(57)【要約】【課題】葉の横方向のサイズを制御する方法に関する。【解決手段】葉の横方向のサイズを制御するＡＮ３遺伝子及びその遺伝子の発現を制御することにより葉の形状を変化させる方法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）又は（２）の塩基配列から成る遺伝子。
（１）配列番号１の塩基配列
（２）配列番号１がコードするアミノ酸配列のＮ末端側の１２５アミノ酸残基分を、シロイヌナズナ以外の植物のＡＮ３遺伝子のホモログとを比較した結果、該植物のＡＮ３遺伝子のホモログのアミノ酸配列がＡＮ３と同じ分岐群に含まれる場合の、該植物のＡＮ３遺伝子のホモログの塩基配列
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子の発現を制御することにより、その植物の葉のサイズを変える方法。
【請求項３】
前記遺伝子の発現を制御することが、該遺伝子の破壊、損植物への該遺伝子のアンチセンス遺伝子を導入すること、又は該遺伝子のＲＮＡ干渉、又は該遺伝子の過剰発現によるものである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子の発現を制御するように処理された植物。
【請求項５】
前記遺伝子の発現を制御することが、該遺伝子の破壊、損植物への該遺伝子のアンチセンス遺伝子を導入すること、又は該遺伝子のＲＮＡ干渉、又は該遺伝子の過剰発現によるものである請求項４に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、シロイヌナズナのＡＮ３遺伝子に関し、より詳細には、葉の横方向のサイズを制御するＡＮ３遺伝子及びその遺伝子の発現を制御することにより葉の形状を変化させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、植物の形態を改変するためには、原理的に、植物ホルモン（ジベレリンやブラシノステロイド、エチレンなど）の内生量や感受性を調節することにより、細胞サイズを制御して行われている。
発明者らは、既にシロイヌナズナにおいて、シトクロムＰ４５０ファミリーに属するＲＯＴＵＮＤＩＦＯＬＩＡ３（ＲＯＴ３）遺伝子を特定し（Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２３８１−２３９１（１９９８））、このＲＯＴ３の発現を制御することにより葉や花の形状を変化させることができることを示した（非特許文献１）。この遺伝子ＲＯＴ３は縦方向への細胞伸長にのみ関与し、ＣＹＰ９０Ｄ１との組み合わせによって、細胞伸長と、それに加えて細胞分裂とが変化する（特願２００２−２４８９１０）。この場合は葉の極性とは関係なく働く。一般的にブラシノステロイドは、葉においては、細胞の伸長と分裂と双方に対して促進的な効果を持つ（非特許文献２）。これらの遺伝子群の機能欠損を起こさせると、細胞の縦への伸長低下か、あるいは、細胞分裂と細胞伸長の双方が全体に低下するか、といったことが起きる。
【０００３】
これらの改変方法は、既存の細胞数に依存するため、器官サイズの制御範囲には限界がある。また生理機能の変更という副作用も大きい。
また植物の葉及び花器官は、縦及び横の極性を持った平面を形成するが、この極性軸に依存した細胞分裂過程を利用した形態制御法は知られていない。
発明者らは、ａｎ３という横幅の広い細胞伸長低下によらない変異体があることを見出していたが（非特許文献３及び４）、その遺伝子については知られていなかった。
なお、今回発明者らが見出したシロイヌナズナのＡＮ３遺伝子のコードするアミノ酸配列は、ヒト等で転写コアクチベーターとして知られている因子（非特許文献５）の植物におけるホモログである。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ｖｏｌ．  ９６，  ｐｐ．  ９４３３−９４３７  （１９９９）
【非特許文献２】
Ｎａｋａｙａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４３：  ２３９−２４４  （２００２）
【非特許文献３】
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｊｕａｎ  Ｍａｒｃｈ  ｄｅ  Ｅｓｔｕｄｉｏｓ  ｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  −  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｌｅａｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １１−１３，  ２００２；  Ｍａｄｒｉｄ，  Ｓｐａｉｎ）
【非特許文献４】
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４３：  ３７２−２７８  （２００２）
【非特許文献５】
