(57)【要約】【課題】蛋白質の発現量を増大させる。【解決手段】蛋白質の遺伝子を発現可能に宿主に組み込み、組換蛋白質を発現させる方法において、組換蛋白質のカルボキシル末端領域（全アミノ酸領域のカルボキシル末端から３０％以内）に相当する遺伝子部分を改変削除することで、タンパク質の特性を保持しつつタンパク質の発現量を増大させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質の遺伝子を発現可能に宿主に組み込み、組換蛋白質を発現させる方法において、組換蛋白質のカルボキシル末端領域（全アミノ酸領域のカルボキシル末端から３０％以内）に相当する遺伝子部分を改変削除することで、タンパク質の特性を保持しつつタンパク質の発現量を増大させる方法。
【請求項２】
蛋白質が超好熱性細菌由来の耐熱性蛋白質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
未改変蛋白質が該宿主中でインクルージョンボディを形成するものであり、カルボキシル末端領域の改変削除後の蛋白質が宿主中でインクルージョンボディを形成しないものである請求項１又は２に記載の方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質のカルボキシル末端領域（全アミノ酸領域のカルボキシル末端から３０％以内）のアミノ酸の一部を、遺伝子を改変して削除することで、蛋白質の性質を変えることなく目的蛋白質を、適当な宿主で大量発現させる技術である。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】
従来、組換蛋白質の発現は、遺伝子配列の開始コドンから終止コドンをすべて発現ベクターに組み込み、適当な宿主で蛋白質を発現させることを行なっていた。しかし、従来の組換蛋白質の発現は、宿主およびベクターの種類により、発現量が少なかったりインクルージョンボデーになったりして、十分な蛋白質量が得られなかった場合があった。
【０００３】
本発明は、蛋白質の活性、安定性等の特性を低下させることなく組換蛋白質の発現量を増大させることを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の方法に関する。
項１．　蛋白質の遺伝子を発現可能に宿主に組み込み、組換蛋白質を発現させる方法において、組換蛋白質のカルボキシル末端領域（全アミノ酸領域のカルボキシル末端から３０％以内）に相当する遺伝子部分を改変削除することで、タンパク質の特性を保持しつつタンパク質の発現量を増大させる方法。
項２．　蛋白質が超高熱性細菌由来の耐熱性蛋白質である項１に記載の方法。
項３．　未改変蛋白質が該宿主中でインクルージョンボディを形成するものであり、カルボキシル末端領域の改変削除後の蛋白質が宿主中でインクルージョンボディを形成しないものである項１又は２に記載の方法
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の発現対象となる蛋白質は、改変削除前の蛋白質の宿主細胞中での発現効率が低いものであり、例えば宿主細胞中でインクルージョンボディを形成するものが挙げられる。
【０００６】
本発明において、蛋白質を「改変削除する」とは、蛋白質のＣ末端の配列を削除して蛋白質の長さを短くするか、或いは、Ｃ末端のアミノ酸の削除と置換を組み合わせて行い、蛋白質のＣ末端部分の配列を短くすると同時にアミノ酸配列を一部改変することの両方を包含する。
【０００７】
本発明において、カルボキシル末端領域のアミノ酸改変削除に関しては、削除することで発現量増大効果のあるアミノ酸種としては、プロリン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニンが挙げられ、特にプロリンが例示される。これらのアミノ酸がＣ末端に多く存在する場合、該アミノ酸を改変削除、特に削除することにより、発現量の増大効果が得られる。
【０００８】
改変置換の対象となる組み換え蛋白質のカルボキシル末端領域は、全アミノ酸領域のカルボキシル末端から３０％以内、好ましくは２５％以内、より好ましくは２０％以内である。また、削除されるアミノ酸の割合は蛋白質の３０％以下、好ましくは１〜２０％程度であり、削除されるアミノ酸の数としては、１〜１００個、好ましくは３〜５０個、より好ましくは５〜３０個である。アミノ酸の改変（置換）に関しては、適宜行うことができる。
【０００９】
宿主としては、大腸菌、枯草菌、カビ、酵母等が例示され、好ましくは大腸菌が例示される。
【００１０】
発現対象の蛋白質としては、超高熱性菌由来の蛋白質が好ましく例示される。これは、超高熱菌由来の耐熱性蛋白質においては、大腸菌等の宿主細胞で発現させた場合、十分な発現量が得られない場合が多いからである。超高熱菌としては、６０℃以上、好ましくは７０℃以上、より好ましくは８０℃以上の温度で生育できる菌が例示され、より具体的には硫黄代謝高熱性古細菌　パイロコッカス、ホリコシ（登録番号ＪＣＭ９９７４）が例示される。
【００１１】
以下に、硫黄代謝高熱性古細菌　パイロコッカス、ホリコシ（登録番号ＪＣＭ９９７４）の蛋白質、エンドグルカネース場合を例に取り、本発明をより具体的に説明する。
【００１２】
