(57)【要約】【課題】霊長類動物の造血系細胞、分化細胞等の供給のための技術を提供すること。【解決手段】霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、ついで、出生したヒツジ胎仔から霊長類動物の造血系細胞を得る、霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法；マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持し、得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させ、出生した胎仔より、該霊長類動物の胚性幹細胞から分化した霊長類動物の造血系細胞を分離する、霊長類動物の造血系細胞の製造方法；該製造方法により得られる造血系細胞；並びに霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植する、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、ついで、出生したヒツジ胎仔から霊長類動物の造血系細胞を得ることを特徴とする、霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法。
【請求項２】
（Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、
を含む、請求項１記載の分化方法。
【請求項３】
ステップ（Ｉ）において、骨形成タンパク質−４の存在下、フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持する、請求項２記載の分化方法。
【請求項４】
（Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、及び
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で出生した胎仔より、該霊長類動物の胚性幹細胞から分化した霊長類動物の造血系細胞を分離するステップ
を含む、霊長類動物の造血系細胞の製造方法。
【請求項５】
請求項４記載の製造方法により得られる造血系細胞。
【請求項６】
霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植することを特徴とする、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、霊長類動物の造血系細胞、分化細胞等の供給のための技術に関する。より詳しくは、本発明は、霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法、該分化方法により得られる造血系細胞、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法、霊長類動物の分化細胞を生産するキメラヒツジの作製方法、並びに霊長類動物の分化細胞の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
再生不良性白血病等の疾患の患者に対して、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血幹細胞移植等に代表される造血幹細胞移植を行ない、患者の体内において、血液細胞を産生させることが行なわれている。
【０００３】
しかしながら、前記造血幹細胞移植においては、移植対象の患者に適合する造血幹細胞の安定供給が困難であること、造血幹細胞の採取の際、ドナーに体力的又は肉体的にダメージを与える場合があること等の欠点がある。
【０００４】
そこで、造血幹細胞の安定供給を図るため、ブタ胎仔に経子宮的にヒト造血幹細胞に移植し、ブタ体内で造血前駆細胞を増幅させることが試みられている（非特許文献１）。
【０００５】
一方、機能障害を有する組織や臓器の機能回復、修復、再生等を目的とする再生医療への応用のため、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞ともいう）の分化について、イン・ビトロでの研究が行なわれている。
【０００６】
胚性幹細胞から血液細胞へのイン・ビトロでの分化の試みの例として、造血幹細胞の自己再生に関連するホメオティックセレクター遺伝子であるＨｏｘＢ４を導入したマウスＥＳ細胞から、最終造血幹細胞の表現型を示す細胞へ分化させること（非特許文献２）、ＯＰ９ストロマ細胞を利用して、マウスＥＳ細胞から、造血前駆細胞と推定される細胞へ分化させること（非特許文献３、非特許文献４）、アカゲザルＥＳ細胞を、マウスＳ１７ストロマ細胞上で培養して、造血幹細胞に分化させること（非特許文献５）、マウスＥＳ細胞から造血前駆細胞へ分化させること（非特許文献６）が挙げられる。
【０００７】
また、前記非特許文献５には、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）存在下で、アカゲザルＥＳ細胞を培養することにより、ＢＭＰ−４非存在下の場合に比べ、造血幹細胞の分化が１５倍に増加することが開示されている。さらに、前記非特許文献６には、ＢＭＰ−４存在下で、マウスＥＳ細胞を培養することにより、ＢＭＰ−４非存在下の場合に比べ、造血前駆細胞の分化が増加することが開示されている。
【０００８】
しかしながら、一般的に、発生の初期に出現する細胞（神経細胞、心筋細胞、胎児造血細胞等）については、イン・ビトロでの分化に比べ、造血幹細胞、肝細胞、膵臓β細胞等の発生の後期に「場」誘導的に出現する細胞は、前記ＥＳ細胞からの分化が困難であるという欠点がある。
【０００９】
また、非特許文献２に記載の分化方法では、ＥＳ細胞に、造血幹細胞の自己再生に関連するＨｏｘＢ４を導入されたＥＳ細胞が用いられるため、得られた造血幹細胞の適用範囲が限定される場合があるという欠点がある。
【００１０】
さらに、非特許文献３及び４に記載の分化方法では、ＯＰ９ストロマ細胞が用いられるため、実際には、卵黄嚢造血（一次造血）が再現されるにとどまるものと考えられ、造血系を再構築しうる造血幹細胞の分化の誘導は困難であるという欠点がある。
【００１１】
【非特許文献１】
中内啓光、他１名、“３．ヒト血液キメラブタの樹立とその応用”、「第１１７回日本医学会シンポジウム記録集  幹細胞と細胞療法−［ＩＩＩ］組織・器官幹細胞：臨床応用への基盤開発（２）  ２０００年８月４日〜６日開催、ｐ９９−１０６  ［ｏｎｌｉｎｅ］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ．ｏｒ．ｊｐ／ｊａｍｓ／ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ／ｋｉｒｏｋｕ／１１７／ｐｄｆ／１１７０９９．ｐｄｆ＞
【非特許文献２】
マイケル  カイバ（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｋｙｂａ）ら、Ｃｅｌｌ、第１０９巻、２００２年４月５日発行、ｐ２９−３７
【非特許文献３】
仲野徹著、“５．胚性幹細胞からの血液細胞への分化”、横田崇ら編、実験医学  増刊「幹細胞研究の最前線と再生医療への応用  発生・分化メカニズムの解明、そして臨床へ」  ２００１年９月２５日発行、第１９巻、第１５号、ｐ１９６６−１９７１
【非特許文献４】
仲野徹（Ｔｏｒｕ  Ｎａｋａｎｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６５巻、１９９４年８月１９日、ｐ１０９８−１１０１
【非特許文献５】
フェイ  リ（Ｆｅｉ  Ｌｉ）ら、Ｂｌｏｏｄ、第９８巻、２００１年７月１５日発行、ｐ３３５−３４２
【非特許文献６】
ブリット  エム．ヨハンソン（Ｂｒｉｔｔ  Ｍ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻、第１号、１９９５年１月発行、ｐ１４１−１５１
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、霊長類の造血系細胞を安定に供給すること、霊長類動物の胚性幹細胞への外来遺伝子の導入等の遺伝子工学的操作を行なうことなく、該霊長類動物の胚性幹細胞を造血系細胞に分化させること等の少なくとも１つを可能にする、霊長類動物の胚性幹細胞からの造血系細胞への分化方法を提供することを目的とする。また、本発明は、霊長類の造血系細胞を安定に供給すること、霊長類の造血系細胞を大量に供給すること、霊長類動物の輸血用血小板を安定に供給すること、霊長類動物の移植用のＣＤ３４＋細胞を安定に供給すること等の少なくとも１つを可能にする、霊長類動物の造血系細胞の製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記製造方法により得られた造血系細胞を提供することを目的とする。また、本発明は、霊長類の造血系細胞を安定に供給することができる、キメラヒツジの作製方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、ついで、出生したヒツジ胎仔から霊長類動物の造血系細胞を得ることを特徴とする、霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法、
