(57)【要約】　　　（修正有）【課題】哺乳動物のＬ−アミノ酸オキシダーゼを単離・同定し、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する新規タンパク質（哺乳動物のＬ−アミノ酸オキシダーゼを含む）を提供するとともに、該タンパク質によって産生される過酸化水素の抗菌作用又は殺菌作用を利用した抗菌・殺菌組成物を提供する。【解決手段】マウス由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は該アミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質を過酸化水素供給成分として抗菌・殺菌組成物に含有する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡからなる請求項２記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項１記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項７】
請求項１記載のタンパク質を過酸化水素供給成分として含有する抗菌・殺菌組成物。
【請求項８】
前記過酸化水素供給成分として、さらに遊離Ｌ−アミノ酸を含有する請求項７記載の抗菌・殺菌組成物。
【請求項９】
医薬組成物、食品添加用組成物又は化粧品添加用組成物である請求項７又は８記載の抗菌・殺菌組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物が、感染菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、又は細菌性感染症の予防・治療剤である請求項９記載の抗菌・殺菌組成物。
【請求項１１】
前記感染菌が乳房感染菌である請求項１０記載の抗菌・殺菌組成物。
【請求項１２】
前記細菌性感染症が乳房炎である請求項１０記載の抗菌・殺菌組成物。
【請求項１３】
遊離Ｌ−アミノ酸を過酸化水素供給成分として含有する乳房用抗菌・殺菌組成物。
【請求項１４】
前記過酸化水素供給成分として、さらにＬ−アミノ酸オキシダーゼを含有する請求項１３記載の乳房用抗菌・殺菌組成物。
【請求項１５】
前記Ｌ−アミノ酸オキシダーゼが、請求項１記載のタンパク質である請求項１３又は１４記載の乳房用抗菌・殺菌組成物。
【請求項１６】
乳房感染菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、又は乳房における細菌性感染症の予防・治療剤である請求項１３〜１５のいずれかに記載の乳房用抗菌・殺菌組成物。
【請求項１７】
前記細菌性感染症が乳房炎である請求項１６記載の乳房用抗菌・殺菌組成物。
【請求項１８】
家畜の乳房に遊離Ｌ−アミノ酸を投与する工程を含む家畜の乳房感染菌の抗菌・殺菌方法。
【請求項１９】
前記家畜の乳房にＬ−アミノ酸オキシダーゼを投与する工程をさらに含む請求項１８記載の抗菌・殺菌方法。
【請求項２０】
前記家畜が、その乳腺において乳汁合成が行われている家畜である請求項１８又は１９記載の抗菌・殺菌方法。
【請求項２１】
前記家畜が、その乳腺において乳汁合成が行われていない家畜である請求項１９記載の抗菌・殺菌方法。
【請求項２２】
家畜の乳房に遊離Ｌ−アミノ酸を投与する工程を含む家畜の乳房における細菌性感染症の予防・治療方法。
【請求項２３】
前記家畜の乳房にＬ−アミノ酸オキシダーゼを投与する工程をさらに含む請求項２２記載の予防・治療方法。
【請求項２４】
前記家畜が、その乳腺において乳汁合成が行われている家畜である請求項２２又は２３記載の予防・治療方法。
【請求項２５】
前記家畜が、その乳腺において乳汁合成が行われていない家畜である請求項２３記載の予防・治療方法。
【請求項２６】
前記細菌性感染症が乳房炎である請求項２２〜２５のいずれかに記載の予防・治療方法。
【請求項２７】
生乳に遊離Ｌ−アミノ酸を添加する工程を含む生乳混入菌の抗菌・殺菌方法。
【請求項２８】
前記生乳にＬ−アミノ酸オキシダーゼを添加する工程をさらに含む請求項２７記載の抗菌・殺菌方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及び上記タンパク質に対する抗体に関する。さらに、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質によって産生される過酸化水素の抗菌作用又は殺菌作用を利用した抗菌・殺菌組成物、乳房用抗菌・殺菌組成物、家畜の乳房感染菌の抗菌・殺菌方法、家畜の乳房における細菌性感染症の予防・治療方法、及び生乳混入菌の抗菌・殺菌方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳房炎は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ジスアガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｉａｇａｌａｃｔｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・ピオゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｔｅｒｉｕｍ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等の病原菌が乳頭口から乳房内に侵入し、乳房内で炎症を起こす疾病であり、乳房を有する哺乳動物において発症する疾病である。哺乳動物の中でも、頻繁に搾乳が行われる乳牛等の家畜動物では、乳房炎の発症率が非常に高い。
【０００３】
乳牛等の家畜動物において乳房炎が発症すると、乳汁の産生量の減少、乳汁の品質の低下、乳汁の細菌汚染等が生じ、多大な経済的損失を被ることとなるので、乳房炎の予防・治療は非常に重要である。
乳房炎の予防・治療には、主として抗生物質が使用されてきたが、抗生物質の使用は、残留薬物の乳汁への移行、耐性菌の出現等の問題を生じていた。
【０００４】
このような状況の下、抗生物質を使用しない乳房炎の予防・治療剤として、キチン質を有効成分とする乳房炎治療剤（特開平６−９４０９号公報）、塩化ベンザルコニウムとキトサン及び／又はキトサン誘導体とを含有する家畜の乳房炎予防剤（特開平６−５６６７５号公報）、ヒノキ科植物抽出物を含有する動物の乳房炎治療剤（特開平７−１０９２２７号公報）、ビタミンＢ２及びメタクレゾールからなる乳房炎の予防・治療剤（特開平１１−１９９４８６号公報）、グリチルリチン又はその医薬上許される塩を有効成分とする家畜の乳房炎治療剤（特開２００１−２０６８４９号公報）、酸性多糖を含有する乳牛の乳房炎治療剤（特開２００１−２１３７８４号公報）、パン酵母生菌又はその含有物を有効成分とする家畜乳房炎予防治療組成物（特開２００１−２２４３１７号公報）が開発されている。
【０００５】
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ−ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｏｘｉｄａｓｅ；ＬＡＯ）は、Ｌ−アミノ酸（例えば、Ｃｙｓ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ｔｙｒ）の酸化的脱アミノ反応を触媒し、Ｌ−アミノ酸を過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、アンモニア及びケト酸に変換する酵素である。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼによって産生される過酸化水素は、過酸化水素及び過酸化水素から生じる他の反応性酸素種の細胞毒性によって抗菌作用又は殺菌作用を示すことが知られている。これまでに、ヘビ毒（非特許文献１）、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ（非特許文献２）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｐａｃｕｓ（非特許文献３）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ（非特許文献４）、Ｃａｌｌｏｓｅｌａｓｍａ　ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ（非特許文献５）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ（特許文献１）のＬ−アミノ酸オキシダーゼについては知られているが、哺乳動物のＬ−アミノ酸オキシダーゼについては知られていない。
【０００６】
また、哺乳動物の乳汁中に含まれる各種遊離アミノ酸の濃度について、「ヒト及びウシにおいて、乳汁中のＧｌｕを除くほとんどの遊離アミノ酸濃度は、乳汁を産生する母親の血清中のアミノ酸濃度よりも低い」（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｍ．Ｄ．，　ａｎｄ　Ｙａｔｅｓ，　Ｋ．Ｎ．　（１９６３）　Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．　１１３，　６８０−６８３）、「ラット及びブタにおいて、乳汁を分泌する乳腺は、循環する血漿から全ての種類のアミノ酸を等しく吸収する」（Ｖｉｎａ，　Ｊ．　Ｒ．ら　（１９８７）　Ｊ．　Ｎｕｔｒ．　１１７，　５３３−５３８　；　Ｓｐｉｎｃｅｒ，　Ｊ．ら　（１９６９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　１１１，　７２７−７３２）、「Ｃｙｓ、Ｇｌｙ及びＬｅｕを除き、ヒト、ヒヒ、アカゲザル、ウマ、ウシ及びブタの乳汁には、タンパク質の構成成分であるアミノ酸がほぼ同量含まれている」（Ｄａｖｉｓ，　Ｔ．Ａ．ら　（１９９４）　Ｂｒ．　Ｊ．　Ｎｕｔｒ．　７２，　８４５−８５３）、「ヒト及びブタにおいて、乳汁中の各遊離アミノ酸濃度は乳汁分泌段階に等しく依存するわけではないが、乳汁中の遊離アミノ酸の不均一は、多数のアミノ酸について等しく観察される」（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，　Ｓ．Ｄ．ら　（１９８０）　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｎｕｔｒ．　３３，　８１１−８１５　；　Ｗｕ，　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｋｎａｂｅ，　Ｄ．Ａ．　（１９９４）　Ｊ．　Ｎｕｔｒ．　１２４，　４１５−４２４　；　Ｒａｓｓｉｎ，　Ｄ．Ｋ．ら　（１９７８）　Ｅａｒｌｙ　Ｈｕｍ，　Ｄｅｖ．　２，　１−１３）等の報告がされているが、哺乳動物の乳汁中にＬ−アミノ酸オキシダーゼが存在するか否かについては報告されていない。
【０００７】
【特許文献１】
特表平８−５０９３６７号公報
【非特許文献１】
レイベカス（Ｒａｉｂｅｋａｓ），Ａ．，バイオケミカル　アンド　バイオフィジカル　リサーチ　コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），１９９８年，第２４８巻，第３号，ｐ．４７６−４７８
【非特許文献２】
ジー　ルー（Ｊｉｅ　Ｌｕ）ら，ＦＥＭＳ　マイクロバイオロジー　レターズ（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ），２００１年，第２０５巻，第２号，ｐ．２９１−２９７
【非特許文献３】
ゲウエケ（Ｇｅｕｅｋｅ），Ｂ．ら，エンザイム　アンド　マイクロバイアルテクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），２００２年，第３１巻，第１−２号，ｐ．７７−７８
【非特許文献４】
ニーダーマン（Ｎｉｅｄｅｒｍａｎｎ），ＤＭ．ら，ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９９０年，第２６５巻，第２８号，ｐ．１７２４６−１７２５１
