(57)【要約】　　　（修正有）【課題】毛包プラコードに発現する新規細胞外マトリックスタンパク質及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供する。【解決手段】本発明にかかるタンパク質及びその遺伝子は、マウス由来の新規な細胞外マトリックス因子であり、マウス由来の特定なアミノ酸配列からなるタンパク質、及び／又は、該アミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質と、これをコードする遺伝子である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項２】
マウス由来である請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち、５２７〜７０４５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２に記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号３に示される塩基配列のうち、１〜９５１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２に記載の遺伝子。
【請求項５】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸からなるタンパク質。
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項６】
ヒト由来である請求項５記載の遺伝子。
【請求項７】
配列番号５に示される塩基配列のうち、１〜６５７９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項５又は６に記載の遺伝子。
【請求項８】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項９】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項１０】
細胞外マトリックスタンパク質である請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
分泌タンパク質である請求項８〜１０の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
毛包プラコードに発現する請求項８〜１１の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１４】
配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項１５】
細胞外マトリックスタンパク質である請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１６】
分泌タンパク質である請求項１３〜１５の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜７の何れか１項に記載の遺伝子を含む組み換え発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１９】
請求項８〜１６の何れか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項２０】
請求項１〜７の何れか１項に記載の遺伝子又は請求項８〜１６の何れか１項に記載のタンパク質を含むことを特徴とする毛包形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、毛包プラコードに発現する新規細胞外マトリックスタンパク質、およびその遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
毛包は、毛根を鞘状に取り囲んでいる組織で、毛根を保護し、毛の伸長の経路となる。毛包の発生には、他の多くの器官と同様に上皮−間葉系細胞（間質）間の相互作用が重要な役割を果たしている。
【０００３】
例えば、マウス頬髭の場合には、上記上皮−間質間の相互作用の過程で、胎齢１２日の上皮にプラコード（毛包上皮原基）が形成される。毛包形成期のプラコードは、間質細胞に働きかけ、プラコード直下の間質に間充織の誘導を促す。そして、上記上皮−間質間の相互作用により毛包が形成されることになる。それゆえ、プラコードに特異的に発現する因子は、毛包形成に重要な働きをすると考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記プラコードに特異的に発現し、毛包の形成に関与すると考えられる因子はすでにいくつか同定されており、これら因子を用いて毛包形成の分子メカニズムの解明が図られている。しかしながら、現時点では、毛包を人工的に作り出すまでには至っていない。これは、毛包形成の分子メカニズムにおいて、未知の因子が存在することを示唆しており、この未知の因子の同定は、上記分子メカニズムの解明と、毛包の人工的な作製に重要であると考えられる。
【０００５】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は、毛包の形成を調節する新規な因子及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、マウス毛包形成期のプラコードを含む組織よりＲＮＡを抽出して毛包プラコードに特異的に発現するｃＤＮＡを選別し、これを用いてタンパク質を発現させ、その機能を解析した。その結果、得られたタンパク質が細胞接着及び伸展活性を有する新規な細胞外マトリックスタンパク質であり、毛包の形成を調節する新規な因子であると推測されること等を見出すとともに、さらに、上記マウスのｃＤＮＡの塩基配列を利用して、ヒトにおいて相同なｃＤＮＡの塩基配列を決定し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明に関わるタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であり、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
【０００８】
（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【０００９】
（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【００１０】
また、本発明に係る他のタンパク質は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であり、本発明に係る他の遺伝子は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１１】
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸からなるタンパク質。
【００１２】
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【００１３】
上記（ａ）のタンパク質は、本発明者らが、今回新たにマウスから毛包プラコードに発現する新規な細胞外マトリックスタンパク質として単離、同定したものである。本発明にかかるタンパク質は、Ｎ末端側に予想分泌シグナル配列を有しているが、膜貫通ドメインがなく、分泌タンパク質であると推測される。
【００１４】
上記（ｃ）のタンパク質は、本発明者らによって、上記マウスＱＢＲＩＣＫタンパク質に対応するヒトの相同タンパク質として同定されたものであり、後述するように、上記マウスＱＢＲＩＣＫタンパク質と相同性を有している。
【００１５】
