(57)【要約】      （修正有）【課題】抗Ｄ因子抗体及びコンジュゲートならびにその使用方法を提供する。【解決手段】Ｄ因子に結合する単離抗体であって、前記抗体が、（ａ）アミノ酸配列ＳＹＹＭＹを含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）アミノ酸配列Ｘ４ＩＮＰＸ５Ｘ６ＧＸ７ＴＮＦＮＥＫＦＫＳを含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ４が、Ｅ及びＷから選択され、Ｘ５が、Ｔ及びＹから選択され、Ｘ６が、Ｎ、Ｓ、及びＱから選択され、Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、及びＥから選択される）、（ｃ）アミノ酸配列ＥＧＧＦＡＹを含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＤＴＤＶＡを含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＲＸ１Ｓを含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択される）、ならびに（ｆ）アミノ酸配列ＱＱＹＸ３ＮＹＰＬＴを含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ３が、Ｎ及びＥから選択される）を含む、前記抗体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ因子に結合する単離抗体であって、前記抗体が、（ａ）アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号１５）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）アミノ酸配列Ｘ４ＩＮＰＸ５Ｘ６ＧＸ７ＴＮＦＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１１）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ４が、Ｅ及びＷから選択され、Ｘ５が、Ｔ及びＹから選択され、Ｘ６が、Ｎ、Ｓ、及びＱから選択され、Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、及びＥから選択される）、（ｃ）アミノ酸配列ＥＧＧＦＡＹ（配列番号２５）を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＤＴＤＶＡ（配列番号９）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（配列番号１０８）を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択される）、ならびに（ｆ）アミノ酸配列ＱＱＹＸ３ＮＹＰＬＴ（配列番号１１０）を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ３が、Ｎ及びＥから選択される）を含む、前記抗体。
【請求項２】
前記抗体が、配列Ｘ２ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（配列番号１０９）を含み、式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択され、Ｘ２が、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、及びＱから選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｘ２が、Ｒである、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
Ｘ１が、Ｙである、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１３または１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、
ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｆ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｇ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｈ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｊ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｋ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または
ｌ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
軽鎖の４９位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、及び６３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、及び６２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、
ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｆ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｇ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｈ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｊ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｋ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｌ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｍ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｎ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｏ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｐ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｑ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
ｒ）配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、または前記抗体が、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
ヒト化またはキメラ抗体である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
Ｄ因子に結合する抗体断片である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
Ｆａｂ断片である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記軽鎖が、配列番号１１２の配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記重鎖が、配列番号１１３、１２８〜１３２、１３４〜１３７、及び１５４〜１５６から選択される配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１５または請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、
ａ）配列番号７１、１１８〜１２２、及び１４０〜１４６から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｂ）配列番号７５、１２３〜１２７、及び１４７〜１５３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｃ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｄ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｅ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｆ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｇ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｈ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｉ）配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｊ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｋ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｌ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｍ）配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｎ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｏ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｐ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｑ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｒ）配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
ｓ）配列番号９９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、
ａ）配列番号７１、１１８〜１２２、及び１４０〜１４６から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
ｂ）配列番号７５、１２３〜１２７、及び１４７〜１５３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、操作システインを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
前記操作システインが、重鎖内のＴ１１０Ｃ、Ａ１３６Ｃ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７５Ｃ、Ｔ１８３Ｃ、またはＴ２０５Ｃ突然変異、ならびに軽鎖内のＩ１０６Ｃ、Ｒ１０８Ｃ、Ｒ１４２Ｃ、Ｋ１４９Ｃ、及びＶ２０５Ｃ突然変異から選択され、残基番号が、Ｋａｂａｔ番号付けに従う、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２３】
Ｄ因子に結合する単離抗体であって、前記抗体が、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、前記抗体。
【請求項２４】
Ｄ因子に結合する単離抗体であって、前記抗体が、配列番号１１９のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号７０のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、前記抗体。
【請求項２５】
Ｄ因子が、配列番号１０６のアミノ酸配列を含むヒトＤ因子である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体が、カニクイザルＤ因子に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
前記カニクイザルＤ因子が、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
前記抗体が、ヒトＤ因子のＫＤよりも１０倍未満、または７倍未満、または５倍未満、または３倍未満高いＫＤでカニクイザルＤ因子に結合する、請求項２６または請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
先行請求項のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離核酸。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項３１】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、前記抗体が産生されるように、請求項３０に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項３２】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的製剤。
【請求項３３】
前記薬学的に許容される担体が、約５．５〜約８．０のｐＨを有する緩衝液を含む、請求項３２に記載の薬学的製剤。
【請求項３４】
前記抗体が、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１９０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２１０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２３０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２４０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２６０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２７０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２８０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２９０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも３００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３２または請求項３３に記載の薬学的製剤。
【請求項３５】
前記抗体が、１５０ｍｇ／ｍｌ〜３５０ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ、または１７０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ、または２００ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
【請求項３６】
前記組成物が、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２０週間、少なくとも２４週間、または少なくとも２８週間、４℃にて保存後に、目に見える沈殿物を含まない、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
【請求項３７】
２５℃で、前記組成物の粘度が、３０ｃＰ未満、２５ｃＰ未満、２０ｃＰ未満、１５ｃＰ未満、または１０ｃＰ未満である、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
【請求項３８】
前記組成物中の抗Ｄ因子抗体の濃度が、１００ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌである、請求項３７に記載の薬学的製剤。
【請求項３９】
前記薬学的製剤が、狭口径針を通した硝子体内投与に適している、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
【請求項４０】
前記狭口径針が、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、または２２ゲージである、請求項３６に記載の薬学的製剤。
【請求項４１】
１つ以上のポリオールに共有結合している、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体を含む、コンジュゲート。
【請求項４２】
前記ポリオールが、多アーム型ポリオールである、請求項４１に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
前記コンジュゲートが、多アーム型ポリオールに共有結合している少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの抗体を含む、請求項４１または請求項４２に記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
前記ポリオールが、システインアミノ酸の遊離スルフヒドリル基を通して少なくとも１つの抗体に共有結合している、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
前記システインアミノ酸が、操作システインである、請求項４４に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
前記システインアミノ酸が、前記抗体の定常領域内にある、請求項４４または請求項４５に記載のコンジュゲート。
【請求項４７】
前記システインアミノ酸が、前記抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端にある、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４８】
前記ポリオールが、リジンアミノ酸の遊離アミノ基を通して少なくとも１つの抗体に共有結合している、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４９】
前記リジンアミノ酸が、前記抗体の定常領域内にある、請求項４８に記載のコンジュゲート。
【請求項５０】
前記リジンアミノ酸が、前記抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端にある、請求項４８に記載のコンジュゲート。
【請求項５１】
前記ポリオールが、二量体、四量体、六量体、及び八量体から選択される多アーム型ポリオールである、請求項４１〜５０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５２】
前記多アーム型ポリオールが、八量体である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【請求項５３】
前記ポリオールが、ポリエチレングリコールである、請求項３８〜４９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５４】
前記ポリエチレングリコールが、約５００Ｄ〜約３００，０００Ｄの重量平均分子量を有する、請求項５３に記載のコンジュゲート。
【請求項５５】
前記ポリエチレングリコールが、約２０，０００Ｄ〜約６０，０００Ｄの重量平均分子量を有する、請求項５３に記載のコンジュゲート。
【請求項５６】
前記ポリエチレングリコールが、約４０，０００Ｄの重量平均分子量を有する、請求項５３に記載のコンジュゲート。
【請求項５７】
前記ポリエチレングリコールが、一般式（Ｉａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000093
式中、各ｍが、独立して、３〜２５０の整数であり、ｎが、１〜１０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ前記抗体に共有結合している、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５８】
前記ポリエチレングリコールが、一般式（Ｉｂ）の構造を有し、
2022002521.tif 000094
（Ｉｂ）
式中、各ｍが、独立して、３〜２５０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ前記抗体に共有結合している、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５９】
前記ポリエチレングリコールが、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000095
式中、各ｍが、独立して、３〜２５０の整数であり、ｎが、１〜１０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ前記抗体に共有結合している、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６０】
ｎが、４である、請求項５９に記載のコンジュゲート。
【請求項６１】
前記ポリエチレングリコールが、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000096
式中、各ｍが、独立して、３〜２５０の整数であり、ｎが、１〜１０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ前記抗体に共有結合している、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６２】
ｎが、４である、請求項６１に記載のコンジュゲート。
【請求項６３】
前記ポリエチレングリコールが、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000097
式中、各ｍが、独立して、３〜２５０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ前記抗体に共有結合している、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６４】
ｍが、５０〜２００の整数である、請求項５７〜６３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６５】
ｍが、１００〜１５０の整数である、請求項６４に記載のコンジュゲート。
【請求項６６】
少なくとも１つのＲ１が、連結基であり、Ｒ１及びＲ２が、１つにまとめると、
2022002521.tif 000098
及びこれらの組み合わせから選択され、式中、各ｉが、独立して、０〜１０の整数であり、ｊが、０〜１０の整数である、請求項５７〜６５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６７】
各Ｒ２が、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項５７〜６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６８】
各Ｒ２が、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される、請求項６７に記載のコンジュゲート。
【請求項６９】
Ｒ２が、マレイミドである、請求項６８に記載のコンジュゲート。
【請求項７０】
Ｒ１及びＲ２が、１つにまとめると、
2022002521.tif 000099
であり、ｉが、０〜１０の整数であり、ｊが、０〜１０の整数である、請求項５７〜６９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７１】
前記Ｒ２基のうちの少なくとも７つが、前記抗体のうちの１つに共有結合している、請求項５７〜６９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７２】
前記Ｒ２基のうちの８つが、前記抗体のうちの１つに共有結合している、請求項７１に記載のコンジュゲート。
【請求項７３】
１つ以上のポリオールに共有結合している、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体を含む、請求項４１〜７２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７４】
一般式（Ｉｂ）の構造を有するポリエチレングリコールに共有結合している、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体を含む、コンジュゲートであって、
2022002521.tif 000100
（Ｉｂ）
式中、各ｍが、独立して、３〜２５０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ前記抗体に共有結合している、コンジュゲート。
【請求項７５】
ｍが、５０〜２００の整数である、請求項７４に記載のコンジュゲート。
【請求項７６】
ｍが、１００〜１５０の整数である、請求項７４に記載のコンジュゲート。
【請求項７７】
前記コンジュゲートが、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体を多アーム型ポリオールに共有結合することによって調製される、請求項４１〜７６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７８】
請求項４１〜７７のいずれか一項に従ってコンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的製剤。
【請求項７９】
前記抗体の濃度が、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも３００ｍｇ／ｍｌである、請求項７８に記載の薬学的製剤。
【請求項８０】
前記抗体の濃度が、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌである、請求項７９に記載の薬学的製剤。
【請求項８１】
２５℃で、前記組成物の粘度が、１０００ｃＰ未満、９００ｃＰ未満、８００ｃＰ未満、７００ｃＰ未満、６００ｃＰ未満、５００ｃＰ未満、４００ｃＰ未満、または３００ｃＰ未満である、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
【請求項８２】
前記組成物中の前記抗Ｄ因子抗体の濃度が、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、請求項８１に記載の薬学的製剤。
【請求項８３】
請求項３２〜４０及び７８〜８２のいずれか一項に記載の薬学的製剤を含む眼内送達のための送達デバイス、ならびに前記製剤を患者の硝子体内に送達するための手段。
【請求項８４】
前記製剤が、その場で長期間効果を持続する、請求項８３に記載の送達デバイス。
【請求項８５】
対象における補体媒介性障害を治療する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体、請求項４１〜７５のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項３２〜４０及び７８〜８２のいずれか一項に記載の薬学的製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項８６】
前記補体媒介性障害が、全身性である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記補体媒介性障害が、補体関連の眼の症状である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記補体関連の眼の症状が、乾燥及び湿潤（非滲出性及び滲出性）型を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記補体関連の眼の症状が、中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ）から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記方法が、移植可能ポート送達系を用いて、前記抗体、コンジュゲート、または薬学的製剤を投与することを含む、請求項８５〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記方法が、硝子体内投与によって、前記抗体、コンジュゲート、または薬学的製剤を投与することを含む、請求項８５〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記硝子体内投与が、狭口径針を通す投与である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記狭口径針が、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、または２２ゲージである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記個体に、追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項８５〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記追加の治療剤が、ＡＮＧ２拮抗薬、ＴＩＥ２拮抗薬、ＶＥＧＦ拮抗薬、及び第２の補体成分拮抗薬から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記追加の治療剤が、抗ＡＮＧ２抗体である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記追加の治療剤が、抗ＴＩＥ２抗体である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記追加の治療剤が、ＶＥＧＦトラップ及び抗ＶＥＧＦ抗体から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記追加の治療剤が、第２の補体成分拮抗薬であり、前記第２の補体成分拮抗薬が、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９から選択される補体成分を阻害する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
対象における補体媒介性障害を治療するための薬剤の調製のために、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体、または請求項４３〜７７のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１０１】
前記補体媒介性障害が、補体関連の眼の症状である、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０２】
前記補体媒介性障害が、全身性である、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０３】
前記補体関連の眼の症状が、乾燥及び湿潤（非滲出性及び滲出性）型を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される、請求項１０２に記載の使用。
【請求項１０４】
前記補体関連の眼の症状が、中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ）から選択される、請求項１０２に記載の使用。
【請求項１０５】
治療剤で用いるための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体、または請求項４１〜７７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０６】
対象における補体媒介性障害を治療する方法で用いるための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体、または請求項４１〜７７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０７】
対象における全身性補体媒介性障害を治療する方法で用いるための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体、または請求項４１〜７７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０８】
前記補体媒介性障害が、補体関連の眼の症状である、請求項１０７に記載の抗体またはコンジュゲート。
【請求項１０９】
前記補体関連の眼の症状が、乾燥及び湿潤（非滲出性及び滲出性）型を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される、請求項１０８に記載の抗体またはコンジュゲート。
【請求項１１０】
前記補体関連の眼の症状が、中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ）から選択される、請求項１０８に記載の抗体またはコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮出願第６２／２４９，１６６号、及び２０１５年１１月４日に出願された米国仮出願第６２／２５０，９９５号の優先権の利益を主張するものであり、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、抗Ｄ因子抗体及びコンジュゲートならびにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
補体系は、免疫複合体のクリアランス、ならびに感染性媒体、外来抗原、ウイルス感染細胞、及び腫瘍細胞に対する免疫反応において、中心的な役割を果たしている。しかしながら、補体は、病的炎症及び自己免疫疾患にも関与する。したがって、補体カスケードの過度なまたは制御されていない活性化の阻害は、かかる疾患及び症状に罹患している患者への臨床的利点を提供し得る。
【０００４】
補体系は、古典的なマンノース結合レクチン及び代替経路と呼ばれる、３つの異なる活性化経路を包含する。Ｖ．Ｍ．Ｈｏｌｅｒｓ  Ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｅｄ．Ｒ．Ｒ．Ｒｉｃｈ，Ｍｏｓｂｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９９６，３６３−３９１。古典的な経路は、カルシウム／マグネシウム依存性カスケードであり、通常は抗原−抗体複合体の形成によって活性化される。マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）経路は、病原体上でのＭＢＬの炭水化物構造への結合によって始まり、Ｃ２とＣ４を切断して、活性型Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ａ、及びＣ４ｂを形成する、ＭＢＬプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）の活性化をもたらす。代替経路は、マグネシウム依存性カスケードであり、ある特定の感受性表面（例えば、酵母及びバクテリアの細胞壁多糖ならびにある特定の生体高分子材料）上でのＣ３の沈着及び活性化によって活性化される。補体経路の活性化は、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、及びＣ５ａアナフィラトキシンならびにＣ５ｂ−９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）のような、補体タンパク質の生物学的に活性な断片を形成し、白血球走化性、マクロファージ、好中球、血小板、マスト細胞、及び内皮細胞の活性化、血管透過性、細胞溶解、及び組織傷害を含む炎症活性を誘発する。
【０００５】
Ｄ因子は、代替補体経路の活性化に不可欠で特異性が高いセリンプロテアーゼである。それは、Ｃ３ｂと結合したＢ因子を切断し、代替経路Ｃ３／Ｃ５コンバターゼの活性要素であるＣ３ｂ／Ｂｂ酵素を生成する。Ｄ因子は、ヒトにおける血漿濃度が極めて低く（１．８μｇ／ｍｌ）、代替補体経路の活性化の律速酵素であることが示されているため、阻害に好適な標的となり得る。Ｐ．Ｈ．Ｌｅｓａｖｒｅ  ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ．（１９７８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：１４９８−１５１０、Ｊ．Ｅ．Ｖｏｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１２：３９５−４０１。
【０００６】
動物モデル及びエキソビボ試験では、補体活性化の下方調節が、いくつかの疾患適応症、例えば、全身性エリテマトーデス及び糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、心肺バイパス法及び血液透析、臓器移植における超急性拒絶反応、心筋梗塞、再灌流傷害、及び成人性呼吸促迫症候群を処置する際に有効であることが実証されている。さらに、熱傷、重度の喘息、アナフィラキシーショック、腸の炎症、蕁麻疹、血管浮腫、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎、及びシェーグレン症候群を含む、その他の炎症状態及び自己免疫／免疫複合体病もまた、補体活性化と密接に関連している。
【０００７】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、中心網膜の進行性慢性疾患であり、視力に大きな影響を与える。Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｌａｎｃｅｔ  ３７９：１７２８。疾患の後期型は、先進工業国において視力低下の主要原因である。４０歳以上の白人人口における、早期ＡＭＤの罹患率は、６．８％と推定され、進行型ＡＭＤでは、１．５％と推定される。ｄｅ  Ｊｏｎｇ（２００６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５５：１４７４。後期ＡＭＤの罹患率は、年齢と共に激増して、８０歳を超えると、１１．８％にまで増加する。非滲出性（乾燥）及び滲出性（湿潤）ＡＭＤの２種類のＡＭＤが存在する。さらに一般的な乾燥型ＡＭＤは、中心網膜（黄斑）の基部にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮性及び肥大性変化、ならびにＲＰＥ上への蓄積（ドルーゼ）が含まれる。進行型乾燥型ＡＭＤは、地図状萎縮（ＧＡ）を含む重篤な網膜損傷を引き起こすことがあり得、不可逆的な視力喪失を伴う。さらに、乾燥型ＡＭＤ患者は、湿潤型へと進行する可能性があり、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）と呼ばれる異常な血管が網膜の下に生じ、体液と血液が漏出し、最終的には網膜中及び網膜下に失明にいたる円盤状の瘢痕が生じる。
【０００８】
新血管形成（血管新生）を標的としている薬物が湿潤型ＡＭＤ治療の中核となっている。ラニビズマブは、抗ＶＥＧＦＡ抗体断片であり、湿潤型ＡＭＤに罹患している患者の視力改善に非常に有効であることが証明されている。最近の研究は、ＡＭＤと補体カスケードにおける重要なタンパク質との間に関係があるとされており、乾燥型ＡＭＤを治療するために特定の補体要素を標的とする多数の治療法が開発されている。Ｄ因子上の非活性部位への結合を介して、Ｄ因子と代替補体経路を強力に阻害するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ断片（野生型ａＦＤ、ランパリズマブ、ＦＣＦＤ４５１４Ｓ）が、現在、乾燥型ＡＭＤと関連するＧＡの治療のために臨床開発されている。Ｋａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：１２８８６．最近の第ＩＩ相治験は、ランパリズマブの毎月の硝子体内注射が進行型乾燥型ＡＭＤ患者におけるＧＡ病変の進行を効果的に遅らせたことを示している。
【０００９】
眼は、多数の独自の生物物理学的及び解剖学的特徴を有し、眼球薬物送達をより困難にする。例えば、血液眼球関門は、眼を感染から守るための防御機構であるが、同時に、薬物が、特に後眼部の疾患のための薬物が透過することを困難にする。その結果、有効性を改善するために薬物のその場での生物学的利用能（例えば、眼球滞留時間）を達成及び維持する高用量投与が望ましいことが多い。一方、眼球後部の限られた空間は、送達される薬物の体積を抑制し、次に、薬物が高濃度製剤で送達されることを要求する。
【００１０】
眼疾患を有する患者はまた、治療薬の長期作用性／徐放性送達から利益を得ることもあり得る。より低い投与頻度は、改善された利便性を患者にもたらし、感染率の低下と臨床的有効性の増加という潜在的な利益を有し得る。高用量薬品の制御放出はまた、薬物の副作用を最小限にし得る。長期作用性送達のための２つの有望な系は、ＰＬＧＡ系固体移植物及び移植可能ポート送達系（ＰＤＳ）である。両方の系が、長期間にわたってほぼゼロ次放出動力学を提供する潜在力を有する。ＰＬＧＡ移植物について、タンパク質薬物が疎水性ポリマーマトリックスにカプセル化され、そのポリマーのゆっくりとした加水分解を介して薬品放出が達成される。その放出速度は、薬物負荷量、ポリマー疎水性、またはポリマー分子量を変えることによって制御され得る。ＰＤＳは、硝子体への放出がチタンフリットを含む多孔性金属膜によって制御される再充填可能なデバイスである。そのリザーバーは低容量であるので、高タンパク質濃度が、そのＰＤＳを用いる効果的な送達に必要である。
【００１１】
高濃度及び長期作用性送達に加えて、またはそれらの代わりに、薬物の生物学的利用能（例えば、眼球滞留時間）の上昇が、そのタンパク質薬物が天然または合成ポリマーと共有結合でコンジュゲートされるポリシアル化、ＨＥＳ化（ヒドロキシエチルデンプンとのコンジュゲーション）及びＰＥＧ化等の翻訳後修飾によって達成または促進され得る。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．８：１２２１−３６、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００９）ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２３：９３−１０９。ＰＥＧ化は、ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のタンパク質への共有結合であり、抗体断片治療薬の半減期の延長に特に有用な確立された技術である。Ｊｅｖｓｅｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．５：１１３−１２８。
【００１２】
薬物が曝露される状態は、使用される送達系に応じて異なる。固体ＰＬＧＡ移植物については、凍結乾燥薬またはスプレー乾燥薬が使用される。薬物が９０℃に近づいている温度に曝露される時間がわずかであるように、移植物は、ホットメルト射出プロセスを用いて生成される。その薬物は放出期間にわたって固体状態のままであるが、ＰＬＧＡの分解によって低ｐＨ環境に曝露され得る。対照的に、ＰＤＳで送達される薬物は、液体状態で高濃度に維持され、生理学的イオン強度及びｐＨにおいて還元的環境として特徴付けられる硝子体に曝露される。
【００１３】
したがって、改善された安定性を有する、好ましくは高濃度製剤及び／または長期作用性送達に適している抗Ｄ因子抗体の大きな必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１４】
ランパリズマブは、現在、進行型の乾燥型ＡＭＤである地図状萎縮（ＧＡ）の治療のために、第ＩＩＩ相治験中である。ＧＡにおけるヒト治験は、治療効果がランパリズマブの毎月の硝子体内注射により得られることが示されているが、さらに良好な有効性を達成するためにより高い薬物用量を使用する動機が存在する。さらに、より低い投与頻度は、改善された利便性を患者にもたらし、感染率の低下と臨床的有効性の増加という潜在的な利益を有し得、低進行型の乾燥型ＡＭＤの患者の治療を促進し得る。より高い薬物投与または長期間作用型送達に適している改善された溶解性及び化学的安定性を有する抗Ｄ因子抗体を開発するために、抗Ｄ因子変異体が研究されている。抗Ｄ因子変異体は、改善された溶解性及び化学的安定性を有することが確認されている。抗Ｄ因子抗体の効果をさらに拡大するために、ＰＥＧ等のポリオールへのコンジュゲーションが、有益であり得る。改善された溶解性及び化学的安定性を有する抗Ｄ因子変異体は、高濃度溶液中のＰＥＧにコンジュゲートされた場合に非常に粘性があることが見出されたが、硝子体内注入にはあまり適さなくなった。本発明者らは、ヒトＤ因子に対してランパリズマブと同等の親和性、カニクイザルＤ因子に対して改善された親和性、ならびに改善された溶解性及び化学安定性を有し、かつＰＥＧにコンジュゲートされた場合にあまり粘性がなく、長時間作用型治療剤としてさらに適している、さらなる抗Ｄ因子抗体を開発した。
【００１５】
本発明は、改善された抗Ｄ因子抗体及びコンジュゲートならびにその使用方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、Ｄ因子に結合する単離抗体であって、（ａ）アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号１５）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）アミノ酸配列Ｘ４ＩＮＰＸ５Ｘ６ＧＸ７ＴＮＦＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１１）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ４が、Ｅ及びＷから選択され、Ｘ５が、Ｔ及びＹから選択され、Ｘ６が、Ｎ、Ｓ、及びＱから選択され、Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、及びＥから選択される）、（ｃ）アミノ酸配列ＥＧＧＦＡＹ（配列番号２５）を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＤＴＤＶＡ（配列番号９）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（配列番号１０８）を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択される）、ならびに（ｆ）アミノ酸配列ＱＱＹＸ３ＮＹＰＬＴ（配列番号１１０）を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ３が、Ｎ及びＥから選択される）を含む、抗体が提供される。
【００１７】
いくつかの態様において、抗体は、配列Ｘ２ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（配列番号１０９）を含み、式中、Ｘ１は、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択され、Ｘ２は、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、及びＱから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、Ｒである。他の態様において、Ｘ１は、Ｙである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１３または１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態において、抗体は、
ａ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｂ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｃ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｄ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｅ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｆ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｇ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｈ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｊ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｋ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または
ｌ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、軽鎖の４９位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）である。
【００２１】
ある特定の態様において、抗体は、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、及び６３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００２２】
他の態様において、抗体は、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、及び６２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２３】
抗体は、
配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含み得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、または抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２５】
抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体、またはモノクローナル、ヒト化、及びキメラの任意の組み合わせであり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、抗体は、Ｄ因子に結合する。
【００２７】
ある特定の態様において、抗体は、断片である。いくつかの実施形態において、断片は、Ｆａｂ断片である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、抗体軽鎖は、配列番号１１２の配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、抗体重鎖は、配列番号１１３、１２８〜１３２、１３４〜１３７、及び１５４〜１５６から選択される配列を含む重鎖定常領域を含む。
【００３０】
ある特定の態様において、抗体は、