【非特許文献５】
マックヘロック（ＭａｃＨｅｒｏｕｘ），Ｐ．ら，ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２００１年，第２６８巻，第６号，ｐ．１６７９−１６８６
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、第一に、哺乳動物のＬ−アミノ酸オキシダーゼを単離・同定し、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する新規タンパク質（哺乳動物のＬ−アミノ酸オキシダーゼを含む）、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及び上記タンパク質に対する抗体を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、第二に、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質によって産生される過酸化水素の抗菌作用又は殺菌作用を利用した抗菌・殺菌組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、第三に、哺乳動物の乳房にＬ−アミノ酸オキシダーゼが存在することを明らかにし、哺乳動物の乳房に存在するＬ−アミノ酸オキシダーゼによって産生される過酸化水素の抗菌作用又は殺菌作用を利用した乳房用抗菌・殺菌組成物、家畜の乳房感染菌の抗菌・殺菌方法、及び家畜の乳房における細菌性感染症の予防・治療方法を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、第四に、哺乳動物の乳汁中にＬ−アミノ酸オキシダーゼが存在することを明らかにし、哺乳動物の乳汁中に存在するＬ−アミノ酸オキシダーゼによって産生される過酸化水素の抗菌作用又は殺菌作用を利用した生乳混入菌の抗菌・殺菌方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、以下のタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及び上記タンパク質に対する抗体、抗菌・殺菌組成物、乳房用抗菌・殺菌組成物、家畜の乳房感染菌の抗菌・殺菌方法、家畜の乳房における細菌性感染症の予防・治療方法、及び生乳混入菌の抗菌・殺菌方法を提供する。
【００１３】
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質
（２）前記（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡからなる前記（２）記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）前記（２）又は（３）記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（５）前記（４）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）前記（１）記載のタンパク質に対する抗体。
【００１４】
（７）前記（１）記載のタンパク質を過酸化水素供給成分として含有する抗菌・殺菌組成物。
（８）前記過酸化水素供給成分として、さらに遊離Ｌ−アミノ酸を含有する前記（７）記載の抗菌・殺菌組成物。
（９）医薬組成物、食品添加用組成物又は化粧品添加用組成物である前記（７）又は（８）記載の抗菌・殺菌組成物。
（１０）前記医薬組成物が、感染菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、又は細菌性感染症の予防・治療剤である前記（９）記載の抗菌・殺菌組成物。
（１１）前記感染菌が乳房感染菌である前記（１０）記載の抗菌・殺菌組成物。
（１２）前記細菌性感染症が乳房炎である前記（１０）記載の抗菌・殺菌組成物。
【００１５】
（１３）遊離Ｌ−アミノ酸を過酸化水素供給成分として含有する乳房用抗菌・殺菌組成物。
（１４）前記過酸化水素供給成分として、さらにＬ−アミノ酸オキシダーゼを含有する前記（１３）記載の乳房用抗菌・殺菌組成物。
（１５）前記Ｌ−アミノ酸オキシダーゼが、前記（１）記載のタンパク質である前記（１３）又は（１４）記載の乳房用抗菌・殺菌組成物。
（１６）乳房感染菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、又は乳房における細菌性感染症の予防・治療剤である前記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の乳房用抗菌・殺菌組成物。
（１７）前記細菌性感染症が乳房炎である前記（１６）記載の乳房用抗菌・殺菌組成物。
【００１６】
（１８）家畜の乳房に遊離Ｌ−アミノ酸を投与する工程を含む家畜の乳房感染菌の抗菌・殺菌方法。
（１９）前記家畜の乳房にＬ−アミノ酸オキシダーゼを投与する工程をさらに含む前記（１８）記載の抗菌・殺菌方法。
（２０）前記家畜が、その乳腺において乳汁合成が行われている家畜である前記（１８）又は（１９）記載の抗菌・殺菌方法。
（２１）前記家畜が、その乳腺において乳汁合成が行われていない家畜である前記（１９）記載の抗菌・殺菌方法。
【００１７】
（２２）家畜の乳房に遊離Ｌ−アミノ酸を投与する工程を含む家畜の乳房における細菌性感染症の予防・治療方法。
（２３）前記家畜の乳房にＬ−アミノ酸オキシダーゼを投与する工程をさらに含む前記（２２）記載の予防・治療方法。
（２４）前記家畜が、その乳腺において乳汁合成が行われている家畜である前記（２２）又は（２３）記載の予防・治療方法。
（２５）前記家畜が、その乳腺において乳汁合成が行われていない家畜である前記（２３）記載の予防・治療方法。
（２６）前記細菌性感染症が乳房炎である前記（２２）〜（２５）のいずれかに記載の予防・治療方法。
【００１８】
（２７）生乳に遊離Ｌ−アミノ酸を添加する工程を含む生乳混入菌の抗菌・殺菌方法。
（２８）前記生乳にＬ−アミノ酸オキシダーゼを添加する工程をさらに含む前記（２７）記載の抗菌・殺菌方法。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列からなるタンパク質（以下「タンパク質（ａ）」という。）
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質（以下「タンパク質（ｂ）」という。）
【００２０】
配列番号１において、１〜２６番目のアミノ酸配列はシグナルペプチドに相当し、２７〜５２３番目のアミノ酸配列は成熟酵素であるＬ−アミノ酸オキシダーゼに相当する。
【００２１】
タンパク質（ａ）は、マウス由来のＬ−アミノ酸オキシダーゼであり、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−システイン、Ｌ−ロイシン及びＬ−ヒスチジンに対する触媒活性は高いが、それ以外のＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸に対する触媒活性は低い（又は触媒活性を有しない）。
【００２２】
また、タンパク質（ａ）は、マウス乳腺において発現しており、マウス乳汁中に含まれている。タンパク質（ａ）は、乳汁合成が行われている期間（搾乳期及び妊娠末期を含む。）のマウス乳腺において発現しているが、乳汁合成が行われていない期間のマウス乳腺、及びマウス乳腺以外の組織（例えば、脳、心臓、肝臓、肺、筋肉、胎盤）においてはほとんど発現していない（又は全く発現していない）。
【００２３】
また、タンパク質（ａ）は、Ｌ−イソロイシンをほとんど酸化しない点、冷凍によってＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性が減少しない点において、ヘビ毒Ｌ−アミノ酸オキシダーゼと異なる性質を有している。
【００２４】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）が有する「Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性」とは、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼが有する酵素活性、すなわち、遊離Ｌ−アミノ酸（例えば、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−システイン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−セリン）の酸化的脱アミノ反応を触媒し、遊離Ｌ−アミノ酸から過酸化水素、アンモニア及びα−ケト酸を産生する酵素活性を意味する。
【００２５】
配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、タンパク質（ｂ）がＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は通常１〜５０個、好ましくは１〜２５個、さらに好ましくは１〜１０個である。このとき、タンパク質（ｂ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する。
【００２６】
また、配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の位置は、タンパク質（ｂ）がＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する限り特に限定されるものではない。
【００２７】
タンパク質（ｂ）には、タンパク質（ａ）（マウス由来のＬ−アミノ酸オキシダーゼ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換又は付加された状態で天然に存在するタンパク質、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、フェレット、ラット等の哺乳動物由来のＬ−アミノ酸オキシダーゼや、これらのＬ−アミノ酸オキシダーゼに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。
【００２８】
タンパク質（ａ）及び（ｂ）には、糖鎖が付加されたタンパク質及び糖鎖が付加されていないタンパク質のいずれもが含まれる。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、タンパク質（ａ）及び（ｂ）には、その医薬的に許容される塩も含まれる。
【００２９】
タンパク質（ａ）及び（ｂ）は、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を用いて常法に従って製造できる。タンパク質（ａ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡを使用できる。
【００３０】
配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、マウス乳腺ら抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号２記載の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得られる。
【００３１】
〔ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、マウス乳腺から全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、バッチ法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。この際、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーが得られる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター等を使用できる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等を使用できる。
