(57)【要約】【課題】新たなＧＡ２−酸化活性を有する植物由来のタンパク質をコードするＤＮＡを提供することを課題とする。さらに、該ＤＮＡを利用して植物のＧＡ含量を調節することにより植物の草型を改変することをも課題とする。【解決手段】縮重プライマーを用いたＰＣＲを行った結果、新規なＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３を得た。ＯｓＧＡ２ｏｘ３の遺伝子産物が、ＯｓＧＡ２ｏｘ１などの他のＧＡ２−酸化酵素とは異なり、ＧＡ２０からＧＡ２９へおよびＧＡ２９からＧＡ２９−カタボライトへの２段階の酸化を触媒することを見出した。さらに、ＯｓＧＡ２ｏｘ３を発現するトランスジェニックイネ植物体の生長が対照の植物体と比較して抑制されることを見出した。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジベレリン２−酸化活性を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
ジベレリンＡ２０からジベレリンＡ２９への代謝を触媒し、さらに、ジベレリンＡ２９からジベレリンＡ２９−カタボライトへの代謝を触媒する活性を有する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
植物が単子葉植物である、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｃ）植物細胞における発現時に、ＲＮＡｉ効果により、請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｄ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡからコードされるタンパク質。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項６に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１１】
請求項８に記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項６に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１２】
請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡを有効成分として含有する、植物の生長抑制剤。
【請求項１３】
請求項４に記載のＤＮＡを有効成分として含有する、植物の生長促進剤。
【請求項１４】
請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の生長を抑制する方法。
【請求項１５】
植物体の細胞内における、内因性の請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制することを特徴とする、植物の生長を促進する方法。
【請求項１６】
請求項４に記載のＤＮＡを植物に導入することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ジベレリン生合成に関与する植物遺伝子およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジベレリン（ＧＡ）類は、ｅｎｔ−ジベレランと称される基本構造を有する四員環ジテルペノイドカルボン酸の巨大なファミリーを作っており、正常な植物の成長および発育に通常不可欠であるような高等植物の生活環の多くの過程を調節している（非特許文献１、２）。ＧＡ１などの生物学的活性のあるＧＡ類は、色素体中の環化酵素、小胞体の膜結合型一原子酸素添加酵素、および細胞質に局在した可溶性２−オキソグルタル酸−依存型二原子酸素添加酵素の連続作用により、ｔｒａｎｓ−ゲラニルゲラニルニリン酸から生成される（非特許文献３、４）。現在ＧＡの生合成経路は概ね確立されている。
【０００３】
イネ（オリザ・サティバ　Ｌ．（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．））の伸長は、生物学的活性のあるジベレリン（ＧＡ）のＧＡ１の内生レベルにより調節される（非特許文献５）。ＧＡ２−酸化酵素は、高等植物において、生物学的活性のあるＧＡおよびその前駆物質の異化作用を触媒すると提案されている（非特許文献６）。すでに、ＧＡ２−酸化酵素遺伝子が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）およびインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）からクローニングされている（非特許文献７〜９）。トーマスら（非特許文献９）は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＧＡ２−酸化酵素遺伝子のＡｔＧＡ２ｏｘ１およびＡｔＧＡ２ｏｘ２の転写レベルが、ＧＡ欠損突然変異体において減少しているが、ＧＡ３の処理後、増加することを報告した。これらの結果に基づき、彼らは、ＧＡ２−酸化酵素は、植物組織において生物学的活性のあるＧＡの濃度の維持に関与していると結論づけた。
【０００４】
また、本発明者らは、イネＧＡ２−酸化酵素遺伝子、ＯｓＧＡ２ｏｘ１のクローニングおよび特性を報告した（非特許文献１０）。ＯｓＧＡ２ｏｘ１の遺伝子生成物は、ＧＡ２０からＧＡ２９へおよびＧＡ１からＧＡ８への代謝を触媒した。しかしながら、ＯｓＧＡ２ｏｘ１の転写レベルは、ＧＡ３の処理によって影響を受けなかった。尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Ｇｒａｅｂｅ，Ｊ．Ｅ．　（１９８７）　Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３８，４１９−４６５
【非特許文献２】Ｈｏｏｌｅｙ，Ｒ．（１９９４）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６，１５２９−１５５５
【非特許文献３】Ｈｅｄｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ　Ｋａｍｉｙａ，Ｙ．（１９９７）　Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４３１−４６０
【非特許文献４】Ｌａｎｇｅ，Ｔ．（１９９８）　Ｐｌａｎｔａ，２０４，４０９−４１９
【非特許文献５】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　３０（７）：９６３−９６９
【非特許文献６】Ｒｏｓｓ　ＪＪ．ｅｔ　ａｌ．，　（１９９５）　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　７：　５１３−５２３
