(57)【要約】【課題】Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ又はＦａｃｔｏｒ  ＩＸ遺伝子がノックアウトされたウサギ、その製造方法及びその用途を提供する。【解決手段】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ又はＦａｃｔｏｒ  ＩＸをノックアウトさせた形質転換ウサギ、その製造方法及びその用途に関する。本発明に係る第８因子及び／又は第９因子がノックアウトされた形質転換ウサギは、血友病発生に重要な機能を担うタンパク質である第８因子及び／又は第９因子の機能が抑制されているため、血友病治療剤の開発に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，ＦＶＩＩＩ）又は第９因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ，ＦＩＸ）のエクソン領域に相補的に結合するターゲッティングドメインを含むｓｇＲＮＡ。
【請求項２】
前記第８因子遺伝子のエクソン領域は、配列番号１の塩基配列で表されるエクソン領域であることを特徴とする、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３】
前記第９因子遺伝子のエクソン領域は、配列番号２の塩基配列で表されるエクソン領域であることを特徴とする、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡを暗号化するポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号３〜６のいずれかの塩基配列で表されることを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム。
【請求項８】
請求項７に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて製造された形質転換ウサギ。
【請求項９】
（ａ）請求項７に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを転写（ｔｒａｎｓｃｉｒｐｔｉｏｎ）してｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ｍＲＮＡを製造する段階；
（ｂ）受精卵に前記（ａ）段階で製造したｍＲＮＡを導入して培養する段階；及び
（ｃ）前記（ｂ）段階で得た受精卵を代理母に移植して分娩させる段階を含む方法で製造されることを特徴とする、請求項８に記載の形質転換ウサギ。
【請求項１０】
前記形質転換ウサギは分娩後に形質転換の有無を確認する段階をさらに含む方法で製造されることを特徴とする、請求項９に記載の形質転換ウサギ。
【請求項１１】
請求項９に記載の形質転換ウサギを交配して子孫形質転換ウサギを生産する段階を含む方法で製造されることを特徴とする、子孫形質転換ウサギ。
【請求項１２】
前記形質転換ウサギの交配は、請求項９に記載の形質転換ウサギ又は正常ウサギと交配することを特徴とする、請求項１１に記載の子孫形質転換ウサギ。
【請求項１３】
前記形質転換ウサギ又は子孫形質転換ウサギは、第８因子又は第９因子がノックアウトされて血友病表現型を示すことを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の子孫形質転換ウサギ。
【請求項１４】
請求項８に記載の形質転換ウサギ又は請求項１１に記載の子孫形質転換ウサギから分離した細胞、組織及び副産物。
【請求項１５】
前記副産物は、血液、血清、尿、糞便、唾液、臓器及び皮膚からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載の副産物。
【請求項１６】
次の段階を含む形質転換ウサギの製造方法。
（ａ）請求項７に記載のＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９システムを転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）してｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ｍＲＮＡを製造する段階；
（ｂ）受精卵に前記（ａ）段階で製造したｍＲＮＡを導入して培養する段階；及び
（ｃ）前記（ｂ）段階で得た受精卵を代理母に移植して分娩させる段階。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法で製造された形質転換ウサギを交配して子孫形質転換ウサギを生産する段階を含む子孫形質転換ウサギの製造方法。
【請求項１８】
前記形質転換ウサギの交配は、請求項１６に記載の方法で製造された形質転換ウサギ又は正常ウサギと交配することを特徴とする、請求項１７に記載の子孫形質転換ウサギの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ又はＦａｃｔｏｒ  ＩＸ遺伝子がノックアウトされたウサギ、その製造方法及びその用途に関し、より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ又はＦａｃｔｏｒ  ＩＸをノックアウトさせた形質転換ウサギ、その製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固は血管損傷に対応して発生する複合的で主要な過程である。これは、出血を止め、損傷した血管の回復を始める血栓の形成によってなされ；損傷部位は、血栓を含むフィブリン及び血小板によってカバーされる。前記過程は、損傷後にほぼ即時に始まる。
【０００３】
血液凝固過程には２種類の成分、すなわち血小板と呼ばれる細胞成分、及び凝固因子と呼ばれるタンパク質成分が関与する。血小板は損傷した部位で直ちにプラグ（ｐｌｕｇ）を形成し、これは一次的止血と呼ばれる。二次的止血は同時に発生し、凝固因子又は凝血因子と呼ばれる血漿内タンパク質が複雑なカスケード過程を経て反応して、血小板プラグを強化させるフィブリンストランドを形成する。
【０００４】
二次的止血の凝固カスケードは、２つの経路、すなわち、接触活性化経路とも呼ばれる内因性経路及び組織因子経路とも呼ばれる外因性経路とに分けられる。多数の凝固因子が関与する他、補助因子及び調節因子も過程を正確に維持するために関与する。
【０００５】
例えば、タンパク質Ｃは、“抗凝固経路”と呼ばれる凝固調節の主要メカニズムの必須因子である。タンパク質Ｃの活性形態（活性化タンパク質Ｃ）はセリンプロテアーゼであり、これは他の補助因子（タンパク質Ｓ）と関連付けられるとき、トロンビンの大量生成に必須である凝血カスケードの２つの因子、すなわち第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子を分解する。これらの因子の破壊は、形成されるトロンビンの量を陰性的に調節し、これは抗凝固効果をもたらす。前記タンパク質は、特に抗血栓活性、抗炎症活性、抗アポトーシス活性及びプロフィブリン溶解活性などの多面発現的な生物学的活性を有するものと知られている。
【０００６】
第ＩＸ因子（下記ではＦＩＸという。）は血液凝固に必須であるセリンプロテアーゼの一つである。前記タンパク質の欠乏は、血友病Ｂと呼ばれる出血障害を引き起こす。血液凝固の間に、活性化されたＦＩＸ（ＦＩＸａ）はその活性化された補助因子である第ＶＩＩＩａ因子（下記ではＦＶＩＩＩａという。）と結合し、これは、特異的基質第Ｘ因子（下記ではＦＸという。）をその活性化誘導体である活性化された第Ｘ因子（下記ではＦＸａという。）に転換させる。
【０００７】
第Ｘ因子は凝血カスケードのさらに他の必須因子である。ＦＸの活性化された形態（ＦＸａ）は、その補助因子（凝血第Ｖａ因子）と結合してプロトロンビンをトロンビンに活性化させ得る唯一のセリンプロテアーゼである。また、受動的な傍観成分として長い間考慮されてきた第Ｘ因子は、その２つの主要受容体、すなわちプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）及びＰＡＲ−２の活性化を通じて非常に様々な細胞類型に対して直接的な参加成分として現れる。最近の発見によれば、ＰＡＲ−２は凝固と疾患の進行との接点を調整する重要な媒介体であり、第Ｘ因子に対するポイントと繊維増殖性疾患、例えば繊維症、組織再形成及び癌において重要な役目を担うという点が提案された（Ｂｏｒｅｎｓｚｔａｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００８；１７２：３０９・２０）。
【０００８】
私たちの身体で止血を担当する様々な血液凝固因子のうち第ＶＩＩＩ因子が不足すると血友病Ａ、第ＩＸ因子が不足すると血友病Ｂと名称している。血友病Ａはフォンヴィレブランド病（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）を除けば全世界で最も多く発病している遺伝性血液凝固疾患であり、全体血友病の８０〜８５％程度を占め、その発生頻度は生存する男児５，０００〜１０，０００名当たり１名と報告される。血友病Ｂは相対的に稀に発病し、血友病Ａの約１／５程度と推算される。
【０００９】
正常人において、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子の活性度は５０〜１５０％程度であり、血友病ＡとＢは血液検査においてその活性度が減少している。凝固因子の活性度によってさらに、重症（第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子活性度１％以下）、中等症（因子活性度１〜５％）、軽症（因子活性度５〜３０％）、亜正常（因子活性度３０〜５０％）に分類し、重症度によってその症状が異なる。例えば、重症血友病Ａ患者の場合は、特別の外傷なしにも自然出血がいつでも起き得るため、治療薬（第ＶＩＩＩ因子濃縮物）が開発される前には脳出血などによって平均寿命が２５歳程度に過ぎなかった。重症度分布をみると、血友病Ａは重症、中等症、軽症患者の頻度がそれぞれ７０％、１５％、１５％程度、血友病Ｂはそれぞれ５０％、３０％、２０％程度である。出血の頻度は一般に、重症患者の場合は週１回、中等症患者の場合は月１回、軽症患者の場合は年１回程度と知られており、出血部位は関節及び筋肉である場合が最も多い。特に、関節出血は１５〜２５歳で明らかになり、出血が反復される場合には平均５０年程度血友病性関節病症（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）による関節の拘縮による苦痛に悩まされる。
