(57)【要約】【課題】正確かつ簡便で多数の検体処理が可能なＬ−システインの酵素的測定方法及び測定用試薬を提供すること。【解決手段】試料中のＬ−システインに、Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素をピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させ、生成されたいずれかの反応生成物を定量するＬ−システインの測定方法、及びＬ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しない酵素及びピリドキサル−５’−リン酸を含むＬ−システインの測定用試薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＬ−システインに、Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させ、生成されたアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素からなる群から選ばれる１種又は２種以上の反応生成物を定量することを特徴とするＬ−システインの測定方法。
【請求項２】
Ｌ−システイン分解酵素が、口腔内に存在する細菌由来のものである請求項１記載のＬ−システインの測定方法。
【請求項３】
Ｌ−システイン分解酵素が、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）又はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のいずれかの細菌由来のものである請求項２に記載のＬ−システインの測定方法。
【請求項４】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号１記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである請求項１〜３のいずれかに記載のＬ−システインの測定方法。
【請求項５】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号２記載の塩基配列、その相補配列、又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列のいずれかによってコードされるものである請求項１〜３のいずれかに記載のＬ−システインの測定方法。
【請求項６】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号３記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである請求項１〜３のいずれかに記載のＬ−システインの測定方法。
【請求項７】
Ｌ−システイン分解酵素が、更にセリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しない酵素である請求項１〜６のいずれかに記載のＬ−システインの測定方法。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの工程を有する請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−システインの測定方法。
（ａ）生成された硫化水素を、硫化物イオンの発色検出により測定する工程、
（ｂ）生成されたアンモニアを、グルタミン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｃ）生成されたピルビン酸を、ピルビン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下において作用させ、生成されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｄ）生成されたピルビン酸を、乳酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｅ）生成されたピルビン酸をピルビン酸酸化酵素の反応の基質とし、色原体及びペルオキシダーゼの存在下において作用させ、反応に伴い増加するキノン色素を発色定量する工程。
【請求項９】
Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しない酵素及びピリドキサル−５’−リン酸を含むことを特徴とするＬ−システインの測定用試薬。
【請求項１０】
Ｌ−システイン分解酵素が、口腔内に存在する細菌由来のものである請求項９記載のＬ−システインの測定用試薬。
【請求項１１】
Ｌ−システイン分解酵素が、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）又はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のいずれかの細菌由来のものである請求項１０に記載のＬ−システインの測定用試薬。
【請求項１２】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号１記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである請求項９〜１１のいずれかに記載のＬ−システインの測定用試薬。
【請求項１３】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号２記載の塩基配列、その相補配列、又はそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列のいずれかによってコードされるものである請求項９〜１１のいずれかに記載のＬ−システインの測定用試薬。
