(57)【要約】      （修正有）【課題】植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該タンパク質を精製する方法、並びにＡＣｈＥ活性の測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質であって、（ａ）特定アミノ酸配列、または、（ｂ）上記のアミノ酸配列において、アミノ酸の一部が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、植物体から該タンパク質を精製する方法、かかる方法により得られるタンパク質、並びにネオスチグミンを用いたアセチルコリンエステラーゼ活性の測定方法である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質であって、
（ａ）配列番号１もしくは２で表されるアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号１もしくは２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸の一部が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号３で表される塩基配列からなる請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号４と５、６と７、８と９、１０と１１、または１２と１３のＤＮＡの組み合わせからなる、植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列増幅用プライマーセット。
【請求項５】
配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるＤＮＡからなる、植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列解析用プライマー。
【請求項６】
植物体からアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質を精製する方法であって、
（１）植物体を磨砕し、アセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質を含有する溶液を調製する工程、
（２）該溶液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、各画分のアセチルコリンエステラーゼ活性を測定し、活性を有する画分（画分１）を回収する工程、
（３）画分１を陰イオン交換クロマトグラフィーへ負荷し、非吸着画分（画分２）を回収する工程、
（４）画分２を陽イオン交換クロマトグラフィーへ負荷し、吸着画分（画分３）を溶出させ回収する工程、
（５）画分３を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、各画分のアセチルコリンエステラーゼ活性を測定し、活性を有する画分（画分４）を回収する工程、
（６）画分４を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、タンパク質バンドに分離し、各バンドのアセチルコリンエステラーゼ活性を測定し、活性を有するバンドからタンパク質を抽出する工程、
からなるアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質の精製方法。
【請求項７】
植物体が、葉、茎、葉枕、節、葉身、葉身および根からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６に記載の精製方法。
【請求項８】
植物体が、トウモロコシである請求項６に記載の精製方法。
【請求項９】
アセチルコリンエステラーゼ活性の測定を、
（１）同一の測定対象から２つのサンプルを採集し、一方をネオスチグミンと接触せしめサンプルＢとし、他方をネオスチグミンと接触させずサンプルＡとし、
（２）サンプルＡおよびサンプルＢの双方を、アセチルチオコリンを基質として５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）により発色せしめ、吸光度を測定し、
（３）サンプルＡの吸光度からサンプルＢの吸光度を差し引くことにより、測定対象のアセチルコリンエステラーゼ活性を測定することを特徴とする、請求項６に記載の精製方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の精製方法によって得られる植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
アセチルコリンエステラーゼ活性の測定方法であって、
（１）同一の測定対象から２つのサンプルを採集し、一方をネオスチグミンと接触せしめサンプルＢとし、他方をネオスチグミンと接触させずサンプルＡとし、
（２）サンプルＡおよびサンプルＢの双方を、アセチルチオコリンを基質として５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）により発色せしめ、吸光度を測定し、
（３）サンプルＡの吸光度からサンプルＢの吸光度を差し引くことにより、測定対象のアセチルコリンエステラーゼ活性を測定する、
ことからなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質、その精製方法および遺伝子、並びにアセチルコリンエステラーゼ活性の測定方法に関する。
【０００２】
