(57)【要約】【課題】透水性が優れ、生物学的活性体との反応性が良好なアミノ基を含有する重合体が強固に結合したポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材及びそれを用いてなる測定方法を提供する。【解決手段】▲１▼　アミノ基を含有する重合体を０．１〜１０重量％含有させたポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材。▲２▼該固定化材を用いてなる、生物学的作用を受けた物質の測定方法。【選択図】　　　　図１
2004105065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的活性体が、アミノ基を含有する重合体を０．１〜１０重量％含有するポリアクリロニトリル系多孔膜に結合していることを特徴とする生物学的活性体の固定化材。
【請求項２】
前記アミノ基を含有する重合体が、ビニルアミン単位を少なくとも１０モル％含有するビニルアミン重合体であって、ポリアクリロニトリル系多孔膜に対して０．１〜１０重量％含有していることを特徴とする請求項１記載の生物学的活性体の固定化材。
【請求項３】
前記ポリアクリロニトリル系多孔膜が、酸性基を０．０１〜２．５モル／ｋｇ含有していることを特徴とする請求項１又は２記載の生物学的活性体の固定化材。
【請求項４】
前記ポリアクリロニトリル系多孔膜が、アミノ基を０．０２〜２．５モル／ｋｇ含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生物学的活性体の固定化材。
【請求項５】
前記ポリアクリロニトリル系多孔膜において、酸性基に対するアミノ基の結合率が２０〜１００モル％であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の生物学的活性体の固定化材。
【請求項６】
前記ビニルアミン重合体が、分子量１０００〜２００，０００である水溶性ビニルアミン重合体であることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の生物学的活性体の固定化材。
【請求項７】
前記生物学的活性体が生物学的活性蛋白質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の生物学的活性体の固定化材。
【請求項８】
前記生物学的活性体が酵素であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の生物学的活性体の固定化材。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材を用いて、該生物学的活性体により生物学的作用を受けた物質を測定することを特徴とする、生物学的活性体の固定材を用いた測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ基含有重合体を含有したポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体が結合した固定化材及びそれを用いてなる測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、生物学的活性体と結合した固定化材及びそれを用いてなる測定方法に関して数多くの提案がなされ、固定化酵素、固定化微生物等の固定化材及びこれらを用いたバイオセンサーもしくはバイオリアクターとして、報告や商品化が行われている。
また、固定化材の担体としては、多孔性アルキルアミンガラス、多糖類誘導体、ポリアクリルアミド、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリアクリロニトリル等が使用され、担体をそのまま又は化学的に修飾し、直接又は間接的（架橋法、包括法）に生物学的活性体を固定化する方法が一般的である。
【０００３】
更に、担体の形状は、多量の生物学的活性体を固定化するためにビーズ状、繊維状、膜状、ゲルと様々な形状が提案されている。
この中で、ポリアクリロニトリル系多孔膜は有害物質の除去または、蛋白質の非特異的吸着の抑制などを目的としてポリアクリロニトリル系多孔膜の化学的改質についても種々検討されてきた。
これらの化学的改質の中でアミノ基を含有するポリアクリロニトリル系多孔膜への改質に関しては、例えば特開昭５８−１３９７０３号公報には、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びホルムアミドの混合溶媒に溶解したアクリロニトリル系重合体に、モノアミノ基化合物及び／又はアルカリを添加し製膜して得られるか、または該膜をプラズマ処理することによって得られ該膜の親水性を増加させる効果があると開示されている。
特開昭５８−１３７４０５号公報にはアクリロニトリル系共重合体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの溶媒に溶解し製膜した後、モノアミノ基含有化合物を含漬処理し、プラズマ加工する方法が開示されている。
更に、特許第３０９９３４２号にはアクリロニトリル系重合体からなる多孔膜において、多孔膜の表面層の重合体主鎖に一級アミノ基が化学的に導入されていることを特徴とする多孔膜が開示されている。
