(57)【要約】【課題】【解決手段】　染色体が組み込まれた組換えＤＮＡを有する、哺乳類形質転換細胞系を提供する。このＤＮＡは哺乳類グルココルチコイド調節性炎症性プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ（griＰＧＨＳ）を発現する。このＤＮＡは構成ＰＧＨＳを発現しない。この細胞系は内在性のＰＧＨＳ活性を発現しない。【選択図】　図１
2004105186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列がヒトＰＧＨＳ−２を発現し、前記ＤＮＡ配列がＰＧＨＳ−１を発現せず、細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しないことを特徴とする、形質転換哺乳類細胞系。
【請求項２】
　霊長類の細胞系である、請求項１に記載の細胞系。
【請求項３】
　ネズミの細胞系である、請求項１に記載の細胞系。
【請求項４】
　ヒトの細胞系である、請求項１に記載の細胞系。
【請求項５】
　組換えＤＮＡ配列がプロモーターをも含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項６】
　組換えＤＮＡ配列が選択標識遺伝子もしくはレポーター遺伝子をも含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項７】
　プラスミドベクター中、ウイルス発現ベクター中、もしくは分離されたＤＮＡ配列として、前記組換えＤＮＡを有する哺乳類細胞系のトランスフェクションによって形質転換哺乳類細胞系が産生されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項８】
　哺乳類細胞内でＰＧＨＳ−２が触媒するプロスタグランジン合成に対する、化合物の阻害力を判定する方法であって、
（ａ）予め選択した量の前記化合物を、細胞系が染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、そのＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現し、前記ＤＮＡがＰＧＨＳ−１を発現せず、細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しない、培養上清中の形質転換哺乳類細胞系に加える段階と、
（ｂ）前記培養上清にアラキドン酸を加える段階と、
（ｃ）前記細胞系が合成したＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の濃度を測定する段階と、
（ｄ）前記濃度を、前記化合物の非存在下で前記細胞系が合成した前記代謝産物の濃度と比較する段階とを含む方法において、
　前記哺乳類ＰＧＨＳ−２がヒトＰＧＨＳ−２であることを特徴とする方法。
【請求項９】
　ＰＧＨＳ−２が触媒するプロスタグランジン合成に対する、化合物の阻害力を判定する方法であって、
（ａ）染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現し、前記ＤＮＡ配列がＰＧＨＳ−１を発現せず、細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しない、形質転換哺乳類細胞系の小胞体抽出物を調製する段階と、
（ｂ）小胞体抽出物の一部分と予め選択した量の前記化合物とを含む、緩衝水性混合液を形成する段階と、
（ｃ）前記混合液にアラキドン酸を加える段階と、
（ｄ）前記混合液中で合成された、ＰＧＨＳ媒介アラキドン酸代謝産物の量を測定する段階と、
（ｅ）前記量を、アラキドン酸は存在するが前記化合物は存在しない条件の下で、前記小胞体抽出物の第二の部分が合成した前記代謝産物の量と比較する段階とを含む方法において、
　前記哺乳類ＰＧＨＳ−２がヒトＰＧＨＳ−２であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
　哺乳類細胞内でＰＧＨＳ−２もしくはＰＧＨＳ−１が触媒するプロスタグランジン合成に対する、化合物の阻害力を判定する方法であって、
（ａ）前記化合物の予め選択した第１の量を、細胞系が染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現し、前記ＤＮＡ配列がＰＧＨＳ−１を発現せず、前記細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しない、培養上清中の第１の形質転換哺乳類細胞系に加える段階と、
（ｂ）前記培養上清にアラキドン酸を加える段階と、
（ｃ）前記第１の細胞系が合成した、ＰＧＨＳ媒介アラキドン酸代謝産物の濃度を測定する段階と、
（ｄ）前記濃度を、前記化合物の非存在下で前記第１の細胞系が合成した、前記代謝産物の濃度と比較する段階と、
（ｅ）前記化合物の予め選択した第２の量を、細胞系が染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−１を発現し、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現せず、前記細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しない、培養上清中の第２の形質転換哺乳類細胞系に加える段階と、
（ｆ）前記培養上清にアラキドン酸を加える段階と、
（ｇ）前記第２の細胞系が合成した、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の濃度を測定する段階と、
（ｈ）前記濃度を、前記化合物の非存在下で前記第２の細胞系が合成した、前記代謝産物の濃度と比較する段階とを含む方法において、
　段階（ａ）において、哺乳類ＰＧＨＳ−２がヒトＰＧＨＳ−２であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
　ＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２が触媒するプロスタグランジン合成に対する、化合物の阻害力を判定する方法であって、
（ａ）染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現し、前記ＤＮＡ配列がＰＧＨＳ−１を発現せず、細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しない、第１の形質転換哺乳類細胞系の第１の小胞体抽出物を調製する段階と、
（ｂ）第１の小胞体抽出物の一部分と前記化合物の予め選択した第１の量とを含む第１の緩衝水性混合液を形成する段階と、
（ｃ）前記第１の混合液にアラキドン酸を加える段階と、
（ｄ）前記第１の混合液中で合成された、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の量を測定する段階と、
（ｅ）前記量を、アラキドン酸は存在するが前記化合物は存在しない条件の下で、前記小胞体抽出物の第二の部分が合成した前記代謝産物の量と比較する段階と、
（ｆ）染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−１を発現し、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現せず、細胞系が自己のＰＧＨＳ−２もしくはＰＧＨＳ−１活性を発現しない、第２の形質転換哺乳類細胞系の小胞体抽出物を調製する段階と、
（ｇ）段階（ｆ）の小胞体抽出物の一部分と前記化合物の予め選択した第２の量とを含む、第二の緩衝水性混合液を形成する段階と、
（ｈ）段階（ｇ）に前記混合液にアラキドン酸を加える段階と、
（ｉ）段階（ｇ）に前記混合液中で合成された、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の量を測定する段階と、
（ｊ）前記量を、アラキドン酸は存在するが前記化合物は存在しない条件の下で、段階（ｆ）の前記小胞体抽出物の第二の部分が合成した前記代謝産物の量と比較する段階とを含む方法において、
　段階（ａ）において、哺乳類ＰＧＨＳ−２がヒトＰＧＨＳ−２であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
　ヒトＰＧＨＳ−２をコード化する単離ＤＮＡ配列。
【請求項１３】
　SEQ ID No.3に一致するヒトＰＧＨＳ−２をコード化する単離ＤＮＡ配列。
【請求項１４】
　単離ヒトＰＧＨＳ−２。
【請求項１５】
　SEQ ID No.4に一致するアミノ酸配列を有する単離ヒトＰＧＨＳ−２。
【請求項１６】
　哺乳類ＰＧＨＳ−２を産生する方法であって、
（ａ）遺伝子の発現を制御する異種構造の制御配列と結合する哺乳類ＰＧＨＳ−２をコード化するヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された宿主細胞を培養し、宿主細胞によって哺乳類ＰＧＨＳ−２が安定的に発現させられる段階と、
（ｂ）細胞培養から哺乳類ＰＧＨＳ−２の遺伝子産生物を回収する段階と、を含む方法。
【請求項１７】
　哺乳類ＰＧＨＳ−２がヒトＰＧＨＳ−２であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
　ヒトＰＧＨＳ−２がSEQ ID No.4に一致するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
　遺伝子改変されたホスト細胞が自己のＰＧＨＳ−２を発現しない哺乳類のホスト細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
　試料中における哺乳類ＰＧＨＳ−２の発現を検出する方法であって、
（ａ）細胞溶解物又は組織部分を含む試料を、ハイブリダイゼーションを許容する条件下において、哺乳類ＰＧＨＳ−２のｍＲＮＡに対して相補的である単一鎖のヌクレオチド配列に接触させる段階と、
（ｂ）試料中において、ｍＲＮＡに対する単一鎖ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションが生起するかを検出する段階と、を含む方法。
【請求項２１】
　哺乳類ＰＧＨＳ−２がヒトＰＧＨＳ−２であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
　ヒトＰＧＨＳ−２がSEQ ID No.3に一致するヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
　ＰＧＨＳ−２遺伝子産生物の活性を選択的に阻害する非ステロイド性化合物を、このような処置の必要なヒト宿主に投与することを含む、ヒト宿主のＰＧＨＳ−２活性を選択的に阻害する方法。
【請求項２４】
　非ステロイド性化合物が、ＰＧＨＳ−２遺伝子産生物の酵素活性を阻害し、かつ、ＰＧＨＳ−１の酵素活性に対して最小限の効能を有することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
　ＰＧＨＳ−１の活性が阻害されないことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
　非ステロイド性化合物が抗炎症性薬剤であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
　ＰＧＨＳ−２遺伝子産生物の活性を選択的に阻害する非ステロイド性化合物を、このような処置の必要なヒト宿主に投与することを含む、ヒト宿主のＰＧＨＳ−２活性を選択的に阻害する方法であって、ヒト宿主において非ステロイド性化合物の活性が著しい毒性副作用を起こさない阻害方法。
【請求項２８】
