(57)【要約】      （修正有）【課題】ジアステレオマーとして純粋な又は実質的にジアステレオマーとして純粋な活性化ホスホラミドクロリデートモルホリノヌクレオシド、それらの調製方法、及びジアステレオマーとして純粋なホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）の立体特異的合成のための立体特異的カップリングにおけるそれらの使用方法を提供する。【解決手段】例えば、下式の様に、ウラシルユニットを有すジアステレオマー混合物を液体クロマトグラフィーにて、それぞれ純粋な活性化ホスホラミドクロリデートモルホリノヌクレオシドを分離し、オリゴヌクレオチドの合成に用いる。2022003067.tif 000044【選択図】図１
2022003067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式２０の化合物、式２１の化合物、式２２の化合物、式２３の化合物、式２４の化合物、式２５の化合物、式２６の化合物、式２７の化合物、式２８の化合物、式２９の化合物、式３０の化合物、及び式３１の化合物からなる群から選択される、実質的にジアステレオマーとして純粋な化合物
【表１】
2022003067.tif 000042
2022003067.tif 000043
［式中、Ｒ１とＲ２は、同一であっても異なってもよく、−Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル、任意選択で置換されたフェニル、任意選択で置換されたナフチルからなる群から選択され、又はそれらが結合している窒素と共に、例えば、ピロリジン、ピペラジン、及びモルホリンであってもよい任意選択で置換された複素環を形成し、
Ｒ３は、これに限定されないが、ＭＭＴｒ（ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル）等を含む置換トリチルであってもよいトリチル（Ｔｒ）、任意選択で置換されたベンジル、４−メトキシベンジル（ＰＭＢ、ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジル、ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）、４−メトキシベンジル、及びスルホニルからなる群から選択され、
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、及び−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７からなる群から選択され、式中、Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ベンジル、２，２，２−トリクロロエチル、又はアリールであり、
Ｒ９は、任意選択で置換されたアルキル、シアノエチル、アシル、カルボネート、カルバメート、任意選択で置換されたベンジル、４−ピバロイルオキシベンジル、及びシリルからなる群から選択される］
及びそのエナンチオマー。
【請求項２】
前記スルホニルが、２−ニトロベンゼンスルホニル、４−ニトロベンゼンスルホニル、及び２，４−ジニトロベンゼンスルホニルからなる群から選択される切断可能なスルホニルである、請求項１に記載の実質的にジアステレオマーとして純粋な化合物。
【請求項３】
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、フェニル、４−メトキシフェニル、４−ブロモフェニル、及び４−ニトロフェニルからなる群から選択される、請求項１に記載の実質的にジアステレオマーとして純粋な化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の実質的にジアステレオマーとして純粋な化合物を反応させるステップを含む、立体化学的に純粋なオリゴヌクレオチドを調製するための方法。
【請求項５】
実質的に立体化学的に純粋な活性化モノマーを選択するステップ、及び
選択した実質的に立体化学的に純粋な活性化モノマーから実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマーを合成するステップ
を含む、実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマーを調製するための方法。
【請求項６】
前記オリゴマーが、キラルリン酸結合を含むオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
実質的に立体化学的に純粋な活性化モノマーを選択するステップの前に、活性化モノマーのジアステレオマー混合物を２つの実質的に立体化学的に純粋なモノマーに分離するステップを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマーが、少なくとも９０％ジアステレオマーとして純粋である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマーが、少なくとも９５％ジアステレオマーとして純粋である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマーが、少なくとも９９％ジアステレオマーとして純粋である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマーが、１００％ジアステレオマーとして純粋である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
実質的に立体化学的に純粋なホスホラミドクロリデートモノマーを選択するステップ、及び
選択した実質的に立体化学的に純粋なホスホラミドクロリデートモノマーから実質的にジアステレオマーとして純粋なホスホラミドクロリデートオリゴマーを合成するステップ
を含む、実質的にジアステレオマーとして純粋なホスホラミドクロリデートオリゴマーを調製するための方法。
【請求項１３】
実質的に立体化学的に純粋なホスホラミドクロリデートモノマーを選択するステップの前に、ホスホラミドクロリデートのジアステレオマー混合物を２つの実質的に立体化学的に純粋なホスホラミドクロリデートモノマーに分離するステップを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ジアステレオマー混合物の分離をクロマトグラフィー及び結晶化からなる群の少なくとも１つの方法によって行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ホスホラミドクロリデートオリゴマーがホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の実質的にジアステレオマーとして純粋な化合物を含む実質的にジアステレオマーとして純粋な組成物。
【請求項１７】
請求項２に記載の実質的にジアステレオマーとして純粋な化合物を含む実質的にジアステレオマーとして純粋な組成物。
【請求項１８】
請求項３に記載の実質的にジアステレオマーとして純粋な化合物を含む実質的にジアステレオマーとして純粋な組成物。
【請求項１９】
請求項４に記載の方法によって作製された実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマー。
【請求項２０】
請求項５に記載の方法によって作製された実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマー。
【請求項２１】
請求項６に記載の方法によって作製された実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマー。
【請求項２２】
請求項７に記載の方法によって作製された実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマー。
【請求項２３】
請求項８に記載の方法によって作製された実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマー。
【請求項２４】
請求項９に記載の方法によって作製された実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマー。
【請求項２５】
請求項１０に記載の方法によって作製された実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマー。
【請求項２６】
請求項１１に記載の方法によって作製された実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマー。
【請求項２７】
請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマー、又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年８月５日に出願された米国特許仮出願第６２／２０１，５１０号の優先権を主張するものである。その出願は、参照により本明細書に組み込まれている。
【分野】
【０００２】
幾つかの実施形態は、ホスホラミドクロリデートモルホリノサブユニットである、実質的にジアステレオマーとして純粋な活性化モノマーの調製に関連し得る。幾つかの実施形態は、立体特異的カップリング反応を介して分子を調製するための、実質的にジアステレオマーとして純粋な活性化リン酸化モルホリノモノマーの使用にも関連し得る。
【背景】
【０００３】
ジアステレオマーとして純粋なホスホロジアミデートオリゴヌクレオチドの合成は、キラルリン酸結合の存在によって相当複雑になる。これは、例えばキラルリン酸を有していないホスホジエステル結合とは対照をなす。ホスホジエステル、ホスホロチオエート（これはキラルリン酸も含む）、及びホスホロジアミデートを比較する図１中に幾つかの例を見ることができる。
【０００４】
キラルリン酸の存在は、一連のホスホロジアミデートヌクレオチドの結合に関する合成経路の相当な課題となる。ホスホロジアミデート結合の立体特異的形成を可能にする立体化学的に純粋な試薬（鋳型、サブユニット、構成単位）の欠如は、立体中心で生成化合物のリン酸キラル性を制御できない反応をもたらす。
【０００５】
図２中に図式的に示したように、任意の有意な長さと配列のオリゴヌクレオチドを調製するため、立体化学的に制御不能なカップリングにヌクレオチドのジアステレオマー混合物を使用することによって、多数のジアステレオマーの不均質混合物が生じる。ジアステレオマーの数は理論上２（ｎ−１）であり、前式でｎは結合してオリゴヌクレオチドを形成するヌクレオチドの数である。図２中に示したように、簡素な４ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（テトラヌクレオチド）でさえ、８個の別ジアステレオマーの混合物の形成をもたらす可能性がある。
【０００６】
相当数のジアステレオマーの形成によって、合成後の高感度分離技法が必要となる可能性がある。原材料を使用して望ましくない多くのジアステレオマーを調製することによって、所望産物の収率が悪影響を受ける可能性がある。
【０００７】
合成前に特異的ジアステレオマーを選択して、次いで立体化学的に純粋な又は実質的に純粋な形の選択ジアステレオマーを合成できることは有用であり得る。
【発明の概要】
【０００８】
幾つかの実施形態は、表１の立体化学的に純粋な又は実質的に立体化学的に純粋な化合物のうちの１つ又は複数を提供することができる。更なる実施形態は、表１の化合物のエナンチオマーを提供することもできる。典型的に、これらのエナンチオマーの立体化学的性質は、モルホリノ環の立体化学的性質の変化によって表１の化合物のそれとは異なる。