詳しくは、本発明は、特定のアミノ酸配列で表される植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質およびかかるタンパク質をコードする遺伝子に関する。また本発明は、植物体からアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質を精製する方法およびかかる方法により得られるタンパク質に関する。さらに本発明は、アセチルコリンエステラーゼ活性の簡便で正確な測定方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
アセチルコリン（ＡＣｈ）は、神経細胞間において神経伝達物質として作用し、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）およびアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の３分子からなる環境刺激応答系で作用すると考えられている。
【０００４】
すなわち、熱ストレス、塩ストレス、重量ストレスなどの環境刺激によって細胞内のＣａ２＋が活性化すると小胞体から遊離したＡＣｈが、中心柱と皮層間に存在する原形質連絡糸の膜チャネルでＡＣｈＲと結合し、その結合時にチャネルが開き、水、イオン、ホルモンなどの流入、流出が起こる。続いてＡＣｈＥが、ＡＣｈＲと結合と結合したＡＣｈを速やかにコリンと酢酸に分解し、コリンは再びＡＣｈに合成されるものと考えられている。したがって、ＡＣｈＥはＡＣｈの量的レベルを制御する重要な酵素である。
【０００５】
近年、ＡＣｈＥは、植物の葉の下垂または回復運動に関与していることが明らかになりつつある（非特許文献１および非特許文献２参照）。かかる下垂または回復運動は、作物体内からの水分蒸発、温度上昇を調節するためのもので、高温ストレスに対する応答反応である。
【０００６】
このように、ＡＣｈＥは植物の環境刺激応答反応系に重要な役割を果たしており、植物体中のＡＣｈＥの量、分布などを把握することにより、植物の環境適応性を評価できる可能性がある。また、ＡＣｈＥを発現する遺伝子で植物を形質転換し、品種改良することも考えられる。
【０００７】
しかし、これまでにＡＣｈＥタンパク質が、植物体から単離された例はない。したがって、ＡＣｈＥタンパク質のアミノ酸配列も明らかになってはいないし、その遺伝子も明らかになってはいない。
【０００８】
【非特許文献１】
桃木芳枝、「作物環境刺激応答反応系におけるアセチルコリンの生理機能」、１９９９年度日本作物学会シンポジウム〔２〕、ｐ８７１−８７３
【非特許文献２】
桃木芳枝、「作物環境刺激応答反応系におけるアセチルコリンの役割」、日本作物学会紀事、第６７巻第３号、１９９８年９月
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質を提供することを目的とする。また、本発明は、かかるタンパク質のアミノ酸配列を明らかにすることを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、上記タンパク質をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに本発明は、植物体からアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質を精製する方法を提供することを目的とする。
【００１２】
加えて、本発明は、上記タンパク質の精製方法に有用なアセチルコリンエステラーゼ活性の測定方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質であって、
（ａ）配列番号１もしくは２で表されるアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号１もしくは２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸の一部が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるタンパク質である。
【００１４】
また本発明は、上記タンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、かかる遺伝子は、配列番号３で表される塩基配列からなる遺伝子を包含する。
【００１５】
さらに本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のプライマーセットを包含する。かかるプライマーセットは、植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列増幅用のプライマーセットである。
【００１６】
（ａ）配列番号４と５のＤＮＡ
（ｂ）配列番号６と７のＤＮＡ
（ｃ）配列番号８と９のＤＮＡ
（ｄ）配列番号１０と１１のＤＮＡ
（ｅ）配列番号１２と１３のＤＮＡ
【００１７】
また、本発明は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるＤＮＡからなる、アセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列解析用のプライマーを包含する。
【００１８】
さらに本発明は、植物体からアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質を精製する方法であって、
（１）植物体を磨砕し、アセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質を含有する溶液を調製する工程、
