(57)【要約】      （修正有）【課題】収差ぼけを防止し、高分解能を得ることができる光学顕微鏡観察方法とデータ処理システムとを提供する【解決手段】光軸平行照射される観察対象物により偏向された光線を対物レンズ７４で集光し、集光光が絞り機構部７５により光源走査され、射出された光線が検出面７７ａに実像として結像される。得られた複数の実像データから複数次元データを生成し、該データがデータ処理され位相差像を取得する。光源の光線１次元走査と連動して絞り面に設置された位相板と背景集光光との相対位置を走査し、また複数次元データが３次元データからなり、位相差像が垂直方向微分位相差像および水平方向微分位相差像からなる。また集光光は位相板を設置した絞り機構部により信号変調され、複数次元データが２回の観察から得られる２つの２次元データからなり、上記位相差像が微分位相像および位相差像からなる。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光軸上の点光源から射出される電子線が物面に対し実質上直交する方向に光軸平行照射される照明工程と、
前記物面に載置される観察対象物により偏向された光線を対物レンズで集光する工程と、
集光光が絞り機構部に導入され、光源走査される走査工程と、
絞り機構部から射出された光線が検出面に実像として結像させる結像工程と、
上記走査工程で得られた複数の実像データから複数次元データを生成するデータ処理工程と、
得られた複数次元データに対し、データ処理により位相差像を取得する工程とからなることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項２】
請求項１記載の光学顕微鏡観察方法において、絞り機構部に位相板を担持したスリット絞りを置き、上記走査工程は上記点光源が固定され、担持された位相板がスリット絞り端縁と直交する方向に移動することにより部分域走査されることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項３】
請求項１記載の光学顕微鏡観察方法において、絞り機構部に位相板を担持したスリット絞りを置き、上記走査工程は担持された位相板が固定され、上記点光源がスリット絞り端縁と直交する方向に移動することにより部分域走査されることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項４】
請求項２又は請求項３記載の光学顕微鏡観察方法において、上記部分域走査は上記位相板の端縁につき内外側に画定されることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項５】
請求項２又は請求項３記載の光学顕微鏡観察方法において、上記部分域走査は上記位相板の端縁につき内側に画定されることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項６】
請求項２又は請求項３記載の光学顕微鏡観察方法において、上記部分域走査は上記位相板の端縁につき外側に画定されることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項７】
請求項１乃至請求項４のいずれか一記載の光学顕微鏡観察方法において、上記走査工程が光源の光線１次元走査と連動して絞り面に設置された位相板と背景集光光との相対位置を走査する工程からなり、上記複数次元データが３次元データからなり、さらに上記位相差像が垂直方向微分位相像および水平方向微分位相像からなることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項８】
請求項７記載の光学顕微鏡観察方法において、上記位相板がπ位相板であることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項９】
請求項１乃至請求項４のいずれか一記載の光学顕微鏡観察方法において、上記集光光が位相板を設置した絞り機構部に導入され信号変調をされる工程からなり、上記複数次元データが２回の観察から得られる２つの２次元データからなり、さらに上記位相差像が微分位相像および位相差像からなることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項１０】
請求項９記載の光学顕微鏡観察方法において、上記位相板がπ位相板であることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項１０のいずれか一記載の光学顕微鏡観察方法において、上記光源が十字状ＬＥＤアレイからなることを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項１２】
位相板を用いた３次元顕微鏡観察により観察物上の各点の位置を実座標とし、点光源位置を周波数座標とする３次元顕微鏡データ｜Ｕ（ｓs，ｒd）｜2を取得するデータ取得部と、
上記３次元顕微鏡データから個別のｒd値に対して２次元関数をなす｜Ｕ（ｓs，ｒd）｜2のｓs座標での線積分演算をする線積分演算部と、
上記３次元顕微鏡データから個別のｒd値に対して２次元関数をなす｜Ｕ（ｓs，ｒd）｜2のｓs座標での１次モーメント演算をする１次モーメント演算部と、
上記１次モーメントを上記線積分にて除算する重心積分演算による微分位相像を取得する微分位相像取得部と、
垂直方向光源より垂直方向微分位相像を取得する垂直方向微分位相像取得部と、
水平方向光源より水平方向微分位相像を取得する水平方向微分位相像取得部と、
上記垂直方向微分位相像と上記水平方向微分位相像より、フーリエ変換を用いて位相差像を回復する位相差像回復部とからなることを特徴とする光学顕微鏡のデータ処理システム。
【請求項１３】
π位相板により半割された絞り開口部が半分ずつ同時点灯された光源により走査されヒルベルト微分コントラスト像Ｉ、ＩＩが取得され、両者の差像と両者の和像の比をとり正規化ヒルベルト微分差像を取得する微分差像取得部と、
上記正規化ヒルベルト微分差像の２次元フーリエ変換をするフーリエ変換部と、
上記２次元フーリエ変換像に対し、階段関数型フィルター関数を乗算し、ゼルニケ位相差像対応のフーリエ変換像を取得するフーリエ変換像取得部と、
上記フーリエ変換像を逆フーリエ変換し、ゼルニケ位相差像を取得するゼルニケ位相差像取得部とからなることを特徴とする光学顕微鏡のデータ処理システム。
【請求項１４】
請求項１２又は請求項１３記載の光学顕微鏡のデータ処理システムにおいて、上記光源が十字状ＬＥＤアレイからなることを特徴とする光学顕微鏡のデータ処理システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、物質を通過する際の光の偏向を利用して観察対象物の微分位相像及び位相像を取得する光学顕微鏡観察方法及び光学顕微鏡のデータ処理システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、顕微鏡による位相情報の取得には、主に干渉効果を利用した方法が用いられてきた。例えば、光学顕微鏡では、シュリーレン法、ゼルニケ位相差顕微鏡法及びノマルスキー微分干渉顕微鏡法などが知られている。
【０００３】
これらの手法はいずれも、位相の異なる２箇の波の位相差を、波の干渉に伴う強度変調に変換し、強度像から位相差を類推するものであり、信号波の他に位相基準を与える参照用の波である参照波を用意する必要がある。参照波として、信号波の一部を利用する簡便法は、「弱位相物体近似」を成立させるために観測可能な位相の大きさが制限され、またその限界を克服できるホログラフィー法などでは、信号波とは別に独立した参照波が必要となるため、装置の工夫や複雑化が避けられない。
【０００４】
一方電子線やＸ線分野では、干渉効果を用いず、物質による照射ビームの偏向を利用して観察対象物の局所屈折率変化を微分位相として求める手法が提案されてきた（非特許文献１〜６参照）。これらの手法では、電子線などの収束ビームを走査しながら観察対象物に照射し、その照射部位における屈折率変化に起因する電子又はＸ線の偏向を検出して画像化している。特に近年走査透過型電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）における応用は目覚しく、微分干渉コントラスト走査透過型電子顕微鏡（ＤＰＣ−ＳＴＥＭ、非特許文献７〜１１）や質量中心画像走査透過型電子顕微鏡（ＣＯＭ−ｉｍａｇｉｎｇ−ＳＴＥＭ、非特許文献１２〜１３）さらに４次元走査透過型電子顕微鏡（図１（Ｂ）参照）（４Ｄ−ＳＴＥＭ、非特許文献１４〜１５）などと呼ばれ盛んに用いられている。
【０００５】
屈折率変化は、位相変化、即ち微分位相の大きさに対応するため、非特許文献１〜１５に記載の技術では、収束電子線の偏向度合いを定量的に取り出すために、電子線回折像（一般に明視野円盤（ｂｒｉｇｈｔ−ｆｉｅｌｄ  ｄｉｓｋ）またはロンチグラム（Ｒｏｎｃｈｉｇｒａｍ）と呼ばれている）の重心移動を観測し、観察対象物の微分位相走査像を構成している。２次元観察法であるＤＰＣ−ＳＴＥＭでは、積分検出器に表象されるコントラストを明視野円盤重心移動量（図２（Ａ）に見られる円盤３１から円盤３２への移動）に対応するとして画像化し、４次元観察法であるＣＯＭ−ｉｍａｇｉｎｇ−ＳＴＥＭや４Ｄ−ＳＴＥＭでは、明視野円盤の２次元データに対し積分計算を行うことにより重心移動量を求め画像化している。ＣＯＭ−ｉｍａｇｉｎｇ−ＳＴＥＭと４Ｄ−ＳＴＥＭは、いずれも観察対象物上を走査する２次元と明視野円盤の２次元の和として４次元データを取得するので４次元法と呼ばれている。ただし最終的には観察対象物各点の微分位相を明視野円盤の重心積分値として画像化するので、次元は２次元像となる。２次元法であるＤＰＣ−ＳＴＥＭと４次元法であるＣＯＭ−ｉｍａｇｉｎｇ−ＳＴＥＭ（４Ｄ−ＳＴＥＭ）は、ほぼ同等の画像を与えるといわれているが、前者は明視野円盤の面積分、後者は１次モーメントを基礎としているので多少の差があり、４次元法（ＣＯＭ−ｉｍａｇｉｎｇ−ＳＴＥＭや４Ｄ−ＳＴＥＭ）がより定量的である（非特許文献１２）。両者共に高分解能観察に特徴があり、１Å近辺の収束電子線を用いることにより、結晶中の原子や分子の高分解能電場観察などを行っている（非特許文献７〜１５）。
（基礎出願特許文献１の要約）
【０００６】
本願発明は、主に電子顕微鏡への応用を企図した基礎出願（特許文献１）を光学顕微鏡へ発展的に応用した発明なので、まず基礎出願の要約を行う。なお、図３の「３５」、「３６」、「３７」及び「３９」は、便宜上電子線又は光線を示す。
本出願者は、従来の収束電子線を用いるＳＴＥＭをベースとした４次元顕微鏡法を、図１に示す「４次元相反定理」を拠り所に、平行照射電子線を用いるＴＥＭをベースとする４次元顕微鏡法（図１（Ａ）参照）（４Ｄ−ＴＥＭ）に変換し、操作の即応性、観測の迅速化、デジタル記憶容量の少量化、観測の高感度化・高分解能化を行った（特許文献１）。これらの改良は、特に有機物である生体分子、例えば蛋白質や核酸の原子分解能の分子構造観察に対し有効性が期待される。
【０００７】
特許文献１（基礎出願）に記載される４Ｄ−ＴＥＭの新規性は、４次元顕微鏡において、走査透過手法（ＳＴＥＭ）を透過手法（ＴＥＭ）に変えることにより、検出面上の明視野円盤信号に代えて光源面上の明視野円盤信号を取得するところにある。この場合、４Ｄ−ＴＥＭの光源走査点の座標（図２の光源面２１の座標）が４Ｄ−ＳＴＥＭの検出面座標（図２の検出面１１４の座標）に対応付けられる。両者の対応を模式的に図２に示す。図２にはまた電子線偏向に伴う４Ｄ−ＳＴＥＭおよび４Ｄ−ＴＥＭの明視野円盤の移動（電子線偏向のない場合の３１から電子線偏向ある場合の３２への移動）が模式的に描かれており、その重心移動量は収束電子線の照射部位の微分位相量３１ａ、３２ａを表す。
４Ｄ−ＴＥＭの４Ｄ−ＳＴＥＭに対する優位性は、光源における走査を絞り（２３、１１２）開口端近傍の部分域に限局することにより、重心移動を担う信号部位だけに電子線資源を投入し、感度向上を実現することにある。特に部分域走査と絞り開口が矩形状のスリット絞りを利用した次元縮減の両者の相乗効果による走査点少数化は、操作の即応性、観測の迅速化、デジタル記憶容量の少量化、観測の高感度化を可能とした。これらの効果は本願発明にも維持される。
【０００８】
