(57)【要約】      （修正有）【課題】損傷組織の修復または再生、および組織修復を促進するための幹細胞のような細胞のターゲティングを改善する方法を提供する。【解決手段】治療用途を有する二重特異性融合タンパク質ならびにこのような融合タンパク質を含む医薬組成物およびこのような融合タンパク質を損傷または疾患組織修復または再生のために使用する方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性タンパク質であって、
ａ)組織の細胞の外表面と関連する標的分子に結合特異性を有するターゲティングドメイン；および
ｂ)組織の細胞の表面と関連する受容体に結合特異性を有する改変アクティベータードメインであって、野生型アクティベータードメインのアミノ酸配列の修飾アミノ酸配列を有し、野生型アクティベータードメインに対して受容体活性化を減少させる、改変アクティベータードメイン
を含み、
受容体または下流エフェクター分子のリン酸化により測定して、標的分子を含まない細胞と比較して、標的分子を含む細胞に少なくとも２倍強い受容体活性化を示す、二重特異性タンパク質。
【請求項２】
改変アクティベータードメインが、欠失、置換、付加、Ｎおよび／またはＣ末端への付加的アミノ酸配列またはこれらの組み合わせを含むように修飾された野生型アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項３】
ＡＫＴのリン酸化により測定して、二重特異性タンパク質標的分子を含まない細胞と比較して、標的分子を含む細胞に少なくとも２倍強い受容体活性化を示す、請求項１または請求項２に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項４】
さらに半減期モジュレーターを含み、ここで、半減期モジュレーターが二重特異性タンパク質の半減期を延長する、請求項１または請求項２に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項５】
半減期モジュレーターがヒト血清アルブミン、Ｆｃ、ｓｃＦｃ、アルブミン結合ドメイン、ＰＡＳ化、ヒトアルファ−フェトタンパク質、またはそのバリアントの配列を含む、請求項４に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項６】
組織再生、細胞生存、細胞分化を促進し、アポトーシスを阻害し、細胞増殖を誘発し、細胞成長を促進し、幹細胞の運動性を促進し、幹細胞の分化を促進し、細胞損傷を予防しおよび／または血管形成を促進する、請求項１または請求項２に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項７】
組織が心組織、腎組織、骨、軟骨、関節、皮膚、肝組織、膵臓組織、血液細胞、肺組織、脳組織、および神経組織である、請求項１または請求項２に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項８】
改変アクティベータードメインが改変増殖因子を含む、請求項１または請求項２に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項９】
改変アクティベータードメインがＩＧＦ−１のバリアントまたはＮＲＧのバリアントを含む、請求項８に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１０】
ターゲティングドメインがアネキシンＡ５またはそのバリアントを含む、請求項１または請求項２に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１１】
ネキシンＡ５が配列番号１〜４、１２２の何れかに示すアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１２】
改変アクティベータードメインが配列番号１８、１９、２３、２４、２８、２９、または１２０の何れかに示すアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１３】
半減期モジュレーターが配列番号５４〜５６、または１２４の何れかに示すアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１４】
さらに改変アクティベータードメインを半減期モジュレーターに結合させるコネクターおよび半減期モジュレーターをターゲティングドメインに結合させるコネクターを含む、請求項４に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１５】
(１)ＩＧＦ−１のバリアントを含むアクティベータードメインおよび(２)アネキシンＡ５またはそのバリアントを含むターゲティングドメインを含む二重特異性タンパク質であって、ここで、アネキシンＡ５またはそのバリアントは、損傷組織内の細胞の外表面でホスファチジルセリンと結合し、ここで、二重特異性タンパク質は健常細胞(ＥＣ５０健常)より低い損傷細胞(ＥＣ５０損傷)における半数効果濃度を有する、二重特異性タンパク質。
【請求項１６】
損傷組織が虚血性組織である、請求項１５に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１７】
ＩＧＦ−１バリアントが少なくとも１０：１のＥＣ５０健常／ＥＣ５０損傷比を有する、請求項１５または請求項１６に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１８】
ＩＧＦ−１バリアントが配列番号１０〜３０または１２０の何れかに示すアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１９】
ＩＧＦ−１バリアントがＡＫＴのリン酸化を誘発する、請求項１５または請求項１６に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項２０】
アネキシンＡ５が配列番号１〜４または１２２の何れかに示すアミノ酸配列を有する、請求項１５または請求項１６に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項２１】
さらにペプチドリンカーを含む、請求項１５または請求項１６に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項２２】
ペプチドリンカーは半減期モジュレーターである、請求項２１に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項２３】
半減期モジュレーターがヒト血清アルブミン、Ｆｃフラグメントまたはそのバリアントである、請求項２２に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項２４】
ヒト血清アルブミンまたはそのバリアントが配列番号５４〜５６または１２４の何れかに示すアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項２５】
ヒトアネキシンＡ５の非内部移行バリアントのアミノ酸配列を含み、ここで、二重特異性タンパク質が、野生型ヒトアネキシンＡ５のアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質と比較して延長した半減期を有する、請求項１５または請求項１６に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項２６】
配列番号４に示すアミノ酸配列を有するターゲティングドメインおよび配列番号１２０に示すアミノ酸配列を有するアクティベータードメインを含む、請求項１５または請求項１６に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項２７】
配列番号６７、７０、７３〜８６、１０８、１１０、１１６または１１８の何れかに示すアミノ酸配列を含む、二重特異性タンパク質。
【請求項２８】
請求項１に記載の二重特異性タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
対象における組織再生または生存を促進する方法であって、
(ａ)組織の第一細胞の外表面と関連する標的分子に結合特異性を有するターゲティングドメインおよび組織の第二細胞の表面と関連する受容体に結合特異性を有する改変アクティベータードメインを有する二重特異性タンパク質を提供し、ここで、改変アクティベータードメインは野生型アクティベータードメインのアミノ酸配列の修飾アミノ酸配列を有し、ここで、改変アクティベータードメインは、野生型アクティベータードメインに対して受容体活性化を減少させ、そして
(ｂ)処置を必要とする患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与することを含み、ここで、ターゲティングドメインが組織の第一細胞に二重特異性融合タンパク質を標的化し、それによりアクティベータードメインが第二細胞の表面で増殖因子受容体に曝されたとき、アクティベータードメインは組織再生を促進するように増殖因子受容体を特異的に活性化し、
ここで、受容体または下流エフェクター分子のリン酸化により測定して、二重特異性タンパク質標的分子を含まない細胞と比較して、標的分子を含む細胞に少なくとも２倍強い受容体活性化を示す、方法。
【請求項３０】
ターゲティングドメインおよびアクティベータードメインが組織の同じ細胞の表面と関連する分子と結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ターゲティングドメインおよびアクティベータードメインが組織の異なる細胞の表面と関連する分子と結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
組織が心組織、腎組織、骨、軟骨、関節、皮膚、肝組織、膵臓組織、血液細胞、肺組織、脳組織、または神経組織である、請求項２９、３０および３１の何れかに記載の方法。
【請求項３３】
対象における組織再生または生存を促進する方法であって、
(ａ)(１)ＩＧＦ−１のバリアントを含むアクティベータードメイン、(２)アネキシンＡ５またはそのバリアントを含むターゲティングドメインを有する二重特異性タンパク質を提供し、そして
(ｂ)処置を必要とする患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与することを含み、ここで、アネキシンＡ５またはそのバリアントは、組織の第一細胞に二重特異性融合タンパク質を標的化し、ここで、細胞は原形質膜の外葉にホスファチジルセリンを発現し、それによりＩＧＦ−１バリアントが第二細胞の表面のＩＧＦ−１受容体に曝されたとき、ＩＧＦ−１バリアントは、組織再生が促進されるようにＩＧＦ−１受容体を特異的に活性化する、方法。
【請求項３４】
アネキシンＡ５またはそのバリアントおよびＩＧＦ−１バリアントが異なる組織の同じ細胞の表面と関連する分子と結合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
アネキシンＡ５またはそのバリアントおよびＩＧＦ−１バリアントが異なる組織の異なる細胞の表面と関連する分子と結合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
二重特異性タンパク質が健常細胞(ＥＣ５０健常)より低い損傷細胞(ＥＣ５０損傷)における半数効果濃度を有する、請求項３３、３４および３５の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月２日出願の米国仮出願６２／２３６,１６９号、２０１５年１０月６日出願の米国仮出願６２／２３７,８８９号、２０１６年４月１５日出願の米国仮出願６２／３２２,９１０号の利益およびこれに基づく優先権を主張し、これら各々を、全体として本明細書に引用により包含させる。
【０００２】
合衆国政府の助成による研究に関する陳述
本発明は、連絡番号１Ｒ４３ＨＬ１２４６７８−０１Ａ１の下、アメリカ国立衛生研究所(ＮＩＨ)ＳＢＩＲプログラムにより与えられた政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表に関する言及
本明細書は、本明細書と共に提供する配列表を含み、これは、２０１６年９月３０日に作成された、４１３,８４７バイトの132463-010304/PCT_ST25.txtなる名称のファイルを含み、その内容を引用により本明細書に包含させる。
【０００４】
技術分野
本発明は、一般に治療用途を有するタンパク質、より具体的に二重特異性タンパク質、このようなタンパク質を含む医薬組成物、および損傷組織修復のためのこのようなタンパク質の使用法に関する。
【背景技術】
【０００５】
背景
組織再生は、疾患または損傷組織の生物学的機能の回復を目的とする、広域科学である。組織再生は、心筋梗塞のような重要な臨床問題に取り組む。心臓発作として一般に知られる心筋梗塞は、冠動脈閉塞が心臓の一部への血液供給を遮断するときに起こる。結果としての酸素欠乏が、心臓が十分な内因性再生プログラムの活性化および自己修復をなし得ないことによる、不可逆的組織損傷(壊死およびアポトーシス)を引き起こす。このような組織損傷は、心臓がもはや効率的に血液をポンプ輸送できず、急性腎傷害をもたらし得る状態である、うっ血性心不全の主原因である。米国において、心臓発作は毎年１００万名を超え、５００万名近くがうっ血性心不全に罹患する。
【０００６】
損傷心組織を再生する有効な処置はない。うっ血性心不全の現在の治療は、不整脈、動脈硬化症進行および心筋梗塞再発の予防に焦点が絞られているが、根底の組織損傷には取り込まれていない。うっ血性心不全と診断された患者の半分以上が、診断から５年以内に死亡する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、損傷組織の修復または再生、および組織修復を促進するための幹細胞のような細胞のターゲティングの改善のための方法が必要とされる。本発明はこれらの要求を満たし、他の関連する利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の簡単な概要
本発明は、二重特異性治療用タンパク質、二重特異性融合タンパク質をコードする核酸分子および組織生存、および／または損傷組織の再生促進のためにこのような二重特異性治療用タンパク質を用いる治療法を提供する。
【０００９】
ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質は組織再生、細胞生存、細胞分化を誘発し、アポトーシスを阻害し、細胞増殖を誘発し、細胞成長を促進し、幹細胞の運動性を促進し、幹細胞の分化を促進し、細胞損傷を阻止しおよび／または血管形成を促進する。ある実施態様において、組織は心組織、腎組織、骨、軟骨、関節、皮膚、肝組織、膵臓組織、血液細胞、肺組織、脳組織、および神経組織であり得る。
【００１０】
他の態様において、本発明は、生理学的に許容される担体と組み合わせて二重特異性タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
なおさらなる態様の範囲内で、医薬組成物を病的組織損傷を有する患者に投与し、それにより患者における病的組織損傷を減退させることを含む、患者における病的組織損傷を処置する方法が提供される。
【００１２】
ある態様において、本発明は、(１)組織の細胞の外表面と関連する標的分子に結合特異性を有するターゲティングドメイン、および(２)組織の細胞の表面と関連する受容体に結合特異性を有する改変アクティベータードメインを含む二重特異性タンパク質を提供し、ここで、改変アクティベータードメインは野生型アクティベータードメインのアミノ酸配列の修飾アミノ酸配列を有し、ここで、改変アクティベータードメインは、野生型アクティベータードメインに対して受容体活性化を減少させる。ある実施態様において、アクティベータードメインは、野生型アクティベータードメインに対して受容体活性化が少なくとも３.５倍低減されるように修飾される。ある態様において、アクティベータードメインは、二重特異性タンパク質におけるターゲティングドメインと結合したとき、受容体または下流エフェクター分子のリン酸化により測定して、標的分子を含まない細胞と比較して、標的分子を含む細胞に少なくとも２倍強い受容体活性化を示す。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、ＡＫＴのリン酸化により測定して、標的分子を含まない細胞と比較して、標的分子を含む細胞に少なくとも２倍強い受容体活性化を示す。
【００１３】
ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、欠失、置換、付加、Ｎおよび／またはＣ末端への付加的アミノ酸配列またはこれらの組み合わせを含むように修飾された野生型アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、改変アクティベータードメインは非免疫原性タンパク質に融合した野生型アクティベータードメインを含む。ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、非免疫原性タンパク質に融合した野生型アクティベータードメインのアミノ酸配列の修飾アミノ酸配列を含む。
【００１４】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質はさらに半減期モジュレーターを含み、ここで、半減期モジュレーターは、二重特異性タンパク質の半減期を延長させる。半減期モジュレーターは、ヒト血清アルブミン、Ｆｃ、ｓｃＦｃ、アルブミン結合ドメイン、ＰＡＳ化、ヒトアルファ−フェトタンパク質、またはそのバリアントの配列を含み得る。
【００１５】
ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、増殖因子受容体に結合親和性を有する。
【００１６】
ある実施態様において、アクティベータードメインおよびターゲティングドメインは、組み換えにより融合される。さらに他の実施態様において、アクティベータードメインおよびターゲティングドメインは化学的にカップリングまたは結合させる。
【００１７】
ある実施態様において、改変アクティベータードメインは増殖因子を含む。ある実施態様において、増殖因子はＩＧＦ−１、ＮＲＧ、またはそのバリアントである。
【００１８】
ある実施態様において、ターゲティングドメインはアネキシンＡ５またはそのバリアントを含む。ある実施態様において、アネキシンＡ５は、配列番号１〜４または１２２の何れかに示すアミノ酸配列を含む。
【００１９】
ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、ＩＧＦ−１(ＬＲ３−Ｙ３１Ａ)を含む。ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、配列番号１８、１９、２３、２４、２８、２９、または１２０の何れかに示すアミノ酸配列を含む。
【００２０】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、ヒト血清アルブミンまたはそのバリアントである。ある実施態様において、ヒト血清アルブミンは、配列番号５４〜５６または１２４の何れかに示すアミノ酸配列を含む。
【００２１】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、Ｆｃまたはそのバリアントを含む。ある実施態様において、Ｆｃは、配列番号５３の何れかに示すアミノ酸配列を含む。
【００２２】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、改変アクティベータードメインを半減期モジュレーターに結合させるコネクターおよび半減期モジュレーターをターゲティングドメインに結合させるコネクターを含む。ある実施態様において、コネクターは、配列番号６０〜６２または１２６〜１２７の何れかに示すアミノ酸配列を含む。
【００２３】
ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、ターゲティングドメインのアミノ末端にペプチド結合により結合され得る。ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、ターゲティングドメインのカルボキシ末端にペプチド結合により結合され得る。
【００２４】
ある態様において、二重特異性タンパク質は、(１)増殖因子を含むアクティベータードメイン、(２)損傷細胞の外表面でホスファチジルセリンに結合するポリペプチドを含むターゲティングドメインを含み、二重特異性タンパク質は、損傷細胞(ＥＣ５０損傷)における半数効果濃度が健常細胞(ＥＣ５０健常)よりも低い。ある実施態様において、損傷細胞は、アポトーシスまたは壊死を受ける細胞であり得る。ある実施態様において、増殖因子は、修飾ＩＧＦ−１タンパク質(ここではＩＧＦ−１のバリアントとも称する)である。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントを含む二重特異性タンパク質は、少なくとも１０：１のＥＣ５０健常／ＥＣ５０損傷比を有する。
【００２５】
ある実施態様において、アクティベータードメインは、ＩＧＦ−１のバリアントを含む。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、ヒトアネキシンＡ５またはそのバリアントを含む。ある実施態様において、アクティベータードメインはＩＧＦ−１のバリアントを含みターゲティングドメインは、ヒトアネキシンＡ５またはそのバリアントを含む。
【００２６】
ある態様において、二重特異性タンパク質は、(１)ＩＧＦ−１のバリアントを含むアクティベータードメイン、(２)アネキシンＡ５またはそのバリアントを含むターゲティングドメインを含み、ここで、アネキシンＡ５またはそのバリアントは、損傷組織内の細胞の外表面でホスファチジルセリンと結合し、ここで、二重特異性タンパク質は、損傷細胞(ＥＣ５０損傷)における半数効果濃度が健常細胞(ＥＣ５０健常)よりも低い。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、ＡＫＴのリン酸化を誘発する。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントを含む二重特異性タンパク質は、少なくとも１０：１のＥＣ５０健常／ＥＣ５０損傷比を有する。
【００２７】
ある実施態様において、損傷組織は虚血性組織である。ある実施態様において、標的化細胞はアポトーシスまたは壊死性細胞である。
【００２８】
ある実施態様において、損傷組織は、糖尿病が原因の糖尿病性組織損傷である。ある実施態様において、損傷組織は、糖尿病性腎症が原因の糖尿病性組織損傷である。ある実施態様において、損傷組織はポドサイト関連障害が原因である。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、ネフリン(ＮＰＨＳ１)、ポドプラニン(ＰＤＰＮ)、ポドカリキシン(ＰＯＤＸＬ)、ジストログリカン(ＤＡＧ１)、ＧＬＥＰＰ１(ＰＴＰＲＯ)、ＮＥＰＨ１(ＫＩＲＲＥＬ)、ＦＡＴ非定型カドヘリン１(ＦＡＴ１)、富システイン型膜貫通ＢＭＰ制御因子１(ＣＲＩＭ１)、インテグリンアルファ−８／ベータ１(ＩＴＧＡ８)のようなポドサイトタンパク質を結合できる。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、配列番号１０〜３０または１２０の何れかに示すアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、ＩＧＦ−１受容体への結合により生存シグナル伝達を誘発する。
【００２９】
ある実施態様において、ターゲティングドメインは、ホスファチジルセリンを結合できる分子を含む。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、アネキシンＡ５を含む。ある実施態様において、アネキシンＡ５は、配列番号１〜４または１２２の何れかに示すアミノ酸配列を有する。
【００３０】
ある実施態様において、ターゲティングドメインは、ネフリン(ＮＰＨＳ１)、ポドプラニン(ＰＤＰＮ)、ポドカリキシン(ＰＯＤＸＬ)、ジストログリカン(ＤＡＧ１)、ＧＬＥＰＰ１(ＰＴＰＲＯ)、ＮＥＰＨ１(ＫＩＲＲＥＬ)、ＦＡＴ非定型カドヘリン１(ＦＡＴ１)、富システイン型膜貫通ＢＭＰ制御因子１(ＣＲＩＭ１)、インテグリンアルファ−８／ベータ１(ＩＴＧＡ８)のようなポドサイトタンパク質と結合できる分子を含む。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、ネフリン(ＮＰＨＳ１)、ポドプラニン(ＰＤＰＮ)、ポドカリキシン(ＰＯＤＸＬ)、ジストログリカン(ＤＡＧ１)、ＧＬＥＰＰ１(ＰＴＰＲＯ)、ＮＥＰＨ１(ＫＩＲＲＥＬ)、ＦＡＴ非定型カドヘリン１(ＦＡＴ１)、富システイン型膜貫通ＢＭＰ制御因子１(ＣＲＩＭ１)、インテグリンアルファ−８／ベータ１(ＩＴＧＡ８)のようなポドサイトタンパク質と結合できる抗体を含む。
【００３１】
ある実施態様において、アクティベータードメインおよびターゲティングドメインは、単一ポリペプチドを形成するようにペプチド結合により共有結合される。
【００３２】
ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントおよびアネキシンＡ５またはそのバリアントは、単一ポリペプチドを形成するようにペプチド結合により共有結合される。ある実施態様において、ＩＧＦ−１のバリアントおよびアネキシンＡ５またはそのバリアントは、単一ポリペプチドを形成するようにペプチド結合によりペプチドリンカーに共有結合される。
【００３３】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらにペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、ペプチドリンカーは半減期モジュレーターである。ある実施態様において、半減期モジュレーターはヒト血清アルブミンまたはそのバリアントである。ある実施態様において、半減期モジュレーターはＦｃフラグメントまたはそのバリアントである。ある実施態様において、ヒト血清アルブミンまたはそのバリアントは、配列番号５４〜５６または１２４の何れかに示すアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、Ｆｃフラグメントは、配列番号５３に示すアミノ酸配列を有する。
【００３４】
ある実施態様において、アクティベータードメインはペプチドリンカーのアミノ末端に結合され、ターゲティングドメインはペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合される。ある実施態様において、アクティベータードメインはペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合され、そのターゲティングドメインはペプチドリンカーのアミノ末端に結合される。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらにアクティベータードメインとペプチドリンカーの間のペプチドコネクターターゲティングドメインとペプチドリンカーの間のペプチドコネクターを含む。
【００３５】
ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントはペプチドリンカーのアミノ末端に結合され、アネキシンＡ５またはそのバリアントはペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合される。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントはペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合され、アネキシンＡ５またはそのバリアントはペプチドリンカーのアミノ末端に結合される。
【００３６】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、ＩＧＦ−１バリアントとペプチドリンカーの間のペプチドコネクターおよびアネキシンＡ５またはそのバリアントとペプチドリンカーの間のペプチドコネクターをさらに含む。
【００３７】
ある実施態様において、ペプチドコネクターは、配列番号６０〜６２または１２６〜１２７の何れかに示すアミノ酸配列を有する。
【００３８】
本発明のある態様において、改変タンパク質は、配列番号８４に記載のアミノ酸配列を有する。本発明のある態様において、核酸は、配列番号１０２に記載の配列を有する。
【００３９】
本発明のある態様において、改変タンパク質は、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有する。本発明のある態様において、核酸は、配列番号１１９に記載の配列を有する。
【００４０】
本発明の態様は、(１)配列番号１８、１９、２３、２４、２８、２９または１２０の何れかに示すアミノ酸配列を含むＩＧＦ−１バリアントおよび(２)配列番号１〜４または１２２の何れかに示すアミノ酸配列を含むアネキシンＡ５またはそのバリアントを含む、二重特異性タンパク質に関する。
【００４１】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、配列番号５４〜５６または１２４の何れかに示すアミノ酸配列を含むヒト血清アルブミンまたはそのバリアントを含む。ある実施態様において、ヒト血清アルブミンまたはそのバリアントは、アネキシンＡ５またはそのバリアントのＣ末端およびＩＧＦ−１バリアントのＮ末端に結合される。
【００４２】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらにヒト血清アルブミンまたはそのバリアントのＮ末端をアネキシンＡ５またはそのバリアントのＣ末端に結合させるコネクターペプチドおよびヒト血清アルブミンまたはそのバリアントのＣ末端をＩＧＦ−１バリアントのＮ末端に結合させるペプチドを含む。ある実施態様において、コネクターペプチドは、配列番号６０〜６２または１２６〜１２７の何れかに示すアミノ酸配列を含む。
【００４３】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらに、リーダーポリペプチドを含む。
【００４４】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらに、ポリペプチド親和性タグを含む。ある実施態様において、親和性タグは、融合タンパク質のアミノ末端、融合タンパク質のカルボキシ末端、または融合タンパク質の中央にある。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、ヒスチジン含有ポリペプチドを含む。
【００４５】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、ヒトアネキシンＡ５の非内部移行バリアントのアミノ酸配列を含み、二重特異性タンパク質は、野生型ヒトアネキシンＡ５のアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質と比較して延長した半減期を有する。例えば、二重特異性タンパク質は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。
【００４６】
本発明の態様は、配列番号６７、７０、７３〜８６、１０８、１１０、１１６、または１１８の何れかに示すアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質に関する。
【００４７】
ここに提供する二重特異性タンパク質は、必ずしも２結合特異性に限定されない。ある実施態様において、ターゲティングドメインに加えて、二重特異性タンパク質は、直接的にまたはペプチド結合により間接的に結合する２以上のアクティベータードメインを含む。ある実施態様において、アクティベータードメインに加えて、二重特異性タンパク質直接的にまたはペプチド結合により間接的に結合する２以上のターゲティングドメインを含む。
【００４８】
本発明の態様は対象における組織再生または生存を促進する方法に関し、方法は、二重特異性タンパク質の治療有効量を処置を必要とする患者に投与し、ここで、ターゲティングドメインは損傷組織の損傷細胞と関連する標的分子に特異的に結合し、それにより二重特異性融合タンパク質を損傷組織にターゲティングし、ここで、アクティベータードメインの増殖因子受容体への暴露により、アクティベータードメインが、損傷組織の再生または生存が促進されるように増殖因子受容体を特異的に活性化することを含む。
【００４９】
本発明の態様は、処置を必要とする患者の処置法に関し、方法は二重特異性を提供し、患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与し、ここで、二重特異性タンパク質は、組織の細胞の原形質膜の外葉上のホスファチジルセリンおよび組織の細胞の表面のＩＧＦ−１増殖因子受容体に結合する。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、組織の同じ細胞の表面と関連する分子と結合する。他の実施態様において、二重特異性タンパク質は、組織の異なる細胞の表面と関連する分子と結合する。
【００５０】
本発明の態様は、対象における組織再生または生存を促進する方法に関し、方法は、(ａ)組織の第一細胞の外表面と関連する標的分子に結合特異性を有するターゲティングドメインおよび組織の第二細胞の表面と関連する受容体に結合特異性を有する改変アクティベータードメインを有する二重特異性タンパク質を提供し、ここで、改変アクティベータードメインは野生型アクティベータードメインのアミノ酸配列の修飾アミノ酸配列を有し、ここで、改変アクティベータードメインは、野生型アクティベータードメインに対して受容体活性化を減少させ、そして(ｂ)処置を必要とする患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与することを含み、ここで、ターゲティングドメインが組織の第一細胞に二重特異性融合タンパク質を標的化し、それによりアクティベータードメインが第二細胞の表面で増殖因子受容体に曝されたとき、アクティベータードメインは組織再生を促進するように増殖因子受容体を特異的に活性化し、ここで、受容体または下流エフェクター分子のリン酸化により測定して、二重特異性タンパク質標的分子を含まない細胞と比較して、標的分子を含む細胞に少なくとも２倍強い受容体活性化を示すことを含む。ある実施態様において、第一細胞はアポトーシスまたは壊死性細胞である。
【００５１】
本発明の態様は、対象における組織再生または生存を促進する方法に関し、方法は、(ａ)(１)ＩＧＦ−１のバリアントを含むアクティベータードメイン、(２)アネキシンＡ５またはそのバリアントを含むターゲティングドメインを有する二重特異性タンパク質を提供し、そして(ｂ)処置を必要とする患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与し、ここで、アネキシンＡ５またはそのバリアントは、組織の第一細胞に二重特異性融合タンパク質を標的化し、ここで、細胞は原形質膜の外葉にホスファチジルセリンを発現し、それによりＩＧＦ−１バリアントが第二細胞の表面のＩＧＦ−１受容体に曝されたとき、ＩＧＦ−１バリアントは、組織再生が促進されるようにＩＧＦ−１受容体を特異的に活性化することを含む。
【００５２】
ある実施態様において、標的化細胞および活性化細胞は同じである。さらに他の実施態様において、標的化細胞および活性化細胞は異なる。ある実施態様において、標的化細胞は損傷細胞であり、活性化細胞は生存可能細胞である。ある実施態様において、標的化細胞は損傷細胞であり、活性化細胞は損傷細胞である。
【００５３】
ある実施態様において、病的組織損傷は、心筋梗塞と関連する心組織損傷である。他の実施態様において、病的組織損傷は、腎組織損傷である。他の実施態様において、病的組織損傷は、骨、軟骨、関節、皮膚、肝組織、膵臓組織、血液細胞、肺組織、または神経組織にある。ある実施態様において、このような方法は、患者に幹細胞を投与することをさらに含む。
【００５４】
ここにまた提供されるのは、ここに記載する二重特異性融合タンパク質をコードする核酸分子である。ある実施態様において、核酸分子はＤＮＡであり、ＤＮＡは、コード配列の転写および翻訳が少なくとも一つの真核生物細胞型で起こるように、さらに二重特異性融合タンパク質コード配列に操作可能に連結された転写および翻訳調節配列を含む。
【００５５】
これらおよび他の本発明の態様は、次の詳細な記載を参照して、明らかとなる。
【００５６】
配列表の記載
配列番号１は、ヒトアネキシンＡ５(ＡｎｘＶ)のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号２は、Ｃ３１６Ｓ置換を有するアネキシンＡ５のバリアント(ＡｎｘＶ−Ｃ３１６Ｓ)のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号３は、Ｃ３１６ＳおよびＣ末端ヘキサヒスチジン含有ペプチドを有するヒトアネキシンＡ５(ＡｎｘＶ−Ｃ３１６Ｓ−６Ｈｉｓ)のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号４は、ヒトアネキシンＡ５の非内部移行バリアント(ｎｉ−ＡｎｘＶ)のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号５は、アネキシンＡ５(ＡｎｘＶ)をコードする核酸配列である。
【００６１】
配列番号６は、ＡｎｘＶ  Ｃ３１６Ｓをコードする核酸配列である。
【００６２】
配列番号７は、ＡｎｘＶ  Ｃ３１６Ｓ−６Ｈｉｓをコードする核酸配列である。
【００６３】
配列番号８は、ｎｉ−ＡｎｘＶをコードする核酸配列である。
【００６４】
配列番号９は、野生型ヒトＩＧＦ−１(成熟形態)のアミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号１０は、ヒトＩＧＦ−１のバリアント(ＩＧＦ−１Ｄｅｓ  １−３)のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号１１は、ヒトＩＧＦ−１のバリアント(ＩＧＦ−１  ＬＯＮＧ)のアミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号１２は、ヒトＩＧＦ−１のバリアント(ＩＧＦ１  Ｅ３Ｒ)のアミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号１３は、ヒトＩＧＦ−１のバリアント(ＩＧＦ１  Ｒ３７Ｘ)のアミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号１４は、残基６８〜７０が欠失したヒトＩＧＦ−１のバリアント(ＩＧＦ１  ３Ｘ)のアミノ酸配列である。
【００７０】
配列番号１５は、ヒトＩＧＦ−１のバリアント(ＩＧＦ−１  ＬＲ３)のアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号１６は、Ｒ３７Ｘ＿３Ｘを含むヒトＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントのアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号１７は、Ｙ２４Ｌを含むヒトＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントのアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号１８は、Ｙ２４Ｌ＿Ｙ３１Ａを含むヒトＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントのアミノ酸配列である。
【００７４】
配列番号１９は、Ｙ３１Ａを含むヒトＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントのアミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号２０は、Ｙ６０ＬＡを含むヒトＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントのアミノ酸配列である。
