(57)【要約】【課題】  分析系全体において不溶成分による詰まりがなく、安定した分析を繰り返し行うことができるようにする。【解決手段】  （Ａ）試料の濃縮では、試料は注入部１８によって試料濃縮流路に注入され、切換えバルブ１４を介してインラインフィルタ３０に導かれる。インラインフィルタ３０では試料成分中の不溶成分が捕捉される。不溶成分が除かれた試料は切換えバルブ１６を介して濃縮カラム２０に送られ、濃縮される。（Ｂ）濃縮後の分析では、濃縮カラム２０に捕捉されていた試料成分は分析用移動相２ａ，２ｂによって分析カラム２４に送られ、検出器２６で検出される。濃縮液５は（Ａ）のときと逆方向からインラインフィルタ３０に導かれる。インラインフィルタ３０では濃縮液５による洗浄が行われ、捕捉されていた不溶成分はドレインへ排出される。【選択図】図１
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【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
分析用移動相とともに導入された試料を成分に分離する分析カラムと、
前記分析カラムにつながる分析用移動相流路に試料を注入する注入部と、
前記分析カラムにより分離された試料成分を検出する検出器と、
試料からタンパク質を排除して試料成分をトラップし、そのトラップした成分を前記分析用移動相により溶出する除タンパク濃縮カラムと、
前記注入部を前記濃縮カラムに接続して濃縮液により濃縮を行なう試料濃縮流路、及び前記濃縮カラムを前記分析カラムに接続して前記分析用移動相により分析を行なう分析用移動相流路を切り換える流路切換え機構と、を備えた液体クロマトグラフにおいて、
前記注入部と前記流路切換え機構の間に、前記濃縮カラムを通過できない大きさの不溶成分を捕捉するインラインフィルタと、
前記濃縮液が前記注入部から前記インラインフィルタを経て前記流路切換え機構に流れる注入用の流路、及び前記濃縮液が前記注入部から前記インラインフィルタを逆方向に流れてドレインへ排出される逆洗流路の間を切り換えるための第２の流路切換え機構をさらに備えたことを特徴とする液体クロマトグラフ。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、高速液体クロマトグラフなどの液体クロマトグラフに関し、特に分離した成分をトラップカラムに捕捉して濃縮する機能を備えた液体クロマトグラフに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、血漿や血清などの生体試料中の薬物成分などを液体クロマトグラフで分析するには、（１）試料を用手により前処理して分析妨害成分であるタンパクを除く処理を行ってから液体クロマトグラフに注入して分析する、（２）除タンパク濃縮カラムを用いて液体クロマトグラフで（１）のタンパクを除く処理をオンラインで行ってから分析する、という方法がある。
【０００３】
しかし、一般に新薬開発における薬物動態実験はその検体数が大量にあるため、（１）のような方法で行う前処理には限界があった。例えばある動物に薬物を投与し、投与時間から決められた時間に採血を行い、それを遠心分離して血漿と血清に分離し、血漿にアセトニトリルを加えてタンパクを沈殿させ、それをフィルタなどで濾過してオートサンプラにセットした後、液体クロマトグラフによって分析を行うといった操作が必要であった。
【０００４】
そのような用手による前処理は操作が煩雑であり、一般に誤操作を起こしやすく、さらに複数の工程を繰り返すために目的対象成分の回収率が低くなってしまう。そこで分析前に粗い濾過を行い、濃縮カラムを用いてオンラインで血漿にアセトニトリルを添加したり、濾過の工程を自動化したりするシステムが考えられた。これにより、分析時間全体が短縮して生産性が大きく向上し、誤操作を起こす確率が低くなるとともに測定成分の回収率も向上した（特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００３−１４９２１６号公報
【考案の開示】
【考案が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし薬物動態のような分析では検体数が多く、一度にセットされる検体数が１００検体近くになることもある。そういった場合、１回の分析時間が例え１０分だとしても、最後の検体の分析が始まるまでに１０時間を超えることがある。そのような場合、オートサンプラ内で分析の順番を待っている間に、遠心分離で分離しきれなかったタンパク質や血漿試料中に存在するタンパク質により、除タンパク濃縮カラムの充填剤の間隙を通過できないような大きな不溶成分が形成されてしまうことがある。