〔２〕  （Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、
を含む、前記〔１〕記載の分化方法、
〔３〕  ステップ（Ｉ）において、骨形成タンパク質−４の存在下、フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持する、前記〔２〕記載の分化方法、
〔４〕  （Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、及び
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で出生した胎仔より、該霊長類動物の胚性幹細胞から分化した霊長類動物の造血系細胞を分離するステップ
を含む、霊長類動物の造血系細胞の製造方法、
〔５〕  前記〔４〕記載の製造方法により得られる造血系細胞、並びに
〔６〕  霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植することを特徴とする、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法、
に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導条件で処理し、得られた細胞を、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔に移植することにより、出生後のヒツジ胎仔が、本質的にサル由来の造血系細胞を産生するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００１５】
本発明の霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、ついで、生まれたヒツジ胎仔から霊長類動物の造血系細胞を得ることを特徴とする方法である。
【００１６】
本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件（以下、造血系分化誘導条件ともいう）で維持することに１つの大きな特徴がある。
【００１７】
本発明の分化方法においては、霊長類動物の胚性幹細胞を、前記造血系分化誘導条件に維持するため、未分化胚性幹細胞をそのまま移植しても、該未分化胚性幹細胞から造血系細胞への分化が実質的に起こらないにもかかわらず、驚くべく、該霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞に分化させることができるという優れた効果を発揮する。
【００１８】
また、本発明の分化方法においては、霊長類動物の胚性幹細胞が、前記造血系分化誘導条件に維持されるため、該霊長類動物の胚性幹細胞は、ヒツジ胎仔へ移植された際、該ヒツジ胎仔の体内環境をより有効に利用して、分化することができるという優れた効果を発揮する。
【００１９】
さらに、本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を造血系細胞に分化させるために、該霊長類動物の胚性幹細胞に、分化を惹起する外来遺伝子（例えば、ホメオティックセレクター遺伝子）の導入等の遺伝子工学的操作を施すことが実質的に要求されない点で有利である。したがって、本発明の分化方法は、高度な技術や高価な機械、試薬等を必要とせず、移植用の細胞、組織の供給等に有用である。
【００２０】
また、本発明の分化方法は、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔が用いられることにも１つの大きな特徴がある。
【００２１】
本発明の分化方法は、前記ヒツジ胎仔が用いられているため、霊長類動物の胚性幹細胞を前記造血系分化誘導条件に維持して得られた細胞を、驚くべく、本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞に分化させることができるという優れた効果を発揮する。
【００２２】
また、本発明の分化方法によれば、前記ヒツジ胎仔が用いられているため、霊長類とのキメラ率が高くなるという優れた効果を得ることができる。したがって、本発明の分化方法によれば、より効率よく、ヒツジ体内で、本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞を得ることができるという優れた効果が発揮される。
【００２３】
さらに、本発明の分化方法によれば、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔が用いられているため、出生後に、霊長類動物の胚性幹細胞を、さらに移植することができるという優れた特徴を有する。したがって、本発明の分化方法によれば、本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞を、より効率よく、安定して供給することができる。
【００２４】
本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、前記造血系分化誘導条件に維持して得られた細胞を、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔に移植することにも１つの大きな特徴がある。
【００２５】
本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、前記造血系分化誘導条件に維持して得られた細胞を、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔に移植するため、霊長類動物に由来する造血系細胞を、効率よく、安定して供給することができる。さらに、本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、前記造血系分化誘導条件に維持して得られた細胞を、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔に移植するため、ヒツジに対しては、作用しない霊長類のサイトカインにより、移植された霊長類動物の胚性幹細胞又は本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞を選択的に刺激することができるという優れた効果を発揮する。したがって、霊長類動物に由来する造血系細胞を、より効率よく、安定して供給することができる。
【００２６】
本明細書において、霊長類動物とは、ヒト、サル等をいう。前記サルとしては、例えば、カニクイザル、アカゲザル、ニホンザル、マーモセット等が挙げられる。
【００２７】
本明細書において、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞ともいう）とは、多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞をいう。
【００２８】
本発明の分化方法に用いられる霊長類動物の胚性幹細胞としては、具体的には、例えば、ＣＭＫ６細胞等が挙げられる。
【００２９】
かかる胚性幹細胞は、例えば、フィーダー細胞として、マウス胚繊維芽細胞等の細胞であって、分裂増殖を停止させた細胞を用い、ＥＳ細胞用培地で培養することにより維持及び供給されうる。
【００３０】
前記ＥＳ細胞用培地としては、胚性幹細胞の種類により、該胚性幹細胞に適した培地であればよい。具体的には、例えば、カニクイザル由来胚性幹細胞株ＣＭＫ６の場合、２００ｍｌあたりの組成として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  １６３ｍｌ、ウシ胎仔血清  ３０ｍｌ（最終濃度１５％）、Ｌ−グルタミン  ２ｍｌ（最終濃度２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）  ２ｍｌ、非必須アミノ酸溶液  ２ｍｌ、２−メルカプトエタノール  １ｍｌ（最終濃度０．１ｍＭ）を含む培地が挙げられる。
【００３１】
前記胚性幹細胞の未分化状態の維持及び増殖は、胚性幹細胞の種類により異なるが、例えば、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在等の条件に培養することにより行なわれうる。
【００３２】
また、前記胚性幹細胞の未分化状態の維持及び増殖のための培養条件としては、胚性幹細胞の種類により異なるが、例えば、５％  ＣＯ２の気相で、３６〜３８℃、好ましくは、３７℃で維持すること等が挙げられる。
【００３３】
前記胚性幹細胞の未分化状態の維持及び増殖のために用いられる前記フィーダー細胞は、細胞の種類により異なるが、例えば、Ｄ１０培地等で維持、増殖等を行なうことができる。
【００３４】
