(57)【要約】【課題】本発明は溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の安定化方法及びその組成物に関する。特に臨床診断に用いられる生体成分中の生理活性物質、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸、中性脂肪、尿素窒素、無機リンの酵素的測定試薬などに用いられるヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の溶液中での安定化方法およびその組成物に関する。【解決手段】ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはそれらの誘導体を含む溶液に、抗生物質を共存させることを特徴とする、溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはそれらの誘導体の安定化方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはそれらの誘導体を含む溶液に、抗生物質を共存させることを特徴とする、溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはそれらの誘導体の安定化方法。
【請求項２】
抗生物質がアミノグリコシド系抗生物質および／またはクロラムフェニコール系抗生物質および／またはマクロライド系抗生物質である、請求項１記載の安定化方法。
【請求項３】
ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはそれらの誘導体、および、抗生物質を共存させることを特徴とする、溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはそれらの誘導体の安定化組成物。
【請求項４】
抗生物質がアミノグリコシド系抗生物質および／またはクロラムフェニコール系抗生物質および／またはマクロライド系抗生物質である、請求項３記載の安定化組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の安定化方法及びその組成物に関する。特に臨床診断に用いられる生体成分中の生理活性物質、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸、中性脂肪、尿素窒素、無機リンの酵素的測定試薬などに用いられるヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の溶液中での安定化方法およびその組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の安定化方法として、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）をｐＨ９．４〜１０．６の炭酸塩緩衝水溶液とグリセリンと共存させ安定化することが開示されている（例えば、特許文献１参照。）。また、ＮＡＤＨ、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ＮＡＤＰＨ、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）をｐＨ６〜８．５で５％Ｖ／Ｖ以上のエタノールなどの非反応性かつ水混和性の有機溶媒または／およびゼラチン等の水溶性ポリマー含有することが開示されている（例えば、特許文献２〜４参照。）。また、ＡＴＰをアルカリ金属アジ化物またはアルカリ土類金属アジ化物を含有させることが開示されている（例えば、特許文献５参照。）。また、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨをアミン塩基、強塩基、１価または２価カチオン、弱酸、強塩基との反応で生じる塩を共存させることが開示されている（例えば、特許文献６参照。）。また、ＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）にｐＨ６．５〜８の緩衝液にキレート剤およびアジ化物を含有させることが開示されている（例えば、特許文献７参照。）。また、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨを塩基性の水溶液にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨと等量またはそれ以上のほう酸等のボレートシス−ヒドロキシアルキル結合化合物を含有することが開示されている（例えば、特許文献８参照。）。また、ＮＡＤＨをｐＨ９．５〜１１でアルカリ金属もしくはアンモニウムカーボネート／ビカーボネート緩衝剤を含有させることが開示されている（例えば、特許文献９参照。）。しかしながら、これらの方法は溶液中での短期間の安定性に限られたものであり、長期にわたる安定性は不十分である。また主にＮＡＤＨ、ＡＴＰ等の単独の安定性に効果を有するものであり、これら補酵素以外の成分の安定性または酵素等の反応性は考慮されていない。
【０００３】
これに対し、前述の安定化剤とは異なる方法として、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の不安定化補酵素より生成した補酵素転化生成物を、該生成物に反応し補酵素を生成するような酵素および基質を存在させ補酵素含量を維持させる方法が開示されている（例えば、特許文献１０〜１３参照。）。しかしながら、これらの方法はＮＡＤＨ等の分解、または変性生成物が特定された場合に有効であるが、実際にはこれらの不安定化要因はいくつかあり十分ではない。