【０００９】
【表１】
2022003067.tif 000003
2022003067.tif 000004
【００１０】
Ｒ１とＲ２は、同一であっても異なってもよく、−Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル、任意選択で置換されたフェニル、任意選択で置換されたナフチルであってもよく、又はそれらが結合している窒素と共に、例えば、ピロリジン、ピペラジン、又はモルホリンであってもよい任意選択で置換された複素環を形成してもよい。
【００１１】
任意選択で置換された部分は、メチル、エチル、ハロゲン、ニトロ、メトキシ、又はシアノのうちの１つ又は複数で置換することができる。
【００１２】
Ｒ３は、これに限定されないが、ＭＭＴｒ（ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル）等を含む置換トリチルであってもよいトリチル（Ｔｒ）、任意選択で置換されたベンジル、４−メトキシベンジル（ＰＭＢ、ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジル、ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）、又は切断可能なスルホニルであってもよいスルホニルであってもよい。幾つかの実施形態では、スルホニルは、２−ニトロベンゼンスルホニル、４−ニトロベンゼンスルホニル、又は２，４−ジニトロベンゼンスルホニルである。
【００１３】
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、又は−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７であってもよく、式中、Ｒ７はアルキル（メチル、エチル、イソプロピル、又は他のＣ１〜Ｃ６アルキル）、ベンジル、２，２，２−トリクロロエチル、又はアリール（これらに限定されないが、フェニル、４−メトキシフェニル、４−ブロモフェニル、及び４−ニトロフェニルを含む）である。Ｒ９は、任意選択で置換されたアルキル、シアノエチル、アシル、カルボネート、カルバメート、任意選択で置換されたベンジル、４−ピバロイルオキシベンジル、又はシリルであってもよい。
【００１４】
更なる実施形態では、表１中に示したヌクレオシド以外のモルホリノヌクレオシドを、ジアステレオマーとして純粋な又は実質的にジアステレオマーとして純粋な形に調製することができる。
【００１５】
幾つかの実施形態は、前に開示した化合物のジアステレオマー混合物を、立体化学的に純粋な又は実質的に立体化学的に純粋な化合物に分離するための方法も提供することができる。更なる実施形態は、本明細書で報告する立体化学的に純粋な又は実質的に立体化学的に純粋な化合物を含む医薬組成物を提供することができる。更なる実施形態は、本明細書で報告する立体化学的に純粋な又は実質的に立体化学的に純粋な化合物の薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を提供することができる。医薬組成物は、治療を必要とする患者に有効量投与することができる。医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含むことができる。
【００１６】
幾つかの実施形態では、表１の化合物のそれぞれにおける以下の部分は、位置ａ、ｂ、及びｅにおいて１つ又は２つのメチル基で置換することができ、位置ｃ及びｄにおいて１つのメチル基で置換することができる。それぞれの場合、メチル基はモルホリノ環の平面の片側に配向し得る。更なる実施形態では、１つ又は複数のメチル基によって任意選択で置換された別のメチレンを、モルホリノ基中の窒素近辺に挿入して７員環への拡張を可能にすることができる。
【００１７】
幾つかの実施形態は、活性化モノマーの立体特異的カップリングを介した、立体化学的に純粋なオリゴヌクレオチドの調製を更に提供する。更なる実施形態は、活性化モノマーの立体特異的カップリングにより作製された、実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマーを提供する。他の更なる実施形態は、本明細書で報告する実質的にジアステレオマーとして純粋な化合物を含む実質的にジアステレオマーとして純粋な組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ホスホジエステル、ホスホロチオエート、及びホスホロジアミデートオリゴヌクレオチド結合を示す図である。
【図２】ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）におけるＲ−及びＳ−リン酸結合を示す図である。図２は、ホスホロジアミデートオリゴマー前駆体のジアステレオマー混合物を使用してジヌクレオチド（２量体）、トリヌクレオチド（３量体）、テトラヌクレオチド（４量体）、及びＮ量体を合成するとき典型的に生じるジアステレオマーの急増も示す。
【図３】ジアステレオマーとして純粋なホスホラミドクロリデートの使用とホスホラミドクロリデートのジアステレオマー混合物の使用の両方による、ジアステレオマーとして純粋なジヌクレオチドの調製を示す図である。
【図４Ａ−４Ｂ】ジアステレオマーとして純粋な又は実質的にジアステレオマーとして純粋なジアステレオマーサブユニットの調製に有用であり得る、一般的なホスホラミドクロリデートのジアステレオマー混合物を示す図である。
【図５】本明細書で報告するジアステレオマーとして純粋なホスホラミドクロリデートを使用したジアステレオマーとして純粋な（均質）オリゴヌクレオチドの調製を示す図である。
【図６】１６量体ＰＭＯの立体特異的合成及び生物物理学的アッセイによる立体異性体の識別に関するスキームを示す図である。
【図７】以下で報告する１６量体ＰＭＯの立体特異的合成及び生物物理学的アッセイによる立体異性体の識別を示す実施例の立体異性体１と２に関する融点を示す図である。
【図８】以下で報告する結晶性化合物１００のＯＲＴＥＰプロットを示す図である。
【図９Ａ−９Ｂ】以下で報告する化合物１００の２フラグメントのＯＲＴＥＰプロットを示す図である。
【詳細な説明】
【００１９】
本発明者らは、活性化モルホリノサブユニットの２つのジアステレオマーはそれらの物理的性質によって選別することができ、ジアステレオマーとして純粋な異性体の調製を可能にすることを発見している。これによって、制御された反応条件下での立体化学的に純粋な又は実質的に立体化学的に純粋なＰＭＯの調製が可能であり、次いでこれを使用して所望の立体化学的性質を有するオリゴヌクレオチドを選択的に調製することができる。
【００２０】
幾つかの実施形態は、前に開示した化合物のジアステレオマー混合物を、立体化学的に純粋な又は実質的に立体化学的に純粋な化合物に分離するための方法を更に提供することができる。分離後、本来ジアステレオマー混合物由来の純粋なジアステレオマーを使用して、立体特異的カップリング反応によりジアステレオマーとして純粋な化合物を調製することができる。
【００２１】
本明細書で言及するように調製したジアステレオマーとして純粋な化合物及び実質的にジアステレオマーとして純粋な化合物は、ジアステレオマーとして純粋なホスホロジアミデートオリゴヌクレオチドであり得る。これらのジアステレオマーとして純粋な及び実質的にジアステレオマーとして純粋なホスホロジアミデートオリゴヌクレオチドは多数の用途を有し得る。例えば、それらは医薬品として有用であり得る。それらは、ホスホロジアミデートオリゴヌクレオチドのジアステレオマーの不均質混合物（立体化学的にランダムな混合物）の性質より優れた可能性がある性質に関して選択することができる。例えば、それらは効能、有効性、安定性、安全性、及び特異性の違いに関して選択することができる。ジアステレオマーとして純粋な及び実質的にジアステレオマーとして純粋なオリゴマーは、立体化学的に不均質なオリゴマー混合物の性質と異なる、物理的、化学的、及び生物学的性質を有し得る。
【００２２】
「立体異性体」は、空間内の原子の配置のみが異なる異性体を指す。
【００２３】
「ジアステレオマー」は、互いの鏡像ではない立体異性体を指す。
【００２４】
「エナンチオマー」は、互いの非重複鏡像である立体異性体を指す。エナンチオマーは、実質的に一種のエナンチオマー、例えば９０％、９２％、９５％、９８％、又は９９％以上、又は１００％に等しい一種のエナンチオマーを含む「エナンチオマーとして純粋な」異性体を含む。
【００２５】
「活性化モノマー」は、これらに限定されないが、アミン及びアルコールを含む求核剤との置換反応を経る、これらに限定されないが、塩化物及びハロゲン化物離脱基を含む離脱基を有する反応性リン酸を伴う５’−Ｏ−リン酸化モルホリノサブユニットを指す。
【００２６】
異性体を記載する用語としての「Ｒ」及び「Ｓ」は、これらに限定されないが、炭素、硫黄、リン酸及びアンモニウムの窒素を含む非対称に置換された原子における立体化学的形状の記述子である。「Ｒ」又は「Ｓ」としての非対称に置換された原子の指定は、カーン−インゴルド−プレローグ順位則の適用によって、当業者によく知られているように、及び国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）のＲｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｅ、Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中に記載されたように行われる。
【００２７】
化学分野の当業者によく知られているように、それが偏光光線面を回転する方向によってエナンチオマーを特徴付けすることができる。（光が移動している方向に対してその観察者が見て）それが光線面を時計回りに回転する場合、そのエナンチオマーは（＋）で表記し右旋性と表示する。その鏡像は偏光光線面を反時計方向に回転し、（−）又は左旋性と表記する。旋光度と呼ばれるエナンチオマーとして純粋な化合物による偏光光線面の回転方向は、偏光計として知られる標準デバイスで容易に測定することができる。
【００２８】
「ラセミ」は、個々のエナンチオマーの均一部分を含有する混合物を指す。
【００２９】
「非ラセミ」は、個々のエナンチオマーの不均一部分を含有する混合物を指す。非ラセミ混合物は、約５０／５０、約６０／４０、及び約７０／３０のＲ−／Ｓ−エナンチオマー、又はＳ−／Ｒ−エナンチオマー混合物を非制限的に含む、Ｒ−又はＳ−形状に拡充することができる。
【００３０】
「実質的に立体化学的に純粋な」及び「実質的な立体化学的純度」は、それぞれ８０％以上エナンチオマー過剰又はジアステレオマー過剰である、エナンチオマー又はジアステレオマーを指す。幾つかの実施形態では、「実質的に立体化学的に純粋な」及び「実質的な立体化学的純度」は、それぞれ８７％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上エナンチオマー過剰又はジアステレオマー過剰である、エナンチオマー又はジアステレオマーを指す。「実質的にジアステレオマーとして純粋」は、８７％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上ジアステレオマー過剰であるジアステレオマーを指す。
【００３１】
エナンチオマーの「エナンチオマー過剰率」（ｅｅ）は、［（主エナンチオマーのモル分率）マイナス（副エナンチオマーのモル分率）］×１００である。２つのジアステレオマーの混合物におけるジアステレオマーのジアステレオマー過剰率（ｄｅ）は同様に定義される。
