(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＳＭＡを過剰発現する前立腺癌及び他の癌を治療するための改良された治療剤を提供する。【解決手段】特定の配列からなるヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する、単離ＦＮ３ドメインを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４４のヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する、単離ＦＮ
３ドメイン。
【請求項２】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号３２のマカカ・ファシキュラリス（Macaca Fascicula
ris）（カニクイザル）ＰＳＭＡ、又は配列番号３３のパン・トログロダイテス（Pan tro
glodytes）（チンパンジー）ＰＳＭＡと交差反応する、請求項１に記載の単離ＦＮ３ドメ
イン。
【請求項３】
ａ）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１のテンコン配列又は配列番号４のテンコン２７
の配列に基づいたものであり、前記配列番号１又は配列番号４が、場合により、残基位置
１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び／又は８６に置換を有するか、あるいは、
ｂ）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号２、３、５、６、７又は８の配列を含むライブラ
リから単離される、請求項２に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項４】
第２の分子と結合させた、請求項１〜３のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項５】
前記第２の分子が、細胞毒性物質、検出可能な標識、ポリエチレングリコール、又は核
酸である、請求項４に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項６】
前記細胞毒性物質が、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン、
ドラスタチン（dolostatin）、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素、又は放射性同位体
である、請求項５に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項７】
前記検出可能な標識が、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光
色素、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンである、請求項
５に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項８】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、５２、５
３、６２に対応する少なくとも１つの残基位置、又はＣ末端にシステイン残基を有する、
請求項１〜７のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項９】
前記ＦＮ３ドメインが、ヒトＰＳＭＡの酵素活性を阻害する、請求項１〜８のいずれか
に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項１０】
前記ＦＮ３ドメインが、ヒトＰＳＭＡとの結合について配列番号４１のＦＮ３ドメイン
と競合する、請求項１〜９のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項１１】
前記ＦＮ３ドメインが、ヒトＰＳＭＡの領域ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ（配列
番号１５９）及びＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号１６０）に結合する、請求項１〜１０のいず
れかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項１２】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号４１のアミノ酸配列と８９％同一であるか、又は配列
番号４１のアミノ酸配列と比較した場合に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
又は１１個の置換を有する、アミノ酸配列を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の
単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項１３】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、
４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、７５、７６、７７、７８、７
９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２
、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０
４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１
４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２
４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３
４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、又は１４０のアミノ酸配列を有する、請
求項１〜１２のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項１４】
前記ＦＮ３ドメインのＮ末端にメチオニンを更に有する、請求項１３に記載の単離ＦＮ
３ドメイン。
【請求項１５】
半減期延長部分と結合された、請求項１〜１４のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン
。
【請求項１６】
前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ア
ルブミン、アルブミン変異体、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、
請求項１５に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチ
ド。
【請求項１８】
配列番号１５６、１５７、又は１５８のポリヌクレオチド配列を有する、単離ポリヌク
レオチド。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＦＮ３ドメインを生成する方法であって、請求項２
０に記載の単離宿主細胞を、前記ＦＮ３ドメインが発現されるような条件下で培養するこ
とと、前記ＦＮ３ドメインを精製することと、を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＦＮ３ドメイン及び薬学的に許容される担体を含む
、医薬組成物。
【請求項２３】
ＰＳＭＡの過剰発現によって特徴付けられる癌を有する対象を治療する方法であって、
細胞毒性物質と結合させた請求項１〜１６のいずれかに記載のＦＮ３ドメインの治療有効
量を、前記癌を治療するうえで充分な時間にわたって、治療を要する患者に投与すること
を含む、方法。
【請求項２４】
前記癌が、固形腫瘍、前立腺癌、大腸直腸癌、胃癌、腎明細胞癌、膀胱癌、肺癌、又は
腎臓癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項５〜１６のいずれかに記載のＦＮ３ドメインを含む、診断用キット。
【請求項２６】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＦＮ３ドメインを含む、癌診断又は捕捉剤。
【請求項２７】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号４９の位置６、１１、２２、２５、２６、５２、５３
、５４、又は６２に対応する少なくとも１つの残基位置にシステイン残基を配置すること
によって改変された、配列番号４９の配列を有する、請求項２６に記載の診断又は捕捉剤
。
【請求項２８】
前記改変されたシステインが、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）と結合させられる、請求
項２６に記載の診断剤。
【請求項２９】
生体試料中のＰＳＭＡ発現細胞を検出する方法であって、前記生体試料を請求項２６〜
２８のいずれかに記載の診断試薬で処理することと、前記生体試料の、前記診断剤の前記
ＦＮ３ドメインとの結合を評価することと、を含む、方法。
【請求項３０】
前記診断剤が、請求項２８に記載の剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
生体試料中のＰＳＭＡ発現細胞を単離する方法であって、前記生体試料を請求項２６又
は２７に記載の捕捉剤で処理することを含む、方法。
【請求項３２】
対象内のＰＳＭＡ発現腫瘍細胞を検出する方法であって、前記対象に請求項４〜１６の
いずれかに記載のＦＮ３ドメインを投与することと、前記対象内における、前記ＦＮ３ド
メインのＰＳＭＡ発現腫瘍細胞との結合を検出することと、を含む、方法。
【請求項３３】
ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞に治療分子を送達する方法であって、請求項５〜１６のいずれか
に記載のＦＮ３ドメインを、ＰＳＭＡ発現腫瘍を有する対象に投与することを含む、方法
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺特異的膜抗原結合分子、並びにその分子の作製及び使用方法に関する
。
【背景技術】
【０００２】
前立腺特異的膜抗原結合分子（ＰＳＭＡ）は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩ
Ｉ又はＮ−アセチル化α結合型酸性ジペプチダーゼ１としても知られる、二量体２型膜貫
通糖タンパク質である。ＰＳＭＡは、葉酸塩及びＮ−アセチル−Ｌ−アスパチル−Ｌ−グ
ルタメートをはじめとする幾つかの基質を切断し、多くの組織で発現し、その発現レベル
は前立腺において最も高く、小腸、中枢及び末梢神経系、腎臓、並びに肺ではそれほど高
くない。ＰＳＭＡは、クラスリンで被覆されたピットから構成的に内在化される。
【０００３】
ＰＳＭＡは、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）（一部の前立腺細胞が異常な外観及び挙動を
呈しはじめる状態）、原発性及び転移性前立腺癌、並びに他の固形腫瘍（例えば、乳癌、
肺癌、膀胱癌、腎臓癌）の血管新生においてしばしば過剰発現される確立された前立腺癌
関連細胞膜抗原である（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  
５：２６７４〜２６８１，１９９９，Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５
７：３６２９〜３６３４，１９９７，Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃ
ｅｒ  Ｒｅｓ  ３：８１〜８５，１９９７；Ｂｏｓｔｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃ
ｅｒ  ８２：２２５６〜２２６１，１９９８）。ＰＳＭＡの発現は、疾患の進行及びグリ
ソンスコアと相関している。ＰＳＭＡの発現は、転移性疾患、ホルモン治療抵抗性の症例
、及びよりグレードの高い病変で増大し、アンドロゲン非依存性腫瘍において更に発現上
昇する（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：１４４１〜１４４３，１９
９５，Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，５７：２３２１〜２３２４，１９９７，Ｗｒｉ
ｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ  ４８：３２６〜３３４，１９９６）。
【０００４】
前立腺癌は、男性における癌の主要因であり、癌による死因としては２番目に多い。世
界的には、およそ１１０万人の新たな症例及び３０万人の死亡例が毎年報告されており、
これは全癌死の約４％に相当する。男性の６人に１人がこの疾患を診断されるものと推定
されている。米国では、前立腺癌の９０％以上が局所期又は限局期で発見されている。こ
れらの早期のステージでは、５年生存率は１００％に近い。しかしながら、癌が転移する
と５年生存率は約２８％に低下する。限局性の前立腺癌はしばしば、ホルモン遮断によっ
て抑制することができる。
【０００５】
前立腺癌の現在の治療方法としては、手術、放射線療法、及びホルモン療法が挙げられ
る。しかしながら、腫瘍細胞はしばしばアンドロゲン非依存性となり、そうなると限られ
た治療選択肢しか残らない。一般的には、癌ワクチンであるシプリューセルＴ（ｓｉｐｕ
ｌｅｕｃｅｌ−Ｔ）、放射性治療剤（塩化ラジウム２２３など）、二次ホルモン療法（ア
ビラテロン又はエンザルタミドなど）、及び／又は化学療法（ドセタキセル及びカバジタ
キセル）が、順番にホルモン療法に加えられる。
【０００６】
ＰＳＭＡを標的としたモノクローナル抗体が、診断用造影剤及び抗体薬物複合体として
臨床評価が行われている。最も広範囲に評価が行われている、ＰＳＭＡを標的とした抗体
薬物複合体（antibody-drug conjugate）（ＡＤＣ）は、同じヒト化／脱免疫化抗ＰＳＭ
Ａ  ｍＡｂであるＪ５９１を用いたものである。Ｊ５９１を用いた少なくとも３つの異な
るＡＤＣについて、異なるリンカー及び弾頭薬物を用いて臨床試験で評価が行われている
。ミレニアム・ファーマシューティカルズ社（Millenium Pharmaceuticals）は、ジスル
フィド結合されたメイタンシンと結合させた抗ＰＳＭＡ  ｍＡｂであるＭＬＮ２７０４を
評価する第１相臨床試験を終えている。プロジェニクス社（Progenics）は、シアトル・
ジェネティクス社（Seattle Genetics）の技術を用い、バリン／シトルリンリンカーを用
いてＪ５９１をＭＭＡＥと連結しており、また、エー・ディー・シー・ティー社（ＡＤＣ
Ｔ）は、Ｊ５９１と結合させたＰＢＴの臨床試験を開始している。現在のところ、臨床的
有効性は限定的であり、顕著な肝臓への取り込みに起因すると考えられる深刻な毒性及び
短い血清半減期を伴ったものとなっている（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃ
ａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：２７０７〜２７１３，２００７）。それにも関わらず、２つ
の別々の臨床試験において、特に高用量の抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣによる反復治療後にＰＳＡ
／ＣＴＣレベルが低下するエビデンスが得られている（Ｄ  Ｐｅｔｒｙｌａｋ，Ｇｅｎｉ
ｔｏｕｒｉｎａｒｙ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，２０１４，Ｇａｌｓｋｙ  
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：２１４７〜２１５４，２００８，Ｄ  
Ｐｅｔｒｙｌａｋ，ＡＳＣＯ  ２０１４）。プロジェニクス社（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ）の
場合では、用量制限毒性によって、好中球減少による敗血症後に死亡例が２例、生じてい
る（Ｄ  Ｐｅｔｒｙｌａｋ，ＡＳＣＯ  ２０１４）。
【０００７】
これらの治療のそれぞれは、癌の増殖を数ヶ月遅らせ、疾患によりもたらされる症状を
緩和することが可能であるが、疾患は最終的にはこれらの治療に対して耐性となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、ＰＳＭＡを過剰発現する前立腺癌及び他の癌を治療するための更なる改良
された治療剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一実施形態は、配列番号１４４のヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異
的に結合する単離ＦＮ３ドメインである。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、配列番号３２のマカカ・ファシキュラリス（Macaca Fascicu
laris）（カニクイザル）ＰＳＭＡ、又は配列番号３３のパン・トログロダイテス（Pan t
roglodytes）（チンパンジー）ＰＳＭＡと交差反応する、配列番号１４４のヒトＰＳＭＡ
に特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインである。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、配列番号４１のアミノ酸配列と８９％同一であるか、又は配
列番号４１のアミノ酸配列と比較した場合に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１
０、又は１１個の置換を有するアミノ酸配列を有する、配列番号１４４のヒトＰＳＭＡに
特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインである。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２
、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、７５、７６、７７、７８、
７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９
２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１
０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１
１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１
２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１
３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、又は１４０のアミノ酸配列を有する、
配列番号１４４のヒトＰＳＭＡに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインである。
【００１３】
本発明の一実施形態は、細胞毒性物質又は検出可能な標識と結合させた配列番号１４４
のヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインである。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、本発明のＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌクレオチド
である。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、本発明のＦＮ３ドメインを生成する方法であって、単離され
た本発明の宿主細胞を、本発明のＦＮ３ドメインが発現されるような条件下で培養するこ
とと、ＦＮ３ドメインを精製することと、を含む、方法である。
【００１８】
本発明の別の態様は、本発明のＦＮ３ドメイン及び薬学的に許容される担体を含む医薬
組成物である。
【００１９】
本発明の別の態様は、ＰＳＭＡの過剰発現によって特徴付けられる癌を有する対象を治
療する方法であって、細胞毒性物質と結合させた本発明のＦＮ３ドメインの治療有効量を
、癌を治療するうえで充分な時間にわたって、治療を要する患者に投与することを含む、
方法である。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、本発明のＦＮ３ドメインを含む診断用キットである。本発明
の別の実施形態は、本発明のＦＮ３ドメインを含む癌診断又は捕捉剤である。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、生体試料中のＰＳＭＡ発現細胞を検出する方法であって、生
体試料を本発明のＦＮ３ドメインを含む診断剤で処理することと、生体試料の、本発明の
ＦＮ３ドメインを含む診断剤との結合を評価することと、を含む、方法である。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、生体試料中のＰＳＭＡ発現細胞を単離する方法であって、生
体試料を本発明のＦＮ３ドメインを含む捕捉剤で処理することと、生体試料の、本発明の
ＦＮ３ドメインを含む診断剤との結合を評価することと、を含む、方法である。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、対象内のＰＳＭＡ発現腫瘍細胞を検出する方法であって、対
象に本発明のＦＮ３ドメインを投与することと、対象内における、ＦＮ３ドメインのＰＳ
ＭＡ発現細胞との結合を検出することと、を含む、方法である。
【００２４】
本発明の別の態様は、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞に治療分子を送達する方法であって、本発
明のＦＮ３ドメインを、ＰＳＭＡ発現腫瘍を有する対象に投与することを含む、方法であ
る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】雄ＮＳＧマウスに静脈内注射した後の非標的化８９Ｚｒ標識センチリンの生体分布を示す。
【図２Ａ】カニクイザルＰＳＭＡ二量体と複合体を形成したＰ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０  ＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメイン（Ｈ１０）の全体の結晶構造を示し、Ｈ１０がＰＳＭＡの活性部位の近くの領域に結合していることが示されている。亜鉛原子（Ｚｎ）は、ＰＳＭＡの活性部位の位置を示している。ＰＳＭＡ及びＨ１０分子のＮ末端及びＣ末端は、複合体の一方について示されている。細胞膜のおおよその位置が示されている。
【図２Ｂ】カニクイザルＰＳＭＡと複合体を形成したＨ１０  ＦＮ３ドメインの結晶構造を示す。Ｈ１０  ＦＮ３ドメインのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧβ鎖が示されている。ＰＳＭＡ活性部位の正に帯電した入口に挿入されたＨ１０のＣＤループ内の負に帯電した残基（残基Ｗ３８、Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ４１及びＥ４３）が示されている。Ｈ１０残基の番号付けは配列番号４１に基づく。
【図２Ｃ】カニクイザルＰＳＭＡと複合体を形成したＨ１０  ＦＮ３ドメインの結晶構造を示す。Ｈ１０の接触残基Ｗ３８、Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ４１及びＥ４３が図に示されている。Ｈ１０と接触するか（Ｒ５１１、Ｋ５１４及びＫ５４５）、亜鉛原子に配位するか（Ｈ３７７、Ｄ３８７、Ｅ４２４、Ｅ４２５、Ｄ４５３、及びＨ５５３）、又は活性部位キャビティを構成する（Ｒ５３６及びＲ５３４）、ｃｙｎｏＰＳＭＡ残基のいくつかが示されている。Ｈ１０β鎖Ｃ、Ｄ、Ｆ及びＧが図に示されている。Ｈ１０及びカニクイザルＰＳＭＡの残基の番号付けは、配列番号４１及び１４１にそれぞれ基づいている。
【図３Ａ】Ｈ１０  ＦＮ３ドメインとカニクイザルＰＳＭＡとの結合部位の結晶構造の詳細図を示す。Ｈ１０  ＦＮ３ドメインの接触残基Ａ３２、Ｗ３６、Ｗ３８−Ｄ４１、Ｅ４３、Ａ４４、Ｖ４６、Ｇ６４、Ｐ６８、Ｙ７０、Ａ７２、Ｗ７９、Ｆ８１、Ｐ８２、Ａ８５、及びＩ８６が示されている。ｃｙｎｏＰＳＭＡの接触残基Ｙ４６０、Ｋ４９９−Ｐ５０２、Ｐ５０４、Ｒ５１１、Ｋ５１４、Ｎ５４０、Ｗ５４１、Ｋ５４５、Ｆ５４６、Ｆ４８８、Ｋ６１０、Ｎ６１３、及びＩ６１４が示されている。Ｈ１０及びカニクイザルＰＳＭＡの残基の番号付けは、配列番号４１及び１４１にそれぞれ基づいている。
【図３Ｂ】Ｈ１０  ＦＮ３ドメイン及びカニクイザルＰＳＭＡの接触残基間の相互作用マップを示す。接触残基を定義するために４Åの距離のカットオフ値を用いた。センチリン及びｃｙｎｏＰＳＭＡの残基はグレー及び白抜きのボックスでそれぞれ示し、ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。残基の番号付けは、配列番号４１（Ｈ１０）及び配列番号１４１（ｃｙｎｏＰＳＭＡ）に基づいている。
【図４Ａ】ヒト（ｈ）ＰＳＭＡとカニクイザル（ｃ）ＰＳＭＡの細胞外ドメイン間のアミノ酸配列の整合を示す。Ｈ１０接触残基には下線を付し、太字で示している。ヒトＰＳＭＡとカニクイザルＰＳＭＡとで異なる残基は影付きで示している。Ｈ１０と相互作用するすべてのｃｙｎｏＰＳＭＡ残基は、Ｎ６１３を除いてヒトＰＳＭＡで保存されている。ヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤ：配列番号１４３、ＣｙｎｏＰＳＭＡ  ＥＣＤ：配列番号３２。
【図４Ｂ】カニクイザルＰＳＭＡと接触しているＨ１０  ＦＮ３ドメインの残基を示す。接触残基には下線を付し、太字で示している。Ｈ１０のアミノ酸配列は、配列番号４１に示されている。
【図５】カニクイザルＰＳＭＡに結合したＨ１０の結晶構造中の、化学的複合体化を行うための可能な部位であるＨ１０センチリンの残基Ｎ６、Ｒ１１、Ｔ２２、Ｄ２５、Ａ２６、Ｓ５２、Ｅ５３、Ｋ６２、並びにＮ末端及びＣ末端の位置を示す。センチリン／ＰＳＭＡ接触領域を黒く示している。Ｈ１０β鎖Ｃ、Ｄ、Ｆ及びＧが図に示されている。残基の番号付けは配列番号４１（Ｈ１０）に基づく。
【図６】抗ＰＳＭＡセンチリン−ＰＥ（黒）及び抗ＰＳＭＡ抗体−ＰＥ（白）で染色した異なる腫瘍細胞株の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比較を示す。
【図７Ａ】ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５−ＡＰＣ、及び抗ＰＳＭＡセンチリン−ＰＥで染色したＬＮＣａＰ細胞のＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す。これらのサムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ−ＰＥ染色、ＣＤ４５−ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色した核、サイトケラチン−ＦＩＴＣの反応性、及び最後にサイトケラチン−ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色の重ね合わせを示す。細胞は、ＣＴＣとしてカウントされるためには、核を有し、サイトケラチンを発現し、ＣＤ４５について陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとしてスコアされるためには、ＰＳＭＡについて陽性シグナルを有さなければならない。
【図７Ｂ】ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５−ＡＰＣ、及び抗ＰＳＭＡセンチリン−ＰＥで染色した２２Ｒｖ１細胞のＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す。これらのサムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ−ＰＥ染色、ＣＤ４５−ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色した核、サイトケラチン−ＦＩＴＣの反応性、及び最後にサイトケラチン−ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色の重ね合わせを示す。細胞は、ＣＴＣとしてカウントされるためには、核を有し、サイトケラチンを発現し、ＣＤ４５について陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとしてスコアされるためには、ＰＳＭＡについて陽性シグナルを有さなければならない。
【図７Ｃ】ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５−ＡＰＣ、及び抗ＰＳＭＡセンチリン−ＰＥで染色したＰＣ３細胞のＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す。これらのサムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ−ＰＥ染色、ＣＤ４５−ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色した核、サイトケラチン−ＦＩＴＣの反応性、及び最後にサイトケラチン−ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色の重ね合わせを示す。細胞は、ＣＴＣとしてカウントされるためには、核を有し、サイトケラチンを発現し、ＣＤ４５について陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとしてスコアされるためには、ＰＳＭＡについて陽性シグナルを有さなければならない。