Ｂｒｅｔｔ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６，  １５５９−１５６４  （１９９７）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
細胞伸長制御のみにより、葉や花器官のサイズ及び形態を制御することには限界がある。しかし、これらの器官の細胞数自体を調節することができれば、この制約を乗り越えることができる。
本発明は、植物器官の細胞数を調節する手段であって、平面的な細胞増殖における横方向に対してより指向性が高い調節手段を提供することを目的とする。従って、縦及び横方向の葉及び花器官サイズ制御法と組み合わせることで、植物形態をより柔軟に調節できる。この手段は、観賞用の花卉、観葉植物において新規形態を持った新品種開発に利用できる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、シロイヌナズナの葉の横方向に対する変異体を解析した結果、葉や花器官の横方向への細胞数を調節する遺伝子ＡＮ３を見出した。
このＡＮ３はヒト等でｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒとして知られている因子の、植物におけるホモログである。しかしこれまでその機能については、単細胞培養系でしか解析されておらず、また植物では全く解析されてこなかったため、これが葉の形態を制御する機能を有することは、全く知られていなかった。
このＡＮ３遺伝子の機能が破壊された場合、植物の葉は長さが変わらないまま、横幅が細くなる。これは葉の原基の細胞分裂活性が低下するためである。特に、葉の横幅方向への細胞の増殖が盛んな時期への影響が強いため、縦の長さではなく、横幅に強い影響が生じる。
【０００７】
即ち、本発明は、（１）又は（２）の塩基配列から成る遺伝子である。
（１）配列番号１の塩基配列（シロイヌナズナのＡＮ３遺伝子）
（２）配列番号１がコードするアミノ酸配列のＮ末端側の１２５アミノ酸残基分を、シロイヌナズナ以外の植物のＡＮ３遺伝子のホモログとを比較した結果、該植物のＡＮ３遺伝子のホモログのアミノ酸配列がＡＮ３と同じ分岐群に含まれる場合の、該植物のＡＮ３遺伝子のホモログの塩基配列
また、本発明は、（１）又は（２）の塩基配列から成る遺伝子であってもよい。
（１）配列番号１の塩基配列（シロイヌナズナのＡＮ３遺伝子）
（２）配列番号１の塩基配列がコードするアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードし、葉や花器官の横方向への細胞数を調節する機能を有する塩基配列
また、本発明は、この遺伝子の発現を制御することにより、その植物の葉のサイズを変える方法である。
更に、本発明は、この遺伝子の発現を制御するように処理された植物である。
この遺伝子の発現は、該遺伝子の破壊、損植物への該遺伝子のアンチセンス遺伝子を導入すること、又は該遺伝子のＲＮＡ干渉、又は該遺伝子の過剰発現により制御することができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ＡＮ３  のアミノ酸配列はヒトのホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ，  ＡＦ２４４９７２）とＮ  末端側が似ている。ＢＬＡＳＴＰ検索をかけると、Ｎ  末端側の相同性は５７％である。Ｃ  末端側は配列そのものは似ていないが、Ｑ，  Ｐ，  Ｇ  等のアミノ酸が多いという特徴は似ている。酵母ゲノムにはＡＮ３  のホモログに相当する配列は含まれない。
【０００９】
シロイヌナズナにはＡＮ３  遺伝子に似た遺伝子が他に２つある（ＳＹＴ２，  ＳＹＴ３  と名付けられている。ＧｅｎＢａｎｋ，  ＡＹ１０２６４０，  ＡＹ１０２６４１）。ヒトの場合と同様にこれらはＡＮ３のＮ  末端側（約７０残基）のみ高い相同性を持っている。一方、ＡＮ３  のＮ  末端側１２５  残基をｑｕｅｒｙ  としてＴＢＬＡＳＴＮ  検索を行うと、７０−１２５  残基の部分でも相同性が認められる他の植物種由来のＥＳＴ  がヒットする。そこで、ＡＮ３  のＮ末端側１２５  残基までの配列とＳＹＴ１，  ＳＹＴ２  及び他の植物のＡＮ３  ホモログとで分子系統樹を作成して、その他の植物の配列がＡＮ３  と同じクレードに含まれれば、ＡＮ３  のホモログと見なせる。
また、Ｃ  末端側は「アミノ酸組成が似ている」という特徴なので、この部分のアミノ酸配列の相同性はそっくりな遺伝子で比較しても、全体として相同性は低くなる。
【００１０】
発明者らが既に見出している、ブラシノステロイド合成に関与する遺伝子ＲＯＴ３は縦方向への細胞伸長にのみ関与するものであった（非特許文献１）。一方、今回のＡＮ３の場合は、葉の中で細胞が縦だけでなく積極的に横方向へも分裂する時期に必要な遺伝子であるため、細胞数は縦よりも横方向に顕著に低下する。しかし細胞のサイズは葉に特有の補償作用の結果、むしろ正常型よりも大きくなる。
【００１１】
【発明の効果】
