(57)【要約】　　　（修正有）【課題】クロライドチャンネル（ＣＬＣＡ）発現気道上皮細胞株および呼吸器疾患の予防・治療剤の提供。【解決手段】カルシウム依存性ＣＬＣＡ発現気道上皮細胞株またはＣＬＣＡを発現する能力を有し粘液を分泌する気道上皮細胞株および同細胞株とサイトカンイを用いる呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療薬のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する気道上皮細胞株。
【請求項２】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１記載の気道上皮細胞株。
【請求項３】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１記載の気道上皮細胞株。
【請求項４】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１記載の気道上皮細胞株。
【請求項５】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を高発現する請求項１記載の気道上皮細胞株。
【請求項６】
粘液を分泌する能力を有する請求項１記載の気道上皮細胞株。
【請求項７】
粘液がＭＵＣ２タンパク質および（または）ＭＵＣ５ＡＣタンパク質である請求項６記載の気道上皮細胞株。
【請求項８】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株に、サイトカインを接触させることを特徴とする、請求項１記載の気道上皮細胞株の製造法。
【請求項９】
サイトカインがＩＬ−１３である請求項８記載の製造法。
【請求項１０】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株が、ＮＩＭ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９１）で標示される細胞である請求項８記載の製造法。
【請求項１１】
ＮＩＭ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９１）で標示される細胞。
【請求項１２】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを用いることを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１記載の気道上皮細胞株を用いることを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１４】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１２または請求項１３記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性が、クロライドチャネル様活性または粘液分泌活性である請求項１２または請求項１３記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインまたは請求項１記載の気道上皮細胞株を含有することを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１７】
請求項１２もしくは請求項１３記載のスクリーニング方法または請求項１６記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。
【請求項１８】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを用いることを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１９】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１８記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを含有することを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項２１】
請求項１８記載のスクリーニング方法または請求項２０記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。
【請求項２２】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを用いることを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２３】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項２２記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを含有することを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項２５】
請求項２２記載のスクリーニング方法または請求項２４記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。
【請求項２６】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株が、ＮＩＭ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９１）で標示される細胞である請求項１２、請求項１８または請求項２２記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項１７、請求項２１または請求項２５記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項２８】
呼吸器疾患の予防・治療剤である請求項２７記載の医薬。
【請求項２９】
呼吸器疾患が慢性閉塞性肺疾患または気管支喘息である請求項２８記載の医薬。
【請求項３０】
鼻炎の予防・治療剤である請求項２７記載の医薬。
【請求項３１】
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株を用いることを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項３２】
請求項１記載の気道上皮細胞株を用いることを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項３３】
請求項１１記載の細胞およびＩＬ−１３を用いることを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項３４】
哺乳動物に対し、請求項１７、請求項２１または請求項２５記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療方法。
【請求項３５】
呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療剤の製造のための、請求項１７、請求項２１または請求項２５記載の化合物またはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規気道上皮細胞株の用途に関する。さらに詳しくは、呼吸器疾患などの予防・治療剤のスクリーニング方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、びまん性汎細気管支炎、内因性喘息などは、喫煙世代の高齢化、平均寿命の延長等にともなって、今後、呼吸器疾患の中心的な病気になると考えられている。また、気管支喘息は気道の慢性炎症性疾患であり、気道狭窄を示し、発作性の呼吸困難、喘鳴、咳などの症状が見られる。その発症と進展には気道上皮細胞、肥満細胞、好酸球、Ｔリンパ球などの多くの細胞が関与している。
外界からの刺激（アレルゲン、排気物）やウイルス感染により気道の炎症反応の引き金が引かれると、気道上皮細胞や気管支周辺の毛細血管内皮細胞上にＶＣＡＭ−１やＩＣＡＭ−１などの接着分子が発現し〔ジャーナル・オブ・アラジー・アンド・クリニカル・イムノロジー（Ｊ．　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、９６巻、９４１頁、１９９５年〕、サイトカインや化学遊走物質が産生される。気管支喘息の患者はＴｈ２型のヘルパーＴ細胞の機能が亢進しており、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦなどのＴｈ２型のサイトカインやｅｏｔａｘｉｎ、ＲＡＮＴＥＳなどのケモカインの産生が増加する。ＩＬ−４やＩＬ−１３はＩｇＥの産生誘導作用があり、ＩＬ−３やＩＬ−４は肥満細胞の増殖誘導作用がある。さらに、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦなどの作用により好酸球が分化増殖し、ｅｏｔａｘｉｎ、ＲＡＮＴＥＳにより気道に浸潤してくる〔アラジー・アンド・アズマ・プロシーディング（Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｓｔｈｍａ　Ｐｒｏｃ．）、２０巻、１４１頁、１９９９年〕。また、サイトカインの中でも、ＩＬ−１３が慢性閉塞性肺疾患の発症や気管支喘息における粘液過分泌の重要な因子であることが報告されてきている〔非特許文献１　ジャーナル　オブ　クリニカル　インヴェスティゲーション（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．）、１０６巻、１０８１頁、２０００年；ジャーナル　オブ　クリニカル　インヴェスティゲーション（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．）、１０３巻、７７９頁、１９９９年〕。
気管・気管支の粘膜を覆っている上皮細胞は外界からの刺激が直接粘膜下組織に伝わるのを防ぐバリヤーの機能、分泌物や異物の排泄機能を持つだけでなく、上皮由来平滑筋弛緩因子の分泌などによって気管の収縮を制御している。この気道上皮細胞からの分泌にはクロライドチャネルが重要な働きを持ち、その異常は様々な呼吸器疾患を引き起こす。気道上皮で機能するクロライドチャネルのうちＣＦＴＲの機能不全が嚢胞性繊維症を引き起こすことや（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻、１１２５頁、１９９２年）、ＣＩＣクロライドチャネルが筋緊張症と関係している（Ｎａｔｕｒｅ、３５４巻、３０４頁、１９９１年）ことが報告されている。特に喘息や慢性閉塞性肺疾患など気道粘液の過分泌を伴う疾患についてはカルシウム依存性クロライドチャネル（以下、ＣＬＣＡと略称することもある）の関与が報告されている〔アメリカン　ジャーナル　オブ　レスピラトリー　アンド　クリティカル　ケア　オブ　メディシン（Ａｍ．　Ｊ．　　Ｒｅｓｐｉｒ．　Ｃｒｉｔ．　Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．）１−６５巻、１１３２頁、２００２年〕。また、ＣＬＣＡ１などの活性を阻害することと喘息などの治療との関連や、Ｇｏｂ−５遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与による気道過敏性亢進の抑制などが報告されている（特許文献１　ＷＯ　０１／３８５３０号公報）。
ＣＬＣＡを発現する細胞株としてはヒトＣＬＣＡ２を発現しているＭＣＦ１０Ａ細胞（非特許文献２　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９巻、５４８８頁、１９９９年）、マウスＣＬＣＡ１を発現しているＨＣ１１細胞（非特許文献３　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７６巻、４０５１０頁、２００１年）などが報告されているが、これらはいずれも胸部上皮細胞株で、機能的にもガンやアポトーシスとの関連が示唆されており、粘液の過分泌との関連についての報告はない。また粘液を分泌する気道上皮細胞株としては、正常ヒト気道上皮細胞株のＮＨＴＢＥ細胞〔アメリカン　ジャーナル　オブ　フィジオロジカル　ラング　セル　モレキュラー　フィジオロジー（Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｌｕｎｇ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ）、２７８巻、Ｌ１１１８頁、２０００年〕、ハムスター初代気道上皮細胞のＨＴＥ細胞〔ジャーナル　オブ　セルラー　フィジオロジー（Ｊ．　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、１２５巻、１６７頁、１９８５年〕などが報告されている。
【特許文献１】
ＷＯ　０１／３８５３０号公報
【非特許文献１】
Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．、１０６巻、１０８１頁、２０００年
【非特許文献２】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９巻、５４８８頁、１９９９年
【非特許文献３】
Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７６巻、４０５１０頁、２００１年
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
気道過敏性や気道粘液の過分泌を伴う疾患については、ＣＬＣＡの関与が報告されており、ＣＬＣＡの発現を抑制する薬剤、ＣＬＣＡの活性を阻害する薬剤は、喘息や慢性閉塞性肺疾患などの呼吸器疾患の有効な治療薬となりうる。しかしながら、ＣＬＣＡは、疾患の発症に伴って発現が誘導される遺伝子であるため、呼吸器由来の細胞でＣＬＣＡを発現する細胞株は報告されておらず、また、ある種の刺激でＣＬＣＡを発現誘導しうる細胞株についても報告されていない。副作用の少ない優れた慢性閉塞性肺疾患や気管支喘息の予防・治療剤を開発するために、ＣＬＣＡを発現または発現誘導しうる細胞株の取得が切望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、初代気道上皮細胞株をＩＬ−１３で刺激することにより、ＣＬＣＡ１を高発現する気道上皮細胞株を見出した。この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する気道上皮細胞株、
（２）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記（１）記載の気道上皮細胞株、
（３）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記（１）記載の気道上皮細胞株、
