(57)【要約】      （修正有）【課題】新たなパーキンソン病のモデル動物、その作出方法、及び当該モデル動物を用いるパーキンソン病予防治療薬のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】CHCHD2遺伝子の機能が欠損したパーキンソン病モデル非ヒト動物であって、下記の（１）〜（４）のすべての性質を有することを特徴とするパーキンソン病モデル非ヒト動物。（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CHCHD2遺伝子の機能が欠損したパーキンソン病モデル非ヒト動物であって、下記の（１）〜（４）のすべての性質を有することを特徴とするパーキンソン病モデル非ヒト動物。
（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する
（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する
（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する
（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する
【請求項２】
中脳黒質ドーパミン細胞内にシヌクレインの蓄積を認める、請求項１記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
【請求項３】
５０週齢以降にドーパミン神経死と運動障害を生じるマウスである請求項１又は２記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
【請求項４】
CHCHD２遺伝子を欠損させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のパーキンソンモデル非ヒト動物の作出方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の非ヒト動物を用いてパーキンソン病予防治療薬をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病モデル非ヒト動物及びパーキンソン病予防治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、中脳黒質のドーパミン神経細胞の脱落・変性を主体とする進行性変性疾患であり、４大症状として、（１）安静時振戦、（２）筋強剛（筋固縮）、（３）無動・寡動、（４）姿勢反射障害を特徴とする。近年では、運動症状のみならず、精神症状などの非運動症状も注目されている。発症年齢は、５０〜６５歳に多いが、高齢になるほど発病率が増加する。４０歳以下で発病するものは若年性パーキンソン病と呼ばれる。
【０００３】
高齢化社会に伴い、パーキンソン病の有病率は確実に上昇しており、病気の進行に伴う生活の質の激しい低下と付随する介護費用は大きな社会問題となっている。パーキンソン病治療薬としては、Ｌ−ｄｏｐａとドーパミンアゴニストが用いられるが、いまだ十分な効果が得られているとは言いがたく、新しい治療薬の開発が望まれている。新しい治療薬の開発には、新しいパーキンソン病のモデル動物が望まれる。
パーキンソン病のモデル動物として、パーキンをコードする遺伝子が不活化し、且つＩＲＰ２が神経細胞で特異的に発現しているモデルマウス（特許文献１）、ドーパミン神経においてatg7遺伝子が欠損したモデル非ヒト動物（特許文献２）、変異型ヒトαシヌクレインフィブリルを非ヒト動物の黒質内に投与して得られるモデル非ヒト動物（特許文献３）、プロサポシン遺伝子変異を有する非ヒトモデル動物（特許文献４）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２２０５０３号公報
【特許文献２】特開２０１８−６８１３６号公報
【特許文献３】特開２０１９−１７０２９４号公報
【特許文献４】特開２０２０−６５４８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、前記のモデル非ヒト動物は、いずれもパーキンソン病のいくつかの症状や病理学的特徴を呈するものの、パーキンソン病特有の病理学的特徴を広く有するものではなかった。
従って、本発明の課題は、パーキンソン病特有の病理学的特徴を呈する新たなパーキンソン病のモデル動物、その作出方法、及び当該モデル動物を用いるパーキンソン病予防治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者らは、遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子の一つであるCHCHD2遺伝子欠損非ヒト動物を作製し、その病理学的特徴、運動障害の発生などを検討したところ、パーキンソン病類似の運動障害を呈し、中脳黒質ドーパミン細胞の脱落を生じると共に、多くのパーキンソン病患者にみられるタンパク質凝集体の形成、ミトコンドリアの変性を有するパーキンソン病モデル非ヒト動物が得られ、このモデル非ヒト動物を用いれば新たなパーキンソン病予防治療薬がスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の発明［１］〜［５］を提供するものである。
