(57)【要約】【課題】酵素活性の低下を防ぎ、高収率かつ高光学過剰率で光学活性エステルおよび／または光学活性カルボン酸を効率的に製造する方法を提供する。【解決手段】一般式（１）で表されるエステル誘導体の光学異性体混合物に、リパーゼまたはエステラーゼを作用させる反応系に、ポリエチレングリコールを存在させる（ただし、式中Ｒ１およびＲ２は、互いに異なり、置換もしくは非置換のアルケニル基、または、置換もしくは非置換のアルキル基を示し、Ｒ３は、置換もしくは非置換のアルキル基を示す。また、式中の＊は炭素原子が不斉炭素原子であることを示し、式（２）における該不斉炭素原子の絶対配置と式（３）における該不斉炭素原子の絶対配置とは互いに異なり、一方がＲであり他方がＳである。）。【化１】2004350522.tif 000004【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるエステル誘導体の光学異性体混合物に、リパーゼまたはエステラーゼを作用させ、下記一般式（２）で表される光学活性エステルおよび／または下記一般式（３）で表される光学活性カルボン酸を製造する方法であって、ポリエチレングリコールを反応系中に存在させることを特徴とする、一般式（２）で表される光学活性エステルおよび／または一般式（３）で表される光学活性カルボン酸の製造方法（ただし、式中Ｒ１およびＲ２は、互いに異なり、置換もしくは非置換のアルケニル基、または、置換もしくは非置換のアルキル基を示し、Ｒ３は、置換もしくは非置換のアルキル基を示す。また、式中の＊は炭素原子が不斉炭素原子であることを示し、式（２）における該不斉炭素原子の絶対配置と式（３）における該不斉炭素原子の絶対配置とは互いに異なり、一方がＲであり他方がＳである。）。
【化１】
2004350522.tif 000003
【請求項２】
Ｒ１が置換アルケニル基であり、Ｒ２が非置換アルキル基である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
Ｒ１が３−クロロ−２−プロペニル基であり、Ｒ２がイソプロピル基である請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
ポリエチレングリコールの平均分子量が、２００〜２０，０００である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
リパーゼまたはエステラーゼが、動物、植物、または微生物由来である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
不活性担体に固定化されたリパーゼまたはエステラーゼを用いる請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、農薬または医薬の中間体として有用な光学活性エステルおよび／または光学活性カルボン酸を、酵素を用いて製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
α位に不斉炭素を有するエステル誘導体に、リパーゼまたはエステラーゼを作用させて一方の光学異性体のみを加水分解することによって、光学活性エステルおよび／または光学活性カルボン酸を製造する方法（該方法を以下、「光学分割法」ということがある。）としては、以下の方法が知られている。
【０００３】
（１）（−）−４−ブタノイロキシ−２−オキサビシクロ［３．３．０］オクト−７−エン−３−オンに、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来リパーゼを一括添加することにより作用させて、抗ＨＩＶ薬である（＋）−４−ブタノイロキシ−２−オキサビシクロ［３．３．０］オクト−７−エン−３−オン、（−）−４−ブタノイロキシ−２−オキサビシクロ［３．３．０］オクト−７−エン−３−オン等の光学活性エステルと、（−）−４−エンドヒドロキシ−２−オキサビシクロ［３．３．０］オクト−７−エン−３−オン等の光学活性アルコールとを得る方法（非特許文献１参照）。
（２）（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピル−４−ペンテン酸エチルエステルにブタ肝臓由来のエステラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｇｒａｄｅ）を一括添加することにより作用させて、（Ｓ）−（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピル−４−ペンテン酸エチルエステルと（Ｒ）−（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピル−４−ペンテン酸とを得る方法（特許文献１参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