配列番号７１、１１８〜１２２、及び１４０〜１４６から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号７５、１２３〜１２７、及び１４７〜１５３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号８８のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
配列番号９９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号９８のアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
【００３１】
いくつかの態様において、抗体は、
配列番号７１、１１８〜１２２、及び１４０〜１４６から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
配列番号７５、１２３〜１２７、及び１４７〜１５３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、抗体は、操作システインを含む。操作システインは、重鎖内のＴ１１０Ｃ、Ａ１３６Ｃ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７５Ｃ、Ｔ１８３Ｃ、またはＴ２０５Ｃ変異、ならびに軽鎖内のＩ１０６Ｃ、Ｒ１０８Ｃ、Ｒ１４２Ｃ、Ｋ１４９Ｃ、及びＶ２０５Ｃ突然変異から選択され得、残基番号は、Ｋａｂａｔ番号付けに従う。
【００３３】
ある特定の態様において、Ｄ因子は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含むヒトＤ因子である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、抗体は、カニクイザルＤ因子に結合する。カニクイザルＤ因子は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含み得る。
【００３５】
いくつかの態様において、抗体は、ヒトＤ因子のＫＤよりも１０倍未満、または７倍未満、または５倍未満、または３倍未満高いＫＤでカニクイザルＤ因子に結合する。
【００３６】
本明細書に記載される抗体のうちのいずれかをコードする単離核酸が包含される。核酸を含む宿主細胞が提供される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本発明は、抗体が産生されるように、宿主細胞を培養することを含む、本明細書に開示される抗体のうちのいずれかを産生する方法を包含する。
【００３８】
本明細書に開示される抗体のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤が、包含される。薬学的に許容される担体は、約５．５〜約８．０のｐＨを有する緩衝液を含んでもよい。抗体は、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１９０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２１０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２３０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２４０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２６０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２７０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２８０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２９０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも３００ｍｇ／ｍｌの濃度で薬学的製剤中に存在し得る。
【００３９】
抗体は、１５０ｍｇ／ｍｌ〜３５０ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ、または１７０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ、または２００ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌの濃度で薬学的製剤中に存在し得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２０週間、少なくとも２４週間、または少なくとも２８週間、４℃にて保存後に、目に見える沈殿物を含まない。
【００４１】
いくつかの実施形態において、２５℃で、組成物の粘度が、３０ｃＰ未満、２５ｃＰ未満、２０ｃＰ未満、１５ｃＰ未満、または１０ｃＰ未満である。
【００４２】
いくつかの態様において、組成物中の抗Ｄ因子抗体の濃度は、１００ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、狭口径針を通した硝子体内投与に適している。狭口径針は、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、または２２ゲージであり得る。
【００４４】
本発明は、１つ以上のポリオールに共有結合している、本明細書に記載される少なくとも１つの抗体を含む、コンジュゲートをさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリオールは、多アーム型ポリオールである。いくつかの態様において、コンジュゲートは、多アーム型ポリオールに共有結合している少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの抗体を含む。
【００４５】
コンジュゲートのポリオールは、システインアミノ酸の遊離スルフヒドリル基を通して少なくとも１つの抗体に共有結合し得る。システインアミノ酸は、操作システインであり得る。システインアミノ酸は、抗体の定常領域内にあり得る。システインアミノ酸は、抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端にあり得る。
【００４６】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、リジンアミノ酸の遊離アミノ基を通して少なくとも１つの抗体に共有結合しているポリオールを含む。リジンアミノ酸は、抗体の定常領域内にあり得る。リジンアミノ酸は、抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端にあり得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ポリオールは、二量体、四量体、六量体、及び八量体から選択される多アーム型ポリオールである。
【００４８】
いくつかの態様において、多アーム型ポリオールは、八量体である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ポリオールは、ポリエチレングリコールである。いくつかの態様において、ポリエチレングリコールは、約５００Ｄ〜約３００，０００Ｄの重量平均分子量を有する。他の態様において、ポリエチレングリコールは、約２０，０００Ｄ〜約６０，０００Ｄの重量平均分子量を有する。他の態様において、ポリエチレングリコールは、約４０，０００Ｄの重量平均分子量を有する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲートは、一般式（Ｉａ）の構造を有するポリエチレングリコールを有し、
2022002521.tif 000002
式中、各ｍが、独立して、４５〜１０００または３〜２５０または５０〜２００または１００〜２５０の整数であり、ｎが、１〜１０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ抗Ｄ因子抗体または抗体変異体に共有結合している。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコールは、一般式（Ｉｂ）の構造を有し、
2022002521.tif 000003
（Ｉｂ）
式中、各ｍが、独立して、４５〜１０００または３〜２５０または５０〜２００または１００〜２５０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ抗Ｄ因子抗体または抗体変異体に共有結合している。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコールは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000004
式中、各ｍが、独立して、４５〜１０００または３〜２５０または５０〜２００または１００〜２５０の整数であり、ｎが、１〜１０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ抗Ｄ因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、ｎは、４である。
【００５３】
いくつかの態様において、ポリエチレングリコールは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000005
式中、各ｍが、独立して、４５〜１０００または３〜２５０または５０〜２００または１００〜２５０の整数であり、ｎが、１〜１０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ抗Ｄ因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、ｎは、４である。
【００５４】
いくつかの態様において、ポリエチレングリコールは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000006
式中、各ｍが、独立して、４５〜１０００または３〜２５０または５０〜２００または１００〜２５０の整数であり、各Ｒ１が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも１つのＲ２が、末端反応基であり、かつ抗Ｄ因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、ｍは、５０〜２００の整数である。他の実施形態において、ｍは、１００〜１５０の整数である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ１は、連結基であり、式中、Ｒ１及びＲ２が、１つにまとめると、
2022002521.tif 000007
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各ｉが、独立して、０〜１０の整数であり、ｊが、０〜１０の整数である。
【００５６】
いくつかの実施形態において、Ｒ２が、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、各Ｒ２が、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される。
【００５８】
いくつかの態様において、Ｒ２は、マレイミドである。
【００５９】
コンジュゲートは、Ｒ１及びＲ２を有し得、１つにまとめると、
2022002521.tif 000008
であり、ｉが、０〜１０の整数であり、ｊが、０〜１０の整数である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、Ｒ２基のうちの少なくとも７つは、抗Ｄ因子抗体または抗体変異体のうちの１つに共有結合している。
【００６１】
いくつかの実施形態において、Ｒ２基のうちの少なくとも８つは、抗Ｄ因子抗体または抗体変異体のうちの１つに共有結合している。
【００６２】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、本明細書に記載される少なくとも１つの抗体を多アーム型ポリオールに共有結合することによって調製される。
【００６３】
本明細書に記載されるコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤が、包含される。抗体の濃度は、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも３００ｍｇ／ｍｌである。他の実施形態において、抗Ｄ因子抗体または抗体変異体の濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌである。
【００６４】
いくつかの実施形態において、２５℃で、薬学的製剤または組成物の粘度は、１０００ｃＰ未満、９００ｃＰ未満、８００ｃＰ未満、７００ｃＰ未満、６００ｃＰ未満、５００ｃＰ未満、４００ｃＰ未満、または３００ｃＰ未満である。
【００６５】
いくつかの実施形態において、製剤または組成物中の抗Ｄ因子抗体の濃度は、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである。
【００６６】
本明細書に記載される薬学的製剤を含む眼内送達のための送達デバイス、及び製剤を患者の硝子体内に送達するための手段も、包含される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、送達デバイス製剤は、その場で長期間効果を持続する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、対象に、有効量の、本明細書に記載される抗体、コンジュゲート、または薬学的製剤を投与することを含む、対象における補体媒介性障害を治療する方法が、包含される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、補体媒介性障害は、全身性である。
【００７０】
別の実施形態において、補体媒介性障害は、補体関連の眼の症状である。
【００７１】
いくつかの態様において、補体関連の眼の症状は、乾燥及び湿潤（非滲出性及び滲出性）型を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される。
【００７２】
いくつかの実施形態において、補体関連の眼の症状は、中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ）から選択される。
【００７３】
いくつかの態様において、本方法は、移植可能ポート送達系を用いて、当該抗体、コンジュゲート、または薬学的製剤を投与することを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本方法は、硝子体内投与によって、当該抗体、コンジュゲート、または薬学的製剤を投与することを含む。硝子体内投与は、狭口径針を通す投与であり得る。いくつかの実施形態において、狭口径針は、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、または２２ゲージである。
【００７５】
いくつかの態様において、追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む治療する方法。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、ＡＮＧ２拮抗薬、ＴＩＥ２拮抗薬、ＶＥＧＦ拮抗薬、及び第２の補体成分拮抗薬から選択される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、抗ＡＮＧ２抗体である。
【００７７】
他の実施形態において、追加の治療剤は、抗ＴＩＥ２抗体である。
【００７８】
いくつかの態様において、追加の治療剤は、ＶＥＧＦトラップ及び抗ＶＥＧＦ抗体から選択される。
【００７９】
他の態様において、追加の治療剤は、第２の補体成分拮抗薬であり、当該第２の補体成分拮抗薬は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９から選択される補体成分を阻害する。
【００８０】
対象における補体媒介性障害を治療するための薬剤の調製のために、本明細書に記載される抗体またはコンジュゲートの使用が、包含される。いくつかの実施形態において、補体媒介性障害は、補体関連の眼の症状である。他の実施形態において、補体媒介性障害は、全身性である。いくつかの態様において、補体関連の眼の症状は、乾燥及び湿潤（非滲出性及び滲出性）型を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される。補体関連の眼の症状は、中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ）から選択され得る。
【００８１】
いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体またはコンジュゲートは、治療法で用いるためのものである。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体またはコンジュゲートは、対象における補体媒介性障害を治療する方法で用いるためのものである。
【００８３】
いくつかの実施形態において、抗体、コンジュゲート、または製剤は、対象における全身性補体媒介性障害を治療する方法で用いるためのものである。いくつかの実施形態において、補体媒介性障害は、補体関連の眼の症状である。いくつかの態様において、補体関連の眼の症状は、乾燥及び湿潤（非滲出性及び滲出性）型を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される。いくつかの実施形態において、補体関連の眼の症状は、中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ）から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１Ａ】マウス２０Ｄ１２軽鎖可変領域、ヒトＶＬカッパＩ（ＶＬＫ）コンセンサス配列、及び２０Ｄ１２のヒト化変異体の軽鎖可変領域の整列を示す。
【図１Ｂ】マウス２０Ｄ１２軽鎖可変領域、ヒトＶＬカッパＩ（ＶＬＫ）コンセンサス配列、及び２０Ｄ１２のヒト化変異体の軽鎖可変領域の整列を示す。
【図１Ｃ】マウス２０Ｄ１２軽鎖可変領域、ヒトＶＬカッパＩ（ＶＬＫ）コンセンサス配列、及び２０Ｄ１２のヒト化変異体の軽鎖可変領域の整列を示す。
【図２Ａ】マウス２０Ｄ１２重鎖可変領域、ヒトＶＨ下位群Ｉ（ＶＨＩ）コンセンサス配列、及び２０Ｄ１２のヒト化変異体の重鎖可変領域の整列を示す。
【図２Ｂ】マウス２０Ｄ１２重鎖可変領域、ヒトＶＨ下位群Ｉ（ＶＨＩ）コンセンサス配列、及び２０Ｄ１２のヒト化変異体の重鎖可変領域の整列を示す。
【図２Ｃ】マウス２０Ｄ１２重鎖可変領域、ヒトＶＨ下位群Ｉ（ＶＨＩ）コンセンサス配列、及び２０Ｄ１２のヒト化変異体の重鎖可変領域の整列を示す。
【図３Ａ】ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０−Ｄ因子の共結晶構造及びランパリズマブ−Ｄ因子の共結晶構造の部分の重ね合わせを示す。Ａ）抗体とＤ因子との間の結合界面の重ね合わせ。
【図３Ｂ】ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０−Ｄ因子の共結晶構造及びランパリズマブ−Ｄ因子の共結晶構造の部分の重ね合わせを示す。Ｂ）抗体とＤ因子との間のある特定の重鎖接触の詳細。
【図３Ｃ】ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０−Ｄ因子の共結晶構造及びランパリズマブ−Ｄ因子の共結晶構造の部分の重ね合わせを示す。Ｃ）抗体とＤ因子との間のある特定の軽鎖接触の詳細。
【図４】ランパリズマブ軽鎖（配列番号１００）及び重鎖可変領域（配列番号１０１）ならびにｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０（「ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１．Ｎ５４Ｓ」）軽鎖（配列番号３２）及び重鎖（配列番号３３）可変領域の整列を示す。
【図５Ａ】Ｂ因子の活性化のＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを用いて測定される、ヒト化２０Ｄ１２抗体Ｆａｂ及びコンジュゲートによるＤ因子の阻害を示す。
【図５Ｂ】Ｂ因子の活性化のＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを用いて測定される、ヒト化２０Ｄ１２抗体Ｆａｂ及びコンジュゲートによるＤ因子の阻害を示す。
【図６Ａ】ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０（６Ａ）及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１（６Ｃ）は、それぞれ、２９２ｍｇ／ｍｌ及び２６０ｍｇ／ｍｌで可溶性であるが、ランパリズマブは、２２７ｍｇ／ｍｌ（６Ｂ）の溶液から沈殿することを示す。
【図６Ｂ】ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０（６Ａ）及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１（６Ｃ）は、それぞれ、２９２ｍｇ／ｍｌ及び２６０ｍｇ／ｍｌで可溶性であるが、ランパリズマブは、２２７ｍｇ／ｍｌ（６Ｂ）の溶液から沈殿することを示す。
【図６Ｃ】ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０（６Ａ）及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１（６Ｃ）は、それぞれ、２９２ｍｇ／ｍｌ及び２６０ｍｇ／ｍｌで可溶性であるが、ランパリズマブは、２２７ｍｇ／ｍｌ（６Ｂ）の溶液から沈殿することを示す。
【図７Ａ】ＰＥＧ−八量体とコンジュゲートしたｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃの典型的なＳＥＣ−ＭＡＬＳプロファイル（７Ａ）、及び流体力学半径（ＲＨ）を決定するためのＳＥＣ−ＱＥＬＳ分析（７Ｂ、７Ｃ）を示す。
【図７Ｂ】ＰＥＧ−八量体とコンジュゲートしたｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃの典型的なＳＥＣ−ＭＡＬＳプロファイル（７Ａ）、及び流体力学半径（ＲＨ）を決定するためのＳＥＣ−ＱＥＬＳ分析（７Ｂ、７Ｃ）を示す。
【図７Ｃ】ＰＥＧ−八量体とコンジュゲートしたｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃの典型的なＳＥＣ−ＭＡＬＳプロファイル（７Ａ）、及び流体力学半径（ＲＨ）を決定するためのＳＥＣ−ＱＥＬＳ分析（７Ｂ、７Ｃ）を示す。
【図８Ａ】ＣＥＸクロマトグラム（８Ａ）、ＰＥＧ−八量体とコンジュゲートしたｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ画分のＳＥＣ−ＭＡＬＳプロファイル（８Ｂ）、ならびにＭｗ（ｋＤａ）、多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）、及び画分のＲＨ（ｎｍ）の表（８Ｃ）を示す。
【図８Ｂ】ＣＥＸクロマトグラム（８Ａ）、ＰＥＧ−八量体とコンジュゲートしたｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ画分のＳＥＣ−ＭＡＬＳプロファイル（８Ｂ）、ならびにＭｗ（ｋＤａ）、多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）、及び画分のＲＨ（ｎｍ）の表（８Ｃ）を示す。
【図８Ｃ】ＣＥＸクロマトグラム（８Ａ）、ＰＥＧ−八量体とコンジュゲートしたｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ画分のＳＥＣ−ＭＡＬＳプロファイル（８Ｂ）、ならびにＭｗ（ｋＤａ）、多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）、及び画分のＲＨ（ｎｍ）の表（８Ｃ）を示す。
【図９Ａ】ＰＥＧ−八量体とコンジュゲートした抗体の濃度依存性粘度を示す。ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ、及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ（９Ａ）、ならびにＡＦＤ．ｖ８．Ｃ＋ＰＥＧ四量体及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３＋ＰＥＧ四量体（９Ｂ）。
【図９Ｂ】ＰＥＧ−八量体とコンジュゲートした抗体の濃度依存性粘度を示す。ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ、及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ（９Ａ）、ならびにＡＦＤ．ｖ８．Ｃ＋ＰＥＧ四量体及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３＋ＰＥＧ四量体（９Ｂ）。
【図１０Ａ】結合能力（１０Ａ）及びＣＥ−ＳＤＳ（１０Ｂ）によるＰＥＧ−八量体とコンジュゲートしたＦａｂの熱的安定性を示す。
【図１０Ｂ】結合能力（１０Ａ）及びＣＥ−ＳＤＳ（１０Ｂ）によるＰＥＧ−八量体とコンジュゲートしたＦａｂの熱的安定性を示す。
【図１１】ヒト化２０Ｄ１２抗体、ランパリズマブ、及び抗Ｄ因子変異体ＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４の様々な特徴を示す。
【図１２Ａ】ヘキサグリセロール（ＨＧＥＯ）コア（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ，ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｃｏｒｐ．）及びトリペンタエリトリトール（ＴＰ）コア（８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ，ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を含む多アーム型ＰＥＧのＭＡＬＤＩ分析を示す（１２Ａ：ＨＧＥＯコア、１２Ｂ：ＴＰコア）。
【図１２Ｂ】ヘキサグリセロール（ＨＧＥＯ）コア（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ，ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｃｏｒｐ．）及びトリペンタエリトリトール（ＴＰ）コア（８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ，ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を含む多アーム型ＰＥＧのＭＡＬＤＩ分析を示す（１２Ａ：ＨＧＥＯコア、１２Ｂ：ＴＰコア）。
【図１３Ａ】経時にわたる、ランパリズマブ（１３Ａ）またはコンジュゲートされていないＡＦＤ．ｖ１４（１３Ｂ）の硝子体内（ＩＶＴ）注射後のカニクイザルにおけるｒＲＢＣの相対溶血によって測定される、全身性ＡＰ補体の活性率（％）を示す。
【図１３Ｂ】経時にわたる、ランパリズマブ（１３Ａ）またはコンジュゲートされていないＡＦＤ．ｖ１４（１３Ｂ）の硝子体内（ＩＶＴ）注射後のカニクイザルにおけるｒＲＢＣの相対溶血によって測定される、全身性ＡＰ補体の活性率（％）を示す。
【図１４Ａ】カニクイザルの眼におけるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ（１４Ａ）またはＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ−Ｏｃｔ（１４Ｂ，、１４Ｃ）のＩＶＴ注射後のｒＲＢＣまたはＥＬＩＳＡの相対溶血によって測定される、全身性ＡＰ補体の活性率（％）を示す。
【図１４Ｂ】カニクイザルの眼におけるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ（１４Ａ）またはＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ−Ｏｃｔ（１４Ｂ，、１４Ｃ）のＩＶＴ注射後のｒＲＢＣまたはＥＬＩＳＡの相対溶血によって測定される、全身性ＡＰ補体の活性率（％）を示す。
【図１４Ｃ】カニクイザルの眼におけるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ（１４Ａ）またはＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ−Ｏｃｔ（１４Ｂ，、１４Ｃ）のＩＶＴ注射後のｒＲＢＣまたはＥＬＩＳＡの相対溶血によって測定される、全身性ＡＰ補体の活性率（％）を示す。
【図１５Ａ】カニクイザルＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイにおけるコンジュゲートされていないＡＦＤ．ｖ１４と比較して、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの血清ＰＫを示す。
【図１５Ｂ】カニクイザルＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイにおけるコンジュゲートされていないＡＦＤ．ｖ１４と比較して、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの血清ＰＫを示す。
【図１５Ｃ】カニクイザルＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイにおけるコンジュゲートされていないＡＦＤ．ｖ１４と比較して、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの血清ＰＫを示す。
【図１６Ａ】雄カニクイザルにおけるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの単回ＩＴＶまたはＩＶ投与後の、血清中の群平均（＋／−ＳＤ）濃度（１６Ａ）、及び硝子体液、房水、または網膜ホモジネート中の群平均（＋／−ＳＤ）濃度（１６Ｂ）を示す。
【図１６Ｂ】雄カニクイザルにおけるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの単回ＩＴＶまたはＩＶ投与後の、血清中の群平均（＋／−ＳＤ）濃度（１６Ａ）、及び硝子体液、房水、または網膜ホモジネート中の群平均（＋／−ＳＤ）濃度（１６Ｂ）を示す。
【図１７Ａ】カニクイザル硝子体液におけるＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔを用いたＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイからのＰＫ結果を示す。
【図１７Ｂ】カニクイザル硝子体液におけるＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔを用いたＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイからのＰＫ結果を示す。
【図１８Ａ】カニクイザル房水におけるＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔを用いたＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイからのＰＫ結果を示す。
【図１８Ｂ】カニクイザル房水におけるＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔを用いたＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイからのＰＫ結果を示す。
【図１９Ａ】カニクイザル網膜ホモジネートにおけるＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔを用いたＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイからのＰＫ結果を示す。
【図１９Ｂ】カニクイザル網膜ホモジネートにおけるＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔを用いたＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイからのＰＫ結果を示す。
【図２０】ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−ＯｃｔのＳＥＣ分析を示す。
【図２１】ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−ＯｃｔのＣＥ−ＳＤＳ非還元（ＮＲ）電気泳動を示す。
【図２２】経時にわたる、１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ（群１、２、及び３）または１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ（群４）を硝子体内に投与したカニクイザルの硝子体液中のＦａｂ濃度を示す。
【図２３】経時にわたる、１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ（群１、２、及び３）または１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ（群４）を硝子体内に投与したカニクイザルの房水中のＦａｂ濃度を示す。
【図２４】経時にわたる、１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ（群１、２、及び３）または１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ（群４）を硝子体内に投与したカニクイザルの網膜中のＦａｂ濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
これより本発明のある特定の実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、添付の構造及び式に例示されている。本発明は、列挙される実施形態と併せて説明されるが、それらは、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図するものではないことを理解されたい。反対に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る、全ての代替例、修正、及び均等物を網羅することを意図するものである。当業者であれば、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されるものに類似または同等である多数の方法及び材料を理解するであろう。本発明は、決して記載される方法及び材料に限定されるものではない。
【００８６】
本開示全体で引用される全ての参照文献は、参照によりそれら全体が本明細書に明示的に組み込まれる。組み込まれる文献、特許、及び同様の資料のうちの１つ以上が、本出願（定義される用語、用語の用法、記載される技法等を含むがそれらに限定されない）と異なるか、または矛盾する場合は、本出願が優先される。
【００８７】
Ｉ．定義
「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含むこと）」、「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含むこと）」、及び「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」という語は、本明細書及び特許請求の範囲内で使用される場合、述べられる特徴、整数、成分、または工程の存在を特定することを意図するものであるが、それらは、１つ以上の他の特徴、整数、成分、工程、またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。
【００８８】
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはそれは、アミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークの配列は、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００８９】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で表され得る。親和性は、本明細書に記載される方法を含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態が、以下に記載される。
【００９０】
「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の改変を有し、かかる改変により抗体の抗原に対する親和性が改善される抗体を指す。
【００９１】
「抗Ｄ因子抗体」、「ａＦＤ抗体」、「ＡＦＤ．Ａｂ」、及び「Ｄ因子に結合する抗体」という用語は、抗体がＤ因子の標的化において診断薬及び／または治療剤として有用になるように十分な親和性でＤ因子に結合することができる抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が非関連非Ｄ因子タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される、抗体のＤ因子への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、Ｄ因子に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎｍ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗Ｄ因子抗体は、異なる種からのＤ因子間で保存されるＤ因子のエピトープに結合する。抗Ｄ因子抗体としては、ＡＦＤ．ｖ＃変異体及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ＃変異体が挙げられるが、これらに限定されず、＃は特定の変異体を特定するために使用される数である。
【００９２】
「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
【００９３】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、無傷抗体が結合する抗原に結合する、無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ−ＳＨ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ−ＳＨ、Ｆａｂ−Ｃ−ＳＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ」は、ＣＨ１ドメイン、または軽鎖定常領域でジスルフィド結合を形成するために十分なＣＨ１ドメインの一部を含むが、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含まない、重鎖定常領域を含む抗体を指す。本明細書で使用される場合、Ｆａｂは、ヒンジ領域の１つ以上のアミノ酸を含み得る。それ故に、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ」という用語は、Ｆａｂ’抗体を包含する。Ｆａｂは、Ｃ末端システイン等のさらなる非天然アミノ酸を含み得、この場合、それは、Ｆａｂ−Ｃと称され得る。以下に論じられるように、Ｆａｂ−Ｃという用語はまた、Ｃ末端で天然システインを含む、ヒンジ領域の天然アミノ酸を含むＦａｂも包含する。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、操作システインを含む（すなわち、Ｆａｂは、ＴＨＩＯＭＡＢであり得る）。
【００９５】
「Ｆａｂ−Ｃ」は、Ｃ末端システインを含むＦａｂを指し、これは、その残基位置で生じる天然システイン（ヒンジ領域からのシステイン等）であり得るか、または天然システインに対応しないＣ末端に付加されたシステインであり得る。抗Ｄ因子抗体としては、ＡＦＤ．Ｃ抗体及びｈｕ２０Ｄ１２．Ｃ抗体が挙げられるが、これらに限定されず、「Ｃ」は、抗体がＣ末端システインを含むＦａｂであることを示す。非限定的な例示のＦａｂ−Ｃ重鎖定常領域には、配列番号１２９、１３０、１３２、１５４、１５５、１５６、１５７、及び１５８の配列が含まれる。
【００９６】
「Ｆａｂ−ＳＨ」は、遊離チオール基を有するＦａｂを指す。いくつかの実施形態において、遊離チオール基は、ＦａｂのＣ末端の最後の１０のアミノ酸に位置している。Ｆａｂ−Ｃ抗体はまた、典型的には、Ｆａｂ−ＳＨ抗体である。配列番号１３１のアミノ酸配列を有するさらに非限定的な例示のＦａｂ−ＳＨ重鎖定常領域。典型的には、操作システインを含むＦａｂ（すなわち、ＴＨＩＯＭＡＢであるＦａｂ）は、Ｆａｂ−ＳＨである。
【００９７】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する抗体、及び逆に、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する参照抗体を指す。例示的な競合アッセイが本明細書に提供される。
【００９８】
「補体関連障害」という用語は、最も広義に使用され、過度のまたは制御されていない補体活性化と関連する障害を含む。それらは、心肺バイパス手術中の補体活性化；急性心筋梗塞、動脈瘤、卒中、出血性ショック、圧挫外傷、多臓器不全、循環血液量減少性ショック、腸虚血、または虚血を生じる他の事象後の虚血再灌流のための補体活性化を含む。補体活性化はまた、炎症性症状、例えば、重度の熱傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人性呼吸促迫症候群、血液透析等の炎症状態；アナフィラキシーショック、重度の喘息、血管性浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、レンサ球菌感染後糸球体腎炎、及び膵炎と関連することも示されている。障害は、薬物の副作用、薬物アレルギー、ＩＬ−２誘導性血管漏出症候群、またはＸ線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。それはまた、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病、及び多発性硬化症のような自己免疫疾患も含む。補体活性化はまた、移植片拒絶とも関連する。補体活性化はまた、眼疾患、例えば、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、及び他の虚血関連網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生とも関連する。
【００９９】
「補体関連の眼の症状」という用語は、最も広義に使用され、全ての眼の症状を含み、この病理学は、補体を含み、古典的かつ代替経路、具体的には、補体の代替経路を含む。補体関連の眼の症状としては、乾燥及び湿潤（非滲出性及び滲出性）型を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の全ての病期、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症及び他の虚血関連網膜症のような、黄斑変性疾患、ならびに糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生のような他の眼内血管新生性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。一例において、補体関連の眼の症状には、非滲出性（例えば、中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出性（例えば、湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））ＡＭＤ、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎、及びブドウ膜炎を含む、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）が含まれる。さらなる例において、非滲出性ＡＭＤは、硬性ドルーゼ、軟性ドルーゼ、地図状萎縮、及び／または色素クランピングの存在を含み得る。一例において、補体関連の眼の症状には、早期ＡＭＤ（例えば、複数の小型から１つ以上の広範囲に及ばない中型ドルーゼを含む）、中期ＡＭＤ（例えば、広範囲に及ぶ中型ドルーゼから１つ以上の大型ドルーゼを含む）、及び進行型ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮または進行型湿潤型ＡＭＤ（ＣＮＶ）を含む、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）が含まれる（Ｆｅｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＲＥＤＳ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．１８、Ｓａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，３４（３）：２３８−４０（２００９）、Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５９（１）：１７３５（２００８））。さらなる例において、中期乾燥型ＡＭＤは、大きなコンフルエントなドルーゼを含み得る。さらなる例において、地図状萎縮は、光受容体及び／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）の喪失を含み得る。さらなる例において、地図状萎縮の領域は、小さくても大きくてもよく、及び／または黄斑領域内もしくは周辺網膜内にあり得る。一例において、補体関連の眼の症状は、中期乾燥型ＡＭＤである。一例において、補体関連の眼の症状は、地図状萎縮である。一例において、補体関連の眼の症状は、湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【０１００】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の源または種に由来し、一方で重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。
【０１０１】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの主要なクラスの抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【０１０２】
「ポリオール」という用語は、概して、本明細書で使用される場合、多価アルコール化合物を指す。ポリオールは、例えば、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであり得、直鎖または分岐鎖を有し得る。好ましいポリオールには、１つ以上のヒドロキシル位置に化学基、例えば１〜４個の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールは、ポリ（アルキレングリコール）、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。しかしながら、当業者であれば、他のポリオール、例えば、ポリ（プロピレングリコール）及びポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、ＰＥＧについて本明細書に記載されるコンジュゲートのための技術を使用して用いることができることが理解されよう。本開示のポリオールには、当該技術分野で公知であるもの及び公的に入手可能なもの、例えば商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
【０１０３】
「コンジュゲート」という用語は、本明細書ではその最も広い定義で使用され、共に接合（ｊｏｉｎｅｄ）または結合（ｌｉｎｋｅｄ）されていることを意味する。分子は、接合されているように作用または機能する場合、「コンジュゲート」されている。特定の実施形態において、「コンジュゲート」は、多アーム型ポリオールに共有結合している抗体（例えば、本明細書に詳述される、抗体断片）を指す。
【０１０４】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、及びＢ細胞の活性化が挙げられる。
【０１０５】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、標的疾患または症状、例えば、補体関連の眼の症状等、例えば、病理において、必要な投与量で必要な期間にわたって、測定可能な改善などの所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。
【０１０６】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。
【０１０７】
「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）において次の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で出現する。
【０１０８】
「完全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。
【０１０９】
「Ｄ因子のグリコシル化型」という用語は、炭水化物残基の付加によって翻訳後修飾されている、Ｄ因子の自然発生型を指す。
【０１１０】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、同義に使用され、外因性核酸が中に導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではない場合があるが、突然変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
【０１１１】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【０１１２】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群からである。一般に、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３にあるような下位群である。いくつかの実施形態において、ＶＬの場合、下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に見られるような下位群カッパＩである。いくつかの実施形態において、ＶＨの場合、下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に見られるような下位群ＩＩＩである。
【０１１３】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１１４】
