(57)【要約】【課題】本発明は、無細胞タンパク質合成系を用いて合成した所望のタンパク質を、形質膜を物質透過性にした細胞に導入し、細胞内における機能・動態を効率よく解析するための方法に関する【解決手段】以下の工程を含む細胞内のタンパク質分子の動態解析法。（１）所望のタンパク質を無細胞タンパク質翻訳系を用いて合成し、（２）細胞を処理して少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にし、（３）該タンパク質を該細胞に導入し、該タンパク質の細胞内における動態を解析する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする細胞内のタンパク質分子の動態解析方法。
（１）細胞を処理して少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にする工程。
（２）目的タンパク質を該細胞に導入し、該タンパク質の細胞内における動態を解析する工程。
【請求項２】
さらに以下の工程のうち少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞内タンパク質分子の動態解析方法。
（１）無細胞タンパク質合成法を用いて目的タンパク質を合成する工程。
（２）必要に応じて該タンパク質を精製する工程。
【請求項３】
無細胞タンパク質合成用抽出液が、植物種子、哺乳類網状赤血球、大腸菌、酵母の群より選択される請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
無細胞タンパク質合成用抽出液が、植物種子の抽出液である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
無細胞タンパク質合成用抽出液が、コムギ胚芽抽出液である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
無細胞タンパク質合成法が、転写系と共役型である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
無細胞タンパク質合成法が、転写系と非共役型である請求項２に記載の方法。
【請求項８】
無細胞タンパク質合成法が、バッチ法、重層法、透析法のいずれかである請求項２に記載の方法。
【請求項９】
該タンパク質が検出及び／又は精製のためのタグ配列が付加されたタンパク質である請求項１〜２に記載の方法。
【請求項１０】
該タンパク質が目的タンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質である請求項１〜２に記載の方法。
【請求項１１】
該蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びその改変型より選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該タンパク質が化学的に修飾されたタンパク質である請求項１〜２に記載の方法。
【請求項１３】
該タンパク質が蛍光色素で修飾された請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
物理的な破壊により形質膜を膜透過性にする請求項１〜２に記載の方法。
【請求項１５】
物理的な破壊がニトロセルロース膜を用いる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
化学的な処理により形質膜を膜透過性にする請求項１〜２に記載の方法。
【請求項１７】
界面活性剤を用いて形質膜を物質透過性にする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
非イオン性界面活性剤が、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ，ｓａｐｏｎｉｎ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ［ＢＩＧＣＨＡＰ］、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ［Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ］、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）  Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ］、Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ［ＭＥＧＡ−８］、の群より選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細菌毒素を用いて形質膜を物質透過性にする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
細菌毒素がコレステロール結合性細胞溶解毒素である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細菌毒素がストレプトリシンＯ、ニューモリシン、セレオリシンＯ、アルベオリシン、パーフリンゴリシンＯ、テタノリシンの群より選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質を所望の条件下であらかじめ調製された細胞質と混合し、該細胞に導入し、該タンパク質の細胞内における動態を解析する請求項１〜２に記載の方法。
【請求項２４】
該細胞質が一つまたは二つ以上の種類または状態の組織、細胞より抽出された細胞質である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞質が一つまたは二つ以上の分化、成長、発生段階の組織、細胞より抽出された細胞質である請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
細胞質が一つまたは二つ以上の正常及び疾患状態の組織、細胞より抽出された細胞質である請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
細胞質が一つまたは二つ以上の薬剤により処理された生物組織、細胞より抽出された細胞質である請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
以下のパーツを含むことを特徴とする、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法を用いて、細胞内のタンパク質分子の動態を解析するための試薬またはキット。
（１）細胞を処理して少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にするために用いる試薬および／または器具。
（２）目的タンパク質を該細胞に導入し、該タンパク質の細胞内における動態を解析するために用いる試薬および／または器具。
【請求項２９】
さらに以下のパーツのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項２８に記載の細胞内タンパク質分子の動態を解析するための試薬またはキット。
（１）無細胞タンパク質合成系による蛋白質合成に用いる試薬および／または器具。