【００７６】
配列番号２１は、Ｒ３７Ｘ＿３Ｘを含むヒトＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントのアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号２２は、Ｙ２４Ｌを含む野生型ヒトＩＧＦ−１のバリアントのアミノ酸配列である。
【００７８】
配列番号２３は、Ｙ２４Ｌ＿Ｙ３１Ａを含む野生型ヒトＩＧＦ−１のバリアントのアミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号２４は、Ｙ３１Ａを含む野生型ヒトＩＧＦ−１のバリアントのアミノ酸配列である。
【００８０】
配列番号２５は、Ｙ６０Ｌを含む野生型ヒトＩＧＦ−１のバリアントのアミノ酸配列である。
【００８１】
配列番号２６は、Ｒ３７Ｘ＿３Ｘを含む野生型ヒトＩＧＦ−１のバリアントのアミノ酸配列である。
【００８２】
配列番号２７は、Ｙ２４Ｌを含むヒトＩＧＦ−１(Ｄｅｓ１−３)バリアントのアミノ酸配列である。
【００８３】
配列番号２８は、Ｙ２４Ｌ＿Ｙ３１Ａを含むヒトＩＧＦ−１(Ｄｅｓ１−３)バリアントのアミノ酸配列である。
【００８４】
配列番号２９は、Ｙ３１Ａを含むヒトＩＧＦ−１(Ｄｅｓ１−３)バリアントのアミノ酸配列である。
【００８５】
配列番号３０は、ヒトＩＧＦ−１(Ｄｅｓ１−３)バリアントＹ６０Ｌのアミノ酸配列である。
【００８６】
配列番号３１は、ＩＧＦ−１をコードする核酸配列である。
【００８７】
配列番号３２は、ＩＧＦ−１(Ｄｅｓ１−３)をコードする核酸配列である。
【００８８】
配列番号３３は、ヒトＩＧＦ１  ＬＯＮＧの核酸配列である。
【００８９】
配列番号３４は、ヒトＩＧＦ１  Ｅ３Ｒの核酸配列である。
【００９０】
配列番号３５は、ヒトＩＧＦ１  Ｒ３７Ｘの核酸配列である。
【００９１】
配列番号３６は、ヒトＩＧＦ１  ３Ｘ(残基６８〜７０の欠失)の核酸配列である。
【００９２】
配列番号３７は、ＩＧＦ−１(ＬＲ３)をコードする核酸配列である。
【００９３】
配列番号３８は、Ｒ３７Ｘ＿３Ｘを含むＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントをコードする核酸配列である。
【００９４】
配列番号３９は、Ｙ２４Ｌを含むＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントをコードする核酸配列である。
【００９５】
配列番号４０は、Ｙ２４Ｌ、Ｙ３１Ａを含むＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントをコードする核酸配列である。
【００９６】
配列番号４１は、Ｙ３１Ａを含むＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントをコードする核酸配列である。
【００９７】
配列番号４２は、Ｙ６０Ｌを含むＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントをコードする核酸配列である。
【００９８】
配列番号４３は、Ｒ３７Ｘ＿３Ｘを含むＩＧＦ−１バリアントをコードする核酸配列である。
【００９９】
配列番号４４は、Ｙ２４Ｌを含むＩＧＦ−１バリアントをコードする核酸配列である。
【０１００】
配列番号４５は、Ｙ２４ＬおよびＹ３１Ａを含むＩＧＦ−１バリアントをコードする核酸配列である。
【０１０１】
配列番号４６は、Ｙ３１Ａを含むＩＧＦ−１バリアントをコードする核酸配列である。
【０１０２】
配列番号４７は、ＩＧＦ−１バリアントＹ６０Ｌをコードする核酸配列である。
【０１０３】
配列番号４８は、ＩＧＦ−１(Ｄｅｓ１−３)バリアントＲ３７Ｘ＿３Ｘをコードする核酸配列である。
【０１０４】
配列番号４９は、ＩＧＦ−１(Ｄｅｓ１−３)バリアントＹ２４Ｌをコードする核酸配列である。
【０１０５】
配列番号５０は、ＩＧＦ−１(Ｄｅｓ１−３)バリアントＹ２４Ｌ、Ｙ３１Ａをコードする核酸配列である。
【０１０６】
配列番号５１は、ＩＧＦ−１(Ｄｅｓ１−３)バリアントＹ３１Ａをコードする核酸配列である。
【０１０７】
配列番号５２は、ＩＧＦ−１(Ｄｅｓ１−３)バリアントＹ６０Ｌをコードする核酸配列である。
【０１０８】
配列番号５３は、Ｆｃペプチドのアミノ酸配列である。
【０１０９】
配列番号５４は、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)のアミノ酸配列である。
【０１１０】
配列番号５５は、ヒト血清アルブミンバリアントｍＨＳＡのアミノ酸配列である。
【０１１１】
配列番号５６は、ヒト血清アルブミンバリアントｍＨＳＡ７のアミノ酸配列である。
【０１１２】
配列番号５７は、ヒト血清アルブミンＨＳＡをコードする核酸配列である。
【０１１３】
配列番号５８は、ヒト血清アルブミンバリアントｍＨＳＡをコードする核酸配列である。
【０１１４】
配列番号５９は、ヒト血清アルブミンバリアントｍＨＳＡ７をコードする核酸配列である。
【０１１５】
配列番号６０は、リンカーｌｋ７のアミノ酸配列である。
【０１１６】
配列番号６１は、リンカーｌｋ１５のアミノ酸配列である。
【０１１７】
配列番号６２は、リンカーｌｋ４０のアミノ酸配列である。
【０１１８】
配列番号６３は、リンカーｌｋ７をコードする核酸配列である。
【０１１９】
配列番号６４は、リンカーｌｋ１５をコードする核酸配列である。
【０１２０】
配列番号６５は、リンカーｌｋ４０をコードする核酸配列である。
【０１２１】
配列番号６６は、ＳＧＦ  ６０２のアミノ酸配列である。
【０１２２】
配列番号６７は、ＳＧＦ  ６８３のアミノ酸配列である。
【０１２３】
配列番号６８は、ＳＧＦ  ７０３のアミノ酸配列である。
【０１２４】
配列番号６９は、ＳＧＦ６０４のアミノ酸配列である。
【０１２５】
配列番号７０は、ＳＧＦ６０６のアミノ酸配列である。
【０１２６】
配列番号７１は、ＳＧＦ６４９のアミノ酸配列である。
【０１２７】
配列番号７２は、ＳＧＦ６８８のアミノ酸配列である。
【０１２８】
配列番号７３は、ＳＧＦ７１１のアミノ酸配列である。
【０１２９】
配列番号７４は、ＳＧＦ７１３のアミノ酸配列である。
【０１３０】
配列番号７５は、ＳＧＦ７１６のアミノ酸配列である。
【０１３１】
配列番号７６は、ＳＧＦ７２７のアミノ酸配列である。
【０１３２】
配列番号７７は、ＳＧＦ７２８のアミノ酸配列である。
【０１３３】
配列番号７８は、ＳＧＦ７２９のアミノ酸配列である。
【０１３４】
配列番号７９は、ＳＧＦ７３０のアミノ酸配列である。
【０１３５】
配列番号８０は、ＳＧＦ７３１のアミノ酸配列である。
【０１３６】
配列番号８１は、ＳＧＦ７３２のアミノ酸配列である。
【０１３７】
配列番号８２は、ＳＧＦ７３３のアミノ酸配列である。
【０１３８】
配列番号８３は、ＳＧＦ７３９のアミノ酸配列である。
【０１３９】
配列番号８４は、ＳＧＦ７４０のアミノ酸配列である。
【０１４０】
配列番号８５は、ＳＧＦ７４１のアミノ酸配列である。
【０１４１】
配列番号８６は、ＳＧＦ７４３のアミノ酸配列である。
【０１４２】
配列番号８７は、ＳＧＦ６０４をコードする核酸配列である。
【０１４３】
配列番号８８は、ＳＧＦ６０６をコードする核酸配列である。
【０１４４】
配列番号８９は、ＳＧＦ６４９をコードする核酸配列である。
【０１４５】
配列番号９０は、ＳＧＦ６８８をコードする核酸配列である。
【０１４６】
配列番号９１は、ＳＧＦ７１１をコードする核酸配列である。
【０１４７】
配列番号９２は、ＳＧＦ７１３をコードする核酸配列である。
【０１４８】
配列番号９３は、ＳＧＦ７１６をコードする核酸配列である。
【０１４９】
配列番号９４は、ＳＧＦ７２７をコードする核酸配列である。
【０１５０】
配列番号９５は、ＳＧＦ７２８をコードする核酸配列である。
【０１５１】
配列番号９６は、ＳＧＦ７２９をコードする核酸配列である。
【０１５２】
配列番号９７は、ＳＧＦ７３０をコードする核酸配列である。
【０１５３】
配列番号９８は、ＳＧＦ７３１をコードする核酸配列である。
【０１５４】
配列番号９９は、ＳＧＦ７３２をコードする核酸配列である。
【０１５５】
配列番号１００は、ＳＧＦ７３３をコードする核酸配列である。
【０１５６】
配列番号１０１は、ＳＧＦ７３９をコードする核酸配列である。
【０１５７】
配列番号１０２は、ＳＧＦ７４０をコードする核酸配列である。
【０１５８】
配列番号１０３は、ＳＧＦ７４１をコードする核酸配列である。
【０１５９】
配列番号１０４は、ＳＧＦ７４３をコードする核酸配列である。
【０１６０】
配列番号１０５は、リーダー配列を構成するアミノ酸配列である。
【０１６１】
配列番号１０６は、リーダー配列をコードする核酸配列である。
【０１６２】
配列番号１０７は、ＳＧＦ  ７０４のアミノ酸配列である。
【０１６３】
配列番号１０８は、ＳＧＦ  ７３４のアミノ酸配列である。
【０１６４】
配列番号１０９は、ＳＧＦ  ７４６のアミノ酸配列である。
【０１６５】
配列番号１１０は、ＳＧＦ  ７５７のアミノ酸配列である。
【０１６６】
配列番号１１１は、ＳＧＦ  ７０４をコードする核酸配列である。
【０１６７】
配列番号１１２は、ＳＧＦ  ７３４をコードする核酸配列である。
【０１６８】
配列番号１１３は、ＳＧＦ  ７４６をコードする核酸配列である。
【０１６９】
配列番号１１４は、ＳＧＦ  ７５７をコードする核酸配列である。
【０１７０】
配列番号１１５は、Ｆｃをコードする核酸配列である。
【０１７１】
配列番号１１６は、ＳＧＦ  ７３７のアミノ酸配列である。
【０１７２】
配列番号１１７は、ＳＧＦ  ７３７の核酸配列である。
【０１７３】
配列番号１１８は、ＳＧＦ−７７６のアミノ酸配列である。
【０１７４】
配列番号１１９は、ＳＧＦ−７７６の核酸配列である。
【０１７５】
配列番号１２０は、Ｅ３ＲおよびＹ３１置換を含む野生型ヒトＩＧＦ−１のバリアントのアミノ酸配列である。
【０１７６】
配列番号１２１は、Ｅ３ＲおよびＹ３１置換を含む野生型ヒトＩＧＦ−１のバリアントをコードする核酸配列である。
【０１７７】
配列番号１２２は、野生型アネキシン５のアミノ酸２〜３２０およびＲ６３Ａ、Ｋ７０Ａ、Ｋ１０１Ａ、Ｅ１３８Ａ、Ｄ１３９Ｇ、Ｎ１６０ＡおよびＣ３１６置換を含む野生型ヒトアネキシン５のバリアントのアミノ酸配列である。
【０１７８】
配列番号１２３は、野生型アネキシン５のアミノ酸２〜３２０およびＲ６３Ａ、Ｋ７０Ａ、Ｋ１０１Ａ、Ｅ１３８Ａ、Ｄ１３９Ｇ、Ｎ１６０ＡおよびＣ３１６置換を含むヒトアネキシン５のバリアントをコードする核酸配列である。
【０１７９】
配列番号１２４は、野生型ヒト血清アルブミンのアミノ酸２６〜６０９およびＣ５８ＳおよびＮ５２７Ｑ置換を含むバリアントヒト血清アルブミンのアミノ酸配列である。
【０１８０】
配列番号１２５は、野生型ヒト血清アルブミンのアミノ酸２６〜６０９およびＣ５８ＳおよびＮ５２７Ｑ置換を含むバリアントヒト血清アルブミンをコードする核酸配列である。
【０１８１】
配列番号１２６は、リンカーｌｋ７のアミノ酸配列である。
【０１８２】
配列番号１２７は、リンカー脂肪族ｌｋ７のアミノ酸配列である。
【０１８３】
配列番号１２８は、抗ホスファチジルセリンｓｃＦＶ  ＰＳ４Ａ７のアミノ酸配列である。
【０１８４】
配列番号１２９は、抗ＤＮＡ  ｓｃＦｖ  ＳＩ−１のアミノ酸配列である。
【０１８５】
配列番号１３０は、抗ＤＮＡ  ｓｃＦｖ  ＳＩ−２２のアミノ酸配列である。
【０１８６】
配列番号１３１は、Ｂ７  ｓｃＦｖ抗ミオシンｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
【０１８７】
配列番号１３２は、ＦＤ２抗ミオシンｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
【０１８８】
配列番号１３３は、ＭＣＡ１抗ミオシンｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
【０１８９】
配列番号１３４は、ＭＣＢ１１抗ミオシンｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
【０１９０】
配列番号１３５は、Ｓ３Ｆ５１抗ミオシンｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
【０１９１】
配列番号１３６は、抗ＤＮＡ  ｓｃＦＶ抗体のアミノ酸配列である。
【０１９２】
配列番号１３７は、モチーフＰＡＳ化のアミノ酸配列である。
【０１９３】
配列番号１３８は、アルブミン結合ドメインヒト抗体(ａｌｄｕｄＡＢ)のアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ある実施態様による、代表的治療用二重特異性タンパク質(ここではＳｍａｒｔ増殖因子または増殖因子とも称する)および非標的化対照タンパク質の概略図である。図１Ａおよび図１Ｂは、ある実施態様による、代表的(１)標的化、有効性低減ＩＧＦ−１ベースのタンパク質、(２)標的化、有効性低減Ｎｒｇ１αベースのタンパク質、(３)非標的化、有効性低減ＩＧＦ−１ベースのタンパク質、(４)非標的化、非有効性低減ＩＧＦ−１ベースのタンパク質、(５)標的化、非有効性低減ＩＧＦ−１ベースのタンパク質、(６)シグナル伝達アーム、(７)ターゲティングアーム、(８)半減期モジュレーター、および(９)リンカーの概略図である。
【０１９５】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ある実施態様による、治療用二重特異性タンパク質および有効性および野生型増殖因子(ｗｔ  ＧＦ)と比較した健常細胞における有効性低減倍率を記載する表である。図２Ａおよび２Ｂは、本発明の実施態様による改変増殖因子が、野生型増殖因子と比較して有効性が減少している(すなわち、ｐＡＫＴ  ＥＣ５０増加)ことを示す。ＥＣ５０は、ｐＡＫＴシグナル伝達レベルの最大半量の達成に必要な濃度として定義する。ｉＰＳＣ由来心筋細胞(ＣＤＩ)を(Ｓ)ＧＦで１０分刺激し、ｐＡＫＴレベルをＥＬＩＳＡで測定した。図２Ａおよび２Ｂは、アミノ酸の付加、欠失もしくは変異または他のタンパク質ドメインへの融合によるＧＦの改変が、ｗｔ  ＧＦと比較して有効性を低減させることを示す。
【０１９６】
【図３Ａ】図３Ａは、ある実施態様による種々の治療用二重特異性タンパク質および非標的化対照タンパク質を使用する健常および損傷心筋細胞におけるｐＡＫＴ(タンパク質キナーゼＢ)用量応答を記載する一連のグラフである。候補Ｓｍａｒｔ増殖因子(ＳＧＦ)の有効性を、多能性幹細胞由来心筋細胞(Cellular Dynamics International)において測定し、シグナル伝達を、リン酸化Ａｋｔ蓄積により定量する。Ｓｍａｒｔ増殖因子のターゲティングを評価するために、用量応答曲線を健常および損傷心筋細胞で集める(損傷＝アポトーシスを誘発するため１２.５μg／mL  ドキソルビシンと２４時間インキュベーション)。用量応答曲線をその後３パラメータＥＣ５０活性化モデルに適合させ、計算ＥＣ５０を、健常(丸、青色)および損傷(四角、赤色)状況で比較する。これらの正規化プロットにおいて、最適フィットの線を示し、個々のデータ点を黒丸または四角として記載する。
【０１９７】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ある実施態様による、対数尺度で非標的化対照タンパク質と比較した種々の治療用二重特異性タンパク質についてのＥＣ５０健常／ＥＣ５０損傷により計算した有効性シフトを記載するグラフである。フィットＥＣ５０値を、健常(黒丸)および損傷(アポトーシスを誘発するため１２.５μg／mL  ドキソルビシンと２４時間インキュベーション；黒三角)状況について表す。エラーバーは、パラメータの９５％信頼区間を表す。改変タンパク質の各々について計算した有効性シフトを、健常および損傷用量応答曲線のフィットＥＣ５０値の比として取る(ＥＣ５０健常／ＥＣ５０損傷)。有効性シフトに注釈を付け、損傷状況シグナル伝達における増加倍率として表す。図３Ｂは、非標的化、非有効性低減分子(例えば、６８８)および非標的化、有効性低減分子(例えば、７０４、６０２、７０３)が明らかな有効性シフトを有しないことを示す。同様に、標的化、非有効性低減分子(例えば、６４９)も明らかな有効性シフトを有しない。標的化、有効性低減分子(例えば、６０６、６８３、７１１、７１３、７１６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３９、７４０、７４１、７４３、７５７)のみが明らかな(＞４倍)有効性シフトを有する。
【０１９８】
【図３Ｃ】図３Ｃは、治療用二重特異性タンパク質７７６(ｓｃ７７６)および対応する非標的化対照タンパク質７７７(ｓｃ７７７)を使用する健常および損傷心筋細胞におけるｐＡＫＴ(タンパク質キナーゼＢ)用量応答を記載するグラフである。図３Ａと同様、候補Ｓｍａｒｔ増殖因子の有効性を多能性幹細胞由来心筋細胞において種々の濃度(nM)で測定し、シグナル伝達(Ｙ軸)を、リン酸化Ａｋｔ蓄積により定量する。健常および損傷状況における用量応答曲線を３パラメータＥＣ５０活性化モデルにフィットさせる。ｓｃ７７６についてのシグナル伝達を、それぞれ健常(青色、黒丸)および損傷(赤色、黒四角)状況について記載する。ｓｃ７７７についてのシグナル伝達応答を、それぞれ健常(紫色、黒三角)および損傷(緑色、逆黒三角)状況について記載する。
【０１９９】
【図４】図４は、ヒト心筋細胞における治療用二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０を使用する低酸素症により誘発されたカスパーゼ活性の減少を記載するグラフである。図４は、本発明の態様による標的化、改変増殖因子が、ヒト心筋細胞におけるアポトーシスを用量依存的方式で減少させることを示す。アポトーシスは、細胞を１％酸素で４８時間培養することにより誘発した。治療用二重特異性タンパク質７４０を、低酸素症期開始時に添加した。カスパーゼ３／７活性を、capsaseGlo(Promega)を使用して測定した。融合タンパク質７４０は、ヒト心筋細胞における低酸素症により誘発されたカスパーゼ活性を有意に(ｐ≦０.０１)減少させる。
【０２００】
【図５】図５は、ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞における治療用二重特異性タンパク質増殖因子７２７、７４０、７３４、および非標的化対照(７４６)を使用する低酸素症誘発細胞死の減少を記載するグラフである。図５は、本発明の実施態様による標的化改変増殖因子がヒト腎臓近位尿細管上皮細胞における低酸素症誘発細胞死を減少させ、一方非標的化対照は効果を示さないことを示す。細胞死を、フローサイトメトリーによりヨウ化プロピジウムで染色が陽性であった細胞のパーセンテージにより測定した。細胞を５時間血清飢餓にし、次いで治療用二重特異性タンパク質増殖因子７２７、７４０、７３４または非標的化対照(７４６)で前処理して、嫌気性パウチに１８時間入れた(インディケーターBD 260683を伴うGasPak EZ Anaerobe pouch System)。正常酸素対照を、対照を嫌気性パウチに入れなかった以外、同じ方法で処理した。全結果を正常酸素対照に対して正規化した。結果は、２〜３の独立した実験の平均である。有意差を、一方向ＡＮＯＶＡ、アルファ＝０.０５により決定した。
【０２０１】
【図６】図６は、種々の治療用二重特異性タンパク質の静脈内投与後の半減期および崩壊速度を記載する表である。マウスにおける種々の治療用二重特異性タンパク質およびｗｔ  ＩＧＦ−１の半減期を、１コンパートメントモデルを使用して計算した。ＳＧＦ  ７２７は、構造ＩＧＦ１(ＬＲ−３−Ｒ３７Ｘ−３Ｘ)＿ｌｋ４０＿ｍＨＳＡ＿ｌｋ４０＿ＡｎｘＶを有し、分子７３９〜７４３は、基本構造ＩＧＦ１＊(ＬＲ３)＿ｌｋ７＿ｍＨＳＡ＿ｌｋ７＿ＡｎｘＶ(ｎｉ)を有し、ここで、＊はＩＧＦ１の有効性低減欠失または変異を意味する。ＳＧＦ７５７は構造Ｎｒｇ１ａ＿ｌｋ７＿ｍＨＳＡ＿ｌｋ７＿ＡｎｘＶ(ｎｉ)を有する。図６は、ある実施態様による標的化改変増殖因子(増殖因子)が、野生型増殖因子(ｗｔ  ＩＧＦ１)より長い半減期を有することを示す。
【０２０２】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、静脈内投与後の血糖値に対する種々の治療用二重特異性タンパク質の効果を記載する一連のグラフである。図７は、ある実施態様による標的化、改変増殖因子(増殖因子)が、標的外効果が減少していることを示す。Ａｎｘ標的化、有効性低減ＩＧＦ１融合タンパク質非標的化、高有効性ＩＧＦ１融合タンパク質と比較して、低血糖が有意に減少される。
【０２０３】
【図７Ａ】図７Ａは、種々の治療用二重特異性タンパク質投与後のマウスにおける血糖値の経時変化を記載するグラフである。データをmg／dL  グルコースレベルとして示す。増殖因子７２７〜７４３は標的化、有効性低減ＩＧＦ１ベースの融合タンパク質であり、一方６８８は非標的化高有効性ＩＧＦ１融合タンパク質である。マウスは、陰性対照としての組み換えＨＳＡおよび陽性対照としてのＩＧＦ−１(ＬＲ３バリアント)を投与された。
【０２０４】
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＳＧＦ有効性(最大半量ｐＡＫＴレベルを達成するのに必要な濃度として定義、すなわち、治療用二重特異性タンパク質のｐＡＫＴ  ＥＣ５０)対３時間血糖曲線下面積(ＡＵＣ)の相関を記載するグラフである。図７Ｂは、大きな有効性低減(すなわち、ｐＡＫＴ  ＥＣ５０増加)が３時間血糖ＡＵＣ増加(すなわち、血糖減少低減)に至ることを示す。
【０２０５】
【図８】図８は、損傷(梗塞)対健常(遠隔)ラット心臓領域における相対的ｐＡＫＴレベルを記載するグラフである。ラット虚血／再灌流モデルを、ラットにおける左前下行冠動脈(ＬＡＤ)の結紮により虚血性傷害を作製するために用いた。１時間の虚血および２時間の再灌流後、心臓を摘出し、解剖学的指標により通知される遠隔(健常)および梗塞(損傷)領域に顕微解剖した。組織ホモジネートを各領域について作製し、総ＡＫＴ／ｐＡＫＴサンドイッチＥＬＩＳＡを使用してホスホ−ＡＫＴについて分析した。この時点で、ＩＧＦ−１は遠隔または梗塞組織何れでもｐＡＫＴを増加させておらず、一方非標的化、高度有効ＩＧＦ１融合タンパク質(６８８)は、遠隔および梗塞組織の両方でｐＡＫＴを非選択的に増加させる。標的化、有効性低減ＩＧＦ１融合タンパク質、６０６は、遠隔組織と比較して、梗塞組織(ｐ＜０.０５)におけるｐＡＫＴを選択的に増加させる。図８は、標的化、改変増殖因子(増殖因子)が、インビボで損傷組織における生存促進性シグナル伝達を活性化させることを示す。標的化、有効性低減ＩＧＦ１融合タンパク質６０６は、インビボで遠隔(健常)組織より梗塞組織でｐＡＫＴシグナル伝達を有意に高く活性化させる。選択的シグナル伝達は、ｗｔ  ＩＧＦ１または非標的化、高有効性融合タンパク質(６８８)で観察されない。
【０２０６】
【図９】図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、ある実施態様による標的化改変増殖因子がインビボで効果的であり、急性心筋梗塞(ＡＭＩ)のラット虚血／再灌流モデルにおける梗塞サイズを減少させることを示す。標的化、有効性低減ＩＧＦ１融合タンパク質(ＳＧＦ  ６０６)は、ラットにおける急性心筋梗塞後の梗塞／リスク領域(ＡＡＲ)を有意に減少させる。ｗｔ  ＩＧＦ１に対して有意に大きな梗塞／ＡＲＲ減少がＳＧＦ６０６で観察される。
【０２０７】
【図９Ａ】図９Ａは、ラット急性心筋梗塞(ＡＭＩ)モデルの概要を示す。ラットＡＭＩモデルの概要。左前下行冠動脈(ＬＡＤ)を、１時間結紮で縛り、次いで緩め、７２時間回復期の間再灌流する。媒体、ＩＧＦ１またはＳＧＦ  ６０６を、外側尾静脈から再灌流の同じ時点で静脈内注射する。７２時間後ＬＡＤを再結紮し、心臓を梗塞サイズの組織学的評価のために処理する
【０２０８】
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａに示すモデルを使用する、虚血後のリスクにある左心室の面積パーセント(リスク領域(ＡＡＲ)／ＬＶ％)を記載するグラフである。外科手技により作製した傷害サイズにおいて、左心室(ＬＶ)の面積に関して、何れかの群間で同等なサイズのリスク領域(ＡＡＲ)により示されるとおり有意差はなかった。
【０２０９】
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＡＭＩにより傷害させ、媒体、ｗｔ  ＩＧＦ１、または標的化治療用二重特異性タンパク質(ＳＧＦ  ６０６)で処置したラットにおける梗塞／リスク領域パーセンテージを記載するグラフである。標的化、有効性低減ＳＧＦ  ６０６は、媒体対照と比較して、７２時間で梗塞サイズ減少に高度に有意に効果的である(ｐ＜０.００１)。ＩＧＦ１も媒体と比較して梗塞サイズを有意に減少できる(ｐ＜０.０５)；しかしながら、ＳＧＦ  ６０６での処置は、ＩＧＦ１と比較して大きな梗塞減少をもたらす(ｐ＜０.０５)。
【０２１０】
【図１０】図１０は、ある実施態様による、標的化改変増殖因子の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０２１１】
発明の詳細な記載
ここで使用する命名は、特定の本発明の実施態様を述べることのみを目的とし、限定を意図しないことは理解されるべきである。
【０２１２】
他に定義しない限り、ここに使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【０２１３】
さらに、引用している段落を問わず、本面細書中で引用する全ての刊行物、特許および特許出願は、引用によりそれら全体を本明細書に包含させる。
【０２１４】
本明細書および特許請求の範囲に使用される単数表現は、文脈に明らかに反しない限り、複数引用も含む。
【０２１５】
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は、アミド結合(ここではペプチド結合とも称する)により共有結合された少なくとも２アミノ酸の配列ポリマーを示すために相互交換可能に使用される。
【０２１６】
ここで使用する用語“二重特異性”は、融合タンパク質の２個の異なるリガンドと相互作用する能力をいう。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、ターゲティングドメインのための標的分子およびアクティベータードメインのための受容体と相互作用する。
【０２１７】
ここで使用する用語“標的分子”は、組織(例えば“リスクがある”、疾患または損傷組織)と関係するあらゆる分子をいう。“標的細胞”は、二重特異性タンパク質またはそのターゲティングドメインが特異的に結合できる細胞を意味する。
【０２１８】
“結合”または“特異的結合”は、ここでは相互交換可能に使用し、タンパク質(またはそのターゲティングポリペプチドドメインまたはそのアクティベータードメイン)が、特異的分子(例えば、ターゲティングドメインが標的分子に対する実質的親和性を示す、またはアクティベータードメインが増殖因子受容体のような細胞の表面と関連する分子に実質的親和性を示す)または該分子を担持する細胞もしくは組織に実質的親和性を示し、タンパク質(またはそのターゲティングポリペプチドドメインまたはそのアクティベータードメイン)が特異的分子に対して実質的親和性を有するときに生じ、他の分子と顕著な交差反応を示さない点で、選択的であると言える。
【０２１９】
ここで使用する用語“組み換え”は、天然で一般にみられるものと異なる遺伝的実体を意味する。ポリヌクレオチドまたは遺伝子に適用されるとき、これは、ポリヌクレオチドが天然でみられるポリヌクレオチドと異なる構造の産物をもたらすクローニング、制限および／またはライゲーションステップ、および他の工程の種々の組み合わせの産物であることを意味する。
【０２２０】
用語“操作可能に結合”は、他の核酸配列と機能的関係を有する核酸配列をいう。核酸は、他の核酸配列と機能的関係を有するとき、“操作可能に結合”される。
【０２２１】
ここで使用する用語“ベクター”は、それが結合している他の核酸を輸送できる、核酸分子をいうことを意図する。ベクターの一つのタイプは“プラスミド”であり、これは、付加的ＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループである。他のタイプのベクターは、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)であり、ここで、付加的ＤＮＡセグメントが、ＤＮＡセグメントによりコードされるタンパク質の発現を駆動するプロモーター(例えば、ウイルスプロモーター)に操作可能に結合するように、ウイルスゲノムにライゲートされ得る。あるベクターは、導入された宿主細胞で自律増殖可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合され、それにより宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、あるベクターは、操作可能に結合している遺伝子の発現の指示ができる。このようなベクターはここでは“発現ベクター”と称する。
【０２２２】
ここで使用する用語“宿主細胞”は、発現ベクターが導入されている細胞をいうことを意図し、その細胞は、ベクターによりコードされるタンパク質の再生、および好ましくは発現が可能である。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫もいうことを意図することは理解されるべきである。変異または環境の影響によりある修飾が次の世代で起こり得て、このような子孫は、実際、親細胞と同じではない可能性があるが、なおここで使用する用語“宿主細胞”の範囲に入る。
【０２２３】
“同一性”は、当分野で知られるとおり、２以上のポリペプチドまたはタンパク質配列の、配列の比較により決定される、関係である。当分野で、“同一性”はまた一連のこのような配列の間のマッチとして決定される、ポリペプチドまたはタンパク質の配列関連性の程度もいう。“同一性”は、当分野で知られる何れかの生体情報方法により容易に計算できる。
【０２２４】
用語“親ポリペプチド”は、野生型ポリペプチドをいい、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、公的に利用可能なタンパク質データベース(例えば、EMBL Nucleotide Sequence Database、NCBI Entrez、ExPasy、Protein Data Bankなど)の一部である。
【０２２５】
用語“変異体ポリペプチド”または“ポリペプチドバリアント”は、アミノ酸配列がその対応する野生型(親)形態、天然に存在する形態または何れかの他の親形態のアミノ酸配列と異なる、ある形態のポリペプチドをいう。変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドをもたらす１以上の変異、例えば、置換、挿入、欠失、付加などを含んでよい。
【０２２６】
用語“親ポリペプチドに対応”は、ポリペプチドのアミノ酸配列が、対応する親ポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも一つのアミノ酸変動の存在によってのみ異なる、本発明のポリペプチドを記載するために使用する。一般に、バリアントポリペプチドおよび親ポリペプチドのアミノ酸配列は、高い同一性パーセンテージを示す。ある例において、“親ポリペプチドに対応”は、バリアントポリペプチドのアミノ酸配列が、親ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約５０％同一性、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一性または少なくとも約９９％同一性を有することを意味する。他の例において、バリアントポリペプチドをコードする核酸配列は、親ポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも約５０％同一性、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一性または少なくとも約９９％同一性を有する。
【０２２７】
ここで使用する用語“実質的同一性”または“実質的類似性”は、核酸またはそのフラグメントに言及されるとき、他の核酸(またはその相補鎖)と適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴い最適にアラインしたとき、配列の少なくとも約９５〜９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【０２２８】
ここで使用し、ペプチドに関連する用語“相同”は、２ペプチド間のアミノ酸配列類似性をいう。両方のペプチドにおけるあるアミノ酸位置が同一アミノ酸で占拠されているならば、それらはその位置で相同である。ここで使用する“実質的に相同”は、配列が対照ペプチドと少なくとも５０％同一、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは９５％相同であり、相同である配列の活性の大部分または全てを保持することを意味する。
【０２２９】
ここで使用する用語“損傷細胞”または“損傷組織”は、例えば、外傷または化学的傷害により損傷または傷害した心血管細胞または組織、虚血性組織、梗塞組織もしくは細胞または組織への正常血流の妨害を生じる何らかの手段で損傷された組織を含むが、これらに限定されない、生物学的細胞または組織を意味し、かつ包含する。
【０２３０】
ここで使用する用語“治療有効量”は、研究者、獣医師、医師または他の臨床医により探索される、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する二重特異性タンパク質の両を意味する。
【０２３１】
ここで使用する用語“薬学的に許容される”は、担体、希釈剤または添加物が製剤の他の成分と適合性であり、その受け手に有害であってはならないことを意味する。
【０２３２】
本発明の態様は、二重特異性治療用タンパク質、薬理学的組成物および損傷または疾患組織または細胞を修復または再生する方法に関する。ある実施態様において、二重特異性治療用タンパク質は、標的化細胞または標的化組織の生存を正に制御できる。特に、二重特異性治療用タンパク質は生存シグナル伝達を促進できる。
【０２３３】
ある実施態様において、本発明の薬理学的組成物は、さらに損傷組織または細胞処置および／または組織再生過程の助けとなる１以上の付加的生物活性剤または成分を含んでよい。
【０２３４】
本発明の態様はまた、ＲＮＡの形またはＤＮＡの形であり得る、治療用二重特異性タンパク質およびそのバリアントをコードするポリヌクレオチドも包含し、このＤＮＡはｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。本発明のバリアントをコードするコード配列遺伝子コードの冗長性または縮重の結果として変わり得る。
【０２３５】
本発明の態様は、各々異なる標的分子または“リガンド”に特異的な２結合ドメインを含む、二重特異性治療用タンパク質に関する。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、ターゲティングドメインまたはターゲティング部分およびアクティベータードメインまたは治療部分を含む。用語“ターゲティング部分”、“ターゲティングドメイン,”または“ターゲティングポリペプチド”は相互交換可能に使用し、二重特異性治療剤を体の特定の組織または領域に選択的に局在化させる分子をいう。局在化は、分子決定基の特異的認識、ターゲティングドメインの分子サイズ、イオン性相互作用、疎水性相互作用などが介在し得る。ここで使用する用語“治療部分”、“アクティベータードメイン”、“アクティベーターポリペプチド”および“シグナル伝達アーム”は相互交換可能に使用し、治療に有効であり、非毒性であり、細胞毒性効果を有さずまたは細胞に有害ではない、増殖因子を含むが、これに限定されないあらゆる薬剤をいう。
【０２３６】
ここで使用する“二重特異性タンパク質”は、２以上の異なる特異的分子に特異的結合できるタンパク質をいう。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、第一特異的標的分子に結合特異性を有するターゲティングドメインおよび第二標的分子に結合特異性を有するアクティベータードメインを含む。ある態様において、アクティベータードメインは、受容体に結合特異性を有する。ある態様において、アクティベータードメインは、組織再生を調節／促進する受容体に結合特異性を有する。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、二重特異性タンパク質を標的細胞または組織に標的化するのに役立ち、一方アクティベータードメインは、細胞を活性化し、それにより標的化組織の再生を促進するのに役立つ。
【０２３７】
ある態様において、二重特異性治療用タンパク質は、アクティベーターポリペプチドに接続されたターゲティングポリペプチドを有するキメラタンパク質である。ある態様において、二重特異性治療用タンパク質は、増殖因子バリアントに接続されたターゲティングポリペプチドを有するキメラタンパク質である。
【０２３８】
ターゲティングドメインは、一般に二重特異性タンパク質を、“標的細胞”とも称する選択した細胞に標的化させるのに使用する。ターゲティングドメインのその標的分子への結合は、標的細胞において顕著な生物学的効果を誘発しない。アクティベータードメインは細胞の第二標的分子またはリガンドに結合する。アクティベータードメインのそのリガンドへの結合は、特異的生物学的効果を調節する、例えば、その生物活性を増強することが意図される。ある実施態様において、アクティベータードメインのそのリガンドへの結合は、標的化細胞または組織の生存を正に制御することが意図される。特に、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインは、生存シグナル伝達を促進できる。
【０２３９】
ある実施態様において、ターゲティングドメインおよびアクティベータードメインは、多量体タンパク質の異なるサブユニットと関連する。ある実施態様において、アクティベータードメインはターゲティングドメインに架橋される。ある実施態様において、アクティベータードメインは、ターゲティングドメインに直接的または間接的に融合される。
【０２４０】
アクティベータードメインにおける１アミノ酸残基の置換が、二重特異性タンパク質の特徴に全体として影響を与える可能性があり、全体的効果が二重特異性タンパク質の薬理学的有効性およびターゲティング特異性に有利(または有害)であり得ることは注意すべきである。
【０２４１】
本発明の方法および組成物のある態様において、二重特異性治療用タンパク質は、野生型アクティベータードメインと比較して有効性が低減するように改変されたアクティベータードメインを有する。アクティベータードメインの有効性の低減は二重特異性治療用タンパク質の選択性を増加でき、標的分子を含む細胞または組織の優先的活性化をもたらすことが観察されている(図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ参照)。ある実施態様において、アクティベータードメインは治療剤である。ある実施態様において、アクティベータードメインは増殖因子バリアントである。観察されたこの野生型アクティベータードメインに対する有効性の低減は、活性化ドメインの立体障害およびまた大型多ドメイン融合タンパク質の状況における拡散速度減少の両方に起因し得る。ある実施態様において、アクティベータードメインはＩＧＦ−１バリアントである。ある実施態様において、アクティベータードメインはＮＲＧバリアントである。
【０２４２】
本発明の方法および組成物のある態様において、二重特異性治療用タンパク質は、アクティベータードメインが野生型アクティベータードメインと比較して活性化有効性が低減されるように、半減期調節ドメインおよびターゲティングドメインの両方に融合したアクティベータードメインを有する。アクティベータードメインの半減期調節およびターゲティングドメインへの融合はアクティベータードメインの有効性を低減させ、それにより二重特異性治療用タンパク質の選択性を増加させ、標的分子を含む細胞または組織の優先的活性化をもたらすことが観察されている。観察されたこの野生型アクティベータードメインに対する有効性の低減は、活性化ドメインの立体障害およびまた大型多ドメイン融合タンパク質の状況における拡散速度減少の両方に起因し得る。ある実施態様において、アクティベータードメインは治療剤である。ある実施態様において、アクティベータードメインは増殖因子バリアントである。ある実施態様において、アクティベータードメインはＩＧＦ−１バリアントである。ある実施態様において、アクティベータードメインはＮＲＧバリアントである。