本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列中で超可変であり、及び／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４本鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）中にあり、３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）中にある。ＨＶＲは、一般に、超可変ループ及び／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、及び／または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）において生じる（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）。）例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５、及びＨ３の９５〜１０２において生じる（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）。）ＶＨ内のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ）−ＣＤＲ、またはａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に収容される。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基３１〜３４（Ｌ１）、５０〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜５８（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）に生じる。（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照のこと。）別途指示されない限り、可変ドメイン（例えば、ＦＲ残基）におけるＨＶＲ残基及び他の残基は、本明細書において上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．に従って番号付けされる。
【０１１５】
抗体を含むタンパク質は、無傷立体配座構造及び生物学的活性を本質的に保持する場合に、「安定している」と言われる。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ（１９９３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０において概説されている。「改善された安定性」を有する抗体変異体は、出発参照抗体と比較してより安定的な抗体変異体を指す。好ましくは、改善された安定性を有する抗体変異体は、物理的安定性及び／または化学的安定性及び／または生物学的活性の改善、及び／または天然抗体の免疫原性の低減を目的として特定のアミノ酸残基が変更されている天然（野生型）抗体の変異体である。Ｗａｌｓｈ（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：８３１−３。
【０１１６】
「異性化」という用語は、一般的に、化学化合物がその異性体型、すなわち、同じ化学的組成を有しているが異なる構造または構成を有しており、したがって、一般的に異なる物理的及び化学的特性を有している型のうちのいずれかに変換される化学的過程を指す。具体的には、ポリペプチドの１つ以上のアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基（複数可）がイソアスパラギン酸残基（複数可）に変換されている過程であるアスパラギン酸異性化が本明細書において使用される。Ｇｅｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７８５−９４。
【０１１７】
「脱アミド」という用語は、一般に、有機化合物からアミド官能基が除去される化学反応を指す。具体的には、ポリペプチドの１つ以上のアスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基（複数可）がアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）に転換されている過程、すなわち、中性アミド側鎖が全体的に酸性の特性を有する残基に転換されている過程であるアスパラギン脱アミド化が本明細書において使用される。Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｗｅｎ（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８：８−１３。
【０１１８】
「コンジュゲート」は、ポリオールを含むがこれに限定されない、１つ以上の異種分子（複数可）にコンジュゲートされる抗体である。
【０１１９】
「患者」または「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、患者、個体、または対象は、ヒトである。
【０１２０】
「単剤療法」とは、一連の治療期間中に、例えば、補体関連の眼の症状等の標的疾患または症状の治療のために単一治療剤のみを含む治療レジメンを意味する。
【０１２１】
「維持療法」とは、疾患再発または進行の可能性を低減するために付与される治療レジメンを意味する。維持療法は、対象の寿命までの長期間を含む、任意の期間にわたって提供され得る。維持療法は、初期療法後に提供されるか、または初期療法もしくは追加療法と併せて提供され得る。維持療法に使用される投薬量は異なる場合があり、他の種類の療法に使用される投薬量と比較して低減した投薬量を含み得る。
【０１２２】
「単離抗体」は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフ法（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される場合、９５％または９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説に関して、例えばＦｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照のこと。
【０１２３】
「単離核酸」は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０１２４】
「抗Ｄ因子抗体をコードする単離核酸」とは、抗体重鎖及び軽鎖（またはそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター内のかかる核酸分子（複数可）を含み、かかる核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
【０１２５】
本明細書で使用される、「Ｄ因子」及び「ｆＤ」及び「ＦＤ」という用語は、細胞内のＤ因子前駆体タンパク質の処理からもたらされる任意の天然の成熟Ｄ因子を指す。この用語には、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からのＤ因子が含まれる。この用語はまた、Ｄ因子の自然発生変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も含む。例示のヒトＤ因子のプレプロペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１０４に示す。例示的な成熟ヒトＤ因子のアミノ酸配列は、配列番号１０４（配列番号１０６）のアミノ酸２６〜２５３である。
【０１２６】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に発生する可能な変異型抗体を除き、かかる変異体は、一般的に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるときの抗体の特徴を示しており、いかなる特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、多様な技法によって作製されてもよく、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
【０１２７】
「裸の抗体」は、異種性部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識に複合されていない抗体を指す。裸の抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。
【０１２８】
「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型うちの１つに割り当てられ得る。
【０１２９】
「バイアル」は、液体または凍結乾燥調製物を保有するのに好適な容器である。いくつかの実施形態において、バイアルは、単回使用バイアル、例えば、栓を有する２０ｃｃの単回使用バイアルである。
【０１３０】
「ポート送達系」または「ＰＤＳ」は、長期間にわたって治療剤の送達を可能にする詰め替え可能なリザーバーを用いる眼用の移植可能なデバイスである。リザーバー及び眼への薬物放出の速度を決定する放出制御要素と連通するリフィルポートを有する移植が、行われる。例えば、米国特許公開第２０１０／０１７４２７２号、同第８，２７７，８３０号、同第８，３９９，００６号、同第８，７９５，７１２号、及び同第８，８０８，７２７号を参照のこと。
【０１３１】
「小穴針」は、３０ゲージ針等の約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、または２２ゲージもしくはそれ以上の液体成分の注射用針を指す。いくつかの実施形態において、小穴針は、標準サイズの壁を有する。別の実施形態において、小穴針は、粘性溶液に好ましくあり得る、薄壁を有する。
【０１３２】
「添付文書」という用語は、かかる治療薬の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、及び／またはその使用に関する警告を含有する、治療剤製品の市販パッケージに通例含まれる指示書を指すように使用される。
【０１３３】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一の候補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）においてユーザ文書と共に申請されており、これは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変動しない。
【０１３４】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によってそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【０１３５】
「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。
【０１３６】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」等のその文法上の変形）とは、治療されている個体の自然経過を変更することを目的とした臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理過程中に実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の縮小、疾患進行速度の減少、病状の回復または寛解、及び緩解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を使用して、疾患の発達を遅延させるか、または疾患の進行を減速させる。免疫関連疾患の治療では、治療剤は、直接的に免疫反応の成分の反応の大きさを変え、または他の治療剤、例えば、抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等による治療に対する疾患に対してより敏感にすることができる。
【０１３８】
補体関連の眼の症状等の疾患の「病理」には、患者の健康状態を損なう全ての現象が含まれる。これには、異常または無制御の細胞増殖（好中球、好酸球、単球、リンパ球細胞）、抗体産生、自己抗体産生、補体産生、隣接する細胞の正常な機能の妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌性産物の放出、任意の炎症応答または免疫応答の抑制または悪化、炎症細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球）の細胞空間への浸潤等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
１つ以上のさらなる治療薬剤と「組み合わせた」投与は、同時（同時期）及び任意の順序の連続した投与を含む。
【０１４０】
１つ以上の他の薬物と「同時に」投与される薬物は、同一治療サイクル中、１つ以上の他の薬物と同じ治療日に、任意に１つ以上の他の薬物と同じ時間に投与される。
【０１４１】
「治療上有効量」は、標的疾患または症状、例えば、補体関連の眼の症状等の症状、例えば、病理において測定可能な改善を達成するのに必要なＤ因子拮抗薬の量である。
【０１４２】
「長期間作用型送達」、「持続放出」、及び「制御放出」という用語は、一般的に、治療薬物の長期または持続性の放出または生物学的利用能を達成するために製剤、剤形、デバイスまたは他の種類の技術を使用する送達機構を説明するために使用される。その用語は、全身循環または対象に対して、または細胞、組織、器官、関節、領域等を含むが、これらに限定されない、対象における局所的作用部位に対して薬物の長期または持続性の放出または生物学的利用能を提供する技術を指す。さらに、これらの用語は、製剤または剤形からの薬物の放出を長期化または延長するために使用される技術を指してもよく、またはそれらは、対象に対する薬物の生物学的利用能または薬物動態または作用期間を延長または長期化するために使用される技術を指してもよく、またはそれらは、製剤によって引き出される薬力学効果を延長または長期化するために使用される技術を指してもよい。「長期作用性製剤」、「持続放出性製剤」、または「制御放出製剤」は、長期作用性送達をもたらすために使用される薬学的製剤、剤形、または他の技術である。いくつかの実施形態において、制御放出は、薬物の局所的生物学的利用能、眼球送達の文脈においては具体的に眼球滞留時間を改善するために用いられる。「眼球滞留時間の増加」は、送達された眼内薬物が質の点（活性）でも量の点（有効量）でも有効であり続ける送達後の期間を指す。高用量及び制御放出に加えて、またはその代わりに、インビボ半減期の増加を達成するためにＰＥＧ化等を介して翻訳後に薬物を修飾することができる。
【０１４３】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照のこと）。単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して抗原に結合する抗体から単離されて、それぞれ、相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照のこと。
【０１４４】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に結合している核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【０１４５】
ＩＩ．組成物及び方法
いくつかの実施形態において、本発明は、部分的に、Ｄ因子に結合する抗体及びかかる抗体を含むコンジュゲートに基づく。本発明の抗体及びコンジュゲートは、例えば、補体関連の眼の症状等の補体関連障害の治療に有用である。
【０１４６】
Ａ．例示的な抗Ｄ因子抗体
Ｄ因子に結合する単離抗体が、本明細書において提供される。具体的には、１００ｐＭ未満、または７５ｐＭ未満、または５０ｐＭ未満、または１０ｐＭ未満のＫＤを有するような非常に高い親和性を有するＤ因子に結合する抗体が、本明細書において提供される。さらに、高溶解性であるＦａｂ等の抗体が、本明細書において提供される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に提供される高濃度の抗体を含む薬学的製剤は、４℃で、少なくとも２０週間保存後に目に見る沈殿物がない。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される高濃度の抗体を含む薬学的製剤は、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２３０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２７０ｍｇ／ｍｌの抗体（Ｆａｂ等）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗体は、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ等の高濃度で製剤化され得、２５℃で、３０ｃＰ未満、または２０ｃＰ未満、または１５ｃＰ未満、または１０ｃＰ未満の粘度を有する。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であってもよい。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、抗体は、Ｆａｂ断片であってもよい。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号１５）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）アミノ酸配列Ｘ４ＩＮＰＸ５Ｘ６ＧＸ７ＴＮＦＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１１）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ４が、Ｅ及びＷから選択され、Ｘ５が、Ｔ及びＹから選択され、Ｘ６が、Ｎ、Ｓ、及びＱから選択され、Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、及びＥから選択される）、（ｃ）アミノ酸配列ＥＧＧＦＡＹ（配列番号２５）を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＤＴＤＶＡ（配列番号９）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（配列番号１０８）を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択される）、ならびに（ｆ）アミノ酸配列ＱＱＹＸ３ＮＹＰＬＴ（配列番号１１０）を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ３が、Ｎ及びＥから選択される）、から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列Ｘ２ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（配列番号１０９；すなわち、ＨＶＲ−Ｌ２を直接先行するアミノ酸Ｘ２を含む）（式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択され、Ｘ２が、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、及びＱから選択される）を含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、Ｒである。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、Ｙである。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３または１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号１５）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）アミノ酸配列Ｘ４ＩＮＰＸ５Ｘ６ＧＸ７ＴＮＦＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１１）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ４が、Ｅ及びＷから選択され、Ｘ５が、Ｔ及びＹから選択され、Ｘ６が、Ｎ、Ｓ、及びＱから選択され、Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、及びＥから選択される）、（ｃ）アミノ酸配列ＥＧＧＦＡＹ（配列番号２５）を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ���配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＤＴＤＶＡ（配列番号９）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（配列番号１０８）を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択される）、及び（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＹＸ３ＮＹＰＬＴ（配列番号１１０）を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ３が、Ｎ及びＥから選択される）、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１０〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１３または１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。上述の実施形態のうちのいずれかにおいて、ＨＶＲ−Ｌ２を直接先行するアミノ酸は、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、及びＱから選択され得る。いくつかの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ２を直接先行するアミノ���は、Ｒである。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号１５）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）アミノ酸配列Ｘ４ＩＮＰＸ５Ｘ６ＧＸ７ＴＮＦＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１１）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ４が、Ｅ及びＷから選択され、Ｘ５が、Ｔ及びＹから選択され、Ｘ６が、Ｎ、Ｓ、及びＱから選択され、Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、及びＥから選択される）、ならびに（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＧＧＦＡＹ（配列番号２５）を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＤＴＤＶＡ（配列番号９）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（配列番号１０８）を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択される）から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＹＸ３ＮＹＰＬＴ（配列番号１１０）を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ３が、Ｎ及びＥから選択される）と、を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号１５）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）アミノ酸配列Ｘ４ＩＮＰＸ５Ｘ６ＧＸ７ＴＮＦＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１１）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ４が、Ｅ及びＷから選択され、Ｘ５が、Ｔ及びＹから選択され、Ｘ６が、Ｎ、Ｓ、及びＱから選択され、Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、及びＥから選択される）、ならびに（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＧＧＦＡＹ（配列番号２５）を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＤＴＤＶＡ（配列番号９）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（配列番号１０８）を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択される）から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＹＸ３ＮＹＰＬＴ（配列番号１１０）を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ３が、Ｎ及びＥから選択される）と、を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、配列Ｘ２ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択され、Ｘ２が、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、及びＱから選択される）を含む（すなわち、ＨＶＲ−Ｌ２を直接先行するアミノ酸Ｘ２を含む）抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、Ｒである。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、Ｙである。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインと、（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７７】
本実施形態のうちのいずれかにおいて、抗Ｄ因子抗体は、ヒト化であり得る。いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体は、上記の実施形態のうちのいずれかにあるようなＨＶＲを含み、ヒトアクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。ある特定の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。ある特定の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、本明細書に記載される突然変異のうちのいずれか１つを含む、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。
【０１７８】
別の態様において、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、及び６３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態において、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、及び６３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態において、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、及び６３において合計で１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／または欠失している。ある特定の実施形態において、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、及び６３において合計で１〜５個のアミノ酸が置換、挿入、及び／または欠失している。ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。任意に、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、及び６３のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態において、ＶＨは、（ａ）アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号１５）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）アミノ酸配列Ｘ４ＩＮＰＸ５Ｘ６ＧＸ７ＴＮＦＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１１）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ４が、Ｅ及びＷから選択され、Ｘ５が、Ｔ及びＹから選択され、Ｘ６が、Ｎ、Ｓ、及びＱから選択され、Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、及びＥから選択される）、及び（ｃ）アミノ酸配列ＥＧＧＦＡＹ（配列番号２５）を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨは、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１６または２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つのＨＶＲを含む。
【０１７９】
別の態様において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、及び６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態において、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、及び６２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態において、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、及び６２において合計で１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／または欠失している。ある特定の実施形態において、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、及び６２において合計で１〜５個のアミノ酸が置換、挿入、及び／または欠失している。ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。任意に、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、及び６２のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態において、ＶＬは、（ａ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＤＴＤＶＡ（配列番号９）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＲＸ１Ｓ（配列番号１０８）を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ１が、Ｙ、Ｋ、及びＲから選択される）、及び（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＹＸ３ＮＹＰＬＴ（配列番号１１０）を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ３が、Ｎ及びＥから選択される）、から選択される、１つ、２つ、または３つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、ＶＬは、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列、から選択される、１つ、２つ、または３つのＨＶＲを含む。上述の実施形態のうちのいずれかにおいて、ＨＶＲ−Ｌ２を直接先行するアミノ酸は、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、及びＱから選択され得る。いくつかの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ２を直接先行するアミノ酸は、Ｒである。
【０１８０】
別の態様において、抗Ｄ因子抗体が提供され、本抗体は、上記に提供される実施形態のうちのいずれかにあるようなＶＨ、及び上記に提供される実施形態のうちのいずれかにあるようなＶＬを含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、本抗体は、それぞれ、配列番号３５及び配列番号３４におけるＶＨ配列及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、それぞれ、配列番号３９及び配列番号３８におけるＶＨ配列及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０１８２】
さらなる態様において、抗Ｄ因子抗体と同じエピトープに結合する抗体が、本明細書において提供される。例えば、ある特定の実施形態において、配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列をそれぞれ含む抗Ｄ因子抗体と同じエピトープに結合する抗体が、提供される。ある特定の実施形態において、配列番号３９のＶＨ配列及び配列番号３８のＶＬ配列をそれぞれ含む抗Ｄ因子抗体と同じエピトープに結合する抗体が、提供される。
【０１８３】
図１Ａ〜Ｃに示されるＫａｂａｔ番号付けに従うＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣ、及びＨＶＲ３−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメインと、図２Ａ〜Ｃに示されるＫａｂａｔ番号付けに従うＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣ、及びＨＶＲ３−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインと、を含む抗体が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、本抗体は、図１Ａ〜Ｃに示されるＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣ、及び／またはＨＶＲ３−ＬＣ配列、ならびにＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、ＦＲ３−ＬＣ、及び／またはＦＲ４−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、図２Ａ〜Ｃに示されるＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣ、及び／またはＨＶＲ３−ＨＣ配列、ならびにＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、ＦＲ３−ＨＣ、及び／またはＦＲ４−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【０１８４】
本発明のさらなる態様において、上記実施形態のうちのいずれかによる抗Ｄ因子抗体は、ヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ−ＳＨ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ−ＳＨ、Ｆａｂ−Ｃ−ＳＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態において、本抗体は、実質的に完全長の抗体、例えば、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、または他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体は、Ｆａｂである。
【０１８５】
さらなる態様において、上記の実施形態のうちのいずれかによる抗Ｄ因子抗体は、以下に記載される特長のうちのいずれかを、単独でまたは組み合わせて組み込むことができる。
【０１８６】
１．抗体親和性
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下を有し、任意に、１０−１３Ｍ以上（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、Ｋｄは、以下のアッセイによって説明されるように、目的とする抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて行われる放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、Ｆａｂを、未標識抗原の一連の滴定の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートと結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２〜５時間室温（約２３℃）で遮断する。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を、目的とするＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一貫する）。その後、目的とするＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）続けて、平衡に達することを確実にすることができる。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、ＰＢＳ中０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を用いてプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）上でプレートを１０分間、計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を競合結合アッセイでの使用に選択する。
【０１８８】
別の実施形態によれば、Ｋｄは、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップと共に、２５℃においてＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。簡潔には、供給業者の指示に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）になるまで希釈した後に、５μＬ／分の流量で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。反応速度測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、２５℃の０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中におよそ２５μＬ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムとを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと）。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオンレートが１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オンレートは、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される場合に、増加する抗原濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技法を使用することによって決定することができる。
【０１８９】
２．抗体断片
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ−ＳＨ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ−ＳＨ、Ｆａｂ−Ｃ−ＳＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片、及び本明細書に記載される、その他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。ｓｃＦｖ抗体断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、またＷＯ９３／１６１８５及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照のこと。エピトープ残基を結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。遊離チオール基を持つ抗体断片は、「−ＳＨ」で示され得る。例えば、Ｆａｂ−ＳＨ（Ｆａｂ−Ｃ−ＳＨを含む）は、定常ドメインの少なくとも１つのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂの呼称である。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片の重鎖のＣ末端は、アミノ酸「ＣＤＫＴＨＴ」（配列番号１６５）、「ＣＤＫＴＨＬ」（配列番号１６６）、「ＣＤＫＴＨ」（配列番号１６７）、「ＣＤＫＴ」（配列番号１６８）、「ＣＤＫ」、または「ＣＤ」で終了する。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片の重鎖のＣ末端は、配列
2022002521.tif 000009
（配列番号１６９）で終了し、式中、
2022002521.tif 000010
は、Ｔを除いた任意のアミノ酸である。Ｃ末端での切断及び／または突然変異は、熱安定性または発現を損なうことなく、Ｆａｂに対してＡＨＡ−反応性を軽減または排除することが可能であり得る。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片の重鎖のＣ末端は、アミノ酸「ＣＤＫＴＨＴＣ」（配列番号１７０）、「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ」（配列番号１７１）、「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＳ」（配列番号１７２）、「ＣＤＫＴＨＴＳＰＰＣ」（配列番号１７３）、「ＣＤＫＴＨＴＡＰＰＣ」（配列番号１７４）、「ＣＤＫＴＨＴＳＧＧＣ」（配列番号１７５）、または「ＣＹＧＰＰＣ」（配列番号１７６）で終了する。いくつかのかかる実施形態において、Ｃ末端アミノ酸中の遊離システインは、コンジュゲーション、例えば、ＰＥＧ等のポリマーの影響を受け得る。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、配列番号１１３（ＣＤＫＴＨＴ（配列番号１６５））、１２８〜１３２（ＣＤＫＴＨＬ（配列番号１６６）、ＣＤＫＴＨＴＣ（配列番号１７０）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号１７１）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＳ（配列番号１７２）、ＣＤＫＴＨＴＳＰＰＣ（配列番号１７３））、１５４〜１５６（ＡＰＰＣ（配列番号１７７）、ＳＧＧＣ（配列番号１７８）、ＣＹＧＰＰＣ（配列番号１７６））、及び１３４〜１３７（ＣＤＫＴＨ（配列番号１６７）、ＣＤＫＴ（配列番号１６８）、ＣＤＫ、ＣＤ）から選択される重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１３８（ＶＥＲＫ（配列番号１７９））の重鎖定常領域を含むＩｇＧ２  Ｆａｂ断片または配列番号１５７（ＶＥＲＫＣ（配列番号１８０））の重鎖定常領域を含むＩｇＧ２  Ｆａｂ−Ｃ断片である。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１３９（ＫＹＧＰＰ（配列番号１８１））、配列番号１６３（ＫＹＧＰ（配列番号１８２））、及び１５９〜１６１（ＫＹＧ、ＫＹ、Ｋ）から選択される重鎖定常領域を含むＩｇＧ４  Ｆａｂ断片、または配列番号１５８（ＫＹＧＰＰＣ（配列番号１８３））の重鎖定常領域を含むＩｇＧ４  Ｆａｂ−Ｃ断片である。Ｃ末端での切断及び／または突然変異の代用として、既存の抗ヒンジ抗体（ＰＥ−ＡＨＡ）反応を避けるために、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４  Ｆａｂ断片がＰＥ−ＡＨＡ反応を示さないため、これらを使用してもよい。
【０１９１】
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【０１９２】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照のこと）。
【０１９３】
抗体断片は、本明細書に記載される、無傷抗体のタンパク分解、ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）の産生を含むが、これらに限定されない、様々な技法によって作製され得る。
【０１９４】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サル由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
【０１９５】
ある特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上の可変ドメインを含み、そのＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはそれらの部分）は、非ヒト抗体に由来し、そのＦＲ（またはそれらの部分）は、ヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むであろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
【０１９６】
ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）で概説され、また、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を記載する）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載する）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載する）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記載する）にさらに記載されている。
【０１９７】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照のこと）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照のこと）、ヒト成熟（体細胞変異された）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照のこと）、ならびにＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９８】
４．ヒト抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、概して、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【０１９９】
ヒト抗体は、抗原投与に応答して、無傷ヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体内にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有する。かかるトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照のこと。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について記載する）、米国特許第５，７７０，４２９号（ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術について記載する）、米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載する）、ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載する）も参照のこと。かかる動物によって生成された無傷抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに改変され得る。
【０２００】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体もまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載する）に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載されている。
【０２０１】
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。次いで、かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法は、以下に記載されている。
【０２０２】
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を保有する抗体についてかかるライブラリーをスクリーニングするための多様な方法が、当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）で概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）にさらに記載されている。
