(57)【要約】【課題】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの試料の調製作業を省力化する。【解決手段】サンプルスライド２１の各凹部に微量の試料液を採取するために、ＬＣ／ＭＳを利用した分取ＬＣを用いる。すなわち、カラム４からの溶出液の一部を質量分析計６で分析し、目的とする質量数毎にマスクロマトグラムを作成する。一方、分岐された溶出液は、サンプルスライド２１が装填されたフラクションコレクタ７に送られる。信号処理部８はマスクロマトグラムにピークが出現すると、そのピークトップ付近の短時間だけ分取を行うべく制御部９に指示を与え、フラクションコレクタ７では、該ピークに対応した溶出液を微量だけ指定の凹部に滴下する。指定された溶出液が全て採取されたならば、分析作業者はサンプルスライド２１を取り出し、マトリクス溶液の滴下、混合、風乾を行う。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルスライドに形成された凹部に、分析対象物質とマトリクスとの混合物が収容されて成るＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料を作成するために利用される試料調製装置であって、
ａ）試料液に含まれる試料成分を時間方向に分離する液体クロマトグラフのカラムと、
ｂ）該カラムから溶出する溶出液を順次検出する検出器と、
ｃ）前記溶出液の一部を分取して前記サンプルスライドの凹部に滴下するフラクションコレクタと、
ｄ）前記検出器による検出信号に基づいて作成したクロマトグラムに出現する目的ピークの一部に対応するタイミングで溶出液が分取されるように前記フラクションコレクタを制御する制御手段と、
を備えることを特徴とするＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用試料調製装置。
【請求項２】
前記検出器は質量分析計であり、サンプルスライドの凹部に分取したい試料成分又はその集合である試料成分群を質量数又は質量数範囲で以て指定するための入力設定手段をさらに備え、前記制御手段は、該入力設定手段により指定された質量数又は質量数範囲毎に作成したマスクロマトグラムに出現するピークの一部に対応するタイミングで溶出液が分取されるように、前記フラクションコレクタを制御することを特徴とする請求項１に記載のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用試料調製装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ＝Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ／Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）用の試料調製装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは、マトリクスと呼ばれるシナピン酸等の溶液と微量の分析対象物質とを略均一に混合した試料を作成し、該試料にレーザ光を照射する。すると、試料中のマトリクスがレーザ光を吸収して熱を発し、その一部が急速に加熱されて分析対象物質と共に気化して、分析対象物質がイオン化される。こうして発生させたイオンを電場によって引き出し、電場及び磁場を有さない飛行空間内に導入する。飛行空間内を飛行する各イオンの速度はその質量数に依存し、質量数が小さいほど大きな速度を有する。従って、イオン検出器に到達するまでの飛行時間に応じ、各種イオンを質量数毎に分離して検出することができる。
【０００３】
こうしたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは、他の質量分析装置では測定が不可能であった分子量が１万を越すような高質量領域までの分析が可能あり、分子量の分布の測定と構造解析とが同時に且つ短時間に行え、また、熱に不安定で分解し易い物質でもフラグメンテーションを起こすことなく分析ができる、といった特徴から、タンパク質、ペプチド等の生体高分子の分析に広く使用されるようになって来ている。
【０００４】
このＭＡＬＤＩ用の試料の作成方法の一例について詳しく述べる。サンプルスライドと呼ばれる金属板には、通常、複数個の凹部が形成されている。分析作業者は、分析対象物質を含有する試料液とマトリクス溶液とを予め混合し、サンプルスライドの凹部内に塗布する。或いは、試料液とマトリクス溶液とをそれぞれサンプルスライドの凹部に滴下し、その中で両者を混合する。その後、サンプルスライドに乾燥風を当てることにより、試料液やマトリクス溶液の溶媒を蒸発させ、凹部にマトリクスと分析対象物質との混合物を残す。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１０−４８１１０号公報（図１〜図３、及び段落００１２〜００２０）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来、上記のような試料の作成作業は、専ら分析作業者が手作業で行うのが一般的であった。