(57)【要約】【課題】セルラーゼを安価に効率良く生産可能とする。【解決手段】酵素の生産方法は、セルロースを含む基質に酵素生産菌を接種して酵素を生産する酵素の生産方法であって、セルロースを含む粒状の基質を成型する工程と、前記基質に酵素生産菌を接種させて、生産菌を好気的条件下で固体培養しつつ酵素を生産させる工程を含む。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースを含む基質に酵素生産菌を接種して酵素を生産する酵素の生産方法であって、
セルロースを含む粒状の基質を成型する工程と、
前記基質に酵素生産菌を接種して、生産菌を好気的条件下で固体培養しつつ酵素を生産させる工程
を含む酵素の生産方法。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素の生産方法であって、
酵素がセルラーゼである酵素の生産方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の酵素の生産方法であって、
前記基質を成型する工程が、前記基質を粒状に成型および／または粉砕する工程を含む酵素の生産方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記基質を接種する酵素生産菌が、糸状菌である酵素の生産方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記基質を成型する工程において、前記粒状の基質が、堆積した粒状基質全体に空気がいきわたるように粒状基質間の空隙を増すために、針状又は繊維状のものを１％以上含んでなる酵素の生産方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記基質の平均粒径が、０．８μｍ〜１０００μｍである酵素の生産方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記基質が、
セルロース率３０％〜７０％、
蛋白質１％〜１０％、
灰分０％〜１０％
である酵素の生産方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記成型後の基質のかさ密度が、乾燥状態で、５．０ｇ／１００ｍＬ〜２５．０ｇ／１００ｍＬである酵素の生産方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記成型後の基質の含水率が、２０％〜６０％である酵素の生産方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記基質で酵素を固体培養する工程が、撹拌しない状態で行われてなる酵素の生産方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記基質を成型する工程が、前記基質を高温水蒸気で処理した後、乾熱滅菌する工程を含む酵素の生産方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記酵素生産菌が、トリコデルマ属、アスペルギルス属、ラミコラ属、アクレモニウム属、フミコラ属の少なくともいずれかもしくはこれらの組合せである酵素の生産方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記酵素生産菌が生産する酵素を固体培養する工程が、
前記酵素生産菌をマンデル培地に接種させて培養する前培養と、
前記前培養で得られた菌体をマンデル培地から遠心分離して、得られた菌体を前記成型基質に接種して培養する本培養と
を含む酵素の生産方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記基質でセルラーゼ酵素を固体培養する工程が、底面に通気性を有するフィルタ、ワイアメッシュデミスター、パンチング板、多孔板のいずれかを配置したタンク内で行われてなる酵素の生産方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、さらに、
前記基質から、固体培養されたセルラーゼ酵素を抽出する工程を含む酵素の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記基質が、麦わらを含む酵素の生産方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記基材が、ペーパースラッジを含む酵素の生産方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記基材が、ペーパースラッジと麦わらを混合したものである酵素の生産方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の酵素の生産方法であって、
前記抽出されたセルラーゼ酵素の最大ＦＰＵ活性値が、０．９００ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙペーパースラッジ以上である酵素の生産方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵素の生産方法で生産された酵素を用いて、セルロース繊維を含むバイオマス資源を糖化分解するセルロース系バイオマス資源の糖化方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載のセルロース系バイオマス資源の糖化方法であって、
前記バイオマス資源が、食品の残渣であるセルロース系バイオマス資源の糖化方法。
【請求項２２】
セルロースを含む基質に酵素生産菌を適用してセルラーゼを生産する酵素生産装置であって、
セルロースを含む粒状の基質を投入するための、フィルタ状の底面を備えるタンクと、
前記タンク内に投入された基質に対し、酵素生産菌を適用するための生産菌適用部と、
前記タンクのフィルタ状底面に、酸素を供給するダクトと、
を備える酵素生産装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素の生産方法及び酵素生産装置並びにバイオマス資源の糖化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒーやお茶などの製造時に発生する食品等の有機物の残渣の処理が問題となっている。このような残渣は、主成分をセルロース繊維とするものが多く、このようなセルロースを含むバイオマスは、下水処理場や微生物の分解といった既存の処理場にそのまま投入することができない。このため、産業廃棄物として廃棄するなど、多くの費用や手間がかかっている。
【０００３】
セルロースは、セルラーゼで加水分解すると、グルコース（ブドウ糖）が得られることが知られている。セルラーゼは、セルロースを、グルコース、セロビオースやセロオリゴトースに加水分解する酵素反応系を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式により、ＦＰアーゼ、ＣＭＣアーゼ、セロビアーゼなど種々の名称で呼ばれる酵素が存在する。
【０００４】
このようなセルラーゼを用いて、セルロースを含むバイオマスを可溶化しグルコースとすることで、微生物などを用いた既存の処理施設に導入できるようになるため、セルラーゼを用いたセルロースの処理が着目されている。これを実現するにはセルラーゼを低コストで効率良く生産することが求められる。
【０００５】
