(57)【要約】【課題】亜硫酸レダクターゼ、その生産方法および使用を提供すること。【解決手段】本発明は、下記特徴：ａ．亜硫酸塩の硫化物への還元を触媒するかまたはジスルフィド基からスルフヒドリル基を回復するよう作用すること；ｂ．前記還元の触媒反応においては、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン（燐）酸（ＮＡＤＰＨ）、メチルビオローゲン（ＭＶＨ）または他の供与基が電子供与基として作用すること；ｃ．分子量は１００，０００から４００，０００であること；ｄ．活性の至適温度は２０℃から３０℃であること；およびｅ．活性の至適ｐＨは６．５から８．０であることを有する精製された亜硫酸レダクターゼに関する。本発明はまた、精製された亜硫酸レダクターゼを生産する方法および亜硫酸レダクターゼを溶液または粉末形態で使用することによって、変性した魚タンパク質を回復する方法に関する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された亜硫酸レダクターゼであって、下記特性：
ａ．亜硫酸塩の硫化物への還元を触媒するかまたはジスルフィド基からスルフヒドリル基を再生する作用を有すること；
ｂ．前記還元の触媒反応においては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、メチルビオロゲン（ＭＶＨ）または他の供与基が電子供与基として作用すること；
ｃ．分子量は１００，０００から４００，０００であること；
ｄ．活性の至適温度は２０℃から３０℃であること；および
ｅ．活性の至適ｐＨは６．５から８．０であること、
を特徴とする亜硫酸レダクターゼ。
【請求項２】
前記電子供与体がＮＡＤＰＨである請求項１に記載の亜硫酸レダクターゼ。
【請求項３】
大腸菌またはサッカロミセス属の１種に由来する請求項１に記載の亜硫酸レダクターゼ。
【請求項４】
前記サッカロミセス属の１種がサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項３に記載の亜硫酸レダクターゼ。
【請求項５】
精製亜硫酸レダクターゼを生産する方法であって、硫酸アンモニウム分画およびクロマトグラフィーを使用して大腸菌またはサッカロミセス属の１種の粗酵素溶液から亜硫酸レダクターゼを精製することを特徴とする方法。
【請求項６】
前記粗酵素溶液が下記工程：
ｐＨ６．５から８．５のリン酸緩衝液を大腸菌またはサッカロミセス属の１種の細胞に添加する工程、
超音波処理器を使用して２から１０℃の温度で０．１から２時間細胞を破砕する工程、
５０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上澄み液を採取する工程、
残渣砕片細胞を同じ緩衝液中に懸濁した後、前記砕片細胞を摩砕する工程、
上記のように遠心分離をした後、上澄み液を採取する工程、
複数の上澄み液を混合する工程、
によって生産される請求項５に記載の精製亜硫酸レダクターゼを生産する方法。
【請求項７】
前記硫酸アンモニウム分画が下記工程：
請求項６に記載のように生産された粗酵素溶液に硫酸アンモニウムを静かに加える工程、
３０００から１５，０００×ｇの速度で０．１から２時間遠心分離した後、３０から６０％飽和状態での沈殿物を採集し、沈殿物の溶液を０．１Ｍから０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５から８．５）に対して透析して透析物を得る工程を含み、全工程は２から１０℃で行われる請求項５に記載の精製亜硫酸レダクターゼを生産する方法。
【請求項８】
前記クロマトグラフィーがＤＥＡＥセファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）カラム・クロマトグラフィーおよび／またはセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３００ＨＲカラム・クロマトグラフィーからなる群から選択される請求項５に記載の亜硫酸レダクターゼを生産する方法。
【請求項９】
変性した魚タンパク質を再生する方法であって、変性した魚タンパク質に変性した魚タンパク質１グラム当たり０．０１から０．５活性単位の量で請求項１の亜硫酸レダクターゼを溶液あるいは粉末形態で適用することを含む方法。
【請求項１０】
溶液あるいは粉末形態の亜硫酸レダクターゼが変性した魚タンパク質に作用する時間が５から４０分である請求項９に記載の変性した魚タンパク質を再生する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は精製された亜硫酸レダクターゼに関する。より詳細には、本発明の亜硫酸レダクターゼは亜硫酸塩の硫化物への還元を触媒し、変性した魚に使用された場合は、変性した魚肉のタンパク質を効果的に再生し、変性した魚タンパク質の反応性スルフヒドリル基の数およびゲル強度を増加させる。本発明はまた、精製された亜硫酸レダクターゼを生産する方法および変性した魚タンパク質を前記溶液または粉末形態の亜硫酸レダクターゼを使用して再生する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物および微生物に広く存在している亜硫酸レダクターゼはシステイン生合成の重要な過程である同化型硫酸塩還元の最終過程で亜硫酸塩の硫化物への還元を触媒する酵素である。次のように６個の電子が反応に提供される：ＳＯ３２−＋６ｅ−＋６Ｈ＋→Ｓ２−＋３Ｈ２Ｏ、亜硫酸塩の硫化物への還元反応中には大腸菌においては還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）が電子供与基として作用し、酵母においてはＮＡＤＰＨまたは還元型メチルビオロゲン（ＭＶＨ）が電子供与基として作用し、他の生物または組織中では他の供与基が作用する。
【０００３】
筋肉タンパク質はほとんどが様々な生理的作用を有する多種のタンパク質であって、ペプチド結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合および疎水基結合を介したＬ−アミノ酸の相互作用によって、および双極子モーメントによる作用によって形成される。「タンパク質の変性」とは、ペプチド結合を破壊することのないタンパク質の二次的、三次的、四次的な三次元構造変化をいう。
【０００４】