（２）蛋白質の精製に用いる試薬および／または器具。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質の細胞内における機能・動態を生化学的、生物物理学的に解析する方法に関する。さらに詳しくは、無細胞タンパク質合成系を用いて合成した所望のタンパク質を、形質膜を物質透過性にした細胞に導入し、細胞内における機能・動態を効率よく解析するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト、マウスをはじめとする種々の生物においてゲノムやｃＤＮＡについて大規模にシーケンスが行われ、莫大な量の遺伝子の一次構造情報が蓄積されてきている。また、ｃＤＮＡアレイ技術の進歩により、遺伝子ＲＮＡの相対的な発現強度の変化という尺度から生命現象を網羅的に解析し、分化や疾患、あるいは薬剤への応答など、種々の現象に関与している遺伝子群の候補を絞込むことが可能になりつつある。しかしながら、種々の生命現象を直接担うのは多くの場合タンパク質である上、ＲＮＡ量とタンパク質量が必ずしも相関していない。そのため、生理現象を分子レベルで厳密に記述するには、個々のタンパク質の機能や動態を解明することが非常に重要である。
【０００３】
これまで、個々のタンパク質の機能や動態を解析することを目的として、生体試料より研究対象の生理活性を担うタンパク質を抽出・精製し、これを用いて同定・解析を行うというストラテジーが用いられてきた。本ストラテジーにおいては、目的のタンパク質が多量に精製された場合には、精製タンパク質を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける機能解析、あるいは種々の培養細胞や実験動物への接種による生理活性の解析、Ｘ線結晶構造解析やＮＭＲなどによる立体構造解析、抗体の作成が行われる。抗体により、さらに、免疫組織化学による組織分布・細胞内分布の分析、生体試料中のタンパク質の定量、発現ベクターｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングが可能となる。しかし、詳細な解析を行うために生体試料から多量の精製タンパク質を入手することが困難な場合が多い。さらに、タンパク質の機能発現において、しかるべき細胞内部位においてしかるべき機能発現をすることが生命活動を担う上で非常に重要であるが、本ストラテジーにおいて細胞内におけるタンパク質の機能・動態解析を行うことは極めて困難である。
【０００４】
近年、遺伝子工学技術の進歩、タンパク質や遺伝子の構造に関する情報の蓄積量の急激な増加により、タンパク質の機能や動態を解析する際にｃＤＮＡのクローニングが優先的に実施されるようになった。ｃＤＮＡからタンパク質の一次構造や機能ドメインが決定され、既知のタンパク質の機能ドメインとの相同性よりタンパク質機能を類推することができる。さらに、ｃＤＮＡクローニングにより、個々のタンパク質遺伝子を大腸菌、酵母、カイコ、動物細胞などに導入して発現させ、精製タンパク質をより簡便に多量に調製することが可能になった。しかし、この場合も生体試料からの抽出、精製のための煩雑な操作を必要とする。さらに、発現するタンパク質が宿主生物に許容されない場合、封入体への蓄積あるいはプロテアーゼによる分解を生じ、調製が困難である。また、これらの問題点は、現在、非常に多くのｃＤＮＡの構造情報が明らかにされているが、これらの遺伝子タンパク質の機能をハイスループットに解析しようとする際にもネックとなる。
【０００５】
また、ｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、細胞内に導入し、そのタンパク質の発現による、形態、増殖、分化、アポトーシスといった細胞の形質変化、あるいはこのｃＤＮＡへの突然変異の挿入による作用の変化を調べ、さらにｉｎ    ｖｉｔｒｏにおける機能解析データを基礎として、細胞内における作用を予測することが可能になった。しかしながら、種々の生命現象は、細胞内の膜構造、細胞骨格、オルガネラといった相対的位置の上に構築されたタンパク質のネットワークにより生み出されるものであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける機能解析データはこのような細胞内トポロジーが加味されておらず、必ずしも細胞内の機能・動態を反映しているとはいえない。一方、ｃＤＮＡの細胞内への導入では形質変化を指標に機能を類推することが可能であるが、生細胞内を操作することが難しく、故に分子レベルでの詳細な機能・動態の解析は難しい。そこで、これらの問題点を克服した方法が必要とされていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、所望のタンパク質の効率よい合成及び精製、ならびに細胞内のタンパク質の機能・動態を解析する方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、無細胞タンパク質合成系を用いて蛋白質を合成し、細胞形質膜を物質透過性にした細胞に該蛋白質を導入することにより、細胞内の細胞膜、細胞骨格、オルガネラのトポロジーを保持された状態で、該タンパク質の細胞内における機能・動態を簡便かつ効率的に解析することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．以下の工程を含むことを特徴とする細胞内のタンパク質分子の動態解析方法。
（１）細胞を処理して少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にする工程。
（２）目的タンパク質を該細胞に導入し、該タンパク質の細胞内における動態を解析する工程。
項２．さらに以下の工程のうち少なくとも１つを含むことを特徴とする、項１に記載の細胞内タンパク質分子の動態解析方法。
（１）無細胞タンパク質合成法を用いて目的タンパク質を合成する工程。
（２）必要に応じて該タンパク質を精製する工程。
項３．無細胞タンパク質合成用抽出液が、植物種子、哺乳類網状赤血球、大腸菌、酵母の群より選択される項１〜２に記載の方法。
項４．無細胞タンパク質合成用抽出液が、植物種子の抽出液である項３に記載の方法。
項５．無細胞タンパク質合成用抽出液が、コムギ胚芽抽出液である項４に記載の方法。
項６．無細胞タンパク質合成法が、転写系と共役型である項２に記載の方法。
項７．無細胞タンパク質合成法が、転写系と非共役型である項２に記載の方法。
項８．無細胞タンパク質合成法が、バッチ法、重層法、透析法のいずれかである項２に記載の方法。
項９．該タンパク質が検出及び／又は精製のためのタグ配列が付加されたタンパク質である項１〜２に記載の方法。
項１０．該タンパク質が目的タンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質である項１〜２に記載の方法。
項１１．該蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びその改変型より選択される項１０に記載の方法。
項１２．該タンパク質が化学的に修飾されたタンパク質である項１〜２に記載の方法。
項１３．該タンパク質が蛍光色素で修飾された項１２に記載の方法。
項１４．物理的な破壊により形質膜を膜透過性にする項１〜２に記載の方法。
項１５．物理的な破壊がニトロセルロース膜を用いる項１４に記載の方法。
項１６．化学的な処理により形質膜を膜透過性にする項１〜２に記載の方法。
項１７．界面活性剤を用いて形質膜を物質透過性にする項１６に記載の方法。
項１８．界面活性剤が非イオン性界面活性剤である項１７に記載の方法。
