(57)【要約】【課題】　生物学的有害物質の存在を確認するための装置及び方法を提供すること。【解決手段】　例示的実施形態は、植物細胞(14)および該植物細胞を生きた状態に維持するための栄養培地(16,18)を使用したバイオセンサ(10)を含む。所望の光学特性を有する光源(40)を植物細胞に差し向け、該植物細胞から伝達された光スペクトルを光検出器(42)で検出する。コントローラ(44)が光検出器(42)からの信号を分析し、植物細胞(14)の作用物質への暴露に応じた状態変化を検出する。【選択図】　図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
　物質の存在を検出するための装置であって、
　　植物細胞(14)および該植物細胞(14)を生きた状態に維持するための栄養培地(16)を含むバイオセンサ(10)と、
　　所望の光学特性を有する光を前記植物細胞(14)上に放射するための光源(40)と、
　　前記植物細胞(14)からの光を受け、それに応答して信号を生成するように構成された光検出器(42)と、
　　前記バイオセンサを前記物質に曝すのに応じて前記バイオセンサの状態変化を検出するようにプログラミングされたコントローラ(44)と、
　からなる装置。
【請求項２】
　前記バイオセンサ(10)は、
　　対向する第１の栄養シート(16)と第２の栄養シート(18)との間に挟まれた植物細胞(14)のマトリクスと、
　　前記栄養シート(16,18)及び前記植物細胞(14)を支持するための支持部材(12)と、
　をさらに含む、請求項１の装置。
【請求項３】
　前記植物細胞(14)は前記物質に曝されたときに状態変化を示すタイプの細胞である、請求項１の装置。
【請求項４】
　前記物質は生物学的有害物質である、請求項１の装置。
【請求項５】
　前記状態変化は生理学的反応を含む、請求項１の装置。
【請求項６】
　サンプル中の作用物質の存在を検出するための方法であって、
　　(a)作用物質に曝したとき状態変化を示す能力を有するように選択された植物細胞(14)および該植物細胞を生きた状態に維持するための栄養培地(16)を含むバイオセンサ(10)を設けるステップと、
　　(b)前記バイオセンサ(10)をサンプルに曝すステップと、
　　(c)前記植物細胞(14)上に放射される光の光学特性を測定するステップと、
　　(d)前記植物細胞(14)に状態変化が生じたか否かを判定するステップと、
　からなる方法。
【請求項７】
　前記バイオセンサ(10)をサンプルに曝す前に、前記植物細胞(14)上に放射された光の光学特性を測定することにより、前記バイオセンサについての制御状態値を確立するステップを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
　前記サンプルが空気を含み、前記ステップ(c)は前記栄養培地(16)を通して前記植物細胞(14)まで前記空気を放散させるステップを含む、請求項７の方法。
【請求項９】
　状態変化の判定に応じて信号を生成するステップを含む、請求項６の方法。
【請求項１０】
　前記バイオセンサ(10)の識別情報に関する機械読み取り可能な指示を前記バイオセンサ(10)に設けることを含む、請求項６の方法。
　
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、生物学的および化学的な化合物、特に生物学的に有害な作用物質の存在を検出するのに有用なバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
　特定環境において生物学的および化学的な汚染物質を検出する能力は、多数の様々な環境において重要な診断手段になる場合がある。たとえば、確認されている有害な生物学的または化学的作用物質が存在することがわかっている何らかの環境で働く必要がある者は、防護服などの適当な防護手段を用いることにより、不注意で有害物質に曝されることを避けることができる。ところが多くの場合、有害な生物学的または化学的作用物質の存在の疑いがあっても、それを確認することができない場合がある。そのような場合、その作用物質に曝される可能性がある人に十分な安全用具を与えたり、その環境に人が曝される前に生物学的有害物質の遮蔽を完了させたりしておく必要がある。いずれの解決方法も問題を完全には解決しない。前者の場合、汚染される可能性がある全ての人に行き渡るだけの十分な保護装置を提供することができない場合があり、また、生物学的有害物質の存在および／または種類が確認されていないことから安全性を確保するために必要な正しい種類の防護用具を利用すなわち選択することができない場合もある。後者の場合、多数の遮蔽試験が完了するまでに非常に長い時間が必要になる。その区域に人が入らなければならない時までに分析試験を完了させ、生物学的有害物質の存在／不在を確認するだけの十分な時間がとれない場合もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
