(57)【要約】【課題】簡便かつ短時間で安定した検査結果を得ることができる有害物質の検出方法の提供。【解決手段】ヌクレオチド分解酵素を用いることを特徴とする、有害物質の検出方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド分解酵素を用いることを特徴とする、有害物質の検出方法。
【請求項２】
以下のステップ：
（ａ）ヌクレオチド分解酵素に基質及び被験試料を添加及び混合するステップ；
（ｂ）酵素反応を行うステップ、並びに
（ｃ）反応系におけるリン酸濃度を測定するステップ、
を含む、有害物質の検出方法。
【請求項３】
ヌクレオチド分解酵素が植物の細胞壁に由来するものである、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
植物がマメ科に属する植物である、請求項３記載の検出方法。
【請求項５】
マメ科に属する植物が、ササゲ（Ｖｉｇｎａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）、ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｓｏｊａ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）からなる群より選択される１以上のものである、請求項４記載の検出方法。
【請求項６】
ヌクレオチド分解酵素がジャガイモ由来Ａｐｙｒａｓｅ及び／又はＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅである、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項７】
水道水源、上下水道又は排水の水質管理に利用する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項８】
ヌクレオチド分解酵素を含むことを特徴とする、有害物質検出用キット。
【請求項９】
さらに、緩衝液、ヌクレオチド分解酵素の基質、反応停止液、発色液、及び／又は発色停止液を含むものである請求項８記載の有害物質検出用キット。
【請求項１０】
さらに、凝集剤、及び／又は凝集助剤を含むものである請求項８又は９記載の有害物質検出用キット。
【請求項１１】
ヌクレオチド分解酵素が植物の細胞壁に由来するものである、請求項８記載の有害物質検出用キット。
【請求項１２】
植物がマメ科に属する植物である、請求項１１記載の有害物質検出用キット。
【請求項１３】
マメ科に属する植物が、ササゲ（Ｖｉｇｎａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）、ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｓｏｊａ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）からなる群より選択される１以上のものである、請求項１２記載の有害物質検出用キット。
【請求項１４】
ヌクレオチド分解酵素がジャガイモ由来Ａｐｙｒａｓｅ及び／又はＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅである、請求項９記載の有害物質検出用キット。
【請求項１５】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ヌクレオシド三リン酸分解活性を有する蛋白質
【請求項１６】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ヌクレオシド三リン酸分解活性を有する蛋白質
【請求項１７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド三リン酸分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１８】
請求項１６又は１７記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１８記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項２０】
請求項１９記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からヌクレオチド分解酵素蛋白質を採取することを特徴とするヌクレオチド分解酵素蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
被験試料中の有害物質を総合的に判定するための有害物質の検出方法に関する。また本発明は、新規なヌクレオチド分解酵素遺伝子及び蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
河川や湖沼など水道水源の保全、及び上下水道、工業用排水、廃棄物処分場排水などの排水の水質管理を目的とした水質監視においては、週毎、月毎などで定期的に採水試料の化学分析が実施されている。これに対して、化学分析によらない総括的な生体毒性を評価するための生物検定法（以下、バイオアッセイという）が検討され、その一部は既に実用化されている。例えば、ドイツ排水令においては、排水水質監視のバイオアッセイとして、魚類の致死効果、ミジンコの遊泳阻害効果、藻類の生長阻害効果、発光細菌の発光阻害効果、ｕｍｕ試験による変異原性などを採用している。
【０００３】
一方、発酵等の工業プロセスの管理や医学における臨床検査などの分野においては、核酸、アミノ酸、脂質などの特定の化学成分の分析を目的として様々なバイオセンサーが開発されており、最近では、このようなバイオセンサーの環境計測への適用が検討されている。例えば、生物化学的酸素要求量（ＢＯＤ）を対象とした、又は、重金属、シアン、リン酸、硝酸、硫酸、アンモニア、界面活性剤などの特定の成分を対象とした、微生物センサーや酵素センサーなどのバイオセンサーが提案されている。また、水質の総括的な有害性の評価を目的としたバイオセンサーとしては、環境変化に対する感受性が高い硝化細菌などの微生物の呼吸阻害効果を利用して有害性を評価すべくバイオセンサーが開発されている（特許文献１）。
【０００４】
水環境において問題となる有害物質は多種多様であり、また、単一の化学物質のみでは有害性は低いが、複数の化学物質が共存した場合に複合的な作用によって生体毒性を示すようになる場合もある。しかし、個々の化学物質を網羅的に分析することには技術的及び／又は時間的な限界がある。
【０００５】
一方、様々な生物体を用いたバイオアッセイは、生体毒性を評価できる利点があるが、生物体には個体差があり、また、有害成分以外の物理的な環境、例えば、水温、ｐＨ、浸透圧などによって判定結果が安定しない。さらに、バイオアッセイの種類によっては、有害成分を判定するために生物体を供試水に長時間にわたって暴露する必要があり、必ずしも早期警戒システムとしては適していない。また、生きている生物又は微生物を使用したバイオセンサーは、生物体の増殖や死滅などによって微生物群の生理状態が刻一刻と変化するため、維持管理が難しいという課題を抱えている。
【０００６】
従って、有害物質を検出するための、簡便かつ安定した検出系の開発が望まれていた。
【特許文献１】
特開平１１−１５３５７４号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、個々の化学物質を網羅的に分析することなく、有害性を評価する技術として、従来のバイオアッセイの問題点を克服し、簡便かつ短時間で安定した検査結果を得ることができる有害物質の検出方法及び簡易な検出用キットを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を達成するため鋭意検討した結果、植物体の環境ストレスに対する応答に着目し、そのような生体応答の引き金となる環境ストレスを受容する酵素蛋白質の１種であるヌクレオチド分解酵素を利用することにより、複数種の有害物質を総合的に検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。また本発明者は、上記検討過程において、新規なヌクレオチド分解酵素を見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ヌクレオチド分解酵素を用いることを特徴とする、有害物質の検出方法である。
上記検出方法は、例えば以下のステップを含むものである：
（ａ）ヌクレオチド分解酵素に基質及び被験試料を添加及び混合するステップ；
（ｂ）酵素反応を行うステップ、並びに
（ｃ）反応系におけるリン酸濃度を測定するステップ。
【００１０】
上記検出方法において、ヌクレオチド分解酵素としては、植物、例えばマメ科に属する植物の細胞壁に由来するものが挙げられる。また該マメ科に属する植物としては、ササゲ（Ｖｉｇｎａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）、ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｓｏｊａ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が挙げられる。また、ヌクレオチド分解酵素としては、ジャガイモ由来Ａｐｙｒａｓｅ又はＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅもまた使用することができる。
また上記検出方法は、特に水道水源、上下水道又は排水の水質管理に用いることができる。
【００１１】
本発明はまた、ヌクレオチド分解酵素を含むことを特徴とする、有害物質検出用キットである。該キットは、さらに、緩衝液、ヌクレオチド分解酵素の基質、反応停止液、発色液、及び／又は発色停止液を含むものであってもよい。また該キットは、さらに、凝集剤、及び／又は凝集助剤を含むものであってもよい。
【００１２】
