(57)【要約】　　　（修正有）【課題】リン肥料を低減できる、リン栄養に発現応答性を有する遺伝子およびそのプロモーターを提供する。【解決手段】イネ由来のＯｓＰＩ１をコードする塩基配列、または、上記塩基配列の一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を備え、リン栄養に発現応答性を有する遺伝子。上記遺伝子のためのプロモーター。特にリン欠乏に応答する、異なる植物種間に共通の塩基配列を有する遺伝子。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表１に記載の塩基配列、または、上記塩基配列の一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を備え、リン栄養に発現応答性を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項２】
蛋白質をコードしないか、あるいは短いポリペプチドによって他のｍＲＮＡ、ＤＮＡまたは蛋白質を制御するものであることを特徴とする請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
イネ科由来であることを特徴とする請求項１または２記載の遺伝子。
【請求項４】
イネ科は、Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａであることを特徴とする請求項３記載の遺伝子。
【請求項５】
イネ科は、Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｓｐｐ．　ｊａｐｏｎｉｃａであることを特徴とする請求項３記載の遺伝子。
【請求項６】
異なる植物種間に共通の、配列表２２に記載の塩基配列、または、上記塩基配列の一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を備え、特にリン欠乏に発現応答性を有することを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載の遺伝子のための遺伝子。
【請求項７】
配列表２１に記載の塩基配列、または、上記塩基配列の一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を備えることを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載の遺伝子のためのプロモーター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リンに関する植物の栄養診断に応用可能な、また、他の植物に組み込みリン応答性を調節するなどの形質転換により環境適用性を向上できる、リン栄養に発現応答性を有する新規遺伝子およびそのプロモーターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物の生育に必須な各元素の一つであるリン（Ｐ）は、土壌中では、大部分、不溶性の無機態リンまたは有機態リン酸として存在しており、リンに関する植物への吸収割合については他の必須元素のそれと比べて低いものである。一方、世界の人口増加に対応した持続的な食糧生産のためにはリン資源の有効利用が必要である。
【０００３】
植物は低リン条件に適応するためにいくつかの方法を発達させた。これらの方法は以下のように２つの戦略に分類できる。
【０００４】
第一の戦略は、根圏からのリンの効率的な獲得である。植物は、リン欠乏条件下で生育する場合には根から酸性ホスファターゼ（ＡＰａｓｅ）と有機酸を分泌して、それぞれ有機態リン酸と難溶性無機態リン酸から可溶性の無機態リン酸を産生させることにより、根圏からリンを効率的に獲得している（Ｇａｒｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９８３，　Ｔａｄａｎｏ　ａｎｄ　Ｓａｋａｉ　１９９１）。
【０００５】
そこで、ルーピン根分泌性酸性ホスファターゼをコードするＬＡＳＡＰ２（Ｗａｓａｋｉ　ｅｔａｌ．　２０００）など、いくつかの遺伝子が単離されて性質が調べられている。高親和性リン酸トランスポーターに関する遺伝子もまた、リン欠乏植物の根で遺伝子発現が増加することが報告されている（Ｍｕｃｃｈａｌ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６，　Ｍｕｃｃｈａｌ　ａｎｄ　Ｒａｇｈｏｔｈａｍａ　１９９９）。
【０００６】
第二の戦略は、吸収したリンの植物体内での効率的利用である。エネルギーの生産よりはリンをあまり使わないためにバイパス経路が貢献していることがいくつかの論文で述べられている（Ｄｕｆｆ　ｅｔ　ａｌ．　１９８９，　１９９１）。リン欠乏条件下では、リボヌクレアーゼの生産も増加し、体内における貯蔵性のＲＮＡプールからリン酸を有効化するために機能している　（Ｌｏｆｆｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９９２，　Ｇｒｅｅｎ　１９９４）。
【０００７】
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）は、酵母（Ｂｅｒｇｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９８６）や大腸菌（Ｔｏｒｒｉａｎｉ　ａｎｄ　Ｌｕｄｔｋｅ　１９８５）のように、植物もリン欠乏応答を制御する‘ｐｈｏ　ｒｅｇｕｌｏｎ’を持っていることを提唱している。しかしながら、植物のリン栄養状態に応答して起きる遺伝子発現システムの詳細はまだ知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
リン肥料の原料となるリン鉱石は、現在のペースで採掘されると埋蔵量は５０年分に限定されていることから、リン肥料を用いない、または、リン肥料を少量にできる、土壌中の有機化したリンを植物に取り込む技術の開発が求められている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の遺伝子は、以上の課題を解決するために、配列表１に記載の塩基配列、または、上記塩基配列の一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を備え、リン栄養（植物のリン栄養状態）に発現応答性を有することを特徴としている。上記遺伝子は、蛋白質をコードしないか、あるいは短いポリペプチドによって、他のｍＲＮＡ、ＤＮＡまたは蛋白質を制御するものであることが好ましい。
【００１０】
上記構成によれば、上記塩基配列を備え、リン栄養に発現応答性を有することにより、上記構成を他の植物の遺伝子に組み込み、他のＲＮＡまたはＤＮＡを制御することによるリン応答性を調節するなどの形質転換により、上記植物の環境適用性（例えば、リン欠乏状態の土壌でも生育可能な）を向上できる。これにより、上記構成は、土壌中の有機化したリンを無機化して植物に取り込むことができ、リン肥料を用いない、または、リン肥料を少量にできる。
【００１１】
上記遺伝子は、イネ科由来であってもよい。上記遺伝子では、イネ科は、Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａであってもよい。上記遺伝子においては、イネ科は、Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｓｐｐ．　ｊａｐｏｎｉｃａであってもよい。
【００１２】
本発明の他の遺伝子（共通の塩基配列）は、以上の課題を解決するために、異なる植物種間に共通の、配列表２２に記載の塩基配列、または、上記塩基配列の一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を備え、特にリン欠乏に発現応答性を有し、上記の何れかに記載の遺伝子のためのものであることを特徴としている。
【００１３】
上記構成によれば、リン栄養に発現応答性を有する、上記遺伝子の発現応答性を制御できて、リン応答性を促進したり、遅延させたりして、上記リン応答性を調整できると共に、イネ科を含めて他の科の植物に対するリン欠乏ストレス診断を迅速に行うことができる。
【００１４】
本発明のプロモーターは、以上の課題を解決するために、配列表２１に記載の塩基配列、または、上記塩基配列の一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を備え、上記の何れかに記載の遺伝子のためのものであることを特徴としている。
【００１５】
上記構成によれば、リン栄養に発現応答性を有する、上記遺伝子の発現応答性を制御できて、リン応答性を促進したり、遅延させたりして、上記リン応答性を調整できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態について図１ないし図５に基づいて説明すれば、以下の通りである。
【００１７】
近年、ゲノム研究が進められている。例えば、シロイヌナズナのゲノム配列決定が完了し（Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ，　２０００）、ジャポニカ種およびインディカ種のイネゲノムのドラフトシークエンスが決定された（Ｇｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ．　２００２，　Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．　２００２）。ゲノム配列に関連したさらなる研究がｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）マイクロアレイを使ったトランスクリプトーム解析を含むポストゲノム研究が発展している。
【００１８】
本発明者らは，ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、リン欠乏状態のイネの根におけるトランスクリプトーム解析を行い、遺伝子発現の変化に基づきリン欠乏において、いくつかの遺伝子の発現量が増加することを確認した。
【００１９】
リン欠乏により最も誘導された、新規の遺伝子をイネの根より単離し、ＯｓＰＩ１　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｇｅｎｅ　１）と命名した。ＯｓＰＩ１遺伝子は短時間のリン欠乏にも発現応答したので、植物における低リン適応戦略において重要な役割を担っている可能性がある。
【００２０】
本研究では、本発明者らはＯｓＰＩ１遺伝子をクローニングして特徴を調査し、リン欠乏条件下での遺伝子発現パターンを調査した。リン欠乏条件下でのＯｓＰＩ１遺伝子の役割も考察した。
【００２１】
ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を用いてのリン欠乏条件下で誘導される新規遺伝子のスクリーニング