【０２０３】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローン化され、ファージライブラリー中で無作為に組み換えられ、それは次いでＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載される抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして抗体断片をディスプレイする。免疫化源由来のライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載されるように、ナイーブレパートリーは、クローン化され（例えば、ヒトから）、いかなる免疫化も伴わずに、幅広い非自己抗原また自己抗原に対する抗体の単一の源を提供することができる。最後に、ナイーブレパートリーは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞から再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローン化し、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、かつインビトロで再配列を達成することによって合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０２０４】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０２０５】
６．多重特異性抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方はＤ因子に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、Ｄ因子の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、Ｄ因子を発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化するために使用してもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【０２０６】
多重特異性抗体を作製するための技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照のこと）、ならびに「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に使用される「ノブ・イン・ホール」または「ＫｎＨ」技術という用語は、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面において一方のポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することにより、インビトロまたはインビボで一緒に対合することを誘導する技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、またはＶＨ／ＶＬ界面に導入されている（例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：７８１−７８８、及びＷＯ２０１２／１０６５８７を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＫｎＨにより、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖を一緒に対合することが促進される。例えば、Ｆｃ領域内にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインをさらに含むことができるか、または同様のもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインをさらに含むことができる。ＫｎＨ技術はまた、２つの異なる受容体の細胞外ドメインを一緒に対合するか、または異なる標的認識配列を含む任意の他のポリペプチド配列（例えば、アフィボディ、ペプチボディ、及び他のＦｃ融合体を含む）を対合するためにも使用することができる。
【０２０７】
本明細書で使用される「ノブ突然変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面において、突起（ノブ）をポリペプチドに導入する突然変異を指す。いくつかの実施形態において、他のポリペプチドは、ホール突然変異を有する。
【０２０８】
本明細書で使用される「ホール突然変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面において、空洞（ホール）をポリペプチドに導入する突然変異を指す。いくつかの実施形態において、他のポリペプチドは、ノブ突然変異を有する。
【０２０９】
簡潔な非限定的考察が、以下に提供される。
【０２１０】
「隆起」とは、第１のポリペプチドの界面から突出し、それ故に隣接した界面（すなわち、第２のポリペプチドの界面）の補償空洞内に位置付け可能になり、これにより、例えば、ヘテロ多量体を安定させ、それによりホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成が好都合になる、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。隆起は、元の界面に存在し得るか、または合成的に（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）導入され得る。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドの界面をコードする核酸は、突起をコードするように変化する。これを達成するために、第１のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸で置き換えられる。２つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解される。様々なアミノ残基の側鎖体積は、例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９の表１に示される。「突起」を導入する突然変異は、「ノブ突然変異」と称され得る。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、隆起の形成のための移入残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択される天然のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、移入残基は、トリプトファンまたはチロシンである。いくつかの実施形態において、突起の形成のための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリン等の小さい側鎖体積を有する。
【０２１２】
「空洞」とは、第２のポリペプチドの界面から凹んでおり、それ故に隣接する第１のポリペプチドの界面上の対応する隆起を収容する少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元の界面に存在し得るか、または合成的に（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）導入され得る。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドの界面をコードする核酸は、空洞をコードするように変化する。これを達成するために、第２のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡで置き換えられる。２つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解される。いくつかの実施形態において、空洞の形成のためのインポート残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される、自然発生するアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、インポート残基は、セリン、アラニン、またはトレオニンである。いくつかの実施形態において、空洞の形成のための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファン等の大きい側鎖体積を有する。「空洞」を導入する突然変異は、「ホール突然変異」と称され得る。
【０２１３】
隆起は、空洞内で「位置付け可能」であり、これは、それぞれ、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの界面の隆起及び空洞の空間的位置、ならびに隆起及び空洞の大きさが、界面での第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの正常な会合を著しく乱すことなく隆起が空洞内に位置し得るようなものであることを意味する。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐ等の突起は、典型的に界面の軸から垂直に延出せず、好ましい構造を有さず、対応する空洞を有する突起のアラインメントは、場合によっては、Ｘ線結晶学または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって得られるもの等の３次元構造に基づいて、突起／空洞の対をモデル化することに依存する。これは、当該技術分野で広く受け入れられている技法を使用して達成され得る。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１定常領域内のノブ突然変異は、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１定常領域内のホール突然変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）から選択される１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１定常領域内のホール突然変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４定常領域内のノブ突然変異は、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４定常領域内のホール突然変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）から選択される１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４定常領域内のホール突然変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）を含む。
【０２１６】
多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するために静電式ステアリング効果を遺伝子操作すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）、二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーを使用すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと）、二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと）、ならびに例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるように三重特異性抗体を調製することによっても作製され得る。
【０２１７】
「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照のこと）。
【０２１８】
本明細書の抗体または断片には、Ｄ因子ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用（Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照のこと）。
【０２１９】
７．抗体変異体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基からの欠失、及び／またはそこへの挿入、及び／またはその置換が含まれる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
【０２２０】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換が表１の「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化が表１の「例示的な置換」の見出しの下に示され、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下にさらに記載されている。アミノ酸置換が目的の抗体中に導入され得、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善について生成物がスクリーニングされ得る。
表１
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【０２２１】
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って群分けされ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２２２】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０２２３】
ある種類の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる試験のために選択される結果として生じる変異体（複数可）は、親抗体と比較したある特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）の改変（例えば、改善）を有し、及び／または実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換型変異体は、例えば、本明細書に記載される技法等のファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が変異され、変異型抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０２２４】
改変（例えば、置換）がＨＶＲで行われて、例えば、抗体親和性を改善することができる。かかる変化は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照のこと）、及び／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行われてもよく、結果として生じる変異体ＶＨまたはＶＬが、結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態において、多様性が、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のうちのいずれかによって、成熟させるために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーがスクリーニングされ、所望の親和性を有する任意の抗体変異型を特定する。多様性を導入する別の方法は、数個のＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）が無作為化されるＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に特定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的化される。
【０２２５】
ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ間で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）がＨＶＲで行われ得る。かかる改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であり得る。上述の変異体ＶＨ配列及びＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、改変されないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
【０２２６】
変異誘発のために標的とされ得る抗体の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって説明される「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）が特定され、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体と抗原との相互作用に影響が及ぼされたかを決定する。さらなる置換が最初の置換に対する機能感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。代替的に、または追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点が特定される。かかる接触残基及び隣接する残基が置換の候補として標的とされ得るか、または排除され得る。変異体がスクリーニングされて、それらが所望の特性を有するかを決定することができる。
【０２２７】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体には、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドへの抗体のＮ末端もしくはＣ末端の融合が挙げられ、これは抗体の血清半減期を増加させる。
【０２２８】
ｂ）グリコシル化変異体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変化させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって好都合に達成され得る。
【０２２９】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物が変化させ得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖としては、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体中におけるオリゴ糖の改変は、特定の特性の改善を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７もまた、抗体の軽微な配列変異に起因して、２９７位の上流または下流の約±３アミノ酸に、すなわち２９４〜３００位の間に位置してもよい。かかるフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、特に実施例１１）、ならびにアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞等のノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７）が挙げられる。
【０２３１】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分される、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。かかる抗体変異体は、低減されたフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。かかる抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）、及び米国特許公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。かかる抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０２３２】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸改変が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異体が生成され得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２３３】
ある特定の実施形態において、本発明は、全てではないが、いくつかのエフェクター機能を有することにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣ等）が不要または有害である用途に望ましい候補となる抗体変異体を企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞が、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照のこと）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるもの等の動物モデルにおいて評価されてもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定もまた、当該技術分野で既知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照のこと）。
【０２３４】
いくつかの実施形態において、新生児Ｆｃ受容体へのＩｇＧ結合を増加させるために、１つ以上のアミノ酸改変が、本明細書に提供される抗体のＦｃ部分に導入されてもよい。ある特定の実施形態において、抗体は、ＥＵ番号付けに従って３つの突然変異：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ突然変異」）を含む（米国特許第８，６９７，６５０号、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１（３３）：２３５１４−２３５２４（２００６）も参照のこと）。ある特定の実施形態において、ＹＴＥ突然変異は、抗体がその同族抗原に結合する能力に影響を及ぼさない。ある特定の実施形態において、ＹＴＥ突然変異は、抗体の血清半減期を、天然（すなわち、非ＹＴＥ突然変異体）抗体と比較して増加させる。いくつかの実施形態において、ＹＴＥ突然変異は、抗体の血清半減期を、天然（すなわち、非ＹＴＥ突然変異体）抗体と比較して３倍増加させる。いくつかの実施形態において、ＹＴＥ変異は、抗体の血清半減期を、天然（すなわち、非ＹＴＥ突然変異体）抗体と比較して２倍増加させる。いくつかの実施形態において、ＹＴＥ突然変異は、抗体の血清半減期を、天然（すなわち、非ＹＴＥ突然変異体）抗体と比較して４倍増加させる。いくつかの実施形態において、ＹＴＥ突然変異は、抗体の血清半減期を、天然（すなわち、非ＹＴＥ突然変異体）抗体と比較して少なくとも５倍増加させる。いくつかの実施形態において、ＹＴＥ突然変異は、抗体の血清半減期を、天然（すなわち、非ＹＴＥ突然変異体）抗体と比較して少なくとも１０倍増加させる。例えば、米国特許第８，６９７，６５０号を参照のこと。また、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１（３３）：２３５１４−２３５２４（２００６）も参照のこと。
【０２３５】
ある特定の実施形態において、ＹＴＥ変異は、抗体の抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を調節する手段を提供する。ある特定の実施形態において、ＹＴＥＯ変異は、ヒト抗原に対するヒト化ＩｇＧ抗体のＡＤＣＣ活性を調節する手段を提供する。例えば、米国特許第８，６９７，６５０号を参照のこと。また、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１（３３）：２３５１４−２３５２４（２００６）も参照のこと。
【０２３６】
ある特定の実施形態において、ＹＴＥ変異は、血清半減期、組織分布、及び抗体活性（例えば、ＩｇＧ抗体のＡＤＣＣ活性）の同時調節を可能にする。例えば、米国特許第８，６９７，６５０号を参照のこと。また、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１（３３）：２３５１４−２３５２４（２００６）も参照のこと。
【０２３７】
低減したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ変異には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位のうちの２つ以上における置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２３８】
ある特定の実施形態において、野生型ヒトＦｃ領域の３２９位（ＥＵ番号付け）（Ｐ３２９）におけるプロリンは、グリシンもしくはアルギニン、またはＦｃのＰ３２９とＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｗ８７及びＷ１１０との間に形成されるＦｃ／Ｆｃγ受容体界面内でプロリンサンドイッチを破壊するのに十分に大きいアミノ酸残基で置換される（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ  ４０６，２６７−２７３（２０  Ｊｕｌｙ  ２０００））。さらなる実施形態において、Ｆｃ変異体内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓであり、さらに別の実施形態において、該少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅであり、これらは全て、ＥＵ番号付けに従うものである（米国特許第８，９６９，５２６号であり、これは参照によりその全体が組み込まれる）。
【０２３９】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃ変異体を含み、このポリペプチドは、グリシンで置換されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＰ３２９を有し、Ｆｃ変異体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅにおいて少なくとも２つのさらなるアミノ酸置換を含み、残基は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされる（米国特許第８，９６９，５２６号であり、これは参照によりその全体が組み込まれる）。ある特定の実施形態において、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）置換を含むポリペプチドでは、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドによりＡＤＣＣが少なくともその２０％に下方調節される場合、及び／またはＡＤＣＰが下方調節される場合は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の低下が示される（米国特許第８，９６９，５２６号であり、これは参照によりその全体が組み込まれる）。
【０２４０】
特定の実施形態において、野生型ヒトＦｃポリペプチドのＦｃ変異体を含むポリペプチドは、三重突然変異、ＥＵ番号付け（Ｐ３２９／ＬＡＬＡ）に従いＰｒｏ３２９、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ位にアミノ酸置換を含む（米国特許第８，９６９，５２６号であり、これは参照によりその全体が組み込まれる）。特定の実施形態において、ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換、すなわち、ＥＵ番号付けに従いＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａを含む。
【０２４１】
ＦｃＲへの結合が改善または低減されたある特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照のこと）。
【０２４２】
ある特定の実施形態において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。
【０２４３】
いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるように、改変はＦｃ領域内で行われ、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の改変（すなわち、改善または低減）をもたらす。
【０２４４】
増加した半減期、及び母体のＩｇＧ類を胎児に移行させる役割を負う新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０２４５】
Ｆｃ変異型の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照のこと。
【０２４６】
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある特定の実施形態において、抗体の１個以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換残基は、コンジュゲーションに利用可能な抗体の部位において生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、他の部分に抗体を複合体化して、本明細書にさらに記載されるように、コンジュゲートを作製することができる。ある特定の実施形態において、以下の残基、軽鎖のＫ１４９（Ｋａｂａｔ番号付け）、軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、重鎖のＡ１４０（ＥＵ番号付け）、重鎖のＬ１７４（ＥＵ番号付け）、重鎖のＹ３７３（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちの任意の１個以上が、システインで置換されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ（ＥＵ番号付け）システイン置換を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）システイン置換を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ＨＣ−Ａ１１８Ｃ（ＥＵ番号付け）システイン置換を含む。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
【０２４７】
ある特定の実施形態において、本抗体は、以下の重鎖システイン置換のうちの１つを含む。
表２Ａ：
2022002521.tif 000012
【０２４８】
重鎖内の、抗体Ｆａｂ断片中のシステイン置換に好適な残基は、１１０、１３６、１７０、１７５、１８３、及び２０５位（Ｋａｂａｔ番号付け）を含む。
【０２４９】
ある特定の実施形態において、抗体は、以下の軽鎖システイン置換のうちの１つを含む。
表２Ｂ：
2022002521.tif 000013
【０２５０】
ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、１つ以上のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で使用されるかどうか等を含むがこれらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
【０２５１】
別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分の複合体が提供される。いくつかの実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであり得、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に隣接する細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むが、これらに限定されない。
【０２５２】
Ｂ．組換え法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換え法及び組成物を使用して産生され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体をコードする単離核酸が提供される。かかる核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのかかる実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらで形質転換されている）。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体を作製する方法が提供され、上記に提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、その抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意で、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む、方法が提供される。
【０２５３】
抗Ｄ因子抗体の組換え産生のために、例えば、上述のもの等の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。かかる核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。
【０２５４】
抗体をコードするベクターのクローン化または発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核生物細胞または真核生物細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌中で産生され得る。細菌内での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照のこと。（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現について記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照のこと。）発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。
【０２５５】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物は、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌及び酵母株を含む。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照のこと。
【０２５６】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。
【０２５７】
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するための、ＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載する）を参照のこと。
【０２５８】
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で成長するように適合された哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）、ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されるような２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載される、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に好適なある特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照のこと。
【０２５９】
Ｃ．アッセイ
本明細書に提供される抗Ｄ因子抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／または生物学的活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、特定され得るか、スクリーニングされ得るか、または特徴付けられ得る。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、その抗原結合活性について、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）、ＦＡＣＳ、またはウェスタンブロット等の既知の方法によって試験される。
【０２６１】
別の態様において、競合アッセイは、Ｄ因子への結合について本明細書に記載される抗体のいずれかと競合する抗体を特定するために使用され得る。ある特定の実施形態において、かかる競合抗体は、本明細書に記載される抗体によって結合されるのと同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示の方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。
【０２６２】
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＤ因子は、Ｄ因子に結合する第１の標識抗体（例えば、本明細書に記載される抗体のいずれか）、及びＤ因子への結合について第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の未標識の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定化されたＤ因子を、第１の標識抗体を含むが第２の未標識の抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体のＤ因子への結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化されたＤ因子に関連する標識の量を測定する。固定化されたＤ因子に関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低減される場合、それは、第２の抗体がＤ因子への結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと。
【０２６３】
抗Ｄ因子抗体、またはその変異体もしくは断片（例えば、抗原結合断片）は、Ｄ因子への結合及び生物学的効果、例えば、代替の生物学的経路溶血の阻害を発揮することができるかどうかを決定するために、溶血性阻害アッセイ、例えば、ウサギＲＢＣを用いて使用され得る。かかる溶血性阻害は、標準的なアッセイを用いて決定され得る（Ｋｏｓｔａｖａｓｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５８：１７６３−７２、Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：１５９−６０）。かかるアッセイにおける補体活性化は、血清または血漿から開始され得る。血清または血漿中のＤ因子の適切な濃度（Ｐａｓｃｕａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３４：５２９−５３６、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ，Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｊ．Ｍｏｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｋ  Ｊ．Ｗａｌｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）、Ｂａｒｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６７：３０３−３０９）は、当該技術分野で既知の方法に従って日常的に決定することができ、これには、Ｐａｓｃｕａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３４：５２９−５３６及びＢａｒｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６７：３０３−３０９等の参照文献に記載されているものが含まれる。本開示は、概して、Ｄ因子と関連する生物学的活性を阻害することができる抗体に関する。例えば、１８μｇ／ｍｌの濃度（血液中のヒトＤ因子のモル濃度の約１．５倍に相当する；約１．５：１の抗Ｄ因子抗体対Ｄ因子のモル比）で、抗体による代替の補体の活性の有意な阻害が観察され得る（例えば、米国特許第６，９５６，１０７号を参照のこと）。
【０２６４】
いくつかの実施形態において、本開示は、抗Ｄ因子抗体及びそのコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のＦａｂ断片は、３０ｎＭ未満、または１５ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満、または５ｎＭ未満のＩＣ５０値で代替経路溶血を阻害する。いくつかの実施形態において、本開示は、抗Ｄ因子抗体及びそのコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のＦａｂ断片は、３０ｎＭ〜２ｎＭ、または２５ｎＭ〜２ｎＭ、または２０ｎＭ〜２ｎＭ、または１０ｎＭ〜２ｎＭ、または７ｎＭ〜２ｎＭのＩＣ５０値で代替経路溶血を阻害する。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、本開示は、抗Ｄ因子抗体及びそのコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のＦａｂ断片は、８０ｎＭ未満、または５０ｎＭ未満、または４０ｎＭ未満、または２０ｎＭ未満、または１５ｎＭ未満のＩＣ９０値で代替経路溶血を阻害する。いくつかの実施形態において、本開示は、抗Ｄ因子抗体及びそのコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のＦａｂ断片は、８０ｎＭ〜５ｎＭ、または７５ｎＭ〜５ｎＭ、または７０ｎＭ〜５ｎＭ、または６５ｎＭ〜５ｎＭ、または６０ｎＭ〜５ｎＭ、または５５ｎＭ〜５ｎＭ、または５０ｎＭ〜５ｎＭ、または５０ｎＭ〜１０ｎＭのＩＣ９０値で代替経路溶血を阻害する。
【０２６６】
いくつかの実施形態において、本開示は、抗Ｄ因子抗体及びそのコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のＦａｂ断片は、約０．０５：１（０．０５）〜約１０：１（１０）、または約０．０９：１（０．０９）〜約８：１（８）、または約０．１：１（０．１）〜約６：１（６）、または約０．１５：１（０．１５）〜約５：１（５）、または約０．１９：１（０．１９）〜約４：１（４）、または約０．２：１（０．２）〜約３：１（３）、または約０．３：１（０．３）〜約２：１（２）、または約０．４：１（０．４）〜約１：１（１）、または約０．５：１（０．５）〜約１：２（０．５）、または約０．６：１（０．６）〜約１：３（０．３３）、または約０．７：１（０．７）〜約１：４（０．２５）、または約０．８：１（０．８）〜約１：５（０．２）、または約０．９：１（０．９）〜約１：６（０．１７）の抗体対Ｄ因子のモル比で代替経路溶血を阻害する。
【０２６７】
いくつかの実施形態において、本開示は、抗Ｄ因子抗体、及びヒト化抗Ｄ因子抗体の断片（例えば、抗原結合断片）を含むコンジュゲートを対象とする。本開示の抗体断片は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ−ＳＨ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ−ＳＨ、Ｆａｂ−Ｃ−ＳＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体断片から形成される多特異的抗体であり得る。さらなる実施形態において、本開示は、全ての網膜を実質的に貫通することができるヒト化抗Ｄ因子抗体断片またはそのコンジュゲート（例えば、抗原結合断片）を対象とする。なおさらなる実施形態において、本開示は、全ての網膜を実質的に貫通することができるヒト化抗Ｄ因子抗体断片またはそのコンジュゲート（例えば、抗原結合断片）を対象とする。
【０２６８】
いくつかの実施形態において、本開示は、抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のコンジュゲートされていないＦａｂ断片は、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼（例えばヒト）中への投与後、少なくとも３、５、７、１０、または１２日の半減期を有する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト化抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のコンジュゲートされていないＦａｂ断片は、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼（例えばヒト）中への投与後、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、または１１５日間、代替経路（ＡＰ）の補体活性化を阻害する。別の実施形態において、本開示は、ヒト化抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを対象とし、代替経路（ＡＰ）の補体活性化を阻害するかかる抗体のコンジュゲートされていないＦａｂ断片の濃度は、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼（例えばヒト）中への投与後、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、または８５日間、網膜組織中に維持される。別の実施形態において、本開示は、ヒト化抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを対象とし、代替経路（ＡＰ）の補体活性化を阻害するかかる抗体のコンジュゲートされていないＦａｂ断片の濃度は、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼（例えばヒト）中への投与後、少なくとも８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、または１１５日間、硝子体液中に維持される。
【０２６９】
Ｄ．コンジュゲート
本発明はまた、ポリオール等の１つ以上の異種分子にコンジュゲートされる本明細書に提供される任意の抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートも提供する。
【０２７０】
１．多アーム型ポリマー
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、多アーム型ポリマーで抗体またはその変異体をコンジュゲートすることによって、本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体を誘導体化することによって行われ得る。所望のサイズでコンジュゲートを提供するか、または本明細書に記載される選択された平均分子量を有するいずれの多アーム型ポリマーが、本開示の抗体−ポリマーコンジュゲートの構築に用いるのに適していると理解されよう。
【０２７１】
多くのポリマーは、医薬品で用いるのに適している。例えば、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｓｅ，ｐｐ．４４１−４５１（１９８０）を参照のこと。本開示の全ての実施形態において、非タンパク質ポリマーは、本開示のコンジュゲートを形成するために使用される。非タンパク質ポリマーは、通常、親水性合成ポリマー、すなわち、実際には見出されないポリマーである。しかしながら、実際に存在し、組換えまたはインビトロ方法によって生成される、ポリマーはまた、天然源から単離されるポリマーであるように、有用であり得る。
【０２７２】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体は、多アーム型ポリオールに、抗体またはその変異体をコンジュゲートすること（例えば、共有結合すること）によって誘導体化される。それ故に、いくつかの態様において、本開示は、１つ以上の多アーム型ポリオールに共有結合している、本明細書に開示される１つ以上の抗Ｄ因子抗体または抗体変異体を含むコンジュゲートを対象とする。用いられるポリオールは、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであり得、直鎖または分岐鎖を有し得る。好適なポリオールには、１つ以上のヒドロキシル位置に化学基、例えば１〜４個の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、それ故に、説明を簡略化するために、考察の残りの部分は、例示の実施形態に関し、用いられるポリオールがＰＥＧであり、ポリペプチドへのポリオールをコンジュゲートするプロセスは、「ペグ化」と称される。しかしながら、当業者であれば、他のポリオール、例えば、ポリ（プロピレングリコール）及びポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、ＰＥＧについて本明細書に記載されるコンジュゲートのための技術を使用して用いることができることが理解されよう。
【０２７３】
本開示のコンジュゲートを形成するために使用されるポリオールは、多アーム型ポリオールである。本明細書で使用される場合、「多アーム型ポリオール」は、少なくとも２つのアームを結合するコア構造を含むポリオールを指す。多アーム型ポリオールは、例えば、二量体（２つのアーム）、四量体（４つのアーム）、六量体（６つのアーム）、八量体（８つのアーム）等であり得る。いくつかの態様において、多アーム型ポリオールは、多アーム型ＰＥＧである。
【０２７４】
抗Ｄ因子抗体及び抗体変異体のペグ化に使用される多アーム型ＰＥＧの重量平均分子量は、異なり得、典型的には、約５００〜約３００，０００ダルトン（Ｄ）の範囲に及び得る。いくつかの実施形態において、多アーム型ＰＥＧの重量平均分子量は、約１，０００〜約１００，０００Ｄであり、いくつかの態様において、約２０，０００〜約６０，０００Ｄである。いくつかの実施形態において、ペグ化は、約４０，０００Ｄの重量平均分子量を有する多アームＰＥＧで行われる。
【０２７５】
タンパク質をペグ化するための様々な方法は、当該技術分野で既知である。ＰＥＧにコンジュゲートされたタンパク質を生成する特定の方法は、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，９３５，４６５号、米国特許第５，８４９，５３５号に記載されており、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。典型的には、タンパク質は、タンパク質のアミノ酸残基のうちの１つ以上を介してポリマー上の末端反応基と共有結合している。反応基（複数可）を有するポリマーは、活性化または官能性化ポリマー（例えば、官能性化ＰＥＧ）として本明細書に示される。反応基は、抗体または抗体変異体上の遊離スルフヒドリルまたはアミノまたは他の反応基と選択的に反応する。多アーム型ＰＥＧポリマーは、ランダムまたは部位特異的様式のいずれかで抗体または抗体変異体上のスルフヒドリルまたはアミノまたは他の反応基と結合し得る。しかしながら、最適結果を得るために、選択される反応基の型及び量、ならびに用いられるポリマーの型及び量が、抗体上の多すぎる活性基と反応する反応基を有することを制限し、好ましくは実質的には回避するために用いられる特定の抗体または抗体変異体に応じて異なることが理解されよう。場合によっては、これを十分に制限または回避することが可能でない場合があるため、典型的には、約０．０５〜約１０００モル、またはいくつかの実施形態において、抗体濃度に応じて、抗体の１モル当たり約０．０５〜約２００モルの官能化ポリマーが、用いられ得る。抗体の１モル当たりの官能化ポリマーの最終量は、最適活性を維持するための平衡であるが、可能であれば、抗体の硝子体液、網膜、及び／または房水半減期を同時に最適化する。