　ＰＧＨＳ−２遺伝子産生物の活性を選択的に阻害する非ステロイド性化合物を、このような処置の必要なヒト宿主に投与することを含む、ヒト宿主のＰＧＨＳ−２活性を選択的に阻害する方法であって、
　ＰＧＨＳ−２遺伝子産生物の活性を選択的に阻害する非ステロイド性化合物の阻害力が、
（ａ）ヒトＰＧＨＳ−２を発現し、かつヒトＰＧＨＳ−１を発現しない遺伝子改変された細胞を非ステロイド性化合物に３０分間接触させ、前記細胞を所定量のアラキドン酸に晒す段階と、
（ｂ）ヒトＰＧＨＳ−１を発現し、かつヒトＰＧＨＳ−２を発現しない遺伝子改変された細胞を非ステロイド性化合物に３０分間接触させ、前記細胞を所定量のアラキドン酸に晒す段階と、
（ｃ）プロスタグランジン代謝産物に対するアラキドン酸の転化率を測定する段階と、
（ｄ）非ステロイド性化合物に晒された各細胞によって転化されたアラキドン酸量を、非ステロイド性化合物に晒されていないコントロール細胞によって転化されたアラキドン酸量と比較して、ＰＧＨＳ−２活性を阻害しかつＰＧＨＳ−１活性を阻害しない非ステロイド性化合物を見出す段階と、によって判定される阻害方法。
【請求項２９】
　炎症を処置するために用いられる、請求項２３、２７及び２８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
　本発明は、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）より与えられた助成金（Ｎｏ．ＤＫ１６１７７）の下、政府援助を受けて行われた。政府は本発明の権利を持つ。
【背景技術】
【０００２】
　（ＰＧＥ２、ＰＧＤ２、ＰＧＦ２ａ、ＰＧＩ２および他の関連化合物を含む）プロスタグランジン類は、脂肪酸代謝由来のオートクリン群およびパラクリンホルモン群の１つで、天然エイコサノイド（プロスタグランジン類、トロンボキサン類およびロイコトリエン類）に属する。エイコサノイドそれ自体は細胞内に貯えられていることはなく、アラキドン酸（細胞膜リン脂質の分解に由来する炭素数２０個の脂肪酸）から、必要に応じて生合成される。正常状況下のエイコサノイド産生は微量だが、細胞の種類によって大きく異なる多数の細胞機能の重要な情報伝達物質（メディエーター）として作用する。しかし、プロスタグランジン類は病態生理学においても極めて重要な役割を果たしている。特に炎症の開始とその維持は、少なくとも部分的には、損傷を受けた細胞内でプロスタグランジン類が過剰に産生されることによる。プロスタグランジン類が炎症で果たす中心的役割は、多くの病的炎症状態の治療において最も効果的であるアスピリン様非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）が、プロスタグランジンの合成を阻害することですべて作用しているという事実によって強調される。残念ながら、非ステロイド性抗炎症剤は正常細胞内のプロスタグランジン類も減少させ、正常な生理の維持に必要なオートクリンおよびパラクリン機能が損なわれる結果生じる副作用（消化管出血、潰瘍、腎不全など）のため、その使用が限られてしまうことが多い。他の細胞内でのプロスタグランジン産生を変化させずに、炎症細胞内のプロスタグランジン類のみを減少させることによって、さらに特異的に作用する新薬を開発することは、今後の薬物治療の大きな目標の１つである。
【０００３】
　プロスタグランジン類合成経路の第１段階はシクロオキシゲナーゼ反応である。まず、プロスタグランジンＧ／Ｈの合成作用を有する酵素（ＰＧＨＳ）が、アラキドン酸をエンドペルオキシドＰＧＧ２に変換すると、これが分解してＰＧＨ２になる（この２つの反応は１つの酵素が触媒する）。続いて、ＰＧＨ２は１つもしくは複数のプロスタグランジン合成酵素（ＰＧＥ２シンターゼ、ＰＧＤ２シンターゼなど）によって代謝され、最終産物である「２つのシリーズ」、すなわちプロスタグランジンシリーズ（ＰＧＥ２、ＰＧＤ２、ＰＧＦ２ａ、ＰＧＩ２）、およびトロンボキサン（ＴＸＡ２）のような他のシリーズを生成する。第１段階（ＰＧＨＳ）はプロスタグランジン合成の律速段階である。それはさておき、ＰＧＨＳの触媒反応は抗炎症剤作用の主要な標的である。そして、ＮＳＡＩＤＳ（アスピリン、インドメサシン、ナプロキセン、およびａ）炎症細胞中のプロスタグランジン類の過剰産生を抑制する（望ましい治療目標）と同時に、ｂ）非炎症細胞中のプロスタグランジン類の正常な産生も減少させる（好ましくない副作用を生じる）ようなその他の抗炎症剤）の薬理作用は、主にＰＧＨＳ作用の阻害による。
【０００４】
　炎症に関連する異常な変化以外にも、複数の因子が実験条件下でプロスタグランジン産生に影響を及ぼすことが知られている。これには成長因子、ｃＡＭＰ、発癌プロモーター、がん遺伝子ｓｒｃの活性化、インターロイキン１および２などが含まれるが、これらすべての因子は全細胞のＰＧＨＳ活性を亢進させる。副腎グルココルチコイドホルモンおよびこれに関連する合成抗炎症ステロイドもプロスタグランジンの合成を阻害するが、これらの代謝作用部位はあまり明らかではない。
【０００５】
　ヒト、ヒツジ、ネズミの各ｃＤＮＡがＰＧＨＳ−１用にクローンされている。これらの配列は互いに似ており、ノーザンブロット法で2.8〜3.0キロベース（ｋｂ）のｍＲＮＡとハイブリッドを形成する。しかし、最近幾つかの研究グループが、ＰＧＨＳ−１に関連があると報告されているタンパク質の配列をある方法で同定し推測した。１９９０年にJ.S.Hanらは、『ＰＮＡＳ　ＵＳＡ』８７巻３３７３頁（１９９０年５月）において、ＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３線維芽細胞がラウス肉腫ウイルスの温度感受性突然変異株ＬＡ９０に感染した後に、ポリペプチドｐｐ６０Ｖ−ｓｒｃによって生じるタンパク質合成の変化について報告した（非特許文献１参照）。巨大２次元ゲル電気泳動の結果、抗シクロオキシゲナーゼ抗体で確認可能な、７２〜７４キロダルトン（ｋＤａ）の１対のタンパク質が検出された。このタンパク質の合成は、血小板由来の成長因子の暴露によっても一時的に促進され、またデキサメサゾン治療によって阻害された。このようなタンパク質合成の変化は、シクロオキシゲナーゼ活性の変化と密接に関係していた。対になっているタンパク質は、マウスＣ１２７線維芽細胞でも認められた。この線維芽細胞でのタンパク質合成は、血清およびデキサメサゾンによって調節されていることが判明し、またシクロオキシゲナーゼ活性と関連があった。『J.Biol.Chem.』２６６巻２３２６１頁（１９９１年１２月５日）掲載のM.K.O'Banionらの報告を参照のこと（非特許文献２参照）。
【０００６】
　W. Xieらは、ｐｐ６０Ｖ−ｓｒｃに相当する１組のｃＤＮＡ（直ちに誘発可能な、ニワトリ胚線維芽細胞中の初期遺伝子）の分離を過去に報告しているが、ＣＥＦ−１４７と呼ばれる遺伝子がＰＧＨＳ−１に関連するタンパク質をコード化していることを、『ＰＮＡＳ　ＵＳＡ』８８巻２６９２頁（１９９１年４月）で報告した（非特許文献３参照）。彼らはこのｐｐ６０Ｖ−ｓｒｃを、有糸分裂促進因子（ミトゲン）を誘発できるＰＧＨＳｃｈｉｃｋｅｎという意味で、誘発型「ｍｉＰＧＨＳｃｈ」と名付けた。Xieらは、プロスタグランジン合成がｓｒｃ産生媒介性細胞形質転換において、ある役割を果たしているのだろうと推測したが、ｍｉＰＧＨＳｃｈをもう１つのシクロオキシゲナーゼとして、あるいは単にヒツジＰＧＨＳ−１である「ＰＧＨＳｏｖ」のニワトリの同族体として、実験で識別することはできなかった。
【０００７】
　他の１連の実験において、D.A.Kujubuらは、有糸分裂促進因子に応答するＳｗｉｓｓ　３Ｔ３細胞（ＴＩＳ１０）をクローンした１次応答遺伝子の１つが、３'側に長い非翻訳領域を持っており、マウスＰＧＨＳ−１と約６０％同じである６６ｋＤａの「推測」タンパク質をコード化していることを、『J.Biol.Chem.』２６６巻１２８６６頁（１９９１年）で報告した（非特許文献４参照）。この推測上のタンパク質の配列は、Xieらのタンパク質配列と本質的に同じであった。配列の類似性から、Kujubuらは、ＴＩＳ１０遺伝子がコード化しているタンパク質の酵素活性は、他の哺乳類のＰＧＨＳ−１の酵素活性とおそらく同じだろうと推測した。彼らは、『しかし、この推測の証明には、発現可能なプラスミドからのこの遺伝子産生の非相同発現と、トランスフェクションされた細胞あるいはＴＩＳ１０タンパク質の精製製剤またはその両者におけるシクロオキシゲナーゼ活性の直接的な測定が必要である』と結論づけた。
【０００８】
【非特許文献１】J.S.Hanら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９０年５月、８７巻、ｐ．３３７３
【非特許文献２】M.K.O'Banionら、J.Biol.Chem.、１９９１年１２月５日、２６６巻、ｐ．２３２６１
【非特許文献３】W.Xieら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、１９９１年４月、８８巻、ｐ．２６９２
【非特許文献４】D.A.Kujubuら、J.Biol.Chem.、１９９１年、２６６巻、ｐ．１２８６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
　プロスタグランジン合成経路の活動の評価方法および調節方法の開発の重要性が増している。前述したとおり、アスピリンやインドメサシンのような非ステロイド性抗炎症剤は、アラキドン酸をＰＧＧ２およびＰＧＨ２に変換するシクロオキシゲナーゼを阻害する。したがって、分子レベルで、従来の抗炎症剤の効果の調査方法、および潜在的な抗炎症剤の効果の評価方法を改良する必要があると同時に、このような方法で使用する試薬が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［発明の概要］
　本発明は、染色体に組み込まれた組換えＤＮＡ配列を有する哺乳類細胞系を提供する。このＤＮＡ配列は哺乳類、特にヒトのグルココルチコイド調節性炎症性ＰＧＨＳを発現する。この細胞系は自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２活性を発現しない。ここでは簡単に、グルココルチコイド調節性炎症性ＰＧＨＳを「ｇｒｉＰＧＨＳ」または「ＰＧＨＳ−２」と呼び、2.8〜3.0ｋｂのｍＲＮＡ（ＥＣ１.１４.９９.１）がコード化し、技術者が認識している哺乳類ＰＧＨＳを「構成シクロオキシゲナーゼ」または「構成ＰＧＨＳ」または「ＰＧＨＳ−１」と呼ぶ。「自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２活性」が存在しないという記述は、組換えＤＮＡ配列が発現するＰＧＨＳ活性は別にして、細胞系がＰＧＨＳ活性を発現不可能であることに関連している。自己のＰＧＨＳは「内在性」ＰＧＨＳ活性と技術者の間で呼ばれることもある。
【００１１】
　本発明は、Hanらが報告した７２〜７４ｋＤＡのシクロオキシゲナーゼ、Xieらが報告したｍｉＰＧＨＳｃｈ、およびKujubuらが報告したＴＩＳ１０タンパク質が本質的にどれも同一のものであること、そしてこれらは別のシクロオキシゲナーゼであることを、我々が発見した結果である。このシクロオキシゲナーゼは、グルココルチコイドによる阻害の主要な標的であり、また非ステロイド性抗炎症剤による阻害の標的でもある。
【００１２】
　１９９１年１２月、我々は、マウスの４ＫｂのｍＲＮＡを経て、Ｃ１２７マウス線維芽細胞中の７０ｋＤａのタンパク質の合成を報告し、得られたアミノ酸の配列を発表した。４ｋｂのｍＲＮＡがコード化しているタンパク質は、そのアミノ酸の８０％が配列の決定した２４０塩基領域において、既知のマウスＰＧＨＳ−１タンパク質産物と同一である。『J.Biol.Chem.』３５巻２３２６１頁（１９９１年１２月５日発行）掲載のM.Kerry　O'Banionらの報告を参照のこと。
【００１３】