変性タンパク質の構造は、折り畳まれていない状態でまたは凝集された状態でランダム螺旋を形成しており、このとき、ペプチド鎖上またはペプチド鎖間の官能基が相互作用し、それによってその元来の生理的、化学的、生物学的特性が失われている。タンパク質が変性する理由は一般的に次のように考えられている。筋肉中の水分が凍結し、これが塩濃度を上昇させ、タンパク質の周囲ｐＨ値を変化させ、その結果塩析や分子間または分子中の疎水基の凝集に起因して、タンパク質分子が沈殿したり、また同時に新しい水素結合、ジスルフィド結合、イオン結合が形成されてタンパク質を凝集させて、変性させる。加えて、タンパク質分子の周りの水分は、タンパク質分子の−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨおよび−ＣＯ等の官能基と結合水を形成する。更に、温度降下により、結合強度が低下した水分子がまず氷の結晶を形成する。同時に、体積膨張によりタンパク質分子の立体配座が変化し、官能基が露出され、新しい結合が分子間または分子内に形成され、これによってタンパク質分子が凝集し変性する。
【０００５】
凍結貯蔵された魚タンパク質が変性すると共有結合が形成される理由は、スルフヒドリル基が酸化されジスルフィド基になることであるとわかっている（Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．６３：７７７−７８１、１９９８、Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．６０：６５２−６５５、１９９８）。凍結貯蔵によって変性した魚肉においては、魚肉の軟化、組織液の流出、スポンジ状組織形成といった現象が起こるばかりでなく、乳化特性、水分保持能、ゲル形成能、および粘弾性が全て、鮮魚より悪化する。これらの劣化の理由は主に筋原繊維タンパク質の変性による。
【０００６】
変性された後、タンパク質は正常な網目構造を形成し、加熱によって硬化した後、この網目構造が弾性特性を筋肉タンパク質に与える。魚タンパク質のゲル化は、魚タンパク質に弾性を与え、魚タンパク質の精製製品への加工中に最も重要とされる性質のひとつである。タンパク質のゲル化は、塩濃度、ｐＨ値、温度、タンパク質濃度、構成成分、添加物、イオン強度、鮮度等の多くの因子の影響を受ける。精製品の生化学的性質から、網目構造を形成する結合には水素結合、疎水基結合、イオン結合、ジスルフィド結合および他の共有結合が含まれることがわかる。
【０００７】
加えて、ゲル強度はすり身の精製品の品質を決定する指標である。精製品の弾性は、塩濃度、ｐＨ値、温度、タンパク質濃度、構成成分、添加物、イオン強度、鮮度等の多くの因子の影響を受ける。したがって、魚肉の精製品の弾性を高めるために多くの方法が提案されてきた。
【０００８】
魚肉のゲル形成能は凍結貯蔵中に低下する。その理由は、主に魚の筋肉タンパク質の溶解性が徐々に低下するからであり、これは、ジスルフィド結合および他の共有結合の形成によりミオシンの二量体および多量体等の高分子が形成される結果生じると考えられている。筋肉タンパク質間でジスルフィド結合が形成された結果、魚筋肉のアクトミオシンが凝集および変性する。
【０００９】
上記のように、魚肉のゲル形成能は凍結貯蔵中に低下し、これによって魚肉がコロイド状タンパク質食品への加工に不適切なものとなる。よって、凍結貯蔵された魚肉のコロイド状タンパク質食品の生産への適用が限られる。
【００１０】
サバすり身のゲル形成能を改良するためにアルカリ洗浄処理が長く用いられてきたが、色の改良には役立たない。アルカリ洗浄サイクルを増やすかまたはオゾン漂白を使用することによってサバの色を実質的に改良することはできるが、サバの筋肉タンパク質のゲル形成能が劣化することになる。
【００１１】
加えて、システイン、二亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸等の化学的還元剤を変性魚筋肉中に加えることによって得られた凍結すり身については、アクトミオシンの全スルフヒドリル基と反応性スルフヒドリル基および抽出可能なアクトミオシンの量が全て、還元剤が添加されていない凍結すり身よりもはるかに高い。タンパク質のゲル形成能は凍結により低下するが、還元剤の添加によってタンパク質の大部分を回復（再生）することができる。したがって、還元剤が凝集および変性されたアクトミオシンを回復できることがわかる。還元剤を添加した結果、挽肉中に凍結変性魚肉のジスルフィド結合が還元されてスルフヒドリル結合になる。精製品のゲル化中にジスルフィド結合が再形成されると、これによって網目構造がより堅く安定になる。しかしながら、化学還元剤は外部添加物であるとみなされ、消費者に簡単には受け入れられない。
【００１２】
本発明の発明者は、化学的還元剤の代わりに、微生物由来の亜硫酸リダクターゼを使用することを提案した。例えば、Ｊｉａｎｇらは、オゾンで脱色変性されかつ凍結変性されたサバすり身の変性魚肉筋肉タンパク質の回復に対する酵母由来の亜硫酸リダクターゼの作用を研究し、粗亜硫酸リダクターゼが変性筋肉タンパク質を回復させ、精製品のゲル形成能を高め得ることを発見した（Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．６０：６５２−６５５、１９９８；Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．６０：７７７−７８１、１９９８）。更に、Ｗｕらはサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から調製した亜硫酸リダクターゼの粗凍結乾燥粉末を凍結魚の加工に応用して、精製製品のゲル形成能が著しく高められたことも発見した（Ｗｕら、Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．６５：１４００−１４０３、２０００）。しかしながら、微生物由来の亜硫酸リダクターゼはこれまで調製されたことがなく、変性魚筋肉の回復に対するその影響もまた研究されたことはなかった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術における前記記載の問題を解消するために、本発明の発明者は微生物由来の亜硫酸リダクターゼを生産する方法および得られた亜硫酸リダクターゼの変性魚肉から生来の筋肉タンパク質の回復に対する影響を研究し、前記目的が、大腸菌またはサッカロミセス属の１種に由来する精製された亜硫酸リダクターゼを使用することによってなし遂げられ得ることを発見した。本発明はこれによって完成された。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
