(57)【要約】【課題】従来のハイブリダイゼーションより多くの情報を得るための方法。【解決手段】支持体上に作られたオリゴヌクレオチド等の固定化してある複数のスポットに対して、該スポットに固定化してあるプローブの配列長とは異なる長さの非標識のＤＮＡまたはＲＮＡ断片をハイブリダイズさせる工程と、該ハイブリダイズ工程終了後に、鋳型およびプライマーを必要とする補酵素によって、非相補鎖部分に相補鎖を形成させる反応工程が、該反応工程中に少なくとも相補鎖が形成されたことを示すための標識物質を成分として添加する、ハイブリダイゼーション。【選択図】　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に作られたオリゴヌクレオチド等の固定化してある複数のスポットに対して、該スポットに固定化してあるプローブの配列長とは異なる長さの非標識のＤＮＡまたはＲＮＡ断片をハイブリダイズさせる工程と、該ハイブリダイズ工程終了後に、鋳型およびプライマーを必要とする補酵素によって、非相補鎖部分に相補鎖を形成させる反応工程が、該反応工程中に少なくとも相補鎖が形成されたことを示すための標識物質を成分として添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、標識されたオリゴヌクレオチドが、少なくとも３塩基以上であることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項３】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、標識されたオリゴヌクレオチドの標識物質の種類が、少なくとも２種類以上であることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項４】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、プローブ側の末端に１塩基のみ標識することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、アミノ酸の性状分類に基づいて、それぞれの分類に異なる標識物質を結合させた、コドン単位のオリゴヌクレオチドを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項６】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、Ｍｅｔのアミノ酸コードＡＵＧ（ＡＴＧ）を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項７】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、Ｃｙｓのアミノ酸コードＵＧＵ、ＵＧＣ、ＴＧＴ、ＴＧＣを持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項８】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、翻訳の開始コドン、終止コドンのアミノ酸コードを持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項９】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、制限酵素の認識配列を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１０】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、予め解っている欠失個所を含む配列を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１１】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、蛋白質のαへリックスとβシート構造をつなぐループと呼ばれる部分のアミノ酸３〜６個のオリゴヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１２】
請求項１のハイブリダイゼーション方法において、蛋白質の抗原決定基を含む部分のオリゴヌクレオチド配列に蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１３】
少なくともマイクロアレイ上の１ドットに２種類以上のターゲット分子が結合した際に、それぞれのターゲット分子に特徴的なオリゴヌクレオチド配列に標識した成分を添加し、該添加物のハイブリダイゼーションを行うことによって、１ドットに２種類以上のターゲット分子が結合したかどうかを確認する方法。
【請求項１４】
請求項１のハイブリダイゼーション終了後に、少なくともプローブ側のＴｍ値以上の温度に加熱して一本鎖化することによって、ターゲット側の試料を回収する方法。
【請求項１５】
請求項１のハイブリダイゼーション後の溶液中に、ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性をもった酵素を添加し、リアルタイムに複数色の蛍光色素が外れていくのを観察または観測することによる、ことを特徴とするシークエンス解析法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、板状の媒体にＤＮＡまたはＲＮＡなどの複数の物質をアレイ状に固相化された、いわゆるＤＮＡマイクロアレイにおいて、その固相に対応する物質を検出する方法、ハイブリダイゼーションにおけるＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来のＤＮＡマイクロアレイにおけるハイブリダイゼーション方法は、ターゲット側、すなわち反応させる検体側に含まれるＤＮＡまたはＲＮＡ等の断片にダイレクトに標識するか、アミノアリル法やビオチン−アビジン反応を利用した間接的標識法が知られている（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。しかしこれらはいずれもターゲット側、すなわち反応させる検体側に標識して、ハイブリダイゼーションによって対応する核酸配列があったことを蛍光検出している。
【０００３】
【非特許文献１】
林埼良英　監修　岡崎康司　編集