［１］CHCHD2遺伝子の機能が欠損したパーキンソン病モデル非ヒト動物であって、下記の（１）〜（４）のすべての性質を有することを特徴とするパーキンソン病モデル非ヒト動物。
（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する
（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する
（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する
（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する
［２］中脳黒質ドーパミン細胞内にシヌクレインの蓄積を認める、［１］記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
［３］５０週齢以降にドーパミン神経細胞死と運動障害を生じるマウスである［１］又は［２］記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
［４］CHCHD２遺伝子を欠損させることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載のパーキンソンモデル非ヒト動物の作出方法。
［５］［１］〜［３］のいずれかに記載の非ヒト動物を用いてパーキンソン病予防治療薬をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のモデル非ヒト動物は、CHCHD2遺伝子の機能が欠損したパーキンソン病モデル非ヒト動物であって、（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する、（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する、（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する、及び（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性するという特性を有する。これらの特性は、多くのパーキンソン病患者が有する特性であることから、本発明の非ヒト動物は、パーキンソン病のモデル非ヒト動物として有用である。また、本発明のモデル非ヒト動物を用いれば、パーキンソン病予防治療薬のスクリーニングが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】CHCHD2遺伝子欠損マウスの設計図を示す図である。
【図２】蛍光染色によるｐ６２、シヌクレイン（Synuclein）陽性細胞内の凝集体の観察結果を示す。
【図３】ミトコンドリアの変性（電顕写真a、b、c、d、e、f）（左）とミトコンドリア変性面積比（右）を示す。
【図４】ビーム試験の様子（左、CHCHD2WT（野生型）、CHCHD2KO（遺伝子欠損））と、８０週齢と１２０週齢で後肢を滑らせる回数を比較した回数を比較した図（右）を示す。
【図５】ロータロッド試験における落下潜時の経時変化を示す図である。115週齢以降で落下潜時の短縮が認められる（CHCHD2WT（野生型）、CHCHD2KO（遺伝子欠損））。
【図６】ドーパミン細胞の脱落を示す図である（CHCHD2WT（野生型）、CHCHD2KO（遺伝子欠損））。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、CHCHD2遺伝子の機能が欠損し、下記の（１）〜（４）のすべての性質を有することを特徴とする。
（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する
（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する
（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する
（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する
【００１１】
本発明のモデル非ヒト動物は、CHCHD2遺伝子の機能が欠損している。
CHCHD2遺伝子から作られるタンパク質は、ミトコンドリアにあるタンパク質であり、パーキンソン病家系ではCHCHD2の特定のアミノ酸変異が共通して見つかっており、CHCHD2遺伝子は、パーキンソン病の原因遺伝子の一つとして同定されている（非特許文献１）。しかし、CHCHD2遺伝子の機能を欠損した非ヒト動物は、いまだ報告されていない。
【００１２】
本発明において、CHCHD2遺伝子の機能が欠損しているには、CHCHD2遺伝子全体が欠損している場合だけでなく、CHCHD2遺伝子の塩基配列の少なくとも一部が欠損又は他の遺伝子と置換していることにより、CHCHD２が作られなくなった状態が含まれる。