【００３２】
大腸菌等の宿主細胞の形質転換は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、組換えベクターを加える方法等により行うことができる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有させておく。
【００３３】
ｃＤＮＡライブラリーの作製にあたっては、市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）等を使用できる。
【００３４】
〔目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニング〕
ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングする際には、配列番号２記載の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断片を得る。ＰＣＲ増幅断片は、適当なプラスミドベクターを用いてサブクローニングしてもよい。
【００３５】
ＰＣＲに使用するプライマーセットは特に限定されるものではないが、例えば、センスプライマー　５’−　ｇｇａｔｇｃｔｇｇｔｃａｃｇａｇｇｔａａ　−３’（配列番号２記載の塩基配列のうち、２６３〜２８２番目の塩基配列に相当する）及びアンチセンスプライマー　５’−　ｃｔａｇｃａｃｔｇａｇｇｃｃａｔ　−３’（配列番号２記載の塩基配列のうち、８３８〜８５３番目の塩基配列と相補的な塩基配列に相当する）からなるプライマーセット、センスプライマー　５’−　ｃｔｇａｔｇａａｇｇａａｇｇａａｃｇｃｔ　−３’（配列番号２記載の塩基配列のうち、６６９〜６８８番目の塩基配列に相当する）及びアンチセンスプライマー　５’−　ｃｇａｃｔｔｇａｔｇｇｃｇｇｔｇｔｃｔａ　−３’（配列番号２記載の塩基配列のうち、１５１３〜１５３２番目の塩基配列と相補的な塩基配列に相当する）からなるプライマーセットを使用できる。
【００３６】
ｃＤＮＡライブラリーに対して、ＰＣＲ増幅断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、目的のＤＮＡが得られる。プローブとしては、ＰＣＲ増幅断片をアイソトープ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、ビオチン、ジゴキシゲニン等で標識したものを使用できる。
【００３７】
目的のＤＮＡを含むクローンは、抗体を用いたイムノスクリーニング等の発現スクリーニングによっても得られる。
【００３８】
取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのまま、又は適当な制限酵素等で切断した後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いて決定できるが、通常は、３７３Ａ　ＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）等の塩基配列分析装置を用いて配列決定する。
【００３９】
以上のようにして、タンパク質（ａ）をコードする遺伝子として、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡが得られる。
配列番号２記載の塩基配列のうち、タンパク質（ａ）は１１１〜１６０１番目の塩基配列によってコードされており、翻訳開始コドンＡＴＧは３３〜３５番目の塩基配列によってコードされており、終止コドンＴＡＧは、１６０２〜１６０４番目の塩基配列によってコードされており、シグナルペプチドは３３〜１１０番目の塩基配列によってコードされている。
【００４０】
タンパク質（ａ）をコードする遺伝子は、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡに限定されるものではなく、タンパク質（ａ）をコードする限り、その他の塩基配列からなるＤＮＡも含まれる。そのようなＤＮＡは、その塩基配列に従って化学合成により得られる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。
【００４１】
タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子は、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、フェレット、ラット等の哺乳動物由来のｃＤＮＡライブラリーから、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをスクリーニングすることにより得られる。
【００４２】
「ストリンジェントな条件」としては、例えば、ナトリウム濃度が５００〜１０００ｍＭ、好ましくは６００〜７００ｍＭ、温度が４２〜６５℃、好ましくは４５〜５５℃である条件が挙げられる。
【００４３】
配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの具体例としては、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４４】
また、タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子は、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡに、例えば部位特異的変異誘発法によって人為的に変異を導入することにより得られる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　シリーズキットを用いて行うことができる。また、塩基配列が既に決定されているＤＮＡについては化学合成によっても得られる。
【００４５】
タンパク質（ａ）及び（ｂ）は、例えば、以下の工程に従って、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることにより製造できる。
【００４６】
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列を、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。
【００４７】
このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体が得られる。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有していてもよい。
【００４８】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。
【００４９】
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
【００５０】
細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用できる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１等の大腸菌や、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ　１１４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　２０７−２１等の枯草菌を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用できる。また、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ　Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用できる。
【００５１】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
【００５２】
酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を使用できる。
【００５３】
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用できる。
【００５４】
動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用できる。
【００５５】
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用できる。
【００５６】
昆虫細胞を宿主とする場合には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用できる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ　５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ４等が挙げられる。
【００５７】
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
【００５８】
〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を通常の培養方法に従って培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを使用してもよい。
【００５９】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用できる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用できる。
【００６０】
形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２５〜３７℃、培養時間は通常１２〜２４時間であり、培養期間中はｐＨを６．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００６２】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用できる。形質転換体の培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３日間行う。また、培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６３】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００　ＩＩ　ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）等を使用できる形質転換体の培養は、通常２７〜３０℃で１６〜３６時間行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６４】
目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン等が挙げられる。
【００６５】
〔タンパク質の単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。
【００６６】
こうして得られるタンパク質（ａ）又は（ｂ）は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製できる。
【００６７】
また、タンパク質（ａ）又は（ｂ）は、そのアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造できる。この際、市販のペプチド合成機を使用できる。
【００６８】
さらに、タンパク質（ａ）又は（ｂ）は、マウス、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、フェレット、ラット等の哺乳動物の乳汁から得ることもできる。乳汁からタンパク質（ａ）又は（ｂ）を単離・精製する際には、後述するタンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する抗体を使用できる。