ＡＮ３のアンチセンス遺伝子あるいはＲＮＡｉを作成し、植物に導入することで、葉の細胞数を制御し、横幅の制御をすることができる。即ち、ＡＮ３  遺伝子（ゲノムＤＮＡ，  ｃＤＮＡ  の全体、一部）及びその他植物のＡＮ３  相同遺伝子を用い、その発現を構成的あるいは器官特異的に起こすことができる。機能欠損型（アンチセンス法、ＲＮＡｉ  法）の場合は、器官サイズの減少と幅方向への成長を抑制することができる。
更に、本発明の方法によれば、従来育種に比較して植物形態制御を精密化、高速化することができ、新品種の開発が容易になる。
【００１２】
一方、上記ａｎとａｎ３は独立に働き、ｒｏｔ３，  ｃｙｐ９０ｄ１とも独立に働く。そこで、これら、細胞のサイズや形状の制御系と組み合わせることで、より細く、あるいは細くかつ短く、等の組み合わせによる自由な制御が可能になると考えられる。さらに、見た目の違いとして、細胞数が減少した細葉化（ａｎ３）と、細胞が小さくなることで起きた細葉化（ａｎ）とでは、色が異なる。前者は通常のものと同じ色彩であるが、後者は、色が濃くなる。これは細胞の密度の違いを反映している。これは、特に花卉園芸においてバイオデザイン上重要である。
【００１３】
また、シロイヌナズナＡＮ３  遺伝子あるいは、その他植物のＡＮ３相同遺伝子を用いて植物を形質転換し、葉及び葉の変形した花器官あたりの細胞増殖能を調節することで、葉および花器官の形態および器官サイズ、生重量を改変することができる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
この実施例では、突然変異株（ａｎ３）における、細胞数と葉器官幅を測定した。
葉器官の幅・長さは及び葉肉細胞の面積は、以下のようにして決定した。まず、植物体から切り取った葉の画像データを顕微鏡を用いて収集する。細胞レベルの観察の場合には、飽水クロラール液（飽水クロラール  ２００ｇ，  グリセロール  ２０ｇ，  脱イオン水  ５０  ｍｌ）  を用い、葉器官に透明化処理を施した。次に、その画像を元に葉器官の幅・長さ、細胞の面積を画像解析ソフトウエアのＩｍａｇｅ  Ｊ  （ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）  を用いて測定した。
葉の幅及び長さ方向の細胞数は、透明化処理を行った葉器官を顕微鏡観察し、目視によって計測した。
【００１５】
シロイヌナズナＡＮ３遺伝子を欠損する突然変異株（ａｎ３−１）  における、葉器官幅の写真を図１に示す。ａｎ３対立変異としてａｎ３−１  からａｎ３−４  が存在し、これらは全て図１に示す表現型を共通して示す。比較のために野生型（ＷＴ）  のものも示す。
突然変異株（ａｎ３−１）の葉身及び葉柄の長さを図２に示す。ａｎ３−１  とＷＴ  でほぼ同じであるが、葉身の幅は、ＷＴ  で４．６  ｍｍ  だったものが、ａｎ３−１  では３．２  ｍｍ  へと減少した。従って、突然変異株（ａｎ３）  は野生型（ＷＴ）  に比べて、葉器官幅が特異的に減少していることが分かる。
突然変異株（ａｎ３−１）の細胞数と細胞サイズを図３に示す。ａｎ３−１  機能欠失変異型株では、野生株に比べ細胞サイズが約２倍増加している一方で、細胞数が少なくなっている（縦で約６０％、横で約５０％）ことがわかる。細胞の写真を図４に示す。
【００１６】
実施例２
突然変異株（ａｎ３）  は野生型（ＷＴ）  のゲノムＤＮＡについて配列番号２と３に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、その結果を図５に示す。その結果、ａｎ３−１，  ａｎ３−３，  ａｎ３−４  はＡＮ３  遺伝子の欠失変異であることを確認した。
ａｎ３−２  遺伝子の塩基配列（配列番号４及び５）を決定したところ、図６に示すように、６  塩基の欠失が生じていた。
これらの結果と実施例１の結果から葉器官幅はＡＮ３  遺伝子によって制御されていることがわかる。
【００１７】
実施例３
この実施例では、シロイヌナズナ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ  変異株（ａｎ）  並びにａｎ３  及びａｎ  の２重変異株（ａｎ  ａｎ３）  における、葉器官幅を測定した。結果を図７及び図８に示す。比較のためａｎ３  変異株（ａｎ３）  のものも示す。
ＡＮ  遺伝子は、動物のＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  と相同性のある遺伝子である（  Ｋｉｍ  Ｇ．  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２１：  １２６７−１２７９  （２００２）  。この遺伝子の機能の異常は、葉を構成する細胞の、細胞表層微小管の配向異常をもたらし、ひいては細胞伸長の方向性に異常をきたす。そのため、この変異体では、葉を構成する細胞がそれぞれ横方向に伸びられず、厚さ方向に伸びる結果、葉が厚く細くなる（Ｔｓｕｇｅ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：  １５８９−１６００  （１９９６））。