　幾つかのアッセイにより、ここでｇｒｉＰＧＨＳまたはＰＧＨＳ−２と呼ぶ７０ｋＤａのタンパク質が、シクロオキシゲナーゼの分離型であることが判明した。このタンパク質は抗ＰＧＨＳ血清で沈殿した。このタンパク質の合成および同時に生じるシクロオキシゲナーゼの濃度は、血清によって急速に誘発されるが、この誘発はデキサメサゾンによって阻害される。ＰＧＨＳ−２合成の調節は、2.8ｋｂのＰＧＨＳ−１  ｍＲＮＡの濃度変化ではなく、４ｋｂのｍＲＮＡ種の濃度変化の結果行われていることが明らかになった。後者のｍＲＮＡ種は、血清処理細胞中の2.8ｋｂのＰＧＨＳ−１　ＤＮＡプローブではほとんど検出不可能だが、シクロヘキシミドまたはイオノホアカルシウム処理細胞中でかなりの濃度まで蓄積する。これとは対照的に、血清、デキサメサゾン、シクロヘキシミドの各処理で、「構成ＰＧＨＳ」すなわちＰＧＨＳ−１をコード化している2.8ｋｂのｍＲＮＡの濃度に変化は認められなかった。我々はハイブリダイゼーション分析により、４ｋｂのｍＲＮＡが、2.8ｋｂのｍＲＮＡを生じる遺伝子とは異なる遺伝子の産物であったことを証明した。
【００１４】
　これらの観察結果は、シクロオキシゲナーゼ遺伝子が２種類存在することを示している。１つは構造的に2.8ｋｂのｍＲＮＡとして発現されるもので、もう一方はＰＧＨＳ−２をコード化する４ｋｂの成長因子調節性およびグルココルチコイド調節性ｍＲＮＡを生じるものである。後者の４ｋｂのｍＲＮＡの発現およびこれと同時に生じるＰＧＨＳ−２濃度の上昇が、炎症の多くの副作用を直接的または間接的に引き起こすプロスタグランジン合成促進の、すべてではないにしても、主な原因であると信じられている。
【００１５】
　本ＰＧＨＳ−２合成形質転換細胞系は、炎症性シクロオキシゲナーゼに対する潜在的生物活性剤の作用を評価するのに有用である。なぜならば、炎症の主要な証明であると共に、炎症の多くの副作用の原因であるプロスタグランジン類の濃度の上昇は、構成的に発現したシクロオキシゲナーゼすなわちＰＧＨＳ−１の変化ではなく、むしろＰＧＨＳ−２濃度の上昇によるからである。
【００１６】
　本発明は、染色体を組み込んだ組換えＤＮＡ配列を有する、別の哺乳類形質転換細胞系も提供する。このＤＮＡ配列は哺乳類（特にヒト）ＰＧＨＳ−１を発現するが、ＰＧＨＳ−２は発現しない。また、この細胞系は自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２活性も発現しない。この別の細胞系も、霊長類、ネズミ、ヒトの細胞系である。
【００１７】
　したがって、本発明は、ＰＧＨＳ−１に対してＰＧＨＳ−２を選択的に阻害する結果、ＰＧＨＳ−２は上昇しているが構成ＰＧＨＳ−１は上昇していない、哺乳類（特にヒト）の炎症組織や哺乳類（特にヒト）宿主の他の生理的または病的状態において、亢進したプロスタグランジン合成を特異的に阻害する化合物の相対的阻害作用を評価する方法も提供する。このアッセイでは、適当な培地または緩衝液中で本ＰＧＨＳ−２発現形質転換細胞系または小胞体抽出物を、予め選択した量の被験化合物と接触させ、ここにアラキドン酸を加える。そして、この細胞系または前記小胞体抽出物を、前記被験化合物の非存在下の対照細胞系または小胞体抽出物の１部と比較して、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の合成、すなわちトロンボキサン合成、プロスタグランジン（例：ＰＧＥ２）合成、その他のシクロオキシゲナーゼ経路固有の代謝産物の合成のレベルを測定する。本ＰＧＨＳ−２発現細胞系の代わりにＰＧＨＳ−１発現形質転換細胞系を用いて、前記操作手順を行う別のアッセイにより、化合物のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２に対する選択的阻害力を評価できる。
【００１８】
　より詳細には、本発明は、哺乳類細胞中でＰＧＨＳ−２またはＰＧＨＳ−１が触媒するプロスタグランジン合成の阻害化合物の作用を測定する方法を提供する。この方法は以下のとおりである。
（ａ）まず、予め選択した量の前記被験化合物を培地内の第１の哺乳類形質転換細胞系に加える。この細胞系は染色体を組み込んだ組換えＤＮＡ配列を持っており、このＤＮＡ配列は哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現するが、ＰＧＨＳ−１は発現しない。また、この細胞系は自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２活性を発現しない。
（ｂ）アラキドン酸をこの培地に加える。
（ｃ）前記の細胞系によって合成された、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の濃度を測定する。
（ｄ）この濃度を、前記被験化合物の非存在下で前記第１の細胞系が合成した前記代謝産物の濃度と比較する。
（ｅ）予め選択した第２の前記被験化合物を、培地内の（ａ）とは異なる哺乳類形質転換細胞系に加える。この細胞系は染色体を組み込んだ組換えＤＮＡ配列を持っており、このＤＮＡ配列は哺乳類ＰＧＨＳ−１を発現するが、ＰＧＨＳ−２は発現しない。また、この細胞系は自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２活性を発現しない。
（ｆ）アラキドン酸をステップ（ｅ）の前記培地に加える。
（ｇ）前記第２の（ｅ）の細胞系によって合成された、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の濃度を測定する。
（ｈ）この濃度を、前記被験化合物の非存在下で前記第２の細胞系が合成した前記代謝産物の濃度と比較する。
【００１９】
　当然のことながら、ステップ（ｄ）および（ｈ）で測定したように、代謝産物すなわちプロスタグランジンの合成を阻害する化合物の相対的作用を比較することにより、ＰＧＨＳ−２およびＰＧＨＳ−１の各阻害に関して、化合物の選択性を直接測定することが可能である。
【００２０】
　したがって、炎症細胞モデルにおいてＰＧＨＳ−２濃度が上昇することから、またシクロオキシゲナーゼ活性を阻害する薬剤の副作用は、ＰＧＨＳ−１の減少によって生じると信じられていることから、本特許請求の範囲の方法を用いてＰＧＨＳ−２およびＰＧＨＳ−１に対する各薬剤の作用を評価する必要があるだろう。過去のin vitroアッセイに基づいた、薬剤候補の抗炎症作用の評価は誤解を招くかもしれない。なぜならば、構成および炎症性シクロオキシゲナーゼの各活性を区別していなかったからである。2.8ｋｂのｍＲＮＡがコード化している構成シクロオキシゲナーゼまたは４ｋｂのｍＲＮＡがコード化している誘発シクロオキシゲナーゼのどちらか一方を発現する、本発明の安定した細胞系を使用し、各細胞系の用量反応曲線を分析すれば、ＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２に対する薬剤の特異性を決定できるだろう。ＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２に対する薬剤作用の比較研究は、様々な非ステロイド性抗炎症剤の独特な臨床利用を明らかにしていくだろう。また、ＰＧＨＳ−２活性を阻害する薬剤用量の滴定を考慮し、他のシクロオキシゲナーゼ活性を保持するだろう。本発明の細胞系の利用は、ＰＧＨＳ−２の特異的阻害剤の発見または開発あるいはその両方に必要なメカニズムを提供する。このような薬剤は、プロスタグランジン生合成の全面阻害によって生じると思われる重大な副作用を引き起こすことなく、従来の薬剤が持つ重要な抗炎症作用を有すると予測される。
【００２１】
　本発明はまた、生物学的活性のあるヒトＰＧＨＳ−２をコード化する分離ＤＮＡ配列（遺伝子）と、これによってコードされた、本質的に純粋な分離ヒトＰＧＨＳ−２から成る。
【発明の効果】
【００２２】
　本発明は、構成および炎症性シクロオキシゲナーゼの両方に対する薬剤作用のスクリーニング用に、簡単なin vitroシステムを提供する。これは、構成プロスタグランジン産生阻害による副作用を引き起こさずに、選択的に炎症を阻害する薬剤の開発に有用だろう。生きている哺乳類細胞（体内の血清薬剤濃度の作用に近い）に、または培養した細胞系から生成した小胞体抽出物に、本アッセイを行える。小胞体抽出物を用いた研究は、薬剤と酵素との直接的な相互作用のさらに正確な測定を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
［発明の詳細な説明］
　本発明は、組換えＤＮＡ配列、好ましくは染色体を組み込んだ組換えＤＮＡ配列を有する形質転換細胞系に関するものである。このＤＮＡ配列は調節性炎症性シクロオキシゲナーゼであるｇｒｉＰＧＨＳすなわち「ＰＧＨＳ−２」をコード化する遺伝子から成る。さらに、この細胞系は組換えＤＮＡ配列がコード化するＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２以外に、自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２を発現しない。組換えＤＮＡも構成ＰＧＨＳ−１（ＥＣ１.14.99.１）をコード化してしない。
【００２４】
　本発明の一実施例は、染色体を組み込んだ、遺伝子操作された（「組換え」）ＤＮＡ配列を有する哺乳類形質転換細胞系である。このＤＮＡ配列は哺乳類（特にヒト）ＰＧＨＳ−２を発現するが、哺乳類構成ＰＧＨＳ−１を発現しない。また、この細胞系は自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２を発現しない。この細胞系は、例証されたサル腎臓ＣＯＳ細胞系のようにヒトまたは霊長類由来であるが、ニワトリやハムスター、ネズミ、ヒツジなど、他の種由来の細胞系も利用できる。
【００２５】
　ここでいう「形質転換」には、組換えＤＮＡ配列の存在によって変化した遺伝子型である、あらゆる細胞または細胞系が含まれる。このようなＤＮＡ配列は、遺伝子工学の技術において、「非相同ＤＮＡ」、「外来性ＤＮＡ」、「遺伝子操作された」あるいは「異質ＤＮＡ」と呼ばれている。遺伝子工学の技術により、前記ＤＮＡは細胞または細胞系の遺伝子型またはゲノムに導入された。
【００２６】
　ここで使用したように、「組換えＤＮＡ配列」は、あらゆる生物から由来あるいは分離され、その後化学的に変化され、哺乳類細胞に導入されたＤＮＡ配列のことである。ある生物「由来の」組換えＤＮＡ配列の例は、ある特定の生物中で有用な断片として同定されるＤＮＡ配列である。同定後、これは本質的に純粋な形態で化学的に合成される。ある生物から「分離された」組換えＤＮＡ配列の例は、化学的方法（例：制限エンドヌクレーゼの利用）によって、その生物から除去または切除される有用なＤＮＡ配列であり、その結果、遺伝子工学の方法論により、発明中の利用目的でさらに操作を加える（例：増幅する）ことができる。
【００２７】
　したがって、「組換えＤＮＡ配列」には、完全合成ＤＮＡ、半合成ＤＮＡ、生物から分離したＤＮＡ、導入ＲＮＡ由来のＤＮＡがある。一般に、組換えＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の受け手（レシピエント）である遺伝子型に本来備わっていないか、あるいは備わっていても発現されない。
【００２８】
　ここで形質転換に使用された分離組換えＤＮＡ配列は環状または直線状、１本鎖または２本鎖である。一般に、ＤＨＡ配列はキメラの直線状ＤＮＡであるか、またはプラスミドあるいはウイルス発現ベクター中に存在する。これらは、結果として生じる細胞系の組換えＤＮＡの発現を促進する調節配列に接するコード領域も持つことができる。例えば、組換えＤＮＡ配列は、哺乳類の細胞内で活性のあるプロモーターから成ることもあれば、形質転換の標的である遺伝子型に既に存在するプロモーターを利用することもある。このようなプロモーターには、ＳＶ４０後期プロモーターやレトロウイルスのＬＴＲｓ（長い末端反復要素）の他に、図４に示したＣＭＶプロモーターがある。
