(57)【要約】【課題】導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドの機能が低下することを抑制して、効率的かつ簡便にタンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入することができる試験キットを提供する。【解決手段】タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入するための試験キットであって、該試験キットは、カチオン性の基を有する重合体が封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器とを含んでなるタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キット。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入するための試験キットであって、該試験キットは、カチオン性の基を有する重合体が封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器とを含んでなる
ことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キット。
【請求項２】
タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入するための試験キットであって、該試験キットは、タンパク質及び／又はペプチドと結合するカチオン化された複合体が封入された容器を含んでなる
ことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットに関する。より詳しくは、細胞内で機能させたいタンパク質を任意の量かつ任意の期間細胞内に存在させるために用いられる試験キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質を細胞内に導入する技術は、タンパク質の性質を知るうえで有用であり、細胞内で機能させたいタンパク質を任意の量かつ任意の期間細胞内に存在させることを可能とする技術である。現在、様々な細胞の増殖・分化・発生に関わるタンパク質の発現・修飾のタイムシグナルが明らかにされつつあり、これらの知見に基づいて、例えば、再生医学や組織工学といった工学面へと応用する際に、タンパク質の細胞内導入技術により、様々な可能性が広がることが期待されている。
【０００３】
このようなタンパク質の細胞内導入技術に関し、現在では、遺伝子導入法が用いられている。遺伝子導入法は、恒常的に細胞内で任意のタンパク質を機能させたい場合に有利な手法であるが、任意のタンパク質を一過的に細胞内で機能させたい場合には、タンパク質そのものを細胞内に導入する手法が用いられている。
従来のタンパク質の細胞内導入技術としては、カチオン性の高いタンパク質や化学修飾によりカチオン化されたタンパク質による手法が挙げられる（例えば、非特許文献１）。この手法においては、負に帯電している細胞表面にカチオン化された導入目的物であるタンパクが静電的に吸着することにより、高効率で細胞内に取り込まれると考えられる。しかしながら、タンパク質のカチオン化による手法では、導入目的物であるタンパク質分子における多部位のアミノ酸側鎖の修飾が必要であったため、タンパク質の機能が低下することとなる。また、再生医学や組織工学等に応用する際に、タンパク質の性質等を効率的に研究するために、細胞内で機能させたいタンパク質を任意の量かつ任意の期間細胞内に存在させることをより簡便にできるようにするための工夫の余地があった。
【０００４】
【非特許文献１】
二見等（Ｆｕｔａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．）著，「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国），第４０巻，第２５号，アメリカンケミカルソサイアティ（Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ），２００１年，ｐ．７５１８−７５２４
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであり、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドの機能が低下することを抑制して、効率的かつ簡便にタンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入することができる試験キットを提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、タンパク質の細胞内導入技術について種々検討したところ、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質とを結合させることにより、好ましくは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とタンパク質とを結合させることにより、導入目的物であるタンパク質の一部分をカチオン化して細胞内に導入することが可能であり、この場合には、タンパク質の機能が低下することを抑制することができることに着目し、更に、このような技術がペプチドの細胞内導入においても適用できることにも着目し、カチオン性の基を有する重合体が封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとの結合試薬が封入された容器とを含んでなる試験キットが、タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入するために有用であることを見いだし、上記課題をみごとに解決することができることに想到した。また、タンパク質及び／又はペプチドと結合する複合体を用いた試験キットにおいても本発明の作用効果が発揮されることも見いだし、本発明に到達したものである。タンパク質及び／又はペプチド分子における多部位のアミノ酸側鎖が修飾される場合には、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドの機能が低下することになるが、カチオン性の基を有する重合体を用いる場合には、タンパク質及び／又はペプチド分子における一部分を修飾することによりタンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入することができることから、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドの機能が低下することを抑制することが可能となる。上記試験キットを用いることにより、カチオン性の基を有する重合体の作用効果を充分に発揮しつつ、効率的かつ簡便にタンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入することが可能となる。