上記有害物質検出用キットにおいて、ヌクレオチド分解酵素としては、植物、例えばマメ科に属する植物の細胞壁に由来するものが挙げられる。また該マメ科に属する植物としては、ササゲ（Ｖｉｇｎａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）、ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｓｏｊａ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が挙げられる。また、ヌクレオチド分解酵素としては、ジャガイモ由来Ａｐｙｒａｓｅ及びＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを例示することができる。
【００１３】
さらに本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質である。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ヌクレオシド三リン酸分解活性を有する蛋白質
【００１４】
さらにまた本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ヌクレオシド三リン酸分解活性を有する蛋白質
【００１５】
上記遺伝子としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものが挙げられる。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド三リン酸分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００１６】
また本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクターである。
本発明はさらに、上記ベクターを含む形質転換体である。
本発明はまた、上記形質転換体を培養し、得られる培養物からヌクレオチド分解酵素蛋白質を採取することを特徴とするヌクレオチド分解酵素蛋白質の製造方法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る有害物質の検出方法（以下、本検出方法という）は、ヌクレオチド分解酵素を用いることを特徴とするものであり、ヌクレオチド分解酵素の酵素活性が、有害物質の存在下において阻害されるという事象を利用するものである。
【００１８】
現在、植物病理学の分野においては、植物と病原体との相互作用について物質レベルでの解明が進んできている。植物は病原体から自身を守るために様々な防御反応を示すことが明らかとなっており、病原体に由来するある種の化学物質が引き金となって、植物は防御反応を起動して病原体の侵入を阻止する抵抗性を発揮する。また、ある種の病原体は植物が防御反応を起動することを阻止するための化学物質を産生し、植物体への侵入を可能にしている現象が報告されている（三瀬ら、植物の生物ストレス応答の解析とその利用、平成８年度開始未来開拓学術研究推進研究プロジェクト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｐｓ．ｇｏ．ｊｐ／ｊ−ｒｆｔｆ／ｐｒｏｊｅｃｔｐｄｆ／ｌ／９６ｌ００６０３．ｐｄｆ）。これらの報告のように、植物と病原体との相互作用について物質レベルでの解明が進んだ結果、植物体のある種の酵素蛋白質の活性の変動と植物体の防御反応発現との間に関連があることが明らかとなりつつある。例えば、マメ科に属する植物の細胞壁内に存在するヌクレオチド分解酵素は、有害な化学物質に対する応答として酵素活性の変化を示すことが報告されている（三瀬ら、前掲）。
【００１９】
本発明者は、ヌクレオチド分解酵素蛋白質の活性変化を検査することによって植物体が受容している化学的なストレスの有無について評価できることを見出し、実験的に確認した。すなわち、ヌクレオチド分解酵素活性の変化を利用することにより、有害物質を検出することができる。
【００２０】
本発明に係るヌクレオチド分解酵素の調製について説明する。
上述したように、本検出方法においては、ヌクレオチド分解酵素を使用する。「ヌクレオチド分解酵素」とは、ヌクレオシド三リン酸分解活性又はヌクレオシド二リン酸分解活性を有する、すなわちＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ＴＴＰ（チミジン三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン三リン酸）などのヌクレオシド三リン酸を分解して、ヌクレオシド二リン酸とリン酸イオンを遊離させる活性を有する酵素、又は、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、ＧＤＰ（グアノシン二リン酸）、ＣＤＰ（シチジン二リン酸）、ＴＤＰ（チミジン二リン酸）、ＵＤＰ（ウリジン二リン酸）などのヌクレオシド二リン酸を分解して、ヌクレオシド一リン酸とリン酸イオンを遊離させる活性を有する酵素を指す。本発明において利用可能なヌクレオチド分解酵素は、上記ヌクレオシド三リン酸分解活性を有する若しくは上記ヌクレオシド二リン酸分解活性を有するものであれば特に限定されない。例えば、ヌクレオチド分解酵素としては、イヌ、ブタなどの動物の組織由来のもの（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＵＢＭＢ）Ｅｎｚｙｍｅ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ：ＥＣ．３．６．１．３）、植物の組織由来のもの（例えば、ＥＣ．３．６．１．５）、植物の細胞壁由来のものなどが挙げられる。
【００２１】
特に、本検出方法においては、マメ科に属する植物の細胞壁に由来するヌクレオチド分解酵素が好ましい。マメ科に属する植物の細胞壁に由来するヌクレオチド分解酵素としては、例えば、ササゲ（Ｖｉｇｎａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）、ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅｓｏｊａ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）などに由来するものが挙げられる。
また、ヌクレオシド三リン酸分解活性を有する限り、ヌクレオチド分解酵素蛋白質の部分ペプチドを用いることもできる。
【００２２】
ヌクレオチド分解酵素は、下記「（１）ヌクレオチド分解酵素の単離・精製」に記載のように、植物などの組織から当技術分野で公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。また、ヌクレオチド分解酵素蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる（下記「（３）組換えベクター及び形質転換体の作製」、並びに「（４）ヌクレオチド分解酵素の製造」を参照）。あるいは、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成方法、例えば固相合成法などによって製造することもできる。
【００２３】
本検出方法においては、ヌクレオチド分解酵素として市販品を用いることも可能である。そのような市販酵素としては、限定するものではないが、馬鈴薯由来Ａｐｙｒａｓｅ（ＥＣ．３．６．１．５）（シグマアルドリッチ社）、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（ＥＣ．３．６．１．３）（シグマアルドリッチ社）などが挙げられる。
【００２４】
（１）ヌクレオチド分解酵素の単離・精製
ヌクレオチド分解酵素は、生物、例えば植物の細胞又は組織（例えば細胞壁）から単離することができる。この酵素は、細胞膜にも存在するが、膜結合型のヌクレオチド分解酵素は、酵素活性の発現にリン脂質などの膜成分が必要であり、さらに、膜成分の性状に酵素活性が大きく影響を受けるために、取扱いが難しく、安定した酵素活性の確保が難しい。このような理由から、本発明においては、膜成分に依存しない、遊離の酵素蛋白質として存在しうる植物細胞壁に由来するヌクレオチド分解酵素を用いることが好ましい。
【００２５】
ヌクレオチド分解酵素を植物から抽出する方法は、まず、植物組織を破砕して細胞壁画分を得、次いで、該細胞壁画分から蛋白質を溶離させ、さらに、必要に応じて濃縮及び／又は脱塩することによって得ることができる。
【００２６】
より詳細に説明すると、植物の葉、茎、胚軸又は芽生えを、食塩水又は好適な緩衝液に浸漬し、ミキサー又は乳鉢で破砕する。この破砕物を遠心分離して得られる沈殿物、又は破砕物のろ過により得られる残渣を回収することにより、細胞壁画分を得ることができる。
【００２７】
前記した沈殿物又はろ過残渣を、終濃度０．１〜３Ｍ、好適には０．５〜１Ｍとなるよう塩化ナトリウム水溶液に分散させ、４℃から室温にて、緩やかに混合攪拌して、細胞壁画分から蛋白質成分を遊離させる。この溶液を遠心分離して得られる上澄み液、又は溶液をろ過して得られるろ液を回収することにより、細胞壁由来の蛋白質を含む溶液を得ることができる。この細胞壁由来の蛋白質を含む溶液は、そのまま無処理で本検出方法に使用することができる。
【００２８】
あるいは、上記細胞壁由来の蛋白質を含む溶液は、当技術分野で公知の濃縮、脱塩手法、例えば硫安塩析、限外ろ過、透析などにより、濃縮又は脱塩することが望ましい。また、当技術分野で公知の蛋白質精製法を利用して、細胞壁由来の蛋白質を含む溶液からヌクレオチド分解酵素蛋白質を分離精製することができる。例えば、細胞壁由来の蛋白質を含む溶液に、アデノシン三リン酸などのヌクレオチドを結合した樹脂を添加して所定時間反応させた後に、遠心分離又はろ過することによって、ヌクレオチド分解酵素蛋白質が結合した樹脂を分離回収することができる。あるいは、ヌクレオチドを結合した樹脂を充填したカラムに細胞壁由来の蛋白質を含む溶液を通過させるカラムクロマトグラフィーによって、ヌクレオチド分解酵素蛋白質を吸着分離することもできる。ヌクレオチド分解酵素蛋白質が結合した樹脂からヌクレオチド分解酵素蛋白質を溶離させるには、公知の手法を採用することができ、例えばｐＨや塩濃度などを変化させればよい。例えば、塩溶液で溶離させるには、０〜３Ｍの範囲で一定濃度の塩化ナトリウム水溶液を使用して溶液部を回収することができる。また、０〜３Ｍの範囲で塩化ナトリウム水溶液の濃度を徐々に変化させて溶液部を順次回収してもよい。
