(57)【要約】【課題】本発明は、骨髄腫に罹患している個体において、骨髄腫を診断するため、疾病の進行または治療の有効性をモニタリングするための方法およびキットに関する。【解決手段】一態様において、本発明は、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法であって、該方法が：−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価すること、を含み；ここで、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列における突然変異の不存在または数の減少が、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答を示す前記方法に関する。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法であって、該方法が：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価すること、
を含み、
ここで、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列における突然変異の不存在または数の減少が、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答を示すか；あるいは、ここで、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列の突然変異の存在または数の増大が、多発性骨髄腫の治療に対する個体の非応答を示す、前記方法。
【請求項２】
多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法であって、該方法が：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−該個体の骨髄単核細胞からの核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関して骨髄単核細胞からの核酸を評価すること、
を含み、
ここで、セルフリー核酸または骨髄単核細胞からの核酸のいずれかまたはその両方におけるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列における突然変異の不存在または数の減少が、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答を示すか；あるいは、ここで、セルフリー核酸または骨髄単核細胞からの核酸のいずれかまたはその両方におけるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列における突然変異の存在または数の増大が、多発性骨髄腫の治療に対する個体の非応答を示す前記方法。
【請求項３】
前記検出された突然変異が、図１０に示されたものから成る群から選択される突然変異をコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、該個体からのセルフリー核酸を、多発性骨髄腫の治療前に該個体から得られたセルフリー核酸と比較することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、個体からの骨髄単核細胞からの核酸を、多発性骨髄腫の治療前に該個体から得られた骨髄単核細胞からの核酸と比較することを含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記検出された突然変異が、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ， ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｃ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈ＿１、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｌ、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｒ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、およびＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈから成る群から選択される突然変異をコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
個体が、多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクが有るかを決定するための方法であって、該方法が：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血の試験サンプルを準備し；
−セルフリーＤＮＡのレベルに関して試験サンプルを評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−多発性骨髄腫に罹患していない個体の末梢血中のセルフリーＤＮＡのレベルに関するデータを含む対照プロファイルを準備し；
−試験サンプルプロファイルを対照プロファイルと比較し、試験サンプルプロファイルと対照プロファイルとの間にセルフリーＤＮＡのレベルの差があるかを確認し；
−試験サンプルプロファイルのセルフリーＤＮＡのレベルが対照プロファイルより高い場合に、個体が多発性骨髄腫に罹患しているか、またはそれを発症するリスクを有すると決定すること、
を含む前記方法。
【請求項８】
前記末梢血の試験サンプルを準備するステップが、診断される個体から直接末梢血サンプルを得ることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記セルフリーＤＮＡのレベルに関して試験サンプルを評価するステップが、末梢血からセルフリーＤＮＡを抽出し、そして、セルフリーＤＮＡ以外の末梢血の全成分を除去することを含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法であって、該方法が：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血の試験サンプルを準備し；
−循環する腫瘍遊離核酸に関して試験サンプルを評価すること、
を含み、
ここで、循環腫瘍遊離核酸の検出で、個体が多発性骨髄腫に罹患しているか、またはそれを発症するリスクを有すると診断する、前記方法。
【請求項１１】
前記循環腫瘍遊離核酸は、少なくとも１つの突然変異がＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列内に存在するセルフリー核酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記突然変異が、図１０で列挙した突然変異のうちの任意の１もしくは複数である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法であって、該方法が：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価すること、
を含み、
ここで、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦまたはＴＰ５３のうちの任意の１もしくは複数における突然変異の検出は、個体が多発性骨髄腫に罹患しているか、またはそれを発症するリスクを有すると診断する、前記方法。
【請求項１４】
セルフリー核酸を抽出した個体から末梢血サンプルを入手するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出された突然変異が、図１０に示されたものから成る群から選択される突然変異をコードする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記突然変異が、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ， ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｃ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈ＿１、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｌ、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｒ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、およびＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法であって、該方法が：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数の配列中の突然変異に関してセルフリー核酸を評価し；
−該個体からの骨髄単核細胞から核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関して骨髄単核細胞からの核酸を評価すること、
を含み、
ここで、セルフリー核酸と骨髄からの核酸の両方での突然変異の検出が、多発性骨髄腫に罹患していると個体を診断する、前記方法。
【請求項１８】
前記ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列内の突然変異が、図１０で列挙されたものから成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
多発性骨髄腫に罹患している個体において進行疾患を診断するための方法であって、該方法が：
−進行疾病の診断が決定されるべき個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−ＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列中の１もしくは複数の突然変異に関してセルフリー核酸を評価すること、
を含み、
ここで、ＴＰ５３中の１もしくは複数の突然変異の検出が、進行疾患に罹患していると個体を診断する、前記方法。
【請求項２０】
前記ＴＰ５３の突然変異が、図１０で列挙されたものうちの任意の１もしくは複数である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
多発性骨髄腫に罹患している個体において進行疾患を診断するための方法であって、該方法が：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血のサンプルから得られたセルフリー核酸および骨髄単核細胞を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦまたはＴＰ５３のうちの任意の１もしくは複数における突然変異についてセルフリー核酸および骨髄由来核酸を評価すること、
を含み、
ここで、３つを超えるＴＰ５３突然変異の検出が、進行疾患に罹患していると個体を診断する、前記方法。
【請求項２２】
前記ＴＰ５３の突然変異が、図１０で列挙されたもののうちの任意の１もしくは複数である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
治療に応答していない、多発性骨髄腫に罹患している、活動性疾患に罹患している、または進行疾患に罹患している、と診断された個体を治療するために薬物を投与するステップをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬物が、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路を標的とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬物が、トラメチニブ、リゴセルチブ、コビメチニブ、セルメチニブ、ソラフェニブおよびベムラフェニブから成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記個体が治療に応答していないとの評価がなされたとき、前記方法が、追加の薬物を用いて既存の治療を置き換えるか、または補足するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記追加の薬物が、デキサメタゾン、シクロホスファミド、サリドマイド、レナリノミド、エトポシド、シスプラチン、ボルテゾミブ、コビメチニブ、イキサゾミブ、リゴセルチブ、セルメチニブ、ソラフェニブ、トラメチニブ、ベムラフィニブ、パノビノスタット、アザシチジン、ペンブロリズマブ、ニボルムマブ、デュルバルマブまたは自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）から選択される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、豪州特許仮出願ＡＵ２０１５９０５０１３およびＡＵ２０１６９０３０１９に対する優先権を主張するものであり、その開示全体をその全体として本明細書中に援用する。
本発明は、個体が骨髄腫に罹患しているか否かを決定する、骨髄腫の進行または骨髄腫の治療の有効性をモニタリングするための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫（ＭＭ）とは、骨髄（ＢＭ）全体にわたる多病巣性腫瘍沈着を特徴とする不治の血液学的悪性腫瘍である。核型の不安定性と数的染色体異常がほとんどすべてのＭＭで存在する。免疫グロビン（ＩｇＨ）遺伝子およびＦＧＦＲ３／ＭＭＳＥＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ３、またはＭＡＦにかかわる一次転座が疾病発症中に起こり、そして、ＭＹＣ遺伝子にかかわる二次転座が疾病進行中に起こる。ＭＭの治療は、プロテアソーム阻害剤と免疫調節薬の導入によって顕著な発展を経験したが、しかしながら、該疾患は、疾患の初期中に存在しないことが多い突然変異の蓄積によって全身療法に対する抵抗性を獲得した細胞により依然として不治のままである。治療法に対する抵抗性は、より耐性のクローンが成長および生存に利点があるＭＭ細胞の遺伝的進化によって媒介されることが多い。診断および予後の予測に関する現在の慣例は、一連のＢＭ生検を行うことであるが、生検検体から得られた遺伝情報（ＧＩ）は、公知の（単数もしくは複数の）腫瘍のクローン間およびクローン内の不均一性によって混乱させられている。
【０００３】
診断の決定、多発性骨髄腫の予後の予測、および／または治療の有効性のモニタリングのための改良法または代替法の必要性が存在している。
該明細書における、あらゆる従来技術の参照も、この従来技術があらゆる権限下で一般知識の一部を形成すること、あるいはこの従来技術が当業者によって、理解され、関連すると見なされ、および／または他の従来技術と組み合わせられると合理的に予想される場合があることを承認もまた示唆もしない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものであり、該方法は：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価すること、
を含み、
ここで、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列における突然変異の不存在または数の減少が、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答を示すか；あるいは、ここで、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列の突然変異の存在または数の増大が、多発性骨髄腫の治療に対する個体の非応答を示す。
【０００５】
本発明は、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものであり、該方法は：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−該個体の骨髄単核細胞からの核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関して骨髄単核細胞からの核酸を評価すること、
を含み、
ここで、セルフリー核酸または骨髄単核細胞からの核酸のいずれかまたはその両方におけるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列における突然変異の不存在または数の減少が、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答を示すか；あるいは、ここで、セルフリー核酸または骨髄単核細胞からの核酸のいずれかまたはその両方におけるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列における突然変異の存在または数の増大が、多発性骨髄腫の治療に対する個体の非応答を示す。
【０００６】
本発明は、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものであり、該方法は：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血の試験サンプルを評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−試験サンプルプロファイルを対照プロファイルと比較し、試験サンプルプロファイルと、対照プロファイルとの間にセルフリー核酸のレベルの差があるか否かを確認することであって、前記対照プロファイルは、多発性骨髄腫に罹患していない個体の末梢血中のセルフリー核酸のレベルに関するデータを含む；
−試験サンプルプロファイルのセルフリー核酸のレベルが対照プロファイルと同じであった場合に、個体が多発性骨髄腫の治療に対して応答すると決定すること、
を含む。
【０００７】
本発明は、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものであり、該方法は：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血の試験サンプルを評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−試験サンプルプロファイルを対照プロファイルと比較し、試験サンプルプロファイルと、対照プロファイルとの間にセルフリー核酸のレベルの差があるか否かを確認することであって、対照プロファイルが治療開始前の個体の末梢血中のセルフリー核酸のレベルに関するデータを含み；
−試験サンプルプロファイルのセルフリー核酸のレベルが対照プロファイルより低い場合に、個体が多発性骨髄腫の治療に対して応答すると決定すること、