（４）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記（１）記載の気道上皮細胞株、
（４ａ）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記（１）記載の気道上皮細胞株、
（５）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を高発現する上記（１）記載の気道上皮細胞株、
（５ａ）　ハウスキーピング遺伝子に対して約０．０１％以上のカルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質遺伝子を発現する上記（１）記載の気道上皮細胞株、
（６）　粘液を分泌する能力を有する上記（１）記載の気道上皮細胞株、
（７）　粘液がＭＵＣ２タンパク質および（または）ＭＵＣ５ＡＣタンパク質である上記（６）記載の気道上皮細胞株、
（８）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株に、サイトカインを接触させることを特徴とする、上記（１）記載の気道上皮細胞株の製造法、
（９）　サイトカインがＩＬ−１３である上記（８）記載の製造法、
（９ａ）　サイトカインを約０．０１ｎｇ／ｍｌ以上用いる上記（８）記載の製造法、
（１０）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株が、ＮＩＭ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９１）で標示される細胞である上記（８）記載の製造法、
（１１）　ＮＩＭ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９１）で標示される細胞、
（１２）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを用いることを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１２ａ）（ｉ）カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを、カルシウム賦活剤で活性化した場合と（ｉｉ）カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株、サイトカインおよび試験化合物の混合物をカルシウム賦活剤で活性化した場合における、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性をそれぞれ測定し、比較を行う上記（１２）記載のスクリーニング方法、
（１３）　上記（１）記載の気道上皮細胞株を用いることを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１３ａ）　（ｉ）上記（１）記載の気道上皮細胞株をカルシウム賦活剤で活性化した場合と（ｉｉ）上記（１）記載の気道上皮細胞株および試験化合物の混合物をカルシウム賦活剤で活性化した場合におけるカルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性をそれぞれ測定し、比較を行うことにより、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を選択する上記（１３）記載のスクリーニング方法、
（１４）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記（１２）または（１３）記載のスクリーニング方法、
（１５）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性が、クロライドチャネル様活性または粘液分泌活性である上記（１２）または（１３）記載のスクリーニング方法、
（１５ａ）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性が、クロライドチャネル様活性または粘液分泌活性である上記（１２ａ）または（１３ａ）記載のスクリーニング方法、
（１６）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインまたは上記（１）記載の気道上皮細胞株を含有することを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１７）　上記（１２）もしくは（１３）記載のスクリーニング方法または上記（１６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
（１８）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを用いることを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１８ａ）　（ｉ）カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを培養した場合と（ｉｉ）カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株、サイトカインおよび試験化合物の混合物を培養した場合における、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、比較することにより、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を選択する上記（１８）記載のスクリーニング方法、
（１８ｂ）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株が、哺乳動物（ヒト、ラット、マウスなど）の初代気道上皮細胞が株化された細胞株である上記（１８）または上記（１８ａ）記載のスクリーニング方法、
（１８ｃ）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株がラット気道上皮細胞株である上記（１８）または（１８ａ）記載のスクリーニング方法、
（１８ｄ）　ラット気道上皮細胞株が、ＮＩＭ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９１）で標示される細胞またはＳＰＯＣ１（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｃｅｌｌａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４巻、１４６頁、１９９６年）細胞である上記（１８ｃ）記載のスクリーニング方法、
（１９）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記（１８）記載のスクリーニング方法、
（２０）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを含有することを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２１）　上記（１８）記載のスクリーニング方法または上記（２０）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
（２２）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを用いることを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２２ａ）　（ｉ）カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを培養した場合と（ｉｉ）カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株、サイトカインおよび試験化合物の混合物を培養した場合における、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の産生量を、それぞれ測定し、比較することにより、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩を選択する上記（２２）記載のスクリーニング方法、
（２３）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、配列番号：１、配列番号：２２または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記（２２）記載のスクリーニング方法、
（２４）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを含有することを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２５）　上記（２２）記載のスクリーニング方法または上記（２４）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
（２６）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株が、ＮＩＭ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９１）で標示される細胞である上記（１２）、（１８）または（２２）記載のスクリーニング方法、
（２７）　上記（１７）、（２１）または（２５）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２８）　呼吸器疾患の予防・治療剤である上記（２７）記載の医薬、
（２９）　呼吸器疾患が慢性閉塞性肺疾患または気管支喘息である上記（２８）記載の医薬、
（３０）　鼻炎の予防・治療剤である上記（２７）記載の医薬、
（３１）　カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株を用いることを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療剤のスクリーニング方法、
（３２）　上記（１）記載の気道上皮細胞株を用いることを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療剤のスクリーニング方法、
（３３）　上記（１１）記載の細胞およびＩＬ−１３を用いることを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療剤のスクリーニング方法、
（３４）　哺乳動物に対し、上記（１７）、（２１）または（２５）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療方法、
（３５）　呼吸器疾患または鼻炎の予防・治療剤の製造のための、上記（１７）、（２１）または（２５）記載の化合物またはその塩の使用などを提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるカルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質（以下、本発明で用いられるタンパク質または本発明のタンパク質と称することもある）としては、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質ファミリーに属するタンパク質などが用いられ、例えば、配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【０００６】
配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表わされるアミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、クロライドチャネル様活性（例、カルシウム依存性クロライドチャネル様活性）、粘液分泌活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、クロライドチャネル様活性、粘液分泌活性などが同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
クロライドチャネル様活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができ、例えば、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、５４巻、２００頁（１９９８）に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
粘液分泌活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができ、例えば、バイオケミカル　ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ）、３１６巻、９４３頁（１９９６）に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
【０００７】
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、▲１▼配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、▲４▼配列番号：１、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲５▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
【０００８】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、マウスＣＬＣＡ１（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　２７３巻、３２０９６頁、１９９８年）、マウスＣＬＣＡ２（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，　２６４巻、９３３頁、１９９９年）などがあげられる。
【０００９】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
【００１０】
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１１】
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１２】