【０００４】
しかしながら、特開昭５８−１３９７０３号公報及び特開昭５８−１３７４０５号公報で開示されたモノアミノ基含有化合物の処理は、ポリアクリロニトリル系多孔膜の親水性向上を目的とした処理であり、かつアミノ基を分子内に１官能基のみ含有するアミノ基含有化合物（モノアミノ基含有化合物と称する）を用いており、多孔膜への処理の際にアミノ基含有化合物が脱落するか架橋するかによってポリアクリロニトリル系多孔膜上に官能基としてのアミノ基を含有させることは困難である。
【０００５】
特許第３０９９３４２号では、多孔膜の表面層の重合体主鎖に一級アミノ基が化学的に導入されていることを特徴としている。
アクリロニトリル系重合体からなる多孔膜への一級アミノ基の導入方法としてアクリロニトリルを化学的に変性して導入する方法が採用され、この化学的な変性とはアクリロニトリル系重合体のニトリル部位を化学的に変化せしめると示されており、具体的方法としてはアクリロニトリル系重合体からなる多孔膜をアルカリ類で加水分解した後、次亜ハロゲン酸塩で処理することによって製造することが出来ると示されている。
この方法はポリアクリロニトリル系重合体膜への一級アミノ基の導入方法としては優れているが、この方法をポリアクリロニトリル系多孔膜に応用した場合、加水分解することによって、ポリアクリロニトリル系多孔膜が膨潤状態となり、多孔膜の基本的性質である透水性が低下してしまう課題がある。また、ポリアクリロニトリル系多孔膜自体を加水分解するため該膜の強度低下は不可避である。
【０００６】
【特許文献１】
特開昭５８−１３７４０５号公報
【特許文献２】
特開昭５８−１３９７０３号公報
【特許文献３】
特許第３０９９３４２号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる従来技術の課題を解決しようとするものであり、透水性が優れ、かつアミノ基を含有するポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性蛋白質が結合した固定化材およびそれを用いてなる測定方法を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、アミノ基を含有する重合体を０．１〜１０重量％含有させたポリアクリロニトリル系多孔膜が特に有効であることを見出し、本発明に到達したものである。
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）　アミノ基を含有する重合体を０．１〜１０重量％含有させたポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材。
（２）　（１）に記載のアミノ基を含有する重合体がビニルアミン単位を少なくとも１０モル％含有するビニルアミン重合体であって、ポリアクリロニトリル系多孔膜に対して０．１〜１０重量％含有している、ポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材。
（３）　（１）又は（２）　に記載のポリアクリロニトリル系多孔膜が、酸性基を０．０１〜２．５モル／Ｋｇ含有している、ポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材。
（４）　（１）〜（３）　のいずれかに記載のポリアクリロニトリル系多孔膜が、アミノ基を０．０２〜２．５モル／Ｋｇ含有する、ポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材。
（５）　（１）〜（４）　のいずれかに記載のポリアクリロニトリル系多孔膜における酸性基に対するアミノ基の結合率が、２０〜１００モル％である、ポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材。
（６）　（２）　〜（５）　のいずれかに記載のビニルアミン重合体が、分子量１０００〜２００，０００である水溶性ビニルアミン重合体である、ポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材。
（７）　生物学的活性体が生物学的活性蛋白質である、（１）〜（６）　のいずれかに記載のポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材。
（８）　生物学的活性体が酵素である（１）〜（６）　のいずれかに記載のポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材。
（９）　上記（１）〜（８）　のいずれかに記載の、アミノ基を含有する重合体を０．１〜１０重量％含有させたポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材を含有する系と該生物学的活性体により作用を受けた物質の変化を測定する、生物学的活性体の固定材を用いた測定方法。
【０００９】
本発明に用いられるアミノ基を含有する重合体とは、アミノ基を分子内に２官能基以上有する重合体のことであり、キトサン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリリジン、ポリビニルアミン、ポリＮ−ビニルホルムアミドの部分加水分解物（完全に加水分解した場合はポリビニルアミンとなる）等を１種又は２種以上組み合わせて用いることが出来る。