を含む。
【０００８】
本発明は、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものであり、該方法は：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血の試験サンプルを評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−試験サンプルプロファイルを対照プロファイルと比較し、試験サンプルプロファイルと、照プロファイルとの間にセルフリー核酸のレベルの差があるか否かを確認することであって、対照プロファイルが治療開始前の個体の末梢血中のセルフリー核酸のレベルに関するデータを含み；
−試験サンプルプロファイルのセルフリー核酸のレベルが対照プロファイルより低い場合に、個体が多発性骨髄腫の治療に対して応答すると決定するか、または
−試験サンプルプロファイルのセルフリー核酸のレベルが対照プロファイルと同じであるか、またはそれより高い場合に、個体が多発性骨髄腫の治療に対して応答しなかったと決定すること、
を含む。
【０００９】
本発明は、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものであり、該方法は：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血の試験サンプルを準備し；
−セルフリー核酸のレベルに関して試験サンプルを評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−多発性骨髄腫に罹患していない個体の末梢血中のセルフリー核酸のレベルに関するデータを含む対照プロファイルを準備し；
−試験サンプルプロファイルを対照プロファイルと比較し、試験サンプルプロファイルと対照プロファイルとの間にセルフリー核酸のレベルの差があるか否かを確認し；
−試験サンプルプロファイルのセルフリー核酸のレベルが対照プロファイルと同じであった場合に、個体が多発性骨髄腫の治療に対して応答すると決定すること、
を含む。
【００１０】
本発明は、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものであり、該方法は：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血の試験サンプルを準備し；
−セルフリー核酸のレベルに関して試験サンプルを評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−多発性骨髄腫に罹患している個体の末梢血中のセルフリー核酸のレベルに関するデータを含む対照プロファイルを準備し；
−試験サンプルプロファイルを対照プロファイルと比較し、試験サンプルプロファイルと対照プロファイルとの間にセルフリー核酸のレベルの差があるか否かを確認し；
−試験サンプルプロファイルのセルフリー核酸のレベルが対照プロファイルより低い場合に、個体が多発性骨髄腫の治療に対して応答すると決定するか；または
−試験サンプルプロファイルのセルフリー核酸のレベルが対照プロファイルと同じであるかまたはそれより高い場合に、個体が多発性骨髄腫の治療に対して応答しなかったと決定すること、
を含む。
【００１１】
本明細書中に記載した本発明の任意の態様において、セルフリー核酸はセルフリーＤＮＡである。本明細書中に記載した本発明の任意の態様において、セルフリー核酸はセルフリー腫瘍由来ＤＮＡである。
本発明はまた、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価すること、
を含み、
ここで、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列における、突然変異の不存在が多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答を示す。
【００１２】
本発明はまた、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものであり、該方法は：
−多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−個体の骨髄単核細胞から核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関して骨髄単核細胞からの核酸を評価すること、
を含み、
ここで、セルフリー核酸または骨髄単核細胞からの核酸のいずれかまたはその両方におけるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列における、突然変異の不存在が多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答を示す。
【００１３】
本発明は、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものであり、該方法は：
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関して、多発性骨髄腫の治療を受けた個体からの末梢血中のセルフリー核酸を評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−試験サンプルプロファイルを対照プロファイルと比較し、試験サンプルプロファイルと対照プロファイルとの間に突然変異の数または少なくとも１つの突然変異を含むセルフリー核酸のレベルの差があるか否かを確認することであって、対照プロファイルは、治療開始前の個体の末梢血中のセルフリーＤＮＡのレベルに関するデータを含み；
−試験サンプルプロファイルにおける突然変異の数または少なくとも１つの突然変異を含むセルフリー核酸のレベルが、対照プロファイルより小さい場合に、個体が多発性骨髄腫の治療に対して応答したと決定すること、
を含む。あるいは、個体が多発性骨髄腫の治療に対して応答しなかったと決定するステップは、試験サンプルプロファイルにおける突然変異の数または少なくとも１つの突然変異を含むセルフリー核酸のレベルが、対照プロファイルと同じであるかまたはそれより大きい場合である。
【００１４】
本発明はまた、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答をモニタリングするための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−本明細書中に記載した本発明の方法に従って、多発性骨髄腫の治療を受けたか、多発性骨髄腫に罹患していると診断されたか、または進行疾患に罹患していると確認された個体を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価すること、
を含み、
ここで、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列における突然変異の不存在または数の減少が、多発性骨髄腫の治療に対する個体の応答を示す。
【００１５】
本発明の任意の態様において、末梢血の試験サンプルを準備するステップは、診断されるまたはモニタリングされる個体からの末梢血液サンプルを直接入手することを伴ってもよい。
本発明の任意の態様において、突然変異に関してセルフリー核酸を評価することは、その突然変異を有する転写産物の数または分画存在度を測定することを含んでもよい。
好ましくは、セルフリー核酸のレベルまたはセルフリー核酸（典型的にＤＮＡ）における突然変異の数に関して試験サンプルを評価するステップは、末梢血からセルフリー核酸を抽出し、そして、セルフリー核酸以外の末梢血の全成分を除去することを含む。
【００１６】
上記の本発明の任意の態様において、そこでは、個体を治療するために１もしくは複数の薬物を投与するステップをさらに含む。好ましくは、その治療は、多発性骨髄腫のための個体の治療全体が変更されるように、患者に対して以前に投与されたものと異なる（単数もしくは複数の）薬物を投与すること含む。いくつかの実施形態において、患者に以前に投与していた（単数もしくは複数の）薬物に、１もしくは複数の追加の薬物が補足される。代替実施形態において、以前に投与された（単数もしくは複数の）薬物が、１もしくは複数の代替の薬物で置き換えられる。
【００１７】
好ましくは、投与された薬物は、デキサメタゾン、シクロホスファミド、サリドマイド、レナリノミド（Lenalinomide）、エトポシド、シスプラチン、イキサゾミブ、ボルテゾミブ、ベムラフィニブ（Vemurafinib）、リゴセルチブ、トラメチニブ、パノビノスタット、アザシチジン、ペンブロリズマブ、ニボルムマブ（Nivolumumab）、デュルバルマブまたは自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）を含めた当業者に公知の治療法である。該治療は、１もしくは複数の薬物、または以下の組み合わせ：デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシドおよびシスプラチン（ＤＣＥＰ）；デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチンおよびサリドマイド（Ｔ−ＤＣＥＰ）；レナリドミドおよびデキサメタゾン（Ｒｄ）、イキサゾミブ−シクロホスファミド−デキサメタゾン（ＩＣｄ）；または、ボルテゾミブ、シクロホスファミドおよびデキサメタゾン（ＶＣＤ）を含めた２以上の薬物の任意の組み合わせを含み得る。該治療は、追加薬物と組み合わせたＤＣＥＰ、Ｔ−ＤＣＥＰ、Ｒｄ、ＩｃｄまたはＶＣＤの組み合わせを含んでもよい。
【００１８】
上記の発明の任意の態様において、個体を治療するために薬物を投与するステップは、決定ステップが患者を治療に応答していないと確認するか、または対応する骨髄由来核酸に比べて、末梢血サンプルに由来するセルフリー核酸もしくは循環腫瘍遊離核酸においてより高い突然変異負荷を患者が有していると確認した場合に起こる。
【００１９】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患している個体のために治療計画（treatment regimen）を決定するための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−多発性骨髄腫の治療を受けているかまたは受けた、あるいは本明細書中に記載した本発明の方法に従って、進行疾患に罹患していると確認された個体を準備し；
−該個体から得られた末梢血サンプルからセルフリー核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価すること、
を含み、
ここで、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３突然変異のうちのいずれか１つから成る群から選択される突然変異を検出することは、該治療計画がＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３を特異的に標的とする薬物の投与を含むことを決定する。
【００２０】
当然のことながら、個体が２以上の突然変異を有すると決定された場合には、該治療は、各突然変異が特異的に標的とされるように２以上の薬物を含んでもよい。
本発明はまた、個体の突然変異が現在の治療プロトコールに応答していないと決定された場合に、特定の薬物の投与をやめて、代替治療方法を開始することを決定するステップを含む。加えて、本発明は、個体において、特異的突然変異を標的とする薬物投与は維持し、異なった突然変異を標的とする１もしくは複数の薬物の添加による治療プロトコールを補完するステップを含む。
【００２１】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患している個体の疾病進行をモニタリングするための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−多発性骨髄腫の進行が決定されるべき個体からの末梢血の試験サンプルを準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子において、循環腫瘍遊離核酸のレベルまたは遊離腫瘍核酸中の突然変異の数に関して試験サンプルを評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−前回と同じ個体のＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子における、循環腫瘍遊離核酸のレベルまたは遊離腫瘍核酸中の突然変異の数に関するデータを含む比較プロファイルを準備し；
−試験サンプルプロファイルを比較プロファイルと比較し、試験サンプルプロファイルと比較プロファイルとの間の循環腫瘍遊離核酸のレベルまたは遊離腫瘍核酸中の突然変異の数の差があるか確認し；
−試験サンプルプロファイルにおいて循環腫瘍遊離核酸のレベルまたは遊離腫瘍核酸の突然変異の数が比較プロファイルより高い場合に、個体の疾患が進行していると決定すること、
を含む。あるいは、試験サンプルプロファイルにおいて循環腫瘍遊離核酸のレベルまたは遊離腫瘍核酸の突然変異の数が比較プロファイルと同じであるかまたはそれより低い場合に、個体の疾患が進行していないと決定する。
【００２２】
好ましくは、前回の同じ個体からの比較プロファイルは、本発明の方法を実施する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または２４カ月前からのものである。
好ましくは、末梢血の試験サンプルを提供するステップは、診断される個体からの末梢血サンプルを直接入手することを伴う。
好ましくは、循環腫瘍遊離核酸中の突然変異の存在、レベル、または数に関して試験サンプルを評価するステップは、末梢血からセルフリーＤＮＡを抽出し、そして、セルフリーＤＮＡ以外の末梢血の全成分を除去することを含む。
【００２３】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患している個体において疾患の進行をモニタリングするための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−疾病の進行が決定されるべき個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−ＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列中の１もしくは複数の突然変異に関してセルフリー核酸を評価すること、
を含み、
ここで、ＴＰ５３中の１もしくは複数の突然変異の検出が、進行疾患に進行したと個体を診断する。好ましくは、ＴＰ５３の突然変異は、図１０で列挙された任意の１もしくは複数の突然変異をコードする。
【００２４】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患している個体において疾患の進行をモニタリングするための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血および骨髄単核細胞のサンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦまたはＴＰ５３のうちの任意の１もしくは複数における突然変異についてセルフリー核酸および骨髄由来核酸を評価すること、
を含み、
ここで、３つを超えるＴＰ５３突然変異の検出で、進行疾患に進行したと個体を診断する。好ましくは、ＴＰ５３の突然変異は、図１０で列挙された任意の１もしくは複数の突然変異をコードする。
【００２５】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患しているまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−循環腫瘍遊離核酸に関して、多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血の試験サンプルを評価すること、
を含み、
ここで、循環腫瘍遊離核酸の存在を決定することで、該個体が多発性骨髄腫に罹患しているか、またはそれを発症するリスクを有すると診断する。好ましくは、循環腫瘍遊離核酸は、少なくとも１つの突然変異がＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列中に存在するセルフリー核酸である。好ましくは、突然変異は、図１０で列挙された突然変異のうちの任意の１もしくは複数をコードする。
【００２６】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血の試験サンプルを準備し；
−循環腫瘍遊離核酸に関して試験サンプルを評価すること、
を含み、
ここで、循環腫瘍遊離核酸の検出で、個体が多発性骨髄腫に罹患しているか、またはそれを発症するリスクを有すると診断する。好ましくは、循環腫瘍遊離核酸は、少なくとも１つの突然変異がＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列中に存在するセルフリー核酸である。好ましくは、突然変異は、図１０で列挙された突然変異のうちの任意の１もしくは複数をコードする。
【００２７】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関してセルフリー核酸を評価すること、
を含み、
ここで、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦまたはＴＰ５３のうちの任意の１もしくは複数における突然変異の検出で、個体が多発性骨髄腫に罹患しているか、またはそれを発症するリスクを有すると診断する。好ましくは、該方法は、セルフリー核酸が抽出された個体からの末梢血サンプルを入手するステップを含む。
【００２８】
本発明の任意の態様において、核酸中に検出された突然変異は、図１０に示されたものから成る群のうちの任意の１もしくは複数から選択される突然変異をコードする。より好ましくは、該突然変異は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ， ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｃ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈ＿１、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｌ、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｒ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、およびＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈのうちの任意の１もしくは複数から選択される。より好ましくは、該突然変異は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、およびＮＲＡＳ Ｑ６１Ｌから選択される。