従来、主としてリグニンとセルロースからなるリグノセルロース系バイオマス資源の糖化に用いるセルラーゼの製造には、トリコデルマ・レーゼイ（Trichoderma reesei）（非特許文献１を参照）、トリコデルマ・ビリデ（T. viride）（非特許文献２を参照）やアスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属等に属する微生物が、セルラーゼ生産菌として用いられていた。しかしながら、これらの菌株ではセルラーゼの生産性が十分に得られないという欠点があった。
【０００６】
バイオマス資源の産業利用には、セルラーゼによる糖化反応が欠かせず、例えば石油代替え燃料としてのバイオエタノールや、その他、炭素を含む化合物の生産の基本出発物質としてバイオマス資源を利用する場合は、セルラーゼを安価に生産する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２７１９２７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Biotechnol. Bioeng., 23, 1837-1849 (1981)
【非特許文献２】Appl. Biochem. Biotechnol., 57-58, 349-360 (1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような背景に鑑みてなされたものであり、その目的の一は、セルラーゼを安価に効率良く生産可能な酵素の生産方法及び酵素生産装置並びにセルロースを含むバイオマス資源の糖化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
【００１０】
本発明の第１の形態に係る酵素の生産方法は、セルロースを含む基質に酵素生産菌を接種して酵素を生産する酵素の生産方法であって、セルロースを含む粒状の基質を成型する工程と、前記基質に酵素生産菌を接種して、生産菌を好気的条件下で固体培養しつつ酵素を生産させる工程とを含むことができる。これにより、粒状の基質同士の隙間に酸素を供給して菌体の成長を促すことにより、市販の酵素と遜色のない活性を呈する酵素を得ることが可能となる。
【００１１】
また、本発明の第２の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記に加えて、前記酵素をセルラーゼとすることができる。
【００１２】
さらに、本発明の第３の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基質を接種する酵素生産菌を、糸状菌とすることができる。
【００１３】
さらにまた、本発明の第４の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基質を成型する工程が、前記基質を粒状に成型および／または粉砕する工程を含むことができる。これにより、粉体状でなく粒体状とすることで、通気性を確保して酸素を供給し易くし菌体の育成を向上させることができる。
【００１４】
さらにまた、本発明の第５の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基質を成型する工程において、前記粒状の基質が、堆積した粒状基質全体に空気がいきわたるように粒状基質間の空隙を増すために、針状又は繊維状のものを１％以上含むことができる。これにより、長繊維状の基質が存在することで基質同士の間に空間が生じ易くなり、空気が入り易くなって菌糸の成長が促される。
【００１５】
さらにまた、本発明の第６の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基質の平均粒径を、０．８μｍ〜１０００μｍとできる。これにより表面積を大きくして効率のよい反応が可能となる。
【００１６】
さらにまた、本発明の第７の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基質を、セルロース率３０％〜７０％、蛋白質１％〜１０％、灰分０％〜１０％とできる。
【００１７】
さらにまた、本発明の第８の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記成型後の基質のかさ密度を、乾燥状態で、５．０ｇ／１００ｍＬ〜２５．０ｇ／１００ｍＬとできる。
【００１８】
さらにまた、本発明の第９の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、成型後の前記基質の含水率を、２０％〜６０％とすることができる。
【００１９】
さらにまた、本発明の第１０の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基質で酵素を固体培養する工程を、撹拌しない状態で行うことができる。これにより、育成された菌糸が切断されることを回避できる。
【００２０】
さらにまた、本発明の第１１の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基質を成型する工程が、前記基質を高温水蒸気で処理した後、乾熱滅菌する工程を含むことができる。これにより、高圧水蒸気処理によりセルロース繊維をほぐした上で乾熱滅菌することにより、菌体による培地の取り込みが促進される。
【００２１】
さらにまた、本発明の第１２の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記酵素生産菌を、トリコデルマ属、アスペルギルス属、ラミコラ属、アクレモニウム属、フミコラ属の少なくともいずれかもしくはこれらの組合せとすることができる。なかでもトリコデルマ属（Trichoderma spp.）は成長速度が高く、酵素生産量も多いので、好ましい。またアスペルギルス属（Aspergillus spp.）は、β−グルコシダーゼの活性が高いセルラーゼを生産できるので好ましい。
【００２２】
さらにまた、本発明の第１３の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記酵素生産菌が生産する酵素を固体培養する工程が、前記酵素生産菌をマンデル培地に接種させて培養する前培養と、前記前培養で得られた菌体をマンデル培地から遠心分離して、得られた菌体を前記成型基質に接種して培養する本培養とを含むことができる。これにより、まずマンデル培地を用いた液体培養で十分な菌液を得た後、セルロースを含む基質に接種させることで、確実な培養が担保される。
【００２３】
さらにまた、本発明の第１４の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基質でセルラーゼ酵素を固体培養する工程を、底面に通気性を有するフィルタ、ワイアメッシュデミスター、パンチング板、多孔板のいずれかを配置したタンク内で行うことができる。
【００２４】
さらにまた、本発明の第１５の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、さらに、前記基質から、固体培養されたセルラーゼ酵素を抽出する工程を含むことができる。
【００２５】
さらにまた、本発明の第１６の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基質が、麦わらを含むことができる。これによりＦＰＵ活性値の優れた酵素が得られる。
【００２６】
さらにまた、本発明の第１７の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基材が、ペーパースラッジを含むことができる。これにより、産業廃棄物であるＰＳを酵素生産菌の培地として有効活用できる利点が得られる。
【００２７】