本発明に係る組み換え発現ベクターは、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１に示される遺伝子が挿入された組み換え発現ベクターが挙げられる。組み換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることが出来るが、特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されたことを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織、器官のみならず、動物個体（マウスやラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として、広く用いられており、ノックアウトマウス等は、細胞外マトリックス因子の、機能解析、同因子が関係する病気の病態解析やその病気の診断法、診断薬、治療法の開発などに有用である。
【００１７】
本発明に係る抗体は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質、又はその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００１８】
後述するように、本発明に係る遺伝子は、胎齢１２日のマウスでは毛包プラコードに特異的に強い発現が見られること、本発明に係るタンパク質はその生理活性として細胞接着及び伸展活性を有することなどから、新たな毛包形成調節因子である可能性が高い。それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、抗体等は、毛包形成促進剤の開発に応用することが可能である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
本発明は、毛包プラコードに発現する新規な細胞外マトリックスとこれをコードする遺伝子とを見出すとともに、これら遺伝子及びタンパク質の機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明の遺伝子、タンパク質の配列、構造について説明し、ついでこれら遺伝子、タンパク質の機能、利用方法等について説明することとする。
【００２１】
（１）本発明に係る遺伝子及びタンパク質の配列、構造
本発明者は、胎齢１２日のマウス胎仔頬上皮由来のｃＤＮＡから、ＲＤＡ法（Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，　Ｌｙｓｉｔｓｙｎ，　Ｗｉｇｌｅｒ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９，　９４６−９５１　（１９９３）他）を用いて、頬上皮に特異的に発現していると考えられるｃＤＮＡの断片を得た。その配列情報を利用して胎齢１２日マウス胎仔頬由来ＲＮＡより、ＰＣＲ法及び５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法を用いて２種類の全長ｃＤＮＡ配列を決定し、さらにこれら２種類のｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ決定した。
【００２２】
これら新規タンパク質の構造解析の結果、第１の新規ｃＤＮＡを「ＱＢＲＩＣＫ遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「ＱＢＲＩＣＫタンパク質」と称して説明する。第２の新規ｃＤＮＡは、上記ＱＢＲＩＣＫ遺伝子の選択的スプライシングアイソフォームと考えられるが、この第２のｃＤＮＡを「ＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質」と称して説明する。
【００２３】
さらに、本発明者らは、上記ＱＢＲＩＣＫ遺伝子と相同性を有する核酸配列をヒトゲノム配列と比較することから、ヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を決定し、さらにこのｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を決定した。そこで、以下の説明では、ヒト由来の新規ｃＤＮＡ配列を「ヒトＱＢＲＩＣＫ遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「ヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質」と称して説明する。
【００２４】
なお、以下の説明では、特に断りのない限り、ＱＢＲＩＣＫ遺伝子又はＱＢＲＩＣＫタンパク質とは、それぞれマウス由来の上記第１の新規ｃＤＮＡ又はそれにコードされるタンパク質を指し、ヒト由来のものは、必ず「ヒトＱＢＲＩＣＫ遺伝子」又は「ヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質」と称して説明する。
【００２５】
本発明に係る遺伝子は、前述のように、（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号１に示される塩基配列のうち、５２７〜７０４５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（ＱＢＲＩＣＫ遺伝子）、▲２▼配列番号３に示される塩基配列のうち、１〜９５１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（ＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子）、▲３▼これらｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子はマウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来である。
【００２６】
また、本発明に係る他の遺伝子は、前述のように、（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子であればよいが、本実施の形態では、▲４▼配列番号５に示される塩基配列のうち、１〜６５７９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（ヒトＱＢＲＩＣＫ遺伝子）、▲５▼このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子はヒト由来である。
【００２７】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。またＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）或いは（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２８】
一方、本発明に係るタンパク質は、上記（　　ａ）又は（ｂ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しており、２１７２のアミノ酸残基からなるＱＢＲＩＣＫタンパク質、及び、▲２▼配列番号４に示されるアミノ酸配列を有しており、３１６のアミノ酸残基からなるＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質が例示される。
【００２９】
また、本発明に係る他のタンパク質は、前記（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有しており、２１９２のアミノ酸残基からなるヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質が例示される。
