(57)【要約】【課題】Ｓ／Ｎ比の向上、検出感度の向上、検出時間の短縮を図った抗原抗体反応利用の生体高分子検出方法およびバイオチップを提供する。【解決手段】ターゲット生体高分子を基板側に捕捉してターゲット生体高分子を検出する生体高分子検出方法であって、蛍光標識したターゲット生体高分子と、表面にプローブ生体高分子とビーズのＩＤ認識用のアドレスリンカーを固定したビーズとを溶液中に入れて、ターゲット生体高分子とプローブ生体高分子をハイブリダイズさせた後、基板上に固定の前記アドレスリンカーとは抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブタンパク質で前記アドレスリンカーを抗原・抗体反応により捕捉する。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット生体高分子を基板側に捕捉してターゲット生体高分子を検出する生体高分子検出方法であって、
蛍光標識したターゲット生体高分子と、表面にプローブ生体高分子とビーズのＩＤ認識用のアドレスリンカーを固定したビーズとを溶液中に入れて、ターゲット生体高分子とプローブ生体高分子をハイブリダイズさせた後、基板上に固定の前記アドレスリンカーとは抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブタンパク質で前記アドレスリンカーを抗原・抗体反応により捕捉することを特徴とする生体高分子検出方法。
【請求項２】
前記アドレスリンカーは、前記ビーズのＩＤを認識するためのアドレス判定用抗原または抗体であることを特徴とする請求項１記載の生体高分子検出方法。
【請求項３】
前記ターゲット生体高分子とビーズをバッファ溶液と共に容器中に入れ、物理的もしくは電気的もしくは化学的手段により攪拌することを特徴とする請求項１または２記載の生体高分子検出方法。
【請求項４】
前記ビーズとして磁気ビーズもしくは金属またはプラスチックを用いたビーズを使用したことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の生体高分子検出方法。
【請求項５】
前記ターゲット生体高分子は、ＤＮＡからの転写産物であるＲＮＡ、またはｃＤＮＡ、またはタンパク質であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の生体高分子検出方法。
【請求項６】
ハイブリダイゼーション法によりターゲット生体高分子と結合するプローブ生体高分子と共にビーズ表面に固定されたＩＤ認識用のアドレスリンカーを、抗原・抗体反応により捕捉することのできるアドレスプローブタンパク質を基板上に固定しているバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ（ＲＮＡはＤＮＡからの転写産物、すなわちｍＲＮＡまたはｒＲＮＡまたはｔＲＮＡまたは低分子ＲＮＡである）、タンパク質などの生体高分子を検出する方法およびそれに用いられるバイオチップに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、マイクロアレイチップを用いて生体高分子（以下ＤＮＡを例にとる）を解読する技術はよく知られている（例えば、特許文献１参照）。そして、この種のＤＮＡのマイクロアレイチップは通常次のように形成され、ＤＮＡを解読することができるようになっている。
【０００３】
ガラス（あるいはプラスチック）基板上に、ターゲットとなるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）と相補的配列をもつプローブＤＮＡをアレー状にスポッティングして固定する。その上に、ターゲットとなるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）に蛍光ラベルを付けたものを滴下する。相補的配列同士のプローブとターゲットはハイブリダイズして結合するが、そうでないものは結合しない。
【０００４】
十分ハイブリダイゼーションが進行した後、基板上をウォッシングバッファ液で洗浄し、ハイブリダイズしなかったターゲットを洗い流す。次に、読取装置で光学的に蛍光ラベルの位置および光量を読み取ることにより、ターゲットとなるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の有無およびその量を測定することができる（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】
特開２０００−１３１２３７号公報（第２頁、図１−３）
【特許文献２】
特開２０００−２３５０３５号公報（第２頁、図７−９）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のＤＮＡマイクロアレイは上記のような一連のプロトコルにより目的とするデータが得られるが、実際には各段階のプロトコル上で色々な問題点を抱えている。その結果、得られたデータには確かさ、再現性、繰り返し特性、感度などの課題が多く、それゆえ実験データの標準化が進まず、更にはコンテンツ面での問題点と相俟って臨床現場でＤＮＡマイクロアレーが普及するには至っていない。
色々な問題点のうち特に問題となる項目は、Ｓ／Ｎ比、検出感度、検出時間、確からしさ、再現性である。
【０００７】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、Ｓ／Ｎ比の向上、検出感度の向上、検出時間の短縮を図った抗原抗体反応利用の生体高分子検出方法およびその方法に用いられるバイオチップを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するために、請求項１の発明は、
ターゲット生体高分子を基板側に捕捉してターゲット生体高分子を検出する生体高分子検出方法であって、
蛍光標識したターゲット生体高分子と、表面にプローブ生体高分子とビーズのＩＤ認識用のアドレスリンカーを固定したビーズとを溶液中に入れて、ターゲット生体高分子とプローブ生体高分子をハイブリダイズさせた後、基板上に固定の前記アドレスリンカーとは抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブタンパク質で前記アドレスリンカーを抗原・抗体反応により捕捉することを特徴とする。
【０００９】
本発明ではビーズを使用しているため、ビーズの表面積は従来のＤＮＡチップの表面積に比べ格段に大きくなり、そのビーズ表面に沢山のプローブ生体高分子を固定することができ、これによりビーズ上のプローブ生体高分子と溶液中のターゲット生体高分子とが邂逅する機会が格段に高まり、ターゲット生体高分子を極めて高い感度で捕捉することができる。一般にＤＮＡアレーの約１０００倍以上の感度である。
ビーズには、さらにＩＤ認識用のアドレスリンカーが固定されている。
