(57)【要約】【課題】エンハンサーあるいはプロモーター配列の導入から植物遺伝子の活性化までを比較的簡単に効率よく行うことができるベクターおよび方法を提供すること。【解決手段】（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセットから構成される植物遺伝子活性化ベクター。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセットから構成される植物遺伝子活性化ベクター。
【請求項２】
毛状根誘発遺伝子が、ｒｏｌＢ遺伝子を含む、請求項１に記載の植物遺伝子活性化ベクター
【請求項３】
エンハンサーが、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター由来である、請求項１又は２に記載の植物遺伝子活性化ベクター
【請求項４】
配列番号１３に記載の塩基配列を有するｐＨＲ−ＡＴ、又はこれと実質的に同一の塩基配列及び実質的の同一の機能を有するベクターである、請求項１に記載の植物遺伝子活性ベクター。
【請求項５】
配列番号１４に記載の塩基配列を有するｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰ、又はこれと実質的に同一の塩基配列及び実質的の同一の機能を有するベクターである、請求項１に記載の植物遺伝子活性ベクター。
【請求項６】
請求項１から５の何れかに記載の植物遺伝子活性化ベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を植物組織に感染し、（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセットを植物組織に導入し、毛状根を形成させることを含む、植物遺伝子の活性化方法。
【請求項７】
毛状根誘発遺伝子が、ｒｏｌＢ遺伝子を含む、請求項６に記載の植物遺伝子の活性化方法。
【請求項８】
エンハンサーが、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター由来である、請求項６又は７に記載の植物遺伝子の活性化方法。
【請求項９】
請求項１から５の何れかに記載の植物遺伝子活性化ベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を植物組織に感染し、（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセットを植物組織に導入し、毛状根を形成させた後に、上記エンハンサー及び／又はプロモーターによって遺伝子発現が誘発された毛状根を選抜することを含む、植物遺伝子の分析方法。
【請求項１０】
請求項１から５の何れかに記載の植物遺伝子活性化ベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を植物組織に感染し、（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセットを植物組織に導入し、毛状根を形成させることにより得られる、植物遺伝子の発現が誘発された毛状根。
【請求項１１】
請求項１から５の何れかに記載の植物遺伝子活性化ベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は植物遺伝子活性化ベクターおよびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物遺伝子を活性化させる方法として、アクティベーションタギング法がある。これは、植物細胞で機能可能なあるいはエンハンサーあるいはプロモーター配列をもつベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を介して植物に導入し、ベクターのＤＮＡが導入された形質転換植物において、挿入されたエンハンサーあるいはプロモーターの作用により、その近傍の遺伝子を活性化させる方法である（モデル植物の実験プロトコール、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４、島本功、岡田清孝監修、秀潤社、１９９６、ｐ１３５−１４２）。この方法により活性化された遺伝子がいくつか単離されているが、そのほとんどが、シロイヌナズナ由来の遺伝子である（Ｗｅｉｇｅｌら、  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２２，  １００３−１０１３  （２０００））。アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を用いたアクティベーションタギング法では、植物体にまで再分化させることが多く、そのため、形質転換植物体を数多く扱えるシロイヌナズナのような小型の実験植物に使用が限られていた。さらにこのような小型の実験植物であってもアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌の感染から、植物体の再分化、遺伝子の活性化に至るまでに、多大な時間と労力が必要であった。
【０００３】
【非特許文献１】
モデル植物の実験プロトコール、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４、島本功、岡田清孝監修、秀潤社、１９９６、ｐ１３５−１４２
【非特許文献２】