【０００７】
すなわち本発明は、タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入するための試験キットであって、該試験キットは、カチオン性の基を有する重合体が封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器とを含んでなるタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットである。
【０００８】
本発明はまた、タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入するための試験キットであって、該試験キットは、タンパク質及び／又はペプチドと結合するカチオン化された複合体が封入された容器を含んでなるタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットでもある。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明の試験キットは、タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入するために、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドを含むカチオン化された複合体を形成するためのものである。カチオン化された複合体は、細胞内に取り込まれることになるが、本発明においては、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドの機能が低下することが抑制され、試験キットの使用により、効率的かつ簡便にタンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入することが可能となる。
上記試験キットにおいて、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドを含むカチオン化された複合体を形成する形態としては、（１）導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとカチオン性の基を有する重合体とを結合することによる形態、（２）導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとカチオン化された複合体とを結合することによる形態が挙げられる。
【００１０】
本発明におけるカチオン性の基を有する重合体としては、水溶液中でカチオンとなり得る原子を有する重合体であればよく、例えば、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、ポリビニルイミダゾール骨格の１種又は２種以上の骨格を有する重合体（共重合体）；これらの重合体の塩、例えば、第一級、第二級、第三級及び第四級アンモニウム塩等が好適であり、中でも、ポリアルキレンポリアミン骨格を有する重合体であるポリエチレンイミンを用いることが好ましい。なお、これらの重合体を化学的に修飾、変成したものも用いることができる。
【００１１】
上記（１）の形態においては、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬を用いることが好ましく、これらを直接的に結合する場合には、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等の脱水縮合剤；Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）；２−イミノチオラン；ＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド  ）等の試薬を用いることが好ましい。また、スペーサー等を介して結合する場合には、例えば、２価性架橋試薬等を用いることが好ましい。これらの中でも、ＥＤＣが好ましい。
【００１２】
上記（２）の形態においては、カチオン化された複合体として、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとが結合した複合体を用いることが好ましく、この場合には、例えば、▲１▼カチオン性の基を有する重合体と、複合体を形成するタンパク質及び／又はペプチドの１種であるアビジン（ａｖｉｄｉｎｅ）とが、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬により結合した複合体；▲２▼カチオン性の基を有する重合体と、複合体を形成するタンパク質及び／又はペプチドの１種であるプロテインＡ及び／又はプロテインＧ（ｐｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇ）とが、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬により結合した複合体；▲３▼カチオン性の基を有する重合体と、複合体を形成するタンパク質及び／又はペプチドの１種である抗体とが、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬により結合した複合体等を用いることが好ましい。上記▲１▼の複合体を用いる場合には、タンパク質及び／又はペプチドをビオチン化試薬によりビオチン化し、アビジンに結合することが好ましい。また、上記▲２▼及び▲３▼の複合体を用いる場合には、抗体がこれらの複合体と結合しやすいことから、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとしては、抗体を用いることが好ましい。
