(57)【要約】【課題】医薬品の合成原料として使用されるセサモールの生物学変換方法による製造方法の提供。【解決手段】１，３−ベンゾジオキソールをセサモールに変換する能力を有するキサントモナス属に属する微生物Ｍｅｒ−Ｈ１０８株からその変換反応に関与する遺伝子群を同定した。さらにその遺伝子群の塩基配列を有するＤＮＡまたはその改変体を保持する微生物が提供され、前記微生物を用いて１，３−ベンゾジオキソールからのセサモールの製造が可能となった。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2004105064.tif 000022
で示される１，３−ベンゾジオキソールの式（ＩＩ）
【化２】
2004105064.tif 000023
で示されるセサモールへの生物学的変換方法による、式（ＩＩ）で示されるセサモールの製造方法であって、
（Ａ）前記生物学的変換方法を行いうるものであって、かつ、配列番号１で示される塩基配列中、２６０２番目から７１８１番目の配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする改変体ＤＮＡを保持する菌株またはその培養菌体の存在下で、式（Ｉ）で示される１，３−ベンゾジオキソールをインキュベーション処理する工程、
（Ｂ）インキュベーション処理液から式（ＩＩ）で示されるセサモールを採取する工程、
を含んでなる方法。
【請求項２】
生物学的変換方法を行いうる菌株がキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属またはエッシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する菌株である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セサモール（または３，４−（メチレンジオキシ）フェノール）の生物学的な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セサモールは、血圧降下剤等の医薬品の合成原料として重要である。セサモールの製造方法としては、ヘリオトロピンからの合成法（例えば、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８９，Ｍａｒｃｈ，１６７、Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．，１９８４，４９，４７４１、石油学会誌　２９（５），３６４（１９８６）、Ｉｎｄ．　Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１９８３，２２，１１５０、特開平７−２５８６８号公報、特開２００２−１３８０８７号公報等）が知られている。またウサギ肝臓由来のＰ４５０酵素を用いた１，３−ベンゾジオキソールのセサモールへの変換方法（Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，　１９９２，　Ｏｃｔ．，　４２（４），　６９５−７０２）は知られていたが、微生物を用いる生物学的な製造方法は知られていなかった。
【０００３】
一方、本発明者らの一部は、先にインドール誘導体の生物学的方法による水酸化を試み、インドール環の７位を効率的に酸化する能力をもつキサントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）　Ｍｅｒ−Ｈ１０８株を見出した。さらにその遺伝子を解析し、７位水酸化反応に関与する遺伝子群（ＩｏｘＡ〜ＩｏｘＦ）を見出し、特許出願している（特開２００１−９５５７７号）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記した合成法が抱える問題点（例えば、毒性の高い化合物の使用、ハロゲン含有溶媒の使用、等）の少ない生物学的変換方法による１，３−ベンゾジオキソールを原料としたセサモールの新規な製造方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために広範な微生物群から１，３−ベンゾジオキソールの５位水素原子を水酸基に変換しうる微生物を探索したところ、意外にもインドール環の７位水素原子を水酸基に変換する能力をもつことが知られているキサントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）　Ｍｅｒ−Ｈ１０８株が目的の変換能をも有することを見出した。さらにその変換反応に関与する遺伝子について調べたところ、インドール環の７位水酸化に関与する遺伝子群が本変換反応についても関与していることを見出した。
【０００６】
従って、本発明は、式（Ｉ）
【化３】
2004105064.tif 000002
で示される１，３−ベンゾジオキソールの式（ＩＩ）
【化４】
2004105064.tif 000003
で示されるセサモールへの生物学的変換方法による、式（ＩＩ）で示されるセサモールの製造方法であって、
（Ａ）前記生物学的変換方法を行いうるものであって、かつ、配列番号１で示される塩基配列中、２６０２番目から７１８１番目の配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする改変体ＤＮＡを保持する菌株またはその培養菌体の存在下で、式（Ｉ）で示される１，３−ベンゾジオキソールをインキュベーション処理する工程、
（Ｂ）インキュベーション処理液から式（ＩＩ）で示されるセサモールを採取する工程、
を含んでなる方法、を提供するものである。
【０００７】