エバンス（Ｅｖａｎｓ）、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．、１９９２年、第１巻、５８９〜５９２頁。
【非特許文献２】
国際公開第０１／０９０７９号パンフレット
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、（１）に示した方法は、収率が２２％、光学過剰率が９２％ｅｅであり、反応終了までに７５時間を要する方法であった。
（２）には、反応に必要な条件が充分に記載されておらず、どのような方法で目的化合物を得たのかは全く不明である。また（２）の方法に基づいて実施しようとした場合には、多くの酵素量が必要になると予想され、工業的な実施において不利な反応であった。
また、（１）、（２）の方法では、原料が水に不溶性であるため、有機溶媒を使用したり、撹拌によってリパーゼまたはエステラーゼを反応系へ分散させたりしていた。このため、酵素活性の低下および反応効率の低下が起こり、収率および光学過剰率が低下し、かつ反応に長時間を要し、工業的に利用するには問題があった。
【０００６】
本発明は、かかる従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、不斉炭素を有するエステル誘導体の光学異性体混合物に、リパーゼまたはエステラーゼを作用させる反応において酵素活性の低下を防ぎ、効率的に反応を行い、高収率かつ高光学過剰率で光学活性エステルおよび／または光学活性カルボン酸を製造する方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ポリエチレングリコールを反応系中に存在させると、酵素活性低下が抑制され、上記課題を解決することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記一般式（１）で表されるエステル誘導体の光学異性体混合物に、リパーゼまたはエステラーゼを作用させ、下記一般式（２）で表される光学活性エステルおよび／または下記一般式（３）で表される光学活性カルボン酸を製造する方法であって、ポリエチレングリコールを反応系中に存在させることを特徴とする、一般式（２）で表される光学活性エステルおよび／または一般式（３）で表される光学活性カルボン酸の製造方法（ただし、式中Ｒ１およびＲ２は、互いに異なり、置換もしくは非置換のアルケニル基、または、置換もしくは非置換のアルキル基を示し、Ｒ３は、置換もしくは非置換のアルキル基を示す。また、式中の＊は炭素原子が不斉炭素原子であることを示し、式（２）における該不斉炭素原子の絶対配置と式（３）における該不斉炭素原子の絶対配置とは互いに異なり、一方がＲであり他方がＳである。）を提供する。
【化２】
2004350522.tif 000002
【０００９】
【発明の実施の形態】
本明細書においては、式（１）で表される化合物を「化合物（１）」のように記す。他の式で表される化合物についても同様に記す。
本発明方法における、原料は、化合物（１）であり、公知の方法により合成できる。化合物（１）は、エステルのα位に不斉炭素を有する化合物である。本明細書においては、このエステルのα位の不斉炭素を、単に「不斉炭素」という。
【００１０】
本明細書における「アルキル基」とは、非置換のアルキル基をいい、炭素数１〜８の直鎖又は分枝鎖のアルキル基が好ましく、特に炭素数１〜６の該基が好ましい。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−オクチル基等が挙げられる。
本明細書における「置換アルキル基」とは、アルキル基中の水素原子の１個以上が置換基で置換された基をいう。該置換基の具体例としては、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、および水酸基等が挙げられる。
【００１１】
また、本明細書における「アルケニル基」とは、非置換のアルケニル基をいい、炭素数２〜８の直鎖又は分枝鎖のアルケニル基が好ましく、特に炭素数２〜６の該基が好ましい。アルケニル基中の二重結合は、１個又は２個以上であり、１個が好ましい。アルケニル基に存在する二重結合はシスまたはトランスのいずれの配置であってもよい。アルケニル基の具体例としては、アリル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、２−（１−プロペニル）基、１−ブテニル基、３−ブテニル基、１−ヘキセニル基、および２−ヘキセニル基等が挙げられる。
本明細書における「置換アルケニル基」とは、アルケニル基中の水素原子の１個以上が置換基で置換された基をいい、上記アルケニル基が置換基で置換された基が好ましい。該置換基としては、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、水酸基等が挙げられる。
【００１２】