さらにまた、本発明の第１８の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記基材を、ペーパースラッジと麦わらを混合したものとすることができる。これにより、ペーパースラッジだけだとかさ密度が大きすぎるところ、元々かさ密度の小さな麦わらなど成分を混和することで、適切な酵素生産菌の培地とすることができる。
【００２８】
さらにまた、本発明の第１９の形態に係る酵素の生産方法によれば、上記いずれかに加えて、前記抽出されたセルラーゼ酵素の最大ＦＰＵ活性値を、０．９００ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙペーパースラッジ以上とすることができる。
【００２９】
さらにまた、本発明の第２０の形態に係るバイオマス資源の糖化方法は、上記いずれかの酵素の生産方法で生産されたセルラーゼを用いて、セルロース繊維を含むバイオマス資源を糖化分解するバイオマス資源の糖化方法である。
【００３０】
さらにまた、本発明の第２１の形態に係るバイオマス資源の糖化方法によれば、上記いずれかに加えて、前記バイオマス資源を、食品の残渣とすることができる。
【００３１】
さらにまた、本発明の第２２の形態に係る酵素生産装置によれば、セルロースを含む基質に酵素生産菌を適用してセルラーゼを生産する酵素生産装置であって、セルロースを含む粒状の基質を投入するための、フィルタ状の底面を備えるタンクと、前記タンク内に投入された基質に対し、酵素生産菌を適用するための生産菌適用部と、前記タンクのフィルタ状底面に、酸素を供給するダクトとを備えることができる。上記構成により、タンク内に投入した基質を培地として固体培養でセルラーゼを生産できる。この結果、従来の液体培養と異なり、高重量の培地を震盪する曝気の動力の必要がなくなり、低消費エネルギーでの生産が実現される。また震盪による菌糸の破断を回避し、酵素の高生産量が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】麦わらとＰＳのメスシリンダーの測定状態を示す写真である。
【図２】乾燥状態の麦わらとＰＳをフラスコに入れた状態を示す写真である。
【図３】含水状態の麦わらとＰＳをフラスコに入れた状態を示す写真である。
【図４】酵素生産装置を示す模式図である。
【図５】ＰＳを示す模式拡大図付き写真である。
【図６】ＦＰＵ測定法を示す模式図である。
【図７】培養温度毎の経過時間と酵素活性の関係を示すグラフである。
【図８】ＰＳの含水率毎の経過時間と酵素活性の関係を示すグラフである。
【図９】含水率５０〜６０％のＰＳの１２日目の写真である。
【図１０】含水率８０％のＰＳの６日目の写真である。
【図１１】培養開始時のＣ／Ｎ比毎の経過時間と酵素活性の関係を示すグラフである。
【図１２】６日目のＰＳの写真である。
【図１３】菌種毎の経過時間と酵素活性の関係を示すグラフである。
【図１４】菌種混合の６日目のＰＳの写真である。
【図１５】ＰＳの前処理毎の経過時間と酵素活性の関係を示すグラフである。
【図１６】酵素糖化実験の手順を示す模式図である。
【図１７】基質にベンコットを用いた場合の経過時間とグルコース濃度の関係を示すグラフである。
【図１８】基質に未処理コーヒー粕を用いた場合の経過時間とグルコース濃度の関係を示すグラフである。
【図１９】コーヒー粕の処理方法毎の経過時間とグルコース濃度の関係を示すグラフである。
【図２０】市販酵素と生産酵素の、経過時間と糖化率の関係を示すグラフである。
【図２１】平均粒径２５０〜５００μｍのＰＳを示す写真である。
【図２２】平均粒径１００〜２５０μｍの麦わらを示す写真である。
【図２３】撹拌の有無別の経過時間と酵素活性の関係を示すグラフである。
【図２４】撹拌ありのＰＳの写真である。
【図２５】撹拌なしのＰＳの写真である。
【図２６】ＰＳとＷＳの経過時間と酵素活性の関係を示すグラフである。
【図２７】ＰＳの写真である。
【図２８】ＷＳの写真である。
【図２９】三角フラスコをシリコセンで栓をした状態を示す写真である。
【図３０】三角フラスコをアルミニウム箔で覆った状態を示す写真である。
【図３１】シリコセンとアルミ箔を用いた場合の経過時間と酵素活性の関係を示すグラフである。
【図３２】シリコセンで栓をしたＷＳの写真である。
【図３３】アルミニウム箔で覆ったＷＳの写真である。
【図３４】６．７ＦＰＵ／ｇ−基質に対する前処理毎の反応時間とグルコースの関係を示すグラフである。
【図３５】１１ＦＰＵ／ｇ−基質に対する前処理毎の反応時間とグルコースの関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。ただし、以下に示す実施の形態は、本発明の技術思想を具体化するための例示であって、本発明は以下のものに特定しない。また、本明細書は特許請求の範囲に示される部材を、実施の形態の部材に特定するものでは決してない。特に実施の形態に記載されている構成部品の寸法、材質、形状、その相対的配置等は特に特定的な記載がない限りは、本発明の範囲をそれのみに限定する趣旨ではなく、単なる説明例にすぎない。なお、各図面が示す部材の大きさや位置関係等は、説明を明確にするため誇張していることがある。さらに以下の説明において、同一の名称、符号については同一もしくは同質の部材を示しており、詳細説明を適宜省略する。さらに、本発明を構成する各要素は、複数の要素を同一の部材で構成して一の部材で複数の要素を兼用する態様としてもよいし、逆に一の部材の機能を複数の部材で分担して実現することもできる。
［実施形態１］
【００３４】
本発明の実施形態１に係る酵素の生産方法は、セルロースを含む基質に酵素生産菌を適用して酵素を生産するものである。具体的には、セルロースを含む粒状の基質を成型する工程と、この基質に酵素生産菌を接種させてセルラーゼ酵素を固体培養する工程と、固体培養されたセルラーゼ酵素を基質から抽出する工程を含む。これにより、固体培養でセルラーゼを生産でき、従来の液体培養と異なり、高重量の培地を震盪する曝気の動力の必要がなくなり、低消費エネルギーでの生産が実現される。また震盪による菌糸の破断を回避し、酵素の高生産量が期待できる。ここで固体培養とは、液状の栄養分を寒天やゼラチンで固化したものではなく、栄養源そのものが固体状態のものを指す。
【００３５】
基質を成型する工程は、基質を粒状に粉砕する工程を含むことが好ましい。これにより、粉体状でなく粒体状とすることで、通気性を確保して酸素を供給し易くし菌体の育成を向上させることができる。もちろん、既に粒状に形成された基質を導入してもよい。
【００３６】
また粒状の基質は、針状又は繊維状のものを１％以上含むことが好ましい。これにより、長繊維状の基質が存在することで基質同士の間に空間が生じ易くなり、空気が入り易くなって菌糸の成長が促される。また針状や繊維状のものは、他の基質と同じ材質のものでもよいし、他の材質を加えてもよい。例えば、ＰＳや麦わら等の基質に、針状や繊維状の他の繊維質、例えばポリウレタンフォーム（ＰＵＦ）やガラス繊維フィルター等を添加してもよい。
【００３７】
基質の平均粒径は、０．８μｍ〜１０００μｍとすることが好ましい。これにより表面積を大きくして効率のよい反応が可能となる。平均粒径の測定には、ＳＥＭで観察した粒子の拡大写真から、平均粒径を演算して求めることができる。例えば基質として麦わらを用いる場合（詳細は後述）、針状ものが含まれるため平均粒径は１００μｍ〜４ｍｍであった。また基質としてペーパースラッジを用いた場合は、同じくＳＥＭ観察の結果、粒体状のもののみならず、繊維状のものも見られ、平均粒径は８００ｎｍ〜８００μｍであった。
【００３８】
