(57)【要約】      （修正有）【課題】核内におけるミスフォールドタンパク質及びタンパク質凝集物の分解を促進するための新規組成物を提供する。【解決手段】ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物であって、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを含む、組成物。前記モジュレーターはＴＲＩＭタンパク質を含む単離されたペプチド又はＴＲＩＭタンパク質をコードしている単離された核酸分子であることが好ましく、前記ペプチドは細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含むことがさらに好ましい。前記組成物は脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、伝染性海綿状脳症（プリオン病）、タウオパチー及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）からなる群より選択される神経変性疾患又は障害の治療に有用である。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物であって、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを含む、該組成物。
【請求項２】
モジュレーターが、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現又は活性を増加させる、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
モジュレーターが、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸からなる群の少なくとも１つである、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
モジュレーターが、ヒトＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１９（本明細書では「ＰＭＬ」とも称される）、ＴＲＩＭ２０、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３４、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４６、ＴＲＩＭ４９、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６７、ＴＲＩＭ６９、ＴＲＩＭ７０、ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７５；並びにマウスＴＲＩＭ３０からなる群より選択される少なくとも１つの発現又は活性を増加させる、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を含む単離されたペプチドを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
単離されたペプチドがさらに、細胞への前記の単離されたペプチドの侵入を可能とする細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
ＣＰＰがＨＩＶｔａｔのタンパク質形質導入ドメインを含む、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
１つ以上のＴＲＩＭタンパク質をコードしている単離された核酸分子を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記疾患又は障害がポリＱ障害である、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記疾患又は障害が、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、伝染性海綿状脳症（プリオン病）、タウオパチー、及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）からなる群より選択される神経変性疾患又は障害である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記疾患又は障害が、ＡＬアミロイド症、ＡＡアミロイド症、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイド症、家族性アミロイド性多発神経炎、血液透析に関連したアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＶアミロイド症、フィンランド型遺伝性アミロイド症、リゾチームアミロイド症、フィブリノーゲンアミロイド症、アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症、ＩＩ型糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイド症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位に限局したアミロイド症、大動脈中膜アミロイド症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、睫毛乱生に関連した角膜アミロイド症、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、及び皮膚苔癬アミロイド症からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記疾患又は障害が、ｐ５３突然変異体の凝集物に関連している癌である、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
必要とする被験者におけるミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための方法であって、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを含む組成物を該被験者に投与する工程を含む、該方法。
【請求項１４】
前記モジュレーターが１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現又は活性を増加させる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記モジュレーターが、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記モジュレーターが、ヒトＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１９（本明細書では「ＰＭＬ」とも称される）、ＴＲＩＭ２０、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３４、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４６、ＴＲＩＭ４９、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６７、ＴＲＩＭ６９、ＴＲＩＭ７０、ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７５；並びにマウスＴＲＩＭ３０からなる群より選択される少なくとも１つの発現又は活性を増加させる、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を含む単離されたペプチドを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
前記の単離されたペプチドがさらに、細胞への前記の単離されたペプチドの侵入を可能とする細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＰＰがＨＩＶｔａｔのタンパク質形質導入ドメインを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質をコードしている単離された核酸分子を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
前記障害がポリＱ障害である、請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患又は障害が、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、伝染性海綿状脳症（プリオン病）、タウオパチー、及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）からなる群より選択される神経変性障害である、請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患又は障害が、ＡＬアミロイド症、ＡＡアミロイド症、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイド症、家族性アミロイド性多発神経炎、血液透析に関連したアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＶアミロイド症、フィンランド型遺伝性アミロイド症、リゾチームアミロイド症、フィブリノーゲンアミロイド症、アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症、ＩＩ型糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイド症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位に限局したアミロイド症、大動脈中膜アミロイド症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、睫毛乱生に関連した角膜アミロイド症、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、及び皮膚苔癬アミロイド症からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患又は障害が、ｐ５３突然変異体の凝集物に関連した癌である、請求項１３記載の方法。
【請求項２５】
被験者の少なくとも１つの神経細胞に前記組成物を投与する工程を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項２６】
機能的突然変異タンパク質の分解に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物であって、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを含む、該組成物。
【請求項２７】
前記モジュレーターが、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現又は活性を増加させる、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
前記モジュレーターが、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸からなる群の少なくとも１つである、請求項２６記載の組成物。
【請求項２９】
前記疾患又は障害が嚢胞性線維症である、請求項２６記載の組成物。
【請求項３０】
必要とする被験者における機能的突然変異タンパク質の分解に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための方法であって、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを含む組成物を該被験者に投与する工程を含む、該方法。
【請求項３１】
前記モジュレーターが１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現又は活性を増加させる、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記モジュレーターが、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患又は障害が嚢胞性線維症である、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物であって、１つ以上のＳＵＭＯ標的化ユビキチンリガーゼ（ＳＴＵｂｌ）のモジュレーターを含む、該組成物。
【請求項３５】
前記モジュレーターが１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させる、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
前記モジュレーターが、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸からなる群の少なくとも１つである、請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
前記モジュレーターがＲＮＦ４の発現又は活性を増加させる、請求項３４記載の組成物。
【請求項３８】
必要とする被験者におけるミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための方法であって、１つ以上のＳＴＵｂＬのモジュレーターを含む組成物を該被験者に投与する工程を含む、該方法。
【請求項３９】
前記モジュレーターが１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させる、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記モジュレーターが、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸からなる群の少なくとも１つである、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
前記モジュレーターがＲＮＦ４の発現又は活性を増加させる、請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
組換えタンパク質を発現するように改変された細胞に、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを投与する工程を含む、組換えタンパク質の生成法。
【請求項４３】
前記モジュレーターが、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を含む単離されたペプチドを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記モジュレーターが、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質をコードしている単離された核酸分子を含む、請求項４２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／１６８,３０９号の優先権を主張し、その内容のその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
米国政府の助成による研究又は開発に関する声明
本発明は、政府の支援により米国国立衛生研究所により授与されたＣＡ０８８８６８、ＧＭ０６０９１１、ＣＡ１８２６７５、ＣＡ１８４８６７、及びＰ３０ ＡＩ０４５００８の下になされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
タンパク質は、細胞の中の最も豊富な巨大分子であり、そして実質的に全ての生理学的プロセスにとって重要である。その生物学的機能を遂行するために、大半のタンパク質は、その天然コンフォメーションへとフォールディングしそしてそれを維持することを必要とする。タンパク質の天然コンフォメーションは、そのアミノ酸配列によって決定されるが、フォールディングプロセスは並外れて複雑であり、そして間違いを非常に起こし易く、そしてその有用性は、遺伝子突然変異、生物発生的な不正確さ、及び翻訳後損傷の状況にさらに限定され得る（Dobson, 2003, Nature, 426: 884-890; Goldberg, 2003, Nature, 426: 895-899）。異常なコンフォメーションを採ったタンパク質、及びそれらによって形成された凝集物は、細胞の生存能及び細胞機能にとって常に脅威を課している。これらのタンパク質の排除の失敗は、様々なヒトの衰弱性疾患の発病に密接に連関している（Selkoe, 2003, Nature, 426: 900-904; Taylor et al., 2002, Science, 296: 1991-1995）。
【０００４】
タンパク質のミスフォールドと戦うために、細胞は、２つの広範なセットのタンパク質品質制御（ＰＱＣ）系を使用する：タンパク質の天然コンフォメーションを達成するためにタンパク質を支援する系、及び一旦ミスフォールドタンパク質が形成された場合にそれらを排除する系。前者は主に、ＡＴＰ依存的にそれらの非天然状態のタンパク質を保護しかつミスフォールド及び凝集を低減させる、多くの分子シャペロン及びそれらのコシャペロンからなる。有名な例としては、（１）多種多様なタンパク質のフォールディングを助ける、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）；（２）連続したフォールディングのために比較的小さなタンパク質を封入するための巨大分子ケージを形成する、Ｈｓｐ６０／シャペロン；並びに（３）細胞シグナル伝達及び転写に関与するタンパク質に対して最も一般的に作用する、ＨＳＰ９０（Hartl et al., 2011, Nature, 475: 324-332）が挙げられる。
【０００５】
ミスフォールドタンパク質を除去する系は、タンパク質脱凝集酵素を含む。例えば、原核生物又は下等真核生物におけるＨｓｐ１００タンパク質（例えば細菌におけるＣｌｐＢ、及び酵母におけるＨｓｐ１０４）は、Ｈｓｐ７０及びそのコシャペロンであるＨｓｐ４０と協奏的に機能してタンパク質凝集物を再可溶化することができる（Glover and Linquist, 1998, Cell, 94: 73-82）。それにも関わらず、タンパク質ミスフォールドは不可避であり、かつ突然変異、生物発生的な間違い又は修復不可能な損傷に因り復帰させることができないことが多いことを考えれば、細胞は最終的には、タンパク質の品質を維持するために分解系に依拠する。しかし、これらの系は依然としてあまり解明されていない。ユビキチン−プロテアソーム経路はオートファジーと共に、これらの系の重要な一部であるに違いないが、どのようにそれらがミスフォールドタンパク質を選択的に認識しかつ分解のためにそれらを標的化するのかの重要な問題は依然として解明されていない（Goldberg, 2003, Nature, 426: 895-899; Tyedmers et al, 2010, Nat Rev Mol Cell Biol, 11: 777-788）。
【０００６】
さらに、小胞体などの他の細胞区画と比較して（Buchberger et al., 2010, Mol Cell, 40: 238-252）、核内のＰＱＣ系は著しく不明瞭である。核内のミスフォールドタンパク質は、有糸分裂中に核エンベロープの分解を通してこれらのタンパク質を除去することができない有糸分裂後の哺乳動物細胞（例えば神経細胞及び心筋細胞）に特に損傷を与え得る。この細胞区画内のＰＱＣを解明することの重要性は、ハンチントン病（ＨＤ）及びいくつかの型の脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）をはじめとする様々な優性遺伝性の神経変性疾患に関連している、神経細胞核内封入体の形成によって強調される。これらの疾患は、関連遺伝子内におけるＣＡＧ反復配列の増幅によって引き起こされ、このＣＡＧ反復配列はポリＱ伸長配列をコードしている。それらは、ポリＱ伸長配列が、疾患特異的である閾値の長さを超えると顕現し、そしてその長さが伸びるにつれて進行的により重度になる（Orr and Zoghbi, 2007, Annu Rev Neurosci, 30: 575-621）。
【０００７】
したがって、ミスフォールドタンパク質を排除するための組成物及び方法が当技術分野において必要とされる。本発明は、この未だ対処されていないニーズを満足させる。
【０００８】
発明の概要
１つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物を提供し、該組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現又は活性を増加させる。１つの実施態様では、該モジュレーターは、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸の少なくとも１つである。
【０００９】
１つの実施態様では、前記モジュレーターは、ヒトＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１９（本明細書では「ＰＭＬ」とも称される）、ＴＲＩＭ２０、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３４、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４６、ＴＲＩＭ４９、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６７、ＴＲＩＭ６９、ＴＲＩＭ７０、ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７５；並びにマウスＴＲＩＭ３０の少なくとも１つの発現又は活性を増加させる。
【００１０】
１つの実施態様では、前記組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を含む単離されたペプチドを含む。１つの実施態様では、単離されたペプチドはさらに、細胞への前記の単離されたペプチドの侵入を可能とする細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。１つの実施態様では、ＣＰＰは、ＨＩＶｔａｔのタンパク質形質導入ドメインを含む。
【００１１】
１つの実施態様では、前記組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質をコードしている単離された核酸分子を含む。
【００１２】
１つの実施態様では、前記疾患又は障害はポリＱ障害である。１つの実施態様では、該疾患又は障害は、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、伝染性海綿状脳症（プリオン病）、タウオパチー、及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）からなる群より選択される神経変性疾患又は障害である。１つの実施態様では、該疾患又は障害は、ＡＬアミロイド症、ＡＡアミロイド症、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイド症、家族性アミロイド性多発神経炎、血液透析に関連したアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＶアミロイド症、フィンランド型遺伝性アミロイド症、リゾチームアミロイド症、フィブリノーゲンアミロイド症、アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症、ＩＩ型糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイド症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位に限局したアミロイド症、大動脈中膜アミロイド症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、睫毛乱生に関連した角膜アミロイド症、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、及び皮膚苔癬アミロイド症からなる群より選択される。１つの実施態様では、該疾患又は障害は、ｐ５３突然変異体の凝集物に関連した癌である。
【００１３】
１つの態様では、本発明は、必要とする被験体におけるミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための方法を提供し、該方法は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを含む組成物を該被験者に投与する工程を含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現又は活性を増加させる。１つの実施態様では、該モジュレーターは、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸の少なくとも１つである。
【００１４】
１つの実施態様では、前記モジュレーターは、ヒトＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１９（本明細書では「ＰＭＬ」とも称される）、ＴＲＩＭ２０、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３４、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４６、ＴＲＩＭ４９、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６７、ＴＲＩＭ６９、ＴＲＩＭ７０、ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７５；並びにマウスＴＲＩＭ３０の少なくとも１つの発現又は活性を増加させる。
【００１５】
１つの実施態様では、前記組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を含む単離されたペプチドを含む。１つの実施態様では、単離されたペプチドはさらに、細胞への前記の単離されたペプチドの侵入を可能とする細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。１つの実施態様では、該ＣＰＰはＨＩＶｔａｔのタンパク質形質導入ドメインを含む。
【００１６】
１つの実施態様では、前記組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質をコードしている単離された核酸分子を含む。
【００１７】
１つの実施態様では、前記疾患又は障害はポリＱ障害である。１つの実施態様では、該疾患又は障害は、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、伝染性海綿状脳症（プリオン病）、タウオパチー、及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）からなる群より選択される神経変性疾患又は障害である。１つの実施態様では、該疾患又は障害は、ＡＬアミロイド症、ＡＡアミロイド症、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイド症、家族性アミロイド性多発神経炎、血液透析に関連したアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＶアミロイド症、フィンランド型遺伝性アミロイド症、リゾチームアミロイド症、フィブリノーゲンアミロイド症、アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症、ＩＩ型糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイド症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位に限局したアミロイド症、大動脈中膜アミロイド症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、睫毛乱生に関連した角膜アミロイド症、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、及び皮膚苔癬アミロイド症からなる群より選択される。１つの実施態様では、該疾患又は障害は、ｐ５３突然変異体の凝集物に関連した癌である。
【００１８】
１つの実施態様では、前記方法は、被験者の少なくとも１つの神経細胞に前記組成物を投与する工程を含む。
【００１９】
１つの態様では、本発明は、機能的突然変異タンパク質の分解に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物を提供し、該組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現又は活性を増加させる。１つの実施態様では、該モジュレーターは、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸からなる群の少なくとも１つである。１つの実施態様では、該疾患又は障害は嚢胞性線維症である。
【００２０】
１つの態様では、本発明は、必要とする被験者における機能的突然変異タンパク質の分解に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための方法を提供し、該方法は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを含む組成物を該被験者に投与する工程を含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現又は活性を増加させる。１つの実施態様では、該モジュレーターは、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸からなる群の少なくとも１つである。１つの実施態様では、該疾患又は障害は嚢胞性線維症である。
【００２１】
１つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物を提供し、該組成物は１つ以上のＳＵＭＯ標的化ユビキチンリガーゼ（ＳＴＵｂｌ）のモジュレーターを含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させる。１つの実施態様では、該モジュレーターは、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸の少なくとも１つである。１つの実施態様では、該モジュレーターは、ＲＮＦ４の発現又は活性を増加させる。
【００２２】
１つの態様では、本発明は、必要とする被験者におけるミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための方法を提供し、該方法は、１つ以上のＳＴＵｂＬのモジュレーターを含む組成物を該被験者に投与する工程を含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させる。１つの実施態様では、該モジュレーターは、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、及びアンチセンス核酸の少なくとも１つである。１つの実施態様では、該モジュレーターは、ＲＮＦ４の発現又は活性を増加させる。
【００２３】
１つの態様では、本発明は、組換えタンパク質の生成法を提供し、該方法は、組換えタンパク質を発現するように改変された細胞に、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーターを投与する工程を含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を含む単離されたペプチドを含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質をコードしている単離された核酸分子を含む。
【００２４】
以下の本発明の好ましい実施態様の詳細な説明は、添付図面と合わせて読めばより良く理解されるだろう。本発明を説明するために、図面に現在好ましい実施態様が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示された実施態様と寸分違わない構成及び手段には限定されないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｂ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｃ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｄ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｅ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｆ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｇ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｈ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｉ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｊ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｋ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｌ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図２Ａ】図２は、図２Ａから図２Ｅを含むが、これはＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。（図２Ａ）インビトロプルダウンアッセイ、その後のＷＢ（上及び下）及びポンソーＳ染色（中央）によって分析された、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＧＦＰ（陰性対照）へのＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ及びＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑの結合。＊ＩｇＧ重鎖。（図２Ｂ）（図２Ａ）のように分析された、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ−ＰＭＬ（右に示される）及び対照ＧＳＴタンパク質の結合。＊対照ビーズに結合させたＢＬ２１細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。（図２Ｃ）ＷＢ（上及び中央）及びクーマシー染色（下）によって分析された、抗ＦｌａｇＭ２ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたＦＬＡＧ−ＰＭＬ ＣＣへの示されたＧＳＴ−Ｈｔｔ融合物の結合。（図２Ｄ）ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するＰＭＬ Ｆ１２／ＳＲＳ２（右に示される）の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのＮ末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。（図２Ｅ）ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した（１００％に設定）、ＰＭＬ ＳＲＳ２結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
【図２Ｂ】図２は、図２Ａから図２Ｅを含むが、これはＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。（図２Ａ）インビトロプルダウンアッセイ、その後のＷＢ（上及び下）及びポンソーＳ染色（中央）によって分析された、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＧＦＰ（陰性対照）へのＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ及びＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑの結合。＊ＩｇＧ重鎖。（図２Ｂ）（図２Ａ）のように分析された、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ−ＰＭＬ（右に示される）及び対照ＧＳＴタンパク質の結合。＊対照ビーズに結合させたＢＬ２１細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。（図２Ｃ）ＷＢ（上及び中央）及びクーマシー染色（下）によって分析された、抗ＦｌａｇＭ２ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたＦＬＡＧ−ＰＭＬ ＣＣへの示されたＧＳＴ−Ｈｔｔ融合物の結合。（図２Ｄ）ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するＰＭＬ Ｆ１２／ＳＲＳ２（右に示される）の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのＮ末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。（図２Ｅ）ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した（１００％に設定）、ＰＭＬ ＳＲＳ２結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
【図２Ｃ】図２は、図２Ａから図２Ｅを含むが、これはＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。（図２Ａ）インビトロプルダウンアッセイ、その後のＷＢ（上及び下）及びポンソーＳ染色（中央）によって分析された、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＧＦＰ（陰性対照）へのＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ及びＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑの結合。＊ＩｇＧ重鎖。（図２Ｂ）（図２Ａ）のように分析された、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ−ＰＭＬ（右に示される）及び対照ＧＳＴタンパク質の結合。＊対照ビーズに結合させたＢＬ２１細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。（図２Ｃ）ＷＢ（上及び中央）及びクーマシー染色（下）によって分析された、抗ＦｌａｇＭ２ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたＦＬＡＧ−ＰＭＬ ＣＣへの示されたＧＳＴ−Ｈｔｔ融合物の結合。（図２Ｄ）ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するＰＭＬ Ｆ１２／ＳＲＳ２（右に示される）の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのＮ末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。（図２Ｅ）ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した（１００％に設定）、ＰＭＬ ＳＲＳ２結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
【図２Ｄ】図２は、図２Ａから図２Ｅを含むが、これはＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。（図２Ａ）インビトロプルダウンアッセイ、その後のＷＢ（上及び下）及びポンソーＳ染色（中央）によって分析された、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＧＦＰ（陰性対照）へのＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ及びＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑの結合。＊ＩｇＧ重鎖。（図２Ｂ）（図２Ａ）のように分析された、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ−ＰＭＬ（右に示される）及び対照ＧＳＴタンパク質の結合。＊対照ビーズに結合させたＢＬ２１細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。（図２Ｃ）ＷＢ（上及び中央）及びクーマシー染色（下）によって分析された、抗ＦｌａｇＭ２ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたＦＬＡＧ−ＰＭＬ ＣＣへの示されたＧＳＴ−Ｈｔｔ融合物の結合。（図２Ｄ）ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するＰＭＬ Ｆ１２／ＳＲＳ２（右に示される）の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのＮ末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。（図２Ｅ）ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した（１００％に設定）、ＰＭＬ ＳＲＳ２結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
【図２Ｅ】図２は、図２Ａから図２Ｅを含むが、これはＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。（図２Ａ）インビトロプルダウンアッセイ、その後のＷＢ（上及び下）及びポンソーＳ染色（中央）によって分析された、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＧＦＰ（陰性対照）へのＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ及びＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑの結合。＊ＩｇＧ重鎖。（図２Ｂ）（図２Ａ）のように分析された、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ−ＰＭＬ（右に示される）及び対照ＧＳＴタンパク質の結合。＊対照ビーズに結合させたＢＬ２１細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。（図２Ｃ）ＷＢ（上及び中央）及びクーマシー染色（下）によって分析された、抗ＦｌａｇＭ２ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたＦＬＡＧ−ＰＭＬ ＣＣへの示されたＧＳＴ−Ｈｔｔ融合物の結合。（図２Ｄ）ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するＰＭＬ Ｆ１２／ＳＲＳ２（右に示される）の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのＮ末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。（図２Ｅ）ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した（１００％に設定）、ＰＭＬ ＳＲＳ２結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
【図３Ａ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図３Ｂ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図３Ｃ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図３Ｄ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図３Ｅ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図３Ｆ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図４Ａ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図４Ｂ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図４Ｃ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図４Ｄ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図４Ｅ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図４Ｆ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図５Ａ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｂ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｃ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｄ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｅ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｆ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｇ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｈ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｉ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図６Ａ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｂ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｃ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｄ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｅ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｆ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｇ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｈ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｉ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図７Ａ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｂ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｃ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｄ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｅ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｆ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｇ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｈ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｉ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図８Ａ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｂ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｃ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｄ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｅ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｆ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｇ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図９Ａ】図９は、図９Ａから図９Ｅを含むが、これはＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図９Ａ）ＰＭＬは、病原性Ｈｔｔと優先的に相互作用する。ＦＬＡＧ−ＧＦＰ又はＦＬＡＧ−ＰＭＬを発現している２９３Ｔ細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ若しくはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ（レーン１〜３及び５〜７）と共に、又は対照グルタチオンビーズ（レーン４及び８）と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。（図９Ｂ）野生型ＰＭＬアイソフォームＩＶ（アミノ酸１〜６３３）（本研究ではＰＭＬと呼ばれる）及び様々な欠失断片（Ｆ１〜Ｆ１０）の図解。ＲＩＮＧドメイン（Ｒ）、Ｂ１ボックス、Ｂ２ボックス、及びコイルドコイル領域（ＣＣ）は標識されている。基質認識部位ＳＲＳ１及びＳＲＳ２は線によって示されている。ＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質（Ｈｔｔ１０３Ｑ又は５２Ｑ）及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ＮＤ：実施されず。（図９Ｃ）完全長ＰＭＬ及びＰＭＬ欠失突然変異体とＨｔｔの相互作用。ＰＭＬタンパク質は、［３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下において共役させたインビトロでの転写／翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ、又はＧＳＴと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のＧＳＴタンパク質をクーマシー染色によって分析した。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図９Ｄ）Ｈｔｔ５２Ｑ及びＣＣ脱安定化（ｃｃ−）突然変異体の配列。Ｈｔｔ５２Ｑｃｃ−においてＰｒｏに変化させたＨｔｔ５２Ｑ内のアミノ酸が赤色で示されている。（図９Ｅ）精製されたＰＭＬ ＣＣ領域（右に示されている）とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図２Ｄのようにアッセイした。＊ＴＥＶプロテアーゼ。
【図９Ｂ】図９は、図９Ａから図９Ｅを含むが、これはＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図９Ａ）ＰＭＬは、病原性Ｈｔｔと優先的に相互作用する。ＦＬＡＧ−ＧＦＰ又はＦＬＡＧ−ＰＭＬを発現している２９３Ｔ細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ若しくはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ（レーン１〜３及び５〜７）と共に、又は対照グルタチオンビーズ（レーン４及び８）と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。（図９Ｂ）野生型ＰＭＬアイソフォームＩＶ（アミノ酸１〜６３３）（本研究ではＰＭＬと呼ばれる）及び様々な欠失断片（Ｆ１〜Ｆ１０）の図解。ＲＩＮＧドメイン（Ｒ）、Ｂ１ボックス、Ｂ２ボックス、及びコイルドコイル領域（ＣＣ）は標識されている。基質認識部位ＳＲＳ１及びＳＲＳ２は線によって示されている。ＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質（Ｈｔｔ１０３Ｑ又は５２Ｑ）及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ＮＤ：実施されず。（図９Ｃ）完全長ＰＭＬ及びＰＭＬ欠失突然変異体とＨｔｔの相互作用。ＰＭＬタンパク質は、［３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下において共役させたインビトロでの転写／翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ、又はＧＳＴと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のＧＳＴタンパク質をクーマシー染色によって分析した。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図９Ｄ）Ｈｔｔ５２Ｑ及びＣＣ脱安定化（ｃｃ−）突然変異体の配列。Ｈｔｔ５２Ｑｃｃ−においてＰｒｏに変化させたＨｔｔ５２Ｑ内のアミノ酸が赤色で示されている。（図９Ｅ）精製されたＰＭＬ ＣＣ領域（右に示されている）とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図２Ｄのようにアッセイした。＊ＴＥＶプロテアーゼ。
【図９Ｃ】図９は、図９Ａから図９Ｅを含むが、これはＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図９Ａ）ＰＭＬは、病原性Ｈｔｔと優先的に相互作用する。ＦＬＡＧ−ＧＦＰ又はＦＬＡＧ−ＰＭＬを発現している２９３Ｔ細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ若しくはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ（レーン１〜３及び５〜７）と共に、又は対照グルタチオンビーズ（レーン４及び８）と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。（図９Ｂ）野生型ＰＭＬアイソフォームＩＶ（アミノ酸１〜６３３）（本研究ではＰＭＬと呼ばれる）及び様々な欠失断片（Ｆ１〜Ｆ１０）の図解。ＲＩＮＧドメイン（Ｒ）、Ｂ１ボックス、Ｂ２ボックス、及びコイルドコイル領域（ＣＣ）は標識されている。基質認識部位ＳＲＳ１及びＳＲＳ２は線によって示されている。ＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質（Ｈｔｔ１０３Ｑ又は５２Ｑ）及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ＮＤ：実施されず。（図９Ｃ）完全長ＰＭＬ及びＰＭＬ欠失突然変異体とＨｔｔの相互作用。ＰＭＬタンパク質は、［３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下において共役させたインビトロでの転写／翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ、又はＧＳＴと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のＧＳＴタンパク質をクーマシー染色によって分析した。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図９Ｄ）Ｈｔｔ５２Ｑ及びＣＣ脱安定化（ｃｃ−）突然変異体の配列。Ｈｔｔ５２Ｑｃｃ−においてＰｒｏに変化させたＨｔｔ５２Ｑ内のアミノ酸が赤色で示されている。（図９Ｅ）精製されたＰＭＬ ＣＣ領域（右に示されている）とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図２Ｄのようにアッセイした。＊ＴＥＶプロテアーゼ。
【図９Ｄ】図９は、図９Ａから図９Ｅを含むが、これはＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図９Ａ）ＰＭＬは、病原性Ｈｔｔと優先的に相互作用する。ＦＬＡＧ−ＧＦＰ又はＦＬＡＧ−ＰＭＬを発現している２９３Ｔ細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ若しくはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ（レーン１〜３及び５〜７）と共に、又は対照グルタチオンビーズ（レーン４及び８）と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。（図９Ｂ）野生型ＰＭＬアイソフォームＩＶ（アミノ酸１〜６３３）（本研究ではＰＭＬと呼ばれる）及び様々な欠失断片（Ｆ１〜Ｆ１０）の図解。ＲＩＮＧドメイン（Ｒ）、Ｂ１ボックス、Ｂ２ボックス、及びコイルドコイル領域（ＣＣ）は標識されている。基質認識部位ＳＲＳ１及びＳＲＳ２は線によって示されている。ＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質（Ｈｔｔ１０３Ｑ又は５２Ｑ）及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ＮＤ：実施されず。（図９Ｃ）完全長ＰＭＬ及びＰＭＬ欠失突然変異体とＨｔｔの相互作用。ＰＭＬタンパク質は、［３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下において共役させたインビトロでの転写／翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ、又はＧＳＴと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のＧＳＴタンパク質をクーマシー染色によって分析した。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図９Ｄ）Ｈｔｔ５２Ｑ及びＣＣ脱安定化（ｃｃ−）突然変異体の配列。Ｈｔｔ５２Ｑｃｃ−においてＰｒｏに変化させたＨｔｔ５２Ｑ内のアミノ酸が赤色で示されている。（図９Ｅ）精製されたＰＭＬ ＣＣ領域（右に示されている）とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図２Ｄのようにアッセイした。＊ＴＥＶプロテアーゼ。
【図９Ｅ】図９は、図９Ａから図９Ｅを含むが、これはＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図９Ａ）ＰＭＬは、病原性Ｈｔｔと優先的に相互作用する。ＦＬＡＧ−ＧＦＰ又はＦＬＡＧ−ＰＭＬを発現している２９３Ｔ細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ若しくはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ（レーン１〜３及び５〜７）と共に、又は対照グルタチオンビーズ（レーン４及び８）と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。（図９Ｂ）野生型ＰＭＬアイソフォームＩＶ（アミノ酸１〜６３３）（本研究ではＰＭＬと呼ばれる）及び様々な欠失断片（Ｆ１〜Ｆ１０）の図解。ＲＩＮＧドメイン（Ｒ）、Ｂ１ボックス、Ｂ２ボックス、及びコイルドコイル領域（ＣＣ）は標識されている。基質認識部位ＳＲＳ１及びＳＲＳ２は線によって示されている。ＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質（Ｈｔｔ１０３Ｑ又は５２Ｑ）及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ＮＤ：実施されず。（図９Ｃ）完全長ＰＭＬ及びＰＭＬ欠失突然変異体とＨｔｔの相互作用。ＰＭＬタンパク質は、［３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下において共役させたインビトロでの転写／翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ、又はＧＳＴと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のＧＳＴタンパク質をクーマシー染色によって分析した。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図９Ｄ）Ｈｔｔ５２Ｑ及びＣＣ脱安定化（ｃｃ−）突然変異体の配列。Ｈｔｔ５２Ｑｃｃ−においてＰｒｏに変化させたＨｔｔ５２Ｑ内のアミノ酸が赤色で示されている。（図９Ｅ）精製されたＰＭＬ ＣＣ領域（右に示されている）とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図２Ｄのようにアッセイした。＊ＴＥＶプロテアーゼ。
【図１０Ａ】図１０は、図１０Ａから図１０Ｃを含むが、これはＰＭＬと変性ルシフェラーゼの相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図１０Ａ）ＰＭＬ断片と変性ルシフェラーゼの相互作用。インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識された完全長ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ欠失突然変異体を、ビーズ上に固定させた天然若しくは変性ルシフェラーゼ、又は対照ビーズと共にインキュベートした。インプット及びビーズに結合させたＰＭＬタンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてルシフェラーゼをクーマシーブルー染色によって分析した。＊、非特異的バンド。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）ＰＭＬ上の第二の基質認識部位（ＳＲＳ２）の同定。（図１０Ｂ）Ｃ末端にアミノ酸を包含しているＰＭＬ欠失突然変異体、及び変性ルシフェラーゼとのその相互作用の要約。（図１０Ｃ）インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識されたＰＭＬ断片のＧＳＴ融合物又はＧＳＴを、（図１０Ａ）に記載のようにルシフェラーゼとの相互作用について試験した。
【図１０Ｂ】図１０は、図１０Ａから図１０Ｃを含むが、これはＰＭＬと変性ルシフェラーゼの相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図１０Ａ）ＰＭＬ断片と変性ルシフェラーゼの相互作用。インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識された完全長ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ欠失突然変異体を、ビーズ上に固定させた天然若しくは変性ルシフェラーゼ、又は対照ビーズと共にインキュベートした。インプット及びビーズに結合させたＰＭＬタンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてルシフェラーゼをクーマシーブルー染色によって分析した。＊、非特異的バンド。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）ＰＭＬ上の第二の基質認識部位（ＳＲＳ２）の同定。（図１０Ｂ）Ｃ末端にアミノ酸を包含しているＰＭＬ欠失突然変異体、及び変性ルシフェラーゼとのその相互作用の要約。（図１０Ｃ）インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識されたＰＭＬ断片のＧＳＴ融合物又はＧＳＴを、（図１０Ａ）に記載のようにルシフェラーゼとの相互作用について試験した。
【図１０Ｃ】図１０は、図１０Ａから図１０Ｃを含むが、これはＰＭＬと変性ルシフェラーゼの相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図１０Ａ）ＰＭＬ断片と変性ルシフェラーゼの相互作用。インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識された完全長ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ欠失突然変異体を、ビーズ上に固定させた天然若しくは変性ルシフェラーゼ、又は対照ビーズと共にインキュベートした。インプット及びビーズに結合させたＰＭＬタンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてルシフェラーゼをクーマシーブルー染色によって分析した。＊、非特異的バンド。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）ＰＭＬ上の第二の基質認識部位（ＳＲＳ２）の同定。（図１０Ｂ）Ｃ末端にアミノ酸を包含しているＰＭＬ欠失突然変異体、及び変性ルシフェラーゼとのその相互作用の要約。（図１０Ｃ）インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識されたＰＭＬ断片のＧＳＴ融合物又はＧＳＴを、（図１０Ａ）に記載のようにルシフェラーゼとの相互作用について試験した。
【図１１Ａ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｂ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｃ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｄ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｅ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｆ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｇ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１２Ａ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｂ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｃ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｄ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｅ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｆ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｇ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｈ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｉ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１３Ａ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１３Ｂ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１３Ｃ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１３Ｄ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１３Ｅ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１３Ｆ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１４Ａ】図１４は、図１４Ａから図１４Ｄを含むが、これはＰＭＬの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。（図１４Ａ）１２週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた（ＰＭＬ＋/＋についてはｎ＝２匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはｎ＝３匹のマウス）。ＰＭＬ−/−マウスは、ＰＭＬ＋/＋マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した（分散分析、ｐ＝０．０３１）。（図１４Ｂ）代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー：１００μm。（図１４Ｃ）長さ１mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含む及び含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋、ＰＭＬ＋/−、及びＰＭＬ−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量（平均値＋標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図１４Ｄ）Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー：５０μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。ＰＭＬ＋/＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−及びＰＭＬ−/−：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−マウスの染色切片が図７Ｇに示されている。
【図１４Ｂ】図１４は、図１４Ａから図１４Ｄを含むが、これはＰＭＬの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。（図１４Ａ）１２週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた（ＰＭＬ＋/＋についてはｎ＝２匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはｎ＝３匹のマウス）。ＰＭＬ−/−マウスは、ＰＭＬ＋/＋マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した（分散分析、ｐ＝０．０３１）。（図１４Ｂ）代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー：１００μm。（図１４Ｃ）長さ１mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含む及び含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋、ＰＭＬ＋/−、及びＰＭＬ−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量（平均値＋標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図１４Ｄ）Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー：５０μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。ＰＭＬ＋/＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−及びＰＭＬ−/−：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−マウスの染色切片が図７Ｇに示されている。
【図１４Ｃ】図１４は、図１４Ａから図１４Ｄを含むが、これはＰＭＬの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。（図１４Ａ）１２週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた（ＰＭＬ＋/＋についてはｎ＝２匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはｎ＝３匹のマウス）。ＰＭＬ−/−マウスは、ＰＭＬ＋/＋マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した（分散分析、ｐ＝０．０３１）。（図１４Ｂ）代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー：１００μm。（図１４Ｃ）長さ１mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含む及び含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋、ＰＭＬ＋/−、及びＰＭＬ−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量（平均値＋標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図１４Ｄ）Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー：５０μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。ＰＭＬ＋/＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−及びＰＭＬ−/−：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−マウスの染色切片が図７Ｇに示されている。
【図１４Ｄ】図１４は、図１４Ａから図１４Ｄを含むが、これはＰＭＬの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。（図１４Ａ）１２週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた（ＰＭＬ＋/＋についてはｎ＝２匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはｎ＝３匹のマウス）。ＰＭＬ−/−マウスは、ＰＭＬ＋/＋マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した（分散分析、ｐ＝０．０３１）。（図１４Ｂ）代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー：１００μm。（図１４Ｃ）長さ１mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含む及び含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋、ＰＭＬ＋/−、及びＰＭＬ−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量（平均値＋標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図１４Ｄ）Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー：５０μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。ＰＭＬ＋/＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−及びＰＭＬ−/−：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−マウスの染色切片が図７Ｇに示されている。
【図１５Ａ】図１５は、図１５Ａから図１５Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２及びＴＲＩＭ５δと、ＥＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの共局在を実証した実験例の結果を示す。（図１５Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。スケールバー：１０μm。（図１５Ｂ及び１５Ｃ）Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰを、ＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７（図１５Ｂ）、及びＴＲＩＭ３２（図１５Ｃ）と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体（緑色）及び抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。ＴＲＩＭ３２は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの細胞内局在にも関わらず、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰと共局在したことに留意されたい。（図１５Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２ＱＰ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。内因性ＴＲＩＭ２７を、抗ＴＲＩＭ２７抗体（赤色）によって検出した。矢頭は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在した内因性ＴＲＩＭ２７構造体を示す。スケールバー：１０μm。
【図１５Ｂ】図１５は、図１５Ａから図１５Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２及びＴＲＩＭ５δと、ＥＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの共局在を実証した実験例の結果を示す。（図１５Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。スケールバー：１０μm。（図１５Ｂ及び１５Ｃ）Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰを、ＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７（図１５Ｂ）、及びＴＲＩＭ３２（図１５Ｃ）と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体（緑色）及び抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。ＴＲＩＭ３２は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの細胞内局在にも関わらず、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰと共局在したことに留意されたい。（図１５Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２ＱＰ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。内因性ＴＲＩＭ２７を、抗ＴＲＩＭ２７抗体（赤色）によって検出した。矢頭は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在した内因性ＴＲＩＭ２７構造体を示す。スケールバー：１０μm。
【図１５Ｃ】図１５は、図１５Ａから図１５Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２及びＴＲＩＭ５δと、ＥＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの共局在を実証した実験例の結果を示す。（図１５Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。スケールバー：１０μm。（図１５Ｂ及び１５Ｃ）Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰを、ＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７（図１５Ｂ）、及びＴＲＩＭ３２（図１５Ｃ）と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体（緑色）及び抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。ＴＲＩＭ３２は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの細胞内局在にも関わらず、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰと共局在したことに留意されたい。（図１５Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２ＱＰ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。内因性ＴＲＩＭ２７を、抗ＴＲＩＭ２７抗体（赤色）によって検出した。矢頭は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在した内因性ＴＲＩＭ２７構造体を示す。スケールバー：１０μm。