Ｗｅｉｇｅｌら、  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２２，  １００３−１０１３  （２０００）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。すなわち、発明は、エンハンサーあるいはプロモーター配列の導入から植物遺伝子の活性化までを比較的簡単に効率よく行うことができるベクターおよび方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、植物遺伝子を毛状根において迅速に活性化する手法を確立することを解決すべき課題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、植物遺伝子活性化ベクターを発明し、該植物遺伝子活性化ベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌の感染により誘発される毛状根を用いることによる遺伝子活性化法を見出し、本発明を完成した。すなわち、土壌細菌アグロバクテリウム・リゾゲネスを感染させることにより、感染部位から毛状根が誘発される。これは菌が持つＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡに存在する毛状根誘発遺伝子が植物ゲノムに入ることによる。そこで毛状根誘発遺伝子、および、植物で機能可能なエンハンサーあるいはプロモーター配列の両者を持つ植物遺伝子活性化ベクターを発明し、該植物遺伝子活性化ベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を植物に感染させることにより、感染部位から毛状根が誘発されることを見出した。しかも毛状根の誘発が、菌が感染した各々の細胞で独立に起こるイベントであるため、誘発された一本一本の根はそれぞれ異なる毛状根クローンであることを見出し、毛状根クローンにおける植物遺伝子活性化が生じることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明によれば、（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセットから構成される植物遺伝子活性化ベクターが提供される。
【０００７】
好ましくは、毛状根誘発遺伝子は、ｒｏｌＢ遺伝子を含む。
好ましくは、エンハンサーは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター由来である。
好ましくは、本発明の植物遺伝子活性ベクターは、配列番号１３に記載の塩基配列を有するｐＨＲ−ＡＴ、又はこれと実質的に同一の塩基配列及び実質的の同一の機能を有するベクターである。
好ましくは、本発明の植物遺伝子活性ベクターは、配列番号１４に記載の塩基配列を有するｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰ、又はこれと実質的に同一の塩基配列及び実質的の同一の機能を有するベクターである。
【０００８】
本発明の別の側面によれば、上記した何れかの本発明の植物遺伝子活性化ベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を植物組織に感染し、（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセットを植物組織に導入し、毛状根を形成させることを含む、植物遺伝子の活性化方法が提供される。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、上記した何れかの本発明の植物遺伝子活性化ベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を植物組織に感染し、（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセットを植物組織に導入し、毛状根を形成させた後に、上記エンハンサー及び／又はプロモーターによって遺伝子発現が誘発された毛状根を選抜することを含む、植物遺伝子の分析方法が提供される。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、上記した何れかの本発明の植物遺伝子活性化ベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を植物組織に感染し、（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセットを植物組織に導入し、毛状根を形成させることにより得られる、植物遺伝子の発現が誘発された毛状根が提供される。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、上記した何れかの本発明の植物遺伝子活性化ベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌が提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、以下に記述された遺伝子工学的方法は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮ  ０−４７１−５０３３８−Ｘ、「モデル植物の実験プロトコール、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４、島本功、岡田清孝監修、秀潤社」（１９９６）、「新版植物のＰＣＲ実験プロトコール、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ７、島本功、佐々木卓治監修、秀潤社」（１９９７）等に記載される通常の方法に準じて実施可能である。
【００１３】
（１）毛状根誘発遺伝子