４次元走査透過型電子顕微鏡（４Ｄ−ＳＴＥＭ）（図１（Ｂ））であれ、４次元顕微鏡（４Ｄ−ＴＥＭ）（図１（Ａ））であれ、４次元法は電子線偏向の観測なので、用いる入射収束電子線（図３の「３５」）の収束幅（４Ｄ−ＳＴＥＭでは電子線収束径、４Ｄ−ＴＥＭでは絞り径の逆数）の大きさと、観察対象物の照射部位（図３の「３９」）の位相変化（屈折率変化に比例）の大きさとの間の関係で２箇の典型的な場合分けが考えられる。このことを模式的に示したのが図３である。図３（Ａ）は特許文献１が前提とする場合で、観察対象物の照射部位屈折率変化が、４Ｄ−ＳＴＥＭでは電子線の収束幅３９よりゆるやか、また４Ｄ−ＴＥＭでは絞り径の逆数（電子線の収束幅３９に対応）よりゆるやかである。この場合、照射部位屈折率変化がプリズム効果として機能し、出射収束電子線３６、３７は一様な偏向を示す。その結果図３（Ａ）の下段に示すように明視野円盤３１から明視野円盤３２への全体的平行移動が生ずる。位相変化がない照射部位では、図３（Ｂ）Ｂ１のように電子線は偏向せず、光軸４３の周りに等方的な明視野円盤３１を作出する（図３（Ａ）ではそれが破線の出射収束電子線３６で示されている）。電子顕微鏡の観察対象物において、電場や磁場のポテンシャル（屈折率＝位相の物理的起源）勾配が電子線の収束幅よりゆるやかに変化する場合はこの条件を満たすが、通常の物質は、無機物、有機物を問わずこの条件を満たさない。なお、出射収束電子線中「３６」は電子線偏向のない場合、「３７」は電子線偏向のある場合を示す。
物質を構成する原子は元素種を問わず原子核に電場ポテンシャルが集中しており、原子３８が作り出す電場ポテンシャル（一般に「原子ポテンシャル」と呼ばれる）は、図３（Ｂ）に示すように、原子核を中心とする極めて急峻な尖塔形状を持つ。収束電子線３５、３６は原子全体をすっぽり包むため、平行移動のような一様な偏向は生ぜず、偏向は明視野円盤内部に限局偏在し、電子線分布は図３（Ｂ）に示すような明視野円盤内部での偏向となる。すなわち、明視野円盤内の一方の端３３ｂの電子線が増強し、対向するもう一方の端３３ａの電子線は減弱する。
特許文献１に係る発明はこのように異なる挙動を示す２箇の電子線偏向に伴う重心移動のうち図３（Ａ）の平行移動の場合のみ扱ったが、本願発明は、両者それぞれに最適な方法で、微分位相像さらに位相像を取り出す観察装置と手法とデータ処理法を提供する。
なお、特許文献１は本願発明の発明者の発明に係る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／００８７２０
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】E. M. Waddell and J. N. Chapman, "Linear imaging of strong phase objects using asymmetrical detection in STEM"、Optik、第54巻、1979年、p.83-96
【非特許文献２】G. R. Morrison and J. N. Chapman, "A comparison of three differential phase contrast systems suitable for use in STEM"、Optik、第64 巻、1983年、p.1-12
【非特許文献３】J. Palmer and G. Morrison, "Differential Phase Contrast Imaging in the Scanning Transmission X-ray Microscope"、Proc. Short-Wavelength Coherent Radiation、第11巻、1991年、p.141-145
【非特許文献４】A. Gianoncelli, G. R. Morrison, B. Kaulich, D. Bacescu and J.Kovac, "Scanning transmission x-ray microscopy with a configurable detector"、Appl. Phys. Lett.、第89巻、2006年、p.251117-1〜3
【非特許文献５】B. Hornberger, M. Feser, C. Jacobsen, "Quantitative amplitude and phase contrast imaging in a scanning transmission X-ray microscope"、Ultramicroscopy、第107巻、2007年、p.644-655
【非特許文献６】P. Thibault, M. Dierolf, A. Menzel, O. Bunk, C. David, and F. Pfeiffer, "High-Resolution Scanning X-ray Diffraction Microscopy"、Science、第321巻、2008年、p.379-382
【非特許文献７】N. Shibata, S. D. Findlay, Y. Kohno, H. Sawada, Y. Kondo and Y. Ikuhara, "Differential phase-contrast microscopy at atomic resolution"、Nat. Phys.、第8巻、2012年、p.611-615
【非特許文献８】A. Lubk and J. Zweck, "Differential phase contrast: An integral perspective"、Phys. Rev.、第A91巻、2015年、p.23805-1〜6
【非特許文献９】I. MacLaren, L. Wang, D. McGrouther, A. J. Craven, S. McVitie, R. Schierholz, A. Kovacs, J. Barthel and R. E. Dunin-Borkowski, "On the origin of differential phase contrast at a locally charged and globally charge-compensated domain boundary in a apolar-oedered material"、Ultramicroscopy、第154巻、2015年、p.57-63
【非特許文献１０】A. Ishizuka, M. Oka, T. Seki, N. Shibata and K. Ishizuka, "Boundary-artifact-free determination of potential distribution from differential phase contrast signals"、Microscopy（on-line）、2017年、p.397-405
【非特許文献１１】E. Yucelen, I. Lazic and E.G.T. Bosch, "Phase contrast scanning transmission electron microscopy imaging of light and heavy atoms at the limit of contrast and resolution"、Sci. Rep. （on-line）、第8巻、2018年、p.2676-1〜10
【非特許文献１２】I. Lazic, E. G. T. Bosch and S. Lazar, "Phase contrast STEM for thin samples: Integrated differential phase contrast"、Ultramicroscopy、第160巻、2016年、p.265-280
【非特許文献１３】M. C. Cao, Y. Han, Z. Chen, Y. Jiang, K. X. Nguyen, E. Turgut, G. D. Fuchs and D. A. Muller, "Theory and practice of electron diffraction from single atoms and extended objects using an EMPAD"、 Microscopy（on-line）、2018年、p.i150-i161
【非特許文献１４】C. Ophus, P. Ercius, M. Sarahan, C. Czarnik and J. Ciston, "Recording and Using 4D-STEM Datasets in Materials Science"、 Microsc. Microanal.、第20巻（Suppl 3）、2014年、p.62-63
【非特許文献１５】M. Simson, H. Ryll, H. Banba, R. Hartmann, M. Huth, S. Ihle, L. Jones, Y. Kondo, K. Muller, P.D. Nellist, R. Sagawa, J. Schmidt, H. Soltau, L. Struder and H. Yang, "4D-STEM Imaging With the pnCCD （S）TEM-Camera"、 Microsc. Microanal.、第21巻（Suppl 3）、2015年、p. 2211-2212
【非特許文献１６】A. Steinecker, and W. Mader, "Measurement of lens aberrations by means of image  displacements in beam-tilt series"、Ultramicroscopy 第81巻、2000年 p. 149-161
【非特許文献１７】H. Sawada, T. Sannomiya, F. Hosokawab, T. Nakamichi, T. Kaneyama, T. Tomita, Y. Kondo, T. Tanaka, Y. Oshima, Y. Tanishiro, and K. Takayanagi, "Measurement method of aberration from Ronchigram by autocorrelation function", Ultramicroscopy 第108巻、 2008、 p.1467-1475
【非特許文献１８】R. Danev, H. Okawara, N. Usuda, K. Kametani and K. Nagayama, "A Novel Phase-contrast Transmission Electron Microscopy Producing High-contrast Topographic Images of Weak Objects", J. Biol. Phys. 第28巻、2002年 p. 627-635
【非特許文献１９】R. Danev and K. Nagayama, "Complex Observation in Electron Microscopy. IV. Reconstruction of Complex Object Wave from Conventional and Half Plane Phase Plate Image Pair", J. Phys. Soc. Jpn. 第73巻、2004年p. 2718-2724
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
収束電子線を用いた４次元の走査型微分位相法（４Ｄ−ＳＴＥＭ）は以下の問題点があった。即ち、（１）検出面で観測される像が回折像で、観察時には観察対象物の画像を直接観察できないため、各種光学調整を行うための操作が必要な場合に速やかに対応することができない。
（２）次元の高い４次元の観測データを取得することに伴う観測時間の長大化とデジタル記憶容量の膨大化。
（３）ＤＰＣ−ＳＴＥＭや４Ｄ−ＳＴＥＭによる原子分解能観察が、高強度の電子線照射に耐える金属や半導体の観察に限定され、電子線照射に弱い生体分子などの有機物に適用できない。
かかるため、原理そのものは、非特許文献１に見られるように４０年以上前に提案されたが、金属、半導体への応用（非特許文献７〜１５）などに限定されてきた。
【００１２】
基礎出願である特許文献１は、前述した４Ｄ−ＳＴＥＭの問題点を解決し、生体分子のような電子線破壊を受けやすい有機物までをも含む対象物の強度像及び微分位相像を操作性良く高分解能かつ高感度で取得することのできる４次元顕微鏡観察方法及び４次元透過型顕微鏡（４Ｄ−ＴＥＭ）装置を提供した。
【００１３】
特許文献１は、４次元顕微鏡において、光の逆進性の表現である図１に示す「４次元相反定理」を拠り所に、収束電子線ではなく斜光平行照射電子線を用いる４次元透過型顕微鏡法（４Ｄ−ＴＥＭ）を見出した。走査透過手法（ＳＴＥＭ）を透過手法（ＴＥＭ）に変えることは、検出面上の明視野円盤信号に代えて光源面上の明視野円盤信号の取得が核心になるため、光源走査部位を任意に設定できる自由度を獲得したことになる。この場合、４Ｄ−ＴＥＭの光源走査点の座標が４Ｄ−ＳＴＥＭの検出面座標に対応付けられる。
図１と同様の両者の対応を図２に示すが、図２にはまた電子線偏向に伴う４Ｄ−ＳＴＥＭおよび４Ｄ−ＴＥＭの明視野円盤の移動（電子線偏向のない場合の３１から電子線偏向ある場合の３２への移動）が模式的に描かれており、その重心移動量は収束電子線照射部位の微分位相量を表現する（非特許文献１）。４Ｄ−ＴＥＭの４Ｄ−ＳＴＥＭに対する優位性は、光源走査の自由度を利用し、走査を絞り開口端近傍部分に限局すること、すなわち重心移動を担う信号部位だけに電子線資源を投入することで、感度向上を示現することにある。特に部分域走査と絞り開口が矩形状のスリット絞り利用に伴う次元縮減を組み合わせると、両者の相乗効果による走査点少数化は、操作の即応性、観測の迅速化、デジタル記憶容量の少量化、観測の高感度化などを可能とした。