【請求項１４】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号３記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである請求項９〜１１のいずれかに記載のＬ−システインの測定用試薬。
【請求項１５】
Ｌ−システイン分解酵素が、更にセリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しない酵素である請求項９〜１４のいずれかに記載のＬ−システインの測定用試薬。
【請求項１６】
更に、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素及びピルビン酸酸化酵素からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酵素を含む請求項９〜１５のいずれかに記載のＬ−システインの測定用試薬。
【請求項１７】
乳酸脱水素酵素が、Ｄ−乳酸脱水素酵素である請求項１６に記載のＬ−システインの測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素による、安価で正確かつ簡便なＬ−システインの測定方法及び測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
システインやメチオニンは生体中のタンパク質を構成する硫黄含有アミノ酸として知られており、生体内では一連の代謝サイクルの中で恒常性を維持している。植物では硫黄を硫酸イオンの形で取り込み、硫化物イオンまで還元した後、システイン合成が行われ、さらにメチオニン合成へと続く。動物では食物連鎖によりメチオニンを食物中のタンパク質から摂取し、通常、生体内でシステインに代謝される。
【０００３】
この代謝過程で中間体として生成するホモシステインは、再メチル化によるメチオニンへの変換、あるいはセリンとの縮合によるシスタチオニンの形成後、システインに導かれる経路により速やかに代謝されるため正常時にはほとんど存在しない。しかしながら、メチル化を触媒する酵素であるメチルテトラヒドロ葉酸メチルトランスフェラーゼやその補助因子である葉酸及びビタミンＢ１２の欠乏、シスタチオニン形成を触媒するシスタチオニンβシンターゼの機能不全等により、代謝サイクルの中で異常が発生すると、ホモシステインが蓄積してしまう。最近、この代謝過程で中間体として生成されるホモシステインが、心筋梗塞あるいは脳梗塞などの血栓塞栓症あるいは動脈硬化症において、独立したリスクファクターとして注目されており、血中濃度と疾患との関係における臨床データが数多く報告されている。
【０００４】
一方、システインはメチオニンの代謝により生成するアミノ酸であることから、ホモシステイン代謝異常の原因把握の補助的な指標とも成り得るため、ホモシステインとの関連が注目されている。最近、ホモシステインとシステインの比を指標として、シスタチオニンβシンターゼのヘテロ接合体遺伝子異常のスクリーニングに有用であるとの報告もなされている（非特許文献１参照）。したがって、ホモシステインのみならずシステインの血中濃度測定は有用と考えられる。
【０００５】
システインの酵素的測定法として、グルタチオン・スルヒィドリル・オキシダーゼを用いた方法が開示されているが（特許文献１参照）、該酵素はグルタチオンやジチオスレイトールのようなチオール化合物にも反応を示すなど基質特異性に乏しく、特異的な測定法とは言い難かった。
【０００６】
【非特許文献１】
ボディーら（Ｂｏｄｄｉｅ　ｅｔ．ａｌ．），メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　），４７（２），２０７〜２１１（１９９８）
【０００７】
【特許文献１】
特許第１５９４８９５号明細書
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
システインの酵素的測定法は、操作性などの面から有用と考えられるが、上述したように、現在までその測定系に応用可能な特異的な酵素が見出されておらず、酵素的測定系の開発は実現されていない。
【０００９】
したがって、本発明の主な目的は、安価であり、正確かつ簡便で多数の検体処理が可能なＬ−システインの酵素的測定方法及び測定用試薬を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決することを主な目的として、本発明者らは鋭意検討を行った。その結果、試料中のＬ−システインに、Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させ、生成されたいずれかの反応生成物を定量することを特徴とするＬ−システインの測定方法を開発し、本発明により、試料中のＬ−システインを安価で、正確かつ簡便に測定することが可能となること、また、Ｌ−システイン測定において多数の検体処理が可能となることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明は以下の構成からなる。
【００１２】
１．試料中のＬ−システインに、Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させ、生成されたアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素からなる群から選ばれる１種又は２種以上の反応生成物を定量することを特徴とするＬ−システインの測定方法。
【００１３】
２．Ｌ−システイン分解酵素が、口腔内に存在する細菌由来のものである１記載のＬ−システインの測定方法。
【００１４】
３．Ｌ−システイン分解酵素が、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）又はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のいずれかの細菌由来のものである２に記載のＬ−システインの測定方法。
【００１５】
