(57)【要約】【課題】本発明の課題は、ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞の処理物を、細胞の増殖を伴わない条件下でニトリルヒドラターゼ活性を維持するだけでなく、一旦、低下したニトリルヒドラターゼ活性を向上する方法を提供することにある。【解決手段】本発明は、ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞の処理物を、細胞の増殖を伴わない条件下で酸化剤と接触させニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法、及び酸化剤と接触させた該細胞または該細胞の処理物を用い、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞の処理物を、細胞の増殖を伴わない条件下で酸化剤と接触させニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項２】
標準電極電位が標準水素電極に対して０．１〜２．１Ｖの範囲にある酸化剤を用いることを特徴とする請求項１記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項３】
酸化剤が酸素、過酸化水素、フェリシアン化カリウム及び過硫酸アンモニウムから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜２のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項４】
酸化剤である酸素が、酸素を含有したガスとして供給されることを特徴とする請求項３記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項５】
酸化剤の濃度が１重量ｐｐｍ〜１０重量％の範囲であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項６】
酸化剤を接触させる際の温度が０〜６０℃の範囲であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項７】
酸化剤を接触させる際のｐＨが５〜１０の範囲であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項８】
ニトリルヒドラターゼが分子内にコバルトを含むニトリルヒドラターゼであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項９】
遺伝子組換えにより分子内にコバルトを含むニトリルヒドラターゼを発現させた細胞または該細胞の処理物を、細胞の増殖を伴わない条件下で酸化剤と接触させることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項１０】
細胞がニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体または該微生物菌体の処理物である請求項１〜９のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項１１】
微生物菌体が遺伝子組換え微生物であることを特徴とする請求項１０記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項１２】
遺伝子組換え微生物が遺伝子組換え大腸菌であることを特徴とする請求項１１記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項１３】
遺伝子組換え大腸菌の宿主が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２由来Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、同ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）、同ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３２２３）または同ＷＡ８０２株（ＡＴＣＣ３３５２６）であることを特徴とする請求項１２に記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項１４】
ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞処理物が、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法に使用されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法により得られたニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞処理物を用い、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアクリルアミドの生産等、工業的に有用なニトリルヒドラターゼの活性の維持または向上させる方法に関する。ここでいう活性とは、実施例記載の方法で測定したニトリル水和活性である。
【０００２】
【従来の技術】
