(57)【要約】【課題】微生物などの生体の核酸をより効率的で、且つ著しく優れた高抽出（回収）率で抽出することを可能にする生体の核酸抽出方法及びこれを用いる水処理システムを提供する。【解決手段】生体の核酸抽出が行われるための試料液に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加する次亜塩素酸ナトリウム添加工程、及び次亜塩素酸ナトリウムを添加した試料液から核酸抽出対象の生体の核酸を抽出する核酸抽出工程を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の核酸抽出が行われるための試料液に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加する次亜塩素酸ナトリウム添加工程、及び前記次亜塩素酸ナトリウムを添加した前記試料液から核酸抽出対象の前記微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程を備える、
生体の核酸抽出方法。
【請求項２】
前記次亜塩素酸ナトリウムの前記濃度範囲を決定する次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程を備え、
前記次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程における前記試験では、前記次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液を用意し、定量的ＰＣＲ法を用い、それぞれの前記試料液に対してアンプリコン増幅曲線を作成し、前記アンプリコン増幅曲線に基づいて前記次亜塩素酸ナトリウムの前記濃度範囲を決定する、
請求項１に記載の生体の核酸抽出方法。
【請求項３】
前記生体が微生物である、
請求項１又は２に記載の生体の核酸抽出方法。
【請求項４】
処理対象の水の水質を改善する水処理部と、
生体の核酸抽出が行われるための試料液に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加する次亜塩素酸ナトリウム添加工程、及び前記次亜塩素酸ナトリウムを添加した前記試料液から核酸抽出対象の前記生体の核酸を抽出する核酸抽出工程を備えた生体の核酸抽出方法を用い、前記水を前記水処理部で処理した後の処理水から得た前記試料液に対して核酸抽出を行い、前記処理水の中の生体量を定量する生体定量部と、
前記生体定量部で定量した前記生体量が予め設定した設定値以下の場合に前記処理水を排出する排水部と、を備えた、
水処理システム。
【請求項５】
前記水処理部は、前記水をろ過処理するろ過部を含む、
請求項４に記載の水処理システム。
【請求項６】
前記水処理部は、前記水を除菌処理する除菌部を含む、
請求項４に記載の水処理システム。
【請求項７】
前記生体定量部で前記生体量を定量する前の前記水を一時的に貯留する貯水部と、
前記生体定量部で定量した前記生体量が前記設定値を上回った場合に前記処理水を前記貯水部に戻す返送ラインと、をさらに備えた、
請求項４乃至６の何れか１項に記載の水処理システム。
【請求項８】
前記生体定量部での前記生体量の定量結果に基づいて前記処理水を前記排水部又は前記貯水部に送るための送水装置と、
前記送水装置の駆動を制御する制御部と、をさらに備えた、
請求項７に記載の水処理システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生体の核酸抽出方法及び水処理システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、ゲノム解析、定性（検出、同定）・定量、大量複製（増幅、増殖）などを行うため、食品、医療・医薬品、農業の技術分野を中心としたあらゆる技術分野で、ウイルス、原核生物（真正細菌、古細菌）、真核生物（藻類、原生生物、菌類、粘菌）、小型動物（ワムシなど）などの微生物や、動植物、人の組織などの各種生体から核酸を抽出／回収する手法に関する研究開発が盛んに行われている。
【０００３】
このような核酸抽出方法に関する研究開発成果は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などの遺伝子増幅法を用いた検査の迅速化、高精度化、高効率化などに活かされている。
【０００４】
また、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法は、各種排水などの水処理を行った後の処理水を河川や湖沼、海、地下水等の公共水域に放流するにあたり、環境や漁業、人等への悪影響を防ぐため、処理水に含まれる微生物等の定量検査、ひいては排水基準、環境基準等に係るコンプライアンスなど、放流水の管理に用いる場合もある。
【０００５】
ここで、定量的ＰＣＲ法による微生物の検査精度、すなわち定量精度を確保するためには、例えば、サンプリングなどして得られた試料水（試料液）からこれに含まれる微生物の核酸の抽出効率／回収率を極力高めることが重要になる。
【０００６】
これに対し、特許文献１では、微生物溶解酵素反応処理の前と後の抽出用溶液に対し、圧力サイクル処理又は超音波処理を行うことで、効率よく微生物由来の核酸を回収できるようにしている。
【０００７】
また、微生物由来の核酸の回収率を高めるために、エタノール沈殿を行う際に、ＤＮＡと共沈するｔＲＮＡ、グリコーゲンなどの多糖類、ポリアクリルアミドなどのキャリアを添加する手法も多用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１３−０４２６７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、圧力サイクル処理や超音波処理、キャリアを用いるなどの従来の核酸抽出、精製手法は、操作が非常に複雑で、多大な時間を要する、高コスト化するなどの問題があった。
【００１０】
このため、従来と比較し、より容易で効率的に、且つ優れた核酸抽出率で効果的に微生物などの生体の核酸抽出が行える手法が強く望まれていた。
【００１１】
本開示は、上記事情に鑑み、微生物などの生体の核酸をより効率的で、且つ著しく優れた高抽出（回収）率で抽出することを可能にする生体の核酸抽出方法及びこれを用いる水処理システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示の生体の核酸抽出方法の一態様は、生体の核酸抽出が行われるための試料液に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加する次亜塩素酸ナトリウム添加工程、及び前記次亜塩素酸ナトリウムを添加した前記試料液から核酸抽出対象の前記微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程を備える。
【００１３】
本開示の水処理システムの一態様は、処理対象の水の水質を改善する水処理部と、上記の生体の核酸抽出方法を用い、前記水を前記水処理部で処理した後の処理水の中の生体量を定量する生体定量部と、前記生体定量部で定量した前記生体量が予め設定した設定値以下の場合に前記処理水を排出する排水部と、を備えた。
【００１４】
なお、本開示における「生体」とは、微生物（顕微鏡などを用いなければ肉眼でその存在を判別できないほどの大きさの生体、ウイルスを含む）だけでなく、人間、動植物などの多細胞生物の一部を構成する組織（血液なども含む）などを含む。
