(57)【要約】【課題】マラリア原虫の種類を自動的に鑑別することを課題とする。【解決手段】検体中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させ、遊離したマラリア原虫を蛍光染色して測定用試料を調製し、測定用試料中のマラリア原虫から蛍光強度を検出し、所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫の頻度分布に基づき、前記マラリア原虫の種類を判定するマラリア原虫測定方法により上記の課題を解決する。【選択図】　図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させ、遊離したマラリア原虫を蛍光染色して測定用試料を調製し、測定用試料中のマラリア原虫から蛍光強度を検出し、所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫の頻度分布に基づき、前記マラリア原虫の種類を判定するマラリア原虫測定方法。
【請求項２】
マラリア原虫の種類を判定する工程が、前記所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫の頻度分布における最頻値を求め、該最頻値を所定の基準値と比較し、比較結果に基づいて前記マラリア原虫の種類を判定する工程からなる請求項１記載のマラリア原虫測定方法。
【請求項３】
マラリア原虫の種類を判定する工程が、熱帯熱マラリアであるか否か判定する工程である請求項１記載のマラリア原虫測定方法。
【請求項４】
前記所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫を、リングフォームとして分類する工程をさらに備える請求項１記載のマラリア原虫測定方法。
【請求項５】
測定用試料を調製する工程は、赤血球の溶血が界面活性剤を含むマラリア原虫測定用試薬を用いて行われる請求項１記載のマラリア原虫測定方法。
【請求項６】
粒子含有試料に励起光を照射する照射部と、試料中の各粒子の発する蛍光を受光する受光部とからなる検出部と、分析部とを備え、分析部は、検出部が検出した蛍光強度をパラメータとして試料中の粒子の頻度分布を作成する頻度分布作成部と、粒子含有試料がマラリア原虫を蛍光染色した試料であるとき、所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫の頻度分布に基づき前記マラリア原虫の種類を判定する判定部からなるマラリア原虫測定装置。
【請求項７】
判定部は、前記所定範囲の蛍光強度を有する粒子の頻度分布における最頻値を所定の基準値と比較する比較部を有し、比較部の比較結果に基づいて前記マラリア原虫の種類を判定する請求項６記載のマラリア原虫測定装置。
【請求項８】
判定部は、前記マラリア原虫の種類が熱帯熱マラリアであるか否か判定する請求項６記載のマラリア原虫測定装置。
【請求項９】
判定部は、前記所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫を、リングフォームとして分類する請求項６記載のマラリア原虫測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、マラリア原虫測定方法と装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マラリアは熱帯、亜熱帯に広く分布する寄生虫感染症である。ＷＨＯの統計によれば世界人口の４０％以上が居住する地域がマラリア汚染地域であり、年間３−５億人が罹患し、そのうち１００〜３００万人が死亡すると推定されている。
【０００３】
マラリアには熱帯熱マラリア、３日熱マラリア、４日熱マラリア、卵形マラリアの４種類があるが、このうち熱帯熱マラリアが特に悪性で、発症後数時間以内に治療を開始しないと重篤な症状や合併症を併発し、死に至る場合も少なくない。一方、その他のマラリアは、症状もそれほど重篤ではなく、死に至ることは極めてまれである。
【０００４】
したがって熱帯熱マラリアとその他のマラリアでは治療方法が大きく異なり、熱帯熱マラリアでは先ず何よりも患者を救命するという観点から、かなりきつい薬剤を大量に投与することもまれではないが、その他のマラリアの場合は副作用を起こさない程度に時間をかけて治療をすることが可能である。そこで臨床診断の段階では、熱帯熱マラリアかそれ以外のマラリアかを正確かつ迅速に鑑別し、それに基づいて適切な治療の方法を決定することがきわめて重要となる。
