(57)【要約】【課題】新規なＤＰＰ−４阻害用組成物を提供することを課題とする。【解決手段】ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌の菌体及び／又はその培養物を有効成分とすることにより、ＤＰＰ−４阻害作用を有する飲食品および飼料を提供する。【選択図】図３
2022000416.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌の菌体及び／又はその培養物を有効成分とするＤＰＰ−４阻害用組成物。
【請求項２】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する菌が、ラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）及びビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載のＤＰＰ−４阻害用組成物。
【請求項３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＳＢＴ１００１０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９９７）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｕｍ  ＳＢＴ２９３３Ｒ（ＦＥＲＭ  Ｐ−８７４３）、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＳＢＴ２４２０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３０８４）から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項２に記載のＤＰＰ−４阻害用組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＰＰ−４阻害用組成物を含む、ＤＰＰ−４阻害用飼料組成物、ＤＰＰ−４阻害用医薬組成物、又はＤＰＰ−４阻害用食品組成物。
【請求項５】
新規ビフィズス菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＳＢＴ２４２０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３０８４）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌および/またはビフィズス菌の菌体、あるいはそれらの培養物を有効成分とするＤＰＰ−４阻害用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖制御機構は生命維持のために欠かすことのできないシステムである。低血糖は、脳へのエネルギー供給不全を引き起こして死に直結するため、絶対に避けなければならない。グルカゴンや糖質コルチコイド、エピネフリン等、血糖増加に働くホルモンが数多く存在する一方、血糖低下に作用するホルモンがインスリンただ一つであることも、その証左であると考えられる。しかしながら、飽食の時代である現在、一般的な生活を送るうえで低血糖に陥る事態はほとんどなく、むしろ高血糖による弊害が問題視されている。
【０００３】
高血糖を特徴とする代表的な疾患は糖尿病である。平成２８年の「国民健康・栄養調査」によれば、糖尿病が強く疑われる者（糖尿病有病者）、糖尿病の可能性を否定できない者（糖尿病予備群）は合わせて２０００万人と推計されており、日本国民の約６人に一人が高血糖状態にあると考えられる。さらに高血糖は、脳卒中や心筋梗塞等の脳・心血管疾患の発症リスクを高めることが知られている。また最近の研究では、認知機能低下に関与することも報告されている。したがって、高血糖を抑制することは、糖尿病を含む将来の様々な疾病発症リスク軽減に寄与し、日本人の健康寿命延長につながると考えられる。
【０００４】
高血糖を抑制するために様々な薬剤や食品成分等が提案されているが、そのターゲットの一つがジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）である。小腸粘膜に局在する内分泌細胞は、食事刺激に伴ってＧＬＰ−１やＧＩＰといったホルモンを分泌する。ＧＬＰ−１やＧＩＰは膵β細胞からのインスリン分泌を促進し、食後血糖の低下に寄与することが知られているが、体内においてＤＰＰ−４によって速やかに分解・不活化される。このＤＰＰ−４を阻害することによって、ＧＬＰ−１やＧＩＰの血中濃度を高め、血糖を低下させるのがＤＰＰ−４阻害剤である。ＤＰＰ−４阻害剤は、わが国において２００９年より使用されているシタグリプチンをはじめ、様々な化合物が糖尿病治療薬として上市されている。
【０００５】
ところで、乳酸菌およびビフィズス菌は、古来より発酵食品の製造に使用される細菌であるが、近年の研究で様々な健康機能の増進に寄与することが明らかとなりつつある。乳酸菌やビフィズス菌等で発酵した食品によるＤＰＰ−４阻害作用についても報告されており、例えば特許文献１では、スターターに乳酸菌を使用したチーズの水溶性画分がＤＰＰ−４活性を阻害すること示されている。また、特許文献２では小豆、インゲン豆発酵物が、特許文献３では大豆発酵物が、それぞれＤＰＰ−４阻害活性をもつことが示されている。しかしながら、これらの文献においては、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌自体が持つＤＰＰ−４阻害活性については検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許４９１５８３３号
【特許文献２】特許５９１６３８７号
【特許文献３】特許５９８４５１２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新たなＤＰＰ−４阻害用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の新たなＤＰＰ−４阻害用組成物を提供するものである。
＜１＞