本発明の生物学的変換方法では、配列番号１で示される塩基配列中、２６０２番目から７１８１番目の配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする改変体ＤＮＡを保持する菌株であって、前記式（Ｉ）で示される１，３−ベンゾジオキソールを前記式（ＩＩ）で示されるセサモールへ変換する能力を有する菌株並びにそれらの培養菌体調製物であれば、属、種および株の種類を問うことなく使用することができる。そのような菌の好ましい例として、前記キサントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）　Ｍｅｒ−Ｈ１０８株の他、本菌株由来の変換反応関連遺伝子をさらに本菌株に導入した形質転換体Ｈ１０８（ｐＩＺ３１１）株　（ＦＥＲＭＰ−１７４２１、特開２００１−９５５７７号）、Ｈ１０８（ｐＲＧ００１）株あるいはエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０９株に導入した形質転換体ＪＭ１０９（ｐＲＧ００１）　株等を挙げることができる。
【０００８】
本菌株Ｍｅｒ−Ｈ１０８株は神奈川県藤沢市の畑の土壌から分離した菌株で、その形態は幅０．４μｍの長桿菌で極鞭毛による運動性があり、酵母エキス　０．１％、ペプトン　０．１％、ＫＨ２ＰＯ４　０．１％、グルコース　０．１％、寒天２％からなる寒天培地（加熱殺菌前にｐＨ　６．８に調整）上で好気的に成育し３１℃で１日培養すると０．５ｍｍ以下の点状で淡黄色の扁平状のコロニーを形成するグラム染色陰性の細菌である。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に平成１１年４月５日付けでＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ　Ｍｅｒ−Ｈ１０８株として寄託されている（受託番号　ＦＥＲＭ　Ｐ−１７３５９）。
【０００９】
本発明の方法に用いる菌株が保持するＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列の２６０２番目から７１８１番目の配列をもつＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする改変体ＤＮＡである。配列番号１における２６０２番目から７１８１番目の塩基配列中には、ＩｏｘＡ（配列番号１中、２６０２〜２７９６番）、ＩｏｘＢ（配列番号１中、２８２５〜３８２９番）、ＩｏｘＣ（配列番号１中、３８４７〜４１１６番）、ＩｏｘＤ（配列番号１中、４１４５〜５７０４番）、ＩｏｘＥ（配列番号１中、５７４０〜６０９９番）およびＩｏｘＦ（配列番号１中、６１２６〜７１８１番）と名付けたＯＲＦが含まれており、これらはいずれもインドールモノオキシゲナーゼのサブユニットをコードしている。
【００１０】
この配列のＤＮＡは元来、キサントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）　Ｍｅｒ−Ｈ１０８株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１７３５９）の染色体ＤＮＡ中から見出されたものである。従ってこのＤＮＡを取得するためには、本菌株を培養してその培養物から取得するのが好適である。その取得方法、配列の決定、確認方法、ホストベクター系等の構築方法等については、特開２００１−９５５７７号公報に具体的に記載されている。本公報番号を引用することによりその記載内容は本明細書に包含される。
【００１１】
また配列番号１で示される塩基配列の２６０２番目から７１８１番目の配列をもつＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする改変体ＤＮＡは、前記ＤＮＡに対して、一定のハイブリダイゼーション条件下、例えば、６０℃で２×ＳＳＣ（標準クエン酸食塩水）中、好ましくは６０℃で０．５×ＳＳＣ中、特に好ましくは６０℃で０．２×ＳＳＣ中のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ１，３−ベンゾジオキソールをセサモールへ変換する能力を欠損した突然異変体あるいは元来その水酸化活性を有していない微生物にその変換能を付与しうる機能を有する改変体ＤＮＡである。
【００１２】
このような改変体のより具体的な例として、配列番号１で示される塩基配列の２６０２番目から７１８１番目の配列と少なくとも５５％、好ましくは７０％、さらに好ましくは９５％の同一性を示すものが挙げられ、これには、その塩基配列の５′末端もしくは３′末端または途中において塩基が除去または付加されたもの、あるいは塩基の一部が他の塩基により置換されているものが含まれる。また、この塩基の一部が他の塩基により置換されている改変体には、同一のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重に伴い、前記ＤＮＡと異なる塩基配列を有するものも含まれる。
【００１３】
遺伝暗号の縮重に伴うもの以外の塩基の置換は、前記ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を参照し、各アミノ酸に由来する側鎖の類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどを基準に、コードされる各タンパク質についてその全体として類似の形状を有するように行うのがよい。前記の改変体は、前記ＤＮＡと同等の機能、すなわち、１，３−ベンゾジオキソールをセサモールへ変換する能力を欠損した突然異変体あるいは元来その水酸化活性を有していない微生物にその変換能を付与しうる機能を有するものが、相当高い確率で得られると推定される。
【００１４】
このような改変体は、前記ＤＮＡの塩基配列またはそれらによりコードされるアミノ酸配列を参考に、核酸合成機を用いて合成するか、あるいは、自体既知の点突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発により作成することができる。
【００１５】
こうして得られるＤＮＡまたはその改変体を常法により宿主となる菌株に導入した形質転換体、あるいは元々それらのＤＮＡを保有している菌株を培地中で培養し、得られた菌体またはその菌体調製物（例えば、有機溶媒処理物、菌体抽出物、固定化処理物）を、出発原料である１，３−ベンゾジオキソールと接触させ、セサモールに変換する。菌体またはその菌体調製物と出発原料の接触は、あらかじめ培地に出発原料を加えておくか、または培養中に出発原料を適宜加えることにより行う。また、培養終了後に、集菌した菌体またはその菌体調製物と出発原料を培地または適当な緩衝液中で、必要により適当な補助因子等を加え、反応器中で撹拌または振盪するか、固定された菌体上に出発原料含有物を流動させることにより、上記接触を行うことができる。