基質を成型する工程は、基質を高温水蒸気で処理した後、乾熱滅菌する工程を含むことが好ましい。これにより、高圧水蒸気処理によりセルロース繊維をほぐした上で乾熱滅菌することにより、菌体による培地の取り込みが促進される。
【００３９】
以上のようにして成型された基質を培地として用いて、酵素生産菌を適用させて酵素を固体培養する。酵素としては、セルラーゼが好適に挙げられる。セルロースを含む粒状の基質を疑似穀物として、この培地でセルラーゼ等の酵素を生産する。酵素生産菌は、培地に含まれる窒素源や炭素源を得て、糸状菌を成長させる。ここで基質でセルラーゼ酵素を固体培養する工程は、基質の水分調整をする工程、酵素生産菌の菌体を固体培地に接種する工程、さらに温度や湿度を調整しながら空気を、固体培地に適度に供給する工程を含む。以下、基質でセルラーゼ酵素を固体培養する工程をセルラーゼ培養工程と呼ぶ。
【００４０】
固体培養とすることで、液体培養と異なり、高重量の培地を振盪する動力の必要がない利点が得られる。また菌種によっては、生産物（酵素）の高生産量が期待できる。
【００４１】
セルラーゼ培養工程は、通気性を維持した環境下で行うことが好ましい。これにより、粒状の基質同士の隙間に酸素を供給して菌体の成長を促すことが可能となる。
【００４２】
またセルラーゼ培養工程は、撹拌しない状態で行うことが好ましい。これにより、育成された菌糸がちぎれることを回避できる。
【００４３】
さらにセルラーゼ培養工程は、セルラーゼ生産菌をマンデル培地に接種させて培養する前培養と、この前培養で得られた菌体をマンデル培地から遠心分離して、得られた菌体を基質に接種して培養する本培養を含むことが好ましい。これにより、まずマンデル培地を用いた液体培養で十分な菌液を得た後、セルロースを含む基質に接種させることで、確実な培養が担保される。
（セルラーゼ生産菌）
【００４４】
セルラーゼ生産菌は、トリコデルマ属、アスペルギルス属、ラミコラ属、アクレモニウム属、フミコラ属の少なくともいずれかとすることが好ましい。なかでもトリコデルマ属（Trichoderma spp.）は成長速度が高く、セルラーゼ生産量も多いので、好ましい。またアスペルギルス属（Aspergillus spp.）は、β−グルコシダーゼの活性が高いセルラーゼを生産できるので好ましい。さらに好適には、セルラーゼ生産菌として、トリコデルマ属とアスペルギルス属の組み合わせを使用する。
（基質）
【００４５】
酵素生産菌を適用する培地を構成する基質は、炭素源となる。このような培地の炭素源として、瀘紙、一般紙類、古紙類、古着のような繊維製品やその破断物、木材、ふすま、麦わら、稲わら、もみがら、竹、おが屑、甲殻類の殻、コーンストーバー乾燥物、バガス（サトウキビ搾りかす）乾燥物、大豆粕、大豆おから、枯れ草、木の葉などの破砕もしくは粉砕物、コーヒー粕、米ぬか、ラクトース、ラクトース水和物、乳清、乳製品、加水分解残渣、粉末セルロース、アビセル、セロビオース、およびこれらの混合物が利用できる。本実施形態では、特にセルロースを含むバイオマス基質に対し有効であり、中でも麦わらやペーパースラッジが好適に利用できる。
【００４６】
基質として麦わらを用いることで、後述する通りＦＰＵ活性値の優れた酵素が得られる。
【００４７】
一方ペーパースラッジ（Paper Sludge：ＰＳ）は、古紙からトイレットペーパー等再生紙を製造する際、紙にならずに排水中に流失した短繊維や無機物を濃縮し脱水したものである。水分は５５〜６０％、灰分は４５〜５２％である。日本では年間約４４０万トンが排出されており、その殆どが焼却、埋め立て処分されている。このようにＰＳは産業廃棄物であり、特に製紙業界では処分に困っているものである。このＰＳは季節性が無く、通年で供給できるため、豊富な量が入手し易いという利点がある。またＰＳは、他の基質、例えば麦わらや稲わら、殻、バガス、コーンストーバー等と異なり、元々が粒状のため別途粉砕工程を必要としない、又は粉砕工程を簡素化できるという利点もある。
【００４８】
本実施形態に係る酵素の生産方法によれば、固体培養による酵素生産の基質として利用することで、このような未利用のＰＳを有効活用して廃棄物の利活用を図り、サスティナブルな循環型の社会実現に資することができる。
【００４９】
基質は、セルロース率３０％〜７０％、蛋白質１％〜１０％、灰分０％〜１０％とすることが好ましい。
【００５０】
例えば基質がＰＳの場合、水分５５〜６０％、灰分８％が好ましい。
【００５１】
また基質がバガスや稲わらの場合、品質にもよるがセルロースが３８％〜５２％；灰分が３％〜８％；粗タンパク質が２〜８％とすることが好ましい。
【００５２】
またバガスの場合、セルロース：３８％〜４５％；灰分：２％〜５％；粗タンパク質：２．４％である。
【００５３】
さらに基質の炭素源と窒素源の比が３９〜５３％であることが好ましい。
【００５４】
基質の含水率は、２０％〜６０％とすることが好ましい。このように初期含水率を調整することで、通気性を確保できる。特に酵素の培養は、初期水分が蒸発し成型基質の水分含量が減少しながら進行する。当初は成型基質の表面において二次元方向に成長が進み、その後表層の水分が減ってくると内部に向かって菌体の生育が進むと思われる。ここで水分が多すぎると、表層だけで生育が完結し内部への生育が弱まり、一方で水分が少なすぎると、菌体の絶対量が少なくなって結果生産物である酵素量が少なくなる。これらを考慮して、上述の範囲に基質の含水率を調整することで、酵素の培養に好適な環境を実現できる。
（かさ密度）
【００５５】
また基質のかさ密度は、乾燥状態で、５．０ｇ／１００ｍＬ〜２５．０ｇ／１００ｍＬとすることが好ましい。このようにかさ密度を低く抑えることで、通気し易い培地とすることができる。後述する実施例で用いた基質として、乾燥状態の麦わらのかさ密度は１３．５ｇ／１００ｍＬ、ＰＳは１１．５ｇ／１００ｍＬであった。
【００５６】
麦わらには針状の試料も含まれており、また水分を含み難いことから、含水させてもあまり凝集せず、いわゆるダマになり難い。これに対してＰＳは、水分を含むとダマになり易く、フラスコの中であまり体積が膨らまない。
【００５７】
また、含水状態でのかさ密度を計算すると、麦わら５．０６ｇ、蒸留水５ｇでメスシリンダーの測定量５７ｍＬであったことから、麦わらの含水状態でのかさ密度は１７．７ｇ／１００ｍＬであった。またＰＳ５．０８ｇ、蒸留水５ｇでメスシリンダーの測定量３８ｍＬであったことから、ＰＳの含水状態でのかさ密度は２６．５ｇ／１００ｍＬであった。ここで、麦わらとＰＳのメスシリンダーの測定状態を図１に、乾燥状態でフラスコに入れたものを図２に、含水状態でフラスコに入れたものを図３に、それぞれ示す。これらの図において、左側が麦わら、右側がＰＳを、それぞれ示している。これらの図に示すように、水分を添加する前の乾燥状態では、フラスコに入れた体積の見た目はさほど変わらない。一方で水分を添加した後の含水状態では、よく混合すると、麦わらとＰＳでは見た目にも大きく差が出ることが判る。
【００５８】
これは、培地の基質に水分が含まれると、ＰＳは目が詰まって密度が大きくなるためと考えられる。乾躁状態では麦わらと同程度のかさ密度であっても、含水されると密度が大きくなり、通気性が悪くなるため、セルラーゼの生産量が低下するものと思われる。換言すると、セルラーゼの生産に適した培地の特性として、基質を構成する繊維間に適度な空隙が確保されていることが好ましく、これにより空隙間に酸素が供給されて菌体が増殖し易くなると思われる。また表面積が大きいことが好ましく、これによって広い表面積により菌体の濃度が高くなって、酵素濃度も高くなると思われる。
【００５９】
