(57)【要約】【課題】簡易な操作によって培養した細胞を非侵襲的に無駄なく回収して、効率的に生体組織補填体を製造する。【解決手段】培地を貯留可能な容器２内に、リン酸カルシウム多孔体等の生体組織補填材からなる補填材層３と、該補填材層３の上面を被覆するゼラチン等からなる溶解層４とを備える生体組織補填体の製造装置１を提供する。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地を貯留可能な容器内に、リン酸カルシウム多孔体等の生体組織補填材からなる補填材層と、該補填材層の上面を被覆するゼラチン等からなる溶解層とを備える生体組織補填体の製造装置。
【請求項２】
前記溶解層が、下方に配される前記補填材層と、上方に配される空間とを密封状態に遮断している請求項１に記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項３】
前記補填材層に、分化誘導因子が混入されている請求項２に記載の生体組織補填材の製造装置。
【請求項４】
リン酸カルシウム多孔体等の生体組織補填材からなる補填材層とその上面を被覆するゼラチン等からなる溶解層とを積層状態に収容した容器内に、培地と細胞とを投入して、所定期間にわたり、溶解層上において細胞を培養する一次培養ステップと、
該一次培養ステップにおいて溶解層が培地に溶解することにより補填材層に付着した細胞を培養する二次培養ステップとを備える生体組織補填体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、骨等の生体組織の欠損部を再生する際に使用する生体組織補填体の製造システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系細胞を含む培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
このような培養骨は、一般に、患者から採取した骨髄細胞をフラスコ内で一次培養して必要細胞数まで増加させた後に、トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いて細胞をフラスコから剥離する。そして、これを骨補填材に付着させて骨形成培地内に留置して二次培養を行うことにより製造される（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
【非特許文献１】
植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【非特許文献２】
吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような培養骨の製造方法では、一次培養された細胞をフラスコから剥離させるために、トリプシンによる蛋白質分解処理が必要となる。蛋白質分解処理は、フラスコの底面に付着した細胞をフラスコから剥離させるために、細胞外周の細胞膜上に存在する膜蛋白質を分解する。このために、細胞の増殖機能に重要な役割を果たす細胞黄色因子受容体等の必要な膜蛋白質をも分解してしまい、細胞に機能障害を生じてしまう不都合がある。
【０００７】
また、細胞をトリプシンによりフラスコから剥離した場合には、細胞は、細胞−細胞間接着を断ち切られて、トリプシン内に混合されることになる。したがって、細胞だけを回収するために遠心分離等の分離処理を行う必要があり、工程が煩雑である。また、分離された細胞を無駄なく回収する必要もある。
【０００８】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な操作によって培養した細胞を非侵襲的に無駄なく回収して、効率的に生体組織補填体を製造する生体組織補填体の製造装置および方法を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、培地を貯留可能な容器内に、リン酸カルシウム多孔体等の生体組織補填材からなる補填材層と、該補填材層の上面を被覆するゼラチン等からなる溶解層とを備える生体組織補填体の製造装置を提供する。
【００１０】
この発明によれば、容器内に培地を貯留して、培地内に細胞を投入することにより、平坦な水平面に付着しやすい細胞が、容器底部の最上位に配されている溶解層の表面に沈降して付着し、該溶解層の表面に沿って増殖する。溶解層は、ゼラチンのように、培地内において時間が経過する内に培地に溶解して消滅する。したがって、細胞が充分に増殖するまで消滅しない程度に溶解層の厚さや成分等を調整しておくことにより、細胞が充分に成長した時期に合わせて消滅させられる。
【００１１】
溶解層の下方には生体組織補填材からなる補填材層が配置されているので、溶解層が消滅することにより、該溶解層上に付着していた細胞は、そのまま補填材層の上面に付着させられて増殖が継続させられる。その結果、細胞は、生体組織補填材を足場として成長し、生体組織補填体が製造されることになる。
【００１２】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の生体組織補填体の製造装置において、前記溶解層が、下方に配される前記補填材層と、上方に配される空間とを密封状態に遮断している生体組織補填体の製造装置を提供する。
この発明によれば、上下の空間を密封状態に遮断する溶解層により、該溶解層の上方に、該溶解層を底面とした容器が形成される。したがって、溶解層が消滅するまでの間は、容器内の培地とこれに混入している細胞が溶解層上において成長することにのみ用いられ、効率的な培養を行うことが可能となる。