前記フィーダー細胞の培養条件は、細胞の種類により異なるが、例えば、５％ＣＯ２の気相で、３６〜３８℃、好ましくは、３７℃で維持すること等が挙げられる。
【００３５】
本明細書において、造血系細胞としては、例えば、造血幹細胞及び該造血幹細胞から分化してできる細胞群、すなわち、赤芽球、骨髄球、巨核球系、リンパ球等の性質を有する細胞が挙げられ、具体的には、赤芽球、骨髄球等が挙げられる。
【００３６】
本発明において、造血系細胞の分化誘導に適した条件、すなわち、造血系分化誘導条件とは、例えば、ＩＶ型コラーゲンの存在下に培養する条件、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ）等の存在下に培養する条件、造血系分化に適したフィーダー細胞上で培養する条件、胚葉体作成後、ディッシュに接着させる条件等の種々の条件及びこれらのいずれかの組み合わせの条件等が挙げられる。
【００３７】
本発明において、「霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞」は、造血コロニー形成能及び表面マーカーの発現を評価した場合、いずれも陰性となる分化段階の細胞である。かかる細胞は、いわゆる中胚葉細胞若しくは該中胚葉細胞の状態、性質等に近い細胞であってもよい。具体的には、カニクイザル由来胚性幹細胞株ＣＭＫ６を造血系細胞の分化誘導に適した条件で約６日間維持して得られた細胞等が挙げられる。
【００３８】
前記造血コロニー形成能は、例えば、後述のコロニーアッセイ等により評価されうる。
【００３９】
前記表面マーカーとしては、ＣＤ４５、ＴＥＲ１１９、α４−インテグリン、ＶＥ−カドヘリン、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、ＣＤ３４、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ｓＩｇＭ、ＣＤ１９等が挙げられる。
【００４０】
造血系分化誘導条件に維持する際に用いられるフィーダー細胞としては、マクロファージ刺激因子を欠損したストロマ細胞株が挙げられ、マクロファージ刺激因子を欠損したマウス骨髄細胞株、マクロファージ刺激因子を欠損したマウス卵黄嚢細胞株等をマイトマイシンＣ処理又はＸ線処理して得られた細胞等が挙げられる。前記マクロファージ刺激因子を欠損したストロマ細胞株としては、ＯＰ９細胞株、前記マウス骨髄細胞株としては、Ｓ１７細胞株〔コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８７年発行、第１３８巻、ｐ１０８２−１０８７〕、前記マウス卵黄嚢細胞株としては、Ｃ１６６細胞株〔ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．、１９９６年発行、第３２巻、ｐ２９２−２９９〕等が挙げられる。
【００４１】
造血系分化誘導条件に維持する際に用いられる前記フィーダー細胞は、例えば、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）を用いて、ゼラチンコートした培養容器に播種すること等により作製されうる。フィーダー細胞は、培養容器を隙間無く覆う程度まで播種すればよい。
【００４２】
前記フィーダー細胞の培養条件は、用いられる細胞の種類により異なるが、ストロマ細胞株ＯＰ９細胞の場合、例えば、５％  ＣＯ２の気相で、好ましくは、３６〜３８℃、特に好ましくは、３７℃で維持すること等が挙げられる。
【００４３】
造血系分化誘導条件に維持する際に用いられるフィーダー細胞は、具体的には、ＯＰ９細胞をフィーダー細胞として用いる場合、
−  ＯＰ９細胞用培地｛例えば、１２５０ｍｌあたりの組成：α−ＭＥＭ〔ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製、カタログ番号：１２０００−０２２〕  ９８０ｍｌ、ウシ胎仔血清  ２５０ｍｌ（最終濃度２０％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）  １０ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン溶液  １０ｍｌ｝で、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養し、
−  培養液内で接着してコンフルエント又はその直前まで生育した細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、
−  洗浄後のディッシュ上の細胞をトリプシンにて処理し、
−  前記ＯＰ９細胞用培地を添加して、細胞を含む培地を回収し、
−  得られた細胞を、前記ＯＰ細胞用培地に、１：４〜５で継代し、
−  ３７℃、５％  ＣＯ２条件下に、コンフルエントになるまで培養し、
−  得られた細胞を、マイトマイシンＣで不活化させ、
−  得られた細胞（例えば、１×１０５細胞／ｍｌ）を、ゼラチンコートした培養ディッシュ上、前記ＯＰ９細胞用培地に播種し、培養すること
により得られうる。
【００４４】
本発明に用いられる妊娠ヒツジは、安全性、例えば、流産を予防する観点から、妊娠後４０日以上、好ましくは、５０日以上、より好ましくは、６０日以上であり、免疫拒絶を減少させ、移植細胞の生着率を十分に得る観点から、妊娠後８５日以下、好ましくは、７５日以下、より好ましくは、６０日以下であることが望ましい。したがって、子宮内の胎仔は、妊娠５０〜８０日であることが望ましい。
【００４５】
本発明の分化方法としては、より具体的には、
（Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、
を含む方法が挙げられる。
【００４６】
前記ステップ（Ｉ）において、霊長類動物の胚性幹細胞は、より分化させるさせる観点から、密度が高くなるように播種することが望ましい。
【００４７】
前記ステップ（Ｉ）において、フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞に応じた培地で培養されることが望ましい。
【００４８】
なお、培養中、培地は、適宜交換すればよい。
【００４９】
また、前記ステップ（Ｉ）において、フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞は、５％  ＣＯ２の気相で、好ましくは、３６〜３８℃、特に好ましくは、３７℃で維持することが望ましい。
【００５０】
具体的には、例えば、カニクイザル胚性幹細胞株ＣＭＫ６の場合、分化用培地〔１００ｍｌあたりの組成：ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）  ８４ｍｌ、８％  ウマ血清  ８ｍｌ、８％  ウシ胎仔血清  ８ｍｌ、５×１０−６Ｍ  ヒドロコルチゾン  ０．１８μｇ、ＢＭＰ−４  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６  １μｇ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ．３リガンド  ２μｇ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ  ２００Ｕ（２Ｕ／ｍｌ）〕  ５ｍｌに懸濁し、得られた細胞懸濁液を、フィーダー細胞上に  ５×１０５細胞に対し、適切量の細胞播種し、その後、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で６日間培養する条件が挙げられる。
【００５１】
前記ステップ（Ｉ）を行なうことにより得られた細胞は、前記「霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞」に該当する。
【００５２】
ステップ（Ｉ）において、より効率よく造血系細胞を得る観点から、好ましくは、前記造血系分化誘導条件に加え、骨形成タンパク質−４の存在下、フィーダー細胞上、白血病阻害因子非存在下に霊長類動物の胚性幹細胞を維持することが望ましい。
【００５３】
前記ステップ（Ｉ）を行なうことにより得られた細胞を、ついで、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させる〔ステップ（ＩＩ）〕。
【００５４】
移植に用いられる細胞は、トリプシンで処理し、例えば、０．１％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩水溶液）に、生着率、キメラ率等を向上させる観点から、例えば、１×１０６細胞以上、好ましくは、１×１０６細胞〜１×１０９細胞、好ましくは、１×１０７細胞〜１×１０９細胞となるように懸濁することにより調製されうる。
【００５５】
ステップ（ＩＩ）において、胎仔への細胞の移植は、例えば、肝臓内、肝実質内、腹腔内、心臓内、臍帯内等に移植用細胞を穿刺注入すること等により行なわれうる。
【００５６】
移植手術は、例えば、
−  妊娠約６０日目の妊娠ヒツジを、予め、移植の１週間〜１０日前に、移植時における飼育環境に慣れさせ、
