(57)【要約】【課題】　部分的にミスマッチの配列のハイブリダイゼーションのために標的核酸にハイブリダイズしたプローブのアレイを分析することにおける実質的な困難性の解決。【解決手段】　標的よりも少数の塩基をもつ多数の核酸プローブにより標的核酸を配列決定する方法であって：そのプローブをその標的と接触させ；その標的に特異的にハイブリダイズする第１プローブを同定し；その第１プローブのＡ，Ｃ，Ｔ，Ｕ、及びＧ伸長物の少なくとも２を含んで成る伸長プローブの第１セットを選び；そしてその伸長プローブの第１セットの他のものよりも強くその標的に特異的にハイブリダイズするその伸長プローブの第１セットの中の１を同定し、それによりその伸長プローブの中の１がその標的核酸の中の１の塩基を同定する、段階を含んで成る方法【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸のヌクレオチド配列が第１核酸の配列と同一であるかどうかを決定する方法であって：
　その標的核酸を多数の核酸プローブに接触させ；
　その配列に１塩基ミスマッチを除き同一であるプローブヘのその標的のアフィニティーを測定し；そして
　その標的の核酸配列がその第１核酸と同一であるかを、１塩基ミスマッチを除き同一であるプローブヘのその標的のアフィニティーが所定のパターンに従う場合に、決定する、ことを含んで成る方法。
【請求項２】
所定のパターンが、配列の完全相補物のアフィニティーに正規化された１塩基ミスマッチのプローブのアフィニティーを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１塩基ミスマッチ・プローブのアフィニティーが、アフィニティー対ミスマッチ位置としてプロットされ、そして配列の完全相補物のアフィニティーに正規化される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標的の核酸配列が、１塩基ミスマッチに相補的なプローブヘのその標的のアフィニティーが所定のパターンに従わない場合に、第１核酸と同一ではないことを決定する段階をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
核酸のプローブ・アレイであって、標的核酸への正確な相補物、並びにその正確な相補物の１塩基ミスマッチを含んで成るように可能性のあるプローブの全てから選ばれているプローブ・アレイ。
【請求項６】
核酸プローブが約８と１５塩基の間の長さをもつ、請求項５に記載のライブラリー。
【請求項７】
ライブラリーが、単一支持体上にある、請求項５に記載のライブラリー。
【請求項８】
ライブラリーがｎ−塩基以下のプローブを含んで成り、そしてそのライブラリーがｎ−塩基の可能性のあるプローブの全ての５０％未満を含んで成る、請求項５に記載のライブラリー。
【請求項９】
ライブラリーがｎ−塩基以下のプローブを含んで成り、そしてそのライブラリｒがｎ−塩基の可能性のあるプローブの全ての１０％未満を含んで成る、請求項５に記載のライブラリー。
【請求項１０】
コア核酸プローブであって、核酸標的に正確に相補的なもの、並びにそのコア・プローブの選択されたＡ，Ｃ，Ｔ，Ｕ、及びＧの１塩基置換物、を含んで成る核酸プローブ・キット。
【請求項１１】
コア・プローブ並びにそのコア・プローブのＡ，Ｃ，Ｔ、及びＧのＴ塩基置換物から本質的に成る、請求項１０に記載の核酸プローブ・キット。
【請求項１２】
標的サンプルが標的と同一であるか又はこれと異なるかどうかを決定するための指示書をさらに含んで成る、請求項１０に記載の核酸プローブ・キット。
【請求項１３】
コア・プローブが８と１５の間の塩基を含んで成る、請求項１０に記載の核酸プローブ・キット。
【請求項１４】
プローブが、鎌状赤血球貧血、Ｐ−５３突然変異、嚢胞性線維症突然変異、ＨＬＡクラス１遺伝子、及びＨＬＡクラス２遺伝子から成る群がら選ばれた遺伝子特徴について標的サンプルを評価するように選ばれる、請求項１０に記載の核酸プローブ・キット。
【請求項１５】
プローブが、鎌状赤血球貧血について標的サンプルを評価するように選ばれる、請求項１０に記載の核酸プローブ・キット。
【請求項１６】
標的核酸の配列決定方法であって、以下の段階：
　プローブのアレイとその標的を接触させ；
　少なくとも同定されたハイブリダイゼーションアフィニティーレベルをもつアレイ内で選択された高アフィニティープローブを同定し；
　その高アフィニティープローブから誘導された多数の候補標的配列を同定し；
　ミスマッチ・プローブであって、少なくとも１の塩基ミスマッチを除きその高アフィニティープローブと同一の塩基配列を含むものを同定し；
　そのミスマッチ・プローブについてのアフィニティーパターンと、その候補標的配列についての予想ミスマッチ・アフィニティー・パターンとを比較し；そして
　その候補標的配列から標的配列を、選択された標的配列が最良のミスマッチパターンをもつように、選択する、
を含んで成る方法。
【請求項１７】
予想されたミスマッチ・アフィニティー・パターンが：
　伸長プローブの末端においてミスマッチをもつプローブ／標的複合体についてのより高い結合アフィニティー；及び
　その複合体の内部においてミスマッチをもつプローブ／標的複合体についてのより低い結合アフィニティー、
を含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アフィニティー・パターンを比較する段階が、以下の段階：
　予想されたミスマッチ・アフィニティー・パターン内のそれぞれのミスマッチ位置について予想されるアフィニティー値を同定し；そして
　その予想されたアフィニティー値からの同定された変動以下のアフィニティー値をもつその多数のミスマッチ位置を選ぶ、
　を含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
以下の段階：
　より短いプローブのアレイと標的を接触させ；
　そのプローブの各々についてその標的の部分との完全マッチの確率を決定し；
　そのプローブの全ての組合せについて、その完全マッチの確率の全てを決定し；そして
　それについて完全マッチの確率の全てが最大化される、そのプローブの組合せからそのプローブの同定された組合せを選択し、それによりそのプローブの同定された組合せがその標的核酸の配列を同定する、
　を含んで成る、標的核酸の配列決定方法。
【請求項２０】
完全マッチの確率の決定段階が、以下の段階：
　多数の既知の断片についてのハイブリダイゼーション・データを集め；
　そのハイブリダイゼーション・データから完全マッチの既知の確率を予測するアルゴリズムを同定し；そして
　そのアルゴリズムを使用してそのプローブについての完全マッチの確率を同定する、
　を含んで成る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
標的よりも少数の塩基をもつ多数の核酸プローブにより標的核酸を配列決定する方法であって、以下の段階：
　その標的とそのプローブを接触させ；
　その標的への高いアフィニティーをもつプローブを同定し；
　その高いアフィニティープローブから多数の候補標的配列を同定し；そして
　その候補標的配列のそれぞれについてのミスマッチ・プローブの標的アフィニティーを分析し、ここで、そのミスマッチ・プローブが少なくとも１塩基ミスマッチを除き候補標的配列の一部と相補的である、を含んで成る方法。
【請求項２２】
候補標的配列が、その標的に等しい塩基数をもつ核酸配列の全てを含み、そしてその高アフィニティー・プローブの少なくとも１に相補的な部分をもつ、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
予想されたアフィニティー・パターンと、その候補標的配列の各々についてのアフィニティー・パターンを比較する段階をさらに含んで成る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
予想されたアフィニティー・パターンが、塩基ミスマッチがミスマッチ・プローブの内部にあるときよりもそのミスマッチ・プローブの末端にある場合により高いアフィニティーを示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
予想されたアフィニティー・パターンに最も近いアフィニティー・パターンをもつ候補標的配列を選択する段階をさらに含んで成る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
標的よりも少数の塩基をもつ多数の核酸プローブにより標的核酸配列を配列決定する方法であって、以下の段階：
　その標的とそのプローブを接触させ；
　その標的アフィニティーに基づきそのプローブの各々について確率を決定し、各々の確率が、対応のプローブがその標的の一部に相補的である見込みを特定し；そして
　その確率に基づいてその標的を同定するプローブのセットを選択する、
　を含んで成る方法。
【請求項２７】
２以上の核酸分子コレクションの、核酸配列を比較する方法であって、
（ａ）標的核酸を含み、固体表面に結合された複数の標的エレメントを提供する工程と、
（ｂ）その標的エレメントを下記と接触させる工程と，
　（ｉ）標識され標的核酸配列と実質的に相補的な配列を含む核酸の第１のコレクション、および
　（ｉｉ）標的核酸配列と相補的な配列を有する少なくとも第２の標識された核酸
　ここで、第１と第２の標識は互いに識別可能である
（ｃ）第１と第２の標識された相補的核酸の標的核酸に対する結合を検出する工程と
　を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
第１の細胞タイプにおける複数の遺伝子の各々の差次的な発現を、第２の細胞タイプにおける同一の遺伝子の発現に対して検出する方法であって、
　これらの２つの細胞タイプからの標識された核酸の混合物を、これらの２つの細胞タイプ由来の複数の既知の遺伝子を表すポリヌクレオチドのアレイに、このアレイ中の相補的配列のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせる条件下で、加える工程と、
　一方の細胞タイプ由来の核酸と主としてハイブリダイズするこのアレイ中のポリヌクレオチドが、明確な蛍光エミッション色を与え、他の細胞タイプ由来の核酸とハイブリダイズするこのアレイ中のポリヌクレオチドが、異なる蛍光エミッション色を与えるような蛍光励起条件下で、このアレイを蛍光で検査する工程とを含むこ
　とを特徴とする方法。
【請求項２９】
第１の細胞タイプにおける複数の遺伝子の各々の差次的な発現を、第２の細胞タイプにおける同一の遺伝子の発現に対して検出する方法であって、
　この２つの細胞タイプから単離された、標識されたｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡ生成物をつくる工程と、
　少なくともこの２つの細胞タイプ由来の複数の既知の遺伝子を表すポリヌクレオチドの高密度アレイのこの２つの細胞タイプからの標識されたｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡ生成物の混合物を、このアレイ中の相補的配列のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせる条件下で、加える工程と、
　一方の細胞タイプ由来の核酸と主としてハイブリダイズするこのアレイ中のポリヌクレオチドが、明確な蛍光エミッション色を与え、他の細胞タイプ由来の核酸とハイブリダイズするこのアレイ中のポリヌクレオチドが、異なる蛍光エミッション色を与えるような蛍光励起条件下で、このアレイを蛍光で検査する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
２以上の核酸分子コレクション中の核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）同定可能な核酸配列を含み固体表面に結合されたポリヌクレオチドのアレイを提供する工程と、
（ｂ）このポリヌクレオチドアレイを下記と接触させる工程と，
　（ｉ）このアレイの核酸と実質的に相補的な配列を有する標識された核酸の第１のコレクション、および
　（ｉｉ）このアレイの核酸と実質的に相補的な配列を有する標識された核酸の少なくとも第２のコレクション
　ここで、第１と第２の標識は互いに識別可能である
（ｃ）第１と第２の標識された相補的核酸のアレイの核酸に対する結合を検出する工程
　とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
標識された核酸の２以上のコレクション中の核酸配列のコピー数を比較する方法であって、
　核酸を含み固体表面に結合された複数のプローブを提供する工程と、
　このプローブを下記と接触させる工程と，
　第１の標識を有する標識された核酸の第１のコレクション、および第２の標識を有する標識された核酸の少なくとも第２のコレクションここで、第１と第２の標識は互いに識別可能であるプローブに相補的な第１の標識をされた核酸および第２の標識をされた核酸のそれぞれの結合量を検出し、これによりこれらの核酸のコピー数を比較する工程と
　を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
２つの細胞タイプからの標識された核酸が第１及び第２の蛍光レポーターで標識されていることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
核酸の試験サンプルがある個体からのものであるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）その個体からの核酸の参照サンプルを提供する工程と、
（ｂ）既知の部位に複数の異なる核酸を有する支持体を提供する工程と、
（ｃ）参照サンプルを支持体に適用して参照ハイブリダイゼーションパターンを得る工程と、
（ｄ）試験サンプルを支持体に適用し試験ハイブリダイゼーションパターンを得る工程と、
（ｅ）参照ハイブリダイゼーションパターンと試験ハイブリダイゼーションパターンとを比較し、この試験サンプルがその個体からのものであるかどうかを決定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
異なる個人間の遺伝的バリエーションを検出する方法であって、
（ａ）各個人のサンプルであってその個人の核酸を含むサンプルを提供する工程と、
（ｂ）既知の部位に複数のプローブを有する支持体を提供する工程と、
（ｃ）各サンプルを支持体に適用してハイブリダイゼーションパターンを得る工程と、
（ｄ）得られたハイブリダイゼーションパターンを比較して遺伝的バリエーションを検出する工程と
を有することを特徴とする方法。
【請求項３５】
異常な組織を診断する方法であって、
（ａ）異常組織のサンプルであってその異常組織の転写産物を含むサンプルを提供する工程と、
（ｂ）既知の部位に複数の異なるプローブを有する支持体を提供する工程と、
（ｃ）サンプルを支持体に適用し発現パターンを得る工程と、
（ｄ）この発現パターンを、複数の既知の組織の異常の発現パターンを有する参照データベースと比較し、これにより異常組織を診断する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
組織の細胞構成物を決定する方法であって、
（ａ）組織のサンプルであってその組織の核酸を含むサンプルを提供する工程と、
（ｂ）既知の部位に複数のプローブを有する支持体を提供する工程と、
（ｃ）サンプルをこの支持体に適用し発現パターンを得る工程と、
（ｄ）この発現パターンを、複数の既知の細胞の発現パターンを有する参照データベースと比較しこれによりその組織の細胞構成物を決定する工程とを含むことを特徴とする方法。．
【請求項３７】
サンプルを分析する方法であって下記の工程を含むことを特徴とする方法