ニトリルヒドラターゼのニトリル水和活性は不安定で、経時的に低下し易い。このようなニトリルヒドラターゼのニトリル水和活性の経時的な低下を防止し、その活性を維持する方法として、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体または菌体処理物の懸濁液または溶液に、安定化剤としてニトリル類、アミド類、及び有機酸またはその塩類の中から選ばれた少なくとも１種の化合物を添加する方法が開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。
【０００３】
また、微生物菌体または菌体処理物を水性媒体に懸濁した状態で、該水性媒体が中性乃至弱塩基性で且つ１００ｍＭ乃至飽和濃度の無機塩類である保存方法も開示されている（例えば、特許文献３参照）。しかしながら、いずれの方法もニトリルヒドラターゼ活性の維持のみに効果があるだけであり、ニトリルヒドラターゼ活性をさらに高める効果については何ら報告されていない。
【０００４】
【特許文献１】
特公平５−４３３５１号公報
【特許文献２】
特公平４−４８４３５号公報
【特許文献３】
特開平８−１１２０８９号公報
【０００５】
一方、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体を培養により製造した後、得られた菌体または菌体処理物に何らかの処理をすることにより、ニトリル水和活性を高める方法としては、例えば得られたニトリルヒドラターゼ活性を有するグラム染色性が陽性である微生物菌体に光を照射する方法が開示されている（例えば、特許文献４参照）。しかしながら、この方法は培養によって得られた微生物菌体のニトリルヒドラターゼの活性を高めるのみに効果があるだけであり、一旦、ニトリルヒドラターゼ活性が低下した微生物菌体の活性を向上するものではない。またニトリルヒドラターゼ活性の維持とは無関係である。
【０００６】
【特許文献４】
特公平２−３５号公報
【０００７】
ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体を培養するときに、酸素が必要であり、また培養中の溶存酸素濃度を１ｐｐｍから飽和濃度に維持することで、菌体の生育が向上し、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性が高発現した菌体を得ることができることも報告されている（例えば、特許文献５参照）。しかしながら、この方法は培養時、すなわちニトリルヒドラターゼを含有する菌体が増殖する条件において、ニトリルヒドラターゼ活性の発現に培養液中の溶存酸素濃度の最適値が存在することを報告しているのみであり、ニトリルヒドラターゼを含有する菌体が増殖しない条件、すなわち培養の終了した以降のニトリルヒドラターゼ活性の維持及び活性の向上については何ら記載されていない。
【０００８】
【特許文献５】
特開２００２−１７３３９号公報
【０００９】
ニトリルヒドラターゼの活性の発現及び活性の低下の詳細な機構は必ずしも明確ではないが、例えばロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．Ｎ−７７１由来の鉄型ニトリルヒドラターゼのニトリル水和活性の低下は、空気中の酸素により、中心金属である非ヘム鉄（ＩＩＩ）に配位するシステインスルフ
ェン酸がシステインスルフィン酸に酸化されることによると記載されている（例えば、非特許文献１参照）。
【００１０】
あるいは例えばロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．Ｎ−７７１由来の鉄型ニトリルヒドラターゼは２−シアノ−２−プロピルヒドロキシペルオキシドという過酸化物により、中心金属である３価の鉄が２価に還元され、かつシステインスルフェン酸がシステインスルフィン酸に酸化されることにより、活性を失うと記載されている（例えば、非特許文献２参照）。
【００１１】
あるいはロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１由来の、中心金属がコバルトであるニトリルヒドラターゼの構造は未だ確定されてはいないものの、鉄型ニトリルヒドラターゼに類似すると予想されると記載されている（例えば、非特許文献３参照）。
【００１２】
【非特許文献１】
Ｍ．  Ｏｄａｋａ，  Ｍ．  Ｔｓｕｊｉｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｉ．  Ｅｎｄｏ：ＲＩＫＥＮ  Ｒｅｖｉｅｗ，  Ｎｏ．４１，  ｐ５８〜６０  （２００１）
【非特許文献２】
尾高雅文、辻村昌也、遠藤勲；  有機化学反応の新展開，  Ｎｏ．３，  ｐ１７〜２０  （２００１）
【非特許文献３】