ｃＤＮＡマイクロアレイ上にスポットされているそれぞれの遺伝子のリン処理による相対的な発現量の違いをスキャッタープロットにより示した。その結果を図１に示した。各スポットのシグナル強度は偏差値で示した。上記偏差値は、アレイ毎のデータの標準化を図るため、シグナル強度を対数化して、その分布をとると正規分布になるという特徴を利用して算出された。
【００２２】
図１（ａ）は、＋Ｐ区の数値をＸ軸に取り、１日経過の−Ｐ区をＹ軸に取ったものであり、図１（ｂ）は、＋Ｐ区の数値をＸ軸に取り、９日経過の−Ｐ区をＹ軸に取ったものである。
【００２３】
ほとんどのスキャッターのスポットは、図１に示すように、＋Ｐ処理区と−Ｐ処理区とで相互間にて違いのないことを示す１：１の線の近傍に存在した。偏差値における５以上の変動が二反復間にて得られたときのみ変動して誘導された遺伝子と定義した。図１において、矢印にて示したように、Ｎｏ．３５２６にスポットされた遺伝子が９日経過の−Ｐ処理区で最も顕著に誘導されていた。
【００２４】
Ｎｏ．３５２６にスポットされた遺伝子のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）　ｃｌｏｎｅｓ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｃ１９８８１　と　ＡＵ１６２２１８）についてＢＬＡＳＴ検索を行ったところ相同的な遺伝子はデータベース上に存在しなかった。この新規の遺伝子をＯｓＰＩ１（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｇｅｎｅ　１）と命名した。
【００２５】
ｃＤＮＡマイクロアレイ解析の再現性を評価するために、ＯｓＰＩ１（ＥｌｅｍｅｎｔＮｏ．　３５２６）とアクチン（ａｃｔｉｎ）のアイソザイム（Ｅｌｅｍｅｎｔ　Ｎｏ．　５８２０）の相対的なｍＲＮＡの量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって調査し、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析の結果と比較した。その結果を表１に示した。表１では、ｎ．ｄ．は調べていないことを示す。
【００２６】
【表１】
2004105030.tif 000002
【００２７】
アクチンのアイソザイムＲＡｃ１は様々な状況で比較的安定した発現を示すことが知られている（ＭｃＥｌｒｏｙ　ｅｔ　ａｌ．　１９９０）。表１に示すように、９日間−Ｐ処理区の根におけるＲＡｃ１のｍＲＮＡの発現量は、＋Ｐ処理区の根と比べて８倍大きく、地上部では＋Ｐ区に比べ−Ｐ区で半分になっていることが定量的ＲＴ−ＰＣＲによって示された。地上部（ｌｅａｖｅｓ）でも根部（ｒｏｏｔｓ）でも、９日間−Ｐ区におけるＯｓＰＩ１のｍＲＮＡの顕著な増加が示された。
【００２８】
イネにおけるＯｓＰＩ１の発現におよぼすリン栄養の影響
＋Ｐ区、−Ｐ区、およびリンの再施与区（ＰＲ区）をそれぞれ設け、イネを水耕栽培によって栽培して、生育程度を示す乾物生産（Ｄｒｙ　Ｍａｔｔｅｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、全リン（Ｐ）濃度、ＯｓＰＩ１のｍＲＮＡ量（発現量）を調査した。それらの結果を図２および図３に示した。
【００２９】
図２では、白丸（○）は−Ｐ区を、黒丸（●）は、＋Ｐ区を、黒三角（▲）は、ＰＲ区を示した。図２（ａ）は地上部の乾物生産の変化を、図２（ｂ）は根部の乾物生産の変化を、図２（ｃ）は地上部の全リン濃度の変化を、図２（ｄ）は根部の全リン濃度の変化を示す。図３では、ＯｓＰＩ１のｍＲＮＡ量（発現量）を示すノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）解析の結果を示し、ｒＲＮＡを電気泳動のコントロールとして示した。図２および図３においては、＋、−、Ｒは、それぞれ＋Ｐ区、−Ｐ区、ＰＲ区を示す。ＰＲ区では、−Ｐの処理開始後７２時間目にリンの再施与を開始した。
【００３０】
図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、地上部・根部とも乾物生産量には処理間で違いはなかったが、全リン濃度は、図２（ｃ）および図２（ｄ）に示すように、−Ｐ区の植物では、経時的に減少し、リン再施与区では、再施与後１２時間で、地上部・根部がそれぞれ８０％、８３％に、７２時間後には１００％、９２％まで回復した。
【００３１】
図３には、ＯｓＰＩ１のノーザンブロット解析の結果を示した。図３（ａ）および図３（ｃ）に示すように、地上部（Ｓｈｏｏｔ）・根部（Ｒｏｏｔ）ともｍＲＮＡの量は−Ｐ条件下で顕著に増加し、経時的にその量は増加した。一方、＋Ｐ区の地上部と根部では、ＯｓＰＩ１のｍＲＮＡは検出されなかった。−Ｐ区の植物にリンを与えた場合（リン再施与、図ではＲにて示した）にはＯｓＰＩ１のｍＲＮＡは迅速に消失した。−Ｐ区の根部ではｍＲＮＡの量が７２時間以後で明瞭に増加し、それ以後−Ｐ区の地上部と比べて２倍程度多いことが示された。
【００３２】
図３（ｂ）および図３（ｄ）に示すように、主要なシグナルは、０．５ｋｂおよび０．６ｋｂの間にみられ、弱いシグナルが−Ｐ区の根部において、８４時間、１４４時間で、０．３ｋｂのところに見られた。
【００３３】
数時間のリン欠如がイネ根のＯｓＰＩ１の発現におよぼす影響を調べるために定量的ＲＴ（Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）−ＰＣＲによる解析を実施した。その解析結果を表２に示した。表２から明らかなように、１時間処理でのｍＲＮＡの変化は有意ではなかったが、４時間−Ｐ処理ではＯｓＰＩ１のｍＲＮＡは有意に増加したことが分かる。表２では、＊は１％で、＊＊は０．１％で有意差があることを示す。
【００３４】
【表２】
2004105030.tif 000003
【００３５】
ＯｓＰＩ１のｃＤＮＡのクローニングと解析
ＯｓＰＩ１のｃＤＮＡの塩基配列を３’−および５’−ＲＡＣＥ法で決定した。その結果を、配列表１、９、１３に示した。配列表１、９、１３においては、決定された塩基配列と、それに対応すると想定される３種のアミノ酸配列がそれぞれ示されている。配列表１、９、１３をまとめて示した表３では、５’−末端の小文字で示した塩基はゲノム配列（Ｔ）と異なっていた配列を示す。上記表３においては、太字は３つのフレームでそれぞれ最長のＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列を示し、二重の下線で示した塩基（表３に示した塩基配列では、１番目と１００番目）はプライマー伸長法で示された転写開始点を示し、下線で示した塩基配列（１７６番目から１８３番目までと、１９０番目から１９７番目まで）はＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙに共通な塩基配列を示す。
【００３６】
【表３】
2004105030.tif 000004
【００３７】
ＯｓＰＩ１のｃＤＮＡは、配列表２０に示すように、ｐｏｌｙ−Ａを除き３７５ｂｐであった。ノーザンブロット解析の結果とは差があるが、一般的にｍＲＮＡの３’末端のｐｏｌｙ−Ａは２０〜２５０ｂａｓｅｓであると報告されており（Ｓｕｇｉｕｒａ　ａｎｄ　Ｔａｋｅｄａ　２０００）、ＯｓＰＩ１のｍＲＮＡは比較的長いｐｏｌｙ−Ａ　ｔａｉｌ　がプロセッシングの際に付加されるものと推定された。ＯｓＰＩ１のｃＤＮＡの配列（配列表１）を、ゲノム配列（配列表２０）と比較した結果、ＯｓＰＩ１遺伝子はイントロンを持たないことが示された。
【００３８】
ＯｓＰＩ１遺伝子のｃＤＮＡにおける５’末端の１塩基（Ｇ）が、ゲノムの配列（Ｔ）と異なっていた。それは、ＰＣＲによる増幅時のエラーが原因であるかも知れないと考えられたが、数回にわたる反復実験でも同じ結果が得られた（データは示していない）ことから、ＯｓＰＩ１遺伝子ｃＤＮＡの５’−末端は、その転写後に修飾が必要とされるのかも知れないことが示唆された。
【００３９】
プライマー伸長法を用いてＯｓＰＩ１遺伝子の転写開始点を正確に決定した。その結果を図４に示した。図４では、矢印は伸長したプライマーの存在位置を示し、左、中央、右の各パネルは、試料とプライマーとをそれぞれ４２℃、５０℃、６０℃でアニールさせたときの結果を示す。
【００４０】
最上流に検出されたシグナルは５’−ＲＡＣＥ法によって推定された転写開始点と一致した（図３、表３、および配列表１を参照）。伸長したプライマーは２つの明瞭なシグナルを示し（図４のＡ、Ｂ）、さらに１塩基短く弱いシグナルも示した（図４のＡ’、Ｂ’）。
【００４１】
これらは厳しいプライマーアニール条件である６０℃でも伸長しており、両方のシグナルがＯｓＰＩ１のｍＲＮＡに由来している可能性を除外することはできない。（図４のＢ、Ｂ’に対応する転写産物はノーザン解析で示された０．３ｋｂの弱いシグナル（図３（ｂ）および（ｄ）参照）と対応するように見える。短いｍＲＮＡはａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　もしくは２つめの転写開始点に由来すると考えられる。ＯｓＰＩ１のｃＤＮＡでは植物の既知遺伝子と相同性のあるものはなかった（データは示していない）が、ＥＳＴである、２つのトウモロコシのＢＧ８３６３５８とオオムギのＡＬ５０４３６５と似ていた（表４を参照）。
【００４２】
表４は、ＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙ、ＯｓＰＩ１、およびＯｓＰＩ１−ｌｉｋｅＥＳＴに保存される配列を示し、星（＊）印は、全ての遺伝子で共通であった塩基配列を示し、ドットはＯｓＰＩ１と一致した配列を示す。
【００４３】
【表４】
2004105030.tif 000005
【００４４】
リン欠乏誘導性の遺伝子としては次のものが単離されている。トマトのＴＰＳＩ１（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７）、ウマゴヤシのＭｔ４（Ｂｕｒｌｅｉｇｈ　ａｎｄ　Ｈａｒｒｉｓｏｎ　１９９７，　１９９８）、シロイヌナズナのＡｔ４（Ｂｕｒｌｅｉｇｈ　ａｎｄ　Ｈａｒｒｉｓｏｎ　１９９９）およびＡｔＩＰＳ１（Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　２０００）である。これらの配列をＯｓＰＩ１およびＯｓＰＩ１−ｌｉｋｅ　ＥＳＴｓと並べてみると８塩基ずつからなる２組のグループが保存されていたが、この他に相同性は見られなかった（表４を参照）。
【００４５】
図５は、遺伝子のサザンブロット（Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）解析の結果を示す。サザンブロット解析では、イネのゲノムＤＮＡを制限酵素　ＢａｍＨＩ，　ＥｃｏＲＶ，　ＨｉｎｄＩＩＩ　および　ＸｂａＩでそれぞれ分解し（レーンの上にそれぞれ示した）、ＯｓＰＩ１のサザンブロットに用いた。ＢａｍＨＩ，　ＥｃｏＲＶ，　ＨｉｎｄＩＩＩ　および　ＸｂａＩでそれぞれ分解した場合に期待されるサイズは、それぞれ、２７，９４２ｂｐ、１３，７６７ｂｐ、１，３２１ｂｐ、８，６１３ｂｐであった。
【００４６】