化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）におけるＲ１およびＲ２は、互いに異なり、置換もしくは非置換のアルケニル基、または、置換もしくは非置換のアルキル基である。
Ｒ１としては、置換アルケニル基が好ましく、ハロゲン原子で置換されたアルケニル基が特に好ましく、塩素原子で置換されたアルケニル基がとりわけ好ましく、３−クロロ−２−プロペニル基がさらに好ましい。
Ｒ２としては、非置換アルキル基が好ましく、炭素数１〜３の該基か特に好ましく、イソプロピル基がとりわけ好ましい。
化合物（１）および化合物（２）におけるＲ３は、置換もしくは非置換のアルキル基であり、非置換のアルキル基が好ましい。該アルキル基としては低級アルキル基が好ましく、特にメチル基またはエチル基が好ましい。
【００１３】
化合物（１）としては、Ｒ１が置換アルケニル基でありＲ２が非置換アルキル基である化合物が好ましく、５−クロロ−２−イソプロピル−４−ペンテン酸メチルエステルが特に好ましい。
【００１４】
化合物（１）は、不斉炭素の絶対配置がＳ体である化合物とＲ体である化合物との混合物、すなわち光学異性体の混合物、である。化合物（１）におけるＳ体である化合物とＲ体である化合物との量比は特に限定されず、Ｓ体である化合物とＲ体である化合物との量比が１：１（モル比）の混合物であるラセミ体混合物、であるのが好ましい。
【００１５】
本発明においては、化合物（１）にリパーゼまたはエステラーゼを作用させ、化合物（２）および／または化合物（３）を製造する。なお、本明細書においては、リパーゼとエステラーゼとを総称して「酵素」とも記す。
本発明における酵素としては、試薬、医薬品、および工業用等の用途において使用される酵素を使用できる。本発明における酵素は化合物（１）の光学異性体の一方のみに作用してこれを加水分解することにより、光学活性な化合物（３）を生成させる。また、化合物（１）の光学異性体の他方には作用しないため、加水分解はおこらない。結果として酵素反応後の反応液中には、光学活性体である化合物（２）と光学活性体である化合物（３）が生成する。
【００１６】
該酵素の起源は、特に限定されない。例えば、リパーゼであれば、酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来の酵素などが、エステラーゼであればブタ肝臓（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ）由来の酵素などが挙げられる。ブタ肝臓由来エステラーゼとしては、例えばジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＤＢＲ）らによってジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９７８年、第１００巻、３１３〜３１５頁に記載され光学分割法に用いられているものを使用できる。また、これらのリパーゼまたはエステラーゼから単離した酵素遺伝子を、各種ベクターに組込み、発現した蛋白質を本発明の酵素として使用してもよい。
【００１７】
リパーゼまたはエステラーゼは、操作性の観点から、不活性担体に固定化されていてもよい。該不活性担体としては、セライト、多孔性グラスビーズ、セルロースおよびその誘導体、キチンおよびその誘導体、アルギン酸カルシウム、κ−カラギーナン、ポリスチレンおよびその誘導体、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体、またはポリブタジエン誘導体が好ましく、特に、多孔性グラスビーズ、キチンおよびその誘導体、またはアルギン酸カルシウムが好ましい。
【００１８】
リパーゼまたはエステラーゼの使用量は、原料である化合物（１）に対する加水分解活性により決定されるものであり、特に制限はない。通常、反応速度の観点から、化合物（１）の添加総量に対して、１×１０−５〜１×１０質量％が好ましく、特に、１×１０−５〜５質量％が好ましい。
【００１９】
本発明の製造方法には、必要に応じて溶媒を用いてもよい。該溶媒としては、水系溶媒および有機溶媒が好ましく、それぞれを単独で使用しても、または２種以上の混合溶媒として使用してもよい。２種以上の混合溶媒である場合としては、水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒であるのが好ましい。
溶媒量は、化合物（１）に対して０．１〜５０質量％が好ましく、特には１〜３０質量％が好ましい。
【００２０】
水系溶媒としては、水または緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、一般的に使用されているものであれば特に制限されない。例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液、酢酸緩衝液、またはＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【００２１】