【００６９】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する抗体は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）を免疫用抗原として用いて作製できる。ここで、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれるとともに、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と反応し得る抗体の断片も含まれる。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。
【００７０】
免疫用抗原としては、例えば、（ｉ）　タンパク質（ａ）又は（ｂ）を発現している細胞又は組織の破砕物又はその精製物、（ｉｉ）　ＤＮＡ組換え技術を用いて、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡ（例えば、タンパク質（ａ）については配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ）　化学合成したペプチド等を使用できる。
【００７１】
ポリクローナル抗体の作製に当たっては、まず、免疫用抗原を用いてラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。タンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。
【００７２】
モノクローナル抗体の作製に当たっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫した後、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に使用される。次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。次いで、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等によりハイブリドーマのクローニングを行い、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を使用できる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植した後、腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体が得られる。
【００７３】
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の精製が必要とされる場合には、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて使用できる。
【００７４】
本発明の抗菌・殺菌組成物は、本発明のタンパク質を過酸化水素供給成分として含有する。本発明のタンパク質は、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するので、遊離Ｌ−アミノ酸の存在下において過酸化水素を供給できる。供給された過酸化水素は、過酸化水素自体又は過酸化水素から生じる反応性酸素種の細胞毒性等を通じて抗菌作用又は殺菌作用を発揮できるとともに、感染症の原因となる細菌の抗菌又は殺菌を通じて細菌性感染症の予防・治療作用を発揮できる。したがって、本発明の抗菌・殺菌組成物は、医薬組成物（例えば、感染菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、又は細菌性感染症の予防・治療剤）、食品添加用組成物（例えば、食品混入菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、食品の防腐剤）、化粧品添加用組成物（例えば、化粧品混入菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、化粧品の防腐剤）として使用できる。
【００７５】
本発明の抗菌・殺菌組成物による過酸化水素の供給には、遊離Ｌ−アミノ酸の存在が必要となる。したがって、本発明の抗菌・殺菌組成物の投与部位や添加対象物に遊離Ｌ−アミノ酸が存在する場合には、本発明の抗菌・殺菌組成物に過酸化水素供給成分として遊離Ｌ−アミノ酸を含有させておく必要はないが、本発明の抗菌・殺菌組成物の投与部位や添加対象物に遊離Ｌ−アミノ酸が存在しない場合には、本発明の抗菌・殺菌組成物に過酸化水素供給成分として遊離Ｌ−アミノ酸を含有させておく必要がある。また、本発明の抗菌・殺菌組成物の投与部位や添加対象物に遊離Ｌ−アミノ酸が存在する場合であっても、投与部位や添加対象物における過酸化水素の供給量を増加させて、より強力な抗菌作用、殺菌作用、又は細菌性感染症予防・治療作用を発揮させるために、本発明の抗菌・殺菌組成物に過酸化水素供給成分として遊離Ｌ−アミノ酸を含有させておくことが好ましい。
【００７６】
本発明の抗菌・殺菌組成物に含有される遊離Ｌ−アミノ酸の種類は、本発明のタンパク質が酸化的脱アミノ反応を触媒し得る限り特に限定されるものではないが、本発明のタンパク質の触媒活性が高い点から、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−システイン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジンが好ましく、この中でも特に、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンが好ましい。本発明の抗菌・殺菌組成物に含有される遊離Ｌ−アミノ酸は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【００７７】
本発明の抗菌・殺菌組成物を医薬組成物として使用する場合、その投与部位は特に限定されるものではないが、通常は、抗菌、殺菌又は細菌性感染症の予防・治療が必要となる組織又は器官であり、そのような組織又は器官としては、例えば、乳房、涙腺、唾液腺、汗腺、子宮、皮膚、口腔内、鼻腔、目、耳等が挙げられる。また、本発明の抗菌・殺菌組成物を食品添加用組成物又は化粧品添加用組成物として使用する場合、添加対象となる食品又は化粧品は特に限定されるものではなく、添加対象となる食品としては、例えば、飲料、麺類、菓子類、水産・畜産加工食品、乳製品、油脂及び油脂加工食品、調味料、惣菜等が挙げられ、添加対象となる化粧品としては、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ファンデーション等が挙げられる。これらの投与部位や添加対象物に遊離Ｌ−アミノ酸が存在する場合であっても、その種類や存在量は投与部位や添加対象物によって異なると考えられるので、本発明の抗菌・殺菌組成物に遊離Ｌ−アミノ酸を含有させる場合には、投与部位や添加対象物に存在する遊離Ｌ−アミノ酸の種類や存在量を考慮して、本発明の抗菌・殺菌組成物における遊離Ｌ−アミノ酸の含有量を適宜調節することが好ましい。
【００７８】
本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物は、遊離Ｌ−アミノ酸を過酸化水素供給成分として含有する。遊離Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの存在下において過酸化水素を供給できる。供給された過酸化水素は、過酸化水素自体又は過酸化水素から生じる反応性酸素種の細胞毒性等を通じて抗菌作用又は殺菌作用を発揮できるとともに、感染症の原因となる細菌の抗菌又は殺菌を通じて細菌性感染症の予防・治療作用を発揮できる。したがって、本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物は、乳房感染菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、又は乳房における細菌性感染症の予防・治療剤として使用できる。
【００７９】
本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物による過酸化水素の供給には、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの存在が必要となる。本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物の投与部位である乳房の乳腺において乳汁合成が行われている場合にはＬ−アミノ酸オキシダーゼが十分に発現しているので、本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物に過酸化水素供給成分としてＬ−アミノ酸オキシダーゼを含有させておく必要はないが、乳腺において乳汁合成が行われていない場合にはＬ−アミノ酸オキシダーゼが十分に発現していないので、本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物に過酸化水素供給成分としてＬ−アミノ酸オキシダーゼを含有させておく必要がある。また、乳腺において乳汁合成が行われている場合であっても、乳房における過酸化水素の供給量を増加させて、より強力な抗菌作用、殺菌作用又は細菌性感染症予防・治療作用を発揮させるために、本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物に過酸化水素供給成分としてＬ−アミノ酸オキシダーゼを含有させておくことが好ましい。
【００８０】
本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物に含有される遊離Ｌ−アミノ酸の種類は、乳房に存在するＬ−アミノ酸オキシダーゼが酸化的脱アミノ反応を触媒し得る限り特に限定されるものではないが、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの触媒活性が高い点から、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−システイン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジンが好ましく、この中でも特に、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンが好ましい。本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物に含有される遊離Ｌ−アミノ酸は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【００８１】
本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物に含有されるＬ−アミノ酸オキシダーゼの種類は特に限定されるものではないが、本発明のタンパク質であることが好ましい。乳房にはＬ−アミノ酸オキシダーゼが存在しているが、その存在量は乳汁合成の有無、乳汁分泌段階等によって変化するので、本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物にＬ−アミノ酸オキシダーゼを含有させる場合には、乳房におけるＬ−アミノ酸オキシダーゼの存在量を考慮して、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの含有量を適宜調節することが好ましい。
【００８２】