項１９．非イオン性界面活性剤が、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ，ｓａｐｏｎｉｎ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ［ＢＩＧＣＨＡＰ］、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ［Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ］、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）  Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ］、Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ［ＭＥＧＡ−８］、の群より選択される項１８に記載の方法。
項２０．細菌毒素を用いて形質膜を物質透過性にする項１に記載の方法。
項２１．細菌毒素がコレステロール結合性細胞溶解毒素である項２０に記載の方法。
項２２．細菌毒素がストレプトリシンＯ、ニューモリシン、セレオリシンＯ、アルベオリシン、パーフリンゴリシンＯ、テタノリシンの群より選択される項２１に記載の方法。
項２３．タンパク質を所望の条件下であらかじめ調製された細胞質と混合し、該細胞に導入し、該タンパク質の細胞内における動態を解析する項１〜２に記載の方法。
項２４．該細胞質が一つまたは二つ以上の種類または状態の組織、細胞より抽出された細胞質である項２３に記載の方法。
項２５．細胞質が一つまたは二つ以上の分化、成長、発生段階の組織、細胞より抽出された細胞質である項２３に記載の方法。
項２６．細胞質が一つまたは二つ以上の正常及び疾患状態の組織、細胞より抽出された細胞質である項２３に記載の方法。
項２７．細胞質が一つまたは二つ以上の薬剤により処理された生物組織、細胞より抽出された細胞質である項２３に記載の方法。
項２８．以下のパーツを含むことを特徴とする、項１〜２７のいずれかに記載の方法を用いて、細胞内のタンパク質分子の動態を解析するための試薬またはキット。
（１）細胞を処理して少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にするために用いる試薬および／または器具。
（２）目的タンパク質を該細胞に導入し、該タンパク質の細胞内における動態を解析するために用いる試薬および／または器具。
項２９．さらに以下のパーツのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする、項２８に記載の細胞内タンパク質分子の動態を解析するための試薬またはキット。
（１）無細胞タンパク質合成系による蛋白質合成に用いる試薬および／または器具。
（２）蛋白質の精製に用いる試薬および／または器具。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における「細胞を処理して細胞形質膜を物質透過性にし」た細胞とは、パーミアビライズドセル（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌ）あるいはセミインタクト細胞とも呼ばれる細胞で、小型（イオン等）、大型（タンパク質等）の種々の分子が細胞膜を拡散により通過して自由に出入りさせることができる一方、細胞膜、細胞骨格、細胞内オルガネラ間の相対的位置、つまり細胞内のトポロジーが保持された細胞である。当該細胞を用いることにより、タンパク質の機能や動態の解析を、タンパク質が本来機能する場所や空間において調べられる一方、「細胞を一個の試験管」に見立て、細胞質成分・低分子阻害剤等を除去または添加するような、生化学的な解析を効率的に行うことが可能となる。
【００１０】
上記透過性の高い膜は、種々の動物細胞の細胞膜を物理的に破壊したり、化学的な処理、すなわち細胞膜に大きな穴をあける細菌毒素や界面活性剤様物質などで細胞膜を処理したりして作る。前者の物理的な方法の代表例としては、ニトロセルロース膜を利用するものである（Ｓｉｍｏｎｓ、Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，６，２２４１−２２４７）。当該方法ではニトロセルロース膜を細胞表面にはりつけてはがすことにより、膜が部分的に一緒にはがれとれることを利用したもので、特別な試薬を必要とせず、簡便である。より具体的には、ニトロセルロース膜を反応バッファー（例えば、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ‐ＫＯＨ  ｐＨ７．４、１１５ｍＭ酢酸カリウム。２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジスレイトール）で湿らせ、余分なバッファーを除いた後、培地を除去した細胞表面上に静かに置く。短時間（細胞、バッファーの条件によるが、通常は数十秒から数分間）静置した後、上記ニトロセルロース膜をはがす。上記ニトロセルロース膜をはりつけたり、はがしたりする操作中にずれないように慎重に作業する必要があるため、多検体処理は難しい。
【００１１】
上記細胞膜を物質透過性にする方法として、化学的な処理による方法もある。当該処理は適当な濃度の薬剤を添加して細胞とインキュベートする様式のものであるため、多検体処理化も可能である。
【００１２】
上記細胞膜を物質透過性にする化学的処理としては界面活性剤を用いる方法がある。上記界面活性剤は、（イオン性界面活性剤と比較して）タンパク質などに対する作用がより温和であることから非イオン性界面活性剤が好ましい。当該界面活性剤としては、例えば、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ，ｓａｐｏｎｉｎ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ［ＢＩＧＣＨＡＰ］、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ［Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ］、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）  Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ］、Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ［ＭＥＧＡ−８］等が挙げられる。より好ましくは、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ，ｓａｐｏｎｉｎが用いられる。上記物質における処理の濃度、温度、時間などの条件は細胞の種類により異なり、所望の解析を行うのに適当な条件を設定しなければならないが、一般的な処理濃度としては、１０〜１０００μｇ／ｍｌ、より一般的には２０〜２００μｇ／ｍｌであり、温度としては２〜３７℃、時間としては１〜３０分間である。当該物質は入手も比較的容易であり、多検体処理化も可能である。しかしながら、形質膜以外の細胞内膜系、すなわち小胞体膜、ゴルジ体膜などのオルガネラ膜も破壊される傾向にあり、細胞膜、細胞骨格、細胞内オルガネラ間の相対的位置（細胞内トポロジー）を必要とする解析に利用することは難しく、当該物質処理に対して比較的耐性のある核へのタンパク質の移行などの解析等に限られる。