好ましくはポリビニルアミン又はポリＮ−ビニルホルムアミドの部分加水分解物を用いることである。ポリビニルアミンまたはポリＮ−ビニルホルムアミドの部分加水分解物は、ビニルアミン単位を少なくとも１０モル％有していることが良く、好ましくは含有量として５０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上である。
ビニルアミン単位の含有量が１０モル％未満では、ポリビニルアミンまたはポリＮ−ビニルホルムアミドの部分加水分解物を大量にポリアクリロニトリル系多孔膜に含有させても十分な一級アミノ基量を付与することは出来ない。
【００１０】
ポリビニルアミンは、一般にポリＮ−ビニルホルムアミドを酸、例えば塩酸、硫酸、燐酸等により加水分解した加水分解物又はその塩酸塩等の塩として容易に入手することができる。
またポリＮ−ビニルホルムアミドの部分加水分解物に含まれるビニルアミン単位の割合は、ポリＮ−ビニルホルムアミドの加水分解度を調節することにより広範囲にわたって調整することができる。
なお、ポリＮ−ビニルホルムアミドをポリアクリロニトリル系多孔膜に含有させた後、水溶液中で上記酸によりｐＨを２〜３に保ってポリＮ−ビニルホルムアミドを加水分解し、ポリＮ−ビニルホルムアミドの部分加水分解物とすることもできる。
この場合もポリＮ−ビニルホルムアミドの部分加水分解物中のビニルアミン単位は１０モル％以上とすることが望ましい。
アミノ基を含有する重合体中のアミノ基は酸により中和されていても、未中和であっても良い。
【００１１】
アミノ基を含有する重合体の含有量は、ポリアクリロニトリル系多孔膜に対して０．１〜１０重量％、好ましくは０．１５〜５．０重量％である。
アミノ基を含有する重合体の含有量が０．１重量％未満ではポリアクリロニトリル系多孔膜中へのアミノ基の含有量が少なく、アミノ基の効果を期待できない。一方、１０重量％を越えるとアミノ基を含有する重合体がポリアクリロニトリル系多孔膜から脱離し易くなってしまう。
アミノ基を含有する重合体の分子量は１，０００〜２００，０００が好ましく、より好ましくは１０，０００〜１００，０００である。
該重合体の分子量が１，０００未満ではポリアクリロニトリル系多孔膜を構成する分子鎖に対する該重合体を構成する分子鎖１本当たりの結合の割合が低下し、該重合体が脱落し易くなる。また分子量が２００，０００を超えるときはポリアクリロニトリル系多孔膜の内部表面、即ち多孔膜の細孔表面を含む表面層全体への均一な分布が困難なる。
また、アミノ基を含有する重合体は水溶性であることが好ましい。
水不溶性のアミノ基を含有する重合体を用いるとポリアクリロニトリル系多孔膜の内部表面への拡散が乏しいため、ポリアクリロニトリル系多孔膜の酸性基との結合率が低くなり、アミノ基を含有する重合体が脱落し易くなる。
【００１２】
ポリアクリロニトリル系多孔膜は、例えば、４０重量％以上のアクリロニトリルと、６０重量％以下のアクリロニトリルと共重合可能な単量体とを共重合することにより得ることができる。
アクリロニトリルと共重合可能な単量体としては、アクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、イタコン酸、メタクリル酸、メタクリル酸メチル、スチレン、アクリルアミド、メタクリルアミド、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、メタリルスルホン酸、メタリルスルホン酸塩、スチレンスルホン酸、スチレンスルホン酸塩、アリルスルホン酸、アリルスルホン酸塩等のビニル単量体が用いられる。これらの単量体は、１種または２種以上を共重合させることができる。
特に好ましいポリアクリロニトリル系多孔膜は、８０重量％以上のアクリロニトリルと、アクリル酸、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、アクリルアミド、酢酸ビニル、塩化ビニリデン、メタリルスルホン酸塩、スチレンスルホン酸塩等のビニル単量体の１種または２種以上を共重合させて得られるポリアクリロニトリル系重合体を得て、更に製膜しポリアクリロニトリル系多孔膜にすることである。
【００１３】
また、ポリアクリロニトリル系多孔膜には、カルボキシル基、スルホン酸基等の酸性基を有していることが好ましい。これはポリアクリロニトリル系多孔膜中の酸性基がアミノ基を含有する重合体のアミノ基と結合してアミノ基を含有する重合体をポリアクリロニトリル系多孔膜に強固に固定させることができるためである。
酸性基を含有するポリアクリロニトリル系多孔膜は、カルボキシル基またはスルホン酸基等の酸性基を有する単量体を共重合したポリアクリロニトリル系重合体からポリアクリロニトリル系多孔膜を製造する方法、カルボキシル基又はスルホン酸基等の酸性基を有する単量体を共重合したポリアクリロニトリル系重合体と酸性基を含まないポリアクリロニトリル系重合体をブレンドして製膜してポリアクリロニトリル系多孔膜を製造する方法、アクリロニトリル系重合体製造時の触媒によりアクリロニトリル系重合体の末端に酸性基を導入する方法、ポリアクリロニトリル系多孔膜形成後のポリアクリロニトリル系多孔膜上に酸性基含有単量体をグラフト重合する方法、などにより得ることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１４】