本発明の抗菌・殺菌組成物又は乳房用抗菌・殺菌組成物が抗菌作用又は殺菌作用を発揮し得る細菌は、過酸化水素自体又は過酸化水素から生じる反応性酸素種が細胞毒性を発揮し得る細菌であり、そのような細菌としては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ジスアガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｉａｇａｌａｃｔｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・ピオゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｔｅｒｉｕｍ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）等が挙げられるが、これらの菌種に限定されるものではない。
【００８３】
また、本発明の抗菌・殺菌組成物又は乳房用抗菌・殺菌組成物が予防・治療作用を発揮し得る細菌性感染症は、過酸化水素自体又は過酸化水素から生じる反応性酸素種が細胞毒性を発揮し得る細菌が原因となる細菌性感染症であり、そのような細菌性感染症としては、例えば、乳房炎、子宮内膜炎、皮膚炎、口内炎、鼻炎、結膜炎、外耳炎等が挙げられる。
【００８４】
本発明の抗菌・殺菌組成物又は乳房用抗菌・殺菌組成物の投与対象動物は特に限定されるものではないが、通常は哺乳動物であり、具体的には、ヒトの他、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ラクダ等の家畜、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット等のコンパニオンアニマルが挙げられる。
【００８５】
本発明の抗菌・殺菌組成物又は乳房用抗菌・殺菌組成物は、それぞれ本発明のタンパク質（場合によっては本発明のタンパク質及び遊離Ｌ−アミノ酸）又は遊離Ｌ−アミノ酸（場合によっては遊離Ｌ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸オキシダーゼ）のみから構成されていてもよいが、通常は、医薬上許容される１種以上の担体及び／又は添加剤とともに常法に従って製剤化する。製剤化する場合、製剤中の過酸化水素供給成分量は、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（本発明のタンパク質を含む）については通常０．１〜１重量％、好ましくは０．３〜０．７重量％、遊離Ｌ−アミノ酸については通常０．１〜１重量％、好ましくは０．３〜０．７重量％である。
【００８６】
医薬上許容される担体としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。
【００８７】
製剤化に際して使用される添加剤としては、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤、安定化剤、抗菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等が挙げられ、これらの添加剤は製剤の投与単位形態等に応じて適宜選択される。これらのうち、通常の蛋白製剤等に使用される成分、例えば、安定化剤、抗菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等が好ましく選択される。
【００８８】
添加剤の具体例を以下に例示する。
安定化剤：ヒト血清アルブミン；グリシン、システィン、グルタミン酸等のＬ−アミノ酸；グルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類及びそれらの誘導体等の糖類；メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体等。
【００８９】
界面活性剤：ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等の界面活性剤。
緩衝剤：ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸及びそれらの塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）。
等張化剤：塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等。
キレート剤：エデト酸ナトリウム、クエン酸等。
【００９０】
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（本発明のタンパク質を含む）又は遊離Ｌ−アミノ酸は、医薬上許容される塩であってもよく、その具体例としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム等の無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。また、上記塩には、タンパク質又はアミノ酸と適当な有機酸又は無機酸との反応による無毒性酸付加塩も含まれる。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。
【００９１】
本発明の抗菌・殺菌組成物又は乳房用抗菌・殺菌組成物は、抗菌、殺菌又は細菌性感染症の予防・治療を目的とする標的部位に直接投与することが好ましい。標的部位への投与は、例えば、シリンジ、カテーテル、注射器等を用いて行うことができる。
【００９２】
本発明の抗菌・殺菌組成物又は乳房用抗菌・殺菌組成物の剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、液剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤、挿入剤等が挙げられる。
【００９３】
本発明の抗菌・殺菌組成物又は乳房用抗菌・殺菌組成物の投与量及び投与回数は、目的とする効果、投与対象動物の年齢や体重等により異なるが、１回あたり投与量（乳房用抗菌・殺菌組成物については１乳房あたり）は、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（本発明のタンパク質を含む）の投与量が通常１〜１００００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１０〜１００ｍｇとなるように、また、遊離Ｌ−アミノ酸の投与量が通常１〜１００００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１０〜１００ｍｇとなるように適宜調節される。また、投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択される。
【００９４】
本発明の家畜の乳房感染菌の抗菌・殺菌方法及び家畜の乳房における細菌性感染症の予防・治療方法は、家畜の乳房に遊離Ｌ−アミノ酸を投与する工程を含む。家畜の乳房に投与された遊離Ｌ−アミノ酸は、家畜の乳房に存在するＬ−アミノ酸オキシダーゼと反応して過酸化水素を供給できる。供給された過酸化水素は、過酸化水素自体又は過酸化水素から生じる反応性酸素種の細胞毒性等を通じて抗菌作用又は殺菌作用を発揮できるとともに、感染症の原因となる細菌の抗菌又は殺菌を通じて細菌性感染症の予防・治療作用を発揮できる。
【００９５】
家畜の乳房に投与する遊離Ｌ−アミノ酸の種類は、乳房に存在するＬ−アミノ酸オキシダーゼが酸化的脱アミノ反応を触媒し得る限り特に限定されるものではないが、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの触媒活性が高い点から、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−システイン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジンが好ましく、この中でも特に、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンが好ましい。家畜の乳房に投与する遊離Ｌ−アミノ酸は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【００９６】
家畜の乳房の乳腺において乳汁合成が行われている場合には、家畜の乳房においてＬ−アミノ酸オキシダーゼが十分に発現しているので、遊離Ｌ−アミノ酸を投与することにより過酸化水素を供給できるが、乳腺において乳汁合成が行われていない場合には、家畜の乳房においてＬ−アミノ酸オキシダーゼが十分に発現していないので、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを投与する工程が必要となる。このとき投与するＬ−アミノ酸オキシダーゼは特に限定されるものではなく、例えば、本発明のタンパク質を投与できる。また、乳腺において乳汁合成が行われている場合であっても、乳房における過酸化水素の供給量を増加させて、より強力な抗菌作用、殺菌作用又は細菌性感染症予防・治療作用を発揮させるために、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを投与することが好ましい。
【００９７】
家畜の乳房へのＬ−アミノ酸オキシダーゼの投与は、遊離Ｌ−アミノ酸の投与と同時に行ってもよいし、遊離Ｌ−アミノ酸の投与の前又は後に行ってもよい。家畜の乳房にはＬ−アミノ酸オキシダーゼが存在しているが、その存在量は乳汁合成の有無、乳汁分泌段階等によって変化するので、乳房におけるＬ−アミノ酸オキシダーゼの存在量を考慮して、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの投与量を適宜調節することが好ましい。
【００９８】
家畜の乳房に遊離Ｌ−アミノ酸（場合によっては遊離Ｌ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸オキシダーゼ）を投与することによって抗菌・殺菌し得る細菌又は予防・治療し得る細菌性感染症は、過酸化水素自体又は過酸化水素から生じる反応性酸素種が細胞毒性を発揮し得る細菌又は細菌性感染症であり、そのような細菌又は感染症としては、上記と同様の細菌又は細菌性感染症が挙げられる。
【００９９】
遊離Ｌ−アミノ酸（場合によっては遊離Ｌ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸オキシダーゼ）を投与する家畜は特に限定されるものではないが、通常は哺乳動物であり、具体的には、ヒトの他、上記と同様の家畜、コンパニオンアニマルが挙げられる。
【０１００】
遊離Ｌ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸オキシダーゼは、乳房へ直接投与することが好ましく、例えば、シリンジ、カテーテル、注射器、挿入用容器等を用いて乳頭から乳房（乳腺槽）へ直接投与できる。遊離Ｌ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸オキシダーゼの投与量及び投与回数は、目的とする効果、投与対象動物の年齢や体重等により異なるが、１回あたり投与量は、遊離Ｌ−アミノ酸については１乳房あたり通常１〜１００００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１０〜１００ｍｇであり、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼについては１乳房あたり通常１〜１００００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１０〜１００ｍｇである。また、投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択される。
【０１０１】
本発明の生乳混入菌の抗菌・殺菌方法は、生乳に遊離Ｌ−アミノ酸を添加する工程を含む。生乳に添加された遊離Ｌ−アミノ酸は、生乳中に存在するＬ−アミノ酸オキシダーゼと反応して過酸化水素を供給できる。供給された過酸化水素は、過酸化水素自体又は過酸化水素から生じる反応性酸素種の細胞毒性等を通じて抗菌作用又は殺菌作用を発揮できる。
【０１０２】