【非特許文献７】Ｌｅｓｔｅｒ　ＤＲ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９９）　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１９：６５−７３
【非特許文献８】Ｍａｒｔｉｎ　ＤＮ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９９）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１２１：７７５−７８１
【非特許文献９】Ｔｈｏｍａｓ　ＳＧ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９９）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９６：４６９８−４７０３
【非特許文献１０】Ｓａｋａｍｏｔｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２５（３）：１５０８−１６
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、イネの草丈を制御しているＧＡ２−酸化酵素遺伝子のＤＮＡ配列を明らかにし、該ＤＮＡを用いてイネの内生ＧＡ含量を調節することにより草丈を制御する技術を提供するとともに、イネ以外の植物についてもその草型を改変することをも目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、新たなイネＧＡ２−酸化酵素遺伝子を単離するために、縮重プライマーを用いたＰＣＲを行った。その結果、３種類のＤＮＡ断片が得られた。１つは以前に同定されたＯｓＧＡ２ｏｘ１と一致した。残りの２つの断片は新規遺伝子であった（ＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３と命名した）。
【０００７】
イネの様々な組織におけるＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３の発現パターンを、ＲＮＡゲルブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ産物のゲルブロットにより解析した結果、ＯｓＧＡ２ｏｘ３の発現は、調べられたあらゆる組織で観察された。また、ＯｓＧＡ２ｏｘ３は、生物学的活性のあるＧＡの濃度によりフィードフォワード方式で制御されることが判明した。また、ＯｓＧＡ２ｏｘ３の遺伝子産物が、単子葉植物で初めてのＧＡ２０からＧＡ２９へおよびＧＡ２９からＧＡ２９−カタボライトへの２段階の酸化を触媒する酵素であることが判明した。さらに、ＯｓＧＡ２ｏｘ３を発現するトランスジェニックイネ植物体の生長が対照の植物体と比較して抑制されることが判明した。
【０００８】
即ち、本発明は、ジベレリン２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその利用に関し、以下の〔１〕〜〔１６〕を提供するものである。
〔１〕　ジベレリン２−酸化活性を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
〔２〕　ジベレリンＡ２０からジベレリンＡ２９への代謝を触媒し、さらに、ジベレリンＡ２９からジベレリンＡ２９−カタボライトへの代謝を触媒する活性を有する、〔１〕に記載のＤＮＡ。
〔３〕　植物が単子葉植物である、〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡ。
〔４〕　下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｃ）植物細胞における発現時に、ＲＮＡｉ効果により、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｄ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
〔５〕　〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡからコードされるタンパク質。
〔６〕　〔１〕から〔４〕のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
〔７〕　〔１〕から〔４〕のいずれかに記載のＤＮＡまたは〔６〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
〔８〕　〔７〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔９〕　〔８〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１０〕　〔８〕または〔９〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１１〕　〔８〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載のＤＮＡまたは〔６〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
〔１２〕　〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを有効成分として含有する、植物の生長抑制剤。
〔１３〕　〔４〕に記載のＤＮＡを有効成分として含有する、植物の生長促進剤。
〔１４〕　〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の生長を抑制する方法。
〔１５〕　植物体の細胞内における、内因性の〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制することを特徴とする、植物の生長を促進する方法。
〔１６〕　〔４〕に記載のＤＮＡを植物に導入することを特徴とする、〔１５〕に記載の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、ジベレリン（ＧＡ）２−酸化活性を有する植物由来のタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【００１０】
ＧＡ２−酸化酵素は、活性型ＧＡおよびその前駆体を不可逆的に不活性化する。従って、本発明のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、生物不活性ＧＡの製造に利用することが可能である。
【００１１】