Ｐ．  Ｋ．  Ｍａｓｃｈａｒａｋ，  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｎｏ．２２５，  ｐ２０１〜２１４  （２００２）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞の処理物を、細胞の増殖を伴わない条件下でニトリルヒドラターゼ活性を維持するだけでなく、一旦、低下したニトリルヒドラターゼ活性を向上する方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞処理物を、細胞の増殖を伴わない条件下で、酸化剤との接触によりニトリルヒドラターゼ活性の維持が可能であるだけでなく、一旦、ニトリルヒドラターゼ活性が低下した細胞または該細胞処理物であっても、それらを反応開始前または反応途中に酸化剤と接触させることにより、ニトリルヒドラターゼ活性を向上させることが可能であることを見出し、本発明に至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞の処理物を、細胞の増殖を伴わない条件下で酸化剤と接触させニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（２）標準電極電位が標準水素電極に対して０．１〜２．１Ｖの範囲にある酸化剤を用いることを特徴とする（１）記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（３）酸化剤が酸素、過酸化水素、フェリシアン化カリウム及び過硫酸アンモニウムから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする（１）〜（２）のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（４）酸化剤である酸素が、酸素を含有したガスとして供給されることを特徴とする（３）記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（５）酸化剤の濃度が１重量ｐｐｍ〜１０重量％の範囲であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（６）酸化剤を接触させる際の温度が０〜６０℃の範囲であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（７）酸化剤を接触させる際のｐＨが５〜１０の範囲であることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（８）ニトリルヒドラターゼが分子内にコバルトを含むニトリルヒドラターゼであることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（９）遺伝子組換えにより分子内にコバルトを含むニトリルヒドラターゼを発現させた細胞または該細胞の処理物を、細胞の増殖を伴わない条件下で酸化剤と接触させることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（１０）細胞がニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体または該微生物菌体の処理物である（１）〜（９）のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（１１）微生物菌体が遺伝子組換え微生物であることを特徴とする（１０）記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（１２）遺伝子組換え微生物が遺伝子組換え大腸菌であることを特徴とする（１１）記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（１３）遺伝子組換え大腸菌の宿主が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２由来Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、同ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）、同ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３２２３）または同ＷＡ８０２株（ＡＴＣＣ３３５２６）であることを特徴とする（１２）に記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（１４）ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞処理物が、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法に使用されることを特徴とする、（１）〜（１３）のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼ活性を維持または向上させる方法。
（１５）（１）〜（１４）のいずれかに記載の方法により得られたニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞処理物を用い、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