生乳に添加する遊離Ｌ−アミノ酸の種類は、生乳中に存在するＬ−アミノ酸オキシダーゼが酸化的脱アミノ反応を触媒し得る限り特に限定されるものではないが、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの触媒活性が高い点から、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−システイン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジンが好ましく、この中でも特に、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンが好ましい。生乳に添加する遊離Ｌ−アミノ酸は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【０１０３】
生乳中にはＬ−アミノ酸オキシダーゼが存在するが、生乳中における過酸化水素の供給量を増加させて、より強力な抗菌作用又は殺菌作用を発揮させるために、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを投与することが好ましい。このとき投与するＬ−アミノ酸オキシダーゼは特に限定されるものではなく、例えば、本発明のタンパク質を添加できる。生乳へのＬ−アミノ酸オキシダーゼの添加は、遊離Ｌ−アミノ酸の投与と同時に行ってもよいし、遊離Ｌ−アミノ酸の投与の前又は後に行ってもよい。生乳中におけるＬ−アミノ酸オキシダーゼの存在量は乳汁分泌段階等によって変化するので、生乳中におけるＬ−アミノ酸オキシダーゼの存在量を考慮して、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの添加量を適宜調節することが好ましい。
【０１０４】
遊離Ｌ−アミノ酸を添加する生乳は特に限定されるものではないが、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ラクダ等の家畜の生乳が挙げられる。
【０１０５】
生乳に遊離Ｌ−アミノ酸（場合によっては遊離Ｌ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸オキシダーゼ）を添加することによって抗菌・殺菌し得る細菌は、過酸化水素自体又は過酸化水素から生じる反応性酸素種が細胞毒性を発揮し得る細菌であり、そのような細菌としては、上記と同様の細菌が挙げられる。
【０１０６】
遊離Ｌ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸オキシダーゼの添加量は、目的とする効果、生乳の種類等により異なるが、遊離Ｌ−アミノ酸については生乳１ｍＬあたり通常０．１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１０ｍｇであり、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼについては生乳１ｍＬあたり通常０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜１ｍｇである。
【０１０７】
【実施例】
〔実施例１〕
１．実験方法
（１−１）動物
ＩＣＲ：ＪＣＬマウスをＳＬＣ（Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）から購入し、１４時間の照明スケジュール（５：００〜１９：００）の下、２３±１℃で維持し、食物及び水を自由に摂取させた。膣栓が観察された日を妊娠０日目とした。分娩の日を乳汁分泌０日目とした。妊娠１３日目に、副腎摘出、卵巣摘出、偽手術をペントバルビタール麻酔下で行った。１ｍｇのコルチゾール又はプロゲステロンを０．１ｍＬのゴマ油に溶解して、手術完了時（０時）に皮下投与した。
【０１０８】
（１−２）乳汁サンプリング
ペントバルビタール麻酔下、穏やかに吸引して、乳汁分泌８日目のマウスから乳汁を集めた。乳汁採取の前にオキシトシン（０．１ユニット）を腹腔内投与した。４℃、１０００×ｇで１０分間遠心し、スキムミルクを調製した。４℃、１００，０００×ｇで３０分間遠心し、スキムミルクから乳清を調製した。全てのサンプルは、使用するまで−５０℃で保存した。
【０１０９】
（１−３）ＬＡＯ活性の測定
ＬＡＯ活性は、Ｈ２Ｏ２産生量によって測定した。ｏ−ジアニシジンをエタノールに５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。セイヨウワサビペルオキシダーゼを０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に４０μｇ／ｍＬとなるように溶解した。ｏ−ジアニシジン溶液１重量部及びペルオキシダーゼ溶液５０重量部からなるアッセイ試薬を調製した。Ｌ−Ｌｅｕ及びＤ−Ｌｅｕ（２００μＭ）をそれぞれ陽性対照及び陰性対照として使用した。サンプルを２．５倍容量のアッセイ試薬と混合した。インキュベーションは特に示さない限り３７℃で１２０分間行った。分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度（Ａ４２０）を測定した。ＬＡＯ活性は、ｏ−ジアニシジンの酸化（Ａ４２０）に基づいて表した。
【０１１０】
（１−４）ＬＡＯの精製
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２（ＨＲ　１６／５０）を用いたＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　ＦＰＬＣを、流速０．６ｍＬ／分の条件で行い、タンパク質を分離した。１／１５Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び１４５ｍＭ　ＮａＣｌからなる溶出緩衝液を使用した。カラムは、ｇｅｌ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて較正した。１ｍＬの乳清をカラムにかけ、１．２ｍＬごとにフラクションを集めた。ＬＡＯ活性を有するフラクションを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して一晩透析した。イオン交換クロマトグラフィーをＲＥＳＯＵＲＣＥＴＭＱカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＡＫＴＡ　ｐｒｉｍｅを用いて流速１ｍＬ／分の条件で行い、０．５ｍＬずつ複数のフラクションを集めた。カラムを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化し、ＮａＣｌ濃度を０から５００ｍＭまで増加させて溶出した。ＬＡＯ活性を有するフラクションは、−２０℃で保存した。Ａ２８０を測定することによりタンパク質濃度を測定した。
【０１１１】
（１−５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びアミノ酸配列決定
２％　ＳＤＳ及び６％　２−メルカプトエタノールの存在下、１００℃で５分間処理してＬＡＯを変性させ、７．５％　ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを７％　酢酸及び２０％　メタノールで固定し、銀染色した。ＬＡＯの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量マーカーとの比較により推定した。
【０１１２】
変性したＬＡＯをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、イモビロン上にトランスファした。クマシーブルーで染色したタンパク質のバンドを切り出し、パルスリキッドフェーズの下、Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてアミノ酸配列解析を行った。ＬＡＯのフラグメントについて、バンドをクマシーブルーで染色したゲルから切り出し、リシルエンドペプチダーゼで３７℃、１８時間消化した。Ｐｕｒｅｓｉｌ　Ｃ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いたＨＰＬＣを、０．１％　トリフルオロ酢酸を含有する２−プロパノール：アセトニトリル（７：３）水溶液のリニアーグラジエント（０−６０％）、流速１ｍＬ／分、６０分間の条件で行い、ペプチドフラグメントを分離した。ＨＰＬＣで分画したペプチドフラグメントのアミノ酸配列解析を、Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。
【０１１３】
（１−６）アミノ酸量の測定
乳清中のタンパク質を５％トリクロロ酢酸で沈澱させ、１０，０００×ｇで３０分間の遠心によって除去した。遊離アミノ酸及びアンモニアを、Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｌ−８５００Ａ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｎａｌｙｚｅｒを用いて解析した。アミノ酸の変換量を測定するために、アミノ酸標準溶液（Ｔｙｐｅ　Ｈ）を０．１Ｎ　ＮａＯＨで中和した後、インキュベートに供した。それぞれ１２５μＭのアミノ酸をテストサンプルとともに３７℃でインキュベートした後、遊離アミノ酸及びアンモニアの量を測定した。
【０１１４】
（１−７）ＲＴ−ＰＣＲ及びヌクレオチド配列決定
Ｉｓｏｇｅｎを用いて第三の胸の乳腺から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度及びタンパク質混在量をそれぞれＡ２６０及びＡ２６０／Ａ２８０により測定した。逆転写酵素及びプライマーの存在下、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩを用いて４２℃で５０分間処理し、全ＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。ｃＤＮＡ、ＥＸ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーによるＰＣＲを、ＴａＫａＲａ　ＴＰ２０００サーマルサイクラーを用いて３５サイクル行った。各サイクルは、９４℃で１分間の変性、５７℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長からなる。最後の反応は、７２℃で１０分間継続した。
【０１１５】
ディファレンシャルディスプレイのために、妊娠１６日目及び１８日目の乳腺からサンプルを調製した。オリゴ（ｄＴ）プライマーの存在下で全ＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、プライマーセット（５’−　ｃｇａｃｔｔｇａ　−３’及び５’−　ａｔｃｇｔｇｃｃ　−３’）を用いたＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。
妊娠１８日目に集めたサンプル中に検出された約１．１ｋｂのＰＣＲ産物の配列決定を行った。その部分配列情報に基づいて、５’末端から３’末端までのヌクレオチド配列を次のように決定した。
【０１１６】
妊娠１８日目の乳腺から全ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲのために、アンチセンスプライマー　５’−　ｃｇａｃｔｔｇａｔｇｇｃｇｇｔｇｔｃｔａ　−３’（アンチセンスＩ：１５１３−１５３２ｎｔ）の存在下、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをセンスプライマー　５’−　ｇｇａｔｇｃｔｇｇｔｃａｃｇａｇｇｔａａ　−３’（センスＩ：２６３−２８２ｎｔ）及びアンチセンスプライマー　５’−　ｃｔａｇｃａｃｔｇａｇｇｃｃａｔ　−３’（アンチセンスＩＩ：８３８−８５３ｎｔ）の存在下、又はセンスプライマー　５’−　ｃｔｇａｔｇａａｇｇａａｇｇａａｃｇｃｔ　−３’（センスＩＩ：６６９−６８８ｎｔ）及びアンチセンスプライマー　５’−　ｃｇａｃｔｔｇａｔｇｇｃｇｇｔｇｔｃｔａ　−３’（アンチセンスＩ）の存在下、ＰＣＲにより増幅した。２種類のＰＣＲ産物をＤＮＡ配列解析に使用した。