しかし特許文献１の方法を光学顕微鏡に発展させるには、次に述べる３箇の問題を解決しなければならないことが判明した。
【００１４】
第１の問題点は、特許文献１で用いられる斜光平行照射法そのものにある。一般に斜光照明は収差に奇数次項をもたらすため収差ボケが激しくなる。収差補正の進んだ光学顕微鏡においても、光軸４３に対し大きい傾斜の斜光照明を用いるとこの収差ボケのため、分解能が抑制される。ここの問題の解決が第１の課題である。
第２は、前述（０００８）した電子線偏向の２つの様式に係わる問題で、光学顕微鏡の観察対象物が、両様式に対応する屈折率変化を内包することに起因する。そこで、電子線偏向の２様式につき、基礎出願の電子顕微鏡のケースを用いて最初に説明し、しかる後に対応する光学顕微鏡での課題を記述する。
４Ｄ−ＳＴＥＭ、４Ｄ−ＴＥＭの別を問わず、４次元法は電子線偏向の観測なので、用いる電子線の収束幅（４Ｄ−ＳＴＥＭでは収束電子線の径、４Ｄ−ＴＥＭでは絞りの径の逆数）の大きさと観察対象物照射部位の位相変化（屈折率変化に比例）の大きさとの間の関係で２箇の典型的場合分けが考えられる。このことを模式的に示したのが図３である。図３（Ａ）は特許文献１の前提とする場合で、観察対象物の照射部位の屈折率変化が、４Ｄ−ＳＴＥＭでは収束電子線の径の範囲でゆるやか、また４Ｄ−ＴＥＭでは絞り径の逆数（収束電子線の径に対応）範囲でゆるやかである。この場合、照射部位の屈折率の変化がプリズム効果として機能し、電子線の偏向は一様となり、明視野円盤の一様な平行移動（図３（Ａ）における３１から３２への平行移動）を生起させる。電子顕微鏡の観察対象物において、電場や磁場のポテンシャル勾配が電子線収束幅よりゆるやかに変化する材料は上記の条件を満たす。
しかし通常の物質は、無機物、有機物を問わずこの条件を満たさない。物質を構成する原子は元素種を問わず屈折率の根源である原子中心の電場ポテンシャル（「原子ポテンシャル」と呼ばれる）が、原子核を中心とする極めて急峻な尖塔形状を示すからである。そのため電子線偏向は平行移動ではなく、図３（Ｂ）に示すような明視野円盤内の電子線偏在となる。すなわち、明視野円盤内の一方の端３３ｂに電子線が偏向し、そこの強度が増し、対向するもう一方の端３３ａの強度は減る。従って電子顕微鏡では、図３（Ｂ）の場合の重心移動観察に対応した新規な手法が求められる。
上記を光学顕微鏡に換骨堕胎すれば、第２の課題は以下のようになる。
４次元電子顕微鏡で用いられる収束電子線は、光学顕微鏡においては、波長オーダーに絞られる収束光に対応すると考えられる。生物を対象とする生物顕微鏡の場合、収束光幅と観察対象物の位相変化スケールの比較に関し、図３で説明した電子線偏向に見られる両様式が認められる。細胞内には液状の細胞質とミトコンドリアや微小管などの顆粒状細胞内器官があるが、前者の位相変化はゆるやかなので平行移動的電子線偏向を生成し、後者の顆粒は、波長より微小なため、その位相変化は急峻で電子偏在的電子線偏向を生成する。よって光学顕微鏡の場合、この両様式を同時に微分位相観察する手法が求められる。
第３は、急峻なエッジを持つ位相板一般に見られる現象、すなわち像エッジフリンジ現象の問題である。これは、強いコントラストの顕微鏡像の周縁（エッジ）が振動的な変調（フリンジ）を受ける現象である。例えば、本願発明の矩形スリット位相板でも位相板端で位相が０からπに急激に変化するので、像エッジフリンジ現象がしばしば生ずる。近年、長期間汎用されていたゼルニケ型位相差法が微分干渉コントラストに代替されつつあるが、背景には、像エッジフリンジ問題がある。この難題は、上記第２の課題を解決する手法に係わるので本願発明の課題とした。
本願発明は上述した第１から第３の３箇の課題を解決し、光線偏向を検出することで微分位相像さらに位相像を観察する適用範囲の広い光学顕微鏡観察方法とデータ処理システムとを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題解決のため、本願発明請求項１による光学顕微鏡観察方法は、光軸上の点光源から射出される電子線が物面に対し実質上直交する方向に光軸平行照射される照明工程と、前記物面に載置される観察対象物により偏向された光線を対物レンズで集光する工程と、集光光が絞り機構部に導入され、光源走査される走査工程と、絞り機構部から射出された光線が検出面に実像として結像させる結像工程と、上記走査工程で得られた複数の実像データから複数次元データを生成するデータ処理工程と、得られた複数次元データに対し、データ処理により位相差像を取得する工程とからなることを特徴とする。
また本願発明請求項２による光学顕微鏡観察方法は、請求項１記載の光学顕微鏡観察方法において、絞り機構部に位相板を担持したスリット絞りを置き、上記走査工程は上記点光源が固定され、担持された位相板がスリット絞り端縁と直交する方向に移動することにより部分域走査されることを特徴とする。
また本願発明請求項３による光学顕微鏡観察方法は、請求項１記載の光学顕微鏡観察方法において、絞り機構部に位相板を担持したスリット絞りを置き、上記走査工程は担持された位相板が固定され、上記点光源がスリット絞り端縁と直交する方向に移動することにより部分域走査されることを特徴とする。
また本願発明請求項４による光学顕微鏡観察方法は、請求項２又は請求項３記載の光学顕微鏡観察方法において、上記部分域走査は上記位相板の端縁につき内外側に画定されることを特徴とする。
また本願発明請求項５による光学顕微鏡観察方法は、請求項２又は請求項３記載の光学顕微鏡観察方法において、上記部分域走査は上記位相板の端縁につき内側に画定されることを特徴とする。
また本願発明請求項６による光学顕微鏡観察方法は、請求項２又は請求項３記載の光学顕微鏡観察方法において、上記部分域走査は上記位相板の端縁につき外側に画定されることを特徴とする。
また本願発明請求項７による光学顕微鏡観察方法は、請求項１乃至請求項４のいずれか一記載の光学顕微鏡観察方法において、上記走査工程が光源の光線１次元走査と連動して絞り面に設置された位相板と背景集光光との相対位置を走査する工程からなり、上記複数次元データが３次元データからなり、さらに上記位相差像が垂直方向微分位相像および水平方向微分位相像からなることを特徴とする。
また本願発明請求項８による光学顕微鏡観察方法は、請求項７記載の光学顕微鏡観察方法において、上記位相板がπ位相板であることを特徴とする。
また本願発明請求項９による光学顕微鏡観察方法は、請求項１乃至請求項４のいずれか一記載の光学顕微鏡観察方法において、上記集光光が位相板を設置した絞り機構部に導入され信号変調をされる工程からなり、上記複数次元データが２回の観察から得られる２つの２次元データからなり、さらに上記位相差像が微分位相像および位相差像からなることを特徴とする。
また本願発明請求項１０による光学顕微鏡観察方法は、請求項９記載の光学顕微鏡観察方法において、上記位相板がπ位相板であることを特徴とする。
また本願発明請求項１１による光学顕微鏡観察方法は、請求項１乃至請求項１０のいずれか一記載の光学顕微鏡観察方法において、上記光源が十字状ＬＥＤアレイからなることを特徴とする。
また本願発明請求項１２による光学顕微鏡のデータ処理システムは、位相板を用いた３次元顕微鏡観察により観察物上の各点の位置を実座標とし、点光源位置を周波数座標とする３次元顕微鏡データ｜Ｕ（ｓs，ｒd）｜2を取得するデータ取得部と、上記３次元顕微鏡データから個別のｒd値に対して２次元関数をなす｜Ｕ（ｓs，ｒd）｜2のｓs座標での線積分演算をする線積分演算部と、上記３次元顕微鏡データから個別のｒd値に対して２次元関数をなす｜Ｕ（ｓs，ｒd）｜2のｓs座標での１次モーメント演算をする１次モーメント演算部と、上記１次モーメントを上記線積分にて除算する重心積分演算による微分位相像を取得する微分位相像取得部と、垂直方向光源より垂直方向微分位相像を取得する垂直方向微分位相像取得部と、水平方向光源より水平方向微分位相像を取得する水平方向微分位相像取得部と、上記垂直方向微分位相像と上記水平方向微分位相像より、フーリエ変換を用いて位相差像を回復する位相差像回復部とからなることを特徴とする。
また本願発明請求項１３による光学顕微鏡のデータ処理システムは、π位相板により半割された絞り開口部が半分ずつ同時点灯された光源により走査されヒルベルト微分コントラスト像Ｉ、ＩＩが取得され、両者の差像と両者の和像の比をとり正規化ヒルベルト微分差像を取得する微分差像取得部と、上記正規化ヒルベルト微分差像の２次元フーリエ変換をするフーリエ変換部と、上記２次元フーリエ変換像に対し、階段関数型フィルター関数を乗算し、ゼルニケ位相差像対応のフーリエ変換像を取得するフーリエ変換像取得部と、上記フーリエ変換像を逆フーリエ変換し、ゼルニケ位相差像を取得するゼルニケ位相差像取得部とからなることを特徴とする。
また本願発明請求項１４による光学顕微鏡のデータ処理システムは、請求項１２又は請求項１３記載の光学顕微鏡のデータ処理システムにおいて、上記光源が十字状ＬＥＤアレイからなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明によれば、光軸平行照射、即ち、光軸４３に近い平行照明光を用いるため、光軸４３を大きく外れた斜光平行照明を用いる際に不可避の収差ぼけを防止し、高分解能を得ることができる。
また、位相をπシフトするπ位相板を光軸に近接設置し、光源を光軸近傍に有限回走査して観測される複数のヒルベルト微分コントラスト像を組み合わせることにより、像エッジフリンジ現象の回避された高感度暗視野微分位相像が取得される。暗視野微分位相像はさらに変換され、通常の位相像が高感度で取得される。これにより電子線照射に弱い有機物の高分解能での観察が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本願発明の原理である４次元相反定理の説明図であり、（Ａ）は本願発明に係る４次元透過型顕微鏡法の図、（Ｂ）は従来の４次元法である４次元走査透過型顕微鏡法の図である。
【図２】４次元透過型顕微鏡法（１００）の検出面１１４および４Ｄ−ＴＥＭ（１０）の光源面２１に観測される、光線が一様に偏向する場合の明視野円盤の光線偏向に伴う重心移動の説明図である。
【図３】電子顕微鏡における電子線偏向に伴う明視野円盤の重心移動の説明図であり、（Ａ）は収束電子線の収束幅に比べ位相変化（屈折率変化）がゆるやかな場合の平行移動的重心移動の図、（Ｂ）は収束電子線の収束幅に比べ位相変化（屈折率変化）が急峻で狭い原子ポテンシャルの場合の明視野円盤内電子線偏在による重心移動を対比的に説明する図である。
【図４Ａ】図３（Ａ）に示す平行移動型重心移動の場合のスリット絞りにより次元縮減した３次元顕微鏡法（走査が１次元で画像が２次元）による光源走査法の説明図であり、（Ａ）は光線偏向がない場合のスリット絞りの開口端縁の全域走査を示す図、（Ｂ）は光線偏向がある場合のスリット絞りの開口端縁の全域走査を示す図である。
【図４Ｂ】図３（Ａ）に示す平行移動型重心移動の場合の、スリット絞りにより次元縮減した３次元顕微鏡法（走査が１次元で画像が２次元）による光源走査法の説明図であり、（Ｃ）は光線偏向がない場合のスリット絞りの開口端縁の部分域走査を示す図、（Ｄ）は光線偏向がある場合のスリット絞りの開口端縁の部分域走査を示す図である。
【図５Ａ】図３（Ｂ）に示す偏在型重心移動の場合のスリット絞りにより次元縮減された３次元顕微鏡法（走査が１次元で画像が２次元）による光源走査法の説明図であり、（Ａ）は光線偏向がない場合のスリット絞りの開口端縁の全域走査を示す図、（Ｂ）は光線偏向がある場合のスリット絞りの開口端縁の全域走査を示す図である。
【図５Ｂ】図３（Ｂ）に示す偏在型重心移動の場合の、スリット絞りにより次元縮減された３次元顕微鏡法（走査が１次元で画像が２次元）による光源走査法の説明図であり、（Ｃ）は光線偏向がない場合のスリット絞りの開口端縁の部分域走査を示す図、（Ｄ）は光線偏向がある場合のスリット絞りの開口端縁の部分域走査を示す図である。
【図６Ａ】光源の部分域走査手法と走査法のバリエーションを示す説明図である。
【図６Ｂ】スリット絞りの部分域走査手法と走査法のバリエーションを示す説明図である。
【図６Ｃ】スリット絞りの端縁を光軸中心に固定した光源走査手法と走査法のバリエーションを示す説明図である。
【図７】（Ａ）は微分位相像を示す古典的なシュリーレン法に対応する光線を遮蔽する絞り機構を示す図、（Ｂ）は（Ａ）の遮蔽板をπ位相板５５に代替した図である。（Ｃ）は本願発明による第１実施例を示し、図６Ｃの部分域光源走査法に対応する、スリット絞り上にπ位相板を設置したときの部分域光源走査法を示す図、（Ｄ）は本願発明による第２実施例を示し、図６Ｃの部分域光源走査法に対応する、点光源をπ位相板が設置された絞り開口の上半部及び下半部において別々にて同時点灯したときの部分域光源走査法を示す図であり、光源走査を小白丸で示す。