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌の菌体及び／又はその培養物を有効成分とするＤＰＰ−４阻害用組成物。
＜２＞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する菌が、ラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）及びビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする＜１＞に記載のＤＰＰ−４阻害用組成物。
＜３＞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＳＢＴ１００１０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９９７）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｕｍ  ＳＢＴ２９３３Ｒ（ＦＥＲＭ  Ｐ−８７４３）、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＳＢＴ２４２０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３０８４）から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする＜２＞に記載のＤＰＰ−４阻害用組成物。
＜４＞
＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載のＤＰＰ−４阻害用組成物を含む、ＤＰＰ−４阻害用飼料組成物、ＤＰＰ−４阻害用医薬組成物、又はＤＰＰ−４阻害用食品組成物。
＜５＞
新規ビフィズス菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＳＢＴ２４２０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３０８４）。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するビフィズス菌の菌体及び／又はその培養物を有効成分とするＤＰＰ−４阻害用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】分解時に化学発光するＤＰＰ−４基質にヒトリコンビナントＤＰＰ−４を添加して３０分間反応させたときの化学発光強度を示したグラフである。
【図２】分解時に化学発光するＤＰＰ−４基質と、ＤＰＰ−４阻害剤であるＤｉｐｒｏｔｉｎ  Ａとを混和したものに、ヒトリコンビナントＤＰＰ−４を添加して３０分間反応させたときの相対化学発光強度を示したグラフである。
【図３】分解時に化学発光するＤＰＰ−４基質と、乳酸菌またはビフィズス菌加熱破砕上清とを混和したものに、ヒトリコンビナントＤＰＰ−４を添加して３０分間反応させたときの相対化学発光強度を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する菌の菌体）
本発明のＤＰＰ−４阻害用組成物では、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に分類されるビフィズス菌であり、且つＤＰＰ−４阻害活性を有するものであればどのようなものでも用いることができる。
具体的には、ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス  アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー  （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  ラクティス  （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス  ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス  パラカゼイ  サブスピーシーズ  パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス  プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス  ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム  カテニュラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム  シュードカテニュラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム  シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）等を例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
本発明のＤＰＰ−４阻害用組成物では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＳＢＴ１００１０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９９７）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＳＢＴ２４２０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３０８４）またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｕｍ  ＳＢＴ２９３３Ｒ（ＦＥＲＭ  Ｐ−８７４３）を使用することが好ましい。
上記の菌株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター（日本、千葉県、木更津市）から入手することができる。
【００１３】
（ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する菌の調製）