【００２９】
（２）ササゲ由来のヌクレオチド分解酵素（ＶｓＮＴＰａｓｅ１）
本発明者は、研究過程において、マメ科に属する植物であるササゲ（Ｖｉｇｎａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から、新規なヌクレオチド分解酵素を単離し、その遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を決定することに成功した。本検出方法においては、このササゲ植物壁由来のヌクレオチド分解酵素（以下、「ＶｓＮＴＰａｓｅ１」という）を利用することも可能である。以下に、ＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子及び蛋白質について説明する。
【００３０】
ＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子は、ササゲ組織より抽出したリボ核酸（ＲＮＡ）から精製したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）又は相補鎖デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）ライブラリーからのスクリーニングにより得ることができる。ＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子の供給源となる植物は、例えば成長した植物体、植物器官（例えば葉、茎等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）、又は植物培養細胞（例えばカルス）などである。
【００３１】
ササゲからのｍＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。
ｍＲＮＡの調製は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、上記供給源から、グアニジウムチオシアネート−トリフルオロ酢酸セシウム法などにより全ＲＮＡを抽出した後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡをさらに分画してもよい。
【００３２】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そしてこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。
【００３３】
上記のようにして得られる形質転換体から目的のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を有する株を選択するには、例えば、他の植物に由来するヌクレオチド分解酵素蛋白質のアミノ酸配列に対応する縮重センスプライマー及び縮重アンチセンスプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、得られた断片をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法、あるいはλファージ（λｇｔ１１等）を用いた場合は、λｇｔ１１インサート増幅用のプライマーを用いてＰＣＲを行う方法を採用することができる。
【００３４】
このようにして得られたＤＮＡ増幅断片を、３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００３５】
好ましくは、クローニングした部分配列のうち配列番号３に示す配列を有するオリゴヌクレオチドと、ライブラリー作製時にｃＤＮＡをλファージＤＮＡにライゲーションしたｃＤＮＡ集団のλファージＤＮＡの配列を有するオリゴヌクレオチドとの間でＰＣＲ法を行い、より長い部分配列を取得する。
その取得した配列を基にしてＰＣＲ法によりプローブを作製し、ｃＤＮＡライブラリーから該遺伝子をスクリーニングすることが望ましい。
【００３６】
次に、得られたクローンから全長のｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡのクローニングには、例えばＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）法が用いられる。ＲＡＣＥ法とは、ｃＤＮＡの５’又は３’欠失部位をＰＣＲにより迅速に回収する方法である。なお、ＲＡＣＥ法は、市販のキット（ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を用いて行うこともできる。
【００３７】
本発明においては、上記スクリーニングにおいて得られたｃＤＮＡの単離クローンについて、ＰＣＲ産物をテンプレートにしてｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ等）を用いて配列決定が行われる。
【００３８】
配列番号１にＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子の塩基配列を、配列番号２にＶｓＮＴＰａｓｅ１のアミノ酸配列を例示する。
但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質が、ヌクレオシド三リン酸分解活性を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。ヌクレオシド三リン酸分解活性とは、上述した通りヌクレオシド三リン酸を分解してリン酸イオンを遊離させる活性を指し、例えば、基質であるヌクレオシド三リン酸と、室温〜３７℃にて、１〜６０分間反応させた場合に、反応生成物であるリン酸量を測定することにより確認することができる。
【００３９】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のヌクレオチド分解酵素蛋白質に含まれる。
【００４０】
上記遺伝子は、ササゲ（Ｖｉｇｎａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）などのマメ科植物から調製したＤＮＡから、上記遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより調製することができる。
【００４１】
また、ＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子の塩基配列が確定しているため、化学合成によってこの遺伝子を得ることもできる。また、部位特異的突然変異誘発法等によってＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子の変異型であってヌクレオシド三リン酸分解活性を有するものを合成することもできる。なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｒａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。
変異した遺伝子により作製される組換え蛋白質が酵素活性を有するか否かは、変異蛋白質のヌクレオシド三リン酸分解活性を測定することにより確認することができる。
【００４２】
さらに、上記塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド三リン酸分解活性若しくはヌクレオシド二リン酸分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子も本発明のＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が０．３〜１．５Ｍ、好ましくは０．７〜０．９Ｍであり、温度が５０〜８０℃、好ましくは６８℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍクエン酸ナトリウム、０．１質量％フィコール４００、０．１質量％ポリビニルピロリドン、０．１質量％牛血清アルブミン、０．１質量％ドデシル硫酸ナトリウムであり、洗浄の条件が０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０７Ｍクエン酸ナトリウム、０．１質量％ドデシル硫酸ナトリウムの場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。
【００４３】
ＶｓＮＴＰａｓｅ１は、非常に安定なヌクレオシド三リン酸分解活性を有するものであり、本検出方法以外にも、このような活性を利用する多くの用途において用いることが可能である。
【００４４】
（３）組換えベクター及び形質転換体の作製
本発明の組換えベクターは、上記ＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００４５】
ベクターには、宿主で自律的に増殖し得るファージミド又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，ｐＥＴ１６ｂ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージミドＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０，λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを用いて形質転換体を作製することもできる。
【００４６】
