高次構造を形成させる場合に前記候補リガンドが前記目的タンパク質と結合することを示唆するスクリーニング方法が提供される。本発明において、合成率とは、無細胞タンパク質合成系の単位容量当たりのタンパク質合成量、又は単位時間当たりのタンパク質合成量のいずれでもよい。また、可溶化率とは、無細胞タンパク質合成系で合成された全タンパク質の内、可溶性画分に回収されるタンパク質量をいう。ここで、候補リガンドとしては種々のものが考えられるが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質及びそれらの誘導体、アルカロイド、テルペン、低分子化合物、補酵素、低分子金属錯体、及び金属イオンからなる群から選ばれる物質である。これらに属する化合物又は分子をそれぞれ単独で又は二種以上を組合わせて無細胞タンパク質合成系に添加する。タンパク質の合成率及び可溶化率は上述したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、あるいはＴｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定することができる。
【００３５】
好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系でのタンパク質の合成率及び可溶化率は、レポータータンパク質との融合タンパク質を合成して測定することができる。例えば、大腸菌由来のβ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子（ｌａｃＺ）は種々の細胞の形質転換におけるレポーター遺伝子としてよく使用されている。この酵素の生体内での基質はラクトースであるが、ほぼあらゆるβガラクトシドを加水分解することができ、例えば、無色の基質であるＯＮＰＧを加水分解して４２０ｎｍの光を吸収する黄色のｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを生成する。また、ｘ−ｇａｌはこの酵素により分解されてインディゴブルーの呈色反応を示す。
【００３６】
アルカリフォスファターゼは、分子触媒活性の極めて高い酵素であり、種々の蛍光及び発光基質も開発されているため高感度測定に好適である。
【００３７】
ホタルルシフェラーゼはＡＴＰの存在下でルシフェリンの酸化を触媒し、光子を生成する化学ルミネッセンス反応を触媒する。通常は鋭いスパイク波光が放射された後、急速に減衰するが、反応系にＣｏｅｎｚｙｍｅ　Ａを加えた場合にはより均一な光放射が得られる。
【００３８】
本実施形態において、特に好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が用いられる。ＧＦＰはオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ）等から発見された蛍光タンパク質であり、共存する発光タンパク質であるエクオリンの青色化学発光をエネルギー変換して緑色にすることが知られている（Ｐｒａｓｈｅｒ，　Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　１１，　２２９−２３３，　１９９２）。このＧＦＰは上記エクオリンやルシフェラーゼのように特殊な蛍光団を必要とせず、自らのアポタンパク質上で自動的に蛍光団を形成する。このため、クローン化されたＧＦＰｃＤＮＡを用いてこれまでに細菌、酵母、カビ、植物、昆虫及び動物細胞等で発現されて、遺伝子発現の指標として用いられている。また、ＧＦＰ遺伝子に種々の方法により変異を導入して多くのＧＦＰ誘導体が作製され、これらの中には野生型ＧＦＰよりも強い蛍光強度を示したり、異なる波長の蛍光を発する誘導体があることが報告されている（Ｅｈｒｉｇ，Ｔ．，　Ｏ’Ｋａｎｅ，Ｄ．，ａｎｄ　Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ，Ｆ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３６７，　１６３−１６６，　１９９５及びＣｒａｍｅｒｉ，Ａ．，　Ｗｈｉｔｅｈｏｍ，　Ｅ．，　Ｔａｔｅ，Ｅ．，　ａｎｄ　Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　１４，　３１５−３１９，　１９９６参照）。本実施形態においてもこれらのＧＦＰ又はその誘導体をレポーターとして用いることによって、無細胞タンパク質合成系でのタンパク質の合成率を迅速かつ簡便に測定することができる。
【００３９】
本発明の他の実施形態において、上記目的タンパク質の合成率や可溶化率に代わりに、目的タンパク質の比活性や高次構造形成を評価することによっても候補リガンドと結合するか否かを同定することができる。目的タンパク質の活性測定方法は、個々のタンパク質の特性に応じて通常の生化学的な活性測定方法が利用される。一方、タンパク質の高次構造形成の評価は種々の方法を用いて行うことができる。ここで、高次構造とは、α−へリックスやβ−シート構造及びランダムコイル等の２次構造、これらの２次構造が空間的に折りたたまれてできる３次構造、さらに、ある種のタンパク質ではこれらの単位がサブユニット成分として複数個集合して形成される４次構造等をいう。所望の高次構造とは、タンパク質が生体内で機能を発揮するために必要な上記何れかの高次構造のことをいう。これらの高次構造は、円偏光二色性（ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）、Ｘ線結晶構造解析やＮＭＲ等の分光学的方法を用いることにより解析することができる。