【図１５Ｄ】図１５は、図１５Ａから図１５Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２及びＴＲＩＭ５δと、ＥＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの共局在を実証した実験例の結果を示す。（図１５Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。スケールバー：１０μm。（図１５Ｂ及び１５Ｃ）Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰを、ＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７（図１５Ｂ）、及びＴＲＩＭ３２（図１５Ｃ）と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体（緑色）及び抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。ＴＲＩＭ３２は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの細胞内局在にも関わらず、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰと共局在したことに留意されたい。（図１５Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２ＱＰ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。内因性ＴＲＩＭ２７を、抗ＴＲＩＭ２７抗体（赤色）によって検出した。矢頭は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在した内因性ＴＲＩＭ２７構造体を示す。スケールバー：１０μm。
【図１６Ａ】図１６は、図１６Ａから図１６Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δによる凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの低減を実証した実験例の結果を示す。（図１６Ａ及び図１６Ｂ）ＨｅＬａ細胞において単独で（−）又は示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒に発現させた場合のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１６Ａ）の左パネルでは、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示され、そしてＴＲＩＭ１１の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。（図１６Ｃ）対照（−）又はＴＲＩＭ２７ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの発現レベル。＊、非特異的バンド。（図１６Ｄ）ＰＩＡＳｙは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、ＰＩＡＳｙ、及びＰＭＬを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。
【図１６Ｂ】図１６は、図１６Ａから図１６Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δによる凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの低減を実証した実験例の結果を示す。（図１６Ａ及び図１６Ｂ）ＨｅＬａ細胞において単独で（−）又は示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒に発現させた場合のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１６Ａ）の左パネルでは、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示され、そしてＴＲＩＭ１１の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。（図１６Ｃ）対照（−）又はＴＲＩＭ２７ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの発現レベル。＊、非特異的バンド。（図１６Ｄ）ＰＩＡＳｙは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、ＰＩＡＳｙ、及びＰＭＬを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。
【図１６Ｃ】図１６は、図１６Ａから図１６Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δによる凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの低減を実証した実験例の結果を示す。（図１６Ａ及び図１６Ｂ）ＨｅＬａ細胞において単独で（−）又は示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒に発現させた場合のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１６Ａ）の左パネルでは、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示され、そしてＴＲＩＭ１１の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。（図１６Ｃ）対照（−）又はＴＲＩＭ２７ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの発現レベル。＊、非特異的バンド。（図１６Ｄ）ＰＩＡＳｙは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、ＰＩＡＳｙ、及びＰＭＬを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。
【図１６Ｄ】図１６は、図１６Ａから図１６Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δによる凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの低減を実証した実験例の結果を示す。（図１６Ａ及び図１６Ｂ）ＨｅＬａ細胞において単独で（−）又は示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒に発現させた場合のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１６Ａ）の左パネルでは、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示され、そしてＴＲＩＭ１１の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。（図１６Ｃ）対照（−）又はＴＲＩＭ２７ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの発現レベル。＊、非特異的バンド。（図１６Ｄ）ＰＩＡＳｙは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、ＰＩＡＳｙ、及びＰＭＬを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。
【図１７Ａ】図１７は、図１７Ａから図１７Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２が、ＰＭＬとは独立して、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを低減させたことを実証した実験例の結果を示す。（図１７Ａ）ＴＲＩＭ２７とＰＭＬの部分的な共局在。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体（緑色）及び抗ＰＭＬ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。（図１７Ｂ）ＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦ内のＴＲＩＭ２７とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物の共局在化。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を、抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）によって染色した。（図１７Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又は示されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦにおいて発現させた。抽出物をフィルター位相差アッセイによって分析した。凝集物に対するＴＲＩＭタンパク質の効果をより良く比較するために、右パネルにおいてより明るい露光が示されている。
【図１７Ｂ】図１７は、図１７Ａから図１７Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２が、ＰＭＬとは独立して、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを低減させたことを実証した実験例の結果を示す。（図１７Ａ）ＴＲＩＭ２７とＰＭＬの部分的な共局在。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体（緑色）及び抗ＰＭＬ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。（図１７Ｂ）ＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦ内のＴＲＩＭ２７とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物の共局在化。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を、抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）によって染色した。（図１７Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又は示されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦにおいて発現させた。抽出物をフィルター位相差アッセイによって分析した。凝集物に対するＴＲＩＭタンパク質の効果をより良く比較するために、右パネルにおいてより明るい露光が示されている。
【図１７Ｃ】図１７は、図１７Ａから図１７Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２が、ＰＭＬとは独立して、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを低減させたことを実証した実験例の結果を示す。（図１７Ａ）ＴＲＩＭ２７とＰＭＬの部分的な共局在。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体（緑色）及び抗ＰＭＬ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。（図１７Ｂ）ＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦ内のＴＲＩＭ２７とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物の共局在化。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を、抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）によって染色した。（図１７Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又は示されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦにおいて発現させた。抽出物をフィルター位相差アッセイによって分析した。凝集物に対するＴＲＩＭタンパク質の効果をより良く比較するために、右パネルにおいてより明るい露光が示されている。
【図１８Ａ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｂ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｃ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｄ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｅ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｆ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｇ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１９Ａ】図１９は、図１９Ａから図１９Ｆを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑに関連したＴＲＩＭタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（緑色）を、示されたＨＡでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ＨＡ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。各ＴＲＩＭタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。（図１９Ａ）ＴＲＩＭ１〜ＴＲＩＭ１６の代表的な局在化パターン。（図１９Ｂ）ＴＲＩＭ１７〜ＴＲＩＭ３２の代表的な局在化パターン。（図１９Ｃ）ＴＲＩＭ３３〜ＴＲＩＭ４１及びＴＲＩＭ４４〜ＴＲＩＭ４１の代表的な局在化パターン。（図１９Ｄ）ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４〜ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ６２〜ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７３〜ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７６の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰと共局在を示したＴＲＩＭタンパク質が黄色で示されている。スケールバー：１０μm。
【図１９Ｂ】図１９は、図１９Ａから図１９Ｆを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑに関連したＴＲＩＭタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（緑色）を、示されたＨＡでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ＨＡ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。各ＴＲＩＭタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。（図１９Ａ）ＴＲＩＭ１〜ＴＲＩＭ１６の代表的な局在化パターン。（図１９Ｂ）ＴＲＩＭ１７〜ＴＲＩＭ３２の代表的な局在化パターン。（図１９Ｃ）ＴＲＩＭ３３〜ＴＲＩＭ４１及びＴＲＩＭ４４〜ＴＲＩＭ４１の代表的な局在化パターン。（図１９Ｄ）ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４〜ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ６２〜ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７３〜ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７６の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰと共局在を示したＴＲＩＭタンパク質が黄色で示されている。スケールバー：１０μm。
【図１９Ｃ】図１９は、図１９Ａから図１９Ｆを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑに関連したＴＲＩＭタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（緑色）を、示されたＨＡでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ＨＡ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。各ＴＲＩＭタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。（図１９Ａ）ＴＲＩＭ１〜ＴＲＩＭ１６の代表的な局在化パターン。（図１９Ｂ）ＴＲＩＭ１７〜ＴＲＩＭ３２の代表的な局在化パターン。（図１９Ｃ）ＴＲＩＭ３３〜ＴＲＩＭ４１及びＴＲＩＭ４４〜ＴＲＩＭ４１の代表的な局在化パターン。（図１９Ｄ）ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４〜ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ６２〜ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７３〜ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７６の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰと共局在を示したＴＲＩＭタンパク質が黄色で示されている。スケールバー：１０μm。
【図１９Ｄ】図１９は、図１９Ａから図１９Ｆを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑに関連したＴＲＩＭタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（緑色）を、示されたＨＡでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ＨＡ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。各ＴＲＩＭタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。（図１９Ａ）ＴＲＩＭ１〜ＴＲＩＭ１６の代表的な局在化パターン。（図１９Ｂ）ＴＲＩＭ１７〜ＴＲＩＭ３２の代表的な局在化パターン。（図１９Ｃ）ＴＲＩＭ３３〜ＴＲＩＭ４１及びＴＲＩＭ４４〜ＴＲＩＭ４１の代表的な局在化パターン。（図１９Ｄ）ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４〜ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ６２〜ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７３〜ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７６の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰと共局在を示したＴＲＩＭタンパク質が黄色で示されている。スケールバー：１０μm。
【図１９Ｅ】図１９は、図１９Ａから図１９Ｆを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑに関連したＴＲＩＭタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（緑色）を、示されたＨＡでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ＨＡ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。各ＴＲＩＭタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。（図１９Ａ）ＴＲＩＭ１〜ＴＲＩＭ１６の代表的な局在化パターン。（図１９Ｂ）ＴＲＩＭ１７〜ＴＲＩＭ３２の代表的な局在化パターン。（図１９Ｃ）ＴＲＩＭ３３〜ＴＲＩＭ４１及びＴＲＩＭ４４〜ＴＲＩＭ４１の代表的な局在化パターン。（図１９Ｄ）ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４〜ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ６２〜ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７３〜ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７６の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰと共局在を示したＴＲＩＭタンパク質が黄色で示されている。スケールバー：１０μm。
【図１９Ｆ】図１９は、図１９Ａから図１９Ｆを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑに関連したＴＲＩＭタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（緑色）を、示されたＨＡでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ＨＡ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。各ＴＲＩＭタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。（図１９Ａ）ＴＲＩＭ１〜ＴＲＩＭ１６の代表的な局在化パターン。（図１９Ｂ）ＴＲＩＭ１７〜ＴＲＩＭ３２の代表的な局在化パターン。（図１９Ｃ）ＴＲＩＭ３３〜ＴＲＩＭ４１及びＴＲＩＭ４４〜ＴＲＩＭ４１の代表的な局在化パターン。（図１９Ｄ）ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４〜ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ６２〜ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７３〜ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７６の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰと共局在を示したＴＲＩＭタンパク質が黄色で示されている。スケールバー：１０μm。
【図２０Ａ】図２０は、図２０Ａ及び図２０Ｂを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰに対するＴＲＩＭタンパク質の体系的な分析の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（図２０Ａ）又はＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（図２０Ｂ）を、ＨｅＬａ細胞において示されたＴＲＩＭタンパク質と共発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。赤色及び緑色で標識されたＴＲＩＭタンパク質は、ポリＱタンパク質のレベルをそれぞれ減少及び増加させたものであるが、黒色で標識されたＴＲＩＭタンパク質は、観察できる効果を全く有さなかった。ＴＲＩＭタンパク質の効果は、本明細書の何処かで記載されているように、それらの発現レベルによって影響を受ける可能性があることに留意されたい。
【図２０Ｂ】図２０は、図２０Ａ及び図２０Ｂを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰに対するＴＲＩＭタンパク質の体系的な分析の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（図２０Ａ）又はＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（図２０Ｂ）を、ＨｅＬａ細胞において示されたＴＲＩＭタンパク質と共発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。赤色及び緑色で標識されたＴＲＩＭタンパク質は、ポリＱタンパク質のレベルをそれぞれ減少及び増加させたものであるが、黒色で標識されたＴＲＩＭタンパク質は、観察できる効果を全く有さなかった。ＴＲＩＭタンパク質の効果は、本明細書の何処かで記載されているように、それらの発現レベルによって影響を受ける可能性があることに留意されたい。
【図２１Ａ】図２１は、図２１Ａから図２１Ｃを含むが、これは組換えＴＡＴ−ＴＲＩＭ１１が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低減することを実証した実験例の結果を示す。ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ、又はＨｔｔ９７Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えＴＲＩＭ１１又はＳＵＭＯ２タンパク質と共にインキュベートした。（図２１Ａ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルは強く減少した。（図２１Ｂ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ｈｔｔ９７Ｑのレベルも強く減少した。（図２１Ｃ）ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルに対して最小限の効果しか及ぼさなかった。
【図２１Ｂ】図２１は、図２１Ａから図２１Ｃを含むが、これは組換えＴＡＴ−ＴＲＩＭ１１が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低減することを実証した実験例の結果を示す。ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ、又はＨｔｔ９７Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えＴＲＩＭ１１又はＳＵＭＯ２タンパク質と共にインキュベートした。（図２１Ａ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルは強く減少した。（図２１Ｂ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ｈｔｔ９７Ｑのレベルも強く減少した。（図２１Ｃ）ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルに対して最小限の効果しか及ぼさなかった。
【図２１Ｃ】図２１は、図２１Ａから図２１Ｃを含むが、これは組換えＴＡＴ−ＴＲＩＭ１１が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低減することを実証した実験例の結果を示す。ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ、又はＨｔｔ９７Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えＴＲＩＭ１１又はＳＵＭＯ２タンパク質と共にインキュベートした。（図２１Ａ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルは強く減少した。（図２１Ｂ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ｈｔｔ９７Ｑのレベルも強く減少した。（図２１Ｃ）ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルに対して最小限の効果しか及ぼさなかった。
【図２２】図２２は、実験例に使用されたＴａｔ−ＴＲＩＭ１１のアミノ酸配列を示す。
【図２３】図２３は、図２３Ａから図２３Ｆを含むが、これはヒト脳試料のＲＮＦ４の染色を実証した実験の結果を示す。抗ＲＮＦ４（緑色）によるハンチントン病脳組織の免疫染色。ＲＮＦ４は、拡散した核内局在化を示したか（図２３Ａ〜図２３Ｃ）又はフォーカスを形成した（図２３Ｄ〜図２３Ｆ）（矢頭によって示される）。スケールバー：１０μm。
【図２４】図２４は、図２４Ａから図２４Ｈを含むが、これはＳＣＡ１患者の神経細胞内封入体とＲＮＦ４の共局在化を実証した実験の結果を示す。抗ポリＱ抗体（１Ｃ２）及び抗ＲＮＦ４抗体を用いてのＳＣＡ１脳組織の免疫染色。スケールバー：１０μm。
【図２５】図２５は、図２５Ａから図２５Ｌを含むが、これはＳＣＡ１患者の神経細胞内封入体とＲＮＦ４の共局在化を実証した実験の結果を示す。図２５は、抗Ｈｔｔ抗体、抗ユビキチン抗体、及び２つの別々のＲＮＦ４抗体を用いてのＨＤ脳組織の免疫染色を示す。Ｈｔｔ及びユビキチンは、中心にＲＮＦ４シグナルを有する、環状の構造（図２５Ａ〜図２５Ｈ）又は均一に分布した封入体（図２５Ｉ〜図２５Ｌ）を形成することに留意されたい。
【図２６】図２６は、図２６Ａから図２６Ｈを含むが、これはＨＤ患者の神経細胞内の封入体とＲＮＦ４の共局在化を実証した実験の結果を示す。ＨＤ脳組織のＨｔｔ及びＲＮＦ４の免疫染色が示されている。２つの異なるＲＮＦ４抗体（１番及び２番）が使用された。スケールバー：１０μm。
【図２７Ａ】図２７は、図２７Ａから図２７Ｄを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ、ｐ５３及びα−シヌクレインのＳＵＭＯ化を実証した実験の結果を示す。図２７Ａは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ、又はＰＭＬを共発現させた場合の、Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化が分析された実験を示す。溶解前に、１０μMのＭＧ１３２を４時間かけて加えた。図２７Ｂは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴと共にインキュベートされた精製Ａｔｘｎ１ ８２ＱのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｃは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１又はＰＭＬと共にインキュベートされた精製Ｆｌａｇ−ｐ５３のインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｄは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下又は非存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。
【図２７Ｂ】図２７は、図２７Ａから図２７Ｄを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ、ｐ５３及びα−シヌクレインのＳＵＭＯ化を実証した実験の結果を示す。図２７Ａは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ、又はＰＭＬを共発現させた場合の、Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化が分析された実験を示す。溶解前に、１０μMのＭＧ１３２を４時間かけて加えた。図２７Ｂは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴと共にインキュベートされた精製Ａｔｘｎ１ ８２ＱのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｃは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１又はＰＭＬと共にインキュベートされた精製Ｆｌａｇ−ｐ５３のインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｄは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下又は非存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。
【図２７Ｃ】図２７は、図２７Ａから図２７Ｄを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ、ｐ５３及びα−シヌクレインのＳＵＭＯ化を実証した実験の結果を示す。図２７Ａは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ、又はＰＭＬを共発現させた場合の、Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化が分析された実験を示す。溶解前に、１０μMのＭＧ１３２を４時間かけて加えた。図２７Ｂは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴと共にインキュベートされた精製Ａｔｘｎ１ ８２ＱのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｃは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１又はＰＭＬと共にインキュベートされた精製Ｆｌａｇ−ｐ５３のインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｄは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下又は非存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。
【図２７Ｄ】図２７は、図２７Ａから図２７Ｄを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ、ｐ５３及びα−シヌクレインのＳＵＭＯ化を実証した実験の結果を示す。図２７Ａは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ、又はＰＭＬを共発現させた場合の、Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化が分析された実験を示す。溶解前に、１０μMのＭＧ１３２を４時間かけて加えた。図２７Ｂは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴと共にインキュベートされた精製Ａｔｘｎ１ ８２ＱのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｃは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１又はＰＭＬと共にインキュベートされた精製Ｆｌａｇ−ｐ５３のインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｄは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下又は非存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。
【図２８Ａ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｂ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｃ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｄ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｅ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｆ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｇ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２９Ａ】図２９は、図２９Ａから図２９Ｃを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２ＱへのＴＲＩＭ１１の結合を実証した実験の結果を示す。図２９Ａは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｂは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ３０ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対するＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１及びＧＳＴタンパク質の結合を示す。
【図２９Ｂ】図２９は、図２９Ａから図２９Ｃを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２ＱへのＴＲＩＭ１１の結合を実証した実験の結果を示す。図２９Ａは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｂは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ３０ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対するＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１及びＧＳＴタンパク質の結合を示す。
【図２９Ｃ】図２９は、図２９Ａから図２９Ｃを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２ＱへのＴＲＩＭ１１の結合を実証した実験の結果を示す。図２９Ａは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｂは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ３０ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対するＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１及びＧＳＴタンパク質の結合を示す。
【図３０Ａ】図３０は、図３０Ａから図３０Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ１１が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図３０Ａは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した実験を示す。図３０Ｂは、ＴＲＩＭ１１を用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。図３０Ｃは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞をＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトした実験を示す。４８時間後、細胞を溶解し、そして２０μM ＴｈＴを用いて染色した。図３０Ｄは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。
【図３０Ｂ】図３０は、図３０Ａから図３０Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ１１が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図３０Ａは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した実験を示す。図３０Ｂは、ＴＲＩＭ１１を用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。図３０Ｃは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞をＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトした実験を示す。４８時間後、細胞を溶解し、そして２０μM ＴｈＴを用いて染色した。図３０Ｄは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。
【図３０Ｃ】図３０は、図３０Ａから図３０Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ１１が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図３０Ａは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した実験を示す。図３０Ｂは、ＴＲＩＭ１１を用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。図３０Ｃは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞をＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトした実験を示す。４８時間後、細胞を溶解し、そして２０μM ＴｈＴを用いて染色した。図３０Ｄは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。
【図３０Ｄ】図３０は、図３０Ａから図３０Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ１１が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図３０Ａは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した実験を示す。図３０Ｂは、ＴＲＩＭ１１を用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。図３０Ｃは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞をＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトした実験を示す。４８時間後、細胞を溶解し、そして２０μM ＴｈＴを用いて染色した。図３０Ｄは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。
【図３１Ａ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｂ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｃ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｄ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｅ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｆ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｇ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｈ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３２Ａ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｂ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｃ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｄ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｅ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｆ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｇ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３３Ａ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３３Ｂ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３３Ｃ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３３Ｄ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３３Ｅ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３３Ｆ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３４Ａ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｂ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｃ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｄ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｅ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｆ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｇ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３５Ａ】図３５は、図３５Ａから図３５Ｄを含むが、これは完全長ＴＲＩＭ１１がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３５Ａは、ＴＲＩＭ１１構造の図解を示す。図３５Ｂは、漸増濃度の示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３５Ｃは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、ＲＢＣ、又はＢ３０．２によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図３５Ｄは、示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図３５Ｂ】図３５は、図３５Ａから図３５Ｄを含むが、これは完全長ＴＲＩＭ１１がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３５Ａは、ＴＲＩＭ１１構造の図解を示す。図３５Ｂは、漸増濃度の示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３５Ｃは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、ＲＢＣ、又はＢ３０．２によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図３５Ｄは、示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図３５Ｃ】図３５は、図３５Ａから図３５Ｄを含むが、これは完全長ＴＲＩＭ１１がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３５Ａは、ＴＲＩＭ１１構造の図解を示す。図３５Ｂは、漸増濃度の示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３５Ｃは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、ＲＢＣ、又はＢ３０．２によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図３５Ｄは、示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図３５Ｄ】図３５は、図３５Ａから図３５Ｄを含むが、これは完全長ＴＲＩＭ１１がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３５Ａは、ＴＲＩＭ１１構造の図解を示す。図３５Ｂは、漸増濃度の示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３５Ｃは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、ＲＢＣ、又はＢ３０．２によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図３５Ｄは、示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図３６Ａ】図３６は、図３６Ａから図３６Ｂを含むが、これは基質へのＴＲＩＭ１１の結合が、ＴＲＩＭ１１の脱凝集機能にとって必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３６Ａは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１、ＧＳＴ−ＲＢＣ、又はＧＳＴ−Ｂ３０．２と共にインキュベートしたことを示す。図３６Ｂは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は他のＴＲＩＭ１１断片と共にインキュベートしたことを示す。
【図３６Ｂ】図３６は、図３６Ａから図３６Ｂを含むが、これは基質へのＴＲＩＭ１１の結合が、ＴＲＩＭ１１の脱凝集機能にとって必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３６Ａは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１、ＧＳＴ−ＲＢＣ、又はＧＳＴ−Ｂ３０．２と共にインキュベートしたことを示す。図３６Ｂは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は他のＴＲＩＭ１１断片と共にインキュベートしたことを示す。
【図３７Ａ】図３７は、図３７Ａから図３７Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、そのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図３７Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴと共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は１００％に設定された。Ｎ＝３。図３７Ｂは、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３７Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３７Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴの免疫蛍光分析を示す。図３７Ｅは、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
【図３７Ｂ】図３７は、図３７Ａから図３７Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、そのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図３７Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴと共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は１００％に設定された。Ｎ＝３。図３７Ｂは、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３７Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３７Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴの免疫蛍光分析を示す。図３７Ｅは、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
【図３７Ｃ】図３７は、図３７Ａから図３７Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、そのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図３７Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴと共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は１００％に設定された。Ｎ＝３。図３７Ｂは、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３７Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３７Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴの免疫蛍光分析を示す。図３７Ｅは、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
【図３７Ｄ】図３７は、図３７Ａから図３７Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、そのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図３７Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴと共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は１００％に設定された。Ｎ＝３。図３７Ｂは、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３７Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３７Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴの免疫蛍光分析を示す。図３７Ｅは、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
【図３７Ｅ】図３７は、図３７Ａから図３７Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、そのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図３７Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴと共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は１００％に設定された。Ｎ＝３。図３７Ｂは、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３７Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３７Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴの免疫蛍光分析を示す。図３７Ｅは、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
【図３８Ａ】図３８は、図３８Ａから図３８Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図３８Ａは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、又はＨｓｐ１０４によるα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｂは、ＴＲＩＭ１１による用量依存的なα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｃは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートしたα−Ｓｙｎ単量体の線維形成のＥＭ画像を示す。図３８Ｄは、ＴＲＩＭ１１及びＨｓｐ１０４ Ａ５０３Ｓによって脱凝集した予め形成されたα−Ｓｙｎ線維を示した沈降アッセイを示す。図３８Ｅは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、又はＨｓｐ１０４による予め形成されたα−Ｓｙｎ線維の脱凝集を示したＴｈＴ分析を示す。
【図３８Ｂ】図３８は、図３８Ａから図３８Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図３８Ａは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、又はＨｓｐ１０４によるα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｂは、ＴＲＩＭ１１による用量依存的なα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｃは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートしたα−Ｓｙｎ単量体の線維形成のＥＭ画像を示す。図３８Ｄは、ＴＲＩＭ１１及びＨｓｐ１０４ Ａ５０３Ｓによって脱凝集した予め形成されたα−Ｓｙｎ線維を示した沈降アッセイを示す。図３８Ｅは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、又はＨｓｐ１０４による予め形成されたα−Ｓｙｎ線維の脱凝集を示したＴｈＴ分析を示す。
【図３８Ｃ】図３８は、図３８Ａから図３８Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図３８Ａは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、又はＨｓｐ１０４によるα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｂは、ＴＲＩＭ１１による用量依存的なα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｃは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートしたα−Ｓｙｎ単量体の線維形成のＥＭ画像を示す。図３８Ｄは、ＴＲＩＭ１１及びＨｓｐ１０４ Ａ５０３Ｓによって脱凝集した予め形成されたα−Ｓｙｎ線維を示した沈降アッセイを示す。図３８Ｅは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、又はＨｓｐ１０４による予め形成されたα−Ｓｙｎ線維の脱凝集を示したＴｈＴ分析を示す。
【図３８Ｄ】図３８は、図３８Ａから図３８Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図３８Ａは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、又はＨｓｐ１０４によるα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｂは、ＴＲＩＭ１１による用量依存的なα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｃは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートしたα−Ｓｙｎ単量体の線維形成のＥＭ画像を示す。図３８Ｄは、ＴＲＩＭ１１及びＨｓｐ１０４ Ａ５０３Ｓによって脱凝集した予め形成されたα−Ｓｙｎ線維を示した沈降アッセイを示す。図３８Ｅは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、又はＨｓｐ１０４による予め形成されたα−Ｓｙｎ線維の脱凝集を示したＴｈＴ分析を示す。
【図３８Ｅ】図３８は、図３８Ａから図３８Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図３８Ａは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、又はＨｓｐ１０４によるα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｂは、ＴＲＩＭ１１による用量依存的なα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｃは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートしたα−Ｓｙｎ単量体の線維形成のＥＭ画像を示す。図３８Ｄは、ＴＲＩＭ１１及びＨｓｐ１０４ Ａ５０３Ｓによって脱凝集した予め形成されたα−Ｓｙｎ線維を示した沈降アッセイを示す。図３８Ｅは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、又はＨｓｐ１０４による予め形成されたα−Ｓｙｎ線維の脱凝集を示したＴｈＴ分析を示す。
【図３９Ａ】図３９は、図３９Ａから図３９Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２１がＴＲＩＭ１１と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図３９Ａは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３９Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図３９Ｃは、漸増濃度のＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３９Ｄは、ルシフェラーゼ（１０nM）を２００nM ＧＳＴ又は２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１と共に４５℃で１分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは１００％に設定された。Ｎ＝３。
【図３９Ｂ】図３９は、図３９Ａから図３９Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２１がＴＲＩＭ１１と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図３９Ａは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３９Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図３９Ｃは、漸増濃度のＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３９Ｄは、ルシフェラーゼ（１０nM）を２００nM ＧＳＴ又は２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１と共に４５℃で１分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは１００％に設定された。Ｎ＝３。
【図３９Ｃ】図３９は、図３９Ａから図３９Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２１がＴＲＩＭ１１と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図３９Ａは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３９Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図３９Ｃは、漸増濃度のＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３９Ｄは、ルシフェラーゼ（１０nM）を２００nM ＧＳＴ又は２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１と共に４５℃で１分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは１００％に設定された。Ｎ＝３。
【図３９Ｄ】図３９は、図３９Ａから図３９Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２１がＴＲＩＭ１１と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図３９Ａは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３９Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図３９Ｃは、漸増濃度のＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３９Ｄは、ルシフェラーゼ（１０nM）を２００nM ＧＳＴ又は２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１と共に４５℃で１分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは１００％に設定された。Ｎ＝３。
【図４０Ａ】図４０は、図４０Ａから図４０Ｅを含むが、これはＰＭＬ及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図４０Ａは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ６のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｂは、漸増濃度のリゾチーム又はＦｌａｇ−ＰＭＬ６（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｃは、リゾチーム、Ｆｌａｇ−ＰＭＬ６又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｄは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ４断片のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｅは、様々なＰＭＬ４断片（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図４０Ｂ】図４０は、図４０Ａから図４０Ｅを含むが、これはＰＭＬ及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図４０Ａは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ６のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｂは、漸増濃度のリゾチーム又はＦｌａｇ−ＰＭＬ６（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｃは、リゾチーム、Ｆｌａｇ−ＰＭＬ６又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｄは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ４断片のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｅは、様々なＰＭＬ４断片（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図４０Ｃ】図４０は、図４０Ａから図４０Ｅを含むが、これはＰＭＬ及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図４０Ａは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ６のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｂは、漸増濃度のリゾチーム又はＦｌａｇ−ＰＭＬ６（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｃは、リゾチーム、Ｆｌａｇ−ＰＭＬ６又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｄは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ４断片のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｅは、様々なＰＭＬ４断片（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図４０Ｄ】図４０は、図４０Ａから図４０Ｅを含むが、これはＰＭＬ及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図４０Ａは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ６のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｂは、漸増濃度のリゾチーム又はＦｌａｇ−ＰＭＬ６（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｃは、リゾチーム、Ｆｌａｇ−ＰＭＬ６又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｄは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ４断片のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｅは、様々なＰＭＬ４断片（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図４０Ｅ】図４０は、図４０Ａから図４０Ｅを含むが、これはＰＭＬ及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図４０Ａは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ６のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｂは、漸増濃度のリゾチーム又はＦｌａｇ−ＰＭＬ６（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｃは、リゾチーム、Ｆｌａｇ−ＰＭＬ６又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｄは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ４断片のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｅは、様々なＰＭＬ４断片（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図４１Ａ】図４１は、図４１Ａから図４１Ｂを含むが、これはマウス一次海馬神経細胞におけるＴＲＩＭ１１を実証した実験の結果を示す。図４１Ａは、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１が、α−Ｓｙｎにより誘発された細胞死をインキュベートしたことを示すＭＴＴ分析を示す。図４１Ｂは、α−Ｓｙｎ線維により処置された海馬神経細胞におけるｐ−α−Ｓｙｎ又はｐ６２の免疫蛍光分析を示す。
【図４１Ｂ】図４１は、図４１Ａから図４１Ｂを含むが、これはマウス一次海馬神経細胞におけるＴＲＩＭ１１を実証した実験の結果を示す。図４１Ａは、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１が、α−Ｓｙｎにより誘発された細胞死をインキュベートしたことを示すＭＴＴ分析を示す。図４１Ｂは、α−Ｓｙｎ線維により処置された海馬神経細胞におけるｐ−α−Ｓｙｎ又はｐ６２の免疫蛍光分析を示す。
【図４２Ａ】図４２は、図４２Ａから図４２Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、皮質神経細胞及び海馬神経細胞において熱ショックに応答してアップレギュレートされることを実証した実験の結果を示す。図４２Ａは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次皮質神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｂは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次海馬神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｃは、海馬神経細胞における熱ショックに応答した、ＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。
【図４２Ｂ】図４２は、図４２Ａから図４２Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、皮質神経細胞及び海馬神経細胞において熱ショックに応答してアップレギュレートされることを実証した実験の結果を示す。図４２Ａは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次皮質神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｂは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次海馬神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｃは、海馬神経細胞における熱ショックに応答した、ＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。
【図４２Ｃ】図４２は、図４２Ａから図４２Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、皮質神経細胞及び海馬神経細胞において熱ショックに応答してアップレギュレートされることを実証した実験の結果を示す。図４２Ａは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次皮質神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｂは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次海馬神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｃは、海馬神経細胞における熱ショックに応答した、ＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。
【００２６】
詳細な説明
本発明は、様々な神経変性障害の病態において役割を果たしているミスフォールドタンパク質の認識及び分解における、トリパータイトモチーフ（ＴＲＩＭ）タンパク質ファミリーメンバー及びＳＵＭＯ依存性ユビキチンリガーゼＲＮＦ４の役割の発見に関する。
【００２７】
１つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物及び方法を提供する。ＴＲＩＭタンパク質は、シャペロンタンパク質として、プロテアソームによる分解のためにミスフォールドタンパク質を標的化する際に、及びタンパク質凝集物又は封入体を脱凝集する際に役割を果たすことが本明細書において実証されている。したがって、特定の態様では、本発明を使用して、細胞内又は細胞外ミスフォールドタンパク質、タンパク質凝集物、又はタンパク質封入体を排除することができる。
【００２８】
例えば、特定の実施態様では、本発明は、必要とする被験者における神経変性障害を治療又は予防するための組成物及び方法を提供する。例えば、特定の実施態様では、本発明は、ポリ−グルタミン（ポリＱ）障害（ＣＡＧコドン反復配列が、ミスフォールドタンパク質凝集物をもたらす可能性のあるポリグルタミン鎖を有するタンパク質をコードしている）である神経変性障害の治療又は予防のための組成物及び方法を提供する。例示的なポリＱ障害としては、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、ハンチントン病、及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、伝染性海綿状脳症（プリオン病）、タウオパチー、及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）を含むがこれらに限定されない、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した神経変性障害の処置のための組成物及び方法を提供する。しかしながら、本発明は、神経変性障害の治療又は予防に限定されない。むしろ、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連したあらゆる疾患又は障害の治療又は予防を包含する。他のこのような疾患及び障害としては、ＡＬアミロイド症、ＡＡアミロイド症、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイド症、家族性アミロイド性多発神経炎、血液透析に関連したアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＶアミロイド症、フィンランド型遺伝性アミロイド症、リゾチームアミロイド症、フィブリノーゲンアミロイド症、アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症、ＩＩ型糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイド症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位に限局したアミロイド症、大動脈中膜アミロイド症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、睫毛乱生に関連した角膜アミロイド症、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、及び皮膚苔癬アミロイド症が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、本発明は、膀胱癌、星状細胞腫、咽頭癌、リンパ腫、及び腺癌を含むがこれらに限定されない、ｐ５３突然変異体の凝集物に関連した癌の治療又は予防を包含する。
【００２９】
１つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質を安定化させるための１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の使用を包含する。特定の態様では、本明細書に記載の１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を介した機能的なミスフォールドタンパク質の安定化は、ミスフォールドタンパク質に関連した疾患又は障害を治療又は予防することができる。例えば、１つの実施態様では、本明細書に記載の１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を介した、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）突然変異体の安定化により、突然変異ＣＦＴＲは、分解される代わりに機能することが可能となるだろう。ミスフォールドタンパク質を安定化させるためのＴＲＩＭタンパク質の使用は、部分的に機能的なタンパク質の分解に関連した嚢胞性線維症及び他の疾患を処置するために使用され得ることが想定される。本明細書に記載の１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を介した、タンパク質の安定化を使用して、嚢胞性線維症及びリソソーム蓄積病、例えばゴーシェ病及びファブリー病を含むがこれらに限定されない、機能的な突然変異タンパク質の分解に関連したあらゆる疾患又は障害を処置することができる。
【００３０】
１つの態様では、本発明は、ＴＲＩＭタンパク質の発現、活性、又はその両方を増加させるための組成物及び方法を提供する。特定の実施態様では、該組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現、活性、又はその両方を増加させる、核酸分子、発現ベクター、タンパク質、ペプチド、低分子などを含む。
【００３１】
１つの態様では、本発明は、１つ以上のＳＵＭＯ標的化ユビキチンリガーゼ（ＳＴＵｂＬ）の発現、活性、又はその両方を増加させるための組成物及び方法を提供する。特定の実施態様では、該組成物は、１つ以上のＳＴＵｂＬの発現、活性、又はその両方を増加させる、核酸分子、発現ベクター、タンパク質、ペプチド、低分子などを含む。
【００３２】
定義
特記しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似した又は等価な任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載されている。
【００３３】
本明細書において使用する以下の各用語は、この章内の用語に関連した意味を有する。
【００３４】
「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という冠詞は、本明細書において１つの又は１つを超える（すなわち少なくとも１つの）文法上の冠詞の目的語を指すために使用される。例えば、「１つの要素」は、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。
【００３５】
