(57)【要約】【課題】抗アレルギー用組成物を提供することを目的とする。【解決手段】ベンジルブタン骨格を有する植物エストロゲン、前記植物エストロゲンに由来する哺乳類リグナン及び前記植物エストロゲンの脱水縮合物から成る群から選択される1以上若しくはそれらの塩又はそれらのプロドラッグを有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベンジルブタン骨格を有する植物エストロゲン、前記植物エストロゲンに由来する哺乳類リグナン及び前記植物エストロゲンの脱水縮合物から成る群から選択される1以上若しくはそれらの塩又はそれらのプロドラッグを有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物。
【請求項２】
前記植物エストロゲンがセコイソラリシレシノール及び/又はその配糖体である、請求項１記載の抗アレルギー用組成物。
【請求項３】
前記哺乳類リグナンが、エンテロジオール、エンテロラクトン、エンテロジオール抱合体及びエンテロラクトン抱合体から成る群から選択される1以上である、請求項１又は２記載の抗アレルギー用組成物。
【請求項４】
前記脱水縮合物がアンヒドロセコイソラリシレシノールである、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗アレルギー用組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の抗アレルギー用組成物を含有する、マスト細胞及び好塩基球の脱顆粒を抑制する組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の抗アレルギー用組成物を含有する、抗アレルギー用飲食品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の抗アレルギー用組成物を含有する、抗アレルギー用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばアレルギー疾患抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、花粉症等のアレルギー疾患の罹患者が増加しており、社会的な問題となっている。特に花粉症の罹患者の増加が著しく、2016年の東京都の調査では東京都民の約48.8％がスギ花粉症を有していることが報告されている(非特許文献１)。花粉症は、くしゃみ、鼻水、鼻づまり等のアレルギー性鼻炎や目のかゆみ等のアレルギー性結膜炎を引き起こす等、日常生活に様々な支障をきたし、患者のQOLの低下につながる。
【０００３】
花粉症に伴い発症するアレルギー性鼻炎やアレルギー結膜炎は、その発症メカニズムからI型アレルギーに分類される。I型アレルギーは、抗原特異的な免疫グロブリンE(IgE)を起点に発症する。抗原の感作を受けて体内で産生されたIgEは、マスト細胞、好塩基球等と架橋構造をとり、体外から進入した抗原と結合することでマスト細胞等の脱顆粒現象を引き起こす。このときにヒスタミン、さらには脂肪酸の代謝によって生じるロイコトリエン、プロスタグランジン等の生理活性物質が放出され、アレルギー発症へとつながる(非特許文献２)。
【０００４】
アレルギー疾患に関する研究により、食品由来成分がアレルギー疾患に関与することが明らかになってきている。その中には、発症や症状の進行に関与するものだけでなく、症状の抑制や改善に寄与するものも存在することが分かってきており、これら食品由来成分を摂取することによりアレルギーの発症を制御できる可能性が注目されている。
【０００５】
以上のことから、日常の食生活を通してアレルギー症状の発症を抑制するという考え方が拡大しており、アレルギー発症抑制や症状軽減を目的とした食品由来成分やそれを含有する食品が望まれている。
【０００６】
そのような観点から、種々検討されている。非特許文献３では、葛根湯に含まれるプエラリン(puerarin)の投与により、アレルギー症状が軽減されることが報告されている。しかしながら、プエラリンの摂取に伴い、腸管においてFoxp3陽性CD4陽性T細胞やCD103陽性CD11c陽性樹状細胞が増加し、免疫寛容が誘導されるため、腸管等での獲得免疫系の低下や病原菌等に対する免疫応答の低下が懸念される。
【０００７】
非特許文献４では、大豆イソフラボンの腸内細菌代謝物であるエクオール(equol)がアレルギー性疾患の起点となる免疫グロブリンE(IgE)の増加を誘導し、アレルギー症状を増悪させることが報告されている。
【０００８】
非特許文献５及び６では、オメガ3脂肪酸である15-hydroxyeicosapentaenoic acidと17,18-epoxyeicosatetraenoic acidが免疫寛容等を誘導することなくアレルギー症状を軽減することが報告されている。しかしながら、15-hydroxyeicosapentaenoic acidと17,18-epoxyeicosatetraenoic acidはどちらも多価不飽和脂肪酸あるため、酸化されやすく、酸化により活性低下や異臭の発生等の懸念がある。非特許文献５〜７では、オメガ3脂肪酸の1種であるα-リノレン酸を豊富に含むアマニ油の摂取により、アレルギー疾患が軽減することが報告されている。しかしながら、アマニ油の主成分であるα-リノレン酸は多価不飽和脂肪酸であり、同様の懸念がある。