ＮＭＲはＸ線結晶構造解析法と共にタンパク質や核酸などの生体高分子の立体構造解析法として幅広く適用されている。ＮＭＲによる解析は分子量２〜３万以下の分子が好ましいが、リガンド結合ドメインの単位としては適当である。ＮＭＲシグナルは分子の局所的環境変化（リガンドとの結合、構造変化など）を敏感に反映する。例えば、タンパク質とリガンドが結合して複合体を形成する場合、リガンドと結合した状態のタンパク質の構造を特異的に検出することもできる。１５Ｎで均一にラベルしたタンパク質を用いた１５Ｎ−１Ｈ　ＨＳＱＣスペクトルを利用すれば、タンパク質のＮＭＲシグナルのみを観測することができる。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用解析のためには、複合体形成に伴うＮＭＲシグナルの化学シフト変化（化学シフト摂動法）や主鎖アミド水素の水素−重水素置換速度変化（Ｈ−Ｄ交換法）、交差飽和法なども用いることができる。
【００４０】
このようなリガンド結合タンパク質の具体例として、受容体、トランスポーター、ＤＮＡ結合タンパク質、タンパク質−タンパク質相互作用するタンパク質、細胞骨格に関連するタンパク質、酸化還元酵素、色素タンパク質又はそれらのリガンド結合ドメインが挙げられる。受容体とリガンドとの結合が異常な場合に、生物学的に病的な状態となることが知られている。本来のリガンドよりも強力に受容体を活性化する物質をスクリーニングしたり、受容体とリガンドとの結合を阻害する分子をスクリーニングすることは医薬品の開発において重要な方法である。本発明の方法を用いることによって、このような受容体等の目的タンパク質の活性化剤又は阻害剤をスクリーニングすることができる。
【００４１】
（目的リガンドと結合するタンパク質のスクリーニング方法）
一方、特定のリガンドに対する受容体等のタンパク質が未知の場合は、この目的リガンドに対する候補タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用意し、前記目的リガンドの存在下及び非存在下において無細胞タンパク質合成系で前記ポリヌクレオチドを発現させ、前記各条件下で発現した候補タンパク質の発現率、可溶化率、比活性及び高次構造形成からなる群から選択される１又は２以上の性質を評価することを含み、前記１又は２以上の性質が前記目的リガンドの添加によって向上若しくは低下し、又は所望の高次構造が形成される場合に、前記候補タンパク質が前記目的リガンドと結合することを示唆するスクリーニング方法が提供される。本発明において、目的リガンドとは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質及びそれらの誘導体、アルカロイド、テルペン、低分子化合物、補酵素、低分子金属錯体、及び金属イオンからなる群から選ばれる物質が考えられ、これらに属する生理活性物質又は薬剤などが挙げられる。例えば、近年、種々の免疫抑制剤は細胞内の特異的な受容体と結合し、この複合体がシグナル伝達経路を介する転写因子の活性化を阻害することによって免疫担当細胞であるＴ細胞の活性化を抑制することが知られている。作用機構の不明な免疫抑制剤などの薬剤について本発明の方法を用いることによって、これらの薬剤が直接結合する受容体をスクリーニングすることができ、その作用機構の解明を通じて新規な医薬品の開発を行うことができる。
【００４２】
【実施例】
以下に本発明の実施例として、シロイヌナズナ由来のタンパク質ドメインＳＰＬ９−ＤＢＤ（アラビドプシスｃＤＮＡ　ＲＡＦＬ０４−１３−Ｉ１１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃ．　Ｎｏ．　ＡＹ０４６００７参照）によってコードされる６６−１５１アミノ酸残基（配列番号２））およびＳＰＬ１２−ＤＢＤ（アラビドプシスｃＤＮＡ：ＲＡＦＬ０９−４１−Ｍ１６（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃ．　Ｎｏ．　ＡＹ０９１０２４参照）によってコードされる１２４−２０５アミノ酸残基（配列番号４））を用いて本発明の方法について検討した結果を詳細に説明する。これらのタンパク質ドメインは、ＢＬＡＳＴなどのホモロジー検索プログラムを用いて他のＤＮＡ結合タンパク質及びジンクフィンガータンパク質（Ｚｎ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）とのアミノ酸配列のホモロジー解析からＤＮＡ結合能及び亜鉛結合能があると推測されるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
［実施例１］
（１）発現ベクターの構築
無細胞タンパク質合成系で遺伝子を発現させるために、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（２段階ＰＣＲ）法（特願２００１−２０１３５６号参照）を用いて、ＳＰＬ９−ＤＢＤ及びＳＰＬ１２−ＤＢＤ遺伝子にＴ７プロモーター、ＳＤ配列、Ｔ７ターミネーターを付加したＤＮＡ断片を調製した。
（ＳＰＬ９−ＤＢＤの場合）
