(57)【要約】【課題】簡便且つ迅速な、嫌気性菌の鑑別方法を提供する。【解決手段】前記鑑別方法では、嫌気性菌の鑑別において、鑑別対象の嫌気性菌に特有の酵素活性に対する発色酵素基質又は発光酵素基質を含ませた吸水性担体と、鑑別対象の嫌気性菌が発育可能な培地上に発育した孤立集落又はその孤立集落を純培養した純培養菌とを、直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を検出する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性菌の鑑別において、鑑別対象の嫌気性菌に特有の酵素活性に対する発色酵素基質又は発光酵素基質を含ませた吸水性担体と、鑑別対象の嫌気性菌が発育可能な培地上に発育した孤立集落又はその孤立集落を純培養した純培養菌とを、直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を検出することを特徴とする、嫌気性菌の鑑別方法。
【請求項２】
吸水性担体が綿棒である、請求項１に記載の嫌気性菌の鑑別方法。
【請求項３】
α−グルコシダーゼ、α−フコシダーゼ、又はシアリダーゼを有するか否かを分析することを特徴とする、色素産生性のプレボテーラ属に属する微生物とポルフィロモナス属に属する微生物との鑑別方法。
【請求項４】
α−グルコシダーゼを有するか否かを分析することを特徴とする、バクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物とバクテロイデス・ウレオリティカスグループに属する微生物との鑑別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、嫌気性菌の鑑別方法、より詳細には、発色又は発光を用いた嫌気性菌の生化学的性状による鑑別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
嫌気性菌は、例えば、慢性呼吸器感染症、耳鼻咽喉科領域の慢性感染症、腹腔内感染症（例えば、化膿性虫垂炎又は肝膿瘍）、脳膿瘍、術後呼吸器感染症、交通外傷、又は口腔感染症（例えば、歯周病）などの各種感染症からの検出率が高く、更に近年、院内感染症として偽膜性大腸炎又は化学療法薬関連下痢症の原因菌としても注目されている。また、食品分野においては、ボツリヌス菌又はウエルッシュ菌などの食中毒においても、嫌気性菌が原因菌となっている。
【０００３】
これら嫌気性菌の同定は、日常検査法として未確立の部分がかなりあること、培養に時間がかかること、嫌気性菌の中には酸素に触れると短時間のうちに死滅する菌種もあることなどから、その同定操作はかなり困難な面があるのが現状である。
従来の嫌気性菌の鑑別及び同定は、分離培地上の集落の形態、グラム染色性及び形態観察が重要であり、これらにより属レベルを推定同定可能な菌もあるが、菌種の特定には、例えば、カタラーゼ試験、インドール試験、ガス産生性、硫化水素産生性、硝酸塩還元試験、ゼラチン液化試験、ウレアーゼ試験、牛乳の凝固・消化試験、胆汁酸による発育促進・抑制試験、各種糖の発酵試験、エスクリン加水分解試験、デンプン加水分解試験、レシチナーゼ産生性、又はリパーゼ産生性などの各種生化学的性状検査及びガスクロマトグラフィーによる脂肪酸の分析などにより行なわれている（非特許文献１〜３）。これらの試験は、検査材料を培地に接種した後、４８時間〜７２時間、また試験項目によっては１週間を要するため、検査の結果が出るまでに長時間を要し、操作も極めて煩雑であるため、嫌気性菌の同定はかなりの熟練性も要求される。
【０００４】
【非特許文献１】
「バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌｏｇｙ）」，  ｖｏｌ．１，Ｗｉｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  １９８４
【非特許文献２】
「バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌｏｇｙ）」，  ｖｏｌ．２，Ｗｉｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  １９８６
【非特許文献３】
上野一恵，「微生物検査マニュアル−臨床嫌気性菌検査法‘９７−」日本臨床微生物学会雑誌，ｖｏｌ１  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１，１９９７
