(57)【要約】【課題】アトピー性皮膚炎を自然発症する遺伝子を有するマウスを提供すること。【解決手段】本発明によれば、下記特性の原因遺伝子であるｎａｄ遺伝子をヘテロまたはホモの状態で有するアトピー性皮膚炎マウスであって、該特性が常染色体性の劣性遺伝形質であるアトピー性皮膚炎マウスが提供される：（１）初期病変として、生後４〜５週齢で眼瞼に浮腫が認められ、その後、口唇および顔面に浮腫が認められ、顔面と首、前肢屈曲部位、胸部に湿疹および脱毛が認められる；（２）アトピー性皮膚炎の病変部皮膚には、皮膚の肥厚または剥離が認められ、マスト細胞の脱顆粒現象が認められる。【選択図】　図１
2004105113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記特性の原因遺伝子であるｎａｄ遺伝子をヘテロまたはホモの状態で有する、アトピー性皮膚炎マウスであって、
該特性が常染色体性の劣性遺伝形質である、アトピー性皮膚炎マウス：
（１）初期病変として、生後４〜５週齢で眼瞼に浮腫が認められ、その後、口唇および顔面に浮腫が認められ、顔面と首、前肢屈曲部位、胸部に湿疹および脱毛が認められる、
（２）アトピー性皮膚炎の病変部皮膚には、皮膚の肥厚または剥離が認められ、マスト細胞の脱顆粒現象が認められる。
【請求項２】
該特性として、
（３）血中ＩｇＥ値は、１０週齢において少なくとも１，０００ｎｇ／ｍｌを示す、
（４）６週齢以上の雌の血中ＩｇＥ値は、同週齡の雄の血中ＩｇＥ値よりも高い、
ことをさらに含んでなる、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
ｎａｄ遺伝子をホモの状態で有する、請求項１または２に記載のマウス。
【請求項４】
ｎａｄ遺伝子が、第１０染色体中のマイクロサテライトマーカーＤ１０ｍｉｔ５３およびＤ１０ｍｉｔ１９３と緊密に連鎖するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマウス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のマウスの子孫であって、請求項１または２に記載の特性を示す、マウス。
【請求項６】
任意のラボラトリーマウスに、ｎａｄ遺伝子を戻し交配により導入することにより得られるコンジェニックマウスである、請求項５に記載のマウス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、アトピー性皮膚炎を自然発症する遺伝子を有するマウスに関する。
【０００２】
背景技術
アトピー性皮膚炎は、主として遺伝的素因に基づく慢性の皮膚疾患である。アトピー性皮膚炎は、食事性抗原やダニをはじめとする吸入性抗原、または、熱、寒さ、湿気、外傷、精神緊張、感染などの各種ストレスによる免疫、自立神経、内分泌の異常等の種々の刺激によって生ずるものであり、アレルギー疾患の一つである。
【０００３】
近時、小児アトピー性皮膚炎患者が著しく増加しつつあり、また、その難治化、および成人化等が進み、それらが大きな社会問題となっている。
しかしながら、アトピー性皮膚炎の発症機序は未だに明確ではなく、適切な治療がなされているとは言い難い。
したがってヒトのアトピー性皮膚炎と同じまたは類似の病態を発症させるモデル動物が存在するならば、アトピー性皮膚炎の発症機序の解明、治療薬の開発に当たって、その寄与は大きなものが期待される。
【０００４】
従来アトピー性皮膚炎のモデル動物としては、下記の２つが知られている：
（ｉ）　ＮＣマウス（ＮＣ／Ｎｇａマウス）［例えば、Ｈｉｒｏｓｈｉ　Ｍａｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．９，　Ｎｏ．３，　ｐｐ４６１−４６６　（１９９７）（非特許文献１）、および　Ｈａｊｉｍｅ　Ｓｕｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔ　Ａｒｃｈ　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　１２０　（ｓｕｐｐｌ　１），　ｐｐ７０−７５　（１９９９）（非特許文献２）］、および、
（ｉｉ）　ＮＯＡマウス［例えば、Ｋｏｎｄｏ　Ｔａｉｚｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｕｓｅ　Ｇｅｎｏｍｅ，　９５，　ｐｐ６９８−７００　（１９９７）（非特許文献４）］。
【０００５】
このうち、ＮＣ／Ｎｇａマウスは、アトピー性皮膚炎のモデルマウスとして多く使用されている。
しかしながら、ＮＣ／Ｎｇａマウスは、ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｈａｔｈｏｇｅｎ　ｆｒｅｅ）（特定の病原微生物に感染していない状態）環境下では全く皮膚炎を発症しないため、通常は、コンベンショナル環境でのダニ感染（ダニ由来アレルゲン付与）によって人為的に皮膚炎を発症させる必要がある。モデルマウスを用いた実験に使用する場合には、多数のマウスを発症させる必要があるため、実験は煩雑にならざるを得なかった。また、ダニ感染よる皮膚炎の発症も必ずしも全てに起きないため、発症したマウスのみをさらに実験用に選抜する必要があった。さらに、ＮＣ／Ｎｇａマウスは１９５０年代に愛玩用マウスから育成された近交系であるため、ＮＣ／Ｎｇａマウスと同一の遺伝的背景をもつ正常コントロールマウスが存在しない。アトピー性皮膚炎が多数の遺伝子による複雑な免疫現象のひとつであることを考えれば、ＮＣ／Ｎｇａマウスと同一の遺伝的背景をもつ正常なコントロールマウスが存在しない状態では、その本態に迫ることは困難と思われる。