　そのため、所与の環境において生物学的または化学的な作用物質の存在を迅速に検出し、確認するための装置および方法が依然として必要とされている。
【０００４】
　生細胞は、生物学的に有害な化合物や物質によって引き起こされる刺激などの生物学的刺激および化学的刺激に対し、反応を示すことが知られている。したがって、生細胞は、細菌、ウイルスおよび分子などの他の細胞に曝された場合、既知の生理的および形態的反応を示す。また、そうした化合物に対するそれらの細胞反応は、細胞の光透過性の変化を検出することや、指示化合物の使用などを含む様々な方法で検出できることも知られている。それらの既知の細胞反応に基づく様々なバイオセンサが既に記載されている。しかしながら、そうしたバイオセンサや、それらのバイオセンサで生物学的有害物質を検出するために使用される方法は、特定環境における生物学的有害化合物の存在を迅速かつ定量的に判定したいという要求に十分対処できないだけでなく、コストがかかりすぎる傾向もあり、また、訓練を受けていない者が使用するのに難しいことが多い。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
　例示の実施形態は、植物細胞及び該植物細胞を生きた状態に維持するための栄養培地を利用したバイオセンサを含む。所望の光学特性を有する光源を植物細胞に差し向け、その細胞から伝達された光スペクトルを光検出器で検出する。コントローラが光検出器からの信号を分析し、作用物質への暴露に応じた植物細胞の状態変化を検出する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
　本発明の例示的実施形態による、バイオセンサカード１２に組み込まれるバイオセンサ１０を図１に示す。以下で詳細に説明するように、バイオセンサ１０は、生きた植物細胞を生物学的および化学的作用物質に暴露したときの該植物細胞の生理学的および形態的変化を検出することにより、それらの作用物質の存在、特に生物学的に有害な環境毒素などの存在を検出することができる。簡単に説明すると、本明細書に示すバイオセンサ１０は、半透明の栄養シートによって提供される栄養豊富な環境に生きた状態で維持される生きた植物材料または組織培養物から作成した植物細胞のマトリクスに基づくものである。本発明で使用される特定タイプの植物細胞は、特定の環境作用物質を含む環境作用物質の存在に応じたそれら植物細胞の生理学的反応が既知のものから選択することができる。植物細胞は作用物質への暴露に応じて生理学的および／または形態的反応を示し、それらの反応が気孔の開閉、細胞質の流動、細胞質のポンピングの変化などを含む様々な形態で現れる。それらの生理学的反応は、光の透過率または反射率の変化、化学的指示、あるいは光の透過率や反射率の変化と化学的指示との組み合わせなどを検出する手段を用いて検出することができる。バイオセンサの状態の変化は、植物細胞から伝達された光スペクトルの光学特性の変化として様々な検出器で検出され、プロセッサ等のコントローラに送信され、そこで反応が分析され、応答が生成される。従って、例示の発明で使用される植物細胞は生物学的スイッチとして働く。
【０００７】
　次に図２を参照する。図２から、バイオセンサ１０は栄養シートの層１６と１８の間に保持される生きた植物細胞１４のマトリクスを含むことが分かる。以下で詳述するように、細胞マトリクスを構成する個々の細胞１４は、作用物質の環境への暴露に応じて何らかの生理学的または形態的反応を示す。そのため、植物細胞１４のマトリクスは本明細書において受容体層２０と呼ばれる。
【０００８】