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、嫌気性菌の鑑別及び同定には、菌分離後、多くの生化学的検査が必要で、多種類の培地及び試薬と日数が必要となり、場合によっては鑑別結果の誤認の危険性もある。更に多くの試験は、嫌気状態下で行なわれなければならず、その操作も煩雑であり、結果の総合判断は、嫌気性菌検査に精通した熟練者でなければ難しいのが現状である。この事実は、嫌気性菌による様々な感染症の診断や食中毒の原因菌の特定に大きな支障となっている。嫌気性菌の鑑別は、形態学的観察と生化学的性状によって行なわれることは周知のことであるが、特に生化学的性状においては、それらの性状の一つ一つはそれぞれの酵素の作用の現れで、生化学的性状検査はとりもなおさず、その細菌のもつ酵素を調べることにほかならない。一つの性状試験は、いくつもの酵素の作用による最終産物により判定される。このことが、鑑別に長時間を要する原因となっている。従って、嫌気性菌による感染症の診断や院内感染の防止、あるいは、安全な食品の供給に、その検査結果が必ずしも反映されているとは言い難い。本発明は、こうした嫌気性菌の鑑別が抱える諸問題を解決することを目的とするものである。
すなわち、本発明の課題は、簡便且つ迅速な、嫌気性菌の鑑別方法を提供することにある。
【０００６】
また、本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討する過程において、或る特定の嫌気性菌の鑑別を可能とする、前記嫌気性菌に特有の酵素活性も見出した。すなわち、本発明の課題は、前記特定嫌気性菌の鑑別方法を提供することにもある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、嫌気性菌の鑑別において、鑑別対象の嫌気性菌に特有の酵素活性に対する発色酵素基質又は発光酵素基質を含ませた吸水性担体と、鑑別対象の嫌気性菌が発育可能な培地上に発育した孤立集落又はその孤立集落を純培養した純培養菌とを、直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を検出することを特徴とする、嫌気性菌の鑑別方法により解決することができる。
本発明の鑑別方法の好ましい態様によれば、前記吸水性担体が綿棒である。
また、本発明は、α−グルコシダーゼ、α−フコシダーゼ、又はシアリダーゼを有するか否かを分析することを特徴とする、色素産生性のプレボテーラ属に属する微生物とポルフィロモナス属に属する微生物との鑑別方法に関する。
更に、本発明は、α−グルコシダーゼを有するか否かを分析することを特徴とする、バクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物とバクテロイデス・ウレオリティカスグループに属する微生物との鑑別方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、例えば、臨床検査又は食品検査における嫌気性菌の簡易で迅速な鑑別法を提供するものである。具体的には、鑑別対象の嫌気性菌が発育可能な培地（選択分離培地）、例えば、嫌気性血液寒天培地、ＧＡＭ寒天培地、クロストリジウム・ディフシル寒天培地（ＣＣＦＡ培地又はＣＣＭＡ寒天培地）、又はバクテロイデス胆汁エスクリン寒天培地（ＢＢＥ寒天培地）上で集落を形成した孤立集落又は純培養菌が有する特定の酵素活性の有無を調べることで、分離した菌を判別することを基本とする。
【０００９】
本発明方法では、この特異酵素を確認する試薬として、鑑別対象の嫌気性菌に特有の酵素活性に対する発色酵素基質又は発光酵素基質を用いる。本明細書において、「鑑別対象の嫌気性菌に特有の酵素」とは、鑑別対象の嫌気性菌には存在するが、当該鑑別において前記鑑別対象嫌気性菌と区別したい嫌気性菌には存在しない酵素を意味する。
本発明方法では、鑑別対象の嫌気性菌に特有の酵素を、鑑別対象の嫌気性菌、及び使用する選択分離培地の種類に応じて、適宜選択することができる。例えば、鑑別対象の嫌気性菌に存在し、それと区別したい嫌気性菌には存在しない酵素を、前記酵素として選択することができる。
【００１０】
例えば、クロストリジウム・ディフシルを他のクロストリジウム属に属する微生物と鑑別する場合には、クロストリジウム・ディフシルに特有の酵素として、例えば、プロリンアミノペプチダーゼを利用することができる。
また、クロストリジウム・パーフィリゲンスを他のクロストリジウム属に属する微生物と鑑別する場合には、クロストリジウム・パーフィリゲンスに特有の酵素として、例えば、アルカリホスファターゼ又はβ−グルクロニダーゼを利用することができる。
また、色素産生性のプレボテーラ属に属する微生物と、ポルフィロモナス属に属する微生物とを鑑別する場合には、色素産生性のプレボテーラ属に属する微生物に特有の酵素として、例えば、α−グルコシダーゼ、α−フコシダーゼ、又はシアリダーゼを利用することができる。
更に、バクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物とバクテロイデス・ウレオリティカスグループに属する微生物との鑑別する場合には、バクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物に特有の酵素として、例えば、α−グルコシダーゼを利用することができる。