【０００６】
ＮＣ／Ｎｇａマウスについては、アトピー性皮膚炎原因遺伝子が第９染色体にマッピングされたことが報告されているが［Ｙｕｋｉ　Ｋｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，　５３，　ｐｐ１５−２１　（２００１）（非特許文献３）］、その原因遺伝子についての探索も未だ充分とはいえない。
【０００７】
ＮＯＡマウスについても、そのアトピー性皮膚炎の主要な原因遺伝子が第１４染色体にマッピングされ、副原因遺伝子が第７染色体および第１３染色体にマッピングされたことが報告されている［Ｋｙｏｋｏ　Ｎａｔｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ，　４４，　ｐｐ３７２−３７６　（１９９９）（非特許文献５）、および　Ｏｔｓｕ　Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ，　４６，　ｐｐ２２１−２２４　（２００１）（非特許文献６）］。しかしながら、ＮＯＡマウスも、ＮＣ／Ｎｇａマウスと同様に正常コントロールマウスが存在せず、またその原因遺伝子についての探索も未だ充分とはいえない。
【０００８】
したがって、アトピー性皮膚炎を自然発症し、かつ、正常なコントロールが存在するアトピー性皮膚炎のモデル動物が提供されれば、アトピー性皮膚炎の原因解明、予防、治療、創薬研究等において極めて有用であると思われる。本発明者の知る限り、そのようなモデル動物の提供は依然としてなされていない。
【０００９】
なお上記記載中で挙げられた文献を列記すると下記の通りである。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｈｉｒｏｓｈｉ　Ｍａｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｔｏｐｉｃ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ−ｌｉｋｅｓｋｉｎ　ｌｅｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＩｇＥ　ｈｙｐｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ＮＣ／Ｎｇａ　ｍｉｃｅ”，　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．９，　Ｎｏ．３，　ｐｐ４６１−４６６　（１９９７）．
【非特許文献２】
Ｈａｊｉｍｅ　Ｓｕｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　”ＮＣ／Ｎｇａ　Ｍｉｃｅ：　Ａ　Ｍｏｕｓｅ　Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　Ａｔｏｐｉｃ　Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ”，　Ｉｎｔ　Ａｒｃｈ　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　１２０　（ｓｕｐｐｌ　１），　ｐｐ７０−７５　（１９９９）．
【非特許文献３】
Ｙｕｋｉ　Ｋｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　”Ａ　ｍａｊｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ−ｔｒａｉｔ　ｌｏｃｕｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ａｔｏｐｉｃ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ−ｌｉｋｅ　ｓｌｉｎ　ｌｅｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ＮＣ／Ｎｇａ　ｍｉｃｅ　ｉｓ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｏｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　９”，　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，　５３，　ｐｐ１５−２１　（２００１）．
【非特許文献４】
Ｋｏｎｄｏ　Ｔａｉｚｏ　ｅｔ　ａｌ．，　”Ｔｈｅ　’ＮＯＡ’　ｍｏｕｓｅ：　ａ　ｎｅｗ　ｈａｉｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｕｔａｎｔ　（ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）”，　Ｍｏｕｓｅ　Ｇｅｎｏｍｅ，　９５，ｐｐ６９８−７００　（１９９７）．
