(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを酵素還元して光学活性なＮ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造する方法において、効率的に高い光学純度の光学活性なＮ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法を提供すること。【解決手段】Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素を作用させることを特徴とする光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法。＜アミノ酸配列群＞（ａ）特定のアミノ酸配列を有する酵素。（ｂ）特定のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列等【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素を作用させることを特徴とする光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【請求項２】
補酵素ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）存在下、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに酵素を作用させることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
２級アルコールの存在下、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに酵素を作用させることを特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
２級アルコールが２−プロパノールであることを特徴とする請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールが、（Ｓ）−（−）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールであることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元してＮ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成させるための触媒としての、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素の使用。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、β−ラクタム系抗生物質やジヒドロピリジン系化合物等の生理活性物質製造の中間体として有用な、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法として、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元するコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物が産生する還元酵素の存在下、このＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して光学活性なＮ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造する方法（例えば、特許文献１記載。）が知られている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平６−１４１８７６号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来法は、基質濃度が低く反応スケールも小さいため実用的ではない。また、微生物の菌体の培養及び酵素の精製を反応毎に行っており工業的に有利とは言い難い。
本発明の課題は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを酵素還元して光学活性なＮ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造する方法において、効率的に高い光学純度の光学活性なＮ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、コリネバクテリウム属に属する微生物由来の還元酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターに組み込んで得られる組み換え大腸菌およびその処理物を用いてＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを還元すると、高い光学純度の光学活性なＮ−ベンジル−３−ピロリジノールを効率的に製造できることを見出し、本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素を作用させることを特徴とする光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノーを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列；
２．補酵素ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）存在下、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに酵素を作用させることを特徴とする前項１記載の製造方法；
３．２級アルコールの存在下、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに酵素を作用させることを特徴とする前項１又は２記載の製造方法；
４．２級アルコールが２−プロパノールであることを特徴とする前項３記載の製造方法；
５．光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールが、（Ｓ）−（−）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールであることを特徴とする前項１記載の製造方法；
６．Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元してＮ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成させるための触媒としての、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素の使用；
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノーを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
等を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明製造方法において、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用させる酵素は、少なくとも「Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力」を有しており、かつ、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素（以下、本還元酵素と記すこともある。）である。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
尚、本還元酵素は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力の他に、さらに当該能力を有する酵素が依存する補酵素を再生する能力を同時に有する酵素であってもよい。
【０００８】
本還元酵素をＮ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用させるには、本還元酵素自体であるタンパク質を当該基質に直接的に作用させてもよいし、本酵素を含有する微生物（天然に存在する微生物若しくは人為的に作製される微生物であってもよい。）又は当該微生物の処理物（例えば、死菌化細胞、抽出物、粗精製物等）の形態で本酵素を当該基質に間接的に作用させてもよい。
【０００９】
人為的に作製される微生物は、突然変異処理により作製される微生物であってもよいし、遺伝子工学的な手法を用いて作製させる微生物（以下、本形質転換体と記すこともある。）であってもよい。尚、本形質転換体を作製する際に用いられる本還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本還元酵素遺伝子と記すこともある。）は、（１）天然に存在する遺伝子の中からクローニングされたものであってもよいし、（２）天然に存在する遺伝子であっても、このクローニングされた遺伝子の塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子（即ち、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変異導入法、突然変異処理等）を行ったものであってもよいし、（３）人為的に合成されたものであってもよい。
【００１０】