（２）該溶液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、各画分のアセチルコリンエステラーゼ活性を測定し、活性の高い画分（画分１）を回収する工程、
（３）画分１を陰イオン交換クロマトグラフィーへ負荷し、非吸着画分（画分２）を回収する工程、
（４）画分２を陽イオン交換クロマトグラフィーへ負荷し、吸着画分（画分３）を溶出させ回収する工程、
（５）画分３を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、各画分のアセチルコリンエステラーゼ活性を測定し、活性の高い画分（画分４）を回収する工程、
（６）画分４をポリアクリルアミドゲル電気泳動により、タンパク質バンドに分離し、各バンドのアセチルコリンエステラーゼ活性を測定し、活性の高いバンドからタンパク質を抽出する工程、
からなるアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質の精製方法である。
【００１９】
また本発明は、上記精製方法によって得られる植物由来のアセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質を包含する。
【００２０】
また、本発明は、アセチルコリンエステラーゼ活性の測定方法であって、
（１）同一の測定対象から２つのサンプルを採集し、一方をネオスチグミンと接触せしめサンプルＢとし、他方をネオスチグミンと接触させずサンプルＡとし、
（２）サンプルＡおよびサンプルＢの双方を、アセチルチオコリンを基質として、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）により発色せしめ、吸光度を測定し、
（３）サンプルＡの吸光度からサンプルＢの吸光度を差し引くことにより、測定対象のアセチルコリンエステラーゼ活性を測定する、
ことからなるアセチルコリンエステラーゼ活性の測定方法である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
（タンパク質）
本発明は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性を有する植物由来のタンパク質であって、
（ａ）配列番号１もしくは２で表されるアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号１もしくは２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸の一部が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるタンパク質である。
【００２２】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（タンパク質Ｘ１ということがある）は、アミノ酸番号１のＡｌａから３６５のＧｌｎまでの３６５個のアミノ酸からなる。タンパク質Ｘ１は、植物、好ましくはトウモロコシから後述する方法で精製することができる。
【００２３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（タンパク質Ｘ２ということがある）は、アミノ酸番号１のＭｅｔから３９４のＧｌｎまでの３９４個のアミノ酸からなる。かかるタンパク質は、タンパク質Ｘ１のＮ末端にアミノ酸番号１のＭｅｔから２９のＧｌｙまでの２９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが付加したタンパク質である。
【００２４】
本発明は、（ｂ）配列番号１もしくは２のアミノ酸配列において、アミノ酸の一部が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（タンパク質Ｙということがある）を包含する。ＡＣｈＥ活性を有する限りアミノ酸の欠失、置換もしくは付加の程度は問わない。タンパク質Ｙは、好ましくは、配列番号１もしくは２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらにより好ましくは５個以下のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したタンパク質である。タンパク質Ｘ１、Ｘ２またはＹは、植物、好ましくはトウモロコシ由来のタンパク質である。
【００２５】
（遺伝子）
本発明は、タンパク質Ｘ１、Ｘ２またはＹをコードする遺伝子を包含する。かかる遺伝子として、配列番号３の１４７１個の塩基で構成される遺伝子が挙げられる。
【００２６】
具体的には、タンパク質Ｘ１をコードする遺伝子として、配列番号３の塩基配列の塩基番号１７３から１２６７までの塩基で構成される遺伝子が挙げられる。タンパク質Ｘ２をコードする遺伝子として、配列番号３の塩基配列の塩基番号８６から１２６７までの塩基で構成される遺伝子が挙げられる。かかる遺伝子は、タンパク質Ｘ１のアミノ酸配列の情報を基礎とし、好適なプライマーセットを設計し、ＰＣＲ法により塩基配列を増幅し得ることが出来る。
【００２７】
好適な塩基配列増幅用のプライマーセットとして以下のＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号４と５のＤＮＡ
（ｂ）配列番号６と７のＤＮＡ
（ｃ）配列番号８と９のＤＮＡ
（ｄ）配列番号１０と１１のＤＮＡ
（ｅ）配列番号１２と１３のＤＮＡ
【００２８】
塩基配列解析用のプライマーセットとして、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるＤＮＡが好適である。
【００２９】
（精製方法）