ベクターに本発明のＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００４７】
本発明のＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明のＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。さらに、大腸菌及び酵母などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種のシャトルベクターを使用することもできる。このようなベクターについても、前記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
【００４８】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後に連結させ、組換えベクターを作製する。
【００４９】
形質転換に使用する宿主としては、導入される遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００５０】
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５１】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されない。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００５２】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。プロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００５３】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００５４】
形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択する。
【００５５】
以上、ＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子を含む組換えベクターを作製し、宿主を形質転換する手法を説明したが、ＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子の代わりに任意のヌクレオチド分解酵素遺伝子を用いることにより、任意のヌクレオチド分解酵素を発現する形質転換体を作製することが可能である。また、ヌクレオチド分解酵素遺伝子は、組換えベクターを作製する場合には、その全長コード配列をベクターに挿入してもよいし、ヌクレオチド分解酵素活性を保持する部分ペプチドをコードする部分配列であってもよい。
【００５６】
（４）ヌクレオチド分解酵素の製造
本発明において、目的のヌクレオチド分解酵素は、そのヌクレオチド分解酵素遺伝子を保有する前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００５７】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５８】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約室温〜４２℃で約１〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。必要に応じて、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を添加してｐＨを調整してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
【００５９】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５容積％ＣＯ２存在下、３７℃で約１〜７日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６０】
培養後、ヌクレオチド分解酵素蛋白質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより蛋白質を抽出する。また、ヌクレオチド分解酵素蛋白質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、蛋白質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からヌクレオチド分解酵素蛋白質を単離精製することができる。
【００６１】
ヌクレオチド分解酵素蛋白質が得られたか否かは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動ないしは硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等により確認することができる。
上述のようにして遺伝子組換え手法により作製されたヌクレオチド分解酵素蛋白質も同様に本検出方法に用いることができる。
【００６２】
次に、本発明に係る有害物質の検出について説明する。
本検出方法においては、上記ヌクレオチド分解酵素と基質とを、被験試料の存在下にて反応させ、酵素反応により生成されるリン酸量を測定する。ここで、被験試料に有害物質が含まれる場合には、酵素反応が阻害されるため、生成リン酸量が低減することとなる。従って、本検出方法により、被験試料中に有害物質が含まれるか否かを判定することができる。本検出方法において、「検出」とは、被験試料中に有害物質が含まれるか否かを判定すること、並びに、被験試料中の有害物質量又は有害物質の有害性の程度を定量的又は定性的に判定することを指す。
【００６３】
本検出方法においては、ヌクレオチド分解酵素を使用する。ヌクレオチド分解酵素は、上記のヌクレオチド分解酵素の調製の項に記載のようにして得ることができる。ヌクレオチド分解酵素は、溶液酵素系として、純水または緩衝液（例えば、トリスバッファー、グッドバッファーなど）に溶解した溶液として使用することができる。あるいは、ヌクレオチド分解酵素は、固定化酵素系として、ガラス、プラスチック、金属などの基材に固定化した担体を反応容器内に装着することにより、あるいは当該酵素蛋白質を反応容器内壁に直接固定化することにより使用することもできる。
【００６４】
本検出方法は、前処理工程、混合工程、反応工程、分析工程、及び／又は判定工程を含むものであり、以下に本検出方法について説明する。
本検出方法においては、酵素反応を行う前に被験試料に前処理を行ってもよい。前処理工程は、例えば、被験試料中にリン酸濃度測定に影響を及ぼす成分の混入が想定される場合には、それを回避するための前処理工程を行う。例えば、このような前処理工程としては、凝集沈殿処理やろ過処理などが挙げられる。
【００６５】
続いて、上記ヌクレオチド分解酵素に基質及び被験試料を添加・混合して、酵素反応を行う（混合工程・反応工程）。
混合工程とは、反応工程に供する反応液を調製する工程であり、被験試料又は前処理した被験試料と基質溶液とを反応容器内で混合するか、あるいは、予め被験試料と基質溶液とを混合した後にその混合溶液を反応容器に送液する工程である。溶液酵素系では、ヌクレオチド分解酵素を含む酵素液も併せて添加・混和する。また固定化酵素系では、反応容器の内壁に予め酵素を固定化した、又は、酵素を固定化した板状の基材を反応容器に予め装填した、又は、酵素を包埋したゲル（例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ゲルなど）粒子を反応容器に予め装填した、ベッセル型若しくは管型の反応容器を用いればよい。
【００６６】
基質溶液は、ヌクレオチド分解酵素の基質を含む、純水または緩衝液（例えば、トリスバッファー、グッドバッファーなど）などの溶液とすることができる。基質は、用いるヌクレオチド分解酵素の性質に応じて選定すればよく、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ＴＴＰ（チミジン三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン三リン酸）、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、ＧＤＰ（グアノシン二リン酸）、ＣＤＰ（シチジン二リン酸）、ＴＤＰ（チミジン二リン酸）、ＵＤＰ（ウリジン二リン酸）、又はそれらの金属塩からなる群より１種又は２種類以上の混合物として用いることができる。用いるヌクレオチドにより、酵素活性の程度や阻害物質に対する応答特性などが異なることがあるため、目的に応じて最適なヌクレオチド基質を選定すればよい。
【００６７】
本検出方法において、有害物質の検出対象となる被験試料は、有害物質が含まれているかどうかを調べようとする試料であれば特に限定されず、例えば、水（飲料水・排水・河川水・湖沼水・地下水・処理水）、土壌またはその溶出液、廃棄物またはその溶出液、食品またはその溶出液などが挙げられる。特に、本検出方法は、水中の有害物質の検出に有用である。
【００６８】
次の反応工程においては、上記混合工程において混合した反応液を、１０℃〜４０℃の範囲の定温で、好適には２０〜３７℃の定温で、１分以上、好適には５〜６０分間の定時間にわたり、酵素反応させる。
【００６９】
続いて、反応工程を経た反応液についてリン酸濃度を分析する（分析工程）。リン酸濃度の測定は、当技術分野で公知の手法により行うことができ、例えば分光光度法又はイオンクロマト法ないしはイオン電極法などにより行うことができる。
【００７０】
分光光度法では、モリブデン青法など既知の方法（例えば、Ｐｅｒｌｉｎ　＆Ｓｐａｎｓｗｉｃｋ（１９８１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８，ｐ５２１；「下水試験方法」；「上水試験方法」など）を用いることができる。モリブデン青法とは、モリブデン試薬がリンと反応してリン−モリブデン酸複合体を生成し、適当な条件下では、モリブデン青を生じて青色に発色することを利用するものであり、リンの定量、リン含有化合物の検出に用いられている方法である。また、分光光度計は、当技術分野で周知であり、例えば日立製作所社製のＵ−２０００型、ナルジェヌンク社製のＮＪ−２３００型などが挙げられる。さらに、既存のリン酸自動分析装置を連結させて、それによって反応液中のリン酸濃度を分析することもできる。市販のリン酸自動分析装置としては、例えば、テクニコン社製のＡＡ−ＩＩ型などが挙げられる。