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１３】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１４】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１５】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１６】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１７】
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　および　Ｍ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
▲２▼ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
▲４▼矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座　１、　タンパク質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００１８】
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：２３、配列番号：２７、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６または配列番号：５７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：２３、配列番号：２７、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６または配列番号：５７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明で用いられるタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：２３、配列番号：２７、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６または配列番号：５７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：２３、配列番号：２７、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６または配列番号：５７で表される塩基配列と約４０％以上、好ましくは約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００１９】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡが、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２３で表される塩基配列を含有するＤＮＡが、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表される塩基配列を含有するＤＮＡが、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４３で表される塩基配列を含有するＤＮＡが、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４５で表される塩基配列を含有するＤＮＡが、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５４で表される塩基配列を含有するＤＮＡが、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５５で表される塩基配列を含有するＤＮＡが、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５６で表される塩基配列を含有するＤＮＡが、配列番号：５３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５７で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２０】
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：２３、配列番号：２７、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６または配列番号：５７で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：２３、配列番号：２７、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６または配列番号：５７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：２３、配列番号：２７、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６または配列番号：５７で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００２１】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２２】
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００２３】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
【００２４】
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ），１３，　２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００２５】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行うことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行うことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，　４７−５５（１９８８））などに記載の方法に従って行うことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００２６】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．　ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．Ａ．　ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，　Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ　１６４０培地〔Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００２７】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００２８】
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００２９】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５　（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３０】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行うことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【００３１】
（１）本発明の気道上皮細胞株
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する気道上皮細胞株（以下、本発明の気道上皮細胞株と略記することもある）としては、本発明で用いられるタンパク質を発現する、ヒトなどの哺乳動物由来の気道上皮細胞株である。
本発明の気道上皮細胞株としては、粘液を分泌する能力を有するものが好ましい。粘液としては、例えば、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質、ＭＵＣ２タンパク質などが挙げられる。
本発明の気道上皮細胞株の気道上皮細胞株であるか否かの確認は、公知の方法を用いて、例えばサイトケラチンの発現の測定によって行えばよい。
本発明の気道上皮細胞株としては、本発明で用いられるタンパク質を高発現するものが好ましい。例えば、ハウスキーピング遺伝子（例、ＧＡＰＤＨ遺伝子）に対して約０．０１％以上、好ましくは約０．１％以上、より好ましくは約１％以上の該タンパク質の遺伝子を発現する気道上皮細胞株などが用いられる。
本発明の気道上皮細胞株は、本発明で用いられるタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞株（以下、気道上皮細胞株Ａと略記することもある）に、サイトカインを接触させることにより得られる。
本発明の気道上皮細胞株には、気道上皮細胞株Ａにサイトカインを接触させることにより得られる、本発明で用いられるタンパク質を発現する細胞も含まれる。
上記気道上皮細胞株Ａとしては、例えば、ヒトなどの哺乳動物の初代気道上皮細胞（例、ラット初代気道上皮細胞など）が株化されたもの、ＳＰＯＣ１細胞〔アメリカン　ジャーナル　オブ　レスピラトリー　セル　アンド　モレキュラーバイオロジー（Ａｍ．　Ｊ．　Ｒｅｓｐｉｒ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．）、１４巻、１４６頁、１９９６年〕などが挙げられる。具体例としては、ラットの気管から細胞を分離し、培地（例、ラット気道上皮細胞用培地〔Ａｍ．　Ｊ．　Ｒｅｓｐｉｒ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１２巻、３８５頁、１９９５年〕の基礎培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に変更し、ＣａＣｌ２を除いた培地など）で、単一細胞に由来するコロニーの出現が認められるまで培養を継続した細胞などが挙げられる。好ましくは、後述の実施例で得られたＮＩＭ−１などが用いられる。
サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１３、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ、ｂＦＧＦなどが挙げられる。好ましくはＩＬ−１３である。
サイトカインの使用量としては、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌ以上、約１ｎｇ／ｍｌ以上が用いられる。
気道上皮細胞株Ａに、サイトカインを接触させる方法は特に限定されず、例えば、プレートに播種された気道上皮細胞株Ａに、サイトカインを添加し、培養する方法などが挙げられる。
【００３２】
（２）気道上皮細胞株Ａまたは本発明の気道上皮細胞株を用いるスクリーニング方法
本発明のタンパク質は、肺・気道の炎症に先立ち発現が増加し、本発明のタンパク質遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドは気道過敏性亢進を抑制するので、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩などは、肺・気道の炎症を伴う肺・胸部疾患や呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、気管支喘息、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、肺線維症など〕、炎症性腸疾患、アレルギー性結膜炎などの予防・治療剤などの医薬として使用できる。
さらに、本発明のタンパク質は、鼻炎時に発現が増加するので、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩などは、例えば、鼻炎（例、アレルギー性鼻炎、花粉症、急性鼻炎、慢性鼻炎、肥厚性鼻炎、萎縮性鼻炎、乾燥性前鼻炎、血管運動性鼻炎、壊疽性鼻炎、副鼻腔炎など）などの予防・治療剤として使用することができる。
したがって、本発明の気道上皮細胞株および気道上皮細胞株Ａは、上記化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性（例えば、クロライドチャネル様活性、粘液分泌活性など）を阻害する化合物またはその塩（以下、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、例えば、（ａ）（ｉ）気道上皮細胞株Ａおよびサイトカインをカルシウム賦活剤で活性化した場合と（ｉｉ）気道上皮細胞株Ａ、サイトカインおよび試験化合物の混合物をカルシウム賦活剤で活性化した場合との比較を行うことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法、（ｂ）（ｉ’）本発明の気道上皮細胞株をカルシウム賦活剤で活性化した場合と（ｉｉ’）本発明の気道上皮細胞株および試験化合物の混合物をカルシウム賦活剤で活性化した場合との比較を行うことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法が挙げられる。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）または（ｉ’）と（ｉｉ’）の場合における、本発明のタンパク質のクロライドチャネル様活性、粘液分泌活性などを測定して、比較する。
クロライドチャネル様活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができ、例えば、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、５４巻、２００頁（１９９８）に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
粘液分泌活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができ、例えば、バイオケミカル　ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ）、３１６巻、９４３頁（１９９６）に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
カルシウム賦活剤としては、例えば、イオノマイシン、Ａ２３１８７（カルシマイシン）などが用いられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００３３】
