(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なプロテアーゼ、このプロテアーゼをコードするＤＮＡ、プロテアーゼの製造方法を提供する。【解決手段】以下の１及び２に示す性質を有するプロテアーゼ。１．分子量、21000±1000 (SDS-PAGEによる)２．特異的プロテアーゼ活性、以下に示すアミノ酸配列(1) を含むペプチドまたはタンパク質をGly-Phe部位で切断するか、アミノ酸配列(2) を含むペプチドまたはタンパク質をGly-Phe部位で切断するか、またはアミノ酸配列(3) を含むペプチドまたはタンパク質をSer-Leu部位で切断する。Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro  (1)、Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Pro  (2)、Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Thr-Pro  (3)、このプロテアーゼをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含む形質転換体、この形質転換体を用いるプロテアーゼの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の▲１▼及び▲２▼に示す性質を有するプロテアーゼ。
▲１▼分子量、２１０００±１０００  （ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
▲２▼特異的プロテアーゼ活性、以下に示すアミノ酸配列（１）  を含むペプチドまたはタンパク質をＧｌｙ−Ｐｈｅ部位で切断するか、アミノ酸配列（２）  を含むペプチドまたはタンパク質をＧｌｙ−Ｐｈｅ部位で切断するか、またはアミノ酸配列（３）  を含むペプチドまたはタンパク質をＳｅｒ−Ｌｅｕ部位で切断する。
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ    （１）
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ    （２）
Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ    （３）
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列の１〜８１６番の塩基配列、または２５３〜８１６番の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列の１〜８１６番の塩基配列、または２５３〜８１６番の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ請求項１に記載の▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列の１〜８１６番の塩基配列、または２５３〜８１６番の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列からなり、かつ請求項１に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項６】
配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、かつ請求項１に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ請求項１に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項２〜４及び８に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を培養し、請求項１に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質を採取するプロテアーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なプロテアーゼ、このプロテアーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、このＤＮＡを含む組換えベクター、この組換えベクターを含む形質転換体、この形質転換体を用いたプロテアーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
熱変性コラーゲンたるゼラチンは、ゲル化剤、起泡剤、増粘剤等として食品、化粧品等に広く用いられ、また、医薬のカプセルとしても用いられている。一方、コラーゲンは、エラスチンとともに動物の結合組織を構成する繊維状タンパク質であり、食品、化粧品、医薬品、塗料、プラスチック材料等の用途がある。
【０００３】
ゼラチンやコラーゲンは、分子量が通常１０万〜３０万程度であり、通常の消化ゼラチンや消化コラーゲンは分子量が１万以下である。
【０００４】
しかしながら、上記の如き多種多様な用途を考慮すると、所望の性質、例えば、低抗原性、易溶解性、低ゲル化強度、易フィルム形成性、易包接性等をもつものが要求され、このため分子量が上記以外のものが求められる。
【０００５】
従来、ゼラチンやコラーゲンを分解し、より低分子量のものとするには、プロテアーゼやコラゲナーゼが用いられ、これら酵素は、アクロモバクター  イオファーガス（Ａｃｈｒｏｍｏ−ｂａｃｔｏｒ  ｉｏｐｈａｇｕｓ）やクロストリジューム  ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）を培養することにより得られることが知られている。
【０００６】
しかしながら、これらの微生物は病原性が確認されており、かつ嫌気的条件下で培養しなければならない等の問題点があり、これらの微生物から大量の酵素を得るためには、煩雑な操作が必要であった。また、これら微生物から得られる酵素は、ゼラチンやコラーゲンを最小単位（分子量数１００〜数１０００）まで分解してしまい、適度の分子量を持つゼラチンやコラーゲンの分解物を得ることができないものであった。
【０００７】
また、小腸由来のコラゲナーゼも知られているが、このものは高価であり、かつ、これを得るためには、煩雑な操作が必要で、多量に調整する事は困難であるため、これを用いることは工業的に有利な方法とは言い難いものであった。更にこのコラゲナーゼは、コラーゲンを分子量数１００〜数１０００に分解してしまうものであった。
【０００８】
そこで、本発明者らは先に、適度な分子量のゼラチンやコラーゲンの分解物を製造するための酵素を提供することを目的として種々の検討を行った。その結果、ゼラチン及びコラーゲンを適度な分子量のペプチドに分解する酵素を自然界に求め鋭意探索した結果、分子量約１３万のゼラチン及びコラーゲンを分子量約７万と約４万のペプチドに分解する酵素を産生する微生物を土壌中に見出し、先に特許出願した（特許文献１）。
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−１０２３８１号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
特許文献１に記載のプロテアーゼは、以下の（１）〜（５）の性質を有するものであった。