４．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号１記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである１〜３のいずれかに記載のＬ−システインの測定方法。
【００１６】
５．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号２記載の塩基配列、その相補配列、又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列のいずれかによってコードされるものである１〜３のいずれかに記載のＬ−システインの測定方法。
【００１７】
６．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号３記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである１〜３のいずれかに記載のＬ−システインの測定方法。
【００１８】
７．Ｌ−システイン分解酵素が、更にセリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しない酵素である１〜６のいずれかに記載のＬ−システインの測定方法。
【００１９】
８．以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの工程を有する１〜７のいずれかに記載のＬ−システインの測定方法。
（ａ）生成された硫化水素を、硫化物イオンの発色検出により測定する工程、
（ｂ）生成されたアンモニアを、グルタミン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｃ）生成されたピルビン酸を、ピルビン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下において作用させ、生成されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｄ）生成されたピルビン酸を、乳酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｅ）生成されたピルビン酸をピルビン酸酸化酵素の反応の基質とし、色原体及びペルオキシダーゼの存在下において作用させ、反応に伴い増加するキノン色素を発色定量する工程。
【００２０】
９．Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しない酵素及びピリドキサル−５’−リン酸を含むことを特徴とするＬ−システインの測定用試薬。
【００２１】
１０．Ｌ−システイン分解酵素が、口腔内に存在する細菌由来のものである９記載のＬ−システインの測定用試薬。
【００２２】
１１．Ｌ−システイン分解酵素が、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）又はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のいずれかの細菌由来のものである１０に記載のＬ−システインの測定用試薬。
【００２３】
１２．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号１記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである９〜１１のいずれかに記載のＬ−システインの測定用試薬。
【００２４】
１３．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号２記載の塩基配列、その相補配列、又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列のいずれかによってコードされるものである９〜１１のいずれかに記載のＬ−システインの測定用試薬。
【００２５】
１４．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号３記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである９〜１１のいずれかに記載のＬ−システインの測定用試薬。
【００２６】
１５．Ｌ−システイン分解酵素が、更にセリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しない酵素である９〜１４のいずれかに記載のＬ−システインの測定用試薬。
【００２７】
１６．更に、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素及びピルビン酸酸化酵素からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酵素を含む９〜１５のいずれかに記載のＬ−システインの測定用試薬。
【００２８】
１７．乳酸脱水素酵素が、Ｄ−乳酸脱水素酵素である１６に記載のＬ−システインの測定用試薬。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００３０】
Ｌ−システイン分解酵素
本発明で用いられる酵素としては、Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素であれば特に制限はない。
Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応は、具体的には、以下の化学式で表される。
2004105057.tif 000002
また、Ｄ−システイン、ホモシステインと実質的に反応しないとは、Ｌ−システインとの反応と比較して、全く反応しないか又はほとんど反応しないことを意味する。例えば、図１においてＬ−システインのかわりにＤ−システイン、ホモシステインを用いて同様の試験を行った場合に、図１におけるＬ−システインが０ｍＭのときとほぼ同様の測定結果が得られることを意味する。測定結果の判定には、定量検査や分析化学の領域における最小測定限界・検出限界・定量限界・実効感度などの評価法等、従来用いられている任意の検定方法を適宜採用することができる。