【００３０】
このＱＢＲＩＣＫタンパク質は、後述する実施例で説明するように、新たな毛包形成調節因子である可能性が高い。それゆえ、本発明に係るタンパク質に含まれる上記（ｂ）のタンパク質とは、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／又は付加されたアミノ酸配列からなる毛包形成調節因子（タンパク質）であればよい。
【００３１】
ここで、上記（ｂ）のタンパク質における「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」とは、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３２】
上記変異を持つタンパク質には、野生型の活性、すなわち毛包形成調節因子の機能等に異常を持つ変異タンパク質（機能欠失型の変異タンパク質と称する）が含まれてもよい。このような機能欠失型の変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、上記機能欠失型の変異タンパク質をコードする遺伝子が含まれても良い。このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
【００３３】
本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）やＦＬＡＧ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。またＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎなどの各種修飾を受けていてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。
【００３４】
次に、本発明に係る上記３種類の遺伝子及びタンパク質について個別に説明する。
【００３５】
＜ＱＢＲＩＣＫ遺伝子及びタンパク質＞
上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質は、図１（ａ）・（ｂ）に示すように、Ｎ末端に２９アミノ酸残基からなる分泌シグナル配列（図中Ｓ）を持ち、膜貫通ドメインは存在しないことがその一次構造から推定されるため、細胞外分泌タンパク質であると予測される。
【００３６】
また、上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質は、図１（ａ）・（ｃ）に示すように、Ｎ末端側に、２つの繰り返し配列と推定される配列（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ（２））を有している。図１（ｃ）では、ＦｉｒｓｔがＮ末端側からの最初の繰り返し配列を示し、Ｓｅｃｏｎｄが二番目の繰り返し配列を示し、図中下線のアミノ酸残基は同一の残基であるか、またはその化学的性質が類似したアミノ酸残基であることを示す。そして、二番目の繰り返し配列には、図中二重下線で示すように、細胞外マトリックスタンパク質の多くが共有する細胞接着シグナルの一つとして知られているＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列が含まれている。
【００３７】
さらに、図１（ａ）及び図２に示すように、上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質は、１２のタンデム繰り返し配列を有している。図２では、Ｆｉｒｓｔ，　Ｓｅｃｏｎｄ，　Ｔｈｉｒｄ・・・の順でそれぞれ１２の繰り返し配列のＮ末端側からの順序を示し、図中下線のアミノ酸残基は同一の残基であるか、またはその化学的性質が類似したアミノ酸残基であることを示す。
【００３８】
また、図１（ａ）及び図３（ａ）に示すように、上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質は、上記１２のタンデム繰り返し配列に続いて、Ｃａｌｘ−βドメインを有している。
【００３９】
さらに、図１（ａ）及び図３（ｃ）に示すように、ＱＢＲＩＣＫタンパク質はＣ末端にタイプＣ−レクチン様ドメインを有している。なお、図１（ａ）におけるＣａｌｘ−βドメインとタイプＣ−レクチン様ドメインとの間の配列を図３（ｂ）に示す。
【００４０】
上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質と相同性を有するタンパク質としては、図８〜図１５及び図１６に示すように、ＥＣＭ３タンパク質とＮＧ２タンパク質が存在する。
【００４１】
図８〜図１５では、ＭｍＱＢＲＩＣＫがマウスのＱＢＲＩＣＫタンパク質を、ＬｖＥＣＭ３がウニのＥＣＭ３タンパク質を、ＨｓＥＣＭ３がヒトのＥＣＭ３タンパク質を、ＲｎＮＧ２がラットのＮＧ２タンパク質を示す。図８〜図１５から明らかなように、ＥＣＭ３タンパク質及びＮＧ２タンパク質の何れもＱＢＲＩＣＫタンパク質と相同性を示す領域を含んでいる。
【００４２】
上記ＥＣＭ３タンパク質については、ウニにおいて、中胚葉細胞の移動に関与することが知られている。また、ＮＧ２タンパク質については、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）による刺激を、ＰＤＧＦ受容体とともに働いて受容することが知られており、また、オリゴデンドロサイト前駆細胞の細胞表面マーカーとして利用されている。
【００４３】
また、図１６に示すように、本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＥＣＭ３タンパク質及びＮＧ２タンパク質は、何れも１０以上の繰り返し配列（図中ｒｅｐｅａｔ　ｄｏｍａｉｎ）を有している。具体的にはＱＢＲＩＣＫタンパク質は上述したように１２の繰り返し配列を有しており、ＥＣＭ３タンパク質も１２の繰り返し配列を有しており、ＮＧ２タンパク質は１５の繰り返し配列を有している。
【００４４】
また本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質は、ＥＣＭ３タンパク質と同様に、Ｃａｌｘ−βドメインを繰り返し配列のＣ末端側に有している。
【００４５】
これに対して、ＥＣＭ３タンパク質及びＮＧ２タンパク質は、何れもＣ末端側に膜貫通ドメイン（図中ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ）を有しているが、本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質は、上述したように膜貫通ドメインを有しておらず、上記タイプＣ−レクチン様ドメイン（図中Ｃ−ｌｅｃｔｉｎ　ｌｉｋｅ　ｄｏｍａｉｎ）を有している。また、ＮＧ２タンパク質はＮ末端側に２つのラミニンＧドメインを有しているが、本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質は、ラミニンＧドメインを有していない。
【００４６】
＜ＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子及びタンパク質＞
ＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子は本発明に係る第２の新規ｃＤＮＡとして見出されたものであり、図４（ａ）・（ｂ）に示すように、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質は、ＱＢＲＩＣＫタンパク質と同様、Ｎ末端の２９アミノ酸残基からなる分泌シグナル配列（図中Ｓ）、及び、図４（ａ）・（ｃ）に示すように、ＲＧＤ配列を含む、２つの繰り返し配列と推定される配列（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ（２））を有している。