【００１３】
非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であればよいが、通常、実験動物として使用される動物であれば制限されず、非ヒト脊椎動物が好ましく、非ヒト哺乳動物がより好ましく、げっ歯類が特に好ましい。実験動物としては、例えば、サル、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどが挙げられる。このうち、マウスが特に好ましく、マウスとしては雑種でも、系統種でもよい。
【００１４】
ドーパミン細胞において染色体上のCHCHD2遺伝子をノックアウトするには、通常染色体上の遺伝子をノックアウトするのに用いられている方法を適用することができ、好ましくは、コンディショナルノックアウト法を用いることができる。コンディショナルノックアウト法は、標的遺伝子の不活化を組織又は時期特異的にコントロールする方法で、例えば、標的遺伝子の全部又は一部をＤＮＡ組換え酵素であるリコンビナーゼの標的配列で挟んだ遺伝子座を有する非ヒト動物を、当該標的配列を認識するリコンビナーゼを組織又は時期特異的に発現する非ヒト動物と交配させることで、標的遺伝子が組織又は時期特異的に不活化された非ヒト動物を得ることができる。
リコンビナーゼと標的配列の組み合わせとしては、ＣｒｅリコンビナーゼとｌｏｘＰ配列（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム）又はＦＬＰリコンビナーゼとＦＲＴ配列（ＦＬＰ−ＦＲＴシステム）等が挙げられる。このうち、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムは、バクテリオファージＰ１の有する部位特異的組換えシステムを利用したもので、ｌｏｘＰ配列と称されるバクテリオファージＰ１のゲノム由来の３４塩基からなるＤＮＡ配列に対し、ＤＮＡ組換え酵素であるＣｒｅリコンビナーゼが働き、ｌｏｘＰ配列同士の間で部位特異的組換えを生じる。ＦＬＰ−ＦＲＴシステムは、出芽酵母由来のＦＲＴ配列にＦＬＰリコンビナーゼが働き、ＦＲＴ配列同士の間で部位特異的組換えを生じる。Ｃｒｅリコンビナーゼ又はＦＬＰリコンビナーゼを発現するためのプロモーターを選択することにより、標的遺伝子の改変を組織又は時期特異的にコントロールできるため、これらシステムはコンディショナルノックアウト法に好適に利用される。
【００１５】
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、例えば、リコンビナーゼ標的配列に前後を挟まれたCHCHD2遺伝子をホモ接合型で有する非ヒト動物を作製し、これとドーパミン細胞特異的に当該標的配列を認識するリコンビナーゼを発現する非ヒト動物とを交配することで得ることができる。以下に、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物の代表的な作製方法について、マウスを例にとり詳細に説明するが、これに限定されるものではなく、また他の非ヒト動物でも同様にして作製し得る。
【００１６】
（１）リコンビナーゼ標的配列で前後を挟まれたCHCHD2遺伝子をホモ接合型で有するマウスの作製
まず、マウスCHCHD2遺伝子の機能を欠損させるための相同組換え用ターゲティングベクターを作製する。ターゲティングベクターは、データベース等より得た塩基配列情報をもとに、欠失させるCHCHD2遺伝子の領域を決め、その上流及び下流にリコンビナーゼ標的配列を同じ向きで挿入し、さらにその上流及び下流に欠失させる領域の両端のゲノム領域（１〜８ｋｂ程度）を相同組換えに必要な相同領域として配置して設計すればよい。欠失させるCHCHD2遺伝子の領域は、特に制限されず、CHCHD2遺伝子の全部でも一部でもよいが、一部を用いる場合、機能ドメインを含むエキソン等、その領域が失われると機能する遺伝子産物が得られなくなる領域が好ましい。例えば、活性部位のシステイン残基が存在するエキソン１４を含む領域が挙げられる。このとき、リコンビナーゼを発現しない細胞では、正常な遺伝子産物が得られるようにする点に留意する。相同領域については、相同組換え効率、相同組換えを起こした細胞の同定方法等を考慮して設計するのが好ましい。
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用する場合、ターゲティングベクターは、例えば、同じ向きのｌｏｘＰ配列で前後を挟まれたCHCHD2遺伝子の全部又は一部を含み、その上流及び下流に相同領域を含む。Ｃｒｅリコンビナーゼ発現下では、染色体上のｌｏｘＰ配列で挟まれたCHCHD2遺伝子は切り出され、正常な遺伝子産物が得られなくなる。
【００１７】