ＳＰＬ９−ＤＢＤをコードするｃＤＮＡ　ＲＡＦＬ０４−１３−Ｉ１１がプラスミド　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋にクローン化されたプラスミドを含む組換え大腸菌培養液（１０倍希釈して使用）と、５’プライマー：５’−　ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＡＧＴＣＧＧＧＴＣＡＧ　−３’（ａｔｒ００１００３８５１．６６ＦＷ；配列番号５）、及び３’プライマー：５’−　ＧＧＧＣＧＧＧＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＴＣＡＴＴＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴ　−３’（ａｔｒ００１００３８５１．１５１ＲＶ；配列番号６）とを用いて第１次ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応組成液を表１に、ＰＣＲ反応プログラムを表２に示した。
【００４４】
【表１】第１次ＰＣＲ反応の反応液組成
2004105070.tif 000003
【００４５】
【表２】第１次及び第２次ＰＣＲ反応のプログラム
2004105070.tif 000004
【００４６】
次に、上記反応によって得られた第１次ＰＣＲ産物（５倍希釈して使用）と、Ｔ７プロモーター配列の下流にＨｉｓタグ配列を有する５’プライマー：５’−ＧＣＴＣＴＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＴＣＧＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣ−３’（Ｔ７Ｐ−ＤＭ２−ＮＨｉｓ、配列番号７）、Ｔ７ターミネーター配列を有する３’プライマー：５’−ＡＡＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＣＣＣＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＧＴＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣＣＧＧＡＴＡＡＣＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣ−３’（Ｔ７Ｔ−ＤＭ５、配列番号８）、およびユニバーサルプライマー：５’−ＧＣＴＣＴＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＴＣＧ−３’（Ｕ２、配列番号９）とを用いて第２次ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液組成を表３に示した。なお、ＰＣＲ反応プログラムは表２に示したものと同様である。
【００４７】
【表３】第２次ＰＣＲ反応の反応液組成
2004105070.tif 000005
【００４８】
（ＳＰＬ１２−ＤＢＤの場合）
ＳＰＬ１２−ＤＢＤ　をコードするｃＤＮＡ　ＲＡＦＬ０９−４１−Ｍ１６がプラスミド　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋にクローン化されたプラスミドを含む組換え大腸菌培養液（１０倍希釈して使用）と、５’プライマー：５’−　ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＡＴＴＴＧＴＴＧＴＣＡＧＧＴＡＧ　−３’（ａｔｒ００１００４２８２．１２４ＦＷ、配列番号１０）及び３’プライマー：５’−　ＧＧＧＣＧＧＧＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＴＣＡＴＴＡＡＧＴＡＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴ　−３’（ａｔｒ００１００４２８２．２０５ＲＶ、配列番号１１）とを用いて第１次ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応組成液及びＰＣＲ反応プログラムは、上記表１（ただし、５’プライマーはａｔｒ００１００４２８２．１２４ＦＷ、３’プライマーはａｔｒ００１００４２８２．２０５ＲＶである。）及び表２と同様である。更に、上記反応によって得られた第１次ＰＣＲ産物と、Ｔ７プロモーター配列の下流にＨｉｓタグ配列を有する５’プライマー（Ｔ７Ｐ−ＤＭ２−ＮＨｉｓ、配列番号７）、Ｔ７ターミネーター配列を有する３’プライマー（Ｔ７Ｔ−ＤＭ５、配列番号８）、及びユニバーサルプライマー（Ｕ２、配列番号９）とを用いて第２次ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応プログラムは上記表３及び表２と同様である。
【００４９】
続いて、このＤＮＡ断片をＴＯＰＯ　ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｐＰＣＲ２．１にクローン化し、発現ベクターＰ０１１１２６−０１　（ＳＰＬ９−ＤＢＤ）及びＰ０１１１２６−０５　（ＳＰＬ１２−ＤＢＤ）をそれぞれ構築した。
【００５０】
（２）透析法を用いた無細胞タンパク質合成反応
大腸菌Ｓ３０抽出液はＺｕｂａｙら（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉ．，７，２６７−２８７，１９７３）の方法に従って、大腸菌ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ株から調製した。タンパク質合成反応は下記の表４に示した組成の反応液を、表５に示した組成の透析外液に対して透析し、３０℃で８時間行った。反応スケールは反応液３０μｌ、透析外液３００μｌとし、亜鉛又はその他の金属化合物を終濃度で５０μＭとなるように反応液及び透析外液の両方に加えた。対照実験はこれらの金属化合物を加えずに合成反応を行った。