ここで、前記（ｂ）にある「アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」や前記（ｄ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素が細胞内で受けるプロセシング、該酵素が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
【００１１】
前記（ｂ）「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
【００１２】
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンをＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を見出すことのできる範囲であればよい。
【００１３】
また前記欠失、置換若しくは付加のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【００１４】
本発明において「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」には、例えば、２つの蛋白質間のアミノ酸配列に関する高い配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。また「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」には２つのＤＮＡ間の塩基配列に関する配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。
ここで「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
前記（ｄ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）に記載される方法や、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）に記載されているサザンハイブリダイゼーション法等の通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（９００ｍＭ  ＮａＣｌ、９０ｍＭ  クエン酸三ナトリウムを含む溶液。尚ここでは、ＮａＣｌ１７５．３ｇ、クエン酸三ナトリウム８８．２ｇを含む溶液を水８００ｍｌで溶解し、１０Ｎ  ＮａＣｌでｐＨを調製した後、全量を１０００  ｍｌとした溶液を２０×ＳＳＣとする。）中で６５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９），  ６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．１×ＳＳＣで６５℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１５】
本還元酵素遺伝子は、例えば、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｅｒｉｔｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本還元酵素遺伝子を調製する。
ここでコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム由来の染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行う場合には、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本還元酵素遺伝子を調製することになる。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）‐５０℃（０．５分間）‐７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）‐５５℃（０．５分間）‐７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  （東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本還元酵素遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。
【００１６】
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（以下、本補酵素再生酵素遺伝子と記すこともある。）は、例えば、本補酵素再生酵素遺伝子が本還元酵素とは異なる酵素である場合には、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）等のバシラス属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号７で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本補酵素再生酵素遺伝子を調製する。
ここでバシラス・メガテリウム由来の染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行う場合には、配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本補酵素再生酵素遺伝子を調製することになる。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）‐５０℃（０．５分間）‐７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）‐５５℃（０．５分間）‐７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  （東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本還元酵素遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。
【００１７】
本形質転換体を調製する方法としては、例えば、（１）本還元酵素遺伝子と本補酵素再生酵素遺伝子との両遺伝子及び宿主細胞で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような遺伝子が宿主細胞中で発現できるような単一な組換プラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入することにより作製する方法、（２）本還元酵素遺伝子と本補酵素再生酵素遺伝子との両遺伝子のうちの一方の遺伝子及び宿主細胞で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような遺伝子のうちの一方の遺伝子が宿主細胞中で発現できるような組換プラスミドを上記遺伝子毎に別々に作製し、これらを宿主細胞に導入することにより作製する方法等があげられる。さらに、一方の遺伝子又は両遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入する方法も利用することができる。
尚、上記単一な組換プラスミドを宿主細胞に導入することにより作製する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両遺伝子に連結して組換プラスミドを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換プラスミドを構築する方法等をあげることができる。
ここで上記の組換プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーを持つ発現ベクターに、本還元酵素をコードする遺伝子が機能可能な形で導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。
ここで、「機能可能な形で」とは、上記の組換プラスミドを宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本還元遺伝子等が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、又は、ｔａｃプロモーターもしくはｔｒｃプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができる。またコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム、バシラス・メガテリウムにおいて本還元遺伝子等の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
また発現ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして容易に選択することができる。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本還元酵素及び／又は本補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ  ２０，  ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ｐ２０２，  講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