【００１１】
前記発色酵素基質又は発光酵素基質としては、酵素反応前には発色又は発光せず、酵素活性により始めて発色又は発光する化合物である限り、特に限定されるものではなく、公知の発色物質又は発光物質をそのまま、あるいは、前記発色物質又は発光物質を酵素基質に結合した合成酵素基質などを用いることができる。この試薬を、吸水性を有する担体に含ませておき、分離培地上の孤立集落、あるいは、孤立集落を純培養した菌と、前記担体とを直接接触させて、適当な条件下で嫌気性菌の酵素活性により遊離する発色物質又は発光物質由来の信号を検出する。この場合、必要に応じて発色試薬を用いることができる。
【００１２】
前記発色物質としては、種々の公知物質を用いることができる。例えば、ｐ−ニトロフェノール、ｏ−ニトロフェノール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、６−クロロ−３−インドリル、ｐ−ニトロアニリン、若しくはβ−ナフチルアミン等、又はそれらの誘導体を挙げることができる。
【００１３】
前記発光物質としては、種々の公知物質を用いることができる。例えば、４−メチルウンベリフェロン、７−アミド−４メチルクマリン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン、若しくは７−アミノ−４トリフルオロメチルクマリン等、又はそれらの誘導体を挙げることができる。
【００１４】
発色物質又は発光物質を酵素基質に結合した合成酵素基質を調製するのに用いることのできる前記酵素基質、すなわち、前記発色物質又は発光物質を結合させる酵素基質となる物質としては、例えば、Ｌ−ピログルタミン酸、β−Ｄ−ガラクトピラノシド、α−Ｄ−ガラクトピラノシド、β−Ｄ−グルコピラノシド、α−Ｄ−グルコピラノシド、β−Ｄ−キシロピラノシド、β−Ｄ−フコシド、α−Ｄ−フコシド、β−Ｄ−アラビノフコシド、α−Ｌ−アラビノフコシド、α−Ｌ−アラビノピラノシド、β−Ｄ−セロピラノシド、β−Ｄ−グルクロニド、α−Ｄ−グルクロニド、ブチレイト、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニド、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−バリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェルアラニン、Ｌ−プログルタミン酸、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、硫酸、又はリン酸等を挙げることができる。
これらの酵素基質を発色物質又は発光物質と結合するには、公知の手段、例えば、共有結合（例えば、ペプチド結合、エステル結合、又はグリコシド結合等）により結合することができる。あるいは、市販の合成酵素基質を用いることもできる。
【００１５】
前記発色酵素基質又は発光酵素基質を含ませる吸水性担体としては、吸水性を有し、前記発色酵素基質又は発光酵素基質を含むことが可能な担体である限り、特に限定されるものではない。例えば、紙、濾紙、セルロース、不織布、又は綿等を挙げることができる。この担体をそのまま使用することもできるし、あるいは、適当な部材、例えば、ガラス、プラスチック、木材、又は金属等に具備させ、取り扱いやすくした状態で用いることもできる。吸水性担体の形状並びに長さ及び太さは、分離培地上の孤立集落又は純培養菌と直接、接触可能である限り、特に限定されるものではない。
【００１６】
発色酵素基質又は発光酵素基質を吸水性担体に含ませる方法としては、例えば、これらの物質を適当な溶媒に溶解させ、その液を担体に含ませる方法を挙げることができる。この場合、発色物質若しくは発光物質又は酵素基質の性能に影響を与えない溶媒を選択する。このような溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド、エタノール、メタノール、アセトン、エーテル、ブタノール、リン酸緩衝液、トリス・マレイン酸塩緩衝液、又は精製水等を使用することができる。
具体的には、例えば、発色酵素基質又は発光酵素基質の０．０１〜１０％の溶解液１０μＬ〜２００μＬを染み込ませ、自然乾燥、送風乾燥、減圧真空乾燥、又は凍結乾燥により乾燥させて用いることができる。
【００１７】
本発明方法における試料としては、鑑別対象の嫌気性菌を含む可能性のある、例えば、臨床材料又は食品を用いることができ、これらから分離した菌を鑑別対象とすることができる。前記臨床材料としては、例えば、体腔液（例えば、血液、髄液、心嚢液、胸水、腹水、又は関節液など）、外科的に採取された材料（例えば、リンパ節、中枢神経系、心、肺、胸膜、骨、関節、又は軟部組織など）、注射器で吸引採取された閉鎖性膿瘍の膿、ダグラス窩穿刺液、経気管吸引液、経皮肺穿刺液、又は糞便などを挙げることができる。前記食品としては、例えば、真空パックされた食品若しくは缶詰、又は瓶詰された加工品などを挙げることができる。