本発明で用いられる「毛状根誘発遺伝子」は、アグロバクテリウム・リゾゲネス菌のＲｉプラスミド上に存在する遺伝子であって、該遺伝子で形質転換した植物細胞を根に分化する遺伝子のことである。たとえばアグロバクテリウム・リゾゲネスＡ４株のｒｏｌＢ遺伝子  （Ｓｌｉｇｈｔｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１，  １０８−１２１  （１９８６））  、アグロバクテリウム・リゾゲネスＭＡＦ０３−１７２４株のｒｏｌＢ遺伝子（特開平５−１９２１５４）などが例示できる。ｒｏｌＢ遺伝子は、単独で用いてもよいし、アグロバクテリウム・リゾゲネス菌のＲｉプラスミド上に存在するｒｏｌＡ遺伝子、ｒｏｌＣ遺伝子（Ｓｌｉｇｈｔｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１，  １０８−１２１  （１９８６）、特開平５−１９２１５４）などと組み合わせて用いることもできる。
【００１４】
（２）エンハンサー
本発明で用いられる「植物で機能可能なエンハンサー」は、真核細胞およびウイルスのゲノムに存在するＤＮＡ配列で、その近傍に存在する植物プロモーターからの転写を著しく促進するＤＮＡ配列のことであり、たとえば、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター中の−９０から４４０塩基の範囲のＤＮＡ配列を例示することができる。このエンハンサー配列は単独で用いることもできるし、２ないし１０個、好ましくは４ないし５個直列に繋げて用いることができる。
【００１５】
（３）植物プロモーター
本発明で用いられる「植物で機能可能なプロモーター」は、植物で機能可能な転写および翻訳開始等の遺伝子発現調節に関与する領域を有する遺伝子のことであり、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＳ）プロモーターなどのＴ−ＤＮＡ由来の構成型プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の１９Ｓ及び３５Ｓプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子のプロモーター、Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＲ）遺伝子のプロモーターなどの誘導プロモーターなどをあげることができる。また、その他の公知の植物根で機能可能なプロモーターも挙げられることができる。好ましくは、タバコＴｏｂＲＢ７遺伝子プロモーター、タバコＣＩＧ２遺伝子プロモーター、タバコｐａｒＡｔ遺伝子プロモーターなどを根で高発現する遺伝子プロモーターを用いることができる。
【００１６】
（４）植物ターミネーター
本発明において、「植物で機能可能なターミネーター」とは、植物で機能可能な転写終結等の遺伝子発現調節に関与する領域を有する遺伝子のことであり、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーター、オクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＳ）ターミネーターなどのＴ−ＤＮＡ由来のターミネーター、タバコｐａｒＡｔ遺伝子ターミネーター、その他の公知の植物根で機能可能なターミネーターも挙げられることができる。
【００１７】
（５）発現カセット
本発明で用いられる「（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセット」とは、（１）上記「毛状根誘発遺伝子」を有し、かつ（２）上記「植物で機能可能なエンハンサーあるいはプロモーター」を有し、その下流に「植物根で機能可能なターミネーター」を実質的に含まない発現カセットである。「植物で機能可能なエンハンサーあるいはプロモーター」の下流のＤＮＡ配列は、「植物根で機能可能なターミネーター」を実質的に含まないＤＮＡ配列であれば特に限定されるものではなく、必要に応じて、葉緑体以降シグナル配列、ミトコンドリア移行シグナル配列などのシグナル配列遺伝子、その他、「植物根で機能可能なターミネーター」を実質的に含まないＤＮＡ配列を付加することができる。また、本発明で用いられる発現カセットには、上記（１）および（２）に加えて、必要に応じて、大腸菌における複製開始点を含む配列、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリンン耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカー、あるいは、ＧＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子などのレポーター遺伝子を含むことができる。
【００１８】
（６）植物遺伝子活性化ベクター
本発明で用いられる「植物遺伝子活性化ベクター」は、上記「（１）  毛状根誘発遺伝子を有すること、かつ（２）  植物で機能可能なエンハンサーあるいはプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まないことを特徴とする発現カセット」から構成されているものである。通常、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌において複製可能であり、かつ、植物細胞に遺伝子の移行が可能な  ＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  １２，  ８７１１−８７２１  （１９８４））を改変したバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ右境界領域と左境界領域の間に、上記発現カセットを挿入し、植物遺伝子活性化ベクターとして用いられる。このような植物遺伝子活性化ベクターとして、ｐＨＲ−ＡＴ、ｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰなどが例示できる。