【００７１】
また、イオン電極法では、市販のリン酸イオン電極などを用いることができる。また、イオンクロマト法では、既存のイオンクロマト分析装置、例えばダイオネクス社製のＤＸ−３００型などを用いることができる。
あるいは、固定化酵素系においては、リン酸イオンを検出するセンサーと共に一体型の酵素センサーとして利用することにより、簡便にリン酸濃度を測定することが可能である。
【００７２】
続いて、上記分析工程で測定したリン酸濃度に基づいて、被験試料中の有害物質混入の有無や程度を判定する（判定工程）。本検出方法において、有害物質としては、ヌクレオチド分解酵素の活性を阻害する物質であれば特に限定されず、例えば、重金属、例えば、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）、クロム（Ｃｒ）、銅（Ｃｕ）ニッケル（Ｎｉ）など；有機塩素化合物、例えばダイオキシン類として、２，３，７，８−四塩化ダイオキシン（ＴＣＤＤ）等のポリ塩化ジベンゾ−パラジオキシン（ＰＣＤＤｓ）、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）及びコプラナーポリクロロビフェニル（ＰＣＢ）など；その他の有機塩素化合物、例えば四塩化炭素、ＰＣＢ、クロロベンゼン類、トルエン、キシレン、アントラセン、フェナントレン、アゾ色素など；多環芳香族化合物、例えばナフタレン、フルオレン、フルオランテン、ピレン、クリセンなど；界面活性剤ないしはその分解物、例えばノニルフェノール類、アルキルフェノール類など；プラスチック可塑剤、例えばフタル酸エステル類；農薬、例えばダイアノジン、フェニトロチオン、シマジン、チウラム、フェニトロチオンなどが挙げられる。
【００７３】
上記ヌクレオチド分解酵素活性を阻害する物質は、生物に対し有害であると考えられる。ある物質がヌクレオチド分解酵素活性の阻害物質であるか否かは、被験物質の存在下においてヌクレオチド分解酵素と基質とを反応させ、生成されるリン酸濃度が低下するかどうかを調べることにより確認することができる。
【００７４】
本検出方法においては、被験試料中の有害物質の種類を決定するものではなく、被験試料中にどの程度の有害物質が存在するか否かを判定するものである。例えば、複数種の有害物質が共存するような複合汚染などを検出することが可能である。複数種の有害物質が共存する場合には、その有害性は、相加的になることもあるが、一般的には相乗的に増大することが多い。本検出方法では、そのような複数種の有害物質の相乗的有害性を、総合的に判定することが可能である。
【００７５】
本検出方法により、被験試料存在下におけるヌクレオチド分解酵素活性が低下している場合、すなわち反応生成物であるリン酸の濃度が低下している場合には、被験試料中に有害物質が存在すると判定することができる。
【００７６】
あるいは、本検出方法では、有害物質の量又は有害物質の有害性の程度を定量的又は定性的に判定することも可能である。そのような定量的又は定性的な検出は、比較対照の溶液についてのリン酸濃度分析値との比較によって行うことができる。比較対照の溶液は、例えば、被験試料の代わりに純水又は緩衝液（例えば、トリスバッファー、グッドバッファー）を用いたものを指し、前記混合工程から分析工程を同様に行ってリン酸濃度分析値を測定する。
【００７７】
被験試料についてのリン酸濃度分析値が、比較対照溶液についてのリン酸濃度分析値を下回る、例えば、約０〜９０％、好ましくは０〜５０％の場合に、被験試料は有害物質を含むと判定できる。
【００７８】
あるいは、被験試料と比較対照溶液とのリン酸濃度を利用することにより、例えば下式（Ｉ）によって、被験試料のヌクレオチド分解酵素活性に対する阻害率（％）を算定することができる。
【００７９】
【数１】
2004105133.tif 000002
【００８０】
式（Ｉ）において、リン酸濃度１は被験試料を添加した場合のリン酸濃度分析値を、リン酸濃度２は比較対照溶液を添加した場合のリン酸濃度分析値を、リン酸濃度３は前記反応工程を省略した場合のリン酸濃度分析値あるいは前記混合工程において被験試料および酵素液の代わりに純水または緩衝液（例えばトリスバッファー、グッドバッファー）を添加した場合のリン酸濃度分析値をそれぞれ意味している。一般に、式（Ｉ）で算定される阻害率が大きいほど、被験試料中の有害物質の混入量が多い、又は有害物質の有害性の程度が高いと判定できる。
【００８１】
本検出方法においては、被験試料中に、有害物質が一定の基準を超えて存在しているかどうかを判定することもできる。ここで、一定の基準とは、任意に決定できる値であるが、例えば、有害物質についての管理基準が設定されている場合にはこの管理基準に準じて決定することができる。すなわち、有害物質の管理基準が設定されている場合には、その管理基準を越えている場合に陽性の結果を得られるように検出系の判定基準を設定することができる。判定基準は、既知濃度の有害物質又は既知の程度の有害性を有する有害物質を含む比較対照試料を用いて、予め検量線などを作製することにより決定する。従って、本検出方法により、例えば水などの被験試料中の有害物質を経時的にモニターし、被験試料を有害物質について管理することが可能となる。
【００８２】
また、本検出方法は、水処理プロセスの運転制御方法において利用することもできる。水処理プロセスにおいて、有害物質が存在する場合の水処理措置としては、高度処理があり、例えば有害物質が存在する場合には、この高度処理が働くよう水処理が制御される。高度処理とは、通常の処理（例えば、凝集、沈殿、ろ過、塩素消毒など）に加えて、生物処理、オゾン処理、紫外線処理、オゾン＋紫外線処理などの促進酸化処理、粒状活性炭処理などを行うことを指す。このような高度処理を行うことによって、水中に存在する有害物質を除去することが可能である。排水の水処理プロセスの運転制御法の一例として、図１に示すように、排水処理プロセスの下流で放流水を採取してそれを被験試料として用いて検査し、有害物質混入の可能性が認められた場合には、例えば次の３つの措置を講じることができる：すなわち、▲１▼高度処理（１）の処理条件を変更する、▲２▼高度処理（２）を補助的に作動させる、▲３▼放流水の放流を停止する。また、図２に示すように、浄水プロセスの上流で原水を採取してそれを被験試料として用いて検査し、有害物質混入の可能性が認められた場合には、例えば次の２つの措置を講じることができる：すなわち、▲１▼原水の取水を停止する、▲２▼後段の高度処理を作動させる。このように、本検出方法を利用することにより、水処理プロセスの運転制御法において、排水及び浄水中の有害物質を経時的にモニターし、排水及び浄水の有害性を管理・制御することができる。
【００８３】
次に、本発明に係る有害物質検出用キットについて説明する。
本検出方法は、有害物質検出用キットを用いて非常に容易かつ迅速に実施することができる。ここで、有害物質検出用キットは、少なくともヌクレオチド分解酵素を含んでいる。また、検出用キットは、さらに、反応液を構成する緩衝液、基質、反応停止液、発色液、発色停止液、などを含んでもよい。また、有害物質検出用キットは、上記酵素反応分析用試薬類に加えて、前処理用の試薬として凝集剤、凝集助剤など、あるいは前処理用の器材としてろ過膜などをさらに含んでいてもよい。
【００８４】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８５】
〔実施例１〕ササゲ細胞壁由来のヌクレオチド分解酵素の精製
本実施例においては、ササゲ黄化胚軸の破砕物から細胞壁画分を得、当該画分よりヌクレオチド分解酵素蛋白質を精製した。
【００８６】
ササゲ黄化胚軸からの細胞壁画分の調製方法は、文献（Ｋｉｂａら（１９９５）Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３６，ｐ８０９）に準拠して行った。すなわち、ササゲ種子を水道水で膨潤させてからバーミキュライトをいれたプラスチック容器に播種し、暗所・２０℃にて２週間程度栽培してササゲの黄化胚軸を得た。当該黄化胚軸１５ｋｇを等質量の０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に浸し、ミキサーで破砕した。破砕液に等容量の１Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加え、室温にて１５分間混和した後に１０分間遠心分離（１０，０００×ｇ；４℃）した。遠心上清を回収し、限外ろ過（排除限界１０ｋＤａ；Ｃｅｎｔｒｉｃｅｌｌ　２０；米国Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．）にて脱塩透析し、細胞壁画分を含む透析膜内部液を回収した。
【００８７】
回収した透析膜内部液に硫酸アンモニウム粉末を質量比で６０％程度になるまで徐々に加えて溶解させた後、２０分間遠心分離（１０，０００×ｇ；４℃）して遠心上清を回収した。当該遠心上清に硫酸アンモニウム粉末をさらに添加して最終濃度８０％（質量比）程度とした。当該溶液を４℃にて１２時間緩やかに撹拌した後、２０分間遠心分離（１０，０００×ｇ；４℃）した。遠心上清を廃棄し、沈殿物を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に溶解し、限外ろ過（排除限界１０ｋＤａ；Ｃｅｎｔｒｉｃｅｌｌ　２０；米国Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．）にて濃縮した。濃縮液を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＭＥＳ（ｐＨ７．６）で希釈し、再び前記と同様に限外ろ過にて濃縮し、この操作を２度繰り返した。このようにして得た濃縮液を次の操作に供した。