【００１８】
臨床材料又は食品中の嫌気性菌の一般的な検査手順は、試料から嫌気培養により菌分離を行なった後、分離培地上の集落の所見、及びグラム染色による形態観察を行い、数多くの生化学性状試験培地で２日〜７日間嫌気培養後、判定した成績を生化学性状鑑別表に照合して菌種を確認する、という工程を経る。それに対して、本発明方法では、分離培地上の孤立集落又は純培養菌に前記担体を直接接触させ、瞬時〜３０分後（例えば、１０分後）に担体自体の発色又は発光を肉眼で判定することで、菌の鑑別を行なうことができる。あるいは、機械的に発色又は発光を検出することもできる。
【００１９】
本発明方法では、発色酵素基質又は発光酵素基質の種類を適宜選択することによって、臨床検査又は食品検査上重要な嫌気性グラム陽性桿菌に属するクロストリジウム・ディフシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）及びクロストリジウム・パーフィリゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を、それぞれ、他のクロストリジウム属に属する微生物から鑑別することができる。また、嫌気性グラム陰性桿菌に属し、分離培地上の所見、及びグラム染色による形態学的所見では全く区別することができない、黒色色素産生性のプレボテーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属に属する微生物と、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物との鑑別、また、バクテロイデス・フラジリスグループ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｇｒｏｕｐ）に属する微生物とバクテロイデス・ウレオリティカスグループ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ）に属する微生物との鑑別等を行うことができる。
以下、各嫌気性菌毎に具体的な鑑別方法について説明するが、本発明方法は、これらの特定嫌気性菌に限定されるものではない。
【００２０】
本発明方法によりクロストリジウム・ディフシルを他のクロストリジウム属に属する微生物と鑑別する場合には、クロストリジウム・ディフシルに特有の酵素として、例えば、プロリンアミノペプチダーゼを利用することができる。プロリンアミノペプチダーゼ活性によって発色又は発光可能な物質としては、例えば、Ｌ−プロリン  ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−プロリン  β−ナフチルアミド、又はＬ−プロリン−７−アミド−４−メチルクマリン  ハイドロブロマイドを用いることができる。
Ｌ−プロリン  ｐ−ニトロアニリドを含ませた吸水性担体は、例えば、Ｌ−プロリン  ｐ−ニトロアニリドを０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｏｌ／Ｌトリス・マレイン酸塩緩衝液（ｐＨ４．０〜１０．０）に溶解し、終濃度として前記酵素基質が０．０５％〜０．５％になるように調整した液を、綿棒に２０〜５０μＬ染み込ませた後、乾燥することにより調製することができる。
【００２１】
本発明におけるクロストリジウム・ディフシル鑑別方法［好ましくは、クロストリジウム・ディフシルを他のクロストリジウム属に属する微生物（例えば、クロストリジウム・パーフィリゲンス）と鑑別する方法］では、クロストリジウム・ディフシルに特有の酵素活性によって発色又は発光可能な物質を含ませた吸水性担体と、クロストリジウム・ディフシルが発育可能な培地［好ましくは、クロストリジウム・ディフシル選択分離培地（例えば、ＣＣＦＡ培地又はＣＣＭＡ培地）］上に発育した孤立集落又はその孤立集落を純培養した純培養菌とを、直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を検出する。
【００２２】
本発明方法によりクロストリジウム・パーフィリゲンスを他のクロストリジウム属に属する微生物と鑑別する場合には、クロストリジウム・パーフィリゲンスに特有の酵素として、例えば、アルカリホスファターゼ又はβ−グルクロニダーゼを利用することができる。アルカリホスファターゼ活性によって発色又は発光可能な物質としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル  ホスフェ−ト、４−トリフルオロメチルウンベリフェリル−ホスフェート、７−（３−フェニルクマリニル）−ホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート、４−ニトロフェニル−ホスフェート、１−ナフチルホスフェート、ｐ−ニトロフェニル−ホスフェート、又はピリジニウム−２−メトキシ−４−（２−ニトロビニル）−フェニル−ホスフェートを用いることができる。β−グルクロニダーゼ活性によって発色又は発光可能な物質としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、又は４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを用いることができる。