【００１０】
血友病の薬物治療において抗体生成（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）反応を予測することは非常に重要である。血友病Ａ患者における抗体生成反応頻度は約３０％であり、血友病Ｂ患者では約３％である（Ｋｅｓｓｌｅｒ  ＣＭ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．２００５：４２９−３５）。血友病治療剤に対する抗体は薬剤露出後５０日以内に最大発生し、通常、０．６ＢＵ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｕｎｉｔ）以上の時に抗体生成群として分類され、５ＢＵ以上の時には高抗体生成群として分類される（Ｋａｓｐｅｒ  ＣＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｄｉａｔｈ  Ｈａｅｍｏｒｒｈ．１９７５；３４（２）：６１２；Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９５；７３（２）：２４７−５１；Ｖｉｅｌ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００９；３６０（１６）：１６１８−２７；Ｋｅｍｔｏｎ  ＣＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（１）：１１−７）。抗体生成反応がある患者の治療は非常に難しく、特に頻繁な出血による関節合併症が頻繁に発生する（Ｐａｒｋ  ＹＳ，Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ２００９；５２（１２）：１２０１−６）。代替療法には、活性化プロトロンビン複合体、第ＶＩＩ因子組換え製剤のような迂回因子の投与があるが、抗体生成反応群では免疫寛容療法によって抗体を除去することがより好ましいだろう（Ｋｅｍｔｏｎ  ＣＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（１）：１１−７；Ｐａｒｋ  ＹＳ，Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ２００９；５２（１２）：１２０１−６）。免疫寛容療法の成功率は３０〜８０％と多様であり、免疫寛容療法施行後に患者は再び第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子製剤の持続した使用が可能である（Ｐａｒｋ  ＹＳ，Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ２００９；５２（１２）：１２０１−６）。
【００１１】
血友病治療剤抗体生成反応の主要予測因子又は原因について様々な研究が進行されてきた。そのうち、遺伝的予測因子としてはＦ８遺伝子の欠陥が最大の原因として知られており（Ｓｃｈｗａａｂ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９５７４（６）：１４０２−６；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９７，７７（２）：２３８−４２）、ＭＨＣ  ＩＩ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＣＴＬＡ−４などの遺伝子に位置しているＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）変異も有意の統計的連関性を示すものと考えられるが、まだ明らかになっていない遺伝的予測因子が多数存在すると予想される（Ｈａｙ  ＣＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９７７７（２）：２３４−７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９７；７７（２）：２３８−４２；Ａｓｔｅｒｍａｒｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６ａ，１０７（８）：３１６７−７２；Ａｓｔｅｒｍａｒｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６ｂ，１０８（１２）：３７３９−４５；Ａｓｔｅｒｍａｒｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００７，５（２）：２６３−５）。
【００１２】
一方、微生物がウイルスに対応するための兔疫体系であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、２０１２年に、異種の細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを導入してターゲット塩基配列を選択的に切断することができ、これを用いて微生物からヒト細胞にまで至る様々な細胞に対するゲノムを編集できるということが知られ、遺伝子編集技術として、生物改良においてより効率的で便利に活用されるものと期待されている（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１，２０１２）。
【００１３】
遺伝子編集技術において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、これを構成するＣａｓ９及びｓｇＲＮＡによってターゲットＤＮＡ上に二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）を生成させ、細胞はこれを損傷部位として認識して非相同的末端接合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）又は相同性基盤修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ，ＨＤＲ）による通常のＤＮＡ修復過程を誘導するようになり、この過程で変異又は遺伝子交替による正常化が可能であり、これを活用してゲノム編集を誘導することができる。非相同的末端接合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）機転は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの作用で生成されたＤＳＢを整えた後、単純接合させるが、その過程でフレームシフト突然変異（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）が導入されて容易に遺伝子欠失を誘導でき、一方、切断された部位と相同性の遺伝子断片が存在する場合には相同性基盤修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ，ＨＤＲ）機転が起き得、この機転によっては遺伝子置換による正常化又は欠失を誘導することができる。
【００１４】
このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは標的遺伝子の正確な位置を欠失できるので、形質転換動物の製造において非常に有利である。血友病研究のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づく形質転換動物を製造するための努力が続いており、最近ではＮＳＧマウス（Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ−Ｉｌ２γ−／−）でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを適用してＦＶＩＩＩ／ＦＩＸがノックアウトされたマウスが報告されたことがある（Ｃｈｉｎｇ−Ｔｚｕ  Ｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１４：２２，２０１６）。ウサギは、マウスに比べて生理学及び解剖学的側面においてヒトとより多くの類似点を示し、ブタとサルに比べて、安価な維持費及び短い妊娠期間がかかることから、生物医学研究のための有望な動物モデルであるが、まだＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた血友病ウサギモデルは知られたことがない実情である。
【００１５】
このような背景の下に、本発明者らは、第８因子及び／又は第９因子がノックアウトされたウサギを製造するために鋭意努力した結果、第８因子及び／又は第９因子のエクソン領域に相補的に結合可能なｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いてウサギを作製する場合、第８因子及び／又は第９因子がノックアウトされたウサギを製造できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
この背景技術の部分に記載された前記情報は、単に本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、そこで、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって既に知られた先行技術を形成する情報を含めなくてもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、第８因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，ＦＶＩＩＩ）又は第９因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ，ＦＩＸ）のそれぞれのエクソン１領域とエクソン２領域に相補的に結合するターゲッティングドメインを含むｓｇＲＮＡ、これを含むベクター及び該ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに関する。
【００１８】