宿主細胞としては、例えば、原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）もしくは真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）である微生物等（尚、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等であってもよい。）を挙げることができる。例えば、本形質転換体の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
本還元酵素及び／又は本補酵素再生酵素が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される塩化カルシウム法や、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ／Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  （１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
宿主細胞において本還元酵素遺伝子及び／又は本補酵素再生酵素遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドが導入された形質転換体を選抜するには、前記の如く、例えば、ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
プラスミドが導入された宿主細胞（即ち、形質転換体）が本還元酵素遺伝子及び本補酵素再生酵素遺伝子を保有していることは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００１８】
本形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
培養温度は、本形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。培地のｐＨは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
本形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
さらに、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｌａｃプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと、本還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが導入されてなる形質転換体の場合には、本還元酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。
【００１９】
本形質転換体の取得は、例えば、前記の培養により得られた培養物を遠心分離等により形質転換体を沈殿物として回収すればよい。必要に応じて、回収前に当該形質転換体を、例えば、１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７）等の緩衝液等を用いて洗浄してもよい。
【００２０】
さらに本形質転換体から、その死菌化細胞を下記の方法により調製することもできる。
死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）をあげることができる。尚、これらの殺菌法のうちできるだけ本還元酵素等の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を各種の反応条件に応じて適宜選択することがよい。
【００２１】
このようにして調製された形質転換体又はその死菌化細胞は、例えば、凍結乾燥細胞、有機溶媒処理細胞、乾燥細胞等の形態、あるいは、固定化された形態（固定化物）で利用してもよい。
【００２２】
固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本形質転換体又はその死菌化細胞を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本形質転換体又はその死菌化細胞を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００２３】
続いて、本発明製造方法における触媒反応について説明する。
本発明製造方法においてＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する反応は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに本還元酵素（尚、勿論、本形質転換体又はその死菌化細胞の形態で提供される本還元酵素であってもよい。）を作用させることによって達成される。
当該反応は、通常、水の存在下で行われる。水は緩衝液の形態であってもよく、この場合に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩が挙げられる。
尚、緩衝液を溶媒として用いる場合、その量はＮ−ベンジル−３−ピロリジノン１重量部に対して、通常、１〜３００重量倍、好ましくは５〜１００重量倍である。
当該反応に際しては、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを反応系内に連続又は逐次加えてもよい。
【００２４】
反応温度としては、本還元酵素の安定性、反応速度の点から１５〜５０℃程度をあげることができ、好ましくは約２０〜４０℃があげられる。
反応ｐＨとしては、反応が進行する範囲内で適宜変化させることができるが、通常４〜１１、好ましくは６〜９をあげることができる。
【００２５】
反応は、水の他に有機溶媒の共存下に行うこともできる。この場合の有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デカン等の炭化水素類、ｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
反応に使用する有機溶媒の量は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに対して、通常、１００重量倍以下であり、好ましくは７０重量倍以下である。
【００２６】
反応はさらに、例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨのような補酵素を加えて通常行うことがよい。
反応に用いられる補酵素の量は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに対して、通常、０．５重量倍以下、好ましくは０．１重量倍以下である。
【００２７】
本発明製造方法における触媒反応では、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンの不斉的な還元反応において化学量論量の還元型補酵素（電子供与体）が消費された結果生じた酸化型補酵素（電子受容体）を、再び還元型補酵素（電子供与体）に変換する能力、即ち、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する能力を有する酵素が依存する補酵素を再生する能力、を有する酵素（即ち、本補酵素再生酵素）の利用が不可欠となる。この場合には、本補酵素再生酵素は、前記不斉的な還元反応を行う本還元酵素とは異なる酵素であってもよいし、また本還元酵素が補酵素再生酵素としての機能を合わせ持つものであってもよい。もちろん両者の組み合わせであってもよい。
ここで、「本還元酵素が補酵素再生酵素としての機能を合わせ持つもの」であることは、例えば、単離された本還元酵素を用いて酸化型補酵素（電子受容体）の存在下で、補酵素再生酵素の基質である再生系原料化合物を酸化させる反応を行うことにより還元型補酵素（電子供与体）を生じるか否かを調べることにより確認すればよい。
本補酵素再生酵素としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。中でも、脂肪族アルコール（例えば、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、２−オクタノール等の２００℃以下の沸点をもつアルコール等）を還元することにより補酵素再生を行う補酵素再生酵素が好ましい。この場合に用いられる脂肪族アルコールの量は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン対して１００モル倍以下、好ましくは２０モル倍以下である。
【００２８】
反応は、例えば、水、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン、本形質転換体又はその死菌化細胞、及び必要に応じて補酵素、有機溶媒等を混合し、攪拌、振盪することにより行うことができる。
【００２９】
反応の終点は、例えば、反応液中の原料化合物の存在量を液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により追跡することにより決定することができる。反応時間の範囲としては、通常、５分間〜１０日間、好ましくは３０分間〜４日間の範囲をあげることができる。
【００３０】