【００３２】
本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」は、本開示における化合物の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。薬学的に許容される塩は、親化合物の活性を保持し、それを投与する対象及び状況においていかなる過度に有害又は望ましくない影響も与えない任意の塩である。薬学的に許容される塩は、これらに限定されないが、金属錯体及び無機酸とカルボン酸両方の塩を含む。薬学的に許容される塩は、アルミニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、マンガン等の金属塩、及び錯体塩も含む。更に薬学的に許容される塩は、これらに限定されないが、例えば、酢酸、アスパラギン酸、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アクセチル（ａｘｅｔｉｌ）酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、重硫酸、重酒石酸、酪酸、エデト酸カルシウム、カンシル酸、炭酸、クロロ安息香酸、クエン酸、エデト酸、エジシル酸、エストール酸、エシル酸、エシリル（ｅｓｙｌｉｃ）酸、蟻酸、フマル酸、グルセプト酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリルアルサニル酸、ヘキサミン酸、ヘキシルレゾルシン酸、ヒドラバミン酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシナフトール酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、硝酸メチル、スルホン酸メチル、粘液酸、ムコン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、ｐニトロメタンスルホン酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、リン酸一水素、リン酸二水素、フタル酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、スルホン酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、テオクル酸、トルエンスルホン酸等の酸の塩を含む。
【００３３】
治療剤の組合せ（例えば、化合物１とＣＤＫ４／６阻害剤）の「有効量」は、対象又は患者において未処置状態のＨＣＣ又はＩＨＣＣと比較して観察可能な治療効果をもたらすのに充分な量である。
【００３４】
本明細書で報告する活性剤を薬学的に許容される担体と組み合わせて、その医薬品製剤を提供することができる。担体及び製剤の詳細な選択は、組成物が目的とする詳細な投与経路に依存する。
【００３５】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」は、製剤化する化合物の薬理学的活性を損ねない、無毒な担体、アジュバント、又は賦形剤を指す。本発明の組成物において使用することができる、薬学的に許容される担体、アジュバント又は賦形剤は、これらに限定されないが、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の不完全グリセリド混合物、水、塩又は電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を含む。
【００３６】
本発明の組成物は、非経口、経口、噴霧吸入、局所、直腸、鼻腔、口腔、膣又は埋め込み型タンク投与等に適している可能性がある。幾つかの実施形態では、製剤は天然又は非天然源由来の成分を含む。幾つかの実施形態では、製剤又は担体は滅菌型で提供することができる。滅菌担体の非制限的な例は、エンドトキシン除去水又は発熱物質除去水を含む。
【００３７】
本明細書で使用する「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、クモ膜下、肝臓内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技法を含む。詳細な実施形態では、化合物を静脈内、経口、皮下、又は筋肉内投与によって投与する。本発明の滅菌注射型組成物は水性又は油性懸濁液であってもよい。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、当技術分野で知られている方法に従い製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、無毒な非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。利用することができる許容可能な賦形剤及び溶媒の中には水、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。更に、滅菌、固定油が溶媒又は懸濁媒体として従来から利用されている。
【００３８】
本発明の幾つかの実施形態は、立体化学的に純粋な異性体又は実質的に立体化学的に純粋な異性体の調製、次にジアステレオマーとして純粋なホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を立体特異的に調製するためのその純粋な異性体の使用を提供する。調製は、ホスホラミドクロリデートヌクレオチドのジアステレオマー混合物の分離による調製であってもよい。分離は、例えばクロマトグラフィー、例えば高速液体クロマトグラフィー又は「ＨＰＬＣ」によって行うことができる。分離は結晶化によって実施することもできる。
【００３９】
分離モノマーは「活性」モノマーと呼ぶことができる。「活性」によって、モノマーが、これらに限定されないが、アミン、アルコール／アルコキシド、チオール／チオレート、アルキルリチウム、及びグリニャール試薬を含む求核剤に対して反応性があるホスホラミドクロリデート部分を含むことを意味する。
【００４０】
Ｉ．ジアステレオマー異性体の調製
一実施形態では、立体化学的に純粋な又は実質的に立体化学的に純粋な活性化モノマーを、モノマーのジアステレオマー混合物の分離によって調製することができる。物理的性質を使用して立体異性体の識別を可能にする方法によって、分離を実施することができる。例えば、クロマトグラフィー又は結晶化によって分離を実施することができる。適切なタイプのクロマトグラフィーは、これらに限定されないが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、擬似移動床式クロマトグラフィー、向流クロマトグラフィー、及び他のタイプの分離クロマトグラフィーを含む。例えば、ジアステレオマー混合物をＨＰＬＣに施して、高速移動分画及び低速移動分画を溶出することができる。これらの分画のそれぞれは、異なる立体化学的に純粋な又は実質的に立体化学的に純粋な量のモノマーである。以下に記載するように、これらのモノマーを使用して、制御反応条件を使用した立体特異的カップリングにより、望ましい立体化学的性質を有するオリゴマーを調製することができる。
【００４１】
本発明者らは、分離後、立体化学的に純粋な活性化モノマーが、更なる化学反応中で使用するのに充分な安定性を有することを更に測定している。更に本発明者らは、立体化学的に純粋な活性化モノマーは立体特異的化学反応を経る可能性があることを測定している。従って、以下でより詳細に論じるように、これらの立体化学的に純粋な活性化モノマーを立体特異的カップリング反応に使用して、立体化学的に純粋な産物を調製することができる。
【００４２】
前に記したように、幾つかの実施形態は、表１の立体化学的に純粋な又は実質的に立体化学的に純粋な化合物のうちの１つ又は複数を提供することができ、これらの化合物は、立体異性体において異なる物理的性質を利用することにより調製することができる。更なる実施形態は、表１の化合物のエナンチオマーを提供することもできる。典型的に、これらのエナンチオマーの立体化学的性質は、モルホリノ環の立体化学的性質の変化によって表１の化合物のそれとは異なる。
【００４３】
【表２】
2022003067.tif 000005
2022003067.tif 000006
【００４４】
式中、Ｒ３は、任意選択で置換されたトリフェニルメチル（「トリチル」とも呼ばれる）、任意選択で置換されたベンジル、又はスルホニルであり、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は−Ｃ（Ｏ）Ｒ７又は−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８であってもよく、式中、Ｒ７はメチル、エチル、又はフェニルであり、Ｒ８はベンジル又は２，２，２−トリクロロエチルである。Ｒ９は、任意選択で置換されたアルキル、シアノエチル（保護基としての使用に関しては、例えば米国特許出願公開第２０１３／０１９７２２０号を参照）、アシル、スルホニル、アセタール／ケタール、カルボネート、カルバメート、任意選択で置換されたベンジル、４−ピバロイルオキシベンジル、又はシリルであってもよい。
【００４５】
幾つかの実施形態では、任意選択で置換されたベンジルは４−メトキシベンジル（ＰＭＢ、ＭＰＭ）である。幾つかの実施形態では、スルホニルは切断型スルホニルである。幾つかの実施形態では、スルホニルは２−ニトロベンゼンスルホニル、４−ニトロベンゼンスルホニル、又は２，４−ジニトロベンゼンスルホニルである。
【００４６】
Ｒ１とＲ２は、同一であっても異なってもよく、−Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル、任意選択で置換されたフェニル、任意選択で置換されたナフチルであってもよく、又はそれらが結合している窒素と共に、例えば、ピロリジン、ピペラジン、又はモルホリンであってもよい任意選択で置換された複素環を形成してもよい。
【００４７】
任意選択で置換された部分は、メチル、エチル、ハロゲン、ニトロ、又はシアノのうちの１つ又は複数で置換されていてもよい。
【００４８】
Ｒ３は、これに限定されないが、ＭＭＴｒ（ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル）等を含む置換トリチルであってもよいトリチル（Ｔｒ）、ベンジル、４−メトキシベンジル（ＰＭＢ、ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジル、ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）であってもよい。
【００４９】
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、又は−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７であってもよく、式中、Ｒ７は、アルキル（メチル、エチル、イソプロピル、又は他のＣ１〜Ｃ６アルキル）又はアリール（これらに限定されないが、フェニル、４−メトキシフェニル、４−ブロモフェニル、及び４−ニトロフェニルを含む）である。
【００５０】
ＩＩ．立体特異的カップリング
分離技術を使用して実質的に立体化学的に純粋な量の活性化モノマーを調製できるかどうかの判定以外に、本発明者らは、幾つかの反応条件下で、これらの活性化モノマーを使用して、立体化学的に純粋なジヌクレオチド、立体化学的に純粋なトリヌクレオチド、及び更に大きな立体化学的に純粋なオリゴマーを調製するための立体特異的カップリングを実施できるかどうか判定した。本明細書で報告する方法の使用によって、新たに形成されるＰＭＯ結合のキラルを、オリゴマー形成のために使用する立体化学的に純粋な活性化モノマーにより特異的にコードすることができる。
