(57)【要約】【課題】  血小板凝集に関連する新規遺伝子を見出し、該治療剤および予防剤として有用な物質を得る方法等を提供する。【解決手段】  血小板凝集に関連する因子であるｇｐ４４を利用した血小板凝集に関連する化合物のスクリーニング方法、活性測定方法、該方法により取得された化合物、該方法に用いるキット、血小板凝集活性を喪失した変異体ポリペプチド、並びに、血小板凝集に関連する疾患の、モデル動物、診断方法、治療または予防のための医薬組成物等の提供。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板凝集促進または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）ｇｐ４４を発現する細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養する；
（２）上記（１）で得られた培養細胞における、下記（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡの発現を検出する：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
（３）上記（２）で検出したｍＲＮＡの発現量を、被験物質の存在下で培養した細胞と、被験物質の非存在下で培養した細胞とで比較する；
（４）被験物質の非存在下で培養した細胞と比較して、ｍＲＮＡの発現量が少ない物質を血小板凝集抑制活性を有する物質として選択しまたはｍＲＮＡの発現量が多い物質を血小板凝集促進活性を有する物質として選択する。
【請求項２】
ｍＲＮＡの発現の検出手段が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法またはランオン・アッセイ法であることを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
血小板凝集促進または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）ｇｐ４４を発現する細胞を被験物質の存在下で培養する；
（２）上記（１）で得られた培養細胞における、下記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現を検出する：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
（３）上記（２）で検出したペプチドの発現量を、被験物質の存在下で培養した細胞と、被験物質の非存在下で培養した細胞とで比較する；
（４）被験物質の非存在下で培養した細胞と比較して、ペプチドの発現量が少ない物質を血小板凝集抑制活性を有する物質として選択しまたはペプチドの発現量が多い物質を血小板凝集促進活性を有する物質として選択する。
【請求項４】
ポリペプチドの発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法)であることを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
物質の、血小板凝集促進または抑制活性を測定する方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）ｇｐ４４を発現する細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養する；
（２）上記（１）で得られた培養細胞における、下記（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡの発現を検出する：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリペプチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（３）上記（２）で検出したｍＲＮＡの発現量を、被験物質の存在下で培養した細胞と、被験物質の非存在下で培養した細胞とで比較する；
（４）被験物質の非存在下で培養した細胞と比較して、ｍＲＮＡの発現量が少ない場合は血小板凝集抑制活性を有しまたはｍＲＮＡの発現量が多い場合は血小板凝集促進活性を有すると判定する。
【請求項６】
ｍＲＮＡの発現の検出手段が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＰＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法またはランオン・アッセイ法であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
物質の、血小板凝集促進または抑制活性を測定する方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）ｇｐ４４を発現する細胞を被験物質の存在下で培養する；
（２）上記（１）で得られた培養細胞における、下記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現を検出する：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
（３）上記（２）で検出したペプチドの発現量を、被験物質の存在下で培養した細胞と、被験物質の非存在下で培養した細胞とで比較する；
（４）被験物質の非存在下で培養した細胞と比較して、ペプチドの発現量が少ない場合は血小板凝集抑制活性を有しまたはペプチドの発現量が多い場合は血小板凝集促進活性を有すると判定する。
【請求項８】
ポリペプチドの発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法)であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
血小板凝集抑制活性が、癌、癌の転移、肺血栓、脳梗塞、心筋梗塞もしくは動脈硬化または血管手術の際の血小板凝集の治療効果または予防効果である請求項１乃至８に記載の方法。
【請求項１０】
血小板凝集促進活性が、出血傾向、血液凝固障害、血友病、尿毒症または慢性骨髄増殖性疾患の治療効果または予防効果である請求項１乃至８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
血小板凝集促進に関連する疾患のモデル動物であって、下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が、該遺伝子を高発現することができるように導入されている非ヒトトランスジェニック動物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１２】
血小板凝集促進に関連する疾患が、癌、癌の転移、肺血栓、脳梗塞、心筋梗塞もしくは動脈硬化または血管手術の際の血小板凝集である、請求項１１に記載の動物。
【請求項１３】
物質の、血小板凝集促進活性または血小板凝集促進に関連する疾患の治療剤若しくは予防剤としての効果を試験する方法であって、下記の工程を含む方法：
（１）請求項１１又は１２に記載の動物に被験物質を投与する；および
（２）（１）の動物の血小板凝集能を測定する。
【請求項１４】
血小板凝集抑制に関連する疾患のモデル動物であって、下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が、該遺伝子を低発現することができるように導入されている非ヒトトランスジェニック動物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１５】
血小板凝集抑制に関連する疾患のモデル動物であって、下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が、ノックアウトされている非ヒト動物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１６】
血小板凝集抑制に関連する疾患が、出血傾向、血液凝固障害、血友病、尿毒症または慢性骨髄増殖性疾患である、請求項１４または１５に記載の動物。
【請求項１７】
物質の、血小板凝集抑制活性または血小板凝集抑制に関連する疾患の治療剤若しくは予防剤としての効果を試験する方法であって、下記の工程を含む方法：
（１）請求項１４乃至１６に記載の動物に被験物質を投与する；および
（２）（１）の動物の血小板凝集能を測定する。
【請求項１８】
検体中の、下記（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列からなるｍＲＮＡの発現量を解析することによる、該検体提供者または該検体提供動物の血小板凝集または血小板機能障害に関連する疾患の診断方法：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１９】
ｍＲＮＡの発現の検出手段が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＰＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法またはランオン・アッセイ法であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
検体中の、下記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現量を解析することによる、該検体提供者または該検体提供動物の血小板凝集または血小板機能障害に関連する疾患の診断方法：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドの発現量の検出手段が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
血小板凝集に関連する疾患が、癌、癌の転移、肺血栓、脳梗塞、心筋梗塞もしくは動脈硬化または血管手術の際の血小板凝集であることを特徴とする、請求項１８乃至２１から選択されるいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
血小板凝集に関連する疾患が、結腸癌、直腸癌、小腸癌、精巣癌、セミノーマ（Seminoma）又は扁平上皮癌であることを特徴とする、請求項１８乃至２１から選択されるいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
血小板機能障害に関連する疾患が、出血傾向、血液凝固障害、血友病、尿毒症または慢性骨髄増殖性疾患であることを特徴とする、請求項１８乃至２１から選択されるいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
下記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに被験物質を含む試料を接触させ、次いで、該ポリペプチドに結合した物質を分離することを特徴とする、血小板凝集促進または抑制活性を有する物質の単離方法。
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
【請求項２６】
下記（ｉ）乃至（ＸＩＶ）のいずれか一つに記載のポリペプチドに被験物質を含む試料を接触させ、次いで、該ポリペプチドに結合した物質を分離することを特徴とする、血小板凝集促進または抑制活性を有する物質の単離方法：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号６７から１３２に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号６７から１３２に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１０３から１９８に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号８８から１８６に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号８２から１８６に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４１のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５０のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５２のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ＩＸ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（Ｘ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４６から５１のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＩ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５７から６２のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＩＩ）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＶ）上記（ｉｉｉ）乃至（ＸＩＩＩ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２７】
血小板凝集促進活性または血小板凝集抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（１）被験物質の存在下でｇｐ４４を発現する細胞と血小板を接触させる：
（２）血小板凝集活性を測定する：
（３）（２）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は抑制活性を有するか否かを判定する。
【請求項２８】
血小板凝集促進活性または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（１）被験物質の存在下でｇｐ４４と血小板を接触させる：
（２）血小板凝集活性を測定する：
（３）（２）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は抑制活性を有するか否かを判定する。
【請求項２９】
血小板凝集促進活性または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（１）被験物質の存在下でｇｐ４４を発現する細胞を非ヒト哺乳動物に投与する：
（２）（１）の非ヒト哺乳動物由来の組織における結節数を測定する：
（３）（２）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は血小板凝集抑制活性を有するか否かを判定する。
【請求項３０】
癌の転移抑制活性又は癌の転移促進活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（１）被験物質の存在下でｇｐ４４を発現する細胞を非ヒト哺乳動物に投与する：
（２）（１）の非ヒト哺乳動物由来の組織における結節数を測定する：
（３）（２）の測定結果に基づいて、被験物質が癌の転移抑制活性又は癌の転移促進活性を有するか否かを判定する。
【請求項３１】
下記の（１）乃至（３）のいずれか一項に記載の物質を少なくとも一つ含むことからなる、血小板凝集促進または抑制活性を有する物質を検出するためのキット：
（１）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズする、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
（３）（１）又は（２）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料。
【請求項３２】
下記の（１）乃至（３）のいずれか一項に記載の物質を少なくとも一つ含むことからなる、血小板凝集促進または抑制活性を有する物質を検出するためのキット：
（１）配列表の配列番号２、４、６、８または１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体；
（２）（１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体；
（３）（１）又は（２）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料。
【請求項３３】
下記の（１）乃至（３）のいずれか一項に記載の物質を少なくとも一つ含むことからなる、血小板凝集に関連する疾患を検出するためのキット：
（１）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズする、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
（３）（１）又は（２）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料。
【請求項３４】
下記の（１）乃至（３）のいずれか一項に記載の物質を少なくとも一つ含むことからなる、血小板凝集に関連する疾患を検出するためのキット：
（１）配列表の配列番号２、４、６、８または１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体；
（２）（１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体；
（３）（１）又は（２）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料。
【請求項３５】
血小板凝集に関連する疾患が癌、癌の転移、肺血栓、脳梗塞、心筋梗塞または動脈硬化であることを特徴とする、請求項３３または請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
血小板凝集に関連する疾患が結腸癌、直腸癌、小腸癌、精巣癌、セミノーマ（Seminoma）、扁平上皮癌であることを特徴とする、請求項３３または請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
下記（ｉ）乃至（ＸＩＶ）のいずれか一つに記載のポリペプチドにに特異的に結合し、血小板凝集阻害活性を有する抗体：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号６７から１３２に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号６７から１３２に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１０３から１９８に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号８８から１８６に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号８２から１８６に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４１のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５０のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５２のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ＩＸ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（Ｘ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４６から５１のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＩ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５７から６２のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＩＩ）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＶ）上記（ｉｉｉ）乃至（ＸＩＩＩ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３８】
請求項１乃至４、並びに、請求項２７乃至３０のいずれか１項に記載された方法により選択された物質、または請求項２５又は２６に記載の方法により単離された物質。
【請求項３９】
下記の（ａ）乃至（ｆ）のいずれか一つに記載のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号３４のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号３４のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号４１のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド；
（ｄ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号５０のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド；
（ｅ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号５２のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド；
（ｆ）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号３４のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド。
【請求項４０】
他のアミノ酸がアラニンであることを特徴とする、請求項３１に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項４１】
請求項３９又は４０に記載の変異体ポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
【請求項４２】
下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４３】
下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドを含有する医薬組成物。
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４４】
下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが組み込まれているベクターを含む、医薬組成物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４５】
下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドが組み込まれているベクターを含む、医薬組成物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４６】
下記の（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドを含有する医薬組成物：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
【請求項４７】
下記の（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドをと特異的に結合する抗体を含有する医薬組成物：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
【請求項４８】
請求項１乃至４、並びに、請求項２７乃至３０のいずれか１項に記載された方法により選択された物質、または請求項２５又は２６に記載の方法により単離された物質を含有する医薬組成物。
【請求項４９】
血小板凝集促進のための、請求項４２、４４及び４６から選択されるいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
血小板凝集抑制のための、請求項４３、４５、４７及び４８から選択されるいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
結腸癌、直腸癌、小腸癌、精巣癌、セミノーマ（Seminoma）、扁平上皮癌、癌の転移、肺血栓、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化、出血傾向、血液凝固障害、血友病、尿毒症もしくは慢性骨髄増殖性疾患の治療もしくは予防のためまたは血管手術の際の血小板凝集を抑制するための、請求項４３、４５、４７及び４８から選択されるいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板凝集に関連する因子を利用した血小板凝集に関連する化合物のスクリーニング方法、活性測定方法、該方法により取得された化合物、該方法に用いるキット、血小板凝集活性を喪失した変異体ポリペプチド、並びに、血小板凝集に関連する疾患の、モデル動物、診断方法、治療または予防のための医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板凝集とは、外傷などにより損傷を受けた血管や血管壁に露出したコラーゲンとフォンヴィレブラント因子が血小板と結合し、さらにコラーゲンやフォンヴィレブラント因子と結合して内部構造が壊れて活性化した血小板より遊離されたトロンボキサンとADPが新しい血小板の活性化を引き起こして外傷部位への粘着を誘導して血小板の止血栓を形成して血流を止める作用をいい、傷からの失血を防止するために重要な役割を果たしている。
【０００３】
血小板が関与していると考えられている疾患は多数存在し、例えば、肺血栓塞栓症(例えば、非特許文献１参照。)、脳梗塞（例えば、非特許文献２及び３参照。）、虚血性心疾患、静脈血栓症、末梢動脈血栓症、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、抗リン脂質抗体症候群、高脂血症、糖尿病性慢性合併症、糸球体腎炎、肝疾患、移植、川崎病および血小板凝集能亢進症等に関連することが知られている(例えば、非特許文献４〜６参照。)。
【０００４】
また、血小板数の先天的または後天的減少や機能障害により、出血傾向、血液凝固障害、血友病、尿毒症、慢性骨髄増殖性疾患等を引き起こすことが知られている(例えば、非特許文献７参照。)。
【０００５】
癌細胞は、種々の血小板凝集物質を放出し、癌細胞内の血栓形成や過凝固状態を促進し、血小板と相互作用して血栓を形成することにより血行性転移を助長するので、癌の転移において、癌細胞と血小板の相互作用が重要な役割をしていることが知られている（例えば、非特許文献８参照。）。特に、骨肉腫（乳幼児に多い）は、血小板凝集を起こすことが知られており、肺転移と相関することが知られている（例えば、非特許文献９参照。）。
【０００６】
マウス末梢リンパ節のＴ細胞依存領域のＩ型胸腺上皮細胞と間質細胞に、gp38という膜タンパクが発現することが知られている（例えば、非特許文献１０参照。）。またgp38のマウスのホモログとしてgp38Pもクローニングされている（例えば、非特許文献１１参照。）。gp38のラットホモログである、E11 antigenは骨芽細胞系の新しいマーカーとして報告されている（例えば、非特許文献１２参照。）。また、gp38のラットホモログであるT1αは、肺のＩ型肺胞上皮細胞上に発現しており、これはＩＩ型の肺胞上皮細胞には発現していないことが示されている（例えば、非特許文献１３参照。）。また、gp38のラットホモログであるT1αは肺胞上皮幹細胞からＩ型肺胞上皮細胞への分化とともに発現されてくることが知られている。更に、gp38のラットホモログであるpodoplaninは、43kDaの糖タンパク質（T1αと99％ホモロジー）で、腎の糸球体上皮細胞（podocyte）に発現しており、ヒトの微小変化群（ネフローゼ症候群のひとつの病理組織型）のラットモデルで、発現が落ちることも報告されている（例えば、非特許文献１４参照。）。
【０００７】
gp38のイヌホモログであるgp40は、type-I Madin-Darby canine kidney (MDCK) 細胞に発現していることが報告されており（例えば、非特許文献１５参照。）、分子量40kDaのシアロ糖タンパク質（sialoglycoprotein）であり、O-結合型糖鎖が豊富で、N-結合型糖鎖の付加部位はない。gp40はイヌの肺、腸、腎、脳、心臓に発現している。
【０００８】
gp38のヒトホモログとして、gp36が発見されている（例えば、非特許文献１６参照。）。gp36はヒト肺、胎盤、骨格筋に高発現（脳、腎、肝に低発現）している。
【０００９】
このようにgp38（あるいはgp38P）に関しては、ホモログも含め、多くの研究がなされてきているにも関わらず、gp38（あるいはgp38P）の機能に関しては、これまで明らかになっていない。
【００１０】
一方、マウスの結腸癌細胞株colon adenocarcinoma 26を繰り返し実験的肺転移させることにより、高転移性株であるNL-17細胞と低転移性株であるNL-14細胞が取得されている（例えば、非特許文献１７参照。）。このNL-17細胞表面に発現する血小板凝集因子gp44はマウスの血小板を凝集させ、その結果肺転移を起こすことが示唆されている（例えば、非特許文献１８参照。）。
【００１１】
しかし、血小板凝集因子gp44の遺伝子配列およびアミノ酸配列については、これまでに報告されていなかった。
【非特許文献１】「臨床成人病」、１９９０年、第２０巻、ｐ.１９９５−２００１
【非特許文献２】「ストローク（Stroke）」、１９８５年、第１６巻、ｐ.５２４−５２６
【非特許文献３】「ストローク（Stroke）」、１９８９年、第２０巻、ｐ.１２７１−１２７２
【非特許文献４】山中学、山崎博男編、「血小板」、医学書院、１９９１年１月、ｐ.２５１−２５３
【非特許文献５】斎藤英彦編、「高血栓薬の基礎と臨床」、医薬ジャーナル社、ｐ.１２３−２３０
【非特許文献６】藤田稠清、「血小板凝集能亢進症と疾患」、金原出版、２００１年６月
【非特許文献７】松田保、「止血・血栓の臨床」、新興医学出版社、１９９６年４月、ｐ.６５−８４
【非特許文献８】「ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Journal of National Cancer Institute）」、１９９９年、第９１巻、ｐ．２２−３６
【非特許文献９】「キャンサー・リサーチ（Cancer Research）」、１９８７年、第４７巻、ｐ．３１１５−３１１７７
【非特許文献１０】「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（The Journal of Experimental Medicine）」、１９９２年、第１７６巻、ｐ．１４７７−１４８２
【非特許文献１１】「ネフロロジー・ダイアリシス・トランスプランテーション（Nephrology Dialysis Transplantation）」、２００２年、第１７巻、ｐ．９７８−９８４
【非特許文献１２】「ボーン（Bone）」、１９９６年、第１８巻、ｐ．１２５−１３２
【非特許文献１３】「アメリカン・ジャーナル・オブ・レスピラトリー・セル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（American Journal of Respiratory cell and Molecular Biology）」、１９９０年、第１９巻、ｐ．１４３−１４９