本超高熱性細菌の遺伝子配列から本酵素活性を示すと思われる遺伝子（開始コドンから終止コドン全て）を発現ベクターに組み込み、ＰＣＲ反応で増幅し抽出した後、蛋白質発現プラスミドｐＥＴ　１１ａに挿入、そのプラスミドを大腸菌に組み込み、本酵素（エンドグルカネース）の生産を行うことができる。生産された酵素は加熱処理およびカラムクロマトグラムで単離精製できる。精製された本酵素には、カルボキシメチルセルロースの加水分解活性が確認された（活性は、カルボキシメチルセルロースを基質として、ソモギーネルソン法で、加水分解後生じる還元性末端を定量することから検出した）。この酵素１００　ｍＭ酢酸（ｐＨ　５．６）緩衝液中、９７℃で数時間処理しても、活性の低下が見られなかった。さらに、活性の至適ｐＨは５．６で、至適温度はｐＨ５．６　で９７℃以上であった。しかし、遺伝子配列の開始コドンから終止コドンをすべて発現ベクターに組み込みこんだ場合、殆どの蛋白質がインクルージョンボデーとなった。そこで、カルボキシル末端から４４残基のアミノ酸を削除した遺伝子を構築して、本酵素を大量に発現させることに成功した。
【００１３】
【発明の効果】
本発明により、反応の至適温度が９７℃以上である耐熱性エンドグルカネースを大腸菌を使用して大量に発現生産できる。さらに、本発明により、種々の組換蛋白質を種々のベクターおよび宿主（大腸菌、枯草菌、カビ、酵母等）を使用して大量に生産することが可能になる。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
（実施例１）（菌の培養）
ＪＣＭ９９７４は次の方法で培養した。
【００１５】
１３．５ｇの食塩、４ｇのＮａ２ＳＯ４，　０．７　ｇのＫＣｌ，　０．２ｇ　のＮａＨＣＯ３　、０．１ｇのＫＢｒ、３０　ｍｇのＨ３ＢＯ３、１０ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｇ　のＣａＣｌ２　、２５ｍｇのＳｒＣｌ２、１．０ｍｌのレザスリン溶液（０．２ｇ／Ｌ），１．０ｇの酵母エキス、５ｇのバクトペプトンを１Ｌに溶かし、この溶液のｐＨを６．８に調整し加圧殺菌した。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を０．２％となるように加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性とした後、ＪＣＭ９９７４を植菌した。培地が嫌気性となったか否かはＮａ２Ｓ溶液を加えて、培養液中でＮａ２Ｓによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を９５℃で２〜４日培養し、その後遠心分離し集菌した。
（実施例２）染色体ＤＮＡの調整
ＪＣＭ９９７４の染色体ＤＮＡは以下の方法により調製した。培養終了後５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を集菌する。菌体を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ　７．５）−１ｍＭ　ＥＤＴＡ　溶液で２回洗浄後ＩｎＣｅｒｔ　Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣ社製）ブロック中に封入する。このブロックを１％Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ−１ｍｇ／ｍｌ　プロテアーゼＫ溶液中で処理することにより、染色体ＤＮＡはＡｇａｒｏｓｅブロック中に分離調製される。
（実施例３）エンドグルカネース遺伝子の同定および発現プラスミドの構築
製品評価技術機構で同定されたエンドグルカネースをコードする遺伝子（図１）を二種類（開始コドンから終止コドン全て含んだものと、カルボキシル末端から４４残基のアミノ酸を削除したもの）をｐＥＴ−　１１ａにクローニングした。
【００１６】
前者は構造遺伝子領域のシグナル配列の直後に制限酵素（ＮｄｅＩ）　と構造遺伝子領域の終止コドンの直後に制限酵素（ＢａｍＨＩ）サイトを構築する目的でＤＮＡプライマー（５’−ＴＴＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡ−　３’及び５’−ＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＴ　ＡＡ−３’）を合成し、ＰＣＲでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。ＰＣＲ反応後、制限酵素（ＮｄｅＩ　とＢａｍＨＩ）で完全分解（３７℃で２時間）した後、その構造遺伝子を精製した。
【００１７】
後者は、構造遺伝子領域のシグナル配列の直後に制限酵素（ＮｄｅＩ）　と構造遺伝子領域の終止コドンから４４残基のアミノ酸を削るために終止コドンを　　（図に矢印で説明）の位置に挿入し、さらにその直後に制限酵素（ＢａｍＨＩ）サイトを構築する目的でＤＮＡプライマー（５’−ＴＴＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＴＡＣ　ＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡ−　３’及び５’−ＡＡＣＧＧＡＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴ　ＴＴＴＧＧＡＡＣＡＡＣＴＡＴＣ−３’）を合成し、ＰＣＲでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。ＰＣＲ反応後、制限酵素（ＮｄｅＩ　とＢａｍＨＩ）で完全分解（３７℃で２時間）した後、その構造遺伝子を精製した。
【００１８】