【０２４３】
本発明のある実施態様は、ターゲティングドメイン、アクティベータードメイン、および所望によりペプチドリンカーまたは半減期モジュレーターを有する改変タンパク質を提供する。種々の実施態様において、本発明は、ここに定義する、親ポリペプチド配列、例えば、ヒトインスリン増殖因子１(ＩＧＦ−１)、アネキシンＡ５(Ａｎｘ  Ａ５またはＡｎｘＶ)、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)の部分とこのレベルの同一性を有するバリアントを提供する。種々の実施態様において、バリアントは、ここに定義する、親ポリペプチドまたは親ポリペプチド配列、例えば、ＩＧＦ−１、アネキシンＡ５、ヒト血清アルブミンの一部と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。
【０２４４】
本発明の方法および組成物のある態様において、二重特異性タンパク質のアクティベータードメイン(すなわち、増殖因子)は、ターゲティングドメインと融合したとき、二重特異性融合タンパク質の半数効果濃度(ＥＣ５０)が健常細胞または組織より損傷細胞または組織で低くなるように改変される。ある実施態様において、二重特異性タンパク質のアクティベータードメイン(すなわち、増殖因子)は、ターゲティングドメインと融合したとき、二重特異性融合タンパク質のＥＣ５０が、健常細胞または組織におけるよりも損傷細胞または組織で一桁低くなるように改変される。
【０２４５】
本発明の方法および組成物のある態様において、二重特異性タンパク質のターゲティングドメインは、アクティベータードメインがそのリガンドに対して有する親和性よりも、そのリガンドに対して少なくとも一桁高い結合親和性を有するように選択され得る。例えば、ターゲティングドメインは、アクティベータードメインがそのリガンドに対して有するよりも少なくとも１０倍以上高い親和性をそのリガンドに有する。ある実施態様において、ターゲティングドメインのそのリガンドに対する親和性は、アクティベータードメインより少なくとも１５倍高いまたは少なくとも２０倍以上高い、２５倍以上高い。ある実施態様において、ターゲティングドメインのそのリガンドに対する親和性は、アクティベータードメインがそのリガンドに対して有する親和性よりも３０倍、４０倍、５０倍または１００倍以上高い。
【０２４６】
アクティベータードメインの有効性差および／またはターゲティングドメインとアクティベーター結合ドメインの結合親和性差は、既知の二重特異性タンパク質を超える、驚くべきそして先に認識されていなかった利点を提供する。特に、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインの１以上の残基の改変(付加、欠失、置換)が、標的細胞に対する高い特異性と共に非標的細胞に対するアクティベータードメインの有効性低減をもたらすことができることが発見された。理論に拘束されないが、低ＥＣ５０(すなわち、高有効性)のため、増殖因子は効率的に標的化され得ないと考えられた。本発明の態様により、有効性が顕著に減少した(すなわち、ＥＣ５０が増加した)増殖因子のバリアントが製造され得る。これらの増殖因子バリアントは、高親和性ターゲティングアームと融合したとき、標的分子を含む細胞または組織上の増殖因子受容体の選択的活性化をもたらすことができ、標的分子を含まない細胞または組織を実質的に活性化させない。
【０２４７】
本発明のある態様において、ターゲティングドメインおよびアクティベータードメインは直接的に結合される。本発明のある態様において、ターゲティングドメインおよびアクティベータードメインは間接的に結合される。本発明のある態様において、ターゲティングドメインおよびアクティベータードメインは共有結合される。さらに、本発明の他の態様において、ターゲティングドメインおよびアクティベータードメインは非共有結合的に結合される。
【０２４８】
アクティベーター部分およびターゲティング部分、アクティベーター部分および半減期モジュレーター(またはペプチドリンカー)およびターゲティング部分および半減期モジュレーター(またはペプチドリンカー)の結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。結合は、含まれる成分のペプチドでの誘導体化およびペプチド間のペプチド結合の形成により形成されるペプチド結合であってよい。結合は、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン結合または特異的抗原／抗体またはハプテン／抗体結合のような非共有結合であり得る。
【０２４９】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、(１)組織の損傷細胞と関連する分子に結合特異性を有するターゲティングドメイン(ここで、当該分子は生存可能細胞では細胞内にあり、損傷細胞においては細胞外空間に曝されている)；および(２)組織における細胞の増殖因子受容体に結合特異性を有するアクティベータードメイン(ここで、アクティベータードメインが増殖因子受容体に曝されたとき、アクティベータードメインは、組織の再生または生存を促進するように増殖因子受容体と結合する)を含む。ある実施態様において、アクティベータードメインは、ターゲティングドメインと融合したとき、二重特異性融合タンパク質の半数効果濃度(ＥＣ５０)が健常細胞または組織より損傷細胞または組織で低くなるように改変される増殖因子である。ある実施態様において、アクティベータードメインは、ターゲティングドメインと融合したとき、二重特異性融合タンパク質が損傷細胞または組織におけるＥＣ５０が健常細胞または組織より少なくとも一桁低いように改変される増殖因子である。
【０２５０】
ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質は、(１)組織の損傷細胞と関連する分子に結合特異性を有するターゲティングドメイン(ここで、分子は生存可能細胞の細胞内にあり、損傷細胞における細胞外空間に曝される)、(２)組織における細胞の表面と関連する分子に結合特異性を有するアクティベータードメイン(ここで、アクティベータードメインが膜関連分子に曝されたとき、アクティベータードメインは、組織の再生が調節されるように膜関連分子に結合する)および(３)ペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、アクティベータードメインは、二重特異性融合タンパク質の半数効果濃度(ＥＣ５０)が健常細胞または組織より損傷細胞または組織で低くなるように改変される増殖因子である。ある実施態様において、アクティベータードメインは、二重特異性融合タンパク質が損傷細胞または組織におけるＥＣ５０が健常細胞または組織より少なくとも一桁低いように改変される増殖因子である。ある実施態様において、リンカーは非免疫原性ペプチドである。ある実施態様において、ペプチドリンカーは、二重特異性タンパク質の半減期を調節(例えば、延長)できる半減期モジュレーターである。
【０２５１】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、(１)虚血関連分子と結合するターゲティングポリペプチドドメインおよび(２)組織の再生または生存を促進するように、組織における細胞の表面の受容体に対する親和性を有しながら、二重特異性融合タンパク質の半数効果濃度(ＥＣ５０)が健常細胞または組織よりも虚血性細胞または組織で低くなるように改変された増殖因子ポリペプチドを含む。
【０２５２】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、(１)ポドサイト関連タンパク質に結合するターゲティングポリペプチドドメイン；および(２)組織の再生または生存を促進するように、組織における細胞の表面の受容体に対する親和性を有しながら、二重特異性融合タンパク質の半数効果濃度(ＥＣ５０)が健常細胞または組織よりも虚血性細胞または組織で低くなるように改変された増殖因子ポリペプチドを含む。
【０２５３】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、(１)組織と関連する少なくとも一つの標的分子に結合特異性を有する少なくとも一つのターゲティングドメイン、(２)組織における細胞の表面と関連する少なくとも一つの分子に結合特異性を有する少なくとも一つのアクティベータードメイン(ここで、結合ドメインが分子に曝されたとき、結合ドメインは組織の再生または生存を促進するように分子に結合する)および(３)所望によりペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、融合タンパク質は２以上のターゲティングドメインを含み、各ターゲティングドメインは、組織と関連する標的分子に対する結合親和性を有する。ターゲティングドメインの各々は同じ結合特異性(例えば、同じ標的分子に対する結合特異性)または異なる結合特異性(例えば、異なる標的分子に対する結合特異性)を有し得る。ターゲティングドメインの各々は、同じ結合親和性または異なる結合親和性を有し得る。ある実施態様において、タンパク質は２以上のアクティベータードメインを含む。アクティベータードメインの各々は同じ結合特異性(例えば、細胞の同じ受容体に対する結合特異性)または異なる結合特異性(例えば、細胞の異なる受容体に対する結合特異性)を有する。アクティベータードメインの各々は、同じ結合親和性または異なる結合親和性を有し得る。ある実施態様において、リンカーはペプチドである。ある実施態様において、リンカーは非免疫原性ペプチドである。ある実施態様において、リンカーは半減期モジュレーターであり、ここで、半減期モジュレーターは二重特異性タンパク質の半減期を調節する。
【０２５４】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は半減期モジュレーター(ＨＬＭ)を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターはポリペプチドである。半減期モジュレーターはＮ末端およびＣ末端の２末端を有してよく、一端でペプチド結合によりターゲティングポリペプチドドメインに結合し、他端でペプチド結合によりアクティベータードメインに結合する。他の実施態様において、半減期モジュレーターは、一端(Ｎ末端またはＣ末端)でアクティベータードメインまたはターゲティングドメインに結合する。従って、半減期モジュレーターは、二重特異性タンパク質のＮ末端にあってもＣ末端にあってもよい。半減期モジュレーターは、ターゲティングドメインまたはアクティベータードメインにペプチド結合により結合され得る。
【０２５５】
当業者は、このような二重特異性タンパク質が組織再生において有用であり得ることを認識する。ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質を、疾患細胞、組織または臓器傷害後または組織の細胞が損傷し得る事象後に使用し得る。ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質は、１以上の増殖因子受容体を発現する細胞を活性化できる。他の実施態様において、二重特異性融合タンパク質は、例えば、傷害、または組織の細胞が損傷し得るまたは機能不全となり得る事象後、例えば、１以上の増殖因子受容体を発現する細胞を、組織に動員するのに有用である。
【０２５６】
ある態様において、このような二重特異性タンパク質の投与を、損傷組織または臓器の修復、生存または再生し促進に使用し得る。ある実施態様において、ここに開示する二重特異性タンパク質は、組織生存調節に有用であり得る。例えば、二重特異性タンパク質は、細胞または組織の生存能を増強または維持できる。ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質は、生存促進性または細胞生存経路を活性化できる。ある実施態様において、二重特異性タンパク質はアポトーシスを減少させ、または細胞死を減少させ得る。
【０２５７】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、(１)ターゲティングポリペプチドドメイン(ここで、ターゲティングドメインは標的分子に結合し、それにより二重特異性融合タンパク質を組織の第一の細胞にターゲティングする)および(２)増殖因子受容体に結合特異性を有するアクティベータードメインを含む。アクティベータードメインが増殖因子受容体に暴露されたら、アクティベータードメインが、細胞動員、アポトーシス阻害、細胞増殖誘発、生存促進性経路活性化、組織の再生および／または生存を促進するように、第二の細胞の受容体を活性化できる。当業者は、二重特異性融合タンパク質が第一細胞集団に結合し、同じ細胞集団(例えば自己分泌様式で)または異なる細胞集団(例えば傍分泌様式で)に作用できることを認識する。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、損傷第一細胞集団と関連する標的分子に特異的に結合し、アクティベータードメインは、生存可能細胞の第二細胞集団の受容体に特異的に結合する。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、損傷細胞集団と関連する標的分子に特異的に結合し、アクティベータードメインは同じ細胞集団の受容体に特異的に結合する。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、第一細胞集団の表面の組織特異的標的分子に特異的に結合し、アクティベータードメインは第二細胞集団に特異的に作用する。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、細胞集団の表面の組織特異的標的分子に特異的に結合し、アクティベータードメインは、同じ細胞集団に特異的に作用する。第一細胞は生存可能細胞でも“リスクがある”細胞でもよい。ここで使用する“リスクがある”細胞は、まだアポトーシスを受けていないかまたは損傷していないが、損傷するリスクがある生存可能細胞をいう。
【０２５８】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、組織または臓器における異なる細胞の異なる分子に結合する２個の異なる結合ドメイン(例えばターゲティングドメインおよびアクティベータードメイン)を有する。さらにある実施態様において、二重特異性タンパク質は、組織における同じ標的細胞の異なる分子に結合する２個の異なる結合ドメインを有し、ターゲティングドメインは標的細胞に特異的に結合するよう選択され、アクティベータードメインは、組織再生、細胞動員、アポトーシス阻害、細胞増殖誘発、生存促進性経路活性化、組織の再生および／または生存を促進するよう、細胞の表面の受容体(例えば、増殖因子受容体)に結合するように選択される。
【０２５９】
標的分子
ある態様において、標的分子は、標的細胞に曝されるかまたはその外側で富化される。ある実施態様において、標的分子は損傷細胞と関連し、標的分子が生存可能または非損傷細胞の内部にあり、そして損傷細胞においては細胞外空間に曝されている。このような分子は、例えば、壊死(例えばＤＮＡ)またはアポトーシス(例えば、ホスファチジルセリン)を受けている細胞においてむき出しの分子、ミオシン(その組織タイプ特異的サブタイプを含む)、ＩＣＡＭ−１またはＰ−セレクチンを含むが、これらに限定されない。さらに他の実施態様において、標的分子は、健常または機能的細胞または組織において検出されるレベルと比較して、疾患または機能不全細胞または組織表面に存在し、または富化されている分子である。ある実施態様において、標的細胞は腫瘍または癌細胞ではない。
【０２６０】
細胞は、脂質二重層を含む原形質膜(または細胞膜)により結合されている。細胞膜は、サイトゾルに面する表面(サイトゾル側または細胞の内面)および細胞の外部または細胞外空間に面する表面からなると考えられ得る。アニオン性リン脂質の原形質膜の内部から外葉への二層間移動がアポトーシス中に生じる。アネキシンＡ５、シナプトタグミンＩまたはラクトアドヘリンのようなアニオン性リン脂質結合タンパク質を使用して、細胞膜の外葉のホスファチジルセリンを検出できる。ホスファチジルセリンは、通常生存可能または非損傷細胞において膜のサイトゾル側に限定され、損傷細胞またはアポトーシスにおいて外側細胞表面または細胞外空間に曝されるようになる、リン脂質である。
【０２６１】
ある実施態様において、標的分子は“虚血関連分子”である。“虚血関連分子”は、虚血(これは低酸素症をもたらす)または低酸素症後顕著に高い(例えば、少なくとも１.５倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い)レベルで検出される何れかの分子である。虚血は、適切な酸素化を提供するのに血流が不十分であるときに生じ、低酸素症の最も重篤な形態として組織低酸素症(酸素減少)または無酸素症(酸素非存在)、最終的に組織壊死、およびアポトーシスをもたらす。ここに提供するものを含む、あらゆる適当な結合アッセイを使用して、虚血関連分子を同定し得る。検出される分子のレベル増加は、ターンオーバーの上方制御または減少による可能性があり、またはアクセシビリティ増加(例えば、細胞損傷に起因)または細胞外曝露増加(例えば、原形質膜の内部から外葉への二層間移動)による可能性がある。ある実施態様において、虚血関連分子は、虚血性事象を受けていない同じ組織の細胞より、虚血後組織の細胞で顕著に高いレベル(例えば、少なくとも１.５倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い)で検出される(すなわち、分子は虚血後組織に特異的であるまたは富化されている)。さらなる実施態様において、虚血関連分子は、細胞損傷と関連する(すなわち、分子は、同じタイプの非損傷細胞より、損傷されている細胞で顕著に高いレベルで検出される)。ある虚血関連分子は、虚血性事象後の心臓において(または心臓における虚血の模倣に使用されるモデルシステムにおいて)富化される(例えば、少なくとも１.５倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い)。ある実施態様において、虚血関連分子は、虚血性事象後の心臓において(または心臓における虚血の模倣に使用されるモデルシステムにおいて)約１.５倍富化、約２倍富化、約３倍富化、約４倍富化、約５倍富化される。ある実施態様において、虚血関連分子は、虚血性事象後の心臓において(または心臓における虚血の模倣に使用されるモデルシステムにおいて)約１.５倍〜約５倍それ以上富化される。ある実施態様において、虚血関連分子は、虚血性事象後の心臓において(または心臓における虚血の模倣に使用されるモデルシステムにおいて)約１.５倍〜約２倍、約２倍〜約２.５倍、約２.５倍〜約３倍、約３倍〜約３.５倍、約３.５倍〜約４倍、約４倍〜約４.５倍、約４.５倍〜約５倍、またはそれ以上富化される。ある実施態様において、このような分子は、壊死(例えば、ＤＮＡであるが、これに限定されない)またはアポトーシス(例えば、ホスファチジルセリンであるが、これに限定されない)を受ける筋細胞または他の心臓細胞上に暴露される分子である。ある実施態様において、このような分子は、コラーゲン(コラーゲンＩ、III)、ミオシン(その細胞型特異的サブタイプを含む)、または虚血後心臓で富化される他の細胞外マトリクスタンパク質のような、瘢痕心組織において富化される分子である。このような分子は、インビボでの虚血−再灌流後またはインビトロでの模擬虚血−再灌流後、またはインビトロで培養した細胞の低酸素症、ＡＴＰ減少、活性酸素種(ＲＯＳ)もしくは一酸化窒素合���酵素(ＮＯＳ)産生増加、または血清飢餓のような状態への曝露後の富化に基づき、同定され得る。
【０２６２】
ある実施態様において、標的分子はポドサイト関連分子である。ある実施態様において、標的分子は、ネフリン(ＮＰＨＳ１)、ポドプラニン(ＰＤＰＮ)、ポドカリキシン(ＰＯＤＸＬ)、ジストログリカン(ＤＡＧ１)、ＧＬＥＰＰ１(ＰＴＰＲＯ)、ＮＥＰＨ１(ＫＩＲＲＥＬ)、ＦＡＴ非定型カドヘリン１(ＦＡＴ１)、富システイン型膜貫通ＢＭＰ制御因子１(ＣＲＩＭ１)、インテグリンアルファ−８／ベータ１(ＩＴＧＡ８)の一つである。
【０２６３】
アクティベータードメイン
アクティベータードメインは、細胞ネットワークの活性を検出可能に調節するまたは細胞をある位置から別の位置に動員させる、あらゆるポリペプチドであり得る。ある実施態様において、アクティベータードメインは、細胞表面の受容体への結合により、シグナル伝達経路を活性化できる。ある実施態様において、あるアクティベータードメインは増殖因子ポリペプチド、または受容体の何れかのアゴニストである。このような調節が、細胞増殖の誘導、細胞成長の誘導、細胞生存の促進および／またはアポトーシスの阻害のような細胞ネットワークの活性の増加であり得ることは、認識される。ある実施態様において、アクティベータードメインは、他の因子または細胞(例えば幹細胞)を動員できる。
【０２６４】
特定の適用のためのアクティベータードメインは、所望の治療結果に基づき、選択し得る。例えば、生存を増加するおよび／または幹細胞分化(再生)目的で、ＩＧＦ、ＨＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１、ＰＤＧＦ、ＳＤＦ１、ＴＢ４、またはＮＲＧ１(またはその一部もしくは誘導体)を含むアクティベータードメインが用いられ得る。細胞増殖増加(再生)目的で、ＩＧＦ、ＦＧＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＢ４、またはＮＲＧ１(またはその一部もしくは誘導体)を含むアクティベータードメインが用いられ得る。同族受容体に結合する能力を実質的に保持するＦＧＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＨＧＦ、ＳＧＦ１、ＴＢ４、ＶＥＧＦアルファ、またはその一部もしくは誘導体を含むアクティベータードメインが、血管形成の増加に一般的に使用され得る。
【０２６５】
ある実施態様において、アクティベータードメインは、タンパク質の野生型形態と比較して、アミノ酸配列、タンパク質三次元構造、および／またはタンパク質の活性の変化を含む。所望の治療効果を有する二重特異性タンパク質の作製のためのアクティベータードメインにおける適当な修飾の選択は、複数因子によることは理解される。
【０２６６】
ある実施態様において、アクティベータードメインは、その天然受容体(例えばＩＧＦ−１受容体)への結合を減少させるため、結合タンパク質(ＩＧＦ結合タンパク質)への結合を減少させるためおよび／またはその天然受容体(例えばＩＧＦ−１受容体)の活性化を減少させるため、野生型増殖因子(例えばＩＧＦ−１)に対してアミノ酸配列修飾を有する増殖因子である。ある実施態様において、アクティベータードメインは、その天然受容体(例えばＩＧＦ−１受容体)への結合を減少させる(例えば、約１〜５％、５〜１０％、１０％〜２０％、約２０％〜４０％、約５０％、約４０％〜６０％、約６０％〜８０％、約８０％〜９０％、９０〜９５％)、アミノ酸配列修飾を有する増殖因子である。
【０２６７】
増殖因子ポリペプチドは、増殖因子受容体の活性化を検出可能に修飾する。ある実施態様において、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインは、野生型生物活性の少なくとも約０.０１％を保持する増殖因子、そのバリアントまたは誘導体である。ある実施態様において、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインは、野生型生物活性の少なくとも約０.１％、少なくとも約１％、少なくとも約１０％を保持する増殖因子、そのバリアントまたは誘導体である。ある実施態様において、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインは、野生型生物活性の約０.０１％〜約０.１％を保持する増殖因子、そのバリアントまたは誘導体である。ある実施態様において、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインは、野生型生物活性の約０.０１％〜約１％を保持する増殖因子、そのバリアントまたは誘導体である。ある実施態様において、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインは、野生型生物活性の約０.０１％〜約１０％を保持する増殖因子、そのバリアントまたは誘導体である。ある実施態様において、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインは、野生型生物活性の約０.１％〜約１％を保持する増殖因子、そのバリアントまたは誘導体である。ある実施態様において、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインは、野生型生物活性の約０.１％〜約１０％を保持する増殖因子、そのバリアントまたは誘導体である。ある実施態様において、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインは、野生型生物活性の約０１％〜約１０％を保持する増殖因子、そのバリアントまたは誘導体である。ある実施態様における生物活性は、適切な細胞における対応する増殖因子受容体の活性化の測定により決定され得る。ある実施態様において、活性化は、例えば、ＡＫＴ、Ｓ６、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｍＴＯＲなどのような、しかしこれらに限定されない受容体キナーゼまたは下流エフェクタータンパク質のリン酸化の測定により評価され得る。
【０２６８】
インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)およびその誘導体
インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)は、インスリン様および増殖刺激性質を有するタンパク質のファミリーを構成する。ＩＧＦヒトＩＧＦ１は、配列番号９および３１に各々示すタンパク質およびＤＮＡ配列を有する７０アミノ酸塩基性ペプチドである。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１受容体は、細胞増殖および生存のような細胞過程に重要である。ＩＧＦ−１またはそのバリアントのＩＧＦ−１受容体への結合はキナーゼ活性を刺激し、複数基質のリン酸化に至り、それによりシグナル伝達カスケードを開始させる。ＩＧＦ−１は、ＡＫＴ経路の活性化により細胞増殖および生存を刺激する。ＩＧＦ−ＩのＩＧＦ−１受容体への結合により、チロシンキナーゼは２個の主要基質、ＩＲＳ−１およびＳｈｃでチロシン残基をリン酸化し、これは続いてＲａｓ／ＲａｆおよびＰＩ  ３−キナーゼ／ＡＫＴ経路を経てシグナル伝達する。
【０２６９】
ＩＧＦ−１(およびＩＧＦ−２)とＩＧＦ−１受容体の相互作用は、ＩＧＦ結合タンパク質(ＩＧＦＢＰ)により制御される。全６個のＩＧＦＢＰ(特にＩＧＦＢＰ５)はＩＧＦ作用を阻害することが示されているが、ある状況下で、刺激性効果が観察されている。循環中のＩＧＦの少なくとも９９％が通常ＩＧＦＢＰに結合する。
【０２７０】
ある実施態様により、二重特異性タンパク質は、ＩＧＦ−１受容体を介してシグナル伝達する能力を維持できる。シグナル伝達能は、下流細胞内標的、例えば、ＡＫＴ(セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＢ)が、二重特異性タンパク質のアクティベータードメインの細胞表面での受容体の結合に応答してリン酸化されるか否かの評価により決定できる。
【０２７１】
ある実施態様において、アクティベータードメイン(ここではシグナル伝達アームとも称する)は、ヒトＩＧＦ−１またはヒトＩＧＦ−１の誘導体である。ある実施態様において、アクティベータードメインは、配列番号９〜３０または１２０の何れかに記載のアミノ酸配列を有する。
【０２７２】
ある実施態様において、アクティベータードメインは、ＩＧＦ−１のバリアントのＩＧＦ−１受容体への結合に応答する受容体リン酸化または下流シグナル伝達タンパク質リン酸化のアッセイにより、ＩＧＦ−１受容体への選択性を維持できるＩＧＦ−１のバリアントである。
【０２７３】
ある実施態様において、アクティベータードメインは、ＡＫＴ経路を活性化する能力を維持しながら、野生型ＩＧＦ−１に比してＩＧＦ−１結合タンパク質(ＩＧＦＢＰ)への結合が減少するように修飾される、ＩＧＦ−１のバリアントである。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、ｐＡＫＴ  ＥＣ５０により評価して、非標的細胞に対する減少した有効性を持ちながら、ＩＧＦ−１受容体を活性化できる。ＥＣ５０は、ｐＡＫＴシグナル伝達レベルの最大半量の達成に必要な濃度として定義する。
【０２７４】
ある実施態様において、アクティベータードメインはヒトＩＧＦ−１の誘導体であり、血清および他の体液に存在するＩＧＦ結合タンパク質へのアクティベータードメインの結合が減少するように改変される。
【０２７５】
ある実施態様において、アクティベータードメインはヒトＩＧＦ−１の誘導体であり、Ｎ末端１３残基伸張(ＩＧＦ−１  ＬＯＮＧとも称する、配列番号１１)、変異Ｅ３Ｒ(配列番号１２)またはこれらの組み合わせ(ＬＯＮＧ  Ｅ３Ｒ、ＬＲ３とも称する、配列番号１５)を含む。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、血清および他の体液に存在するＩＧＦ結合タンパク質へのアクティベータードメインの結合を低減させるために、Ｅ３Ｒ置換、Ｎ末端１３残基伸張、アミノ酸１〜３の欠失((Ｄｅｓ１−３)、配列番号１０)またはこれらの組み合わせを含む。
【０２７６】
ある実施態様において、アクティベータードメインはヒトＩＧＦ−１の誘導体であり、次の修飾の１以上を含む。Ｎ末端１３残基伸張(ＩＧＦ−１  ＬＯＮＧと称する、配列番号１１)、アミノ酸１〜３の欠失(Ｄｅｓ−１−３、配列番号１０)、ポリペプチドの３位のＧｌｕをＡｒｇに置き換える置換(Ｅ３Ｒ、配列番号１２)、３７位に無アルギニン(Ｒ３７Ｘ、配列番号１３)、アミノ酸６８〜７０の欠失(３Ｘ、配列番号１４)、またはＮ末端１３残基伸張および野生型ポリペプチドの３位のＧｌｕをＡｒｇに置き換える置換(ＬＲ３、配列番号１５)。
【０２７７】
ある実施態様において、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１バリアントは、チロシン残基の１以上での置換を含み得る。例えば、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１バリアント(例えばＬＲ３、Ｄｅｓ  １−３)は、次の置換、Ｙ２４Ｌ(配列番号１７、２２、および２７)、Ｙ３１Ａ(配列番号１９、２４および２９)、およびＹ６０Ｌ(配列番号２０、２５および３０)の１以上を含み得る。例えば、ＩＧＦ−１バリアントはＹ２４Ｌ置換およびＹ３１置換(配列番号１８、２３および２８)を含み得る。ある実施態様において、１以上のチロシン残基(Ｙ２４、Ｙ３１、Ｙ６０またはこれらの組み合わせ)は、短脂肪族アミノ酸で置換され得る。ある実施態様において、１以上のチロシン残基(Ｙ２４、Ｙ３１、Ｙ６０またはこれらの組み合わせ)は、極性アミノ酸で置換され得る。ある実施態様において、１以上のチロシン残基(Ｙ２４、Ｙ３１、Ｙ６０またはこれらの組み合わせ)は、ロイシン、アラニン、イソロイシン、セリン、スレオニンまたは何れかの他のアミノ酸で置換され得る。
【０２７８】
ある実施態様において、アクティベータードメインは、次の修飾の１以上を含むヒトＩＧＦ−１の誘導体である。Ｎ末端１３残基伸張(ＩＧＦ−１  ＬＯＮＧ)、アミノ酸１〜３の欠失(Ｄｅｓ−１−３)、ポリペプチドの３位のＧｌｕをＡｒｇに置き換える置換(Ｅ３Ｒ)、３７位に無アルギニン(Ｒ３７Ｘ)、アミノ酸６８〜７０の欠失(３Ｘ)、Ｎ末端１３残基伸張および野生型ポリペプチドの３位のＧｌｕをＡｒｇに置き換える置換(ＬＲ３)、チロシン残基の１以上の置換(Ｙ２４、Ｙ３１、Ｙ６０またはこれらの組み合わせ(例えばＹ２４Ｌ、Ｙ３１Ａ、Ｙ６０Ｌ置換またはこれらの組み合わせ)。
【０２７９】
ある実施態様において、アクティベータードメインは、３位および３１位に置換を含むヒトＩＧＦ−１の誘導体である。例えば、アクティベータードメインは、Ｅ３ＲおよびＹ３１置換を含むヒトＩＧＦ−１の誘導体であり得る。ある実施態様において、アクティベータードメインは、配列番号１２０を有するアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、アクティベータードメインは、配列番号１２１を有する核酸配列によりコードされる。
【０２８０】
ある実施態様において、アクティベータードメインは、残基２４〜３７の１以上に変異(例えば置換、欠失)を含むヒトＩＧＦ−１の誘導体である。
【０２８１】
ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、ＩＧＦ−１バリアントに存在するグリコシル化部位の１以上でグリコシル化により修飾され得る。
【０２８２】
ＩＧＦ−１  ＬＯＮＧ、ＩＧＦ−１  ＬＯＮＧ  Ｅ３Ｒ(ＩＧＦ−１(ＬＲ３)と称する)またはＩＧＦ１  Ｄｅｓ１−３を含む二重特異性タンパク質は、野生型ＩＧＦ−１に比してＩＧＦ結合タンパク質への親和性が減少していると考えられる。ある実施態様において、ここに記載する二重特異性タンパク質のＩＧＦ−１バリアントは、野生型ＩＧＦ−１と比較してＩＧＦ−１結合タンパク質との相互作用が実質的に減少しながら、シグナル伝達経路を活性可できる。
【０２８３】
ある実施態様において、ここに記載するＩＧＦ−１バリアントを含む二重特異性タンパク質は、野生型ＩＧＦ−１の非標的細胞に対するより低い、非標的細胞に対する有効性を有する。
【０２８４】
増殖因子受容体に結合するあるアクティベータードメインは、ここに配列番号９〜３０および１２０に提供される。
【０２８５】
ペプチドが非修飾ペプチドと実質的に同じ活性または機能を有する限り、ここに開示する配列のアミノ酸配列の変動、欠失、置換または誘導体化のような付加的ペプチド配列修飾が包含され得る。顕著なことに、該修飾ペプチドは、非修飾ペプチドと関連する活性または機能を保持し、該修飾ペプチドは、一般に非修飾配列のアミノ酸配列と“実質的に相同”であるアミノ酸配列を有する。
【０２８６】
ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、配列番号９〜３０および１２０に提供するアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一性または少なくとも約９９％同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、配列番号９〜３０および１２０に提供するアミノ酸配列と約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９８％、約９８％〜約９９％同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、配列番号９〜３０または１２０におけるアミノ酸の何れかの１０、２０、３０、４０、５０、６０またはそれ以上の連続アミノ酸を含み得る。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、配列番号１５〜２０の何れかに示すアミノ酸配列を有し得る。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、配列番号１０または２６〜３０の何れかに記載するアミノ酸配列を有し得る。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、配列番号１１〜１４または２１〜２５および１２０の何れかに記載のアミノ酸配列を有し得る。
【０２８７】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、二重特異性タンパク質の損傷組織におけるＥＣ５０を健常組織におけるより少なくとも一桁低くするように選択される増殖因子バリアントを有するアクティベータードメインを含む。例えば、二重特異性タンパク質ドメインは増殖因子バリアントを含み、健常組織におけるＥＣ５０より損傷組織におけるＥＣ５０が少なくとも１０倍低い、少なくとも１５倍低い、少なくとも２０倍低い、少なくとも２５倍低い、少なくとも３０倍低い、少なくとも３５倍低い、少なくとも４０倍低い、少なくとも４５倍低い、少なくとも５０倍低い、少なくとも５５倍低い、少なくとも６０倍低い、少なくとも６５倍低い、少なくとも７０倍低い、少なくとも７５倍低い、少なくとも８０倍低い、少なくとも８５倍低い、少なくとも９０倍低い、少なくとも９５倍低い、少なくとも１００倍低い、少なくとも１１０倍低い。
【０２８８】
ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントを含む二重特異性タンパク質は、損傷組織における半数効果濃度(ＥＣ５０)が健常組織におけるより低い。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントを含む二重特異性タンパク質は、半数効果濃度(ＥＣ５０)が健常組織より損傷組織で少なくとも１０倍低い、少なくとも１５倍低い、少なくとも２０倍低い、少なくとも２５倍低い、少なくとも３０倍低い、少なくとも３５倍低い、少なくとも４０倍低い、少なくとも４５倍低い、少なくとも５０倍低い、少なくとも５５倍低い、少なくとも６０倍低い、少なくとも６５倍低い、少なくとも７０倍低い、少なくとも７５倍低い、少なくとも８０倍低い、少なくとも８５倍低い、少なくとも９０倍低い、少なくとも９５倍低い、少なくとも１００倍低い、少なくとも１１０倍低い。
【０２８９】
二重特異性融合タンパク質の受容体への結合についての結合親和性および動的会合および解離速度を標準技術を使用して測定し、他の陰性対照分子(無関係の対照アクティベータードメインとの融合タンパク質、アクティベータードメインを欠く融合タンパク質)および陽性対照分子(増殖因子のような組み換え野生型受容体リガンド)と比較し得る。二重特異性融合タンパク質の平衡および動的結合パラメータをまた非融合野生型リガンドについて測定した同じパラメータと比較し、リガンドの他の分子への融合が、リガンドのその対応する受容体への通常の結合に影響するか否かを決定できる。このような情報を二重特異性融合タンパク質の有効用量の決定に使用し得る。
【０２９０】
二重特異性融合タンパク質は、固定化増殖因子受容体に、陰性対照について観察されるより顕著に高い親和性(例えば、少なくとも１００倍)で結合する。二重特異性融合タンパク質は、固定化増殖因子受容体に、陰性対照について観察されるより顕著に高い親和性(例えば、少なくとも１００倍)で、しかし、陽性対照について観察されるより低い親和性(例えば、少なくとも５倍)で結合する。
【０２９１】
さらに、固定化受容体への結合を、ポリペプチドまたは受容体と結合する過剰の可溶性ポリペプチド、可溶性受容体、または抗体を使用して競合させ、これらの相互作用を遮断させ得る。ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質は、増殖因子受容体に天然リガンド結合の１０００倍内の親和性でその受容体に結合する。
【０２９２】
天然増殖因子はアクティベータードメインとして使用され得る。しかしながら、有効性が減少されるが、同族増殖因子受容体を活性化する能力を保持するように設計された改変配列を有する増殖因子を有する二重特異性融合タンパク質が使用され得ることが観察されている。ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質は、ＩＧＦ−１結合タンパク質および／またはＩＧＦ−１受容体への結合または相互作用が減少するように設計された改変配列を有する修飾ＩＧＦ−１シグナル伝達アームを有する。驚くべきことに、このような修飾増殖因子を有する二重特異性タンパク質は、損傷組織標的化に対する高い特異性を有することが示されている。