【０００６】
一般に濃縮カラムにおいては、分子量の大きなタンパクは除タンパク濃縮カラムの充填剤の間を通り抜け、血漿中の分子量の小さな薬物成分が充填剤に保持されて濃縮され、カラムスイッチングバルブを切り換えて分析されるのが一般的である。しかし先に説明した不溶成分は、その大きさのために除タンパクカラムの充填剤の隙間を通過することができず、濃縮カラム先端で目詰まりを起こすことがある。
そのような場合、濃縮時に送液圧力が大きくなり、濃縮カラムそのものを破壊したり、カラムスイッチング後に分析カラムを詰まらせたりすることがあり、分析の妨害になる。
【０００７】
本考案は、分析系全体において不溶成分による詰まりがなく、安定した分析を繰り返し行うことができる液体クロマトグラフを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本考案の液体クロマトグラフは、分析用移動相とともに導入された試料を成分に分離する分析カラムと、分析カラムにつながる分析用移動相流路に試料を注入する注入部と、分析カラムにより分離された試料成分を検出する検出器と、試料からタンパク質を排除して試料成分をトラップし、そのトラップした成分を分析用移動相により溶出する除タンパク濃縮カラム（単に濃縮カラムという。）と、注入部を濃縮カラムに接続して濃縮液により濃縮を行なう試料濃縮流路、及び濃縮カラムを分析カラムに接続して分析用移動相により分析を行なう分析用移動相流路を切り換える流路切換え機構と、を備えている。そして、注入部と流路切換え機構の間には、濃縮カラムを通過できない大きさの不溶成分を捕捉するインラインフィルタと、濃縮液が注入部からインラインフィルタを経て流路切換え機構に流れる注入用の流路、及び濃縮液が注入部からインラインフィルタを逆方向に流れてドレインへ排出される逆洗流路の間を切り換えるための第２の流路切換え機構をさらに備えている。
【０００９】
試料の濃縮時は、注入部により注入された測定対象成分がインラインフィルタにより濾過され、分析に支障を来たす大きな不溶成分は取り除かれる。試料の濃縮後は、第２の流路切換えバルブにより流路が切り替えられ、濃縮用の移動相によりフィルタに残存した大きな不溶成分は逆洗浄されて、液体クロマトグラフの系外に排出される。
【考案の効果】
【００１０】
本考案による流路構成では、注入部と除タンパク濃縮カラムの間にインラインフィルタを備えているため、濃縮カラム又は分析カラムに不溶成分が運ばれることがなく、不溶成分による圧力上昇が起きることはない。
また、第２の流路切換えバルブを濃縮時と逆方向に切り換えると、インラインフィルタに逆方向から濃縮液を流すことでフィルタの洗浄が行えるようになり、繰り返しの分析でも不溶成分の影響を受けることがなくなるため、カラムの圧力上昇を起こすことがなくなる。
【考案を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本考案の一実施例を説明する。
図１は本考案の液体クロマトグラフの一実施例を示す流路図であり、（Ａ）は試料濃縮時、（Ｂ）は濃縮試料の分析時を示している。
この液体クロマトグラフは、オートサンプラにより試料が注入される注入部１８、試料からタンパク質を排除して試料成分をトラップし、そのトラップした成分を分析用移動相２ａ，２ｂにより溶出するためのカラムとしての濃縮カラム２０、それらを切り換えるための流路切換え機構としての切換えバルブ１６、第２の流路切換え機構としての切換えバルブ１４、及びそれに接続され、不溶成分を捕捉又は排出するためのフィルタとしてのインラインフィルタ３０を備えている。
【００１２】
濃縮カラム２０としては、例えばシリカゲル表面を親水性高分子のメチルセルロースで修飾した後、更に内表面をオクタデシルシランで修飾した充填剤を充填したカラムを使用することができる。
インラインフィルタ３０としては、孔径が２μｍ程度のものが適当である。そのようなフィルタ３０の一例は厚さが１μｍ程度のポリテトラフルオロエチレン膜を備えたものや、チタンやステンレスなどの金属焼結体からなるディスク状のものなどがある。
【００１３】
５は試料を濃縮カラム２０に搬送するための濃縮液であり、濃縮液５を送液するために試料搬送ポンプ１０が設けられている。