【非特許文献１４】「ザ・アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（The American Journal of Pathology）」、 １９９７年、第１５１巻、ｐ．１１４１−１１５２
【非特許文献１５】「バイオケミカル・ジャーナル（Biochemical Journal）」、１９９７年、第３２６巻、ｐ．９９−１０８
【非特許文献１６】「バイオケミカル・ジャーナル（Biochemical Journal）」、１９９９年、第３４１巻、ｐ．２７７−２８４
【非特許文献１７】「キャンサー・リサーチ（Cancer Research）」、１９８３年、第４３巻、ｐ．５４３７−５４４２
【非特許文献１８】「キャンサーリサーチ（Cancer Research）」、１９９１年、第５１巻、ｐ．９２１−９２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、血小板凝集に関連する新規遺伝子を見出し、血小板凝集に関連する新規物質、血小板凝集または血小板機能低下に関連する疾患の治療剤および予防剤、該治療剤および予防剤として有用な物質を得る方法、物質の血小板凝集促進・阻害活性を測定する方法、血小板凝集に関連するポリペプチドの機能の解明、並びに、血小板凝集または血小板機能低下に関連する疾患の診断方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、血小板凝集に関連する遺伝子を探索する目的で、血小板凝集作用を有する事が知られていたｇｐ４４の遺伝子配列を特定すべく鋭意努力した結果、gp38Pとして知られているタンパク質の遺伝子配列がｇｐ４４をコードしていることを見出した。また、本発明者らは、この配列にコードされたタンパク質（ｇｐ３８P）またはこの配列にコードされたタンパク質の発現に関与する物質が血小板凝集促進剤または血小板凝集抑制剤として使用できること、またgp38Pのホモログタンパク質またはこのホモログタンパク質の発現に関与する物質が血小板凝集促進剤または血小板凝集抑制剤として使用できること、そして、該蛋白質が血小板凝集作用を有するために必須のアミノ酸を特定し、並びに、これら配列にコードされるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を測定することにより、血小板凝集に関連する物質の探索および評価並びに血小板凝集または血小板機能低下に関連する疾患の診断に利用できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
本発明は、
（１）  血小板凝集促進または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（ｉ）ｇｐ４４を発現する細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養する；
（ｉｉ）上記（ｉ）で得られた培養細胞における、下記（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡの発現を検出する：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で検出したｍＲＮＡの発現量を、被験物質の存在下で培養した細胞と、被験物質の非存在下で培養した細胞とで比較する；
（ｉｖ）被験物質の非存在下で培養した細胞と比較して、ｍＲＮＡの発現量が少ない物質を血小板凝集抑制活性を有する物質として選択しまたはｍＲＮＡの発現量が多い物質を血小板凝集促進活性を有する物質として選択する、
（２）  ｍＲＮＡの発現の検出手段が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法またはランオン・アッセイ法であることを特徴とする、（１）に記載のスクリーニング方法、
（３）  血小板凝集促進または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）ｇｐ４４を発現する細胞を被験物質の存在下で培養する；
（ｂ）上記（ａ）で得られた培養細胞における、下記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現を検出する：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
（ｃ）上記（ｂ）で検出したペプチドの発現量を、被験物質の存在下で培養した細胞と、被験物質の非存在下で培養した細胞とで比較する；
（ｄ）被験物質の非存在下で培養した細胞と比較して、ペプチドの発現量が少ない物質を血小板凝集抑制活性を有する物質として選択しまたはペプチドの発現量が多い物質を血小板凝集促進活性を有する物質として選択する、
（４）  ポリペプチドの発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）であることを特徴とする、（３）に記載のスクリーニング方法、
（５）  物質の、血小板凝集促進または抑制活性を測定する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ｉ）ｇｐ４４を発現する細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養する；
（ｉｉ）上記（ｉ）で得られた培養細胞における、下記（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡの発現を検出する：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリペプチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）上記（ｂ）で検出したｍＲＮＡの発現量を、被験物質の存在下で培養した細胞と、被験物質の非存在下で培養した細胞とで比較する；
（ｄ）被験物質の非存在下で培養した細胞と比較して、ｍＲＮＡの発現量が少ない場合は血小板凝集抑制活性を有しまたはｍＲＮＡの発現量が多い場合は血小板凝集促進活性を有すると判定する、
（６）  ｍＲＮＡの発現の検出手段が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＰＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法またはランオン・アッセイ法であることを特徴とする、（５）に記載の方法、
（７）  物質の、血小板凝集促進または抑制活性を測定する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）ｇｐ４４を発現する細胞を被験物質の存在下で培養する；
（ｂ）上記（ａ）で得られた培養細胞における、下記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現を検出する：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
（ｃ）上記（ｂ）で検出したペプチドの発現量を、被験物質の存在下で培養した細胞と、被験物質の非存在下で培養した細胞とで比較する；
（ｄ）被験物質の非存在下で培養した細胞と比較して、ペプチドの発現量が少ない場合は血小板凝集抑制活性を有しまたはペプチドの発現量が多い場合は血小板凝集促進活性を有すると判定する、
（８）  ポリペプチドの発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）であることを特徴とする、（７）に記載の方法、
（９）  血小板凝集抑制活性が、癌、癌の転移、肺血栓、脳梗塞、心筋梗塞もしくは動脈硬化または血管手術の際の血小板凝集の治療効果または予防効果である（１）乃至（８）のいずれか１項に記載の方法、
（１０）  血小板凝集促進活性が、出血傾向、血液凝固障害、血友病、尿毒症または慢性骨髄増殖性疾患の治療効果または予防効果である（１）乃至（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）  血小板凝集促進に関連する疾患のモデル動物であって、下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が、該遺伝子を高発現することができるように導入されている非ヒトトランスジェニック動物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（１２）  血小板凝集促進に関連する疾患が、癌、癌の転移、肺血栓、脳梗塞、心筋梗塞もしくは動脈硬化または血管手術の際の血小板凝集である、（１１）に記載の動物、
（１３）  物質の、血小板凝集促進活性または血小板凝集促進に関連する疾患の治療剤若しくは予防剤としての効果を試験する方法であって、下記の工程を含む方法：
（ａ）（１１）又は（１２）に記載の動物に被験物質を投与する；および
（ｂ）（ａ）の動物の血小板凝集能を測定する。
（１４）  血小板凝集抑制に関連する疾患のモデル動物であって、下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が、該遺伝子を低発現することができるように導入されている非ヒトトランスジェニック動物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（１５）  血小板凝集抑制に関連する疾患のモデル動物であって、下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が、ノックアウトされている非ヒト動物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（１６）  血小板凝集抑制に関連する疾患が、出血傾向、血液凝固障害、血友病、尿毒症または慢性骨髄増殖性疾患である、（１４）または（１５）に記載の動物、
（１７）  物質の、血小板凝集抑制活性または血小板凝集抑制に関連する疾患の治療剤若しくは予防剤としての効果を試験する方法であって、下記の工程を含む方法：
（ａ）（１４）乃至（１６）に記載の動物に被験物質を投与する；および
（ｂ）（ａ）の動物の血小板凝集能を測定する。
（１８）  検体中の、下記（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列からなるｍＲＮＡの発現量を解析することによる、該検体提供者または該検体提供動物の血小板凝集または血小板機能障害に関連する疾患の診断方法：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（１９）  ｍＲＮＡの発現の検出手段が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＰＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法またはランオン・アッセイ法であることを特徴とする、（１８）に記載の方法、
（２０）  検体中の、下記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現量を解析することによる、該検体提供者または該検体提供動物の血小板凝集または血小板機能障害に関連する疾患の診断方法：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
（２１）  ポリペプチドの発現量の検出手段が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法であることを特徴とする、（２０）に記載の方法、
（２２）  血小板凝集に関連する疾患が、癌、癌の転移、肺血栓、脳梗塞、心筋梗塞もしくは動脈硬化または血管手術の際の血小板凝集であることを特徴とする、（１８）乃至（２１）から選択されるいずれか１項に記載の方法、
（２３）  血小板凝集に関連する疾患が、結腸癌、直腸癌、小腸癌、精巣癌、セミノーマ（Seminoma）、扁平上皮癌であることを特徴とする、（１８）乃至（２１）から選択されるいずれか１項に記載の方法、
（２４）  血小板機能障害に関連する疾患が、出血傾向、血液凝固障害、血友病、尿毒症または慢性骨髄増殖性疾患であることを特徴とする、（１８）乃至（２１）から選択されるいずれか１項に記載の方法、
（２５）  下記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに被験物質を含む試料を接触させ、次いで、該ポリペプチドに結合した物質を分離することを特徴とする、血小板凝集促進または抑制活性を有する物質の単離方法。
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
（２６）  下記（ｉ）乃至（ＸＩＶ）のいずれか一つに記載のポリペプチドに被験物質を含む試料を接触させ、次いで、該ポリペプチドに結合した物質を分離することを特徴とする、血小板凝集促進または抑制活性を有する物質の単離方法：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号６７から１３２に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号６７から１３２に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１０３から１９８に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号８８から１８６に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号８２から１８６に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４１のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５０のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５２のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ＩＸ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（Ｘ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４６から５１のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＩ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５７から６２のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＩＩ）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＶ）上記（ｉｉｉ）乃至（ＸＩＩＩ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２７）血小板凝集促進活性または血小板凝集抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（ａ）被験物質の存在下でｇｐ４４を発現する細胞と血小板を接触させる：
（ｂ）血小板凝集活性を測定する：
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は抑制活性を有するか否かを判定する、
（２８）血小板凝集促進活性または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（ａ）被験物質の存在下でｇｐ４４と血小板を接触させる：
（ｂ）血小板凝集活性を測定する：
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は抑制活性を有するか否かを判定する、
（２９）血小板凝集促進活性または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（ａ）被験物質の存在下でｇｐ４４を発現する細胞を非ヒト哺乳動物に投与する：
（ｂ）（ａ）の非ヒト哺乳動物由来の組織における結節数を測定する：
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は血小板凝集抑制活性を有するか否かを判定する、
（３０）癌の転移抑制活性又は癌の転移促進活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（ａ）被験物質の存在下でｇｐ４４を発現する細胞を非ヒト哺乳動物に投与する：
（ｂ）（ａ）の非ヒト哺乳動物由来の組織における結節数を測定する：
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、被験物質が癌の転移抑制活性又は癌の転移促進活性を有するか否かを判定する、
（３１）  下記の（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一項に記載の物質を少なくとも一つ含むことからなる、血小板凝集促進または抑制活性を有する物質を検出するためのキット：
（ａ）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｂ）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズする、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料。
（３２）  下記の（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一項に記載の物質を少なくとも一つ含むことからなる、血小板凝集促進または抑制活性を有する物質を検出するためのキット：
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、８または１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体；
（ｂ）（ａ）に記載の抗体に結合し得る二次抗体；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料。
（３３）  下記の（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一項に記載の物質を少なくとも一つ含むことからなる、血小板凝集に関連する疾患を検出するためのキット：
（ａ）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｂ）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズする、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料、
（３４）  下記の（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一項に記載の物質を少なくとも一つ含むことからなる、血小板凝集に関連する疾患を検出するためのキット：
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、８または１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体；
（ｂ）（ａ）に記載の抗体に結合し得る二次抗体；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料、
（３５）  血小板凝集に関連する疾患が癌、癌の転移、肺血栓、脳梗塞、心筋梗塞または動脈硬化であることを特徴とする、（３３）または（３４）に記載のキット、
（３６）血小板凝集に関連する疾患が結腸癌、直腸癌、小腸癌、精巣癌、セミノーマ（Seminoma）、扁平上皮癌であることを特徴とする、（３３）または（３４）に記載のキット、
（３７）  下記（ｉ）乃至（ＸＩＶ）のいずれか一つに記載のポリペプチドにに特異的に結合し、血小板凝集阻害活性を有する抗体：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号６７から１３２に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号６７から１３２に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１０３から１９８に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号８８から１８６に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号８２から１８６に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４１のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５０のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５２のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ＩＸ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（Ｘ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４６から５１のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＩ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５７から６２のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＩＩ）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
（ＸＩＶ）上記（ｉｉｉ）乃至（ＸＩＩＩ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（３８）  （１）乃至（４）、並びに、（２７）乃至（３０）のいずれか１項に記載された方法により選択された物質、または（２５）又は（２６）に記載の方法により単離された物質、
（３９）  下記の（ａ）乃至（ｆ）のいずれか一つに記載のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号３４のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号３４のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号４１のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド；
（ｄ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号５０のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド；
（ｅ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号５２のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド；
（ｆ）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、アミノ酸番号３４のアミノ酸が他のアミノ酸に変換されていることを特徴とする、変異体ポリペプチド、
（４０）他のアミノ酸がアラニンであることを特徴とする、（３１）に記載の変異体ポリペプチド、
（４１）（３９）又は（４０）に記載の変異体ポリペプチドをコードしているＤＮＡ、
（４２）  下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（４３）  下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドを含有する医薬組成物。
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（４４）  下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが組み込まれているベクターを含む、医薬組成物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（４５）下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドが組み込まれているベクターを含む、医薬組成物：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
（４６）  下記の（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドを含有する医薬組成物：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド、
（４７）  下記の（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドをと特異的に結合する抗体を含有する医薬組成物：
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド、
（４８）  （１）乃至（４）、並びに、（２７）乃至（３０）のいずれか１項に記載された方法により選択された物質、または（２５）又は（２６）に記載の方法により単離された物質を含有する医薬組成物、
（４９）  血小板凝集促進のための、（４２）、（４４）及び（４６）から選択されるいずれか１項に記載の医薬組成物、
（５０）  血小板凝集抑制のための、（４３）、（４５）、（４７）及び（４８）から選択されるいずれか１項に記載の医薬組成物、
（５１）  結腸癌、直腸癌、小腸癌、精巣癌、セミノーマ（Seminoma）、扁平上皮癌、癌の転移、肺血栓、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化、出血傾向、血液凝固障害、血友病、尿毒症もしくは慢性骨髄増殖性疾患の治療もしくは予防のためまたは血管手術の際の血小板凝集を抑制するための、（４３）、（４５）、（４７）及び（４８）から選択されるいずれか１項に記載の医薬組成物、
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のポリペプチドは血小板凝集活性を有し、従って、本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする遺伝子は、血小板凝集促進剤として有用であり、血小板機能障害に関連する疾患の治療剤として有用である。また、本発明のポリペプチドおよび遺伝子は、血小板凝集または血小板機能障害に関連する疾患の治療剤および予防剤として有用な物質を得る方法、物質の血小板凝集促進・阻害活性を測定する方法、並びに、血小板凝集または血小板機能低下に関連する疾患の診断方法に使用することができる。更に、本発明の血小板凝集活性または抑制活性を有する物質は、血小板凝集促進剤または抑制剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において、「血小板凝集に関連する疾患」とは、上記疾患を含む血小板凝集に起因または間接的に関与する疾患のことである。
【００１７】
本明細書において、「血小板機能低下に関連する疾患」とは、上記疾患を含む血小板数の減少または血小板機能低下に起因または間接的に関与する疾患のことである。
【００１８】
従って、本発明の「血小板凝集抑制活性を有する物質」は、血小板凝集に起因または間接的に関与する疾患、例えば、癌（特に、癌の転移)、肺血栓・脳梗塞・虚血性心疾患（心筋梗塞）（特に交通事故など外傷の激しい症状の際におきる肺血栓の抑制）、動脈硬化、静脈血栓症、末梢動脈血栓症、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、抗リン脂質抗体症候群、高脂血症、糖尿病性慢性合併症、糸球体腎炎、肝疾患、移植、川崎病および血小板凝集能亢進症等の治療または予防あるいはバイパス手術または血管形成手術の後の閉塞または最狭窄の防止に有用である。
【００１９】
また、「血小板凝集促進活性を有する物質」は、血小板数の減少または血小板機能低下に起因または間接的に関与する疾患、例えば、出血傾向、血液凝固障害、血友病、尿毒症、慢性骨髄増殖性疾患等の治療または予防に有用である。
【００２０】
本明細書において、「ｇｐ４４」とは、下記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）からなる群から選択されるいずれか一つに記載のポリペプチドのことである。
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
【００２１】
なお、糖鎖等により修飾されたペプチドも本発明のｇｐ４４に包含される。
【００２２】
また、「ｇｐ４４を発現する細胞」とは、内在的にｇｐ４４を発現しまたは人為的操作によりｇｐ４４をコードした遺伝子を導入して発現した細胞のことである。細胞としては、動物細胞、昆虫細胞等を用いることができるが、好適には動物細胞であり、より好適にはマウス、ラット、イヌまたはヒトの細胞であり、特に好適には、マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、マウスリンパ節ストローマＣＡ−１２細胞、マウス脳毛細血管ＭＢＥＣ−４細胞、ＣＨＯ細胞またはヒト２９３Ｔ細胞である。内在的にｇｐ４４を発現する細胞としては、動物細胞のうち、骨芽細胞、または、肺、脳、皮膚、骨、腸、腎、心臓、胎盤、骨格筋由来の細胞を挙げることができる。人為的に遺伝子を導入した細胞としては、例えば、一時的（一過性：transient）に遺伝子を形質発現させた細胞または定常的に遺伝子を形質発現させた（ステーブル）細胞を挙げることができる。
【００２３】
「物質」とは、単一の化合物の他、混合物をも含み、例えば、人工的に合成された有機化合物、天然に存在する有機化合物、抗体、ペプチドまたは遺伝子が挙げられる。
【００２４】
「検体」とは、被験者（患者、臨床試験の被験者を含む）または被験動物等から得られた、血液、生体組織または排泄物等の試料のことであり、好適には、骨芽細胞、肺、脳、皮膚、骨、腸、腎、心臓、胎盤または骨格筋の組織であり、より好適には、肺または骨格筋の組織である。
【００２５】
本明細書において、「ポリペプチド」は、糖鎖等により修飾されていてもよい。
【００２６】
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ExpressHyb Hybridization Solution（クローンテック社）中、６８℃でハイブリダイズすることである。また、ＤＮＡを固定したフィルターを用いた場合には、０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる）を用い６８℃で洗浄することにより同定することができる条件またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることである。
【００２７】
本発明の、血小板凝集抑制活性または血小板凝集促進活性を有する物質は、医薬として使用することができ、その投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等による経口投与又は注射剤若しくは坐剤等による非経口投与を挙げることができる。
【００２８】
１．培養細胞を用いたスクリーニング方法
