(57)【要約】【課題】コンタミネーションの発生及び培養細胞の損傷を極力防止することができる細胞の遠心分離方法を提唱する。【解決手段】培地が漏出することの無いガス透過膜１２を有した培養容器１０を用い、この培養容器１０内において密閉状態にて細胞Ｃを付着培養した後、培養容器１０ごと遠心分離可能な遠心分離装置Ｓを行いて、細胞Ｃを遠沈させ、培地と細胞Ｃとを分離する。培養容器１０から細胞Ｃ及び培地を他の容器に移動させることなく細胞Ｃの回収を可能とする。【選択図】　　　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地が漏出することの無いガス透過膜を有した培養容器を用い、当該容器内において密閉状態にて細胞を付着培養した後、前記容器ごと遠心分離を行い、前記細胞を遠沈させることを特徴とする細胞の遠心分離方法。
【請求項２】
前記培養容器を保持し、回転させることにより、前記容器内の細胞を遠沈させることを特徴とする請求項１の方法を実現する遠心分離装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、付着培養した細胞の培地交換や継代における遠心分離方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
培養細胞には、培養容器の壁面に付着し、増殖を行う付着系の細胞と、培地中に浮遊した状態で増殖を行う浮遊系の細胞がある。これらの培養細胞は、一定の密度以上に増殖を行うと、死滅してしまうため、一般に、培地中の細胞密度を低減させる継代という作業を行う。また、培養細胞が増殖を行うためには、栄養源となる培地が必要となるため、一定期間ごとに、当該培地を交換する必要がある。
【０００３】
ここで、図４を参照して従来の付着培養細胞の培地交換の流れについて説明する。先ず初めに、培地の入ったシャーレ等の細胞培養用の容器１００に目的とする細胞Ｃを収容し、培養して増殖させる。細胞Ｃは容器１００の内壁面に付着して増殖する（上段左側に示す。）。その後、トリプシン等のタンパク融解酵素を加えて、細胞Ｃを容器１００の内壁面から剥離し、単細胞状態まで分散させる（上段中央に示す。）。そして、単細胞状態まで分散させた培養細胞Ｃ及びトリプシンを含有する培地（細胞懸濁溶液）を遠沈管１０１に回収する（上段右側に示す。）。
【０００４】
このとき、細胞懸濁溶液中には、上述の如くトリプシン等の酵素が含有されていることから、当該トリプシン等の酵素と細胞Ｃとを分離させるため、上記遠沈管１０１を遠心分離機１０２に固定する。そして、遠心分離器１０２を運転し、遠沈管１０１を回転し（下段左側に示す。）、遠心により細胞Ｃを遠沈させる（下段中央左側に示す。）。その後、遠沈管１０１を遠心分離器１０２から取り外し、遠心管１０１内の上清の培地を除去する。細胞Ｃが残留した遠心管１０１に、新たな培地を加えて細胞Ｃを分散させる（下段中央右側に示す。）。そして、当該細胞Ｃを分散させた細胞懸濁溶液を再びシャーレ等の細胞培養用の容器１００に移し、再び細胞Ｃの培養を行っていた。尚、上述の如き培地交換は、例えば、特許文献１においても記載されている。
【０００５】
【特許文献１】
特許第２７７１４２４号公報（第１−２頁）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法による培地交換では、培養用の容器１００から遠沈管１０１に細胞Ｃが分散された細胞懸濁溶液を移し、遠心を行い、その後、新たな培地に細胞Ｃを懸濁させ、再度培養用の容器１００に移し、培養を継続していた。そのため、培地交換や継代において、少なくとも２度、細胞Ｃを懸濁溶液の状態で容器交換を行う必要がある。
【０００７】
容器を移し替える際に、雑菌が混入するおそれが高いため、細胞Ｃにコンタミネーション（雑菌による汚染）が発生する危険性があった。また、容器の移し替えにより、細胞Ｃ自体に悪影響を及ぼし、培地交換後において、細胞の生存率が低下する問題があった。
【０００８】
更にまた、上述の如く培地交換を行う際に、付着培養細胞Ｃは、トリプシンなどのタンパク融解酵素を用いて培養容器から剥離されるが、係る方法によっても細胞Ｃが損傷するため、培地交換後における細胞の生存率の低下を招いていた。
【０００９】