　受容体層２０は植物細胞から構成されているが、「植物細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、生物の分類学上の特定のカテゴリに属する細胞ではなく、特定の性質を有する細胞を意味する。したがって、「植物細胞」は、本明細書で使用する場合、比較的硬い細胞壁を有し、生物学的および／または化学的な化合物などの環境作用物質に曝したときに検出可能な生理学的および／または形態的変化を示す細胞を意味する。本発明に関連して使用される植物細胞の細胞壁を参照すると、植物細胞は、通常セルロースその他の糖類化合物などの多糖類化合物や、シリカ等から形成された比較的硬い細胞壁を有するものとして特徴付けられる。この細胞壁構造は、多種類の生物で一般的なものであり、例示の発明に関して有用な機能上の利点が得られる。例えば、例示の発明に関して有用な細胞としては、限定はしないが、後で具体的に説明するような植物細胞、菌細胞、及びクロミスタのような現時点では植物分野に属するものとして特徴付けられないことも生物の細胞も含まれる。
【０００９】
　そのような植物細胞に見られる比較的硬い細胞壁は、その構造が構造的変化を受けにくいので、バイオセンサ１０の目的に有用な比較的丈夫な細胞構造を提供する。植物細胞は、動物細胞に比較して、バイオセンサとして使用する目的で有用ないくつかの特徴を有する。例えば、図２に示すように受容体層２０などの細胞マトリクスを栄養シート間に挟み込んだ場合、個々の細胞１４の硬い細胞壁は、脱水、すなわち浸透圧によって生じる破裂に耐えることができ、同様に収縮や崩壊にも耐えることができる。従って、硬い細胞壁によって得られる構造的な剛性は、植物細胞が動物細胞よりも長い寿命になる傾向を示す一要因となる。簡単に言うと、記載したタイプの植物細胞は他のタイプの細胞よりも頑強であり、寿命が長い。
【００１０】
　本発明で対象とする生理学的および形態的性質について言及すると、本発明に関して使用を選択される植物細胞は、環境作用物質に曝したときに何らかの検出可能な生理学的または形態的反応を示すことが分かっている。
【００１１】
　本発明で使用する場合、「作用物質」という用語は通常、植物細胞１４において検出可能な細胞の変化を引き起こす、環境中に存在する化合物を意味する。それらの作用物質には、例えば細菌やウイルスなどの生物学的作用物質が含まれ、化学的化合物を含む分子も含まれる。そのような幅広いカテゴリの中には、化学的毒素のような、生物学的および化学的化合物のもっと詳細な分類も存在する。本明細書で用いられる植物細胞は、そのような生物学的および化学的化合物への暴露に対して多数の異なる態様で反応を示し、それらの反応を細胞構造または細胞活動の検出可能な変化として表現する。具体的な生理学的および形態的細胞反応としては、個々の細胞の大きさの変化、細胞内の生物学的ポンピングの速度変化、細胞質の流動速度の増減、および気孔の開閉によって生じるような気孔の大きさの変化などが含まれる。
【００１２】
　従って、本明細書で用いられるように、環境作用物質への暴露に応じた植物細胞における検出可能な生理学的または形態的変化は、いずれも「状態」変化と呼ばれる。別の言い方をすれば、その状態変化をどのように示すかにかかわらず、植物細胞は、作用物質への暴露に対して、検出可能な生理学的または形態的反応を示す。
【００１３】
　本明細書で用いられる意味での状態変化を示す多数種類の植物細胞が知られている。いくつかの例を挙げると、Ｍｉｍｏｓａ　ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ及びＭｉｍｏｓａ　ｐｕｄｉｃａを含むＭｉｍｏｓａ（オジギソウ）の仲間の植物が含まれる。今述べた変種の両方を含む植物ミモザは、環境毒素によって与えられる類の外部刺激に対し、迅速に反応を示す細胞ポンプを有することが知られている。そのようなミモザ細胞を特定種類の毒素に曝した場合、この細胞は、細胞質流動の速度の急激な変化、すなわち状態変化として容易に検出することが可能な細胞の生理学的および形態的変化を示す。他の植物細胞として、生物学的および化学的作用物質に曝したときに気孔の変化を示すものもある。気孔を取り囲む孔辺細胞を有する植物細胞は、そのような作用物質に対し、気孔の大きさを変更することによって反応を示す。たとえば、特定種類の毒素に曝した場合、いくつかの植物細胞において気孔を素早く閉じる。Ｅｌｏｄｅａ、およびＰａｐｉｌｌｏｎａｃｅａｅの仲間のうちのいくつかなどの更に別の植物細胞は、毒素が存在するときに細胞室流動の変化を示す。それらの変化は検出可能であるため、本明細書で使用する用語の意味での状態変化を有するものとみなされる。