したがって本発明は下記特性：
ａ．亜硫酸塩硫化物への還元を触媒するかまたはジスルフィド基からスルフヒドリル基を回復（再生）する作用を有すること；
ｂ．前記還元の触媒反応においては、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン（燐）酸（ＮＡＤＰＨ）、メチルビオロゲン（ＭＶＨ）または他の供与基が電子供与基として作用すること；
ｃ．分子量は１００，０００から４００，０００であること；
ｄ．活性の至適温度は２０℃から３０℃であること；および
ｅ．活性の至適ｐＨは６．５から８．０であること
を特徴とする精製亜硫酸レダクターゼを提供する。
【００１５】
好ましくは、亜硫酸レダクターゼの電子供与体はＮＡＤＰＨである。加えて、亜硫酸レダクターゼが大腸菌またはサッカロミセス属の１種に由来することが好ましい。サッカロミセス属の１種は、サッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・バヤナス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・エリプソイデウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）およびサッカロミセス・アセテイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ａｃｅｔｉ）であってよい。以上の中で、サッカロミセス・セレビシアエが好ましい。
【００１６】
加えて、本発明はまた、硫酸アンモニウム分画またはクロマトグラフィーを使用して大腸菌またはサッカロミセス属の１種の粗酵素溶液から亜硫酸レダクターゼを精製することを特徴とする精製亜硫酸レダクターゼを生産する方法も提供する。
【００１７】
精製亜硫酸レダクターゼを生産する方法では、前記粗酵素溶液が次の工程：
ｐＨ６．５から８．５のリン酸緩衝液を大腸菌またはサッカロミセス属の１種の細胞に添加する工程、超音波処理器を使用して２から１０℃の温度で０．１から２時間細胞を破砕する工程、５０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上澄み液を採取する工程、残渣砕片細胞を同緩衝液中に懸濁した後、前記砕片細胞を摩砕する工程、上記のように遠心分離をした後、上澄み液を採取する工程、複数の上澄み液を混合する工程、によって生産される。
【００１８】
更に、硫酸アンモニウム分画は、次の工程：上記（請求項６に記載）のように生産された前記粗酵素溶液に硫酸アンモニウムを静かに加える工程、３０００から１５，０００×ｇの速度で０．１から２時間遠心分離した後、３０から６０％飽和状態での沈殿物を採集し、沈殿物の溶液を０．１Ｍから０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５から８．５）に対して透析して透析物を得る工程を含み、全工程は２から１０℃で行われる。
【００１９】
また更に、前記クロマトグラフィーはＤＥＡＥセファセル・カラム・クロマトグラフィーおよび／またはセファクリルＳ−３００ＨＲカラム・クロマトグラフィーからなる群より選択される。
【００２０】
本発明はまた、変性した魚タンパク質に適用することを含む変性した魚タンパク質を再生する方法を提供する。本発明の亜硫酸レダクターゼは、溶液あるいは粉末形態で、変性した魚タンパク質１グラム当たり０．０１から０．５活性単位の量で使用し得る。溶液あるいは粉末形態の亜硫酸レダクターゼが変性魚タンパク質に作用する時間は５から４０分である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明において、亜硫酸レダクターゼ、すなわち原料の酵素溶液および原料の酵素粉末は大腸菌またはサッカロミセス・セレビシアエから得た。更に、変性した魚肉タンパク質の再生に対する上記酵素の影響についても研究した。
【００２２】
使用した材料および装置、亜硫酸レダクターゼの生産および関連実験またはテスト方法をまず述べる。
（Ａ）材料および装置
（１）細菌および酵母細胞
１．三角フラスコ中の４．０％スクロース、０．４％酵母抽出物、０．４％トリプトン（ｐＨ７．５）を含む培養培地に、台湾カルチャーコレクションおよび研究センター（ヒスンチュー（Ｈｉｓｎｃｈｕ）、台湾）から購入した活性化大腸菌（ＣＣＲＣ１１６３４）１％をループで播種し、１００ｒｐｍで振蘯しながら３７℃で１８時間培養した。大腸菌細胞を５０００×ｇで３０分間遠心分離して、採集した。
【００２３】
２．三角フラスコ中、０．３％酵母抽出物、０．３％麦芽抽出物、０．５％ペプトンおよび１．０％デキストロース（ｐＨ７．０）を含むＹＭブロス培養培地に、台湾カルチャーコレクションおよび研究センター（ヒスンチュー（Ｈｉｓｎｃｈｕ）台湾）から購入したサッカロミセス・セレビシアエ（ＣＣＲＣ２２２２３）をループで播種し、１００ｒｐｍで振蘯しながら２４℃で６０時間で培養した。サッカロミセス・セレビシアエの細胞を４０００×ｇで３０分間遠心分離して採集した。
【００２４】
（２）試薬
ＤＥＡＥセファセル、セファクリルＳ−３００ＨＲ、電気泳動分子量標準およびゲル浸透濾過分子量標準をファルマシア・バイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ウプサラ、スウェーデン）から購入した。
酵母抽出物、トリプトンはデイフコ（Ｄｉｆｃｏ）から購入した。
硫酸アンモニウムはメルク（ダルムスタッド（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）ドイツ）から購入した。
【００２５】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）、グルタチオン、ジチオスレイトール、システイン、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、β−メルカプトエタノール（β−Ｍｅ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、シグマ化学株式会社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。
【００２６】