【０２９３】
二重特異性融合タンパク質(およびそのアクティベータードメイン)は、さらに同族受容体活性化に介在する能力を有する。このような活性を、例えば、細胞モデルにおいて評価し得る。虚血について、新生仔ラット心室筋細胞(ＮＲＶＭ)または誘導型多能性幹細胞由来心筋細胞または細胞株のような培養心筋細胞を使用する虚血再灌流の細胞モデルが使用され得る。模擬虚血(ＳＩ)は、代謝阻害剤(デオキシグルコースおよび亜ジチオン酸)および代謝物(高カリウム、乳酸、低ｐＨ)または嫌気性チャンバーもしくは低酸素バッグにおける低酸素症により開始され得る。再灌流を、酸素化緩衝液に再懸濁させることにより模倣できる。あらゆる外来性代謝阻害剤または代謝物非存在下で、虚血の主要２成分  −  低酸素症および代謝物蓄積  −  を提供する虚血のインビトロ成体心筋細胞ペレットモデルが開発されている。下記表１は、二重特異性融合タンパク質が心筋細胞の損傷阻止、心臓幹細胞の生長、運動性もしくは分化促進および／または損傷組織の修復促進をする能力を示す、代表的方法を示す。
【表１】
2022002528.tif 000002
【表２】
2022002528.tif 000003
【０２９４】
ある場合、アクティベータードメインおよびターゲティングポリペプチド両方の活性を同時に評価することが望まれる可能性がある。ＥＬＩＳＡは、この目的で好都合に使用され得る。
【０２９５】
ターゲティングポリペプチド(例えば、アネキシンＡ５)の基質をＥＬＩＳＡプレートに吸着させ、次いで適切なＢＳＡ含有緩衝液で遮断し得る。次いで二重特異性融合タンパク質を添加し、その後アクティベータードメインに対する組み換え基質(例えば、アクティベーターが増殖因子であるならば、基質は組み換え同族受容体または受容体フラグメント(外部ドメイン)である)を添加してよい。この基質は検出のために蛍光標識されているかまたはリガンド結合に顕著に影響しない受容体の領域に対する標識抗体を使用して検出されるかの何れかであり得る。
【０２９６】
改変二重特異性融合タンパク質のインビボ活性は、一般に二重特異性融合タンパク質のアクティベータードメインにより制御される分子におけるシグナル伝達変化の検出により評価される。これは、処理組織のフローサイトメトリー、免疫蛍光、ＥＬＩＳＡ、ホスホ標識、またはウェスタン分析により検出される、細胞表面受容体リン酸化状態またはホスホ−ＡＫＴまたはホスホ−ＥＲＫのような下流メディエーターにおける変化を含み得る。他の機能的評価は、染色および形態学的同定による生存可能細胞数、アネキシンＡ５結合(免疫蛍光による)またはフローサイトメトリーによるアポトーシスレベル、カスパーゼ活性の検出、ＴＵＮＥＬアッセイ(ＴＵＮＥＬ陽性細胞数減少)またはＤＮＡラダリングの試験を含む。ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質は、アッセイにより検出される制御分子のレベル、機能的活性、またはリン酸化の顕著な(例えば、少なくとも２０％)変化を誘発するならば、インビボで機能する。
【０２９７】
患者における損傷組織修復は、あらゆる臨床的に適切な標準を使用して評価できる。例えば、梗塞組織修復は、筋細胞、線維芽細胞の数のような細胞数または瘢痕形成量の定量化、またはＬＶＥＤＰ、ＬＶＤＰ、＋ｄｐ／ｄＴ、ＬＶ重量、チャンバー体積および拡張期壁応力を含む心臓機能の拍出または構造的態様についての機能的アッセイで測定できる。このような評価の方法は周知であり、文献に十分記載されている。一般に、二重特異性融合タンパク質は、このような臨床的評価の何れかで顕著な(例えば、少なくとも１０％)変化をもたらすならば、損傷組織を修復するといえる。
【０２９８】
ターゲティングドメイン
本発明のある態様において、ターゲティングドメインは、組織と関連する標的分子(例えば、虚血関連分子)に特異的である。本発明のある態様において、二重特異性タンパク質のターゲティングドメインは、二重特異性タンパク質を非癌または非腫瘍細胞または組織に標的化させる。ある実施態様において、ターゲティングドメインはポドサイト関連分子に特異的である。
【０２９９】
ターゲティングドメインは、この機能を果たすあらゆるポリペプチド配列であり得る。ある実施態様において、ターゲティングドメインの標的分子への結合は、生物活性を有しないかまたは生物活性を調節しない。ここで使用する“生物活性”は、分子のタンパク質のドメインへの曝露により実施される、規定された、既知活性である。
【０３００】
ある実施態様において、ターゲティングドメインは、標的分子、そのフラグメントまたはそのバリアントに結合親和性を有する非抗体ポリペプチド、そのフラグメントまたはそのバリアントである。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、標的分子、そのフラグメントまたはそのバリアントに結合親和性を有するペプチド配列を有する非抗体ポリペプチドである。
【０３０１】
さらに他の実施態様において、ターゲティングポリペプチドドメインは１以上の抗体可変領域を含む。標的分子に直接的または間接的に結合できるあらゆるターゲティングドメインが企図されることを当業者は認識する。
【０３０２】
アネキシンＡ５およびそのバリアント
ある態様において、ターゲティングドメインはアネキシンである。用語“アネキシン”は、リン脂質、特にホスファチジルセリン(ＰＳ)に結合でき、アネキシンファミリーのメンバーであるあらゆるタンパク質をいう。ある実施態様において、アネキシンはアネキシンＡ５であるが、他のアネキシンも本発明のアネキシンバリアントの製造および使用に同等に使用できる。ある実施態様において、ターゲティングドメインはヒトアネキシンＡ５(ＡｎｘＶ、配列番号１)、その機能的フラグメント、またはそのバリアントである。アネキシンＡ５のバリアントは、少なくとも一つのアミノ酸を、親アネキシンＡ５ポリペプチド(野生型、配列番号１)でこれらアミノ酸が見られない少なくとも一つの位置に有する。ある実施態様において、ターゲティングドメインはアネキシンＡ５のバリアントである(配列番号２〜４、１２２)。アネキシンバリアントは、従って、１以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含んでよく、ここで、アミノ酸置換、欠失、または付加は、二重特異性タンパク質のアネキシンＡ５バリアントがＰＳのような少なくとも一つのリン脂質に結合する能力に実質的に影響しない。ある実施態様において、アネキシンＡ５バリアントは、配列番号１〜４、１２２に提供するアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一性または少なくとも約９９％同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ある実施態様において、アネキシンＡ５バリアントは、配列番号１〜４、１２２におけるアミノ酸の何れかの５０、１１０、２００、３００、またはそれ以上の連続アミノ酸を含み得る。ある実施態様において、アネキシンＡ５を修飾して、ホスファチジルセリン結合親和性を維持しながら、アネキシンＡ５の内部移行を減少させる。ある実施態様において、アネキシンバリアントは、少なくとも一つのリン脂質、特にホスファチジルセリン(ＰＳ)に結合でき、細胞に内部移行しないかまたは野生型アネキシンより遅い速度で内部移行する。
【０３０３】
ある実施態様において、アネキシンＡ５の１以上の残基を改変して、より好都合な標的分子への結合のオンレート、またはより好都合な標的分子への結合のオフレートを達成するように結合を修飾し得る。本発明のアネキシンバリアントの一部は、細胞への内部移行を阻害するように修飾される、配列番号１のアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、アネキシンＡ５の非内部移行バリアント(ｎｉ−アネキシンＡ５またはｎｉ−ＡｎｘＶとも称する、配列番号４)である。ある実施態様において、アネキシンＡ５の非内部移行変異体は、配列番号４に提供するアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一性または少なくとも約９９％同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ある実施態様において、アネキシンＡ５の非内部移行変異体は、配列番号４に提供するアミノ酸配列と約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９８％、約９８％〜約９９％同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ある実施態様において、アネキシンＡ５バリアントは、配列番号４におけるアミノ酸の何れかの５０、１１０、２００、３００、またはそれ以上の連続アミノ酸を含み得る。
【０３０４】
内部移行を実質的にもたらさないアネキシンＡ５には多くの変化が想定される。アネキシンＡ５の非内部移行バリアントは、野生型Ａ５を含む二重特異性タンパク質と比較して、二重特異性タンパク質の半減期の延長が提供され得ることは認められるべきである。
【０３０５】
ある実施態様において、内部移行を実質的にもたらさないアネキシンＡ５のバリアントは、アネキシンバリアントまたはアネキシンバリアントと関連するタンパク質の半減期を延長させるために使用できる。ある実施態様において、内部移行を実質的にもたらさないアネキシンＡ５のバリアント、または内部移行を実質的にもたらさないアネキシンＡ５のバリアントを含む融合タンパク質は、野生型アネキシンＡ５、または野生型アネキシンＡ５を含む融合タンパク質と比較して、１.１〜１.２倍、１.１〜１.３倍、１.１〜１.４倍、１.１〜１.５倍、１.１〜１.６倍、１.１〜１.７倍、１.１〜１.８倍、１.１〜１.９倍、１.１〜２倍長い半減期を有し得る。例えば、ｎｉ−アネキシンＡ５(ＳＧＦ  ７４０、配列番号８４)を含む二重特異性融合タンパク質の半減期延長は、ｗｔアネキシンＡ５(ＳＧＦ  ７３７)を含むこの二重特異性融合タンパク質のバリアントと比較して約１.１５倍延長である。さらに、内部移行を実質的にもたらさないアネキシンＡ５のバリアントは、造影試験またはプレターゲティング試験において使用されたもののような、他のアネキシンＡ５含有タンパク質または融合分子の半減期延長に有用である。
【０３０６】
ここで使用する用語“非内部移行”および“内部移行を実質的にしない”は、本発明の二重特異性タンパク質の相当量が内部移行しないことをいう。例えば、用語“内部移行を実質的にしない”は、本発明の二重特異性タンパク質の５０％未満が二重特異性タンパク質が結合する細胞により内部移行される、または本発明の二重特異性タンパク質の２５％未満が二重特異性タンパク質が結合する細胞により内部移行される、または本発明の二重特異性タンパク質の１０％未満が二重特異性タンパク質が結合する細胞により内部移行される、または本発明の二重特異性タンパク質の５％未満が二重特異性タンパク質が結合する細胞により内部移行される、または本発明の二重特異性タンパク質の３％未満が二重特異性タンパク質が結合する細胞により内部移行される、または本発明の二重特異性タンパク質の１％未満が二重特異性タンパク質が結合する細胞により内部移行されるとして理解される。
【０３０７】
ここで使用する用語“対応する”は、しばしば、ポリペプチド(例えば、アネキシンＡ５)におけるアミノ酸残基の位置／同一性を指定するために使用する。当業者は、単純化の目的で、例えば、３１６位残基に“対応する”アミノ酸が実際に特定のアミノ酸鎖における３１６番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ、例えば、Ｎ末端メチオニンの翻訳後除去前のアネキシンＡ５における３１６位に見られる残基に対応するように、規準的ナンバリングシステム(野生型アネキシンＡ５に基づく)がここで利用されることを認識し、当業者は、どのように対応するアミノ酸を同定するか容易に認識する。特に、野生型アネキシンＡ５のアミノ酸配列(配列番号１)は、メチオニン残基がプロセシング中に開裂されるため、該メチオニンから開始しないことは注意すべきである。
【０３０８】
ある実施態様において、アネキシンＡ５は、二量体形成を低減するために、３１５位のシステイン(Ｃ３１６に対応)をセリンまたはアラニンで置換するよう修飾される。ある実施態様において、３１５位のシステインがセリンに置換されたアネキシンＡ５バリアントは配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、アネキシンＡ５バリアントは、３１５位のシステインがアラニンに置換されている。ある実施態様において、アネキシンＡ５の非内部移行変異体は、３１５位のシステイン(Ｃ３１６に対応)がセリンまたはアラニンに置換されるよう修飾されたアネキシンＡ５と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一性または少なくとも約９９％同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【０３０９】
ある実施態様において、Ｄ１４３がNに置換されおよび／またはＥ２２７がＡに置換されたアネキシンＡ５のバリアントが使用され得る(Mira, 1997; Kenis, 2004; Kenis 2010 and Ungethum, 2010参照)。例えば、３１５位のシステインに置換を有するアネキシンＡ５バリアントは、Ｄ１４３および／またはＥ２２７で置換を有するよう修飾され得る。
【０３１０】
ある実施態様において、アネキシンＡ５またはアネキシンＡ５バリアント(例えばＣ３１６、Ｄ１４３および／またはＥ２２７に置換を有する)は、次の置換Ｒ６２Ａ、Ｋ６９Ａ、Ｋ１００Ａ、Ｅ１３７Ａ、Ｄ１３８Ｇ、Ｎ１５９Ａ、Ｌ３１３Ｅの１以上を含むように修飾される(Ｒ６３Ａ、Ｋ７０Ａ、Ｋ１０１Ａ、Ｅ１３８Ａ、Ｄ１３９Ｇ、Ｎ１６０Ａ、Ｌ３１４Ｅに対応)。例えば、配列番号１を有するアネキシンＡ５を、Ｃ３１５ＡまたはＣ３１５Ｓ置換(野生型アネキシンＡ５に対してＣ３１６ＡまたはＣ３１６Ｓに対応)および次の置換Ｒ６２Ａ、Ｋ６９Ａ、Ｋ１００Ａ、Ｅ１３７Ａ、Ｄ１３８Ｇ、Ｎ１５９Ａ、Ｄ１４３Ｎ、Ｅ２２７Ａ、Ｃ３１５ＳまたはＣ３１５Ａの１以上(野生型アネキシンＡ５に対してＲ６３Ａ、Ｋ７０Ａ、Ｋ１０１Ａ、Ｅ１３８Ａ、Ｄ１３９Ｇ、Ｎ１６０Ａ、Ｌ３１４Ｅに対応)を有するように修飾できる。
【０３１１】
ある実施態様において、アネキシンＡ５(配列番号１)またはアネキシンＡ５バリアント(例えばＣ３１６、Ｄ１４３および／またはＥ２２７に置換を有する)は、次の置換Ｒ６２Ａ、Ｋ６９Ａ、Ｋ１００Ａ、Ｅ１３７Ａ、Ｄ１３８Ｇ、Ｎ１５９Ａ、Ｄ１４３Ｎ、Ｅ２２７Ａ、Ｃ３１５ＳまたはＣ３１５Ａの１以上(野生型アネキシンＡ５に対してＲ６３Ａ、Ｋ７０Ａ、Ｋ１０１Ａ、Ｅ１３８Ａ、Ｄ１３９Ｇ、Ｄ１４４Ｎ、Ｎ１６０Ａ、Ｅ２２８Ａ、Ｃ３１６ＳまたはＣ３１６Ａに対応)を含むように修飾される。
【０３１２】
ある実施態様において、ターゲティングドメインは、野生型アネキシンＡ５に対してＲ６３Ａ、Ｋ７０Ａ、Ｋ１０１Ａ、Ｅ１３８Ａ、Ｄ１３９Ｇ、Ｎ１６０ＡおよびＣ３１６ＡまたはＣ３１６Ｓ置換を有するように改変されているアネキシンＡ５である。例えば、ターゲティングドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列を有し得る。
【０３１３】
ある実施態様において、アネキシンＡ５バリアントは、細胞におけるアネキシンの内部移行をさらに減少させるために、異なる領域における１以上、２、または２以上の置換を含む。例えば、アネキシンＡ５バリアントは、Ｒ６２ＡおよびＫ６９Ａ、Ｒ６２ＡおよびＫ１００Ａ、Ｒ６２ＡおよびＥ１３７Ａ、Ｒ６２ＡおよびＤ１３８Ｇ、Ｒ６２ＡおよびＮ１５９Ａ、Ｒ６２ＡおよびＫ６９ＡおよびＫ１００Ａ、Ｒ６２ＡおよびＫ６９ＡおよびＥ１３７Ａなどを含み得る。
【０３１４】
従って、アネキシンバリアントは、さらに１以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含んでよく、ここで、アミノ酸置換、欠失、または付加は、二重特異性タンパク質のアネキシンＡ５バリアントがＰＳのような少なくとも一つのリン脂質に結合する能力に実質的に影響しない。
【０３１５】
他の非抗体ターゲティングドメイン：
他の実施態様において、ターゲティングドメインは、シナプトタグミンＩ、そのフラグメント、またはそのバリアントである。シナプトタグミンＩ(ＳｙｔＩ)は、ホスファチジルセリンにＣａ＋＋依存的態様で約５〜４０nMの結合親和性で結合することが示されている。ある実施態様において、シナプトタグミンの２個のＣ２ドメインの一方(例えば、Ｃ２Ｂ)がターゲティングドメインとして使用され得る。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、シグナル伝達または膜輸送(例えば、タンパク質キナーゼＣ、血液凝固第ＶおよびVIII因子)に関与するＣａ＋＋依存性膜ターゲティングタンパク質のＣ２ドメインである。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、引用により全体として本明細書に包含させる米国特許出願１３／０６８,８０８号に提供される配列番号１１４に示す配列を有する。乳脂肪球−ＥＧＦ  ８としても知られるラクトアドヘリンは、マクロファージにより分泌される４５kDaホスファチジルセリン結合糖タンパク質である。ラクトアドヘリンは、アミノ末端にＥＧＦ様ドメインおよびカルボキシ末端に２個のＣドメインを含む。従って、ある実施態様において、ターゲティングドメインは、ラクトアドヘリン、そのフラグメントまたはそのバリアントのＣドメインを含む。ある実施態様において、Ｃ２ドメインの１以上の残基は、より好都合な標的分子への結合のオンレートを達成するよう、またはより好都合な標的分子への結合のオフレートを達成するよう、結合を修飾するために改変され得る。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、引用により全体として本明細書に包含させる米国特許出願１３／０６８,８０８号に提供される、配列番号１１５または１１６に示す配列を有する。ある実施態様において、ターゲティングポリペプチドドメインは、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン１および４(ＴＩＭタンパク質)を含む。他の実施態様において、ターゲティングポリペプチドドメインは、血漿２−糖タンパク質１を介してホスファチジルセリンに間接的に結合できる３Ｇ４抗体または抗体ドメインである。さらに他の実施態様において、ターゲティングポリペプチドドメインは、引用により全体として本明細書に包含させる米国特許出願１３／０６８,８０８号に提供する、ホスファチジルセリンと結合できる抗ホスファチジルセリン抗体(例えばＰＳ４Ａ７、配列番号１２８)または抗体ドメインを含む。
【０３１６】
ある実施態様において、ターゲティングポリペプチドドメインは、標的分子に結合するポリペプチドを含む。代表的なこのようなポリペプチドは、配列番号１〜４および１２２としてここに提供する配列を含むまたは有する。代表的ポリペプチドは、配列番号１〜４および１２２として提供する配列と少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一性または少なくとも約９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは有する。代表的なこのようなポリペプチド核酸配列は、ここに配列番号５〜８および１２３として提供する配列を含むまたは有する。代表的ポリペプチド核酸配列は、配列番号５〜８および１２３として提供する配列と少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一性または少なくとも約９９％同一性を有する核酸配列を含み得るまたは有し得る。
【０３１７】
天然ポリペプチドはターゲティングドメインとして使用され得る。しかしながら、このような天然配列の一部および改変配列を有するポリペプチドも、このようなポリペプチドが下にさらに詳細に記載する適切な結合親和性(Ｋｄ)で標的分子と結合する能力を維持する限り、使用できる。
【０３１８】
抗体ターゲティングドメイン：
ここで使用する“抗体”は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１以上のポリペプチドからなるタンパク質である。典型的抗体は、ポリペプチド鎖の２個の同一ペアからなる四量体であり、各ペアは１個の“軽”鎖(約２５kD)および１個の“重”鎖(約５０〜７０kD)を有する。“ＶＬ”および“ＶＨ”は、それぞれこれら軽鎖および重鎖をいう。“抗体可変領域”は、主に抗原認識を担うアミノ酸残基を含む抗体可変鎖(ＶＬまたはＶＨ)のＮ末端領域をいう。当業者は抗体可変領域を容易に同定でき、抗原認識を提供するのに必要な最小サイズを決定できる。一般に、抗体可変領域は少なくとも７０アミノ酸残基、より一般に少なくとも１００アミノ酸残基含む。抗体可変領域を含むポリペプチドは、他の軽鎖および／または重鎖配列をさらに含んでよく(しかし必ずしもではない)、抗体由来ではない配列をさらに含んでよい(しかし必ずしもではない)。抗体可変領域の配列は天然に存在するものであってよく、または機能(抗原認識)が保持される限り、標準技術を使用して修飾されてよい。抗体可変領域を含むあるポリペプチドは、一本鎖抗体(単一ポリペプチド鎖として存在する抗体)、より好ましくは、可変重鎖領域および可変軽鎖領域が(直接的にまたはペプチドリンカーを介して)一緒に連結されて、連続的ポリペプチドを形成する一本鎖Ｆｖ抗体(ｓｃＦｖ)である。ｓｃＦｖ抗体は化学合成してよく、または直接的に連結されたまたはペプチドコード化リンカーにより連結されたＶＨおよびＶＬコード化配列を含む核酸から発現されてよい。
【０３１９】
このような一本鎖抗体も、用語“抗体”の範囲内に入ることが意図される。
【０３２０】
二重特異性抗体も用語“抗体”の範囲内に包含される。二重特異性抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２ドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによりドメインが他の鎖の相補性ドメインと対形成し、２抗原結合部位を形成する、二価、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は化学合成してよく、またはペプチドコード化リンカーにより連結されたＶＨおよびＶＬコード化配列を含む核酸から発現されてよい。
【０３２１】
“Ｆａｂ領域”、“Ｆａｂドメイン”、“Ｆａｂフラグメント”は、抗体が結合できる特異的標的を規定する可変領域を含む。Ｆａｂフラグメントは、酵素でのタンパク分解的開裂のような当分野で知られる方法を使用してインタクト抗体から製造でき、または標準組み換えＤＮＡおよびタンパク質発現テクノロジーを使用して組み換えにより産生してよい。
【０３２２】
用語“抗体”の範囲内に包含される結合フラグメントの例は、故に、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる単価フラグメントであるＦａｂフラグメント、(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ)２およびＦ(ａｂ’)２フラグメント、(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるｓｃＦｖフラグメント、(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメントおよび(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)を含むが、これらに限定されない。このような抗体は、当分野で知られる方法を使用してインタクト抗体から製造してよく、または標準組み換えＤＮＡおよびタンパク質発現テクノロジーを使用して組み換えにより産生してよい。
【０３２３】
ある実施態様において、ホスファチジルセリンに結合するキメラ抗体バビツキシマブのような抗ホスファチジルセリン抗体を、ターゲティングドメインとして使用できる。
【０３２４】
ある実施態様において、ポドサイト関連タンパク質に結合する抗体を、ターゲティングドメインとして使用できる。例えば、ネフリン(ＮＰＨＳ１)、ポドプラニン(ＰＤＰＮ)、ポドカリキシン(ＰＯＤＸＬ)、ジストログリカン(ＤＡＧ１)、ＧＬＥＰＰ１(ＰＴＰＲＯ)、ＮＥＰＨ１(ＫＩＲＲＥＬ)、ＦＡＴ非定型カドヘリン１(ＦＡＴ１)、富システイン型膜貫通ＢＭＰ制御因子１(ＣＲＩＭ１)、インテグリンアルファ−８／ベータ１(ＩＴＧＡ８)に結合できる抗体が使用され得る。
【０３２５】
細胞表面シグナル伝達受容体であるネフリンは、ポドサイト機能を制御する。これは腎臓糸球体濾過バリアにおける重要なポドサイト分子である。ネフリンはＩｇ様膜貫通タンパク質である。これはポドサイトスリットダイアフラグムの主要成分であり、正常糸球体透過性の維持に必須である。
【０３２６】
ポドプラニンは、糸球体ポドサイト膜ムコタンパク質である。ポドプラニンは、ポドサイト足突起の独特な形態および糸球体透過性の維持に役割を有する。ラットにおいて、４３kD膜内在性タンパク質ポドプラニンはポドサイトの表面に局在化し、ピューロマイシンネフローゼで転写的に下方制御された。
【０３２７】
ポドカリキシンは、ポドサイトの頂端膜に発現される主要シアロ糖タンパク質である。接着および細胞形態学および癌進行の両方の制御に関与する。これは電荷斥力によりポドサイトにおける隣接足突起間の濾過経路開放を維持できる、抗接着分子として機能する。これは接着促進分子として作用し、細胞の固定化リガンドへの粘着性を増強し、インテグリン依存的方式で遊走速度および細胞−細胞接触を増加させる。本タンパク質は、頂端アクチン依存性微絨毛の形成を誘発する。これは最初の上皮性極性化の設定のための亜頂端原形質膜サブドメインの形成および腎管形成中の頂端管腔形成に関与する。これはアクチン結合タンパク質ＥＺＲとの相互作用を介して細胞遊走および侵襲を誘発することにより、癌発症および攻撃性に役割を有する。これはＥＺＲ依存性シグナル伝達事象に影響し、癌細胞におけるＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路の活性増加を引き起こす。
【０３２８】
腎臓において、ジストログリカン(ＤＧ)は、ポドサイトの側底および頂端膜を覆うことが示されている。アルファ−ＤＧは高度にグリコシル化され、これは、その糸球体基底膜におけるラミニンおよびアグリンとの結合に重要である。これはアルファ−ＤＧはラットにおいてポドサイト細胞膜全体を覆い、ポドサイトの側底側および頂端側両方で発現される。この局在化は、アルファ−ＤＧが、糸球体基底膜への結合によるポドサイトの特有の構造の維持、および濾過スリットの完全性維持にそれぞれ二重の役割を有することを示唆する。ジストログリカンは、ポドサイトの細胞表面全体にわたり汎発性に発見された。
【０３２９】
ＧＬＥＰＰ１(ＰＴＰＲＯ)は、内臓糸球体上皮細胞および足突起の頂端細胞膜に位置するポドサイト受容体膜タンパク質チロシンホスファターゼであり、急性ポドサイト傷害のマーカーとして使用されている。
【０３３０】
ＮＥＰＨ１(ＫＩＲＲＥＬ)は、Ｉｇスーパーファミリーのポドサイト膜タンパク質である。これらのタンパク質の細胞質ドメインは、ポドシンのＣ末端と相互作用する。これはサイズおよび電荷選択的限外濾過を確実にする細胞である腎臓ポドサイトに発現される。
【０３３１】
ＦＡＴ非定型カドヘリン１(ＦＡＴ１)は、細胞極性化のための必須タンパク質であり、細胞遊走を指示し、細胞−細胞接触を調節し、高度に極性化されたポドサイト細胞型に発現される。
【０３３２】
富システイン型膜貫通ＢＭＰ制御因子１(ＣＲＩＭ１)は、腎臓糸球体において組織富化発現を有し、骨形態形成タンパク質のようなトランスフォーミング増殖因子ベータファミリーのメンバーとの相互作用により組織発達に役割を有すると考えられる。
【０３３３】
インテグリンアルファ−８／ベータ１(ＩＴＧＡ８)は、間葉性細胞から上皮性構造への動員を制御することにより、腎臓およびおそらく他の臓器の発生において機能する。これは、ＴＮＣ、ＦＮ１、ＳＰＰ１  ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ３およびＶＴＮを含む幅広いリガンドにおける配列Ｒ−Ｇ−Ｄを認識する。ＮＰＮＴは、おそらく腎臓発生におけるその機能的リガンドである。ＩＴＧＡ８は、糖尿病性腎症のような腎臓傷害に応答して腎臓糸球体に蓄積することが示されている。
【０３３４】
ターゲティングドメインの結合
好ましい実質的結合は、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたはそれより良好な解離定数(Ｋｄ)での結合を含む。例えば、抗体−抗原相互作用のＫｄは、抗体および抗原分子の５０％が熱力学的平衡で一緒に結合する、抗体の濃度(モル濃度として表す)である。それ故に、適当な固定抗原濃度で、高(すなわち、強)親和性抗体の５０％は、低親和性抗体で同じパーセント結合を達成するのに必要であるより低い抗体濃度で抗原分子に結合する。Ｋｄはまた動的会合および解離速度(ｋｏｎおよびｋｏｆｆ)の比であり、すなわち、Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎである。それ故に、低Ｋｄ値は高(強)親和性を示す。ここで使用する“良好な”親和性は強い親和性であり、そのコンパレーターより低い数値の解離定数により同定され、１０−１０ＭのＫｄが低い数値であり、それ故に、１０−９ＭのＫｄより良好な親和性を表す。１０−７Ｍより良好な、好ましくは１０−８Ｍより良好な(すなわち、低Ｋｄ値およびそれ故に強い)親和性が一般に好ましい。ここに示すものの間の値もまた企図され、好ましい結合親和性は解離定数の範囲として表すことができ、例えばここに開示する抗体についての好ましい結合親和性は、１０−６〜１０−１２Ｍ(すなわち、マイクロモル濃度〜ピコモル濃度)、好ましくは１０−７〜１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍまたはそれより良好な範囲のＫｄ値により表される。“顕著な交差反応を示さない”抗体は、オフターゲット抗原に認識できるほどに結合しないものである。例えば、ある実施態様において、心臓ミオシンに特異的かつ選択的に結合する抗体は、心臓ミオシンに対して、心臓ミオシン以外のミオシン分子または非ミオシンタンパク質またはペプチドより、少なくとも２桁、好ましくは３桁または４桁またはそれ以上良好な結合親和性(すなわち、２桁、３桁または４桁またはそれ以上低いＫｄ値を示す結合)を示す。結合親和性および選択性は、例えば、スキャッチャード分析および／または競合的(競合)結合アッセイを含む、このような特徴決定のための当分野で認識されている何れかの方法を使用して決定できる。
【０３３５】
当分野で周知の多様な技法の何れかを使用して、結合を評価し、Ｋｄ値を決定できる。例えば、虚血関連ＤＮＡ分子への結合は、一般に適切な固体支持体(例えば、ビーズ、ＥＬＩＳＡプレートまたはＢＩＡＣＯＲＥチップ)を標的ＤＮＡフラグメントでコーティングすることにより評価する。ＤＮＡの何れかの配列に結合するターゲティングポリペプチドドメインについて、１０塩基対以上のＤＮＡフラグメント(一本鎖または二本鎖)が固体基質に固定化される。特異的配列またはＤＮＡ複合体(例えば、ＤＮＡ−ヒストン複合体)に結合するターゲティングポリペプチドドメインについて、適切な対応する標的が固定化される。虚血関連分子添加前に、タンパク質に対する非特異的結合部位を、ＢＳＡ、ミルク、または何れかの他の適切なブロッカーで遮断する。非被覆ウェルまたは非標的分子でコートしたウェルは、特異性対照として役立つ。二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)の濃度を増加させながら、標的被覆基質または対照基質とインキュベートする。標的に結合しない融合タンパク質またはドメインも特異性対照として試験する。次いで、二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)の標的特異的、用量依存性結合を、使用する固体支持体および結合テクノロジーに対応する標準プロトコールを使用して、対照に対して、増加用量の関数として標的に結合する二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)の量を測定することにより評価する。代表的なこのようなプロトコールは、Wassaf et al., Anal. Biochem. 351(2):241-53 (2006); Epub 2006 Feb 10 (BIACORE); and Murray and Brown, J. Immunol. Methods. 127(1):25-8 (1990) (ELISA)に記載のものを含む。さらに、固定化標的分子の量を変えるまたは競合因子として可溶性標的分子のレベルを増加させる試験も、結合および特異性のモニターのために実施してよい。
【０３３６】
標的分子への結合についての結合親和性ならびに動的会合および解離速度を、標準技法を使用して測定し、他の陰性対照分子(例えば、無関係なターゲティングポリペプチドとの融合タンパク質またはターゲティングポリペプチドを欠く融合タンパク質または非結合ターゲティングポリペプチドとの融合タンパク質)および陽性対照分子(例えば、標的分子を標的とする親抗体、または標的分子に結合することが知られている他の抗体または抗体フラグメント)と比較する。例えば、非結合ターゲティングポリペプチドは、非結合アネキシンＡ５バリアント、非結合シナプトタグミンバリアントまたは非結合ｃＦｖであり得る。
【０３３７】
ある実施態様において、Ｋｄを、バイオセンサーを使用して(例えば、表面プラズモン共鳴(例えば、BIAcore)または共振ミラー分析(IAsys)により)決定する。このような決定は、Hefta et al., Measuring Affinity Using Biosensors, in "Antibody Engineering: A Practical Approach," McCafferty et al. (eds), pp. 99-116 (Oxford University Press, 1996)およびそこに引用されている引用文献に記載のとおり実施し得る。簡潔には、動的会合および解離速度(ｋｏｎおよびｋｏｆｆ)を、虚血関連分子がカップリングされているセンサーチップを使用して決定する。結合(ｋｏｎ)を評価するために、種々の濃度の二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)の溶液をチップをとおして流し、その間結合を質量感受性検出を使用してモニターする。ＢＩＡｃｏｒｅシステム(GE Healthcare; Piscataway, NJ)を使用して、ｋｏｎは、Ｒに対するｄＲ／ｄｔのプロットの傾斜であり、ここで、Ｒは、観察されたシグナルである。結合後、解離が、緩衝液をチップをとおして流すことにより観察され、ｋｏｆｆが同様の形式で決定される。次いで、Ｋｄを式
Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ
を使用して計算する。
【０３３８】
本発明において、１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満で結合するならば、二重特異性融合タンパク質は標的分子に結合する。さらに、このアッセイにおける二重特異性融合タンパク質の標的分子への結合は、二重特異性融合タンパク質の陰性対照への結合より顕著に高い(例えば、少なくとも２倍、１０倍または１００倍高い)。好ましくは、固定化標的への結合は、過剰の可溶性標的を使用しても競合され得る。
【０３３９】
上記のとおり、ある標的分子は、損傷細胞に特異的である(または富化されている)。代表的標的分子は、ホスファチジルセリン、ＤＮＡ、ミオシン、心臓ミオシン、ｃ−Ｍｅｔ(ＨＧＦ受容体)、ホスファチジルセリン、Ｐ−セレクチン、およびＩＣＡＭ−１を含むが、これらに限定されない。損傷細胞への結合は、壊死またはアポトーシスを誘発する条件に曝される培養細胞を使用して、インビトロで好都合に示される。例えば、本質的にShan et al., Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 294:833-841 (2008)に記載されるとおり、壊死を培養心筋細胞において模擬虚血／再灌流により誘導し、ＬＤＨ放出アッセイ、またはトリパンブルーアッセイを使用してモニターし、続いてアポトーシスを受けている細胞数を減算することができる。このアッセイは、総死細胞を定量し、総細胞数とアポトーシス細胞数の差異は、下により詳細に記載するとおり、壊死に起因する。アポトーシスを誘発する条件は、Ｈ２Ｏ２または低酸素症への曝露を含み、アポトーシスを、例えば、アネキシンＡ５結合、アポトーシスにより活性化される既知カスパーゼによる標的ペプチド配列の開裂、またはＤＮＡラダリング(ＴＵＮＥＬアッセイにより測定、本質的にKuramochi, J. Biol. Chem. 279(49): 51141-47 (2004)に記載のとおり)を含む、当分野で知られる多様な技法の何れかを使用してモニターできる。壊死またはアポトーシスを受けている細胞への結合を、蛍光標識二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)または適切な対照タンパク質を、アポトーシスまたは壊死誘導後細胞に添加することにより評価し得る。タンパク質と細胞を、数分〜１日の範囲の時間インキュベーションした後、細胞を洗浄し、次いで細胞結合蛍光を免疫蛍光、フローサイトメトリー、または類似技法を使用して測定する。あるいは、放射標識またはＥＬＩＳＡプロトコールで一般的方法である融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)にコンジュゲートした酵素の使用を含む、二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)を検出する他の方法を使用し得る。二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)は、傷害を経験していない細胞(例えば、アポトーシスまたは壊死を受けていない細胞)と比較して、虚血後の細胞(例えば、壊死またはアポトーシスを受けている細胞)に顕著に高い(例えば、２倍高い)結合が検出されるならば、標的細胞に結合する。
【０３４０】
例えば、動物モデルにおける虚血を誘発し、虚血前後の標的組織における投与二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)のレベルを比較することにより、インビボターゲティングが示され得る。損傷細胞へのインビボターゲティングは、動物モデルにおける組織損傷の誘発、二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)の投与、および損傷対非損傷細胞における二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)のレベルの比較により示され得る。ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質は、虚血−再灌流傷害後の組織損傷領域を標的とするよう設計される。このような場合、インビボターゲティングは、組織損傷を、好ましくは虚血と続く血液供給の再確立をもたらす方法により誘発することにより、示され得る。多くの方法が、異なる組織においてこれを実施するために利用可能である。例えば、マウスの後肢への血流を、単純な止血帯により一過性に遮断できる。あるいは、腎臓に至る動脈の一過性クランプが用いられ得る。虚血−再灌流傷害は、マウス、ラット、イヌ、およびブタで示されるとおり、冠動脈の一過性遮断により心臓で誘導可能である。動物モデルにおいて組織損傷を誘発する代表的方法を、下の表２に要約する。
【表３】
2022002528.tif 000004
【０３４１】
虚血−再灌流傷害の動物モデルは、次の参考文献にさらに詳述されている。
Greenberg et al., Chapter 7.  Mouse models of ischemic angiogenesis and ischemia-reperfusion injury.  Methods Enzymol. 444:159-74 (2008). 