【図８】（Ａ）は本願発明による透過型光学顕微鏡装置の実施の形態を示す概要説明図、（Ｂ）はその制御システム図、（Ｃ）は（Ａ）の十字状ＬＥＤアレイ光源を示す正面図である。
【図９】図７Ｃ（Ｃ）に示す本願発明による第１の実施形態で用いられるデータ処理システムを示すフローチャートである。
【図１０】図７Ｃ（Ｄ）に示す本願発明による第２の実施形態で用いられるデータ処理システムを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本願発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して、詳細に説明する。図１（Ａ）は、検出面２４上の１つの像点に集光する光が、光源面２１上の３箇の異なる点光源から射出される様子を示す。この場合の光線図は、物面２２上における観察対象物３４の有無で異なり、その様子はそれぞれ実線と破線で示される。これは、従来の収束光照射における検出面１１４上の明視野円盤の移動に対応し、平行光照射における検出面２４上の１点に収束する多数の点光源からなる光源面の領域（以下、４次元走査透過型顕微鏡法で使われている「検出面明視野円盤」に対応し、「光源面明視野円盤」と呼ぶ）。）の移動を表し、この移動を定量できれば微分位相量が観察対象物３４上の各点で求めることができる。
【００１９】
（従来法における微分位相量の観測原理）
光には逆進性があることから、本願発明の理解のために、まず、すでに報告されている収束光走査回折像観察４次元顕微鏡の結像過程について説明する。
【００２０】
（収束光の偏向と微分位相）
図１（Ｂ）は、前述した収束光の偏向を用いた４次元顕微鏡法の結像過程の概略を示す図である。図１（Ｂ）に示す結像光学系は、４箇の光学面を備えており、第１光学面が光源面、第２光学面が絞り面、第３光学面が物面、第４光学面が検出面となる。ここで光源面と物面が光学的共役関係、絞り面と検出面が光学的共役関係にある。この光学系１００では、第１レンズ１０１の前焦点面にある光源面１１１上の１つの光源点から射出した光が第１レンズ１０１、絞り１１２、第２レンズ１０２を通過し、物面１１３上の観察対象物３４の光源点共役部位に収束光として照射される。
【００２１】
観察対象物３４により偏向した収束光は、第３レンズ１０３を通過し、後焦点面に設置された検出面１１４上に絞りの像である検出面明視野円盤（便宜上図２の「３２」を参照）を形成する。この検出面明視野円盤３２の移動が微分位相を与え、光源位置を走査すれば微分位相走査像が得られる。光による物の結像過程は、以下見るように４つの光学面をつなぐ３箇のレンズ１０１〜１０３によるフーリエ変換（以下「ＦＴ」と略称する）過程でもある。
【００２２】
具体的には、第１レンズ１０１の前焦点面にある光源面１１１上の１点ｒsから射出された光δ（ｒ）は、第１レンズ１０１を通過する際に逆フーリエ変換（ＦＴ-1）で表される作用を受け、絞りにおいて絞り関数Ｐ（ｓ）で表される作用を受け、第２レンズ１０２を通過する際にＦＴで表される作用を受け、プローブ関数ｐ（ｒs−ｒ）で表される収束光としてｔ（ｒ）で表される物面１１３に照射される。そして、物で偏向した収束光は、第３レンズ１０３を通過する際にＦＴで表される作用を受け、後焦点面に置かれた検出面１１４上に下記数式１で表される検出面明視野円盤３２を形成する。
【００２３】
【数１】
2022000667.tif 000003
【００２４】
この検出面明視野円盤３２の移動が微分位相を与え、光源位置を走査すれば、照射レンズ系により収束する光は観察対象物３４を走査するので、微分走査像が得られる。このように光線による物の結像過程は、４つの光学面をつなぐ３箇のレンズによるＦＴ過程でもある。ちなみに、絞り関数Ｐ（ｓ）とプローブ関数ｐ（ｒ）はＦＴでむすばれている。
【００２５】
ところで、検出面明視野円盤３２の移動を定量するのに必要な検出器の大きさは、検出面明視野円盤３２の移動幅を考慮して、最大移動幅を付加した検出面明視野円盤３２の直径の大きさが下限となる。検出面明視野円盤３２自体は、絞り面１１２に配置された絞りの像なので、その大きさは絞りの大きさに比例し、空間分解能を良くするため収束光を小さく収束すればするほど逆比例関係にある絞りは大きくなり、対応する検出器も大きくなる。一方、微分位相の観測精度は、検出器の空間解像度に比例する。検出器の要求仕様は、このように求めたい画像空間分解能と微分位相観測精度の両者に依存する。
【００２６】
一般に、観察対象物３４を透過する光波や電子波などの搬送波は、屈折率に依存した位相変化を受ける。屈折率は空間的に分布するので、対応する位相も空間的に分布する。その際、位相と屈折率の関係は下記数式２により表される。
【００２７】
【数２】
2022000667.tif 000004
【００２８】
上記数式２において、θ（ｒ）は位相分布、ｎ（ｒ）は屈折率分布、ｌ（ｒ）は厚さの分布、ｒは２次元空間座標、λは搬送波の波長を表す。また、（ｎ（ｒ）−１）の「１」は空気（正確には真空）の屈折率であり、物がある時とない時のその場所の屈折率の変化が、位相変化に対応している。そして、（ｎ（ｒ）−１）ｌ（ｒ）が光学距離に相当する。
【００２９】
屈折率の分布は、微小範囲で見れば小さなプリズムの分布と近似できる。微小プリズムは、微小部分の屈折率の空間変化であり、上記数式１の関係から、位相の空間変化に対応することになり、結局位相空間分布の勾配（２次元１次微分＝∇θ（ｒ）＝（∂θ（ｒ）／∂ｘ，∂θ（ｒ）／∂ｙ））に比例する。一方、観察対象物３４を微小プリズムの集まりと考えた場合、収束光で狭い部分を照明すると、光線は微小プリズムにより入射方向とは異なる方向に曲げられる。これが収束光を観察対象物３４に照射したときに起こる光線偏向の物理過程である。
【００３０】
従って、収束光の偏向を定量できれば、微分位相量を観測することができる。そして、偏向量の最も簡単な方法は、観察対象物３４に照射された収束光により、検出面に作出される検出面明視野円盤の偏向に伴う空間移動を定量することである。
【００３１】
（収束光照射とその走査による従来の微分位相像観察法）
最も簡略化した顕微鏡光学系は、対物レンズと接眼レンズとから構成される２レンズ系であるが、本実施形態の顕微鏡観察方法では、光源面と検出面でそれぞれ独立に定義された光源面２次元座標と検出面２次元座標を用いて表される４次元座標に基づいて４次元的観察を行うため、光源面を明示的に定義する必要がある。そこで、本実施形態の顕微鏡観察方法では、図１（Ｂ）で示したような光源面と集光レンズ（コレクターレンズ）を含めた３レンズ系を採用する。
【００３２】
３レンズ・４光学面系の扱いをさらに単純化するため、本実施形態の顕微鏡観察方法では、３箇のレンズは同じ焦点距離ｆを持ち、レンズと光学面合わせて７つの要素が同じ焦点距離間隔で結合される３レンズ・４光学面・６焦点系とする。ここでは、顕微鏡の拡大機能は考えないので、結像倍率は１倍として扱う。また、本実施形態においては、レンズ作用を、物理的に扱うときは光の収束効果、数理的に扱うときはＦＴ作用として扱う。
【００３３】
３レンズ・４光学面系の光学系において、収束光を走査しながら照射する従来の微分位相像観察法を図示したのが図１（Ｂ）である。ここで、検出面明視野円盤を現出させる光場を、光源面の実空間座標ｒsと検出面の周波数空間座標ｓdを用いてＵSTEM（ｒs，ｓd）と表記する。４次元関数の変数である２箇の２次元座標の順序は、光源面座標を最初に、検出面座標を２番目に置いた。ＵSTEM（ｒs，ｓd）は、個別ｒsをパラメーターとしてｓd座標検出面に展開する回折像２次元関数であり、観察対象物３４に共役な光源点ｒsを２次元走査して初めて４次元となる。なお微分位相は、収束光の偏向に伴う３１から３２への検出面明視野円盤の移動で表されるので、具体的な計算は、光場により形成されるｓd座標強度像（２乗検出像）としての検出面明視野円盤関数、｜ＵSTEM（ｒs，ｓd）｜2の重心計算を用いて行われる。これを、検出面におけるｓd重心と呼ぶ。
【００３４】
一般に、顕微鏡においては、観察対象物３４に収束光を照射し、その収束光を２次元走査し、検出面上に置いた広角検出器で回折像の全強度を取得することにより、操作的に２次元像を取得する走査法と、観察対象物３４に平行光を照射し、走査なしの１回の照射により生成される２次元実像を検出面上に置いた２次元検出器により取得する平行光照射法がある。前述したように、収束光照射の場合、照明光は観察対象物３４の狭い領域に当たるので、局所的に偏向度合いを特定することができる。一方、平行光照射の場合、照明光が観察対象物３４の広い領域に照射されて四方八方に偏向されるため、観察対象物３４上の局所での偏向度合いを特定し、場所依存的には微分位相を抽出することはできないと考えられてきた。
しかしながら、本願発明前は光の逆進性より以下の知見を見出し、本願発明をなすに至った。
【００３５】
（平行光照射を用いた４次元透過型顕微鏡法による微分位相量観測原理）
まず、本願発明の基本である平行光照射による４次元透過型顕微鏡（４Ｄ−ＴＥＭ）法による微分位相両の観測原理について説明する。本願発明者は、光の逆進の性質を用い、かつ、通常の２次元的観察ではなく、４次元的観察を行えば、平行光照射法でも微分位相の観察が可能であることを見出し、本願発明をなすに至った。本願発明に対応する光学系１０である図１（Ａ）は、多数の点光源から射出される平行照明光を模式化した平行光照射型４次元法の結像図である。ただし、多数の点光源からの同時照射実験はないので、図１（Ａ）は異なる個別的点光源実験の重ね合わせを概念的に示したものである。図１（Ｂ）と図１（Ａ）は鏡映対象であり、電子顕微鏡ですでに見出されている収束照明光を用いる走査透過型電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）と平行照明光を用いる透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の間に成立するＴＥＭ−ＳＴＥＭ相反定理の４次元法への拡張であり、以後４次元相反定理と呼ぶ。
【００３６】
収束光を適用した走査型４次元法では、光源面１１１上の１つの光源点ｒsから光線束が射出される。図１（Ｂ）に示すように、その様子は例えば代表的な３箇の光線で表現される。そして、各光線は、レンズ１０１及びレンズ１０２により物面１１３上の１点に収束され、観察対象物３４により散乱された後、レンズ１０３により回折されて、検出面１１４の２次元座標上に広がる回折像、明視野円盤として観察される（明視野円盤３２は図２に示される）。図１（Ａ）に示す実線は光線が観察対象物３４によって局所的に偏向する様子を示し、破線は観察対象物３４がない時に直進する様子を示している。即ち、図１（Ｂ）には、観察対象物３４による収束光の偏向に伴い、検出面１１４上で検出面明視野円盤３２が移動する様子が明示されている。この移動量が微分位相量に対応する。
【００３７】
光の逆進性を利用し、図１（Ｂ）に示す結像図を鏡映反転しても光線図は成立する。図１（Ａ）は、図１（Ｂ）の光逆進光線図であり、光源面の多数の点からそれぞれ光軸に対して傾きをもった平行照明光が観察対象物３４に照射される。図１（Ａ）は、いわば図１（Ｂ）の光源面と検出面とを置換した上で、左右逆転させた結像図となっている。図１（Ａ）は、検出面２４上の１つの像点に集光する光線が、光源面２１上の３箇の異なる点光源から射出される様子を示す。この場合の光線図は、物面２２上における観察対象物３４の有無で異なり、その様子はそれぞれ実線と破線で示される。これは、従来の収束光照射における検出面１１４上の明視野円盤の移動に対応し、平行光照射における検出面２４上の１点に収束する多数の点光源からなる光源面の領域の移動を表し、この移動を定量できれば微分位相量が観察対象物３４上の各点で求めることができる。なお、図２には、便宜上走査透過型４次元法の検出面明視野円盤３２および対応する透過型４次元法の光源面明視野円盤（３２）の両方について、光線偏向に伴う移動の様子が４次元相反的に描かれている。
【００３８】