【００１３】
本発明の試験キットは、上記（１）の形態の場合、カチオン性の基を有する重合体が封入された容器（以下、「容器１」ともいう）と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器（以下、「容器２」ともいう）とを含んでなる。
また上記（２）の形態の場合、タンパク質及び／又はペプチドと結合するカチオン化された複合体が封入された容器（以下、「容器３」ともいう）を含んでなる。この場合には、カチオン性の基を有する重合体と複合体を形成するタンパク質及び／又はペプチドとが封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器２とを含んでなる形態；複合体を形成するタンパク質及び／又はペプチドが封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体が封入された容器１と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器２とを含んでなる形態であってもよい。
【００１４】
これらの場合、試験キットの使用方法としては、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドを含むカチオン化された複合体を形成することになる限り特に限定されるものではない。
上記（１）の形態の場合には、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドを容器１に入れ、次いで容器１の内容物を容器２に入れる方法；容器１の内容物を容器２に入れ、次いで導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドを容器２に入れる方法等が好ましい。
【００１５】
上記（２）の形態の場合には、下記のような使用方法が好適である。
▲１▼カチオン性の基を有する重合体とアビジンとによる複合体を用いる場合：ビオチン化した導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドを、カチオン性の基を有する重合体とアビジンとによる複合体が封入された容器３に入れる方法；カチオン性の基を有する重合体とアビジンとが封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器２とを用いて容器３を形成し、該容器３にビオチン化した導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドを入れる方法；アビジンが封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体が封入された容器１と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器２とを用いて容器３を形成し、該容器３にビオチン化した導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドを入れる方法。
【００１６】
▲２▼カチオン性の基を有する重合体とプロテインＡ及び／又はプロテインＧとによる複合体を用いる場合：導入目的物である抗体を、カチオン性の基を有する重合体とプロテインＡ及び／又はプロテインＧとによる複合体が封入された容器３に入れる方法；カチオン性の基を有する重合体とプロテインＡ及び／又はプロテインＧとが封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器２とを用いて容器３を形成し、該容器３に導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドを入れる方法；プロテインＡ及び／又はプロテインＧが封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体が封入された容器１と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器２とを用いて容器３を形成し、該容器３に導入目的物である抗体を入れる方法。
【００１７】
▲３▼カチオン性の基を有する重合体と抗体とによる複合体を用いる場合：導入目的物である抗体を、カチオン性の基を有する重合体と抗体とによる複合体が封入された容器３に入れる方法；カチオン性の基を有する重合体と複合体を形成する抗体とが封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器２とを用いて容器３を形成し、該容器３に導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドを入れる方法；複合体を形成する抗体が封入された容器と、カチオン性の基を有する重合体が封入された容器１と、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬が封入された容器２とを用いて容器３を形成し、該容器３に導入目的物である抗体を入れる方法。
【００１８】
なお、これらの形態において、上記複合体を形成するタンパク質及び／又はペプチドと、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとは同一であっても異なっていてもよい。また、タンパク質及び／又はペプチドとしては、１種を用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１９】
上記（１）の形態の場合、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとカチオン性の基を有する重合体との割合としては、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドの１分子に対して結合する上記重合体の分子数が１〜１０個となるようにすることが好ましい。より好ましくは、１〜３個である。また、個々の上記重合体におけるタンパク質及び／又はペプチドとの結合部位数が１点となるようにすることが好ましい。より好ましくは、１個のタンパク質及び／又はペプチドに対して、１個の上記重合体が１点だけで結合することである。