【００８８】
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡化したＡＴＰ結合アガロース（米国Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ　Ｌｔｄ．）をカラムに充填し、前記濃縮液を通水した。その後、カラムからの流出液の吸光度（波長２８０ｎｍ）が０．０１以下になるまで、カラムに５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を通水した。
【００８９】
カラムに保持されているＡＴＰ結合性の蛋白質は、０．５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを添加した５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）にて溶出させた。溶出液を前記と同様に限外ろ過にて濃縮し、さらに濃縮した液を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＭＥＳ（ｐＨ８．０）で希釈して再び同様に限外ろ過にて濃縮した。
【００９０】
２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ；スウェーデンＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．）に、前記濃縮液を通水し、さらに、カラムからの流出液の吸光度（波長２８０ｎｍ）が０．０１以下になるまで、カラムに２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を通水洗浄した。
【００９１】
カラムに保持されているＡＴＰ結合性の蛋白質は、塩化ナトリウムを添加した２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて溶出させ、回収した。塩化ナトリウムの濃度は０〜２５０ｍＭへと徐々に高めた。カラムからの溶出液を１ｍＬずつ分離回収した。
【００９２】
それぞれの画分について、吸光度（波長２８０ｎｍ）とＡＴＰ分解活性を測定した。ＡＴＰ分解活性の測定は、既存の文献（Ｐｅｒｌｉｎ　＆　Ｓｐａｎｓｗｉｃｋ（１９８１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８，ｐ５２１など）に記載の方法で実施した。すなわち、終濃度３ｍＭとなるようにＡＴＰ及びＭｇＳＯ４を添加した３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ（ｐＨ６．５）に、前記酵素液を一定量添加した反応液を調整し、３７℃にて３０分間反応させた後に、遊離のリン酸濃度をモリブデン青法で分光分析した。モリブデン青法では、１０質量％アスコルビン酸水溶液と、０．４２質量％でモリブデン酸ナトリウムを溶解させた０．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を、発色反応を行う数分前に１：５の割合で混合して発色試薬として用いた。この発色試薬を酵素反応後の反応液に対して２容量を添加し、さらに２５℃にて１５分間反応させて発色させ、当該溶液の波長８２０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で計測し、遊離のリン酸濃度を算出した。リン酸濃度を反応液中の蛋白質濃度と酵素反応時間とで除して、単位時間当たり及び単位蛋白質濃度当たりのリン酸生成量を算出してＡＴＰ分解活性とした。
【００９３】
ＡＴＰ分解活性が確認された画分を統合し、前記と同様に限外ろ過にて濃縮し、さらに濃縮した液を３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＭＥＳ（ｐＨ６．５）で希釈して再び限外ろ過にて濃縮した。これにより、ササゲ黄化胚軸の細胞壁画分由来のヌクレオチド分解酵素蛋白質を精製できた。
【００９４】
図３に陰イオン交換カラムからのヌクレオチド分解酵素蛋白質の溶出に関する結果を示す。蛋白質濃度の指標となる波長２８０ｎｍの吸光度のピークとＡＴＰ分解活性のピークとが一致していることから、ヌクレオチド分解酵素蛋白質を精製できていることが明らかである。
【００９５】
さらに、本実施例で得られた精製物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、泳動後のポリアクリルアミドゲルを銀染色した結果を図４に示す。図４より、本実施例において精製した蛋白質溶液には分子量５０ｋＤａ程度の蛋白質が主成分として含まれていることが示される。
【００９６】
〔実施例２〕有害物質によるヌクレオチド分解酵素の阻害効果
本実施例においては、ササゲ黄化胚軸から粗精製したヌクレオチド分解酵素について有害物質による阻害効果を調べた。
【００９７】
ササゲ種子を水道水で膨潤させてからバーミキュライトをいれたプラスチック容器に播種し、暗所・２０℃にて２週間程度栽培してササゲの黄化胚軸を得た。当該黄化胚軸１００ｇを細断し、後述の磨砕用緩衝液１００ｍＬを添加して乳鉢で磨砕した。磨砕用緩衝液は、７５ｍＭ　３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（水酸化カリウムにてｐＨ７．６に調整）、８５．６ｇ／Ｌショ糖、５ｍＭエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．２Ｍサリチルヒドロキシサム酸（ＳＨＡＭ）、２００ｍｇ／Ｌブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、５ｇ／Ｌ牛血清アルブミン、及び５６０ｍｇ／Ｌメタ重炭酸カリウムとした。
【００９８】
前記した黄化胚軸の磨砕物をガーゼで濾し、残渣を回収した。当該残渣を後述の希釈用緩衝液１００ｍＬに懸濁し、再び乳鉢で磨砕した。当該操作をのべ５回繰り返した。希釈用緩衝液は、５ｍＭ　ＭＯＰＳ（水酸化カリウムにてｐＨ６．５に調整）、８５．６ｇ／Ｌ　ショ糖、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ　ＰＭＳＦ、７５０ｍｇ／Ｌ　ＫＣｌ、及び１５０ｍｇ／Ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）とした。
【００９９】
さらに、得られた磨砕物をガーゼで濾し、残渣を回収した。当該残渣を等重量の１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液中に懸濁させ、４℃にて１時間静置した後、ガーゼで濾し、ろ液を回収した。
【０１００】
回収したろ液に質量比８０％で硫安を加え、４℃にて１時間、穏やかに攪拌して硫安を溶解させた。さらに、遠心分離（１０，０００ｒｐｍにて２０分間）した後、遠心上清を除去し、残った沈殿物を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に溶解した。当該溶液中の硫安を除去するために、透析膜（分画分子量１，０００；Ｓｐｅｃｔｒａ社Ｐｏｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ）にて５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に対して透析して、得られた透析膜内部液を細胞壁画分として次の操作に供した。
【０１０１】
容積１５ｍＬの遠沈管にＡＴＰアガロース（Ｓｉｇｍａ社）０．２ｍｇを入れ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を加えて膨潤させた後、前記の細胞膜画分を加え、氷上で１０分間緩やかに振盪した。その後、遠心分離（１，０００ｒｐｍにて５分間）して、遠心上清を除去した。
【０１０２】
沈殿物を３ｍＬの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に懸濁し、再び遠心分離して、遠心上清を除去した。この洗浄操作をのべ５回繰り返した。
得られた沈殿物を２ｍＬの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／１ＭＮａＣｌに懸濁し、ＡＴＰアガロースに結合した蛋白質を溶出させた。遠心分離した後の遠心上清を回収し、当該溶液の蛋白質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｖｏｌ．７２、ｐ．２４８）で定量した。その後、蛋白質濃度が２μｇ／ｍＬ程度となるように３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液で希釈して酵素液として以降の試験に供した。
【０１０３】
本実施例では、上記ササゲ細胞壁由来の酵素液のＡＴＰ分解活性、すなわちリン酸生成量を指標とし、被験試料の有害性をＡＴＰ分解活性の阻害性として判定した。なお、ＡＴＰ分解活性の試験方法は、実施例１に記載した公知文献（Ｐｅｒｌｉｎ　ａｎｄ　Ｓｐａｎｓｗｉｃｋ（１９８１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．、ｖｏｌ．６８、ｐ．５２１など）に準拠し、反応後の溶液中のリン酸濃度をモリブデン青法で測定した。すなわち、前記酵素液、３０ｍＭ　ＡＴＰ水溶液、及び３０ｍＭ　硫酸マグネシウム水溶液をそれぞれ１０μＬ、５μＬ、及び５μＬを混合した。この混合液に、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液若しくは当該緩衝液に被験試料を所定濃度で溶解させた溶液を３０μＬ添加した後、３７℃にて３０分間反応させた。反応後の溶液のリン酸濃度は、モリブデン青法にて測定した。すなわち、１０質量％アスコルビン酸水溶液と０．４２質量％モリブデン酸アンモニウム−１Ｎ硫酸とを１：５で混合した発色試薬を１００μＬ添加し、２５℃にて３０分間反応させた後に波長８２０ｎｍの吸光度を測定した。なお、吸光度からのリン酸濃度の算出は、リン酸二水素カリウム水溶液を標準物質としてモリブデン青法で測定して求めた吸光度からリン酸濃度への換算係数を用いた。