本発明の他の目的は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて製造された第８因子及び／又は第９因子がノックアウトされた形質転換ウサギ及びその製造方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、第８因子及び／又は第９因子がノックアウトされた形質転換ウサギを血友病研究のモデルとして活用するなどの用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記目的を達成するために、本発明は、第８因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，ＦＶＩＩＩ）又は第９因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ，ＦＩＸ）のエクソン領域の一部に相補的に結合するターゲッティングドメインを含むｓｇＲＮＡを提供する。
【００２１】
本発明はまた、前記ｓｇＲＮＡを暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドが挿入されたベクター、前記ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及び前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて製造された第８因子及び／又は第９因子がノックアウトされた形質転換ウサギを提供する。
【００２２】
本発明はまた、（ａ）前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）して、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ｍＲＮＡを製造する段階；（ｂ）受精卵に前記（ａ）段階で製造したｍＲＮＡを導入して培養する段階；及び（ｃ）前記（ｂ）段階で得た受精卵を代理母に移植して分娩させる段階を含む、第８因子又は第９因子がノックアウトされた形質転換ウサギの製造方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、第８因子又は第９因子がノックアウトされた形質転換ウサギから分離した細胞、組織及び副産物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】（Ａ）は、本発明の一実施例に係る形質転換ウサギを作製するために製造するｓｇＲＮＡがターゲッティングする第８因子遺伝子の位置を示す模式図であり、（Ｂ）は、本発明の一実施例に係る形質転換ウサギを作製するために製造するｓｇＲＮＡがターゲッティングする第９因子遺伝子の位置を示す模式図である。
【図２】（Ａ）は、本発明で製造した形質転換ウサギにおいて第８因子のノックアウトを検出するためのＮＧＳ基盤シーケンシング分析に用いられるアンプリコンの配列を示すものであり、（Ｂ）は、本発明で製造した形質転換ウサギにおいて第９因子のノックアウトを検出するためのＮＧＳ基盤シーケンシング分析に用いられるアンプリコンの配列を示すものである。
【図３】（Ａ）は、本発明で製造した第８因子ノックアウトウサギ第２個体において第８因子遺伝子の４ｂｐが欠失したことを確認した結果であり、（Ｂ）は、本発明で製造した第８因子ノックアウトウサギ第３個体において第８因子遺伝子の欠失突然変異を確認した結果である。
【図４】（Ａ）は、本発明で製造した第９因子ノックアウトウサギ第６個体において第９因子遺伝子の欠失突然変異を確認した結果であり、（Ｂ）は、本発明で製造した第９因子ノックアウトウサギ第７個体において第９因子遺伝子の欠失突然変異を確認した結果であり、（Ｃ）は、本発明で製造した第９因子ノックアウトウサギ第８個体において第９因子遺伝子の欠失突然変異を確認した結果である。
【図５】（Ａ）は、本発明で製造した第９因子ノックアウトウサギ第９個体において第９因子遺伝子の欠失突然変異を確認した結果であり、（Ｂ）は、本発明で製造した第９因子ノックアウトウサギ第１１個体において第９因子遺伝子の欠失突然変異を確認した結果である。
【図６】（Ａ）は、本発明で製造した第９因子ノックアウトウサギ第１２個体において第９因子遺伝子の欠失突然変異を確認した結果であり、（Ｂ）は、本発明で製造した第９因子ノックアウトウサギ第１３個体において第９因子遺伝子の欠失突然変異を確認した結果であり、（Ｃ）は、本発明で製造した第９因子ノックアウトウサギ第５個体において第９因子遺伝子の欠失突然変異を確認した結果である。
【図７】（Ａ）は、第８因子又は第９因子がノックアウトされた形質転換ウサギのＡＰＴＴ分析結果を測定したグラフであり、正常ウサギ４匹、第８因子がノックアウトされたウサギ２匹、及び第９因子がノックアウトされたウサギ７匹の血漿で２回或いは３回反復して行った実験を示し、（Ｂ）は、正常ウサギ９匹、第８因子がノックアウトされたウサギ３匹、及び第９因子がノックアウトされたウサギ８匹の血漿で２回或いは３回反復して行ったＴＧＡ分析結果を示すグラフであり、この結果は、ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍを示すものであり、統計的有意性は両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）、対応のないｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）で確認し、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する。
【図８】Ｆ１世代及びＦ２世代生産のための繁殖家系図を示す。
【図９】本発明で製造した第８因子ノックアウトウサギ第２個体である雄を正常雌と交配させて得た子孫雌の遺伝子インデル（Ｉｎｄｅｌ）突然変異を確認した結果である。
【図１０】本発明で製造した第９因子ノックアウトウサギ第６個体である雄を正常雌と交配させて得た子孫雌の遺伝子欠失突然変異を確認した結果である。
【図１１】本発明で製造した第８因子ノックアウトウサギのＦ１世代である雌（Ｘ’Ｘ）を正常雄と交配させて得たＦ２雄の遺伝子インデル（Ｉｎｄｅｌ）突然変異を確認した結果である。
【図１２】本発明で製造した第９因子ノックアウトウサギのＦ１世代である保因者雌（Ｘ’Ｘ）を正常雄と交配させて得たＦ２雄の遺伝子インデル突然変異を確認した結果である。
【図１３】ウサギ爪出血モデルを製造するための模式図である。
【図１４】溶血したサンプルから血液中のヘモグロビン量を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
特に定義されない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は、この技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
【００２６】
本発明の用語“核酸”と“ポリヌクレオチド”は、線形又は環状の立体形態において、そして一本鎖又は二本鎖の形態においてデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド重合体を指す。本発明の目的において、これらの用語は重合体の長さに対して限定するものとして解釈されない。これらの用語は、自然ヌクレオチドの公知された類似体だけでなく、塩基、糖及び／又はリン酸塩モイエティ（例えば、ホスホロチオエート中枢）で修飾されるヌクレオチドを包括できる。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は同一の塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対をなすだろう。
【００２７】
本発明の用語“ヌクレオチド”は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは標準ヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、及びウリジン）又はヌクレオチド類似体であり得る。ヌクレオチド類似体は、修飾されたプリン又はピリミジン塩基又は修飾されたリボースモイエティを有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、自然的に発生するヌクレオチド（例えば、イノシン）又は非自然的に発生するヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖又は塩基モイエティ上で修飾の無制限的な実例は、、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、及びチオール基の付加（又は除去）だけでなく、塩基の炭素と窒素原子の他の原子（例えば、７−デアザプリン）への置換を含む。ヌクレオチド類似体はまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びモルフォリノを含む。
【００２８】
本発明の用語“ｓｇＲＮＡ”とは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにおいてＣａｓタンパク質を標的領域に誘導する誘導ＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）において、標的領域と相補的に結合する最初の領域を意味する。
【００２９】
本発明において誘導ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と相互作用してＣａｓタンパク質を特定の標的部位に向かわせ、前記部位において誘導ＲＮＡの５’端部は染色体配列内に特定のプロトスペーサー配列と塩基対をなす。
【００３０】
各誘導ＲＮＡは３種類の領域を含む：染色体配列内の標的部位に相補的な５’端部で１番目の領域、ステムループ構造を形成する２番目の内部領域、及び本質的に一本鎖として残っている３番目の３’領域。各誘導ＲＮＡの１番目の領域は、各誘導ＲＮＡが融合タンパク質を特定の標的部位に誘導するように互いに異なる。各誘導ＲＮＡの２番目と３番目の領域は全ての誘導ＲＮＡにおいて同一であり得る。
【００３１】
誘導ＲＮＡの１番目の領域は、誘導ＲＮＡの１番目の領域が標的部位と塩基対をなし得るように、染色体配列内の標的部位で配列（すなわち、プロトスペーサー配列）に相補的である。様々な具体例において、誘導ＲＮＡの１番目の領域は、約１０個のヌクレオチド又は約２５個を超えるヌクレオチドを含むことができる。例えば、誘導ＲＮＡの１番目の領域と染色体配列内の標的部位との間に塩基ハマグリの領域は長さにおいて約１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２２個、２３個、２４個、２５個、又は２５個よりも多いヌクレオチドであり得る。例示的な具体例において、誘導ＲＮＡの１番目の領域は長さにおいて約１９個、２０個、又は２１個のヌクレオチドである。