また、ＧＡ−欠失突然変異体の研究と、植物への外来ＧＡおよび／またはＧＡ生合成阻害剤の適用の作用から、ＧＡ類が植物の生長にとって必須かつ強力なレギュレーターであることが明らかとなっている。これらは、比較的草丈の高い植物の生長における広範な事象に影響を及ぼし、茎伸長の刺激にも関与している。従って、本発明のＤＮＡは、植物の生長を改変させ、例えば、野生型とは異なる草型の植物体を作出することに利用することも可能である。植物の草型の改変、殊に、矮性化には、高い植栽密度、効率的光摂取、風害の減少、農作業の軽減など様々な利点が存在し、このことは果樹を含む農作物および園芸作物の育種にとって最も価値のある特徴である。
【００１２】
本発明において、ＧＡ２−酸化活性とは、反応基質であるＣ１９−ＧＡ類から対応する２β‐水酸化物への代謝（例えば、ＧＡ１、ＧＡ４、ＧＡ９、ＧＡ２０からそれぞれＧＡ８、ＧＡ３４、ＧＡ５１、ＧＡ２９への代謝）を触媒する活性であるが、好ましくは、多くの高等植物の茎葉における活性型ジベレリン、ＧＡ１の直前の前駆体であるＧＡ２０から不活性型のＧＡ２９およびＧＡ２９−カタボライトへの代謝を触媒してＧＡ１への代謝を抑制する活性である。このような活性は、一般的には、本発明のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、融合タンパク質として大腸菌内で過剰発現させ、その結果得られる細胞抽出液を酵素液として、反応基質であるＣ１９−ＧＡ類またはＧＡ２９および補因子である鉄イオン、２オキソグルタル酸の存在下で反応をｉｎ　ｖｉｔｒｏで行なわせ、最終的に反応生成物をＧＣ−ＭＳによって確認することにより検出することができる。
【００１３】
本発明において、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが由来する植物としては、特に限定はなく、イネ、コムギ、オオムギ等ムギ類、トウモロコシ、シロイヌナズナ、エンドウマメ、インゲンマメなどが挙げられる。
【００１４】
また、本発明のＤＮＡが導入されることで生長が改変される植物としては、特に制限はなく、例えば、有用農作物や鑑賞用植物等を挙げることができる。具体的には、有用農作物としては、例えばイネなどの単子葉植物や、ダイズ、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。また、観賞用植物としては、例えばキク、アサガオ、ポインセチア、コスモス等の花卉植物が挙げられる。また、果樹としては、リンゴ、ミカン、ナシ等が挙げられる。
【００１５】
本発明において、ＧＡ２−酸化活性を有する植物由来のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：１または３に記載の塩基配列（それぞれＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３のｃＤＮＡ配列）のコード領域を含むＤＮＡや配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列（それぞれＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３のアミノ酸配列）からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。本発明者らによって単離されたＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３をコードするタンパク質は、活性部位でＦｅに結合しているアミノ酸残基を保持していた。また、他のＧＡ２−酸化酵素とその配列において有意な相同性を示した。従って、本発明者らにより単離されたＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３のｃＤＮＡは、ＧＡ２−酸化酵素をコードしていると考えられる。
【００１６】
また、本発明は、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と構造的に類似しており、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
【００１７】
あるＤＮＡが、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、該ＤＮＡからコードされるタンパク質が、Ｃ１９−ＧＡ類から対応する２β−水酸化物への代謝を触媒するか否か、または、ＧＡ２９からＧＡ２９−カタボライトへの代謝を触媒するか否かを検討することで検証可能である。また、実施例に記載の方法と同様な方法で、該ＤＮＡが導入された植物の生長が抑制されるか否かを観察することで検証することができる。
【００１８】
このようなＤＮＡには、例えば、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アリル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００１９】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ　Ｗ　＆　Ｆｒｉｔｚ　Ｈ−Ｊ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１５４：　３５０，　１９８７）が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。このように、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても、天然型のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質（配列番号：２または４）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限りは、本発明のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに含まれる。また、たとえ塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わないこと（縮重変異）があるが、このような縮重変異体も本発明のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに含まれる。