本発明のＬ−システイン分解酵素は、Ｄ−システイン、ホモシステインと実質的に反応せず、高い基質特異性を有していることから、試料に対する測定精度が高く、Ｌ−システインの正確な定量が可能となる。
【００３１】
本発明のＬ−システイン分解酵素は、更に、セリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しないものが好ましい。セリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンと実質的に反応しないとは、Ｌ−システインとの反応と比較して、全く反応しないか又はほとんど反応しないことを意味する。
【００３２】
セリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しないことによって、基質特異性が更に高まり、従って、試料に対する測定精度が高まって、Ｌ−システインのより正確な定量が可能となる。
本発明のＬ−システイン分解酵素は、好ましくは、口腔内に存在する細菌由来、より好ましくは口腔内常在細菌由来のものである。ここで、口腔内常在細菌とは、頻繁に口腔内から検出される細菌を意味する。
口腔内常在細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・サリバリアス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｒａｌｉｓ）、アクチノマイセス・ネスランディー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、ペプトストレプトコッカス・ミクロス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｃｒｏｓ）、キャプノサイトファーガ・オクラセア（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ）、キャンピロバクター・グラシリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ユーバクテリウム・ノダタム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｏｄａｔｕｍ）等が例示される。
このうち、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）又はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のいずれかの細菌に由来するＬ−システイン分解酵素が酵素反応性の点で好ましい。更に、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）に由来するＬ−システイン分解酵素が酵素反応性と、安定性の点でもっとも好ましい。
【００３３】
また、本発明における、Ｌ−システイン分解酵素として、好ましくは、以下のものが挙げられる。
【００３４】
配列番号１記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むＬ−システイン分解酵素。
【００３５】
配列番号２記載の塩基配列、その相補配列、又はそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列のいずれかによってコードされるＬ−システイン分解酵素。
【００３６】
配列番号３記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むＬ−システイン分解酵素。
【００３７】
配列番号１記載のアミノ酸配列を含むＬ−システイン分解酵素としては、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）由来の酵素が挙げられる。
【００３８】
配列番号２記載の塩基配列によってコードされるＬ−システイン分解酵素としては、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）由来の酵素が挙げられる。
【００３９】
配列番号３記載のアミノ酸配列を含むＬ−システイン分解酵素としては、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）由来の酵素が挙げられる。
【００４０】
上記において、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したものとは、従来周知の技術により得ることができ、かつ、上述した酵素の性質及び機能が失われていない範囲内のものである。
【００４１】
また、上記において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件とは、通常、「１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」程度、好ましくは「０．５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」程度、更に好ましくは、「０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」程度である。
【００４２】
本発明で用いられる酵素は、該酵素を生産する微生物、例えば上述した口腔内に存在する細菌を培養して菌体を回収し、この菌体を超音波処理等により破砕して得られる破砕液を、必要に応じて、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトゲル、ゲル濾過等のカラムクロマトグラフィを組合せて精製することにより得ることができる。