一方、粒状の麦わらは、水分が中まで浸透し難く、また撥水性を発揮しているものと思われる。加えて、酸素濃度の高いセルロース表面に菌糸が増殖し、表面積の大きな麦わらのほうが菌体濃度がＰＳよりも高い。またこの結果、酵素生産量も麦わらのほうがＰＳよりも大きくなるので、好ましい。
【００６０】
さらに上述の通り、ＰＳなどのセルロース原料に対して、湿状態のかさ密度を減らすための針状の繊維を混和することが効果的となる。
【００６１】
なお、かさ密度に代えて、比表面積［ｍ-1］で基質の特性を選定することもできる。
（酵素生産装置）
【００６２】
基質でセルラーゼ酵素を固体培養する工程は、底面に通気性を有するフィルタを配置したタンク内で行うことが好ましい。ここで、セルラーゼを生産する酵素生産装置１００を図４に示す。この図に示す酵素生産装置１００は、タンク１と、生産菌適用部２と、ダクト３を備えている。
【００６３】
タンク１は、セルロースを含む粒状の基質を投入するための部材である。タンク１の底面は、フィルタ状としている。
【００６４】
生産菌適用部２は、タンク１内に投入された基質に対し、酵素生産菌を適用するための部材である。
【００６５】
ダクト３は、タンク１のフィルタ状底面に、酸素を供給するための部材である。
【００６６】
このような酵素生産装置１００により、タンク１内に投入した基質を培地として固体培養でセルラーゼを生産できる。特に酵素生産装置１００を、粉体床気相浮揚型糸状菌培養装置とすることで、粉体状の食品廃棄物を利用して糸状菌を培養することが可能となる。この結果、従来の液体培養と異なり、高重量の培地を震盪する曝気の動力の必要がなくなり、低消費エネルギーでの生産が実現される。また震盪による菌糸の破断を回避し、酵素の高生産量が期待できる。
【００６７】
特に基質としてＰＳを用いる場合は、上述の通りウエットな状態でかさ密度が大きくなってしまう問題がある。そこで、糸状菌を増殖させる場合、空気でこれら菌糸のベットを浮上させながら粉状に舞い上がらせながら増殖させることが有効と思われる。ただ、この場合は空気の供給を伴うため、発生する呼吸代謝ガスを効率良く排出させることが必要となる。そこで、上述の通りタンク１の床面にフィルタを設けて、このフィルタを介して粉体を中に留めながらガス成分の入れ替えを行う。これによって、排出ガスの滞留を避けつつ、新鮮な空気を供給して効率良く糸状菌を増殖させることが可能となる。
【００６８】
このようにして得られたセルラーゼを用いて、セルロース繊維を含むバイオマス資源を糖化分解することができる。このようなバイオマス資源には、食品の残渣が挙げられる。有機物の廃棄物である食品の残渣をセルラーゼで糖化分解することで、微生物を用いた処理が容易となる。またこのようなバイオマス資源の例として、コーヒー粕が挙げられる。
【００６９】
さらにセルラーゼ培養工程は、酵素生産菌をマンデル培地に接種させて培養する前培養と、この前培養で得られた菌体をマンデル培地から遠心分離して、得られた菌体を基質に接種して培養する本培養を含むことが好ましい。これにより、まずマンデル培地を用いた液体培養で十分な菌液を得た後、セルロースを含む基質に接種させることで、確実な培養が担保される。
［実施例１：ＰＳ］
【００７０】
以下、実施例１として、ＰＳを基質に用いる場合の酵素生産方法を、説明する。ここでは、ＰＳを用いて固体培養法によりセルラーゼを生産し、高生産量（高活性値）を示す培養条件を探索した。具体的には、セルラーゼ培養工程の好ましい温度条件や含水率、菌種等について検討した。また生産されたセルラーゼの特性を評価するため、余剰の食品廃棄物であるコーヒー粕を基質として糖化実験を行い、市販酵素との比較、評価を行った。
【００７１】
セルラーゼを生産する酵素生産菌としては、トリコデルマ属（Trichoderma spp.）、スペルギルス属（Aspergillus spp.）、ラミコラ属（Ramicola spp.）、アクレモニウム属 (Acremonium spp.)、フミコラ属 (Humicol spp.) 等が挙げられる。ここでは、成長速度が高く、酵素生産量も多いトリコデルマ属と、β−グルコシダーゼの活性が高いセルラーゼを生産するアスペルギルス属を用いた。
（前培養）
【００７２】
この酵素生産菌を用いて、基質でセルラーゼ酵素を固体培養する。ここでは、セルラーゼ培養工程を、前培養と本培養に分けて行う。まず前培養では、前培養用培地としてマンデル培地と炭素源を成型し、フラスコに入れる。ここでのマンデル培地は、（ＮＨ4）ＳＯ4を１．４ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4を２．０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏを０．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏを０．００５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ・６Ｈ2Ｏを０．００３７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏを０．００１６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏを０．００５ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを０．００１４ｇ／Ｌ、尿素を０．３ｇ／Ｌ、ペプトンを０．１ｇ／Ｌ、それぞれ含んでいる。なおここでの濃度は、炭素源と混合した時のものである。また炭素源は、グルコース５．０ｇ／Ｌ、アビセル１０．０ｇ／Ｌを含んでいる。なお濃度は、同じくマンデル培地と混合した時のものである。このマンデル培地と炭素源を、１：１の比率で、培養容積１００ｍＬのフラスコに入れ、さらに酵素生産菌を接種して、２８℃で４８時間、１８０ｒｐｍで撹拌した。また酵素生産菌の使用菌株はTrichoderma reesei ATCC 26921、Trichoderma reesei ATCC 56765、Aspergillus oryzae ATCC 12892を用いた。
（本培養）
【００７３】
このようにして前培養で得られた菌体を、前培養培地から抽出する。ここでは、遠心分離により、菌体を取り出した。この菌体に栄養源を添加して菌液とする。栄養源には、窒素源として高濃度マンデル培地（上記マンデル培地成分を１０倍の濃度としたもの）５．０ｍＬを添加した。
【００７４】
さらに本培養として、このようにして得られた菌液をセルロースを含む基質に適用する。ここでは基質としてＰＳを用いた。ＰＳは、セルロース５２．２％、灰分８．０％を含んでいる。またＰＳの粒径は、図５に示すようにペレット状の直径を２．５〜３．５ｍｍφ、長さを１５〜３０ｍｍとした。このＰＳを乾燥状態で５．０ｇ、また栄養源を添加した菌液を５．０ｍＬずつ、各フラスコに投入する。なおＰＳの含水率は滅菌水で調整した。このフラスコを一定温度で培養し、経過を観察した。具体的には、一日ごとにいずれかのフラスコを抽出して、０．０５Ｍクエン酸バッファを加え、２〜３ｈ振盪した。さらに３５００ｒｐｍで１５分遠心し、上清のみ分離し、これを酵素液とし、得られた酵素液に対し、濾紙分解活性（ＦＰＵ）を測定した。
（ＦＰＵ測定法）
【００７５】