ＡＣｈＥは、植物体中に微量に含まれ、不安定で分解しやすく、植物体から得られた例はなかった。
【００３０】
そこで、本発明者は、植物体からＡＣｈＥを効率良く精製する方法を鋭意検討した結果、特定のクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動を、特定の順序で組み合わせることを見出し、本発明に到達した。また本発明者は、精製工程の各段階でＡＣｈＥ活性を正確に把握すると、精製を極めて効率良く行うことが出来ることを見出し、本発明に到達した。
【００３１】
すなわち本発明は、植物体からＡＣｈＥ活性を有するタンパク質を精製する方法であって、
（１）植物体を磨砕し、ＡＣｈＥ活性を有するタンパク質を含有する溶液を調製する工程、
（２）該溶液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、各画分のＡＣｈＥ活性を測定し、活性を有する画分（画分１）を回収する工程、
（３）画分１を陰イオン交換クロマトグラフィーへ負荷し、非吸着画分（画分２）を回収する工程、
（４）画分２を陽イオン交換クロマトグラフィーへ負荷し、吸着画分（画分３）を溶出させ回収する工程、
（５）画分３を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、各画分のＡＣｈＥ活性を測定し、活性を有する画分（画分４）を回収する工程、
（６）画分４をポリアクリルアミドゲル電気泳動により、タンパク質バンドに分離し、各バンドのＡＣｈＥ活性を測定し、活性を有するバンドからタンパク質を抽出する工程、
からなるＡＣｈＥ活性を有するタンパク質の精製方法である。
【００３２】
＜工程１＞
植物体を磨砕し、ＡＣｈＥ活性を有するタンパク質を含有する溶液を調製する工程である。具体的には、該溶液は、植物体を緩衝液の存在下で磨砕し、精製することにより得ることができる。また該溶液は、植物体を磨砕した後、緩衝液と混合して精製することにより得ることができる。
【００３３】
植物体は、葉、茎、葉枕、節、葉身、葉身および根からなる群から選ばれた少なくとも一種を用いることができる。植物体として、トウモロコシ、キュウリ、ダイコン、マメ、シロイヌナズナ、サイラトロ、インゲンマメ、アズキなどが挙げられる。植物体として、種子を滅菌した後、発芽させ、数日間、育成した後の地上部のみを用いることが好ましい。
【００３４】
緩衝液は、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムなどから構成される。
【００３５】
精製は、植物体の磨砕物を遠心分離し、上澄みを回収し、塩析後、沈殿物を回収し、再度、遠心分離し上澄みを回収することにより行うことが出来る。
【００３６】
＜工程２＞
ＡＣｈＥ活性を有するタンパク質を含有する溶液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、各画分のＡＣｈＥ活性を測定し、活性を有する画分（画分１）を回収する工程である。
【００３７】
ゲルろ過クロマトグラフィーの充填剤として、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した樹脂からなる粒子が好ましい。かかる粒子の直径は１０〜２００μｍの範囲であることが好ましい。分画範囲は、分子量５，０００〜６００，０００の範囲であることが好ましい。このような充填剤として、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２００（アマシャムバイオサイエンス社）が挙げられる。
【００３８】
各画分のＡＣｈＥ活性は、アセチルチオコリンを基質として、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）により発色せしめ、吸光度を測定し、把握することができる。好ましくは、後述する方法で測定する。本工程では、ＡＣｈＥ活性を有する画分を画分１として回収する。
【００３９】
＜工程３＞
画分１を陰イオン交換クロマトグラフィーへ負荷し、非吸着画分を画分２として回収する工程である。
【００４０】
陰イオン交換クロマトグラフィーの充填剤として、４級化ポリエチレンイミン粒子が好ましい。粒子の直径は、５〜１００μｍの範囲であることが好ましい。このような充填剤として、Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ／２０（パーフユージョン社）が挙げられる。
【００４１】
＜工程４＞
画分２を、陽イオン交換クロマトグラフィーへ負荷し、吸着画分を溶出させ画分３として回収する工程である。
【００４２】
陽イオン交換クロマトグラフィーの充填剤として、スルフォプロピル樹脂からなる粒子が好ましい。粒子の直径は、５〜１００μｍの範囲であることが好ましい。このような充填剤として、Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ／２０（パーフユージョン社）が挙げられる。
【００４３】
＜工程５＞
画分３を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、各画分のＡＣｈＥ活性を測定し、活性を有する画分を画分４として回収する工程である。
【００４４】
ゲルろ過クロマトグラフィーの充填剤として、デキストランと架橋アガロースビーズからなる粒子が好ましい。かかる粒子の直径は１０〜１００μｍの範囲であることが好ましい。分画範囲は、分子量１０，０００〜６００，０００の範囲であることが好ましい。このような充填剤として、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００（アマシャムバイオサイエンス社）が挙げられる。