本明細書において使用する「約」は、測定可能な数値、例えば量、時間範囲などを指す場合には、明記された数値からの±２０％、±１０％、±５％、±１％、又は±０．１％の変動を包含することを意味する。なぜなら、このような変動は、開示された方法を実施するのに適切であるからである。
【００３６】
生物、組織、細胞、又はその成分の脈絡において使用される場合の「異常」という用語は、「正常な」（予想される）それぞれの特徴を示すそうした生物、組織、細胞、又はその成分とは少なくとも１つの観察可能な又は検出可能な特徴（例えば年齢、処置、時刻など）が異なるそうした生物、組織、細胞、又はその成分を指す。ある細胞型又は組織型にとっては正常又は予想される特徴は、異なる細胞型又は組織型にとっては異常である場合がある。
【００３７】
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができずそして該疾患が寛解しなければ悪化し続ける、動物の健康状態である。
【００３８】
これに対し、動物の「障害」は、動物が恒常性を維持することができるが、該障害が存在しない場合よりも好ましくない、健康状態である。処置されずに放置されても、障害は、動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。
【００３９】
疾患又は障害は、疾患又は障害の兆候又は症状の重度、このような兆候又は症状が患者に起こる頻度、あるいはその両方が低減される場合に「軽減」する。
【００４０】
化合物の「有効量」又は「治療有効量」は、該化合物が投与される被験者に有益な効果を提供するに十分な化合物の量である。送達ビヒクルの「有効量」は、化合物と効果的に結合するか又は化合物を送達するに十分な量である。
【００４１】
本明細書において使用する「説明用資料」は、本明細書に列挙された様々な疾患又は障害の軽減を奏功するためのキット内の本発明の化合物、組成物、ベクター、又は送達システムの有用性を伝えるために使用され得る、出版物、記録、図解、又は任意の他の表現媒体を含む。場合により、又は代替的に、説明用資料は、哺乳動物の細胞又は組織における疾患又は障害を軽減する１つ以上の方法を記載し得る。本発明のキットの説明用資料は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、ベクター、若しくは送達システムを含有している容器に貼りつけられていても、又は同定された化合物、組成物、ベクター、若しくは送達システムを含有している容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、説明用資料は、説明用資料及び化合物がレシピエントによって共同で使用されることを意図して、容器とは別に出荷されてもよい。
【００４２】
「患者」、「被験者」、「個体」などの用語は本明細書において同義語として使用され、そしてインビトロであろうがインビボであろうが本明細書に記載の方法を受けることのできる任意の動物又はその細胞を指す。特定の非限定的な実施態様では、患者、被験者、又は個体はヒトである。
【００４３】
「治療的」処置は、兆候又は症状を減少又は排除する目的で、疾患又は障害のそうした兆候又は症状を示す被験者に投与される処置である。
【００４４】
本明細書において使用する「疾患又は障害を処置する」は、患者に起こる疾患又は障害の兆候又は症状の重度及び／又は頻度を低減することを意味する。
【００４５】
本明細書において使用する「生物学的試料」という語句は、核酸又はポリペプチドの発現が存在するか又は検出され得る細胞、組織、又は体液を含むあらゆる試料を含むことを意図する。液体の性質である試料は、本明細書において「体液」と称される。生物学的試料は、例えば、被験者の領域を掻爬若しくはふきとることによって、又は体液を得るために針を使用することによってなどの、様々な技術によって患者から得ることができる。様々な生体試料を回収するための方法は当技術分野において周知である。
【００４６】
本明細書において使用する「イムノアッセイ」は、標的分子に特異的に結合して標的分子を検出及び定量することのできる抗体を使用するあらゆる結合アッセイを指す。
【００４７】
抗体に関して本明細書において使用する「特異的に結合する」という用語とは、特異的な抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないか又は結合しない、抗体を意味する。例えば、ある種に由来する抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の種に由来する抗原にも結合し得る。しかし、このような種間交差反応性はそれ自体、特異的であるとする抗体の分類を変化させない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、該抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかしながら、このような交差反応性はそれ自体、特異的であるとする抗体の分類を変化させない。
【００４８】
場合によっては、「特異的な結合」又は「特異的に結合」という用語は、抗体、タンパク質、又はペプチドと第二の化学種との相互作用に関して使用され得、該相互作用は、化学種上の特定の構造（例えば抗原決定基すなわちエピトープ）の存在に依存し；例えば、抗体は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識しそしてそれに結合することを意味する。抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識された「Ａ」と抗体とを含有している反応における、エピトープＡを含有している分子の存在（すなわち遊離した標識されていないＡ）は、抗体に結合する標識されたＡの量を減少させるだろう。
【００４９】
遺伝子の「コード領域」は、遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡ分子のコード領域に対してそれぞれ相同であるか又は相補的である、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基及び遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。
【００５０】
ｍＲＮＡ分子の「コード領域」は、ｍＲＮＡ分子の翻訳中に転移ＲＮＡ分子のアンチコドン領域と適合するか又は終止コドンをコードしている、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基からなる。したがって、コード領域は、ｍＲＮＡ分子によってコードされる成熟タンパク質には存在しないアミノ酸残基（例えば、タンパク質輸送シグナル配列内のアミノ酸残基）のコドンを含むヌクレオチド残基を含み得る。
【００５１】
核酸を指すために本明細書において使用する「相補的」は、２本の核酸鎖の領域間又は同じ核酸鎖の２つの領域間の広い概念の配列相補性を指す。第一の核酸領域のアデニン残基は、第一の領域に対して逆平行である第二の核酸領域の残基と、該残基がチミン又はウラシルである場合には、特異的な水素結合を形成（「塩基対形成」）することができることが知られている。同様に、第一の核酸鎖のシトシン残基は、第一の鎖に対して逆平行である第二の核酸鎖の残基と、該残基がグアニンである場合には、塩基対を形成することができることが知られている。２つの領域が逆平行に並べられた場合、第一の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第二の領域の残基と塩基対を形成することができる場合、核酸の第一の領域は、同じ又は異なる核酸の第二の領域に対して相補的である。好ましくは、第一の領域は第一の部分を含み、そして第二の領域は第二の部分を含み、これにより、第一及び第二の部分を逆平行に並べた場合、第一の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が、第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対を形成することができる。より好ましくは、第一の部分の全てのヌクレオチド残基が、第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対を形成することができる。
【００５２】
「単離された」は、天然状態から変化させた又は取り出されたことを意味する。例えば、生存動物内にその通常の態様で天然に存在している核酸又はペプチドは「単離」されていないが、その天然の態様の共存物質から部分的に又は完全に分離された同核酸又はペプチドは「単離」されている。単離された核酸若しくはタンパク質は実質的に精製された形態で存在し得るか、又は例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
【００５３】
「単離された核酸」は、天然の状態でフランキングしている配列から分離された核酸セグメント又は断片、すなわち、該断片に通常は隣接している配列、すなわちそれが天然に存在するゲノム内の断片に隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。該用語はまた、天然には核酸に伴う他の成分、すなわち天然では細胞内でそれに伴うＲＮＡ又はＤＮＡ又はタンパク質から実質的に精製された核酸に適用する。それ故、該用語は、例えば、ベクターに、自己複製プラスミド若しくはウイルスに、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれているか、あるいは他の配列とは独立して別々の分子として（すなわちＰＣＲ又は制限酵素による消化によって生成されたｃＤＮＡ又はゲノム断片又はｃＤＮＡ断片として）存在する、組換えＤＮＡを含む。それはまた、追加のポリペプチド配列をコードしているハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。
【００５４】
本発明の脈絡において、一般的に存在している核酸塩基のために以下の略称を使用する。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、そして「Ｕ」はウリジンを指す。
【００５５】
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書において使用する核酸及びポリヌクレオチドは同義語である。当業者は、核酸は、単量体「ヌクレオチド」へと加水分解され得るポリヌクレオチドであるという一般的な知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドへと加水分解され得る。本明細書において使用するようにポリヌクレオチドは、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術及びＰＣＲなどを使用した組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含むがこれらに限定されない、当技術分野において利用可能な任意の手段によって、及び合成手段によって得られる全ての核酸配列を含むがこれらに限定されない。
【００５６】
本明細書において使用する「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は同義語として使用され、そしてペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質又はペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、そしてタンパク質又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数には制限を課されない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに接続された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書において使用する該用語は、当技術分野において例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも一般的に称される短い鎖、並びに、多くのタイプがあるタンパク質と当技術分野において一般的に称されるより長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質をとりわけ含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はその組合せを含む。
【００５７】
本明細書において使用する「コンジュゲートした」は、ある分子の第二の分子への共有結合による付着を指す。
【００５８】
「変異体」は該用語が本明細書において使用される場合、それぞれ基準核酸配列又はペプチド配列とは配列が異なるが、基準分子の必須な生物学的特性を保持している核酸配列又はペプチド配列である。核酸変異体の配列の変化は、基準核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を変化させ得ないか、又はアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、及び切断短縮がもたらされ得る。ペプチド変異体の配列の変化は、典型的には制限されているか又は保存的であるので、よって基準ペプチド及び変異体の配列は全体的に密接に類似し、そして多くの領域において同一である。変異体及び基準ペプチドのアミノ酸配列は、１つ以上の置換、付加、欠失の任意の組合せによって異なり得る。核酸又はペプチドの変異体は対立遺伝子変異体などの天然に起こるものであり得るか、又は天然に起こることが知られていない変異体であり得る。核酸及びペプチドの天然には起こらない変異体は、突然変異誘発技術によって又は直接合成によって作製され得る。
【００５９】
本明細書において使用する「１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーター」は、モジュレーターの非存在下におけるＴＲＩＭタンパク質の発現、活性、又は生物学的機能と比較して、ＴＲＩＭタンパク質の発現、活性、又は生物学的機能を改変する化合物である。
【００６０】
本明細書において使用する「ＲＮＦ４のモジュレーター」は、モジュレーターの非存在下におけるＲＮＦ４の発現、活性、又は生物学的機能と比較して、ＲＮＦ４の発現、活性、又は生物学的機能を改変する化合物である。
【００６１】
範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様は範囲の形式で提示され得る。範囲の形式の記載は単に簡便性及び簡潔さのためであり、そして本発明の範囲に対する融通の利かない制限として捉えられるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲、並びに、その範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、並びに、その範囲内の個々の数、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を具体的に開示したと考えられるべきである。これは範囲の広さに関係なく適用される。
【００６２】
説明
１つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物及び方法を提供する。例えば、本発明は、ミスフォールドタンパク質の認識及び排除を増加させるための組成物及び方法を提供する。特定の実施態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質のＳＵＭＯにより媒介されるユビキチン化及び最終的な分解を提供する。特定の実施態様では、本発明は、タンパク質凝集物又は封入体の脱凝集を提供する。したがって、本発明は、細胞内又は細胞外の両方のミスフォールドタンパク質、タンパク質凝集物、又はタンパク質封入体を排除するために使用され得る。
【００６３】
本発明は、多くの神経変性疾患及び障害をはじめとする、様々な疾患及び障害の病態において役割を果たしているミスフォールドタンパク質の認識及び分解における、トリパータイトモチーフ（ＴＲＩＭ）タンパク質ファミリーメンバー及びＳＵＭＯ標的化ユビキチンリガーゼ（ＳＴＵｂＬ）であるＲＮＦ４の役割の発見に関する。
【００６４】
本明細書に提示されたデータは、ＴＲＩＭタンパク質ファミリーメンバーがミスフォールドタンパク質と共局在し、そしてミスフォールドタンパク質の分解を媒介することを実証する。さらに、ＲＮＦ４は、ミスフォールドタンパク質のユビキチン化及び分解を媒介するユビキチンリガーゼであることが本明細書に記載されている。したがって、本発明は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質、１つ以上のＳＴＵｂＬ、又はその組合せの発現、活性、又は両方を増加させる組成物を提供する。例えば、ＴＲＩＭタンパク質及び組換えＴＲＩＭタンパク質をコードしている核酸分子はミスフォールドタンパク質の分解を促進することが実証されている。
【００６５】
１つの実施態様では、前記組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現又は活性のモジュレーターを含む。例えば、１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の発現又は活性を増加させる。１つ以上のＴＲＩＭタンパク質は、例えば哺乳動物及び非哺乳動物メンバーを含むＴＲＩＭタンパク質ファミリーの任意のメンバーを含む。特定の実施態様では、該モジュレーターは、ヒトＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１９（本明細書では「ＰＭＬ」とも称される）、ＴＲＩＭ２０、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３４、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４６、ＴＲＩＭ４９、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６７、ＴＲＩＭ６９、ＴＲＩＭ７０、ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７５；並びにマウスＴＲＩＭ３０の１つ以上の発現又は活性を増加させる。
【００６６】
１つの実施態様では、前記組成物は、１つ以上のＳＴＵｂＬのモジュレーターを含む。例えば、１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させる。例示的なＳＴＵｂＬとしては、ＲＮＦ４及びＲＮＦ１１１（アルカディアとしても知られる）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６７】
１つの実施態様では、前記組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のモジュレーター及び１つ以上のＳＴＵｂＬのモジュレーターを含む。
【００６８】
本発明は、必要とする被験者における、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための方法を提供する。ＴＲＩＭタンパク質又はＳＴＵｂＬの発現又は活性のレベルを増加させることにより、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することができ、これにより被験者における疾患又は障害を処置することができることが本明細書において判明する。
【００６９】
本発明の組成物及び方法によって治療又は予防され得る神経変性疾患又は障害の例としては、ポリＱ障害、例えばＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、伝染性海綿状脳症（プリオン病）、タウオパチー、及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）が挙げられるがこれらに限定されない。しかしながら、本発明は、神経変性障害の治療又は予防に限定されない。むしろ、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連したあらゆる疾患又は障害の治療又は予防を包含する。他のこのような疾患及び障害としては、ＡＬアミロイド症、ＡＡアミロイド症、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイド症、家族性アミロイド性多発神経炎、血液透析に関連したアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＶアミロイド症、フィンランド型遺伝性アミロイド症、リゾチームアミロイド症、フィブリノーゲンアミロイド症、アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症、ＩＩ型糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイド症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位に限局したアミロイド症、大動脈中膜アミロイド症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、睫毛乱生に関連した角膜アミロイド症、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、及び皮膚苔癬アミロイド症が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、本発明は、膀胱癌、星状細胞腫、咽頭癌、リンパ腫、及び腺癌を含むがこれらに限定されない、ｐ５３突然変異体の凝集物に関連した癌の治療又は予防を包含する。
【００７０】
１つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質を安定化させるための１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の使用を包含する。特定の態様では、本明細書に記載の１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を介した機能的ミスフォールドタンパク質の安定化は、嚢胞性線維症及びリソソーム蓄積病、例えばゴーシェ病及びファブリー病を含むがこれらに限定されない、ミスフォールドタンパク質に関連した疾患又は障害を治療又は予防することができる。
【００７１】
１つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を診断するための方法を提供する。例えば、１つの実施態様では、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬは、診断マーカーとして使用される。
【００７２】
１つの態様では、本発明は、関心対象の組換えタンパク質の製造のための組成物及び方法に指向される。例えば、特定の実施態様では、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質及び１つ以上のＳＴＵｂＬを使用して、関心対象の組換えタンパク質のタンパク質凝集物を脱凝集することができる。
【００７３】
組成物
様々な実施態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を予防又は治療するモジュレーター組成物、及び、方法を含む。様々な実施態様では、本発明のモジュレーター組成物及び予防法又は治療法は、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を調節する。いくつかの実施態様では、本発明のモジュレーター組成物は、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を増加させるアクチベーターである。
【００７４】
本明細書に提供された開示に基づいて、遺伝子又は遺伝子産物の調節は、転写、翻訳、スプライシング、分解、酵素活性、結合活性、又はその組合せの調節を含むがこれらに限定されない、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性の調節を包含することが当業者によって理解されるだろう。したがって、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性の調節は、核酸の転写、翻訳、分解、スプライシング、又はその組合せの調節を含むがこれらに限定されず；そしてそれはまた、同様にポリペプチド遺伝子産物の任意の活性の調節も含む。
【００７５】
１つの実施態様では、前記モジュレーターは、遺伝子又は遺伝子産物の産生を増加させることによって、例えば遺伝子の転写又は遺伝子産物の翻訳を調節することによって、遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を増加させる。１つの実施態様では、該モジュレーターは、外来性遺伝子又は遺伝子産物を提供することによって、遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を増加させる。例えば、特定の実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬをコードしている、単離された核酸を含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質及び１つ以上のＳＴＵｂＬをコードしている、単離された核酸を含む。特定の実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬを含む、単離されたペプチドを含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質及び１つ以上のＳＴＵｂＬを含む、単離されたペプチドを含む。１つの実施態様では、該モジュレーターは、遺伝子又は遺伝子産物の分解を阻害することによって、遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を増加させる。例えば、１つの実施態様では、該モジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬのユビキチン化、プロテアソームによる分解、又はタンパク質分解を減少させる。１つの実施態様では、該モジュレーターは、遺伝子産物の安定性又は半減期を増加させる。
【００７６】
様々な実施態様では、調節される遺伝子又は遺伝子産物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質である。例えば、ＴＲＩＭタンパク質は、ミスフォールドタンパク質を認識し、そしてミスフォールドタンパク質及びタンパク質凝集物の分解を媒介することが本明細書に記載されている。１つの実施態様では、遺伝子又は遺伝子産物は、１つ以上のＳＴＵｂＬである。例えば、ＳＴＵｂＬタンパク質ファミリーのメンバーであるＲＮＦ４は、ミスフォールドタンパク質及びタンパク質凝集物の分解を媒介することが本明細書に記載されている。
【００７７】
遺伝子又は遺伝子産物の調節は、本明細書に開示されているような方法をはじめとする多種多様な方法、並びに、当技術分野において公知であるか又は将来開発される予定の方法を使用して評価され得る。すなわち、日常実務者は、本明細書に提供された開示に基づいて、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性の調節が、遺伝子産物（例えばｍＲＮＡ）をコードしている核酸のレベル、生物学的試料中に存在するポリペプチド遺伝子産物のレベル、生物学的試料中に存在するポリペプチド遺伝子産物の活性、又はその組合せを評価する方法を使用して容易に評価され得ることを理解するだろう。
【００７８】
遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を調節する本発明のモジュレーター組成物及び方法は、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、アンチセンス核酸（例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）又はその組合せを含むがこれらに限定されると捉えられるべきではない。当業者は、本明細書に提供された開示に基づいて、モジュレーター組成物が遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を調節する化合物を包含することを容易に理解するだろう。さらに、モジュレーター組成物は、化学分野の技術者には周知であるように、化学的に修飾された化合物及び誘導体も包含する。
【００７９】
１つの実施態様では、本発明のモジュレーター組成物は、遺伝子又は遺伝子産物の発現、活性、又は生物学的機能を増加させるアゴニストである。例えば、特定の実施態様では、本発明のモジュレーターは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬのアゴニストである。
【００８０】
さらに、当業者は、本開示及び本明細書に例示された方法を備えれば、モジュレーターは、将来発見されるような、遺伝子及び遺伝子産物の調節の生理学的結果などの薬理学の分野における周知の基準によって同定され得るような、本明細書で詳述されているような、及び／又は当技術分野において公知であるようなそのようなモジュレーターを含むことを理解するだろう。それ故、本発明は、いずれにしても、本明細書に例示又は開示されているようないずれかの特定のモジュレーター組成物に限定されず；むしろ、本発明は、当技術分野において公知であるような及び将来発見されるような、日常実務者によって有用であると理解されるであろうそのようなモジュレーター組成物を包含する。
【００８１】
モジュレーター組成物を同定及び生成するさらなる方法は当業者には周知である。あるいは、モジュレーターは、化学合成され得る。さらに、日常実務者は、本明細書に提供された教義に基づいて、モジュレーター組成物が組換え生物から得ることができることを理解するだろう。モジュレーターを化学合成するための及びそれらを天然源から得るための組成物及び方法は、当技術分野において周知であり、そして当技術分野において記載されている。
【００８２】
当業者は、モジュレーターが、低分子化学物質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、タンパク質をコードしている核酸構築物、アンチセンス核酸、アンチセンス核酸をコードしている核酸構築物、又はその組合せとして投与され得ることを理解するだろう。タンパク質又はタンパク質をコードしている核酸構築物を細胞又は組織に投与するための数多くのベクター及び他の組成物及び方法は周知である。それ故、本発明は、遺伝子又は遺伝子産物のモジュレーターである、ペプチド又はペプチドをコードしている核酸を含む。例えば、本発明は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質、１つ以上のＳＴＵｂＬ、又はその組合せを含む、ペプチド又はペプチドをコードしている核酸を含む（Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York）。
【００８３】
ペプチド
１つの実施態様では、本発明の組成物は、１つ以上のペプチドを含む。例えば、１つの実施態様では、該組成物のペプチドは、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のアミノ酸配列を含む。例えば、１つの実施態様では、該ペプチドは、ＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１９、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２の１つ以上を含む。特定の実施態様では、該ペプチドは、１つ以上のＳＴＵｂＬのアミノ酸配列を含む。例えば、１つの実施態様では、該ペプチドは、ＲＮＦ４及びＲＮＦ１１１（アルカディア）の１つ以上を含む。
【００８４】
ＴＲＩＭタンパク質の例示的なアミノ酸配列、及びＴＲＩＭタンパク質をコードしているｃＤＮＡヌクレオチド配列が以下の表１に提供されている。
【００８５】
【表１】
2022000459.tif 000003
2022000459.tif 000004
【００８６】
本発明はまた、本明細書に開示されたペプチドに対してかなり相同性を有する任意の形態のペプチドを含むと捉えられるべきである。好ましくは、「かなり相同性」であるペプチドは、本明細書に開示されたペプチドのアミノ酸配列に対して、約５０％相同性、より好ましくは約７０％相同性、さらにより好ましくは約８０％相同性、より好ましくは約９０％相同性、さらにより好ましくは約９５％相同性、さらにより好ましくは約９９％相同性である。
【００８７】
１つの実施態様では、本発明の組成物は、本明細書に記載のペプチド、ペプチド断片、相同体、変異体、ペプチドの誘導体又は塩を含む。例えば、特定の実施態様では、該組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の断片、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の相同体、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の変異体、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の誘導体、又は１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の塩を含む、ペプチドを含む。特定の実施態様では、該組成物は、１つ以上のＳＴＵｂＬ、１つ以上のＳＴＵｂＬの断片、１つ以上のＳＴＵｂＬの相同体、１つ以上のＳＴＵｂＬの変異体、１つ以上のＳＴＵｂＬの誘導体、又は１つ以上のＳＴＵｂＬの塩を含む、ペプチドを含む。
【００８８】
１つの実施態様では、前記組成物は、本明細書に記載のペプチドの組合せを含む。例えば、特定の実施態様では、該組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を含むペプチドと、１つ以上のＳＴＵｂＬを含むペプチドとを含む。１つの実施態様では、該組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質と１つ以上のＳＴＵｂＬとを含むペプチドを含む。
【００８９】
特定の実施態様では、前記ペプチドは、該ペプチドを所望の場所へと標的化する標的化ドメインを含む。例えば、特定の実施態様では、標的化ドメインは、標的化された細胞、タンパク質、又はタンパク質凝集物に結合し、これにより、治療用ペプチドを所望の場所に送達する。例えば、１つの実施態様では、標的化ドメインは、アミロイドβ、α−シヌクレイン、タウ、プリオン、ＳＯＤ１、ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、ｐ５３突然変異体、及びハンチンチン、アタキシンなどのポリグルタミン反復配列を伴うタンパク質のタンパク質及びタンパク質凝集物を含むがこれらに限定されない、疾患又は障害に関連したタンパク質及びタンパク質凝集物に結合するよう方向付けられる。
【００９０】
特定の実施態様では、標的化ドメインは、標的化された細胞、タンパク質、又はタンパク質凝集物への結合能を有する、ペプチド、核酸、低分子などを含む。例えば、１つの実施態様では、標的化ドメインは、標的化された細胞、タンパク質、又はタンパク質凝集物に結合する、抗体又は抗体断片を含む。
【００９１】
本発明のペプチドは、化学的方法を使用して作製され得る。例えば、ペプチドは、固相技術（Roberge J Y et al (1995) Science 269: 202-204）によって合成され得、樹脂から切断され得、そして分取高速液体クロマトグラフィーによって精製され得る。自動合成は、例えば、ＡＢＩ４３１Ａペプチド合成装置（パーキンエルマー社）を使用して製造業者によって提供された説明書に従って達成され得る。
【００９２】
ペプチドは、代替的には、組換え手段によって、又はより長いポリペプチドからの切断によって作製され得る。ペプチドの組成は、アミノ酸分析又はシークエンスによって確認され得る。
【００９３】
本発明に記載のペプチドの変異体は、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされたものであってもそうでなくてもよいもの、（ｉｉ）１つ以上の修飾されたアミノ酸残基、例えば置換基の付着によって修飾されている残基が存在しているもの、（ｉｉｉ）ペプチドが本発明のペプチドの選択的スプライシング変異体であるもの、（ｉｖ）ペプチドの断片、及び／又は（ｖ）ペプチドが別のペプチド、例えばリーダー配列若しくは分泌配列、又は精製（例えばＨｉｓ−タグ）若しくは検出（例えばＳｖ５エピトープタグ）のために使用される配列に融合されているものであり得る。断片は、元来の配列のタンパク質分解による切断（複数の部位のタンパク質分解を含む）を介して生成されたペプチドを含む。変異体は翻訳後修飾又は化学的修飾を受け得る。このような変異体は、本明細書の教義から当業者の技能範囲内であると想定される。
【００９４】
本発明のペプチドは、翻訳後修飾され得る。例えば、本発明の範囲内に該当する翻訳後修飾は、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質フォールディング、及びタンパク質分解プロセシングなどを含む。いくつかの修飾又はプロセシング事象は、追加の生物学的マシーナリーの導入を必要とする。例えば、プロセシング事象、例えばシグナルペプチド切断及びコアグリコシル化は、イヌミクロソーム膜又はツメガエル卵抽出物を標準的な翻訳反応に添加することによって調べられる（米国特許第６，１０３，４８９号）。
【００９５】
本発明のペプチドは、翻訳後修飾によって又は翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって形成された非天然アミノ酸を含み得る。タンパク質翻訳中に非天然アミノ酸を導入するために様々なアプローチが利用可能である。例えば、特殊なｔＲＮＡ、例えばサプレッサー特性を有するｔＲＮＡであるサプレッサーｔＲＮＡが、部位特異的非天然アミノ酸置換（ＳＮＡＡＲ）のプロセスに使用されている。ＳＮＡＡＲでは、タンパク質合成中に非天然アミノ酸を特有の部位へと標的化するように作用する、特有のコドンがｍＲＮＡ及びサプレッサーｔＲＮＡ上に必要とされる（国際公開公報第９０／０５７８５号に記載）。しかしながら、サプレッサーｔＲＮＡは、タンパク質翻訳系に存在するアミノアシルｔＲＮＡシンターゼによって認識可能であってはならない。特定の場合では、天然アミノ酸を特異的に修飾しかつアミノアシル化されたｔＲＮＡの機能的活性を有意に変化させない化学反応を使用して、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化した後に、非天然アミノ酸が形成され得る。これらの反応は、アミノアシル化後の修飾と称される。例えば、その同族のｔＲＮＡに連結されたリジンのε−アミノ基（ｔＲＮＡＬＹＳ）は、アミン特異的光親和性標識を用いて修飾され得る。
【００９６】
本発明のペプチドを、他の分子、例えばタンパク質にコンジュゲートさせることにより、融合タンパク質を調製し得る。これは、例えば、Ｎ末端又はＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得るが、ただし、得られた融合タンパク質は、本発明のペプチドの機能を保持しているものとする。
【００９７】
本発明のペプチドの環状誘導体もまた、本発明の一部である。環状化は、他の分子との会合のためにより好ましいコンフォメーションをペプチドが取ることを可能とし得る。環状化は、当技術分野において公知の技術を使用して達成され得る。例えば、ジスルフィド結合が、遊離スルフヒドリル基を有する２つの適切な間隔を置いた成分間で形成され得るか、又は、アミド結合が、一方の成分のアミノ基と他方の成分のカルボキシル基との間で形成され得る。環状化はまた、Ulysse, L., et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8466-8467に記載のように、アゾベンゼン含有アミノ酸を使用して達成され得る。結合を形成する成分は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸成分、又は２つの組合せであり得る。本発明の１つの実施態様では、環状ペプチドは、右の位置にβ−ターンを含み得る。β−ターンは、本発明のペプチド中に、右の位置にアミノ酸Ｐｒｏ−Ｇｌｙを付加することによって導入され得る。
【００９８】
上記のようなペプチド結合を含有している環状ペプチドよりも可動性の環状ペプチドを生成することが望ましくあり得る。より可動性のペプチドは、ペプチドの右及び左の位置にシステインを導入し、そして２つのシステイン間にジスルフィド橋を形成することによって調製され得る。２つのシステインは、β−シート及びターンを変形させないように並べられる。該ペプチドは、ジスルフィド結合の長さ、及びβ−シート部分における水素結合の数がより少ないことの結果としてより可動性である。環状ペプチドの相対的可動性は、分子動態シミュレーションによって決定され得る。
【００９９】
本発明のペプチドは、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸などの無機酸、又はギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸などの有機酸との反応によって薬学的塩へと変換され得る。
【０１００】
本発明のペプチドはまた修飾を有し得る。修飾（通常は一次配列を変化させない）は、ポリペプチドのインビボ又はインビトロでの化学的誘導体化、例えばアセチル化又はカルボキシル化を含む。また、グリコシル化の修飾、例えば、その合成及びプロセシング中の又はさらに他のプロセシング工程におけるポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって；例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物グルコシル化酵素又は脱グルコシル化酵素に該ポリペプチドを曝すことによって作製されたものが含まれる。リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホトレオニンを有する配列も包含される。
【０１０１】
タンパク質分解に対するその抵抗性を向上するために、又は溶解特性を最適化するために、又はそれらを治療剤としてより適切なものとするために、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されているペプチドも含まれる。このような変異体は、天然のＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸又は非天然合成アミノ酸を含有しているものを含む。本発明のペプチドはさらに、それらの治療的適用において有用である非アミノ酸部分にコンジュゲートされていてもよい。特に、該ペプチドの安定性、生物学的半減期、水溶性、及び／又は免疫学的特徴を向上させる部分が有用である。このような部分の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０１０２】
水溶性ポリマーへの生物学的に活性な化合物の共有結合による付着は、これらの化合物の体内分布、薬物動態、及びしばしば毒性を改変及び制御するための１つの方法である（Duncan et al., 1984, Adv. Polym. Sci. 57:53-101）。これらの効果を達成するために多くの水溶性ポリマーが使用され、例えばポリ（シアル酸）、デキストラン、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール−コ−プロピレングリコール）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン（ＰＡｃＭ）、及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である（Powell, 1980, Polyethylene glycol. In R. L. Davidson (Ed.) Handbook of Water Soluble Gums and Resins. McGraw-Hill, New York, chapter 18）。ＰＥＧは理想的な一連の特性を有する：非常に低い毒性（Pang, 1993, J. Am. Coll. Toxicol. 12: 429-456）、水溶液中での優れた溶解度（Powell、上記）、低い免疫原性及び抗原性（Dreborg et al., 1990, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6: 315-365）。タンパク質上に単一又は複数のポリエチレングリコール鎖を含有している、ＰＥＧのコンジュゲートした又は「ＰＥＧ化」タンパク質治療薬が科学文献に記載されている（Clark et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 21969-21977; Hershfield, 1997, Biochemistry and immunology of poly(ethylene glycol)-modified adenosine deaminase (PEG-ADA). In J. M. Harris and S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, D.C., p 145-154; Olson et al., 1997, Preparation and characterization of poly(ethylene glycol)ylated human growth hormone antagonist. In J. M. Harris and S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, D.C., p 170-181）。
【０１０３】
本発明のペプチドは、慣用的な技術によって合成され得る。例えば、本発明のペプチドは、固相ペプチド合成を使用した化学合成によって合成され得る。これらの方法は、固相又は液相合成法のいずれかを使用する（例えば、固相合成技術についてはJ. M. Stewart, and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ndEd., Pierce Chemical Co., Rockford Ill.（1984）及びG. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis Synthesis, Biology editors E. Gross and J. Meienhofer Vol. 2 Academic Press, New York, 1980, pp. 3-254：並びに古典的な液相合成についてはM Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin 1984、及びE. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, suprs, Vol 1を参照）。
【０１０４】
ペプチドは、メリーフィールド型固相ペプチド合成によって化学合成され得る。この方法は、約６０〜７０残基長までのペプチドを生成するために日常的に実施され得、そして場合によっては、約１００アミノ酸長までのペプチドを作製するために利用され得る。より長いペプチドもまた、断片縮合又は自然な化学的ライゲーションを介して合成的に作製され得る（Dawson et al., 2000, Ann. Rev. Biochem. 69:923-960）。合成ペプチド経路を利用する利点は、大量のペプチドを、天然には稀にしか存在しないペプチドでさえ、比較的高い純度で、すなわち、研究、診断又は治療の目的にとって十分な純度で生成できることである。
【０１０５】
固相ペプチド合成は、Stewart et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.；及びBodanszky and Bodanszky in The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New Yorkによって記載されている。初めに、適切に保護されたアミノ酸残基を、そのカルボキシル基を通して、誘導体化された不溶性のポリマー支持体、例えば架橋ポリスチレン又はポリアミド樹脂に付着する。「適切に保護された」は、アミノ酸のα−アミノ基及び任意の側鎖の官能基の両方の上の保護基の存在を指す。側鎖保護基は、一般的に、合成中に使用される溶媒、試薬、及び反応条件に対して安定であり、そして最終ペプチド産物に影響を及ぼさないであろう条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からＮ−保護基を除去し、そしてそこに所望のペプチドの配列内の次のアミノ酸のカルボキシル末端をカップリングすることによって行なわれる。このアミノ酸もまた適切に保護される。入って来るアミノ酸のカルボキシルを活性化させることにより、反応性の基への形成、例えばカルボジイミド、対称的な酸無水物、又は「活性エステル」基、例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はペンタフルオロフェニルエステルへの形成によって、支持体に結合させたアミノ酸のＮ末端と反応させることができる。
【０１０６】
固相ペプチド合成法の例としては、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを利用するＢＯＣ法、及びアミノ酸残基のα−アミノを保護するための９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを利用するＦＭＯＣ法が挙げられ、どちらの方法も、当業者には周知である。
【０１０７】
Ｎ末端及び／又はＣ末端の遮断基の組み込みはまた、固相ペプチド合成法には慣用的なプロトコールを使用して達成され得る。Ｃ末端遮断基の取り込みのために、例えば、所望のペプチドの合成は典型的には、固相として、樹脂からの切断により所望のＣ末端遮断基を有するペプチドが得られるように化学的に修飾されている支持体樹脂を使用して実施される。Ｃ末端が一級アミノ遮断基を有するペプチドを提供するために、例えば、合成は、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を使用して実施され、よって、ペプチド合成が完了すれば、フッ化水素酸による処理により、所望のＣ末端のアミド化されたペプチドが遊離される。同様に、Ｃ末端へのＮ−メチルアミン遮断基の組み込みは、Ｎ−メチルアミノエチルで誘導体化されたＤＶＢ樹脂を使用して達成され、ＨＦによる処理により、Ｎ−メチルアミド化Ｃ末端を有するペプチドが遊離される。エステル化によるＣ末端の遮断もまた、慣用的な手順を使用して達成され得る。これは、樹脂から側鎖ペプチドの遊離を許容する樹脂／遮断基の組合せの使用を必要とし、これにより、所望のアルコールとの続く反応が可能となり、これによりエステル官能基が形成される。ＦＭＯＣ保護基を、メトキシアルコキシベンジルアルコール又は等価なリンカーを用いて誘導体化されたＤＶＢ樹脂と組み合わせて、この目的のために使用し得、支持体からの切断は、ジクロロメタン中のＴＦＡによって行なわれる。次いで、例えばＤＣＣを用いての、適切に活性化されたカルボキシル官能基のエステル化は、所望のアルコールの添加、続いて脱保護及びエステル化ペプチド生成物の単離によって進行し得る。
【０１０８】
本発明のペプチドは、標準的な化学的又は生物学的なペプチド合成手段によって調製され得る。生物学的方法としては、宿主細胞又はインビトロでの翻訳系におけるペプチドをコードしている核酸の発現が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０９】
本発明には、本発明のペプチドをコードする核酸配列が含まれる。１つの実施態様では、本発明は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬのアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。したがって、本発明のペプチドをコードしている核酸配列のサブクローンは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, New York (2012)、及びAusubel et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (New York, NY) (1999及び前の版)（各々のその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載のように、遺伝子断片をサブクローニングするための慣用的な分子遺伝子的操作を使用して生成され得る。その後、サブクローンをインビトロ又はインビボで細菌細胞において発現させることにより、小さなタンパク質又はポリペプチドが得られ、これを特定の活性について試験することができる。
【０１１０】
特定の製剤と組み合わせると、このようなペプチドは効果的な細胞内薬剤であり得る。しかしながら、このようなペプチドの効力を高めるために、本発明の１つ以上のペプチドは、「経細胞輸送」、例えば細胞によるペプチドの取り込みを促進する第二のペプチドとの融合ペプチドとして提供され得る。例えば、１つの実施態様では、ペプチドは、細胞透過性ドメイン、例えば細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含み得、これにより、ペプチドは細胞に侵入することが可能となる。１つの実施態様では、ＣＰＰはＨＩＶ Ｔａｔに由来する。
【０１１１】
説明するために、本発明の１つ以上のペプチドは、経細胞輸送を促進することのできるＨＩＶタンパク質ＴａｔのＮ末端ドメインの全部又は断片、例えばＴａｔの残基１〜７２又はより小さなその断片との融合ポリペプチドの一部として提供され得る。１つの実施態様では、該ペプチドは、ＨＩＶ Ｔａｔのタンパク質形質導入ドメイン（YGRKKRRQRRR；配列番号１６３））を含む。他の実施態様では、１つ以上のペプチドは、アンティナペディアＩＩＩタンパク質の全部又は一部との融合ポリペプチドとして提供され得る。ペプチドの取り込みを媒介する他の細胞透過性ドメインは当技術分野において公知であり、そして本発明の融合ペプチドへの使用のために等しく適用可能である。
【０１１２】
核酸
１つの実施態様では、本発明の組成物は、１つ以上の単離された核酸を含む。例えば、１つの実施態様では、１つ以上の単離された核酸は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質をコードする。例えば、１つの実施態様では、１つ以上の単離された核酸は、ヒトＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１９（本明細書では「ＰＭＬ」とも称される）、ＴＲＩＭ２０、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３４、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４６、ＴＲＩＭ４９、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６７、ＴＲＩＭ６９、ＴＲＩＭ７０、ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７５；並びにマウスＴＲＩＭ３０の１つ以上をコードする。特定の実施態様では、１つ以上の単離された核酸は、１つ以上のＳＴＵｂＬをコードする。例えば、１つの実施態様では、１つ以上の単離された核酸は、ＲＮＦ４及びＲＮＦ１１１（アルカディア）の１つ以上をコードする。
【０１１３】
ＴＲＩＭタンパク質をコードしている例示的なヌクレオチド配列は表１に見られる。
【０１１４】
特定の実施態様では、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬに対応するペプチドは、公知の技術を使用して細胞内でインビボ又はインビトロで１つ以上の核酸から発現される。
【０１１５】
単離された核酸のヌクレオチド配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ配列と、ポリペプチドに翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。他の実施態様によると、ヌクレオチド配列は、本発明のペプチドのアミノ酸配列から推測される。当技術分野においては公知であるように、いくつかの代替的なヌクレオチド配列が、翻訳されたペプチドの生物学的活性を保持しながら、重複コドンに因り可能である。
【０１１６】
さらに、本発明は、本明細書に開示されたコードしているヌクレオチド配列に対してかなりの相同性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸を包含する。好ましくは、単離された核酸のヌクレオチド配列は「かなり相同」であり、すなわち、本発明のペプチドをコードしている単離された核酸のヌクレオチド配列に対して約６０％相同性、より好ましくは約７０％相同性、さらにより好ましくは約８０％相同性、より好ましくは約９０％相同性、さらにより好ましくは約９５％相同性、さらにより好ましくは約９９％相同性である。
【０１１７】
１つの実施態様では、前記組成物は、本明細書に記載の核酸分子の組合せを含む。例えば、特定の実施態様では、該組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質をコードしている単離された核酸分子と、１つ以上のＳＴＵｂＬをコードしている単離された核酸分子とを含む。１つの実施態様では、該組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質と１つ以上のＳＴＵｂＬをコードしている、単離された核酸分子を含む。
【０１１８】
したがって、本発明は、例えば、Sambrook et al.（2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）及びAusubel et al.（1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York）に記載のものなどのような、外来性ＤＮＡを細胞に導入し、同時に細胞内で外来性ＤＮＡを発現するための発現ベクター及び方法を包含する。
【０１１９】
１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬをコードしている所望の核酸を、多くのタイプのベクターにクローニングすることができる。しかしながら、本発明は、いずれかの特定のベクターに限定されると捉えられるべきではない。その代わりに、本発明は、容易に入手可能であり及び／又は当技術分野において周知である多種多様なベクターを包含すると捉えられるべきである。例えば、本発明の所望のポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に関心の高いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシークエンス用ベクターが挙げられる。
【０１２０】
具体的な実施態様では、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター、及び哺乳動物細胞ベクターからなる群より選択される。上記に考察された組成物の少なくとも一部又は全部を含む、数多くの発現ベクター系が存在する。原核細胞及び／又は真核細胞ベクターに基づいた系を、本発明での用途に使用することができ、これによりポリヌクレオチド又はその同族のポリペプチドを生成することができる。多くのこのような系が商業的にいろいろな場所で入手可能である。
【０１２１】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、そして例えばSambrook et al.（2012）及びAusubel et al.（1997）並びに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物内で機能的な複製起点、プロモーター配列、慣用的な制限酵素部位、及び１つ以上の選択マーカーを含有している（例えば、国際公開公報第０１／９６５８４号；国際公開公報第０１／２９０５８号；及び米国特許第６，３２６，１９３号参照）。
【０１２２】
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスに基づいた系が開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための簡便な構築基盤を提供する。選択された遺伝子を、当技術分野において公知である技術を使用して、ベクターに挿入し、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、そしてインビボ又はエクスビボのいずれかで被験者の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系が当技術分野において公知である。いくつかの実施態様では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当技術分野において公知である。１つの実施態様では、レンチウイルスベクターが使用される。
【０１２３】
例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、長期の遺伝子導入を達成するのに適したツールである。なぜなら、それらは、導入遺伝子の長期で安定な組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にするからである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性の細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどの発癌レトロウイルスに由来するベクターを上回る追加の利点を有する。それらはまた、低い免疫原性という追加の利点も有する。好ましい実施態様では、該組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを含む。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、様々な障害の処置のための強力な遺伝子送達ツールとなっている。ＡＡＶベクターは、これらを病原性がないこと、最小限の免疫原性、及び安定かつ効率的に有糸分裂後の細胞に形質導入することができることを含む、遺伝子療法にとって理想的に適したものにする多くの特色を有する。ＡＡＶベクター内に含有される特定の遺伝子の発現を、ＡＡＶ血清型、プロモーター及び送達法の適切な組合せを選択することによって、１つ以上の細胞型に特異的に標的化することができる。
【０１２４】
１つの実施態様では、コード配列は、ＡＡＶベクター内に含有される。３０個を超える天然血清型のＡＡＶが利用可能である。ＡＡＶカプシドの多くの天然変異体が存在し、骨格筋に特に適した特性を有するＡＡＶの同定及び使用が可能である。ＡＡＶウイルスは、慣用的な分子生物学的技術を使用して工学操作され得、この技術より、核酸配列の細胞特異的送達のために、免疫原性を最小限とするために、安定性及び粒子の寿命を調整するために、効率的な分解のために、核への正確な送達などのために、これらの粒子を最適化することが可能となる。
【０１２５】
したがって、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現は、１つ以上のコード配列を含有している組換え工学操作ＡＡＶ又は人工的ＡＡＶを送達することによって達成され得る。ＡＡＶの使用は、ＤＮＡの外来性送達の一般的な形態である。なぜなら、それは比較的無毒性であり、効率的な遺伝子導入を提供し、そして具体的な目的のために容易に最適化され得るからである。例示的なＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２６】
ベクターへの会合に望ましいＡＡＶ断片としては、ｃａｐタンパク質（ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び超可変領域を含む）、ｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含む）、及びこれらのタンパク質をコードしている配列が挙げられる。これらの断片は、様々なベクター系及び宿主細胞に容易に利用され得る。このような断片は、単独で、他のＡＡＶ血清型の配列若しくは断片と組み合わせて、又は他のＡＡＶ若しくは非ＡＡＶウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用され得る。本明細書において使用する人工的なＡＡＶ血清型としては、非天然のキャプシドタンパク質を有するＡＡＶが挙げられるがこれらに限定されない。このような人工キャプシドは、任意の適切な技術によって、異なる選択されたＡＡＶ血清型から、同じＡＡＶ血清型の非連続部分から、ＡＡＶ以外のウイルス源から、又は非ウイルス源から得ることのできる異種配列と組み合わせて、選択されたＡＡＶ配列（例えばｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を使用して生成され得る。人工的なＡＡＶ血清型は、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであり得るがこれらに限定されない。したがって、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現に適した、例示的なＡＡＶ又は人工的なＡＡＶとしてはとりわけ、ＡＡＶ２／８（米国特許第７，２８２，１９９号参照）、ＡＡＶ２／５（米国国立衛生研究所から入手可能）、ＡＡＶ２／９（国際公開公報第２００５／０３３３２１号）、ＡＡＶ２／６（米国特許第６，１５６，３０３号）、及びＡＡＶｒｈ８（国際公開公報第２００３／０４２３９７号）が挙げられる。
【０１２７】
所望のポリヌクレオチドの発現のために、各プロモーター内の少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成のための開始点を位置付けるように機能する。この最も良く知られている例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子用のプロモーター及びＳＶ４０遺伝子用のプロモーターなどのＴＡＴＡボックスを欠失しているいくつかのプロモーターでは、開始点それ自体に横たわる個別のエレメントが、開始場所を固定することを助ける。
【０１２８】
追加のプロモーターエレメント、すなわちエンハンサーは、転写開始頻度を調節する。典型的には、これらは、開始点の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターが近年、同様に開始点の下流に機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメントの間隔は頻繁に可動性であるので、プロモーターの機能は、エレメントが互いに対して反転するか又は移動した場合にも保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメントの間隔は、活性が下降する前に、５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、協同的に又は独立してのいずれかで機能して、転写を活性化することができるようである。
【０１２９】
プロモーターは、コードセグメント及び／又はエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができるような、遺伝子又はポリヌクレオチド配列に天然に会合しているものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と称され得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する、ポリヌクレオチド配列と天然に会合しているものであり得る。あるいは、組換え又は異種プロモーター（これはその天然の環境ではポリヌクレオチド配列と通常は会合していないプロモーターを指す）の制御下にコーディングポリヌクレオチドセグメントを配置することによって一定の利点が得られるであろう。組換え又は異種エンハンサーもまた、その天然環境ではポリヌクレオチド配列と通常は会合していないエンハンサーを指す。このようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、並びに任意の他の原核生物、ウイルス、又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、並びに「天然に存在」していない、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び／又は発現を改変させる突然変異を含有しているプロモーター若しくはエンハンサーを含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書に開示された組成物に関連した（米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号）、ＰＣＲ（商標）をはじめとする、組換えクローニング技術及び／又は核酸増幅技術を使用して生成され得る。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの核以外の細胞小器官内の配列の転写及び／又は発現を指齢する制御配列も同様に使用され得ることが考えられる。
【０１３０】
当然、発現のために選択された細胞型、細胞小器官、及び生物内でのＤＮＡセグメントの発現を効率的に指齢するプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することが重要であろう。分子生物学の技術分野の専門家は、一般的に、タンパク質の発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組合せの使用法を知っている。例えばSambrook et al.（2012）を参照されたい。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模生産において有利であるように、構成性、組織特異性、誘導性、及び／又は適切な条件下において導入されたＤＮＡセグメントの高い発現レベルを指齢するのに有用であり得る。プロモーターは、異種であっても、内因性であってもよい。
【０１３１】
１つの実施態様では、プロモーター又はエンハンサーは、腸上皮内の神経組織内において１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現を特異的に指齢する。例えば、特定の実施態様では、プロモーター又はエンハンサーは、神経細胞、星状細胞腫、オリゴデンドロサイト、プルキンエ細胞、錐体細胞などにおける１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現を特異的に指齢する。
【０１３２】
所望のポリヌクレオチドの発現を評価するために、細胞内に導入しようとする発現ベクターはまた、ウイルスベクターを通してトランスフェクト又は感染させようと探究されている細胞個体群からの発現している細胞の同定及び選択を容易にするための、選択マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又はその両方を含有することができる。他の実施態様では、選択マーカーは、別のＤＮＡ片上に担持され、そして共トランスフェクション手順に使用されてもよい。選択マーカー及びリポーター遺伝子は両方共に、適切な調節配列とフランキングすることにより、宿主細胞内での発現が可能となり得る。有用な選択マーカーは当技術分野において公知であり、そしてこれには例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばｎｅｏなどが挙げられる。
【０１３３】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定し、そして調節配列の機能を評価するために使用される。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードしているレポーター遺伝子は当技術分野において周知である。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物若しくは組織に存在しないか又はそれによって発現されておらず、かつ、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって顕現するタンパク質をコードしている、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時期にアッセイされる。
【０１３４】
適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードしている遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含み得る（例えばUi-Tei et al., 2000 FEBS Lett. 479:79-82参照）。適切な発現系は周知であり、そして周知の技術を使用して調製され得るか、又は商業的に入手することができる。内部欠失構築物は、特有な内部制限酵素部位を使用して、又は特有ではない制限酵素部位の部分的消化によって生成され得る。次いで、構築物を、高いレベルのｓｉＲＮＡポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド発現を示す細胞にトランスフェクトし得る。一般的に、最も高い発現レベルのレポーター遺伝子を示す、最小の５’フランキング領域を有する構築物がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結させ得、そしてこれを使用して、プロモーターにより駆動される転写を調節する能力について薬剤を評価し得る。
【０１３５】
発現ベクターの脈絡において、ベクターは、当技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に導入され得る。
【０１３６】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈降法、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、電気穿孔法などが挙げられる。ベクター及び／又は外来性核酸を含む細胞を生成するための方法は当技術分野において周知である。例えば、Sambrook et al.（2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）及びAusubel et al.（1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York）を参照されたい。
【０１３７】
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡベクター及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物に、例えばヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどから導かれ得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【０１３８】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、及び脂質を基剤とした系、（例えば水中油滴型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む）が挙げられる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとしての使用のために好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。このような系の調製及び使用は、当技術分野において周知である。
【０１３９】
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法に関わらず、宿主細胞内での組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施され得る。このようなアッセイとしては、例えば、当業者には周知である「分子生物学的」アッセイ、例えばサザン及びノザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、並びにＰＣＲ；例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によって又は本明細書に記載のアッセイによって特定のペプチドの有無を検出することにより、本発明の範囲内に該当する薬剤を同定する「生化学的」アッセイが挙げられる。
【０１４０】
任意のＤＮＡベクター又は送達ビヒクルを利用して、所望のポリヌクレオチドをインビトロ又はインビボで細胞に導入することができる。ウイルス以外の送達システムが利用される場合には、好ましい送達ビヒクルはリポソームである。それ故、上記の送達システム及びプロトコールは、Gene Targeting Protocols, 2ed., pp 1-35（2002）及びGene Transfer and Expression Protocols, Vol. 7, Murray ed., pp 81-89（1991）に認められ得る。
【０１４１】
「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集物の生成によって形成された様々な単層及び多重層脂質小胞を包含している一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部の水性媒体とを有する小胞構造を有するとして特徴付けられ得る。多重層リポソームは、水性媒体によって隔てられた多重脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると自然発生的に形成される。脂質成分は自己再編成を受け、その後、閉じた構造が形成され、そして水と溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する。しかしながら、本発明はまた、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中に有する組成物も包含する。例えば、脂質はミセル構造を取り得るか、又は単に脂質分子の不均一な凝集物として存在し得る。また、リポフェクタミン−核酸複合体も考えられる。
【０１４２】
１つの実施態様では、本発明の組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの１つ以上の成分をコードしているインビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡを含む。１つの実施態様では、ＩＶＴ ＲＮＡは、一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入され得る。ＲＮＡは、合成で作製されたプラスミドＤＮＡ鋳型を使用してインビトロでの転写によって生成される。任意の供給源由来の関心対象のＤＮＡを、適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲによって、インビトロでのｍＲＮＡ合成のための鋳型へと直接変換することができる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、又は任意の他の適切なＤＮＡ供給源であり得る。インビトロでの転写のために望ましい鋳型は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬである。
【０１４３】
１つの実施態様では、ＰＣＲのために使用しようとするＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含有している。ＤＮＡは、生物のゲノムに由来する天然のＤＮＡ配列に由来し得る。１つの実施態様では、ＤＮＡは、関心対象の完全長の遺伝子又は遺伝子の一部である。遺伝子は、５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のいくつか又は全部を含み得る。遺伝子は、エキソン及びイントロンを含み得る。１つの実施態様では、ＰＣＲのために使用しようとするＤＮＡは、ヒト遺伝子である。別の実施態様では、ＰＣＲのために使用しようとするＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト遺伝子である。ＤＮＡは、代替的には、天然の生物には通常発現されない人工ＤＮＡ配列であってもよい。例示的な人工ＤＮＡ配列は、一緒に連結された遺伝子の部分を含有し、これにより融合タンパク質をコードしているオープンリーディングフレームを形成しているものである。一緒に連結されているＤＮＡの部分は単一の生物に由来しても、又は１つを超える生物に由来してもよい。
【０１４４】
１つの実施態様では、本発明の組成物は、本明細書に記載の１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又はＲＮＦ４をコードしている修飾された核酸を含む。例えば、１つの実施態様では、該組成物は、ヌクレオチドの修飾されたＲＮＡを含む。１つの実施態様では、該組成物は、ヌクレオシドの修飾されたｍＲＮＡを含む。ヌクレオシドの修飾されたｍＲＮＡは、修飾されていないｍＲＮＡを上回る特定の利点（例えば、向上した安定性、低い免疫原性、及び増強された翻訳を含む）を有する。本発明において有用であるヌクレオシドの修飾されたｍＲＮＡはさらに、米国特許第８，２７８，０３６号に記載され、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４５】
改変された細胞
本発明は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質、１つ以上のＳＴＵｂＬ、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質をコードしている核酸、１つ以上のＳＴＵｂＬをコードしている核酸、又はその組合せを含む細胞を含む組成物を含む。１つの実施態様では、細胞は、本発明のタンパク質及び／又は核酸を発現するように遺伝子的に改変されている。特定の実施態様では、遺伝子的に改変された細胞は、本発明の組成物を用いて処置される被験者に対して自己である。あるいは、該細胞は、被験者に対して同種、同系、又は異種であってもよい。特定の実施態様では、該細胞は、発現されたタンパク質を細胞外空間に分泌又は遊離することにより、該ペプチドを１つ以上の他の細胞に送達することができる。
【０１４６】
遺伝子的に改変された細胞は、インビボ又はエクスビボにおいて当技術分野における標準的な技術を使用して改変され得る。細胞の遺伝子改変は、発現ベクターを使用して又は単離された裸核酸構築物を使用して実施され得る。
【０１４７】
１つの実施態様では、前記細胞は、本明細書に記載の１つ以上のタンパク質をコードしている単離された核酸を使用してエクスビボで得られそして改変される。１つの実施態様では、該細胞は、被験者から得られ、タンパク質及び／又は核酸を発現するように遺伝子的に改変され、そして被験者に再投与される。特定の実施態様では、該細胞は、エクスビボ又はインビトロで増幅されて細胞個体群を生成し、ここで該個体群の少なくとも一部が必要とされる被験者に投与される。