光の逆進で重要なのは、光源面と検出面が入れ代わることである。これに伴い光学的共役関係も入れ代わり、光源面と絞り面が光学的共役関係、物面と検出面が光学的共役関係となる。ただし、光学面の位置は変わるが、各光学面に付与された座標系の物理的性質、即ち、実空間座標系か周波数空間座標系かの性質は保持される。その結果、検出面（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｐｌａｎｅ）の周波数空間座標ｓdは、光源面（ｓｏｕｒｃｅ  ｐｌａｎｅ）の周波数空間座標ｓsに、光源面（ｓｏｕｒｃｅ  ｐｌａｎｅ）の実空間座標ｒsは、検出面（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｐｌａｎｅ）の実空間座標ｒdに、それぞれ変更される（（下つきのｄおよびｓはそれぞれｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｐｌａｎｅ、ｓｏｕｒｃｅ  ｐｌａｎｅを意味している）。前述した収束光照射４次元法の検出面光場の標記法ＵSTEM（ｒs，ｓd）に従うと、平行光を用いる平行光照射４次元法（４Ｄ−ＴＥＭ）の検出面光場はＵTEM（ｓs，ｒd）と表記される。ＵTEM（ｓs，ｒd）は、個別ｓsをパラメーターとしてｒd座標検出面に展開する実像２次元関数であり、光源点ｓsを２次元走査して初めて４次元となる。なお微分位相の計算は、個別ｒdに対応して計算的に生成されるｓs座標強度像（２乗検出像）｜ＵTEM（ｓs，ｒd）｜2に対して実行される。
【００３９】
平行光照射４次元法の場合、収束光照射４次元法とは異なり、光線の偏向は、個別ｒdに対応して仮想的に観測される光源面明視野円盤の移動として現れるので、微分位相量は、ｒdを固定してｓs座標で２次元展開される光源面明視野円盤関数｜ＵTEM（ｓs，ｒd）｜2の重心計算を用いて行われる。これを光源面におけるｓs重心と呼ぶ。
【００４０】
光学顕微鏡の平行光照射法では、通常点光源が光軸上に置かれるが、本願発明による平行光照射法では、収束光照射４次元法と同様に、光軸から離れた点から発せられる光線を２次元走査する。
【００４１】
この場合、光軸から離れた点から観察物対象物を照明すること、即ち、通常用いられる光軸に平行な光線の照射に代えて、光軸に対して傾きをもつ平行光を照射することにより、検出面で観察される実像を記録する。そして、光源点を２次元的に走査し、その都度観察像を、例えば顕微鏡装置に設けられたデータ記憶部に蓄積する。こうしてデータは、光源面の２次元座標と実像検出面の２次元座標の合成である４次元座標上に展開され４次元データとなる。
【００４２】
３レンズ・４光学面の７要素で構成される光学系を用いて、収束光照射と平行光照射を比較すると、図１（Ｂ）に示すように、収束光照射では、光源面１１１−検出面１１４結像過程の数理はＦＴ-1、ＦＴ及びＦＴの順となる。一方、図１（Ａ）に示すように、光の逆進に対応し、平行光照射では、光源面２１−検出面２４結像過程の数理はＦＴ、ＦＴ及びＦＴ-1の順となる。
【００４３】
そして、収束光照射で得られる４次元像は、下記数式３で表される照射光のプローブ関数ｐ（ｒ）と、下記数式４で表される対象物の透過係数または透過関数ｔ（ｒ）を用いて、下記数式５で表される。なお、プローブ関数ｐ（ｒ）と対象物透過関数ｔ（ｒ）は、共に複素数である。
【００４４】
【数３】
2022000667.tif 000005
【００４５】
【数４】
2022000667.tif 000006
【００４６】
【数５】
2022000667.tif 000007
【００４７】
一方、平行光照射で得られる４次元像は、下記数式６で表される。
【００４８】
【数６】
2022000667.tif 000008
【００４９】
ここで、上記数式６における絞り関数Ｐ（ｓ）は下記数式７で表され、照射光プローブ関数とＦＴで結ばれる。また、Ｔ（ｓ）は、下記数式８で表され、対象物透過関数とＦＴで結ばれる。なお、Ｐ（ｓ）とＴ（ｓ）は、共に複数である。
【００５０】
【数７】
2022000667.tif 000009
【００５１】
【数８】
2022000667.tif 000010
【００５２】
収束光照射による４次元法と平行光照射による４次元法での観察対象物３４の各点ｒにおける微分位相量は、座標ｓに展開する明視野円盤の重心積分より求まるが、上記数式２〜８を用いて、それぞれ数式９及び数式１０で表される。
【００５３】
【数９】
2022000667.tif 000011
【００５４】
【数１０】
2022000667.tif 000012
【００５５】
上記数式９及び数式１０において、分子は１次モーメントを表し、分母は信号強度に対応する面積分を表す。また、割り算は重心に対応し、こうした演算を重心積分という。
【００５６】
ｓd重心に対する上記数式９は、透過関数の位相成分の微分∇θt（ｒ）とプローブ関数の位相成分の微分∇θp（ｒ）の双方を含んでいる。微分符号などは若干異なるが、これは、Ｗａｄｄｅｌｌらにより世界で最初に導出された数式と同じである（非特許文献１参照）。一方、上記数式１０に示すｓs重心の表式は、本願発明者が発見したものであり、本出願が世界初出である。そして、上記数式９及び数式１０を比較すると、光源面における実座標ｒsを変数とするか、検出面における実座標ｒdを変数とするかの違いを除けば、透過関数とプローブ関数の位相成分の微分表現が同じ表式を与えていることがわかる。
【００５７】
この結果は、図１（Ａ）、図１（Ｂ）に示す２箇の４次元法の光場が光の逆進から考え等価であることを解析的に示していると共に、Ｗａｄｄｅｌｌらにより提案された収束光の観察対象物３４上走査４次元法が、平行光照射を用いた光源面上点光源走査４次元法に代替できることを意味している。ここで、プローブ関数ｐ（ｒ）について考えると、顕微鏡のプローブ関数は、ほとんどのケースで中心対称なので、位相微分∇θp（０）は０となり、ｓd重心及びｓs重心は、共にｔ（ｒ）の位相成分θt（ｒ）の微分のみを用いて表される。ただし、本願発明の平行光照射４次元顕微鏡観察方法で用いられる微分は、２次元１次微分、即ち下記数式１１に示す勾配を意味し、∇θt（ｒ）は下記数式１２で表される。
【００５８】
【数１１】
2022000667.tif 000013
【００５９】
【数１２】
2022000667.tif 000014
【００６０】
ここで収束光の収束幅より小さい顆粒の透過関数ｔ（ｒ）を具体的に表式し、数式９、１０をさらに簡略化する。その上で図３に示す明視野円盤の２箇の異なる光線強度変動につき理論的に考察する。その中で２箇の強度変動現象が微分位相法の本質に迫る典型であることを示す。
【００６１】
理論を単純化するため、吸収のない純位相物体を仮定すると、その透過関数は以下で表式される。
【００６２】
【数１３】
2022000667.tif 000015
ここで顆粒の位相θ（ｒ）は１より充分小さくまた顆粒が充分小さいとしてその空間依存性をデルタ関数（δ（ｒ））で近似すれば、位相θ（ｒ）は以下で表される。
【００６３】
【数１４】
2022000667.tif 000016
これらを用いて数式９、１０は下記に簡略化される。
【００６４】
【数１５】
2022000667.tif 000017
【００６５】
【数１６】
2022000667.tif 000018
数式１５、１６の第１項は定数項なので、それを無視すれば、両者は以下の同一表式にまとまる。
【００６６】
【数１７】
2022000667.tif 000019
【００６７】
【数１８】
2022000667.tif 000020
【００６８】
数式１８には右辺第１項と第３項に異なる微分表式が現れている。この２箇の表式が図３に示した明視野円盤の重心積分と関係する。
数式１８と図３の対応は次のようになる。入射収束光３５の観察対象物３４面での形状がプローブ関数｜ｐ（ｒ）｜2に、光線収部位３９の観察対象物３４位相がθ（ｒ）に対応する。
従って、光線収束が位相変化の傾向より狭い図３（Ａ）の場合、｜ｐ（ｒ）｜2をデルタ関数とみたて、右辺第１項を採用すれば、数式１８は最終的に以下の簡略形となる。
【００６９】
【数１９】
2022000667.tif 000021
【００７０】
すなわち、重心移動は正確に観察対象物３４の位相の微分に比例する。
一方、小顆粒のように位相変化が、収束光幅に較べ急峻でデルタ関数的のとき、θ（ｒ）をデルタ関数とみたて、右辺第３項を採用すれば、数式１８は最終的に以下の簡略形となる。
【００７１】
【数２０】
2022000667.tif 000022
【００７２】
すなわち、重心移動は小顆粒の位相の大きさσを反映するが、そのｒ座標依存性、すなわち像形状は、プローブ関数の微分∇｜ｐ（ｒ）｜2という装置関数固有のものになる。
【００７３】
以上から、収束光３５、３６の照射による４次元顕微鏡データ及び平行光照射による４次元顕微鏡データの両方について数式９及び数式１０に示すｓ重心計算を行えば、観察対象物３４の微分位相が求まることが分かる。実験で得られた∇θ（ｒ）（２次元）からθ（ｒ）（１次元）を得るには、勾配からポテンシャルを求める定法に従い、下記数式１５に示す線積分操作を行えばよい。
【００７４】
【数２１】
2022000667.tif 000023
【００７５】
上記数式１５において、積分路Ｃは、例えばある起点ｒi＝（ｘi，ｙi）からｘ軸に平行な直線（ｘ，ｙi）、その直線端点（ｘf，ｙi）でｙ軸に平行な直線（ｘf，ｙ）で、終点が求めたいｒf＝（ｘf，ｙf）点となるような道筋である。数式１５はまた位相を回復するのに直交する２箇の微分位相成分があれば充分であることを示している。
【００７６】
また、上記数式９及び数式１０で周波数空間の重心（ｓ重心）を計算するとき、下記数式１６に示すｔ（ｒ）の強度情報は、分母に現れる光場２乗検出の全積分値として得られているので、観察対象物３４の光学情報、位相と強度の両方が得られたことになる。
【００７７】
【数２２】
2022000667.tif 000024
（高感度化の方法）
【００７８】
本願発明による４次元透過型顕微鏡では、図３に示す光線偏向の２箇の様式に対し以下に述べる高感度化を実現できる。図３は、元来、電子線に対する２つの偏向様式を説明する図であるが、光学顕微鏡においても、電子線を「光線」に、急峻で狭い原子ポテンシャルを「細胞内器官のような波長以下の小顆粒３８」に読み換えれば、２箇の光線偏向様式が成立する。従って以下図３における電子線を光線に読み替えて説明を行う。
まず図３（Ａ）を見ると、明視野円盤３１の平行移動が小さい場合、その変化は移動方向に直交する絞り周辺部の狭い領域で生じていることが分かる。これは重心移動を与える信号が絞り周辺部の狭い領域３１ａ、３２ａに集中していることを意味している。事実４Ｄ−ＳＴＥＭの観測データにおいても重心移動を与える信号が不均等であり、絞り周辺部分の積分走査で高感度の微分位相が求められるとの報告がある（非特許文献１３）。これを本願発明による４Ｄ−ＴＥＭに応用した場合、光源の一様均等走査の代わりに、絞り周辺部の部分域走査を行うことにより、高感度の新規４次元観察法が可能となる。なお、図３（Ａ）では便宜上、光線を細かい点々で表わし、平行移動した部分を「３１ａ」、「３２ａ」として表わした。
次に図３（Ｂ）を見ると、光線偏在による偏向がある場合、Ｂ２に見るように明視野円盤の光線偏向は、円盤周辺部の狭い領域（光線強度の減弱部分３３ａと光線強度の増強部分３３ｂ）に集中していることがわかる。これはその光線偏在集中域に対応する光源点を部分域走査すれば良いことを意味している。これらの部分域走査は、観測の高速化のみならず、部分域走査と全域走査とで全光線量をそろえた場合、ノイズは変わらず、信号寄与の大きい部分域走査の信号が全域走査での平均信号より大となり、最終的に感度を向上が可能となる。他方、４次元走査透過型顕微鏡は明視野円盤内部の信号を全て一度に取り込むので、４次元透過型顕微鏡では可能となる部分域走査対応の部分信号検出はできない。従って感度向上も期待することができない。
【００７９】
図３（Ｂ）において、微小点エリア３３ｂは光線の偏在を表現しており、明視野円盤３３内部の光線の偏在（光線の強度減縮部分３３ａと光線の強度増強部分３３ｂ）は光線偏向の一種で、図３（Ａ）に示す明視野円盤の平行移動と同様に重心移動を引き起こす。そしてこれは、重心移動すなわち微分位相の大きさの観測精度（感度）に係わる。図３（Ｂ）に見るように、強度の偏在は水平方向に反対称であるため、２箇の絞り開口端縁のｓ（３３ａ又は３３ｂ）の観測でも重心移動を推定することができる。しかし、背景光に重なって正負反対に偏在する信号光線強度を別個に観測し、その両者の差をとると、背景光や２次散乱、非弾性散乱のような信号擾乱要因が除去され、暗視野の中に微分位相像のみ浮かびあがる極めてクリーンな微分位相像が現出する。
【００８０】
（分解能と感度の相克性）
分解能は、絞り開口５１の大きさと収差の影響を受けずに、その開口いっぱいに広がる光線（すなわち高周波情報を担う光線）をどこまで拾えるかに係わる。別言すれば、開口の像である矩形明視野円盤の大きさが分解能を規定する。前述のように、図３（Ａ）に示す明視野円盤３１の平行移動が小さい場合、その変化は移動方向に直交する絞り周辺部の狭い領域で生じる。すなわち重心移動を与える信号が絞り周辺部の狭い領域３１ａ、３２ａに集中している。この場合、分解能を上げるため開口を広く取ると重心移動領域３１ａ、３２ａは相対的に小さくなる。光線資源につき開口全体をカバーするように照射する場合、当然重心移動を与える信号成分は光線資源のごく一部を使うことになり感度が落ちる。これは観測法一般に見られる分解能と感度の相克性の例である。これを回避するのが、本願発明に係る部分域走査法であり、光線資源を信号に寄与する絞り周辺部領域３１ａ、３２ａに集中することができる。