【００４７】
しかしながら、図１６にも示すように、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質は、１２のタンデム繰り返し配列、Ｃａｌｘ−βドメイン、及びタイプＣ−レクチン様ドメインを完全に欠損していることから、ＱＢＲＩＣＫタンパク質の選択的スプライシングアイソフォームをコードしていると考えられる。なお、図４（ａ）におけるＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ（２）に続く配列を図４（ｄ）に示す。
【００４８】
＜ヒトＱＢＲＩＣＫ遺伝子及びタンパク質＞
ヒトＱＢＲＩＣＫ遺伝子は、その塩基配列が上記マウスＱＢＲＩＣＫ遺伝子と高い相同性を有しており、同じく、ヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質は、図８〜図１５に示すように、マウスＱＢＲＩＣＫタンパク質と高い相同性を有している。図５（ａ）〜（ｃ）、図６、及び図７（ａ）〜（ｃ）に示すように、ヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質は、マウスＱＢＲＩＣＫタンパク質と同様、分泌シグナル配列、２つの繰り返し配列と推定される配列、ＲＧＤ配列、１２のタンデム繰り返し配列、Ｃａｌｘ−βドメイン、及びタイプＣ−レクチン様ドメインを有している。加えて、図７（ｂ）に下線で示すように、ヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質は、Ｃａｌｘ−βドメインとタイプＣ−レクチン様ドメインの間に、第２のＲＧＤ配列を有している。
【００４９】
また、図１６に示すように、本発明に係るヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質は、ＱＢＲＩＣＫタンパク質と同様に、１２の繰り返し配列を有しており、ＥＣＭ３タンパク質やＮＧ２タンパク質と類似する構造を有している。
【００５０】
（２）本研究に係る新規細胞外マトリックスタンパク質の機能
本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質は、分泌シグナル配列を有しており、何れも細胞外分泌型のタンパク質（分泌タンパク質）であることが予測される。しかも、本発明に係るＱＢＲＩＣＫ遺伝子は、ホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果から、胎齢１２日のマウス胎仔において、頬髭の毛包プラコードに特異的に発現が見られること（後述の実施例２及び図１７参照）、さらにＲＴ−ＰＣＲによる解析の結果から、ＱＢＲＩＣＫ　ｍＲＮＡの発現が皮膚で見られること（後述の実施例５及び図１８参照）から本発明に係るＱＢＲＩＣＫ遺伝子及びＱＢＲＩＣＫタンパク質が、毛包形成に大きく関与していることが示唆される。また、細胞接着アッセイの結果から、ＱＢＲＩＣＫタンパク質が細胞接着活性を有すること（後述の実施例７及び図２０参照）、及び細胞伸展アッセイの結果から、ＱＢＲＩＣＫタンパク質が細胞伸展活性を有すること（後述の実施例６及び図１９参照）から、ＱＢＲＩＣＫ遺伝子及びＱＢＲＩＣＫタンパク質が、毛包形成に関与した細胞内シグナル伝達に機能している可能性が考えられる。
【００５１】
さらに、上記ヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質は、マウスＱＢＲＩＣＫタンパク質と高い相同性を有しているため、上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質と同様の機能を有すると考えられる。
【００５２】
また、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子は、前述したように、ＱＢＲＩＣＫタンパク質の選択的スプライシングフォームをコードしていると考えられるため、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子及びＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質は、上記ＱＢＲＩＣＫ遺伝子及びＱＢＲＩＣＫタンパク質と一部共通の機能を有していることが予測される。
【００５３】
（３）本発明に係るタンパク質、及びその遺伝子の利用法
上記のように、本発明に係るタンパク質は、本発明者によって初めて明らかにされた新規な細胞外マトリックスタンパク質であり、毛包プラコードに特異的に発現する細胞外マトリックスタンパク質であると予測される。したがって、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は以下の有用性を有する。
【００５４】
まず、毛包形成に大きく関与していると推定されることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、毛包形成に異常をきたす疾患の診断、治療へ応用することが可能であるとともに、毛包形成の異常により引き起こされる疾患等の診断、治療への応用、並びに治療薬探索の標的タンパク質として利用が可能である。
【００５５】
また、細胞外マトリックスは、細胞の増殖、分化、移動など細胞の諸活動に大きな影響を与え、その結果、発生、加齢、疾患などに重要な働きを持つことが明らかになっている。
【００５６】
それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、及びその抗体等は、受精、胚発生、形態形成、さらには細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾病を研究する上で大変有用な道具となり得る。また、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断薬や、その治療効果を検査するための検査薬として有効に用いることが出来る。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質などは、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に応用可能である。
【００５７】
また、前述したように、細胞外マトリックスの多くは細胞接着、伸展活性を持ち、組織での細胞の接着を支持することにより細胞の形態を規定する物理的作用のほかに、細胞表面レセプターを介して細胞に生存、増殖、分化等細胞の生命活動を支配する細胞内シグナルを伝達する。個々の細胞外マトリックス因子は異なる細胞内シグナルを伝達し、これによって細胞、及びその集合体である組織の形成、機能を緻密に制御している。本発明に係るタンパク質は、新たな細胞機能制御因子として、これら制御に関わっていることが十分予測される。
【００５８】
従って、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、例えば生体内において罹患時や術後の組織修復の促進もしくはその制御にも有用であると考えられる。
以下では、本発明に係る遺伝子、タンパク質等の具体的な利用法について説明する。
【００５９】