【００２９】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−多発性骨髄腫に関連していることが知られている突然変異を検出するように設計された複数のプローブを準備し；
−セルフリー核酸へのプローブの結合を可能にするのに好適な条件下、末梢血サンプル由来のセルフリー核酸を複数のプローブと接触させ；そして
−セルフリー核酸へのプローブの結合を検出すること、
を含む。
【００３０】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−図１０に示されたものから成る群から選択される突然変異をコードする核酸中の１もしくは複数の突然変異を検出するように設計された複数のプローブを準備し；
−セルフリー核酸へのプローブの結合を可能にするのに好適な条件下、末梢血サンプル由来のセルフリー核酸を複数のプローブと接触させ；そして
−セルフリー核酸へのプローブの結合を検出すること、
を含む。
【００３１】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血サンプルから得られたセルフリー核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数の配列中の突然変異に関してセルフリー核酸を評価し；
−該個体からの骨髄単核細胞から核酸を準備し；
−ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からの任意の１もしくは複数のヌクレオチド配列における突然変異に関して骨髄単核細胞からの核酸を評価すること、
を含み、
ここで、セルフリー核酸と骨髄からの核酸の両方での突然変異の検出で、多発性骨髄腫に罹患していると個体を診断する。
【００３２】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−セルフリーＤＮＡのレベルに関して、多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血の試験サンプルを評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−試験サンプルプロファイルを対照プロファイルと比較し、試験サンプルプロファイルと、対照プロファイルとの間にセルフリーＤＮＡのレベルの差があるか否かを確認することであって、ここで対照プロファイルが、多発性骨髄腫に罹患していない個体の末梢血中のセルフリーＤＮＡのレベルに関するデータを含み；
−試験サンプルプロファイルにおけるセルフリーＤＮＡのレベルが対照プロファイルより高い場合に、個体が多発性骨髄腫に罹患しているか、またはそれを発症するリスクを有すると決定すること、
を含む。
【００３３】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血の試験サンプルを準備し；
−セルフリーＤＮＡのレベルに関して試験サンプルを評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−多発性骨髄腫に罹患していない個体の末梢血中のセルフリーＤＮＡのレベルに関するデータを含む対照プロファイルを準備し；
−試験サンプルプロファイルと対照プロファイルを比較し、試験サンプルプロファイルと対照プロファイルとの間にセルフリーＤＮＡのレベルの差があるか否かを確認し；
−試験サンプルプロファイルのセルフリーＤＮＡのレベルが対照プロファイルより高い場合に、個体が多発性骨髄腫に罹患しているか、またはそれを発症するリスクを有すると決定すること、
を含む。
【００３４】
本発明は、多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するための方法を提供するものでもあり、該方法は：
−多発性骨髄腫の診断が決定されるべき個体からの末梢血の試験サンプルを準備し；
−セルフリーＤＮＡのレベルに関して試験サンプルを評価し、それによって、試験サンプルプロファイルを形成し；
−前回に同じ個体の末梢血中のセルフリーＤＮＡのレベルに関するデータを含む比較プロファイルを準備し；
−試験サンプルプロファイルを比較プロファイルと比較し、試験サンプルプロファイルと比較プロファイルとの間にセルフリーＤＮＡのレベルの差があるか否かを確認し；
−試験サンプルプロファイルのセルフリーＤＮＡのレベルが比較プロファイルより高い場合に、個体が多発性骨髄腫に罹患しているか、またはそれを発症するリスクを有すると決定すること、
を含む。
【００３５】
先に記載した本発明の任意の態様は、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路を標的とするモダリティーを用いた治療を個体に関して確認するのに使用でき、好ましくは該モダリティーがＲａｓ−ＭＡＰＫ経路の阻害剤である。例えば、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路にかかわる生成物をコードする遺伝子における突然変異の確認は、個体がＲａｓ−ＭＡＰＫ経路の阻害剤を用いた治療の利益を得られる可能性があるか確認する。
本発明の任意の態様において、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列中の突然変異は、図１０で列挙されたものから成る群から選択されるアミノ酸配列中の突然変異をコードする。
【００３６】
本明細書中に記載した本発明の任意の態様において、多発性骨髄腫、活動性疾患または進行疾患に罹患していると診断された個体を治療するために薬物を投与するステップをさらに含む。多発性骨髄腫を治療するための薬物は、本明細書中に記載したものを含む治療に典型的に使用されるいずれでもあってもよい。
本明細書中に記載した本発明の任意の態様において、突然変異に関して評価するとは、該個体からのＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦまたはＴＰ５３遺伝子の全部または一部を含むヌクレオチド配列を、（単数もしくは複数の）対照個体からの（例えば、多発性骨髄腫に罹患していない、または場合によって、新規診断された、非進行疾患に罹患している、１もしくは複数の個体由来の）ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦまたはＴＰ５３遺伝子の全部または一部を含むヌクレオチド配列と比較することを含む。
【００３７】
本発明はまた、多発性骨髄腫に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有すると個体を診断するのに使用するため、または疾患の進行または病期をモニタリングするため、あるいは治療の有効性をモニタリングするのに使用するためのキットを提供するものでもあり、該キットは：
−図１０で列挙されたものから成る群から選択される突然変異をコードするＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子からのヌクレオチド配列中の任意の１もしくは複数の突然変異を検出する手段；
−個体の末梢血サンプルからセルフリー核酸を単離するかまたは抽出するための試薬、
を含む。
【００３８】
好ましくは、該キットはまた、多発性骨髄腫に罹患していない個体からのＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子のヌクレオチド配列も含む。
好ましくは、該キットはまた、多発性骨髄腫に罹患している患者で確認された突然変異が検出された位置におけるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子の野生型配列も含む。典型的には、多発性骨髄腫に罹患している患者で同定された突然変異が図１０で列挙されている。
好ましくは、該キットはまた、本明細書中に記載した本発明の方法におけるキットの使用について書かれた取扱説明書を含む。
【００３９】
好ましくは、１もしくは複数の突然変異を検出する手段は、突然変異を含む配列にハイブリダイズするかまたは突然変異を含む配列を増幅するかのいずれかの１もしくは複数の核酸プローブまたはプライマーである。該プローブがオリゴヌクレオチドプローブであることが好ましく、そしてそれは、相補的塩基対合によってＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子の配列内のそれらの標的部位に結合する。誤解を避けるために、本発明との関連において、オリゴヌクレオチドプローブの定義は、完全長のＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子（または、その相補体）を含まない。
【００４０】
本発明はまた、本明細書中に記載した方法で使用するための、または使用する際に、固体支持体に固定された複数のプローブを含む多発性骨髄腫検出システムも提供する。好ましくは、該プローブは、図１０で列挙された群から選択された１もしくは複数の突然変異を検出するように設計されている。
本明細書中の任意の態様において、骨髄単核細胞は骨髄生検からのものであってもよい。
【００４１】
本発明はまた、多発性骨髄腫に罹患している個体を治療する方法であって、該個体を治療するための薬物を投与することを含む方法を提供するものでもあり、ここで、該個体は、本明細書中に記載した本発明の任意の方法によって多発性骨髄腫に罹患していると診断される。好ましくは、投与される薬物は、デキサメタゾン、シクロホスファミド、サリドマイド、レナリノミド、エトポシド、シスプラチン、イキサゾミブ、ボルテゾミブ、ベムラフィニブ、リゴセルチブ、トラメチニブ、パノビノスタット、アザシチジン、ペンブロリズマブ、ニボルムマブ、デュルバルマブまたは自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）を含めた当業者に知られている治療法である。該治療は、１もしくは複数の薬物、または以下の組み合わせ：デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシドおよびシスプラチン（ＤＣＥＰ）；デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチンおよびサリドマイド（Ｔ−ＤＣＥＰ）；レナリドミドおよびデキサメタゾン（Ｒｄ）、イキサゾミブ−シクロホスファミド−デキサメタゾン（ＩＣｄ）；あるいは、ボルテゾミブ、シクロホスファミドおよびデキサメタゾン（ＶＣＤ）で含まれる２以上の薬物の任意の組み合わせを含んでもよい。該治療は、追加の薬物と組み合わせてＤＣＥＰ、Ｔ−ＤＣＥＰ、Ｒｄ、ＩｃｄまたはＶＣＤの組み合わせを含んでもよい。
【００４２】
本明細書中に使用される際、文脈が他のことを望む場合を除き、用語「含む」およびその用語の変形、例えば「含んでいる」、「含む（複数形）」および「含まれた」などは、さらなる添加物、成分、整数またはステップを排除することを意図しない。
本発明のさらなる態様および前段落に記載の態様のさらなる実施形態は、実施例によって与えられ、かつ、添付図面に関する以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）量は、多発性骨髄腫（ＭＭ）に罹患している患者からの血漿中で有意に高い。棒グラフは、ＭＭ患者（ｎ＝３７）および健常ボランティア（ＮＶ）（ｎ＝２１）からの１ｍｌの血漿（ＰＬ）から採取したｃｆＤＮＡの量をｎｇ単位で示す。統計解析用のGraphPad Prism V6を利用したマン−ホイットニーｔ−検定によって評価した場合、ＭＭにおける量は有意に高く、ｐ＝０．００８５の有意性を示す。
【図２】ｃｆＤＮＡ量は病期に関連する。棒グラフは、ＮＶ、活動性疾患および安定疾患（stable disease）に罹患しているＭＭ患者の１ｍｌのＰＬから採取したｃｆＤＮＡの量をｎｇ単位で示す。マン−ホイットニーｔ−検定を使用して比較した、活動性疾患に罹患している患者のｃｆＤＮＡのレベルはＮＶより有意に高い（ｐ＝０．００６７）。
【図３】ｃｆＤＮＡ量は、パラプロテイン、血清遊離軽鎖（ＳＦＬＣ）または骨髄（ＢＭ）ＭＭ細胞比率と相関しない。相関関係プロットは、ｃｆＤＮＡの量がパラプロテインの量、ＳＦＬＣおよびＢＭ ＭＭ細胞比率と相関しないことを示す。ピアソンの相関係数分析が、GraphPad Prism V6fを使用した相関関係についてｒ値を決定するために行われた。
【図４】ＭＭ患者の対応するＢＭおよびＰＬサンプルの突然変異の分布。棒グラフは、ＢＭおよびＰＬサンプル中に存在するＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＴＰ５３およびＢＲＡＦの突然変異の数と比率を表す。
【図５】再発／難治性（ＲＲ）および新規診断（ＮＤ）患者における突然変異の分布。棒グラフは、各患者の中のＢＭおよびＰＬ内に見られた突然変異の数を示す。ＰＬだけで検出可能な突然変異が実証された４８人のＲＲ患者の１８カ所のうちの１０カ所は、ＢＭ生検の部位から遠く離れた突然変異的に異なる疾患と一致している（ＲＲ１ＲＲ２、４、１０、１２、１３、１４、１５、２８、３５および８および１１、ならびにＮＤ１３の棒グラフの最上部）。
【図６】サンプルのＢＭおよびＰＬにおける突然変異存在度（ＭＡ）。ドットプロットは、ＢＭ、ＰＬまたはＢＭとＰＬの両方に存在する突然変異のＭＡの表示である。ＭＡレベルの中央値が示されている。ＢＭのＭＡレベルの中央値は、両方の部分で検出された突然変異に関して、ＰＬより有意に高い（ｐ＝０．０１４）。ＢＭとＰＬの両方で見られた突然変異では、ＢＭのＭＡ中央値は、ＢＭだけで見られた突然変異のＭＡ中央値より有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。ＰＬのみでの突然変異のＭＡは、ＢＭとＰＬの両方で検出されるＰＬ突然変異のＭＡより有意に低かった（ｐ＝０．００３）。すべての分析が、マン−ホイットニーｔ−検定を使用して行われた。
【図７−１】突然変異タイプの分布。（Ａ）４８人の患者のＢＭおよび／またはＰＬで検出されるすべての突然変異。ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋが最もよく見られた。（Ｂ）検出されたＫＲＡＳ突然変異、（Ｃ）検出されたＮＲＡＳ突然変異、（Ｄ）検出されたＴＰ５３突然変異、および（Ｅ）検出されたＢＲＡＦ突然変異。
【図７−２】突然変異タイプの分布。（Ａ）４８人の患者のＢＭおよび／またはＰＬで検出されるすべての突然変異。ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋが最もよく見られた。（Ｂ）検出されたＫＲＡＳ突然変異、（Ｃ）検出されたＮＲＡＳ突然変異、（Ｄ）検出されたＴＰ５３突然変異、および（Ｅ）検出されたＢＲＡＦ突然変異。
【図７−３】突然変異タイプの分布。（Ａ）４８人の患者のＢＭおよび／またはＰＬで検出されるすべての突然変異。ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋが最もよく見られた。（Ｂ）検出されたＫＲＡＳ突然変異、（Ｃ）検出されたＮＲＡＳ突然変異、（Ｄ）検出されたＴＰ５３突然変異、および（Ｅ）検出されたＢＲＡＦ突然変異。
【図８−１】ＭＭは、優性ＫＲＡＳ突然変異を有する。（Ａ）ＢＭのみ、（Ｂ）ＰＬのみ、（Ｃ）ＢＭとＰＬの両方で検出されるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＴＰ５３突然変異の比率。
【図８−２】ＭＭは、優性ＫＲＡＳ突然変異を有する。（Ａ）ＢＭのみ、（Ｂ）ＰＬのみ、（Ｃ）ＢＭとＰＬの両方で検出されるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＴＰ５３突然変異の比率。
【図９】ＮＤおよびＲＲ患者における突然変異の分布。棒グラフは、それぞれＲＲおよびＮＤ患者に存在する突然変異の数とタイプを表す。１もしくは複数のＲＡＳ突然変異が、患者の６９％超で存在していた。
【図１０−１】ＯＭＤパネルのＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＴＰ５３突然変異の一覧。
【図１０−２】ＯＭＤパネルのＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＴＰ５３突然変異の一覧。
【図１１−１】患者の骨髄（ＢＭ）、末梢血（ＰＢ）サンプルまたはその両方で検出された突然変異の概要。
【図１１−２】患者の骨髄（ＢＭ）、末梢血（ＰＢ）サンプルまたはその両方で検出された突然変異の概要。
【図１２−１】患者番号１〜３のＰＬ中の変異体クローンの一連の追跡。  （Ａ）：折れ線グラフは、患者番号１におけるｄｄＰＣＲによる変異体クローンのＦＡを表す。ＰＬは、診断後１、２、３、５、８、および１０カ月にて採取された。１０カ月目にて明らかな明白な疾病進行を伴った血清κ型遊離軽鎖（κ型ＬＣ）レベルは、右側のＹ軸に示されている。左側のＹ軸にプロットした、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈではなく、変異体クローンＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＦＡの著しい増加は、経口のアザシチジン、レブリミドおよびデキサメタゾン（Ｒｄ）治療法の間の血清学的な進行と一致した。  （Ｂ）：折れ線グラフは、レブリミドおよびデキサメタゾンの間の、１、２、６、１２、１５、および１７カ月目に採取された一連のＰＬにおける変異体クローンＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＦＡおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ（左側のＹ軸）を表す。λ型軽鎖（ＬＣ）およびパラプロテイン（右側のＹ軸）は、１２カ月目に低下し、続いて、１５および１７カ月目に増大した。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖのレベルは、治療法の間のλ型ＬＣ増大と一致した。
【図１２−２】（Ｃ）：折れ線グラフは、同種移植片（Ａｌｌｏ）後１、４および１３カ月目に採取された一連のＰＬ中の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣのＦＡを表す（左側のＹ軸）。ＦＡレベルは、κ型軽鎖（ＬＣ）と一致し、右側のＹ軸に示されたａｌｌｏ後４および１３カ月目の安定疾患と一致して検出可能なレベルで存在した。  患者ＰＬ中の変異体クローンの一連の追跡。折れ線グラフは、患者番号３におけるｄｄＰＣＲによる変異体クローンのＦＡを表す。ＰＬは、診断後１、２、３、５、８、および１０カ月にて採取された（赤色の星印で示す）。血清κ型遊離軽鎖（κ型ＬＣ）レベルは、１０カ月目にて明らかな明白な疾病進行を伴った。ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈではなく、変異体クローンＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＦＡの著しい増加は、経口のアザシチジン、レブリミドおよびデキサメタゾン（Ｒｄ）治療法の間の血清学的な進行と一致した。