【００３２】
誘導ＲＮＡはまた、二次構造を形成する２番目の領域を含む。一部の具体例において、二次構造は、ステム（又は、ヘアピン）及びループを含む。ループとステムの長さは変わり得る。例えば、ループは長さにおいて約３個〜約１０個のヌクレオチド範囲で変わり、またステムは長さにおいて約６個〜約２０個の塩基対範囲で変わり得る。ステムは、１個〜約１０個ヌクレオチドの１つ又はそれ以上の突出を含むことができる。したがって、２番目の領域の全般的な長さは、長さにおいて約１６個〜約６０個のヌクレオチド範囲で変わり得る。例示的な具体例において、ループは長さにおいて約４個のヌクレオチドであり、またステムは約１２個の塩基対を含む。
【００３３】
誘導ＲＮＡはまた、本質的に一本鎖として残っている３’端部において３番目の領域を含む。したがって、３番目の領域は関心の細胞内に任意の染色体配列に対する相補性を有さず、そして誘導ＲＮＡの残り部分に相補性を有しない。３番目の領域の長さは変わり得る。一般に、３番目の領域は長さにおいて約４個よりも多いヌクレオチドである。例えば、３番目の領域の長さは、長さにおいて約５個〜約６０個のヌクレオチド範囲で変わり得る。
【００３４】
誘導ＲＮＡの２番目と３番目の領域（また、普遍的な又は骨格領域と呼ばれる）の合計長さは、長さにおいて約３０〜約１２０個のヌクレオチド範囲で変わり得る。一様相において、誘導ＲＮＡの２番目と３番目の領域の合計長さは、長さにおいて約７０個〜約１００個のヌクレオチド範囲で変わる。
【００３５】
本発明ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて第８因子及び／又は第９因子がノックアウトされたウサギを製造できるかどうか確認しようとした。
【００３６】
すなわち、本発明の一実施例では、第８因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，ＦＶＩＩＩ）又は第９因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ，ＦＩＸ）のエクソン領域の一部に相補的に結合するターゲッティングドメインを含むｓｇＲＮＡを製造し、これを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）して、ウサギ受精卵に注入した後、培養して代理母に移植した後、ウサギを生産した結果、製造されたウサギの第８因子又は第９因子のエクソン領域で欠失突然変異が発生することを確認した（図３〜図７）。
【００３７】
したがって、本発明は、一観点において、第８因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，ＦＶＩＩＩ）又は第９因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ，ＦＩＸ）のエクソン領域の一部に相補的に結合するターゲッティングドメインを含むｓｇＲＮＡに関する。
【００３８】
本発明において、前記第８因子遺伝子のエクソン領域は、配列番号１の塩基配列で表されるエクソン領域であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【００３９】
本発明において、前記第９因子遺伝子のエクソン領域は、配列番号２の塩基配列で表されるエクソン領域であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明はまた、前記ｓｇＲＮＡを暗号化するポリヌクレオチドに関する。
【００４１】
本発明において、前記ポリヌクレオチドは配列番号３〜６のいずれかの塩基配列で表されることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【００４２】
本発明において、前記ｓｇＲＮＡを暗号化するポリヌクレオチドは一般に、関心の細胞又は胚芽においてｓｇＲＮＡの発現のために少なくとも一つの転写制御配列に作動可能に連結される。例えば、ｓｇＲＮＡをエンコードするＤＮＡは、ＲＮＡ重合酵素ＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。適合したＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターの実例には哺乳類Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、及び７ＳＬ  ＲＮＡプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドが挿入されたベクターに関する。
【００４４】
ｓｇＲＮＡをエンコードするＤＮＡ分子は線形又は環状であり得る。一部の具体例において、ｓｇＲＮＡをエンコードするＤＮＡ配列はベクターの部分であり得る。適合したベクターは、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／微小染色体、トランスポゾン、及びウイルスベクターを含む。例示的な具体例において、Ｃａｓタンパク質をエンコードするＤＮＡはプラスミドベクター内に存在する。適合したプラスミドベクターの無制限的な実例は、、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びこれらの変異体を含む。ベクターは追加発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選別可能マーカー配列（例えば、抗生剤耐性遺伝子）、複製起点、その他を含むことができる。
【００４５】
Ｃａｓタンパク質とｓｇＲＮＡの両方ともＤＮＡ分子として細胞内に導入される具体例において、それぞれは別個の分子の部分（例えば、融合タンパク質コード配列を内包する一つのベクター及びｓｇＲＮＡコード配列を内包する２番目のベクター）であり得るか、或いは両方とも同一の分子の部分（例えば、融合タンパク質と誘導ＲＮＡの両方に対するコード（及び調節）配列を内包する一つのベクター）であり得る。
【００４６】
本発明はまた、前記ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに関する。
【００４７】
本発明において、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、タイプＩ、タイプＩＩ、又はタイプＩＩＩシステムであり得る。適合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の無制限的な実例は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６を含む。
【００４８】
本発明において、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は前記Ｃａｓ９タンパク質から由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ノカルジオプシスダッソンビエイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトミセスプリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトミセスビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセスビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウムロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウムロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、アリサイクロバチルスアシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルスシュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルスセレニティレドセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エキシグオバクテリウムシビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバシラスデルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルスサリヴァリゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、マイクロシーラマリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ）、バークホルデリアバクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナスナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）種、クロコスファエラワトソニー（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ミクロキスティスエルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）種、アセトハロビウムアラビティカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アンモニフェックスデゲンシイ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルジセルロシルプトルベスシ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｓｃｉｉ）、カンジデイタスデサルホルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、クロストリジウムボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディアマグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）、ナトロアナエロビウスサーモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクルムサーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシディチオバチルスカルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ）��アシディチオバチルスフェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマチウムビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）種、ニトロソコッカスハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカスワトソニイ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナスハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドノバクターラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウムエベスチガータム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナバリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノジュラリアスプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）種、アルスロスピラマキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラプラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）種、リングビア（Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．）種、ミクロコレウスクソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オスキラトリア（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ）種、ペトロトガモビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシフォアフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、又はアカリオクロリスマリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ）に由来し得る。
【００４９】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも一つのＲＮＡ認識及び／又はＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ認識及び／又はＲＮＡ結合ドメインは誘導ＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮＡ分解酵素又はＲＮＡ分解酵素ドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮＡ分解酵素ドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメインだけでなく、他のドメインを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、又は野生型又は修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、核酸結合親和性及び／又は特異性を増加させ、酵素的活性を変更及び／又はタンパク質の他の性質を変化させるために修飾され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素）ドメインは修飾されたり、欠失したり、又は不活性化され得る。代案として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は融合タンパク質の機能に必須でないドメインを除去するために切頭され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質はまた、融合タンパク質の作動体ドメインの活性を最適化するために切頭又は修飾され得る。
【００５０】
一部の具体例において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はその断片から由来し得る。他の具体例において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、修飾されたＣａｓ９タンパク質から由来し得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質の一つ又はそれ以上の性質（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性など）を変更するために修飾され得る。代案として、ＲＮＡ−誘導された開裂に関連しないＣａｓ９タンパク質のドメインがタンパク質から除去され得、したがって、修飾されたＣａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも小さい。
【００５１】
一般に、Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２個のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮＡ分解酵素）ドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。ＲｕｖＣとＨＮＨドメインは一本鎖を切断してＤＮＡで二本鎖切断を作るために共に作動する（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６−８２１）。一部の具体例において、Ｃａｓ９−由来したタンパク質は、単に一つの機能的ヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様又はＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか一方）だけを内包するように修飾され得る。例えば、Ｃａｓ９−由来したタンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうち一つが欠失したり又は突然変異され、したがって、これがそれ以上機能しないように（すなわち、ヌクレアーゼ活性が不在するように）修飾され得る。ヌクレアーゼドメインのうち一つが非活性である一部の具体例において、Ｃａｓ９−由来したタンパク質は二本鎖核酸内にニックを導入できるが（かかるタンパク質は“ニック酵素”と命名する）、二本鎖ＤＮＡを開裂しない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおいてアスパラギン酸塩からアラニン（Ｄ１０Ａ）への転換は、Ｃａｓ９−由来したタンパク質をニック酵素に転換する。同様に、ＨＮＨドメインにおいてヒスチジンからアラニン（Ｈ８４０Ａ又はＨ８３９Ａ）への転換は、Ｃａｓ９−由来したタンパク質をニック酵素に転換する。各ヌクレアーゼドメインは、広く公知された方法、例えば、部位−指向された突然変異誘発、ＰＣＲ−媒介された突然変異誘発、そして全体遺伝子合成だけでなく、当分野に公知の他の方法を用いて修飾され得る。
【００５２】
本発明において、前記Ｃａｓタンパク質をエンコードするＤＮＡは、少なくとも一つのプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。一部反復において、ＤＮＡコード配列は関心の真核細胞又は動物で発現のためにプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。プロモーター制御配列は、構造性のもの、調節されたもの、又は組織特異的なものであり得る。適合した構造性プロモーター制御配列には、サイトメガロウイルス極初期プロモーター（ＣＭＶ）、類人猿ウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、延長因子（ＥＤ１）−アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、これらの断片、又は前述したものの任意の組合せが含まれるが、それらに限定されない。適合した調節されたプロモーター制御配列の実例は制限されず、熱ショック、金属、ステロイド、抗生剤、又はアルコールによって調節されたものを含む。組織特異的プロモーターの無制限的な実例は、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ−１プロモーター、エンドグリンプロモーター、繊維結合素プロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ−２プロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、及びＷＡＳＰプロモーターを含む。プロモーター配列は野生型であるか、或いはより効率的な又は有効な発現のために修飾され得る。一例示的な具体例において、エンコーディングＤＮＡは哺乳類細胞において構造性発現のためにＣＭＶプロモーターに作動可能に連結され得る。
【００５３】
本発明において、前記Ｃａｓタンパク質をエンコードする配列は、試験管内ｍＲＮＡ合成のためのファージＲＮＡ重合酵素によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。かかる具体例において、試験管内転写されたＲＮＡは公知の方法で精製して使用することができる。例えば、プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモーター配列又はＴ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモーター配列の変異であり得る。例示的な具体例において、Ｃａｓタンパク質をエンコードするＤＮＡは、Ｔ７ＲＮＡ重合酵素を用いた試験管内ｍＲＮＡ合成のためにＴ７プロモーターに作動可能に連結される。
【００５４】