本発明の方法は、具体的には、配列表の配列番号１、３、５、７または１３に示されるヌクレオチド配列、または、それがコードするポリペプチドと同じ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるｍＲＮＡの発現を、当該ｍＲＮＡの特異的検出によって測定し、該ｍＲＮＡの発現量を低下又は上昇させるような被験物質を血小板凝集抑制又は促進剤として選択する方法である。
【００２９】
なお、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む配列は、Mouse glycoprotein 38 mRNA, complete cdsとして、GenBankにアクセッション番号M96645として登録されており、配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む配列はRattus norvegicus Sprague-Dawley (T1-alpha) mRNA, complete cdsとして、GenBankにアクセッション番号U07797として登録されており、配列表の配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含む配列は、C.familiaris mucin-type membrane protein gp40として、GenBankにアクセッション番号Z81018として登録されており、配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む配列は、Homo sapiens lung type-I cell membrane-associated protein hT1a-2 (hT1a-2) mRNA, complete cdsとしてGenBankにアクセッション番号AF030428として登録されており、配列表の配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含む配列はMus musculus mRNA for glycoprotein 38 podoplanin homologue (Gp38P gene)として、GenBankにアクセッション番号AJ297944として登録されている。
【００３０】
また、本発明の方法は、具体的には、配列表の配列番号２、４、６、８または１４のアミノ酸配列、または、これらと同じ活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を、当該ポリペプチドの特異的検出によって測定し、該ポリペプチドの発現量を低下／上昇させるような被験物質を血小板凝集抑制／促進剤として選択する方法である。
【００３１】
なお、配列表の配列番号２、４、６、８または１４に示されるアミノ酸配列は、GenBankのアクセッション番号M96645、U07797、Z81018、AF030428またはAJ297944に登録されている。
【００３２】
（１）ｇｐ４４を発現する細胞の調製
コロニーハイブリダイゼーション等の公知の方法により、マウス、ラット、イヌまたはヒトの組織由来のｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡを取得し、該ｃＤＮＡを細胞に導入することにより、ｇｐ４４を発現する細胞を得ることができる。
【００３３】
ｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡを取得する際に使用されるプローブとしては、配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載されたヌクレオチド配列の一部からなる、１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド断片のプローブを使用することができる。プローブの長さは、好適には、１５乃至２０塩基長である。
【００３４】
導入する細胞としては、動物細胞、昆虫細胞等を用いることができるが、好適には動物細胞であり、より好適には、霊長類、げっ歯類またはイヌであり、より更に好適にはマウス、ラット、イヌまたはヒトの細胞である。
【００３５】
細胞に導入する方法としては、ウイルスベクターを用いる方法、発現プラスミドを直接投与する方法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、カルシウムホスフェート法またはエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３６】
ウイルスベクターを用いる場合、使用されるウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のＤＮＡウイルス、または、ＲＮＡウイルスを挙げることができる。これらのうち、好適には、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはワクシニアウイルスであり、更に好適には、レトロウイルスまたはアデノウイルスである。
【００３７】
（２）ｇｐ４４を発現する細胞の培養および被験物質の添加
ｇｐ４４を発現する細胞は、ｇｐ４４を発現可能な条件であれば、通常用いられる培養方法で培養することができる。例えば、新生化学実験講座（日本生化学会編  東京化学同人  １９９０）記載の方法により培養することができる。
【００３８】
被験物質は、培地、燐酸バッファー等で所望の濃度に調製した後、培養培地に添加して一定期間培養する。
【００３９】
被験物質としては、特に限定されず、微生物の培養液や動植物の組織からの抽出物、培養細胞の培養液からの抽出物、人工的に合成された無機または有機化合物、組換えタンパク質、抗体またはその断片、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ等の核酸、それらの塩、それらの誘導体、もしくはそれらの中の複数種類の物質を混合した組成物などがいずれも用いられ得る。
【００４０】
被験物質の添加量および濃度は、適宜設定するかまたは希釈系列を作成する等により複数種の添加量を設定することができる。
【００４１】
被験物質添加後の培養時間は、適宜設定することができるが、通常３０分から２４時間である。
【００４２】
上記により培養した細胞は、所望により、以下の（３）の方法を用いてそのｍＲＮＡの発現を検出することにより、または、以下の（４）の方法を用いてそのポリペプチドの発現を検出することにより、被験物質のスクリーニングを行うことができる。
【００４３】
（３）ｍＲＮＡを用いたスクリーニング方法
（３−１）ｍＲＮＡ試料の調製
ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む。以下同じ。）は、培養を終了した細胞を直ちにＲＮＡ抽出用の溶媒（例えば、フェノール等リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するのが好ましい。
【００４４】
また、ＲＮＡは、細胞を破壊しないようにスクレーパーで慎重に掻きとる方法またはトリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いて穏やかに培養基材から分離させる方法等により細胞を回収した後、抽出することもできる。
【００４５】
ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸グアジニン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアジニン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159）等が挙げられるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。また、市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えば、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン（株）製）ＴＲＩＺＯＬ試薬（ギブコ・ビーアールエル社）等）を試薬に添付のプロトコールに従って用いることもできる。
【００４６】
ｍＲＮＡは、上記方法により得られたＲＮＡ抽出物を更に精製することにより得ることができる。真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られており、ｍＲＮＡは、この特徴を利用して精製することができる。例えば、ｍＲＮＡをビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブに吸着させて複合体を生成させ、次いで、この複合体をビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に捕捉し、洗浄した後、溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することもできる。
【００４７】
ただし、本発明の方法には、これらｍＲＮＡの精製工程は必須ではなく、配列表の配列番号１、３、５、７及び１３に示されるヌクレオチド配列、並びに、それがコードするポリペプチドと同じ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列からなるｍＲＮＡの発現の検出が可能である限り、ＲＮＡ抽出物をそのまま検出工程に用いることができる。
【００４８】
（３−２）ｍＲＮＡ発現の検出・評価
抽出されたｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ランオン・アッセイ、ＤＮＡチップ解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析、メンブレンフィルター解析またはその他の解析法を用いることにより、検出することができる。
【００４９】
（３−２−１）ＲＴ−ＰＣＲ法
上記（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列からなるｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素反応を行い、次いで、ＰＣＲを実施して特異的にＤＮＡ断片を増幅する。
【００５０】
逆転写酵素反応に使用するプライマーは、対象となるｍＲＮＡの特定の部分配列に相補的な、連続した１５乃至４０塩基長のアンチセンスプライマーである。プライマーの長さは、好適には１８乃至３０塩基長であり、更に好適には２１乃至３０塩基長である。
【００５１】
逆転写酵素反応により精製されるｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅する際に使用するプライマーは、該ｃＤＮＡの特定の部分配列に相補的な、連続した１５乃至４０塩基長のセンスプライマーである。プライマーの長さは、好適には１８乃至３０塩基長であり、更に好適には２１乃至３０塩基長である。
【００５２】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、常法に従って行うことができる。なお、ＲＴ−ＰＣＲに用いる試料は、精製されたｍＲＮＡでなくても良い。
【００５３】
増幅されたｍＲＮＡは、ＰＣＲ終了後、反応液を電気泳動にかけて目的の長さの核酸が示すバンドを測定することにより検出することができる。定量的な検出を行うためには、あらかじめ段階希釈したｃＤＮＡクローンを標準の鋳型ＤＮＡとして同条件でＰＣＲにより増幅し、定量的検出が可能な温度サイクル数を定めておくか、または、例えば５サイクル毎に一部反応液をサンプリングしてそれぞれ電気泳動を行う。また、例えば、ＰＣＲ反応時に放射標識ｄＣＴＰを用いることにより、バンド中に取り込まれた放射能の量を指標に定量を行うこともできる。更に、ポリヌクレオチド定量の信頼性を高めた方法として、上記ＲＴ−ＰＣＲを改良した競合ＲＴ−ＰＣＲ法（Souaze et al. (1996) BioTechniques 21, 280-285）や、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ法（Heid et al. (1996) Genom. Res. 6, 986-994）等も利用することができる。
【００５４】
被験物質の存在下で培養した細胞から抽出したｍＲＮＡの量が、被験物質の非存在下で培養した細胞から抽出したｍＲＮＡの量と比べて、増加している場合は血小板凝集促進活性を有する物質として選択し、減少している場合には血小板凝集抑制活性を有する物質として選択することができる。
【００５５】
（３−２−２）ノーザンハイブリダイゼーション
本方法は、本発明が属する技術分野において周知の方法で行うことができる（例えば、バイオ実験イラストレイテッド４, p148, 秀潤社）。
【００５６】
物質の選択は上記（３−２−１）と同様に行うことができる。
【００５７】
（３−２−３）リボヌクレアーゼ保護アッセイ
ＲＮＡ試料中の目的のｍＲＮＡのみを、相補的な標識プローブとハイブリダイズさせ、二本鎖ポリヌクレオチドを形成させた後、リボヌクレアーゼを添加してインキュベーションを行う。これにより、二本鎖を形成しているポリヌクレオチドはリボヌクレアーゼにより消化されず、二本鎖を形成していないＲＮＡはリボヌクレアーゼにより消化される。よって、上記インキュベーション後の二本鎖ポリヌクレオチドを定量することにより、目的のｍＲＮＡの発現量を測定することができる。なお、好適には、二本鎖を形成しなかった標識プローブを、二本鎖ポリヌクレオチドから分離して定量する。
【００５８】
本方法において、標識プローブとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡを使用することができ、好適には、ＲＮＡである。プローブの長さは、好適には、５０乃至５００塩基長である。標識プローブは５×１０５ｐｍｏｌ相当の量を用いるのが好ましい。
【００５９】
ＲＮＡプローブは、例えば、以下の方法によって調製することができる。鋳型ＤＮＡをバクテリオファージのプロモーター（Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３プロモーター等）を有するプラスミドベクター（例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ製）等）に挿入して組換えプラスミドベクターを作製する。該プラスミドベクターを制限酵素で消化し、挿入断片のすぐ下流の一箇所で切断する。得られた直鎖ＤＮＡを鋳型とし、プロモーターに対応したポリメラーゼを用いて、放射能標識されたリボヌクレオチド存在下、インビトロ転写反応を行う。本反応は、例えば、リボプローブシステム−Ｔ７、リボプローブシステム−ＳＰ６またはリボプローブシステム−Ｔ３（いずれもプロメガ社）を用いて行うこともできる。
【００６０】
リボヌクレアーゼとしては、所望のものを使用することができるが、標識プローブとしてＤＮＡを使用する場合には、一本鎖ＤＮＡも消化できるものが好ましい。
【００６１】
ＲＮＡ試料としては、精製されたｍＲＮＡを使用することが好ましい。また、ＲＮＡ試料は１０乃至２０μｇ相当の量を用いることが好ましい。
【００６２】
なお、本方法は、市販のキット（HybSpeed RPA Kit, アンビオン社）を用いて行うことができる。
【００６３】
得られたリボヌクレアーゼ消化後の試料は、８Ｍ尿素を含む４乃至１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムでオートラジオグラフィーを行うことにより検出することができる。検出したバンドの定量は、常法に従って行うことができる。また、各試料間のＲＮＡ量の差などに起因するばらつきは、ベータ−アクチン遺伝子の発現量を同時に測定することにより補正することができる。
【００６４】
物質の選択は上記（３−２−１）と同様に行うことができる。
【００６５】
（３−２−４）ランオン・アッセイ（Run-on assay, Greenberg, M.E. and Ziff, E.B.B. (1984) Nature 311, 433-438, Groudine, M. et al. (1981) Mol. Cell Biol. 1, 281-288）
本方法は、細胞内のｍＲＮＡの量を直接検出するのではなく、細胞から単離した核の中にある目的の遺伝子の転写活性を測定する方法であり、本発明の、「ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法」は、本方法を包含する。
【００６６】
細胞核を単離して、試験管内で転写反応を行うことにより、核を単離する前に既に転写が開始され、ｍＲＮＡ鎖が生成されている途中のものを伸張させる反応を進行させることができる。本転写反応において、放射標識したリボヌクレオチドを添加することにより、伸張するｍＲＮＡを標識することができる。非標識のプローブにハイブリダイズするｍＲＮＡを検出することにより、核を単離した時点における目的のポリヌクレオチドの転写活性を測定することができる。
【００６７】
被験物質の存在下で培養した細胞の核の転写活性が、被験物質の非存在下で培養した細胞の核の転写活性と比べて、強い場合は血小板凝集促進活性を有する物質として選択し、弱い場合には血小板凝集抑制活性を有する物質として選択することができる。
【００６８】
（３−２−５）ＤＮＡチップ解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析、メンブレンフィルター解析
（プローブの標識）
前記、（３−１）で得られたｍＲＮＡをプローブ用試料として標識する。標識する試料は、精製されたｍＲＮＡが好ましい。
【００６９】
アフィメトリクス社製ＤＮＡチップにより解析する場合、使用するプローブは、該チップに添付されたプロトコールに従い、ビオチンで標識する。
【００７０】
ＤＮＡマイクロアレイにより解析する場合、使用するプローブは、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、蛍光色素(例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。この際、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料をそれぞれ異なる色素で標識した場合には、後のハイブリダイゼーション操作において、両者を混合して用いることができる。
【００７１】
メンブレンフィルターを用いて解析する場合、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３３Ｐなど）で標識されたｄ−ＣＴＰなどを加えておくことによりプローブを標識することができる。
【００７２】
(固相化試料の作製)
(a)  ＤＮＡチップ解析
固相化試料としては、例えば、データベース上のＥＳＴ（expressed sequence tag）配列若しくはｍＲＮＡ配列を基に合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップ（例えば、アフィメトリックス社製（Lipshuts, R. J. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment, 20-24）等）を使用することができる。
【００７３】
固相化するオリゴヌクレオチドのＥＳＴ配列またはｍＲＮＡ配列の由来は、本発明のポリペプチドを検出しうるものであれば特に限定は無いが、好適には、近縁種の動物由来であり、更に好適には、プローブの調製に用いた動物と同種の動物由来である。
【００７４】
(b)  ＤＮＡマイクロアレイ解析・メンブレンフィルター解析
また、固相化試料としてプローブ調製に用いた細胞と同種若しくは近縁の動物の臓器組織から単離若しくは株化された細胞から得られたｍＲＮＡより作製されたｃＤＮＡ若しくはＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化されたＤＮＡマイクロアレイ若しくはメンブレンフィルターを使用することができる。
【００７５】
固相化するｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物としては、例えば、ｍＲＮＡの材料とした動物のＥＳＴデータベースなどの配列情報を基に作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものを使用することができる。試料を調製するための材料としては、配列表の配列番号１、３、５、７または１３に示されるヌクレオチド配列、または、それがコードするポリペプチドと同じ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する遺伝子の少なくともいずれか一つを発現している細胞を使用する。該細胞として、好ましくは、プローブ調製に用いた細胞と同種若しくは近縁の動物の臓器組織から単離若しくは株化された細胞である。ｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物としては、予め発現量の異なるｍＲＮＡを、サブトラクション法（Diatchenko, L. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 6025-6030）、ディファレンシャルディスプレイ法（Kato, K. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 3685-3690）等を利用して選択しながら作製されたものを使用することもできる。ＤＮＡマイクロアレイまたはメンブレンフィルターは、検出対象となる遺伝子を含むものでれば市販品を利用することもでき、または、市販のスポッター（例えば、ＧＭＳ４１７アレイヤー：宝酒造社）を用いて固相化して作製することもできる。
【００７６】
（ハイブリダイゼーション・解析）
上記で得られたプローブ、固相化試料を用いて、ハイブリダイゼーション操作を行う。（Brown, P. O. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment, 33-37）
(a)  ＤＮＡチップ解析
例えば、アフィメトリックス社製遺伝子チップに添付のプロトコール（発現解析技術マニュアル）に従って、アフィメトリックス社製の解析装置（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００）を用いてハイブリダイゼーションおよび解析を行い、アビジンによる発光を検出、解析を行う。
【００７７】
(b)  ＤＮＡマイクロアレイ解析
常法によりハイブリダイゼーションを行ない、洗浄した後、蛍光検出器を用いて蛍光強度を検出する。例えば、アレイとして例えば、宝酒造（株）社の市販アレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーションおよび洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（宝酒造（株）社）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。
【００７８】
(c)  メンブレンフィルター解析
常法によりハイブリダイゼーションを行ない、例えば、市販のフィルター製マイクロアレーである、アトラスシステム（クローンテック社）を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クローンテック社等）を用いて検出を行う。
【００７９】
前記(a)乃至(c)のいずれに記載の方法も、同一ロットの固相化試料に被験物質存在下で培養した細胞由来のプローブと、被験物質非存在下で培養した細胞由来のプローブをそれぞれハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーション以外の条件は同じとする。蛍光標識プローブを用いる場合には、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることができる（Brown, P. O. et al. (1999) Nature genet, 21, supplement, 33-37）。
【００８０】
（判定）
物質の選択は上記（３−２−１）と同様に行うことができる。
【００８１】
（３−２−６）その他の解析法
本発明の方法は、上記以外にも被験物質存在下または非存在下で培養した細胞由来のｍＲＮＡを検出することができる方法であれば、特に限定されない。上記以外の検出方法としては、例えば、サブトラクションクローニング法、ディファレンシャルディスプレイ法、単一の反応においてＰＣＲとハイブリダイゼーションプロービング（以下、「プロービング」という。）を組み合わせて行う「Taqman」として知られる技術（Holland, P. M. et al. (1991) Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88, 7276-7280）、単一の反応においてＰＣＲをプロービングと組み合わせた方法（Higuchi et al. Biotechnology，10, 413-417（1992））、ライトサイクラーシステム（ロシュ・ダイアグノスティクス社、日本特許公開２０００−３１２６００号公報参照）等を挙げることができる。
【００８２】
（４）ポリペプチドを用いたスクリーニング方法
（４−１）ポリペプチド試料の調製
(a)  ウエスタンブロット法
ウエスタンブロット法に用いる試料は、例えば、培養上清をトリクロロ酢酸処理してタンパク質を沈殿させ、遠心分離により沈殿物を回収し、回収した沈殿物を氷冷したアセトンで洗浄し、風乾後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液（バイオラッド社等）に溶解することにより作製することができる。
【００８３】
(b)  ドットブロット法、スロットブロット法、固相酵素免疫定量法
ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法に用いる試料は、例えば、培養上清そのものまたは緩衝液で適宜希釈することにより得られる。
【００８４】
（４−２）ポリペプチド試料の固相化
上記により得られた試料中のポリペプチドを特異的に検出するため、該試料を固相化する。
【００８５】
(a)  ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法
ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法では、試料を電気泳動した後、ゲルからメンブレンにポリペプチドを移す（ブロッティング）ことにより固相化することができる。
【００８６】
使用されるメンブレンとしては、例えば、ニトロセルロースメンブレン（バイオラッド社等）、ナイロンメンブレン（ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社）等）、コットンメンブレン（ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）（バイオラッド社等）を挙げることができる。
【００８７】
ブロッティング方法としては、ウェット式ブロッティング法、セミドライ式ブロッティング法（ともにCURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume2 ed. by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober参照）等を挙げることができる。また、ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法のための市販のキットを使用することもできる（例えば、バイオラッド社等）。
【００８８】
(b)  固相酵素免疫定量法（ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法）
固相酵素免疫定量法では、試料またはその希釈液を専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社）等）に加え、４℃乃至室温で一晩または３７℃で１乃至３時間静置することによりウェル内底面にポリペプチドを吸着させて固相化することができる。
【００８９】
（４−３）抗体の調製
本方法に用いる抗体は、本発明のｇｐ４４またはその一部を特異的に認識するものである。具体的には、本方法に用いる抗体は、下記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）に記載のポリペプチドまたはその一部を特異的に認識するものである。
（ｉ）下記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、または、その一部からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド：
（ｉ−１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ−５）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記（ｉ−１）乃至（ｉ−５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチド：
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）上記（ｉｉｉ）乃至（ｖｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチド。
【００９０】
本発明の方法に使用する抗体として、好適には、上記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つのポリペプチドと結合することができ、かつ、他のいかなるマウス又はヒト由来のタンパク質とも結合しないような抗体である。
【００９１】
本発明の方法に使用する抗体は、常法により（例えば、新生化学実験講座１, タンパク質１, p389-397, (1992)）、抗原となるポリペプチドまたはその一部を動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497 (1975), Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p.365-367 (1980), Prenum press, N.Y.）に従って、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【００９２】
抗原としては、上記（ｉ）乃至（ｖｉｉｉ）のいずれか一つに記載のポリペプチドもしくはその少なくとも６個連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのポリペプチドに任意のアミノ酸配列や単体が付加された誘導体を使用することができる。
【００９３】
抗原となるポリペプチドは、in vitroにて合成し、または、遺伝子操作した宿主細胞に産生させることにより得ることができる。具体的には、発現ベクターに抗原となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、該ベクターを転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で反応させることにより得ることができる。または、形質転換させた、原核生物若しくは真核生物の宿主細胞に、該ヌクレオチドを発現させることにより、目的のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００９４】