「必ずデータが出るＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」羊土社
【非特許文献２】
「Ｇｅｎｅ　Ｃｈｉｐプロトコール」Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、アミノアリル法のように、ハイブリダイゼーション反応の際に懸念される標識物の立体障害要素を嫌い、そのあとで間接的に反応させたとしても、本来のネイティブなハイブリダイゼーション反応とは異なるために、反応温度や、塩濃度等の反応諸条件に微妙な違いを生ずるため、異なる標識物質間での比較が容易でないという問題があった。
【０００５】
本発明は、以上の点に着目して成されたもので、従来のハイブリダイゼーションより多くの情報を得るための、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法、確認する方法、試料を回収する方法およびシークエンス解析法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明は、何の修飾もしていない、そのままのＤＮＡまたはＲＮＡ断片を反応させ、２本鎖複合体が形成されたあと、補酵素によるポリメラーゼ反応を用いて、標識オリゴ断片または標識核酸を取り込み、ターゲット側とプローブ側で塩基配列の長さが異なる部分を伸長させてしまうことによって、本来そのものの自然な形で、ハイブリダイゼーションによる対応塩基配列の検出を行うことが出来るよう考案したものである。
【０００７】
また、このような方法をとることによって、新たな利点も発生する。例えば、従来のように標識−ｄＵＴＰを添加して、ランダムに取り込ませるのではなく、意味を持った配列の標識オリゴヌクレオチド断片を、ポリメラーゼ反応の要素として添加する。例えば、▲１▼親水性のアミノ酸コード、疎水性のアミノ酸コードを持つコドン単位のオリゴヌクレオチドにそれぞれ異なる蛍光色素の標識をしたものを混ぜる。こうすることで、そのターゲット断片の疎水性／親水性に関する情報や、ペプタイドの構造に関する情報を得る。▲２▼Ｍｅｔのアミノ酸コードＡＵＧ（ＡＴＧ）を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを添加する。ＭｅｔのＳは孤立電子対を持つので金属と結合しやすいことや、メチル基の関与する代謝反応でメチル基供与体として働くといった、蛋白質の機能に関する情報を得る。▲３▼Ｃｙｓのアミノ酸コードＵＧＵ、ＵＧＣ（以下Ｕ→Ｔ省略）を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを添加する。Ｃｙｓは酸化されるとｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ鎖間にｄｉｓｕｌｆｉｄｅ結合（−Ｓ−Ｓ−）を形成し，ｃｙｓｔｉｎｅとなって蛋白質構造を固定するので、蛋白質の構造に関する情報を得る。▲４▼翻訳の開始コドン、終止コドンのアミノ酸コードを持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを添加する。ペプタイドの頭尾に関する情報を得る。▲５▼制限酵素の認識配列を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを添加する。ペプタイドをクローニングする際などその他、研究者に必要な個別情報を提供する。▲６▼予め解っている欠失個所を含む配列のオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを添加する。欠失を持つ疾患の臨床診断に応用できる。▲７▼蛋白質のαへリックスとβシート構造をつなぐループと呼ばれる部分のアミノ酸３〜４個のオリゴヌクレオチド配列や、構造的にあるいは病気との関連で、特徴的な部分の配列に対するオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを添加する。蛋白の活性部分や機能に関する情報を得るのに役立つ。▲８▼末端だけ標識を行う。標識ラベルが一つだけ入るので、もともとの存在量を把握するのに役立つ。
【０００８】
以上▲１▼〜▲８▼は、本発明のハイブリダイゼーションの形態をとることでの利点を説明した。結局本発明は、研究者が注目したいとする任意の配列を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを添加することで、研究者が注目する配列を検出できる、ということに集約される。さらに研究者が注目したいとする任意の配列が、十分長く、ギャップを埋めるポリメラーゼ反応や、ライゲーションを必要としないでハイブリダイゼーションできる場合には、単なる多段階ハイブリダイゼーションとしても構わないわけである。また▲１▼〜▲８▼は、可能な限り複数の蛍光色素を用いて、より多くの情報を得られるように組み合わせても良い。
【０００９】
本発明はターゲット側とプローブ側に配列長に差があることを利用したもので、本明細書ではこれを、ＳＣＨ（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｃｈａｉｎ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）と呼ぶことにする。ＳＣＨの更なる利点は、標識−ｄｄＮＴＰで末端だけ標識すれば、定量的把握がしやすく、逆に蛍光量が足らなければ、鎖長差分だけ、蛍光を取り込みながら伸長してしまえばよいという柔軟性もさることながら、例えばマイクロアレイ上の１ドットに複数のターゲット分子が１塩基ミスマッチ程度の違いで交差反応してしまった場合、それに続く次の配列が異なれば、異なる蛍光色素でＳＣＨを行うことによって識別可能な点である。
【００１０】
またその後のアプリケーションにも期待が持てる。蛍光ラベルされている側は、プローブ側なので、ウェル状のマイクロプレートでＳＣＨを行えば、後でＴｍ以上に加熱して一本鎖化することによって、ターゲット側の試料を回収できる。またＳＣＨ後、ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性をもった酵素を添加し、リアルタイムに複数色の蛍光色素が外れていくのを観察すれば、アレイ状に同時複数の塩基配列をシークエンス解析できる。
【００１１】
以上、本発明についてその詳細を説明したが、これを下記に整理して記述する。
【００１２】