【０２７６】
Ｎ末端アミノ酸基等の残基が、抗体または抗体変異体上の任意の反応アミノ酸であり得るが、いくつかの実施形態において、反応性アミノ酸はシステインであり、これは官能化ポリマーの反応基にその遊離チオール基を通して結合しており、これらは、例えば、ＷＯ９９／０３８８７、ＷＯ９４／１２２１９、ＷＯ９４／２２４６６、米国特許第５，２０６，３４４号、米国特許第５，１６６，３２２、及び米国特許第５，２０６，３４４号に記載されており、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。かかる実施形態において、ポリマーは、親抗体上の遊離スルフヒドリルまたはチオール基（複数可）と特異的に反応することができる少なくとも１つの末端反応基を含み得る。かかる基としては、とりわけ、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーは、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第７，１２２，６３６号、及びＪｅｖｓｅｖａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｊ．，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．１１３−１２８（２０１０）に記載される、プロトコル及びシステム等の選択されるカップリング系の化学に適している任意のプロトコルを用いて、親抗体と結合し得る。あるいは、反応アミノ酸は、リジン（その遊離エプシロン−アミノ基を介して官能化ポリマーの反応基に連結される）（例えば、ＷＯ９３／００１０９を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）であり得るか、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸（アミド結合を介して重合体に連結される）であり得る。次いで、ポリマーの反応基は、例えば、共有結合を形成するために、タンパク質のα（アルファ）及びε（エプシロン）アミンまたはスルフヒドリル基と反応させることができる。本開示が、抗体または抗体断片とポリマーとの間の任意の特定のタイプの連結を使用するコンジュゲートに限定されないことが理解されよう。
【０２７７】
本開示のコンジュゲートを調製するのに用いるために好適な官能化多アーム型ＰＥＧは、多くの従来の反応によって生成され得る。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ−ＮＨＳ−ＰＥＧ）は、Ｂｕｃｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒ，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１８２，ｐｐ．１３７９−１３８４（１９８１）の方法に従って、ＰＥＧ−モノメチルエーテルから、Ｎ，Ｎ’−ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応によって調製することができる。加えて、ＰＥＧ末端ヒドロキシ基は、例えば、臭化チオニルと反応させて、ＰＥＧ−Ｂｒを形成した後、過剰のアンモニアでアミノ分解して、ＰＥＧ−ＮＨ２を形成することによって、アミノ基に転換することができる。次いで、ＰＥＧ−ＮＨ２は、ウッドワード試薬Ｋ等の標準的なカップリング試薬を用いて、目的の抗体または抗体変異体にコンジュゲートされ得る。さらに、ＰＥＧ末端ＣＨ２ＯＨ基は、例えば、ＭｎＯ２での酸化によってアルデヒド基に転換することができる。アルデヒド基は、水素化シアノホウ素等の試薬を用いる還元性アルキル化によって抗体または抗体変異体にコンジュゲートされ得る。
【０２７８】
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉ）の構造を有し、
2022002521.tif 000014
式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５〜約１０００、約３〜約２５０、または約５０〜約２００、または約１００〜約１５０の整数であり、ｎは、約１〜約１０の整数である。
【０２７９】
いくつかの実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉ）の構造を有し、式中、ｎは、１であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。別の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉ）の構造を有し、式中、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。別の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉ）の構造を有し、式中、ｎは、３であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。
【０２８０】
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩ）の構造を有し、
2022002521.tif 000015
式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５〜約１０００、約３〜約２５０、または約５０〜約２００、または約１００〜約１５０の整数であり、ｎは、約１〜約１０の整数である。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩ）の構造を有し、式中、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。別の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩ）の構造を有し、式中、ｎは、４であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。別の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩ）の構造を有し、式中、ｎは、６であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。
【０２８２】
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、
2022002521.tif 000016
式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５〜約１０００、約３〜約２５０、または約５０〜約２００、または約１００〜約１５０の整数であり、ｎは、約１〜約１０の整数である。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。別の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｎは、４であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。別の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｎは、６であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。
【０２８４】
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶ）の構造を有し、
2022002521.tif 000017
（ＩＶ）
式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５〜約１０００、約３〜約２５０、または約５０〜約２００、または約１００〜約１５０の整数である。
【０２８５】
一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のうちのいずれかの構造を有する多アーム型ＰＥＧは、例えば、官能化多アーム型ＰＥＧを生成するために上述の技術のうちのいずれかを用いて、抗体（例えば、抗体断片）と反応するか、またはこれにコンジュゲートするのに適している末端反応基と結合するように官能化され得る。他の実施形態において、しかしながら、多アーム型ＰＥＧは、例えば、米国特許第７，１２２，６３６号（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＰＥＧ及び連結される抗体または抗体変異体の１つ以上のアミノ酸残基と反応する多機能性架橋剤を通して抗Ｄ因子抗体に共有結合され得る。
【０２８６】
他の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、少なくとも１つの末端反応基を含む官能化多アーム型ＰＥＧである。末端反応基は、本開示のコンジュゲートを形成するために、抗Ｄ因子抗体に直接コンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000018
【０２８７】
式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５〜約１０００、約３〜約２５０、または約５０〜約２００、または約１００〜約１５０の整数であり、ｎは、約１〜約１０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応基であり、かつ少なくとも１つのＲ２は、末端反応基である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
【０２８８】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、式中、ｎは、１〜３の整数である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、式中、ｎは、１であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。別の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、式中、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。別の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、式中、ｎは、３であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。かかる実施形態において、八量体は、一般式（Ｉｂ）の構造を有し、
2022002521.tif 000019
（Ｉｂ）
式中、ｍ、Ｒ１、及びＲ２は、上に定義されるとおりである。
【０２８９】
一般式（Ｉｂ）の構造を有する多アーム型ＰＥＧは、トリペンタエリトリトール（ＴＰ）コア構造を有し、本明細書において、ＴＰ八量体とも称される。
【０２９０】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の構造を有し、式中、各Ｒ１は、存在する場合、同じであるか、または異なり、Ｒ１及びＲ２は、１つにまとめると、
2022002521.tif 000020
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各ｉは、独立して、０〜１０の整数であり、ｊは、０〜１０の整数であり、Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各Ｒ１は、連結基である。
【０２９１】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、１つにまとめると、
2022002521.tif 000021
であり、式中、ｉ、ｊ、及びＲ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、１つにまとめると、
2022002521.tif 000022
であり、式中、ｉは、２であり、ｊは、２または３であり、Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。
【０２９２】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の構造を有し、式中、各Ｒ２は、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、マレイミドである。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の構造を有し、式中、各Ｒ２は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000023
であり、式中、ｉ及びｊは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000024
であり、式中、ｉは、２であり、ｊは、２である。
【０２９４】
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000025
【０２９５】
式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５〜約１０００、約３〜約２５０、または約５０〜約２００、または約１００〜約１５０の整数であり、ｎは、約１〜約１０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応基であり、かつ少なくとも１つのＲ２は、末端反応基である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、ｎは、２〜６の整数である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、ｎは、３である。別の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、ｎは、４であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。別の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、ｎは、６であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。一般式（ＩＩａ）の構造を有する八量体は、ヘキサグリセリン（ＨＧ）コア構造を有し、本明細書において、ＨＧ八量体とも称される。
【０２９７】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、各Ｒ１は、存在する場合、同じであるか、または異なり、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000026
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各ｉは、独立して、０〜１０の整数であり、ｊは、０〜１０の整数であり、Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各Ｒ１は、連結基である。
【０２９８】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000027
であり、式中、ｉ、ｊ、及びＲ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、１つにまとめると、
2022002521.tif 000028
であり、式中、ｉは、２であり、ｊは、２または３であり、Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。
【０２９９】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、各Ｒ２は、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、マレイミドである。
【０３００】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、各Ｒ２は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると
、
2022002521.tif 000029
であり、式中、ｉ及びｊは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000030
であり、式中、ｉは、２であり、ｊは、２である。
【０３０１】
別の態様において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000031
【０３０２】
式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５〜約１０００、または約３〜約２５０、または約５０〜約２００、または約１００〜約１５０の整数であり、ｎは、約１〜約１０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応基であり、かつ少なくとも１つのＲ２は、末端反応基である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
【０３０３】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、ｎは、２〜６の整数である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。別の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、ｎは、４であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。別の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、ｎは、６であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。一般式（ＩＩＩａ）の構造を有する八量体は、ヘキサグリセロール（ＨＧＥＯ）コア構造を有し、本明細書において、ＨＧＥＯ八量体とも称される。
【０３０４】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、各Ｒ１は、存在する場合、同じであるか、または異なり、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000032
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各ｉは、独立して、０〜１０の整数であり、ｊは、０〜１０の整数であり、Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各Ｒ１は、連結基である。
【０３０５】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000033
であり、式中、ｉ、ｊ、及びＲ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、１つにまとめると、
2022002521.tif 000034
であり、式中、ｉは、２であり、ｊは、２または３であり、Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。
【０３０６】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、各Ｒ２は、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、マレイミドである。
【０３０７】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、各Ｒ２は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000035
であり、式中、ｉ及びｊは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000036
であり、式中、ｉは、３であり、ｊは、２である。
【０３０８】
別の態様において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、
2022002521.tif 000037
式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５〜約１０００、または約３〜約２５０、または約５０〜約２００、または約１００〜約１５０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、不在であるか、または連結基であり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応基であり、かつ少なくとも１つのＲ２は、末端反応基である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
【０３０９】
一般式（ＩＶａ）の構造を有する多アーム型ＰＥＧは、ブタンジオールコア構造を有し、本明細書において、ＤＸ八量体とも称される。
【０３１０】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、式中、各Ｒ１は、存在する場合、同じであるか、または異なり、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000038
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各ｉは、独立して、０〜１０の整数であり、ｊは、０〜１０の整数であり、Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各Ｒ１は、連結基である。
【０３１１】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000039
であり、式中、ｉ、ｊ、及びＲ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、１つにまとめると、
2022002521.tif 000040
であり、式中、ｉは、２であり、ｊは、２または３であり、Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。
【０３１２】
いくつかの実施形態において、各Ｒ２が、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、マレイミドである。
【０３１３】
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、式中、各Ｒ２は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000041
であり、式中、ｉ及びｊは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、一緒にまとめると、
2022002521.tif 000042
であり、式中、ｉは、３であり、ｊは、２である。
【０３１４】
本開示で用いるのに適している他の官能化多アーム型ＰＥＧは、米国特許出願公開第２０１１／０２８６９５６号、及び米国特許出願公開第２０１５／００７３１５５号に記載されており、これらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３１５】
本開示で用いるのに適している官能化多アーム型ＰＥＧはまた、多くの製造供給元から購入することができる。例えば、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡは、マレイミドで官能化されたＰＥＧ八量体（例えば、８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ及び８ＡＲＭ（ＨＧ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ）ならびに四量体を販売している。ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐ．もまた、マレイミドで官能化されたＰＥＧ八量体（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＤＸ−４００ＭＡ）、及び四量体（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＰＴＥ−４００ＭＡ）を販売している。かかる八量体及び四量体は、４０，０００Ｄの重量平均分子量を含む、様々な分子量において利用可能である。
【０３１６】
２．コンジュゲート
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される１つ以上の抗Ｄ因子抗体または抗体変異体及び１つ以上の多アーム型ポリオールを含むコンジュゲートを対象とし、該コンジュゲートは、少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体または抗体変異体をポリオールに共有結合することによって調整される。いくつかの実施形態において、多アーム型ポリオールは、ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、八量体である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、または（ＩＶａ）の構造を有する。
【０３１７】
本開示のコンジュゲートは、各多アーム型ＰＥＧにコンジュゲートされた抗Ｄ因子抗体の数によって特徴付けられ得る。これは、本明細書において、「ｆａｂ化」または「ｆａｂ化度」と称される。各ＰＥＧにコンジュゲートされた抗Ｄ因子抗体の数は、以下を含む、様々な要因に応じて異なり得る：１）ＰＥＧ内のアームの数、２）ＰＥＧ上の末端反応基の数及び／または反応性、３）ＰＥＧのコア構造、及び／または、４）ペグ化反応条件。コンジュゲートを調製するために使用される高い多分散性の多アーム型ＰＥＧは、場合によっては、最終コンジュゲートの分析を複雑にし、具体的には、１ＰＥＧ当たりの抗体（例えば、Ｆａｂ）の数の精密測定をさらに困難かつ不明確にし得る。したがって、コンジュゲートを形成するために使用されるＰＥＧは、典型的には、約１〜約１．３５の範囲内で多分散性（当該技術分野で既知の方法を用いて決定される）を有し、様々な実施形態において、約１〜約１．２５、約１〜約１．２、約１〜約１．１５、約１〜約１．１、約１．０５、またはさらに約１の多分散性を有する。
【０３１８】
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体または抗体変異体は、ＰＥＧに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、少なくとも２つの抗Ｄ因子抗体は、ＰＥＧに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、少なくとも３つの抗Ｄ因子抗体は、ＰＥＧに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、少なくとも４つの抗Ｄ因子抗体は、ＰＥＧに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、少なくとも５つの抗Ｄ因子抗体は、ＰＥＧに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、少なくとも６つの抗Ｄ因子抗体は、ＰＥＧに共有結合している。別の実施形態において、該コンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、少なくとも７つの抗Ｄ因子抗体は、ＰＥＧに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、少なくとも８つの抗Ｄ因子抗体は、ＰＥＧに共有結合している。いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、５〜８つの抗Ｄ因子抗体は、ＰＥＧに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、６〜８つの抗Ｄ因子抗体は、ＰＥＧに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、７〜８つの抗Ｄ因子抗体は、ＰＥＧに共有結合している。
【０３１９】
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、または（ＩＶａ）のうちのいずれか１つの構造を有する多アーム型ＰＥＧを含む。かかる実施形態において、少なくとも１つのＲ２は、本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、または（ＩＶａ）のうちのいずれか１つの構造を有する多アーム型ＰＥＧは、八量体であり、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または８つ全てのＲ２基は、本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体または抗体変異体に共有結合している。
【０３２０】
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、多アーム型ポリオールが親抗体上の特異的部位（複数可）に共有結合している、すなわち、ポリマー結合が、親抗体または抗体断片中の特定の領域または特定のアミノ酸残基（複数可）を標的としている種を含む。標準的な変異誘発技術は、親抗体または抗体断片中の潜在的なペグ化部位の数及び／または位置を変化させるために使用することができる。それ故に、アミノ酸置換がシステイン及びリジン等のアミノ酸を導入または置換する範囲内において、本開示の抗Ｄ因子抗体及びその変異体は、天然配列抗Ｄ因子よりも多いまたは少ない数の潜在的なペグ化部位を含有し得る（図１Ａ〜Ｃに示される）。
【０３２１】
上に論じられるように、ポリマーの部位特異的コンジュゲーションは、最も一般的には、親抗体または抗体断片中のシステイン残基への結合によって達成される。かかる実施形態において、そのカップリング化学は、例えば、親抗体においてジスルフィド架橋の中にないシステイン残基の遊離スルフヒドリル基を利用することができる。
【０３２２】
いくつかの実施形態において、親抗体中に天然に存在する１つ以上のシステイン残基（複数可）は、ポリマーコンジュゲーションのための結合部位（複数可）として使用される。他の実施形態において、この抗体または抗体変異体の遊離アミノ基は、Ｐｅｄｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．７０，ｐｐ．１１２６−１１３０（１９９４）に記載されるように、２−イミノ−チオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）とチオール化し、次いで、マレイミドに官能化されたＰＥＧに結合させることができる。別の実施形態において、１つ以上のシステイン残基（複数可）は、ポリマーの特定の結合部位（複数可）を提供するために親抗体中の選択された部位（複数可）に操作されている。
【０３２３】
システイン操作抗体は、上述されている（米国特許公開第２００７／００９２９４０号及びＪｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．３３２（ｌ−２），ｐｐ．４１−５２（２００８）に記載されており、全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、システイン操作抗体は、親抗体であり得る。これらは、特定の位置、典型的には、定常領域内で、例えば、ＣＬまたはＣＨ１において、遊離システインを有する抗体断片を生成するために有用である。システインを含むように操作された親抗体は、本明細書において、「チオＭａｂ」と称され、かかるシステイン操作抗体から産生されたＦａｂ断片は、産生の方法に関わらず、本明細書において、「チオＦａｂ」と称される。上述のように（例えば、米国特許公開第２００７／００９２９４０号及びＪｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．３３２（ｌ−２），ｐｐ．４１−５２（２００８）を参照のこと）、置き換えられた（「操作」）システイン（Ｃｙｓ）残基を有する突然変異体は、新しく導入された、操作システインチオール基の反応性について評価される。チオール反応性値は、０〜１．０の範囲内の相対的な数値であり、任意のシステイン操作抗体について測定され得る。反応性チオール基を有することに加えて、チオＭａｂは、それらが抗原結合能力を保持されるよう選択されるべきである。システイン操作抗体の設計、選択、及び調製は、以前に詳述されている（例えば、ＷＯ２０１１／０６９１０４を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、操作システインは、重鎖または軽鎖の定常ドメインに導入される。したがって、システイン操作抗体は、それらの野生型の親抗体対応物の抗原結合能力を保持し、したがって、抗原に特異的に結合可能である。
【０３２４】
いくつかの実施形態において、本開示は、抗体断片−ポリマーコンジュゲートに関し、該抗原断片は、Ｆａｂであり、ポリマーは、軽鎖及び重鎖を連結する鎖間ジスルフィド結合を通常形成し得るＦａｂ断片の軽鎖または重鎖内の１つ以上のシステイン残基に結合している。
【０３２５】
別の態様において、本開示は、抗体断片−ポリマーコンジュゲートに関し、該抗原断片は、Ｆａｂ−Ｃであり、ポリマー結合は、Ｆａｂ−Ｃ断片のヒンジ領域を標的としている。いくつかの実施形態において、抗体断片のヒンジ領域中に天然に存在する１つ以上のシステイン残基（複数可）は、ポリマーを結合するために使用される。別の実施形態において、１つ以上のシステイン残基（複数可）は、ポリマーの特定の結合部位（複数可）を提供するためにＦａｂ−Ｃ断片のヒンジ領域に操作されている。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は、ポリマーコンジュゲーションの１つの結合部位を提供するためにＣ’末端に１つのシステインを付加することによって改変される。別の実施形態において、本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は、ポリマーコンジュゲーションの２つの結合部位を提供するためにＣ’末端に４つのさらなる残基、Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号１６２）を付加することによって改変される。さらに別の実施形態において、本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は、ポリマーコンジュゲーションの１つの結合部位を提供するためにＣ’末端に４つのさらなる残基、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（例えば、配列番号１２１を参照のこと）を付加することによって改変される。
【０３２６】
ペグ化の度合い及び部位はまた、官能化されたＰＥＧ及びタンパク質の濃度ならびにｐＨのような反応条件を調節することによって操作され得る。ペグ化の所望の度合いに適している条件は、標準的なペグ化反応のパラメータを変動させることによって実験的に決定され得る。
【０３２７】
抗Ｄ因子抗体及び抗体変異体のペグ化は、任意の便宜的方法によって行われる。好適なペグ化条件は、ＷＯ２０１１／０６９１０４及びＷＯ０３／０２９４２０に記載されており、これらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２８】
３．特徴付け
ペグ化タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、ペプチドマッピング、液体クロマトグラフィー−質量分析法、及びインビトロ生物学的アッセイによって特徴付けすることができる。ｆａｂ化の度合いは、典型的には、まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示される。１０％  ＳＤＳ中のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、溶出緩衝液として１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１  ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中で実施される。どの残基がペグ化されているかを示すために、トリプシン及びＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ等のプロテアーゼを用いたペプチドマッピングを実施することができる。それ故に、ペグ化及び非ペグ化抗体の試料を、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ等のプロテアーゼで消化させ、得られたペプチドを、逆相ＨＰＬＣ等の技術によって分離することができる。生成されたペプチドのクロマトグラフィーパターンを、抗Ｄ因子ポリペプチドに対してこれまでに決定されたペプチドマップと比較することができる。
【０３２９】
次いで、各ピークをピーク中のコンジュゲートのサイズを証明するために質量分析法によって分析することができる。コンジュゲーションに使用されるＰＥＧ、及びピーク中のコンジュゲートのサイズに応じて、ＰＥＧにコンジュゲートされた抗体またはその変異体の数を推測することができる。ＰＥＧ基にコンジュゲートされた断片（複数可）は、通常、注入後にはＨＰＬＣカラムに保持されておらず、クロマトグラフから消失している。クロマトグラフからのそのような消失は、少なくとも１つのペグ化可能なアミノ酸残基を含んでいるに違いない特定の断片に対するペグ化を示している。ペグ化された抗Ｄ因子抗体及び抗体変異体は、Ｄ因子と相互作用する能力、及び当該技術分野で既知の方法を用いて他の生物学的活性についてさらにアッセイすることができる。
【０３３０】
ペグ化は、抗体薬物の物理的及び化学的特性を変化させ、改善された安定性、免疫原性の低減、循環寿命の延長、ならびに眼の滞留時間の増加のような改善された薬物動態挙動をもたらし得る。
【０３３１】
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、対応するコンジュゲートされていない抗Ｄ因子抗体または抗体変異体と比較して、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼（例えばヒト）中への投与後、半減期の増加を有する。いくつかの実施形態において、半減期の増加は、対応するコンジュゲートされていない抗Ｄ因子抗体または抗体変異体の半減期の少なくとも１．４倍、または少なくとも１．８倍、または少なくとも２倍である。
【０３３２】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、延長期間にわたって安定しており、生理学的条件で、Ｄ因子の結合能力を１カ月当たり２０％未満、１５％未満、または１０％未満喪失する。
【０３３３】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、狭口径針を通す投与に適している粘度を有する。いくつかの実施形態において、コンジュゲートの粘度は、１５０〜２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で８００ｃＰ未満、７００ｃＰ未満、６００ｃＰ未満、５００ｃＰ未満、４００ｃＰ未満、または３００ｃＰ未満である。いくつかの実施形態において、コンジュゲートの粘度は、２００ｍｇ／ｍｌの濃度で３００ｃＰ未満である。
【０３３４】
いくつかの実施形態において、ＲＨは、３〜３０ｎＭの範囲に及ぶ。
【０３３５】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗Ｄ因子抗体はいずれも、生物学的試料中のＤ因子の存在の検出に有用である。本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、定量または定性検出を包含する。「生物学的試料」は、例えば、細胞または組織を含む。
【０３３６】
いくつかの実施形態において、診断または検出方法に使用するための抗Ｄ因子抗体が提供される。さらなる態様において、生物学的試料中のＤ因子の存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、生物学的試料と、本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体とを、Ｄ因子に抗Ｄ因子抗体が結合することを許容する条件下で接触させることと、複合体が、生物学的試料中で、抗Ｄ因子抗体とＤ因子との間で形成されるかどうかを検出することと、を含む。かかる方法は、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、Ｄ因子が患者の選択のためのバイオマーカーである場合、抗Ｄ因子抗体は、抗Ｄ因子抗体での療法に適格な対象を選択するために使用される。さらなる実施形態において、生物学的試料は、細胞または組織である。
【０３３７】
さらなる実施形態において、診断または検出方法は、基質に固定化された第１の抗Ｄ因子抗体を、Ｄ因子の存在について試験されるべき生物学的試料と接触させることと、その基質を第２の抗Ｄ因子抗体に曝露することと、その第２の抗Ｄ因子抗体が、生物学的試料中で、第１の抗Ｄ因子抗体とＤ因子との間の複合体に結合されるかどうかを検出することとを含む。基質は、任意の支持培地、例えば、ガラス、金属、セラミック、ポリマービーズ、スライド、チップ、及び他の基質であってもよい。ある特定の実施形態において、生物学的試料は、細胞または組織を含む。ある特定の実施形態において、第１または第２の抗Ｄ因子抗体は、本明細書に記載される抗体のいずれかである。
【０３３８】
ある特定の実施形態において、標識された抗Ｄ因子抗体が提供される。標識としては、直接検出される標識または部分（蛍光標識、発色団標識、電子密度の高い標識、化学発光標識、及び放射性標識等）、ならびに間接的に、例えば、酵素反応または分子相互作用により検出される酵素またはリガンド等の部分が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセイン等のフルオロフォア及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環式オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ＨＲＰ等の、染料前駆体を酸化するために過酸化水素を利用する酵素と結合したもの、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識物質、バクテリオファージ標識物質、安定フリーラジカル等が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、標識は、陽電子放出体である。陽電子放出体としては、６８Ｇａ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、８６Ｙ、７６Ｂｒ、８９Ｚｒ、及び１２４Ｉが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、陽電子放出体は、８９Ｚｒである。
【０３３９】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体またはコンジュゲートの薬学的製剤は、所望の純度を有する抗体またはコンジュゲートを、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体と混合することによって（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、一般的に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、これには、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／または非イオン性界面活性、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。いくつかの実施形態において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０３４０】
例示的な凍結乾燥抗体またはコンジュゲート製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体またはコンジュゲート製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０３４１】
本明細書における製剤はまた、必要に応じて、治療されている特定の適応症に対する１つを超える活性成分を含有してもよい。いくつかの実施形態において、活性成分は、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する。
【０３４２】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に封入され得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０３４３】
徐放性調製物が調製され得る。持続放出調製物の好適な例としては、抗体またはコンジュゲートを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）等の分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーが１００日間にわたる分子の放出を可能にする一方で、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化された抗体は、長期間にわたって体内に残存する場合、それらは、３７℃の水分への曝露の結果として変性または凝集し、生物学的活性の損失、及び免疫原性の変化の可能性をもたらし得る。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略が講じられ得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、及び特的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
【０３４４】
インビボ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成され得る。
【０３４５】
眼疾患または症状の予防または治療のための本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、典型的には、眼、眼内、及び／または硝子体内注射、及び／または強膜近傍注射、及び／またはテノン嚢下注射、及び／または上脈絡叢（ｓｕｐｅｒｃｈｏｒｏｉｄａｌ）注射、及び／または点眼剤及び／または軟膏の形態での局所投与によって投与される。本発明のかかる化合物は、様々な方法、例えば、Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ  ２００６）のような参照文献に記載されているものを含む、化合物の硝子体液中への遅い放出を可能にするデバイス及び／またはデポーとして硝子体内に送達され得る。一例において、デバイスは、ミニポンプ及び／またはマトリックス及び／または受動拡散システム及び／または長い時間の間、化合物を放出するカプセル化細胞（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ  ２００６）の形態であり得る。局所、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、及び病巣内投与を含むが、これらに限定されない、他の投与方法もまた、使用されてもよい。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。
【０３４６】
眼、眼内、または硝子体内投与のための製剤は、当該技術分野で既知の方法によって、既知の成分を使用して調製することができる。効果的な治療のための主たる必要条件は、眼を通る適切な透過である。薬剤が局所的に送達され得る眼球の前面の疾患と異なり、網膜疾患は、より部位特異的なアプローチを必要とする。点眼剤及び軟膏は、眼底まで浸透することは滅多になく、血液眼関門が全身投与された薬物の眼組織中への浸透を妨害する。したがって、通常、ＡＭＤやＣＮＶ等の網膜疾患を治療するための薬物送達の最適な方法は、直接の硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常、患者の症状、及び送達される薬物の特性及び半減期に依存する間隔で繰り返される。眼内（例えば硝子体内）浸透のためには、通常、より小さいサイズの分子が好ましい。
【０３４７】
眼への投与のために、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、薬学的に許容される担体中で、ｐＨ５．５で製剤化され得る。
【０３４８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、移植可能ポート送達系（ＰＤＳ）を用いて送達のために製剤化され得る。上述のように、ＰＤＳは、硝子体への放出がチタンフリットを含む多孔性金属膜によって制御される再充填可能なデバイスである。そのリザーバーは低容量であるので、いくつかの実施形態において、高タンパク質濃度が、そのＰＤＳを用いる効果的な送達に必要である。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、高濃度で製剤化される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１９０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２１０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２３０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２４０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２６０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２７０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２８０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２９０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも３００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、１５０ｍｇ／ｍｌ〜３５０ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ、または１７０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ、または２００ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化され得る。