図５から明らかなように、全てのレーンで単一のバンドが検出されており、これらのサイズはＯｓＰＩ１の存在するＰＡＣ　ｃｌｏｎｅ　Ｐ３１Ｄ１１から計算されたサイズと一致した。このＰＡＣ　ｃｌｏｎｅ　は１番染色体に位置することがわかっている。このことからＯｓＰＩ１がｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｐｙの遺伝子であり、１番染色体に位置することが示された。
【００４７】
考察
上述したトマトのＴＰＳＩ１、ウマゴヤシのＭｔ４、シロイヌナズナのＡｔ４およびＡｔＩＰＳ１は、共通の特性をもつことからＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙと分類されている。つまり、ＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙでは、（ｉ）その発現はリン欠乏でのみ地上部・根部で誘導される、（ｉｉ）リンの再施与または菌根菌の感染によって迅速に発現が減少する、（ｉｉｉ）およそ２０塩基からなる共通配列を共有する、（ｉｖ）ｃＤＮＡは、１０００ｂｐ以下であり、共通でない短いＯＲＦ（Ｏｐｅｎ　Ｒｅａｄ　Ｆｒａｍｅ）をもつのみである、（ｖ）ｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｐｙの遺伝子でイントロンがない、ことを特徴としている。これらの特徴は、ＯｓＰＩ１遺伝子にも認められるので、ＯｓＰＩ１遺伝子もＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙに属すると考えられる。
【００４８】
当初、ＴＰＳＩ１は５８個のアミノ酸残基からなるポリペプチドをコードすると報告された（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７）。表３に示したとおり、ＯｓＰＩ１も最大３４残基からなる短いポリペプチドをコードする可能性がある。しかし、ＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙは共通したＯＲＦを形成しないことから、Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）は、ＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙがｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒとして機能する可能性を指摘した。
【００４９】
ＯｓＰＩ１およびＯｓＰＩ１−ｌｉｋｅ　ＥＳＴｓ（ＢＧ８３６３５８とＡＬ５０４３４５、データは示していない）もまた小さい複数のＯＲＦを有するのみであり、保存領域は共通のＯＲＦに存在しなかった。
【００５０】
この事実は、ＯｓＰＩ１を含むＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙがポリペプチド（蛋白質）をコードせずにｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒ（他の因子をＲＮＡの状態のままで直接制御するＲＮＡ）として役割を果たすという仮説を支持する。これらが制御因子として働くためには、表４および配列表２２に示した共通塩基配列がリン欠乏応答に関連するｍＲＮＡやＤＮＡまたは蛋白質などの何らかの分子と結合して、リン欠乏による発現応答性といった機能を発揮することが予想される。
【００５１】
上記のような植物のｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒに関しては報告例がない。一方、大腸菌のｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒである、ＤｓｒＡとＯｘｙＳはｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ（ステムループ構造）を形成して相補的な配列が他のｍＲＮＡに結合してその翻訳を制御する（Ａｌｔｕｖｉａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９８，　Ｌｅａｓｅ　ｅｔ　ａｌ．　１９９８）。
【００５２】
ただし、ＯｓＰＩ１のｍＲＮＡはｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓをもたないと推測されることから、ＯｓＰＩ１は大腸菌のｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒとは直接の構造的な類似性はない。ＯｓＰＩ１の分子機構解明のためには、ポリペプチドの形成の可能性も含めて、さらなる研究が必要である。
【００５３】
前記のサザンブロット（Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）解析の結果、ＯｓＰＩ１遺伝子はｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｐｙで１番染色体に存在することが明らかになったが（図５参照）、この染色体上には２つの興味深いＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｔｒａｉｔ　Ｌｏｃｕｓ、量的形質遺伝子座）が存在する。一つのＱＴＬは低リン条件下で分げつと乾物生産の増加に貢献すると考えられている（Ｎｉ　ｅｔ　ａｌ．　１９９８）。もう一つのＱＴＬは低リン条件下で酸性ホスファターゼ活性の増加に寄与する（Ｈｕ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）。これらのＱＴＬが、ＯｓＰＩ１の機能と関連している可能性がある。
【００５４】
リン供給を停止してからＯｓＰＩ１は迅速に地上部と根部の両方で発現が増加し、リン再施与後１２時間以内に発現が消失した（図３参照）。前述のように、リン栄養状態への迅速な応答はＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙ　に共通に見られる（Ｌｉｕｅｔ　ａｌ．　１９９７，　Ｂｕｒｌｅｉｇｈ　ａｎｄ　Ｈａｒｒｉｓｏｎ　１９９８，　Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　２０００）。ＯｓＰＩ１が発現している時点としなくなった時点との間で、地上部と根部の全リン濃度が大きく異ならなかったことから（図２および図３参照）、ＯｓＰＩ１の発現が単にそれぞれの器官での全リン濃度の変化だけで制御されていなかった。
【００５５】
Ｂｕｒｌｅｉｇｈ　ａｎｄ　Ｈａｒｒｉｓｏｎ　（１９９８）　は根の半分ずつを＋Ｐと−Ｐ区に分ける根分け実験を行い、リン酸濃度とＭｔ４のｍＲＮＡの発現量の関係を調べた。彼らは根分けの−Ｐ区の根では根分けの＋Ｐ区と比べてリン酸濃度が半分になっているにもかかわらず、根分けしたどちらの半分の根ともＭｔ４の発現が根分けしていない＋Ｐ区の根と同じ低いレベルであった。
【００５６】
Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）は、シロイヌナズナのｐｈｏ１　ｍｕｔａｎｔ　（植物体内のリン移動に関与しているリン酸トランスポーターが欠如している変異株）を用いてＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙのメンバーであるＡｔＩＰＳ１の発現パターンを調査した。ｐｈｏ１　ｍｕｔａｎｔはリンを木部へ輸送する能力が欠如しているので、根で十分量のリンを吸収したとしてもこの変異株の地上部はリン欠乏の症状を示す　（Ｐｏｉｒｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９９１）。ｐｈｏ１　ｍｕｔａｎｔ　にリンを与えた場合でも、ＡｔＩＰＳ１は全身的に発現していた（Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　２０００）。
【００５７】
これらの結果は、地上部のリン栄養状態がリンストレスに対する根の応答に影響をおよぼし、地上部から根への長距離輸送のシグナルがＡｔＩＰＳ１の発現に関与している可能性を示す。Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　はリン欠乏条件下で植物ホルモンが長距離シグナルとしての効果を持つと評価し、サイトカイニンがトマトとシロイヌナズナにおいて、いくつかのリン欠乏誘導性遺伝子の発現を減少させることを示した。彼らはサイトカイニンがリン酸欠乏応答の長距離シグナルにおける負の制御に関与している可能性を指摘した。植物ホルモンの関与する可能性も含め、ＯｓＰＩ１とリン欠乏条件下での長距離シグナルの機能と機構を解明するにはさらなる研究が必要である。
【００５８】
ＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙ、リン酸トランスポーター、酸性ホスファターゼのようないくつかのリン欠乏誘導性遺伝子は同様の発現パターンを示す（Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　２０００，　Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ　ｅｔ　ａｌ．　２００２，　Ｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．　２０００）。Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　は、リン酸のアナログ化合物である亜リン酸がシロイヌナズナとトマトの生育とリン欠乏誘導性遺伝子の発現におよぼす影響を調査した。亜リン酸をリン酸とともに与えた場合には生育に影響しないが、リン酸を与えない場合には生育が低下した（Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ　ｅｔ　ａｌ．　２００２）。亜リン酸はシロイヌナズナのリン欠乏誘導性遺伝子の発現を短時間で低下させた（Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ　ｅｔ　ａｌ．　２００２）。亜リン酸は根においてリン酸の関与するシグナル伝達系路に影響したことが考えられる。すなわち、このことは長距離シグナルを受信して働くだけでなく、体外または体内のリン酸濃度を感知することができる分子機構が存在し、これが短時間のストレスに対して応答していることを示唆している。
【００５９】
本発明者らはこれまでに、ルーピン根分泌性酸性ホスファターゼの分泌が根のリン濃度の減少がなくても誘導されることを示した　（Ｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．　１９９９）。一方で、酸性ホスファターゼの活性とｍＲＮＡの量はルーピンの体内のリン濃度が減少したときに劇的に増加することを示した　（Ｏｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９５，　Ｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．　２００２）。