Chimenti et al., Myocardial infarction: animal models. Methods Mol. Med. 98:217-26 (2004).
Black SC,  In vivo models of myocardial ischemia and reperfusion injury: application to drug discovery and evaluation.  J. Pharmacol. Toxicol. Methods 43(2):153-67 (2000).
【０３４２】
ターゲティングの特異性は、放射標識二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)を使用する、Chen et al., FASEB J. 4(12): 3033-39 (1990)に示すとおり、非クランプ対非クランプ腎臓におけるまたはZbinden et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292: H1891-H1897 (2007)に示すとおり処置対非処置後肢における二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)沈着の比較により確立できる。あるいは、二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)を、ＥＬＩＳＡの使用により均質化組織で検出でき、または造影用の適当な金属(例えば、Ｔｃ９９、ＹまたはＧｄ)で標識した二重特異性融合タンパク質(またはターゲティングポリペプチドドメイン)を使用してリアルタイムで造影できる。心臓の損傷領域における特異的沈着を、Dumont et al., Circulation 102(13):1564-8 (2000)に記載のとおり測定できる。タンパク質の損傷組織へのターゲティングを示すための代表的方法を下の表３に示す。
【表４】
2022002528.tif 000005
【０３４３】
上記のとおり、あるターゲティングポリペプチドドメインは、標的分子(例えば、ＤＮＡ、ミオシン、心臓ミオシン、ｃ−Ｍｅｔ、Ｐ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ホスファチジルセリン)に結合する抗体を含む。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、抗ミオシン抗体(例えばヒト心臓ミオシンに対するＲ１１Ｄ−１０、心臓ミオシン重鎖に対する２Ｇ４−ｓＤ７、ヒト心臓ミオシン重鎖に対する１Ｂ２および５Ｃ２、ヒト心臓ミオシンに対する２Ｆ４、ミオシンに対するモノクローナル抗体、Ｂ７抗体、Ｂ７  ｓｃＦｖ、または当分野で知られる他の抗体)である。ある実施態様において、あるターゲティングポリペプチドドメインは、標的分子に結合するｓｃＦｖ抗体を含む。例えば、ターゲティングドメインは、抗ＤＮＡ  Ｓｌ−１  ｓｃＦｖおよび抗ＤＮＡ  ＳＩ−２２  ｓｃＦｖであり得る。代表的なこのような抗体およびｓｃＦｖ抗体は、配列番号１２８〜１３６に提供する配列を含むまたは有する。ある実施態様において、代表的なこのような抗体およびｓｃＦｖ抗体核酸配列は、引用により全体として本明細書に包含させる米国特許出願１３／０６８,８０８号における配列番号２２０〜２２４として提供する配列を含むまたは有する。
【０３４４】
機能的に関連する抗体もまた、または代替として、ターゲティングポリペプチドドメインとして使用し得ることは認識される。抗体は、標的抗原と主に６重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に位置するアミノ酸残基により相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列より個々の抗体で多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用を担うため、ある抗体からのＣＤＲ配列と異なる抗体からのフレームワーク配列を合わせ、元の抗体の性質を模倣する修飾抗体を作製することが可能である。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースから得ることができる。
【０３４５】
それ故に、ここに提供するターゲティングポリペプチドドメイン配列のＣＤＲの１以上を使用して、元のターゲティングポリペプチドドメインの結合特性を保持する機能的に関連する抗体を作ることができる。重および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じまたは異なる抗体配列に由来し得る。ＣＤＲ領域は、ＶｂａｓｅおよびＩＭＧＴのようなデータベースにおける既知配列とのアラインメントを使用して容易に同定される。
【０３４６】
抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３ドメインが、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を有することは当分野で周知である。従って、ある実施態様において、ここに記載する特定の抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体が産生される。抗体は、さらにここに開示する抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２を含み得る。
【０３４７】
上記改変抗体のＣＤＲ１、２、および／または３領域は、まさにここに開示するアミノ酸配列を含み得る。しかしながら、当業者は、正確なＣＤＲ配列からのいくぶんかの逸脱が可能であり得ることは認識され、特にＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列について、エピトープ特異性を変えることなくＣＤＲ３配列より多様な変動に耐容性であり得る(このような逸脱は、例えば、保存的アミノ酸置換であり得る)。従って、他の実施態様において、改変抗体は、ここに挙げる抗体の対応するＣＤＲと、例えば、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９.５％同一であるＣＤＲ１およびＣＤＲ２の１以上からなり得る。
【０３４８】
他の実施態様において、ＣＤＲの残基の１以上を改変して、より好都合な結合のオンレート、またはより好都合な結合のオフレートを達成するように結合を修飾し得る。この戦略を使用して、超高結合親和性(例えば、Ｋｄ＝１０−１０以下)を有する抗体が達成され得る。当分野で周知の親和性成熟技法を使用して、ＣＤＲ領域を改変し、続いて得られた結合分子を所望の結合の変化についてスクリーニングし得る。従って、ＣＤＲの改変に連れて、結合親和性ならびに免疫原性における変化をモニターし、結合および低免疫原性の最良の組み合わせについて最適化された抗体が達成されるように点数化し得る。
【０３４９】
修飾はまた、これらの修飾後の抗原結合親和性が実質的に減少されない限り、抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のフレームワークまたは連結領域(すなわち、非ＣＤＲ残基)の１以上で実施し得る。
【０３５０】
ペプチドリンカーおよび半減期モジュレーター
治療適用において使用する二重特異性タンパク質は、その比較的低い分子量のため、最適血清半減期を示さない可能性を当業者は認識する。ある治療適用において、それ故に、二重特異性タンパク質の半減期を修飾することが望まれ得る。ある実施態様において、臓器の疾患、傷害または損傷領域への二重特異性タンパク質の蓄積を達成するために、二重特異性タンパク質を、ペプチドリンカーとコンジュゲート、操作可能に結合または融合する。ある実施態様において、二重特異性タンパク質の臓器の疾患、傷害または損傷領域への蓄積を達成するために、二重特異性タンパク質を半減期モジュレーターとコンジュゲート、操作可能に結合または融合する。好ましくは、ペプチドリンカーまたは半減期モジュレーターは、ヒトにおいて非免疫原性である。
【０３５１】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、融合タンパク質のインビボ半減期を延長できる。例えば、半減期モジュレーターを含む二重特異性タンパク質の半減期は、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間またはそれ以上である。ある実施態様において、半減期モジュレーターを含む二重特異性タンパク質の半減期は約２４時間以上である。ある実施態様において、半減期モジュレーターを含む二重特異性タンパク質の半減期は約１週間以上である。
【０３５２】
ターゲティングポリペプチドドメインおよびアクティベータードメインは、ペプチド結合により直接結合され得る。ある実施態様において、それらは半減期モジュレーターを介して結合され得る。好ましい実施態様において、半減期モジュレーターはポリペプチドである。従って、半減期モジュレーターは２末端、Ｎ末端およびＣ末端を有し得る。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、一端でペプチド結合によりターゲティングポリペプチドドメインに結合し、他端でペプチド結合によりアクティベータードメインに結合する。ある実施態様において、リンカーは、Ｎ末端でターゲティングポリペプチドドメインのＣ末端に結合し、Ｃ末端でアクティベータードメインのＮ末端に結合する。他の実施態様において、リンカーは、Ｃ末端でターゲティングポリペプチドドメインに結合し、Ｎ末端でアクティベータードメインに結合する。さらに、他の実施態様において、半減期モジュレーターは、二重特異性タンパク質の末端の一方で結合する。例えば、ある実施態様において、半減期モジュレーターは、Ｃ末端でアクティベータードメインのＮ末端に結合する。他の実施態様において、半減期モジュレーターは、ターゲティングドメインのＣ末端で結合する。他の実施態様において、半減期モジュレーターは、Ｎ末端でアクティベータードメインのＣ末端に結合され得る。さらに他の実施態様において、半減期モジュレーターは、Ｎ末端でターゲティングドメインのＣ末端に結合され得る。
【０３５３】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、腎クリアランスを最小化するために、約７０kDaまたは同等な半径を超えるサイズの二重特異性融合タンパク質を駆動するように設計される。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、ＦｃＲｎ受容体介在再循環またはヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)のような血清成分への結合による二重特異性融合タンパク質の半減期を延長するように設計される。
【０３５４】
ある実施態様において、ペプチドリンカーまたは半減期モジュレーターは、ヒトにおいて非免疫原性である。半減期モジュレーターは、ヒト血清タンパク質または少なくとも１００連続アミノ酸からなる領域にわたり少なくとも５０％配列同一性を保持するその誘導体であり得る。ここで使用する“配列同一性”は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の参照配列との対比において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が最適にアラインされたとき、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が同じであるまたは対照配列内の対応する位置と同じであるヌクレオチドまたは残基の特定のパーセンテージを意味する。
【０３５５】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、半減期モジュレーターに存在する１以上のグリコシル化部位のグリコシル化により修飾され得る。例えば、次のアミノ酸アスパラギン、セリン、スレオニンを、半減期モジュレーターのグリコシル化の改変のために付加しても除去してもよい。ある実施態様において、二重特異性タンパク質における半減期モジュレーターのグリコシル化は、二重特異性タンパク質の半減期を調節できる。ある実施態様において、半減期モジュレーター配列を、グリコシル化を低減するように修飾する。このような修飾は、Ａｓｎ(Ｎ)のＧｌｎ(Ｑ)またはＡｌａ(Ａ)による置換および／またはＳｅｒ(Ｓ)またはＴｈｒ(Ｔ)のＡｌａ(Ａ)による置換を含む。
【０３５６】
ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ、配列番号５４)は、一部ＦｃＲＮへのその結合および再循環により、自然に長い血清半減期を有する。ＨＳＡは血中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおける安全性は証明されている。
【０３５７】
ある実施態様において、半減期モジュレーターはＨＳＡバリアントである。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ヒト血清アルブミンアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ヒト血清アルブミンアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも２００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ヒト血清アルブミンアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも３００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ヒト血清アルブミンアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも４００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ヒト血清アルブミンアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも５００連続アミノ酸を含む。
【０３５８】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、ヒト血清アルブミン配列またはそのバリアントを含み得る。ある実施態様において、ヒト血清アルブミン配列は、ＨＳＡのＣ末端に３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａまたはそれ以上の欠失を有し得る。
【０３５９】
ある実施態様において、ＨＳＡバリアントは、次の置換の１以上を有し得る。
システインＣ５８は、例えば、セリンで置換され得る(Ｃ５８Ｓ)、
リシンＫ４２０は、例えば、グルタミン酸で置換され得る(Ｋ４２０Ｅ)、
アスパラギンＮ５２７は、例えば、グルタミンで置換され得る(Ｎ５２７Ｑ)、
グルタミン酸Ｅ５０５は、例えば、グリシンＧで置換され得る(Ｅ５０５Ｇ)、
バリンＶ５４７は、例えば、アラニンで置換され得る(Ｖ５４７Ａ)、
アスパラギンＮ５２７は、例えば、グルタミンで置換され得る(Ｎ５２７Ｑ)。
【０３６０】
ある実施態様において、ＨＳＡバリアントはアミノ酸２６〜６０９を有し、次の置換の１以上を有する。
システインＣ５８は、例えば、セリンで置換され得る(Ｃ５８Ｓ)、
リシンＫ４２０は、例えば、グルタミン酸で置換され得る(Ｋ４２０Ｅ)、
アスパラギンＮ５２７は、例えば、グルタミンで置換され得る(Ｎ５２７Ｑ)、
グルタミン酸Ｅ５０５は、例えば、グリシンＧで置換され得る(Ｅ５０５Ｇ)、
バリンＶ５４７は、例えば、アラニンで置換され得る(Ｖ５４７Ａ)、
アスパラギンＮ５０３および／またはＮ５２７は、例えば、グルタミンで置換され得る(Ｎ５０３Ｑおよび／またはＮ５２７Ｑ)。
【０３６１】
ある実施態様において、ＨＳＡバリアント(ここではｍＨＳＡと称する)は、次の置換Ｃ３４Ｓ、Ｎ５０３Ｑを有する(配列番号５５)。ある実施態様において、ＨＳＡバリアント(ここではｍＨＳＡ７と称する)は、次の置換Ｃ３４Ｓ、Ｎ５０３Ｑ、Ｅ５０５ＧおよびＶ５４７Ａを有する(配列番号５６)。ある実施態様において、ＨＳＡバリアントは、アミノ酸２６〜６０９および次の置換Ｃ５８ＳおよびＮ５２７Ｑを有する(配列番号１２４)。
【０３６２】
ある実施態様において、脱アミドされ、半減期を低減させ得る、ＨＳＡの５０３位および／または５２７位のアスパラギンをＮ５０３Ｑおよび／またはＮ５２７Ｑ置換により除去できる。ある実施態様において、ＨＳＡのシステインＣ３４をセリンまたはアラニン(ＳまたはＡ)に置換して、遊離システインを除去し、代替ジスルフィド結合形成を最小化し得る。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、Ｎ５０３Ｑ置換および付加的末端グリシンを有する修飾ＨＳＡのドメインIIIの修飾バージョン(ｍＨＳＡ＿ｄIII)である。このような修飾バージョンは、ＦｃＲｎへの結合のＨＳＡ性質を保持し、血清半減期を延長する。
【０３６３】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、ヒトＦｃアミノ酸配列(引用により全体として本明細書に包含させる米国特許出願１３／０６８,８０８号に提供される配列番号２１)と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ヒトＦｃアミノ酸配列と約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。抗体のＦｃドメインは、ＦｃＲｎに結合する自然能力を有し、半減期延長をもたらす。ある実施態様において、抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ(ガンマ)Ｒに結合しないように改変される。例示的実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｎ２９７がQで置換されるように改変される(Ｎ２９７Ｑバリアント)。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、ｓｃＦｃと呼ばれる、Ｆｃの単量体バリアント形態である。例えば、Ｆｃを形成するように天然で二量体化されるＩｇＧ重鎖のサブセットはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３である。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３と、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのような可動性リンカーの結合により一本鎖を形成するように改変され、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３鎖を作る。例示的実施態様において、一本鎖Ｆｃ(ｓｃＦｃ)は、Ｎ２９７をＱおよびＣ２２０をＳで置換するように改変される(Ｎ２９７Ｑ、Ｃ２２０Ｓ)。
【０３６４】
ある実施態様において、タンパク質は、半減期モジュレーターとして免疫グロブリン分子(例えばＩｇＧ)のＦｃ領域を含み得る。このようなフレームワークの使用は、構成的二量体タンパク質をもたらす。Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸の一次翻訳産物は、例えば、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃの一本鎖と結合した、シグナル伝達および／またはターゲティングアームを含む単一分子である。翻訳後であるが、分泌の前、この融合分子は、Ｆｃ領域における３システイン残基により二量体して、二量体融合タンパク質を形成する。ある実施態様において、Ｆｃ融合タンパク質は、２シグナル伝達アーム、２ターゲティングアームまたは２シグナル伝達アームおよび２ターゲティングアームを有するホモ二量体であり得る(図１Ａ参照)
【０３６５】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ヒトアルファ−フェトタンパク質(ＡＦＰ)アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ヒトアルファ−フェトタンパク質(ＡＦＰ)アミノ酸配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、ＡＦＰのＮ結合グリコシル化部位はＮ２５１Ｑ置換により除去される。
【０３６６】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ビタミンＤ結合タンパク質(ＶＤＢＰ)アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ビタミンＤ結合タンパク質(ＶＤＢＰ)アミノ酸配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、ＶＤＢＰのＮ結合グリコシル化部位は、Ｎ２８８ＱまたはＮ２８８Ｔ置換により除去され得る。
【０３６７】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ヒトトランスサイレチン(ＴＴＲ)アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、野生型ヒトトランスサイレチン(ＴＴＲ)アミノ酸配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、トランスサイレチンを修飾して、Ｎ１１８  Ｎ−グリコシル化部位を除去する。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、ＴＴＲの単量体形態である。
【０３６８】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、ＰＡＳ化アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ＰＡＳ化は、ペグ化を模倣するプロリン、アラニンおよび／またはセリン富配列である(ＷＯ／２００８／１５５１３４号参照)。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、ＰＡＳ化アミノ酸配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ＰＡＳ化は、ペグ化を模倣するプロリン、アラニンおよび／またはセリン富化配列である(ＷＯ／２００８／１５５１３４号参照)。プロリン、アラニン、および／またはセリンのポリペプチドストレッチは、大きな水力学的半径を有する半構造的三次元ドメインを形成し、それにより融合タンパク質のクリアランスを低減する。ある実施態様において、ＰＡＳ化アミノ酸配列は約２００、３００、４００、５００または６００アミノ酸長である。例えば、ＰＡＳ化は、アミノ酸配列ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ(配列番号１３７)の２０回反復である。
【０３６９】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、Ｎおよび／またはＣ末端および／またはアミノ酸側鎖への化学結合による融合タンパク質への１以上のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)鎖の結合を含む(例えば、システインへのＰＥＧ−マレイミド結合)。ＰＥＧ鎖は大きな水力学的半径を有する半構造的三次元ドメインを形成し、それにより融合タンパク質のクリアランスを低減する。
【０３７０】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、アルブミン結合ドメインヒト抗体(ａｌｂｕｄＡｂ)アミノ酸配列(配列番号１３８)と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、アルブミン結合ドメインヒト抗体(ａｌｂｕｄＡｂ)アミノ酸配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である少なくとも１００連続アミノ酸を含む。アルブミン結合ドメイン抗体は、血清アルブミンに非共有結合により結合することにより、融合タンパク質半減期を延長できる(ＷＯ２００８／０９６１５８号参照)。ある実施態様において、アルブミン結合ドメインヒト抗体は、Ｌｙｓ−Ａｒｇ  Ｋｅｘ２プロテアーゼ部位を除去するためにＣ末端アルギニンを除去するように改変される。
【０３７１】
代表的なこのような半減期モジュレーターは、配列番号５７〜５９の何れかに記載のものを含む。
【０３７２】
ある実施態様において、半減期モジュレーターを、システイン残基をセリンまたはアラニン残基に置換するよう修飾して、ジスルフィド結合を結合する能力を低減させ得る。
【０３７３】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、半減期モジュレーターを有しない融合タンパク質と比較して、二重特異性融合タンパク質の長い半減期を提供する。半減期モジュレーターの効果は、生理的条件下の安定性を決定するアッセイを使用して評価できる。例えば、二重特異性融合タンパク質を、サンプルをインキュベーション開始時およびその後２４時間毎に除去しながら、３７℃で血清(例えば、ヒト血清)中１２０時間インキュベートしてよい。上記結合アッセイを、その後、各時点での機能的二重特異性融合タンパク質のレベルの検出のために実施する。次いで、このレベルを、半減期モジュレーターを用いずに(または異なる半減期モジュレーターを使用して)構築した二重特異性融合タンパク質のレベルと比較し、血清安定性比較を提供する。
【０３７４】
何れか要素
半減期モジュレーターは、二重特異性融合タンパク質に単独でまたは短(例えば、２〜４０、２〜５０、２〜１００アミノ酸残基)コネクターペプチドを使用して取り込みまたはコンジュゲートし得る。ある実施態様において、コネクターポリペプチドは、半減期モジュレーターのＮ末端、Ｃ末端またはＮ末端およびＣ末端の両方に、一端または両端で存在する。リンカーのＮ末端での使用のための適当な短コネクターポリペプチドは、例えば、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−(ＧＳ)、−Ｇｌｙ−Ａｌａ−(ＧＡ)および−Ａｌａ−Ｓｅｒ−(ＡＳ)のようなジペプチドを含む。リンカーのＣ末端での使用のための適当な短コネクターポリペプチドは、例えば、−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−(ＬＱ)および−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−(ＴＧ)のようなジペプチドを含む。ある実施態様において、コネクターは２アミノ酸より長い。例えば、コネクターは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長以上である。ある実施態様において、コネクターは２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上のアミノ酸長である。好ましくは、このようなコネクターは可動性(例えばグリシン富)または構造的(例えば、アルファヘリックス富)である。ある実施態様において、コネクターリンカーは、配列番号６０〜６２に示す配列を有する。ある実施態様において、コネクターリンカーは、セリンがグルタミン酸で置換される配列番号６０〜６２に示す配列を有し得る。例えば、リンカーは、配列番号１２６に示す配列を有し得る。ある実施態様において、コネクターリンカーは、引用により全体的に本明細書に包含させる米国特許出願１３／０６８,８０８号に提供する配列番号２８〜３０に示す配列を有する。配列番号２８〜３０に示すこのような短コネクターポリペプチドおよびコネクターは、存在するならば、半減期モジュレーターの何れか一端または両端に位置し得る。
【０３７５】
ある実施態様において、コネクターポリペプチドは脂肪族リンカー、すなわちアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、プロリンまたはグリシンのような脂肪族基を有するリンカーであり得る。例えば、コネクターは、次の配列ＡＡＡＬＡＡＡ(配列番号１２７)を有し得る。
【０３７６】
ある実施態様において、コネクターは、トランスサイレチンのようなヒトタンパク質に基づく。
【０３７７】
上記のもの以外の要素が、場合によりここに提供する二重特異性融合タンパク質に包含され得ることは認識される。このような要素は、二重特異性融合タンパク質の発現、製造または精製促進、またはターゲティング機能の発揮を含む多様な目的のために存在し得る。
【０３７８】
ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質は、発現中に開裂され得るＮ末端分泌シグナルを有する。例えば、Ｎ末端リーダーポリペプチドが存在し得る。ある実施態様において、Ｎ末端リーダーポリペプチドは、配列番号１０５に示す配列を有する。
【０３７９】
二重特異性融合タンパク質はまた、または代替的に、精製を促進するためのポリヒスチジン(例えば、ヘキサヒスチジン)タグを含み得る。このようなタグは、少なくとも６ヒスチジン連続アミノ酸残基を含み、ＣまたはＮ末端に位置し得る。ある実施態様において、ヘキサヒスチジンタグは、二重特異性タンパク質のＣ末端に含まれる。付加的アミノ酸残基もポリヒスチジンと二重特異性タンパク質の残りの接合部に存在し得る。
【０３８０】
代表的二重特異性タンパク質
本発明のある態様により、二重特異性タンパク質はＮ末端アクティベーター(シグナル伝達アームとも称する)、Ｃ末端ターゲティングアームおよび中央ペプチドリンカーまたは半減期モジュレーターを有する。さらに本発明のある態様において、二重特異性タンパク質は、Ｎ末端アクティベーター(ここではシグナル伝達アームとも称する)、およびＣ末端ターゲティングアームを有する。さらに本発明の他の態様において、二重特異性タンパク質は、Ｃ末端アクティベーター(ここではシグナル伝達アームとも称する)、およびＮ末端ターゲティングアームを有する。さらに本発明の他の態様において、二重特異性タンパク質は、Ｃ末端アクティベーター(ここではシグナル伝達アームとも称する)、Ｎ末端ターゲティングアームおよび中央ペプチドリンカーまたは半減期モジュレーターを有する。
【０３８１】
本発明のある態様において、二重特異性タンパク質は、さらにターゲティングアームを半減期モジュレーターにおよび／またはアクティベータードメインを半減期モジュレーターに結合するリンカーまたはコネクターを有し得る。
【０３８２】
代表的二重特異性融合タンパク質は(Ｎ末端からＣ末端方向で)：
(ａ)何れかのリーダーポリペプチド；
(ｂ)ターゲティングポリペプチドドメイン(例えば、配列番号１〜４および１２２に示す配列を含むまたは有する)；
(ｃ)何れかのコネクターペプチド(例えば、配列番号６０〜６２、１２６〜１２７に示す配列に示す配列を含むまたは有する)；
(ｄ)ペプチドリンカーまたは半減期モジュレーター(例えば、配列番号５４〜５６および１２４の何れかに示す配列を含むまたは有する)；
(ｅ)何れかのコネクターペプチド(例えば、配列番号６０〜６２、１２６〜１２７に示す配列に示す配列を含むまたは有する)；
(ｆ)アクティベータードメイン(例えば、配列番号１０〜３０または１２０の何れかに示す配列に示す配列を含むまたは有する)；および
(ｇ)何れかのポリヒスチジンペプチド
を含む。
【０３８３】
代表的二重特異性融合タンパク質は(Ｎ末端からＣ末端方向で)：
(ａ)何れかのリーダーポリペプチド；
(ｂ)アクティベータードメイン(例えば、配列番号１０〜３０および１２０の何れかに示す配列に示す配列を含むまたは有する)；
(ｃ)何れかのコネクターペプチド(例えば、配列番号６０〜６２、１２６〜１２７に示す配列に示す配列を含むまたは有する)；
(ｄ)ペプチドリンカーまたは半減期モジュレーター(例えば、配列番号５４〜５６または１２４の何れかに示す配列に示す配列を含むまたは有する)；
(ｅ)何れかのコネクターペプチド(例えば、配列番号６０〜６２、１２６〜１２７に示す配列に示す配列を含むまたは有する)；
(ｆ)ターゲティングポリペプチドドメイン(例えば、配列番号１〜４および１２４に示す配列に示す配列を含むまたは有する)；および
(ｇ)何れかのポリヒスチジンペプチド
を含む。
【０３８４】
代表的二重特異性タンパク質は、次のものを含むが、これらに限定されない。
【表５】
2022002528.tif 000006
【表６】
2022002528.tif 000007
【０３８５】
代表的対照は、次のものを含むが、これらに限定されない。
【表７】
2022002528.tif 000008
【表８】
2022002528.tif 000009
【表９】
2022002528.tif 000010
【０３８６】
代表的二重特異性タンパク質は、タンパク質ＳＧＦ  ６０６(配列番号７０)、ＳＧＦ  ６８３(配列番号６７)、ＳＧＦ  ７１１(配列番号７３)、ＳＧＦ  ７１３(配列番号７４)、ＳＧＦ  ７１６(配列番号７５)、ＳＧＦ  ７２７(配列番号７６)、ＳＧＦ  ７２８(配列番号７７)、ＳＧＦ  ７２９(配列番号７８)、ＳＧＦ  ７３０(配列番号７９)、ＳＧＦ  ７３１(配列番号８０)、ＳＧＦ  ７３２(配列番号８１)、ＳＧＦ  ７３３(配列番号８２)、ＳＧＦ  ７３９(配列番号８３)、ＳＧＦ  ７４０(配列番号８４)、ＳＧＦ  ７４１(配列番号８５)、ＳＧＦ  ７４３(配列番号８６)、ＳＧＦ  ７３４(配列番号１０８)、ＳＧＦ  ７３７(配列番号１１６)、ＳＧＦ  ７５７(配列番号１１０)、ＳＧＦ  ７７６(配列番号１１８)を含むが、これらに限定されない。代表的二重特異性タンパク質は、図１Ａ〜１Ｂおよび図１０に図説するタンパク質ＳＧＦを含むが、これらに限定されない。
【０３８７】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、Ｃ末端からＮ末端方向で、配列番号１２０を有するアクティベータードメイン、配列番号６０〜６２、１２６〜１２７を有するコネクター、配列番号１２４を有するリンカー、配列番号６０〜６２、１２６〜１２７を有するコネクター、および配列番号１２２を有するターゲティングドメインを有する改変タンパク質である。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、ＩＧＦ１(Ｅ３Ｒ／Ｙ３１Ａ)＿ｌｋ７＿ＨＳＡ  ２６−６０９(Ｃ５８Ｓ／Ｎ５２７Ｑ)＿ｌｋ７＿ＡｎｘＶ  ２−３２０(Ｒ６３Ａ／Ｋ７０Ａ／Ｋ１０１Ａ／Ｅ１３８Ａ／Ｄ１３９Ｇ／Ｎ１６０Ａ／Ｃ３１６Ａ)である。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、配列番号１１８を有する。
【０３８８】