【００２０】
上記容器１に封入するカチオン性の基を有する重合体は、水溶液の形態とすることが好ましい。より好ましくは、使用直前に水に溶解し、重合体水溶液として用いることである。上記重合体水溶液中の上記重合体の濃度としては、１質量％以上、また、６０質量％以下とすることが好ましい。１質量％未満であると、タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に充分に導入することができなくなるおそれがある。６０質量％を超えると、タンパク質及び／又はペプチドの機能や構造を充分に保持することができなくなるおそれがある。より好ましくは、５質量％以上、また、２０質量％以下である。
【００２１】
上記カチオン性の基を有する重合体の水溶液のｐＨとしては、３．０以上、また、１１．０以下とすることが好ましい。より好ましくは、４．０以上、また、１０．０以下である。上記重合体水溶液のｐＨの調整は、塩酸や硫酸等を用いることができる。
上記容器に封入する試薬の形状としては、特に限定されず、粉末状であっても、媒体に溶解した状態であっても良い。試薬の量としては特に限定されず、上記重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するのに適当な量を設定することとなる。
【００２２】
上記（２）の形態の場合、容器３におけるカチオン化された複合体を形成するタンパク質及び／又はペプチド、すなわち上記▲１▼の形態においてはアビジン、上記▲２▼の形態においてはプロテインＡ及び／又はプロテインＧ、上記▲３▼の形態においては抗体の１分子に対して結合する上記重合体の分子数としては特に限定されず、例えば、１〜１０個が好ましい。より好ましくは、１〜３個である。また、個々の上記重合体におけるタンパク質及び／又はペプチドとの結合部位数が１点となるようにすることが好ましい。より好ましくは、１個のタンパク質及び／又はペプチドに対して、１個の上記重合体が１点だけで結合することである。
【００２３】
上記容器３におけるカチオン化された複合体と、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとのモル比としては、上記▲１▼の形態においては、１０／９０〜９０／１０とすることが好ましく、２０／８０〜８０／２０とすることがより好ましい。上記▲２▼の形態においては、１０／９０〜９０／１０とすることが好ましく、３０／７０〜７０／３０とすることがより好ましい。上記▲３▼の形態においては、１０／９０〜９０／１０とすることが好ましく、３０／７０〜７０／３０とすることがより好ましい。これにより、本発明の作用効果が充分に発揮されるように、容器３における複合体と導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとの結合を適切に行うことができる。
【００２４】
容器としては、０．５〜１０ｍＬのものを用いることが好適である。これらの容器は、オートクレープや紫外線、ガンマ線などで滅菌処理してもよい。また、カビの発生や容器内の物質の腐敗を防ぐために、容器の内側をコーティングしてもよい。更に、窒素やアルゴンなどの不活性ガス下で、容器に内容物を封入することも好ましい。なお、容器の保存方法としては、容器内に上記物質を封入後、５℃以下の低温で密封保存することが好ましい。
本発明の試験キットにおける好ましい形態の１つは、図１に示すような容器を含んでなる試験キットである。
【００２５】
以下では、本発明において使用することができる試験物質や試薬等について更に詳しく説明する。
本発明におけるタンパク質及び／又はペプチドとしては、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合して生じる化合物を用いることができる。このようなタンパク質及び／又はペプチドとしては、例えば、ペプチド、酵素、抗体、その他機能性（薬理作用等の生理活性）を有し、医薬・薬物として有用なタンパク質及び／又はペプチド等が挙げられる。分子量としては、１００〜１００００００であることが好ましい。なお、本発明におけるタンパク質及び／又はペプチドは、糖鎖、脂質、リン酸基等が結合した複合タンパク質及び／又はペプチドをも含む。
なお、構造としては、天然状態であっても変性状態であってもよい。
【００２６】
本発明におけるカチオン性の基を有する重合体としては、２を超えて３００００以下のカチオン価を有する重合体であることが好ましい。２以下であると、カチオン性の基を有する重合体と結合するタンパク質及び／又はペプチドの機能を充分に保持することができなくなるおそれがあり、また、３００００を超えると、本発明の作用効果を充分に発揮することができないおそれがある。より好ましくは、２００００以下であり、更に好ましくは、２５００以下であり、特に好ましくは、２５０以下であり、最も好ましくは、４以上、７０以下である。
【００２７】
上記カチオン価とは、重合体のアミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）と該重合体の数平均分子量との積を１０００で割った値であり、また、アミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）は、試料化合物中に含まれるアミンの総量の指標を意味し、試料化合物１ｇに含まれるアミンのｍｍｏｌ数で表される。試料化合物のアミン価は、一般的なアミノ基の定量方法に従って測定することができる。一般的なアミノ基の定量方法としては、例えば、「新実験化学講座  第１３巻  有機化学構造Ｉ」（日本化学会編、丸善株式会社、昭和５３年１１月２０日、ｐ．８８−９９）に記載の方法やコロイド滴定法（例えば、千手諒一著、「コロイド滴定法」、第１版、株式会社南江堂、１９６９年１１月２０日参照。）が挙げられる。上記アミン価の分析は、試料化合物の形態、溶解性、含有不純物等を考慮して、精度よく分析できる方法を適宜選択する必要がある。上記重合体のアミン価としては、１〜３０であることが好ましく、５〜２５であることがより好ましい。
【００２８】