【００６０】
これらの結果は、リンストレスへの応答が２つの段階からなることを示しており（Ｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．　２００２）、このことはＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙのような他のリン欠乏誘導性遺伝子の反応とも一致している。わずかなリンストレスでは体内と体外のリン酸濃度の両方が、厳しいリンストレスでは全リン濃度がその反応において重要なのだと考えられる。
リン欠乏応答性の転写因子ＰＨＲ１が単離され、ＡｔＩＰＳ１のプロモーター領域に結合することが示された（Ｒｕｂｉｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）。ＰＨＲ１の結合する配列（ＧＮＡＴＡＴＮＣ）は、他のＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙのメンバー、ｔｙｐｅ　５　ＡＰａｓｅ、Ｐｉ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ　およびｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　（Ｒｕｂｉｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）と同様に、ＯｓＰＩ１のプロモーター領域にも存在した（配列表２１、および表５を参照）。
【００６１】
【表５】
2004105030.tif 000006
【００６２】
Ｍｕｋａｔｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）は、ＴＰＳＩ１／Ｍｔ４　ｆａｍｉｌｙとシロイヌナズナのリン酸トランスポーター遺伝子ＡｔＰＴ２に共通に見られるｃｉｓ配列（遺伝子の転写調節因子が結合する領域）として、ＰＨＯ　ｅｌｅｍｅｎｔ　（ＣＡＣＧＴＧ／Ｃ；　Ｏｓｈｉｍａ　１９９７）、ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ　ｅｌｅｍｅｎｔ　（ＣＡＴ（／Ｇ）Ａ（／Ｃ）ＴＧ；　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　ａｎｄ　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　１９９０）、ＮＩＴ２　ｅｌｅｍｅｎｔ　（ＴＡＴＣＡ（／Ｔ）Ａ（／Ｔ）；　Ｆｕ　ａｎｄ　Ｍａｒｚｌｕｆ　１９９０）　を挙げた。また、リン酸応答性　ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　のＶｓｐＢ遺伝子の結合ドメインが同定され、ｖｓｐ　ＢｏｘＩＩと命名されている　（Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）。
【００６３】
ＯｓＰＩ１のプロモーター領域にもこれらの配列は含まれているから（配列表２１を参照）、植物のリン栄養状態に対する反応に中心的な役割を持つことが予想される。プロモーター解析に関するさらなる研究を行うことによって、リン欠乏応答における分子レベルでの詳細な機構が解明されるであろう。
【００６４】
以下に、本発明の遺伝子およびそのプロモーターを得るための、材料と方法とを説明する。
【００６５】
【実施例１】
植物の栽培方法と、生育（ｇｒｏｗｔｈ）、リン（Ｐ）の取り込み（ｕｐｔａｋｅ）、ＯｓＰＩ１のｍＲＮＡの蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）の調査方法について
イネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．　ｓｓｐ．　ｊａｐｏｎｉｃａ　ｃｖ．　Ｍｉｃｈｉｋｏｇａｎｅ）の種子を、７０％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）で表面殺菌した後、１ｍＭのＣａＣｌ２で３６時間エアレーションを行いながら暗所で発芽処理を行った。発芽種子は１ｍＭのＣａＣｌ２で４日間前培養した後に、以下の培養液に移植した。培養液は、０．８３ｍＭのＮＨ４ＮＯ３、０μＭ（−Ｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または３２μＭ（＋Ｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）のＮａＨ２ＰＯ４、０．３８ｍＭのＫＣｌ、０．１９ｍＭのＫ２ＳＯ４、０．７５ｍＭのＣａＣｌ２、０．８２ｍＭのＭｇＳＯ４、３６μＭのＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ、９．１μＭのＭｎＳＯ４、４６μＭのＨ３ＢＯ３、３．１μＭのＺｎＳＯ４、０．１６μＭのＣｕＳＯ４および７．４ｎＭの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４を含み、ｐＨが５．２に０．１ＭのＮａＯＨを用いて調節されたものである。培養液は毎日交換した。栽培では、栽培温度２８℃、２４時間明期、葉の表面での光の照度が約１３０　μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ−２・ｓ−１、相対湿度５０％になるように設定した人工気象機を用いた。
【００６６】
イネの幼植物は、３２μＭのＮａＨ２ＰＯ４を含む培養液で前培養した後、＋Ｐｏｒ　−Ｐ区に移植した。植物は地上部と根部に分けて、移植してから、１２、３６、７２、８４、１０４、および１４４時間後にそれぞれ採取した。７２時間目には−Ｐ区の植物の半数を＋Ｐの培養液に移植し（ＰＲ区）、処理開始時から８４、１０８、および１４４時間目に同じ方法でそれぞれ採取した。試料は液体窒素で凍結し、−８０℃にて保存した。
【００６７】
凍結乾燥した試料約５０ｍｇをＨ２ＳＯ４−Ｈ２Ｏ２で分解し、リン濃度をＳａｈｅｋｉ
ｅｔ　ａｌ．　（１９８５）の方法で測定した。
【００６８】
ＤＮＡおよびＲＮＡ　Ｇｅｌ　Ｂｌｏｔ　解析
ゲノムＤＮＡは、イネの葉からＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　１９８０）　で抽出した。全ＲＮＡは、ＳＤＳ−ｐｈｅｎｏｌ法　（Ｐａｌｍｉｔｅｒ　１９７４）で抽出した。７μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素　ＢａｍＨＩ，　ＥｃｏＲＶ，　ＨｉｎｄＩＩＩ　および　ＸｂａＩでそれぞれ分解し、０．８％　アガロースゲルで分離した。２０μｇのＲＮＡを１．０％　アガロースゲルで分離した。これらの核酸はＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋　膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，　ＮＪ）に転写した。
【００６９】
ＯｓＰＩ１のプローブはＰＣＲで調製し、Ｇｅｎｅ　Ｉｍａｇｅｓ　ＴＭ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＵＴＰ　でラベルした。ハイブリダイゼーションと検出は厳しい条件である６５℃でＧｅｎｅ　ＩｍａｇｅｓＴＭ　ｓｙｓｔｅｍ　を使って説明書通りに行った。
【００７０】
ｃＤＮＡのマイクロアレイ分析について
＋Ｐ区の植物の半数を処理開始８日目に−Ｐ区の培養液に移植し、その翌日残り半数の＋Ｐ区、−Ｐ区の植物と同時に全ての植物を採取した。８日目に＋Ｐ区から−Ｐ区に移植したものを短時間−Ｐ処理区、９日間通して−Ｐ区で育てたものを長時間−Ｐ処理区、＋Ｐの培養液で育てたものを＋Ｐ処理区とした。根を脱イオン水で洗浄し、地上部と根部に分けて新鮮重をはかってから液体窒素で瞬間的に凍結した。試料は−８０℃にて保存した。
【００７１】
Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡは、ＳＤＳ−ｐｈｅｎｏｌ　法　（Ｐａｌｍｉｔｅｒ　１９７４）　で抽出しＣｓＣｌ密度勾配超遠心法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．　１９８９）で精製した。１つのアレイセットに対して４０　μｇの精製ｔｏｔａｌ　ＲＮＡをターゲットとして用いた。ターゲットの標識はＣｙ５−ｄＣＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ）を用いて行った。未標識のプライマーと色素はＧＦＰ　ｃｏｌｕｍｎｓ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で除去した。
【００７２】
イネのｃＤＮＡ　マイクロアレイはＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅのシステムを利用して、日本のマイクロアレイプロジェクトで作成されたものである（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００２）。このアレイはイネの各種の器官から単離された８，９８７　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅｓ
が２枚のスライドグラスにスポットされたものである。
【００７３】
ハイブリダイゼーションは湿潤箱と　ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ）を用いて６０℃で４時間行った。ハイブリ後はスライドグラスを洗浄してから乾燥させ、アレイスキャナ　（ＦＬＡ８０００；　Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）　を用いてシグナル画像を取り込み、Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ　のソフトウェアであるＡｒｒａｙ　Ｇａｕｇｅを用いて各スポットのシグナル強度を数値化した。
【００７４】
各スポットのシグナル強度を標準化するため、シグナル強度の生の数値の対数値を取り、対数値を正規化した値を求めて偏差値を換算した。得られた偏差値の変動より、各々の遺伝子の発現量の変化を評価した。
【００７５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析
Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡは前述の方法で単離した後、ＤＮａｓｅ　（ＲＴ　ｇｒａｄｅ，　Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）処理を３７℃で６０分間行い、混入したゲノムＤＮＡを分解した。１ｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　ＲＴ−ＰＣＲ　（ＡＭＶ）　（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，　Ｂａｓｅｌ，　Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて逆転写反応を行い、１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　をＬｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行う定量的ＲＴ−ＰＣＲの鋳型に用いた。ＴａｑＳｔａｒｔ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）　を用いて、非特異的増幅を抑えた。
【００７６】
アクチンのアイソフォームであるＲＡｃ１遺伝子（ＭｃＥｌｒｏｙ　ｅｔ　ａｌ．　１９９０）をコントロール遺伝子として選んだ。検量線は特異的なプラスミドに基づいて作成した。転写産物の量は＋Ｐの根の値に対する相対値で示した　（Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｂａｓｉｓ）。ＯｓＰＩ１転写産物の量はＲＡｃ１の転写産物で除した値でも示した　（ＲＡｃ１　ｂａｓｉｓ）。
【００７７】
ＯｓＰＩ１遺伝子のクローニングと塩基配列の解析
ＯｓＰＩ１のｃＤＮＡの部分配列を含むＥＳＴ　ｃｌｏｎｅ　（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｃ１９８８１）は、ＤＮＡ　ｂａｎｋ　（農業生物資源研究所）から分譲された。３’と５’末端は３’−および５’−Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ　（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｏｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）　を説明書に基づいて用いてクローニングした。
【００７８】
リン欠乏のイネの根から単離したＲＮＡを合成し、ＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型に用いた。増幅した断片はｐＧＥＭ−Ｔ　ベクター　（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）にサブクローニングした。
【００７９】
ＤＮＡの塩基配列はジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９７７）に基づいた方法で、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ　ｉｎｓｔｅａｄ　ｏｆ　ｄＧＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　４０００ＬＳ　（Ｌｉ−Ｃｏｒ，　Ｌｉｎｃｏｌｎ，　ＵＳＡ）を用いて行った。
【００８０】
相同性検索はＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．　１９９０，　Ｇｉｓｈ　ａｎｄ　Ｓｔａｔｅｓ１９９３）を用いて行った。アミノ酸配列のアライメントはＣｌｕｓｔａｌＷ　プログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９９４）　で行った。
【００８１】
ＯｓＰＩ１　遺伝子の転写開始点を同定するために、プライマー伸長を行った。ＯｓＰＩ１遺伝子を含むＰＡＣクローン（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＰ００３２３１）をもとにプライマーセット（ｏｐ１ＧＥ−Ｓ；　５´−　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　Ｃ　−３´，　ｏｐ１ＧＥ−Ａ；　５´−　ＴＧＴ　ＣＧＡ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　Ｃ　−３´）を設計した。イネゲノムＤＮＡ　１０　ｍｇ　をＰＣＲの鋳型に用いた。増幅産物はｐＧＥＭ−Ｔ　ベクター　にサブクローニングし、ｐＧＥＭ−５ＵＴＲｏｐ１と命名した。
【００８２】
ＯｓＰＩ１特異的な断片の塩基配列の決定と逆転写のためにＩＲＤ８００標識プライマーをデザインした：　ｏｐ１ＰＥ−ＩＲＤ　（５´−　ＩＲＤ８００−ＡＧＡ　ＣＣＴ　ＧＣＣ　ＡＡＡ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＴＡＧ　ＴＴＧ　Ｃ　−３´：　Ａｌｏｋａ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）。ｐＧＥＭ−５ＵＴＲｏｐ１　をサイクルシークエンシングの鋳型に用いた。
【００８３】
逆転写には　ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　（Ｔｏｙｏｂｏ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）　を用いた。Ｐｏｌｙ（Ａ）＋　ＲＮＡ　５　μｇをリン欠乏のイネ地上部から単離し、１　ｐｍｏｌ　の　ｏｐ１ＰＥ−ＩＲＤ　ｐｒｉｍｅｒ　と一緒に９５℃で２分間変性処理を行い、２分間氷冷した。転写産物と　ｏｐ１ＰＥ−ＩＲＤをアニールさせるために、反応液を６８℃で１５分間インキュベートし、２分間氷冷した。その後１００　Ｕ　ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｅｎｚｙｍｅ　と　４０　Ｕ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　を反応液に入れ、４２℃で２分間、５０℃で１０分間、６０℃で３０分間の３種類の逆転写反応を行った。伸長したｃＤＮＡはＤＮＡシークエンシング用ゲルにｐＧＥＭ−５ＵＴＲｏｐ１のシークエンス試料と同時にアプライした。
【００８４】
プロモーターの利用および発現制御の方法について
プロモーター配列は、ＯｓＰＩ１の全長を含むＰＡＣクローン　（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＰ００３２３１）の配列を元に定義した。すなわち、ＯｓＰＩ１のｍＲＮＡをコードする領域よりも上流域の配列のうち、ＯｓＰＩ１の上流に予想される別の遺伝子（ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　の３’−末端の直後の配列からＯｓＰＩ１の５’−末端の直前の配列までをＯｓＰＩ１の発現制御を行うプロモーター領域であると定義した。
【００８５】
ＰＣＲ法によって配列表２１に記載のプロモーターを全て含む断片を増幅するために、ＯｓＰＩ１ｕＳ１プライマー（ＧＣＣ　ＧＴＴ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＡＴ）とＯｓＰＩ１ｕＡ１プライマー（ＴＧＧ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣ　ＴＴＧ　ＧＴ）を作成した。これらプライマーを用いて、イネゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＬＡ−ＴａｑＴＭ（Ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ）にて実施して、目的の上流配列ＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動後に増幅ＤＮＡをゲルより抽出し、精製した。
【００８６】
この増幅ＤＮＡの末端を平滑化ならびにリン酸化処理を施した後に、制限酵素ＳｍａＩで切断ならびにアルカリフォスファターゼ処理をしたｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ）と連結し、アグロバクテリウムに形質転換した。ＰＣＲ法により、上流配列をインサートとして含む組換えプラスミドを保有するクローンを選別取得した。
【００８７】
得られたクローンに含まれるプラスミドＤＮＡのインサート内部ならびに挿入領域周辺の塩基配列を解析することにより、ＯｓＰＩ１遺伝子の上流配列がＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）の配列に対して順方向に挿入され、かつ、ＧＵＳコード配列の読み枠がＬＡＳＡＰ２遺伝子の翻訳開始コドンから連続する形になっていることが確認されたキメラ遺伝子クローン１個を選択し、発現ベクターとした。
【００８８】
上記発現ベクターを含む菌を液体培養し、抗生物質ハイグロマイシン（５０μｇ／Ｌ）と２，４−Ｄ（２ｍｇ／Ｌ）を含むＮ６培地でイネ胚由来カルスと共存培養した。抗生物質カルベニシリン（５００μｇ／Ｌ）、ハイグロマイシン（５０μｇ／Ｌ）と２，４−Ｄ（２ｍｇ／Ｌ）を含むＮ６培地で除菌しながら２１日間培養した。このカルスは抗生物質カルベニシリン（１００μｇ／Ｌ）、ハイグロマイシン（５０μｇ／Ｌ）と３％ソルビトール、０．２％カザミノ酸、２μｇ／Ｌナフタレン酢酸、２ｍｇ／Ｌカイネチンを含むＭＳ培地に移植し、２週間以上培養した。得られた個体再生イネは、抗生物質カルベニシリン（１００μｇ／Ｌ）、ハイグロマイシン（５０μｇ／Ｌ）を含むＭＳ培地で培養した。
【００８９】
上記の形質転換個体を標準リン処理区、リン欠如処理区のそれぞれに移植し、３日間の水耕栽培を行った後、根組織を採取した。それぞれの処理区から採取した根の切片を固定液（０．３％ホルムアルデヒド、１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）、０．３Ｍのマニトール）に浸漬し、真空ポンプで１分間吸引処理後、室温で１時間放置した。切片を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で数回洗浄し、１ｍＭのＸ−ｇｌｕｃ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬し、真空ポンプで１分間吸引処理後、３７℃で一晩インキュベートした。
【００９０】
リン欠如区でＧＵＳの活性を示す青色が強く発現しており、このプロモーターに迅速にリン栄養状態に反応する部位が含まれていることが確認された。
【００９１】
ところで、外部刺激や環境ストレスに起因する生物の成長阻害を統括的に解消もしくは制御することを目的とする発明が、特開２００１−３３３７７９号公報に開示されている。上記公報に記載の発明では、植物のシグナル伝達系のレセプターあるいはシグナル伝達を調節するリン酸化酵素を対象としている。
【００９２】
上記公報に記載の発明に対して、本願発明においては、上記レセプターあるいは酵素の発現そのものを含めた環境ストレスより、むしろ植物の栄養状態に応答して制御する点で異なる。すなわち、本願発明のＯｓＰＩ１遺伝子は、ＲＮＡの形態、或いは短いポリペプチドによって、ＤＮＡ、他のｍＲＮＡ、蛋白質を直接的に制御していると考えられる。
【００９３】