ポリペプチドのin vitroでの合成方法としては、例えば、ラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）（ロシュ・ダイアゴノスティックス社）を用いた方法を挙げることができる。本方法は、目的の遺伝子をＴ７プロモーターにより制御される発現ベクターにクローニングし、該ベクターとＴ７ＲＮＡポリメラ−ゼをin vitroの反応系に添加して、鋳型ＤＮＡよりｍＲＮＡを転写させ、次いで、大腸菌溶解液中のリボソーム等を加えることにより、ｍＲＮＡが翻訳されて目的のポリペプチドが反応液中に合成させる方法である（Biochemica, 1, 20-23 (2001), Biochemica, 2, 28-29 (2001)）。
【００９５】
ポリペプチドを遺伝子操作した宿主細胞に産生させることにより得る場合、宿主として使用することができる原核細胞は、本方法に使用することができる原核細胞であれば特に限定はなく、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）等を挙げることができる。
【００９６】
大腸菌としては、例えば、Ｋ１２株を使用することができる。
【００９７】
枯草菌としては、例えば、２０７−２５株を使用することができる。
【００９８】
ベクターとしては、本方法に使用することができるベクターであれば特に限定はなく、例えば、宿主として大腸菌を用いた場合には、ｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられ、宿主として枯草菌を用いた場合には、ｐＴＵＢ２８８（Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93）が用いられる。宿主として枯草菌を用いた場合、枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結させることにより、発現したポリペプチドを菌体外へ分泌させることができる。
【００９９】
宿主として原核細胞を使用する場合、プロモーターとしては、目的のポリペプチドの産生に使用することができるプロモーターであれば特に限定はないが、例えば、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクト−ス（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられる。
【０１００】
また、宿主として使用することができる真核細胞は、本方法に使用することができる真核細胞であれば特に限定はなく、例えば、脊椎動物細胞、昆虫細胞、酵母等を挙げることができる。脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182, ATCC CRL-1650）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（ATCC CCL-61)のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L.A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4 126-4220）を挙げることができる。
【０１０１】
宿主として真核細胞を使用する場合、プロモーターとしては、発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するものを使用することができ、必要に応じて複製起点を有するプロモーターも使用することができる。該プロモーターを有する発現ベクターとしては、例えば、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（Invitrogen社）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864）等を挙げることができる。
【０１０２】
例えば、宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、転写プロモーター、転写終結シグナル、および、ＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができる。
【０１０３】
該発現ベクターを、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）またはエレクトロポレーション法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることにより、所望の形質転換細胞を得ることができる。
【０１０４】
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al. (1989) : “Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, NY）またはｐＳＶ２ｎｅｏ（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【０１０５】
宿主細胞として昆虫細胞を用いる場合、そのような昆虫細胞としては、例えば、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugi perdaの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichoplusia niの卵細胞由来High Five細胞（Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396）等を用いることができる。
【０１０６】
宿主細胞として昆虫細胞を用いる場合、使用されるベクターとしては、バキュロウイルストランスファーベクター、特に、オートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３（Kidd, I. M. and V.C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 137-159）、または、バキュロウイルスのＰ１０若しくは同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクター等を挙げることができる。また、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質のＮ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させることもできる。
【０１０７】
宿主細胞として酵母を用いる場合、そのような酵母としては、サッカロミセス属酵母（例えば、パン酵母Saccharomyces cerevisiae、石油酵母Pichia pastoris等）が好適である。
【０１０８】
宿主細胞として酵母を用いる場合、使用されるベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025）または酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5）等が好適である。また、分泌シグナル配列および宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼもしくは既知のプロテアーゼの切断部位を目的タンパク質のＮ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させることもできる。例えば、石油酵母でトリプシン型セリンプロテアーゼであるヒトマスト細胞トリプターゼを発現させる場合、目的タンパク質のＮ末端側に、酵母のαファクターの分泌シグナル配列および石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位を繋ぎ、目的タンパク質を発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Andrew, L. Niles,et al. (1998) Biotechnol.Appl. Biochem. 28, 125-131)。
【０１０９】
目的のポリペプチドは、上記で得られる形質転換体を常法に従い培養することにより、細胞内または細胞外に産生させることができる。培養に使用する培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種培地を適宜選択できる。例えば、上記ＣＯＳ細胞の培養には、ＲＰＭＩ１６４０培地、ダルベッコ変法イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」という。）等に、必要に応じてウシ胎児血清等の血清成分を添加した培地を使用することができる。
【０１１０】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した公知の分離操作法により、分離・精製することができる。該方法としては、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理；限外濾過；分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー若しくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー；透析法；またはこれらの組み合わせを挙げることができる。また、発現させる目的の組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。好適には、上記方法を組み合わせることにより分離・精製を行う。
【０１１１】
本発明の方法に用いることができる抗体としては上記方法によって取得された抗体の他に、ｇｐ４４に特異的に結合していることが既に知られている抗体を用いることもできる。そのような抗体としては例えば、モノクローナル抗体８Ｆ１１（M. Watanabe et al, Cancer Res., 1988, 48, 6411-6416）を挙げることができる。
【０１１２】
（４−４）抗体の標識
上記により得られたポリペプチドを抗原として取得した抗体は、以下の検出工程において、直接標識して使用するか、または、該抗体を一次抗体とし、該抗体を特異的に認識する標識二次抗体と共同で使用することができる。
【０１１３】
標識の方法としては、通常使用される方法であれば特に限定はなく、好適には、酵素（例えば、アルカリフォスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ等）またはビオチン（ストレプトアビジンと共に使用する）である。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）としては、種々の市販品を使用することができる。ＲＩＡの場合、例えば、Ｉ１２５等の放射性同位元素で標識することができる。
【０１１４】
（４−５）ポリペプチドの検出
抗体の標識に使用した酵素の活性等を検出することにより、抗原であるポリペプチドの量を測定することができる。例えば、標識として、アルカリフォスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼを使用した場合、それらの酵素と市販されている基質を反応させ、生じた発色または発光を測定することにより、ポリペプチドの量を測定することができる。また、抗体を放射性同位元素で標識した場合、液体シンチレーションカウンター等を用いて測定することにより、ポリペプチドの量を測定することができる。
【０１１５】
基質として、発色を生じさせる基質を使用した場合、ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法においては、目視で検出することができる。ＥＬＩＳＡ法においては、好適には、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定することにより定量する。また、好適には、上記（４−３）で抗体作製のために使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として目的の試料と同時に検出操作を行って、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、目的の試料中の抗原濃度を定量することができる。
【０１１６】
基質として、発光する基質を使用した場合、ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法においては、Ｘ線フィルム若しくはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーまたはインスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーまたはモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社）等を利用して定量することもできる。ＥＬＩＳＡ法においては、発光マイクロプレートリーダー（バイオラッド社等）を利用して定量することもできる。
【０１１７】
（４−６）測定操作
(a)  ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法
抗体の非特異的吸着を阻止するため、メンブレンを、非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液（以下、「ブロッキング溶液」という。）中に一定時間浸しておく（以下、「ブロッキング」という。）。
【０１１８】
ブロッキング溶液の組成としては、例えば、５％スキムミルクおよび０．０５％乃至０．１％ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が挙げられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１乃至１０％のウシ血清アルブミン、０．５乃至３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を使用することもできる。
【０１１９】
ブロッキングの温度および時間は、４℃で１６乃至２４時間または室温で１乃至３時間である。
【０１２０】
次にメンブレンを０．０５％乃至０．１％ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下、「洗浄液」という。）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（４−３）、（４−４）記載の方法で作製された抗体をブロッキング溶液で適宜希釈した溶液に一定時間浸して、抗体をメンブレン上の抗原に結合させる。抗体の希釈倍率は、例えば上記（４−３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料として予備のウエスタンブロッティング実験を行うことにより決定することができる。
【０１２１】
抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。
【０１２２】
抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄して抗体を除去する。
【０１２３】
標識した抗体を使用する場合、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０１２４】
標識しない抗体を使用する場合、次いで二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用することができ、その場合はブロッキング溶液で２０００乃至２００００倍に希釈して使用する（市販の二次抗体に添付された指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う。）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを、室温で４５分乃至１時間二次抗体溶液に浸し、洗浄液で洗浄する。洗浄操作は、例えば、まずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから洗浄液を新しいものに交換し、更に５分振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。次いで、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０１２５】
(b)  固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法）
上記（４−２）において試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、上記(a)と同様にブロッキングを行う。
【０１２６】
ウェル内を洗浄液で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（４−３）、（４−４）記載の方法で作製された抗体をブロッキング溶液で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーションし、抗体を抗原に結合させる。抗体の希釈倍率は、例えば上記（４−３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料として予備のＥＬＩＳＡ実験を行うことにより決定することができる。
【０１２７】
抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。
【０１２８】
抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄して抗体を除去する。
【０１２９】
標識した抗体を使用する場合、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０１３０】
標識しない抗体を使用する場合、次いで二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用することができ、その場合はブロッキング溶液で２０００乃至２００００倍に希釈して使用する（市販の二次抗体に添付された指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う。）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して、室温で１乃至３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄する。洗浄操作は、例えば、まずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから洗浄液を新しいものに交換し、更に５分振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。次いで、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０１３１】
また、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは、例えば、以下に記載する方法により実施することができる。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか一つにおいて、親水性に富む領域を２箇所選び、それぞれの領域に含まれる６残基以上のアミノ酸からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を上記（４−４）記載の方法に準じて標識する。標識しない方の抗体は、上記（４−２）記載の方法に準じて９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に加えて室温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェルを洗浄した後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０１３２】
（４−７）リガンド
抗体の他に、本発明のポリペプチドに特異的に結合する基質、補酵素、調節因子などのリガンドを用いることによっても、本発明のポリペプチドを定量することができる。
【０１３３】
（４−８）判定
被験物質の存在下で培養した細胞から抽出した本発明のポリペプチドの量が、被験物質の非存在下で培養した細胞から抽出した本発明のポリペプチドの量と比べて、増加している場合は血小板凝集促進活性を有する物質として選択し、減少している場合には血小板凝集抑制活性を有する物質として選択することができる。
【０１３４】
また、上記方法の他、プロテインチップ法またはプロテインアレイ法等も、本発明の方法として使用することができる。
【０１３５】
２．動物個体を用いたスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、哺乳動物個体に被験物質を投与し、その後該動物個体から摘出された臓器または組織細胞における本発明のｍＲＮＡまたは本発明のポリペプチドの量を検出する方法も含まれる。
【０１３６】
被験物質としては、人工的に合成した化合物、微生物の代謝産物、植物もしくは動物等の組織の抽出物、それらの塩もしくは誘導体またはそれらの混合物等を挙げることができる。
【０１３７】
動物個体への被験物質の投与は、被験物質の物性などにより、経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与または皮下注射などの投与形態を使い分けることができる。
【０１３８】
被験物質の投与量および濃度は、適宜設定するかまたは希釈系列を作成する等により複数種の投与量を設定することができる。
【０１３９】
被験物質投与後の飼育期間は、適宜設定することができるが、通常一週間から一年間である。
【０１４０】
被験物質投与後、一定期間飼育した動物個体よりｇｐ４４を発現する臓器または組織細胞を取り出し、該臓器または組織細胞中の本発明のｍＲＮＡまたは本発明のポリペプチドの量を上記培養細胞における測定と同様に測定する。ｇｐ４４を発現する臓器または組織細胞としては、例えば、骨芽細胞、または、肺、脳、皮膚、骨、腸、腎、心臓、胎盤、骨格筋等が挙げられる。
【０１４１】
被験物質を投与した動物個体の臓器または組織細胞から抽出した本発明のｍＲＮＡまたはポリペプチドの量が、被験物質を投与しない動物個体の臓器または組織細胞から抽出した本発明のｍＲＮＡまたはポリペプチドの量と比べて、増加している場合は血小板凝集促進活性を有する物質として選択し、減少している場合には血小板凝集抑制活性を有する物質として選択することができる。
【０１４２】
３．被験物質の血小板凝集促進または抑制活性測定方法
被験物質の血小板凝集促進または抑制活性は、上記１．または２．に記載の方法に準じて検出し、発現したｍＲＮＡまたはポリペプチドの量を比較する。例えば、非投与のものと比べて多い場合には血小板凝集促進活性を有し、少ない場合には血小板凝集抑制活性を有すると判定することができる。好ましくは、既知の血小板凝集促進物質または抑制物質を対照群として同時に測定することにより、対象群と比較して被験物質の血小板凝集促進または抑制活性の強さを判定する。
【０１４３】
４．トランスジェニック動物／ノックアウト動物を用いた試験方法
遺伝子操作により、正常動物において本発明に係る遺伝子を高発現若しくは低発現させたトランスジェニック動物または本発明に係る遺伝子を破壊したノックアウト動物を作成し、血小板凝集を調整する機能に異常のある動物モデルを提供することができる。該モデル動物は、血小板凝集を調整する機能に異常のある疾患を対象とした医薬の評価等に使用することができる。
【０１４４】
トランスジェニック動物は、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し発生させることにより得ることができる。その手順については、既に確立されている方法に従うことができる（発生工学実験マニュアル, 野村達次  監修, 勝木元也  編, (1987)、マウス胚の操作マニュアル("Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual") B. Hogan, F. Costantini and E. Lacy著、山内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎  訳, (1989)、特公平５−４８０９３号公報等参照）。具体的には、例えばマウスの場合、まず雌マウスに排卵誘起剤を投与後、同系統の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるための、プロモーターやエンハンサー等の調節遺伝子としては、導入された動物の細胞内で機能するものであればいずれも使用することができる。また、導入遺伝子の所望の発現量に応じて、プロモーター、エンハンサー等の調節因子を選択することができる。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩又は帝王切開により出生させる。このようにして得られた動物が導入した遺伝子を保持していることを確認する方法としては、該動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型として導入遺伝子に特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲを行う方法、該ＤＮＡを数種の制限酵素で消化後ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜やナイロン膜等にブロッティングしたものについて導入遺伝子の全部または一部を標識したものをプローブとしたサザンブロット解析を行なう方法等を挙げることができる。また、導入された遺伝子が実際に動物体内で発現しているか否かは、下記５．に記載の方法により血小板凝集能を測定することにより確認することができる。導入された遺伝子が実際に動物体内で高発現している場合は、遺伝子を導入しない動物よりも血小板凝集能が高くなり、低発現している場合は、遺伝子を導入しない動物よりも血小板凝集能が低くなる。
【０１４５】
また、トランスジェニック動物は上記の他、胚幹細胞にＤＮＡを導入した後キメラを作成する方法、レトロウイルスベクターを初期発生胚に感染させ導入する方法等によっても得ることができる（Kanegae Y.ら、Nucleic Acids Res. 23: 3816-3821 (1995)、Kanegae Y.ら、Gene. 181: 207-212、Wakita T.ら、J. Biol. Chem. 273: 9001-9006参照）。
【０１４６】
ノックアウト動物は、遺伝子導入し相同組換え体を得た後、その組換え体を胚盤胞の時期の胚に注入してキメラ動物を作成し、該キメラ動物を組み合わせることにより得ることができる。具体的には、例えば、まず、ゲノムライブラリーより目的の遺伝子をクローニングし、削除するエキソンの周りの遺伝子地図を作成する。その地図をもとに相同組換えを起こすのに必要な領域のＤＮＡをサブクロ−ニングし削除したい部分をネオマイシン耐性遺伝子若しくは他の薬剤耐性遺伝子で置き換え、遺伝子ターゲティング用ＤＮＡ組換え体を作製する。組換えの効率を更に上げるためには、その遺伝子が発現すると細胞が死滅するネガティブ選択を起こす遺伝子をつないでおくことができる。次いで、胚幹細胞にエレクトロポレーションなどにより遺伝子を導入し、胚幹細胞トランスフォーマントを作製する。ここで使用する胚幹細胞は、ゲノムシステム社またはレキシコンジェネティック社から購入することができる。
【０１４７】
雌マウスに排卵誘起剤を投与後、同系統の雄と交配し、４日後雌マウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入する胚幹細胞トランスフォーマント１５乃至２０個を、微小ガラス管を用いて、胚盤胞の内部細胞塊に接触するように注入する。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠４日目の仮親雌動物（マウスの場合、Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩又は帝王切開により出生させる。得られたキメラ動物を正常動物とかけ合わせヘテロ接合型動物を作成し、更に、このヘテロ接合型動物を掛け合わせることによりホモ接合型動物を作成することができる。
【０１４８】
なお、Ｃｒｅ-ｌｏｘＰシステムを使用することにより、不要な薬剤耐性遺伝子を消失させたり、発現時期特異的なノックアウト動物を作成することもできる。
【０１４９】
このようにして得られた動物が導入した遺伝子を消失していることを確認する方法としては、該動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型として導入遺伝子に特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲを行う方法、該ＤＮＡを数種の制限酵素で消化後ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜やナイロン膜等にブロッティングしたものについて導入遺伝子の全部または一部を標識したものをプローブとしたサザンブロット解析を行なう方法等を挙げることができる。また、消失した遺伝子が実際に動物体内で発現しているか否かは、下記５．に記載の方法により血小板凝集能を測定することにより確認することができる。導入された遺伝子が実際に動物体内で消失している場合は、遺伝子を消失しない動物よりも血小板凝集能が低くなる。
【０１５０】
そのようにして得られた遺伝子導入動物に被検物質を投与して、血小板凝集を促進または抑制する活性を測定する（好ましくは、遺伝子導入しない動物にも被検物質を投与して結果を比較し、遺伝子導入した動物で顕著に血小板凝集を促進または抑制する活性を測定する）。また、遺伝子導入動物に被験物質を投与して、対象となる病体の治療または予防効果を試験することもできる。
【０１５１】
この方法では、導入された遺伝子の発現を抑制または阻害する物質のみならず、該遺伝子にコードされるポリペプチド自体の機能や、該ポリペプチドと相互作用して該ポリペプチドの機能発現に寄与する因子（例えば、レセプター）等、該ポリペプチドの作用による血小板凝集に関わる生体反応のいずれかを阻害する物質を見出すことができる。そのような物質も血小板凝集促進又は抑制に関連する疾患の治療または予防剤となり得る。
【０１５２】
５．血小板凝集活性を利用した血小板凝集促進活性または血小板凝集抑制活性を有する物質のスクリーニング方法
血小板凝集促進活性または血小板凝集抑制活性を有する物質は被験物質の血小板凝集活性を測定することによって、取得することができる。具体的には、以下のＡまたはＢのスクリーニング方法によって血小板凝集促進活性または血小板凝集抑制活性を有する物質を取得することができる。
【０１５３】
Ａ．血小板凝集促進活性または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（１）被験物質の存在下でｇｐ４４を発現する細胞と血小板を接触させる：
（２）血小板凝集活性を測定する：
（３）（２）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は抑制活性を有するか否かを判定する。
【０１５４】
Ｂ.血小板凝集促進活性または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（１）被験物質の存在下でｇｐ４４と血小板を接触させる：
（２）血小板凝集活性を測定する：
（３）（２）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は抑制活性を有するか否かを判定する。
以下、上記、Ａ及びＢのスクリーニング方法について、順次説明する。
【０１５５】
Ａ．血小板凝集促進活性または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（１）被験物質の存在下でｇｐ４４を発現する細胞と血小板を接触させる工程