【図７Ｄ】ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５−ＡＰＣ、及び抗ＰＳＭＡセンチリン−ＰＥで染色したＳＫＢＲ３細胞のＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す。これらのサムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ−ＰＥ染色、ＣＤ４５−ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色した核、サイトケラチン−ＦＩＴＣの反応性、及び最後にサイトケラチン−ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色の重ね合わせを示す。細胞は、ＣＴＣとしてカウントされるためには、核を有し、サイトケラチンを発現し、ＣＤ４５について陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとしてスコアされるためには、ＰＳＭＡについて陽性シグナルを有さなければならない。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書で使用される「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメ
イン）なる用語は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイト
カイン受容体、及び原核細胞酵素を含むタンパク質に高頻度で見られるドメインのことを
指す（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  
ＵＳＡ  ８９：８９９０〜８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ  １７５：１９１０〜１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａ
ｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１５６５９〜１５６６５，１９９０）。代表的
なＦＮ３ドメインとしては、ヒトテネイシンＣに存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン
、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、及び例えば
米国特許第８，２７８，４１９号に記述される非天然の合成ＦＮ３ドメインがある。個々
のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号とタンパク質名で呼ばれる（例えばテネイシンの３番
目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（Ｆ
Ｎ１０））。
【００２７】
本明細書で使用される「センチリン」とは、ヒトテネイシンＣに存在する１５個の異な
るＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づいたＦＮ３ドメインのことを指す。
【００２８】
「捕捉剤」なる用語は、特定の種類の細胞に結合し、他の細胞からその細胞を単離する
ことを可能とする物質のことを指す。捕捉剤の例としては、これらに限定されるものでは
ないが、磁気ビーズ、磁性流体、カプセル化試薬などが挙げられる。
【００２９】
「生体試料」なる用語は、血液、組織、骨髄、唾液などのことを指す。
【００３０】
「診断試薬」なる用語は、生体試料を分析するために使用することができる任意の物質
を指し、かかる物質が単一の物質として流通しているか、又は診断キット内の他の物質と
組み合わせて流通しているかによらない。
【００３１】
本明細書で使用される「置換する」、又は「置換された」、又は「突然変異する」、又
は「突然変異した」なる用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列中の１つ以上の
アミノ酸又はヌクレオチドを変化、欠失させるか、又は１つ以上のアミノ酸又はヌクレオ
チドを挿入することによってその配列の変異体を生成することを指す。
【００３２】
本明細書で使用される「ランダム化する」、又は「ランダム化された」、又は「多様化
された」、又は「多様化する」なる用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に少
なくとも１つの置換、挿入、又は欠失を行うことを指す。
【００３３】
本明細書で使用される「変異体」とは、例えば、置換、挿入、又は欠失のような１つ以
上の改変において参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドと異なるポリペプチド又は
ポリヌクレオチドを指す。
【００３４】
本明細書で使用される「特異的に結合する」又は「特異的な結合」なる用語は、所定の
抗原と、約１×１０−６Ｍ以下、例えば約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、
約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０
−１２Ｍ以下、又は約１×１０−１３Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する本発明のＦＮ
３ドメインの能力のことを指す。一般的に、本発明のＦＮ３ドメインは、例えばＰｒｏｔ
ｅｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（バイオラド社（ＢｉｏＲａｄ））を使用した表面プラズ
モン共鳴によって測定した場合に非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ又はカゼイン）に対する
ＫＤよりも少なくとも１０倍低いＫＤで所定の抗原（すなわちヒトＰＳＭＡ）に結合する
。しかしながら、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する本発明の単離ＦＮ３ドメインは、他の
関連する抗原、例えば、マカカ・ファシキュラリス（Macaca Fascicularis）（カニクイ
ザル、ｃｙｎｏ）、又はパン・トログロダイテス（Pan troglodytes）（チンパンジー）
などの他種由来の同じ所定の抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有しうる。
【００３５】
本明細書で使用される「エピトープ」なる用語は、本発明のＦＮ３ドメインが特異的に
結合する抗原の部分を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は多糖類側鎖などの部位
の化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）表面基からなり、特定の三次元構造特
性及び特定の電荷特性を有しうる。エピトープは、立体配座的な空間単位を形成する連続
的なかつ／又は不連続的なアミノ酸で構成されうる。不連続的エピトープでは、抗原の直
鎖配列の異なる部分のアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間で近接す
る。
【００３６】
「ライブラリ」なる用語は、変異体のコレクションのことを指す。ライブラリは、ポリ
ペプチド又はポリヌクレオチドの変異体で構成されうる。
【００３７】
本明細書で使用される「安定性」なる用語は、分子が、例えばヒトＰＳＭＡなどの特定
の抗原との結合など、その正常な機能活性の少なくとも１つを保持するように、分子が生
理学的条件下で折り畳み状態を維持できることを指す。
【００３８】
本明細書で使用されるヒトＰＳＭＡとは、短い細胞内ドメイン（残基１〜１８）、膜貫
通ドメイン（残基１９〜４３）、及び細胞外ドメイン（残基４４〜７５０）を有する約１
００ｋＤの周知の２型糖タンパク質のことを指す。成熟したヒトＰＳＭＡのアミノ酸配列
を配列番号１４４に示す。
【００３９】
本明細書で互換的に使用される「過剰発現する」、「過剰発現された」、及び「過剰発
現している」とは、同じ組織型の正常な細胞と比較して、その表面に測定可能な程度によ
り高いレベルのＰＳＭＡを有する癌又は悪性細胞のことを指す。こうした過剰発現は、遺
伝子増幅、又は転写若しくは翻訳の増大によって引き起こされうる。ＰＳＭＡの過剰発現
は、例えば生細胞又は溶解した細胞でＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、
又は放射免疫測定を用いた周知のアッセイを用いて測定することができる。これに代えて
又はこれに加えて、ＰＳＭＡの核酸分子の濃度は、例えば蛍光インサイチューハイブリダ
イゼーション、サザンブロッティング、又はＰＣＲ法を用いて細胞中で測定することがで
きる。ＰＳＭＡは、正常細胞と比較して、細胞表面上のＰＳＭＡのレベルが少なくとも１
．５倍高い場合に過剰発現されている。
【００４０】
本明細書で使用される「テンコン」とは、配列番号１に示され、米国特許出願公開第２
０１０／０２１６７０８号に述べられる合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイ
ンを指す。
【００４１】
本明細書で使用される「癌細胞」又は「腫瘍細胞」は、インビボ、エクスビボ、及び組
織培養のいずれかにおいて、新しい遺伝材料の取り込みを必ずしも伴わない自発的又は人
為的な表現型の変化を有する癌性、前癌性、又は形質転換細胞を指す。形質転換は、形質
転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の取り込み、又は外因性の核酸の取り込みによ
り発生し得るが、自然に又は発癌物質に対する暴露後にも発生して、それによって内因性
の遺伝子を変異させ得る。形質転換／癌は、例えば、インビトロ、インビボ、及びエクス
ビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性
度、腫瘍特異的マーカーレベル、浸潤性、ヌードマウスなどの適した動物宿主における腫
瘍の増殖又は抑制等によって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａ
ｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（
３ｒｄ  ｅｄ．１９９４））。
【００４２】
「増殖を阻害する」（例えば、腫瘍細胞などの細胞に言及する場合）は、当業者に周知
の適切な対照条件で増殖された同一の細胞の増殖と比較して、治療薬、又は治療薬若しく
は薬剤の組み合わせと接触されるときのインビトロ又はインビボでの細胞増殖における測
定可能な減少を指す。インビトロ又はインビボでの細胞の増殖の阻害は、少なくとも約１
０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、又
は１００％であり得る。細胞増殖の阻害は、例えばアポトーシス、壊死などの様々な機構
により、又は細胞分裂の阻害により、又は細胞の溶解によって生じうる。
【００４３】
「ベクター」なる用語は、生体系内で複製されうる、又はこうした系間を移動すること
ができるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生物系に
おいてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポ
リアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメントを含んでいる。そのような生物
システムの例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターの複製を可能にする
生物学的要素を利用して再構成された生物システムを挙げることができる。ベクターを構
成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子で
あってもよい。
【００４４】
用語「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコ
ードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成生物系において利用
することができるベクターを意味する。
【００４５】
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格鎖又は他の同等の共有結合化学を介して
共有結合されたヌクレオチド鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲ
ＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００４６】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されてポリペプ
チドを生成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個未満のア
ミノ酸からなる小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。
【００４７】
本明細書で使用される「価数」は、分子中の抗原に対して特異的な結合部位が明記され
た数存在することを指す。そのため、「１価」、「２価」、「４価」、及び「６価」なる
用語はそれぞれ、抗原に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個
存在することを指す。
【００４８】
本明細書で使用される「〜と組み合わせて」なる用語は、２つ又は３つ以上の治療薬が
、対象に混合物の状態で一緒に、それぞれ単独の薬剤として同時に、又はそれぞれ単独の
薬剤として任意の順番で順次に投与できることを意味する。
【００４９】
「相乗」、「相乗作用」又は「相乗的な」は、組み合わせることで得られると予想され
る相加効果を超えることを意味する。
【００５０】
組成物
本発明は、ヒトＰＳＭＡに結合するＦＮ３ドメイン、及び毒素又は検出可能な標識と結
合させたＰＳＭＡに結合するＦＮ３ドメインを提供する。本発明は、本発明のＦＮ３ドメ
インをコードするポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそ
れらを作製及び使用する方法を提供する。
【００５１】
ＰＳＭＡ結合分子
本発明は、必要に応じて毒素又は検出可能な標識と結合させたヒト前立腺特異的膜抗原
（ＰＳＭＡ）に特異的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供す
る。これらの分子は、治療及び診断用とで幅広く使用することができる。本発明は、本発
明のＦＮ３ドメインをコードしたポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター、宿主
細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。
【００５２】
本発明のＦＮ３ドメインはＰＳＭＡと高いアフィニティーで結合し、ＰＳＭＡ発現細胞
内に内在化されることにより、腫瘍細胞内に治療薬を送達するための効率的な方法を提供
するものである。
【００５３】
本発明の一実施形態は、配列番号１４４のヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異
的に結合する単離ＦＮ３ドメインである。
【００５４】
本明細書に述べられる本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、
配列番号３２のマカカ・ファシキュラリス（Macaca Fascicularis）（カニクイザル）Ｐ
ＳＭＡ、又は配列番号３３のパン・トログロダイテス（Pan troglodytes）（チンパンジ
ー）と交差反応する。
【００５５】
本発明のＦＮ３ドメインは、ヒト、マカカ・ファシキュラリス（Macaca Fascicularis
）、及び／又はパン・トログロダイテス（Pan troglodytes）のＰＳＭＡと、当業者によ
って実施される表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法により測定した場合に、約１×１
０−７Ｍ未満、例えば、約１×１０−８Ｍ未満、約１×１０−９Ｍ未満、約１×１０−１
０Ｍ未満、約１×１０−１１Ｍ未満、約１×１０−１２Ｍ未満、又は約１×１０−１３Ｍ
の解離定数（ＫＤ）で結合することができる。特定のＦＮ３ドメイン−抗原相互作用につ
いて測定されるアフィニティーは、異なる条件下（例えば、浸透圧、ｐＨ）で測定した場
合には異なりうる。したがって、アフィニティー及び他の抗原結合パラメータ（例えば、
ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、足場タンパク質及び抗原の標準化溶液、並びに本明
細書に述べられるバッファーなどの標準化バッファーを用いて行われる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインは、分子のＮ末端に連結された
開始メチオニン（Ｍｅｔ）を有する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインは、ＦＮ３ドメインのＣ末端に
連結されたシステイン（Ｃｙｓ）を有する。
【００５８】
Ｎ末端のＭｅｔ及び／又はＣ末端のＣｙｓの付加は、半減期延長分子の発現及び／又は
複合体化を促すことができる。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインであっ
て、ヒトＰＳＭＡの酵素活性を阻害する、単離ＦＮ３ドメインである。ＰＳＭＡの酵素活
性は、常法を用いて測定することができる。例えば、ＰＳＭＡの検出可能な、又は標識さ
れたＰＳＭＡ基質の加水分解を用いることができる。使用することが可能な代表的なＰＳ
ＭＡの基質としては、Ｎ−アセチルアスパルチルグルタメート（ＮＡＡＧ）、葉酸ポリグ
ルタメート、メトトレキセートトリ−γグルタメート、メトトレキセートジ−γグルタメ
ート、プテロイルペンタグルタメート、及びこれらの誘導体がある。基質は、例えば、放
射性マーカー、化学発光マーカー、酵素マーカー、色素マーカー、又は他の検出可能なマ
ーカーで標識することができる。ＰＳＭＡ活性を検出するための適当な方法については、
例えば米国特許第５，９８１，２０９号又は米国特許出願公開第２００６／０００９５２
５号に記載されている。本発明の単離ＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインは、分子が、ＦＮ３ド
メインを含まない試料と比較した場合にヒトＰＳＭＡ活性を約２０％、３０％、４０％、
５０％、６０％、７０％、８０％、９０％超、又はそれ以上、阻害する場合に、ヒトＰＳ
ＭＡ酵素活性を阻害する。
【００６０】
本明細書に述べられる本発明のいくつかの実施形態では、単離ＦＮ３ドメインは、配列
番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７
、４８、４９、５０、５１、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、
８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９
７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、
１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、
１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、
１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、
１３８、１３９、又は１４０のアミノ酸配列を有する。
【００６１】
本明細書に述べられる本発明のいくつかの実施形態では、単離ＦＮ３ドメインは、配列
番号４１のアミノ酸と８９％同一のアミノ酸を有する。
【００６２】
本明細書に述べられる本発明のいくつかの実施形態では、単離ＦＮ３ドメインは、配列
番号４１のアミノ酸と比較した場合に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は
１１個の置換を有するアミノ酸配列を有する。
【００６３】
本明細書に述べられる本発明のいくつかの実施形態では、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合
する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、５２、
５３、６１に対応する少なくとも１つの残基位置、又はＣ末端にシステイン残基を有する
。
【００６４】
タンパク質配列へのシステインの導入につながる置換を用いることによって、細胞毒性
物質、検出可能な標識、ポリエチレングリコール、及び／又は核酸などの小分子をＦＮ３
ドメインと、標準的な化学反応を用いて化学的に結合させることができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ヒトＰ
ＳＭＡへの結合について配列番号４１のＦＮ３ドメインと競合する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ヒトＰ
ＳＭＡの領域ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ（配列番号１５９）及びＮＷＥＴＮＫＦ
（配列番号１６０）に結合する。
【００６７】
本発明のＦＮ３ドメインによって結合されるヒトＰＳＭＡのエピトープには、配列番号
１５９又は配列番号１６０に示されるアミノ酸配列内の一部又はすべての残基が含まれる
。本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインによって結合
されるエピトープは、ヒトＰＳＭＡ（配列番号１４４）の領域ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰ
ＲＩＳＫ（配列番号１５９）及びＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号１６０）内の少なくとも１個
のアミノ酸を有する。本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ド
メインによって結合されるエピトープは、ヒトＰＳＭＡ（配列番号１４４）の領域ＫＫＳ
ＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ（配列番号１５９）内の少なくとも２、３、４、５、６、又
は７個のアミノ酸と、領域ＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号１６０）内の少なくとも２、３、４
、５、又は６個のアミノ酸とを含む。
【００６８】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳ
ＭＡと、残基Ｋ４９９、Ｋ５００、Ｓ５０１、Ｐ５０２、Ｐ５０４、Ｒ５１１、Ｋ５１４
、Ｎ５４０、Ｗ５４１、Ｅ５４２、Ｎ５４４、Ｋ５４５及びＦ５４６（残基の番号付けは
配列番号１４４に基づく）において結合する。
【００６９】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳ
ＭＡと、残基Ｒ１８１、Ｙ４６０、Ｆ４８８、Ｋ６１０及び／又はＩ６１４において結合
する。
【００７０】
ｃｙｎｏＰＳＭＡと複合体を形成したＦＮ３ドメインＰ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０の結晶構
造が解明されている。ヒトとｃｙｎｏＰＳＭＡの接触残基は１個の残基を除いて同じであ
るため、Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０は、ｃｙｎｏＰＳＭＡに結合するのと同じエピトープ残
基においてヒトＰＳＭＡと結合すると考えられる。
【００７１】
ＦＮ３ドメインを、周知のインビトロの方法を用いてヒトＰＳＭＡとの結合に関し、参
照分子との競合について評価することができる。代表的な一方法では、ヒトＰＳＭＡを組
換えにより発現するＣＨＯ細胞を、非標識参照分子と４℃で１５分間インキュベートした
後、過剰量の蛍光標識した試験ＦＮ３ドメインと４℃で４５分間インキュベートすること
ができる。ＰＢＳ／ＢＳＡ中での洗浄後、常法を用いて、フローサイトメトリーにより蛍
光を測定することができる。別の代表的な方法では、ヒトＰＳＭＡの細胞外部分をＥＬＩ
ＳＡプレートの表面にコーティングすることができる。過剰量の非標識参照分子を約１５
分間加え、その後、ビオチン化試験ＦＮ３ドメインを加えることができる。ＰＢＳ／Ｔｗ
ｅｅｎ中で洗浄後、試験ビオチン化ＦＮ３ドメインの結合を、西洋わさびペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン、及び常法を用いて検出されたシグナルを用いて検
出することができる。競合アッセイでは、参照分子を標識し、試験ＦＮ３ドメインを標識
しなくてよいことは明らかであろう。試験ＦＮ３ドメインは、参照分子が試験ＦＮ３ドメ
インの結合を阻害する場合、又は試験ＦＮ３ドメインが参照分子の結合を２０％、３０％
、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％阻
害する場合に参照分子と競合する。試験ＦＮ３ドメインのエピトープは、例えばペプチド
マッピングにより、又は周知の方法を用いた水素／重水素保護アッセイにより、又は結晶
構造の決定により、更に定義することができる。代表的な参照ＦＮ３ドメインは、配列番
号４１のアミノ酸配列を有するドメインである。
【００７２】
配列番号４１のＦＮ３ドメインと同じヒトＰＳＭＡ上の領域に結合するＦＮ３ドメイン
は、例えば、常法を用い、本明細書に述べられるようにして、マウスを配列番号１５９及
び１６０に示されるアミノ酸配列を有するペプチドで免疫化することによって作製するこ
とができる。ＦＮ３ドメインは、例えば、周知のインビトロの方法を用い、上記に述べた
ようにして、ヒトＰＳＭＡとの結合について、配列番号４１のＦＮ３ドメインと試験ＦＮ
３ドメインとの競合をアッセイすることによって更に評価することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメイ
ンは、検出可能な標識と結合させられる。
【００７４】
検出可能な標識は、本発明のＦＮ３ドメインと結合させた場合に、ＦＮ３ドメインを、
分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段によって検出可能なものとす
ることができる組成物を含む。代表的な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属
ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡで一般的に
使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンが挙げられる。特異的な放
射性標識としては、例えば３Ｈ、ｎＣ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、１２３Ｉ、１
２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、Ｕ１ｌｎ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、
６４Ｃｕ及び６８Ｇａを含む最も一般的な市販の同位体が挙げられる。適当な色素として
は、例えば、５（６）−カルボキシフルオロセイン、ＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤマレイミド
又はＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙
げられる。
【００７５】
検出可能な標識と結合させたヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインを、腫瘍
分布、腫瘍細胞の存在の診断、及び／又は腫瘍の再発を評価するための造影剤として使用
してことができる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは
、細胞毒性物質と結合させられる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、細胞毒性物質は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素（例
えば細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素活性を有する毒素、又はそのフラグメン
ト）、又は放射性同位体（すなわち放射性複合体）である。
【００７８】
細胞毒性物質と結合させたヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、複合体
化されていないこれらの細胞毒性物質の全身投与が正常細胞に許容されないレベルの毒性
を生じうる場合に、細胞毒性物質をＰＳＭＡ発現腫瘍細胞、及びＰＳＭＡ発現腫瘍細胞内
の細胞内蓄積部への標的化送達に使用することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、細胞毒性物質は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトト
レキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、
メイタンシノイド、又はカリケアミシンである。細胞毒性物質は、チューブリン結合、Ｄ
ＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によりその細胞毒性又は細胞増殖抑制作
用をもたらすことができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、細胞毒性物質としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の
非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas ae
ruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、アレウリ
テス・フォルディ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ
・アメリカナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ
−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロ
チン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミ
トゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンなどの酵
素活性を有する毒素がある。
【００８１】
いくつかの実施形態では、細胞毒性物質は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０
Ｙ、及び１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
【００８２】
本発明のＦＮ３ドメインと細胞毒性物質との複合体は、例えばＮ−スクシンイミジル−
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イ
ミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチル塩酸塩）、活性エステル
（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド
）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビ
ス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジア
ミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活
性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの各種
の二官能性タンパク質カップリング剤を使用して生成することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、細胞毒性物質は、ドラスタチン又はドラスタチンのペプチド
類似体及び誘導体、アウリスタチン又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンであ
る。代表的な分子が、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号に
開示されている。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管の動力学、ＧＴＰの加水分
解、並びに核及び細胞分裂を妨げ（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃ
ｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０〜３５８
４））、抗癌及び抗真菌活性を有することが示されている。ドラスタチン及びアウリスタ
チン薬剤部分は、ペプチド薬剤部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を介
して（国際公開第０２／０８８１７２号）、又はＦＮ３ドメインに組み込まれた任意のシ
ステインを介して、本発明のＦＮ３ドメイン含有分子に結合することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、腎クリ
アランスにより血液から除去される。
【００８５】
テンコン配列に基づいたライブラリからのＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインの単離
テンコン（配列番号１）は、ヒトテネイシンＣ由来の１５個のＦＮ３ドメインのコンセ
ンサス配列から設計された、天然に存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメ
インである（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２；米国特
許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。テンコンの結晶構造は、ＦＮ３ドメインの
特徴である７本のβ鎖をつなぐ６回表面露出ループを示し、各β鎖は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ、及びＧと呼ばれ、各ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧループ
と呼ばれる（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  
Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：８９９０〜８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０１
号）。これらのループ又は各ループ内の選択された残基を、フィブロネクチンＩＩＩ型（
ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築するためにランダム化することができ、これらを用
いてＰＳＭＡに結合する新規分子を選択することができる。表１は、テンコン（配列番号
１）の各ループ及びβ鎖の位置及び配列を示す。
【００８６】
これにより、以下に記述されるライブラリＴＣＬ１又はＴＣＬ２などの、Ｔｅｎｃｏｎ
配列に基づいて設計されたライブラリは、無作為化ＦＧループ、又は無作為化ＢＣ及びＦ
Ｇループを有し得る。Ｔｅｎｃｏｎ  ＢＣループは、長さがアミノ酸７個であり、このた
め、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸を、ＢＣループで多様化させて、Ｔｅ
ｎｃｏｎ配列に基づいて設計したライブラリにおいて無作為化してもよい。Ｔｅｎｃｏｎ
ＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、このため、１、２、３、４、５、６、又は
７個のアミノ酸を、ＦＧループで多様化させて、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計したラ
イブラリにおいて無作為化してもよい。Ｔｅｎｃｏｎライブラリにおけるループでの更な
る多様性は、ループでの残基の挿入及び／又は欠失によって達成され得る。例えば、ＦＧ
及び／又はＢＣループを、アミノ酸１〜２２個伸長させてもよく、又はアミノ酸１〜３個
減少させてもよい。ＴｅｎｃｏｎにおけるＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、抗
体重鎖における対応するループは、残基４〜２８個の範囲である。最大の多様性を提供す
るために、ＦＧループを、残基４〜２８個の抗体ＣＤＲ３の長さの範囲に対応するように
、配列並びに長さを多様化させてもよい。例えば、追加の１、２、３、４、又は５個のア
ミノ酸によってループを伸長させることにより、ＦＧループの長さを更に多様化させるこ
とができる。
【００８７】
テンコン配列に基づいて設計されたライブラリはまた、ＦＮ３ドメインの側面を形成す
るランダム化された代替表面を有してもよく、それらは２本以上のβ鎖と少なくとも１つ
のループを含んでもよい。そのような１つの代替表面は、Ｃ及びＦのβ鎖、並びにＣＤ及
びＦＧループのアミノ酸によって形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。テンコンの代
替的なＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づいたライブラリの設計については、米国特許出願公
開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。テンコン配列に基づいて設計された
ライブラリはまた、１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６番目の位置（残基の
番号付けは配列番号１に対応する）の残基で置換を有し、改善された熱安定性を示すテン
コン変異体などのテンコン変異体に基づいて設計されたライブラリを含む。代表的なテン
コン変異体が米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されており、配列番
号１のテンコンと比較してＥ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉの置換を有するテン
コン２７（配列番号４）が含まれる。
【００８８】
【表１】
2022002526.tif 000002
【００８９】
テンコン及び他のＦＮ３配列に基づくライブラリは、ランダムな、又は所定のアミノ酸
の組を用いて、選択された残基位置でランダム化することができる。例えば、ランダムな
置換を有するライブラリ内の変異体を、天然に存在する２０種すべてのアミノ酸をコード
するＮＮＫコドンを用いて作製することができる。他の多様化スキームにおいて、アミノ
酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ
、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンを使用することができ
る。あるいは、２０種すべてのアミノ酸残基を生じさせ、同時に停止コドンの頻度を低減
するために、ＮＮＳコドンを使用することもできる。多様化させる位置で偏ったアミノ酸
分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例えばＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技
術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成することができる
。この技術は、何千もの遺伝子合成プロセスにおいて充分な万能構成単位として機能する
、既製の二本鎖トリプレットのライブラリを使用する。トリプレットのライブラリは、あ
らゆる所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要な、すべての考えられる配列組合せを示す。
コドン指定は、周知のＩＵＢコードによる。
【００９０】
本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ｃｉｓディスプレイを用
いて、足場タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡ
フラグメントにライゲートすることによって、各タンパク質がそれをコードするＤＮＡと
安定的に会合している、インビトロ翻訳後に生成されるタンパク質−ＤＮＡ複合体のプー
ルを生成することによりテンコンライブラリなどのＦＮ３ライブラリを生成し（米国特許
第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａ
ｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１，２８０６〜２８１０，２００４）、このライブラリを、当
該技術分野では周知の、実施例に記載される任意の方法によって、ＰＳＭＡに対する特異
的結合についてアッセイすることによって、単離することができる。用いることができる
例示的な周知の方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、並びに競合的及び非
競合的アッセイである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照され
たい）。ＰＳＭＡに特異的に結合する特定されたＦＮ３ドメインは、それらのＰＳＭＡ活
性の阻害、内在化、安定性、及び他の所望の特性について更に特性評価が行われる。
【００９１】
本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ライブラリを作製するた
めに鋳型として任意のＦＮ３ドメインを用いること、及び本明細書に提供される方法を用
いて、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する分子についてライブラリをスクリーニングするこ
とによって作製することができる。用いることができる例示的なＦＮ３ドメインは、テネ
イシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）（配列番号１４５）、フィブコン（配列番
号１４６）、及びフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）（配列番号
１４７）である。標準的なクローニング及び発現技術を用いて、インビトロでライブラリ
を発現又は翻訳させるために、ベクターにおいてライブラリをクローニングするか、又は
ライブラリの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成する。例えば、リボソームディスプレイ（Ｈ
ａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ
Ａ，９４，４９３７〜４９４２，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  
ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４，１２
２９７〜１２３０２，１９９７）、又は他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号
）を用いることができる。ＦＮ３ドメイン変種のライブラリは、例えば任意の適したバク
テリオファージの表面上に表示された融合タンパク質として発現され得る。バクテリオフ
ァージの表面上に融合ポリペプチドを提示する方法は周知である（米国特許出願公開第２
０１１／０１１８１４４号；国際公開第２００９／０８５４６２号；米国特許第６，９６
９，１０８号；同第６，１７２，１９７号；同第５，２２３，４０９号；同第６，５８２
，９１５号；同第６，４７２，１４７号）。
【００９２】
本明細書に述べられる本発明のいくつかの実施形態では、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合
するＦＮ３ドメインは、配列番号１のテンコン配列又は配列番号４のテンコン２７の配列
に基づいたものであり、配列番号１又は配列番号４が、場合により残基位置１１、１４、
１７、３７、４６、７３、及び／又は８６に置換を有するものである。
【００９３】
本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、熱安定性を改善するため
、並びに熱によるフォールディング及びアンフォールディングの可逆性を改善するためな
どの特性を改善するために改変することができる。タンパク質及び酵素の見かけの熱安定
性を増加させるために、類似の高熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスルフィ
ド架橋を安定化する設計、α−へリックス性向を増加させる変異、塩架橋の改変、タンパ
ク質の表面電荷の変化、定方向進化、及びコンセンサス配列の組成を含むいくつかの方法
が適用されている（Ｌｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ，１２，３７１〜３７５，２００１）。高熱安定性は、発現したタンパク質
の収率を増加させ、溶解度又は活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコール
ドチェーンの必要性を最小化することができる。テンコン（配列番号１）の熱安定性を改
善するために置換することができる残基は、１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は
８６番目の残基位置であり、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載され
ている。これらの残基に対応する置換を、本発明の分子を含むＦＮ３ドメインに組み込む
ことができる。
【００９４】
タンパク質安定性及びタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性の同じ又は異な
る態様として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、溶液中の場
合には周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過によって課される力
学的剪断力、紫外線放射、γ線照射によるなどの電離放射線、化学的若しくは熱脱水、又
はタンパク質構造の破壊を引き起こし得るその他の任意の作用若しくは力によって引き起
こされる変性に対して感受性がある、又は「不安定」である。分子の安定性は、標準方法
を用いて決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準方法を用いて、分子の半
分がアンフォールドされるセ氏での温度（℃）である、熱融解（「Ｔｍ」）温度を測定す
ることによって決定することができる。一般的には、Ｔｍが高いほど、分子はより安定し
ている。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質が特定の三次元構造を維持する能力を
変化させる。
【００９５】
一実施形態において、本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、Ｔ
Ｍの増大によって測定した場合に、改変前の同じドメインと比較して、少なくとも５％、
１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、
６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％又はそれよりも
高い安定性の増大を示しうる。
【００９６】
化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学変性剤には、塩酸
グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベ
ンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化
ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイトール
、β−メルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン、及び水素化ホウ素ナトリウムなど
の水素化物）、非イオン性及びイオン性洗浄剤、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（Ｃ
Ｈ３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、及び標的化変性
剤が挙げられる。変性の程度の定量化は、標的分子の結合能などの機能的特性の喪失、又
は凝集傾向、これまで溶媒が到達できなかった残基の露出、若しくはジスルフィド結合の
破壊若しくは形成などの物理化学的特性に依存し得る。
【００９７】
本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、価数を増加させ、このため標的分子結合の結合力
を増加させる手段として、又は２つ以上の異なる標的分子に同時に結合する二重特異性若
しくは多重特異性の足場を作製する手段として、単量体、二量体、又は多量体として作製
され得る。二量体及び多量体は、例えばアミノ酸リンカー、例えばポリグリシン、グリシ
ン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含むリンカーを含めることによって単特異性
、二重特異性、又は多重特異性タンパク質足場を連結させることによって作製され得る。
代表的なリンカーとしては、（ＧＳ）２、（配列番号１４８）、（ＧＧＧＳ）２（配列番
号１４９）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号１５０）、（ＡＰ）２（配列番号１５１）、（
ＡＰ）５（配列番号１５２）、（ＡＰ）１０（配列番号１５３）、（ＡＰ）２０（配列番
号１５４）及びＡ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号１４２）が挙げられる。二量体及び
多量体を、ＮからＣ−方向に互いに連結させてもよい。ポリペプチドを新規な連結された
融合ポリペプチドに連結するための天然に存在するペプチドリンカー及び人工ペプチドリ
ンカーの使用は、文献において周知である（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂ
ｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４，５２６０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａ
ｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８，７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆
Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１０９〜１１６，１９９６；米国特許
第５，８５６，４５６号）。
【００９８】
半減期延長部分
本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインには、例えば共有結合を介し
て他のサブユニットを組み込むことができる。本発明の一態様では、本発明のＦＮ３ドメ
インは、半減期延長部分を更に含む。代表的な半減期延長部分としては、アルブミン、ア
ルブミン変異体、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン、並
びにそのフラグメント及び類似体、並びにＦｃ領域がある。代表的なアルブミン変異体の
１つに、配列番号１５５に示されるものがある。ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列は周知のも
のであり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ  Ｆｃ
領域を含んでいる。
【００９９】
抗体定常領域の全体又は一部を、本発明のＦＮ３ドメインに結合させて、抗体様特性、
特にＣ１ｑ結合などのＦｃエフェクター機能、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受
容体結合、抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞
受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどの、Ｆｃ領域に関連する特性を付与して
もよく、これらの活性に関与するＦｃにおける残基を修飾することによって更に修飾する
ことができる（論評に関しては、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．２０，６８５〜６９１，２００９を参照されたい）。
【０１００】
本発明のＦＮ３ドメインには、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００などのポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ス
テアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、
アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン
二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリジン、オクタン、炭水化物（
デキストラン、セルロース、オリゴ糖又は多糖）などの更なる部分を、所望の特性を得る
ために組み込むことができる。これらの部分は、タンパク質足場コード配列との直接融合
体であってもよく、標準的なクローニング及び発現技術によって作製してもよい。あるい
は、周知の化学カップリング方法を用いて、組換え技術によって産生された本発明の分子
にその部分を結合させることができる。
【０１０１】
例えば、システイン残基を分子のＣ末端に組み込むか、又は、分子のヒトＰＳＭＡ結合
面から離れる方向に面した残基位置にシステインを組み込み、周知の方法によってＰＥＧ
化基をシステインに結合させることによって、本発明のＦＮ３ドメインにＰＥＧ化部分を
付加することができる。更なる部分を組み込んだ本発明のＦＮ３ドメインを、いくつかの
公知のアッセイによって、官能性について比較することができる。例えば、Ｆｃドメイン
及び／又はＦｃドメイン変異体を組み込むことにより変化した特性を、ＦｃγＲＩ、Ｆｃ
γＲＩＩ、Ｆｃ  γＲＩＩＩ、又はＦｃＲｎ受容体などの可溶性型受容体を用いるＦｃ受
容体結合アッセイにおいてアッセイしてもよく、又は例えばＡＤＣＣ若しくはＣＤＣを測
定する周知の細胞系アッセイを用いて、又はインビボモデルにおける本発明の分子の薬物
動態特性を評価してアッセイしてもよい。
【０１０２】
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
本発明は、本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードした核酸
を、インビトロ転写／翻訳のために使用される直鎖ＤＮＡ配列、その組成物の真核生物、
原核生物、又はフィラメントファージでの発現、分泌、及び／又は提示と適合するベクタ
ー、又はその標的化突然変異源を含む、単離ポリヌクレオチドとして、又は発現ベクター
の一部として、又は直鎖ＤＮＡ配列の一部として、提供する。特定のポリヌクレオチドの
例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は特定の発現系におけるコドンの
選択性を考慮すると、本発明のＦＮ３ドメインをコードする他のポリヌクレオチドも本発
明の範囲内に含まれる。
【０１０３】
本発明の一実施形態は、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、
４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、７５、７６、７７、７８、７
９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２
、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０
４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１
４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２
４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３
４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、又は１４０のアミノ酸配列を有する、ヒ
トＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードした単離ポリヌクレオチドである
。
【０１０４】
本発明の一実施形態は、配列番号１５６、１５７、１５８又は１５９のポリヌクレオチ
ド配列を有する単離ポリヌクレオチドである。
【０１０５】
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成装置での固相ポリヌクレオチ
ド合成などの化学合成により作製され、完全な一本鎖又は二本鎖分子に構築され得る。あ
るいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続いて通常のクローニングを行うなどの
他の技術により作製され得る。所定の公知の配列のポリヌクレオチドを作製又は得る技術
は、当技術分野で周知である。
【０１０６】
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリ
アデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するｃｉｓ配列等などの、少なくとも１つの非
コード配列を含み得る。ポリヌクレオチド配列はまた、例えば、タンパク質の精製又は検
出を容易にするためのヒスチジンタグ又はＨＡタグなどのマーカー又はタグ配列、シグナ
ル配列、ＲｅｐＡ、Ｆｃなどの融合タンパク質パートナー、又はｐＩＸ若しくはｐＩＩＩ
などのバクテリオファージコートタンパク質をコードした更なるアミノ酸をコードする更
なる配列を含んでもよい。
【０１０７】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクター
である。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイ
ルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって所定の
生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他
の任意のベクターであり得る。そのようなベクターは、そのようなベクターによってコー
ドされるポリペプチドの発現を制御、調節、誘発、又は許容することができる核酸配列エ
レメントを含む発現ベクターであり得る。このようなエレメントは、転写エンハンサー結
合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所定の発現系において
コードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含み得る。このような発現系は、
当該技術分野において公知の細胞に基づく系、又は無細胞系であり得る。
【０１０８】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。本発明のヒトＰＳ
ＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、必要に応じて、当該技術分野では周知の細胞
株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団によって産生させることがで
きる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏ
ｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．
，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２
ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｈ
ａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇ
ａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２０
０１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ
，（１９９７〜２００１）を参照。
【０１０９】
発現用に選択される宿主細胞は、哺乳動物起源であり得るか、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ
−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅ  Ｇ２、ＳＰ２／０、Ｈｅ
Ｌａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はその任意の誘導体、不死化
若しくは形質転換細胞から選択され得る。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコ
シル化することができない種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２
１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４
（ＤＥ３）、及び天然若しくは改変大腸菌種（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｐｐ）、クレブシエラ種
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ）、又はシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  
ｓｐｐ）の菌株のいずれかなどの原核細胞又は生物から選択され得る。
【０１１０】
本発明の別の実施形態は、本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメイ
ンを生成する方法であって、単離された本発明の宿主細胞を、ヒトＰＳＭＡに特異的に結
合する単離ＦＮ３ドメインが発現されるような条件下で培養することと、ＦＮ３ドメイン
を精製することと、を含む、方法である。
【０１１１】
ヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、周知の方法、例えばプロテインＡ
精製、硫酸アンモニウム、又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換
クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
、及びレクチンクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
って、組換え細胞培養物から精製することができる。
【０１１２】
本発明のヒトＰＳＭＡに結合するＦＮ３ドメインの用途
本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ヒト疾患の症状、又は細
胞、組織、臓器、体液若しくは一般に宿主中の特定の病態を、診断、監視、調節、治療、
緩和、発症の予防、又は低減するために使用することができる。本発明の方法を用いて、
任意の分類に属する動物被験体を治療することができる。このような動物の例としては、
ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
【０１１３】
本発明の一実施形態は、ＰＳＭＡの過剰発現によって特徴付けられる癌を有する対象を
治療する方法であって、対象に、細胞毒性物質と結合させた本発明のヒトＰＳＭＡに特異
的に結合するＦＮ３ドメインを、対象を治療するうえで充分な時間にわたって投与するこ
とを含む、方法である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、大腸直腸癌、胃癌、腎明細胞癌、膀胱癌、
肺癌、又は腎臓癌である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、癌は、例えば前立腺癌又は良性前立腺過形成（ＢＰＨ）など
の前立腺疾患である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、癌は前立腺癌である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、癌は大腸直腸癌である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、癌は胃癌である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、癌は腎明細胞癌である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、癌は膀胱癌である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、癌は腎臓癌である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、癌は、例えば固形腫瘍の増殖によって特徴付けられる癌など
の血管新生疾患である。ＰＳＭＡの過剰発現により特徴付けられ、本発明に基づく治療に
適した腫瘍血管系を有する代表的な癌としては、例えば、腎明細胞癌（ＣＣＲＣＣ）、大
腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、及び膵臓癌が挙げられる（例えば、Ｂａｃｃａｌａ  ｅ
ｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ  ７０：３８５．３９０，２００７（ＣＣＲＣＣにおけるＰ
ＳＭＡの発現）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３６２９〜３６
３４，１９９７（腎臓癌、尿路上皮癌、肺癌、直腸癌、乳癌、及び肝臓の腺癌を含む各種
の非前立腺癌におけるＰＳＭＡの発現）；及びＭｉｌｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：５４０〜５４７，２００７を参照）。
【０１２４】
本発明の一実施形態は、ＰＳＭＡの過剰発現によって特徴付けられる前立腺癌を有する
対象を治療する方法であって、対象に、細胞毒性物質と結合させた本発明のヒトＰＳＭＡ
に特異的に結合するＦＮ３ドメインを、対象を治療するうえで充分な時間にわたって投与
することを含む。方法である。
【０１２５】
本明細書に述べられる本発明のヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインを投与
する対象には、ＰＳＭＡの過剰発現により特徴付けられる特定の疾患を発症する高いリス
クにある患者、及び既存のそうした疾患を呈する患者が含まれる。一般的には、対象は、
治療が望まれる疾患を有するものとして診断がなされている。更に、対象は、治療過程に
おいて疾患のあらゆる変化について監視することができる（例えば、疾患の臨床的症状の
増大又は減少について）。
【０１２６】
予防用途では、医薬組成物又は薬剤を、特定の疾患を罹患しやすい、又はそのリスクを
有する患者に、疾患のリスクをなくす若しくは低減するか、又は疾患の発症を遅らせるう
えで充分な量で投与する。治療用途では、組成物又は薬剤を、そのような疾患が疑われる
か又は既に罹患している患者に、疾患の症状及びその合併症を治癒するか、又は少なくと
も部分的に抑制するうえで充分な量で投与する。これを実現するのに適した量を、治療有
効用量又は量と呼ぶ。予防的及び治療的レジメンの両方において、薬剤は通常、充分な応
答（例えば、望ましくない血管新生活性の阻害）が得られるまで複数回の用量で投与され
る。一般的には、応答を監視し、所望の応答が消失し始めたならば反復用量を投与する。
【０１２７】
本明細書の方法に基づく治療を行うための対象患者を特定するには、受け入れられてい
るスクリーニング法を用いて特定の疾患に伴うリスク因子を判定するか又は対象において
特定された既存の疾患の状態を判定することができる。かかる方法としては、例えば、個
人に特定の疾患を診断された親戚がいるか否かを調べることが挙げられうる。スクリーニ
ング法にはまた、例えば、遺伝性要素を有することが知られている特定の疾患について家
族歴を調べる従来の検査も含まれる。例えば、様々な癌が、特定の遺伝性要素を有するこ
とも知られている。癌の遺伝性要素としては、例えば、癌化を引き起こす複数の遺伝子（
例えばＲａｓ、Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、及び他の遺伝子）における突然変異、特定
のＨＬＡ及びキラー阻害受容体（ＫＩＲ）分子の有無、又は、癌細胞がＮＫ細胞及びＴ細
胞などの細胞の免疫抑制を直接的又は間接的に調節することができる機構が挙げられる（
例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．７：３２９〜３３９，２００７；Ｂｏｙｔｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎｎ，
Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１〜８，２００７を参照）。この目的のた
め、対象となる特定の疾患に伴う遺伝子マーカーを有する個人を識別するためにヌクレオ
チドプローブをルーチン的に利用することができる。更に、特定の疾患のマーカーを同定
するうえで有用な様々な免疫学的方法が当該技術分野で知られている。例えば、モノクロ
ーナル抗体プローブを利用して特定の腫瘍に関連した抗原を検出する様々なＥＬＩＳＡ法
が存在しており、当該技術分野で知られている。既知の患者の症状、年齢因子、関連する
リスク因子などによって示されるようなスクリーニングを実施することができる。これら
の方法により、臨床医は、治療を行うために本明細書に述べられる方法を必要とする患者
をルーチン的に選択することができる。これらの方法によれば、病因となるＰＳＭＡ発現
細胞の標的化を、独立した治療プログラムとして、又は他の治療に対するフォローアップ
、補助的、又は調和的治療レジメンとして実施することが可能である。
【０１２８】
本明細書に述べられる特定の方法では、細胞毒性物質と結合させた本発明のヒトＰＳＭ
Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインを第２の治療薬と併用して、前立腺癌を有する対象
を治療することができる。
【０１２９】
本明細書に述べられる特定の方法では、細胞毒性物質と結合させた本発明のヒトＰＳＭ
Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインを使用して、第２の治療薬による治療に対して耐性
を有するか、又は耐性を獲得した対象を治療することができる。
【０１３０】
第２の治療薬は、例えばアビラテロン酢酸エステル（ザイティガ）、ビカルタミド、カ
バジタキセル、カソデックス（ビカルタミド）、デガレリクス、ドセタキセル、エンザル
タミド、ゴセレリン酢酸塩、ジェブタナ（カバジタキセル）、ロイプロリド酢酸塩、リュ
ープロン（ロイプロリド酢酸塩）、リュープロンデポー（ロイプロリド酢酸塩）、リュー
プロンデポー−３ヵ月（ロイプロリド酢酸塩）、リュープロンデポー−４ヵ月（ロイプロ
リド酢酸塩）、リュープロンデポー−Ｐｅｄ（ロイプロリド酢酸塩）、ミトキサントロン
塩酸塩、プレドニゾン、プロベンジ（シプロイセル−Ｔ）、二塩化ラジウム２２３、シプ
ロイセル−Ｔ、タキソテール（ドセタキセル）、ビアデュール（Viadur）（ロイプロリド
酢酸塩）、ゾフィーゴ（二塩化ラジウム２２３）、イクスタンジ（エンザルタミド）、又
はゾラデックス（ゴセレリン酢酸塩）などの前立腺癌の治療用に承認された薬剤とするこ
とができる（出典：アメリカ国立がん研究所）。
【０１３１】
様々な質的及び／又は量的な方法を用いて、対象が治療に対して耐性を有しているか、
治療に対する耐性を獲得しているか、又は耐性を獲得しやすいかを判定することができる
。耐性に伴いうる症状としては、例えば、患者の健康状態の低下若しくはプラトー状態、
腫瘍サイズの増大、腫瘍の増殖の低減の停止若しくは遅延、及び／又は１つの場所から他
の臓器、組織若しくは細胞への体内の癌性細胞の拡がりが含まれる。食欲低下、認知障害
、うつ病、呼吸困難、疲労、ホルモン障害、好中球減少、疼痛、末梢神経障害、及び性機
能障害などの癌に関連する様々な症状の再確立又は悪化もまた、対象が治療に対する耐性
を獲得したか、又は獲得しやすいことを示す指標となりうる。癌に関連する症状は、癌の
種類に応じて異なりうる。例えば、前立腺癌に関連する症状としては、排尿困難若しくは
頻繁な尿意、排尿痛、血尿若しくは精子に混じる血、骨盤、背中及び／又は臀部の持続的
痛みを挙げることができる。肺癌に関連する症状としては、しつこい咳、喀血、息切れ、
ぜーぜーする胸痛、食欲減退、意図しない体重減少、及び疲労を挙げることができる。腫
瘍学の当業者であれば、特定の種類の癌に関連する症状を容易に特定することが可能であ
る。
【０１３２】
「治療する」又は「治療」なる用語は、治療的処置及び予防的又は防止的措置の両方を
指すものであり、その目的は、癌の進行又は転移のような望ましくない生理学的変化又は
障害を予防又は遅延（緩和）することにある。本発明の目的では、有益な若しくは所望の
臨床結果としては、これらに限定されるものではないが、検出可能であるか又は検出不能
であるかによらず、症状の緩和、疾患の程度の軽減、安定した（すなわち、悪化しない）
疾患状態、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分寛解又
は完全寛解であるかによらない）が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けていない場
合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長させることを意味し得る。治療を要
する者には、既に状態若しくは疾患を有している者、及び、状態若しくは疾患を有しやす
い者、又は状態若しくは疾患を予防しようとする者が含まれる。
【０１３３】
「治療的有効量」とは、所望の治療結果を得るために必要な用量及び期間で有効な量を
指す。本発明のＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインの治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、
及び体重、並びに個体における所望の応答を引き出す本発明のＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメイ
ンの能力等の因子に従って変動し得る。抵抗に伴って低下又は減少しうる有効なＰＳＭＡ
結合ＦＮ３ドメインの指標の例としては、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍サイズの
減少若しくは縮小、腫瘍の増殖の停止若しくは鈍化、及び／又は体内の他の場所への癌細
胞の転移がないことが挙げられる。
【０１３４】
投与／医薬組成物
本発明は、必要に応じて本発明の第２の分子と結合させた、ヒトＰＳＭＡに特異的に結
合するＦＮ３ドメイン及び薬学的に許容される担体からなる医薬組成物を提供する。治療
的使用では、本発明のＦＮ３ドメインは、薬学的に許容される担体中の活性成分として有
効量のドメイン又は分子を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」な
る用語は、活性化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。
そのようなビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は
合成起源のものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水
及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状
物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌するこ
とができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補
助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑剤、並びに着色剤等を含む
ことができる。そのような医薬製剤中の本発明の分子の濃度は幅広く変化してよく、すな
わち約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％から最大で１５又は２０重量％ま
で変化してもよく、また、選択される特定の投与様式に従って、主として必要とされる用
量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタン
パク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ
ｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎ
ｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ  ６９１〜１０９２に記
載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
【０１３５】
本発明のＦＮ３ドメインの治療的使用における投与方法は、錠剤、カプセル剤、液剤、
粉剤、ゲル、粒子として、注射器、埋め込み式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイ
クロポンプに入れられた製剤を用いた、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静
脈内、又は皮下、肺；経粘膜投与（経口、鼻腔内、膣内、直腸）；又は当該技術分野にお
いて周知の、当業者が理解する他の手段など、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路で
あってよい。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、
洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心
膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、
胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経
皮送達によって達成され得る。
【０１３６】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎ
ｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２
５ｍｇの本発明のＦＮ３ドメインを含むように調製することができる。
【０１３７】
本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、静脈内（ＩＶ）注射又はボーラス注射により非経
口的に、筋肉内又は皮下又は腹腔内になど任意の適当な経路によって患者に投与すること
ができる。ＩＶ注射は、１５分ほどで投与してもよいが、多くの場合、３０分、６０分、
９０分、又は更には２若しくは３時間にわたって投与することができる。本発明のＰＳＭ
Ａ結合ＦＮ３ドメインは、疾患の部位（例えば腫瘍自体）に直接注射することもできる。
癌を有する患者に投与される用量は、治療される疾患を緩和するか又は少なくとも部分的
に抑制するうえで充分な量（「治療有効量」）であり、しばしば、０．１〜１０ｍｇ／ｋ
ｇ体重、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８，９、又は１０ｍｇ／ｋｇであるが、
更に高くてもよく、例えば、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
又は１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。例えば、５０、１００、２００、５００、又は１
０００ｍｇの固定単位用量が与えられるか、又は用量は、例えば、４００、３００、２５
０、２００、若しくは１００ｍｇ／ｍ２の患者の表面積に基づいてもよい。癌を治療する
には、通常、１〜８回の用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８回）を投与
することができるが、１０、１２、２０回以上の用量が投与される場合もある。本発明の
ＦＮ３ドメインの投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週
間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上後
に繰り返すことができる。治療過程を繰り返すことも可能であり、長期にわたる投与も同
様に可能である。繰り返し投与は、同一用量であるか、又は異なる用量であってよい。
【０１３８】
例えば、静脈内注射用の本発明のＦＮ３ドメインの医薬組成物は、８０ｋｇの患者に投
与するためには、約２００ｍＬの減菌リンガー液、及び約８ｍｇ〜約２４００ｍｇ、約４
００ｍｇ〜約１６００ｍｇ、又は約４００ｍｇ〜約８００ｍｇのＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメ
インを含むように調製することができる。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は
周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａ
ｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に、より詳細に記載されている。
【０１３９】
本発明のＦＮ３ドメインは、保存のために凍結乾燥し、使用に先立って適当な担体中で
戻すことができる。この技術は、通常のタンパク調製物に関して有効であることが示され
ており、当該技術分野で公知の凍結乾燥法及び溶解技術を用いることができる。
【０１４０】
本発明のＦＮ３ドメインは、対象に１回用量で投与してもよく、又は投与を、例えば１
日後、２日後、３日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、１か月後、５
週間後、６週間後、７週間後、２か月後、又は３か月後に繰り返してもよい。反復投与は
、同じ用量又は異なる用量で行うことができる。投与は、１回、２回、３回、４回、５回
、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれより多く繰り返してもよい。
【０１４１】
本発明のＦＮ３ドメインは、第２の治療剤と組み合わせて、同時、順次、又は別々に投
与することができる。
【０１４２】
本発明のＦＮ３ドメインは、必要に応じて第２の治療薬と組み合わせて、任意の形態の
放射線療法、及び任意の形態の放射線手術、及び／又は外科手術と共に投与され得るが、
そのような放射線療法には、体外照射療法、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）が挙げられ
、放射線手術には、ガンマナイフ、サイバーナイフ、Ｌｉｎａｃ、及び組織内放射線照射
（例えば、放射性シードの埋め込み、Ｇｌｉａ  Ｓｉｔｅバルーン）が挙げられる。
【０１４３】
特に固形腫瘍の治療に関して、エンドポイント及び抗腫瘍活性を評価するためのプロト
コールは、当該技術分野では周知のものである。それぞれのプロトコールは異なる腫瘍応
答の評価を定義しうるが、ＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃ
ｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ）（固形腫瘍における応答評価基準）
基準が、現在のところ、アメリカ国立がん研究所による腫瘍応答の評価の推奨されるガイ
ドラインと考えられている（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ
ｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５〜２１６，２０００を参照）。ＲＥＣＩＳＴ基準によれば
、腫瘍応答とは、あらゆる測定可能な病変又は転移の低減又は消失を意味する。疾患は、
従来の方法によって少なくとも１つの次元において２０ｍｍ以上であることが、又は医療
用写真又はレントゲン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ
）、又は臨床診察（病変が表在性である場合）により、明確に定義されたマージンを有し
、螺旋ＣＴスキャンによって１０ｍｍ以上であることが正確に測定できる病変を有する場
合に一般的に測定可能とみなされる。測定不能な疾患とは、従来の方法によって２０ｍｍ
未満の、又は螺旋ＣＴスキャンによって１０ｍｍ未満の病変からなる疾患、及び、真に測
定不能な病変（小さすぎて正確に測定できない）からなる疾患を意味する。測定不能な疾
患には、胸膜滲出液、腹水、及び間接的なエビデンスによって記述される疾患が含まれる
。
【０１４４】
固形腫瘍応答を評価するためのプロトコールでは、客観的な状態の基準が必要とされる
。代表的な基準としては以下のものがある。すなわち、（１）あらゆる測定可能な疾患の
完全な消失、すなわち、新たな病変がないこと、疾患に関連する症状がないこと、測定不
能な疾患のエビデンスがないこととして定義される、完全な応答（ＣＲ）、（２）標的病
変の最長径の合計の３０％の減少として定義される部分応答（ＰＲ）、（３）標的病変の
最長径の合計の２０％の増大又は新たな病変の出現として定義される進行性疾患（ＰＤ）
、（４）ＣＲ、ＰＲ、又は進行性疾患としての条件を満たさないものとして定義される、
安定又は不応答、である。（上記のＴｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌを参照）。
【０１４５】
腫瘍学の分野で受け入れられている更なるエンドポイントとしては、全生存期間（ＯＳ
）、無病生存期間（ＤＦＳ）、客観的奏功率（ＯＲＲ）、無増悪期間（ＴＴＰ）、及び無
増悪生存期間（ＰＦＳ）が挙げられる（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：
Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｐｐｒｏｖａ
ｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ａｐｒｉｌ  ２０
０５，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，ＦＤＡ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄを参照）。
【０１４６】
医薬組成物は、本明細書に述べられる医薬組成物を含む容器を含むキットとして供給す
ることができる。医薬組成物は、例えば１回又は複数用量用の注射用溶液の形態で、又は
注射の前に戻される滅菌粉末として提供することができる。あるいは、かかるキットは、
医薬組成物を投与するための乾燥粉末分散器、液体エアゾール発生器、又はネブライザー
を含むことができる。かかるキットは、医薬組成物の指示及び使用について書かれた情報
を更に含むことができる。
【０１４７】
以上、本発明を一般論として説明したが、本発明の各実施形態を、特許請求の範囲を限
定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例において更に開示する。
【０１４８】
試薬及びコンストラクト
カニクイザル（ｃｙｎｏタンパク質データベースの参照番号ＥＨＨ５６６４６．１、配
列番号３２）及びチンパンジー（Ｕｎｉｐｒｏｔ、参照番号Ｈ２Ｑ３Ｋ５、配列番号３３
）ＰＳＭＡの細胞外ドメインを、ｐＵｎｄｅｒ発現ベクターに６Ｈｉｓ及びＡｖｉタグと
共にクローニングした。タンパク質を、２９３ＨＥＫ−ｅｘｐｉ細胞で一過性に発現させ
た。上清を回収し、遠心して清澄化した。タンパク質は、１）ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラ
ムによるＩＭＡＣ精製、及び２）溶出バッファーとしてＰＳＭＡの二量体化を安定化する
ためにＭｇ２＋、Ｃａ２＋、及び０．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２を含んだＤＰＢＳを用いたサイ
ズ排除精製（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）の２工程の精製プロセスを用いて精製した。対
象とするタンパク質を含む画分をプールし、タンパク質濃度をＡ２８０によって測定した
。
【０１４９】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのソルターゼＡをコードした遺伝子をＤＮＡ２．０によって作製し、
Ｔ５プロモーターの制御下で発現させるためにｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクター（ＤＮ
Ａ２．０）にサブクローニングした。可溶性発現させるためのこのソルターゼコンストラ
クトは、アミノ酸２５個からなる天然タンパク質のＮ末端ドメインが膜結合性であること