ここで、ＦＰＵ（Filter paper unit）の測定法を説明する。ＦＰＵは１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量である。ここでは図６に示すように、まず作製した酵素液を２５０μＬ、マイクロチューブに投入する。またマイクロチューブには、クエン酸バッファ０．０５Ｍ（ｐＨ５．０）１ｍＬを投入する。このマイクロチューブ内に、幅１ｃｍ、長さ６ｃｍ、重さ５５ｍｇの濾紙（Whatman製 No.1のろ紙）を丸めて、液浸させる。この状態で、５０℃で１時間放置後、１０分間煮沸を行う。そしてソモギ・ネルソン法で還元糖量を測定する。具体的には、マイクロチューブから取り出した酵素液１００μＬを、別のマイクロチューブに投入し、さらにソモギ銅試薬１００μＬを加える。そして１０分間煮沸し急冷後、さらにネルソン試薬１００μＬを加えて１５分間放置する。この状態で、蒸留水１．２ｍＬを添加して、６６０ｎｍの吸光度測定を行う。
（１：培養温度による比較）
【００７６】
まず培養温度による比較を行った。ここでは培養温度は、３０℃又は３６℃とした。具体的には、使用菌株をTrichoderma reesei ATCC 56765、Trichoderma reesei ATCC 26921とし、培養開始時のＰＳの含水率を５０〜６０％とした。そして培養温度として、（条件１）全日３０℃、（条件２）培養開始〜２日目３０℃、３日目以降３６℃とした。
なおＰＳの前処理は、乾熱滅菌のみとした。なお乾熱滅菌とは、ＰＳが完全に乾燥するまで行ったものであり、約１〜２時間要した（以下同じ）。また培養開始時のＣ／Ｎ比は５３．３であった。
【００７７】
このような、ＰＳを基質とした酵素生産における培養温度による比較試験の結果を図７のグラフに示す。このグラフは、経過時間に対する酵素活性［ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙＰＳ］を示している。また最大ＦＰＵ活性値時の培養データを、表１に示す。
【００７８】
【表１】
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【００７９】
図７、表１に示すとおり、Trichoderma reesei ATCC 56765を３０℃で培養したものが、５日目で高い酵素活性を示した。またＰＳの目視による観察でも全体が黄土色で、表面に薄く白い菌糸が確認された。よって、培養温度と使用菌株はこの組み合わせが好ましいと判断し、次の実験からはこの条件を用いて培養を行った。
【００８０】
なお、他の文献“Applied Biochemistry and Biotechnology, 161, 382-394, 2010”、“Production of cellulase from Kraft paper mill sludge by Trichoderma Reesei Rut C-30”によれば液体培養での実験であり純粋に比較は難しいものの、ＰＳに前処理を加えることで、生産酵素のＦＰＵ活性値が向上することが報告されている。またＰＳ未処理の状態では、生産菌がほぼ増殖しない。さらに水での洗浄で、ＦＰＵ＝１〜１．５程度となっている。これらから、固体培養により同程度のＦＰＵ活性値を得られたのは好ましい結果であると言える。
（２：培養開始時のＰＳの含水率による比較）
【００８１】
固体培養の観点から含水率を検討すべく、培養開始時のＰＳの含水率による比較を行った。ここでは培養開始時のＰＳの含水率を５０〜６０％又は８０％とした。具体的には、使用菌株をTrichoderma reesei ATCC 56765とした。そして培養開始時のＰＳの含水率を、（条件１）５０〜６０％、（条件２）８０％とした。なお、培養温度は、３０℃とし、ＰＳの前処理は高圧蒸気処理と乾熱滅菌とした。なお高圧水蒸気処理は、１２１℃で２０分間行った（以下同じ）。また培養開始時のＣ／Ｎ比は同じく５３．３とした。
【００８２】
この結果を、図８のグラフに示す。この図においても、横軸は経過時間、縦軸は酵素活性を示している。含水率５０〜６０％の最大ＦＰＵ値は、１２日目の０．９２６ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙＰＳであり、一方、含水率８０％の最大ＦＰＵ値は、６日目の０．９１０ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙＰＳであり、大きな差は見られなかった。また、条件１、２それぞれの最大ＦＰＵ値を示した、５０〜６０％の場合の１２日目のＰＳの写真を図９に、８０％の６日目のＰＳの写真を図１０に、それぞれ示す。図９に示すように、６０％のＰＳの１２日目では淡黄色で、表面を白い菌糸が薄く覆っている様子が確認された。一方、図１０に示すように８０％のＰＳの６日目では、黄土色で、表面を白い菌糸が厚く覆っている様子が確認された。
（３：培養開始時のＣ／Ｎ比による比較）
【００８３】
次に、培養開始時のＣ／Ｎ比による比較として、本培養開始時の炭素源と窒素源の比をＣ／Ｎ＝５３．３又はＣ／Ｎ＝１７．８とした。具体的には、使用菌株を同じくTrichoderma reesei ATCC 56765とし、培養開始時のＰＳの含水率を５０〜６０％、培養温度を３０℃とした。またＰＳの前処理は、高圧蒸気処理と乾熱滅菌とした。そして培養開始時のＣ／Ｎ比を、（条件１）５３．３、（条件２）１７．８とした。
【００８４】
この結果を、図１１のグラフに示す。この図に示すように、条件１のＣ／Ｎ比＝５３．３と、条件２の１７．８とでは、Ｃ／Ｎ比を変化させてもＦＰＵ活性値に大きな差はみられなかった。また、最大ＦＰＵ値を示した６日目のＰＳの写真を、図１２に示す（本培養培地濃度３倍）。この図に示すように、一部のＰＳが淡黄色に変化し始め、表面を白い菌糸が薄く覆っている様子が確認された。
（４：菌種の組み合わせによる相乗効果）
【００８５】
さらに、菌種の組み合わせるによる相乗効果を確認するため、Trichoderma reesei ATCC56765とAspergillus oryzae ATCC12892を用いて、それぞれ単独の場合と、これらの菌種を組み合わせた場合を比較した。ここでは、培養開始時のＰＳの含水率を５０〜６０％とし、培養温度を３０℃とした。またＰＳの前処理は高圧蒸気処理、乾熱滅菌とし、培養開始時のＣ／Ｎ比は５３．３とした。
【００８６】
この結果を、図１３に示す。この図に示すように、培養開始２日目にして急激にＦＰＵ活性値が上昇した。上昇の速度が速いことから、菌種の組み合わせによる酵素群の多様化により、相乗効果が得られると思われる。また最大ＦＰＵ値を示した菌種混合の例の６日目のＰＳの写真を図１４に示す。この図に示すように、ＰＳが見えなくなるくらい分厚く白い菌糸で覆われている様子が確認できる。
（５：ＰＳの前処理による効果）
【００８７】
さらに、ＰＳの前処理による効果を確認した。ここでは、使用菌株をTrichoderma reesei ATCC 56765とし、培養開始時のＰＳの含水率を５０〜６０％とし、培養温度：３０℃とした。そしてＰＳの前処理として、（条件１）乾熱滅菌のみ、（条件２）１２１℃で２０分、高圧水蒸気処理し、乾熱滅菌、（条件３）３０秒間カッターミルで粉砕し、１２１℃で２０分高圧水蒸気処理し、乾熱滅菌を行った場合の、３種類の前処理を事前に行った。なお培養開始時のＣ／Ｎ比は５３．３とした。この結果を、図１５のグラフに示す。この図に示すように、条件３の粉砕＋高圧水蒸気処理＋乾熱滅菌が、よい酵素活性を示した。この理由として、粉砕処理によりＰＳの表面積が増し、高圧水蒸気処理によりＰＳの繊維をほぐす効果が得られた結果、ＦＰＵ活性値が向上したものと推察される。
【００８８】
なおＦＰＵ活性値について、文献では培養期間が５、６日程度で、ある点で一定になるものが多く見られた。またプロテアーゼの存在を考えて、文献を調べたが、そのような記載は見られなかったので、プロテアーゼの影響は考えにくいと思われる。
（酵素糖化実験）
【００８９】