【０００９】
以上のような背景から、アレルギーの発症を抑制できるか、またアレルギーの症状を軽減することができる食品由来成分又はそれを含有する食品であり、且つ安定性が高く長期保存が可能であり、易水溶性である等、消費者が使用しやすい特性を有した組成物が求められている。
【００１０】
一方、リグナンは、2,3-ジベンジルブタン骨格を有するフェノール化合物の一種である。これらは、前駆体と呼ばれるモノマー単位(例えば、桂皮酸、コーヒー酸、フェルラ酸、クマル酸及び没食子酸)のカップリングによって形成される。リグナンは、植物中に広く分布しており、根、葉、茎、種、果実等の各種植物体の部位に含まれている。種や果実等では、リグナンは繊維成分と結合したグリコシド接合体として存在している。哺乳動物において、リグナン前駆体(グリコシド接合体)は、穀物由来製品の摂食により供給される。
【００１１】
アマニ(亜麻仁)は、欧州の地中海地方原産の自生植物である亜麻科植物アマ(亜麻、学名：Linum usitatissimum)の種子(仁)のことであり、フラックスシードと呼ばれることもある。アマニは、リグナンを高濃度に含有する食用植物であることが知られており、そのリグナンは、セコイソラリシレシノールジグルコシド(Secoisolariciresinol diglucoside：SDG)である。セコイソラリシレシノールジグルコシドのような植物性リグナンは、腸内細菌によってセコイソラリシレシノール(SECO)、2,3-bis(3,4-dihydroxybenzyl)butene-1,4-diol、さらにはエンテロジオール(ED)又はエンテロラクトン(EL)に変換される。
【００１２】
リグナンは、エストロゲン様作用を有することが知られており、「植物エストロゲン」とも呼ばれている。特にエンテロラクトンは、多くの有益な疾患の治療に有用であり、使える性質を有していることが知られている。例えば、植物エストロゲンが乳癌(非特許文献８)や高コレステロール血症(非特許文献９)に有用であることが示されている。また、閉経後の女性において、アマニを加えた食事を摂取することにより、更年期の症状が改善されることが知られている(非特許文献１０)。エンテロラクトンは、エストロゲンレセプターαへ結合することにより、あるいは、ステロイド代謝アロマターゼを阻害することにより、前記のようなエストロゲン依存性疾患に対して予防又は改善効果を発揮していると考えられる。
【００１３】
アンヒドロセコイソラリシレシノール(AHS)は、SDG、セコイソラリシレシノールモノグルコシド(SMG)若しくはSECOを酸処理することで得られるリグナン誘導体の一種である。非特許文献１１においてAHSは抗酸化作用を有すること、非特許文献１２において乳癌細胞増殖抑制作用があることが報告されており、AHSは生体内で生理活性を発揮するリグナン誘導体として期待されている。しかしながら、アレルギーに対するAHSの影響及びその活用法は明らかになっていなかった。
【００１４】
このように、リグナン及びその誘導体が有用な健康増進あるいは健康維持機能を有していることは広く知られているが、アレルギー疾患の発症抑制、症状軽減、又は症状改善といった効果を有することは知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】東京都福祉保健局 花粉症患者実態調査報告書 平成28年度, p.39, 5-2 都内のスギ花粉症の推定有病率
【非特許文献２】Galli SJ et al., Nat Med., 2012 May 4;18(5):693-704.
【非特許文献３】Yamamoto et al., Biochem Biophys Res Commun., 2019 Aug 27;516(3):626-631.
【非特許文献４】Sakai et al., J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 2010;56(1):72-6.
【非特許文献５】Sawane et al., Nutrients, 2019 Nov 22;11(12).
【非特許文献６】Kunisawa et al., Sci Rep., 2015 Jun 11;5:9750.
【非特許文献７】Hirakata et al., FASEB J., 2019 Mar;33(3):3392-3403.
【非特許文献８】Ingram D et al., Clin Endocrinol (Oxf), 2002 Mar;56(3):321-8.
【非特許文献９】Zhang W et al., Br J Nutr., 2008 Jun;99(6):1301-9.
【非特許文献１０】Tarpila S et al., Eur J Clin Nutr., 2002 Feb;56(2):157-65.
【非特許文献１１】Ping Lan et al., J Agric Food Chem., 2019 Dec 26;67(51):14152-14159.