から、このドメインを欠いたものである（Ｔｏｎ−Ｔｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：１２４２４〜１２４２９，１９９９）。ソ
ルターゼを、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号３４）に、タグを除去するた
めのＴＥＶプロテアーゼ部位（ＥＮＬＹＦＱＳ、配列番号５４）が続いたものとして発現
させ、配列番号５２のアミノ酸配列を有するソルターゼを得た。使用したソルターゼタン
パク質は、野生型タンパク質と比較して酵素の触媒効率を増大させることが報告されてい
る５個の突然変異配列も含んでいる（配列番号５３）（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：１１３９９〜１１４０４，２０１１
）。このプラスミドを、発現させるためにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｇｏｌｄ細胞（アジ
レント社（Ａｇｉｌｅｎｔ））に形質転換した。シングルコロニーをピックし、カナマイ
シンを添加したＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（テクノバ社（Teknova））中で増殖させ、３７
℃、２５０ＲＰＭで１８時間インキュベートした。カナマイシンを添加した２５０ｍＬの
Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（テクノバ社（Teknova））に、これらの継代培養物から
接種し、３７℃で振盪しながら約４時間増殖させた。タンパク質の発現を１ｍＭ  ＩＰＴ
Ｇで誘導し、タンパク質を３０℃で１８時間発現させた。細胞を６０００Ｇで遠心して回
収し、精製を行うまで−２０℃で保存した。凍結した細胞ペレットを室温で３０分、解凍
し、３０ｍＬ当たり１μＬの組換えライソザイム（イーエムディー・ミリポア社（EMD Mi
llipore））を添加したＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴタンパク質抽出試薬（イーエムディー・
ミリポア社（EMD Millipore））に細胞ペースト１ｇ当たり５ｍｌで懸濁し、室温にてシ
ェーカー上で３０分間インキュベートした。ライセートを７４６００Ｇで３０分間遠心し
て清澄化した。
【０１５０】
上清を、バッファーＡ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ
リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０））で予め平衡化した３ｍＬのＱｉａｇｅｎ  
Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を充填した重力カラムに流した。ローディング後
、カラムを１００ｍＬのバッファーＡで洗った。タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールを
添加したバッファーＡで溶出し、ＰＢＳ（ギブコ社（Gibco））中で平衡化した分取用ゲ
ル濾過カラムＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（２１．５×６００ｍｍ）（東ソー株式会
社）にロードした。ゲル濾過クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ−ＡＶＡＮＴクロマトグラ
フィーシステムを使用し、室温で、流速１０ｍＬ／分にてＰＢＳで行った。次いで、精製
したソルターゼをＴＥＶプロテアーゼで消化してＨｉｓ６タグを除去した。２８ｍｇのソ
ルターゼを１０ｍＬ中、３０００単位のＡｃＴＥＶプロテアーゼ（インビトロジェン社（
Invitrogen））と、１ｍＭ  ＤＴＴを添加した供給されたバッファー中、３０℃で２時間
インキュベートした。タグを外したソルターゼをＮｉ−ＮＴＡ樹脂により精製した。反応
液をＰＤ−１０カラム（ジーイー・ヘルスケア社（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使
用してＴＢＳバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に
交換し、バッファーＡで予め平衡化した０．５ｍＬのＱｉａｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ
Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を充填した重力カラムに流した。フロースルーを回収し、樹脂を３ｍ
ＬのバッファーＡで洗い、これをフロースルーに加えた。このフロースルーをＡｍｉｃｏ
ｎ１５コンセントレータ（イーエムディー・ミリポア社（EMD Millipore））により１０
ｋＤａのカットオフで約０．５ｍＬにまで濃縮した。更なるＴＢＳバッファーを加え、試
料を再び濃縮して（これを２回繰り返す）バッファーをＴＢＳに交換した。１／３の体積
の４０％グリセロールを加え（１０％グリセロールの最終濃度）、ソルターゼを短期間で
使用する場合には−２０℃で、長期間では−８０℃で保存した。
【実施例】
【０１５１】
実施例１．ランダム化されたループを有するテンコンライブラリの構築
テンコン（Tencon）（配列番号１）は、ヒトテネイシンＣからの１５個のＦＮ３ドメイ
ンのコンセンサス配列から設計された、免疫グロブリン様足場構造のフィブロネクチンＩ
ＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１
７，２０１２；米国特許第８，２７８，４１９号）。テンコンの結晶構造は、７個のβ鎖
を連結する６個の表面露出ループを示す。これらのループ又は各ループ内の選択された残
基をランダム化することでフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを
構築することができ、このライブラリを用いて特異的標的に結合する新規分子を選択する
ことができる。
【０１５２】
テンコン：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲ
ＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１）
【０１５３】
テンコンを足場として使用し、異なる設計手法を用いて、各種のライブラリを生成した
。一般的に、ライブラリＴＣＬ１及びＴＣＬ２は、良好な結合分子を生成した。ＴＣＬ１
及びＴＣＬ２ライブラリの生成については、国際公開第２０１４０８１９４４Ａ２号に詳
細に述べられている。
【０１５４】
ＴＣＬ１ライブラリの構築
ｃｉｓディスプレイシステムで用いるため、テンコン（配列番号１）のＦＧループのみ
をランダム化するように設計されたライブラリＴＣＬ１を構築した（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅ
ｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２）。このシステムでは、Ｔａｃプロモータ
ー、テンコンライブラリコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓエレメント、及びｏｒ
ｉエレメントの配列を組み込んだ一本鎖ＤＮＡを作製する。インビトロ転写／翻訳系で発
現させると、それがコードされたＤＮＡに対してｃｉｓで結合したテンコン−ＲｅｐＡ融
合タンパク質の複合体が産生される。次に、標的分子に結合する複合体を単離して、以下
に述べるようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。
【０１５５】
ｃｉｓディスプレイで用いるためのＴＣＬ１ライブラリの構築は、ＰＣＲの連続ラウン
ドによって行われ、最終的に直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子が２つの半分子として産生された
。すなわち、プロモーター及びテンコン配列を含む５’末端フラグメントと、ｒｅｐＡ遺
伝子とｃｉｓ及びｏｒｉエレメントとを含む３’末端フラグメントである。これらの２つ
の半分子同士を制限酵素消化によって結合させて、完全な構築物を産生する。テンコンの
ＦＧループであるＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号５５）のみにランダムなアミノ酸を組み込ん
で、ＴＣＬ１ライブラリを設計した。このライブラリの構築にはＮＮＳコドンを用い、こ
れにより２０種類すべてのアミノ酸と１個の終止コドンがＦＧループに組み入れられると
考えられる。ＴＣＬ１ライブラリは、多様性を更に大きくするために、それぞれが７〜１
２残基の異なるランダム化ＦＧループの長さを有する、６個の個別のサブライブラリを含
む。
【０１５６】
ＴＣＬ１ライブラリ（配列番号２）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ７〜１２
ＰＬＳＡＥＦＴＴ；
ただし、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２は、任意のアミノ酸又は欠失である。
【０１５７】
ＴＣＬ２ライブラリの構築
テンコンのＢＣ及びＦＧループの両方がランダム化され、それぞれの位置のアミノ酸の
分布が厳密に制御されたＴＣＬ２ライブラリを構築した。表３は、ＴＣＬ２ライブラリの
所望のループ位置のアミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布には２つの狙いがある
。第１に、ライブラリを、テンコン結晶構造の解析及び／又はホモロジーモデリングに基
づいて、テンコンのフォールディング及び安定性にとって構造的に重要となると予想され
た残基に偏らせた。例えば、２９番目の位置は、テンコンが折り畳まれる際に疎水性コア
の中に埋もれることから、疎水性アミノ酸のサブセットのみとなるように固定した。第２
の層の設計としては、高アフィニティーの結合分子を効率よく生成するため、抗体の重鎖
ＨＣＤＲ３に選択的に見出される残基の分布に近くなるようにアミノ酸分布を偏らせた（
（Ｂｉｒｔａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７７：１５１８〜２８，
２００８；Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １６：４７６〜８４，
２００７）。この目標のため、表２の「設計された分布」は、以下の分布を指す。すなわ
ち、６％アラニン、６％アルギニン、３．９％アスパラギン、７．５％アスパラギン酸、
２．５％グルタミン酸、１．５％グルタミン、１５％グリシン、２．３％ヒスチジン、２
．５％イソロイシン、５％ロイシン、１．５％リジン、２．５％フェニルアラニン、４％
プロリン、１０％セリン、４．５％トレオニン、４％トリプトファン、１７．３％チロシ
ン、及び４％バリン。この分布には、メチオニン、システイン、及び終止コドンは含まれ
ない。
【０１５８】
ＴＣＬ２ライブラリ（配列番号３）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＦ
ＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩ
ＹＧＶＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＸ１４Ｘ１５ＬＳＡＥＦＴＴ；ただし、
Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＴｙｒであり、
Ｘ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、又はＴｈｒであり、
Ｘ９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
あり、
Ｘ１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
あり、
Ｘ１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
あり、
Ｘ１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
あり、
Ｘ１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
あり、
Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
ある。
【０１５９】
【表２】
2022002526.tif 000003
＊残基の番号は、配列番号１のテンコン配列に基づく。
【０１６０】
続いて、これらのライブラリを、野生型テンコンと比較して安定化した、置換Ｅ１１Ｒ
／Ｌ１７Ａ／Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉを有するテンコンフレームワーク（テンコン２７：配列
番号４）上でライブラリを構築すること（米国特許第８，５６９，２２７号）、並びにＢ
Ｃ及びＦＧループにおいてランダム化される位置を変えることを含む様々な方法によって
改良した。テンコン２７は、国際出願第２０１３０４９２７５号に記載されている。これ
より、テンコンのＦＧループのみ（ライブラリＴＣＬ９）、又はＢＣ及びＦＧループの組
み合わせ（ライブラリＴＣＬ７）をランダム化するように設計した新たなライブラリを作
製した。これらのライブラリは、ｃｉｓディスプレイシステムで使用することを目的とし
て構築したものである（Ｏｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：２８０６〜２８１０，２００４）。この設計の詳細を以下に
示す。
【０１６１】
安定化したテンコン（テンコン２７）（配列番号４）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲ
ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【０１６２】
ＴＣＬ７（ランダム化したＦＧ及びＢＣループ）（配列番号５）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９
ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹ
ＴＶＳＩＹＧＶＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＳＮＰ
ＬＳＡＩＦＴＴ；
ただし、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ
１５及びＸ１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ
、Ｗ又はＹであり、
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、Ｘ１８及びＸ１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、
Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、又は欠失である。
【０１６３】
ＴＣＬ９（ランダム化したＦＧループ）（配列番号６）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ  Ｘ１Ｘ２
Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９  Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、及びＸ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ
、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり、
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、及びＸ１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、
Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、又は欠失である。
【０１６４】
ライブラリ構築のため、ランダム化したＢＣループ（６〜９個分の位置の長さ）又はＦ
Ｇループ（７〜１２個分の位置の長さ）をコードしたＤＮＡフラグメントを、Ｓｌｏｎｏ
ｍｉｃｓ技術（スローニング・バイオテクノロジー社（Sloning Biotechnology GmbH））
を用いて合成することにより、ライブラリのアミノ酸分布を制御し、終止コドンを除去し
た。ＢＣループ又はＦＧループをランダム化したＤＮＡ分子の２つの異なるセットを独立
して合成し、後でＰＣＲを用いて結合させることによって完全なライブラリ産物を生成し
た。
【０１６５】
ＦＧループライブラリ（ＴＣＬ９）の構築
５’末端のＴａｃプロモーターに、ＦＧループ内のコドンをランダム化した以外は、テ
ンコンの完全な遺伝子配列が続くものとして構成される合成ＤＮＡ分子のセットを作製し
た（配列番号２６〜３１）。ＦＧループのランダム化を行うため、システイン及びメチオ
ニンを除くすべてのアミノ酸を同比率でコードした。多様化させる部分の長さは、これら
の部分がＦＧループ内の７、８、９、１０、１１、又は１２個のアミノ酸をコードするよ
うなものとした。それぞれの長さの変異体のサブライブラリを２μｇのスケールで個々に
合成し、次いで、オリゴヌクレオチドＳｌｏｎｉｎｇ−ＦＯＲ（配列番号９）及びＳｌｏ
ｎｉｎｇ−Ｒｅｖ（配列番号１０）を使用したＰＣＲによって増幅した。
【０１６６】
ライブラリの３’末端フラグメントは、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコー
ド領域、並びにｃｉｓ及びｏｒｉエレメントを含む、ディスプレイ用のエレメントを含ん
だ一定のＤＮＡ配列である。鋳型としてのプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（インビト
ロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をＭ１３フォワードプライマー及びＭ１３リバー
スプライマーと共に使用して、ＰＣＲ反応を行ってこのフラグメントを増幅した。得られ
たＰＣＲ産物を、ＰｓｐＯＭＩで一晩消化して、ゲル精製した。ライブラリＤＮＡの５’
末端部分を、ｒｅｐＡ遺伝子を含む３’末端ＤＮＡにライゲートするために、２ｐｍｏｌ
（約５４０ｎｇ〜５６０ｎｇ）の５’末端ＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯＭＩ酵素並び
にＴ４リガーゼの存在下で、３７℃にて一晩、等モル量（約１．２５μｇ）の３’末端ｒ
ｅｐＡ  ＤＮＡとライゲートした。ライゲートしたライブラリ産物を、オリゴヌクレオチ
ドとしてＰＯＰ２２５０（配列番号１１）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１２）を使
用して１２サイクルのＰＣＲ反応によって増幅した。それぞれのサブライブラリについて
、１２回のＰＣＲ反応より得られたＤＮＡを加え合わせてＱｉａｇｅｎスピンカラムによ
り精製した。ＴＣＬ９のそれぞれのサブライブラリの収率は、３２〜３４μｇの範囲であ
った。
【０１６７】
ＦＧ／ＢＣループライブラリ（ＴＣＬ７）の構築
ＴＣＬ７ライブラリは、ランダム化されたテンコンのＢＣ及びＦＧループを有するライ
ブラリを与えるものである。このライブラリでは、アミノ酸６〜９個の長さのＢＣループ
を、アミノ酸７〜１２個の長さのランダム化されたＦＧループとコンビナトリアルに混合
した。合成テンコンフラグメントＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、及びＢＣ９（配列番号１３〜
１６）を、ＢＣループが６、７、８、又は９個のランダム化されたアミノ酸で置換される
ように、残基ＶＸまでの、かつ残基ＶＸを含むタンパク質のＮ末端部分をコードしたテン
コン遺伝子を含むように作製した。これらのフラグメントは、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ
８３Ｉ突然変異の発見よりも前に合成されたものであるが（ＣＥＮ５２４３）、これらの
突然変異は下記に述べる分子生物学的ステップにより導入した。このフラグメントを、ラ
ンダム化したＦＧループをコードしたフラグメントと結合するため、以下のステップを行
った。
【０１６８】
最初に、Ｔａｃプロモーターとテンコンの５’末端配列をアミノ酸Ａ１７をコードする
ヌクレオチドまでコードしたＤＮＡフラグメント（１３０ｍｅｒ−Ｌ１７Ａ、配列番号１
７）を、オリゴヌクレオチドＰＯＰ２２２２ｅｘｔ（配列番号１８）及びＬＳ１１１４（
配列番号１９）を使用したＰＣＲによって作製した。これは、Ｌ１７Ａ突然変異がライブ
ラリに含まれるように行った（ＣＥＮ５２４３）。次に、ランダム化したＢＣループを含
むテンコンの残基Ｒ１８〜Ｖ７５をコードしたＤＮＡフラグメントを、鋳型としてのＢＣ
６、ＢＣ７、ＢＣ８、又はＢＣ９と、オリゴヌクレオチドとしてＬＳ１１１５（配列番号
２０）及びＬＳ１１１７（配列番号２１）を使用したＰＣＲによって増幅した。このＰＣ
Ｒのステップによって３’末端にＢｓａＩ部位を導入した。この後、これらのＤＮＡフラ
グメントを、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＰＯＰ２２２２ｅｘｔ及びＬＳ１１１
７を使用した重複ＰＣＲによって連結した。得られた２４０ｂｐのＰＣＲ産物をプールし
、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットにより精製した。精製したＤＮＡをＢｓａＩ−ＨＦで消
化し、ゲル精製した。
【０１６９】
ＦＧループをコードしたフラグメントを、鋳型としてのＦＧ７、ＦＧ８、ＦＧ９、ＦＧ
１０、ＦＧ１１、及びＦＧ１２を、オリゴヌクレオチドＳＤＧ１０（配列番号２２）及び
ＳＤＧ２４（配列番号２３）と共に使用したＰＣＲにより増幅して、ＢｓａＩ制限部位並
びにＮ４６Ｖ及びＥ８６Ｉ変異を組み込んだ（ＣＥＮ５２４３）。
【０１７０】
消化したＢＣフラグメントとＦＧフラグメントとを、３Ｗａｙライゲーションを用いて
１ステップで互いにライゲートした。それぞれのライゲーション反応で２つのＢＣループ
の長さと２つのＦＧループの長さとを組み合わせた４つのライゲーション反応を、１６個
の可能な組み合わせで準備した。各ライゲーションは、約３００ｎｇの全ＢＣフラグメン
トと３００ｎｇのＦＧフラグメントを含んでいた。次いで、これら４つのライゲーション
プールを、オリゴヌクレオチドＰＯＰ２２２２（配列番号２４）及びＳＤＧ２８（配列番
号２５）を使用したＰＣＲにより増幅した。次いで、７．５μｇのそれぞれの反応生成物
をＮｏｔ１で消化し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製カラムにより精製した。５．２μｇのこ
のＤＮＡを、ＰｓｐＯＭＩで消化した等モル量のＲｅｐＡのＤＮＡフラグメント（約１４
μｇ）とライゲートし、生成物を、オリゴヌクレオチドＰＯＰ２２２２を使用したＰＣＲ
により増幅した。
【０１７１】
実施例２  別の結合表面を有するテンコンライブラリの作製
特定のライブラリ設計においてランダム化しようとする残基の選択によって、形成され
る相互作用表面の全体の形状が決まる。ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループがランダム化された
ライブラリからマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合するように選択された足場タ
ンパク質を含むＦＮ３ドメインのＸ線結晶解析により、ＭＢＰの活性部位に嵌まり込む大
きく湾曲した界面を有していることが示されている（Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４：６６３２〜６６３７，２００７）。
これに対して、ＭＢＰに結合するように選択されたアンキリン繰り返し足場タンパク質は
、より平坦な相互作用表面を有し、活性部位から離れたＭＢＰの外表面に結合することが
見出されている（Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：５７
５〜５８２，２００４）。これらの結果は、足場分子の結合表面の形状（湾曲と平坦）が
、どの標的タンパク質又はそれらの標的タンパク質上の特定のエピトープが足場によって
効果的に結合されるかを決定しうることを示唆するものである。タンパク質結合用のＦＮ
３ドメインを含んだタンパク質足場の設計に関する、これまでに発表されている研究は、
標的に結合するための隣接したループを設計し、これにより、湾曲した結合表面を生じさ
せることに頼っている。このアプローチは、こうした足場によってアクセス可能な標的及
びエピトープの数を制限しうる。
【０１７２】
テンコン及び他のＦＮ３ドメインは、分子の互いに反対側の面に存在する２組のＣＤＲ
様ループを有しており、第１の組は、ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループによって形成され、第
２の組は、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループによって形成されている。これら２つのループの
組は、ＦＮ３構造の中心を形成するβ鎖によって分離されている。テンコンの像を９０°
回転させると、代わりとなる表面が可視化されうる。このわずかに凹んだ表面は、ＣＤル
ープ及びＦＧループと２個の逆平行のβ鎖であるＣβ鎖及びＦβ鎖とによって形成される
ものであり、本明細書ではＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と呼ぶ。Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面は、
表面を形成する残基のサブセットをランダム化することによりタンパク質足場相互作用表
面のライブラリを設計するための鋳型として使用することができる。β鎖は、繰り返し構
造を有し、１つ置きの残基の側鎖がタンパク質の表面に露出している。このため、β鎖内
の一部又はすべての表面露出残基をランダム化することによって、ライブラリを作製する
ことができる。β鎖内の適当な残基を選択することにより、他のタンパク質と相互作用す
るための固有の足場表面を与える一方で、テンコン足場の本来の安定性の低下を最小限に
抑えなければならない。
【０１７３】
ライブラリＴＣＬ１４（配列番号７）は、テンコン２７足場内で設計した（配列番号４
）。
【０１７４】
このライブラリを構築するために用いた方法の完全な説明は、米国特許出願公開第２０
１３／０２２６８３４号に記載されている。
【０１７５】
ＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号７）：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３
ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ８ＶＸ９
ＩＸ１０ＧＶＫＧＧＸ１１Ｘ１２ＳＸ１３ＰＬＳＡＩＦＴＴ；
ただし、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、
及びＸ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ
、Ｙ、Ｃ、又はＭである。
【０１７６】
テンコン２７のＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面を形成する２本のβ鎖は、Ｃ鎖が、Ｓ３０、Ｌ
３２、Ｑ３４、Ｑ３６、Ｆ鎖が、Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２、及びＶ７４の全部で
９個の表面露出残基を有しているのに対して、ＣＤループは、Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、
Ｖ４１、Ｇ４２、及びＥ４３の６個の可能な残基を有し、ＦＧループは、Ｋ７５、Ｇ７６
、Ｇ７７、Ｈ７８、Ｒ７９、Ｓ８０、及びＮ８１の７個の可能な残基を有している。選択
された残基は、２２個の残基すべてがランダム化された場合のライブラリのより大きな理
論上のサイズのため、ＴＣＬ１４の設計に含まれるように選択した。
【０１７７】
ランダム化を行うために、Ｃ鎖のＬ３２、Ｑ３４、及びＱ３６、ＣＤループのＳ３８、
Ｅ３９、Ｋ４０、及びＶ４１、Ｆ鎖のＴ６８、Ｓ７０、及びＹ７２、ＦＧループのＨ７８
、Ｒ７９、及びＮ８１の１３個のテンコンの位置を選択した。Ｃ及びＦ鎖において、Ｓ３
０及びＥ６６は、ＣＤ及びＦＧループを超えてすぐの位置にあり、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表
面の一部とは明確には考えられないことから、ランダム化しなかった。ＣＤループでは、
Ｇ４２及びＥ４３は、柔軟性を与えるグリシンはループ領域において貴重な存在であり得
、Ｅ４３は表面の接合部に位置することから、ランダム化しなかった。ＦＧループでは、
Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、及びＳ８０は除外した。グリシンは上記の理由で除外したのに
対し、結晶構造を注意深く調べたところ、Ｓ８０はコアと主要な接点を形成して安定的な
ＦＧループの形成を助けることが判明した。Ｋ７５は、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面の表面か
ら離れる方向に面しており、ランダム化の候補としてはそれほど重要と考えられなかった
。上記に述べた残基は元のＴＣＬ１４の設計ではランダム化しなかったが、デノボ選択用
、又は例えば選択したＴＣＬ１４の標的特異的なヒットについてのアフィニティー成熟ラ
イブラリ用に更なる多様性を与えるため、後のライブラリの設計ではこれらを含めること
ができる。
【０１７８】
ＴＣＬ１４の作製後、３つの更なるテンコンライブラリの同様の設計を作製した。これ
ら２つのライブラリＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１及びＴＣＬ２３は、ＴＣＬ１４と同じ位置（
上記を参照）においてランダム化したが、これらの位置に存在するアミノ酸の分布を変え