【図１３−１】患者番号４、５、６、および７のＰＬ中の変異体クローンの一連の追跡。  （Ａ）折れ線グラフは、パノビノスタット治療法中の新規診断患者の１、４および７カ月目に採取されたＰＬにおける患者番号４のＰＬのみ突然変異ＫＲＡＳ Ｇ１３ＣのＦＡを表す。有意な変化は、４〜７カ月目の間のλ型軽鎖（ＬＣ）およびパラプロテインレベルの両方に検出されなかった；しかしながら、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｃレベルは４〜７カ月目の間に急上昇し、疾患再発と一致した（左側のＹ軸）。  （Ｂ）患者番号５に関する治療法の間のＰＬ突然変異の検出。折れ線グラフは、経口アザシチジン、レブリミドおよびデキサメタゾン（Ｒｄ）の間の１、１０、２０および９０日目に採取された患者番号５のＰＬ中の変異体クローンＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ＿１、およびＢＲＡＦ Ｖ６００ＥのＦＡを表す。ＦＡレベルが治療の１０日目で減少し、その一方で、κ型軽鎖（ＬＣ）の減少は２０日目からのみ検出された。
【図１３−２】（Ｃ）折れ線グラフは、治療法の間の１、１３および２４カ月目に採取された再発患者の一連のＰＬ中の４つの変異体クローン（左側のＹ軸）およびλ型ＬＣ（右側のＹ軸）のＦＡを表す。患者番号６は、λ型ＬＣと一致して、１３カ月目に２つの変異体クローンＫＲＡＳ Ｇ１２ＶおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ａのレベルの増大を伴ってレブリミドとデキサメタゾンにて再発したが、しかしながら、ＴＰ５３ Ｒ２７３ＨおよびＮＲＡＳ Ｇ１３Ｒ ＦＡが減少したのがわかった。１３カ月目のイキサゾミブ、シクロホスファミドおよびデキサメタゾン（カドミウム）への切り換えは、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｒレベルの増強を伴ってＫＲＡＳ Ｇ１２ＡおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖのレベルを低下させ、治療に対する変異体クローンの示差的応答を示唆した。  （Ｄ）折れ線グラフは、非分泌性患者である患者番号７におけるｄｄＰＣＲによる変異体クローンのＦＡを表す。ＰＬは、診断後１、３、１３、１７および１９カ月目に採取された。ＭＭ細胞のＢＭの比率は、自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）後たった９カ月の１３カ月目のＢＭ再発と一致して、４つのクローンのＦＡの増大で示される。１９カ月目における、ＶＣＤに対するＢＭ応答は明白であったが、ＮＲＡＳ Ｇ１３ＤクローンのＦＡ増強を伴った。患者はその後まもなく、難治性の進行性疾患で死亡した。
【図１４】ｄｄＰＣＲを使用したOnTarget（商標） Mutation Detectionプラットフォーム（ＯＭＤ）結果のバリデーション。表には、突然変異の存在（レ）または不存在（Ｘ）に関して、ｄｄＰＣＲを使用して特異的突然変異についてチェックされたＢＭおよびＰＬサンプルについてまとめる。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
ここでは、本発明の特定の実施形態について詳細に記載する。本発明は実施形態と関連して記載されるが、その一方で、本発明がそれらの実施形態に限定されないことが理解される。それどころか、本発明は、すべての選択肢、修飾形、および同等物を網羅することを意図し、そしてそれらは、特許請求の範囲で規定されるように本発明の範囲内に含まれ得る。
当業者は、本明細書中に記載したものに類似するまたは同等な多くの方法および材料を認識するであろうし、そしてそれらは、本発明の実施に使用される場合がある。本発明は、記載した方法および材料に限定されることはない。
当然のことながら、この明細書に開示および規定された発明は、テキストまたは図面で言及されたかまたは明白な２以上の個々の特徴のすべての代替の組み合わせまで拡大する。これらの様々な組み合わせのすべてが本発明の様々な代替の態様を構成する。
【００４５】
該発明者らは、末梢血中のセルフリーＤＮＡを検出することによって多発性骨髄腫および様々な病期の多発性骨髄腫の疾病進行を診断する方法を決定した。それにより、本発明は、非侵襲性の方法（血液のサンプリング対骨髄の生検）により疾病進行および治療に対する応答をモニタリングすることが可能であること、ならびにセルフリーＤＮＡの検出による突然変異状態の検出が単一部位の組織生検より腫瘍の遺伝子シグネチャーの包括的な実態を提供することを含めた顕著な利点を提供する。これらの利点は、よりロバストな診断を可能にし、かつ、その疾患に存在する遺伝子変化と連携されるべき特定の治療を可能にする。より具体的には、発明者らは、疾患進行をモニタリングするための従来法が、治療がうまくいっていることを示し得る場合に、本発明の方法が、疾患動態のより正確なモニタリングを含めた疾患の進行に関するより正確な評価を可能にすることを示した。このタイプの洞察は、臨床医がより個別化された治療を提供することを可能にし、ここで、個体の突然変異状態が疾患の経過全般を変化させる場合を含めて、個体について測定される突然変異状態に対応して治療プロトコールを適合させることによって、特定の分子経路を標的化できる。さらに、本発明の方法は、ある治療アプローチがもはや有効でない場合に、より早い介入を可能にし、疾患が進行しているとき、個体の突然変異状態の変化を反映する治療プロトコールの適応を容易にする。
【００４６】
核酸は、細胞のアポトーシス、ネクローシス、および他の起源もあるが特にＤＮＡ／ＲＮＡ−リポタンパク質複合体の自然放出によって血漿および血清中に放出される。循環セルフリー腫瘍由来ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、複数の独立した腫瘍起源のＤＮＡを伴った腫瘍ゲノム全体の表示を含んでいる。このｃｔＤＮＡの全ゲノムまたはエクソームの配列決定は、腫瘍の一連の生検を必要とすることなく癌療法に対する獲得耐性に関連している突然変異を同定するのに利用できる。原発腫瘍の再生検によるよりも、血漿中では二次突然変異がより容易に検出可能であることも、後者に関連する高い偽陰性率、標的癌遺伝子の特徴づけのための血漿ベースの分析の有用性の正当化、および疾病進行中に獲得される突然変異の同定により明白になった。そのため、有効データは、循環核酸の分析が単一部位の組織生検より（単数もしくは複数の）腫瘍の遺伝子状況の潜在的により包括的な実態を提供することを示す。発明者らは、個々のＭＭ患者の遺伝子状況のより包括的な実態を示す、本明細書中に記載した結果を得たが、これが複数の独立した腫瘍から生じ得る腫瘍ゲノム全体およびトランスクリプトームの表示を含むとき、末梢血（ＰＢ）由来の循環セルフリー核酸、すなわち、セルフリーＤＮＡおよびＲＮＡ（それぞれｃｆＤＮＡおよびｃｆＲＮＡ）を分析することである。
【００４７】
本明細書中に使用される「セルフリー核酸」または「ｃｆＤＮＡ」は、細胞が存在する血液にまたはその他の体液中に細胞から放出されたかまたは別の方法で流出した核酸、好ましくは（ゲノムまたはミトコンドリア）ＤＮＡである。例えば末梢血などの体液からのセルフリー核酸（例えば、ＤＮＡ）の抽出または分離は、該体液中に存在するすべての細胞の破裂を伴うわけではない。セルフリーＤＮＡは、例えば細胞または細胞破片などの流体中のすべてまたは実質的にすべての粒状物質が取り除かれた体液から単離されたＤＮＡであってもよい。
【００４８】
セルフリー核酸（すなわち、腫瘍を起源とし、かつ、血液または他の体液中に放出される核酸）が腫瘍由来であった場合、セルフリー腫瘍由来ＤＮＡまたはｃｔＤＮＡという用語が使用できる。
例えばＤＮＡなどのセルフリー核酸は、例えばLo et al, 米国特許６，２５８，５４０；Huang et al, Methods Mol. Biol, 444: 203-208 (2008)（参照によって本明細書中に援用される）；などを含めた技術を使用して末梢血サンプルから抽出されてもよい。限定されない実施例として、末梢血は、ＥＤＴＡチューブ内に採取されてもよく、その後、それは遠心分離によって血漿、白血球、および赤血細胞成分に分画され得る。（例えば、０．５〜２．０ｍＬからの）セルフリー血漿画分中に存在するＤＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、QIAamp DNA Blood Miniキット（Qiagen, Valencia, CA）またはキットのようなものを使用して抽出されてもよい。
文脈上での別段の記述のない限り、循環セルフリー腫瘍由来核酸および循環腫瘍遊離核酸は、セルフリー腫瘍由来ＤＮＡおよび循環遊離腫瘍ＤＮＡであるとして、互換的に使用される。
【００４９】
本発明は、診断、疾病進行または個体の治療有効性のモニタリングに使用できる。本発明は、個体の疾患の経過にわたる突然変異状態における、および／または様々な治療アプローチに対する応答における変化を特徴づけることを含む、骨髄腫に罹患している個体の突然変異状態または状況を特徴づけるのに使用できる。
疾病進行または治療有効性のモニタリングは、くすぶり型または緩慢性多発性骨髄腫、活性多発性骨髄腫、多発性孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、分泌性、非分泌性、ＩｇＧλ型またはκ型軽鎖（ＬＣ）タイプを含めた、任意のタイプの多発性骨髄腫に罹患している個体のモニタリングであってもよい。多発性骨髄腫の骨髄腫細胞によって産生される最も一般的な免疫グロブリン（Ｉｇ）は、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭであり、それほど一般的ではないが、ＩｇＤまたはＩｇＥは関与する。
例えば疾病進行または治療有効性のモニタリングなどの本発明の態様は、従来の末梢血バイオマーカー（例えばパラプロテイン、または実施例を含めて本明細書中に記載されたか、もしくは当該技術分野で知られているその他のマーカー）が検出可能でない場合に、個体において特に有用であり得る。
【００５０】
本発明の方法は典型的に、個体からの核酸（「試験サンプル」と呼ばれることもある）と対照プロファイルの核酸との比較を含む。
場合によっては、「対照プロファイル」は、任意の臨床的または生化学的に検出可能な多発性骨髄腫に罹患していない（単数もしくは複数の）個体の末梢血サンプルからのセルフリー核酸、好ましくはセルフリーＤＮＡのレベルを含んでもよい。そういった場合には、任意の臨床的または生化学的に検出可能な多発性骨髄腫に罹患していない（単数もしくは複数の）個体の末梢血サンプルは、本明細書中で「対照サンプル」とも呼ばれる。「対照プロファイル」は、一般的に、−多発性骨髄腫の不存在についてではなく−彼らが多発性骨髄腫に罹患しているか否かについて決定するために選択された個体と同じであるか、または非常に類似している個体由来であってもよい。対照プロファイルを得るための（単数もしくは複数の）個体の末梢血からの対照サンプル中のセルフリーＤＮＡのレベルの計測は、一般的に、試験サンプルのセルフリーＤＮＡの計測に使用されるのと同じアッセイ形式を使用して行われる。
【００５１】
対照プロファイルは、異なった時点、例えば１年または数年前ではあるが、試験サンプルが採取されたのと同じ個体由来であることもまた理解される。このように、対照プロファイルはまた、個体が多発性骨髄腫の治療を受ける前、または多発性骨髄腫の治療中の初期病期における個体からのセルフリー核酸のレベルも含み得る。それによって、斯かる対照プロファイルはまた、個体のセルフリーＤＮＡのレベルのベースラインまたは基礎レベルプロファイルも形成し、そしてそれに対して、試験サンプルが比較されてもよい。
【００５２】
セルフリー核酸のレベルの測定値を提供することに加えて、対照プロファイルはまた、本明細書中に記載した特定の突然変異の存在または不存在に関する情報も提供してもよく、それらの突然変異は個体からのセルフリー核酸において検出される。
例えば、疾患の進行を計測するか、または治療有効性をモニタリングするための対照プロファイルは、異なった時点、例えば１年または数年前であるが、試験サンプルが採取されたのと同じ個体から作り出され得る。それによって、斯かる対照プロファイルは、（ａ）循環腫瘍遊離核酸のレベル、（ｂ）循環腫瘍遊離核酸中の突然変異の数、または（ｃ）少なくとも１もしくは複数の突然変異を含む循環腫瘍遊離核酸の比率、から成る個体のベースラインまたは基礎レベルプロファイルを形成する。
【００５３】
本明細書において、治療の失敗とは、いずれかの一過性の改善を経験することなく治療（例えば、化学療法）計画を受けている間の疾患の進行、治療計画の１もしくは複数のサイクルを受けた後に客観的な応答がない、または治療計画を受けている間に続いて起こる進行を伴った限定された応答、を含む。治療法に応答しない骨髄腫はまた、「難治性多発性骨髄腫」と呼ばれてもよい。難治性骨髄腫は、彼らの治療療法から応答が見られない患者に生じ得るか、またはそれは治療に対して初めは応答性であったが、再発後に治療に対して応答性でなくなった患者に起こり得る。
【００５４】
本明細書において、「再発」とは、別段の定めがない限り、改善期間後の癌の兆候および症状の復帰を意味する。
本明細書中で使用される場合、「進行疾患」とは、再発した、および／または難治性多発性骨髄腫に罹患している個体を含む。
【００５５】
「治療する」または「治療」または「治療に対する応答」という単語は、対象が望ましくない生理学的変化または障害を遅らせる（少なくなる）治療療法を指す。本願発明の目的のために、有益であるかまたは所望の臨床結果は、これだけに限定されるものではないが、検出可能または検出不可能にかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾病進行の遅延または減速、および（部分的または全体的のいずれかの）寛解を含む。治療はまた、治療を受けなかった場合の予想された生存と比較して延長された生存を意味する。治療は、疾患または障害の完全な排除をもたらすことを必要としない可能性があるが、感染症の合併症および副作用、ならびに疾患または障害の進行を低減または最小限化し得る。
【００５６】
本発明は、ヒトにおける適用を見出したが、本発明はまた、治療学的な獣医学目的にも有用である。本発明は、例えばウシ、ヒツジ、ウマおよび家禽などの家畜または農場動物；例えばネコおよびイヌなどのコンパニオンアニマル；動物園の動物、に有用である。
本発明はまた、その後で、例えばトラメチニブ、リゴセルチブ、コビメチニブ、セルメチニブ、ソラフェニブまたはベムラフェニブなどのＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路を標的とする治療学的なモダリティーによって治療可能であり得る個体を確認するのに使用できる個体のＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路の突然変異状態も提供する。
【００５７】
本発明は多発性骨髄腫の治療の有効性をモニタリングすることを含み、ここで、該治療は、これだけに限定されるものではないが：デキサメタゾン、シクロホスファミド、サリドマイド、レナリノミド、エトポシド、シスプラチン、イキサゾミブ、ボルテゾミブ、ベムラフィニブ、リゴセルチブ、トラメチニブ、パノビノスタット、アザシチジン、ペンブロリズマブ、ニボルムマブ、デュルバルマブまたは自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）のうちの任意の１もしくは複数の投与を含む。
【００５８】
該治療は、１もしくは複数の薬物、または以下の組み合わせ：デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシドおよびシスプラチン（ＤＣＥＰ）；デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチンおよびサリドマイド（Ｔ−ＤＣＥＰ）；アザシチジンおよびレナリドミド（Ｒｄ）、イキサゾミブ−シクロホスファミド−デキサメタゾン（ＩＣｄ）；またはボルテゾミブ、シクロホスファミドおよびデキサメタゾン（ＶＣＤ）で含まれる２以上の薬物の任意の組み合わせを含み得る。該治療は、追加の薬物と組み合わせてＤＣＥＰ、Ｔ−ＤＣＥＰ、Ｒｄ、ＩｃｄまたはＶＣＤの組み合わせを含んでもよい。
【００５９】
本発明はまた、多発性骨髄腫の治療を受けている個体突然変異状態を決定またはモニタリングした結果に基づいて多発性骨髄腫の治療を適合させるかまたは変更することを含む。該適応または変更は、治療プロトコールから特定の（単数もしくは複数の）薬物を外すことや、薬物を１もしくは複数の代替の薬物に置き換えることを含んでもよい。あるいは、該適応または変更は、追加の薬物を用いて既存の治療を補足することを含んでもよい。
【００６０】
任意の実施形態において、置き換えまたは補足治療は、デキサメタゾン、シクロホスファミド、サリドマイド、レナリノミド、エトポシド、シスプラチン、ボルテゾミブ、コビメチニブ、イキサゾミブ、リゴセルチブ、セルメチニブ、ソラフェニブ、トラメチニブ、ベムラフィニブ、パノビノスタット、アザシチジン、ペンブロリズマブ、ニボルムマブ、デュルバルマブまたは自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）のうちの任意の１もしくは複数を投与することを含む。置き換えまたは補足治療はまた、以下の組み合わせ：デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシドおよびシスプラチン（ＤＣＥＰ）；デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチンおよびサリドマイド（Ｔ−ＤＣＥＰ）；レナリドミドおよびデキサメタゾン（Ｒｄ）；イキサゾミブ−シクロホスファミド−デキサメタゾン（ＩＣｄ）；または、ボルテゾミブ、シクロホスファミドおよびデキサメタゾン（ＶＣＤ）のうちのの任意の１もしくは複数を投与することを含んでもよい。該治療は、追加の薬物と組み合わせてＤＣＥＰ、Ｔ−ＤＣＥＰ、Ｒｄ、ＩｃｄまたはＶＣＤの組み合わせを含んでもよい。
【００６１】
本発明の方法を使用して個体の突然変異状態の進行および変化をモニタリングすることによって、臨床医または開業医は、任意の個体に採用された治療アプローチに関連する詳細な情報を得た上での決断をすることができる。例えば、特定の実施形態において、ＭＭ患者で同定された特定の変異体クローンが第一の治療に応答していないが、第二の治療に応答している一方で、該個体で同定された他のクローンは、第一の治療に応答しているが、第二の治療に応答していないことを決定し得る。よって、本発明の方法を使用して様々な治療アプローチに対する変異体クローンの応答をモニタリングすることによって、該個体のクローンの様々なサブセットをそれぞれ標的化する２以上の治療を組み合わせるアプローチに適応させることも可能である。