【非特許文献１２】Abdelali Lehraiki et al., J Med Food., 2010 Aug;13(4):834-41.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上述の実情に鑑み、免疫寛容を誘導することなくアレルギー症状を抑制できる、安全性の高い抗アレルギー用組成物、更には、安定性が高く、水への溶解性が高い抗アレルギー用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ベンジルブタン骨格を有する植物エストロゲン、当該植物エストロゲンに由来する哺乳類リグナン及び当該植物エストロゲンの脱水縮合物がアレルギー疾患を抑制する効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）ベンジルブタン骨格を有する植物エストロゲン、前記植物エストロゲンに由来する哺乳類リグナン及び前記植物エストロゲンの脱水縮合物から成る群から選択される1以上若しくはそれらの塩又はそれらのプロドラッグを有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物。
（２）前記植物エストロゲンがセコイソラリシレシノール及び/又はその配糖体である、（１）記載の抗アレルギー用組成物。
（３）前記哺乳類リグナンが、エンテロジオール、エンテロラクトン、エンテロジオール抱合体及びエンテロラクトン抱合体から成る群から選択される1以上である、（１）又は（２）記載の抗アレルギー用組成物。
（４）前記脱水縮合物がアンヒドロセコイソラリシレシノールである、（１）〜（３）いずれか１記載の抗アレルギー用組成物。
（５）（１）〜（４）のいずれか１記載の抗アレルギー用組成物を含有する、マスト細胞及び好塩基球の脱顆粒を抑制する組成物。
（６）（１）〜（４）のいずれか１記載の抗アレルギー用組成物を含有する、抗アレルギー用飲食品。
（７）（１）〜（４）のいずれか１記載の抗アレルギー用組成物を含有する、抗アレルギー用医薬品。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る抗アレルギー用組成物によれば、有効成分が食習慣のある亜麻由来成分であるため安全性が高く、また免疫寛容を誘導することなくアレルギー症状を軽減することができる。更には、本発明に係る抗アレルギー用組成物の有効成分は、安定性が高く長期保存が可能であり、水溶性であるため日常生活で容易に摂取することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アレルギー性鼻炎モデルマウスを用いた、セコイソラリシレシノールジグルコシド(SDG)のアレルギー疾患への影響の評価方法の概要を示す。
【図２】アレルギー性鼻炎モデルマウスを用いた、SDG投与による鼻炎症状の抑制を示すグラフである。
【図３】アレルギー性鼻炎モデルマウスを用いた、SDG投与による血漿中の卵白アルブミン(OVA)特異的IgE(OVA-IgE)濃度、OVA特異的IgG1(OVA-IgG1)濃度及びOVA特異的IgG2a(OVA-IgG2a)濃度を示すグラフである。
【図４】植物エストロゲン及び哺乳類リグナンによるアレルギー疾患への影響に関する、ラット由来好塩基球細胞RBL-2H3細胞を用いたβ-ヘキソサミニダーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図５】植物エストロゲンによるアレルギー疾患への影響に関する、ラット由来好塩基球細胞RBL-2H3細胞を用いたβ-ヘキソサミニダーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図６】哺乳類リグナンのアグリコン及び抱合体によるアレルギー疾患への影響に関する、ラット由来好塩基球細胞RBL-2H3細胞を用いたβ-ヘキソサミニダーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図７】アマニ抽出物又はアマニ酸分解物によるアレルギー疾患への影響に関する、ラット由来好塩基球細胞RBL-2H3細胞を用いたβ-ヘキソサミニダーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図８】アンヒドロセコイソラリシレシノール(AHS)によるアレルギー疾患への影響に関する、ラット由来好塩基球細胞RBL-2H3細胞を用いたβ-ヘキソサミニダーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明に係る抗アレルギー用組成物(以下、「本発明に係る組成物」という)は、ベンジルブタン骨格を有する植物エストロゲン、当該植物エストロゲンに由来する哺乳類リグナン及び当該植物エストロゲンの脱水縮合物から成る群から選択される1以上若しくはそれらの塩又はそれらのプロドラッグを有効成分として含有するものである。本発明に係る組成物によれば、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、接触皮膚炎、食物アレルギー、気管支喘息等のアレルギー疾患を予防、治療又は改善することができる。従って、本発明に係る組成物は、アレルギー疾患の予防、治療若しくは改善剤として使用することもできる。さらに、本発明に係る組成物は、脱顆粒抑制作用を有し、マスト細胞及び好塩基球の脱顆粒を抑制する組成物として使用することもできる。
【００２３】