代案の具体例において、Ｃａｓタンパク質をエンコードする配列は、細菌又は真核細胞においてＣａｓタンパク質の試験管内発現のためにプロモーター配列に作動可能に連結され得る。かかる具体例において、発現されたタンパク質は公知の方法で精製して使用することができる。適合した細菌プロモーターは制限されず、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｐプロモーター、それらの変異、及びそれらの組合せを含む。例示的な細菌プロモーターは、ｔｒｐとｌａｃプロモーターのハイブリッドであるｔａｃである。適合した真核プロモーターの無制限的な実例は、前記で列挙されている。追加の様相において、Ｃａｓタンパク質をエンコードするＤＮＡはまた、ポリアデニル化信号（例えば、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ信号、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ｐｏｌｙＡ信号など）及び／又は少なくとも一つの転写終結配列に連結され得る。
【００５５】
様々な具体例において、Ｃａｓタンパク質をエンコードするＤＮＡはベクター内に存在し得る。適合したベクターは、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／微小染色体、トランスポゾン、及びウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ関連したウイルスベクターなど）を含む。一具体例において、Ｃａｓタンパク質をエンコードするＤＮＡはプラスミドベクター内に存在する。適合したプラスミドベクターの無制限的な実例は、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びそれらの変異体を含む。前記ベクターは追加発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選別可能マーカー配列（例えば、抗生剤耐性遺伝子）、複製起点、その他を含むことができる。追加情報は、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３、又は“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参考にすればよい。
【００５６】
誘導ＲＮＡと共にＣａｓタンパク質は染色体配列内で標的部位に指向され、ここで、Ｃａｓタンパク質は染色体配列内に二本鎖切断を導入する。標的部位は、前記配列の直後に（下流）共通配列が続くという点を除けば、配列制限を有しない。このような共通配列はまた、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られている。ＰＡＭの実例には、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ、及びＮＮＡＧＡＡＷ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドと規定され、そしてＷはＡ又はＴと規定される）が含まれるが、それらに限定されない。上述の通り、誘導ＲＮＡの１番目の領域（５’端部において）は標的配列のプロトスぺーサーに相補的である。
【００５７】
典型的に、誘導ＲＮＡの１番目の領域は、長さにおいて約１９個〜２１個ヌクレオチドである。したがって、一定の様相において、染色体配列内に標的部位の配列は５’−Ｎ１９−２１−ＮＧＧ−３’である。ＰＡＭはイタリック体で表示される。標的部位は遺伝子のコード領域、遺伝子のイントロン、遺伝子の制御領域、遺伝子間の非コード領域などにあり得る。遺伝子は、タンパク質コード遺伝子又はＲＮＡコード遺伝子であり得る。遺伝子は関心の任意の遺伝子であり得、好ましくは第８因子又は第９因子であり得る。
【００５８】
本発明は、他の観点において第８因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，ＦＶＩＩＩ）又は第９因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ，ＦＩＸ）のエクソン領域の一部に相補的に結合するターゲッティングドメインを含むｓｇＲＮＡを暗号化するポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて製造された形質転換ウサギに関する。
【００５９】
本発明において、前記形質転換ウサギは、
（ａ）上記の本発明に係るＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９システムを転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）してｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ｍＲＮＡを製造する段階；
（ｂ）受精卵に前記（ａ）段階で製造したｍＲＮＡを導入して培養する段階；及び
（ｃ）前記（ｂ）段階で得た受精卵を代理母に移植して分娩させる段階；を含む方法で製造されることを特徴とし得る。
【００６０】
本発明において、前記形質転換ウサギは、分娩後に形質転換の有無を確認する段階をさらに含む方法で製造されることを特徴とし得る。
【００６１】
本発明は、さらに他の観点において、前記形質転換されたウサギを交配して子孫形質転換ウサギを生産する段階を含む方法で製造されることを特徴とする子孫形質転換ウサギに関する。
【００６２】
本発明において、前記“子孫”は、前記形質転換ウサギと交配して生存可能な全ての形質転換仔ウサギを意味し、より具体的には、前記形質転換ウサギを親にして形質されたウサギ同士又は前記形質転換ウサギと正常ウサギとを交配して生産したＦ１世代、Ｆ１世代の保因者ウサギと正常ウサギとを交配して生産したＦ２世代及びそれ以降の世代を意味するが、これに限定されるものではない。
【００６３】
本発明において、前記交配は、前記形質転換ウサギ又は正常ウサギと交配することを特徴とし得る。
【００６４】
本発明において、前記形質転換ウサギ又は子孫形質転換ウサギは、第８因子又は第９因子がノックアウトされて血友病表現型を示すことを特徴とし得る。
【００６５】
本発明はまた、前記形質転換ウサギ又は子孫形質転換ウサギから分離した細胞、組織及び副産物に関する。
【００６６】
本発明において、前記副産物は、前記形質転換ウサギから由来した物質の全てを意味し、好ましくは、血液、血清、尿、糞便、唾液、臓器及び皮膚からなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【００６７】
一側面において、本発明は
（ａ）前記本発明に係るＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９システムを転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）してｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ｍＲＮＡを製造する段階；
（ｂ）受精卵に前記（ａ）段階で製造したｍＲＮＡを導入して培養する段階；及び
（ｃ）前記（ｂ）段階で得た受精卵を代理母に移植して分娩させる段階を含む方法は、第８因子又は第９因子がノックアウトされた形質転換ウサギの製造方法に関する。
【００６８】
本発明はまた、前記製造方法で製造された形質転換ウサギを交配して子孫形質転換ウサギを生産する段階を含む子孫形質転換ウサギの製造方法に関する。
【００６９】
本発明において、前記交配は、前記形質転換ウサギ又は正常ウサギと交配することを特徴とし得る。
【００７０】
本発明はまた、第８因子がノックアウトされたウサギを交配して所望だけの血友病Ａ表現型を示す形質転換ウサギ及びその製造方法に関する。
【００７１】
本発明はまた、第９因子がノックアウトされたウサギを交配して所望だけの血友病Ｂ表現型を示す形質転換ウサギ及びその製造方法に関する。
【００７２】
本発明はまた、第８因子がノックアウトされたウサギ或いは第９因子がノックアウトされたウサギを交配してヒト第８因子或いは第９因子の注入による免疫反応を研究できる形質転換ウサギ及びその製造方法に関する。
【００７３】
本発明の第８因子及び第９因子がノックアウトされたウサギは、自分の第８因子及び第９因子の活性がないので、ヒト第８因子及び第９因子の注入による免疫反応研究及び血友病治療剤開発研究に有用である。
【００７４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００７５】
実施例１．ｓｇＲＮＡ設計及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター構築及び転写（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）
１−１．ｓｇＲＮＡ設計
第８因子の場合、エクソン１領域で下記の配列番号１で表される配列を用いて配列番号３及び配列番号４の塩基配列で表されるｓｇＲＮＡを設計した（図１）。
配列番号１：
ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGTTTCTTTGTGTGTATTTTACAATTGAGCTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGAACTGTCCTGGGACTATATGCACAGTGAC CTGCTCAGTGA
配列番号３：ｓｇＲＮＡ１（＋Ｓｔｒａｎｄ）
5’- GCCACCAGAAGATACTACCTGGG -3’
配列番号４：ｓｇＲＮＡ２（−Ｓｔｒａｎｄ）
5’- GTCACTGTGCATATAGTCCCAGG -3’
【００７６】
第９因子の場合、エクソン２領域において下記の配列番号２で表される配列を用いて配列番号５及び配列番号６の塩基配列で表されるｓｇＲＮＡを設計した。
配列番号２：
TTTTTCTTGATCATGAAAATGCCACCAAAATTCTGAATCGGGCAAAGAGGTACAATTCAGGTAAACTGGAAGAGTTTGTTTCAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATAGAAGAAAGGTGTAGTTTTGAAGAAGCTCGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAAAACT
配列番号５：ｓｇＲＮＡ１（＋Ｓｔｒａｎｄ）
5’- ATGCCACCAAAATTCTGAATCGG -3