【００１３】
上記細胞膜を物質透過性にする化学的処理として、より好ましくは細菌毒素を用いる方法である。細菌毒素が細胞膜を傷害する様式には、（１）膜に“イオンのみが通過する小さな孔、径１〜２ｎｍ”を形成する、（２）“タンパク質分子が通過する程度の大きな孔、直径１０〜３０ｎｍ”を形成する、（３）膜の構成脂質やタンパク質を酵素的に分解する、（４）細胞膜の情報伝達物質を標的とし細胞内情報伝達を撹乱する、という大きく分けて４つの機構がある（清水徹、林英生：蛋白質核酸酵素４６、５３２−５３９（２００１））。このうち、当該方法に用いられる細菌毒素は主として（２）の性質を有する毒素、すなわちチオール活性化溶血毒（ｔｈｉｏｌ  ｏｒ  ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｏｘｉｎｓ）、酸素感受性溶血毒（ｏｘｙｇｅｎ  ｌａｂｉｌｅ，ｏｘｙｇｅｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）などと総称される一群であれば特に限定されない。上記毒素の生物学的ないし生化学的な性状は、精製が困難であったことから培養液や粗精製品を用いて調べられたものであるが、遺伝子工学の進歩による大量産生系からの精製標品ではこのような性状は認められず、毒素以外の混入物に起因するものであることがあきらかになった。現在、上記毒素の一群のコレステロールに結合するという共通の特徴的な性状から、コレステロール結合性細胞溶解毒素と総称することが提唱されている（Ａｌｏｕｆ，Ｊ．Ｅ．（１９９９）ｉｎ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ，４４３−４５６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００１４】
上記細胞膜を物質透過性にするのに用いられ得るグラム陽性細菌が産生するコレステロール結合性細胞溶解毒素を表１に例示する。
【００１５】
【表１】
2004350642.tif 000002
【００１６】
上記細胞膜を物質透過性にするために用いられる細菌毒素のうち、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のストレプトリシンＯを用いることがより好ましい。ストレプトリシンＯは、例えばＰｉｍｐｌｉｎｋａｒ  Ｓ．Ｗ．らが極性細胞内の機能を生化学的に解析するため、極性小胞輸送アッセイ系を構築する際に細胞膜を物質透過性にするために用いている（Ｐｉｍｐｌｉｎｋａｒ  Ｓ．Ｗ．（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２５，１０２５−１０３５）。
ストレプトリシンＯの処理条件としては、細胞膜のコレステロール含有量などの相違により細胞種毎に至適条件が異なる。一般的には、処理濃度としては０．１〜１０ｕｎｉｔ／ｍｌ、処理温度としては４〜３７℃、処理時間としては３〜３０分である。より好ましくは、４〜１０℃で１〜１５分インキュベートして細胞毒素を細胞膜に結合させ、遊離の細胞毒素を洗浄した後、３０〜３７℃で定着・会合させる方法である。当該処理による形質膜の処理は、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎなどの界面活性剤による処理に比べ、形質膜以外の細胞内膜系、すなわち小胞体膜、ゴルジ体膜などのオルガネラ膜は無傷の状態で保持されるため、細胞膜、細胞骨格、細胞内オルガネラ間の相対的位置（細胞内トポロジー）を必要とする解析に適した系である。
【００１７】
本発明における上記細胞膜を物質透過性にした細胞に導入されるタンパク質は無細胞タンパク質合成系を用いて合成される。無細胞タンパク質合成系とは、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、所望のタンパク質をコードする核酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ等）及び当該タンパク質の構成材料となるアミノ酸を含有する反応液を用いて、無細胞条件下でタンパク質合成を行う方法である。当該方法によれば、従来技術では細胞毒性等により製造することが困難であるか、または製造することができなかったタンパク質を容易に製造することが可能になる。さらに、タンパク質において、細胞から抽出する際に必要な細胞破砕のための操作が不要となり、ハイスループット化が容易となる。
【００１８】
上記無細胞タンパク質合成系に使用される無細胞タンパク質合成用細胞抽出液とは、植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞等の種々の細胞や組織から抽出される生体のタンパク質合成に関与する成分であって、無細胞タンパク質合成に適用可能な状態、すなわち無細胞条件下でタンパク質合成能力を有する状態で存在する成分を含有する溶液を意味する。当該細胞抽出液は、通常、上記のような細胞を破砕した後、タンパク質成分及びリボソームを可溶化するための数種類の塩を含有する緩衝液を加えホモジナイズし、遠心分離にて不溶成分を沈澱させ、ゲル濾過等により細胞由来の低分子成分を除去するという方法によって得られるものである。
【００１９】
上記無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の由来としては特に限定されないが、入手が容易であること、簡便な調製方法が確立されていること、タンパク質の合成能力が高いこと、等の点より、好ましくは植物種子、大腸菌、哺乳動物網状赤血球、酵母由来のものが挙げられる。当該植物種子における植物としては、好ましくはコムギ、オオムギ、イネ、コーン、ホウレンソウ等が挙げられ、特に好ましくはコムギが挙げられる。当該大腸菌としては、好ましくはプラスミドを持たない方が好ましく、一般にＫ−１株由来の大腸菌が用いられることが多い。また、当該哺乳動物網状赤血球における哺乳動物としては、好ましくはウサギ、マウス、ラット、モルモットが挙げられる。なかでも植物種子、特に好ましくはコムギ種子由来のものが挙げられ、なかでも胚乳を含まない胚芽、特にコムギ胚芽由来のものが好ましい。
【００２０】
当該胚乳を含まない胚芽由来の細胞抽出液（胚芽抽出液）、特にコムギ胚芽抽出液は、胚乳に局在するリボソーム特異的グリコシダーゼ（トリチン）等のタンパク質合成阻害剤成分をほとんど含有しておらず、これを無細胞タンパク質合成系に適用した場合、高効率でタンパク質を合成することが可能である。当該胚芽抽出液、好ましくはＫ．Ｍａｄｉｎらの方法（Ｋ．Ｍａｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４）に従って胚芽を水溶液中で超音波洗浄して胚乳成分を洗浄することにより胚芽を純化し、次いで純化した胚芽を常法（例えば、Ａ．Ｈ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０）に従って処理することにより得られる。
【００２１】