【００４５】
各画分のＡＣｈＥ活性は、アセチルチオコリンを基質として、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）により発色せしめ、吸光度を測定し、把握することができる。好ましくは、後述する方法で測定する。
【００４６】
＜工程６＞
画分４を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、タンパク質バンドに分離し、各バンドのＡＣｈＥ活性を測定し、活性を有するバンドからタンパク質を抽出する工程である。
【００４７】
ポリアクリルアミドゲルは、ミニスラブゲル作製キット（ＡＥ−６４０１型；アトー社）等の市販のものを使用し作製できる。
【００４８】
各バンドのＡＣｈＥ活性は、アセチルチオコリンを基質として、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）により発色せしめ、吸光度を測定し、把握することができる。好ましくは、後述する方法で測定する。
【００４９】
（ＡＣｈＥ活性の測定）
従来、ＡＣｈＥ活性の測定は、基質としてアセチルチオコリンを用い、その加水分解によって生じるチオコリンを５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）との発色反応によって定量していた。
【００５０】
しかし、アセチルチオコリンはＡＣｈＥの存否に拘らず、水に溶解後ＤＴＮＢと反応し発色する。これは、アセチルチオコリンがＤＴＮＢと反応性を有するチオール化合物に分解するためであると考えられている。このように従来の方法では、ＡＣｈＥによる分解に起因するＤＴＮＢ発色以外の発色の影響を排除できず、ＡＣｈＥ活性の測定精度は悪かった。
【００５１】
そこで、本発明者は、アセチルチオコリンの、ＡＣｈＥによる分解に起因するＤＴＮＢ発色と、その他の要因によるＤＴＮＢ発色とを区別する方法を鋭意検討した。
【００５２】
その結果、ＡＣｈＥの阻害剤であるネオスチグミン添加区および非添加区を用意し、両方のＤＴＮＢの発色を吸光度によって測定し、ネオスチグミン非添加区の吸光度から添加区のそれを差し引くことにより、ＡＣｈＥ以外に起因する発色の影響を排除できることを見出し本発明を想到した。さらに、本発明者は、ゲル電気泳動で分離したタンパク質バンドのＡＣｈＥ活性の測定方法を見出した。
【００５３】
すなわち、本発明は、ＡＣｈＥ活性の測定方法であって、
（１）同一の測定対象から２つのサンプルを採集し、一方をネオスチグミンと接触せしめサンプルＢとし、他方をネオスチグミンと接触させずサンプルＡとし、
（２）サンプルＡおよびサンプルＢの双方を、アセチルチオコリンを基質として５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）により発色せしめ、吸光度を測定し、
（４）サンプルＡの吸光度からサンプルＢの吸光度を差し引くことにより、測定対象のＡＣｈＥ活性を測定する、
ことからなるＡＣｈＥ活性の測定方法である。
【００５４】
測定対象が液体の場合、以下の態様が好ましい。すなわち、
（１）ネオスチグミンを含有する溶液（ｂ液）とネオスチグミンを含有しない溶液（ａ液）とを用意し、
（２）同一の測定対象から採集した２つのサンプルのうち、一方をｂ液に添加し、他方をａ液に添加し、ここでｂ液をサンプルＢ、ａ液をサンプルＡとし、
（３）サンプルＡおよびサンプルＢの双方に、アセチルチオコリンを添加し、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）により発色せしめ、吸光度を測定し、
（４）サンプルＡの吸光度からサンプルＢの吸光度を差し引くことにより、測定対象のＡＣｈＥ活性を測定する。
【００５５】
測定対象が、ゲル電気泳動で分離したタンパク質バンドのような固体である場合、以下の態様が好ましい。すなわち、
（１）同一の測定対象から２つのサンプルを採集し、一方をネオスチグミンを含有する溶液（ｂ液）に添加しサンプルＢとし、他方をネオスチグミンを含有しない溶液（ａ液）に添加しサンプルＡとし、
（２）サンプルＡおよびサンプルＢの双方を、アセチルチオコリンを基質として５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）により発色せしめ、吸光度を測定し、
（３）サンプルＡの吸光度からサンプルＢの吸光度を差し引くことにより、測定対象のＡＣｈＥ活性を測定する。
【００５６】
ａ液は、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を９２〜９４重量％、超純水を８〜６重量％含有することが好ましい。ｂ液は、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を９２〜９４重量％、１００ｍＭ臭化オスチグミンを８〜６重量％含有することが好ましい。
【００５７】
ネオスチグミンとの接触は、同一の測定対象から採集した２つのサンプルのうち、一方をｂ液に添加し、他方をａ液に添加し、１０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３５℃、さらに好ましくは３０℃で、アセチルコリンエステラーゼ活性が完全に失活するまで、好ましくは１０分以上、一定の温度条件下で静置する。
【００５８】
発色反応は、サンプルＡおよびＢのそれぞれにアセチルチオコリンを含む溶液を添加し、０℃〜１００℃のうちで、サンプル中のアセチルコリンエステラーゼが活性を維持できる温度、好ましくは２０℃〜４０℃で、発色反応が十分に進行するまで、１２０分以上静置することが好ましい。
