(57)【要約】【課題】原発性大腸癌手術後の転移及び再発の選択的な選別を可能とする検査法の開発。【解決手段】手術後の患者より採取したリンパ節組織を間接免疫ペルオキシダーゼ法を用いてリンパ節組織中に浮遊した潜在性悪性細胞をサイトケラチン免疫組織化学染色し、次いでこのリンパ節組織中の染色された浮遊潜在性悪性細胞の数をカウントし、原発性大腸癌手術後の転移及び再発を選別する検査方法。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
手術後の患者より採取したリンパ節組織を間接免疫ペルオキシダーゼ法を用いてリンパ節組織中に浮遊した潜在性悪性細胞をサイトケラチン免疫組織化学染色し、次いでこのリンパ節組織中の染色された浮遊潜在性悪性細胞の数をカウントして原発性大腸癌手術後の転移及び再発を選別する検査方法。
【請求項２】
無作為にサンプリングした癌細胞を認めない１０個の病期Ｉ，ＩＩ又はＩＩＩ  のリンパ節組織のうち、サイトケラチン免疫組織化学染色で染色された浮遊潜在悪性細胞の数が合計５個又はそれ以上を転移・再発高危険群とし、合計４個又はそれ以下を転移・再発低危険群と選別する請求項１に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は原発性大腸癌の手術後の転移及び再発の選択的な選別を可能とする検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、我が国における原発性大腸癌の治療成績は、手術的治療に加え化学療法や放射線療法などの補助療法の発達と共に、著しく改善されてきている。例えばリンパ節転移を伴わないＤｕｋｅｓ’Ｂ（又は病期ＩＩ）の症例の根治治癒切除症例では、５年生存率は約８０％と良好であるが、リンパ節転移を伴うＤｕｋｅｓ’Ｃ（又は病期ＩＩＩ）の症例の根治治癒切除症例では、５年生存率は直腸癌で約６０％と著しく低くなっている。即ち根治治癒切除症例でも、約３０〜４０％は転移・再発を生じ、生命予後（手術後の生存率）を脅かすことになるのが現状である。
【０００３】
一般的に原発性大腸癌の致命的死因は肝転移と肺転移であるが、現在までのところ、生命予後に対する臨床的指標としては、手術時のリンパ節転移の有無と腫瘍マーカーの値に依存するところが極めて大きい。しかし、これらの情報からは、手術後、癌が転移・再発しやすい症例かどうかを全く選別できず、一律の病期分類別治療を行っているのが現状である。
【０００４】
このため本発明者は、根治治癒切除症例の手術後の再発高危険群をより正確に選別できるか否かにつき検討を行ってきた。原発性大腸癌の転移・再発には何が一番重要な規定因子であるかを検索するため、サイトケラチン免疫組織化学染色を用いて微小リンパ節転移の検索を行ってきた。従来微小リンパ節転移の有無は、Ｄｕｋｅｓ’Ｃ症例として病期分類されるが生命予後には反映しないという報告がほとんどであった（例えば、非特許文献１及び２参照）。これらの報告はリンパ節内に生着した癌細胞及び／又は癌病巣を免疫組織化学染色で定性的に（＋）又は（−）で判定したものであった。
【０００５】