ヨード酢酸（ＩＡＡ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、Ｐ−クロロマーキュリフェニルスルホン酸（ＰＣＭＰＳ）、Ｐ−クロロマーキュリベンゾエート（ＰＣＭＢ）、フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、およびＮ，Ｎ．Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）は、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（リッチモンド、カリフォルニア州、米国）から購入した。
他の全ての化学物質は生物化学試薬等級であった。
【００２７】
（２）装置
１．低温発振培養箱：ホテック７１８、ホテック（Ｈｏｔｅｃｈ）装置株式会社（台北、台湾）製
２．低温および高速遠心分離：ＳＣＲ２０Ｂ、日立株式会社、日本
３．超音波処理器；モデルＷ−２００、ウルトラソニック株式会社、日本
４．物性デターミネータ：モデルＣＲ−２００、サン化学、東京、日本
５．分光測光計：日立Ｕ−２００１、日立株式会社、日本
６．ミニ電気泳動：ミニプロテアン（ＰＲＯＴＥＡＮ）ＩＩセル、電源供給器はバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）モデル２００／２．０、バイオラッド米国
７．ｐＨメータ：ＨＭ−３０Ｓ、トーア（ＴＯＡ）電気株式会社、日本
８．水浴タンク：モデルＢ２０４、マラトン（ＭＡＲＡＴＯＮ、台湾）、
９．グラインダ：ＣＦ５ｋｇ、チューヤ  ファー（Ｃｈｙａｕ  Ｆａｒ）株式会社、台湾、
１０．カラム：Ｃ２６／４０、Ｃ２６／１００、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー、ウプサラ、スウェーデン
１１．フラクション・コレクター：ＦＲＡＣ−２００、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー、ウプサラ、スウェーデン
１２．高速タンパク質液クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム：コントローラーＬＣＣ−５００プラスおよびポンプＰ−５００、ファルマシアＬＫＢ、バイオテクノロジー、ウプサラ、スウェーデン
１３．−２０℃のフリーザ、バイオフリーザ、モデル８４４２、フォルマサイエンテイフィック（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国
１４．アミコン限外濾過濃縮装置：アミコン、米国から購入、主要構造は濃縮タンク（攪拌セル、モデル８０５０）および濾過フィルム（ＹＭ１０４３ｍｍ膜）
１５．消泡ホモジナイザ：バッフルの付加したワーリング・ブレンダ
【００２８】
（Ｂ）亜硫酸レダクターゼの生産および精製
抽出：大腸菌は、４．０％スクロース、０．４％酵母抽出物、および０．４％トリプトン（ｐＨ７．５）を含む培地で３７℃、１８時間培養した後、５０００×ｇで３０分間遠心分離して採集し、（細胞体積に対して）２体積量の、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液と混合した。採集した細胞は次に、超音波処理器を使用して４℃で３０分間で破砕し、５０００×ｇで３０分間遠心分離して採集した。得られたサンプルを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中に懸濁し、破砕し、上記のように再度遠心分離した。一方、サッカロミセス・セレビジアエ細胞は、０．３％酵母抽出物、０．３％麦芽抽出物、０．５％ペプトンおよび１．０％デキストロース（ｐＨ７．０）を含む培地で６０時間培養した後、４０００×ｇで３０分間遠心分離して採集した。細胞は（細胞の体積量に対して）２体積量の、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．３）を含む０．３Ｍリン酸カリウム緩衝液と混合し、超音波モデルＷ−２００音波処理器で３０分間４℃で破砕した。細胞および破砕片を３０分間１３０００×ｇで遠心分離して採集した。残渣を０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、再び破砕、遠心分離を行った。
【００２９】
硫酸アンモニウム分画：固体の硫酸アンモニウムを攪拌しながら静かに粗酵素中に添加した。３０から６０％飽和率での沈殿物を５０００×ｇで３０分間遠心分離して採集し、その後０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）に対して２４時間透析した。全ての工程は４℃で行った。
【００３０】
ＤＥＡＥ−セファセル・カラム・クロマトグラフィー：透析した粗酵素は、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥセファセル（２．６×２０ｃｍ）上で色層分析（クロマトグラフ）した。１０体積量のリン酸緩衝液で洗浄した後、吸着されたタンパク質を０．１Ｍリン酸緩衝液中０から１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配によって流速１ｍＬ／分で溶出した。５ｍＬの画分を複数、フラクション・コレクタを使用して採取した。粗レダクターゼを０．３２から０．４０Ｍの塩化ナトリウム濃度で溶出した。
【００３１】
セファクリル  Ｓ−３００  ＨＲ  カラム・クロマトグラフィー：ＤＥＡＥセファセル・クロマトグラフィーでレダクターゼ活性を有した画分を濃縮し、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限外濾過を使用して、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液で平衡化した。得られたサンプルを、０．５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液で予め平衡化したセファクリル  Ｓ−３００  ＨＲカラム（２．６ｘ９０ｃｍ）に加えた。流速は１ｍＬ／分であり、１画分あたり５または２．５ｍＬを採取した。このセファクリル  Ｓ−３００ＨＲクロマトグラフィーは３回行った。精製された酵素は−７０℃で使用時まで貯蔵した。
【００３２】
（Ｃ）亜硫酸レダクターゼの生化学的特性のテスト
酵素活性の測定