次に、得られた生産酵素を用いて基質に対して糖化実験を行い、市販の酵素と比較した。ここでは生産酵素として、酵素生産時の培養条件を、菌種にTrichoderma reesei ATCC 56765を用いて、培養温度３０℃で、培養開始時のＰＳの含水率を５０％として、ＰＳの前処理は乾熱滅菌のみとして、３０日間培養して得られた酵素を用いた。一方、市販酵素には、ＭｅｉｊｉＳｅｉｋａファルマ株式会社製アクレモニウムセルラーゼを用いた。これはAcremonium cellulolyticus由来で、至適温度は５０〜６０℃、至適ｐＨは４〜５、ＦＰＵ活性は２６９ＦＰＵ／ｇ−粉末酵素であった。
【００９０】
これらの酵素を用いて、基質としてベンコット（セルロース繊維）と未処理コーヒー粕を用いて、糖化実験を行った。具体的には、図１６に示すように、ボトル内に、酵素液にクエン酸バッファ０．０５Ｍ（ｐＨ５）を加えたものと、基質とを入れて、５０℃で１４０ｒｐｍで撹拌し、反応上清をマイクロチューブに取り出して、グルコースオキシダーゼ法（ＧＯＤ）でグルコース濃度を測定した。この結果を、図１７、図１８のグラフに示す。これらの図において、図１７は基質にベンコットを用いて、基質濃度を４０ｇ／Ｌ、６．６ＦＰＵ／ｇ−基質としたところ、８７％糖化された。また図１８は基質に未処理コーヒー粕を用いて、基質濃度を５０ｇ／Ｌ、５ＦＰＵ／ｇ−基質としたところ、ほとんど糖化されないことが判明した。このようにベンコットは糖化された一方で、コーヒー粕が糖化されない理由は、コーヒー粕中のセルロースがリグニンその他に覆われ、セルロースに酵素が接触しなかったため、と考えられる。そこで、以下ではコーヒー粕への前処理を検討した。
【００９１】
ここでは様々な条件で酵素糖化実験を行い、最適な条件を検討した。まず生産酵素に対し、（１）基質（コーヒー粕）の前処理の条件を変えて比較を行った。ここでは基質を、（ａ）未処理；（ｂ）３ｗｔ％のＮａＯＨ処理；（ｃ）ボールミル粉砕後、６ｗｔ％のＮａＯＨで処理の３種類に対して、糖化実験を行った。ここで、基質が未処理の場合は、糖類４３．８％、酸不溶性成分３９．９％であった。この状態でボールミル後、６ｗｔ％のＮａＯＨ処理により、糖類６５．５％、酸不溶性成分１５．５％となった。なお基質濃度はいずれも５０ｇ／Ｌ、酵素活性は５ＦＰＵ／ｇ−基質とした。この結果を図１９に示す。この図に示すように、コーヒー粕に処理を施すことで、未処理の場合よりも糖化率を上昇させることができた。
【００９２】
次に、（２）生産酵素と市販酵素（アクレモニウムセルラーゼ）との比較を行った。ここでは、上記（ｃ）と同じく、基質（コーヒー粕）にボールミル後６ｗｔ％ＮａＯＨ処理した場合の糖化実験を行った。ここでも、基質濃度は５０ｇ／Ｌ、酵素活性は５ＦＰＵ／ｇ−基質とした。この結果を図２０に示す。この図に示すように、生産した酵素は市販の酵素（アクレモニウムセルラーゼ）と比較して、２倍以上の糖化力を発揮し得ることが確認された。
【００９３】
以上から、酵素の生産に際して、培養温度は、菌種Trichoderma reesei ATCC 56765の場合、３０℃前後が適切であることが判明した。また培養開始時の含水率は、ＦＰＵ活性値で比較すると含水率５０〜６０％でも８０％と同等であることが確認された。この結果、培養体積、重量を削減でき、培養装置のスケールダウンが図られる。
【００９４】
また本培養開始時のＣ／Ｎ比の変化は、ＦＰＵ活性値に影響が無いことが確認された。これにより、栄養源に要する費用を削減し得る。さらに菌種の組み合わせとして、Trichoderma reesei ATCC 56765、Aspergillus oryzae ATCC12892を組み合わせると、最大ＦＰＵ活性値になるまでの日数が早められ、相乗効果が得られることが確認された。さらにまた、ＰＳの前処理として、高温高圧水蒸気処理、粉砕処理がＦＰＵ活性値向上に有効であることが確認された。特に最大ＦＰＵ活性値として、０．９２６ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙＰＳを得ることができた。
【００９５】
さらに、酵素糖化として、コーヒー粕に前処理を施すことで未処理の場合よりも糖化を進めることができることが確認された。特に生産酵素により、市販酵素（アクレモニウムセルラーゼ）の約２倍の糖化率を得た。
【００９６】
以上のように、酵素生産培地（酵素生産基質）で生産した生産酵素を用いて、糖化ターゲット基質の酵素糖化を行う基質の糖化方法においては、糖化ターゲット基質に対して、アルカリ処理する工程を含むことが好ましい。例えば基質の粉砕後に、リグニンをＮａＯＨで溶解させることで、加水分解が促進される。ＮａＯＨの濃度は、３ｗｔ％〜１０ｗｔ％とすることが好ましい。
［実施例２：麦わら］
【００９７】
以上の例では、セルラーゼを固体培養で生産する培地の基質としてＰＳを用いる例を説明した。ただ本発明は、基質をＰＳに限定するものでなく、他の基質を利用することができる。次に、麦わら（wheat straw：ＷＳ）を基質として用いた場合とペーパースラッジ（Paper Sludge：ＰＳ）の場合との比較例を検討する。
【００９８】
ここでは、未利用セルロース系バイオマスを用いて固体培養法によりセルラーゼを生産し、高活性値を示す培養条件を探索するため、基質にＰＳと麦わらを用いた場合を比較した。使用菌株としては、上述の通り活性の高いセルラーゼを生産するものが多いトリコデルマ属（Trichoderma sp.）の中でも、酵素生産性が高いTrichoderma reesei ATCC 56765を用いた。また、実験条件は概ね上述した実施例１に準じた。すなわち、マンデル培地と前培養菌を混ぜたものを５ｍｌ加えた。またＣ／Ｎ比はＰＳの場合５３．３、ＷＳの場合３８．７６とした。また基質（ＰＳ及びＷＳ）は３０秒間カッターミルで処理した。さらにミル後の基質を、１２１℃で２０分間蒸気滅菌処理して、完全に乾くまで乾熱滅菌した。乾燥重量を５ｇとした。ただし、培養温度は、３０℃で行った。また培養中の撹拌を、行う場合と行わない場合とで比較した。さらに通気条件として、培養容器（１００ｍＬ三角フラスコを、シリコセンで栓をする場合と、アルミニウム箔で覆う場合とを比較した。
【００９９】
具体的に、前培養において、実施例１と同様のマンデル培地と炭素源を成型し、菌種を適用して、３０℃で４８時間、１８０ｒｐｍで振盪培養した。
【０１００】
また本培養において、基質としてＰＳを平均粒径８００ｎｍ〜８００μｍ（図２１）、ＷＳを平均粒径１００μｍ〜４ｍｍ（図２２）、蒸気滅菌と乾熱滅菌したものを用いた。ここでＰＳは、セルロース率：５２．２％、たんぱく質：８．０％、灰分：８．０％であった。またＷＳは、セルロース率：３７．９％、たんぱく質：１．４％、灰分：７．５％であった。このような基質を、それぞれ三角フラスコに導入した。一方で、前培養で得た菌体０．９７ｇ／１００ｍＬの前培養液を遠心分離し、菌体を抽出して栄養源を５ｍＬ添加したものを、三角フラスコに導入した。この状態で培養し、一日ごとにサンプリングしてＦＰＵを測定する。なお初期含水率は６２％であった。
【０１０１】
このようにして培地で菌を成長させた後、酵素を抽出する。ここでは、０．０５ＭｐＨ５クエン酸バッファを加えて、ＰＳについては２０ｍＬ、ＷＳについては５０ｍＬを、約１時間震盪させる。そして３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清の酵素液に対して、濾紙分解活性（ＦＰＵ）を測定した。ＦＰＵの測定は、上述した実施例１と同様の手順で行った。
（１：撹拌の有無による比較）
【０１０２】