切換えバルブ１４は、濃縮液５が注入部１８からインラインフィルタ３０を経て流路切換え機構に至る注入用の流路を流れるか、濃縮液５が注入部１８からインラインフィルタ３０を逆方向に流れてドレインへ排出される逆洗流路を流れるかを切り換えるものである。
切換えバルブ１６は、注入部１８と濃縮カラム２０とを接続して注入部１８から注入された試料を濃縮液５により濃縮する試料濃縮流路と、濃縮カラム２０と分析カラム２４とを接続して濃縮された試料を分析用移動相２ａ，２ｂにより溶出して成分に分離して分析する分析用移動相流路とを切り換えるものである。
【００１４】
分析用移動相２ａ、２ｂは試料を分析カラム２４に送液するためのものであり、これら分析用移動相２ａ，２ｂを送液するためにそれぞれに分析ポンプ８ａ、８ｂが設けられている。分析ポンプ８ａ，８ｂの流量を制御することにより移動相の組成を調整してグラジエント分析を行なうことができる。分析ポンプ８ａ，８ｂの下流には分析用移動相２ａ，２ｂを混合するミキサ２２が設けられている。
【００１５】
ポンプ８ａ、８ｂの上流側にはデガッサ２８が設けられており、移動相中に含まれる気泡を取り除くようになっている。
分析カラム２４で成分ごとに分離された試料は下流側の検出器２６に送られ検出される。
【００１６】
以下に同実施例の動作を説明する。
サンプルは、測定対象成分が投与された動物の血液や尿などであり、採取したそれら生体試料を遠心分離させて不溶成分を沈殿させる。その後、上清をフィルタを使って分析上問題ないレベルまで濾過してオートサンプラにセットして分析を行う。または、それら生体試料を直接オートサンプラにセットして分析を行う。
【００１７】
［濃縮］
図１（Ａ）において、太線で示された流路は試料を濃縮する際に濃縮液５と試料が流れる試料濃縮流路である。濃縮液５はポンプ１０から注入部１８に送液される。注入部１８は試料ビンなどから試料を吸入しており（図示略）、吸入された試料は送液されてくる濃縮液５とともに切換えバルブ１４を介してインラインフィルタ３０に導かれる。インラインフィルタ３０では試料成分中の不溶成分が捕捉される。
【００１８】
インラインフィルタ３０を経た試料は、送液されてくる濃縮液５とともに切換えバルブ１６を介して濃縮カラム２０に導かれる。濃縮カラム２０では試料中の分子量の大きいタンパク質が除かれ、目的成分が捕捉されることにより濃縮される。濃縮カラム２０を経たタンパク質は濃縮液５とともに切換えバルブ１６を経てドレインへ排出される。
【００１９】
［濃縮後分析］
図１（Ｂ）において、太線で示された流路は濃縮カラム２０に捕捉された試料を分析カラム２４に送る際に分析用移動相２ａ，２ｂと試料が流れる分析用移動相流路、及びインラインフィルタ３０により捕捉された不溶成分を逆洗浄して排出するための流路であり、（Ａ）の状態から切換えバルブ１４，１６が切り換えられた状態である。ミキサ２２からの分析用移動相２ａ，２ｂは切換えバルブ１６に送られ、濃縮カラム２０に導かれる。濃縮カラム２０に捕捉されていた測定対象成分は導かれた分析用移動相２ａ，２ｂによって濃縮カラム２０から溶出され、分析用移動相２ａ，２ｂとともに切換えバルブ１６を介して分析カラム２４に導かれて成分ごとに分離され、検出器２６で検出される。
【００２０】
一方、濃縮液５はポンプ１０から切換えバルブ１４を経てインラインフィルタ３０に図１（Ａ）のときと逆方向から導かれる。インラインフィルタ３０では濃縮液５による洗浄が行われ、不溶成分を含んだ溶液はドレインへ排出される。このとき、濃縮液５をインラインフィルタ３０を洗浄するための別の溶液に切り換えて洗浄するようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本考案は、生体試料中に含まれる薬物などの微量成分を分析する液体クロマトグラフなどに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本考案の液体クロマトグラフの一実施例を示す流路図であり、（Ａ）は試料濃縮時、（Ｂ）は濃縮試料の分析時を示している。
【符号の説明】
【００２３】
２ａ、２ｂ      分析用移動相
５      濃縮液
８ａ，８ｂ，１０      ポンプ
１４，１６      切換えバルブ
１８      注入部
２０      除タンパク濃縮カラム
２２      ミキサ
２４      分析カラム
２６      検出器
２８      デガッサ
３０      インラインフィルタ
【図１】
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