（１）作用：
分子量約１３万の熱変性コラーゲン及び分子量約３０万の未変性可溶化コラーゲンを分子量約７万と分子量約４万のペプチドに分解する限定分解活性を示すが、コラゲナーゼ基質であるＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇの合成基質に対してはわずかに分解活性を示し、ＤＮＰ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇの合成基質に対しては、分解活性を示さない。また、アゾコール及びカゼインに対して分解活性を示す。なお、ここでＤＮＰはジニトロフェニル基を示し、ＤはＡｒｇがＤ体であることを示す。
（２）至適ｐＨ：
ｐＨ５．５〜７
（３）至適温度：
３７〜４０℃
（４）分子量：
２３，０００±２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
（５）酵素阻害：
ｏ−フェナントリン、Ｌ−システインにより活性阻害を受けるが、エチレンジアミン四酢酸、Ｎ−エチルマレイミド、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ヨードアセトアミドによる活性阻害は少ない。
【００１１】
上記プロテアーゼは、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造したものである。尚、特許文献１には、上記プロテアーゼは、オウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造した旨、記載されているが、その後の検討で、オウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属は、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に統合されている。
【００１２】
ところが、本発明者らがさらに検討した結果、上記培養物には、上記プロテアーゼ以外の新たなプロテーアゼが含まれ、このプロテアーゼが、上記特許文献１に記載のプロテアーゼとは異なるアミノ酸配列の切断特異性等を有するプロテアーゼであって、ゼラチン及びコラーゲンを大きな断片に分解できる酵素であることを見出し、さらにそのアミノ酸配列及び塩基配列を解読して、本発明を完成した。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下のとおりである。
（１）以下の▲１▼及び▲２▼に示す性質を有するプロテアーゼ。
▲１▼分子量、２１０００±１０００  （ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
▲２▼特異的プロテアーゼ活性、以下に示すアミノ酸配列（１）  を含むペプチドまたはタンパク質をＧｌｙ−Ｐｈｅ部位で切断するか、アミノ酸配列（２）  を含むペプチドまたはタンパク質をＧｌｙ−Ｐｈｅ部位で切断するか、またはアミノ酸配列（３）  を含むペプチドまたはタンパク質をＳｅｒ−Ｌｅｕ部位で切断する。
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ    （１）
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ    （２）
Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ    （３）（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の１〜８１６番の塩基配列、または２５３〜８１６番の塩基配列を有するＤＮＡ。
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の１〜８１６番の塩基配列、または２５３〜８１６番の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ請求項１に記載の▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の１〜８１６番の塩基配列、または２５３〜８１６番の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列からなり、かつ請求項１に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（６）配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、かつ（１）に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質。
（７）配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ（１）に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質。
（８）（５）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（９）（２）〜（４）及び（８）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（１０）（９）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１１）（１０）に記載の形質転換体を培養し、（１）に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質を採取するプロテアーゼの製造方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
［プロテアーゼ］
本発明のプロテアーゼは、以下の▲１▼及び▲２▼に示す性質を有する。
▲１▼分子量、２１０００±１０００  （ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
▲２▼特異的プロテアーゼ活性、以下に示すアミノ酸配列（１）  を含むペプチドまたはタンパク質をＧｌｙ−Ｐｈｅ部位で切断するか、アミノ酸配列（２）  を含むペプチドまたはタンパク質をＧｌｙ−Ｐｈｅ部位で切断するか、またはアミノ酸配列（３）  を含むペプチドまたはタンパク質をＳｅｒ−Ｌｅｕ部位で切断する。
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ    （１）
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ    （２）
Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ    （３）
【００１５】
本発明のプロテアーゼは、上記（１）〜（３）で示すアミノ酸配列のいずれかを含むペプチド及びタンパク質を上記部位で切断する特異的プロテアーゼ活性を有し、本発明においてプロテアーゼとは、上記切断活性（特異的プロテアーゼ活性）を有する酵素をいう。本発明のプロテアーゼは、上記（１）〜（３）で示すアミノ酸配列のいずれか２つ以上を含むペプチド及びタンパク質についても、各部位を切断する。
【００１６】
本発明のプロテアーゼの調製方法について説明する。