【００１４】
　もう一度図２を参照すると、受容体層２０は２つの栄養シート１６と１８との間に挟まれている。栄養シートは、受容体層に用いられる特定のタイプの植物細胞１４の栄養必要量に応じて選択され、それらの光透過性すなわち光を透過する能力が確保されるとともに、シートを通して気体を透過させる能力が確保される。具体的には、栄養シート１６及び１８は、シート内に形成された寒天培地などの成長培地を含む。適当な栄養シートは多数の製造業者から市販されている。
【００１５】
　今述べた基準を満たす栄養シートを組み合わせて、シート１６、１８間に受容体層２０を配置した層構成を形成する。バイオセンサカード１２は縁部２４で縁どられた中央開口部２２を画定し、上記３つの層はバイオセンサカード１２に組み込まれる。縁部２４には、硬いプラスチックやボール紙などの任意の適当な材料を用いることができる。受容体層２０を構成する植物細胞１４は、図２に示すようなバイオセンサカード１２に組み込んだ場合、相当長い時間にわたって生き続ける。バイオセンサカードは、容易かつ安価に製造することができ、小型であるため現場で容易に取り扱うことができる。バイオセンサカードは、適当なシールおよび内部パッケージング環境を用いて個々の包装にパッケージングすることもできるし、２枚以上のカードから成るグループにパッケージングすることもできる。縁部２４には、２枚の栄養シートと受容体層のための支持部材としての機能がある。また、栄養シートには受容体層を支持するための支持部材としての機能がある。したがって、縁部２４ならびに栄養シート１６および１８には、他の機能に加えて、受容体層２０内の細胞１４を物理的な損傷から保護するための機能もある。本明細書で説明したバイオセンサカード１２は、植物細胞のマトリクスを栄養培地原料に隣接して保持するのに用いることが可能な支持部材の多数の様々な構造のうちの一例にすぎないことは、当業者に明らかであろう。
【００１６】
　上記のバイオセンサ１０は、分析装置と組み合わせ、迅速に検査を実施して、サンプル中に対象作用物質が存在するか否かを判定するのに有用である。バイオセンサ１０は小型で、安価で、使い捨てにすることができるので、本システムは現場で使用するのに特に適している。しかしながら、本明細書に記載するシステムは、任意の他の環境においても当然同じように使用することが可能である。
【００１７】
　図３を参照すると、分析装置３０は、該分析装置の分析ポート３２に挿入されたバイオセンサカード１２の受容体層２０の状態変化を検出するように構成されている。以下で説明するように、分析装置３０は、状態変化を検出し、それらの変化を分析して分析結果を報告するのに適した構成要素を含む。好ましい実施形態において分析装置３０は、ポート３２に挿入されたバイオセンサカード１２へ流体サンプルを供給するためのポンプ（図示せず）と流通するように接続されたサンプル吸入用マニホルド３４を有する自給式の装置である。例えば、分析すべきサンプルが空気サンプルの場合、バイオセンサカードをポート３２に入れたまま、ポンプでバイオセンサカード１２に空気を供給する。空気サンプルは、制御された速度および圧力で供給され、栄養層１８全体にわたって受容体層２０がその空気サンプルに曝されるまで供給される。この空気は、ポンプにより生じた圧力差によってバイオセンサカードを通して拡散され、排気ポート（図示せず）を通して排気される。分析装置は、以下で説明するように、分析器を構成するハードウエアおよびソフトウエアを含む。
【００１８】
　受容体層２０を構成する細胞１４の状態変化は、受容体層２０を通過した光および／または受容体層２０から反射された光の光学特性の変化によって検出することができる。植物細胞は栄養シート１６及び１８と同様に半透明なので、所望の光学特性を有する光を栄養シート及び受容体層を通して通過させることができ、また受容体層で反射させることもできる。次に、分析装置３０の概略を示す図４を参照する。分析装置３０は吸入用マニホルド３４に配管されたポンプ３６を含み、ポンプ３６はサンプル（例えば空気など）を適当な圧力および流速でバイオセンサカード１２に供給するように構成される。ポンプ３６とカード１２との間にオプションでサンプル拡散器３８を配設し、カードの開口部２２全体にわたって均一に空気サンプルを拡散させるようにすることもできる。分析装置３０は、バイオセンサカード１２の開口部２２を通して所望の光学特性を有する光を透過させ、及び／又は、該カードからそのような光を反射させるように構成された１以上の分析用光源を含む。