【０１４８】
１つの実施態様では、前記細胞は、タンパク質を安定に発現するように遺伝子的に改変されている。別の実施態様では、該細胞は、タンパク質を一過性に発現するように遺伝子的に改変されている。
【０１４９】
基質
本発明は、本発明のタンパク質、本発明の単離された核酸、本発明のタンパク質を発現している細胞、又はその組合せを含む、足場組成物又は基質組成物を提供する。例えば、１つの実施態様では、本発明のタンパク質、本発明の単離された核酸、本発明のタンパク質を発現している細胞、又はその組合せは足場内に組み込まれる。別の実施態様では、本発明のタンパク質、本発明の単離された核酸、本発明のタンパク質を発現している細胞、又はその組合せは、足場の表面に適用される。本発明の足場は、当技術分野において公知である任意のタイプであり得る。このような足場の非限定的な例としては、ヒドロゲル、エレクトロスパン足場、泡、網、シート、パッチ、及びスポンジが挙げられる。
【０１５０】
治療法
本発明はまた、タンパク質ミスフォールド、タンパク質凝集物、又はその組合せに関連した疾患又は障害のための治療法を提供する。
【０１５１】
様々な実施態様では、本発明の方法によって処置可能な疾患及び障害としては、ポリＱ障害、例えばＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、伝染性海綿状脳症（プリオン病）、タウオパチー、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、ＡＬアミロイド症、ＡＡアミロイド症、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイド症、家族性アミロイド性多発神経炎、血液透析に関連したアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＩアミロイド症、アポリポタンパク質ＡＩＶアミロイド症、フィンランド型遺伝性アミロイド症、リゾチームアミロイド症、フィブリノーゲンアミロイド症、アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症、ＩＩ型糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイド症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位に限局したアミロイド症、大動脈中膜アミロイド症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、睫毛乱生に関連した角膜アミロイド症、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、及び皮膚苔癬アミロイド症が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、該方法は、膀胱癌、星状細胞腫、咽頭癌、リンパ腫、及び腺癌を含むがこれらに限定されない、ｐ５３突然変異体の凝集物に関連した癌の治療又は予防を含む。
【０１５２】
本明細書に詳述された方法を含む本開示を備えれば、本発明は、すでに確立されているタンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患の処置に限定されないことが当業者によって理解されるだろう。特に、疾患又は障害は、被験者にとって有害となるまで顕現されている必要はなく；実際に、疾患又は障害は、処置が投与される前に被験者において検出される必要はない。すなわち、疾患又は障害の有意な兆候又は症状が、本発明が恩恵を与え得る前に起こる必要がない。それ故、本発明は、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を予防するための方法を含み、本明細書の何処かで以前に考察されているようなモジュレーター組成物は、疾患又は障害の発症する前に被験者に投与され得、これにより疾患又は障害を予防することができる。
【０１５３】
当業者は、本明細書の開示を備えれば、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患の予防が、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患の発症又は進行に対する予防的措置としてモジュレーター組成物を被験者に投与する工程を包含することを理解するだろう。本明細書の何処かでより完全に考察されているように、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を調節する方法は、ポリペプチド遺伝子産物のレベル及び活性を調節するだけでなく、転写、翻訳のいずれか又はその両方を含む核酸の発現も調節するための多種多様な技術を包含する。
【０１５４】
さらに、本明細書で何処かに開示されているように、当業者は、一旦本明細書に提供された技術を備えれば、本発明は、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した様々な疾患の治療法又は予防法を包含し、ここで遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を調節することにより疾患が治療又は予防されることを理解するだろう。疾患がタンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連しているかどうかを評価するための様々な方法が当技術分野において公知である。さらに、本発明は、将来発見されるこのような疾患の治療又は予防を包含する。
【０１５５】
１つの態様では、該方法は、ミスフォールドタンパク質を安定化させるための１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の使用を含む。特定の態様では、本明細書に記載の１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を介した機能的ミスフォールドタンパク質の安定化により、ミスフォールドタンパク質に関連した疾患又は障害を治療又は予防することができる。例えば、１つの実施態様では、本明細書に記載の１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を介した、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）突然変異体の安定化により、突然変異ＣＦＴＲは、分解される代わりに機能することが可能となるだろう。ミスフォールドタンパク質を安定化させるためのＴＲＩＭタンパク質の使用は、部分的に機能的なタンパク質の分解に関連した嚢胞性線維症及び他の疾患を処置するために使用され得ることが想定される。本明細書に記載の１つ以上のＴＲＩＭタンパク質を介した、タンパク質の安定化を使用して、嚢胞性線維症及びリソソーム蓄積病、例えばゴーシェ病及びファブリー病を含むがこれらに限定されない、機能的な突然変異タンパク質の分解に関連したあらゆる疾患又は障害を処置することができる。
【０１５６】
本発明は、遺伝子又は遺伝子産物のモジュレーターの投与を包含する。本発明の方法を実施するために、当業者は、本明細書に提供された開示に基づいて、適切なモジュレーター組成物を製剤化しそして被験者に投与する方法を理解するだろう。本発明は、いずれかの特定の投与法又は処置計画に限定されない。
【０１５７】
１つの実施態様では、前記方法は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させる組成物の有効量を必要とする被験者に投与する工程を含む。
【０１５８】
例えば、１つの実施態様では、前記方法は、ヒトＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１９（本明細書では「ＰＭＬ」とも称される）、ＴＲＩＭ２０、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３４、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４６、ＴＲＩＭ４９、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６７、ＴＲＩＭ６９、ＴＲＩＭ７０、ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７５；並びにマウスＴＲＩＭ３０の１つ以上の発現又は活性を増加させる組成物の有効量を必要とする被験者に投与する工程を含む。
【０１５９】
１つの実施態様では、前記方法は、ＲＮＦ４及びＲＮＦ１１１（アルカディア）の１つ以上の発現又は活性を増加させる組成物の有効量を必要とする被験者に投与する工程を含む。
【０１６０】
１つの実施態様では、前記方法は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質及び１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させる組成物の有効量を被験者に投与する工程を含む。
【０１６１】
１つの実施態様では、前記方法は、被験者の少なくとも１つの神経細胞において、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させる工程を含む。例えば、特定の実施態様では、該方法は、少なくとも１つの神経細胞、星状細胞腫、オリゴデンドロサイト、プルキンエ細胞、錐体細胞などにおいて、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させる工程を含む。
【０１６２】
１つの実施態様では、前記方法は、被験者の神経組織を、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの１つ以上の成分の発現又は活性を増加させる組成物の有効量と接触させる工程を含む。例えば、特定の実施態様では、該方法は、被験者の神経細胞、星状細胞腫、オリゴデンドロサイト、プルキンエ細胞、錐体細胞などを、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させる組成物の有効量と接触させる工程を含む。
【０１６３】
当業者は、本発明のモジュレーターは単独で又は任意の組み合わせで投与され得ることを理解しているだろう。さらに、本発明のモジュレーターは、時間的な意味で、単独で又は任意の組合せで投与され得、それらは同時に、又は互いに前に及び／又は後に投与され得る。当業者は、本明細書に提供された開示に基づいて、本発明のモジュレーター組成物を使用して、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を予防又は治療することができ、そしてモジュレーター組成物を単独で又は別のモジュレーターと任意に組み合わせて使用することにより、予防結果又は治療結果をもたらすことができることを理解しているだろう。
【０１６４】
様々な実施態様では、本明細書に記載の本発明のいずれかのモジュレーターを、単独で、又はタンパク質ミスフォールド若しくはタンパク質凝集物に関連した疾患に関連した他の分子の他のモジュレーターと組み合わせて投与することができる。様々な実施態様では、本明細書に記載の本発明のいずれかのモジュレーターを、単独で、又はタンパク質ミスフォールド若しくはタンパク質凝集物に関連した疾患を治療若しくは予防するために使用され得る他の治療剤若しくは予防剤と組み合わせて投与することができる。本発明のモジュレーターと組み合わせて使用され得る例示的な治療剤としては、抗アミロイドβ抗体及び抗タウ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６５】
遺伝子療法
被験者の細胞を、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を増加させるタンパク質をコードする核酸組成物と接触させることにより、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害の１つ以上の症状の発症を抑制又は遅延させることができる。
【０１６６】
１つの実施態様では、本発明の核酸組成物は、１つ以上のペプチドをコードする。例えば、１つの実施態様では、核酸組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドをコードし得る。例えば、１つの実施態様では、核酸組成物は、ヒトＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１９（本明細書では「ＰＭＬ」とも称される）、ＴＲＩＭ２０、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３４、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４６、ＴＲＩＭ４９、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６７、ＴＲＩＭ６９、ＴＲＩＭ７０、ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７５；並びにマウスＴＲＩＭ３０の１つ以上を含む、ペプチドをコードする。特定の実施態様では、核酸組成物は、１つ以上のＳＴＵｂＬのアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。例えば、１つの実施態様では、核酸組成物は、ＲＮＦ４及びＲＮＦ１１１（アルカディア）の１つ以上を含むペプチドをコードする。
【０１６７】
本発明はまた、本明細書に開示されたペプチドに対してかなりの相同性を有するペプチドをコードしている任意の形態の核酸を含むと捉えるべきである。好ましくは、「かなり相同」であるペプチドは、本明細書に開示されたペプチドのアミノ酸配列に対して、約５０％相同性、より好ましくは約７０％相同性、さらにより好ましくは約８０％相同性、より好ましくは約９０％相同性、さらにより好ましくは約９５％相同性、さらにより好ましくは約９９％相同性である。
【０１６８】
１つの実施態様では、本発明の組成物は、ペプチド、ペプチド断片、相同体、変異体、本明細書に記載のペプチドの誘導体又は塩をコードしている核酸を含む。例えば、特定の実施態様では、該組成物は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の断片、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の相同体、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の変異体、又は１つ以上のＴＲＩＭタンパク質の誘導体を含む、ペプチドをコードしている核酸を含む。特定の実施態様では、該組成物は、１つ以上のＳＴＵｂＬ、１つ以上のＳＴＵｂＬの断片、１つ以上のＳＴＵｂＬの相同体、１つ以上のＳＴＵｂＬの変異体、又は１つ以上のＳＴＵｂＬの誘導体を含む、ペプチドをコードしている核酸を含む。
【０１６９】
本発明によると、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの減少した活性又は不十分な活性を伴う正常な遺伝子又は突然変異遺伝子を有する細胞に、タンパク質を供給する方法も提供される。突然変異遺伝子を有する細胞にタンパク質を供給することにより、レシピエント細胞の正常な機能が可能となるはずである。ペプチドをコードしている核酸をベクターで細胞内に導入し得、これにより、核酸は染色体外に留まる。このような状況では、核酸は、染色体外の位置から細胞によって発現されるだろう。より好ましいのは、核酸又はその一部が、細胞のゲノムに組み込まれるか又は細胞内に存在する内因性突然変異遺伝子と組み換えるように細胞内に導入される状況である。組換え、組み込み、及び染色体外での維持の両方のために遺伝子を導入するためのベクターは当技術分野において公知であり、そして任意の適切なベクターが使用され得る。電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈降法、及びウイルス形質導入法などのＤＮＡを細胞に導入するための方法は当技術分野において公知であり、そして方法の選択は実践者の技量内である。
【０１７０】
一般的に上記に考察されているように、核酸（適用可能な場合）を遺伝子療法に使用して、これにより野生型遺伝子が「正常な」レベルで発現されているが遺伝子産物が不十分にしか機能していない人においてさえ本発明のペプチドのレベル又は活性を増加させることができる。
【０１７１】
「遺伝子療法」は、持続的な効果が１回の処置によって達成される慣用的な遺伝子療法と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの単回投与又は反復投与を含む遺伝子療法剤の投与の両方を含む。オリゴヌクレオチドを、例えばその負に荷電したホスホジエステル基を非荷電の基によって置換することによって修飾することにより、その取り込みを増強させ得る。本発明の１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬを、遺伝子療法を使用して、例えば神経細胞若しくは神経組織に局所的に、又は全身的に（例えば、特定の組織型に選択的に標的化するベクター、例えば組織特異的アデノ随伴ウイルスベクターを介して）送達することができる。いくつかの実施態様では、個体から収集された一次細胞を、本発明のいずれかのペプチドをコードしている核酸を用いてエクスビボでトランスフェクトし、その後、トランスフェクトされた細胞を個体の体内に戻すことができる。
【０１７２】
遺伝子療法は当技術分野において周知である。例えば、細胞内抗体を生成するための遺伝子療法の使用を開示した国際公開公報第９６／０７３２１号を参照されたい。遺伝子療法はまた、ヒト患者において成功したことが実証されている。例えば、Baumgartner et al., Circulation 97: 12, 1114-1123 (1998),  Fatham, C.G. ‘A gene therapy approach to treatment of autoimmune diseases’, Immun. Res. 18:15-26 (2007)；及び米国特許第７，３７８０８９号（両方共に参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。また、Bainbridge JWB et al. “Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital Amaurosis”. N Engl J Med 358:2231-2239, 2008；及びMaguire AM et al. “Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s Congenital Amaurosis”. N Engl J Med 358:2240-8, 2008も参照されたい。
【０１７３】
ペプチド又はタンパク質をコードしている核酸（場合によりベクターに含有されている）を患者の細胞にインビボ及びエクスビボで導入するための２つの主要なアプローチがある。インビボでの送達のために、特定の場合には、核酸を患者に、時にはタンパク質が最も必要とされる部位に直接注入する。エクスビボでの処置では、患者の細胞を取り出し、核酸を、これらの単離された細胞に導入し、そして改変された細胞を患者に直接投与するか、又は例えば多孔性の膜内に封入して、これを患者に埋め込む（例えば米国特許第４，８９２，５３８号及び第５，２８３，１８７号を参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術がある。技術は、核酸が、インビトロで培養された細胞に導入されるか、又はインビボで目的の宿主の細胞に導入されるかに応じて変更される。インビトロで哺乳動物細胞に核酸を導入するのに適した技術としては、リポソーム、電気穿孔法、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用が挙げられる。遺伝子のエクスビボでの送達のために一般的に使用されるベクターは、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターである。
【０１７４】
遺伝子療法は、例えばFriedman et al., 1991, Cell 66:799-806又はCulver, 1996, Bone Marrow Transplant 3:S6-9; Culver, 1996, Mol. Med. Today 2:234-236に記載のような一般的に受け入れられている方法に従って実施されるだろう。１つの実施態様では、患者の細胞をまず、当技術分野において公知である診断法によって分析し、これにより、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性を確認する。発現制御エレメントに連結された遺伝子又はその機能的等価体のコピーを含有し、かつ細胞内で複製することのできる、ウイルスベクター又はプラスミドベクターを調製する。ベクターは、細胞内で複製することができる。あるいは、ベクターは複製欠損でもよく、そして遺伝子療法に使用するためにヘルパー細胞において複製される。米国特許第５，２５２，４７９号及び国際公開公報第９３／０７２８２号及び米国特許第５，６９１，１９８号；第５，７４７，４６９号；第５，４３６，１４６号及び第５，７５３，５００号に開示されているように、適切なベクターは公知である。次いで、ベクターを患者に注入する。トランスフェクトされた遺伝子が各々の標的化された細胞のゲノムに永久的に取り込まれない場合、処置を定期的に反復しなければならない可能性がある。
【０１７５】
当技術分野において公知である遺伝子導入システムは、本発明の遺伝子療法の実践において有用であり得る。これらは、ウイルス性導入法及び非ウイルス性導入法を含む。多くのウイルスが、遺伝子導入ベクターとして、又は遺伝子導入ベクターを修復するための基盤として使用され、これには、パポバウイルス（例えばＳＶ４０、Madzak et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:1533-1536）、アデノウイルス（Berkner, 1992;Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:39-66）、ワクシニアウイルス（Moss, 1992, Current Opin. Biotechnol. 3:518-522; Moss, 1996, PNAS 93:11341-11348）、アデノ随伴ウイルス（Russell and Hirata, 1998, Mol. Genetics 18:325-330）、ＨＳＶ及びＥＢＶをはじめとするヘルペスウイルス（Fink et al., 1996, Ann. Rev. Neurosci. 19:265-287）、レンチウイルス（Naldini et al., 1996, PNAS 93:11382-11388）、シンドビス及びセムリキ森林ウイルス（Berglund et al., 1993, Biotechnol. 11:916-920）、及びトリ起源のレトロウイルス（Petropoulos et al., 1992, J. Virol. 66:3391-3397）、マウス起源のレトロウイルス（Miller, 1992, Hum. Gene Ther. 3:619-624）及びヒト起源のレトロウイルス（Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher and Panganiban, 1992, J. Virol. 66:2731-2739）が含まれる。大半のヒト遺伝子療法プロトコールは、無効にしたマウスレトロウイルスに基づくが、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスも使用されている。
【０１７６】
当技術分野において公知である非ウイルス性遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム共沈降法などの化学的技術；力学的技術、例えばマイクロインジェクション；リポソームを介した膜融合により媒介される導入；並びに直接的なＤＮＡの取り込み及び受容体媒介ＤＮＡ導入（Curiel et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol 6:247-252）が挙げられる。ウイルスにより媒介される遺伝子導入を、リポソームでの送達を使用した直接的なインビトロでの遺伝子導入と組み合わせることにより、ウイルスベクターを腫瘍細胞に指向させ、かつ周辺の分裂していない細胞には指向させないことが可能となる。次いで、産生株の細胞の注入は、連続的なベクター粒子の供給源を提供するだろう。この技術は、手術不可能な脳腫瘍を有するヒトへの使用に認可されている。
【０１７７】
生物学的な遺伝子導入法と物理的な遺伝子導入法を組み合わせたアプローチでは、任意のサイズのプラスミドＤＮＡを、アデノウイルスヘキソンタンパク質に対して特異的であるポリリジンにコンジュゲートさせた抗体と組み合わせ、そして得られた複合体をアデノウイルスベクターに結合させる。次いで、三分子複合体を使用して細胞に感染させる。アデノウイルスベクターは、結合したＤＮＡが損傷される前にエンドソームの効率的な結合、内部移行、及び分解を可能とする。アデノウイルスに基づいたベクターの送達のための他の技術については、米国特許第５，６９１，１９８号；第５，７４７，４６９号；第５，４３６，１４６号及び第５，７５３，５００号を参照されたい。
【０１７８】
リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接的なインビボでの遺伝子導入を媒介することができることが示された。標準的なリポソーム調製物では、遺伝子導入プロセスは非特異的であるが、腫瘍病巣に局在化したインビボでの取り込み及び発現が、例えば直接的なインサイツでの投与後に報告されている。
【０１７９】
遺伝子療法の脈絡での発現ベクターは、その中にクローニングされたポリヌクレオチドを発現するのに十分な配列を含有している構築物を含むことを意味する。ウイルス発現ベクターでは、構築物は、構築物のパッケージングを支持するのに十分なウイルス配列を含有している。ポリヌクレオチドがタンパク質をコードしている場合、発現によりタンパク質が産生されるだろう。ポリヌクレオチドがアンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムをコードしている場合、発現によりアンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムが産生されるだろう。したがってこの脈絡では、発現は、タンパク質産物が合成されることを必要としていない。発現ベクターにクローニングされたポリヌクレオチドに加えて、ベクターはまた、真核細胞において機能するプロモーターも含有している。クローニングされたポリヌクレオチド配列は、このプロモーターの制御下にある。適切な真核生物プロモーターとしては、上記されたものが挙げられる。発現ベクターはまた、選択マーカー及び本明細書に記載の他の配列などの配列も含み得る。
【０１８０】
特定の実施態様では、前記方法は、単離された核酸を神経組織に直接標的化する遺伝子導入技術の使用を含む。受容体媒介遺伝子導入は、例えば、核酸分子（通常、共有結合で閉環されたスーパーコイルドプラスミドの形態）をタンパク質リガンドにポリリジンを介してコンジュゲートさせることによって達成される。リガンドは、標的細胞／組織型の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択される。これらのリガンド−ＤＮＡコンジュゲートは所望であれば血中に直接注入され得、そして標的組織に向かい、ここでＤＮＡ−タンパク質複合体と受容体との結合及びＤＮＡ−タンパク質複合体の内部移行が起こる。ＤＮＡの細胞内破壊の問題を克服するために、アデノウイルスとの共感染を含めることにより、エンドソーム機能を破壊することができる。
【０１８１】
医薬組成物及び製剤
本発明はまた、本発明の方法を実施するために本発明の医薬組成物又はその塩の使用を包含する。このような医薬組成物は、被験者への投与に適した形態の本発明の少なくとも１つのモジュレーター組成物又はその塩からなり得るか、あるいは、医薬組成物は、本発明の少なくとも１つのモジュレーター組成物又はその塩、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、１つ以上の追加の成分、又はこれらのいくつかの組合せを含み得る。本発明の化合物又はコンジュゲートは、当技術分野において周知であるように、医薬組成物中に生理学的に許容される塩の形態で、例えば生理的に許容される陽イオン又は陰イオンと組み合わせて存在し得る。
【０１８２】
１つの実施態様では、本発明の方法を実施するのに有用な医薬組成物は、１ng/kg/日から１００mg/kg/日の用量を送達するように投与され得る。別の実施態様では、本発明を実施するのに有用な医薬組成物は、１ng/kg/日から５００mg/kg/日の用量を送達するように投与され得る。
【０１８３】
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の追加の成分の相対量は、処置される被験者のアイデンティティー、サイズ、及び容態に応じて、並びにさらには組成物を投与しようとする経路に応じて変更されるだろう。例えば、該組成物は、０．１％〜１００％（ｗ/ｗ）の活性成分を含み得る。
【０１８４】
本発明の方法において有用である医薬組成物は、経口、直腸、膣内、非経口、局所、肺内、鼻腔内、頬側、眼内、又は別の投与経路用に適切に開発され得る。本発明の方法の範囲で有用な組成物は、哺乳動物の皮膚、膣、又は任意の他の組織に直接投与され得る。他の考えられる製剤としては、リポソーム調製物、活性成分を含有している再封入された赤血球、及び免疫製剤が挙げられる。投与経路（群）は当業者には容易に理解され、そして処置される疾患の種類及び重度、処置される動物被験体又はヒト被験者のタイプ及び年齢などをはじめとする多数の数の因子に依存するだろう。
【０１８５】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であるか又は以後開発される任意の方法によって調製され得る。一般的に、このような調製法は、活性成分を担体又は１つ以上の他の補助的成分と配合し、その後、必要であれば又は所望であれば、産物を所望の単回用量単位又は複数回用量単位へと成形又は梱包する工程を含む。
【０１８６】
本明細書において使用する「単位用量」は、予め決定された量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は一般的に、被験者に投与されるであろう活性成分の用量に等しいか、又は、このような用量の好都合な分数、例えばこのような用量の半分又は三分の一に等しい。単位投与剤形は、１日１回用量又は１日複数回用量の１つ（例えば１日あたり約１〜４回以上）であり得る。１日複数回用量が使用される場合、単位投与剤形は各用量について同じであっても異なっていてもよい。
【０１８７】
本明細書に提供された医薬組成物の記載は原則的に、ヒトへの倫理的な投与に適した医薬組成物に向けられているが、このような組成物は一般的に全ての種類の動物への投与に適していることが当業者によって理解されるだろう。様々な動物への投与に適した組成物とするための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変は、よく理解されており、そして通常の技能を有する獣医学薬理学者は、（あるとしても）単に通常の実験を用いてこのような改変を設計及び実施し得る。本発明の医薬組成物の投与が考えられる被験者は、ヒト及び他の霊長類、哺乳動物（市販の妥当な哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌを含む）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８８】
１つの実施態様では、本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は担体を使用して製剤化される。１つの実施態様では、本発明の医薬組成物は、治療有効量の本発明の化合物又はコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む。有用である薬学的に許容される担体としては、グリセロール、水、食塩水、エタノール、及び他の薬学的に許容される塩溶液、例えばリン酸塩及び有機酸の塩が挙げられるがこれらに限定されない。これら及び他の薬学的に許容される担体の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（1991, Mack Publication Co.、ニュージャージー州）に記載されている。
【０１８９】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有している、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、又はポリアルコール、例えばマンニトール及びソルビトールを組成物中に含めることが好ましいだろう。注射用組成物の延長吸収は、該組成物中に、吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを含めることによってもたらされ得る。１つの実施態様では、薬学的に許容される担体はＤＭＳＯのみではない。
【０１９０】
製剤は、経口、膣内、非経口、鼻腔内、静脈内、皮下、経腸、又は当技術分野において公知である任意の他の適切な投与形態に適した、慣用的な賦形剤、すなわち、薬学的に許容される有機又は無機担体物質と混合して使用され得る。医薬調製物は滅菌され得、そして所望であれば補助物質、例えば潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤及び／又は芳香物質などと混合し得る。それらはまた、所望であれば、他の活性物質、例えば他の鎮痛剤と配合してもよい。
【０１９１】
本明細書において使用する「追加の成分」は、以下の１つ以上を含むがこれらに限定されない：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性な希釈剤；造粒剤及び崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；香味剤；着色剤；保存剤；生理学的に分解可能な組成物、例えばゼラチン；水性ビヒクル及び溶媒；油性ビヒクル及び溶媒；懸濁化剤；分散剤又は湿潤剤；乳化剤；粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；並びに薬学的に許容されるポリマー性材料又は疎水性材料。本発明の医薬組成物中に含まれ得る他の「追加の成分」は当技術分野において公知であり、そして例えばGenaro, ed.（1985, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA）（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１９２】
本発明の組成物は、前記組成物の全重量に対して約０．００５％〜２．０％の保存剤を含み得る。保存剤は、環境中の汚染物質に曝露された場合に腐敗を防ぐために使用される。本発明に従って有用な保存剤の例としては、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素及びその組合せからなる群より選択されるものが挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましい保存剤は、約０．５％から２．０％のベンジルアルコール及び０．０５％から０．５％のソルビン酸の組合せである。
【０１９３】
前記組成物は好ましくは、化合物の分解を抑制する抗酸化剤及びキレート剤を含む。いくつかの化合物のために好ましい抗酸化剤は、該組成物の全重量に対して約０．０１重量％から０．３重量％の好ましい範囲内のＢＨＴ、ＢＨＡ、α−トコフェロール、及びアスコルビン酸、より好ましくは０．０３重量％から０．１重量％の範囲内のＢＨＴである。好ましくは、キレート剤は、該組成物の全重量に対して０．０１重量％から０．５重量％の量で存在する。
【０１９４】
特に好ましいキレート剤としては、前記組成物の全重量に対して約０．０１重量％から０．２０重量％の重量範囲内の、より好ましくは０．０２重量％から０．０１重量％の範囲内のエデト酸塩（例えばエデト酸二ナトリウム）及びクエン酸が挙げられる。キレート剤は、製剤の有効期間にとって有害であり得る組成物中の金属イオンをキレートするのに有用である。ＢＨＴ及びエデト酸二ナトリウムは、いくつかの化合物にとってそれぞれ特に好ましい抗酸化剤及びキレート剤であるが、他の適切かつ等価な抗酸化剤及びキレート剤も、それ故、当業者に公知であろうように代用され得る。
【０１９５】
液体懸濁液は、水性又は油性ビヒクル中に活性成分の懸濁を達成するための慣用的な方法を使用して調製され得る。水性ビヒクルとしては、例えば、水及び等張食塩水が挙げられる。油性ビヒクルとしては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油、又はココナッツ油、分別植物油、及び鉱油、例えば流動パラフィンが挙げられる。液体懸濁液はさらに、懸濁化剤、分散剤、又は湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、香味剤、着色剤、及び甘味剤を含むがこれらに限定されない、１つ以上の追加の成分を含み得る。油性懸濁液はさらに増粘剤を含み得る。公知の懸濁化剤としては、ソルビトールシロップ、硬化食用脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム、及びセルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられるがこれらに限定されない。公知の分散剤又は湿潤剤としては、レシチンなどの天然のホスファチド、アルキレンオキシドと脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸とヘキシトールから誘導された部分エステルとの、又は脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えばそれぞれポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられるがこれらに限定されない。公知の乳化剤としては、レシチン及びアカシアが挙げられるがこれらに限定されない。公知の保存剤としては、メチル、エチル、又はｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾアート、アスコルビン酸、及びソルビン酸が挙げられるがこれらに限定されない。公知の甘味剤としては、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、及びサッカリンが挙げられる。油性懸濁液のための公知の増粘剤としては、例えば、蜜ろう、固形パラフィン、及びセチルアルコールが挙げられる。
【０１９６】
水性又は油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じような方法で調製され得、主な差は、活性成分を溶媒中に懸濁するのではなく溶解することである。本明細書において使用する「油性」液体は、炭素を含有している液体分子を含み、かつ水よりも極性が低いという特徴を示すものである。本発明の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載された各成分を含み得、懸濁化剤は、溶媒中の活性成分の溶解を必ずしも助けないであろうことが理解される。水性溶媒としては、例えば、水及び等張食塩水が挙げられる。油性溶媒としては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、又はココナッツ油、分別植物油、及び鉱油、例えば流動パラフィンが挙げられる。
【０１９７】
本発明の医薬調製物の粉末製剤及び顆粒製剤は、公知の方法を使用して調製され得る。例えば錠剤を形成するために、カプセル剤を充填するために、又は水性若しくは油性ビヒクルをそこに添加することによって水性若しくは油性懸濁液若しくは溶液を調製するために使用された、このような製剤は被験者に直接投与され得る。これらの各製剤はさらに、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤、及び保存剤の１つ以上を含み得る。追加の賦形剤、例えば充填剤及び甘味剤、香味剤、又は着色剤も、これらの製剤に含め得る。
【０１９８】
本発明の医薬組成物はまた、水中油滴型エマルション又は油中水滴型エマルションの剤形で調製、梱包、又は販売され得る。油相は、オリーブ油若しくは落花生油などの植物油、流動パラフィンなどの鉱油、又はこれらの組合せであり得る。このような組成物はさらに、１つ以上の乳化剤、例えばアカシアゴム又はトラガカントゴムなどの天然ゴム、大豆又はレシチンホスファチドなどの天然ホスファチド、脂肪酸とヘキシトール無水物の組合せから誘導されたエステル又は部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン、及びこのような部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを含み得る。これらのエマルションはまた、例えば甘味剤又は香味剤をはじめとする追加の成分を含有し得る。
【０１９９】
材料を化学的組成物を用いて浸漬又はコーティングするための方法は当技術分野において公知であり、そしてこれには、化学的組成物を表面上に沈着又は結合させる方法、化学的組成物を材料（すなわち、例えば生分解性材料を用いて）の合成中に材料の構造中に組み込む方法、及び水性若しくは油性の溶液又は懸濁液を吸着材料に吸着させる方法（その後の乾燥を伴う又は伴わない）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２００】
投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。治療用製剤は、疾患の診断前又は診断後のいずれかに被験者に投与され得る。さらに、数回の分割用量並びに互い違いの用量は１日１回若しくは順次投与され得るか、又は用量は持続的に点滴され得るか、又はボーラス注射であり得る。さらに、治療用製剤の用量は、治療状況又は予防状況の緊急性に応じて比例的に増加又は減少させ得る。
【０２０１】
本発明の組成物の被験者への、好ましくは哺乳動物への、より好ましくはヒトへの投与は、公知の手順を使用して、疾患を予防又は治療するのに効果的な用量及び期間をかけて行なわれ得る。治療効果を達成するのに必要とされる治療用化合物の有効量は、使用される具体的な化合物の活性；投与時刻；該化合物の排泄速度；処置期間；該化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、又は材料；処置される被験者の疾患又は障害の状態、年齢、性別、体重、容態、全般的な健康状態、及び以前の病歴、並びに医学分野において周知な同様の因子などの因子に応じて変更され得る。用量計画は、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、数回の分割用量を１日１回投与しても、又は用量を、治療状況の緊急性に応じて比例的に減少させてもよい。本発明の治療用化合物についての有効用量範囲の非限定的な例は、約１〜５，０００mg/kg（体重）/日である。当業者は関連する因子を研究することができ、そして過度な実験を行なうことなく治療用化合物の有効量に関して決定することができるだろう。
【０２０２】
前記化合物は、１日数回など頻繁に被験者に投与されても、あるいは、例えば１日１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１か月に１回、又はさらにより少ない頻度で、例えば数か月毎に１回、又はさらには１年に１回、又はそれより少ない頻度などの、より少ない頻度で投与されてもよい。１日あたりに投薬される化合物の量は、非限定的な例では、毎日、隔日に、２日間毎に、３日間毎に、４日間毎に、又は５日間毎に投与され得ることが理解される。例えば、隔日の投与では、５mg/日の用量を月曜日に開始し、最初の次の５mg/日の用量は水曜日に投与され、２回目の次の５mg/日の用量は金曜日に投与され得るなどである。投与頻度は当業者には容易に明らかであり、そして処置される疾患の種類及び重度、動物の種類及び年齢などであるがこれらに限定されない多数の因子に依存するだろう。
【０２０３】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、被験者に毒性を生じることなく、特定の被験者、組成物、及び投与形態において所望の治療応答を達成するのに効果的である活性成分の量が得られるように変更され得る。
【０２０４】
当技術分野における通常の技能を有する医者、例えば内科医又は獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定かつ処方し得る。例えば、内科医又は獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで医薬組成物中に使用される本発明の化合物の用量を開始し、そして所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加させることができる。
【０２０５】
特定の実施態様では、投与の簡易さ及び用量を均一にするために、単位投与剤形で化合物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用する単位投与剤形は、処置されようとする被験者のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的ビヒクルと共に、所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された量の治療用化合物を含有している。本発明の単位投与剤形は、（ａ）治療用化合物の特有の特徴及び達成しようとする具体的な治療効果、並びに（ｂ）被験者における疾患の処置のためにこのような治療用化合物を配合／製剤化する技術分野に固有の限界によって左右されそしてそれに直接的に依存する。
【０２０６】
１つの実施態様では、本発明の組成物は、１日１〜５回又はそれ以上の範囲の用量で被験者に投与される。別の実施態様では、本発明の組成物は、１日１回、２日間に１回、３日間に１回から１週間に１回、及び２週間毎に１回を含むがこれらに限定されない用量の範囲で被験者に投与される。本発明の様々な組合せ組成物の投与頻度は、年齢、処置しようとする疾患又は障害、性別、全般的な健康状態、及び他の因子を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存して、被験者毎に変更されるであろうことが当業者には容易に理解されるだろう。したがって、本発明は、いずれかの特定の投薬計画に制限されると捉えられるべきではなく、任意の被験者に投与しようとする正確な用量及び組成物は、被験者に関する全ての他の因子を考慮して担当の内科医によって決定されるだろう。
【０２０７】
投与のための本発明の化合物は、約１mgから約１０，０００mg、約２０mgから約９，５００mg、約４０mgから約９，０００mg、約７５mgから約８，５００mg、約１５０mgから約７，５００mg、約２００mgから約７，０００mg、約３０５０mgから約６，０００mg、約５００mgから約５，０００mg、約７５０mgから約４，０００mg、約１mgから約３，０００mg、約１０mgから約２，５００mg、約２０mgから約２，０００mg、約２５mgから約１，５００mg、約５０mgから約１，０００mg、約７５mgから約９００mg、約１００mgから約８００mg、約２５０mgから約７５０mg、約３００mgから約６００mg、約４００mgから約５００mg、並びにその間のいずれか及び全てが全体的に又は部分的に増加したものの範囲内であり得る。
【０２０８】
いくつかの実施態様では、本発明の化合物の用量は、約１mgから約２，５００mgである。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物中に使用される本発明の化合物の用量は、約１０，０００mg未満、又は約８，０００mg未満、又は約６，０００mg未満、又は約５，０００mg未満、又は約３，０００mg未満、又は約２，０００mg未満、又は約１，０００mg未満、又は約５００mg未満、又は約２００mg未満、又は約５０mg未満である。同様に、いくつかの実施態様では、本明細書に記載のような第二の化合物（すなわち、本発明の組成物によって処置されるのと同じ又は別の疾患を処置するために使用される薬物）の用量は、約１，０００mg未満、又は約８００mg未満、又は約６００mg未満、又は約５００mg未満、又は約４００mg未満、又は約３００mg未満、又は約２００mg未満、又は約１００mg未満、又は約５０mg未満、又は約４０mg未満、又は約３０mg未満、又は約２５mg未満、又は約２０mg未満、又は約１５mg未満、又は約１０mg未満、又は約５mg未満、又は約２mg未満、又は約１mg未満、又は約０．５mg未満、並びにそのいずれか及び全てが全体的に又は部分的に増加したものである。
【０２０９】
１つの実施態様では、本発明は、治療有効量の本発明の化合物又はコンジュゲートを、単独で又は第二の医薬と組み合わせて保持する容器；及び、被験者における疾患の１つ以上の症状を治療、予防、又は低減するために該化合物又はコンジュゲートを使用するための説明書を含む、梱包された医薬組成物に向けられる。
【０２１０】
「容器」という用語は、医薬組成物を保持するための任意の入れ物を含む。例えば、１つの実施態様では、容器は、医薬組成物を含有している包装である。他の実施態様では、容器は、医薬組成物を含有している包装ではない、すなわち、容器は、包装された医薬組成物又は未包装の医薬組成物と医薬組成物の使用説明書とを含有している、箱又はバイアルなどの入れ物である。さらに、包装技術は当技術分野において周知である。医薬組成物の使用説明書は、医薬組成物を含有している包装上に含有され得、従って、説明書は、包装された製品に対して機能的に高められた関係を形成することが理解されるべきである。しかしながら、説明書は、化合物がその目的とする機能（例えば被験者における疾患を治療若しくは予防すること、又は造影剤若しくは診断剤を被験者に送達すること）を遂行する能力に関しての情報を含有し得ることが理解されるべきである。
【０２１１】
本発明のいずれかの組成物の投与経路としては、経口、鼻腔、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜（例えば舌下、舌、（経）頬側、（経）尿道、膣内（例えば経膣及び膣周囲）、鼻腔（内）、及び（経）直腸）、膀胱内、肺内、脳内、硬膜外、脳室内、十二指腸内、胃内、くも膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、及び局所投与が挙げられる。
【０２１２】
適切な組成物及び剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、丸剤、ジェルカプセル剤、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、顆粒剤、ビーズ、経皮パッチ、ジェル剤、散剤、ペレット剤、泥膏剤、ロゼンジ剤、クリーム剤、ペースト剤、プラスター剤、ローション剤、ディスク、坐剤、鼻腔内又は経口投与用の液体噴霧剤、吸入用の乾燥粉末又はエアゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物及び製剤などが挙げられる。本発明において有用であろう製剤及び組成物は、本明細書に記載の特定の製剤及び組成物に限定されないことが理解されるべきである。
【０２１３】
診断法
本発明は、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を有するか又は発症するリスクがある被験者を診断するための方法を提供する。例えば、１つの実施態様では、該方法は、診断マーカーとして１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの発現又は活性のレベルを使用する工程を含む。１つの実施態様では、該方法は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬをコードしている核酸の遺伝子突然変異の存在を検出する工程を含む。
【０２１４】
１つの実施態様では、前記方法を使用して、被験者が、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を有すると診断する。１つの実施態様では、該方法を使用して、被験者が、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を発症するリスクがあると診断する。１つの実施態様では、該方法を使用して、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した神経変性疾患又は障害の治療法の有効性を評価する。
【０２１５】
１つの実施態様では、前記方法は、被験者から生物学的試料を回収する工程を含む。例示的な試料としては、血液、尿、糞便、汗、胆汁、血清、血漿、組織生検材料などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、１つの実施態様では、試料は、神経組織の少なくとも１つの細胞を含む。１つの実施態様では、試料は、神経細胞、星状細胞腫、オリゴデンドロサイト、プルキンエ細胞、錐体細胞などを含む。
【０２１６】
１つ以上のＴＲＩＭタンパク質又は１つ以上のＳＴＵｂＬの減少した発現又は活性を検出するための方法は、遺伝子又はその産物を核酸レベル又はタンパク質レベルのいずれかで調べる任意の方法を含む。このような方法は当技術分野において周知であり、そしてこれには、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸逆転写法、及び核酸増幅法、ウェスタンブロット、ノザンブロット、サザンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、免疫細胞化学法が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、破壊された遺伝子の転写が、タンパク質レベルで、例えば特定のタンパク質に対して指向される抗体を使用して検出される。これらの抗体は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、フローサイトメトリー、又は免疫細胞化学技術などの様々な方法において使用され得る。
【０２１７】
組換えタンパク質の製造法
特定の実施態様では、本発明は、関心対象の組換えタンパク質の産生において、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質、１つ以上のＳＴＵｂＬ、又はその組合せを使用する方法を提供する。例えば、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質、１つ以上のＳＴＵｂＬ、又はその組合せを使用して、関心対象の組換えタンパク質のタンパク質凝集物を脱凝集することができ、これにより、関心対象の組換えタンパク質の産生及び回収が可能となる。
【０２１８】
特定の実施態様では、前記方法は、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質、１つ以上のＳＴＵｂＬ、１つ以上のＴＲＩＭタンパク質をコードしている核酸分子、１つ以上のＳＴＵｂＬをコードしている核酸分子、又はその組合せを細胞に投与する工程を含む。特定の実施態様では、該細胞は、関心対象の組換えタンパク質を発現するように改変されている。該細胞は、酵母発現系、細菌発現系、昆虫発現系、又は哺乳動物発現系を含むがこれらに限定されない任意の発現系のものであり得る。
【０２１９】
実験例
本発明は、以下の実験例を参照にしてさらに詳細に記載される。これらの実施例は説明のためだけに提供され、特記されない限り制限する意図はない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して捉えられるべきではなく、むしろ、本明細書に提供された教示の結果として明白となった任意の及び全ての変化形を包含するものと捉えられるべきである。
【０２２０】
さらに説明しなくても、当業者は、前記及び以下の例示的実施例を使用して、本発明を作製及び利用し、そして特許請求された方法を実施することができると考えられる。それ故、以下の作業実施例は、本発明の好ましい実施態様を具体的に指摘するものであり、そしていずれにしても残りの開示を制限するものと捉えられるべきではない。
【０２２１】
実施例１：ミスフォールドタンパク質を分解しそして神経変性症から保護する細胞系
ミスフォールドタンパク質は細胞機能を損ないそして疾患を引き起こす。これらのタンパク質がどのように検出されそして分解されるかはあまりよく解明されていない。本明細書に提示された実験は、ＰＭＬ（ＴＲＩＭ１９としても知られる）及びＳＵＭＯ依存性ユビキチンリガーゼＲＮＦ４が一緒に、哺乳動物細胞核内のミスフォールドタンパク質の分解を促進するように作用することを示す。ＰＭＬは個別の基質認識部位を通してミスフォールドタンパク質と選択的に相互作用し、そしてこれらのタンパク質をそのＳＵＭＯリガーゼ活性を通して低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）とコンジュゲートさせる。次いで、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質はＲＮＦ４によって認識されそしてユビキチン化され、そして続いてプロテアソームによる分解のために標的化される。さらに、ＰＭＬの欠損は、脊髄小脳失調症１（ＳＣＡ１）マウスモデルにおけるポリグルタミン（ポリＱ）疾患を悪化させることが本明細書において実証されている。これらの所見は、連続的なＳＵＭＯ化及びユビキチン化を通してミスフォールドタンパク質を除去する哺乳動物系を明らかとし、そしてタンパク質ミスフォールド疾患に対する保護におけるその役割を規定する。
【０２２２】
前骨髄球性白血球タンパク質（ＰＭＬ；ＴＲＩＭ１９としても知られる）は、Ｎ末端のＴＲＩＭ／ＢＲＣＣ領域（ＲＩＮＧドメイン、１つ又は２つのＢボックス、及びコイルドコイル（ＣＣ）モチーフからなる）、続いてＣ末端可変領域を含有している、トリパータイトモチーフ（ＴＲＩＭ）タンパク質ファミリーのメンバーである。ＰＭＬは主に核内タンパク質であり、そしてＰＭＬ核内構造体の冠名の成分である。それは、アポトーシス、転写、ＤＮＡ損傷シグナル伝達、及び抗ウイルス応答をはじめとする多種多様な細胞プロセスに関与している（Bernardi and Pandolfi, 2007, Nat Rev Mol Cell Biol, 8: 1006-1016）。とりわけ、ＰＭＬはまたＳＣＡに関連したポリＱタンパク質によって形成された凝集物と共局在し（Skinner et al., 1997, Nature, 389, 971-974; Takahashi et al., 2003, Neurobiol Dis, 13: 230-237）、そして過剰発現されると、それらの中の少なくとも１つ（アタキシン−７の突然変異体）の分解を促進する（Janer et al., 2006, J Cell Biol, 174: 65-76）。これらの観察が重要である可能性があるにも関わらず、ミスフォールドタンパク質の除去におけるＰＭＬの役割はあまりよく解明されていない。特に、ＰＭＬが、核内ミスフォールドタンパク質の除去に広範な役割を果たしているかどうかは不明である。ＰＭＬがミスフォールドタンパク質を除去する分子機序の重要な問題は取り組まれていない。さらに、ミスフォールドタンパク質に対するＰＭＬの効果の生理学的関連性も不明である。
【０２２３】
これらの実験に使用された材料及び方法をこれから記載する。
【０２２４】
プラスミド
全てのタンパク質は特記されない限りヒト起源である。哺乳動物細胞において以下のタンパク質を発現するためのプラスミドは、ｐＲＫ５においてＰＣＲによって作製され、そして各々を、ＮＨ２末端又はＣＯＯＨ末端において、示されているようなＨＡ、ＦＬＡＧ、又は６×Ｈｉｓタグ、又はＧＳＴ若しくはＧＦＰタンパク質と融合させた：ＦＬＡＧ−ＰＭＬ突然変異体（特記されない限りアイソフォームＩＶ）；ＧＳＴ−ＰＭＬ；Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧ、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ；ＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ、及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）；ＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ；ＨＡ−ＲＮＦ４、ＨＡ−ＲＮＦ４ ＳＩＭｍ、ＨＡ−ＲＮＦ４−ＦＬＡＧ、及びＨＡ−ＲＮＦ４ ＳＩＭｍ−ＦＬＡＧ；並びにＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲ。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑプラスミドは、H. Orr（Riley et al., 2005, J Biol Chem, 280: 21942-21948）によって提供されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／ｐｃＤＮＡプラスミドに基づいて作製され；Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（ここでＫ６、Ｋ９、及びＫ１５はＡｒｇへと変化させた）はSteffan et al., 2004, Science, 304: 100-104に基づき；そしてｎＦｌｕｃプラスミドはGupta et al., 2011, Nat Methods, 8: 879-884に基づいている。各ｎＦｌｕｃタンパク質を、ＮＨ２末端においてＳＶ４０核移行シグナル（PKKKRKV）（配列番号１４７）に融合させ、そしてＣＯＯＨ末端においてＧＦＰと融合させた。ＦｌｕｃＤＭでは、Ｒ１８８及びＲ２６１をＧｌｕへと変化させ；ＦｌｕｃＳＭでは、Ｒ１８８をＧｌｕへと変化させた（Gupta et al., 2011, Nat Methods, 8: 879-884）。ＲＮＦ４のＰＣＲ増幅用鋳型は、オープンバイオシステムズ社（遺伝子アクセッション番号：ＮＭ００２９３８）から購入した。ＲＮＦ４ ＳＩＭｍでは、ＳＩＭ内の以下の残基をＡｌａへと変化させた：Ｉ３６、Ｌ３８、及びＶ３９（ＳＩＭ１）；Ｉ４６、Ｖ４７、及びＬ４９（ＳＩＭ２）；Ｖ５７、Ｖ５８、及びＶ５９（ＳＩＭ３）；並びにＶ６７、Ｖ６８、Ｉ６９、及びＶ７０（ＳＩＭ４）。ＳＵＭＯ２ ＫＲでは、内部ＳＵＭＯ化共通部位のＬｙｓ１１をＡｒｇへと突然変異させた。
【０２２５】
細菌における発現のために、Ｈｔｔ ２５Ｑ、Ｈｔｔ １０３Ｑ、Ｈｔｔ ５２Ｑ、Ｈｔｔ ５２Ｑｃｃ−、ＰＭＬ ＣＣ−ＦＬＡＧ、ＲＮＦ４、及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍのＧＳＴ融合物を、追加のクローニング部位を有するｐＧＥＸ−１λＴの誘導体であるｐＧＥＸ−１ＺＴにおいて構築した。Ｈｔｔ ２５Ｑ、Ｈｔｔ ５２Ｑ、及びＨｔｔ １０３Ｑは、Ｈｔｔアミノ酸１〜１７、次いで長さの示されたポリＱ伸長配列を含有していた（Krobitsch and Lindquist, 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97: 1589-1594）。Ｈｔｔ ５２Ｑ及びＨｔｔ ５２Ｑｃｃ−ｃＤＮＡを、合成オリゴを接続することによって構築した。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｆ１２（５７１−６３３）−６ｘＨｉｓをｐＥＴ２８ａにおいて構築した。この研究のために作製された全てのプラスミドはＤＮＡシークエンスによって確認された。
【０２２６】
以下のプラスミドは以前に記載されていた：ＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６（これは、Ｃ５７Ｓ、Ｃ６０Ｓ、Ｃ１２９Ａ、Ｃ１３２Ａ、Ｃ１８９Ａ、及びＨ１９４Ａ突然変異を有していた）、６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１、及び６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ２（Chu and Yang, 2011, Oncogene, 30: 1108-1116）；ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧＡｔｘｎ１ ３０Ｑ（Riley et al., 2005, J Biol Chem, 280: 21942-21948）；ルシフェラーゼ−６×Ｈｉｓ（フォティナス・ピラリス（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ変異体）（Sharma et al., 2010, Nat Chem Biol, 6: 914-920）；ＧＳＴ−ｒＲＮＦ４（ここで「ｒ」はラット起源を示し、以下も同じである）、ＧＳＴｒＲＮＦ４ ＣＳ１（ここでＣ１３６及びＣ１３９をＳｅｒに変化させた）、ＦＬＡＧ−ｒＲＮＦ４、及びＦＬＡＧｒＲＮＦ４ ＣＳ（ここでＣ１３６、Ｃ１３９、Ｃ１７７、及びＣ１８０をＳｅｒに変化させた）（Hakli et al., 2004, FEBS Lett, 560: 56-62）；及びＰＭＬアイソフォームＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶＩ（図８Ａに使用される）（Xu et al., 2005, Mol Cel, 17: 721-732）。
【０２２７】
ｓｉＲＮＡ
ＰＭＬ及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡはキアゲン社から購入し、そしてセンス鎖配列は以下であった：ＰＭＬ＃４、CTCCAAGATCTAAACCGAGAA（配列番号１４８）；ＰＭＬ＃９、CACCCGCAAGACCAACAACAT（配列番号１４９）；ＲＮＦ４＃５、CCCTGTTTCCTAAGAACGAAA（配列番号１５０）；ＲＮＦ４＃６（TAGGCCGAGCTTTGCGGGAAA）（配列番号１５１）；ＲＮＦ４＃８、AAGACTGTTTCGAAACCAACA（配列番号１５２）。ＲＮＦ４を、ｓｉＲＮＡを個々に用いて又は等モル比で組み合わせてのいずれかでノックダウンした。ＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡ（サーモサイエンティフィック社、siGENOME SMARTpool M-016005-03-0005）は４つの標的特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖のプールであった。センス鎖配列は以下であった：TCAAGAAACUCAAAGAATC（配列番号１５３）、GACAGGGTGTTCCAATGAA（配列番号１５４）、GGTTTCTCTTTGAGGGTCA（配列番号１５５）、及びGAATAAATGGGCATGCCAA（配列番号１５６）。ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ（サンタクルズ社、ｓｃ−３７１６７）は、３つの異なるｓｉＲＮＡ二本鎖のプールであり、そしてセンス鎖配列はCCCAUUCCUUUAUUGUACA（配列番号１５７）、CAGAGAAUGACCACAUCAA（配列番号１５８）、及びCAGUUAUGUUGUCGUGUAU（配列番号１５９）であった。
【０２２８】
細胞培養及びトランスフェクション
ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３を発現しているＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから）及びＵ２ＯＳ細胞（Mukhopadhyay et al., 2006, J Cell Biol, 174: 939-949）を、標準的な培養条件で維持した。ＤＮＡプラスミドを、リポフェクタミン２０００を使用して細胞にトランスフェクトした。ＰＭＬ及びＡｔｘｎ１を共トランスフェクトした場合、ＦＬＡＧ−ＰＭＬとＡｔｘｎ１ ８２Ｑ／３０Ｑ−ＧＦＰ、又はＨＡ−ＰＭＬとＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／３０Ｑを使用した。ＨＡ−ＲＮＦ４及びＨＡ−ＲＮＦ４−ＦＬＡＧプラスミドを、それぞれタンパク質発現及び細胞内局在化を試験するために使用した。
【０２２９】
製造業者の説明書に従って、リポフェクタミン２０００又はＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン社）を使用したｓｉＲＮＡ。ノックダウン実験のために、２回のｓｉＲＮＡトランスフェクションを連日実施した。ＤＮＡ及びｓｉＲＮＡの両方をトランスフェクトした場合、ＤＮＡは、組み合わせたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いての処置から４〜６時間後、及び他のｓｉＲＮＡを用いての処置の翌日にトランスフェクトされた。ＭＧ１３２（シグマ社）を、７．５〜１０μM（最終濃度）で最後のトランスフェクションから２４時間後に４〜５時間かけて加えた。
【０２３０】
ＲＮＦ４ ｓｈＲＮＡの安定な細胞株の作製
ｐＬＫＯ．１にクローニングされたヒトＲＮＦ４に対するｓｈＲＮＡはサーモサイエンティフィック社から得られた。ｓｈＲＮＡ４のアンチセンス配列はTGGCGTTTCTGGGAGTATGGG（配列番号１６０）（TRCN0000017054）である。レンチウイルスでの産生のために、２９３Ｔ細胞を、レンチウイルスベクター、Ｇａｇヘルパープラスミド、Ｒｅｖヘルパープラスミド、及びＶＳＶＧヘルパープラスミドを用いてトランスフェクトした。ウイルス含有培地を４８時間目及び７２時間目に回収し、そして１００ｇで５分間遠心分離にかけた。ＨｅＬａ細胞を、ポリブレンと共にウイルス含有上清を使用して形質導入し、そしてピューロマイシンを用いて選択した。ｐＬＫＯ．１ベクターを使用して安定な対照細胞を作り出した。
【０２３１】
細胞溶解液の分画、フィルター位相差アッセイ、及びウェスタンブロット
細胞溶解液をＮＰ−４０含有緩衝液中で作製し、そして遠心分離によって上清（ＮＳ）及びペレットへと分画した。両方の画分を、２％ＳＤＳを含有している緩衝液中で煮沸し、そしてウェスタンブロットによって分析した。ペレットの一部をＳＲ種についてフィルター位相差アッセイによって分析した。
【０２３２】
試料は、改変を加えて記載の通りに調製された（Janer et al., 2006, J Cell Biol, 174: 65-76）。細胞を収集し、そして５０mMトリス、ｐＨ８．８、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ２、０．５％ＮＰ−４０、２mM ＤＴＴ、２５０IU/mlのベンゾナーゼ（シグマ社）、１mM ＰＭＳＦ、１×完全プロテアーゼ混液（ロシュ社）、及び２０mM Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ；シグマ社）を含有している緩衝液中で氷上で３０分間かけて溶解した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ（バイオラッドラボラトリーズ社）によって決定された。全細胞溶解液を４℃で１３，０００rpmで１５分間遠心分離にかけた。ＮＰ−４０に可溶性（ＮＳ）のタンパク質を含有している上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ペレットをペレット緩衝液（２０mMトリス、ｐＨ８．０、１５mM ＭｇＣｌ２、２mM ＤＴＴ、２５０IU/mlベンゾナーゼ、１mM ＰＭＳＦ、１×完全プロテアーゼ混液、及び２０mM ＮＥＭ）に再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベートした。ペレット画分を２％ＳＤＳ、５０mM ＤＴＴ中で煮沸した。煮沸されたペレット画分の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてゲルに進入しているタンパク質（ＳＤＳ可溶性、ＳＳ）をウェスタンブロットによって検出した。他の部分を、以前に記載されているように（Wanker et al., 1999, Methods Enzymol, 309: 375-386）孔径０．２μmのメンブランフィルターにアプライし、そしてフィルター上に保持されたＳＤＳ抵抗性（ＳＲ）凝集物をイムノブロットによって分析した。
【０２３３】
以下のタンパク質に対する一次抗体を、ウェスタンブロットのために使用し、製品の情報及び希釈率が示されている：ＰＭＬ（ウサギ、Ｈ−２３８、１：１，０００及びヤギ、Ｎ−１９、１：５００）、ユビキチン（マウス、Ｐ４Ｄ１、１：１０，０００）及びＨＡ（ウサギ、Ｙ−１１、１：５００）（サンタクルズバイオテクノロジー社）；ＦＬＡＧ（マウス、Ｍ２、１：７，５００）、アクチン（ウサギ、１：１０，０００）、及びβ−チューブリン（マウス、１：５，０００）（シグマ社）；ＧＦＰ（マウス、１：４，０００）（クロンテック社）；ＧＳＴ（ヤギ、１：１０００、ＧＥヘルスケアライフサイエンシーズ社）；ＳＵＭＯ１（マウス、１：５００、インビトロジェン社）；ＳＵＭＯ２／３（ウサギ、１：２５０、アブジェント社）；ＨＡ（トランスフェクトされたＨＡ−ＲＮＦ４のための）（ラット、３Ｆ１０、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はＨＲＰにコンジュゲート、１：１０，０００）（ロシュ社）；ＲＮＦ４（マウス、１：５００、アブノバ社、及び抗原ペプチドDLTHNDSVVI（配列番号１６１）を使用してアブマート社によって開発されたマウスモノクローナル抗体、１：１，０００）。トランスフェクトされたＦＬＡＧ−ＰＭＬを抗ＦＬＡＧ抗体によって検出し、そしてトランスフェクトされたＨＡ−ＰＭＬ及びＨＡ−ＲＮＦ４をＨＡ抗体によって検出した。
【０２３４】
二次抗体をＨＲＰ（サンタクルズバイオテクノロジー社）にコンジュゲートさせたか、又はＩＲＤ Ｆｌｕｏｒ８００又はＩＲＤ Ｆｌｕｏｒ６８０（ＬＩ−ＣＯＲ社）を用いて標識した。ウェスタンブロットを、ＥＣＬ試薬を使用して展開し、そしてＩｍａｇｅＪを使用して分析したか、又はオデッセイ赤外線イメージングシステムを用いて走査し、そしてImage Studio Lite（ＬＩ−ＣＯＲ社）を使用して分析した。
【０２３５】
培養細胞の免疫蛍光
カバーガラス上に培養した細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分間かけて固定し、０．２％トリトンＸ−１００を用いて１５分間かけて透過処理を行ない、１％ＢＳＡを用いて遮断し、そして示されたような抗体と共にインキュベートした。細胞に、ＤＡＰＩ（ＤＮＡ検出用）（ベクターラボラトリーズ社）を含有している培地を載せ、そしてニコンＥｃｌｉｐｓｅＥ８００又はオリンパスＩＸ８１顕微鏡を用いて画像を取得した。以下の一次抗体を使用し、製品の情報及び濃度が示されている：ＰＭＬ（ウサギ、Ｈ−２３８、及びマウス、ＰＧ−Ｍ３、１：１００）、ＲＮＦ４（ヤギ、Ｃ−１５、１：２５）（サンタクルズバイオテクノロジー社）、及びＦＬＡＧ（トランスフェクトされたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＨＡ−ＲＮＦ４−ＦＬＡＧのための）（マウス、Ｍ２、１：２，０００）（シグマ社）。二次抗体は、ＦＩＴＣのコンジュゲートした抗マウス、抗ウサギ（ザイムド社）、及び抗ヤギ（インビトロジェン社）ＩｇＧ；テキサスレッドのコンジュゲートした抗マウス及び抗ウサギＩｇＧ（ベクターラボラトリーズ社）；並びにローダミンレッド−Ｘのコンジュゲートした抗ヤギ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社）であった。
【０２３６】
Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ、及びＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の定量のために、１０個以上の無作為に選択された領域からのそれぞれ約４００個、５００個、及び２００個の細胞を調べた。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体のサイズをＩｍａｇｅＪを使用して測定し、そして細胞を、細胞内の最大の封入物に基づいて分類した。ＰＭＬの存在下及び非存在下において様々なサイズの凝集物を有する細胞の比率のＰ値を、カイ二乗検定を使用して計算した。Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰを用いてトランスフェクトされた細胞については、それらの中の約３０％が細胞質内又は核内の凝集物のいずれかを有していた。
【０２３７】
タンパク質の半減期のアッセイ
細胞を、［３５Ｓ］Ｍｅｔ及び［３５Ｓ］Ｃｙｓの補充されたＭｅｔ及びＣｙｓ非含有ＤＭＥＭ培地中でパルス標識し、その後、通常のＤＭＥＭ中で培養した。あるいは、細胞をＣＨＸを用いて処置した。細胞溶解液中の免疫沈降した［３５Ｓ］Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は標識されていないＡｔｘｎ１ ８２Ｑを、オートラジオグラフィー又はウェスタンブロットによって分析した。
【０２３８】
パルスチェイス分析のために、ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを単独で用いて又は適度の量のＰＭＬと一緒に用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから１７時間後、細胞を、Ｍｅｔ及びＣｙｓ非含有ＤＭＥＭ培地中で３０分間培養し、その後、［３５Ｓ］Ｍｅｔ及び［３５Ｓ］Ｃｙｓ（各々１００μCi/ml）を用いて３０分間かけてパルス標識した。その後、細胞をＰＢＳで２回濯ぎ、そして１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で０〜１８時間かけて追跡した。細胞を、２％ＳＤＳ及び５０mM ＤＴＴを含有しているＩＰ−溶解緩衝液（５０mM ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、及び２mM ＤＴＴ）中で溶解し、そして９５℃で１０分間煮沸した。全細胞溶解液を１３，０００rpmで１５分間遠心分離にかけた。上清をＩＰ−溶解緩衝液中で２０倍に希釈し、そして抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズと共に４℃で一晩インキュベートした。ビーズを、追加の０、０．５M、及び１M ＫＣｌを含むＩＰ溶解緩衝液で順次洗浄し、そして２％ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてオートラジオグラフィーによって分析した。様々な条件下でＡｔｘｎ１ ８２Ｑの半減期をより良く比較するために、０時間目において同じようなシグナル強度を有する露光を提示した。
【０２３９】
Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのトランスフェクトされた細胞のシクロヘキシミド（ＣＨＸ）による処置のために、トランスフェクションから４〜５時間後に１５０μg/mlのＣＨＸを細胞培養培地に加えた。細胞を収集し、そして指定された時点でドライアイス上で瞬間凍結させ、溶解し、そしてウェスタンブロット分析のために分画した。ｎＦｌｕｃＤＭのトランスフェクトされた細胞のＣＨＸによる処置のために、トランスフェクションから１７時間後に５０μg/mlのＣＨＸを細胞培養培地に加えた。細胞を指定された時点で収集し、そして全細胞溶解液をウェスタンブロット分析のために使用した。
【０２４０】
定量ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡをトリゾール（インビトロジェン社）を使用して抽出した。ｃＤＮＡ合成を、ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（マーリゲンバイオサイエンシーズ社）を使用して全ＲＮＡの逆転写によって実施した。ヒトＡｔｘｎ１（Hs00165656_m1）及び１８ｓｒＲＮＡ（4333760F）プライマー／プローブセットを含むタックマン遺伝子発現アッセイ（アプライドバイオシステムズ社）をｑＰＣＲ分析のために使用した。
【０２４１】
タンパク質の精製
ＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＡを２９３Ｔ細胞において発現させ、そして改変を加えて以前に記載されているように（Tang et al., 2006, Nat Cell Biol, 8: 855-862; Tang et al., 2004, J Biol Chem, 279: 20369-20377）、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズ（シグマ社）によって精製した。細胞を、１mM ＰＭＳＦ及び１×完全プロテアーゼ混液の補充されたＩＰ溶解緩衝液（５０mMトリス、ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ−１００、０．５％ＮＰ−４０、及び２mM ＤＴＴ）中で溶解した。ＰＭＬの精製のために、ＩＰ溶解緩衝液にも、２０μM ＺｎＣｌ２を補充した。溶解液を１３，０００rpmで１５分間遠心分離にかけた。上清を、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズと共に４℃で４時間から一晩インキュベートした。Ｍ２ビーズを順次、０、０．５、及び１M ＫＣｌを含有しているＩＰ溶解緩衝液を用いて、並びに溶出緩衝液（５０mMトリス、ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、及び２mM ＤＴＴ）を用いて洗浄した。結合したタンパク質を、０．１〜０．３mg/mlの３×ＦＬＡＧペプチド（シグマ社）を含有している溶出緩衝液で溶出した。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６調製物中に観察される主要な追加のバンドは、ウェスタンブロット及び質量分光分析の両方に基づいてＰＭＬに由来していた（図１１Ｇ）。
【０２４２】
ＰＭＬのＧＳＴ融合物を、２９３Ｔ細胞において発現させ、そしてグルタチオン−セファロース（商標）４Ｂビーズ（ＧＥヘルスケアライフサイエンシーズ社）を使用して上記のものと類似した溶解条件及び洗浄条件を用いて精製した。ｒＲＮＦ４、ｒＲＮＦ４ ＣＳ１、ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍのＧＳＴ融合物を、エシェリヒアコリＢＬ２１ ＤＥ３又はロゼッタ２（ＥＭＤケミカルズ社）において発現させ、そして以前に記載されているように（Hakli et al., 2001, J Biol Chem, 276: 23653-23660）精製した。細菌を３７℃でＡ６００nm＝０．６〜０．８となるまで増殖させ、そしてタンパク質発現のために０．３mM ＩＰＴＧを用いて３０℃で３時間かけて誘導した。ＧＳＴでタグ化されたタンパク質を、グルタチオンビーズを用いて精製した。０．１mM ＩＰＴＧをタンパク質発現の誘導に使用した以外は、ＧＳＴ及びＨｔｔ２５Ｑ、Ｈｔｔ１０３ＱのＧＳＴ融合物を同じようにして精製した。結合したタンパク質を、３０mMグルタチオン（シグマ社）を含有している溶出緩衝液で溶出した。