酸性基としては、アミノ基を含有する重合体との結合の強さからスルホン酸基が好ましい。
ポリアクリロニトリル系多孔膜の酸性基含有量は、ポリアクリロニトリル系多孔膜１ｋｇ当たり０．０１〜２．５モル、好ましくは０．０１〜１．５モルである。
酸性基含有量が０．０１モル未満ではアミノ基を含有する重合体と酸性基との結合が不十分となり、アミノ基を含有する重合体がポリアクリロニトリル系多孔膜から容易に脱離し易く、２．５モルを超えるとポリアクリロニトリル系多孔膜の多孔性を維持することが困難となる。
【００１５】
本発明の多孔膜の製造方法は、湿式製膜法などの公知の製膜方法を用いて得ることが出来る。
該多孔膜の形状については平膜状、中空糸状、管状、円筒状、他の多孔性支持体との複合体などを用いることが出来るがこれらに限定されるものではない。
例えば、ポリアクリロニトリル系重合体を７０重量％の硝酸水溶液に１０〜２０重量％となるように溶解し原液とし、その後凝固液中に該原液を吐出させ凝固膜を作成する。水洗後、２軸延伸してポリアクリロニトリル系多孔膜を得ることが出来る。
本発明のポリアクリロニトリル系多孔膜は、アミノ基を含有する重合体をポリアクリロニトリル系多孔膜に含有させることにより製造することができる。
本発明のポリアクリロニトリル系多孔膜は、アミノ基を含有する重合体をポリアクリロニトリル系多孔膜製膜時に混合して製膜する方法、ポリアクリロニトリル系多孔膜をアミノ基を含有する重合体溶液に浸漬または噴霧する、等の手段により製造することができるがこれらに限定されるものではない。
【００１６】
また、本発明において好ましいのは、酸性基を持ったポリアクリロニトリル系多孔膜にアミノ基を含有する重合体水溶液を付着させることである。さらに好ましいのは、酸性基を含有するポリアクリロニトリル系多孔膜にポリビニルアミンまたはポリＮ−ビニルホルムアミドの部分加水分解物水溶液を付着させることである。
酸性基を含有するポリアクリロニトリル系多孔膜にアミノ基を含有する重合体を付着させた場合には、ポリアクリロニトリル系多孔膜の酸性基とアミノ基を含有する重合体とが結合し、アミノ基を含有する重合体の脱落が少なくなる。
さらに酸性基を含有するポリアクリロニトリル系多孔膜にアミノ基を含有する重合体を付着させる際または付着後に、６０℃以上、好ましくは６０〜１２０℃の温度で５〜３００分処理することによってポリアクリロニトリル系多孔膜の酸性基とアミノ基を含有する重合体の結合率が向上し、一層アミノ基を含有する重合体のポリアクリロニトリル系多孔膜からの脱離が抑制される。
【００１７】
本発明において、ポリアクリロニトリル系多孔膜の酸性基とアミノ基を含有する重合体との結合は、酸性基に対してアミノ基の結合率が１０〜１００モル％であることが好ましい。より好ましくは５０〜１００モル％、さらに好ましくは６０〜１００モル％である。
酸性基の結合率が１０モル％未満ではアミノ基を含有する重合体がポリアクリロニトリル系多孔膜から脱離し易くなる。酸性基に対するアミノ基を含有する重合体の結合率は、ポリアクリロニトリル系多孔膜の総酸性基量およびアミノ基を含有する重合体と結合していない残存酸性基量（以下、残存酸性基量と言う）により下式（１）から求めることができる。
酸性基の結合率（モル％）＝〔（総酸性基量−残存酸性基量）／総酸性基量〕×１００　　　・・・（１）
（ただし、総酸性基量および残存酸性基量の単位はモル／ｋｇである。）
酸性基に対するアミノ基を含有する重合体の結合率は、ポリアクリロニトリル系多孔膜が含有する酸性基の結合割合を示すものである。
【００１８】
アミノ基を含有する重合体を含有していないポリアクリロニトリル系多孔膜は、総酸性基量と残存酸性基量が同じ値を示し、酸性基の結合率は０モル％となるが、アミノ基を含有する重合体をポリアクリロニトリル系多孔膜に含有させることによって残存酸性基量が低下し、酸性基の結合率が向上する。
また、６０℃以上の温度で処理することによって更に残存酸性基量が低下し、酸性基に対するアミノ基を含有する重合体の結合率が向上する。
この原因は定かではないが、ポリアクリロニトリル系多孔膜が含有する酸性基とアミノ基を含有する重合体のアミノ基間のイオン的結合が６０℃以上の温度により促進していることに起因しているためと考えられる。このイオン的結合の促進によってアミノ基を含有する重合体のポリアクリロニトリル系多孔膜からの脱落抑制が推進される。
【００１９】
本発明の多孔膜の透水量は、好ましくは１ｍ３／ｍ２／日／０．１ＭＰａ〜１００ｍ３／ｍ２／日／０．１ＭＰａであり、さらに好ましくは１０ｍ３／ｍ２／日／０．１ＭＰａ〜５０ｍ３／ｍ２／日／０．１ＭＰａである。
透水量が１ｍ３／ｍ２／日／０．１Ｍｐａ未満では多孔質膜としての特性を発現することが困難であり、透水量が１００ｍ３／ｍ２／日／０．１Ｍｐａ以上では多孔質膜としての強度が不十分となる。
また、本発明の多孔質膜の膜厚は好ましくは湿潤状態で５μｍ〜５００μｍである。更に好ましくは湿潤状態で膜厚１０μｍ〜１００μｍである。
湿潤状態で膜厚が５μｍ以下では多孔質膜の強度が不十分であり、湿潤状態で膜厚が５００μｍ以上では透水量を維持することが困難となる。
【００２０】