そのため、作業効率が悪いのみならず、作業に関わるミスも起こり易かった。こうした作業の手間を軽減するため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料を作成するための特殊な試料調製装置も提案されている。例えば、特許文献１に開示されている試料調製装置では、試料液とマトリクス溶液とを用意すれば、移動自在のピペットが試料液及びマトリクス溶液をそれぞれ自動的に吸引してサンプルスライドの凹部に滴下し、その後、自動的に乾燥風をサンプルスライドに当てて乾燥させる構成を備える。
【０００７】
しかしながら、たとえこうした試料調製装置を用いたとしても、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用試料の調製作業のうちのかなりの部分を手作業で行う必要が生じる場合がある。すなわち、上述したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは、タンパク質、ペプチド等の生体関連試料の分析にしばしば使用されるが、こうした生体関連試料には、通常、非常に多くの種類のタンパク質等の物質が含まれている。そのため、この試料をそのままマトリクスと混合して分析しても、目的とする分析対象物質以外の様々な物質がいわば夾雑物となるため、正確な分析を行うことは実用上不可能である。そこで、生体関連試料の分析を行う際には、目的とする分析対象物質を或る程度分離・抽出する必要があり、上記のような試料調製装置を前処理に用いるにしても、マトリクス溶液と混合する試料液を用意するために、元の試料から分析対象物質を分離して取り出すような作業が必要となる。こうした作業は結局、手作業で行わなければならず、非常に効率が悪く、スループットの向上を妨げる一因となっている。
【０００８】
本発明はかかる課題を解決するために成されたものであり、その主たる目的とするところは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用試料の調製作業において、特に元の試料が他種類の物質を含有している場合でも、効率よく且つ分析作業者の負担を軽減して試料の調製を行うことができるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用試料調製装置を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために成された本発明は、サンプルスライドに形成された凹部に、分析対象物質とマトリクスとの混合物が収容されて成るＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料を作成するために利用される試料調製装置であって、
ａ）試料液に含まれる試料成分を時間方向に分離する液体クロマトグラフのカラムと、
ｂ）該カラムから溶出する溶出液を順次検出する検出器と、
ｃ）前記溶出液の一部を分取して前記サンプルスライドの凹部に滴下するフラクションコレクタと、
ｄ）前記検出器による検出信号に基づいて作成したクロマトグラムに出現する目的ピークの一部に対応するタイミングで溶出液が分取されるように前記フラクションコレクタを制御する制御手段と、
を備えることを特徴としている。
【００１０】
【発明の実施の形態、及び効果】
本発明では、一般に、多数の試料成分が含まれる試料を各成分毎に分取・分画するために利用される分取液体クロマトグラフを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料を調製する際の、試料の分離及び採取に利用する。本発明の一実施形態として、前記検出器は質量分析計であり、サンプルスライドの凹部に分取したい試料成分又はその集合である試料成分群を質量数又は質量数範囲で以て指定するための入力設定手段をさらに備え、前記制御手段は、該入力設定手段により指定された質量数又は質量数範囲毎に作成したマスクロマトグラムに出現するピークの一部に対応するタイミングで溶出液が分取されるように、前記フラクションコレクタを制御する構成とすることができる。
【００１１】
この構成では、分析作業者は予め採取したい試料成分又はその集合である試料成分群を、その試料成分が持つ質量数又は試料成分群が含まれる質量数範囲として設定しておく。但し、通常、液体クロマトグラフと質量分析計とを組み合わせたＬＣ／ＭＳで測定可能な質量数の上限は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで測定可能な質量数よりも小さい。そのため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析しようとする分析対象物質の多くは、その質量数がＬＣ／ＭＳで測定可能な質量数の上限を越えている。従って、上記入力設定手段で設定する質量数又は質量数範囲は、採取したい試料成分自体の分子イオンの質量数ではなく、フラグメントイオン等の試料成分を推測し得るイオンの質量数としてもよい。