【０００５】
マラリアはハマダラカと呼ばれる蚊によって媒介される。マラリア原虫を持つハマダラカに吸血されると、ハマダラカの唾液とともに原虫が人の血液中に注入される。原虫は肝細胞内に進入し、そこで増殖し、再び血液中に放出される。このときの原虫の形態をメロゾイト（分裂小体：ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ）とよぶ。メロゾイトは血液中に放出されると直ちに赤血球内に侵入し、その形態を変化させながら発育していく。この形態変化を生活環と呼び、生活環の各段階（ステージ）はリングフォーム（輪状体：ｒｉｎｇ　ｆｏｒｍ）、トロポゾイト（栄養体：ｔｒｏｐｏｚｏｉｔｅ）、シゾント（分裂体：ｓｃｈｉｚｏｎｔｅ）と呼ばれる。シゾントまで発育した原虫は赤血球を破壊し、再びメロゾイトとなって血液中に放出される。放出されたメロゾイトは赤血球に侵入し、再び生活環を繰り返して増殖を繰り返す。マラリア原虫はこのサイクルを繰り返すことによって増殖し、血液中の赤血球を破壊し続ける。
【０００６】
生活環の各ステージにある原虫に感染した赤血球は末梢血中を還流しているが、その挙動はマラリアの種類によって異なっている。熱帯熱マラリア以外の３種のマラリアでは、生活環の各ステージの原虫に感染した赤血球のすべてが血液中に浮遊し還流しているが、熱帯熱マラリアの場合はリングフォームの原虫に感染した赤血球のみが末梢血中に存在し、トロポゾイトとシゾントのステージの原虫に感染した赤血球はその表面に接着分子を分泌して血管壁に付着し、末梢血には現れてこない。
【０００７】
これにより熱帯熱マラリアは末梢血管に血栓を生じ、脳、目などを含む各臓器を破壊する。これが熱帯熱マラリアが他のマラリア種に比べて悪性である原因の１つである。このように熱帯熱マラリアは、他の種類のマラリアに比べ悪性が強く、治療方法も異なってくるので、前記のように診断段階でこれが熱帯熱マラリアであるか、他の種類のマラリアであるかを迅速に鑑別する必要がある。
【０００８】
これに対し、従来よりマラリア診断のために最も多用され、現在も多用されている検査法は、目視による顕微鏡検査である。血液塗抹標本をギムザ染色し、顕微鏡で目視観察することによりマラリア原虫に感染している赤血球を検出する。この方法によるマラリア種の鑑別は、主としてマラリア原虫の形態を観察することにより行われている。マラリア原虫の形態は各マラリア種で異なるため、顕微鏡で原虫の形態を観察することによりマラリア種の弁別が可能である。
【０００９】
またマラリア原虫の形態は生活環の各ステージにおいて特徴的であるため、原虫の形態を観察することにより、その原虫がどのステージのものであるかを弁別することが可能である。従って、トロポゾイトやシゾントの存在を確認することにより、それが熱帯熱マラリア以外のマラリアであると鑑別することが可能である。
【００１０】
一方、近年盛んに研究されているフローサイトメトリ法を用いても、マラリア種の鑑別が可能である。フローサイトメトリ法によるマラリア原虫の検出に関しては、（１）マラリア原虫測定用試薬と血液試料を混合して測定用試料を調製し、（２）測定用試料をフローサイトメータに導入し、（３）シースフロー中を流れる細胞に励起光を照射し、細胞が発する散乱光と蛍光を測定し、（４）散乱光強度と蛍光強度によりマラリア原虫と他の細胞成分を弁別する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【００１１】
【特許文献１】
特開平１１−７５８９２号公報（〔００３４〕参照）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
顕微鏡検査は現在最も多用されているマラリアの検査方法であるが、この方法では、塗抹標本の作成、固定、染色等の工程を必要とし、作業が煩雑で長時間を要する。さらにマラリア原虫の検査には高い精度が要求されるが、高精度に原虫を検出するためには長時間かけて多数の赤血球を顕微鏡観察する必要があり、多数の試料を迅速に処理することが不可能である。
【００１３】
また原虫の検出、観察を顕微鏡観察者が行うため、測定の精度が観察者の知識や経験に大きく作用され、正確さに欠ける傾向がある。特にマラリア種の鑑別は主として原虫の形態の違いによって行われることが多いが、この場合微妙な形態の違いを検知しなければならず、正確な鑑別には熟練を要するという問題がある。