【００５１】
立体特異的カップリングの典型的反応条件は非プロトン性溶媒における反応を含む。これらの溶媒は、これらに限定されないが、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，３−ジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、クロロホルム、１，４−ジオキサン、酢酸エチル、２−メチルテトラヒドロフラン、及び酢酸イソプロピルであってもよい。カップリング反応は、非求核性第３級アミン塩基及び芳香族塩基の存在下で実施することができる。適切な塩基は、これらに限定されないが、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、２，６−ルチジン、トリメチルピリジン（コリジン）、及びＮ−エチルモルホリンを含む。反応温度は室温（約２０℃）〜５０℃の範囲であってもよい。幾つかの場合、超音波処理を施して基質（複数可）の溶解を助長することができる。
【００５２】
立体特異的カップリングの実現可能性を実証するため、多数の実質的に立体化学的に純粋なＰＭＯジヌクレオチドを、高速及び低速溶出する実質的に立体化学的に純粋な活性モノマー（ホスホロアミドクロリデート）の立体特異的ＰＭＯカップリングによって調製した。以下の表２は、これらの実質的に立体化学的に純粋なＰＭＯジヌクレオチドのＨＰＬＣ保持プロファイルを要約する。この表は、表の左に挙げた５’末端モノマーの組合せから調製したジヌクレオチドに関する保持時間と、上部に挙げた３’末端モノマーの高速溶出と低速溶出両方の異性体の保持時間を比較する。この表は、実質的に立体化学的に純粋な活性モノマーの立体特異的カップリングによって、異なる物理的性質を有する異なるジアステレオマーとして純粋なジヌクレオチドが生じることを実証する。
【００５３】
【表３】
2022003067.tif 000007
【００５４】
表２の実質的に立体化学的に純粋なＰＭＯジヌクレオチドのプロファイリングに関する分析ＨＰＬＣ条件を以下に報告する：
【００５５】
【表４】
2022003067.tif 000008
【実施例】
【００５６】
ＩＩＩ．活性化モノマーのジアステレオマー分離の実施例
以下の実施例は、本明細書中に表す特定実施形態による活性化モノマーのジアステレオマー分離を示す。
【００５７】
Ａ．Ｕ−モノマー
【化１】
2022003067.tif 000009
【００５８】
活性化Ｕモノマーに関する分析ＨＰＬＣ条件：
【００５９】
【表５】
2022003067.tif 000010
【００６０】
活性化Ｕモノマーに関する分取ＨＰＬＣ条件：
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＣ、２１×２５０ｍｍ、５μ；溶出カラム、酢酸エチルを用いて１１ｍｌ／分、室温、２６０ｎｍ検出。
【００６１】
［Ｕ１に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１８（ｂｒ，１Ｈ）、７．４５（ｍ，６Ｈ）、７．１５−７．３２（ｍ，１０Ｈ）、６．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０＆９．６Ｈｚ）、５．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、４．３９（ｍ，１Ｈ）、４．１１（ｍ，２Ｈ）、３．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、３．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、２．６５（ｓ，３Ｈ）、２．６２（ｓ，３Ｈ）、１．４９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．３９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）
【００６２】
［Ｕ２に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０７（ｂｒ，１Ｈ）、７．４４（ｍ，６Ｈ）、７．１４−７．３４（ｍ，１０Ｈ）、６．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２＆９Ｈｚ）、５．６１（ｄ，１Ｈ，８．０Ｈｚ）、４．３９（ｍ，１Ｈ）、４．０８（ｍ，２Ｈ）、３．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、３．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、２．６６（ｓ，３Ｈ）、２．６２（ｓ，３Ｈ）、１．４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．３８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、
【００６３】
Ｂ．Ａ−モノマー
【化２】
2022003067.tif 000011
【００６４】
活性化Ａモノマーに関する分析ＨＰＬＣ条件：
【００６５】
【表６】
2022003067.tif 000012
【００６６】
活性化Ａモノマーに関する分取ＨＰＬＣ条件：
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＣ、２１×２５０ｍｍ、５μ；１００％酢酸エチルを用いて１５ｍｌ／分で溶出、室温、ｕｖ２６０ｎｍ検出。
【００６７】
［Ａ１に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．０１（ｂｒ，１Ｈ）、８．７９（ｓ，１Ｈ）、８．００（ｍ，３Ｈ）、７．５８（ｍ，１Ｈ）、７．４−７．６（ｍ，８Ｈ）、７．２−７．４（ｍ，１０Ｈ）、６．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、４．５１（ｍ，１Ｈ）、４．１２（ｍ，３Ｈ）、３．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、３．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、２．６２（ｓ，３Ｈ）、２．５９（ｓ，３Ｈ）、１．８１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．６２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）
【００６８】
［Ａ２に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．０４（ｂｒ，１Ｈ）、８．７９（ｓ，１Ｈ）、８．００（ｍ，３Ｈ）、７．５６（ｍ，１Ｈ）、７．４−７．６（ｍ，８Ｈ）、７．２−７．４（ｍ，１０Ｈ）、６．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、４．５１（ｍ，１Ｈ）、４．１２（ｍ，３Ｈ）、３．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、３．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、２．６４（ｓ，３Ｈ）、２．６１（ｓ，３Ｈ）、１．８２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．６３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）
【００６９】
Ｃ．Ｃ−モノマー
【化３】
2022003067.tif 000013
【００７０】
活性化Ｃモノマーに関する分析ＨＰＬＣ条件：
【００７１】
【表７】
2022003067.tif 000014
【００７２】
活性化Ｃモノマーに関する分取ＨＰＬＣ条件：
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＣ、７５％酢酸エチル及び２５％ｎ−ヘプタンを用いて１５ｍｌ／分で溶出。室温及びｕｖ２６０ｎｍ検出。
【００７３】
［Ｃ１に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、７．４３（ｍ，６Ｈ）、７．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．１５−７．３２（ｍ，９Ｈ）、６．１８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２＆９．２Ｈｚ）、４．４２（ｍ，１Ｈ）、４．０８−４．１６（ｍ，２Ｈ）、３．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、３．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、２．６４（ｓ，３Ｈ）、２．６０（ｓ，３Ｈ）、２．２３（ｓ，３Ｈ）、１．５１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．２５（ｍ，１Ｈ）。
【００７４】
［Ｃ２に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、７．４３（ｍ，６Ｈ）、７．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．１５−７．３２（ｍ，９Ｈ）、６．１９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１＆９．２Ｈｚ）、４．４１（ｍ，１Ｈ）、４．０６−４．１５（ｍ，２Ｈ）、３．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、３．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、２．６４（ｓ，３Ｈ）、２．６１（ｓ，３Ｈ）、２．２２（ｓ，３Ｈ）、１．４９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．２５（ｍ，１Ｈ）
【００７５】
Ｄ．Ｇ−モノマー（グアニン、モノ保護型）
【化４】
2022003067.tif 000015
【００７６】
活性化Ｇモノマーに関する分析ＨＰＬＣ条件：
【００７７】
【表８】
2022003067.tif 000016
【００７８】
活性化Ｇモノマーに関する分取ＨＰＬＣ条件：
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＣ、１００％酢酸エチルを用いて１５ｍｌ／分で溶出。室温及びｕｖ２６０ｎｍ検出。
【００７９】
Ｅ．Ｔ−モノマー
【化５】
2022003067.tif 000017
【００８０】
活性化Ｔモノマーに関する分析ＨＰＬＣ条件：
【００８１】
【表９】
2022003067.tif 000018
【００８２】
活性化Ｔモノマーに関する分取ＨＰＬＣ条件：
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＣ、５０×５００ｍｍ、２０ｕ。酢酸エチルを用いて６０ｍｌ／分で溶出。室温、２６０ｎｍ検出。保持時間は２５分と４０分である。
【００８３】