【非特許文献５】
Ｋｙｏｋｏ　Ｎａｔｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，　”Ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ　ｉｎ　ＮＯＡ　（Ｎａｒｕｔｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｏｔｓｕｋａ　Ａｔｒｉｃｈｉａ）　ｍｉｃｅ，　ａｎ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ”，　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ，　４４，　ｐｐ３７２−３７６　（１９９９）．
【非特許文献６】
Ｏｔｓｕ　Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　”Ｌｏｃｉ　ｏｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　７　ａｎｄ　１３　ｔｈａｔ　ｍｏｄｉｆｙ　ｔｈｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭＯＡ　ｍｏｕｓｅ，　ａｎ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ａｔｏｐｏｉｃ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ”，　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ，　４６，　ｐｐ２２１−２２４　（２００１）．
【００１１】
【発明の概要】
本発明者は今般、アトピー性皮膚炎を自然発症するマウスの作出に成功した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１２】
よって、本発明はアトピー性皮膚炎を自然発症する遺伝子を有するマウスの提供をその目的としている。
【００１３】
そして本発明によるマウスは、下記特性の原因遺伝子であるｎａｄ遺伝子をヘテロまたはホモの状態で有するアトピー性皮膚炎マウスであって、該特性が常染色体性の劣性遺伝形質であるものである。
（１）初期病変として、生後４〜５週齢で眼瞼に浮腫が認められ、その後、口唇および顔面に浮腫が認められ、顔面と首、前肢屈曲部位、胸部に湿疹および脱毛が認められる、
（２）アトピー性皮膚炎の病変部皮膚には、皮膚の肥厚または剥離が認められ、マスト細胞の脱顆粒現象が認められる。
【００１４】
本発明の一つの好ましい態様によれば、前記特性として、
（３）血中ＩｇＥ値は、１０週齢において少なくとも１，０００ｎｇ／ｍｌを示す、
（４）６週齢以上の雌の血中ＩｇＥ値は、同週齡の雄の血中ＩｇＥ値よりも高い、
ことをさらに含んでなる、アトピー性皮膚炎マウスが提供される。
【００１５】
【発明の具体的説明】
受精卵の寄託
本発明によるマウスの受精卵、すなわちｎａｄ遺伝子をヘテロの状態で有するマウスの受精卵は、ＮＡＤマウス（ＮＡＤ　ｍｏｕｓｅ）の表示で、平成１４（２００２）年６月２０日（受託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８９４である。
【００１６】
本発明によるマウス
本明細書において、アトピー性皮膚炎マウスという場合には、特に記載のない限り、アトピー性皮膚炎の原因遺伝子であるｎａｄ遺伝子を、ホモまたはヘテロのいずれの状態で有するものを意味する。したがって、本発明によるアトピー性皮膚炎マウスは、前記特性の原因遺伝子をヘテロまたはホモの状態で有する限りにおいて、そのマウスの種類（系統、交雑系など）、すなわちその遺伝的背景としてのマウスの種類自体は、特に制限されない。よって、該マウスの系統としては、ＮＡＤマウスの由来となった近交系ＫＯＲマウスの他に、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＡＫＲ／Ｍｓ、およびＡ／Ｊマウス等が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、ＮＡＤマウスという場合には、本発明によるアトピー性皮膚炎マウスであって、ＫＯＲマウス由来のものをいう。
【００１８】
またここで、ホモ接合体とは、下記特性の原因遺伝子であるｎａｄ遺伝子をホモの状態で有するマウスを意味し、ヘテロ接合体とは、ｎａｄ遺伝子をヘテロの状態で有するマウスを意味する。
したがって、本発明によるアトピー性皮膚炎マウスには、アトピー性皮膚炎を自然発症するホモ接合体、および皮膚炎を発症しないヘテロ接合体のいずもが包含される。なおヘテロ接合体は、正常マウスと同等の寿命を有するため、扱いやすく、継代や運搬等を行う場合に有利となることがある。
【００１９】