　１ｃｍ２あたり１００より多いオリゴヌクレオチドを含む、１以上のオリゴヌクレオチド高密度アレイを、１以上の固体サポート上に載せる或いは形成する工程であって、このオリゴヌクレオチドはこの固体サポート上に形成されるか或いは前もって形成されてからこのサポートの既知の場所に載せられる、
　メッセンジャーＲＮＡサンプルを少なくとも２つの細胞集団から抽出し、このメッセンジャーＲＮＡあるいはこの少なくとも２つの細胞集団からのメッセンジャーＲＮＡサンプルの生成物を標識する工程と、
　この抽出及び標識工程の生成物をこの１以上の高密度アレイにさらす工程と、
　この生成物がこの高密度アレイのどこでハイブリダイズしたかを検出する工程と、
　この検出工程に基づいて、この少なくとも２つの細胞集団におけるこのメッセンジャーＲＮＡの発現レベルを決定する工程。
【請求項３８】
第１の細胞タイプにおける複数の遺伝子の各々の差次的な発現を、第２の細胞タイプにおける同一の遺伝子の発現に対して検出する方法であって、
　これらの２つのタイプの細胞からの標識された核酸の混合物を、これらの２つのタイプの細胞由来の複数の既知の遺伝子を表すポリヌクレオチドのアレイに、アレイの相補的配列のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせる条件下で、加える工程と、
　一方の細胞タイプ由来の標識された核酸とハイブリダイズするアレイのポリヌクレオチドが、明確な蛍光エミッション色を与え、他の細胞タイプ由来の標識された核酸とハイブリダイズするアレイのポリヌクレオチドが、異なる蛍光エミッション色を与えるような蛍光励起条件下で、このアレイを蛍光で検査する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
複数のサンプルをマーキングする方法であって、
（ａ）それぞれ固有の配列でコードされる異なるポリマーからなる
複数のマーカーを提供する工程と、
（ｂ）異なるマーカーを各サンプルに包含させる工程と
を有することを特徴とする方法。
【請求項４０】
試薬基質（ｒｅａｇｅｎｔ　ｍａｔｒｉｘ）を調製する方法であって、
（ａ）複数の第１の標的エレメントを、少なくとも１ｃｍ２あたり１０３個の異なる第１の標的エレメントが支持体上に存在するように、支持体の特定の部位に提供する工程、
（ｂ）少なくとも１つの第１の標的エレメントと特異的に結合可能であり、試薬にリンクされている第２の標的エレメントを、提供する工程と、
（ｃ）特異的結合可能な条件下で、この第２の標的エレメントを支持体に接触させ、これにより試薬基質を調製する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
固体支持体に付けられた複数の位置的識別可能な配列特異的試薬を含む組成物であって、この試薬が、少なくとも３つのサブユニットを有する前もって選ばれたマルチサブユニット長さの所定のサブユニット配列と特異的に結合でき、またこの試薬が、この前もって選ばれた長さの可能な配列のすべてを実質的に表すことを特徴とする組成物。
【請求項４２】
個人における突然変異を検出する方法であって、
（ａ）個人の核酸のサンプルを提供する工程と、
（ｂ）少なくともいくつかのオリゴヌクレオチドは突然変異配列を有し少なくとも他のいくつかのオリゴヌクレオチドは野生型配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを既知の部位に有する支持体を提供する工程と、
（ｃ）各サンプルを支持体に適用してハイブリダイゼーションパターンを得る工程と、
（ｄ）このハイブリダイゼーションパターンを分析してその個人における突然変異を検出する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
複数の配列をお互いに対してマッピングする方法であって
（ａ）複数の配列特異的プローブが位置的に付着された支持体を調製する工程と、
（ｂ）それぞれの配列を支持体にさらし、これによりこの配列特異的プローブと配列との相互作用のパターンを決定する工程と、
（ｃ）この配列特異的プローブの相互作用のこの配列における相対的位置を決定し、この配列のオーバーラップと順番を決定する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
複数のポリヌクレオチド配列をお互いに対してマッピングする方法であって
（ａ）既知の位置に複数の配列特異的プローブが、少なくとも１ｃｍ２あたり約１００プローブの割合で、付着された支持体を調製する工程と、
（ｂ）それぞれのポリヌクレオチド配列を、ハイブリダイゼーション条件下で、支持体に付着されたプローブに接触させる工程と、
（ｃ）この配列におけるハイブリダイゼーションの相対的位置を決定し、この複数のポリヌクレオチド配列のオーバーラップと配列の順番を決定する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
表面に、１ｃｍ２の表面積あたり少なくとも１０３の別個のポリヌクレオチド或いはポリペプチド・バイオポリマーのマイクロアレイをもつ支持体であって、各別個のバイオポリマーサンプルは（ｉ）このアレイの別々の限定された位置に配置され、（ｉｉ）少なくとも５０サブユニットの長さを有し、（ｉｉｉ）標識された標的サンプルとハイブリダイズされたときに検出可能な量であることを特徴とする支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、核酸分析、検出、及び配列決定の分野に関する。より特に、１の態様においては、本発明は、核酸のアレイ（ａｒｒａｙｓ）の合成、核酸のハイブリダイジング、一本鎖プローブと標的核酸から成る２本鎖核酸内のミスマッチの検出、及びＤＮＡ又はＲＮＡあるいは他のポリマーの配列の決定のための改良技術を提供する。
【背景技術】
【０００２】
　（政府の権利）
　本明細書中に記載する発明は、エネルギー省とＡｆｆｙｍａｘとの間の契約第ＤＥ−ＦＧ０３−９２ＥＲ　８１２７５号（認可第２１０１２−９２−ＩＩ）の中で又はその下で；並びにＮＩＨ　契約第１Ｒ０１ＨＧ　００８１３−０１号の中で又はその下で生じた。
【０００３】
　（発明の背景）
　多くの分野において核酸の配列を決定することは重要である。なぜなら、例えば核酸は酵素、構造タンパク質、及び生物学的機能の他のエフェクターをコードしているからである。ポリペプチドをコードする核酸のセグメントに加えて、遺伝子発現の制御及び調節に関係する多くの核酸配列が存在する。
【０００４】
　ヒト：ゲノム計画は、核酸配列決定技術を使用した計画の１例である。この計画は、ヒト生物のゲノムの完全な配列を決定することを目的としている。このような配列は、各々の特定の個人の配列とは必ずしも一致しないであろうけれども、その生物一般に関する有意義な情報と特定の個人からのゲノム・セグメント内に含まれる特定配列を提供するであろう。このヒト・ゲノム計画は、さらに詳細な研究に有用なマッピング情報をも提供するであろう。
【０００５】
　配列決定計画、例えばヒト・ゲノム計画の要求におけるよりも明らかな、高迅速で、正確で、そして安価が配列決定技術についての必要性は、どこにもない。ヒト・ゲノムの配列決定を完成するためには、約３×１０９、又は３０億の、塩基対の決定が必要であろう。
【０００６】
　配列決定のために今日典型的に使用される手順は、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３−５４６７、とＭａｘａｍ　ｅｔ　ａ１．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５：４９９−５５９中に記載された方法を含む。このサンガー法は、鎖延長停止ジデオキシ・ヌクレオチドによる酵素的伸長を使用する。マキサム・ギルバート法は、塩基特異的解裂反応を示す化学反応を使用する。両方法は、多数の複雑な操作、例えば同種ＤＮＡ断片の単離、サンプルの骨の折れる、かつ、のろい調製、分離用ゲルの調製、そのゲルヘのサンプルの適用、そのゲル上でのサンプルの電気泳動、最終ゲルの調製、及びその手順の結果の分析を必要とする。
【０００７】
　他の技術も核酸の配列決定のために提案されてきた。全目的をもって引用により本明細書中に取り込むＰＣＴ特許公開第９２／１０５８８号は、標識された、標的核酸の配列が支持体上の核酸プローブのアレイヘのハイブリダイゼーションにより決定されるような１の改良技術を記載している。各プローブは、その支持体上に位置的に区別できる場所に位置する。この標識された標的がその支持体に晒されるとき、それは、相補的ヌクレオチド配列を含む位置において結合する。その結合位置におけるプローブの配列の知識を通じて、ある者は、標的核酸のヌクレオチド配列を決定することができる。この技術は、ひじょうに大きなアレイの核酸プローブが使用されるとき、特に効率的である。このようなアレイは、Ｐｉｒｒｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．に付与された米国特許第５，１４３，８５４号中に記載された技術に従って形成されることができる。また、米国出願逐次番号第０７／８０５，７２７号をも参照のこと。両方を、全目的をもって引用により本明細書中に取り込む。
【０００８】
　これらの核酸プローブが標的よりも短い長さをもつとき、ある者は、より短いプローブからのアフィニティー・データに基づき、より大きな標的の配列を決定するための再構築技術を使用することができる。Ｄｒｍａｎａｃ　ｅｔ　ａｌ．への米国特許第５，２０２，２３１号、とＳｏｕｔｈｅｒｎへのＰＣＴ特許公開第８９／１０９７７号を参照のこと。この困難性を克服するための１つの技術は、ハイブリダイゼーション又はＳＢＨによる配列決定といわれてきた。例えば、１２−ｍｅｒの標的ＤＮＡ　５’−ＡＧＣＣＴＡＧＣＴＧＡＡが全部で８ヌクレオチドのプローブのアレイと混合されると仮定する。この標的が正確に相補的なヌクレオチド配列をもつようなプローブだけと結合する場合、６５，５３６のオクタマーの中のたった５つのプローブ（３’−ＴＣＧＧＡＴＣＧ，ＣＧＧＡＴＣＧＡ，ＧＧＡＴＣＧＡＣ，ＧＡＴＣＧＡＣＴ、とＡＴＣＧＡＣＴ）がこの標的にハイブリダイズするであろう。これらのハイブリダイジング・プローブからの重複配列の整列は、その元の１２−ｍｅｒの標的の相補物を再構築する：
　　　　　　　　　ＴＣＧＧＡＴＣＧ
　　　　　　　　　　ＣＧＧＡＴＣＧＡ
　　　　　　　　　　　ＧＧＡＴＣＧＡＣ
　　　　　　　　　　　　ＧＡＴＣＧＡＣＴ
　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＧＡＣＴＴ
　　　　　　　　　ＴＣＧＧＡＴＣＧＡＣＴＴ
。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
　多くの楽観に会ったにもかかわらず、従来技術は、特定の限定とも会った。例えば、従事者は、他の困難性の中で、部分的にミスマッチの配列のハイブリダイゼーションのために標的核酸にハイブリダイズしたプローブのアレイを分析することにおける実質的な困難性に遭遇した。本発明は、このようなアレイによる配列決定における有意な進歩を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
　項目１．標的よりも少数の塩基をもつ多数の核酸プローブにより標的核酸を配列決定する方法であって：
　そのプローブをその標的と接触させ；
　その標的に特異的にハイブリダイズする第１プローブを同定し；
　その第１プローブのＡ，Ｃ，Ｔ，Ｕ、及びＧ伸長物の少なくとも２を含んで成る伸長プローブの第１セットを選び；そしてその伸長プローブの第１セットの他のものよりも強くその標的に特異的にハイブリダイズするその伸長プローブの第１セットの中の１を同定し、それによりその伸長プローブの中の１がその標的核酸の中の１の塩基を同定する、
段階を含んで成る方法。
【００１１】
　項目２．核酸プローブの実質的に全てがｎヌクレオチドを含んで成り、そして伸長プローブが第１プローブのｎ−１ヌクレオチドを含んで成る、項目１に記載の方法。
【００１２】
　項目３．伸長プローブの第１セットから反対の方向において伸長するＡ，Ｃ，Ｔ，Ｕ、及びＧ伸長プローブの第２セットを選び；そして
　その伸長プローブの第２セットの他のものよりも強く標的に特異的にハイブリダイズするその伸長プローブの第２セットの中の１を同定し、それにより、その伸長プローブの第２セットの中の１が標的核酸内の第２の塩基を同定する、
段階をさらに含んで成る、項目１に記載の方法。
【００１３】
　項目４．伸長プローブのセットを選ぶ段階を繰り返し、そして５回以上伸長プローブを同定する、
段階をさらに含んで成る、項目１に記載の方法。
【００１４】
　項目５．同定の段階が、１塩基ミスマッチ・プローブであって、伸長プローブの第１セットのＡ，Ｃ，Ｔ，Ｕ、及びＧモノ置換の中の少なくとも２を含んで成るものを同定し；
　その１塩基ミスマッチ・プローブのハイブリダイゼーション・アフィニティー・データを記録し；そして
　そのハイブリダイゼーション・アフィニティー・データが、その１塩基ミスマッチ・プローブの予想ハイブリダイゼーションアフィニティー・データを確信させるときその第１プローブの正しい伸長として伸長プローブの第１セットの中の１を選ぶ、
段階をさらに含んで成る、項目１に記載の方法．
　項目６．予想されるハイブリダイゼーション・データが：伸長プローブの末端においてミスマッチをもつプローブ／標的複合体についてのより高い結合アフィニティー；及び
　その複合体の内部においてミスマッチをもつプローブ／標的複合体についてのより低い結合アフィニティー、
を含んで成る、項目５に記載の方法。
【００１５】
　項目７．ハイブリダイゼーション・データが伸長プローブの中の１についてのハイブリダイゼーション値に対して正規化され；そして
　同定の段階が、その伸長プローブの中の１つの正規化された値よりも高い正規化されたハイブリダイゼーション値をもたない末端１塩基ミスマッチ・プローブをもつ伸長プローブの中の１を選ぶことを含んで成る、
項目６に記載の方法。
【００１６】
　項目８．同定の段階が、他の伸長プローブよりも高い、標的に対する結合アフィニティーを示す伸長プローブのセットの中の１を選ぶ段階を含んで成る、項目１に記載の方法。
【００１７】
　項目９．同定の段階が、適当にプログラムされたコンピューター内で行われる、項目１に記載の方法。
【００１８】
　項目１０．標的核酸のヌクレオチド配列が第１核酸の配列と同一であるかどうかを決定する方法であって：
　その標的核酸を多数の核酸プローブに接触させ；
　その配列に１塩基ミスマッチを除き同一であるプローブヘのその標的のアフィニティーを測定し；そして
　その標的の核酸配列がその第１核酸と同一であるかを、１塩基ミスマッチを除き同一であるプローブヘのその標的のアフィニティーが所定のパターンに従う場合に、決定する、ことを含んで成る方法。
【００１９】
　項目１１．所定のパターンが、配列の完全相補物のアフィニティーに正規化された１塩基ミスマッチのプローブのアフィニティーを含んで成る、項目１０に記載の方法。
【００２０】
　項目１２．１塩基ミスマッチ・プローブのアフィニティーが、アフィニティー対ミスマッチ位置としてプロットされ、そして配列の完全相補物のアフィニティーに正規化される、項目１１に記載の方法。
【００２１】
　項目１３．標的の核酸配列が、１塩基ミスマッチに相補的なプローブヘのその標的のアフィニティーが所定のパターンに従わない場合に、第１核酸と同一ではないことを決定する段階をさらに含んで成る、項目１０に記載の方法。
【００２２】
　項目１４．核酸のプローブ・アレイであって、標的核酸への正確な相補物、並びにその正確な相補物の１塩基ミスマッチを含んで成るように可能性のあるプローブの全てから選ばれているプローブ・アレイ。
【００２３】
　項目１５．核酸プローブが約８と１５塩基の間の長さをもつ、項目１４に記載のライブラリー。
【００２４】
　項目１６．ライブラリーが、単一支持体上にある、項目１４に記載のライブラリー。