【００６２】
以下のものは、疾患の経過のわたりＭＭの治療を適応させる際の、本発明の有用性を例示するいくつかのシナリオである：
−個体は、数カ月間、レナリノミド（レブリミド）とデキサメタゾンの組み合わせを用いた治療を受ける。治療の経過にわたり、パラプロテインおよびλ型ＬＣのレベルは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ突然変異を有する血漿中のクローンの存在度のように、漸減する。治療の１５カ月後に、血漿中のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖクローンの分画存在度は、パラプロテインおよびλ型ＬＣの量の緩やかな増大のみを超える速度で劇的に増強される。その結果は、治療プロトコールの変更がＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖクローンを特異的に標的化するために必要であることを示す。ＫＲＡＳ Ｇ２１Ｓクローンを標的化する際のレナリノミド−デキサメタゾンの有効性を考えれば、ＲＡＳ経路を標的化する追加薬物を用いた既存の治療プロトコールの補足が推奨される。
【００６３】
−個体は、アザシチジンとＲｄ（レナリノミドおよびデキサメタゾン）の組み合わせを用いた治療を受ける。治療の数カ月後に、血漿中のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄクローンの分画存在度が劇的に増強され、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路を標的化するような治療プロトコールの変更が必要であることを示している。
−個体は、ＡＳＣＴを用いた治療を受け、２カ月後にＭＭについて診断を受ける。治療後の数カ月間、ＫＲＡＳ Ｇ３１Ｃクローンの存在度は減少する。パナビノスタットへの治療の切り換えに続いて、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｃクローンの分画存在度が増強され、この薬物が首尾よくこれらのクローンを標的化しないこと、および代替手段または補足の治療が必要とされることを示す。
【００６４】
−個体は、組み合わせＲｄ（レナリノミドおよびデキサメタゾン）を用いた治療を受ける。治療の経過のわたり、ＴＰ５３ Ｒ２７３ＨおよびＲＮＡＳ Ｇ１３Ｒクローンの分画存在度が減少して、これらのクローンがＲｄを用いた治療に対して応答性であったことを示した。しかしながら、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＶおよびＧ１２Ａクローンの存在度は増強され、これらのクローンが初期治療に対して応答性でなかったことを示した。イキサゾミブ、シクロホスファミドおよびデキサメタゾン（Ｉｃｄ）でのＲｄ治療の置き換えは、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＶおよびＧ１２Ａクローンがその治療に対して応答性であったが、ＲＮＡＳ Ｇ１３Ｒクローンの分画存在度が増強されたことを示した。ＩＣｄ治療は、次に、Ｒｄ治療を補足され、それによって、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２ＡおよびＲＮＡＳ Ｇ１３Ｒクローンを標的化した。
【００６５】
−個体は、ボルテゾミブ、シクロホスファミドおよびデキサメタゾン（ＶＣＤ）を用いた治療を受け、それに続いてＡＳＣＴを用いた治療を受ける。血漿中の様々なクローンの分画存在度は、初期治療後に減少し、次の数カ月の経過にわたり、わずかだけ増加した。デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチンおよびサリドマイド（Ｔ−ＤＣＥＰ）治療は、骨髄ＭＭの増大に応答して開始される。Ｔ−ＤＣＥＰ治療は効果がなく、Ｇ１３ＤクローンおよびＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋクローンの分画存在度のその後の増大がある。その後のＶＣＤ治療への切り換えは、骨髄ＭＭおよびＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋクローンを首尾よく標的化するが、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄクローンは標的化せず、このクローンを標的化する薬物による補足治療が必要とされることを示す。
【００６６】
上記のシナリオのそれぞれは、本発明の方法による疾患進行のモニタリングが、疾患の進行として血漿中で機能的存在度を増したクローンを特異的に標的化するため、既存の治療の置き換えまたは補足が可能であることを示す。
【００６７】
本発明において有効として、図１０および１１に記載し、および本明細書中に言及した突然変異は、特定のタンパク質のアミノ酸突然変異として示される。例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄは、野生型の通常タンパク質で現れるグリシン（Ｇ）からアスパルタート（Ｄ）に１２位における変更を引き起こす、ＫＲＡＳをコードする遺伝子の突然変異を指す。図１０中のアミノ酸突然変異を引き起こす核酸内の任意の突然変異も本明細書中に企図される。すべてのアミノ酸突然変異の番号付けは、所定のタンパク質からの野生型ヒトアミノ酸配列の位置に相当する。しかしながら、アミノ酸残基番号は、別の動物において異なっている可能性があるので、本発明は本明細書中に記載したヒトまたは他の動物からのオルソログまたはパラログで図１０に示したものと同等な突然変異を企図する。ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦまたはＴＰ５３遺伝子のヌクレオチド配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースなどの任意の公知のデータベースによって、例えば、受入番号ＮＭ＿００４９８５．３によってヒトＫＲＡＳに、受入番号ＮＭ＿００２５２４．４によってヒトＮＲＡＳに、受入番号ＮＭ＿００４３３３．４によってヒトＢＲＡＦに、および受入番号ＮＭ＿０００５４６．５によってヒトＴＰ５３にアクセスできる。
【００６８】
Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２キルスティンラット肉腫ウイルス癌遺伝子相同体およびＫＲＡＳとしても知られているＧＴＰアーゼＫＲＡＳは、ヒトでは、ＫＲＡＳ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＫＲＡＳは、ＫＲＡＳ；Ｃ−Ｋ−ＲＡＳ；ＣＦＣ２；Ｋ−ＲＡＳ２Ａ；Ｋ−ＲＡＳ２Ｂ；Ｋ−ＲＡＳ４；Ｋ−ＲＡＳ４Ｂ；ＫＩ−ＲＡＳ；ＫＲＡＳ１；ＫＲＡＳ２；ＮＳ；ＮＳ３；ＲＡＳＫ２と呼ばれてもよい。
ＮＲＡＳは、ヒトでは、ＮＲＡＳ遺伝子によってコードされる酵素である。ＮＲＡＳは、ＮＲＡＳ；ＡＬＰＳ４；ＣＭＮＳ；Ｎ−ｒａｓ；ＮＣＭＳ；ＮＲＡＳ１；ＮＳ６と呼ばれてもよい。
【００６９】
ＢＲＡＦは、Ｂ−Ｒａｆと呼ばれるタンパク質を作り出すヒト遺伝子である。該遺伝子はまた、癌原遺伝子Ｂ−Ｒａｆやｖ−Ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子相同体Ｂとも呼ばれる一方で、そのタンパク質は、セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼＢ−Ｒａｆとしてより正式に知られている。ＢＲＡＦは、ＢＲＡＦ；Ｂ−ＲＡＦ１；ＢＲＡＦ１；ＮＳ７；ＲＡＦＢ１と呼ばれてもよい。
ｐ５３、細胞性腫瘍抗原ｐ５３（ＵｎｉＰｒｏｔ名）、リン酸化タンパク質ｐ５３、腫瘍サプレッサｐ５３、抗原ＮＹ−ＣＯ−１３、または形質転換関連タンパク質５３（ＴＲＰ５３）としても知られている腫瘍タンパク質ｐ５３は、例えばＴＰ５３（ヒト）やＴｒｐ５３（マウス）などの様々な生物体における相同遺伝子によってコードされたタンパク質のアイソフォームのいずれかである。ＴＰ５３は、ＴＰ５３；ＢＣＣ７；ＬＦＳ１；Ｐ５３；ＴＲＰ５３と呼ばれてもよい。
【００７０】
本明細書中に使用される場合、「核酸」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはその類似体のユニットを組み込んだ任意の分子、好ましくは高分子分子を指す。核酸は、一本鎖であっても、または二本鎖であってもよい。一本鎖核酸は、変性二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖核酸である。あるいは、それは、任意の二本鎖ＤＮＡ由来ではない一本鎖核酸であってもよい。好適な核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含めたＤＮＡである。他の好適な核酸分子は、ｍＲＮＡを含めたＲＮＡである。
本明細書中で使用される場合、「単離された」または「部分的に精製された」という用語は、核酸の場合には、その天然源で見られるような核酸とともに存在する、および／または細胞によって発現されたときに核酸と共に存在するであろう、少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸またはポリペプチド）と分離された核酸を指す。化学的に合成された核酸またはインビトロ転写／翻訳を使用して合成されたものは「単離された」と見なされる。
【００７１】
本明細書中に使用される場合、核酸分子の「部分」とは、その分子に含まれた隣接するヌクレオチドのセットを指す。部分とは、分子に含まれたヌクレオチドの全部または一部のみを含む。部分とは、二本鎖であっても、または一本鎖であってもよい。
本明細書中に使用される場合、「増幅した産物」、「増幅産物」、または「単位複製配列」とは、特定の標的核酸鋳型鎖および／またはその相補的配列の一部のコピーである、増幅反応から生じたオリゴヌクレオチドを指し、そしてそれは、ヌクレオチド配列において、鋳型核酸配列および／またはその相補的配列に相当する。増幅産物は、プライマーに特異的な配列であり、かつ、標的核酸の一部および／またはその相補鎖である配列の両側に配置された配列をさらに含み得る。本明細書中に記載した増幅産物は、通常、二本鎖ＤＮＡであるが、言及は、その個々の鎖に対して行われ得る。
【００７２】
本明細書中に記載した本発明の任意の方法において、（ａ）循環セルフリー腫瘍由来核酸または循環腫瘍遊離核酸、あるいは（ｂ）セルフリー核酸、の量、レベル、存在または突然変異をサンプルで評価するかまたは測定することは、例えばＰＣＲ、マイクロアレイ、配列決定などの形態の、本明細書中に記載した任意の方法によってもよい。
核酸の量は、本明細書中に記載した任意の方法、あるいは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または特異的な定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）もしくはドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＰＣＲ）を使用して定量化されてもよい。
【００７３】
ＱＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術であり、標的化された核酸分子を増幅し、かつ、同時に定量化するために使用される。ＱＰＣＲは、ＤＮＡサンプル中の特異的配列の検出と、（絶対コピー数として、またはＤＮＡ入力または追加の正規化遺伝子に対して正規化したときには相対量として）定量化の両方を可能にする。該手順は、それがそれぞれの増幅サイクル後にリアルタイムで反応において蓄積するので、増幅されたＤＮＡが定量化されるという付加的な特徴を伴う、ポリメラーゼ連鎖反応の一般的な原理に従う。ＱＰＣＲは、例えばKurnitら（米国特許第６，０３３，８５４号）、Wangら（米国特許第５，５６７，５８３号および同第５，３４８，８５３号）、Maら（The Journal of American Science, 2(3), 2006）、Heidら（Genome Research 986-994, 1996）、SambrookおよびRussell（Quantitative PCR, Cold Spring Harbor Protocols, 2006）、およびHiguchi（米国特許第６，１７１，７８５号および同第５，９９４，０５６号）に記載されている。これらの内容を全体として参照により本明細書に援用する。
【００７４】
一例が、実施例に記載のOnTarget（商標）Mutation Detection（ＯＭＤ）プラットフォーム（Boreal Genomics）である。
核酸を配列決定するための任意の高速大量処理技術が、セルフリー核酸またはセルフリー腫瘍核酸の量、レベルまたは突然変異を測定するために本発明の方法で使用できる。様々な配列決定技術が、そうした能力によって利用可能であり、そしてそれらは、市販されている、Illumina, Inc.（San Diego, CA）；Life Technologies, Inc.（(Carlsbad, CA)。
【００７５】
いくつかの実施形態において、それらが並行して配列決定される固体表面上に個々の分子が空間的に単離されるステップを含む高速大量処理配列決定が利用される。斯かる固体表面は、無孔表面（例えばSolexa sequencing、例えばBentley et al, Nature,456: 53-59 (2008)またはComplete Genomics sequencing、例えばDrmanac et al, Science, 327: 78-81 (2010)など）、ウェルのアレイ（それはビーズまたは粒子結合鋳型を含んでもよい）（例えば４５４など、例えばMargulies et al, Nature, 437: 376-380 (2005)またはIon Torrent sequencing、米国特許公報第２０１０／０１３７１４３号または同第２０１０／０３０４９８２号）、微細加工された膜（例えばSMRT sequencingなど、例えばEid et al, Science, 323: 133-138 (2009)）、あるいはビーズアレイ（例えばSOLiD sequencingまたはpolony sequencingなど、例えばKim et al, Science, 316: 1481-1414 (2007)）を含んでもよい。別の態様において、斯かる方法は、それらが固体表面に空間的に単離される前または後に分離された分子を増幅することを含む。事前増幅には、例えばエマルジョンＰＣＲなどのエマルジョンベースの増幅、またはローリングサークル増幅を含んでもよい。特に興味深いものは、Bentleyら（先に引用）および製造業者の取扱説明書（例えば、TruSeq（商標）Sample Preparation Kit and Data Sheet, Illumina, Inc., San Diego, CA, 2010）；およびさらに以下の参考文献：米国特許第６，０９０，５９２号；同第６，３００，０７０号；同第７，１１５，４００号；およびＥＰ０９７２０８１Ｂ１（これらを参照により本明細書に援用する）に記載されるように、個々の鋳型分子が固体表面上に空間的に単離され、その後、それらが架橋ＰＣＲによって並行して増幅されて、別々のクローン集団またはクラスタを形成し、次に、配列決定されるＳｏｌｅｘａベースの配列決定である。全エクソームの配列決定は、実施例に記載されている。
【００７６】
本明細書中に記載した突然変異は、プローブ、好ましくはオリゴヌクレオチドを使用することで検出され得る。プローブは、従来のソフトウェアを使用して、いくつかの所望のパラメーターに基づいて標的遺伝子配列に結合するように設計されている。結合条件は、高レベルの特異性が提供されるようなものである−すなわち、結合が「ストリンジェント条件」下で起こることが好ましい。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（規定されたイオン強度およびｐＨ下にて）標的配列の５０％が完全に一致したプローブに結合する温度である。これに関して、ｐＨ７、約０．０２Ｍ以下の塩濃度にて、本発明のプローブのＴｍは、好ましくは４０℃超、かつ、好ましくは７０℃未満、より好ましくは約５３℃である。予混合結合溶液が入手可能であり（例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.製のEXPRESSHYB Hybridisation Solution）、結合は、製造業者の取扱説明書に従って行われる。あるいは、当業者は、これらの結合条件の変動を案出できる。
【００７７】
ストリンジェント（好ましくは高ストリンジェント）条件下での結合、洗浄に続いて、非結合核酸分子を取り除く。典型的なストリンジェント洗浄条件は、５５〜６５℃にて、０．１％ ＳＤＳ含有０．５〜２ｘ ＳＳＣ溶液中での洗浄を含む。典型的な高ストリンジェント洗浄条件は、５５〜６５℃にて、０．１％ ＳＤＳ含有０．１〜０．２ｘ ＳＳＣ溶液中での洗浄を含む。当業者は、例えば、洗浄溶液中のＳＳＣの代わりにＳＳＰＥを用いることによって、同等な条件を容易に案出できる。
ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは別として、ハイブリダイゼーション特異性は、全体的な配列類似性、ミスマッチ塩基の分布および位置、およびそのプローブと標的配列によって形成されるＤＮＡ二本鎖体の自由エネルギの量を含めた、様々なプローブ設計要素によって影響を受け得る。
【００７８】
核酸配列の「相補体」は、相補的な塩基対合を介して前記核酸配列に結合する。非コード（アンチセンス）核酸鎖が相補的塩基対合を介してコーディング（センス）鎖に結合するため、それらもまた「相補鎖」として知られている。
よって、一態様において、該プローブは、図１０で列挙された突然変異の任意の１もしくは複数を含むＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子のヌクレオチド配列のコーディング（センス）鎖内の標的配列に結合する。あるいは、別の態様において、該プローブは、図１０で列挙された突然変異の任意の１もしくは複数を含むＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子のヌクレオチド配列の相補的な、非コーディング（アンチセンス）鎖内の標的配列に結合する。
【００７９】
一態様において、プローブは支持体またはプラットフォームに固定されてもよい。プローブを固定することは、物理的位置をプローブに提供し、所望の位置にプローブを固定する役割を果たし得る、および／またはプローブの回収または分離を容易にし得る。