【００４３】
Ｌ−システインの測定方法
本発明のＬ−システインの測定方法は、試料中のＬ−システインに、上述のＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させ、生成されたアンモニア、ピルビン酸又は硫化水素のいずれかの反応生成物を定量することを特徴とする。
【００４４】
反応生成物を定量する方法としては、例えば、生成された硫化水素を、一般的に知られた硫化物イオンの測定法、すなわち、発色検出として、２，２’−ジピリジルジスルファイド（Ｓｖｅｎｓｏｎ，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７；５１〜５５（１９８０））やニトロプルシッドナトリウムを用いる方法、強酸性下で、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｐ−フェニレンジアミンと塩化第二鉄を用いてメチレンブルーを生成させ青色発色を検出する方法（メチレンブルー法）、セレニウムを触媒として色素（トルジンブルーやメチレンブルー）の退色量及び速度を測定する方法（Ｍｏｕｓａｖｉ等，Ｂｕｌｌ．　Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　Ｊｐｎ，６５；２７７０〜２７７２（１９９２）、Ｇｏｋｍｅｎ等，Ａｎａｌｙｓｔ，１１９；７０３〜７０８（１９９４））などで定量する方法等が挙げられる。
【００４５】
また、生成されたアンモニアを、グルタミン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する方法等が挙げられる。
【００４６】
また、生成されたピルビン酸を、ピルビン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下において作用させ、生成されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する方法、或いは、生成されたピルビン酸を乳酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する方法等が挙げられる。また、生成されたピルビン酸をピルビン酸酸化酵素の反応の基質とし、色原体及びペルオキシダーゼの存在下において作用させ、反応に伴い増加するキノン色素を発色定量するなどの手法と組合せることもできる。
【００４７】
このうち、乳酸脱水素酵素を用いて反応生成物を定量する方法が酵素の安定性の点で好ましい。また、乳酸脱水酵素としてＤ−乳酸脱水素酵素を用いる場合がより好ましい。Ｄ−乳酸脱水素酵素は、生体試料に存在するＬ−乳酸による影響を受ける可能性がないため、本発明においてより好ましく用いることができる。
【００４８】
本発明の測定方法におけるＬ−システイン分解酵素の使用濃度は特に限定されないが、０．０００５〜１ｍｇ／ｍｌであり、特に０．００１〜０．０１ｍｇ／ｍｌの範囲とすることが好ましい。
【００４９】
また本発明において、補酵素として用いるピリドキサル−５’−リン酸の使用濃度も特に限定されないが、通常０．００１〜０．１ｍｍｏｌ／ｍｌであり、特に０．００５〜０．０５ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００５０】
本発明において、更に補酵素（電子供与体）としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いる場合には、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの使用濃度は、通常０．０１〜１０ｍｍｏｌ／ｍｌであり、特に０．０５〜０．２ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲が好ましい。補酵素の還元体を定量するために、還元されることによって発色する発色剤を併用してもよい。かかる発色剤は、使用する補酵素に応じて適宜選択すればよく、例えばＮＡＤの還元体であるＮＡＤＨを定量するために、電子キャリアーとして、フェナジンメトサルフェートやジアホラーゼとテトラゾリウム塩を共存させ、生成されるホルマザン色素を比色定量する方法等が挙げられる。
【００５１】
本発明においては、緩衝液として、ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の、通常使用されるものを用いることができる。
【００５２】
本発明の測定方法が適用される試料（検体）としては、Ｌ−システインの濃度を測定したいものであれば特に制限はない。例えば、血液、血清、血漿、髄液、尿などの生体試料、又はこれらの生体試料から調製された試料等が好適に使用される。
【００５３】
Ｌ−システイン測定用試薬
本発明のＬ−システイン測定用試薬は、上述したＬ−システイン分解酵素とピリドキサル−５’−リン酸を含むことを特徴とする。
【００５４】
本発明のＬ−システイン測定用試薬には、更に、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素及びピルビン酸酸化酵素からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酵素を含むことが好ましい。
【００５５】
また、該乳酸脱水素酵素は、Ｄ−乳酸脱水素酵素であることがより好ましい。
【００５６】
本発明のＬ−システイン測定用試薬を生体試料に添加して反応を行わせた後、生成されたアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素からなる群から選ばれる１種又は２種以上の反応生成物を定量することによって、Ｌ−システインの測定を行うことができる。
【００５７】
本発明の測定試薬におけるＬ−システイン分解酵素の含有濃度は特に限定されないが、通常０．０００５〜１ｍｇ／ｍｌであり、特に０．００１〜０．０１ｍｇ／ｍｌの範囲とすることが好ましい。