【００２９】
　標的細胞の形質転換が可能な組換えＤＮＡを生成する一般的な方法は、技術に熟練している者にはよく知られており、ここで有用なＤＮＡを生成するのに、同様な組成および生成方法を利用できる。例えば、J.Sambrookらは『Molecular　Cloning:A　Laboratory　Manual』(Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press第２版、１９８９年)の中で、適切な生成方法を紹介している。
【００３０】
　ＰＧＨＳ−１やＰＧＨＳ−２、その他の部分用の転写単位として作用する組換えＤＮＡ配列の他に、組換えＤＮＡの１部が転写されずに、調節または構造的機能を果たすことがある。
【００３１】
　細胞内に導入される組換えＤＮＡ配列は、一般に、形質転換細胞の選択および同定を促進する、選択可能な標識遺伝子またはレポーター遺伝子、あるいはその両方を含んでいる。代わりに、選択標識が別のＤＮＡに存在して、これを一緒に形質転換過程に利用することがある。選択標識およびレポーター遺伝子は適当な調節配列に接して、哺乳類の細胞での発現を可能にしている。有用な選択標識は技術者によく知られており、例えば抗生物質および除草剤抵抗性遺伝子がある。
【００３２】
　本発明で有用なＤＮＡ配列の製造源には哺乳類細胞のポリＡ　ＲＮＡがある。ｇｒｉＰＧＨＳをコード化する約４ｋｂのｍＲＮＡがこれに由来し、技術者に知られている方法で、相当するｃＤＮＡの合成に用いられる。このような製造源には、『J.Biol.Chem.』２６６巻２３２６１頁（１９９１年）でM.K.O'Banionらが述べているように、血清およびシクロヘキシミドで処理したＣ１２７ネズミ線維芽細胞から分離し、大きさで分けたポリＡ  ＲＮＡのラムダＺＡＰII（Stratagene）ライブラリーがある。Xieらは、『ＰＮＡＳ　ＵＳＡ』８８巻２６９２頁（１９９１年）で述べているとおり、ニワトリのｇｒｉＰＧＨＳをコード化するｍＲＮＡを入手した。ｇｒｉＰＧＨＳをコード化するヒトｍＲＮＡの製造源には、M.K.O'Banionらの『ＰＮＡＳ　ＵＳＡ』８９巻４６８８頁（１９９２年６月）によると、インターロイキン−１およびシクロヘキシミドで処理したヒト単球由来のＲＮＡがある。ＰＧＨＳ−１をコード化するヒトｍＲＮＡの製造源も技術者によく知られている。殺菌性化合物に対する抵抗性を伝える酵素をコード化する選択標識遺伝子を、下の表１にまとめる。
【００３３】
【表１】
2004105186.tif 000003
【００３４】
　レポーター遺伝子は、潜在的な形質転換細胞の同定および調節配列の機能性の評価に用いられる。簡単にアッセイ可能な標識タンパク質をコード化するレポーター遺伝子は、技術者によく知られている。一般に、レポーター遺伝子は、宿主生物または組織に存在しないか、存在しても発現されない遺伝子であり、簡単に検出可能な何らかの性質（例：酵素活性）によって発現が証明されるタンパク質をコード化している。優先遺伝子には、大腸菌のＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）、大腸菌のｕｉｄＡ座のβ-グルクロニダーゼ遺伝子（ｇｕｓ）、ホタルのPhotinus pyralis由来のルシフェラーゼ遺伝子がある。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、適当な時間を置いてからアッセイする。
【００３５】
　イントロンやエンハンサー、ポリアデニル化配列のような他の要素も、時に組換えＤＮＡ配列の１部分となる。これらの要素はＤＮＡ機能に必要なこともあれば、必要でないこともあるが、ｍＲＮＡの安定性や転写などに影響を及ぼすことでＤＮＡの発現を亢進させることがある。細胞内でＤＮＡを最大限に形質転換させる目的で、これらの要素はＤＮＡに含まれることがある。
【００３６】
　組換えＤＮＡ配列は、ウイルス発現ベクターのような発現ベクターを用いてトランスフェクションすることにより、標的細胞に容易に導入できる。発現ベクターは、リン酸カルシウム沈降法の変法（C.Chenら：Mol.Cell.Biol.,　7；2745,　1987）により、ｇｒｉＰＧＨＳすなわちＰＧＨＳ−１をコード化するｃＤＮＡから成る。トランスフェクションは、リポフェクション法を始め、市販のキット（例：ＢＲＬ提供のキット）を用いた他の方法でも可能である。
【００３７】
　次に詳細な例を参照して本発明をさらに詳しく説明する。
例１　ネズミＰＧＨＳ−２遺伝子の分離、クローニングおよびシークエンシング
Ａ．細胞および細胞培養
　Peter　Howley氏（ＮＩＨ）よりＣ１２７マウス線維芽細胞を入手し、ブドウ糖含有量の多いダルベッコ変法イーグル培地に、抗生物質を含まない１０％ウシ胎児血清（HyClone　Laboratories）を加えて増殖させた。D.R.Lowyらの『J.Viol.』26巻291頁（1978年）を参照のこと。培養は、T.R.Chenの方法（Exp.Cell　Res.,　104；255,　1977）に従い、マイコプラズマ混入についてHoechst　33258染色でモニターした。
【００３８】
　幾何級数的に増殖する亜集密（６０〜８０％）細胞単層（３５ｍｍの層）を、メチオニンを含まないダルベッコ変法イーグル培地（GIBCO）で、２００μCi/mlのTran３５Ｓの標識（＞１，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＩＣＮ）を１５〜３０分間加えて、標識を行った。ウシ胎児血清（１０％）が標識中に存在した例もあった。２００μlのＡ８緩衝液（９.５M尿素、２％（w/v）Nonidet　Ｐ−４０、２％（w/v）アンホリン（ＬＫＢ、１.６％ｐＨ５〜８、０４％ｐＨ３.５〜１０）、５％（w/v）２−メルカプトエタノール）での溶解の前に、メチオニンを含む氷冷ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で単層を２回すすいだ。タンパク質への標識取り込みはトリクロロ酢酸沈降で測定した。デキサメサゾン（Ｓｉｇｍａ）をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で新たに調製し（２５０nnで１．５×１０４l/mol/cmのモル消失係数に基づく株濃度）、１μMまで加えた。イオノホアカルシウムＡ２３１８７（Calbiochem）を、エタノール中で２．５ｍＭ株から５μMの濃度で使用した。シクロヘキシミド（Sigma）を、水で１００×株から２５μMの濃度で使用した。この濃度は１５分以内に９７％以上タンパク質合成を阻害する。対照培養には適切な量の溶剤を与えた。
【００３９】
　外因性アラキドン酸基質（３０μM３７℃１５分間）を加えることにより、培地でシクロオキシゲナーゼ活性を測定した後、プロスタグランジンＥ〓産物をメチルオキシメート型に変換した。続いて、この２環式誘導体をラジオイムノアッセイ（Amersham社のキット）で定量した。
【００４０】
Ｂ．ＲＮＡの生成
　イソチオシアン酸グアニジン溶解を用いて、total　ＲＮＡを１５cmの平板から分離した後、塩化セシウムクッションで遠心分離を行った（J.M.Chirgwinら：Biochemistry,　18；5294,　1979）。H.Avivらが『PNAS　USA』69巻1408頁（1972年）に発表したように、ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによる２経路で生成した。ＲＮＡを２６０nmの吸光度測定で定量した。
【００４１】
Ｃ．ｃＤＮＡ合成
　J.Sambrookらが前記雑誌に発表したように、血清およびシクロヘキシミド（２５μM）で２時間半処理したＣ１２７細胞のＲＮＡを多く含むポリＡ５０μgを、１０mMのＣＨ３ＨｇＯＨ存在下に１０〜３０％ショ糖勾配で分画した。他のすべての分画について、任意プライミングで標識した１.６kbのヒツジＰＧＨＳ　ｃＤＮＡの５'末端（Oxford　Biomedical　Research社から入手）を用いて、４kbのｍＲＮＡの存在をノーザンブロット法でアッセイした。ＲＮＡサンプルおよび分子量マーカー（３μg；Bethesda　Research　Laboratories　ＲＮＡラダー）について、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動を行った後（J.Sambrookら：前述に引用したMolecular　Cloning；7.30〜7.32）、１０×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム）での一晩毛細管転移により、ナイロン膜（Duralon,Stratagene）にブロットした。
【００４２】
　ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）プライミングにより４kbのｍＲＮＡに富む分画から生成し（U.Gublerら：Gene　(Amst.),　25；263,　1988）、λ−ＺＡＰ　IIに結合させた（（J.M.Shortら：Nucleic　Acid　 Res.,　16；7583,　1988）Stratagene）。緊縮性が低下した状態下で（３０％ホルマミド、ハイブリダイゼーション温度を４２℃まで低下、５５℃で２×ＳＳＣ＋0.1％ＳＤＳで洗浄したフィルター）、２５万個のプラークがヒツジＰＧＨＳプローブでスクリーニングされた。Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼを用いて、欠失サブクローンを組み込んだＥｘｏ　IIIの２本鎖ジデオキシターミネーションシークエンシングを、両方向に行った。Heinikoffの『Gene』28巻351頁（1984年）およびG.Del　Salらの『Bio-Techniques』7巻514頁（1989年）を参照のこと。
【００４３】
Ｄ．in vitroでの転写・翻訳、免疫沈降、プライマー伸長
　Bluescriptベクター（Stratagene）中のｃＤＮＡ１μgを、３'末端でＸｈｏ Iで直線状にし、キャップ形成剤ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ（Stratageneのキット）を含む反応中でＴ３　ＲＮＡポリメラーゼで転写した。精製後、転写されたＲＮＡの５分の１と、前記ようにシクロヘキシミドおよび血清処理Ｃ１２７細胞から精製したポリＡ　ＲＮＡ2.5μgを、製造元（Promega）が述べたとおり３５Ｓ−メチオニンを含む別のin　vitro反応中で翻訳した。ただし、ＲＮＡはあらかじめ3.5mMのＣＨ３ＨｇＯＨで、室温で１０分間インキュベーションした。反応を修正ＲＩＰＡ緩衝液で希釈し、多クローン性抗ＰＧＨＳ血清（Oxford　Biomedical　Research社）で沈降させた。あるいは、５０μl/mlタンパク質Ａ−セファロース（Pharmacia　LKB　Biotechnology社；５０％（v/v））で３０分間インキュベーションすることにより、あらかじめまず安全を証明した。0.01の分量の抗血清またはウサギ血清を溶解産物に加え、４℃で２時間インキュベーションした後、タンパク質Ａ−セファロースで沈降させた。ペレット状ビーズを免疫沈降緩衝液で４回洗浄し、室温で３０分間Laemmli溶解緩衝液に再び懸濁した。免疫沈降産物を標準１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、蛍光間接撮影法により視覚化した。
【００４４】