本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、各種ホスト細胞中に導入して、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質又はその変異タンパク質を発現させることが出来る。導入された本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、ホスト細胞中でベクターとして存在してもいいし、ホスト細胞のゲノムＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、ホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定のホスト細胞のゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加してホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００６０】
上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけではなくターミネーター配列を含めても良い。
【００６１】
また、上記遺伝子又は変異遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いても良い。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターとともにホスト細胞へ導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することが出来る。あるいは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質のＧＦＰ融合タンパク質を発現させても良い。
【００６２】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることが出来る。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の細菌、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）や分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等の酵母、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物の培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００６３】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００６４】
前述したように、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、研究用の各種試薬だけでなく、細胞外マトリックスの関与する病気の診断や治療、治療効果の検査等に用いられる各種薬剤に応用することが可能となる。
【００６５】
本発明に係る遺伝子やタンパク質等の薬剤化については、従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば研究用試薬の場合、本発明に係る遺伝子を形質転換キット化したり、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質を異種発現系で大量生産し精製したりすればよい。
【００６６】
同様に、本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質及びＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることが出来る。
【００６７】
また、本発明に係る遺伝子又はタンパク質は、毛包形成調節因子と推定されることから、毛包形成促進剤として利用できる可能性がある。このような毛包形成促進剤として利用する場合、その具体的な組成は、本発明に係る遺伝子またはタンパク質が含まれていれば特に限定されるものではない。具体的には、使用対象の動物個体の種類に応じて、毛包形成の促進のために、本発明に係る遺伝子またはタンパク質の機能が発揮出来るような緩衝液等が含まれていればよい。
【００６８】
また、本研究に係る遺伝子の一部配列をプローブやプライマーとして用いることが出来る。上記一部配列とは、上記ＱＢＲＩＣＫ遺伝子及びＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子に含まれる特徴的・特異的な配列であればよい。このようにプローブとして用いる場合としては、例えば、本発明に係る遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査、診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００６９】
（４）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係る上記ＱＢＲＩＣＫ遺伝子、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子、及びヒトＱＢＲＩＣＫ遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、又はヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを作製し、ヒトやマウスなどのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、又はヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００７０】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作製及びその塩基配列の決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００７１】
また、上記プローブの配列を、上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、又はヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質をコードするｃＤＮＡの機能上重要と考えられる領域（例えば、分泌シグナル配列、ＲＧＤ配列、１２の繰り返し配列、Ｃａｌｘ−βドメイン、タイプＣ−レクチン様ドメイン等）の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、ＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、又はヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質と同等の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００７２】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、又はヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト・マウスなどのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含む断片を大量に取得できる。
【００７３】
本発明に係るタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、又はヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質、あるいはその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を導入した組み換え発現ベクター作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞等に組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、又はヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質等の本発明に係るタンパク質を容易に取得する事が出来る。