上記カチオン性の基を有する重合体の数平均分子量としては、細胞導入効率、取扱い性等の点から、１００〜１０００００であることが好ましい。より好ましくは、１００〜１００００であり、更に好ましくは、２００〜３０００である。なお、数平均分子量の測定方法については、分子量を精度よく測定するために、数平均分子量が１００００以下の場合は沸点上昇法により測定することが好ましく、１００００を超える場合はゲルパーミーエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定することが好ましい。
【００２９】
上記カチオン性の基を有する重合体としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン等のポリアルキレンイミン等のポリアルキレンポリアミン；ポリアリルアミン、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド等のポリアリルアミン；ポリアクリルアミドのホフマン分解物、ポリビニルアセトアミド加水分解物、ポリビニルフタルイミドの加水分解物、Ｎ−ビニルホルムアミドポリマーの加水分解物等のポリビニルアミン；ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド（共）重合体等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド（共）重合体；ポリメタアクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート（共）重合体；ポリアミジン；ポリビニルピリジン；ポリビニルイミダゾール；ジシアンジアミド系縮合物；エピクロロヒドリン・ジメチルアミン縮合物等のエピクロロヒドリン・ジアルキルアミン縮合物；ジメチルアミン・エチレンジクロライド縮合物等のジアルキルアミン・アルキルジハライド縮合物；ポリビニルイミダゾリン；ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド；カルボキシメチルセルロース第四級アンモニウム（第四級アンモニウムＣＭＣ）；グリコールキトサン；カチオン化デンプン等が好ましく、中でも、上述したようにポリエチレンイミンを用いることが好ましい。
【００３０】
上記カチオン性の基を有する重合体のアミン価の理論値について、以下の表に例示する。
【００３１】
【表１】
2004350526.tif 000002
【００３２】
上記表中、アミン価の理論値は、重合体を形成する単量体の分子量の逆数に１０００をかけた値を表す。一般的に、上述の方法により測定されるアミン価の実測値は、その理論値と測定誤差の範囲内でほぼ一致し、上述の方法により測定されるアミン価に基づいて、重合体のカチオン価を算出することができる。アミン価は、重合体の合成方法の変更、他成分との共重合、重合体の化学的修飾により、任意に変化させることが可能である。
【００３３】
本発明におけるカチオン性の基を有する重合体としては、上述したようにポリエチレンイミンを用いることが好ましく、例えば、下記一般式（１）で表されるものを用いることが好ましい。
【００３４】
【化１】
2004350526.tif 000003
【００３５】
式中、Ｘ及びＹは、同一又は異なって、１以上の整数を表す。
【００３６】
上記ポリエチレンイミンは、大きな正の電荷密度を有する水溶性ポリマーであり、かまぼこの沈殿剤等の食品添加物としても利用されており、生体に対する安全性が確認されている。その構造は、直鎖状のものであっても、分岐鎖を多数有する枝分かれ状のものであってもよいが、例えば、より正電荷密度が高いことから、下記一般式（２）で表されるような枝分かれ構造を有するポリエチレンイミンが好ましい。
【００３７】
【化２】
2004350526.tif 000004
【００３８】
上記（１）の形態の場合、カチオン性の基を有する重合体と導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとの結合は、共有結合であることが好ましく、また、各種の合成手法を利用することにより、様々な結合方法で結合させることが可能である。例えば、カチオン性の基を有する重合体としてポリエチレンイミンを用い、カチオン性の基を有する重合体とタンパク質及び／又はペプチドとを結合するための試薬としてＥＤＣ、ＤＣＣ等の脱水縮合剤を用いる場合には、ポリエチレンイミンのアミノ基と、タンパク質及び／又はペプチド分子中のアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基又は炭素末端のカルボキシル基との間にアミド結合を形成することができる。ＥＤＣを用いた場合の例を下記式に模式的に示す。
【００３９】
【化３】
2004350526.tif 000005
【００４０】
上記試薬としてＳＰＤＰ等を用いる場合には、ポリエチレンイミンのアミノ基と、タンパク質及び／又はペプチド分子中のシステイン残基のチオール基との間に、ジスルフィド結合を含む共有結合を形成することができる。ＳＰＤＰを用いた場合の例を下記式に模式的に示す。
【００４１】
【化４】
2004350526.tif 000006
【００４２】
上記ジスルフィド結合は、可逆的な結合であり、細胞質内の還元条件下で解離する。そのため、ジスルフィド結合により結合した複合体は、細胞内に導入されるとタンパク質及び／又はペプチドとポリエチレンイミンとに分離し、該タンパク質及び／又はペプチドが、より有利にその機能を細胞内で発揮することが期待される。
【００４３】
上記試薬として２−イミノチオラン等を用いる場合には、タンパク質及び／又はペプチド分子中のリジン残基又はＮ末端のアミノ基と、ポリエチレンイミンのアミノ基とを結合することができる。また、ＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド  ）等を用いる場合には、タンパク質及び／又はペプチド分子中のシステイン残基のチオール基と、ポリエチレンイミンのアミノ基との間にチオエーテル結合を含む共有結合を形成することができる。
【００４４】
上記以外の試薬を用いて、例えば、エーテル結合、エステル結合、イミド結合、炭素−炭素結合、アミジン結合等を形成することができる。これらの結合方法については、文献（例えば、東京化学同人社、「タンパク質ＩＶ  構造機能相関」、社団法人日本生化学会編、第１版、１９９１年３月２０日）等を参照することにより、様々な結合方法を採用することができる。