【００２０】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ＥＭ：　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　９８：　５０３，　１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ　ＲＫ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：　１３５０，　１９８５、Ｓａｉｋｉ　ＲＫ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：　４８７，　１９８８）を利用する方法が挙げられる。すなわち、ＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１もしくは３）、または、その一部をプローブとして、また、ＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３のｃＤＮＡの塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得るＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた、本発明のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに含まれる。
【００２１】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できると期待される。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００２２】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：２２６４−２２６８，　１９９０、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：　５８７３，　１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：　４０３，　１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００２３】
本発明のＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを有するイネ品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、本発明のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行って調製することも可能である。ｃＤＮＡは、例えば、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを有するイネ品種から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰなどのベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またＰＣＲを行うことにより調製できる。
【００２４】
また、本発明は、上記ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質を提供する。該タンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することができる。組換えタンパク質の製造は、例えば、下記のようにして行なうことができる。まず、ｐＭＡＬ−ｃ２発現ベクター（ＮＥＢ社）のマルチクローニングサイトに対し、予め制限酵素サイトを設けたプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより合成した本発明のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをサブクローニングする。この構築物を、定法により、ＢＬ２１（プロテアーゼ欠失株）に形質転換する。これにより得られる形質転換体を用いてタンパク質の誘導を行う。大腸菌は、２ｘＹＴ、０．２％グルコースの培地で３７℃振とう培養する。ＯＤ６００が０．６前後になったところで、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように加え、更に１８℃で２４時間培養する。酵素液の抽出に関しては、培養後、集菌し、これをｓｕｓｐｅｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ８．０，　１０％グリセロール，　２ｍＭ　ＤＴＴ，　１ｍｇ／ｍｌ　リゾチーム）に懸濁する。懸濁液を４℃にて３０分放置後、−８０℃にて、凍結するまでインキュベートする。凍結した懸濁液を解凍し、ＳＯＮＩＣＡＴＯＲ（ＨＥＡＴ　ＳＹＳＴＥＭＳ−ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣＳ，ＩＮＣ．ＭＯＤＥＬ　Ｗ−２２５Ｒ）を用いて、ＭＡＸレベルにて、３０秒間、５分のインターバルをおき、２回超音波処理を行う。処理した懸濁液を遠心（１５，０００ｒｐｍ，　４℃，　２０分）し、その上清を粗酵素液とすることができる。
【００２５】
また、精製タンパク質の調製は、例えば、本発明のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合した形態で大腸菌などで発現させ、これをそれぞれニッケルカラム、アミロースカラム、ＧＳＴ−グルタチオンカラムにて精製することにより行なうことができる。さらに、精製後は、必要に応じて、スロンビンやファクターＸａなどの制限プロテアーゼを利用して上記タグを切り離すこともできる。また、天然のタンパク質の場合は、例えば、調製した組み換えタンパク質若しくはその部分ペプチドを適当な免疫動物に免疫することにより調製した抗体を結合したアフィニティーカラムに、本発明のタンパク質を発現しているイネの組織などから調製した抽出液を接触させて、該カラムに結合するタンパク質を精製することにより調製することができる。
【００２６】
また、本発明のＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、植物の生長を抑制する（例えば、矮性化する）ための生長抑制剤として用いることができる。生長が抑制された形質転換植物体を作製するには、上記ＤＮＡを適当なベクターに挿入して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。本発明は、このような植物の生長を抑制させる方法を提供する。
【００２７】
本発明は植物の生長を促進させる方法もまた提供する。生長が促進した形質転換植物体は、例えばＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの発現を抑制するＤＮＡを適当なベクターに挿入して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによって作製できる。このように、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの発現を抑制するＤＮＡは、植物の生長促進剤として利用可能である。
【００２８】
「ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの発現の抑制」には、該ＤＮＡの転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。また、翻訳されたタンパク質が植物細胞内で本来の機能を発揮しないことも含まれる。
【００２９】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ｅｃｋｅｒ　ＪＲ　＆　Ｄａｖｉｓ　ＲＷ：　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８３：　５３７２，　１９８６）。その後、タバコやペチュニアにおいてもアンチセンスＲＮＡの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ　ＡＲ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｎａｔｕｒｅ　３３３：　８６６，　１９８８）、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００３０】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上：　新生化学実験講座２　核酸ＩＶ　遺伝子の複製と発現　（日本生化学会編，　東京化学同人）　ｐｐ．３１９−３４７，　１９９３）。
【００３１】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００３２】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ　Ｐに含まれるＭ１　ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子：　蛋白質核酸酵素，　３５：　２１９１，　１９９０）。
【００３３】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２２８：　２２８，　１９８８）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（ＫｏｉｚｕｍｉＭ，　ｅｔ　ａｌ：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２３９：　２８５，　１９８８、小泉誠および大塚栄子：　蛋白質核酸酵素　３５：　２１９１，　１９９０、　Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１７：　７０５９，　１９８９）。例えば、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１または３）中には、標的となり得る部位が複数存在する。
【００３４】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ　ＪＭ：　Ｎａｔｕｒｅ　３２３：　３４９，　１９８６）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｙ　＆Ｓａｓａｋｉ　Ｎ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：　６７５１，　１９９１、菊池洋：　化学と生物　３０：　１１２，　１９９２）。
【００３５】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ　３：　７３３，　１９９０、Ｄｚｉａｎｏｔｔ　ＡＭ　＆　Ｂｕｊａｒｓｋｉ　ＪＪ：　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：　４８２３，　１９８９、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ　ＣＡ　＆　Ｃｅｃｈ　ＴＲ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：　３８７５，　１９９１、Ｔａｉｒａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：　５１２５，　１９９１）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　１８６：　１２７１，　１９９２）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３６】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ（ＲＮＡｉ）によっても行うことができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ＲＮＡｉの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖ＲＮＡが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。ＲＮＡｉは植物においても効果を奏することが知られている（Ｃｈｕａｎｇ　ＣＦ　＆　Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ　ＥＭ：　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９７：　４９８５，　２０００）。例えば、植物体におけるＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの発現をＲＮＡｉにより抑制するためには、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１または３）またはこれと類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを目的の植物へ導入し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が遅延した植物を選択すればよい。ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００３７】
内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部はＲＮＡｉの機構と重複していると考えられている。共抑制は植物においても観察される（Ｓｍｙｔｈ　ＤＲ：　Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ　７：　Ｒ７９３，　１９９７、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ　Ｒ：　Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ　６：　８１０，　１９９６）。例えば、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが共抑制された植物体を得るためには、ＧＡ２−酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはこれと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が遅延した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００３８】