本明細書において、「自然発症」とは、突然変異等の天然由来の形質をひきつぐことにより、アトピー性皮膚炎を発症することができるか、またはアトピー性皮膚炎を潜在的に発症し得る状態にあることをいう。ここで「アトピー性皮膚炎を潜在的に発症し得る状態にある」とは、原因遺伝子をヘテロの状態で有する場合をいう。したがって、本発明によるマウスは、アトピー性皮膚炎を自然発症するか、また自然発症を潜在的にし得るものであり、遺伝子工学的技術を用いて遺伝子を人為的に操作したマウス、例えばノックアウト型マウスおよびトランスジェニック型マウスとは区別されるものである。
【００２０】
マウスの由来
本発明者は、１９８８年および１９８９年に福島県郡山市で捕獲した日本産野生マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ　ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ）由来の近交系ＫＯＲマウスの中に、アトピー性皮膚炎を自然発症するマウスを見出した。本発明者は、これをＮＡＤ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ａｔｏｐｉｃ　Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）マウスと命名した。
【００２１】
マウスの特性
本発明によるアトピー性皮膚炎マウスは、下記特性１）〜５）を発現する原因遺伝子（ｎａｄ遺伝子）をヘテロまたはホモの状態で有するものである。
【００２２】
１）外観的特徴
アトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）には、初期病変として、生後４〜５週齢時で眼瞼に浮腫が認められる。その後、口唇と顔面に浮腫が認められ、同時に顔面と首、前肢屈曲部位、胸部に湿疹および脱毛が認められる。この湿疹および脱毛は、通常、前肢による掻痒行動によってさらに悪化する。浮腫や、湿疹および脱毛に関するこれらの症状は、ヒトのアトピー性皮膚炎のものに酷似している。また通常、雄よりも同週齡の雌の方が発症した皮膚炎の症状は重い。
【００２３】
例えば、７週齢のアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）の例では、眼瞼の浮腫が肥大化し、閉眼し、また、顔面全体に浮腫が広がり、正常マウスに比べて腫れあがっている。このことはこのマウスと同腹の同週齡正常マウスとの外観比較より明らかである（図１）。また、１９週齢の雄のアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）の例では、皮膚炎による病変部皮膚の症状がさらに進行して、顔面の皮膚が剥離し、滲出、血痂、びらんが認められる（図２）。
【００２４】
２）病理組織の所見
アトピー性皮膚炎の病変部皮膚には、皮膚の肥厚または剥離が認められ、マスト細胞の増加と脱顆粒現象が認められる。また単核細胞の浸潤を伴う海綿状態と真皮の血管周囲性の炎症細胞が認められ、マクロファージの増加も認められる。さらに、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現が認められる。
【００２５】
３）血中ＩｇＥ値
アトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）の血中ＩｇＥ値は、４週齢以後から正常マウスに比べて明らかに高い値を示す。その値は、週齡を経るに従って顕著に高くなる。すなわち、アトピー性皮膚炎マウスの血中ＩｇＥ値は、１０週齢において少なくとも１，０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２，０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは３，０００ｎｇ／ｍｌを示す。具体例を示すと、例えば１０週齢において雄マウスの血中ＩｇＥ値は約５，０００ｎｇ／ｍｌであり、雌マウスの血中ＩｇＥ値は約１３，０００ｎｇ／ｍｌである。正常マウスの血中ＩｇＥ値は、通常１００ｎｇ／ｍｌ以下であることから、アトピー性皮膚炎マウスの血中ＩｇＥ値は、正常マウスの１０倍以上、１０週齢以後のマウスではその１００倍以上、の高ＩｇＥ血症を示す。
また、アトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）においては、雌の血中ＩｇＥ値は、同週齡の雄の血中ＩｇＥ値よりも通常高くなる。例えば、６週齢以上の雌の血中ＩｇＥ値は、同週齡の雄の血中ＩｇＥ値よりも通常高くなる。
【００２６】
４）遺伝様式
本発明によるアトピー性皮膚炎マウスの特性は、常染色体性の劣性遺伝形質である。すなわち、本発明によるマウスの交配実験によれば、アトピー性皮膚炎は、常染色体劣性遺伝様式によって発症し、単純なメンデル遺伝に従った。本発明によるマウスのアトピー性皮膚炎は、その原因遺伝子であるｎａｄ遺伝子をホモの状態で有する場合（ホモ接合体の場合）において発症する。一方、ヘテロ接合体の外観は正常であり、血中ＩｇＥ値も正常である。
【００２７】
したがって、本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）と任意のラボラトリーマウスとの交配によって得られたＦ１個体は、ヘテロ接合体であるため、病変は認められない。Ｆ１個体同士の交配により得られるＦ２個体は、その約１／４はホモ接合体となるため、この個体はアトピー性皮膚炎と高ＩｇＥ血症とを発症する。