本発明において有効成分である植物エストロゲンとは、植物に含まれ、エストロゲン様作用を有する化合物群のことである。このような植物エストロゲンとしてリグナン及びイソフラボンが知られている。リグナンは、フェニルアラニンを出発物質とし、モノリグノールとして知られる置換ケイ皮アルコールの二量化反応(置換ケイ皮アルコール側鎖のβ位同士の酸化的縮合)によって生成するジベンジルブタン骨格を有するポリフェノール性物質の一群であり、植物に広く分布している。化学構造や生理活性により、リグナンの一部が植物エストロゲンに分類されており、全てのリグナンがエストロゲン作用を有しているわけではない。従って、エストロゲン作用を有するリグナンは、「ベンジルブタン骨格を有する植物エストロゲン」と換言することができる。本発明において、以降、エストロゲン様作用を有するリグナンのことを単に「植物エストロゲン」と略すが、この用語が、イソフラボン等のリグナンに分類されない(ベンジルブタン骨格を有さない)エストロゲン様作用を有する植物由来成分を含むことを意図しない。
【００２４】
植物エストロゲンとして、セサミン(sesamin)、ヒドロキシマタイレシノール(hydroxymatairesinol)、マタイレシノール(matairesinol)、セコイソラリシレシノール(secoisolariciresinol：SECO)、シリンガレシノール(syringaresinol)、アークチゲニン(arctigenin)、ラリシレシノール(lariciresinol)、ピノレシノール(pinoresinol)、アンヒドロセコイソラリシレシノール（anhydrosecoisolaiciresinol）等及びそれらの配糖体(例えば、セコイソラリシレシノールであれば、セコイソラリシレシノールジグルコシド（secoisolariciresinol diglucoside：SDG)及びセコイソラリシレシノールモノグルコシド（secoisolariciresinol monoglucoside：SMG))が知られている。これらは、アマ、カボチャ、ヒマワリ、ラッカセイ、ダイズ等の種子；小麦、ライ麦、大麦、オーツ麦等の穀物；ブラックベリー、クランベリー、イチゴ等の果実；ブロッコリー等の緑黄色野菜等に含まれている。特に、亜麻科植物アマ(学名：Linum usitatissimum)の種子である亜麻仁には、セコイソラリシレシノールジグルコシドが豊富に含まれており、マタイレシノール、ピノレシノール、イソラリシレシノール及びこれらの配糖体等が少量含まれている。
【００２５】
亜麻仁からリグナンを製造する方法は、公知の方法であれば特に制限はない。例えば、亜麻仁をミキサーやホモジナイザー等の粉砕機で粉砕し、粉砕物をn-ヘキサン等の脂溶性有機溶媒で油分を除去し、亜麻仁脱脂粉砕物を調製する。その亜麻仁脱脂粉砕物から低級アルコール(エタノール、メタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノールなど)又はその含水アルコールを用いてリグナンを抽出し、必要であればケン化処理、中和を行い、吸着剤としてオクタデシルシリカ、シリカゲル等を使用して、分画、精製してセコイソラリシレシノールジグルコシドを得ることができる。あるいは、前記亜麻仁脱脂粉砕物の代わりにコールドプレス法等でアマニ油を搾油した搾油副産物を用いてもよい。
【００２６】
亜麻仁リグナンとして、アマニそのままに加えて、アマニから公知の方法で抽出したアマニ抽出物を用いても良く、更に、精製して得たものを用いても良い。さらにリグナンを多く含有するアマニをそのまま又は加工して使用してもよい。例えばアマニには、10gあたり約100mgのSDGが含まれるので、これを粉砕して組成物に添加することができる。本発明において、アマニは、国内産、外国産等の産地や栽培用、搾油用の品種を問わず使用でき、焙煎、非焙煎の処理の有無に関係なく原料として使用できる。また、搾油工程で産生するアマニ粕を原料としてもよい。
【００２７】
本発明において、植物エストロゲンは特に制限されるものではなく、公知の植物エストロゲンであればよく、好ましくはセコイソラリシレシノール及び/又はその配糖体である。セコイソラリシレシノールジグルコシドであれば、安定性が高く、水への溶解性が高いため、保存性及び摂取形態の多様化を図れる観点から更に好ましい。
【００２８】
一方、本発明において有効成分である哺乳類リグナンに関して、植物エストロゲンは、それ自体はエストロゲン様作用の役割を果たすものではないが、腸内細菌の代謝によりセコイソラリシレシノール及び2,3-bis(3,4-dihydroxybenzyl)butene-1,4-diol等の中間代謝物を経てエンテロジオール、エンテロフランないしはエンテロラクトンに変換され、エストロゲン様作用を発揮するようになる。一般に、植物エストロゲンが腸内細菌により代謝され、エストロゲン様作用を有する代謝産物のことを「哺乳類リグナン」と称される。本発明において、哺乳類リグナンは特に制限されるものではなく、植物エストロゲン起源であってエストロゲン様作用を有する代謝産物であればよく、好ましくはエンテロジオール(ED)、エンテロフラン（EF）、エンテロラクトン(EL)又はそれらの抱合体である。
【００２９】
本発明において有効成分である植物エストロゲンの脱水縮合物とは、ベンジルブタン骨格側鎖γ位の水酸基同士が脱水縮合されて5員環状エーテル化されたものであり、例えばアンヒドロセコイソラリシレシノール(AHS)等が挙げられる。
【００３０】
植物エストロゲンの脱水縮合物を得る方法は、公知の脱水縮合方法であれば特に制限はない。例えば、セコイソラリシレシノールジグルコシド(SDG)、セコイソラリシレシノールモノグルコシド(SMG)、セコイソラリシレシノール(SECO)を出発物質とする場合、酸性条件下で加熱攪拌することにより糖の脱離と脱水縮合を受け、SECOが5員環状エーテル化したAHSを得ることができる。また、SDG、SMG、SECOを含有する亜麻仁若しくは亜麻仁脱脂粉砕物から低級アルコール(エタノール、メタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール等)又はその含水アルコールを用いて抽出したものを使用してもよい。あるいは、前記亜麻仁脱脂粉砕物の代わりにコールドプレス法等で亜麻仁油を搾油した搾油副産物を用いてもよい。