「被験物質」は既に上記「１．」の項で示したように、人工的に合成した化合物、微生物の代謝産物、植物もしくは動物等の組織の抽出物、それらの塩もしくは誘導体またはそれらの混合物等を挙げることができる。被験物質の添加量および濃度は、適宜設定するかまたは希釈系列を作成する等により複数種の添加量を設定することができる。
【０１５６】
「ｇｐ４４を発現する細胞」も、上記「１．」の項に説明した細胞を用いることができる。
【０１５７】
「血小板」としては、血小板凝集活性を測定することができる限りにおいてどのような形態でもよく、例えば、血小板を含む溶液を用いることができる。溶液中の血小板濃度も血小板凝集活性を測定できる限りにおいて特に制限はない。血小板を含む溶液としては、血液をそのまま、血球を除いた血漿、血漿をＰＢＳ等の溶液で適当量（例えば、３倍）に希釈した溶液等を用いることができるが、血小板凝集活性を測定できる限りにおいて特に制限はない。血小板は発現しているｇｐ４４がどの生物由来のものかによって適当な生物由来のものを用いることができ、例えば、ヒト由来のｇｐ４４を発現している細胞を用いるときには、ヒト由来の血小板を用いることができ、マウス由来のｇｐ４４を発現している細胞を用いるときには、マウス由来の血小板を用いることができ、ラット由来のｇｐ４４を発現している細胞を用いるときには、ラット由来の血小板を用いることができ、イヌ由来のｇｐ４４を発現している細胞を用いるときには、イヌ由来の血小板を用いることができる。
【０１５８】
ｇｐ４４を発現する細胞と血小板を接触させる方法としては、例えば、ｇｐ４４を発現する細胞溶液に血小板を含む溶液を添加すればよい。
（２）血小板凝集活性を測定する工程
血小板凝集活性は、血小板の凝集活性を測定することができる限りにおいて得に制限はないが、例えば、血小板凝集に伴う光の透過度上昇を利用した血小板凝集のアッセイ法（Watanabe M, Okochi E, Sugimoto Y, Tsuruo T. Cancer Res. 1988; 48: 6411-6およびKato Y, Fujita N, Yano H, Tsuruo T. Cancer Res. 1997; 57: 3040-5）、カルシウム感受性蛍光物質（Quin2, Fura2）を用いた、血小板内カルシウム濃度の上昇を利用した血小板凝集のアッセイ法（Sage SO, Merritt JE, Hallam TJ, Rink TJ. Biochem J. 1989; 258: 923-6、Rink TJ, Sage SO. J Physiol. 1987; 393: 513-24およびSoslau G, Class R, Morgan DA, Foster C, Lord ST, Marchese P, Ruggeri ZM. J Biol Chem. 2001; 276: 21173-83）、カルシウム感受性発光蛋白（Aequorin）を用いた、血小板内カルシウム濃度の上昇を利用した血小板活性化のアッセイ法（Johnson PC, Ware JA, Cliveden PB, Smith M, Dvorak AM, Salzman EW. J Biol Chem. 1985; 260: 2069-76）、または、45Caを利用した血小板内カルシウム濃度の上昇を利用した血小板活性化のアッセイ法（Feinstein MB, Fraser C. J Gen Physiol. 1975; 66: 561-81）等を用いて測定することができる。
（３）（２）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は抑制活性を有するか否かを判定する工程
上記測定結果に基づいて、血小板凝集促進活性も血小板凝集抑制活性も示さないコントロールに比べて、高い血小板凝集活性を示す被験物質は、血小板凝集促進活性を有する物質であると判定することができ、一方、コントロールに比べて、低い血小板凝集活性を示すか、あるいは血小板凝集活性を全く示さない被験物質は、血小板凝集抑制活性を有する物質であると判定することができる。
上記スクリーニング方法によって血小板凝集抑制活性を有する物質として、抗ｇｐ４４モノクローナル抗体である８Ｆ１１が取得できる。
【０１５９】
Ｂ．血小板凝集促進活性または抑制活性を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
（１）被験物質の存在下でｇｐ４４と血小板を接触させる工程
「被験物質」及び「血小板」は上記「Ａ．」と同様である。「ｇｐ４４」はｇｐ４４を発現している生物の細胞から精製することもできるし、上記「１．」の項に記載した方法によって取得することもできる。
「（２）血小板凝集活性を測定する工程」及び「（３）（２）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は抑制活性を有するか否かを判定する工程」については、上記「Ａ．」と同様である。
【０１６０】
６．抗体結合部位の同定
ｇｐ４４に対する抗ｇｐ４４抗体の結合部位は、当業者が通常用いる方法によって決定することができる（Fujita N, Sato S, Katayama K, Tsuruo T. J. Biol. Chem. 2002; 277: 28706-13）が、例えば、ｇｐ４４のｃＤＮＡの種々の遺伝子断片をｐＥＴ-２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のような発現ベクターに組み込み、大腸菌で発現させ、発現したポリペプチドと抗ｇｐ４４抗体との反応性を調べ、反応性を示した断片と示さなかった断片とを比較することによって決定することができる。また、ｇｐ４４のｃＤＮＡに部位特異的変異を導入した遺伝子をｐｃＤＮＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のような発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞で発現させ、発現した変異タンパク質と抗ｇｐ４４抗体との反応性を調べ、反応性を示さない変異部位を特定することによってもｇｐ４４に対する抗ｇｐ４４抗体の結合部位を決定することができる。
【０１６１】
例えば、抗ｇｐ４４モノクローナル抗体である８Ｆ１１について、上記方法によって抗体結合部位を調べると、配列表の配列番号２あるいは配列番号１４のアミノ酸番号３９乃至４４に示されるアミノ酸配列を認識することが明らかとなる。すなわち、配列表の配列番号２あるいは配列番号１４のアミノ酸番号３９乃至４４に示されるアミノ酸配列を認識する抗体はｇｐ４４の血小板凝集活性を阻害することが明らかとなる。同様に、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４６から５１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５７から６２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体もｇｐ４４の血小板凝集活性を阻害する抗体となる。
【０１６２】
７．ｇｐ４４の血小板凝集に必須な部位の同定
ｇｐ４４のアミノ酸配列上で血小板凝集に必須な部位は、当業者が通常行う方法によって決定することができるが、例えば、ｇｐ４４のｃＤＮＡがコードする特定の箇所のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した各種変異体の遺伝子を作製し、ｐＣＤＮＡ３ベクターに導入し、ＣＨＯ細胞表面に発現させ、血小板が豊富な血漿画分（Platelet-rich plasma：PRP）を添加して、血小板の凝集活性を観察することによって、決定することができる。
【０１６３】
このような実験によって、例えば、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質についてはアミノ酸番号３４のスレオニンが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質についてはアミノ酸番号３４のスレオニンが、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質についてはアミノ酸番号４１とアミノ酸番号５０のスレオニンが、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質についてはアミノ酸番号５２のスレオニンが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質についてはアミノ酸番号３４のスレオニンが血小板凝集活性に必須であることが分かる。
【０１６４】
従って、上記血小板凝集活性に必須のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列からなる変異タンパク質は血小板凝集活性を有さない変異タンパク質となり、例えば、血小板凝集活性を有する天然型のタンパク質との比較により、血小板凝集機構の解明に利用することができ、血小板凝集促進物質や血小板凝集阻害物質の研究にも利用することができる。
【０１６５】
８．直接相互作用する物質の探索
本発明の他の一つの態様としては、ｇｐ４４の活性を抑制するような物質を得ることを目的とした、該蛋白質の立体構造をベースとしたドラッグデザインの手法を含む。このような手法は、ラショナルドラッグデザイン法として知られており、酵素活性などの機能や、リガンド、コファクター、またはＤＮＡへの結合などを効率よく阻害もしくは活性化させるような化合物の探索に利用されている。この例として、すでに上市されている抗ＨＩＶ剤であるプロテアーゼの阻害剤がよく知られている。ｇｐ４４の三次元構造解析においても、Ｘ―線結晶解析や核磁気共鳴法といった一般的によく知られている手法が利用できると考えられる。さらに、ｇｐ４４の機能を抑制する物質の探索には、コンピュータードラッグデザイン（ＣＡＤＤ）を活用した設計も可能である。なお、ｇｐ４４の活性に必須なアミノ酸として、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４１のアミノ酸あるいはアミノ酸番号５０のアミノ酸、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５２のアミノ酸、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４に示されるアミノ酸が明らかとなり、また抗ｇｐ４４モノクローナル抗体である８Ｆ１１はアミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を認識し、血小板凝集活性を阻害することが明らかとなったので、かかる領域付近の立体構造を利用することもできる。
【０１６６】
この例としては、慢性関節リウマチ治療の新たなゲノム新薬として期待されているＡＰ−１の働きを阻害する低分子化合物（国際特許出願公開ＷＯ９９／５８５１５号）などが知られている。このような方法により、ｇｐ４４に直接結合し、あるいはｇｐ４４と他の因子との相互作用を阻害することにより、ｇｐ４４の機能を抑制するような物質を得ることができる。
【０１６７】
さらに、他の一つの態様は、ｇｐ４４が会合するポリペプチド、すなわちｇｐ４４のパートナー蛋白質あるいはｇｐ４４と結合する化合物等に関する。すなわち、本発明は、ｇｐ４４の活性を調節するパートナー蛋白質や結合する化合物等のスクリーニング方法に関する。
【０１６８】
このスクリーニング方法の一つの態様は、ｇｐ４４に被験物質を接触させ、ｇｐ４４に結合する被験物質を選択する工程を含む。このような方法としては、例えば、精製したｇｐ４４を用いて、これに結合する蛋白質のアフィニティー精製を行う方法が挙げられる。また、ｇｐ４４の血小板凝集に必須のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなる部分ポリペプチドを用いることもできる。このような部分ポリペプチドとしては、例えば、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号４１ないしアミノ酸番号５０のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５２のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３４のアミノ酸を含み、連続した６個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号３９から４４のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを挙げることができる。
【０１６９】
具体的な方法の一例を示せば、ｇｐ４４または上記部分ポリペプチドにヒスチジン６個よりなる配列をアフィニティータグとして融合したものを作製して、これを細胞の抽出液（予めニッケル−アガロースカラムにチャージして、このカラムを素通りした画分）と４℃で１２時間インキュベートし、次いで、この混合物に別途ニッケル−アガロース担体を加えて４℃で１時間インキュベートする。ニッケル−アガロース担体を洗浄バッファーで十分洗浄した後、１００ｍＭイミダゾールを加えることにより、ｇｐ４４または部分ポリペプチドと特異的に結合する細胞抽出液中の蛋白質を溶出させて精製し、この構造を決定する。このようにして、ｇｐ４４またはその部分ペプチドと直接結合する蛋白質、及びｇｐ４４または部分ペプチドとの結合活性は持たないが、サブユニットとしてｇｐ４４に直接結合する蛋白質と複合体を形成することにより間接的にｇｐ４４に結合する蛋白質が精製できる［実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ５「転写因子研究法」ｐｐ２１５−２１９（羊土社刊）］。
【０１７０】
別の方法としては、ファーウエスタンブロット法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ７６−８１（羊土社刊）］や、酵母や哺乳類動物細胞を用いたツーハイブリッドシステム法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ６６−７５（羊土社刊）、「チェックメイト・マンマリアン・ツーハイブリッドシステム」（プロメガ社）］によるクローニングも可能であるが、これらの方法に限定されない。
【０１７１】
また、被験物質として化合物等を用いるときは、上記細胞の抽出液の代わりに被験物質を含む溶液を用いることができる。
【０１７２】
このようにして、ｇｐ４４と直接もしくは間接的に相互作用するパートナー蛋白質のｃＤＮＡが得られれば、ｇｐ４４と該パートナー蛋白質との相互作用を阻害する物質の機能的スクリーニングに利用することができる。具体的には、例えば、ｇｐ４４とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質を調製して、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビオチン化した該パートナー蛋白質をこの融合蛋白質と接触させ、該融合蛋白質との結合をストレプトアビジン化アルカリフォスファターゼで検出する。ビオチン化した該パートナー蛋白質添加の際、被験物質も添加し、融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合を促進あるいは阻害する物質を選択する。この方法では、融合蛋白質に直接作用する物質または該パートナー蛋白質に直接作用する物質が得られる。
【０１７３】
融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合が間接的であり、何らかの別の因子を介しているような場合には、例えば該因子を含むような細胞抽出液存在下で、同様に上記アッセイを行う。この場合には、該因子に対して作用するような物質も選択される可能性がある。
【０１７４】
また、得られたパートナー蛋白質が、ｇｐ４４の機能を抑制する活性を有している場合には、既に記載したｇｐ４４遺伝子の発現ベクターを応用した試験方法に従って、血小板凝集抑制活性を持つ有用な候補物質のスクリーニングを行うことができる。また、得られたパートナー蛋白質が、ｇｐ４４の機能を抑制する活性を有している場合には、このような抑制因子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、血小板凝集に起因する疾患の遺伝子治療に用いることができる。
【０１７５】
そのようなポリヌクレオチドは、例えば同定された阻害因子のアミノ酸配列を解析し、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを合成してｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより取得できる。また、ｇｐ４４の機能の阻害活性を有するぺプチドが、ランダムに合成された人工ペプチドライブラリー由来である場合は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを化学合成する。
【０１７６】
また、ｇｐ４４またはその部分ポリペプチドと結合する被験物質は上記、「５．」の項目で示したスクリーニング方法で血小板凝集促進活性または阻害活性を有するか否かを判定することができる。
【０１７７】
９．ｇｐ４４遺伝子の癌特異的発現
ｇｐ４４遺伝子が癌特異的に発現している遺伝子であるか否かは、癌組織と正常組織、あるいは、癌患者の癌部と非癌部におけるｇｐ４４遺伝子の発現量を比較することによって決定することができる。例えば、様々な癌患者の癌部と非癌部のｍＲＮＡを固相化したCancer Profiling Array II（BD Bioscience社）についてヒトホモログｇｐ３６遺伝子の発現量を比較すると、Colon（結腸）、Rectum（直腸）、Small intestine（小腸）、精巣の癌部において非癌部に比べｇｐ３６の発現量が上昇している傾向が観察される。すなわち、ｇｐ４４及びｇｐ４４遺伝子は腸及び精巣の癌（例えばSeminoma）診断用マーカーとして用いることができる。
【０１７８】
また、同様に癌患者の癌部と非癌部、更に転移部についてｇｐ４４の発現量の比較をすると、大腸癌の癌部で非癌部より発現量が増加していることが観察され、転移部ではさらに発現量が増加している傾向が観察される。すなわち、ｇｐ４４遺伝子の発現が大腸癌の転移促進に関与していると考えられる。
【０１７９】
ｇｐ４４の発現量を指標にした、腸癌及び／又は精巣癌の診断用キットとして、具体的には、以下の（１）乃至（６）から選択される少なくともいずれか一つを含むものを使用することができる。なお、これらのキットは組織における、癌の有無を検出することができるに止まらず、組織中の癌部と非癌部、さらに，転移部についても検出することができる。
（１）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズする、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
（３）（１）又は（２）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料。
（４）配列表の配列番号２、４、６、８または１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体；
（５）（４）に記載の抗体に結合し得る二次抗体；
（６）（４）又は（５）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料。
【０１８０】
１０．ｇｐ４４遺伝子及びｇｐ４４の癌組織型による発現量の差
（１）ｇｐ４４遺伝子の発現量
上記、「９．ｇｐ４４遺伝子の癌特異的発現」に記載の方法と同様の方法で、Cancer Profiling Array II（BD Biosciences社）及びCancer Profiling Array（BD Biosciences社）メンブレンを用いて肺癌における組織型とヒトホモログｇｐ３６遺伝子の発現レベルとの関係を調べると、扁平上皮癌では腺癌よりもｇｐ３６の発現が上昇している症例が多いことが確認できる。
【０１８１】
すなわち、ｇｐ４４遺伝子は、癌の組織型によって発現量に差があり、扁平上皮癌で発現量が上昇し、腺癌では発現量の上昇は認められない。したがって、ｇｐ４４遺伝子の発現量を調べることで、発現量が上昇していれば、扁平上皮癌であると判断でき、発現量が上昇していなければ、扁平上皮癌ではないと判断することができる。すなわち、ｇｐ４４遺伝子は扁平上皮癌のマーカーとして用いることもできる。
【０１８２】
（２）ｇｐ４４の発現量
ヒト肺癌組織及び正常肺組織における、ヒトホモログｇｐ３６の発現を免疫組織染色で調べると、扁平上皮癌ではｇｐ３６が発現していることが確認できるが、腺癌や正常な肺ではｇｐ３６の発現は確認できない。このことは、扁平上皮癌ではｇｐ３６の発現量が増加していることを示す。
【０１８３】
すなわち、ｇｐ４４は、癌の組織型によって発現量に差があり、扁平上皮癌で発現量が上昇し、腺癌では発現量の上昇は認められない。したがって、ｇｐ４４の発現量を調べることで、発現量が上昇していれば、扁平上皮癌であると判断でき、発現量が上昇していなければ扁平上皮癌ではないと判断することができる。すなわち、ｇｐ４４は扁平上皮癌のマーカーとして用いることができる。
【０１８４】
（３）扁平上皮癌検出用キット
ｇｐ４４及びｇｐ４４遺伝子は癌の組織型のうち，扁平上皮癌で発現量が上昇している。したがって、ｇｐ４４及び／又はｇｐ４４遺伝子の発現量を測定すれば，癌組織型が扁平上皮癌であるかどうかを判定することができる。
【０１８５】
扁平上皮癌検出用キットとしては、具体的には，以下の（ａ）乃至（ｆ）から選択される少なくともいずれか一つを有するものを挙げることができる。
（ａ）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｂ）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズする、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料。
（ｄ）配列表の配列番号２、４、６、８または１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体；
（ｅ）（ｄ）に記載の抗体に結合し得る二次抗体；
（ｆ）（ｄ）又は（ｅ）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料
１１．ｇｐ４４の癌転移促進効果
ｇｐ４４は血小板の凝集を促進する機能を有する。ｇｐ４４を発現する細胞を非ヒト哺乳動物の血管に投与すると、ｇｐ４４の血小板凝集能により、投与した細胞は凝集塊を形成する。この凝集塊は毛細血管を詰まらせ、そこで結節（腫瘍）を生成する。このようにして形成される結節を転移結節という。
【０１８６】
すなわち、ｇｐ４４を発現する細胞を投与することで、非ヒト哺乳動物に結節を生成させることができる。
【０１８７】
例えば、ｇｐ４４のヒトホモログであるｇｐ３６遺伝子を発現するＣＨＯ細胞をマウスの尾静脈より静脈注射によリ投与すると、ｇｐ３６を発現しない細胞を投与した場合に比べ、有意に結節の生成数が増加する。
【０１８８】
転移結節は、ヒトホモログｇｐ３６を発現する細胞を投与した非ヒト哺乳動物の肺、肝臓、リンパ節など各種組織で観察することができるが、例えば、ｇｐ３６を発現するＣＨＯ細胞を静脈から投与した場合には、肺を用いた目視観察により結節の生成を確認することができる。
【０１８９】
１２．転移結節の生成数の測定を利用した血小板凝集促進活性または血小板凝集抑制活性を有する物質のスクリーニング方法
ｇｐ４４を大量に発現している細胞を非ヒト哺乳動物に投与すると血小板凝集に伴う細胞の凝集を原因とする結節が確認される。したがって、結節を測定することによって被験物質が血小板凝集促進活性または血小板凝集抑制活性を有するか否かを判定することができる。また、結節数を測定することで被験物質が癌の転移を抑制する物質か又は促進する物質か否かを判定することもできる。
【０１９０】
このような性質を有する物質は具体的には、以下のスクリーニング方法によって取得することができる。
Ａ．以下の工程（１）乃至（３）を含むスクリーニング方法：
（１）被験物質の存在下でｇｐ４４を発現する細胞を非ヒト哺乳動物に投与する：
（２）（１）の非ヒト哺乳動物由来の組織における結節数を測定する：
（３）（２）の測定結果に基づいて、被験物質が血小板凝集促進活性又は血小板凝集抑制活性を有するか否かを判定する。
Ｂ．以下の工程（１）乃至（３）を含むスクリーニング方法：
（１）被験物質の存在下でｇｐ４４を発現する細胞を非ヒト哺乳動物に投与する：
（２）（１）の非ヒト哺乳動物由来の組織における結節数を測定する：
（３）（２）の測定結果に基づいて、被験物質が癌の転移抑制活性又は癌の転移促進活性を有するか否かを判定する。
【０１９１】
上記スクリーニング方法で用いることができる被験物質及びｇｐ４４を発現する細胞は、上記、「１．培養細胞を用いたスクリーニング方法」の項に記載したものと同様のものを用いることができる。
【０１９２】
ｇｐ４４を発現している細胞を被験物質存在下で非ヒト哺乳動物に投与した場合に，被験物質を投与しない場合に比べ結節数が低下していた場合、被験物質は血小板の凝集抑制活性を有すると判断することができる。また、転移結節数が低下していた場合には被験物質は、癌の転移抑制物質であると判断することもできる。
【０１９３】
また、ｇｐ４４を発現している細胞を被験物質存在下で非ヒト哺乳動物に投与した場合に、被験物質を投与しない場合に比べ結節数が増加していた場合、被験物質は血小板の凝集促進活性を有すると判断することができる。また、結節数が増加していた場合には、被験物質は、癌の転移促進物質であると判断することもできる。
【０１９４】
１３．血小板凝集または血小板機能障害に関連する疾患の診断方法
患者および正常人より得られた検体から抽出したｍＲＮＡまたはポリペプチドを試料として、上記「３．」または「４．」の項に記載の方法により、本発明に係るｍＲＮＡまたは本発明に係るポリペプチドの発現量を測定し、該発現量を患者由来の検体と正常人由来の検体とで比較することにより、血小板凝集または血小板機能障害に関連する疾患を診断することができる。
【０１９５】
すなわち、患者より得られた検体中の本発明に係るｍＲＮＡまたは本発明に係るポリペプチドの発現量が、正常人より得られた検体中の該ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現量と比べて多い場合には、血小板凝集促進に関連する疾患であるかまたは該疾患にかかる可能性が高いと診断することができる。また、患者より得られた検体中の本発明に係るｍＲＮＡまたは本発明に係るポリペプチドの発現量が、正常人より得られた検体中の該ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現量と比べて少ない場合には、血小板凝集抑制に関連する疾患であるかまたは該疾患になる可能性が高いと診断することができる。更に、本発明に係るｍＲＮＡまたは本発明に係るポリペプチドの発現量を経時的に観察することにより患者の予後を観察し、予測することもできる。
【０１９６】
本発明の診断方法は、被験動物および正常動物から得られた検体を用いることにより、哺乳動物についても適用することができる。
【０１９７】
上記において、「正常人」または「正常動物」とは、血小板凝集活性に異常がない人または動物を意味する。
【０１９８】
１４．血小板凝集促進または血小板凝集抑制活性を有する物質を測定するためのキット
血小板凝集促進または血小板凝集抑制を有する物質は、下記（１）乃至（５）の少なくとも一つに記載の物質を含むキットを用いて検出することができる。
（１）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）配列表の配列番号１、３、５、７または１３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
（３）配列表の配列番号２、４、６、８または１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合し、該タンパク質を検出するための抗体；
（４）（３）に記載の抗体に結合し得る二次抗体；
（５）（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の物質が固定された固相化試料。
【０１９９】
上記（１）に記載されたプライマーは、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列に基づき市販のプライマー設計ソフト（例えば、Wisconsin GCG package Version 10.2）を用いる等、情報により設計し、増幅することができる。
【０２００】
上記（２）に記載されたプローブは、本発明に係るポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであれば限定されない。このようなプローブとしては、好適には、１００乃至１５００塩基長であり、さらに好適には、３００乃至６００塩基長である。
【０２０１】
これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識または蛍光標識等）されていてもよく、また、リンカーが付加されていても良い。
【０２０２】
上記（５）の固相化試料のうち、（１）に記載のプライマーまたは（２）に記載のプローブを固相化した試料は、該プライマーまたはプローブをガラス板、ナイロンメンブレンなどの固相に固定することにより作製される。試料の固相化方法は、上記１．の（３−２−５）欄の（固相化試料の作製）に記載の方法と同様に行うことができる。
【０２０３】
また、上記（３）および（４）に記載の抗体は、上記１．の（４−３）に記載の方法と同様にして行うことができる。該抗体は、上記１．の（４−４）に記載の方法と同様にして、適宜標識（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識）されていてもよい。また、（５）の固相化試料のうち、該抗体を固相化した試料は、上記１．の（４−２）に記載の方法に準じて行うことができる。
【０２０４】
本キットは、上述の方法に準じて使用することにより、本発明に係るポリヌクレオチドまたは本発明に係るポリペプチドの検出、血小板凝集促進または抑制活性を有する物質のスクリーニング、物質の血小板凝集促進活性または抑制活性の測定あるいは血小板凝集促進または抑制に関連する疾患の診断に使用することができる。
【０２０５】
１５．医薬組成物
本発明の医薬組成物の有効成分である、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、常法により得ることができるが、例えば、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを産生する細胞を培養し、該細胞より抽出・精製するか、または、試験管内で該ポリヌクレオチドを増幅させ、若しくは、該ポリペプチドを発現させることにより得ることができる。
【０２０６】
得られた抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、抗原性の問題からヒト型抗ヒトｇｐ４４抗体を作製することが望ましい。ヒト型抗ヒトｇｐ４４抗体の作製は、以下の方法により得ることができる。
【０２０７】
（１）ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−４存在下、抗原であるｇｐ４４で感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１８２３）と細胞融合させることにより、ヒト型抗ｇｐ４４モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する。これらのハイブリドーマの産生する抗体の中からヒトｇｐ４４の活性を中和する抗体を選別することによりヒト型抗ヒトｇｐ４４抗体を得ることができる。