また、本開示における「試料液」は、生体の核酸抽出が行われるための「液体の試料」を意味するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本開示の生体の核酸抽出方法によれば、微生物などの生体の核酸をより効率的で、且つ著しく優れた高抽出（回収）率で抽出することを可能になる。
【００１６】
本開示の水処理システムによれば、上記の生体の核酸抽出方法を用いて処理水の検査を行うことで、信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】一態様の水処理システムの一例を示す図、微生物の核酸抽出方法のフローの一例を示す図である。
【図２】一態様の生体（微生物）の核酸抽出方法において、次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定に用いられるアンプリコン増幅曲線の一例を示す図である。
【図３】一態様の生体（微生物）の核酸抽出方法において次亜塩素酸ナトリウム濃度と核酸初期濃度の関係の一例を示す図である。
【図４】ｐＨと次亜塩素酸の溶存形態の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図１から図４を参照し、一実施形態に係る生体の核酸抽出方法及び水処理システムについて説明する。
【００１９】
ここで、本実施形態においては、本開示の水処理システムが工業排水などの排水を処理して公共水域に放流する、もしくは処理水を再利用するための水処理システムであるものとして説明を行う。また、本実施形態では、本開示の生体の核酸抽出方法を本実施形態の水処理システムで処理した処理水中の微生物（ウイルスを含む：生体）の核酸を抽出し、放流、再利用の前に処理水の処理状況を確認、管理するために用いるものとして説明を行う。
但し、本実施形態の水処理システムや生体の核酸抽出方法は、その適用、用途、方法を本実施形態のように限定する必要はなく、あらゆる水処理、あらゆる生体の核酸抽出を要するケースに適用可能である。
なお、本実施形態では、以下、「生体の核酸抽出方法」を「微生物の核酸抽出方法」という。
【００２０】
（水処理システム）
本実施形態の水処理システム１は、図１に示すように、検出対象の微生物を含有し得る工業排水などの排水（処理対象の水）Ｗ１を一時的に貯留する貯水部２と、排水Ｗ１を浄化処理、すなわち、水質を改善するための水処理部３と、本実施形態の微生物の核酸抽出方法を用いて、水処理部３で浄化処理した後の処理水Ｗ２からサンプリングした試料液（試料、試料水）Ｗ２’を用い、処理水Ｗ２中の微生物量（生体量）を計測（定量）するための微生物定量部（生体定量部）４と、微生物定量部４で微生物の微生物量が予め設定した設定値以下の場合に処理水Ｗ２を排出する排水部５と、を備えて構成されている。
【００２１】
水処理部３は、例えば、活性汚泥法などの生物処理や、凝集沈殿、ろ過、ＵＶ照射などの高度処理などの物理化学的処理を施し、排水中のＮ（窒素）、Ｐ（リン）、Ｃ（有機炭素などの炭素）、重金属類などの有害物質の除去、分離、濃度調整、その他、ｐＨの調整などの適宜必要な処理を行い、処理対象の排水Ｗ１に対し浄化処理を施す。
【００２２】
微生物定量部４は、水処理部３で処理した後の処理水Ｗ２に対し、処理水Ｗ２中に含有する微生物を定量し、排出の要否を判定するために具備されている。
【００２３】
この微生物定量部４では、例えば、排水部５から処理水Ｗ２を河川、湖沼、海などの公共水域等に放流した場合に、あるいは処理水Ｗ２を再生水として再利用するような場合に、自然環境、漁業や農業などの産業、人等への悪影響、不都合な事象を発生させ得る微生物を検出し、その微生物量の定量を行う。なお、処理水Ｗ２中に微生物の存在によって悪影響、不都合な事象を発生させる場合だけでなく、存在していることが好ましい微生物を検出、定量することも勿論あり得る。
【００２４】
なお、本実施形態における微生物（生体）としては、例えば、ブドウ球菌、大腸菌、サルモネラ菌、緑膿菌、コレラ菌、赤痢菌、炭疽菌、結核菌、ボツリヌス菌、破傷風菌、レンサ球菌、白癬菌、カンジダ、アスペルギルス、ノロウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶなど、あらゆるウイルス、原核生物（真正細菌、古細菌）、真核生物（藻類、原生生物、菌類、粘菌）、小型動物（ワムシなど）などが挙げられる。すなわち、本実施形態における微生物は、その検出、定量を要するあらゆる微生物（ウイルスを含む）が対象となる。なお、本開示の生体の核酸抽出方法における生体には、多細胞生物の一部を構成する組織なども含まれ、生体を必ずしも微生物に限定しなくてもよい。
【００２５】
ちなみに、河川や海などの公共水域などに処理水Ｗ２を放流する場合には、漁業への影響を十分に考慮することが求められる。例えば、フグやハマチ、カキ、サケなどの養殖場においては、微生物由来の病気の発症などを防ぐために多大な労力、コストを要している。このため、処理水Ｗ２放流する放流箇所の付近への影響だけでなく、広域への影響を考慮することが重要とされている。また、農業など、他の業種に対しても同様であり、さらに、動植物、人などへの影響も当然に考慮することが求められる。
【００２６】
本実施形態の微生物定量部４は、処理水Ｗ２からサンプリングした試料液Ｗ２’に対し、検出・定量対象の微生物の細胞壁、細胞膜、細胞質、その他、核酸を囲繞するように存在する組織などを破壊（溶解）し、核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を抽出する。なお、ウイルスの場合は、カプシッド、エンベロープなどを破壊して核酸を抽出する。
【００２７】
そして、定量的ＰＣＲ法などのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて、抽出した核酸を増幅するとともにその定量を行う。
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法は、周知の通り、決められたサイクル数までの一連のＰＣＲによって発生した蛍光物質を測定する手法であり、ｑＰＣＲ検査での核酸合成を計測し、蛍光強度から鋳型ＤＮＡ（主にｃＤＮＡ）の量（核酸量）を求めることができる。このため、食品、医療分野だけでなく、各種排水Ｗ１などの水処理を行った後の処理水Ｗ２を河川や湖沼、海、地下水等の公共水域などに放流するにあたり、処理水Ｗ２に含まれる微生物等の定量検査、ひいては排水基準、環境基準等に係るコンプライアンスなど、放流水の管理などにも用いられている。なお、主な定量的ＰＣＲ法としては、ｉ）ＭＰＮ−ＰＣＲ法、ｉｉ）競合的ＰＣＲ法、ｉｉｉ）定量的リアルタイムＰＣＲ法などが挙げられる。
【００２８】
核酸（遺伝子）の量は、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）を測定することで算出することができる。Ｃｔ値とは、一定の増幅産物量になるＰＣＲサイクル数を意味し、Ｃｔ値は標的となる核酸の初期量に反比例することから、Ｃｔ値を測定することで、核酸の量を算出することができる。
【００２９】