該支持体は、例えば、ガラスまたはプラスチックから作られた堅い固体支持体であってもよく、または該支持体は、例えば、ナイロンまたはニトロセルロース膜などの膜であってもよい。３Ｄマトリックス−例えば、ポリアクリルアミドまたはＰＥＧゲル、は本発明による使用のための好適な支持体である。
【００８０】
一実施形態において、該支持体は、１もしくは複数のビーズまたはミクロスフェアの形態、例えば、液体ビーズマイクロアレイの形態であってもよい。好適なビーズまたはミクロスフェアが商業的に入手可能である（例えば、Luminex Corp., Austin, Texas）。該ビーズの表面は、ＤＮＡの取付けのためにカルボキシル化されてもよい。該ビーズまたはミクロスフェアは独自に同定されてもよく、それによって、それらの独特な特徴（例えばビーズ径もしくは色、または独特な標識）によってソーティングを可能にする。一態様において、ビーズ／ミクロスフェアは、フルオロフォア（例えば、赤と／または赤外線のフルオロフォア）で内部的に染色され、それらの様々な蛍光強度によって互いに区別できる。
【００８１】
一態様において、図１０で列挙された突然変異の任意の１もしくは複数を含むＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子のヌクレオチド配列を前記オリゴヌクレオチドプローブと接触させる前に、該方法は、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子またはその相補体の一部を増幅するステップを含み、それによって、単位複製配列を作り出す。
サンプルが小さい、および／またはＤＮＡ配列の異種収集物を含む場合に、標的核酸を増幅することが望ましいこともある。
増幅は、当該技術分野で公知の方法によって行われても、かつ、ＰＣＲによって好ましくは行われる。当業者は、核酸配列の増幅を活性化するのに好適な条件を測定することができる。
【００８２】
よって、一態様において、増幅は一対の配列特異的プライマーを使用して行われ、ここで、前記プライマーは、相補的に塩基対合によって、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子、またはその相補体内の標的部位に結合する。好適なＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ前駆体（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で、プライマーは伸長され、それによって、標的核酸の個々の鎖に相補的な新規核酸鎖の合成を開始する。それによって、該プライマーは、ＫＲＡＳ ＮＲＡＳ ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子、またはその相補体の一部の増幅を駆動し、それによって、単位複製配列を作り出す。この単位複製配列は、該プローブが結合する標的配列を含むか、または直接配列決定されて、１もしくは複数の、本明細書中に記載した突然変異の存在が確認されてもよい。
【００８３】
誤解を避けるために、本発明との関連において、オリゴヌクレオチドプライマーの定義は、完全長のＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子（または、その相補体）を含まない。
プライマー対は、フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを含む。フォワードプライマーは、標的核酸の相補的な、非コーディング（アンチセンス）鎖に結合するものであり、そして、リバースプライマーは、標的核酸の対応するコーディング（センス）鎖に結合するものである。本明細書中に使用される場合、標的核酸は、突然変異、好ましくは、図１０で列挙された突然変異の存在が決定されるべきＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、および／またはＴＰ５３遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸である。
【００８４】
本発明のプライマーは、例えばPrimer Express（Applied Biosystems）などの従来のソフトウェアを使用して、所望のパラメーターの選択に基づいて標的遺伝子配列に結合するように設計されている。これに関して、結合条件が高レベルの特異性を提供するようになることが好ましい。プライマーの融解温度（Ｔｍ）は、好ましくは５０℃を超え、そして、最も好ましくは約６０℃である。本発明のプライマーは、好ましくは標的核酸に結合するが、好ましくは、自己相補性および二量体生成（プライマー−プライマ結合）を最小にするようにスクリーニングされる。
【００８５】
フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、典型的に１〜４０ヌクレオチドの長さである。より短いプライマーを使用することは利点であり、これは標的核酸へのより速いアニーリングを可能にするからである。
好ましくは、フォワードプライマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、そして、フォワードプライマーは、好ましくは最長３５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは最長３０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは最長２８ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは最長２５ヌクレオチドの長さである。一実施形態において、フォワードプライマーは約２０〜２１ヌクレオチドの長さである。
【００８６】
好ましくは、リバースプライマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは少なくとも２５ヌクレオチドの長さであり、そして、リバースプライマーは、好ましくは最長３５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは最長３０ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは最長２８ヌクレオチドの長さである。一実施形態において、リバースプライマーは約２６ヌクレオチドの長さである。
【００８７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特定のＤＮＡ配列のインビトロ増幅のための反応を意味する。言い換えれば、ＰＣＲとは、プライマー結合部位が両側に配置された標的核酸の複数のコピーまたは複製を作製するための反応であり、斯かる反応は、以下のステップ：（ｉ）標的核酸を変性させ、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニーリングさせ、そして（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下で、核酸ポリメラーゼによってプライマーを伸長すること、の１もしくは複数回の反復を含む。通常、該反応は、サーマルサイクラー機器を使って各ステップに最適化された様々な温度を経て循環される。特定の温度、各ステップの継続時間、およびステップ間の変化率は、例えば参照文献：McPherson et al, editors, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach（それぞれ、IRL Press, Oxford, 1991および1995）によって例示される、当業者にとって周知の複数の要因に依存する。
【００８８】
例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲでは、二本鎖標的核酸を、温度＞９０℃にて変性させ、プライマーを５０〜７５℃の範囲内の温度にてアニーリングさせ、そして、プライマーを７２〜７８℃の範囲内の温度にて伸長させ得る。「ＰＣＲ」という用語は、これだけに限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネスト化ＰＣＲ（nested PCR）、定量的ＰＣＲ、多重化ＰＣＲなどを含めた反応の派生形を包含する。反応容量は、数百ナノリットル、例えば、２００ｎｌから数百μｌ、例えば、２００μｌに及ぶ。「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、相補的な一本鎖ＤＮＡに標的ＲＮＡを変換する転写反応が先行し、次にその相補的な一本鎖ＤＮＡが増幅されるＰＣＲを意味する、例えば、Tecottら、米国特許第５，１６８，０３８号（それらの特許を参照により本明細書に援用する）。「リアルタイムＰＣＲ」とは、反応を続けながら、反応生成物、すなわち、単位複製配列の量をモニタリングするＰＣＲを意味する。反応生成物をモニタリングするのに使用される検出化合物が主に異なるたくさんの形態のリアルタイムＰＣＲが存在する、例えば、Gelfandら、米国特許第５，２１０，０１５号（「taqman」）；Wittwerら、米国特許第６，１７４，６７０号および同第６，５６９，６２７号（インターカレーティング色素）；Tyagiら、米国特許第５，９２５，５１７号（分子ビーコン）（それらの特許を参照により本明細書に援用する）。
【００８９】
リアルタイムＰＣＲの検出化合物は、Mackay et al, Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002)で概説される（それらの特許も参照により本明細書に援用する）。「ネスト化ＰＣＲ」とは、第一のＰＣＲの単位複製配列が、新規プライマーセット（少なくともその一方が第一の単位複製配列の内側に結合する）を使用する第二のＰＣＲのサンプルになる二段階のＰＣＲを意味する。本明細書中に使用される場合、ネスト化増幅反応に関する「初期プライマー」とは、第一の単位複製配列を作り出すのに使用されるプライマーを意味し、そして、「二次プライマー」とは、二次、またはネスト化された単位複製配列を作り出すのに使用される１もしくは複数のプライマーを意味する。「多重化ＰＣＲ」とは、複数の標的配列（または単独の標的配列と１もしくは複数は参照配列）が同じ反応混合物中で同時に行われるＰＣＲを意味する、例えば、Bernard et al, Anal. Biochem., 273: 221-228 (1999)（二色型リアルタイムＰＣＲ）。通常、各配列を増幅するために、異なるプライマーセットが利用される。典型的に、多重化ＰＣＲの標的配列の数は、２〜５０、２〜４０、または２〜３０の範囲内である。「定量的ＰＣＲ」とは、サンプルまたは標本中の１もしくは複数の特定の標的配列の存在度を計測するように設計されたＰＣＲを意味する。定量的ＰＣＲは、かかる標的配列の絶対定量と相対定量の両方を含む。
【００９０】
定量測定は、標的配列と別々にまたは一緒にアッセイされ得る１もしくは複数の参照配列または内部標準を使用して行われる。該参照配列は、サンプルまたは標本に対して内因性であっても、または外因性であってもよく、そして後者の場合では、１もしくは複数の競合鋳型を含んでもよい。典型的な内因性参照配列としては、以下の遺伝子：βアクチン、ＧＡＰＤＨ、ｐ２−ミクログロブリン、リボソームＲＮＡなど、の転写産物のセグメントが挙げられる。定量的ＰＣＲの技術は、以下の参照文献（それらの特許を参照により本明細書に援用する）：Freeman et al, Biotechniques, 26: 112-126 (1999)；Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447 (1989)；Zimmerman et al, Biotechniques, 21 : 268-279 (1996)；Diviacco et al, Gene, 122: 3013-3020 (1992)；Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989)；など、で例示されるように、当業者にとって周知である。
【実施例】
【００９１】
実施例１
末梢血（ＰＢ）採取と処理：
ＰＢのサンプル（３０ｍｌ）を、Alfred Human Ethics Committeeに従ったインフォームドコンセント後に、１０ｍｌのＳｔｒｅｃｋセルフリーＤＮＡ ＢＣＴチューブまたは１０ｍｌのＥＤＴＡチューブを使用して健常ボランティア（ＮＶ）またはＭＭ患者から入手した。サンプル採取直後に、チューブを転倒して、採取チューブ内の血液を保存料と混合し、サンプル処理および保管中の血球細胞からのＤＮＡの放出を予防した（Das K, et al. (2014) Molecular diagnosis & therapy 18(6):647-653; Qin J, Williams TL, & Fernando MR (2013) BMC research notes 6:380）。血漿（ＰＬ）を、８２０×ｇにて１０分間（ｍｉｎ）の遠心分離によりＰＢから分離した。細胞層を乱すことなく上清を回収し、１６，０００×ｇにて１０分間、再び遠心分離して、すべての残留細胞残屑を取り除いた。その上清を回収し、そして、血漿からのｃｆＤＮＡの分離までの長期保存として、１ｍｌのアリコートで−８０℃にて保存した。
【００９２】
セルフリーＤＮＡの抽出：
凍っている血漿サンプルを、製造業者の取扱説明書に従ったＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（Qiagen, Germany）を使用したｃｆＤＮＡ抽出に用いた。平均６ｍｌの血漿をｃｆＤＮＡ抽出に使用した。それに続いて、血漿ｃｔＤＮＡを、QUBIT Fluorometerおよび高感度ＤＮＡ検出キット（Life Technologies, Australia）を用いて定量化した。ＤＮＡの収率を、Qubit2.0Fluorometer（Life Technologies）を使用して計測した。ＱＵＢＩＴアッセイに利用した最大入力体積は５μｌであった。抽出したＤＮＡを、さらに処理するまで−８０℃にて保存した。
【００９３】
骨髄単核細胞のフィコール分離、ＭＭ細胞比率の測定、およびＣＤ１３８＋ＭＭ細胞の分離
Alfred Hospital Human Ethics Committee-approvedプロトコールに従った書面でのインフォームドコンセント後に、ＰＢサンプリングと同様に、ＭＭ患者またはＮＶからＢＭを得た。Ficoll Paque Plus（GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australia）を、製造業者のガイドラインに従って、骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を含む淡黄褐色の層を分離するのに利用した。赤血球を、３７℃にて５分間、赤血球溶解バッファー（１０ｍｍｏｌ／ＬのＫＨＣＯ３、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、および０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を使用して取り除き、それに続いて、無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することによって、すべての溶解バッファーを除去した。次に、細胞を、一晩１０％のＦＣＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。各患者から分離したＢＭＭＮＣ中のＭＭまたは健常血漿細胞（ＰＣ）の比率を、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、およびＣＤ４５染色のフローサイトメトリー計数によって決定した。簡単に言えば、細胞を、室温にて２０分間、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（Becton Dickinson (BD) Biosciences, North Ryde, NSW, Australia）、ＣＤ３８−ＰｅｒＣＰ（BD Biosciences）、およびＣＤ１３８−ＰＥ（Miltenyi Biotec, Macquarie Park, NSW, Australia）で染色し、洗浄し、そして、３００μＬのバッファー（０．５％のＦＣＳ／ＰＢＳ）中に再懸濁した。BD FACSCalibur Flow Cytometerによりサンプルを得て、ＭＭ ＢＭからのＣＤ３８＋／ＣＤ４５−／ＣＤ１３８＋細胞の比率を決定した。ＭＭ細胞を分離するために、製造業者ガイドライン（Miltenyi Biotec）を使用して、ＣＤ１３８マイクロビーズを用いた。細胞を、ビーズバッファー（ＰＢＳ／２ｍＭのＥＤＴＡ／０．５％のＢＳＡ）で洗浄し、２０分間、マイクロビーズで染色した。ＣＤ１３８＋細胞を、ＭＳカラム（Miltenyi Biotec）を使用した磁気分離によって選択した。QIAGEN Blood DNeasy Kit（Qiagen, Valencia, CA）を使用して、ＤＮＡ抽出を行い、そして、QUBIT Fluorometer2.0を用いて定量化した。
【００９４】
OnTarget（商標）Mutation Detection（ＯＭＤ）プラットフォーム
患者からのＣＤ１３８ ＭＭ細胞および対になる血漿（２ｍｌ）からのゲノムＤＮＡを、潜在的にＭＭに関連する４３個の突然変異（ＢＲＡＦ ｎ＝６；ＫＲＡＳ ｎ＝１８；ＮＲＡＳ ｎ＝１０およびＴＰ５３ ｎ＝９）を伴うＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、ＦＯＸＬ２、ＧＮＡＳおよびＢＲＡＦの９６個の突然変異を含むOnTarget（商標）Mutation Detection（ＯＭＤ）プラットフォーム（Boreal Genomics）を用いた突然変異の特徴づけに利用した（図１０および１１）。
ＯＭＤのサンプル抽出、定量化、処理および突然変異濃縮、MiSeqライブラリ作成および配列決定、データ分析のための方法は、以下に提供されており、かつ、先に記載されている（Kidess E, Heirich K, Wiggin M, Vysotskaia V, Visser BC, Marziali A, et al. Mutation profiling of tumor DNA from plasma and tumor tissue of colorectal cancer patients with a novel, high-sensitivity multiplexed mutation detection platform. Oncotarget. 2015;6:2549-61）。
【００９５】
OnTarget（商標）Mutation Detection（ＯＭＤ）プラットフォームのサンプル抽出、定量化、および処理