代表的二重特異性融合タンパク質は、配列番号６７、７０、７３〜８６、１０８、１１０、または１１６に示す配列を有し得る。ある実施態様において、タンパク質はターゲティングアームを有さず、陰性対照として役立つ。ある実施態様において、非標的化対照タンパク質は、図１Ａ〜１Ｂに図説する、タンパク質ＳＧＦ  ６０４(配列番号６９)、ＳＧＦ  ６８８(配列番号７２)、ＳＧＦ  ７０３(配列番号６８)、ＳＧＦ  ７０４(配列番号１０７)、ＳＧＦ  ６０２(配列番号６６)、ＳＧＦ  ７４６(配列番号１０９)を含むが、これらに限定されず、またはターゲティングアームを欠く代表的二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ６０６、ＳＧＦ  ７１１、ＳＧＦ  ７１３、ＳＧＦ  ７２７、ＳＧＦ  ７２８、ＳＧＦ  ７２９、ＳＧＦ  ７３０、ＳＧＦ  ７３１、ＳＧＦ  ７３２、ＳＧＦ  ７３３、ＳＧＦ  ７３４、ＳＧＦ  ７３７、ＳＧＦ  ７３９、ＳＧＦ  ７４０、ＳＧＦ  ７４１、ＳＧＦ  ７４３、ＳＧＦ  ６４９が使用され得る。ある実施態様において、ターゲティングアームを欠くタンパク質が、例えば有効性シフトアッセイにおいて、陰性対照使用され得る。ある実施態様において、タンパク質は、半減期モジュレーターとしてＩｇＧのＦｃ領域を含み得る。このようなフレームワークの使用は、構成的二量体タンパク質をもたらす。
【０３８９】
二重特異性タンパク質の製造
本発明の改変タンパク質を、当分野で知られる慣用的技法、例えば、固相ペプチド合成のような化学合成により合成し得る。このような方法は、当業者に知られる。一般に、これらの方法は、当分野で周知の固相または液相合成方法を用いる。具体的に、方法は、成長中のペプチド鎖への１以上のアミノ酸または適当に保護されたアミノ酸の逐次的付加を含む。通常、第一アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基を適当な保護基で保護する。次いで、保護または誘導体化アミノ酸を不活性固体支持体に固定するかまたは溶液で使用し、アミド結合形成に適する条件下、適当に保護された相補性(アミノまたはカルボキシル)基を有する配列における次のアミノ酸を添加することにより使用する。保護基を、次いで、この新たに添加したアミノ酸残基から除去し、次のアミノ酸(適当に保護された)をその後添加するなど。所望のアミノ酸全てが適当な配列で並んだら、何らかの残存保護基およびあらゆる固体支持体を、逐次的にまたは同時に除去して、最終ポリペプチドを得る。この一般法の単純な修飾により、例えば、保護トリペプチドと、適切に保護されたジペプチドのカップリング(キラル中心をラセミ化しない条件下)をカップリングさせ、脱保護後、ペンタペプチドを形成させることにより、１を超えるアミノ酸を、同時に生長している鎖に添加することが可能である。
【０３９０】
二重特異性タンパク質を、液相および固相ペプチド合成および組み換えＤＮＡ技法を含む標準技法を使用して合成し得る。固相合成に関して、配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に結合させ、残りのアミノ酸を順に添加する。約５０アミノ酸より長いポリペプチドについて、この方法で短い領域を合成し、次いで縮合させて長いポリペプチドを形成させ得る。カルボキシル末端の活性化によるペプチド結合の形成方法(例えば、カップリング剤Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの使用による)は、当分野で周知である。本発明のある態様において、ポリペプチドを、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡの合成により、組み換えＤＮＡ技法で製造できる。所望のポリペプチドのコード配列が合成または単離されたら、それらを発現のための何れかの適当なベクターにクローン化できる。多数のクローニングベクターが当業者に知られ、適切なクローニングベクターの選択は、好みの問題である。遺伝子を、プロモーター、リボソーム結合部位(細菌発現のため)および、場合により、オペレーター(ここでは集合的に“制御”要素と呼ぶ)の制御下に置き、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、この発現構築物を含むベクターにより形質転換された宿主細胞においてＲＮＡに転写されるようにする。コード配列はシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでも含まなくてもよい。宿主生物からの発現ポリペプチドの分泌を引き起こす異種リーダー配列を、コード配列に付加できる。宿主細胞の増殖に対してタンパク質配列の発現の制御を可能にする他の制御配列も望ましい可能性がある。このような制御配列が当業者に知られ、例は、制御化合物の存在下を含む、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現のオンまたはオフをもたらすものを含む。他のタイプの制御要素、例えば、エンハンサー配列もベクターに存在し得る。
【０３９１】
制御配列および他の制御配列は、コード配列が上記クローニングベクターのようなベクターに挿入される前にライゲートされ得る。あるいは、コード配列を、既に制御配列および適切な制限部位を含んでいる発現ベクターに直接クローン化し得る。
【０３９２】
本発明はまた、ＲＮＡの形またはＤＮＡの形であり得る、上記タンパク質およびタンパク質バリアントをコードするポリヌクレオチドも包含し、このＤＮＡはｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。本発明のバリアントをコードするコード配列遺伝子コードの冗長性または縮重の結果として変わり得る。
【０３９３】
組み換えＤＮＡ技法について、二重特異性融合タンパク質をコードするＤＮＡは化学的にまたは融合タンパク質の各部分をコードするＤＮＡの単離およびライゲートにより製造する。二重特異性融合タンパク質の各セグメントをコードするＤＮＡを、既知遺伝子から単離するかまたはデノボ合成してよい。ＤＮＡを直接化学合成する方法は当分野で周知であり、このような合成は自動化シンセサイザーを使用して日常的に実施される。化学合成は、一本鎖ポリヌクレオチドを作製し、これを、相補性配列とのハイブリダイゼーションまたはＤＮＡポリメラーゼを使用して二本鎖ＤＮＡに変換する。ＤＮＡの化学合成は、一般に二重特異性融合タンパク質より短い配列に限定されるが、完全二重特異性融合タンパク質が、短配列のインフレームのライゲーションにより得られることは明らかである。あるいは、二重特異性融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列はクローニングにより製造される。クローニング技法は当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual (3rd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)のような標準参考書に十分に記載される。ＤＮＡの一部をインレームでライゲートして、完全長コード配列を作製し得る。
【０３９４】
二重特異性融合タンパク質をコードするＤＮＡが得られたら、ＤＮＡを、原核生物または真核生物宿主細胞における発現のためにベクターにクローン化し得る。ＤＮＡをこのようなベクターに取り込む技法は、当業者に周知である。このような発現ベクター内で、二重特異性融合タンパク質をコードするＤＮＡは、発現に必要なヌクレオチド配列に操作可能に結合される(例えば、適当なプロモーターおよび、必要であれば、終結シグナル)。プロモーターは、隣に結合したコード配列の転写を指示するヌクレオチド配列である(一般にコード配列の５’に位置)。終結シグナルは、翻訳を終了させる停止コドンおよび／または転写終結シグナルであり得る。付加的制御要素(例えば、エンハンサー要素)も発現ベクター内に存在し得る。このようなベクターは、好ましくはプラスミドまたはウイルスベクターである。好ましくは、発現ベクターは、さらに選択可能マーカーを含み、これは選択に対する耐性を付与する。これは、細胞がベクターをその染色体に安定に取り込み、増殖して増殖巣を形成し、これが次にクローン化され、細胞株に拡張され得ることを可能とする。多様な選択可能マーカーが当分野で知られ、例えば、アンピシリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、アミノグリコシドＧ−４１８、ハイグロマイシンおよびピューロマイシンに対する耐性を提供する遺伝子を含む。当業者は、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、およびＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株のような種々の高級真核生物細胞を含むタンパク質の発現に利用可能な多数の発現系の知識を有する。
【０３９５】
宿主細胞は、標準方法を使用して、二重特異性融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされる。宿主細胞における発現は、ＤＮＡの対応するｍＲＮＡへの転写、続くｍＲＮＡの二重特異性融合タンパク質を産生する翻訳をもたらす。
【０３９６】
発現されたら、二重特異性融合タンパク質を、例えば、硫酸アンモニウム沈殿または親和性カラムクロマトグラフィーを含む標準法により精製できる。少なくとも約９０〜９５％均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均一性が医薬用途に最も好ましい。部分的にまたは望ましい均一性まで精製されたら、治療的に使用するならば、ポリペプチドは、実質的に内毒素を含んではならない。
【０３９７】
医薬組成物
本発明はまた、少なくとも一つの生理学的に許容される担体と共に、少なくとも一つのここに記載する二重特異性融合タンパク質を含む、医薬組成物を提供する。このような組成物は、組織損傷予防、または損傷組織修復または再生のために、組織損傷を有するまたはそのリスクがある患者の処置に使用され得る。このような患者は、例えば、心筋梗塞、腎臓損傷、および／または虚血性卒中を経験している患者を含む。所望により、幹細胞または損傷組織の修復を促進する他の薬剤のような他の活性成分も医薬組成物に包含させ得る。
【０３９８】
“患者”は、哺乳動物、好ましくはヒトである。用語“処置する”(または“処置”または“処理”)は、症状、障害、状態、または疾患の進行または重症化の遅延、軽減または回復を意味する。
【０３９９】
用語“治療有効量”は、患者への単または複数用量投与により、所望の処置を提供する本発明の二重特異性タンパク質の量または用量である。
【０４００】
ここで使用する用語“生理学的に許容される”は、動物、およびより具体的にはヒトにおける使用のために連邦政府または州政府の規制当局により承認されているまたは米国薬局方または他の一般に認識される薬局方に挙げられていることを意味する。用語“担体”は、二重特異性融合タンパク質と共に投与する希釈剤、アジュバント、添加物、または媒体を意味する。生理学的に許容される担体は、水および石油、動物、植物または合成起源(例えば、ピーナツ油、ダイズ油、鉱油、またはゴマ油)のものを含む油のような滅菌液体であり得る。水は、医薬組成物を静脈内投与するとき、好ましい担体である。食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射可能溶液のための、液体担体として用い得る。適当な医薬添加物は、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールを含む。組成物は、所望により、また小量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含んでよい。
【０４０１】
医薬組成物を、予防および／または治療処置のための、例えば、非経腸、鼻腔内、局所、経口、または経皮手段によるような局所投与を含む適切な何れかの投与方式のために製剤し得る。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、エマルジョン剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、エアロゾル剤および徐放性製剤のような投与方式に適する多様な周知の形態の何れかをとり得る。組成物は、トリグリセリドのような伝統的結合剤および担体を用いて、坐薬として製剤できる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準担体を含み得る。適当な医薬投与方式および担体の例は、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy," A.R. Gennaro, ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (21st ed., 2005)に記載される。
【０４０２】
一般に、ここに提供する医薬組成物は、非経腸的(例えば、静脈内、筋肉内、または皮下注射による)、または経口摂取または局所適用により投与される。
【０４０３】
ここで使用する用語“投与”は、宿主対象内または上(適切な場合)への組成物の実際の物理的導入として定義される。組成物の対象への導入の何れかかつ全ての方法が、本発明により企図され、方法は導入の何らかの特定の手段によらず、そう解釈されてはならない。導入の手段は当業者に周知であり、好ましくは、組成物を皮下または腫瘍内投与する。当業者が、１以上の経路が投与のために使用できるが、特定の経路が、他の経路よりも即時かつより有効な反応を提供できることを認識する。局所または全身送達は、体腔への適用または滴下を含む投与、エアロゾルの吸入または吹送(insufflation)、または筋肉内、静脈内、門脈内、肝内、腹腔、皮下、または皮内投与を含む非経腸導入により達成され得る。
【０４０４】
非経腸投与のために、二重特異性融合タンパク質を担体に懸濁または溶解し得る。水、緩衝化水、食塩水またはリン酸緩衝化食塩水のような滅菌水性担体が一般に好ましい。さらに、滅菌、固定油は、溶媒または懸濁媒体として用いられ得る。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含むあらゆる無菌性固定油を用い得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射可能組成物の製造に有用である。ｐＨ調節剤および緩衝剤、張性調節剤、分散剤、懸濁化剤、湿潤剤、界面活性剤、防腐剤、局所麻酔剤および緩衝剤のような薬学的に許容される補助的物質も、生理学的条件に近似させるために使用できる。
【０４０５】
ある実施態様において、医薬組成物は、患者(例えば、ヒト)への静脈内投与のために製剤される。一般に、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、組成物はまた、可溶化剤および注射部位の疼痛を軽減するためにリグノカインのような局所麻酔剤も含み得る。一般に、これら成分は、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェットのような閉鎖(例えば、密封)された容器に、例えば、乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々にまたは単位用量形態で一緒に混合されて提供される。組成物が点滴により投与されるとき、滅菌医薬グレード水または食塩水を含む点滴ビンを用いて投薬され得る。組成物が注射により投与されるとき、成分が投与前に混合され得るように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルが提供され得る。
【０４０６】
経口使用を意図する組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁液剤、分散可能粉末または顆粒剤、エマルジョン剤、硬または軟カプセル剤、またはシロップ剤またはエリキシル剤として提供され得る。このような組成物は、さらに甘味剤風味剤、着色剤および防腐剤のような成分の１以上を含み得る。錠剤は、錠剤の製造に適する生理学的に許容される添加物と混合された活性成分を含む。このような添加物は、例えば、不活性希釈剤、造粒および崩壊剤、結合剤および滑沢剤を含む。経口使用のための製剤はまた、活性成分が不活性固体希釈剤と混合される硬ゼラチンカプセル剤、または活性成分が水または油媒体と混合される軟ゼラチンカプセルとしても提供され得る。水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適する１以上の添加物と混合された活性物質を含む。このような添加物は、懸濁化剤および分散または湿潤剤を含む。水添加により水性懸濁液の製造に適する分散可能粉末および顆粒は、分散または湿潤剤、懸濁化剤および１以上の防腐剤と混合された活性成分を含む。
【０４０７】
油性懸濁液は、活性成分を植物油(例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはココナツ油)または液体パラフィンのような鉱油に懸濁することにより製剤され得る。医薬組成物はまた水中油型エマルジョンの形であり得る。油相は、植物油または鉱油またはこれらの混合物であり得る。適当な乳化剤は、例えば、天然に存在するガム、天然に存在するフォスファチドおよび無水物を含む。
【０４０８】
医薬組成物は、慣用の滅菌技法により滅菌でき、または滅菌濾過され得る。滅菌水溶液をそのまま包装してよく、または凍結乾燥し、凍結乾燥製剤を投与前に滅菌水性担体と合わせてよい。水性医薬組成物のｐＨは、一般に３〜１１、より好ましくは５〜９または６〜８、最も好ましくは７〜８、例えば７〜７.５である。
【０４０９】
ここに提供する二重特異性融合タンパク質は、一般に単一用量の投与が患者に治療有効量を送達するような濃度で医薬組成物内に提供される。治療有効量は、損傷組織の検出可能な修復または再生または組織損傷の症状の軽減のような認識できる患者利益をもたらす量である。治療有効量は、表３に例示する１以上の動物モデルにおける検出可能な組織修復または再生を達成するのに十分な量から近似され得る。それにも係わらず、用いる二重特異性融合タンパク質の活性、患者の年齢、体重、一般的健康、性別および食習慣、投与の時間および経路、排泄速度、薬物組み合わせのような何らかの同時処置および処置を受ける患者の組織損傷のタイプおよび重症度を含む、多様な因子が治療有効量に影響することは明らかである。最適用量は一般的試験を使用して確立でき、その方法は、当分野で周知である。用量は、一般に用量あたり二重特異性融合タンパク質約０.５mg〜約４００mg(例えば、用量あたり０.５mg、１mg、２mg、５mg、１０mg、５０mg、１００mg、２００mg、３００mg、または４００mg)の範囲である。一般に、約０.１mg〜約１００mg／kg体重／日の範囲の用量レベルを提供する組成物が好ましい。ある実施態様において、用量単位形態は約１０mg〜約１００mgの二重特異性融合タンパク質を含む。
【０４１０】
医薬組成物を、組織損傷の処置または予防のため(例えば、心筋梗塞または腎臓損傷の処置のため)包装し得る。包装された医薬製剤は、治療有効量のここに記載する少なくとも一つの医薬組成物および包含される組成物が患者における組織損傷(例えば心筋梗塞または腎臓損傷)の処置に使用するものであることを示す指示(例えば、ラベル)を入れた容器を含む。医薬組成物は、複数単一用量単位で包装されてよく、各々密封包装内に固定量の二重特異性融合タンパク質を含む。あるいは、容器は、複数用量の医薬組成物を含み得る。
【０４１１】
ここに記載する二重特異性タンパク質の１以上ならびに組織損傷の処置のためのこのような薬剤の使用の指示を含むキットも包含される。
【０４１２】
処置方法
医薬組成物を、患者(好ましくはウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、またはより好ましくはヒトのような哺乳動物)における病的組織損傷を処置するために、患者に投与できる。本発明の範囲内で、用語“処置”は予防および治療投与の両方を包含する。予防適用において、ここに記載する医薬組成物を、病的組織損傷を発症する素因があるまたは他の点でリスクがある患者に、組織損傷を防止、遅延または重症度低減のために投与する。治療適用において、処置を、病的組織損傷の重症度制限または損傷後の組織再生のために実施する。ある実施態様において、医薬組成物を、他の治療組成物と組み合わせて投与し得る。
【０４１３】
代表的病的組織損傷は、心組織損傷(例えば、心筋梗塞と関連する損傷)、腎組織損傷および虚血性卒中(例えば脳虚血症としても知られる脳虚血、重症虚血肢または他の虚血)後の組織損傷を含む。ある実施態様において、医薬組成物を使用して、組織を損傷から守るおよび／または組織もしくは臓器損傷後の組織を再生するおよび／または血液供給することができる。
【０４１４】
急性心筋梗塞(ＡＭＩ)で入院する患者のうち、約２０％が急性腎臓傷害(ＡＫＩ)を発症し、これは、持続性腎臓機能障害および末期腎疾患を含む有害な長期予後と関連する。ある実施態様において、医薬組成物を使用して、急性心筋梗塞(ＡＭＩ)後の腎組織を損傷から保護するおよび／または腎臓損傷もしくは組織損傷後の組織を再生するおよび／または血液供給をすることができる。
【０４１５】
ある実施態様において、医薬組成物を、自己免疫性疾患、例えば、狼瘡としても知られる全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)の予防、遅延、軽減または処置のために投与し得る。ＳＬＥは、多くの組織または系、例えば、関節、皮膚、肝臓、腎臓、血液細胞、心臓、肺、神経系、血管が攻撃され、炎症を起こす自己免疫性疾患である。免疫系が自己に対する、特に核タンパク質およびＤＮＡに対する、抗体を産生する。ある実施態様において、医薬組成物を、それを必要とする対象に、組織を損傷から守るおよび損傷後の組織を再生するために投与できる。ある実施態様において、医薬組成物を、既存の免疫抑制または他の処置と組み合わせて投与できる。
【０４１６】
ある実施態様において、医薬組成物を、それを必要とする対象に、Ｉ型糖尿病の予防、遅延、軽減または処置のために投与できる。Ｉ型糖尿病において、体の自分の免疫系が膵臓におけるインスリン産生ベータ細胞を破壊する。ある実施態様において、医薬組成物を、それを必要とする対象にベータ細胞再生のために投与できる。ある実施態様において、医薬組成物を、当分野で知られるＩ型糖尿病処置と組み合わせて投与できる。
【０４１７】
ある実施態様において、医薬組成物を、それを必要とする対象に、糖尿病性腎症またはポドサイト関連障害の予防、遅延、軽減または処置のために投与できる。糖尿病性腎症(キンメルスチール−ウィルソン症候群、または結節性糖尿病性糸球体硬化症、または毛細血管間糸球体腎炎としても知られる)は、糖尿病の３つの合併症の一つであり、血液透析開始の筆頭原因であり、西洋諸国における慢性腎不全および末期腎疾患の最も一般的な原因である。ポドサイト関連疾患または障害は、ポドサイト傷害によるもの(機械的負荷、虚血、酸素供給不足、毒性物質、内分泌学的障害、感染、造影剤、機械的外傷、細胞毒性剤、投薬、炎症、放射線、感染、免疫系の機能不全、遺伝的障害、臓器不全、臓器移植、または泌尿器系疾患によるもの)であり得る。ある実施態様において、医薬組成物を、それを必要とする対象に、糖尿病性腎症またはポドサイト関連障害処置のために投与できる。ある実施態様において、医薬組成物を、当分野で知られる糖尿病性腎症処置と組み合わせて投与できる。
【０４１８】
ある実施態様において、医薬組成物を、それを必要とする対象に、組織または臓器変性の予防、遅延、軽減または処置のために投与できる。例えば、医薬組成物を、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ルー・ゲーリック病としても知られるまたは筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)のような脳、脊髄または神経変性の処置に使用できる。ある実施態様において、医薬組成物を、当分野で知られる既存の処置と組み合わせて投与できる。
【０４１９】
ある実施態様において、医薬組成物を、それを必要とする対象に、骨および／または軟骨関連疾患の予防、遅延、軽減または処置のために投与できる。ある実施態様において、医薬組成物を骨および／または軟骨組織の再生に使用できる。医薬組成物を、当分野で知られる既存の処置と組み合わせて投与できる。
【０４２０】
二重特異性融合タンパク質を投与するための多様な既知送達系の何れかが使用でき、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、二重特異性融合タンパク質の発現が可能な組み換え細胞、受容体介在、またはレトロウイルスベクターまたは他の核酸ベクターへの封入を含む。二重特異性融合タンパク質を何れかの慣用の経路で、例えば点滴またはボーラス注射、上皮または皮膚粘膜裏層(例えば、経口粘膜、直腸および腸管粘膜など)からの吸収により投与してよく、他の生物活性剤と共に投与してよい。投与は全身性でも局所的でもよい。さらに、二重特異性融合タンパク質を、脳室内および髄腔内注射を含む何れかの適当な経路により中枢神経系に導入することが望ましい可能性があり、脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーのようなリザーバーに接続された脳室内カテーテルにより促進され得る。肺投与も、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤との製剤の使用により、用いられ得る。
【０４２１】
ある実施態様において、本発明の二重特異性融合タンパク質を、処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい可能性があり、これは、例えば、手術中の局所点滴、局所適用(例えば、手術後の創傷被覆と組み合わせて)、注射、カテーテルの手段、坐薬の手段、またはインプラントの手段により達成でき、該インプラントはシリコン剤膜のような膜または繊維を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン状物質である。他の実施態様において、リポソームのような小胞を、二重特異性融合タンパク質の送達に使用できる。さらに他の実施態様において、二重特異性融合タンパク質を制御放出系で送達し、例えば、このような制御放出系を治療標的(例えば、組織損傷を経験しているまたはそのリスクがある体の臓器)にまたはその近くに配置し得る。このような送達系の使用は当業者に周知である。
【０４２２】
ある実施態様において、ここに提供する二重特異性融合タンパク質は、少なくとも一部幹細胞を損傷組織に動員する能力により、病的組織損傷の処置に有効である。ある場合、十分な幹細胞が患者内に存在し得る(例えば、常在心臓幹細胞)。ある実施態様において、しかしながら、幹細胞(例えば、骨髄由来自己幹細胞)を共投与するのが有利であり得る。このような幹細胞を二重特異性融合タンパク質の前または後に投与してよく、または同時に投与してよい(同じ医薬組成物または別々の組成物で)。
【０４２３】
ある実施態様において、ここに提供する二重特異性タンパク質は、組織生存増強に有効である。ある実施態様において、二重特異性タンパク質を投与し、特異的組織または臓器(例えば心臓)を標的とできる。その後、二重特異性タンパク質は、組織関連標的分子へのターゲティングドメインの結合により特定の組織または臓器(例えば他の臓器とは対照的に心臓)に蓄積され得る。標的分子に結合したら、二重特異性融合タンパク質は標的分子から解離し、離れ、傍分泌様方式での組織の異なる細胞(例えば損傷細胞または“リスクがある”細胞)の増殖因子受容体である標的分子と再結合し得る。
【０４２４】
上記のとおり、最適用量は当分野で知られる特定の因子によるが、一般に、用量あたり約０.５mg〜約４００mgの二重特異性融合タンパク質(例えば、用量あたり１０mg、５０mg、１００mg、２００mg、３００mg、または４００mg)の範囲である。二重特異性融合タンパク質の用量(上記医薬組成物内)を、患者に時間、日、週、月または年あたり１回以上治療的に投与できる(例えば、日、週、月または年あたり２回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、または１２回)。より一般には、日または週あたり約０.１mg〜約１００mg／kg体重範囲の量の二重特異性融合タンパク質を含む単一用量が投与される。
【０４２５】
他の実施態様において、二重特異性融合タンパク質を含む医薬組成物を、患者に約０.１mg／週〜約２５００mg／週、約０.１mg／週〜約１０mg／週、約１mg／週〜約１００mg／週、約１０mg／週〜約５００mg／週、約１００mg／週〜約２５００mg／週、約１０mg／週〜約１００mg／週、または約１００mg／週〜約１０００mg／週の範囲の用量で投与し得る。あるいは、二重特異性融合タンパク質を含む医薬組成物を、約０.１mgを隔日〜約５００mgを隔日、約１mgを隔日〜約７５mgを隔日、約１０mgを隔日〜約５０mgを隔日、または約２０mgを隔日〜約４０mgを隔日の範囲の用量で投与し得る。二重特異性融合タンパク質を含む医薬組成物は、あるいは約０.１mgを週３回〜約１００mgを週３回、約１mgを週３回〜約７５mgを週３回、約１０mgを週３回〜約５０mgを週３回、または約２０mgを週３回〜約４０mgを週３回の範囲の用量で投与し得る。
【０４２６】
ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質を含む医薬組成物を、哺乳動物(例えば、ヒト)に１時間、２時間、３時間、または４時間連続的に、１日１回、２回、３回、または４回；隔日または３日、４日、５日または６日毎、週に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回、隔週、月に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、または３０回、隔月、６ヶ月毎に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回、年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、または２０回または年２回投与する。二重特異性融合タンパク質を含む医薬組成物を、必須ではないが、治療レジメの間に異なる頻度で投与してよいことは明らかである。
【０４２７】
組み合わせ治療
ある実施態様において、本発明のタンパク質を、１以上の付加的化合物または治療と組み合わせて投与できる。例えば、１以上の本発明のタンパク質を、１以上の治療化合物と組み合わせて共投与できる。組み合わせ治療は同時のまたは交互の投与を含み得る。
【０４２８】
次の実施例は、限定としてではなく、説明として提供する。特に断らない限り、全ての試薬および溶媒は、標準市販グレードであり、さらに精製することなく使用する。常習的な変更を使用して、次の実施例に提供する方法を、本発明の範囲内の他の二重特異性融合タンパク質および医薬組成物を製造し、使用するために当業者が変え得る。
【０４２９】
ある本発明の態様は、(ａ)組織の細胞の外表面と関連する標的分子に結合特異性を有するターゲティングドメイン；および(ｂ)組織の細胞の表面と関連する受容体に結合特異性を有する改変アクティベータードメインを含む二重特異性タンパク質に関し、ここで、改変アクティベータードメインは野生型アクティベータードメインのアミノ酸配列の修飾アミノ酸配列を有し、ここで、改変アクティベータードメインは、野生型アクティベータードメインに対して受容体活性化を減少させ、ここで、受容体または下流エフェクター分子のリン酸化により測定して、二重特異性タンパク質標的分子を含まない細胞と比較して、標的分子を含む細胞に少なくとも２倍強い受容体活性化を示す。
【０４３０】
ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、欠失、置換、付加、Ｎおよび／またはＣ末端への付加的アミノ酸配列またはこれらの組み合わせを含むように修飾された野生型アミノ酸配列を含む。改変アクティベータードメインは非免疫原性タンパク質に融合した野生型アクティベータードメインを含み得る。改変アクティベータードメインは非免疫原性タンパク質に融合した野生型アクティベータードメインのアミノ酸配列の修飾アミノ酸配列を含み得る。
【０４３１】
ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、野生型アクティベータードメインに対して受容体活性化を少なくとも３.５倍減少させる。ある実施態様において、ＡＫＴのリン酸化により測定して、二重特異性タンパク質標的分子を含まない細胞と比較して、標的分子を含む細胞に少なくとも２倍強い受容体活性化を示す。
【０４３２】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらに半減期モジュレーターを含んでよく、ここで、半減期モジュレーターは二重特異性タンパク質の半減期を延長する。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、ヒト血清アルブミン、Ｆｃ、ｓｃＦｃ、アルブミン結合ドメイン、ＰＡＳ化、ヒトアルファ−フェトタンパク質、またはそのバリアントの配列を含む。
【０４３３】
ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、増殖因子受容体に結合親和性を有する。ある実施態様において、改変アクティベータードメインおよびターゲティングドメインは、組み換えにより融合される。ある実施態様において、改変アクティベータードメインおよびターゲティングドメインは、化学的に結合される。
【０４３４】
ある実施態様において、二重特異性融合タンパク質は、組織再生、細胞生存、細胞分化を促進し、アポトーシスを阻害し、細胞増殖を誘発し、細胞成長を促進し、幹細胞の運動性を促進し、幹細胞の分化を促進し、細胞損傷を予防しおよび／または血管形成を促進する。ある実施態様において、組織は心組織、腎組織、骨、軟骨、関節、皮膚、肝組織、膵臓組織、血液細胞、肺組織、脳組織、および神経組織である。
【０４３５】
ある実施態様において、改変アクティベータードメインは増殖因子を含む。ある実施態様において、増殖因子はＩＧＦ−１、ＮＲＧ、またはそのバリアントを含む。ある実施態様において、ターゲティングドメインはアネキシンＡ５またはそのバリアントを含む。ある実施態様において、アネキシンＡ５は、配列番号１〜４、または１２２の何れかに示すアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、ＩＧＦ−１(ＬＲ３−Ｙ３１Ａ)を含む。ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、配列番号１８、１９、２３、２４、２８、２９、または１２０の何れかに示すアミノ酸配列を含む。
【０４３６】
ある実施態様において、半減期モジュレーターは、ヒト血清アルブミンまたはそのバリアントである。ある実施態様において、ヒト血清アルブミンは、配列番号５４〜５６、または１２４の何れかに示すアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、Ｆｃまたはそのバリアントを含む。ある実施態様において、Ｆｃまたはそのバリアントは、配列番号５３に示すアミノ酸配列を含む。
【０４３７】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらに改変アクティベータードメインを半減期モジュレーターに結合させるコネクターおよび半減期モジュレーターをターゲティングドメインに結合させるコネクター含む。ある実施態様において、リンカーは、配列番号６０〜６２、または１２６〜１２７の何れかに示すアミノ酸配列を含む。