【００１４】
一方、フローサイトメトリ法は多くの場合測定が自動化されており、顕微鏡検査の欠点を解消するものである。ところで、従来のフローサイトメトリ法では、マラリア種の鑑別、特に熱帯熱マラリアの同定を行う場合、原虫の形態の違いによるマラリア種の鑑別は困難であり、もっぱらマラリア原虫のトロポゾイトもしくはシゾントの存在が検出されることにより、それが熱帯熱マラリア以外のマラリアである、と鑑別することとなる。
【００１５】
しかしながら、熱帯熱マラリア以外のマラリアに感染した患者の末梢血、特に感染初期の患者の末梢血には、リングフォームのみが出現し、トロポゾイトやシゾントが出現していない検体もしばしば見られる。従って、トロポゾイトもしくはシゾントの有無という基準でマラリア種を判別した場合、いずれのステージもスキャッタグラム上に出現していないため、このような検体は熱帯熱マラリアと弁別することができないという問題がある。
【００１６】
この発明はこのような事情を考慮してなされたもので、迅速な自動測定が可能というフローサイトメトリの特徴を保持しつつ、リングフォームしか出現していない検体でも熱帯熱マラリアか、それ以外のマラリア種であるかを判別が可能な方法と装置を提供するものである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
この発明は、検体中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させ、遊離したマラリア原虫を蛍光染色して測定用試料を調製し、測定用試料中のマラリア原虫から蛍光強度を検出し、所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫の頻度分布に基づき、前記マラリア原虫の種類を判定するマラリア原虫測定方法を提供するものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
この発明において、同一条件下で核酸染色性染料によりマラリア原虫を蛍光染色した場合、同じリングフォームでも熱帯熱マラリアとその他のマラリアでは核酸と結合する色素量に差があること、したがってその色素量に比例する光の吸収量、透過量、蛍光強度などの光学的パラメータに差があることが見出された。したがってこの光学パラメータを用いれば、リングフォームしか出現していない熱帯熱マラリア以外のマラリア検体でも、その測定結果から熱帯熱マラリアと弁別することが可能である。
【００１９】
但し、光学パラメータの強度は、同じマラリア種の同じリングフォームでも個々の原虫でばらつきが有り、１つ１つの原虫についてその測定結果を比較した場合、必ずしも他の種類に対して有意な差があるものばかりではない。しかし、あるまとまった数の原虫を測定し、測定した結果の値の分布から最頻値もしくは中央値もしくは平均値等の統計的パラメーターを求めて比較すると、熱帯熱マラリアとその他のマラリアでは有意に差があり、弁別が可能である。
【００２０】
本発明によるマラリア原虫の測定は、検体の前処理（溶血・染色）、フローサイトメータによる光学的情報の検出、解析といったステップからなるが、検体の前処理、フローサイトメータによる光学的情報の検出は従来技術を利用できる。
【００２１】
本発明の特徴は解析のステップにある。
つまり、この発明による測定方法は、検体中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させ、遊離したマラリア原虫を蛍光染色して測定用試料を調製し、測定用試料中のマラリア原虫から蛍光強度を検出し、所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫の頻度分布に基づき、前記マラリア原虫の種類を判定するマラリア原虫測定方法を特徴とする。
【００２２】
マラリア原虫の種類を判定する工程は、前記所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫の頻度分布における最頻値を求め、該最頻値を所定の基準値と比較し、比較結果に基づいて前記マラリア原虫の種類を判定する工程であってもよい。
マラリア原虫の種類を判定する工程が熱帯熱マラリアであるか否か判定するものであってもよい。
前記所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫を、リングフォームとして分類する工程をさらに備えてもよい。