血漿サンプルからのＤＮＡを、QIAamp Circulating Nucleic Acidキット（Qiagen, Valencia, CA、部品番号５５１１４）の変更バージョンを使用して抽出した。サンプルを終量６０μｌの０．１×ＴＥ中に溶解した。骨髄由来のＤＮＡサンプルを、６０μｉｎの０．１×ＴＥに希釈した。品質管理のために、５μｌのアリコートを取り出した。残りをOnTargetアッセイに使用のために保存した。各ＤＮＡサンプル中に存在するゲノムのコピー数を、ｑＰＣＲを使用してアッセイした。５μｌのサンプルアリコートを、１５倍および６０倍に連続希釈し、そして、ＣＯＧ５およびＡＬＢ遺伝子内に含まれた単位複製配列を使用したｑＰＣＲによって、二連でアッセイした。アッセイの入力質量限界である３００ｎｇ未満を含ことがわかっているサンプルを、アッセイを実施するために消費した一方で、３００ｎｇ超を含むサンプルを、ｑＰＣＲによって計測した場合に、５０μｌのアリコートが３００ｎｇをもたらすように、ｄＨ２Ｏで希釈した。３０〜３００ｎｇの野性型ＤＮＡ（Roche Human Genomic DNA、部品番号１１６９１１１２００１）を含む６（６）つの陰性対照サンプルを、受け入れたサンプルと並行して実験した。
【００９６】
次に、個別に各突然変異のプロセス収率を計算するために、および各突然変異についてアッセイの成功を確かめるために使用する、内部陽性対照を、それぞれサンプルに加えた。該内部陽性対照は、ＰＣＲプライマーおよびOnTarget相同性部位の突然変異対立遺伝子と同一配列を有するが、さらに、ランダムな識別子（ＲＩＤ）、個々の入力分子について収率計算を容易にし、かつ、配列決定に続いて、対照を本当の変異体と容易に区別できるようにするランダムＤＮＡバーコードを含む。約１００個の内部陽性対照分子が、９６個の突然変異パネルの各突然変異に加えられた。つぎに、各サンプルに、多重化１２ＶサイクルバーコーディングＰＣＲ反応（ＰＣＲ１）において独特なサンプルＤＮＡバーコードを付与した。それぞれのサンプルの９９％は、バーコーディング反応において鋳型として使用されて、パネル内に９６個の突然変異を含む遺伝子座を増幅する。残った１％は、突然変異パネル遺伝子座および２つの追加対照遺伝子座（ＣＯＧ５およびＡＬＢ、定量化に使用される）を増幅する別々の反応でバーコードを付された。両方のバーコーディングＰＣＲ反応では、すべてのプライマーが、ユニバーサルプライマーとして使用される５’タグを含んでおり、後のステップで単独のプライマーセットを用いたすべての遺伝子座の増幅を可能にした。次に、バーコードを付与した増幅産物および定量化反応生成物を貯留し、そのサンプルのすべてのＰＣＲ産物を含んでいるそれぞれのサンプルの単一のアリコートを得た。各サンプルのＰＣＲ産物の１５％を貯留し、それに続いて、製造業者の取扱説明書に従ってZymo DNA CleanおよびConcentratorカラムを使用して精製した。それぞれのサンプルの残りを確保した。
【００９７】
OnTarget Mutation濃縮
サンプルセットをOnTarget内に添加し、９６個の突然変異、ならびに野性型ＣＯＧ５およびＡＬＢ配列を濃縮した。次に、濃縮したOnTarget出力を、製造業者の取扱説明書に従ってBioRad Micro BioVSpin6カラムを使用して精製した。
【００９８】
MiSeqライブラリ作成と配列決定
次に、濃縮および精製OnTarget出力を、Illumina MiSeqライブラリ作成に使用した。生成物を、増幅し、そして、セット特異的バーコードおよび５’MiSeqアダプタータグを含むユニバーサルプライマー（ＰＣＲ２）を使用した３５サイクルのＰＣＲによってMiSeqアダプターを用いてタグを付与した。次に、ＰＣＲ出力を、Agencourt AMPure XPキットを使用して精製した。次に、配列決定ライブラリを、KAPA Library Quantキットを使用したｑＰＣＲによって定量化し、５ｎＭの濃度に正規化し、そして次に、ライブラリをIllumina MiSeqにより配列決定した。
【００９９】
データ解析配列アラインメント
配列決定データを、OnTarget 96-plex突然変異パネルおよびアラインメント後の追加データ操作のためのSAM Toolsからの配列を調整したカスタム参考ライブラリに対するアラインメントのためにＢＷＡを使用して記述したカスタム分析スクリプトを使用して、完全自動化様式で分析した。突然変異の定量化、品質管理、および視覚化を、Perl、PythonおよびMySqlで記述したスクリプト、ならびにGraphvizなどのツールを使用して行った。アルゴリズムの簡単な説明が続く。MiSeq製の未加工FastQファイルは、最初に、サンプルおよびセットバーコードによって逆多重化され（それぞれ第一および第二のＰＣＲ反応を加えられ）、バーコーディングＰＣＲプライマー間にあるそれぞれの分子の内因性領域のみを保持するためにトリミングされ、次に、以下の基準に従ってフィルタリングした：
ａ）フォワードおよびリバースの読出しが同じ参照配列にアラインしなければならない、ｂ）両方の読出しが同じ突然変異を担持している、ｃ）確認された突然変異が、OnTarget 96-plexパネル内に含まれていなければならない。
【０１００】
上記の条件を満たす読出しが、サンプルバーコードおよび突然変異に応じてグループ分けした。次に、残った読出しを、それらが、以下の内部陽性対照分子の別々の参考ライブラリにアラインしたか否か測定するために再分析した：
１．それぞれの読出しの内因性部分の最初の１５塩基を、OnTarget 96-plexパネル内の遺伝子座の還元参照配列セットとアラインした。
２．ＲＩＤバーコードは、その遺伝子座に特異的なフランキング配列を検索することによって見出された。
３．次に、内因性配列からＲＩＤ配列を取り除き；次に、残った内因性配列を先の試験（ａ）〜（ｃ）に通した。
【０１０１】
該フイルターを通過した内部陽性対照読出しを、ＲＩＤ内の誤差に関して補正し、そして、サンプルバーコード、突然変異、および独特なＲＩＤ配列に応じてグループ分けした。次に、それぞれのサンプルバーコード／突然変異組み合わせについてワークフロー全体を通じた平均単一分子収率を、そのバーコードおよび突然変異のすべてのＲＩＤにわたる読出しの平均数として計算した。
【０１０２】
品質管理チェック
シーケンサがあらゆるＩＰＣ分子を、および外延によって、ワークフローに参加するあらゆるゲノム変異体分子を、検出したことを保証するために、品質管理チェックを実施した。各サンプルの各突然変異について、２つのチェックを行った：
（ａ）検出された内部陽性対照分子数が、予想される入力内部陽性対照分子数の少なくとも５０％でなければならない。
（ｂ）それぞれの入力分子についてモニタリングした読出しの平均数が１０超でなければならない。上記の条件の両方に合致しない突然変異は感度を落としたとして印を付した。
【０１０３】
検出計算および突然変異の呼び方（calling）の制限
各サンプル内の各突然変異の入力変異体分子の数を、所定のバーコードの変異体読出し数をその突然変異およびバーコードの平均単一分子収率で割ることによって計算した。類似のプロセスを、ＷＴ ＣＯＧ５およびＡＬＢ配列について行い、ワークフローに参入したゲノムの総数を計測するのに使用した；これらの遺伝子座の１％のみがバーコーディングＰＣＲ反応で増幅されたことを考慮する。突然変異存在度を、入力変異体コピー対総入力ゲノムコピーの比として計算した。２つのサンプルに関して、任意の内部陽性対照をサンプルに加えず、そしてそれは、単一分子収率を直接計測することができないことを意味した。これらの２つのサンプルの単一分子収率は、並行して処理された他の９つのサンプルに関する単一分子収率を平均することによって概算された。次に、概算した単一分子収率を、変異体読出し数から変異体コピー数を決定するために使用した。この分析の妥当性をチェックするために、この計算法を、内部陽性対照を含んだセットの中の他のサンプルのすべてについて実施し、標準的な計算に対してチェックした；結果は、すべてのサンプルのすべての突然変異について２０％未満異なった。突然変異は、変異体コピー数が検出されたそれらが検出限界より大きい場合にのみ、陽性と呼ばれ、そしてそれは、以下のように定義される：
【０１０４】
【化１】
2022000059.tif 000002
【０１０５】
ここで、合計中の用語は：
・２つの入力変異体コピー
・ＷＴサンプルの最大予想変異体バックグラウンド（９９．９％の信頼区間、片側）は、入力ゲノム数（Ｎゲノム）で割ることによってコピーに変換した、歴史的なBoreal Genomics wildVtypeサンプル＋３つの標準偏差（ＷＴ＿バックグラウンド）で検出された平均突然変異存在度として計算した。
・単位複製配列内の他の配列に対する配列決定エラーから生じる最大予測クロストーク。これは、合計（すべての検出された入力コピー（ｃｐｉｎ））の１％が単位複製配列内の突然変異に合致しないと計算され、そして、ＷＴおよび96-plexパネル内の突然変異の両方を含む。ある突然変異が高い存在度で存在する場合、これは、密接に関連する突然変異の検出限界に重大な影響を及ぼす可能性がある。
【０１０６】
全エクソームの配列決定
対応する患者からのＷＥＳ、ゲノムＤＮＡおよびｃｔＤＮＡに関して、ライブラリ準備およびエクソーム捕獲を、NEBNext Ultra Library prepキット（Genesearch）およびSureSelect XT2ヒトエクソームV5.0キット（Agilent）のそれぞれを用いて開始した。次に、配列決定を、Illumina HiSeq2500で開始し、そして、ＡＰＦヒトエクソームパイプラインを介して加工した。
【０１０７】
ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）：ＯＭＤのバリデーションと患者ｃｔＤＮＡの追跡
ＯＭＤの知見を、突然変異特異的ｄｄＰＣＲを用いて正当であると確認し、患者からの一連のＰＬサンプルもまた、ｄｄＰＣＲ（Biorad QX200 droplet digital PCR system）を用いて量的に追跡した。ＰＣＲを、QX200 ddPCR（Biorad）を使用して実施した。ドロップレットを、２０μｌの反応が最大２０，０００ナノリットルのドロップレットの乳濁液に仕切られるドロップレット発生器を使用して作り出した。次に、該ドロップレットを、Prime PCRアッセイ条件（Biorad）を使用して行われたＰＣＲ増幅に供した。すべてのｄｄＰＣＲ構成が、無鋳型対照を有した。ＰＣＲに続いて、ドロップレットを、二蛍光検出器を用いて読出して、着目の突然変異に関して陽性であるドロップレットを決定した。Quantasoft（商標）ソフトウェアバージョン１．７は、サンプルの変異体コピーおよび分画存在度（ＦＡ）の測定を可能にした。
【０１０８】
実施例２
ＭＭ患者のセルフリーＤＮＡ量は、健常ボランティアより有意に高い
ＭＭ患者（ｎ＝３７）およびとＮＶ（ｎ＝２１）のＣｆＤＮＡ量を測定した。ｃｆＤＮＡの高い数量は、ＮＶよりＭＭｐｔｓから得られた（それぞれ、中央値２３ｎｇ／ｍｌ［範囲５〜１９５ｎｇ／ｍｌ］対１５ｎｇ／ｍｌ［範囲６〜３２ｎｇ／ｍｌ］、ｐ＝０．００８５、図１）。ｃｆＤＮＡの量を病期と関連させたとき、活動性疾患（ＮＤおよび再発疾患）に罹患している患者は、ＮＶと比較して有意に高いｃｆＤＮＡ量を有していたことが明らかになった（ｐ＝０．００６７；図２）。ｃｆＤＮＡの量が活動性疾患に罹患している患者で有意に高かったが、レベルはパラプロテイン量、血清遊離軽鎖およびＢＭ ＭＭ細胞比率と相関していなかった（図３、スピアマンの順位相関係数）。
【０１０９】
実施例３
ＢＭ ＭＭ細胞およびｃｔＤＮＡの両方のプロファイリングが、ＭＭ患者の突然変異的状況の包括的な実態を提供する
４８人のＭＭｐｔｓ（１５人の新規診断［ＮＤ］および３３人の再発／難治性［ＲＲ］）は、集められたＣＤ１３８濃縮ＭＭ腫瘍細胞集団およびＯＭＤを受けた６つの野生型（ＷＴ）ＤＮＡ対照と共にすべての対応するＢＭ ＭＭ ＤＮＡおよびｃｔＤＮＡ標本の同時性を有した。合計１２８個の突然変異（ＫＲＡＳ ｎ＝６５［５０．７％］、ＮＲＡＳ ｎ＝３７［２８．９％］、ＢＲＡＦ ｎ＝１０［７．８％］、ＴＰ５３ ｎ＝１６［１２．５％］）が、ＷＴ対照で検出されずＭＭ患者（ＢＭおよび／またはｃｔＤＮＡ）で検出された（図４）。１２８個の突然変異のうち、ｎ＝３８個の突然変異がＢＭおよびＰＬで見られた、ＢＭでｎ＝５９およびＰＬでｎ＝３１。そのうえ、合計５３．９％の突然変異がＰＬで見られ、ＭＭにおけるｃｔＤＮＡの存在を示した。４８人の患者のうち１０人が、ＰＬ中に３１個の突然変異を有し、そしてＢＭ中には有しておらず、それによって、合計２４．２％が、ＢＭ生検部位の遠方で、限局してまたは主に検出された（図１０）。
【０１１０】
４８人の患者のうち、１２人の患者はＢＭまたはＰＬのいずれにもあらゆる検出可能な突然変異を有しなかった（２５％）、そして、１６人（３３．３％）はＰＬに突然変異を有しておらず、そして、３人（６％）はＰＬにのみ突然変異を有した。
ＲＲコホートの中で、ＮＤコホート（１個の突然変異）と比較してＰＬ（３０個の突然変異）でのみより多くの突然変異が見られ、ＢＭ生検部位の遠方に限局して存在するＲＲ患者の遺伝的に異種の優位なサブクローンの存在のより大きな可能性と一致した（図５）。加えて、ＰＬのみの突然変異のより高い頻度は、ＮＤよりもＲＲ患者で検出された（２７．２％対６．６％、ｐ＝０．２５、χ二乗検定）。突然変異の存在／数は、存在下、高リスク細胞遺伝といずれの相関も有していなかった。
【０１１１】
ＢＭまたはＰＬのいずれかで検出された突然変異を有していない患者（１２人の患者）を実証分析から排除した。対応するＢＭとＰＬを伴った初期コホートから残っている３６人の患者を、ｄｄＰＣＲを使用して選択的突然変異に関して正当性を確認した。ＢＭおよびＰＩサンプルを、ＯＭＤとｄｄＰＣＲの間で９２．６％の一致を有するｄｄＰＣＲによって１２３個の突然変異について試験した。
ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、ＯＭＤで検出された突然変異のその後の正当性確認に利用した。対応するＢＭとＰＬを伴った初期コホートからの合計１２人の患者を、選択的突然変異（ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ａ、およびＧ１２Ｒ）に関してｄｄＰＣＲを使用して正当性を確認した。ＯＭＤによって提示された突然変異の１０／１１（９０．９％の一致）が、ｄｄＰＣＲ（図１４）によって検出され、そして、ＯＭＤにおいて陰性であった突然変異の４／１３（３０．７％）がｄｄＰＣＲによって検出され、ｄｄＰＣＲのより高い感度を示した。
【０１１２】
突然変異存在度は、ＭＭ患者の遺伝的不均一状況を反映する
ＢＭ中の突然変異の突然変異存在度（ＭＡ）は、０．００５９％〜３２％（中央値０．１４％）、およびＰＬに関して０．００９０％〜１４％（中央値０．１１％）に及んだ（図６）。ＢＭの中央値ＭＡは、ＢＭ単独で見られる突然変異に比べて、ＢＭおよびＰＬの両方で見られる突然変異のＰＬの中央値ＭＡより有意に高く（図６；ｐ＜０．０００１）、ＢＭのより優位なクローンもまた、ＰＬで検出可能であることを示した（図６、ｐ＝０．０１４）。これは、ＯＭＤで表された変異プロファイルが、アッセイの検出レベルを下回るより小さいＢＭクローンを含まなかったという概念と一致している。同様に、ＰＬのＭＡのみの突然変異は、ＢＭおよびＰＬの両方で検出されるＰＬ突然変異のＭＡに比べて有意に低かった（図６；ｐ＝０．００３）。
【０１１３】
突然変異は、主にＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路に関連していた
ＢＭおよびＰＬの両方で見られた上位４つの突然変異は、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ（８．６％）、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ＿１（７．０％）、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ（６．３％）およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（６．３％）であった（図７Ａ）。ＫＲＡＳ突然変異の中で、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ＿１（１３．９％）が最も際立っていて、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ（１２．３％）およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（１２．３％）（図７Ｂ）がそれに続いたが、その一方で、ＮＲＡＳ突然変異では、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ（２９．７％）が最も高い発生率を有し、ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（１３．５％）およびＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄ（１０．８％）がそれに続いた（図７Ｃ）。ＴＰ５３、ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｄ、Ｒ２７３Ｈ、およびＲ２４８Ｗの間で同じ発生率（１８．８％；図７Ｄ）を有していたが、その一方で、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（５０％；図７Ｅ）が、試験した４つのＢＲＡＦ変異すべての中で最も高い発生率を有した。
【０１１４】
試験した４８人の患者のうち、３３人（６９％）が少なくとも１つのＲＡＳ活性化突然変異を有していた。ＫＲＡＳ突然変異は、ＰＬのみ、ＢＭのみ、および両方（図８Ａ〜Ｃ）で最も高い発生率を有した（図８Ｃ）。ＲＡＳ突然変異はＮＤおよびＲＲ患者の両方の間に分布し、ＮＤ患者の７３％およびＲＲ患者の６７％が少なくとも１つのＲＡＳ活性化変異を有した（図９）。しかしながら、進行疾患に罹患している個々の患者は、ＮＤ（４／１５（２７％）が有した）と比較して、より多くのＲＡＳ突然変異を有した（３５人中１５人（４３％）が≧２の活性化変異を保有する）（図９、ｐ＝０．３５、χ二乗検定）。ＲＲコホートの中で、３人の患者（ＲＲ２４、ＲＲ１２およびＲＲ１３、図９）が１０を超える活性化ＲＡＳ突然変異を有した。ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路の突然変異の中で、ＫＲＡＳは、ＲＲ患者の中でも最も高い発生率を有し（５６個の突然変異）、ＮＲＡＳ突然変異（２７個の突然変異）がそのあとに続いた。しかしながら、ＮＤ患者では、ＮＲＡＳ（１０個の突然変異）はＫＲＡＳ（９個の突然変異）より高かった。これらの結果は、ＫＲＡＳおよびＮＲＡＳ突然変異がＭＭにおいて支配的であることを示す。ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路の突然変異は発生率が高かった一方で、ＴＰ５３突然変異はＲＲ患者に限局して見られた（図９）。