【００１３】
請求項３に係る発明は、請求項２に記載の生体組織補填体の製造装置において、前記補填材層に、分化誘導因子が混入されている生体組織補填体の製造装置を提供する。
この発明によれば、溶解層により上下の空間が密封されている状態では、補填材層内の分化誘導因子を機能させることなく、溶解層表面における細胞の増殖のみを行わせ、溶解層が消滅した状態で細胞が生体組織補填体に付着した後に、分化誘導因子を機能させて、細胞を骨等の所望の組織へ分化させることが可能となる。
【００１４】
請求項３に係る発明は、リン酸カルシウム多孔体等の生体組織補填材からなる補填材層とその上面を被覆するゼラチン等からなる溶解層とを積層状態に収容した容器内に、培地と細胞とを投入して、所定期間にわたり、溶解層上において細胞を培養する一次培養ステップと、該一次培養ステップにおいて溶解層が培地に溶解することにより補填材層に付着した細胞を培養する二次培養ステップとを備える生体組織補填体の製造方法を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造装置および方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１は、培養骨の製造装置であって、図１に示されるように、容器２と、該容器２の底面２ａとなる内面に配置されたβリン酸三カルシウム多孔体（生体組織補填材）のブロックからなる補填材層３と、該補填材層３の上面を全面にわたって被覆するように配置された溶解層４とを備えている。
【００１６】
容器２は、後述する培地Ａを貯留可能な、比較的平坦な底面２ａを有し、上面には貫通孔５が設けられているとともに、該貫通孔５に開閉可能な蓋体６が配置されている。貫通孔５は、蓋体６が開放されることにより、容器２の内部に培地Ａや細胞を投入することを可能とし、蓋体６が閉鎖されることにより、容器２の内部への塵埃や細菌等の侵入を防止することができるようになっている。また、貫通孔５には、容器２の内部を所定の培養条件に保持するためのガス供給手段（図示略）が接続されてもよい。
【００１７】
補填材層３の上面に配置された溶解層４は、ゼラチンからなるシート状の部材により構成されている。溶解層４の上面は、略平坦に形成されており、付着性の細胞が付着しやすい形態に形成されている。
この溶解層４は、培地Ａ内に所定時間投入状態に配置されることにより、培地Ａ内に溶解し、次第に消滅するような厚さおよび成分に調整されている。所定時間とは、例えば、間葉系幹細胞が溶解層４の表面において、充分な細胞数となるまで増殖するのに必要な時間である。
【００１８】
このように構成された本実施形態に係る製造装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態の製造装置１を用いて培養骨を製造するには、まず、図２に示されるように、蓋体６を取り外すことにより容器２の貫通孔５を開放し、該貫通孔５から、容器２内部に培地Ａと細胞とを供給する。
【００１９】
培地Ａは、例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤を８４：１５：１の配合比率で混合したものである。なお、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
培地Ａ内に投入する細胞は、例えば、骨髄液から抽出した骨髄細胞である。
そして、このようにして、培地Ａと骨髄細胞とを供給した状態で、容器２の内部を所定の培養条件、例えば、３７±０．５℃、５％ＣＯ２濃度となるように維持する。
【００２０】
次に、この状態で、所定期間、例えば８〜１０日間にわたって静置培養する、いわゆる一次培養ステップを実施することにより、培地Ａ内に浮遊していた骨髄細胞の内、付着性の間葉系幹細胞７が沈降して、図３に示されるように、容器２底部の最上位に配されている溶解層４の上面に付着する。
溶解層４の上面は、比較的平坦に形成されているので、図３〜図５に示すように、間葉系幹細胞は溶解層４の表面に沿って増殖していくことになる。
【００２１】
一次培養ステップの途中においては、培養によって失われた栄養分を補給しかつ間葉系幹細胞７から排出された排出物を除去するために、定期的に培地Ａの交換を行う。培地Ａの交換は、古くなった廃培地を貫通孔５から吸引あるいは、容器２を傾けることによって排出した後に、新たな培地Ａを貫通孔５から供給することにより行われる。
【００２２】
この一次培養ステップにおいては、溶解層４が培地Ａ内に漸次溶解していく。すなわち、溶解層４は、培地Ａに溶解しやすいゼラチン等により構成されているので、時間の経過とともに培地Ａ内に溶解して、図３〜図５に示されるように、漸次薄肉化していくことになる。
そして、間葉系幹細胞７が溶解層４の表面上に充分な細胞数となるまで成長すると、これと時期を同じくして溶解層４もほぼ消滅させられる。
【００２３】
溶解層４が消滅すると該溶解層４に付着して増殖してきた間葉系幹細胞７は、図５に示されるように、溶解層４の下方に配されていた骨補填材３の表面に付着させられることになる。この状態で、培地Ａ内にデキサメタゾンのような分化誘導因子、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等の成長因子やこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合する。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。