まず、本培養中の撹拌の有無による比較を行った結果を、図２３のグラフに示す。ここでの撹拌は、２４時間に１回、薬さじで三角フラスコ中を５回ほどかき混ぜることとする。また撹拌ありの基質を図２４に、撹拌なしの基質を図２５に、それぞれ示す。ここでは培養条件として、使用基質はＰＳで、培養温度を３０℃とし、培養容器として１００ｍＬ三角フラスコを用いて、シリコセンで栓をした。図２３から、本培養中の撹拌なしの方が、全体的にＦＰＵ値が高い結果となった。撹拌するとＦＰＵはほぼ上昇しなかった。撹拌した場合の最大ＦＰＵは７日目で、０．２５ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙＰＳであった。また撹拌しない場合の最大ＦＰＵは８日目で、０．７９ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙＰＳであった。また図２４、図２５から、撹拌ありとなしでＰＳの見た目にほぼ差は見られなかった。
（２：基質による比較）
【０１０３】
次に、基質の違いによる比較を行った結果を、図２６のグラフに示す。ここでの培養条件は、使用基質としてＰＳ又はＷＳを用いた。培養温度は３０℃、培養中の撹拌はなしとした。また培養容器には１００ｍＬ三角フラスコを用いて、シリコセンで栓をした。またＰＳの写真を図２７に、ＷＳの写真を図２８に、それぞれ示す。
【０１０４】
図２６に示すとおり、ＰＳは２日目から３日目でＦＰＵが上昇し、８日目で最大となったが、その後ＦＰＵは下降した。また図２７に示す通り、全体が黄土色で、表面は白かった。一方、ＷＳは３日目から４日目で急激にＦＰＵが上昇した。また図２８に示すとおり、全体的に白っぽく、菌の生育が感じられた。ＦＰＵ活性値を比較すれば、ＰＳよりもＷＳの方が高かった。
（３：通気条件による比較）
【０１０５】
次に、通気条件による比較を行った。ここでの培養条件は、使用基質としてＷＳを用い、培養温度を３０℃とした。また培養中の撹拌は行わなかった。培養容器は１００ｍＬ三角フラスコとし、図２９に示すようにシリコセンで栓をしたものと、図３０に示すように、アルミニウム箔で覆ったものとを比較した。この結果を、図３１のグラフに示す。またシリコセンで栓をしたＷＳの写真を図３２に、アルミニウム箔で覆ったＷＳを図３３に、それぞれ示す。図３１に示すように、アルミ箔の場合は４日目でＦＰＵが急上昇した。また全体的に、シリコセンよりアもルミ箔の方がＦＰＵ値が高い結果を示した。さらに図３２、図３３に示すように、シリコセン、アルミ箔共に全体が白くなり、菌の生育が看取された。
（酵素糖化実験）
【０１０６】
さらに、市販酵素と生産酵素の糖化力を比較し、生産酵素の利用可能性を確認した。ここでは、基質として、（Ａ）未処理の麦わらと、（Ｂ）３％のＮａＯＨを１２１℃で３０分間オートクレーブにてアルカリ処理した麦わらを用いた。なお、未処理の麦わらは、セルロース３７．９％、リグニン２２．８％であり、ＮａＯＨ処理した麦わらは、セルロース５３．６％、リグニン６．３％であった。
【０１０７】
また市販酵素にはＭｅｉｊｉＳｅｉｃａファルマ株式会社製メイセラーゼを用いた。メイセラーゼはTrichoderma viride由来であり、至適温度は５０〜６０℃、至適ｐＨは５．０、ＦＰＵ活性は１２６ＦＰＵ／ｇ−粉末酵素である。一方の生産酵素は、酵素生産時の培養条件として、使用基質をＷＳ、培養温度を３０℃、培養中の撹拌なし、通気条件はアルミ箔として、６日間培養したものを使用した。
【０１０８】
これらの酵素を基質に適用して５０℃、１６０ｒｐｍで振盪した後、ＧＯＤ法を用いてグルコース量を定量した。
【０１０９】
このような酵素糖化実験を行うにあたり、基質と酵素の組み合わせとして、以下を用いた。
（ａ）未処理麦わらに市販酵素を適用して、６．７ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙ基質にて糖化した。これにより、未処理麦わらは市販酵素でも糖化されないことを確かめた。
（ｂ）ＮａＯＨ処理した麦わらに生産酵素を適用して、６．７又は１１ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙ基質にて糖化した。
（ｃ）ＮａＯＨ処理した麦わらに市販酵素を適用して、６．７又は１１ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙ基質にて糖化した。
【０１１０】
この結果を、反応時間に対するグルコース濃度として、図３４及び図３５に示す。図３４は６．７ＦＰＵ／ｇ−基質に対し、基質濃度：５０ｇ／Ｌ（未処理）、３０．７ｇ／Ｌ（ＮａＯＨ処理）とした結果を、図３５は１１ＦＰＵ／ｇ−基質に対し、基質濃度：２５ｇ／Ｌ（ＮａＯＨ処理）とした結果を、それぞれ示している。図３４から、未処理の麦わらではいずれの酵素でも糖化が進まないことが明らかとなった。また６．７ＦＰＵ／ｇ−基質での糖化速度については、生産酵素の糖化能が、市販酵素に劣るものであった。一方、図３５に示すとおり、基質に対する酵素添加量を高くした１１ＦＰＵ／ｇ−基質での糖化能は、生産酵素の糖化能は市販酵素に匹敵するものとなり、十分か効能が得られることが確認された。
【０１１１】
以上から、固体培養法を用いて培養温度・撹拌の有無・基質・通気条件による比較を行った結果として、ＷＳを用いた固体培養法によるＴ．ｒｅｅｓｅｉのセルラーゼ生産の有用性が確認された。また固体培養による場合、最大ＦＰＵ活性値として２．８５ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙＷＳ［μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−ｄｒｙＷＳ］が得られた。
【０１１２】
なお、参考までに液体培養の報告例として、ＰＳに対してTrichoderma reesei NBRC 31329より０．００５０ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙＰＳが、ＷＳに対してTrichoderma reesei ATCC 56765で０．００８２ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙＷＳが得られている。これに対しても、本実施例に係る固体培養法による酵素の生産方法は、格段に高い乾燥基質当たりのＦＰＵを実現しており、その優位性が確認された。
【０１１３】
以上のように、セルラーゼの生産菌として、強力なセルラーゼを生産するものが多い糸状菌に注目した。糸状菌によるセルラーゼ生産には、液体培養法と固体培養法があり、一般的には簡易な液体培養法が行われている。これに対し本実施例では、高力価の酵素を生産する場合が多く、高重量の培地を振盪する動力の必要がない固体培養法を用いて、セルラーゼを効率良く生産することができた。また従来の液体培養と異なり、高重量の培地を震盪する曝気の動力の必要がなくなり、低消費エネルギーでの生産が実現される。さらに震盪による菌糸の破断を回避し、酵素の高生産量が期待できる。このように、固体培養により高品質なセルラーゼ酵素を安価に生産できる。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明に係る酵素の生産方法及び酵素生産装置並びにセルロース系バイオマス資源の糖化方法によれば、ペーパースラッジや麦わらなどのセルロース系バイオマス資源を用いてセルラーゼを生産でき、産業廃棄物の有効利用による環境負荷の低減が実現される。
【符号の説明】
【０１１５】
１００…酵素生産装置
１…タンク
２…生産菌適用部
３…ダクト
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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