（１）支持体上に作られたオリゴヌクレオチド等の固定化してある複数のスポットに対して、該スポットに固定化してあるプローブの配列長とは異なる長さの非標識のＤＮＡまたはＲＮＡ断片をハイブリダイズさせる工程と、該ハイブリダイズ工程終了後に、鋳型およびプライマーを必要とする補酵素によって、非相補鎖部分に相補鎖を形成させる反応工程が、該反応工程中に少なくとも相補鎖が形成されたことを示すための標識物質を成分として添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００１３】
（２）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、標識されたオリゴヌクレオチドが、少なくとも３塩基以上であることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００１４】
（３）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、標識されたオリゴヌクレオチドの標識物質の種類が、少なくとも２種類以上であることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００１５】
（４）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、プローブ側の末端に１塩基のみ標識することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００１６】
（５）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、アミノ酸の性状分類に基づいて、それぞれの分類に異なる標識物質を結合させた、コドン単位のオリゴヌクレオチドを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００１７】
（６）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、Ｍｅｔのアミノ酸コードＡＵＧ（ＡＴＧ）を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００１８】
（７）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、Ｃｙｓのアミノ酸コードＵＧＵ、ＵＧＣ、ＴＧＴ、ＴＧＣを持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００１９】
（８）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、翻訳の開始コドン、終止コドンのアミノ酸コードを持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００２０】
（９）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、制限酵素の認識配列を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００２１】
（１０）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、予め解っている欠失個所を含む配列を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００２２】
（１１）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、蛋白質のαへリックスとβシート構造をつなぐループと呼ばれる部分のアミノ酸３〜６個のオリゴヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドに蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００２３】
（１２）前記（１）のハイブリダイゼーション方法において、蛋白質の抗原決定基を含む部分のオリゴヌクレオチド配列に蛍光標識したものを、相補鎖を形成させる反応工程中に添加することを特徴とした、ＤＮＡマイクロアレイ等のハイブリダイゼーション方法。
【００２４】
（１３）少なくともマイクロアレイ上の１ドットに２種類以上のターゲット分子が結合した際に、それぞれのターゲット分子に特徴的なオリゴヌクレオチド配列に標識した成分を添加し、該添加物のハイブリダイゼーションを行うことによって、１ドットに２種類以上のターゲット分子が結合したかどうかを確認する方法。
【００２５】
（１４）請求項１のハイブリダイゼーション終了後に、少なくともプローブ側のＴｍ値以上の温度に加熱して一本鎖化することによって、ターゲット側の試料を回収する方法。
【００２６】
（１５）前記（１）のハイブリダイゼーション後の溶液中に、ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性をもった酵素を添加し、リアルタイムに複数色の蛍光色素が外れていくのを観察または観測することによる、ことを特徴とするシークエンス解析法。
【００２７】
【発明の実施の形態】
図１〜図４に本発明の実施の形態を示した。
【００２８】
図１はＤＮＡマイクロアレイの一部分を示したもので、支持体１の上に、複数のスポット２、および３が形成されている。支持体１の材質はガラス、プラスチックなどの有機系高分子材料など、プローブＤＮＡまたはＲＮＡの固相表面を形成するものなら何でも構わない。また読取装置に応じて、マイクロプレートリーダであれば、ウェル状、マイクロアレイスキャナであれば板状、フローサイトメータのような装置であれば粒状、であったりしてもよい。これに検体側のターゲットＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイゼーションを行ったところを図２に示した。スポット２には２種類のターゲット断片４，５が、スポット３には１種類のターゲット断片６が反応したことを示した。しかしこれらは何の修飾もしていないターゲット断片４，５，６である。
【００２９】
図２では鎖のほぼ末端同士がハイブリダイズされているが、そうでなくても良い。またそのため（反応の立体障害緩和）には、リンカー１０はある程度長いほうが良く、固相密度も検討すべきである。また図２ではターゲット側は、プローブ側より長い配列を持っているが、逆の関係にあっても構わない。その際にはプローブ側に蛍光標識が入ることになる。