４−メチルウンベリフェリル  ホスフェ−トを含ませた吸水性担体は、例えば、４−メチルウンベリフェリル  ホスフェ−トを０．０３〜０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜１０．０）に溶解し、終濃度として前記酵素基質が０．０５〜０．５％になるように調整した液を、綿棒に２０〜５０μＬ染み込ませた後、乾燥することにより調製することができる。
【００２３】
本発明におけるクロストリジウム・パーフィリゲンス鑑別方法［好ましくは、クロストリジウム・パーフィリゲンスを他のクロストリジウム属に属する微生物（例えば、クロストリジウム・ディフシル）と鑑別する方法］では、クロストリジウム・パーフィリゲンスに特有の酵素活性によって発色又は発光可能な物質を含ませた吸水性担体と、クロストリジウム・パーフィリゲンスが発育可能な培地［好ましくは、クロストリジウム・パーフィリゲンス選択分離培地（例えば、嫌気性菌用血液寒天培地）］上に発育した孤立集落又はその孤立集落を純培養した純培養菌とを、直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を検出する。
【００２４】
本発明方法により、色素産生性のプレボテーラ属に属する微生物と、ポルフィロモナス属に属する微生物とを鑑別する場合には、プレボテーラ属に属する微生物に特有の酵素として、例えば、α−グルコシダーゼ、α−フコシダーゼ、又はシアリダーゼを利用することができる。α−グルコシダーゼ活性によって発色又は発光可能な物質としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、又は４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドを用いることができる。α−フコシダーゼ活性によって発色又は発光可能な物質としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−フコシド、又は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−フコシドを用いることができる。シアリダーゼ活性によって発色又は発光可能な物質としては、例えば、２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルヌラミック  アシッド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルヌラミック  アシッド、又は２−（パラ−ニトロフェニル）−Ｎ−アセチルヌラミック  アシッドを用いることができる。
４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含ませた吸水性担体は、例えば、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドをＮ−Ｎ−ジメチルフォルムアミドに溶解し、終濃度として酵素基質が０．０５〜０．５％、溶媒が１０〜５０％になるように０．０３〜０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜１０．０）で希釈調整した液を、綿棒に２０〜５０μＬ染み込ませた後、乾燥することにより調製することができる。
【００２５】
本発明における色素産生性のプレボテーラ属に属する微生物とポルフィロモナス属に属する微生物との鑑別方法では、プレボテーラ属に属する微生物に特有の酵素活性によって発色又は発光可能な物質を含ませた吸水性担体と、色素産生性のプレボテーラ属に属する微生物及びポルフィロモナス属に属する微生物の両方が発育可能な培地［好ましくは、嫌気性菌選択分離培地（例えば、嫌気性血液寒天培地又はＧＡＭ寒天培地）］上に発育した孤立集落又はその孤立集落を純培養した純培養菌とを、直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を検出する。
【００２６】
なお、色素産生性のプレボテーラ属に属する微生物とポルフィロモナス属に属する微生物とを鑑別する場合に、プレボテーラ属に属する微生物に特有の酵素として、例えば、α−グルコシダーゼ、α−フコシダーゼ、又はシアリダーゼを利用することができることは、今回、本発明者により始めて見出されたものである。従って、本発明においては、鑑別対象の嫌気性菌が、プレボテーラ属に属する微生物に特有の酵素を有するか否かを分析する場合に、必ずしも、発色酵素基質又は発光酵素基質を含む吸水性担体を使用する必要はなく、任意の手段により分析することができる。すなわち、本発明には、α−グルコシダーゼ、α−フコシダーゼ、又はシアリダーゼを有するか否かを分析することを特徴とする、色素産生性のプレボテーラ属に属する微生物とポルフィロモナス属に属する微生物との鑑別方法が含まれる。