つまり、ＡＮは細胞伸長の制御系、ＡＮ３  は細胞分裂の制御系で、互いに制御系が異なる。両者の２重変異株においては葉器官幅がさらに減少しており、このことからも、ａｎ  とａｎ３  は独立に働くことが分かる。
【００１８】
実施例４
本実施例では、細胞分裂のＧ２／Ｍ  期に発現する遺伝子（ＣＹＣＢ１；２）  のプロモーター：：レポーターラインを用いて、ａｎ３  およびＷＴ  における葉原基発達過程での細胞分裂の性質について解析した。図９に模式的に示すように、このレポーターラインを利用すると、ＧＵＳ  染色により細胞分裂直後の細胞核や、分裂中の染色体を観察できる（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，  Ｂ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０７−４１９）。
図１０にはａｎ３  およびＷＴ  バックグランドでのレポーター活性をＧＵＳ  染色により検出した例を示している。このような画像データを顕微鏡観察により収集し、分裂中あるいは分裂直後の細胞の染色像から、細胞分裂面を画像に書き込んだデータを作成した。その後、分裂面の葉の縦軸に対する角度を集計した。
【００１９】
葉原基内では縦方向に発生段階の勾配が形成されており、先端部により発達した細胞が含まれる。図１１では、若い葉原基（Ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ）  とより発達した葉原基（Ｌａｔｅ  ｓｔａｇｅ）での細胞分裂面を縦（０−３０°，  １５０−１８０°）、横  （６０−１２０°）、斜め（３０−６０°，  １２０−１５０°）  に分類した。
葉の発生の進行に伴う細胞分裂面の変化を調べるため、Ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅの基部側（Ｅ２）  と先端側（Ｅ１）  およびさらに発達したＬａｔｅ  ｓｔａｇｅ  の中間部（Ｌ２）  を比較した（図１２）。この図１１に示す結果から、発生段階の若い領域に含まれる葉細胞は主に縦方向に増殖し、その後発生が進行すると縦にも横にも分裂するようになることが分かった。また、細胞分裂の方向性はａｎ３  変異の影響はないことも分かった。
【００２０】
実施例１の結果から、ａｎ３  変異株においては縦方向よりも横方向の細胞増殖が大きな影響を受けていることが考えられる。そこで、横方向への細胞増殖がより活発なＬａｔｅ  ｓｔａｇｅ  の葉原基内での細胞分裂活性を検討した。本実施例（図１１）で用いた方法で、分裂中の細胞の数をＬ１，  Ｌ２，  Ｌ３  それぞれの領域において計測した。
その結果、図１３に示すようにａｎ３  変異株では、葉原基基部の細胞分裂活性は野生株と同等であるのに対し、Ｌ２，  Ｌ３  では細胞分裂活性が大きく低下することが分かる。従って、ＡＮ３  遺伝子の機能が欠損すると、葉原基の中で横方向への細胞増殖が活発なステージが短くなり、葉の形態に大きな影響を与えることが判明した。
【００２１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】突然変異株（ａｎ３−１）と野生型（ＷＴ）の子葉、ロゼット葉、茎生葉を示す図である。
【図２】突然変異株（ａｎ３−１）と野生型（ＷＴ）の第１葉の葉身の長さ、幅、葉柄の長さの比較を示す図である。
【図３】突然変異株（ａｎ３−１）と野生型（ＷＴ）の第１葉の縦方向と横方向の葉肉細胞数（Ａ）と葉肉細胞の面積（Ｂ）の比較を示す図である。
【図４】突然変異株（ａｎ３−１）と野生型（ＷＴ）の葉肉細胞顕微鏡写真を示す図である。右は突然変異株（ａｎ３−１）、左は野生型（ＷＴ）を表す。
【図５】突然変異株（ａｎ３）と野生型（ＷＴ）のＡＮ３  遺伝子を増幅するＰＣＲ反応の結果を示す図である。矢印はＡＮ３遺伝子（６３３ｂｐ）を示す。
【図６】ａｎ３−２遺伝子座の変異部位の塩基配列（配列番号１の１〜１２０位）を示す図である。下線は欠失部位を示す。
【図７】変異株（ａｎ）、ａｎ３  変異株（ａｎ３）  及びａｎとａｎ３の２重変異株（ａｎ  ａｎ３）の葉器官を示す図である。
【図８】変異株（ａｎ）、ａｎ３  変異株（ａｎ３）  及びａｎとａｎ３の２重変異株（ａｎ  ａｎ３）の葉器官を示す図である。
【図９】細胞分裂角度の計測を示す図である。
【図１０】ＣＹＣＢ１；２：：ＧＵＳレポータ活性の検出を示す図である。右は突然変異株（ａｎ３−１）、左は野生型（ＷＴ）を表す。黒点はＧ２／Ｍ期の細胞を示す。
【図１１】葉の発生に伴う細胞分裂面頻度を示す図である。右の図は発生ステージの異なる葉原基領域内での細胞分裂面を示す。
【図１２】葉の発生に伴う細胞分裂面の変化を示す図である。
【図１３】１枚の葉原基内の各領域における細胞分裂頻度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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