反応終了後は、触媒として酵素を使用して化合物を製造する方法において通常用いられる化合物の回収方法により目的物を採取すればよい。例えば、まず反応液をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出する。必要に応じて反応液を濾過したり、又は遠心分離等の処理により不溶物を除去した後に前記抽出操作を行なえばよい。次に抽出された有機層を乾燥した後、濃縮物として目的物を回収することができる。目的物は、必要によりカラムクロマトグラフィー等によりさらに精製することができる。
【００３１】
【実施例】
以下、製造例等により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１  （本還元酵素遺伝子を含有する形質転換体及び本還元酵素の調製）
Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９９）５２：３８６−３９２等に記載される公知のプラスミドｐＵＡＲ（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１２７）を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。
次に、フラスコに液体培地（水１０００ｍｌにトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ及び塩化ナトリウム５ｇを溶解した。この溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨを７．０に調整した。）１００ｍｌを入れ、滅菌した後、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ、ＺｎＣｌ２を０．０１％（ｗ／ｖ）、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を０．４ｍＭになるように加えた。このようにして調製された培地に、上記で得られた形質転換体（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＵＡＲ株）が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１４時間振盪培養することにより、本還元酵素遺伝子を含有する形質転換体を含む培養物を得て、これを本還元酵素として下記の実施例で使用した。
【００３３】
実施例２  （本発明製造方法の例（その１））
ｐＨ７に調製された５０ｍＭリン酸緩衝液に２−プロパノール５０ｍｌ、ＮＡＤ＋０．９４ｇを混合して１ｋｇとした溶液を、温度計を備えたガラス製フラスコに仕込み３０℃に保温した。その中に、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン１０ｇ（５７．０７ｍｍｏｌ）と実施例１で得られた本還元酵素３３．３３ｇとを投入し、２０時間撹拌して反応させた。この反応混合液を１ｌのトルエンで３回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エバポレーターを用いて濃縮して、濃縮オイル６ｇを得た。得られた濃縮オイルをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析したところ、純度９５．５％光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールであり、収率は５６．７％であった。これを単蒸留し、ＧＣ純度９０％以上の画分を合わせたところ、収率５２．６％であった。単蒸留して得られた光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の結果、立体構造は（Ｓ）−体であり、光学純度は９９％ｅｅ以上であることが確認された。
【００３４】
実施例３  （本発明製造方法の例（その２））
実施例２と同様の緩衝液に２−プロパノール０．７５ｍｌ、ＮＡＤ＋１４．１ｍｇを混合して１５ｍｌとした溶液を、温度計を備えたガラス製フラスコに仕込み３０℃に保温した。その中に、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン１５０ｍｇ（０．８５６ｍｍｏｌ）と実施例１と同様にして得られた還元酵素１０ｇとを投入し、２０時間撹拌して反応させた。この反応混合液を１５ｍｌのトルエンで抽出し、得られた有機層をＧＣ分析したところ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンから光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールへの変換率は１００％であった。得られた光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールは、ＨＰＬＣによる分析の結果、立体構造は（Ｓ）−体であり、光学純度は９９％ｅｅ以上であることが確認された。
【００３５】
実施例４  （本発明製造方法の例（その３））  実施例３における本還元酵素の使用量を０．５ｇに変更した以外は実施例３と同様に光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造した。その結果、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンから光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールへの変換率は９９％であった。得られた光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールは、ＨＰＬＣによる分析の結果、立体構造は（Ｓ）−体であり、光学純度は９９％ｅｅ以上であることが確認された。
【００３６】
実施例５  （本発明製造方法の例（その４））
実施例３における本還元酵素の使用量を１ｇに変更し、かつ反応温度を４０℃に変更した以外は実施例３と同様に光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造した。その結果、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンから光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールへの変換率は１００％であった。得られた光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールは、ＨＰＬＣによる分析の結果、立体構造は（Ｓ）−体であり、光学純度は９９％ｅｅ以上であることが確認された。
【００３７】
上記の実施例におけるＨＰＬＣ分析条件及びＧＣ分析条件は次の通りである。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：キラルパックＯＤ−Ｈ（０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ；ダイセル化学工業社製）
カラム温度：２０℃
溶離液：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール／ジエチルアミン＝９５／５／０．１
検出：２５４ｎｍ
溶離液流速：０．５ｍｌ／ｍｌ
溶出時間：（Ｓ）−体２０分、（Ｒ）−体２３分
【００３８】
＜ＧＣ分析条件＞
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（０．２５ｍｍφ×３０ｍ；Ｊ＆Ｗ社製）
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：ヘリウム
カラム初期温度：１００℃
インジェクター温度：２３０℃
検出器温度：２３０℃
【００３９】
実施例６  （本還元酵素遺伝子の調製）
（６−１）染色体ＤＮＡの調製
フラスコに液体培地（水１０００ｍｌにトリプトン５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、塩化ナトリウム４ｇ、ゼラチン２．５ｇ、酢酸ナトリウム１．５ｇ及びスレオニン２．４ｇを溶解する。この溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨを７．０に調整する。）１００ｍｌを入れ、滅菌する。このようにして調製された培地に、特開平１０−９４３９９等に記載される公知のコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム亜種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｅｒｉｔｉｃｕｍ）ＳＴ−１０株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３１５０）が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１０時間振盪培養する。
培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収する。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、洗浄菌体を得る。
このようにして得られる洗浄菌体を用いて、Ｊ．Ｃ．Ｗａｎｇらの方法（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （１９９９）５２：３８６−３９２）によって染色体ＤＮＡを調製する。
【００４０】
（６−２）本還元酵素遺伝子を含有するプラスミドの調製（プラスミドｐＴｒｃＰＡＲの構築）