また、ターゲティングベクターには、ベクターが取り込まれた細胞や目的とする相同組換えの起こっている可能性の高い細胞を選択するためのマーカー遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子（ＤＴ−Ａ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）等の薬剤選択に通常用いられる遺伝子が挿入されていることが好ましい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子は、ネオマイシン類似体であるＧ４１８を用いることにより相同組換えが生じた細胞の選抜を可能にするポジティブ選択用マーカー遺伝子である。また、目的細胞を選抜するためのネガティブ選択に用いるマーカー遺伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子（選択剤としてガンシクロビル等を用い、それに対する感受性により非相同組換え体を選抜除去する）、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子（ＤＴ−Ａにより発現されたジフテリア毒素により、非相同組換え体を選抜除去する）等をポジティブ選択用マーカー遺伝子と共に用いることもできる。ターゲティングベクターにおいて、ポジティブ選択用マーカー遺伝子は、上流と下流の相同領域に挟まれた領域に位置するのが好ましく、リコンビナーゼ存在下でマーカー遺伝子が切り出されることからリコンビナーゼ標的配列に挟まれた領域に位置するのがさらに好ましい。また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子を、CHCHD2遺伝子の切り出しに用いるのとは異なるリコンビナーゼ標的配列で挟んでおけば、後で当該リコンビナーゼによりマーカー遺伝子のみを除去することもできる。ネガティブ選択用マーカー遺伝子は、上流又は下流の相同領域の外側の領域に位置するのが好ましい。
【００１８】
斯かるターゲティングベクターの調製は、通常のＤＮＡ組換え技術により行うことができ、例えば、常法に従ってクローニングしたCHCHD2遺伝子やＢＡＣクローンを利用して、これを適当な制限酵素で切断して得られる断片、又はＰＣＲ法などにより増幅して調製したＤＮＡ断片等を、合成されたリンカーＤＮＡやレポーター遺伝子、薬剤耐性マーカー遺伝子を含む断片等と、前記のような設計に従って適当な順序で結合させればよい。
【００１９】
次に、調製した相同組換え用ターゲティングベクターを、通常キメラ動物の作出に用いられる適当な細胞に導入する。ここで用いる細胞は、例えば卵細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が挙げられるが、生体のあらゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を有している点でＥＳ細胞が好ましい。
【００２０】
ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から樹立され、未分化状態を保ったまま増殖・培養可能な細胞株であり、ＥＳ細胞を用いる遺伝子導入の方法は、マウスについては確立されている（Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８（１９８８））。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、例えばマウスの場合、ＴＴ２、Ｃ５７ＢＬ／６等のマウス系統由来のＥＳ細胞が挙げられる。あるいは、新たに樹立したものを用いてもよい。ＥＳ細胞は、常法に従って継代培養すればよい。
【００２１】
ターゲティングベクターの細胞への導入は、通常の方法、例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等によって行うことができる。このうち、簡便で多数の細胞を処理できることから、エレクトロポレーション法が好適に用いられる。エレクトロポレーション法による遺伝子導入の条件は、通常の動物細胞への遺伝子導入の条件を用いればよい。
【００２２】
ターゲティングベクターを導入したＥＳ細胞は、常法に従い、フィーダー細胞上で培養することで、単一細胞由来のコロニーを得ることができる。このとき、相同組換えが生じたＥＳ細胞では、ベクター中のCHCHD2遺伝子とともにマーカー遺伝子も染色体に組み込まれているため、マーカー遺伝子の発現に基づいて、例えば適当な期間薬剤存在下で培養することにより、目的のＥＳ細胞を選択することができる。また、当該コロニーから抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法又はサザンハイブリダイゼーション法等により、相同組換えが生じたＥＳ細胞を選択することもできる。ＰＣＲ法の場合は、例えば、相同領域の外側に設計したプライマーと、マーカー遺伝子内に設計したプライマーを用い、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、所望の長さのバンドが得られるかどうかで判断することができる。サザンハイブリダイゼーション法の場合は、例えば、相同組換えによる切断パターンの変化を観察しやすい制限酵素でゲノムＤＮＡを消化したＤＮＡ断片と、相同領域の外側に設計したプローブ及びマーカー遺伝子に設計したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、目的の位置にバンドが得られるかどうかで判断することができる。