【００１９】
（７）アグロバクテリウム菌
本発明で用いる「アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌」は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌に分類される菌であれば、特に限定されるものではない。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０ＲＫ株）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株などを例示できる。「植物遺伝子活性化ベクター」は、植物細胞工学ｖｏｌ．４  Ｎｏ．３  ｐ１９３−２０３  （１９９２）記載のエレクトロポレーション法、塩化カルシウム法などによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌に導入することができる（以下、本発明形質転換アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌とする）。
【００２０】
（８）植物の形質転換
本発明の形質転換アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌は、植物細胞工学ｖｏｌ．４  Ｎｏ．３  ｐ１９３−２０３  （１９９２）記載のアグロバクテリウム・リゾゲネス菌を用いた毛状根誘発方法に沿って植物組織に感染させることにより毛状根を誘発することができる。感染する植物は特定されないが、ダイズ、エンドウ、アルファルファ、インゲン、ミヤコグサなどのマメ科植物、タバコ、トマト、ナス、ジャガイモ、キンギンナスビなどのナス科植物、ダイコン、ナタネ、キャベツ、シロイヌナズナなどのアブラナ科植物、メロン、キュウリ、カボチャなどのウリ科植物、ニンジン、セロリなどのセリ科植物、ジョチュウギクなどのキク科植物などを例示できる。
【００２１】
（９）遺伝子の活性化
本発明で得られた毛状根は、必要に応じて、一本ずつ分離してクローニングした後、使用してもよいし、複数の毛状根を集団のまま利用してもよい。本発明によれば、本発明で得られた毛状根には遺伝子が活性化したものが含まれているので、例えば、植物ステロイドの生合成増強に関与する遺伝子が活性化されたものを取得したいのであれば、キャピラリー電気泳動と四重極／飛行時間ハイブリッド型質量分析計とを直列させた分析装置などで、毛状根抽出物を分析し、植物ステロイド含量が増加した毛状根クローンを選抜することができる。また、耐塩性に関与する遺伝子が活性化されたものを取得したいのであれば、複数の毛状根の集団を、高塩濃度の培養液で培養し、生育する毛状根クローンを選抜することができる。
【００２２】
これらの毛状根クローンからＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン登録商標）ＤＮＡ抽出キットなどを用いてゲノムＤＮＡを抽出し、新版植物のＰＣＲ実験プロトコール、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ７、島本功、佐々木卓治監修、秀潤社、１９９７、ｐ８３−８９に記載されているＴＡＩＬ−ＰＣＲ法などによって、「本発現カセット」が挿入された植物ゲノム上の遺伝子の部分配列が判明する。また、これらの毛状根クローンが、植物遺伝子活性化ベクターに大腸菌での複製開始点を含む配列、薬剤耐性マーカーなどが含まれているベクターを保持する本発明の形質転換アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌によって得られたものであれば、新版モデル植物の実験プロトコール、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ１５、島本功、岡田清孝監修、秀潤社、２００１、ｐ１３５−１４２に記載されているプラスミドレスキュー法により、「本発現カセット」が挿入された植物ゲノム上の遺伝子の部分配列が判明する。遺伝子の発現量は、新版植物のＰＣＲ実験プロトコール、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ７、島本功、佐々木卓治監修、秀潤社、１９９７、ｐ１０６−１１５に記載されているＲＴ−ＰＣＲ法などにより検出することにより、遺伝子の活性化を検出することができる。
【００２３】
（１０）活性化した遺伝子の利用
上記のように活性化した遺伝子を有する毛状根クローンは、そのまま培養して用いることができる。例えば、植物ステロイドが増強した毛状根クローンは、大量培養することにより、植物ステロイドの生産に用いることができる。あるいは、常法によって遺伝子クローニングし、必要に応じて、他の植物に導入して用いることもできる。たとえば耐塩性に関して活性化した遺伝子は、耐塩性のない植物に導入することにより、その植物に耐塩性を付与することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１：ｒｏｌ−ｔｙｐｅ  アクティベーションタギングベクターｐＨＲ−ＡＴの構築