【００１６】
本発明で使用する培地は、使用する微生物が良好に生育し、かつ１，３−ベンゾジオキソールの５位を水酸化する活性を発現するのに適当な炭素源、窒素源、無機塩及び天然有機栄養物等により成り立っている。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、ソルビトール、アルコール類、酢酸、澱粉等を単独に用いるかもしくは併用でき、その使用濃度は特に限定されず、おおよそ１〜１０％が適当である。窒素源としてはアンモニア、尿素、硫安、硝安、酢安等の化合物を一種または二種以上使用することができる。無機塩としては、燐酸一カリウム、燐酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄などの塩類を使用することが出きる。さらに使用菌の生育促進効果を持つ有機栄養源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチーブリカー、カザミノ酸などが用いられ、さらにビタミン類、核酸類を少量培地に含有させることもできる。
【００１７】
１，３−ベンゾジオキソールの５位を水酸化するための１，３−ベンゾジオキソールの添加時期は、菌体の生育の最初から及び生育後のいずれでもよく、また、培養液から菌体を回収し菌体を適当な水溶液に懸濁させた液中に添加してもよい。１，３−ベンゾジオキソールは種々の濃度で用いることが出きるが、約０．１ｇ／リットルから１ｇ／リットルの濃度で用いることが望ましく、これを一括添加しても分割して添加してもよい。
【００１８】
培養は通気撹拌培養、振盪培養等の好気的条件下、あるいは静置培養でもよい。培養中のｐＨは中性ないし弱アルカリ性が好適であり、このためのｐＨ中和剤としては、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、塩酸等の公知のものが使用できる。培養温度は２０〜４０℃の範囲で使用菌の成育に最適な温度で培養できる。培養時間は使用菌株の相違、原料の添加方法、添加濃度等により差はあるが、おおよそ１〜４日でセサモールが生成蓄積する。
【００１９】
生成蓄積したセサモールはそれ自体公知の方法に準拠して単離・精製することができる。すなわち、疎水性の担体あるいはイオン吸着樹脂に吸着せしめ、有機溶媒あるいはアルカリ水、酸性水で溶出し、濃縮後、結晶化等によって回収される。
【００２０】
【実施例】
以下、具体例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００２１】
実施例１：Ｍｅｒ−Ｈ１０８株を用いた１，３−ベンゾジオキソールからセサモールへの緩衝液中での変換
フェノールを０．０１％添加したＬ培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ　０．５％、グルコース０．１％、ｐＨ　７．２）２ｍｌにキサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１７３５９）を植菌し２８℃で２０時間、振盪培養を行った。得られた培養液を、フェノールを０．０１％添加したＬ培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容のエルレンマイヤーフラスコ５本に１％植菌して同様の培養条件で２４時間培養を行った。生育した菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分）で回収し、０．８％食塩水で洗浄した後、滅菌した食塩０．８％、グルコース１％、ＦｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ　０．０００７％を添加した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　６．８）１００ｍｌに菌体を懸濁して滅菌した５００ｍｌ容のエルレンマイヤーフラスコに移した。これに１，３−ベンゾジオキソールを１ｍＭ添加して２８℃で振盪しながら変換反応を行った。反応を開始してから経時的にサンプリングして反応液中の生成したセサモールを定量した。反応開始２、５、２２、２５時間後における緩衝液中のセサモールの蓄積量はそれぞれ０．０１６、０．０２１、０．０２６、０．０２７ｍＭであった。
【００２２】
なお、セサモールおよび１，３−ベンゾジオキソールはＨＰＬＣによって以下の条件で定量分析した。カラムはＹＭＣ−ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ　（１５０×４．６　ｍｍ　Ｉ．Ｄ．）を用い、移動相は０．０１Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４水溶液とアセトニトリルの混液（６５／３５）、流速は０．５　ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は４５℃、検出は２９７ｎｍのＵＶ吸収で行った。この分析条件でセサモールおよび１，３−ベンゾジオキソールの保持時間はそれぞれ６．７分、１９．５分であった。
【００２３】
実施例２：Ｍｅｒ−１０８株の形質転換株を用いた１，３−ベンゾジオキソールからセサモールへの緩衝液中での変換
キサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８株と、同菌株に１，３−ベンゾジオキソールをセサモールへ水酸化する同菌株由来のモノオキシゲナーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドｐＩＺ３１１を導入したセルフクローニング株であるＭｅｒ−Ｈ１０８（ｐＩＺ３１１）株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１７４２１）とを用いてセサモールの生産量の比較を行った。両菌株をフェノール０．０１％とＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．００１％を添加したＬ培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ　０．５％、グルコース０．１％、ｐＨ　７．２）５０ｍｌを含む２５０ｍｌ容のエルレンマイヤーフラスコにそれぞれ植菌し２８℃で２４時間振盪培養を行った。なお、セルフクローニング株はカナマイシンを２０μｇ／ｍｌ添加して培養した。