そのため、本願発明の応用に関しても、上記公報と異なっており、１）作物栄養診断への応用、２）ＯｓＰＩ１遺伝子のプロモーターに対して、ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＰＥＰＣ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ＰＥＰ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＣＳ（ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）などの低リンストレスに耐性を示すことにつながると考えられる遺伝子を連結することにより、そのようなプロモーターが連結した上記遺伝子を導入した各種植物の低リン耐性の強化、３）ＯｓＰＩ１遺伝子をＲＮＡｉあるいはアンチセンスＤＮＡによって破壊して、リン酸が過剰に供給されても、その吸収にフィードバック阻害がかからないようすること、４）上記３）の効果として、効率的に施肥を行う技術の確立、が挙げられる。
【００９４】
また、栄養診断への応用においては、このようなｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒ全般が各種の栄養状態での指標に利用可能である。特に、配列表２２に示した共通配列をもつ遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調査するなどの方法は、図２と図３のように生育に影響が及ぶ以前に調査が可能であることが示されており、各種の植物に応用が可能である。
【００９５】
以下に、上述した各引用文献の一覧を示す。
【００９６】
Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，　Ｇｉｓｈ　Ｗ，　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｗ，　Ｍｙｅｒｓ　ＥＷ，　Ｌｉｐｍａｎ　ＤＪ　（１９９０）　Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ．　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：　４０３−４１０
Ａｌｔｕｖｉａ　Ｓ，　Ｚｈａｎｇ　Ａ，　Ａｒｇａｍａｎ　Ｌ，　Ｔｉｗａｒｉ　Ａ，　Ｓｔｏｒｚ　Ｇ　（１９９８）　Ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＯｘｙＳ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＲＮＡ　ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ　ｆｈｌＡ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ．　ＥＭＢＯ　Ｊ　１７：　６０６９−６０７５
Ｂｅｒｇｍａｎ　ＬＷ，　ＭｃＣｌｉｎｔｏｎ　ＤＣ，　Ｍａｄｄｅｎ　ＳＬ，　Ｐｅｒｉｓ　ＬＨ　（１９８６）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　（ＰＨＯ５）　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８３：　６０７０−６０７４
Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　ＴＫ，　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　Ｈ　（１９９０）　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＭｙｏＤ　ａｎｄ　Ｅ２Ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５０：　１１０４−１１１０
Ｂｕｒｌｅｉｇｈ　ＳＨ，　Ｈａｒｒｉｓｏｎ　ＭＪ　（１９９７）　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｇｅｎｅ　ｗｈｏｓｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ　ｒｏｏｔｓ　ｉｓ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｖｅｓｉｃｕｌａｒ−ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　（ＶＡＭ）　ｆｕｎｇｉ　ａｎｄ　ｔｏ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．　ＰｌａｎｔＭｏｌ　Ｂｉｏｌ　３４：　１９９−２０８
Ｂｕｒｌｅｉｇｈ　ＳＨ，　Ｈａｒｒｉｓｏｎ　ＭＪ　（１９９８）　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｔ４　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ．　Ｇｅｎｅ　２１６：　４７−５３
Ｂｕｒｌｅｉｇｈ　ＳＨ，　Ｈａｒｒｉｓｏｎ　ＭＪ　（１９９９）　Ｔｈｅ　ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｔ４−ｌｉｋｅ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｃｃｕｒｓ　ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ　ａｎｄ　ｉｎｖｏｌｖｅｓ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｈｏｏｔｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１１９：　２４１−２４８
Ｄｕｆｆ　ＳＭＧ，　Ｍｏｏｒｈｅａｄ　ＧＢＧ，　Ｌｅｆｅｖｂｒｅ　ＤＤ，　Ｐｌａｘｔｏｎ　ＷＣ　（１９８９）　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｂｙｐａｓｓｅｓ　ｏｆ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎｉｇｒａ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｅｌｌｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　９０：　１２７５−１２７８Ｄｕｆｆ　ＳＭＧ，　Ｐｌａｘｔｏｎ　ＷＣ，　Ｌｅｆｅｂｖｒｅ　ＤＤ　（１９９１）　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌｓ：　Ｄｅ　ｎｏｖｏ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８８：　９５３８−９５４２
Ｆｕ　ＹＨ，　Ｍａｒｚｌｕｆ　ＧＡ　（１９９０）　ＮＩＴ−２，　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ａｃｔｉｎｇ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ，　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８７：　５３３１−５３３５
Ｇａｒｄｎｅｒ　ＷＫ，　Ｂａｒｂｅｒ　ＤＡ，　Ｐａｒｂｅｙ　ＤＧ　（１９８３）　Ｔｈｅ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｂｙ　Ｌｕｐｉｎｕｓ　ａｌｂｕｓ　Ｌ．　ＩＩＩ．　Ｔｈｅ　ｐｒｏｂａｂｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｂｙ　ｗｈｉｃｈ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｍｏｖｅｍｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｏｉｌ／ｒｏｏｔ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｉｓ　ｅｎｈａｎｃｅｄ．　Ｐｌａｎｔ　Ｓｏｉｌ　７０：　１０７−１２４
Ｇｉｓｈ　Ｗ，　Ｓｔａｔｅｓ　ＤＪ　（１９９３）　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｂｙ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｓｅａｒｃｈ．　Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ　３：　２６６−２７２
Ｇｏｆｆ　Ｓ．，　Ｒｉｃｋｅ　Ｄ，　Ｌａｎ　Ｔ−Ｈ，　Ｐｒｅｓｔｉｎｇ　Ｇ，　Ｗａｎｇ　Ｒ，　Ｄｕｎｎ　Ｍ，　Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ　Ｊ，　Ｓｅｓｓｉｏｎｓ　Ａ，　Ｏｅｌｌｅｒ　Ｐ，　Ｖａｒｍａ　Ｈ，　Ｈａｄｌｅｙ　Ｄ，　Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ　Ｄ，　Ｍａｒｔｉｎ　Ｃ，　Ｋａｔａｇｉｒｉ　Ｆ，　Ｌａｎｇｅ　ＢＭ，　Ｍｏｕｇｈａｍｅｒ　Ｔ，　Ｘｉａ　Ｙ，　Ｂｕｄｗｏｒｔｈ　Ｐ，　Ｚｈｏｎｇ　Ｊ，　Ｍｉｇｕｅｌ　Ｔ，　Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　Ｕ，　Ｚｈａｎｇ　Ｓ，　Ｃｏｌｂｅｒｔ　Ｍ，　Ｓｕｎ　Ｗ−Ｌ，　Ｃｈｅｎ　Ｌ，　Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂ，　Ｐａｒｋ　Ｓ，　Ｗｏｏｄ　ＴＣ，　Ｍａｏ　Ｍ，　Ｑｕａｉｌ　Ｐ，　Ｗｉｎｇ　Ｒ，　Ｄｅａｎ　Ｒ，　Ｙｕ　Ｙ，　Ｚｈａｒｋｉｋｈ　Ａ，　Ｓｈｅｎ　Ｒ，　Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅ　Ｓ，　Ｔｈｏｍａｓ　Ａ，　Ｃａｎｎｉｎｇｓ　Ｒ，　Ｇｕｔｉｎ　Ａ，　Ｐｒｕｓｓ　Ｄ，　Ｒｅｉｄ　Ｊ，　Ｔａｖｔｉｇｉａｎ　Ｓ，　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　Ｊ，Ｅｌｄｒｅｄｇｅ　Ｇ，　Ｓｃｈｏｌｌ　Ｔ，　Ｍｉｌｌｅｒ　ＲＭ，　Ｂｈａｔｎａｇａｒ　Ｓ，　Ａｄｅｙ　Ｎ，　Ｒｕｂａｎｏ　Ｔ，　ＴｕｓｎｅｅｍＮ，　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｒ，　Ｆｅｌｄｈａｕｓ　Ｊ，　Ｍａｃａｌｍａ　Ｔ，　Ｏｌｉｐｈａｎｔ　Ａ，　Ｂｒｉｇｇｓ　Ｓ　（２００２）　Ａ　ｄｒａｆｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｉｃｅ　ｇｅｎｏｍｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．　ｓｓｐ．　ｊａｐｏｎｉｃａ）．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９６：　９２−１００