を提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の詳細について概説する。本発明にいうニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物のニトリル基を水和して対応するアミド化合物を生成する能力をもつ酵素をいう。本発明にいう細胞は微生物、植物細胞、動物細胞の何れであっても構わない。ニトリルヒドラターゼを含有する微生物としては、ニトリル化合物のニトリル基を水和して対応するアミド化合物を生成する能力を産出する微生物であれば、特に制限されるものではない。具体例としては、シュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＪＣＭ３０９５、アクロモバクター・キセロシス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｅｒｏｓｉｓ）ＩＦＯ１２６６８、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１等を挙げることができる。
【００１７】
また該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も含まれる。ここでいう任意の宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の他、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属細菌、酵母や放線菌、糸状菌等が挙げられる。遺伝子組換え大腸菌の宿主としては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２由来Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、同ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）、同ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３２２３）、同ＷＡ８０２株（ＡＴＣＣ３３５２６）株を挙げることができる。そのようなものの具体例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。
【００１８】
また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、薬剤耐性、温度耐性等を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も本発明の微生物に含まれる。
【００１９】
本発明の微生物は通常、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法を利用して調製される。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には２０〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で生育させ、続いて該微生物を遠心分離等によって培養液より分離することにより得られる。
【００２０】
本発明における細胞処理物は、上記菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離精製して得られる後分離物、該細胞や該細胞の抽出物、磨砕物、後分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニトリルヒドラターゼの活性を有している限りは本発明の細胞処理物に相当するものである。これらは単一の種類を用いてもよいし、２種類以上の異なる形態のものを同時あるいは交互に用いてもよい。
【００２１】
本発明における細胞の増殖しない条件としては、例えば、該細胞または該細胞の処理物を水、生理食塩水、またはリン酸塩等の緩衝剤、硫酸塩や炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、アミド化合物等を適当な濃度で溶解させた水溶液などに溶解ないし懸濁させた条件があげられる。また該細胞または該細胞処理物を用いてニトリル化合物からアミド化合物を製造するときの反応液もあげられる。あるいは、該微生物を培養によって生育させるとき、微生物の増殖における静止期以降や培養を停止させた培養液も含まれる。あるいは薬剤または熱により殺菌された培養液も含まれる。
【００２２】
本発明で使用される酸化剤は標準電極電位が標準水素電極に対して０．１〜２．１Ｖの範囲にある有機物質及び無機物質である。０．１Ｖ未満の物質には酸化剤としての能力が弱いため、ニトリルヒドラターゼ活性の維持及び活性化の効果が乏しい。また２．１Ｖを超える物質の場合、酸化剤としての能力が強すぎるため、ニトリルヒドラターゼが大きく変質してしまい、ニトリルヒドラターゼ活性をむしろ低下させるので好ましくない。そのような物質の例としては、化学便覧（日本化学会編）に一覧が記載されており、それらの中から単一の種類を用いてもよいし、２種類以上の物質を同時あるいは交互に用いてもよい。例えば、酸素、過酸化水素、フェリシアン化カリウム、過硫酸塩、過マンガン酸塩、過ヨウ素酸塩、過塩素酸及び過塩素酸塩、硝酸及び硝酸塩、セリウム（ＩＶ）塩などがあげられる。好ましくは、酸素、過酸化水素、フェリシアン化カリウム、過硫酸アンモニウムを酸化剤として用いるのがよい。さらに好ましくは、純酸素または酸素を空気として供給するのがよい。
【００２３】
本発明で使用される酸化剤は、該細胞または該細胞の処理物と一括して接触させてもよいし、逐次的に接触させてもよい。
【００２４】