【０２０８】
上記のようにして得られたヒト型抗ヒトｇｐ４４モノクローナル抗体は、以下の方法により高親和化することができる。上記の方法により得られたヒト型抗ヒトｇｐ４４モノクローナル抗体は、そのＣＤＲ領域（特にＣＤＲ−３）にランダム変異を導入する。変異を導入した抗体をファージで発現させて、ヒトｇｐ４４を固相化したプレートを用いてファージディスプレー法を行い、抗原であるヒトｇｐ４４に強力に結合するファージを選択する。該ファージを大腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有するＣＤＲのアミノ酸配列を決定する。得られたヒト型抗ｇｐ４４モノクローナル抗体をコードする遺伝子を、一般的に使用されている哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで、発現させることにより、ヒト型抗ヒトｇｐ４４モノクローナル抗体を得ることができる。これらの抗体の中から、ヒトｇｐ４４の生物活性を中和し、かつ高親和性であるヒト型抗ｇｐ４４モノクローナル抗体を選別することにより、所望の高親和性の抗体を得ることができる。
【０２０９】
（２）Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、常法（Kohler et al.: Nature 256, p.495-497, 1975）に従いマウス型抗ヒトｇｐ４４モノクローナル抗体を作製し、ヒトｇｐ４４の生物活性を中和し、かつ高親和性を有するモノクローナル抗体を選択する。この高親和性マウス型抗ヒトｇｐ４４モノクローナル抗体のＣＤＲ−領域（ＣＤＲ−１、２および３）をＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ法（Winter and Milstein: Nature 349, p293-299, 1991）によりヒトＩｇＧのＣＤＲ領域に移植することにより、高親和性の抗体を得ることができる。
【０２１０】
（３）ヒト抹消血リンパ球をＳｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに移植する。ＳＣＩＤマウスはヒト型抗体を生産する（Mosier D. E. et al.: Nature 335, p256-259, 1988; Duchosal M. A. et al.: Nature 355, p258-262, 1992）ため、ヒトｇｐ４４を抗原として該マウスを感作し、スクリーニングすることにより、ヒトｇｐ４４に特異的なヒト型モノクローナル抗体を生産するリンパ球を採取することができる。得られたリンパ球を、上記（１）と同様の方法により、マウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１８２３）と細胞融合させ、得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【０２１１】
以上により得られたハイブリドーマを培養することにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を大量に製造できる。
【０２１２】
また、目的のヒト型モノクローナル抗体をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）をクローニングし、この遺伝子を遺伝子工学的手法により適当なベクターに組み込み、各種動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現させることにより、遺伝子組換えヒト型モノクローナル抗体を大量に製造することができる。更に、本方法で得られた抗ｇｐ４４モノクローナル抗体より、ｇｐ４４の生物活性を中和する抗体を得ることもできる。
【０２１３】
このようにして得られたｇｐ４４の生物活性を中和する抗体は、生体内でのｇｐ４４の生物活性、即ち、細胞の血小板凝集を阻害することから、医薬として、特に血小板凝集に関連する疾患の治療及び／または予防剤として使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗ｇｐ４４抗体によるｇｐ４４の生物活性の中和活性は例えば、上記５．記載の方法に従いｇｐ４４を過剰発現している細胞の血小板凝集の抑制活性を測定することにより確認することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ｇｐ４４抗体の血小板凝集に関連する疾患に対する治療及び／または予防効果は、例えば、ｇｐ４４を過剰に発現しているトランスジェニック動物に同ｇｐ４４抗体を投与し、血小板凝集に関連する疾患の変化を測定することにより確認することができる。
【０２１４】
更に、上記方法に準じて、ｇｐ４４の活性を促進する抗体も得ることができる。該抗体は、血小板凝集を促進することから、医薬として、特に血小板機能障害に関連する疾患の治療及び／または予防剤として使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗ｇｐ４４抗体によるｇｐ４４の促進活性は例えば、上記５．記載の方法に従いｇｐ４４を過剰発現している細胞の血小板凝集の促進活性を測定することにより確認することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ｇｐ４４抗体の血小板機能障害に関連する疾患に対する治療及び／または予防効果は、例えば、ｇｐ４４を低発現しているトランスジェニック動物に同ｇｐ４４抗体を投与し、血小板機能障害に関連する疾患の変化を測定することにより確認することができる。
【０２１５】
有効成分として、ポリヌクレオチドを使用する場合、通常遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法として知られる方法で投与することができる。例えば、このような方法としては、ウイルスベクターを利用した方法または非ウイルス性の導入方法（日経サイエンス, 1994年４月号，20-45頁、実験医学増刊, 12 (15) (1994)、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」, 羊土社(1996)）などを挙げることができる。
【０２１６】
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ＴＲ４または変異ＴＲ４をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法を挙げることができる。このうち、好適には、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはワクシニアウイルスを使用する。
【０２１７】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接組織内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、燐酸カルシウム法またはエレクトロポレーション法などが挙げられ、好適には、ＤＮＡワクチン法またはリポソーム法である。
【０２１８】
また、遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するインビボ（in vivo）法または人等から臓器若しくは組織の細胞を取り出して体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボ（ex vivo）法がある（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月間薬事, 36 (1), 23-48 (1994)、実験医学増刊, 12 (15) (1994)）。
【０２１９】
例えば、該遺伝子治療剤がインビボ法により投与される場合は、疾患、症状等に応じ、静脈、動脈、皮下、皮内、組織（筋肉を含む）内等、適当な投与経路により投与される。またインビボ法により投与する場合は、該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【０２２０】
配列表の配列番号１、３、５、７または１３のヌクレオチド配列またはその部分配列に相補的なヌクレオチド配列は、いわゆるアンチセンス治療に用いることができる。アンチセンス分子としては、通常１５乃至３０ｍｅｒからなるＤＮＡ、もしくはそのホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはモルフォリノ誘導体などの安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体を用いることができる。そのようなアンチセンス分子は、例えば、微量注入、リポソームカプセル化またはアンチセンス配列を有するベクターの利用等、本発明の技術分野において周知の方法で細胞に導入することができる。このようなアンチセンス療法は、配列表の配列番号１、３、５、７または１３に示されるヌクレオチド配列がコードするタンパク質の活性を減少させることができ、血小板凝集促進に関連する疾患の治療に有用である。
【０２２１】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、医薬として許容できる担体と混合する等、公知の方法によって製造することができる（例えば、レミントンのPharmaceutical Sciences）。配列番号１、３、５、７または１３に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現やその遺伝子産物の活性に異常の認められる血小板凝集促進活性に関連する疾患の治療には、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の十分な量を投与する。その有効量は、患者の状態、体重、性別、及び年齢などの種々の因子や、皮下、局所、経口、及び組織（筋肉を含む）内といった投与方法の違いによって変化する。例えば、静脈注射する場合には、０．０２乃至０．２ｍｇ／ｋｇ／時間で２時間、また、皮下投与の場合には、１乃至２００ｍｇ／ｍ2／日を投与することができる。
【０２２２】
有効成分としてポリペプチドを使用する場合、その投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等による経口投与又は注射剤若しくは坐剤等による非経口投与を挙げることができる。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤：及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；脂肪酸ナトリウム塩；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【０２２３】
その使用量は症状、年齢、投与方法等により異なるが、例えば、経口投与の場合には、１回当り、下限として、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ体重）、上限として、１００ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは、１０ｍｇ／ｋｇ体重）を、静脈内投与の場合には、１回当り、下限として、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重）、上限として、１０ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ体重）を１日当り１乃至数回症状に応じて投与することが望ましい。
【０２２４】
また、有効成分として抗体を使用する場合、製剤化して経口的あるいは非経口的に投与することができる。医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。モノクローナル抗体は高分子蛋白質であることから、バイアル瓶などのガラス容器や注射筒などへの吸着が著しい上に不安定であり、種々の物理化学的因子、例えば、熱、ｐＨ及び湿度等により容易に失活するため、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤等を添加することにより安定な形で製剤化することができる。安定化剤としてはグリシン、アラニン等のアミノ酸類、デキストラン４０及びマンノース等の糖類、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。またこれらの二種以上を併用してもよい。これらの安定化剤の添加量は、抗体の重量に対して０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。緩衝剤としては、例えばリン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。緩衝剤の添加量としては、例えば液状製剤あるいは凍結乾燥製剤を採用解した後の水量に対し、１〜１０ｍＭとするのが好ましい。界面活性剤としては、好ましくはポリソルベート２０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレングリコール等、特に好ましくはポリソルベート８０が挙げられ、またこれらの２種以上を併用してもよい。界面活性剤の添加量としては、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水重量に対して０．００１〜１．０％添加することが好ましい。
【０２２５】
特に医療用または動物用注射剤として用いる場合は、浸透圧として許容される浸透圧比は１〜２が好ましい。浸透圧比は、製剤化に際して塩化ナトリウムの増減により調製することができる。製剤中の抗体含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜調整することができ、ヒトに対するヒト型抗体の投与量は、抗体のヒトｇｐ４４に対する親和性、即ち、ヒトｇｐ４４に対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができる。ヒト型抗ｇｐ４４抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜３０日間に１回投与すればよい。
【実施例】
【０２２６】
以下、実施例を示してこの発明を詳細かつ具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」（Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.著, Cold SpringHarbor Laboratory Pressより1989年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【０２２７】
（実施例１）血小板凝集を引き起こす癌細胞でのｇｐ３８Ｐの発現検討
（１）細胞培養
マウス脳毛細血管内皮細胞ＭＢＥＣ−４（Tatsuta T, Naito M, Oh-hara T, Sugawara I, Tsuruo T. J Biol Chem. 1992; 267: 20383-91）、マウスリンパ節ストローマ細胞ＣＡ−１２（Fujita N, Kataoka S, Naito M, Heike Y, Boku N, Nakajima M, Tsuruo T. Cancer Res. 1993; 53: 5022-7）、マウス結腸癌細胞colon26とそのサブラインであるＮＬ−１４、ＮＬ−１７、ＮＬ−４４（Watanabe M, Okochi E, Sugimoto Y, Tsuruo T. Cancer Res. 1988; 48: 6411-6）、マウスＢ１６メラノーマ細胞のサブラインであるＢ１６／Ｆ１とＢ１６／Ｆ１０（Watanabe M, Sugimoto Y, Tsuruo T. Cancer Res. 1990; 50: 6657-62）、および、チャイニーズハムスター卵巣繊維芽細胞（ＣＨＯ）は、２ｍＭのL-グルタミン、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび10%のheat-inactivated FBSを加えたＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、湿度９５％ 、５％ＣＯ２の条件下で培養した。マウス骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（Sakamoto, S. and Sakamoto, M. Biochem. Int., 9, 51−58, 1984）、ヒト胎児腎臓細胞２９３Ｔは、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１０％のheat-inactivated FBSを加えたダルベッコ改変イーグル培地で、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【０２２８】
マウスの正常腹腔内マクロファージは、以下の方法により取得した。８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに１ｍＬの３％チオグリコレート溶液を腹腔に注射した。４日後に５ｍＬのＰＢＳを注射して、腹部を軽くもんでから腹腔液を吸い取り、細胞を遠心した後、ＰＢＳで２回洗い細胞を得た。（Gallily R, Feldman M.  Immunology. 1967 Feb;12(2):197-206参照）
（２）ウエスタンブロッティング（ＭＢＥＣ−４、ＣＡ−１２、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）
（１）に記載の方法により培養したＭＢＥＣ−４、ＣＡ−１２およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の各細胞を１×１０７個ずつ回収し、５００μｌのlysis  Ｂ（２５ｍＭTris （ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Na deoxycholate、２％ Nonidet P-40、０．２％  ＳＤＳ）に懸濁させ、１０分に1回攪拌しながら、氷上で１時間放置した。BCA-Protein Assay法（Pierce社）にて蛋白定量後、ＳＤＳサンプルバッファー（２−メルカプトエタノール入り）を２０μｌずつ加え、５分間煮沸したあと、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。ＰＶＤＦメンブレンに転写し、ブロッキングの後ｇｐ４４特異的に反応するモノクローナル抗体である８Ｆ１１抗体(１０μｇ／ｍｌ)（Watanabe et al, Cancer Res, 1991）, βアクチン抗体（シグマ社）を室温で１時間反応させた。０．０５％  Tween２０入りのＰＢＳで１０分３回洗い、ＨＲＰ標識２次抗体を反応させた。同様に洗浄後、ECL-detectionを行った。
【０２２９】
結果を図１のＡに示す。図１Ａから明らかなように、８Ｆ１１抗体はMC3T3-E1上の約４４ｋＤａの蛋白を認識することが明らかとなった。また、８Ｆ１１抗体で認識される抗原はマウス脳毛細血管内皮細胞MBEC-4、マウスリンパ節ストローマ細胞CA-12、マウスの正常腹腔内マクロファージにも認められた。
【０２３０】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ（ＮＬ−１７、ＮＬ−１４、ＮＬ−４４、Ｂ１６Ｆ１、Ｂ１６Ｆ１０細胞）
（１）記載の方法により培養したNL-17, NL-14, NL-44, B16F1, B16F10の各細胞を１×１０７個調製し、RNA PCR Kit (AMV) Ver.2.1(宝酒造)を用いてRNAを調製した。RT-PCRは常法に従い行なった（Morinaga Y, Fujita N, Ohishi K, Tsuruo T. Int J Cancer, 1997, 71; 422-8）。ｍＲＮＡ量の補正の為のコントロールとしてβアクチンの発現量を検出した。検出に用いたプライマーは、βアクチンのセンスプライマーとして、
５’−gatatcgctgcgctggtcgtcgac−３’ （配列表の配列番号１５）
に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、アンチセンスプライマーとして、
５’−caagaaggaaggctggaaaagagc−３’（配列表の配列番号１６）
に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ｇｐ３８Pのセンスプライマーとして、
５’−tcaagatgtg gaccgtgcca gtg−３’（配列表の配列番号９）
に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（図１Ｂ）または、
５’−ctcaagcttc aagatgtgga ccgtgccagt g−３’（配列表の配列番号１１）
に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（図１Ｃ）、アンチセンスプライマーとして、
５’−cgccatgggt catcttcctc cac−３’（配列表の配列番号１０）
に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（図１Ｂ）または、
５’−gaggaattcg ggcgagaacc ttccagaaat c−３’（配列表の配列番号１２）
に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（図１Ｃ）を用いた。
【０２３１】
結果を図１のＢ及びＣに示す。
【０２３２】
図１のＢに示すように、８Ｆ１１抗体の認識するgp44（マウス大腸癌細胞（Colon 26）とそのサブラインの場合）とｇｐ４０（マウスメラノーマ細胞の場合）を発現している細胞株では全てｇｐ３８ＰのｍＲＮＡ発現が認められた。また、正常マウス大腸ではｇｐ３８ＰのｍＲＮＡ発現が癌細胞より低いことが明らかとなった。さらに、図１Ｃに示すように、ＮＬ−１７細胞と比べて、血小板凝集能が低くｇｐ４４の発現量が少ないＮＬ−１４細胞では、８Ｆ１１抗体によるウエスタンブロッティングにより、ｇｐ３８Ｐ  ｍＲＮＡ発現量も少ないことが、ＲＴ−ＰＣＲ法にて確認された。つまり、８Ｆ１１抗体はｇｐ３８Ｐ（またはｇｐ３８）として知られる分子を認識することが示された。
【０２３３】
（実施例２）フローサイトメトリー
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列からなるｇｐ３８ＰのｃＤＮＡを取得するため、ＮＬ−１７細胞のｍＲＮＡを鋳型にセンスプライマーとして、
5’-ctcaagcttcaagatgtggaccgtgccagtg-3’（配列表の配列番号１７）
に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、アンチセンスプライマーとして、
５’−ttacttgtcgtcatcgtctttgtagtcgggcgagaaccttccagaaatc−３’（配列表の配列番号１８）
に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った。取得したPCR産物を、Concert Rapid PCR  Purification System (Gibco社)を用いて精製し、Xcm Iにより切断したp3Tベクター（MoBiTec社）にligationし、p3T/gp38Pを作製した。さらにp3T/gp38PをHindIIIとNotIで末端を切断し、pcDNA3ベクター（Invitrogen社）のEcoRI-NotIサイトにつなぎかえ、pcDNA3-gp38Pを作製した。作製したpcDNA3-gp38PプラスミドをＣＨＯ細胞に遺伝子導入し、Ｇ４１８（１mg/mL）で選択することにより、ｇｐ３８Ｐをステーブルに発現しているＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞株を樹立した。ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞を実施例１に記載の方法で培養した後、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗って、遠心にて回収した。１サンプルあたり１×１０６個の細胞に対し、８Ｆ１１抗体を１μｇずつ加え、氷上で１時間反応させた。PBSにて洗浄後、抗ラットＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Cappel社）を１００倍に希釈し、５０μｌ／サンプルで加え、氷上で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、FACS Caliber (Becton Dickinson)により測定した。
【０２３４】
結果を図２のＡに示す。８Ｆ１１抗体はＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞由来のサンプルにのみに反応し、親株のＣＨＯ由来のサンプルには反応しないことが明らかとなり、８Ｆ１１抗体は、ｇｐ４４およびｇｐ３８Ｐのいずれとも反応することが明らかとなった。これより、ｇｐ３８Ｐは、ｇｐ４４に対応する物質であることが示唆された。
【０２３５】
（実施例３）ウエスタンブロッティング
CHO細胞に遺伝子導入し、G418（1 mg/mL）で選択することにより、空遺伝子をステーブルに導入したトランスフェクタント（CHO/Mock）を得た。また、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるヒトホモログｇｐ３６をコードする遺伝子を、ヒト肺のcDNA library（コスモバイオ社）を鋳型に、センスプライマーとして、
5’-ctcaagcttgaacgatgtggaaggtgtcagc-3’（配列表の配列番号１９）
に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、アンチセンスプライマーとして、
５’−gaggaattcgggcgagtaccttcccgaca−３’（配列表の配列番号２０）
に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った。取得したPCR産物を、Concert Rapid PCR Purification System (Gibco社)を用いて精製し、HindIIIとEcoRIで末端を切断して、Eco RIとHind IIIであらかじめ切断しておいたpcDNA3-FLAG（pcDNA3ベクター（Invitrogen社）のEcoRI-NotIサイトにあらかじめFLAGタグの配列を挿入したもの）ベクターにligationし、pcDNA3-gp36を作製した。作製されたpcDNA3-gp36をステーブルに導入したトランスフェクタント（CHO/gp36）を樹立した。また、ヒト胎児腎細胞293T細胞に一過性にpcDNA3-gp38P、pcDNA3-gp36、pFLAG-CMV-2-gp38P（pcDNA3-gp38Pを鋳型にPCRを行ない、SIGMA社より入手したpFLAG-CMV-2ベクターのEco RIサイトにPCR産物をligationして作製した、N末にFLAGタグがつくgp38P発現プラスミド）の各プラスミドを遺伝子導入した。ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞、ＣＨＯ／ｇｐ３６細胞、ＣＨＯ／Ｍｏｃｋ細胞、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列からなるｇｐ３８Ｐをコードする遺伝子を一過性に発現させた２９３Ｔ細胞および配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるｇｐ３６をコードする遺伝子を一過性に発現させた２９３Ｔ細胞を実施例１の方法で培養した後、各細胞を１×１０７個ずつ回収し、５００μｌのlysis B(２５ｍＭTris (ｐＨ7.4、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム（Na deoxycholate）、２％ ノニデット（Nonidet） P-40、０．２％ＳＤＳ)に懸濁させ、１０分に1回攪拌しながら、氷上で１時間放置した。BCA-プロテインアッセイ法（Pierce社）にてタンパク質の定量後、ＳＤＳサンプルバッファー（２−メルカプトエタノール入り）を２０μｌずつ加え、５分間煮沸したあと、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。ＰＶＤＦメンブレンに転写し、ブロッキングの後８Ｆ１１抗体(１０μｇ／ｍｌ)、βアクチン抗体（シグマ社）を室温で１時間反応させた。０．０５％Tween 20入りのＰＢＳで１０分３回洗い、ＨＲＰ標識２次抗体を反応させた。同様に洗浄後、ECL-detectionを行った。
【０２３６】
結果を図２のＢに示す。８Ｆ１１抗体はＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞の約４４ｋＤａの蛋白を認識し、親株やモックトランスフェクタント、ヒトホモログｇｐ３６遺伝子発現株とは反応しなかった。さらに、ヒト２９３Ｔ細胞に一過性にｇｐ３８Ｐを遺伝子導入した細胞の約４４ｋＤａ蛋白質と反応することも確認された。一方、ヒトホモログｇｐ３６を遺伝子導入したものでは反応しないことから、トランスフェクトされたｇｐ３８Ｐが８Ｆ１１抗体の抗原であることが確認され、ｇｐ３８Ｐ発現にともなう２次的な蛋白発現ではないことが示唆された。
【０２３７】
（実施例４）免沈-ウエスタンブロッティング
ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞を実施例１の方法で培養した後、各細胞を１×１０７個ずつ回収し、５００μlのlysis B（２５ｍＭ Tris-HCl (ｐＨ７．４)、５０ｍＭ NaCl、０．５％ Na deoxycholate、２％ Nonidet P-40、０．２％ＳＤＳ）に懸濁させ、１０分に1回攪拌しながら、氷上で１時間放置した。ＣＨＯ親株とＦＬＡＧのタグ付きであるＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞の細胞溶解液から８Ｆ１１抗体、抗ＦＬＡＧ抗体、正常ラット抗体（コントロール用）を用いて免疫沈降し、８Ｆ１１抗体またはｇｐ４４を認識するもう一つの抗ｇｐ４４モノクローナル抗体である２０Ａ１１抗体(Watanabe M, Okochi E, Sugimoto Y, Tsuruo T. Cancer Res. 1988; 48: 6411-6参照。）を用いて、以下の方法によりウエスタンブロッティングを行った。８Ｆ１１抗体、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体（シグマ社）、コントロール用正常ラットＩｇＧ抗体（ＮＲ  ＩｇＧ；シグマ社）を１０μｇずつ、プロテインＧ−セファロース４Ｂゲル(Zymed社)１０μｌと氷上で１時間反応させたあと、ＰＢＳで洗い、各細胞のライセートを１００μｌずつ加え、氷上で１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファー（２−メルカプトエタノール入り）を２０μｌずつ加え、５分間煮沸したあと、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。ＰＶＤＦメンブレンに転写し、ブロッキングの後８Ｆ１１抗体（１０μｇ／ｍｌ）、２０Ａ１１抗体（培養上清）を室温で１時間反応させた。ＰＶＤＦメンブレンを０．０５％Tween 20入りのＰＢＳで１０分×３回洗い、抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社）を反応させた。同様に洗浄後、ECL-検出（detection）を行った。