【０１０４】
本実施例では、カドミウムを被験試料とし、終濃度０．５〜５００ｍｇ／Ｌの範囲で試験した。被験試料添加の場合及び被験試料無添加の場合について各々リン酸生成量を測定し、前記式（Ｉ）によってＡＴＰ分解活性の阻害率を算出した。
【０１０５】
結果を図５に示す。図５から明らかなように、カドミウム添加量が１ｍｇ／Ｌにて１０％程度の活性阻害率が観察され、カドミウム添加量を高めると活性阻害率が顕著に高まることが確認できた。従って、当該酵素の活性阻害を指標として有害物質の存在を判断できる。
【０１０６】
〔実施例３〕ササゲ細胞壁ヌクレオチド分解酵素遺伝子の単離
本実施例においては、ササゲ細胞壁ヌクレオチド分解酵素の遺伝子を単離し、当該遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を特定した。
【０１０７】
ササゲ種子を水道水で膨潤させてからバーミキュライトをいれたプラスチック容器に播種し、暗所・２０℃にて２週間程度栽培してササゲの黄化胚軸を得た。１２ｇの黄化胚軸から、Ｐｒｏｍｅｇａ社Ｐｏｌｙ　Ａ　Ｔｔｒａｃｔ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いてメッセンジャーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡ）を抽出し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社ＺＡＰ−ｃＤＮＡ　ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔを用いて相補鎖ＤＮＡ（以下、ｃＤＮＡ）ファージミドを作製した。当該ファージミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＦＲ´株に感染させ、ＮＺＹ平板培地（１質量％ＮＺ　ａｍｉｎｅ、０．５質量％酵母エキス、０．５質量％ＮａＣｌ、１．５質量％寒天）で３７℃にて１２時間培養した。独立したプラークが形成されたＮＺＹ平板培地表面にメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（＋））を接触させてプラークを移し取り、当該メンブレンを常法に従いアルカリ処理、中和処理した。洗浄後、紫外線照射によりメンブレン上にライブラリーＤＮＡを固着させ、一次スクリーニング用メンブレンを得た。延べ４０万個のｃＤＮＡライブラリーを遺伝子単離の一次スクリーニングに供した。
【０１０８】
スクリーニングでは、エンドウＮＴＰアーゼ遺伝子ＰｓＡＰＹ１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号　ＡＢ０７１３６９）の３７０塩基から７０７塩基までの３３８塩基対に相当するＤＮＡ断片をＰＣＲ　ＤＩＧ　Ｐｒｏｂｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）にてジゴキシゲニン標識し、それをプローブとして用いた。このプローブの配列を配列番号３に示す。
【０１０９】
０．０２質量％ＳＤＳ、０．１質量％ラウリルサルコシン、６×ＳＳＣ（１ＭＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、２質量％ブロッキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）、３０質量％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液に前記スクリーニング用メンブレンを浸漬して、３７℃にて２時間反応させた後、前記プローブを添加して、さらに３７℃にて１０時間反応させた。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション反応後のメンブレンを取り出し、０．１質量％ＳＤＳを添加した２×ＳＳＣ（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）に浸漬して６５℃にて１５分間洗浄した。メンブレンを取り出し、再び０．１質量％ＳＤＳを添加した２×ＳＳＣ（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、０．０３Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）に浸漬して６５℃にて１５分間洗浄した。
【０１１１】
前記洗浄後のメンブレンをＤＩＧ緩衝液（０．３質量％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１Ｍ　マレイン酸）で洗浄し、さらに抗ジゴキシゲニン抗体アルカリフォスファターゼ標識物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を添加した抗体液（１質量％ブロッキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１Ｍ　マレイン酸）に浸漬し、室温にて１時間反応させた。当該反応後のメンブレンを前記ＤＩＧ緩衝液で洗浄し、発光基質ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を添加したアルカリ溶液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．５））に浸した後、Ｘ線フィルムと接触させた。Ｘ線フィルム上の感光スポットに相当する陽性プラークをＮＺＹ平板培地から単離回収し、再び、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＦＲ´株に感染させた。この菌株をＮＺＹ平板培地で３７℃にて１２時間培養し、独立したプラークが形成されたＮＺＹ平板培地表面にメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（＋））を接触させてプラークを移し取り、当該メンブレンを常法に従いアルカリ処理、中和処理した。洗浄後、紫外線照射によりメンブレン上にライブラリーＤＮＡを固着させ、二次スクリーニング用メンブレンを得た。
【０１１２】
二次スクリーニング用メンブレンについて、前記した一次スクリーニングと同様の操作によって、二次スクリーニングを実施した。
二次スクリーニングにより単離した陽性プラークからＤＮＡを回収し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社Ｒａｐｉｄ　Ｅｘｃｉｓｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）ファージミドベクターへクローニングし、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を決定した。決定した塩基配列について蛋白質をコードする領域を解析した。
【０１１３】
決定した塩基配列について、蛋白質をコードする領域（開始コドンから終止コドン）を配列番号１に示し、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１１４】
当該アミノ酸配列をエンドウＮＴＰアーゼ遺伝子ＰｓＡＰＹ１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号　ＡＢ０７１３６９）のアミノ酸配列と比較したところ、６５．６％の相同性であった。また、当該アミノ酸配列から推定される蛋白質の分子量は５０．２ｋＤａであり、実施例１で精製した蛋白質の分子量とよく一致した。これらのことから、本実施例においてクローニングした遺伝子は、ササゲのＮＴＰアーゼ遺伝子であると判断し、ＶｓＮＴＰａｓｅ１と命名した。
【０１１５】
〔実施例４〕ＶｓＮＴＰａｓｅ１の遺伝子組換え手法による生産
本実施例においては、ササゲ細胞壁ＮＴＰアーゼを、遺伝子組換え手法を利用して生産した。
【０１１６】
実施例３で単離同定したＶｓＮＴＰａｓｅ１についてアミノ酸をコードする領域をＰＣＲ法で増幅し、ヒスチジンポリマーとの融合蛋白質を得るためにｐＥＴ１６ｂプラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入し、このベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。当該形質転換体を培養し、その培養物を破砕し、蛋白質溶液を回収し、Ｎｉ２＋−ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｏｌｕｍｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いてＶｓＮＴＰａｓｅ１とヒスチジンポリマーとの融合蛋白質を得た。
【０１１７】
得られた融合蛋白質について、実施例１に記した方法でＡＴＰ分解活性があることを確認した。
【０１１８】
本実施例より、少なくともＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子は、大腸菌において酵素活性を保持した組換え蛋白質として生産させることができることは明らかである。
【０１１９】
〔実施例５〕ＶｓＮＴＰａｓｅ１
本実施例においては、実施例４により得たササゲ細胞壁ＮＴＰアーゼについて有害物質による活性阻害効果を調べた。
実施例２におけるササゲ細胞壁由来の酵素液の代わりに、実施例４で得た組換え蛋白質を含む酵素液に関して、実施例２に記載の方法と同様にして、酵素活性に及ぼす亜鉛の阻害効果を調べた。なお、被験試料とした亜鉛は、終濃度０．３〜３００ｍｇ／Ｌの範囲で検討した。
【０１２０】