【００１２】
上記設定を行った上で試料を液体クロマトグラフ分析し、カラムから溶出した溶出液を検出器で検出する。検出器が質量分析計である場合には、検出器に導入された溶出液は消費されてしまうので、検出器の手前で溶出液を分岐させ、並行してフラクションコレクタに導入する。制御手段は、上記設定された質量数又は質量数範囲毎に作成したマスクロマトグラムに出現するピークを検出し、そのピークの一部に対応するタイミングで、上記分岐された溶出液が分取されるようにフラクションコレクタの動作を制御する。これによって、フラクションコレクタは、設定された試料成分又は試料成分群が含まれている少量の溶出液を、所定のサンプルスライドの所定位置の凹部に滴下する。分析作業者は、こうして溶出液が採取されたサンプルスライドを取り出し、上記のような自動化装置を利用して或いは手作業で、マトリクス溶液を凹部に滴下して溶出液と混合し、さらに乾燥を行えばよい。
【００１３】
以上のようにして本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用試料調製装置では、多数の成分が含まれる試料を分析しようとする際に、分析対象とする１乃至複数の試料成分を分離・抽出する作業を自動的に行うことができるので、従来よりも大幅に作業効率を向上させることができ、分析のスループットも改善される。また、分析作業者の負担の軽減になるとともに、試料調製に関する作業のミスの発生の防止にも有効である。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明の一実施例であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用試料調製装置について、図１〜図３を参照して説明する。
【００１５】
図１は本試料調製装置の全体構成図である。本装置の基本は、高速液体クロマトグラフを利用した分取液体クロマトグラフである。すなわち、溶離液槽１に貯留されている溶離液（移動相）は送液ポンプ２により吸引され、一定流量で以て試料導入部３を介してカラム４に流される。試料導入部３において移動相中に注入された試料溶液は移動相に乗ってカラム４に導入され、カラム４を通過する間に時間方向に成分分離されて溶出する。カラム４の出口には流路分岐部５が設けられ、該流路分岐部５において所定の分流比率で分岐された一方の流路には質量分析計６が、他方の流路にはフラクションコレクタ７が設けられている。通常、フラクションコレクタには溶出液を分取・分画するために複数のバイアル瓶がセットされるようになっているが、本装置のフラクションコレクタ７では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの試料作成に使用されるサンプルスライド２１がセットできるように構成されている。
【００１６】
質量分析計６では、導入された溶出液が順次気化されるとともに、該溶出液に含まれる各成分分子がイオン化される。そして、これら各種イオンを、四重極質量フィルタ等の質量分析器により質量数（質量／電荷）毎に分離して検出する。この質量分析計６の検出信号は信号処理部８へと入力される。信号処理部８は質量分析計６による検出信号に基づき、或る質量数又は質量数範囲に着目した時間−信号強度を表すマスクロマトグラムを作成し、そのマスクロマトグラムに出現するピークを利用して、分取すべき試料成分の分取タイミングを指示するための制御信号を発生する。この制御信号を受けた分取制御部９は、フラクションコレクタ７に内蔵される電磁弁やアーム等を制御し、上記流路分岐部５により分岐されて供給される溶出液を適宜分取してサンプルスライド２１に滴下させる。
【００１７】
図２は本実施例を用いた試料調製作業を説明するための、サンプルスライド２１の縦断面図である。図２（ａ）に示すように、サンプルスライド２１には複数の凹部２１ａが形成されている。フラクションコレクタ７においては、サンプルスライド２１の凹部２１ａの上方に移動されたニードル２０の下端穴から、凹部２１ａに向けて試料液（カラム４からの溶出液）２２を滴下する。このとき、１個の凹部２１ａ当たり、滴下する試料液量は１ｍＬ以下のごく微量である。
【００１８】
図３は、本試料調製装置における試料採取動作を説明するための簡略化したタイミング図である。図３により本装置の動作を説明する。試料の採取に先立って、分析作業者は入力設定部１０から、分析対象物質、つまり凹部２１ａに採取したい物質に対応する質量数、又は複数の物質を含む物質群に対応する質量数範囲を１乃至複数指定する。いま、ここでは、ｍ１、ｍ２、ｍ３なる３種の質量数範囲にそれぞれ含まれる３つの物質群を、１個のサンプルスライド２１のそれぞれ異なる凹部２１ａに採取する場合について考える。
【００１９】
