(57)【要約】【課題】本発明はアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法およびその組成物に関する。本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有するＡＳＯを提供することにある。【解決手段】アスコルビン酸オキシダーゼに２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法、および、安定化組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコルビン酸オキシダーゼに２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
【請求項２】
アスコルビン酸オキシダーゼがｐＨ６．０〜７．５に調製された溶液中に存在する、請求項１記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
【請求項３】
２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質が０．０１〜３ｍＭの濃度で用いられる請求項１記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
【請求項４】
アスコルビン酸オキシダーゼに２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
【請求項５】
アスコルビン酸オキシダーゼがｐＨ６．０〜７．５に調製された溶液中に存在する、請求項４記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
【請求項６】
２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質が０．０１〜３ｍＭの濃度で用いられる請求項４記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
【請求項７】
中性脂肪測定試薬で用いられる請求項４記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法およびその組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体成分を酵素的に測定する方法はこれまで種々開発されてきている。この中でグリセロリン酸オキシダーゼなどのオキシダーゼを用いる方法は、オキシダーゼの作用により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、水素供与体の発色系に導き比色定量に供する。本測定系は生体成分中のアスコルビン酸の影響を受けやすいことから、過酸化水素測定前または測定時に生体成分中に存在するアスコルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼ（以下ＡＳＯと略す）を作用させ、デヒドロアスコルビン酸に変換せしめ影響を回避することが一般的に行なわれている。しかし、溶液中のＡＳＯは非常に不安定であり、試薬保存中に失活し試薬の保存安定性を左右する要因となっている。
【０００３】
これに対し、安定化剤としてカタラーゼ、ゼラチン、グロブリン、ペルオキシダーゼ、メトヘモグロビンまたはヘマチン等を用いることで効果があることが示されている。また、金属と陰性の酸基とからなる化合物及びカタラーゼ及び／またはペルオキシダーゼの添加でＡＳＯの保存安定性が向上することが開示されている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、これらの方法では液状試薬として耐えうる安定性には尚問題が残る。
【０００４】
【特許文献１】
特開昭６３−４９０８１号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有するＡＳＯを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、ＡＳＯに２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることにより、ＡＳＯを液状状態で長期間安定に保つことを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）アスコルビン酸オキシダーゼに２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
（２）ｐＨ６〜７．５に調製された（１）のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
（３）２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質が０．０１〜３ｍＭの濃度で用いられる（１）のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
（４）アスコルビン酸オキシダーゼに２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
（５）ｐＨ６〜７．５に調製された（４）のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
（６）２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質が０．０１〜３ｍＭの濃度で用いられる（４）のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
（７）中性脂肪測定試薬で用いられる（４）のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において「安定」とは、加温処理に対しても酵素活性が維持されていることを意味し、具体的には、酵素を　０．５〜１０　ＩＵ／ｍＬ（好ましくは１〜５　ＩＵ／ｍＬ）の濃度になるよう溶解した液（ｐＨ　６〜７．５（好ましくはＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．６））の液を、３０〜４０℃（好ましくは　３５℃±２℃）で７日間保存後の残存酵素活性が加温処理していないものと比較して、７５％以上（好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上）維持されていることをいう。
【０００９】
本発明の一実施態様として、ＡＳＯに２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることを特徴とするＡＳＯの安定化方法がある。
【００１０】
本発明に使用される２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンは、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、塩酸塩、アンモニウム塩の形で用いてもよい。また、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンと５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物としてスペルコ社よりＰｒｏＣｌｉｎ１５０、ＰｒｏＣｌｉｎ３００が市販されているがこれらは好適に用いられる。ＡＳＯを含む溶液中の濃度としては特に限定されるものではないが、範囲の上限は、好ましくは３．０ｍＭさらに好ましくは０．６ｍＭ、範囲の下限は、好ましくは０．０１ｍＭさらに好ましくは０．０５ｍＭで、使用されるのが望ましい。
【００１１】
本発明に係るＡＳＯ溶液には緩衝剤が含まれてよい。緩衝剤としては、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ＧＯＯＤ緩衝剤などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝剤にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。該緩衝液のｐＨ調整範囲は特に限定されないが、一般に生体試料の測定に必要な酵素等がいずれも中性付近で安定な性質を示しており、本発明においても中性付近の緩衝液を用いることが好ましい。一方、ＡＳＯの反応至適ｐＨは概ね弱酸性域にあるが、安定性は低下する傾向にある。しかし、本発明により酸性側でも安定に保つことができることから、ｐＨ調整範囲は中世付近から更にＡＳＯの反応至適ｐＨまで広く選択することができる。範囲の上限は、好ましくは９．５さらに好ましくは７．５、範囲の下限は、好ましくは４．５さらに好ましくは６．０で、調整されるのが望ましい。