−  ヒツジ母体を麻酔し、
−  ヒツジを、施術するに適切な体位に固定し、
−  清潔操作で、移植箇所への移植用細胞を容易にするように、種々の手術、例えば、腹腔内又は肝実質内に細胞を移植する場合、下腹部正中切開で開腹後、子宮母体腹腔外に翻転させること
等により行なわれうる。
【００５７】
腹腔内へ細胞を移植する場合、例えば、ヒツジの子宮筋層を切開し、温存したまま露出させた卵膜内にヒツジ胎仔を追い込み、透明な卵膜を通して直視下に胎仔腹腔内に移植用細胞を穿刺注入し、子宮筋層、腹膜筋層、皮膚を層々に縫合閉腹すればよい。また、肝実質内へ細胞を移植する場合、子宮壁上から超音波ガイド下、ヒツジ胎仔の肝実質内に、移植用細胞を穿刺注入し、腹膜筋層、皮膚を層々に縫合閉腹すればよい。
【００５８】
ステップ（ＩＩ）において、移植手術の施術後、妊娠ヒツジは、出生までの間、例えば、通常の飼育と同様の条件下、飼育される。
【００５９】
ステップ（ＩＩ）で得られたヒツジ胎仔が、本質的に霊長類に由来する造血系細胞を産生していることは、ヒツジ胎仔より、適切な組織、例えば、肝臓、骨髄等の組織を採取し、初代培養用の細胞を得、得られた細胞について、（１）  造血コロニーアッセイを行なうこと、（２）  前記（１）で形成された造血コロニーについて、霊長類動物に特異的なマーカー遺伝子の発現を調べることにより、評価されうる。
【００６０】
前記（１）の造血コロニーアッセイは、例えば、
▲１▼  ヒツジ胎仔より、肝臓の組織生検、骨髄等の組織を得、
▲２▼  得られた組織について、トリプシン処理、ＤＮａｓｅＩ処理、溶解処理等の組織に応じた適切な処理を行ない、細胞を得、
▲３▼  得られた細胞を、２％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）−ＩＭＤＭに懸濁して、細胞浮遊液を得、
▲４▼  得られた細胞浮遊液と、ＭｅＣ培地｛例えば、商品名：ＭｅｔｈｏＣｕｌｔＧＦ＋〔ステムセルテクノロジーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、カタログ番号：ＳＴ−０４４３５〕等｝とを混合して、攪拌し、
▲５▼  ついで、得られた細胞を含む培地を、ディッシュの中央に注入し、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で１４日間インキュベーションする
ことにより行なわれる。
【００６１】
また、前記（２）の霊長類動物に特異的なマーカー遺伝子の発現は、造血コロニーアッセイで形成されたコロニーから、慣用の方法でＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡについて、例えば、霊長類動物に特異的なマーカー遺伝子に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション、特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ等により、該遺伝子を検出することにより、評価されうる。
【００６２】
なお、本発明の分化方法においては、前記ステップ（ＩＩ）で得られたヒツジ胎仔に、ステップ（Ｉ）で得られた細胞をさらに移植してもよい。ステップ（Ｉ）で得られた細胞をさらに移植することにより、霊長類の造血系細胞を、効率よく、安定に供給することができる。
【００６３】
また、本発明の分化方法においては、前記ステップ（ＩＩ）で得られたヒツジ胎仔に、霊長類動物に特異的なサイトカイン等を投与してもよい。サイトカインをヒツジ胎仔に投与することにより、ヒツジ胎仔の体内において、本質的に霊長類に由来する造血系細胞への分化を選択的に刺激することが可能になる。
【００６４】
前記サイトカインとしては、幹細胞因子（ＳＣＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、オンコステインＭ（ＯＳＭ）、ｆｌｋ２／ｆｌｋ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ケモカイン、エリスロポエチン、トロンボポエチン等及びこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。
【００６５】
本発明の分化方法により得られる霊長類動物の造血系細胞の評価は、例えば、ＣＤ４５、ＴＥＲ１１９、α４−インテグリン、ＶＥ−カドヘリン、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、ＣＤ３４（幹細胞マーカー）、ＣＤ１３（骨髄球マーカー）、ＣＤ１４（骨髄球マーカー）、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ（巨核球系マーカー）、ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ４（Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ８（Ｔ細胞マーカー）、ｓＩｇＭ（Ｂ細胞マーカー）、ＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）等の発現の有無を指標とすることにより行なわれうる。
【００６６】
本発明の分化方法は、霊長類動物の造血系細胞の製造に用いられる。したがって、本発明により、霊長類動物の造血系細胞の製造方法が提供される。
【００６７】
本発明の霊長類動物の造血系細胞の製造方法は、
（Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、及び
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で出生した胎仔より、該霊長類動物の胚性幹細胞から分化した霊長類動物の造血系細胞を分離するステップ
を含む方法である。
【００６８】
本発明の製造方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系分化誘導条件で維持することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の製造方法によれば、霊長類動物の胚性幹細胞を、前記造血系分化誘導条件に維持するため、未分化胚性幹細胞をそのまま移植しても、該未分化胚性幹細胞から造血系細胞への分化が実質的に起こらないにもかかわらず、驚くべく、該霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞を製造することができるという優れた効果を発揮する。
【００６９】
また、本発明の分化方法においては、霊長類動物の胚性幹細胞が、ヒツジ胎仔へ移植された際、該胚性幹細胞に、該ヒツジ胎仔の体内環境をより有効に利用させることができるため、霊長類動物の造血系細胞を安定に供給することができるという優れた効果を発揮する。
【００７０】
また、本発明の製造方法は、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔が用いられることにも１つの大きな特徴がある。
【００７１】
本発明の製造方法は、前記ヒツジ胎仔が用いられているため、霊長類とのキメラ率が高くなり、それにより、霊長類動物の胚性幹細胞から、霊長類動物の造血系細胞を霊長類の造血系細胞を大量に供給することができるという優れた効果を発揮する。
【００７２】
さらに、本発明の製造方法によれば、出生後に、霊長類胚性幹細胞を、さらに移植することができ、また、ヒツジに対しては、作用しない霊長類のサイトカインにより、移植された霊長類胚性幹細胞又は本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞を選択的に刺激することができるため、本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞を、より効率よく、安定して供給することができる。
【００７３】
また、本発明の製造方法によれば、輸血用血小板、移植用ＣＤ３４＋細胞を、安定して供給することができる。
【００７４】
本発明の製造方法における前記ステップ（Ｉ）及びステップ（ＩＩ）は、本発明の分化方法におけるステップ（Ｉ）及びステップ（ＩＩ）と同様である。
【００７５】
前記ステップ（ＩＩＩ）においては、前記ステップ（ＩＩ）で出生した胎仔より、該霊長類動物の胚性幹細胞から分化した霊長類動物の造血系細胞を分離する。
【００７６】
ステップ（ＩＩＩ）においては、ヒツジ胎仔は、キメラ率の観点から、出生後、できる限り早期の個体であることが望ましい。
【００７７】
また、前記分化方法の場合と同様に、霊長類の造血系細胞を、効率よく、安定に供給する観点から、前記ステップ（ＩＩ）で出生したヒツジ胎仔に、ステップ（Ｉ）で得られた細胞をさらに移植してもよく、霊長類動物に特異的な前記サイトカイン等を投与してもよい。
【００７８】
ステップ（ＩＩＩ）において、霊長類動物の造血系細胞の分離は、例えば、
１）  ヒツジ胎仔から、肝臓、骨髄、血液（末梢血、臍帯血）、胸腺、脾臓等を採取し、