【００２３】
次に、相同組換えを生じたＥＳ細胞を用いて、インジェクション法又はアグリゲーション法等の通常のキメラ動物の作出に用いられる方法に従い、キメラ動物を作製する。具体的には、相同組換えを生じたＥＳ細胞を胚形成の初期の適当な時期、例えば８細胞期の胚又は胚盤胞に注入し、得られた胚を偽妊娠状態の雌の仮親の子宮内に移植することにより、正常なCHCHD2遺伝子座をもつ細胞とＥＳ細胞由来のCHCHD2遺伝子座をもつ細胞とから構成されるキメラ動物が得られる。宿主胚をどのような系統の動物から得るのかの選択は、常法に従い毛色等の表現型によりＥＳ細胞由来の細胞と宿主胚由来の細胞とを区別することができるように行えばよい。
【００２４】
キメラ動物の生殖細胞の一部がＥＳ細胞由来のCHCHD2遺伝子座をもつ場合には、キメラ個体を正常個体と交配することにより得られた個体群より、全ての組織がＥＳ細胞由来のCHCHD2遺伝子座をもつ細胞で構成された個体（CHCHD2  Ｆ／＋）を毛色等の判別法により選別することができる。
例えば、Ｊ１株のマウスＥＳ細胞とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系の宿主胚を用いて得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系と交配する場合は、娩出される産仔は、キメラマウスの生殖細胞が相同組換えＥＳ細胞に由来していれば該ＥＳ細胞が由来するマウスと同じ野生色（アグーチ）を呈し、宿主胚に由来していれば該宿主胚が由来するマウスと同じ黒色を呈する。
【００２５】
かくして得られた個体は、相同組換えＥＳ細胞由来CHCHD2遺伝子座を一方の相同染色体に有するヘテロ接合型である（CHCHD2  Ｆ／＋）。このＦ１ヘテロ接合型の個体同士を交配すれば、Ｆ２ヘテロ接合型及びＦ２ホモ接合型（CHCHD2  Ｆ／Ｆ）の個体を得ることができる。CHCHD2遺伝子の機能を組織特異的に欠損させるには、ホモ接合型を用いることが好ましい。
【００２６】
（２）ドーパミン細胞特異的にリコンビナーゼを発現するマウスの作製
ドーパミン細胞特異的にリコンビナーゼを発現するマウスは、例えば、ドーパミン細胞特異的に作用するプロモーターの下流にリコンビナーゼをコードする遺伝子を発現可能に連結したトランスジーンを用いて、公知のトランスジェニックマウスを作製する方法により作製することができる。
【００２７】
まず、ドーパミン細胞特異的に作用するプロモーターにリコンビナーゼをコードする遺伝子を発現可能に連結したトランスジーンを含む発現ベクターを作製する。
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いる場合、リコンビナーゼをコードする遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするｃｒｅ遺伝子を用いればよい。ｃｒｅ遺伝子としては、ｌｏｘＰ配列を認識してｌｏｘＰ配列に挟まれたＤＮＡ配列を切り出すことができるタンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限されないが、好ましくはバクテリオファージＰ１由来のｃｒｅ遺伝子が用いられる（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ０３４５３）。
【００２８】
ｃｒｅ遺伝子の発現を制御するプロモーターとしては、ドーパミン細胞特異的に機能し得るプロモーターであればよく、例えばチロシン水酸化酵素（ＴＨ）プロモーターが挙げられる。当該プロモーターにより、Ｃｒｅリコンビナーゼがドーパミン細胞特異的に発現される。なお、「ドーパミン細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現する」とは、ドーパミン細胞においてそれ以外の組織と比較してＣｒｅリコンビナーゼを顕著に多く発現することをいう。
【００２９】
発現ベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。発現ベクターには、ｃｒｅ遺伝子の下流にポリＡシグナルを含むことが好ましく、また、トランスジーンが導入された細胞の選抜のため、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【００３０】
斯かる発現ベクターの調製は、通常のＤＮＡ組換え技術により行うことができ、例えば、常法に従いクローニングしたＴＨプロモーター及びｃｒｅ遺伝子を利用して、これを適当な制限酵素で切断して得られる断片、又はＰＣＲ法などにより増幅して調製したＤＮＡ断片等を、合成されたリンカーＤＮＡや薬剤耐性マーカー遺伝子を含む断片等と、前記のような設計に従って適当な順序で結合させればよい。
【００３１】