有機溶媒としては、一般的に使用されているものであれば特に制限されない。例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノ−ル、ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール系溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒；塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素系溶媒；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒；およびその他溶媒として、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシド等を適宜使用できる。ただし、エステル系溶媒を使用する場合には、それ自体に酵素が作用する可能性があり、また該エステル系溶媒と原料との間でエステル交換反応が起こる可能性があるため、酵素が作用しないエステル系溶媒を選択して使用するのが好ましい。有機溶媒は単独で使用しても、または２種以上の混合溶媒として使用してもよい。
【００２２】
溶媒を使用する場合、溶媒量は化合物（１）の総量に対して０．１〜６０質量％が好ましく、工業的なスケールでの製造を考慮すると１〜５０質量％がさらに好ましい。
【００２３】
本発明においては、ポリエチレングリコールを反応系中に存在させる。ポリエチレングリコールは酵素保護作用を有するため、酵素の変性および酵素活性の低下を抑制する。
ポリエチレングリコールはオキシエチレン単位を２以上有するジオールである。ポリエチレングリコールの平均分子量は、特に制限されず、操作性、および反応速度等の観点から、２００〜２０，０００が好ましく、１，０００〜７，５００が特に好ましく、さらに１，５４０〜６，０００が好ましい。通常ポリエチレングリコールは重合度が異なる２種以上の混合物であるのが入手しやすさの点で好ましいが、重合度が同一である単一の化合物を用いてもよい。
ポリエチレングリコールの添加量は、化合物（１）および酵素の種類等によって決定され、通常は、化合物（１）に対して０．０１〜２０質量％が好ましく、さらに０．１〜１０質量％が好ましい。
【００２４】
ポリエチレングリコールは、化合物（３）による酵素活性の低下を防ぐ作用を有する。したがってポリエチレングリコールは化合物（３）の生成前に反応系中に存在させるのが好ましい。具体的には反応の開始前、酵素の添加時、または酵素の添加直後に反応系にポリエチレングリコールを添加するのが好ましい。
また、ポリエチレングリコールが液状である場合には、そのまま用いてもよいし、溶媒を用いて溶液として用いてもよい。また、ポリエチレングリコールが固体状である場合には、加温して溶解させてから使用してもよいし、溶媒を用いて溶液として使用してもよい。
本発明の反応の操作方法としては、化合物（１）とポリエチレングリコールとを溶媒に溶解させた後、酵素を加えて反応を行う方法、ポリエチレングリコールを溶媒に溶解させた溶液に、酵素を添加し、さらに化合物（１）を添加して反応を行う方法等が挙げられる。化合物（１）は一括で添加しても連続的または断続的に添加してもよい。
【００２５】
本発明の製造方法における酵素反応は、通常は反応温度、および反応液のｐＨ等の反応条件を制御しながら行う。この反応条件は、酵素反応、反応生成物のラセミ化、副生成物の生成等の状況を考慮し、その時々で決定されうるが、溶媒を使用する場合の反応温度は、通常は−２０〜＋９０℃が好ましく、さらに０〜６０℃が好ましく、とりわけ２５〜４５℃であることが、反応速度の観点から好ましい。また、反応液のｐＨは、反応速度の観点から、１〜１０が好ましく、さらに３〜９が好ましい。
【００２６】
反応時間は、酵素の活性が維持され、反応が進行する時間であれば、特に制限されない。通常、工業的な製造を考慮すると、反応時間は連続添加の操作を終了してからさらに１時間から１０日間が好ましく、さらに１〜９６時間が好ましい。
【００２７】
本発明の方法によれば、酵素は式（１）で表される化合物の片方の光学異性体に作用する。たとえば式（１）で表される化合物のＲ体に作用した場合にはＲ体である式（３）で表される化合物を生成させる。一方、酵素が作用しない式（１）で表される化合物のＳ体は、そのままＳ体として反応系中に残る。式（２）で表される化合物と式（３）で表される化合物は、式（２）で表される化合物中の−ＣＯＯＲ３基と式（３）で表される化合物中の−ＣＯＯＨ基との性質の差を利用した分離方法により分離でき、結果として光学分割ができる。
【００２８】
本発明における製造方法は、式（２）で表される化合物または式（３）で表される化合物を得る方法であっても、式（２）で表される化合物と式（３）で表される化合物の両方を得る方法であってもよい。
【００２９】