一方、図３（Ｂ）においては、光線偏向は、Ｂ２に見るように、明視野円盤内部の光線偏在として表れる。高分解能化のため開口を広く取り、明視野円盤が大きくなっても、光線偏在は円盤周辺部の狭い領域（３３ａと３３ｂ）に集中しているため、この偏在領域に対し、光線源を部分域走査すれば、例えば細胞内器官のような波長以下の小顆粒３８であっても高感度の観察を維持できるのである。
すなわち、本願発明に係る光源の部分域走査法は、光線偏向の様式によらず分解能と感度の相克性問題を解決する。この手法は、常に明視野円盤全体を観察対象とする４次元走査透過型顕微鏡では実現しえない４次元透過型顕微鏡独自のものである。
【００８１】
（次元縮減の方法）
４次元法の他の難点である高次元性に関しては、本願発明による４Ｄ−ＴＥＭで特徴的な次元縮減法がある。図１（Ａ）より、４次元法の真髄は偏向光線の絞りによる蹴られにあることが分かる。逆説的に言えば、絞りがなければ明視野円盤は無限に広がり重心位置を特定することができない。よって、一方向に大きくに開いた絞り、すなわち図４Ａ、図４Ｂ及び図５Ａ、図５Ｂに示すような絞り開口５１が横長の矩形状のスリット絞り５０を用いれば、光線の蹴られは長手方向に直交するスリット絞り５０の開口５１の端部のみで起こるので、その方向の微分位相が得られることになる。理論的考察からこの手法は、図３（Ｂ）に示す光線偏在型偏向の場合にも適用できる４Ｄ−ＴＥＭの特徴である。これは一方向（次元）の微分なので対応する走査も、絞り開口５１が矩形状のスリット絞り５０の長手方向に直交した１次元走査となり、４次元データを３次元データへと次元縮減することができる。これにより、観測の効率化を実現することができる。感度向上で述べた部分域走査法についても次元縮減法を適用することができ、走査範囲の低減化と合わせ観測時間をさらに縮小することができる。図４Ａ、図４Ｂ及び図５Ａ、図５Ｂは矩形の光源面明視野円盤を図象化してものであり、５０はスリット絞りである。またｓy軸上の微小白丸点は走査する光源点を表し、ｓy軸の方向が光源走査方向に対応する。ｓy軸上の微小白丸点対応のデータは、３次元に次元縮減されたデータ｜ＵTEM（ｓs，ｒd）｜2において、各２次元観察点ｒdでのｓy方向の光源面明視野円盤３２（実際には１次元データなので、線状の「光源面明視野杖」と呼ばれる）として観測される。また光源面明視野杖の観測に簡略化された４Ｄ−ＴＥＭは３Ｄ−ＴＥＭと呼ばれる。
なお、図４Ａ（Ａ）〜図４Ｂ（Ｄ）はいずれも図３（Ａ）に示す「３１」から「３２」の状態になる明視野円盤平行移動の場合に対応し、図４Ａ（Ｂ）と図４Ｂ（Ｄ）の「３１ａ」「３２ａ」は図３（Ｂ）の「３１ａ」「３２ａ」と同一である。また図５Ａ（Ａ）〜（Ｄ）はいずれも図３（Ｂ）に示す「３１」から「３３」の状態になる明視野円盤内光線偏在の場合に対応し、図５Ａ（Ｂ）と図５Ｂ（Ｄ）の「３３ａ」「３３ｂ」は図３（Ｂ）の「３３ａ」「３３ｂ」と同一である。スリット絞り５０のサイズは、対物レンズの焦点距離及び求めたい分解能に依存する。サイズが大きいほど絞り開口５１が大きいので高分解能になる。例えば焦点距離１ｍｍで２ｍｍ開口幅では、５００ｎｍ波長で５００ｎｍ分解能となる。本実施例ではスリット絞り５０のサイズは、標準的には、縦ａ２ｍｍ、横ｂ４ｍｍである。
（感度向上と次元縮減とを組み合わせる方法）
【００８２】
次に感度向上と次元縮減を組み合わせた実験法につき説明する。図４Ａ及び図４Ｂは、図３（Ａ）に示す平行移動型の光線偏向の場合のこの方法の基本形を模式的に示しており、図５Ａ及び図５Ｂは、図３（Ｂ）に示す偏在型の光線偏向の場合のこの方法の基本形を模式的に示している。図４Ａ、図４Ｂ及び図５Ａ、図５Ｂともに、光源を２次元走査したときに現れるスリット形の光源面明視野円盤３１、３２がスリット絞り５０の矩形状開口５１に一致するように光源面に投影して描かれている（図４Ａ及び図４Ｂ並びに図５Ａ及び図５Ｂの５１（３１）の表記は図３の「３１」に対応し、図４Ａ及び図４Ｂ並びに図５Ａ及び図５Ｂの５１（３２）の表記は図３の「３２」に対応し、図５の５１（３３）の表記は図３の「３３」に対応する）。いずれの場合も絞り開口５１が矩形状のスリット絞り５０（図４Ａ及び図４Ｂ並びに図５Ａ及び図５Ｂに示す）の長手方向に直交する方向に光源の１次元走査を行う。また図４Ａ、図４Ｂ及び図５Ａ、図５Ｂともに、光源の走査点はスリット絞り５０の中央を横切る小さい白丸点列として表示されている。
【００８３】
図４Ａ及び図４Ｂに示す平行移動型の光線偏向の場合、走査領域は絞り開口５１が矩形状のスリット絞り５０の端を越え、観察対象の光線偏向幅の最大値までをカバーし、スリット絞り５０の全域を走査するように設定される。
図５Ａ及び図５Ｂに示す偏在型の光線偏向の場合、走査領域は絞り開口５１が矩形状のスリット絞り５０の内側、すなわち開口部５１のみに設定される。光源の走査点はスリット絞り開口５１の中央を横切る小さい白丸点列として表示される。これらは、３次元に次元縮減されたデータ｜ＵTEM（ｓs，ｒd）｜2において各２次元観察点ｒdでのｓy方向の光源面明視野杖として観測される。微分位相を求める４次元顕微鏡の重心積分処理は、次元を下げた３次元顕微鏡において、本来の２次元面積分から１次元線積分に簡略化される。
【００８４】
図４Ｂ（Ｄ）及び図５Ｂ（Ｄ）に示す部分域走査３次元顕微鏡法がどの程度の感度向上をもたらすかは簡単な考察で推計することができる。
平行移動型の光線偏向の場合、図４Ａ（Ｂ）に示す全域走査ではＬ＋ｌ／２の点が走査される。他方図４Ｂ（Ｄ）に示す部分域走査ではｌの点が走査される。両者ともに重心を求める線積分は同一の微分位相∂θ（ｒ）／∂ｙを与える。しかし部分域走査（図４Ｂ（Ｄ））では光線がｌ点に集中するので、信号の絶対値は、Ｌ＋ｌ／２点の全域走査に分散される全域走査に比べ、（Ｌ＋ｌ／２）／ｌ倍される。一方部分域走査も全域走査も、総光量は観察対象物３４の照射部位の限界光線量にそろえるので、ノイズは同一である。従って感度は、部分域走査法が全域走査法に対し（Ｌ＋ｌ／２）／ｌ倍高まる。ｌの大きさはカバーすべき重心移動量∂θ（ｒ）／∂ｙの最大値で決まるが、一般にＬを定める絞り開口幅に比べはるかに小さいので（Ｌ＋ｌ／２）／ｌは極めて大きな量になり、信号対雑音比で決まる画質が劇的に向上する効果がある。
偏在型の光線偏向の場合、図５Ａ（Ｂ）に示す全域走査ではＬの点が走査される。他方図５Ｂ（Ｄ）に示す部分域走査ではｌの点が走査される。図５Ｂ（Ｄ）に見られる光線の偏在は、ｘ軸方向には一様で、ｙ軸方向には定数項に（−π／２、π／２）をカバーする正弦関数（ｓｉｎ型）が乗るという極めて簡単な分布形状をしている。光線偏在もこの分布形に対する、部分域走査対応の（−π／２、π／２）域両端抽出重心積分と全域走査対応の（−π／２、π／２）全域重心積分の比は理論的に１．７と与えられる。これは部分域走査法の感度優位性を示しており、平行移動型の光線偏向の場合（図４Ｂ（Ｄ））ほどは劇的でないが、感度向上効果を奏する。
小顆粒３８により散乱された光線は、図５Ａ（Ａ）から図５Ａ（Ｂ）に示すようにスリット絞り５０の内部での強度変動をもたらす。このとき最も大きな強度変動はスリット絞りの開口の端縁近傍である。よって光線資源をそこに集中する光源走査を行うことにより、感度が向上する効果がある。その模式図を図５Ｂ（Ｃ）から図５Ｂ（Ｄ）に示す。
（斜光平行照射から光軸平行光照射への転換）
【００８５】
特許文献１の４次元透過型電子顕微鏡のもうひとつの課題は、斜光平行照射に必然的に随伴する大きな収差ボケである。これを回避しかつ４次元法を実効するベストな方法は、光軸平行光照射と絞り走査の組み合わせである。４次元走査透過型電子顕微鏡において、観察対象物３４の上を収束光で走査する手法と光源を光軸４３に固定し観察対象物３４を走査する方法は等価である。同じように、４次元透過型電子顕微鏡において、光源を走査する方法と光源を光軸４３に固定し絞りを走査する方法は等価である。後者の方法は斜光を用いないので、斜光平行照射に伴う収差ボケ回避の切り札となる。光軸平行光照射を核心とする３次元顕微鏡（次元縮減した４次元顕微鏡）の１次元走査法につき、部分域走査の種々のバリエーションと共に図６に示す。
【００８６】
光軸平行光照射を基本とする３次元顕微鏡の１次元走査法に関しては、図６Ｂのような光源を光軸４３に固定し絞り自体を走査する手法と図６Ｃのような絞り端を光軸４３に近接させ光軸４３の周りで光源を走査する手法の２箇が考えられる。比較のために、特許文献１に記載した斜光平行照射を利用する光源走査法も図６Ａとして載せてある。
絞り開口５１が矩形状のスリット絞り５０の部分域走査には、種々のバリエーションがある。以下説明する。
【００８７】
（光軸平行光照射・絞り部分域走査法）
図６Ｂの「６１」は図６Ａの「６１」に対応する絞り部分域走査法の基本形で、絞り開口５１が矩形状のスリット絞り５０の長手方向に直交する方向に光軸近傍で絞り開口端の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｂ１、Ｂ２）あるが、独立に２箇の開口端両側の走査を行い２箇の３次元データを取得する。走査に伴い光軸４３は、上方開口端走査（Ｂ１）、下方開口端走査（Ｂ２）ともに開口部５１、遮蔽部５２両者を通過する。平行移動型の光線偏向の場合、開口端両側の全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値の２倍までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
図６Ｂの「６２」は図６Ａの「６２」に対応する絞り部分域走査法で、図６Ｂの「６１」と同じようにスリット絞り５０に直交する方向に絞り開口端の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｂ１、Ｂ２）あるが、どちらか片方の開口端両側の走査を行い１箇の３次元データを取得する。図では、上方開口端（Ｂ１）を走査する場合のみを示しているが、下方開口端（Ｂ２）のみを走査することも可能である。走査に伴い光軸４３は、開口部５１、遮蔽部５２両者を通過する。平行移動型の光線偏向の場合、開口端両側の全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値の２倍までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
図６Ｂの「６３」は図６Ａの「６３」に対応する絞り部分域走査法で、図６Ｂの「６１」と同じようにスリット絞り５０に直交する方向に絞り開口端の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｂ１、Ｂ２）あるが、独立に２箇の開口端片側の走査を行い２箇の３次元データを取得する。走査に伴い光軸４３は開口部５１のみを通過する。平行移動型の光線偏向の場合、開口端片側の全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
図６Ｂの「６４」は図６Ａの「６４」に対応する絞り部分域走査法で、図６Ｂの「６１」と同じようにスリット絞り５０に直交する方向に絞り開口端の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｂ１、Ｂ２）あるが、どちらか片方の開口端片側の走査を行い１箇の３次元データを取得する。図では、上方開口端（Ｂ１）を走査する場合のみを示しているが、下方開口端（Ｂ２）のみを走査することも可能である。走査に伴い光軸４３は開口部５１のみを通過する。平行移動型の光線偏向の場合、開口端片側全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
図６Ｂの「６５」は図６Ａの「６５」に対応する絞り部分域走査法で、図６Ｂの「６１」と同じようにスリット絞り５０に直交する方向に絞り開口端の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｂ１、Ｂ２）あるが、独立に２箇の開口端片側の走査を行い２箇の３次元データを取得する。走査に伴い光軸４３は遮蔽部５２のみを通過する。平行移動型の光線偏向の場合、開口端片側全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
図６Ｂの「６６」は図６Ａの「６６」に対応する絞り部分域走査法で、図６Ｂの「６１」と同じようにスリット絞り５０に直交する方向に絞り開口端の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｂ１、Ｂ２）あるが、どちらか片方の開口端片側の走査を行い１箇の３次元データを取得する。図では、上側開口端（Ｂ１）を走査する場合のみを示しているが、下側開口端（Ｂ２）のみを走査することも可能である。走査に伴い光軸４３は遮蔽部５２のみを通過する。平行移動型の光線偏向の場合、開口端片側全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