【００２５】
　項目１７．ライブラリーがｎ−塩基以下のプローブを含んで成り、そしてそのライブラリーがｎ−塩基の可能性のあるプローブの全ての５０％未満を含んで成る、項目１４に記載のライブラリー。
【００２６】
　項目１８．ライブラリーがｎ−塩基以下のプローブを含んで成り、そしてそのライブラリーがｎ−塩基の可能性のあるプローブの全ての１０％未満を含んで成る、項目１４に記載のライブラリー。
【００２７】
　項目１９．コア核酸プローブであって、核酸標的に正確に相補的なもの、並びにそのコア・プローブの選択されたＡ，Ｃ，Ｔ，Ｕ、及びＧの１塩基置換物、を含んで成る核酸プローブ・キット。
【００２８】
　項目２０．コア・プローブ並びにそのコア・プローブのＡ，Ｃ，Ｔ、及びＧのＴ塩基置換物から本質的に成る、項目１９に記載の核酸プローブ・キット。
【００２９】
　項目２１．標的サンプルが標的と同一であるか又はこれと異なるかどうかを決定するための指示書をさらに含んで成る、項目１９に記載の核酸プローブ・キット。
【００３０】
　項目２２．コア・プローブが８と１５の間の塩基を含んで成る、項目１９に記載の核酸プローブ・キット。
【００３１】
　項目２３．プローブが、鎌状赤血球貧血、Ｐ−５３突然変異、嚢胞性線維症突然変異、ＨＬＡクラス１遺伝子、及びＨＬＡクラス２遺伝子から成る群がら選ばれた遺伝子特徴について標的サンプルを評価するように選ばれる、項目１９に記載の核酸プローブ・キット。
【００３２】
　項目２４．プローブが、鎌状赤血球貧血について標的サンプルを評価するように選ばれる、項目１９に記載の核酸プローブ・キット。
【００３３】
　項目２５．標的核酸の配列決定方法であって、以下の段階：
　プローブのアレイとその標的を接触させ；
　少なくとも同定されたハイブリダイゼーション・アフィニティー・レベルをもつアレイ内で選択された高アフィニティー・プローブを同定し；
　その高アフィニティー・プローブから誘導された多数の候補標的配列を同定し；
　ミスマッチ・プローブであって、少なくとも１の塩基ミスマッチを除きその高アフィニティー・プローブと同一の塩基配列を含むものを同定し；
　そのミスマッチ・プローブについてのアフィニティー・パターンと、その候補標的配列についての予想ミスマッチ・アフィニティー・パターンとを比較し；そして
　その候補標的配列から標的配列を、選択された標的配列が最良のミスマッチ・パターンをもつように、選択する、
を含んで成る方法。
【００３４】
　項目２６．予想されたミスマッチ・アフィニティー・パターンが：
　伸長プローブの末端においてミスマッチをもつプローブ／標的複合体についてのより高い結合アフィニティー；及び
　その複合体の内部においてミスマッチをもつプローブ／標的複合体についてのより低い結合アフィニティー、
を含んで成る、項目２５に記載の方法．
　項目２７．アフィニティー・パターンを比較する段階が、以下の段階；
　予想されたミスマッチ・アフィニティー・パターン内のそれぞれのミスマッチ位置について予想されるアフィニティー値を同定し；そして
　その予想されたアフィニティー値からの同定された変動以下のアフィニティー値をもつその多数のミスマッチ位置を選ぶ、
を含んで成る、項目２５に記載の方法。
【００３５】
　項目２８．以下の段階：
　より短いプローブのアレイと標的を接触させ；
　そのプローブの各々についてその標的の部分との完全マッチの確率を決定し；
　そのプローブの全て各々組合せについて、その完全マッチの確率の全てを決定し；そして
　それについて完全マッチの確率の全てが最大化される、そのプローブの組合せからそのプローブの同定された組合せを選択し、それによりそのプローブの同定された組合せがその標的核酸の配列を同定する、
を含んで成る、標的核酸の配列決定方法。
【００３６】
　項目２９．完全マッチの確率の決定段階が、以下の段階：
　多数の既知の断片についてのハイブリダイゼーション・データを集め；
　そのハイブリダイゼーション・データから完全マッチの既知の確率を予測するアルゴリズムを同定し；そして
　そのアルゴリズムを使用してそのプローブについての完全マッチの確率を同定する、
を含んで成る、項目２８に記載の方法。
【００３７】
　（発明の要約）
　核酸（オリゴヌクレオチド）を合成し、ハイブリダイズし、分析し、そして配列決定するための改良された技術を本発明により提供する。
【００３８】
　本発明の１の態様に従って、標的オリゴヌクレオチドが多数の、より短い長さの固定化されたプローブに晒される。これらのプローブを、集合的に、“アレイ（ａｒｒａｙ）”という。本法においては、ある者は、標的に高いアフィニティーをもつコア・プローブを最初に固定し、そして次にこのコア・プローブと比較したとき１塩基のミスマッチをもつ全てのプローブの結合特性を評価することにより、標的核酸がそのアレイ内のプローブに相補的であるかどうかを同定する。この１塩基ミスマッチ・プローブが特徴的な結合又はアフィニティー・パターンを示す場合、このときそのコア・プローブは、その標的核酸の少なくとも一部に正確に相補的である。
【００３９】
　本法は、コア・プローブの“左”と“右”伸長といわれることができるプローブの結合アフィニティーを評価することによりそのアレイ内のいずれのプローブよりも大きな標的核酸を配列決定するために拡大されることができる。コアの正しい左と右伸長は、１塩基ミスマッチ・プローブの特定のハイブリダイゼーション・パターン及び／又は最も強い結合アフィニティーを示すようなものである。１塩基ミスマッチ・プローブの結合アフィニティー特定は、その３’又は５’末端上にミスマッチをもつプローブ／標的複合体が内部ミスマッチをもつプローブ／標的複合体よりも安定である特性パターンに従う。この方法は、次に、核酸標的の配列を提供するために、コア・プローブの追加の左と右伸長を決定するために繰り返される。
【００４０】
　いくつかの態様、例えば診断においては、標的は、特定の配列をもつと予想される、標的が予想配列をもつかどうかを決定するために、相補的プローブ並びに１塩基ミスマッチ・プローブの全ての全サブセット又はその中のいくつかのサブセットを含むプローブのアレイが合成される。このようなプローブヘのこの標的のハイブリダイゼーション・パターンの分析を通じて、その標的が予想配列をもつかどうか決定されることができ、そしてそうでない場合その標的の配列が場合により決定されることができる。
【００４１】
　核酸標的の分析のためのキットも、本発明により提供される。１の態様に従えば、キットは、核酸プローブのアレイを含む。このプローブは、標的核酸に対する完全な相補物を含むことができる。これらのプローブは、その完全に相補的なプローブの１塩基置換物であるプローブをも含む。このキットは、完全相補物の１以上のＡ，Ｃ，Ｔ，Ｇ、及び／又はＵ置換を含むことができる。このようなキットは、特定の遺伝子配列についての標的の分析，を含むさまざまな用途、例えば遺伝子疾患のための分析におけるものをもつであろう。
【発明の効果】
【００４２】
　本発明によって、部分的にミスマッチの配列のハイブリダイゼーションのために標的核酸にハイブリダイズしたプローブのアレイを分析することにおける実質的な困難性にを解決するための、アレイによる配列決定における有意な進歩を提供した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
　本明細書中における本発明の性質と利点のさらなる理解は、本明細書の残りの部分と添付図面を参照することにより理解されるであろう。
【００４４】
　（好ましい態様の説明）
　目次
　　Ａ．合成
　　Ｂ．ハイブリダイゼーション
　　Ｃ．ミスマッチ分析
　　Ｄ．適用
　　Ｅ．結論
　（定義）
　プローブ−典型的には固体表面上で形成された公知の組成又はモノマー配列の分子であって、標的分子に晒され又は晒されてもよく、そしてそのプローブがその標的にハイブリダイズされたかどうかを決定するために検査され又は検査されてもよいもの。“コア（ｃｏｒｅ）”プローブは、標的に強いアフィニティーを示すプローブである。“伸長（ｅｘｔｅｔｅｎｓｉｏｎ）”プローブは、コア・プローブ配列の全部又は一部に加えそのコア・プローブ配列の１以上の可能性のある伸長を含むプローブである。本明細書は、プローブの３’−末端における伸長として“左”伸長と、そしてプローブの５’−末端における伸長として“右”伸長という。但し、反対の表記法も明らかに採用されることができるであろう。
【００４５】
　標的−それについて、その組成又はモノマー配列を研究することが望ましい、典型的には、未知の組成又はモノマー配列をもつ分子。標的は、より大きな分子の一部、例えば、より長い核酸内の数塩基であることができる。
【００４６】
　ｎ−塩基ミスマッチ−ｎが１以上である、コアプローブ内の対応モノマーとは異なる、ｎモノマーをその中にもつプローブ。
【００４７】
　Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕ−は、それぞれ、以下のヌクレオチド、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、とウリジンについての略号である。
【００４８】
　ライブラリー−１以上の支持体内にしばしば形成される、所定ヌクレオチド配列の核酸プローブのコレクションであって、標的核酸のハイブリダイゼーション試験において使用されるもの。
Ａ．合成
　光指定オリゴヌクレオチド合成のための方法を図１中に示す。このような戦略は、本発明者の譲受人に譲渡され、そして全目的をもって引用により本明細書中に取り込む米国特許第５，１４３，８５４号中により詳細に記載されている。
【００４９】
　図１において説明する光指定合成法においては、光不安定性保護基又は基（Ｘ）により誘導体化された表面（２）を、フォトリトグラフ・マスク（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ　ｍａｓｋ）Ｍ１を通して照射して、反応性ヒドロキシル（ＯＨ）基を露出させる。（光不安定性の保護基により５’−ヒドロキシルにおいて保護された）ホスホルアミジット活性化ヌクレオシドのシリーズの第１の（Ｔ−Ｘ）を次に表面全体に晒す。先行する照射の間に先に晒された部位においてのみカップリングが生じる。
【００５０】
　上記カップリング反応が完了した後、支持体を濯ぎ、そしてその表面を再び、新たな又は平行移動されたマスクＭ２を通して照射して、カップリングのための異なる基を露出させる。（光不安定性の保護基により５’−ヒドロキシルにおいて再び保護された）新たな
ホスホルアミジット活性化ヌクレオシドＣ−Ｘを添加し、そして上記露出部位にカップリングさせる。上記工程を、光脱保護とカップリングのサイクルを通じて繰り返して、支持体上にオリゴヌクレオチド・プローブの所望のセットを作り出す。フォトリトグラフィーが使用されるので、この工程は微細にされることができる。さらに、反応が光により場所的にアドレスされた部位においてのみ生じるので、各部位におけるプローブのヌクレオチド配列は正確に知られ、そして標的分子（標的核酸又は、他の態様においては、タンパク質、例えばレセプタのいずれか）との、各部位におけるオリゴヌクレオチド・プローブの相互作用を評価することができる。５’−〇−（α−メチル−６−ニトロピペロニルオキシカルボニル）−Ｎ−アシル−２’−デオキシヌクレオシド、又はＭｅＮＰｏｃ−Ｎ−アシル−デオキシヌクレオシド、ＭｅＮＰｏｃ−ｄＴ，ＭｅＮＰｏｃ−ｄＣｉｂｕ，ＭｅＮＰｏｃ−ｄＧＰＡＣ、及びＭｅＮＰｏｃ−ｄＡＰＡＣを含む光保護デオキシヌクレオシドを本工程のために開発した。保護基化学は、ＰＣＴ特許公開第９２／１００９２号及び１９９０年１２月６日に出願された米国出願逐次番号第０７／６２４，１２０号、及び１９９２年１２月２日に出願された第０７／９７１，１８１号であって、共に本発明の譲受人に譲渡され、そして全目的をもって引用により本明細書中に取り込まれたものの中にかなり詳細に開示されている。
実施例
　１．保護基
　塩基は２８０ｎｍ領域内に強いπ−π＊遷移をもつので、光除去性保護基の脱保護波長は、不所望のヌクレオシド光化学を回避するために２８０ｎｍよりも長い波長でなければならない。さらに、４つのデオキシヌクレオシドの光脱保護速度は、光が、全照射合成部位内で、ヒドロキシル（又は他の官能基、例えばスルフヒドリル又はアミノ基）を均しく脱保護するであろうように、近似していなければならない。
【００５１】
　これらの基準に適合するために、１セットの、５’−〇−（α−メチルー６−ニトロピペロニルオキシカルボニル）−Ｎ−アシル−２’−デオキシヌクレオシド（ＭｅＮＰｏｃ−Ｎ−アシル−デオキシヌクレオシド）が光指定合成のために開発され、そして保護されたヌクレオシドの光速度論的挙動が測定された。５’−〇−（α−メチルー６−ニトロピペロニルオキシカルボニル）−Ｎ−アシル−２’−デオキシヌクレオシド・ホスホルアミジットを合成するための合成系路をスキームＩに示す。
【００５２】
【数１】
2004105189.tif 000002
　第１段階において、Ｎ−アシル−２’−デオキシヌクレオシドを１−（２−ニトロ−４，５−メチレンジオキシフェニル）−エタン−１−クロロホルメートと反応させて、５’−ＭｅＮＰｏｃ−Ｎ−アシル−２’−デオキシヌクレオシドを作る。第２段階において、その３’−ヒドロキシルを、標準的な手順を用いて２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルクロロホスホルアミジットと反応させて、５’−ＭｅＮＰｏｃ−Ｎ−アシル−２’−デオキシヌクレオシド−３’−〇−ジイソプロピルクロロホスホルアミジットを作る。これらの試薬は、４℃においてアルゴン下で乾燥保存されるとき長時間安定であった。
【００５３】
　４つのデオキシヌクレオシド、ＭｅＮＰｏｃ−ｄＴ，ＭｅＮＰｏｃ−ｄＣｉｂｕ，ＭｅＮＰｏｃ−ｄＧＰＡＣ、とＭｅＮＰｏｃ−ｄＡＰＡＣのそれぞれの０．１ｍＭ　溶液をジオキサン中で調製した。アリコート（２００ｍＬ）を、さまざまな時間にわたり狭い経路（２ｍｍ）の石英キュベット内で１４．５ｍＷ／ｃｍ２の３６５ｎｍ　光で照射した。４〜５の時間点を、各塩基について採取し、そしてそれらの溶液を、０．１（ｖ／ｖ）％ＴＦＡを含む水中６０（ｖ／ｖ）％の移動相により溶出して、２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣ装置とヌクレオジル５−Ｃ８ＨＰＬＣカラムにより出発材料の損失について分析した（ＭｅＮＰｏｃ−ｄＴは水中７０（ｖ／ｖ）％メタノールの移動相を必要とした。）。残ったＭｅＮＰｏｃ−Ｎ−アシル−デオキシヌクレオシドのピーク面積を計算して、ＭｅＮＰｏｃ−ｄＴ，ＭｅＮＰｏｃ−ｄＣｉｂｕ，ＭｅＮＰｏｃ−ｄＧＰＡＣ、とＭｅＮＰｏｃ−ｄＡＰＡＣについて、それぞれ２８秒、３１秒、２７秒、と１８秒の光分解半減期を得た。その後のリトグラフ実験において、４，５分間の照射時間（９＊ｔ１／２ＭｅｎＰｏｃ−ｄＣ）は、９９％以上のＭｅＮＰｏｃ保護基の除去を導いた。
【００５４】
　光指定合成においては、全体の合成収率は、光脱保護の収率、光脱保護のコントラスト、と化学的カップリングの効率に依存する。光速度論的条件は、好ましくは、光脱保護の収率が９９％を超えることを確保するように選ばれる。支持体の通常暗い領域内の不所望の光分解は、その合成忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）に悪影響を及ぼすことができるが、高吸光度（５０ＤＵ）によるリトグラフ・マスクを使用することにより、そして光学表面の注意深いインデックス・マッチング（ｉｎｄｅｘ　ｍａｔｃｈｉｎｇ）により最小化されることができる。ガラス支持体へのＤＭＴ−Ｎ−アシル−デオキシヌクレオシド・ホスホルアミジットの縮合効率は、９５％〜９９％のレンジ内で測定された。ＭｅＮＰｏｃ−Ｎ−アシル−デオキシヌクレオシド・ホスホルアミジットの縮合効率も、９０％を上廻って測定された。但し、それらの効率は、合成間で変動することができ、そして監視されなければならない。