次に、発現ベクターを公知の手段を用いてマウスに導入する。発現ベクターを動物細胞又は動物個体に導入する方法としては、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルスベクターを利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、導入細胞種、発現効率などを考慮して適宜選択すればよい。例えば、受精卵を用いる場合には、直鎖状にした発現ベクターＤＮＡをマウスの前核期受精卵にマイクロインジェクション法により導入し、当該受精卵を偽妊娠状態の雌の仮親に移植し、うまれた子の中から目的遺伝子を発現している個体をＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法等により確認し、選抜することができる。
【００３２】
かくして得られたＦ０動物は、ｃｒｅ遺伝子を相同染色体の一方にのみ有するヘテロ接合型（ＴＨ−Ｃｒｅ（＋／−））である。本発明においては、当該ヘテロ接合型の個体を用いればよい。以下、ＴＨ−Ｃｒｅ（＋／−）マウスをＴＨ−Ｃｒｅマウスとも称す。
【００３３】
ＴＨ−Ｃｒｅマウスは上述の方法等により作製できるが、内在性のドーパミン細胞特異的に作用するプロモーターの下流にｃｒｅ遺伝子が発現可能に挿入されるように設計したターゲティングベクターを作製し、これを上記同様の相同組換えによりＥＳ細胞に導入し、ノックインマウスを作製することでも得ることができる。あるいは、既存のＴＨ−Ｃｒｅマウスを用いてもよく、例えば、Savitt et al., The Journal of Neuroscience, Vol.25, No. 29, 2005, 6721-6728に記載のマウスが挙げられる。
【００３４】
（３）ドーパミン神経においてCHCHD2遺伝子の機能が欠損したマウスの作製
本発明のドーパミン神経においてCHCHD2遺伝子の機能が欠損したマウスは、（１）で得られたリコンビナーゼ標的配列で前後を挟まれたCHCHD2遺伝子をホモ接合型で有するマウスと、（２）で得られたドーパミン細胞特異的にリコンビナーゼを発現するマウスを交配することで得ることができる。例えば、（１）のCHCHD2  Ｆ／Ｆマウスと（２）のＴＨ−Ｃｒｅ（＋／−）マウスを交配する場合、得られるＦ１動物はCHCHD2  Ｆ／＋：ＴＨ−Ｃｒｅ（＋／−）、あるいはCHCHD2  Ｆ／＋：ＴＨ−Ｃｒｅ（−／−）である。このＦ１動物同士を交配すれば、Ｆ２動物の一部がCHCHD2  Ｆ／Ｆ：ＴＨ−Ｃｒｅ（＋／−）となる。
CHCHD2  Ｆ／Ｆ：ＴＨ−ｃｒｅ（＋／−）マウスは、ＴＨプロモーターの働きにより、ドーパミン細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現し、当該Ｃｒｅリコンビナーゼにより染色体上のCHCHD2遺伝子が切り出されるため、ドーパミン神経においてａｔｇ７遺伝子の機能が欠損したマウスとなる。当該マウスは、ドーパミン神経特異的にオートファジーを欠損する。以下、CHCHD2  Ｆ／Ｆ：ＴＨ−ｃｒｅ（＋／−）マウスをCHCHD2  Ｆ／Ｆ：ＴＨ−ｃｒｅマウスとも称す。
【００３５】
CHCHD2遺伝子を欠損させる手段としては、ゲノム編集技術も挙げられる。ゲノム編集技術としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａs９が挙げられ、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９を用いるのが特に好ましい。
【００３６】
得られた非ヒト動物が、CHCHD2遺伝子を欠損しているかどうかは、非ヒト動物から採取したＤＮＡについて、２段階ＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物に対してＴ７Ｅ１アッセイを行えばよい。ＰＣＲ産物でミスマッチのＤＮＡがあれば、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１が特異的に認識し、切断するので、変異陽性の非ヒト動物を同定することができる。その後、ＰＣＲ産物を用いてダイレクトシークエンスあるいはＴＡクローニング後にシークエンス解析を行う。
【００３７】
後記実施例に示す通り、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、CHCHD2遺伝子の機能が欠損し、下記の（１）〜（４）のすべての性質を有することを特徴とする。
（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する
（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する
（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する
（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する
この（１）〜（４）の性質はパーキンソン病に特徴的な運動障害と３つの病理像を再現するものであることから、本発明の非ヒト動物は、パーキンソン病モデル非ヒト動物として有用である。
【００３８】