【０００４】
一方、ＮＡＤＨの分解様式として、夾雑物質として存在するヌクレオチドピロフォスファターゼ等によるＮＡＤＨからＮＭＮＨ（還元型ニコチンアミドモノヌクレオチド）への分解がある。この反応はＮＡＤＨと同様に３４０ｎｍに最大吸収をもつため、吸収特性からは劣化の確認ができない上、ＮＭＮＨは酵素反応を阻害する問題もある。これに対し、ｐＨ７．５〜１１の条件下でキレート剤を共存させることが開示されている（例えば、特許文献１４参照。）。しかしながら、この方法においても長期保存を考慮した場合十分ではなく、十分な効果を得ようとする場合キレート剤の含有量を上げる必要があり、測定対象もしくは反応成分として用いられる酵素等に悪影響を及ぼすという短所がある。
【０００５】
【特許文献１】
特公昭５５−４７８７９号公報
【特許文献２】
特公昭５８−４３０７８号公報
【特許文献３】
特開昭５３−５２６８５号公報
【特許文献４】
特開昭６０−１０５４９４号公報
【特許文献５】
特公昭５４−４２８０号公報
【特許文献６】
特開昭５５−４２５９９号公報
【特許文献７】
特公平２−７３１９号公報
【特許文献８】
特公昭６３−２８９２０号公報
【特許文献９】
特開平４−２２９１９２号公報
【特許文献１０】
特開昭６３−３５２３８号公報
【特許文献１１】
特表平１１−５０２４１０号公報
【特許文献１２】
特開平８−２４８０２８号公報
【特許文献１３】
特開平１０−１７９１９３号公報
【特許文献１４】
特開２０００−７６９６号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有し、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持した溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の安定化方法及びその組成物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体および夾雑物質としてヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を分解する物質を含む溶液に、抗生物質を共存させることにより、溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を液状状態で長期間安定に保ち、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施態様として、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬において、ＡＴＰを含む試薬または反応溶液中に抗生物質を共存させることを特徴とするＡＴＰの安定化方法がある。
【０００９】
また、本発明の一実施態様として、第一試薬としてキサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてキサンチンオキシダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ペルオキシダーゼ、イノシン等を含有する２試薬系からなる無機リン測定試薬において、イノシンを含む試薬または反応溶液中に抗生物質を共存させることを特徴とするイノシンの安定化方法もある。
【００１０】
本発明において「安定」とは、２〜３５℃においてヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の濃度が維持されていることを意味し、具体的には、抗生物質を含有した、５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）　緩衝液中に、１ｍＭのＡＴＰと共存させたとき、３５℃、２週間保存後のＡＴＰ残存濃度が調製直後濃度と比較して、７０％以上（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）維持されていることをいう。また、抗生物質を含有した、２０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ６．８）　緩衝液中に、１２ｍＭのイノシンと共存させたとき、３５℃、２週間保存後のイノシン残存濃度が調製直後濃度と比較して、７０％以上（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）維持されていることをいう。
【００１１】
本発明において「十分な反応性」とは、中性脂肪の測定においては、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン溶液の測定吸光度を対照とし算出した中性脂肪濃度が、３０００ｍｇ／ｄＬ以下の範囲において理論値を回収することを意味し、具体的には測定値が理論値の９５％を下回らないことを意味する。また無機リンの測定においては、精製水および５ｍｇ／ｄＬ無機リン溶液の測定吸光度を対照とし算出した無機リン濃度が、４０ｍｇ／ｄＬ以下の範囲において理論値を回収することを意味し、具体的には測定値が理論値の９５％を下回らないことを意味する。
【００１２】