【００５９】
吸光度は、以下の方法で測定することが好ましい。すなわち、酵素反応を終えた溶液へＤＴＮＢを添加し、発色反応を開始する。ＤＴＮＢ添加後、黄色の発色反応が十分に進行した状態で、反応液の一部あるいは全部の４１２ｎｍにおける吸光度を測定する。吸光度の測定は、分光光度計（日立製作所レジオビームＵ−１５００）を使用することができる。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
【００６１】
実施例において、ＡＣｈＥ活性の測定は以下の方法で行った。
【００６２】
（１）画分１および画分４のＡＣｈＥ活性の測定
表１に示す組成の反応液（ａ液およびｂ液）を調製した。
【００６３】
【表１】
2004350616.tif 000002
【００６４】
ａ液およびｂ液それぞれに、１００μｌのサンプルを添加し、３０℃で１０分間反応を行った。次に、各液に、２．４８Ｍ塩化アセチルチオコリンを２５０μｌ添加し、３０℃で１２０分間恒温槽に静置する。その後、各液に、１％ＤＴＮＢ溶液を７５μｌ添加し、４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６５】
（２）電気泳動ゲル中のタンパク質バンドのＡＣｈＥ活性染色
２つのタッパウエアケースを用意し、一方には、適量（１０〜２０ｍｌ）の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を入れた（ネオスチグミン非添加区）。他方には、適量（１０〜２０ｍｌ）の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）および１００ｍＭ臭化ネオスチグミンを２００μｌ加えた（ネオスチグミン添加区）。それぞれに電気泳動終了後のゲルを入れた後、１０分間、振とうした。次に２．４８Ｍ塩化アセチルチオコリンおよび１％ＤＴＮＢをそれぞれ５ｍｌずつ加えた。ネオスチグミン非添加区に入れたサンプルをサンプルＡ、ネオスチグミン添加区に入れたサンプルをサンプルＢとした。サンプルＡおよびＢに、ドライヤーで温風を当て、１〜２分間、温めた。ゲル上に現れる黄色のバンドを検出した。この時、サンプルＡ（ネオスチグミン非添加区）にのみ現れたバンドがＡＣｈＥ活性を有するバンドである。
【００６６】
（３）吸光度の測定は、分光光度計（日立製作所レジオビームＵ−１５００）を使用し４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６７】
（実施例１）ＡＣｈＥタンパク質の精製
（１）トウモロコシ種子の洗浄と発芽
トウモロコシの種子を１０％次亜塩素酸ナトリウムで洗浄し、水道水に一晩、流水浸漬した。その後、種子を１．２％（有効塩素濃度）次亜塩素酸ナトリウムで滅菌した。次に、種子を蒸留水で洗浄した。
【００６８】
洗浄した種子をキッチンペーパー上に胚が下方向になるように横一列に並べ、キッチンペーパーを巻き込み、テープで留め、すべての種子が同じ条件になるように胚を下方向にそろえて、プラスチック製ポットに静置した。ポットに水を入れ、２８℃、暗所で５日間発芽させた。５日後、種子と根を切り捨て、地上部のみを−３０℃で保存した。
【００６９】
（２）粗酵素液の調製
上記工程で得られた地上部２００ｇに、４％硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、乳鉢および乳棒にて磨砕した。得られた溶液を、遠心分離し（６０００×Ｇ、４℃、１５分間）、上澄みを回収した。この工程を二度繰り返した。上澄み液へ８０％飽和になるように固形硫酸アンモニウムを加えた。得られた溶液を４℃、暗所にて１２時間静置した。得られた溶液を遠心分離し（１５，０００×Ｇ、４℃、１５分間）、沈殿を回収した。
【００７０】
沈殿を３ｍｌの表２に示すＰＢＳに溶解し、脱塩のため同緩衝液に対し透析した。その後、再度、遠心分離し（１５，０００×Ｇ、４℃、１５分間）、上澄みを回収し粗酵素液とし、使用するまで−３０℃で保存した。
【００７１】
【表２】
2004350616.tif 000003
【００７２】
（３）Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２００ゲルろ過クロマトグラフィー
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２００（アマシャムバイオサイエンス社）へ、粗酵素液を流速１５６．２５μｌ／ｍｉｎで負荷した。同緩衝液にて溶出させ、２ｍｌごとに分画した。各画分のＡＣｈＥ活性を測定した。各画分の吸光度を表３に示す。得られた、９９個の画分の内、最もＡＣｈＥ活性の高い第６２番目から６９番目の画分を画分１として回収した。
【００７３】
【表３】
2004350616.tif 000004
【００７４】
（４）Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ／２０強陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
画分１を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｏｒｏｓ  ＨＱ（パーフュージョン社）へ流速３ｍｌ／ｍｉｎで負荷した。同緩衝液にて非吸着画分を溶出させた。ＡＣｈＥタンパク質は、非吸着画分に含まれるので、非吸着画分を回収した。非吸着画分を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析し画分２として回収した。
【００７５】
