(57)【要約】　　　（修正有）【課題】Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの全部もしくは一部を微生物または植物細胞にセンスまたはアンチセンスの形で組み込むことにより、１．Ｎ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産する。２．カフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物を効率よく生産する。３．カフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変する。等の課題を達成する。【解決手段】マテ由来の特定なアミノ酸配列を有し、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含むベクターで形質転換された微生物または植物体または培養細胞を用いてＮ−メチルトランスフェラーゼを生産する、またはアンチセンスＲＮＡによりＮ−メチルトランスフェラーゼの発現量を抑制する。【効果】植物中のカフェイン含有量を変化させ得る。またＮ−メチルトランスフェラーゼを生産できる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の１番から３６６番のアミノ酸配列で規定され、かつＮ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１の１番〜１４４６番の塩基配列で規定される請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号２の１番〜１４４６番の塩基配列で規定される請求項４に記載のＲＮＡ。
【請求項６】
請求項２または３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
微生物および／または植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを発現させる請求項６記載のベクター。
【請求項８】
微生物および／または植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素の発現を抑える作用を有するアンチセンスＲＮＡを発現させることができる請求項６記載のベクター。
【請求項９】
請求項４または５に記載のＲＮＡを含むベクター。
【請求項１０】
微生物および／または植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素の発現を抑える作用を有するアンチセンスＲＮＡを発現させることができる請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された微生物。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換された微生物を用いて、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法。
【請求項１３】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された植物細胞、植物組織または植物体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換植物、該植物の培養細胞または植物を用いて植物二次代謝産物を製造する方法。
【請求項１５】
植物二次代謝産物が、キサントシン、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミン、テオフィリン、カフェインから選ばれる少なくとも１つ以上の化合物である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
形質転換植物がツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、がコラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属植物又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物である請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マテ由来Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、該酵素をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、該ＤＮＡで形質転換された微生物および植物、ならびに該植物またはその培養細胞または組織を用いて、該ＲＮＡを含む核酸構造物によりカフェイン及びテオブロミンまたはその前駆体量を変化させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３１，　２５７５−（１９９２）
【０００４】
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，　１４６，　８７−（１９７５）
【０００５】
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３７，　１５７７−（１９９４）
【０００６】
【非特許文献４】Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，　９８，　６２９−（１９９６）
【０００７】
【特許文献１】特願平１１−１４６３５８号公報
【０００８】
【特許文献２】特願２０００−１５１７１８号公報
【０００９】
【特許文献３】特願２０００−２７５０６３）号公報
【００１０】
【特許文献４】特願２００１−２０９０７２公報
カフェインは、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）等のツバキ科ツバキ属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ　ａｒａｂｉｃａ）等のアカネ科コーヒー属植物、マテ（Ｉｌｅｘ　ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）等のモチノキ属植物等に含まれるプリンアルカロイドであり、医薬品原料や食品添加物として使用されている。現在のところ、カフェインは前記植物種を始めとするカフェイン産生植物からの抽出、または有機合成によって製造されている。また、チャやコーヒー、マテ茶などの嗜好品においては、それらの刺激性を緩和また又は増強するために、古典的な育種手法等を用いてカフェインおよびその中間体の含有量の低減または増加が試みられている。
【００１１】
カフェインはキサントシンからテオブロミンを経て３段階のＮ−メチル化により生合成されることが１４Ｃ−トレーサー実験により明らかにされている［非特許文献１］。このメチル化を触媒する酵素活性は、１９７５年にチャ葉の粗抽出液を用いた研究で最初に報告された［非特許文献２］。コーヒーでメチルトランスフェラーゼの精製が試みられているが［非特許文献３］、精製倍率はきわめて低かった。チャでは、メチルトランスフェラーゼの部分精製の報告はあるが［非特許文献４］、酵素タンパク質は単離されていなかった。このような中、カフェインシンターゼ、即ち、カフェイン生合成の最終反応である７−メチルキサンチン〜テオブロミン〜カフェインの２段階のメチル化反応を触媒するＮ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列及びそのアミノ酸配列をコードするＤＮＡに関しては、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から加藤等が世界に先駆けて単離精製し、報告している（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【００１２】