本発明のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体としては、特に限定されるものではないが、例えば、現在臨床診断に用いられる生体成分中の生理活性物質の酵素を用いた測定法における補酵素もしくは基質としての還元型または酸化型ＮＡＤＨ、還元型または酸化型ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、イノシン、キサントシン、ピリドキサール５りん酸などが挙げられる。また、生体試料中の核酸検出においてプローブまたは遺伝子増幅用のプライマーとして用いられるポリヌクレオチド、更には遺伝子増幅反応の生成物なども含まれる。
【００１３】
本発明はまた、ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはそれらの誘導体を含む溶液に、抗生物質を共存させることを特徴とする、ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を分解する物質を含む溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはそれらの誘導体の安定化方法である。
【００１４】
本発明の、ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を分解する物質には、（１）保存状態でヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体と共存する物質、（２）ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体と保存状態では共存しないが反応時に共存する物質、（３）測定対象である血液、尿などの生体試料など、に含まれるヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を分解するものが含まれる。
【００１５】
具体的にはたとえば酵素作用により核酸を分解するものとして、ヌクレオチドピロホスファターゼ、アデノシントリホスファターゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ヌクレオシダーゼ、ヌクレオチダーゼ等があげられる。これらは由来により分解反応の至適ｐＨ、活性化する条件が異なると考えられるが、本発明の抗生物質の種類、濃度の組み合わせを変えて適宜至適化することができる。
【００１６】
本発明のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を分解する物質は、例えば次のように検出することができる。
（検出法１）
▲１▼測定試液
酢酸バッファー（ｐＨ６．０）　７５ｍＭ
ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）　５ｍＭ
▲２▼測定
測定試液　１．５ｍＬを３０℃でインキュベーションし、これに被検試料０．５ｍＬを添加混合し、正確に３０℃、１５分反応させ、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液を２．０ｍＬ添加し反応を停止する。その後、精製水を対照に４００ｎｍの吸光度を測定する。試薬ブランクは測定試液　１．５ｍＬに、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液を２．０ｍＬ添加し３０℃、１５分反応させ、これに被検試料０．５ｍＬを添加混合し同じく４００ｎｍの吸光度を測定する。分解活性は、１分間当り、１マイクロモルのＰＮＰＰを分解する活性を１Ｕとし、得られた吸光度は、式：（被検試料吸光度−試薬ブランク吸光度）×４／（１８．１×１５×０．５）で算出される。
【００１７】
（検出法２）
▲１▼測定試液
トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）　１００ｍＭ
ＡＴＰ　２．４ｍＭ
ホスホエノールピルビン酸　０．８７ｍＭ
ＫＣｌ　１０ｍＭ
ＭｇＳＯ４　２．５ｍＭ
ＮＡＤＨ　０．１５ｍＭ
ピルビン酸キナーゼ　１０Ｕ／ｍＬ
ラクテートデヒドロゲナーゼ　１０Ｕ／ｍＬ
▲２▼測定
測定試液　２．６ｍＬを２５℃でインキュベーションし、これに被検試料０．２ｍＬを添加混合し、２５℃下３４０ｎｍの吸光度変化を精製水を対照に３〜４分間モニタリングし、反応タイムコースよりその初期直線部分の１分間当りの吸光度変化率を求める。試薬ブランクは被検試料に変えて精製水を用いて同様に実施する。分解活性は、１分間当り、１マイクロモルのＮＡＤＨを酸化する活性を１Ｕとし、得られた吸光度は、式：（被検試料吸光度変化率−試薬ブランク吸光度変化率）×２．８／（６．２２×０．２）で算出される。
【００１８】
（検出法３）
▲１▼測定試液
測定試液１
トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）　５０ｍＭ
イノシン　０．２ｍＭ
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ　２Ｕ／ｍＬ
キサンチンオキシダーゼ　１０Ｕ／ｍＬ
測定試液２
トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）　５０ｍＭ
イノシン　２０ｍＭ
▲２▼測定