そこで、本発明は、従来の技術的課題を解決するために成されたものであり、コンタミネーションの発生及び培養細胞の損傷を極力防止することができる細胞の遠心分離方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の細胞の遠心分離方法は、培地が漏出することの無いガス透過膜を有した培養容器を用い、当該容器内において密閉状態にて細胞を付着培養した後、容器ごと遠心分離を行い、細胞を遠沈させることを特徴とする。
【００１１】
本発明によれば、培地が漏出することのないガス透過膜を有した培養容器を用い、当該容器内において密閉状態にて細胞を付着培養した後、容器ごと遠心分離を行い、細胞を遠沈させるので、容器を交換することなく、細胞のみを回収することができるようになる。
【００１２】
これにより、細胞の培養時における培地の交換に際して、容器を交換することなく細胞と培地とを分離することができ、衛生的に培地の交換を行うことができるようになる。そのため、コンタミネーション（雑菌汚染）の発生を極力低減することができる。
【００１３】
また、容器交換及び細胞の培養容器からの剥離時において生じる細胞の損傷を回避することができるようになり、細胞の死滅率も低下させることができる。これにより、培養実験の効率化を図ることができるようになる。
【００１４】
請求項２の発明の遠心分離装置は、請求項１の方法を実現する培養容器を保持し、回転させることにより、前記容器内の細胞を遠沈させることを特徴とする。
【００１５】
請求項２の発明の遠心分離装置によれば、請求項１の方法を実現する培養容器を保持し、回転させることにより、容器内の細胞を遠沈させるので、容易に、請求項１の方法における培養容器を用いて容器内の細胞の遠沈を行うことができるようになる。そのため、容易に請求項１の方法を実現することができるようになる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
次に、図面に基づき本発明の実施の形態を詳述する。図１は本発明に使用する細胞培養用の容器（培養容器）１０の斜視図、図２は図１の培養容器１０のガス透過膜１２−ガス透過膜１２間の横断面図、図３は本発明の細胞の遠心分離方法を適用した培地交換の手順を示した流れ図である。
【００１７】
本実施例において用いられる培養容器１０は、図１に示す如く２枚のガス透過膜１２、１２と、このガス透過膜１２、１２の外周を連結する枠体１４とから構成されている。２枚のガス透過膜１２、１２は、図２に示す如く、所定間隔を存して対峙しており、このガス透過膜１２、１２の外周は枠体１４にて囲繞されているため、ガス透過膜１２、１２の間には密閉空間１６が形成される。
【００１８】
また、枠体１４には、例えば、一側面に外部と密閉空間１６とを連通するアクセスポート１８、１８が、複数（本実施例では、二箇所）形成されている。このアクセスポート１８は、通常は外部と密閉空間１６とが連通しないように密閉空間１６を密閉している。
【００１９】
また、本実施例におけるガス透過膜１２、１２は厚さ１００μｍのポリエチレンの膜により構成されており、この膜は図２に示すように培地や細胞Ｃ等の液体を通さずに、二酸化炭素（ＣＯ２）や酸素（Ｏ２）等の気体を自在に通すことができるものである。従って、ガス透過膜１２、１２間に培地を注入しても当該培地及び細胞Ｃは、漏出しない。
【００２０】
以上の構成により、付着系の培養細胞Ｃを培養する際には、先ず、培養容器１０の密閉空間１６内に当該細胞Ｃを含有する培地を注入する。かかる場合には、細胞Ｃを含有する培地を収容した図示しない注入器を枠体１４に形成されたアクセスポート１８に差し込み、外部から密閉空間１６に培地等を注入する。尚、培地等を注入した後は、アクセスポート１８から前記注入器を抜くことによりアクセスポート１８は自閉し、密閉空間１６は外部と遮断される。
【００２１】
これにより、密閉空間１６内では、目的細胞Ｃはガス透過膜１２、１２それぞれの内表面に図２に示す如く付着した状態で二次元平面的に増殖し、培養される。
【００２２】
次に、本発明の細胞の遠心分離方法を適用した培地交換の手順を図３を用いて説明する。上述の如くガス透過膜１２、１２の内表面に細胞Ｃが二次元平面的に付着して増殖した培養容器１０（図３の上段左側に示す。）を、遠心分離装置Ｓに固定する（図３の上段右側に示す。）。ここで、遠心分離装置Ｓは、前記培養容器１０を係脱自在に保持することが可能な図示しない容器保持部が複数設けられているものである。そして、この遠心分離装置Ｓは、例えば、当該容器保持部を水平方向に回転可能とすることにより、保持された培養容器を遠心させることができるものとする。