オリゴヌクレオチド  ＡｓｃＩ−ＡｖｒＩＩ  （ＣｌａＩ＋）（配列番号１）およびオリゴヌクレオチド  ＡｓｃＩ−ＡｖｒＩＩ  （ＣｌａＩ−）（配列番号２）を合成した。１００μＭのＡｓｃ  Ｉ−Ａｖｒ  ＩＩ  （ＣｌａＩ＋）と、１００μＭのＡｓｃＩ−ＡｖｒＩＩ  （ＣｌａＩ−）を２０μｌずつ混合して、７０℃で５分間熱処理後、室温に戻すことによって、上流側から制限酵素ＡｓｃＩおよびＡｖｒ  ＩＩサイトを含み、両末端に５’−ＣＧ−３’の５’突出末端を持つを持つ２本鎖ＤＮＡを調製した。  次いで、該２本鎖ＤＮＡを、制限酵素Ｃｌａ  Ｉで消化したベクターｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴ（ＲＢに近接してタンデム化した４コピーのカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター中のエンハンサー領域、Ｃｏｌ  Ｅ１の複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺伝子をＴ−ＤＮＡ部分に有する：Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：  １３５０−１３５３  （１９９２））にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造登録商標）を用いてキットに記載された方法に従ってライゲーションし、プラスミドｐＰＣＶＩＣＥ  （ＡｓｃＩ−ＡｖｒＩＩ）を得た（図１）。
【００２６】
アグロバクテリウム・リゾゲネスＭＡＦＦ０３−０１７２４株の有するＲｉプラスミド、ｐＲｉ１７２４上にコードされるｒｏｌＡ，  ｒｏｌＢおよびｒｏｌＣ遺伝子を含むＤＮＡ領域（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５８：  ５４８−５５１  （１９９４）、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号Ｄ２３６６９に記載）を鋳型として、制限酵素ＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩサイトを５’端に付加したセンスプライマーＤ２３６６９  （１＋，  ＡｓｃＩ／ＥｃｏＲＩ）（配列番号３）と制限酵素ＡｖｒＩＩサイトを５’端に付加したアンチセンスプライマーＤ２３６６９  （７５５５−，  ＡｖｒＩＩ）（配列番号４）を用いて、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社登録商標）で、９４℃２分間の後、９４℃３０秒間次いで６２℃３０秒間さらに７２℃１１分間の保温を１サイクルとして２５サイクルからなるＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分析した結果、約７．６ＫｂのＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片を制限酵素ＡｓｃＩおよびＡｖｒＩＩで消化した。さらに、プラスミドｐＰＣＶＩＣＥ  （ＡｓｃＩ−ＡｖｒＩＩ）を制限酵素ＡｓｃＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、上記の約７．６ＫｂのＡｓｃＩ−ＡｖｒＩＩ断片とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造登録商標）を用いてライゲーションし、ｐＨＲ−ＡＴを構築した（図２）。ｐＨＲ−ＡＴの塩基配列（１７５１１ｂｐ）を配列表の配列番号１３に示す。
【００２７】
実施例２：ｒｏｌ−ｔｙｐｅ  アクティベーションタギングベクターｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰの構築
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）遺伝子およびノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーターを有する断片をプラスミド３５Ｓ  ｏｍｅｇａ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ  ６：３２５−３３０  （１９９６））を鋳型として制限酵素ＡｓｃＩサイトを５’端に付加したセンスプライマー３５Ｓ−５  （ＡｓｃＩ）（配列番号５）と制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを５’端に付加したアンチセンスプライマーＮＯＳ−Ｔ−３（ＥｃｏＲＩ）（配列番号６）を用いてＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社登録商標）で、９４℃２分間の後、９４℃３０秒間次いで６０℃３０秒間さらに７２℃２分間の保温を１サイクルとして２５サイクルからなるＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分析した結果、約１．４ＫｂのＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片を制限酵素ＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。さらに、実施例１で構築したｐＨＲ−ＡＴを制限酵素ＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、上記の約１．４ＫｂのＡｓｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片とをライゲーションし、ｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰを構築した（図３）。ｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰの塩基配列（１８９８７ｂｐ）を配列表の配列番号１４に示す。