酸化剤として酸素と接触させる場合には、酸素を含有したガスを供給する。供給源は空気、純酸素、空気と窒素またはその他のガスを一定割合で混合したガス、酸素と窒素またはその他のガスを一定割合で混合したガス、いずれを供給してもよい。ここでいうその他のガスとは窒素やアルゴン、ヘリウムなどの単一の種類を用いてもよいし、２種類以上のガスを混合して用いてもよいし、反応を阻害しないガスであれば特に制限はない。例えば撹拌槽で細胞または該細胞の処理物を水性媒体に懸濁する場合、ガスを撹拌槽の気相部に供給、パージしながら撹拌によって酸素を溶解させて供給することができる。あるいはガスをスパージャー分散させてガスを拡散させ、さらに撹拌により気液接触面積を増加させて供給することもできる。ここで供給するガスは、懸濁液中に雑菌が混入して腐敗することを防止するために除菌フィルターで除菌してから供給することが好ましい。
【００２５】
本発明において該細胞または該細胞の処理物をそのまま酸化剤と接触させてもよいが、通常、水性媒体に懸濁させた状態で酸化剤と接触させる。ここでいう水性媒体とは水を含む媒体であり、生理食塩水、またはリン酸塩等の緩衝剤、硫酸塩や炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、アミド化合物等を適当な濃度で溶解させた水溶液、あるいはニトリル化合物からアミド化合物を製造するときの反応液、及び静止期以降の培養液などを示す。
【００２６】
該細胞または該細胞の処理物の水性媒体に懸濁するときの濃度に特に制限はないが、通常は該細胞乾燥重量換算で、該水性媒体に対し０．１〜３０重量％の範囲とすればよい。
【００２７】
本発明でニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞の処理物に酸化剤を接触させる時の酸化剤の濃度は、ニトリルヒドラターゼ活性が維持または向上できる濃度であれば特に制限はないが、通常は該水性媒体に対し１重量ｐｐｍ〜１０重量％の範囲が好ましい。
【００２８】
本発明におけるニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞の処理物と酸化剤との接触温度は通常０〜６０℃である。好ましくは０〜５０℃、さらに好ましくは５〜４０℃である。また接触時のｐＨは通常５〜１０である。好ましくはｐＨ５〜９、さらに好ましくは６〜８である。
【００２９】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞処理物を、細胞の増殖を伴わない条件下で、酸化剤との接触によりニトリルヒドラターゼ活性の維持が可能であるだけでなく、一旦、ニトリルヒドラターゼ活性が低下した細胞または該細胞処理物であっても、それらを反応開始前または反応途中に酸化剤と接触させることにより、ニトリルヒドラターゼ活性を向上させることが可能である。従って、ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞処理物とこれら酸化剤との接触は、ニトリル水和反応の終了以前の任意の時点で行うことができる。
【００３０】
すなわち、該菌体または菌体処理物を反応に供する前に酸化剤と接触させてもよいし、あるいは該菌体または菌体処理物を反応に供したのちに、反応に酸化剤も供して該菌体または菌体処理物と酸化剤を接触させてもよい。しかしながら、反応に酸化剤を供した場合、ニトリル化合物の水和反応とは異なる副反応、例えばニトリル化合物が（メタ）アクリロニトリルの場合、ニトリル化合物自身、あるいは対応する生成物である（メタ）アクリルアミドが重合する可能性などがあるので、好ましくは該菌体または菌体処理物を反応に供する前に酸化剤と接触させるのがよい。
【００３１】
培養の終了した微生物の菌体もしくは菌体処理物を酸化剤と接触させて、ニトリルヒドラターゼに基づくニトリル水和活性を向上させたのち、該菌体もしくは菌体処理物をそのまま反応に供することができるが、必要に応じてこれらを洗浄した後、反応に供することもできる。例えば、該菌体もしくは菌体処理物を水性媒体へ懸濁させた状態で、酸化剤として酸素を接触させた場合には、ニトリル水和活性の向上が確認された後、窒素通気などで水性媒体中の溶存酸素を除去しても、ニトリル水和活性は保持されるので、その状態で反応に供することができる。
【００３２】
本発明において、ニトリル化合物の種類については特に限定されるものではなく、具体的には炭素数が２〜２０程度のニトリル化合物であり、広い範囲のニトリル、例えば脂肪族ニトリル、芳香族ニトリルなどが含まれる。脂肪族ニトリルとしては、炭素数２〜６の飽和または不飽和ニトリル、例えばアセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレルニトリル、イソバレロニトリル、カプロニトリルなどの脂肪族飽和モノニトリル類；マロノニトリル、サクシノニトリル、アジポニトリルなどの脂肪族飽和ジニトリル類；アクリロニトリル、メタクリロニトリル、クロトンニトリルなどの脂肪族不飽和ニトリルなどが挙げられる。
【００３３】