【００４５】
上記（２）の形態の場合、カチオン化された複合体を導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドのキャリヤーとして用いることにより、複合体と導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとを可逆的に結合させることができる。この可逆的な結合としては、複合体と導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとが直接的に可逆的に結合しなくても、例えば、複合体と導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとが可逆的に結合できるようなスペーサーを介して結合する形態であってもよい。なお、本発明において結合とは、結合及び／又は会合を意味するものである。
【００４６】
上記導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドは、カチオン化された複合体を形成するタンパク質及び／又はペプチドの一部分と結合することが好ましい。この結合は、可逆的な非共有結合であることが好ましい。上記導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとカチオン化された複合体とは、例えば、タンパク質と該タンパク質に対するリガンドとの関係にあるものと考えられる。タンパク質に対するリガンドとは、例えば、酵素に対する基質若しくは補酵素、抗体に対する抗原、又は、アビジンやストレプトアビジンに対するビオチンのように、特定のタンパク質に親和性を有し、そのタンパク質に非共有結合的に結合する化合物である。
【００４７】
上記導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとカチオン化された複合体との結合形態としては、例えば、アビジンとビオチンとの結合；ブドウ球菌由来プロテインＡ及び／又はプロテインＧと、各種哺乳類等の抗体のサブクラス：ＩｇＧのＦｃフラグメントとの結合；抗体のＦｃ部位を認識する２次抗体と１次抗体との結合等が挙げられる。これらの結合を利用して細胞内に導入しようとするタンパク質及び／又はペプチドを複合体中のタンパク質及び／又はペプチドに結合することができる。このように導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドに対して親和性を有するタンパク質及び／又はペプチドを複合体に用いることにより、該複合体と導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドとを混合するだけで導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドは複合体中のタンパク質及び／又はペプチドに結合することができる。
【００４８】
また上記導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドと複合体との結合としては、細胞内で開裂する結合であってもよく、このような細胞内で開裂する結合には、例えば、導入目的物であるタンパク質及び／又はペプチドと複合体との間に導入したスペーサー部位で開裂する形態も含まれる。
【００４９】
また本発明の試験キットにおいて製造又は使用される複合体は、必要に応じて標識していてもよい。標識方法としては特に限定されず、例えば、蛍光標識、オートラジオグラフィ、高電子密度物質、色素不溶化酵素を用いる方法であることが好ましい。特に好ましい方法は、蛍光標識化合物を共有結合により複合体を標識する方法である。
【００５０】
蛍光標識に用いる蛍光物質としては特に限定されず、例えば、ピレン、アントラニロイル基、ダンシル基、フルオレセイン、ローダミン、ニトロベンゾキサジアゾール基等の蛍光団を有する化合物が挙げられる。上記の蛍光団を有する化合物は、文献（例えば、平塚寿章、「タンパク質  核酸  酵素」、１９９７年、第４２巻、第７号等参照）等に開示されており、常法によりタンパク質分子又はペプチド等に導入することができる。
【００５１】
本発明のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットを用いて細胞内にタンパク質及び／又はペプチドを導入する方法としては特に限定されず、例えば、タンパク質及び／又はペプチドを導入しようとする細胞を含む培地中に、該試験キットにおいて形成された複合体、又は、それを含む溶液を添加する。その後、上記細胞を適切な培養温度、培養時間等の培養条件で培養する方法が好適である。これにより、上記複合体は細胞内に取り込まれ、時間の経過とともに該複合体の細胞への取り込み量は増加することとなる。このような導入方法では、複合体の添加量、添加濃度、添加時間等を変化させることにより、タンパク質及び／又はペプチドの細胞内への導入量を容易に制御することが可能である。
【００５２】
上記導入方法においては、上記複合体は、該複合体が有する正電荷と細胞表面の負電荷との静電相互作用に起因する機構により細胞内へ取り込まれるものと推測されるため、培地中で細胞に該複合体を取り込ませる場合には、ヘパリン、核酸等のアニオン性ポリマーが共存しない条件下で行うことが好ましい。また、上記複合体を含む溶液を、例えば、経口投与、静脈内投与、患部への注射、皮膚への塗布等の方法により、直接生体に接種して、生体内の細胞に上記複合体を取り込ませることもできる。
【００５３】
本発明の試験キットにおけるタンパク質の細胞内導入技術は、生細胞におけるタンパク質及び／又はペプチドの機能解析への応用、更に、医療品、医薬品、試薬、創薬支援、再生医療に適用することができる。このような形態は、本発明の好ましい実施形態の一つである。例えば、薬物として薬理作用等の生理活性を有するタンパク質及び／又はペプチド（例えば、酵素、抗体、ホルモン等）と、ポリエチレンイミンとを結合させて複合体としたものを医薬として用いることができる。このような医薬は、ポリエチレンイミンがキャリヤーとして作用し、薬物であるタンパク質又ペプチドが効率良く細胞内に送達されるため非常に有用である。また、体外で（ｅｘ  ｖｉｖｏ）タンパク質及び／又はペプチド等を導入した細胞を再び体内に戻す治療方法にも適用することができる可能性を有する。