気道上皮細胞株Ａ、サイトカインおよび試験化合物の混合は、（１）気道上皮細胞株Ａにサイトカインを接触させ、カルシウム賦活剤で活性化する前に試験化合物と混合する、（２）気道上皮細胞株Ａにサイトカインを接触させ、カルシウム賦活剤で活性化した後に試験化合物と混合する、（３）気道上皮細胞株Ａにサイトカインを接触させ、カルシウム賦活剤と試験化合物の混合物を添加するなど、気道上皮細胞株Ａにカルシウム賦活剤を接触させる前に、気道上皮細胞株Ａにサイトカインを接触される順序であれば、いずれの順序で行ってもよい。
本発明の気道上皮細胞株と試験化合物との混合は、本発明の気道上皮細胞株をカルシウム賦活剤で活性化する前または後の何れであってもよく、また本発明の気道上皮細胞株に試験化合物とカルシウム賦活剤の混合物を添加してもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、気道上皮細胞株Ａまたは本発明の気道上皮細胞株をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
例えば、上記（ｉｉ）または（ｉｉ’）の場合におけるクロライドチャネル活性または粘液分泌活性などを、上記（ｉ）または（ｉ’）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
【００３４】
以下に、スクリーニングの具体例を記載する。
（Ａ）気道上皮細胞株Ａを９６穴ブラッククリアボトムプレートにウェルあたり４×１０４個播種する。２日ごとに新鮮な培地〔例、ラット気道上皮細胞用培地（Ａｍ．　Ｊ．　Ｒｅｓｐｉｒ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．、１２巻、３８５頁、１９９５年）の基礎培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に変更し、ＣａＣｌ２を除いた培地など〕に交換しながら培養を継続し、コンフルエントになった細胞にＩＬ−１３を終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、さらに２日間培養する。Ｃｌ−チャネル活性の測定はＦＬＩＰＲ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（モレキュラーデバイス社製）を使用する。２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳバッファー（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂ）で希釈した電位感受性色素（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ａ）を１ウェルあたり７５μｌ添加し、３７℃で２０分間反応する。そのプレートにＣｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂ、またはＣｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂで一定濃度に希釈した試験化合物を１ウェルあたり２５μｌ添加し、３７℃で１０分間反応する。その後、プレートをＦＬＩＰＲにセットし、Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂまたは終濃度１０μＭのイオノマイシンを含むＣｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂを１ウェルあたり５０μｌ添加する。添加後の蛍光変化をＣｌ−チャネル活性として観察する。試験化合物無添加の状態で、イオノマイシン刺激時のＣｌ−チャネル活性を１００％、イオノマイシン無刺激時のＣｌ−チャネル活性を０％として、Ｃｌ−チャネル活性を評価し、Ｃｌ−イオンチャネル阻害作用を有する化合物を選択する。
【００３５】
（Ｂ）本発明の気道上皮細胞株を９６穴ブラッククリアボトムプレートにウェルあたり４×１０５個播種し一晩培養する。２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳバッファー（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂ）で希釈した電位感受性色素（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ａ）を１ウェルあたり７５μｌ添加し、３７℃で２０分間反応する。そのプレートにＣｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂ、またはＣｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂで一定濃度に希釈した試験化合物を１ウェルあたり２５μｌ添加し、３７℃で１０分間反応する。その後、プレートをＦＬＩＰＲにセットし、Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂまたは終濃度１０μＭのイオノマイシンを含むＣｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂを１ウェルあたり５０μｌ添加する。添加後の蛍光変化をＣｌ−チャネル活性として観察する。試験化合物無添加の状態で、イオノマイシン刺激時のＣｌ−チャネル活性を１００％、イオノマイシン無刺激時のＣｌ−チャネル活性を０％として、Ｃｌ−チャネル活性を評価し、Ｃｌ−イオンチャネル阻害作用を有する化合物を選択する。
【００３６】
さらに、本発明は、気道上皮細胞株Ａを用いることを特徴とする本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩（以下、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法も提供する。より具体的には、例えば、
（ｉｉｉ）気道上皮細胞株Ａおよびサイトカインを培養した場合と（ｉｖ）気道上皮細胞株Ａ、サイトカインおよび試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の場合における、本発明のタンパク質遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、気道上皮細胞株Ａをスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の発現を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明のタンパク質遺伝子の発現量は、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやＲｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡＢＩ社製、ＴａｑＭａｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
【００３７】
以下に、スクリーニングの具体例を記載する。
気道上皮細胞株Ａを９６穴プレートにウェルあたり２×１０４個播種し、２日ごとに新鮮培地〔例、ラット気道上皮細胞用培地（Ａｍ．　Ｊ．　Ｒｅｓｐｉｒ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．、１２巻、３８５頁、１９９５年）の基礎培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に変更し、ＣａＣｌ２を除いた培地など〕に交換しながら、４日間培養する。そのプレートに新鮮培地、または新鮮培地で一定濃度に希釈した試験化合物を１ウェルあたり１０μｌ添加し、３７℃で１０分間反応する。その後、ＩＬ−１３を終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、さらに１日間培養し、細胞中の全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ　９６　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出する。これらの全ＲＮＡを出発材料としてＴａｑＭａｎ　Ｇｏｌｄ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。その一部を用いてＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００シークエンスディテクター（アプライドバイオシステムズ社製）を用いたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法により、本発明で用いられるタンパク質の遺伝子（例、ＣＬＣＡ１遺伝子など）のコピー数を測定する。試験化合物無添加の状態で、ＩＬ−１３添加時の本発明で用いられるタンパク質の遺伝子（例、ＣＬＣＡ１遺伝子など）の発現量を１００％、ＩＬ−１３無添加時の本発明で用いられるタンパク質の遺伝子（例、ＣＬＣＡ１遺伝子など）の発現量を０％として、本発明で用いられるタンパク質の遺伝子（例、ＣＬＣＡ１遺伝子など）の発現の阻害度を評価し、本発明で用いられるタンパク質の遺伝子（例、ＣＬＣＡ１遺伝子など）の発現を阻害する作用を有する化合物を選択する。
【００３８】
本発明は、気道上皮細胞株Ａおよびサイトカインを用いることを特徴とする本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩（以下、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法も提供する。より具体的には、例えば、
（ｖ）気道上皮細胞株Ａおよびサイトカインを培養した場合と（ｖｉ）気道上皮細胞株Ａおよびサイトカインと試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体などを用いて（ｖ）と（ｖｉ）の場合における、本発明のタンパク質の産生量（本発明のタンパク質量）を測定（例、本発明のタンパク質の発現を検出、本発明のタンパク質の発現量を定量等）して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、気道上皮細胞株Ａをスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（ｖｉ）の場合における本発明のタンパク質の産生を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の産生（発現）を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
【００３９】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明の気道上皮細胞株、または気道上皮細胞株Ａおよびサイトカインを含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、または本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物もしくはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
【００４０】
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、または本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物もしくはその塩は、例えば、肺・気道の炎症を伴う肺・胸部疾患や呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、気管支喘息、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、肺線維症など〕、炎症性腸疾患、アレルギー性結膜炎に対する予防・治療剤などの医薬として有用である。さらには鼻炎（例、アレルギー性鼻炎、花粉症、急性鼻炎、慢性鼻炎、肥厚性鼻炎、萎縮性鼻炎、乾燥性前鼻炎、血管運動性鼻炎、壊疽性鼻炎、副鼻腔炎など）などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
上記化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。
例えば、上記化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００４１】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、慢性閉塞性肺疾患治療の目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、慢性閉塞性肺疾患治療の目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４２】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ　　　　：相補デオキシリボ核酸
Ａ　　　　　　：アデニン
Ｔ　　　　　　：チミン
Ｇ　　　　　　：グアニン
Ｃ　　　　　　：シトシン
ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
【００４３】
Ｇｌｙ　　　　　　：グリシン
Ａｌａ　　　　　　　　　：アラニン
Ｖａｌ　　　　　　　　　：バリン
Ｌｅｕ　　　　　　　　　：ロイシン
Ｉｌｅ　　　　　　　　　：イソロイシン
Ｓｅｒ　　　　　　　　　：セリン
Ｔｈｒ　　　　　　　　　：スレオニン
Ｃｙｓ　　　　　　　　　　：システイン
Ｍｅｔ　　　　　　　　　：メチオニン
Ｇｌｕ　　　　　　　　　：グルタミン酸
Ａｓｐ　　　　　　　　　：アスパラギン酸
Ｌｙｓ　　　　　　　　　：リジン
Ａｒｇ　　　　　　　　　：アルギニン
Ｈｉｓ　　　　　　　　　：ヒスチジン
Ｐｈｅ　　　　　　　　　：フェニルアラニン
Ｔｙｒ　　　　　　　　　：チロシン
Ｔｒｐ　　　　　　　　　：トリプトファン
Ｐｒｏ　　　　　　　　　：プロリン
Ａｓｎ　　　　　　　　　：アスパラギン
Ｇｌｎ　　　　　　　　　：グルタミン
ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
【００４４】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ　　　　　　：メチル基
Ｅｔ　　　　　　：エチル基
Ｂｕ　　　　　　：ブチル基
Ｐｈ　　　　　　：フェニル基
ＴＣ　　　　　　：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ　　　　　：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ　　　　　：ホルミル