配列番号６：ｓｇＲＮＡ２（＋Ｓｔｒａｎｄ）
5’ CGGGCAAAGAGGTACAATTCAGG -3’
【００７７】
１−２．ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ｍＲＮＡ転写
実施例１−１で設計したｓｇＲＮＡ配列に合うオリゴヌクレオチドをデザインしてｐＵＣ５７−Ｔ７ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  ５１３０６）にクローニングした後、完成されたｓｇＲＮＡ及びその前に位置したＴ７プロモーターを配列番号７及び８のプライマーでＰＣＲによって増幅した。
【００７８】
前記ＰＣＲ増幅産物をＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて生産（ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ）した後、精製した（ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）。
配列番号７：Ｔ７−Ｆ
5’- GAAATTAATACGACTCACTAT -3’
配列番号８：Ｔ７−Ｒ
5’- AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC -3’
【００７９】
Ｃａｓ９ｍＲＮＡの場合、Ｃａｓ９発現ベクターを線形化（ｌｉｎｅａｒｉｚｅ）した後、ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ  ＳＰ６  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＣａｐｐｅｄ  ｍＲＮＡの形態に生産した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【００８０】
実施例２．受精卵に転写されたＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ注入
公知の方法（Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１６；６：２２２０２４）でウサギ受精卵に、実施例１で得たＣａｓ９／ＦＶＩＩＩ  ｓｇＲＮＡ又はＣａｓ９／ＦＩＸ  ｓｇＲＮＡをそれぞれ導入した。
【００８１】
概略には、受精後１８〜２０時間が過ぎた後に得られたウサギ受精卵を受精卵培養培地（９．５ｇ  ＴＣＭ−１１９、０．０５ｇ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ，Ｓ４０１９）、０．７５ｇ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｈ３７８４）、０．０５ｇペニシリン、０．０６ｇストレプトマイシン、１．７５５ｇ  ＮａＣｌ、３．０ｇ  ＢＳＡ及び１Ｌ  Ｍｉｌｌｉ  Ｑ蒸留水）に移した後、ＦＶＩＩＩ  ｓｇＲＮＡ（２５ｎｇ／μｌ）とＣａｓ９  ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）又はＦＩＸ  ｓｇＲＮＡ（２５ｎｇ／μｌ）とＣａｓ９  ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を受精卵（ｅｍｂｒｙｏ）の細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）に注入した後、培養培地で３８．５℃で３０〜６０分間５％二酸化炭素条件で培養した後、代理母に移植して分娩させた。
【００８２】
実施例３．形質転換ウサギ遺伝型分析
３−１．第８因子ノックアウトウサギの遺伝型分析
図２の（ａ）に表示されたアンプリコンを配列番号９及び１０のプライマーを用いて増幅した後、２次及び３次ＰＣＲによってアダプター及びタグ（ｔａｇ）を付着した後、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｖ）を用いて深いシーケンシング（ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った後、その結果をＣａｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１７Ｊａｎ１５；３３３（２）：２８６−２８８）を用いて分析した。
配列番号９：Ｆ８−Ｆ
5’- gagccatgcaaatagagctc -3’
配列番号１０：Ｆ８−Ｒ
5’- atctttctccagccagagtc -3’
その結果、表１及び図３に示すように、第２個体及び第３個体のＦＶＩＩＩ遺伝子からインデルが検出されることが確認できた。
【００８３】
【表１】
2022000055.tif 000003
【００８４】
すなわち、第２個体では４ｂｐの核酸が欠失した突然変異が検出され、未成熟終止コドン（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）及びナンセンス変異依存分解系（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｃａｙ）を引き起こして遺伝子発現を阻害することを確認し、第３個体では３ｂｐと１２ｂｐの核酸が欠失した突然変異を検出した（図３）。
【００８５】
３−２．第９因子ノックアウトウサギの遺伝型分析
図２の（ｂ）に表示されたアンプリコンを配列番号１１及び１２のプライマーを用いて増幅した後、２次及び３次ＰＣＲによってアダプター及びタグを付着した後、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｖ）を用いて深いシーケンシングを行った後、その結果をＣａｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１７Ｊａｎ１５；３３３（２）：２８６−２８８）を用いて分析した。第５個体の場合、配列番号１３のＦ９−Ｒ２プライマーを用いて１次増幅した。
配列番号１１：Ｆ９−Ｆ
5’- ttggctttgggattagttgg -3’
配列番号１２：Ｆ９−Ｒ
5’- tcaaaaacttctcgagcttc -3’
配列番号１３：Ｆ９−Ｒ２
5‘- tctctgtctgtaactctacc -3’
【００８６】
その結果、表２及び図４〜図６に示すように、第５個体、第６個体、第７個体、第８個体、第９個体、第１１個体、第１２個体及び第１３個体のＦＩＸ遺伝子においてインデルが検出されることが確認できた。
【００８７】
【表２】
2022000055.tif 000004
【００８８】
実施例４．形質転換ウサギの血友病表現型確認
４−１．ＡＰＴＴ（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ  Ｔｉｍｅ）分析
ＡＰＴＴ分析を行うために、Ｓｔａｒｔ  ４  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｔａｇｏ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて実時間でＡＰＴＴクロット（ｃｌｏｔ）のウェーブフォームを観察した。すなわち、５０μｌのＡＰＴＴ試薬（Ｄａｄｅ（登録商標）  Ａｃｔｉｎ  ＦＳＬ，Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）溶液と形質転換ウサギから採取した５０μｌの血漿をキュベットで混ぜた後、３７゜Ｃで３分間培養した後、５０μｌの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液（最終濃度：２５ｍＭ）をキュベットに注入した後、クロットができる時間を測定した。
【００８９】
その結果、図７のＡに開示されたように、ＦＶＩＩＩがノックアウトされたウサギの場合、クロット形成時間が１９．４±１．１秒で、ＦＩＸがノックアウトされたウサギの場合、その時間が１８．９±２．５秒であり、いずれも、血友病患者に該当する時間であることが確認できた。
【００９０】
４−２．トロンビン生産分析（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，ＴＧＡ）
トロンビン生産は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）蛍光プレートリーダーをＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶソフトウェアで分析して測定した。すなわち、形質転換ウサギの血漿８０μｌと組織因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ）及びリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）を含有した２μｌのＰＰＰ−ｒｅａｇｅｎｔ  ＬＯＷを混ぜて３７℃のＩｍｍｕｌｏｎ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ２ＨＢ−Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎｕｎｃ）で培養した。コントロールウェルには８０μｌのウサギ血漿と２０μｌのトロンビン校正試薬（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  ｒｅａｇｅｎｔ）を混ぜて培養し、反応を開始する前に、蛍光を持つトロンビン基質とあらかじめ温めておいたＦｌｕ−Ｃａ試薬を注入してよく混ぜた。２０μｌのＦｌｕ−Ｃａ試薬を注入して反応を開始し、生産されるトロンビンの量はＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０で分析した。
【００９１】
その結果、図７のＢに開示された通り、対照群では３６．９±１．８ｎＭのトロンビンが生産されるのに対し、ＦＶＩＩＩがノックアウトされた形質転換ウサギでは０．１±０．１ｎＭが生産され、またＦＩＸがノックアウトされた形質転換ウサギでは０ｎＭのトロンビンが生産されることを確認した。
【００９２】
したがって、ＦＶＩＩＩ或いはＦＩＸの遺伝子が除去された形質転換ウサギは、血友病表現型を示すことが確認できる。
【００９３】
実施例５．Ｆ１世代及びＦ２世代生産のための繁殖家系図