【００５４】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味するものとする。
【００５５】
参考例１
容器１（１．５ｍｌのプラスチック製透析保存用チューブ）に数平均分子量が６００であるポリエチレンイミン（ＷＡＫＯ社製、カタログ番号１６１−１７８３１、以下「ＰＥＩ６００」と記載。）を３０ｍｇ／ｍｌ溶解した水溶液（塩酸にてｐＨ５に調整）、０．８ｍｌを窒素ガス下で封入した。また、容器２（１．５ｍｌのプラスチック製透析保存用チューブ）には、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ＰＩＥＣＥ社製）２ｍｇを封入した。
【００５６】
参考例２
リコンビナントプロテインＧ（シグマ社製、カタログ番号Ｐ５１７０）５ｍｇを濃度０．５ｍｇ／ｍｌになるように６０ｍｇ／ｍｌＰＥＩ６００溶液（塩酸にてｐＨ５に調整）に溶解した。５ｍｇのＥＤＣ（ＰＩＥＣＥ社製）を前記プロテインＧ溶液に添加し、４℃で一晩放置した。超純水に対して透析を行うことにより未反応のＰＥＩを除き、標記のプロテインＧ−ＰＥＩを得た。
得られたプロテインＧ−ＰＥＩを、１μＭとなるように調整し、容器（１．５ｍｌのプラスチック製透析保存用チューブ）に１．０ｍｌ封入した。
【００５７】
参考例３
ＰＥＩ６００溶液（塩酸にてｐＨ５に調整）１ｍｌに、アビジン１ｍｇを溶解した。５ｍｇのＥＤＣを添加してボルテックスミキサーで３０秒間攪拌後、室温で２時間インキュベートした。反応溶液を水に対して透析し、凍結乾燥した後、０．５Ｍのヒドロキシルアミン溶液１ｍｌを添加し、室温で５時間インキュベートした。反応終了後、反応溶液を水に対して透析し、アビジン−ＰＥＩを得た。
得られたアビジン−ＰＥＩを０．１μＭとなるように調整し、容器１（１．５ｍｌのプラスチック製透析保存用チューブ）に１．０ｍｌ封入した。
また、容器２（１．０ｍｌのプラスチック製透析保存用チューブ）には、ビオチン−ＡＣ５−ＯＳＵ（同仁化学社製）をＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に２ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液１００μＬを封入した。
【００５８】
実施例１
参考例１で作成したキットを用いて、以下の実験を実施した。
蛋白質として、ｅＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた。ｅＧＦＰは、アミノ末端側にＨｉｓタグを含み、大腸菌リコンビナント蛋白質として発現・精製したものである。
参考例１の容器１に、ｅＧＦＰを２ｍｇ溶解した。ピペットを用いて、容器１の溶液全量を容器２に注入し、室温で３時間放置した。容器２の溶液を、超純水に対して充分透析することで、ｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体を得た。
Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３  Ａ３１Ｋ  細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養し、その培養上清に１００ｎＭ（３μｇ／ｍｌ）のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体を添加し、８時間後に共焦点顕微鏡にて細胞を観察した。その観察結果を図２に示す。図２の観察結果からわかるとおり、ｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体は効率的に細胞内に取り込まれていることが確認された。なお、蛍光観察は生細胞のままで、固定等は行っていない。
【００５９】
実施例２
実施例２に供する蛋白質として、ＦＩＴＣ標識したＩｇＧを以下の要領で調整した。
０．１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ９）０．５ｍｌにＩｇＧ（シグマ社製、ヤギ由来）１０ｍｇを溶解した。１ｍｌのＤＭＦに３．０ｍｇのＦＩＴＣ（Ｉ型、同仁化学研究所社製）を溶解した液を３０μＬとり、ＩｇＧ溶液に添加した。室温で２時間反応させた後、ゲルろ過にて精製してＦＩＴＣで修飾されたＩｇＧを得た。得られたＦＩＴＣ標識ＩｇＣは、濃縮後、実施例２に供した。
参考例１で作成したキットを用いて、以下の実験を実施した。
参考例１の容器１に、ＦＩＴＣ標識ＩｇＧを５００μｇ溶解した。ピペットを用いて、容器１の溶液全量を容器２に注入し、室温で３時間放置した。容器２の溶液を、超純水に対して充分透析することで、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ複合体を得た。
Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３  Ａ３１Ｋ  細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養し、その培養上清に１００ｎＭ（３μｇ／ｍｌ）のＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ複合体を添加し、３時間後に共焦点顕微鏡にて細胞を観察した。
その観察結果を図３に示す。図３の観察結果からわかるとおり、ＦＩＴＣ−１ｇＧ−ＰＥＩ複合体は効率的に細胞内に取り込まれていることが確認された。なお、蛍光観察は生細胞のままで、固定等は行っていない。
【００６０】
実施例３
定法に従って、ＦＩＴＣ標識ＩｇＧ（ウサギ由来）の４μＭ濃度に調整した溶液を準備した。
参考例２で作成したキットを用いて、以下の実験を実施した。
プロテインＧ−ＰＥＩ水溶液を１００μＬ、ＦＩＴＣ標識ＩｇＧ水溶液を１００μＬ混和して、氷上で３０分間放置した。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３  Ａ３１Ｋ  細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。その培養上清に、プロテインＧ−ＰＥＩが２５ｎＭとなるように添加し、３時間後に共焦点顕微鏡にて細胞を観察した。図４の観察結果からわかるとおり、プロテインＧ−ＰＥＩ複合体は効率的に細胞内に取り込まれていることが確認された。なお、蛍光観察は生細胞のままで、固定等は行っていない。