【００２７】
α−グルコシダーゼ、α−フコシダーゼ、又はシアリダーゼを有するか否かを分析する方法としては、吸水性担体を利用する本発明の鑑別方法を用いることもできるし、あるいは、公知の分析方法、例えば、酵素活性を分析する酵素化学的手法、遺伝子の有無又はそのｍＲＮＡ転写の有無を分析する遺伝子工学的手法（例えば、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法）、あるいは、抗体を用いる免疫学的手法などを用いることもできる。
【００２８】
本発明方法によりバクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物とバクテロイデス・ウレオリティカスグループに属する微生物とを鑑別する場合には、バクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物に特有の酵素として、例えば、α−グルコシダーゼを利用することができる。
α−グルコシダーゼ活性によって発色又は発光可能な物質としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、又は４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドを用いることができる。
４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含ませた吸水性担体は、例えば、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドをＮ−Ｎ−ジメチルフォルムアミドに溶解し、終濃度として酵素基質が０．０５〜０．５％、溶媒が１０〜５０％になるように０．０３〜０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜１０．０）で希釈調整した液を、綿棒に２０〜５０μＬ染み込ませた後、乾燥することにより調製することができる。
【００２９】
本発明におけるバクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物とバクテロイデス・ウレオリティカスグループに属する微生物との鑑別方法では、バクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物に特有の酵素活性によって発色又は発光可能な物質を含ませた吸水性担体と、バクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物及びバクテロイデス・ウレオリティカスグループに属する微生物の両方が発育可能な培地［好ましくは、嫌気性菌分離培地（例えば、嫌気性血液寒天培地又はＧＡＭ寒天培地  ）］上に発育した孤立集落又はその孤立集落を純培養した純培養菌とを、直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を検出する。
【００３０】
なお、バクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物とバクテロイデス・ウレオリティカスグループに属する微生物とを鑑別する場合に、バクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物に特有の酵素として、例えば、α−グルコシダーゼを利用することができることは、今回、本発明者により始めて見出されたものである。従って、本発明においては、鑑別対象の嫌気性菌がバクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物に特有の酵素を有するか否かを分析する場合に、必ずしも、発色酵素基質又は発光酵素基質を含む吸水性担体を使用する必要はなく、任意の手段により分析することができる。すなわち、本発明には、α−グルコシダーゼを有するか否かを分析することを特徴とする、バクテロイデス・フラジリスグループに属する微生物とバクテロイデス・ウレオリティカスグループに属する微生物との鑑別方法が含まれる。
【００３１】
α−グルコシダーゼを有するか否かを分析する方法としては、吸水性担体を利用する本発明の鑑別方法を用いることもできるし、あるいは、公知の分析方法、例えば、酵素活性を分析する酵素化学的手法、遺伝子の有無又はそのｍＲＮＡ転写の有無を分析する遺伝子工学的手法（例えば、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法）、あるいは、抗体を用いる免疫学的手法などを用いることもできる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【調製実施例１】