【００５１】
【表４】タンパク質合成反応液組成
2004105070.tif 000006
【００５２】
【表５】透析外液組成
2004105070.tif 000007
【００５３】
（３）合成率と可溶化率の評価
合成反応終了後の反応液１０μｌに１ｘＰＢＳ　ｂｕｆｆｅｒ　（１３７ｍＭ　ＮａＣｌ，　８．１ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，　２．６８ｍＭ　ＫＣｌ，　１．４７ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，　ｐＨ７．８）を５０μｌ加えて、１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離し、上清（可溶性画分）と沈殿（不溶性画分）に分けた。可溶性画分にはアセトンを１２０μｌ加えてｖｏｒｔｅｘ　ｍｉｘｅｒで撹拌し、１０分間氷冷した後、１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離を行った。遠心分離上清を捨て、沈殿を遠心エバポレーターで乾燥させた後、３０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒを加えて煮沸し、泳動サンプルの調製を行った。これらの泳動サンプル１０μｌを２０〜１５％のグラジエントゲルでＴｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色して合成されたタンパク質ドメインの合成率と可溶化率の評価を行った。
【００５４】
その結果を図１に示した。図１でレーン１は分子量マーカー、レーン２〜９は塩化亜鉛存在下又は非存在下で発現ベクターＰ０１１１２６−０１又はＰ０１１１２６−０５を用いて合成反応を行ったサンプル、レーン１０及び１１は鋳型ＤＮＡ無添加で合成反応を行ったサンプルである。なお、レーン２〜１１の偶数レーンは可溶性画分、奇数レーンは不溶性画分をそれぞれ示す。亜鉛に無関係なタンパク質の場合、亜鉛を添加すると通常はタンパク質の合成量が低下するものであるが、発現ベクターＰ０１１１２６−０１を用いて合成反応を行ったサンプル中のＳＰＬ９−ＤＢＤドメインは亜鉛を添加することで可溶化したタンパク質の合成量が飛躍的に向上していた。また、発現ベクターＰ０１１１２６−０５を用いて合成反応を行ったサンプル中のＳＰＬ１２−ＤＢＤドメインは亜鉛を添加しないときには不溶化した状態で合成されたが、亜鉛を添加することで可溶性が著しく向上し、また合成量自体も増加した。
【００５５】
図２は、発現ベクターＰ０１１１２６−０５を用いて各種金属化合物の存在下でタンパク質合成を行った結果を示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２〜１７は各種金属化合物を添加して合成反応を行ったサンプル、レーン１８と１９は対照として金属化合物を添加せずに、レーン２０と２１は鋳型ＤＮＡ無添加で合成反応を行ったサンプルである。レーン２〜２１において、偶数レーンは可溶性画分、奇数レーンは不溶性画分である。ＳＰＬ１２−ＤＢＤドメインの発現は、金属イオン無添加の場合はほとんどが不溶性画分に認められるが、銅イオンや鉄イオンなどを添加した場合には若干可溶性画分に認められ、亜鉛を添加した場合は可溶性画分のタンパク質量が著しく増加していた。
【００５６】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、極めて簡便に且つ効率よく無細胞タンパク質合成系でリガンド結合タンパク質を合成することができる。合成されたタンパク質は正しい立体構造を形成している可能性が高く、その構造や機能の解析に用いることができる。また、本発明の方法を用いて新規なリガンドやリガンド結合タンパク質をスクリーニングすることにより、タンパク質を中心とする生体分子間の相互作用を網羅的、系統的且つハイスループットに解明することができ、細胞レベルの様々な生命現象の理解と共に、タンパク質相互作用を活性化又は阻害するための薬剤の開発に極めて有用である。
【００５７】
【配列表】
2004105070.tif 000008
2004105070.tif 000009
2004105070.tif 000010
2004105070.tif 000011
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2004105070.tif 000014
2004105070.tif 000015
2004105070.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【図１】２種類の発現ベクターＰ０１１１２６−０１及びＰ０１１１２６−０５を塩化亜鉛の存在又は非存在下において無細胞タンパク質合成系で発現させた試料をＴｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果である。図中の矢印は発現させたタンパク質ドメインＳＰＬ９−ＤＢＤ、及びＳＰＬ１２−ＤＢＤを示す。
【図２】発現ベクターＰ０１１１２６−０５を各種金属化合物の存在下において無細胞タンパク質合成系で発現させた試料をＴｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果である。図中の矢印は発現させたタンパク質ドメインＳＰＬ１２−ＤＢＤを示す。
【図１】
2004105070.tif 000017
【図２】
2004105070.tif 000018