【０２４３】
ルシフェラーゼ−６×Ｈｉｓを、以前に記載されているように（Sharma et al., 2010, Nat Chem Biol, 6: 914-920）ＢＬ２１ＤＥ３において発現させた。固定された天然ルシフェラーゼＬｕｃ（Ｎ）を生成するために、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（キアゲン社）を細菌溶解液と共にインキュベートし、そして製造業者の説明書に従って洗浄した。変性させたルシフェラーゼＬｕｃ（Ｄ）は、固定されたＬｕｃ（Ｎ）を８M 尿素で５分間処理することによって生成された。ルシフェラーゼ活性アッセイは、僅か０．２％の酵素活性が尿素処理後に残っていたことを示した。対照ビーズのために、ルシフェラーゼを全く発現していない細菌からの溶解液を、Ｎｉ−ＮＴＡビーズと共に平行してインキュベートした。
【０２４４】
ルシフェラーゼペプチド走査に使用するＰＭＬ突然変異体を生成するために、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｆ１２（５７１〜６３３）−６ｘＨｉｓ及びＧＳＴ−ＰＭＬ ＣＣ−ＦＬＡＧを、ＢＬ２１ ＤＥ細胞において室温で、３時間及び１時間かけてそれぞれ０．１mM ＩＰＴＧにより誘導しながら発現させた。Ｆｌａｇ−ＰＭＬ Ｆ１２（５７１〜６３３）−６ｘＨｉｓを、Ｍ２ビーズ及びＦＬＡＧペプチド溶出液を使用してまず精製し、そして製造業者の説明書に従ってＮｉ−ＮＴＡビーズを使用して２回目の精製にかけた。ＰＭＬ ＣＣドメインを生成するために、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、ＧＳＴとＰＭＬ ＣＣの間に導入した。ＧＳＴ−ＰＭＬ ＣＣ−ＦＬＡＧのコンジュゲートしたグルタチオンビーズを、ＴＥＶプロテアーゼ（シグマ社）と共に製造業者の説明書に従ってインキュベートして、ＧＳＴ部分から（及びビーズから）ＰＭＬ ＣＣ−ＦＬＡＧを遊離させた。プルダウンアッセイのために使用するＰＭＬ ＣＣ−ＦＬＡＧを、精製されたＰＭＬ ＣＣ−ＦＬＡＧタンパク質をＭ２ビーズと共にインキュベートすることによって生成し、そして上記のように洗浄した。
【０２４５】
プルダウンアッセイ
ＦＬＡＧプルダウンアッセイのための、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズに結合させたＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＧＦＰ、及びＰＭＬ ＣＣ−ＦＬＡＧは、上記のように調製された。精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ ２５Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ １０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ ５２Ｑ又はＧＳＴ−Ｈｔｔ ５２Ｑｃｃ−を、１３，０００rpmで１５分間遠心分離にかけ、あらゆる凝集タンパク質を除去した。同等なモル濃度のＦＬＡＧ−ＰＭＬ（２．５μg）又はＦＬＡＧ−ＧＦＰ（１．１μg）を、ＧＳＴ−Ｈｔｔ ２５Ｑ又はＧＳＴ−Ｈｔｔ １０３Ｑ（各々２．５μg）と共に、Ｈｓｐ７０（２．５μg）及びＨｓｐ４０（１．４μg）（エンドライフサイエンシーズ社）の非存在下又は存在下で、最終容量２００μlのアッセイ緩衝液（５０mMトリス、ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、及び２mM ＤＴＴ、０．５％ＮＰ−４０）中で４℃で２時間インキュベートした。ビーズを、コンパクトリアクションカラム（アフィメトリックス／ＵＳＢ社）でＩＰ溶解緩衝液を用いて３回洗浄し、そして２％ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸した。試料をウェスタンブロットによって分析した。ＰＭＬ ＣＣプルダウンアッセイは、ＰＭＬ ＣＣ−ＦＬＡＧ １．６μgを含有しているＭ２ビーズ又は対照Ｍ２ビーズをＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｈｔｔタンパク質 ５μgと共にインキュベートした以外は、同じように実施された。
【０２４６】
ＧＳＴプルダウンアッセイのために、グルタチオン−セファロース（商標）４Ｂビーズに結合させたＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ ２５Ｑ、及びＧＳＴ−Ｈｔｔ １０３Ｑタンパク質の各々２μgをＦＬＡＧ−ＰＭＬタンパク質を発現している２９３Ｔ細胞由来の溶解液４００μgと共に４℃で４時間インキュベートした。ビーズを、コンパクトリアクションカラムでＩＰ溶解緩衝液を用いて３回洗浄し、そして２％ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸した。試料をウェスタンブロットによって分析した。ＰＭＬ突然変異体とＨｔｔとの間の相互作用を検出するために、［３５Ｓ］Ｍｅｔで標識された完全長及び突然変異体のＰＭＬタンパク質を、ＳＰ６結合転写／翻訳共役系（プロメガ社）を使用して生成し、そしてビーズに結合させたＧＳＴ、ＧＳＴ−２５Ｑ、及びＧＳＴ−Ｈｔｔ １０３Ｑと共に１５０μlのＩＰ溶解緩衝液中で４℃で一晩インキュベートした。ビーズを、上記のように洗浄しそして煮沸した。インプット及びプルダウン試料をオートラジオグラフィー及びクーマシーブルー染色によって分析した。オートラジオグラフィーのために、異なるゲル上で分離された同じ実験由来のプルダウン試料を同じ露光時間にかけた。
【０２４７】
ルシフェラーゼプルダウンアッセイのために、等量の細菌溶解液から調製されたＮｉ−ＮＴＡビーズ又は対照ビーズに結合させたＬｕｃ（Ｎ）又はＬｕｃ（Ｄ）３μgを、精製されたＧＳＴ（１μg）、ＧＳＴ−ＰＭＬ（３μg）と共に、Ｈｓｐ７０（３μg）及びＨｓｐ４０（１．７μg）又は［３５Ｓ］Ｍｅｔで標識された完全長及び突然変異ＰＭＬタンパク質の非存在下又は存在下において、１５mMイミダゾール、１mM ＤＴＴ、０．５％トリトンＸ−１００及び０．５％ＮＰ−４０を含有しているＰＢＳ ２００μl中で、４℃で４時間インキュベートした。ビーズを、２０mMイミダゾール、１mM ＤＴＴ、０．５％トリトンＸ−１００及び０．５％ＮＰ−４０を含有しているＰＢＳを用いて３回洗浄し、そして煮沸した。インプット試料及びプルダウン試料を上記のように分析した。
【０２４８】
ＰＭＬドメインへの結合についてのセルロース結合ペプチドのスクリーニング
フォティナス・ピラリスルシフェラーゼについてのペプチドライブラリー（１０個のアミノ酸が重複している１３アミノ酸長）を、自動スポット合成（ＪＰＴペプチドテクノロジーズ社）によって調製した。ペプチドアレイ膜に、精製されたＰＭＬ ＳＲＳ１及びＳＲＳ２断片をプローブした。ペプチドアレイ膜をオデッセイ遮断緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ社）を用いて遮断し、そしてＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｆ１２（５７１〜６３３）−ＨｉｓＸ６又はＰＭＬ Ｆ４／ＣＣ−ＦＬＡＧ（各々１５０nM）と共にＴＢＳ−Ｔ（５０mMトリス、ｐＨ８．０、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ及び１mM ＤＴＴ）中で４℃で２時間インキュベートした。膜を洗浄し、そして製造業者の説明書に従ってマウス抗Ｆｌａｇ抗体及び抗マウスＨＲＰ抗体を用いてブロットした。ブロットを、ＥＣＬ試薬を使用して展開した。抗Ｆｌａｇ抗体及び抗マウスＨＲＰ抗体のみを有するブロット上のバックグラウンドシグナルは長時間の露光でも最小限であった。ペプチドアレイ膜を製造業者のプロトコールに従って再生した。
【０２４９】
ＳＵＭＯ化及びユビキチン化分析
細胞又はインビトロの反応混合物を、２％ＳＤＳを含有している緩衝液中で煮沸し、その後、ＳＤＳを含まない緩衝液で希釈したか、又はバイオスピンクロマトグラフィーカラムを通過させることにより、ＳＤＳ濃度を低下させた。タンパク質を免疫沈降させ（変性ＩＰすなわちｄ−ＩＰ）、そしてウェスタンブロットによって分析した。
【０２５０】
インビボでのＳＵＭＯ化及びユビキチン化アッセイ
細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１、ＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ及び示されているような他の発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。図４Ａに示された実験のために、ＳＵＭＯ２を発現しているプラスミドも使用した。トランスフェクションから２４時間後、細胞を、７．５μMのＭＧ１３２又はＤＭＳＯを用いて５時間かけて処置したか、又は未処置のままとし、そして２％ＳＤＳ及び５０mM ＤＴＴの補充されたＩＰ溶解緩衝液中で収集した。変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）のために、細胞溶解液を９５℃で１０分間煮沸した。１つの分取分を、ウェスタンブロット分析のために保存した。残りの溶解液はＩＰ溶解緩衝液で２０倍に希釈したか、又はＩＰ溶解緩衝液を用いて平衡化したバイオスピンクロマトグラフィーカラム（バイオラッド社）を通過させ、ＳＤＳの濃度を低下させた。次いで、溶解液を抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズと共に４℃で４時間又は一晩インキュベートした。ビーズを、ＦＬＡＧでタグ化されたタンパク質の精製について記載されている通りに洗浄し、そして２％ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸した。ビーズからのタンパク質を、ウェスタンブロットによって抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＳＵＭＯ２／３抗体、抗ＳＵＭＯ１抗体、抗ユビキチン抗体、及び示されているような他の抗体を用いて分析した。ユビキチン化種又はＳＵＭＯ化種のレベルをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾タンパク質を含有しているｄ−ＩＰ産物をしばしばウェスタンブロット分析のために使用した。
【０２５１】
インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイ
インビトロでのユビキチン化及びＳＵＭＯ化反応のための成分はボストンバイオケム社から購入した。インビトロのＳＵＭＯ化アッセイは、精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧ（６００ng/２００nM）、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ（図４Ｄでは、５０及び２００ng、又は２２及び９０nM；図４Ｅでは、１００ng又は４５nM）又はＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６（１００ng又は４５nM）、ＳＡＥ１／ＳＡＥ２（１２５nM）、Ｕｂｃ９（１μM）、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ２（２５μM）、Ｈｓｐ７０（４２０ng/２００nM）、Ｈｓｐ４０（２４０ng/２００nM）及びＢＳＡ（０．１μg/ml）を含有している反応緩衝液（５０mMトリスｐＨ７．５、５．０mM Ｍｇ２＋−ＡＴＰ、及び２．５mM ＤＴＴ）３０μl中で３７℃で１．５時間実施された。反応混合物を、２％ＳＤＳ及び５０mM ＤＴＴを含有しているＩＰ溶解緩衝液 ３０μlの添加、及び９５℃で１０分間の加熱によって変性させた。加熱した反応混合物の１つの分取分を、ウェスタンブロット分析のために保存し、そして残りをＳＤＳを含まないＩＰ溶解緩衝液で２０倍に希釈した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１−ＦＬＡＧを抗ＨＡビーズ（ロシュ社）によって免疫沈降させ、そして抗ＳＵＭＯ２／３抗体を使用してＳＵＭＯ２／３による修飾について分析した。
【０２５２】
インビトロのユビキチン化アッセイ
ＲＮＦ４の自己ユビキチン化のためのインビトロアッセイを、精製されたＧＳＴ−ＲＮＦ４タンパク質（２５０ng/５３０nM）、ＵＢＥ１（１２５nM）、ＵｂｃＨ５ａ（６２５nM）、ユビキチン（２．５μg/３０μM）、及びＭｇ２＋−ＡＴＰ（２．５mM）を含有している反応緩衝液（５０mMトリスｐＨ７．５及び２．５mM ＤＴＴ）１０μl中で３７℃で１時間実施した。反応混合物を９５℃で１０分間加熱し、そしてウェスタンブロットによって分析した。
【０２５３】
ＳＵＭＯ化されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのインビトロでのユビキチン化のために、ＳＵＭＯ化Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質と未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質との混合物をユビキチン化反応基質として調製した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＡ（１．５μg/３００nM）にコンジュゲートさせたＭ２ビーズ及び対照Ｍ２ビーズを、５mM ＡＴＰ（ボストンバイオケム社）を含有しているＭｇ２＋−ＡＴＰ−エネルギー再生溶液総容量５０μlの中、０．７５μM ＳＡＥ１／ＳＡＥ２、１２．５μM Ｕｂｃ９、１２５μM 
Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ２、及び２．５mM ＤＴＴと混合した。十分なＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を達成するために、反応を３７℃で２４時間実施し、そして反応緩衝液を１２時間後に交換した。次いで、ビーズを、追加の０、０．５、及び１M ＫＣｌを含むＩＰ溶解緩衝液及びユビキチン化反応緩衝液（５０mMトリス、ｐＨ７．５、及び１５０mM ＮａＣｌ）を用いて順次洗浄した（Tang et al., 2006, Nat Cell Biol, 8: 855-862）。
【０２５４】
次いで、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑビーズ及び対照ビーズを、反応緩衝液（５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、及び２．５mM ＤＴＴ）中、ＧＳＴ−ｒＲＮＦ４（０、４０、１６０及び５００ng、又は０、４３、１７０、及び５３０nM）、ＵＢＥ１（１００nM）、ＵｂｃＨ５ａ（５００nM）、ユビキチン（５μg/３０μM）、及びＭｇ２＋−ＡＴＰ（２．５mM）を含有している容量 ２０μlのユビキチン化反応混合物と共に３７℃で１時間インキュベートした。その後、ビーズを上清から分離し、そしてＩＰ溶解緩衝液を用いて洗浄した。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを変性させ、そして２％ＳＤＳ及び５０mM ＤＴＴを含有しているＩＰ溶解緩衝液の添加及び９５℃で１０分間の加熱によってビーズから遊離した。希釈後、Ａｔｘｎ１ ８２ＱをＭ２ビーズを用いて免疫沈降させた。反応液からのＩＰ産物及び上清をウェスタンブロットによって分析した。
【０２５５】
マウスの飼育及び遺伝子型の同定
プルキンエ細胞特異的プロモーターエレメントによって駆動される８２個のＣＡＧ反復配列を有するヒトＳＣＡ１コード領域を有する、ヘテロ接合体Ｂ０５トランスジェニックマウス（Ａｔｘｎｔｇ/−）が提供された（Burright et al., 1995, Cell, 82: 937-948）。ＰＭＬ−/−マウスが提供された（Wang et al., 1998, Science, 279: 1547-1551）。Ａｔｘｎｔｇ/−マウス（ＦＶＢバックグラウンド）をＰＭＬ−/−（１２９Ｓｖバッググラウンド）と交配した。第一世代のＰＭＬ＋/−：Ａｔｘｎｔｇ/−マウスを、ＰＭＬ−/−又はＰＭＬ＋/＋と交配することにより、ロータロッド試験及び病理学的検査のために使用するマウスを作成した。交配スキームは、ロータロッドの成績、凝集物の形成、分子層の厚さ、又は第二世代のＰＭＬ＋若しくはＰＭＬ＋/−：Ａｔｘｎｔｇ/−マウスの樹状突起分岐には影響を及ぼさなかった。マウスの遺伝子型は、記載のように（Burright et al., 1995, Cell, 82: 937-948）（Ａｔｘｎ１について）又は米国国立癌研究所のマウスレポジトリによる提案に従って（ＰＭＬについて）のいずれかでＰＣＲによって決定された。
【０２５６】
加速ロータロッド試験
加速ロータロッド装置（４７６００、ウゴバジレ社、イタリア）を使用して、運動調整及びバランスを測定した。ナイーブ動物のみを使用した。各動物に４日間連続して１日３回の試験を与え、試験の合間に１時間の休憩をとった。各試験のために、マウスを１０分間かけて４〜８０rpmまで加速するロータロッド上に置いた。ロータロッドから落ちるまでのその潜伏時間（秒）を記録した。
【０２５７】
マウス小脳の免疫染色及び病理学的分析
パラフィンに包埋された正中矢状小脳切片を、示された抗体を用いて染色し、そしてライカＳＰ５ＩＩレーザー走査共焦点顕微鏡を使用して可視化したか、又はヘマトキシリンを用いて染色し、そしてオリンパスＢＸ５１顕微鏡を使用して可視化した。
【０２５８】
免疫組織化学法及び免疫蛍光法を、改変を加えて以前に記載されているように（Duda et al., 2000, J Neuropathol Exp Neurol, 59: 830-841; Emmer et al., 2011, J Biol Chem 286: 35104-35118）実施した。パラフィンに包埋された小脳を１０μmの切片へと切断した。分子層の測定のために、マウス１匹あたり１００μmの間隔を有する３つのヘマトキシリンで染色された正中矢状切片を分析した。各切片の最初の亀裂における２０回の測定を平均化した。
【０２５９】
プルキンエ細胞樹状突起分岐を定量するために、小脳の正中矢状切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質カルビンディンに対する抗体（マウス、ＣＢ−９５５、１：２５０；シグマ社）を用いて染色した。２０個の０．５μmの光学的切片を、ライカＳＰＩＩレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて蓄積した。最も明るい連続的な１２個の切片（６μm）が最大強度のために投影された。山頂前裂の同領域からの蛍光強度プロファイルを、ＩｍａｇｅＪを使用してプロットした。
【０２６０】
プルキンエ細胞を定量するために、正中矢状切片を抗カルビンディン抗体を用いて染色し、そして同等な領域を細胞計数のために使用した。プルキンエ細胞層の長さを、ＩｍａｇｅＪを使用して、プルキンエ細胞の細胞体中心に沿って分割した線を描くことによって測定した。各マウスについて、約３０mmに沿った３５０〜９００個の神経細胞が測定された。プルキンエ細胞密度は、細胞数をプルキンエ細胞層の長さで割ることによって決定された。
【０２６１】
凝集物を有するプルキンエ細胞の数を決定するために、正中矢状切片を抗ユビキチン抗体（マウス、Ｕｂｉ−１、ＭＡＢ１５１０、１：２，０００；ミリポア社）を用いて染色した。マウス１匹あたり３００個又はそれ以上の細胞が、同じ脳領域から計数された。画像は、ＤＰ７１オリンパスデジタルカメラの搭載されたオリンパスＢＸ５１顕微鏡を使用して撮影された。
【０２６２】
１つの遺伝子型あたり４匹のマウスを、１才齢のマウスのプルキンエ細胞を計数するために使用し、１つの遺伝子型あたり２匹のＰＭＬ＋/＋マウスを樹状突起分岐の定量のために使用し、そして１つの遺伝子型あたり３匹のマウスを残りの研究のために使用した。
【０２６３】
統計分析
凝集物を有する細胞の数を、適宜、カイ二乗検定及びスチューデントｔ検定によって分析した。行動スコア及び小脳病態を、繰り返し測定する二元配置分散分析及びスチューデントｔ検定によって分析した。全てのデータを、プリズム５ソフトウェア又はマクロソフトエクセル２００８を使用して分析した。
【０２６４】
実験結果をこれから記載する。
【０２６５】
ＰＭＬは、病原性アタキシン−１タンパク質のプロテアソームによる分解を促進する
ＳＣＡ１は、進行性の失調症及び神経細胞の減少、特に小脳プルキンエ細胞の減少によって特徴付けられる致命的な神経学的障害である。それは、ＳＣＡ１遺伝子産物であるアタキシン−１（Ａｔｘｎ１）におけるポリＱ伸長配列の増幅によって引き起こされる（Orr and Zoghbi, 2007, Annu Rev Neurosci, 30: 575-621）。核内のミスフォールドタンパク質の排除におけるＰＭＬの役割を調べるために、Ｃ末端で高感度緑色蛍光タンパク質に融合させた８２個の連続したグルタミンを有する病原性Ａｔｘｎ１タンパク質、すなわちＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰをＨｅＬａ細胞において発現させた細胞培養モデルを作成した。ヒトＳＣＡ１患者及びマウスＳＣＡ１トランスジェニックモデルにおける病原性Ａｔｘｎ１タンパク質と同様に（Skinner et al., 1997, Nature, 389: 971-974）、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰは核に局在し、拡散した局在化パターンを示し、顕微鏡で見ることのできる封入体内で顕著により高い濃度であった（図１Ａ及び図１Ｂ）。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰによりまた、細胞溶解液中にＮＰ−４０可溶性種（可溶性すなわちＮＳ）及びＮＰ−４０不溶性種（凝集した）の両方を生じた。後者はさらにＳＤＳ可溶性種（ＳＳ）及びＳＤＳ抵抗性種（ＳＲ）へと分類され得る（図１Ｃ）。
【０２６６】
以前の報告（Skinner et al., 1997, Nature, 389: 971-974）と一致して、内因性ＰＭＬはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体と共局在し、それらに隣接する細胞体内に蓄積し、そしてまたその中にも分散されていた（図１Ａ）。ＰＭＬはいくつかのアイソフォームとして発現されている（Nisole et al., 2013, Front Oncol, 3: 125）。５つの主要なＰＭＬアイソフォーム（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶＩ）を調べ、そして５つ全てがＡｔｘｎ１−ＧＦＰ封入体と共局在したことが判明した（図８Ａ）。その後の分析のために、一般的に使用されるアイソフォームＩＶ（本明細書では特記されない限り、以後ＰＭＬと呼ぶ）が選択された。
【０２６７】
ＰＭＬは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑと共発現した場合、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ核内封入体のサイズを有意に減少させた（図１Ｂ）。それはまたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰタンパク質、特に凝集したＳＳ種及びＳＲ種の定常状態レベルを減少させた（図１Ｃ、左）。内因性ＰＭＬ（全てのアイソフォーム）の効果を評価するために、それは、２つの独立した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用してノックダウンされた。これは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、特に凝集種のレベルを著しく上昇させた（図１Ｃ、右）。ＰＭＬのサイレンシングもまた、ＦＬＡＧでタグ化されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の定常状態レベルを上昇させた（図８Ｂ）。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑに対するＰＭＬ ｓｉＲＮＡの効果は、ｓｉＲＮＡ抵抗型のＰＭＬによって復帰させることができ（図８Ｃ）、ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果は除外された。
【０２６８】
ＰＭＬが病原性Ａｔｘ１タンパク質を特異的に減少させるかどうかを評価するために、非病原性のアタキシン−１タンパク質、すなわちＡｔｘｎ１ ３０Ｑを使用した。ＰＭＬの強制発現によりＡｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰの存在量は減少しなかったが、ＰＭＬのノックダウンによってもそれは有意に増大せず（図１Ｄ）、これは病原性Ａｔｘｎ１タンパク質に対するＰＭＬの選択的効果を強調する。
【０２６９】
ＰＭＬは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ遺伝子の転写を阻害しなかった（図８Ｄ）。ＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の分解を促進するかどうかを決定するために、パルスチェイスアッセイを実施した。共トランスフェクトされたＰＭＬの非存在下において、全ての［３５Ｓ］標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質はかなり安定であり、そしてそのレベルは１８時間で僅か約２０％しか減少しなかった。これに対して、ＰＭＬの存在下では、全ての［３５Ｓ］Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質は不安定化され、そしてそのレベルは同じ期間かけて約８０％減少した（図１Ｅ）。
【０２７０】
実験をシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を使用して実施して、タンパク質の合成を遮断し、そして既存のＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の分解を調べた。ＰＭＬの強制発現は、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解を加速し、その半減期を約８時間から約２時間まで減少させ、一方で可溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑに対して最小限の効果しか及ぼさなかった（図１Ｆ）。逆に、ＰＭＬのサイレンシングは、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの半減期を延長し、そしてより低い程度で可溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの半減期を延長した（図１Ｇ）。ＰＭＬが凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去する能力は、プロテアソーム阻害剤のＭＧ１３２によって顕著に減少した（図１Ｈ）。これに対して、ＰＭＬはＡｔｘｎ１ ３０Ｑの半減期を変化させなかった（図８Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ＰＭＬが、プロテアソームによる分解のために、病原性Ａｔｘｎ１タンパク質を標的化するが、正常なＡｔｘｎ１タンパク質を標的化しないことを示す。
【０２７１】
核内ミスフォールドタンパク質の分解におけるＰＭＬの一般的役割
ＰＭＬが核内のミスフォールドタンパク質の分解において広範な役割を果たすかどうかを評価するために、神経変性症に連関した２つの追加のタンパク質を試験した：（１）ＨＤ遺伝子の第一エキソンによってコードされるハンチンチン（Ｈｔｔ）の病原性断片であるＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（Steffan et al., 2004, Science, 304: 100-104）；及び（２）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病としても知られる）及びユビキチン化封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−Ｕ）の両方に関連したＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）（Chen-Plotkin et al., 2010, Nat Rev Neurosci, 6: 211-220）。Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰは、核内及び細胞質内の両方において顕微鏡で見ることのできる封入体を形成したが（図１Ｉ）、ＴＤＰ−４３は主に核内に封入体を形成した。ＰＭＬは、核内のＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ封入体を減少させたが、細胞質内のＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ封入体を減少させず（図１Ｉ）、そして凝集したＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの量を減少させた（図１Ｊ、レーン１及び２）。ＰＭＬはまた凝集しているＴＤＰ−４３の量を減少させたが、可溶性ＴＤＰ−４３の量は減少させなかった（図１Ｋ）。
【０２７２】
これらの分析を伸展させるために、シャペロン基質モデルのホタルルシフェラーゼの構造的に不安定化された突然変異体（ＦｌｕｃＤＭ）を使用し、これは細胞内ＰＱＣ系の能力についての探索子として開発された（Gupta et al., 2011, Nat Methods, 8: 879-884）。内因性ＰＭＬは、封入体を形成した核内型のＦｌｕｃＤＭ（ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ）と部分的に共局在したが、野生型対応物（ｎＦｌｕｃＷＴ−ＧＦＰ）とは共局在せず、これは分散した局在化を示した（図８Ｆ）。ＰＭＬのサイレンシングは、凝集したｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰのレベルを著しく上昇させ（図８Ｇ）、そして全てのｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰタンパク質の半減期を延長した（図１Ｌ）。要するに、これらの結果は、ＰＭＬが、哺乳動物細胞核内における複数のミスフォールドタンパク質の除去を促進することを示す。
【０２７３】
ＰＭＬ上の個別の部位によるミスフォールドタンパク質の認識
ＰＭＬがミスフォールドタンパク質を分解する機序を調べるために、ＰＭＬがこれらのタンパク質を直接認識することができるかどうかをまず調べた。これらの実験のために、病原性（１０３Ｑ）及び非病原性（２５Ｑ）Ｈｔｔ断片（各々、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させている）を使用した。精製組換えタンパク質を用いたインビトロアッセイでは、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑを減少させたが、対照タンパク質であるＦＬＡＧ−ＧＦＰは減少させず（図２Ａ）、このことは、ＰＭＬとＨｔｔ １０３Ｑの間の特異的かつ直接的な相互作用を示す。ＦＬＡＧ−ＰＭＬはまた、ＧＳＴ−Ｈｔｔ ２５Ｑも減少させた。しかしながら、この相互作用は、ＰＭＬ−Ｈｔｔ １０３Ｑの相互作用よりかなり弱かった（図２Ａ）。相反する実験では、固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ １０３Ｑタンパク質はまた、固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ ２５ＱよりもＦＬＡＧ−ＰＭＬとより強く相互作用した（図９Ａ）。広範なミスフォールドタンパク質を認識する、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ４０は、ＰＭＬ−Ｈｔｔ １０３Ｑの相互作用を増強させなかった（図２Ａ）。これらの結果は、ＰＭＬがポリＱタンパク質と直接会合することができ、そして病原型と優先的に会合できることを示唆する。
【０２７４】
ＰＭＬが変性したルシフェラーゼと選択的に結合するかどうかも調べた。Ｎｉ−ＮＴＡビーズに固定された６ｘＨｉｓでタグ化されたルシフェラーゼを尿素で変性させたか、又は天然型で保持した。変性したルシフェラーゼは、ＧＳＴ−ＰＭＬと特異的に相互作用したが天然ルシフェラーゼは特異的に相互作用せず、そしてＨｓｐ７０／Ｈｓｐ４０系はこの相互作用を増強しなかった（図２Ｂ）。したがって、ＰＭＬは、ミスフォールドルシフェラーゼを直接認識することができるが、天然ルシフェラーゼを直接認識することはできない。
【０２７５】
ＰＭＬとミスフォールドタンパク質の相互作用についての分子基礎を解明するために、ＰＭＬの基質認識部位（ＳＲＳ）並びにこれらのＳＲＳが識別する基質上の構造的特徴を同定する努力がなされた。その長さに依存した様式で、ポリＱ及びフランキング領域はＣＣ構造（これはポリＱタンパク質がオリゴマー状態又は凝集状態へと会合することを促進する）を形成し、そしてまた、ポリＱタンパク質とＣＣ含有タンパク質の相互作用を媒介することが以前に示された（Fiumara et al., 2010, Cell, 143: 1121-1135）。したがって、ＰＭＬは、ＴＲＩＭ／ＲＢＣＣモチーフ内のそのＣＣ領域を介して、病原性ポリＱタンパク質と相互作用すると仮定された。一連のＰＭＬ断片（Ｆ１〜Ｆ５）を構築し、各断片はＣＣ領域を含有していたか又は欠失していたかのいずれかであった（図９Ｂ）。ＣＣ領域を含有している断片（Ｆ１）はＨｔｔ １０３Ｑと相互作用したが、この領域を欠失している２つの断片（Ｆ２及びＦ３）は相互作用しなかった（図９Ｂ及び図９Ｃ）。さらに、ＣＣ領域のみ（Ｆ４）はＨｔｔ １０３Ｑに結合したが、ＰＭＬタンパク質全体からこの領域を欠失させると（Ｆ５又はΔＣＣ）この結合は大きく減少した。したがって、ＰＭＬはほぼ排他的にＣＣ領域を通してＨｔｔ １０３Ｑを認識する。完全長ＰＭＬと同じように、ＰＭＬ ＣＣは、非病原性Ｈｔｔ ２５Ｑよりも病原性Ｈｔｔ １０３Ｑに対して明瞭な結合選択性を示した（図２Ｃ）。ＰＭＬ ＣＣはまた、別の病原性Ｈｔｔ構築物であるＨｔｔ ５２Ｑとも強く相互作用した（図２Ｃ）。したがって、ＰＭＬ ＣＣはＳＲＳ（ＳＲＳ１と呼ばれる）を構成する可能性が高い。
【０２７６】
ＰＭＬ ＣＣがＨｔｔタンパク質内の相同なＣＣ構造を認識するかどうかを試験するために、ＣＣの形成に関与すると予測されたＨｔｔ ５２Ｑ内の残基を突然変異させることにより、Ｈｔｔ ５２Ｑｃｃ−が得られた（図９Ｄ）。類似した突然変異が、Ｈｔｔ ７２Ｑ内のＣＣ構造の形成を減少させることが以前に示された（Fiumara et al., 2010, Cell, 143: 1121-1135）。実際に、Ｈｔｔ ５２Ｑｃｃ−はＨｔｔ ５２Ｑと比較して顕著に減少した凝集物形成傾向、及びＰＭＬ ＣＣとのかなり弱い相互作用を示した（図２Ｃ）。それ故、ＰＭＬ ＣＣ／ＳＲＳ１は、病原性Ｈｔｔタンパク質上のＣＣ構造と相互作用する可能性が高い。
【０２７７】
ＰＭＬはまた、ポリＱ以外のタンパク質、例えばルシフェラーゼ及びＴＤＰ−４３の分解も促進することを考えると（図１及び図８）、ＰＭＬは、ミスフォールドタンパク質上のＣＣ構造ではない特徴を識別することのできる少なくとも別のＳＲＳを含有する可能性があると判断された。この可能性を試験するために、一連のＰＭＬ断片を、変性ルシフェラーゼとの相互作用について調べた。ＣＣ領域のみで、変性ルシフェラーゼと相互作用することができたが、この領域を欠失しているがＣ末端（アミノ酸３６１〜６３３）を含有している２つの断片（Ｆ２及びＦ５）においても有意なレベルの相互作用が観察された（図９Ｂ及び図１０Ａ）。Ｃ末端内の追加の欠失構築物を使用して（Ｆ６〜Ｆ１８、図９Ｂ及び図１０Ｂ）、６３アミノ酸（アミノ酸５７１〜６３３）の伸長配列が変性ルシフェラーゼへの結合にとって十分であったことが判明した。この伸長配列のＮＨ２末端又はＣＯＯＨ末端のいずれかの欠失により、結合は消失した（図１０）。したがって、ＰＭＬの最後の６３アミノ酸が別のＳＲＳ（ＳＲＳ２と呼ばれる）を構成する可能性が高い。
【０２７８】
ＰＭＬ ＳＲＳ２によって認識され得るルシフェラーゼ内の線形配列を調べるために、精製されたＰＭＬ ＳＲＳ２を使用して、ルシフェラーゼの完全配列を提示したセルロースに結合させたペプチドライブラリーをスクリーニングした。該ライブラリーは、１８０個のペプチドからなり、各々は、隣のペプチドと１０個だけ重複している１３アミノ酸残基を含有していた。Ｈｓｐ７０及びＣｌｐＢなどのシャペロンと同じように（Rudiger et al., 1997, EMBO J, 16: 1501-1507; Schlieker et al., 2004, Nat Struct Mol Biol, 11: 607-615）、ＰＭＬ ＳＲＳ２はこれらのペプチドの部分集合のみに結合し（図２Ｄ）、このことは、異なるアミノ酸組成を有するペプチドを識別できることを示す。ライブラリー中の全てのペプチドに対する、ＰＭＬ ＳＲＳ２相互作用性ペプチドにおける２０個全てのアミノ酸の相対的存在率の分析は、ＰＭＬ ＳＲＳ２が芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）及び正に荷電した残基（Ａｒｇ及びＬｙｓ）を強く好み、そして負に荷電した残基（Ａｓｐ及びＧｌｕ）を嫌ったことを示した（図２Ｅ）。このアミノ酸の選択性は、ＳＲＳ２がＬｅｕ及びＨｉｓ（これはＣｌｐＢによって嫌われた）に対してさらなる選択性を示したこと以外は、ＣｌｐＢと類似していた（Schlieker et al., 2004, Nat Struct Mol Biol, 11: 607-615）。
【０２７９】
比較のために、ペプチドライブラリーへのＰＭＬ ＣＣ／ＳＲＳ１の結合を試験した。この領域が線形配列ではなく高次構造を認識するという概念と一致して、ＰＭＬ ＣＣ／ＳＲＳ１はほんの僅かのペプチドに弱く結合した（図９Ｅ）。これらの結果に基づいて、ＰＭＬは、ミスフォールドタンパク質を認識することのできる少なくとも以下の２つの領域を含有すると結論付けられた：ＴＲＩＭ／ＲＢＣＣモチーフ内のＣＣ領域（ＳＲＳ１）、並びにＣＣ構造と、芳香族アミノ酸及び塩基性アミノ酸の両方に富んだ露出ペプチドとをそれぞれ識別することのできるそのＣ末端の６３アミノ酸の伸長配列（ＳＲＳ２）。
【０２８０】
Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＳＵＭＯ化の関与
ＰＭＬが認識時にどのようにミスフォールドタンパク質の分解を促進するのかを調べるために実験を実施した。神経変性症に関連したミスフォールドタンパク質は、ＳＵＭＯによって頻繁に修飾されているが、この修飾の役割は依然として不明である（Martin et al., 2007, Nat Rev Neurosci, 8: 948-959）。哺乳動物細胞は３つの主要なＳＵＭＯタンパク質（ＳＵＭＯ１〜ＳＵＭＯ３）を発現する。ＳＵＭＯ２及びＳＵＭＯ３はその配列が互いにほぼ同一であり（まとめてＳＵＭＯ２／３と呼ぶ）、そしてＳＵＭＯ１に対して約５０％同一である（Wilkinson and Henley, 2010, Biochem J, 428: 133-145）。これらのＳＵＭＯタンパク質によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるその関与を調べた。
【０２８１】
Ａｔｘｎ１ ８２Ｑは、外来性ＳＵＭＯ１（Riley et al., 2005, J Biol Chem, 280: 21942-21948）及び内因性ＳＵＭＯ１（図３Ａ、左）の両方によって修飾され、そしてこの修飾は、Ａｔｘｎ１ ３０Ｑより弱かった（Riley et al., 2005, J Biol Chem, 280: 21942-21948）。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑはまた内因性ＳＵＭＯ２／３によっても修飾され（図３Ａ、右）、そして核内においてＧＦＰ−ＳＵＭＯ２／３と共局在していた（図３Ｂ）。ＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３とコンジュゲートしたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ内の部位は異なる可能性がある。なぜなら、ＳＵＭＯ１とのコンジュゲーションが損なわれた突然変異Ａｔｘｎ１ ８２ＱであるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）（Riley et al., 2005, J Biol Chem, 280: 21942-21948）は、ＳＵＭＯ２／３とのコンジュゲーションに全く異常を示さなかったからである（図１１Ａ）。
【０２８２】
注目すべきは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑは、Ａｔｘｎ１ ３０Ｑと比較して内因性ＳＵＭＯ２／３によってより強く修飾され（図３Ｃ）、これは、ＰＭＬにより媒介される分解に対するこれらのＡｔｘｎ１タンパク質の異なる応答に相関する（図１及び図８）。同じように、ＴＤＰ−４３は内因性ＳＵＭＯ２／３によって修飾された（図１１Ｂ）。ＳＵＭＯ２／３はまたＦｌｕｃＤＭ並びに別の構造的に不安定化されたルシフェラーゼ突然変異体であるＦｌｕｃＳＭも修飾した（Gupta et al., 2011, Nat Methods, 8: 879-884）。これらのルシフェラーゼ突然変異体のＳＵＭＯ２／３による修飾もまた、野生型ルシフェラーゼよりも強かった（図１１Ｃ）。
【０２８３】
さらに、プロテアソームの阻害は、Ａｔｘｎ１ ８２ＱとＧＦＰ−ＳＵＭＯ２／３の共局在化を増強させた（図３Ｂ）。それはまた、ユビキチン化Ａｔｘｎ１ ８２Ｑと同時に、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑも増加させたが、ＳＵＭＯ１により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑを増加させなかった（図３Ａ及び図３Ｄ、レーン２及び３）。同様に、プロテアソームの阻害は、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＴＤＰ−４３及びルシフェラーゼ突然変異体を増加させた（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。
【０２８４】
Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びプロテアソームによる分解におけるＳＵＭＯタンパク質の役割を評価するために、ＳＵＭＯ２／３及びＳＵＭＯ１をｓｉＲＮＡを使用して別々にサイレンス状態とした。ＳＵＭＯ２／３のサイレンシングにより、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化は効果的に減少したが、ＳＵＭＯ１のサイレンシングによっては減少しなかった（図３Ｄ、レーン４〜７）。ＳＵＭＯ２／３のサイレンシングによりまた、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、特に凝集型のレベルも上昇したが、対照タンパク質のＧＦＰのレベルは上昇せず（図１１Ｄ〜図１１Ｆ）、そしてそれはＰＭＬが、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去する能力を減少させた（図３Ｅ）。
【０２８５】
ＳＵＭＯ２及びＳＵＭＯ３は、ポリ鎖の形成を可能とする内部ＳＵＭＯ化共通部位を含有している。ＳＵＭＯ１はこの部位を含有せず、そしてそれをＳＵＭＯ２／３鎖にコンジュゲートさせると、鎖の伸長を終了させることができる（Wilkinson and Henley, 2010, Biochem J, 428: 133-145）。それ故、ＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾を阻害するために２つの追加の戦略が使用された。まず、ＳＵＭＯ１を過剰発現させた。これは、ＳＵＭＯ２／３へのＡｔｘｎ１ ８２Ｑのコンジュゲーションを強力に減少させ、そして同時に、ユビキチンへのＡｔｘｎ１ ８２Ｑのコンジュゲーション（図３Ｄ、レーン８及び９）及びＰＭＬによるその分解（図３Ｆ、左）を妨害した。第二に、鎖形成の欠損したＳＵＭＯ２突然変異体であるＳＵＭＯ２ ＫＲを使用した。ＳＵＭＯ２ ＫＲの過剰発現は、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ種、特に高分子量種の量を効果的に減少させた。それはまた、ユビキチンにより修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ種も減少させ（図３Ｄ、レーン１２及び１３）、そしてＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２Ｑを分解する能力も鈍らせた（図３Ｆ、右）。さらに、ＳＵＭＯ化の欠損したＨｔｔ突然変異体であるＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（Steffan et al., 2004, Science, 304: 100-104）を使用し、そしてそれはＰＭＬにより媒介される分解に対して抵抗性であることが判明した（図１Ｊ）。要するに、これらの結果は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び同じような他のミスフォールドタンパク質のユビキチン化及び分解は、ＳＵＭＯ２／３によるその修飾に依存していることを示す。
【０２８６】
Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼとしてのＰＭＬ
ＰＭＬは、ＳＵＭＯ化の効力及び特異性を増強するＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を有することが以前に実証された（Chu and Yang, 2011, Oncogene, 30: 1108-1116）。したがって、ＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進するかどうかを調べた。細胞内でＡｔｘｎ１ ８２Ｑと共発現させると、ＰＭＬは、プロテアソーム阻害剤のＭＧ１３２の非存在下及び存在下の両方において、ＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾を強く増加させた（図４Ａ）。逆に、ＰＭＬのサイレンシングは、これらの条件下においてＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑを著しく減少させた（図４Ｂ）。同様に、ＰＭＬのサイレンシングは、ＳＵＭＯ２／３によるｎＦｌｕｃＤＭの修飾を減少させた（図４Ｃ）。
【０２８７】
Ａｔｘｎ１ ８２Ｑに対するＰＭＬのＳＵＭＯ Ｅ３活性を確認するために、精製された組換えタンパク質を用いてインビトロでのＳＵＭＯ化アッセイを実施した。ＰＭＬの非存在下では、Ａｔｘｎ１ ８２ＱはＳＵＭＯ２によって弱く修飾され（図４Ｄ及び図４Ｅ）、これは、ＳＵＭＯ化がＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼがなくてもインビトロで進行し得るという以前の観察と一致した（Wilkinson and Henley, 2010, Biochem J, 428: 133-145）。注目すべきことに、ＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を用量依存的に増大させた（図４Ｄ及び図４Ｅ）。これに対して、ＳＵＭＯ Ｅ３の欠損した突然変異体のＰＭＬ Ｍ６（Chu and Yang, 2011, Oncogene, 30: 1108-1116）はそれができなかった（図４Ｅ及び図１１Ｇ）；ＰＭＬ Ｍ６はまた、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることにおいても無効であった（図４Ｆ）。これらの結果は、ＰＭＬはＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼであり、そしてこの活性がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与していることを示唆する。
【０２８８】
ミスフォールドタンパク質の分解におけるＲＮＦ４の役割
ポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートしたタンパク質は、４つの直列のＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）を有するＲＩＮＧドメインユビキチンリガーゼであるＲＮＦ４によって認識及びユビキチン化され得る（Sun et al., 2007, EMBO J, 26: 4102-4112）。しかしながら、ミスフォールドタンパク質の分解におけるＲＮＦ４の役割は依然として定義されていない。ＲＮＦ４の強制発現は、細胞溶解液中の凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの定常状態レベル（図５Ａ）、並びに、核内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体の数（図１２Ａ）を強力に減少させた。ＲＮＦ４はまた、凝集しているＡｔｘｎ１ ８２Ｑの半減期も短縮させたが、可溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの半減期は短縮させなかった（図５Ｂ、レーン１〜１２；図５Ｃ及び図１２Ｂ）。逆に、内因性ＲＮＦ４を３つのｓｉＲＮＡを用いて個々に又は組み合わせてノックダウンすることにより、細胞溶解液中の全ての及び凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質（図５Ｄ、図１２Ｃ及び図１Ｄ）、並びに、核内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体（図５Ｅ）は増加した。ｓｉＲＮＡに抵抗型のＲＮＦ４は、ＲＮＦ４ノックダウンの効果を復帰させることができ（図１２Ｃ）、これはｓｉＲＮＡの特異性を示す。
【０２８９】
さらに、内因性及び外因性ＲＮＦ４タンパク質の両方共が通常、分散した核内分布パターンを示し、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体と最小限又は中程度に共局在していた。しかしながら、プロテアソームを遮断すると、ＲＮＦ４はＡｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体内に高度に濃縮されるようになり（図５Ｆ及び図１２Ｅ）、このことは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを排除するＲＮＦ４の試みが失速したことを反映している可能性が高い。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑに対するその効果とは対照的に、ＲＮＦ４はＡｔｘｎ１ ３０Ｑのレベルを減少させなかった（図５Ｇ）。要するに、これらの結果は、病原性Ａｔｘｎ１タンパク質の排除におけるＲＮＦ４の役割を実証する。
【０２９０】
ミスフォールドタンパク質に対するＲＮＦ４の一般的な効果を評価するために、それはＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ、ＴＤＰ−４３及びｎＦｌｕｃＤＭに対して試験された。ＲＮＦ４の強制発現は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ、特に凝集型を顕著に減少させたが、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）に対してははるかに弱い効果を示した（図５Ｈ）。同様に、ＲＮＦ４の強制発現はＴＤＰ−４３のレベルを減少させ（図１２Ｆ）、一方、ＲＮＦ４のサイレンシングは、核内封入体を有するＴＤＰ−４３発現細胞の比率を増大させた（図１２Ｇ及び図１２Ｈ）。プロテアソームを阻害すると、内因性ＲＮＦ４は、ＴＤＰ４３封入体内に高度に濃縮されるようになり（図１２Ｉ）、これは同じ条件下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体内におけるその蓄積と類似していた（図５Ｆ）。さらに、ＲＮＦ４のサイレンシングは、ｎＦｌｕｃＤＭの半減期を延長させた（図５Ｉ）。要するに、これらの観察は、ＲＮＦ４が多様なミスフォールドタンパク質の分解に重要な役割を果たすことを示唆する。
【０２９１】
ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を媒介する
ＰＭＬと同じように、ＲＮＦ４がミスフォールドタンパク質を排除する能力は、ＳＵＭＯ２／３に依存していた。なぜなら、この能力は、ＳＵＭＯ２／３の欠損した細胞では損なわれたが、ＳＵＭＯ１の欠損した細胞では損なわれなかったからである（図１３Ａ）。注目すべきは、ＲＮＦ４の強制発現は、未修飾タンパク質よりも、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及びｎＦｌｕｃＤＭを優先的に減少させた（図６Ａ及び図６Ｂ）。逆に、ＲＮＦ４のサイレンシングは、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑを増加させ（図６Ｃ）、そしてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体へのＧＦＰ−ＳＵＭＯ２の局在化を増強させた（図１３Ｂ）。これらの結果は、ＲＮＦ４が、分解のためにＳＵＭＯ２／３により修飾されたミスフォールドタンパク質を標的化することを示す。
【０２９２】
ＲＮＦ４がＳＵＭＯ２／３のコンジュゲートしたミスフォールドタンパク質をユビキチン化することを確認するために、インビトロでのユビキチン化アッセイを、未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質とＳＵＭＯ２により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質との混合物を使用して実施した（図６Ｄ）。漸増用量のＲＮＦ４の存在下において、比較的低分子量であるＳＵＭＯ２により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質（図６Ｅ、レーン１、６及び９）は、より高い分子量の種へと進行的に変換され、これもまたユビキチンによって修飾された（レーン２〜４、７〜９、及び１２〜１４）。これに対し、未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質はユビキチン化されなかった（レーン１〜４）。それ故、ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のためのユビキチンリガーゼであるが、未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のためのユビキチンリガーゼではない。
【０２９３】
ＲＮＦ４は、ユビキチンリガーゼ活性及びＳＵＭＯ結合活性の両方を有する（Sun et al., 2007, EMBO J, 26: 4102-4112）。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるこれらの活性の関与を確認するために、ユビキチンリガーゼ活性（ＣＳ及びＣＳ１）又はＳＵＭＯ結合活性（ＳＩＭｍ）のいずれかが欠損したＲＮＦ４突然変異体を作製した（図１３Ｃ）。ＣＳ及びＣＳ１は、そのユビキチンＥ３活性を欠失しているにも関わらず（図１３Ｄ）、依然としてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体と共局在することができた（図６Ｆ）。他方で、ＳＩＭｍは、かなりのレベルのユビキチンリガーゼ活性を保持していたが（図１３Ｅ）、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体と共局在することができなかった（図６Ｇ）。いずれのＲＮＦ４突然変異体クラスも、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去することができなかった（図６Ｈ）。要するに、これらの結果は、ＲＮＦ４が、そのＳＩＭ領域を介してＳＵＭＯ２／３により修飾されたミスフォールドタンパク質に結合し、そしてそのリガーゼ活性を介してこれらのタンパク質をユビキチン化することを示唆する。
【０２９４】
ＰＭＬの強制発現により、対照細胞内の凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑは効果的に排除されたが、この能力は、ＲＮＦ４の枯渇した細胞では大きく減少した（図６Ｉ）。逆に、ＲＮＦ４の強制発現は、対照細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解を加速するのに非常に効果的であるにも関わらず、ＰＭＬ枯渇細胞においてはそうすることができなかった（図５Ｂ、レーン１９〜２４対レーン７〜１２；及び図５Ｃ）。さらに、高いレベルのＡｔｘｎ１ ８２Ｑを示したＰＭＬ枯渇細胞におけるＲＮＦ４のサイレンシングは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルをさらに上昇させなかった（図１３Ｆ）。これらの結果は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＰＭＬとＲＮＦ４の相互依存性を示す。
【０２９５】
ＰＭＬの欠損は、ＳＣＡ１のマウスモデルにおいて行動表現型及び病理学的表現型を増悪させる
上記の結果は、連続的なＰＭＬにより媒介されるＳＵＭＯ化及びＲＮＦ４により媒介されるユビキチン化を通して、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び同じような他の核内ミスフォールドタンパク質を分解するＰＱＣ系を明らかとした。この系の生理学的役割を調べるために、小脳プルキンエ細胞内でＡｔｘｎ１ ８２Ｑ導入遺伝子（Ａｔｘｎ１ｔｇ／−）を発現しているＳＣＡ１マウスモデル（Ｂ０５）を使用した。ヒトＳＣＡ１患者と似て、Ｂ０５マウスは加齢と共に失調症及び神経学的異常を発症した（Burright et al., 1995, Cell, 82: 937-948）。マウスにおけるＲＮＦ４の欠損により胚の致死がもたらされ（Hu et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107: 15087-15092）、Ｂ０５マウスに対するその作用の分析は妨げられる。しかしながら、ＰＭＬノックアウト（ＰＭＬ−／−）マウスは生存可能であり、そして正常に発達するようである（Wang et al., 1998, Science, 279: 1547-1551）。Ｂ０５マウスをＰＭＬ−／−及びＰＭＬ野生型（ＰＭＬ＋／＋）マウスと交雑し、そして全ての遺伝子型（ＰＭＬ＋／＋、ＰＭＬ＋／−、及びＰＭＬ−／−、ＰＭＬ＋／＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−、ＰＭＬ＋／−：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−、及びＰＭＬ−／−：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−）の同腹仔を、運動性能及び神経病態の両方について比較した。
【０２９６】
運動性能（バランス、協調性、及び持久力を含む）を、加速してロータロッド装置を使用して評価した。あらゆる起こり得る行動異常が、発達障害ではなく、進行的に低下する能力に起因していたかどうかを決定するために、様々な年齢のマウスを調べた。長期運動記憶の影響を除外するために、ナイーブ動物のみを使用し、各々を４日間連続して試験した。
【０２９７】
７週齢において、全てのマウスはロータロッド上で同じように行動した（図７Ａ）。明確に異なる遺伝子型のマウス間で幾分の差異が観察されたが、それらは統計学的に有意ではなく（分散分析ｐ＝０．５３）、このことは、ＰＭＬ−／−マウスが、それらの運動機能に既存の障害を有さなかったことを示唆する。１１週齢において、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ導入遺伝子を欠失している全てのマウス（ＰＭＬ＋／＋、ＰＭＬ＋／−、及びＰＭＬ−／−）は依然として、その性能に統計学的な差は全く示さず（分散分析ｐ＝０．３３）（図７Ｂ）、そしてＰＭＬ＋／＋及びＰＭＬ＋／＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−も同じように行動した。これらの観察は、ＰＭＬの欠損又はＡｔｘｎ１ ８２Ｑ導入遺伝子の発現のいずれかのみでは、この年齢において運動異常を引き起こすには不十分であったことを示唆する。興味深いことに、ＰＭＬ−／−：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−は、ＰＭＬ＋／＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−又はＰＭＬ−／−マウスのいずれかと比較して、ロータロッド性能において重度な障害を示した。これらの３つの群の動物は、他の２つの群とは異なり、４日間連続した試験日の開始時には同等であったが、ＰＭＬ−／−：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスは、時間の経過と共に最小限の改善しか示さなかった。ロータロッド上でのＰＭＬ−／−：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスの改善が認められないことは、進行段階のＡｔｘｎ１ｔｇ／−マウスを回想させた（Clark et al., 1997, J Neurosci, 17: 7385-7395）。ＰＭＬヘテロ接合体対応物（ＰＭＬ＋／−：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウス）は、ロータロッド上で中等度の障害を示した（３つのＡｔｘｎ１ｔｇ／−群についての分散分析、ｐ＝０．０００４）（図７Ｂ）。したがって、ＰＭＬの欠損は、Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスの運動異常を増悪する。
【０２９８】
Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスの主要な神経病理学的表現型は、小脳皮質の最上部層（分子層）の構成成分であるプルキンエ細胞の変性である。この変性は最初に、分子層の縮み及びプルキンエ細胞樹状突起の萎縮に現れ、そして後にプルキンエ細胞体の減少に現れる（Burright et al., 1995, Cell, 82: 937-948; Clark et al., 1997, J Neurosci, 17: 7385-7395）。１２週齢においてＰＭＬ＋／−及びＰＭＬ−／−マウスは、分子層にほんの僅かなかつ統計学的に有意ではない縮みを示したが、ＰＭＬ＋／＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスは、ＰＭＬ＋／＋マウスと比較して識別可能な縮みを示した（図７Ｃ及び７Ｄ）。ＰＭＬ＋／＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスはロータロッド上でＰＭＬ＋／＋マウスと同じように行動したので（図７Ｂ）、ＰＭＬ＋／＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスにおける神経変性は臨界閾値に達していない可能性があった。ＳＣＡ１トランスジェニックモデルの行動表現型と病理学的表現型との間のこの非線形相関は以前に観察されている（Gehrking et al., 2011, Hum Mol Genet, 20: 2204-2212）。重要なことには、ＰＭＬ＋／＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスと比較して、ＰＭＬ＋／−：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウス及びＰＭＬ−／−：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスは、分子層の厚さにおいて、それぞれ中程度の減少及び強力なさらなる減少を示した（図７Ｃ及び図７Ｄ）。これは、ロータロッド上でのこれらの動物の悪化した性能と相関した（図７Ｂ）。したがって、ＰＭＬの欠損は、Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスにおける分子層の縮みを増悪する。
【０２９９】
プルキンエ細胞の樹状突起分岐はまた、プルキンエ細胞特異的タンパク質であるカルビンディンに対する抗体を用いての免疫蛍光染色によって調べられた。１２週齢において、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ導入遺伝子を含有している全ての群におけるプルキンエ細胞樹状突起の蛍光強度は非常に低いレベルまで減少し、これにより正確な比較は妨げられた（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。注目すべきことには、ＰＭＬ＋／＋同腹仔と比較して、ＰＭＬ−／−マウスはすでに、プルキンエ細胞の樹状突起分岐の強い減少を示したが、ＰＭＬ＋／−マウスは中程度の減少を示した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。これらの結果は、ＰＭＬそれ自体が、神経変性症に対する保護において役割を果たすことを示す。
【０３００】
ＰＭＬの欠損に関連した分子層の菲薄化及びプルキンエ細胞樹状突起の減少にも関わらず、異なる遺伝子型の１２週齢の動物間にプルキンエ細胞個体群の有意差は全く観察されなかった（図１４Ｃ）。１才齢において、ＰＭＬ−／−マウスは、ＰＭＬ＋／＋マウスと比較してプルキンエ細胞数のほんの軽度（１１．０％）かつ統計学的に有意ではない（ｐ＝０．１０７）減少を示したが、ＰＭＬ＋／＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスは顕著な減少を示した（図７Ｅ及び図７Ｆ）。注目すべきことには、ＰＭＬ−／−：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスは、ＰＭＬ＋／＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスと比較して、プルキンエ細胞密度の有意なさらなる減少を示し（約２４％、ｐ＝０．００２３）、そしてＰＭＬ＋／−：Ａｔｘｎ１ｔｇ／−マウスは中程度の細胞減少を示した（図７Ｅ及び図７Ｆ）。ここでも、これらの結果は、ＰＭＬの欠損が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ導入遺伝子によって引き起こされた神経病理学的異常を悪化させることを実証する。
【０３０１】
Ｂ０５マウスの神経変性症は、プルキンエ細胞内のユビキチン陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体の形成を伴う（Clark et al., 1997, J Neurosci, 17: 7385-7395）。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ核内封入体に対するＰＭＬの効果を決定するために、これらの封入体を有するプルキンエ細胞を、１２週齢のマウスにおいて定量した。ＰＭＬの欠損だけでは、凝集物は形成されなかったが（図１４Ｄ）、それはＡｔｘｎ１ ８２Ｑトランスジェニックマウスにおいて凝集物含有プルキンエ細胞の数を有意に増加させる（図７Ｇ及び図７Ｈ）。要するに、これらの結果は、内因性ＰＭＬが、ＳＣＡ１動物におけるミスフィールドタンパク質の蓄積の防止及びこの神経変性疾患の進行の抑制に役割を果たすことを示唆する。
【０３０２】
ミスフォールドタンパク質を分解するＰＱＣ系
哺乳動物細胞核内のミスフォールドタンパク質を分解するＰＱＣ系についてのエビデンスが本明細書に提示されている。この系は、ミスフォールドタンパク質に選択的に結合しそしてこれらのタンパク質をポリＳＵＭＯ２／３鎖を用いて印を付ける認識部門であるＰＭＬ、並びに、ＳＵＭＯ化されたミスフォールドタンパク質をユビキチン化しそしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化するエフェクター部門であるＲＮＦ４を含む。この連携系は、哺乳動物細胞内のミスフォールドタンパク質とプロテアソームとの間の重要な連関を提供している可能性が高く、そしてそれは、神経変性症及び他のタンパク質症に対する保護において重要な役割を果たし得る（図７Ｉ）。
【０３０３】
ＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の選択的認識
この系の精巧な選択性は、少なくとも２つのＳＲＳを含有するＰＭＬに存する。ＴＲＩＭ／ＲＢＣＣモチーフ内のＣＣ領域からなるＳＲＳ１は、病原性ポリＱタンパク質及びおそらく他のミスフォールドタンパク質上のＣＣ構造を好む。Ｃ末端の６３アミノ酸からなるＳＲＳ２は、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）及び正に荷電したアミノ酸（Ａｒｇ及びＬｙｓ）の両方の富んだ短いペプチドを認識する。ＳＲＳ２が、ミスフォールドタンパク質において露出していることが多くかつＨｓｐ７０が関与する残基であるＬｅｕを含有しているペプチドも好む（Rudiger et al., 1997, EMBO J, 16: 1501-1507）ということ以外、ＳＲＲ２は細菌Ｈｓｐ１００ＣｌｐＢ（Schlieker et al., 2004, Nat Struct Mol Biol, 11: 607-615）と類似している。したがって、ＳＲＳ２は、ＣｌｐＢ及びＨｓｐ７０に対して二重基質特異性を示す。これらの観察は、ＰＭＬがミスフォールドタンパク質に一般的に認められる構造又は領域を認識することができることを示す。
【０３０４】
ミスフォールドタンパク質の分解におけるＳＵＭＯ化の役割
ＳＵＭＯへのコンジュゲーションは、数多くのタンパク質で起こる主要な翻訳後修飾であり、そして大半の真核生物の生命にとって不可欠である。しかし、それはタンパク質間相互作用を変化させるという一般論以外には、ＳＵＭＯ化の生理学的機能は依然として解明されていない（Wilkinson and Henley, 2010, Biochem J, 428: 133-145）。ＰＭＬ−ＲＮＦ４系の卓越した特徴は、ユビキチン化の前のＳＵＭＯ２／３による修飾の関与である（図３、図４、及び図１１）。細胞内タンパク質へのＳＵＭＯ２／３のコンジュゲーションは、タンパク質変性ストレスによって顕著に増強されることが以前に観察された（Saitoh and Hinchey, 2000, J Biol Chem, 275: 6252-6258）。本研究に提示されたエビデンスはこの観察の説明を提供し、そしてＳＵＭＯ２／３による修飾の主な生理学的機能は、ユビキチン化と協奏的に作用して、ミスフォールドタンパク質の分解を促進する可能性が高いことを示唆する。
【０３０５】
ＳＵＭＯとのコンジュゲーションは、タンパク質の溶解度を増強させる（Panavas et al., 2009, Methods Mol Biol, 497: 303-317）。凝集したタンパク質はプロテアソームによって効果的に分解されることができないので（Verhoef et al., 2002, Hum Mol Genet, 11: 2689-2700）、タンパク質の溶解度を増強させることは、ユビキチン化前にＰＭＬによって付与される有益な効果であり得る。さらに、ＳＵＭＯ化の程度は、所与のミスフォールドタンパク質がリフォールディングのために選択されるか又は分解のために選択されるかに関する「トリアージ決断」を可能とし得る。この概念と一致して、単一のＳＵＭＯへのコンジュゲーションは、タンパク質の溶解度を増強するのに十分であるようであり（Panavas et al., 2009, Methods Mol Biol, 497: 303-317）、したがってリフォールディングを促進し得る。これに対して、ＳＵＭＯ２／３鎖へのコンジュゲーションは、ユビキチン化及び分解のためのＲＮＦ４上の４つの直列ＳＩＭによる効果的な認識のために必要とされる（Tatham et al., 2008, Nat Cell Biol, 10: 538-546）。このような鎖はリフォールディングの試みが失敗した後に形成され得る。
【０３０６】
ミスフォールドタンパク質のＳＵＭＯ化は、神経変性疾患を促進又は阻害のいずれかを行なうと報告されている（Martin et al., 2007, Nat Rev Neurosci, 8: 948-959）。これらの矛盾しているように思われる観察は、ミスフォールドタンパク質の除去におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３の明確に異なる機能に（図３）、並びにＳＵＭＯ化の機能が二分していること（異常なタンパク質の溶解度を増強すること（これはその毒性を増強させ得る）、及びその分解を促進すること）に合致し得る。したがって、上昇したＳＵＭＯ化の結果は、それが細胞内分解能と適合し得るかどうかに依存する可能性が高い。
【０３０７】
可能性ある主なＰＱＣ系
核内のタンパク質は、何処にあるタンパク質でもそうであるように、突然変異を有し得るか、又は急性及び慢性の損傷を維持し得る。核の非常に混雑した環境により、タンパク質の質を維持することが特に困難となる可能性が高い。ユビキチン−プロテアーゼ経路は、核内の主な分解系であると予想され、核内ではオートファジーが作動することは知られていない。以前の研究は、核内ミスフォールドタンパク質の分解における、いくつかのユビキチンリガーゼ、例えば酵母Ｓａｎ１及びＤｏａ１０並びに哺乳動物ＵＨＲＦ−２及びＥ６−ＡＰの関与を示した（Cummings et al., 1999, Neuron, 24: 879-892; Deng and Hochstrasser, 2006, Nature, 443: 827-831; Gardner et al., 2005, Cell, 120: 803-815; Iwata et al., 2009, J Biol Chem, 284: 9796-9803）。それにも関わらず、多様なミスフォールド核内タンパク質に対するＰＭＬ及びＲＮＦ４の強力な効果と共に、ＰＭＬが圧倒的に核内に局在化することは、ＰＭＬ−ＲＮＦ４系が哺乳動物細胞核における主なＰＱＣ系の可能性が高いことを示唆する。
【０３０８】
ＴＲＩＭファミリータンパク質は、Ｃ．エレガンスの約２０個のメンバーからマウス及びヒトの７０個を超えるメンバーまで、後生動物間で共有されている（Ozato et al., 2008, Nat Rev Immunol, 8: 849-860）。少なくともいくつかの他のＴＲＩＭタンパク質もまたＳＵＭＯ Ｅ３活性を有していることが以前に実証された（Chu and Yang, 2011, Oncogene, 30: 1108-116）。核内に加えて細胞質内へのその局在化を考えると（Ozato et al., 2008, Nat Rev Immunol, 8: 849-860）、ＴＲＩＭタンパク質はまた細胞質内のＰＱＣにも関与していることが推測される。進化中のＴＲＩＭタンパク質の急速な増殖は、一部には、長寿命動物の細胞内のタンパク質の質を管理する複雑さが増していることに対する応答である可能性がある。
【０３０９】
ＲＮＦ４は、脊椎動物間で保存されている（Sun et al., 2007, EMBO J, 26: 4102-4112）。ＳＵＭＯ依存性ユビキチンリガーゼはまた低級真核生物種にも存在し（Sun et al., 2007, EMBO J, 26: 4102-4112）、そして少なくとも１つの酵母転写因子突然変異体の分解にも関与している（Wang and Prelich, 2009, Mol Cell Biol, 29: 1694-1706）。したがって、ＰＭＬ−ＲＮＦ４系に類似した系が、これらの生物内のタンパク質の質を維持する上で役割を果たし得る可能性もある。
【０３１０】
ＰＭＬ−ＲＮＦ４系及び神経変性症
ＰＭＬ−／−マウスは、腫瘍発生をはじめとする様々な表現型について十分に特徴付けられている（Wang et al., 1998, Science, 279: 1547-1551）。本研究は、神経変性症からの保護におけるＰＭＬの役割を示す（図７及び図１４）。ＳＣＡ及びＨＤを含む神経変性障害は、通常、後期発症型疾患である。蓄積しつつあるエビデンスは、加齢中のＰＱＣの進行的な下降を示唆する（Balch et al., 2008, Science, 319: 916-919）。ＳＣＡ１、ＨＤ及びＡＬＳに関連した病原性タンパク質に対するＰＭＬ−ＲＮＦ４の強力な効果、並びにＳＣＡ１マウスモデルの進行に対するＰＭＬの欠損の強力な効果は、様々な神経変性疾患を有する患者における神経細胞封入体内のＰＭＬの蓄積と共に（Skinner et al., 1997, Nature, 389, 971-974; Takahashi et al., 2003, Neurobiol Dis, 13: 230-237）、ＰＭＬ−ＲＮＦ４系の不十分さ又は機能不全が、これらの疾患において役割を果たし得ることを示唆する。したがって、ＰＭＬ−ＲＮＦ４系及び類似の系は、その処置における価値ある標的であろう。
【０３１１】
実施例２：ＴＲＩＭタンパク質はミスフォールドタンパク質を認識し、そしてその分解を促進することができる
トリパータイトモチーフ含有（ＴＲＩＭ）ファミリーは、Ｃ．エレガンスの約２０個のタンパク質からマウス及びヒトの７０個を超えるタンパク質まで、後生動物細胞内の多くのタンパク質からなる。これらのタンパク質はそれらのＮ末端に特徴的なＴＲＩＭ又はＲＢＣＣモチーフを共有し、これはＲＩＮＧドメイン、１つ又は２つのＢボックス（これはＲＩＮＧドメインのように、亜鉛イオンが配位している）、及びコイルドコイル領域を含む。この後に、ＴＲＩＭタンパク質間ではるかにより可変性でありそして個別のモチーフを含有しているＣ末端領域が続く（Hatakeyama, 2011, Nat Rev Cancer, 11: 792-804; Ozato et al., 2008, Nat Rev Immunol, 8: 849-860）。ＴＲＩＭタンパク質は、癌及びウイルス感染から保護するプロセスをはじめとする、様々な細胞内プロセスを調節する。生化学的には、多くのＴＲＩＭタンパク質がユビキチンＥ３リガーゼ活性を示し、これはＴＲＩＭ／ＲＢＣＣ領域内のＲＩＮＧドメインに起因する。さらに、少なくともいくつかのＴＲＩＭタンパク質が、ＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）へのタンパク質のコンジュゲーションのためのＥ３リガーゼを有する。しかしながら、ＳＵＭＯ Ｅ３のＴＲＩＭファミリーの基質に関する未解決な問題は依然として残っている。
【０３１２】
上記のように、ＰＭＬ（前骨髄性白血病タンパク質；ＴＲＩＭ１９としても知られる）はミスフォールドタンパク質の排除において重要な役割を果たすことが実証された。ＰＭＬは当初、大半の急性前骨髄性白血病に関連しているｔ（１５；１７）染色体転座に関与している遺伝子産物として同定された。それは、ＰＭＬ核内構造体の主要な構造成分かつ同名成分である。ＰＭＬは、様々なミスフォールドタンパク質に特異的に結合しそしてその分解を促進することができることが示された。ＰＭＬは、個別の領域を介して、芳香族アミノ酸残基及びコイルドコイル構造に富んだペプチドをはじめとする、ミスフォールドタンパク質に見られる共通の特徴を識別することができる。その後、ＰＭＬは、ミスフォールドタンパク質を、ポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖を用いてそのＳＵＭＯ Ｅ３活性を通してタグ化する。これにより、修飾されたミスフォールドタンパク質は、ＳＵＭＯ標的化ユビキチンリガーゼ（ＳＴＵｂＬ）ＲＮＦ４によって認識されることが可能となり、このリガーゼはミスフォールドタンパク質をユビキチン化しそしてプロテアソーム内の連続的分解のためにそれらを標的化する。タンパク質の品質制御におけるＰＭＬの役割は、神経変性疾患に対する保護のために重要である。なぜなら、ＰＭＬの欠損は、アタキシン−１におけるポリグルタミン（ポリＱ）伸長配列の増幅によって引き起こされる進行的かつ致命的疾患である脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）のマウスモデルの行動表現型並びに神経病理学的表現型を増悪するからである。多くのＴＲＩＭタンパク質が存在することを考えると、ＰＭＬを使用して得られた結果は、ＰＭＬのような他のＴＲＩＭタンパク質がミスフォールドタンパク質を認識しそして分解することができるかどうかについての重要な問題を提起する。本明細書に提示された実験において、一連のＴＲＩＭタンパク質を分析し、そしてミスフォールドタンパク質を認識しそして分解する能力はＴＲＩＭタンパク質間で広範に存在することが観察され、このことは、後生動物細胞におけるタンパク質の品質制御におけるこのファミリーの重要な役割を示す。
【０３１３】
これらの実験において使用された材料及び方法をこれから記載する。
【０３１４】
プラスミド
ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７、ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ３２及びＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ５δは、ＰＣＲによってｐＲＫにおいて作製された。ＰＣＲ増幅用の鋳型は、オープンバイオシステムズ社から購入し、そして対応する遺伝子アクセッション番号はそれぞれＢＣ０１３５８０、ＢＣ００３１５４及びＣＶ０２９０９６である。３つ全ての遺伝子はヒト起源である。以下のプラスミドは以前に記載されていた：ＦＬＡＧ−ＰＭＬ（アイソフォームＩＶ）（Chu and Yang, 2011, Oncogene, 30: 1108-116）；Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30）；ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１（Ishikawa et al., 2006, FEBS Lett, 580: 4784-4792）；ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２２（長い形態）（Barr et al., 2008）；ＨＡ−ＴＲＩＭ３９（Lee et al., 2009, Exp Cell Res, 315: 1313-132）；ＨＡでタグ化されたＴＲＩＭ１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、及び３２（Reymond et al., 2001, EMBO J, 20: 2140-2151; Uchil et al., 2008, 2008, PLoS Pathog, 4: e16）；並びに、Ｎ末端のＨＡタグ又はＣ末端のＶ５タグのいずれかを有するタンパク質を発現している、残りのＴＲＩＭ発現プラスミド（Versteeg et al., 2013, Immunity, 38: 384-398）。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰのレベルに対するＴＲＩＭタンパク質の効果を分析するために、Ｔｒｉｍ１１（ＮＭ＿１４５２１４．２）、Ｔｒｉｍ１５（ＮＭ＿０３３２２９．２）、Ｔｒｉｍ２８（ＮＭ＿００５７６２．２）、Ｔｒｉｍ３４（ＮＭ＿０２１６１６．５）、Ｔｒｉｍ３９（ＮＭ＿０２１２５３．３）、Ｔｒｉｍ４２（ＮＭ＿１５２６１６．４）、Ｔｒｉｍ４３（ＮＭ＿１３８８００．１）、Ｔｒｉｍ６５（ＮＭ＿１７３５４７．３）、Ｔｒｉｍ６７（ＮＭ＿００１００４３４２．３）、Ｔｒｉｍ７０（ＮＭ＿００１０３７３３０．１）、Ｔｒｉｍ７１（ＮＭ＿００１０３９１１１．２）及びＴｒｉｍ７５（ＮＭ＿００１０３３４２９．２）を、５’−ＨＡタグを含有しているｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターに構築した。全ての他のＴｒｉｍプラスミドが得られた（Versteeg et al., 2013, Immunity, 38: 384-398）。
【０３１５】
ｓｉＲＮＡ
ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ（サンタクルズ社ｓｃ−３７１６７）は、5’-CCCAUUCCUUUAUUGUACA-3’（配列番号１５７）、5’-CAGAGAAUGACCACAUCAA-3’（配列番号１５８）、及び5’-CAGUUAUGUUGUCGUGUAU-3’（配列番号１５９）のセンス鎖配列を有する３つの異なるｓｉＲＮＡ二本鎖のプールであった。
【０３１６】
ＴＲＩＭ２７ｓｉＲＮＡはキアゲン社から購入し、センス鎖配列は5’-AACTCTTAGGCCTAACCCAGA-3’（配列番号１６２）であった。
【０３１７】
細胞培養及びトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞をＡＴＣＣから入手した。ＰＭＬ＋／＋及びＰＭＬ−／−ＭＥＦ細胞は、対応する遺伝子型を有するマウスの胚から得られた。細胞を標準的な培養条件で維持した。ＤＮＡプラスミドを、リポフェクタミン２０００を使用して細胞にトランスフェクトし、そしてｓｉＲＮＡをリポフェクタミン２０００又はＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン社）のいずれかを使用して製造業者の説明書に従って連日２回細胞にトランスフェクトした。ＤＮＡ及びｓｉＲＮＡの両方をトランスフェクトした場合、ＤＮＡを、２回目のｓｉＲＮＡのトランスフェクションの翌日にトランスフェクトした。ＭＧ１３２（シグマ社）を、最後のトランスフェクションから２４時間後に７．５〜１０μM（最終濃度）で４〜５時間かけて加えた。
【０３１８】
免疫蛍光法
カバーガラス上に培養した細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分間かけて固定し、０．２％トリトンＸ−１００を用いて１５分間かけて透過処理し、そして一次抗体及び二次抗体を用いて順次インキュベートした。一次抗体は抗ＨＡ、抗ＦＬＡＧ（マウスｍＡｂ Ｍ２、１：２，０００）（シグマ社）及び抗ＴＲＩＭ２７であった。二次抗体はＦＩＴＣのコンジュゲートした抗マウス、抗ウサギ（ザイムド社）、及び抗ヤギ（インビトロジェン社）ＩｇＧ；テキサスレッドのコンジュゲートした抗マウス及び抗ウサギＩｇＧ（ベクターラボラトリーズ社）；並びにローダミンレッド−Ｘのコンジュゲートした抗ヤギ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社）であった。その後、細胞に、ＤＡＰＩ（ベクターラボラトリーズ社）を含有している培地を載せ、そしてニコンＥｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００又はオリンパスＩＸ８１顕微鏡を用いて画像を取得した。
【０３１９】
細胞溶解液の分画、ウェスタンブロット、及びフィルター位相差アッセイ
試料を記載のように（Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30）調製した。簡潔に言えば、細胞を、２５０IU/mlのベンゾナーゼ（シグマ社）、１mM ＰＭＳＦ、１×完全プロテアーゼ混液（ロシュ社）、及び２０mM Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ；シグマ社）の補充されたＮＰ−４０溶解緩衝液（５０mMトリス、ｐＨ８．８、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ２、０．５％ＮＰ−４０、２mM ＤＴＴ）中に氷上で溶解した。細胞溶解液を４℃で１３，０００rpmで１５分間遠心分離にかけた。ＮＰ−４０可溶性（ＮＳ）タンパク質を含有している上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって分析した。ペレットを、２５０IU/mlのベンゾナーゼ、１mM ＰＭＳＦ、１×完全プロテアーゼ混液、及び２０mM ＮＥＭの補充されたペレット緩衝液（２０mMトリス、ｐＨ８．０、１５mM ＭｇＣｌ２、２mM ＤＴＴ）中に再懸濁した。ペレット画分を、２％ＳＤＳと５０mM ＤＴＴ中で煮沸し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルに進入したタンパク質（ＳＤＳ可溶性、ＳＳ）をウェスタンブロットによって検出した。フィルター位相差（ドットブロット）アッセイのために、煮沸されたペレットの一部を、孔径０．２μmのメンブランフィルターにアプライし、そしてフィルター上に留まったＳＤＳ抵抗性（ＳＲ）凝集物をイムノブロットによって分析した。一次抗体は、抗ＨＡ（ウサギ、Ｙ−１１、１：５００）（サンタクルズバイオテクノロジー社）；抗ＦＬＡＧ（マウス、Ｍ２、１：７，５００）、及び抗アクチン（ウサギ、１：１０，０００）（シグマ社）；抗ＧＦＰ（マウス、１：４，０００）（クロンテック社）；及びＳＵＭＯ２／３（ウサギ、１：２５０、アブジェント社）であった。二次抗体は、ＨＲＰ（サンタクルズバイオテクノロジー社）にコンジュゲートされていたか、又はＩＲＤ Ｆｌｕｏｒ８００若しくはＩＲＤ Ｆｌｕｏｒ６８０（ＬＩ−ＣＯＲ社）で標識されているかのいずれかであった。ウェスタンブロットをＥＣＬ試薬を使用して展開し、そしてＩｍａｇｅＪを使用して分析するか、又はオデッセイ赤外線イメージングシステムを用いて走査し、そしてImage Studio Lite（ＬＩ−ＣＯＲ社）を使用して分析した。
【０３２０】
タンパク質精製及びインビトロでのＳＵＭＯ化アッセイ
ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７及びＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを２９３Ｔ細胞において発現させ、そして改変を加えて以前に記載されているように（Tang et al., 2006, Nat Cell Biol, 8: 855-862; Tang et al., 2004, J Biol Chem, 279: 20369-20377）、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズ（シグマ社）によって精製した。細胞を、１mM ＰＭＳＦ及び１×完全プロテアーゼ混液の補充されたＩＰ溶解緩衝液（５０mMトリス、ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ−１００、０．５％ＮＰ−４０及び２mM ＤＴＴ）中で溶解した。ＴＲＩＭ２７の精製では、ＩＰ溶解緩衝液には２０μM ＺｎＣｌ２も補充された。溶解液を抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズと共に４℃で４時間から一晩インキュベートした。Ｍ２ビーズを、０、０．５、及び１M ＫＣｌを含有しているＩＰ溶解緩衝液を用いて並びに溶出緩衝液（５０mMトリス、ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、及び２mM ＤＴＴ）を用いて洗浄した。結合したタンパク質を、０．１〜０．３mg/mlの３×ＦＬＡＧペプチド（シグマ社）を含有している溶出緩衝液で溶出した。
【０３２１】
インビトロでのＳＵＭＯ化反応のための他の成分はボストンバイオケム社から購入した。インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイを、精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧ（６００ng/２００nM）、ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７、ＳＡＥ１／ＳＡＥ２（１２５nM）、Ｕｂｃ９（１μM）、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ２（２５μＭ）及びＢＳＡ（０．１μg/ml）を含有している反応緩衝液（５０mMトリス、ｐＨ７．５、５．０mM Ｍｇ２＋−ＡＴＰ、及び２．５mM ＤＴＴ）３０μl中で３７℃で１．５時間実施した。反応混合物を、２％ＳＤＳ及び５０mM ＤＴＴを含有しているＩＰ溶解緩衝液３０μlの添加及び９５℃で１０分間の加熱によって変性させた。加熱した反応混合物の１つの分取分をウェスタンブロット分析のために保存し、そして残りを、ＳＤＳを含まないＩＰ溶解緩衝液で２０倍に希釈した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを、抗ＨＡビーズ（ロシュ社）によって免疫沈降させ、そして抗ＳＵＭＯ２／３抗体を使用してＳＵＭＯ２／３による修飾について分析した。
【０３２２】
実験結果をこれから記載する。
【０３２３】
ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δと、病原性アタキシン−１及びハンチンチンタンパク質との共局在化
ＰＭＬ／ＴＲＩＭ１９は、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）に関連している８２個のグルタミンの伸長配列を有する病原性アタキシン１タンパク質であるＡｔｘｎ１ ８２Ｑをはじめとする様々な核内ミスフォールドタンパク質の分解を認識及び促進することができることが以前に示された（Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30）。ヒト及びマウスにおけるＴＲＩＭファミリータンパク質は、保存されたＴＲＩＭ／ＲＢＣＣモチーフのＣ末端領域の構造特徴に基づいて識別され得る７０個を超えるメンバーからなる（Ozato et al., 2008, Nat Rev Immunol, 8: 849-860）。大半のＴＲＩＭタンパク質は、この領域内に、１つ以上の保存されたドメインを含有し、その中の最も一般的なものとしては、ＰＲＹ−ＳＰＲＹドメイン（約４０個のＴＲＩＭタンパク質に存在）及び複数のＮＨＬドメイン（４つのＴＲＩＭタンパク質に存在）が挙げられる。さらに、いくつかのＴＲＩＭタンパク質は、Ｃ末端領域に認識可能なモチーフを含有していない。ＰＭＬのような他のヒトＴＲＩＭタンパク質がミスフォールドタンパク質を認識することができるかどうかを調べるために、ＴＲＩＭ２７（ＰＲＹ−ＳＰＲＹドメインを含む）、ＴＲＩＭ３２（複数のＮＨＬドメインを含む）、及びＴＲＩＭ５δ（公知のドメインを全く含まないＴＲＩＭ５の短いスプライス変異体）がまず選択された。ＨｅＬａ細胞において発現させると、これらの３つのＴＲＩＭタンパク質は、重複しているが明確に異なる細胞内局在化パターンを示した：ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２は、細胞質内及び核内の両方に局在したが、ＴＲＩＭ５δは細胞質内のみに局在した。それにも関わらず、３つ全てのタンパク質は、顆粒状構造体内のそれらのそれぞれの区画（群）に濃縮されている（図１５Ａ）。
【０３２４】
ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δと、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑとの、並びに、ＨＤに関連している９７個のグルタミンの伸長配列を含有しているハンチンチンタンパク質（Ｈｔｔ）断片（Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７Ｑ）との共局在化を調べるために実験を実施した。高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合物として発現されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑは、核内のみに封入体を形成したが、ＨＡでタグ化されたＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰは、核内及び細胞質内の両方に封入体を形成した（Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30）（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。外因性ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２は、核内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体（図１５Ａ）と、並びに核内及び細胞質内の両方のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７Ｑ封入体（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）と共局在した。さらに、内因性ＴＲＩＭ２７もまた、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体と共局在した（図１５Ｄ）。外因性ＴＲＩＭ５δは、細胞質内ＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ封入体とのみ共局在した（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）。したがって、そのＣ末端配列が異なるにも関わらず、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２及びＴＲＩＭ５δは、それらのそれぞれの細胞内区画（群）に形成されたミスフォールドタンパク質を認識することができる。
【０３２５】
ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δは、不溶性及び可溶性の両方のＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを低減させる
これらのＴＲＩＭタンパク質がミスフォールドタンパク質のレベルを減少させることができるかどうかを調べるために、それらの各々をＨｅＬａ細胞内においてＦＬＡＧでタグ化されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑと共に発現させた。ＮＰ４０可溶性（可溶性すなわちＮＳ）及びＮＰ４０不溶性であったがＳＤＳ可溶性（凝集又はＳＳ）であった、細胞溶解液中のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルを分析した。注目すべきことには、各ＴＲＩＭタンパク質は、可溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質及び凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを減少させることができた（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２もまた、ＮＢ−４０及びＳＤＳ（ＳＲ）の両方に対して抵抗性であったＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを減少させ、これは、フィルター位相差アッセイによって検出され、そしてβ−アミロイド構造（以下参照）を提示する可能性が高かった。
【０３２６】
３つ全てのＴＲＩＭタンパク質、特にＴＲＩＭ３２は、同じようなレベルで発現されると、可溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルの低減においてＰＭＬよりも強い活性を示した（図１６Ａ）。さらに、ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ５δの活性は幾分より弱かったが、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの低減におけるＴＲＩＭ３２の活性は、ＰＭＬと同等であった（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。ＴＲＩＭ２７がさらなる分析のために選択された。内因性ＴＲＩＭ２７の発現をｓｉＲＮＡを使用してノックダウンし、これにより、可溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質及び凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の両方のレベルは有意に増加した（図１６Ｃ）。要するに、これらの結果は、ＰＭＬと同じように、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δは、ミスフォールドタンパク質を除去することができることを示唆する。これらのＴＲＩＭタンパク質とは対照的に、ＳＵＭＯ Ｅ３のＰＩＡＳファミリーメンバーであるＰＩＡＳｙは、可溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑのいずれかのレベルを減少させることができなかった（図１６Ｄ）。
【０３２７】
Ａｔｘｎ１ ８２Ｑに対するＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２の効果はＰＭＬとは独立している
ＴＲＩＭ２７は、ＰＭＬ核内構造体に部分的に共局在している（Cao et al., 1998, J Cell Sci, 111(Pt 10): 1319-132）（図１７Ａ）。ＴＲＩＭ２７及び他の核内局在化ＴＲＩＭタンパク質であるＴＲＩＭ３２が、ミスフォールドタンパク質を分解するためにＰＭＬに依拠するかどうかを調べるために、ＰＭＬ野生型（ＰＭＬ＋／＋）及びＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用した。ＴＲＩＭ２７とＰＭＬ核内構造体の共局在にも関わらず、ＴＲＩＭ２７は、ＰＭＬの非存在下でさえＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物内に存在していた（図１７Ｂ）。ＳＤＳ不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物のレベルは、ＰＭＬ＋／＋ＭＥＦと比較してＰＭＬ−／−において顕著により高く（図１７Ｃ）、これは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの除去におけるＰＭＬの役割と一致する（Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30）。ＰＭＬの再導入は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物のレベルを減少させた。注目すべきことには、ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２は、ＰＭＬ＋／＋及びＰＭＬ−／−細胞の両方において凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを低減するに際してＰＭＬと同じぐらいに効果的であった（図１７Ｃ）。要するに、これらの結果は、ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２はＰＭＬとは独立してＡｔｘｎ１ ８２Ｑを排除することができることを示唆する。
【０３２８】
ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δは、ＳＵＭＯ２／３依存的な様式でプロテアソームによる分解のためにＡｔｘｎ１ ８２Ｑを標的化する
ＰＭＬは、そのＳＵＭＯ Ｅ３活性を介してミスフォールドタンパク質のプロテアソームによる分解を促進することが以前に判明した（Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30）。細胞をプロテアソーム阻害剤のＭＧ１３２を用いて処置した場合、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２及びＴＲＩＭ５δが可溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質及び特に不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を低減する能力は有意に損なわれ、このことは、これらの３つのＴＲＩＭタンパク質がまたプロテアソームによる分解のためにＡｔｘｎ１ ８２Ｑを標的化することを示唆する（図１８Ａ〜図１８Ｃ）。さらに、内因性ＳＵＭＯ２／３がｓｉＲＮＡを用いてノックダウンされた場合、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δはもはやＡｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルを効果的に低減させることができなかった（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）。したがって、これらのＴＲＩＭタンパク質もまた、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの分解においてＳＵＭＯ２／３に依拠する。
【０３２９】
一例としてＴＲＩＭ２７を使用して、ＰＭＬ以外のＴＲＩＭタンパク質がＡｔｘｎ１ ８２ＱのためのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼとして作用することができるかどうかを次に調べた。ＳＵＭＯ Ｅ１（ＳＡＥ１／ＳＡＥ２）、Ｅ２（Ｕｂｃ９）、ＳＵＭＯ２、及びＡＴＰをはじめとする、ＳＵＭＯ化反応成分と共にインキュベートすると、Ａｔｘｎ１ ８２ＱはＳＵＭＯ２に最小限にしかコンジュゲートしなかった。しかしながら、ＳＵＭＯ２へのＡｔｘｎ１ ８２Ｑのコンジュゲーションは、ＴＲＩＭ２７の用量依存的に増強され（図１８Ｇ）、このことは、ＴＲＩＭ２７がＡｔｘｎ１ ８２ＱのためのＳＵＭＯ Ｅ３であることを示唆する。
【０３３０】
ミスフォールドタンパク質との共局在は、ＴＲＩＭタンパク質の広く存在している特性である
これらの観察によって促され、残りのＴＲＩＭタンパク質を、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを認識するその能力について試験した。マウスには存在するがヒトには存在しない２つ（ＴＲＩＭ１２及びＴＲＩＭ３０）を除いて、他の全てのＴＲＩＭタンパク質はヒト起源である。各ＴＲＩＭをＨＡ、Ｆｌａｇ、又はＶ５エピトープのいずれかを用いてタグ化し、そしてＨｅＬａ細胞内でＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＥＧＦＰと共発現させた。
【０３３１】
ＴＲＩＭタンパク質の部分集合の以前の調査は、これらのタンパク質が細胞質内及び核内の両方の区画と同一であるとみなされることを示した（Reymond et al., 2001, EMBO J, 20: 2140-2151）。ここで試験されたＴＲＩＭタンパク質の中で、１１個（ＴＲＩＭ４２、４３、５３、５９〜６１、６７、７０〜７２、及び７５）は、免疫蛍光法によって検出することができなかった。残りの６３個のＴＲＩＭタンパク質の中で、その中の５つ（ＴＲＩＭ２２、２８、３３、６５、及び６６）が専ら核内に局在し、局在化パターンはＰＭＬに類していた。しかしながら、ここで試験されなかったこれらのＴＲＩＭタンパク質の特定のアイソフォームが細胞質内に存在し得るという可能性は排除できなかった。例えば、このような細胞質内アイソフォームがＰＭＬについて示されている。２７個のＴＲＩＭタンパク質（ＴＲＩＭ１〜５、７、９、１０、１３、１８、２０、２４、２５、２９、３４、３６、３７、３９、４５〜４７、５０、５４、６３、６９、及び７６）は主に又は専ら細胞質内に局在した。２７個のＴＲＩＭタンパク質（ＴＲＩＭ６、８、１１、１２、１６、２１、２３、２７、３０〜３２、３５、３８、４０、４４、４８、４９、５１、５２、５５、５６、５８、６２、６４、６８、７３及び７４）はかなりの量が核内及び細胞質内の両方に存在していた。多くのＴＲＩＭタンパク質が核内又は細胞質内に顆粒状又は繊維状の構造のいずれかを形成し、他は分散して局在し、そしてその中のいくつかは核周囲の局在を示した。しばしば、ＴＲＩＭタンパク質は、同じ又は異なる細胞のいずれかにおいてこれらの局在化パターンの組合せを示した（図１９及び表２）。
【０３３２】
ＰＭＬ／ＴＲＩＭ１９をはじめとする、１４個のＴＲＩＭタンパク質（ＴＲＩＭ６、８、１１、１９、２１、２２、２７、２８、３０、３２、３３、３５、３８及び５１）は、かなりの数の細胞において核内Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ封入体と共局在し（図１９及び表２）、３２個のＴＲＩＭタンパク質のほぼ４３％が、部分的に又は専らのいずれかで核内に存在していたことを示す。これらのＴＲＩＭタンパク質は、異なるＣ末端配列を有する明確に異なる亜群に由来する。６つのタンパク質（ＴＲＩＭ６、１１、２１、２２、３５及び３８）は、ＴＲＩＭ２７のように、ＰＲＹモチーフの後にくることが多いＳＰＲＹモチーフを含有しているＩＶ亜群のメンバーである。ＴＲＩＭ８は、ＰＭＬのように、公知のドメインを全く含有していない、Ｖ群のメンバーである。ＴＲＩＭ２８及びＴＲＩＭ３３は、ＰＨＤ−ＢＲモチーフを含有しているＶＩ群のメンバーである。ＴＲＩＭ３２は、５つのＮＨＬ反復配列を有するＶＩＩ亜群に属する。ＴＲＩＭ５１は、２つのＢボックスを欠失しているがＲＩＮＧドメイン及びコイルドコイル領域を含有しているＴＲＩＭ様タンパク質であると考えられ；それはまた、ＩＶ亜群のメンバーのようにＳＰＲＹドメインも含有している。要するに、これらの結果は、かなりの数のＴＲＩＭタンパク質が、それらのＣ末端における多様性にも関わらず、ミスフォールドタンパク質を認識する能力を有することを示す。
【０３３３】
他のＴＲＩＭタンパク質によって媒介されるミスフォールドタンパク質の分解
タンパク質の品質制御におけるＴＲＩＭタンパク質の役割を調べるために、ＴＲＩＭ５３（偽遺伝子）及びＴＲＩＭ５７（ＴＲＩＭ５９と同じ）並びにＴＲＩＭ１２及びＴＲＩＭ３０（マウス起源）を除く全てのヒトＴＲＩＭタンパク質を、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ分解能について試験した。３５個のヒトＴＲＩＭタンパク質（ＴＲＩＭ３、４、５、６、７、９、１１、１３〜１７、１９、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３４、３９、４３〜４６、４９、５０、５２、５８、５９、６５、７０、７４、及び７５）及びマウスＴＲＩＭ３０は、異なる程度でＡｔｘｎ１ ８２ＱのＮＳ及び／又はＳＳ画分のレベルを低減させることができた（図２０Ａ及び表２）。ＴＲＩＭ４、５、９、１１、１６、１７、２０、３０、３９、４３、６５、７０、７５をはじめとするいくつかのＴＲＩＭタンパク質は強力な活性を示し（図２０Ａ及び表２）、そして最も強い活性を有するものはＴＲＩＭ１１のようであった（図１６Ａ、図２０Ａ及び表２）。注目すべきことには、ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを低減させることができることが上記に示されているが、これはこのアッセイにおいては効果を示さなかった。この差異は、発現レベルに起因する可能性が高かった。上記の実験では、ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２をプラスミドｐＲＫ５にクローニングした。しかしこの章に記載された実験では、ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２はｐｃＤＮＡにクローニングされた。ｐｃＤＮＡプラスミドからの発現と比較してｐＲＫ５プラスミドからのより強力な発現が一貫して観察された。それ故、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを分解する活性を示さなかったものでさえ、その発現レベルが上昇すればそれらは示し得る。それ故、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの分解を促進する能力は、ＴＲＩＭタンパク質間に広く存在すると結論付けられる。
【０３３４】
注目すべきことには、ＴＲＩＭ２６、３３、４２、４７、４８、６６、６９及び７６をはじめとする、いくつかのＴＲＩＭタンパク質がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を阻害するのではなくむしろ増強した。このことは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑに対する様々なＴＲＩＭタンパク質の多様な効果を示唆する。
【０３３５】
平行して、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰに対するＴＲＩＭタンパク質の効果も調べた（図２０Ｂ）。ＴＲＩＭ３、１１、３０、６８、７４及び７５をはじめとする、ほんの僅かなＴＲＩＭタンパク質が、ＮＳ及び／又はＳＳ画分内のＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰのレベルを低減させることができた。ＴＲＩＭ１、４、６〜１０、１２〜１５、２１、２３〜２８、３２〜３９、４１〜４７、４９〜５１、５４〜５６、５８、６０〜６７、６９〜７３、７６及び７７をはじめとする、大半のＴＲＩＭタンパク質が、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰのレベルを増加させることができた。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑとは異なり、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰを発現しているほんの僅かな割合の細胞が封入体を含有していた。一貫して、ＳＳ画分内のＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰタンパク質の割合は、同じ画分内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの割合と比較して非常に低かった。また、以前の研究では、（ｐＲＫ５プラスミド内にクローニングされた）ＰＭＬはＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰのレベルを低減させることができたが、ここで（ｐｃＤＮＡにクローニングされた）ＰＭＬはできなかった。したがって、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰに対するＴＲＩＭタンパク質の効果は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑに対するそれらの効果のように、それらの発現レベルによっても影響され得る。これらの結果は、様々なミスフォールドタンパク質に対するＴＲＩＭタンパク質の様々な効果を示唆し、これはとりわけ、それらの発現レベルによって影響を受け得る。
【０３３６】
ＴＲＩＭタンパク質
以前に、ＰＭＬは、哺乳動物細胞の核内に提示された様々なミスフォールドタンパク質を排除することができることが示された。本明細書において提示された実験は、ほぼ全てのＴＲＩＭタンパク質を系統的に分析し、そしてそれらの中の前例のない多数が、ミスフォールドタンパク質を認識することができることを見い出す。依然として、この数は過小評価されている可能性が高い。なぜなら、１つのミスフォールドタンパク質のＡｔｘｎ１ ８２Ｑが主に使用されたからである。少なくとも２つの基質認識部位（ＳＲＳ）、すなわちＲＢＣＣモチーフ内のコイルドコイル領域及び最後の６０アミノ酸を含む領域が、ＰＭＬにおいて同定された。これらのＳＲＳは、コイルドコイル構造と、芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）に富んだペプチドとをそれぞれ識別することができ、これらはいくつかの変性したタンパク質に見られる。ＴＲＩＭタンパク質はそれらのＣ末端領域において最も多様である（Hatakeyama, 2011, Nat Rev Cancer, 11: 792-804; Ozato et al., 2008, Nat Rev Immunol, 8: 849-860）。他のＴＲＩＭタンパク質は、明確に異なる構造特徴のミスフォールドタンパク質を認識する特異的な能力を有し得る可能性が高い。また、多くのＴＲＩＭタンパク質が、細胞質内のミスフォールドタンパク質を認識することができる可能性が高い。したがって、この観察は、タンパク質の品質制御においてこの大きなファミリーが非常に重要であることを強調する。
【０３３７】
注目すべきことには、ＴＲＩＭ５δは、その細胞質内の局在化にも関わらずＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解を促進することができた。ＴＲＩＭ５δは、核内に輸送される前に、細胞質内で可溶性でミスフォールドされたＡｔｘｎ１ ８２Ｑを認識できる可能性がある。また、ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２は、可溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを分解する強力な能力を示し、一方、ＰＭＬはより少ない活性を示す。これは、ＰＭＬとは異なり、ＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２は一部が細胞質に局在し、細胞質内でＡｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質（及び実質的に全ての他のタンパク質）が生成されるという事実に関連し得る。したがって、核内へと向かうミスフォールドタンパク質を認識することによって、細胞質内ＴＲＩＭタンパク質は、核内でのタンパク質品質制御において重要な役割を果たし得る。
【０３３８】
ＰＭＬは、そのＳＵＭＯ Ｅ３活性に依存した様式でミスフォールドタンパク質を分解する（Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30）。同様に、ＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するのにＳＵＭＯに依拠する。インビトロでのアッセイはまた、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑに対するＴＲＩＭ２７のＳＵＭＯ Ｅ３活性を確認する。したがって、ＴＲＩＭタンパク質は、細胞からミスフォールドタンパク質を取り除くために同じような機序を使用し得る。ミスフォールドタンパク質を分解するための最も関連性のあるＳＵＭＯタンパク質は、ＳＵＭＯ２／３である。ＳＵＭＯ２／３によって形成されたポリ鎖は、ＲＮＦ４上の複数のＳＩＭによる認識を促進する（Tatham et al., 2008, Nat Cell Biol, 10: 538-546）。タンパク質品質制御における役割と一致して、ストレス無負荷の細胞におけるＳＵＭＯ２／３は主に非コンジュゲート型であるが、タンパク質損傷ストレス後に標的タンパク質とコンジュゲートするようになる（Golebiowski et al., 2009, Sci Signal, 2: ra24; Saitoh and Hinchey, 2000, J Biol Chem, 275: 6252-6258）。それにも関わらず、ＴＲＩＭタンパク質間の多様性及びいくつかに伴うユビキチンＥ３リガーゼ活性を考えれば（Meroni and Diez-Roux, 2005, Bioessays, 27: 1147-1157）、いくつかのＴＲＩＭタンパク質は主に、ミスフォールドタンパク質のためのユビキチンＥ３として機能し得るという可能性が依然としてある。
【０３３９】
現在、なぜいくつかのＴＲＩＭタンパク質は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑなどのミスフォールドタンパク質を分解することができるが、他のものはできないのかは不明である。また、試験されたＴＲＩＭタンパク質の中で、ＴＲＩＭ１１は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを低減する顕著に強力な活性を有する。何がその活性の原因となり得るかは依然として決定されていない。いくつかのＴＲＩＭタンパク質は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び特にＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰの発現レベルを増強することができる。これはさらに、これらのタンパク質の機能的多様性を強調する。ＴＲＩＭタンパク質は、タンパク質ミスフォールドを防ぐためのシャペロンとして、及び以前に形成されたタンパク質凝集物を溶解するための脱凝集剤として機能することができる。これらの活性は一部には、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び特にＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰを安定化させるためのＴＲＩＭタンパク質の効果の一因となり得る。これは、ミスフォールドタンパク質に関連した疾患の治療法におけるＴＲＩＭタンパク質の別の重要な用途を示唆する。多くのヒト疾患が、部分的に機能的である突然変異タンパク質の分解に密接に連関している。顕著な例は嚢胞性線維症（ＣＦ）であり、これは嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の突然変異によって引き起こされる。これらの突然変異は、細胞質内で分解される。ＣＦＴＲ突然変異体を安定化させるための治療法が開発され、これにより、ＣＦＴＲ突然変異体は、その機能を果たすためにメンバーに到達することが可能となる。ＴＲＩＭタンパク質を使用することにより、部分的に機能的なタンパク質の分解に関連したＣＦ及び他の疾患におけるこのような目標を達成し得ると想定される。
【０３４０】
【表２】
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【０３４１】
【表３】
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【０３４２】
【表４】
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【０３４３】
実施例３：哺乳動物細胞への組換えＴＲＩＭ１１の送達は、ミスフォールドタンパク質の分解を促進する
上記のように、トリパータイトモチーフ含有（ＴＲＩＭ）ファミリーメンバーは、ミスフォールドタンパク質の認識及び分解において重要な役割を果たすことが実証されている。最初に一例としてＰＭＬ／ＴＲＩＭ１９を使用して、ＰＭＬは、ミスフォールドタンパク質に共通して見られる構造特徴を認識する個別の領域を介してミスフォールドタンパク質に特異的に結合することができることが示された。その後、ＰＭＬは、そのＳＵＭＯ Ｅ３活性を使用して、ポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖を用いてミスフォールドタンパク質をタグ化する。これにより、ミスフォールドタンパク質は、ＳＵＭＯ化に標的化されるユビキチンリガーゼ（ＳＴＵｂＬ）ＲＮＦ４によって認識されることが可能となり、結果としてミスフォールドタンパク質のユビキチン化及びプロテアソームによる分解が起こる。このＰＭＬ−ＲＮＦ４により媒介される連続的なＳＵＭＯ化及びユビキチン化系は、神経変性疾患に対する保護において重要な役割を果たすことがさらに示された。
【０３４４】
続いて、公知の全てのヒトＴＲＩＭタンパク質の圧倒的大多数を調べ、そしてそれらの中のかなりの数が、病原性アタキシン１（Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ）及びハンチンチン（Ｈｔｔ９７Ｑ）タンパク質などのミスフォールドタンパク質によって形成された封入体に局在化することができることが判明した。代表的なＴＲＩＭタンパク質を試験することによって、多くのＴＲＩＭタンパク質もまた、ＳＵＭＯ依存的にミスフォールドタンパク質を分解することができることが示された。注目すべきことには、試験されたＴＲＩＭタンパク質の中で、あるＴＲＩＭタンパク質、すなわちＴＲＩＭ１１が、ミスフォールドタンパク質を低減させる特に強力な活性を示す。
【０３４５】
本明細書に提示された実験において、神経変性症に関連した細胞内ミスフォールドタンパク質を分解するための薬剤としての組換えＴＲＩＭ１１を開発することを探究した。このために、ＨＩＶ Ｔａｔ由来ペプチドが使用され、これはタンパク質を哺乳動物細胞に送達することができる（図２２）。ＴＲＩＭ１１を、Ｔａｔ由来ペプチドと融合させ、融合タンパク質を細菌において発現させ、そしてタンパク質を、アフィニティ樹脂、続いてゲルろ過カラムを使用して均一となるまで精製した。比較のために、Ｔａｔペプチドに融合させたＳＵＭＯ２タンパク質も平行して精製した。
【０３４６】
ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ、又はＨｔｔ９７Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えＴＲＩＭ１１又はＳＵＭＯ２タンパク質と共にインキュベートした。図２１Ａに示されているように、ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルは強く減少した。Ｈｔｔ９７Ｑのレベルも強く減少した（図２１Ｂ）。これに対し、ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルに対しては最小限の効果しか及ぼさなかった（図２１Ｃ）。これらのデータは、哺乳動物細胞へのＴＲＩＭ１１の送達が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低下させ、神経変性症及び他のタンパク質ミスフォールド疾患の治療法のためにＴＲＩＭ−ＲＮＦ４系を標的化するための証明又は概念の証拠を提供することを示唆する。
【０３４７】
実施例４：ＳＣＡ１及びＨＤ患者における神経細胞封入体へのＲＮＦ４の局在化
マウスにおけるＲＮＦ４の欠損により胚の致死がもたらされ（Hu et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107: 15087-15092）、神経変性症のマウスモデルに対するその欠損の分析は妨げられる。以前の研究は、ＰＭＬがＳＵＭＯ及びユビキチンと共に、ポリグルタミン疾患患者における神経細胞封入体と共局在することを示し（Dorval and Fraser; 2006, J BIol Chem 281:9919-24; Martin et al., 2007, Nat Rev Neurosci 8:948-59; Skinner et al., 1997, Nature 389:971-4; Takahasi et al., 2003, Neurobiol Dis 13:230-70）、このことは、これらの疾患におけるＰＭＬの関与を示唆する。本明細書に提示されたデータは、ヒトＳＣＡ１及びＨＤ患者の死後脳組織におけるＲＮＦ４の局在化を分析する。
【０３４８】
これらの実験において使用された材料及び方法をこれから記載する。
【０３４９】
ＨＤ患者組織（淡蒼球）はハーバード脳組織リソースセンターによって提供された：ＡＮ０６５６４、ＡＮ１２１２７、及びＡＮ１２０２９（凝集物が観察された）、並びにＡＮ０９０４８、ＡＮ１９６８５、ＡＮ１４９４２、ＡＮ１３６１２、及びＡＮ１７４６７（凝集物は全く観察されず）；ＳＣＡ１患者組織（基底点）は国立失調症財団から入手した。免疫組織化学法及び免疫蛍光法は、改変を加えて以前に記載されているように実施された（Duda et al., 2000, J Neuropathol Exp Neurol 59:830-41; Emmer et al., 2011, J Biol Chem 286:35104-18）。ＨＤ及びＳＣＡ１患者の脳をパラフィンに包埋し、そして６□m切片に切断した。切片を、示されているような抗ＲＮＦ４（＃１：ウサギ、１１−２５、１：３００、シグマ社；＃２：ヤギ、Ｃ１５、１：２５、サンタクルズ社）、抗ハンチンチン（マウス、ＭＡＢ５３７４、１：５００；ミリポア社）、抗ユビキチン（マウス、Ｕｂｉ−１、ＭＡＢ１５１０、１：２，０００；ミリポア社）、及び抗ポリＱ（マウスＭＡＢ１５７４、１Ｃ２、１：１，０００；ミリポア社）について染色した。対照ウサギ抗体を使用して、抗ＲＮＦ４染色の特異性を確認した。
【０３５０】
実験結果をこれから記載する。
【０３５１】
封入体を含まない患者の神経細胞において検出された場合、ＲＮＦ４は核全体に分散して分布しているか又は核内フォーカスを形成する傾向があった（図２３）。調べた２つのＳＣＡ１症例では、抗ポリＱ抗体（１Ｃ２）に対して反応性である核内封入体が存在していた。ＲＮＦ４は、それぞれ１６個中５個及び１７個中４個の１Ｃ２反応性核内封入体に認められた（図２４）。
【０３５２】
ＨＤ患者間では、抗ハンチンチン抗体又は抗ユビキチン抗体のいずれかに対して反応性である細胞質内封入体が、調べた８人中３人の患者試料における淡蒼球領域に存在していた。これは、核内封入体が成人発症型ＨＤ症例では稀であるという以前の観察と一致していた（DiFiglia et al., 1997, Science 277:1990-3）。それにも関わらず、ＲＮＦ４は、２つの別々の抗ＲＮＦ４抗体を用いての結果に基づいて淡蒼球領域内の封入体の約２０％と共局在していた（図２５及び図２６）。ＲＮＦ４を含有している封入体は、ハンチンチン又はユビキチンシグナルの輪によって囲まれたＲＮＦ４免疫反応性を示す傾向があった（図２５及び図２６）。ＳＣＡ１及びＨＤ患者におけるＲＮＦ４とポリＱ凝集物の部分的な共局在化は、ＰＭＬとポリＱ凝集物の部分的な共局在化を回想させ（Skinner et al., 1997, Nature 389:971-4; Takahashi et al., 2003, Neurobiol Dis 13:230-7）、そしてそれは疾患に罹患した神経細胞におけるＰＭＬ／ＴＲＩＭ−ＲＮＦ４系の遮断を反映し得る。
【０３５３】
実施例５：ＴＲＩＭタンパク質の分子シャペロン活性及びタンパク質脱凝集活性
本明細書に記載されたデータは、ＴＲＩＭ１１が、分子シャペロン及び脱凝集剤として機能することができることを実証する。１つの態様では、ＴＲＩＭ１１は、凝集物の形成を防ぐことができる。他方では、ＴＲＩＭ１１は、ストレスにより誘発された非アミロイド凝集物（ルシフェラーゼ及びＧＦＰ凝集物）をリフォールドできるだけでなく、アミロイド凝集物（Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物及びα−シヌクレイン線維）を脱凝集することができる。さらに、また、ＴＲＩＭ１１は、Ａｔｘｎ１ ８２ＱをＳＵＭＯ化し、そして続いて分解することができる、ＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼでもあることが本明細書において示される。それ故、ＴＲＩＭ１１は、タンパク質の脱凝集と分解との間の連関としての役目を果たし得る。
【０３５４】
これらの実験に使用された材料及び方法をこれから記載する。
【０３５５】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
マウスＴＲＩＭ１１ｓｉＲＮＡ（ｓｃ−７６７３５）はサンタクルズ社から購入した。１日目に、海馬神経細胞（１５０００個の細胞/ウェル）を播種培地を含む９６ウェルプレート中に播種した。２日目に（播種から約１８時間後）、播種培地から神経細胞用培地へと完全に交換した。３日目に、ｓｉＲＮＡ（１pmol）をリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸによって細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション法は、製造業者の説明書に従って実施された。
【０３５６】
細胞培養
ＨＣＴ１６細胞を、マッコイ５Ａ培地を用いて培養した。Ａ５４９細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養した。ＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ培地を用いて培養した。
【０３５７】
これらの培養培地は全て、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有している。一次神経細胞が得られた。神経細胞を以前に記載された方法に従って培養した。簡単に言えば、細胞をまず、播種培地（複合Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｂ２７、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳを示された希釈比で）を用いて播種した。１８〜２４時間後、播種培地を神経細胞用培地（複合Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｂ２７、ＧｌｕｔａＭＡＸ、及びペニシリン／ストレプトマイシンを示された希釈比で）に完全に交換する。通知したものを除いて、全ての細胞は加湿５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で維持された。
【０３５８】
免疫蛍光法
カバーガラス上に播種された細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。細胞をさらにメタノールを用いて２０℃で１０分間透過処理を行なった。細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、そして次いで２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって室温で３０分間かけて遮断した。細胞を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、続いて蛍光二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。最後に、カバーガラスを、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ベクトンラボラトリーズ社；Ｈ−１２００）を含有している封入剤と共にスライドガラスに載せた。抗体の希釈のために、抗ＨＡ（１：１００）、抗ｐ−α−Ｓｙｎ（１：１００）及び抗ｐ６２（１：２００）を適用した。
【０３５９】
抗体
抗ＴＲＩＭ１１（ＡＢＣ９２６）抗体はミリポア社から購入した。モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体、ウサギＦｌａｇ抗体、及び抗Ｆｌａｇアガロースビーズはシグマ社から購入した。抗ＨＡアフィニティマトリックス（クローン３Ｆ１０、１１８１５０１６００１）はロシュ社から購入した。抗ＨＳＦ１（ｓｃ−９１４４）はサンタクルズ社から購入した。抗α−シヌクレインホスホ−Ｓｅｒ１２９（８２５７０１）はバイオレジェンド社から購入した。抗Ｈｓｐ７０（ＡＤＩ−ＳＰＡ−８１０−Ｄ）はエンゾ社から購入した。抗α−シヌクレイン（２６４２）及び抗Ｈｓｐ９０（４８７４）はセルシグナリングテクロノロジー社から購入した。
【０３６０】
タンパク質の分画、フィルター位相差アッセイ及びイムノブロット
細胞を溶解緩衝液（５０mMトリス、ｐＨ８．８、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ２、０．５％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０、１mM ＤＴＴ、２５０IU/mlベンゾナーゼ（シグマ社）、１mM ＰＭＳＦ、及び１×完全プロテアーゼ混液（ロシュ社））を用いて氷上で３０分間かけて溶解した。上清は、１３０００rpmで４℃で１５〜２０分間遠心分離することによって得られた。ペレットをさらにペレット緩衝液（２０mMトリス、ｐＨ８．０、１５mM ＭｇＣｌ２、１mM ＤＴＴ、２５０IU/mlベンゾナーゼ、１mM ＰＭＳＦ、及び１×完全プロテアーゼ混液）に氷上で３０分間かけて再懸濁し、その後、２％ＳＤＳ緩衝液と共に直接煮沸した。タンパク質の濃度をブラッドフォードアッセイ（バイオラッドラボラトリーズ社）によって測定した。全てのタンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによるイムノブロットにかけた。上清は可溶性画分と判断された。ペレットは不溶性画分（ＳＤＳ可溶性）と判断された。他の部分はフィルター位相差アッセイにかけられた。簡単に言えば、ペレット試料を孔径０．２μMのメンブランを通してろ過し、これによりメンブラン上に保持されたＳＤＳ抵抗性凝集物をイムノブロットによって分析した。
【０３６１】
タンパク質の精製
Ｆｌａｇ−Ａｔｘｎ１−８２Ｑ−ＨＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、そして抗Ｆｌａｇ Ｍ２ビーズによって精製した。高度に精製されたタンパク質を得るために、ビーズを漸増濃度のＮａＣｌを用いて十分に洗浄した。
【０３６２】
Ｈｉｓ−ルシフェラーゼを、ＢＬ２１ ＤＥ３細胞において発現させ精製した。固定化された天然の又は変性させたルシフェラーゼを生成するために、天然ルシフェラーゼをまず、製造業者の説明書に従って細菌細胞溶解液から精製した。第二に、天然ルシフェラーゼを８M 尿素と共に５分間インキュベートすることによって、変性ルシフェラーゼを生成した。
【０３６３】
インビボ及びインビトロでのＳＵＭＯ化アッセイ
インビボでのＳＵＭＯ化アッセイのために、細胞を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトした。４８時間後、細胞を、２％ＳＤＳ及び５０mM ＤＴＴの補充された溶解緩衝液（５０mMトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１５０mM ＮａＣｌ、０．５％トリトン、１mM ＤＴＴ、１mM ＰＭＳＦ、及び１×完全プロテアーゼ混液）中に溶解した。細胞溶解液をさらに９５℃で１０分間煮沸した。１つの分取分をインプットのために保存した。残りの細胞溶解液を溶解緩衝液で１０倍に希釈し、そしてその後、抗ＨＡビーズと共に４℃で一晩インキュベートした。ビーズを十分に洗浄し、そして示された抗体を用いてイムノブロットによって分析した。インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−２（ＵＬ−７５３）、ＵｂｃＨ９（Ｅ２−４６５）及びＳＵＭＯ Ｅ１（Ｅ−３１５）はボストンバイオケム社から購入した。
【０３６４】
プラスミド
Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１は、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩ ＴＲＩＭ１１ ｃＤＮＡを、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩにより消化されたｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｌａｇベクターに挿入することによって構築された。Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１突然変異（１２／１３ＥＥから１２／１３ＡＡ）は、部位特異的突然変異によって作製された。ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１は、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ ＴＲＩＭ１１ ｃＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩにより消化されたｐＧＥＸ−１λＴベクターに挿入することによって構築された。ＧＦＰ−Ｈｓｐ７０及びＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１は、Ｈｓｐ７０及びＴＲＩＭ１１ｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターに挿入することによって構築された。全ての構築物はＤＮＡシークエンスによって確認された。
【０３６５】
ルシフェラーゼ再活性化アッセイ
凝集物を生成するために、ルシフェラーゼリフォールディング緩衝液（ＬＲＢ；２５mMＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ［ｐＨ７．４］、１５０mM ＫＡＯｃ、１０mM ＭｇＡＯｃ、１０mM ＤＴＴ）中のホタルルシフェラーゼ（１００nM）を４５℃で８〜１０分間加熱した。凝集したルシフェラーゼ（１０nM）を示された濃度のＴＲＩＭ１１又は他のタンパク質と共に２５℃で９０分間インキュベートした。Ｈｓｐ１０４／Ｈｓｐ７０−Ｈｓｐ４０ジ−シャペロン系のために、５mM ＡＴＰ及びＡＴＰ再生系（１mM クレアチンホスフェート、０．５uM クレアチンキナーゼ）が必要とされた。インビボでのルシフェラーゼリフォールディングアッセイのために、９６ウェルプレート中の細胞を、野生型ルシフェラーゼを用いて一過性にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を４２℃又は４５℃で１時間又は３０分間それぞれ加熱した。熱ショック前に、２０μg/mlのシクロヘキシミドを培養培地に加えた。熱ショック後に、細胞をさらに１．５又は３時間３７℃のインキュベーターに移した。ルシフェラーゼ活性をプロメガルシフェラーゼシステムを用いて測定した。
【０３６６】
ＧＦＰ脱凝集アッセイ
凝集物を生成するために、緩衝液Ａ（２０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００mM ＫＣｌ、２０mM ＭｇＣｌ２、５mM ＤＴＴ、０．１mM ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中のＧＦＰ（４．５μM）を８５℃で１５分間インキュベートした。ＧＦＰ凝集物（０．４５μM）を、様々な量の示されたタンパク質と共に２５℃で６０分間インキュベートした。ＧＦＰ凝集物の脱凝集は、３９５nmでの励起時の５１０nmの蛍光を測定することによって検出された（インフィニットＭ２００ｐｒｏ）。
【０３６７】
試薬
ルシフェラーゼ（Ｌ９５０６）、Ｍｇ−ＡＴＰ（Ａ９１８７）、ホスホクレアチン（Ｐ１９３７）及びクレアチンキナーゼ（Ｃ３７５５）はシグマ社から購入した。ＫＲＩＢＢ１１（３８５５７０）はミリポア社から購入した。β−アミロイド（１−４２）（ＲＰ１００１７）はジェンスクリプト社から購入した。
【０３６８】
実験結果をこれから記載する。
【０３６９】
ＰＭＬ（ＴＲＩＭ１９）は、プロテアソームを通して分解されるためにＲＮＦ４によって認識されることのできるミスフォールドタンパク質をＳＵＭＯ化した。しかしながら、ＴＲＩＭ１１はまたＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼでもあるかどうかは不明である。ＴＲＩＭの構造分析によると、ＴＲＩＭ２５の２つの高度に保存されたグルタミン酸（Ｇｌｕ９及びＧｌｕ１０）がそのユビキチンＥ３リガーゼ活性に必要とされる。それ故、Ｅ３リガーゼ活性を欠失させた突然変異させたＴＲＩＭ１１（Ｇｌｕ１２／Ｇｌｕ１３からＡｌａ１２／Ａｌａ１３へ）が作製された（図２７Ａ及び図２７Ｂ）。インビボでのＳＵＭＯ化アッセイは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑが、ＰＭＬによってだけでなく野生型ＴＲＩＭ１１によっても効率的にＳＵＭＯ化されたことを示した（図２７Ａ）。これをさらに確認するために、インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイは、精製されたＡｔｘｎ１ ８２ＱがＴＲＩＭ１１によって有意にＳＵＭＯ化され得ることを示した。それ故、ＴＲＩＭ１１もまた、Ａｔｘｎ１ ８２ＱのためのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼであった。細胞内では、ＴＲＩＭ１１はＨｓｐ７０のように、主に細胞質内に局在していた（図２８Ａ及び図２８Ｂ）。興味深いことに、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得（図２８Ｃ及び図２８Ｄ）、このことは、ＴＲＩＭ１１とＡｔｘｎ１ ８２Ｑの間に相互作用がある可能性があることを示唆する。これを試験するために、プルダウン分析は、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑに選択的に結合したことを提示した（図２９Ａ）。重要なことには、ＴＲＩＭ１１は、病原型のＡｔｘｎ１ ８２Ｑとは優先的に相互作用したが、Ａｔｘｎ１ ３０Ｑとは相互作用しなかった（図２９Ｂ）。それ故、ＴＲＩＭ１１は、ミスフォールドタンパク質に選択的に結合する能力を有すると仮定した。予想を調べるために、天然ルシフェラーゼビーズ又は変性ルシフェラーゼビーズをさらに作製し、そしてその後、プルダウンアッセイを実施した。図２９Ｃに示されているように、対照ＧＳＴタンパク質とは対照的に、ＴＲＩＭ１１は変性ルシフェラーゼに特異的に結合し、このことは、ＴＲＩＭ１１がミスフォールドタンパク質に結合することができることを示した。
【０３７０】
分子シャペロンであるＨｓｐ７０が、ＳＣＡ１マウスにおいて病態に関連したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を抑制することができることが実証された。さらに、Ｈｓｐ７０は、洗浄剤に不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ画分のタンパク質レベルを減少させ、これは本明細書に提示された結果と一致した（図２８Ｅ）。凝集物の形成についてＴＲＩＭ１１とＨｓｐ７０との間に類似性が存在するかどうかを次に調べた。これを研究するために、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの可溶化特徴を、洗浄剤の分画によって分析した。図２８Ｅに示されているように、ＴＲＩＭ１１は、Ｈｓｐ７０のように、洗浄剤に不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ画分を減少させ、このことは、ＴＲＩＭ１１がタンパク質の凝集を制御することができたことを示唆する。さらに、ＭＧ１３２による処置は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの不溶性画分を中程度に増加させ（図２８Ｅ）、これは、プロテアソームがＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物形成の制御に必要とされるという以前の報告と一致した。興味深いことに、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを野生型ＴＲＩＭ１１又は突然変異型ＴＲＩＭ１１と共発現させると、突然変異型ＴＲＩＭ１１は、野生型ＴＲＩＭ１１と比較することによって、洗浄剤に不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ画分を減少させる能力がより低く（図２８Ｆ）、このことは、ＴＲＩＭ１１のＥ３リガーゼ活性がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の減少に必要とされたことを示唆する。ＴＲＩＭ１１が、細胞内でアミロイド様凝集物に対して効果を及ぼしたかどうかをさらに試験するために、野生型又は突然変異型ＴＲＩＭ１１を細胞にトランスフェクトし、そしてＴｈＴ染色は、野生型及び突然変異型ＴＲＩＭ１１が両方共に、アミロイド様凝集物のレベルをダウンレギュレートすることができたことを示した（図２８Ｇ）。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの安定な過剰発現は、ＴｈＴ染色を中程度に増強させた（図３０Ａ）。同様に、ＴＲＩＭ１１はまた、安定な細胞内において洗浄剤に不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ画分を減少させることができた（図３０Ｂ）。重要なことには、野生型ＴＲＩＭ１１は、突然変異型ＴＲＩＭ１１よりも細胞内凝集物を低減させるより強力な能力を有していた（図３０Ｃ及び３０Ｄ）。
【０３７１】
Ｈｓｐ７０及びＴＲＩＭ１１の類似性のために、ＴＲＩＭ１１は、タンパク質凝集を制御するための分子シャペロンとして機能し得ると仮定された。一般的には、シャペロンは、凝集しがちなミスフォールドタンパク質を防ぐ能力を有する。これは、タンパク質凝集を制御するための最も重要でかつ効果的な方法である。それ故、凝集物の形成におけるＴＲＩＭ１１の防止機能を調べた。ルシフェラーゼ活性は、熱ショックに応答してシャペロンの非存在下では急速に減少した（図３１Ａ）。しかしながら、ＴＲＩＭ１１並びにＨｓｐ７０のインキュベーションは、熱による失活からルシフェラーゼを効果的に保護することができた（図３１Ａ）。同様に、ＴＲＩＭ１１はまた、熱からＧＦＰタンパク質も保護する（図３１Ｃ）。これらの結果は、ＴＲＩＭ１１は、Ｈｓｐ７０のように分子シャペロンとして機能し得ることを示唆した。細胞内では、ＴＲＩＭ１１の安定な過剰発現は、熱ショックからルシフェラーゼを中程度に保護することができた（図３１Ｃ及び図３１Ｄ）。さらには、ＴＲＩＭ１１はまた、ルシフェラーゼの熱による失活を明らかに回復することができ（図３１Ｃ及び図３１Ｄ）、これによりさらにＴＲＩＭ１１のシャペロン様機能が確認された。重要なことには、ＴＲＩＭ１１の過剰発現は、Ｈｓｐ７０のタンパク質レベルを変化させなかった（図３１Ｅ）。次に、アルツハイマー病に関連したβ−アミロイド（１−４２）を、ＴＲＩＭ１１の防止機能を研究するための基質として使用した。図３１Ｆに示されているように、ＴＲＩＭ１１は、ＴｈＴ分析によりアミロイド線維形成を阻害することができた。さらに、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを精製して、凝集物の形成プロセスを試験した。対照タンパク質のＧＳＴはＡｔｘｎ１凝集物の形成を防ぐことができなかったが、ＴＲＩＭ１１は、凝集物の形成を効果的に遮断した（図３１Ｇ）。さらに、ＴＲＩＭ１１はまた、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのアミロイド様凝集物も防ぐことができた（図３１Ｇ）。ｐ５３はインビトロにおいて凝集物を形成する傾向があることが知られている。図３１Ｈに示されているように、ＴＲＩＭ１１は、ｐ５３を変性から有意に防いだ。興味深いことには、ｐ５３は、インビトロにおいてＴＲＩＭ１１によってＳＵＭＯ化され得（図２７Ｃ）、そしてｐ５３のＳＵＭＯ化は、アミロイド様の凝集物を遮断することができたが、オリゴマー形成を促進した。要約すると、ＴＲＩＭ１１は、凝集物の形成を防ぐための分子シャペロンとして機能し得る。
【０３７２】
ＴＲＩＭ１１が、熱ショックに応答してアップレギュレートされ得るかどうかを決定するために、ベクター又はＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を使用した。対照の安定な細胞においては、ＴＲＩＭ１１は、熱ショック後の回復中に増加した（図３２Ａ）。しかしながら、ＴＲＩＭ１１発現細胞では、外因性ＴＲＩＭ１１タンパク質はアップレギュレートされ得ず（図３２Ｂ）、このことは、熱によって誘発されるＴＲＩＭ１１のアップレギュレーションは、タンパク質の安定性の変化に起因しなかったことを意味する。熱により誘発されるＴＲＩＭ１１のアップレギュレーションはさらにＨｅＬａ細胞においても確認された（図３２Ｃ）。多くのストレスがタンパク質ミスフォールドを誘発し得るので、ＴＲＩＭ１１が他のストレスによって誘発され得るかどうかを調べた。図３０Ｄ及び３０Ｅに示されているように、ＴＲＩＭ１１のタンパク質レベルはＡｓ２Ｏ３及びＨ２Ｏ２による処置に応答してアップレギュレートされた。ＴＲＩＭ１１のｍＲＮＡレベルは、熱ショックに応答して誘導され得（図３２Ｆ）、これは、Ｈｓｐ７０と類似している。ＴＲＩＭ１１が熱ショックによって誘発された機序を調べるために、熱応答性タンパク質を制御するための重要な転写因子であるＨＳＦ１を安定に発現するＡ５４９細胞を作製した。驚くべきことに、ＨＳＦ１の過剰発現は、熱ショックによる処置を行なっても又は行なわなくてもＴＲＩＭ１１タンパク質レベルをダウンレギュレートさせ（図３２Ｇ）、このことは、ＨＳＦ１がおそらくＴＲＩＭ１１の転写を調節するために必要とされなかったことを示唆する。
【０３７３】
別の重要な転写因子であるｐ５３も、熱ショック応答中に活性化され得る。ｐ５３もまた、ＴＲＩＭ、例えばＴＲＩＭ２１及びＴＲＩＭ２４の転写を直接増加させることができる。それ故、ＴＲＩＭ１１が熱ショックに応答してｐ５３によって制御され得るかどうかを調べた。図３３Ａに示されているように、ＴＲＩＭ１１は、ｐ５３野生型ＨＣＴ１１６細胞では熱ショックに応答して増加したが、ｐ５３ヌルＨＣＴ１１６細胞では増加しなかった。したがって、ＴＲＩＭ１１のｍＲＮＡレベルだけが、ｐ５３野生型ＨＣＴ１１６細胞において増強され（図３３Ｂ）、このことは、ｐ５３がＴＲＩＭ１１の転写に寄与したことを示唆する。ｐ５３の重要性をさらに確認するために、ＴＲＩＭ１１のタンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルは、ｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞においてはアップレギュレートされることができなかった（図３３Ｃ）。類似の現象が、ｐ５３ノックダウンＨＣＴ１１６細胞においても再度確認された（図３３Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートするための重要な因子であり得ることを強く意味した。ＨＳＦ１は、熱ストレス後の細胞の生存のための保護物質と考えらえる。化学物質阻害剤であるＫＲＩＢＢ１１を使用して、ＨＳＦ１活性を阻害することができる。図３３Ｅ及び図３３Ｆに示されているように、ＫＲＩＢＢ１１による処置により、ｐ５３ヌルは熱ショックに対してより感受性が高くなり、このことはｐ５３もまた、熱ストレスに応答した細胞の生存能に寄与することを意味した。
【０３７４】
Ｈｓｐ７０は、いくつかの種類のタンパク質凝集物の溶解を促進し得る。次に、ＴＲＩＭ１１がタンパク質凝集物を脱凝集することができるかどうかを調べた。予想された通り、ＴＲＩＭ１１は、不溶性凝集物に由来する熱で失活したルシフェラーゼを再可溶化し（図３４Ａ）、そして用量依存的にルシフェラーゼ活性を回復させた（図３４Ｂ）。また、ＴＲＩＭ１１の可溶化機能はさらに、基質として予め形成されたＧＦＰ凝集物を使用して確認された（図３４Ｃ及び図３４Ｄ）。これらの結果は、ＴＲＩＭ１１が、無秩序な凝集物を脱凝集することができることを示唆した。次に、アッセイを、基質としてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を使用して実施した。図３４Ｅに示されているように、ＴＲＩＭ１１は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を効果的に再可溶化することができた。注目すべきことには、Ｈｓｐ７０／Ｈｓｐ４０ジ−シャペロンのみが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのアミロイド様構造をペレットへと脱凝集し（図３４Ｆ）、このことは、ＴＲＩＭ１１は異なる方法で作用し得ることを示唆する。予想された通り、ＴＲＩＭ１１並びにＨｓｐ１０４は、アミロイド様構造を上清中に有意に回復させた（図３４Ｇ）。
【０３７５】
ＴＲＩＭ１１のどの機能的ドメインがＴＲＩＭ１１の脱凝集活性に必要とされるかを決定するために、加熱したルシフェラーゼ凝集物を基質として使用した。図３５Ｂに示されているように、ＴＲＩＭ１１は、ルシフェラーゼ活性の熱による失活を効果的に回復することができたが、ＴＲＩＭ１１のＲＢＣ断片又はＢ３０．２断片はより弱い再活性化能を有していた。矛盾なく、沈降アッセイにおいて、ＴＲＩＭ１１は、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物を再可溶化する上でその２つの断片よりも強力な活性を有していた（図３５Ｃ）。さらに、それぞれの単一のドメインは、完全長のＴＲＩＭ１１と比較することによって、リフォールディング活性をほぼ失っていた（図３５Ｄ）。さらに、完全長のＴＲＩＭ１１は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑと非常に強力に相互作用したが、ＲＢＣ又はＢ３０．２はＡｔｘｎ１ ８２Ｑに結合しなかった（図３６Ａ）。同様に、ＴＲＩＭ１１の単一ドメインは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑに結合しなかった（図３６Ｂ）。これらの結果は、基質への結合が、ＴＲＩＭ１１の脱凝集機能に必要とされる可能性があることを強く示唆した。
【０３７６】
ＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性が、タンパク質の脱凝集に必要とされるかどうかを次に調べた。ここで突然変異型ＴＲＩＭ１１を使用して、その脱凝集活性を試験した。図３７Ａに示されているように、突然変異型ＴＲＩＭ１１は、野生型ＴＲＩＭ１１と同様にルシフェラーゼの熱による失活を防止する能力を維持していた。さらに、突然変異型ＴＲＩＭ１１はまた、変性したルシフェラーゼ活性を回復するのに野生型ＴＲＩＭ１１と類似した能力を有していた（図３７Ｂ）。突然変異型ＴＲＩＭ１１は依然として、変性ルシフェラーゼに選択的に結合することができた（図３７Ｃ）。これらの全ての結果は、インビトロでＴＲＩＭ１１は、そのＥ３活性とは独立して、その脱凝集機能を遂行することを示した。とりわけ、突然変異型ＴＲＩＭ１１は主に核内に局在化し（図３７Ｄ）、これは野生型ＴＲＩＭ１１とは異なっていた。さらに、突然変異型ＴＲＩＭ１１はまた、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑと共局在することができた。
【０３７７】
以前の研究は、後生動物のタンパク質脱凝集酵素系であるＨｓｐ１１０、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ４０は、アミロイドを効果的に脱凝集することができなかったことを示した。それ故、ＴＲＩＭ１１はアミロイド線維を脱凝集することができるかどうかを調べた。ここでα−シヌクレインをクライアントとして適用した。まず、ＴＲＩＭ１１は、α−シヌクレイン線維形成も防ぐことができるかどうかを決定した。図３８Ａに示されているように、ＴＲＩＭ１１並びにＨｓｐ７０及びＨｓｐ１０４は、α−シヌクレインアミロイド線維の形成を効率的に阻害する（図３８Ａ）。また、阻害は用量依存的であった（図３８Ｂ）。実際に、電子顕微鏡（ＥＭ）により、α−シヌクレイン線維は対照ＧＳＴタンパク質によって示されたが、ＴＲＩＭ１１によって線維は全く観察されなかったことが明らかとなった（図３８Ｃ）。次に、α−シヌクレイン線維を使用して、ＴＲＩＭ１１の脱凝集を試験した。図３８Ｄに示されているように、ＴＲＩＭ１１又は突然変異型Ｈｓｐ１０４による処置を用いると、α−シヌクレイン線維の可溶化は用量依存的に増加した。したがって、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ１０４を用いての処置による線維の脱会合は、ＴｈＴ蛍光によって明らかであった（図３８Ｅ）。
【０３７８】
共通のＮ末端及び異なるＣ末端を有する７０個を超えるＴＲＩＭファミリーメンバーが存在する。それ故、次に他のＴＲＩＭタンパク質もまたＴＲＩＭ１１のような類似した機能を有するかどうかを調べた。それ故、ＴＲＩＭ２１を選択した。なぜなら、それはＴＲＩＭ１１と同じドメインを共有するからである。インビトロでのプルダウンアッセイは、ＴＲＩＭ２１も、変性ルシフェラーゼに優先的に結合することを明らかとした（図３９Ａ）。同様に、ＴＲＩＭ２１は、加熱されたルシフェラーゼ凝集物を中程度に可溶化することができ（図３９Ｂ）、そしてルシフェラーゼの熱による失活を回復させることができた（図３９Ｃ）。ＴＲＩＭ２１もまた、熱による失活からルシフェラーゼを保護することができた（図３９Ｄ）。ＰＭＬは、プロテアソームを通してＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を分解することができた。よってＡｔｘｎ１凝集物の脱凝集及び分解がＰＭＬと共役するかどうかを調べるために、ＰＭＬを２９３Ｔ細胞から精製した（図４０Ａ）。図４０Ｂに示されているように、ＰＭＬは、用量依存的にＧＦＰ蛍光の熱による失活を回復させることができた。しかしながら、回復能はＴＲＩＭ１１より弱かった（図４０Ｃ）。ＰＭＬのいくつかの断片もまた、２９３Ｔ細胞から精製された（図４０Ｄ）。興味深いことに、ＰＭＬの１つの断片（３６１−６３３）が、加熱されたＧＦＰ凝集物の再活性化のために必要とされる可能性がある（図４０Ｅ）。
【０３７９】
α−シヌクレイン凝集物の形成の制御におけるＴＲＩＭ１１の役割をより良く理解するために、マウス一次海馬神経細胞をモデルとして使用した。α−シヌクレイン線維（ＰＥＦ）を、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１を用いてインビトロで作製した（ＧＳＴ−ＰＥＦ及びＴＲＩＭ１１−ＰＥＦ）。ＰＥＦの添加から２週間後、約３０％の神経細胞死が、ＰＥＦ凝集物によって誘発された（図４１Ａ）。しかしながら、ＴＲＩＭ１１−ＰＥＦは、神経細胞に対してより低い毒性を示す（図４１Ａ）。実際に、免疫蛍光法により、パーキンソン病脳のレビー小体の特徴を再現したかなりのα−シヌクレイン凝集物が存在したが、ＴＲＩＭ１１−ＰＥＦの添加後には大きな凝集物は全く存在しなかったことが判明し（図４１Ｂ）、これはさらに、ＴＲＩＭ１１が、α−シヌクレイン線維の形成の防止機能を有することを示した。とりわけ、２種類の神経細胞（皮質神経細胞及び海馬神経細胞）において、ＴＲＩＭ１１は、熱ショックに応答してアップレギュレートされることができた（図４２Ａ及び図４２Ｂ）。さらに、ＴＲＩＭ１１のｍＲＮＡレベルもまた、海馬神経細胞において増加した（図４２Ｃ）。ＴＲＩＭ１１が、神経変性疾患の制御に関与している可能性が高いことは興味深いことであった。
【０３８０】
本明細書において引用されている各々の及び全ての特許、特許出願、及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は具体的な実施態様を参照して開示されているが、本発明の他の実施態様及び変法も、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような実施態様及び等価な変法を含むと捉えらえることを意味する。
【図１Ａ】
2022000459.tif 000012
【図１Ｂ】
2022000459.tif 000013
【図１Ｃ】
2022000459.tif 000014
【図１Ｄ】
2022000459.tif 000015
【図１Ｅ】
2022000459.tif 000016
【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2022000459.tif 000018
【図１Ｈ】
2022000459.tif 000019
【図１Ｉ】
2022000459.tif 000020
【図１Ｊ】
2022000459.tif 000021
【図１Ｋ】
2022000459.tif 000022
【図１Ｌ】
2022000459.tif 000023
【図２Ａ】
2022000459.tif 000024
【図２Ｂ】
2022000459.tif 000025
【図２Ｃ】
2022000459.tif 000026
【図２Ｄ】
2022000459.tif 000027
【図２Ｅ】
2022000459.tif 000028
【図３Ａ】
2022000459.tif 000029
【図３Ｂ】
2022000459.tif 000030
【図３Ｃ】
2022000459.tif 000031
【図３Ｄ】
2022000459.tif 000032
【図３Ｅ】
2022000459.tif 000033
【図３Ｆ】
2022000459.tif 000034
【図４Ａ】
2022000459.tif 000035
【図４Ｂ】
2022000459.tif 000036
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2022000459.tif 000039
【図４Ｆ】
2022000459.tif 000040
【図５Ａ】
2022000459.tif 000041
【図５Ｂ】
2022000459.tif 000042
【図５Ｃ】
2022000459.tif 000043
【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
2022000459.tif 000045
【図５Ｆ】
2022000459.tif 000046
【図５Ｇ】
2022000459.tif 000047
【図５Ｈ】
2022000459.tif 000048
【図５Ｉ】
2022000459.tif 000049
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2022000459.tif 000051
【図６Ｃ】
2022000459.tif 000052
【図６Ｄ】
2022000459.tif 000053
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2022000459.tif 000060