前述の如く、現在までのところ、微小リンパ節転移は、患者の生存率には関与しないという報告が多く認められ、生存率に関与するという報告は少ない。しかし、これらの報告はいずれも微小リンパ節転移の検索としてリンパ節に生着した癌細胞及び／又は癌病巣の有無をその判定法として、染色性を（＋）、（−）による定性的に評価したものがほとんどであった。リンパ節洞中に浮遊した潜在性悪性細胞が存在するという報告も認められるが、本発明者らのように、その浮遊潜在性悪性細胞の細胞数を具体的にカウントしてその臨床的意義を提唱した報告は認められない。リンパ節転移を伴わない原発性大腸癌Ｄｕｋｅｓ’Ｂ症例には、一般的な根拠から抗癌剤を静脈投与しないことが多い。しかし、もしＤｕｋｅｓ’Ｂ症例の転移・再発症例を手術後早期に再発する高危険群として選別可能であれば、より積極的にＤｕｋｅｓ’Ｃ症例に対して施行している第一選択化学療法である、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）及びロイコボリン（ＬＶ）の組合せ療法を施した方がＤｕｋｅｓ’Ｂ症例の再発例を減らし、生存率に大きく貢献できると考えられる。一方、Ｄｕｋｅｓ’Ｃ症例には手術後補助化学療法及び／又は放射線治療等の併用療法を施行することが第一選択療法となっているが、Ｄｕｋｅｓ’Ｃ症例の再発高危険群に対しては更に強力な組合せ療法又は放射線療法が必要であると考えられる。反対にＤｕｋｅｓ’Ｃ症例の再発低危険群に対しては前記した手術後の併用補助化学療法が不必要であったり、又は強力過ぎたりする例が含まれているおそれがある。
【０００６】
【非特許文献１】
Ａ．Ｏｂｅｒｇ他、Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ４１，１２４４−１２４９，１９９８
【非特許文献２】
Ｒ．Ｂｒｏｌｌ他、Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ４０，１４６５−１４７１，１９９７
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は原発性大腸癌の手術後の転移及び再発の選択的な選別を可能とする検査方法を開発することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明に従えば、手術後の患者より採取したリンパ節組織を間接免疫ペルオキシダーゼ法を用いてリンパ節組織中に浮遊した潜在性悪性細胞をサイトケラチン免疫組織化学染色し、次いでこのリンパ節組織中の染色された浮遊潜在性悪性細胞の数をカウントして原発性大腸癌手術後の転移及び再発を選別する検査方法が提供される。
【０００９】
本発明に従って、前記原発性大腸癌手術後の転移・再発を選別するにあたって、無作為にサンプリングした癌細胞を認めない１０個の病期Ｉ，ＩＩ又はＩＩＩ  のリンパ節組織のうちサイトケラチン免疫組織化学染色で染色された浮遊潜在悪性細胞の数が合計５個又はそれ以上を転移・再発高危険群とし、合計４個又はそれ以下を転移・再発低危険群と選別することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、前述の如く、原発性大腸癌の手術後の転移・再発には何が一番重要な規定因子であるのかを検索するため、サイトケラチン免疫組織化学染色を用いて微小リンパ節転移の病理組織学的検索と臨床データの対比検討を行ってきた。
【００１１】
本発明者らはリンパ節辺縁内のリンパ節洞に浮遊した浮遊潜在性悪性細胞に着目し、その生命予後の指標としての有用性につき検討を行った。その結果、Ｄｕｋｅｓ’Ｂ症例の再発群もＤｕｋｅｓ’Ｃ症例の再発群も共にリンパ節洞に浮遊した潜在性悪性細胞が有意に多く認められ、これらの浮遊細胞数が癌の転移・再発のエネルギー力に深く関連していることを見出した。なおリンパ節の浮遊潜在性悪性細胞の数を具体的にカウントした報告は現在まで全く認められず、ましてそれによって原発性大腸癌の転移・再発の危険性の有無を選別できるようになるなどといったことは全く触れられていない。本発明者は、主病巣から離れたリンパ節の微小循環内に流入した浮遊細胞数の残存数を切除標本内でカウントし、さらに転移・再発群ではこれらの細胞数が明らかに増加していることを認め、癌の転移・再発、特に他臓器への遠隔転移の主原因ではないかと考え、本発明に至った。