上記無細胞タンパク質合成における所望のタンパク質をコードする核酸は、当該タンパク質をコードし、転写及び／または翻訳され得る適切な配列を含むものであれば、特に限定されず、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、適当なプロモーター（例えば、ＳＰ６、Ｔ７プロモーター）の制御下におかれたゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡ、あるいは当該発現カセットを担持するベクター等が挙げられる。ＤＮＡを使用する場合、転写反応に必要なＲＮＡポリメラーゼ等を添加する必要があるが、転写反応とタンパク質合成を同一反応液中で連続的に行うことができ（転写反応とタンパク質合成の「共役」）、転写反応後のＲＮＡの精製操作等が不要であるため、作業効率は向上する。しかしながら、タンパク質の収量が低下することから、あらかじめ別途調製されたｍＲＮＡを使用してタンパク質合成を行う（転写反応とタンパク質合成の「非共役型」）ことが好ましい。
【００２２】
また、上記反応液には、必要に応じて、非タンパク質性成分を補強することができる。当該非タンパク質成分とは、もともと無細胞タンパク質合成用細胞抽出液成分であるが、別途添加することでタンパク質合成能を向上させることができる成分である。当該成分としては、ｔＲＮＡが挙げられる。当該成分の反応液中の濃度としては、想定される無細胞タンパク質の合成条件、合成するタンパク質の種類等によって適宜設定することができるが、ｔＲＮＡの場合、通常０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは０．２〜０．３ｍｇ／ｍｌである。
【００２３】
さらに、上記反応液は、必要に応じて、タンパク質やＲＮＡの保護及び／又は安定化剤等の各種添加剤を含有していてもよい。当該添加剤としては、例えば、リボヌクレア−ゼ阻害剤（胎盤由来リボヌクレア−ゼインヒビター等）、タンパク質安定化剤（ジチオトレイトール等）、ＲＮＡ安定化剤（スペルミジン等）、プロテアーゼ阻害剤（Ｅ６４（商品名）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））等が挙げられる。これらの濃度は、使用される無細胞タンパク質合成用細胞抽出液のタンパク質合成活性、合成するタンパク質の種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、リボヌクアーゼ阻害剤の場合、通常５００〜２，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ（好ましくは１，０００〜１，５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）であり、タンパク質安定化剤の場合、通常１〜１０ｍＭ（好ましくは２〜６ｍＭ）であり、ＲＮＡ安定化剤の場合、通常０．１〜０．５ｍＭ（好ましくは０．３〜０．４ｍＭ）であり、プロテアーゼ阻害剤の場合、０．１〜１０μＭ（好ましくは０．３〜０．４μＭ）である。
【００２４】
上記無細胞タンパク質合成における反応条件は、使用する無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、合成するタンパク質等によって適宜設定すればよいが、通常は２０〜４０℃、好ましくは２３〜３７℃である。
【００２５】
上記無細胞タンパク質合成における具体的な手段は解析に必要なタンパク質量を取得できれば特に限定されない。しかしながら、従来から行われてきたバッチ法（例えば、Ｋ．Ｍａｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４）では合成量を上げることが難しいため、好ましくはＴ．Ｓａｗａｓａｋｉらによって開発された反応液層に低分子エネルギー物質を含むバッファー層を重層し、低分子エネルギー物質を補給する重層法（Ｔ．Ｓａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５１４，１０２−１０５），さらにＡ．Ｓ．Ａｐｉｒｉｎらによって開発された半透膜（限外濾過膜）を介して低分子エネルギー物質を供給する透析法（Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４）が用いられる。
【００２６】
上記無細胞タンパク質合成系で合成されるタンパク質には、検出及び／又は精製のための一般にタグと呼ばれるアミノ酸配列や何らかの融合タンパク質が付加されていることは好ましい。本発明におけるタグには、後者融合タンパク質をも含む。本発明で合成されたタンパク質はそのまま、細胞形質膜を処理された細胞に導入することもできるが、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液中の何らかの因子が上記タンパク質の細胞内動態に対して影響を与える可能性を排除すべく、精製されていることが好ましい。精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、ヒドロキシアパタイト、または等電点クロマトグラフィーが挙げられる。中でもタグ配列によるアフィニティー精製がより効率的である。さらに、該タンパク質の細胞内存在部位を調べるには該タンパク質に対する抗体を利用した細胞染色を行うこともできるが、もともと細胞や細胞質に存在するタンパク質と区別することができない。そのため、細胞や細胞質のタンパク質と該導入タンパク質を区別、比較するのに、当該タグ配列は、当該タグ配列に対する抗体や特異的結合物質を利用した細胞染色にも使用できる。本発明において使用可能なタグは、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＳＴＲＥＰタグ、Ｓタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｉｏｎ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＢＰ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＲＥＸ（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）などが挙げられる。
【００２７】
さらに、上記無細胞タンパク質合成系で合成されるタンパク質は、所望のタンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質であることがより好ましい。蛍光タンパク質が融合されることによって、所望のタンパク質の動態を観察する際に、細胞の固定や、抗体染色などの煩雑な操作が不要となる。前記蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び種々のアミノ酸置換を導入した改変型などが挙げられる。
【００２８】
あるいは、上記無細胞タンパク質合成系で合成されるタンパク質は合成中に化学的に修飾されたアミノ酸（非天然アミノ酸）を導入されるか、合成後に化学的に修飾されたタンパク質であってもよい。上記化学的修飾としては、当該タンパク質に架橋基が付加され、相互作用するタンパク質と化学結合を可能にするか、あるいは蛍光色素が付加され、細胞の固定や抗体染色することなくタンパク質を観察可能にする例が挙げられる。前記合成中に非天然アミノ酸を導入する方法は無細胞タンパク質合成系以外の手法では困難であるが、タンパク質の所望の部位を修飾することが可能であり、より詳細な解析を行うためには重要な手法となりうる。
【００２９】