赤血球の溶血は、界面活性剤を含むマラリア原虫測定用試薬を用いて行われてもよい。
【００２３】
さらに、この発明は、粒子含有試料に励起光を照射する照射部と、試料中の各粒子の発する蛍光を受光する受光部とからなる検出部と、分析部とを備え、分析部は、検出部が検出した蛍光強度をパラメータとして試料中の粒子の頻度分布を作成する頻度分布作成部と、粒子含有試料がマラリア原虫を蛍光染色した試料であるとき、所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫の頻度分布に基づき前記マラリア原虫の種類を判定する判定部からなるマラリア原虫測定装置を提供するものである。
【００２４】
判定部は、前記所定範囲の蛍光強度を有する粒子の頻度分布における最頻値を所定の基準値と比較する比較部を有し、比較部の比較結果に基づいて前記マラリア原虫の種類を判定するものであってもよい。
判定部は、前記マラリア原虫の種類が熱帯熱マラリアであるか否か判定するものであってもよい。
判定部は、前記所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫を、リングフォームとして分類してもよい。
【００２５】
なお、生活環の同じステージにある同種のマラリア原虫、例えば熱帯熱マラリアのリングフォームであってもその核酸に結合した色素量にはばらつきがあり、前記測定により得られた各原虫ごとの光学パラメータ（例えば、蛍光強度）にはばらつきがある。したがって同じステージにある異種のマラリアの測定結果を比較した場合、測定結果の一部には相互差の無いものやその大きさが逆転したものが含まれる。
【００２６】
例えばリングフォームのマラリアの蛍光強度を比較した場合、総体的には３日熱マラリアの蛍光強度のほうが熱帯熱マラリアの蛍光強度より大きいといえるが、熱帯熱マラリアの一部には３日熱マラリアの蛍光強度より大きな蛍光強度を発するものがあり、３日熱マラリアの中には熱帯熱マラリアより小さい蛍光強度のものもある。
【００２７】
そこで正確な結果を得るために、一検体から１個−数個の原虫の測定結果を比較するだけでは十分ではなく、一検体から少なくとも十個以上、出来れば数十個以上の原虫を測定し、その結果を統計的に処理して、最頻値、中央値、平均値などの統計的パラメータを求めて、マラリア種の相互で比較することが好ましい。
【００２８】
マラリア感染患者のマラリア感染率（感染率：総赤血球数に対するマラリア原虫感染赤血球数の割合）は１０％以上のものから０．０１％以下のものまで、大きなばらつきがあり、すべての試料で一定量を測定した場合、低感染率の試料では有意な統計処理に必要な原虫数を測定できない場合があり、高い感染率の試料では多量の原虫が測定されて、不必要に時間や染色液を消費してしまう場合がある。
【００２９】
このような場合は測定する試料量、もしくは測定時間を測定される原虫の個数に応じて可変とし、低い感染率の試料では必要な原虫数が確保されるよう測定試料量を十分多くするかもしくは測定時間を十分長くし、高感染率試料の場合は測定時間や染色液等を節約するために、測定試料量もしくは測定時間を少なくすれば良い。この時、試料中の原虫濃度は、測定に要した試料量と測定した原虫の個数から求めることが可能である。
【００３０】
実施例
以下、図面に示す実施例に基づいてこの発明を詳述する。これによってこの発明が限定されるものではない。
【００３１】
フローサイトメータの構成
図７はこの発明の方法に用いるフローサイトメータの光学系を示す斜視図である。同図においてシースフローセル１のノズル６から粒子含有試料が吐出され、シース液に包まれてオリフィス部１３を通過する。レーザ光源２１から出射されたビームはコリメートレンズ２２を介してシースフローセル１のオリフィス部１３を照射する。オリフィス部１３を通過する粒子から発せられる前方散乱光は、集光レンズ２４とピンホール板２５とを介してフォトダイオード２６に入射する。
【００３２】
一方、オリフィス部１３を通過する粒子から発せられる側方散乱光と側方蛍光については、側方散乱光は集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とを介してフォトマルチプライアチューブ（以下、フォトマルという）２９に入射し、側方蛍光は集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ３６とピンホール板３０を介してフォトマル３１に入射する。
【００３３】