後記実施例に示す通り、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、野生型動物に比べて、加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する。
運動障害の有無は、常法に従い、ロータロッド試験、ビーム課題等により評価することができ、例えば、ロータロッド試験では転倒又は落下潜時の短縮がみられ、ビーム課題では頻繁に滑り、後肢がビームから外れるような運動症状がみられる。
ここで、「野生型動物」とは、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物と同系統、かつドーパミン神経においてCHCHD2遺伝子の機能が欠損していない非ヒト動物のことであり、例えば、遺伝子改変を行っていない非ヒト動物、CHCHD2  Ｆ／Ｆ非ヒト動物等が挙げられる。野生型動物に比した運動機能の低下が生じる週齢は、動物種により異なり得るが、マウスの場合、１００週以降、好ましくは１１０週以降、更に好ましくは１１５週以降である。例えば、本発明のパーキンソン病モデルマウスを用いれば、従来寿命内では困難とされた運動障害の観察が可能となる。
【００３９】
後記実施例に示す通り、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、黒質緻密部において、野生型動物に比してドーパミン細胞が減少している。「野生型動物」については、上述の通りである。野生型動物に比したドーパミン細胞の減少が生じる週齢は、動物種により異なり得るが、マウスの場合、特に限定されず、好ましくは１００週以降、更に好ましくは１１０週以降、更に好ましくは１１５週以降である。ドーパミン細胞の減少は、例えば、免疫染色法により検出することができる。黒質緻密部におけるドーパミン細胞の減少も、パーキンソン病に特徴的な病理像の１つであり、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、当該特徴をも再現することができる。
【００４０】
後記実施例に示す通り、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する。当該凝集体の存在は、例えば、ドーパミン細胞を電子顕微鏡で観察することで確認することができる。また、当該凝集体には、レビー小体の主要構成成分であるα−シヌクレインの他、ｐ６２が含まれることが、免疫染色により確認できる。タンパク質凝集体の形成は、パーキンソン病に特徴的な病理像の１つであり、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、当該特徴を再現することができる。
【００４１】
後記実施例に示すとおり、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する。ミトコンドリアの変性は、例えば、ドーパミン細胞を電子顕微鏡で観察することで確認することができる。ミトコンドリアの変性は、パーキンソン病に特徴的な病理像の１つであり、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、当該特徴を再現することができる。また、タンパク質凝集体の形成とミトコンドリアの変性という、パーキンソン病に特徴的な病理像を示すモデル非ヒト動物は報告がない。
【００４２】
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、加齢に伴い運動障害を生じるというパーキンソン病による運動障害を再現し、タンパク質凝集体の形成、ミトコンドリアの変性及びドーパミン細胞の減少というパーキンソン病に特徴的な病理像をあわせもつ。従って、当該モデル非ヒト動物を用いれば、パーキンソン病治療薬をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、運動機能、タンパク質凝集体、ミトコンドリアの変性及び黒質緻密部のドーパミン細胞から選ばれる１以上を測定すれば、パーキンソン病治療薬をスクリーニングすることができる。測定項目としては、上記のいずれか１以上を測定すればよく、タンパク質凝集体の形成、ミトコンドリアの変性及び黒質緻密部のドーパミン細胞を測定することが好ましく、全てを測定するのがさらに好ましい。
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与した場合に、野生型非ヒト動物と比較した時の運動機能低下が改善される、凝集体形成が抑制される及び／又は野生型非ヒト動物と比較した時のドーパミン細胞減少が抑制されれば、その被験物質はパーキンソン病治療薬である。「野生型非ヒト動物」は、上述の通りである。
あるいは、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与した場合に、被験物質を投与していない本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較して、運動機能低下が改善される、凝集体形成が抑制される、ミトコンドリアの変性が観察される及び／又はドーパミン細胞減少が抑制されれば、その被験物質はパーキンソン病治療薬である。比較の明確さの点で、被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物をコントロールとするのが好ましい。