【００３１】
哺乳類リグナンは、経口投与に加えて、腹腔内注射や静脈注射等、非経口的に投与することができるが、好ましくは経口製剤として経口投与される。また、哺乳類リグナンを直接摂取する以外にも、セサミン(sesamin)、ヒドロキシマタイレシノール(hydroxymatairesinol)、マタイレシノール(matairesinol)、セコイソラリシレシノール(secoisolariciresinol：SECO)、セコイソラリシレシノールジグルコシド(secoisolariciresinol diglucoside：SDG)、シリンガレシノール(syringaresinol)、アークチゲニン(arctigenin)、ラリシレシノール(lariciresinol)、ピノレシノール(pinoresinol)、アンヒドロセコイソラリシレシノール（anhydrosecoisolaiciresinol）等の植物エストロゲンを含有する食品等を経口摂取することで、腸内細菌による代謝を介して体内の哺乳類リグナン量を増加させることができる。
【００３２】
植物エストロゲンの脱水縮合物の摂取方法は、経口的投与に加え、腹腔内注射や静脈注射等非経口的に投与することができるが、好ましくは経口製剤である。
【００３３】
植物エストロゲン、哺乳類リグナン及び植物エストロゲンの脱水縮合物は、これらの化合物の任意の幾何異性体又は立体異性体又は異性体の任意の混合物(例えばラセミ体)を含むと理解される。これらの化合物の塩、付加物及び複合体もこの用語に含まれると理解される。また、植物エストロゲンを含有する天然物（例えば、SDG、SMG、SECOを含有するアマニ等）を加工する過程で生成した植物エストロゲンの脱水縮合物（例えばAHS）を、そのまま又は抽出等の加工を経て摂取することもできる。
【００３４】
植物エストロゲン、哺乳類リグナン及び植物エストロゲンの脱水縮合物の塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、スルホン酸(例えば、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸)、アミノ酸(例えば、グルタミン酸)等の有機酸との塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、リジン塩、アルギニン塩が挙げられる。
【００３５】
哺乳類リグナン抱合体を形成する水溶性物質としては、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる1種以上が挙げられる。アミノ酸としては、生体内に存在するアミノ酸、例えば必須アミノ酸が挙げられる。結合モル比は、哺乳類リグナン：水溶性物質＝1：1〜1：3であるのが好ましく、1：1〜1：2がより好ましく、1：1がさらに好ましい。
【００３６】
植物エストロゲン、哺乳類リグナン及び植物エストロゲンの脱水縮合物又はその塩のプロドラッグとは、生物系に投与した場合に、自発的な化学反応の結果として、又は触媒する酵素若しくは代謝反応により、植物エストロゲン、哺乳類リグナン、植物エストロゲンの脱水縮合物又はその塩を生ずる全ての化合物を示す。
【００３７】
植物エストロゲン、哺乳類リグナン、植物エストロゲンの脱水縮合物若しくはそれらの塩又はそれらのプロドラッグは、医薬製剤(Pharmaceutical preparation)、栄養補助食品、臨床で使用する栄養製剤又は機能性食品の形態で供給される可能性がある。
【００３８】
本発明に係る組成物は、さらに任意の成分として公知のアレルギー疾患抑制効果を有する成分を含むことができる。このような成分としては、例えばα-リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等のω3系高度不飽和脂肪酸、トリテルペン類、食物繊維、食用微生物、ポリフェノール類及びそれらの誘導体が挙げられる。
【００３９】
ω3系高度不飽和脂肪酸としては、好ましくはα-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸である。これらは単離して単独で配合することも、また、混合物として使用することもでき、さらにこれらを多く含有する油脂をそのまま使用することができる。α-リノレン酸はエゴマ油、アブラナ(キャノーラ)油、ダイズ油、アマニ油等の種子由来油に多く含まれ、好ましくは食用アマニ油として添加される。食用アマニ油は例えば原料のアマニを低温圧搾製法により搾油し、水分、ガム質、遊離脂肪酸、色素、臭い等不純物を取り除く精製工程を経て得ることができる。エイコサンペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸を多く含有する食用油脂として魚油が挙げられる。また、配合する油脂は単独又は混合して使用することもできる。
【００４０】
本発明に係る組成物は、助剤と共に任意の形態に製剤化して、経口投与又は非経口投与が可能な医薬品とすることができる。例えば、経口投与用の剤形としては、例えば錠剤、口腔内速崩壊錠、カプセル、カプレット、トローチ剤、粉末、顆粒、細粒等の固形投薬形態、エリキシル、エマルジョン、シロップ及び懸濁液のような液体投薬形態が挙げられる。非経口投与用の剤形としては、例えば点鼻剤、注射剤、点眼剤、貼付剤、坐剤、皮膚外用剤の形態が挙げられる。なお、医薬品には医薬部外品も含まれる。
【００４１】
固形投薬形態とする場合、一般製剤の製造に用いられる種々の添加剤を適当量含んでいてもよい。このような添加剤としては、例えば賦形剤、結合剤、酸味料、発泡剤、人工甘味料、香料、滑沢剤、着色剤、安定化剤、pH調整剤、界面活性剤等が挙げられる。
【００４２】