【００２８】
実施例３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１  （ｐＭＰ９０ＲＫ）株を２  ｍｌのＹＥＰ培地（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０ｇ，  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ，  ＮａＣｌ  ５ｇ、水１Ｌ）で２８℃、２００  ｒｐｍで約２４時間振とう培養した。培養液全量を５０  ｍｌのＹＥＰ培地に移し、ＯＤ６００が約０．８になるまでさらに振とう培養を続けた。３０００  ｘ  ｇ，  １０分間の遠心分離により集菌した後、１  ｍｌの２０  ｍＭ塩化カルシウムに懸濁した。懸濁した菌液を１００μｌずつ分注し、液体窒素により凍結した後、使用するまで−８０℃で凍結保存した。この状態の菌をコンピテントセルとする。凍結したコンピテントセルに実施例１および２で得られたｐＨＲ−ＡＴ、ｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰを１μｇ添加し、３７℃で５分間処理した後、１ｍｌのＹＥＰ培地を添加し、２８℃、２００  ｒｐｍで約２時間振とう培養した。１２，０００  ｘ  ｇ，  ２分間の遠心分離により集菌した後、１００μｌのＹＥＰ培地に懸濁した。この菌液をカルベニシリン１００ｍｇ／ｌ，  リファンピシン１００ｍｇ／ｌおよびゲンタマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＹＥＰ寒天培地に添塗した。形質転換したアグロバクテリウム・ツメファシエンスは、導入されたプラスミドが有するβ−ラクタマーゼ遺伝子により付与されるカルベニシリンに対する薬剤耐性を利用して該培地で選択する事によって得られた。形質転換したアグロバクテリウム・ツメファシエンスをカルベニシリン１００ｍｇ／ｌ，  リファンピシン１００ｍｇ／ｌおよびゲンタマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＹＥＰ培地で２８℃、２日間培養し、得られた培養液からプラスミド精製を行い、ｐＨＲ−ＡＴあるいは  ｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰを有していることを確認した。
【００２９】
実施例４：シロイヌナズナ形質転換
シロイヌナズナのエコタイプ  ＷＳの種子を有効塩素濃度１％の次亜塩素酸溶液で滅菌処理した後、ＭＳ寒天培地に置床し、２日間４℃処理した。２６℃日長１６時間で９日間培養し、発芽させた。発芽した幼植物から胚軸を切り取り、４μＭの２，４−Ｄおよび０．４μＭのベンジルアデニンを添加したＭＳ培地に置床し、２６℃、日長１６時間で７日間培養し、緑化したカルスを誘導した。実施例３で調製したｐＨＲ−ＡＴあるいは  ｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスをカルベニシリン１００ｍｇ／ｌ，  リファンピシン１００ｍｇ／ｌおよびゲンタマイシン２５ｍｇ／ｌを含む２  ｍｌのＹＥＰ培地で２８℃、２日間培養した。
【００３０】
１２，０００  ｘ  ｇ，  ２分間の遠心分離により集菌した後、ＯＤ６００＝０．２となるように滅菌水に懸濁した。菌液に胚軸カルスを２分間浸した後、滅菌濾紙上に移して余分な菌液を除いた。ＭＳ寒天培地に置床し、２６℃、日長１６時間で４８時間共培養した後、胚軸カルスを２５０ｍｇ／ｌのクラフォラン（アベンティス・ファーマ株式会社、登録商標）を含む滅菌水で洗浄した。２５０ｍｇ／ｌのクラフォランおよび２５ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを添加したＭＳ培地に置床し、２６℃、日長１６時間で培養した。感染処理２０日前後から形質転換根が誘発され、ｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰを導入した全ての形質転換根でＧＦＰの蛍光が観察された。
【００３１】
実施例５：シロイヌナズナ形質転換根クローンの培養
実施例４において誘発した、ｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰが導入されたシロイヌナズナ形質転換根を根端を含むように一本ずつ切り取り、２５０ｍｇ／ｌのクラフォランおよび２５ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを添加したＨＦ寒天培地（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５０，  ２７１５  （１９８６））で培養した。それぞれの形質転換根クローンを、３０ｍｌのＨＦ液体培地に入れ、イノーバプラットフォームシェーカー２３５０型（ニューブランズウィックサイエンティフィック社製）で、２６℃、１００回転／分で旋回培養した。４週間ごとに増殖した毛状根の一部約１ｇ湿重を、新鮮な３０ｍｌのＨＦ液体培地に入れ、継代培養した。
【００３２】
実施例６：ゲノミックサザン解析による導入遺伝子の確認