このように、第１の分析用光源４０は、光がカード１２を直接通過して光検出器４２上に入射するような向きに配置される。同様に、反射スペクトルが対象となる場合、第２の分析用光源４５は、バイオセンサカードに対して、光がカードの有効な部分で反射して光検出器４２上に入射するような向きに配置される。光検出器４２はプロセッサ４４などのコントローラと相互接続され、プロセッサ４４は光検出器で受信されてプロセッサに送信されたデータを分析するのに適した処理能力すなわちソフトウェア及びハードウェアを有する。プロセッサ４４は、所定のアルゴリズム計算でデータを分析し、表示装置４６への出力信号を生成する。表示装置４６には、ＣＲＴやＬＣＤ画面などの視覚的検出を行なうことが可能な装置等、任意の適当な表示装置を用いることもできるし、あるいは変換器などの可聴メッセージ発生器と同程度に簡単な装置を用いることもできる。
【００１９】
　次に、図４の概略図に示す分析ステップについて詳細に説明する。バイオセンサカード１２を分析装置３０（図３に示す）のポート３２に挿入した状態で、分析用光源４０から所望の強度および波長などの所望の光学特性を有する光をバイオセンサカード１２の中央開口部２２を通して透過させ、図４に矢印Ｄで示す透過スペクトルを生成する。あるいは、所望の強度および波長の光をカードの中央部２２で反射させ、図４に矢印Ｅで示す反射スペクトルを生成する。さらに別の形態として、透過スペクトルと反射スペクトルの両方を生成して分析することもできる。いずれの場合も、透過スペクトルまたは反射スペクトルが光検出器４２で検出され、結果得られたデータがプロセッサ４４に送信される。プロセッサ４４は、光検出器からのデータを処理するだけの十分な分析情報および分析アルゴリズムで予めプログラミングされている。サンプルが存在しないときに光検出器によって検出されたスペクトルは、受容体シートについての制御状態を生成するのに用いられる。この制御状態すなわち基準は、上で定義したような用語の意味での状態変化を生じさせる作用物質が存在しないときの受容体シートの状態を表している。
【００２０】
　制御状態の判定が済むと、本システムはサンプルを分析する準備が整う。分析すべきサンプルは、ポンプ３６を作動させることにより得られる。例示の目的で、分析すべきサンプルが空気を含むものと仮定した場合、対象のサンプルは吸入用マニホルド３４を通して分析装置に吸い込まれ、矢印Ａで示すようにサンプル拡散器３８に供給される。サンプル拡散器は、矢印Ｂで示すように、そのサンプルをバイオセンサカード１２に分散させ、詳しくは中央開口部２２（図１）全体にわたって分散させる。上記のように、ポンプ３６は、予め決められた所望の流速及び圧力でサンプルをバイオセンサカードに供給し、そこでサンプルが、この場合空気が栄養シート１８を通り、受容体層２０を通過して、さらに栄養シート１６を通って放散されるように、前もって設定される。サンプル空気は、バイオセンサカードを通過した後、矢印Ｃで概略的に示すように排気ポート５０を通して排気される。
【００２１】
　サンプル中に作用物質が存在した場合、受容体層２０の細胞１４は状態変化として反応を示す。受容体層２０のこの状態変化により透過スペクトルおよび／または反射スペクトルに変化が生じ、この変化が光検出器４２で検出される。プロセッサ４４は光検出器からのデータを分析し、状態変化が検出された場合、適当な警告信号を表示装置４６に出力する。プロセッサは、その状況における具体的な必要性に応じて、様々な複雑さの命令でプログラミングすることができる。例えばプロセッサは、受容体層２０内に存在する植物細胞のタイプ、特定の作用物質に反応して生じるそのタイプの植物細胞で予想される特定の生理学的および／または形態的変化、ならびにその状態変化が透過スペクトルに与える予想される影響を分析に含めるようにプログラミングすることができる。この種の分析を行なう場合、プロセッサを用いて、その状態変化を引き起こした特定のタイプの作用物質についての情報を含む信号を出力することができる。ＹＥＳ／ＮＯの出力を出力するようにプロセッサをプログラミングすることで、比較的簡単な出力を得ることができる。すなわち、状態変化が検出された場合は、「ＹＥＳ」の警報を表示装置４６に出力する。一方、状態変化が検出されなかった場合は、「ＮＯ」の信号を表示装置に出力する。
【００２２】