［Ｔ１に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４−７．５（ｍ，５Ｈ）、７．２６−７．３３（ｍ，６Ｈ）、７．１６−７．２２（ｍ，３Ｈ）、７．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１Ｈｚ）、６．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２＆１０Ｈｚ）、４．３９（ｍ，１Ｈ）、４．１２（ｍ，２Ｈ）、３．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、３．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、２．６６（ｓ，３Ｈ）、２．６３（ｓ，３Ｈ）、１．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１Ｈｚ）、１．４９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．４１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ））
【００８４】
［Ｔ２に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４−７．５（ｍ，６Ｈ）、７．２４−７．３５（ｍ，６Ｈ）、７．１４−７．２２（ｍ，３Ｈ）、７．０３（ｓ，１Ｈ）、６．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２＆１０Ｈｚ）、４．３９（ｍ，１Ｈ）、４．０９（ｍ，２Ｈ）、３．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、３．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、２．６６（ｓ，３Ｈ）、２．６２（ｓ，３Ｈ）、１．８２（ｓ，３Ｈ）、１．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．４０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）
【００８５】
Ｆ．Ｃ−モノマー（ＮＢｚ）
【化６】
2022003067.tif 000019
【００８６】
活性化Ｃモノマー（ＮＢｚ）に関する分析ＨＰＬＣ条件：
【００８７】
【表１０】
2022003067.tif 000020
【００８８】
活性化Ｃモノマー（ＮＢｚ）に関する分取ＨＰＬＣ条件：
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＢ、２０×２５０ｍｍ、５ｕ。１００％アセトニトリルを用いて９ｍｌ／分で溶出。室温及びｕｖ２６０ｎｍ検出。保持時間は１３分と１６分である。
【００８９】
Ｇ．Ｇ−モノマー（グアニン、二重保護型）
【化７】
2022003067.tif 000021
【００９０】
活性化Ｇモノマー（グアニン、二重保護型）に関する分析ＨＰＬＣ条件：
【００９１】
【表１１】
2022003067.tif 000022
【００９２】
活性化Ｇモノマー（グアニン、二重保護型）に関する分取ＨＰＬＣ条件：
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡ、５０×５００ｍｍ、１００％酢酸エチルを用いて６０ｍｌ／分で溶出。室温及びｕｖ２６０ｎｍ検出。保持時間は２０分と２４分である。
【００９３】
［Ｇ１（グアニン、二重保護型）に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７６（ｓ，２Ｈ）、７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ）、７．４−７．５（ｍ，６Ｈ）、７．２６−７．３２（ｍ，６Ｈ）、７．１６−７．２２（ｍ，３Ｈ）、７．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ）、６．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２＆１０Ｈｚ）、５．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、５．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、４．４８（ｍ，１Ｈ）、４．１（ｍ，２Ｈ）、３．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、３．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、３．２（ｍ，１Ｈ）、２．６２（ｓ，３Ｈ）、２．５９（ｓ，３Ｈ）、１．７５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．５７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、１．３３（ｓ，９Ｈ）、１．３３（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）
【００９４】
［Ｇ２（グアニン、二重保護型）に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７８（ｓ，１Ｈ）、７．７７（ｓ，１Ｈ）、７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ）、７．４−７．５（ｍ，６Ｈ）、７．２６−７．３３（ｍ，６Ｈ）、７．１５−７．２２（ｍ，３Ｈ）、７．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ）、６．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２＆１０Ｈｚ）、５．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、５．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、４．４７（ｍ，１Ｈ）、４．１（ｍ，２Ｈ）、３．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、３．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、３．２（ｍ，１Ｈ）、２．６４（ｓ，３Ｈ）、２．６０（ｓ，３Ｈ）、１．７５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．５８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．３３（ｓ，９Ｈ）、１．３３（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）
【００９５】
ＩＶ．ジアステレオマーとして純粋な活性化モノマーとの立体特異的ＰＭＯカップリングの実施例
以下の実施例は、立体化学的に均質な産物を調製するための立体特異的カップリングの使用を報告する。
【００９６】
Ａ．活性化Ｕ−モノマー（Ｕ１及びＵ２）＋Ｕ−モルホリン−ＮＨ（１）
【化８】
2022003067.tif 000023
【００９７】
Ｕ１（１１ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、１当量、９９．０％ｄｅ）をアセトニトリル（０．１１ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（８μＬ、０．０５ｍｍｏｌ、２．５当量）と混合した。Ｕ−モルホリン−ＮＨ（１；１４ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、１．６当量）を添加し、超音波処理を施して溶解を補助した。０．５時間撹拌した後、反応混合物の少量アリコートをＣＤＣｌ３で希釈し、１ＨＮＭＲによって分析した。反応混合物の残り全てをＨＰＬＣ分析用にアセトニトリル（８ｍｌ）で希釈し、フリーザー中に維持した。２の立体特異的形成はＨＰＬＣ分析によって確認した（９９．４％ｄｅ）。前述のプロトコールはＵ２のカップリングにも利用して（９５．６％ｄｅ）、３を立体特異的に得た（９６．０％ｄｅ）。
【００９８】
Ｕ／Ｕ−カップリングに関する分析ＨＰＬＣ条件：
【００９９】
【表１２】
2022003067.tif 000024
【０１００】
［２に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６（ｍ，４Ｈ）、７．２−７．５（ｍ，２０Ｈ）、７．１−７．２（ｍ，３Ｈ）、６．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、５．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、５．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、５．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、４．４０（ｍ，１Ｈ）、３．９３（ｍ，２Ｈ）、３．８１（ｍ，１Ｈ）、３．７０（ｍ，２Ｈ）、３．４１（ｍ，２Ｈ）、３．４０（ｍ，３Ｈ）、３．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、２．７８（ｍ，１Ｈ）、２．５６（ｓ，３Ｈ；ＮＭｅ）、２．５４（ｓ，３Ｈ；ＮＭｅ）、２．４８（ｍ，１Ｈ）、１．４７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．３５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．０４（ｓ，９Ｈ）
【０１０１】
［３に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６（ｍ，４Ｈ）、７．３−７．５（ｍ，１１Ｈ）、７．２−７．３（ｍ，９Ｈ）、７．１（ｍ，３Ｈ）、６．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０＆９．６Ｈｚ）、５．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、５．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０＆１０．４Ｈｚ）、４．３１（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｍ，１Ｈ）、３．８５（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｍ，２Ｈ）、３．６５（ｍ，１Ｈ）、３．３１（ｍ，２Ｈ）、３．２４（ｍ，１Ｈ）、３．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、２．６８（ｍ，１Ｈ）、２．６５（ｓ，３Ｈ；ＮＭｅ）、２．６２（ｓ，３Ｈ；ＮＭｅ）、２．２６（ｍ，１Ｈ）、１．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、１．２９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．０４（ｓ，９Ｈ）
【０１０２】
Ｂ．活性化Ｃ−モノマー（Ｃ１及びＣ２）＋Ｃ−モルホリン−ＮＨ（４）