【０３４９】
ＡＭＤまたはＣＮＶ等の補体関連の眼の症状の治療の有効性は、眼内疾患を評価するのに一般的に使用される様々なエンドポイントによって測定することができる。例えば、視力喪失を評価することができる。視力喪失は、限定しないが、例えば、ベースラインから所望の時点までの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の平均変化を測定することによって（例えば、ＢＣＶＡが糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）に基づく場合、視力チャート及び４メートルの検査距離での判定）、ベースラインと比較して所望の時点で１５文字より少ない視力を失う患者の割合を測定することによって、ベースラインと比較して所望の時点で１５文字以上を獲得する患者の割合を測定することによって、所望の時点で２０／２０００もしくはそれより悪いスネレン等価視力を持つ患者の割合を測定することによって、ＮＥＩ視覚機能質問票を測定することによって、所望の時点でのＣＮＶのサイズ及びＣＮＶの漏出量を、例えば、蛍光眼底血管造影法によって測定すること等によって、評価することができる。例えば、眼の検査に実施、眼内圧の測定、視力評価、スリットランプ圧の測定、眼内炎症の評価等を、例えば、含むが、これらに限定されない、眼球評価を行うことができる。
【０３５０】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体またはそのコンジュゲートは、１眼当たりの約０．３ｍｇ〜約３０ｍｇの用量で硝子体内投与される。
【０３５１】
投与のための投与スケジュールは、疾患の種類、疾患の重症度、及び治療剤に対する対象の感受性を含む、多くの臨床因子に応じて、月１回から毎日まで異なり得る。
【０３５２】
Ｇ．治療法及び組成物
本明細書に提供される抗Ｄ因子抗体またはコンジュゲートのいずれも、方法、例えば、治療方法において使用され得る。
【０３５３】
本明細書において実施形態のいずれかによる「個体」、「患者」、または「対象」は、ヒトであり得る。
【０３５４】
本開示の抗Ｄ因子抗体及びコンジュゲートは、哺乳動物を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体またはコンジュゲートは、例えば、前臨床データを得るために、非ヒト哺乳動物に投与される。治療される例示的な非ヒト哺乳動物には、前臨床試験が行われる、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類、及び他の哺乳類動物が含まれる。そのような哺乳類動物は、抗体で治療される疾患の確立された動物モデルであり得、または目的の抗体の毒性を試験するために使用され得る。これらの実施形態の各々において、用量増加試験は、哺乳類動物に対して実施してもよい。
【０３５５】
抗Ｄ因子抗体またはコンジュゲートは、非経口、皮下、腹腔内、硝子体内、肺内、及び経鼻投与を含む任意の好適な手段（局所免疫抑制治療が所望される場合、病巣内投与）によって投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、硝子体内、または皮下投与が含まれる。加えて、コンジュゲートは、パルス注入によって、特に抗体またはその抗体変異体またはその断片（例えば、抗原結合断片）の用量を低下させながら好適に投与される。いくつかの実施形態において、投薬は、投与が短時間であるか慢性的であるかに部分的に応じて、静脈内または皮下注射等の注射によって行われる。
【０３５６】
疾患の予防または治療のため、抗Ｄ因子抗体またはコンジュゲートの適切な投与量は、治療される疾患の種類、その疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、これまでの治療法、患者の臨床歴及び抗体への反応、ならびに主治医の判断に応じて異なる。
【０３５７】
疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によって、または連続注入によって、約１〜２５ｍｇ／眼（１眼当たり０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜０．３６ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者への投与のための初回候補投薬量である。数日間またはそれ以上にわたる反復投与については、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が継続される。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、従来の技法及びアッセイによって容易に監視される。例示の投薬レジメンは、ＷＯ９４／０４１８８において開示されている。
【０３５８】
コンジュゲート組成物は、良好な医療行為と一致する様式で、製剤化され、投薬され、及び投与され得る。この文脈において考慮する要因には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、及び医師に既知である他の要因が含まれる。投与されるコンジュゲートの「治療上有効量」は、このような考慮によって決定され、疾患または障害を予防、改善、または治療するために必要な最小の量である。コンジュゲートは、必ずしもそうである必要はないが、任意に、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する、抗体またはその抗体変異体またはその断片（例えば、抗原結合断片）の量、障害または治療の種類、及び上記で考察される他の因子に応じて異なる。これらは、概して、それまでに使用されたのと同じ投与量及び投与経路で、またはそれまでに用いられた投与量の約１〜９９％で使用される。
【０３５９】
これらの抗体を含むそれらの標的及びコンジュゲートとしてＤ因子を認識する本明細書に開示される抗体は、補体媒介性障害を治療するために使用され得る。これらの障害は、過度のまたは制御されていない補体活性化と関連する。それらは、心肺バイパス手術中の補体活性化；急性心筋梗塞、動脈瘤、卒中、出血性ショック、圧挫外傷、多臓器不全、循環血液量減少性ショック、及び腸虚血後の虚血再灌流のための補体活性化を含む。これらの障害はまた、炎症性症状、例えば、重度の熱傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人性呼吸促迫症候群、血液透析、アナフィラキシーショック、重度の喘息、血管性浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、レンサ球菌感染後糸球体腎炎、及び膵炎等である疾患または症状も含まれ得る。障害は、薬物の副作用、薬物アレルギー、ＩＬ−２誘導性血管漏出症候群、またはＸ線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。それはまた、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病、及び多発性硬化症のような自己免疫疾患も含む。補体活性化はまた、移植片拒絶とも関連する。近年、補体活性化と、眼疾患、例えば、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、及び他の虚血関連網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生との間に強い相関関係が示されている。
【０３６０】
コンジュゲートの抗Ｄ因子抗体は、単独で、または少なくとも第２の治療化合物と組み合わせて投与することができる。コンジュゲート及び任意の第２の治療化合物の投与は、同時に、例えば単一の組成物として、または２つ以上の異なる組成物として、同じまたは異なる投与経路を使用して行うことができる。代替的に、または追加的に、投与は、順次、任意の順序で行うことができる。ある特定の実施形態において、分単位から日単位、週単位、月単位に及ぶ間隔が、２つ以上の組成物の投与間に存在し得る。例えば、Ｄ因子拮抗薬を含むコンジュゲートがまず投与され、続いて第２の治療化合物が投与されてもよい。しかしながら、同時投与、またはコンジュゲートの前の第２の治療化合物の投与もまた企図される。いくつかの実施形態において、第２の治療化合物は、ＨＴＲＡ１拮抗薬、ＡＮＧ２拮抗薬（例えば、ＵＳ２００９／０３０４６９４Ａ１に開示される、抗ＡＮＧ２抗体等）、ＴＩＥ２拮抗薬（例えば、米国特許第６，３７６，６５３号に開示される抗ＴＩＥ２抗体等）、ＶＥＧＦ拮抗薬（例えば、２０１５年２月２６日に発行された米国特許第６，８８４，８７９号、及びＷＯ９８／４５３３１（ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体）に開示されるＶＥＧＦ拮抗薬等；ＷＯ２００５／０１２３５９及びＷＯ２００５／０４４８５３（Ｇ６またはＢ２０シリーズ抗体（例えば、Ｇ６−３１，Ｂ２０−４．１）；ＷＯ９８／４５３３１（ラナビズマブ）、ならびに第２の補体成分拮抗薬から選択される。いくつかの実施形態において、ＨＴＲＡ１拮抗薬は、抗ＨＴＲＡ１抗体である。いくつかの実施形態において、ＡＮＧ２拮抗薬は、抗ＡＮＧ２抗体である。いくつかの実施形態において、ＴＩＥ２拮抗薬は、抗ＴＩＥ２抗体である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ拮抗薬は、ＶＥＧＦトラップ（アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）等）及び抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）等）またはラナビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）））から選択される。いくつかの実施形態において、第２の補体成分拮抗薬は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９補体成分から選択される、古典的または代替補体経路（補体阻害剤）の様々なメンバーを阻害する。
【０３６１】
いくつかの実施形態において、補体媒介性障害に罹患しているヒト対象における補体媒介性障害のための本開示の治療は、対象に、有効量の治療化合物、例えば、コンジュゲートの抗Ｄ因子抗体を投与することを含み、対象に、有効量の第２の治療化合物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の治療化合物は、ＨＴＲＡ１拮抗薬である。いくつかの実施形態において、第２の治療化合物は、ＡＮＧ２拮抗薬である。いくつかの実施形態において、第２の治療化合物は、ＴＩＥ２拮抗薬である。いくつかの実施形態において、第２の治療化合物は、ＶＥＧＦ拮抗薬である。いくつかの実施形態において、第２の治療化合物は、第２の補体成分拮抗薬である。いくつかの実施形態において、補体媒介性障害は、補体関連の眼の症状である。いくつかの実施形態において、眼の障害は、非滲出性（例えば、中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出性（例えば、湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））ＡＭＤ、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎、及びブドウ膜炎を含む、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）である。一例において、補体関連の眼の症状は、中期乾燥型ＡＭＤである。いくつかの実施形態において、補体関連の眼の症状は、地図状萎縮である。いくつかの実施形態において、補体関連の眼の症状は、湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【０３６２】
本明細書における併用投与には、別個の製剤または単一の薬学的製剤を使用する共投与と、いずれかの順序における連続投与とが含まれ、概して、両方（または全て）の活性剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間が存在する。
【０３６３】
さらなる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供される抗Ｄ因子抗体またはコンジュゲートのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗Ｄ因子抗体またはコンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む。別の実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗Ｄ因子抗体またはコンジュゲートと、少なくとも１つのさらなる治療剤と、を含む。
【０３６４】
上記製剤または治療方法のうちのいずれも、本発明のコンジュゲート及び／または抗Ｄ因子抗体のいずれかまたはその両方を使用して行われ得ることが理解される。
【０３６５】
Ｈ．製品
本明細書における治療方法に有用な、本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体を含有する、製品または「キット」が提供される。いくつかの実施形態において、このキットは、抗Ｄ因子抗体を含む容器を含む。このキットは、容器上の、または容器と関連したラベルまたは添付文書をさらに含んでもよい。「添付文書」という用語は、かかる治療薬の適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌症についての情報、及び／またはその使用に関する警告を含む、治療薬の商用のパッケージに通例含まれる説明書を指すように使用される。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスター包装等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の多様な材料から形成されてもよい。容器は、本明細書において治療方法で用いるのに有効な本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体またはその製剤を保持してもよく、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。ラベルまたは添付文書は、組成物が本明細書に記載されて特許請求される治療方法で使用されることを表示する。製品は、薬学的に許容される緩衝剤、例えば、注入用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０３６６】
本キットは、本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体の投与のための指示書をさらに備えてもよい。いくつかの実施形態において、ラベルまたは添付文書は、組成物が、眼の障害、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む、例えば、以前に列挙された症状のうちのいずれかのような補体関連の障害を治療するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、抗体組成物を患者に投与するための説明書をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、キットが、抗Ｄ因子抗体を含む第１の組成物及び第２の薬学的製剤を含む場合、キットは、第１及び第２の薬学的組成物を、それを必要とする患者に同時に、順次に、または別個に投与するための指示書をさらに含んでもよい。
【０３６７】
いくつかの実施形態によれば、キットは、本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体、及び薬学的に許容される緩衝剤、例えば、注入用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０３６８】
いくつかの実施形態において、キットは、移植可能ポート送達系（ＰＤＳ）、及び本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体またはコンジュゲートを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＰＤＳを移植し、抗体またはコンジュゲートを入れるリザーバーを充填させるための指示書を含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＰＤＳを詰め替えるために製剤化された抗Ｄ因子抗体またはコンジュゲートを含む組成物を含む。
【０３６９】
別の実施形態において、様々な目的に、例えば、補体関連の障害の治療、予防、及び／または診断のために、補体関連の溶血アッセイのために、細胞からのＤ因子ポリペプチドの精製もしくは免疫沈降のために有用なキットもまた、提供される。Ｄ因子ポリペプチドの単離及び精製のために、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合した抗Ｄ因子抗体を含み得る。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいてＤ因子ポリペプチドをインビトロで検出及び定量化するために抗体を含むキットが、提供され得る。製品と同様に、キットは、容器とその容器上の、またはその容器に添えられたラベルまたは添付文書を含む。その容器は、少なくとも１つの抗因子抗体を含む本開示のコンジュゲートを含む組成物を保持する。例えば、希釈剤及び緩衝液、対照抗体を含む追加の容器が含まれてもよい。そのラベルまたは添付文書は、その組成物の説明ならびに意図されているインビトロまたは検出用途についての指示書を提供してもよい。そのラベルまたは添付文書は、対象への投与（例えば、抗体またはその抗体断片（例えば抗原結合断片）についての指示書を提供してもよい。
【実施例】
【０３７０】
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述の概要を得ると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０３７１】
実施例１：抗Ｄ因子ヒト化抗体の作製
Ｄ因子上の非活性部位への結合を介してＤ因子及び代替補体経路を強力に阻害するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ断片であるランパリズマブ（「野生型ａＦＤ」または「ＦＣＦＤ４５１５Ｓ」とも称される場合がある）が、現在、進行型乾燥型ＡＭＤである地図状萎縮（ＧＡ）の治療のために臨床開発されている。ランパリズマブは、２１４残基の軽鎖（配列番号１０２）及び２２３残基の重鎖（配列番号１０３）を含む。
【０３７２】
ＧＡにおける第ＩＩ相ヒト治験は、治療効果が野生型ａＦＤの毎月の硝子体内注射により得られることが示されているが、さらに良好な有効性を達成するためにより高い薬物用量を使用する動機が存在する。一方、より低い投与頻度は、改善された利便性を患者にもたらし、感染率の低下と臨床的有効性の増加という潜在的な利益を有し得、低進行型乾燥型ＡＭＤ患者の治療を促進し得る。
【０３７３】
より低い粘度を有し、かつ沈殿することなく保存され得る、高濃度で製剤化され得るＤ因子阻害剤を開発するために、新規のヒト化抗Ｄ因子抗体は、抗Ｄ因子マウス抗体２０Ｄ１２に基づいて開発された。ＰＣＴ公開第２００８／１４７８８３Ａ１号を参照のこと。簡潔に言えば、マウス２０Ｄ１２からのＶＬ及びＶＨドメイン（配列番号８のＶＨ及び配列番号７のＶＬ）を、ヒトＶＬカッパＩ（ＶＬＫＩ）及びヒトＶＨサブグループＩ（ＶＨＩ）コンセンサス配列とアライメントさせた。マウス２０Ｄ１２抗体からの超可変領域（ＨＶＲ）は、以下に論じられるように、ＣＤＲ移植した変異体を作製するために、ＶＬＫＩ及びＶＨＩ受容体フレームワークに操作された。
【０３７４】
２０Ｄ１２  ＶＬドメインから、２４〜３４位（Ｌ１）、５０〜５６位（Ｌ２）、及び８９〜９７位（Ｌ３）を、ＶＬＫＩに移植した。２０Ｄ１２  ＶＨドメインから、３１〜３５位（Ｈ１）、５０〜６５位（Ｈ２）、及び９５〜１０２位（Ｈ３）を、ＶＨＩに移植した。ＨＶＲ定義は、それらの配列超可変性（Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．＆  Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（１９７０））、それらの構造的位置（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．＆  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（１９８７））、及び抗原−抗体接触におけるそれらの関与（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））によって定義される。ＶＬにおける３６位及び４６位、ならびにＶＨにおける６７位、６９位、及び７１位を含む、ある特定のバーニア位置を突然変異して、マウス配列に戻した。図１Ａ〜Ｃ及び２Ａ〜Ｃを参照のこと。
【０３７５】
抗体２０Ｄ１２、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１（図１Ａ〜Ｃ及び２Ａ〜Ｃ；配列番号２９のＶＨ、配列番号２８のＶＬ）の初期ヒト化されたバージョンの可変ドメインをコードする合成遺伝子を生成し、完全長ＩｇＧとして発現のためにベクターにクローン化した。抗体を、ＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、上述のように精製した（Ｋｅｌｌｅｙ  ＆  Ｍｅｎｇ（２０１２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９０１：２７７−９３）。ヒトＤ因子への結合親和性は、マウス２０Ｄ１２（捕捉キット＃ＢＲ−１００８−３８）及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１  ＩｇＧ（捕捉キット＃ＢＲ−１００８−３９）における抗Ｆｃ捕捉を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定によって決定された。下表３に示されるように、マウス２０Ｄ１２及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１は、ヒトＤ因子に対する比較親和性を有する。
【０３７６】
抗体は、以下のように、溶血アッセイにおいてＤ因子阻害についてもアッセイされた。ウサギ赤血球（Ｅｒ）を用いたＡＰ溶血アッセイは、上述されている（Ｐａｎｇｂｕｒｎ（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６２：６３９、Ｋａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：１０４７３）。Ｅｒ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ血清）を、０．５％のウシ皮膚ゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ）で３回洗浄し、再懸濁した。抗Ｄ因子抗体の希釈を、２倍濃度で調製し、９６ウェルポリプロピレンプレートに添加した。Ｅｒ懸濁液を、ＧＶＢ／０．１Ｍ  ＥＧＴＡ／０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２と混合し、プレートに添加した。補体活性化が、古典的な経路を介したいかなる補体活性化（ＣｏｍｐＴｅｃｈ；ＧＶＢ中で１：３に希釈）も回避するように、Ｃ１ｑ−欠乏ヒト活性の添加から開始した。室温で３０分間インキュベートした後、ＧＶＢ中で１０ｍＭのＥＤＴＡを添加することによって反応を停止した。プレートを遠心分離し、上清を移した。上清の吸収度を、４１２ｎｍで読み込んだ。半最大阻害（ＩＣ５０）を生じるＡＦＤ．Ａｂ濃度は、非線形回帰分析によって決定された。その分析の結果を、表３に示す。
表３：ＩｇＧフォーマット（ｆｏｒｍａｔｅｅｄ）のマウス及びヒト化２０Ｄ１２におけるヒトＤ因子結合動力学的データ
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【０３７７】
表３に示されるように、ヒト化抗体ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１の親和性は、親マウス抗体の親和性に相当する。Ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１もまた、溶血アッセイにおけるＤ因子に対して阻害活性を保持した。
【０３７８】
実施例２：ｈｕ２０Ｄ１２  Ｆａｂ断片の生成及び特徴付け
ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１のＦａｂ断片をコードする遺伝子の部分は、上述のものと同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにサブクローン化した（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３）。小規模な発現及び精製のために、ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ株６４Ｂ４に形質転換した。単一のコロニーを、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン（ｍｅｄｉａ  ｐｒｅｐコードＡ３２３２）を含有する５ｍＬのＬＢ培地（ｍｅｄｉａ  ｐｒｅｐコードＡ２００８）に選択され、インキュベーター中で、３７℃にて２００ＲＰＭで振とうしながら、１４ｍＬの培養チューブ中で一晩成長させた。これらの培地を使用して、１Ｌのバッフル付き振盪フラスコ中で、２５０ｍＬの完全大豆ｃｒａｐ培地（ｍｅｄｉａ  ｐｒｅｐコードＡ４５６４）、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを植え付けた。培養物を、２００ＲＰＭで振とうしながら、３０℃で一晩成長させ、遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを、ＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて溶解し、Ｆａｂを、Ｇｒａｖｉｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製し、続いて、プロトコルは製造業者によって供給された。Ｆａｂの大規模生産のために、形質転換細胞の１０Ｌの発酵からの細胞ペーストを、抽出緩衝液中に懸濁し、マイクロフルダイザーを用いて均質化した。Ｆａｂを、カッパ選択の免疫親和性クロマトグラフィーによって捕捉し、低ｐＨ緩衝液で溶出した。溶出物を、１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）で直ちに中和し、緩衝液を、Ａｍｉｃｏｎセントリコン濾過デバイス（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳに交換した。このプールを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて、さらに精製した。この溶液は、酢酸を添加することによってｐＨを６．５に調節し、硫酸アンモニウムを２．５Ｍの最終濃度になるまで添加することによってＨＩＣのために調製した。ＨＩＣは、２５ｍＭのＮａＰＯ４、２．５Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ６．５）で平衡化している３ｍＬのＰｒｏＰａｃ  ＨＩＣ−１０カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にあった。２５ｍＭのＮａＰＯ４、２５％イソプロピルアルコール（ｐＨ６．５）溶出緩衝液を用いた２ステップの勾配を用いて、結合タンパク質を溶出した。画分を、無傷Ｆａｂ液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）を用いて分析して、ピーク同定を決定した。Ｆａｂタンパク質を含有する画分は、ＰＢＳに交換された緩衝液であった。
【０３７９】
実施例３：ｈｕ２０Ｄ１２の安定性及び分子的評価
長期作用送達系で見出され得る条件でｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１の曝露を刺激するために、ＰＢＳ中の１００ｍｇ／ｍＬで抗体Ｆａｂは、３７℃で４週間加圧された。ＰＢＳは、ヒト硝子体のｐＨ及びイオン強度の模倣体として使用された。Ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１は、この応力条件に対する凝集に対して、モノマーの０．６％のみ喪失する良好な耐性を示し、Ａｓｎ−５４（ＣＤＲ−Ｈ２）の脱アミドは、トリプシンペプチドマッピングを使用することによって示された。
【０３８０】
上述のように、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１は、ＨＶＲ−Ｈ２においてＮＧ脱アミド部位を含む。したがって、ＨＶＲ−Ｈ２におけるＮ５４は、Ｓ（Ｎ５４Ｓ）またはＱ（Ｎ５４Ｑ）に対して突然変異して、ＮＧ脱アミド部位を除去した。点突然変異を、キットで供給されたプロトコルに従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ）変異誘発キットを用いて部位特異的突然変異誘発法によって導入した。必要とされるコドン変化を特定するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。設計された変化を有するプラスミドを特定し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。変異体Ｆａｂは、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１において上述のようにＥ．ｃｏｌｉに発現させ、精製した。図１Ａ〜Ｃ及び２Ａ〜Ｃにおいて、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１（配列番号２９のＶＨ、配列番号２８のＶＬ）は、Ｎ５４突然変異を有さないＣＤＲ移植した抗体を示し、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０は、Ｎ５４Ｓ突然変異を有するＣＤＲ移植した抗体（配列番号３３のＶＨ、配列番号３２のＶＬ）を示し、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１．１は、Ｎ５４Ｑ突然変異を有するＣＤＲ移植した抗体（配列番号３１のＶＨ、配列番号３０のＶＬ）を示す。Ｄ因子に対する２つの変異体Ｆａｂ及び親ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１  Ｆａｂの結合親和性（ＫＤ）は、本明細書に記載される抗ｈｕＦａｂ捕捉プロトコルを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定によって評価された（例えば、実施例５を参照のこと）。Ｆａｂはまた、溶血アッセイにおいてＤ因子阻害についてもアッセイされた。表４は、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１のＮ５４Ｓ及びＮ５４Ｑ変異体の親和性ならびに溶血アッセイにおける各抗体のＩＣ５０を示す。
表４：ヒトＤ因子のためのＦａｂフォーマットの抗体の相対的結合親和性
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【０３８１】
表４に示されるように、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０）のＮ５４Ｓ変異体は、Ｄ因子に対する比較親和性を有した。Ｎ５４Ｓ及びＮ５４Ｑ変異体もまた、溶血アッセイにおけるＤ因子に対して阻害活性を保持した。Ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０は、さらなる分析及び親和性改善に対して選択された。
【０３８２】
分子的評価（ＭＡ）は、さらなる開発のために抗体の適合性を決定するために、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０において行われた。これらの実験では、分子は、３７℃または４０℃でインキュベーションを含む加速安定性試験において試験される。化学安定性は、ペプチドマッピングを用いて評価され、ＳＥＣは、凝集への感受性を決定するために使用され、いくつかの条件には、抗体結合のＳＰＲ測定は、活性の保持を評価するために使用される。これらの試験は、分子が、標準的な製造、製剤、または送達の方法への任意の難題をもたらすかどうかを示す。表５は、応力試験の結果を示す。
表５：ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０の応力試験
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【０３８３】
ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１と同様に、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０は、ＰＢＳ中の１００ｍｇ／ｍＬで、３７℃で４週間応力する場合に凝集しなかった。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１とは異なり、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０は、この応力条件下で脱アミド部位を示さず、Ｎ５４Ｓ置換が脱アミドをなくし、変異体が生理学的ｐＨ及びイオン強度でより高い安定性を有し得ることを示唆した。Ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０はまた、眼薬に適しているｐＨ５．５の製剤中に良好な安定性を示した。
【０３８４】
実施例４：ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０：Ｄ因子複合体の構造決定
どのようにｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０がヒトＤ因子と結合するのかをより良好に理解するために、Ｄ因子と複合したｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０  Ｆａｂの構造が決定された。ヒトＤ因子タンパク質及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０  Ｆａｂを、１：１のモル比で混合し、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）及び１５０ｍＭのＮａＣｌと前平衡されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上に精製した。複合体を含むピーク画分をプールし、３２ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、結晶化試験において使用した。結晶は、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．５）及び１Ｍのクエン酸ナトリウムを含有するリザーバー溶液とタンパク質を２：１（ｖ／ｖ）で混合することによって蒸気核酸方法を用いて、４℃で成長させた。結晶は、２０％のエチレングリコールを含有する人工的な母液中で凍結保護され、液体窒素中で急速冷凍された。２．９Åデータセットを、ＡＬＳ  ５．０．２で収集し、分子置換法によって解かれた。これまでに解かれた別の抗Ｄ因子Ｆａｂ：Ｄ因子複合体との比較（Ｋａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７，１２８８６）を、図３Ａ〜Ｃの重ね合わせで示す。これらの２つの抗体が異なるＣＤＲ配列を有するが、それらは、Ｄ因子上のほぼ同じエピトープに結合する。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０（「ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ１．Ｎ５４Ｓ」）を含む前Ｄ因子抗体（ランパリズマブ）のアラインメントを図４に示す。
【０３８５】
実施例５：より高い親和性抗Ｄ因子ヒト化抗体変異体の設計
ファージディスプレイ等の従来のスクリーニング方法によってｐＭ親和性を有する抗体の親和性の改善は、典型的には、非常に困難である。それ故に、記載される結晶構造を用いて、２０Ｄ１２のＤ因子への結合の構造系分析は、親和性を改善するために突然変異され得る特異的アミノ酸残基を特定するために使用された。
【０３８６】
ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０とＤ因子との間でのある特定の接触は、潜在的に準最適であるように特定され、これらの残基は、対応するランパリズマブのアミノ酸の突然変異のために選択され、抗原に対するより高い親和性を提供し得る。ｆＤ：ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０複合体構造の試験は、Ａｓｐ−１７３の側鎖がｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０と接触しているが、ｆＤ  Ａｓｐは、抗体Ｆａｂとの塩橋または完全水素結合を作製しない。図３Ｃを参照のこと。ＡｒｇまたはＬｙｓ等の抗体上で陽性に荷電した残基の導入は、Ａｓｐのためのイオン対の必要条件を満たし得る。このような相互作用を構築するのにほぼ十分であるように思われるｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０上の位置は、軽鎖のＦＲ２内の４９位である。この位置は、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０中のＴｙｒであり、そのため、この位置でのＬｙｓまたはＡｒｇ置換がｆＤ結合親和性を増加し得るかどうかを試験した。加えて、ランパリズマブは、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０（１０ｐＭ未満対３９ｐＭ、図１１を参照のこと）よりもより高い親和性でｆＤと結合し、界面内の主要接触での異なる残基を有する。例えば、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０  ＣＤＲ−Ｈ２残基Ｇｌｕ−５０、Ｔｈｒ−５３、Ｇｌｙ５６は、ランパリズマブにおいてＴｒｐ−５０、Ｔｙｒ−５３、及びＧｌｕ−５６である。図３Ｂを参照のこと。ランパリズマブ重鎖の５０位でのトリプトファン（Ｗ）は、Ｄ因子で疎水性相互作用を形成し得るが、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０は、その位置でグルタミン酸（Ｅ）を有する。ランパリズマブ重鎖の５３位でのチロシンはまた、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０中のその位置でスレオニン（Ｔ）よりもＤ因子に隣接する残基と共により良好に収容され得る。軽鎖内で、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０におけるＣＤＲ−Ｌ２  Ｔｙｒ−５５及びＣＤＲ−Ｌ３−Ａｓｎ９２は、ランパリズマブにおいてＣＤＲ−Ｌ２  Ａｒｇ−５５及びＣＤＲ−Ｌ３−Ａｓｐ９２である。これらの残基のそれぞれが、Ｄ因子：ランパリズマブ複合体構造においてＤ因子に接触すると見られ、ＣＤＲ−Ｌ−Ａｓｐ９２がＤ因子のＬｙｓ２２３ａと荷電相互作用する。Ｌｙｓ２２３ａ番号付けについては、Ｋａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）を参照のこと。
【０３８７】
これらの観察等に基づいて、さらなる２０Ｄ１２変異体が設計された。２０Ｄ１２変異体の軽鎖及び重鎖配列を、それぞれ、図１Ａ〜Ｃ及び２Ａ〜Ｃに示す。変異体は、ｆＤへの結合における効果について試験した。突然変異は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｆａｂ発現プラスミドに導入され、変異体Ｆａｂは、上述のように発現させ、精製した。
【０３８８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定によるＤ因子結合親和性
固定化ｈｕ２０Ｄ１２バージョンへのＤ因子についての動力学的及び結合定数ＫＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定によって決定した。抗体Ｆａｂ断片を、製造業者によって記載されるプロトコルに従って、抗ｈｕＦａｂ捕捉キット（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号２８−９５８３−２５）を用いてシリーズＳ  ＣＭ５センサ上に固定化した。結合動力学を、２倍単位で０．３９ｎＭ〜２５ｎＭの濃度で変化させた、６０μＬのアリコートのヒトＤ因子の溶液の注射後に記録されたセンサグラムから計算した。この流量は、３０μＬ／分であり、泳動用緩衝液は、ＨＢＳ−Ｐ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ−１００６−７１）であり、分析温度は、２５℃であり、リアルタイム参照セル減算が用いられ、Ｄ因子の注射後に１０分間解離した。高親和性及び遅いオフ速度を有するいくつかの変異体については、解離速度のより正確な測定値を得るために、解離を２時間モニタリングした。センサグラムの減算が、泳動用緩衝液の注射に対して観察された後、動力学的及び親和性定数を抽出するために、ＢｉａＥｖａｌソフトウェアｖ４．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、１：１のモデルに従って、データを分析した。
【０３８９】
軽鎖残基Ｔｙｒ−４９のＡｒｇ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１）への置換は、ｆＤへの結合において、４倍以上の改善をもたらす。図１１を参照のこと。親和性の増加は、解離においてより遅いオフ速度の結果である。Ｔｙｒ−４９のＳｅｒ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．６）、Ｌｙｓ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．７）、またはＧｌｎ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．８）への置換は、ｆＤに対する親和性を増加させない。ＣＤＲ−Ｈ２  Ｇｌｕ−５０のＴｒｐ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．９）への置換、またはＣＤＲ−Ｌ２  Ｔｙｒ−５５のＬｙｓ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１０）もしくはＡｒｇ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１１）への置換は、ｆＤに対する親和性の大幅な減少をもたらす。ＣＤＲ−Ｌ２  Ｇｌｙ−５６のＡｓｐ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．２）もしくはＧｌｕ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．４）への、またはＴｈｒ−５３のＴｙｒ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．５）への個々の置換は、親和性の増加をもたらすとは思われないが、変異体におけるＹ４９Ｒを用いたこれらの変化の組み合わせ（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１２、ｖ２．１４、ｖ２．１５、ｖ２．３）は、親和性をさらに増加すると思われる。ｈｕ２０Ｄ１２の配列とランパリズマブとの比較は、ＣＤＲ−Ｌ２上のＴｙｒ−５５の置換が、ｆＤ  Ａｓｐ−１７３との予測された相互作用により、親和性の増加を有する変異体をもたらし得ることを示す。しかしながら、結晶構造は、Ｔｙｒ−４９のＡｒｇとの置換（Ｙ４９Ｒ）が、親和性を増加させるためのより良好な選択であることを示す。個別に試験されていないが、ＣＤＲ−Ｌ３置換Ｎ９２Ｅは、結合親和性において好ましい増加を生じるために、変異体（ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１３）においてＹ４９Ｒと混合すると思われる。
【０３９０】
ｈｕ２０Ｄ１２変異体ｖ２．１、ｖ２．３、ｖ２．１２〜ｖ２．１５、またランパリズマブのヒトＤ因子（ｈＦＤ）に対するＤ因子の結合親和性は、現在のＳＰＲ技術における検出の限界（ＫＤ約１０ｐＭ）である。ｈｕ２０Ｄ１２変異体ｖ２．１、ｖ２．３、ｖ２．１４、及びｖ２．１５のいくつかは、最も高い親和性（ＫＤ＝１７ｐＭ）を有するｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１を有するカニクイザルＤ因子（ｃｙｆＤ）に結合する。加えて、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１のカニクイザルＤ因子への結合親和性は、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０と比較して約１０倍改善され、ランパリズマブと比較して約２倍改善した。カニクイザルは、しばしば、治療候補の前臨床安全性及び有効性評価において使用され、そのため、ｃＦＤへの高い結合親和性は、望ましい特性である。Ｆａｂは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって熱安定性について試験された。表６は、熱安定性分析の結果を示す。
表６：ＤＳＣによる融解温度
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【０３９１】
試験されたｈｕ２０Ｄ１２変異体の全てが、ランパリズマブの２つの変異体であるＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４について観察されたものよりも高い融点を有する高い熱安定性を示した。
【０３９２】
実施例６：Ｄ因子の阻害のためのｈｕ２０Ｄ１２変異体の有効性
Ｄ因子の阻害のためのｈｕ２０Ｄ１２変異体及びコンジュゲート化ｈｕ２０Ｄ１２  Ｆａｂ−Ｃバージョンの有効性が、Ｄ因子依存的なＢ因子の活性化の時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイにおいて決定された。ｈｕ２０Ｄ１２  Ｆａｂ、コンジュゲートされたｈｕ２０Ｄ１２  Ｆａｂ−Ｃバージョン、または対照の希釈を、４倍濃度で酵素反応緩衝液（ＥＲＢ；７５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．００５％  ポリソルベート２０、ｐＨ７．３）中で調製し、０．５ｎＭまたは０．２ｎＭのＤ因子（ｆＤ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ）またはＥＲＢ（酵素対照なし）と等体積で混合した。ラニビズマブ（抗ＶＥＧＦ）を、陰性対照として用いた。Ｄ因子／ＡＦＤ．Ａｂ混合物（７μｌ／ウェル）を、３６４ウェルＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ  Ｆ＋黒色プレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に添加し、続いて、７μｌ／ウェルの基質に添加した。基質は、７μｇ／ｍＬ（４０ｎＭ）のＣ３ｂ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び１μｇ／ｍＬ（１５ｎＭ）のＢ因子（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の混合物から成った。Ｆａｂまたはコンジュゲート化Ｆａｂ−Ｃバージョン、酵素、補因子、及び基質を、穏やかに撹拌しながら室温で４５分間インキュベートした。反応は、８ｎＭのビオチン化抗Ｂｂ因子（２Ｆ１２、ＧＮＥ  ＰＲＯ２８２９０９）、４ｎＭのユウロピウムコンジュゲート化抗Ｂａ因子（１Ｃ３のカスタムコンジュゲーション、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによるＧＮＥ  ＰＲＯ２８２９０８）、及び２５ｎＭのストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  ６４７から成る、７μｌ／ウェルの検出試薬カクテル混合物で停止させた。プレートを室温にて３０分間暗室中でインキュベートした。時間分解蛍光エネルギー移動は、３３７ｎｍでの励起、６２０ｎｍでユウロピウム発光及び６６５ｎｍでＡｌｅｘａ蛍光によって、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ；Ｃａｒｙ，ＮＣ）で検出された。半最大阻害（ＩＣ５０）を生じるＡＦＤ．Ａｂ濃度は、４パラメータフィットモデル（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ相乗効果ソフトウェア；Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いて非線形回帰分析によって決定された。
【０３９３】
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイの阻害曲線を、図５Ａ、図５Ｂ（及び表７）、及び図１１（このアッセイにおける条件は、５０ｐＭのＤ因子、１５ｎＭのＢ因子（ｆＢ）、及び４０ｎＭのＣ３ｂ因子であった）に示す。ランパリズマブは、２４ｐＭのＤ因子依存的なｆＢの活性化の阻害のためのＩＣ５０を有し、ＩＣ５０における標準誤差は、±２５％である（図５Ｂ（表７）及び図１１）。アッセイの感度は、５０ｐＭより低いＤ因子濃度での試験を除外する。それ故に、Ｄ因子の５０％が阻害される濃度と同等であり、阻害剤及びＤ因子の相互作用が１：１であると仮定すれば、測定することができる最も低いＩＣ５０は、２５ｐＭである。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０のＩＣ５０は、ランパリズマブに対して測定されたものよりも約２倍高い。図５Ｂ（表７）及び図１１を参照のこと。試験された変異体の全て（ｖ２．１、２．１４、２．１５、２．３）が、ランパリズマブに対して測定された値と同じ、またはそれに近いＩＣ５０値を有するｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０と比較して、有効性が増加した。図５Ａ、５Ｂ（表７）、及び図１１を参照のこと。