本発明のＤＰＰ−４阻害用組成物において使用する、ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する菌は、各菌の培養の常法に従って培養し、所望の量を調製すればよい。調製の一例を以下に示す。ラクトバチルス属に属する乳酸菌はＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）を用いて、ビフィドバクテリウム属に属するビフィズス菌は１％グルコース含有ＧＡＭブイヨン（日水）を用いてそれぞれ培養し、得られた培養物を遠心分離により集菌することにより菌体を得る。得られた菌体をそのまま用いてもよいし、濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した菌体を用いることもできる。菌体は加熱乾燥などにより死菌体にしたものを用いることもできる。
【００１４】
（利用方法）
上記したとおり、本発明の組成物は濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した菌体、加熱乾燥などにより得られる死菌体も有効成分とすることができることから、製剤、飲食品、飼料の原料として広く用いることができる。製剤、飲食品、又は飼料を培地として菌体を培養して、当該培地、培養物、懸濁物、又はその他の菌体含有物をそのまま製剤、飲食品、又は飼料として用いてもよく、または、他の培地で培養した菌体を製剤、飲食品、又は飼料に添加してもよい。
培養物などの形態としては、合成培地であるＧＡＭ培地（日水製薬社製）、還元脱脂乳培地など一般的に乳酸菌又はビフィズス菌の培養に用いられる培地を用いた培養物だけでなく、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料などの乳製品などを例示することができるが特に限定されるものではない。
【００１５】
本発明のＤＰＰ−４阻害用組成物の製剤化に際しては製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して濃縮、凍結乾燥することができる。これらの乾燥物、濃縮物、ペースト状物も含有される。また、ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する菌のＤＰＰ−４阻害作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能であり、これらを経口的に投与することが望ましい。
【００１６】
本発明のＤＰＰ−４阻害用組成物はどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキな
どの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
また、本発明のＤＰＰ−４阻害用組成物を配合した飲食品は、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品、又は美容用食品として使用することも可能である。
【００１７】
本発明のＤＰＰ−４阻害用組成物は、飼料に配合することができる。前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
【００１８】
本発明の組成物の投与対象は特に限定されず、ヒトに対して投与することができるが、投与対象はヒト以外の動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ又はウサギ等）であることもできる。投与対象がヒトである場合は、２０歳未満の未成年、成人、又は６５歳以上の高齢者などに投与することができる。本発明の組成物は、健康な対象に投与することもでき、糖尿病を有する対象に投与することもできる。
本発明の組成物の摂取量は、投与対象者の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、通常成人の場合、一日あたり０．１−５０００ｍｇ程度摂取すればよい。
【００１９】
（ＤＰＰ−４阻害活性の評価方法）
実施例に記載の方法、すなわち、ＤＰＰＩＶ−ＧｌｏＴＭＰｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた方法で評価が可能である。具体的には、以下の通りである。
（１）菌体粉末を１０ｍｇ/ｍｌになるようにＰＢＳ（−）で希釈し、８０℃にて３０分間加熱して加熱死菌体を得る。
（２）加熱死菌体をＳＯＮＩＦＩＥＲ ＳＦＸ１５０ＨＨ（ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて、氷上にて超音波破砕する（ｏｎ  ｔｉｍｅ  ５ｓｅｃ，  ｏｆｆ  ｔｉｍｅ  ５  ｓｅｃ，ｔｏｔａｌ  ｔｉｍｅ  ３０ ｍｉｎ，Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ３０％）。破砕後、４℃にて１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収する。
（３）上清を０．２２  μｍフィルターにて濾過する。
（４）キットの説明書に従ってＤＰＰＩＶ−ＧｌｏＴＭＲｅａｇｅｎｔを調製する。
（５）ヒトリコンビナントＤＰＰ−４ （Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ）を、氷上にて解凍したのち、ＰＢＳ（−）で１０ｎｇ/ｍｌとなるように希釈する。
（６）３８４  ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の各ｗｅｌｌに、ＤＰＰＩＶ−ＧｌｏＴＭＲｅａｇｅｎｔを２５μｌ、ＰＢＳ（−）またはＰＢＳ（−）で希釈した（３）で濾過した上清を２０μｌ、希釈したＤＰＰ−４を５μｌ加え、ピペッティングにてよく混合し、暗所で室温にて３０分間以上インキュベートする。
（７）インキュベート後、ＶＩＣＴＯＲ  Ｎｉｖｏ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて１０００  ｍｓｅｃにて発光強度を測定する。