２）  得られた器官から、適切な手法により、細胞群を得、
３）  得られた細胞群から、霊長類動物に由来する造血系細胞を分離すること
等により得られうる。
【００７９】
前記ステップ３）においては、例えば、霊長類動物に特異的なマーカー又は該マーカーに対する抗体等を用いたフロサイトメトリー、イムノビーズを用いる方法等が行なわれる。
【００８０】
前記「霊長類動物に特異的なマーカー」としては、例えば、霊長類に交叉し、ヒツジに交叉しないマーカーであればよく、ＨＬＡ−ＡＢＣ、β２−ミクログロブリン、ＣＤ４５等が挙げられる。
【００８１】
本発明の製造方法により得られる霊長類動物の造血系細胞の評価は、前記分化方法と同様に、例えば、ＣＤ４５、ＴＥＲ１１９、α４−インテグリン、ＶＥ−カドヘリン、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、ＣＤ３４、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ｓＩｇＭ、ＣＤ１９等の発現の有無を指標とすることにより行なわれうる。
【００８２】
なお、本発明の製造方法により得られた霊長類動物の造血系細胞も本発明に含まれる。かかる造血系細胞は、特に限定されないが、例えば、血管新生療法用の移植材料等の用途が期待され、心筋梗塞等の虚血性疾患への応用が可能となる。
【００８３】
また、本発明の分化方法と同様の操作により、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジを作製することができる。したがって、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法も本発明に含まれる。
【００８４】
本発明の霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植することを１つの大きな特徴とする。
【００８５】
本発明のキメラヒツジの作製方法によれば、霊長類の造血系細胞をより安定に供給することができるキメラヒツジを得ることができる。
【００８６】
本発明のキメラヒツジの作製方法により得られたキメラヒツジは、免疫的に寛容な状態で、本質的に霊長類動物に由来する細胞を有しているため、該キメラヒツジには、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞をさらに移植することができる。また、本発明のキメラヒツジの作製方法により得られたキメラヒツジは、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与することにより、体内において、本質的に霊長類に由来する造血系細胞への分化を選択的に刺激することができる。
【００８７】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例によりなんら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、「％」は、特に明記がない場合は、重量％を示すものとする。また、ＣＯ２、Ｏ２及びＮ２における「％」表記は、体積％を示すものとする。
【００８８】
実施例１  サル胚性幹細胞の培養
（１）フィーダー細胞の作製
継代５回までのマウス胚繊維芽細胞ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１（Ｈ２抗原のハプロタイプＨ−２ｄ）（日本クレア社供給）を、最終濃度  １０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを含むＤ１０培地〔組成：１０％  ＦＣＳ、ＤＭＥＭ〕で２〜４時間培養することにより、細胞の分裂増殖を停止させて、不活化させた。ついで、マイトマイシンＣを含む培地を除去した。処理後の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。洗浄後の細胞をトリプシン・ＥＤＴＡ処理（０．０５％  トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）して、細胞浮遊液を得、ついで、細胞浮遊液を遠心分離して細胞を得た。
【００８９】
ついで、得られた細胞をＤ１０培地に懸濁し、ゼラチンコートした６ｃｍ培養ディッシュ〔ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）社製、商品名：Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ〕に１×１０６個となるように播種した。ディッシュに接着するまで培養して得られた細胞を、フィーダー細胞として用いた。
【００９０】
（２）カニクイザル由来ＥＳ細胞株ＣＭＫ６の培養
前記実施例１（１）のフィーダー細胞の培養物より、Ｄ１０培地を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水で、該フィーダー細胞を洗浄した。
【００９１】
ついで、凍結保存されていたカニクイザル由来ＥＳ細胞ＣＭＫ６を、ＥＳ細胞用培地〔２００ｍｌあたりの組成：ＤＭＥＭ−Ｆ１２〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製〕  １６３ｍｌ、ウシ胎仔血清  ３０ｍｌ（最終濃度１５％）、Ｌ−グルタミン  ２ｍｌ（最終濃度２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）  ２ｍｌ、非必須アミノ酸溶液〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製〕  ２ｍｌ、２−メルカプトエタノール  １ｍｌ（最終濃度０．１ｍＭ）〕  ５ｍｌに懸濁した。得られた細胞懸濁液を、前記フィーダー細胞上に、播種した。なお、培養は、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で行なった。また、ＥＳ細胞用培地は、２日に１回交換した。
【００９２】
７日間培養後、古い培地を吸引して、除去し、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。ついで、ディッシュ上の細胞に、０．２５％  トリプシン／ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩水溶液）  １ｍｌを添加し、３７℃で４〜５分間インキュベーションした。その後、常温下でディッシュの底を軽く叩き、細胞のコロニーを剥離させた。
【００９３】
ついで、前記細胞のコロニーから、前記ＥＳ細胞用培地を用いて、５ｍｌピペットによるピペッティングで未分化な細胞のコロニーを回収した。回収された細胞を前記ＥＳ細胞用培地に懸濁し、得られた細胞懸濁液  ５ｍｌを、６ｃｍディッシュ上のフィーダー細胞に播種した。その後、コロニーの大きさに応じ、２〜４日毎に継代した。
【００９４】
得られた未分化ＥＳ細胞を、ヒツジ胎仔への移植に用いた。また、かかる未分化ＥＳ細胞を、以下の造血系分化誘導に用いた。
【００９５】
また、前記未分化ＥＳ細胞を、培地〔組成：１５％  ＦＣＳ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２〕で培養することにより、胚様体を得た。かかる胚葉体をヒツジへの移植に用いた。
【００９６】
実施例２  サル胚性幹細胞の造血系分化誘導
（１）フィーダー細胞の作製
マクロファージコロニー刺激因子の機能不全マウスである（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）Ｆ２−ｏｐ／ｏｐマウスの新生仔頭蓋冠より作製されたストロマ細胞株で、前脂肪細胞株であるＯＰ９細胞を、ＯＰ９細胞用培地｛１２５０ｍｌあたりの組成：α−ＭＥＭ〔ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製、カタログ番号：１２０００−０２２〕  ９８０ｍｌ、ウシ胎仔血清  ２５０ｍｌ（最終濃度２０％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）  １０ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン溶液  １０ｍｌ｝で、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。その後、培養液内で接着してコンフルエント又はその直前まで生育した細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄した。ついで、洗浄後のディッシュ上の細胞に、０．１％  トリプシン−ＥＤＴＡ（２ｍｌ／１０ｃｍディッシュ）を添加し、インキュベーターで５分間保温した。
【００９７】