また、コーヒーにおいては７−メチルキサンチン〜テオブロミンの一段階のみのメチル化を触媒する酵素の存在について、同グループが世界に先駆けて単離し報告している（特許文献４）。しかしながら、マテにおいては、カフェイン生合成のメチル化反応を触媒する上記Ｎ−メチルトランスフェラーゼとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＮ−メチルトランスフェラーゼの存在は、これまでのところ全く知られていなかった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの全部もしくは一部を微生物または植物細胞にセンスまたはアンチセンスの形で組み込むことにより、以下の目的を達成しようとするものである。
（１）　工業用、食品用または医療用酵素として利用できるＮ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産する。
（２）　カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、先に単離したチャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）のカフェインシンターゼのＤＮＡ配列を基にプライマーを作成し、このプライマーを用いてマテ（Ｉｌｅｘ　ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）のｍＲＮＡから新たなホモログ遺伝子を単離した。次にこのＤＮＡをベクターに組み込んだ後大腸菌に導入し、当該ＤＮＡに由来するタンパク質を大量に発現させた。このタンパク質の酵素学的性質を調べたところ、得られた遺伝子がＮ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを確認した。本発明者らは以上の知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１５】
則ち本発明は以下のとおりである。
［１］　　配列表の配列番号１に記載の１番から３６６番のアミノ酸配列で規定され、かつＮ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチド。
［２］　　上記［１］に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［３］　　配列表の配列番号１の１番〜１４４６番の塩基配列で規定される上記［２］に記載のＤＮＡ。［４］　　上記［１］に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡ。
［５］　　配列表の配列番号２の１番〜１４４６番の塩基配列で規定される上記［４］に記載のＲＮＡ。［６］　　上記［２］または［３］に記載のＤＮＡを含むベクター。
［７］　　微生物および／または植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを発現させる上記［６］記載のベクター。
［８］　　微生物および／または植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素の発現を抑える作用を有するアンチセンスＲＮＡを発現させることができる［６］記載のベクター。
［９］　　上記［４］または［５］に記載のＲＮＡを含むベクター。
［１０］　　微生物および／または植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素の発現を抑える作用を有するアンチセンスＲＮＡを発現させることができる上記［９］記載のベクター。
［１１］　　上記［６］〜［１０］のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された微生物。
［１２］　　上記［１１］記載の形質転換された微生物を用いて、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法。
［１３］　　上記［６］〜［１０］のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された植物細胞、植物組織または植物体。
［１４］　　上記［１３］に記載の形質転換植物、該植物の培養細胞または植物を用いて植物二次代謝産物を製造する方法。
［１５］　　植物二次代謝産物が、キサントシン、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミン、テオフィリン、カフェインから選ばれる少なくとも１つ以上の化合物である上記［１４］記載の方法。
［１６］　　形質転換植物がツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、がコラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属植物又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物である上記［１５］記載の方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に関し詳細に説明する。
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼは、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を同時に有する、もしくはそれらの酵素活性のうちの少なくとも一つを有するチャもしくはコーヒー由来のＮ−メチルトランスフェラーゼとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするマテ由来のポリペプチドである。
【００１７】
このＮ−メチルトランスフェラーゼとしては、配列番号：１に示したアミノ酸配列を有しているもの、配列番号：１のアミノ酸配列に、所望とするＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を損なわない範囲で、アミノ酸の置換、挿入または欠失を行って得られた変異アミノ酸配列を有しているものを挙げることができる。すなわち、所望とする上記のＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号：１のアミノ酸配列及びその変異配列を有するポリペプチドをＮ−メチルトランスフェラーゼと総称する。
【００１８】
上記の変異アミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、それ自身が実質的にマテのＮ−メチルトランスフェラーゼと同等の機能を有し、且つ配列番号：１のアミノ酸配列と酵素活性にかかわる部位においてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチドを挙げることができる。
【００１９】
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、すなわちＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としては、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を挙げることができ、その具体例としては、配列番号：１のＤＮＡ配列、配列番号：２のＲＮＡ配列を挙げることができる。これらのＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も、本発明におけるＮ−メチルトランスフェラーゼをコード遺伝子に含まれる。
【００２０】
所望とするＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を維持した変異アミノ酸配列としては、この変異アミノ酸配列をコードする変異ヌクレオチド配列と、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものが実用上好適に利用し得る。
【００２１】
また、変異Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としても、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものが実用上好適に利用し得る。その具体例としては、配列番号：１のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ分子及び配列番号：２のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＲＮＡ分子を挙げることができる。