液体投薬形態とする場合、医薬品は、必要に応じてpH調整剤、緩衝剤、溶解剤、懸濁剤等、等張化剤、安定化剤、防腐剤等の存在下、常法により製剤化することができる。
【００４３】
皮膚外用剤の形態としては、特に限定されず、例えば、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の医薬品等とすることができる。上記成分以外に、通常医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、各種皮膚栄養成分、紫外線吸収剤、酸化防止剤、油性成分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、色剤、水、防腐剤、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００４４】
一実施形態において、アレルギー性鼻炎の予防、治療若しくは改善剤の場合、本発明に係る組成物を点鼻剤として経鼻投与することが好ましい。
【００４５】
また、一実施形態において、医薬品(又は医薬製剤)は、好ましくは、経口製剤である。
【００４６】
投与される患者又は被験体(ヒト)の年齢、体重、性別、症状の程度、投与形態によって異なるが、本発明に係る組成物を含む医薬品の典型的な用量の範囲は、有効成分である植物エストロゲン、哺乳類リグナン及び／又は植物エストロゲンの脱水縮合物若しくはそれらの塩又はそれらのプロドラッグの量として、成人1人あたり約1mg/日〜約6000mg/日、好ましくは成人1人あたり約10mg/日〜約600mg/日、あるいは成人1人あたり約0.01mg/日〜約10000mg/日、好ましくは成人1人あたり約0.1mg/日〜約1000mg/日、より好ましくは成人1人あたり約1mg/日〜約100mg/日である。
【００４７】
本発明に係る組成物は、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品等の保健機能食品、特別用途食品(例えば、病者用食品)、健康補助食品、サプリメント等として調製されてもよい。例えば、本発明に係る組成物は、「アレルギー疾患を抑制する」、「目や鼻の不快感を軽減する」等を表示した機能性表示食品に利用できる。サプリメントとして、例えば、一般的なサプリメントの製造に用いられる種々の添加剤と共に錠剤、丸状、カプセル(ハードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む)状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状(シロップ状、乳状、懸濁状を含む)等の形状とすることができる。
【００４８】
本発明に係る組成物は、飲食品に配合することができる。配合可能な飲食品としては、特に限定はないが、例えば、飴、グミ、チューインガム等の菓子類；クッキー、クラッカー、ビスケット、チョコレート、プリン、ゼリー、スナック菓子、米菓、饅頭、羊羹等の菓子類；アイスクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、ジェラート等の冷菓；ドーナツ、ケーキ、食パン、フランスパン、クロワッサン等のベーカリー食品；うどん、そば、中華めん、きしめん等の麺類；白飯、赤飯、ピラフ等の米飯類；カレー、シチュー、ドレッシング等のソース類；ハム、ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、魚肉ソーセージ等の練り製品；天ぷら、コロッケ、ハンバーグ等の各種惣菜類；ジュース、お茶等の飲料等が挙げられる。
【００４９】
本発明に係る組成物を含有する典型的な食品は、特に、機能性食品、栄養補助食品、栄養剤、ファーマフーズ、ニュートラシューティカル、健康食品、デザイナーフード又は任意の食品である。
【００５０】
摂取する患者又は被験体(ヒト)の年齢、体重、性別、症状の程度、摂取形態によって異なるが、本発明に係る組成物を含む飲食品の摂取量は、成人では1日あたり、有効成分である植物エストロゲン、哺乳類リグナン及び／又は植物エストロゲンの脱水縮合物若しくはそれらの塩又はそれらのプロドラッグの量として、好ましくは1〜6000mg、より好ましくは20〜300mg、あるいは好ましくは0.01〜10000mg、より好ましくは1〜1000mg、更に好ましくは20〜300mgである。小児では1日あたり、有効成分である植物エストロゲン、哺乳類リグナン及び／又は植物エストロゲンの脱水縮合物若しくはそれらの塩又はそれらのプロドラッグの量として、好ましくは1〜3000mg、より好ましくは2〜150mg、あるいは好ましくは0.01〜3000mg、より好ましくは0.1〜300mg、更に好ましくは2〜150mgである。
【００５１】
また、本発明に係る組成物は、ペットフードに配合することができる。ペットフードとは、犬、猫、ハムスター、リス等の哺乳類の愛玩動物用の食餌をいう。本発明において、ペットフードの形態は特に限定されるものではなく、例えばドライタイプ、ウェットタイプ、セミモイストタイプ、ビスケットタイプ、ソーセージタイプ、ジャーキータイプ、粉末、顆粒、カプセル等が挙げられる。
【００５２】
本発明に係る組成物の効果は、例えば卵白アルブミン投与によりアレルギー性鼻炎を再現したアレルギー性鼻炎モデルマウスにおいて評価することができる(J Immunol. 2007 Nov 1;179(9):5897-906.)。例えば、当該アレルギー性鼻炎モデルマウスに対して本発明に係る組成物を経口投与し、特定の時間におけるくしゃみ(アレルギー性鼻炎の症状)の回数をカウントする。本発明に係る組成物を投与してない等の対照群と比較して、くしゃみの回数が有意に減少した場合、本発明に係る組成物はアレルギー性鼻炎を抑制すると判断することができる。
【００５３】