シーゲル他（Ｓｉｅｇｅｌ、１９７３）の酵素活性決定法による亜硫酸でのＮＡＤＰＨの酸化に習って、亜硫酸レダクターゼ活性を３４０ｎｍ、好気性状態下、分光測光法で測定した。０．９ｍＬの反応混合物［０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＮａＨＳＯ３、１μＭ  ＦＭＮ、および０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）］に０．１ｍＬのレダクターゼを添加し、２５℃でインキュベートした。活性はレダクターゼを添加した後の初期速度に従って決定し、亜硫酸不存在下でＮＡＤＰＨのゆるやかな酸化によって補正した。１活性単位は、上記条件下、２５℃で１分以内に、１マイクロモルのＮＡＤＰＨの酸化を触媒する酵素の量と規定した。
【００３３】
タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度を染料結合法によって測定した。ウシ血清アルブミンをマーカーとして使用した。
【００３４】
分子量
亜硫酸レダクターゼの分子量をセファクリルＳ−３００ＨＲカラムクロマトグラフィーを使用して測定した。チログロブリン（６６９ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）およびウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）を標準タンパク質として使用した。
【００３５】
温度およびｐＨの影響
至適温度：０．９ｍＬの反応混合物［０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＮａＨＳＯ３、１μＭＦＭＮおよび０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）］に、０．１ｍＬレダクターゼを添加し、様々な温度（５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０℃）で５分間インキュベートした。活性を初期速度から決定し、シーゲル他（Ｓｉｅｇｅｌ他、１９７３）の方法に従って、亜硫酸不存在下でのＮＡＤＰＨの酸化により補正した。
【００３６】
熱安定性：０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中の精製された亜硫酸レダクターゼを様々な温度（５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０℃）で３０分間インキュベートした。残留活性をシーゲル他（Ｓｅｉｇｅｌ（１９７３））の方法に従って測定した。
【００３７】
至適ｐＨ値：様々なｐＨ（０．２Ｍクエン酸緩衝液：ｐＨ４．０から６．０；０．２Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ６．０から８．０；０．２Ｍ重炭酸緩衝液：ｐＨ８．０から１０．０；全ての緩衝液は０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＮａＨＳＯ３、１μＭＦＭＮおよび０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含む）の０．９ｍＬの反応混合物に、０．１ｍＬのレダクターゼを添加し、２５℃で５分間インキュベートした。活性を初期速度から決定し、シーゲル他（Ｓｅｉｇｅｌ（１９７３））の方法に従って、亜硫酸不存在下のＮＡＤＰＨの酸化で補正した。
【００３８】
ｐＨ安定性：様々なｐＨ（０．２Ｍクエン酸緩衝液：ｐＨ４．０から６．０；０．２Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ６．０から８．０；０．２Ｍ重炭酸緩衝液：ｐＨ８．０から１０．０）の緩衝液中にいれた精製亜硫酸レダクターゼを２５℃で３０分間インキュベートした。残留活性をシーゲル他（Ｓｅｉｇｅｌ（１９７３））の方法に従って測定した。
【００３９】
金属イオンまたは阻害剤の影響
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中の精製亜硫酸レダクターゼを様々な金属または阻害剤と共に２５℃でインキュベートした。金属の最終濃度は０．５、１．０、５．０、および１０．０ｍＭであり、阻害剤の濃度は１．０ｍＭであった。インキュベーション３０分後、残留活性をシーゲル他（Ｓｅｉｇｅｌ（１９７３））の方法に従って測定した。
【００４０】
低温貯蔵安定性
酵素溶液を４℃と−２０℃でそれぞれ貯蔵した。残留酵素活性を定時間間隔で測定し、低温貯蔵の安定性をテストした。
【００４１】
（Ｄ）サバ、イトヨリダイおよび太刀魚の凍結変性魚筋肉の回復テスト
凍結したサバ、イトヨリダイおよび太刀魚の調製
原料としてサバ、イトヨリダイおよび太刀魚の魚筋肉を冷凍庫で−２５℃で６カ月間貯蔵し、凍結変性させた。凍結魚筋肉は、頭を落とし腸を除き骨をとって氷水で３回洗浄し、遠心脱水器で水分含量約７８％になるまで遠心分離した。得られたすり身を１０分間挽いて、０．２％ポリリン酸および５％糖類またはグリシトールと混合し、中心温度を−１８℃より低くするために−４０℃の送風凍結装置に入れ、急速に冷凍し、後に使用するために冷凍貯蔵庫に貯蔵した。
【００４２】
精製品の生産
上記の冷凍すり身を、中心温度を−２から−５℃の凍っていない状態にするために、空調室に置いた後、上記で得られた亜硫酸レダクターゼ、その原料の酵素溶液またはその原料の酵素粉末を加えた。同時に、２．５％の塩を加えた後、すり身をグラインダで挽いて、次いで２０分間挽いた。最終的に３％のジャガイモ澱粉を加え均一に混合した。得られたサンプルをケースに詰めて２５℃で３０分間落ち着かせてから、９５℃で２０分間加熱した。サンプルを流水で冷やした後、４℃で貯蔵した。その特性を翌日測定した。
【００４３】
すり身の性状決定
すり身のアクトミオシンをノグチ（Ｎｏｇｕｃｈｉ）およびマツモト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ）（１９７８））の方法に従って抽出した。アクトミオシンの反応基はイトウ他（Ｉｔｏｈ（１９７９））の改良方法に従って決定した。ゲル形成性はすり身の精製品を高さ３．０ｃｍに切断し、ゲル強度を５ｍｍ径のプラグを有する物性デターミネータを使用して測定することによって決定した。
【００４４】
すり身からのアクトミオシンの調製およびＳＨの測定
アクトミオシン（ＡＭ）をノグチ（Ｎｏｇｕｃｈｉ）およびマツモト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ）（１９７８））の方法に従って抽出した。０．６Ｍ  ＫＣＬおよび６ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中のアクトミオシンを０．０１Ｍ  ＤＴＮＢ溶液と混合し、５℃で１時間インキュベートした。反応性ＳＨをイトウら（Ｉｔｏｈ（１９７９））に従って決定した。