【図７Ｃ】
2022000459.tif 000061
【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2022000459.tif 000069
【図８Ｃ】
2022000459.tif 000070
【図８Ｄ】
2022000459.tif 000071
【図８Ｅ】
2022000459.tif 000072
【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
2022000459.tif 000078
【図９Ｅ】
2022000459.tif 000079
【図１０Ａ】
2022000459.tif 000080
【図１０Ｂ】
2022000459.tif 000081
【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
2022000459.tif 000107
【図１４Ｄ】
2022000459.tif 000108
【図１５Ａ】
2022000459.tif 000109
【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２８Ｆ】
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【図２８Ｇ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３１Ｇ】
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【図３１Ｈ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
2022000459.tif 000181
【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３４Ｇ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
2022000459.tif 000188
【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
2022000459.tif 000190
【図３６Ａ】
2022000459.tif 000191
【図３６Ｂ】
2022000459.tif 000192
【図３７Ａ】
2022000459.tif 000193
【図３７Ｂ】
2022000459.tif 000194
【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
2022000459.tif 000196
【図３７Ｅ】
2022000459.tif 000197
【図３８Ａ】
2022000459.tif 000198
【図３８Ｂ】
2022000459.tif 000199
【図３８Ｃ】
2022000459.tif 000200
【図３８Ｄ】
2022000459.tif 000201
【図３８Ｅ】
2022000459.tif 000202
【図３９Ａ】
2022000459.tif 000203
【図３９Ｂ】
2022000459.tif 000204
【図３９Ｃ】
2022000459.tif 000205
【図３９Ｄ】
2022000459.tif 000206
【図４０Ａ】
2022000459.tif 000207
【図４０Ｂ】
2022000459.tif 000208
【図４０Ｃ】
2022000459.tif 000209
【図４０Ｄ】
2022000459.tif 000210
【図４０Ｅ】
2022000459.tif 000211
【図４１Ａ】
2022000459.tif 000212
【図４１Ｂ】
2022000459.tif 000213
【図４２Ａ】
2022000459.tif 000214
【図４２Ｂ】
2022000459.tif 000215
【図４２Ｃ】
2022000459.tif 000216
【配列表】
2022000459000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年10月22日(2021.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【図１Ａ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｂ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｃ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｄ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｅ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｆ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｇ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｈ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｉ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｊ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｋ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図１Ｌ】図１は、図１Ａから図１Ｌを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、１０μm。（図１Ｂ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、２０μm。右、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ封入体のサイズに基づいた細胞の定量。（図１Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させたか（左）、あるいは、対照（−）又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて事前に処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分（示されている場合）及び全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、フィルター位相差アッセイ（ＳＲ画分について）又はウェスタンブロット（ＷＢ；残りについて）によって分析した。分子量標準物質（kDa単位）及びＳＳ又はＳＲ Ａｔｘｎ１対アクチンの相対比が示されている。（図１Ｄ）単独で又はＰＭＬと一緒にＨｅＬａ細胞内で発現させた場合（左）、あるいは対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内で単独で発現させた場合（右）の、ＷＢによって分析された、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又は３０Ｑの定常状態レベル。（図１Ｅ）パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質の安定性に対するＰＭＬの効果。３５Ｓで標識されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑの相対量が示されている。（図１Ｆ及び図１Ｇ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの安定性に対するＰＭＬ過剰発現（図１Ｆ）及びノックダウン（図１Ｇ）の効果。（図１Ｈ）ＭＧ１３２の非存在下又は存在下におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。（図１Ｉ）上、ＰＭＬの非存在下又は存在下における、細胞質内（左）及び核内（右）封入体を有するＨｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ発現細胞の相対的比率（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。下、抗Ｈｔｔ抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ凝集物を示す。（図１Ｊ及び図１Ｋ）ＰＭＬの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ９７ＱＰ（ＫＲ）（図１Ｊ）及びＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（図１Ｋ）のレベル。実質的に全てのＨｔｔ凝集物がＳＲ画分にあった。（図１Ｌ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇細胞におけるｎＦｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性。
【図２Ａ】図２は、図２Ａから図２Ｅを含むが、これはＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。（図２Ａ）インビトロプルダウンアッセイ、その後のＷＢ（上及び下）及びポンソーＳ染色（中央）によって分析された、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＧＦＰ（陰性対照）へのＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ及びＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑの結合。＊ＩｇＧ重鎖。（図２Ｂ）（図２Ａ）のように分析された、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ−ＰＭＬ（右に示される）及び対照ＧＳＴタンパク質の結合。＊対照ビーズに結合させたＢＬ２１細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。（図２Ｃ）ＷＢ（上及び中央）及びクーマシー染色（下）によって分析された、抗ＦｌａｇＭ２ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたＦＬＡＧ−ＰＭＬ ＣＣへの示されたＧＳＴ−Ｈｔｔ融合物の結合。（図２Ｄ）ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するＰＭＬ Ｆ１２／ＳＲＳ２（右に示される）の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのＮ末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。（図２Ｅ）ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した（１００％に設定）、ＰＭＬ ＳＲＳ２結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
【図２Ｂ】図２は、図２Ａから図２Ｅを含むが、これはＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。（図２Ａ）インビトロプルダウンアッセイ、その後のＷＢ（上及び下）及びポンソーＳ染色（中央）によって分析された、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＧＦＰ（陰性対照）へのＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ及びＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑの結合。＊ＩｇＧ重鎖。（図２Ｂ）（図２Ａ）のように分析された、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ−ＰＭＬ（右に示される）及び対照ＧＳＴタンパク質の結合。＊対照ビーズに結合させたＢＬ２１細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。（図２Ｃ）ＷＢ（上及び中央）及びクーマシー染色（下）によって分析された、抗ＦｌａｇＭ２ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたＦＬＡＧ−ＰＭＬ ＣＣへの示されたＧＳＴ−Ｈｔｔ融合物の結合。（図２Ｄ）ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するＰＭＬ Ｆ１２／ＳＲＳ２（右に示される）の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのＮ末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。（図２Ｅ）ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した（１００％に設定）、ＰＭＬ ＳＲＳ２結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
【図２Ｃ】図２は、図２Ａから図２Ｅを含むが、これはＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。（図２Ａ）インビトロプルダウンアッセイ、その後のＷＢ（上及び下）及びポンソーＳ染色（中央）によって分析された、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＧＦＰ（陰性対照）へのＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ及びＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑの結合。＊ＩｇＧ重鎖。（図２Ｂ）（図２Ａ）のように分析された、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ−ＰＭＬ（右に示される）及び対照ＧＳＴタンパク質の結合。＊対照ビーズに結合させたＢＬ２１細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。（図２Ｃ）ＷＢ（上及び中央）及びクーマシー染色（下）によって分析された、抗ＦｌａｇＭ２ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたＦＬＡＧ−ＰＭＬ ＣＣへの示されたＧＳＴ−Ｈｔｔ融合物の結合。（図２Ｄ）ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するＰＭＬ Ｆ１２／ＳＲＳ２（右に示される）の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのＮ末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。（図２Ｅ）ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した（１００％に設定）、ＰＭＬ ＳＲＳ２結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
【図２Ｄ】図２は、図２Ａから図２Ｅを含むが、これはＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。（図２Ａ）インビトロプルダウンアッセイ、その後のＷＢ（上及び下）及びポンソーＳ染色（中央）によって分析された、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＧＦＰ（陰性対照）へのＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ及びＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑの結合。＊ＩｇＧ重鎖。（図２Ｂ）（図２Ａ）のように分析された、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ−ＰＭＬ（右に示される）及び対照ＧＳＴタンパク質の結合。＊対照ビーズに結合させたＢＬ２１細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。（図２Ｃ）ＷＢ（上及び中央）及びクーマシー染色（下）によって分析された、抗ＦｌａｇＭ２ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたＦＬＡＧ−ＰＭＬ ＣＣへの示されたＧＳＴ−Ｈｔｔ融合物の結合。（図２Ｄ）ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するＰＭＬ Ｆ１２／ＳＲＳ２（右に示される）の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのＮ末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。（図２Ｅ）ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した（１００％に設定）、ＰＭＬ ＳＲＳ２結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
【図２Ｅ】図２は、図２Ａから図２Ｅを含むが、これはＰＭＬによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。（図２Ａ）インビトロプルダウンアッセイ、その後のＷＢ（上及び下）及びポンソーＳ染色（中央）によって分析された、固定されたＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＧＦＰ（陰性対照）へのＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ及びＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑの結合。＊ＩｇＧ重鎖。（図２Ｂ）（図２Ａ）のように分析された、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ−ＰＭＬ（右に示される）及び対照ＧＳＴタンパク質の結合。＊対照ビーズに結合させたＢＬ２１細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。（図２Ｃ）ＷＢ（上及び中央）及びクーマシー染色（下）によって分析された、抗ＦｌａｇＭ２ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたＦＬＡＧ−ＰＭＬ ＣＣへの示されたＧＳＴ−Ｈｔｔ融合物の結合。（図２Ｄ）ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するＰＭＬ Ｆ１２／ＳＲＳ２（右に示される）の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのＮ末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。（図２Ｅ）ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した（１００％に設定）、ＰＭＬ ＳＲＳ２結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
【図３Ａ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図３Ｂ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図３Ｃ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図３Ｄ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図３Ｅ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図３Ｆ】図３は、図３Ａから図３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及びＰＭＬにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。（図３Ａ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置されたＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ１及びＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの修飾。修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを含む変性免疫沈降（ｄ−ＩＰ）産物をＷＢによって分析した。＊非特異的バンド。（図３Ｂ）ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＧＦＰ−ＳＵＭＯ２又はＧＦＰ−ＳＵＭＯ３発現Ｕ２ＯＳ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出、赤色）の局在化。スケールバー、１０μm。（図３Ｃ）ｄ−ＩＰ、その後のＷＢ（上）及びポンリーＳ染色（下）によって分析された、ＨｅＬａ細胞におけるＳＵＭＯ２／３によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及び３０Ｑの修飾。（図３Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、示されたｓｉＲＮＡを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅＬａ細胞において、単独で又はＳＵＭＯ１若しくはＨＡ−ＳＵＭＯ２ ＫＲと一緒に発現させた。細胞をＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化及びユビキチン化をｄ−ＩＰ及びＷＢによって分析した。（図３Ｅ）示されたｓｉＲＮＡを用いて予め処置されたＨｅＬａ細胞において、単独で又は漸増量のＰＭＬと一緒に発現させたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図３Ｆ）ＳＵＭＯ１又はＳＵＭＯ２ ＫＲの存在下又は非存在下における、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬの効果。
【図４Ａ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図４Ｂ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図４Ｃ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図４Ｄ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図４Ｅ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図４Ｆ】図４は、図４Ａから図４Ｆを含むが、これはＰＭＬがＡｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図４Ａ）ＨＡ−ＰＭＬ細胞の非存在下又は存在下、及びＭＧ１３２による処置を伴わない又は伴う、ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化。トランスフェクションに使用されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ ＤＮＡの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。（図４Ｂ及び図４Ｃ）ＭＧ１３２を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びＰＭＬｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図４Ｂ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図４Ｃ）のＳＵＭＯ化。（図４Ｄ及び図４Ｅ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されているような組換えＦＬＡＧ−ＰＭＬ、ＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６、及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。（図４Ｄ）においては、様々なｄ−ＩＰ産物の量は、同じようなレベルの未修飾Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（中央）が生じるように調整された。（図４Ｆ）漸増量のＰＭＬ又はＰＭＬ Ｍ６の非存在下又は存在下における、ＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。
【図５Ａ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｂ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｃ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｄ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｅ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｆ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｇ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｈ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図５Ｉ】図５は、図５Ａから図５Ｉを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解におけるＲＮＦ４の役割を実証した実験例の結果を示す。（図５Ａ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。（図５Ｂ及び図５Ｃ）ＣＨＸによる処置及びＷＢによって分析された、対照細胞及びＰＭＬ枯渇ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ安定性に対するＲＮＦ４過剰発現の効果。ＳＳ Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ／アクチンの相対比が（図５Ｃ）に示されている。（図５Ｄ）対照ｓｉＲＮＡ（−）又は３つのＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図５Ｅ）対照細胞及びＲＮＦ４ノックダウンＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの代表的な蛍光画像。スケールバー、２０μm。（図５Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び内因性ＲＮＦ４の局在化。スケールバー、１０μm。（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＲＮＦ４の過剰発現を伴わない及び伴うＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ（図５Ｇ）又はＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ及びＨＡ−Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（ＫＲ）（図５Ｈ）のレベル。（図５Ｉ）ｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＲＮＦ４を安定に発現しているＨｅＬａ細胞内のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰの安定性（左）及びこれらの細胞内のＲＮＦ４のレベル（右）。
【図６Ａ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｂ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｃ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｄ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｅ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｆ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｇ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｈ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図６Ｉ】図６は、図６Ａから図６Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ＳＵＭＯ２／３により修飾されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。（図６Ａ及び図６Ｂ）ＲＮＦ４の非存在下又は存在下において、ＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置されたＨｅＬａ細胞における、ＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（図６Ａ）及びＦＬＡＧ−ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ（図６Ｂ）のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するｄ−ＩＰ産物並びにＷＣＬを分析した。（図６Ｃ）（図６Ａ）のように分析された、対照ｓｉＲＮＡ又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの組合せを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＳＵＭＯ化ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。（図６Ｄ及び図６Ｅ）Ｍ２ビーズ（＋）又は対照Ｍ２ビーズ（−）にコンジュゲートさせた未修飾の及びＳＵＭＯ２により修飾されたＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質を、ＧＳＴ−ＲＮＦ４の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。（図６Ｄ）実験デザインの図解。（図６Ｅ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（左）及びＧＳＴ−ＲＮＦ４（右）のＷＢ分析。（図６Ｆ及び図６Ｇ）ＨｅＬａにおけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＲＮＦ４タンパク質の局在化（抗ＦＬＡＧ抗体によって検出）。スケールバー、１０μm。（図６Ｈ）ＨｅＬａ細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対する示されたＲＮＦ４タンパク質の効果。（図６Ｉ）対照又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰレベルに対するＰＭＬ過剰発現の効果。
【図７Ａ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｂ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｃ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｄ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｅ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｆ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｇ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｈ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図７Ｉ】図７は、図７Ａから図７Ｉを含むが、これはＰＭＬの欠損が、ＳＣＡ１マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。（図７Ａ及び図７Ｂ）７週齢（図７Ａ）及び１１週齢（図７Ｂ）における加速式ロータロッド上での保持時間（平均値＋標準誤差）であり、動物数が括弧内に示されている。（図７Ｃ及び図７Ｄ）１２週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。（図７Ｃ）分子層の厚さの定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｄ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｅ及び７Ｆ）１才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。（Ｅ）長さ１mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり４匹のマウス）。（Ｆ）代表的な染色画像。スケールバー、２００μm。（図７Ｇ及び図７Ｈ）１２週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。（図７Ｇ）凝集物を含むプルキンエ細胞の比率（平均値±標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図７Ｈ）代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、５０μm。Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった（図１４Ｄ参照）。（図７Ｉ）ＰＭＬ−ＲＮＦ４系によるＰＱＣのモデル。ＰＭＬは、ＳＲＳを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性を通してポリ−ＳＵＭＯ２／３鎖とコンジュゲートさせる（ａ）。ＲＮＦ４は、ＳＵＭＯ化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し（ｂ）、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する（ｃ）。
【図８Ａ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｂ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｃ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｄ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｅ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｆ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図８Ｇ】図８は、図８Ａから図８Ｇを含むが、これはＰＭＬが、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在し、そして不溶性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを減少させることを実証した実験例の結果を示す。（図８Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、各々の示されたＰＭＬアイソフォームと一緒に、ＰＭＬ欠損（ＰＭＬ−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において発現させた。細胞を抗ＰＭＬ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。（図８Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ４番、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示されている。（図８Ｃ）ＨｅＬａ細胞を対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４（ＰＭＬ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに標的化した）、又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４とＰＭＬのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド（したがってｓｉＲＮＡに対して抵抗性）を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベルを分析した。（図８Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃４、及びＰＭＬ ｓｉＲＮＡ＃９を用いて処置し、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに正規化された定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８Ｅ）Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ−ＧＦＰを、ＰＭＬの非存在下又は存在下においてＨｅＬａ細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてＣＨＸを用いて処置した。（図８Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰ及び対応する野生型ルシフェラーゼ（ＷＴ）タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性ＰＭＬは抗ＰＭＬ抗体（赤色）によって検出され、そしてＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）によって検出された。スケールバー：１０μm。（図８Ｇ）ＰＭＬノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。ＨｅＬａ細胞を対照又はＰＭＬ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ又はｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。ＳＲ画分は非常に少量のｎＦｌｕｃＤＭ−ＧＦＰを含有していた。
【図９Ａ】図９は、図９Ａから図９Ｅを含むが、これはＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図９Ａ）ＰＭＬは、病原性Ｈｔｔと優先的に相互作用する。ＦＬＡＧ−ＧＦＰ又はＦＬＡＧ−ＰＭＬを発現している２９３Ｔ細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ若しくはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ（レーン１〜３及び５〜７）と共に、又は対照グルタチオンビーズ（レーン４及び８）と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。（図９Ｂ）野生型ＰＭＬアイソフォームＩＶ（アミノ酸１〜６３３）（本研究ではＰＭＬと呼ばれる）及び様々な欠失断片（Ｆ１〜Ｆ１０）の図解。ＲＩＮＧドメイン（Ｒ）、Ｂ１ボックス、Ｂ２ボックス、及びコイルドコイル領域（ＣＣ）は標識されている。基質認識部位ＳＲＳ１及びＳＲＳ２は線によって示されている。ＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質（Ｈｔｔ１０３Ｑ又は５２Ｑ）及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ＮＤ：実施されず。（図９Ｃ）完全長ＰＭＬ及びＰＭＬ欠失突然変異体とＨｔｔの相互作用。ＰＭＬタンパク質は、［３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下において共役させたインビトロでの転写／翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ、又はＧＳＴと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のＧＳＴタンパク質をクーマシー染色によって分析した。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図９Ｄ）Ｈｔｔ５２Ｑ及びＣＣ脱安定化（ｃｃ−）突然変異体の配列。Ｈｔｔ５２Ｑｃｃ−においてＰｒｏに変化させたＨｔｔ５２Ｑ内のアミノ酸が赤色で示されている。（図９Ｅ）精製されたＰＭＬ ＣＣ領域（右に示されている）とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図２Ｄのようにアッセイした。＊ＴＥＶプロテアーゼ。
【図９Ｂ】図９は、図９Ａから図９Ｅを含むが、これはＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図９Ａ）ＰＭＬは、病原性Ｈｔｔと優先的に相互作用する。ＦＬＡＧ−ＧＦＰ又はＦＬＡＧ−ＰＭＬを発現している２９３Ｔ細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ若しくはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ（レーン１〜３及び５〜７）と共に、又は対照グルタチオンビーズ（レーン４及び８）と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。（図９Ｂ）野生型ＰＭＬアイソフォームＩＶ（アミノ酸１〜６３３）（本研究ではＰＭＬと呼ばれる）及び様々な欠失断片（Ｆ１〜Ｆ１０）の図解。ＲＩＮＧドメイン（Ｒ）、Ｂ１ボックス、Ｂ２ボックス、及びコイルドコイル領域（ＣＣ）は標識されている。基質認識部位ＳＲＳ１及びＳＲＳ２は線によって示されている。ＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質（Ｈｔｔ１０３Ｑ又は５２Ｑ）及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ＮＤ：実施されず。（図９Ｃ）完全長ＰＭＬ及びＰＭＬ欠失突然変異体とＨｔｔの相互作用。ＰＭＬタンパク質は、［３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下において共役させたインビトロでの転写／翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ、又はＧＳＴと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のＧＳＴタンパク質をクーマシー染色によって分析した。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図９Ｄ）Ｈｔｔ５２Ｑ及びＣＣ脱安定化（ｃｃ−）突然変異体の配列。Ｈｔｔ５２Ｑｃｃ−においてＰｒｏに変化させたＨｔｔ５２Ｑ内のアミノ酸が赤色で示されている。（図９Ｅ）精製されたＰＭＬ ＣＣ領域（右に示されている）とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図２Ｄのようにアッセイした。＊ＴＥＶプロテアーゼ。
【図９Ｃ】図９は、図９Ａから図９Ｅを含むが、これはＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図９Ａ）ＰＭＬは、病原性Ｈｔｔと優先的に相互作用する。ＦＬＡＧ−ＧＦＰ又はＦＬＡＧ−ＰＭＬを発現している２９３Ｔ細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ若しくはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ（レーン１〜３及び５〜７）と共に、又は対照グルタチオンビーズ（レーン４及び８）と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。（図９Ｂ）野生型ＰＭＬアイソフォームＩＶ（アミノ酸１〜６３３）（本研究ではＰＭＬと呼ばれる）及び様々な欠失断片（Ｆ１〜Ｆ１０）の図解。ＲＩＮＧドメイン（Ｒ）、Ｂ１ボックス、Ｂ２ボックス、及びコイルドコイル領域（ＣＣ）は標識されている。基質認識部位ＳＲＳ１及びＳＲＳ２は線によって示されている。ＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質（Ｈｔｔ１０３Ｑ又は５２Ｑ）及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ＮＤ：実施されず。（図９Ｃ）完全長ＰＭＬ及びＰＭＬ欠失突然変異体とＨｔｔの相互作用。ＰＭＬタンパク質は、［３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下において共役させたインビトロでの転写／翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ、又はＧＳＴと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のＧＳＴタンパク質をクーマシー染色によって分析した。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図９Ｄ）Ｈｔｔ５２Ｑ及びＣＣ脱安定化（ｃｃ−）突然変異体の配列。Ｈｔｔ５２Ｑｃｃ−においてＰｒｏに変化させたＨｔｔ５２Ｑ内のアミノ酸が赤色で示されている。（図９Ｅ）精製されたＰＭＬ ＣＣ領域（右に示されている）とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図２Ｄのようにアッセイした。＊ＴＥＶプロテアーゼ。
【図９Ｄ】図９は、図９Ａから図９Ｅを含むが、これはＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図９Ａ）ＰＭＬは、病原性Ｈｔｔと優先的に相互作用する。ＦＬＡＧ−ＧＦＰ又はＦＬＡＧ−ＰＭＬを発現している２９３Ｔ細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ若しくはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ（レーン１〜３及び５〜７）と共に、又は対照グルタチオンビーズ（レーン４及び８）と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。（図９Ｂ）野生型ＰＭＬアイソフォームＩＶ（アミノ酸１〜６３３）（本研究ではＰＭＬと呼ばれる）及び様々な欠失断片（Ｆ１〜Ｆ１０）の図解。ＲＩＮＧドメイン（Ｒ）、Ｂ１ボックス、Ｂ２ボックス、及びコイルドコイル領域（ＣＣ）は標識されている。基質認識部位ＳＲＳ１及びＳＲＳ２は線によって示されている。ＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質（Ｈｔｔ１０３Ｑ又は５２Ｑ）及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ＮＤ：実施されず。（図９Ｃ）完全長ＰＭＬ及びＰＭＬ欠失突然変異体とＨｔｔの相互作用。ＰＭＬタンパク質は、［３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下において共役させたインビトロでの転写／翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ、又はＧＳＴと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のＧＳＴタンパク質をクーマシー染色によって分析した。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図９Ｄ）Ｈｔｔ５２Ｑ及びＣＣ脱安定化（ｃｃ−）突然変異体の配列。Ｈｔｔ５２Ｑｃｃ−においてＰｒｏに変化させたＨｔｔ５２Ｑ内のアミノ酸が赤色で示されている。（図９Ｅ）精製されたＰＭＬ ＣＣ領域（右に示されている）とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図２Ｄのようにアッセイした。＊ＴＥＶプロテアーゼ。
【図９Ｅ】図９は、図９Ａから図９Ｅを含むが、これはＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図９Ａ）ＰＭＬは、病原性Ｈｔｔと優先的に相互作用する。ＦＬＡＧ−ＧＦＰ又はＦＬＡＧ−ＰＭＬを発現している２９３Ｔ細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ若しくはＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ（レーン１〜３及び５〜７）と共に、又は対照グルタチオンビーズ（レーン４及び８）と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。（図９Ｂ）野生型ＰＭＬアイソフォームＩＶ（アミノ酸１〜６３３）（本研究ではＰＭＬと呼ばれる）及び様々な欠失断片（Ｆ１〜Ｆ１０）の図解。ＲＩＮＧドメイン（Ｒ）、Ｂ１ボックス、Ｂ２ボックス、及びコイルドコイル領域（ＣＣ）は標識されている。基質認識部位ＳＲＳ１及びＳＲＳ２は線によって示されている。ＰＭＬと病原性Ｈｔｔタンパク質（Ｈｔｔ１０３Ｑ又は５２Ｑ）及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ＮＤ：実施されず。（図９Ｃ）完全長ＰＭＬ及びＰＭＬ欠失突然変異体とＨｔｔの相互作用。ＰＭＬタンパク質は、［３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下において共役させたインビトロでの転写／翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたＧＳＴ−Ｈｔｔ１０３Ｑ、ＧＳＴ−Ｈｔｔ２５Ｑ、又はＧＳＴと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のＧＳＴタンパク質をクーマシー染色によって分析した。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図９Ｄ）Ｈｔｔ５２Ｑ及びＣＣ脱安定化（ｃｃ−）突然変異体の配列。Ｈｔｔ５２Ｑｃｃ−においてＰｒｏに変化させたＨｔｔ５２Ｑ内のアミノ酸が赤色で示されている。（図９Ｅ）精製されたＰＭＬ ＣＣ領域（右に示されている）とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図２Ｄのようにアッセイした。＊ＴＥＶプロテアーゼ。
【図１０Ａ】図１０は、図１０Ａから図１０Ｃを含むが、これはＰＭＬと変性ルシフェラーゼの相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図１０Ａ）ＰＭＬ断片と変性ルシフェラーゼの相互作用。インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識された完全長ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ欠失突然変異体を、ビーズ上に固定させた天然若しくは変性ルシフェラーゼ、又は対照ビーズと共にインキュベートした。インプット及びビーズに結合させたＰＭＬタンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてルシフェラーゼをクーマシーブルー染色によって分析した。＊、非特異的バンド。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）ＰＭＬ上の第二の基質認識部位（ＳＲＳ２）の同定。（図１０Ｂ）Ｃ末端にアミノ酸を包含しているＰＭＬ欠失突然変異体、及び変性ルシフェラーゼとのその相互作用の要約。（図１０Ｃ）インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識されたＰＭＬ断片のＧＳＴ融合物又はＧＳＴを、（図１０Ａ）に記載のようにルシフェラーゼとの相互作用について試験した。
【図１０Ｂ】図１０は、図１０Ａから図１０Ｃを含むが、これはＰＭＬと変性ルシフェラーゼの相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図１０Ａ）ＰＭＬ断片と変性ルシフェラーゼの相互作用。インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識された完全長ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ欠失突然変異体を、ビーズ上に固定させた天然若しくは変性ルシフェラーゼ、又は対照ビーズと共にインキュベートした。インプット及びビーズに結合させたＰＭＬタンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてルシフェラーゼをクーマシーブルー染色によって分析した。＊、非特異的バンド。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）ＰＭＬ上の第二の基質認識部位（ＳＲＳ２）の同定。（図１０Ｂ）Ｃ末端にアミノ酸を包含しているＰＭＬ欠失突然変異体、及び変性ルシフェラーゼとのその相互作用の要約。（図１０Ｃ）インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識されたＰＭＬ断片のＧＳＴ融合物又はＧＳＴを、（図１０Ａ）に記載のようにルシフェラーゼとの相互作用について試験した。
【図１０Ｃ】図１０は、図１０Ａから図１０Ｃを含むが、これはＰＭＬと変性ルシフェラーゼの相互作用を実証した実験例の結果を示す。（図１０Ａ）ＰＭＬ断片と変性ルシフェラーゼの相互作用。インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識された完全長ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ欠失突然変異体を、ビーズ上に固定させた天然若しくは変性ルシフェラーゼ、又は対照ビーズと共にインキュベートした。インプット及びビーズに結合させたＰＭＬタンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてルシフェラーゼをクーマシーブルー染色によって分析した。＊、非特異的バンド。３つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように（試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む）で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）ＰＭＬ上の第二の基質認識部位（ＳＲＳ２）の同定。（図１０Ｂ）Ｃ末端にアミノ酸を包含しているＰＭＬ欠失突然変異体、及び変性ルシフェラーゼとのその相互作用の要約。（図１０Ｃ）インビトロで翻訳され［３５Ｓ］で標識されたＰＭＬ断片のＧＳＴ融合物又はＧＳＴを、（図１０Ａ）に記載のようにルシフェラーゼとの相互作用について試験した。
【図１１Ａ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｂ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｃ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｄ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｅ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｆ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１１Ｇ】図１１は、図１１Ａから図１１Ｇを含むが、これはＳＵＭＯ２／３によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞を、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ（５ＫＲ）をｄ−ＩＰによって単離し、そしてそれらのＳＵＭＯ２／３修飾をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル（ＤＭＳＯ）（−）又はＭＧ１３２（＋）を用いて処置した。ｄ−ＩＰは、抗ＧＦＰ抗体又は対照抗体を使用して実施された。ｄ−ＩＰ産物はウェスタンブロットによって分析された。（図１１Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｎＦｌｕｃ−ＧＦＰ、ｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰ、及びｎＦｌｕｃＳＭ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし（各々はまた、ＦＬＡＧエピトープを用いてＮ末端がタグ化された）、そしてＭＧ１３２を用いて又は用いずに処置した。ｎＦｌｕｃタンパク質をｄ−ＩＰによって単離した。全細胞溶解液（ＷＣＬ）及びＩＰ産物をウェスタンブロットによって分析した。ＷＴルシフェラーゼ対ＳＭ／ＤＭルシフェラーゼのＳＵＭＯ２／３による修飾の間の差異（上、レーン１〜３）は、ＷＣＬにおける全体的なＳＵＭＯ２／３コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい（下）。（図１１Ｄ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、対照（Ｃｔｒｌ）、ＳＵＭＯ２／３、又はＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｅ及び図１１Ｆ）ＨｅＬａ細胞を、対照（Ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、若しくはＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて処置したか（図１１Ｅ）、又はこれらのｓｉＲＮＡを用いて処置し、そしてその後、ＧＦＰを用いてトランスフェクトした（図１１Ｆ）。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１１Ｇ）インビトロでのＳＵＭＯ化アッセイのために使用されたＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６タンパク質。ＦＬＡＧ−ＰＭＬ及びＦＬＡＧ−ＰＭＬ Ｍ６を２９３Ｔ細胞において発現させ、そして抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）ビーズによって精製した。タンパク質をＢＳＡ標準物質と共にクーマシー染色（左）によって及びウェスタンブロット（右）によって分析した。ＰＭＬ及びＰＭＬ Ｍ６レーンの両方（左）に提示された２本の追加のバンド（矢頭）は、ウェスタンブロット（右）及び質量分析の両方に基づいてＰＭＬ断片であると決定された。Ｍ６突然変異体の図解が下に示されている。＊：点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
【図１２Ａ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｂ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｃ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｄ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｅ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｆ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｇ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｈ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１２Ｉ】図１２は、図１２Ａから図１２Ｉを含むが、これはＲＮＦ４が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。（図１２Ａ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰを単独で又はＲＮＦ４と一緒に発現しているＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー：２０μm。画像は、図１Ｂに示されているのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｂ）ＲＮＦ４過剰発現を伴う及び伴わないＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰの半減期。試料は、図１Ｆに示されたのと同じ実験に由来するものである。（図１２Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（−）、ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡのみ、又はＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｄ）ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、対照ｓｉＲＮＡ及び示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いてｄ−ＩＰによって単離した。ＷＣＬ及びＩＰ産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（図１２Ｅ）Ａｔｘｎ ８２Ｑ−ＧＦＰ及びＦＬＡＧ−ＲＮＦ４の両方を発現しているＨｅＬａ細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＭＧ１３２を用いて処置した。外因性（Ｅｘｏ．）ＲＮＦ４を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ＤＭＳＯを用いて処置された対照細胞では、外因性ＲＮＦ４は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物と部分的な共局在を示した。ＭＧ１３２による処置時に、外因性ＲＮＦ４とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の完全な共局在化が、細胞の１００％において観察された。スケールバー：１０μm。（図１２F）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を単独で用いて又は漸増量のＲＮＦ４と一緒に用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。（図１２Ｇ）ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を、対照ｓｉＲＮＡ（−）又は示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて前処置された細胞内で発現させた。５００個の細胞が各実験において計数された。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３フォーカスを有する細胞の比率が示されている。（図１２Ｈ）ＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトした。細胞を抗ＲＮＦ４抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。ＴＤＰ−４３は、ＲＮＦ４がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが（塗りつぶされた矢頭）、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい（白抜きの矢頭）。（図１２Ｉ）ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を用いてトランスフェクトし、そしてＭＧ１３２を用いて処置した。内因性ＲＮＦ４を、抗ＲＮＦ４抗体を用いて染色した（赤色）。ＲＮＦ４はまた、ＴＤＰ−４３が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい（図１２Ｅ〜図１２Ｈ）。
【図１３Ａ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１３Ｂ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１３Ｃ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１３Ｄ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１３Ｅ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１３Ｆ】図１３は、図１３Ａから図１３Ｆを含むが、これはＳＵＭＯ２／３が、ＲＮＦ４により媒介されるＡｔｘｎ１ ８２Ｑの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。（図１３Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ及び／又はＲＮＦ４を、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＵＭＯ２／３ｓｉＲＮＡ、及びＳＵＭＯ１ ｓｉＲＮＡを用いて前処置されたＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１３Ｂ）ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞をまず、示されたＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（−）を用いて、その後、ＦＬＡＧ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２陽性Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている（平均値＋標準偏差、ｎ＝３）。各実験において、２００個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。ＧＦＰ−ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。（図１３Ｃ）野生型及び突然変異ＲＮＦ４タンパク質の図解。ＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＩＭ）１〜４及びＲＩＮＧドメインが示されている。＊：点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）ラット（ｒ）ＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＣＳ１（図１３Ｄ）又はヒトＲＮＦ４及びＲＮＦ４ ＳＩＭｍ（図１３Ｅ）の精製された組換えＧＳＴ融合物を、示されているようなユビキチンＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、及びユビキチン（Ｕｂ）とＭｇ２＋−ＡＴＰと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗ＧＳＴ抗体を使用して分析した。（図１３Ｆ）示されているような対照、ＰＭＬ、及びＲＮＦ４ ｓｉＲＮＡの示された組合せを用いて処置された細胞におけるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
【図１４Ａ】図１４は、図１４Ａから図１４Ｄを含むが、これはＰＭＬの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。（図１４Ａ）１２週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた（ＰＭＬ＋/＋についてはｎ＝２匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはｎ＝３匹のマウス）。ＰＭＬ−/−マウスは、ＰＭＬ＋/＋マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した（分散分析、ｐ＝０．０３１）。（図１４Ｂ）代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー：１００μm。（図１４Ｃ）長さ１mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含む及び含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋、ＰＭＬ＋/−、及びＰＭＬ−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量（平均値＋標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図１４Ｄ）Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー：５０μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。ＰＭＬ＋/＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−及びＰＭＬ−/−：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−マウスの染色切片が図７Ｇに示されている。
【図１４Ｂ】図１４は、図１４Ａから図１４Ｄを含むが、これはＰＭＬの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。（図１４Ａ）１２週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた（ＰＭＬ＋/＋についてはｎ＝２匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはｎ＝３匹のマウス）。ＰＭＬ−/−マウスは、ＰＭＬ＋/＋マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した（分散分析、ｐ＝０．０３１）。（図１４Ｂ）代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー：１００μm。（図１４Ｃ）長さ１mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含む及び含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋、ＰＭＬ＋/−、及びＰＭＬ−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量（平均値＋標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図１４Ｄ）Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー：５０μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。ＰＭＬ＋/＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−及びＰＭＬ−/−：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−マウスの染色切片が図７Ｇに示されている。
【図１４Ｃ】図１４は、図１４Ａから図１４Ｄを含むが、これはＰＭＬの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。（図１４Ａ）１２週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた（ＰＭＬ＋/＋についてはｎ＝２匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはｎ＝３匹のマウス）。ＰＭＬ−/−マウスは、ＰＭＬ＋/＋マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した（分散分析、ｐ＝０．０３１）。（図１４Ｂ）代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー：１００μm。（図１４Ｃ）長さ１mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含む及び含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋、ＰＭＬ＋/−、及びＰＭＬ−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量（平均値＋標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図１４Ｄ）Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー：５０μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。ＰＭＬ＋/＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−及びＰＭＬ−/−：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−マウスの染色切片が図７Ｇに示されている。
【図１４Ｄ】図１４は、図１４Ａから図１４Ｄを含むが、これはＰＭＬの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。（図１４Ａ）１２週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた（ＰＭＬ＋/＋についてはｎ＝２匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはｎ＝３匹のマウス）。ＰＭＬ−/−マウスは、ＰＭＬ＋/＋マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した（分散分析、ｐ＝０．０３１）。（図１４Ｂ）代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー：１００μm。（図１４Ｃ）長さ１mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含む及び含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋、ＰＭＬ＋/−、及びＰＭＬ−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量（平均値＋標準誤差、１つの遺伝子型あたり３匹のマウス）。（図１４Ｄ）Ａｔｘｎ１ｔｇ/−を含まない１２週齢のＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー：５０μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。ＰＭＬ＋/＋：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−及びＰＭＬ−/−：Ａｔｘｎ１ｔｇ/−マウスの染色切片が図７Ｇに示されている。
【図１５Ａ】図１５は、図１５Ａから図１５Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２及びＴＲＩＭ５δと、ＥＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの共局在を実証した実験例の結果を示す。（図１５Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。スケールバー：１０μm。（図１５Ｂ及び１５Ｃ）Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰを、ＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７（図１５Ｂ）、及びＴＲＩＭ３２（図１５Ｃ）と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体（緑色）及び抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。ＴＲＩＭ３２は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの細胞内局在にも関わらず、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰと共局在したことに留意されたい。（図１５Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２ＱＰ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。内因性ＴＲＩＭ２７を、抗ＴＲＩＭ２７抗体（赤色）によって検出した。矢頭は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在した内因性ＴＲＩＭ２７構造体を示す。スケールバー：１０μm。
【図１５Ｂ】図１５は、図１５Ａから図１５Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２及びＴＲＩＭ５δと、ＥＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの共局在を実証した実験例の結果を示す。（図１５Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。スケールバー：１０μm。（図１５Ｂ及び１５Ｃ）Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰを、ＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７（図１５Ｂ）、及びＴＲＩＭ３２（図１５Ｃ）と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体（緑色）及び抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。ＴＲＩＭ３２は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの細胞内局在にも関わらず、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰと共局在したことに留意されたい。（図１５Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２ＱＰ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。内因性ＴＲＩＭ２７を、抗ＴＲＩＭ２７抗体（赤色）によって検出した。矢頭は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在した内因性ＴＲＩＭ２７構造体を示す。スケールバー：１０μm。
【図１５Ｃ】図１５は、図１５Ａから図１５Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２及びＴＲＩＭ５δと、ＥＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの共局在を実証した実験例の結果を示す。（図１５Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。スケールバー：１０μm。（図１５Ｂ及び１５Ｃ）Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰを、ＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７（図１５Ｂ）、及びＴＲＩＭ３２（図１５Ｃ）と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体（緑色）及び抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。ＴＲＩＭ３２は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの細胞内局在にも関わらず、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰと共局在したことに留意されたい。（図１５Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２ＱＰ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。内因性ＴＲＩＭ２７を、抗ＴＲＩＭ２７抗体（赤色）によって検出した。矢頭は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在した内因性ＴＲＩＭ２７構造体を示す。スケールバー：１０μm。