【００４３】
本発明における被験物質は、パーキンソン病に対する治療効果を予測したい薬物であればよく、特に限定されない。被験物質の投与方法としては、特に制限はなく、投与される動物種や被験物質の特性に応じて適宜選択すればよい。例えば、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、直腸内投与等が挙げられる。被験物質の投与量も、投与される動物種や被験物質の特性に応じて適宜設定すればよい。
【実施例】
【００４４】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例1
CHCHD2遺伝子欠損マウスの作製
CHCHD2の機能を知るために、CHCHCHD2ノックアウトマウスを作製した。ターゲッティングベクターは、1.5 kb及び7 kbのDNAフラグメントを5 '及び3'の相同配列とし、C57BL / 6に ES細胞を用いてトランスフェクトした（図１参照）。 G418を選択後、サザンブロッティングにより相同組換えについてクローンをスクリーニングした。 5 'の外部プローブとneo配列に特異的なプローブを使用して、クローンが目的の相同組換えを持つことを確認し、これらのクローンに由来するES細胞をC57BL / 6胚に注入した。キメラの子孫をC57BL / 6マウスと交配させ、生殖系列伝達を得た。次に、ヘテロ接合性マウスを交配させて、ホモ接合性ノックアウト及び野生型対照マウスを得た。続いて、野生型と標的とされた対立遺伝子に特異的なプライマーを用いたPCRにより、マウスの遺伝子型を決定した。
【００４６】
実施例２
中脳黒質ドーパミン細胞内に凝集体の形成及びミトコンドリアの変性を観察
（１）１２０週齢のCHCHD2遺伝子欠損マウスのドーパミン細胞を免疫染色して、凝集体の形成を観察した。
４％パラホルムアルデヒド（PFA）で灌流固定後、脳を取り出し４℃で３６時間浸透固定した。固定サンプルを２０％スクロースで凍結し、凍結ミクロトームでスライスして厚さ４０μmの極薄切片を作製する。シヌクレイン（赤）とｐ６２（緑）の二重免疫蛍光染色では、極薄切片をウサギ・シヌクレイン抗体（AB5038P；ミリポア）とモルモット・ｐ62抗体（PROGEN Biotechnik, GmbH）でインキュベートした。次に、Alexa Fluor546抗ウサギIgG及びAlexa Fluor488抗モルモットIgGとインキュベートした。蛍光シグナルは、LSM780共焦点顕微鏡（Zeiss）で観察した。
蛍光染色によるｐ62、シヌクレイン陽性細胞内封入体を観察した結果を図２に示す。図２より、CHCHD2遺伝子欠損マウスは、ｐ62陽性及びシヌクレイン陽性タンパク質凝集体を形成していた。
【００４７】
（２）１２０週齢のCHCHD2遺伝子欠損マウスのドーパミン細胞の電子顕微鏡観察により、ミトコンドリアの変性の有無を検討した。
２．５％グルタルアルデヒド/(0.1 mol / L) PB（pH 7.2）で灌流固定後、脳を取り出し４℃で３６時間浸透固定した。 脳スライスをエポキシ樹脂に埋め込み、超薄切片（７０ nm）を作製し、HT7700電子顕微鏡（HITACHI）で観察した。 これらの電子顕微鏡データを使用して、ドーパミン作動性ニューロン内のミトコンドリアの数と面積を「CellSens」分析ソフトウェア（Olympus）を使用し計測した。
ミトコンドリアの変性を示す電顕写真及びミトコンドリア面積比を図３に示す。図３より、CHCHD2遺伝子欠損マウスは、ドーパミン細胞のミトコンドリア変性が認められた。
【００４８】
実施例３
加齢により運動障害が生じる
CHCHD2遺伝子欠損マウスは、出生時に生存可能で、同腹子と外観が区別できず、正常な生存率だった。これらのマウスはまだ生涯にわたる観察は実施していないが、１１５週間で運動行動障害を示し始めた。これらの臨床異常は、ビーム試験、ロータロッド試験で観察できた。ビーム試験では、野生型マウスは巧妙な動きを示し、前肢または後肢がビームから脱落することはなかった。対照的に、CHCHD2欠損マウスは頻繁に滑っていた。特に、CHCHD2欠損マウスの後肢は、しばしばビームから外れた(図４)。さらに、ロータロッド試験では、CHCHD2欠損マウスで転倒潜時が短縮された（図５）。CHCHD2欠損による体重と寿命への影響はなかった。歩行障害が進行し、末期（１２０週間を超える）になるとマウスの大部分は無動となった。
【００４９】
実施例４
ドーパミン細胞の脱落
運動症状を呈するCHCHD2遺伝子欠損マウスのドーパミン細胞を計測した結果、黒質緻密部の神経細胞死の減少が認められた。また、高速液体クロマトグラフィ（HPLC）によるドーパミン細胞の定量を行ったところCHCHD2遺伝子欠損マウスでドーパミンの減少が認められた（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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