【００５８】
また、ピリドキサル−５’−リン酸の含有濃度も特に限定されないが、通常０．００１〜０．１ｍｍｏｌ／ｍｌであり、特に０．００５〜０．０５ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００５９】
更に補酵素（電子供与体）としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いる場合には、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの含有濃度は、通常０．０１〜１０ｍｍｏｌ／ｍｌであり、特に０．０５〜０．２ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００６０】
本発明のＬ−システイン測定用試薬は、補酵素及び測定用酵素を別々に組合せたものでもよい。具体的には、ＮＡＤＨと脱水素酵素とを含む第１試薬と、Ｌ−システイン分解酵素とピリドキサル−５’−リン酸とを含む第２試薬との組合わせなどが挙げられる。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６２】
酵素製造例（Ｌ−システイン分解酵素の製造）
（１）染色体ＤＮＡ　の調製
ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）　ＦＷ７３株をブレインハートインフージョン（ｂｒａｉｎ　ｈｅａｒｔ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ブロス中において、５％二酸化炭素存在下で３７℃、一昼夜培養した。定常期に達した菌液に等量の培地を加えて、さらに同じ条件下で約１時間培養した。さらに、培養液の３／２０容量の２０％　グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）溶液を加え、約１時間培養した。その後、培養液を遠心して上清を取り除き、培養液の１／５０容量の緩衝液（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　５０　ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ；　ｐＨ　８）で菌体を懸濁した。同懸濁液　（２５０　μｌ）　に　１．０　ｍｇ／ｍｌ　（１，０００　Ｕ／ｍｌ）　のムタロライシン　Ｋ−１（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ　Ｋ−１）　（２５　μｌ）　を加え３７℃で３０分間反応させた。同反応液に１００　μｌ　のリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ；　和光純薬工業）を加え、３７℃で６０分間反応させた。その後、溶液中のＲＮＡを除去するために、１０　μｌのリボヌクレアーゼ（１０　ｍｇ／ｍｌ；　ニッポンジーン）を加え、３７℃で３０分間反応させた。さらに、　１０　μｌ　のプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ）　（１４０　Ｕ／ｍｌ；　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　ＵＳＡ）　を混合し、３７℃で６０分間反応させた。続いて同反応液にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１％になるように加え、穏やかに混合した。この反応液を用いて、フェノール・クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）混合溶液による抽出を４回程度行い、さらにクロロホルムによる抽出を１回行った。この抽出液と等量のイソプロパノールを緩やかに混合した際、白雲状に認められる染色体ＤＮＡをガラス棒で絡め取り、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥ溶液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ；　ｐＨ　８．０）に溶解し、使用時まで４℃で保存した。なお、本実施例で用いたストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）　ＦＷ７３株は、九州大学大学院歯学研究院口腔保健推進学講座で継代保存されているものを用いた。
【００６３】
（２）Ｌ−システイン分解酵素遺伝子を発現させるプラスミドの構築
ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）　ＦＷ７３株のＬ−システイン分解酵素をコードする遺伝子は、すでに、吉田らによってクローン化され、その塩基配列は国際ＤＮＡデータベースである、ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ　（ＤＤＢＪ）に登録されている（登録番号：ＡＢ０８４８１２）。その塩基配列をもとに、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩの制限酵素サイトを付したプライマーを設計した（フォワードプライマー；　５’−ＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＴＴＴＣＡＡＡ−３’（配列番号４）、リバースプライマー；　５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＣＣＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡ−３’（配列番号５））。