【化９】
2022003067.tif 000025
【０１０３】
Ｃ１（２０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、１当量、９３．５％ｄｅ）をＴＨＦ（０．４０ｍｌ）に溶解／懸濁させ、ジイソプロピルエチルアミン（１２μＬ、０．０６９ｍｍｏｌ、２．３当量）と混合した。ＴＨＦ（０．２０ｍｌ）に溶解させたモルホリノ−シトシン（４；１６ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。１．０〜２．０時間撹拌した後、反応混合物の少量アリコートをアセトニトリルで希釈しＬＣ／ＭＳによって分析した。反応混合物のアリコート（３０〜５０μＬ）をＨＰＬＣ分析用にジクロロメタン（０．６ｍｌ）で希釈した。６の立体特異的形成はＨＰＬＣ分析によって確認した（９４．３％ｄｅ）。反応混合物はシリカゲルカラムに直接充填し、酢酸エチル中０〜１５％メタノールの勾配移動相で溶出した。前述のプロトコールをＣ２のＣ／Ｃカップリングにも利用して（９０．２％ｄｅ）、５を立体特異的に得た（９０．０％ｄｅ）。
【０１０４】
Ｃ／Ｃ−カップリングに関する分析ＨＰＬＣ条件：
【０１０５】
【表１３】
2022003067.tif 000026
【０１０６】
［５に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．９（ｂｒ，１Ｈ）、７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．６２（ｍ，５Ｈ）、７．３５−７．４４（ｍ，１３Ｈ）、７．２１−７．３５（ｍ，６Ｈ）、７．１５（ｍ，４Ｈ）、６．１４（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、５．５８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４＆９．４Ｈｚ）、５．５３（ｂｒ，１Ｈ）、４．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６＆１０Ｈｚ）、４．０９（ｍ，１Ｈ）、３．７０−３．８０（ｍ，４Ｈ）、３．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．３＆１０Ｈｚ）、３．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、３．２８（ｍ，１Ｈ）、２．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、２．６９（ｓ，３Ｈ；ＮＭｅ）、２．６７（ｓ，３Ｈ；ＮＭｅ）、２．６５（ｍ，１Ｈ）、２．２５（ｍ，１Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、１．３１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．１３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．０４（ｓ，９Ｈ）。
【０１０７】
［６に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．５７（ｂｒ，１Ｈ）、７．６２−７．７０（ｍ，７Ｈ）、７．３５−７．５０（ｍ，１４Ｈ）、７．２３−７．３５（ｍ，４Ｈ）、７．１２（ｍ，４Ｈ）、６．３１（ｍ，１Ｈ）、５．７９（ｍ，１Ｈ）、５．７０（ｍ，１Ｈ）、４．６１（ｍ，１Ｈ）、４．０３（ｍ，１Ｈ）、３．８０−３．９０（ｍ，２Ｈ）、３．７２（ｍ，２Ｈ）、３．５８（ｍ，１Ｈ）、３．４８（ｍ，１Ｈ）、３．０９（ｍ，１Ｈ）、２．７５（ｍ，１Ｈ）、２．５８（ｓ，３Ｈ；ＮＭｅ）、２．５５（ｓ，３Ｈ；ＮＭｅ）、２．５３（ｍ，１Ｈ）、２．３８（ｍ，１Ｈ）、２．２１（ｓ，３Ｈ）、１．４７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ）、１．２２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ）、１．０６（ｓ，９Ｈ）。
【０１０８】
Ｃ．活性化Ａ−モノマー（Ａ１及びＡ２）＋Ｕ−モルホリン−ＮＨ（１）
【化１０】
2022003067.tif 000027
【０１０９】
Ａ１（５．９ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１１８μＬ）に懸濁させた。ジイソプロピルエチルアミン（５μＬ、０．０３ｍｍｏｌ）、次にモルホリノ−ウラシル（１；４．６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を添加した。超音波処理を１分間施し、生成した均質混合物は周囲温度で撹拌した。一晩撹拌した後、その混合物（濃密な白いペースト）をアセトニトリル（５．０ｍｌ）とメタノール（０．３０ｍｌ）の混合物で希釈し均質で透明な溶液を得た。少量アリコートを、更なる希釈無しでＨＰＬＣによって直接分析した。
【０１１０】
Ａ２（Ｆ２；５．０ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１００μＬ）に懸濁させた。ジイソプロピルエチルアミン（４μＬ、０．０２ｍｍｏｌ）、次にモルホリノ−ウラシル（４．１ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）を加えた。超音波処理を１分間施し、生成した濃密懸濁液は周囲温度で撹拌した。一晩撹拌した後、アセトニトリル（５．０ｍｌ）を加え、超音波処理を施して均質で透明な溶液を得た。少量アリコートを、更なる希釈無しでＨＰＬＣによって直接分析した。
【０１１１】
Ｕ／Ａ−カップリングに関する分析ＨＰＬＣ条件：
【０１１２】
【表１４】
2022003067.tif 000028
【０１１３】
Ｄ．活性化Ｇ−モノマー（Ｇ１及びＧ２）＋Ｕ−モルホリン−ＮＨ（１）
【化１１】
2022003067.tif 000029
【０１１４】
Ｇ１（６．５ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、１当量、９９．９％ｄｅ）をＴＨＦ（０．１３ｍｌ）に溶解／懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン（３．６μＬ、０．０２ｍｍｏｌ、２．２当量）と混合した。ＴＨＦ（０．０７ｍＬ）に溶解したモルホリノ−ウラシル（１；４．７ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。１．０〜２．０時間撹拌した後、反応混合物の少量アリコートをアセトニトリルで希釈しＬＣ／ＭＳによって分析した。反応混合物のアリコート（１００μＬ）をＨＰＬＣ分析用にジクロロメタン（０．４ｍｌ）で希釈した。９の立体特異的形成はＨＰＬＣ分析によって確認した（９９．９％ｄｅ）。
【０１１５】
Ｕ／Ｇ−カップリングに関する分析ＨＰＬＣ条件：
【０１１６】
【表１５】
2022003067.tif 000030
【０１１７】
前に報告したジアステレオマーとして実質的に純粋な化合物を使用して、立体化学的に純粋なオリゴヌクレオチド及び他の化合物を調製することができる。考えられるオリゴヌクレオチドの例は、例えばＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ（１９９９）．「Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：Ｔｈｅ  Ｃａｓｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ＲＮａｓｅ−Ｈ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｔｙｐｅ．」Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ１４８９（１）：１４１〜５８中、及びＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ；Ｗｅｌｌｅｒ  Ｄ．（１９９７）．「Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：Ｄｅｓｉｇｎ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ７（３）：１８７〜９５中で見られる。これらの文献の両方が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１１８】
Ｖ．１６量体ＰＭＯの立体特異的合成及び生物物理学的アッセイによる立体異性体の識別の実施例
この実施例は、活性化モノマーを使用した立体特異的カップリングによる、一対の立体化学的に純粋な１６量体ＰＭＯを標的化した合成を報告する。これらのＰＭＯはそれらのリン酸結合に関して対向した立体化学的配置を有する。
標的配列：
【化１２】
2022003067.tif 000031
立体化学的に純粋な活性モノマー（構成単位）：
【化１３】
2022003067.tif 000032
【０１１９】
【表１６】
2022003067.tif 000033
【０１２０】
１６量体ＰＭＯの立体特異的合成及び生物物理学的アッセイによる立体異性体の識別に関するスキームを図６中に示す。１６量体ＰＭＯの立体異性体１及び立体異性体２は、（開始時樹脂重量）５０ｍｇスケールで、アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂における固相合成（約３００μｍｏｌ／ｇ充填、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００９０１３１６２４Ａ１号参照）により手作業で調製した。
【０１２１】
固相合成用ストック溶液：
【０１２２】
【表１７】
2022003067.tif 000034
【０１２３】
各ＰＭＯカップリングに関する作業サイクル：
【０１２４】
【表１８】
2022003067.tif 000035
【０１２５】
樹脂からの切り離し及び脱保護：
（脱トリチル化後の）樹脂結合１６量体に１：３（ｖ／ｖ）の２８％アンモニア水／エタノール（約５ｍｌ）を加えた。混合物は密封し４５℃で２０時間加熱した。室温まで冷却した後、混合物を濾過しメタノールで洗浄した。濾過物を濃縮し、１５ｍＭトリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）バッファーｐＨ７．０でダイアフィルトレーション処理した。使用した装置は、Ｕｌｔｒａｃｅｌ  １ｋＤａ  ＵＦ膜を備えるＡｍｉｃｏｎ  Ｓｔｉｒｒｅｄ  Ｃｅｌｌ（５０ｍＬ）であった。元溶媒が１％元濃度に低減するまで（約５サイクル）試料を希釈／濃縮によってダイアフィルトレーション処理し、次いで逆相分取ＨＰＬＣ精製を施した。
【０１２６】
ＰＭＯ精製のための逆相分取ＨＰＬＣ法：
【０１２７】
【表１９】
2022003067.tif 000036
【０１２８】
ＰＭＯの品質アセスメントのためのＬＣ／ＭＳ法：
【０１２９】
【表２０】
2022003067.tif 000037
【０１３０】
融解温度（Ｔｍ）測定に関する物質及び条件
【０１３１】
【表２１】
2022003067.tif 000038
【０１３２】
立体化学的に異なるＰＭＯと相補的ＲＮＡの複合体の加熱融解特徴に関する要約：
【表２２】
2022003067.tif 000039
【０１３３】
立体異性体１及び２に関する融点を図７中に示す。異なる融点に基づき、別々の量の実質的に純粋な立体異性体が調製されたと結論付けることができる。