【００２４】
それぞれの菌体を遠心分離により回収し、フェノール０．０１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．００１％、１，３−ベンゾジオキソール４００μｇ／ｍｌを添加した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　６．８）にＯＤ値（６６０ｎｍ）が１．０になるように懸濁した。この菌の懸濁液を２８℃で振盪しながら変換反応を行った。反応時間２、４、６時間後のセサモールの蓄積量はＭｅｒ−Ｈ１０８株においてそれぞれ０．０６３、０．２９５、０．３９５ｍＭであり、Ｍｅｒ−Ｈ１０８（ｐＩＺ３１１）株ではそれぞれ０．３７４、０．６６８、０．７８２ｍＭであった。セルフクローニング株は野生株のほぼ２倍のセサモール蓄積量を示した。
【００２５】
実施例３：エッシェリヒア・コリへモノオキシゲナーゼ遺伝子を導入した形質転換株を用いた１，３−ベンゾジオキソールからセサモールへの緩衝液中での変換
キサントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）　Ｍｅｒ−Ｈ１０８（ｐＩＺ３１１）株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１７４２１）からプラスミドｐＩＺ３１１を単離し、このプラスミドからモノオキシゲナーゼ遺伝子以外の遺伝子ＩｏｘＨとＩｏｘＩを除いたプラスミドｐＲＧ００１を構築し、これをエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０９株に導入した。具体的には、以下の手順で行った。
【００２６】
特開２００１−９５５７７号公報〔００２７〕段落に記載された方法に従って、プラスミドｐＩＺ３１１からプラスミドｐＩＯＸＲＧを調製し、これを制限酵素ＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ製）で処理して７．０ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＩｏｘＡ〜ＩｏｘＦを含み、ＩｏｘＨとＩｏｘＩを含まない）を切り出し、フェノール−クロロホルム抽出でＤＮＡを精製後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。精製ＤＮＡ産物をＤＮＡライゲーション・キット・バージョン２（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２、ＴａＫａＲａ製）を用いてＸｂａＩで処理したｐＣＦ７０４に連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、カナマイシン２０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ寒天培地（ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ　０．５％、グルコース０．１％、寒天１．５％）にプレーティングを行った。生えてきたコロニーを数個ＬＢ培地（ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、グルコース０．１％）に接種して一晩培養後、プラスミドの抽出を行い、目的のプラスミドが導入されているコロニーを選択した。こうして得られたｐＣＦ７０４のＸｂａＩサイトに前記７．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドをｐＲＧ００１とした。
【００２７】
エッシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９株と、同株をプラスミドｐＲＧ００１で形質転したエッシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９（ｐＲＧ００１）株とを１ｍｌのＬ培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ　０．５％、グルコース０．１％、ｐＨ　７．２）にそれぞれ植菌し３２℃で１８時間振盪培養を行った。なお、組換え株はカナマイシンを２０μｇ／ｍｌ添加して培養した。遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分）によって菌体を回収し、１，３−ベンゾジオキソール４００μｇ／ｍｌ、２−オキソグルタル酸０．１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．００１％を添加した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　６．８）１ｍｌに懸濁して３２℃で振盪しながら変換反応を行った。変換反応の開始と共に経時的に１００μｌの反応液をエッペンドルフチューブに取り、１００μｌのメタノールを加えて良く攪拌してから１６０００ｒｐｍで５分間遠心して得た上清をＨＰＬＣで分析して、生成したセサモールを定量した。エッシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９株ではセサモールの生成は見られなかったが、エッシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９（ｐＲＧ００１）株では反応開始１．５、３、５時間でそれぞれ０．０１６、０．０８４、０．１５１ｍＭのセサモールを蓄積した。
【００２８】
【配列表】
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