配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに、前記（６−１）で調製される染色体ＤＮＡを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行う。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００４１】
［反応液組成］
染色体ＤＮＡ                      １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）                  ０．４μｌ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）            各０．７５μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ２）              ５μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ  （３．５ｘ１０３Ｕ／ｍｌ）    ０．３７５μｌ
超純水                            ４１．７２５μｌ
【００４２】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する。
【００４３】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化する。次いで得られるＤＮＡ断片を精製する。
一方、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化する。次いで得られるＤＮＡ断片を精製する。
このようにして精製して得られる２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションする。得られるライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換する。
得られる形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＰＡＲと記すこともある。）を取り出す。
【００４４】
実施例７  （本補酵素再生酵素遺伝子の調製）
（７−１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調製するための準備
フラスコにＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）１００ｍｌを入れ、滅菌した。このようにして調製された培地に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＩＦＯ１２１０８株が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１０時間振盪培養した。
培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収した。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、洗浄菌体を得た。
このようにして得られた洗浄菌体からＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐ  （Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、それに付属するマニュアルに記載される方法に従って染色体ＤＮＡを精製した。
【００４５】
（７−２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調製（その１：プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２の構築）
Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２６４，  Ｎｏ．１１，  ６３８１−６３８５（１９８９）に記載された公知のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＩＷＧ３由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列に基づいて配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを合成した。
配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（７−１）で精製された染色体ＤＮＡを鋳型にして実施例６（６−２）に記載させる反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用）
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＴＯＰＯＴＭＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇキットを用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターの既存「ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ挿入サイト」にライゲーションした。得られたライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてグルコース脱水素酵素を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２と記すこともある。）を取り出した。
次に、取り出されたプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型として、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー製）を用いたシークエンス反応を行った後、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（パーキンエルマー製）で解析した。その結果を配列番号７に示す。
【００４６】
（７−３）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調製（その２：プラスミドｐＡＧＤＨ１２の構築）
（７−３−１）プラスミドｐＴＧＤＨ１２の構築
配列番号７で示される塩基配列を基にして配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを合成した。
配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（７−１）で精製された染色体ＤＮＡを鋳型にして以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００４７】
［反応液組成］
染色体ＤＮＡ原液                      １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）                  ０．４μｌ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）              各０．７５μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ）                ５μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ  （３．５ｘ１０３Ｕ／ｍｌ）      ０．３７５μｌ
超純水                              ４１．７２５μｌ
【００４８】
［ＰＣＲ反応条件］
上記組成に反応液が入った容器をＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回、さらに７２℃で７分間保持した。
【００４９】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
一方、ベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）を２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴＧＤＨ１２と記すこともある。）を取り出した。
【００５０】
（７−３−２）プラスミドｐＣＧＤＨ１２の構築
ベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）の塩基配列を基にして配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、プラスミドｐＴＧＤＨ１２を鋳型にして以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００５１】
［反応液組成］
プラスミドｐＴＧＤＨ１２溶液          １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）                  ０．４μｌ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）              各０．７５μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ）                ５μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ  （３．５ｘ１０３Ｕ／ｍｌ）      ０．３７５μｌ