【０４３８】
ある実施態様において、改変アクティベータードメインは、ペプチド結合によりターゲティングドメインのアミノ末端に結合するかまたはアクティベータードメインはペプチド結合によりターゲティングドメインのカルボキシ末端に結合する。
【０４３９】
ある実施態様において、ターゲティングドメインは、ホスファチジルセリンに結合特異性を有する。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、ポドサイト関連分子に結合特異性を有する。
【０４４０】
本発明の態様は、(１)増殖因子を含むアクティベータードメイン、(２)損傷細胞の外表面でホスファチジルセリンに結合するポリペプチドを含むターゲティングドメインを含む二重特異性タンパク質に関し、ここで、二重特異性タンパク質は、損傷細胞(ＥＣ５０損傷)における半数効果濃度が健常細胞(ＥＣ５０健常)よりも低い。ある実施態様において、損傷細胞は、アポトーシスまたは壊死を受けている細胞である。ある実施態様において、アクティベータードメインは、ＩＧＦ−１のバリアントを含む。ある実施態様において、ターゲティングドメインは、ヒトアネキシンＡ５またはそのバリアントを含む。ある実施態様において、アクティベータードメインはＩＧＦ−１のバリアントを含みターゲティングドメインは、ヒトアネキシンＡ５またはそのバリアントを含む。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、少なくとも１０：１のＥＣ５０健常／ＥＣ５０損傷比を有する。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、ＩＧＦ−１受容体への結合により生存シグナル伝達を誘発する。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、ＡＫＴのリン酸化を誘発する。ある実施態様において、アネキシンＡ５は、配列番号１〜４、または１２２の何れかに示すアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントおよびアネキシンＡ５またはそのバリアントは、単一ポリペプチドを形成するようにペプチド結合により共有結合される。ある実施態様において、ＩＧＦ−１のバリアントおよびアネキシンＡ５またはそのバリアントは、単一ポリペプチドを形成するようにペプチド結合によりペプチドリンカーに共有結合される。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントはペプチドリンカーのアミノ末端に結合され、アネキシンＡ５またはそのバリアントはペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合される。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントはペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合され、アネキシンＡ５またはそのバリアントはペプチドリンカーのアミノ末端に結合される。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらにＩＧＦ−１バリアントとペプチドリンカーの間のペプチドコネクターおよびアネキシンＡ５またはそのバリアントとペプチドリンカーの間のペプチドコネクターを含む。
【０４４１】
本発明の態様は、(１)ＩＧＦ−１のバリアントを含むアクティベータードメインおよび(２)アネキシンＡ５またはそのバリアントを含むターゲティングドメインを含む二重特異性タンパク質に関し、ここで、アネキシンＡ５またはそのバリアントは、損傷組織内の細胞の外表面でホスファチジルセリンと結合し、二重特異性タンパク質は、健常細胞(ＥＣ５０健常)より低い損傷細胞(ＥＣ５０損傷)における半数効果濃度を有する。ある実施態様において、損傷組織は虚血性組織である。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、少なくとも１０：１のＥＣ５０健常／ＥＣ５０損傷比を有する。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、配列番号１０〜３０、または１２０の何れかに示すアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、ＩＧＦ−１受容体への結合により生存シグナル伝達を誘発する。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントは、ＡＫＴのリン酸化を誘発する。ある実施態様において、アネキシンＡ５は、配列番号１〜４、または１２２の何れかに示すアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントおよびアネキシンＡ５またはそのバリアントは、単一ポリペプチドを形成するようにペプチド結合により共有結合される。ある実施態様において、ＩＧＦ−１のバリアントおよびアネキシンＡ５またはそのバリアントは、単一ポリペプチドを形成するようにペプチド結合によりペプチドリンカーに共有結合される。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントはペプチドリンカーのアミノ末端に結合され、アネキシンＡ５またはそのバリアントはペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合される。ある実施態様において、ＩＧＦ−１バリアントはペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合され、アネキシンＡ５またはそのバリアントはペプチドリンカーのアミノ末端に結合される。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらにＩＧＦ−１バリアントとペプチドリンカーの間のペプチドコネクターおよびアネキシンＡ５またはそのバリアントとペプチドリンカーの間のペプチドコネクターを含む。
【０４４２】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらにペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、ペプチドリンカーは半減期モジュレーターである。ある実施態様において、半減期モジュレーターはヒト血清アルブミンまたはそのバリアントである。ある実施態様において、半減期モジュレーターは、Ｆｃフラグメントまたはそのバリアントである。
【０４４３】
ある実施態様において、ヒト血清アルブミンまたはそのバリアントは、配列番号５４〜５６、または１２４の何れかに示すアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、Ｆｃフラグメントは、配列番号５３に示すアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、ペプチドコネクターは、配列番号６０〜６２、または１２６〜１２７の何れかに示すアミノ酸配列を有する。
【０４４４】
本発明の態様は、(１)配列番号１８、１９、２３、２４、２８、２９、または１２０の何れかに示すアミノ酸配列を含むＩＧＦ−１バリアント；および(２)配列番号１〜４、または１２２の何れかに示すアミノ酸配列を含むアネキシンＡ５またはそのバリアントを含む二重特異性タンパク質に関する。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらに配列番号５４〜５６、または１２４の何れかに示すアミノ酸配列を含むヒト血清アルブミンまたはそのバリアントを含む。ある実施態様において、ヒト血清アルブミンまたはそのバリアントは、アネキシンＡ５またはそのバリアントのＣ末端およびＩＧＦ−１バリアントのＮ末端に連結される。ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、さらにヒト血清アルブミンまたはそのバリアントのＮ末端をアネキシンＡ５またはそのバリアントのＣ末端に連結するペプチドコネクターおよびヒト血清アルブミンまたはそのバリアントのＣ末端をＩＧＦ−１バリアントのＮ末端に連結するペプチドコネクターを含む。ある実施態様において、ペプチドコネクターは、配列番号６０〜６２、または１２６〜１２７の何れかに示すアミノ酸配列を含む。
【０４４５】
本発明の態様は、ここに記載する二重特異性タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【０４４６】
本発明の態様は、ここに記載する二重特異性タンパク質をコードする単離組み換え核酸配列に関する。
【０４４７】
本発明の態様は、配列番号８４を有する改変タンパク質に関する。本発明の態様は、配列番号１０２を有する単離組み換え核酸に関する。本発明の態様は、配列番号８４を有する二重特異性融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【０４４８】
本発明の態様は、配列番号１１８を有する改変タンパク質に関する。本発明の態様は、配列番号１１９を有する単離組み換え核酸に関する。本発明の態様は、配列番号１１８を有する二重特異性融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【０４４９】
本発明の態様は、対象における組織再生または生存を促進する方法に関し、方法は、(ａ)ここに記載するターゲティングドメインを有する二重特異性タンパク質を提供し、そして(ｂ)処置を必要とする患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与することを含み、ここで、ターゲティングドメインが二重特異性融合タンパク質を組織の細胞に標的化し、それにより、アクティベータードメインが細胞の表面で増殖因子受容体に曝されたとき、アクティベータードメインは組織再生を促進するように増殖因子受容体を特異的に活性化する。
【０４５０】
本発明の態は、対象における組織再生または生存を促進する方法に関し、方法は、(ａ)ここに記載するターゲティングドメインを有する二重特異性タンパク質を提供し、そして(ｂ)処置を必要とする患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与することを含み、ここで、ターゲティングドメインが組織の第一細胞に二重特異性融合タンパク質を標的化し、それによりアクティベータードメインが第二細胞の表面で増殖因子受容体に曝されたとき、アクティベータードメインは組織再生を促進するように増殖因子受容体を特異的に活性化する。
【０４５１】
ある実施態様において、ターゲティングドメインおよびアクティベータードメインは、組織の同じ細胞の表面と関連する分子と結合する。他の実施態様において、ターゲティングドメインおよびアクティベータードメインは、組織の異なる細胞の表面と関連する分子と結合する。ある実施態様において、組織は、心組織、腎組織、骨、軟骨、関節、皮膚、肝組織、膵臓組織、血液細胞、肺組織、脳組織、または神経組織である。
【０４５２】
本発明の態様は、対象における組織再生または生存を促進する方法に関し、方法は、(ａ)ここに記載するターゲティングドメインを有する二重特異性タンパク質を提供し、そして(ｂ)処置を必要とする患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与することを含み、ここで、アネキシンＡ５またはそのバリアントが二重特異性融合タンパク質を組織の細胞に標的化し、ここで、細胞は原形質膜の外葉にホスファチジルセリンを発現し、それによりＩＧＦ−１バリアントが細胞表面でＩＧＦ−１受容体に曝されたとき、ＩＧＦ−１バリアントは、組織再生が促進されるようにＩＧＦ−１受容体を特異的に活性化する。
【０４５３】
本発明の態様は、対象における組織再生または生存を促進する方法に関し、方法は、(ａ)ここに記載するターゲティングドメインを有する二重特異性タンパク質を提供し、そして(ｂ)処置を必要とする患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与することを含み、ここで、アネキシンＡ５またはそのバリアントは、組織の第一細胞に二重特異性融合タンパク質を標的化し、ここで、細胞は原形質膜の外葉にホスファチジルセリンを発現し、それによりＩＧＦ−１バリアントが第二細胞の表面のＩＧＦ−１受容体に曝されたとき、ＩＧＦ−１バリアントは、組織再生が促進されるようにＩＧＦ−１受容体を特異的に活性化する。
【０４５４】
ある実施態様において、アネキシンＡ５またはそのバリアントおよびＩＧＦ−１バリアントは、異なる組織の同じ細胞の表面と関連する分子と結合する。他の実施態様において、アネキシンＡ５またはそのバリアントおよびＩＧＦ−１バリアントは、異なる組織の異なる細胞の表面と関連する分子と結合する。
【０４５５】
本発明の態様は、対象における組織再生または生存を促進する方法に関し、方法は、(ａ)ここに記載するターゲティングドメインを有する二重特異性タンパク質を提供し、そして(ｂ)処置を必要とする患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与することを含み、ここで、二重特異性タンパク質は、組織の細胞の原形質膜の外葉上のホスファチジルセリンおよび組織の細胞の表面のＩＧＦ−１増殖因子受容体に結合する。
【０４５６】
本発明の態様は、対象における組織再生または生存を促進する方法に関し、方法は、(ａ)ここに記載するターゲティングドメインを有する二重特異性タンパク質を提供し、そして(ｂ)処置を必要とする患者に二重特異性タンパク質の治療有効量を投与することを含み、ここで、二重特異性タンパク質は、組織の第一細胞の原形質膜の外葉上のホスファチジルセリンおよび組織の第二細胞の表面でＩＧＦ−１増殖因子受容体に結合する。
【０４５７】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、組織の同じ細胞の表面と関連する分子と結合する。他の実施態様において、二重特異性タンパク質は、組織の異なる細胞の表面と関連する分子と結合する。
【０４５８】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、ヒトアネキシンＡ５の非内部移行バリアントのアミノ酸配列を含み、ここで、二重特異性タンパク質は、野生型ヒトアネキシンＡ５のアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質と比較して延長した半減期を有する。
【０４５９】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するターゲティングドメインを含む。
【０４６０】
ある実施態様において、二重特異性タンパク質は配列番号６７、７０、７３〜８６、１０８、１１０、１１６、または１１８の何れかに示すアミノ酸配列を含む。
【実施例】
【０４６１】
次の実施例は、本開示の範囲を限定すると解釈してはならない。
【０４６２】
実施例１. 二重特異性融合タンパク質は、健常細胞に対する有効性を低減するために改変され得る。
損傷細胞に対するターゲティング／選択性を可能とするために、ＩＧＦ１を、ｗｔ  ＩＧＦ−１と比較して、健常細胞に対する有効性を低減するように改変した(図２Ａ〜２Ｂ)。有効性を、ｐＡＫＴシグナル伝達の最大の半分のレベルを達成するのに必要な濃度として定義する(ｐＡＫＴ  ＥＣ５０)。ある実施態様において、ＩＧＦ１改変バリアントを、１３アミノ酸Ｎ末端伸張および３位のグルタミン酸のアルギニンへの置換を含むＩＧＦ−１(ＬＲ３)バリアントを使用して改変した。グルタミン酸のアルギニンへの置換を、ＩＧＦ−１バリアントを含む融合タンパク質のＩＧＦ結合タンパク質(ＩＧＦＢＰ)への結合を阻止するために付加し、有効性に顕著に影響しない(図２Ａ〜２Ｂ参照、Ｗｔ  ＩＧＦ１のＥＣ５０は１.２２±０.７４であり、それに対しＩＧＦ−１(ＬＲ３)のＥＣ５０は０.７３±０.３５である)。
【０４６３】
６倍以上の有効性低減が次のことにより達成され得る。
１. アミノ酸置換。ある実施態様において、チロシン残基が置換され得る。ある実施態様において、アミノ酸２４および／または３１が置換され得る(例えば、Ｙ３１置換を含む増殖因子７４０および７３３、Ｙ２４Ｌ置換を含む増殖因子７３９(配列番号８３)および７３２(配列番号８１)、Ｙ６０Ｌ置換を含む増殖因子７２８(配列番号７７)および７４１(配列番号８５)またはＹ２４ＬおよびＹ３１置換の両方を含むＳＧＦ  ７３１)。
２. アミノ酸欠失。ある実施態様において、タンパク質分解の部位に対応するアミノ酸配列(例えばＫＲ、ＲＲ)またはＫおよび／またはＲ残基が欠失され得る。ある実施態様において、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０のようなＣ末端アミノ酸が欠失され得る。ある実施態様において、アミノ酸Ｒ３７が欠失され得る。ある実施態様において、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０のようなＣ末端アミノ酸およびアミノ酸Ｒ３７が欠失され得る(例えば、残基Ｒ３７の欠失を含むＳＧＦ  ６０２ならびに残基Ｒ３７の欠失および３個のＣ末端ＩＧＦ−１残基(Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０)の欠失を含む増殖因子６８３、７２７、６０６、７４３、および７３０)。ある実施態様において、Ｃ末端の最大３、最大４、最大５、最大６、最大７、最大８、最大９、最大１０アミノ酸が欠失され得る。
３. 融合タンパク質のタンパク質ドメインへのペプチド(ここではコネクターとも称する)付加(または融合)(例えば、ＩＧＦ−１(ＬＲ３)を、７または１５アミノ酸リンカーを経てヒト血清アルブミンのバリアント(ｍＨＳＡ)に融合する増殖因子７０３、７１１、７１３、７２９、７１６、７０４)。ある実施態様において、リンカーは、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長であり得る。ある実施態様において、リンカーは、少なくとも２アミノ酸長、少なくとも５アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長、少なくとも４０アミノ酸長であり得る。
【０４６４】
二重特異性タンパク質を、多能性幹細胞由来心筋細胞(Cellular Dynamics International(ＣＤＩ)からのｉＰＳＣ由来心筋細胞)で測定し、シグナル伝達をリン酸化ＡＫＴ(ｐＡＫＴ)の蓄積により定量した。
【０４６５】
０日目、心筋細胞を標準プロトコールに従い解凍し、Plating Media(CDI catalog # CMM-100-110-005)に１.５ｅ４細胞／ウェルで播種した。
【０４６６】
２日目、培地を数回ピペットで吸引および排出して死滅細胞を除去し、１００μL／ウェル温Maintenance Media(CDI catalog # CMM-100-120-001)に置き換えた。Maintenance Mediaを隔日で置き換えた。
【０４６７】
１４日目、低血清培地を調製した(ＤＭＥＭ無グルコース(Invitrogen 11966-025)、１mM  ピルビン酸ナトリウム、１０mM  ガラクトース、０.５％血清(ＣＤＩにより供給)、０.７mM  ＣａＣｌ２)。Maintenance Mediaを吸引し、１００μL／ウェル低血清培地で置き換えた。
【０４６８】
１５日目、溶解溶液を調製し[完全Ｍ−ＰＥＲ溶解緩衝液：Ｍ−ＰＥＲ溶解緩衝液(Pierce/ThermoScientific Cat # 78501)＋１５０mM  ＮａＣｌ＋プロテアーゼ(Roche Complete)およびホスファターゼ阻害剤(Roche PhosSTOP))]、二重特異性タンパク質を０.７mM  ＣａＣｌ２を伴う低血清培地で調製した。種々の連続希釈(１：７希釈)を調製した。細胞を、２５μL／ウェルの希釈二重特異性タンパク質を各ウェルに既に存在する１００μLに添加し、プレートを１０秒軽打して混合することにより、二重特異性タンパク質の希釈溶液で刺激した。細胞を、１０分、３７℃でインキュベートした。刺激を、ウェルから培地を除去することにより停止させた。細胞を、２００μL／ウェル冷ＰＢＳで洗浄し、プレートを逆さにして軽打して、過剰のＰＢＳを除去した。細胞を２５μL／ウェル完全Ｍ−ＰＥＲ溶解緩衝液に溶解した。プレートを、ホイルプレートシールで封し、オービタルシェーカーに３０分、４℃で置いた。次いで、プレートをＥＬＩＳＡの準備ができるまで−８０℃で保存した。
【０４６９】
ｐＡＫＴ  ＥＬＩＳＡについて、０日目に、３８４ウェル平白色プレート(LIA High Binding, Greiner Bio-One, 781074)を、抗Ａｋｔ捕捉抗体(クローンＳＫＢ１、Millipore 05-591)で被覆した。抗Ａｋｔ捕捉ＡｂをＰＢＳ中１：２５０希釈し、２０μL／ウェルを添加し、プレートを、室温で一夜封した。
【０４７０】
１日目、細胞ライセートサンプルを４℃で解凍した。ＥＬＩＳＡプレートをPlate Washerを使用して８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを、５０μL／ウェル２％ＢＳＡ／ＰＢＳで、１時間、室温で遮断した。組み換えヒト活性Ａｋｔ標準曲線を９６ウェルプレート(非結合表面プレート、Corning 3641)でＭＰＥＲ緩衝液中調製した。最高濃度のｒｈ活性Ａｋｔ１／ＰＫＢα(Millipore 14-276)ストック(９１６５ng／ml)を１：２００希釈(９連続１：２希釈)の製造により調製した。遮断後、ＥＬＩＳＡプレートを、８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２０μL／ウェルサンプルおよび標準をＥＬＩＳＡプレートに添加し、２時間、室温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２０μL／ウェル検出抗体(２％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中１：１０００希釈したＣＳＴ  ４０６０)を添加し、１.５時間、室温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２０μL／ウェルの二次抗体(抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ、ＣＳＴ  ７０７４、２％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ中１：１０００希釈)を添加し、３０分、室温でシェーカー上でインキュベートした(遮光)。ＥＬＩＳＡプレートを、８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。等部のエンハンサーおよび過酸化物基質と混合した２０μL／ウェル  SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce/ThermoScientific)を添加し、プレートを１分振盪させ、蛍光を読んだ。
【０４７１】
用量応答曲線を３パラメータＥＣ５０活性化モデルにフィットさせ、計算ＥＣ５０をｗｔ  ＩＧＦ−１および二重特異性タンパク質(増殖因子６４９、７１１、６８３、７１３、７２９、７１６、７２７、６０６、７４３、７３０、７４０、７３３、７３９、７３２、７２８、７４１、７３１、７５７)および非標的化対照タンパク質(６８８、７０３、７０４、６０２、図２Ａ〜２Ｂ)で比較した。融合タンパク質の各々の計算された有効性低減を、融合タンパク質とｗｔ  ＩＧＦ−１用量応答曲線のフィットＥＣ５０値比(ＥＣ５０融合／ＥＣ５０ｗｔ ＩＧＦ１)として取った。
【０４７２】
実施例２：標的化、有効性低減二重特異性融合タンパク質は、標的分子を含まない細胞と比較して、標的分子含有細胞において選択的にシグナル伝達する(すなわち、有効性シフトを示す)
ホスファチジルセリン(ＰＳ)標的化、有効性低減二重特異性タンパク質が、標的分子ＰＳを含む細胞において選択的にシグナル伝達する能力を、健常(細胞表面にＰＳを示さない)対損傷(細胞表面にＰＳを示す)多能性幹細胞由来心筋細胞(Cellular Dynamics International)で測定し、シグナル伝達をリン酸化ＡＫＴの蓄積により定量した(図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ)。
【０４７３】
ホスファチジルセリン(ＰＳ)標的化、有効性低減二重特異性タンパク質(ｗｔ  ＩＧＦ−１に比して６倍以上有効性低減されている、例えばそれぞれ配列番号８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、および７０の増殖因子７４３、７４１、７４０、７３９、７３３、７３２、７３１、７３０、７２９、７２８、７２７、７１６、７１３、７１１、６０６)を、非標的化有効性低減融合タンパク質(ｗｔ  ＩＧＦ−１と比較して６倍以上有効性低減されている、それぞれ配列番号１０７、６６および６８の例えば７０４、６０２、７０３)、非標的化非有効性低減融合タンパク質(ｗｔ  ＩＧＦ−１と比較して２倍以下減少、例えばＳＧＦ  ６８８、配列番号７２)、および標的化非有効性低減ｗｔ  ＩＧＦ−１と比較して２倍以下減少(例えばＳＧＦ  ６４９、配列番号７１)と比較した。例えば、タンパク質特性については図１Ｂおよびｗｔ  ＩＧＦ−１に対する有効性減少を示す表については図２Ａ〜２Ｂ参照。
【０４７４】
０日目、心筋細胞を標準プロトコールに従い解凍し、Plating Media(CDI catalog # CMM-100-110-005)に１.５ｅ４細胞／ウェルで播種した。
【０４７５】
２日目、培地を数回ピペットで吸引および排出して死滅細胞を除去し、１００μL／ウェル温Maintenance Media(CDI catalog # CMM-100-120-001)に置き換えた。Maintenance Mediaを隔日で置き換えた。
【０４７６】
１４日目、低血清培地を調製した(ＤＭＥＭ無グルコース(Invitrogen 11966-025)、１mM  ピルビン酸ナトリウム、１０mM  ガラクトース、０.５％血清(ＣＤＩにより供給)、０.７mM  ＣａＣｌ２)。低血清培地を１２.５μg／mlドキソルビシンで調製した。損傷／処理細胞について、Maintenance Mediaを吸引し、１００μL／ウェル低血清培地＋１２.５μg／mLドキソルビシンで置き換えた。健常／非処理細胞について、Maintenance Mediaを吸引し、１００μL／ウェル低血清培地で置き換えた。
【０４７７】
１５日目、溶解溶液を調製し[完全Ｍ−ＰＥＲ溶解緩衝液：Ｍ−ＰＥＲ溶解緩衝液(Pierce/ThermoScientific Cat # 78501)＋１５０mM  ＮａＣｌ＋プロテアーゼ(Roche Complete)およびホスファターゼ阻害剤(Roche PhosSTOP))]、二重特異性タンパク質を０.７mM  ＣａＣｌ２を伴う低血清培地で調製した。種々の連続希釈(１：７希釈)を調製した。細胞を、２５μL／ウェルの希釈二重特異性タンパク質を各ウェルに既に存在する１００μLに添加し、プレートを１０秒軽打して混合することにより、二重特異性タンパク質の希釈溶液で刺激した。細胞を、１０分、３７℃でインキュベートした。刺激を、ウェルから培地を除去することにより停止させた。細胞を、２００μL／ウェル冷ＰＢＳで洗浄し、プレートを逆さにして軽打して、過剰のＰＢＳを除去した。細胞を２５μL／ウェル完全Ｍ−ＰＥＲ溶解緩衝液に溶解した。プレートを、ホイルプレートシールで封し、オービタルシェーカーに３０分、４℃で置いた。次いで、プレートをＥＬＩＳＡの準備ができるまで−８０℃で保存した。
【０４７８】
ｐＡＫＴ  ＥＬＩＳＡについて、０日目に、３８４ウェル平白色プレート(LIA High Binding, Greiner Bio-One, 781074)を、抗Ａｋｔ捕捉抗体(クローンＳＫＢ１、Millipore 05-591)で被覆した。抗Ａｋｔ捕捉ＡｂをＰＢＳ中１：２５０希釈し、２０μL／ウェルを添加し、プレートを、室温で一夜封した。
【０４７９】
１日目、細胞ライセートサンプルを４℃で解凍した。ＥＬＩＳＡプレートをPlate Washerを使用して８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを、５０μL／ウェル２％ＢＳＡ／ＰＢＳで、１時間、室温で遮断した。組み換えヒト活性Ａｋｔ標準曲線を９６ウェルプレート(非結合表面プレート、Corning 3641)でＭＰＥＲ緩衝液中調製した。最高濃度のｒｈ活性Ａｋｔ１／ＰＫＢα(Millipore 14-276)ストック(９１６５ng／ml)を１：２００希釈(９連続１：２希釈)の製造により調製した。遮断後、ＥＬＩＳＡプレートを、８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２０μL／ウェルサンプルおよび標準をＥＬＩＳＡプレートに添加し、２時間、室温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２０μL／ウェル検出抗体(２％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中１：１０００希釈したＣＳＴ  ４０６０)を添加し、１.５時間、室温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２０ｕｌ／ウェルの二次抗体(抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ、ＣＳＴ  ７０７４、２％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ中１：１０００希釈)を添加し、３０分、室温でシェーカー上でインキュベートした(遮光)。ＥＬＩＳＡプレートを、８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。等部のエンハンサーおよび過酸化物基質と混合した２０μL／ウェル  SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce/ThermoScientific)を添加し、プレートを１分振盪させ、蛍光を読んだ。
【０４８０】
用量応答曲線を健常および損傷心筋細胞で比較した(図３Ａ)。用量応答曲線を次いで３パラメータＥＣ５０活性化モデルにフィットさせ、計算ＥＣ５０を健常(丸、青色)および損傷(四角、赤色)心筋細胞で比較した。
【０４８１】
図３Ｂは、２２二重特異性タンパク質の対数尺度での有効性シフトを示す。フィットＥＣ５０値を、健常(黒丸)および損傷(黒三角)心筋細胞の両方で示す。エラーバーは、パラメータの９５％信頼区間を表す。二重特異性タンパク質の各々の計算された有効性シフトを、健常および損傷用量応答曲線のフィットＥＣ５０値の比として取る(ＥＣ５０健常／ＥＣ５０損傷)。有効性シフトに注釈を付け、損傷状況シグナル伝達における増加倍率として表す。
【０４８２】
図３Ｃは、治療用二重特異性タンパク質７７６(ｓｃ７７６)および対応する非標的化対照タンパク質７７７(ｓｃ７７７)を使用する、健常および損傷心筋細胞におけるｐＡＫＴ(タンパク質キナーゼＢ)用量応答を記載するグラフ(底１０ログ濃度の関数でのシグナル伝達、nM)である。
【０４８３】
図３Ａと同様、Ｓｍａｒｔ増殖因子ｓｃ７７６および非標的化対照ｓｃ７７７の有効性を多能性幹細胞由来心筋細胞で測定し、シグナル伝達を、リン酸化Ａｋｔ蓄積により定量する。健常および損傷状況における用量応答曲線を３パラメータＥＣ５０活性化モデルにフィットさせる。ｓｃ７７６についてのシグナル伝達を、それぞれ健常(青色、黒丸)および損傷(赤色、黒四角)状況について記載する。ｓｃ７７７についてのシグナル伝達応答を、それぞれ健常(紫色、黒三角)および損傷(緑色、逆黒三角)状況について記載する。ｓｃ７７６の組成はＩＧＦ１(Ｅ３Ｒ／Ｙ３１Ａ)＿ｌｋ７＿ＨＳＡ(Ｃ５８Ｓ／Ｎ５２７Ｑ)＿ｌｋ７＿ＡｎｘＶ(Ｒ６３Ａ／Ｋ７０Ａ／Ｋ１０１Ａ／Ｅ１３８Ａ／Ｄ１３９Ｇ／Ｎ１６０Ａ／Ｃ３１６Ａ)である。非標的化対照ｓｃ７７７はＩＧＦ１(Ｅ３Ｒ／Ｙ３１Ａ)＿ｌｋ７＿ＨＳＡ(Ｃ５８Ｓ／Ｎ５２７Ｑ)からなる。図３Ｂにおけるとおり、損傷状況におけるシグナル伝達の特異性を、健常および損傷用量応答曲線のフィットＥＣ５０値の比として取る(ＥＣ５０健常／ＥＣ５０損傷)。非標的化、有効性低減分子ｃ７７７は有効性シフトを示さず、一方標的化、有効性低減分子ｃ７７６は、５７倍有効性シフトする。
【０４８４】
これらのデータは、ＩＧＦ−１のＰＳ標的化、有効性低減(ｗｔ  ＩＧＦ−１と比較して≧６倍有効性低減)バリアント(例えば、増殖因子７４３、７４１、７４０、７３９、７３３、７３２、７３１、７３０、７２９、７２８、７２７、７１６、７１３、７１１、６０６、７７６)が、ＡｎｘＶベースのターゲティングアーム付加により、損傷心筋細胞に健常心筋細胞を超える優先的(１０〜９２倍増加)シグナル伝達を示すことを示す。また、Ｎｒｇ１ａ(ＳＧＦ  ７５７)のＰＳ標的化、有効性低減(ｗｔ  Ｎｒｇ１ａと比較して約４倍有効性低減)バリアントは、ＡｎｘＶベースのターゲティングアーム付加により、損傷心筋細胞に健常心筋細胞を超える優先的(５倍増加)シグナル伝達を示す。ターゲティングアームを欠く対照融合タンパク質(例えば、増殖因子７０４、６０２、６８８、７０３)は、健常心筋細胞と比較して損傷心筋細胞における無視できる(≦２倍)優先的シグナル伝達を示し、損傷細胞における選択的シグナル伝達誘発におけるＰＳ選択的ターゲティングアームの重要性を提供する。さらに、標的化、非有効性低減二重特異性タンパク質(ｗｔ  ＩＧＦ−１と比較して＜２倍有効性低減)ＳＧＦ  ６４９も、健常心筋細胞と比較して損傷心筋細胞における無視できる(＜２倍)優先的シグナル伝達を示し、損傷細胞における選択的シグナル伝達誘発における有効性低減の重要性を提供する。
【０４８５】
実施例３：二重特異性タンパク質を使用するインビトロでのヒト心筋細胞における低酸素症誘発アポトーシスの減少
図４は、インビトロヒト心筋細胞低酸素症誘発アポトーシスアッセイにおける融合タンパク質ＳＧＦ  ７４０を使用するアポトーシスの減少を示す。
【０４８６】
Ｎ末端からＣ末端方向でＩＧＦ−１のバリアント(ＬＲ３、Ｙ３１Ａ)、７アミノ酸リンカーｌｋ７、ＨＳＡのバリアント(ｍＨＳＡ：Ｃ５８Ｓ、Ｋ４２０Ｅ、およびＮ５２７Ｑ)、７アミノ酸リンカーｌｋ７、およびアネキシンＡ５の非内部移行バリアント(ｎｉ−ＡｎｘＶ：Ｒ６３Ａ、Ｋ４０Ａ、Ｋ１０１Ａ、Ｅ１３８Ａ、Ｄ１３９Ｇ、Ｎ１６０Ａ)を含む二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０(配列番号８４)を、インビトロでその効果の評価に使用した。アポトーシスを、細胞を１％酸素で４８時間培養することにより誘導した。融合タンパク質ＳＧＦ  ７４０を、低酸素症期開始時に添加した。カスパーゼ活性を測定した。カスパーゼは、アポトーシスの一次メディエーターとして働くアスパラギン酸特異的、システインプロテアーゼのファミリーである。アポトーシスカスパーゼは、外因性または内因性細胞死シグナルを受け取ると、活性化される。
【０４８７】