フォトダイオード２６から出力される前方散乱光信号と、フォトマル２９から出力される側方散乱光信号と、フォトマル３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２，３３，３４により増幅され、分析部３５に入力される。
【００３４】
図８は図７に示すフローサイトメータの流体系を示す系統図である。同図において、先ず洗浄工程においては、バルブ４１，５０が開かれ、シース液を収容したシース液チャンバー４２からシース液が圧力装置４３から印加される圧力Ｐによって送出され、バルブ４１と定量シリンジ４４とノズル６とを介して廃液チャンバー４５へ排出されると共に、バルブ５０とセル１とを介して廃液チャンバー４５に排出され、所定時間後にバルブ４１，５０が閉じられる。これによって、定量シリンジ４４，ノズル６，セル１およびその経路がシース液により洗浄される。
【００３５】
次に、測定工程においては、バルブ４６，４７が開かれ、測定用試料を収容する反応チャンバー４８から測定用試料が吸引装置４９の負圧により吸引され、バルブ４６とノズル６間の経路が測定用試料で満たされると、バルブ４６，４７が閉じられる。次に、バルブ５０が開かれると、シース液がシース液チャンバー４２から圧力装置４３の圧力によりセル１へ送出され、廃液チャンバー４５に排出される。
【００３６】
次に、バルブ４１が開かれると、圧力装置４３からの圧力Ｐは定量シリンジ４４を介してノズル６の先端へも伝達され、ノズル６の先端においてノズル外部のシース液の圧力とノズル内部の試料液の圧力とが平衡する。従って、この状態で定量シリンジ４４のピストン４４ｂがモータ４４ａにより駆動されると、バルブ４６とノズル６間に存在する測定用試料はノズル６からオリフィス部１３へ容易に吐出され、シース液によって細く絞られてオリフィス部１３を通過し、シース液と共に廃液チャンバー４５へ排出される。
そして、定量シリンジ４４のピストン４４ｂの駆動が終了すると、測定工程を終了する。
【００３７】
次に、モータ４４ａが逆転してピストン４４ｂが引き戻され、定量シリンジ４４は初期状態に復帰するが、この間にはバルブ４１，５０は開かれたままであるので、前述の洗浄工程が行われ、次の測定工程に備えられることになる。
【００３８】
従って、他の測定用反応チャンバー５１，５２，５３に収容された他の測定用試料についてもバルブ５４，５５，５６を開閉して前述と同様の工程を順次実行することにより測定を行うことができる。
なお、バルブ５７は廃液チャンバー４５から廃液を排出するバルブであり、必要に応じて開閉される。
【００３９】
図９は、図７の分析部３５の構成を示すブロック図である。図９において、６１は各種の数値や領域などの条件を予め設定するためのデータの入力部であり、例えば、キーボードやマウスにより構成される。
【００４０】
また、６２は設定された各種条件を格納する設定条件格納部、６３はフォトダイオード２６とフォトマル２９，３１の出力信号から得られる光学情報を格納するデータ格納部である。６４はデータ格納部６３に格納された光学情報、つまり前方散乱光強度（ＦＳＣ），側方散乱光強度（ＳＳＣ），側方蛍光強度（ＳＦＬ）の内いずれかのパラメータを用いて１次元および２次元頻度分布図を作成する分布図作成部、６５は分布図作成部６４で作成された分布図から座標や領域を抽出する抽出部である。
【００４１】
６６は分布図作成部６４で作成される分布図に基づいて粒子の種類を判定する判定部、６７は判定された粒子数の計数を行う演算部である。判定部６６は分布図のデータと入力部６１から入力された基準値とを比較して粒子の種類を判定する比較部６６ａを備える。そして、判定部６６の判定結果や演算部６７の演算結果は、分布図作成部６４で作成された分布図と共に表示部６８に表示される。６９は図８に示すバルブ４１，４６，４７，５０，５４，５５，５６，５７およびモータ４４ａを駆動する流体系駆動部である。また、分析部３５はパーソナルコンピュータで構成される。
【００４２】
フローサイトメータによる予備測定
マラリアに感染した患者の血液について、次のように測定を行った。
まず、以下の組成のマラリア原虫測定用試薬を調製した。
アクリジンオレンジ　　　　　　　３ｍｇ
トリシン　　　　　　　　　　　１０ｍＭ
ＬＴＡＣ　　　　　　　　　１０００ｍｇ
リン酸２水素ナトリウム　　　１２０ｍＭ
精製水　　　　　　　　　　　　　１Ｌ
ＮａＯＨでｐＨ９に調製