Ｂｚｌ　　　　　：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ　　　　　：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ　　　　　：ベンジルオキシメチル
Ｚ　　　　　　　：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ　　　　：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ　　　　：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ　　　　　：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ　　　　　：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ　　　　　：トリチル
Ｂｕｍ　　　　　：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ　　　　：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ　　　　：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ　　　：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ　　　　：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ　　　　　：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００４５】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ラットＣＬＣＡ１タンパク質の部分アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するラットＣＬＣＡ１タンパク質部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
参考例１で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
参考例１で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
参考例１で用いられたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
参考例１で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
参考例１で用いられたプライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
参考例１で用いられたプライマー６の塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
参考例１で用いられたプライマー７の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例３で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例３で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例３で用いられたＴａｑＭａｎプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
参考例１で用いられたプライマー１０の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
参考例１で用いられたプライマー１１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
参考例１で用いられたＴ７　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
参考例１で用いられたＭ１３ＲＶ　ｐｒｉｍｅｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
参考例１で用いられたプライマー１２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
参考例１で用いられたプライマー１３の塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
参考例１で用いられたプライマーＡＰ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
参考例１で用いられたプライマーＡＰ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
参考例１で用いられたＵ１９　ｐｒｉｍｅｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
ラットＣＬＣＡ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を有するラットＣＬＣＡ１タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
参考例１で用いられたプライマー１４の塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
参考例１で用いられたプライマー１５の塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
マウスＣＬＣＡ４タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２７〕
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を有するマウスＣＬＣＡ４タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
マウスＣＬＣＡ４遺伝子５’側の塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
マウスＣＬＣＡ４遺伝子３’側の塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
参考例２で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
参考例２で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
参考例２で用いられたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
参考例２で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
参考例２で用いられたプライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
参考例２で用いられたプライマー６の塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
参考例２で用いられたプライマー７の塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
参考例２で用いられたプライマー８の塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
参考例２で用いられたプライマー９の塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
参考例２で用いられたプライマー１０の塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
参考例２で用いられたＴ７　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（プロモーター　プライマー）の塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
参考例２で用いられたＭ１３ＲＶ　ｐｒｉｍｅｒ（プライマー）の塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
マウスＣＬＣＡ４Ａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４３〕
配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を有するマウスＣＬＣＡ４Ａタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
ラットＣＬＣＡ４タンパク質の部分アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４５〕
配列番号：４４で表される部分アミノ酸配列を有するラットＣＬＣＡ４タンパク質の部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
参考例２で用いられたプライマー１１の塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
参考例３で用いられたプライマー１２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
参考例３で用いられたプライマー１３の塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
参考例３で用いられたプライマー１４の塩基配列を示す。
〔配列番号：５０〕
ヒトＣＬＣＡ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５１〕
マウスｇｏｂ−５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５２〕
ヒトＣＬＣＡ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５３〕
ヒトＣＬＣＡ４タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５４〕
配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を有するヒトＣＬＣＡ１タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
配列番号：５１で表されるアミノ酸配列を有するマウスｇｏｂ−５タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５６〕
配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を有するヒトＣＬＣＡ２タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５７〕
配列番号：５３で表されるアミノ酸配列を有するヒトＣＬＣＡ４タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【００４６】
後述の実施例１で得られたＮＩＭ−１は、２００２年６月２６日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９１として寄託されている。
後述の参考例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｒＣＬＣＡ１は、２００２年１月９日から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７８４６として、２００１年１２月１８日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ　１６７４２として寄託されている。
後述の参考例２で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＣＬＣＡ４は、２００２年２月１２日から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７８８７として、２００２年１月２９日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７５１として寄託されている。
後述の参考例２で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＣＬＣＡ４Ａは、２００２年３月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３４として、２００２年２月１９日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７６４として寄託されている。
【００４７】
【実施例】
以下に、実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇに記載されている方法に従った。
【００４８】
参考例１
（１）ラットＣＬＣＡ１遺伝子のクローニング
ヒトＣＬＣＡ１遺伝子の塩基配列〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５４巻、２００頁（１９９８）〕、マウスｇｏｂ−５遺伝子の塩基配列〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２５５巻、３４７頁（１９９９）〕およびブタＣＬＣＡ１遺伝子の塩基配列〔Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３巻、１０１頁（２０００）〕の共通配列を参考にして５種のプライマー〔プライマー１（配列番号：３）、プライマー２（配列番号：４）、プライマー３（配列番号：５）、プライマー４（配列番号：６）およびプライマー５（配列番号：７）〕を設計・合成した。次に、ラット胃粘膜組織からＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）を用いて全ＲＮＡを調製した。この全ＲＮＡ　２００ｎｇを出発材料としてＴａｑＭａｎ　Ｇｏｌｄ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて１００μｌの反応液中で逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型としてプライマー１とプライマー４、プライマー１とプライマー５、プライマー２とプライマー３、プライマー３とプライマー５の組み合わせでＰＣＲを行った後、アガロース電気泳動により予想される大きさのＤＮＡ断片が増幅されることを認めた。反応はＴａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いてサーマルサイクラーＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（パーキンエルマー社製）にて、最初９４℃で１分間反応させた後、９４℃で１０秒、６５℃で３０秒、７２℃で２分３０秒を１反応サイクルとして３５サイクル繰り返し、最後は７２℃で１０分間反応させた。得られたＤＮＡ断片はｐＴ７　Ｂｌｕｅ−Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングした。さらにＴ７　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：１５）、Ｕ１９　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：２１）および２種の合成プライマー〔プライマー６（配列番号：８）およびプライマー７（配列番号：９）〕を用いてサイクルシークエンス反応を行い、蛍光ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）で得られた反応物の塩基配列を決定した。その結果、ラットＣＬＣＡ１遺伝子の部分塩基配列として１８７９個の塩基配列を決定した（配列番号：２）。配列番号：２で表される塩基配列を基に、６２５個のアミノ酸配列を決定した（配列番号：１）。該部分アミノ酸配列は、ヒトＣＬＣＡ１の対応する配列とは７５％、マウスｇｏｂ−５の対応する配列とは８８％の相同性を有していた。