【００７４】
上記ＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、又はヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　Ｇｅｎｅ　１５２，　２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの公知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することが出来る。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００７５】
【実施例】
以下の実施例では、本発明に係るＱＢＲＩＣＫ遺伝子、及びＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子をマウスから取得した具体的な方法、並びにヒトＱＢＲＩＣＫ遺伝子をヒトから取得した具体的な方法、及び本発明に係るＱＢＲＩＣＫ遺伝子の発現を調べた結果、さらにはＱＢＲＩＣＫタンパク質の生理活性を調べた結果について、順番に説明する。
【００７６】
〔実施例１〕：ＱＢＲＩＣＫ　ｃＤＮＡのクローニング
胎齢１２日（Ｅ１２）のマウス胎仔頬上皮由来ｃＤＮＡより、ＲＤＡ法を用いて頬上皮に特異的に発現していると考えられるｃＤＮＡの断片を得た。さらに、これらのｃＤＮＡ断片の配列情報を利用して、胎齢１２日マウス胎仔頬上皮由来ＲＮＡより、ＰＣＲ法、５’ＲＡＣＥ法、及び３’ＲＡＣＥ法を用いて全長ｃＤＮＡを合成し、その塩基配列を決定した。
【００７７】
その結果、配列番号１に示すように、全長が９３２８塩基で、２１７２のアミノ酸よりなるタンパク質をコードしていると推定されるＱＢＲＩＣＫ遺伝子が得られた。
【００７８】
また、アミノ酸配列の解析から、図１〜図３に示すように、Ｎ末端に２９アミノ酸よりなる分泌シグナル配列を有するが、膜貫通ドメインが無いことから、分泌タンパク質であると推定されること、分子内に１２のタンデム繰り返し配列があること、ＲＧＤ配列が含まれること、Ｃａｌｘ−βドメインを有すること、タイプＣ−レクチン様ドメインを有すること、図８〜図１５に示すように、ウニの細胞外マトリックスタンパク質の１種であるＥＣＭ３タンパク質やラットのプロテオグリカンの１種であるＮＧ２タンパク質に対し高い相同性を示すことが明らかとなった。
【００７９】
〔実施例２〕：ＱＢＲＩＣＫ−Ｓ　ｃＤＮＡのクローニング
胎齢１３日（Ｅ１３）の胎仔より、常法により全ＲＮＡを抽出した。それぞれの全ＲＮＡ１５０ｎｇをｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、配列番号７に示すフォワードプライマーと、配列番号８に示すリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行った。
【００８０】
ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣ　（配列番号７）
ＡＴＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡ　（配列番号８）
具体的には、全ＲＮＡ１５０ｎｇより得られたｃＤＮＡに対して、硫酸マグネシウム１ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ＫＯＤ　−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）２Ｕ、フォワードプライマー０．５μＭ、リバースプライマー０．５μＭ、ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ　−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を加えてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃にて２分反応させた後、９４℃にて１５秒、５５℃にて３０秒、６８℃にて７分を１サイクルとして５サイクル行い、その後さらに、９４℃にて１５秒、６０℃にて３０秒、６８℃にて７分を１サイクルとして２６サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙクローニングベクターに組み込んだ。このＰＣＲ産物を含むクローニングベクターを精製し、その塩基配列を常法により決定した。
【００８１】
その結果、３１６アミノ酸よりなるＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質をコードする、全長６５６４塩基よりなるＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子が得られた。ＱＢＲＩＣＫ−Ｓ遺伝子は、ＱＢＲＩＣＫ遺伝子の５２７番目から７０４１番目の塩基に相当するが、ＱＢＲＩＣＫ遺伝子の１３７３番目から１３７６番目の塩基に相当する４塩基が欠失していること、またＱＢＲＩＣＫ遺伝子の４９６６番目と４９６７番目の塩基の間に相当する部位に、５３塩基が挿入されていることから、ＱＢＲＩＣＫタンパク質の選択的スプライシングアイソフォームをコードしていると考えられる。
【００８２】
〔実施例３〕：ヒトＱＢＲＩＣＫ　ｃＤＮＡの塩基配列の決定
マウスＱＢＲＩＣＫ遺伝子の塩基配列を用いてＮＣＢＩホームページのＢＬＡＳＴｎを用いて相同性検索を行った。その結果、ｇｉ番号で示す、以下の塩基配列を得た。
【００８３】
２０５３９８４２　全長４９３５塩基
２１４１０２７７　全長２４３９塩基
マウスＱＢＲＩＣＫ遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列に基づき、２０５３９８４２の１〜４７９０塩基までに続いて、２１４１０２７７の４４９〜２４３９塩基までを結合し、新たに６７８１塩基からなる塩基配列を得た。この塩基配列を用いてＢＬＡＳＴｎでヒトＥＳＴに対して相同性検索を行い、相同なヒトＥＳＴを得た。得られたヒトＥＳＴと前述の塩基配列を比較したところ、６５６０番目の塩基「ｇ（グアニン）」については、以下に示す１７のヒトＥＳＴ（ｇｉ番号で示す）
５８５５６３３，６５７００５４，４６６４８６３，１４２４１６６，４２８３０４７，
５２３４１１１，５５９２７６９，４１８６７０８，５４４４７０８，１３７２９８６５，
５８７４７２３，５３６７８７３，４１７４９４７，３５３９０３０，７３４６５４，
２１０６９４３，６７００６８０，５８７７４８９，３８７１７０４，２０９９９９８２，
１３７４８５４３，１２８１３０９
においてはそこに相当する塩基はいずれも「ｔ（チミン）」であるため、６５６０番目の塩基は「ｔ」に修正した。この方法で得られた塩基配列のうち、１〜６７５３塩基までがヒトＱＢＲＩＣＫ遺伝子の１〜６７５３塩基に相当する。
【００８４】
また、ヒトＱＢＲＩＣＫ遺伝子における６７５４〜６８１８塩基については、以下に示す１５のヒトＥＳＴ（同じくｇｉ番号で示す）
５８５５６３３，６５７００５４，４６６４８６３，５２３４１１１，５５９２７６９，
４１８６７０８，５４４４７０８，５８７４７２３，５３６７８７３，４１７４９４７，
３５３９０３０，２１０６９４３，６７００６８０，５８７７４８９，３８７１７０４
の間で完全に一致する、６５塩基からなる塩基配列を用いた。
【００８５】
その結果、最終的に、配列番号５に示すように、全長が６８１８塩基で、２１９２のアミノ酸よりなるタンパク質をコードしていると推定される新規ヒトＱＢＲＩＣＫ遺伝子が得られた。
【００８６】