本発明においては、アミノ基を含有する重合体を含有したポリアクリロニトリル系多孔質膜は、必要に応じて生物学的活性体と結合させる以前に、不活性媒体、例えば水性媒体下にグルタルアルデヒドなどの架橋化剤を用いて、グルタルアルデヒドの重合を防止のために冷却化にて処理し、さらに、これに例えばヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミンなどのアルキレンジアミン、リジンなどのスペ−サーとしての化合物を、同様な水性媒体下０℃〜室温にて処理し、再度架橋化剤にて処理して、目的の支持体としてもよい。
次いで、この多孔質構造を有するアミノ基を含有する重合体を含有したポリアクリロニトリル系膜の支持体と生物学的活性体とを結合する。
【００２１】
この生物学的活性体としては、酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、転位酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ等である。
即ち、酸化還元酵素としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシターゼ、コレステロールオキシターゼ、がラクトースオキシターゼ、コリンオキシターゼ、ピルビン酸オキシターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシターゼ、アミノオキシターゼ、ザルコシンオキシターゼ、ジアホラーゼ、ウリカーゼ、パーオキシダーゼ、カタラーゼ、リボキシゲナーゼ等が挙げられる。
【００２２】
加水分解酵素としては、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、コレステロールエステラーゼ、ホスファターゼ、アミラーゼ、グルコシターゼ、ガラクトシターゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ウレアーゼ、アミノアシラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、セファロスポリンアシラーゼ、ペニシリナーゼ、セファロスポリナーゼ、クレアリナーゼ、クレアチニナーゼなどが挙げられる。
転位酵素としては、クレアチンホスキナーゼ、ピルベートキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グリセロールキナーゼ等が挙げられる。
イソメラーゼとしては、アラニンイソメラーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースホスフェートイソメラーゼ等が挙げられ、リガーゼとしては、クルタチオンシンテターゼ等が挙げられる。
【００２３】
以上の酵素該外に、蛋白質であって生物学的活性を有しているもので、該支持体と結合し得るものであればよく、またこれらの蛋白質を公知の種々の手段をもって、その誘導体となしたものであってもよく、さらに使用される該生物学的活性体は、単独または２以上を同時に使用してもよい。
次いで、上記支持体と生物学的活性体とを結合する方法としては、この支持体をカラムに充填したカラム法、又は容器に分散させたバッチ法のいずれを用いても良い。
その際に用いられる不活性媒体としては、使用する生物学的活性体が失活しない媒体であれば良く、水又は種々のｐＨに調整した緩衝液（例えばｐＨ４〜６の酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８のリン酸緩衝液、ｐＨ８〜９のホウ酸緩衝液等）、含水アセトン等の水性媒体が好ましい。
【００２４】
また、結合における温度は、同様に失活しない温度であればよく、通常０〜３０℃程度である。
さらに、使用する生物学的活性体の量としては、該支持体の結合容量が充分満たされるまで使用してもよく、その際は結合後の不活性媒体中の生物学的活性体の活性の有無により判断してもよい。
また、得られた固定化材の生物学的活性の測定を行ってもよく、使用する生物学的活性体に応じてその結合における使用量を変更すればよい。
このように処理することにより、アミノ基を含有する重合体を含有したポリアクリロニトリル系膜の支持体と生物学的活性体とを結合した固定化材が得られる。
さらに必要に応じて、同一系または別の系として結合化剤を使用してもよい。
【００２５】
使用される結合化剤としては、該支持体の反応性基、例えば遊離アミノ基と生物学的活性体の遊離基であり、例えばアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、などを利用するものであって、例えばヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジチオシアネート、トルエンジイソシアネート、キシレンジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドスターチ、ジメチルアジピミデート、ジメチルスベリイミデート、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート、無水コハク酸、クロトンアルデヒド、アクロレインなどの架橋化剤を用いることにより、該支持体と生物学的活性体が架橋結合される。