オウレオバクテリウム・エスピー（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＭＩＭ−ＣＧ−９５３５−Ｉ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３２６）を培地に接種し、常法に従って培養し、得られた培養物から当該プロテアーゼを採取することにより得られる。但し、培養物から当該プロテアーゼの採取には、本発明のプロテアーゼの特異的プロテアーゼ活性、即ち、上記▲２▼に示すアミノ酸部位での切断活性に基づいて行う。この点については後述する。
【００１７】
前記菌体の培養に使用される培地は、通常の微生物の培地に用いられ、当該菌体が生育可能なものであれば、特に限定されないが、該培地中には、資化し得る窒素源、炭素源、無機塩類を適当量含有せしめておくことが好ましい。
【００１８】
窒素源、炭素源、無機塩類は特に制限されないが、例えば窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、ペプトン、炭素源としては、グルコース、フルクトース、ショ糖、グリセリン、無機塩類としては、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛等が挙げられる。
【００１９】
培地のｐＨは６〜７程度が好ましく、培養温度は２８〜３０℃で、２０〜４８時間振とう培養することが好ましい。
【００２０】
培養物中からの目的物質であるプロテアーゼの採取及び精製は、本発明のプロテアーゼの特異的プロテアーゼ活性、即ち、上記▲２▼に示すアミノ酸部位での切断活性に基づいて行う。
具体的には、培養物を遠心、又は濾過などによって菌体を分離し、その培養濾液を通常の分離手段、例えば、硫酸アンモニウム沈澱法、限外濾過膜により濃縮した後、これをカラムクロマトグラフィー等により精製する。但し、精製の際に、上記▲２▼に示すアミノ酸部位での切断活性を有するフラクションのみを回収する。
前記特許文献１においては、プロテアーゼの精製の際に、アゾコール活性を有するフラクションを回収していた（段落００２８）。さらに、酵素活性の検定にもアゾコール活性を用いていた。
【００２１】
本発明者らの検討の結果、アゾコール活性を有するフラクションと上記▲２▼に示すアミノ酸部位での切断活性を有するフラクションとは、一部重複していた。本発明のプロテアーゼの製造においては、回収する上記▲２▼に示すアミノ酸部位での切断活性を有するフラクションは、アゾコール活性も有する。しかし、アゾコール活性を有するフラクションには、上記▲２▼に示すアミノ酸部位での切断活性を有するフラクションと前記切断活性を有しないフラクションとがあり、特許文献１においてのされたプロテアーゼは、アゾコール活性を有するフラクションのほぼ全てから回収されたタンパク質である。
【００２２】
本発明のタンパク質は、図１に示すタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果からも明らかなように、分子量が２１０００±１０００である単一成分からなるものである。それに対して、特許文献１の図６にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果が示されたタンパク質分解酵素は、分子量が２３０００±２０００であり、両者は、明らかに別物質である。従って、特許文献１に記載のタンパク質分解酵素は、本発明のプロテアーゼを含む複数のタンパク質の混合物であると推測される。但し、下記に示すように、特許文献１に記載のタンパク質分解酵素と本発明のプロテアーゼとでは、基質特異性も全く異なる。よって、特許文献１に記載のタンパク質分解酵素に、本発明のプロテアーゼが含まれていたとしても、極少量であり、その特性は実質的に検知されていなかったものと考えられる。
【００２３】
上記▲２▼に示すアミノ酸部位での切断活性（特異的プロテアーゼ活性）は、以下の方法で測定できる。
以下の（１）〜（３）に示すアミノ酸配列を有するペプチドであって、蛍光標識をしたペプチドを常法により合成する。具体的には、下記いずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの切断部位の一方の側に、蛍光物質を標識し、他方の側に消光物質を標識する。この標識されたペプチドは、切断されて始めて蛍光が観測され、下記のアミノ酸配列に対して切断活性を有さない酵素の基質として用いても、蛍光は観測されない。ペプチドを標識するための物質は、蛍光物質及び消光物質であれば、特に制限はないが、蛍光物質としては、例えば、Ｎ−メチルアントラニックアシドを用い、消光物質としては、例えば、ジニトロフェニル基を用いることができる。
【００２４】
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ    （１）
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ    （２）
Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ    （３）
【００２５】
本発明において、特異的プロテアーゼ活性は、上記（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの一端にＮ−メチルアントラニックアシドを標識し、他端にジニトロフェニル基を標識した蛍光標識合成ペプチドのいずれかを基質として、遮光下で所定時間、所定量の酵素とインキュベートし、その後、生成物を逆相ＨＰＬＣにて分離し、分離物の蛍光強度を測定して、切断活性を検定する。
参考までに、特許文献１に記載の酵素が分解できる基質であるＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎの分解活性も同様にして測定できる。
本発明の酵素（プロテアーゼ）及び特許文献１に記載の酵素の切断活性を以下の表１にまとめる。
【００２６】
【表１】
2004350513.tif 000002
注意：↓は切断箇所を示す
【００２７】
本発明の上記特異的プロテアーゼ活性の発現には、基質となるペプチドまたはタンパク質が、前記（１）〜（３）に示すアミノ酸配列の全てを含むことが必要であり、上記アミノ酸配列の一部を欠いても、上記特異的プロテアーゼ活性は発現されない。但し、前記（１）〜（３）に示すアミノ酸配列の全てを含んでいれば、さらに追加のアミノ酸を含んでいても、上記特異的プロテアーゼ活性は発現される。因みに、前記（１）及び（２）に示すアミノ酸配列に対応する上記合成基質は、Ｎ末端にＧｌｙを含むが、このＧｌｙを含んでも含まなくても、上記特異的プロテアーゼ活性は発現される。
【００２８】
どのアミノ酸配列が特異的プロテアーゼ活性発現に必須か（１）のアミノ酸配列についてペプチド鎖の配列を変えた蛍光標識合成ペプチドを用いて検討した結果を以下の表に示す。この表の結果から、特異的プロテアーゼ活性発現には、前記（１）に示すアミノ酸配列の全てを含むことが必要であることが分かる。尚、表２ではアミノ酸は一文字コードで表した。
【００２９】
【表２】
2004350513.tif 000003
【００３０】
本発明のプロテアーゼは、上記▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性以外に、以下の特性も有する。
（１）至適ｐＨ  ５．５〜７．０