液体培養した形質転換根クローンからＮｕｃｌｅｏｎ  ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ，  ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｇａｌ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、添付のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出した。調製したゲノムＤＮＡ  １０μｇを制限酵素ＮｈｅＩで完全消化した後、全量を０．８％アガロースゲル電気泳動分画に供した。泳動終了後、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０１：  １３４−１３９  （１９９２））の方法に従い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋  ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ（アマシャム登録商標）にＤＮＡをトランスファーした後、１２０℃で３０分間ベーキングすることによりメンブラン上のＤＮＡを固定した。ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（ロシュ）を用いて調製した。ｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴプラスミド１ｎｇを鋳型として、センスプライマーＡＭＰＲ５（配列番号７）とアンチセンスプライマーＡＭＰＲ３（配列番号８）を用いて、７０μＭのＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰ存在下で９４℃２分間の後、９４℃３０秒間次いで５５℃３０秒間さらに７２℃３分間の保温を１サイクルとして３５サイクルからなるＰＣＲを行うことによりＤＩＧ標識されたβ−ラクタマーゼ遺伝子ＤＮＡ断片を得た。１ｍｌあたり２μｌのＰＣＲ反応液を含むＤＩＧイージーハイブ（ロシュ）を用いて４２℃、１６時間のハイブリダイゼーションを行った後、１  ｘ  ＳＳＣ，  ０．１％  ＳＤＳ、１０分間、室温さらに  ０．１  ｘ  ＳＳＣ，  ０．１％  ＳＤＳ、３０分間、６８℃の条件でメンブランを洗浄した。アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ロシュ）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（ロシュ）を用いて添付のプロトコールに従い、プローブとハイブリダイズしたゲノムＤＮＡ断片を検出した。その結果、ゲノミックサザン解析に供した１０ラインの形質転換根クローンの全てに関してｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰ由来Ｔ−ＤＮＡの挿入が確認された。
【００３３】
実施例７：プラスミドレスキュー法によるＴ−ＤＮＡライトボーダー近傍ゲノム断片のクローニング
実施例６においてＴ−ＤＮＡの挿入を確認した形質転換根クローン（４−Ｄ）を材料に用い、モデル植物の実験プロトコール  −イネ・シロイヌナズナ編−、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４、島本功、岡田清孝監修、秀潤社、１９９６、ｐ１３５−１４２に記載されているプラスミドレスキュー法によって、Ｔ−ＤＮＡライトボーダーに近接するシロイヌナズナのゲノム領域（約１．６Ｋｂ）をクローニングした。プライマー＃１９Ｔ−ＤＮＡ１００６７（−）（配列番号９）およびＳＫＩ０１５ＲＢ（配列番号１０）を用いてクローン化されたゲノム領域の塩基配列を決定した。Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／Ｂｌａｓｔ／）に記載の方法によってＢＬＡＳＴサーチを行った結果、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＮＡ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ５，  ＢＡＣ  ｃｌｏｎｅ  Ｆ９Ｇ１４  （ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＬ１６２９７３）  中の配列と一致し、挿入されたＴ−ＤＮＡ中の３５Ｓエンハンサーリピートから約５００  ｂｐの距離にＡｔ５ｇ０２７１０遺伝子の翻訳開始コドンが準方向に位置していることが判明した。
【００３４】
実施例８：ノーザンハイブリダイゼーション法によるライトボーダー近接遺伝子の発現解析
形質転換根クローン４−ＤにおけるＡｔ５ｇ０２７１０遺伝子の発現が、近傍に挿入された３５Ｓエンハンサーリピートの影響により活性化されているかをノーザンハイブリダイゼーション法により調べた。形質転換根クローン４−Ｄ及びネガティブコントロールとして、他の独立した形質転換根クローン（１−Ａおよび４−Ａ）からＲＮＡＷＩＺＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて添付のプロトコールに従いトータルＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡ  １５μｇを１％ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０１：  １３４−１３９  （１９９２））の方法に従い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋  ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ（アマシャム登録商標）にＲＮＡをトランスファーした後、１２０℃で３０分間ベーキングすることによりメンブラン上のＲＮＡを固定した。