　当業者であれば、サンプル中の生物学的有害物質の存在を判定する高速な検査手段としての例示した本発明の柔軟性および有用性が分かるであろう。また、当業者であれば、例示した本発明の範囲から外れることなく、上記の特徴に様々な変更を施すことも可能であることが分かるであろう。例えば、様々な作用物質を検査するために、様々なバイオセンサカードを用意することができる。あるカードには、細菌などの生物学的作用物質の存在に反応を示すことがわかっている特定タイプの植物細胞を組み込むことができる。別のカードでは、ウイルス粒子の存在に反応を示すことが分かっている植物細胞を受容体層２０に用いることができる。さらに別のカードは、特定種類の化学物質に既知の態様で反応を示す植物細胞を用いることができる。さらに、カードは、広範囲の化合物に反応を示すことが可能な植物細胞を用いて形成することもできる。さらに、様々な異なるタイプの作用物質に応答して状態変化を生じるバイオセンサを製造するため、バイオセンサカードには、複数の異なる植物タイプの細胞を含む混合細胞培養物を組み込むこともできる。
【００２３】
　バイオセンサカードは、分析の際に有用な情報を提供するために、従来のバーコードのような機械読み取り可能な指示をオプションで含むことができる。たとえば、分析装置３０はバーコードリーダを含むことができ、カード１２は受容体層の細胞１４の種類に関するデータを提供するバーコードを含むことができ、その情報を分析中に用いることができる。
【００２４】
　また、検査の第１のステップとして制御状態を確立せずにサンプルの検査を実施することも可能である。バイオセンサカードがどの種類の細胞が存在するのかを分析装置に示すための指示を有する場合、プロセッサ４４は、そのカードについての制御状態値を表す値を予めプログラミングしておくことができる。したがって、制御状態値が予めプログラミングされた制御状態値からの変化を示した場合、状態が変化したものと解釈される。制御状態に関する予めプログラミングされた情報を使用しない場合であっても、植物細胞がサンプルに曝されている間に検出された状態の変化は、状態変化のインジケータとして使用することができる。
【００２５】
　また、検査を実施する前に植物細胞１４の生存可能性を確認することもできる。従って、プロセッサ４４には、所与のバイオセンサカードの受容体層における特定のタイプの細胞についての既知の制御状態値に関する情報をプログラミングすることができる。バーコードを用いることにより、プロセッサがポート３４中のカード１２を検出した場合、検査ルーチンの実行時に測定された制御状態値をそのカードについての既知の制御状態値と比較することができる。既知の制御状態値と判定された制御状態値との間に差があった場合、その差は死滅した細胞の個体数に起因するものであり、そのバイオセンサカードが適切に機能していないことを示している。その場合、警告メッセージを表示装置４６に送信し、その状態をユーザに通知することができる。
【００２６】
　ここまで本発明の例示的実施形態について説明してきたが、当業者であれば本発明の範囲内で他の変更を施すことも可能であることが分かるであろう。したがって、本発明の思想および範囲は、それらの実施形態に限定されることはなく、特許請求の範囲に規定したような種々の変更形態および均等にまで及ぶものと考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明による、バイオセンサカードに組み込まれるようなバイオセンサの例示的実施形態を示す斜視図である。
【図２】図１に示すバイオセンサカードを線２−２に沿って切断して見たときの断面図である。
【図３】例示的実施形態によるバイオセンサカードを分析するためのバイオセンサ分析システムを示す概略図である。
【図４】例示的な実施形態によるバイオセンサカードを分析するための、コンピュータに接続された分析装置を示す概略図である。
【符号の説明】
【００２８】
１０　バイオセンサ
１２　バイオセンサカード
１４　植物細胞
１６，１８　栄養シート
４０，４５　光源
４４　プロセッサ
【図１】
2004105184.tif 000003
【図２】
2004105184.tif 000004
【図３】
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【図４】
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