【０１１７】
５’−ＲＡＣＥのために、アンチセンスプライマー　５’−　ｃａｔｇａｃｔｔｃｔｇａｇｇｃａｃｇａｔ−３’（アンチセンスプライマーＩＩＩ：４８７−５０６ｎｔ）の存在下で調製した。キットに含まれるｔａｉｌｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍを用いて３’末端にオリゴ（ｄＣ）を付加した。最初のＰＣＲは、短縮型アンカープライマー（キットに含まれる）及びアンチセンスＩＩＩプライマーの存在下で行った。ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲは、ユニバーサル増幅プライマー（キットに含まれる）及びアンチセンスプライマー　５’−　ｃｃａａｇｔｔｃｔａａｇｔａｃｃａｇｃｃ　−３’（アンチセンスＩＶ：３４５−３５９ｎｔ）の存在下で行った。ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を配列決定に使用した。
【０１１８】
３’−ＲＡＣＥのために、（ｄＴ）１５−アダプタープライマー（キットに含まれる）の存在下でｃＤＮＡを調製した。（ｄＴ）１５−アダプタープライマー及びセンスプライマー　５’−　ｔａｇａｃａｃｃｇｃｃａｔｃａａｇｔｃｇ　−３’（センスＩＩＩ：１５１３−１５３２ｎｔ）の存在下でＰＣＲを行った。
【０１１９】
ＴＡクローニングキットを用いて、ＰＣＲ産物をプラスミド中に挿入した。ＡＬＦ　ＤＮＡシークエンサー（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び自動サイクル配列決定キットを用いて、配列を決定した。全ての操作は、キットに添付されている説明書に従って行った。
【０１２０】
（１−８）ノーザンブロット及びｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーション解析
センスＩプライマー及びアンチセンスＩＩプライマーの存在下で増幅した５９１ｂｐのＤＮＡを、ＴＡクローニングキットを用いてプラスミド中にサブクローニングした。プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶ又はＨｉｎｄＩＩＩによって消化した。消化したプラスミドＤＮＡをＳＰ６及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの鋳型とし、ＤＩＧ　ＲＮＡ　ラベリングキットを用いて、ＤＩＧ標識したアンチセンス及びセンスＲＮＡプローブを合成した。ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブを検出用プローブとして用いた。
【０１２１】
５μｇの全ＲＮＡを、６０％ホルムアミド及び７．７％ホルムアルデヒドを含有する電気泳動用緩衝液（２５ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、６ｍＭ　酢酸ナトリウム及び１．２ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解し、６５℃で１０分間加熱した。変性したＲＮＡを、１．２％アガロースゲルで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン上にトランスファした。メンブレンをアンチセンスＲＮＡプローブとともに一晩インキュベートとした。抗ＤＩＧ抗体とインキュベートとした後、ＤＩＧヌクレオチド検出キットを用いてシグナルを検出した。エチジウムブロマイドで染色したリボソームＲＮＡを内部標準として用いた。
【０１２２】
ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを、Ｆｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，　ｓ．ら　（１９９８）　Ｊ．　Ｖｅｔ．　Ｍｅｄ．　Ｓｃｉ．　６０，　９３７−９４２）に従って行った。すなわち、新鮮な乳腺をパラホルムアルデヒドで固定し、エタノールで脱水し、パラフィン中に包埋して、６μｍ切片を作製した。脱パラフィン処理した切片をプロテイナーゼＫで消化した。この切片をアンチセンス又はセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。洗浄及びブロッキングの後、各切片をアルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体とともにインキュベートし、次いでニトロブルーテトラゾリウム塩及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートとともにインキュベートした。切片をメチルグリーンで対比染色した。
【０１２３】
２．実験結果
（２−１）マウス乳汁中の遊離アミノ酸
マウス乳汁中の遊離アミノ酸濃度の測定結果を表１のカラムＩに示す。
【０１２４】
【表１】
2004105119.tif 000002
【０１２５】
表１のカラムＩに示すように、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＧｌｕは豊富に存在しており、それらの濃度は２４０μＭを越えていた。Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ及びＡｒｇの濃度は６７〜１３１μＭであった。その他のアミノ酸（Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ）の濃度は、２５μＭ未満であった。特に、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度は、５μＭ未満であった。
【０１２６】
乳清中の遊離アミノ酸の変換を調べるために、乳清に外部からアミノ酸（ＴｙｐｅＨ　標準）をそれぞれ１２５μＭの濃度で添加し、３７℃で２時間インキュベートした場合の遊離アミノ酸濃度を、０時における遊離アミノ酸濃度と比較して遊離アミノ酸の減少率を求めた。その結果を表１のカラムＩＩに示す。表１のカラムＩＩに示すように、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ及びＩｌｅに変化は観察されなかった。Ｌｅｕ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ及びＴｙｒには６０％を越える減少率が観察された。これらのうち、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｙｒは完全に消失した。見かけ上の減少率は、Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ＞Ｃｙｓ，Ｌｅｕ＞Ｈｉｓ＞＞Ａｒｇ，Ｖａｌ＞＞その他のアミノ酸の順であった。表１のカラムＩに示す乳汁中に少量含まれるアミノ酸は、その他のアミノ酸よりも効率的にかつ迅速に変換された（ｒ＝−０．５８５，ｐ＝０．０１４）。
【０１２７】
（２−２）ＬＡＯの特性
ＬＡＯ活性の指標として、Ｈ２Ｏ２の時間依存的産生量を測定した。その結果を図１に示す。図１中、−●−はＬ−Ｌｅｕの存在下で乳清をインキュベートしたときの結果、−○−はＤ−Ｌｅｕの存在下で乳清をインキュベートとしたときの結果、−−○−−はＬｅｕの不存在下で乳清をインキュベートとしたときの結果を示す。図１に示すように、Ｌ−Ｌｅｕの存在下においてＬＡＯは時間依存的にＨ２Ｏ２を産生し、Ｈ２Ｏ２産生量は〜１２０分で最大値に達した。Ｄ−Ｌｅｕの存在下におけるＨ２Ｏ２産生量はＬｅｕの不存在下におけるＨ２Ｏ２量と同程度であり、Ｄ−ＬｅｕはＨ２Ｏ２産生に影響を与えなかった。
【０１２８】
Ｌｅｕの不存在下において観察された高いバックグラウンドが観察されなかったので、以下では、図３に示す１１３ｋＤａフラクションをＬＡＯの供給源として用いた。ＬＡＯは、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｌｅｕ又はＬ−Ｐｈｅの存在下ではＨ２Ｏ２を産生したが、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｅｕ又はＤ−Ｐｈｅの存在下ではＨ２Ｏ２の産生は観察されなかった。
【０１２９】
様々な濃度のＬ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｌｅｕ又はＬ−Ｐｈｅの存在下において、３７℃で１２０分間インキュベートを行った。２０〜１００μＭの低濃度において、Ｈ２Ｏ２産生量はインキュベーション時間の進行に伴って線形的に増加し（ｒ＞０．９５）、いずれの濃度においても最大産生値はＬ−Ｐｈｅの存在下において観察された。
アミノ酸濃度とＡ４２０との線形的関係を得るために、１１３ｋＤａフラクションを２倍容量の水で希釈し、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｌｅｕ及びＬ−Ｈｉｓ（０．４、０．８、１．６及び３．２ｍＭ）とともにインキュベートとした。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの式に従って、アミノ酸濃度をＡ４２０に対してプロットしたところ（データは示さず）、各線は直線となった（ｒ＞０．９６）。ＬＡＯの見かけのＫｍは、Ｌ−Ｐｈｅに対しては１．０ｍＭ、Ｌ−Ｌｅｕに対しては８．１ｍＭ、Ｌ−Ｈｉｓに対しては２０．２ｍＭであった。Ｖｍａｘは約３．９であった。
【０１３０】
アミノ酸の量と種類を確かめるために、１１３ｋＤａフラクション中のＬＡＯを、各種アミノ酸（ＴｙｐｅＨ　標準）とともに２４０分間インキュベートとし、０時のときの値を１００％として各種アミノ酸の減少率を求めた。その結果を図２に示す。図２中、●はＰｈｅ、○はＴｙｒ、■はＭｅｔ、□はＬｅｕ、▲はＣｙｓ、△はＨｉｓ、◆はその他のアミノ酸を示す。Ｌｅｕ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ及びＴｙｒは、時間依存的に減少したが、その他のアミノ酸は変化せず、４時間のインキュベーション時間の終了時において９２〜１００％であった。見かけ上の減少率は、Ｐｈｅ＞Ｍｅｔ，Ｔｙｒ＞Ｌｅｕ，Ｃｙｓ＞Ｈｉｓ＞＞その他のアミノ酸の順であった。インキュベーションの間、アンモニアの濃度は時間依存的に増加した（データは示さず）。
【０１３１】
（２−３）ＬＡＯの精製
超遠心によりスキムミルクを乳清フラクション及びカゼインフラクション中に分離した。乳清フラクションはＬＡＯ活性を有していたので、乳清フラクションを用いた。乳清フラクションのゲル濾過の結果を図３に示す。図３中、○はタンパク質濃度（Ａ２８０）、■はＬＡＯ活性（Ａ４２０）を示し、図の上部の数値は分子量マーカーを示す。図３に示すように、ゲル濾過によって、ＬＡＯのピークが見かけの分子量Ｍｒ＝１１３，０００の位置にあることが判明した。
【０１３２】
１１３ｋＤａフラクション中のＬＡＯをイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。すなわち、１１３ｋＤａフラクションをカラムにかけ、ＮａＣｌのリニアーグラジエント（０−５００ｍＭ）（図４中の点線）で溶出した。イオン交換クロマトグラフィーの結果を図４に示す。図４中、○はタンパク質濃度（Ａ２８０）、■はＬＡＯ活性（Ａ４２０）を示し、図の上部の矢印はそれぞれフラクションＩ、ＩＩ及びＩＩＩを示す。図４に示すように、ＬＡＯは３つのフラクションに溶出した。高いＬＡＯ活性はフラクションＩ及びＩＩで観察された。最も高い精製度のＬＡＯはフラクションＩから得られた。
【０１３３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色の結果を図５に示す。図５中、レーン１はゲル濾過クロマトグラフィー処理した１１３ｋＤａフラクション、レーン２はイオン交換クロマトグラフィー処理したフラクションＩを示し、図の右側の数値は分子量マーカーを示す。図５に示すように、フラクションＩには分子量Ｍｒ＝６０，０００のタンパク質が含まれていることが判明した。