上記無細胞タンパク質合成系により合成されたタンパク質をパーミアビライズドセルへ導入する際には、細胞から流出した細胞質成分を補うため、あらかじめ別の組織や細胞から抽出された細胞質を添加する。当該細胞質は、細胞を超音波処理破砕し細胞膜成分を除去した細胞抽出液や、細胞をホモジナイズにより破砕し核画分や細胞膜成分を除去した細胞質抽出液などが用いられる。さらに、より好ましくは、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＡＴＰ再生系（Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅなど）のエネルギー源等を添加する。当該成分の反応液中の濃度としては、ＡＴＰ、ＧＴＰの場合、通常０．５〜５ｍＭである。
【００３０】
上記細胞質として、一つまたは二つ以上の種類または状態の組織や細胞から抽出された細胞質を用いることによって、異なる細胞質環境下での所望のタンパク質の動態、機能を比較することが可能である。一つまたは二つ以上の種類または状態の組織や細胞としては、分化、成長、発生段階の相違、正常あるいは疾患状態、あるいは薬剤処理などが挙げられる。
【００３１】
大腸菌により製造した蛋白質を用いて細胞内のタンパク質分子の動態解析を行なった場合、細胞毒性等により、不溶化や、分解される確率がより高く、無細胞タンパク質合成系の方が発現の成功確率が高い。特に、従来の無細胞系はＲＩ（ラジオアイソトープ）検出レベルの発現量であったが、コムギ胚芽抽出液を利用した無細胞蛋白質合成試薬（Ｐｒｏｔｅｉｏｓ、東洋紡績製）では発現量が大幅に向上し、ｎｏｎ−ＲＩでも十分検出が可能である。
【００３２】
また、大腸菌では発現・破砕・精製フローが煩雑となるが、無細胞発現系では特に破砕処理が不要で、何種類ものサンプルを同時に比較的簡便に処理することが可能である。
【００３３】
動態の解析の例としては、例えば細胞内局在を調べることができる。実施例に示すように目的のタンパク質を蛍光標識して、細胞内での局在部位を顕微鏡で観察する。この際、細胞質の種類を変えることで（例えば病気と正常）、存在部位に変化がないか調べる。あるいは細胞質に薬剤を添加したり、抗体処理によりタンパク質因子を除去したりして、あるいは影響を与える可能性のあるタンパク質因子を添加したりして、局在が変化しないかを調べることができる。
【００３４】
解析した結果は、薬剤のスクリーニングなどに利用されうる。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００３６】
実施例１  Ｎ末端Ｈｉｓタグ合成用ベクターｐＥＵ−５Ｈの構築（図１）
コムギ胚芽抽出液を利用した無細胞タンパク質合成試薬ＰＲＯＴＥＩＯＳ（東洋紡績）専用の発現ベクターｐＥＵ３−ＮＩＩ（試薬に含まれる）をＧａｔｅｗａｙシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対応するベクターに改変した。
まず、ｐＥＵ３−ＮＩＩにＮ末端Ｈｉｓタグ及びＧａｔｅｗａｙ配列を挿入してｐＥＵ−５Ｈを構築した。具体的には、ｐＤＥＳＴ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を制限酵素ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ（東洋紡績）で消化し、Ｎ末端Ｈｉｓタグ及びＧａｔｅｗａｙ配列を含む断片を精製し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡績）で平滑末端化処理を行った。一方、ｐＥＵ−ＮＩＩは制限酵素ＥｃｏＲＶ（東洋紡績）で消化後、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（東洋紡績）で脱リン酸化処理した。該処理ベクターを前記Ｎ末端Ｈｉｓタグ及びＧａｔｅｗａｙ配列を含む断片とｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績）を用いてライゲーション反応を行い、コンピテントセルＤＨ５α（東洋紡績）に形質転換し、ｐＥＵ−５Ｈを取得した。
【００３７】
実施例２  Ｎ末端Ｈｉｓタグ・ＥＧＦＰ融合タンパク質合成用ベクターｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰを構築（図２）
ｐＥＵ３−ＮＩＩにＮ末端Ｈｉｓタグ、ＥＧＦＰ遺伝子、及びＧａｔｅｗａｙ配列を挿入したｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰを構築した。具体的にはｐＥＵ３−ＮＩＩを制限酵素ＳｐｅＩ、ＮｃｏＩ（東洋紡績）で消化後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡績）で平滑末端化処理し、さらにＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（東洋紡績）で脱リン酸化処理した。該ベクターをＧａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｒｆＢ  Ｃａｓｅｅｔｔｅとライゲーションし、ｐＥＵ−ＤＳを取得した。該ｐＥＵ−ＤＳベクターは制限酵素ＥｃｏＲＶ（東洋紡績）で消化後、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（東洋紡績）で脱リン酸化処理した。
次に、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１を鋳型として、オリゴヌクレオチド１、２（ＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ）（配列番号１、２）、ＰＣＲ試薬ＫＯＤ  ＰＬＵＳ（東洋紡績）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＥＧＦＰ遺伝子を増幅した。この際、オリゴヌクレオチド１によりＥＧＦＰ遺伝子配列の５‘末端側に翻訳開始メチオニン及びＨｉｓタグ配列を付加した。さらに、オリゴヌクレオチドはあらかじめＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績）で処理して５’末端がリン酸化されたものを使用した。
前期処理ベクターと該ＥＧＦＰ遺伝子断片をライゲーションし、ｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰを取得した。
【００３８】
実施例３  Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬ発現プラスミドの構築（図３）
ｐＥＮＴＲ−１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を制限酵素ＳａｌＩ、ＮｏｔＩで消化し、ｐＥＹＦＰ−Ｐｅｒｏｘｉ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からＳａｌＩ、ＮｏｔＩで切り出したＥＹＦＰ遺伝子及び３‘末端のペルオキシソーム移行シグナル配列ＳＫＬ（セリン、リジン、ロイシン）含む断片を挿入した（ｐＥＮＴＲ−ＥＹＦＰ−ＳＫＬ）。続いて、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＥＮＴＲ−ＥＹＦＰ−ＳＫＬとｐＥＵ−５Ｈの組換え反応を行い、Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬ発現ベクターｐＥＵ−Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬを取得した。
【００３９】