【００２８】
５）原因遺伝子であるｎａｄ遺伝子の染色体マッピング
本発明におけるアトピー性皮膚炎の原因遺伝子であるｎａｄ遺伝子は、第１０染色体にのっていることが、本発明者によりここで明らかにされている。そして、ｎａｄ遺伝子は、第１０染色体中のマイクロサテライトマーカーＤ１０ｍｉｔ５３およびＤ１０ｍｉｔ１９３の極近傍（１８．６ｃＭ）にあり、これらと緊密に連鎖する。ここでこれらマイクロサテライトマーカーとｎａｄ遺伝子との関連性は、例えば次のようにして評価することができる。
【００２９】
ＮＡＤマウスと、ＢＡＬＢ／ｃマウスとからＦ２個体を得、このＦ２個体のうち、アトピー性皮膚炎発症全個体の各マイクロサテライトマーカーの電気泳動像を、ＮＡＤホモタイプか、ＢＡＬＢ／ｃホモタイプまたはＦ１ヘテロタイプかを判定する。得られた結果とそれらの理論値との適合性をχ２検定により評価すると、χ２値は、２００以上の値を示す（実施例参照）。例えば文献［Ｙｕｋｉ　Ｋｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，　５３，　ｐｐ１５−２１　（２００１）（非特許文献３）］によれば、このχ２値が１５．２以上であると高度の関連性を有するとされており、さらにこの文献では１６．４の場合が記載されている。したがって、上記χ２値（＝２００以上）の値は従来の場合に比べて顕著な関連性を有すものである。
【００３０】
したがって、前記「緊密に連鎖する」という場合の「緊密」とは、このような顕著な関連性（好ましくはχ２値が５０以上、より好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００〜３００である場合）を有する場合を意味する。
【００３１】
なお、マウスの第１０染色体は、ヒト染色体の１２ｑおよび６ｑと相同性があることが知られている。この部位にはＩｇＥ産生を抑制するインターフェロンγ、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ　（ＳＣＦ）、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ（ＬＴＡ４Ｈ）、ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ−Ｙ　ｂ　ｓｕｂｕｎｉｔ　（ＮＦ−ＹＢ）、ＳＴＡＴ６、インターフェロンγレセプター１およびＴＮＦαＩＰ３などのアトピーの原因につながる候補遺伝子が存在する。
【００３２】
前記したように、既知のＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎原因遺伝子は、第９染色体にマッピングされており、また、ＮＯＡマウスの主要な原因遺伝子は第１４染色体にマッピングされており、さらにその副原因遺伝子は第７染色体および第１３染色体にマッピングされていることが知られている。したがって、本発明によるマウスは、公知のＮＣ／ＮｇａマウスおよびＮＯＡマウスとは、原因遺伝子が異なる新規アトピー性皮膚炎発症マウスである。
【００３３】
マウスの寿命
本発明によるマウス（ＮＡＤマウス）では、生後２ヶ月齢のアトピー性皮膚炎マウスの平均生存率は５０％以上であり、生後４ヶ月齢のマウスの平均生存率は５０％未満である。ここで平均生存率とは、評価する個体全体に対して同週齡において生存している個体数の割合を示す。
ＮＡＤマウスの平均寿命は、通常、約３ヶ月程度であり、寿命は長いものでも８月齢以下である。ここで平均寿命とは、複数のマウスの寿命の平均値のことをいい、前記平均寿命の値はホモ接合個体である雌１２個体と雄１５個体とから求められた値である。正常マウスの平均寿命が約２年であるため、アトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）の平均寿命は正常マウスに比べて著しく短命であるといえる。
【００３４】
マウスの継代
本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）の皮膚炎の症状は、雄よりも雌の方が重くなる傾向が強く、繁殖力が劣る傾向がある。したがって、継代維持はヘテロ接合雌個体とホモ接合雄個体の交配によって行うことが望ましい。このような交配によって得られる子のうち、アトピー性皮膚炎の発症個体は雌雄共にすべてホモ接合個体であり、外観上正常な個体は雌雄共にすべてヘテロ接合個体である。
さらに次世代を得たい場合には、例えば、同様にヘテロ接合雌個体とホモ接合雄個体とによる交配により得ることができる。
【００３５】
外観によるホモ接合個体とヘテロ接合個体との判別は、４〜６週齢、すなわち交配時期までに、眼瞼における浮腫、眼周囲の脱毛、上下唇の浮腫などの初期症状の有無によって容易に行うことができる。
またホモ接合個体は、生後５〜６週齢以降において、血中ＩｇＥ値が高い値を示すようになるので、その個体から微量の採血とその検査により、ホモ接合個体とヘテロ接合個体との判別を容易に行うことが可能である。なおこの場合、血中のＩｇＥ濃度が少なくとも１，０００ｎｇ／ｍｌであるものが、ホモ接合個体と判断される。
【００３６】
マウスの繁殖
本発明によるマウスの繁殖は、近交系動物の繁殖に通常用いられているように、兄妹交配によって増殖を行って、必要なマウス数を確保することができる。