芳香族ニトリルとしては、ベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，及びｐ−クロロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，及びｐ−フルオロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，及びｐ−ニトロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，及びｐ−トルニトリル、ベンジルシアナイドなどが挙げられる。中でもアクリロニトリル、メタクリロニトリル、及びクロトンニトリル等が好適な例として挙げられる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。以下において、反応液のＨＰＬＣ分析は、ＨＰＬＣカラムとしてＵＬＴＲＯＮ  ８０ＨＧ（５０×８φｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用した。アクリルアミド及びアクリロニトリルは２２０ｎｍの吸光度により検出し、濃度を測定した。また溶存酸素濃度は、酸素電極（ＩｎＰｒｏ６８００／１２／３２０  メトラー・トレド社製）と溶存酸素濃度指示計（４０５０ｅ型  メトラー・トレド社製）によって測定したが、予め５％亜硫酸ナトリウム水溶液でゼロを、さらに予め十分に空気が飽和した１０℃の純水で飽和酸素濃度が１０．９２ｐｐｍを指示するように校正してから測定した。
【００３５】
実施例１
本実施例に使用するニトリルヒドラターゼを含有する細胞は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が大腸菌ＨＢ１０１株に導入され、三井化学株式会社が寄託しているＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５、特開平１１−２５３１６８号公報参照）を用いた。
【００３６】
本菌株の培養は３０Ｌの培養槽に下記の組成の培地１５．０Ｌを調整し、１２１℃、２０分間の高圧蒸気より滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンシピリンを添加した後、上記菌株を一白菌耳植菌し、３７℃、７００ｒｐｍにて２０時間培養した。また、この際、培養開始約１５時間後にＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度１００μｍｏｌ／Ｌになるよう添加し培養する。
【００３７】
2004350573.tif 000002
ｐＨ７．５
【００３８】
培養が終了し、菌体の増殖が停止した菌体懸濁液５００ｍＬを、酸素電極と温度計が取りつけられた１Ｌフラスコに移液した。内温１０℃を維持しながら、フラスコ気相部に空気を４００Ｎ−ｍｌ／ｍｉｎ通気、排気し撹拌した。保存０、２４時間後に菌体懸濁液の一部を取りだした。その間、該菌体懸濁液の溶存酸素濃度は１０．０〜１０．９ｐｐｍを指示していた。
【００３９】
予め内部を十分に窒素で置換された１００ｍｌの密栓可能なガラス容器で、該菌体懸濁液２３．０ｍｇを１０．０ｇの予め脱酸素された５０ｍＭトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．１）に懸濁し、この懸濁液に予め脱酸素されたアクリロニトリルをその終濃度が１９重量％になるように添加し、２０℃にて撹拌を行いながら２時間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を８０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて該菌体懸濁液の乾燥菌体重量濃度をもとめ、単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を算出した。保存０時間目の生成量を１とすると、２４時間目で１．１であり、この間ニトリルヒドラターゼのニトリル水和活性が安定に保持されていた。
【００４０】
実施例２
実施例１と同様にして得られた菌体の増殖が停止した菌体懸濁液５００ｍＬを、酸素電極と温度計が取りつけられた１Ｌフラスコに移液した。内温１０℃を維持しながら、フラスコ気相部に空気を４００Ｎ−ｍｌ／ｍｉｎと窒素４０００Ｎ−ｍｌ／ｍｉｎを混合通気、排気し撹拌した。保存０、２４時間後に菌体懸濁液の一部を取りだした。その間、該菌体懸濁液の溶存酸素濃度は１．０〜１．５ｐｐｍを指示していた。実施例１と同様にして該菌体懸濁液の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を求めた。保存０時間目の生成量を１とすると、２４時間目で１．０であり、この間ニトリルヒドラターゼのニトリル水和活性が安定に保持されていた。
【００４１】
比較例１
実施例１と同様にして得られた菌体の増殖が停止した菌体懸濁液５００ｍＬを、酸素電極と温度計が取りつけられた１Ｌフラスコに移液した。内温１０℃を維持しながら、フラスコ気相部に窒素を４００Ｎ−ｍｌ／ｍｉｎを通気、排気し撹拌し該菌体懸濁液を脱酸素した。保存０、１、３時間後に菌体懸濁液の一部を取りだした。その間、該菌体懸濁液の溶存酸素濃度は０．０ｐｐｍを指示していた。実施例１と同様にして該菌体懸濁液の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を求めた。保存０時間の生成量を１とすると、１時間目で０．４５、３時間目で０．２０であり、この間にニトリルヒドラターゼのニトリル水和活性が経時的に低下した。
【００４２】
比較例２