（２）至適温度  ３７〜４０℃
（３）酵素阻害  以下の表３に示す。
【００３１】
【表３】
2004350513.tif 000004
【００３２】
本発明は、配列番号１に記載の塩基配列の１〜８１６番の塩基配列、または２５３〜８１６番の塩基配列を有するＤＮＡを包含する。配列番号１に記載の塩基配列の１〜８１６番の塩基配列を有するＤＮＡは、プレプロ体をコードするＤＮＡであり、それに対して、配列番号１に記載の塩基配列の２５３〜８１６番の塩基配列を有するＤＮＡは、成熟体をコードするＤＮＡである。
【００３３】
本発明は、さらに、配列番号１に記載の塩基配列の１〜８１６番の塩基配列、または２５３〜８１６番の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
【００３４】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３６】
さらに、タンパク質が、上記▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性を有することは、前述のように蛍光標識合成ペプチドを用いて測定することができる。
【００３７】
本発明は、さらに、配列番号１に記載の塩基配列の１〜８１６番の塩基配列、または２５３〜８１６番の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列からなり、かつ上記▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
タンパク質が、上記▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性を有することは、上記と同様に測定できる。
【００３８】
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００３９】
本発明のＤＮＡの取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１に記載した塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて各種微生物、特に、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するプロテアーゼ生産菌のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のＤＮＡを単離することができる。尚、前述のよにう、オウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属は、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に統合されているので、オウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するとされているプロテアーゼ生産菌のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっても本発明のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを発現している細胞から常法により作製することができる。
【００４０】
ＰＣＲ法により本発明のＤＮＡを取得することもできる。上記プロテアーゼ生産菌の染色体ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００４１】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４２】
本発明は、配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、アミノ酸数２７２のタンパク質であり、成熟体（８５〜２７２）を含むプロ体である。それに対して、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（アミノ酸数１８８）は、成熟体のタンパク質である。
【００４３】
本発明は、さらに、配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、かつ上記▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質を包含する。
タンパク質が、上記▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性を有することは、上記と同様に測定できる。
【００４４】
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００４５】
本発明は、配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質を包含する。
本明細書で言う「配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、７０％以上であれば特に限定されないが、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上である。
【００４６】
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。
組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、本明細書の上記に記載した当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
【００４７】
本発明は、さらに、上記のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを包含する。このＤＮＡは、配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００４８】
例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４９】
本発明は、上記本発明のＤＮＡを含む組換えベクターを包含する。
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００５０】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００５１】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌の  ｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
【００５２】
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００５３】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００５４】
本発明の組換えベクターを構成するベクターは、宿主内で発現し得るベクターであれば、特に制限はなく、宿主との関係で適宜決定することができる。
【００５５】
本発明は、上記本発明の組換えベクターを含む形質転換体を包含する。
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００５６】