【００４９】
（２）ラットＣＬＣＡ１完全長遺伝子のクローニング
上記参考例１（１）で調製したラット胃粘膜全ＲＮＡよりｍＲＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてｍＲＮＡを調製した。このｍＲＮＡ　１μｇを出発材料としてＭａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてＡｄａｐｔｏｒ−ｌｉｇａｔｅｄ　ｃＤＮＡを合成した。５’−ＲＡＣＥのために、このｃＤＮＡを鋳型としてプライマー１０（配列番号：１３）とプライマーＡＰ１（配列番号：１９）（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の組み合わせでＰＣＲを行った後、その反応液を鋳型にプライマー１１（配列番号：１４）とプライマーＡＰ２（配列番号：２０）（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の組み合わせでｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行い、増幅してきたＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ　ｖｅｃｔｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。Ｔ７　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：１５）、Ｍ１３ＲＶ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：１６）を用いてサイクルシークエンス反応を行い、蛍光ＤＮＡシークエンサー３１００（アプライドバイオシステムズ社製）で得られた反応物の塩基配列を決定した。その結果、ラットＣＬＣＡ１　Ｎ末端アミノ酸配列に相当する塩基配列は含まれていなかったので、さらにプライマー１２（配列番号：１７）を合成し、Ａｄａｐｔｏｒ−ｌｉｇａｔｅｄ　ｃＤＮＡを鋳型に、プライマーＡＰ２（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）との組み合わせでＰＣＲを行い、増幅してきたＤＮＡ断片の塩基配列を直接、蛍光ＤＮＡシークエンサー３１００（アプライドバイオシステムズ社製）で決定した。その結果、ラットＣＬＣＡ１　Ｎ末端アミノ酸配列に対応する塩基配列が判明した。
また、３’−ＲＡＣＥのために、Ａｄａｐｔｏｒ−ｌｉｇａｔｅｄ　ｃＤＮＡを鋳型としてプライマー３とプライマーＡＰ１（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の組み合わせでＰＣＲを行った後、その反応液を鋳型にプライマー１３（配列番号：１８）とプライマーＡＰ２（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の組み合わせでｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。続いて増幅してきたＤＮＡ断片の塩基配列を直接、蛍光ＤＮＡシークエンサー３１００（アプライドバイオシステムズ社製）で決定した。その結果、ラットＣＬＣＡ１　Ｃ末端アミノ酸配列に対応する塩基配列が判明した。
以上の結果、ラットＣＬＣＡ１完全長遺伝子は２７３０個の塩基配列を有していることが判明した（配列番号：２３）。配列番号：２３で表される塩基配列がコードする９１０個のアミノ酸配列を、配列番号：２２に示す。
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、ラットＣＬＣＡ１タンパク質と命名した。ラットＣＬＣＡ１タンパク質は、アミノ酸レベルでヒトＣＬＣＡ１と７６％、マウスｇｏｂ−５と８９％の相同性をそれぞれ示した。
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列の第２６８番目から第８８９番目は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第４番目から第６２５番目のアミノ酸配列と同一であった。配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第３番目のＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕは、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列の第２６５番目から第２６７番目ではＡｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇに置換されている。
配列番号：２で表される塩基配列の第１番目から第１０番目の配列は、対応する配列番号：２３の塩基配列ではＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧに置換されている。また、第１７番目のＴ、第２２４番目のＣ、第１７８７番目のＡおよび第１８６８番目のＣは、対応する配列番号：２３の塩基配列では、それぞれＣ、Ｔ、ＣおよびＧに置換されている。
これらの結果をもとに、ラット胃粘膜ｃＤＮＡを鋳型としてプライマー１４（配列番号：２４）とプライマー１５（配列番号：２５）の組み合わせでＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行い、配列番号：２３で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ　ｖｅｃｔｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。このプラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｒＣＬＣＡ１と命名した。
【００５０】
参考例２
（１）マウスＣＬＣＡ４遺伝子のクローニング
ヒトＣＬＣＡ４遺伝子の塩基配列〔ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、４５５巻、２９５頁（１９９９）〕、マウスｇｏｂ−５遺伝子の塩基配列〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２５５巻、３４７頁（１９９９）〕を参考にして４種のプライマー〔プライマー１（配列番号：３０）、プライマー２（配列番号：３１）、プライマー３（配列番号：３２）およびプライマー４（配列番号：３３）〕を設計・合成した。次に、マウス大腸組織からＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）を用いて全ＲＮＡを調製した。さらにｍＲＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてｍＲＮＡを調製した。このｍＲＮＡ　１μｇを出発材料としてＭａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型としてプライマー１とプライマー２、プライマー３とプライマー４の組み合わせでＰＣＲを行った後、アガロース電気泳動により予想される大きさのＤＮＡ断片が増幅されることを認めた。反応はｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いてサーマルサイクラーＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（パーキンエルマー社製）にて、最初９４℃で３０秒間反応させた後、９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分３０秒を１反応サイクルとして３５サイクル繰り返し、最後は７２℃で１０分間反応させた。得られたＤＮＡ断片はｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。さらにＴ７　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：４０）、Ｍ１３ＲＶ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：４１）および６種の合成プライマー〔プライマー５（配列番号：３４）、プライマー６（配列番号：３５）、プライマー７（配列番号：３６）、プライマー８（配列番号：３７）、プライマー９（配列番号：３８）およびプライマー１０（配列番号：３９）〕を用いてサイクルシークエンス反応を行い、蛍光ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）で得られた反応物の塩基配列を決定した。その結果、マウスＣＬＣＡ４遺伝子の部分塩基配列としてマウスＮ末端配列を含有する２０２７個の塩基配列を挿入したクローンＮｏ．３−１（配列番号：２８）とマウスＣ末端配列を含有する１８６９個の塩基配列を挿入したクローンＮｏ．７−３（配列番号：４）を取得した。両者の重複配列を除き、マウスＣＬＣＡ４は２７７２個の塩基配列からなることが判明した（配列番号：２７）。配列番号：２７で表される塩基配列を基に、９２４個のアミノ酸配列を決定し（配列番号：２６）、マウスＣＬＣＡ４タンパク質と命名した。つづいてクローンＮｏ．７−３をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１．４ＫｂのマウスＣＬＣＡ４　Ｃ末端領域を含むＤＮＡ断片を切り出した。これを同じくＨｉｎｄＩＩＩで消化したクローンＮｏ．３−１のマウスＣＬＣＡ４　Ｎ末端領域を含むベクター配列に連結し、マウスＣＬＣＡ４完全長配列を含むプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＣＬＣＡ４を構築した。このプラスミドを含む形質転換体をエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　���ｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＣＬＣＡ４と命名した。
マウスＣＬＣＡ４は、アミノ酸レベルで、ヒトＣＬＣＡ４と６８％の相同性を、マウスｇｏｂ−５と５１％の相同性を有していた。
【００５１】
（２）マウスＣＬＣＡ４Ａ遺伝子のクローニング
マウスＣＬＣＡ４遺伝子のクローニングの際、マウスＣＬＣＡ４とは異なる塩基配列を有するクローンの存在が示唆された。そこで、マウス平滑筋ｃＤＮＡ（Ｍｏｕｓｅ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩＩ：クロンテック社製）を鋳型として、プライマー１（配列番号：３０）とプライマー１１（配列番号：４６）の組み合わせでＰＣＲを行い、アガロース電気泳動により２．７ＫｂのＤＮＡ断片が増幅されることを認めた。反応はｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いてサーマルサイクラーＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（パーキンエルマー社製）にて、最初９４℃で３０秒間反応させた後、９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で５分を１反応サイクルとして３５サイクル繰り返し、最後は７２℃で１０分間反応させた。得られたＤＮＡ断片はｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。さらにＴ７　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：４０）、Ｍ１３ＲＶ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：４１）および６種の合成プライマー〔プライマー５（配列番号：３４）、プライマー６（配列番号：３５）、プライマー７（配列番号：３６）、プライマー８（配列番号：３７）、プライマー９（配列番号：３８）およびプライマー１０（配列番号：３９）〕を用いてサイクルシークエンス反応を行い、蛍光ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）で得られた反応物の塩基配列を決定した。その結果、マウスＣＬＣＡ４とアミノ酸レベルで９４％、ヒトＣＬＣＡ４と６８％の相同性を示す９２４個のアミノ酸からなるタンパク質（配列番号：４２）がコードされていることが判明し（配列番号：４３）、マウスＣＬＣＡ４Ａタンパク質と命名した。上記プラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＣＬＣＡ４を構築した。このプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯを含む形質転換体をエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＣＬＣＡ４Ａと命名した。
【００５２】
参考例３
ラットＣＬＣＡ４遺伝子のクローニング