具体的には、例えば、まず、既知のＤＮＡ量を含む試料を段階希釈した標準液列を用いて、初期ＤＮＡ量に応じて等間隔に並んだ増幅曲線を得る。増幅曲線が立ち上がる地点に閾値を設定し、増幅曲線と交わる点をＣｔ値として求める。次に、Ｃｔ値と初期ＤＮＡ量との間で直線の検量線を作成する。そして、未知のＤＮＡ量を含む試料についても同様にＣｔ値を測定し、検量線と照らし合わせることで未知のＤＮＡ量を含む試料の初期ＤＮＡ量を求める。
【００３０】
なお、より簡易的な定量方法として、ＰＣＲの結果として得られた増幅曲線のうち、直線的な部分を選択し、当該部分を外挿して算出された切片における蛍光強度を初期核酸量として用いてもよい。
【００３１】
ここで、本実施形態の微生物定量部４で核酸の量を定量する手法は、微生物の核酸量を定量することが可能であれば、例えば、培養法、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）法、ＣＰＲＩＮＳ−ＦＩＳＨ（Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法などを用いてもよく、必ずしもＰＣＲ法（定量的ＰＣＲ法）に限定しなくてもよい。
【００３２】
本実施形態の水処理システム１では、微生物定量部４での微生物の定量検査に基づいて、処理水Ｗ２中の微生物量が適正であると判断された場合には、排水部５に処理水Ｗ２を送り、この排水部５から、適宜、工業水域に放流したり、再生水として再利用する。また、処理水Ｗ２中の微生物量が適正であると判断された場合には、例えば、排水部５に送る前に、あるいは排水部５から返送ライン６を通じて貯水部２に処理水Ｗ２を返送する。
【００３３】
ここで、従来、核酸増幅を行う前処理としての微生物の核酸抽出方法としては、例えば、微生物を熱処理する方法、界面活性剤を添加する方法、フェノール抽出法、浸透圧ショック法、凍結融解法、酵素消化法、ＤＮＡ抽出用キットの使用、超音波処理法、フレンチプレス法、ホモジナイザーの使用などが用いられている。また、これらの方法を２種以上組み合わせて行うケースもある。
【００３４】
しかしながら、本願の発明者の鋭意研究によって、上記従来の微生物などの生体の核酸抽出方法は多大な時間や労力、コストを要する上、核酸抽出効率が低くなるケースがあることが確認された。このため、より容易で効率的且つ優れた核酸抽出効率で効果的に微生物などの生体の核酸を抽出可能な方法の開発が求められ、本願の発明者はこの点に関する研究に注力し、本開示の生体の核酸抽出方法を発明にするに至った。
【００３５】
（微生物などの生体の核酸抽出方法）
本実施形態の微生物の核酸抽出方法は、微生物の核酸増幅を行う前工程（前処理工程）として、微生物の核酸抽出が行われるための試料液Ｗ２’に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように酸化剤を添加する酸化剤添加工程と、酸化剤を添加した試料液Ｗ２’から核酸抽出対象の微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程と、を備える。
また、本実施形態の酸化剤添加工程は次亜塩素酸ナトリウム添加工程であり、酸化剤として次亜塩素酸（次亜塩素酸ナトリウム溶液）を添加する。
【００３６】
さらに、本実施形態の微生物の核酸抽出方法は、酸化剤の次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定する次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程（酸化剤濃度決定工程）を備える。
この次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程における前記試験では、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液Ｗ２’を用意し、定量的ＰＣＲ法を用い、それぞれの試料液Ｗ２’に対して、図２に示すようなアンプリコン増幅曲線（ＰＲＣサイクルと蛍光強度の関係の曲線）を作成する。そして、得られたアンプリコン増幅曲線に基づいて次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定する。
【００３７】
そして、必要に応じて添加した次亜塩素酸ナトリウムを中和処理した後の試料液Ｗ２’に対して、従来の核酸抽出、精製、定量の操作を行う。例えば、Ｅｘｔｒａｐ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ  Ｐｌｕｓ  ｖｅｒ．２（日鉄環境株式会社製）などの検査キットを用い、プロトコールに従い、試料液Ｗ２’に対して微生物の核酸の抽出及び精製を行う。
【００３８】
したがって、本実施形態の微生物の核酸抽出方法及びこれを用いた水処理システム１においては、ＰＣＲ法などの核酸抽出を行う前段の前工程として、本願の発明者の鋭意研究の成果に基づき、次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程、次亜塩素酸ナトリウム添加工程を備え、試料液Ｗ２’に対し核酸抽出を行う微生物に応じた濃度となるように次亜塩素酸ナトリウム（次亜塩素酸ナトリウム溶液）を添加する。これにより、従来と比較し、格段に優れた核酸抽出率（核酸回収率）で核酸を抽出することが可能になる。本願の発明者の鋭意研究の成果としては、図２及び図３に示すように、従来（０重量ｐｐｍ（以下、ｐｐｍと記載））と比較して１０〜１００倍の核酸抽出率の向上効果が確認されている。なお、図３の縦軸は、無処理のＤＮＡ初期濃度を１とした場合のＤＮＡ初期濃度の相対値であり、横軸は、次亜塩素酸ナトリウム濃度である。
【００３９】
すなわち、本願の発明者による格別顕著な知見、研究成果に基づいて、核酸抽出対象の微生物（細胞壁、細胞膜などの破壊の困難性／容易性）に対応した濃度になるように適量の次亜塩素酸ナトリウムを試料に添加するだけで、従来よりも格段に優れた核酸抽出を実現することが可能になる。
【００４０】
言い換えれば、細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどの溶解（破壊）の困難性／容易性が異なる各種の核酸抽出対象の微生物に対し、次亜塩素酸ナトリウムの濃度を調整するだけで、核酸を痛めることなく、好適に細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどを破壊し、非常に優れた核酸抽出率で核酸を抽出することが可能になる。
【００４１】
よって、従来のように煩雑な作業等を不要にし、容易で、効率的且つ効果的に微生物の核酸を抽出することが可能な画期的な微生物の核酸抽出方法を実現、提供することができる。
【００４２】
また、定量的ＰＣＲ法を用いた試験を実施し、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液Ｗ２’に対してアンプリコン増幅曲線を作成することによって、核酸抽出対象の微生物の核酸抽出に最適な次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定することができる。
これにより、次亜塩素酸ナトリウム添加工程で、試験で決定した次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲となるように次亜塩素酸ナトリウムを試料液に添加することによって、核酸抽出率ひいては信頼性の高い核酸抽出を実現することが可能になる。すなわち、より確実に、容易で効率的且つ効果的に微生物の核酸抽出を実現することが可能になる。