【００５５】
　２．カップリング効率の測定
　光保護されたヌクレオシドのカップリング効率を調べるために、４つのＭｅＮＰｏｃ−アミジットのそれぞれを最初に、（ＤＭＴ化学物質を介して）支持体にカップリングした。その支持体の領域を照射し、そしてＭｅＮＰｏｃ一ホスホルアミジットを保護基なしで添加した。その支持体の新たな領域を次に照射し；蛍光デオキシヌクレオシド・ホスホルアミジット（ＦＡＭ−ホスホルアミジットＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をカップリングして；そしてその支持体をシグナルについて走査した。蛍光標識されたホスホルアミジットが、新たに露出されたヒドロキシル基と先に未反応とヒドロキシル基の両方において反応する場合、その時、２つの部位の間の蛍光強度の比は、そのカップサング効率の尺度を提供する。この計測は、表面光分解の収率が不変に近いということを受け入れる。この又は近似の検定を使用した化学的カップリング収率は、変動性であるが、高く、８０〜９５％の間のレンジにある。
【００５６】
　別個の検定において、化学的カップリング効率は、ヘキサエチレングリコール誘導体化支持体上で測定される。まず、グリコール・リンカーを脱トリチル化し、ＭｅＮＰｏｃ−デオキシヌクレオシド−Ｏ−シアノエチルホスホルアミジットをキャッピングなしでその樹脂にカップリングした。次に、ＤＭＴ−デオキシヌクレオシド−シアノエチルホスホルアミジット（リポーター−アミジット）をその樹脂にカップリングした。このリポーター−アミジットは、上記第１段階からのいずれかの未反応のヒドロキシル基にカップリングする。このトリチル溶出液を集め、そして吸収分光光度計により定量した。溶出液を、そのデリバリー・ライン内に残った残存トリチルを測定するためにＭｅＮＰｏｃ−ホスホルアミジット・カップリング直後にそのラインからも集めた。この検定において、カップリング効率は、１００％の、リポーター−アミジットのカップリング効率を呈すると測定される。ヘキサエチレングリコール・リンカーへのＭｅＮＰｏｃ−デオキシリボヌクレオシド−Ｏ−シアノエチルホスホルアミジットのカップリング効率と１６のジヌクレオチドの効率が測定され、そしてＤＭＴ−デオキシヌクレオシド・ホスホルアミジットとは区別できなかった。
【００５７】
　３．オリゴヌクレオチド・プローブの場所的に指定された合成
　オリゴヌクレオチド・プローブの合成を始めるために、支持体を調製し、そしてＭｅＮＰｏｃ−ｄＣｉｂｕ−３’−〇−ホスホルアミジットを合成リンカーを通じて合成サポートに付着させた。このサポートに付着させた。このサポートの領域を、リトグラフ・マスクの８００×１２８０μｍの孔を通しての照射により合成のために活性化した。７つの追加のホスホルアミジット合成サイクルを（対応のＤＭＴ保護されたデオキシヌクレオシドをもって）行い、Ｓ−３’−ＣＧＣＡＴＣＣＧを作り出した。室温において４時間濃ＮＨ４ＯＨにより、ホスフェートと環外アミン保護基の除去の後、支持体を、水ジャケット付熱制榔されたハイブリダイゼーション・チャンバー内に載せた、この支持体を、以下に述べるミスマッチ実験において使用した。
【００５８】
　Ｂ．ハイズリダイゼーション
　オリゴヌクレオチド・アレイは、ハイブリダイゼーション研究を含む、多種多様の用途において使用されることができる。ハイブリダイゼーション研究においては、そのアレイは、図１中に示すように、着目のレセプタ（Ｒ）に晒されることができる。このレセプタは、適当な標識（＊）、例えばフルオレセインにより標識されることかできる。このレセプタが結合した支持体上の位置が測定され、そして、その位置におけるオリゴヌクレオチド・プローブの配列の知識を通じて、ある者は次に、そのレセプタがオリゴヌクレオチドである場合、そのレセプタ配列を決定することができる。
【００５９】
　ハイブリダイゼーションにより配列決定（ＳＢＨ）は、各部位におけるプローブの同一性が知られているアレイを形成するために、多くのプローブを表面に付着させることにより最も効率良く行われる。標識された標ＤＮＡ又はＲＮＡは次にそのアレイにハイブリダイズされ、そしてそのハイブリダイゼーション・パターンが、そのアレイ内の全相補的プローブの同一性を決定するために調べられる。ミスマッチ・プローブ／標的複合体が重要でないことを教示する従来の技術とは反対に、本発明は、ミスマッチ・プローブ／標的複合体のハイブリダイゼーション・シグナルが、そのアレイ上の完全にマッチしたプローブ／標的複合体の同一性を同定し又は確認するような分析方法を提供する。
【００６０】
　オリゴヌクレオチドのアレイは、光指定合成技術を用いたハイブリダイゼーション研究のために効率的に生成される。以下に討議するように、全テトラヌクレオチドのアレイを１６サイクルにおいて作り出した。これは完成するのにたった４時間しか必要としなかった。組合せ戦略が使用されるので、アレイ上の異なる化合物の数は合成の間に指数関数的に増加する。一方、化学的カップリング・サイクルの数は、直線的に増加する。例えば、４８（６５，５３６）オリゴヌクレオチドの完全セットにこの合成を拡張することは、１６の追加のサイクルが必要であるためにその合成にほんの４時間（又はこれ未満）を追加する。さらに、組合せ合成戦略を、いずれかの所望のプローブ組成を作り出すために行われることができる。例えば、ドデカマー（４１２）の完全セットは、４８以下の光分解とカップリング・サイクルにおいて作り出されるので（ｂｎ化合物は多くともｂ×ｎサイクルを必要とする。）、（より短いオリゴヌクレオチドのいずれかのサブセットを含む〉ドデカマーのいずれかのサブセットは、４８以下の化学的カップリング段階において構築されることができる。アレイ内の化合物の数は、合成部位の密度と全体のアレイ・サイズによってのみ制限される。本発明は、片面上２５ミクロンの正方形部位内で合成されたプローブをもつアレイにより行われている。この解像度において、６５，５３６オクタヌクレオチドの完全セットは、たった０．６４ｃｍ２の寸法のアレイ内に置かれることができる。１，０４８，５７６ドデカヌクレオチドのセットは、この個々のプローブ部位サイズにおいてたった２．５６ｃｍ２のアレイを必要とする。
【００６１】
　ゲノム配列決定プロジェクトの成功は、効率的なＤＮＡ配列決定技術に依存する。最近の方法は、複雑な手順に高く頼り、そして実質的な手作業を必要とする。ＳＢＨは、最近の実施における手作業の多くを自動化するための潜在能力を提供する。光指定合成は、ＳＢＨのためだけでなく多くの他の用途のためにも微細化されたアレイの大規模生産のための効率的な手段を提供する。
【００６２】
　オリゴヌクレオチド・アレイは、一次的な配列決定用途のために使用されることができるけれども、多くの診断方法は、標的核酸配列内のほんの数個のヌクレオチドの位置の分析を含む．１塩基の変更は、プローブ・アレイ上の標的のハイブリダイゼーション・パターン内に多数の変化を引き起こすので、本発明に係るオリゴヌクレオチド・アレイと方法は、ある者が、先に明白されたＤＮＡ配列の正確さをチェックし、又は標的核酸内での特定の特異的配列内の変化又は突然変異について走査することを可能にする。例えば、後者は、遺伝子、疾患、晶質管理、及び法延分析のために重要である。オクタヌクレオチド・プローブセットにより、標的核酸内の１塩基変化は、８つの完全ハイブリッドの損失により、そして８つの新たな完全ハイブリッドの生成により、検出されることができる。この１塩基変化は、アレイ上の変更されたミスマッチ・プローブ／標的複合体の形成を通じて検出されることもできる。おそらく、さらに驚ろくべきことに、複雑な核酸内のこのような１塩基対の変化は、アレイ上の標的の全ハイブリダイゼーション・パターンを劇的に変更する。本発明に従って、この全ハイブリダイゼーション・パターンにおけるこのような変化は、この分析を実際に単純化するために使用される。
【００６３】
　光指定オリゴヌクレオチド・アレイの高い情報含有量は、遺伝子診断テストにかなり有益である。１００〜１，０００の異なる突然変異の配列比較は、１時間に１回の形式におけるものの代わって、同時に検定されることができる。アレイは、多種多様な病因生物の迅速な同定についての遺伝子マーカーを含み、そして、ＲＮＡ／ＲＮＡ，ＲＮＡ／ＤＮＡ、タンパク質／ＲＮＡ又はタンパク質／ＤＮＡ、相互作用の配列特異性を研究するために、構築されることもできる。ある者は、アンチセンス、トリプル・ヘリックス、又は他の用途のために非ワトソン・クリック・オリゴヌクレオチド及び新規の合成ヌクレオシド・アナロブを使用することができる。好適に保護されたＲＮＡモノマーが、ＲＮＡ合成のために使用されることができ、そして多種多様の合成及び非天然核酸アナロブが、実施者の動機付けに依存して、使用されることができる。例えば、引用により本明細書に取り込む、ＰＣＴ特許公開第９１／１９８１３号、第９２／０５２８５号、及び第９２／１４８４３号を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド検定は、オリゴヌクレオチド複合体の形成及び安定性を支配する熱力学と速度論の規則を演繹するために使用されることができる。
【００６４】
　実施例
　１．表面オリゴヌクレオチドヘの標的のハイブリダイゼーション
　先に討議した支持体結合オクタヌクレオチド・プローブを、１５℃における１５分間のインキュベーションによりハイブリダイゼーション・チャンバー内で５’ＧＣＧＴＡＧＧＣ−フルオレセインの標的にハイブリダイズさせた。アレイ表面を次に蛍光外（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡（４８８ｎｍ　アルゴン・イオン励起）に応答信号を送った（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ）。この走査の蛍光画像を図２に示す。この蛍光強度パターンは、プローブの合成を指定するために使用される８００×１２８０μｍストライプにマッチする。さらに、シグナル強度は、（ガラス支持体の背景を４倍上廻って）高く、そのプローブヘの標的の特異的結合を立証する。
【００６５】
　標的−プローブ複合体の挙動を、そのハイブリダイゼーション溶液の温度を上昇させることにより調べた。各温度において１０分間の平衡化の後、支持体をシグナルについて走査した。２本鎖は、研究下配列について予想される温度レンジ内でメルトした（Ｔｍ＝〔２°（Ａ＋Ｔ）＋４°（Ｇ＋Ｃ）〕の規則から得られたＴｍ≒２８℃）。アレイ内のプローブは、標的ＤＮＡの再ハイブリダイゼーションにより立証されるように、標的−プローブ複合体の温度変性に対して安定であった。
【００６６】
　２．標的ハイブリダイゼーションの配列特異性
　標的ハイブリダイゼーションの配列特異性を立証するために、２つの異なるプローブを８００×１２８０μｍのストライプ内で合成した。図３Ａは、２つのプローブの位置を同定する。プローブＳ−３’−ＣＧＣＡＴＣＣＧをストライプ１，３と５内で合成した。プローブＳ−３’−ＣＧＣＴＴＣＣＧをストライプ２，４と６内で合成した。図３Ｂは、１５℃における支持体への５’−ＧＣＧＴＡＧＧＣ−フルオレセイン標的のハイブリダイゼーションの結果を示している。これらのプローブはたった１の内部塩基が異なるけれども、上記標的は、（ストライプ１，３と５内の背景を〜５００カウント上廻って）その相補的配列に特異的にハイブリダイズし、位置２，４と６（〜１０カウント）内には検出可能なシグナルはほとんど又は全くない。図３Ｃは、両配列への標的のハイブリダイゼーションの結果を示す。図３中のすべての位置内のシグナルは、図３Ｂにおけるシグナルの非存在が１塩基ミスマッチの不安定性にのみ依ることを説明している．標的には、等モル濃度において存在するけれども、図３Ｂ中のストライプ２，４と６内のシグナルの比は、領域１，３と５内のシグナルよりも約１．６倍高い。この２本鎖は、領域２，４と６を占める２本鎖よりもわずかに高い予想Ｔｍをもつ。これらの２本鎖は、１５分間で４５℃までその温度を上昇させることにより解離され、そしてそのハイブリダイゼーションは、上記と逆の順番で繰り返され（図３Ｄと３Ｅ）、これは、逆方向におけるハイブリダイゼーションの特異性を立証している。
【００６７】
　３．プローブ・マトリックスの組合せ合成とそれへの核酸標的のハイブリダイゼーション
　光指定合成においては、製品の位置と組成は、照射と化学的カップリング試薬の順番に依存する（完全な説明については、Ｆｏｄｏｒ　ｅｔ　ａ１．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：７６７−７７３を参照のこと。）図４において説明するように、２５６テトラヌクレオチドの合成について考える。マスク１は、合成の第１ラウンドにおける４つのヌクレオシドの第１とのカップリングのために支持体表面の１／４を活性化する。サイクル２において、マスク２は第２ヌクレオシドとのカップ１ナングのためにその支持体の別の１／４を活性化する。この工程がモノヌクレオチドの４つの領域を作り上げるために続けられる。ラウンド２のマスクは、ラウンド１のものに垂直であり、そしてラウンド２の各サイクルは、４つの新たなヌクレオチドを作り出す。この工程は、図４において説明するように１６のヌクレオチドを形成するためにラウンド２まで続けられる。ラウンド３のマスクは、各カップリングのサイクルが１６のトリマーを作り出すように上記合成領域をさらに亜分割する。この支持体の亜分割は、テトラヌクレオチドを形成するためにラウンド４まで続けられる。このプローブ・マトリックスの合成は、（Ａ＋Ｃ＋Ｇ＋Ｔ）４の多項表記法において簡単に表現されることができる。この多項式の展開は、２５６のテトラヌクレオチドを作り出す。
【００６８】
　プローブ・マトリックスを生り出すために光指定組合せ合成により合成された２５６プローブのアレイの適用を、図５Ａに説明する。この合成のための多項式は：３’−ＣＧ（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）４ＣＧにより与えられる。この合成マップを図５Ｂに与える。全ての可能性のあるテトラヌクレオチドを、３’−末端と５’−末端におけるＣＧに隣接するように合成した。１５℃におけるこのアレイヘの標的５’−ＧＣＧＧＣＧＧＣ−フルオレセインのハイブリダイゼーションは、最も強い位置（２，６９８カウント）としてＳ−３’−ＣＧＣＣＧＣＣＧ相補プローブを正確に作り出した。以下のミスマッチ：
【００６９】
【数２】
2004105189.tif 000003
についても有意な強度が観察された。
Ｃ．ミスマッチ分析
　先に討議したアレイを、より短い長さｋのプローブのアレイを使用して長さｎのオリゴヌクレオチドの核酸配列を決定するための本発明に係る方法において使用されることができる。図６は単純な例について説明する。この標的は、配列５’−ＸＸＹＸＹ−３’｛ここで、ＸとＹは相補的核酸、例えばＡとＴ又はＣとＧである。｝をもつ。討議目的のために、図６における説明を、たった２つの塩基とひじょうに短い配列の使用により単純化するが、この技術は、例えば全部で４つのＲＮＡ又はＤＮＡの塩基によるより大きな核酸に容易に拡張されることができる。
【００７０】
　標的の配列は、一般に最初から（ａｂ　ｉｎｉｔｉｏ）知られていない。ある者は、より短いプローブのアレイを用いて本発明を使用して標的の配列を決定することができる。本実施例においては、全ての可能性のあるＸとＹの４−ｍｅｒのアレイを合成し、そして次に５ｍｅｒ標的の配列を決定するために使用する。
【００７１】
　最初に、“コア（ｃｏｒｅ）”プローブを同定する。このコア・プローブは、本発明に係るミスマッチ分析法を使用して標的内の配列に正確に相補的である。このコア・プローブは、以下の基準の中の１又は両方を使用して同定する：
　１．コア・プローブは、他のプローブよりも強い標的への結合アフィニティー、典型的には、（先の分析サイクル内でコア・プローブとして同定されていない）アレイ内のいずれかのプローブの最高の結合アフィニティーを示す。
【００７２】