患者から採取して抗凝固剤処理を行ったマラリア原虫培養赤血球を含む培養液１μＬを上記試薬１ｍＬに加え、３５℃、３０秒インキュベートした測定用試料を前述のフローサイトメータで測定を行った。レーザ光源２１にアルゴンイオンレーザーを用い、波長４８８ｎｍのレーザ光を出射し、前方散乱光および側方蛍光を測定した。
なお、対象となるマラリア種の鑑別、生活環のステージの判定、感染率測定は、予め顕微鏡にて目視により行った。
【００４３】
３日熱マラリア患者検体、熱帯熱マラリア患者検体の測定（図１、図２）
・図１は３日熱マラリア患者から採取した血液試料を測定して得られた２次元頻度分布図、つまりスキャッタグラムであり、領域Ａはリングフォームの原虫の出現領域、領域Ｂはトロポゾイトの原虫の出現領域、領域Ｃはシゾントの原虫出現領域、領域Ｄは白血球の出現領域である。なお、縦軸に前方散乱光強度ＦＳＣを、横軸に側方蛍光強度ＳＦＬをとっている。また、領域Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、顕微鏡検査によって予め確認された多数のサンプルを測定して得られた領域であり、設定条件格納部６２（図９）に格納されている。
【００４４】
・図２は熱帯熱マラリア患者から採取した血液試料を測定して得られたスキャッタグラムである。
３日熱マラリア患者の検体ではリングフォーム（図１の領域Ａ）と同時にトロポゾイト（図１の領域Ｂ）及びシゾント（図１の領域Ｃ）が検出されたのに対し、熱帯熱マラリア患者の検体ではリングフォーム（図２の領域Ａ）のみが検出された。これは顕微鏡による観察結果と一致した。感染率（感染率：総赤血球数に対するマラリア原虫感染赤血球数の割合）は３日熱マラリアが１．１％、熱帯熱マラリアが０．７％であった。
【００４５】
感染初期の３日熱マラリア患者検体の測定（図３）
・図３は、感染初期の３日熱マラリア患者の検体を測定したスキャッタグラムである。
このスキャッタグラムでは、マラリア原虫はリングフォーム（図３の領域Ａ）しか出現していない。これも顕微鏡検査の結果と一致した。しかし、このような検体では、スキャッタグラムからは熱帯熱マラリア（図２）と区別ができない。
【００４６】
この発明による鑑別基準の決定
スキャッタグラムから図４と図５に示すヒストグラム（側方蛍光強度ＳＦＬの頻度分布を示す）を作成した。
・図４は図２に示す測定結果の側方蛍光強度ＳＦＬのヒストグラムである（横軸は側方蛍光強度ＳＦＬ、縦軸は全体のドット数に対する頻度Ｆの割合）。
・図５は図３に示す測定結果の側方蛍光強度ＳＦＬのヒストグラムである（横軸は側方蛍光強度ＳＦＬ、縦軸は全体のドット数に対する頻度Ｆの割合）。
【００４７】
図４と図５を比較すると、熱帯熱マラリアのリングフォーム領域Ａの蛍光強度ＳＦＬの最頻値は８０であり、３日熱マラリアのリングフォーム領域Ａの側方蛍光強度ＳＦＬの最頻値は１１６である。明らかに３日熱マラリアの最頻値のほうが大きいことがわかる。
【００４８】
この発明は、このように熱帯熱マラリアのリングフォーム領域Ａの側方蛍光強度ＳＦＬの最頻値が、他の種類のマラリアより小さいことを利用する。熱帯熱マラリアと他の種類のマラリアとを区別するための基準値を以下のように求めた。
・マラリア患者１２７名（内訳：熱帯熱マラリア（Ｐｆ）８８検体、それ以外のマラリアとして三日熱マラリア（Ｐｖ）３９検体）の血液検体の測定を行った。
・測定の結果得られた各々の検体のスキャッタグラム上の、リングフォームと認識された粒子の側方蛍光強度ＳＦＬの最頻値を求め、直交座標グラフ上にプロットした。
【００４９】
その直交座標を図６に示す（縦軸に前方散乱光強度ＦＳＣ、横軸に側方蛍光強度ＳＦＬをとっている）。
全ての検体において、熱帯熱マラリア以外のマラリアＰｖの側方蛍光強度ＳＦＬの最頻値のほうが熱帯熱マラリアＰｆの側方蛍光強度ＳＦＬの最頻値よりも大きい。熱帯熱マラリア以外のマラリアＰｖの側方蛍光強度ＳＦＬの最頻値の最小値と熱帯熱マラリアＰｆの側方蛍光強度ＳＦＬの最頻値の最大値との平均は約１０６であった。
【００５０】
基準値によるマラリアの種類の鑑別方法
この平均１０６を基準値として用いることにより、実際のマラリアの種類の鑑別を図１０のフローチャートに示す手順で行うことができる。つまり、
・患者検体を前記の条件で測定して光学パラメータを得る（ステップＳ１）。
・光学パラメータに基づき２次元スキャッタグラムを作成し、出現した粒子をマラリアの生活環の各ステージ、及び他の血球（白血球など）に弁別する（ステップＳ２）。
・リングフォーム領域Ａ以外にマラリア原虫が出現してるか判断し、出現していればその検体は熱帯熱マラリア以外の種類と判断する（ステップＳ３）