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ストレプトコッカス・アンジノサス　ＦＷ７３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法にてＬ−システイン分解酵素をコードする約１．２　ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。以上のＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）　を用いて未反応のｄＮＴＰおよびプライマーを除去した。発現ベクターとして、Ｎ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ　（ＧＳＴ）をコードする遺伝子および　プレサイション　プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ）切断部位を含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１　（Ａｍａｒｓｈａｍ）を用いた。得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断した後に、同様にＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、脱リン酸化処理した発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−Ｉと等モルずつライゲーションした。こうして得られたプラスミドをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）ＢＬ２１株に形質導入した。本プラスミドはｐＭＩＬＣＤ１１０と名付けた。
【００６４】
（３）組換えＬ−システイン分解酵素の精製
組換えＬ−システイン分解酵素の精製にはＲｅｄｉＰａｃｋ　ＧＳＴ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｍｏｄｕｌｅ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　を用い、操作はキットに添付されている指示書にしたがって行った。まず、ＢＬ２１株にｐＭＩＬＣＤ１１０を導入した形質転換株を、１００　μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む　２　×ＹＴ培地を用いて３７°Ｃで培養し、この菌液が５５０　ｎｍでの吸光度約１．０　に達した時点でＩＰＴＧを１　ｍＭになるように加え、さらに３７°Ｃで１．５時間培養した。その後、培養液を４°Ｃ、６，０００×ｇで１０分間遠心して集菌した。この菌体を１　ｇ　（湿重量）　あたり２−５　ｍｌの氷冷したＰＢＳ　（１４０　ｍＭ　ＮａＣｌ、２．７　ｍＭ　ＫＣｌ、１０　ｍＭ　Ｋ２ＨＮＯ３、１．８　ｍＭ　ＫＨ２ＮＯ３；　ｐＨ　７．３）　で懸濁し、超音波破砕機　（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ　Ｉｎｃ．，　ＵＳＡ）　を用いて、氷上にて冷却しながら出力３０％、パルス幅０．５秒で３０秒の菌体破砕を、冷却のため６０秒の休止をおきながら合計５回行った。菌体破砕液は４°Ｃ、１２，０００×ｇで３０分間遠心して上清を回収した。次に、グルタチオン　セファロース（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４Ｂの入ったカラムを氷冷したＰＢＳ　６００　μｌで平衡化した後、６００　μｌの菌体破砕液上清を加え、４°Ｃ、３，０００×ｇで１分間遠心してカラムに吸着させた。このカラムを６００　μｌの氷冷したＰＢＳで３回洗浄したのち、６００　μｌの氷冷したプレサイションクリベージバッファー（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒ）　（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；　ｐＨ　７．０）　で２回洗浄した。これに１８０　μｌのプレサイションクリベージバッファー（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒ）および１０　μｌのプレサイションプロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ））　を加え、４°Ｃで一晩ＧＳＴ融合タンパクを消化した後に、カラムを４°Ｃ、３，０００×ｇで１分間遠心して精製し、Ｌ−システイン分解酵素であるＬ−システインデスルフヒドラーゼ（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｄｅｓｕｌｆｈｙｄｒａｓｅ）を得た。
【００６５】
実施例１
上記酵素製造例で得られたＬ−システイン分解酵素、及び、電子供与体として補酵素ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母製）を用いて、以下に示すＬ−システイン定量用試薬を作成した。
【００６６】
試薬組成：
＜第１試薬＞
５０ｍＭ：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．１２ｍＭ：ＮＡＤＨ
６０Ｕ／ｍｌ　：Ｄ−乳酸脱水素酵素（東洋紡績社製）
＜第２試薬＞
５０ｍＭ：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．０６ｍＭ：ピリドキサル−５’−リン酸
０．０２２ｍｇ／ｍｌ：Ｌ−システイン分解酵素
そして、この試薬を用いて、以下に示すようにして、各種濃度（０．１〜１．０ｍＭ）のＬ−システイン溶液を測定した。
【００６７】
各濃度のＬ−システイン溶液各１０μｌに対し、第１試薬０．２５ｍｌを添加して３７℃で５分反応させ、次に第２試薬０．０５ｍｌを添加して３７℃で５分反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度を１２秒毎に測定して、生成されたピルビン酸の定量を行った。これらの操作は、日立７１５０形自動分析装置により行った。水及びＬ−システイン溶液を試料として用いた際のタイムコースを図１に示す。