表７：ＩＣ５０
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【０３９４】
実施例７：親和性成熟ｈｕ２０Ｄ１２の安定性及び分子的評価
分子的評価は、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３において行われた。非標準的技法を必要とする問題は、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１においては特定されなかった。対照的に、ランパリズマブは、製剤及び長期作用送達においていくつかのリスクを有する（表８中のランパリズマブにおける応力試験の結果）。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１に対する粘度の濃度依存性が決定され、このＦａｂが眼製剤のために用いられた緩衝液中の低い粘度を有し、高濃度製剤に適していることを示した。Ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０は、試験された少なくとも同じ高さの２９２ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＰＢＳ中で溶解し、一方、ランパリズマブは、２２７ｍｇ／ｍｌで沈殿を示す。図６Ａ及び６Ｂを参照のこと。加えて、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．０溶液は、４℃で２７週間後に沈殿の痕跡がなく、透明のままであった。これは、改善された有効性を有するより低い投与頻度に有用であるＦａｂの高濃度製剤が、ランパリズマブよりも２０Ｄ１２のヒト化変異体においてより容易に得られることを示す。表８は、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の応力試験の結果を示す。
表８：ランパリズマブの応力試験
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表９：ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の応力試験
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【０３９５】
長期作用送達系におけるｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１  Ｆａｂによって経験され得る症状を模擬実験するために、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１  Ｆａｂの高濃度試料を、以下の２つの製剤条件下、３７℃で１カ月間保持した：（１）約２００ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、及び（２）約１７０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩、ｐＨ５．５。ＰＢＳは、ヒト硝子体液のｐＨ及びイオン強度を模倣するために選択された。ヒスチジン塩酸塩は、液体眼科学的治療薬用の代表的な製剤として選択された。製剤濃度（１７０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ）は、抗Ｄ因子の長期作用送達のための臨床的に関連する投与製剤に反映するように選択された。分子安定性は、化学安定性についてはイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）及び凝集傾向についてはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して評価された。抗原結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定は、活性保持を評価するために使用された。
【０３９６】
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２００ｍｇ／ｍＬでまたは２０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ５．５）中の１７０ｍｇ／ｍＬで製剤化されたＨｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１を、０．２２μｍのＳｔｅｒｉＦｌｉｐユニット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて滅菌濾過し、アリコートし（１００μＬ）、３７℃で０、２、または４週間インキュベートした。インキュベーションの完了時に、試料を、スクロース含有製剤緩衝液中で希釈し、−２０℃で冷凍した。解凍後、試料を、以下に記載されるように、ＩＥＣ、ＳＥＣ、及びＳＰＲによって分析した。
【０３９７】
イオン交換クロマトグラフィーによる化学安定性評価。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の化学安定性は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）を用いてモニタリングした。ＩＥＣを、直列ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣにおいて行った。解凍したタンパク質試料を、ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬに希釈させることによってＩＥＣのために調製した。カラム上に注射する前に、試料を、２〜８℃で保持して、安定性を維持した。２０μｇのタンパク質注射の分離を、４０℃でＰｒｏＰａｃ  ＳＡＸ−１０  ２ｘ２５０ｍｍカラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて行った。溶媒Ａは、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．２）であり、溶媒Ｂは、溶媒Ａ中の２５０ｍＭの塩化ナトリウムであった。ＰＢＳ緩衝液ブランクを、ＵＶシグナルへの緩衝液の貢献の減算のために含んだ。化学的分解の分離のために使用された塩勾配を、表１０に示す。
表１０．ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１におけるイオン交換クロマトグラフィー勾配
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【０３９８】
データは、タンパク質に起因する全てのクロマトグラムピークを統合するために、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ６．８ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて処理された。ピーク面積の割合を、等式１を用いて計算し、酸性変異体、主ピーク、及び塩基性変異体と称される、目的の全てのピークについて報告した。酸性または塩基性変異体におけるピークが検出されなかった場合、ピーク面積の割合は、ゼロとして報告された。
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【０３９９】
ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の３７℃での高濃度安定性試料についてのＩＥＣの結果を、表１１Ａ〜Ｂに報告する。
表１１Ａ．イオン交換クロマトグラフィーによるｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の３７℃での高濃度安定性試料（ＰＢＳ）の化学安定性
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表１１Ｂ．イオン交換クロマトグラフィーによるｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の３７℃での高濃度安定性試料（Ｈｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ５．５）の化学安定性
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【０４００】
サイズ排除クロマトグラフィーによる分子サイズ分布評価。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の分子サイズ分布は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてモニタリングした。ＳＥＣを、直列ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣにおいて行った。解凍したタンパク質試料を、ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬに希釈させることによってＳＥＣのために調製した。カラム上に注射する前に、試料を、２〜８℃で保持して、安定性を維持した。１００μｇのタンパク質注射の分離を、周囲温度でＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、部品番号０８５４１）を用いて行った。移動相は、０．２０Ｍのリン酸カリウム、０．２５Ｍの塩化カリウム（ｐＨ  ６．２±０．１）から成った。ＵＶ試料シグナルを、２８０ｎｍでモニタリングした。ＰＢＳ緩衝液ブランクを、ＵＶシグナルへの緩衝液の貢献の減算のために含んだ。
【０４０１】
データは、タンパク質に起因する全てのクロマトグラムピークを統合するために、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ６．８ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて処理された。ピーク面積の割合を、上の等式１を用いて計算し、高分子量種（ＨＭＷＳ）、主ピーク（モノマー）、及び低分子量種（ＬＭＷＳ）と称される、目的の全てのピークについて報告した。ＨＭＷＳまたはＬＭＷＳにおけるピークが検出されなかった場合、ピーク面積の割合は、ゼロとして報告された。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の３７℃での高濃度安定性試料についてのＳＥＣの結果を、表１２Ａ〜Ｂに報告する。
表１２Ａ．サイズ排除クロマトグラフィーによるｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の３７℃での高濃度安定性試料（ＰＢＳ）の分子サイズ分布
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表１２Ｂ．サイズ排除クロマトグラフィーによるｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の３７℃での高濃度安定性試料（Ｈｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ５．５）の分子サイズ分布
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【０４０２】
表面プラズモン共鳴測定によるＤ因子結合親和性。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定は、応力ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１試料の結合能力を決定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行われた。シリーズＳカルボキシメチル化デキストラン（ＣＭ５）センサチップを、製造業者によって説明されるプロトコルに従ってアミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてヒトＤ因子（標的ＲＵ約３，０００）を固定化することによって調製した。非応力ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の標準溶液を、２倍希釈で１０６．５ｎＭ〜３．３１ｎＭのＨＢＳ−Ｐ＋泳動用緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で調製し、１０μＬ／分で１８０秒間注射して、標準曲線を作成した。応力試料を、ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液中で約４０ｎＭまで希釈し、１０μＬ／分で１８０秒間注射した。各注射後、センサチップ表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）を用いて、３０μＬ／分で３０秒間再生した。濃度分析を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００分析ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。この種の分析は、±１０％の標準誤差を有し、そのため、９０〜１１０％の結合能力を有する試料は、完全に活性であると見なされる。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の３７℃での高濃度安定性試料についてのＳＰＲ  Ｄ因子の結合能力の結果を、表１３Ａ〜Ｂに示す。
表１３Ａ．表面プラズモン共鳴測定によるｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の３７℃での高濃度安定性試料（ＰＢＳ）のＤ因子の結合能力
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表１３Ｂ．表面プラズモン共鳴測定によるｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１の３７℃での高濃度安定性試料（Ｈｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ５．５）のＤ因子の結合能力
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全体的に、これらの結果は、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１がＰＢＳ及び２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ５．５）中の高濃度製剤に適していることを示す。３７℃で少なくとも４週間の熱応力において、初期試料と比較して、ＳＥＣ及びＩＥＣの両方によって主ピークのわずかに遅い喪失率があり、Ｄ因子の結合のごくわずかな減少がある。
【０４０３】
実施例８：ｈｕ２０Ｄ１２変異体のポリマーコンジュゲーション
硝子体の半減期は、抗体Ｆａｂの流体力学的半径を増加させることによって延長させ得る。Ｆａｂの流体力学的半径は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーの共有結合によって増加し得る。この改変においては、生物学的活性におけるコンジュゲーションの影響を最小限に抑えるために、抗原結合領域から除去された部位で、部位特異的様式で行われることは有益であり得る。改変のために遊離システイン残基の使用は、この目的のために望ましい。単一または複数の遊離システインは、単一または複数の部位の結合を可能にするために使用することができる。重鎖のＣ末端で単一のシステインは、改変のためにＦａｂに含まれた。抗体のＦａｂ−Ｃバージョンは、Ｃｙｓ−２２６（ＥＵ番号付け）を含むように、１つの残基によってＦａｂ重鎖を延長することによって作製された。ＩｇＧ１分子において、Ｃｙｓ−２２６は、ヒンジの第１の鎖内重鎖ジスルフィド結合を形成する。オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ（配列番号１１９）及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃ（配列番号１２４）のＦａｂ−Ｃバージョンのための遺伝子構築体を生成するために上述のように行った。同様の突然変異誘発の手順は、さらなるＦａｂ−Ｃ構築体、例えば、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃにおいては配列番号７１、１１８〜１２２、及び１４０〜１４６、ならびにｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃにおいては配列番号７５、１２３、１２５〜１２７、及び１４７〜１５３を作製するために使用することができる。
【０４０４】
ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１（「ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ」）及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３（「ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃ」）のＦａｂ−Ｃバージョンは、Ｅ．ｃｏｌｉに発現させ、実質的には以下のように精製した。Ｆａｂ−Ｃ変異体は、Ｇａｍｍａ  Ｐｌｕｓ樹脂を用いて捕捉し、５カラム体積において６．５ｍＭのＧＳＨ（ｐＨ８．５）で洗浄し、ｃ末端システインを非ブロック化し、Ｆａｂ−Ｃの二量体の形成を崩壊させ、続いて、０．１Ｍの酢酸（ｐＨ２．９）に溶出した。Ｆａｂ−Ｃモノマーを、ＳＰセファロース高性能強陽イオン性交換樹脂を用いて２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中のＧＥからさらに単離し、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を用いて、内毒素を１９時間除去した。溶出を、２０カラム体積にわたって０〜２０％２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）＋１ＭのＮａＣｌの勾配を用いて行った。Ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃまたはｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃを、約５ｍｇ／ｍＬの濃度で、２５ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＥＤＴＡ中のＰＥＧ八量体にコンジュゲートした。Ｆａｂ−Ｃは、Ｆａｂ−Ｃ二量化によるシステイン反応性の喪失を最小限に抑えるために、さらに濃縮されなかった。室温に平衡化した後、ＪｅｎＫｅｍからの４０Ｋ  ＴＰ  ＰＥＧ粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度まで２５ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．０）に再懸濁した。ｐＨは、ｐＨ６以下に維持して、マレイミド開環を回避した。一旦ＰＥＧを可溶化してから、それを、０．１１２５：１のＰＥＧ対Ｆａｂ−Ｃのモル比でＦａｂ−Ｃプールに添加した。次いで、混合物を、穏やかに一晩撹拌しながら室温で放置した。翌日、コンジュゲーション効率を、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって確認した。コンジュゲーション後、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔを、２０ｍＭのＨｉｓ−アセテート（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ（アイソクラチック勾配）中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製し、続いて、ＳＰセファロース高性能強陽イオン性交換樹脂を用いてＧＥから陽イオン性交換（ＣＥＸ）をし、８つのＦａｂ／ＰＥＧに濃縮した。ＣＥＸステップは、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中で実施され、５０ＣＶにわたって１０〜２０％１Ｍ  ＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。ＣＥＸクロマトグラム（図８Ａ）、及びＳ３００プール中のＦａｂ分布（図８Ｂ）の一例を示す。異なる画分のためのデータを図８Ｃに示す。
【０４０５】
全てのプロセスのために、Ｆａｂ／ＰＥＧの比は、アイソクラチック条件下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて、０．８ｍＬ／分で実施される３００×８ｍｍ  Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定された。モル質量を、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるインライン静的な多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＳ）を用いて決定した。コンジュゲートしたｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔのために典型的なＳＥＣ−ＭＡＬＳプロファイルを、図７Ａに示す。光子相関分光法は、９９．０°での検出のために単一の光子計数モジュールである準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を用いて、また、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって、流体力学半径（ＲＨ）を決定するために使用した。図７Ｂを参照のこと。生データを、モル質量及びＲＨ定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定された、Ｗｙａｔｔ特許Ａｓｔｒａソフトウェアを用いて分析した。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−ＯｃｔにおけるＲＨ値は、１０．３ｎｍである。図７Ｃを参照のこと。
【０４０６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）はまた、抗Ｄ因子コンジュゲートのサイズ変異体分布を決定するためにも使用される。抗Ｄ因子コンジュゲート（３００μｇ）の溶液を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液を用いて２ｍｇ／ｍｌになるまで希釈する。分析のために、ＵＶ検出を２８０ｎｍで勾配流を可能にするＨＰＬＣ系を使用する。クロマトグラフィーカラムは、Ｔｏｓｏｈ  Ｇ４０００  ＳＷｘｌ（８μｍ、４５０Å、７．８ｍｍＩＤ×３０ｃｍ）であり、０．５ｍｌ／分で操作される。移動相で希釈した５０マイクロリットルの２ｍｇ／ｍｌの抗Ｄ分子を、ＨＰＬＣ系に注入する。カラム温度は、周囲温度であり、オートサンプラーは、２〜８℃であり、移動相は、アイソクラチックモードである。安定したベースラインが得られるまで、カラムは平衡化し、一致したクロマトグラフィープロファイルが、最低２つの連続注入で観察されるまで、参照材料が注入される。このサイズ変異体に基づいたアッセイは、コンジュゲートされていないＦａｂ形態を、コンジュゲート及び凝集形態から分離することができる（図２０）。
【０４０７】
ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの両方は、八量体−ＰＥＧへのコンジュゲーション後に、ＴＲ−ＦＲＥＴ阻害アッセイにおける完全活性を保持した。図５Ａを参照のこと。部位特異的なコンジュゲーションは、活性を保つと思われた。さらに、多重結合の骨格におけるＦａｂの配列は、阻害剤の潜在力に著しく影響を及ぼさない。
【０４０８】
製剤の粘度は、注入のための適合を決定するために重要なパラメータである。したがって、粘度測定は、ＰＥＧ化Ｆａｂ−Ｃのために行われた。粘度測定は、１０００ｓ−１の剪断速度を用いて、２５℃のサーモスタットでＴＡ装置円錐平板レオメーターにおいて行われた。Ｆａｂの測定のために、タンパク質を、ｐＨ５．５の低塩緩衝液中で調製した。ＰＥＧ化Ｆａｂ−Ｃ材料における粘度測定は、２０ｍＭのＨｉｓ−アセテートの緩衝液、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．５）を用い、測定温度は、２０℃であった。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ（「ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ」）及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃ（「ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ」）の両方のＰＥＧ−八量体コンジュゲートは、低粘度及び粘度の濃度依存性を示し、これは高濃度製剤の注射に適している。図９Ａを参照のこと。対照的に、ランパリズマブの変異体である、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ（「ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ」）のＰＥＧ−八量体コンジュゲートは、より高い粘度及び粘度の濃度依存性を示し、これは高濃度製剤の注射に対してさらに難題をもたらす。図９Ａを参照のこと。粘度測定はまた、４０Ｋ−四量体−ＰＥＧ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＰＴＥ−４００  ＭＡ、表１５を参照のこと）にコンジュゲートしたＦａｂ−Ｃタンパク質においても行われた。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃ（「ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃ＋ＰＥＧ四量体」）のＰＥＧ四量体コンジュゲートは、低粘度及び粘度の濃度依存性を示し、これは高濃度製剤の注射に適している。図９Ｂを参照のこと。対照的に、ランパリズマブの変異体である、ＡＦＤ．ｖ８．Ｃ（「ＡＦＤ．ｖ８．Ｃ＋ＰＥＧ四量体」）のＰＥＧ−四量体コンジュゲートは、より高い粘度及び粘度の濃度依存性を示し、これは高濃度製剤の注射に対してさらに難題をもたらす。図９Ｂを参照のこと。
【０４０９】
粘度測定はまた、陽極酸化アルミ形状の２０ｍｍ直径、１°角度を有するＡＲ−Ｇ２新型レオメーター（部品番号５１３２０４．９０５）を用いてｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔにおいても行われた。測定は、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、０．０２％ポリソルベート−２０から成る緩衝液中の変化したタンパク質濃度の溶液において行われた。温度は、２５℃であり、剪断速度は、１０００ｓ−１であった。表１４に示されるように、この製剤化は、タンパク質濃度における粘度の依存性で非常に良好なプロファイルを有し、試験した最高Ｆａｂ濃度（２３５ｍｇ／ｍＬ）で、粘度は、わずかに２０３センチポアズ（ｃＰ）であった。
表１４．変化したタンパク質濃度で、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、０．０２％ポリソルベート−２０中に製剤化されたｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１−Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの粘度。
2022002521.tif 000058
【０４１０】
ＰＥＧの調製：ＰＥＧ粉末は、水を用いて１０ｍｇ／ｍＬになるまで再構成した。１０ｍＭのトリフルオロ酢酸ナトリウム溶液は、陽イオン化剤として使用された。５０％アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した、２０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス溶液が、用いられた。ＰＥＧ溶液、トリフルオロ酢酸ナトリウム、及び５０％アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸を、３：３：４の比で混合した。１マイクロリットルのＰＥＧ混合物を、ＭＡＬＤＩ標的プレート上に沈着させた。１マイクロリットルのマトリックスを、スポットに添加し、周囲温度で乾燥させた。分析を、５０００〜１０００００の範囲のｍ／ｚ及び５０００のレーザー出力を有する、線形モードにおいて、３５５ｎｍ、２００Ｈｚ  Ｎｄ：Ｙａｇレーザーで備えた４８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ装置（Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）において行われた。
【０４１１】
外部較正を、同様の試料条件下で、サイズが２０００〜４００００ダルトンの範囲に及ぶＰＥＧ標準物質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて行われた。質量の読み込みは、分解されないスペクトルにおいて最高点として報告され、１つを超えるピークが存在した場合、読み込みは、各ピークの頂点として報告された。ピークを、Ｄａｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェア（Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を用いて視覚化した。
【０４１２】
再構成したＰＥＧ溶液はまた、Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ  ＥＭＲ（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｍａｓｓ  Ｒａｎｇｅ）オービトラップ装置（ＥＭＲ，Ｔｈｅｒｍｏ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上のＮａｎｏｍａｔｅ（Ａｄｖｉｏｎ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）を介して直接注入によって分析された。７０％Ｈ２Ｏ：３０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した、１％（１０ｍｇ／１ｍｌ）１，８−ビス（テトラメチルグアニジノ）ナフタレン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液を、電荷還元試薬として使用した。１０ｕｌの１０ｍｇ／ｍＬ  ＰＥＧ溶液を、１０ｕｌ  １％１，８−ビス（テトラメチルグアニジノ）ナフタレンと混合し、以下の捕捉パラメータでＥＭＲに直接注入された：スプレーガス圧、１．０ｐｓｉ；１．５０ｋＶに印加するためのスプレー電圧；キャピラリー温度、３２５℃；ＳレンズＲＦレベル、１００；走査範囲、１０００〜２００００ｍ／ｚ；インソースフラグメンテーション、ＣＩＤ  ２００Ｅｖ、ＣＥ２００；解像度、１７５００；陽極性；マイクロスキャン、１０；ＡＧＣ  ｔａｒｇｅ、３ｅ６；最大射出時間、５０；ＡＧＣモード、固定；平均化、１００；電流源ＤＣオフセット、２５Ｖ；Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌａｔａｐｏｌｅ  ＤＣ、８Ｖ；Ｉｎｔｅｒ  Ｆｌａｔａｐｏｌｅレンズ、７Ｖ；Ｂｅｎｔ  Ｆｌａｔａｐｏｌｅ  ＤＣ、６Ｖ、Ｔｒａｎｓｆｅｒ多極ＤＣチューンオフセット、０Ｖ；Ｃ−Ｔｒａｐエントランスレンズチューンオフセット、０Ｖ；Ｔｒａｐｐｉｎｇガス圧設定、８。スペクトルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｘｃａｌｉｂｕｒ  Ｑｕａｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて視覚化し、手動で注釈を付けた。
【０４１３】
コアＰＥＧ構造及びコンジュゲートの数が試料タイプによって変化したＰＥＧ−Ｆａｂコンジュゲートは、線形モードにおいて、４８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦにおいて分析され得る。４マイクロリットルのＰＥＧ−Ｆａｂコンジュゲートを、４マイクロリットルのトリフルオロ酢酸ナトリウム、及び２マイクロリットルの５０％アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸と混合する。等体積のＰＥＧ−Ｆａｂ溶液及び２０ｍｇ／ｍＬのシナピン酸（５０％アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸中、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）マトリックスを、分析のために、ＭＡＬＤＩ標的プレート上に沈着させた。ｍ／ｚ範囲は、１０００００〜５０００００で設定し、標的質量を、４０００００に設定した。スペクトルを、Ｄａｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒを用いて視覚化し、手動で注釈を付けた。
【０４１４】
実施例９：ポリマーコンジュゲートの熱安定性
長期作用送達系で見出され得る条件でｈｕ２０Ｄ１２コンジュゲートの曝露を刺激するために、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃ  ＴＰコンジュゲート（上述のように調製された）の試料を、２つの異なるｐＨ及び塩条件下で３７℃で数週間加圧した。具体的には、コンジュゲートを以下の製剤において評価した：
製剤１：約２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ、
製剤２：約２５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．５）。
【０４１５】
ＰＢＳは、ヒト硝子体のｐＨ及びイオン強度の模倣体として使用された。ＰＢＳ中の２５ｍｇ／ｍＬまたは２０ｍＭのＨｉｓ−Ａｃ（ｐＨ６．５）、５０ｍＭのＮａＣｌで製剤化されたｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１またはｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．３コンジュゲートの溶液のアリコート（１００μＬ）を、０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心分離チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて遠心分離濾過によって滅菌濾過し、次いで、３７℃で０、２、４、または８週間インキュベートした。インキュベーションを、−７０℃で冷凍することによって終了した。解凍後、試料を、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ、ＣＥ−ＳＤＳ、及びＤ因子結合能力を評価するためにｂｉａｃｏｒｅ（下述のような方法）によって分析した。測定における標準誤差（±１０％）よりも結合能力の変化は、３７℃でのコンジュゲートのインキュベーションにおいて決定された。結合能力（ＳＰＲ）によって分析されるｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの熱安定性（３７℃）を示す、図１０Ａを参照のこと。斜交平行領域は、±１０％の標準誤差を示す。結合能力は、ＰＢＳ中の３７℃で４週間後、及びｐＨ６．５で４週間後でさえ一定に保たれた。ＣＥ−ＳＤＳによるｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートの分析は、両方の製剤中で良好な熱安定性（３７℃）を示した。図１０Ｂを参照のこと。わずかに約１％／週のコンジュゲートのピーク領域の喪失（％）が観察された。
【０４１６】
ａ．ＦＱ標識手順
試料を、以下の手順に従って標識した。ｈｕ２０Ｄ１２．２．１−Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ（３００μｇ）の溶液を、潜在的に競合する製剤構成物質を除去するために、ＮＡＰ−５ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム反応緩衝液中で交換した。２５０μＬのアリコートの脱塩コンジュゲートを、４％ＳＤＳに溶解した３０μＬの１５０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドと混合し、７０℃で５分間インキュベートして、変性条件下でジスルフィド入れ替えをした。１０マイクロリットルの各２．５ｍＭのＦＱ及び３０ｍＭのＫＣＮ試薬を、ＳＤＳ−ｈｕ２０Ｄ１２．２．１−Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ溶液に添加し、１％ＳＤＳで３倍希釈する前に、最終溶液を、５０℃で１０分間インキュベートし、反応を停止した。還元分析のために、希釈試料のアリコートを、５０ｍＭのＤＴＴで７０℃にて１０分間インキュベートした。
【０４１７】
ｂ．ＣＥ−ＳＤＳ分析
ＰＥＧ化Ｆａｂ試料の分離が、４０℃の熱制御されたカートリッジに入れられた５０μｍのＩＤ（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ，ＵＳＡ）の３１．２ｃｍ（２１ｃｍの有効長）の溶融シリカキャピラリーで行われた。完全自動化したＢｅｃｋｍａｎ  ＰＡ８００＋系（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、ＬＩＦ検出で装備し、３２  Ｋａｒａｔバージョン９．１を用いて、装置を制御した。ＬＩＦ検出器を、４８８ｎｍで励起を有する３．５ｍＷ  アルゴンイオンレーザーを使用し、発光は、６００±２０ｎｍのバンドパスフィルター（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を通して収集した。電圧を、陰性モード（逆極性）において適用した。試料溶液を、５ｋＶで２５秒間電気動力学的に導入し、１７ｋＶで分離した。泳動の間に、キャピラリーを、それぞれ、０．１ＭのＮａＯＨ、０．１ＭのＨＣｌ、及びＢｅｃｋｍａｎゲル緩衝液で５分間、１分間、１分間、及び１０分間洗浄した。例えば、Ｍｉｃｈｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７９：５９６３−７１、Ｍｉｃｈｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，３３：８１５−２６を参照のこと。ｈｕ２０Ｄ１２．２．１−Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの非還元試料の一例の電気泳動を図２１に示す。
【０４１８】
ｃ．表面プラズモン共鳴分析
シリーズＳ、ＣＭ５センサチップを、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にドックし、１Ｘ泳動緩衝液でプライムし、製造業者によって供給されるプロトコルに従って７０％グリセロールで正規化した。センサチップ表面を、提供された材料及び製造業者によって示唆されたプロトコルを有するアミンカップリングキットを用いて抗原のアミンカップリングにおいて活性化された。ヒトＤ因子（ｆＤ）を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を用いてｆＤ（ＰＵＲ＃２０４９１、２．４ｍｇ／ｍＬ）の希釈によって調製された１００μｇ／ｍＬの抗原を含有する溶液を注入することによって共有結合で固定化した。流量は、１０μＬ／分であり、７０μＬの注入体積を使用した。これにより、ｆＤにおいて約５０００共鳴ユニット（ＲＵ）の複数の実験にわたって典型的なカップリング密度を生じた。未反応アミンカップリング部位は、７０μＬの１Ｍ  エタノールアミンの注入によってブロックした。
【０４１９】
抗体Ｆａｂの抗原結合活性濃度は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００評価ソフトウェアの較正依存性の濃度分析を用いて決定した。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの標準曲線を、ストック溶液の重量希釈を通じて５μｇ／ｍＬになるまで調製し、続いて、連続２倍希釈して、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６、及び０．０７８μｇ／ｍＬの試料を生成した。試験試料を、約０．５、１．０、または１．５μｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得るために重量希釈によって調製した。全ての試料（２００μＬの体積）を、１Ｘ泳動緩衝液を用いて調製した。６０μＬのアリコートを、１０μＬ／分の流量を用いて特異的抗原表面にわたって注入し、センサチップを２５℃で維持し、１Ｘ泳動緩衝液でプライムした。特異的抗原に結合する抗体は、試料注入の終了に近づいたときにＳＰＲシグナルから決定した。結合抗体は、３０μＬの１０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）の注入を通じて各結合サイクルの終了時に溶出され、抗体−抗原複合体の解離を生じた。ｈｕ２０Ｄ１２．２．１−Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの標準曲線は、データを分析するために４つのパラメータ機能を用いて、ＳＰＲシグナルの抗体濃度への関係を決定するために使用された。標準曲線から計算されたパラメータは、観察されたＳＰＲシグナルに基づいて試験試料の抗原結合濃度を計算するために使用された。吸光速度によって決定されたタンパク質濃度に対するこの濃度の比は、画分またはパーセント結合を得る。
【０４２０】
実施例１０：ポリマーコンジュゲーションのためのさらなる抗Ｄ因子抗体変異体
上に論じられるように、抗Ｄ因子Ｆａｂの定常領域内の遊離システイン等は、コンジュゲーションを改善し、抗原への結合障害を最小限に抑えることができる。重鎖Ｆａｂ  Ｃ末端「ＣＤＫＴＨＴＣ」に加えて、Ｆａｂ断片の重鎖はまた、Ｆａｂ−Ｃ対照物のヒンジ領域から初めの４つの残基を添加することによって改変され、Ｃ末端「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ」を得てもよい。Ｃ末端「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＳ」、「ＣＤＫＴＨＴＳＰＰＣ」、「ＣＤＫＴＨ」、「ＣＤＫＴ」、「ＣＤＫ」、「ＣＤ」、「ＡＰＰＣ」、「ＳＧＧＣ」、または「ＣＹＧＰＰＣ」も、使用してもよい。いくつかの実施形態において、「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ」末端は、２つのＰＥＧ分子の結合を可能にする。得られるＦａｂは、多アーム型ＰＥＧとコンジュゲートされ得る。
【０４２１】
実施例１１：抗Ｄ因子抗体コンジュゲートの調製
重鎖Ｆａｂ末端「ＣＤＫＴＨＴＣ」、「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ」、「ＣＤＫＴＨＴＳＰＰＣ」、「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＳ」、「ＣＤＫＴＨ」、「ＣＤＫＴ」、「ＣＤＫ」、「ＣＤ」、「ＡＰＰＣ」、「ＳＧＧＣ」、または「ＣＹＧＰＰＣ」を有するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ変異体は、変動するコア構造を有する市販のマレイミド官能化多アーム型ＰＥＧとコンジュゲートされる。
【０４２２】
ａ．マレイミド官能化多アーム型ＰＥＧ
下表１５に詳述されるマレイミド官能化多アーム型ＰＥＧは、コンジュゲーション反応に使用される：
2022002521.tif 000059
2022002521.tif 000060
【０４２３】
８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）及びＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ（ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｃｏｒｐ．）を、ＭＡＬＤＩ用いて分析して、ＴＰコアまたはＨＧＥＯコアのいずれかを含有するＰＥＧ八量体の均一性を比較した。これらの結果を、図１２Ａ及び１２Ｂに示す。これらの図に示されるように、ＴＰコアを含有する８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬは、ＨＧＥＯコアを含有するＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡよりもより均一であった。
【０４２４】
ｂ．マレイミド官能化多アーム型ＰＥＧによるＦａｂのコンジュゲーション
システイン改変Ｆａｂは、Ｇａｍｍａ  Ｐｌｕｓ樹脂を用いて捕捉し、５カラム体積において６．５ｍＭのＧＳＨ（ｐＨ８．５）で洗浄し、Ｃ末端システインを非ブロック化し、Ｆａｂ−Ｃの二量体の形成を崩壊させ、続いて、０．１Ｍの酢酸（ｐＨ２．９）に溶出した。システイン改変Ｆａｂモノマーを、ＳＰセファロース高性能強陽イオン性交換樹脂を用いて２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中のＧＥからさらに単離し、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を用いて、内毒素を１９時間除去した。溶出を、２０カラム体積にわたって０〜２０％２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）＋１ＭのＮａＣｌの勾配を用いて行う。次いで、非ブロック化ｃ末端システインを有する単量体のＦａｂ−Ｃを、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を用いてｐＨ６．５になるまで滴定することによってＰＥＧ化のために調製する。次いで、Ｆａｂ−Ｃを、約５ｍｇ／ｍＬの濃度で、２５ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＥＤＴＡ中のＰＥＧ八量体にコンジュゲートする。Ｆａｂ−Ｃは、Ｆａｂ−Ｃ二量化によるシステイン反応性の喪失を最小限に抑えるために、さらに濃縮されない。室温に平衡化した後、ＪｅｎＫｅｍからの４０Ｋ  ＴＰ  ＰＥＧ粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度まで２５ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．０）に再懸濁する。ｐＨは、ｐＨ６以下に維持して、マレイミド開環を回避する。一旦ＰＥＧを可溶化してから、それを、０．１１２５：１のＰＥＧ対Ｆａｂ−Ｃのモル比でＦａｂ−Ｃプールに添加する。次いで、混合物を、穏やかに一晩撹拌しながら室温で放置する。翌日、コンジュゲーション効率を、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって確認する。
【０４２５】
実施例１２：コンジュゲートの例示的な精製及び特徴付け
実施例１０に調製されたコンジュゲートを、ＰＥＧ化を確認し、異なるＰＥＧコア構造におけるコンジュゲーション効率を決定するために、ＳＥＣ−ＭＡＬＳを用いて、精製し、分析する。コンジュゲーション効率は、アイソクラチック条件下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて、０．８ｍＬ／分で実施される３００×８ｍｍ  Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定される。モル質量を、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるインライン静的な多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＳ）を用いて決定する。光子相関分光法は、９９．０°での検出のために単一の光子計数モジュールである準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を用いて、また、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって、流体力学半径（ＲＨ）を決定するために使用した。生データを、モル質量及びＲＨ定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定される、Ｗｙａｔｔ特許Ａｓｔｒａソフトウェアを用いて分析する。
【０４２６】
ａ．Ｃｙｓ改変Ｆａｂ−８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬコンジュゲート（「Ｆａｂ  ＴＰコンジュゲート」）
コンジュゲートを、２０ｍＭのＨｉｓ−アセテート（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ（アイソクラチック勾配）中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製する。モル質量を、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＳｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ８０４（１３Ｃ）によるインライン静的な多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＳ）を用いて決定する。生データを、モル質量定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定された、Ｗｙａｔｔ特許Ａｓｔｒａソフトウェアを用いて分析する。モル質量は、各ＰＥＧに結合するＦａｂの平均数を推定するために使用される。Ｆａｂ化は、ＭＡＬＳ測定質量から４０ｇ／モル（ＰＥＧ八量体の平均質量）を減算し、次いで、システイン改変Ｆａｂの平均質量で除算することによって決定される。８つのＦａｂ＋４０Ｋ  ＰＥＧ八量体の理論上のモル質量は、４１６，０５６ｇ／モルである。例示的なデータを表１６に示す。
表１６
2022002521.tif 000061
ａｇｇ＝凝集体
【０４２７】
ＴＰコアを有する多アーム型ＰＥＧ八量体によるシステイン改変ＰＥＧ八量体のコンジュゲーションは、８つのＦａｂ／ＰＥＧを含むコンジュゲートを生成し、これは、良好なコンジュゲーションがＴＰコアを含むＰＥＧ八量体で達成することができることを示す。
【０４２８】
ｂ．Ｃｙｓ改変Ｆａｂ−８ＡＲＭ−ＰＥＧ−ＭＡＬコンジュゲート（「Ｆａｂ  ＨＧコンジュゲート」）