実施例４  Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２発現プラスミドの構築（図４）
ＨｅＬａＳ３細胞１×１０７ｃｅｌｌからＴＲＩＺＯＬ  ＲＥＡＧＥＮＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇを鋳型として、ｃＤＮＡ合成試薬ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ−α―（東洋紡績）を用いてｃＤＮＡに変換した。前記ｃＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド３，４（ＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ）（配列番号３、４）及びＰＣＲ反応試薬ＫＯＤ  ＰＬＵＳを用いてＥＲＫ２（遺伝子を増幅し、制限酵素ＸｈｏＩで消化した。別途ｐＥＮＴＲ−１ＡをＤｒａＩ、ＸｈｏＩで消化し、前記ＥＲＫ２遺伝子断片を挿入した（ｐＥＮＴＲ−ＥＲＫ２）。続いて、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＥＮＴＲ−ＥＲＫ２とｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰの組換え反応を行い、Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２発現ベクターｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２を取得した。
【００４０】
実施例５  鋳型ＲＮＡの調製
５μｇ発現ベクター（ｐＥＵ−Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬ、ｐＥＵ−Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２）を鋳型として、１５０ｕｎｉｔ  ＴＴ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績）及び反応バッファー、２．５ｍＭ  ＮＴＰｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４０ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡績）を混合して、３７℃、４時間の転写反応を行った。反応後、合成したｍＲＮＡを、Ｐｒｏｔｅｉｏｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｍｉｘで平衡化したＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたゲル濾過法により精製し、吸光度測定（ＯＤ２６０）を行い、濃度を算出した。
【００４１】
実施例６  Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬ、Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の無細胞タンパク質合成
Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬについては、１２μｇ  ｍＲＮＡ、２μｌ  Ｂｕｆｆｅｒ＃２、１７μｇ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、４０ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１０μｌ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔ（コムギ胚芽抽出液）を混合して滅菌水で５０μｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘを調製した。続いて、９６穴ウェルプレート（ＥＬＩＳＡ用）にＢｕｆｆｅｒｍｉｘ  ２５０μｌを分注し、前記Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘをＢｕｆｆｅｒｍｉｘ層の下側に添加し、２３℃で一晩反応を行った。
Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２については、４８μｇ  ｍＲＮＡ、４μｌ  Ｂｕｆｆｅｒ＃２、３４μｇ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、８０ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、２０μｌ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔ（コムギ胚芽抽出液）を混合して滅菌水で１００μｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘを調製した。続いて、Ｂｕｆｆｅｒ  ｍｉｘ  ２ｍｌを分注し、その中に透析膜に入れた前記Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘを添加し、２３℃で４８時間反応を行った。
【００４２】
実施例７  Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬ、Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の精製
前記無細胞合成反応液を１０，０００×ｇで１０分間遠心し、可溶性、不溶性画分に分画した。前記可溶性画分から、Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬあるいはＨｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２をＨｉｓタグタンパク質精製試薬ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  −Ｈｉｓ  ｔａｇ−（東洋紡績）を用いて精製した。さらに、溶出（精製）フラクションをＴＢバッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ‐ＫＯＨ  ｐＨ７．４、１１５ｍＭ酢酸カリウム。２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジスレイトール）で２時間透析した。図５は５’Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬ、５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の無細胞タンパク質合成及びＨｉｓタグ精製の結果を示す電気泳動像である。
【００４３】
実施例８  ＨｅＬａ細胞のパーミアビリゼーション