【００２２】
このストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ；　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行うことができ、市販のシステムとしては、ＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム）を挙げることができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００２３】
試験すべきＤＮＡまたはＲＮＡ分子を転写した膜を、製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０容のキット添付のブロッキング試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては、例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　２％（重量／容量）ＦｉｃｌｌＴＭ４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５培濃度で調製したものを１／２０に希釈して使用することができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは、３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは、４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。
【００２４】
ハイブリダイゼーションの温度は、４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は、６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは２×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を、プローブに用いた標識を利用して識別することができる。
【００２５】
なお、変異は、自然界において生じたものでもよく、ヌクレオチド配列における部位突然変異により人工的に起こしたものでも良い。
【００２６】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ分子は、例えば、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ技術（植物のＰＣＲ実験プロトコール（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社（１９９５））を利用して、本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼを生産する細胞から分離することができる。
【００２７】
具体的には、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡにリンカーを結合させ、Ｎ−メチルトランスフェラーゼを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡとリンカー間でＰＣＲを行うこと等により、目的ｃＤＮＡの全長配列を単離することができる。
【００２８】
このようなハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術により得られるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子は、少なくとも単離に使用する部位においては、配列番号：１に記載のＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドである。
【００２９】
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（遺伝子）を有するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を単離するために用いる生物としては、カフェインまたはその前駆体を産生する生物であればすべて使用できるが、中でもマテ（Ｉｌｅｘ　ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）等のモチノキ属植物、チャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを例示することができる。
【００３０】
次にＮ−メチルトランスフェラーゼを含む発現ベクターの構築方法ならびに形質転換植物の作製方法及びＲＮＡｉ法によるＮ−メチルトランスフェラーゼ酵素の発現抑制方法について説明する。
【００３１】
本報告中のＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子もしくはそのアンチセンスＲＮＡを植物細胞内で発現させるためには、（ｉ）植物細胞内で転写可能なプロモーター、（ｉｉ）プロモーターの下流にセンス方向またはアンチセンス方向に連結したＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＡの全部または一部、（ｉｉｉ）必要に応じて該遺伝子ＤＮＡの下流に連結された転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列、を含む発現カセットを植物細胞に導入する。
【００３２】
ここでアンチセンスＲＮＡの鋳型としては、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ分子の全部または一部またはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子をアンチセンス方向に連結したヌクレオチド配列、あるいはＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＲＮＡ分子の全部または一部またはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＲＮＡ分子をアンチセンス方向に連結したヌクレオチド配列であって、カフェインまたはその前駆体を産生する宿主細胞中において発現した際に宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現を阻害する機能を有するものを挙げることができる。
【００３３】
ここで、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわちアンチセンスＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させるためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。この部分としては、このようなアンチセンスｍＲＮＡの形成に必要となる部分であり、例えば少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げることができる。
【００３４】
アンチセンスｍＲＮＡ形成用のＤＮＡ分子としては、例えば、配列番号：１のヌクレオチド配列の全部または一部と相補性を有しているＤＮＡ分子を挙げることができ、アンチセンスＲＮＡ分子としては、配列番号：２のヌクレオチド配列の全部または一部と相補性を有しているＲＮＡ分子を挙げることができる。これらのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る変異配列の全部または一部と相補性を有しているＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子もこのような目的に用いることができる。
【００３５】