〔実施例４〕：ホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる各組織での遺伝子発現解析
得られたＱＢＲＩＣＫ遺伝子における塩基配列９７４〜１４７６番目、２６５３〜３２０６番目、４６２７〜５１２６番目、５９２７〜６４２６番目、及び６７９７〜７３２６番目の配列をもとに、アンチセンスプローブ及びセンスプローブをジゴキシゲニンラベリングキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて作製した。これら５つのプローブを混合したもので、胎齢１２日（Ｅ１２）のマウス胎仔を用いて、常法により、ホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。発現解析はジゴキシゲニン同定キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行った。その結果、図１７に示すように、頬髭毛包のプラコード特異的に遺伝子発現が認められた。
【００８７】
〔実施例５〕：ＲＴ−ＰＣＲによる組織での遺伝子発現解析
各胎齢の胎仔及び成体のマウスからそれぞれの器官或いは胎仔を取り出し、常法によりそれぞれ全ＲＮＡを抽出した。それぞれの全ＲＮＡ１５０ｎｇをｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、配列番号９に示すフォワードプライマーと、配列番号１０に示すリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行った。
【００８８】
ＴＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＣＴＡＧＡ　（配列番号９）
ＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＧＴＡＧＣＧＧＡＡＡ　（配列番号１０）
具体的には、全ＲＮＡ１５０ｎｇより得られたｃＤＮＡに対して、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ＥｘＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ　ＥｘＴａｑ、宝酒造社製）２Ｕ、フォワードプライマー０．５μＭ、リバースプライマー０．５μＭ、ＥｘＴａｑバッファー（宝酒造社製）を加えてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応条件は、９６℃にて２分反応させた後、９６℃にて３０秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて１分を１サイクルとして３２サイクル行った。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲルを用いて電気泳動し、ＤＮＡを染色することにより確認した。
【００８９】
その結果、図１８に示すように、本発明に係るＱＢＲＩＣＫ　ｍＲＮＡは、胎仔期（胎齢１０日〜１８日の胎仔）では恒常的に発現しており、成体の組織では、眼、卵巣、腎臓などで強い発現が認められた。なお、図１８の電気泳動図における“ｓｋｉｎ（皮膚）”では、ＱＢＲＩＣＫ　ｍＲＮＡのバンドが見え難くなっているが、実際には発現している。
【００９０】
〔実施例６〕：ＱＢＲＩＣＫタンパク質の細胞伸展活性のアッセイ
ＱＢＲＩＣＫタンパク質のＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−Ｎ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼにＱＢＲＩＣＫタンパク質のアミノ酸残基２３〜２８０を含む断片を融合させたタンパク質）、及びＧＳＴ−ＮにおいてＱＢＲＩＣＫタンパク質の２０７番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸残基をグルタミン酸に置換した変異体ＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅを大腸菌に発現させ精製した。
【００９１】
９６穴のマイクロタイタープレートを１ウェル当たり１０μｇ／ｍｌ，５０μｌのＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｎ或いはＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅを用いて４℃にて一晩インキュベートし、プレートをコーティングした。コーティングしたウェルをＰＢＳで二度洗浄した後、５０μｌの１％牛血清アルブミンを用いて室温で３０分間ブロッキングした。
【００９２】
牛血清アルブミン溶液を除去後、ＤＭＥ培地、或いは１ｍｇ／ｍｌのＧＲＧＤＳＰ又はＧＲＧＥＳＰペプチドを添加したＤＭＥ培地に対し、２×１０５／ｍｌの濃度となるように懸濁したＨｅＬａ細胞を１００μｌ添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、伸展した細胞の割合を測定した。
【００９３】
その結果、図１９に示すように、ＧＳＴと比較した場合、ＧＳＴ−Ｎでは顕著な細胞伸展が認められた。この細胞伸展は、ＧＲＧＤＳＰペプチドの添加によって阻害されたが、ＧＲＧＥＳＰペプチドでは阻害されなかった。一方、ＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅでは顕著な細胞伸展は認められなかった。以上の結果から、ＱＢＲＩＣＫタンパク質は、そのＲＧＤ配列に依存した細胞伸展活性を有することが明らかとなった。
【００９４】
〔実施例７〕：ＱＢＲＩＣＫタンパク質の細胞接着活性のアッセイ
ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＮおよびＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅを大腸菌に発現させ精製した。９６穴のマイクロタイタープレートを１ウェル当たり０，１，２，５，１０，２０μｇ／ｍｌ，５０μｌの精製ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＮあるいはＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅで４℃、一晩インキュベートし、プレートをコーティングした。コーティングしたウェルをＰＢＳで二度洗浄した後、５０μｌの１％牛血清アルブミンを用いて室温で３０分ブロッキングした。
【００９５】
牛血清アルブミン溶液を除去後、０．１％牛血清アルブミンを含むＤＭＥ培地に対し２×１０５／ｍｌに懸濁したＨｅＬａ細胞を１００μｌ添加した。３７℃で１時間インキュベート後、ＤＭＥ培地でウェルを洗浄し、接着した細胞数を測定した。
【００９６】
その結果、図２０に示すように、ＧＳＴと比較した場合、ＧＳＴ−Ｎでは、コーティング濃度に依存した顕著な細胞接着が認められた。一方、ＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅでは顕著な細胞接着は認められなかった。以上の結果から、ＱＢＲＩＣＫタンパク質は、そのＲＧＤ配列に依存した細胞接着活性を有することが明らかとなった。
【００９７】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、毛包形成に大きく関与していることが示唆されるため、毛包形成の異常をきたす疾患の診断、治療へ応用することが可能であるとともに、毛包形成の異常により引き起こされる疾患等の診断、治療への応用、並びに治療薬探索の標的タンパク質として利用が可能であるという効果を奏する。
【００９８】