【図１５Ｄ】図１５は、図１５Ａから図１５Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２及びＴＲＩＭ５δと、ＥＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの共局在を実証した実験例の結果を示す。（図１５Ａ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。スケールバー：１０μm。（図１５Ｂ及び１５Ｃ）Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰを、ＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７（図１５Ｂ）、及びＴＲＩＭ３２（図１５Ｃ）と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体（緑色）及び抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。ＴＲＩＭ３２は、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰの細胞内局在にも関わらず、Ｈｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰと共局在したことに留意されたい。（図１５Ｄ）ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２ＱＰ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。内因性ＴＲＩＭ２７を、抗ＴＲＩＭ２７抗体（赤色）によって検出した。矢頭は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物と共局在した内因性ＴＲＩＭ２７構造体を示す。スケールバー：１０μm。
【図１６Ａ】図１６は、図１６Ａから図１６Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δによる凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの低減を実証した実験例の結果を示す。（図１６Ａ及び図１６Ｂ）ＨｅＬａ細胞において単独で（−）又は示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒に発現させた場合のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１６Ａ）の左パネルでは、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示され、そしてＴＲＩＭ１１の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。（図１６Ｃ）対照（−）又はＴＲＩＭ２７ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの発現レベル。＊、非特異的バンド。（図１６Ｄ）ＰＩＡＳｙは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、ＰＩＡＳｙ、及びＰＭＬを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。
【図１６Ｂ】図１６は、図１６Ａから図１６Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δによる凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの低減を実証した実験例の結果を示す。（図１６Ａ及び図１６Ｂ）ＨｅＬａ細胞において単独で（−）又は示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒に発現させた場合のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１６Ａ）の左パネルでは、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示され、そしてＴＲＩＭ１１の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。（図１６Ｃ）対照（−）又はＴＲＩＭ２７ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの発現レベル。＊、非特異的バンド。（図１６Ｄ）ＰＩＡＳｙは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、ＰＩＡＳｙ、及びＰＭＬを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。
【図１６Ｃ】図１６は、図１６Ａから図１６Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δによる凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの低減を実証した実験例の結果を示す。（図１６Ａ及び図１６Ｂ）ＨｅＬａ細胞において単独で（−）又は示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒に発現させた場合のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１６Ａ）の左パネルでは、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示され、そしてＴＲＩＭ１１の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。（図１６Ｃ）対照（−）又はＴＲＩＭ２７ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの発現レベル。＊、非特異的バンド。（図１６Ｄ）ＰＩＡＳｙは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、ＰＩＡＳｙ、及びＰＭＬを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。
【図１６Ｄ】図１６は、図１６Ａから図１６Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３２、及びＴＲＩＭ５δによる凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑの低減を実証した実験例の結果を示す。（図１６Ａ及び図１６Ｂ）ＨｅＬａ細胞において単独で（−）又は示されたＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒に発現させた場合のＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１６Ａ）の左パネルでは、アクチンに対するＳＳ画分中のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの比が示され、そしてＴＲＩＭ１１の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。（図１６Ｃ）対照（−）又はＴＲＩＭ２７ ｓｉＲＮＡを用いて処置されたＨｅＬａ細胞内のＡｔｘｎ１ ８２Ｑの発現レベル。＊、非特異的バンド。（図１６Ｄ）ＰＩＡＳｙは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、ＰＩＡＳｙ、及びＰＭＬを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析。
【図１７Ａ】図１７は、図１７Ａから図１７Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２が、ＰＭＬとは独立して、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを低減させたことを実証した実験例の結果を示す。（図１７Ａ）ＴＲＩＭ２７とＰＭＬの部分的な共局在。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体（緑色）及び抗ＰＭＬ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。（図１７Ｂ）ＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦ内のＴＲＩＭ２７とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物の共局在化。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を、抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）によって染色した。（図１７Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又は示されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦにおいて発現させた。抽出物をフィルター位相差アッセイによって分析した。凝集物に対するＴＲＩＭタンパク質の効果をより良く比較するために、右パネルにおいてより明るい露光が示されている。
【図１７Ｂ】図１７は、図１７Ａから図１７Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２が、ＰＭＬとは独立して、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを低減させたことを実証した実験例の結果を示す。（図１７Ａ）ＴＲＩＭ２７とＰＭＬの部分的な共局在。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体（緑色）及び抗ＰＭＬ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。（図１７Ｂ）ＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦ内のＴＲＩＭ２７とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物の共局在化。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を、抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）によって染色した。（図１７Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又は示されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦにおいて発現させた。抽出物をフィルター位相差アッセイによって分析した。凝集物に対するＴＲＩＭタンパク質の効果をより良く比較するために、右パネルにおいてより明るい露光が示されている。
【図１７Ｃ】図１７は、図１７Ａから図１７Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ２７及びＴＲＩＭ３２が、ＰＭＬとは独立して、凝集したＡｔｘｎ１ ８２Ｑを低減させたことを実証した実験例の結果を示す。（図１７Ａ）ＴＲＩＭ２７とＰＭＬの部分的な共局在。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体（緑色）及び抗ＰＭＬ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。（図１７Ｂ）ＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦ内のＴＲＩＭ２７とＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ凝集物の共局在化。ＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ２７を、抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）によって染色した。（図１７Ｃ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又は示されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＰＭＬ＋/＋及びＰＭＬ−/−ＭＥＦにおいて発現させた。抽出物をフィルター位相差アッセイによって分析した。凝集物に対するＴＲＩＭタンパク質の効果をより良く比較するために、右パネルにおいてより明るい露光が示されている。
【図１８Ａ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｂ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｃ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｄ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｅ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｆ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１８Ｇ】図１８は、図１８Ａから図１８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭタンパク質が不溶性のＡｔｘｎ１ ８２Ｑを除去するために、ＳＵＭＯ２／３及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。（図１８Ａ〜図１８Ｆ）Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰを、単独で又はＴＲＩＭ５δ、ＴＲＩＭ２７、及びＴＲＩＭ３２と一緒に、ＭＧ１３２を用いずに若しくは用いて処置された細胞において（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、又は対照若しくはＳＵＭＯ２／３ノックダウン細胞（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。（図１８Ｇ）精製されたＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧのＳＵＭＯ化を、示されたような組換えＦＬＡＧ−ＴＲＩＭ１１及びＳＵＭＯ２の存在下で実施した。ＨＡ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＦＬＡＧを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びＩＰ試料をウェスタンブロットによって分析した。
【図１９Ａ】図１９は、図１９Ａから図１９Ｆを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑに関連したＴＲＩＭタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（緑色）を、示されたＨＡでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ＨＡ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。各ＴＲＩＭタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。（図１９Ａ）ＴＲＩＭ１〜ＴＲＩＭ１６の代表的な局在化パターン。（図１９Ｂ）ＴＲＩＭ１７〜ＴＲＩＭ３２の代表的な局在化パターン。（図１９Ｃ）ＴＲＩＭ３３〜ＴＲＩＭ４１及びＴＲＩＭ４４〜ＴＲＩＭ４１の代表的な局在化パターン。（図１９Ｄ）ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４〜ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ６２〜ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７３〜ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７６の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰと共局在を示したＴＲＩＭタンパク質が黄色で示されている。スケールバー：１０μm。
【図１９Ｂ】図１９は、図１９Ａから図１９Ｆを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑに関連したＴＲＩＭタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（緑色）を、示されたＨＡでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ＨＡ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。各ＴＲＩＭタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。（図１９Ａ）ＴＲＩＭ１〜ＴＲＩＭ１６の代表的な局在化パターン。（図１９Ｂ）ＴＲＩＭ１７〜ＴＲＩＭ３２の代表的な局在化パターン。（図１９Ｃ）ＴＲＩＭ３３〜ＴＲＩＭ４１及びＴＲＩＭ４４〜ＴＲＩＭ４１の代表的な局在化パターン。（図１９Ｄ）ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４〜ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ６２〜ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７３〜ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７６の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰと共局在を示したＴＲＩＭタンパク質が黄色で示されている。スケールバー：１０μm。
【図１９Ｃ】図１９は、図１９Ａから図１９Ｆを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑに関連したＴＲＩＭタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（緑色）を、示されたＨＡでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ＨＡ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。各ＴＲＩＭタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。（図１９Ａ）ＴＲＩＭ１〜ＴＲＩＭ１６の代表的な局在化パターン。（図１９Ｂ）ＴＲＩＭ１７〜ＴＲＩＭ３２の代表的な局在化パターン。（図１９Ｃ）ＴＲＩＭ３３〜ＴＲＩＭ４１及びＴＲＩＭ４４〜ＴＲＩＭ４１の代表的な局在化パターン。（図１９Ｄ）ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４〜ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ６２〜ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７３〜ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７６の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰと共局在を示したＴＲＩＭタンパク質が黄色で示されている。スケールバー：１０μm。
【図１９Ｄ】図１９は、図１９Ａから図１９Ｆを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑに関連したＴＲＩＭタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（緑色）を、示されたＨＡでタグ化されたＴＲＩＭタンパク質と一緒にＨｅＬａ細胞において発現させた。細胞を、抗ＨＡ抗体（赤色）を用いて免疫染色した。各ＴＲＩＭタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。（図１９Ａ）ＴＲＩＭ１〜ＴＲＩＭ１６の代表的な局在化パターン。（図１９Ｂ）ＴＲＩＭ１７〜ＴＲＩＭ３２の代表的な局在化パターン。（図１９Ｃ）ＴＲＩＭ３３〜ＴＲＩＭ４１及びＴＲＩＭ４４〜ＴＲＩＭ４１の代表的な局在化パターン。（図１９Ｄ）ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４〜ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ６２〜ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７３〜ＴＲＩＭ７４、及びＴＲＩＭ７６の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてＡｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰと共局在を示したＴＲＩＭタンパク質が黄色で示されている。スケールバー：１０μm。
【図２０Ａ】図２０は、図２０Ａ及び図２０Ｂを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰに対するＴＲＩＭタンパク質の体系的な分析の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（図２０Ａ）又はＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（図２０Ｂ）を、ＨｅＬａ細胞において示されたＴＲＩＭタンパク質と共発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。赤色及び緑色で標識されたＴＲＩＭタンパク質は、ポリＱタンパク質のレベルをそれぞれ減少及び増加させたものであるが、黒色で標識されたＴＲＩＭタンパク質は、観察できる効果を全く有さなかった。ＴＲＩＭタンパク質の効果は、本明細書の何処かで記載されているように、それらの発現レベルによって影響を受ける可能性があることに留意されたい。
【図２０Ｂ】図２０は、図２０Ａ及び図２０Ｂを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ及びＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰに対するＴＲＩＭタンパク質の体系的な分析の結果を示す。Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ（図２０Ａ）又はＨｔｔｅｘ１ｐ ９７ＱＰ（図２０Ｂ）を、ＨｅＬａ細胞において示されたＴＲＩＭタンパク質と共発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。赤色及び緑色で標識されたＴＲＩＭタンパク質は、ポリＱタンパク質のレベルをそれぞれ減少及び増加させたものであるが、黒色で標識されたＴＲＩＭタンパク質は、観察できる効果を全く有さなかった。ＴＲＩＭタンパク質の効果は、本明細書の何処かで記載されているように、それらの発現レベルによって影響を受ける可能性があることに留意されたい。
【図２１Ａ】図２１は、図２１Ａから図２１Ｃを含むが、これは組換えＴＡＴ−ＴＲＩＭ１１が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低減することを実証した実験例の結果を示す。ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ、又はＨｔｔ９７Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えＴＲＩＭ１１又はＳＵＭＯ２タンパク質と共にインキュベートした。（図２１Ａ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルは強く減少した。（図２１Ｂ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ｈｔｔ９７Ｑのレベルも強く減少した。（図２１Ｃ）ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルに対して最小限の効果しか及ぼさなかった。
【図２１Ｂ】図２１は、図２１Ａから図２１Ｃを含むが、これは組換えＴＡＴ−ＴＲＩＭ１１が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低減することを実証した実験例の結果を示す。ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ、又はＨｔｔ９７Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えＴＲＩＭ１１又はＳＵＭＯ２タンパク質と共にインキュベートした。（図２１Ａ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルは強く減少した。（図２１Ｂ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ｈｔｔ９７Ｑのレベルも強く減少した。（図２１Ｃ）ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルに対して最小限の効果しか及ぼさなかった。
【図２１Ｃ】図２１は、図２１Ａから図２１Ｃを含むが、これは組換えＴＡＴ−ＴＲＩＭ１１が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低減することを実証した実験例の結果を示す。ＨｅＬａ細胞を、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＧＦＰ、Ａｔｘｎ１ ３０Ｑ、又はＨｔｔ９７Ｑ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えＴＲＩＭ１１又はＳＵＭＯ２タンパク質と共にインキュベートした。（図２１Ａ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルは強く減少した。（図２１Ｂ）ＨｅＬａ細胞をＴＲＩＭ１１を用いて処置することにより、Ｈｔｔ９７Ｑのレベルも強く減少した。（図２１Ｃ）ＳＵＭＯ２は、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑのレベルに対して最小限の効果しか及ぼさなかった。
【図２２】図２２は、実験例に使用されたＴａｔ−ＴＲＩＭ１１のアミノ酸配列を示す。
【図２３】図２３は、図２３Ａから図２３Ｆを含むが、これはヒト脳試料のＲＮＦ４の染色を実証した実験の結果を示す。抗ＲＮＦ４（緑色）によるハンチントン病脳組織の免疫染色。ＲＮＦ４は、拡散した核内局在化を示したか（図２３Ａ〜図２３Ｃ）又はフォーカスを形成した（図２３Ｄ〜図２３Ｆ）（矢頭によって示される）。スケールバー：１０μm。
【図２４】図２４は、図２４Ａから図２４Ｈを含むが、これはＳＣＡ１患者の神経細胞内封入体とＲＮＦ４の共局在化を実証した実験の結果を示す。抗ポリＱ抗体（１Ｃ２）及び抗ＲＮＦ４抗体を用いてのＳＣＡ１脳組織の免疫染色。スケールバー：１０μm。
【図２５】図２５は、図２５Ａから図２５Ｌを含むが、これはＳＣＡ１患者の神経細胞内封入体とＲＮＦ４の共局在化を実証した実験の結果を示す。図２５は、抗Ｈｔｔ抗体、抗ユビキチン抗体、及び２つの別々のＲＮＦ４抗体を用いてのＨＤ脳組織の免疫染色を示す。Ｈｔｔ及びユビキチンは、中心にＲＮＦ４シグナルを有する、環状の構造（図２５Ａ〜図２５Ｈ）又は均一に分布した封入体（図２５Ｉ〜図２５Ｌ）を形成することに留意されたい。
【図２６】図２６は、図２６Ａから図２６Ｈを含むが、これはＨＤ患者の神経細胞内の封入体とＲＮＦ４の共局在化を実証した実験の結果を示す。ＨＤ脳組織のＨｔｔ及びＲＮＦ４の免疫染色が示されている。２つの異なるＲＮＦ４抗体（１番及び２番）が使用された。スケールバー：１０μm。
【図２７Ａ】図２７は、図２７Ａから図２７Ｄを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ、ｐ５３及びα−シヌクレインのＳＵＭＯ化を実証した実験の結果を示す。図２７Ａは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ、又はＰＭＬを共発現させた場合の、Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化が分析された実験を示す。溶解前に、１０μMのＭＧ１３２を４時間かけて加えた。図２７Ｂは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴと共にインキュベートされた精製Ａｔｘｎ１ ８２ＱのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｃは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１又はＰＭＬと共にインキュベートされた精製Ｆｌａｇ−ｐ５３のインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｄは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下又は非存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。
【図２７Ｂ】図２７は、図２７Ａから図２７Ｄを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ、ｐ５３及びα−シヌクレインのＳＵＭＯ化を実証した実験の結果を示す。図２７Ａは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ、又はＰＭＬを共発現させた場合の、Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化が分析された実験を示す。溶解前に、１０μMのＭＧ１３２を４時間かけて加えた。図２７Ｂは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴと共にインキュベートされた精製Ａｔｘｎ１ ８２ＱのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｃは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１又はＰＭＬと共にインキュベートされた精製Ｆｌａｇ−ｐ５３のインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｄは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下又は非存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。
【図２７Ｃ】図２７は、図２７Ａから図２７Ｄを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ、ｐ５３及びα−シヌクレインのＳＵＭＯ化を実証した実験の結果を示す。図２７Ａは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ、又はＰＭＬを共発現させた場合の、Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化が分析された実験を示す。溶解前に、１０μMのＭＧ１３２を４時間かけて加えた。図２７Ｂは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴと共にインキュベートされた精製Ａｔｘｎ１ ８２ＱのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｃは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１又はＰＭＬと共にインキュベートされた精製Ｆｌａｇ−ｐ５３のインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｄは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下又は非存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。
【図２７Ｄ】図２７は、図２７Ａから図２７Ｄを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２Ｑ、ｐ５３及びα−シヌクレインのＳＵＭＯ化を実証した実験の結果を示す。図２７Ａは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ、又はＰＭＬを共発現させた場合の、Ａｔｘｎ１ ８２ＱのＳＵＭＯ化が分析された実験を示す。溶解前に、１０μMのＭＧ１３２を４時間かけて加えた。図２７Ｂは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴと共にインキュベートされた精製Ａｔｘｎ１ ８２ＱのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｃは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下、ＴＲＩＭ１１又はＰＭＬと共にインキュベートされた精製Ｆｌａｇ−ｐ５３のインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。図２７Ｄは、Ｅ１、Ｅ２及びＳＵＭＯ２の存在下又は非存在下、ＴＲＩＭ１１ ＷＴと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのＳＵＭＯ化を示す。
【図２８Ａ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｂ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｃ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｄ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｅ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｆ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２８Ｇ】図２８は、図２８Ａから図２８Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図２８Ａは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ｈｓｐ７０の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｂは、２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１の免疫蛍光分析を示す。図２８Ｃは、Ｈｓｐ７０がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｄは、ＴＲＩＭ１１がＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図２８Ｅは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｆは、Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ（野生型）又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴ（突然変異）を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、１０μM ＭＧ１３２を３時間かけて加える。図２８Ｇは、ＨＣＴ１１６を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。４８時間後、細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した。
【図２９Ａ】図２９は、図２９Ａから図２９Ｃを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２ＱへのＴＲＩＭ１１の結合を実証した実験の結果を示す。図２９Ａは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｂは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ３０ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対するＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１及びＧＳＴタンパク質の結合を示す。
【図２９Ｂ】図２９は、図２９Ａから図２９Ｃを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２ＱへのＴＲＩＭ１１の結合を実証した実験の結果を示す。図２９Ａは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｂは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ３０ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対するＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１及びＧＳＴタンパク質の結合を示す。
【図２９Ｃ】図２９は、図２９Ａから図２９Ｃを含むが、これはＡｔｘｎ１ ８２ＱへのＴＲＩＭ１１の結合を実証した実験の結果を示す。図２９Ａは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｂは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ又はＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ３０ＱをＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートした実験を示す。図２９Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素で変性させた（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対するＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１及びＧＳＴタンパク質の結合を示す。
【図３０Ａ】図３０は、図３０Ａから図３０Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ１１が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図３０Ａは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した実験を示す。図３０Ｂは、ＴＲＩＭ１１を用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。図３０Ｃは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞をＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトした実験を示す。４８時間後、細胞を溶解し、そして２０μM ＴｈＴを用いて染色した。図３０Ｄは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。
【図３０Ｂ】図３０は、図３０Ａから図３０Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ１１が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図３０Ａは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した実験を示す。図３０Ｂは、ＴＲＩＭ１１を用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。図３０Ｃは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞をＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトした実験を示す。４８時間後、細胞を溶解し、そして２０μM ＴｈＴを用いて染色した。図３０Ｄは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。
【図３０Ｃ】図３０は、図３０Ａから図３０Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ１１が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図３０Ａは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した実験を示す。図３０Ｂは、ＴＲＩＭ１１を用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。図３０Ｃは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞をＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトした実験を示す。４８時間後、細胞を溶解し、そして２０μM ＴｈＴを用いて染色した。図３０Ｄは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。
【図３０Ｄ】図３０は、図３０Ａから図３０Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ１１が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図３０Ａは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を溶解し、そしてその後、２０μM チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）を用いて染色した実験を示す。図３０Ｂは、ＴＲＩＭ１１を用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。図３０Ｃは、ＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞をＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトした実験を示す。４８時間後、細胞を溶解し、そして２０μM ＴｈＴを用いて染色した。図３０Ｄは、ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＴＲＩＭ１１ ＭＵＴを用いてトランスフェクトされたＧＦＰ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑ−ＨＣＴ１１６細胞の沈降分析を示す。
【図３１Ａ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｂ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｃ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｄ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｅ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｆ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｇ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３１Ｈ】図３１は、図３１Ａから図３１Ｈを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図３１Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｂは、ＧＦＰ（０．４５uM）を２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は２００nM Ｈｓｐ７０と共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ＧＦＰ蛍光を１００％と設定した。Ｎ＝３。図３１Ｃは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で３０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｄは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたＨＣＴ１１６におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。４５℃で６０分間の熱ショック後、又はインキュベーターで１．５時間若しくは３時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図３１Ｅは、対照ベクター又はＦｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット分析を示す。図３１Ｆは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１又はＨｓｐ７０によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３１Ｇは、リゾチーム、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１によるＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図３１Ｈは、ＬＴＲＩＭ１１によるｐ５３凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、Ｅ１、Ｅ２、ＳＵＭＯ２又はＡＴＰを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
【図３２Ａ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｂ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｃ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｄ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｅ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｆ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３２Ｇ】図３２は、図３２Ａから図３２Ｇを含むが、これはＨＳＦ１が、ＴＲＩＭ１１の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図３２Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｂは、Ｆｌａｇ−ＴＲＩＭ１１を安定に発現しているＨＣＴ１１６細胞を、熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｃは、ＨｅＬａ細胞を熱ショック（４２℃）を用いて又は用いずに１時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｓ２Ｏ３を用いて又は用いずに３０分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｅは、Ａ５４９細胞をＨ２Ｏ２を用いて又は用いずに１００分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図３２Ｆは、熱ショックに応答したＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。図３２Ｇは、ベクター又はＨＳＦ１を安定に発現しているＡ５４９細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして３時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量ＰＣＲを分析した。
【図３３Ａ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３３Ｂ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３３Ｃ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３３Ｄ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３３Ｅ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３３Ｆ】図３３は、図３３Ａから図３３Ｆを含むが、これはｐ５３が熱ショック応答においてＴＲＩＭ１１をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図３３Ａは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞のイムノブロットを示す。図３３Ｂは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたＨＣＴ１１６ｐ５３野生型又はｐ５３ヌル細胞におけるＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。図３３Ｃは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させた対照（Ｃｔｒｌ）又はｐ５３ｓｈＲＮＡを安定に発現しているＡ５４９細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｄは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして３時間かけて回復させたＣｔｒｌ又はｐ５３ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット及び半定量ＰＣＲ分析を示す。図３３Ｅは、加熱されそして２４時間かけて回復させたＨＣＴ１１６細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、ＫＲＩＢＢ１１を加えた。図３３Ｆは、ＯＤ４９０によって分析された図３３Ｅに提示された相対的細胞数の結果を示す。
【図３４Ａ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｂ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｃ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｄ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｅ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｆ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３４Ｇ】図３４は、図３４Ａから図３４Ｇを含むが、これはＴＲＩＭ１１が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図３４Ａは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｃは、漸増濃度のリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３４Ｄは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離した加熱により凝集したＧＦＰを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｅは、予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物はリゾチーム、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図３４Ｆは、１μM Ｈｓｐ７０及び０．５μM Ｈｓｐ４０によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物（左）及びｐ５３凝集物（右）を示す沈降アッセイを示す。図３４Ｇは、０．５μM ＧＳＴ、０．５μM ＴＲＩＭ１１、１μM Ｈｓｐ７０、０．５μM Ｈｓｐ４０又は１μM Ｈｓｐ１０４によって脱凝集した予め形成されたＡｔｘｎ１ ８２Ｑ凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
【図３５Ａ】図３５は、図３５Ａから図３５Ｄを含むが、これは完全長ＴＲＩＭ１１がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３５Ａは、ＴＲＩＭ１１構造の図解を示す。図３５Ｂは、漸増濃度の示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３５Ｃは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、ＲＢＣ、又はＢ３０．２によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図３５Ｄは、示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図３５Ｂ】図３５は、図３５Ａから図３５Ｄを含むが、これは完全長ＴＲＩＭ１１がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３５Ａは、ＴＲＩＭ１１構造の図解を示す。図３５Ｂは、漸増濃度の示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３５Ｃは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、ＲＢＣ、又はＢ３０．２によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図３５Ｄは、示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図３５Ｃ】図３５は、図３５Ａから図３５Ｄを含むが、これは完全長ＴＲＩＭ１１がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３５Ａは、ＴＲＩＭ１１構造の図解を示す。図３５Ｂは、漸増濃度の示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３５Ｃは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、ＲＢＣ、又はＢ３０．２によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図３５Ｄは、示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図３５Ｄ】図３５は、図３５Ａから図３５Ｄを含むが、これは完全長ＴＲＩＭ１１がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３５Ａは、ＴＲＩＭ１１構造の図解を示す。図３５Ｂは、漸増濃度の示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３５Ｃは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、ＲＢＣ、又はＢ３０．２によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図３５Ｄは、示されたタンパク質（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図３６Ａ】図３６は、図３６Ａから図３６Ｂを含むが、これは基質へのＴＲＩＭ１１の結合が、ＴＲＩＭ１１の脱凝集機能にとって必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３６Ａは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１、ＧＳＴ−ＲＢＣ、又はＧＳＴ−Ｂ３０．２と共にインキュベートしたことを示す。図３６Ｂは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は他のＴＲＩＭ１１断片と共にインキュベートしたことを示す。
【図３６Ｂ】図３６は、図３６Ａから図３６Ｂを含むが、これは基質へのＴＲＩＭ１１の結合が、ＴＲＩＭ１１の脱凝集機能にとって必要とされることを実証した実験の結果を示す。図３６Ａは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１、ＧＳＴ−ＲＢＣ、又はＧＳＴ−Ｂ３０．２と共にインキュベートしたことを示す。図３６Ｂは、ビーズ上に固定された精製されたＦｌａｇ−Ａｔｘｎ１ ８２Ｑを、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１又は他のＴＲＩＭ１１断片と共にインキュベートしたことを示す。
【図３７Ａ】図３７は、図３７Ａから図３７Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、そのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図３７Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴと共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は１００％に設定された。Ｎ＝３。図３７Ｂは、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３７Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３７Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴの免疫蛍光分析を示す。図３７Ｅは、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
【図３７Ｂ】図３７は、図３７Ａから図３７Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、そのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図３７Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴと共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は１００％に設定された。Ｎ＝３。図３７Ｂは、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３７Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３７Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴの免疫蛍光分析を示す。図３７Ｅは、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
【図３７Ｃ】図３７は、図３７Ａから図３７Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、そのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図３７Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴと共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は１００％に設定された。Ｎ＝３。図３７Ｂは、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３７Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３７Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴの免疫蛍光分析を示す。図３７Ｅは、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
【図３７Ｄ】図３７は、図３７Ａから図３７Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、そのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図３７Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴと共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は１００％に設定された。Ｎ＝３。図３７Ｂは、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３７Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３７Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴの免疫蛍光分析を示す。図３７Ｅは、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
【図３７Ｅ】図３７は、図３７Ａから図３７Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、そのＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図３７Ａは、ルシフェラーゼ（１０nM）を、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴと共に４５℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は１００％に設定された。Ｎ＝３。図３７Ｂは、２００nM ＧＳＴ、２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３７Ｃは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３７Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクトされたＧＦＰ−ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴの免疫蛍光分析を示す。図３７Ｅは、ＴＲＩＭ１１ ＭＵＴはＡｔｘｎ１ ８２Ｑの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
【図３８Ａ】図３８は、図３８Ａから図３８Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図３８Ａは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、又はＨｓｐ１０４によるα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｂは、ＴＲＩＭ１１による用量依存的なα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｃは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートしたα−Ｓｙｎ単量体の線維形成のＥＭ画像を示す。図３８Ｄは、ＴＲＩＭ１１及びＨｓｐ１０４ Ａ５０３Ｓによって脱凝集した予め形成されたα−Ｓｙｎ線維を示した沈降アッセイを示す。図３８Ｅは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、又はＨｓｐ１０４による予め形成されたα−Ｓｙｎ線維の脱凝集を示したＴｈＴ分析を示す。
【図３８Ｂ】図３８は、図３８Ａから図３８Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図３８Ａは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、又はＨｓｐ１０４によるα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｂは、ＴＲＩＭ１１による用量依存的なα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｃは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートしたα−Ｓｙｎ単量体の線維形成のＥＭ画像を示す。図３８Ｄは、ＴＲＩＭ１１及びＨｓｐ１０４ Ａ５０３Ｓによって脱凝集した予め形成されたα−Ｓｙｎ線維を示した沈降アッセイを示す。図３８Ｅは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、又はＨｓｐ１０４による予め形成されたα−Ｓｙｎ線維の脱凝集を示したＴｈＴ分析を示す。
【図３８Ｃ】図３８は、図３８Ａから図３８Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図３８Ａは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、又はＨｓｐ１０４によるα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｂは、ＴＲＩＭ１１による用量依存的なα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｃは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートしたα−Ｓｙｎ単量体の線維形成のＥＭ画像を示す。図３８Ｄは、ＴＲＩＭ１１及びＨｓｐ１０４ Ａ５０３Ｓによって脱凝集した予め形成されたα−Ｓｙｎ線維を示した沈降アッセイを示す。図３８Ｅは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、又はＨｓｐ１０４による予め形成されたα−Ｓｙｎ線維の脱凝集を示したＴｈＴ分析を示す。
【図３８Ｄ】図３８は、図３８Ａから図３８Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図３８Ａは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、又はＨｓｐ１０４によるα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｂは、ＴＲＩＭ１１による用量依存的なα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｃは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートしたα−Ｓｙｎ単量体の線維形成のＥＭ画像を示す。図３８Ｄは、ＴＲＩＭ１１及びＨｓｐ１０４ Ａ５０３Ｓによって脱凝集した予め形成されたα−Ｓｙｎ線維を示した沈降アッセイを示す。図３８Ｅは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、又はＨｓｐ１０４による予め形成されたα−Ｓｙｎ線維の脱凝集を示したＴｈＴ分析を示す。
【図３８Ｅ】図３８は、図３８Ａから図３８Ｅを含むが、これはＴＲＩＭ１１はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図３８Ａは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、又はＨｓｐ１０４によるα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｂは、ＴＲＩＭ１１による用量依存的なα−Ｓｙｎ線維形成の防止を示したＴｈＴ分析を示す。図３８Ｃは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１と共にインキュベートしたα−Ｓｙｎ単量体の線維形成のＥＭ画像を示す。図３８Ｄは、ＴＲＩＭ１１及びＨｓｐ１０４ Ａ５０３Ｓによって脱凝集した予め形成されたα−Ｓｙｎ線維を示した沈降アッセイを示す。図３８Ｅは、ＧＳＴ、ＴＲＩＭ１１、又はＨｓｐ１０４による予め形成されたα−Ｓｙｎ線維の脱凝集を示したＴｈＴ分析を示す。
【図３９Ａ】図３９は、図３９Ａから図３９Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２１がＴＲＩＭ１１と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図３９Ａは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３９Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図３９Ｃは、漸増濃度のＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３９Ｄは、ルシフェラーゼ（１０nM）を２００nM ＧＳＴ又は２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１と共に４５℃で１分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは１００％に設定された。Ｎ＝３。
【図３９Ｂ】図３９は、図３９Ａから図３９Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２１がＴＲＩＭ１１と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図３９Ａは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３９Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図３９Ｃは、漸増濃度のＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３９Ｄは、ルシフェラーゼ（１０nM）を２００nM ＧＳＴ又は２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１と共に４５℃で１分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは１００％に設定された。Ｎ＝３。
【図３９Ｃ】図３９は、図３９Ａから図３９Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２１がＴＲＩＭ１１と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図３９Ａは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３９Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図３９Ｃは、漸増濃度のＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３９Ｄは、ルシフェラーゼ（１０nM）を２００nM ＧＳＴ又は２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１と共に４５℃で１分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは１００％に設定された。Ｎ＝３。
【図３９Ｄ】図３９は、図３９Ａから図３９Ｄを含むが、これはＴＲＩＭ２１がＴＲＩＭ１１と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図３９Ａは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定された天然（Ｎ）及び尿素変性（Ｄ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対する、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１ ＷＴ又はＭＵＴの結合を示す。図３９Ｂは、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図３９Ｃは、漸増濃度のＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図３９Ｄは、ルシフェラーゼ（１０nM）を２００nM ＧＳＴ又は２００nM ＧＳＴ−ＴＲＩＭ２１と共に４５℃で１分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは１００％に設定された。Ｎ＝３。
【図４０Ａ】図４０は、図４０Ａから図４０Ｅを含むが、これはＰＭＬ及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図４０Ａは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ６のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｂは、漸増濃度のリゾチーム又はＦｌａｇ−ＰＭＬ６（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｃは、リゾチーム、Ｆｌａｇ−ＰＭＬ６又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｄは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ４断片のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｅは、様々なＰＭＬ４断片（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図４０Ｂ】図４０は、図４０Ａから図４０Ｅを含むが、これはＰＭＬ及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図４０Ａは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ６のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｂは、漸増濃度のリゾチーム又はＦｌａｇ−ＰＭＬ６（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｃは、リゾチーム、Ｆｌａｇ−ＰＭＬ６又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｄは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ４断片のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｅは、様々なＰＭＬ４断片（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図４０Ｃ】図４０は、図４０Ａから図４０Ｅを含むが、これはＰＭＬ及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図４０Ａは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ６のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｂは、漸増濃度のリゾチーム又はＦｌａｇ−ＰＭＬ６（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｃは、リゾチーム、Ｆｌａｇ−ＰＭＬ６又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｄは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ４断片のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｅは、様々なＰＭＬ４断片（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図４０Ｄ】図４０は、図４０Ａから図４０Ｅを含むが、これはＰＭＬ及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図４０Ａは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ６のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｂは、漸増濃度のリゾチーム又はＦｌａｇ−ＰＭＬ６（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｃは、リゾチーム、Ｆｌａｇ−ＰＭＬ６又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｄは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ４断片のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｅは、様々なＰＭＬ４断片（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図４０Ｅ】図４０は、図４０Ａから図４０Ｅを含むが、これはＰＭＬ及びＡｔｘｎ１ ８２Ｑの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図４０Ａは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ６のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｂは、漸増濃度のリゾチーム又はＦｌａｇ−ＰＭＬ６（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｃは、リゾチーム、Ｆｌａｇ−ＰＭＬ６又はＧＳＴ−ＴＲＩＭ１１（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図４０Ｄは、２９３Ｔ細胞由来の精製されたＦｌａｇ−ＰＭＬ４断片のクーマシーブルー染色を示す。図４０Ｅは、様々なＰＭＬ４断片（ｎ＝３）を使用した、予め形成されたＧＦＰ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
【図４１Ａ】図４１は、図４１Ａから図４１Ｂを含むが、これはマウス一次海馬神経細胞におけるＴＲＩＭ１１を実証した実験の結果を示す。図４１Ａは、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１が、α−Ｓｙｎにより誘発された細胞死をインキュベートしたことを示すＭＴＴ分析を示す。図４１Ｂは、α−Ｓｙｎ線維により処置された海馬神経細胞におけるｐ−α−Ｓｙｎ又はｐ６２の免疫蛍光分析を示す。
【図４１Ｂ】図４１は、図４１Ａから図４１Ｂを含むが、これはマウス一次海馬神経細胞におけるＴＲＩＭ１１を実証した実験の結果を示す。図４１Ａは、ＧＳＴ又はＴＲＩＭ１１が、α−Ｓｙｎにより誘発された細胞死をインキュベートしたことを示すＭＴＴ分析を示す。図４１Ｂは、α−Ｓｙｎ線維により処置された海馬神経細胞におけるｐ−α−Ｓｙｎ又はｐ６２の免疫蛍光分析を示す。
【図４２Ａ】図４２は、図４２Ａから図４２Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、皮質神経細胞及び海馬神経細胞において熱ショックに応答してアップレギュレートされることを実証した実験の結果を示す。図４２Ａは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次皮質神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｂは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次海馬神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｃは、海馬神経細胞における熱ショックに応答した、ＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。
【図４２Ｂ】図４２は、図４２Ａから図４２Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、皮質神経細胞及び海馬神経細胞において熱ショックに応答してアップレギュレートされることを実証した実験の結果を示す。図４２Ａは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次皮質神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｂは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次海馬神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｃは、海馬神経細胞における熱ショックに応答した、ＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。
【図４２Ｃ】図４２は、図４２Ａから図４２Ｃを含むが、これはＴＲＩＭ１１が、皮質神経細胞及び海馬神経細胞において熱ショックに応答してアップレギュレートされることを実証した実験の結果を示す。図４２Ａは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次皮質神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｂは、４２℃の熱ショックを用いて３０分間処置されそして３時間かけて回復させたマウス一次海馬神経細胞のイムノブロットを示す。図４２Ｃは、海馬神経細胞における熱ショックに応答した、ＴＲＩＭ１１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＧＡＰＤＨの半定量ＰＣＲ分析を示す。
【外国語明細書】
2022000459000001.pdf