測定試液１　２．５ｍＬに被検試料０．２ｍＬ添加混合し、３７℃、５分間インキュベーションし、これに測定試液２を０．３ｍＬ添加混合し、３７℃下２９３ｎｍの吸光度変化を精製水を対照に約２０分間モニタリングし、測定試液２添加後１０〜２０分の１分間当りの吸光度変化率を求める。試薬ブランクは被検試料に変えて精製水を用いて同様に実施する。分解活性は、１分間当り、１マイクロモルの尿酸を生成する活性を１Ｕとし、得られた吸光度は、式：（被検試料吸光度変化率−試薬ブランク吸光度変化率）×３／（１２．５×０．２）で算出される。
【００１９】
（検出法４）
▲１▼反応試液
ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）　１００ｍＭ
ＡＴＰ　３ｍＭ
ＫＣｌ　２０ｍＭ
ＭｇＳＯ４　６ｍＭ
▲２▼測定試液
ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）　５０ｍＭ
グルコース　１００ｍＭ
ＭｇＳＯ４　５ｍＭ
ＮＡＤ　０．２ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ　２Ｕ／ｍＬ
ヘキソキナーゼ　２Ｕ／ｍＬ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル　０．１％
▲３▼測定
被検試料　２ｍＬに対し、反応試液　２ｍＬを混合し正確に３５℃、４８時間インキュベーションし、これに測定対象としてＡＴＰ濃度を測定する。対照として被検試料を精製水に変えて実施する。これらのＡＴＰ測定は測定試液　３ｍＬに被検試料０．２ｍＬを添加混合し、３７℃、１０分間インキュベーション後、３４０ｎｍの吸光度を精製水を対照に吸光度を測定する。ＡＴＰ濃度は、被検試料に変えて精製水およびＡＴＰ既知濃度溶液を同様に測定した吸光度を元にキャリブレーションを行い算出する。分解活性は、３５℃、４８時間のＡＴＰ減少量として算出する。
【００２０】
（検出法５）
▲１▼反応試液
ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）　１００ｍＭ
ＮＡＤ　３ｍＭ
ＫＣｌ　２０ｍＭ
ＭｇＳＯ４　６ｍＭ
▲２▼測定試液
ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）　５０ｍＭ
グルコース−６−リン酸　４ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ　３Ｕ／ｍＬ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル　０．１％
▲３▼測定
被検試料　２ｍＬに対し、反応試液　２ｍＬを混合し正確に３５℃、４８時間インキュベーションし、これに測定対象としてＮＡＤ濃度を測定する。対照として被検試料を精製水に変えて実施する。これらのＮＡＤ測定は測定試液　３ｍＬに被検試料０．２ｍＬを添加混合し、３７℃、１０分間インキュベーション後、３４０ｎｍの吸光度を精製水を対照に吸光度を測定する。ＮＡＤ濃度は、被検試料に変えて精製水およびＡＴＰ既知濃度溶液を同様に測定した吸光度を元にキャリブレーションを行い算出する。分解活性は、３５℃、４８時間のＮＡＤ減少量として算出する。
【００２１】
（検出法６）
▲１▼反応試液
ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．８）　２０ｍＭ
イノシン　１２ｍＭ
▲２▼測定試液
リン酸バッファー（ｐＨ６．８）　５０ｍＭ
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ　２Ｕ／ｍＬ
キサンチンオキシダーゼ　１０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン　０．０５％
ＡＤＰＳ　０．１％
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル　０．１％
▲３▼測定
被検試料　２ｍＬに対し、反応試液　２ｍＬを混合し正確に３５℃、４８時間インキュベーションし、これに測定対象としてイノシン濃度を測定する。対照として被検試料を精製水に変えて実施する。これらのイノシン測定は測定試液　３ｍＬに被検試料０．１ｍＬを添加混合し、３７℃、１０分間インキュベーション後、３４０ｎｍの吸光度を精製水を対照に吸光度を測定する。イノシン濃度は、被検試料に変えて精製水およびイノシン既知濃度溶液を同様に測定した吸光度を元にキャリブレーションを行い算出する。分解活性は、３５℃、４８時間のイノシン減少量として算出する。
【００２２】
本発明の溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を分解する物質の濃度（活性）は特に限定しないが、少なくとも前述の検出法１〜６で有意に検出されるものであればよく、本発明の効果はこれらのヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を分解する物質に対し効果を有す。
【００２３】
本発明の抗生物質は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の安定化効果のあるものであれば特に限定しないが、好ましくはアミノグリコシド系抗生物質またはクロラムフェニコール系抗生物質またはマクロライド系抗生物質またはこれらの組み合わせが用いられる。アミノグリコシド系抗生物質としては、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、トブラマイシン、フラジオマイシン、ベカナマイシン、ジベカシン、シソマイシン、ミクロノマイシン、ネチルマイシンアストロマイシン、イセパマイシン、アルベカシンなどが挙げられる。クロラムフェニコール系抗生物質としてはクロラムフェニコールなどが挙げられる。マクロライド系抗生物質としてはエリスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシンなどが挙げられる。