【０１１５】
表１：サンプル情報。表には、サンプルおよびサンプルの変異プロファイルに関する情報がある。
【表１】
2022000059.tif 000003
【０１１６】
実施例４
進行疾患に罹患しているＭＭ患者は、ｃｔＤＮＡ中により多くの突然変異を保有する
より多くのＭＴＳが、ＮＤｐｔｓと比較してＲＲｐｔｓで存在する−中央値２．５、それぞれ、突然変異／患者（範囲、０〜１１）対１突然変異／患者（範囲、０〜３）、ｐ＝０．０３。ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路（ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ）の活性化ＭＴＳを、９０％のＮＤｐｔｓ（ＭＴＳの中央値１、範囲０〜３）および７２％のＲＲｐｔｓ（ＭＴＳの中央値１、範囲０〜１１）を含めた、２８ｐｔｓのうちの２２（７９％）で検出し（ＢＭおよび／またはｃｔＤＮＡ）、そのうえ、１８人のＲＲｐｔｓのうち８人（４４％）が≧２の活性化ＭＴＳ（それぞれ、２、２、３、４、４、８、８、１１）を保有した。加えて、１３個のＴＰ５３ ＭＴＳのすべてがＲＲ患者に限局して見られた。
【０１１７】
実施例５
全エクソーム配列決定は、ｃｔＤＮＡ突然変異検出に利用できる
予備的ＷＥＳを、４つのｃｔＤＮＡサンプルに対して与え、それぞれ、１１５、７９、７８、および６５の読出し深度の中央値で１０８、１５２、１０１、および９８個の異なった遺伝子の優性エクソン変異形を実証した。変異形を、ＭＭ ＢＭのＷＥＳを用いて記載したようにチミンへのメチル化シトシンの自然発生的な脱アミノ化を反映したＣ＞Ｔ遷移について濃縮した（それぞれ、全変異形の５１％、４５％、５１％および４４％）。
本明細書中のデータは、ＭＭの突然変異特徴づけの補助としてｃｔＤＮＡ評価の有用性を確認する。さらに、高感度標的化アプローチを使用して、以前にＢＭ ＷＥＳで示されたものより複雑なＭＭにおける突然変異的状況を実証した。本明細書中のコホートでは、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路の活性化ＭＴＳが高度に蔓延しており、その知見がこの経路に対する著しいサブクローンの収束を示した。実用的なＭＴＳを同定することを目的とした血漿ｃｔＤＮＡの評価を組み込んだ高感度アプローチは、将来のＭＭ治療戦略を個別化するための試みの著しい進展を示す可能性があり、しかも、ＭＭに関するＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路標的化アプローチを組み込んだ将来の研究が不可欠である。
【０１１８】
実施例６
以下の実施例において突然変異転写産物についてモニタリングした７人の患者に関する方法論
患者にはAlfred Hospital Human Research Ethics Committee、Melbourne, Australiaによって承認された調査研究のために採取される血液に関して書面によるインフォームドコンセントを提供した。
臨床要件に基づいて、患者から血液サンプルを得た。すべての血液サンプルをStreck DNAチューブ内に採取し、採取後４８時間以内に加工した。８００ｇにて１０分間の遠心分離後に血漿を分離し、続いて、１６００ｇにてさらに１０分間遠心分離した後で、血漿を１．８ｍｌのチューブ内に等分し、必要になるまで−８０℃にて保存した。血漿ＤＮＡを、製造業者の取扱説明書に従ってQIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen）を使用して抽出した。ＤＮＡを、１００μｌのBuffer AVEを使用して溶出し、そして、NanoDrop 1000 Spectrophotometer（ThermoScientific）を使用して定量化した。
【０１１９】
各患者の突然変異を、Boreal Genomicsによって同定し、そして、我々は、ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＰＣＲ）（BioRad）を使用して突然変異を追跡し、定量した。我々は、BioRad QX200 DDPCRシステムおよびＤＤＰＣＲプローブマスターミックス［プローブ用のDDPCR Supermix（ｄＵＴＰ不含）］、ならびに特定の変異体クローンを標的化するプライマーを使用した。これらの変異体および野性型プライマーを、BioRadから購入し、そして、これらのプライマー配列はその企業に独自のものである。
ＤＮＡサンプルを、２０μｌのＤＤＰＣＲ反応物あたり５ユニットの濃度でのＤＤＰＣＲ反応物へのＭＳＥ１の直接添加によって達成される制限酵素消化によって断片化し、９６ディープウェル反応モジュールを備えたC1000 Touch Thermal Cyclerにより作業した。突然変異の増幅のための熱サイクルプロトコールは、酵素を活性化するために９５℃にて１０分間、それに続いて９４℃にて３０秒間の変性であった。アニーリングが５５℃にて６０秒間であり、そして、変性およびアニーリングステップを３９×反復し、その後、９８℃にて１０分間の酵素失活が続き、そして、機械からサンプルを取り出すまで反応物を１２℃にて保持した。すべてのステップのランピング速度は毎秒２℃に設定した。ＰＣＲステップの完了後に、サンプルを、QX200 Droplet Readerに添加し、QuantaSoft Ver1.7を使用して分析した。
【０１２０】
実施例７
進行性再発疾患に罹患している患者番号１は、レブリミドおよびデキサメタゾン（Ｒｄ）と組み合わせた経口アザシチジンの第１ｂ相試験で治療している間に採取された一連のＰＬサンプルを有した。以前に確認したＴＰ５３ Ｒ２７３ＨおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異に関してｄｄＰＣＲによって、ｃｔＤＮＡを試験した。優位なクローンであるように見えたＫＲＡＳ Ｇ１２ＤのＦＡは、疾患の再発と一致して急速に増加したが、ＴＰ５３ ２７３Ｈのそれは経時的に有意に変化しなかった（図１２Ａ）。
多発性骨髄腫（特異的にＩｇＧλ型）に罹患しているヒト患者のこの臨床例は、疾患の別の病期でも検出可能な突然変異の不均一性を示した。
【０１２１】
実施例８
患者番号２は、再発ＭＭに罹患しており、かつ、レブリミドおよびデキサメタゾン（Ｒｄ）中に採取された一連のＰＬサンプルを有した。２つの突然変異、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＳおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖに関するｃｔＤＮＡの分析は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ突然変異が経時的にわずかな変化を示した一方で、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＶクローンのＦＡはλ型軽鎖（ＬＣ）のレベルの変化と並行して変化し、共に治療法に対する不応性の出現によって増加したことを示した（図１２Ｂ）。
多発性骨髄腫（特異的にＩｇＧλ型）に罹患しているヒト患者のこの臨床例は、疾患の別の病期でも検出可能な突然変異の不均一性を示した。
【０１２２】
実施例９
患者番号３は、再発ＭＭに罹患しており、再発および同種移植後の時点で採取された一連のＰＬを有する。κ型ＬＣのレベルは、同種移植片後１２カ月間にわたって徐々に減少した；対照的に、変異体クローンＫＲＡＳ Ｇ１２ＣのＦＡは、同種移植後に急激な減少があり、安定疾患と一致して、検出可能な低いレベルだけがＰＬで維持された（図１２Ｃ）。
多発性骨髄腫（特異的ＩｇＧκ型）に罹患しているヒト患者のこの臨床例は、循環腫瘍ＤＮＡの減少後に血清マーカーの減少を示した。
【０１２３】
実施例１０
患者番号４は、ＭＭ患者向けのパノビノスタットの第ＩＩ相試験に登録された新規診断ＭＭであったが、高用量化学療法で調整された自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）の結果として起こる完全奏功を達成しなかった。ＡＳＣＴ前後およびパノビノスタット治療３カ月後の一連のＰＬサンプルを、ＢＭで同定されないＰＬのみの突然変異ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｃについて分析した。ＫＲＡＳ Ｇ１３ＣのＦＡは、ＰＰまたはλ型ＬＣのわずかな変化を伴った治療中に増加し、その後の再発と試験治療の休止の前兆であった（図１３Ａ）。
これは、腫瘍組織量の標準的な評価基準のモニタリング可能な変化との不一致に先行するかまたは示すＦＡの変化を伴う疾病状態のより良いバイオマーカーとしてのｃｔＤＮＡの臨床例であり、血清マーカーによって予測したそれより早く治療法を切り替えることを可能にする。
【０１２４】
実施例１１
患者番号５は、進行性再発ＭＭに罹患しておりＲｄと組み合わせた経口アザシチジンの、第１ｂ相試験で治療している間に９０日間にわたって採取された一連のＰＬを有した。３つの変異体クローン、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ＿１およびＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅを追跡し、３つの変異体クローンのすべてのＦＡにおける急激な減少を治療後１０日以内にモニタリングした。対照的に、κ型ＬＣは２０日目まで上昇し続けていた。最高のＦＡを有したＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ＿１レベルは９０日目まで減少し続け、κ型ＬＣレベルと一致した（図１３Ｂ）。
腫瘍組織量の標準的な評価基準のモニタリング可能な変化との不一致に先行するかまたは示すＦＡの変化を伴う疾病状態のより良いバイオマーカーとしてのｃｔＤＮＡの臨床例であり、血清マーカーより早く疾患応答の予測を可能にする。
【０１２５】
実施例１２
患者番号６は、再発疾患に罹患しており、Ｒｄに対してＴＰ５３ Ｒ２７３ＨおよびＮＲＡＳ Ｇ１３Ｒクローンの両方の減少を伴った。軽鎖逸脱と一致したλ型ＬＣの急激な増加は、これまでに検出されなかったＰＬ中の２つの新規ＫＲＡＳクローン、Ｇ１２ＡおよびＧ１２Ｖの出現と一致した。両ＫＲＡＳクローンのＦＡは、イキサゾミブ−シクロホスファミド−デキサメタゾン（ＩＣｄ）治療法への切り替えにより減少し、血清学的応答と一致した。しかしながら、応答し続けたＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈクローンとは対照的に、Ｒｄに対して感受性であったＮＲＡＳ Ｇ１３ＲクローンのＦＡはＩＣｄにより上昇し、２つの異なった治療法の系列に対して、４つの変異体クローンの示差的応答を強調した（図１３Ｃ）。
腫瘍組織量の標準的な評価基準のモニタリング可能な変化との不一致に先行するかまたは示すＦＡの変化を伴う疾病状態のより良いバイオマーカーとしてのｃｔＤＮＡの臨床例であり、血清マーカーより早く疾患応答の予測を可能にし、場合により、治療法の切り替えを可能にする。それはまた、難治性疾患と相関する新しい変異の増加を示すと同時に、既存の突然変異は同じレベルで残っていることも示す。
【０１２６】
実施例１３
患者番号７は、新規に診断された非分泌性ＭＭに罹患しており、従来の末梢血マーカーを有していない。一連のＰＬ ｃｔＤＮＡ分析では、ＢＭによる診断に存在していた変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２ＶおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄクローンの再発、ならびに２つの新規クローン、ＮＲＡＳ Ｇ１３ＤおよびＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋの出現と、再発疾患が関連しており、前者は、サリドマイド−デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシドおよびシスプラチン（Ｔ−ＤＣＥＰ）、ならびにボルテゾミブ（ベルケイド）−シクロホスファミド−デキサメタゾン（ＶＣＤ）での再治療の両方に対して不応性を示し、かつ、その後まもなく進行性疾患で患者が亡くなるまで続いたことを示した（図１３Ｄ）。興味深いことに、１９カ月目のＢＭ生検は、ＶＣＤの再導入と一致した疾患組織量の見かけ上の減少を示したが、ＰＬｃｔＤＮＡのｄｄＰＣＲは、ＶＣＤ−難治性疾患と一致するＮＲＡＳ Ｇ１３ＤクローンのＦＡの増加を示した。
【０１２７】
多発性骨髄腫に罹患しているヒト患者のこの臨床例は、突然変異の状況と治療の有効性のマーカーとして循環セルフリーＤＮＡを検出することの臨床的有用性を強調した。この実施例は、従来の末梢血バイオマーカー（すなわち、パラプロテインを有していない）を有していない患者が、循環セルフリーＤＮＡレベルまたは突然変異を検出することから特に利益を得るであろうことを明確に示している。
本明細書中に記載した実施例における臨床結果は、様々な形態の多発性骨髄腫に罹患している患者にとっての、（疾患の病期および治療の有効性を確認するために使用できる）循環セルフリー核酸の非侵襲性試験の恩恵を明確に示している。これは、医師および開業医が疾患の全体的な突然変異状態をより徹底的に理解することを可能にし、癌の進行を駆動しているシグナル伝達経路に向けられたオーダーメイド治療につながる。
【０１２８】
ＭＭ患者の多病巣性腫瘍沈着とクローン間の不均一性は、空間的および時間的制限のため、一つのＢＭ部位でＷＧＳまたはＷＥＳを使用した包括的な突然変異の特徴づけを困難な状況にしている。疾患が再発するときにＲＡＳ、ＦＧＦＲ３、ＴＲＡＦ３、およびＴＰ５３における多くの二次活性化変異が高頻度で存在することが知られており、包括的な特徴づけが治療法決定について情報を与える場合があることを示している。個々のＭＭ患者の遺伝子状況のより包括的な実態を提供し得る代替アプローチは、ＰＬ由来のｃｔＤＮＡを分析することであり、このことが、理論的に複数の独立した腫瘍から生じる腫瘍ゲノム全体の表示を含んでいるからである。ＭＭにおける本明細書中に記載した試験は、患者の治療法中の突然変異の特徴づけおよび変異体クローンのリアルタイムモニタリングのための、ＢＭ生検への補助としてのＰＬ由来ｃｔＤＮＡの有用性を評価しようと試みた。
【０１２９】
この試験では、ＮＤおよびＲＲ ＭＭ患者からのＰＬおよび対応するＢＭサンプル中のｃｔＤＮＡの評価を、４つの遺伝子、すなわち、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＴＰ５３のＭＭとの関連に焦点を合わせてＭＭ患者の変異プロファイルを特徴づけるためにＯＭＤプラットフォームを使用して実施した。突然変異をＢＭおよびＰＬのサンプルの両方で検出し、ＭＭの包括的な突然変異の特徴づけのためにＢＭ生検の補助としてのｃｔＤＮＡの有用性を示す。複数の独立した腫瘍を起源とするｃｔＤＮＡの概念は、ＰＬでしか見られない突然変異の３１％で強化された。患者の一部（２３％）では、ＢＭとｃｔＤＮＡの両方で見られる突然変異を用いて、突然変異荷重はｃｔＤＮＡ内で比例して大きくなり、さらにこの概念を強化した。さらに、ＲＲ患者はＰＬのみの突然変異のより高い発生率を有しており、疾病進行中に複数の腫瘍サイトわたって遺伝的構造が変化するという概念を支持した。同様に、一連のＰＬのｄｄＰＣＲを実施したとき、患者番号１は、難治性疾患再発に対応する、ＢＭ部位の遠方の、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄクローンの出現があった（図１２）。総合して、これらの結果は、単一部位のＢＭ生検は、特に、腫瘍動態のリアルタイムモニタリングおよび治療に対する抵抗性の予測が所望される場合に、変化する腫瘍ゲノムを包括的に捕捉するその能力に制限される証拠を提供する。
【０１３０】
本明細書中に記載したコホートでは、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路の活性化変異は非常に高頻度であって、ＢＭおよび／またはＰＬにおいて患者の７９％に少なくとも１つの活性化変異が存在しており、それによって、この経路における著しいサブクローンの収束を実証した。これらのデータはまた、一部の患者におけるサブクローナル構造が、以前のＮＧＳ試験によって示唆されているより複雑であり、以前に記載されているよりもＲＡＳ突然変異の頻度が高いことも確認し、そして、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路を標的化する適切に設計された有望な臨床試験の必要性を高めた。さらに、特定の変異体サブクローンの定量的な追跡のためのｃｔＤＮＡのｄｄＰＣＲの使用は、治療法の決定に関してより良好な情報を提供するはずである。そのうえ、（ＷＥＳ ＢＭ分析と比較して）このアプローチを用いて検出される突然変異数の増大は、それによって、高度に変異した実態を有する患者、例えばＲＲ患者１〜４（図９）、が治療学的な関連性について認識するのを可能にする。最近のモニタリングは、チェックポイント阻害が、最も高い突然変異負荷を有する固形腫瘍患者でより効果的であることを示唆している。斯かる治療戦略は、患者のより包括的な突然変異の特徴づけとの関連において、より指向性の様式を有するようになり得る。
【０１３１】
同様に、以前に同定された突然変異に関するｄｄＰＣＲを使用した一連のｃｔＤＮＡ分析は、特定の変異体クローンのＦＡの増大が再発に一致するかまたはそれに先行することを明らかにした（図１２および１３）。これに基づいて、潜在的な実用的突然変異の存在に関する標的化ｃｔＤＮＡの評価は、腫瘍組織量の非侵襲性リアルタイム測定のみではなく、治療学的選択のための重要情報も提供し得ることが提案される。そのうえ、ｃｔＤＮＡ評価から得られた定量データは、単一部位ＢＭ生検検査から得られたものよりも、全身腫瘍組織量のより全体論的な基準とその後の標的療法に対する応答の評価を提示し得る。これは、ＭＭの突然変異特徴づけのための補助としてのｃｔＤＮＡの有用性を評価したＭＭにおける最初の概念実証研究である。高感度標的化アプローチを使用することで、発明者らは、これまでＢＭ ＷＥＳで示されたものに比べて、ＭＭにおけるより複雑な突然変異的状況を実証し、そして、重要なことに、患者の治療中に追跡できる変異体クローンの存在を、主にまたは限局して、ＢＭ生検部位の遠方に示す。発明者らは、実用的な突然変異を同定することを目的としたＰＬｃｔＤＮＡ評価を組み込んだ高感度アプローチが、将来のＭＭ治療戦略を個別化する試みにおいて著しい進歩を示し、そして、ＭＭに関するＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路標的化アプローチを組み込んだ未来研究が不可欠であると結論づけた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年11月5日(2021.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。