　２．コア・プローブ配列に比較したとき、標的とミスマッチであるプローブは、以下により詳細に討議するような特徴的なパターンを示す。ここで、そのプローブの３’−と５’−末端においてミスマッチするプローブは、内部の位置においてミスマッチするプローブよりも強く結合する。この特定の実施例においては、選定基準＃１は、そのプローブが標的にハイブリダイズしたものとして示されている図６Ａ中に示すように、配列３’−ＹＹＸＹをもつ標的に最高の結合アフィニティーをもつコア４−ｍｅｒプローブを同定する。（標的の５’−ＸＸＹＸ位に一致する）プローブ３’−ＹＹＸＹは、それ故、‘‘コア”プローブとして選ばれる。
【００７３】
　選定基準＃２は、このコア・プローブが標的核酸に正確に相補的であることを確保するための“チェック（ｃｈｅｃｋ）”として使用される。この第２の選定基準は、そのコア・プローブと比較するとき１塩基ミスマッチをもつプローブのハイブリダイゼーション・データ（例えば、支持体上のプローブのアレイにハイブリダイズした標識された標的の蛍光強度、但し、他の技術も当業者によく知られている。）を評価する。この特定のケースにおいては、コア・プローブはＳ−３’−ＹＹＸＹとして選ばれた。このコア・プローブの１塩基ミスマッチ・プローブは：Ｓ−３’−ＸＹＸＹ，Ｓ−３’−ＹＸＸＹ，Ｓ−３’−ＹＹＹＹ、とＳ−３’−ＹＹＸＹである。これらの１塩基ミスマッチの結合アフィニティー特性は、“正しい（ｃｏｒｒｅｃｔ）”コアが選ばれたことを確かめ、又は類似の結合アフィニティーを示すプローブのセットの中からそのコア・プローブを選ぶために使用される。
【００７４】
　予想される結合アフィニティー対ミスマッチ位置の例示的、仮定的なプロットを図６Ｂにおいて提供する。これらの結合アフィニティー値（典型的には、プローブにハイブリダイズされた標識された標的の蛍光強度、但し、アフィニティーに関する多くの他の要因を使用することもできる。）は、このグラフの左手の位置上に１の値としてプロットされた、標的へのＳ−３’−ＹＹＸＹの結合アフィニティーに対して全て正規化される。たった２つのヌクレオチドが本例において含意されるので、１位（そのプローブの３’−末端におけるヌクレオチド）においてミスマッチするプローブについてプロットされた値は、Ｓ−３’−ＸＹＸＹの正規化された結合アフィニティーである。２位におけるミスマッチについてプロットされた値は、Ｓ−３’一ＹＸＸＹの正規化されたアフィニティーである、３位におけるミスマッチについてプロットされた値は、Ｓ−３’−ＹＹＹＹの正規化されたアフィニティーであり、そして４位におけるミスマッチについてプロットされた値は、Ｓ−３’−ＹＹＸＸの正規化されたアフィニティーである。上記のように、“アフィニティー（ａｆｆｉｎｉｔｙ）”は、例えば、標的上の蛍光マーカーからの光子カウントの数を含む、多くの方法において測定されることができる。
【００７５】
　全部で３つのミスマッチのアフィニティーは、この説明においてそのコアよりも低い。その上、アフィニティー・プロットは、そのプローブの３’−末端におけるミスマッチが、この特定のケースにおいてはプローブの５，−末端におけるミスマッチよりもより少ない影響力をもつことを示している、但し、これは、常にそうではない。さらに、このプロ一ブの末端におけるミスマノチは、このプローブの中央におけるミスマッチよりも少ない妨害をもたらす。図６Ｂ中において示すようにプロットされたとき“スマイル（ｓｍｉｌｅ）”形状のグラフをもたらすこれらの特徴は、“正しい”コア・プローブの選定後、又は、標的配列の他の部分に関してのコア・プローブであるミスマッチ・プローブを考慮した後の、１塩基ミスマッチのほとんどのプロットにおいて見られるであろう。この情報は、コア・プローブの最初の選定、又は正しくマッチしたコア・プローブが選ばれていることを確保するためのチェッキングのいずれかにおいて使用されることができるであろう。もちろん、特定の情報においては、先のセクションＢ中に述べたように、例えば、法延の又は遺伝子の研究、等において必要とされるコアの同定が、全てである。
【００７６】
　配列決定研究においては、この工程を次に、このコア・プローブの左及び／又は右伸長のために繰り返す。図６において説明する例においては、このコア・プローブの右伸長だけが可能である。このコア・プローブの可能性のある４−ｍｅｒ伸長プローブは３’−ＹＸＹＹと３’−ＹＸＹＸである。再び同一の選定基準を使用する。３’−ＹＸＹＹと３’−ＹＸＹＸの間では、３’−ＹＸＹＸが最も強い結合アフィニティーをもつであろうことが通常見い出されるであろうし、そしてこのプローブは、正しいプローブ伸長として選ばれる。この選定は、上記コア・プローブと比較するとき１塩基ミスマッチをもつプローブの正規化された結合アフィニティーを再びプロットすることにより確かめられることができる。推定プロットを図６Ｃに説明する。再び、特徴的な“スマイル”パターンが観察され、これは、“正しい”伸長、すなわち３’−ＹＸＹＸが選ばれていることを示している。この情報から、ある者は、標的の配列が５−ＸＸＹＸＹであると正しく結論付けるであろう。
実施例
　１．（Ａ＋Ｔ）８アレイと１塩基ミスマッチの安定性
　２０ステップの、４−レプリカ組合せ合成を、Ｍｅｎ　Ｐｏｃ−ｄＡとＭｅｎ　Ｐｏｃ−ｄＴを使用して行った。リトグラフ・マークを、１セットの２５６オクタヌクレオチドの各メンバーが１．２８×１．２８ｃｍアレイ上の４つの別々の位置内で合成され、１０２４の異なる合成部位であって、各々がオリゴヌクレオチド・プローブを含み、各々の部位がサイズ４００×４００μｍである部位を作り出すように選んだ。ｄＡアミンの合成とフェノキシアセチル脱保護の後、支持体を、サーモスタットで調節された染色及びフロー・セル内に置き、１５℃において１ｎＭ　５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡ−フルオロセインとインキュベートし、そして次にＺｅｉｓｓ蛍光外顕微鏡内で走査した。得られた蛍光画像を図７に示す。
【００７７】
　１塩基ミスマッチの関数としてのハイブリダイゼーション事件の蛍光強度を図８にグラフにより提供する。１塩基においてそのコア・プローブと異なる各オリゴヌクレオチド・プローブについての４つの独立した強度のそれぞれをプロットする。０位ミスマッチ（すなわち、完全な相補物３’−ＴＴＴＴＴＴＴＴ）は、〜９００カウントにおいてアレイ上に最も明るい位置であり；このアレイの背景シグナルは、約２２０カウントである。ミスマッチ１位（プローブの３’−末端）は、〜７６０カウントにおいて次に明るい。これに続く位置の“スマイル”又は“Ｕ”形曲線は、プローブ／標的複合体の各位置におけるミスマッチの相対的安定性を示している。この“ミスマッチ・ファミリー”は、プローブのアレイとの核酸の相互作用を特徴付け、そして標的配列の同定を提供し又は確かなものにする。３，４，５と６位におけるミスマッチは、より脱安定性であり、そして背景からは事実上区別されることができない強度を作り出す。１位におけるミスマッチ（オクタヌクレオチドの３’−末端が支持体につながれている点）は、８位における対応のミスマッチ（その遊離の５’−末端）よりもより脱安定性されていない。アレイ合成の均一性と標的ハイブリダイゼーションは、上記の４つの２連の合成部位の間の強度の低い変化を反映している。
【００７８】
　本発明に係る方法は、２以上のミスマッチをプローブとの標的ハイブリダイゼーションからの情報をも利用することができる。ミスマッチの対の関数としての蛍光強度を図９に表わす。このケースにおいては、強度データは、完全なマッチが強度１をもつように正規化された。例えば、インデックス１，８におけるデータは、そのプローブ／標的２本鎖の各末端におけるミスマッチに対応する。２項（インデックス１，１〜８，８）を、図８に説明した１ミスマッチに対応する。この最高強度は、プローブ／標的複合体の末端におけるミスマッチの１と対に対応する。
【００７９】
　２．（Ｇ＋Ｔ）８アレイと配列再構築
　Ｍｅｎ　Ｐｏｃ−ｄＧとＭｅｎ　Ｐｏｃ−ｄＴのオクタヌクレオチド・アレイを合成した。合成の形式は、先に討議した（Ａ＋Ｔ）８アレイのためのものと同様であり、そして４の反復（全部で１０２４）におけるＧとＴの２５６オクタヌクレオチドをもたらす。最終脱保護と温度制御された（１５℃）ハイブリダイゼーション・チャンバーヘの接続後、プローブ・アレイを１ｎＭ　５’−ＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣ−フルオレセイン標的とインキュベートし、そして走査した。得られた画像を図１０に与える。４つの明確であるが重複性の、完全に相補的なオクタヌクレオチド・ハイブリダイゼーションが予想される：３’−ＴＴＧＧＧＴＴＴ，ＴＧＧＧＴＴＴＧ，ＧＧＧＴＴＴＧＧ、とＧＧＴＴＴＧＧＧ。本明細書中に示すように、１塩基対のミスマッチをもつプローブ／標的複合体の中程度の安定性は、中程度のシグナルをもつプローブのファミリーを作り出す。図１０の多くの強度特性の粗略な検査は、複雑なパターンを現わした。
【００８０】
　本発明により提供される再構築された実践的研究（ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ）は、図１０における複雑なデータ・パターンを使用する。このアルゴリズムは、完全にマッチしたプローブ／標的複合体がより高い蛍光強度をもち、そして完全なマッチと関連の１塩基ミスマッチが典型的には図６に示すものと類似の特性を形成するという一般的な規則として推定される。
【００８１】
　最高の強度をもつプローブは、その標的への完全なマッチであるはずである。対応のミスマッチ曲線を図１１Ａ〜１１Ｃに示す。ある者は、そのプローブが標的に正確に相補的であることを確認するために最高強度をもつプローブ（このケースにおいてはＳ−３’−ＴＧＧＧＴＴＴＧ）についてのミスマッチ曲線を最初にプロットする。このプローブが標的の断片に相補的であると仮定して、我々は、その標的の３’−末端上に１塩基の“伸長”を考える。この場合、２つのプローブの選択がある。２つの８−ｍｅｒ　プローブＳ−３’−ＧＧＧＴＴＴＧＴとＳ−３’−ＧＧＧＴＴＴＧＧの中の１は、標的核酸に正確に相補的であろう。これらの２つのプローブのそれぞれについての並びにプローブＳ−３’−ＴＧＧＧＴＴＴＧについてのミスマッチ曲線を図１１Ａに強度値により示す。プローブＳ−３’−ＴＧＧＧＴＴＴＧがプローブＳ−３’−ＴＧＧＧＴＴＴＧのもの（典型的な“スマイル”プロット）と最も近似したミスマッチ曲線をもつということに注目のこと。それ故、ある者は、正しい伸長プローブがＳ−３’−ＧＧＧＴＴＴＧＧであると結論付けるであろう。
【００８２】
　図１１Ｂは、標的配列の３’−末端を評価するための本工程の反復を示す。プローブＳ−３−ＧＧＴＴＴＧＧはコアＳ−３’−ＧＧＧＴＴＴＧＧに最も近似したスマイル形のミスマッチ曲線をもち、そしてプローブＳ−３’−ＧＧＴＴＴＧＧＴはそうではないので、ある者は、プローブＳ−３’−ＧＧＧＴＴＴＧＧが正しい伸長プローブであると正しく結論付けるであろう。この工程は、曲線が正しい形をもつまでか、又は標的の“末端”に到達していることを示す。絶対強度が最高強度のものよりもかなり下廻るまでのいずれかまで、繰り返されることができる。同様の方法は、５’−末端に伸長する標的の配列を提供する。図１１Ｃは、完全にマッチしたプローブの全てのミスマッチ曲線を示しており；各曲線は、この標的について予測された無矛盾の形状をもつ。
【００８３】
　上記技術は、もちろん、図１２Ａ〜１２Ｄの各パネルにおいて説明するように、いずれかの長さの核酸に容易に延長されることができる。図１２Ａにおいて示すように、１０−ｍｅｒ標的が配列決定されるであろうし、そしてその配列は、５’−Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｎ７Ｎ８Ｎ９Ｎ１０−３’｛ここで、Ｎはいずれかのヌクレオチド又は核酸モノマーであり、そして下付き添字はそのプローブ内のヌクレオチド位置を示し、３はその３’−末端モノマーであることを示す。｝により示される。当業者は、プローブが支持体に付着された５’−末端をもって合成された場合、本発明に係る方法が、適当な修飾をもって適用されることができることを理解する。
【００８４】
　より短いオリゴヌクレオチドのアレイを、本発明の１の態様に従ってより大きなヌクレオチドを配列決定するために使用することができる。図１２Ａ〜１２Ｄに示す特定の例においては、４−ｍｅｒ（長さ４モノマーのオリゴヌクレオチド・プローブ）を未知の１０−ｍｅｒ標的を配列決定するために使用する。実際には、より長いプローブと標的が典型的には使用されるが、この例示的な例は、本発明の理解を容易にする。４−ｍｅｒアレイの１のメンバーは図１２Ａに示され、そして配列Ｓ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６｛ここで、各Ｐ（プローブ）ヌクレオチドは、その用途に依存してＡ，Ｔ，Ｃ，Ｕ，Ｇと他のモノマーからなる群がら選ばれ、そしてその添字は、標的に対する位置を示す。｝をもつ。討議目的のために、このハイブリダイゼーション・データは１のアレイから入手されることができると推定される。しかしながら、ある者は、本法を実施するために、多数のアレイ、異なる時において合成されたアレイ、又はさらに個々のプローブを使用することができる。上述のように、４の長さのプローブを討議を容易にするために選ばれ；実際には、より長いプローブが典型的には使用されるであろう。
【００８５】
　Ｓ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６は、標的への強い結合アフィニティーと正しいミスマッチ特性をそれが示すために、そのアレイからのコア・プローブとして選ばれる。全４−ｍｅｒのアレイにおいて、配列Ｓ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６がそのコア配列として選ばれる。なぜなら、フルオレセイン標識された標的（図１２Ａ中５’−Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｎ７Ｎ８Ｎ９Ｎ１０−３’として示す）が支持体に晒されるとき、その標的が図１２Ａに示す矢印により示されるように、そのプローブにハイブリダイズし、そして高い蛍光強度（すなわち、多数の光子カウント）がその支持体の他の部分と比較するとき、プローブＳ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６を含む支持体の部分内で観察されるからである。通常、最も強い結合アフィニティーを示す配列が第１コア配列として選ばれるであろう。
【００８６】
　ある者は、好ましくは、最初に選ばれたコア配列が、１塩基においてコア・プローブと異なるアレイ内のプローブの蛍光強度を調べることにより標的に完全に相補的であるかどうか確認する。図１２Ｂは、１塩基ミスマッチの相対強度対Ｓ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６コア・プローブについてのミスマッチの位置の典型的なプロットを定量的に説明する。簡単な例としてＳ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６においてヌクレオチドＣが存在しないと仮定する。図１２Ｂは、配列Ｓ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６内へのＣの置換によりそのコア配列プローブと異なるプローブの正規化された蛍光強度を定性的に説明しており、そして、ここで、Ｃ一含有ミスマッチ・プローブのいずれも標的内の他の配列に正確に相補的ではない。従って、図１２Ｂは、それらが標的とハイブリダイズされるとき、そのコア・プローブに正規化された、以下のプローブ・セット
　　　　　　　Ｓ−３’−ＣＰ４Ｐ５Ｐ６，
　　　　　　　Ｓ−３’−Ｐ３ＣＰ５Ｐ６，
　　　　　　　Ｓ−３’−Ｐ３Ｐ４ＣＰ６、及び
　　　　　　　Ｓ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｃ
の相対的蛍光強度をプロットする。他の態様においては、平均曲線が、各位置における可能性のあるヌクレオチドの全ての置換（ミスマッチ・プローブの“ファミリー”）についてプロットされ、又は最も高い強度が各位置についてプロットされる。従って、図１２ＢにおけるグラフのＸ軸上の０位は、置換がないことを表し、そしてコア・プローブＳ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６への標的ハイブリダイゼーションのための蛍光強度を示す。図１２Ｂ中の全ての値がこの値に関して正規化されているので、“置換無し”のケースは、１の正規化強度をもつ。Ｃが３，４，５と６位において置換されるとき、その相対強度値は、通常、小さい。なぜなら、これらの配列のいずれも本例においては標的に正確に相補的でないからである。
【００８７】
　３’−又は５’−末端においてミスマッチをもつプローブ／標的複合体の相対蛍光強度が、プローブ／標的複合体の中央においてミスマッチをもつ複合体よりも典型的には高い。なぜなら、このプローブの末端におけるミスマッチは、プローブ／標的複合体の中央におけるミスマッチよりもより少なく脱安定化される傾向をもつからである。このプローブの３’−末端にミスマッチをもつプローブ／標的複合体は、推定するに、この態様においては支持体表面へのそのプローブの３’−末端の近接のために、そのプローブの５’−末端におけるミスマッチをもつものよりもより少なく影響を及ぼす（そしてそれ故、より高い蛍光強度をもつ）ことができる。それ故、結合アフィニティーに関する正規化係数対ミスマッチ位置をプロットする曲線は、図１２Ｂ中に示すような“ゆがんだスマイル（ｃｒｏｏｋｅｄ　ｓｍｉｌｅ）”の形をもつ傾向がある。
【００８８】
　この方法論を使用して、ある者は、そのコア・プローブと同一の配列であるが一端において伸長しており、そして場合により他端においてより短いものをもつアレイ上のプローブを調べることによりそのコア配列を延長することができる。これらのプローブは、標的に完全にハイブリダイズする。プローブを決定するための第２のコア・配列として評価されることができる。この工程の繰返しにより、ある者は、その標的のヌクレオチド配列の全体を決定することができる。
【００８９】
　本法を説明するために、図１２Ｃは、コア・プローブＳ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６の４つの可能性のある４−員“左伸長”を示す。図示するように、Ｓ−３’−Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６に相補的な標的の配列に隣接するヌクレオチドはＡ，Ｔ，Ｃ、又はＧのいずれかであり、又はその標的上に隣接するヌクレオチドは全く存在しない（すなわち、Ｐ３は標的の５’−末端である。）。それ故、Ｐ３Ｐ４Ｐ５Ｐ６コア・プローブの可能性のある左伸長は、プローブＳ−３’−ＡＰ３Ｐ４Ｐ５，Ｓ−３’−ＴＰ３Ｐ４Ｐ５，Ｓ−３’−ＣＰ３Ｐ４Ｐ５、とＳ−３’−ＧＰ３Ｐ４Ｐ５である。この説明の目的のために、Ｔが実際に“正しい”ものであると推定される。なぜならＡは、その標的核酸の相補位置内にあるからである。
【００９０】
　図１２Ｄにおける上左のプロットは、Ｓ−３’−ＡＰ３Ｐ４Ｐ５プローブのミスマッチ特性について予想されるハイブリダイゼーション・データを説明する。全てのデータがＳ−３’−ＡＰ３Ｐ４Ｐ５に対して正規化されている。２−５位の各々における置換の全てについてのデータ点を示すが、各々の位置における３つの値についての平均データも使用されることができるであろうし、各の位置における１の置換を使用することができ、３つの値の最高のものを利用してもよく、又はいくつかの他の組合せでもよい。Ｓ−３’−ＡＰ３Ｐ４Ｐ５グラフにおいて示されるように、１の点は残りのものよりもかなり高い結合アフィニティーを示す。これは、２位におけるＡについてのＴ置換である。ＡＰ３Ｐ４Ｐ５グラフ内の残りのデータは、図１２Ｂ中に示す通常の“スマイル”特徴をもつ。同様のプロットが図１２Ｂの底部分において示されたＣとＧ置換について顕出された。それぞれのケースにおいては、全データ点は、そのグラフ内の推定“コア”プローブに対して正規化されている。
【００９１】
　図１２Ｄの上右部分において示されるＴ伸長グラフは、３’−ＡＰ３Ｐ４Ｐ５グラフその他のような異常曲線をもたないであろう。なぜなら、３’−ＴＰ３Ｐ４Ｐ５プローブの２位におけるモノ置換のいずれも標的に正確に相補的であるであろうからである。従って、２位におけるＡ，Ｃ、とＧの置換は全て、標的に対して１塩基ミスマッチをもつプローブについて予想される特徴的な“スマイル”プロットを作り出す。さらに、Ｔ置換プローブ／標的複合体の蛍光強度は、Ｃ，Ｇ、とＡプローブ／標的複合体の蛍光強度よりも通常高いであろう。これらのデータは、各種組合せにおいてどの伸長が“正しい”かどうかを、そしてそれによりその標的核酸の配列を決定するために、使用されることができる。
【００９２】
　図１２Ａ〜１２Ｄ中に示されたデータから、ある者は、コア・プローブに相補的な配列に対してその標的の左伸長物に正確に相補的なプローブが、その標的内の２位においてＡモノマーをもつと結論付ける。
【００９３】
　この工程は、グラフのいずれも適当な特徴をもたなくなるまで繰り返され、この時に、標的の末端に達している。同様に、右伸長が、その標的の末端（又は着目の配列の末端）に達するまで評価される。
【００９４】
　上記技術は、明らかに、ハイブリダイゼーション・データのマニュアル観察を通して行うことができる。しかしながら、好ましい態様においては、データは、１以上の適切にプログラムされたデジタル・コンピューターを使用して分析される。例示のシステムを、図１３中に説明する。図中に示すように、このシステムは、ＣＰＵの制御下でオペレートされ、そしてメモリー（３０４）、例えばハード・ディスク、とメモリー（３０６）、例えばダイナミック・ランダム・アクセス・メモリー（ｄｙｎａｍｉｃ　ｒａｎｄｏｍ　ａｃｃｅｓｓ　ｍｅｍｏｒｙ）を含む１又は複数のコンピューターを含む。このコンピューターは、支持体（２）の部分にカップリングされた標識された標的ヌクレオチドからの蛍光強度又は他の関連情報を測定するスキャニング装置（３０８）を制御するために使用される。
【００９５】
　この支持体（２）は、その上に既知の位置において既知配列のプローブ・ヌクレオチドを含む。ユーザーは、インプット装置（３１３）を介してインプットを提供する。
【００９６】
　蛍光強度又は他の関連情報は、メモリー（３０４／３０６〉内に保存される。ＣＰＵ（３１０）は、その蛍光データを処理して、プリント装置（３１２）又はディスプレイ（３１４）の１又は両方にアウトプットを提供する。本明細書中に記載する方法に従ってデータを処理し、そして先に示したようなグラフの形態における、又は核酸モノマーの配列における、又は単純な（＋）／（−）アウトプットにおけるアウトプット又はこのようなデータの分析の他の結果を得ることができる。好適なコンピューターは、例えば、ＩＢＭ　ＰＣ又は互換性ＳＰＡＲＣワークステーション、又は同様の装置を含む。
【００９７】
　図１４は、ｎ−ｍｅｒｓのアレイを評価するための、そして（ミスマッチ分析のための）正確に相補的な配列又は（配列決定又は他の目的のための）より大きなｋ−ｍｅｒを同定するための、典型的なコンピューター・プログラムのためのフローチャートである。図中に示すように、システムは最初に、例えば、プローブのいくつかの特定のセットの最も高い結合アフィニティーをもつプローブを選ぶことによりステップ（４０２）においてコア・プローブを同定する。本法は、しばしば、反復工程においてオペレーション可能であろう。ここでアレイ内の最も高いアフィニティーのプローブは、第１反復（ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）後に選ばれず、そして他の場合においては、例えば、１，２，３、又はそれ以上の最高結合プローブを選び、そして各々について左と右の伸長を行い、そして次にこの情報を保存し、そして最終的なアウトプットを提供する前に他のデータとこの情報を比較することが価値のあることである。これらの結果は、正しい配列の確認において援助することができる。
【００９８】
　ステップ（４０４）において、このシステムは、コアｎ−ｍｅｒの左伸長の全てを同定する。ステップ（４０６）において、本システムは：
　−どの左伸長物がプリセットされたモノマー置換パターンと最も無矛盾である挙動を示すかを決定し、そして／又は
　−その最高の結合アフィニティーを示す左伸長を選択する、
の１又は両方により、適切な左伸長選定する。
【００９９】
　上記選択基準その他は、いくつかの態様において、ＡＮＤ法において使用されることができる。すなわち、これらの基準の両方が適合し、又はこのシステムは、１が末端モノマーに達したか又はそのシステムが許容可能な状態で行われないかのいずれかを仮定する。他の態様においては、上記基準の中の１が、主な選択機構として選ばれることができ、そして他のものが、注意、すなわち、可能性のある誤った選定、又は他の選定をユーザーに提供するために使用されることができる。
【０１００】
　その後、本システムは、選定基準がステップ４０８においていくつかの最小標準に適合したかどうかを決定する。そうでない場合、本システムは、その配列の末端がステップ（４１０）に達したと仮定する。この選定基準が適合する場合、先のコアからの正しい伸長物として選ばれた新たな“コア”によりステップ（４０４）の始めに戻される。
【０１０１】
　その後、本工程は、右伸長について有効に繰り返される。ステップ（４１２）において右伸長が同定される。ステップ（４１４）において、プリセットされたミスマッチ特性のプローブ及び／又は高アフィニティー右伸長物が同定される。ステップ（４１６）において、本システムは、この分子の末端に達しているかどうかを決定する。そうでない場合、この工程はステップ（４１２）に戻される。そうである場合、その分子は配列決定されていると仮定し、そしてこの工程は、プリンター又は他のアウトプット装置への適当なアウトプットをもって終了される。
【０１０２】
　ミスマッチ分析の使用方法の他の態様を、図１５ａ中に例示する。この図は、未知の標的断片の配列を決定するためにデザインされた典型的なコンピューター・プログラムのためのフローチャートを表す。このような方法は通常、適当にプログラムされたデジタル・コンピューター、例えばＩＢＭ　ＰＣ又は同等なもの、Ｓｕｎワークステーション、あるいは他の類似のコンピューター・システムにおいて行われるであろう。ステップ（５０２）に示すように、ハイブリダイゼーション・データ（例えば、上記のような蛍光強度、但し当業者によく知られた他の技術を通じて得られた他のデータも使用することができる。）をこのシステムに入れる。いくつかの態様においては、このデータは実験システムから直接的にインプットされることができ、一方、その他においては、これらのデータは、別個のシステムにおいて採取されることができる。ステップ（５０４）において、このシステムは、このデータ・セット内の“最良”データに対応するプローブ配列を選択する。蛍光強度データを使用する態様においては、この最良データは、最高強度レベルを示すようなプローブに典型的には対応するであろう。このデータ・セットの不履行パーセンテージが使用されることができ、又は場合により、オペレーターは、そのデータ・セットのサイズ、そのシステムの計算能力、及びそのデータ・セットのサイズのような要因に基づいて選ばれたパーセンテージにより、最強強度データの特定パーセンテージを選ぶためにそのシステムに指令する。ステップ（５０６）においては、このシステムは、ステップ（５０４）において選ばれたプローブ配列の組合せを通じて誘導されることができる特定長さの全断片のセットを同定する。このように同定された断片を“候補”断片という。
【０１０３】
　ステップ（５０８）においては、このシステムは、核酸プローブから測定されたハイブリダイゼーション・データを使用して、上記セット内の各候補断片についての完全にマッチしたプローブについて先に記載されたようなミスマッチ分析アフィニティー・プロットを構築する。ステップ（５１０）においては、各アフィニティー・プロットは、それが、その標的ＤＮＡの他の部分とのそのプローブの交差ハイブリダイゼーションについて考慮した後アフィニティー・プロットの予測された形状にどのくらいよく一致するかを反映するように格付けされる。
【０１０４】
　この格付けステップ（５１０）が一旦終了すると、このプログラムは、各候補断片（ステップ５１２）についてのすべてのアフィニティー・プロットからの等級を合計し、そしてステップ（５１４）において次の候補断片を検査するために前進する。ステップ（５１６）において、全候補断片が検査されたとき、このシステムは、個々の候補断片についての合計されたアフィニティー・プロット等級を比較する。最後に、ステップ（５１８）において、このシステムは、それについて、その等級がその鋳型との最も近い全体的なマッチを示すところの候補断片（単数又は複数）を選択する。この候補断片の配列は、未知の標的断片の配列に対応する。
【０１０５】
　図１５ｂは、アフィニティー・プロットを格付けするための１の好ましい態様についてのフローチャートである。最初に、予想、された結合アフィニティー対ミスマッチ位置（“鋳型”）の所定プロットをシステムにエンターする（ステップ６０２）。典型的には、この鋳型は上記のような“スマイル”形を示すであろう。ステップ（６０４）においては、このシステムは、ステップ６０６〜６２０において特定されるようにその鋳型と各アフィニティー・プロットを比較する。ステップ（６０６）と（６０８）においては、このシステムは、その鋳型内の対応ミスマッチ位置の値と各ミスマッチ位置についてのアフィニティー値を比較する。ステップ（６１０）においては、このアフィニティー値を、最初に、測定された値が鋳型の値の選ばれた間隔内にあるかどうかを決定するために検査される。いくつかの態様においては、この間隔は、不履行レベルにセットされ；その他においては、それは、その実験誤差の予想される大きさのような要因に基づいて、オペレーターにより選ばれる。
【０１０６】
　所定のミスマッチ位置における値がその間隔内にある場合、ステップ（６１２）において、このシステムは、完全候補断片とミスマッチを含む塩基配列（“ミスマッチ配列”）を比較する。ステップ（６１４）において、このプロセスは、そのミスマッチ配列と上記候補断片のいずれかの部分との間の完全なマッチが存在するかどうかを決定する。このようなマッチが見つかった場合、このシステムは、そのプロットのその等級付けからそのミスマッチ位置を除外し（ステップ６１６）、そしてステップ（６２０）に続く；その他の場合、その位置は、その後の計算における包含のためにマークされる（６１８）。ステップ（６２０）において、この処理は、各ミスマッチ位置が検査されるまで続けられる。鋳型値と実験値のフィットは次に、ステップ（６１８）における包含のためにマークされた各ミスマッチ位置についてのステップ（６２２）の計算において決定される。いくつかの態様においては、この計算は、その間隔内又はその間隔の外側のいずれかとして各点を等級付けすることを含むことができ、その他の態様は、それによりそれぞれの含まれた位置がその予想された値からのその逸脱を反映するように等級付けされるような方法であって、根−平均−二乗（Ｒｏｏｔ−Ｍｅａｎ−Ｓｑｕａｒｅｓ）分析としてよく知られるような技術を含むものを利用する。最後に、このシステムは、ステップ（６２４）において各アフィニティー・プロットについて全等級を計算する。
実施例