【００２３】
そして、上述の如き遠心分離装置Ｓに固定された培養容器１０は、当該遠心分離装置Ｓが運転されることにより、培養容器１０のガス透過膜１２に付着した細胞Ｃは、遠心分離装置Ｓの遠心力によって、剥離され、培養容器１０の特定部位、即ち、本実施例では、培養容器１０の下隅部に遠沈される。
【００２４】
これにより、培養容器１０から細胞Ｃを他の容器（遠心用の容器）に移すことなく、細胞Ｃを遠沈させ、細胞Ｃのみを回収することができるようになる。
【００２５】
その後、枠体１４に形成されたアクセスポート１８に例えば空の注入器を差し込み、密閉空間１６内において細胞Ｃと分離された培地（上清）を注入器内に抜き出す。そして、新たな培地が充填された注入器をアクセスポート１８に差し込み、密閉空間１６内に当該培地を注入する。
【００２６】
そして、当該培養容器１０を振ることにより、密閉空間１６内では、新たな培地に細胞Ｃが懸濁され（図３の下段中央に示す。）、再び、細胞Ｃの培養を継続することができるようになる（図３の下段右側に示す。）。
【００２７】
これにより、上述の如く培地と細胞Ｃとを分離する遠心作業を、培養を行う培養容器１０のまま行うことができるため、衛生的に培地の交換や継代を行うことができるようになる。そのため、コンタミネーション（殺菌汚染）の発生を極力低減することができるようになり、培地交換後の細胞Ｃの死滅率を低減することができるようになる。
【００２８】
また、本発明による細胞Ｃの付着壁（本実施例では、ガス透過膜１２の内表面）からの剥離は、遠心力により行われるため、トリプシンなどのタンパク融解酵素による生化学的な剥離や、剥離手段としてのラバー等による物理的な剥離による細胞Ｃの損傷を回避することができるようになる。そのため、より一層、細胞Ｃの死滅率を低減させることができ、培養実験の効率化を図ることができるようになる。
【００２９】
また、本実施例において、培養容器１０に密閉された培地等は、当該容器１０ごと保持し回転させることができる遠心分離装置Ｓにより遠心分離されるため、より一層、容易に細胞Ｃの剥離及び細胞Ｃと培地との分離を行うことができるようになる。
【００３０】
尚、実施例で使用した容器はそれに限定されるものでは無く、本発明を実施可能なものであれば、その形態は限定されるものではない。
【００３１】
【発明の効果】
以上詳述した如く本発明によれば、培地が漏出することのないガス透過膜を有した培養容器を用い、当該容器内において密閉状態にて細胞を付着培養した後、容器ごと遠心分離を行い、細胞を遠沈させるので、容器を交換することなく、細胞のみを回収することができるようになる。
【００３２】
これにより、細胞の培養時における培地の交換に際して、容器を交換することなく細胞と培地とを分離することができ、衛生的に培地の交換を行うことができるようになる。そのため、コンタミネーション（雑菌汚染）の発生を極力低減することができる。
【００３３】
また、容器交換及び細胞の培養容器からの剥離時において生じる細胞の損傷を回避することができるようになり、細胞の死滅率も低下させることができる。これにより、培養実験の効率化を図ることができるようになる。
【００３４】
請求項２の発明の遠心分離装置によれば、請求項１の方法を実現する培養容器を保持し、回転させることにより、容器内の細胞を遠沈させるので、容易に、請求項１の方法における培養容器を用いて容器内の細胞の遠沈を行うことができるようになる。そのため、容易に請求項１の方法を実現することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に使用する細胞培養用の容器の斜視図である。
【図２】本発明に使用する容器１０のガス透過膜−ガス透過膜間の横断面図である。
【図３】本発明の付着系の培養細胞の遠心分離方法を適用した培地交換の手順を示した流れ図である。
【図４】従来の付着系の培養細胞の培地交換の手順を示した流れ図である。
【符号の説明】
Ｓ　遠心分離装置
Ｃ　細胞
１０　容器
１２　ガス透過膜
１４　枠体
１６　密閉空間
１８　アクセスポート
【図１】
2004105139.tif 000003
【図２】
2004105139.tif 000004
【図３】
2004105139.tif 000005
【図４】
2004105139.tif 000006