　プライマー伸長分析については、血清およびシクロヘキシミドで２時間処理したＣ１２７細胞由来のポリＡ　ＲＮＡの２μgを、配列決定された4.1kbのｃＤＮＡのヌクレオチド（ｎｔ）５５〜７５に相補的な３２Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドを用いて、C.C.Bakerらが『EMBO　J.』6巻1027頁（1987年）で述べたとおり、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（BRL）で逆転写した。同じプライマーを利用するBluescriptベクター中のｃＤＮＡの３５Ｓ標識ジデオキシシークエンシング反応と並行し、反応産物を標準シークエンシングゲルで電気泳動した。
【００４５】
Ｅ．ｃＤＮＡ発現およびＰＧＥ測定
　4.1kbのｍＲＮＡがシクロオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコード化しているか否かを調べるために、ｃＤＮＡをＳＶ４０後期プロモーター発現ベクター（SVL、（R.Breatnachら：Nucleic　Acid　Res.,　11：7119,（1983）））に挿入した。D.L.DeWittらが『J.Biol.Chem.』265巻5192頁（1990年）に報告したように、ＣＯＳ細胞は自己のオキシゲナーゼ活性をほとんどあるいは全く持たない。したがって、この細胞に、2.5または５μgのベクター単独あるいは4.1kbのｃＲＮＡを有するベクターをトランスフェクションした。トランスフェクション細胞由来の３５Ｓ標識タンパク質の２次元ゲル電気泳動の結果、4.1kbのｃＤＮＡ発現細胞中に、タンパク質対（72/74kDa、pl7.5）が認められた。このタンパク質対は、合成が成長因子で促進し、グルココルチコイドホルモンで抑制されるＣ１２７マウス線維芽細胞で認められた、免疫沈降シクロオキシゲナーゼタンパク質対に正確に一致する。
【００４６】
　トランスフェクション細胞のシクロオキシゲナーゼ活性もアッセイした。4.1kbのｃＤＮＡを発現するＣＯＳ細胞は、対照細胞よりも約２等級多くプロスタグランジンＥ２を産生した（表２）。さらに、プロスタグランジン産生は、トランスフェクションされたＤＮＡの量に応じて増加した。これらの結果は、4.1kbのｍＤＮＡが、「グルココルチコイド調節性炎症性ＰＧＨＳ（ｇｒｉＰＧＨＳ）」と名付けられた活性シクロオキシゲナーゼをコード化していることを明らかに示している。
【００４７】
【表２】
2004105186.tif 000004
【００４８】
　ＣＯＳ細胞中の4.1kbのｃＤＮＡが発現されると、プロスタグランジンが合成される。２重になっている６０mmの平板中の亜集密ＣＯＳ　Ａ.２細胞に、指示された量の発現ベクター単独（SVL）または4.1kbのｃＤＮＡを有する発現ベクター（SVL-4.1）をトランスフェクションし、ＰＧＥ産生について２日後にアッセイした。
【００４９】
　ＰＧＥ２産生アッセイのため、あらかじめ暖めたＤＭＥＭで細胞を１回すすぎ、３０μMのアラキドン酸を含むＤＭＥＭを１ml加えた。１０〜１５分後に上澄みを採取し、短時間の遠心分離でこれを清浄化し、メチルオキシメート型に変換後、ラジオイムノアッセイでＰＧＥ２をアッセイした（Amersham社のキット）。単層は0.5Ｎ水酸化ナトリウムで可溶化し、１Ｎ塩酸で中和し、遠心分離で清浄化してから、タンパク質濃度を測定した。
【００５０】
Ｆ．ノーザンブロット分析
　Ｃ１２７細胞由来のＲＮＡ（2.5μg）に富むポリＡをホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動で分画に分け、膜（Duralon,　Stratagene）に転移させた。A.P.Feinbergらが『Anal　Biochem.』132巻6頁（1983年）に発表したように、任意プライミングにより３２Ｐで標識した4.1kbのｃＤＮＡの1.2kbの５'ＥｃｏＲｌ断片を用いて、M.K.O'Banionらが『J.Virol.』65巻3481頁（1991年）で述べたようにハイブリダイゼーションを行った。2.8kbのヒツジＰＧＨＳ　ｃＤＮＡ（Oxford　Biomedical　Research社）を同様に標識した断片（1.6kbの５'末端）と、β−チューブリンに相補的な末端標識４０−ｍｅｒ（Oncor）で、もう１度後で膜のハイブリダイゼーションを行った。ＲＮＡ分子量マーカー（SRL）を臭化エチジウム染色で視覚化した。同様の分析を、グアニジニウム酸フェノール抽出法（P.Chomezynskiら：Anal.Biochem.,　162；156,　1987）で、ヒト単球から分離したtotal　ＲＮＡ（５μg/lane）についても行った。
【００５１】
Ｇ．結果
　方向をクローンしたｃＤＮＡライブラリーは、４kbのｍＲＮＡに富むショ糖勾配分画由来のλ−ＺＡＰ　IIで作成され、緊縮性の低い状態下で、2.8kbのＰＧＨＳ　ｃＤＮＡの放射性ラベルをした断片でスクリーニングした。陽性プラークを幾つか分離かつ分析した。長さ約4.1kbのプラークについて、完全にシークエンシングを行った。このクローンは、抗シクロオキシゲナーゼ血清で特異的に沈降する、７０kDaのタンパク質をコード化しており、in　vitroで翻訳されたポリＡ−ｍＲＮＡ由来の免疫沈降タンパク質産物と同じ移動をする。配列のｎｔ　７５から始まる２０−ｍｅｒを利用したプライマー伸長分析の結果、転写はｃＤＮＡクローンの２４塩基上流で始まることが明らかになった。4.1kbの配列（図１）を、以前にクローンした2.8kbのマウスＰＧＨＳ　ｃＤＮＡの配列（ヒツジおよびヒト組織からクローンした配列と非常に類似している）と比較した結果、2.8kbのＰＧＨＳ　ｃＤＮＡがコード化するタンパク質と６４％同一のアミノ酸を持つ、１つのオープンリーディングフレーム（読み枠）が明らかになった。推定タンパク質配列は同一直線上にある。ただし、4.1kbのｃＤＮＡのアミノ末端は短く、カルボキシ末端は長い。完全な配列はGenBankに寄託してあり、受託番号はＭ８８２４２号である。
【００５２】
　４つの潜在的なＮ−糖鎖形成部位のうち３つは２分子間で保存され、推定軸状ヘム結合ドメイン周囲の領域（アミノ酸２７３−３４２）、および推定アスピリン修飾セリン５１６周囲の領域（アミノ酸５０４−５５０）に特に高い類似性がある。２つのｃＤＮＡにおけるはるかに大きい相違は、4.1kbのｃＤＮＡにある2.1kbの３'非翻訳領域の存在である。この領域は、多くのサイトカインおよびプロトオンコジーンｍＲＮＡの安定性低下に関連のある５'-AUUUA-３'モチーフに富んでいる。このようなモチーフの存在は、シクロヘキシミドによる4.1kbのｍＲＮＡの大きな重複誘発性に一致しているが、これは2.8kbのｍＲＮＡでは認められない。
【００５３】
　ネズミ2.8および4.1kbのｍＲＮＡをコード化するシクロオキシゲナーゼのｃＤＮＡおよびタンパク質配列を図２で比較する。ネズミＣ１２７細胞からクローンした4.1kbのｃＤＮＡ構造およびネズミの2.8kbのｃＤＮＡ（D.L.Dewittら：J.Biol.Chem.,　265；5192,（1990））構造を、図の上部および下部に太い直線で示す。4.1kbのｃＤＮＡはプライマー伸長データに基づいて番号を付けてある。2.8kbのマウスｍＲＮＡの５'末端が決定されていないため、翻訳開始部位および終了部位に番号は付けられていない。他のｃＤＮＡクローンから確立されたもう１つのポリアデニル化部位を「Ａ」で示し、５'-AUUUnA-３'モチーフを配列の下に点で明確にした。このモチーフは2.8kbのｃＤＮＡでは認められない。推定タンパク質配列を、ギャップ（4.1kbのｍＲＮＡ産物のアミノ末端の１７ａａおよび2.8kbのｍＲＮＡ産物のカルボキシ末端の１８　ａａ）を付け、線で結んで同一直線上に示す。2.8kbのＰＧＨＳの２６番目のアミノ酸（ａａ）リーダー配列を示す。この伸長は正確には判明していないが、１８番目のアミノ酸のＮ末端を持つｇｒｉＰＧＨＳ用の、非相同性の短いリーダー配列が存在するようである。潜在的なＮ糖鎖形成部位（ＮＸＳ／Ｔ，“Ｎ”）および保存されたアスピリン修飾セリンが、各分子に認められる。各分子中央付近のハッチ領域は、前記DeWittらが提案したように、推定軸状ヘム結合部位（TIWLREHNRV（SEQ　ID　NO:7）、２分子間で同一）および遠位ヘム結合部位（KALGH(SEQ　ID　NO:8／RGLGH(SEQ　ID　NO:9)）を含む。図中央の配列は、２つのマウスＰＧＨＳタンパク質（非保存Ｎ末端およびＣ末端は省略）の間の類似性を、２０個のアミノ酸グループの同一残基のパーセンテージで示している。配列枠内の斜線の密度が大きくなるにつれて、各々４０〜５５％（斜線なし）、６０〜７５％、８０〜９５％、１００％の同一性を表す。全体の同一性は６４％で、保存的変化を伴う類似性指数は７９％である。
【００５４】
例２　ヒト単球におけるｇｒｉＰＧＨＳの発現
　N.J.Robertsらが『J.Immunol.』121巻1052頁（1978年）で述べたように、健康供与者から分離された粘着ヒト単球を、血清を含まないＭ１９９培地に１×１０６細胞/ml懸濁させた。５mlポリプロピレン製チューブ中の１mlアリコットを、ゆるい栓を付けて時々振りながら、３７℃の５％ＣＯ２中でインキュベーションした。図３Ａに示したオートラジオグラフを得るため、P.Chomczynskiらが前記雑誌で述べた方法でtotal　ＲＮＡを分離する前に、デキサメサゾン（１μM；Sigma）の存在下または非存在下で、単球を４時間インキュベーションした。M.K.O'Banionらが『J.Biol.Chem.』34巻23261頁（1991年）で述べたように、１×１０９cpm/μg以上の比活性まで任意プライミング（Boehringer-Mannheim社のキット）で標識した指定のプローブを用いて、５μgのＲＮＡにノーザンブロット分析を行った。図３Ｂに示したオートラジオグラフを得るため、total　ＲＮＡを分離する前に、デキサメサゾン（１μM）およびＩＬ−１β（１０半最高単位；Collaborative　Research）またはそのどちらか一方で単球を指示された時間処理した。サイトカインまたはホルモンを加える１５分前に、１組のインキュベーションにシクロヘキシミド（２５μM；Sigma）を加えた。
【００５５】
　図３に総単球ＲＮＡのノーザンブロットを示す。これは、4.8kbのｍＲＮＡ種がマウスｇｒｉＰＧＨＳ　4.1kbのプローブで検出されることを示している。β−チューブリンのハイブリダイゼーションシグナル単位当たり、ｇｒｉＰＧＨＳ　ｍＲＮＡ濃度はデキサメサゾンで４時間で下方調節される（本例で５倍）が、2.8kbのＰＧＨＳ　ｍＲＮＡ濃度は影響を受けない。この実験で、４時間のインキュベーション後、上澄み中に蓄積されたＰＧＥ２濃度は、デキサメサゾンにより１０４単球当たり122.5pgから52.5pgに低下した。別の実験で、ＩＬ−１βで処理した単球では、ｇｒｉＰＧＨＳ　ｍＲＮＡ濃度は４時間後（対照の2.5倍）および１２時間後（１４倍）に上昇した（図３）。デキサメサゾンが存在する時、この上昇は有意に小さかった。さらに、ＩＬ−１βの誘発および豊富なｇｒｉＰＧＨＳ　ｍＲＮＡのデキサメサゾン抑制は、シクロヘキシミドの存在下で生じ、4.8kbのｍＲＮＡの重複誘発が明らかに著明であった（図３）。これとは対照的に、2.8kbのｍＲＮＡ濃度は、ＩＬ−１β、デキサメサゾン、シクロヘキシミドの各処理により、β−チューブリンに関して有意な変化はなかった。
【００５６】
例３　ｇｒｉＰＧＨＳトランスフェクタントを用いた薬剤アッセイ
Ａ．発現ベクターの構築