プローブの調製は以下の方法により行った。形質転換根クローン４−Ｄから調製したトータルＲＮＡを材料として、ＴａｋａＲａ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  （ＡＭＶ）  Ｖｅｒ．２．１（宝酒造）を用いて添付のプロトコールに従いｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡ  ２μｌを鋳型として、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（宝酒造）を用いてセンスプライマーＡｔ５ｇ０２７１０−５（配列番号１１）とアンチセンスプライマーＡｔ５ｇ０２７１０−３（配列番号１２）を用いて、９４℃２分間の後、９４℃３０秒間次いで５５℃３０秒間さらに７２℃１分間の保温を１サイクルとして２５サイクルからなるＰＣＲを行うことにより、Ａｔ５ｇ０２７１０遺伝子の全長コード領域に相当する約５４０ｂｐのｃＤＮＡ断片を単離した。得られたｃＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  キット（インビトロジェン）を用いてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした後、塩基配列を決定してｃＤＮＡ断片の挿入方向を確認した。ノーザンハイブリダイゼーションに用いるプローブとして、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現しているＡｔ５ｇ０２７１０遺伝子ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応により合成した。Ａｔ５ｇ０２７１０遺伝子ｃＤＮＡを含むプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＶでリニアライズし、得られたＤＮＡ断片１μｇを鋳型としてＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロシュ）およびＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（ロシュ）を用いて３５０μＭのＤＩＧ−１１−ＵＴＰ存在下で、添付のプロトコールに従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行い、ＤＩＧラベルされたアンチセンスＲＮＡを調製した。ＤＩＧイージーハイブ（ロシュ）を用いて６８℃、１６時間、１００  ｎｇ／ｍｌプローブ濃度のハイブリダイゼーションの後、１  ｘ  ＳＳＣ，  ０．１％  ＳＤＳ、１０分間、室温、さらに０．１  ｘ  ＳＳＣ，  ０．１％  ＳＤＳ、３０分間、６８℃の条件で洗浄を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ロシュ）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（ロシュ）を用いて添付のプロトコールに従いプローブとハイブリダイズしたｍＲＮＡを検出した。その結果、形質転換根ライン４−ＤにおいてはＡｔ５ｇ０２７１０遺伝子のｍＲＮＡレベルが顕著に増高していることが確認された（図４）。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、植物遺伝子を毛状根において迅速に活性化できるようになった。本発明によって活性化された遺伝子は、有用成分の生産、ストレス耐性植物などの有用植物の作出などに利用することができる。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はｐＰＣＶＩＣＥ（ＡｓｃＩ−ＡｖｒＩＩ）の構造図を示す。ＨＰＴ；  ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、Ａｍｐｒ；  β−ラクタマーゼ遺伝子、ｏｒｉ；  Ｃｏｌ  Ｅ１複製開始点、３５Ｓ  ｘ  ４；  カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターエンハンサーの４タンデムリピート、ＲＢ；  Ｔ−ＤＮＡライトボーダー配列、ＬＢ；  Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー配列を示す。
【図２】図２はｐＨＲ−ＡＴの構造図を示す。ｒｏｌＡ，Ｂ，Ｃ；  アグロバクテリウム・リゾゲネスＭＡＦＦ０３−０１７２４株の有するＲｉプラスミド、ｐＲｉ１７２４上にコードされるｒｏｌＡ，  ｒｏｌＢおよびｒｏｌＣ遺伝子を示す。
【図３】図３はｐＨＲ−ＡＴ−ＧＦＰの構造図を示す。３５ＳＰ；  カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＧＦＰ；  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮＯＳＴ；  ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーターを示す。
【図４】図４はノザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。パネル上：Ａｔ５ｇ０２７１０をプローブとしたノザンハイブリダイゼーションを示す。パネル下：トータルＲＮＡの電気泳動を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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