（５）Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ／２０強陽イオン交換カラムクロマトグラフィー
画分２を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＰｏｒｏｓ  ＨＳ（パーフュージョン社）へ流速３．０ｍｌ／ｍｉｎで負荷した。同緩衝液にて非吸着画分を溶出させた。０〜０．７ＭＮａＣｌ直線濃度勾配によって吸着画分を溶出させ、１ｍｌごとに分画した。各画分のＡＣｈＥ活性を測定した。各画分の吸光度を表４に示す。得られた、３５個の画分の内、最もＡＣｈＥ活性の高い第２４番目から２５番目の画分を画分３として回収した。画分３を遠心エバポレーターによって約３５０μｌに濃縮した。
【００７６】
【表４】
2004350616.tif 000005
【００７７】
（６）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過クロマトグラフィー
画分４を、１０％グリセリンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（アマシャムバイオサイエンス社）へ流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで負荷した。同緩衝液にて溶出させ、２５０μｌごとに分画した。各分画のＡＣｈＥ活性を測定した。得られた、６３個の画分の内、最もＡＣｈＥ活性の高い第５６番目から６０番目の画分を画分４として回収した。画分４を遠心エバポレーターにて、約５００μｌに濃縮した。
【００７８】
【表５】
2004350616.tif 000006
【００７９】
（７）未変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）
ミニスラブゲル作製キット（ＡＥ−６４０１型；アトー社）を用いて１０．８％Ｔ、２．６２％Ｃ分離ゲル（高さ４ｃｍ）および３．１％Ｔ、２０％Ｃ濃縮ゲル（高さ１．５ｃｍ）からなるポリアクリルアミドゲルを作製した。
【００８０】
画分４を、ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽（ＡＥ−６５００型；アトー社）を用いて１５ｍＡの定電流で電気泳動した。電気泳動後のゲルの一端を切断し、ＡＣｈＥ活性を測定した。残りのゲルは、クマジーブリリアントブルーによって染色した。
【００８１】
ＡＣｈＥ活性測定によって検出されたタンパク質バンドに相当するバンドを切り出し−３０℃で保存した。タンパク質バンドの一部を後述するアミノ酸配列分析に用い、残りのタンパク質バンドからタンパク質を抽出した。得られたタンパク質は、後述するように配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目のＡｌａから３６５番目のＧｌｎまでの３６５個のアミノ酸からなるタンパク質であった。
【００８２】
（実施例２）ＡＣｈＥタンパク質のアミノ酸配列分析
（１）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ミニスラブゲル作製キット（ＡＥ−６４０１型；アトー社）を用いて７．５％Ｔ、２．６２％Ｃ分離ゲル（高さ７．５ｃｍ）および５％Ｔ、２０％Ｃ濃縮ゲル（高さ１．５ｃｍ）からなるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルを作製した。
【００８３】
実施例１で得られたＡＣｈＥ活性を有するタンパク質を含有するバンドを、作製したドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルに負荷し、ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽（ＡＥ−６５００型；アトー社）を用いて１５ｍＡの定電流で電気泳動した。電気泳動後のゲルは、クマジーブリリアントブルーによって染色し、ＡＣｈＥを検出した。４４ｋＤａ付近に出現したタンパク質バンドを有するゲル片を切り出した。
【００８４】
（２）精製ＡＣｈＥの部分アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列ミニスラブゲル作製キット（ＡＥ−６４０１型；アトー社）を用いて、７．５％Ｔ、２．６２％Ｃ分離ゲル（高さ７．５ｃｍ）および５％Ｔ、２０％Ｃ濃縮ゲル（高さ１．５ｃｍ）からなるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルを作製した。
【００８５】
前記工程（１）で切り出したＡＣｈＥ活性を有するタンパク質バンド（４４ｋＤａ）を有するゲル片を、作製したドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルに負荷し、ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽（ＡＥ−６５００型；アトー社）を用いて１５ｍＡの定電流で電気泳動した。セミドライブロッティング装置（日本エイドー社）を用いてゲル中のＡＣｈＥをＰＶＤＦ膜へ転写した。
【００８６】
膜上のＡＣｈＥをクマジーブリリアントブルーによって染色し、検出した。検出されたバンドを切り取り、プロテインシーケンサ（Ｍｏｄｅｌ  ４９２ＨＴ）；（アプライドバイオシステムズ社）にてＮ末端アミノ酸配列を分析した。その結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目のＡｌａから２２番目のＴｈｒまでの配列が得られた。
【００８７】
（３）内部アミノ酸配列分析