【００４３】
ここで、一例として示した図２及び図３のように、本実施形態の微生物の核酸抽出方法の次亜塩素酸ナトリウム添加工程では、濃度が０．５〜８ｐｐｍ、好ましくは０．５〜２ｐｐｍが次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲となる。この濃度範囲は、本願の発明者によって行われた各種微生物、生体の核酸抽出の試験の知見に基づいたものである。
【００４４】
また、本実施形態の水処理システム１は、微生物定量部４で微生物量を定量する前の排水Ｗ１を一時的に貯留する貯水部２と、微生物定量部４で微生物量が設定値を上回った場合に処理水Ｗ２を貯水部２に戻す返送ライン６と、を備えている。
さらに、本実施例の水処理システム１は、微生物定量部４での微生物量の定量結果に基づいて処理水Ｗ２を排水部５又は貯水部２に送るためのポンプなどを有する送水装置７と、送水装置７の駆動を制御する制御部８と、をさらに備えている。
【００４５】
そして、貯水部２と返送ライン６とを備えることで、微生物の核酸抽出方法を用いて、処理水Ｗ２の微生物量を効率的且つ効果的に検出し、排水部５を通じて処理水Ｗ２を外部に排出できないと判断された場合に、返送ライン６によって処理水Ｗ２を貯水部２に戻すことができる。これにより、処理水Ｗ２の再処理を行うことができ、また、より高度な処理を施すことができ、さらに効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
【００４６】
また、送水装置７と制御部８とを備えることで、微生物の核酸抽出方法を用いて、処理水Ｗ２の微生物量を効率的且つ効果的に検出し、処理水Ｗ２を排水部５を通じて外部に排出する可否判断結果に応じて、制御部８が送水装置７を駆動制御し、処理水Ｗ２を自動的に貯水部２に戻したり、排水部５に送って排出することが可能になる。これにより、より一層効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
【００４７】
ここで、本実施例の水処理システム１において、水処理部３は、例えば、水をろ過処理するろ過部３ａを備えたり、水を除菌処理する除菌部３ｂを備えて構成されている。
【００４８】
例えば、砂ろ過、ＭＦ膜、ＵＦ膜、ＲＯ膜などのろ過手段を単数又は複数組み合わせてろ過部３ａが構成されている場合には、本実施形態の微生物の核酸抽出方法を用いて、処理水Ｗ２の微生物量を効率的且つ効果的に検出できることで、必要なろ過手段、ろ過手段の組み合わせを容易に選別することができる。これにより、より効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
【００４９】
また、例えば、ＵＶ照射殺菌、オゾン殺菌、殺菌剤添加などの除菌手段を単数又は複数組み合わせて除菌部が構成されている場合に、本実施形態の微生物の核酸抽出方法を用いて、処理水Ｗ２の微生物量を効率的且つ効果的に検出できることで、必要な除菌手段、除菌手段の組み合わせを容易に選別することができる。これにより、より効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
【００５０】
よって、返送ライン６を通じて貯水部２ひいては水処理部３に処理水Ｗ２が戻された場合に、処理水Ｗ２の再処理を行うことができ、また、適宜ろ過手段や除菌手段を選択、組み合わせるなどして、より高度な処理を施すことができ、さらに効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
【００５１】
ここで、除菌剤（殺菌剤）を排水Ｗ１や返送処理水Ｗ２に添加して微生物を除菌処理する場合には、例えば、除菌剤として、細胞壁や微生物の集合体からなるバイオフィルムなどを破壊し、殺菌できるものであることが好ましい。例えば、ハロゲン系殺菌剤、オゾン、過酸化水素等が挙げられる。ハロゲン系殺菌剤としては、例えば、次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）及びその塩（例えば、次亜塩素酸ナトリウム等）、アンモニアクロラミン（ＮＨ２Ｃｌ）、ブロムクロルジメチルヒダントイン（Ｂｒ，Ｃｌ−ＤＭＨ）、ブロムスルファミン酸（ＢｒＮＨＳＯ３Ｈ）、ブロムクロラミン（ＮＨ４Ｂｒ＋ＨＣｌＯ）等が挙げられる。中でも、殺菌力の強さから、ハロゲン系殺菌剤又はオゾンが好ましく、次亜塩素酸及びその塩がより好ましい。
【００５２】
また、除菌剤を添加した場合には必要に応じて中和処理することが望ましい。例えば、除菌剤として次亜塩素酸ナトリウムを使用した場合には、中和剤としてチオ硫酸ナトリウム等が挙げられる。
【００５３】
（実施例）
次に、以下、火力発電所などから排出される排ガスから湿式排ガス脱硫装置によって硫黄酸化物を除去する際に発生する排液（例えば、石灰石膏法で使用される吸収液（スラリー）を含む排水Ｗ１を浄化処理し、本実施形態の微生物の核酸抽出方法を用い、処理後の処理水Ｗ２中の微生物量の検査に本実施形態の微生物の核酸抽出方法を適用した一例を挙げ、本実施形態の微生物の核酸抽出方法及び水処理システム１をより具体的に説明する。
【００５４】
ここで、排ガスと接触し、硫黄酸化物を吸収した吸収液は、化学的酸素要求量（ＣＯＤ）が高いケースがある。本願の発明者による鋭意研究によって、これは、硫黄酸化物を吸収した吸収液の排液において、独立栄養細菌である硫黄酸化細菌（例えばＴｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌）が増殖したことが一要因であることが知見として得られている。また、硫黄酸化細菌が増殖すると、硫黄酸化細菌の産出物（有機物）を利用して増殖する従属栄養細菌（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌）が増殖し、増殖した従属栄養細菌によっても糖類等の有機物が産出されることから、排液のＣＯＤが上昇するおそれがある。
【００５５】
そして、ＣＯＤが排水基準よりも高いと、排水を河川等の公共水域に放流することが当然にできないため、水処理システム１によって浄化処理を施すことになる。
【００５６】
一方、排水基準に規定されていない硫黄酸化細菌を含む処理水Ｗ２を下水管などを通じて放流、排水すると、下水管など、下水処理施設のコンクリート腐食を発生させることが知られている。
具体的に、下水中に含まれた硫酸還元菌によって嫌気状態の下水中の硫酸イオンが還元されて硫化水素が発生し、硫化水素が下水中から空気中に放出されるとともに、コンクリート表面の結露などに吸収、溶解される。この状態で、硫黄酸化細菌が好気状態のコンクリート表面に存在すると、結露などに吸収された硫化水素が硫黄酸化細菌によって酸化されて硫酸が発生し、この硫酸によってコンクリートが溶け、いわゆるコンクリート腐食が発生する。このような微生物を要因として地中の下水道などのコンクリート腐食が発生すると、コンクリートが粘土のような状態となってコンクリート構造物の耐力が喪失し、下水道施設としての機能は勿論、予期せぬ突然の道路の陥没、地盤沈下などを発生させることがある。
【００５７】
このため、硫黄酸化物を吸収した吸収液を含む排水Ｗ１を浄化処理した処理水Ｗ２に対して、微生物の硫黄酸化細菌や硫酸還元菌の菌量を定量し確認してから公共水域等に放流することが望まれる。
【００５８】