本発明の形質転換体を構成する宿主には特に制限はないが、細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
【００５７】
但し、本発明のタンパク質（プロテアーゼ）を効率よく産生できるという観点から、本発明の形質転換体を構成する宿主はブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物であることが好ましい。ブレビバチルスに属する微生物としては、例えば、ブレビバチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルスチョシネンシス（Ｂ．ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルスフォルモサス（Ｂ．ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルスパラブレビス（Ｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルスレウスゼリ（Ｂ．ｒｅｕｓｚｅｒｉ）、ブレビバチルスアグリ（Ｂ．ａｇｒｉ）、ブレビバチルスセントロシポラス（Ｂ．ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルスボルステレイシス（Ｂ．ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルスラテロシポラス（Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルステルモルベル（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）等を挙げることができる。
【００５８】
細菌細胞以外に酵母細胞を挙げることもできる。酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓ１ａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００５９】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００６０】
本発明は、上記本発明の形質転換体を培養し、上記▲２▼に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質を採取するプロテアーゼの製造方法を包含する。
本発明の形質転換体の培養は、宿主の種類に応じて適宜決定できる。
形質転換体の培養に使用される培地は、通常の微生物の培地に用いられ、当該形質転換体が生育可能なものであれば、特に限定されないが、該培地中には、資化し得る窒素源、炭素源、無機塩類を適当量含有せしめておくことが好ましい。
【００６１】
窒素源、炭素源、無機塩類は特に制限されないが、例えば窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、ペプトン、炭素源としては、グルコース、フルクトース、ショ糖、グリセリン、無機塩類としては、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛等が挙げられる。
【００６２】
培地のｐＨ及び培養温度は、宿主の種類に応じて決定されるが、宿主がバチルスに属する微生物の場合、ｐＨは７．５〜１０及び培養温度は約３０℃とすることができる。
また、培養時間も適宜決定できるが、例えば、２０〜４８時間振とう培養することができる。
【００６３】
本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００６４】
培養物中からの目的物質であるプロテアーゼの採取及び精製は、本発明のプロテアーゼの特異的活性、即ち、上記▲２▼に示すアミノ酸部位での切断活性に基づいて行う。切断活性の測定は、前述の本発明のプロテアーゼの調製方法における説明と同様とする。
【００６５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
本発明のプロテアーゼの製造
オウレオバクテリウム・エスピー（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＭＩＭ−ＣＧ−９５３５−Ｉ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３２６）を、増殖培地（表４）で好気的に２８℃、１６〜２４時間培養した。培養後遠心分離により菌体を分離した培養液に、硫酸アンモニウムを加えて５５％飽和沈澱画分を遠心分離にて集めた。この沈澱を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）、８ｍＭ塩化カルシウム、０．１Ｍ硫酸アンモニウム緩衝液に溶解し、同緩衝液０．８Ｍ硫酸アンモニウム濃度に調製後遠心分離を行い、上清を得た。
【００６６】
【表４】
2004350513.tif 000005
ｐＨ６．８
【００６７】
上記上清を以下の精製法で精製した。
精製方法（硫安による精製）
ブァッファー  Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）・１ｍＭ  ＣａＣｌ２・０．９Ｍ  ＡｍＳＯ４
ブァッファー  Ｂ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）・１ｍＭ  ＣａＣｌ２・０．１Ｍ  ＡｍＳＯ４
ｉ）−２０℃凍結保存しておいた培養濃縮液を融解した。
ｉｉ）イオンクロマトカラム（Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）を作成し、ブァッファー  Ａで平衡化。
ｉｉｉ）融解した培養液をブァッファー  Ａと導電導率になるようにＡｍＳＯ４を加え、よく攪拌後、ｐＨ７．４に調製して遠心し、上清を得る。
ｉｖ）上清をカラムにアプライし、終了後洗浄した。
ｖ）洗浄後、ブァッファー  Ａとブァッファー  Ｂを用いて溶出を行い得られたフラクションの活性及びタンパク量を測定し、更に各フラクションの電気泳動を行い、プール画分を決定した。
ｖｉ）プール画分を分子量１万膜により濃縮、その後透析した。
ｖｉｉ）５ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５）・１５０ｍＭ  ＮａＣｌ２・５ｍＭ  ＣａＣｌ２に溶解し、精製を終了した。
【００６８】
分子量の測定
分子量の測定は以下のように行った。
上記精製された酵素はＳＤＳ及び２−メルカプトエタノール（還元剤）により処理したものを電気泳動し、分子量マーカー及びサンプルの泳動距離から算出した。結果は、図１に示す。
【００６９】
切断活性（特異的プロテアーゼ活性）の測定
切断活性（特異的プロテアーゼ活性）の測定は、以下のように行った。
以下の（１）〜（３）に示すアミノ酸配列を有し、一端にＮ−メチルアントラニックアシドを標識し、他端にジニトロフェニル基を標識したＮｍａ／Ｄｎｐ型蛍光標識ペプチド（励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ）を、常法により、ペプチド合成機を用いて合成した。
Ｎｍａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（ＤＮＰ）ｒ−ＮＨ２    （１）