これらの阻害用のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子自体は、必ずしも本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするものでなくともよい。
【００３６】
発現カセットは、挿入されているＤＮＡを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有し得る。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、嫌気的条件、特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入によって発現するイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるシロイヌナズナの「ＨＳＰ１８．２」遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるイネの「ｒａｂ」遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。またイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸等の特定の化合物によって、イネの「ｒａｂ」遺伝子プロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００３７】
或いはまた、発現カセットに挿入されているＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターを単離して利用する方法も挙げられる。具体的なプロモーターの単離方法の一例には、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子、例えばＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡの全部又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション技術の利用により、ゲノムＤＮＡ断片を選択し、該遺伝子の上流部ＤＮＡを特定する方法を挙げることができる。
【００３８】
組み換えＤＮＡ分子の植物への導入に備えるために、大腸菌の複製シグナル及び形質転換された細菌の細胞を選抜するためのマーカー遺伝子を含むクローニングベクターが数多く利用できる。このようなベクターの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系等がある。適当な制限酵素切断部位で、目的の配列をベクターに導入することができる。得られたプラスミドＤＮＡの特徴を明らかにするため、制限酵素切断部位分析、ゲル電気泳動、及びその他の生化学的−分子生物学的方法が一般に用いられる。各々の操作を終えた後、プラスミドＤＮＡを切断して、別のＤＮＡに結合させることができる。各プラスミドＤＮＡの配列を、同じプラスミド又は別のプラスミド中にクローニングすることができる。
【００３９】
植物宿主細胞の中に発現カセットを導入するためには、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または、アグロバクテリウム　リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストへの直接導入（インジェクション法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガン法等やその他の可能性が含まれる。
【００４０】
プロトプラストへの直接導入では、特別に必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になることもある。例えばＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、ＴｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも右端の配列、大抵は両端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。
【００４１】
アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき発現カセットを、特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクター中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列と相同な領域をもつため、相同組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴｉまたはＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含まれている必要がある。通常ＴｉまたはＲｉプラスミドにｖｉｒ領域が含まれており、その働きにより、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００４２】
一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００４３】
なお、このようにして得られた発現カセットを含む中間ベクターまたはバイナリーベクター、及びこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。
【００４４】
形質転換された植物細胞は、再生過程を経ることにより植物体に変換することができる。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネではＦｕｊｉｍｕｒａら［Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｅｔｔ．，　２，　７４−（１９９５）］の方法、トウモロコシでは、Ｓｈｉｌｌｉｔｏら［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　７，　５８１−（１９８９）］の方法、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法［Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．，　１２，
７−（１９９２）］などが挙げられる。
【００４５】
これらの方法により作出された植物体は、カフェイン及びカフェインまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質の発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン及びテオブロミン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン及びテオブロミン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られたトランスジェニック植物は本発明の対象である。本発明において、「植物体」とは植物に分類される生物個体の全体もしくは一部の器官（例えば、葉、茎、根、花、果実、種子等）もしくは培養細胞を指す。
【００４６】
前記のＳＡＭをメチル基供与体としてカフェインを生成する植物としては、チャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、カカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物など、カフェイン産生植物を例示することができる。
【００４７】
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを導入してＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質を大量に発現させるための微生物としては、大腸菌や枯草菌等の細菌及びバキュロウイルス等のウイルスを例示することができる。
【００４８】