結果を図６に示す。図６から明らかなように、亜鉛添加量が５ｍｇ／Ｌにて数％程度の活性阻害率が観察され、亜鉛添加量を高めると活性阻害率が顕著に高まることが確認できた。従って、当該酵素の活性阻害を指標として有害物質の存在を判断できる。
【０１２１】
本実施例により、少なくとも大腸菌で生産させたＶｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子の組換え蛋白質は、ササゲ胚軸から抽出した細胞壁由来のヌクレオチド分解酵素と同様に有害物質によって酵素活性が阻害されることから、有害物質の存在を検定するための試験方法において利用できる。
【０１２２】
〔実施例６〕溶液酵素系バイオセンサーの作製
本実施例においては、ササゲ細胞壁ヌクレオチド分解酵素を使った溶液酵素系のバイオセンサーを作製した。
【０１２３】
図７に示すように、バイオセンサーは、攪拌機３を備えた反応容器１を恒温槽２の槽内に設置し、該反応容器へは流入ラインＬ１〜Ｌ５、及び、反応容器１の底部に設置した流出口１０を介した流出ラインＬ６、Ｌ７が接続されている。被験試料は流入ラインＬ１から送液ポンプ４によってバルブ６を経て、酵素液は流入ラインＬ３から送液ポンプ７によって、基質液は流入ラインＬ４から送液ポンプ８によって、それぞれ反応容器１へ流入させた。反応容器１へ流入した被験試料、酵素液、及び基質液を攪拌機３で混合しながら定温で反応させ、所定時間経過後に流入ラインＬ５から送液ポンプ９によって発色試薬を注入し、さらに、攪拌機３で混合しながら定温で反応させた後に、反応容器１内の溶液を流出口１０から送液ポンプ１１によってバルブ１３を経て検出器１２に送液して、当該溶液の吸光度を計測した。吸光度の計測を終了した溶液は廃液として排出させた。
【０１２４】
また、対照試料を分析するために、流入ラインＬ１から被験試料を送液する替わりに、純水若しくは緩衝液を流入ラインＬ２から送液ポンプ５によってバルブ６を経て反応容器１へ送液した。必要に応じて、酵素液を流入ラインＬ３から、基質液を流入ラインＬ４からそれぞれ反応容器１内へ送液した。
【０１２５】
また、反応容器１の内部を洗浄するために、純水若しくは緩衝液を流入ラインＬ２から送液ポンプ５によってバルブ６を経て反応容器１へ送液し、攪拌機３にて所定時間混合攪拌した後に、流出口１０から送液ポンプ１１によってバルブ１３及び流出ラインＬ６を経て廃液として排出させた。
【０１２６】
なお、本実施例において、酵素液としては実施例１又は実施例２において精製したササゲ細胞壁由来のヌクレオチド分解酵素を、基質液としてはアデノシン三リン酸を、発色液としてはモリブデン酸・アスコルビン酸混合液をそれぞれ用い、発色後の反応液について波長８２０ｎｍの吸光度を計測した。
【０１２７】
〔実施例７〕溶液酵素系バイオセンサーの作製
本実施例においては、ササゲ細胞壁ヌクレオチド分解酵素を使った溶液酵素系のバイオセンサーを作製した。
【０１２８】
図８に示すように、本センサーは、攪拌機３を備えた反応容器１を恒温槽２の槽内に設置し、該反応容器へは流入ラインＬ１〜Ｌ４、及び、反応容器１の底部に設置した流出口１０を介した流出ラインＬ６が接続されている。被験試料は流入ラインＬ１から送液ポンプ４によってバルブ６を経て、酵素液は流入ラインＬ３から送液ポンプ７によって、基質液は流入ラインＬ４から送液ポンプ８によって、それぞれ反応容器１へ流入させた。反応容器１へ流入した被験試料、酵素液、及び基質液を攪拌機３で混合しながら定温で反応させた後に、リン酸イオン電極１４を接続した検出器１２で反応容器１内の溶液中のリン酸イオン濃度を計測した。計測後、反応容器１内の溶液を流出口１０から送液ポンプ１１によって流出ラインＬ５を経て廃液として排出させた。
【０１２９】
また、対照試料を分析するために、流入ラインＬ１から被験試料を送液する替わりに、純水若しくは緩衝液を流入ラインＬ２から送液ポンプ５によってバルブ６を経て反応容器１へ送液した。必要に応じて、酵素液を流入ラインＬ３から、基質液を流入ラインＬ４からそれぞれ反応容器１内へ送液した。
【０１３０】
また、反応容器１の内部を洗浄するために、純水若しくは緩衝液を流入ラインＬ２から送液ポンプ５によってバルブ６を経て反応容器１へ送液し、攪拌機３にて所定時間混合攪拌した後に、流出口１０から送液ポンプ１１によって流出ラインＬ６を経て廃液として排出させた。
【０１３１】
なお、本実施例において、酵素液としては実施例１又は実施例２において精製したササゲ細胞壁由来のヌクレオチド分解酵素を、基質液としてはアデノシン三リン酸を、発色液としてはモリブデン酸・アスコルビン酸混合液をそれぞれ用い、発色後の反応液について波長８２０ｎｍの吸光度を計測した。
【０１３２】
〔実施例８〕市販のヌクレオチド分解酵素
本実施例においては、市販のヌクレオチド分解酵素について有害物質による活性阻害効果を調べた。
【０１３３】
実施例２におけるササゲ細胞壁由来の酵素液の代わりに、市販のヌクレオチド分解酵素、すなわちシグマ社製のジャガイモ由来のＡｙｐｒａｓｅを含む酵素液に関して、実施例２に記載の方法と同様にして、酵素活性に及ぼすカドミウムの阻害効果を調べた。なお、被験試料としたカドミウムは、終濃度０．７〜７０００ｍｇ／Ｌの範囲で検討した。
【０１３４】
結果を図９に示す。図９から明らかなように、カドミウム添加量が１ｍｇ／Ｌにて数％程度の活性阻害率が観察され、カドミウム添加量を高めると活性阻害率が顕著に高まることが確認できた。従って、当該酵素の活性阻害を指標として有害物質の存在を判断できる。
【０１３５】
本実施例により、市販のシグマ社製のＡｐｙｒａｓｅは、ササゲ胚軸から抽出した細胞壁由来のヌクレオチド分解酵素と同様に有害物質によって酵素活性が阻害されることから、有害物質の存在を検定するための試験方法において利用できる。
【０１３６】
〔実施例９〕市販のヌクレオチド分解酵素
本実施例においては、市販のヌクレオチド分解酵素について複数の有害物質による相乗的な活性阻害効果を調べた。
【０１３７】
実施例２におけるササゲ細胞壁由来の酵素液の代わりに、市販のヌクレオチド分解酵素、すなわちシグマ社製のジャガイモ由来のＡｙｐｒａｓｅを含む酵素液に関して、実施例２に記載の方法と同様にして、酵素活性に及ぼすカドミウム及び／または亜鉛の阻害効果を調べた。なお、被験試料としたカドミウムは終濃度５ｍｇ／Ｌで、亜鉛は４０ｍｇ／Ｌで検討した。
【０１３８】
結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、亜鉛添加量が４０ｍｇ／Ｌにて１．６％の活性阻害率が観察され、カドミウム添加量が５ｍｇ／Ｌにて５．１％の活性阻害率が観察された。これに対して、４０ｍｇ／Ｌの亜鉛と５ｍｇ／Ｌのカドミウムを同時に添加した場合、活性阻害率が１９．６％となり、亜鉛とカドミウムをそれぞれ単独で添加した場合の活性阻害率の和、すなわち６．８％に比べて、同時に添加した場合に活性阻害率が顕著に高まることが確認できた。従って、複数の有害物質が共存した場合には相乗的な活性阻害として判断できる。
【０１３９】
本実施例により、市販のシグマ社製のＡｐｙｒａｓｅは、複数の有害物質が共存した場合に、相乗的に酵素活性が阻害されることから、有害物質の複合的な存在を検定するための試験方法において利用できる。
【０１４０】
【発明の効果】
本発明により、ヌクレオチド分解酵素の活性阻害を指標として、被験試料中の有害物質の存在を検出することができる。
【０１４１】
本発明に係る有害物質の検出方法により、有害物質の存在及び有害性を総合的に判定することができるため、複数種の有害物質が存在する場合であっても、その有害物質の各々を調べることなく、それらの量及び有害性を総合的に判定でき、例えば排水及び飲料水などの水中の有害物質検査に有用である。
【０１４２】
また本検出方法は、河川や湖沼などの水道水源の保全、上下水道、工業用排水、廃棄物処分場排水などの排水の水質管理、又は水処理設備の運転制御などにも有用である。
【０１４３】
【配列表】
2004105133.tif 000003
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【０１４４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：合成オリゴヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を適用した排水処理プロセスの運動制御の例を示す図である。
【図２】本発明を適用した浄水プロセスの運動制御の例を示す図である。
【図３】陰イオン交換カラムからのヌクレオチド分解酵素蛋白質の溶出を示す図である。
【図４】精製した蛋白質溶液のポリアクリルアミドゲル電気泳動結果を示す図である。
【図５】被験試料の、ササゲ細胞壁由来ヌクレオチド分解酵素活性に対する阻害を示す図である。
【図６】被験試料の、遺伝子組換え手法により生産したＶｓＮＴＰａｓｅ１蛋白質の酵素活性に対する阻害を示す図である。
【図７】溶液酵素系バイオセンサーの例を示す図である。
【図８】溶液酵素系バイオセンサーの例を示す図である。
【図９】被験試料の、市販のヌクレオシド分解酵素の酵素活性に対する阻害を示す図である。
【図１０】複数の有害物質が共存する被験試料の、市販のヌクレオシド分解酵素の酵素活性に対する阻害を示す図である。
【符号の説明】
１　反応容器
２　恒温槽
３　攪拌機
４　送液ポンプ
６　バルブ
７　送液ポンプ
８　送液ポンプ
９　送液ポンプ
１０　流出口
１１　送液ポンプ
１２　検出器
１３　バルブ
１４　リン酸イオン電極
Ｌ１〜Ｌ５　流入ライン
Ｌ６，Ｌ７　流出ライン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2004105133.tif 000017
【図７】
2004105133.tif 000018
【図８】
2004105133.tif 000019
【図９】
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【図１０】
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