【００４５】
ゲル強度の測定
ゲル強度をレオメータで測定し、破壊力（ｇ）、変形（ｃｍ）［ゲル強度（ｇ×ｃｍ）＝破壊力（ｇ）×変形（ｃｍ）］で表した。
【００４６】
統計的分析
統計的分析にはダンカンの多重範囲テストを使用した。ゲル強度については、各グループから１０の測定値を分析した。有意差はｐ＜０．０５で規定した。
【００４７】
（Ｅ）実施例
本発明をより詳しく説明するために次の調製実施例および使用実施例を例示する。しかしながら、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００４８】
調製実施例１：大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの抽出、精製および生化学的特性
大腸菌細胞（ＣＣＲＣ１１６３４）１体積部に、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸カリウム２体積部を加えた。細胞を４℃で３０分間、３０％出力の超音波処理器を使用して破砕し、染色した。顕微鏡を使用して細胞が完全に破砕されたかどうかを観察した。細胞緩衝液混合物を次に５０００×ｇで３０分間遠心分離した。その上澄み液を採取した。同体積部の同リン酸緩衝液を残りの破砕細胞中に添加した。得られたものを同様な方法で再び粉砕し、遠心分離して上澄み粗酵素溶液を採集した。
【００４９】
採集した複数の粗酵素溶液上澄み液を混合した。固体硫酸アンモニウムを攪拌しながら静かに粗酵素中に添加した。３０から６０％の飽和率での沈殿物が最も高い活性を有していたことがわかった。３０から６０％の飽和率での沈殿物を採集し、０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）に対して２４時間透析した。全ての工程は４℃で行った。
【００５０】
透析された粗酵素は、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥセファセル（２．６×２０ｃｍ）上で色層分析（クロマトグラフ）した。１０体積量のリン酸緩衝液で洗浄した後、吸着されたタンパク質を０．１Ｍリン酸緩衝液中０．１Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配によって、流速１ｍＬ／分で溶出した。５ｍＬの画分を複数をフラクション・コレクタを使用して採集した。粗レダクターゼを０．３２から０．４０Ｍの塩化ナトリウム濃度で溶出した。
【００５１】
ＤＥＡＥセファセル・クロマトグラフィーでレダクターゼ活性を有した画分を濃縮し、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液でアミコン限外濾過を使用して平衡化した。得られたサンプルを、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液で予め平衡化したセファクリルＳ−３００  ＨＲカラム（２．６×９０ｃｍ）に加えた。流速は１ｍＬ／分であり、１画分あたり５または２．５ｍＬを採取した。このセファクリル  Ｓ−３００  ＨＲクロマトグラフィーを３回行った。精製した酵素は−７０℃で使用するまで貯蔵された。
【００５２】
分析後、大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの収量および比活性はそれぞれ３１．７％および１０．０３単位／ｍｇであったと確認された。更に、（表１に表示されているように）５７９．５倍の精製が達成された。
【００５３】
【表１】
表１−大腸菌由来亜硫酸レダクターゼの生産および精製のまとめ
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大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの生化学的特性は以下の通りであった。
【００５４】
（１）分子量
セファクリル  Ｓ−３００ＨＲゲル濾過カラム・クロマトグラフィーによって標準タンパク質から得られた検量線（図１に表示する）により、大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの分子量は１１９，０００と推定された。
【００５５】
（２）至適ｐＨ値およびｐＨ安定性
大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼは、７．７に至適ｐＨを有し、ｐＨ６．５から８．０で非常に安定していた（図２に示す）。２５℃、ｐＨ４．０から１０．０で静置した後、亜硫酸レダクターゼの活性を測定した。ｐＨ６．５から７．５では９５％以上の活性が残留していたことがわかった。ｐＨ６．５では７３．７％以上の活性が残り、ｐＨ８．０では７９．０％以上の活性が残っていた。したがって、酵素の安定性は若干酸性またはアルカリ性よりも中性状態の方が良好であることがわかった。
【００５６】
（３）至適温度および熱安定性
大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの至適温度は２５℃であった。熱安定性としては、酵素は５から２５℃の温度範囲で非常に安定であり、９８％以上の活性が残っていた。２５℃より上の温度では、酵素は徐々に不活性化され、５０℃に達すると完全に不活性化された（図３に示す）。
【００５７】
（４）阻害剤の酵素活性に対する影響
大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの触媒活性は、ＰＣＭＢおよびＫＣＮで完全に阻害され、ＮＥＭ、ＰＭＳＦおよびＩＡＡで部分的に阻害された。
【００５８】
（５）金属イオンの酵素活性に対する影響
大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの触媒活性は、Ｈｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、およびＣｕ２＋によって強く阻害され、Ｃｄ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、およびＢａ２＋によって中等度の阻害を受けた。しかし、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＭｇ２＋は酵素活性に影響を与えなかった。金属イオンの内、Ｈｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、およびＺｎ２＋は酵素のスルフヒドリル基と相互作用し、その活性を阻害する。この項の結果から、酵素の活性部位にはシステイン残基が含まれていることが証明された。