　８−ｍｅｒ　プローブのアレイを、Ｐｉｒｒｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．に付与された米国特許第５，１４３，８５４号と米国出願逐次番号第０７／８０５，７２７号（両方を全目的をもって引用により本明細書中に取り込む）中に記載された方法に従って構築した。このアレイを１６−６ｍｅｒ標的とインキュベートし、そして公知の方法を使用して蛍光強度について走査した（例えば、引用により全目的をもって本明細書中に取り込む、米国出願逐次番号第０８／１９５，８８９号を参照のこと。）。得られた蛍光強度データを、これまでの方法に従って分析した、アフィニティー・プロットを作り、そして等級付けした後、６９−７１のレンジにある等級をもつ４つの候補断片：５’−ＡＧＴＴＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＧＴ，ＴＧＴＴＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＧＴ，ＧＧＴＴＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＧＴ、とＣＧＴＴＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＧＴを同定した。この４つの類似の断片は、その断片の５’末端における塩基の同一性においてのみ異なり、それは、他の位置の受ける２本鎖分析の利益を受けない。他の候補断片についての等級からのこれらの４つの候補についての等級の分離は実質的であり；次に高い等級の候補が５４の等級を受け取った。
【０１０７】
　さらに他の本発明の態様においては、先に討議したアレイを、以下の方法により未知の標的の断片の配列を同定するために使用することができる。
【０１０８】
　長さ“ｎ”のプローブからのハイブリダイゼーション・データのセット（ここで、“ｎ”は、プローブ内の塩基の数に等しく、そして未知の標的断片の長さ末端である。）を、適当にプログラムされたコンピューター・システムにエンターする。本明細書中に企図されたハイブリダイゼーション・データ・セットは、先に記載されたような蛍光強度データのセット、並びに当業者に知られた他の技術を通じて得られたデータのセットを含む。このシステムは、（Ｈａｒａｒｙ，Ｆ．，Ｇｒａｐｈ　Ｔｈｅｏｒｙ，Ａｄｄｉｔｉｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＭＡ（１９６９）及びＡｈｕｊａ，Ｒ．Ｋ．，Ｍａｇｎａｎｔｉ，Ｔ．Ｌ．，Ｏｒｌｉｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｎｅｔｗｏｒｋ　Ｆｌｏｗｓ，Ｔｈｏｏｒｙ，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ　Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９３）、（両方を全目的をもって本明細書中に取り込む。）中に記載されたような）指定グラフを構築した、ここで、頂点（ｖｅｒｔｉｃｅｓ）（又は“節点（ｎｏｄｅｓ）”）は、上記データ・セットの全（ｎ−１）−ｍｅｒｓに対応する塩基配列であり、そしてその端は、そのセットの全ｎ−ｍｅｒｓに対応する塩基配列である。各端は、その端が最初に含まれた（ｎ−１）−ｍｅｒから終りに含まれた（ｎ−１）−ｍｅｒまで接続するように構築される。標的ｋ−ｍｅｒがＡＣＴＧＴＴＧとして知られており、そしてｎ−ｍｅｒｓが３−ｍｅｒｓである上記のような指定グラフのサンプルは、図１６として包含される。図１６においては、３−ｍｅｒ配列に対応する端だけが含まれ；その標的塩基配列が知られていない典型的な場合においては、このシステムは、その分析においてｎ−ｍｅｒ節点に接続する全ての可能性のある端を含むであろう。
【０１０９】
　さらに、このシステムは、（ｎ−１）−ｍｅｒ節点のいずれとも異なる、指定グラフ内のソース節点、並びにそのソース節点からそのグラフ内の（ｎ−１）−ｍｅｒ節点のそれぞれまでの端を作り出す。最終的にこのシステムは、先に作り出された節点のいずれとも異なる、グラフ内の沈み節点（ｓｉｎｋ　ｎｏｄｅｓ）、並びにそのグラフの（ｎ−１）−ｍｅｒ節点の各々からその沈み節点までの端を作り出す。
【０１１０】
　本システムは次に上記グラフの端のそれぞれに値を“コスト（ｃｏｓｔ）”を指定する。出願節点からの端先導（ｅｄｇｅｓ　ｌｅａｄｉｎｇ）と沈み節点までの端先導は全てゼロのコストと指定される。他の全ての端は、その端に対応する塩基配列が標的ｋ−ｍｅｒ内のセグメントの完全マッチである確率の関数としてのコストを指定される。この確率を、“完全マッチの確率（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｐｅｒｆｅｃｔ　ｍａｔｃｈ）”という。好ましい態様においては、各ｎ−ｍｅｒ端に指定されたコストは、その端に対応する配列が完全にマッチしない確率により除された、その端に対応する配列がその標的断片内のセグメントの完全マッチである確率の自然対数の負に等しい。いくつかの態様においては、これらの端は、別々の、追加の値“キャパシティー（ｃａｐａｃｉｔｙ）”を指定されることができ；このような態様については、出発節点から他の節の各々までの端先導、並びに沈み節点までの端先導は、全て１のキャパシティーを指定され；このグラフの他の全ての端は、無限キャパシティーを指定される。
【０１１１】
　出発節点から始まり、そしてその指定端に沿って続き、多くの経路がそのグラフを通じてトレースされることができ、沈み節点に終わり、それが、標的断片の配列におそらく対応することができる。このグラフの各々端がコストを指定されているので、これらの経路の各々についての全コストを決定することができる。この方法の最終段階においては、このシステムは、出発節点に始まり、そして沈み節点において終り、グラフを通してのそれぞれの可能性のある経路についてのこの全コストを決定するためにこのグラフにアルゴリズムを適用する。この段階における使用についてもくろまれるアルゴリズムは、当業者によく知られた最小コスト／最大フロー・プログラミング・アルゴリズム、例えば、引用により本目的をもって本明細書中に取り込まれるＡｈｕｊａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｔｗｏｒｋ　Ｆｌｏｗｓ，Ｔｈｅｏｒｙ，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ　Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９９３）、中に記載されるものを含む。このようなアルゴリズムを使用して、このシステムは、それについて完全マッチの最高の組合せの確率が存在する合計コストをもつ経路を選び出す。例えば、最小コスト／最大フロー・アルゴリズムを使用する態様においては、完全マッチの最大確率をもつ経路は、最小コストをもつ経路に対応する。それ故、この経路に関連する塩基の配列は、その標的についての最も類似する配列に対応する。
【０１１２】
　好ましい態様においては、個々のプローブについての完全マッチの確率は、以下のように蛍光ハイブリダイゼーション・データから決定される。選ばれたアレイの各々のプローブについて、一連の関連プローブについてのハイブリダイゼーション・データがこのシステムにエンターされ；着目のプローブに関連するプローブの強度のパターンを次に、上記のミスマッチ分析を使用して公知の標的配列とのマッチについて分析する。この段階により考慮される関連プローブのセットは、典型的には、利用可能なデータ・セットのサイズと計算キャパシティーのような要因に基づいてオペレーターにより選ばれるような、１以上の塩基のミスマッチをもつようなプローブを含む。このセットに含まれるデータは、典型的には、そのプローブの強度と塩基組成を含み、そして場合により、そのプローブがその標的内のどこかと完全マッチになることを引き起こすであろう塩基置換に関するデータ（“クロストーク（ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）”）を含むであろう、好ましくは、これらのデータは、標的として既知のＤＮＡ配列を使用した大シリーズの実験のために集められるであろうし；異なる実験からの投入データを次に神経ネットワーク（Ｎｅｕｒａｌ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）、又は（例えば、Ｒｉｃｈ，Ｅ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ｋ．Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｉｎｔｅｌｌｉｎｇｅｎｃｅ，２ｎｄ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９１）、これを全目的をもって本明細書中に取り込む、中に記載されているような）他のよく知られた学習に基づく分類法を通じて分析して、プローブが強度、塩基組成、及び場合によりクロストークの関数として完全マッチであるかどうかを予測するためのアルゴサズムを開発することができる。このような予測の信頼レベルは、このアルゴリズム内で推定されることができ；この信頼レベルは、コスト値を上記指定グラフの端に指定することにおいて使用される完全マッチの確率に対応する。
Ｄ．適用
　本明細書中に記載する技術は、特に、標的核酸が特定のヌクレオチド配列又は既知配列と異なるいくつかの他の配列をもつかどうかを決定することが望まれる場合に、広いレンジの適用をもつであろう。例えば、本明細書中の本発明の１の適用は、突然変異検出に見い出される。これらの技術は、診断、法廷、生体分析論、その他を含む多種多様な分野に適用されることができる。
【０１１３】
　例えば、“野生型”の核酸が配列５’−Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４｛ここで、再びＮは、モノマー、例えば核酸中のヌクレオチドを表し、そして添字は位置番号を表す。｝をもつと仮定する。標的核酸が、それが５’−ＮｌＮ２Ｎ３Ｎ４と同一であるかどうか又はそれがこの配列と異なり、そしてそれが突然変異又は突然変異体配列を含むかどうかを決定するように評価されると仮定する。この標的核酸は、先に討議したように、典型的にはより短いプローブのアレイに最初に晒される。その後、１以上の“コア”配列が同定され、その各々が、その標的が突然変異配列又は突然変異を含まない場合、その標的に高い結合アフィニティーをもつと予想されるであろう。この特定の例においては、高い結合アフィニティーを示すと予想されるであろう１のプローブは、３−ｍｅｒアレイが使用されると仮定して、５’−Ｎ１Ｎ２Ｎ３（３’−Ｐ１Ｐ２Ｐ３）に相補的であるであろう。再び、このプローブ及び／又は標的がより長い核酸分子の一部であることができると認められるであろう。
【０１１４】
　最初のスクリーリング・ツールとして、３’一Ｐ１Ｐ２Ｐ３プローブヘの標的の絶対結合アフィニティーがその標的の最初の３つの位置が予想された配列をもつかどうかを決定するために使用されるであろう。５’−ＮｌＮ２Ｎ３への相補性がその標的への強い結合を示さない場合、その標的が野生型をもたないということが適切に結論付けられることができる。
【０１１５】
　１塩基ミスマッチ特性も、標的が突然変異体又は野生型配列を含むかどうかを決定するために本発明に従って使用されることができる。図１７Ａと１７Ｂは、野生型（図１７Ａ）と突然変異体（図１７Ｂ）である標的から生じる典型的な例示プロットを説明する。図示するように、野生型標的のための１塩基ミスマッチは、一般的には、典型的な、スマイル形のプロットに従う。これに反し、標的が特定の位置において突然変異をもつとき、特定コア・プローブヘの標的の絶対結合アフィニティーが小さいであろうばかりでなく、その１塩基ミスマッチ特定が予想される挙動から逸脱するであろう。
【０１１６】
　本発明の１の態様に従って、核酸の選択された群をもつ支持体（他には、核酸の“ライブラリー”と本明細書中にいう。）を、特定の核酸が野生型又は他の予想された核酸と同一であるか又は異なるかどうかの決定において使用される。核酸のライブラリーは、通常、プローブのアレイ又は“プローブ・アレイ”として提供されるであろう。このようなプローブ・アレイは、好ましくは、プローブの同一性がその支持体上のその位置によって決定されるような単一支持体上で形成される。場合により、このような支持体は、その標的のヌクレオチドが野生型と同一であるかどうかを決定するだけではなく、その標的に関する配列情報をも提供するであろう。このような支持体は、上述の分野、例えば、法延、診断、その他における用途を見い出されるであろう、単に特定の例により、本発明は、鎌状赤血球貧血に関連する診断、多数のＰ−５３突然変異のいずれかの検出、多数の嚢胞性線維症突然変異のいずれかのために、高く多形のＨＬＡクラス１又はクラス２遺伝子（特にクラス２ＤＰ，ＤＱとＤＲベータ遺伝子）に関連するいずれかの特定変異体配列のために、並びに遺伝子疾患、遺伝子素因、及び遺伝子評価に関連する多くの他の配列のために、使用されることができる。
【０１１７】
　支持体がこのような用途において使用されるとき、その支持体上に特定の長さの可能性のある核酸の全てを提供することは必要でない。実際、本発明を使用して可能性のある配列の全ての比較的小さなサブセットだけを提供することが必要であろう。例えば、標的核酸が特に着目の５−塩基配列を含んで成り、そしてある者がその５−塩基配列内の１置換を検出するために使用されることができる支持体を開発することを欲すると想定する。本発明の１の態様に従って、支持体を、５塩基配列の１塩基ミスマッチ・プローブの全て又はほとんどと一緒に、その表面上に形成された予想５塩基配列により形成されるであろう。従って、支持体上に全ての可能性のある５塩基配列を含むことは必要でないであろう。但し、より大きなアレイがしばしば好ましいであろう。典型的には、本発明に従う支持体上の核酸プローブの長さは、約５と１００塩基の間、約５と５０塩基の間、約８と３０塩基の間、又は約８と１５塩基の間であろう。
【０１１８】
　特定の長さの全ての可能性のあるプローブの中での１塩基ミスマッチ・プローブの選択により、支持体上のプローブの数がかなり制限されることができる。例えば、３塩基配列においては、６９の可能性のあるＤＮＡ塩基配列が存在するが、予想された配列に正確に相補的なたった１のものと９つの可能性のある１塩基ミスマッチ・プローブが存在するであろう。これらのプローブだけを選ぶことにより、スクリーニングに必要な多様性が減少されるであろう。好ましくは、必ずしもそうではないが、このような１塩基ミスマッチ・プローブの全てが１の支持体上で合成される。支持体はその１塩基ミスマッチに加えて着目の他のプローブを含むようにしばしば形成されるけれども、このような支持体は通常、ｎ−塩基の可能性のあるプローブの全ての５０％未満、しばしば、ｎ−塩基の可能性のあるプＰ一ブの全ての２０％未満、ｎ−塩基の可能性のあるプローブの１０％未満、そしてしばしばｎ−塩基の可能性のあるプローブの５％未満をもつであろう。
【０１１９】
　核酸プローブは、しばしば、特定の遺伝子配列の分析のためのキットにおいて提供されるであろう。１の態様に従えば、このキットは、着目の標的核酸に相補的なプローブを含むであろう。さらに、キットは、標的の１塩基ミスマッチを含むであろう。このキットは通常、このようなプローブの１以上のＣ，Ｇ，Ｔ，Ａ及び／又はＵの１塩基ミスマッチを含むであろう。このようなキットは、しばしば、本明細書中の教示に従って特定の核酸サンプルの配列の決定において、相補的プローブと１塩基ミスマッチの使用のための適当な指示を提供されるであろう。本発明の１の態様に従って、本キットは、１塩基ミスマッチだけと共々に、その標的に対する相補的を提供する。このようなキットは、しばしば、それが特定の遺伝子の特徴を示すかどうかを決定するための遺伝子材料の適当なサンプルの評価において使用されるであろう。このようなキットは、鎌状赤血球貧血の検出、多数のＰ−５３突然変異の中のいずれかの検出、多数の嚢胞性線維症突然変異の検出、高く多形のＨＬＡクラス１又はクラス２遺伝子（特にクラス２ＤＰ，ＤＱ及びＤＲベータ遺伝子）に関連した特定の変異体配列の検出、並びに遺伝子疾患、遺伝子素因、及び遺伝子評価に関連した他の多くの配列の検出における、上述のようなサンプルの評価において使用されることができる。