また、ホスト細胞の代謝を改変して特定化合物の生産性向上や特定の化合物群の生成比改変を図ることを目的に、本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡをセンスまたはアンチセンスの形で組み込む植物としては、カフェインまたはその前駆体を産生する植物であればすべて使用できるが、中でもチャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、カカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを例示することができる。
【００４９】
これらの方法により作出された植物体は、カフェインまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼの発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られたトランスジェニック植物は本発明の対象である。
【００５０】
また近年、植物のポストトランスレーショナルなジーンサイレンシングの研究から、ウイルス等の外来核酸に対して植物が本来備えている防御機項を利用して、目的遺伝子の発現を抑制することが可能なことがわかってきた（Ｃｅｌｌ，９５，１７７−１８７（１９９８）、化学と生物、３７、５３２−（１９９９）、蛋白質核酸酵素、４４、１３９６−（１９９９））。これによれば、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等が植物に進入した場合、植物はこれらの鋳型からアベラントＲＮＡを転写し、植物が本来持っている配列の転写産物と配列特異的に二本鎖ＲＮＡを形成する。この二本鎖ＲＮＡはＲＮａｓｅにより分解されることにより、目的の遺伝子の発現を抑制することが可能となる（Ｃｅｌｌ，９６，　３０３−（１９９９））。本方法の重要な特徴のひとつは、発現を抑制したい配列を目的植物に必ずしも形質転換させる必要がない点にある。また本方法のさらなる特徴は、植物の一部（下位葉等）に目的の核酸を感染等により導入すれば、その効果が植物体全体に広がることである。具体的な発現抑制方法は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子またはＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部の配列またはそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の全部または一部を含む二本鎖ＲＮＡや、二本鎖ＤＮＡを持つアグロバクテリウムを植物の下位葉に感染させる。ここで、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわちアベラントなＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させるためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。この部分としては、このようなアベラントなｍＲＮＡの形成に必要となる部分であり、例えば少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げることができる。
【００５１】
これらの方法を施された植物体は、カフェインまたはテオブロミンまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質の発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られた植物は本発明の対象である。本発明でいう植物には、葉、花、果実、種子などの植物の特定の組織または細胞も含まれる。
【００５２】
上記の構成のベクターで形質転換されたもしくはベクターの感染された植物細胞または植物組織を培養して、あるいは同様に形質転換された植物体を栽培して、カフェイン及びテオブロミン合成系にかかる二次代謝産物の製造やこれらの形質転換体で生産される二次代謝産物の組成の改変を行うことができる。この二次代謝産物としては、例えば、７−メチルキサンチン、パラキサンチン、テオブロミン及びカフェインからなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の化合物を挙げることができる。
【００５３】
形質転換に用いる植物細胞、植物組織または植物体の供給原としては、例えば、形質転換植物体が、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属植物又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物を挙げることができる。中でもチャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを好ましいものとして例示することができる。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］　Ｎ−メチルトランスフェラーゼのクローニングのための１本鎖ｃＤＮＡの合成
（１）ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの単離
５ｇの若いマテ（Ｉｌｅｘ　ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）を液体窒素存在下で乳棒、乳鉢を用いて破砕した。液体窒素の昇華後、５ｍｌの２％ＣＴＡＢ，０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ９．５）、　２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１．４Ｍ　ＮａＣｌ、　５％β−　ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌに溶かして６５℃に１０分放置する。等量のクロロホルム液を加えて撹拌し、総量で１０ｍｌ程度にした。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、水層をとり、２．５ｍｌの１０Ｍ塩化リチウム液を加え、少なくとも２時間、−２０℃に放置する。４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上清を除去し、沈殿を１ｍｌのＴＥに溶解し、再度、遠心分離を行った。上清を回収し、１ｍｌのＴＥ飽和フェノール溶液を加えて転倒混和し、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。さらに上清にフェノール／クロロホルムを加えて撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。水層を回収し、等量のクロロホルム液を加え、撹拌する。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、水層を回収し、１／４倍量の１０Ｍ塩化リチウム液を加え、少なくとも２時間、−２０℃に放置する。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、得られた沈殿に７０％　エタノールを加えて、再度、遠心分離を行った。沈殿を真空ポンプでドライアップした後、２００μｌの水に溶解しｔｏｔａｌ　ＲＮＡの画分とした。
【００５５】
（２）　３’−ＲＡＣＥ法による３’末端のクローニングに必要なｃＤＮＡ合成３’−ＲＡＣＥはＴＡＫＡＲＡの３’−Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔを使用した。配列表にないプライマーはこのセットに添付されているものである。６５℃５分間の熱処理を行ったｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　１μｇをテンプレートにして、このセットの取扱説明書に書かれている方法でｏｌｉｇｏ　ｄＴ−３−ｓｉｔｅｓ　Ａｄａｐｔｏｒ　Ｐｒｉｍｅｒを用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。反応液の組成は以下の通りである。この反応液をＧｅｎｅ　ＡｍｐＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　２４００（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いて、３０℃／１０分、５０℃／１時間、９５℃／５分反応させる条件で反応生成物を得た。