本実施例では、このような処理水中の硫黄酸化細菌の菌量を検査するために、本実施形態の微生物の核酸抽出方法及び水処理システム１を適用し、排水中の硫黄酸化細菌の菌体量を、硫黄酸化細菌の既知の遺伝子の増幅用プライマー対を用いたＰＣＲ法によって検出した。なお、検出された硫黄酸化細菌の菌体量に応じて、酸化性殺菌剤の量を調整し、処理水Ｗ２を殺菌（除菌）処理するなどした後に放流することになる。
【００５９】
ちなみに、使用される吸収液は、硫黄酸化物を吸収可能なものであれば任意であり、例えば、石灰石を溶解（分散）させたスラリー（石灰石膏法）、水酸化ナトリウム水溶液（苛性ソーダ法）、水酸化マグネシウムを溶解（分散）させたスラリー（マグネシウム法）を適用することができる。本実施例では、一例として、石灰石を溶解させた（分散させた）スラリーを吸収液として使用したケースを基に説明を行う。
【００６０】
また、核酸抽出対象の微生物である硫黄酸化細菌は、サルファイド（Ｓ２−）、元素硫黄（ＳＯ）、チオ硫酸、ポリチオン酸、亜硫酸等の還元型無機硫黄化合物の酸化エネルギーを増殖のエネルギーとして利用する細菌である。硫黄酸化細菌としては、例えば、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ属、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ属、Ｔｈｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属等の一時的に体内に硫黄を沈着する細菌；Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｔｈｉｏｍｏｎａｓ属、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ属等の菌体内に硫黄を蓄積しない中温性細菌；Ｔｈｅｒｍｏｔｈｒｉｘ属等の好熱性細菌；Ａｃｉｄｉａｎｕｓ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属等の超高熱細菌等が挙げられる。本実施例では、一例として、脱硫装置内に存在する硫黄酸化細菌が、Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌であるものとして説明を行っている。
【００６１】
そして、本実施例では、処理水Ｗ２中の硫黄酸化細菌の菌体量を硫黄酸化細菌の既知の遺伝子の増幅用プライマー対を用いたＰＣＲ法により検出し定量する。
【００６２】
処理水Ｗ２中の硫黄酸化細菌の菌体量は、硫黄酸化細菌の既知の遺伝子の量として検出される。既知の遺伝子としては、硫黄酸化細菌が有する遺伝子であって、硫黄酸化細菌に特有のものであればよく、例えば、硫黄代謝に関与する遺伝子を用いることができる。硫黄代謝には、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｌｆｕｒ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ（ＰＳＯ経路、ｓｏｘ経路ともいう）と、Ｓ４  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｐａｔｈｗａｙ（Ｓ４経路）とが存在する。ＰＳＯ経路には、ｓｏｘ遺伝子クラスターにコードされている酵素（ｓｏｘＸＡＹＺＢＣＤ）が主要な役割を担っている。当該酵素として具体的には、例えば、ｓｏｘＹＺ、ｓｏｘＸＡ、ｓｏｘＢ、ｓｏｘＣＤ等が挙げられる。中でも、既知の遺伝子としては、ｓｏｘＢ遺伝子が好ましい。硫黄酸化細菌のｓｏｘＢ遺伝子は、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなる。
【００６３】
一方、Ｓ４経路に関与する遺伝子としては、例えば、チオ硫酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、亜硫酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、テトラチオン酸ハイドラロラーゼ（４ＴＨａｓｅ）遺伝子等が挙げられる。
【００６４】
既知の遺伝子の増幅用プライマー対は、標的となる遺伝子の塩基配列、Ｔｍ値、ＧＣ含量等を勘案して、公知の方法を用いて設計することができる。
例えば、ｓｏｘＢ遺伝子、特に、配列番号１で表される塩基配列からなる領域の増幅用プライマー対としては、例えば、表１及び以下の１）〜８）からなる群より選ばれる１種以上のプライマー対等が挙げられる。
【００６５】
１）配列番号２で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３で表される塩基配列からなるリバースプライマー；
２）配列番号４で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５で表される塩基配列からなるリバースプライマー；
３）配列番号６で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号７で表される塩基配列からなるリバースプライマー；
４）配列番号８で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号９で表される塩基配列からなるリバースプライマー；
５）配列番号１０で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１１で表される塩基配列からなるリバースプライマー；
６）配列番号１２で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１３で表される塩基配列からなるリバースプライマー；
７）配列番号１４で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１５で表される塩基配列からなるリバースプライマー；
８）配列番号１６で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１７で表される塩基配列からなるリバースプライマー；
【００６６】
【表１】
2022000003.tif 000003
【００６７】
上記のプライマー対は、使用可能なプライマー対の一例である。通常、プライマーは１５塩基以上３０塩基以下程度の長さに設計できることから、上記のプライマー対において、ＧＣ含量やＴｍ値を鑑みて、塩基長を例えば、１塩基、２塩基、３塩基、５塩基、１０塩基程度、増加又は減少させたものも同様に用いることができる。
【００６８】
上述した既知の遺伝子を標的としたＰＣＲ法では、排水Ｗ１中に含まれる硫黄酸化細菌の菌体量を、硫黄酸化細菌の既知の遺伝子の量として定量することができる。このとき、処理水Ｗ２中に含まれる硫黄酸化細菌から核酸を抽出した後、得られた抽出液を鋳型試料としてＰＣＲを行うという２段階の操作を行うことで、３時間以上１日間以下の短時間で測定結果を得ることができる。
【００６９】
（硫黄酸化細菌のＤＮＡ抽出方法）
ここで、ＰＣＲ法による菌体量の定量を行うための前処理では、例えば、Ｅｘｔｒａｐ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ  Ｐｌｕｓ  ｖｅｒ．２（日鉄環境株式会社製）を用い、プロトコールに従い、脱硫装置から採取した石膏サンプルより硫黄酸化細菌のＤＮＡの抽出及び精製を行う。