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　ＡＨ，　Ｂａｒｅｔｌｅｉｎ　ＤＡ，　Ｄａｎｏｎ　Ａ　（１９８９）　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ　ｓｔｒｅｓｓａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐ　７：　７−１６
Ｇｒｅｅｎ　ＰＪ　（１９９４）　Ｔｈｅ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ　ｏｆ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ．　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４５：　４２１−４４５
Ｈｕ　Ｂ，　Ｗｕ　Ｐ，　Ｌｉａｏ　ＣＹ，　Ｚｈａｎｇ　ＷＰ，　Ｎｉ　ＪＪ　（２００１）　ＱＴＬｓ　ａｎｄ　ｅｐｉｓｔａｓｉｓ　ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｕｎｄｅｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）．　Ｐｌａｎｔ　Ｓｏｉｌ　２３０：　９９−１０５
Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ　Ｎ，　Ｙａｚａｋｉ　Ｊ，　Ｆｕｊｉｉ　Ｆ，　Ｓｈｉｍｂｏ　Ｋ，　Ｏｈｔａ　Ｔ，　Ｓｈｉｍａｔａｎｉ　Ｚ，　Ｎａｇａｔａ　Ｙ，　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ａ，　Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｓ　（２００２）　Ｒｉｃｅ　ｃＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：　Ａ　ｐｏｗｅｒｆｕｌ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｏｍｉｃｓ．　　Ｒｅｃ　Ｒｅｓ　Ｄｅｖ　ＰｌａｎｔＢｉｏｌ　２：　４９−５９
Ｌｅａｓｅ　ＲＡ，　Ｃｕｓｉｃｋ　ＭＥ，　Ｂｅｌｆｏｒｔ　Ｍ　（１９９８）　Ｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ：　ＤｓｒＡ　ＲＮＡ　ａｃｔｓ　ｂｙ　ＲＮＡ：ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ａｔ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｌｏｃｉ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９５：　１２４５６−１２４６１
Ｌｉｕ　Ｃ，　Ｍｕｃｈｈａｌ　ＵＳ，　Ｒａｇｈｏｔｈａｍａ　ＫＧ　（１９９７）　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＰＳＩ１，　ａ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｏｍａｔｏ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　３３：　８６７−８７４
Ｌｏｆｆｌｅｒ　Ａ，　Ａｂｅｌ　Ｓ，　Ｊｏｓｔ　Ｗ，　Ｂｅｉｎｔｅｍａ　ＪＪ，　Ｇｌｕｎｄ　Ｋ　（１９９２）　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｔｏｍａｔｏ　（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）　ｃｅｌｌｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　９８：　１４７２−１４７８．
Ｍａｒｔｉｎ　ＡＣ，　ｄｅｌ　Ｐｏｚｏ　ＪＣ，　Ｉｇｌｅｓｉａｓ　Ｊ，　Ｒｕｂｉｏ　Ｖ，　Ｓｏｌａｎｏ　Ｒ，　ｄｅ　ｌａ　Ｐｅｎａ　Ａ，　Ｌｅｙｖａ　Ａ，　Ｐａｚ−Ａｒｅｓ　Ｊ　（２０００）　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　２４：　５５９−５６７
ＭｃＥｌｒｏｙ　Ｄ，　Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ　Ｍ，　Ｒｅｅｃｅ　ＫＳ，　Ｗｕ　Ｒ　（１９９０）　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｒｉｃｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）　ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　１５：　２５７−２６８
Ｍｕｃｈｈａｌ　ＵＳ，　Ｐａｒｄｏ　ＪＭ，　Ｒａｇｈｏｔｈａｍａ　ＫＧ　（１９９６）　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ　ｆｒｏｍｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９３：　１０５１９−１０５２３
Ｍｕｃｃｈａｌ　ＵＳ，　Ｒａｇｈｏｔｈａｍａ　ＫＧ　（１９９９）　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９６：　５８６８−５８７２
Ｍｕｋａｔｉｒａ　ＵＴ，　Ｌｉｕ　Ｃ，　Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ　ＤＫ，　Ｒａｇｈｏｔｈａｍａ　ＫＧ　（２００１）　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１２７：　１８５４−１８６２
Ｍｕｒｒａｙ　ＭＧ，　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＷＦ　（１９８０）　Ｒａｐｉｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔｐｌａｎｔ　ＤＮＡ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　８：　４３２１−４３２５
Ｎｉ　ＪＪ，　Ｗｕ　Ｐ，　Ｓｅｎａｄｈｉｒａ　Ｄ，　Ｈｕａｎｇ　Ｎ　（１９９８）　Ｍａｐｐｉｎｇ　ＱＴＬｓ　ｆｏｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）．　Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ　９７：　１３６１−１３６９
Ｏｓｈｉｍａ　Ｙ　（１９９７）　Ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｇｅｎｅｔ　Ｓｙｓｔ　７２：　３２３−３３４
Ｏｚａｗａ　Ｋ，　Ｏｓａｋｉ　Ｍ，　Ｍａｔｓｕｉ　Ｈ，　Ｈｏｎｍａ　Ｍ，　Ｔａｄａｎｏ　Ｔ　（１９９５）　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｕｐｉｎ　ｒｏｏｔｓ　ｕｎｄｅｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．　Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉ　Ｐｌａｎｔ　Ｎｕｔｒ　４１：　４６１−４６９
Ｐａｌｍｉｔｅｒ　ＲＤ　（１９７４）　Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．　Ｅｘｐｅｄｉｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｕｎｄｅｒｇｒａｄｅｄ　ｐｏｌｙｓｏｍｅｓ　ａｎｄｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：　３６０６−３６１５
Ｐｏｉｒｉｅｒ　ＷＲ　Ｔｈｏｍａ　Ｓ，　Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ　Ｃ，　Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎ　Ｊ　（１９９１）　Ａ　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｉｎ　ｘｙｌｅｍ　ｌｅａｄｉｎｇ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　５０：　６６５−６９３
Ｒｕｂｉｏ　Ｖ，　Ｌｉｎｈａｒｅｓ　Ｆ，　Ｓｏｌａｎｏ　Ｒ，　Ｍａｒｔｉｎ　ＡＣ，　Ｉｇｌｅｓｉａｓ　Ｊ，　Ｌｅｙｖａ　Ａ，　Ｐａｚ−Ａｒｅｓ　Ｊ　（２００１）　Ａ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ＭＹＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｂｏｔｈ　ｉｎ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ｉｎ　ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｌｇａｅ．　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｖ　１５：　２１２２−２１３３
Ｓａｈｅｋｉ　Ｓ，　Ｔａｋｅｄａ　Ａ，　Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｔ　（１９８５）　Ａｓｓａｙ　ｏｆ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｉｌｄ　ｐＨ　ｒａｎｇｅ，　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１３：　３６０５−３６１５
Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ，　Ｆｒｉｔｓｃｈ　ＥＦ，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ　（１９８９）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹＳａｎｇｅｒ　Ｆ，　Ｎｉｃｋｌｅｎ　Ｓ，　Ｃｏｕｌｓｏｎ　ＡＲ　（１９７７）　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７４：　５４６３−５４６７
Ｓｕｇｉｕｒａ　Ｍ，　Ｔａｋｅｄａ　Ｙ　（２０００）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ．　Ｉｎ　Ｂｕｃｈａｎａｎ　Ｂ，　Ｇｒｕｉｓｓｅｍ　Ｗ，　Ｊｏｎｅｓ　Ｒ　ｅｄｓ，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ．　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ，　ｐｐ　２６０−３１０