前記ディッシュに、前記ＯＰ９細胞用培地を添加し、細胞を含む培地を５０ｍｌコニカルチューブに回収した。回収された細胞を含む培地を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた細胞を、前記ＯＰ細胞用培地に、１：４〜１：５（約２．５×１０５細胞〜４×１０５細胞で播種し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下に、コンフルエントになるまで培養した。
【００９８】
得られた細胞を、１０ｃｍディッシュ〔ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）社製）上、最終濃度１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを含む前記ＯＰ９細胞用培地  １０ｍｌで２〜４時間培養することにより、細胞の分裂増殖を停止させて、不活化させた。ついで、マイトマイシンＣを含む培地を除去した。処理後の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。洗浄後の細胞をトリプシン・ＥＤＴＡ処理（０．０５％  トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）して、細胞浮遊液を得、ついで、細胞浮遊液を遠心分離して細胞を得た。
【００９９】
得られた細胞を、ゼラチンコートした６ｃｍ培養ディッシュ〔ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）社製、商品名：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ〕上、前記ＯＰ９細胞用培地  に、１：２（培地あたり約１×１０５細胞／ｍｌ）で播種した。培養して得られた細胞を、以下の造血系分化誘導培養におけるフィーダー細胞として用いた。
【０１００】
（２）造血系分化誘導培養
前記実施例１で、０．２５％  トリプシン／ＨＢＳＳ  １ｍｌに回収されたカニクイザル由来ＥＳ細胞株ＣＭＫ６株及びＣＭＫ６／ＳｅＶ株を、分化用培地〔１００ｍｌあたりの組成：ＩＭＤＭ  ８４ｍｌ、８％  ウマ血清  ８ｍｌ、８％ウシ胎仔血清  ８ｍｌ、５×１０−６Ｍ  ヒドロコルチゾン  ０．１８μｇ、ＢＭＰ−４  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６  １μｇ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ．３リガンド  ２μｇ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ  ２００Ｕ（２Ｕ／ｍｌ）〕  ５ｍｌに懸濁し、得られた細胞懸濁液を、前記実施例２（１）で得られた造血系分化誘導培養におけるフィーダー細胞上に１：３で播種した。
【０１０１】
その後、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で６日間培養した。なお、培養中、培地を適宜交換した。得られた細胞を、造血系分化誘導処理細胞として、以下の移植等に用いた（図１）。
【０１０２】
（３）移植用細胞処理
前記実施例２（２）で得られた造血系分化誘導処理細胞のディッシュから、培地を吸引して、除去し、ディッシュに、０．２５％  トリプシン／ＨＢＳＳ  １ｍｌを添加し、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下、４分間インキュベーションした。
【０１０３】
ついで、スクレーパー〔商品名：ｃｅｌｌ  ｓｃｒａｐｅｒ−Ｍ、スミロン（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）〕で、フィーダー細胞上の細胞を、フィーダー細胞ごと、前記分化用培地  ２０ｍｌの入った５０ｍｌ容コニカルチューブに回収し、８００ｒｐｍ、４分間遠心分離した。
【０１０４】
上清を、吸引し、除去し、細胞を、５０ｍｌ容コニカルチューブ中、前記分化用培地  ２０ｍｌに懸濁し、細胞浮遊液を得た。
【０１０５】
移植直前に、前記細胞浮遊液を、８００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を吸引して、除去し、ついで、得られた細胞に、０．１％ＢＳＡ／ＨＢＳＳ  ２０ｍｌを添加し、懸濁して、８００ｒｐｍで４分間遠心分離することにより、洗浄した、
【０１０６】
その後、上清を吸引して、除去し、細胞を、０．１％ＢＳＡ／ＨＢＳＳ  ０．４ｍｌに懸濁した。得られた懸濁液を、１．５ｍｌ  アシストチューブに入れ、氷上で保存した。
【０１０７】
実施例３  細胞移植
実験用ヒツジ取り扱い業者ジャパンラムから購入した妊娠ヒツジを使用した。妊娠約６０日目に移植を予定し、移植の１週間〜１０日前に、移植時における飼育環境に慣れさせた。また、腹部超音波検査による胎仔の確認を行なった。
【０１０８】
ヒツジ母体を、ケタミン筋注（１５ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した。ヒツジを、手術台上に仰向けに寝かせ、体位をとって固定後、経口気管内挿管し、自発呼吸のもとＯ２／空気／ハロセンで全身麻酔下に手術を行なった。
【０１０９】
手術は、清潔操作で行なった。下腹部正中切開で開腹後、子宮を腹腔内に翻転させた。
【０１１０】
移植用細胞の注入場所は、胎仔の▲１▼腹腔内及び▲２▼肝実質内の二通りとした。
【０１１１】
腹腔内への移植の場合、ヒツジの子宮筋層を切開し、温存したまま露出させた卵膜内にヒツジ胎仔を追い込み、透明な卵膜を通して直視下に胎仔腹腔内に２３Ｇ針で、実施例１で得られた未分化ＥＳ細胞、胚葉体、実施例２で得られた移植用細胞（１×１０７〜１×１０８細胞）を穿刺注入し、子宮筋層、腹膜筋層、皮膚を層々に縫合閉腹した。また、肝実質内への移植の場合、子宮壁上から超音波ガイド下、ヒツジ胎仔肝実質内に２５Ｇカテラン針で、移植用細胞（１×１０７〜１×１０８細胞）を穿刺注入し、腹膜筋層、皮膚を層々に縫合閉腹した。
【０１１２】
手術終了後、抗生物質（マイシリン・ゾル）を筋肉内注射した。ついで、抜管し、ヒツジの麻酔覚醒を確認した。
【０１１３】
実施例４  胎仔からの試料採取
移植後１ヶ月目の胎仔について、母体全身麻酔下に帝王切開で取り出して解剖し、造血組織を含む全身組織を試料として採取した。
【０１１４】
具体的には、左右の子宮に２頭〔移植胎仔（尾切）、対照胎仔〕ずつ、計４頭の胎仔を妊娠している母体より、以下のような手順で、組織の採取及び処理を同時に行なった。
【０１１５】
採取した組織を以下に示す。
内胚葉系組織
１．肝（胆管、肝実質、肝動脈、門脈領域を含む）
２．膵頭部（膵管、膵実質）
３．胸腺
４．甲状腺
５．肺（気管支、肺胞）
６．小腸
７．大網（臓側腹膜）
外胚葉系組織
８．大脳
９．脊髄
１０．皮膚（付属器；毛、汗腺、脂腺）
１１．尾部切断創（皮膚）  〔細胞移植した胎仔より採取〕
中胚葉系組織
１２．脂肪（結合組織）
１３．軟骨（骨端軟骨）
１４．骨髄
１５．リンパ節
１６．骨格筋
１７．心筋
１８．大動脈
１９．脾臓
２０．腎臓
２１．生殖腺
なお、初代培養用に下記試料を採取した。
２２．末梢血（臍帯動脈血）
２３．臍帯血（臍帯静脈血）
２４．骨髄（還流後）
２５．肝（還流後）
２６．腹水（還流後）
【０１１６】
ヒツジ母体に、経口挿管により、自発呼吸、Ｏ２／空気／ハロセンで麻酔導入を開始した。１５分後、母体を帝王切開し、片側子宮の胎仔２頭を取り出し、組織を採取し、処理した。なお、細胞を移植した胎仔（移植胎仔）の体重は、９５０ｇであり、対照胎仔の体重は、１０４０ｇであった。
【０１１７】
ついで、臍帯が母体とつながった状態で、臍帯静脈血（臍帯血試料）と臍帯動脈血（末梢血試料）とを採血した。ここで、採血量は、移植胎仔の臍帯血試料について、１０ｍｌ、移植胎仔の末梢血試料について、２０ｍｌ、対照胎仔の臍帯血試料について、２０ｍｌ、対照胎仔の末梢血試料について、２０ｍｌとした。
【０１１８】
臍帯を切離し、ついで、臍帯静脈に、６Ｇアトムチューブでカニューレ挿入した。臍帯動脈について、カニューレ挿入ができなかったため、切離断端を開放とした。
【０１１９】
臍帯静脈側のカニューレに還流液（冷ラクテック５００ｍｌ）をつなぎ、点滴にて還流を開始した。臍帯動脈側を脱血路として血液の流出が無くなるまで（全１０００ｍｌ程度）還流を行なった。
【０１２０】
移植胎仔及び対照胎仔それぞれについて、開腹し、部分肝、大腿骨を初代培養用試料として清潔操作で採取した。また、臓器を摘出した。摘出された臓器を、氷上のシャーレに分けて置いた。
【０１２１】
５ｍｍ×５ｍｍ×３ｍｍの組織標本を、各３検体ずつ切り出した。そのうち２検体は、４％  緩衝パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／８％  スクロースの入った１５ｍｌサンプル瓶へ入れ、一晩固定を行なった。かかる試料を、４％  ＰＦＡ固定試料とした。
【０１２２】
なお、骨髄試料については、脱灰を行なった。
【０１２３】