一方、基板上のサイトにはアドレスリンカーと抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブタンパク質が固定されている。基板に前記ビーズを注ぐと、抗原・抗体反応によりアドレスリンカーはアドレスプローブタンパク質に強力な結合力で捕捉される。
このようにして、高Ｓ／Ｎ比、高検出感度でターゲット生体高分子を基板上に捕捉することができる。
【００１０】
前記アドレスリンカーは、請求項２のように前記ビーズのＩＤを認識するためのアドレス判定用抗原または抗体である。
また、請求項３のように、ターゲット生体高分子とビーズをバッファ溶液と共に容器中に入れ、物理的もしくは電気的もしくは化学的手段により攪拌すると、従来方式が単にブラウン運動にて相補的プローブを探すことに比べ、本発明では他からのエネルギーを得て相補的プローブを探すことになるので、邂逅する機会が格段に高まり、その結果プローブ生体高分子とターゲット生体高分子のハイブリダイゼーションを高速化することができる。
【００１１】
ビーズとしては、請求項４のように磁気ビーズ、もしくは金属またはプラスチックを用いたビーズを使用する。また、ターゲット生体高分子は、請求項５のようにＤＮＡからの転写産物であるＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡまたはｔＲＮＡまたは低分子ＲＮＡ）、またはｃＤＮＡ、またはタンパク質である。
【００１２】
請求項６の発明は、ハイブリダイゼーション法によりターゲット生体高分子と結合するプローブ生体高分子と共にビーズ表面に固定されたＩＤ認識用のアドレスリンカーを、抗原・抗体反応により捕捉することのできるアドレスプローブタンパク質を基板上に固定していることを特徴とするバイオチップである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明では、ビーズの良いところとＤＮＡアレーの良いところを組合わせている。ビーズの良いところは、表面積が大きいためプローブＤＮＡを沢山結合しておくことができ（平板状のサイトにプローブＤＮＡを結合するのに比して格段に多い）、しかも溶液中を自由に移動することができるので、溶液中のターゲット生体高分子と邂逅する機会が飛躍的に向上し、その結果溶液中の微量のターゲットＤＮＡを極めて高い感度で捕捉することができる（一般にＤＮＡアレーの約１０００倍以上である）点である。
【００１４】
しかしながら、一方で、各ビーズのＩＤすなわちどのビーズにどのＤＮＡが結合したかが分らないという欠点がある。このビーズのＩＤを認識するため、通常、カラービーズを使ったり、２色の光源で識別したりと色々な試みがなされているが、識別できる数が少ないという問題と、装置が複雑化、高額化、大型化し、そして取り扱いが難しくなるという問題がある。本発明ではビーズ上とアレイ上のタンパク質の抗原・抗体反応により識別できるようにして、この問題をうまく解決している。
【００１５】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１ないし図３は本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する図である。なお、ここでは、生体高分子がＤＮＡである場合について説明する。
図１に示すように、ビーズ１の表面にプローブＤＮＡ２を固定する。ビーズとしては、磁気ビーズや金属もしくはプラスチックを用いたビーズなどが使用できる。
【００１６】
ビーズ１の表面には、それに加えてビーズの特定番号ＩＤを認識するためのアドレスリンカー３（アドレス判定用抗原もしくはアドレス判定用抗体）を固定する。他方、ターゲットとなるＲＮＡあるいはｃＤＮＡあるいはタンパク質（以下これらを代表してＲＮＡという）４には、蛍光タグ５を標識する。
【００１７】
前記ビーズ１とターゲットＲＮＡ４とバッファ溶液６を共に容器７中に入れ、必要に応じて物理的もしくは電気的もしくは化学的手段によって攪拌する。この結果、ビーズ１表面のプローブＤＮＡ２には、これと相補的関係にあるターゲットＲＮＡ４が結合する。
【００１８】
次に、前記結合したビーズを図２に示すバイオチップ１０のアレイ状のサイト１１上に注ぐ。なお、同図（ａ）は側面図、同図（ｂ）は平面図である。
サイト１１上には、ビーズ１表面のＩＤ認識用アドレスリンカー３を抗原・抗体反応により捕捉し、ビーズ１のＩＤを認識するためのアドレスプローブタンパク質１２があらかじめ固定されている。なお、図３は図２の丸囲み部分Ａの拡大図である。
【００１９】
アドレスリンカー３とアドレスプローブタンパク質１２は抗原・抗体反応により結合する。ビーズ１がどのプローブサイト１１のアドレスプローブタンパク質１２に結合したかは蛍光ラベル５によって認識することができる。蛍光ラベルは蛍光読取装置（図示せず）により容易に検出できる。
このようにしてターゲットＲＮＡ４の存在およびその量を効率よく測定することができる。
【００２０】
なお、以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。したがって本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
【００２１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば次のような効果がある。
（１）ビーズは表面積が大きいため沢山のプローブＤＮＡを結合でき、したがって溶液中の微量のターゲット生体高分子を極めて高い感度（一般のＤＮＡアレーの約１０００倍以上の感度）で容易に捕捉することができる。
（２）１つのビーズに結合した沢山のプローブＤＮＡにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせ結合させ得るので、容易にＳ／Ｎ比を上げることができる。
（３）１つのビーズに沢山のプローブＤＮＡを結合していることと、溶液を攪拌することにより、ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとの邂逅の機会が多くなり、検出時間（主としてハイブリダイゼーションに要する時間）を容易に短縮することができると同時に、極めて高い感度でターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する図である。
【図２】本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する他の説明図である。
【図３】本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する他の説明図である。
【符号の説明】
１  ビーズ
２  プローブタンパク
３  アドレスリンカー
４  ターゲットＤＮＡ
５  蛍光タグ
６  溶液
７  容器
１０  基板
１１  サイト
１２  アドレスプローブタンパク
【図１】
2004184312.tif 000003
【図２】
2004184312.tif 000004
【図３】
2004184312.tif 000005