Ｔａｄａｎｏ　Ｔ，　Ｓａｋａｉ　Ｈ　（１９９１）　Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆｓｅｖｅｒａｌ　ｃｒｏｐ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．　Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉ　Ｐｌａｎｔ　Ｎｕｔｒ　３７：　１２９−１４０
Ｔａｎｇ　Ｚ，　Ｓａｄｋａ　Ａ，　Ｍｏｒｉｓｈｉｇｅ　ＤＴ，　Ｍｕｌｌｅｔ　ＪＥ　（２００１）　Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ　ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｉｎｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｏｙｂｅａｎ　ＶｓｐＢ　ｔｒｉｐａｒｔｉｌｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１２５：　７９７−８０９
Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ　（２０００）　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．　Ｎａｔｕｒｅ　４０８：　７９６−８１５
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＪＤ，　Ｈｉｇｇｉｎｓ　ＤＧ，　Ｇｉｂｓｏｎ　ＴＪ　（１９９４）　Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ：　ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，　ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇａｐ　ｐｅｎａｌｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｔｒｉｘ　ｃｈｏｉｃｅ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２２：　４６７３−４６８０
Ｔｏｒｒｉａｎｉ　Ａ，　Ｌｕｄｔｋｅ　ＤＮ　（１９８５）　Ｔｈｅ　Ｐｈｏ　ｒｅｇｕｌｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．　Ｉｎ　Ｓｈａｅｃｈｔｅｒ　Ｍ，　Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ　ＦＣ，　Ｉｎｇｒａｈａｍ　Ｊ，　Ｋｊｅｌｄｇａａｒｄ　ＮＯ　ｅｄｓ，　Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ，　Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｂａｒｔｌｅｔｔ，　Ｂｏｓｔｏｎ，　ｐｐ　２２４−２４２
Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ　ＤＫ，　Ｋａｒｔｈｉｋｅｙａｎ　ＡＳ，　Ｍａｔｉｌｄａ　ＰＤ，　Ｒａｇｈｏｔｈａｍａ　ＫＧ　（２００２）　Ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ，　ａｎ　ａｎａｌｏｇ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｔｈｅ　ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１２９：　１２３２−１２４０
Ｗａｓａｋｉ　Ｊ，　Ｏｍｕｒａ　Ｍ，　Ａｎｄｏ　Ｍ，　Ｓｈｉｎａｎｏ　Ｔ，　Ｏｓａｋｉ　Ｍ，　Ｔａｄａｎｏ　Ｔ　（１９９９）　Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　ｌｕｐｉｎ　（Ｌｕｐｉｎｕｓ　ａｌｂｕｓ　Ｌ．）　ａｎｄ　ａ　ｋｅｙ　ｓｉｇｎａｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ．　Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉ　Ｐｌａｎｔ　Ｎｕｔｒ　４５：　９３７−９４５
Ｗａｓａｋｉ　Ｊ，　Ｏｍｕｒａ　Ｍ，　Ａｎｄｏ　Ｍ，　Ｄａｔｅｋｉ　Ｈ，　Ｓｈｉｎａｎｏ　Ｔ，　Ｏｓａｋｉ　Ｍ，　Ｉｔｏ　Ｈ，　ＭａｔｓｕｉＨ，　Ｔａｄａｎｏ　Ｔ　（２０００）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｒｏｏｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｌｕｐｉｎ　（Ｌｕｐｉｎｕｓ　ａｌｂｕｓ　Ｌ．）．　Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉ　Ｐｌａｎｔ　Ｎｕｔｒ　４６：　４２７−４３７
Ｗａｓａｋｉ　Ｊ，　Ｙａｍａｍｕｒａ　Ｔ，　Ｓｈｉｎａｎｏ　Ｔ，　Ｏｓａｋｉ　Ｍ　（２００２）　Ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　ｌｕｐｉｎ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．　Ｐｌａｎｔ　Ｓｏｉｌ　（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）
Ｙｕ　Ｊ，　Ｈｕ　Ｓ，　Ｗａｎｇ　Ｊ，　Ｗｏｎｇ　ＧＫ−Ｓ，　Ｌｉ　Ｓ，　Ｌｉｕ　Ｂ，　Ｄｅｎｇ　Ｙ，　Ｄａｉ　Ｌ，　Ｚｈｏｕ　Ｙ，　Ｚｈａｎｇ　Ｘ，　Ｃａｏ　Ｍ，　Ｌｉｕ　Ｊ，　Ｓｕｎ　Ｊ，　Ｔａｎｇ　Ｊ，　Ｃｈｅｎ　Ｙ，　Ｈｕａｎｇ　Ｘ，　Ｌｉｎ　Ｗ，　Ｙｅ　Ｃ，　Ｔｏｎｇ　Ｗ，Ｃｏｎｇ　Ｌ，　Ｇｅｎｇ　Ｊ，　Ｈａｎ　Ｙ，　Ｌｉ　Ｌ，　Ｌｉ　Ｗ，　Ｈｕ　Ｇ，　Ｈｕａｎｇ　Ｘ，　Ｌｉ　Ｗ，　Ｌｉ　Ｊ，　Ｌｉｕ　Ｚ，　ＬｉＬ，　Ｌｉｕ　Ｊ，　Ｑｉ　Ｑ，　Ｌｉｕ　Ｊ，　Ｌｉ　Ｌ，　Ｌｉ　Ｔ，　Ｗａｎｇ　Ｘ，　Ｌｕ　Ｈ，　Ｗｕ　Ｔ，　Ｚｈｕ　Ｍ，　Ｎｉ　Ｐ，　ＨａｎＨ，　Ｄｏｎｇ　Ｗ，　Ｒｅｎ　Ｘ，　Ｆｅｎｇ　Ｘ，　Ｃｕｉ　Ｐ，　Ｌｉ　Ｘ，　Ｗａｎｇ　Ｈ，　Ｘｕ　Ｘ，　Ｚｈａｉ　Ｗ，　Ｘｕ　Ｚ，　Ｚｈａｎｇ　Ｊ，　Ｈｅ　Ｓ，　Ｚｈａｎｇ　Ｊ，　Ｘｕ　Ｊ，　Ｚｈａｎｇ　Ｋ，　Ｚｈｅｎｇ　Ｘ，　Ｄｏｎｇ　Ｊ，　Ｚｅｎｇ　Ｗ，　Ｔａｏ　Ｌ，　Ｙｅ　Ｊ，Ｔａｎ　Ｊ，　Ｒｅｎ　Ｘ，　Ｃｈｅｎ　Ｘ，　Ｈｅ　Ｊ，　Ｌｉｕ　Ｄ，　Ｔｉａｎ　Ｗ，　Ｔｉａｎ　Ｃ，　Ｘｉａ　Ｈ，　Ｂａｏ　Ｑ，　Ｌｉ　Ｇ，　Ｇａｏ　Ｈ，　Ｃａｏ　Ｔ，　Ｗａｎｇ　Ｊ，　Ｚｈａｏ　Ｗ，　Ｌｉ　Ｐ，　Ｃｈｅｎ　Ｗ，　Ｗａｎｇ　Ｘ，　Ｚｈａｎｇ　Ｙ，　Ｈｕ　Ｊ，　Ｗａｎｇ　Ｊ，　Ｌｉｕ　Ｓ，　Ｙａｎｇ　Ｊ，　Ｚｈａｎｇ　Ｇ，　Ｘｉｏｎｇ　Ｙ，　Ｌｉ　Ｚ，　Ｍａｏ　Ｌ，　Ｚｈｏｕ　Ｃ，　Ｚｈｕ　Ｚ，　Ｃｈｅｎ　Ｒ，　Ｈａｏ　Ｂ，　Ｚｈｅｎｇ　Ｗ，　Ｃｈｅｎ　Ｓ，　Ｇｕｏ　Ｗ，　Ｌｉ　Ｇ，　Ｌｉｕ　Ｓ，　Ｔａｏ　Ｍ，　Ｗａｎｇ　Ｊ，　Ｚｈｕ　Ｌ，　Ｙｕａｎ　Ｌ，　Ｙａｎｇ　Ｈ　（２００２）　Ａ　ｄｒａｆｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｉｃｅ　ｇｅｎｏｍｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．　ｓｓｐ．　ｉｎｄｉｃａ）．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９６：　７９−９２
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【配列表】
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【００９８】
【発明の効果】
本発明の遺伝子は、以上のように、配列表１に記載の塩基配列、または、上記塩基配列の一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を備え、リン栄養に発現応答性を有する構成である。
【００９９】
それゆえ、上記構成は、リン発現応答性を調節するなどの形質転換により、上記植物の環境適用性（例えば、リン欠乏状態の土壌でも生育可能な）を向上できる。これにより、上記構成は、土壌中の有機化したリンを無機化して植物に取り込むことができて、植物の栽培において、リン肥料を用いない、または、リン肥料を少量にできるという効果を奏する。
【０１００】
特に、配列表２２に記載の各種植物に共通の塩基配列を検出することによる栄養診断技術の開発により、極めて迅速に植物の栄養状態を評価することが可能となる。
【０１０１】
その上、このようなｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒは他の栄養ストレス、他の種にも広く存在していると考えられることから、広範な植物の各種栄養に対する診断技術につながる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る遺伝子（ＯｓＰＩ１）を含む、リン欠乏状態のイネの根から得られたｃＤＮＡに対するマイクロアレイで解析された遺伝子の相対的発現量のスキャタープロットを示すグラフであり、（ａ）は、−Ｐ区に１日のものを示し、（ｂ）は、−Ｐ区に９日のものを示す。
【図２】上記イネの栽培による、乾物生産（Ｄｒｙ　Ｍａｔｔｅｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、全リン（Ｐ）濃度の経時的な変化を示すグラフであって、（ａ）は、地上部の乾物生産、（ｂ）は、根部の乾物生産、（ｃ）は、地上部の全リン濃度、（ｄ）は、根部の全燐濃度を示す。
【図３】上記の栽培したイネの経時的な、ノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）解析の結果により、ＯｓＰＩ１のｍＲＮＡ量（発現量）を示す電気泳動図であって、（ａ）および（ｂ）は、地上部、（ｃ）および（ｄ）は、根を示す。
【図４】上記遺伝子（ＯｓＰＩ１）に対するプライマー伸長の結果を示す図であり、（ａ）は２つの強いシグナルの一方を示し、（ｂ）２つの強いシグナルの他方を示す。
【図５】上記遺伝子（ＯｓＰＩ１）に対するサザンブロット（Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）解析の結果を示す電気泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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