た（表３）。ＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１は、システイン及びメチオニンのみを除き、すべ
ての位置で１８種類の天然アミノ酸の等しい分布（それぞれ５．５５％）を有するように
設計した。ＴＣＬ２３は、表３に示されるように、それぞれのランダム化した位置が機能
性抗体のＨＣＤＲ３ループ（Ｂｉｒｔａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  
３７７：１５１８〜１５２８，２００８）に見られるアミノ酸分布に近くなるように設計
した。ＴＣＬ２１ランダム化と同様、システイン及びメチオニンは除外した。
【０１７９】
他のライブラリの可能性のある標的結合表面を拡張するために、第３の更なるライブラ
リを構築した。このライブラリ（ＴＣＬ２４）では、ＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２
１、及びＴＣＬ２３のライブラリと比較して４つの更なるテンコンの位置をランダム化し
た。これらの位置には、Ｄ鎖のＮ４６及びＴ４８と、Ｇ鎖のＳ８４及びＩ８６が含まれる
。位置４６、４８、８４、及び８６は、詳細には、これらの残基の側鎖がβ鎖Ｄ及びＧか
ら表面露出しており、Ｃ及びＦ鎖のランダム化した部分に構造的に隣接して位置するため
、標的タンパク質との結合のためにアクセス可能な表面積が大きくなることから選択され
た。ＴＣＬ２４の各位置で用いたアミノ酸分布は、表３でＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１につ
いて述べたものと同じである。
【０１８０】
ＴＣＬ２４ライブラリ（配列番号８）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３
ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＸ８ＬＸ９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１０
ＶＸ１１ＩＸ１２ＧＶＫＧＧＸ１３Ｘ１４ＳＸ１５ＰＬＸ１６ＡＸ１７ＦＴＴ；
ただし、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ
１５、Ｘ１６、及びＸ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、
Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙ、又はＷである。
【０１８１】
【表３】
2022002526.tif 000004
【０１８２】
ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、及びＴＣＬ２４ライブラリの作製
アミノ酸分布を制御するため、Ｃｏｌｉｂｒａライブラリ技術（アイソジェニカ社（Ｉ
ｓｏｇｅｎｉｃａ））を使用してＴＣＬ２１ライブラリを作製した。アミノ酸分布を制御
するため、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（モルフォシス社（Morphosys））を使用してＴＣＬ
１９、ＴＣＬ２３、及びＴＣＬ２４遺伝子フラグメントを作製した。最初の合成の後、Ｐ
ＣＲを用いて各ライブラリを増幅した後、ループライブラリに関して上記に述べたＣＩＳ
ディスプレイシステム（Ｏｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：２８０６〜２８１０，２００４））を用いた選択に用いるた
めに、ＲｅｐＡの遺伝子とライゲートした。
【０１８３】
実施例３：ＰＳＭＡに結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
プレートに基づく選択
ＣＩＳディスプレイを用いて、ＴＣＬ７、ＴＣＬ９、ＴＣＬ１９、及びＴＣＬ２１ライ
ブラリからＰＳＭＡ結合センチリン（Centyrin）を選択した。インビトロ転写及び翻訳（
ＩＴＴ）を行うため、３μｇのライブラリＤＮＡを３０℃で、０．１ｍＭの完全アミノ酸
、１ＸＳ３０プレミクス成分、及び１５μＬのＳ３０エクストラクト（プロメガ社（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ））と５０μＬの全体積中でインキュベートした。１時間後、３７５μＬのブ
ロッキング溶液（１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０１％  Ｉ−ｂｌｏｃｋ（ライフ・テ
クノロジーズ社（Life Technologies）、＃Ｔ２０１５）、１００μｇ／ｍｌニシン精子
ＤＮＡ）を加え、反応混合物を氷上で１５分間インキュベートした。ＩＴＴ反応液を、抗
ヒトＰＳＭＡ抗体（ライフスパン・バイオサイエンス社（Lifespan Bioscience）、カタ
ログ番号ＬＣ−Ｃ１５０５２７）でコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂプレー
ト上に固定化した組換えタンパク質であるチンパンジーＰＳＭＡ（ｐａｎ  ２２９）若し
くはカニクイザルＰＳＭＡ（ｐａｎ  ２３０）、又はカニクイザルＰＳＭＡ−ＦＣ融合タ
ンパク質（ｐａｎ  ２３１）と共にインキュベートした。未結合のライブラリ成分をＴＢ
ＳＴ及びＴＢＳで順に洗浄して除去した。洗浄後、ＤＮＡを、８５℃に１０分間加熱する
ことにより標的タンパク質から溶出し、更なるパニングのラウンドを行うためにＰＣＲに
より増幅した。各ラウンドにおける標的ＰＳＭＡの濃度を４００ｎＭから１００ｎＭに連
続的に低下させ、洗浄のストリンジェンシーを高くしていくことによって、高いアフィニ
ティーで結合する結合分子を単離した。
【０１８４】
パニング後、選択したＦＮ３ドメインをＰＣＲによって増幅し、リガーゼ非依存的クロ
ーニング部位を含むように改変されたｐＥＴベクターにサブクローニングし、大腸菌で可
溶性発現させるために標準的な分子生物学の技法を用いてＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）
（ストラタジーン社（Stratagene））細胞に形質転換した。精製及び検出を可能にするた
めに、Ｃ末端ポリヒスチジンタグをコードした遺伝子配列を各ＦＮ３ドメインに付加した
。１ｍＬの９６ウェルブロック中、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを添加したＴＢ培地
中で、培養物を３７℃で吸光度が０．６〜０．８となるまで増殖させた後、ＩＰＴＧを１
ｍＭとなるように添加し、その時点で温度を３０℃に低下させた。およそ１６時間後に細
胞を遠心沈降させて回収し、−２０℃で凍結した。各ペレットを０．６ｍＬのＢｕｇＢｕ
ｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ細胞溶解バッファー（ノバジェン・イーエムディー・バイオサ
イエンシーズ社（Novagen EMD Biosciences））中で、室温で４５分間、振盪しながらイ
ンキュベートすることによって、細胞溶解物を得た。
【０１８５】
ビーズに基づく選択
センチリンを、更に、ビーズに基づいた捕捉セットアップを用いて選択した。上記に述
べたようにしてＩＴＴ反応混合物を調製し、次いで、ビオチン化組換えタンパク質である
チンパンジー又はカニクイザルＰＳＭＡとインキュベートした。ビオチン化組換えタンパ
ク質及び結合したライブラリ成分を、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコー
ティングした磁気ビーズ上に捕捉した。未結合のライブラリ成分を、ＴＢＳＴ及びＴＢＳ
で順に洗浄して除去した。洗浄後、ＤＮＡを、８５℃に１０分間加熱することにより標的
タンパク質から溶出し、更なるパニングのラウンドを行うためにＰＣＲにより増幅した。
各ラウンドにおける標的ＰＳＭＡの濃度を４００ｎＭから１００ｎＭに連続的に低下させ
、洗浄のストリンジェンシーを高くしていくことによって、高いアフィニティーで結合す
る結合分子を単離した。
【０１８６】
オフレート選択（Off-rate selection）
ビーズに基づく選択の５回目のラウンドからの生成物に、４ラウンドのオフレート選択
を行った。ＩＴＴ反応混合物をビオチン化組換えチンパンジー又はカニクイザルタンパク
質とインキュベートした後、タンパク質と結合ライブラリ成分をニュートラアビジン又は
ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ上に捕捉し、ＴＢＳＴでよく洗浄し、
結合した複合体を５μＭの低温の組換えＰＳＭＡタンパク質中で１時間洗浄した。次いで
、ビーズに結合したＩＴＴをＴＢＳＴ及びＴＢＳ中でよく洗浄した後、溶出した。ビオチ
ン化した標的抗原濃度を、ラウンド６及び７の２５ｎＭからラウンド８及び９の２．５ｎ
Ｍに段階的に下げた。ラウンド７及び９からの選択生成物を、発現及びスクリーニングを
行うために改変ｐＥＴ１５ベクターにサブクローニングした。
【０１８７】
アフィニティー成熟ライブラリ選択
ＢＣループの位置２３〜３０及びＦＧループの位置７８〜８３をランダム化した、クロ
ーンＰ２２９ＣＲ９Ｐ８１９−Ｈ１１（配列番号４０）の配列に基づいたアフィニティー
成熟ライブラリ（ＴＣＬ２５）を、モルフォシス社（ドイツ、ミュンヘン）のＳｌｏｎｏ
ｍｉｃｓ技術を用いて作製した。ライブラリ内の標的結合の維持は、各ランダム化した位
置に６５％の標的頻度で親アミノ酸（Ｐ２２９ＣＲ９Ｐ８１９−Ｈ１１からの）をコード
したヌクレオチドをドープすることによって行った。ヌクレオチドの残りの３５％は、含
まれていなかったシステイン及びメチオニンを除く、すべての他の２０種類の天然アミノ
酸を同じ確率でコードしたコドンの混合物を含むように設計した。表４は、ＴＣＬ２５の
成熟ライブラリの設計を示す。表中、括弧内の数値は、各位置に対応するアミノ酸を含む
ように設計されたライブラリ内の分子の比率（％）を表す。このドーピング手法（１４個
の位置で６５％の親分子）により、親分子と比較して大部分が３、４、５、６、又は７個
の変化を含む理論上の分子の分布が得られる。
【０１８８】
【表４】
2022002526.tif 000005
【０１８９】
ＣＩＳディスプレイを用いて、ＴＣＬ２５ライブラリからＰＳＭＡに結合するセンチリ
ンを選択した。ＩＴＴ反応混合物を、ビオチン化組換えタンパク質であるチンパンジー及
びカニクイザルＰＳＭＡとインキュベートした。ビオチン化組換えタンパク質及び結合し
たライブラリ成分を、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコーティングした磁
気ビーズ上に捕捉した。未結合のライブラリ成分を、ＴＢＳＴ及びＴＢＳで順に洗浄して
除去した。洗浄後、ＤＮＡを、８５℃に１０分間加熱することにより標的タンパク質から
溶出し、更なるパニングのラウンドを行うためにＰＣＲにより増幅した。各ラウンドにお
ける標的ＰＳＭＡの濃度を４００ｎＭから１００ｎＭに連続的に低下させ、洗浄のストリ
ンジェンシーを高くしていくことによって、センチリン結合分子を単離した。
【０１９０】
選択の２回目のラウンドからの生成物に、４ラウンドのオフレート選択を行った。ＩＴ
Ｔ反応混合物をビオチン化組換えＰＳＭＡタンパク質とインキュベートした後、タンパク
質と結合ライブラリ成分をニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコーティングし
た磁気ビーズ上に捕捉し、ＴＢＳＴでよく洗浄し、結合した複合体を５μＭの低温の組換
えＰＳＭＡタンパク質中で１時間洗浄した。次いで、ビーズに結合したＩＴＴをＴＢＳＴ
及びＴＢＳ中でよく洗浄した後、溶出した。ビオチン化した標的抗原濃度を、ラウンド３
及び４の２５ｎＭからラウンド５及び６の２．５ｎＭに段階的に下げた。ラウンド７及び
９からの選択生成物を、発現及びスクリーニングを行うために改変ｐＥＴ１５ベクターに
サブクローニングした。
【０１９１】
ＰＳＭＡに結合するセンチリンの生化学的スクリーニング
ニュートラアビジンでコーティングしたプレートを、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  
Ｔ２０（ピアース社（Pierce））で１時間ブロッキングした後、ビオチン化ＰＳＭＡ（パ
ニングと同じ抗原を使用したもの）又はネガティブコントロールで１時間コーティングし
た。プレートをＴＢＳＴですすぎ、希釈したライセートをプレートに１時間加えた。更な
るすすぎの後、各ウェルをＨＲＰ結合抗センチリン抗体（ＰＡＢ２５）で１時間処理し、
次いでＰＯＤ（ロシュ社（Roche））によりアッセイした。バックグラウンドよりも少な
くとも１０倍高いシグナルを有するセンチリンを、更なる分析を行うために選択した。
【０１９２】
サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＳＭＡに結合するセンチリンの凝集状態を
測定した。各精製センチリンのアリコート（１０μＬ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ５／
１５０カラム（ジーイー・ヘルスケア社（GE Healthcare））に流速０．３ｍＬ／分でＰ
ＢＳ（ｐＨ７．４）を移動相として注入した。カラムからの溶出液を、２８０ｎｍの吸光
度によってモニターした。各ランに、コントロールとして野生型テンコンを含ませた。ア
ジレント社（Agilent）のＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｒｅｖ．Ｂ．０４．０
２）を使用して溶出プロファイルを分析した。同じランの野生型タンパク質の溶出プロフ
ァイルと同様の溶出プロファイルを示したタンパク質のみを、更なる特性評価を行うため
の考慮対象とした。
【０１９３】
センチリンの高スループット発現、複合体化及び精製
生化学的結合ＥＬＩＳＡによって同定された固有のヒットから単離したクローンを、９
６ウェルブロックプレートで増殖させるためにシングルヒットプレートで加え合わせた。
クローンを、振盪しながら３７℃で一晩、１ｍＬの培養物（選択用にカナマイシンを添加
したＬＢ培地）中で増殖させた。９６ブロックプレートでタンパク質発現を行うため、カ
ナマイシンを添加した１ｍＬのＴＢ培地に５０μＬの一晩培養物を接種し、ＯＤ６００＝
０．６〜１となるまで３００ｒｐｍで連続的に振盪しながら３７℃で増殖させた。目標Ｏ
Ｄに達した時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭにまで加えることにより、タンパク質発現を誘導し
、プレートを３０℃（３００ｒｐｍ）に移行して一晩増殖させた。一晩培養物を遠心して
細胞を回収し、細菌ペレットを使用できる状態となるまで−８０℃で保存した。ポジティ
ブコントロール及びネガティブコントロールの両方を、各プレート上の重複実験に含めた
。
【０１９４】
ソルターゼタグと結合させるため、細菌ペレットを解凍し、組換えヒトライソザイム（
ＥＭＤ社、カタログ番号７１１１０）を添加したＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴ（ＥＭＤ社、カ
タログ番号７０９２２）中に再懸濁して溶解した。静かに攪拌しながら室温で溶解を進行
させ、その後、プレートを４２℃に移行して宿主タンパク質を沈降させた。遠心により破
片をペレット化し、上清をソルターゼ触媒標識を行うために新しいブロックプレートに移
した。Ｇｌｙ３−ｖｃ−ＭＭＡＦ（コンコルティス社（Concortis））、タグレスソルタ
ーゼＡ及びソルターゼバッファー（Ｔｒｉｓ、塩化ナトリウム、及び塩化カルシウム）を
含むマスターミックスを２倍濃度で調製し、ライセートの上清に等量で加えた。標識反応
を室温で２時間進行させた後、Ｎｉ−ＮＴＡ  ｍｕｌｔｉ−ｔｒａｐ  ＨＰプレート（Ｇ
Ｅ社、カタログ番号２８−４００９−８９）を使用してタンパク質を精製した。タンパク
質複合体を、イミダゾール含有溶出バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０
０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）による段階的溶出によって回収し、フィル
ターを滅菌して、細胞を用いた細胞毒性アッセイに直接使用した。
【０１９５】
センチリン−薬剤複合体の高スループット細胞毒性アッセイ
９６ウェル黒色組織培養コーティングプレート（ビーディー／コーニング社（ＢＤ／Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ）社カタログ番号３５３２１９）に、アッセイ培地（５％ウシ胎児血清を添
加した無フェノールレッドＲＰＭＩ（ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies）
カタログ番号１１８３５−０３０））中、１０，０００細胞／ウェルの密度でＬＮＣａＰ
ＦＧＣ細胞（ＡＴＣＣ，カタログ番号ＣＲＬ−１７４０）を播種した。播種したプレー
トを、５％ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートして細胞を付着させた。２４時間後、
ＣＤＣをアッセイ培地中に希釈し（１：１００、１：３００、１：１０００、又は１：３
０００）、ＬＮＣａＰ細胞に直接加えた。この後、ＬＮＣａＰ細胞を、５％ＣＯ２下、３
７℃で６６〜７２時間インキュベートした。細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試
薬（プロメガ社（Promega）カタログ番号Ｇ７５７１）を使用して評価し、調製した試薬
１００μＬを、処理したウェルに直接加え、光から保護して静かに振盪しながら１０分間
インキュベートした。発光量を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーを使用し
て測定した。値を非処理のコントロールに対して正規化し、５０％よりも高い毒性が得ら
れた場合に更なる分析を行うために選択した。
【０１９６】
実施例４：抗ＰＳＭＡセンチリンの特性評価
大規模発現及び精製
センチリン突然変異体をコードした遺伝子配列をパニングによって見つけ、これをＴ７
プロモーターの制御下で発現させるためにｐＥＴ１５ｂベクターにクローニングするか、
又はＤＮＡ２．０社によって作製されたものをＴ５プロモーターの制御下で発現させるた
めにｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクター（ＤＮＡ２．０社）にサブクローニングした。こ
の得られたプラスミドを、発現させるためにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｇｏｌｄ（アジレ
ント社（Ａｇｉｌｅｎｔ））又はＢＬ２１ＤＥ３  Ｇｏｌｄ（アジレント社（Ａｇｉｌｅ
ｎｔ））に形質転換した。シングルコロニーをピックし、カナマイシンを添加したＬｕｒ
ｉａ  Ｂｒｏｔｈ（テクノバ社（Teknova））中で増殖させ、３７℃、２５０ＲＰＭで１
８時間インキュベートした。カナマイシンを添加した１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔ
ｈ（テクノバ社（Teknova））に、これらの継代培養物から接種し、３７℃で振盪しなが
ら４時間増殖させた。目標６００ｎｍの吸光度における光学密度が１．０に達した時点で
、１ｍＭのＩＰＴＧによりタンパク質発現を誘導した。タンパク質を３７℃で４時間、又
は３０℃で１８時間発現させた。細胞を６０００Ｇで遠心して回収し、精製を行うまで−
２０℃で保存した。凍結した細胞ペレット（約１５〜２５ｇ）を室温で３０分、解凍し、
０．２ｍｇ／ｍＬの組換えライソザイム（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を添加したＢｕｇＢ
ｕｓｔｅｒＨＴタンパク質抽出試薬（イーエムディー・ミリポア社（EMD Millipore））
に細胞ペースト１ｇ当たり５ｍＬで懸濁し、室温にてシェーカー上で１時間インキュベー
トした。ライセートを７４６００Ｇで２５分間遠心して清澄化した。上清を、ＡＫＴＡ  
ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを使用し、氷中に浸漬した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ
Ｎｉ−ＮＴＡカートリッジ上に４ｍＬ／分の流速で加えた。他のすべてのＮｉ−ＮＴＡ
クロマトグラフィーのステップは、流速５ｍｌ／分で行った。Ｎｉ−ＮＴＡカラムを、０
．５Ｍ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾールを含んだ２５．０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）（バッファーＡ）中で平衡化した。ローディング後、
カラムを１００ｍＬのバッファーＡ、次いで１０ｍＭ  イミダゾール、１％ＣＨＡＰＳ及
び１％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド洗剤を含んだ１００ｍｌの５０ｍＭ  Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）、及び１００ｍｌのバッファーＡで洗浄した。
タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールを添加したバッファーＡで溶出し、ＰＢＳ（ギブコ
社（Ｇｉｂｃｏ））中で平衡化した分取用ゲル濾過カラムＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００Ｓ
Ｗ（２１．５×６００ｍｍ）（東ソー株式会社）にロードした。ゲル濾過クロマトグラフ
ィーを、ＡＫＴＡ−ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを使用し、室温で、流速１０
ｍＬ／分にてＰＢＳで行った。
【０１９７】
熱安定性の測定
熱安定性をキャピラリーＤＳＣによって測定した。各試料を、１ｍｇ／ｍｌの濃度にＰ
ＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した。オートサンプラー（マイクロカル社（ＭｉｃｒｏＣａｌ
，ＬＬＣ））を備えたＶＰ−ＤＳＣ機器を使用して、これらの試料の融解温度を測定した
。試料を１０℃から９５℃又は１００℃まで毎分１℃の速度で加熱した。各試料の走査の
間にバッファーのみの走査を完結して、積分用のベースラインを計算した。バッファーの
みのシグナルを引いた後、データを２状態アンフォールディングモデルに当てはめた。セ
ルから試料を取り出さずに各試料について走査を繰り返すことによって、熱変性の可逆性
を測定した。
【０１９８】
ＰＳＭＡ陽性細胞に対する抗ＰＳＭＡセンチリン薬剤複合体の選択的細胞毒性
センチリンを、システイン／マレイミド化学反応（Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３：２〜１３，１９９２）又は上記に述べたソルター
ゼ反応を用いて、ｖｃ−ＭＭＡＦと結合させた。センチリン−ｖｃＭＭＡＦ複合体の細胞
毒性を、インビトロでＬＮＣａＰ、ＶＣＡＰ、ＭＤＡ−ＰＣ−２Ｂ、及びＰＣ３細胞で評
価した。細胞を９６ウェル黒色プレートに２４時間置いた後、異なる用量のセンチリン−
ｖｃＭＭＡＦ複合体で処理した。細胞をセンチリン薬剤複合体（ＣＤＣ）と６６〜７２時
間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏを使用し、上記に述べたようにして毒
性を評価した。発光量の値をＥｘｃｅｌにインポートし、ここからＰｒｉｓｍにコピーア
ンドペーストしてグラフによる分析を行った。データをＸ＝Ｌｏｇ（ｘ）を用いて変換し
た後、非線形回帰を用いて分析し、３パラメータモデルを適用してＩＣ５０を決定した。
【０１９９】
表６に、複数の配列群にまたがったパニングによって特定された固有ヒットを要約する
。センチリンは、ｖｃＭＭＡＦと結合させた場合に５５℃〜８５℃で熱安定性を示し、Ｌ
ＮＣａＰ細胞に対して細胞毒性を示し、ＩＣ５０値は２２．６〜０．３８ｎＭであった。
【０２００】
実施例４：抗ＰＳＭＡセンチリンの特性評価
大規模発現及び精製
センチリン突然変異体をコードした遺伝子配列をパニングによって見つけ、これをＴ７
プロモーターの制御下で発現させるためにｐＥＴ１５ｂベクターにクローニングするか、
又はＤＮＡ２．０社によって作製されたものをＴ５プロモーターの制御下で発現させるた
めにｐＪｅｘｐｒｅｓｓ  ４０１ベクター（ＤＮＡ２．０社）にサブクローニングした。
この得られたプラスミドを、発現させるためにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｇｏｌｄ（アジ
レント社（Agilent））又はＢＬ２１ＤＥ３  Ｇｏｌｄ（アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ
））に形質転換した。シングルコロニーをピックし、カナマイシンを添加したＬｕｒｉａ
Ｂｒｏｔｈ（テクノバ社（Teknova））中で増殖させ、３７℃、２５０ＲＰＭで１８時
間インキュベートした。カナマイシンを添加した１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（
テクノバ社（Teknova））に、これらの継代培養物から接種し、３７℃で振盪しながら４
時間増殖させた。目標６００ｎｍの吸光度における光学密度が１．０に達した時点で、１
ｍＭのＩＰＴＧによりタンパク質発現を誘導した。タンパク質を３７℃で４時間、又は３
０℃で１８時間発現させた。細胞を６０００Ｇで遠心して回収し、精製を行うまで−２０
℃で保存した。凍結した細胞ペレット（約１５〜２５ｇ）を室温で３０分、解凍し、０．
２ｍｇ／ｍｌの組換えライソザイム（シグマ社（Sigma））を添加したＢｕｇＢｕｓｔｅ
ｒＨＴタンパク質抽出試薬（イーエムディー・ミリポア社（EMD Millipore））に細胞ペ
ースト１ｇ当たり５ｍｌで懸濁し、室温にてシェーカー上で１時間インキュベートした。
ライセートを７４６００Ｇで２５分間遠心して清澄化した。上清を、ＡＫＴＡ  ＡＶＡＮ
Ｔクロマトグラフィーシステムを使用し、氷中に浸漬した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ  Ｎｉ−
ＮＴＡカートリッジ上に４ｍＬ／分の流速で加えた。他のすべてのＮｉ−ＮＴＡクロマト
グラフィーのステップは、流速５ｍｌ／分で行った。Ｎｉ−ＮＴＡカラムを、０．５Ｍ  
ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾールを含んだ２５．０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ７．０）（バッファーＡ）中で平衡化した。ローディング後、カラムを
１００ｍＬのバッファーＡ、次いで１０ｍＭイミダゾール、１％  ＣＨＡＰＳ及び１％ｎ
−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド洗剤を含んだ１００ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）、及び１００ｍｌのバッファーＡで洗浄した。タンパク
質を２５０ｍＭイミダゾールを添加したバッファーＡで溶出し、ＰＢＳ（ギブコ社（Ｇｉ
ｂｃｏ））中で平衡化した分取用ゲル濾過カラムＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（２１
．５×６００ｍｍ）（東ソー株式会社）にロードした。ゲル濾過クロマトグラフィーを、
ＡＫＴＡ−ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを使用し、室温で、流速１０ｍＬ／分
にてＰＢＳで行った。
【０２０１】
熱安定性の測定
熱安定性をキャピラリーＤＳＣによって測定した。各試料を、１ｍｇ／ｍｌの濃度にＰ
ＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した。オートサンプラー（マイクロカル社（MicroCal, LLC）
）を備えたＶＰ−ＤＳＣ機器を使用して、これらの試料の融解温度を測定した。試料を１
０℃から９５℃又は１００℃まで毎分１℃の速度で加熱した。各試料の走査の間にバッフ
ァーのみの走査を完結して、積分用のベースラインを計算した。バッファーのみのシグナ
ルを引いた後、データを２状態アンフォールディングモデルに当てはめた。セルから試料
を取り出さずに各試料について走査を繰り返すことによって、熱変性の可逆性を測定した
。
【０２０２】
ＰＳＭＡ陽性細胞に対する抗ＰＳＭＡセンチリン薬剤複合体の選択的細胞毒性
センチリンを、システイン／マレイミド化学反応（Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３：２〜１３，１９９２）又は上記に述べたソルター
ゼ反応を用いて、ｖｃ−ＭＭＡＦと結合させた。センチリン−ｖｃＭＭＡＦ複合体の細胞
毒性を、インビトロでＬＮＣａＰ、ＶＣＡＰ、ＭＤＡ−ＰＣ−２Ｂ、及びＰＣ３細胞で評
価した。細胞を９６ウェル黒色プレートに２４時間置いた後、異なる用量のセンチリン−
ｖｃＭＭＡＦ複合体で処理した。細胞をセンチリン薬剤複合体（ＣＤＣ）と６６〜７２時
間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏを使用し、上記に述べたようにして毒
性を評価した。発光量の値をＥｘｃｅｌにインポートし、ここからＰｒｉｓｍにコピーア
ンドペーストしてグラフによる分析を行った。データをＸ＝Ｌｏｇ（ｘ）を用いて変換し
た後、非線形回帰を用いて分析し、３パラメータモデルを適用してＩＣ５０を決定した。
【０２０３】
表５に、複数の配列群にまたがった、パニングによって特定された固有ヒットを要約す
る。センチリンは、ｖｃＭＭＡＦと結合させた場合に５５℃〜８５℃で熱安定性を示し、
ＬＮＣａＰ細胞に対して細胞毒性を示し、ＩＣ５０値は２２．６〜０．３８ｎＭであった
。表６、７及び８に、選択したクローンのＢＣ、Ｃ、ＣＤ、Ｆ及びＦＧループのアミノ酸
配列を示す。表９に、各クローンのアミノ酸配列を示す。
【０２０４】
【表５】
2022002526.tif 000006
【０２０５】
【表６】
2022002526.tif 000007
【０２０６】
【表７】
2022002526.tif 000008
【０２０７】
【表８】
2022002526.tif 000009
【０２０８】
【表９】
2022002526.tif 000010