超純水                              ４１．７２５μｌ
【００５２】
［ＰＣＲ反応条件］
上記組成に反応液が入った容器をＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回、さらに７２℃で７分間保持した。
【００５３】
得られたＰＣＲ反応液とＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＴＯＰＯＴＭＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇキットＶｅｒ．Ｅとを用いて、ＰＣＲによって得られた約１０００ｂｐのＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターの既存「ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ挿入サイト」にライゲーションし、そのライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＣＧＤＨ１２と記すこともある。）を取り出した。
【００５４】
（７−３−３）プラスミドｐＡＧＤＨ１２の構築）
プラスミドｐＣＧＤＨ１２に制限酵素（ＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該プラスミドを消化した。次いで、得られるＤＮＡ断片（約１０００ｂｐ）を精製した。
一方、ベクターｐＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン社製）に制限酵素（ＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ベクターを消化した。次いで得られるＤＮＡ断片を精製した。さらに、セルフライゲーションを防ぐため、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化処理を行った。
【００５５】
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から４コロニーを無作為に選抜した。この選抜されたコロニーをそれぞれ２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。それぞれの培養菌体からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素（ＢａｍＨＩ）により消化した後、当該消化物を電気泳動することにより、取り出されたプラスミド全てには前記ＤＮＡ断片（約１０００ｂｐ）が挿入されていることを確認した。（以下、取り出されたプラスミドをプラスミドｐＡＧＤＨ１２と記すこともある。）
【００５６】
実施例８  （本還元酵素遺伝子及び本補酵素再生酵素遺伝子を含有するプラスミドの調製：プラスミドｐＴｒｃＰＡＲＳｂＧの構築）
実施例７（７−２）で調製されたプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２に２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩとＸｂａＩ）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させる。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製する。
一方、実施例６で調製されるプラスミドｐＴｒｃＰＡＲに２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩとＸｂａＩ）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させる。次いで得られるＤＮＡ断片を精製する。
このようにして精製して得られる２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションする。得られるライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換する。
得られる形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて本還元酵素遺伝子及び本補酵素再生遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＰＡＲＳｂＧと記すこともある。）を取り出す。
【００５７】
実施例９  （本還元酵素遺伝子及び本補酵素再生酵素遺伝子を含有する形質転換体の調製）
実施例８で調製されるプラスミドｐＴｒｃＰＡＲＳｂＧを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換する。得られる形質転換体を０．４ｍＭのＩＰＴＧ、０．０１％（Ｗ／Ｖ）のＺｎＣｌ２及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×３本）に接種した後、これを振盪培養する（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体を回収する。
【００５８】
実施例１０  （光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法）
１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ６．５）２０ｍｌに、実施例９で調製される洗浄菌体１ｇ、ＮＡＤ＋１２ｍｇ及びグルコース２．５ｇを加える。この混合物に、さらに２４０ｍｇのＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを加えた後、当該混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で７に調製する。このようにして得られる混合物（反応液）を３０℃で４時間攪拌することにより反応を行う。反応終了後、反応液にトルエン２５ｍｌを注加攪拌し、次いで遠心分離することにより有機層及び水層を別々に回収する。回収される水層に再度トルエン２５ｍｌを加えて同様な操作を行う。このようにして得られる有機層を混合し、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥する。乾燥後、トルエンを留去することにより、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを得る。
【００５９】
参考例１  （Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールに変換する能力を有する微生物の取得方法
（１−１）  洗浄菌体の調製
市販の微生物又は土壌等から単離された微生物を滅菌ＬＢ培地（１０ｍｌ）に接種した後、これを振盪培養する（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体を回収する。
（１−２）  スクリーニング
１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ６．５）２０ｍｌに、上記（１４−１）で調製された洗浄菌体１ｇ、ＮＡＤＰ＋１２ｍｇ、ＮＡＤ＋１２ｍｇ及びグルコース２．５ｇを加える。この混合物に、さらに２４０ｍｇのＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを加えた後、当該混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で７に調製する。このようにして得られる混合物（反応液）を３０℃で４時間攪拌することにより反応を行う。反応終了後、反応液にトルエン２５ｍｌを注加攪拌し、次いで遠心分離することにより有機層及び水層を別々に回収する。回収される水層にトルエン２５ｍｌを加えて同様な操作を行う。このようにして得られる有機層を混合した後、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥する。乾燥後、トルエンを留去することにより残渣を得る。得られる残渣に、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールが含まれていることを液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーにて定性分析及び／定量分析（光学純度分析も可能）により確認する。
【００６０】
【発明の効果】
本発明により、生理活性物質製造の中間体として有用な、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法等が提供可能になった。
［配列表フリーテキスト］
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
【００６１】
【配列表】
2004350625.tif 000002
2004350625.tif 000003
2004350625.tif 000004
2004350625.tif 000005
2004350625.tif 000006
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