【００７０】
本実施例の硫黄酸化細菌のＤＮＡ抽出方法（本実施例の微生物の核酸抽出方法）では、まず、次亜塩素酸ナトリウム濃度（終濃度）が０．５ｐｐｍ（Ｃａｓｅ１）、１ｐｐｍ（Ｃａｓｅ２）、２ｐｐｍ（Ｃａｓｅ３）、４ｐｐｍ（Ｃａｓｅ４）、８ｐｐｍ（Ｃａｓｅ５）、１６ｐｐｍ（Ｃａｓｅ６）となるように、対象生物懸濁液の試料液１ｃｃに対し、次亜塩素酸ナトリウム濃度が異なるそれぞれの次亜塩素酸ナトリウム溶液を１ｃｃ添加してＣａｓｅ１〜Ｃａｓｅ６の６種の試料液（混合液）Ｗ２’を生成し、ボルテックスミキサーなどを用いてそれぞれ３０ｍｉｎ間振とうする。なお、試料液Ｗ２’の温度は２５℃とした。
【００７１】
このように振とう処理した後、対象生物懸濁液と次亜塩素酸ナトリウムとの混合液である６種の試料液Ｗ２’にそれぞれ、チオ硫酸ナトリウムなどの中和剤溶液を添加し、各試料液Ｗ２’中に残存する残留塩素を中和することが望ましい。本実施例では、チオ硫酸ナトリウム溶液を用い、添加した次亜塩素酸ナトリウムの量に対応した当量のチオ硫酸ナトリウム溶液を添加して中和処理を行っている。
【００７２】
次に、対象生物懸濁液と次亜塩素酸ナトリウム溶液とチオ硫酸ナトリウム溶液の混合液であるそれぞれの試料液Ｗ２’を、遠心分離機を用いて１３５００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離処理する。
【００７３】
そして、本実施例では、このように遠心分離処理して固液分離して得られたペレット（ＰＣＲ法による菌体量の定量を行うための前処理を行った後のペレット）から、例えば、Ｅｘｔｒａｐ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ  Ｐｌｕｓ  ｖｅｒ．２（日鉄環境株式会社製）を用い、プロトコールに従い、硫黄酸化細菌の核酸（ＤＮＡ）の抽出及び精製を行う。
【００７４】
硫黄酸化細菌の核酸の抽出及び精製のプロトコールは以下の通りである。
【００７５】
１）Ｂｅａｄ  Ｔｕｂｅｓに、試料のペレット：０．５ｇ（ちなみに、液体試料の場合は５００μＬ）、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（主成分／リン酸水素二ナトリウムの混合物）：９５０μＬ、Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（主成分／ドデシル硫酸ナトリウムの混合物）：５０μＬを添加する。
なお、濃縮が必要な場合には、メンブレンフィルターを用いて試料中の微生物をろ過・捕捉し、このフィルターから核酸を抽出するようにすることが望ましい。
【００７６】
２）ボルテックスミキサーで５秒間撹拌する。
【００７７】
３）ビーズビーティング（４〜６ｍ／秒又は４２００〜６８００ｒｐｍで３０〜４５秒間）を行う。
【００７８】
４）遠心分離（１４０００×ｇ、５分、４℃）を行う。
【００７９】
５）上清６００μＬを１．５ｍＬチューブに移し、ＰＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（酢酸ナトリウム溶液）：３００μＬを添加する。
【００８０】
６）５）のチューブを１０回程度転倒混和し、撹拌する。
【００８１】
７）遠心分離（１４０００×ｇ、５分、４℃）を行う。
【００８２】
８）上清８００μＬを２ｍＬチューブに移す。
【００８３】
９）８）のチューブにＭＢｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（主成分／グアニジン塩酸塩、三二酸化鉄の混合物）：５０μＬ、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（主成分／グアニジンチオシアン酸塩の混合物）：８９０μＬを添加する。
【００８４】
１０）９）のチューブを２分間程度転倒混和し、よく撹拌する。
【００８５】
１１）１０）のチューブをスピンダウンし、マグネティックスタンドにセットする。
【００８６】
１２）１分以上集磁したのち、マイクロピペットを使用して上清を除去する。
【００８７】
１３）１２）のチューブにＷａｓｈｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（主成分／グアニジンチオシアン酸塩の混合物）：８００μＬを添加し、ボルテックスミキサー（低速）で十分に撹拌する。
【００８８】
１４）１３）のチューブをスピンダウンし、マグネティックスタンドにセットして１分以上集磁したのち、マイクロピペットを使用して上清を除去する。
【００８９】
１５）７０％エタノール溶液：１ｍＬを添加し、ボルテックスミキサー（低速）で十分に撹拌する。
【００９０】
１６）１５）のチューブをスピンダウンし、マグネティックスタンドで１分以上集磁したのち、マイクロピペットを使用してエタノールを除去する。
【００９１】
１７）１５）〜１６）の工程を再度繰り返す。
【００９２】
１８）チューブの蓋をあけたまま、室温で磁性粒子を１０分間程度風乾する。
【００９３】
１９）溶出液（ＴＥバッファー、滅菌水等）：１００μＬを添加後、ボルテックスミキサー（低速）で十分に撹拌する。
【００９４】
２０）途中で数回攪拌しながら、６５℃のヒートブロック（またはウォーターバス）で５〜１０分間加温する。
【００９５】
２１）マグネティックスタンドにチューブをセットして集磁したのち、溶出液を新しいチューブに移す。
【００９６】
これにより、核酸が溶出して含有された溶出液（試料液）が得られる。
【００９７】
次に、精製したサンプルを鋳型として、前述の表１に示した８種類のプライマー対のうち、プライマー対５〜８を用い、リアルタイムＰＣＲ法によってｓｏｘＢ遺伝子の量を定量した。ＰＣＲの反応条件は、初期変性として９８℃２分間反応を行った後、「９８℃１０秒間のＤＮＡ変性反応、５５℃１０秒間のアニーリング、６８℃３０秒間の伸長反応」を４５サイクル行うこととした。
【００９８】
これにより、プライマー対のうちプライマー対８を用い、サイクル数を４５サイクルとしたリアルタイムＰＣＲ法の結果である図２に示すような次亜塩素酸ナトリウム濃度を変化させた場合の各アンプリコン増幅曲線（ＰＲＣサイクルと蛍光強度の関係の曲線）を得ることができる。
【００９９】
よって、次亜塩素酸ナトリウムを添加する前処理を行い、次亜塩素酸ナトリウムの濃度を調整するだけで、好適に細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどを破壊し、非常に優れた核酸抽出率で核酸を抽出できることが実証された。また、各アンプリコン増幅曲線から、次亜塩素酸ナトリウム濃度が０．５〜８ｐｐｍとなるように試料液Ｗ２’に次亜塩素酸ナトリウムを添加すれば、従来よりも優れた核酸抽出率で好適に各種微生物の核酸を抽出できることも実証された。
【０１００】
なお、上記のようにして排水Ｗ１の処理水Ｗ２中の微生物定量結果に基づき、必要に応じて処理水Ｗ２に殺菌剤を添加するなどする。このとき、殺菌に使用する酸化性殺菌剤の量は、硫黄酸化細菌の菌体量に応じて、適宜調整することができる。また、使用する酸化性殺菌剤の種類に応じても、適宜調整することができる。例えば、酸化性殺菌剤として次亜塩素酸ナトリウムを用いる場合に、次亜塩素酸ナトリウムの添加量は、処理水Ｗ２中の終濃度が１ｐｐｍ以上７０ｐｐｍ以下となるような量とすることができる。