【００８８】
（光軸平行光照射・光源部分域走査法）
図６Ｃの「６１」は図６Ａの「６１」に対応する光源部分域走査法の基本形で、矩形状のスリット絞り５０の絞り開口端を光軸４３の近傍に固定し、長手方向に直交する方向に光源の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｃ１、Ｃ２）あるが、独立に２箇の開口端両側の走査を行い２箇の３次元データを取得する。光軸４３は、開口５１側に置かれる。平行移動型の光線偏向の場合、開口端両側全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値の２倍までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
図６Ｃの「６２」は図６Ａの「６２」に対応する光源部分域走査法で、図６Ｃの「６１」と同じように矩形状のスリット絞り５０の絞り開口端を光軸４３の近傍に固定し、長手方向に直交する方向に光源の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｃ１、Ｃ２）あるが、どちらか片方の開口端両側の走査を行い１箇の３次元データを取得する。図では、上方開口端（Ｃ１）を走査する場合のみを示しているが、下方開口端（Ｃ２）のみを走査することも可能である。光軸４３は、開口５１側に置かれる。平行移動型の光線偏向の場合、開口端両側全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値の２倍までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
図６Ｃの「６３」は図６Ａの「６３」に対応する光源部分域走査法で、図６Ｃの「６１」と同じように矩形状のスリット絞り５０の絞り開口端を光軸４３の近傍に固定し、長手方向に直交する方向に光源の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｃ１、Ｃ２）あるが、独立に２箇の開口端開口側の走査を行い２箇の３次元データを取得する。光軸４３は、開口５１側に置かれる。平行移動型の光線偏向の場合、開口端片側全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
図６Ｃの「６４」は図６Ａの「６４」に対応する光源部分域走査法で、図６Ｃの「６１」と同じようにスリット絞り５０に直交する方向に絞り開口端の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｃ１、Ｃ２）あるが、どちらか片方の開口端開口側の走査を行い１箇の３次元データの取得を行う。図では、上側開口端（Ｃ１）を走査する場合のみを示しているが、下側開口端（Ｃ２）のみを走査することも可能である。光軸４３は、開口５１側に置かれる。平行移動型の光線偏向の場合、開口端片側全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
図６Ｃの「６５」は図６Ａの「６５」に対応する光源部分域走査法で、図６Ｃの「６１」と同じように絞り開口５１が矩形状のスリット絞り５０の絞り開口端を光軸４３の近傍に固定し、長手方向に直交する方向に光源の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｃ１、Ｃ２）あるが、独立に２箇の開口端遮蔽側の走査を行い２箇の３次元データを取得する。光軸４３は、開口５１側に置かれる。平行移動型の光線偏向の場合、開口端片側全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
図６Ｃの「６６」は図６Ａの「６６」に対応する光源部分域走査法で、図６Ｃの「６１」と同じように絞り開口５１が矩形状のスリット絞り５０の絞り開口端を光軸４３の近傍に固定し、長手方向に直交する方向に光源の１次元走査を行う。絞り開口端は対向して２箇（Ｃ１、Ｃ２）あるが、どちらか片方の開口端遮蔽側の走査を行い１箇の３次元データを取得する。図では、上側開口端（Ｃ１）を走査する場合のみを示しているが、下側開口端（Ｃ２）のみを走査することも可能である。光軸４３は、開口５１側に置かれる。平行移動型の光線偏向の場合、開口端片側全走査幅は観察対象の光線偏向の最大値までをカバーする。偏在型の光線偏向の場合、走査幅は１点から数十点とする。
（部分域走査による効果）
【００８９】
部分域走査の長所は、光線資源の局所集中による感度向上、走査点数が少なくなることによる高速化そして像エッジフリンジ現象の回避である。
図６Ａはスリット絞り５０の矩形状の絞り開口５１の絞り開口端縁の両側か片側かの走査選択および向き合う２箇の絞り開口端縁の両側か片側かの走査選択の組み合わせによりバリエーションが生まれる。
図６Ｂは、光源が光軸４３上で固定され、スリット絞り５０が上下方向に移動される場合である。この場合、光軸４３に絞り開口５１の端縁が上方から近接するか、下方から近接するかの２箇の走査手法があり、Ｂ１が前者をＢ２が後者を各示す。絞り開口端縁の両側か片側かの走査選択および向き合う２箇の絞り開口端縁の両方か片方かの走査選択の組み合わせにより上述の如きバリエーションが生まれる。図６Ｂにおいて絞り基板５２の移動を表わすため、矢印で表示した。光線の走査は、絞り基板５２を移動させ、対向する開口５１の端縁の片方即ち下部Ｂ２又は上部Ｂ１を走査することを表わすため、便宜、上部Ｂ１又は下部Ｂ２を分けて表わした。この絞り基板５２を移動しての上部Ｂ１又は下部Ｂ２の走査はそれぞれ１回合計２回行われる。
図６Ｃは、反対に、スリット絞り５０が固定され、光源の方が上下方向に移動される場合である。光線の走査は、絞り開口５１の上部Ｂ１又は下部Ｂ２を光軸４３の近傍に移動後、光源走査を対向する開口端縁の片方即ち下部Ｂ２又は上部Ｂ１にて行うことを表わすため、便宜、上部Ｂ１又は下部Ｂ２を分けて表わした。光源の移動を表わすため、小白丸点で表示した。
走査の高速化については、光源の移動である図６Ｃの場合の方が図６Ｂの場合より著しい効果がある。図６Ｃの光源操作の場合、走査速度はマイクロ秒とすることが可能となる。一方、図６Ｂの機械操作の場合、このような高速化は、困難である。
像エッジフリンジ現象の回避については、部分域走査が周波数空間で見ると、π位相板５５を少しずつずらして重ね合わせる合成フィルター生成の機能も担うので、π位相板５５の端部での急激な位相変化を緩和することにつながる、すなわち合成フィルターでは、π位相板５５の端部での０からπへの位相変化がゆるやかになり、像エッジフリンジ現象が回避される。
【００９０】
光学顕微鏡への応用の観点から図６の種々の部分域走査法を眺めると、図６Ａは、光軸４３から遠く離れた絞り５０の端縁近傍で光源の部分域走査をする方法、図６Ｂは光源を光軸４３に固定し、絞りの光軸４３近傍での部分域走査をする方法、図６Ｃは、図６Ａと図６Ｂの中間形で、絞り端を光軸４３に近接させて固定し、光軸４３近傍で光源を部分域走査する方法であることがわかる。図６Ｃによる中間形の光源走査法の図６Ａによる方法に較べた利点は、斜光照明回避による像劣化の回避であり、図６Ｂによる絞り走査法（図６Ｂ）に較べた利点は、絞りの機械的走査の回避による走査の高速化である。特に、図６Ｃの６３で示す方法は、図３で説明した２種の光線偏向様式を内包する細胞観察に適した部分域走査法である。よって、各種の優れた特性を持つこの図６Ｃの６３で示す部分域走査法が望ましい。
（位相板活用による更なる高感度化）
【００９１】
ところで、図６のＣ６３に示す部分域走査法は、１９世紀以来光学の世界で使用されてきた図７Ａに示すシュリ−レン法を想起させる。これは通常絞り４０の基板４２の開口部分の半分をナイフエッジなどの遮蔽板４４で覆う方法であり、微分位相像が得られる。さらに、遮蔽板４４をπ位相をずらす位相板４５に代えれば、シュリ−レン法と同等の微分位相像が２倍の感度（信号対雑音比）で得られる。これはヒルベルト微分コントラスト法とも称されるが、位相板への代替により、遮蔽板４４により喪失した光線が透過し復活するので、微分位相像の信号が倍化し感度が２倍向上するのである。
即ち、絞りの遮蔽板４４を、図７（Ｂ）のようにπ位相をずらす位相板４５に代えればよい。この方法を図６Ｃの６３に示す部分域走査法に適用すれば、部分域走査法の高感度化をさらに倍化できることになる。具体的には、図７（Ｃ）のようにπ位相をずらすπ位相板５５により開口５１の半分を覆う絞り機構を採用する。本願発明による第１実施例は、遮蔽板をほぼ透明なπ位相板５５に変えるので、π位相板５５自体が図６のＣ６３に見られる上下スプリットした絞り端を連結させる機能を持つ。電子顕微鏡ではπ位相板５５への照射は帯電問題からタブーであったが、ガラスからなる位相板を用いる光学顕微鏡では、この帯電問題が存在しないので、遠く離れた２つの絞り端をわざわざ用いる回り道が不要となる。図６Ｃ１、Ｃ２に示す６３の上側の部分域走査（Ｃ１）は、図７（Ｃ）のπ位相板５５の上側部分５６ａの部分域走査に、また図６Ｃ１、Ｃ２に示す６３の下側の部分域走査（Ｃ２）は、図７（Ｃ）のπ位相板５５の下側部分５６ｂの部分域走査に各対応させることができる。すなわち部分域走査はこのような上側の走査点５６ａと下側の走査点５６ｂの垂直方向の順次点灯走査５６を図６のＣ１、Ｃ２に示すＣ６３のように２回行わずに、一気通貫的に１回の部分域走査により行うことができる。
また、多数の走査点を一度に点灯せしめれば、部分域走査が上下半分ずつの２回まで簡易化することができる。図７（Ｄ）はその手法を図示している。
（ヒルベルト微分ペアー観測法）
【００９２】
図７（Ｃ）では、光源が部分域走査される。これを忠実に実行すれば、データは３次元となり、微分像を求めるにはその後も積分演算が必要となる。しかし、図７（Ｄ）の同時点灯法では、次元がさらに縮減され、３次元データは、微分方向を異にする２箇のヒルベルト微分コントラスト像に究極的に縮減する。これが次元縮減、部分域走査法、ヒルベルト位相板、同時点灯法の総合から得られる４Ｄ−ＴＥＭの高感度化の究極的な観察方法である。
【００９３】
矩形状のスリット開口５１を覆うπ位相板５５を利用して得られる微分位相像は、通常微分とは異なる特長、例えば簡便な位相像回復ルート（次段落と図１０参照）を持つ。よって本願発明では、この微分様式を通常微分と区別するためヒルベルト微分と呼ぶ。図７（Ｄ）で得られるヒルベルト微分位相像は、微分方向反転のため符号も反転しており、両者の差像は、純粋に微分位相像だけを保持した暗視野微分位相像となる。背景由来の強い明視野も２次成分や非弾性散乱由来の信号も除去されるので暗視野微分位相像と呼べる。
ヒルベルト微分位相像は、ＦＴと変形版の階段関数によるフィルター（以後階段関数型フィルターと呼ぶ）操作でゼルニケ位相差法に変換可能である（非特許文献１８）。従って最終的には位相差像自体も得られる。これは、暗視野位相差像と呼べる。
本願発明によれば、このように異なる挙動を示す２箇の様式の光線偏向に伴う重心移動の両者に対し部分域走査法により高感度化がもたらされるので、２箇の光線偏向様式をもつ細胞などの高感度微分位相観察に活用することができる。
【００９４】
図８は、図７に基き説明したスリット絞り５０を備える透過型の光学顕微鏡装置７０の実施例を示す。
透過型光学顕微鏡装置７０は、図面左から、光線を射出する十字状のＬＥＤアレイからなる光源７１、射出光線を平行光線として観察対象物３４（図３（Ｂ）参照）に照射するコンデンサーレンズ７２、観察対象物３４を保持する試料ステージ７３、試料透過光線を集光する対物レンズ７４、π位相板５５を担持する絞り基板５２を保持する絞り機構部７５、π位相板５５により変調された光線を検出面７７ａに投影結像させる投影レンズ７６、結像した実像を記録する固体検出器７７、上記光源７１から固体検出器７７までの装置要素を電子制御する制御システム７９、固体検出器７７より転送された画像データを、保管、処理、表示するデータ処理システム７８から構成される。上記π位相板５５は位相を一様にシフトする膜厚一定の素材からなり、上記絞り機構部７５に担持される。この中で上記光源７１と絞り機構以外は既製の光学顕微鏡要素を用いる。図中、７１ａは上記光源７１の光源面、７３ａは上記試料ステージ７３の物面、５２ａは上記絞り基板５２の絞り面である。
【００９５】
（実施例１）