【００３７】
例えば、雌のヘテロ接合個体と雄のホモ接合個体とを用いて交配させ、生まれる子の中から、前記したような判別手段を用いてホモ接合個体を選択することによって、目的とする多くの個体を得ることができる。
【００３８】
よって本発明の別の態様によれば、該アトピー性皮膚炎マウス同士を交配させ、ｎａｄ遺伝子をホモの状態で有するマウスを選択することを含んでなる、アトピー性皮膚炎を自然発症するモデルマウスの作出方法が提供される。
【００３９】
マウスの飼育条件
本発明によるアトピー性皮膚炎マウスの飼育条件は、特に制限はなく慣用のマウス飼育法にしたがって飼育することができる。例えば、飼育条件は、室温２２±２℃で、湿度６５±５％のＳＰＦ環境で、飼料として、普通飼料（船橋農場製、Ｆ２）を不断給餌し、水は水道水を自由摂取させることである。またマウスは、木製チップを床敷きにしたアルミケージ内で飼育することができる。
【００４０】
本発明によるマウスは、任意のラボラトリーマウスとを交配させて得られる交雑マウスや、後述するコンジェニック系マウスを包含する。
【００４１】
本発明の別の態様によれば、前記したアトピー性皮膚炎マウスの子孫であって、前記した特性を示すマウスが提供される。
ここでいう子孫には、本発明によるアトピー性皮膚炎マウスと、任意のラボラトリーマウスとを交配させて得られる交雑マウスや、後述するコンジェニック系マウスが包含される。
【００４２】
本発明のさらに別の態様によれば、下記の常染色体性の劣性遺伝形質を有する、アトピー性皮膚炎マウスが提供される：
（１）初期病変として、生後４〜５週齢で眼瞼に浮腫が認められ、その後、口唇および顔面に浮腫が認められ、顔面と首、前肢屈曲部位、胸部に湿疹および脱毛が認められる、
（２）アトピー性皮膚炎の病変部皮膚には、皮膚の肥厚または剥離が認められ、マスト細胞の脱顆粒現象が認められる。
【００４３】
コンジェニック系マウス
本発明によれば、任意のラボラトリーマウスに、ｎａｄ遺伝子を戻し交配により導入することによって得られるコンジェニックマウスであるアトピー性皮膚炎マウス、すなわちコンジェニック系マウスが提供される。このコンジェニック系マウスは、ｎａｄ遺伝子以外について、遺伝的背景がＮＡＤマウスではなく、任意のラボラトリーマウスとなっているものである。このコンジェニック系マウスもｎａｄ遺伝子を有するため、アトピー性皮膚炎を発症する。
【００４４】
このようなコンジェニック系マウスは、ＮＡＤマウス（ホモ接合体）と、任意のラボラトリーマウスとを公知の戻し交雑育種法にしたがって戻し交配を進めることにより、作出することができる。このとき、供与親をＮＡＤマウス（ホモ接合体）とし、反復親を任意のラボラトリーマウスとする。また通常戻し交配によりコンジェニック系マウスを確立する場合には、交配世代は少なくとも８世代、典型的には１２世代程度経る必要がある。
またここで用いられる任意のラボラトリーマウスとしては、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＡＫＲ／ＭｓおよびＡ／Ｊマウスが挙げられる。
【００４５】
具体例として本発明者は、ラボラトリーマウスとして、免疫学的にヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の機能が異なりＴｈ２優位なＢＡＬＢ／ｃマウスと、Ｔｈ１優位なＣ５７ＢＬ／６マウスとを用いて、遺伝的背景の異なる２系統のコンジェニック系マウスの作出を行っている。
コンジェニック系マウスはＮ１２世代で完成するとされており、作出には通常３〜４年を要する。Ｎ３世代においてすでに、ＢＡＬＢ／ｃ系とＣ５７ＢＬ／６系との両方について、表現型に差異が本発明者により確認されている。このような状況から、当業者であれば、コンジェニック系マウスの作出が可能であることが理解できよう。
【００４６】
ＮＡＤマウスは、前記したように日本産野生マウスの遺伝的背景を持つのに対して、原因遺伝子をラボラトリーマウスに導入したコンジェニック系マウスは、異なる遺伝的背景を持つ。このため、ＮＡＤマウスと、コンジェニック系マウスとは、遺伝的背景の差異がアトピー性皮膚炎の病態に及ぼす影響を解析するのに有用である。
【００４７】
モデル動物としての有用性
（ａ）　本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）は、ＳＰＦ環境下においてもアトピー性皮膚炎を自然発症することができ、その発症率も１００％である。これに対して、既知のアトピー性皮膚炎のモデルマウスであるＮＣ／Ｎｇａマウスは、ＳＰＦ環境下では全く発症せず、ダニ感染による人為的発症処理を別途必要とする。本発明のマウスによれば、ＳＰＦ環境下でも皮膚炎を発症するため、実験処理を簡便にすることができ、また実験精度を高めることができる。よって、本発明のマウスは、アトピー性皮膚炎の発症機序、その予防および治療、創薬研究の分野において有用な研究用モデルマウスになると考えられる。
【００４８】