０日目、iCell Cardiomyocytes(Cellular Dynamics, Inc、(ＣＤＩ)ヒト誘導型多能性幹(ｉＰＳ)細胞由来心筋細胞、catalog # CMC-100-010-001)を、標準プロトコールに従い解凍した。９６ウェルプレートを、前もって０.１％ゼラチンで１時間、３７℃で被覆した。細胞を１.５ｅ４細胞／ウェルで播種し、３７℃／７％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【０４８８】
２日目、培地をピペットで５回吸引および排出し、１００μL／ウェル温Maintenance Mediaに置き換えた。この時点で細胞を３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターに移した。このスイッチ後、細胞を実験の残り時間、３７℃／５％ＣＯ２に置いた。
【０４８９】
４日目、培地を新鮮Maintenance Mediaに置き換えた。
【０４９０】
７日目、低酸素症アッセイ培地(ＨＡＭ、ＤＭＥＭ無グルコース、無グルタミン、無フェノールレッド(Life Technologies, A14430-01)＋２mM  Ｌ−カルニチン、５mM  タウリン、５mM  クレアチン、１Ｘ非必須アミノ酸(Life Technologies, 11140-50)、１０mM  ＨＥＰＥＳ、１mM  ピルビン酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ(Life Technologies, 35050-061)、２.７５mM  Ｄ−(＋)グルコース、１Ｘリノール酸−オレイン酸−アルブミン(Sigma L9655))を新たに調製した。細胞を８０μL  ＨＡＭで２回洗浄して、Maintenance Mediaを置き換えた。１００μL  ＨＡＭを次いでプレートのウェルに添加し、プレートを、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターに２日置いた。
【０４９１】
８日目、培地を１００μL  新鮮ＨＡＭと置き換えた。
【０４９２】
９日目、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中の低酸素症チャンバーを１％Ｏ２に設定した。培地を新鮮ＨＡＭ(９０μL)で置き換えた。１０Ｘ濃縮ＳＧＦ(二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０)ストックをＨＡＭ(細胞に添加前滅菌濾過)中で調節した。１０μL  ＳＧＦまたはＨＡＭをウェルに添加した。低酸素症プレートを、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中の低酸素症チャンバーに、１％Ｏ２で４８時間置いた。正常酸素プレートを、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター(大気酸素で平衡化)に４８時間置いた。
【０４９３】
１１日目、サンプルを、カスパーゼ−３／７活性を測定するカスパーゼＧＬＯ  ３／７アッセイ(Promega)を使用して分析した。アッセイは、蛍光前駆体カスパーゼ−３／７  ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン基質および熱安定なルシフェラーゼを、カスパーゼ−３／７活性、ルシフェラーゼ活性および細胞溶解に最適化された試薬で使用する。試薬の添加は、細胞溶解、続く基質のカスパーゼ開裂をもたらす。これは遊離アミノルシフェリンを放出し、これはルシフェラーゼにより消費され、カスパーゼ−３／７活性に比例する発光シグナルを生じる。
【０４９４】
図４は、対照サンプル[無低酸素症(すなわち、酸素正常状態)]および種々の濃度の二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０(３３０nM  二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０、５０nM  二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０、７.８nM  二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０、１.２nM  二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０、および０.１８nM  二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０)で処理した低酸素症サンプルにおけるカスパーゼ活性を示す。図４は、二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０が、インビトロで低酸素症により誘発されるカスパーゼ活性およびアポトーシスを有意に減少させる(ｐ≦０.０１)ことを示す。
【０４９５】
これらの結果は、二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０が、用量依存的方式でヒト心筋細胞における低酸素症誘発アポトーシスを有意に(ｐ≦０.０１)減少させることを示す。数濃度の二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０で、低酸素症誘発アポトーシスは、正常酸素(すなわち、無低酸素症)レベルまで減少する。この結果は、増殖因子がヒト心筋細胞における低酸素症誘発アポトーシス処置に有効であることを示す。
【０４９６】
実施例４：二重特異性タンパク質を使用するインビトロでの腎臓近位尿細管上皮細胞における低酸素症誘発細胞死の減少
二重特異性タンパク質増殖因子７４０、７２７、および７３４を、非標的化対照、ＳＧＦ  ７４６(配列番号１０９)と比較した低酸素症誘発細胞死アッセイにおける有効性の評価に使用した(図５)。二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７４０(配列番号８４)は、Ｎ末端からＣ末端方向でＩＧＦ−１のバリアント(ＬＲ３、Ｙ３１Ａ)、７アミノ酸リンカーｌｋ７、ＨＳＡのバリアント(ｍＨＳＡ：Ｃ５８Ｓ、Ｋ４２０Ｅ、およびＮ５２７Ｑ)、７アミノ酸リンカーｌｋ７、およびアネキシンＡ５の非内部移行バリアント(ｎｉ−ＡｎｘＶ：Ｒ６３Ａ、Ｋ４０Ａ、Ｋ１０１Ａ、Ｅ１３８Ａ、Ｄ１３９Ｇ、Ｎ１６０Ａ)を含む。二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７２７(配列番号７６)は、Ｎ末端からＣ末端方向でＩＧＦ−１のバリアント(ＬＲ３−Ｒ３７Ｘ−３Ｘ)、４０アミノ酸リンカーｌｋ４０、ヒト血清アルブミンバリアントｍＨＳＡ  半減期モジュレーター、４０アミノ酸リンカーｌｋ４０、およびアネキシンＡ５を含む。二重特異性タンパク質ＳＧＦ  ７３４(配列番号１０８)は、Ｎ末端からＣ末端方向でＩＧＦ−１のバリアント(ＬＲ３、Ｙ２４Ｌ／Ｙ３１Ａ)、７アミノ酸リンカーｌｋ７、ＨＳＡのバリアント(ｍＨＳＡ７：Ｃ５８Ｓ、Ｋ４２０Ｅ、およびＮ５２７Ｑ、Ｅ５０５Ｇ、Ｖ５４７Ａ)、７アミノ酸リンカーｌｋ７、およびアネキシンＡ５の非内部移行バリアント(ＡｎｘＶ(ｎｉ)：Ｒ６３Ａ、Ｋ４０Ａ、Ｋ１０１Ａ、Ｅ１３８Ａ、Ｄ１３９Ｇ、Ｎ１６０Ａ)を含む。非標的化対照ＳＧＦ  ７４６は、Ｎ末端からＣ末端方向でＩＧＦ−１のバリアント(ＬＲ３、Ｙ３１Ａ)、７アミノ酸リンカーｌｋ７、およびＨＳＡのバリアント(ｍＨＳＡ：Ｃ５８Ｓ、Ｋ４２０Ｅ、およびＮ５２７Ｑ)を含む。
【０４９７】
０日目、ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞(ATCC, PCS-400-010)を、９６ウェルプレートで、完全培地(Renal Epithelial Cell Basal Medium、Renal Epithelial Cell Growth kit、１０単位／mLペニシリン、１０μg／mL  ストレプトマイシン、１０μg／mL  ゲンタマイシン、０.２５μg／mL  アンホテリシンＢ、ＡＴＣＣ)中、１０,０００細胞／ウェルで播種した。滅菌水を、端のウェルに添加した。
【０４９８】
２日目、ウェルをＰＢＳで洗浄し、培地を、低血清培地(Renal Epithelial Cell Basal Medium、０.５％ＦＢＳ、５μg／ml  トランスフェリン、２.４mM  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン(１０単位／mLペニシリン＋１０μg／mL  ストレプトマイシン))、１００μL／ウェルに変えた。５時間後、細胞を、２.５mM  ＣａＣｌ２含有培地(または対照として低血清培地)中、種々の濃度(５nM、５０nM、５００nM、または２.５nM、２５nM、２５０nM)の、二重特異性タンパク質増殖因子７４０、７２７、７３４、または非標的化対照タンパク質ＳＧＦ  ７４６で処理した。２５μLの５Ｘ濃度サンプルを添加し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで１時間インキュベートした。
【０４９９】
ＳＧＦで１時間前処理後、細胞を嫌気性パウチ(Indicator含有GasPak EZ Anaerobe Pouch System, BD 260683)に入れ、低酸素症を誘発し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターに入れるかまたは３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中正常酸素(すなわち、大気酸素で平衡化)に置いた(対照として)。細胞を１８時間インキュベートした。
【０５００】
３日目、細胞をフローサイトメトリーのために採取した。培地および浮遊細胞を吸引し、Ｖ底プレートに移した。細胞を２０μL／ウェルＰＢＳで洗浄した。３０μL／ウェルトリプシン／ＥＤＴＡを一次細胞(ATCC PCS-999-003)に添加した。プレートを、３７℃インキュベーターに１０分戻した。
【０５０１】
細胞を、プレートの軽打により除去した。３０μL／ウェルトリプシン中和溶液を添加して、細胞を採取し、細胞をＶ底プレートに移した。プレートを、７００ｇで４℃、５分遠心分離した。上清を除去し、細胞を１００μL／ウェルで再懸濁した。細胞をＰＢＳ＋０.０２％ＥＤＴＡ(０.５mM  ＥＤＴＡ)で洗浄し、何らかの結合二重特異性タンパク質を除去した。ＡｎｘＶ−ＦＩＴＣ染色溶液(ヨウ化プロピジウム(ＰＩ)含有)を調製した；０.３μg／mL  ＡｎｘＶ−ＦＩＴＣ(２３０μg／mLストックから７６６.６Ｘ希釈)＋１μg／mL  ＰＩ(１mg／mLストックから１０００Ｘ希釈)。プレートを、７００ｇで４℃、５分遠心分離した。上清を除去し、細胞を５０μL／ウェルＡｎｘＶ−ＦＩＴＣ染色溶液に再懸濁した。プレートを、１５分、室温でインキュベートした。２００μL／ウェルＡｎｘＶ結合緩衝液を細胞に添加した。細胞死を、フローサイトメトリーを使用してヨウ化プロピジウム陽性細胞のパーセントとして測定した。
【０５０２】
図５は、二重特異性タンパク質増殖因子７４０、７２７、および７３４が、ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞における低酸素症誘導細胞死を有意に減少させることを示す。非標的化対照タンパク質７４６は細胞死を減少させなかった。これらのデータは、標的化二重特異性増殖因子がヒト腎臓近位尿細管上皮細胞における低酸素症誘発細胞死の処置に有効であり、一方非標的化タンパク質は有効ではないことを示す。
【０５０３】
実施例５：静脈内投与後の二重特異性タンパク質半減期比較
マウスにおける二重特異性タンパク質の半減期を、シングルコンパートメントモデルで計算した(図６)。ＳＧＦ  ７２７は、構造ＩＧＦ−１(ＬＲ３−Ｒ３７Ｘ−３Ｘ)−ｌｋ４０−ｍＨＳＡ−ｌｋ４０−ＡｎｘＶ(配列番号７６)を有し、二重特異性タンパク質７３９−７４３は基本構造ＩＧＦ−１＊(ＬＲ３)−ｌｋ７−ｍＨＳＡ−ｌｋ７−ＡｎｘＶ(ｎｉ)を有し、ここで、＊はＩＧＦ−１の有効性低減欠失または変異を示す。二重特異性タンパク質７５７は、構造Ｎｒｇ１ａ＿ｌｋ７＿ｍＨＳＡ＿ｌｋ７＿ｎｉ−ＡｎｘＶ(配列番号１１０)を有する。
【０５０４】
方法：
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス(８〜１２週齢)を秤量し、外側尾静脈を血管拡張させるためにヒートランプ下、５〜１０分温めた。動物をレストレイナーに入れ、尾をアルコールパッドで清潔にし、次いでＰＢＳ＋０.１％ＭＳＡ中製剤した１００μlのＳＧＦを４０nmol／mlで注射した。小体積(５〜１０μL)の血液を、投与１時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２６.５時間、２８時間、３１.５時間、３３.５時間、３５.７５時間、および５１時間後、採血チューブに外側尾静脈を切断後に採取した。各後続採取について、尾上に形成されたかさぶたを除去し、採血した。血液を採血後１０分凝血させ、１０,０００xgで１０〜１５分、４℃で回転させた。
【０５０５】
血液サンプル中のＳＧＦ濃度の分析を、捕捉および検出ＨＳＡのために設計されたＥＬＩＳＡを使用して実施した。アッセイプレート(３８４ウェルLIA High Binding, Greiner bio-one, REF 781074)を、ダルベッコＰＢＳで１：５０希釈した２０μL／ウェル交差吸着抗ＨＳＡ抗体(Bethyl Labs, A80-229A)で、一夜、４℃で被覆した。翌日、ウェルをＰＢＳ−Ｔ(ＰＢＳ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０)で３回洗浄した。次いで、プレートを８０μL／ウェル無タンパク質遮断緩衝液(Pierce, 37572)で、１〜２時間、室温(ＲＴ)で遮断し、同時に各ＳＧＦおよび血清サンプル(ＰＢＳ中２５ｘ、１００ｘ、４００ｘ,１６００ｘ、６４００ｘ希釈)について標準曲線を作製した。ウェルを、プレートウォッシャーを使用してＰＢＳ−Ｔ(ＰＢＳ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０)で３回洗浄し、各２０μlのサンプルまたは標準を適切なプレートウェルに添加し、プレートをAluminaSealで封し、２時間、ＲＴでシェーカー上でインキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔ(ＰＢＳ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０)で３回洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔで１：２５０００希釈した４０μL／ウェル交差吸着ヤギ抗ＨＳＡ−ＨＲＰ検出抗体(Bethyl labs, A80-229P)を添加した。プレートを、３０分、ＲＴで、シェーカープラットフォームで、遮光してインキュベートし、次いでプレートウォッシャーを使用してＰＢＳ−Ｔ(ＰＢＳ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０)で３回洗浄した。結合抗体を、Super Signal ELISA Pico化学発光基質製品 # 37069, Thermo(２０μl／ウェル)で検出した。プレート発光を、次いで、Tecan Infinite 200 Proで分析した。
【０５０６】
標準一または二コンパートメントＰＫモデルを、マウスにおける実験薬物−血清衰退データに対して、Simbiology MATLABソフトウェアプラットフォーム(Mathworks, Inc., Natick, MA)のために書かれたカスタムスクリプトを使用して較正した。較正を、指数誤差関数(exp)を伴う内臓非線形適合アルゴリズム(nlinfit)を使用して実施した。
【０５０７】
結果：
図６は、ｗｔ  ＩＧＦ−１、ｗｔ  Ｎｒｇおよび増殖因子７２７、７３９、７４０、７４１、７４３および７５７の計算半減期および崩壊速度を挙げる。値は、上記一コンパートメントモデルを使用するＭＡＴＬＡＢで決定した。ＩＧＦ−１ベースのＳＧＦの半減期は、ｗｔ  ＩＧＦ−１と比較して８.４５〜２４.６倍の範囲で伸びた。さらに、増殖因子は、ｗｔ  ＩＧＦ−１と比較して、２.１〜５.６６倍の範囲で崩壊速度が減少した。
【０５０８】
実施例６：マウスにおける血糖値に対するＩＧＦ−１ベースの二重特異性タンパク質の影響
ＩＧＦ−１の臨床適用は低血糖の危険性により限定され、それ故に、これらの半減期延長増殖因子の血糖値に対する影響を理解することが重要である。ある実施態様によると、二重特異性タンパク質の重要な利益は、効率的ターゲティングのための有効性低減ＩＧＦ−１シグナル伝達アームの存在のため、これらの分子は、低血糖に関してはるかに安全である可能性がある。
【０５０９】
アポトーシス細胞の表面に露出したホスファチジルセリン(ＰＳ)に結合するように設計されたインシュリン様増殖因子−１(ＩＧＦ−１)からなるシグナル伝達アーム、半減期調節アーム(ＨＬＭ)およびアネキシンＡ５(ＡｎｘＶ)ターゲティングアーム(ＴＡ)を含む二重特異性タンパク質を使用して、１６０nmol／kg用量で使用したときマウスの血糖値に対する影響を評価した。
【０５１０】
方法：
尾静脈注射およびグルコースモニタリング
２４〜２７ｇのマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ１(ｎ＝２／用量)を使用した。到着後３〜５日間、使用前に動物収容施設に慣れさせた。動物は、餌および水を、これらの高用量が危険な低血糖をもたらす可能性があるまで、自由に利用させた。
【０５１１】
実験の日、タンパク質用量を、担体タンパク質としての０.１％マウス血清アルブミン(ＭＳＡ)と共にＰＢＳ中に調製した。総注射体積は１００μlであった。
【０５１２】
動物を、血管拡張させ、尾静脈を見つけやすくするために、注射前５〜１０分ヒートランプで温めた。
【０５１３】
動物を適切なレストレイナーに拘束し、尾を滅菌アルコールティッシュで清潔にし、一用を外側尾静脈に注射した。
【０５１４】
最初の採取のために、尾およびかみそりの刃をエタノールティッシュで滅菌した。小量の血液(２〜３μL)をグルコース試験紙に適用した(Abbott, AlphaTrak2 Glucose Meter、犬用設定)。
【０５１５】
その後の採取について、尾上に形成されたかさぶたを除去し、採血し、グルコース測定を繰り返した。
【０５１６】
結果：
図７ａは、標的化有効性低減二重特異性タンパク質(増殖因子７２７(配列番号７６)、７３９(配列番号８３)、７４０(配列番号８４)、７４１(配列番号８５)および７４３(配列番号８６))投与後のマウスにおける血糖値の経時変化を、血液濃度のグルコースmg／dLとして示す。マウスに、組み換えヒト血清アルブミン、ＩＧＦ１(ＬＲ３バリアント)、または対照として非有効性低減、非標的化、半減期延長増殖因子(タンパク質６８８：ＩＧＦ１(ＬＲ３−Ｒ３７Ｘ−３Ｘ)−Ｆｃ)を投与した。これらのデータは、標的化、有効性低減二重特異性タンパク質(増殖因子７２７、７３９、７４０、７４１および７４３)が、非標的化、非有効性低減、半減期延長増殖因子(タンパク質６８８)およびＩＧＦ１(ＬＲ３)と比較して、低血糖に関して非常に改善された安全性プロファイルを有することを示す。有効性低減二重特異性分子を受けた動物は低血糖(＜７０mg／dLとして規定)を経験せず、一方ＩＧＦ１(ＬＲ３)または非有効性低減、半減期延長増殖因子６８８を受けた動物は、この用量レベルで低血糖を経験する。ＩＧＦ１(ＬＲ３)投与が原因の血糖低下は、ＩＧＦ１(ＬＲ３)の極めて短い(約０.２時間)半減期のため、ＳＧＦ  ６８８よりも一時的であった(すなわち、３時間までに回復が見られる)ことは注意すべきであった。図７ｂは、ＳＧＦ有効性(最大半量ｐＡＫＴレベルを達成するのに必要な濃度として定義、すなわち、ｐＡＫＴ  ＥＣ５０)対３時間血糖曲線下面積(ＡＵＣ)の相関を示す。このグラフは、大きな有効性低減(すなわち、ｐＡＫＴ  ＥＣ５０増加)が３時間血糖ＡＵＣ増加(すなわち、血糖減少低減)に至ることを示す。
【０５１７】
ＩＧＦ−１ベースの増殖因子により誘発される低血糖に対する患者応答は、高度に不均一である可能性があり、これらのデータは、特に慢性処置が必要である可能性がある適応について、ｗｔ  ＩＧＦ１または非標的化、非有効性低減、半減期延長ＧＦの高用量は、重篤な安全性リスクを引き起こすことを示唆する。これらの結果は、標的化分子の作製のための有効性の考察の重要性を強調する。ある実施態様によると、非標的細胞に対する有効性が低減された標的化分子および目的の標的分子を含む細胞に対する有効性増強は、天然のまたは単純な半減期延長ＧＦよりはるかに望ましい安全性プロファイルを有する可能性がある。
【０５１８】
実施例７：健常および虚血性ラット組織における二重特異性タンパク質のシグナル伝達レベルの分析
ここに記載する二重特異性タンパク質が、虚血性傷害後の心臓においてどのようにシグナル伝達するかを分析するために、急性心筋梗塞(ＡＭＩ)のラット虚血／再灌流(Ｉ／Ｒ)モデルにおける健常および損傷組織のシグナル伝達(ＡＫＴのリン酸化)を、１)媒体(ＰＢＳ＋０.１％マウス血清アルブミン)、２)ｗｔ  ＩＧＦ１(RnD Systems)、３)非標的化、非有効性低減対照タンパク質(６８８、ＩＧＦ１(ＬＲ３−Ｒ３７ｘ−３ｘ)＿ｌｋ４０＿Ｆｃ、配列番号７２)、および４)標的化、有効性低減二重特異性タンパク質(ＳＧＦ  ６０６、ＧＦ１(ＬＲ３−Ｒ３７ｘ−３ｘ)＿ｌｋ４０＿ｍＨＳＡ＿ｌｋ４０＿ＡｎｘＶＣ３１６Ｓ＿ｌｋ８＿Ｈｉｓ６、配列番号７０)の４試験化合物を使用して評価した、図８参照。
【０５１９】
試験化合物を、再灌流時に静脈内投与により１６nmol／kgで投与し、組織を再灌流２時間後分析のために採取した。時間および用量は、健常マウスの心臓における６時間の時間にわたるここに記載する二重特異性タンパク質の薬力学に基づき選択した。これらのデータに基づき、この用量および時点は、損傷心臓における好都合な薬力学シグナルを有する二重特異性タンパク質の同定を可能にすると判断された。
【０５２０】
方法：
組織採取
１時間の虚血続く再灌流および即時の媒体、ＩＧＦ−１またはＳＧＦ用量の静脈内(尾静脈)注射のラットＩ／Ｒ手術を実施した。２時間の再灌流後、動物をイソフルランで麻酔し、組織採取中ノーズコーンからの深麻酔下に維持した。胸腔を開け、右心房を剥離鋏でつまみ、動物を左心室尖部をとおして１５〜２０ml  ０.９％ＮａＣｌで灌流し、循環系および血液がよく灌流する組織を浄化した。心臓を摘出し、心組織をかみそりまたはミクロトーム刃で横方向に分割し、尖部、中央部、上部および基底部の４切片に切断した。中央部切片はわずかに右心室を有し、大部分左心室からなり、最大量の梗塞を含み、これは、しばしばその蒼白によりわずかに可視であった。健常組織(遠隔切片)を、梗塞および境界ゾーン(梗塞切片)を含む領域から注意深く切り離し、各組織片を遠隔および梗塞とラベルした別々のチューブに入れた。
【０５２１】
組織均質化
約２：１比μL緩衝液：mg組織(例えば、３００mg組織について６００μL緩衝液使用)中のＲＩＰＡ緩衝液＋プロテアーゼ(Roche Complete)およびホスファターゼ阻害剤(Roche PhosSTOP)を、心組織サンプル含有チューブに添加した。組織をマイクロ剪刀で細分化し、ビーズ均質化を促進した。１.６mmステンレス鋼ビーズを、１：１組織重量：ビーズ重量で添加した。サンプルを８の速度に設定したBullet Blenderに、４分載せ、次いで１分桑折に戻した。サンプルを４℃で最大速度で１分、次いで１５分、１４,０００rpmで回転させた。１μLの上清を除去し、５９μLまたは１１９μL  ＰＢＳと合わせてＢＣＡアッセイを実施した。タンパク質濃度を、デュプリケートでＢＣＡにより測定した。
【０５２２】
ＰＤアッセイ(ｐＡＫＴ  ＥＬＩＳＡ)
プロトコール：
１日目、３８４ウェル平白色プレート(LIA High Binding (Greiner bio-one, REF 781074)をＰＢＳ中１：２５０希釈した２０μL／ウェル抗Ａｋｔ捕捉抗体(クローンＳＫＢ１、Millipore)で被覆した。
【０５２３】
２日目、組織を氷上で解凍した。ＥＬＩＳＡプレートを８０μL／ウェル０.０５％ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡプレートを、５０μL／ウェル２％ＢＳＡ／ＰＢＳで、１時間、室温で遮断した。組み換えヒト活性Ａｋｔ標準曲線を、９６ウェルプレート(非結合表面(ＮＢＳ)Corningプレート)でＰＢＳ中１４.４４％ＲＩＰＡに調製した。ｒｈ活性Ａｋｔ１／ＰＫＢα(Millipore)を、９１６５ng／mLに２００倍希釈した。遮断後、ＥＬＩＳＡプレートを、プレートウォッシャーを用いてＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。２０μL／ウェルサンプルまたは標準を準備プレートから添加し、２時間、室温でインキュベートした。抗ホスホＡｋｔ検出抗体を調製した。組織ライセートのための非ビオチニル化ウサギ抗ＡＫＴ  ｍＡｂ、Cell Signalingを２％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで１：１０００希釈した。ＥＬＩＳＡプレートを、８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２０μL／ウェル希釈抗ホスホＡｋｔ検出  Ａｂを添加し、プレートを２時間、室温でインキュベートした。二次検出抗体：抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰ  Ａｂ(ＣＳＴ  ７０７４)を、２％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで１：１０００希釈した。ＥＬＩＳＡプレートを８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２０μL／ウェル希釈二次検出試薬を添加し、プレートを３０分、室温で振盪させながらインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、８０μL／ウェル０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。検出を２０μl／ウェルSuper Signal ELISA Pico化学発光基質(Thermo)で実施した。プレートを１分振盪し、発光をプレートリーダーで読んだ。
【０５２４】
結果
データを図８に示す。全例で、対照媒体投与動物は、治験間の比較のためのベースラインとして作用した。示す全データについて、ＳＧＦ投与動物の遠隔または梗塞心組織からのホモジネートにおけるｐＡＫＴレベルは、それぞれ媒体投与(ＰＢＳ−ＭＳＡ)遠隔または梗塞組織ホモジネートに対して正規化されている。従って、各ＳＧＦのデータは、各組織領域についてｐＡＫＴレベルの媒体投与動物を超える“増加倍率”として示す。
【０５２５】
各地検について、データを分析して、対サンプルとして遠隔および梗塞組織を処理することにより、同じ動物内の遠隔組織または梗塞組織における相対的ｐＡＫＴレベルを比較した。二元配置ＡＮＯＶＡ、続くSidak多重比較検定を実施した。
【０５２６】
データは、ｗｔ  ＩＧＦ−１を投与された動物からの組織におけるｐＡＫＴレベルが、投与２時間後の遠隔または梗塞組織において、媒体投与動物を超えて有意に増加しなかったことを示し、ｗｔ  ＩＧＦ−１が投与後２時間、増加ｐＡＫＴレベルを維持することが不可能であることを示唆する。半減期延長、非標的化、非有効性低減ＳＧＦ(６８８、配列番号７２)は、投与２時間後媒体と比較して遠隔および梗塞両方の組織においてｐＡＫＴレベルを増加させ、非標的化、半減期延長ＧＦは、少なくとも投与後２時間ｐＡＫＴレベルを非選択的に(すなわち、遠隔および梗塞両方の組織)増加できることを示す。対照的に、標的化、有効性低減ＳＧＦ(６０６)は、投与２時間後梗塞組織でのみ選択的ｐＡＫＴ上昇をでき、ＳＧＦ  ６０６はこの同じ時点で遠隔組織に有意なｐＡＫＴ上昇をもたらさない(媒体と比較して)。遠隔領域よりも梗塞領域で表面ホスファチジルセリンに曝されるアポトーシス細胞が相当多いため、これらのデータは、標的化、有効性低減増殖因子が標的含有組織(例えば、梗塞組織)において選択的にシグナル伝達し、重要なことに、標的を含まない組織(例えば遠隔組織)においてシグナル伝達しないことを示す。これらの結果は、損傷心筋細胞に対するインビトロ選択性が、損傷心組織におけるインビボ選択性に反映されることを示す(ＳＧＦ  ６０６が非アポトーシス細胞と比較してアポトーシス細胞で選択性が２２倍増加することを示す図３と、同じ分子(ＳＧＦ  ６０６)の梗塞心組織における選択的シグナル伝達を示す、図８におけるデータとの対比参照)。
【０５２７】
実施例８：ラット虚血／再灌流モデルにおける有効性低減、標的化ＨＳＡベースのＳＧＦ  ６０６の有効性
ここに記載する二重特異性タンパク質が、虚血性傷害後の組織損傷をどのように阻止するかを分析するために、急性心筋梗塞(ＡＭＩ)のラット虚血／再灌流(Ｉ／Ｒ)モデルにおける梗塞／リスク領域(ＡＡＲ)を、１)媒体(ＰＢＳ＋０.１％マウス血清アルブミン)、２)ｗｔ  ＩＧＦ１(RnD Systems)、３)標的化、有効性低減ＳＧＦ(６０６、ＧＦ１(ＬＲ３−Ｒ３７ｘ−３ｘ)＿ｌｋ４０＿ｍＨＳＡ＿ｌｋ４０＿ＡｎｘＶＣ３１６Ｓ＿ｌｋ８＿Ｈｉｓ６、配列番号７０)の３試験化合物を使用して評価した、図９Ａ〜Ｃ参照。
【０５２８】
治験デザインを図９Ａに示す。７２時間の再灌流後、動物を屠殺し、組織を主要エンドポイントとして梗塞／リスク領域(ＡＡＲ)分析のために採取した。
【０５２９】
方法：
手術
急性心筋梗塞(ＡＭＩ)を、次の外科的虚血／再灌流(Ｉ／Ｒ)プロトコールにおいて左冠動脈を一過性にライゲートすることによりラットにおいて誘導した。雄ＣＤ  ＩＧＳ(２００〜３００ｇ)ラットを、順応させるため試験少なくとも７２時間前に到着するように発注した。全外科的器具を、各手術時間前にオートクレーブした。器具チップを、各動物の間、アルコールに浸し、アルコールガーゼパッドで綺麗にぬぐい、ガラスビーズ滅菌器に入れて、浄化した。動物をケタミン／キシラジンカクテル(各８０〜１００mg／kgおよび５〜１０mg／kg)で麻酔し、視線誘導下カテーテルを挿管し、人工呼吸器(７０〜８５ＢＰＭ、一回換気量＝１０ml／kg)に置いた。動物を、手術中体温維持のために、右側臥位で、水循環加熱パッド上に置いた。電極を動物の肢に設置し、虚血と関連するＥＣＧ変化をモニターした。ブプレノルフィン(０.１mg／kg)を皮下投与した。通常食塩水(５ml  ＳＣ)での標準補液療法を提供した。
【０５３０】
手術部位の毛を剃り、アルコールおよびベタジンで浄化した。麻酔の適切な外科的水準が確認されたら、動物の左側の第４〜第５肋間間隙にわたり皮膚切開した。根底の筋肉を無遠慮に切開して、肋間筋を露出させた。ブピバカイン(０.２５％、０.２ml)を、切開部位に添って皮下投与した。次に、肋骨開大器を注意深く設置して、心臓を見えるようにした。心膜を開け、左心耳を穏やかに縮める、縫合糸(絹またはProlene、サイズ６−０または７−０)を左冠動脈(ＬＣＡ)周囲に、その開始点から約１mm置いた。縫合糸を滅菌ポリエチレンチューブ上で結紮し、６０分維持した。適切な閉塞を、心筋の白化およびＥＣＧ波形の虚血性変化(すなわちＳＴ上昇)により確認した。心室細動が示されたら、心臓を穏やかにマッサージして、正常リズムを回復させた。虚血時間後、チューブを除去し、縫合糸を緩めて再灌流させた。その直後、尾を温め、担体タンパク質として０.１％血清アルブミンを含む総体積２００μl  ＰＢＳに懸濁した試験品(媒体、対照または増殖因子)を、外側尾静脈からの１回静脈内注射で投与した。胸壁を４−０vicryl縫合糸(胸壁および筋肉を通る１層)で閉じた。皮膚創傷を創傷クリップまたは適当な皮膚縫合で閉じ、注意深く死腔を最小化した。動物を、麻酔が切れ始めて気づき始めたとき、人工呼吸器から離した。その後、通常の歩行および探索行動を示すまで、温かい回復ユニットに移した。ブプレノルフィン(０.１〜０.２mg／動物)を、手術後最大５日間補助的軟餌に投与し、必要に応じて新しくした。追加的酸素を回復ユニットに供給してよい。次いで、動物を清潔なケージに入れ、動物室に戻した。動物は、屠殺するまで餌および水を自由に利用できた。
【０５３１】
組織採取
組織採取時、動物を５％イソフルランで深麻酔し、胸腔を開いた。動物を１０〜２０ml食塩水で灌流し、１〜２mlの２％エバンスブルーを左心室に注射した。次いで心臓をガーゼで乾燥させ、５分、−８０℃で短く凍結させた。次いで、心臓を横方向に約２mm切片に、ラット心臓スライサーを使用して切片化した。次いでこれらの切片を１％ＴＴＣ中、３７℃で１５〜２０分インキュベートし、画像分析のために両側をデジタルカメラで撮影した。
【０５３２】
画像分析
画像を、コンピューター利用画像分析を使用して分析した。
【０５３３】
結果：
結果を、Prismで実施した一元配置ＡＮＯＶＡとテューキー多重比較検定を使用して分析した。外科手技により作製した傷害サイズにおいて、左心室(ＬＶ)の面積に関して、何れかの群間で同等なサイズのリスク領域(ＡＡＲ)により示されるとおり有意差はなかった。図９Ｂおよび図９Ｃは、ＩＧＦ−１およびＳＧＦ  ６０６の両方が、予想どおり、媒体対照投与動物と比較して、梗塞サイズを有意に減少できたことを示す。結果は、ＳＧＦ  ６０６が、ｗｔ  ＩＧＦ１よりも有意な梗塞／ＡＡＲ減少をもたらすことを示し、標的化、有効性低減ＳＧＦ(例えばＳＧＦ  ６０６)が梗塞サイズ減少にｗｔ  ＩＧＦ１より効果的であることを示す。
【０５３４】
ここに記載する実施例および実施態様は説明の目的のためのみであり、それを考慮した種々の修飾または変化が、本出願の精神および権限内および添付する特許請求の範囲の範囲内に含まれることは理解される。ここに引用する全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のために、全体として引用により本明細書に包含させる。
【０５３５】
引用による取り込み
ここに記載する全ての刊行物、特許および配列データベースエントリーは、各個々の刊行物または特許が具体的におよび個々に引用により包含されることが示されているのと同様、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
2022002528.tif 000013
【図２Ａ】
2022002528.tif 000014
【図２Ｂ】
2022002528.tif 000015
【図３Ａ】
2022002528.tif 000016
【図３Ｂ】
2022002528.tif 000017
【図３Ｃ】
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【図４】
2022002528.tif 000019
【図５】
2022002528.tif 000020
【図６】
2022002528.tif 000021
【図７】
2022002528.tif 000022
【図８】
2022002528.tif 000023
【図９】
2022002528.tif 000024
【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年10月6日(2021.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書および図面に記載された発明。
【外国語明細書】
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