また、本発明に係る組成物の効果は、例えばラット由来好塩基球細胞RBL-2H3細胞を用いたβ-ヘキソサミニダーゼアッセイ測定試験による脱顆粒反応(β-ヘキソサミニダーゼ放出)の抑制効果を指標として評価することができる(J Nutr. 2013 May;143(5):632-9.)。例えば、ラット由来好塩基球細胞RBL-2H3細胞にAnti-DNP-IgEを添加し、細胞を感作させた後、本発明に係る組成物を添加し、培養する。その後、DNP-BSAを加え、培養し、培養上清におけるβ-ヘキソサミニダーゼ放出量を測定する。本発明に係る組成物を添加していない等の対照群と比較して、β-ヘキソサミニダーゼ放出量が有意に減少した場合、本発明に係る組成物は脱顆粒抑制作用を有し、アレルギーを抑制すると判断することができる。
【００５４】
一方、上述の本発明に係る組成物の記載に準じて、本発明は、本発明に係る組成物を患者又は被験体(ヒト)に投与するか、又は摂取させることを含む、アレルギー疾患の抑制方法、又はアレルギー疾患の予防、治療若しくは改善方法にも関する。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５６】
〔実施例１〕植物エストロゲン、哺乳類リグナン及び植物エストロゲンの脱水縮合物のアレルギー疾患への効果
１．材料及び方法
＜アマニ種子からのセコイソラリシレシノールジグルコシド(SDG)の抽出及び精製方法＞
SDGは、特開2006-347978号公報に記載の方法で得た。すなわち、アマニ種子を粉砕し、n-ヘキサンにより脱脂した後、含水メタノールにより還流抽出を行った。前記抽出物をケン化処理し、中和後、吸着剤としてオクダデシルシリカ、シリカゲルを使用してSDG画分を精製した。
【００５７】
＜アマニ酸分解物の調製＞
アマニ酸分解物は、アマニ抽出物を酸分解することで入手した。アマニ抽出物を1N塩酸水溶液に溶解させ、90℃で3時間反応させた。反応液を分液漏斗へ回収し、反応容器を等量の酢酸エチルで洗いこみ、同じ分液漏斗へ回収した。分液操作をした後に酢酸エチル層を回収し、エバポレーターで溶媒を除去した。得られた画分をアマニ酸分解物とし、以降の実験に使用した。
【００５８】
＜アンヒドロセコイソラリシレシノール(AHS)の調製＞
AHSは、非特許文献１１、１２を参考に入手した。先ず、SDG 300 mgを1N塩酸水溶液25 mlに溶解させ、90℃で3時間反応させた。反応液を分液漏斗へ回収し、反応容器を等量の酢酸エチルで洗いこみ、同じ分液漏斗へ回収した。分液操作をした後に酢酸エチル層を回収し、再度等量の水と混合して分液操作を行った。酢酸エチル層を回収し、エバポレーターで溶媒を除去した。得られた残留物をヘキサン/酢酸エチル2:3の溶媒に溶解させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーへ供した。ヘキサン/酢酸エチル2:3の展開相でカラム分離を行い、AHSを含む画分を回収し、減圧濃縮した。得られた画分にはAHSのみが含まれていることを薄層クロマトグラフィーの単一スポットをもって確認し、以降の実験に使用した。
【００５９】
＜哺乳類リグナン抱合体の調製＞
哺乳類リグナン抱合体であるエンテロジオールグルクロニド（ED-Glu）とエンテロラクトングルクロニド（EL-Glu）は、Brian Dean et al., Arch Biochem Biophys. 2004 Sep 15;429(2):244-51を参考に調製した。原料となるエンテロジオール（ED）とエンテロラクトン（EL）の標準品は、Sigma-Aldrich社から入手した。1.25 mMウリジン5’-ジホスホグルクロン酸、10 mM D-サッカリン酸1,4-ラクトン、10 mM (±)-ジチオトレイトール、10 mM塩化マグネシウム、0.02% Triton-X100を含む0.15 M Tris-HCl bufferを調製し、EDもしくはELが100 μMとなるように添加した。37℃で1時間インキュベートし、等量のメタノールを加えて反応を停止した。遠心分離して上清を回収し、クロロホルム/メタノール/水（反応液）が2:1:1の比率になるように混合し、液液分配を行った。上層を回収して濃縮し、分取HPLCに供してED-GluもしくはEL-Gluに該当するピークを分取した。分取した画分を濃縮乾固し、PBSもしくはHBSSに再溶解して以降の実験に使用した。
【００６０】
＜マウスによるアレルギー評価試験＞
アレルギー疾患への影響の評価は、以下の方法で行った。概要を図１に掲載した。
7週齢メスのBalb/cマウス(日本SLC)を購入し、AIN93G飼料で1週間予備飼育した。その後、AIN93G飼料での飼育と並行し、10 mg/mlの濃度で蒸留水に懸濁したSDG溶液200μlを週3回マウスへ経口投与した。対照群へは蒸留水を経口投与した。SDG及び蒸留水の経口投与は試験終了まで継続した。
【００６１】
経口投与開始4週間後より、卵白アルブミン(OVA)誘導性のアレルギー性鼻炎モデルを適用した。OVA 10μgと水酸化アルミニウム1 mgのPBS懸濁液をマウス腹腔へ合計2回注射し、感作を施した。最終感作の1週間後から、OVA 250μgをPBS 20μlへ溶解させた液をマウスへ経鼻投与し、アレルギー性鼻炎を惹起した。鼻炎を誘導しない群へはPBS 20μlを投与した。投与直後5分間のくしゃみの回数を計測することで、アレルギー症状の重篤度を評価した。経鼻投与は連続7日間継続して行った。
【００６２】
7日目の投与の翌日、マウスへ再度経鼻投与を行い、投与5分後にマウスからヘパリン存在下で採血した。血液に遠心分離を施して血漿を回収し、使用まで凍結保存した。
血漿中のOVA特異的IgE(OVA-IgE)濃度は、DS Mouse IgE ELISA kit(DSファーマ)を用いて測定した。また、血漿中のOVA特異的IgG1とIgG2a(OVA-IgG1、OVA-IgG2a)は、非特許文献４に記載の方法で測定した。