（ｂ）　本発明によるマウス（特にＮＡＤマウス）は、系統として確立されている近交系ＫＯＲマウスに由来するものであるため、このＫＯＲマウスを正常のコントロールマウスとして使用することができる。すなわち、アトピー性皮膚炎マウス（ＮＡＤマウス）（異常マウス）と、コントロールとなるＫＯＲマウス（正常マウス）とは、遺伝的背景を同じとするため、これらを用いて実験系を構築することにより、研究の精度を高める等することができる。既知のＮＣ／Ｎｇａマウス等は、遺伝的背景を同じとするようなコントロールとなるマウスの系統が存在しないため、厳密な意味での比較実験は行うことは困難であった。この点で本発明によるマウスは研究用モデルマウスとして極めて有用であるといえる。
【００４９】
（ｃ）　本発明によるアトピー性皮膚炎マウスは、その皮膚炎の原因遺伝子（ｎａｄ遺伝子）が存在する染色体の番号（第１０染色体）、およびその染色体上における番地もほぼ特定されいる。またこのマウス第１０染色体と、ヒト染色体とのおおよその対応関係も知られている。これらの情報を有するため、本発明によるマウスは、アトピー性皮膚炎の発症機序、その予防および治療、創薬研究の分野における研究において優れたモデルマウスになると考えられる。また本発明によるマウスは、ヒトのアトピー性皮膚炎の未知の原因遺伝子の探索のためのモデルとして多方面での利用が期待される。
【００５０】
（ｄ）　本発明によるアトピー性皮膚炎マウスを用いることにより、そのコンジェニック系マウスの系統を構築することができる。このようなコンジェニック系マウスの系統の構築は、未だ不明な点が多いヒトアトピー性皮膚炎の発症機序の解明、新しい治療戦略と創薬研究、遺伝子治療ターゲットの選定、個別化治療の開発、予防法等に有用であると考えられる。またコンジェニック系マウスの遺伝的背景としたラボラトリーマウスが正常コントロールマウスとして使用することができる。さらにコンジェニック系マウスとすることにより、マウスの繁殖性を向上させ、寿命を延ばすことが可能となる。すなわちこのようなことから、コンジェニック系マウスは、有用な疾患モデルマウスとなると期待される。
【００５１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００５２】
作出の経緯
本発明のＮＡＤマウスは、１９８８年および１９８９年に福島県郡山市で捕獲した日本産野生マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ　ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ）由来の近交系ＫＯＲマウスの中に、２０００年７月に見出された。異常は、顔面の腫れおよび脱毛等の外観上の特徴と、血中ＩｇＥ値が正常マウスの１０倍以上であることであった。
このマウスについて検索を行うと同時に、この異常が遺伝的疾患であることを想定して、両親および同腹の兄妹の交配実験によってアトピー性皮膚炎症のマウスを分離、継代し、本発明によるマウスを得た。
最初に見出された背景となるＫＯＲ系は、すでにＦ２４世代の近交系となっている。本発明のＮＡＤマウスは、そのＫＯＲ系中に突然変異として見出されたアトピー性皮膚炎マウスを、突然変異系ＮＡＤ系統として確立したものである。
【００５３】
ＮＡＤマウスは、室温は２２±２℃，湿度６５±５％のＳＰＦ環境で飼育した。飼料は普通飼料（船橋農場製、Ｆ２）を不断給餌した。水は水道水を自由摂取させ、木製チップを床敷きにしてアルミケージで飼育した。
【００５４】
血中ＩｇＥ濃度の検出
マウスの血中ＩｇＥ濃度の検出は、マウスＩｇＥ測定キット「ヤマサ」ＥＩＡ（ＹＳＥ−７６７５、ヤマサ醤油株式会社製）を用いて行った。
結果は図３に示される通りであった。
すなわち、血中ＩｇＥ値は、４週齢以後から正常マウスに比べて明らかに高い値を示し、その値は、週齡を経るに従って顕著に高くなった。アトピー性皮膚炎マウスの血中ＩｇＥ値は、１０週齢の雄で約５，０００ｎｇ／ｍｌ、同週齡の雌で約１３，０００ｎｇ／ｍｌであった。なお正常マウスの血中ＩｇＥ値は、通常１００ｎｇ／ｍｌ以下である。また、６週齢以上の雌の血中ＩｇＥ値は、同週齡の雄の血中ＩｇＥ値よりも通常高いものであった。
【００５５】
平均寿命
アトピー性皮膚炎マウスを発症したＮＡＤマウス（ホモ接合体）の内、雌１２個体と雄１５個体とをサンプルとして採用し、これらの寿命から、本発明によるマウスの平均寿命を算出した。
図４には、雄雌についての個体の生存率と、時間との関係を示した。
正常マウスの平均寿命は約２年であるが、本発明によるマウスの平均寿命は、約３ヶ月であった。また雌の方が、平均寿命は短かった。
【００５６】
病理組織の観察
ＮＡＤマウスの病変部皮膚組織と、正常マウス（ＫＯＲマウス）の皮膚組織（ＮＡＤマウスについて組織を採取した部分と同じところの組織）をそれぞれ、１０％フォルマリン固定後パラフィン包埋し、常法に従ってヘマトキシリン・エオジン（Ｈ−Ｅ）染色、トルイジンブルー染色、および免疫組織染色を行い、これを顕微鏡（倍率４００倍）により観察した。
結果は図５および図６に示される通りであった。
図５は、皮膚表層部付近の病理組織を拡大した写真である。正常マウスに比べて、異常マウスの病理組織では、皮膚組織が剥離し、皮膚の肥厚が認められる。また図６は、皮膚組織の免疫染色像の写真である。写真上段にはＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現が認められる。また、写真下段ではマクロファージの増加が認められる。