ヒトＣＬＣＡ４遺伝子の塩基配列〔ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、４５５巻、２９５頁、１９９９年〕、マウスＣＬＣＡ４遺伝子の塩基配列（配列番号：２７）およびマウスＣＬＣＡ４Ａ遺伝子の塩基配列を参考にして２種のプライマー〔プライマー１２（配列番号：４７）およびプライマー１３（配列番号：４８）〕を設計・合成した。次に、ラット腸組織からＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）を用いて全ＲＮＡを調製した。さらにｍＲＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてｍＲＮＡを調製した。このｍＲＮＡ　１μｇを出発材料としてＭａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型としてプライマー１２とプライマー１３の組み合わせでＰＣＲを行った後、アガロース電気泳動により予想される大きさのＤＮＡ断片が増幅されることを認めた。反応はｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いてサーマルサイクラーＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（パーキンエルマー社製）にて、最初９４℃で３０秒間反応させた後、９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分を１反応サイクルとして３５サイクル繰り返し、最後は７２℃で１０分間反応させた。得られたＤＮＡ断片はｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。さらにＴ７　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：４０）、Ｍ１３ＲＶ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：４１）および３種の合成プライマー〔プライマー１２（配列番号：４７）、プライマー１３（配列番号：４８）、プライマー１４（配列番号：４９）〕を用いてサイクルシークエンス反応を行い、蛍光ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）で得られた反応物の塩基配列を決定した。その結果、ラットＣＬＣＡ４遺伝子の部分塩基配列として１１１９個の塩基配列を挿入したクローンＮｏ．ａ−２０（配列番号：４５）を取得した。配列番号：４５で表される塩基配列を基に、３７３個の部分アミノ酸配列を決定した（配列番号：４４）。該部分アミノ酸配列は、ヒトＣＬＣＡ４の対応する配列とは６６％、マウスＣＬＣＡ４、マウスＣＬＣＡ４Ａの対応する配列とは８１％の相同性を有していた。
【００５３】
実施例１
（１）ラット初代気道上皮細胞の分離
Ｗｉｓｔａｒラット（オス、７週齢）を密封容器に入れ、炭酸ガス注入により窒息死させた後、組織培養の技術〔第２版〕１３２頁（日本組織培養学会編、朝倉書店）記載の方法に準じて、カニューレを気管に挿入後、気管を摘出した。取り出した気管の内外をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン社製）で十分に洗浄し、付着した血液を除去した後、注射筒を用いてカニューレから充分量の１％プロテアーゼ液（Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ｔｙｐｅ１４、シグマ社製）を気管の内部に流した。その後、気管下端を手術糸で結紮し、１％　プロテアーゼ液で気管内腔を満たし、５０ｍｌ遠心管内のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に浸した。３７℃で１時間処理後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋５％　ＦＢＳを入れた注射筒をカニューレに連結し、内筒を数回上下させ、気管内の細胞を含んだプロテアーゼ液を気管から出し入れして細胞の分離を十分にした後、気管の下端をハサミで切開してプロテアーゼ液を押し流し、細胞を含んだプロテアーゼ液を遠心管に集めた。上記方法で得られた細胞を含んだ液を遠心（１０００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ラット気道上皮細胞用培地〔アメリカン　ジャーナル　オブ　レスピラトリーセル　アンド　モレキュラー　バイオロジー（Ａｍ．　Ｊ．　Ｒｅｓｐｉｒ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．）１２巻、３８５頁（１９９５）〕の基礎培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に変更し、ＣａＣｌ２を除いた培地（以下、改変ラット気道上皮細胞用培地と称する）に懸濁し、１０ｃｍ２φ　ＴｙｐｅＩコラーゲンコートディッシュ（岩城硝子社製）に播種した。
【００５４】
（２）ラット気道上皮細胞株、ＮＩＭ−１細胞の樹立
２日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら培養を継続し、コンフルエントになった細胞を０．２５％　トリプシン・１ｍＭ　ＥＤＴＡ液（インビトロジェン社製）で剥がし、新たに３×１０４個の細胞を１０ｃｍ２φ　ＴｙｐｅＩコラーゲンコートディッシュに播種した。２日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら、４０日間培養を継続した。その後、細胞を０．２５％トリプシン・１ｍＭ　ＥＤＴＡ液で剥がし、新たに５×１０４個の細胞を１０ｃｍ２φ　ＴｙｐｅＩコラーゲンコートディッシュに播種した。さらに２日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら、２０日間培養を継続した。その後、細胞を０．２５％　トリプシン・１ｍＭ　ＥＤＴＡ液で剥がし、新たに３×１０４個の細胞を１０ｃｍ２φ　ＴｙｐｅＩコラーゲンコートディッシュに播種した。さらに２日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら、１５日間培養を継続した。その後、細胞を０．２５％　トリプシン・１ｍＭ　ＥＤＴＡ液で剥がし、新たに３×１０４個の細胞を１０ｃｍ２φ　ＴｙｐｅＩコラーゲンコートディッシュに播種した。さらに２日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら、１２日間培養を継続した。その後、細胞を０．２５％　トリプシン・１ｍＭ　ＥＤＴＡ液で剥がし、新たに３×１０３個の細胞を１０ｃｍ２φ　ＴｙｐｅＩコラーゲンコートディッシュに播種した。さらに２日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら培養を行うことにより、単一細胞に由来するコロニーの出現が認められ、ＮＩＭ−１細胞として樹立した。
【００５５】
実施例２
抗サイトケラチン抗体、抗ムチン抗体を用いた気道上皮細胞の証明
実施例１で得られたＮＩＭ−１細胞を８穴コラーゲンコートカルチャースライド（ベクトン・ディッキンソン社製）にウェルあたり５×１０４個播種した。培養２日目に新鮮培地に交換し、培養４日目にＰＢＳで洗浄後、４％パラフォルムアルデヒド（和光純薬社製）で１０分間、細胞を固定した。０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＰＢＳ溶液で洗浄後、５％　ＢＳＡで３０分間ブロッキングした。その後、上皮細胞を認識するための一次抗体としてウサギ由来の抗サイトケラチン抗体（ＩＣＮ社製）を４℃で一晩反応させ、その検出にＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で蛍光標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（モレキュラープローブス社製）を室温で３０分間反応させた。さらに粘液を認識するための一次抗体として、マウス由来の抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体、または抗ＭＵＣ２抗体（ともにネオマーカーズ社製）を室温で３０分間反応させ、その検出にＴｅｘａｓ　Ｒｅｄで蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体（モレキュラープローブス社製）を室温で３０分間反応させた。反応後、細胞核検出用のＤＡＰＩを含む封入剤ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ベクターラボラトリーズ社製）にて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＮＩＭ−１細胞はサイトケラチンを発現する気道上皮細胞であり、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質およびＭＵＣ２タンパク質を含有する粘液を産生していることが確認された。
【００５６】
実施例３
ＮＩＭ−１細胞におけるＩＬ−１３添加によるラットＣＬＣＡ１遺伝子の発現誘導
実施例１で得られたＮＩＭ−１細胞を９６穴コラーゲンコートプレート（ベクトン・ディッキンソン社製）にウェルあたり２×１０４個播種した。培養２日目に新鮮培地に交換し、培養４日目にマウスＩＬ−１３を終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、添加２４時間後の全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ　９６　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。これらの全ＲＮＡを出発材料としてＴａｑＭａｎ　Ｇｏｌｄ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて１００μｌの反応液中で逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。そのうちの１０μｌを用いてＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００シークエンスディテクター（アプライドバイオシステムズ社製）を用いたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法により、ラットＣＬＣＡ１遺伝子コピー数を測定した。
遺伝子量検出に用いたプライマー〔プライマー１（配列番号：１０）、プライマー２（配列番号：１１）〕およびＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：１２）はＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓプログラムを用いて設計した。ＴａｑＭａｎプローブのレポーター色素には６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）を使用した。内部標準としてラットＧＡＰＤＨ遺伝子のコピー数をＴａｑＭａｎ　Ｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ＶＩＣ　Ｐｒｏｂｅ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて求めた。非特異的な増幅を除去するために逆転写酵素を含まないサンプルも同様に処理し、次式より、ＧＡＰＤＨ遺伝子あたりのラットＣＬＣＡ１遺伝子コピー数を求めた。
（逆転写酵素含有サンプル中の遺伝子コピー数）−（逆転写酵素非含有サンプル中の遺伝子コピー数）＝（遺伝子コピー数）
その結果、ＮＩＭ−１細胞では、ラットＣＬＣＡ１がＩＬ−１３に依存して発現誘導されることがわかった（図１）。
【００５７】
実施例４
ＮＩＭ−１細胞におけるＩＬ−１３添加によるＣａ２＋依存性Ｃｌ−チャネル活性の増加
実施例１で得られたＮＩＭ−１細胞を９６穴ブラッククリアボトムプレート（コースター社製）にウェルあたり４×１０４個播種した。２日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら培養を継続し、コンフルエントになった細胞にマウスＩＬ−１３を終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、さらに２日間培養した。Ｃｌ−チャネル活性の測定はＦＬＩＰＲ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（モレキュラーデバイス社製）を使用した。２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳバッファー（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂ）で希釈した電位感受性色素（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ａ）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、３７℃で３０分間反応させた。その後、プレートをＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社製）にセットし、終濃度１０μＭのイオノマイシン刺激後の膜電位変化を蛍光強度の変化として観察した。その結果、ＩＬ−１３を添加して培養したＮＩＭ−１細胞において、Ｃａ２＋依存性Ｃｌ−チャネル活性の増加に伴う膜電位の上昇が観察された（図２）。
【００５８】
実施例５
ラット気道上皮細胞株におけるＩＬ−１３添加による粘液分泌の増加
実施例１で得られたＮＩＭ−１細胞を９６穴コラーゲンコートプレートにウェルあたり４×１０４個播種した。２日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら培養を継続し、コンフルエントになった細胞にマウスＩＬ−１３を終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、さらに２日間培養した。ＰＢＳで洗浄後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換し３７℃、２０分間反応を３回行った。その後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に希釈した終濃度１０μＭのイオノマイシンを添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、分泌された粘液を含む上清を新たな９６穴プレートに移し、３７℃で２時間吸着させた。上清中の粘液をプレートに吸着させた後、０．３％　ＢＳＡおよび０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＮ社製）を含むＰＢＳ溶液で洗浄後、３％　ＢＳＡで３７℃、２時間のブロッキングを行った。その後、粘液を認識するために、ビオチン化したＵｌｅｘ　Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｉ（ＵＥＡ−Ｉ、和光純薬社製）を３７℃、１時間反応させ、その検出用にＨＲＰ標識したストレプトアビジン（ベクターラボラトリーズ社製）を室温で１時間反応させた。０．３％　ＢＳＡおよび０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄後、ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）にて３分間発色反応を行い、ＴＭＢ　Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ社製）で反応停止後、吸光光度計にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。ムチン濃度はコントロールとして使用したブタ胃ムチン（シグマ社製）の吸光度をもとに検量線を作成して算出した。