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【００５６】
［実施例２］　３’−ＲＡＣＥ法によるカフェインシンターゼ遺伝子のクローニング
先に述べた方法で調製した１本鎖ｃＤＮＡをテンプレートにした以下の反応液を調製した。本発明者等が既に単離報告しているチャ由来のカフェインシンターゼＴＣＳ１から配列番号３のプライマーＴＣＳ−ＳＡＭ１を設計しＰＣＲ反応に供試した。この反応液をＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　２４００（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９５℃／１分の反応後、９４℃／１分、５７℃／１分、７２℃／１分３０秒を３０サイクル反応させる条件でＰＣＲを行い、反応生成物を得た。
【００５７】
テンプレートｃＤＮＡを含む先の反応液　　　　　　２０μｌ
１０×ｂｕｆｆｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　１０μｌ
２．５ｍＭ　ＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　１６μｌ
ＴＣＳ−ＳＡＭ１　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ（２０ｐｍｏｌ）
３　ｓｉｔｅｓ　Ａｄａｐｔｏｒ　Ｐｒｉｍｅｒ　　　１μｌ（２０ｐｍｏｌ）
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５１μｌ
ＥｘＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）　　　　　　　　　　　　１μｌ
【００５８】
［実施例３］　プラスミドベクターへのサブクローニング
０．８％　アガロースゲルを用いてＴＡＥ中で反応生成物の電気泳動を行い、得られた目的生成物のバンドを切り取り、ＧＥＮＥ　ＣＬＥＡＮ（フナコシ）を用いてゲルからＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをｐＴ７ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォーメーションした。Ｘ−ｇａｌを用いてカラーセレクションを行った後に、アンピシリンを含むＬＢ培地で液体培養を行い、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。インサートの有無はアガロース電気泳動によって確認した。
【００５９】
［実施例４］　塩基配列の決定
単離したプラスミドを用いて下記のターミネーションミックス反応液中でプライマーエクステンションを行った。反応条件は９８℃／５分間反応させた後、９８℃／１分、５０℃／４５秒、７２℃／１．５分間を２５サイクル行った後に７２℃／１分間反応させた。反応終了後、各チューブに反応停止液を８μｌずつ加えた。９８℃／５分の熱変性を行い。サンプルを氷中で急冷した後に、島津ＤＳＱ−２０００Ｌ（Ｓ）システムを用いて分析した。試薬は、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ　に添付されているものを用いた。
【００６０】
サンプルミックス反応液
プラスミドＤＮＡ　（１ｐｍｏｌ）　　　　　　　　　　３μｌ
標識Ｐｒｉｍｅｒ（２ｐｍｏｌ）　　　　　　　　　　１μｌ
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２μｌ
ターミネーションミックス反応液　（１サンプルにつき４種類）
Ａ反応液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
サンプルミックス　　　　　　　　　　　　　　　　　６μｌ
Ｇ反応液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
サンプルミックス　　　　　　　　　　　　　　　　　６μｌ
Ｃ反応液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
サンプルミックス　　　　　　　　　　　　　　　　　６μｌ
Ｔ反応液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
サンプルミックス　　　　　　　　　　　　　　　　　６μｌ
【００６１】
［実施例５］　５’ＲＡＣＥ法によるＮ−メチルトランスフェラーゼｍＲＮＡの５’上流域の単離
５’上流域の単離には、５’−Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。
３‘ＲＡＣＥの結果から得られた配列情報をもとに配列番号４〜８のプライマーを設計した。配列番号４（ＬＣＳ−ＲＴ）のプライマーを用いて１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを行い、ｈｙｂｒｉｄ　ＲＮＡの分解、ライゲーション反応による１本鎖ｃＤＮＡの環化の後に、配列番号５（ＬＣＳ１−ＡＲ）及び配列番号６（ＬＣＳ１−Ｂｎ）のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃／３分の反応後、９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／１分を３０サイクルとし、反応生成物を得た。さらにこれを鋳型として配列番号７（ＬＣＳ１−ＣＲ）及び配列番号８（ＬＣＳ１−Ｄｎ）のプライマーを用いて９４℃／３分の反応後、９４℃／３０秒、５２℃／３０秒、７２℃／３０秒を３０サイクルとし、反応生成物を得た。アクリルアミド電気泳動により反応生成物のバンドを分離し、ゲルからＤＮＡを回収し、ｐＴ７ｂｌｕｅベクターにサブクローニングし、島津製作所のＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてサンプルを調製した後に、島津ＤＳＱ−２０００Ｌ（Ｓ）システムを用いてＤＮＡの塩基配列を決定した。３’ＲＡＣＥと５’ＲＡＣＥの結果を合わせて結合させ、得られた全長の配列を配列表の配列番号１に示す。該配列はＬＣＳ１と命名した。
【００６２】
［実施例６］　Ｎ−メチルトランスフェラーゼの大腸菌での発現
単離したＬＣＳ１遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションした。得られた大腸菌を３７℃で２時間培養した後に、ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭになるように加え、３０℃でさらに５時間培養を行った。培養終了後集菌し、３ｍｌの培養液の菌体に対し０．２ｍｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ−Ｎａ２中で１分間断続的に超音波破砕を行った。これを１４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を酵素液とした。この酵素液を用い活性を測定したところ、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性が認められた。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によれば、工業用、食品用または医療用酵素として利用できるＮ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産する事が可能になる。
【００６４】
本発明によれば、カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変することが可能になる。
【００６５】
【配列表】
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