また、前記４％  ＰＦＡ固定試料を、順に、５０％  エタノール、６０％  エタノール、７０％  エタノール、８０％  エタノール、９０％  エタノールで１〜２時間維持し、１００％  エタノールで１〜２時間維持し、さらに、１００％エタノールで１〜２時間維持し、その後、１００％  エタノールで１晩維持し、さらに１００％  エタノールで１晩維持することにより脱水し、ベンゼンに浸漬（３０分間×２回）させ、ついで、パラフィンに浸漬（４５分間×２回）させることにより、４％  ＰＦＡ固定後パラフィン包埋切片試料を得た。
【０１２４】
残部の１検体は、クリオモルド１号に設置し包埋凍結させた。前記包埋凍結は、ＯＣＴコンパウンドで包埋し、液体窒素で凍結させることにより行なった。かかる試料を、新鮮凍結切片用の標本とした。
【０１２５】
残った臓器から小片をいくつか切り出し、クライオチューブ３本に１つずつ入れ、チューブごと液体窒素で凍結させた。これらの臓器の小片を、ＤＮＡ抽出用又はＲＮＡ抽出用の標本とした。
【０１２６】
また、流産、死産若しくは出生後死亡した場合、胎仔を取り出し、末梢血（ヘパリン採血）  約２０ｍｌ、骨髄〔ヘパリン生食（１０単位／ｍｌ）に採取〕  適量、臍帯血（ヘパリン採血）  約２０ｍｌ、肝臓（ヘパリン生食中に採取）  約１０ｇを採取し、体表、腹腔内、胸腔内及び脳を剖検し、テラトーマ等の腫瘍形成がないか確認した。腫瘍形成が確認された場合、腫瘍を摘出し、４％  パラホルムアルデヒドで固定した。
【０１２７】
また、出生後に解析を行なった症例では、出生後からおよそ月に１回のペースで末梢血と骨髄を採取した。具体的には、出生時には、臍帯血（ヘパリン採血）約２０ｍｌを採取し、出生時又は生後７日以内において、末梢血（ヘパリン採血）  約２０ｍｌを採取した。出生後には、末梢血（ヘパリン採血）  約２０ｍｌを、最初の数ヶ月間において、２週間毎に採取し、骨髄（ヘパリン生食中に採取）を１ヶ月毎に適量採取した。採取した試料を、無菌コニカルチューブに入れて、室温で振とう保管し、有核細胞を分離し、凍結保存した。
【０１２８】
肝臓、臍帯血、骨髄、末梢血等の造血系組織や細胞は、溶血法により白血球分化画に分離し、ＤＮＡ抽出用又はＲＮＡ抽出用試料、初代培養用試料、ＦＡＣＳ解析用試料として凍結保存した。
【０１２９】
なお、初代培養用試料として、肝臓については、以下のように細胞処理を行なった。試料を無菌操作下で採取し、該試料を適当に細切し、５０ｍｌ  コニカルチューブに回収し、１％  トリプシン／ＥＤＴＡ／リン酸緩衝化生理食塩水  ２０ｍｌを添加し、よく懸濁し、３７℃で１０分間振盪させながらインキュベーションした。得られた産物に、ＤＮａｓｅ  Ｉ溶液〔１０ｍｇ  ＤＮａｓｅ  Ｉを１ｍｌ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌに溶解させた溶液〕  ２００μｌを添加し、さらに、１Ｍ  ＭｇＣｌ２を１００μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベーションした。その後、産物を、７０ｍｍ径  ナイロンメッシュ〔ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）社製、商品名：ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）でろ過し、産物と同量のＤ１０培地を添加した。その後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引除去した。なお、赤血球が混入によりペレットが赤色である場合、該ペレットに、約１Ｏ倍量以上のＡＣＫ  ｌｙｓｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、１５〜０分間氷上で維持し、ついで、１５００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離した。約４０ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水で、ペレットを２回洗浄した。上清を、吸引して、除去し、得られたペレットを、１０６〜１０７細胞／バイアルでセルバンカーに懸濁し、−８０℃で凍結保存した。
【０１３０】
また、初代培養用試料として、臍帯血、末梢血及び骨髄については、以下のように細胞処理を行なった。試料を、ヘパリン採血に順じて無菌操作で採取し、血液  ３５ｍｌを５０ｍｌ  コニカルチューブに入れ、１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。血漿を、吸引して、除去し、ペレットを、５０ｍｌ  コニカルチューブ５本に分注した。ついで、各コニカルチューブに、４０ｍｌ（ペレットの約１０倍量）のＡＣＫ  ｌｙｓｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、混和させ、氷上で、１５分間インキュベーションした。１５００ｒｐｍで５分間、４℃での遠心分離後、上清を吸引して、除去した。なお、ペレットが赤色である場合、１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を繰り返した。ついで、ペレットに、リン酸緩衝化生理食塩水  ４０ｍｌを添加し、懸濁し、それぞれのチューブを１本のチューブにまとめ、１５００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離することにより洗浄を行なった。かかる洗浄を、２回行なった。上清を吸引除去し、ペレットを５×１０６細胞／バイアル／ｍｌとなるようにセルバンカーで懸濁し、凍結保存した。
【０１３１】
実施例５  各組織由来のゲノムＤＮＡの解析
前記実施例４で得られた試料からＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ及びＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、キットに添付の製造者のプロトコールに従い、ＤＮＡを抽出した。
【０１３２】
サル由来の細胞を移植したヒツジ胎仔の解析のために、サルβ２−ミクログロブリンに対するプライマー対として、外部プライマー対：
ＣＢ２ＭＧ−２Ｆ：５’−ＧＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧ−３’  （配列番号：１）とｈＢ２ＭＧ  ５Ｒ：５’−ＧＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＡＧＴＣＡＣＡＴＧＧ−３’  （配列番号：２）とからなるプライマー対、及び
内部プライマー対：
ＣＢ２ＭＧ−２Ｆ：５’−ＧＴＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧ−３’  （配列番号：３）とｈＢ２ＭＧ−３Ｒ：５’−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＴＡＧＴＡＣＡＡ  Ｇ−３’  （配列番号：４）とからなるプライマー対
を用い、前記ＤＮＡを鋳型として、半定量的ＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲ条件は、  反応液〔組成：Ｈ２０  ３０．７５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液  ５μｌ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）  ４μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．２５μｌ、プライマー（各１０ｐＭ）  各２．５μｌ、試料由来ＤＮＡ（２５０ｎｇ相当量）  ５μｌ〕を用い、９５℃で５分間のインキュベーションの後、９５℃で１分間と５８℃で１分間と７２℃で１分間とを１サイクルとして、外部増幅時には、２５サイクル、内部増幅時には、３０サイクルを行ない、７２℃で５分間インキュベーションして、４℃で維持する条件とした。
【０１３３】
また、β−アクチンに対するプライマー対：
Ｃβ１：５’−ＣＡＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＣＧＡＣＧＧ−３’（配列番号：５）と
Ｃβ２：５’−ＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＴＣＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号：６）と
からなるプライマー対を用い、同様にＰＣＲを行なった。
【０１３４】
なお、定量のために、下記表１に示す希釈系列の試料を作製し、用いた。
【０１３５】
【表１】
2004350601.tif 000002
【０１３６】
また、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞を移植したヒツジ胎仔を対照として用いた。このとき、β２−ミクログロブリンに対するプライマー対として、外部プライマー対：