【００１２】
本発明に従えば、原発性大腸癌の特にＤｕｋｅｓ’Ｂ＆Ｃ症例を手術後早期に再発高危険群と再発低危険群とに選別し、より個別化した集中化学療法を施すことができ、従って再発高危険群の生存率を改善し、そして大腸癌治療の全生存率に大きく貢献し真の生存率益が得られるものと考えられる。即ち、本発明によれば、リンパ節のサイトケラチン免疫組織化学染色を用いてリンパ節洞に浮遊した潜在性悪性細胞の数を具体的にカウントし、再発高危険群をより正確に決定できるものである。
【００１３】
本発明で使用するリンパ節のサイトケラチン化学染色方法は、免疫組織化学の技法の一つである抗原抗体の特異的反応を基礎とした酵素抗体法を用いて、例えば従来から既に確立されている間接免疫ペルオキシダーゼ法を用いて実施することができる。手術後の患者より採取したリンパ節から従来のヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色で癌細胞が存在しないと判断されたリンパ節組織計１０個を無作為に抽出し、各々連続切片でＨＥ染色、ケラチン−エーイーワン／エーイースリー（ＡＥ１／ＡＥ３）抗体、ケラチン−キャム（ＣＡＭ）５．２抗体につき染色陽性率を求め、かつ浮遊している染色潜在性悪性細胞の数をカウントする。ＨＥ染色によりリンパ節内に生着した癌細胞及び／又は癌病巣を除き、リンパ節洞に浮遊している染色潜在性悪性細胞を、例えば光学顕微鏡にて検索する。サイトケラチンによる免疫組織化学染色性は、（＋）（サイトケラチン陽性細胞１個以上）と（−）（陰性）で判定し、さらに染色陽性細胞数を各々カウントし、計１０個のリンパ節組織サンプル内にケラチン−ＡＥ１／ＡＥ３又はケラチン−ＣＡＭ５．２のいずれかを用いる方法で合計５個又はそれ以上の潜在性悪性細胞を認めた場合に再発高危険群であると判定し、合計４個又はそれ以下の場合には再発低危険群であると判定する。
【００１４】
以上、サイトケラチン免疫組織化学染色に用いる抗体としてＡＥ１／ＡＥ３抗体及びＣＡＭ５．２抗体について説明したが、この目的のために従来から知られている任意の抗体を用いることができ、そのような抗体のうち、市販のサイトケラチンモノクローナル抗体として、例えば以下のものがあげられる。
３４βＢ４；ＡＥ５；６Ｂ１０；ＬＨＫ６Ｂ；ＣＫ７，ＬＤＳ−６８，ＬＰ５Ｋ，ＯＶ−ＴＬ１２／３０，Ｃ−１８，Ｃ−３５，Ｃ−４６，ＫＳ７．１８；３５βＨ１１，ＫＭ１９５，Ｍ２０，４．１．１８，ＴＳ１，ＬＰ３Ｋ，Ｃ０５１；ＤＥ−Ｋ１０，ＳＢ４，ＬＨ１／２／３，ＬＨＰ１；ＡＥ８，ＫＳ１３．１，ＫＳ−１Ａ３；ＣＫＢ１，ＬＬ００２；ＬＨＫ１５；ＬＬ０２５；Ｅ３；ＣＫ５，ＬＥ６５，ＫＳ１８．１８，ＫＳ１８．８，ＫＳ１８．０４Ｂ１８，ＫＳＢ１７．２，ＣＹ−９０，ＲＣＫ１０６，ＤＣ−１０，ＤＡ７，Ｃ−５１，Ｋ９１８．０４；ＬＰ２Ｋ，ＫＳ１９．１，ＲＣＫ１０８，ＢＡ１７，１７０．２．１４、Ａ５３Ｂ／Ａ２；Ｋｓ２０．８；ＣＫ６；ＡＥ３；ＡＥ２；ＰＣＫ−２６；３４βＥ１２；ＫＳ８．６０；Ｃ−１１；Ｄ５／１６Ｂ４；ＲＣＫ１０２，ＳＢ２；ＤＥ−Ｋ（ＢＣ）；Ｃ−５０；５Ｄ３／ＬＰ３４；ＭＮＦ１１６；ＬＰ３４；ＬＤＳ２３．６５．６８；Ｃ４６；ＰＫＫ２；ＵＣＤ／ＰＲ−１０．１１，６Ｄ７＋３Ｆ３；ＰＲ−１０．１１＆ＫＡ；ＰＫＫ１，ＮＣＬ−５Ｄ３，ＳＢ３，２Ａ４，５ＤＳ，５Ｄ３；ＫＬ１；ＤＥ−Ｋ１３；ＡＥ１，ＫＡ−４；ＬＥ６４；Ｌｕ５，ＺＫＳ３，Ｃ−１１／ＰＣＫ−２６／ＣＹ−９０／Ｋｓ−１Ａ３／Ｍ２０／Ａ５３−Ｂ／Ａ２，ＡＥＬ／ＫＳ２，ＡＥ１／ＡＥ３／ＫＳ１，Ｆ１２−１９，ＵＣＤ／ＰＲ１０．１１＋ＫＡ−４，５Ｄ３／ＬＰ３４．