【０２０９】
選択したセンチリン薬剤複合体を、一群の細胞株にわたって試験した。表１０に、ｖｃ
ＭＭＡＦと結合させたいくつかのセンチリンのＩＣ５０値を示す。データは、１〜９つの
曲線当てはめの平均を示す。データは平均±ＳＥＭで示している。ＣＤＣは、ＰＳＭＡを
高いレベルで発現することが知られている細胞株であるＬＮＣａＰ細胞において最も高い
効果を示した。ＣＤＣは、ＰＳＭＡのレベルがより低い前立腺癌細胞株であるＭＤＡ−Ｐ
ＣＡ−２Ｂ及びＶＣＡＰ細胞においても活性を示した。ＰＳＭＡ陰性細胞株であるＰＣ３
細胞では活性は認められず、選択性が示された。
【０２１０】
【表１０】
2022002526.tif 000011
【０２１１】
実施例５：抗ＰＳＭＡセンチリンの操作
システイン走査
タンパク質の異なる位置にシステイン残基が導入された抗ＰＳＭＡセンチリンＰ２３３
ＦＲ９＿１０をコードした遺伝子をＤＮＡ２．０社より入手し、これを使用して上記に述
べたようにタンパク質を発現させて精製した。得られたセンチリンを、上記に述べたよう
に、熱安定性（ｖｃＭＭＡＦ複合体のある場合とない場合）及びＬＮＣａＰ細胞毒性につ
いて評価した。結果を表１１に要約する。
【０２１２】
【表１１】
2022002526.tif 000012
【０２１３】
実施例６：非標的化センチリンの生体分布のイメージング
アイソ・セラピューティクス・グループ社（IsoTherapeutics Group, ＬＬＣ）（テキ
サス州アングルトン）において、位置６２にシステインを有するように操作された標的抗
原に対して特異的結合を示さないセンチリンを、ＤＯＴＡと結合させ、次いでジルコニウ
ム８９放射性同位体と結合させた。去勢した雄ＮＳＧマウス（ジャクソン・ラボラトリー
ズ社（Jackson laboratories））を１．５％イソフルランで麻酔し、シーメンス社（Siem
ens）のＩｎｖｅｏｎ  ｍｉｃｒｏＰＥＴ／ＣＴでイメージングした。マウスに尾静脈注
射により約０．２ｍＣｉ［８９Ｚｒ］のセンチリン（配列番号５１）を投与し（低温のセ
ンチリンを１ｍｇ／ｋｇ用量となるように）、最初の６０分間にわたって連続的にイメー
ジングし、その後、センチリン注射の３、６、及び２４時間後にイメージングした。
【０２１４】
３次元ＰＥＴ画像を、「２Ｄサブセット化による期待値最大化アルゴリズム」（2D ord
ered-subsets expectation maximization algorithm）（シーメンス・ヘルスケア社（Sie
mens Healthcare）、テネシー州ノックスビル）を使用して、ボクセルサイズ０．１０７
ｍｍ×０．１０７ｍｍ×０．１０７ｍｍで７６８×７６８×５１２のトモグラフィ体積に
再構成した。ＰＭＯＤ  ｖ３．０ソフトウェア（ピーエムオーディー・テクノロジーズ社
（PMOD Technologies）、スイス、チューリッヒ）を使用して、画像を処理して分析した
。既知の活性の円筒体をＰＥＴスキャナー内でスキャンして用量キャリブレータによって
測定された注射用量との相互較正、及びＰＥＴ画像のボクセル当たりのカウントを得た。
ＰＭＯＤ画像融合ソフトウェアを用いて各ＰＥＴ画像をＣＴ画像と位置合わせすることに
より、解剖学的基準点を与えた。関心領域（ＲＯＩ）を、分析しようとする各組織につい
て４つの切片ごとに周囲に描画した。ボクセル当たりの平均カウントを導き出し、既知の
活性の較正円筒体から導き出された補正係数を用いて体重１ｇ当たりの注射された用量の
比率（％）に変換した。放射活性のすべての測定値を、Ｚｒ８９の既知の半減期（７８．
４１時間）を用いて崩壊について補正した。
【０２１５】
図１は、時間に対する放射性標識されたＦＮ３ドメインの組織分布を示す。腎臓及び膀
胱における急速な蓄積が観察されたが、肝臓への蓄積はわずかであり、センチリンが腎臓
によって排出されることを示唆している。
【０２１６】
実施例７：ｃｙｎｏＰＳＭＡと複合体化された抗ＰＳＭＡ  Ｐ２３３ＦＲ９−Ｈ１０の
結晶構造
Ｈｉｓタグを付加したＰ２３３ＦＲ９−Ｈ１０センチリン（本明細書でＨ１０センチリ
ンと呼ぶ）を大腸菌で発現させ、アフィニティー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用
いて精製した。センチリンはｄＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に受けた。
【０２１７】
カニクイザルＰＳＭＡ細胞外ドメインを、ｈｕＩｇＧ１  ＦｃドメインとのＣ末端融合
としてＧｎＴＩ−細胞で発現させ、アフィニティー及びサイズ排除クロマトグラフィーを
用いて精製した。融合タンパク質を、ｄＰＢＳ、０．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２（ｐＨ７．２）
中に受けた。次いで、ＦｃドメインをＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ処理により除
去した後、アフィニティー及びサイズ排除クロマトグラフィーを行った。単離したカニク
イザルＰＳＭＡ（cynoPSMA）の細胞外ドメインを、ｄＰＢＳ、０．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２（
ｐＨ７．２）中に保存した。
【０２１８】
２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）０．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２に対して４℃で４８時間
透析しながら、ｃｙｎｏＰＳＭＡをＨ１０センチリンと１：３のモル比（センチリン過剰
）で混合することによりＨ１０センチリン／ｃｙｎｏＰＳＭＡ複合体を調製した。次いで
、複合体を、４８〜６８ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０％
グリセロールによりｍｏｎｏＳカラムから溶出し、３．４ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｘ線回
折に適した結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を２０℃で用いて、２５％  ＰＥＧ
（３ｋＤａ）、０．２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）から得た
。
【０２１９】
Ｘ線データ収集のため、結晶を、２０％グリセロールを添加した母液を含むクライオプ
ロテクタント溶液中に数秒間浸漬した後、液体窒素中で凍結した。アルゴンヌ国立研究所
のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）のビームライン１７−ＩＤ
においてＤｅｃｔｒｉｓ  Ｐｉｌａｔｕｓ  ６Ｍ  Ｐｉｘｅｌ  Ａｒｒａｙ検出器によっ
て、Ｘ線データを収集した。回折データをプログラムＨＫＬ２０００で処理した（Ｏｔｗ
ｉｎｏｗｓｋｉ  ＆  Ｍｉｎｏｒ，１９９７）。Ｘ線データ統計を表１２に示す。
【０２２０】
構造を、Ｐｈａｓｅｒを用いた分子置換法（ＭＲ）により解析した（Ｒｅａｄ、２００
１）。ＭＲの検索モデルは、ヒトＰＳＭＡ（ＰＤＢコード２Ｃ６Ｇ）の結晶構造及びＰ１
１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３  Ｗ３３Ａセンチリンの構造とした。ＰＨＥＮＩＸにより構造を
精密化し（Ａｄａｍｓら、２００４）、ＣＯＯＴを用いてモデル調整を行った（Ｅｍｓｌ
ｅｙ  ＆  Ｃｏｗｔａｎ、２００４）。他のすべての結晶学的計算は、ＣＣＰ４プログラ
ム群により行った（ＣＣＰ４、１９９４）。すべての分子グラフィックは、ＰｙＭｏｌを
用いて生成した（ＤｅＬａｎｏ、２００２）。構造精密化の統計を表１２に示す。
【０２２１】
【表１２】
2022002526.tif 000013
＊最外郭の値は（）内に示す。
【０２２２】
ホモ二量体ｃｙｎｏＰＳＭＡの構造は、二量体のサブユニット当たり、プロテアーゼ（
残基５７〜１１６及び３５２〜５９０）、頂端（残基１１７〜３５１）及び螺旋状（残基
５９１〜７５０）ドメイン、並びに１１個の可能なＮ結合型グリカンのうち８個（Ａｓｎ
−７６、−１２１、−１４０、−１９５、−４５９、−４７６、−６１３、及び−６３８
における）に対応した残基５７〜７５０を有している。ｃｙｎｏＰＳＭＡ活性部位は、３
つのドメイン間の界面に位置し、ヒスチジン（Ｈ３７７及びＨ５５３）により配位された
２個の亜鉛原子、及びグルタミン酸／アスパラギン酸（Ｄ３８７、触媒活性を有するＥ４
２４、Ｅ４２５、及びＤ４５３）残基、及び水分子を有している。Ｈ１０センチリン（配
列番号４１）構造は、残基２〜９２を有している。Ｈ１０残基は、配列番号４１に基づい
て順に番号付けされている。ｃｙｎｏＰＳＭＡ残基は、配列番号１４１の完全長ｃｙｎｏ
ＰＳＭＡ配列に基づいて番号付けされている。成熟ｃｙｎｏＰＳＭＡ（シグナルペプチド
のないもの）は、配列番号１４１の残基４４から始まっている。
【０２２３】
非対称ユニット中に１個のｃｙｎｏＰＳＭＡがあり、各ＰＳＭＡサブユニットに１個の
Ｈ１０センチリンが結合している（図２Ａ）。２個のセンチリン／ＰＳＭＡ複合体は、Ｐ
ＳＭＡサブユニット内のすべての同等の原子の重ね合わせについての０．７２Åの二乗平
均偏差の平方根（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）によって示されるように、構造的に非常によく似て
いる。また、センチリン複合体中のｃｙｎｏＰＳＭＡ分子と未結合のヒトＰＳＭＡとのＣ
α原子の重ね合わせについての０．５Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．により示されるように（ＰＢ
Ｄコード２ＯＯＴ、１．６Åの分解能における構造）、ヒトＰＳＭＡとカニクイザルＰＳ
ＭＡとの間には高次の構造的類似性があり、センチリンの結合によって引き起こされる大
きなコンフォメーション変化は見られない。興味深い点として、センチリンとの相互作用
によるループコンフォメーションの安定化により、ループ領域５４１〜５４７はカニクイ
ザルタンパク質においてのみ見えている。
【０２２４】
センチリン／ＰＳＭＡの結合部位は、結合残基の位置を高い信頼度で決定することがで
きる２Ｆｏｂｓ−Ｆｃａｌｃ電子密度マップによってよく定義されている。Ｂ鎖とＣ鎖（
それぞれＰＳＭＡ鎖及びセンチリン鎖）との間の相互作用についてのみ、以下のセクショ
ンで述べることとする。
【０２２５】
Ｈ１０センチリンは、ＰＳＭＡ活性部位の近くの領域に結合し（図２Ａ）、約１，１７
０Å２のｃｙｎｏＰＳＭＡの面積を覆っている。詳細には、センチリンは、ｃｙｎｏＰＳ
ＭＡを、図３及び４に示されるようにプロテアーゼ（Ｙ４６０、Ｆ４８８、Ｋ４９９〜Ｐ
５０２、Ｐ５０４、Ｒ５１１、Ｋ５１４、Ｎ５４０〜Ｅ５４２、及びＮ５４４〜Ｆ５４６
）、頂端（残基１１８）及び螺旋状（残基Ｋ６１０、Ｎ６１３、及びＩ６１４）ドメイン
において認識する。
【０２２６】
センチリンの４本の鎖からなるβシートの面は、ＰＳＭＡ表面上に充填され、ＣＤルー
プが活性部位の入口の奥深くに挿入されている（図２Ｂ及び２Ｃ）。詳細には、ＰＳＭＡ
結合に関与するＨ１０センチリン残基は、Ｃ（Ａ３２及びＧ３４）、Ｄ（Ｖ４６）、Ｆ（
Ｇ６４、Ｐ６８、Ｙ７０、及びＡ７２）及びＧ（Ｓ８４−Ｉ８６）β鎖、並びにＣＤ（Ｗ
３６、Ｗ３８−Ｄ４１、Ｅ４３、及びＡ４４）及びＦＧループ（Ｗ７９、Ｆ８１、及びＰ
８２）内に位置している。残基Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ４１、及びＥ４３は、センチリンのＣ
Ｄループに負電荷を与え、これらの残基が活性部位内の亜鉛イオンにつながる深さ約２０
Åの正に帯電した漏斗状部分内に挿入されることで、漏斗状部分内への基質の入り込み及
びＰＳＭＡ酵素活性をブロックするものと考えられる（図２Ｂ及び２Ｃ）。しかしながら
、センチリンは、亜鉛イオン又は亜鉛イオンに配意している残基と直接的には相互作用し
ない。
【０２２７】
保存されたＰＳＭＡ残基Ｗ５４１、Ｙ４６０、Ｆ４８８、Ｐ５０２及びＰ５０４は、セ
ンチリン残基Ｗ３６、Ｐ６８、Ｙ７０、Ｗ７９、Ｆ８１、及びＰ８２との結合部位にわた
って芳香族クラスターを形成する（図３Ａ）。保存されたＲ５１１は、結合部位及びセン
チリンの４本の鎖からなるβシートの中心残基である水素結合Ｙ７０の中心位置にある。
図３Ｂは、パラトープ及びエピトープの残基の図を示したものである。
【０２２８】
ヒトＰＳＭＡとカニクイザルＰＳＭＡとは、Ｓ６１３Ｎの変化を除いて９７％同一であ
り、Ｈ１０と相互作用するすべての残基は２つの種間で保存されている（図４）。Ｓ６１
３Ｎの変化は、ｃｙｎｏＰＳＭＡのＮ６１３のグリコシル化、及び、ヒト酵素には存在し
ない炭水化物とセンチリン残基Ｅ６６、Ｉ８６、Ｔ８８（Ｆ及びＧβ鎖）との間のファン
デルワールス接触の獲得につながる。
【０２２９】
複合体形成におけるセンチリン残基
結合部位の外側の異なるＨ１０センチリン残基は、小分子（毒性弾頭分子）と結合させ
るために、ＰＳＭＡの結合又はセンチリンのフォールディングを妨げることなく改変する
ことができる。システインは、これまでにＣ末端（Ｈｉｓタグの後）並びに位置Ｒ１１、
Ｅ５３、及びＫ６２に配置され、これらの位置で弾頭分子と結合させられているが、これ
らの変異体のすべてが同様に強力な細胞毒性を示している。更に、ＢＣループ内の残基Ｔ
２２、Ｄ２５、及びＡ２６、並びにＤＥループ内の末端残基Ｎ６、及びＳ５２は、突然変
異誘発後に化学的複合体化を行うには潜在的によい部位である（図５）。これらの溶媒に
露出した残基は、センチリン／ＰＳＭＡ界面から離れており、構造的に柔軟な領域に位置
している。
【０２３０】
更に、Ｎ末端領域及びＣ末端領域は、両方とも他のタンパク質ドメインとの融合が行え
るよう自由となっている。Ｎ末端は、ＰＳＭＡプロテアーゼドメインの方向に向いており
、融合リンカーが届くことができるようになっている一方で、やはりアクセス可能なＣ末
端はＰＳＭＡの螺旋状ドメインの方向を向いている。センチリンの融合パートナーまでの
最適なリンカーの長さは、融合パートナーの構造及び標的分子上のその結合部位の位置に
よって決まる。
【０２３１】
作用機序
Ｈ１０センチリンは、センチリン／ＰＳＭＡ複合体が内在化されることから、前立腺癌
細胞内に弾頭分子（毒性小分子、核酸など）を標的化によって送達させるための候補物質
である。更に、Ｈ１０センチリンは、多重特異性型とされる場合に、前立腺癌細胞に免疫
細胞を再び方向付けるための候補物質である。
【０２３２】
Ｈ１０センチリンは、ＰＳＭＡの酵素活性を阻害するとも考えられており、細胞の適応
性及び生存率の低下に寄与している可能性がある。センチリン／ｃｙｎｏＰＳＭＡ構造は
、活性部位の入口に結合したセンチリンを示しており、これにより、立体障害及び結合部
位に対する直接的競合によりＰＳＭＡと基質との相互作用を妨げうる。
【０２３３】
実施例８：更なる抗ＰＳＭＡセンチリン変異体の作製
選択した抗ＰＳＭＡセンチリンを、親センチリンの特性を改良するために更に操作した
。ＰＳＭＡに結合するＦＮ３ドメインを、上記に述べたライブラリを用いて作製し、その
ＰＳＭＡとの結合について試験した。
【０２３４】
【表１３−１】
2022002526.tif 000014
【０２３５】
【表１３−２】
2022002526.tif 000015
【０２３６】
【表１３−３】
2022002526.tif 000016
【０２３７】
【表１３−４】
2022002526.tif 000017
【０２３８】
【表１３−５】
2022002526.tif 000018
【０２３９】
【表１３−６】
2022002526.tif 000019
【０２４０】
【表１３−７】
2022002526.tif 000020
【０２４１】
【表１３−８】
2022002526.tif 000021
【０２４２】
実施例９：蛍光色素と結合させた抗ＰＳＭＡセンチリンを使用した腫瘍細胞上のＰＳＭ
Ａ発現の検出
本実施例は、蛍光色素と結合させた抗ＰＳＭＡセンチリンによる、細胞上に存在するＰ
ＳＭＡの検出を示すものである。アミノ酸５３に遊離システインを有する、Ｃ末端にＨｉ
ｓタグを付加した抗ＰＳＭＡセンチリンＰ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（配列番号４９）を、Ｒ
−フィコエリトリン（ＰＥ）（プロザイム社（Prozyme）、カタログ番号ＰＢ３１）と結
合させた。ＰＥをｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ピアース社（Pierce）、カタログ番号２２１２
２）を用いて６０分間活性化させ、活性化したＰＥを遊離ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣから、Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５及びＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを使用したゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより分離した。センチリンをＴＣＥＰ（シグマ社（Sigma）、カタログ番号６
４６５４７）を用いて３０分間還元した。還元したセンチリンを遊離ＴＣＥＰから、Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５及びＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを使用したゲル濾過クロマトグラ
フィーにより分離した。活性化したＲ−ＰＥを還元センチリンと９０分間共有結合させた
後、Ｎ−エチルマレイミド（シグマ社（Sigma）、カタログ番号０４２６０）で２０分間
、クエンチした。「ＰＥ結合センチリン」を、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣ（
ゼネラル・エレクトリック社（General Electric））上で、東ソー株式会社製ＴＳＫゲル
Ｇ３０００ＳＷカラムを使用し、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ硫酸ナトリウ
ム、０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ６．５）中でサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ
ＥＣ）により精製した。
【０２４３】
ＰＥ結合センチリンを、フローサイトメトリー及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ血液循環腫瘍
細胞（ＣＴＣ）アッセイにより、ＰＳＭＡ陽性及び陰性細胞化ブロックを使用して感受性
及び特異性について試験した。以下の前立腺癌細胞株をＡＴＣＣより購入し、抗ＰＳＭＡ
センチリンの特異性を評価するために使用した。すなわち、ＬＮＣａＰ（高ＰＳＭＡ発現
）、２２Ｒｖ１（低ＰＳＭＡ発現）及びＰＣ３（ＰＳＭＡ発現なし）である。
【０２４４】
フローサイトメトリーによる細胞株上のＰＳＭＡの検出
標準的な細胞培養手順により前立腺癌細胞株を収穫した。細胞（約３０，０００個）を
、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んだ０．１ｍＬのＰＢＳ中で、ＰＥ結合センチ
リンと２０分間染色した。バイオレジェンド社（Biolegend）（クローンＬＮＩ−１７、
カタログ番号３４２５０４）より入手した抗ＰＳＭＡ抗体−ＰＥ複合体を、ポジティブコ
ントロールとして使用した。インキュベーション後、３ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡバッファー
を加え、未結合のＰＥ複合体を８００Ｇで５分間遠心して除去した。上清を吸引して、０
．３ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡ中に、細胞を再懸濁した。ビーディー・バイオサイエンシーズ
社（BD Biosciences）のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにより試料を分析した。各細胞株からの
ＰＳＭＡ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、抗ＰＳＭＡ抗体によるＭＦＩと比較し
た。ＭＦＩは、ＰＳＭＡの発現レベルと直接的な関係を示し、高ＰＳＭＡ発現細胞株から
は高いＭＦＩが得られる。図６は、抗ＰＳＭＡ抗体−ＰＥによるＭＦＩ値と比較した、Ｐ
Ｅ結合センチリンにより検出された異なる細胞株からのＭＦＩ値を示している。
【０２４５】
これらの結果は、ＰＥ結合センチリンがＰＳＭＡ陽性細胞株と結合し、ＰＳＭＡ陰性細
胞と非特異的に結合しないことを示している。ＭＦＩは、予想されたように、低ＰＳＭＡ
発現細胞株（２２Ｒｖ１）による低いＭＦＩと比較して、高ＰＳＭＡ発現細胞（ＬＮＣａ
Ｐ）ではより高くなっている。ＰＳＭＡ陰性細胞株（ＰＣ３）によるＭＦＩは、バックグ
ラウンドシグナルに近い。更に、異なる細胞株との結合におけるＰＥ結合センチリンＥの
性能は、センチリンと抗体複合体の両方において同様のＭＦＩ値が得られたことから、抗
ＰＳＭＡ抗体−ＰＥと同様である。この例は、ＰＴ結合センチリンが、腫瘍細胞上のＰＳ
ＭＡの検出において感受性及び特異性を示すことを示している。
【０２４６】
循環腫瘍細胞アッセイによるＰＳＭＡの検出
上記の結果を、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨアッセイによりＰＥ結合センチリンを試験し、７
．５ｍＬの血液から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出し、計数することによって更に確認し
た。循環腫瘍細胞の計数は、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（ベリデックス社（Veridex LLC）、
米国、ニュージャージー州、ラリタン）を使用し、製造者のプロトコール及びトレーニン
グに従って行った。ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨアッセイでは、磁性流体磁気粒子と結合させた
抗ＥｐＣＡＭを使用して、フルオロセインと結合させたサイトケラチン８、１８及び１９
に特異的な抗サイトケラチンを捕捉することによりＣＴＣを可視化する。ＣＥＬＬＳＥＡ
ＲＣＨアッセイは、試料の調製にＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ  ＡｕｔｏＰｒｅｐを使用し、分
析にはＣＥＬＬＴＲＡＣＫＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）（ＣＴＡ  ＩＩ）を
使用する。ＣＴＡ  ＩＩは、４色の半自動化蛍光顕微鏡であり、ＣＴＣを特定及び計数す
るために３色を使用する。ＣＴＡ  ＩＩの第４の色は、更なる対象とするマーカーによっ
てＣＴＣの表現型を決定するために使用することができる。この例では、組織培養した腫
瘍細胞を正常血液に加えることによって血液中のＣＴＣを再現した。約５００個の腫瘍細
胞（ＬＮＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＰＣ３〜９又はＳＫＢＲ３細胞）を、ＣＥＬＬＳＡＶＥチ
ューブ（ジャンセン・ダイアグノスティクス社（Janssen Diagnostics））中に採取した
７．５ｍｌの正常なドナー血液中に加えた。また、乳癌細胞株（ＳＫＢＲ３）もＰＳＭＡ
陰性細胞株として使用した。各試料を、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ  ＣＸＣキット及びマーカ
ーとしてＰＥ結合センチリンを使用し、ＡｕｔｏＰｒｅｐ上で処理した。ＡｕｔｏＰｒｅ
ｐ試料調製システムは、抗ＥｐＣＡＭ磁性流体を使用して腫瘍細胞を捕捉することによっ
て腫瘍細胞を濃縮するものである。ＣＴＣを濃縮した試料を、有核細胞を識別するための
核酸色素（ＤＡＰＩ）、腫瘍細胞を識別するためのフルオレセインイソチオシアナート（
ＦＩＴＣ）と結合させた抗サイトケラチン抗体、及び白血球を識別するためのアロフィコ
シアニン（ＡＰＣ）と結合させた抗白血球抗体により染色した。試料を０．３２ｍｌの最
終体積にまで処理し、ＭａｇＮｅｓｔ（登録商標）細胞提示装置内に入れたまま、試料チ
ャンバに移した。ＭａｇＮｅｓｔ（登録商標）装置は、ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＳ  Ａｎａｌ
ｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）による分析用に磁気標識した細胞を提示するものである。Ｃ
ＴＡＩＩを用いて試料を分析してＣＴＣを計数し、ＣＴＣ上のＰＳＭＡを検出した。この
分析装置は自動的に試料を分析し、ＤＡＰＩ及びサイトケラチンについて陽性の候補腫瘍
細胞をレビュー用のサムネイル画像として提示するものである。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈア
ッセイにおいてＰＥ結合センチリンで染色した腫瘍細胞から得られた結果を、図７に示す
。ＰＴ結合センチリンで染色したＣＴＣの画像を、ＰＳＭＡ−ＰＥとして示した列に示す
。
【０２４７】
図７Ａは、ＬＮＣａＰ腫瘍細胞上のＰＳＭＡの発現を示しており、これらの細胞の１０
０％がＰＳＭＡについて陽性である。低ＰＳＭＡ発現細胞株（２２Ｒｖ１）は、ＰＳＭＡ
について２６％が陽性である（図７Ｂ）。これに対して、ＰＳＭＡ陰性細胞株（ＰＣ３〜
９及びＳＫＢＲ３）は、ＰＳＭＡについて陰性である（図７Ｃ及び７Ｄ）。これらの結果
は、フローサイトメトリーの結果と一致している。この例では、抗ＰＳＭＡセンチリンを
使用してＣＴＣ上のＰＳＭＡの発現を検出できることが示され、抗ＰＳＭＡセンチリンの
感受性及び特異性が更に確認された。
【０２４８】
配列
配列番号１＝元のテンコン配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲ
ＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ
【０２４９】
配列番号２＝ＴＣＬ１ライブラリ
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ（Ｘ）７〜
１２ＰＬＳＡＥＦＴＴ；
ただし、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２は、任意のアミノ酸又は欠失である。
【０２５０】
配列番号３＝ＴＣＬ２ライブラリ
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＦ
ＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩ
ＹＧＶＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＸ１４Ｘ１５ＬＳＡＥＦＴＴ；
ただし、
Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＴｙｒであり、
Ｘ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、又はＴｈｒであり、
Ｘ９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌであ
り、
Ｘ１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
あり、
Ｘ１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
あり、
Ｘ１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
あり、
Ｘ１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
あり、
Ｘ１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
あり、
Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで
ある。
【０２５１】
配列番号４＝安定化したテンコン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲ
ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【０２５２】
配列番号５＝ＴＣＬ７ライブラリ（ＦＧ及びＢＣループ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９
ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹ
ＴＶＳＩＹＧＶＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＳＮＰ
ＬＳＡＩＦＴＴ；
ただし、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ
１５及びＸ１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ
、Ｗ又はＹであり、
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、Ｘ１８及びＸ１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、
Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、又は欠失である。
【０２５３】
配列番号６＝ＴＣＬ９（ＦＧループ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ  Ｘ１Ｘ２
Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９  Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；
ただし、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、及びＸ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ
、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり、