Ｎｍａ−  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（ＤＮＰ）ｒ−ＮＨ２    （２）Ｎｍａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（ＤＮＰ）ｒ−ＮＨ２    （３）Ｎｍａ：  Ｎ−メチルアントラニックアシド
ＤＮＰ：  ジニトロフェニル基
【００７０】
得られた蛍光標識合成ペプチドのいずれかを基質として、以下の条件で、切断活性の測定を行った。
蛍光標識合成ペプチド１００μｇを１０ｍＭトリス緩衝液にて０．２ｍｇ／ｍＬに調整し、上記本発明のプロテアーゼ１μｇを添加して、遮光下で３７℃で１０分間インキュベートした。得られた酵素反応液についてＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ  ８０Ｔ（東ソー）を用いた逆相ＨＰＬＣで、０．１％ＴＦＡから８０％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡ、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、４０分間のグラジェントにより分解ペプチドを分離した。Ａ２１５及び島津高速液クロマトグラフ用分光蛍光検出器を用いて励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍの蛍光強度を検出した。
【００７１】
結果は、前記表１に示す通りである。
比較のため、特許文献１に記載の酵素の切断活性を同様の条件で測定した。結果は、前記表１に示す通りである。
また、特許文献１に記載の酵素が切断活性を示すＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎについても上記と同様に蛍光標識合成ペプチドを得、上記と同様に本発明の酵素及び特許文献１に記載の酵素について切断活性を測定した。結果は、前記表１に示す通りである。
【００７２】
また、（１）に示すアミノ酸配列について、ペプチド鎖の構成を変更して、上記と同様に蛍光標識合成ペプチドを合成し、上記と同様に切断活性の測定を行い、前記特異的分解活性に必須なアミノ酸を検証した。結果は前記表２に示す通りである。
【００７３】
上記で得られた本発明の酵素（プロテアーゼ）について、以下の特性を以下のように測定した。
（１）酵素の温度安定性と至適温度
ｉ）温度安定性
０〜６０℃における各温度で酵素を１時間放置し、その後３７℃、３０分間合成基質と反応させた後、酵素活性を測定した。
ｉｉ）至適温度
０〜６０℃のおける各温度で合成基質溶液及び酵素液を３０分反応させた後、酵素活性を測定した。
【００７４】
（２）酵素のｐＨ安定性と至適ｐＨ
ｉ）ｐＨ安定性
緩衝液はｐＨ３．０〜５．０の範囲は酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０〜９．０はＭＥＳ−ＨＥＰＥＳ−ホウ酸緩衝液をｐＨ０．５刻みで調製した。各緩衝液に酵素を添加し、緩やかに撹拌しながら１時間氷冷した。その後、合成基質溶液を加え、残存酵素活性を測定した。
ｉｉ）至適ｐＨ
上記の各緩衝液で合成基質溶液を調製し、酵素液を添加、酵素活性を測定した。
【００７５】
（３）酵素阻害の影響
阻害剤として用いた試薬は、Ｏ−フェナントロリン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、Ｌ−システイン、２−メルカプトエタノール、Ｎ−エチルマレイミド、アンチパイン、レウペプシン、Ｅ−６４、ホスホラミドン、トリプシンインヒビター、キモスタイン、ＴＣＰＫ、ＰＭＳＦ、ヨードアセトアミドであった。各試薬を合成基質に混合し、そこへ酵素を添加した。３７℃、３０分の分解反応を行い、酵素活性を測定した。阻害剤を添加しない場合を１００％とし、相対的に残存酵素活性を算出した。
【００７６】
上記測定の結果は以下の通りである。
（１）温度安定性  酵素自身は熱に弱く、４０℃以上でほぼ失活し、３０℃でも半分しか残存活性はなかった。
至適温度  ３７〜４０℃
（２）ｐＨ安定性  ｐＨ３〜９の広い範囲で安定であった。
至適ｐＨ  ５．５〜７．０
（３）酵素阻害  前記の表３に示す。
【００７７】
上記で得られた本発明の酵素（プロテアーゼ）についてＤＮＡ配列決定及びアミノ酸配列決定を行った。
ＤＮＡ配列決定法
塩基配列の決定は、ｆｏｒｗａｒｄ／ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを用い、ＤＹＥｎａｍｉｃＴＭ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍａｒｓｈａｍ）によりシーケンスＰＣＲを行った。配列は、ＤＮＡＳＹＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅおよびＧｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ−１０．０を用いて解析した。結果を配列表の配列番号１に示す。
【００７８】
アミノ酸配列決定法
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサーにて解析し、同様にプロテアーゼによる分解物についても内部アミノ酸配列を解析した。得られた配列をもとにオリゴヌクレオチドプライマーを作成し、ＰＣＲによる増幅を行った。結果を配列表の配列番号２及び３に示す。
【配列表】
2004350513.tif 000006
2004350513.tif 000007
2004350513.tif 000008
2004350513.tif 000009
2004350513.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のタンパク質（プロテアーゼ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果。
【図１】
2004350513.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月31日(2004.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
以下の(a)及び(b)に示す性質を有するプロテアーゼ。
(a)分子量、21000±1000 (SDS-PAGEによる)
(b)特異的プロテアーゼ活性、以下に示すアミノ酸配列(1) を含むペプチドまたはタンパク質をGly-Phe部位で切断するか、アミノ酸配列(2) を含むペプチドまたはタンパク質をGly-Phe部位で切断するか、またはアミノ酸配列(3) を含むペプチドまたはタンパク質をSer-Leu部位で切断する。
Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro  (1)
Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Pro  (2)
Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Thr-Pro  (3)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列の1〜816番の塩基配列、または253〜816番の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ請求項１に記載の(b)に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
ところが、本発明者らがさらに検討した結果、上記培養物には、上記プロテアーゼ以外の新たなプロテアーゼが含まれ、このプロテアーゼが、上記特許文献１に記載のプロテアーゼとは異なるアミノ酸配列の切断特異性等を有するプロテアーゼであって、ゼラチン及びコラーゲンを大きな断片に分解できる酵素であることを見出し、さらにそのアミノ酸配列及び塩基配列を解読して、本発明を完成した。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下のとおりである。
(１)以下の(a)及び(b)に示す性質を有するプロテアーゼ。
(a)分子量、21000±1000 (SDS-PAGEによる)
(b)特異的プロテアーゼ活性、以下に示すアミノ酸配列(1) を含むペプチドまたはタンパク質をGly-Phe部位で切断するか、アミノ酸配列(2) を含むペプチドまたはタンパク質をGly-Phe部位で切断するか、またはアミノ酸配列(3) を含むペプチドまたはタンパク質をSer-Leu部位で切断する。
Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro  (1)
Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Pro  (2)
Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Thr-Pro  (3)
(２)配列表の配列番号１に記載の塩基配列の1〜816番の塩基配列、または253〜816番の塩基配列を有するＤＮＡ。
(３)配列表の配列番号１に記載の塩基配列の1〜816番の塩基配列、または253〜816番の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ（１）に記載の(b)に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(４)配列表の配列番号１に記載の塩基配列の1〜816番の塩基配列、または253〜816番の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列からなり、かつ（１）に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(５)配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
(６)配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、かつ(1)に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質。
(７)配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ(1)に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質。
(８)(５)〜(７)のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
(９)(２)〜(４)及び(８)に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
(１０)(９)に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(１１)(１０)に記載の形質転換体を培養し、(1)に記載の特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質を採取するプロテアーゼの製造方法。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【発明の実施の形態】
［プロテアーゼ］
本発明のプロテアーゼは、以下の(a)及び(b)に示す性質を有する。
(a)分子量、21000±1000 (SDS-PAGEによる)
(b)特異的プロテアーゼ活性、以下に示すアミノ酸配列(1) を含むペプチドまたはタンパク質をGly-Phe部位で切断するか、アミノ酸配列(2) を含むペプチドまたはタンパク質をGly-Phe部位で切断するか、またはアミノ酸配列(3) を含むペプチドまたはタンパク質をSer-Leu部位で切断する。
Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro  (1)
Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Pro  (2)
Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Thr-Pro  (3)


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明のプロテアーゼの調製方法について説明する。
オウレオバクテリウム・エスピー（Aureobacterium sp.）ＭＩＭ−ＣＧ−９５３５−Ｉ（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３２６）を培地に接種し、常法に従って培養し、得られた培養物から当該プロテアーゼを採取することにより得られる。但し、培養物から当該プロテアーゼの採取には、本発明のプロテアーゼの特異的プロテアーゼ活性、即ち、上記(b)に示すアミノ酸部位での切断活性に基づいて行う。この点については後述する。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
培養物中からの目的物質であるプロテアーゼの採取及び精製は、本発明のプロテアーゼの特異的プロテアーゼ活性、即ち、上記(b)に示すアミノ酸部位での切断活性に基づいて行う。
具体的には、培養物を遠心、又は濾過などによって菌体を分離し、その培養濾液を通常の分離手段、例えば、硫酸アンモニウム沈澱法、限外濾過膜により濃縮した後、これをカラムクロマトグラフィー等により精製する。但し、精製の際に、上記(b)に示すアミノ酸部位での切断活性を有するフラクションのみを回収する。
前記特許文献１においては、プロテアーゼの精製の際に、アゾコール活性を有するフラクションを回収していた（段落００２８）。さらに、酵素活性の検定にもアゾコール活性を用いていた。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明者らの検討の結果、アゾコール活性を有するフラクションと上記(b)に示すアミノ酸部位での切断活性を有するフラクションとは、一部重複していた。本発明のプロテアーゼの製造においては、回収する上記(b)に示すアミノ酸部位での切断活性を有するフラクションは、アゾコール活性も有する。しかし、アゾコール活性を有するフラクションには、上記(b)に示すアミノ酸部位での切断活性を有するフラクションと前記切断活性を有しないフラクションとがあり、特許文献１において記載されたプロテアーゼは、アゾコール活性を有するフラクションのほぼ全てから回収されたタンパク質である。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