本発明の製造方法においては、生成する化合物（２）および化合物（３）は、それぞれ目的に応じた後処理および／または精製処理を行うのが好ましい。
たとえば、上記反応によって得た反応粗液に、非水系溶媒（例えば、ヘキサン、酢酸エチル、ｔ−ブチルメチルエーテル、塩化メチレン、クロロホルム、ジエチルエーテル等）を、反応粗液量と同等量添加して、分液ロート中で激しく混ぜて分液して非水系溶媒を分離する抽出操作を行う方法が挙げられる。非水系溶媒による分離抽出操作は、２回以上繰返してもよい。２回以上繰り返す場合には、２回目以降の非水系溶媒量は、１回目よりも少ない量にするのが好ましい。
さらに抽出操作を行った後、アルカリ金属炭酸塩の水溶液（好ましくは、５％炭酸ナトリウム溶液。）を添加するのが好ましい。これにより化合物（２）は非水系溶媒層に残り、化合物（３）は、水層に抽出される。つぎに非水系溶媒層を減圧濃縮または蒸留することによって、化合物（２）を単離できる。また水層を塩酸等を用いて酸性（ｐＨ４以下であるのが好ましい。）にし、つぎに非水系溶媒で抽出することによって、非水系溶媒層に化合物（３）を抽出し、該非水系溶媒層を減圧濃縮または蒸留することによって、化合物（３）を単離できる。
【００３０】
本発明により得られる化合物（２）および化合物（３）は、農薬または医薬の中間体として有用な光学活性化合物である。
本発明によれば、有用な該化合物（２）および化合物（３）を、効率的な方法で、高収率かつ高光学過剰率で製造できる効果を奏する。すなわち、ポリエチレングリコールを反応系中に存在させることにより、酵素の活性低下を抑制し、反応効率を高める。従って、化合物（２）および化合物（３）を、従来よりも短い反応時間で、高収率かつ高光学過剰率で得ることができる。
【００３１】
【実施例】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
なお、製造した化合物の構造は、公知のデータと比較することにより決定した。光学純度と光学過剰率は、ガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＣ」と記す。）において、カラムとしてＬｉｐｏｄｅｘ  Ｅ  ５０ｍ×０．２５ｍｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）を用いて測定した。
また、以下において、使用した酵素の量は、「Ｕｎｉｔｓ」で示す。１Ｕｎｉｔとは、ｐＨ８．０、２５℃において、１μｍｏｌの酪酸エチルから１μｍｏｌの酪酸を１分間に生成する酵素活性と定義する。
【００３２】
［実施例１］
（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピル−４−ペンテン酸メチルエステルのラセミ体（２０ｇ）と、ポリエチレングリコール（ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨの式で表される化合物であり、ｎは、平均分子量が１，５００となる平均重合度を示す。）５ｇとを、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）２３０ｍｌに添加した。次いで、反応系内を原料が充分に分散する程度に撹拌翼を用いて撹拌し、温度を３５〜４０℃に調整した。これに、ブタ肝臓由来エステラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｇｒａｄｅ）９６０Ｕｎｉｔｓを添加し、２６時間反応を継続した。反応生成物をｔ−ブチルメチルエーテルで抽出後、さらに有機溶媒層を５％炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、（Ｒ）−（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピル−４−ペンテン酸を水層に移した。有機溶媒層に回収された（Ｓ）−（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピル−４−ペンテン酸メチルエステルのＧＣ分析を実施すると、光学過剰率は９８％ｅｅであり、収率は９６％であった。
［比較例１］
ポリエチレングリコールを使用しなかったこと以外は実施例１と同様の方法で反応を行ったところ、（Ｓ）−（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピル−４−ペンテン酸メチルエステルの光学過剰率は９０％ｅｅ以下であった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、農薬または医薬の中間体として有用な化合物（２）および化合物（３）を、高収率および高光学過剰率で得ることができる。本発明の方法は、従来の方法より短い反応時間で実施できることから、経済性に優れた方法である。また、本発明の方法は、特別な反応装置を用いることなしに実施でき、反応の収率も非常に高いことから、工業的にも有用な方法である。