（８）発光強度を、ＤＰＰ−４を含まないＢｌａｎｋ（１０ｎｇ/ｍｌ  ＤＰＰ−４の代わりにＰＢＳ（−）を添加したｗｅｌｌ）の測定値にて補正したのち、Ｃｏｎｔｒｏｌ（（３）で濾過した上清の代わりにＰＢＳ（−）を添加したｗｅｌｌ）の値を１００％としたときの相対値として算出する。
【００２０】
本明細書において、「ＤＰＰ−４阻害」とは、好ましくは、上記工程（１）〜（８）により活性を評価した時に、菌体粉末の発光強度が、コントロールと比較して、有意に低いことを意味する。本明細書において、ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する菌の菌体のＤＰＰ−４阻害効果は、コントロールと比較して、発光強度において、好ましくは７０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２０％以下である。
【００２１】
以下、本発明の実施例をもとにさらに詳細に説明するが、本発明は係る実施例に限定して解釈されるものではない。
【実施例】
【００２２】
（実施例品１）乳酸菌およびビフィズス菌加熱菌体破砕上清
下記（１）の各供試菌を、ラクトバチルス属はＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）、ビフィドバクテリウム属は１％グルコース含有ＧＡＭブイヨン（日水）にそれぞれ植菌し、３７℃にて１６−２４時間静置培養を行った。培養物を、生理食塩水にて２回、滅菌水にて１回洗浄し、洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を凍結乾燥処理して菌体粉末を得た。菌体粉末を１０  ｍｇ/ｍｌになるようにＰＢＳ（−）で希釈し、８０℃にて３０分間加熱して加熱死菌体を得た。加熱死菌体はＳＯＮＩＦＩＥＲ ＳＦＸ１５０ＨＨ（ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて、氷上にて超音波破砕した（ｏｎ  ｔｉｍｅ  ５ｓｅｃ，  ｏｆｆ  ｔｉｍｅ  ５ｓｅｃ，  ｔｏｔａｌ  ｔｉｍｅ  ３０ｍｉｎ，  Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ３０％）。破砕後、４℃にて１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。上清は０．２２μｍフィルターにて濾過したのち、試験に供するまで−８０℃にて保存した。
【００２３】
（１）供試菌
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＳＢＴ１００１０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９９７）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＳＢＴ２４２０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３０８４）またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｕｍ  ＳＢＴ２９３３Ｒ（ＦＥＲＭ  Ｐ−８７４３）を供試菌とした。
上記の菌株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター（日本、千葉県、木更津市）から入手することができる。
【００２４】
[試験例１]陽性対照（Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ）によるＤＰＰ−４活性阻害効果に関する試験
ＤＰＰ−４活性は、ＤＰＰＩＶ−ＧｌｏＴＭＰｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。キットの説明書に従ってＤＰＰＩＶ−ＧｌｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔを調製した。ヒトリコンビナントＤＰＰ−４（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ）は、氷上にて解凍したのち、ＰＢＳ（−）で１０ｎｇ/ｍｌとなるように希釈した。３８４  ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の各ｗｅｌｌに、ＤＰＰＩＶ−ＧｌｏＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔを２５μｌ、ＰＢＳ（−）またはＰＢＳ（−）で希釈したＤｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を２０μｌ、希釈したＤＰＰ−４を５μｌ加え、ピペッティングにてよく混合し、暗所で室温にて３０分間以上インキュベートした。インキュベート後、ＶＩＣＴＯＲ  Ｎｉｖｏ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて１０００ｍｓｅｃにて発光強度を測定した。発光強度は、ＤＰＰ−４を含まないＢｌａｎｋ（１０ｎｇ/ｍｌ  ＤＰＰ−４の代わりにＰＢＳ（−）を添加したｗｅｌｌ）の測定値にて補正したのち、Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａの代わりにＰＢＳ（−）を添加したｗｅｌｌ）の値を１００％としたときの相対値として示した。尚、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は次式に当てはめて算出した。
ＩＣ５０＝１０＾（Ｌｏｇ（Ａ／Ｂ）−（５０−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）＋Ｌｏｇ（Ｂ））
Ａ ： 阻害率５０％を挟む２つの濃度のうち高い方の濃度
Ｂ ： 阻害率５０％を挟む２つの濃度のうち低い方の濃度
Ｃ ： Ｂにおける阻害率 （％）
Ｄ ： Ａにおける阻害率 （％）
【００２５】