その結果、ＩＬ−１３を添加して培養したＮＩＭ−１細胞において、イオノマイシン刺激による粘液分泌の増加が観察された（図３）。
【００５９】
実施例６
ラットＣＬＣＡ１遺伝子の発現を指標としたスクリーニング
実施例１で得られたＮＩＭ−１細胞を９６穴プレートにウェルあたり２×１０４個播種し、２日ごとに新鮮改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら、４日間培養する。そのプレートに新鮮培地、または新鮮培地で一定濃度に希釈した試験化合物を１ウェルあたり１０μｌ添加し、３７℃で１０分間反応する。その後、マウスＩＬ−１３を終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、さらに１日間培養し、実施例３に記載の方法に従い、細胞中の全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ　９６　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出する。これらの全ＲＮＡを出発材料としてＴａｑＭａｎ　Ｇｏｌｄ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。その一部を用いてＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００シークエンスディテクター（アプライドバイオシステムズ社製）を用いたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法により、ＣＬＣＡ１遺伝子コピー数を測定する。試験化合物無添加の状態で、ＩＬ−１３添加時のＣＬＣＡ１発現量を１００％、ＩＬ−１３無添加時のＣＬＣＡ１発現量を０％として、ＣＬＣＡ１発現の阻害度を評価し、ＣＬＣＡ１発現阻害作用を有する化合物を選択する。
【００６０】
実施例７
Ｃａ２＋依存性Ｃｌ−チャネル活性を指標としたスクリーニング
実施例４で示したＦＬＩＰＲ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔを使用してＣａ２＋依存性Ｃｌ−チャネル活性を指標としたスクリーニングを行う。
実施例１で得られたＮＩＭ−１細胞を９６穴ブラッククリアボトムプレートにウェルあたり４×１０４個播種する。２日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら培養を継続し、コンフルエントになった細胞にマウスＩＬ−１３を終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、さらに２日間培養する。Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂで希釈したＣｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ａを１ウェルあたり７５μｌ添加し、３７℃で２０分間反応する。そのプレートにＣｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂ、またはＣｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂで一定濃度に希釈した試験化合物を１ウェルあたり２５μｌ添加し、３７℃で１０分間反応する。その後、プレートをＦＬＩＰＲにセットし、ＣｏｍｐｏｎｅｎｔＢまたは終濃度２μＭのイオノマイシンを含むＣｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｂを１ウェルあたり５０μｌ添加する。添加後の蛍光変化をＣｌ−チャネル活性として観察する。試験化合物無添加の状態で、イオノマイシン刺激時のＣｌ−チャネル活性を１００％、イオノマイシン無刺激時のＣｌ−チャネル活性を０％として、Ｃｌ−チャネル活性を評価し、Ｃｌ−イオンチャネル阻害作用を有する化合物を選択する。
【００６１】
実施例８
粘液分泌を指標としたスクリーニング
実施例５で示した粘液分泌活性を指標としたスクリーニングを行う。
実施例１で得られたＮＩＭ−１細胞を９６穴コラーゲンコートプレートにウェルあたり４×１０４個播種する。２日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら培養を継続し、コンフルエントになった細胞にマウスＩＬ−１３を終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、さらに２日間培養する。ＰＢＳで洗浄後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換し３７℃、２０分間反応を３回行う。培地を除去後、新たなＤＭＥＭ／Ｆ１２培地またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で一定濃度に希釈した試験化合物を１ウェルあたり１００μｌ添加し、３７℃で１０分間反応する。その後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に希釈した終濃度１０μＭのイオノマイシンを１ウェルあたり１００μｌ添加し、３７℃で３０分間反応させる。反応後、分泌された粘液を含む上清を回収し、新たな９６穴プレートに３７℃で２時間吸着させる。０．３％　ＢＳＡおよび０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄後、３％　ＢＳＡで３７℃、２時間のブロッキングを行う。その後、ビオチン化したＵＥＡ−Ｉを３７℃、１時間反応させ、その検出用にＨＲＰ標識したストレプトアビジンを室温で１時間反応させる。０．３％　ＢＳＡおよび０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄後、ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅにて３分間発色反応を行い、ＴＭＢ　Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎで反応停止後、吸光光度計にて４５０ｎｍの吸光度を測定する。コントロールとして使用したブタ胃ムチンの吸光度をもとに検量線を作成し、ムチン濃度を算出する。試験化合物無添加の状態で、イオノマイシン刺激時のムチン濃度を１００％、イオノマイシン無刺激時のムチン濃度を０％として、粘液分泌活性を評価し、粘液分泌阻害作用を有する化合物を選択する。
【００６２】
実施例９
ラットＣＬＣＡ１遺伝子の発現を指標としたスクリーニング
ラット気道上皮細胞株（ＳＰＯＣ１）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４巻、１４６頁、１９９６年）を９６穴コラーゲンプレート（ベクトン・ディキンソン社製）に１×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し４日間培養した。培養４日目に、リコンビナントマウスＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ社製）および、各種濃度（１、１０および１００μＭ）のワートマンニン（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を添加し、さらに２４時間培養した。なお、ワートマンニンを添加していない細胞をコントロールとした。
細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μｌ／ｗｅｌｌのＬｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ　Ｈｉｇｈ　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｋｉｔ、Ｂａｙｅｒ社製）を加え、３７℃で３０分間静置し細胞を溶解した。各穴に１００μｌのＰｒｏｂｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ　Ｈｉｇｈ　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｋｉｔ、Ｂａｙｅｒ社製）を加えてピペッティングにより攪拌した後、１００μｌをサンプリングしてｂＤＮＡ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｐｌａｔｅ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ　Ｈｉｇｈ　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｋｉｔ、Ｂａｙｅｒ社製）に添加し、５３℃で１６〜２４時間反応させた。Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ　Ｈｉｇｈ　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｋｉｔ、Ｂａｙｅｒ社製）でプレートを２回洗浄後、１００μｌのＡｍｐｌｉｆｅｒ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ　Ｈｉｇｈ　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｋｉｔ、Ｂａｙｅｒ社製）を加え、４６℃で２時間反応させた。さらに、Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒでプレートを２回洗浄後、Ｌａｂｅｌ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ　Ｈｉｇｈ　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｋｉｔ、Ｂａｙｅｒ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４６℃で２時間反応させた。プレートを室温に戻しＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒでプレートを２回洗浄後、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ　Ｈｉｇｈ　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｋｉｔ、Ｂａｙｅｒ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４６℃で１時間反応させた。プレートを室温に戻した後、プレートリーダーで発光強度を測定した。ラットＣＬＣＡ１の発現量に比例して発光強度が増加するので、発光強度を測定することによりラットＣＬＣＡ１のｍＲＮＡを定量することができる。ワートマンニンを添加していないコントロール細胞では、ＩＬ−１３によりラットＣＬＣＡ１が発現誘導され発光強度が増加する。
結果を図４に示す。
これより、ワートマンニンは濃度依存的にラットＣＬＣＡ１の発現を抑制することがわかる。
よって、上記スクリーニングを用いて、ＣＬＣＡ１の発現を抑制する化合物を選択することができる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の上皮気道細胞株は、長期間、安定に本発明で用いられるタンパク質を高発現する。従って、本発明の上皮気道細胞株や、上皮気道細胞株Ａおよびサイトカインを用いることにより、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩が、効率よくスクリーニングでき、上記化合物またはその塩は、例えば、肺・気道の炎症を伴う肺・胸部疾患や呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、気管支喘息、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、肺線維症など〕、炎症性腸疾患、アレルギー性結膜炎、鼻炎（例、アレルギー性鼻炎、花粉症、急性鼻炎、慢性鼻炎、肥厚性鼻炎、萎縮性鼻炎、乾燥性前鼻炎、血管運動性鼻炎、壊疽性鼻炎、副鼻腔炎など）などの予防・治療剤として有用である。
【００６４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３における、ＮＩＭ−１細胞のＩＬ−１３添加時のラットＣＬＣＡ１遺伝子の発現量を表す図である。図中、□はＩＬ−１３無添加培養群、■はＩＬ−１３添加培養群を示す。
【図２】実施例４における、ＩＬ−１３を添加して培養したＮＩＭ−１細胞のＣａ２＋依存性Ｃｌ−チャネル活性の増加に伴う膜電位の上昇を表す図である。図中、■はＩＬ―１３添加培養・イオノマイシン刺激群、□はＩＬ―１３添加培養・イオノマイシン無刺激群、▲はＩＬ―１３無添加培養・イオノマイシン刺激群、△はＩＬ―１３無添加培養・イオノマイシン無刺激群を示す。
【図３】実施例５における、ＩＬ−１３を添加して培養したＮＩＭ−１細胞の、イオノマイシン刺激による粘液分泌の増加を表す図である。図中、□はＩＬ―１３無添加培養群、■はＩＬ―１３添加培養群を示す。
【図４】実施例９における、ＳＰＯＣ１細胞でのＩＬ−１３によるラットＣＬＣＡ１遺伝子の発現誘導に対するワートマンニンの抑制作用を表す図である。図中、縦軸はコントロールの発光強度を１００％としたときのワートマンニン添加時の発光強度を示す。白いバーはワートマンニン濃度１００μＭ、灰色のバーはワートマンニン濃度１０μＭ、黒いバーはワートマンニン濃度１μＭを添加した場合のラットＣＬＣＡ１遺伝子の発現量である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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