実施例２で製造した血友病ウサギをＰ（又はＦ０）といい、その子孫に該当するＦ１とＦ２を得るために次を進行した。第８因子ノックアウト或いは第９因子をノックアウトさせた形質転換ウサギの子孫を得るためには、図８に開示されたように個体を繁殖させた。すなわち、血友病は、血友病遺伝子がＸ染色体上に存在する伴性遺伝病に該当するので、実施例２で製造した第８因子ノックアウト及び第９因子ノックアウト形質転換ウサギ父体（Ｐ，Ｘ’Ｙ）を正常ウサギ雌（ＸＸ）と交差させて子孫を生成した。最初の交差から得られた子孫雌（Ｆ１）の遺伝子分析をして、保因者（Ｘ’Ｘ）を確認した後、正常雄（ＸＹ）と交差させて第８因子ノックアウト及び第９因子ノックアウトをさせた形質転換ウサギの雄（Ｆ２，Ｘ’Ｙ）を製造した。
【００９４】
実施例６．Ｆ１世代の形質転換ウサギ遺伝型分析
６−１．第８因子ノックアウトウサギ保因者の遺伝型分析
表１の４ｂｐの核酸が欠失した突然変異が検出された＃２個体である雄ウサギ（Ｘ’Ｙ）をＳａｍｔａｋｏから購入した体重２ｋｇ以上及び１０〜１２週齢である正常雌（ＸＸ）と交配させて子孫を得、これを実施例３−１のような方法で遺伝子分析を行い、Ｆ１世代である雌保因者（Ｘ’Ｘ）を確認した。表３及び図９に示すように、第１個体と第５個体のＦＶＩＩＩ遺伝子からインデルパターンが検出されることが確認できた。
【００９５】
【表３】
2022000055.tif 000005
【００９６】
６−２．第９因子ノックアウトウサギ保因者の遺伝型分析
表２で６ｂｐの核酸が欠失した突然変異が検出された＃６個体である雄（Ｘ’Ｙ）を正常雌（ＸＸ）と交配させて子孫（Ｆ１）を得、実施例３−２のような方法で遺伝子分析を行って雌保因者（Ｘ’Ｘ）を確認した。表４及び図１０に示すように、＃４個体のＦＩＸ遺伝子からインデルパターンが検出されることが確認でき、形態は−６ｂｐ欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）と１ｂｐ挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）である。
【００９７】
【表４】
2022000055.tif 000006
【００９８】
実施例７．Ｆ２世代の形質転換ウサギ遺伝型分析
７−１．第８因子ノックアウトウサギの遺伝型分析
Ｆ１世代である保因者雌（Ｘ’Ｘ）をＳａｍｔａｋｏから購入した体重２ｋｇ以上及び１０〜１２週齢である正常雄（ＸＹ）と交配させて得たＦ２雄（Ｘ’Ｙ）に対して、実施例３−１のような方法で遺伝子分析を実施した。表５及び図１１に示すように、＃１−４個体と＃５−１個体のＦＶＩＩＩ遺伝子からインデルパターンが検出されることが確認できた。
【００９９】
【表５】
2022000055.tif 000007
【０１００】
７−２．第９因子ノックアウトウサギの遺伝型分析
Ｆ１世代である保因者雌（Ｘ’Ｘ）を正常雄（ＸＹ）と交配させて得たＦ２雄（Ｘ’Ｙ）に対して、実施例３−２のような方法で遺伝子分析を実施した。表６及び図１２に示すように、＃４−１個体のＦＩＸ遺伝子からインデルパターンが検出されることが確認でき、形態は６ｂｐ、７ｂｐ、２７ｂｐ欠失の形態であるが、７ｂｐ、２７ｂｐ欠失は、その比率がそれぞれ０．０２３％、０．００１％であり、配列分析エラーと判断され、その形態は６ｂｐ核酸欠失変異であることを確認した。
【０１０１】
【表６】
2022000055.tif 000008
【０１０２】
実施例８．Ｆ２世代として得られた形質転換ウサギの表現型確認
８−１．爪出血モデル
ウサギにおける爪出血モデルを誘導するために、体重２ｋｇ以上及び１２週齢以上になった実施例７の血友病ウサギとＳａｍｔａｋｏから購入した体重２ｋｇ以上及び１０〜１２週齢である正常ウサギにジアゼパム（Ｄｉａｚｅｐａｍ）０．４ｍｇ／ｋｇとペントバルビタールナトリウム（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ  ｓｏｄｉｕｍ）２５ｍｇ／ｋｇを耳介静脈から注射して麻酔した。麻酔されたウサギの片前足をバリカン（ｈａｉｒ  ｃｌｉｐｐｅｒ）で除毛し、デジマチックキャリパ（ｄｉｇｉｍａｔｉｃ  ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて第３足指の爪の遠位部の端から２ｍｍ近位部をクイック油性ペンを用いて表示した後、ワイヤカッター（ｗｉｒｅ  ｃｕｔｔｅｒ）を用いて切断した（図１３）。爪を切断すると直ちに３７゜Ｃに維持させた滅菌生理食塩水が入っている５０ｍＬ円錐管（ｃｏｎｉｃａｌ  ｔｕｂｅ）に入れて６０分間血液を集めた後、１５００ｘｇで５分間遠心分離して上澄液を除去した後、１０ｍＬピペットを用いて円錐管に３次蒸留水を２０ｍＬまで入れた後、ｖｏｒｔｅｘを用いて血液を完全に溶血させた。
【０１０３】
８−２．ヘモグロビン分析（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ａｓｓａｙ：ＨＢ）の分析
実施例８−１で溶血したサンプルを用いてヘモグロビン分析キット（Ｓｉｇｍａ  ａｎｄ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＡＫ１１５−１ＫＴ，＃ＢＦ０３Ａ２６Ｖ）の方法で血液中のヘモグロビンの量を定量して失血（ｂｌｏｏｄ  ｌｏｓｓ）を測定した。正常ウサギの場合、ヘモグロビンの濃度が１，０１４ｎＭ（Ｒａｎｇｅ：５０２−１５０３）であることを確認し、第８因子ノックアウトウサギのヘモグロビンの濃度が４５，７８７ｎＭ、第９因子ノックアウトウサギのヘモグロビンの濃度が４，６２０ｎＭであることを確認した（図１４）。
【０１０４】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に述べてきたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明に係る第８因子及び／又は第９因子がノックアウトされた形質転換ウサギは、血友病発生に重要な機能を果たすタンパク質である第８因子及び／又は第９因子の機能が抑制されているため、血友病治療剤の開発に利用したり血友病研究に有用である。
【図１】
2022000055.tif 000009
【図２】
2022000055.tif 000010
【図３】
2022000055.tif 000011
【図４】
2022000055.tif 000012
【図５】
2022000055.tif 000013
【図６】
2022000055.tif 000014
【図７】
2022000055.tif 000015
【図８】
2022000055.tif 000016
【図９】
2022000055.tif 000017
【図１０】
2022000055.tif 000018
【図１１】
2022000055.tif 000019
【図１２】
2022000055.tif 000020
【図１３】
2022000055.tif 000021
【図１４】
2022000055.tif 000022
【配列表】
2022000055000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年10月6日(2021.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第９因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ，ＦＩＸ）のエクソン領域に相補的に結合するターゲッティングドメインを含むｓｇＲＮＡであって、前記ｓｇＲＮＡが配列番号５又は６の塩基配列で表される、ｓｇＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のｓｇＲＮＡが挿入されたベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質又はそれをコードするＤＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム。
【請求項４】
請求項３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて製造された形質転換ウサギ。
【請求項５】
（ａ）ウサギ受精卵に請求項３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを導入して培養する段階；及び
（ｂ）前記（ａ）段階で得た受精卵を代理母に移植して形質転換ウサギを分娩させる段階
を含む方法で製造されることを特徴とする、請求項４に記載の形質転換ウサギ。
【請求項６】
前記形質転換ウサギは分娩後に形質転換の有無を確認する段階をさらに含む方法で製造されることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換ウサギ。
【請求項７】
請求項５に記載の形質転換ウサギを交配して子孫形質転換ウサギを生産する段階を含む方法で製造されることを特徴とする、子孫形質転換ウサギ。
【請求項８】
前記形質転換ウサギの交配は、請求項５に記載の形質転換ウサギ又は正常ウサギと交配することを特徴とする、請求項７に記載の子孫形質転換ウサギ。
【請求項９】
前記形質転換ウサギ又は子孫形質転換ウサギは、第９因子がノックアウトされて血友病表現型を示すことを特徴とする、請求項７に記載の子孫形質転換ウサギ。
【請求項１０】
請求項４に記載の形質転換ウサギ又は請求項７に記載の子孫形質転換ウサギから分離した副産物であって、
前記副産物が血液、血清、尿、糞便、唾液、臓器及び皮膚からなる群から選択される、前記副産物。
【請求項１１】
請求項４に記載の形質転換ウサギ又は請求項７に記載の子孫形質転換ウサギから分離した細胞。
【請求項１２】
請求項４に記載の形質転換ウサギ又は請求項７に記載の子孫形質転換ウサギから分離した組織。
【請求項１３】
次の段階を含む形質転換ウサギの製造方法。
（ａ）ウサギ受精卵に請求項３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを導入して培養する段階；及び
（ｂ）前記（ａ）段階で得た受精卵を代理母に移植して形質転換ウサギを分娩させる段階。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法で製造された形質転換ウサギを交配して子孫形質転換ウサギを生産する段階を含む子孫形質転換ウサギの製造方法。
【請求項１５】
前記形質転換ウサギの交配は、請求項１３に記載の方法で製造された形質転換ウサギ又は正常ウサギと交配することを特徴とする、請求項１４に記載の子孫形質転換ウサギの製造方法。
【外国語明細書】
2022000055000001.pdf