【０１２０】
　従って、本発明に従って選ばれるプローブをもつ支持体は、多くの突然変異の検出並びに他の働きを行うことができるであろうが、このような働きを行うために限定された数のプローブだけを必要とするであろう。
実施例
　１．（Ｇ＋Ｔ）８アレイと示差配列決定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
　（Ｇ＋Ｔ）８アレイを調製し、そして（５’−ＡＡＣＣＣＡＡＡ　ＣＣＣと比べたとき突然変異体配列を表す）１ｎＭ　
【０１２１】
【数３】
2004105189.tif 000004
と共にインキュベートし、そしてその配列が“野生型”又は“突然変異体”であるかどうかをテストするために走査した。得られた画像を図１８に与える。４つの重複した、正確に相補性のオクタヌクレオチド・プローブ／標的ハイブリダイゼーションが、ある者が、その標的がプローブ；Ｓ−３’−ＴＴＧＧＧＴＴＧ，ＴＧＧＧＴＴＧＧ，ＧＧＧＴＴＧＧＧ、とＧＧＴＴＧＧＧＧにより５’−ＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣでなければならないと仮定する場合に予想される。これらの結果は、１塩基変更の効果が、特に、アレイ上に形成する異なるミスマッチ・プローブ／標的複合体の数と同一性においてきわめて劇的であるということを立証する。図１８においてシグナルを作り出す標的核酸が５’−ＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣ（すなわち、野生型）であるとある者が仮定する場合、相補的プローブＳ−３’−ＴＴＧＧＧＴＴＴのためのミスマッチ特性を図１９Ａに示す。このミスマッチ特性は、予想された形状をもたず、そしてプローブ／標的複合体は低い蛍光強度をもつ。８位におけるミスマッチに対応する強いピークは、この標的内のこの位置内の“正しい”塩基がおそらくＡであるということを示している。なぜなら、ＡとＣだけがこの実験において標的内にあるからである。６位のミスマッチも小さなピークを示す。これに反し、コアとしてＳ−３’−ＴＴＧＧＧＴＴＧプローブ配列を用いた同様のプロットは、“スマイル”形と高い蛍光強度を作り出した。図１９Ｂにおいて、次の８−ｍｅｒプローブについての同一の特性を示す。このピークは、左に１位ミストしており、再び、この配列が標的内の８位において野生型から変化していることを確かなものとする。これらは、その元の１１−ｍｅｒの標的断片内の同一の位置に対応していた。これらのデータは、野生型に比べたとき、標的の８位において１塩基の変化が存在することを予測させる。
【０１２２】
　仮定断片５’−ＡＡＣＣＣＡＡＣＣＣＣに対応するミスマッチ・プローブの特性を図１９Ｃに示す。ある者は、上記配列から下位に“動く（ｍｏｖｉｎｇ）”突然変異体の位置を観察する。最終的に、図１９Ｄにおいて、このミスマッチ・プロットは、予想されたスマイル特徴を伴って、５’−ＡＡＣＣＣＡＡＣＣＣＣに相補する４つのプローブに対応することが示される。
Ｅ．結論
　本発明は、ヌクレオチド配列及び核酸の他の分子との相互作用の研究のための改良方法と装置を提供する。これまでの記載は例示的であり、そして制限的なものではない。本発明の多くの変更は、本開示のレビューに基づき当業者に明らかとなるであろう。単に、実施例によって、本明細書中に記載した本発明の特定のものが、他のポリマー、例えばペプチドとタンパク質への適用をもつであろうし、そして他の合成技術を使用することができる。それ故、本発明の範囲は、これまでの説明を参照して決められるべきではないが、その代わりに、それらの十分な均等の範囲と共に添付クレームを参照して決定されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、オリゴヌクレオチドの光指定合成（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を説明する．光保護されたヒドロキシル（ＯＸ）を担持する表面（２）が、その光脱保護された領域内で遊離のヒドロキシル（ＯＨ）を生成するフォトリトグラフ・マスク（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ　ｍａｓｋ）（Ｍ１）を通して照射される。これらのヒドロキシル基は次に、５’−光保護されたデオキシヌクレオシド・ホスホルアミジット（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）（例えば、Ｔ−Ｘ）にカップリングされる。新たなマスク（Ｍ２）を、その表面上に新たなパターンを照射するために使用し、そして第２の光保護されたホスホルアミジット（例えば、Ｃ−Ｘ）を次にカップリングする。照射とカップリングのラウンドを、オリゴヌクレオチド・プローブの所望のセットが得られるまで繰り返す。場合により標識（＊）をもつ、標的（Ｒ）を、これらのオリゴヌクレオチドに晒す。標的がアレイに結合する位置を、その標的の配列を決定するために使用する；
【図２】図２は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと熱解離を説明し、プローブのアレイにハイブリダイズした標的核酸（５’−ＧＣＧＴＡＧＧＣ−フルオレセイン）の蛍光スキャンを示す。この支持体表面は、４８８ｎｍアルゴン・イオン・レーザー励起を使用してＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｓｃｏｐ　２０顕微鏡により走査された。５２０ｎｍを超える蛍光エミッションを、光子計数モードにおいて操作された冷却光増幅装置（Ｈａｍａｔｓｕ　９３４−０２）を使用して検出した。シグナル強度は、この画像の右に示したスケール上に示される。温度は℃において各パネルの右に示される；
【図３】図３は、ハイブリダイゼーションの配列特異性を説明する。（Ａ）は、各合成部位におけるプローブ組成の係数である。３’−ＣＧＣＡＴＣＣＧ表面固定プローブ（本明細書中Ｓ−３’−ＣＧＣＡＴＣＣＧという。）がストライプ１，３、と５内で合成され、そしてプローブＳ−３’−ＣＧＣＴＴＣＣＧがストライプ２，４、と６内で合成された。（Ｂ）は、標的核酸（１０ｎＭ　５’−ＧＣＧＴＡＧＧＣ−フルオレセイン）とのこの支持体のハイブリダイゼーションを示す蛍光画像である。ハイブリダイゼーションを１５分間、１５℃において６×ＳＳＰＥ，０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中で行った。（Ｃ）は、（Ｂ）のハイブリダイゼーション溶液に添加された第２核酸（１０ｎＭ　５’−ＧＣＧＡＡＧＧＣ）とのハイブリダイゼーションを示す蛍光画像である。（Ｄ）は、（１）（Ｃ）からのフルオレセイン化標的の高湿度解離；及び（２）１５分間１５℃における標的核酸（１０ｎＭ　５’−ＧＣＧＡＡＧＧＣ）との支持体のインキュベーション、の後のハイブリダイゼーション結果を示す蛍光画像である。（Ｅ）は、（Ｄ）のハイブリダイゼーション溶液に添加された第２核酸（１０ｎＭ　５’−ＧＣＧＴＡＧＧＣ）とのハイブリダイゼーションを示す蛍光画像である；
【図４】図４は、４４テトラヌクレオチドの組合せ合成（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を説明する。ラウンド１においては、合成領域の１／４が、第１ＭｅＮＰｏｃ−ヌクレオシド（このケースにおいてはＴ）のカップリングのためにマスク１を通しての照射により活性化される。ラウンド１のサイクル２においては、マスク２は、その合成支持体の異なる１／４セクションを活性化し、そして異なるヌクレオシド（Ｃ）がカップリングされる。さらなるアレイのリトグラフィー的亜分割及び化学的カップリングは、完全な２５６テトラヌクレオチドのセットを生り出す；
【図５Ａ】図５Ａと５Ｂは、２５６オクタヌクレオチドのアレイヘのハイブリダイゼーションを説明する。図５Ａは、１５℃における１５分間６×ＳＳＰＥ，０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中での標的核酸（１０ｎＭ　５’−ＧＣＧＧＣＧＧＣ−フルオレセイン）とのアレイのハイブリダイゼーション後の蛍光画像である。図５Ｂは、Ｓ−３’ＣＧ（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）４ＣＧの合成の間に作られた各々のプローブがどこに位置するかを示すマトリックス解読器である。プローブ配列Ｓ−３’−ＣＧＣＧＣＣＣＧを含む部位を暗領域として示す。本明細書中に使用する組合せ合成の表記法（ｎｏｔａｔｉｏｎ）は、全目的をもって引用により本明細書中に取り込む米国出願逐次番号第０７／６２４，１２０号中に十分に記載されている；
【図５Ｂ】図５Ａと５Ｂは、２５６オクタヌクレオチドのアレイヘのハイブリダイゼーションを説明する。図５Ａは、１５℃における１５分間６×ＳＳＰＥ，０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中での標的核酸（１０ｎＭ　５’−ＧＣＧＧＣＧＧＣ−フルオレセイン）とのアレイのハイブリダイゼーション後の蛍光画像である。図５Ｂは、Ｓ−３’ＣＧ（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）４ＣＧの合成の間に作られた各々のプローブがどこに位置するかを示すマトリックス解読器である。プローブ配列Ｓ−３’−ＣＧＣＧＣＣＣＧを含む部位を暗領域として示す。本明細書中に使用する組合せ合成の表記法（ｎｏｔａｔｉｏｎ）は、全目的をもって引用により本明細書中に取り込む米国出願逐次番号第０７／６２４，１２０号中に十分に記載されている；
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、ｋ−ｍｅｒプローブを使用したｎ−ｍｅｒ標的を配列決定するための技術を説明する。図６Ａは、支持体上のプローブにハイブリダイズした標的を説明する。図６Ｂと６Ｃは、通常の結合アフィニティ−対ミスマッチ位置のプロットを説明する；
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、ｋ−ｍｅｒプローブを使用したｎ−ｍｅｒ標的を配列決定するための技術を説明する。図６Ａは、支持体上のプローブにハイブリダイズした標的を説明する。図６Ｂと６Ｃは、通常の結合アフィニティ−対ミスマッチ位置のプロットを説明する；
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、ｋ−ｍｅｒプローブを使用したｎ−ｍｅｒ標的を配列決定するための技術を説明する。図６Ａは、支持体上のプローブにハイブリダイズした標的を説明する。図６Ｂと６Ｃは、通常の結合アフィニティ−対ミスマッチ位置のプロットを説明する；
【図７】図７は、ハイブリダイゼーション実験の蛍光画像を説明する；
【図８】図８は、１塩基ミスマッチの関数としてハイブリダイゼーション事件をグラフにより説明する；
【図９】図９は、ミスマッチの対の関数としての蛍光強度を説明する；
【図１０】図１０は、１塩基ミスマッチ実験の蛍光画像を説明する；
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｃは、各種１塩基ミスマッチ特性を説明する；
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃは、各種１塩基ミスマッチ特性を説明する；
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、各種１塩基ミスマッチ特性を説明する；
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｄは、より短いｋ−員プローブからのハイブリダイゼーション結果に基づくｎ−員（そのヌクレオチジ内のモノマーの数）の標的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定方法を説明する。特に、図１２Ａ〜１２Ｄは、４−塩基プローブにより１０塩基標的を配列決定するための本発明の適用について説明する；
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｄは、より短いｋ−員プローブからのハイブリダイゼーション結果に基づくｎ−員（そのヌクレオチジ内のモノマーの数）の標的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定方法を説明する。特に、図１２Ａ〜１２Ｄは、４−塩基プローブにより１０塩基標的を配列決定するための本発明の適用について説明する；
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｄは、より短いｋ−員プローブからのハイブリダイゼーション結果に基づくｎ−員（そのヌクレオチジ内のモノマーの数）の標的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定方法を説明する。特に、図１２Ａ〜１２Ｄは、４−塩基プローブにより１０塩基標的を配列決定するための本発明の適用について説明する；
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄは、より短いｋ−員プローブからのハイブリダイゼーション結果に基づくｎ−員（そのヌクレオチジ内のモノマーの数）の標的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定方法を説明する。特に、図１２Ａ〜１２Ｄは、４−塩基プローブにより１０塩基標的を配列決定するための本発明の適用について説明する；
【図１３】図１３は、ヌクレオチド配列の決定のためのコンピューター・システムを説明する；
【図１４】図１４は、標的核酸のミスマッチ分析のための、そして、その決定のためのコンピューター・プログラムを説明する；
【図１５Ａ】図１５Ａと１５Ｂは、いくつかの可能性の中の選択により標的核酸のヌクレオチド配列を決定するためのコンピュー夕ー・プログラム、並びにこのコンピューター・プログラムにおける使用のためのスコアリング・ルーチン（Ｓｃｏｒｉｎｇ　ｒｏｕｔｉｎｅ）の例を説明する；
【図１５Ｂ】図１５Ａと１５Ｂは、いくつかの可能性の中の選択により標的核酸のヌクレオチド配列を決定するためのコンピュー夕ー・プログラム、並びにこのコンピューター・プログラムにおける使用のためのスコアリング・ルーチン（Ｓｃｏｒｉｎｇ　ｒｏｕｔｉｎｅ）の例を説明する；
【図１６】図１６は、ヌクレオチド配列の決定における使用のための指定グラフを説明する；
【図１７Ａ】図１７Ａと１７Ｂは、１塩基ミスマッチ特性を使用した野生型と突然変異の分析を説明する；
【図１７Ｂ】図１７Ａと１７Ｂは、１塩基ミスマッチ特性を使用した野生型と突然変異の分析を説明する；
【図１８】図１８は、１塩基ミスマッチ・テストの蛍光画像である；
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｄは、核酸配列同定のための技術を説明する。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜１９Ｄは、核酸配列同定のための技術を説明する。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｄは、核酸配列同定のための技術を説明する。
【図１９Ｄ】図１９Ａ〜１９Ｄは、核酸配列同定のための技術を説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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