ｐＥＴ−　１１ａ、（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｄｅＩ　とＢａｍＨＩで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ４リガーゼで１６℃、２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部をＥ．　ｃｏｌｉ　ＸＬ２　Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’　のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミド２種類をアルカリ法で精製した。
（実施例４）組換え遺伝子の発現
大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ，　Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬ移す。その中に発現プラスミド溶液０．００５ｍＬを加え氷中に３０分間放置した後４２度でヒートショックを３０秒間行い、ＳＯＣｍｅｄｉｕｍ０．９ｍＬを加え、３７度で１時間振とう培養する。その後アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７度で一晩培養し、形質転換体を得た。
【００１９】
本形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地で６００ｎｍの吸収が０．６に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を加えさらに６時間培養した。培養後遠心分離（７，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）で集菌した。
（実施例５）耐熱性酵素の精製
２種類の蛋白質の調製を大腸菌を使用して行なった。集菌した菌体を１０倍量の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，　２０ｍｉｎ）し、上清を８５℃で３０ｍｉｎ加熱した後に、再度遠心分離（１８，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）し、上澄をＨｉＴｒａｐＱ（ファルマシア社製）カラムに吸着させ活性画分を得た。
（実施例６）得られた２種類の精製酵素の諸性質は、以下に示すように同じであった。
（１）至適ｐＨ
酵素活性の至適ｐＨの測定は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、１００ｍＭリン酸緩衝液および１００ｍＭホウ酸緩衝液でｐＨ４〜９までの基質（カルボキシメチルセルロース）０．５％溶液を調整し、８５℃で酵素の加水分解活性の初速度を測定することにより求めた。ｐＨ５．６〜６．０近傍で最大初速度が得られたため、最適ｐＨは５．６￣６．０と結論した。
（２）至適温度
基質として０．５％カルボキシメチルセルロースを使用し、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ　５．６）中に一定量の酵素を加えて３０分反応させ、相対活性を調べた。最大活性（至適温度）は９７℃以上であった。
（３）耐熱性
当該酵素溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）中、９７℃で３時間加熱後、温度を８５℃に低下させ残存活性を調べた。残存活性は８０％であった。
（実施例７）
各酵素遺伝子をコードするプラスミドを保持する大腸菌を、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含む１００ｍｌのＬＢ培地にて３７℃にて培養し、６００ｎｍにおける濁度が０．６になったところでＩＰＴＧを添加し、さらに５時間培養した。菌体を遠心分離（７，０００　ｒｐｍ，　５　ｍｉｎ）によって集菌し、得られた沈殿を、１０ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて、菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，　２０ｍｉｎ）し、上清を８５℃にて３０分間熱処理したのち、再度遠心分離１５，０００ｒｐｍ，　２０ｍｉｎ）することによって大腸菌由来のたんぱく質を沈殿させた。この上清を用いて、大腸菌からの酵素の発現量を１２．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた結果、後者は前者の約１００倍の発現量が確認された。
【００２０】
高温（１００℃以上）で生育する古細菌ＪＣＭ９９７４のゲノム解析データから、エンドグルカネースをコードすると思われる遺伝子が同定され、本酵素を大腸菌で大量に発現するために、活性に関与しないと思われるアミノ酸のカルボキシル末端領域の除去を行なった。その結果、本酵素の性質を換えることなく発現量を１００倍近く増大させることに成功した。
【００２１】
【配列表】
2004105130.tif 000002
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2004105130.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】耐熱性エンドグルカネースの遺伝子（アミノ酸）配列を示す。矢印からＣ末端側は削除された部分である。
【図２】耐熱性エンドグルカネースのアミノ酸配列。矢印からＣ末端側は削除された部分である。
【図１】
2004105130.tif 000011
【図２】
2004105130.tif 000012