【００２４】
このようにして、間葉系幹細７が補填材層３を構成する骨補填材を足場として成長する二次培養ステップが、所定の期間、例えば２週間程度にわたって行われる。この二次培養ステップにおいても、定期的な培地Ａの交換が行われる。これにより、間葉系幹細胞は骨芽細胞に分化して骨基質が形成され、患部に補填可能な培養骨が製造されることになる。
【００２５】
本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、間葉系幹細胞７の細胞数を増殖させる一次培養ステップから、骨基質を形成する二次培養ステップへの移行に際して、間葉系幹細胞７を容器２から引き剥がす必要がない。すなわち、スクレーパやトリプシン等による侵襲的な剥離作業が行われないので、一次培養ステップにおいて培養された間葉系幹細胞７を、無駄なく、健全な状態で二次培養ステップに引き渡すことができる。
したがって、細胞を効率的に使用して、迅速に培養骨を製造することができるという効果がある。
【００２６】
なお、上記実施形態においては、補填材層３を構成する生体組織補填材として、ブロック状のβリン酸三カルシウム多孔体を例示して説明したが、これに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。
【００２７】
また、ブロック状とする場合には、骨欠損部への補填の際に培養骨を分割する必要が生ずるため、分割しやすいように、予め分割線に沿って細胞が付着し難くする処理、例えば、親水性を呈するように処理したり、あるいは、細胞の住み難い溝のような凹凸形状を付与したりしてもよい。また、分割後に、分割された各ブロックを回転させながら、さらに培養することにしてもよい。
【００２８】
また、ブロック状の骨補填材に代えて、顆粒状の骨補填材によって補填材層３を構成することにしてもよい。この場合には、溶解層４が消滅した後の二次培養ステップに先立って、間葉系幹細胞７と骨補填材とが混合されるように攪拌することにしてもよい。
【００２９】
また、上記実施形態においては、補填材層３の上面を被覆するようにシート状の溶解層４を配置することにしたが、この溶解層４を構成するシートの周囲を容器２の壁面２ｂに接着させることにより、溶解層４の上下の空間を密封状態に区画することにしてもよい。このようにすることで、溶解層４が存在する状態では、容器２内に供給した培地Ａが補填材層３に入り込むことなく、溶解層４上の間葉系幹細胞７の培養のためにのみ利用されることになる。また、培地Ａ内に浮遊している間葉系幹細胞７を、ほぼ全て溶解層４上に沈降させて付着させることができるので、細胞を無駄にすることがないという効果もある。
【００３０】
また、このように溶解層４により、容器２内部を密封状態に区画することにより、二次培養ステップのみにおいて必要となる物質、例えば、分化誘導因子等を補填材層３に混入しておくことも可能となる。すなわち、一次培養ステップにおいては、培地Ａは補填材層３には侵入しないので、補填材層３に混入されている物質が機能することはなく、溶解層４上の間葉系幹細胞７は、細胞数を増加させる増殖のみを行うことになる。そして、溶解層４が消滅した後の二次培養ステップにおいては、培地Ａが補填材層３に侵入することにより補填材層３に混入している物質が間葉系幹細胞７に接触させられることになる。
【００３１】
また、上記各実施形態においては、生体組織補填体として培養骨を例に挙げて説明したが、生体組織補填材に付加する細胞としては、ＥＳ細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞、骨細胞や軟骨細胞等の体細胞でもよい。また、自家細胞でも、他家細胞でもよい。また、上記実施形態においては、骨髄液から抽出した間葉系幹細胞７を培養する場合について説明したが、骨髄液のみならず末梢血や臍帯血から抽出することにしてもよい。
また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００３２】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る生体組織補填体の製造装置および方法によれば、トリプシン等を用いた剥離処理を行うことなく、必要細胞数まで培養された細胞を生体組織補填材に付着させるできる。したがって、細胞の健全性を損なうことなく、より多数の細胞を無駄なく生体組織補填材に付着させて、効率的に生体組織補填体を製造することができる。また、トリプシン等による剥離工程を削除することができるので、作業を簡易にすることができ、製造の迅速化を図ることができるという効果もある。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造装置を示す縦断面図である。
【図２】図１の製造装置に培地および細胞を供給する状態を示す縦断面図である。
【図３】図１の製造装置による一次培養ステップの初期状態を示す縦断面図である。
【図４】図１の製造装置による一次培養ステップの途中状態を示す縦断面図である。
【図５】図１の製造装置により二次培養ステップが開始された状態を示す縦断面図である。
【符号の説明】
Ａ　培地
１　生体組織補填体の製造装置
２　容器
３　補填材層
４　溶解層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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