【００５９】
（６）還元剤の酵素活性に対する影響
グルタチオン、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、およびシステイン等の還元剤はすべて大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの活性を改善した。
【００６０】
（７）低温貯蔵安定性
大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの酵素溶液を４℃および−２０℃の温度でそれぞれ貯蔵した。残留酵素活性を一定の時間間隔で測定した。テストの結果、４℃で２８日間貯蔵した後、酵素活性はまだ７７．８％であり、−２０℃で２カ月間貯蔵した後には、活性はほとんど変化していないことがわかった。
【００６１】
調製実施例２：サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの生産、精製および生化学的特性
サッカロミセス・セレビシアエ（ＣＣＲＣ２２２２３）の細胞の１体積部に、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．３）を含む０．３Ｍリン酸緩衝液２体積部を加えた。細胞を４℃で３０分間３０％出力の超音波処理器を使用して破砕し、染色した。顕微鏡を使用して細胞が完全に破砕されたかどうかを観察した。細胞緩衝液混合物を次に１３，０００×ｇで６０分間遠心分離した。その上澄み液を採取した。同体積部の同リン酸緩衝液を残りの破砕細胞中に添加した。破砕細胞は同様な方法で再び細かくつぶされ遠心分離し、上澄み液を採集した。
【００６２】
採集した複数の粗酵素溶液上澄み液を混合した。固体硫酸アンモニウムを攪拌しながら静かに粗酵素液に添加した。３０から６０％飽和率での硫酸アンモニウム沈殿物が最も高い活性を有していたことがわかった。３０から６０％飽和率での沈殿物を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解し、同緩衝液に対して２４時間透析した。全ての工程は４℃で行った。
【００６３】
透析された粗酵素は、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液で予め平衡化されたＤＥＡＥ  セファセル（２．６×２０ｃｍ）上で色層分析（クロマトグラフ）した。１０体積量のリン酸緩衝液で洗浄した後、吸着されたタンパク質を０．１Ｍリン酸緩衝液中０．１Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配によって、流速１ｍＬ／分で溶出した。５ｍＬの画分を複数、フラクション・コレクターを使用して採取した。粗レダクターゼを０．３２から０．４０Ｍの塩化ナトリウム濃度で溶出した。
【００６４】
ＤＥＡＥセファセル・クロマトグラフィーでレダクターゼ活性を有した画分を濃縮し、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液でアミコン限外濾過を使用して平衡化した。得られたサンプルを、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液で予め平衡化されたセファクリル  Ｓ−３００  ＨＲカラム（２．６×９０ｃｍ）に加えた。流速は１ｍＬ／分であり、１画分あたり５または２．５ｍＬを採取した。このセファクリル  Ｓ−３００  ＨＲクロマトグラフィーを３回行った。精製した酵素は使用するまで−７０℃で使用時まで貯蔵した。
【００６５】
分析後、サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの収量および比活性はそれぞれ１４．２％および１．３４単位／ｍｇであった。更に、４３２．３倍の精製を行った（表２に表示）。
【００６６】
【表２】
表２−サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの生産および精製のまとめ
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【００６７】
サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの生化学的特性は以下の通りである。
（１）分子量
セファクリル  Ｓ−３００ＨＲゲル濾過カラム・クロマトグラフィーによって、標準タンパク質から得られた検量線により、サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの分子量は３５８，０００と推定された。
【００６８】
（２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼは、７．３に至適ｐＨを有し、ｐＨ６．５から７．５で非常に安定していた。
【００６９】
（３）至適温度および熱安定性
サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの至適温度は２５℃であった。５から３０℃の温度範囲で非常に安定であった。
【００７０】
（４）阻害剤の酵素活性に対する影響
サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの触媒活性は、ＰＣＭＰＳ、ＰＣＭＢおよびＫＣＮで完全に阻害され、ＮＥＭ、ＰＭＳＦおよびＩＡＡで部分的に阻害された。
【００７１】
（５）金属イオンの酵素活性に対する影響
サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの触媒活性は、Ｈｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｐｂ２＋、およびＣｕ２＋によって強く阻害され、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋およびＢａ２＋によって部分的に阻害を受けた。しかしながらＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋は酵素活性に影響を与えなかった。
【００７２】