　J.M.Shortらが『Nucleic　Acids　Res.』16巻7583頁（1988）で述べた方法論に従い、4.1　ｇｒｉＰＧＨＳ　ｃＤＮＡクローンをin　vivoで、λ−ＺＡＰ　IIベクターおよびアンピシリン平板上で分離したｇｒｉＰＧＨＳ−Bluescript構築から切除した。Acc　Iでの消化、Klenow補充およびNot　Ｉでの消化により、ｐＲＣ／ＣＭＶ発現ベクター（Invitrogen）への定方向サブクローニング用のｇｒｉＰＧＨＳを生成した。ｃＤＮＡ末端から５０塩基上流のNot　I部位からｎｔ１９４７まで伸びるこの断片を、ゲル電気泳動で分離した。そして、これは５'-AUUUA-３'　ｍＲＮＡ不安定化領域の直前で切断された完全コード領域を含む。ｐＲＣ／ＣＭＶベクターＤＮＡをまずXba　Iで消化し、Klenowを補充し、続いてNot　Iで消化した。さらに、これを子ウシの腸のアルカリホスファターゼで処理した。受容能力を持つＤＨ５α細胞（Library　Efficiency；Life　Science　Technologies）への形質転換後、結合させたｐＲｃ／ＣＭＶ−ｇｒｉＰＧＨＳ組換え体をアンピシリン平板から分離し、ＤＮＡミニ標本の制限分析で確認した。構築を図４に示す。
【００５７】
Ｂ．安定した細胞系の樹立およびトランスフェクション
　６０mm平板の亜集密ＣＯＳ　Ａ２細胞は、自己のシクロオキシゲナーゼをほとんどあるいは全く持たない。これを１または2.5μgの精製ｐＲＣ／ＣＭＶ−ｇｒｉＰＧＨＳ、あるいはベクター単独に、製造元（Life　Science　Technologies）の指示に従って２３時間のリポフェクション法によりトランスフェクションした。正常培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）で２日間増殖させた後、ＣＯＳ細胞にとって有毒であることがすでに判明している濃度、８００μg/mlのGeneticin（Ｇ４１８、活性成分６５７μg/ml；Life　Science　Technologies）を含む培地にトランスフェクション細胞を移した。培地は３日毎に交換した。２週間後、組換え体またはベクター単独をトランスフェクションした培地には、多くの独立したコロニーが認められたが、トランスフェクションＤＮＡを含まない培地には認められなかった。３６個のｐＲＣ／ＣＭＶ−ｇｒｉＰＧＨＳトランスフェクションコロニーおよび１２個のベクタートランスフェクションコロニーを、クローニングシリンダーを用いて分離した。これらの大部分は、クローン細胞系増殖中、８００μg/mlのＧ４１８での連続選択でも生存した。樹立された培養は、４００μg/mlのＧ４１８と共に、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清中で維持する。
【００５８】
Ｃ．薬剤試験
　プロスタグランジンアッセイを前記とおり行った。薬剤試験については、細胞を無血清ＤＭＥＭ中で様々な濃度の薬剤に３０分間曝露し、ＤＭＥＭ中の２５×株から直接、アラキドン酸を加えた。１５分後、上澄みを採取した。対照は、最高濃度の賦形剤（１％メタノールまたはエタノール）で処理したウェルおよび薬剤を含まない。各薬剤はSigma社から入手し、２００mM株溶液として（アセトアミノフェンおよびイブプロフェンはメタノールで、インドメタシンはエタノールで、ナプロキセンは水で）調製した。
【００５９】
Ｄ．結果
１．発現ベクターの選択
　ｐＲＣ／ＣＭＶ真核生物発現ベクター（図４）は、我々の目的に明らかに有利な性質を幾つか提供する。細菌宿主でも真核生物宿主でも選択しやすいことに加え、我々のクローン化したｃＤＮＡの発現は強力なＣＭＶプロモーターで生じる。また、このベクターは、ｇｒｉＰＧＨＳ　３'非翻訳配列を含まない（翻訳終止コドンから１２塩基対（ｂｐ）で終わる）ために必要であるポリＡシグナルも提供する。急速なｍＲＮＡの分解用のシグナル（５'-AUUUA-３'）をin　vivoで提供するため、これらの配列の除去は重要である。そして、このベクターは、自己のシクロオキシゲナーゼ活性をほとんどあるいは全く持たないＣＯＳ細胞での使用に非常に適している。
【００６０】
２．細胞系の特徴づけ
　３６個のｇｒｉＰＧＨＳ−ｐＲｃ／ＣＭＶクローンネオマイシン抵抗性コロニーおよび１２個のベクター単独クローンネオマイシン抵抗性コロニーのうち、各々２９個および９個のＰＧＥ２産生について調べた。全例で、ベクター単独トランスフェクタントのＰＧＥ２産生は、１アッセイ当たり８pg未満であった（数字は、２０μlの収集した培地で１０〜１５分後に分泌されたＰＧＥ２の量を反映している）。しかし、ｇｒｉＰＧＨＳトランスフェクションクローンは、幅広いプロスタグランジン産生を示した。これらのうち、１１個のプロスタグランジン産生クローンおよび２個のベクター単独含有クローンをさらに増殖させ、再試験を行った。
【００６１】
　ｇｒｉＰＧＨＳ構造を持つクローンが分泌したＰＧＥ２の量は、10.6〜72.2pg/μg細胞タンパク質であった（表３）。
【００６２】
【表３】
2004105186.tif 000005
【００６３】
　表右側の値は、３０μMアラキドン酸に１０分間曝露させた時のプロスタグランジンの分泌量を示し、総回収細胞タンパク質当たりで表してある。細胞系Ａ２およびＡ５はベクターのみを含み、他の細胞系にはｇｒｉＰＧＨＳ−ｐＲｃ／ＣＭＶをトランスフェクションした。ベクターのみを有する細胞以上にＰＧＥ２産生が上昇しなかった細胞系が、１つだけあった（Ｆ１４；星印２個（＊＊）付き）。
【００６４】
　cyropreservation用に各細胞系を増殖させ、培養の簡単さおよび有意なＰＧＥ２産生で、１種類（Ｅ９）の細胞系を選び、これをさらなる研究に使用した。この細胞系のサンプルは、ブダペスト条約の規定の下、American　Type　Culture　Collection（米国メリーランド州ロックヴィル）に受託番号ＡＴＣＣ１１１１９号で寄託してある。
【００６５】
３．ＰＧＥ　産生の安定性
　Ｅ９細胞系でのシクロオキシゲナーゼ活性発現の安定性について、ＰＧＥ２産生を最低５代の細胞系に渡って比較して調べた。これらの細胞は、６週間後も高濃度のＰＧＥ２を産生した。タンパク質測定による細胞数の標準化を行わなかった例もあるため、数字を直接比較することはできないが、この標準アッセイでのＥ９細胞系のＰＧＥ２分泌量は（２０μlアッセイ培地当たり）35〜90pgであった。さらに、実験の範囲内で、Ｅ９細胞系のＰＧＥ２産生濃度はウェル毎に非常に一定していた。例えば、調べた１２の上澄みで、ＰＧＥ２濃度は48.4＝3.5pg/20μl（平均±ＳＥＭ）であった。
【００６６】
４．薬剤試験
　我々の細胞系の薬剤試験での有用性を証明するため、Ｅ９細胞の重複ウェルをある範囲の用量（0.2μM〜２mM）の４種類の非ステロイド性抗炎症剤（アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン）に曝露させた。薬剤を含む無血清培地に細胞を３０分間置いた後、（培地に直接加えた）アラキドン酸に１５分間曝露させた。次に、合成されたＰＧＥ２を、我々の標準ラジオイムノアッセイで上澄みから定量した。結果を図５に示す。この結果から、各薬剤について特異的な用量反応曲線が明らかになった。ｇｒｉＰＧＨＳ活性に対する作用は、インドメタシンが最も大きく、アセトアミノフェンが最も小さかった。各例における最大阻害（ただし、完全阻害には２mMでも明らかに不十分であったアセトアミノフェンは除く）は、ベクターのみを有するＣＯＳ細胞（３〜８pg）でみられた阻害と同じであった。低用量の各薬剤は、未処理対照の値（平均48.4pg）に相当するレベルを示した。対照では、１％賦形剤（メタノールまたはエタノール；２mM薬剤条件での曝露に匹敵する）の有無によるＰＧＥ２産生の違いはなかった。
【００６７】
例４　小胞体抽出物の生成およびin vitroでのシクロオキシゲナーゼ活性試験
　小胞体抽出物の生成および細胞シクロオキシゲナーゼ活性の測定は、基本的にA.Razらが『J.Biol.Chem.』263巻3022頁（1989年）および『PNAS USA』86巻1657頁（1989年）に述べたとおりに行った。細胞を氷冷ＰＢＳ（ｐＨ＝7.4）で１回すすぎ、使い捨てのプラスチック製スクレーパー（Gibco）でディッシュから剥がし、1.5ml滅菌チューブに氷冷ＰＢＳと共に入れ、遠心分離（８００×gで８分間）によりペレット状にする。上澄みを除去し、細胞ペレットをＰＢＳですすぐ。この時点で、細胞ペレットは−７０℃で保存可能である。
【００６８】
　抽出物を得るため、ペレットを可溶化緩衝液（５０mM　Tris、１mMジエチルジチオカルバミド酸（ナトリウム塩）、１０mMＥＤＴＡ、１％（v/v）ツウィーン２０、0.2mg/mlα２-マクログロブリン（ｐＨ＝8.0））に再び懸濁した後、音波処理（５×１０秒バースト、低出力設定）を行う。抽出物を４℃で遠心分離（１６,０００×gで２０分間）で清浄化する。タンパク質測定用にアリコットを取り、１００mM塩化ナトリウム、２０mMホウ酸ナトリウム、1.5mMＥＤＴＡ、1.5mMＥＧＴＡ、0.3mMＰＭＳＦ、１０mMＮＥＭ、0.5％ＢＳＡ、0.5％TritonＸ−100、１mMエピネフリンおよび１mMフェノール（ｐＨ9.0）を含む溶液で、５０μlアリコットを５００μlに希釈する。
【００６９】
　前記緩衝液中のアラキドン酸を１００μMの小胞体抽出物に加えて反応させ、３７℃で３０分間インキュベーションする。その結果生じたＰＧＥ２を、ＲＩＡキット製造元（Amersham社）の指示どおりメチルオキメート型に定量変換した後、ＲＩＡで測定する。非ステロイド性抗炎症化合物の効果を調べるため、アラキドン酸との反応の５分前に、薬剤を様々な用量で加える。
【００７０】
例５　ヒトＰＧＨＳ−１およびヒトＰＧＨＳ−２ｃＤＮＡクローンの生成
　ＲＮＡは、血清およびシクロオキシゲナーゼで４時間処理したヒト線維芽細胞系（Ｗ１３８）から分離した。total ＲＮＡは、グアニジニウム溶解の後、塩化セシウムクッション遠心分離により分離した（J.M.Chirgwinら：Biochem.,　18；5294,　1977）。ヒトＰＧＨＳ−１およびＰＧＨＳ−２に特異的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを生成し、１転写または他のコード領域を増幅させた（表４）。続いて行うクローニング用に、５'末端プライマーにはＨｉｎｄIII制限部位が、３'末端プライマーにはＮｏｔ　I制限部位がある。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、E.S.Kawasakiが『PCR　Protocols:A　Guide　to　Methods　and　Applications』（M.A.Innisら編集、Academic　Press、ニューヨーク、1990年）で述べているとおり、２kbの特異的プライマー生成ＰＣＲ産物を用いて行った。
【００７１】
【表４】
2004105186.tif 000006
【００７２】
例６　配列決定およびトランスフェクション用プラスミド構築の生成
　Ｈｉｎｄ　IIIおよびＮｏｔ　Iでの消化および精製の後、２つのＰＣＲ産物をｐＲＣ／ＣＭＶベクター（Invitrogen社）に各々結合させた（図４参照）。受容能力を持つＤＨ５ａ細胞（BRL）への形質転換後、結合させたｐＲＣ／ＣＭＶ−ＰＧＨＳ組換えプラスミドを、アンピシリン平板から分離した。制限地図生成により、ＰＧＨＳ挿入の有無についてクローンをスクリーニングした。
【００７３】
　３つのＰＧＨＳ−２クローンについて、Applied　Biosystems製自動シークエンサー（Model＃３７３Ａ）で両方向にシークエンシングを行った。トランスフェクションには、図６に示したＰＧＨＳ−２遺伝子配列から成るクローンを選択した。HlaおよびNeilsonが『PNAS』89巻7384頁（1992）で発表したように、この配列はヒトＰＧＨＳ−２配列とは異なる。ＰＧＨＳ−２遺伝子産物の１６５番目のアミノ酸が、グリシン（ｗ）ではなくグルタミン酸（Ｅ）である（図７）。ＰＧＨＳ−２遺伝子配列は、別のＰＣＲ法から得られた他の２つのｈＰＧＨＳ−２クローンの配列の同一性を確立することで確認した。その結果、観察された相違はＰＣＲアーチファクトではないことが判明している。さらに、図１に示すように、マウスＰＧＨＳ−２も同じ位置にグルタミン酸を持っている。ＰＧＨＳ−１クローンを同様にスクリーニングし、ＰＧＨＳ−１遺伝子配列および酵素が、C.Tokoyamaらが『Biochem.　Biophys.　Res.　Commun.』165巻888頁（1989年）に発表し、図２に示したもの（SEQ　ID　NO：6）と同一であることが確認された。T.　Hlaの『Prostaglandins』32巻829頁（1986年）も参照のこと。