【００５７】
ＮＡＤマウスのアトピー性皮膚炎原因遺伝子の染色体マッピング
ＮＡＤマウスとＢＡＬＢ／ｃマウスとのＦ２個体約１，０００匹を作出し、これらのアトピー性皮膚炎発症の有無を、皮膚症状、病理組織学的診断および血中ＩｇＥ値により判定し、表現型を確認した。
次いでマウスの腎臓からゲノムＤＮＡを調整し、マイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析により原因遺伝子の染色体マッピングを行なった。
ＰＣＲの条件は、初期変性（９４℃で１分間）、アニーリング反応（５５℃で１分間）、および伸長反応（７２℃で１分間）を１サイクルとして、これを３０サイクル行い、最後の伸長反応は７５℃で５分とした。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅとＡｇａｒｏｓｅを３：１に混合して作成）、およびＴＢＥ緩衝液で電気泳動した後、臭化エチジウム溶液を用いて染色し、トランスイルミネーター（フナコシ社製）を用いて判定した。なおマイクロサテライトマーカーはＲｅｓｅｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社より入手した。
【００５８】
Ｆ２個体のうち、アトピー性皮膚炎発症全個体の各マイクロサテライトマーカーの電気泳動像を、ＮＡＤホモタイプか、ＢＡＬＢ／ｃホモタイプまたはＦ１ヘテロタイプかを判定した。得られた結果がその理論値（ＮＡＤホモタイプ：ＢＡＬＢ／ｃホモタイプ＋Ｆ１ヘテロタイプ＝１：３）に適合しているか否かについてχ２検定により評価した。その結果、マイクロサテライトマーカーＤ１０ｍｉｔ５３およびＤ１０ｍｉｔ１０９についてのχ２値はそれぞれ、２８６．１および２７８．１であった。
したがって、原因遺伝子（ｎａｄ遺伝子）はマウス第１０染色体上のＤ１０ｍｉｔ５３、およびＤ１０ｍｉｔ１０９の極近傍（１８．６ｃＭ）にあることが明らかになった（図７）。
【００５９】
コンジェニックマウスの作出
ＮＡＤマウス（ホモ接合体）と、ラボラトリーマウスとを公知の戻し交雑育種法にしたがって戻し交配を進めることにより、コンジェニック系マウスの作出を行った。戻し交配では、供与親をＮＡＤマウス（ホモ接合体）とし、反復親を任意のラボラトリーマウスとした。
ラボラトリーマウスとしては、免疫学的にヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の機能が異なりＴｈ２優位なＢＡＬＢ／ｃマウスと、Ｔｈ１優位なＣ５７ＢＬ／６マウスとを用いた。これにより、遺伝的背景の異なる２系統のコンジェニック系マウス
が作出される。
戻し交配開始後、ＢＡＬＢ／ｃ系とＣ５７ＢＬ／６系との両方の系統において、Ｎ３世代で、表現型に差異が確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）、およびそれと同腹の正常マウスの写真（生物の形態の写真、いずれも７週齢）である。
左：異常マウス（眼瞼の浮腫が肥大化し、閉眼して眼球が確認できず、また、顔面全体に浮腫が広がり、正常マウスに比べて腫れあがっている）。
右：正常マウス。
【図２】本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）（１９週齢雄）の写真（生物の形態の写真）である。皮膚炎による浮腫が進行して、顔面の表皮が剥離し、その皮下組織が露出している。
【図３】本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）（雌および雄）の血中ＩｇＥ濃度の週齡による変化を示した図である。
【図４】本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）の寿命を示した図である。ここで雌は１２個体の平均値であり、雄は１５個体の平均値である。
【図５】本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）の病理組織（特に皮膚表層部付近）をヘマトキシリン・エオジン（Ｈ−Ｅ）染色して、これを拡大した写真である。
左：異常マウスの病理組織（皮膚組織が剥離し、皮膚の肥厚が観察される）。
右：正常マウスの対応する箇所の組織。
【図６】本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）の免疫組織染色像の写真である。
左上：異常マウスの病理組織（ＣＤ８陽性Ｔ細胞の染色が観察される）。
右上：正常マウスの対応する箇所の組織。
左下：異常マウスの病理組織（マクロファージの染色によってその増大が観察される）。
右下：正常マウスの対応する箇所の組織。
【図７】本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）の第１０染色体における遺伝子の配置を模式的に示した図である。図の右側は、対応するヒト染色体（ヒト第６染色体）における相同部位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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