実施例１における透過型顕微鏡装置７０による観察は、コンデンサーレンズ７２、対物レンズ７４、投影レンズ７６の各レンズに対し実質的に直交する光軸平行光照射を用い、上記光源７１の各ＬＥＤ点灯制御にて光線１次元走査を行い、得られた３次元顕微鏡データから微分位相像さらに位相差像を演算取得する観察方法である。即ち、光軸４３上のＬＥＤ点光源７１ａから射出された光線を観察対象物３４に光軸近傍に平行照射する照明工程と、観察対象物３４で偏向された光線を対物レンズ７４で集光する工程と、集光光を絞り機構部７５に導入し、上記光源７１の水平または垂直どちらかのＬＥＤ列１次元走査と連動して絞り面５２ａに設置されたπ位相板５５と背景集光光との相対位置を走査する工程と、絞り機構部７５から射出された光線を投影レンズ７６で検出器７７の検出面７７ａに実像として結像させる結像工程と、データ処理システム７９にて、上記光源７１による光源走査工程で得られた複数の実像データから３次元データを生成するデータ処理工程と、得られた３次元データに対し、データ処理方法Ｉ（光源面１次元座標における重心積分を計算して、観察対象物３４の微分位相画像を取得する微分位相像取得工程と、上記光源７１の直交する２つのＬＥＤ列の順次点灯走査により得られた直交する２つの微分位相像より、フーリエ変換をベースとする積分演算の定法（非特許文献１３）に従い微分位相から位相を回復する工程）と、からなる。
なお、十字ＬＥＤアレイの直交する２つのＬＥＤ列７１ｘ、７１ｙに対しそれぞれの光源走査を行う際、対応するπ位相板５５も、端縁が直交する２つの別々の位相板を用いることになる。
【００９６】
（実施例２）
実施例２における透過型顕微鏡装置７０による観察は、まず、コンデンサーレンズ７２、対物レンズ７４、投影レンズ７６の各レンズに対し、上記光源の直交するＬＥＤ列７１ｙまたはＬＥＤ列７１ｘのどちらかを用い、上側または下側のＬＥＤを同時点灯にて、レンズに実質的に直交する光軸平行光照射を行い、得られた３次元顕微鏡データから微分位相像さらに位相差像を演算取得する観察方法である。即ち、上記光源７１の垂直方向ＬＥＤ列７１ｙまたは水平方向ＬＥＤ列７１ｘの上半分の同時点灯と下半分の同時点灯の２回の観察のそれぞれにおいて、ＬＥＤ点光源から射出された光線を観察対象物３４に光軸平行照射する照明工程と、観察対象物３４で偏向された光線を対物レンズ７４で集光する工程と、集光光をπ位相板５５を設置した絞り機構部７５に導入し信号変調を行う工程と、絞り機構部７５から射出された光線を投影レンズ７６にて検出器７７の検出面７７ａに実像として結像させる結像工程と、データ処理システム７８にて２回の観察から得られた２つの２次元実像データからデータ処理方法ＩＩに準拠し、観察対象物３４の微分位相像および位相差像を取得する工程からなる。
なおπ位相板５５の端縁の方向は、同時点灯されるＬＥＤ列方向と直交する方向に設定される。
【００９７】
光線順次走査または同時点灯の点数は１から数十にわたる任意の点数が、観察目的に応じて選択される。また、上記光源７１により、直交する微分方向を持つ２つの独立３次元データが得られる。実施例１に示すように、通常微分型３次元データの場合、微分位相像から位相像を回復するには、この直交する２つの微分位相像が必要だが、実施例２に示すように、ヒルベルト微分型３次元データの場合、直交する２つの微分位相像のどちらか１つだけで位相像を回復することができる。対応する２つのータ処理方法煮については以下に記述する。
４次元光学顕微鏡において、実施例１によるデータ量の小さい３次元データへの次元縮減又は実施例２による２点データという究極的次元縮減と、高速の光線走査の適用が可能になったのは、電子顕微鏡に比べ光学顕微鏡が持つ次の２つの利点のためである。即ち、１）位相板の帯電に伴う性能劣化が存在しないことにより、強力な背景光の位相板照射が可能であること、２）ガラスレンズの収差補正性能が電磁レンズに比べ圧倒的に高いため、実質的な光軸平行照射光を適用することができ、機械的絞り走査を回避した高速光源走査法が可能であることによる。換言すれば、基礎出願の４次元光学顕微鏡への発展は、電子顕微鏡分野から出発した４次元光源走査による光線走査顕微鏡法のより効果的な展開といえる。
（データ処理方法Ｉ：実施例１の場合の通常微分型データへの適用）
【００９８】
＜ステップ１：３次元データ取得＞
上記光源７１の垂直方向または水平方向のＬＥＤ列のＬＥＤを順次点灯させ、ヒルベルト位相板を用いた、観察物上の各点の位置を実座標とし、点光源位置を周波数座標とする３次元顕微鏡データ｜Ｕ（ｓs，ｒd）｜2を取得する（Ｓ１）。
【００９９】
＜ステップ２：線積分演算＞
＜ステップ２：正規化ヒルベルト微分差像の２次元ＦＴ＞
個別のｒd値に対して２次元関数をなす｜Ｕ（ｓs，ｒd）｜2のｓs座標での線積分演算を行う（Ｓ２）。
【０１００】
＜ステップ３：１次モーメント演算＞
個別のｒd値に対して２次元関数をなす｜Ｕ（ｓs，ｒd）｜2のｓs座標での１次モーメント演算を行う（Ｓ３）。
【０１０１】
＜ステップ４：重心積分による微分位相像取得＞
ステップ３で得た１次モーメントをステップ２で得た線積分で除算する重心積分演算により微分位相像を取得する（Ｓ４）。
【０１０２】
＜ステップ５：垂直方向微分位相像の取得＞
上記光源７１の垂直方向のＬＥＤ列を用いて、ステップ１からステップ４の工程を行い、垂直方向微分位相像を取得する（Ｓ５）。
【０１０３】
＜ステップ６：水平方向微分位相像の取得＞
上記光源７１の水平方向のＬＥＤ列を用いて、ステップ１からステップ４の工程を行い、水平方向微分位相像を取得する（Ｓ６）。
【０１０４】
＜ステップ７：位相差像取得＞
垂直方向微分位相像と水平方向微分位相像より、フーリエ変換を用いる積分操作の定法に従い位相差像を回復する。
【０１０５】
（データ処理方法ＩＩ：実施例２の場合のヒルベルト微分型データへの適用）
【０１０６】
以下図１０のフローチャートに示すデータ処理の方法につき説明する。
＜ステップ１：ヒルベルト微分コントラストペアと微分位相差像の取得＞
ヒルベルト位相板を用いた３次元顕微鏡において、上記光源７１の垂直方向または水平方向のＬＥＤ列の上半分を同時点灯してヒルベルト微分コントラスト像Ｉを取得し、次いで、ＬＥＤ列のした下半分同時点灯してヒルベルト微分コントラスト像ＩＩを取得する（Ｓ１ａ）。次いで、両者の差像と両者の和像の比を取り正規化ヒルベルト微分差像を取得する（Ｓ１ｂ）。
【０１０７】
＜ステップ２：正規化ヒルベルト微分差像の２次元ＦＴ＞
ステップ１で得られた正規化ヒルベルト微分差像の２次元フーリエ変換を行う（Ｓ２）。
【０１０８】
＜ステップ３：フィルタリングによるゼルニケ位相差回折像の取得＞
ヒルベルト微分の簡易積分の初段として、上記２次元フーリエ変換像に対し、π位相板５５と同時点灯の相乗効果として生み出され、光学顕微鏡像を変調する階段関数型フィルターの効果を取り除くため、該階段関数型フィルター関数を乗算し、ゼルニケ位相差像対応のＦＴ像を取得する（Ｓ３）。
【０１０９】
＜ステップ４：ゼルニケ位相差像の取得＞
簡易積分の第２段として、上記のフィルター処理フーリエ変換像を逆フーリエ変換し、最終ゴールであるゼルニケ位相差像を得る。通常の２次元微分位相像の場合、位相差像を得るには２次元積分操作、もしくは等価なＦＴ操作が適用される。その場合、微分方向の直行する２箇の微分位相像が必須だが（非特許文献１２）、ヒルベルト微分をベースとした本願発明による位相差像回復は、１つの微分位相像に対するＦＴ＋フィルター操作だけで実現される（Ｓ４）。
【０１１０】
本願発明は上記実施の形態に限定されない。例えば、光軸平行照射光は、スリット絞り５０の短形状の絞り開口５１の左右方向端縁のときも、上述した上下方向端縁のときと同様の効果、即ち、高感度、高分解能、高速走査等の効果がある。また、正方形に形成されたスリット絞り５０を用いれば、上下方向走査、左右方向走査の両方が１つの絞りで可能となる。矩形状のスリットにする理由は特定方向の微分の精度を上げるためである。なお、走査については、２点を最小走査とする。
図９に示す第１実施例では、Ｓ２の工程とＳ３の工程はいずれが先行してもよい。また、Ｓ５の工程とＳ６の工程はいずれが先行してもよい。
図１０に示す第２実施例では、Ｓ１ａの工程とＳ１ｂの工程はいずれが先行してもよい。
（用語）
【０１１１】
本願発明では、次の如く用語を定義する。
４次元：４次元顕微鏡において、走査透過手法を透過手法に変えることにより、検出面上の明視野円盤信号に代えて光源面上の明視野円盤信号を取得する。両者を区別するため必要に応じ検出面上明視野円盤、光源面上明視野円盤の用語を採用した。４次元顕微鏡における「４次元」は、光源面２次元座標と検出面２次元座標を独立に扱う本願発明の基本原理を両者の和として４次元で表現したものであり、いわゆる時空を意味する４次元ではない。
光軸平行照射（ａｘｉａｌ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）：入射角が光軸４３即ちレンズ中心をとおりレンズ面に垂直な軸に対し０°である照射であり、軸外平行照射である斜光照明（ｏｂｌｉｑｕｅ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）とは区別される。光軸近傍に平行照射する場合を含む。
ゆるやかに：収束電子（光）線の収束域（図３（Ｂ）に「３９」で示す）の幅程度の領域で、一定またはゆるやかに位相変化がある場合に用いた。
原子ポテンシャル：原子核の電荷が作る電場により生起する静電ポテンシャルをいう。原子ポテンシャルは相互作用パラメーターを介して位相に変換される。
π位相板：π近傍の位相シフト量を与える位相板をいう。位相シフト量の最適値は加速電圧に依存する（低加速の場合、πよりやや小さい）ため、正確な意味でのπ位相板に限られない。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本願発明による光学顕微鏡観察方法及び光学顕微鏡のデータ処理システムは、細胞における蛋白質凝集などを微小な屈折率変化により実時間で高感度に観察することができ、アルツハイマー病解明などの医科学研究や健康・医療研究に貢献することができる。
【符号の説明】
【０１１３】
１０  ４次元透過型顕微鏡光学系
１１  レンズ
１２  レンズ
１３  レンズ
２１  光源面
２２  物面
２３  絞り面
２４  検出面
３１    重心移動のない検出面／光源面明視野円盤
３１ａ  重心移動に伴う明視野円盤の変動部分
３２    平行移動による重心移動のある検出面／光源面明視野円盤
３２ａ  重心移動に伴う明視野円盤の変動部分
３３    明視野円盤内光線偏在による重心移動のある検出面／光源面明視野円盤
３３ａ  光線偏在に伴う強度減弱部分
３３ｂ  光線偏在に伴う強度増強部分
３４  観察対象物
３５  入射収束光線
３６  出射収束光線（光線偏向なし）
３７  出射収束光線（光線偏向あり）
３８  小顆粒
３９  光収束部位
４０  円形絞り
４１  絞り開口
４２  絞り基板
４３  光軸
４４  遮蔽板
４５  位相板  
５０  スリット絞り
５１（３１）  絞り開口（図３の３１対応）
５１（３２）  絞り開口（図３の３２対応）
５２  絞り基板
５２ａ  絞り面
５５  π位相板
５６  垂直方向順次点灯走査点
５６ａ  垂直方向順次点灯上側走査点
５６ｂ  垂直方向順次点灯下側走査点
５７  垂直方向同時点灯部位
５７ａ  垂直方向同時点灯上側部位  
５７ｂ  垂直方向同時点灯下側部位
６０  １次元走査方向
６１  開口両端両側走査法
６２  開口片端両側走査法
６３  開口両端開口側走査法
６４  開口片端開口側走査法
６５  開口両端遮蔽側走査法
６６  開口片端遮蔽側走査法
７０  光学顕微鏡装置
７１  光源（十字状ＬＥＤアレイ）
７１ａ  光源面
７１ｘ  水平方向ＬＥＤ列
７１ｙ  垂直方向ＬＥＤ列
７２  コンデンサーレンズ
７３  試料ステージ
７３ａ  物面
７４  対物レンズ
７５  絞り機構部
７６  投影レンズ
７７  検出器
７７ａ  検出面
７８  データ処理システム
７９  制御システム
１００  ４次元走査透過型顕微鏡光学系
１０１  レンズ
１０２  レンズ
１０３  レンズ
１１１  光源面
１１２  絞り
１１３  物面
１１４  検出面
【図１】
2022000667.tif 000025
【図２】
2022000667.tif 000026
【図３】
2022000667.tif 000027
【図４Ａ】
2022000667.tif 000028
【図４Ｂ】
2022000667.tif 000029
【図５Ａ】
2022000667.tif 000030
【図５Ｂ】
2022000667.tif 000031
【図６Ａ】
2022000667.tif 000032
【図６Ｂ】
2022000667.tif 000033
【図６Ｃ】
2022000667.tif 000034
【図７】
2022000667.tif 000035
【図８】
2022000667.tif 000036
【図９】
2022000667.tif 000037
【図１０】
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