【０１３４】
ＶＩ．立体化学的に純粋なＰＭＯジヌクレオチド化合物１００（５’−ＴＡ２−３’）の立体特異的合成及び絶対的立体化学的配置の実施例
【化１４】
2022003067.tif 000040
【０１３５】
低速溶出活性Ａモノマー（Ａ２；２００ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（２．０ｍｌ）とＤＩＰＥＡ（０．１２ｍｌ、０．６９ｍｍｏｌ、２．５当量）の混合物中に溶解させた。Ｔ−モルホリン−ＮＨ（１；１４６ｍｇ、０．３０５ｍｍｏｌ、１．１当量）を次いで加え、透明な溶液を得るまで、生成した懸濁液を数分間超音波処理した。反応混合物は一晩室温で撹拌した。ＬＣ／ＭＳによりモニタリングして反応の終了時に、混合物を濃縮しカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中３％メタノール、Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳｎａｐＵｌｔｒａ  １０ｇＳｉＯ２）に施した。透明な産物の分画を組合せ、真空下で濃縮し白い固体として完全保護型の立体化学的に純粋な５’−ＴＡ−３’ジヌクレオチド２を得た（２４０ｍｇ、０．２０６ｍｍｏｌ、７４％収率）。
【化１５】
2022003067.tif 000041
【０１３６】
２５ｍｌフラスコ中の完全保護型ジヌクレオチド２（５００ｍｇ、０．４２９ｍｍｏｌ）に、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ；４．０ｍｌ）及び酢酸（１．０ｍｌ）を室温で加えた。生成した混合物は室温で撹拌しＬＣ／ＭＳによりモニタリングした。３０分後、飽和水性ＮａＨＣＯ３及びＤＣＭで反応を消失させた。２層を分離し水層を再度抽出した。全ての有機層を組合せ、半飽和塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し濃縮して白い泡沫として粗製産物を得た。この粗製産物をカラムクロマトグラフィー（アセトン中２０％ＭｅＯＨ、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｓｎａｐ  Ｕｌｔｒａ  ２５ｇＳｉＯ２カートリッジ）により精製し、ガラス状の固体として一部保護型ジヌクレオチド３を得た（３００ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ、７６％収率）。
【０１３７】
一部保護型ジヌクレオチド３（２５０ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）をメタノール（１２．５ｍｌ）とＴＨＦ（１２．５ｍＬ）の混合物中に溶解させ、室温において１ＭのＮａＯＨ（１０．８ｍｌ）で処理した。２２時間室温で撹拌した後（進行はＬＣ／ＭＳによりモニタリング）、混合物は１ＭのＨＣｌ（１０．８ｍＬ）で中和しｐＨ８に調節し、次いで真空下で乾燥状態に濃縮した。残渣は水（５ｍＬ）中に溶解させ、ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）で洗浄した。水層は真空下で乾燥状態に濃縮し、白い固体として粗製産物を得た（４８０ｍｇ）。粗製産物はサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０、ＭｅＯＨ／水４：１）により精製し、白い固体として完全脱保護型ジヌクレオチド化合物１００を得た（１３７ｍｇ、０．２３６ｍｍｏｌ、８７％収率）。
【０１３８】
化合物１００の水溶液（２００ｍｇ／ｍｌ）の一滴を純水と共に１日ウエル内に密封し単結晶を増大させた。単結晶のＸ線回折構造によってリン酸結合の絶対配置をＳとして確認した。このＸ線回折構造は図８中にＯＲＴＥＰプロットで示す。別フラグメントのＯＲＴＥＰプロットは図９Ａ及び図９Ｂ中に示す。Ｘ線回折データは以下で報告するように収集した。
【０１３９】
データ収集
化合物１００の単結晶（Ｃ２２Ｈ３３Ｎ１０Ｏ７Ｐ）をグラスファイバー上に載せた。全ての測定は、グラファイト単色Ｃｕ−Ｋα放射線を使用して回折計で行った。
【０１４０】
範囲７．７５＜２θ＜１４７．１０°で３６４７３の慎重に位置決めした反射の設定角を使用して最小二乗法による精密化から得たセル定数及び配向マトリックスは以下の寸法を有するＣ中心型単斜晶系セルに相当した：
ａ＝３３．３５２３（２）Å
ｂ＝１３．８００２０（１１）Å  β＝９６．８０７５（６）°
ｃ＝１４．１９９５６（１０）Å
Ｖ＝６４８９．５３（８）Å３
【０１４１】
Ｚ＝４及び式重量＝５８０．５４に関して、計算した密度は０．５９４ｇ／ｃｍ３である。反射条件
ｈｋｌ：ｈ＋ｋ＝２ｎ
パッキング事項、強度分布の統計解析、及び構造の首尾よい解明と精密化に基づき、空間群は
Ｃ２（＃５）
であると決定した。
【０１４２】
１４７．７°の最大２θ値までω−２θスキャン技法を使用して、２３±１℃の温度でデータを回収した。データ収集前に行った数個の高反射のオメガスキャンは、０．００°のハーフハイト及び６．０°の取り出し角で平均幅を有していた。（０．００＋０．００ｔａｎθ）°のスキャンは０．０°／分のスピード（ω単位）で行った。
【０１４３】
データ整理
５０７９５の反射を回収し、この場合１２００８が固有であった（Ｒｉｎｔ＝０．０４５３）。データを回収し、ＣｒｙｓＡｌｉｓＰｒｏ（Ｒｉｇａｋｕ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）を使用して処理した。（ＣｒｙｓＡｌｉｓＰｒｏ：Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｉｇａｋｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（２０１５）。東京１９６−８６６６、日本）。減衰補正は施さなかった。
【０１４４】
Ｃｕ−Ｋα放射線に関する線形吸収係数、μは６．０１１ｃｍ−１である。実験的吸収補正を施し０．３４１〜１．０００の範囲の透過因子をもたらした。ローレンツ及び分極効果に関してデータを補正した。
【０１４５】
構造の解明と精密化
構造は直接法（ＳＨＥＬＸＴバージョン２０１４／５：Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ、Ｇ．Ｍ．（２０１４）．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ａ７０、Ｃ１４３７）によって解明し、フーリエ技法を使用して拡張した。非水素原子は異方的に精密化した。水素原子はライディングモデルを使用して精密化した。Ｆ２において（最小二乗法による最小関数：（ＳＨＥＬＸＬバージョン２０１４／７）；Σ（ｗ（Ｆｏ２−Ｆｃ２）２、前式でｗ＝加重最小二乗法）を使用した）完全行列最小二乗法による精密化の最終サイクルは１２００８の観察した反射及び８４９の変数パラメーターに基づき、以下の非加重及び加重一致因子で収束した（最大パラメーターシフトはそのｅｓｄの０．００倍であった）：
Ｒ１＝Σ｜｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜｜／Σ｜Ｆｏ｜＝０．０５２２
ｗＲ２＝［Σ（ｗ（Ｆｏ２−Ｆｃ２）２）／Σｗ（Ｆｏ２）２］１／２＝０．１６３２
【０１４６】
適合度は１．４５であった。適合度は、［Σ（ｗ（Ｆｏ２−Ｆｃ２）２／（Ｎｏ−Ｎｖ）］１／２、前式でＮｏ＝観察の数及びＮｖ＝変数の数として定義する。
【０１４７】
単位加重を使用した。最終差フーリエ図における最大及び最小ピークは、それぞれ１．７９及び−０．６９ｅ−／Å３に相当した。最終Ｆｌａｃｋパラメーターは０．０２９（７）であり、その構造が反転双晶であることを示した（Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｓ．及びＦｌａｃｋ，Ｈ．（２００４）、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ａ６０、ｓ６１；Ｆｌａｃｋ，Ｈ．Ｄ．及びＢｅｒｎａｒｄｉｎｅｌｌｉ（２０００）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．３３、１１４〜１１４８）。
【０１４８】
中性原子散乱因子を、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（ＩＴ）、Ｖｏｌ．Ｃ、Ｔａｂｌｅ６．１．１．４．（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｖｏｌ．Ｃ（１９９２）．Ａ．Ｊ．Ｃ．Ｗｉｌｓｏｎ編、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、Ｔａｂｌｅ６．１．１．４、５７２頁）から得た。異常分散効果はＦｃａｌｃ（Ｉｂｅｒｓ，Ｊ．Ａ．及びＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｗ．Ｃ．；Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、１７、７８１（１９６４））中に含まれており、Δｆ’及びΔｆ’’に関する値はＣｒｅａｇｈ  ａｎｄ  ＭｃＡｕｌｅｙの値であった。（Ｃｒｅａｇｈ，Ｄ．Ｃ．及びＭｃＡｕｌｅｙ，Ｗ．Ｊ．；「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ｖｏｌ  Ｃ、（Ａ．Ｊ．Ｃ．Ｗｉｌｓｏｎ編）、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｔａｂｌｅ４．２．６．８、２１９〜２２２頁（１９９２））。質量減衰係数に関する値はＣｒｅａｇｈ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌｌの値である。（Ｃｒｅａｇｈ，Ｄ．Ｃ．及びＨｕｂｂｅｌｌ，Ｊ．Ｈ．；「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ｖｏｌ  Ｃ、（Ａ．Ｊ．Ｃ．Ｗｉｌｓｏｎ編）、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｔａｂｌｅ４．２．４．３、２００〜２０６頁（１９９２））。ＳＨＥＬＸＬバージョン２０１４／７を使用して実施した精密化以外、全ての計算はＣｒｙｓｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅ結晶解析用ソフトウエアパッケージを使用して実施した。（ＣｒｙｓｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅ４．２：Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｒｉｇａｋｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（２０００〜２０１５）。東京１９６−８６６６、日本；ＳＨＥＬＸＬバージョン２０１４／７：Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．（２００８）。Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ａ６４、１１２〜１２２）。
【０１４９】
結晶データ、強度測定、及び構造の解明と精密化は以下に示した通りである：
Ａ．結晶データ
実験式  Ｃ２２Ｈ３３Ｎ１０Ｏ７Ｐ
式重量  ５８０．５４
結晶色、晶癖  ｎＯＮＥ、ｎＯＮＥ