・出現していなければ、リングフォーム領域Ａの側方蛍光強度ＳＦＬの頻度分布を求め、その最頻値を求める。（ステップ４）
・求めた最頻値を所定の基準値（１０６）と比較し、１０６以下であれば熱帯熱マラ　リア、１０６以上であればそれ以外のマラリアと判定する（ステップＳ５，Ｓ　６）。
【００５１】
なお、マラリア原虫の蛍光強度の分布はほとんどすべての検体において左右対称のガウス分布を示すから、中心値や平均値は最頻値にほぼ一致し、最頻値の代わりにこれらの値を用いても熱帯熱マラリアとそれ以外のマラリアの鑑別は可能である。
【００５２】
また、図６は、各検体のトロポゾイトやシゾントの蛍光の最頻値も示している（破線で囲んだ領域Ｅ）。これらは熱帯熱マラリアのリングフォームの蛍光の最頻値より明らかに大きいから、これらの蛍光の最頻値と熱帯熱マラリアのリングフォームの蛍光の最頻値を単純比較しても、熱帯熱マラリアとそれ以外のマラリア種との鑑別が可能である。
【００５３】
上記の実施例では試料に含まれる各原虫の核酸に結合した色素の量に比例した信号として、フローサイトメータにより粒子毎の蛍光強度を検出しているが、試料に含まれる各原虫の核酸に結合した色素の量に比例した信号が原虫１個１個について得られる測定方法であれば、光の透過量や吸収量であってもよい。
【００５４】
また、上記実施例では検体に溶液中で染色を施し、液体試料を測定対象としたが、原虫もしくは原虫を含む細胞を固定する方法を用いてもよい。その場合、ガラス等の平板上に試料を薄く塗布した塗抹標本を作製し、その試料をそのままもしくはメタノール等で固定して染色する。溶液中での染色と同様に、染色の定量性を確保するために、ｐＨ、色素濃度等の染色条件は一定に保って染色しなければならない。用いる平板の材質は、測定に用いる光学的方法に依存する。光の透過量や吸収量を測定する場合は、平板の材質は用いられた波長の光を透過するものでなければならないが、蛍光強度を測定する場合で、光源と検出部を平板の同じ側に配置して測定する場合は、平板の材質は任意である。
【００５５】
さらに、試料が固定された原虫もしくは原虫を含む細胞である場合、光学情報の検出には、画像解析もしくはスキャニングサイトメトリと呼ばれる方法等が用いられる。画像解析によって原虫の核酸に結合した色素を測定する場合は、測定する全領域に光を照射し、測定領域を例えばＣＣＤカメラ等で撮像し、得られた画像を解析して、各原虫に関わる光学パラメータの強度を測定する。スキャニングサイトメトリと呼ばれる方法では、照射する光をレンズ等で絞り、絞った光で測定領域をスキャンし、それによって得られる信号を経時的に測定して、その結果から各原虫に関わる光学パラメータの強度を測定することが可能である。
【００５６】
【発明の効果】
この発明によれば、マラリア原虫の蛍光強度の頻度分布からその種類を自動的に鑑別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例によって得られる２次元スキャッタグラムの例を示す。
【図２】この発明の実施例によって得られる２次元スキャッタグラムの例を示す。
【図３】この発明の実施例によって得られる２次元スキャッタグラムの例を示す。
【図４】この発明の実施例によって得られる１次元頻度分布図である。
【図５】この発明の実施例によって得られる１次元頻度分布図である。
【図６】この発明の実施例によって得られる最頻値の２次元分布図である。
【図７】この発明の方法を用いるフローサイトメータの光学系を示す斜視図である。
【図８】この発明の方法を用いるフローサイトメータの流体系を示す説明図である。
【図９】この発明の方法を用いるフローサイトメータの分析部を示すブロック図である。
【図１０】この発明の方法の手順を示すフローチャートである。
【符号の説明】
１　シースフローセル
６　ノズル
１３　オリフィス部
２１　レーザ光源
２２　コリメートレンズ
２４　集光レンズ
２５　ピンホール板
２６　フォトダイオード
２７　集光レンズ
２８　ダイクロイックミラー
２９　フォトマルチプライアチューブ
３０　ピンホール板
３１　フォトマルチプライアチューブ
３２　アンプ
３３　アンプ
３４　アンプ
３５　分析部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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