【００１５】
リンパ節のサイトケラチン染色方法は、典型的には従来から用いられている間接免疫ペルオキシダーゼ法を用いることができる。その一例をあげれば、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックよりリンパ節組織の最大割面を用い、３μｍの薄切切片を作製する。この切片を脱パラフィン後、例えば１０ｍＭ塩化カルシウムのトリプシン溶液中で、酵素処理を行い、過酸化水素メタノール溶液中で室温で内因性ペルオキシダーゼをブロックし、次いでリン酸塩緩衝生理水にて洗浄する。その後、正常羊血清を反応させ、一次抗体を反応させる。抗体は、モノクローナル  抗サイトケラチン抗体を使用する。リン酸塩緩衝生理水で洗浄後抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として３０分間反応させ、リン酸塩緩衝生理水で洗浄後Ｈ２  Ｏ２  添加後、テトラヒドロクロライドを基質として発色させ、ヘマトキシリン、で核染後、脱水封入を行う。この方法は比較的簡単且つ容易であり安定した染色方法である。このようにして染色された浮遊潜在性悪性細胞の数を光学顕微鏡で目視カウントする。
【００１６】
上記の本発明による判定方法を使用することにより主としてＤｕｋｅｓ’Ｂ＆Ｃ症例における再発高危険群に対し、より個別化した集中化学療法が可能になり、その結果、再発高危険群の生存率を改善することができ、大腸癌治療の全生存率に大きく貢献し、真の生存率益が得られるものである。また、本発明の判定法は肺癌、乳癌、食道癌、胃癌などの他のリンパ節転移を生じやすい癌において広く臨床応用が可能であると考えられ、あらゆる癌に対する予後因子としての対応性が期待される。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に従って、更に具体的に説明するが、本発明の範囲を以下の実施例に限定するものでないことはいうまでもない。
【００１８】
例１（Ｄｕｋｅｓ’Ａ症例）
Ｄｕｋｅｓ’Ａ（病期Ｉ）症例の手術後のリンパ節組織（１２０個のリンパ節）について、従来のＨＥ染色及び間接免疫ペルオキシダーゼ法を用いてリンパ節組織中に浮遊した潜在性悪性細胞を従来から用いられている間接免疫ペルオキシダーゼ法を用いてサイトケラチン染色した。
【００１９】
ＨＥ染色
病理組織学において最も一般的に用いられている染色法に準じ、先ずパラフィン包埋されたリンパ節試料をキシレンで脱パラフィンし、アルコールで脱キシレン後、水洗した。次にヘマトキシリン液（メルク社製、市販）で５分間染色後、湯水（約６０℃）で５分間、核の色出しをする。次にエオジン液（和光純薬工業（株）、市販）で２分間染色後、水洗しアルコールでエオジンの分別及び脱水し、キシレンで透徹した。これにより核はヘマトキシリンで紫藍色、細胞質および各種組織はエオジンで赤染される。
【００２０】
サイトケラチン染色
ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックよりリンパ節組織の最大割面を用い、３μｍの薄切切片を作製し、この各切片を脱パラフィン後、１０ｍＭ塩化カルシウム入りの０．１％  トリプシン溶液中で、３７℃で３０分間酵素処理（ペルオキシダーゼ：和光純薬（株））を行った。０．３％過酸化水素メタノール、室温３０分間で内因性ペルオキシダーゼをブロックし、次いで０．０１Ｍ  リン酸塩緩衝生理水にて洗浄した。その後、一次抗体を一夜反応させた。使用した抗体は、モノクローナル  抗サイトケラチン抗体（ＣＡＭ５．２，ＡＥ１：ＡＥ３；富士化学工業（株））を使用する。０．０１Ｍ  リン酸塩緩衝生理水で洗浄後抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐ．，ラベルしたペルオキシダーゼ、米国）を二次抗体として３０分間反応させ、０．０１Ｍ  リン酸塩緩衝生理水で洗浄後Ｈ２  Ｏ２  −添加  シアノベンジン  テトラヒドロクロリド、（武藤化学工業（株））を基質として発色させ、ヘストキシリンで核染後、脱水封入を行った。この方法で比較的簡単且つ容易に安定した染色が得られる。
【００２１】
得られた染色細胞を光学顕微鏡（２００倍：オリンパス製）で目視カウントした結果を表Ｉに示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
表Ｉには再発群及び無再発群（術後５年以上生存）についてＨＥ染色による陽性（＋）及び陰性（−）を求め、カイニ乗検定した結果ならびにサイトケラチン染色による染色個数について平均値、標準偏差（ＳＤ）及び中央値を求めＵ検定した結果を示す。
Ｄｕｋｅｓ’Ａの症例では個数が少ないためもあってか、表Ｉに示す通り有意な検定結果が得られなかった。
【００２４】
例２（Ｄｕｋｅｓ’Ｂ症例）
Ｄｕｋｅｓ’Ｂ（病期ＩＩ）症例（３４０個のリンパ節）について例１の方法と同様にしてＨＥ染色及びサイトケラチン染色を行なった。結果は表ＩＩに示す通りであり、表ＩＩの結果から明らかなように再発群及び無再発群（術後５年以上）について有意な検定結果が得られた。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
例３（Ｄｕｋｅｓ’Ｃ症例）
Ｄｕｋｅｓ’Ｃ（病期ＩＩＩ）症例（６４０個のリンパ節）について例１及び２と同様にしてＨＥ染色及びサイトケラチン染色を行なった。結果は表ＩＩＩ  に示す通りであり、再発群及び無再発群（術後５年以上）について有意な検定結果が得られた。
【００２７】
【表３】
2004184110.tif 000005
【００２８】
【発明の効果】
本発明に従えば、原発性大腸癌の手術後の転移及び再発を、採取したリンパ節洞の間接免疫ペルオキシダーゼ法でサイトケラチン免疫組織化学染色する染色試験法により、高い確率で再発高危険群と再発低危険群とに選別することができるので、患者に対する手術後の治療をより適確に個別化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のＨ．Ｅ．法で染色したリンパ節組織の図面に代る光学顕微鏡写真（倍率：２００倍）である。
【図２】本発明に従って間接免疫ペルオキシダーゼ法を用いて免疫特殊染色した同じリンパ節組織の図面に代る光学顕微鏡写真（倍率：２００倍）であり、図１では認められなかった浮遊潜在性悪性細胞（矢印参照）が顕著に認められる。実際の写真はカラーで、この細胞は褐色に染色されており、カウントを極めて容易に行なうことができる。
【図１】
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【図２】
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