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、及びＸ１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、
Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、又は欠失である。
【０２５４】
ＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号７）：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３
ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ８ＶＸ９
ＩＸ１０ＧＶＫＧＧＸ１１Ｘ１２ＳＸ１３ＰＬＳＡＩＦＴＴ；
ただし、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、
及びＸ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ
、Ｙ、Ｃ、又はＭである。
【０２５５】
ＴＣＬ２４ライブラリ（配列番号８）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３
ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＸ８ＬＸ９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１０
ＶＸ１１ＩＸ１２ＧＶＫＧＧＸ１３Ｘ１４ＳＸ１５ＰＬＸ１６ＡＸ１７ＦＴＴ；
ただし、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ
１５、Ｘ１６、及びＸ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、
Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙ、又はＷである。
【０２５６】
配列番号９＝Ｓｌｏｎｉｎｇ−ＦＯＲ
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣ
【０２５７】
配列番号１０＝Ｓｌｏｎｉｎｇ−ＲＥＶ
ＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧ
【０２５８】
配列番号１１＝ＰＯＰ２２５０
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣ
【０２５９】
配列番号１２＝ＤｉｇＬｉｇＲｅｖ
ＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡ
【０２６０】
配列番号１３＝ＢＣ９
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧ
ＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡ
ＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣ
ＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣ
ＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【０２６１】
配列番号１４＝ＢＣ８
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣ
ＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣ
ＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧ
ＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴ
ＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【０２６２】
配列番号１５＝ＢＣ７
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧ
ＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡ
ＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴ
ＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴ
ＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【０２６３】
配列番号１６＝ＢＣ６
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴ
ＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【０２６４】
配列番号１７＝１３０ｍｅｒ−Ｌ１７Ａ  ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡ
ＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣ
ＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡ
ＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧ
【０２６５】
配列番号１８＝ＰＯＰ２２２ｅｘｔ
ＣＧＧ  ＣＧＧ  ＴＴＡ  ＧＡＡ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＴＡＣ
【０２６６】
配列番号１９＝ＬＳ１１１４
ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＧＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＡＡＣ
ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＣＧＧ
ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＴＴＣ
【０２６７】
配列番号２０＝ＬＳ１１１５
ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＧＧ
【０２６８】
配列番号２１＝ＬＳ１１１７
ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＣＴＧ  ＧＡＴ
ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＧＡＡ
【０２６９】
配列番号２２＝ＳＤＧ１０
ＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＣ
ＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴ
【０２７０】
配列番号２３＝ＳＤＧ２４
ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＧＧＴＴＡＧ
【０２７１】
配列番号２４＝ＰＯＰ２２２２
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣ
【０２７２】
配列番号２５＝ＳＤＧ２８
ＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣ
ＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣ
【０２７３】
配列番号２６＝ＦＧ１２
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣ
ＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣ
ＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡ
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【０２７５】
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【０２７７】
配列番号３０＝ＦＧ８
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【０２７８】
配列番号３１＝ＦＧ７
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【０２７９】
配列番号３２＝ＰＳＭＷ１（Ｎ’−ＡｖｉＴａｇ−ＨｉｓＴａｇ−ＧＳ−ＣｙｎｏＰＳ
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【０２８０】
配列番号３３＝ＰＳＭＷ８（Ｎ’−ＡｖｉＴａｇ−ＨｉｓＴａｇ−ＧＳ−Ｃｈｉｍｐ  
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【０２８１】
配列番号３４：ヘキサヒスチジンタグ
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配列番号３７＝Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７１＿Ｆ０４
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配列番号３９＝Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７１＿Ｄ０２
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配列番号４４＝Ｐ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｄ９
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【０２９２】
配列番号４５＝Ｐ２３４ＣＲ９＿Ａ０７
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【０２９３】
配列番号４６＝Ｐ２３４ＣＲ９＿Ｈ０１
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配列番号４８＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｋ６２Ｃ）
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配列番号４９＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｅ５３Ｃ）
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【０２９７】
配列番号５０＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｒ１１Ｃ）
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【０２９８】
配列番号５１＝非標的化センチリン（Ｋ６２Ｃ）
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【０２９９】
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【０３００】
配列番号５３＝タグ無しソルターゼＡ
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【０３０１】
配列番号５４：ＴＥＶプロテアーゼ切断部位
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【０３０２】
配列番号５５：テンコンのＦＧループ
ＫＧＧＨＲＳＮ
【０３０３】
配列番号５６：ＢＣループ
ＤＩＤＥＱＲＤＷ
【０３０４】
配列番号５７：ＢＣループ
ＴＩＤＥＱＲＤＷ
【０３０５】
配列番号５８：ＢＣループ
ＶＩＤＥＱＲＤＷ
【０３０６】
配列番号５９：ＢＣループ
ＡＩＤＥＱＲＤＷ
【０３０７】
配列番号６０：ＢＣループ
ＥＷＷＶＩＰＧＤ
【０３０８】
配列番号６１：ＢＣループ
ＧＥＱＦＴＩ
【０３０９】
配列番号６２：ＢＣループ
ＴＡＰＤＡＡ
【０３１０】
配列番号６３：Ｃループ
ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥ
【０３１１】
配列番号６４：Ｃループ
ＦＥＳＦＬＩＱＹＱＥ
【０３１２】
配列番号６５：Ｃループ
ＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥ
【０３１３】
配列番号６６：Ｃループ
ＦＤＳＦＰＩＧＹＷＥ
【０３１４】
配列番号６７：Ｃループ
ＦＤＳＦＴＩＧＹＷＥ
【０３１５】
配列番号６８：ＣＤループ
ＳＥＫＶＧＥ
【０３１６】
配列番号６９：ＣＤループ
ＷＤＤＤＧＥ
【０３１７】
配列番号７０：Ｆループ
ＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
【０３１８】
配列番号７１：Ｆループ
ＴＥＹＴＶＳＩＹＧ
【０３１９】
配列番号７２：Ｆループ
ＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶ
【０３２０】
配列番号７３：Ｆループ
ＴＥＹＷＶＹＩＡＧＶ
【０３２１】
配列番号７４：Ｆループ
ＴＥＹＨＶＹＩＡＧＶ
【０３２２】
配列番号７５〜１４０は、上記表に示す。
【０３２３】
配列番号１４１：完全長ｃｙｎｏＰＳＭＡ
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ＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＳＥＶＴＲＩＹＮＶＩ
ＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶ
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ＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＹＮＬＴＫ
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＞１４２リンカー
ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＡＡ
＞１４３ヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤ
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ＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩ
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ＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳ
ＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
＞１４４シグナル配列を有するヒトＦＬ  ＰＳＭＡ
ＭＷＮＬＬＨＥＴＤＳＡＶＡＴＡＲＲＰＲＷＬＣＡＧＡＬＶＬＡＧＧＦＦＬＬＧＦＬＦ
ＧＷＦＩＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱ
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ＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
＞１４５テネイシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン
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＞１４６フィブコン
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＞１４７フィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン
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ＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ
＞１４８
ＧＳＧＳ
＞１４９
ＧＧＧＳＧＧＧＳ
＞１５０
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
＞１５１
ＡＰＡＰ
＞１５２
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
＞１５３
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
＞１５４
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ
Ｐ
＞１５５アルブミン変異体
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＞１５６  ｃＤＮＡ  Ｈ１０
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ＣＴＴＣＣＣＧＣＴＧＡＧＣＧＣＧＡＴＣＴＴＴＡＣＣＡＣＣ
＞１５７  ｃＤＮＡ  Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７１＿Ｄ０２
ＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＧＴＧＴＣＡＣＴ
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ＧＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴ
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ＣＣＧＴＡＧＣＡＡＴＣＣＧＣＴＧＡＧＣＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣ
＞１５８  ｃＤＮＡ
Ｐ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｈ３−１
ＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＴＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣ
ＧＡＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧ
ＣＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡ
ＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＡＧＣＧＡＧ
ＣＧＴＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＡＣＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＴ
ＡＴＣＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴＴＧＣＧＧＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧＴＣ
ＧＴＴＣＣＣＧＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＴＡＣＧＡＣＣ
＞１５９  ＰＳＭＡエピトープ
ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ
＞１６０  ＰＳＭＡエピトープ
ＮＷＥＴＮＫＦ
【図１】
2022002526.tif 000023
【図２Ａ】
2022002526.tif 000024
【図２Ｂ】
2022002526.tif 000025
【図２Ｃ】
2022002526.tif 000026
【図３Ａ】
2022002526.tif 000027
【図３Ｂ】
2022002526.tif 000028
【図４Ａ】
2022002526.tif 000029
【図４Ｂ】
2022002526.tif 000030
【図５】
2022002526.tif 000031
【図６】
2022002526.tif 000032
【図７Ａ】
2022002526.tif 000033
【図７Ｂ】
2022002526.tif 000034
【図７Ｃ】
2022002526.tif 000035
【図７Ｄ】
2022002526.tif 000036
【配列表】
2022002526000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年10月26日(2021.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４７】
図７Ａは、ＬＮＣａＰ腫瘍細胞上のＰＳＭＡの発現を示しており、これらの細胞の１００％がＰＳＭＡについて陽性である。低ＰＳＭＡ発現細胞株（２２Ｒｖ１）は、ＰＳＭＡについて２６％が陽性である（図７Ｂ）。これに対して、ＰＳＭＡ陰性細胞株（ＰＣ３〜９及びＳＫＢＲ３）は、ＰＳＭＡについて陰性である（図７Ｃ及び７Ｄ）。これらの結果は、フローサイトメトリーの結果と一致している。この例では、抗ＰＳＭＡセンチリンを使用してＣＴＣ上のＰＳＭＡの発現を検出できることが示され、抗ＰＳＭＡセンチリンの感受性及び特異性が更に確認された。
以下の態様を包含し得る。
［１］  配列番号１４４のヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する、単離ＦＮ３ドメイン。
［２］  前記ＦＮ３ドメインが、配列番号３２のマカカ・ファシキュラリス（Macaca Fascicularis）（カニクイザル）ＰＳＭＡ、又は配列番号３３のパン・トログロダイテス（Pan troglodytes）（チンパンジー）ＰＳＭＡと交差反応する、上記［１］に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［３］  ａ）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１のテンコン配列又は配列番号４のテンコン２７の配列に基づいたものであり、前記配列番号１又は配列番号４が、場合により、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び／又は８６に置換を有するか、あるいは、
ｂ）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号２、３、５、６、７又は８の配列を含むライブラリから単離される、上記［２］に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［４］  第２の分子と結合させた、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［５］  前記第２の分子が、細胞毒性物質、検出可能な標識、ポリエチレングリコール、又は核酸である、上記［４］に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［６］  前記細胞毒性物質が、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン、ドラスタチン（dolostatin）、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素、又は放射性同位体である、上記［５］に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［７］  前記検出可能な標識が、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンである、上記［５］に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［８］  前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、５２、５３、６２に対応する少なくとも１つの残基位置、又はＣ末端にシステイン残基を有する、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［９］  前記ＦＮ３ドメインが、ヒトＰＳＭＡの酵素活性を阻害する、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［１０］  前記ＦＮ３ドメインが、ヒトＰＳＭＡとの結合について配列番号４１のＦＮ３ドメインと競合する、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［１１］  前記ＦＮ３ドメインが、ヒトＰＳＭＡの領域ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ（配列番号１５９）及びＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号１６０）に結合する、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［１２］  前記ＦＮ３ドメインが、配列番号４１のアミノ酸配列と８９％同一であるか、又は配列番号４１のアミノ酸配列と比較した場合に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個の置換を有する、アミノ酸配列を有する、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［１３］  前記ＦＮ３ドメインが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、又は１４０のアミノ酸配列を有する、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［１４］  前記ＦＮ３ドメインのＮ末端にメチオニンを更に有する、上記［１３］に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［１５］  半減期延長部分と結合された、上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［１６］  前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、アルブミン変異体、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、上記［１５］に記載の単離ＦＮ３ドメイン。
［１７］  上記［１］〜［１６］のいずれかに記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
［１８］  配列番号１５６、１５７、又は１５８のポリヌクレオチド配列を有する、単離ポリヌクレオチド。
［１９］  上記［１７］又は［１８］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［２０］  上記［１９］に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
［２１］  上記［１］〜［１６］のいずれかに記載のＦＮ３ドメインを生成する方法であって、上記［２０］に記載の単離宿主細胞を、前記ＦＮ３ドメインが発現されるような条件下で培養することと、前記ＦＮ３ドメインを精製することと、を含む、方法。
［２２］  上記［１］〜［１６］のいずれかに記載のＦＮ３ドメイン及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
［２３］  ＰＳＭＡの過剰発現によって特徴付けられる癌を有する対象を治療する方法であって、細胞毒性物質と結合させた上記［１］〜［１６］のいずれかに記載のＦＮ３ドメインの治療有効量を、前記癌を治療するうえで充分な時間にわたって、治療を要する患者に投与することを含む、方法。
［２４］  前記癌が、固形腫瘍、前立腺癌、大腸直腸癌、胃癌、腎明細胞癌、膀胱癌、肺癌、又は腎臓癌である、上記［２３］に記載の方法。
［２５］  上記［５］〜［１６］のいずれかに記載のＦＮ３ドメインを含む、診断用キット。
［２６］  上記［１］〜［１６］のいずれかに記載のＦＮ３ドメインを含む、癌診断又は捕捉剤。
［２７］  前記ＦＮ３ドメインが、配列番号４９の位置６、１１、２２、２５、２６、５２、５３、５４、又は６２に対応する少なくとも１つの残基位置にシステイン残基を配置することによって改変された、配列番号４９の配列を有する、上記［２６］に記載の診断又は捕捉剤。
［２８］  前記改変されたシステインが、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）と結合させられる、上記［２６］に記載の診断剤。
［２９］  生体試料中のＰＳＭＡ発現細胞を検出する方法であって、前記生体試料を上記［２６］〜２８］のいずれかに記載の診断試薬で処理することと、前記生体試料の、前記診断剤の前記ＦＮ３ドメインとの結合を評価することと、を含む、方法。
［３０］  前記診断剤が、上記［２８］に記載の剤である、上記［２９］に記載の方法。
［３１］  生体試料中のＰＳＭＡ発現細胞を単離する方法であって、前記生体試料を上記［２６］又は［２７］に記載の捕捉剤で処理することを含む、方法。
［３２］  対象内のＰＳＭＡ発現腫瘍細胞を検出する方法であって、前記対象に上記［４］〜［１６］のいずれかに記載のＦＮ３ドメインを投与することと、前記対象内における、前記ＦＮ３ドメインのＰＳＭＡ発現腫瘍細胞との結合を検出することと、を含む、方法。
［３３］  ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞に治療分子を送達する方法であって、上記［５］〜［１６］のいずれかに記載のＦＮ３ドメインを、ＰＳＭＡ発現腫瘍を有する対象に投与することを含む、方法。
【外国語明細書】
2022002526000001.pdf