上記(b)に示すアミノ酸部位での切断活性(特異的プロテアーゼ活性)は、以下の方法で測定できる。
以下の（1）〜(3)に示すアミノ酸配列を有するペプチドであって、蛍光標識をしたペプチドを常法により合成する。具体的には、下記いずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの切断部位の一方の側に、蛍光物質を標識し、他方の側に消光物質を標識する。この標識されたペプチドは、切断されて始めて蛍光が観測され、下記のアミノ酸配列に対して切断活性を有さない酵素の基質として用いても、蛍光は観測されない。ペプチドを標識するための物質は、蛍光物質及び消光物質であれば、特に制限はないが、蛍光物質としては、例えば、N-メチルアントラニックアシドを用い、消光物質としては、例えば、ジニトロフェニル基を用いることができる。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明のプロテアーゼは、上記(b)に示す特異的プロテアーゼ活性以外に、以下の特性も有する。
（１）至適ｐＨ  ５．５〜７．０
（２）至適温度  ３７〜４０℃
（３）酵素阻害  以下の表３に示す。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【表３】
2004350513.tif 000012
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明は、さらに、配列番号１に記載の塩基配列の1〜816番の塩基配列、または253〜816番の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記(b)に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
さらに、タンパク質が、上記(b)に示す特異的プロテアーゼ活性を有することは、前述のように蛍光標識合成ペプチドを用いて測定することができる。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明は、さらに、配列番号１に記載の塩基配列の1〜816番の塩基配列、または253〜816番の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列からなり、かつ上記(b)に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
タンパク質が、上記(b)に示す特異的プロテアーゼ活性を有することは、上記と同様に測定できる。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より一層好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明は、さらに、配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、かつ上記(b)に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質を包含する。
タンパク質が、上記(b)に示す特異的プロテアーゼ活性を有することは、上記と同様に測定できる。


【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本発明は、配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記(b)に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質を包含する。
本明細書で言う「配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、７０％以上であれば特に限定されないが、より好ましくは８０％以上、より一層好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上である。


【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。


【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
細菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモーター、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモーター、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモーターなどが挙げられる。


【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネーターに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）などの要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。


【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモーター、および所望によりターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。


【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
本発明は、上記本発明の形質転換体を培養し、上記(b)に示す特異的プロテアーゼ活性を有するタンパク質を採取するプロテアーゼの製造方法を包含する。
本発明の形質転換体の培養は、宿主の種類に応じて適宜決定できる。
形質転換体の培養に使用される培地は、通常の微生物の培地に用いられ、当該形質転換体が生育可能なものであれば、特に限定されないが、該培地中には、資化し得る窒素源、炭素源、無機塩類を適当量含有せしめておくことが好ましい。


【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
培養物中からの目的物質であるプロテアーゼの採取及び精製は、本発明のプロテアーゼの特異的活性、即ち、上記(b)に示すアミノ酸部位での切断活性に基づいて行う。切断活性の測定は、前述の本発明のプロテアーゼの調製方法における説明と同様とする。


【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
得られた蛍光標識合成ペプチドのいずれかを基質として、以下の条件で、切断活性の測定を行った。
蛍光標識合成ペプチド100μgを10mMトリス緩衝液にて0.2mg/mLに調整し、上記本発明のプロテアーゼ1μgを添加して、遮光下で37℃で10分間インキュベートした。得られた酵素反応液についてTSK gel ODS 80T(東ソー)を用いた逆相HPLCで、0.1%TFAから80%アセトニトリル-0.1%TFA、流速1mL/min、40分間のグラジェントにより分解ペプチドを分離した。A215及び島津製高速液体クロマトグラフ用分光蛍光検出器を用いて励起波長340nm、蛍光波長440nmの蛍光強度を検出した。