また、支持体と生物学的活性体とを直接共有結合する場合には、縮合剤、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドなどの水溶性縮合剤が使用される。
上記の如くの結合化剤を用いるに当たっては、不活性媒体、例えばテトラヒドロフラン、アセトン、エタノールなどを含有してもよい水性媒体中で行われる。その際、室温下の条件が好ましく、また使用する生物学的活性体の安定なｐＨの範囲、一般にｐＨ４〜１２の範囲にて選択して行えばよく、また使用する結合化剤は結合する遊離基に対して１〜２モル程度でよい。
【００２６】
以上の如くして得られた固定化材において、その生物学的活性は著しく良好であり、この固定化材はその生物的活性体の性質に応じて種々に利用されるものである。
従って、以上の如くして得られた固定化材は、その一定量をカラムなどの一定容器に入れ、これを遊離アミノ基を有してなる支持体を生物学的活性体とを結合した固定化材の系となし、この際に必要に応じて生物学的活性体の安定を保つため緩衝液を使用することが好ましい。
【００２７】
また、本発明においては、この固定化材の系に対して、用いた生物学的活性体の活性により作用を受ける物質を含有する系を設けても良い。
この系に使用される物質としては、前記の生物学的活性体に対するものであればよく、例えば前記の種々の酵素の場合においてはその基質が挙げられる。
また、その基質は状態により種々有るが、水溶液、水性媒体（例えば緩衝液など）、血液、溶液またはこれらの処理液などの体液の状態のものであってもよい。
例えば、前記の生物学的活性体が酵素である場合においては、酵素としてアシラーゼを挙げるならば、基質としては７−アシル−セファロスポラン酸誘導体の溶液、６−アシル−ペニシラン酸誘導体の溶液、７−アミノ−３−セフェム−４−カルボン酸又はその誘導体、または６−アミノ−ペナム−３−カルボン酸又はその誘導体とチエニル酢酸メチルエステルとの溶液が一例として挙げられる。
また、酵素としてコリンオキシターゼ、種々のホスホリパーゼ、ウリガーゼ、グルコースオキシターゼを挙げるならば、対応するリン脂質、尿酸、グルコースなどの血液、尿溶液などの体液が挙げられる。
【００２８】
さらに、これらの系に、上記の組み合わせの系によるその酵素反応系の変化を得る系を組み合わせることがよく、装置、方法に関しては限定されるものではない。
例えば、固定化材を有した反応系と電極等の計測部を有した計測系を有した方法が挙げられる。
電極としては、酵素反応系で生じた生成物の定量が出きればよく、例えばガラス電極、酸素電極、過酸化水素電極等が挙げられ、必要に応じて誤差を小さくするために微分変換器を用いてもよい。
また、計測系を電極の代わりに、呈色剤からなる比色測定法を用いてもよい。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、例中の％は特に限定しない場合には重量％を意味する。
▲１▼　透水量の測定
直径４５ｍｍの円形に切断した膜を湿潤状態のまま、有効面積１０ｃｍ２のメンブランフィルターホルダーに組み込み３５℃の純水を満たした。０．１ＭＰａの静水圧をかけ、測定時間内に透過した水の重量を測定した。
測定は３５℃の環境下で実施し、透水量（ｍ３／ｍ２／日／０．１ＭＰａ）を求めた。
▲２▼　総酸性基量および残存酸性基量の測定
乾燥したポリアクリロニトリル系多孔膜１．０ｇを１０％塩化ナトリウム水溶液３００ｍｌに入れ４０℃恒温槽中で３０時間振とうした後、精製水で付着塩化ナトリウムを十分に洗浄し、８０℃で１時間乾燥してナトリウムイオン結合ポリアクリロニトリル系多孔膜とした。次いで、該ポリアクリロニトリル系多孔膜を９６％硫酸５ｍｌ、６２％硝酸４０ｍｌ、７０％過塩素酸２ｍｌ混合液中で電熱ヒーター上で５時間湿式分解を行った。
ここで得られた液体を１００倍に精製水で希釈し、炎光分析によりナトリウム定量分析を行い、このナトリウム量よりナトリウムと当量のイオン結合をしたと見なした酸性基量を求めた。
測定に供したポリアクリロニトリル系多孔膜がアミノ基を含有する重合体の処理前である場合を総酸性基量（モル／ｋｇ）とし、アミノ基を含有する重合体の処理後である場合を残存酸性基量（モル／ｋｇ）とした。
【００３０】
▲３▼　アミノ基量の測定
乾燥したアミノ化ポリアクリロニトリル系多孔膜０．３ｇを１／１００Ｎ塩酸水溶液３０ｍｌに入れ３０℃の恒温槽中で３０時間振とうした後、残存アミノ基を指示薬としてＢＴＢ溶液を用いて１／１００Ｎの水酸化アトリウム水溶液で滴定する。
同様に乾燥した未処理のポリアクリロニトリル系多孔膜０．３ｇを滴定し、この差により消費塩酸基量をアミノ基量とした。
▲４▼　酵素活性度の測定
図１に示す装置２（計測部分）に、酵素固定化材０．５ｇと蒸留水３０ｍｌ及び夫々の酵素に対する測定物質を所定量挿入し、挿入１分後の積算分解物質量（酸素、水素等）の消費又は発生モル量を計測し、下式（１）により酵素活性を算出した。
酵素活性（ｕ／ｍｇ）＝消費又は発生物質量（μモル）／酵素固定量（ｍｇ）・・・・・（１）
【００３１】
【実施例１〜３】および
【比較例１〜２】
アクリロニトリル９４．５％、アクリル酸メチル５．０％およびメタリルスルホン酸ナトリウム０．５％を共重合して重合体を得た。該重合体の重量平均分子量は１５万であった。
該重合体を７０％の硝酸に溶解、減圧脱泡して重合体濃度１７％の製膜原液を調整した。該製膜原液を幅２０ｃｍ、スリット間隙０．２５ｍｍのスリットダイにより＋１８℃の３０％硝酸中に押出し、凝固させた後、水洗して膜厚１２０μｍの水洗膜を得た。