本発明は、本発明のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む形質転換植物体の製造方法を提供する。
【００３９】
本発明において、植物細胞が由来する植物としては、特に制限はない。また、植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここで言う「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００４０】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。アグロバクテリウム（例えば、ＥＨＡ１０１）を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法（特許第３１４１０８４号）を用いることが可能である。また、パーティクルガン法においては、例えば、バイオラッド社のものを用いることが可能である。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１００：　１５０３，　１９９５）。
【００４１】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ　ＳＫ：　Ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｔｏ　Ｐｌａｎｔｓ　（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，　Ｅｄｓ）　ｐｐ．６６−７４，　１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１００：　１５０３，　１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　Ｐ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：　９５７，　１９９１）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　６：　２７１，　１９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００４２】
ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）　植物材料
野生型イネ（オリザ・サティバ　Ｌ．（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）すなわち、日本晴）の種子を１％ＮａＣｌＯ中で１時間殺菌し、寒天培地に播いた。苗は、連続光の下、３０℃で、グロースチャンバーの中で成長させた。ＧＡ−酸化酵素遺伝子の発現におけるＧＡ３およびウニコナゾールの影響を調べるため、野生型イネの苗を１０μＭのＧＡ３または１０μＭのウニコナゾールを含む水耕栽培へ移し、３日間成長させた。
【００４４】
（２）　イネＧＡ２−酸化酵素遺伝子の分子クローニングおよび配列分析
イネからのＧＡ２−酸化酵素を増幅するために、ＧＡ２０−酸化酵素（ＡｔＧＡ２０ｏｘ１，　Ｘ８３３７９；　ＡｔＧＡ２０ｏｘ２，　Ｘ８３３８０；　ＡｔＧＡ２０ｏｘ３，　Ｘ８３３８１）、ＧＡ２０−酸化酵素（ＯｓＧＡ２０ｏｘ１，　Ｕ５０３３３）、およびＧＡ３−酸化酵素（ＯｓＧＡ３ｏｘ１，　ＡＢ０５４０８４；　ＯｓＧＡ３ｏｘ２，　ＡＢ０５６５１９）の保存領域から設計された２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマー（フォワードプライマー、５’−ＧＧＩＴＴＹＧＧＩＧＡＲＣＡＹＡＣＩＧＡＹＣＣＩＣＡ−３’（配列番号：６）；リバースプライマー、５’−ＴＧＩＡＲＩＶＮＲＴＣＩＣＣＩＡＣＲＴＴＩＡＣＲＡＡ−３’（配列番号：７））を使ってＰＣＲを行った。増幅された断片はｐＣＲ　ＩＩ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）へクローニングされ、それらの配列を決定した。以前に記載されているように（Ｓａｋａｍｏｔｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２５（３）：１５０８−１６）、サブクローニングされたＰＣＲ断片でイネゲノムライブラリーのスクリーニングを行った。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムにより分析された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ）。
【００４５】
（３）　発現分析
ＲＮＡゲルブロット分析は、以前に記載されているように、それぞれＲＮＡを１０μｇ調製して行った（Ｓａｋａｍｏｔｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２５（３）：１５０８−１６）。
【００４６】
（４）　酵素アッセイ
大腸菌でのＯｓＧＡ２ｏｘ３のｃＤＮＡの異種発現後の細胞溶解物を以前に記載されているように、酵素アッセイに使用した（Ｓａｋａｍｏｔｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２５（３）：１５０８−１６）。
【００４７】
（５）　プラスミド構築と植物形質転換
以前に記載されているように（Ｓａｋａｍｏｔｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２５（３）：１５０８−１６）、ＯｓＧＡ２ｏｘ３の完全長ｃＤＮＡをハイグロマイシン耐性バイナリーベクターｐＡｃｔ−Ｈｍ２のイネアクチンプロモーターとノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）ポリアデニル化シグナルの間に挿入し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＥＨＡ１０１へ導入した。イネのアグロバクテリウム媒介の形質転換は、記載されているように（Ｔａｎａｋａ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）　ＷＯ　０１／０６８４４　Ａ１）行った。トランスジェニック植物は、５０　ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む培地で選択された。