ｈＢ２ＭＧ−２Ｆ  ５’−ＧＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧ−３’  （配列番号：７）と前記ｈＢ２ＭＧ  ５Ｒとからなるプライマー対、及び
内部プライマー対：
ｈＢ２ＭＧ−２Ｆ  ５’−ＧＴＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧ−３’  （配列番号：３と同じ）と前記ｈＢ２ＭＧ−３Ｒとからなるプライマー対を用い、前記ＤＮＡを鋳型として、半定量的ＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲ条件は、  反応液〔組成：Ｈ２０  ３０．７５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液  ５μｌ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）  ４μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．２５μｌ、プライマー（各１０ｐＭ）  各２．５μｌ、試料由来ＤＮＡ（２５０ｎｇ相当量）  ５μｌ〕を用い、９５℃で５分間のインキュベーションの後、９５℃で１分間と５８℃で１分間と７２℃で１分間とを１サイクルとして、外部増幅時には、２５サイクル、内部増幅時には、３０サイクルを行ない、７２℃で５分間インキュベーションして、４℃で維持する条件とした。
【０１３７】
なお、定量のために、下記表２に示す希釈系列の試料を作製し、用いた。
【０１３８】
【表２】
2004350601.tif 000003
【０１３９】
ＰＣＲにより生成した産物を、２％  アガロースゲル（０．０１％  ＥｔＢｒ含有）による電気泳動に供した。
【０１４０】
その結果、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（対照群）をヒツジ胎仔の肝実質内に移植後、約４ヶ月の個体の末梢血からのみ０．０１％未満のキメラ率でサル由来のβ２−ミクログロブリンの塩基配列が検出された。
【０１４１】
実施例６  造血系組織及び細胞のコロニーアッセイ及びコロニー解析
初代培養用に分離した細胞で造血コロニーアッセイを行なった。
【０１４２】
凍結保存されていた細胞のクライオチューブを３７℃の恒温槽で溶解し、９ｍｌの２％  ＦＢＳ−ＩＭＤＭを入れた１５ｍｌ  コニカルチューブ中に懸濁し、得られた懸濁液の一部を用いて細胞数を計数した。ついで、懸濁液を、１３００ｒｐｍで４分間遠心分離し、得られたペレットを、２％  ＦＢＳ−ＩＭＤＭで１×１０６細胞／ｍｌとなるように懸濁し、細胞浮遊液を得た。さらに、２％  ＦＢＳ−ＩＭＤＭで１０倍希釈して、１×１０５細胞／ｍｌの細胞浮遊液を調製した。
【０１４３】
１４ｍｌのポリスチレン丸底チューブに、商品名：Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ＋〔ステムセルテクノロジーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、カタログ番号：ＳＴ−０４４３５〕を４ｍｌ入れ、細胞浮遊液を４００μｌ添加し、キャップを閉めて激しく振って攪拌した。その後、泡が消えるまで約５分間静置した。
【０１４４】
ついで、得られた細胞を含む培地  １．１ｍｌを、１８Ｇ針を付けた２．５ｍｌ  注射器で、３．５ｍｍ  ディッシュの中央に注入し、ディッシュの底に均一に広げた。
【０１４５】
１５ｃｍ  ペトリ皿に、３．５ｃｍ  ディッシュを６枚と、リン酸緩衝化生理食塩水  ３ｍｌを含む  ３．５ｃｍ  ディッシュを保湿用として入れ、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下でインキュベーションした。
【０１４６】
コロニーの計数は、インキュベーション開始から、１４日目に行なった。
【０１４７】
しかしながら、かかる方法では、サル由来の造血前駆細胞だけでなくヒツジ由来の造血前駆細胞もコロニーを形成していることがわかった。
【０１４８】
そこで、コロニーを形成している培地からコロニーを取り、各コロニーからＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを鋳型とし、サルβ２−ミクログロブリンに対するプライマー対を用いて、ＰＣＲを行ない、サル由来の造血前駆細胞の存在を確認した。
【０１４９】
サルβ２−ミクログロブリンに対するプライマー対として、外部プライマー対：前記ＣＢ２ＭＧ−２ＦとｈＢ２ＭＧ  ５Ｒとからなるプライマー対、及び
内部プライマー対：前記ＣＢ２ＭＧ−２ＦとｈＢ２ＭＧ−３Ｒとからなるプライマー対を用い、前記ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲ条件は、  反応液〔組成：Ｈ２０  ３０．７５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液  ５μｌ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）  ４μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．２５μｌ、プライマー（各１０ｐＭ）  各２．５μｌ、試料由来ＤＮＡ（２５０ｎｇ相当量）  ５μｌ〕を用い、９５℃で５分間のインキュベーションの後、９４℃で３０秒間と５７℃で１分間と７２℃で１分間とを１サイクルとして、外部増幅時及び内部増幅時ともに、２５サイクルを行ない、７２℃で５分間インキュベーションして、４℃で維持する条件とした。得られた産物について、２％  アガロースゲルによる電気泳動により解析した。
【０１５０】
その結果、造血系分化誘導サルＥＳ細胞を用いた場合、図２に示されるように、造血系分化誘導処理をしたＥＳ細胞を腹腔内に移植後１ヶ月の個体の胎仔肝臓で約３０％（ｎ＝１）であり、造血系分化誘導処理をしたＥＳ細胞を肝実質内に移植した出生後（移植後３〜６ヶ月）の個体の骨髄で約１％（ｎ＝３）の頻度でサル由来の造血コロニーがあることがわかった。すなわち、ＥＳ細胞を、造血系分化誘導処理し、ヒツジ胎仔に導入することにより、該ヒツジ胎仔は、サル由来の造血系細胞を産生することがわかった。
【０１５１】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、プライマーＣＢ２ＭＧ−２Ｆの配列である。
【０１５２】
配列番号：２は、プライマーｈＢ２ＭＧ  ５Ｒの配列である。
【０１５３】
配列番号：３は、プライマーＣＢ２ＭＧ−２ＦＣＢ又はｈＢ２ＭＧ−２Ｆの配列である。
【０１５４】
配列番号：４は、プライマーｈＢ２ＭＧ−３Ｒの配列である。
【０１５５】
配列番号：５は、プライマーＣβ１の配列である。
【０１５６】
配列番号：６は、プライマーＣβ２の配列である。
【０１５７】
配列番号：７は、プライマーｈＢ２ＭＧ−２Ｆの配列である。
【０１５８】
【発明の効果】
本発明の霊長類動物の胚性幹細胞からの造血系細胞への分化方法によれば、霊長類の造血系細胞を安定に供給することができ、霊長類動物の胚性幹細胞への外来遺伝子の導入等の遺伝子工学的操作を行なうことなく、該霊長類動物の胚性幹細胞を造血系細胞に分化させることができ、霊長類動物の個体にとって異種動物において、該個体にとって同種である造血系細胞を得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の霊長類動物の造血系細胞の製造方法によれば、霊長類の造血系細胞を安定に供給することができ、霊長類の造血系細胞を大量に供給することができ、霊長類動物の個体にとって異種動物において、該個体にとって同種である造血系細胞を得ることができ、霊長類動物の輸血用血小板を安定に供給することができ、霊長類動物の衣装供養のＣＤ３４＋細胞を安定に供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の霊長類の造血系細胞を産生するキメラヒツジの作製方法によれば、霊長類の造血系細胞を安定に供給することができるキメラヒツジを得ることができるという優れた効果を奏する。
【０１５９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を示す。パネル（Ａ）は、未分化胚性幹細胞を示し、スケールバーは、１００μｍを示す。パネル（Ｂ）は、ＯＰ９細胞上ＢＭＰ−４の存在下での培養時の細胞を示す。パネル（Ｃ）は、胚性幹細胞を、造血系分化誘導条件に維持して得られた細胞を示し、スケールバーは、１００μｍを示す。
【図２】図２は、移植後に得られたヒツジ胎仔において、サルβ２−ミクログロブリンを検出した結果を示す図である。図中、パネル（Ａ）は、胎仔肝臓、パネル（Ｂ）は、骨髄の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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