ミニスラブゲル作製キット（ＡＥ−６４０１型；アトー社）を用いて７．５％Ｔ、２．６２％Ｃ分離ゲル（高さ７．５ｃｍ）および５％Ｔ、２０％Ｃ濃縮ゲル（高さ１．５ｃｍ）からなるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルを作製した。
【００８８】
前記工程（１）で切り出したＡＣｈＥ活性を有するタンパク質バンド（４４ｋＤａ）を有するゲル片と、１μｇのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８  ｐｒｏｔｅａｓｅ（和光純薬社）を、作製したドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルに負荷し、ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽（ＡＥ−６５００型；アトー社）を用いて１５ｍＡの定電流で電気泳動した。
【００８９】
タンパク質のゾーンが濃縮ゲルの中央付近に到達した時点で一旦通電を止め、３７℃にて１時間静置した。再び通電し、通常通り泳動を行った。
【００９０】
次に、セミドライブロッティング装置（日本エイドー社）を用いてゲル中の消化断片ペプチドをＰＶＤＦ膜へ転写した。膜上の消化断片ペプチドをクマジーブリリアントブルーによって染色し検出した。検出されたバンドを切り取り、プロテインシーケンサ（Ｍｏｄｅｌ  ４９２ＨＴ；アプライドバイオシステムズ社）にてそれぞれのＮ末端アミノ酸配列を分析した。
【００９１】
その結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１４２のＴｙｒから１６１のＴｙｒまでの２０個の配列が明らかになった。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１７０のＶａｌから１７９のＧｌｕまでの１０個の配列が明らかになった。
【００９２】
以上の結果および後述する塩基配列の解析結果より、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目のＡｌａから３６５番目のＧｌｎまでの配列、および配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目のＭｅｔから３９４番目のＧｌｎまでの配列が明らかになった。
【００９３】
（実施例３）塩基配列の決定
（１）プライマーの設計
決定されたアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１〜２２番、１４２〜１６１番、１７０〜１７９番）を基に、以下のプライマーを設計した。
【００９４】
（ａ）配列番号４と５のＤＮＡ
（ｂ）配列番号６と７のＤＮＡ
（ｃ）配列番号８と９のＤＮＡ
（ｄ）配列番号１０と１１のＤＮＡ
（ｅ）配列番号１２と１３のＤＮＡ
（２）トウモロコシ幼苗からのｃＤＮＡ調製
実施例１の（１）トウモロコシ種子の洗浄と発芽の手順と同様に、トウモロコシ種子を発芽させ幼苗を発芽させた。３ｇの幼苗から、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてトータルＲＮＡを調製した。ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック社）を用いてｃＤＮＡを調製した。
【００９５】
（３）ＰＣＲおよびＤＮＡシークエンシング
調製したｃＤＮＡ、並びに（ａ）配列番号４と５のＤＮＡ、（ｂ）配列番号６と７のＤＮＡ、（ｃ）配列番号８と９のＤＮＡ、（ｄ）配列番号１０と１１のＤＮＡ、および（ｅ）配列番号１２と１３のＤＮＡのプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。
【００９６】
ＰＣＲの反応液組成を表６に示す。反応条件を表７に示す。ＰＣＲキットは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ（ニッポンジーン社）、サーマルサイクラーは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ社）を使用した。
【００９７】
【表６】
2004350616.tif 000007
【００９８】
【表７】
2004350616.tif 000008
【００９９】
得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に負荷した。ゲル中のＤＮＡをＥａｓｙＴｒａｐ  ｖｅｒ．  ２（タカラバイオ社）にて抽出した。次に、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてサイクルシーケンスした。ＤＮＡシークエンサ（Ｍｏｄｅｌ  ３７７、アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定した。決定した配列を配列番号３として示す。
【０１００】
【発明の効果】
本発明によれば、植物由来のＡＣｈＥ活性を有する新規タンパク質が提供される。かかるタンパク質は、植物の環境刺激反応系の解析に有用である。
【０１０１】
また、本発明によれば、上記タンパク質をコードする遺伝子が提供される。かかる遺伝子を用いて植物を形質転換することが期待できる。
【０１０２】
さらに本発明の精製方法によれば、植物体からＡＣｈＥ活性を有するタンパク質を、効率良く精製することができる。
【０１０３】
また、本発明のＡＣｈＥ活性の測定方法によれば、ＡＣｈＥ活性を、簡便に、正確に測定することができる。
【０１０４】
【配列表】
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