【００７４】
例７　安定トランスフェクション哺乳類細胞系の生成
　６０mm平板の５０％集密ＣＯＳ−Ａ２（サル）細胞には、シクロオキシゲナーゼ活性がほとんどまたは全くない。これに１〜2.5μgの精製ｐＲＣ／ＣＭＶ;ｈＰＧＨＳ−２プラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ;ｈＰＧＨＳ−２プラスミド、あるいはｐＲＣ／ＣＭＶベクター単独を、リン酸カルシウム沈降法（Chenら：Mol.Cell.Biol.,　7；2745,（1987））でトランスフェクションした。３５℃、３％ＣＯ２で２４時間、平板を正常培地（ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＤ）＋１０％ウシ胎児血清）でインキュベーションした。暖めたＤＭＥＭで２回すすいだ後、平板を３７℃、５％ＣＯ２中に移し、さらに２４時間インキュベーションした。続いて、ＣＯＳ細胞にとって有毒な濃度に相当する８００μgのGeneticin（active　component　G418,　657μg/ml,　Life　Science　Technologies）を含む正常培地で、選択を開始した。３日毎に培地を交換した。２週間後、組換えＰＧＨＳベクターまたはベクターのみをトランスフェクションしたディッシュに、多くの独立したコロニーが認められた。しかし、トランスフェクションＤＮＡを含まないディッシュには、コロニーは認められなかった。各トランスフェクションから１２〜２４個のコロニーを、クローニングシリンダーで分離した。これらの大部分は、クローン細胞系の増殖中、連続Ｇ４１８選択でも存在し続けた。樹立された培養は、４００μg/mlのＧ４１８と共に、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清中で維持する。
【００７５】
例８　Ｇ４１８抵抗性細胞系試験およびＰＧＨＳ−２活性とＰＧＨＳ−１活性の安定発現
　１２穴のプレートに置いたトランスフェクションＣＯＳ細胞をほぼ集密になるまで増殖させ、暖めた無血清培地で２回すすいだ後、３００μlの３０μMアラキドン酸（ナトリウム塩；Sigma）で被った。１５分後、上澄みを氷上のEppendorfチューブに入れて、１５,０００×gで２分間遠心分離し、メチルオキシメート型に変換後、イムノアッセイでＰＧＥ２産生を調べた（Amersham社のキット）。
【００７６】
　BioRadの薬品を用いてタンパク質濃度を測定するため（Bradford変法アッセイ）、細胞単層を0.5M水酸化ナトリウムで可溶化し、１M塩酸で中和した。ＰＧＨＳ活性を発現する細胞系をさらに増殖させ、１０％ＤＭＳＯを加えた培地で凍結させた。
【００７７】
　ＰＧＨＳ−２を発現する細胞系４Ｂ４およびＰＧＨＳ−１を発現する細胞系Ｈ１７Ａ５を、１９９３年３月５日にAmerican　Type　Culture　Collection（米国メリーランド州ロックヴィル）に寄託した（細胞系４Ｂ４はＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１２８４号、細胞系Ｈ１７Ａ５はＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１１２８３号とした）。
【００７８】
　安定トランスフェクション細胞系でのＰＧＨＳ発現レベルは、表５のデータに示すように、ＰＧＨＳ−１細胞系のほうがＰＧＨＳ−２細胞系よりもはるかに高かった。
【００７９】
【表５】
2004105186.tif 000007
【００８０】
　数カ月の培養後も、これらの細胞系は高いレベルのＰＧＨＳ発現を続けている。例えば、細胞系４Ｂ４を５カ月に渡って６回調べた結果、発現は５０〜６０pg PGE２/μg細胞タンパク質である。細胞系のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２の排他的存在は、Northern analysesにより、ＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２に特異的なハイブリッド形成プローブを使って確認された。
【００８１】
例９　安定ヒトＰＧＨＳ−１およびＰＧＨＳ−２細胞系に対する非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）の研究
　ＰＧＨＳ−１およびＰＧＨＳ−２細胞系（４Ｂ４とＨ１７Ａ５を含む）を、血清を含まないＤＭＥＭ中で様々な濃度のＮＳＡＩＤに３０分間さらした。ＤＭＥＭ中の２５ｘストックから直接アラキドン酸を加え、１５分後に上澄み液を採取した。対照は、薬剤処理なしのものと、最高濃度の賦形剤（１％メタノールまたはエタノール）で処理した細胞とからなるものとした。薬剤はSigma Chem.社から入手し、２００mM株溶液として（アスピリンおよびイブプロフェンはメタノールで、インドメタシンはエタノールで、ナプロキセンは水で）調製した。シクロオキシゲナーゼ活性は前記方法で測定した。用量反応曲線は薬剤間で明らかに異なっており、ＰＧＨＳ−１およびＰＧＨＳ−２に各々特徴的であった。特に図８および図９に示したインドメタシンおよびアスピリンのように、阻害に必要な薬剤濃度はＰＧＨＳ−１発現細胞およびＰＧＨＳ−２発現細胞間で異なっていた（図８および図９）。
【００８２】
　すべての出版物、特許および特許出版は、あたかも参考文献が各々を特異的かつ独立的に組み入れているように、参照により文献として本文である程度組み入れてある。
【００８３】
　付属の請求の範囲の意図または範囲からはずれることなく、本発明で多くの変形および変更が可能であることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、ｃＤＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）およびネズミｇｒｉＰＧＨＳ（「ＰＧＨＳ−２」）の推定アミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）を示す。−２４でのプライマー伸長によって決定した転写開始部位に基づき、この配列の番号は２５から始まる。１７および１８番目のアミノ酸間に推定されるシグナルペプチド切断部位を矢印で示す。推定アスピリン修飾セリンの位置を丸印で、また潜在的なＮ−糖鎖形成部位には２本線を引いて示した。
【図２】図２は、ネズミの2.8および4.1ｋｂのＲＮＡをコード化したシクロオキシゲナーゼ用タンパク質配列およびｃＤＮＡの比較を示す概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、インターロイキンー１（既知の炎症メディエーター）処理に対する応答において、ヒトの単球で発現されるように、ｇｒｉＰＧＨＳおよび構成ＰＧＨＳ−１をコード化する遺伝子の発現をモニターするノーザンブロット法によって得られた、オートラジオグラフィーの写真である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、インターロイキンー１（既知の炎症メディエーター）処理に対する応答において、ヒトの単球で発現されるように、ｇｒｉＰＧＨＳおよび構成ＰＧＨＳ−１をコード化する遺伝子の発現をモニターするノーザンブロット法によって得られた、オートラジオグラフィーの写真である。
【図４】図４は、ｇｒｉＰＧＨＳ発現ベクターの構造を示す概略図である。ｇｒｉＰＧＨＳの３'側の非翻訳領域中の点は、５'−ＡＵＵＵＡ−３'ｍＲＮＡ不安定化配列の位置を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、予め選択した量の数種類の非ステロイド性抗炎症剤による、トランスフェクションされた哺乳類安定細胞系中のネズミｇｒｉＰＧＨＳ活性の阻害を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、予め選択した量の数種類の非ステロイド性抗炎症剤による、トランスフェクションされた哺乳類安定細胞系中のネズミｇｒｉＰＧＨＳ活性の阻害を示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、予め選択した量の数種類の非ステロイド性抗炎症剤による、トランスフェクションされた哺乳類安定細胞系中のネズミｇｒｉＰＧＨＳ活性の阻害を示すグラフである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、予め選択した量の数種類の非ステロイド性抗炎症剤による、トランスフェクションされた哺乳類安定細胞系中のネズミｇｒｉＰＧＨＳ活性の阻害を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、ヒトＰＧＨＳ−２遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ヒトＰＧＨＳ−２遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）を示す。
【図７】図７は、本発明のヒトＰＧＨＳ−２のアミノ酸配列（図の上段）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）とHlaらが発表したアミノ酸配列（下段）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）の比較を示す。各配列は標準的な１文字コードで示した。
【図８Ａ】図８Ａは、４種類の非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）による、形質転換された安定ＣＯＳ細胞内のヒトＰＧＨＳ−２活性の阻害を示すグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、４種類の非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）による、形質転換された安定ＣＯＳ細胞内のヒトＰＧＨＳ−２活性の阻害を示すグラフである。
【図８Ｃ】図８Ｃは、４種類の非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）による、形質転換された安定ＣＯＳ細胞内のヒトＰＧＨＳ−２活性の阻害を示すグラフである。
【図８Ｄ】図８Ｄは、４種類の非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）による、形質転換された安定ＣＯＳ細胞内のヒトＰＧＨＳ−２活性の阻害を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、４種類のＮＳＡＩＤによる、形質転換された安定ＣＯＳ細胞内のヒトＰＧＨＳ−１活性の阻害を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、４種類のＮＳＡＩＤによる、形質転換された安定ＣＯＳ細胞内のヒトＰＧＨＳ−１活性の阻害を示すグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、４種類のＮＳＡＩＤによる、形質転換された安定ＣＯＳ細胞内のヒトＰＧＨＳ−１活性の阻害を示すグラフである。
【図９Ｄ】図９Ｄは、４種類のＮＳＡＩＤによる、形質転換された安定ＣＯＳ細胞内のヒトＰＧＨＳ−１活性の阻害を示すグラフである。
【００８５】
配列リスト
（１）一般情報
　　（ｉ）出願人：ドナルド・エイ・ヤング