【００６３】
＜β-ヘキソサミニダーゼアッセイによるアレルギー評価試験＞
植物エストロゲン、哺乳類リグナン、哺乳類リグナン抱合体、アマニ酸分解物及びアンヒドロセコイソラリシレシノールによるアレルギー疾患への影響は、ラット由来好塩基球細胞RBL-2H3細胞を用いたβ-ヘキソサミニダーゼアッセイ測定試験で評価した。
【００６４】
RBL-2H3細胞を24穴プレートに2.5×105細胞/穴となるように播種し、24時間培養(二酸化炭素5％、37℃)後、PBSで2回洗浄した後、Anti-DNP-IgE(50 ng/ml)入りHBSSバッファーを500μlとなるように添加し、2時間培養して細胞を感作させた。前記Anti-DNP-IgE溶液を除去し、HBSSバッファーで2回洗浄した。セコイソラリシレシノール(SECO)、エンテロジオール(ED)、エンテロラクトン(EL)、エンテロジオールグルクロニド（ED-Glu）、エンテロラクトングルクロニド（EL-Glu）及びアンヒドロセコイソラリシレシノール（AHS）の標準品又は調製品のいずれかを100μMを含む0.1％エタノール含有HBSSバッファーをそれぞれ準備し、ウェルへ400μlずつ添加した。ネガティブコントロール及びポジティブコントロールには、0.1％エタノール含有HBSSバッファーを400μl添加した。これらを、37℃、二酸化炭素5％インキュベーターで10分間培養した。ネガティブコントロールにはHBSS溶液を、それ以外にはDNP-BSA溶液(1μg/ml)を100μl加え、良く混合し、37℃、二酸化炭素5％インキュベーターで30分間培養した。
【００６５】
反応終了後に培養上清を採り、Supernatantとした。残った細胞に0.1％ Triton X-100溶液を500μl入れ、氷上で5分間静置し、溶解したものをCell lysateとした。Supernatant, Cell lysateをそれぞれ50μlずつ96穴マイクロプレートにとり、37℃、5分間プレインキュベーションした。これらに、p-ニトロフェニル-2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコプラノシド(3.3 mM)を100μl加え、良く混合した後、37℃、30分インキュベーションした。2 mMグリシンバッファーを100μl加え、良く混合した後、マイクロプレートリーダーで405 nmの吸光度を測定した。添加した試料が405 nmに吸収を持つ可能性があるため、別でSupernatant及びCell lysateを採取しておき、反応停止溶液→基質溶液の順で加えた際の吸光度を同時に測定し、以下の計算式でβ-ヘキソサミニダーゼ放出率(％)を算出し、コントロールを放出率100％としたときのサンプル添加時の放出率(％)を算出した。
【００６６】
β-ヘキソサミニダーゼ放出率(％) ＝ 100×〔(S − Sc)/｛(S − Sc)＋(CL − CLc)｝〕
CL：Cell lysateの吸光度
CLc：反応停止溶液→基質溶液の順で加えた際のCell lysateの吸光度
S：Supernatantの吸光度
Sc：反応停止溶液→基質溶液の順で加えた際のSupernatantの吸光度
【００６７】
２．結果及び考察
＜アレルギー評価：マウスのくしゃみ回数に与えるSDGの影響＞
くしゃみの回数を計測したところ、SDGを投与した群では蒸留水を投与した群と比較してくしゃみの回数が減少し、アレルギー症状が軽減された(図２)。この時、血漿中OVA-IgE濃度は両群間で差が見られず、OVA-IgG1、OVA-IgG2aについても両群間で差がみられなかった(図３)。以上のことから、SDGは免疫寛容を誘導することなくアレルギー症状を軽減する成分として利用できると考えられた。
【００６８】
＜アレルギー評価：β-ヘキソサミニダーゼ放出率に与える植物エストロゲン及び哺乳類リグナンの影響＞
β-ヘキソサミニダーゼ放出率(％)を計算したところ、セコイソラリシレシノール(SECO)、エンテロジオール(ED)、エンテロジオールグルクロニド（ED-Glu）、エンテロラクトン(EL)及びエンテロラクトングルクロニド（EL-Glu）を添加した場合において、放出率が減少していた(図４〜６)。以上のことから、植物エストロゲン（セコイソラリシレシノール）、哺乳類リグナン（エンテロジオール及びエンテロラクトン）及び哺乳類リグナン抱合体は脱顆粒抑制作用を持ち、アレルギー抑制作用を発揮していることが分かった。また、哺乳類リグナンのアグリコンは、哺乳類リグナンの抱合体よりもβ-ヘキソサミニダーゼ放出率を効果的に減少させることが判った（図６）。
【００６９】
＜アレルギー評価：β-ヘキソサミニダーゼ放出率に与えるアマニ酸分解物の影響＞
RBL-2H3を用いて脱顆粒抑制活性を評価したところ、100 μg/mlのアマニ抽出物ではβ-ヘキソサミニダーゼ放出率(％)は抑制されなかったが、同濃度のアマニ酸分解物を添加した場合には放出率が抑制されていた(図７)。このことから、アマニ抽出物を酸分解することで得られる生成物の中に、脱顆粒抑制作用を持つ何らかの物質が含まれていることが示唆された。
【００７０】
＜アレルギー評価：β-ヘキソサミニダーゼ放出率に与えるAHSの影響＞
アマニのアルコール抽出物にはSDGが含まれ、このSDGは酸分解によりAHSへ変換されることが知られている。このことから、AHSがアレルギー抑制活性を発揮することが推察された。そこで、AHSを添加したところ、脱顆粒抑制作用を発揮した(図８)。以上のことから、アマニに含まれるSDGを酸分解することで生成するAHSは、脱顆粒抑制作用を持ちアレルギー抑制作用を発揮することが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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