該水洗膜を９８℃の熱水中で製膜方向に２．４倍延伸し、その後製膜方向と直交する方向に２．４倍延伸する逐次２軸延伸を行いポリアクリロニトリル系多孔膜を得た。該多孔膜の膜厚は６５μｍ、透水量は３５（ｍ３／ｍ２／日／０．１ＭＰａ）であり、また総酸性基量は０．０６モル／ｋｇであった。
【００３２】
該ポリアクリロニトリル系多孔膜を固定枠に保持した上でビニルアミン重合体としてビニルアミン単位を９５．０モル％有するポリＮ−ビニルホルムアミドの部分加水分解物（分子量約６０，０００、未中和物）１．０重量％（実施例１）、０．２重量％（実施例２）、５．０重量％（実施例３）、０重量％（比較例１）、０．０５重量％（比較例２）を含有する３０℃の水溶液に浸漬し１２０分間処理した後十分に水洗を行った。
得られたアミノ基含有ポリアクリロニトリル系多孔膜の透水量、酸性基の結合率及びアミノ基含有率を表１に示した。
【００３３】
次いで、該試料をそれぞれ１０ｍｇ（湿重量）採取し、１２．５重量％グルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）４０ｍｌに加え、０℃、２０分間攪拌して、濾取し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄後、グルコースオキシターゼ（２１０ｕ／ｍｇ）１０ｍｇを含有した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌに加えて３０℃、６０分間攪拌し、その後濾取して０．５Ｍ食塩／０．１リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄し、さらに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄して、該試料とグルコースオキシターゼとを結合した固定化材を得た。
得られたグルコースオキシターゼ固定化材のグルコースオキシターゼ活性を表１に示した。
【００３４】
さらに、実施例１の固定化材を、５ｍｍ×５ｍｍ片に切り取り、図１に示す通りの装置を用いて、この片を酵素電極３にセットし、これをナイロンネットで覆い、計測部分２に漬け、それら恒温槽７にセットした。
次いで、この計測部分２に０．０１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌを注入口Ａより注入して溶存酸素値を安定せしめた後、注入口Ａより各濃度のグルコース溶液２０μｌを注入して、その結果を微分変換器を具備したメーター５（溶存酸素計）を接して記録計６にて、グルコース濃度とその最大速度変化値（ｄｔｏ２）から、その検量線を求めた。
【００３５】
実施例１〜３は何れも高い透水量および高いアミノ基含有量を示した。
これは、酸性基の結合率が最も低い実施例２においても０．０７モル／ｋｇと高い値を示しておりアミノ基を含有する重合体が強固にポリアクリロニトリルの多孔膜に結合した結果と考えられる。
また、実施例１のグルコースオキシターゼ固定化材の検量線及び繰返し使用安定性試験の結果、正確な検量線及び最大速度変化値５０回使用しても極めて安定的であった。
【００３６】
【実施例４】
実施例１で作成したアミノ基含有ポリアクリロニトリル系多孔膜を１０ｍｇ（湿重量）採取し、１２．５重量％グルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）４０ｍｌに加え、０℃、２０分間攪拌して、濾取し、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて洗浄後、ウリカーゼ（５００ｕ／ｍｇ）１０ｍｇを含有した０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）５ｍｌに加えて３０℃、６０分間攪拌し、その後濾取して０．５Ｍ食塩／０．１ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて洗浄し、さらに０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて洗浄して、該試料とウリカーゼとを結合した固定化材を得た。得られたウリカーゼ固定化材のウリカーゼ活性を表１に示した。
さらに、この固定化材を、５ｍｍ×５ｍｍ片に切り取り、図１に示す通りの装置を用いて、この片を酵素電極３にセットし、これをナイロンネットで覆い、計測部分２に漬け、それら恒温槽７にセットした。次いで、この計測部分２に０．０１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌを注入口Ａより注入して溶存酸素値を安定せしめた後、注入口Ａより各濃度の尿素溶液２０μｌを注入して、その結果を微分変換器を具備したメーター５（溶存酸素計）を接して記録計６にて、尿素濃度とその最大速度変化値（ｄｔｏ２）から、その検量線を求めた。
この結果、ウリカーゼ固定化材の検量線及び繰返し使用安定性試験の結果、正確な検量線及び最大速度変化値５０回使用しても極めて安定的であった。
【００３７】
【実施例５】