【００４８】
［実施例１］
縮重プライマーを用いたＰＣＲにより３種類のＤＮＡ断片が得られた。１つは以前に同定されたＯｓＧＡ２ｏｘ１と一致した。残りの２つの断片は新規遺伝子であった（ＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３と命名した）。完全長のゲノムクローンを得るために、これらのクローンをゲノムライブラリーのスクリーニングに使用した。ゲノムクローンのシークエンシング後、予測されるＯｓＧＡ２ｏｘ３についての読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ））を引き続いてＲＴ−ＰＣＲにより増幅した、一方ＯｓＧＡ２ｏｘ２についてのＲＴ−ＰＣＲは成功しなかった。
【００４９】
予測されるＯｓＧＡ２ｏｘ２ＯＲＦは３９２のアミノ酸のタンパク質をコードする１１７６ｂｐを含み、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたＯｓＧＡ２ｏｘ３のＯＲＦは３２７のアミノ酸のタンパク質をコードする９８１　ｂｐを含んでいた。活性中心において、Ｆｅ２＋が配位するアミノ酸配列（Ｖａｌｅｇａｒｄ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９８）　Ｎａｔｕｒｅ　３９４：　８０５？８０９）は高度に保存されていた（図１）。その２つの遺伝子の論理的に推理されるアミノ酸配列を、他のジベレリン生合成に関わる２−オキソグルタル酸依存型二原子酸素添加酵素遺伝子と比較した（図２）。ＧＡ２−酸化酵素遺伝子ファミリーは２つのサブファミリーへ分類することができる。ＯｓＧＡ２ｏｘ３およびシロイヌナズナＧＡ２−酸化酵素遺伝子は、同じサブファミリーへグループ化され、ＡｔＧＡ２ｏｘ１を除くこのサブファミリーにおけるすべての遺伝子は多段階反応を触媒した。他方、ＯｓＧＡ２ｏｘ１、ＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＰｓＧＡ２ｏｘ２はもう一つのサブファミリーのメンバーであり、ＯｓＧＡ２ｏｘ１遺伝子産物は１段階の酸化を触媒する。ＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３の配列は、ＧＡ２−酸化酵素遺伝子の配列と最も高い相同性をもち、ＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３はＧＡ２−酸化酵素をコードすることが判明した。
【００５０】
［実施例２］
イネの様々な器官におけるＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３の発現パターンを、ＲＮＡゲルブロット分析により調べた（図３）。ＯｓＧＡ２ｏｘ３の転写は、茎、花および根で多量に検出され、生長する茎頂、葉身および葉鞘でもまた比較的低いレベルで検出された。他方、ＯｓＧＡ２ｏｘ２の転写は、いずれの組織においてもＲＮＡゲルブロット分析により検出されなかった。ＲＴ−ＰＣＲ産物のゲルブロット分析からも同様の結果を得た。ＯｓＧＡ２ｏｘ３のこの発現パターンは、生長するイネ組織においての主なＧＡ３β−水酸化酵素をコードする遺伝子であるＯｓＧＡ３ｏｘ２（Ｉｔｏｈ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９８（１５）：８９０９−１４）の発現パターンと非常に似ていることが確認された。
【００５１】
［実施例３］
ＯｓＧＡ２ｏｘ３の機能分析のために、以前に記載されているように（Ｓａｋａｍｏｔｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２５（３）：１５０８−１６）、組換えタンパク質を調製し、基質、重水素標識されたＧＡ２０、ＧＡ２９、およびＧＡ１とインキュベーションした。フルスキャンＧＣ−ＭＳ分析から、ＧＡ１は対応する２β−水酸化物であるＧＡ８に転化されることを明らかにした（表１）。
【００５２】
【表１】
2004105154.tif 000002
ａ：生成物の同定は、ＫＲＩおよびメチルエステルトリメチルシリルエーテル誘導体のフルスキャンの質量スペクトルを基礎とするＧＣ−ＭＳにより行った。
【００５３】
しかしながら、ＧＡ２０は、ＧＡ２９−カタボライトへ代謝された。さらに、代謝実験により、ＧＡ２９のＧＡ２９−カタボライトへの代謝が確認された。これらの結果より、ＯｓＧＡ２ｏｘ３は、酸化の２段階、すなわち、ＧＡ２０からＧＡ２９へおよびＧＡ２９からＧＡ２９−カタボライトへの代謝を触媒していることが判明した（図４）。
【００５４】
［実施例４］
ＯｓＧＡ２ｏｘ３遺伝子生成物の活性をインビボで調べるために、完全長ＯｓＧＡ２ｏｘ３　ｃＤＮＡをイネアクチンプロモーターに融合させ、アグロバクテリウム媒介の遺伝子転移により野生型イネへ導入した。２７の独立系からのトランスジェニック植物のすべてが、極度に矮性表現型を示した（図５）。それらの葉身は、暗緑色で、野生型植物のそれらよりも短く幅広かった。これらの表現型のすべては、ＧＡ欠損性矮性イネにとって典型的である。野生型植物は播種後約３ヶ月で花が咲くが、これらの植物では播種後４ヶ月でさえも花が咲かなかった。
【００５５】
［実施例５］
ＧＡ３およびＧＡ生合成の抑制剤であるウニコナゾールの、ＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３の転写のレベルにおける影響を調べた（図６Ａ）。ＯｓＧＡ２ｏｘ３転写レベルはＧＡ３の適用により増加し、ウニコナゾールの適用により減少した（図６Ａ）。これに反して、生合成酸素であるＧＡ２０−酸化酵素をコードしているＯｓＧＡ２０ｏｘ１の転写レベルにおけるＧＡ３およびウニコナゾールの影響は完全に逆であった。ＯｓＧＡ２ｏｘ２転写はＧＡ３の処理後でさえも検出されなかった。さらなる実験により、ＯｓＧＡ２ｏｘ３転写レベルは、ＧＡ３の適用後１時間ですでに増加したが、適用後６時間では、適用の前のそれよりもいっそう低かったことが明らかになった（図６Ｂ）。
【００５６】
本発明者らは、イネから２つの新規なＧＡ２−酸化酵素をコードする遺伝子、ＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３を単離した。ＯｓＧＡ２ｏｘ３は、ＧＡ１およびその直接の前駆体であるＧＡ２０を不活性化することが確認された（図４）。ゆえに、イネについては、少なくとも２つの活性のあるＧＡ２−酸化酵素遺伝子：ＯｓＧＡ２ｏｘ１およびＯｓＧＡ２ｏｘ３がある。ＯｓＧＡ２ｏｘ３はＧＡ　応答性があるのに対し、ＯｓＧＡ２ｏｘ１はＧＡ　応答性がない。また、ＯｓＧＡ２ｏｘ３の遺伝子産物は、ＯｓＧＡ２ｏｘ１の遺伝子産物とは異なり、ＧＡ２０の多段階の酸化を触媒し、かつ、ＯｓＧＡ２ｏｘ３の発現は調べられたあらゆる組織で観察され、生物学的活性のあるＧＡの濃度によりフィードフォワード方式で制御された。ＧＡ２−酸化酵素遺伝子のフィードフォワード制御については、すでにＡｔＧＡ２ｏｘ１およびＡｔＧＡ２ｏｘ２について報告されている（Ｔｈｏｍａｓ　ＳＧ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９９）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９６：４６９８−４７０３）。