１０％  ＦＣＳ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＢｉｏＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、日水製薬）を用いて、ＨｅＬａ細胞を３５ｍｍガラスベースディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に９０％コンフレントになるように培養した。ＰＢＳ（＋）で細胞を数回洗浄した後、１ｕｎｉｔ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  Ｏ（ＳＬＯ）を加え、４℃で７分間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ（＋）で数回洗浄し、０．３μｇ／ｍｌＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を含むＴＢバッファーを加え、３２℃で５分間インキュベートした。図６は膜不透過性のＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅにより核（核酸）が染色された（細胞膜が物質透過性にされた）ＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡観察像である。
【００４４】
実施例９  ＨｅＬａ細胞からの細胞質の抽出
ＨｅＬａ  Ｓ３細胞を、１０％  ＦＣＳ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ―Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｂｉｏ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４を添加したＨａｍ‘ｓ  Ｆ１２  Ｍｅｄｉｕｍ（日水製薬）１Ｌで細胞数が２×１０８になるまで回転培養した。細胞を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、細胞を１μＭ  Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｄ（Ｓｉｇｍａ）を含む１ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２２５ｍｌに懸濁し、氷上で５分間インキュベートした。４２０×ｇ、５分間遠心し、上清を除去した。膨潤した細胞をダウンス型ホモジナイザーに移し、２５μｇ／ｍｌ  Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、１／１０容量の１０×ＴＢバッファーを加え、ホモジナイズした。前記細胞破砕液を８９，０００×ｇ、１６分間遠心し、上清をさらに２３，０００×ｇ、９０分間遠心した。この上清をＨｅＬａ細胞質サンプルとし、使用するまで液体窒素中で保存した。
【００４５】
実施例１０  パーミアビライズドＨｅＬａ細胞への５’Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬ、５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の導入
ＨｅＬａ細胞質、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＴＰ、２．５  ｍＭ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０ｕｎｉｔ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ、及び前記精製Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬ、Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２（約１μｇ）を混合して１００μｌとし、前記処理条件によりパーミアビライズされたＨｅＬａ細胞に加えた。３２℃で３０分間インキュベートし、ＴＢバッファーで軽く洗浄した後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した。図７はＨｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬのペルオキシソーム局在、図８はＨｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核移行を示す観察像である。
【００４６】
【発明の効果】
上述したように、本発明の方法により、無細胞タンパク質合成されたタンパク質をパーミアビライズドセル内に導入し、生細胞で観察される動態を再構成することが可能になった。この方法により、パーミアビライズドセルに添加する細胞質の種類を変えたり、該細胞質への添加剤・タンパク質因子の添加、あるいはタンパク質因子の除去など、タンパク質の動態を生化学的に解析することが可能である上、無細胞タンパク質合成により種々のタンパク質の合成・精製・導入が簡便化され、ハイスループットな解析などに利用することが可能である。
【００４７】
【配列表】
2004350642.tif 000003
【００４８】
2004350642.tif 000004
【００４９】
2004350642.tif 000005
【００５０】
2004350642.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における無細胞タンパク質合成されたタンパク質のパーミアライズドセルへ導入解析フローを示す図面である。
【図２】Ｇａｔｅｗａｙシステム化された、Ｎ末端Ｈｉｓタグタンパク質用無細胞タンパク質合成系発現ベクターｐＥＵ−５Ｈの構築フローを示す図面である。
【図３】Ｇａｔｅｗａｙシステム化された、Ｎ末端Ｈｉｓタグ及びＥＧＦＰ融合タンパク質用無細胞タンパク質合成系発現ベクターｐＥＵ−５Ｈｉｓ／ＥＧＦＰの構築フローを示す図面である。
【図４】Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬ（ＳＫＬ；ペルオキシソーム移行シグナル配列）発現プラスミドｐＥＵ−Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬの構築フローを示す図面である。
【図５】Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２発現プラスミドｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の構築フローを示す図面である。
【図６】Ｈｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬ、Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の無細胞タンパク質合成及びＨｉｓタグ精製の結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】細胞膜が物質透過性にされた結果、膜不透過性のＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅにより核（核酸）が染色されたＨｅＬａ細胞を示す図面に蛍光顕微鏡観察像である。
【図８】パーミアビライズドセル内に導入されたＨｉｓ／ＥＹＦＰ−ＳＫＬのペルオキシソーム局在を示す共焦点レーザー顕微鏡による観察像である。
【図９】パーミアビライズドセル内に導入されたＨｉｓ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核移行を示す観察像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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