【００２４】
これらの濃度はヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の安定化に必要な濃度である必要があるが、これらの溶解性を考慮し０．００５〜０．２％、好ましくは０．００５〜０．１％の範囲で用いられる。
【００２５】
本発明に用いられる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。該緩衝液の濃度は特に限定されず、１０〜３００ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭで用いられる。該緩衝液のｐＨは、本発明の適用される反応条件等により異なるが、ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の安定至適ｐＨ等を勘案し、５〜９の範囲で調整される。さらには６〜８．５が好ましい。緩衝液の種類またはそのｐＨによりヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を分解する物質を活性化したり、阻害したりする場合があるが、本発明の抗生物質の濃度を適宜調節することにより種々の緩衝液の種類、濃度、ｐＨ条件を選択することが可能である。
【００２６】
本発明の溶液にはさらに抗生物質を除く防腐剤、界面活性剤、酵素、基質などを添加してもよい。
防腐剤としては、アジ化物、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、イミダゾリジニルウレア、などが挙げられる。界面活性剤としては非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤などが挙げられる。これらの界面活性剤は単独または２種以上または他の界面活性剤と組み合わせて用いることができる。また、界面活性剤の種類によりヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を分解する物質を活性化したり、阻害したりする場合があるが、本発明の抗生物質の濃度を適宜調節することにより種々の界面活性剤を適用することが可能である。また、溶液中の濃度としては特に限定するものではないが、好ましくは０．０１％〜０．５％の範囲であり、さらには０．０２％〜０．２％が酵素反応への影響が少ない点で好ましい。中でも０．０５％〜０．１５％が好ましい。酵素としては、哺乳動物、植物、微生物等から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものを含有する。また、これら酵素の特異性、安定性を向上させる目的または反応セルに吸着する性質を改変する目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものも用いられる。
【００２７】
本発明の溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の濃度は、特に限定されない。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
アデノシン３リン酸（ロッシュ社製）１ｍＭと各種抗生物質　各０．０５％とを添加した下記の中性脂肪測定試薬　第一試液に添加溶解し３５℃で１４日間保存し、ＡＴＰ残存量（溶解直後の濃度に対する保存後の濃度の割合）を検討した。また、３５℃、１４日間保存した試薬を用いて中性脂肪濃度２０００ｍｇ／ｄＬの試料を測定し、各測定値の理論値に対する回収率を算出した。
【００２９】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ　　５０ｍＭ　ｐＨ７．０
ＭｇＣｌ２　　０．２ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ　０．３ｍＭ
アデノシン３リン酸　　１ｍＭ
エマルゲンＡ６０　　４ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００　　２ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン　　０．１ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩　　８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１）　３Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１）　５Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１）　３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製）　２００Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ　５０ｍＭ　ｐＨ７．０