【０２３８】
結果を図２のＣに示す。それぞれ、ウエスタンブロッティングに８Ｆ１１抗体を用いたものを図２Ｃ左に、モノクローナル抗体２０Ａ１１を用いたものを図２Ｃ右に示す。抗FLAG抗体で免疫沈降されるｇｐ３８Ｐが、８Ｆ１１抗体と２０Ａ１１抗体で認識されることから、ｇｐ４４として見つけていた分子はｇｐ３８Ｐと同一であることが証明された。
【０２３９】
（実施例５）血小板凝集実験
マウスよりヘパリンを用いて血液を採取し、９００ｒｐｍで１０分遠心を行い、血小板が豊富な血漿画分（Platelet-rich plasma：PRP）を集めた。このＰＲＰをＰＢＳで３倍の体積に希釈し、血小板凝集用のＰＲＰとした。血小板凝集に用いる細胞は、トリプシンで処理し回収した後、セルバンカーで一晩凍結したものを使用した。実際にはマウスＰＲＰを２００μｌずつ分注し、２x１０７cells／ｍｌのＣＨＯ親株、ＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞をそれぞれ１０μｌずつ加え、ヘマトレーサー（NKK HEMA TRACER I MODEL PAT-4M; Niko Bioscientific CO, Tokyo, Japan）を用いて血小板凝集の様子を記録した（参考文献：Watanabe M, Okochi E, Sugimoto Y, Tsuruo T. Cancer Res. 1988; 48: 6411-6）。また８Ｆ１１抗体による血小板凝集抑制効果を検討する場合には、ＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞をコントロール用Ｎｏｒｍａｌ  Ｒａｔ  ＩｇＧ（コントロール抗体；Sigma社）または８Ｆ１１抗体（５００μｇ）と２０分氷浴上で反応させた後に上記の血小板凝集実験を行なった。
【０２４０】
結果を図３のＡおよびＢに示す。図３ＡにあるようにＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞のみで血小板凝集が確認され、ｇｐ３８Ｐが血小板を凝集させる活性を持つことが確認された。また図３Ｂより、このＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞による凝集は、細胞をあらかじめ８Ｆ１１抗体と反応させることにより抑制されることから、本結果の示す血小板凝集はｇｐ３８遺伝子産物の発現によることが確認された。
【０２４１】
（実施例６）抗ヒトgp36ポリクローナル抗体（TT679）の作製
Japanese White Rabbitに以下のアミノ酸配列からなるペプチドにキャリアーとしてKeyhole Limpet Hemocyanin (KLH)を共有結合させたペプチド：
Cys Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val（配列表の配列番号２１）
を6回免疫し、血清を回収した。血清を上記ペプチドをセファロースゲルに固相化したカラムにてaffinity精製を行なった。
【０２４２】
（実施例７）ウエスタン・ブロッティング
CHO細胞に発現する遺伝子を含んでいない空のpcDNA3（Mock）、pcDNA3-gp38P、pcDNA3-gp36、またはgp38Pの点変異体のgp38P-M41A cDNAを含んだpcDNA3プラスミド（pcDNA3-gp38P-M41A）を遺伝子導入し、２４時間後に1x107個ずつ回収し、５００μlのlysis B(25 mM Tris (pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.5% デオキシコール酸ナトリウム（sodium deoxycholate）、2% ノニデット（Nonidet）P-40、0.2% SDS) に懸濁させ、１０分に1回ボルテックス（vortex）しながら、氷上で１時間放置した。Pierce社のBCA-Protein Assay法にて蛋白定量後、SDS sample buffer（２−メルカプトエタノール入り）を２０μlずつ加え、５分間煮沸したあと、10％ ポリアクリルアミド・ゲル（polyacrylamide gel）を用いて電気泳動を行った。PVDFメンブレンに転写し、ブロッキングの後、抗gp36ポリクローナル抗体（TT679）、8F11抗体(10μg/ml)を室温で１時間反応させた。0.05% Tween 20入りのPBSで１０分３回洗い、HRP標識２次抗体を反応させた。同様に洗浄後、ECL-検出（detection）を行った。
【０２４３】
結果を図４Ａに示す。抗gp36ポリクローナル抗体（TT679）はCHO/gp36細胞由来のサンプルのみに反応し、CHO/Mock、CHO/gp38P、CHO/gp38P-M41Aには反応せず、一方8F11抗体はCHO/gp38P細胞由来のサンプルのみに反応し、CHO/Mock、CHO/gp38P-M41A、CHO/gp36には反応せず、作製された抗gp36ポリクローナル抗体（TT679）は特異的にヒトホモログgp36に反応することが確認された。
【０２４４】
（実施例８）マウス・ヒト血小板凝集実験
マウスまたはヒト健常人よりヘパリンを用いて血液を採取し、900rpmで１０分間遠心を行い、血小板が豊富な血漿画分（Platelet-rich plasma：PRP)を集めた。このPRPをPBSで３倍の体積に希釈し、血小板凝集用のPRPとした。血小板凝集に用いる細胞は、トリプシンで処理し回収した後、使用した。実際にはマウスまたはヒトPRPを200μlずつ分注し、２x１０7cells/mlのCHO親株、CHO/gp38P、CHO/gp36、をそれぞれ１０μlずつ加え、ヘマトレーサー（NKK HEMA TRACER I MODEL PAT-4M; Niko Bioscientific CO, Tokyo, Japan）を用いて血小板凝集の様子を記録した（参考文献：Watanabe, M., Okochi, E., Sugimoto, Y., and Tsuruo, T. Cancer Res. 48: 6411-6416, 1988）。
結果を図４のＢ、Ｃ、Ｄに示す。図４Ｂに示すように、マウスのgp38P遺伝子が発現しているCHO/gp38P細胞だけでなく、gp38Pのヒトホモログであるgp36遺伝子が発現しているCHO/gp36細胞にもマウス血小板凝集を誘導する活性があることが確認された。また図４Ｃに示すように、マウスのgp38P遺伝子が発現しているCHO/gp38P細胞にはヒト血小板を凝集させる活性を持つことが確認された。さらに図４Ｄに示すように、ヒトのgp36遺伝子が発現しているCHO/gp36細胞にはヒト血小板を凝集させる活性を持つことが確認された。本結果より、gp38Pとヒトホモログであるgp36には、マウス・ヒトといった種を超えた血小板凝集誘導活性を持つことが確認された。
【０２４５】
（実施例９）8F11抗体による血小板凝集阻害
マウスよりヘパリンを用いて血液を採取し、900rpmで１０分間遠心を行い、血小板が豊富な血漿画分（Platelet-rich plasma：PRP）を集めた。このPRPをPBSで３倍の体積に希釈し、血小板凝集用のPRPとした。血小板凝集に用いたCHO/gp38P細胞は、トリプシンで処理し回収した後、使用した。実際にはマウスPRPを200μlずつ分注し、8F11抗体またはコントロール用Ｎｏｒｍａｌ  Ｒａｔ  ＩｇＧ（コントロール抗体；Sigma社）を1 mg添加し３７℃で３０分反応させた。その後、２x１０7cells/mlのCHO/gp38Pを１０μlずつ加え、ヘマトレーサー（NKK HEMA TRACER I MODEL PAT-4M; Niko Bioscientific CO, Tokyo, Japan）を用いて血小板凝集の様子を記録した（参考文献：Watanabe, M., Okochi, E., Sugimoto, Y., and Tsuruo, T. Cancer Res. 48: 6411-6416, 1988）。
【０２４６】
結果を図５Ａに示す。8F11抗体はgp38Pを恒常的に発現させたCHO/gp38P細胞によるgp38P依存的な血小板凝集を抑制することが分かり、コントロール用Ｎｏｒｍａｌ  Ｒａｔ  ＩｇＧ（コントロール抗体）添加では血小板凝集が抑制されないことから、8F11抗体はgp38Pを認識して結合することにより血小板凝集を中和する活性を示す抗体であることが明らかとなった。
【０２４７】
（実施例１０）gp38Pフラグメントを用いた8F11抗体結合部位の同定
全長gp38P遺伝子を含むプラスミドを鋳型にPCRを行ない、PCR産物をEcoRIとNheIで処理した後、pET-21a vector（Novagen社）にFLAGタグをコードする遺伝子をあらかじめ組み込んだプラスミドにligationした。このプラスミドで形質転換した大腸菌を培養しIPTG添加により発現誘導を行なった。この大腸菌の菌体を遠心により集め、直接SDS sample buffer（２−メルカプトエタノール入り）を５０μlずつ加え、5分間煮沸したあと、10％ ポリアクリルアミド・ゲルを用いて電気泳動を行った。PVDFメンブレンに転写し、ブロッキングの後、抗FLAG-M2抗体（シグマ社）、8F11抗体(10μg/ml)を室温で１時間反応させた。0.05% Tween 20入りのPBSで１０分間×３回洗浄し、HRP標識２次抗体を反応させた。同様に洗浄後、ECL検出を行った。
【０２４８】
結果を図５のＢ及びＣに示す。図５Ｂに示すように、8F11抗体はｇｐ３８ＰのＮ末から４６番（配列表の配列番号１４のアミノ酸番号４６番）目以降をコードするgp38Pの遺伝子断片から生成されたポリペプチドには強く反応するが配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１乃至４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、弱い反応性しか示さなかった。なお、配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１乃至４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが発現していることは抗FLAG抗体で確認した。また、8F11抗体は配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至４０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドには全く反応しないという結果が得られた。また図５Ｃに示すように、N末を削った配列表の配列番号１４のアミノ酸番号４１乃至１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドには全く反応しないが、配列表の配列番号１４のアミノ酸番号３９乃至１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドには強く反応した。gp38Pの遺伝子断片から生成されたポリペプチドに対する8F11抗体の反応性をまとめると図５Ｄのようになる。8F11抗体のgp38P上の認識部位は配列表の配列番号１４のアミノ酸番号３９乃至４４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが推測された。
【０２４９】
（実施例１１）gp38Pの点変異体を用いた8F11抗体結合部位の確認
gp38P cDNA（WT）を用いて、配列表の配列番号１４のアミノ酸番号３８のグリシンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＧ３８Ａ（配列表の配列番号２２にヌクレオチド配列を示し、配列番号２３にアミノ酸配列を示す。）、配列番号１４のアミノ酸番号４０のグリシンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＧ４０Ａ（配列表の配列番号２４にヌクレオチド配列を示し、２５にアミノ酸配列を示す。）、配列番号１４のアミノ酸番号４１のメチオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＭ４１Ａ（配列表の配列番号２６にヌクレオチド配列を示し、２７にアミノ酸配列を示す。）、配列番号１４のアミノ酸番号４２のバリンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＶ４２Ａ（配列表の配列番号２８にヌクレオチド配列を示し、２９にアミノ酸配列を示す。）、配列番号１４のアミノ酸番号４３のプロリンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＰ４３Ａ（配列表の配列番号３０にヌクレオチド配列を示し、３１にアミノ酸配列を示す。）、配列番号１４のアミノ酸番号４５のグリシンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＧ４５Ａ（配列表の配列番号３２にヌクレオチド配列を示し、３３にアミノ酸配列を示す。）、配列番号１４のアミノ酸番号４９のリジンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＫ４９Ａ（配列表の配列番号３４にヌクレオチド配列を示し、３５にアミノ酸配列を示す。）、配列番号１４のアミノ酸番号３４のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＴ３４Ａ（配列表の配列番号３６にヌクレオチド配列を示し、３７にアミノ酸配列を示す。）、配列番号１４のアミノ酸番号３７のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＴ３７Ａ（配列表の配列番号３８にヌクレオチド配列を示し、３９にアミノ酸配列を示す。）、配列番号１４のアミノ酸番号５１のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＴ５１Ａ（配列表の配列番号４０にヌクレオチド配列を示し、４１にアミノ酸配列を示す。）、配列番号１４のアミノ酸番号５２のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したＴ５２Ａ（配列表の配列番号４２にヌクレオチド配列を示し、４３にアミノ酸配列を示す。）の各変異体をQuickChange Mutagenesis Kit (Stratagene社)を用いて作製した。これら変異体に変異が導入されていることをシーケンスにて確認後、pcDNA3ベクターに組み込み、CHO細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入２４時間後にＣＨＯ細胞を1x107個ずつ回収し、５００μlのlysis B(25 mM Tris (pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.5% デオキシコール酸ナトリウム、 2% Nonidet P-40, 0.2% SDS) に懸濁し、１０分に1回vortexしながら、氷上で１時間放置した。Pierce社のBCA-Protein Assay法にて蛋白定量後、SDS sample buffer（2−メルカプトエタノール入り）を２０μlずつ加え、５分間煮沸したあと、10％ ポリアクリルアミド・ゲルを用いて電気泳動を行った。PVDFメンブレンに転写し、ブロッキングの後、抗FLAG-M2抗体（Sigma社）、8F11抗体(10μg/ml)を室温で１時間反応させた。0.05% Tween 20入りのPBSで１０分３回洗い、HRP標識２次抗体を反応させた。同様に洗浄後、ECL検出を行った。
【０２５０】
結果を図６Ａに示す。8F11抗体はＧ４０Ａ、Ｍ４１Ａ、Ｖ４２Ａ、Ｐ４３Ａの各変異体には反応せず、Ｇ３８Ａの変異体に対しては弱い反応性しか示さなかった。その他の変異体に対して8F11抗体は強く反応した。よって、先の図５の結果と合わせ、8F11抗体はgp38Pのアミノ酸番号３９から４４番目（配列表の配列番号１４のアミノ酸番号３９乃至４４）のペプチド配列を認識することが明らかになった。
【０２５１】
（実施例１２）ELISAによる8F11抗体の反応部位の確認
gp38P蛋白の３９番目から４７番目（配列表の配列番号１４のアミノ酸番号３９乃至４７）のアミノ酸配列のＣ末にシステイン（Ｃ）を加えたアミノ酸配列：
Asp Gly Met Val Pro Pro Gly Ile Glu Cys（配列表の配列番号４４）からなるペプチド（ＷＴ)と、
アミノ酸番号４１のメチオニンをアラニンにしたアミノ酸配列：
Asp Gly Ala Val Pro Pro Gly Ile Glu Cys（配列表の配列番号４５）からなるペプチド(Ｍ４１Ａｐｔ)、アミノ酸番号４２のバリンをアラニンにしたアミノ酸配列：
Asp Gly Met Ala Pro Pro Gly Ile Glu Cys（配列表の配列番号４６）からなるペプチド(Ｖ４２Ａｐｔ)、アミノ酸番号４３のプロリンをアラニンにしたアミノ酸配列:
Asp Gly Met Val Ala Pro Gly Ile Glu Cys（配列表の配列番号４７）からなるペプチド（Ｐ４３Ａｐｔ）、アミノ酸番号４４のプロリンをアラニンにしたアミノ酸配列：
Asp Gly Met Val Pro Ala Gly Ile Glu Cys（配列表の配列番号４８）からなるペプチド(Ｐ４４Ａｐｔ)をペプチド合成機にて合成し、96-well plateに固相化した。常法に従い（参考文献： Kato, Y., Fujita, N., Yano, H., and Tsuruo, T. Cancer Res., 57, 3040-3045, 1997）8F11抗体とコントロールラット抗体（Sigma社）のペプチドに対する反応性をELISA法にて検討した。
【０２５２】
結果を図６Ｂに示す。図６Ｂに示すように、8F11抗体はWTペプチドには反応するが、他の変異ペプチドには反応性を示さず、図６Ａの結果が別の実験で再現でき、確かに8F11抗体はgp38Pのアミノ酸39から44番目（配列表の配列番号１４のアミノ酸番号３９乃至４４）を認識することが明らかになった。
【０２５３】
（実施例１３）8F11抗体によるgp38Pの血小板凝集阻害機構の検討
8F11抗体により認識されるペプチド配列がgp38Pの血小板凝集活性に必須であるなら、この部位のアミノ酸配列に変異を入れた変異gp38Pには血小板凝集活性が認められない可能性がある。そこで、マウスよりヘパリンを用いて血液を採取し、900rpmで１０分間遠心を行い、血小板が豊富な血漿画分（Platelet-rich plasma：PRP）を集めた。このPRPをPBSで３倍の体積に希釈し、血小板凝集用のPRPとした。血小板凝集に用いる細胞は、トリプシンで処理し回収した後、使用した。実際にはマウスPRPを200μlずつ分注し、２x１０7cells/mlのCHO親株、CHO/gp38P、gp38Pの４１番目のメチオニンをアラニンに置換したM41A-gp38P（配列表の配列番号２７）をステーブルに発現するCHO/M41Aをそれぞれ１０μlずつ加え、ヘマトレーサー（NKK HEMA TRACER I MODEL PAT-4M; Niko Bioscientific CO, Tokyo, Japan）を用いて血小板凝集の様子を記録した（参考文献：Watanabe, M., Okochi, E., Sugimoto, Y., and Tsuruo, T. Cancer Res. 48: 6411-6416, 1988）。
【０２５４】
結果を図６Ｃ及びＤに示す。図６Ｃに示すように、マウスのgp38P遺伝子が発現しているCHO/gp38P細胞だけでなく、gp38Pの４１番目（配列表の配列番号１４のアミノ酸番号４１）のメチオニンをアラニンに置換したM41A-gp38Pをステーブルに導入したCHO/M41A細胞もマウスの血小板凝集を誘導する活性を持つことが確認された。このことは図６Ｄに示すように、8F11抗体が8F11認識部位近傍に存在するgp38Pの糖鎖を立体的に障害することにより、糖鎖依存的な血小板凝集を阻害している可能性を示すものである。
【０２５５】
（実施例１４）gp38P蛋白質上の血小板凝集に必須な部位の同定
配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる、野生型gp38P のアミノ酸番号４１のメチオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換した変異体タンパク質Ｍ４１Ａ、アミノ酸番号３４のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換した変異体タンパク質Ｔ３４Ａ(配列表の配列番号３７)、アミノ酸番号３７のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換した変異体タンパク質Ｔ３７Ａ（配列表の配列番号３９）、アミノ酸番号５１のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換した変異体タンパク質Ｔ５１Ａ（配列表の配列番号４１）、及び、アミノ酸番号５２のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換した変異体タンパク質Ｔ５２Ａ（配列表の配列番号４３）の各変異体タンパク質をコードするcDNAを含んだpcDNA3ベクターをCHO細胞に一過性に遺伝子導入しそれぞれの蛋白を膜表面上に発現させ、２４時間後にトリプシンで処理し回収した。マウスよりヘパリンを用いて血液を採取し、900rpmで１０分遠心を行い、血小板が豊富な血漿画分（Platelet-rich plasma：PRP）を集めた。このPRPをPBSで３倍の体積に希釈し、血小板凝集用のPRPとした。実際にはマウスPRPを200μlずつ分注し、２x１０7cells/ml濃度の、変異体タンパク質Ｍ４１Ａを一過性に発現させたCHO/M41A、変異体タンパク質Ｔ３４Ａを一過性に発現させたCHO/T34A、変異体タンパク質Ｔ３７Ａを一過性に発現させたCHO/T37A、変異体タンパク質Ｔ５１Ａを一過性に発現させたCHO/T51A、及び変異体タンパク質Ｔ５２Ａを一過性に発現させたCHO/T52Aをそれぞれ１０μlずつ加え、ヘマトレーサー（NKK HEMA TRACER I MODEL PAT-4M; Niko Bioscientific CO, Tokyo, Japan）を用いて血小板凝集の様子を記録した（参考文献：Watanabe, M., Okochi, E., Sugimoto, Y., and Tsuruo, T. Cancer Res. 48: 6411-6416, 1988）。
【０２５６】
結果を図７Ａに示す。図７Ａに示すように、変異体タンパク質Ｔ３４Ａを一過性に発現させたCHO/T34A細胞にはマウスの血小板凝集を誘導する活性が全くないことが分かり、３４番目（配列表の配列番号１４のアミノ酸番号３４）のスレオニンが血小板凝集に必須な部位であることが明らかになった。この部位は図７Ｂに示すように、スレオニンの次にプロリンが続く部位であり、糖鎖がつきやすい部位であることが知られている（参考文献：Yoshida, A., Suzuki, M., Ikenaga, H., and Takeuchi, M. J. Biol. Chem. 272: 16884-16888, 1997）。この部位（図７Ｂの＊マークの部位）はマウスのgp38Pだけでなく、他のヒト（配列表の配列番号８のアミノ酸番号５２）・ラット（配列表の配列番号４のアミノ酸番号３４）・イヌ（配列表の配列番号６のアミノ酸番号４１あるいはアミノ酸番号５０）のホモログにも保存されていることが、それぞれのアミノ酸配列を比較した図７Ｂより分かり、血小板凝集活性に重要な部位であることが示唆された。
【０２５７】
（実施例１５）ヒトホモログgp36蛋白質上の血小板凝集に必須な部位の同定
野生型gp36 cDNA（WT）とその５２番目（配列表の配列番号８のアミノ酸番号５２）のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したgp36-T52A（配列表の配列番号４９にヌクレオチド配列を示し、５０にアミノ酸配列を示す。）、配列表の配列番号８のアミノ酸番号５５のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したgp36-T55A（配列表の配列番号５１にヌクレオチド配列を示し、５２にアミノ酸配列を示す。）の各変異体をコードするcDNAを含んだpcDNA3ベクターをCHO細胞に一過性に遺伝子導入しそれぞれの蛋白を膜表面上に発現させ、２４時間後にトリプシンで処理し回収した。マウスよりヘパリンを用いて血液を採取し、900rpmで１０分遠心を行い、血小板が豊富な血漿画分（Platelet-rich plasma：PRP）を集めた。このPRPをPBSで３倍の体積に希釈し、血小板凝集用のPRPとした。実際にはマウスPRPを200μlずつ分注し、２x１０7cells/mlの野生型gp36を一過性に発現させたCHO/gp36、gp36の５２番目（配列表の配列番号８のアミノ酸番号５２）のスレオニンをアラニンに置換したgp36-T52Aを一過性に発現させたCHO/gp36-T52A、gp36の５５番目（配列表の配列番号８のアミノ酸番号５５）のスレオニンをアラニンに置換したgp36-T55Aを一過性に発現させたCHO/gp36-T55Aをそれぞれ１０μlずつ加え、ヘマトレーサー（NKK HEMA TRACER I MODEL PAT-4M; Niko Bioscientific CO, Tokyo, Japan）を用いて血小板凝集の様子を記録した（参考文献：Watanabe, M., Okochi, E., Sugimoto, Y., and Tsuruo, T. Cancer Res. 48: 6411-6416, 1988）。
【０２５８】
結果を図７Ｃに示す。図７Ｃに示すように、gp36-T52Aを一過性に発現させたCHO/gp36-T52A細胞にはマウスの血小板凝集を誘導する活性が全くないことが分かり、配列番号８のアミノ酸番号５２のスレオニンが血小板凝集に必須な部位であることが明らかとなった。この部位は図７Ｂに示すように、gp38Pとホモロジーの極めて高い部位であり、かつgp38P同様にスレオニンの次にプロリンが続く部位で糖鎖がついている可能性が高い部位であることが知られている（参考文献：Yoshida, A., Suzuki, M., Ikenaga, H., and Takeuchi, M. J. Biol. Chem. 272: 16884-16888, 1997）。また、犬のホモログに関しては、このスレオニンに糖鎖が結合している可能性をEdman分解後のシーケンスの際に読めないことから示唆している（参考文献：Zimmer, G., Lottspeich, F., Maisner, A., Klenk, H. D., and Herrler, G. Biochem. J. 326: 99-108, 1997）。よって、種を超えて保存されているこの部位（図７Ｂの＊マークの部位）が血小板凝集誘導活性に極めて大事な部位であることが示唆された。
【０２５９】
（実施例１６）ヒトホモログgp36遺伝子の腸癌における発現上昇
Cancer Profiling Array II（BD Biosciences社）は、様々な癌患者（160症例）の癌部（T）と非癌部（N）からmRNAを抽出し、cDNAに変換し、４種類のhouse-keeping遺伝子でcDNAの量を各々補正した後にナイロンメンブレン上に固相化したものである。このCancer Profiling Array IIメンブレンに32Pラベルしたヒトホモログgp36遺伝子をプローブとしてハイブリダイズし、各々のdotにおける放射比活性をBAS1000 phosphoimage analyzer（フジフィルム社）にて可視化・定量化し、gp36遺伝子の癌における発現レベルの検討を行なった。基本的な方法はBD Biosciences社のプロトコールに従った（参考文献：Wiechen, K., Diatchenko, L., Agoulnik, A., Scharff, K. M., Schober, H., Arlt, K., Zhumabayeva, B., Siebert, P. D., Dietel, M., Schafer, R., and Sers, C. Am. J. Pathol. 159, 1635-1643, 2001）。また癌部（T）と非癌部（N）での発現の差異は、Cancer Profiling Array IIメンブレンに32Pラベルしたヒトユビキチン遺伝子をコントロールプローブとしてハイブリダイズし、BAS1000 phospho-image analyzerにて可視化・定量化してgp36遺伝子の放射比活性を補正し、各々の患者の癌部（T）と非癌部（N）の発現の比率を計算した。また、Cancer Profiling Array II に固相化されている大腸癌患者No.5と小腸癌患者No.2のcDNAをBD Biosciences社より購入し、これをtemplateとしてgp36遺伝子を増幅するプライマー：
5’-TGTGGAAGGTGTCAGCTCTG-3’（センス：配列表の配列番号５３）
5’-TTAGGGCGAGTACCTTCCCG-3’（アンチセンス：配列表の配列番号５４）
コントロール用Ribosomal protein S9遺伝子を増幅するプライマー：
5’-GATGAGAAGGACCCACGGCGTCTGTTCG-3’（センス：配列表の配列番号５５）
5'-GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGGACA-3’（アンチセンス：配列表の配列番号５６）を用いてPCRを行なった。PCRの条件としては、BD Biosciences社の推奨するプロトコールに従い、９４℃30秒後、35回９４℃30秒・６８℃2分のPCRを行ない、最終的に68℃で5分間反応液を熱した後、アガロース電気泳動を行なった。
結果を追加図８のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤに示す。図８Ａに示すように、gp36遺伝子をプローブとして用いた場合には、gp36遺伝子の発現がColon（結腸）、Rectum（直腸）、Small intestine（小腸）の癌部（T）において９０％以上の確率で非癌部（N）に比べ上昇していることが認められる。一方、Lung（肺）、Breast（乳房）、Ovary（卵巣）の癌部（T）と非癌部（N）ではあまりgp36の遺伝子発現レベルには変化が認められず、腸癌で特異的にgp36遺伝子の発現上昇が認められた。さらにユビキチン遺伝子をコントロールプローブとして用いて、メンブレン上のcDNAの量を補正し、各々の患者の癌部（T）と非癌部（N）におけるgp36遺伝子の発現量の比を計算した結果を追加図５Bに示す。また他の臓器由来の癌におけるgp36遺伝子の発現量の比を計算した結果を追加図５Cに示す。これらの図からも分かるようにColon（結腸）、Rectum（直腸）、Small intestine（小腸）、Testis（精巣）の癌部（T）において高頻度にgp36遺伝子の発現量の増加が確認され、gp36発現の有無が腸及び精巣の癌の診断マーカーとして使用できる可能性が示唆された。またこのCancer Profiling Array IIの結果が正しいことを証明するために、Cancer Profiling Array IIで固相化されている大腸癌患者No.5と小腸癌患者No.2のcDNA（図８Ａで数字の周りを円で囲っているサンプル）を用いて、gp36遺伝子のプライマーでPCRを行なった結果、確かに癌部（T）より調製したcDNAにおいてgp36遺伝子の発現量が非癌部（N）に比べ多いことが確認された（図８Ｄ）。尚、コントロール用にribosomal protein S9を増幅するプライマーで同様にPCRを行なった結果、PCRに用いた癌部（T）と非癌部（N）のcDNA量は等しいことが確認されている（図８Ｄ下図）。