本調製実施例では、本発明方法に用いる試薬及び担体を作製した。
（Ａ）プロリンアミノペプチダーゼテスト（ＰＲＯテスト）用
Ｌ−プロリン  ｐ−ニトロアニリド（入手先：シグマ社）を０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス・マレイン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、終濃度として前記酵素基質が０．２％になるように調整した液を、工業用綿棒（株式会社  日本綿棒）に３０μＬ染み込ませ、２５℃で１８時間、乾燥後、乾燥剤入りの遮光容器にいれて保存した。
また、発色試薬として、１ｍｏｌ／Ｌの塩酸にｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド（入手先：シグマ社）を１％に溶解したものを遮光瓶にいれて保存した。
【００３３】
（Ｂ）アルカリホスファターゼテスト（ＭＰＨＯＳテスト）用
４−メチルウンベリフェリル  ホスフェ−ト（入手先：シグマ社）を０．０６７ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、終濃度として前記酵素基質が０．２％になるように調整した液を、工業用綿棒に３０μＬ染み込ませ、２５℃で１８時間、乾燥後、乾燥剤入りの遮光容器にいれて保存した。
【００３４】
（Ｃ）α−グルコシダーゼテスト（ＭαＧＬＵテスト）用
４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（入手先：シグマ社）をＮ−Ｎ−ジメチルフォルムアミドに溶解し、終濃度として酵素基質が０．１％、溶媒が２０％になるように０．０６７ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈調整した液を、工業用綿棒に３０μＬ染み込ませ、２５℃で１８時間、乾燥後、乾燥剤入りの遮光容器にいれて保存した。
【００３５】
【実施例１】
《クロストリジウム・ディフシル及びクロストリジウム・パーフィリゲンスの鑑別》
（Ａ）試験菌及び試験菌の培養
試験菌はすでに同定済みの以下に示す臨床分離保存株を用いて行なった。
１．クロストリジウム・ディフシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２６株
２．クロストリジウム・パーフィリゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）２３株
試験菌をブルセラＨＫ寒天培地（ＲＳ）（極東製薬）にて３７℃で４８時間培養後、以下の各テストに供試した。
【００３６】
（Ｂ）ＰＲＯテスト
試験菌をＰＲＯテスト用基質綿棒に接触させ、０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス・マレイン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）３０μＬを分注した小試験管に入れ、３６℃で１０分間反応させた後、発色液３０μＬを添加し、綿棒の色調変化（陽性の場合：紫色；陰性の場合：無変化）を肉眼で判定した。
【００３７】
（Ｃ）ＭＰＨＯＳテスト
試験菌をＭＰＨＯＳテスト用基質綿棒に接触させ、０．０６７ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０μＬを分注した小試験管に入れ、３６℃で１０分間反応させた後、３６６ｎｍのＵＶランプを照射し、綿棒の発光（陽性の場合：青色蛍光；陰性の場合：無蛍光）の有無を肉眼で判定した。
【００３８】
（Ｄ）結果
試験菌の各試験結果を表１に示す。
表１に示すように、クロストリジウム・ディフシル２６株はすべてＰＲＯテスト陽性となり、クロストリジウム・パーフィリゲンス２３株はすべてＭＰＨＯＳテスト陽性となった。従って、臨床で重要なクロストリジウム・ディフシルは、本菌の選択分離培地上に発育した集落からＰＲＯテストを用いることにより、また、食中毒の原因菌として重要なクロストリジウム・パーフィリゲンスは、嫌気性菌用血液寒天培地上で溶血を示す集落からＭＰＨＯＳテストを用いることで、わずか１０分で鑑別可能であることが判明した。
【００３９】
【表１】
2004350537.tif 000002
【００４０】
【実施例２】
《色素産生性嫌気性菌の鑑別》
（Ａ）試験菌及び試験菌の培養
試験菌はすでに同定済みの以下に示す臨床分離保存株を用いて行なった。
１．プレボテーラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）１１株
２．プレボテーラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）１１株