【０１０１】
酸化性殺菌剤による殺菌時間は、例えば、１分間以上２４時間以下程度とすることができ、１分間以上１２時間以下が好ましく、１分間以上６時間以下がより好ましい。殺菌時間を上記下限値以上とすることで、より十分な殺菌効果が得られ、一方、上記上限値以下であることで、脱硫装置への腐食等の損傷を軽減することができる。
【０１０２】
以上、本開示の生体の核酸抽出方法及び水処理システム１の実施形態について説明したが、本開示に係る生体の核酸抽出方法及び水処理システム１は、上記の実施形態に限定されるものではなく、変更例等を含め、その趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。
【０１０３】
例えば、本実施形態では、次亜塩素酸ナトリウム添加工程において、微生物（生体）の核酸抽出が行われるための試料液Ｗ２’に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加するものとした。
また、本実施形態では、次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程における試験で、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液Ｗ２’を用意し、定量的ＰＣＲ法を用い、それぞれの試料液に対してアンプリコン増幅曲線を作成し、アンプリコン増幅曲線に基づいて次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定するものとした。
【０１０４】
これに対し、図４に示すように、次亜塩素酸は、ｐＨの違いによって次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）、次亜塩素酸イオン（ＣｌＯ−）、溶存塩素ガス（Ｃｌ２）の３種の溶存形態に変化し、これら３種の溶存の割合がｐＨによって異なる。
このため、次亜塩素酸ナトリウムの濃度を一定とした場合であっても、試料液Ｗ２’のｐＨを調整すれば、酸化力が強い次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）の割合（濃度）を調整することができ、核酸抽出対象の微生物の細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどの破壊の困難性に合わせてｐＨを調整したり、検査対象の水Ｗ１、Ｗ２のｐＨに応じて次亜塩素酸ナトリウムの濃度を調整、設定するだけで、結果的に核酸抽出に有効な次亜塩素酸の濃度を調整することができ、本実施形態と同様に、非常に優れた核酸抽出率で核酸を抽出することが可能になる。
【０１０５】
なお、本実施形態では、核酸抽出対象の微生物などの生体の細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどを好適に破壊するために、前処理として次亜塩素酸ナトリウムを試料液Ｗ２’に添加するものとした。
一方、次亜塩素酸ナトリウム以外の酸化剤であっても同様の作用効果を奏功することができ得る。また、上記のように他の酸化剤においてもｐＨによって溶存形態、ひいては核酸抽出対象の微生物などの生体の細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどの破壊に適した形態が変化する。
このため、細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどの破壊の困難性に合わせ、酸化剤の選択、濃度やｐＨの調整を行うことで、やはり、本実施形態と同様の作用効果を得ることができると言える。
このような酸化剤としては、公知のあらゆる酸化剤を適用することが可能である。例えば、ハロゲン系のアンモニアクロラミン（ＮＨ２Ｃｌ）、ブロムクロルジメチルヒダントイン（Ｂｒ，Ｃｌ−ＤＭＨ）、ブロムスルファミン酸（ＢｒＮＨＳＯ３Ｈ）、ブロムクロラミン（ＮＨ４Ｂｒ＋ＨＣｌＯ）などを挙げることができる。また、オゾンや過酸化水素、過マンガン酸カリウム、第一鉄、第二鉄、０価の鉄なども挙げることができる。
なお、例えば、生体の細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどの破壊して核酸抽出率を向上させる目的、関連からすると、ヨウ素酸のように酸性溶液中で酸化力が強く、塩基性溶液中で酸化力が弱い傾向が大きい酸化剤と比較し、次亜塩素酸ナトリウムのように中性域の溶液中で酸化力が強く、酸性、塩基性が強くなるほど溶液中で酸化力が低くなる酸化剤（図４のような傾向を示す酸化剤）の適用がより好ましいことが発明者の鋭意研究によって確認されている。
【０１０６】
さらに、本実施形態では、水処理システムで処理した後の処理水中の微生物量を定量するために本開示の微生物の核酸抽出方法を用いるものとして説明を行った。さらに、実施例では、核酸抽出対象の微生物が硫黄酸化細菌として説明を行った。
これに対し、本開示の生体の核酸抽出方法、これを用いた水処理システムは、河川や湖沼、池、海域の水、その他、あらゆる任意の水の中に含まれる微生物などの生体の核酸を抽出するために適用可能である。すなわち、その用途等を限定する必要はない。
【０１０７】
また、本実施形態及び実施例では、試料液に次亜塩素酸ナトリウムを添加して前処理を行い、この前処理を行った試料液に対し、従来周知の核酸抽出キットを用いて本工程の核酸抽出を行い、ＰＣＲ法を用いて微生物量を定量するものとした。
ここで、試料液に対して添加する次亜塩素酸ナトリウムを予め具備した形で核酸抽出キットを構成してもよい。この場合には、従来と比較し、より一層効率的で、核酸抽出率を向上させることができ、信頼性の高い核酸抽出キットを実現、提供することが可能になる。
【０１０８】
最後に、実施形態に記載の内容は、例えば以下のように把握される。
【０１０９】
（１）本開示の一態様に係る生体の核酸抽出方法は、生体の核酸抽出が行われるための試料液（試料水、試料液Ｗ２’）に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加する次亜塩素酸ナトリウム添加工程、及び次亜塩素酸ナトリウムを添加した試料液から核酸抽出対象の生体の核酸を抽出する核酸抽出工程を備える。
【０１１０】
上記（１）の生体の核酸抽出方法においては、本願の発明者の鋭意研究の成果を用いることによって、すなわち、試料液に対し核酸抽出を行う微生物などの生体に応じた濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加することによって、従来よりも格段に優れた核酸抽出率（核酸回収率）で核酸を抽出できるという本願の発明者による格別顕著な知見、研究成果に基づき、核酸抽出対象の生体に対応した濃度になるように適量の次亜塩素酸ナトリウムを試料に添加するだけで、従来よりも格段に優れた核酸抽出を実現することが可能になる。
【０１１１】
すなわち、例えば、細胞壁、細胞膜、細胞質、ウイルスの場合は、カプシッド、エンベロープなどの溶解（破壊）の困難性が異なる各種の核酸抽出の生体に対し、次亜塩素酸ナトリウムの濃度を調整するだけで、好適に細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどを破壊し、非常に優れた核酸抽出率で核酸を抽出することが可能になる。
【０１１２】