既に上で述べたように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析対象とすることの多いタンパク質やペプチド等の分子量は大きく、ＬＣ／ＭＳで分析可能な質量数範囲の上限を越えている。従って、上記ｍ１、ｍ２、ｍ３なる質量数範囲は、分析対象物質の分子イオンの質量数そのままではなく、その物質から生じるフラグメンテーションイオンのうち、それぞれの物質群を特徴付けることが可能であるような質量数を選定する。そのため、このような質量数又は質量数範囲に基づく物質の分離は完全ではなく、例えば偶然に同じ質量数範囲に入ってしまうような他の物質が混じることがあり得るが、ＴＯＦＭＳで排除できるので実用的にはあまり問題とならない。
【００２０】
分析作業者は、上記のように設定を行った後、試料採取の開始を指示する。すると、液体クロマトグラフ分析が開始され、上述したようにカラム４に一定流量で送られる移動相中に試料が注入され、カラム４の出口から時間的に分離された各成分が順次溶出する。その溶出液の一部は質量分析計６に導入され、上記設定された質量数範囲ｍ１、ｍ２、ｍ３について繰り返し検出信号が取得される。この検出信号を受けて、信号処理部８では、図３（ａ）に示すように、質量数範囲ｍ１、ｍ２及びｍ３に対するマスクロマトグラムがそれぞれ作成される。
【００２１】
信号処理部８では、各マスクロマトグラムにおいてピークの開始点を検出し、ピークトップを挟んでその前後の所定時間だけ分取を行うための制御信号を生成する（図３（ｂ）〜（ｄ）参照）。流路分岐部５から質量分析計６までの流路の長さと、同じく流路分岐部５からフラクションコレクタ７までの流路の長さとは、上記のような制御信号が生成されるまでに要する時間と、その制御信号で分取されるべき溶出液がフラクションコレクタ７に到達するまでの時間とを考慮して適宜に定められている。そのため、分取制御部９が上記のように生成された制御信号に基づいてフラクションコレクタ７の動作を制御すると、各制御信号の元になったピークトップ付近に対応する溶出液が、ニードル２０からサンプルスライド２１の３つの凹部２１ａにそれぞれ滴下される（図３（ｅ）参照）。
【００２２】
このようにして、サンプルスライド２１の各凹部２１ａにそれぞれ目的とする試料成分（分析対象物質）を採取したならば、分析作業者はサンプルスライド２１を取り出し、次の作業に移る。すなわち、分析作業者は、マイクロピペットを用いて少量のマトリクス溶液を吸引し、図２（ｂ）に示すように、その一部を、溶出液２２が採取されている凹部２１ａに滴下する。このときのマトリクス溶液２３の液量は、溶出液２２の液量に比べればかなり多量である。そして、凹部２１ａ内でマトリクス溶液２３と溶出液２２とが均一になるように撹拌する。その後、乾燥風をサンプルスライド２１に当て、溶媒等を気化させて飛ばし、マトリクスと分析対象物質との混合物を凹部２１ａに残す。なお、こうした作業は手作業で行ってもよいが、上述したような自動化装置で行ってもよい。こうして作成したサンプルスライド２１をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにセットし、所定の手順で分析を実行する。
【００２３】
なお、上記実施例では、マスクロマトグラムに出現した１個のピークに対応して分取のための制御信号を生成していたが、例えば異なる質量数又は質量数範囲のマスクロマトグラムに出現するピークの論理和や論理積等の論理演算を実行し、その結果に基づいて分取のための制御信号を生成するようにしてもよい。
【００２４】
また、上記実施例では、液体クロマトグラフの検出器に質量分析計を利用していたが、紫外可視分光光度計などの他の検出器を用いてもよい。但し、質量分析計以外の検出器を利用した場合、クロマトグラムに出現するピークのみ（つまり質量数の情報は利用できない）で分取のタイミングを決める必要があるため、どのような状態にピークが出現するのかを確認するために予備的な液体クロマトグラフ分析を行うことが好ましい。これによりクロマトグラムを作成し、そのクロマトグラム上に現れたピークを分析作業者が指定することで、引き続き行う分取の際の動作を指示することができる。こうした手順は、通常の分取液体クロマトグラフと同様である。
【００２５】
なお、上記実施例は一例であって、本発明の趣旨の範囲で適宜変更や修正を行なえることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用試料調製装置の全体構成図。
【図２】本実施例を用いた試料調製作業を説明するための図。
【図３】本実施例の試料調製装置の動作を説明するための図。
【符号の説明】
１…溶離液槽
２…送液ポンプ
３…試料導入部
４…カラム
５…流路分岐部
６…質量分析計
７…フラクションコレクタ
８…信号処理部
９…分取制御部
１０…入力設定部
２０…ニードル
２１…サンプルスライド
２１ａ…凹部
２２…溶出液
２３…マトリクス溶液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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