また、本発明に係るタンパク質は細胞外マトリックスタンパク質であると推定されるため、細胞外マトリックスの機能解析等の研究に利用できるばかりでなく、細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常に起因する疾患、疾病の診断薬、治療薬、治療効果を検査するための検査薬の開発等に有効利用できるという効果を奏する。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に利用できるという効果を奏する。
【００９９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は、本発明にかかるＱＢＲＩＣＫタンパク質の一次構造の概略を示す模式図であり、（ｂ）は、（ａ）に示すＱＢＲＩＣＫタンパク質のシグナル配列を示すアミノ酸配列図であり、（ｃ）は、（ａ）に示すＱＢＲＩＣＫタンパク質におけるＮ末端側の２つの繰り返し配列と推定される配列を示すアミノ酸配列図である。
【図２】図１（ａ）に示すＱＢＲＩＣＫタンパク質における１２のタンデム繰り返し配列を示すアミノ酸配列図である。
【図３】（ａ）は、図１（ａ）に示すＱＢＲＩＣＫタンパク質におけるＣ末端側のＣａｌｘ−βドメインを示すアミノ酸配列図であり、（ｂ）は、図１（ａ）に示すＱＢＲＩＣＫタンパク質におけるＣａｌｘ−βドメインとタイプＣ−レクチン様ドメインとの間の配列を示すアミノ酸配列図であり、（ｃ）は、図１（ａ）に示すＱＢＲＩＣＫタンパク質におけるＣ末端側のタイプＣ−レクチン様ドメインを示すアミノ酸配列図である。
【図４】（ａ）は、本発明にかかるＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質の一次構造の概略を示す模式図であり、（ｂ）は、（ａ）に示すＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質のシグナル配列を示すアミノ酸配列図であり、（ｃ）は、（ａ）に示すＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質における２つの繰り返し配列と推定される配列を示すアミノ酸配列図である。
【図５】（ａ）は、本発明にかかるヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質の一次構造の概略を示す模式図であり、（ｂ）は、（ａ）に示すヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質のシグナル配列を示すアミノ酸配列図であり、（ｃ）は、（ａ）に示すヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質におけるＮ末端側の２つの繰り返し配列と推定される配列を示すアミノ酸配列図である。
【図６】図１（ａ）に示すヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質における１２のタンデム繰り返し配列を示すアミノ酸配列図である。
【図７】（ａ）は、図５（ａ）に示すヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質におけるＣ末端側のＣａｌｘ−βドメインを示すアミノ酸配列図であり、（ｂ）は、図５（ａ）に示すヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質におけるＣａｌｘ−βドメインとタイプＣ−レクチン様ドメインとの間の配列を示すアミノ酸配列図であり、（ｃ）は、図５（ａ）に示すヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質におけるＣ末端側のタイプＣ−レクチン様ドメインを示すアミノ酸配列図である。
【図８】本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、およびヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図９】本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、およびヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図８の続きを示す。
【図１０】本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、およびヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図９の続きを示す。
【図１１】本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、およびヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図１０の続きを示す。
【図１２】本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、およびヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図１１の続きを示す。
【図１３】本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、およびヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図１２の続きを示す。
【図１４】本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、およびヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図１３の続きを示す。
【図１５】本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質、ＱＢＲＩＣＫ−Ｓタンパク質、およびヒトＱＢＲＩＣＫタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図１４の続きを示す。
【図１６】本発明に係るＱＢＲＩＣＫ遺伝子が、胎齢１２日の胎仔マウスの組織で発現する状態を示す図である。
【図１７】本発明に係るｎＰＧタンパク質、ｎＰＧ−Ｓタンパク質、およびヒトｎＰＧタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのドメイン構造を比較する模式図である。
【図１８】本発明に係るＱＢＲＩＣＫ　ｍＲＮＡにおける、胎仔および成体マウスの組織での発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す電気泳動図である。
【図１９】本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質のＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−ＮおよびＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅを用いて、細胞伸展活性を検討した結果を示す図である。
【図２０】本発明に係るＱＢＲＩＣＫタンパク質のＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−ＮおよびＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅを用いて、細胞接着活性を検討した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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