したがって、従来のように煩雑な作業等を不要にし、容易で、効率的且つ効果的に微生物などの生体の核酸を抽出することが可能な画期的な微生物の核酸抽出方法を実現、提供することができる。
【０１１３】
（２）本開示の別の態様に係る生体の核酸抽出方法は、上記（１）の生体の核酸抽出方法であって、次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定する次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程を備え、次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程における試験では、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液を用意し、定量的ＰＣＲ法を用い、それぞれの試料液に対してアンプリコン増幅曲線を作成し、アンプリコン増幅曲線に基づいて次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定する。
【０１１４】
上記（２）の生体の核酸抽出方法においては、定量的ＰＣＲ法を用いた試験を実施し、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液に対してアンプリコン増幅曲線を作成することによって、核酸抽出対象の生体の核酸抽出に最適な次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定することができる。
これにより、次亜塩素酸ナトリウム添加工程で、試験で決定した次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲となるように次亜塩素酸ナトリウムを試料液に添加することによって、核酸抽出率ひいては信頼性の高い核酸抽出を実現することが可能になる。すなわち、より確実に、容易で効率的且つ効果的に生体の核酸抽出を実現することが可能になる。
【０１１５】
（３）本開示の別の態様に係る生体の核酸抽出方法は、上記（１）又は（２）の生体の核酸抽出方法であって、生体が微生物である。
【０１１６】
上記（３）の生体の核酸抽出方法においては、本願の発明者によって行われた各種微生物の核酸抽出の試験の知見に基づき、試料液に次亜塩素酸ナトリウムを添加すれば、従来よりも優れた核酸抽出率で好適に各種微生物の核酸を抽出することが可能になる。
【０１１７】
（４）本開示の一態様に係る水処理システムは、処理対象の水（排水Ｗ１）の水質を改善する水処理部（水処理部３）と、生体の核酸抽出が行われるための試料液に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加する次亜塩素酸ナトリウム添加工程、及び次亜塩素酸ナトリウムを添加した試料液から核酸抽出対象の微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程を備えた生体の核酸抽出方法を用い、水処理部で処理した後の処理水（処理水Ｗ２）から得た試料液に対して核酸抽出を行い、処理水の中の生体量を定量する生体定量部（微生物量定量部、微生物量決定部４）と、生体定量部で定量した生体量が予め設定した設定値以下の場合に処理水を排出するための排水部（排水部５）と、を備えた。
【０１１８】
上記（４）の水処理システムにおいては、次亜塩素酸ナトリウム添加工程及び核酸抽出工程を備えた生体の核酸抽出方法を用い、水処理部で処理した後の水の中の生体量を定量する生体定量部を備えることによって、上記（１）の生体の核酸抽出方法の作用効果を奏功することができる。これにより、信頼性の高い水処理を実現することができ、ひいては排水部から排出される水の信頼性を好適に確保することが可能になる。
【０１１９】
（５）本開示の別の態様に係る水処理システムは、上記（４）の水処理システムであって、水処理部は、水をろ過処理するろ過部（ろ過部３ａ）を含む。
【０１２０】
上記（５）の水処理システムにおいては、例えば、砂ろ過、ＭＦ膜、ＵＦ膜、ＲＯ膜などのろ過手段を単数又は複数組み合わせてろ過部が構成されている場合に、上記（１）乃至（３）の何れかの生体の核酸抽出方法を用いて、処理水の生体量を効率的且つ効果的に検出できることで、必要なろ過手段、ろ過手段の組み合わせを容易に選別することができる。これにより、より効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
【０１２１】
（６）本開示の別の態様に係る水処理システムは、上記（４）の水処理システムであって、水処理部は、水を除菌処理する除菌部（除菌部３ｂ）を含む。
【０１２２】
上記（６）の水処理システムにおいては、例えば、ＵＶ照射殺菌、オゾン殺菌、次亜塩素酸殺菌などの殺菌手段を単数又は複数組み合わせて殺菌部が構成されている場合に、上記（１）乃至（３）の何れかの生体の核酸抽出方法を用いて、処理水の生体量を効率的且つ効果的に検出できることで、必要な殺菌手段、殺菌手段の組み合わせを容易に選別することができる。これにより、より効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
【０１２３】
（７）本開示の別の態様に係る水処理システムは、上記（４）乃至（６）の何れかの水処理システムであって、生体定量部で生体量を定量する前の水を一時的に貯留する貯水部（貯水部２）と、生体定量部で定量した生体量が設定値を上回った場合に処理水を貯水部に戻す返送ライン（返送ライン６）と、をさらに備えた。
【０１２４】
上記（７）の水処理システムにおいては、上記（１）乃至（３）の何れかの生体の核酸抽出方法を用いて、処理水の生体量を効率的且つ効果的に検出し、処理水を排水部を通じて外部に排出できないと判断した場合に、返送ラインによって処理水を貯水部に戻すことができる。これにより、処理水の再処理を行うことができ、また、より高度な処理を施すことができ、さらに効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
【０１２５】
（８）本開示の別の態様に係る水処理システムは、上記（７）の水処理システムであって、生体定量部での生体量の定量結果に基づいて水を排水部又は貯水部に送るための送水装置（送水装置７）と、送水装置の駆動を制御する制御部（制御部８）と、をさらに備えた。
【０１２６】
上記（８）の水処理システムにおいては、上記（１）乃至（３）の何れかの生体の核酸抽出方法を用いて、処理水の生体量を効率的且つ効果的に検出し、処理水を排水部を通じて外部に排出する可否判断結果に応じて、制御部が送水装置を駆動制御し、処理水を自動的に貯水部に戻したり、排水部に排出することが可能になる。これにより、より一層効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
【符号の説明】
【０１２７】
１  水処理システム
２  貯水部
３  水処理部
３ａ  ろ過部
３ｂ  除菌部
４  微生物定量部、微生物量決定部（生体定量部、生体量決定部）
５  排水部
６  返送ライン
７  送水装置
８  制御部
Ｗ１  排水（水）
Ｗ２  処理水
Ｗ２’  試料液（試料水）
【図１】
2022000003.tif 000004
【図２】
2022000003.tif 000005
【図３】
2022000003.tif 000006
【図４】
2022000003.tif 000007