　　　　　　　　　エム・ケリー・オーバニオン
　　　　　　　　　ヴァージニア・ディー・ウィン
　　（ii）発明の名称
調節性炎症性シクロオキシゲナーゼを発現する安定に形質転換された哺乳動物細胞
　　（iii）配列数：１３
　　（iv）連絡用住所
　　　　　（Ａ）宛名人：マーチャント・アンド・グールド
　　　　　（Ｂ）街区：ノーウェスト・センター３１００
　　　　　（Ｃ）市：ミネアポリス市
　　　　　（Ｄ）州：ミネソタ州
　　　　　（Ｅ）国：アメリカ合衆国
　　　　　（Ｆ）郵便番号：５５４０２
　　（ｖ）コンピュータ可読形式
　　　　　（Ａ）媒体タイプ：フロッピー・ディスク
　　　　　（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ互換機
　　　　　（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
　　　　　（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  リリース＃１．０、
　　　　　　　　　　　　　　　バージョン＃１．２５
　　（vi）現出願データ
　　　　　（Ａ）出願番号
　　　　　（Ｂ）出願日
　　　　　（Ｃ）分類
　（viii）弁理士／代理人情報
　　　　　（Ａ）氏名：ウォレン・ディー・ウェスナー
　　　　　（Ｂ）登録番号：３０，４４０
　　　　　（Ｃ）参照／整理番号：９８４０．２０−ＵＳ−０１
　　（ix）通信情報
　　　　　（Ａ）電話：６１２−３３２−５３００
　　　　　（Ｂ）テレファックス：６１２−３３２−９０８１
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：１２００塩基対
　　　　　（Ｂ）タイプ：核酸
　　　　　（Ｃ）鎖：一本
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ
　　（vi）採取源
　　　　　（Ａ）対象生物：Ｍｕｒｉｎｅ  ｇｒｉ  ＰＧＨＳ
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
2004105186.tif 000008
2004105186.tif 000009
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：アミノ酸６０４個
　　　　　（Ｂ）タイプ：アミノ酸
　　　　　（Ｃ）鎖：一本
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：蛋白
（vi）採取源
　　　　　（Ａ）対象生物：Ｍｕｒｉｎｅ  ｇｒｉ  ＰＧＨＳのアミノ酸配列
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
2004105186.tif 000010
2004105186.tif 000011
2004105186.tif 000012
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：１８３４塩基対
　　　　　（Ｂ）タイプ：核酸
　　　　　（Ｃ）鎖：一本
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ
　　（vi）採取源
　　　　　（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−２
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３
2004105186.tif 000013
2004105186.tif 000014
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：アミノ酸６０４個
　　　　　（Ｂ）タイプ：アミノ酸
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：蛋白
　　（vi）採取源
　　　　　（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−２のアミノ酸配列
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４
2004105186.tif 000015
2004105186.tif 000016
2004105186.tif 000017
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：アミノ酸６０４個
　　　　　（Ｂ）タイプ：アミノ酸
　　　　　（Ｃ）鎖：一本
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：蛋白
　　（vi）採取源
　　　　　（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−２のアミノ酸配列
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５
2004105186.tif 000018
2004105186.tif 000019
2004105186.tif 000020
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：１８１９塩基対
　　　　　（Ｂ）タイプ：核酸
　　　　　（Ｃ）鎖：一本
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ
　　（vi）採取源
　　　　　（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−１遺伝子
　　（ix）特徴
　　　　　（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
　　　　　（Ｂ）場所：８．．１８０４
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６
2004105186.tif 000021
2004105186.tif 000022
2004105186.tif 000023
2004105186.tif 000024
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：アミノ酸１０個
　　　　　（Ｂ）タイプ：アミノ酸
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：ペプチド
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７
2004105186.tif 000025
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：アミノ酸５個
　　　　　（Ｂ）タイプ：アミノ酸
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：ペプチド
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
2004105186.tif 000026
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：アミノ酸５個
　　　　　（Ｂ）タイプ：アミノ酸
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：ペプチド
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９
2004105186.tif 000027
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：２８塩基対
　　　　　（Ｂ）タイプ：核酸
　　　　　（Ｃ）鎖：一本
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ
　　（vi）採取源
　　　　　（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−１  ＰＣＲプライマー
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０
2004105186.tif 000028
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：２８塩基対
　　　　　（Ｂ）タイプ：核酸
　　　　　（Ｃ）鎖：一本
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ
　　（vi）採取源
　　　　　（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−１  ＰＣＲプライマー
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１
2004105186.tif 000029
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：２９塩基対
　　　　　（Ｂ）タイプ：核酸
　　　　　（Ｃ）鎖：一本
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ
　　（vi）採取源
　　　　　（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−２  ＰＣＲプライマー
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２
2004105186.tif 000030
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に関する情報
　　（ｉ）配列特性
　　　　　（Ａ）長さ：２９塩基対
　　　　　（Ｂ）タイプ：核酸
　　　　　（Ｃ）鎖：一本
　　　　　（Ｄ）形状：直線
　　（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ
　　（vi）採取源
　　　　　（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−２  ＰＣＲプライマー
　　（xi）配列の記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３
2004105186.tif 000031
【図１】
2004105186.tif 000032
【図２】
2004105186.tif 000033
【図３Ａ】
2004105186.tif 000034
【図３Ｂ】
2004105186.tif 000035
【図４】
2004105186.tif 000036
【図５Ａ】
2004105186.tif 000037
【図５Ｂ】
2004105186.tif 000038
【図５Ｃ】
2004105186.tif 000039
【図５Ｄ】
2004105186.tif 000040
【図６Ａ】
2004105186.tif 000041
【図６Ｂ】
2004105186.tif 000042
【図７】
2004105186.tif 000043
【図８Ａ】
2004105186.tif 000044
【図８Ｂ】
2004105186.tif 000045
【図８Ｃ】
2004105186.tif 000046
【図８Ｄ】
2004105186.tif 000047
【図９Ａ】
2004105186.tif 000048
【図９Ｂ】
2004105186.tif 000049
【図９Ｃ】
2004105186.tif 000050
【図９Ｄ】
2004105186.tif 000051