塩化マグネシウム・６水和物　　０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム　　０．１ｇ／Ｌ
ＡＤＰＳ　　０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）　２．９Ｕ／ｍＬ
リパーゼ（東洋紡社製ＬＰＬ−３１４）　２Ｕ／ｍＬ
トリトンＸ−１００　１ｇ／Ｌ
【００３０】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．１μＬに第一試薬　１８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求めた。
【００３１】
【表１】
2004105024.tif 000002
【００３２】
結果　　表１に示す。実施例ではいずれも比較例に対しＡＴＰ残存率が高く良好な安定性を示し、また保存後の中性脂肪の測定値回収率も良好であり反応性を維持した。
【００３３】
（実施例２）
ＡＴＰ・２Ｎａ（ロッシュ社製）１ｍＭを含有する実施例１に記載の中性脂肪測定試薬　第一試液にカナマイシン０．００５％〜０．２％を添加溶解し３５℃で１４日間保存し、ＡＴＰ残存量（溶解直後の濃度に対する保存後の濃度の割合）を検討した。
【００３４】
【表２】
2004105024.tif 000003
【００３５】
結果　表２に示す。実施例ではいずれも比較例に対しＡＴＰ残存率が高く良好な安定性を示し、また保存後の中性脂肪の測定値回収率も良好であり反応性を維持した。低濃度のカナマイシンでも効果を確認できた。
【００３６】
（実施例３）
イノシン（コウジン社製）１２ｍＭを含む下記の無機リン測定試薬　第ニ試液に各種抗生物質　各０．０５％を添加溶解し３５℃で１４日間保存し、ＡＴＰ残存量（溶解直後の濃度に対する保存後の濃度の割合）を検討した。また、３５℃、１４日間保存した試薬を用いて無機リン濃度４０ｍｇ／ｄＬの試料を測定し、各測定値の理論値に対する回収率を算出した。
【００３７】
（試薬の調製）
下記組成からなる無機リン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ　　５０ｍＭ　ｐＨ７．０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ　０．３ｍＭ
トリトンＸ−１００　　２ｇ／Ｌ
ＡＤＰＳ　　０．１ｇ／Ｌ
キサンチンオキシダーゼ（東洋紡社製ＸＴＯ−２１１）　５Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）　１Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１）　３Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ　５０ｍＭ　ｐＨ７．０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ　０．３ｍＭ
トリトンＸ−１００　　２ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン　　０．３ｇ／Ｌ
イノシン　１２ｍＭ
キサンチンオキシダーゼ（東洋紡社製ＸＴＯ−２１１）　１Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）　１Ｕ／ｍＬ
プリンヌクレオチドホスホリラーゼ（東洋紡社製ＰＮＰ−３０１）　１Ｕ／ｍＬ
【００３８】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．１μＬに第一試薬　１８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および５ｍｇ／ｄＬ無機リン水溶液の測定吸光度より算出し無機リン濃度として求めた。
【００３９】
【表３】
2004105024.tif 000004
【００４０】
結果　表３に示す。実施例ではいずれも比較例に対しイノシン残存率が高く良好な安定性を示し、また保存後の無機リンの測定値回収率も良好であり反応性を維持した。
【００４１】
（実施例４）
アデノシン３リン酸（ロッシュ社製）１ｍＭとカナマイシン０．０３、０．０６％とを添加した下記の中性脂肪測定試薬　第一試液に添加溶解し１０℃で１２ヶ月間保存し、ＡＴＰ残存量（溶解直後の濃度に対する保存後の濃度の割合）を検討した。また、１０℃、１２ヶ月間保存した試薬を用いて中性脂肪濃度２０００ｍｇ／ｄＬの試料を測定し、各測定値の理論値に対する回収率を算出した。
【００４２】
【表４】
2004105024.tif 000005
【００４３】
結果　　表４に示す。実施例ではいずれも比較例に対しＡＴＰ残存率が高く良好な安定性を示し、また保存後の中性脂肪の測定値回収率も良好であり反応性を維持した。長期保存安定性も良好であった。
【００４４】
【発明の効果】
本発明においては、ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはそれらの誘導体を含む溶液に、抗生物質を共存させることにより、溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体を液状状態で長期間安定に保ち、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持する方法およびその組成物を提供できる。