【００６１】
実施例４
参考例３で作成したキットを用いて、以下の実験を実施した。
実施例１で用いたｅＧＦＰをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ、リン酸緩衝食塩水）に２．５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液１ｍＬを準備した。ここに、容器２に封入した溶液を５０μＬを添加し、純粋に対して透析することで、ビオチン−ｅＧＦＰの溶液を得た。
容器１のアビジン−ＰＥＩと、ビオチン−ｅＧＦＰ溶液が１：２のモル比となるように混合し、氷上で３０分間放置した。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３  Ａ３１Ｋ細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。その培養上清に、先の混合物をアビジン−ＰＥＩが１００ｎＭ、ビオチン−ｅＧＦＰが２００ｎＭとなるように添加し、３時間後に共焦点顕微鏡にて細胞を観察した。図５の観察結果からわかるとおり、ビオチン−ｅＧＦＰ＋アビジン−ＰＥＩの複合体は効率的に細胞内に取り込まれていることが確認された。なお、蛍光観察は生細胞のままで、固定等は行っていない。
【００６２】
【発明の効果】
本発明の試験キットは、上述のような構成よりなるため、任意のタンパク質及び／又はペプチドを、その機能を損なうことなく、効率的にかつ容易に細胞内に導入することを可能とするものである。すなわち本発明の試験キットを用いることにより、１〜数個以内の少数のアミノ酸側鎖の修飾で多数のカチオンを導入することができるため、タンパク質及び／又はペプチドの構造や機能に対する影響が軽微となるうえに、機能が未知のタンパク質及び／又はペプチドの機能解析を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における試験キットの好ましい形態を例示した概念図である。
【図２】実施例１において、本発明のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットを用いることにより、ｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体がＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３  Ａ３１Ｋ  細胞内に取り込まれたことを蛍光及び透過光により観察した観察図である。
【図３】実施例２において、本発明のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットを用いることにより、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ複合体がＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３  Ａ３１Ｋ  細胞内に取り込まれたことを蛍光及び透過光により観察した観察図である。
【図４】実施例３において、本発明のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットを用いることにより、プロテインＧ−ＰＥＩ複合体がＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３Ａ３１Ｋ  細胞内に取り込まれたことを蛍光及び透過光により観察した観察図である。
【図５】実施例４において、本発明のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットを用いることにより、ビオチン−ｅＧＦＰ＋アビジン−ＰＥＩの複合体がＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３  Ａ３１Ｋ  細胞内に取り込まれたことを蛍光及び透過光により観察した観察図である。
【図１】
2004350526.tif 000007
【図２】
2004350526.tif 000008
【図３】
2004350526.tif 000009
【図４】
2004350526.tif 000010
【図５】
2004350526.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月20日(2003.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における試験キットの好ましい形態を例示した概念図である。
【図２】実施例１において、本発明のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットを用いることにより、ｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体がＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３  Ａ３１Ｋ  細胞内に取り込まれたことを蛍光及び透過光により観察した観察図である。
【図４】実施例３において、本発明のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットを用いることにより、プロテインＧ−ＰＥＩ複合体がＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３Ａ３１Ｋ  細胞内に取り込まれたことを蛍光及び透過光により観察した観察図である。
【図５】実施例４において、本発明のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットを用いることにより、ビオチン−ｅＧＦＰ＋アビジン−ＰＥＩの複合体がＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３  Ａ３１Ｋ  細胞内に取り込まれたことを蛍光及び透過光により観察した観察図である。


【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】削除
【補正の内容】