３．プレボテーラ・コルポリス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ）１株
４．ポルフィロモナス・アサッカロリティカ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）１３株
５．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）１１株
試験菌をブルセラＨＫ寒天培地（ＲＳ）（極東製薬）にて３７℃で４８時間培養後、以下の各テストに供試した。
【００４１】
（Ｂ）ＭαＧＬＵテスト
試験菌をＭαＧＬＵテスト用基質綿棒に接触させ、０．０６７ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０μＬを分注した小試験管に入れ、３６℃で１０分間反応させた後、３６６ｎｍのＵＶランプを照射し、綿棒の発光（陽性の場合：青色蛍光；陰性の場合：無蛍光）の有無を肉眼で判定した。
【００４２】
（Ｃ）結果
試験結果を表２に示す。
黒色色素産生性プレボテーラ属とポルフィロモナス属は、嫌気性グラム陰性桿菌に属し、分離培地上の集落所見及びグラム鑑別における所見も同じであるため、その鑑別は困難であったが、表２に示すように、ＭαＧＬＵテストにより、この両者をわずか１０分で鑑別することができた。
【００４３】
【表２】
2004350537.tif 000003
【００４４】
【実施例３】
《色素非産生性グラム陰性桿菌のＭαＧＬＵテスト》
（Ａ）試験菌
１．バクテロイデス・フラジリスグループ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｇｒｏｕｐ）
２．バクテロイデス・ウレオリティカスグループ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ）
３．色素非産生性プレボテーラ（Ｎｏｎ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）
４．フゾバクテリウム・モルティフェラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ）
５．フゾバクテリウム・ヌクラータム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）
６．フゾバクテリウム・ネクロフォラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）
【００４５】
（Ｂ）ＭαＧＬＵテスト
前記実施例２と同様に行なった。
【００４６】
（Ｃ）結果
試験結果を表３に示す。
表３に示すように、バクテロイデス・フラジリスグループはＭαＧＬＵテスト陽性となり、バクテロイデス・ウレオリティカスグループとの鑑別が容易であった。また、フゾバクテリウム属は本テスト陰性となった。
【００４７】
【表３】
2004350537.tif 000004
【００４８】
実施例２及び実施例３の結果から、嫌気性グラム陰性桿菌は、従来行なわれていた推定同定に必要な、嫌気性血液寒天培地上の集落の所見（色素産生性、赤蛍光の有無、集落の形態）、ＢＢＥ寒天培地上の集落の所見（発育の有無、エスクリン分解性、集落の形態）、及びインドール試験の結果に、１０分で判定可能なＭαＧＬＵテストを組み合わせることで、より詳細な鑑別が可能となった（図１参照）。
なお、図１において、記号「αＧＬＵ」、「ＩＮＤ」、及び「ＣＡＴ」は、それぞれ、「ＭαＧＬＵテスト」、「インドール試験」、及び「カタラーゼ試験」を意味し、「Ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ」及び「ｎｏｎ  Ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ」は、それぞれ、「色素産生あり」及び「色素産生なし」を意味する。また、記号「＋」及び「−」は、それぞれ、各試験項目において「陽性」及び「陰性」であることを意味する。
また、実施例１〜実施例３の結果から、発色又は発光酵素基質綿棒は、嫌気性菌の鑑別に有用であることを確認することができた。
【００４９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明方法によれば、例えば、臨床材料又は食品検査において、分離培地上に発育した集落を鑑別する場合、従来行なわれていた方法に比べ、嫌気状態を必要としないことからその操作性は飛躍的に簡便になった。しかも、従来、長時間を要した判定結果も短時間（例えば、１０分間）で判定可能である。この迅速性と簡易性は、嫌気性菌検査に大きく貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】嫌気性グラム陰性桿菌の鑑別方法を示す説明図である。
【図１】
2004350537.tif 000005