結晶寸法  記載なし
結晶系  単斜晶系
格子タイプ  Ｃ中心型
ユニットに使用した反射数
セル測定（２θ範囲）  ３６４７３（７．７〜１４７．１°）
ハーフハイトでのオメガスキャンピーク幅  ０．００°
格子パラメーター  ａ＝３３．３５２３（２）Å
ｂ＝１３．８００２０（１１）Å
ｃ＝１４．１９９５６（１０）Å
β＝９６．８０７５（６）°
Ｖ＝６４８９．５３（８）Å３
空間群  Ｃ２（＃５）
Ｚ値  ４
Ｄ計算値  ０．５９４ｇ／ｃｍ３
Ｆ０００  １２２４．００
μ（ＣｕＫα）  ６．０１１ｃｍ−１
Ｂ．強度測定
回折計
放射線  Ｃｕ−Ｋα（λ＝１．５４１８７Å）グラファイト単色
取り出し角  ２．８°
検出器の口径  ２．０〜２．５ｍｍ水平面
２．０ｍｍ垂直面
結晶から検出器の距離  ２１ｍｍ
温度  ２３．０℃
スキャンタイプ  ω−２θ
スキャン率  ０．０°／分（ω単位）（０スキャンまで）
スキャン幅  （０．００＋０．００ｔａｎθ）°
２θｍａｘ  １４７．７°
測定した反射数  合計：５０７９５
固有：１２００８（Ｒｉｎｔ＝０．０４５３）
パーソンズ指数（Ｆｌａｃｋ  ｘパラメーター）：４８１３
補正  ローレンツ分極
吸収補正（透過因子０．３４１〜１．０００）
Ｃ．構造の解明と精密化
構造の解明  直接法（ＳＨＥＬＸＴバージョン２０１４／５）
精密化  Ｆ２における完全行列最小二乗法
最小関数  Σｗ（Ｆｏ２−Ｆｃ２）２
加重最小二乗法  ｗ＝１／［σ２（Ｆｏ２）＋（０．１０００・Ｐ）２＋０．００００・Ｐ］、前式でＰ＝（Ｍａｘ（Ｆｏ２，０）＋２Ｆｃ２）／３
２θｍａｘカットオフ  １４７．７°
異常分散  全て非水素原子
観察数（全反射）  １２００８
変数の数  ８４９
反射／パラメーター比  １４．１４
残差：Ｒ１（Ｉ＞２．００σ（Ｉ））  ０．０５２２
残差：Ｒ（全反射）  ０．０５３４
残差：ｗＲ２（全反射）  ０．１６３２
適合度指標  １．４５０
Ｆｌａｃｋパラメーター  （パーソンズ指数＝４８１３）  ０．０２９（７）
最終サイクル中の最大シフト／誤差  ０．００１
最終差フーリエ図における最大ピーク  １．７９ｅ−／Å３
最終差フーリエ図における最小ピーク  −０．６９ｅ−／Å３
【０１５０】
［化合物１００に関する１Ｈ−ＮＭＲデータ］
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ８．２５（ｓ，１Ｈ）、８．１５（ｓ，１Ｈ）、７．４０（ｓ，１Ｈ）、５．８５（ｄ，１Ｈ）、５．４５（ｄ，１Ｈ）、４．２５（ｍ，２Ｈ）、４．０５（ｍ，１Ｈ）、３．８５（ｍ，１Ｈ）、３．６（ｍ，２Ｈ）、３．４（ｍ，４Ｈ）、２．９０（ｍ，４Ｈ）、２．６０（ｄ，６Ｈ）、１．８（ｓ，３Ｈ）。
【０１５１】
本出願中で言及した全ての文書は参照により本明細書に組み込まれている。組み込み文書と本文書の間に何らかの不一致があった場合、従って本文書が統制する。
【図１】
2022003067.tif 000045
【図２】
2022003067.tif 000046
【図３】
2022003067.tif 000047
【図４Ａ】
2022003067.tif 000048
【図４Ｂ】
2022003067.tif 000049
【図５】
2022003067.tif 000050
【図６】
2022003067.tif 000051
【図７】
2022003067.tif 000052
【図８】
2022003067.tif 000053
【図９Ａ】
2022003067.tif 000054
【図９Ｂ】
2022003067.tif 000055
【配列表】
2022003067000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年10月26日(2021.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも９０％立体化学的に純粋なホスホラミドクロリデートモルホリノモノマーを選択するステップ、及び
選択した少なくとも９０％立体化学的に純粋なホスホラミドクロリデートモルホリノモノマーの立体特異的カップリングによって少なくとも９０％ジアステレオマーとして純粋なホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを合成するステップ
を含む、少なくとも９０％ジアステレオマーとして純粋なキラルリン酸結合を含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを調製するための方法であって、
前記立体特異的カップリングが、非プロトン性溶媒において、非求核性第３級アミン塩基又は芳香族塩基の存在下、２０℃〜５０℃の温度で実施され、
前記少なくとも９０％立体化学的に純粋なホスホラミドクロリデートモルホリノモノマーが、ホスホラミドクロリデートモルホリノモノマーのジアステレオマー混合物を分離することで得られる、方法。
【請求項２】
前記ジアステレオマー混合物の分離が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、擬似移動床式クロマトグラフィー、及び向流クロマトグラフィーからなる群から選択されるクロマトグラフィーによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも９０％立体化学的に純粋なホスホラミドクロリデートモルホリノモノマーが、式２０の化合物、式２１の化合物、式２２の化合物、式２３の化合物、式２４の化合物、式２５の化合物、式２６の化合物、式２７の化合物、式２８の化合物、式２９の化合物、式３０の化合物、及び式３１の化合物並びにそのエナンチオマーからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法
【表１】
2022003067.tif 000056
2022003067.tif 000057
［式中、Ｒ１とＲ２は、同一であっても異なってもよく、−Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル、任意選択で置換されたフェニル、任意選択で置換されたナフチルからなる群から選択され、又はそれらが結合している窒素と共に、例えば、ピロリジン、ピペラジン、及びモルホリンであってもよい任意選択で置換された複素環を形成し、
Ｒ３は、ＭＭＴｒ（ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル）、置換トリチルであってもよいトリチル（Ｔｒ）、任意選択で置換されたベンジル、４−メトキシベンジル（ＰＭＢ、ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジル、ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）、４−メトキシベンジル、及び切断可能なスルホニルからなる群から選択され、
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、及び−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７からなる群から選択され、式中、Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ベンジル、２，２，２−トリクロロエチル、又はアリールであり、
Ｒ９は、任意選択で置換されたアルキル、シアノエチル、アシル、カルボネート、カルバメート、任意選択で置換されたベンジル、４−ピバロイルオキシベンジル、及びシリルからなる群から選択される］。
【請求項４】
前記切断可能なスルホニルが、２−ニトロベンゼンスルホニル、４−ニトロベンゼンスルホニル、及び２，４−ジニトロベンゼンスルホニルからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ジアステレオマーとして純粋なホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーが、少なくとも９５％ジアステレオマーとして純粋である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ジアステレオマーとして純粋なホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーが、少なくとも９９％ジアステレオマーとして純粋である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ジアステレオマーとして純粋なホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーが、１００％ジアステレオマーとして純粋である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法で製造された、少なくとも９０％ジアステレオマーとして純粋な、キラルリン酸結合を含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー。
【請求項９】
請求項８に記載の少なくとも９０％ジアステレオマーとして純粋な、キラルリン酸結合を含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー、又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。
【請求項１０】
前記ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーが、
【化１】
2022003067.tif 000058
［式中、
Ｒは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ７又はＣ（Ｏ）ＯＲ７から選択され；
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル又はアリールから選択され、ここで前記アリールは、ハロゲン、ニトロ及びメトキシからなる群から選択される置換基で任意選択で置換されている］
からなる群から選択されるモノマー、及び
式２８
【化２】
2022003067.tif 000059
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、フェニル又はナフチルから選択され、ここで前記Ｃ１〜Ｃ３アルキル、フェニル及びナフチルは、ハロゲン、ニトロ、シアノ、メチル及びエチルからなる群から選択される１つ又は複数の置換基でそれぞれ任意選択で置換されており；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、フェニル又はナフチルから選択され、ここで前記Ｃ１〜Ｃ３アルキル、フェニル及びナフチルは、ハロゲン、ニトロ、シアノ、メチル及びエチルからなる群から選択される１つ又は複数の置換基でそれぞれ任意選択で置換されており；
Ｒ３は、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル又はベンジルから選択され、ここでトリフェニルメチル及びベンジルのフェニル部分は、１つまたは複数のメトキシ置換基で任意選択で置換されている］
のモノマーをＮ−エチルジイソプロピルアミンの存在下で含む３量体から１６量体のオリゴマーから選択される、請求項８に記載の少なくとも９０％ジアステレオマーとして純粋な、キラルリン酸結合を含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー。
【外国語明細書】
2022003067000001.pdf