【００３０】
図３はポリメラーゼ、リガーゼ反応によって、標識された相補鎖を形成させたところである。リガーゼは、標識されたオリゴヌクレオチド配列が、形成される相補鎖と、あたかも単にニックを形成したように隣接して入る場合には、作用させることが必要である。
【００３１】
図４は、この発明の実施例の最終生成物を示し、それぞれ異なる蛍光標識物質を備えた最終生成物７，８，９として得られる。
【００３２】
スポット３のように、単一核酸に標識されたもの（＋印）がポリメラーゼ反応に取り込まれる場合には、なくても良い。リガーゼ反応には、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼが一般的に用いられる。ポリメラーゼ反応には、Ｔａｑポリメラーゼ、ＢｃａＢＥＳＴ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを使うことが出来る。また、標識については、一般的に使用されている一例をあげると、Ｃｙ　Ｄｙｅシリーズ、ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、Ａｌｅｘａシリーズなどの蛍光色素、α−３２Ｐ、α−３５Ｓ、３ＨなどのＲＩ標識を用いることが出来る。また蛍光標識の方法としてはアミノアリル、ビオチンなどを用いた、間接標識法でも良い。
【００３３】
【実施例】
１．マイクロアレイの作製
人のインスリンを構成する、Ａ鎖およびＢ鎖をＮ末端側から１５塩基単位ごとに分割し、合計１０個のマイクロアレイを作った。固相化の方法は、特開平１１−１８７９００号公報の実施例に従った。以下に、Ａ鎖およびＢ鎖の配列を、ドット単位ごとに｜記号で示した。
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【００３４】
２．検体の調整
人のすい臓のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを入手（クロンテック社）し、ＴａＫａＲａ
ＲＮＡ　ＬＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔを使って、ｃＤＮＡを得た。これをエタノール洗浄、ドライアップしたものを、ＯＤ２６０を測定し、生理食塩水を用いて０．５μｇ／μｌに調整した。
【００３５】
３．一次ハイブリダーゼーション
作製した検体２０μｌに１００％ホルムアミド２０μｌ、１０％ＳＤＳ　１μｌ加えたものを、ハイブリチャンバー中に入れ、４５℃、１６時間反応させた。反応終了後、１％ＳＤＳ含１×生理食塩水で、３回洗浄したあと、０．２×生理食塩水で１回洗浄した。
【００３６】
４．末端標識による検出
一次ハイブリダーゼーションを終了した検体に、標識−ｄｄＮＴＰを用いて、末端標識する。
【００３７】
標識試薬は、ＡＢＩ社のＢｉｇ　Ｄｙｅを用い、ＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ（ＴａＫａＲａ社）および添付バッファを用いて、３７℃、４５分反応させた。次に１％ＳＤＳ含１×生理食塩水で３回洗浄したあと、０．２×生理食塩水で１回洗浄し、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂでアレイ画像を測定した。
【００３８】
５．蛋白質の情報に関する検出（その１）
Ｓ−Ｓ結合に関与するＣｙｓのアミノ酸コードＴＧＴ、ＴＧＣの５’末端にローダミン標識したものをオリゴヌクレオチド合成メーカーから入手し、これにＴ４　ＤＮＡ　ポリメラーゼとｄＮＴＰｓを添付バッファに加え、３の一次ハイブリダーゼーションを終了したマイクロアレイと３７℃、４５分反応させた。次に１％ＳＤＳ含１×生理食塩水で３回洗浄したあと、０．２×生理食塩水で１回洗浄し、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂでアレイ画像を測定した。
【００３９】
５．蛋白質の情報に関する検出（その２）
インスリンの機能として重要なＡ鎖の部分ＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＴの５’末端にローダミン標識したものをオリゴヌクレオチド合成メーカーから入手し、生理食塩水で５０ｎＭの濃度に調整したものを、３の一次ハイブリダーゼーションを終了したマイクロアレイと２回目のハイブリダイゼーションを４５℃、２時間反応させた。次に１％ＳＤＳ含１×生理食塩水で３回洗浄したあと、０．２×生理食塩水で１回洗浄し、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂでアレイ画像を測定した。
【００４０】
６．ターゲット側試料の回収
１のマイクロアレイの固相をマイクロプレート上のウェル内に行った。２の調整済み検体と３の一次ハイブリダイゼーションを行い、その後マイクロプレートを密閉状態で９５℃、３０分加熱し、上清をピペットで回収した。
【００４１】
７．蛍光のリアルタイム観察
６の一次ハイブリダイゼーション終了後のマイクロプレートに、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＩＩとその添付バッファを添加し、プレート固相面に合焦点である蛍光マイクロプレートリーダで計測した。
【００４２】
【発明の効果】
この発明によれば、従来のハイブリダイゼーションより多くの情報を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態を示した説明図
【図２】本発明の実施の形態を示した説明図
【図３】本発明の実施の形態を示した説明図
【図４】本発明の実施の形態を示した説明図
【符号の説明】
１　支持体
２，３　複数のスポット
４，５，６　ターゲット断片
７，８，９　最終生成物
１０　リンカー
【図１】
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【図２】
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【図３】
2004105071.tif 000006
【図４】
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