実施例１で作成したアミノ基含有ポリアクリロニトリル系多孔膜を１０ｍｇ（湿重量）採取し、１２．５重量％グルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）４０ｍｌに加え、０℃、２０分間攪拌して、濾取し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄後、ラクテートデヒドロゲナーゼ（５０００ｕ／ｍｇ）１０ｍｇを含有した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌに加えて３０℃、６０分間攪拌し、その後濾取して０．５Ｍ食塩／０．１リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄し、さらに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄して、該試料とラクテートデヒドロゲナーゼとを結合した固定化材を得た。
得られたラクテートデヒドロゲナーゼ固定化材のウリカーゼ活性を表１に示した。
さらに、この固定化材を、５ｍｍ×５ｍｍ片に切り取り、図１に示す通りの装置を用いて、この片を酵素電極３にセットし、これをナイロンネットで覆い、計測部分２に漬け、それら恒温槽７にセットした。次いで、注入口Ａより各濃度の乳酸とＮＡＤ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の混合溶液２０μｌを注入して、その結果を微分変換器を具備したメーター５（電気伝導度計）を接して記録計６にて、乳酸濃度とその電気伝導率変化値から、その検量線を求めた。
この結果、ラクテートデヒドロゲナーゼ固定化材の検量線及び繰返し使用安定性試験の結果、正確な検量線及び最大速度変化値５０回使用しても極めて安定的であった。
【００３８】
【比較例３】
アクリロニトリル９４．５％、アクリル酸メチル５．０％およびメタリルスルホン酸ナトリウム０．５％を共重合して重合体を得た。該重合体の重量平均分子量は１５万であった。
該重合体を７０％の硝酸に溶解、減圧脱泡して重合体濃度１７％の製膜原液を調整した。該製膜原液を幅２０ｃｍ、スリット間隙０．２５ｍｍのスリットダイにより＋１８℃の３０％硝酸中に押し出し、凝固させた後、水洗して膜厚１２０μｍの水洗膜を得た。該水洗膜を９８℃の熱水中で製膜方向に２．４倍延伸し、その後製膜方向と直交する方向に２．４倍延伸する逐次２軸延伸を行い、ポリアクリロニトリル系多孔膜を得た。該多孔膜の膜厚は６５μｍ、透水量は３５（ｍ３／ｍ２／日／０．１ＭＰａ）であり、また総酸性基量は０．０６モル／ｋｇであった。
【００３９】
該ポリアクリロニトリル系多孔膜を固定枠に保持した上でビニルアミン重合体として、ビニルアミン単位を５．０モル％有するポリＮ−ビニルホルムアミドの部分加水分解物（分子量約６０，０００、未中和物）５．０％を含有する３０℃の水溶液に浸漬し、１２０分間処理した後十分に水洗を行った。得られたアミノ基含有ポリアクリロニトリル系多孔膜の透水量、酸性基の結合率、およびアミノ基含有量を表１に示した。
次いで、該試料を１０ｍｇ（湿重量）採取し、１２．５重量％グルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）４０ｍｌに加え、０℃、２０分間攪拌して、濾取し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄後、グルコースオキシターゼ（２１０ｕ／ｍｇ）１０ｍｇを含有した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌに加えて３０℃、６０分間攪拌し、その後濾取して０．５Ｍ食塩／０．１リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄し、さらに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄して、該試料とグルコースオキシターゼとを結合した固定化材を得た。得られたグルコースオキシターゼ固定化材のグルコースオキシターゼ活性を表１に示した。
この結果、得られたアミノ基含有ポリアクリロニトリル系多孔膜の透水量が２０（ｍ３／ｍ２／日／０．１ＭＰａ）と良好な透水量を示すが、アミノ基含有量は、０．００５モル／ｋｇと低い結果であった。また、グルコースオキシターゼ固定化材のグルコースオキシターゼ活性も低いものであった。さらに酸性基の結合率が１６．７％と低く、アミノ基を含有する重合体とポリアクリロニトリルの多孔膜との結合が不十分であり、アミノ基を含有する重合体の処理後の水洗で該重合体が脱落した結果と考えられる。
【００４０】
【表１】
2004105065.tif 000003
【００４１】
【発明の効果】
本発明によると、透水性が優れ、かつ生物学的活性体との反応性が良好なアミノ基を含有する重合体が強固に結合したポリアクリロニトリル系多孔膜と生物学的活性体を結合した固定化材及びそれを用いてなる測定方法を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の固定化材の性能を測定するための標準装置を示す模式図である。
【符号の説明】
１　本発明の固定化材
２　計測部分
３　電極
５　メーター（溶存酸素計又は電気伝導度計）
６　記録計
７　恒温槽
１０　マグネチックスターラー
【図１】
2004105065.tif 000004