実施例１０において調製されたＣｙｓ改変Ｆａｂ−８ＡＲＭ−ＰＥＧ−ＭＡＬコンジュゲート（ＨＧコア構造（ＪｅｎＫｅｍ）を含み、以下、「Ｆａｂ  ＨＧコンジュゲート」）を、２０ｍＭのＨｉｓ−アセテート（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ（アイソクラチック勾配）中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上でＳＥＣを用いて精製する。画分を含むコンジュゲートをプールし、２０ｍＭのＨｉｓ−アセテート（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ（アイソクラチック勾配）中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上でＳＥＣを用いてさらに精製する。モル質量を、Ｔｏｓｏｈ  Ｇ３０００ＰＷカラム、及びＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるインライン静的なＭＡＬＳを用いて決定する。光子相関分光法は、９９°での検出による単一の光子計数モジュールである準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を用いて、また、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって、流体力学半径（ＲＨ）を決定するために使用される。生データを、モル質量及びＲＨ定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定される、Ｗｙａｔｔ特許Ａｓｔｒａソフトウェアを用いて分析する。モル質量は、各ＰＥＧに結合するＦａｂの数を推定するために使用される。例示的な結果を表１７に示す。
表１７
2022002521.tif 000062
ａｇｇ＝凝集体
ｎ／ｄ＝決定されず
【０４２９】
表１７に見られるように、ＨＧコアを含むＰＥＧ八量体によるＣｙｓ改変Ｆａｂのコンジュゲーションは、８つのＦａｂ／ＰＥＧを含むコンジュゲートを生成する。ＨＧコアによるコンジュゲーションはまた、ＴＰコアで観察されたよりも５〜７つのＦａｂ／ＰＥＧを含むさらなるコンジュゲートも生成した。
【０４３０】
Ｆａｂ化の推定及びＲＨ測定を改善するために、上で調製されたＨＧ最終プールは、代替的には、ＰＢＳ中の１０／３００  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム（ｐＨ７．４）上でＳＥＣ−ＭＡＬＳを用いて分析し、０．２５ｍＬ／分で実施され得る。モル質量及びＲＨを、上述のように決定する。例示的な実験において、８ＡＲＭ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（ＨＧコア）を用いて調製され、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ上で精製されたコンジュゲートは、１２．２ｎｍ（±４．５％）の平均ＲＨ、３４０．３ｋＤａ（±８．９％）の平均モル質量、及び６．４のＦａｂ／ＰＥＧの平均を有する。
【０４３１】
ｃ．Ｃｙｓ改変Ｆａｂ−ＨＧＥＯ−４００ＭＡコンジュゲート（「Ｆａｂ−ＨＧＥＯ１  コンジュゲート」）
実施例４において調製されたＣｙｓ改変Ｆａｂ−ＨＧＥＯ−４００ＭＡコンジュゲート（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ  ＰＥＧを含み、以下、「Ｆａｂ  ＨＧＥＯ１コンジュゲート」）を、２０ｍＭのＨｉｓ−アセテート（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ（アイソクラチック勾配）中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上でＳＥＣを用いて精製する。モル質量及びＲＨを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲを用いて決定し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２５ｍＬ／分で実施する。
【０４３２】
例示的な実験において、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ  ＰＥＧ（ＨＧＥＯコア）を用いて調製されたコンジュゲートは、１５．２ｎｍ（±４．５％）の平均ＲＨ、４２３．８ｋＤａ（±１０．６％）の平均モル質量、及び８．２のＦａｂ／ＰＥＧの平均を有する。
【０４３３】
ｄ．Ｃｙｓ改変Ｆａｂ−８ＡＲＭ（ＨＧＥＯ）−ＰＥＧ−ＭＡＬコンジュゲート（「Ｆａｂ  ＨＧＥＯ２コンジュゲート」）
上述のように調製されたＣｙｓ改変Ｆａｂ−８ＡＲＭ（ＨＧＥＯ）−ＰＥＧ−ＭＡＬコンジュゲート（ＨＧＥＯコア構造（ＪｅｎＫｅｍ）を含み、以下、「Ｆａｂ  ＨＧＥＯ２コンジュゲート」）を、２０ｍＭのＨｉｓ−アセテート（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ（アイソクラチック勾配）中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上でＳＥＣを用いて精製する。モル質量を、上述のように決定する。モル質量は、各ＰＥＧに結合するＦａｂの数を推定するために使用される。例示的な結果を表１８に記載する。
表１８
2022002521.tif 000063
【０４３４】
表１８に見られるように、ＨＧＥＯ２コアを含むＰＥＧ八量体によるＣｙｓ改変Ｆａｂのコンジュゲーションは、８つのＦａｂ／ＰＥＧを含むコンジュゲートを生成する。ＨＧＥＯ２コアによるコンジュゲーションはまた、ＴＰコアで観察されたよりも５〜６つのＦａｂ／ＰＥＧを含むさらなるコンジュゲートも生成する。
【０４３５】
実施例１３：コンジュゲートの濃縮
著しく製剤粘度を増加させることなく、硝子体内製剤中のＦａｂ濃度を増加させるための１つの方法は、製剤中の高度にｆａｂ化したコンジュゲートの割合を増加させることである。この例において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、高度にｆａｂ化したコンジュゲートを濃縮するために使用される。
【０４３６】
上述のようにＦａｂ  ＴＰコンジュゲートのＳＥＣ精製から推定されたｆａｂ化の８つのＦａｂ／ＰＥＧを含有する画分をプールし、例えば、ＳＰセファロース高性能強陽イオン交換樹脂を用いて、ＧＥから陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を用いて、１９時間洗浄し、内毒素を除去し、続いて、５０カラム体積（ＣＶ）にわたって１０〜２０％  １Ｍ  ＮａＣｌ間で勾配溶出する。モル質量を、上述のように決定する。例示的な結果を表１９に記載する。
表１９
2022002521.tif 000064
【０４３７】
コンジュゲートを含有する画分をプールし、アイソクラチック条件下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて、０．８ｍＬ／分で実施される３００×８ｍｍ  Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱを用いてさらに精製する。モル質量及びＲＨを、上述のように決定する。
【０４３８】
濃縮後、１０．５ｎｍ（±２．５％）の平均ＲＨ、４０７．１ｋＤａ（±０．２％）の平均モル質量、及び７．８のＦａｂ／ＰＥＧの平均を有する、８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ（ＴＰコア）を用いて調製されたコンジュゲートを得る。
【０４３９】
実施例１４：カニクイザルにおける全身性の代替補体経路活性の測定
ランパリズマブは、カニクイザルにおける全身性補体機能を一時的に阻害することがこれまでに示されている（Ｌｏｙｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２０１４，Ｖｏｌ．３５１，ｐｐ．５２７−５３７を参照のこと）。本例では、全身性の代替補体経路（ＡＰ）活性における抗Ｄ因子抗体変異体またはＡＦＤ．Ａｂコンジュゲートの硝子体内投与の効果は、カニクイザルにおいて評価された。
【０４４０】
ａ．カニクイザルにおける薬物動態学的／薬力学的試験
ＡＦＤ．Ａｂ変異体及びコンジュゲートを、分子の薬力学的（ＰＫ）及び薬力学的（ＰＤ）を評価するために、中国産雄カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）への単回投与または静脈内注入によって投与した。これらの試験は、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で行われた。全ての手順を、米国農務省動物福祉法規制（ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（９  ＣＦＲ  ３）、実験動物のケアと使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）、及び実験動物福祉局（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ）に従って行った。
【０４４１】
４つの試験を行った。第１の（対照）試験（試験１、ｎ＝１０）では、ランパリズマブを、１５分間隔で、２回の５０μＬのＩＶＴ用量で両眼に投与した。これらの動物に、合計２０ｍｇ／動物を１０ｍｇ／眼で施した。血液は、４５分、２、６、１０、２４、３４、４８、９６、１２０、１５４、１９２、２８８、及び３８４時間の時点で投与前（２日前）及び投与後に採血した。２４、４８、１２０、１９２、及び３８４時間で採血した後、１群当たり２匹の動物を、この試験から取り出し、眼マトリックスを収集するために殺処分した。ランパリズマブ対照試験は、Ｌｏｙｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２０１４，３５１：５２７−５３７においてこれまでに記載されている。
【０４４２】
試験２（ｎ＝３）では、ＡＦＤ．ｖ１４を、１５分間隔で、２回の５０μＬのＩＶＴ用量で両眼に投与した。これらの動物に、合計５０ｍｇ／動物を２５ｍｇ／眼で施した。血液は、３０分、２、８、２４、４８、及び９６時間の時点で投与前（１日前及び３日前）及び投与後に採血した。
【０４４３】
試験３（ｎ＝１０）では、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体を、１５分間隔で、２回の５０μＬのＩＶＴ用量で両眼に投与し、合計７．８ｍｇ／動物のＡＦＤ．ｖ１４を３．９ｍｇ／眼のＡＦＤ．ｖ１４で施した。血液は、１、６、２４、４８、７２、９６、１４４、１９２、２８８、及び４８０時間の時点で投与前（１週間前及び２週間前）及び投与後に採血した。各時点（２４、９６、１９２、２８８、及び４８０時間）で１群当たり２匹の動物を、この試験から取り出し、眼マトリックスを収集するために殺処分した。
【０４４４】
試験４では、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体を、１５分間隔で、２回の５０μＬのＩＶＴ用量で両眼に投与し、合計１４．２ｍｇ／動物または２３．６ｍｇ／動物のＡＦＤ．ｖ１４を７．１ｍｇ／眼のＡＦＤ．ｖ１４（ｎ＝２）または１１．８ｍｇ／眼のＡＦＤ．ｖ１４（ｎ＝１）のいずれかで施した。血液は、１、６、２４、９６、及び１６８時間の時点で投与前（７日前及び１日前）及び投与後に採血した。
【０４４５】
全ての試験においては、投与前及び投与後の血清試料は、ＰＫ及びＰＤ分析のために大腿静脈を介して各動物から収集した。各時点で、全血は、血清分離チューブに採血し、周囲温度で少なくとも２０分間凝血させて、２℃〜８℃の温度範囲で設定された冷凍遠心器で遠心分離した。血清は、遠心分離の２０分間以内に採取し、分析まで−６０℃〜−８０℃で保存した。
【０４４６】
ｂ．全てのＡＦＤ．ｖ１４／コンジュゲート分析
Ｇｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイは、カニクイザル血清におけるＡＦＤ．ｖ１４、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体、及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体を定量化するために使用した。試料を、試料緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１５ｐｐｍ  プロクリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．２５％ＣＨＡＰＳ、５０μｇ／ｍＬのｍｕＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ、カタログ番号ＳＬＭ６６）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））中で１：４〜１：３０００に希釈した。ＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４  ＴＰ及びＨＧコンジュゲートの標準曲線は、試料緩衝液中の２．０６〜１５００ｎｇ／ｍＬのＡＦＤ．ｖ１４、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体、またはＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体を連続希釈することによって調製した。捕捉及び検出試薬を、ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／０．０２％ＮａＮ３及びＡｌｅｘａ−抗ＣＤＲ（クローン２３４，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）中の１００μｇ／ｍＬのビオチン−コンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＨＣ＋ＬＣ、ベチル、カタログ番号Ａ８０−３１９Ｂ）ならびにＲｅｘｘｉｐ  Ｆ（Ｇｙｒｏｌａｂ）中の２５ｎＭで適用した。アッセイを、Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００  ＣＤにおいて実施し、洗浄ステップは、ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／０．０２％ＮａＮ３を使用し、続いて、Ｇｙｒｏｓ  ｐＨ１１洗浄緩衝液を使用した。装置を起動し、データは、１％ＰＭＴ設定で製造業者によって記載されるように分析した。ＡＦＤ．ｖ１４、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体、及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体の濃度は、その標準曲線の５パラメータフィットから決定された。最小限の定量化可能な濃度は、カニクイザル血清におけるＡＦＤ．ｖ１４、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体、及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体においては８．２４ｎｇ／ｍＬ（０．１６ｎＭ）であった。
【０４４７】
ｃ．カニクイザル血清中のＤ因子に対する薬力学的アッセイ
サンドイッチＥＬＩＳＡは、カニクイザル血清におけるＤ因子（ｆＤ）を定量化するために使用した。マウス抗ヒトＤ因子クローン４６７６（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、コーティング緩衝液（０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中で１μｇ／ｍＬになるまで希釈し、３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４６４７１８）上で４℃にて一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた２時間のインキュベーション中、ブロックした。この及び全てのその後のインキュベーションは、穏やかに撹拌しながら室温で行った。カニクイザルｆＤ標準曲線を、試料緩衝液（５００ｎｇ／ｍＬのＡＦＤ．ｖ１４治療薬及び５０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを補充したアッセイ緩衝液）中で０．０４〜５ｎｇ／ｍＬのｆＤを連続希釈することによって調製した。血清試料及び対照は、試料緩衝液中の最低限の１：１００になるまで希釈された。次いで、希釈した標準物質、対照、及び試料を、プレート上で２時間インキュベートし、プレート結合ｆＤ／ＡＦＤ．Ａｂ複合体を、ＡＦＤ．Ａｂ（クローン２４２、１μｇ／ｍＬ）に対してビオチン−コンジュゲート化マウス抗ＣＤＲ  ｍＡｂを用いて１時間検出し、続いて、高い感受性ＳＡ−ＨＲＰ（３ｎｇ／ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２１１３０）も１時間検出した。最終洗浄の後に、テトラメチルベンジジン（Ｍｏｓｓ、カタログ番号ＴＭＢＥ−１０００）を加え、１０〜１５分間発色させ、１Ｍリン酸を用いて反応を停止した。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを６２０ｎｍの参照と共に４５０ｎｍで読み取った。ｆＤの濃度は、標準曲線の４パラメータフィットから決定された。カニクイザル血清中の最低限の定量可能な濃度は、３．９ｎｇ／ｍＬ（０．１６ｎＭ）であった。
【０４４８】
ｄ．ＡＰ溶血アッセイ
ＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体がＡＰ活性を阻害する能力を、Ｐａｎｇｂｕｒｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８８，１６２：６３９−６５３）及びＫａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，２８４：１０４７３−１０４７９）によって設計され、説明されているように、（ヒトまたはサルのいずれかの）血清が、ウサギ赤血球と組み合わせられた、溶血アッセイにおいて評価した。補体活性化が古典的な補体経路（ＣＰ）を介して生じなかったことを確認するために、Ｃ１ｑ欠乏ヒト血清（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｙｌｅｒ，ＴＸ）を使用し、緩衝液は、ＣＰ活性に不可欠である陽イオンのキレートカルシウムにＥＧＴＡを含んだ。
【０４４９】
Ｃ１ｑ欠乏ヒト血清は、ＡＰを活性化するために使用した。１０％Ｃ１ｑ欠乏ヒト血清中に存在するｆＤの濃度は、血清（Ｂａｒｎｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８４，６７：３０３−３０９、Ｌｏｙｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２０１２，５３：６６２８−６６３７）中のこれまでに報告されたｆＤレベルに一致する値に合う９．６ｎＭであった。
【０４５０】
ｅ．ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体で処置したカニクイザル血清中の全身性ＡＰ活性の阻害の決定
全身性ＡＰ活性の任意の潜在的阻害、続いて、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体またはＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体の投与の時間的経過及び線量依存性を評価するために、プレートベースのＷＩＥＳＬＡＢ補体系ＡＰ  ＥＬＩＳＡまたはエクスビボアッセイが行われた。
【０４５１】
全身性ＡＰ活性の任意の潜在的阻害、続いて、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体またはＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体の投与の時間的経過及び線量依存性を評価するために、プレートベースのＷＩＥＳＬＡＢ補体系ＡＰ  ＥＬＩＳＡ（このアッセイからのデータを、図１３及び１４中において「ＡＰ補体活性（％）」と称される）または上述のインビトロＡＰ溶血アッセイと同様にエクスビボアッセイのいずれかが、行われた（このアッセイからのデータを、図１４中において「相対溶血（％）」と称される。しかしながら、このアッセイにおいては、血清試料に外因性ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体またはＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体の希釈曲線を添加する代わりに、試料はそれ自体、連続希釈し、溶血性活性のいかなる阻害もＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体またはＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体の注入投与に起因した。
【０４５２】
赤血球を調製し、以下の改変を有するＡＰ溶血アッセイにおいて、本明細書に記載されるように、アッセイが行われた。最大の溶解に対応する吸光度を決定するために、全溶解対照を、滅菌水（８０μｌ／ウェル）で調製し、一方、ＧＶＢを全ての他のウェル（５０μｌ）に添加した。カニクイザル血清試料を、６つの時点にわたって１：１．５に連続希釈し、９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレート（３０μｌ／ウェル）に陰性対照（緩衝液のみ）と共に添加した。全溶解対照は、最大（１００％）溶血を表した。データポイントは、三重に収集し、平均パーセントの最大溶血を、アッセイ中の最終血清希釈の逆数をプロット化した。５０％の最大溶血として定義される、５０％の最大溶血（ＡＨ５０）値を、４パラメータフィットモデルを用いて非線形回帰分析によって決定された。飽和に達しなかったような曲線においては、ＡＨ５０は、上側の漸近線を１００％で固定した、曲線フィットを用いて推定された。相対溶血の割合は、［（個々の時点における投与後のＡＨ５０）／（投与前のＡＨ５０）］×１００として各個々の時点において計算した。各個々の正常なカニクイザルからの血清におけるＡＨ５０値は、ＡＨ５０値の全平均よりも２倍高く変化し得る。したがって、各試験動物からの投与前及び投与後の試料を、ＡＰ活性の投与後の変化を個々の動物のベースラインの補体活性と直接比較することを確実にするために、同じアッセイプレート上で泳動させた。
【０４５３】
全ｆＤ及び治療活性と比較した相対溶血の割合を、図１３Ａ（ランパリズマブ、１０ｍｇ／眼）、１３Ｂ（ＡＦＤ．ｖ１４、２５ｍｇ／眼）、及び１４Ａ（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体、３．９ｍｇ／眼）に示す。ランパリズマブデータ（図３３Ａ）は、Ｌｏｙｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２０１４，３５１：５２７−５３７）に記載される、１０ｍｇ／眼のランパリズマブのＩＶＴ投与後に得られた比較データである。図１３Ｂに見られるように、２５ｍｇ／眼のＡＦＤ．ｖ１４の投与は、全身性ＡＰ活性を一時的に阻害し、ランパリズマブについてこれまでに観察された結果と同様に、活性が２４時間後の投与によってベースラインに戻った（図１３Ａ）。相対的に、全身性ＡＰ阻害は、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ八量体の３．９ｍｇ／眼の投与後に観察された（図１４Ａ）。いかなる特定の理論に拘束されることも望まないが、Ｆａｂ（例えば、ランパリズマブ及びＡＦＤ．ｖ１４）と比較したコンジュゲートで得られた眼からのより遅いクリアランスは、ｆＤがより早期の時点でＡＦＤ．Ａｂを飽和状態にすることを可能にし、全身性補体阻害を防ぐと考えられている。
【０４５４】
全ｆＤ及び全コンジュゲートと比較した相対溶血の割合を、図１４Ｂ（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体、７．１ｍｇ／眼）及び１４Ｃ（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体、１１．８ｍｇ／眼）に示す。これらの図から見られるように、ごくわずかな全身性補体阻害が、最大１１．８ｍｇ／眼のＩＶＴ投薬における、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ八量体に対して観察された。眼からのより遅いクリアランスにより、コンジュゲート濃度は、具体的には、１０時間よりも早い時点でｆＤのモル濃度より低いままである。これは、ＡＦＤ．Ａｂ  Ｆａｂの同様の眼に投与された濃度とは対照的であり、これにより、これらの早期時点で、モル濃度がｆＤのモル濃度を超え、全身性ＡＰ阻害をもたらす。
【０４５５】
２０Ｄ１２．ｖ２．１、２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ、２０Ｄ１２．ｖ２．３、及び２０Ｄ１２．ｖ２．３．ＣのＰＥＧ八量体は、コンジュゲートされていないバージョンの２０Ｄ１２．ｖ２．１、２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ、２０Ｄ１２．ｖ２．３、及び２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃと比較して、全身性補体阻害のレベルの低下を示すことによって、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧ−Ｏｃｔコンジュゲートと同様に挙動することが期待され得る。
【０４５６】
実施例１５：ＡＦＤ．Ａｂ変異体及びコンジュゲートにおけるカニクイザルＰＫ
ＡＦＤ．Ａｂ変異体またはコンジュゲートのインビボＰＫプロファイルを評価するための１つの方法が、カニクイザルにおいて行われた単回投与実験である。ＡＦＤ．ｖ１４＋ＴＰ−ＯｃｔコンジュゲートにおけるインビボＰＫ試験が、カニクイザルにおいて行われた。ＰＫパラメータを、単回投与実験から決定した。コンジュゲートされていない非改変ＡＦＤ．ｖ１４（ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ）を、対照として使用した。動物のケアは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの指針に従った。
【０４５７】
ａ．試験パラメータ
カニクイザル（２８匹の雄動物；投与時、２ｋｇ〜４ｋｇ、約２〜７歳）を、４つの投与群のうちの１つに割り当てた。群１（対照）の動物（４匹の動物）は、３０ゲージ針を通してＡＦＤ．ｖ１４の５ｍｇ／眼の両側の硝子体内投与（１０ｍｇ／動物）を受けた（１００μｌの投与体積）。群２及び３の動物（各群に１０匹の動物）は、それぞれ、３０ゲージ針を通してＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−ＯｃｔコンジュゲートのＦａｂ重量に基づいて、１または４ｍｇ／眼の両側の硝子体内投与（２または８ｍｇ／動物）を受けた（１００μｌの投与体積）。動物は、鎮静状態にし（１０ｍｇ／ｋｇのケタミンＨＣｌ、０．５ｍｇ／ｋｇのジアゼパム）、注入前にプロパラカインで局所処置した。次いで、ＡＦＤ．ｖ１４またはＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートを、縁よりも４ｍｍの後方に、針を水晶体よりも後方に、硝子体中央部に向けて、強膜及び扁平部を通して投与した。群４の動物（４匹の動物）は、０．４ｍｇ／動物で単回ＩＶボーラス（１ｍＬ）のＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートを受けた。ＩＶ投与のために、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートを、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、１０％トレハロース、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ５．０）として製剤化した。
【０４５８】
眼組織は、全ての群から収集した。投与後に以下の時点で、群１においては、１群当たり１匹の動物（２つの眼）を殺処分し、群２及び３においては、２匹の動物（４つの眼）を殺処分した。群１−１日目（２４時間）、２日目、４日目、及び８日目；群２及び３−１日目（２４時間）、４日目、８日目、１２日目、及び２０日目。殺処分後、両眼を摘出し、ＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲート濃度を、硝子体及び房水及び網膜組織において決定した。眼の瞬間冷凍後、濾紙を、全レチナール層を収集するために、後に使用した。
【０４５９】
全ての血液試料（約１ｍＬ）を、大腿骨または橈側皮静脈を介して収集した。ＩＶＴまたはＩＶ投与後の以下の時点で、試料を、解凍した。群１−１時間、６時間、１日目（２４時間）、２日目、３日目、４日目、５日目、及び７日目；群２及び３−１時間、６時間、１日目（２４時間）、２日目、４日目、６日目、８日目、１２日目、及び２０日目；群４−１時間、６時間、１日目（２４時間）、２日目、４日目、７日目、１１日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目、及び２８日目。血液採取から１時間以内に、試料を室温で凝血させ、血清を遠心分離によって分離し、−６０℃〜−８０℃で保存した。試験プロトコルの詳細を、表２０に記載する。
表２０：カニクイザルＰＫ試験パラメータ
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【０４６０】
ｂ．ＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートにおける薬物動態学的アッセイ
Ｇｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイは、カニクイザル血清、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートを定量化するために使用した。試料を、試料緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１５ｐｐｍ  プロクリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．２５％ＣＨＡＰＳ、５０μｇ／ｍＬのｍｕＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ、カタログ番号ＳＬＭ６６）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））中で１：４〜１：３０００に希釈した。ＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートの標準曲線は、試料緩衝液中の２．０６〜１５００ｎｇ／ｍＬのＡＦＤ．ｖ１４またはＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートを連続希釈することによって調製した。捕捉及び検出試薬を、ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／０．０２％ＮａＮ３及びＡｌｅｘａ−抗ＣＤＲ（クローン２３４，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）中の１００μｇ／ｍＬのビオチン−コンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＨＣ＋ＬＣ、ベチル、カタログ番号Ａ８０−３１９Ｂ）ならびにＲｅｘｘｉｐ  Ｆ（Ｇｙｒｏｌａｂ）中の２５ｎＭで適用した。アッセイを、Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００  ＣＤにおいて実施し、洗浄ステップは、ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／０．０２％ＮａＮ３を使用し、続いて、Ｇｙｒｏｓ  ｐＨ１１洗浄緩衝液を使用した。装置を起動し、データは、１％ＰＭＴ設定で製造業者によって記載されるように分析した。ＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートの濃度は、その標準曲線の５パラメータフィットから決定された。最小限の定量化可能な濃度は、カニクイザル血清、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートにおいて８．２４ｎｇ／ｍＬ（０．１６ｎＭ）であった。
【０４６１】
硝子体液、房水、及び網膜ＰＫの結果を、下の表２１〜２３、図１７Ａ（硝子体）、１７Ｂ（正規化された硝子体）、１８Ａ（水性）、１８Ｂ（正規化された水性）、１９Ａ（網膜）、及び１９Ｂ（正規化された網膜）に記載される。
表２１：ＡＦＤ．ｖ１４対照（群１）及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲート（群２及び３）における硝子体ＰＫ
2022002521.tif 000066
表２２：ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲートにおける水性ＰＫ
2022002521.tif 000067
表２３：網膜ＰＫ  ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲート
2022002521.tif 000068
【０４６２】
表２１及び図１７Ａ〜Ｂに見られるように、コンジュゲート化ＡＦＤ．ｖ１４群の両方（群２及び３）において硝子体末端半減期は、コンジュゲートされていないＡＦＤ．ｖ１４対照（群１）のものよりも長く、コンジュゲートされていないランパリズマブ及びラニビズマブＦａｂの平均半減期よりも長かった（約２．３４日）。コンジュゲート化ＡＦＤ．ｖ１４の群２及び３における平均ＡＵＣ／ｍｇ−用量（約２０４０）は、コンジュゲートされていないランパリズマブＦａｂにおける平均ＡＵＣ／ｍｇ−用量よりも高かった（約１７３３）。硝子体末端の半減期に基づいて、４．０ｍｇ／眼の用量は、１．０ｍｇ／眼の用量よりもさらにゆっくりと除去した。表２２及び２３、ならびに図１８及び１９に見られるように、より長い末端の半減期はまた、コンジュゲートされていないＦａｂと比較して、群２及び３（コンジュゲート化ＡＦＤ．ｖ１４）における房水及び網膜においても観察された。
【０４６３】
群２及び３における血清ＰＫの結果を、図１５Ａ及び１５Ｂ（正規化した）に記載され、群４における血清ＰＫを、図１５Ｃに記載する。群２及び３（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲート）における血清ＰＫ曲線は、互いに平行し、投与正規化後に重ね合わされる。図１５Ａ及び１５Ｂを参照のこと。群２及び３における血清ＡＵＣは、最後に測定された時点まで用量に比例している。
【０４６４】
群４（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲート；ＩＶ投与）における末端半減期は、７．５日であり、クリアランスは、１５．８ｍＬ／日（５．６４ｍＬ／ｋｇ／日（群４のサルの平均体重は、２．８ｋｇであった））であった。２１、２４、及び２８日の測定日に、血清濃度は、４群の４匹のサルのうちの３匹において検出の限界より下まで低下した。
【０４６５】
ｃ．カニクイザル血清中のＤ因子に対する薬力学的アッセイ
サンドイッチＥＬＩＳＡが、カニクイザル血清、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のＤ因子（ｆＤ）を定量化するために使用された。マウス抗ヒトＤ因子クローン４６７６（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、コーティング緩衝液（０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中で１μｇ／ｍＬになるまで希釈し、３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４６４７１８）上で４℃にて一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた２時間のインキュベーション中、ブロックした。この及び全てのその後のインキュベーションは、穏やかに撹拌しながら室温で行った。カニクイザルｆＤ標準曲線を、試料緩衝液（５００ｎｇ／ｍＬのＡＦＤ．ｖ１４治療薬及び５０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを補充したアッセイ緩衝液）中で０．０４〜５ｎｇ／ｍＬのｆＤを連続希釈することによって調製した。血清試料及び対照は、試料緩衝液中の最低限の１：１００になるまで希釈された。硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート試料及び対照は、試料緩衝液中の最低限の１：１０になるまで希釈された。次いで、希釈した標準物質、対照、及び試料を、プレート上で２時間インキュベートし、プレート結合ｆＤ／ＡＦＤ．Ａｂ複合体を、ＡＦＤ．Ａｂ（クローン２４２、１μｇ／ｍＬ）に対してビオチン−コンジュゲート化マウス抗ＣＤＲ  ｍＡｂを用いて１時間検出し、続いて、高い感受性ＳＡ−ＨＲＰ（３ｎｇ／ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２１１３０）も１時間検出した。最終洗浄の後に、テトラメチルベンジジン（Ｍｏｓｓ、カタログ番号ＴＭＢＥ−１０００）を加え、１０〜１５分間発色させ、１Ｍリン酸を用いて反応を停止した。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを６２０ｎｍの参照と共に４５０ｎｍで読み取った。ｆＤの濃度は、標準曲線の４パラメータフィットから決定された。カニクイザル血清中の最低限の定量可能な濃度は、３．９ｎｇ／ｍＬ（０．１６ｎＭ）であった。カニクイザル硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中の最小限の定量化可能な濃度は、０．３９ｎｇ／ｍｌ（０．０１６ｎＭ）であった。
【０４６６】
群２、３、及び４における平均血清ｆＤ及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲート濃度を、図１６に記載する。図１６Ａは、血清ｆＤ濃度が試験した全ての時点でＡＦＤ．Ａｂ濃度よりも高かったことを示す。これらの結果は、全身性ＡＰ補体活性は、全ての群において維持されることを示す。
【０４６７】
群２及び３における平均眼ｆＤ及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔコンジュゲート濃度は、図１６Ｂに記載され、これは、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のＡＦＤ．Ａｂ濃度が、試験した全ての時点でｆＤ濃度を超えたことを示す。
【０４６８】
ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−ＯｃｔコンジュゲートのＩＶＴ投与後に、ＰＫパラメータについて、この例に記載されるデータに基づいて、ＡＦＤ．ｖ１４のコンジュゲーションは、眼の硝子体液及び房水中の持続レベルのコンジュゲートをもたらした。しかしながら、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のＡＦＤ．Ａｂ濃度が試験した全ての時点でｆＤ濃度を超えたが、これは、ＩＶＴ投与と共に血清試料中のいかなる時点でも見られなかった。この例に記載されるものと同様の方法は、２０Ｄ１２．ｖ２．１、２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ、２０Ｄ１２．ｖ２．３、及び２０Ｄ１２．ｖ２．３．ＣのＰＥＧ八量体を評価するために使用することができる。ＩＶＴ投与した場合に、コンジュゲート化２０Ｄ１２．ｖ２．１、２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ、２０Ｄ１２．ｖ２．３、及び２０Ｄ１２．ｖ２．３．Ｃがコンジュゲート化ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔと同様に挙動され得ると期待される。
【０４６９】
実施例１６：ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．ＣにおけるカニクイザルＰＫ
ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃのインビボ薬物動態的（ＰＫ）プロファイルを評価するために、インビボＰＫ試験が、放射性ヨウ化ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ（１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ）及びｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ（１２５Ｉ−２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ）を用いてカニクイザルにおいて行われた。ＰＫパラメータを、収集された各組織中のμｇ−当量／ｍＬまたはグラム濃度への放射性シグナルの変換後に、単回投与実験から決定した。動物のケアは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの指針に従った。
【０４７０】
ａ．試験パラメータ
カニクイザル（４３匹の雌動物；投与時、２ｋｇ〜４ｋｇ、約３〜４歳）を、５つの投与群のうちの１つに割り当てた。群１、２、及び３の動物（ｎ＝１０／群）は、それぞれ、２７ゲージ針を通して１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔの両側の硝子体内投与の１ｍｇ／眼（２ｍｇ／動物）、７．５ｍｇ／眼（１５ｍｇ／動物）、または１５ｍｇ／眼（３０ｍｇ／動物）を受けた（１００μｌの投与体積）。群４の動物（ｎ＝１０）は、２７ゲージ針を通してコンジュゲートされていない１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃの両側の硝子体内投与の１５ｍｇ／眼（３０ｍｇ／動物を受けた（１００μｌの投与体積）。動物は、鎮静状態にし（５〜１５ｍｇ／ｋｇのケタミンＨＣｌ及び吸入効果へのイソフルラン）、注入前に０．５％プロポアラカインＨＣｌ、２．５％フェニレフリンＨＣｌ、及び１％トロピカミドで局所処置した。次いで、１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔまたはコンジュゲートされていない１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃを、針を球の後方軸に、硝子体中央部に向けて、強膜を通して投与した。
【０４７１】
眼組織は、全ての群から収集した。投与後に以下の時点で、１群当たり２匹の動物（４つの眼）を殺処分した。１日目（投与から４時間後）、３日目、８日目、１３日目、及び２９日目。殺処分後、両眼を摘出し、１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ及びコンジュゲートされていない１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ放射線レベルを、硝子体液、房水、及び網膜において決定した。試験プロトコルの詳細を、表２４に記載する。
表２４：カニクイザル放射性ＰＫ試験パラメータ
2022002521.tif 000069
【０４７２】
ｂ．１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ及びコンジュゲートされていない１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃにおける薬物動態学的ラジオアッセイ
ラジオ検出アッセイは、カニクイザル硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中の放射能の量を検出するために使用した。硝子体液を、セルマニックビーズを用いて均質化し、次いで、０．０２５〜０．０５ｇの三重秤量したアリコートを、ガンマ計数のためにホモジネートから除去した。房水は、放射能においては、そのままで計数した。網膜を、均質化し、次いで、放射能においては、全体として計数した。全てのマトリックスの放射能を、Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４７０ガンマ計数器を用いて検出した。放射能検出後、１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ及びコンジュゲートされていない１２５Ｉ−ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃの濃度を、各アーム（μＣｉ／ｍＬの単位で）に特異的な活性の用量溶液を用いて、１ｍＬの組織当たりの放射能を１ｍＬの組織当たりのμｇ当量に変換することによって計算した。１ｇ＝１ｍＬの仮定を、変換時に適用した。
【０４７３】
硝子体液、房水、及び網膜ＰＫの結果を、下の表２５〜２７、及び図２２（硝子体）、２３（水性）、及び２４（網膜）に記載する。
表２５：ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ及びコンジュゲートされていないｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃにおける硝子体液ＰＫ
2022002521.tif 000070
表２６：ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ及びコンジュゲートされていないｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃにおける房水ＰＫ
2022002521.tif 000071
表２７：ＩＶＴ投与後に、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ及びコンジュゲートされていないｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃにおける網膜ＰＫ
2022002521.tif 000072
【０４７４】
表２５及び図２２に見られるように、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ群（群１、２、及び３）において硝子体末端半減期は、コンジュゲートされていないｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ対照（群４）のものよりも長く、コンジュゲートされていないランパリズマブ及びラニビズマブＦａｂの平均半減期よりも長かった（約２．３４日）。ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ群における平均ＡＵＣ／ｍｇ用量は、コンジュゲートされていないｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ対照（約２０６７日＊μｇ／ｍＬ／ｍｇの用量）及びコンジュゲートされていないランパリズマブＦａｂにおける平均ＡＵＣ／ｍｇ用量よりも高かった（約１７３３）。表２６及び２７、ならびに図２３及び２４に見られるように、より長い末端の半減期はまた、コンジュゲートされていないｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃと比較して、ｈｕ２０Ｄ１２．ｖ２．１．Ｃ＋ＴＰ−Ｏｃｔ群における房水及び網膜においても観察された。
【０４７５】
前述の発明が明確な理解のために例証及び例によって多少詳しく説明されているが、これらの説明及び例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
配列表
2022002521.tif 000073
2022002521.tif 000074
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【図１Ａ】
2022002521.tif 000101
【図１Ｂ】
2022002521.tif 000102
【図１Ｃ】
2022002521.tif 000103
【図２Ａ】
2022002521.tif 000104
【図２Ｂ】
2022002521.tif 000105
【図２Ｃ】
2022002521.tif 000106
【図３Ａ】
2022002521.tif 000107
【図３Ｂ】
2022002521.tif 000108
【図３Ｃ】
2022002521.tif 000109
【図４】
2022002521.tif 000110
【図５Ａ】
2022002521.tif 000111
【図５Ｂ】
2022002521.tif 000112
【図６Ａ】
2022002521.tif 000113
【図６Ｂ】
2022002521.tif 000114
【図６Ｃ】
2022002521.tif 000115
【図７Ａ】
2022002521.tif 000116
【図７Ｂ】
2022002521.tif 000117
【図７Ｃ】
2022002521.tif 000118
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2022002521.tif 000120
【図８Ｃ】
2022002521.tif 000121
【図９Ａ】
2022002521.tif 000122
【図９Ｂ】
2022002521.tif 000123
【図１０Ａ】
2022002521.tif 000124
【図１０Ｂ】
2022002521.tif 000125
【図１１】
2022002521.tif 000126
【図１２Ａ】
2022002521.tif 000127
【図１２Ｂ】
2022002521.tif 000128
【図１３Ａ】
2022002521.tif 000129
【図１３Ｂ】
2022002521.tif 000130
【図１４Ａ】
2022002521.tif 000131
【図１４Ｂ】
2022002521.tif 000132
【図１４Ｃ】
2022002521.tif 000133
【図１５Ａ】
2022002521.tif 000134
【図１５Ｂ】
2022002521.tif 000135
【図１５Ｃ】
2022002521.tif 000136
【図１６Ａ】
2022002521.tif 000137
【図１６Ｂ】
2022002521.tif 000138
【図１７Ａ】
2022002521.tif 000139
【図１７Ｂ】
2022002521.tif 000140
【図１８Ａ】
2022002521.tif 000141
【図１８Ｂ】
2022002521.tif 000142
【図１９Ａ】
2022002521.tif 000143
【図１９Ｂ】
2022002521.tif 000144
【図２０】
2022002521.tif 000145
【図２１】
2022002521.tif 000146
【図２２】
2022002521.tif 000147
【図２３】
2022002521.tif 000148
【図２４】
2022002521.tif 000149
【配列表】
2022002521000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年10月13日(2021.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2022002521000001.pdf