【００６８】
１２秒毎の測定を１ポイントとし、５０ポイントの値より２６ポイントの値を引くことで、測定値を求めた。その結果を図２に示す。
【００６９】
図２から明らかなように、Ｌ−システイン濃度０〜１ｍＭまで、直線的な吸光度変化の上昇が得られた。得られた直線の関係は、ｙ＝１４５ｘ、ｒ２＝０．９９９（ここで、ｙは吸光度変化、ｘはシステイン濃度、ｒは相関係数）であって、正確なＬ−システインの定量が可能であることが分かった。
【００７０】
実施例２
上記酵素製造例で得られたＬ−システイン分解酵素、及び、電子供与体として補酵素ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母製）を用いて、以下に示すＬ−システイン定量用試薬を作成した。
【００７１】
試薬組成：
＜第１試薬＞
５０ｍＭ：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．１２ｍＭ：ＮＡＤＨ
６０Ｕ／ｍｌ　：Ｄ−乳酸脱水素酵素（東洋紡績社製）
＜第２試薬＞
５０ｍＭ：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．０６ｍＭ：ピリドキサル−５’−リン酸
０．００８７ｍｇ／ｍｌ：Ｌ−システイン分解酵素
そして、この試薬を用いて、以下に示すようにして各種濃度（１〜１０ｍＭ）のＬ−システイン溶液を測定した。
【００７２】
各濃度のＬ−システイン溶液各１０μｌに対し、第１試薬０．２５ｍｌを添加して３７℃で５分反応させ、次に第２試薬０．０５ｍｌを添加して３７℃で５分反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度変化を１２秒毎に測定し、レイトアッセイ（反応速度の測定）を実施した。測定結果は時間あたりの吸光度変化として表した。これらの操作は、日立７１５０形自動分析装置により行った。その結果を図３に示す。
【００７３】
図３から明らかなように、Ｌ−システイン濃度０〜１０ｍＭまで、直線的な吸光度変化の上昇が得られた。得られた直線の関係式は、ｙ＝４５．５ｘ、ｒ２＝０．９９６（ここで、ｙは時間あたりの吸光度変化、ｘはシステイン濃度、ｒは相関係数）であって、正確なＬ−システインの定量が可能であることが分かった。
【００７４】
実施例３
上記酵素製造例で得られたＬ−システイン分解酵素を用いて、以下に示すＬ−システイン定量用試薬を作成した。
【００７５】
試薬組成：
５０ｍＭ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
３Ｕ／ｍｌ：ピルビン酸酸化酵素（東洋紡績社製）
５Ｕ／ｍｌ：ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）
０．５ｍＭ：チアミンピロリン酸
０．０１ｍＭ：ＦＡＤ
１０ｍＭ：硫酸マグネシウム
０．５ｍＭ：４−アミノアンチピリン
０．６ｍＭ：色原体ＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン）
０．０１ｍＭ：ピリドキサル−５’−リン酸
０．００９ｍｇ／ｍｌ：Ｌ−システイン分解酵素
そして、この試薬を用いて、以下に示すようにして各種濃度（１〜６ｍＭ）のＬ−システイン溶液を測定した。
【００７６】
各濃度のＬ−システイン溶液各１０μｌに対し、試薬０．３ｍｌを添加して３７℃で１０分反応させ、１０分後の波長５４６ｎｍの吸光度変化を測定し、生成されたピルビン酸の定量を行った。
【００７７】
これらの操作は、日立７１５０形自動分析装置により行った。その結果を下記表１に示す。
【００７８】
2004105057.tif 000003
表１の結果から明らかなように、Ｌ−システイン濃度の増加に従って、吸光度変化の上昇が得られ、Ｌ−システインの定量が可能であることが分かった。
【００７９】
【発明の効果】
このように、本発明によれば、Ｌ−システインを含む試料にＬ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させることにより、Ｌ−システイン分解酵素が、Ｌ−システインに直接作用して、生成されたいずれかの化合物を測定することにより、正確なＬ−システインの定量が可能となる。本発明により、安価であり、正確かつ簡便なＬ−システインの測定方法及び測定用試薬が提供される。また、本発明においては、主に関与する酵素は、Ｌ−システイン分解酵素のみであることから、複雑な酵素共役系を介することなく、簡便に、安価に、かつ正確にＬ−システインを定量することが可能となる。更に、汎用の自動分析装置を用いて多数の検体処理を行うことも可能となる。
【００８０】
【配列表】
2004105057.tif 000004
2004105057.tif 000005
2004105057.tif 000006
2004105057.tif 000007
2004105057.tif 000008
2004105057.tif 000009
2004105057.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明によるＬ−システイン測定のタイムコースを示す。図中の●◆▲は、それぞれ、Ｌ−システイン溶液のＬ−システイン濃度が０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭである時の結果を示す。
【図２】図２は、本発明によるＬ−システイン測定の結果を示す。
【図３】図３は、本発明によるＬ−システイン測定の結果を示す。
【図１】
2004105057.tif 000011
【図２】
2004105057.tif 000012
【図３】
2004105057.tif 000013