（６）還元剤の酵素活性に対する影響
グルタチオン、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、およびシステイン等の還元剤はすべてサッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの活性を改善した。
【００７３】
（７）低温貯蔵安定性
サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの酵素溶液を４℃および−２０℃でそれぞれ貯蔵した。残留酵素活性を定時間隔をおいて測定した。テストの結果、４℃で２８日間貯蔵した後、酵素活性はまだ７７．８％であり、−２０℃で２カ月間貯蔵した後、活性はほとんど変化していないことがわかった。
【００７４】
使用実施例１：大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの凍結変性されたサバのすり身に対する影響
凍結変性されたサバのすり身における反応性スルフヒドリル基の数およびゲル強度に対する添加された大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼ量の影響を図４に示した。様々な活性単位の大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼを凍結変性したサバのすり身に添加した。反応性スルフヒドリル基は、添加レダクターゼの量の増加に伴い顕著に増加した。ミンチ肉１ｇあたり０．０３活性単位の亜硫酸レダクターゼを添加した場合、サバのすり身の反応性スルフヒドリル基の数は４．１９×１０−５から７．２３×１０−５モル／ｇミンチへと増加した。レダクターゼを０．０３単位／ｇミンチより多く添加しても、反応性スルフヒドリル基に明らかな変化はみられなかった。同様の傾向はゲル強度の変化においても観察された。ゲル強度は、大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼを０．０３単位／ｇミンチを添加したとき、１１５．０ｇ×ｃｍから２３５．７ｇ×ｃｍに増加した。レダクターゼを０．０３単位より多く添加してもゲル強度に明らかな変化はみられなかった。
【００７５】
凍結変性されたサバのすり身に対する大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの反応時間の影響を図５に示した。０．０３活性単位／ｇミンチの大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼを添加した。反応時間が長くなるほど、反応性スルフヒドリル基の数が顕著に増加した。反応性スルフヒドリル基の数は、対照の４．２０ｘ１０−５モル／ｇからインキュベーション２５分後には７．６５×１０−５モル／ｇミンチに増加した。同様の傾向はゲル強度の変化においても観察された。ゲルの強度は１０９．４ｇ×ｃｍから２１１．２ｇ×ｃｍに増加し、その後緩やかに変化する傾向にあった。
【００７６】
使用実施例２：サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼの凍結変性されたサバのすり身に対する影響
様々な活性単位の大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼを凍結変性されたサバのすり身中に添加した。反応性スルフヒドリル基の数は、添加レダクターゼの量の増加に伴い顕著に増加した。サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼを０．５単位の／ｇミンチを添加した場合、反応性スルフヒドリル基の数は対照の２．１９×１０−５モル／ｇから３．４８×１０−５モル／ｇミンチへと増加した。同様の傾向はゲル強度の変化においても観察された。図６に示したように、ゲル強度は、サッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼを０．５単位／ｇミンチを添加した時、１１５．０ｇ×ｃｍから３６９．９ｇ×ｃｍに増加した。
【００７７】
上記記載の例は、説明としてあげられたもので本発明を制限するものではなく、本発明の意図および範囲を逸脱することなしに様々な変化および変更がなされ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの分子量をセファクリルＳ−３００ＨＲゲル透過カラム・クロマトグラフィーを使用して決定するための検量線を示す。図において、ポイントＡはチログロブリン（６６９ｋＤａ）、ポイントＢはフェリチン（４４０ｋＤａ）、ポイントＣはカタラーゼ（２３２ｋＤａ）、ポイントＤはアルドラーゼ（１５８ｋＤａ）およびポイントＥはウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）を示す。
【図２】大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの活性に対するｐＨ値の影響を示す。図において、「〇」はｐＨ依存活性を、「●」は表示ｐＨにおける安定性を示す。
【図３】大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼの安定性に対する温度の影響を示す。図において、「〇」は温度依存活性を、「●」は表示温度における安定性を示す。
【図４】凍結変性したサバのすり身の反応性スルフヒドリル基の数およびゲルの強度に対する、添加した大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼ量の影響を示す。図において、「●」は反応性スルフヒドリル基の数、「■」はゲル強度を示す。
【図５】凍結変性したサバのすり身の反応性スルフヒドリル基の数およびゲルの強度に対する、大腸菌由来の亜硫酸レダクターゼが凍結変性したサバのすり身の肉に作用する時間の影響を示す。図において「●」は反応性スルフヒドリル基の数、「■」はゲル強度を示す。
【図６】オゾンで脱色したサバのすり身の反応性スルフヒドリル基の数およびゲルの強度に対する、添加したサッカロミセス・セレビシアエ由来の亜硫酸レダクターゼ量の影響を示す。図において「〇」は反応性スルフヒドリル基の数、「●」はゲル強度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【外国語明細書】
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