【００１２】
本発明に用いられるＡＳＯとはＥＣ１．１０．３．３に分類される以下の反応を触媒する酵素である。
Ｌ−アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ
上記酵素はキュウリ、カボチャ等の植物などから採取されるものなどを含有する。
また、本発明に用いられるＡＳＯには特開平６−２０９７７０に記載の以下の反応を触媒する酵素も含む。
Ｌ−アスコルビン酸＋Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ２
上記酵素は微生物などから採取されるものなどを含有する。微生物としてはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属またはユペニシリニウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属）が挙げられる。
ＡＳＯを含む溶液中のＡＳＯの濃度は、酵素の起源によっても異なり、通常０．１〜５０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。
【００１３】
本発明において、ＡＳＯ溶液には、さらに防腐剤、界面活性剤などを添加してもよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。界面活性剤としては非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤などが挙げられる。
【００１４】
また、該ＡＳＯ溶液中には診断用試薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。該診断用試薬としては、例えば尿酸、遊離脂肪酸、グルコース、中性脂肪、コレステロール、リン脂質等を測定する試薬、が挙げられる。これらの診断用試薬は２つ以上に分包されていてもよく、その場合ＡＳＯはそのいずれかに含まれていればよい。
【００１５】
例えば中性脂肪測定試薬としては、一般にＡＳＯの他、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色源体が含有される。
【００１６】
本発明における上記安定化剤を含むＡＳＯ組成物は水溶液であっても、凍結乾燥したものであってもよい。
【００１７】
ＡＳＯの活性測定は以下の測定条件で行うのが好ましい。
〈反応液〉
１００ｍＭ　リン酸緩衝液　ｐＨ５．６
０．５ｍＭ　Ｌ−アスコルビン酸
〈測定条件〉
（１）上記反応液１ｍＬをキュベットにとり、３０℃で約５分間予備加温する
。
（２）酵素溶液０．１ｍＬを添加し反応を開始する。正確に５分間反応させた　後に、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液を分光光度計　　で２４５ｎｍの吸光度を測定する。
（３）盲検は反応液を３０℃で５分放置後、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加　えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。この液を同様に吸光度を　　測定する。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１：ＡＳＯ（東洋紡績製ＡＳＯ−３１１）１Ｕ／ｍＬを含む下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬に▲１▼２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン　０．２ｍＭ、▲２▼５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン　０．２ｍＭ、▲３▼１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン　０．２ｍＭを添加した試薬をを調製し、無添加を対照として、３５℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２０】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝剤　１００ｍＭ　ｐＨ６．６
ＭｇＣｌ２　　１ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩　　１ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン　　０．４ｍｍｏｌ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩　　８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１）　３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製）　２００Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３２１）　３Ｕ／ｍＬ
ＡＳＯ（東洋紡績製ＡＳＯ−３１１）１Ｕ／ｍＬ
【００２１】
【表１】
2004105025.tif 000002
【００２２】
結果　表１に示す。２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンのいずれかを添加することで無添加に対し良好な安定性が得られた。
【００２３】
実施例２：ＡＳＯ（東洋紡績製ＡＳＯ−３１１）１Ｕ／ｍＬを含む実施例▲１▼の組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬に５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを濃度を０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、３ｍＭに変えて調製し、３５℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２４】
【表２】
2004105025.tif 000003
【００２５】
結果　表２に示す。５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを低濃度で共存させても良好な安定性が得られた。
【００２６】
実施例３：ＡＳＯ（東洋紡績製ＡＳＯ−３１１）１Ｕ／ｍＬを含む実施例▲１▼の組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬のｐＨを６．０、６．５、７．０、７．５に調製し、各々の試薬において５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの添加（０．２ｍＭ）または無添加の試薬を調製し、３５℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２７】
【表３】
2004105025.tif 000004
【００２８】
結果　表３に示す。５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの添加により広範なｐＨ域で安定化効果が確認されたが、ＡＳＯの反応至適ｐＨである弱酸性域、特にｐＨ６、または６．５の弱酸性域で良好な安定性が確認され、好ましい結果が得られた。
【００２９】
なお、弱酸性域はグリセロリン酸オキシダーゼの反応至適ｐＨでもあるので、弱酸性域で安定であることは、中性脂肪測定の際にはさらに好ましいといえる。
【００３０】
実施例４：ＡＳＯ（東洋紡績製ＡＳＯ−３１１）１Ｕ／ｍＬを含む実施例▲１▼の組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬に２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを有効成分とするプロクリン３００（スペルコ社製）を０．０４％になるように添加調製し、１０℃で１２ヶ月間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００３１】
【表４】
2004105025.tif 000005
【００３２】
結果　表４に示す。実施例では比較例に対しな良好な長期保存安定性が確認された。
【００３３】
【発明の効果】
本発明においては、ＡＳＯを含有する組成物中に２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることにより、従来よりも液状状態で長期間安定な組成物が得られる。