【００５７】
結論として、ＯｓＧＡ２ｏｘ３は、イネにおいて生物学的活性のあるＧＡの濃度のホメオスタシス調節を担っていることが示唆され、一方、ＯｓＧＡ２ｏｘ１は、頂端分裂組織の成長の調節のような特定の役割をもっているものと思われる（Ｓａｋａｍｏｔｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２５（３）：１５０８−１６）。２つのイネＧＡ３β−水酸化酵素遺伝子（ＯｓＧＡ３ｏｘ１およびＯｓＧＡ３ｏｘ２）があり、ＯｓＧＡ３ｏｘ２の発現は生物学的活性のあるＧＡのレベルによるフィードバック制御の下にあったが、ＯｓＧＡ３ｏｘ１はそうではなかったことは特筆すべきことである（Ｉｔｏｈ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９８（１５）：８９０９−１４）。このように、ＧＡ１の濃度は、ＯｓＧＡ３ｏｘ２（活性化）およびＯｓＧＡ２ｏｘ３（不活性化）の発現のホメオスタシス調節を通して、適切なレベルに維持されているものと思われる。この機構は、イネにとって茎葉の伸長を調節するために重要であるにちがいない。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、植物のジベレリンの不活性化に関与する新規なＤＮＡ、並びに該ＤＮＡの発現を調節することにより植物体内におけるジベレリン活性が改変された植物が提供された。本発明により、植物体内のジベレリン活性化を改変させ、植物の草型を人為的に改変することが可能となった。特に、本発明によって主要なＧＡ２−酸化酵素遺伝子が判明したので、アンチセンス技術などを用いて植物の伸長促進を図ることが容易になると考えられる。また、植物体内のジベレリンの不活性化により、特に伸長生長の抑制によって引き起こされる植物の矮性を誘起できる。このため、例えば、イネにおいては多肥料によって生育を促しても背丈が伸びすぎて倒伏してしまうこともなくなる。また、葉の受光量の効率が上昇するため収量の大幅な増加が期待できる。さらに収穫や生育管理の作業の効率化も図ることが可能である。また、植物体内における本発明のＤＮＡの発現を抑制して、植物体内のジベレリン活性化を促進することにより、植物体全体の収量を増加させることも考えられる。このことは、特に、飼料用作物全体の収穫量を向上させる上で有意義である。
【００５９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】イネＧＡ２−酸化酵素の配列の特徴を示す図である。イネＧＡ２−酸化酵素の推理アミノ酸配列のアラインメントを示している。灰色部分は、３つの酵素で保存されている配列を示している。また、三角印は、提案されている２−オキソグルタル酸依存性型二原子酸素添加酵素の活性中心と関連のあるアミノ酸を示す。
【図２】ＧＡ２０−酸化酵素、ＧＡ３−酸化酵素およびＧＡ２−酸化酵素についてのアミノ酸配列の系統発生樹を示す図である。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）からのＧＡ２０−酸化酵素（ＡｔＧＡ２０ｏｘ１，　Ｘ８３３７９；　ＡｔＧＡ２０ｏｘ２，　Ｘ８３３８０；　ＡｔＧＡ２０ｏｘ３，　Ｘ８３３８１）およびイネからのＧＡ２０−酸化酵素（ＯｓＧＡ２０ｏｘ１，　Ｕ５０３３３；　ＯｓＧＡ２０ｏｘ２，　ＡＢ０７７０２５）、シロイヌナズナ（Ａ．　ｔｈａｌｉａｎａ）からのＧＡ３β−水酸化酵素（ＡｔＧＡ３ｏｘ１，　Ｌ３７１２６；ＡｔＧＡ３ｏｘ２，　ＡＦ０７０９３７）およびイネ（Ｏ．　ｓａｔｉｂａ）からのＧＡ３−酸化酵素（ＯｓＧＡ３ｏｘ１，　ＡＢ０５４０８４；　ＯｓＧＡ３ｏｘ２，　ＡＢ０５６５１９）、シロイヌナズナ（Ａ．　ｔｈａｌｉａｎａ）からのＧＡ２−酸化酵素（ＡｔＧＡ２ｏｘ１，　ＡＪ１３２４３５；　ＡｔＧＡ２ｏｘ２，　ＡＪ１３２４３６；　ＡｔＧＡ２ｏｘ３，　ＡＪ１３２４３７）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）からのＧＡ２−酸化酵素（ＰｃＧＡ２ｏｘ１，　Ａｔ１３２４３８）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）からのＧＡ２−酸化酵素（ＰｓＧＡ２ｏｘ１，　ＡＦ１００９５４；　ＰｓＧＡ２ｏｘ２，　ＡＦ１００９５５）、およびイネ（Ｏ．　ｓａｔｉｖａ）からのＧＡ２−酸化酵素（ＯｓＧＡ２ｏｘ１，　ＡＢ０５９４１６；　ＯｓＧＡ２ｏｘ２，；　ＯｓＧＡ２ｏｘ３，）。
【図３】野生型イネの様々な器官におけるＯｓＧＡ２ｏｘ２およびＯｓＧＡ２ｏｘ３の発現を示す写真である。生長する茎頂、茎、葉身、葉鞘、花および根からのトータルＲＮＡ（１０μｇ）のノーザンブロットをＯｓＧＡ２ｏｘ２（上部パネル）およびＯｓＧＡ２ｏｘ３（中間パネル）についての３２Ｐ標識されたｃＤＮＡにハイブリダイズさせた。下部パネルはエチジウムブロマイド染色のアガロースゲル像を示している。
【図４】イネにおけるＧＡ１の合成および代謝の経路を示す図である。太い矢印は、イネＧＡ２−酸化酵素により触媒される段階を示す。
【図５】ＯｓＧＡ２ｏｘ３　ｃＤＮＡを過剰発現するトランスジェニックイネ植物を示す写真である。バーは１ｃｍに相当する。
【図６】ＧＡ生合成およびＧＡ代謝作用についてのイネ遺伝子の転写量におけるＧＡおよびウニコナゾールの影響を示す写真である。Ａ：（上部パネル）未処理（Ｃ）または１０μＭ　ＧＡ３（Ｇ）および１０μＭ　ウニコナゾール（Ｕ）で処理された野生型苗からのトータルＲＮＡ（１０μｇ）のノーザンブロットをＯｓＧＡ２ｏｘ２、ＯｓＧＡ２ｏｘ３およびＯｓＧＡ２０ｏｘ２についての３２Ｐ標識されたｃＤＮＡにハイブリダイズさせた。下部パネルはエチジウムブロマイド染色のアガロースゲル像を示している。Ｂ：１０μＭ　ＧＡ３の適用後のＯｓＧＡ２ｏｘ３の転写量における変化を示す写真である。（上部パネル）適用後０時間、１時間、３時間、６時間、１２時間および２４時間にトータルＲＮＡ（１０μｇ）を調製し、ブロッティングに使用した。下部パネルはエチジウムブロマイド染色のアガロースゲル像を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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