ＤＰＰ−４活性の評価方法について検討した結果を図１、２に示した。ヒトリコンビナントＤＰＰ−４を含まないｗｅｌｌと比較して、１ｎｇ/ｍｌ  ＤＰＰ−４を含むｗｅｌｌでは、顕著な化学発光強度の増大が認められた（図１）。すなわち、基質の分解を化学発光強度で評価可能であることが示された。また、ＤＰＰ−４阻害剤であるＤｉｐｒｏｔｉｎ  ＡによるＤＰＰ−４阻害活性を評価したところ、Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａの濃度増加に伴って、発光強度の増大が抑制されることが示された（図２）。さらに、このデータから５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出したところ、Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  ＡのＩＣ５０は４．１３μＭであった。この値は、文献やカタログデータ（２．７−６．３６μＭ）と比較しても遜色のない値であったことから、当該試験系を用いることでＤＰＰ−４阻害活性を評価可能であると判断した。
【００２６】
[試験例２]乳酸菌およびビフィズス菌によるＤＰＰ−４活性阻害効果に関する試験
実施例品１を以下の試験に供した。
ＤＰＰ−４活性は、ＤＰＰＩＶ−ＧｌｏＴＭＰｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。キットの説明書に従ってＤＰＰＩＶ−ＧｌｏＴＭＲｅａｇｅｎｔを調製した。ヒトリコンビナントＤＰＰ−４（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ）は、氷上にて解凍したのち、ＰＢＳ（−）で１０ｎｇ/ｍｌとなるように希釈した。３８４ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の各ｗｅｌｌに、ＤＰＰＩＶ−ＧｌｏＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔを２５μｌ、ＰＢＳ（−）または実施例品１を２０μｌ、希釈したＤＰＰ−４を５μｌ加え、ピペッティングにてよく混合し、暗所で室温にて３０分間以上インキュベートした。インキュベート後、ＶＩＣＴＯＲ  Ｎｉｖｏ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて１０００ｍｓｅｃにて発光強度を測定した。発光強度は、ＤＰＰ−４を含まないＢｌａｎｋ（１０ｎｇ/ｍｌ  ＤＰＰ−４の代わりにＰＢＳ（−）を添加したｗｅｌｌ）の測定値にて補正したのち、Ｃｏｎｔｒｏｌ（実施例品１の代わりにＰＢＳ（−）を添加したｗｅｌｌ）の値を１００％としたときの相対値として示した。
【００２７】
乳酸菌またはビフィズス菌の菌体破砕上清を添加したときのＤＰＰ−４活性を図３に示した。ヒトリコンビナントＤＰＰ−４のみを添加したＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して、菌体破砕上清とヒトリコンビナントＤＰＰ−４を添加した群では、相対化学発光強度が有意に低い値を示した。Ｃｏｎｔｒｏｌ群（１００％）と比較した相対化学発光強度は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＳＢＴ１００１０破砕上清添加群では６０％、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＳＢＴ２４２０破砕上清添加群では４１％、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｕｍ  ＳＢＴ２９３３Ｒ破砕上清添加群では１５％であった。ＤＰＰ−４阻害率は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＳＢＴ１００１０は４０％、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＳＢＴ２４２０は５９％、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｕｍ  ＳＢＴ２９３３Ｒは８５％であった。菌体破砕上清存在下においてＤＰＰ−４基質の分解が抑制されたことから、試験に供した菌体破砕上清はＤＰＰ−４阻害活性をもつことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明によれば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌の菌体及び／又はその培養物を有効成分とするＤＰＰ−４阻害用組成物を提供することができる。
【００２９】
[寄託生物材料への言及]
（１）ＳＢＴ２９３３Ｒ
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号２９２−０８１８）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
昭和６１年４月２２日（原寄託日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−８７４３
（２）ＳＢＴ１００１０
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号２９２−０８１８）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
令和１年６月２６日（原寄託日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９９７
（３）ＳＢＴ２４２０
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号２９２−０８１８）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
令和１年１１月２８日（原寄託日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ  Ｐ−０３０８４
【図１】
2022000416.tif 000003
【図２】
2022000416.tif 000004
【図３】
2022000416.tif 000005