実施例１と同様にして得られた菌体の増殖が停止した菌体懸濁液５００ｍＬを、酸素電極と温度計が取りつけられた１Ｌフラスコに移液した。内温１０℃を維持しながら、フラスコ気相部に窒素を４００Ｎ−ｍｌ／ｍｉｎを通気、排気し撹拌した。実施例１と同様にして保存０時間後の該菌体懸濁液の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を求めた。保存１時間後に菌体懸濁液の一部を取りだし、菌体懸濁液を窒素雰囲気下で遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを懸濁液より分離し、湿菌体を得た。
【００４３】
予め内部を十分に窒素で置換された１００ｍｌの密栓可能なガラス容器で、上記で得られた湿菌体０．２０ｇを予め脱酸素された純水に懸濁し、総量２０．００ｇになるように調整した。該菌体懸濁液を、内温２０℃を維持しながら１５分間撹拌した。
【００４４】
予め内部を十分に窒素で置換された１００ｍｌの密栓可能なガラス容器で、該菌体懸濁液６６．０ｍｇを１０．０ｇの予め脱酸素された５０ｍＭトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．１）に懸濁し、この懸濁液に予め脱酸素されたアクリロニトリルをその終濃度が１９重量％になるように添加し、２０℃にて撹拌を行いながら４時間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を８０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて該菌体懸濁液の乾燥菌体重量濃度をもとめ、単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を算出した。保存１時間後に遠心分離によって得られた湿菌体の生成量を１．０とすると、保存０時間の生成量は２．９あり、比較例２で得た湿菌体はニトリルヒドラターゼ活性が低下したものであることを確認した。
【００４５】
実施例３〜９
実施例１と同様にして得られた菌体の増殖が停止した菌体懸濁液を遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを懸濁液より分離し、湿菌体を得た。得られた湿菌体０．２０ｇを、予め内部を十分に窒素で置換された１００ｍｌの密栓可能なガラス容器で、予め脱酸素された純水に懸濁し、さらに酸化剤としてフェリシアン化カリウムを下表１に示すような終濃度になるように添加、懸濁し、総量２０．００ｇになるように調整した。一方、酸化剤を添加しない菌体懸濁液も同様にして調整した。該菌体懸濁液を、内温２０℃を維持しながら１５分間撹拌した。
【００４６】
予め内部を十分に窒素で置換された１００ｍｌの密栓可能なガラス容器で、該菌体懸濁液６６．０ｍｇを１０．０ｇの予め脱酸素された５０ｍＭトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．１）に懸濁し、この懸濁液に予め脱酸素されたアクリロニトリルをその終濃度が１９重量％になるように添加し、２０℃にて撹拌を行いながら４時間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を８０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて該菌体懸濁液の乾燥重量濃度をもとめ、単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を算出した。酸化剤を添加しない場合の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を１．０として、実施例３〜９の生成量を相対値で下表１に示す。
【００４７】
実施例１０〜１１
実施例３でフェリシアン化カリウムを使用する代わりに、酸化剤として過硫酸アンモニウムを下表１に示すような終濃度になるように添加、懸濁した以外は同様にして単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を求めた。酸化剤を添加しない場合の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を１．０として、実施例１０〜１１の生成量を相対値で下表１に示す。
【００４８】
実施例１２
実施例３でフェリシアン化カリウムを使用する代わりに、酸化剤として過酸化水素が下表１に示すような終濃度になるように３０重量％過酸化水素水を添加、懸濁した以外は同様にして単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を求めた。酸化剤を添加しない場合の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を１．０として、実施例１２の生成量を相対値で下表１に示す。
【００４９】
【表１】
2004350573.tif 000003
【００５０】
上記の結果から、微生物菌体をフェリシアン化カリウム、過酸化水素、過硫酸アンモニウムのような酸化剤と接触させると、ニトリルヒドラターゼのニトリル水和活性が向上することがわかる。
【００５１】
実施例１３