【０２６０】
（実施例１７）ヒトホモログgp36蛋白質の結腸癌における発現
ヒト結腸癌におけるgp36蛋白質発現増加を検討するために、ヒト結腸癌組織および正常結腸組織の切片に対する免疫組織染色を行なった。具体的には、Ambion社よりLandMark Tissue Microarrays Low Density Colorectalを購入し、これを上述の抗ヒトgp36ポリクローナル抗体であるTT679抗体を用いて免疫染色した。このMicroArrayは直径600 μmのニードルでパンチした結腸癌と正常組織のホルマリン固定された組織切片をスライドグラス上にのせ、パラフィン包埋したものである。この組織切片に対して、TT679抗体を一次抗体として反応させ、二次抗体にはビオチン標識抗rabbit抗体を用い、ペルオキシダーゼ標識streptoavidin（DAKO社、LSAB2 kit）を反応後DABを基質として発色させて、抗体が反応している部分は茶色に染まるようにした。ヘマトキシレン・エオジン（H&E）染色した各々の組織の写真は、Ambion社においてH&E染色されたサンプルを写真にとったものである。
【０２６１】
結果を図９に示す。図９のＡ及びＣにあるように、ヒト結腸癌の組織切片に対してTT679抗体は強い反応性を示したが、正常な結腸の組織切片に対してはほとんど反応性を示さず（図９Ｅ）、gp36は図８で示した遺伝子レベルだけでなく、蛋白質レベルでも確かに腸癌で発現が上昇していることが示され、腸癌の診断において、ｇｐ４４のヒトホモログgp36の発現上昇がマーカーとなることが確認された。
【０２６２】
（実施例１８）ヒトホモログgp36発現レベルと結腸癌転移との相関
Cancer Profiling Array（BD Biosciences社）は、上述のCancer Profiling Array  IIと同様に、様々な癌患者（241症例）の癌部（T）と非癌部（N）、さらには幾つかの症例では転移部（M）からmRNAを抽出し、cDNAに変換し、４種類のhouse-keeping遺伝子でcDNAの量を各々補正した後にナイロンメンブレン上に固相化したものである。このCancer Profiling Arrayメンブレンに32Pラベルしたヒトgp36遺伝子をプローブとしてハイブリダイズし、各々のdotにおける放射比活性をBAS1000 phosphoimage analyzer（フジフィルム社）にて可視化・定量化し、gp36遺伝子の原発巣・転移巣における発現レベルの検討を行なった。基本的な方法はBD Biosciences社のプロトコールに従った（参考文献：Wiechen, K., Diatchenko, L., Agoulnik, A., Scharff, K. M., Schober, H., Arlt, K., Zhumabayeva, B., Siebert, P. D., Dietel, M., Schafer, R., and Sers, C. Am. J. Pathol. 159, 1635-1643, 2001）。また癌部（T）と非癌部（N）、転移部（M）での発現の差異は、Cancer Profiling Array メンブレンに32Pラベルしたヒトユビキチン遺伝子をコントロールプローブとしてハイブリダイズし、BAS1000 phospho-image analyzerにて可視化・定量化してgp36遺伝子の放射比活性を補正し、各々の患者の非癌部（N）での発現を１とした際の比率で癌部（T）と転移部（M）での発現比率を計算した。
【０２６３】
結果を図１０のＡ及びＢに示す。図１０Ａにあるように、ヒトホモログgp36遺伝子をプローブとして用いた場合には、gp36遺伝子の発現が大腸癌の癌部（T）で非癌部（N）より多くなっていることが分かる。さらに転移部（M）ではさらにgp36遺伝子発現が増加している場合が多いことが分かる。ユビキチン遺伝子をコントロールプローブとして用いて、メンブレン上のcDNAの量を補正し、各々の患者の非癌部（N）におけるgp36遺伝子の発現量を１とした際の癌部（T）と転移部（M）の比を計算した結果を図１０Ｂに示す。その結果、明らかに転移部（M）でのgp36発現が癌部（T）、さらには非癌部（N）より増加している場合が多く、この結果よりgp36遺伝子発現が大腸癌の転移促進に関わっていることが明らかになった。
【０２６４】
（実施例１９）ヒトホモログgp36発現に伴う肺転移増加
実施例３に記載した方法により、配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるヒトホモログgp36遺伝子を含んだpcDNA3-gp36プラスミド及びコントロールとしてgp36遺伝子を含まないpcDNA3プラスミドをCHO細胞に遺伝子導入し、G418（1 mg/mL）に対する耐性で選択した。
【０２６５】
ここで樹立された細胞株のうち、ヒトホモログgp36をステーブルに発現している細胞株をCHO/gp36細胞と命名し、gp36遺伝子を含まないpcDNA3プラスミドを含んだ細胞株をCHO/mock細胞と命名した。CHO/gp36細胞及びCHO/mock細胞を実施例１に記載の方法で培養した後、トリプシン処理し、PBSで洗って、遠心にて回収した。
【０２６６】
CHO/gp36細胞及びCHO/mock細胞をそれぞれ、Hanks’ Balanced Salt Solution（マグネシウム・カルシウム不含： 0.40 g/L KCl、0.06 g/L KH2PO4、8.0 g/L NaCl、0.35 g/L NaHCO3、0.048 g/L Na2HPO4、1.00 g/L D-Glucose、0.01 g/L Phenol Red）に1 mL当たり2.5X106個の細胞濃度になるように調製した。調製した各細胞を含む溶液をBALB/cヌードマウス（チャールズリバー・ジャパンより購入、５週齢・メス）の尾静脈より200μLずつ（5X105細胞／マウス）移植した（参考文献：Sugimoto, Y., Watanabe, M., Oh-hara, T., Sato, S., Isoe, T., and Tsuruo, T. Cancer Res. 51: 921-925, 1991）。細胞を移植したヌードマウスを移植１９日後にエーテル麻酔下にて屠殺し、肺を摘出した。摘出した肺を飽和ピクリン酸にて固定し、肺結節を可視化した。
【０２６７】
結果を図１１に示す。CHO/mock細胞を移植したヌードマウスの肺にはほとんど転移結節が認められないのに対し、CHO/gp36細胞を移植したヌードマウスの肺は、肺自体の大きさも大きくなっているだけでなく、肺表面に多数の結節が認められた。またその転移結節数を測定した結果、CHO/mock細胞を移植した場合には２〜４個であるのに対し、CHO/gp36細胞を移植した場合には７８〜１０６個であり、gp36発現に伴い肺転移が劇的に増加することが明らかとなり、ｇｐ４４のヒトホモログgp36の発現と転移形成に相関があることが確認された。
【０２６８】
（実施例２０）肺癌の組織型とヒトホモログgp36遺伝子発現との相関
実施例１６に記載の方法により、Cancer Profiling Array II（BD Biosciences社）及びCancer Profiling Array（BD Biosciences社）メンブレンに32Pラベルしたヒトホモログgp36遺伝子及び32Pラベルしたヒトユビキチン遺伝子をプローブとしてハイブリダイズし、各々のdotにおける放射比活性をBAS1000 phosphoimage analyzer（フジフィルム社）にて定量化し、gp36遺伝子の肺癌における発現レベルの検討を行なった。またCancer Profiling Array II及びCancer Profiling Arrayに添付の各々の癌における組織型を参考に、gp36遺伝子発現レベルと肺癌の組織型との相関を検討した。
【０２６９】
結果を図１２に示す。Cancer Profiling Array II及びCancer Profiling Arrayで重複しているサンプルを除き、腺癌１３症例と扁平上皮癌１５症例におけるヒトホモログgp36遺伝子の発現をプロットした。その結果、扁平上皮癌は腺癌よりgp36の発現が上昇している症例が多いことが明らかとなった。カットオフ値を1.5にとった場合、癌部で発現上昇している腺癌症例は０であるのに対し、扁平上皮癌の場合には１５症例中１０症例でgp36遺伝子発現上昇が認められた。
【０２７０】
（実施例２１）肺癌の組織型とヒトホモログｇｐ３６発現との相関
ヒト肺癌におけるｇｐ３６の蛋白質としての発現を検討するために、ヒト肺癌組織及び正常肺組織の切片に対する免疫組織染色を行なった。具体的には、実施例１７に記載のLandMark Low Density Lung Tissue Microarrays（カタログナンバー3172、ロットナンバー122P14A）を用いて、実施例６に記載の抗ヒトgp36ポリクローナル抗体であるTT679抗体を用いて免疫染色した。このMicroArrayは実施例１７と同様に直径600μmのニードルでパンチした肺癌と正常肺組織のホルマリン固定された組織切片をスライドグラス上にのせ、パラフィン包埋したものである。この組織切片に対して、TT679抗体を一次抗体として反応させ、二次抗体にはビオチン標識抗ウサギ抗体を用い、ビオチン標識ペルオキシダーゼ・ストレプトアビジン複合体（DAKO社、CSA System）を反応させ、さらにビオチン標識タイラマイドとペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを反応後DABを基質として発色させて、抗体が反応している部分は染色するようにした。
【０２７１】
結果を図１３に示す。図１３の上部３つの写真にあるように、扁平上皮癌では染色されている癌細胞が多数認められるが、腺癌および正常肺は全く染まっておらず、扁平上皮癌特異的にｇｐ３６が発現していることが確認された。LandMark Low Density Lung Tissue Microarrays上にある扁平上皮癌８症例中、７症例（87.5 %）でgp36の発現が陽性であったが、腺癌では１３症例中gp36の発現が陽性であったのは２症例（15.4 %）だけであり、実施例２０の結果と合わせ、扁平上皮癌で特異的にｇｐ４４のヒトホモログgp36の蛋白質レベルでの発現が上昇していることが確認された。
【０２７２】
（製剤例１）ソフトカプセル剤
消化性油状物、例えば、大豆油、綿実油又はオリーブ油中に入れた、以下の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチドの混合物を調製し、正置換ポンプでゼラチン中に注入して、10 mgの活性成分を含有するソフトカプセルを得、洗浄後、乾燥する：
（ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５１９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から５０１に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号１から５１０に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１から４８９に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号１３のヌクレオチド番号１から５４０に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
（ｇ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から１６９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から１７２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｇ）乃至（ｋ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血小板凝集促進活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【０２７３】
（製剤例２）錠剤
常法に従って、10 mgの製剤例１に記載のオリゴヌクレオチド２、0.2 mgのコロイド性二酸化珪素、5 mgのステアリン酸マグネシウム、275 mgの微結晶性セルロース、11 mg のデンプン及び98.8 mg のラクトースを用いて製造する。
【０２７４】
尚、所望により、剤皮を塗布する。
【０２７５】
（製剤例３）懸濁剤
5 ml中に、10 mgの製剤例１に記載のオリゴヌクレオチド、100 mgのナトリウムカルボキシ基メチルセルロ−ス、5 mgの安息香酸ナトリウム、1.0 g のソルビトール溶液 (日本薬局方) 及び0.025 mlのバニリンを含有するように製造する。
【０２７６】
（製剤例４）注射剤
1.5 重量% の製剤例１に記載のオリゴヌクレオチドを、10容量% のプロピレングリコール中で撹拌し、次いで、注射用水で一定容量にした後、滅菌して製造した。
【図面の簡単な説明】
【０２７７】
【図１】Ａ：マウス脳毛細血管内皮細胞MBEC-4、マウスリンパ節ストローマ細胞CA-12、マウス骨芽細胞MC3T3-E1、正常マウスマクロファージおよびLPS刺激した活性化マウスマクロファージの細胞溶解液を、８Ｆ１１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示した図である。左より、ＭＢＥＣ−４、ＣＡ−１２、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、正常マウスマクロファージ、ＬＰＳ刺激マウスマクロファージの順である。
【０２７８】
Ｂ：マウス大腸癌Colon 26細胞のサブラインであるNL-17、NL-44、Colon 26、マウスメラノーマB16細胞のサブラインであるB16/F1、B16/F10及び正常マウス大腸より調製したmRNAを、gp38Pのプライマーを用いてRT-PCRを行なった結果を示した図である。左から、マーカー（６０３ｂｐ）、NL-17、NL-44、Colon 26、B16/F1、B16/F10、正常マウス大腸の順である。
【０２７９】
Ｃ：NL-17とNL-14の細胞より調製したmRNAを、gp38Pおよびβアクチンのプライマーを用いてRT-PCRを行なった結果を示した図である。
【図２】Ａ：ＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞と親株（Parental CHO）のフローサイトメトリーの結果を示す。縦軸には細胞数を、横軸には蛍光強度を示す。親株には８Ｆ１１抗体が反応しなかったため蛍光強度の強い（８Ｆ１１抗体で認識されている）細胞は存在しない（ピークが左によっている）が、ＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞に対しては８Ｆ１１抗体が反応して蛍光強度の強い細胞が多く存在している（ピークが右にシフトしている）。
【０２８０】
Ｂ：８Ｆ１１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。左から、CHO/Mock細胞、CHO/gp38P細胞、CHO/gp36細胞、293T細胞に一過性（transient）にpcDNA3-FLAG-gp38Pを導入した細胞、同じくpcDNA3-FLAG-gp36を導入した細胞、pFLAG-CMV-2-gp38Pを導入した細胞（右端２レーン）の結果を示す。
【０２８１】
Ｃ：CHO/gp38P細胞と親株CHO細胞の免疫沈降後のウエスタンブロッティングの結果を示す。左の写真は８Ｆ１１抗体、右の写真は２０Ａ１１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果であり、それぞれ、左から、２レーンずつ、８Ｆ１１抗体、抗ＦＬＡＧ抗体、正常マウスＩｇＧ抗体で免疫沈降したサンプルを示す。各免疫沈降のサンプルのうち、左がＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐのサンプル、右が親株ＣＨＯのサンプルを示す。
【図３】gp38Pの血小板凝集能に関して親株ＣＨＯとＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞を用いマウス血液より調製した正常血小板を凝集させる活性を検討した。
【０２８２】
Ａ：親株ＣＨＯと配列番号１３に記載のgp38P遺伝子を導入したＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞の血小板凝集抑制活性を血小板凝集計により測定した結果を示した図である。
【０２８３】
Ｂ：ＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞をあらかじめ８Ｆ１１抗体と反応させた場合の8F11抗体の血小板凝集抑制活性を血小板凝集計により測定した結果を示した図である。
【図４】マウスgp38P及びヒトgp36の血小板凝集能に関して、親株ＣＨＯと各々の発現プラスミドをCHO細胞に遺伝子導入したCHO/gp38PとCHO/gp36を用いマウスとヒト血液より調製した正常血小板を凝集させる活性を検討した。
【０２８４】
Ａ：ＣＨＯ細胞に空のpcDNA3ベクター（Mock）、pcDNA3-gp38P、pcDNA3-gp38P-M41A、pcDNA3-gp36を一過性に遺伝子導入し、各々の細胞溶解液をgp36を特異的に認識するTT679ポリクローナル抗体と８Ｆ１１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果である。TT679ポリクローナル抗体はpcDNA3-gp36を遺伝子導入した細胞のみに、８Ｆ１１抗体はpcDNA3-gp38Pを遺伝子導入した細胞のみに反応していることが分かる。
【０２８５】
Ｂ：親株ＣＨＯと配列番号１３に記載のgp38P遺伝子を導入したＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞、配列番号７に記載のgp36遺伝子を導入したＣＨＯ／ｇｐ３６細胞のマウス血小板を凝集させる活性を血小板凝集計により測定した結果を示した図である。
【０２８６】
Ｃ：親株ＣＨＯと配列番号１３に記載のgp38P遺伝子を導入したＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞のヒト血小板を凝集させる活性を血小板凝集計により測定した結果を示した図である。
【０２８７】
Ｄ：親株ＣＨＯと配列番号７に記載のgp36遺伝子を導入したＣＨＯ／ｇｐ３６細胞のヒト血小板を凝集させる活性を血小板凝集計により測定した結果を示した図である。
【図５】gp38Pの血小板凝集誘導活性を阻害する8F11抗体のgp38P認識部位の検索をおこなった結果である。
【０２８８】
Ａ：ＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞をあらかじめ８Ｆ１１抗体またはコントロール抗体各１mgと反応させた場合の8F11抗体による血小板凝集抑制活性を血小板凝集計により測定した結果を示した図である。
【０２８９】
Ｂ：大腸菌に、配列番号１３に記載のgp38P遺伝子の遺伝子断片をコードする遺伝子を含んだpET-21aベクター（Novagen社）を遺伝子導入した後、大腸菌内でこれら遺伝子がコードする蛋白質を発現させた。大腸菌溶解液を、８Ｆ１１抗体または抗FLAG抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示した図である。左より、配列番号１４に記載のgp38P蛋白質のアミノ酸番号１−４０、１−４３、１−４６、１−４９、１−５４、１−６０を発現させた大腸菌の順である。
【０２９０】
Ｃ：上記と同様に、大腸菌溶解液を８Ｆ１１抗体または抗FLAG抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示した図である。左より、配列番号１４に記載のgp38P蛋白質のアミノ酸番号３７−１７２、３９−１７２、４１−１７２を発現させた大腸菌の順である。
【０２９１】
Ｄ：大腸菌に発現させたgp38P蛋白質断片に対する8F11抗体の反応性をまとめた図である。反応性の認められなかったものは白カラムで、反応性の弱かったものは灰色カラムで、反応性の強く認められたものは黒カラムで示した。その結果、8F11抗体の認識する部位は配列番号１４に記載のアミノ酸番号３９から４４番目であることが推測された。
【図６】8F11抗体のgp38P認識部位と血小板凝集活性の相関について検討した図である。
【０２９２】
Ａ：ＣＨＯ細胞に空のpcDNA3（Mock）、配列番号１３に記載のgp38P遺伝子を含んだpcDNA3（WT）、あるいは配列番号１３に記載のgp38P遺伝子のアミノ酸１つをアラニンに置換した各種変異gp38Pを含んだpcDNA3を一過性に遺伝子導入し、その細胞溶解液を８Ｆ１１抗体または抗FLAG抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示した図である。
【０２９３】
Ｂ：配列表の配列番号１４のアミノ酸番号３９乃至４７のアミノ酸配列のＣ末にシステインを加えたアミノ酸配列からなるペプチド（ＷＴｐｔ：配列表の配列番号４４）と、アミノ酸番号４１のメチオニンをアラニンにしたアミノ酸配列からなるペプチド(Ｍ４１Ａｐｔ：配列表の配列番号４５)、アミノ酸番号４２のバリンをアラニンにしたアミノ酸配列からなるペプチド(Ｖ４２Ａｐｔ：配列表の配列番号４６)、アミノ酸番号４３のプロリンをアラニンにしたアミノ酸配列からなるペプチド（Ｐ４３Ａｐｔ：配列表の配列番号４７）、アミノ酸番号４４のプロリンをアラニンにしたアミノ酸配列からなるペプチド(Ｐ４４Ａｐｔ：配列表の配列番号４８)を96-well plateに固相化した後、8F11抗体とコントロール抗体の各ペプチドに対する反応性をELISA法にて検討した結果である。
【０２９４】
Ｃ：親株ＣＨＯと配列番号１３に記載のgp38P遺伝子を導入したＣＨＯ／ｇｐ３８Ｐ細胞、gp38Pの４１番目のメチオニンをアラニンに置換したM41A-gp38Pをステーブルに発現するCHO/M41Aの血小板凝集抑制活性を血小板凝集計により測定した結果を示した図である。
【０２９５】
Ｄ：ｇｐ３８Ｐによる血小板凝集を抑制する8F11抗体の認識部位と、８F１１抗体による凝集阻害機構を模式化した図である。
【図７】gp38Pとgp36における血小板凝集誘導活性に必須な部位の同定を行なった図である。
【０２９６】
Ａ：配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる、野生型gp38P のアミノ酸番号４１のメチオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換した変異体タンパク質Ｍ４１Ａ、アミノ酸番号３４のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換した変異体タンパク質Ｔ３４Ａ、アミノ酸番号３７のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換した変異体タンパク質Ｔ３７Ａ、アミノ酸番号５１のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換した変異体タンパク質Ｔ５１Ａ、及び、アミノ酸番号５２のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換した変異体タンパク質Ｔ５２Ａの各変異体タンパク質をコードするcDNAを含んだpcDNA3ベクターをCHO細胞に一過性に遺伝子導入しそれぞれの蛋白を膜表面上に発現させ、各々の細胞の血小板凝集誘導活性を血小板凝集計により測定した結果を示した図である。
Ｂ：Ａで同定されたマウスgp38P上の血小板凝集に必須な部位の、他の種のホモログ蛋白質上におけるアライメントを行なった図である。マウスで認められたgp38P上の血小板凝集に必須な部位は他の種のホモログにおいても高度に保存されているだけでなく、特に大事なマウスgp38P上のスレオニン（配列表の配列番号１４のアミノ酸番号３４；図７Bの＊で示した部位）は、他のヒト（配列表の配列番号８のアミノ酸番号５２）・ラット（配列表の配列番号４のアミノ酸番号３４）・イヌ（配列表の配列番号６のアミノ酸番号４１あるいはアミノ酸番号５０）のホモログにも保存されていることが分かる。
【０２９７】
Ｃ：野生型gp36 cDNA（WT）とその５２番目（配列表の配列番号８のアミノ酸番号５２）のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したgp36-T52A、配列表の配列番号８のアミノ酸番号５５のスレオニンをコードする遺伝子をアラニンをコードする遺伝子に置換したgp36-T55Aの各変異体をコードするcDNAを含んだpcDNA3ベクターをCHO細胞に一過性に遺伝子導入しそれぞれの蛋白を膜表面上に発現させ、各々の細胞の血小板凝集抑制活性を血小板凝集計により測定した結果を示した図である。
【図８】腸癌におけるgp36遺伝子発現上昇を検討した図である。
【０２９８】
Ａ：Cancer Profiling Array IIメンブレン（BD Biosciences社）に32Pラベルしたヒトgp36 cDNA（配列表の配列番号７）またはヒトユビキチンcDNAをプローブとしてハイブリダイズし、各々の癌部（T）と非癌部（N）における放射比活性をBAS1000 phosphoimage analyzer（フジフィルム社）にて可視化・定量化し、gp36遺伝子の癌における発現レベルを可視化したものである。
【０２９９】
Ｂ：Ａで同定された癌部（T）と非癌部（N）での発現の差異を、ヒトユビキチンcDNAの放射比活性で補正し、各々の患者の癌部（T）と非癌部（N）の発現の比率を定量化しdotで示した結果である。各々の臓器由来の癌の平均値はバーで示した。
【０３００】
Ｃ：Ｂと同様に、各臓器由来癌におけるgp36遺伝子発現を定量化した結果である。各々の臓器由来の癌の平均値はバーで示した。
Ｄ：Cancer Profiling Array II に固相化されている大腸癌患者No.5と小腸癌患者No.2のcDNA（Ａで数字を丸で囲っているサンプル）をBD Biosciences社より購入し、これをtemplateとしてgp36遺伝子を増幅するプライマー（配列表の配列番号５３と５４）またはコントロール用Ribosomal protein S9遺伝子を増幅するプライマー（配列表の配列番号５５と５６）を用いてPCRを行なった結果である。
【図９】結腸癌におけるgp36蛋白質発現を検討した図である。Ambion社よりLandMark Tissue Microarrays Low Density Colorectalを購入し、これをサンプルに抗gp36ポリクローナル抗体であるTT679抗体を用いて免疫染色した結果である（A、C、E）。ヘマトキシレン・エオジン（H&E）染色した各々の組織の写真（B、D、F）は、Ambion社においてH&E染色された各々のサンプルである。
【図１０】結腸癌転移部位におけるgp36遺伝子発現上昇を検討した図である。Ａ：Cancer Profiling Array（BD Biosciences社）に32Pラベルしたヒトgp36 cDNA（配列表の配列番号７）またはヒトユビキチンcDNAをプローブとしてハイブリダイズし、各々の癌部（T）と非癌部（N）、さらには転移部（M）における放射比活性をBAS1000 phosphoimage analyzer（フジフィルム社）にて可視化・定量化し、gp36遺伝子の癌における発現レベルを可視化したものである。
【０３０１】
Ｂ：Ａで同定された癌部（T）と非癌部（N）、さらには転移部（M）での発現の差異を、ヒトユビキチンcDNAの放射比活性で補正し、各々の患者の癌部（T）と非癌部（N）、さらには転移部（M）の発現の比率を定量化し棒グラフで示した結果である。転移巣において、癌部よりもさらにgp36遺伝子の発現が上昇している症例が多く認められることが分かる。
【図１１】ＣＨＯ／ｍｏｃｋ細胞を移植したマウスとＣＨＯ／ｇｐ３６細胞を移植したマウスの肺にできた結節を示す図。
【図１２】ヒト肺の扁平上皮癌と腺癌の癌部と非癌部におけるｇｐ３６  ｍＲＮＡの発現量の差を示す図。
【図１３】ヒト肺の扁平上皮癌、腺癌及び正常肺におけるｇｐ３６の発現を示す図。ｇｐ３６が発現している部分は染色されている。
【配列表フリーテキスト】
【０３０２】
配列番号９：ｇｐ３８Ｐ用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１０：ｇｐ３８Ｐ用ＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号１１：ｇｐ３８Ｐ用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１２：ｇｐ３８Ｐ用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１５：β−アクチン用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１６：β−アクチン用ＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号１７：ｇｐ３８Ｐ用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１８：ｇｐ３８Ｐ用ＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号１９：ｇｐ３６用ＰＣＲプライマー
配列番号２０：ｇｐ３６用ＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号２１：抗ｇｐ３６ポリクローナル抗体作製用部分ポリペプチド
配列番号２２：Ｇ３８Ａ
配列番号２３：Ｇ３８Ａ
配列番号２４：Ｇ４０Ａ
配列番号２５：Ｇ４０Ａ
配列番号２６：Ｍ４１Ａ
配列番号２７：Ｍ４１Ａ
配列番号２８：Ｖ４２Ａ
配列番号２９：Ｐ４２Ａ
配列番号３０：Ｐ４３Ａ
配列番号３１：Ｐ４３Ａ
配列番号３２：Ｇ４５Ａ
配列番号３３：Ｇ４５Ａ
配列番号３４：Ｋ４９Ａ
配列番号３５：Ｋ４９Ａ
配列番号３６：Ｔ３４Ａ
配列版番号３７：Ｔ３４Ａ
配列番号３８：Ｔ３７Ａ
配列番号３９：Ｔ３７Ａ
配列番号４０：Ｔ５１Ａ
配列番号４１：Ｔ５１Ａ
配列番号４２：Ｔ５２Ａ
配列番号４３：Ｔ５２Ａ
配列番号４４：Ｃ末にシステインが付加されたｇｐ３８Ｐの部分ペプチド
配列番号４５：ｇｐ３８Ｐの部分ペプチドの変異体；Ｍ４１ｐｔ
配列番号４６：ｇｐ３８Ｐの部分ペプチドの変異体；Ｖ４２Ａｐｔ
配列番号４７：ｇｐ３８Ｐの部分ペプチドの変異体；Ｐ４３Ａｐｔ
配列番号４８：ｇｐ３８Ｐの部分ペプチドの変異体；Ｐ４４Ａｐｔ
配列番号４９：ｇｐ３６−Ｔ５２Ａ
配列番号５０：ｇｐ３６−Ｔ５２Ａ
配列番号５１：ｇｐ３６−Ｔ５５Ａ
配列番号５２：ｇｐ３６−Ｔ５５Ａ
配列番号５３：ｇｐ３６用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号５４：ｇｐ３６用ＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号５５：リボゾーマル・プロテインＳ９用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号５６：リボゾーマル・プロテインＳ９用ＰＣＲアンチセンスプライマー
【図１】
2004350677.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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