実施例３と同様にして得られた湿菌体０．２０ｇを、予め内部を十分に窒素で置換された１００ｍｌの密栓可能なガラス容器で、予め脱酸素された純水に懸濁し、さらに酸化剤としてフェリシアン化カリウムを終濃度０．７７重量％になるように添加、懸濁し、総量２０．００ｇになるように調整した。該菌体懸濁液を、内温２０℃を維持しながら撹拌した。撹拌開始後０時間、１０分間、２時間、２４時間経過した時点で、該菌体懸濁液を少量採取し、実施例３と同様にして単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を算出した。撹拌開始０時間目の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を１として、撹拌開始後１０分間、２時間、２４時間目の生成量を相対値で下表２に示す。
【００５２】
【表２】
2004350573.tif 000004
【００５３】
上記の結果から、微生物菌体をフェリシアン化カリウムのような酸化剤と接触させるとき、接触時間によってニトリルヒドラターゼのニトリル水和活性が向上するとともに向上した活性が維持されることがわかる。
【００５４】
実施例１４
実施例３と同様にして湿菌体を得た。続いて酸素電極と温度計が取りつけられた１００ｍｌフラスコで、上記で得られた湿菌体１．５ｇを４８．５ｇの純水に懸濁した。内温１０℃を維持しながら、フラスコ気相部に空気を４０Ｎ−ｍｌ／ｍｉｎ通気、排気し撹拌した。保存０、１、２、３、７、１９日後に菌体懸濁液の一部を採取した。その間、該菌体懸濁液の溶存酸素濃度は１０．０〜１０．９ｐｐｍを指示していた。採取した該菌体懸濁液は実施例３と同様にして単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を求めた。保存０日目の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を１として、保存１、２、３、７、１９日目の生成量を相対値で下表３に示す。
【００５５】
実施例１５
実施例３と同様にして湿菌体を得た。続いて酸素電極と温度計が取りつけられた１００ｍｌフラスコで、上記で得られた湿菌体１．５ｇを４８．５ｇの純水に懸濁した。内温１０℃を維持しながら、フラスコ気相部に空気を４０Ｎ−ｍｌ／ｍｉｎと窒素４００Ｎ−ｍｌ／ｍｉｎを混合通気、排気し撹拌した。保存０、１、２、３、７、１９日後に菌体懸濁液の一部を採取した。その間、該菌体懸濁液の溶存酸素濃度は１．０〜１．５ｐｐｍを指示していた。採取した該菌体懸濁液は実施例３と同様にして単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を求めた。保存０日目の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を１として、保存１、２、３、７、１９日目の生成量を相対値で下表３に示す。
【００５６】
【表３】
2004350573.tif 000005
【００５７】
上記の結果から、微生物菌体に酸化剤として酸素を接触させると、接触時間によってニトリルヒドラターゼのニトリル水和活性が向上し、ある経過時間以降はニトリル水和活性が高い状態で安定に保持されることがわかる。
【００５８】
実施例１６〜１８
実施例３と同様にして得られた湿菌体０．２０ｇを、予め内部を十分に窒素で置換された１００ｍｌの密栓可能なガラス容器で、予め脱酸素された純水に懸濁し、さらに酸化剤としてフェリシアン化カリウムを終濃度２．０重量％になるように添加、次いで水酸化ナトリウム水溶液または硫酸で下表５に示すようなｐＨになるように調整し、総量２０．００ｇになるように調整した。一方、酸化剤の添加、ｐＨ調整をしない菌体懸濁液も同様にして調整した。該菌体懸濁液を、内温２０℃を維持しながら１５分間撹拌した。実施例３と同様にして単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を算出した。酸化剤の添加、ｐＨ調整をしない場合の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を１として、実施例１６〜１８の生成量を相対値で下表４に示す。
【００５９】
【表４】
2004350573.tif 000006
【００６０】
実施例１９〜２１
実施例３と同様にして得られた湿菌体０．２０ｇを、予め内部を十分に窒素で置換された１００ｍｌの密栓可能なガラス容器で、予め脱酸素された純水に懸濁し、さらに酸化剤としてフェリシアン化カリウムを終濃度２．０重量％になるように添加、懸濁し、総量２０．００ｇになるように調整した。一方、酸化剤を添加しない菌体懸濁液も同様にして調整した。該菌体懸濁液を、内温が下表６の温度を維持するように１５分間撹拌した。実施例３と同様にして単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を算出した。酸化剤を添加せず内温２０℃で懸濁させた場合の単位乾燥菌体重量あたりのアクリルアミド生成量を１として、実施例１９〜２１の生成量を相対値で下表５に示す。
【００６１】
【表５】
2004350573.tif 000007
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼを含有する細胞または該細胞の処理物を、簡便な方法で、細胞の増殖を伴わない条件下でニトリルヒドラターゼ活性を維持するだけでなく、一旦、低下したニトリルヒドラターゼ活性を向上することができるので、工業的にも有利である。