【０１３４】
（２−４）ＬＡＯのアミノ酸配列決定
フラクションＩ中のＬＡＯを用いてアミノ酸配列決定を行った。ＬＡＯのＮ末端のアミノ酸配列は、ＬＹＥＮＬＶＫＸＦＱＤＰＤＹＥＡＦＬＬＩであった。リシルエンドペプチダーゼで消化したペプチドのアミノ酸配列はＬＹＥＮＬＶＫ、ＴＹＶＱＫ、ＮＰＧＩＬＧＹ、ＹＲＴＤＧＰＴＳＡＬＨＫ及びＡＴＲＧＨＴＡＬであった。これらのうち、フラグメントＡＴＲＧＨＴＡＬの末尾に位置するＬｅｕをＬＡＯのＣ末端と同定した。
【０１３５】
（２−５）ＬＡＯ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
ＬＡＯ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２に示す。ＬＡＯ　ｃＤＮＡは１９４１個のヌクレオチド及び３’末端のポリ（Ａ）からなる。Ｎ末端のＬｅｕは、１１１−１１３番目のヌクレオチドによってコードされている。Ｃ末端残基はＬｅｕであり、コドンＣＴＴは１５９９−１６０１番目のヌクレオチドに存在している。終止コドンＴＡＧは、１６０２−１６０４番目のヌクレオチドであると考えられる。ＬＡＯは、１１１−１６０１番目のヌクレオチドによってコードされている。翻訳開始コドンである最初のＡＴＧは、３３−３５番目のヌクレオチドによってコードされている。シグナルペプチドは、３３−１１０番目のヌクレオチドによってコードされている。ａａｔａａａポリアデニル化シグナルは、１６４３−１６４８番目のヌクレオチドによってコードされており、ポリ（Ａ）テイルは１９４２番目のヌクレオチドに存在する。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。アミノ酸配列解析によって決定されたアミノ酸配列は、推定アミノ酸配列の２７−３２、２７−４６、１２４−１２８、１６０−１６６、３００−３１１及び５１６−５２３番目のアミノ酸配列に相当する。ＬＡＯ及びシグナルペプチドはそれぞれ４９７及び２６個のアミノ酸からなる。
【０１３６】
（２−６）乳腺におけるＬＡＯ　ｍＲＮＡの発現
ＬＡＯの組織依存的発現及び段階依存的発現を調べるために、妊娠１８日目のマウスから組織（乳腺、脳、心臓、肝臓、肺、筋肉、胎盤）を採取し、ＬＡＯ　ｍＲＮＡのレベルをノーザンブロット解析により測定した。その結果を図６に示す。図６中、（ａ）は乳腺ＲＮＡのノーザンブロットの結果、（ｂ）の上側のパネルはノーザンブロットの結果、（ｂ）の下側のパネルはエチジウムブロマイド染色の結果を示す。図６（ａ）に示すように、乳腺におけるＬＡＯ　ｍＲＮＡは、約２．０ｋｂの明確なバンドとして検出され、約４．６ｋｂの位置に存在する曖昧なバンドはおそらくｈｎＲＮＡに相当するものと考えられた。図６（ｂ）に示すように、乳腺以外の組織（脳、心臓、肝臓、肺、筋肉、胎盤）では、ＬＡＯｍＲＮＡの発現は観察されなかった。
【０１３７】
乳腺におけるＬＡＯ　ｍＲＮＡの発現を、妊娠及び乳汁分泌の様々な段階において測定した結果を図７に示す。図７中、上側のパネルはノーザンブロットの結果、下側のパネルはエチジウムブロマイド染色の結果を示し、「ｄ」は日を意味する。図７に示すように、ＬＡＯ　ｍＲＮＡの発現は、妊娠７日目には観察されなかったが、妊娠１３日目には曖昧なバンドが観察された。妊娠１８日目（分娩の１日前）には、妊娠１６日目と比較してＬＡＯ　ｍＲＮＡの発現の明らかな増加が観察された。ＬＡＯ　ｍＲＮＡは、乳汁分泌を通じて発現していたが、乳汁分泌の終期では発現が弱くなっていた。
【０１３８】
妊娠１３日目のマウスの卵巣を切除し、ＬＡＯ　ｍＲＮＡの発現をｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションによって測定した。その結果を図８に示す。図８中、（ａ）は妊娠１３日目にアンチセンスプローブを用いて測定した結果、（ｂ）は妊娠１３日目にセンスプローブを用いて測定した結果、（ｃ）は卵巣摘出１６時間後にアンチセンスプローブを用いて測定した結果、（ｄ）は卵巣摘出１６時間後にセンスプローブを用いて測定した結果、（ｅ）は妊娠１６日目にアンチセンスプローブを用いて測定した結果、（ｆ）は妊娠１８日目にアンチセンスプローブを用いて測定した結果を示す。陽性シグナルは茶色を呈した。各写真は同一倍率（×２００）で撮った。図８（ａ）及び（ｂ）に示すように、妊娠１３日目において、アンチセンスプローブ及びセンスプローブのいずれを用いた場合にもシグナルは検出されなかった。図８（ｅ）に示すように、妊娠１６日目における乳房上皮細胞では強いシグナルが観察される部分もあったが、大部分は弱いシグナルが観察されるか又はシグナルが全く観察されなかった。図８（ｆ）に示すように、妊娠１８日目における乳房上皮細胞では全ての部分で強い陽性シグナルが観察された。
【０１３９】
（２−７）ＬＡＯ遺伝子発現のホルモンによる制御
図８（ａ）及び（ｂ）に示すように、妊娠１３日目における腺房（ａｌｖｅｏｌｕｓ）は狭い内腔を有していた。図８（ｃ）及び（ｄ）に示すように、卵巣摘出１６時間後、内腔は明らかに広がっており、乳腺中には多数の脂肪滴が存在していた。
【０１４０】
卵巣摘出後の乳腺におけるＬＡＯ　ｍＲＮＡの時間依存的発現の測定結果を図９に示す。図９中、上側のパネルはノーザンブロットの結果、下側のパネルはエチジウムブロマイド染色の結果を示す。図９に示すように、ＬＡＯ　ｍＲＮＡは卵巣摘出後８〜１６時間で明らかに増加し、２４時間でピークに達し、その後顕著に減少した。図８（ｃ）に示すｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションによって、全ての乳房細胞でＬＡＯ　ｍＲＮＡが発現しており、その発現パターンは妊娠１８日目における乳腺で観察される発現パターン（図８（ｆ）参照）と類似していることが判明した。
【０１４１】
ＬＡＯ遺伝子発現のプロゲステロン及び／又はグルココルチコイド依存的制御を調べるために、妊娠１３日目において両側卵巣及び副腎を切除した。卵巣切除／副腎切除マウスにおいてＬＡＯ　ｍＲＮＡは検出されなかった。
【０１４２】
コルチゾール及び／又はプロゲステロンを投与したときのＬＡＯ　ｍＲＮＡの発現を測定した。その結果を図１０に示す。図１０中、レーン１及び２は卵巣切除マウス、レーン３〜６は卵巣／副腎切除マウスにおける結果を示し、レーン１〜３はゴマ油、レーン４はプロゲステロン、レーン５はコルチゾール、レーン６はコルチゾール及びプロゲステロンを０時に投与したときの結果を示し、レーン１は投与後０時、レーン２〜６は投与後１６時間における乳腺の結果を示し、上側のパネルはノーザンブロット、下側のパネルはエチジウムブロマイド染色の結果を示す。図１０に示すように、コルチゾールの投与によってＬＡＯ　ｍＲＮＡは増加したが、プロゲステロンの投与による影響は観察されなかった。
【０１４３】
３．考察
ＤＤＢＪプログラムを用いたＣｌｕｓｔｅｒ法によるアライメントの結果、マウス乳汁ＬＡＯをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ヘビ毒アポキシン１（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＦ０９３２４８）、ヘビ毒ＬＡＯ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＦ０７１５６４）、マウスＦｉｇ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｕ７０４２９）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列とそれぞれ５３．２、５２．７及び５１．１％の相同性を有していた。最近、５０８ｂｐのｃＤＮＡが乳汁を分泌するマウス乳腺からクローニングされた（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＢＥ８５０８５５）。それと同じヌクレオチド配列が、マウス乳汁ＬＡＯ　ｃＤＮＡの１２５２−１７５９番目のヌクレオチドに存在していた。ＦＡＤは、ＬＡＯ活性の発現に必要であり、ＦＡＤ結合モチーフをコードするヌクレオチド配列は、２０７−２５４番目のヌクレオチドに存在していた。
【０１４４】
マウス乳腺は、乳汁分泌を通じてＬＡＯ遺伝子を発現しており、乳汁分泌間におけるＬＡＯ　ｍＲＮＡ発現の変化は、マウスにおけるγ−カゼイン　ｍＲＮＡ発現の変化及び乳汁産生の変化と類似している。卵巣摘出した妊娠マウスにおいて、乳腺は、手術後、時間依存的にＰＲＬ受容体及びカゼイン遺伝子を発現する。本実験によって、乳汁合成の開始に伴いＬＡＯ遺伝子も発現することが示された。循環するマウス血漿では、卵巣摘出後と同様に妊娠終期において、プロゲステロンが減少し、コルチコステロンが増加する。グルココルチコイド（コルチゾール又はコルチコステロン）は、ＰＲＬ受容体遺伝子の活性化に必要であるとともに、ＰＲＬ受容体の数を維持するのに必要である。本実験によって、ＬＡＯ遺伝子発現はコルチゾールに依存するがプロゲステロンには依存しないことが示された。同様のホルモン依存性が、マウス乳腺のミトコンドリア　Ｔｉｍ２３遺伝子の発現において見られる。ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）において、ＬＡＯは誘導性酵素であり、その遺伝子発現は強力な制御下にある。インターロイキン−４は、マウスＢ細胞におけるＦｉｇ１の合成を誘導する。したがって、グルココルチコイドは、乳腺におけるＬＡＯ遺伝子発現に必要であると考えられる。
【０１４５】
マウス乳汁ＬＡＯは２つのサブユニットから構成されていた。３種類のイソ酵素が検出され、その電気的に異なるパターンは、ヘビ毒ＬＡＯで観察されるものに類似していた。基質特異性は、その他のＬＡＯで報告されているものと類似していた。ヘビ毒ＬＡＯと異なり、マウス乳汁ＬＡＯは、Ｌ−Ｉｌｅをほとんど酸化しなかった。マウス乳汁ＬＡＯは、ラット肝臓及び腎臓で見られるようなＤ−アミノ酸を酸化しなかった。その他のＬＡＯと同様に、マウス乳汁ＬＡＯはＨ２Ｏ２及びアンモニアを産生した。ヘビ毒ＬＡＯは冷凍によって不活性化する。−２０℃又は−５０℃の長期保存の後、マウス乳汁ＬＡＯにおいてはＬＡＯ活性の減少が観察されなかった。類似の結果がキングコブラ（Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ　Ｈａｎｎａｈ）毒ＬＡＯにおいて観察される。乳汁における遊離アミノ酸の不均一は、試験した１５種類のアミノ酸に共通して観察される。このことは本実験によってマウスにおいても当てはまることが確認された。マウス乳汁ＬＡＯは、特定のアミノ酸と反応した。本実験によって、ＬＡＯによって変換され得るアミノ酸は、マウス乳汁にほとんど存在しないことが示された。マウス乳汁ＬＡＯによって変換されたアミノ酸の反応性は、速い、中程度、遅いと分類できる。乳汁中のＨ２Ｏ２の濃度は高く一定に保持されていると考えられる。
【０１４６】
ヘビ毒におけるＬＡＯは、ＬＡＯ活性に関連した抗菌性を有することが示されてきた。Ｈ２Ｏ２によって誘導されるＤＮＡのダメージ及び細胞死は、Ｈ２Ｏ２の直接的な細胞毒性及びＨ２Ｏ２から生じるその他の反応性酸素種が原因となる。ラクトペルオキシダーゼは、ウシ乳汁中に存在する。ラクトペルオキシダーゼはＨ２Ｏ２及びＳＣＮ−の存在下で抗菌作用を示す。また、Ｈ２Ｏ２はペルオキシダーゼの存在下で抗菌作用を示す。本実験によって、遊離アミノ酸の存在下においてＬＡＯはＨ２Ｏ２の供給体として作用することが示された。アミノ酸は乳腺におけるＬＡＯによって消費されるので、搾乳において観察されるアミノ酸量は実際に乳汁中に分泌されるアミノ酸量と等しくない。乳清中のＬＡＯは、外因性の遊離アミノ酸を利用してＨ２Ｏ２を産生し、そのときのＨ２Ｏ２量はＬ−Ｌｅｕの存在下（２００ｎｍｏｌ／ｍＬ）で産生されるＨ２Ｏ２量とほぼ等しい。ＬＡＯはアミノ酸１分子の酸化を通じてＨ２Ｏ２１分子を産生する。乳腺の乳汁中に産生されるＨ２Ｏ２総量は、予想外に大きく、おそらく約１μｍｏｌ／ｍＬに達するものと考えられる。ウサギの眼液中のＨ２Ｏ２が高濃度であるという報告がある。
【０１４７】
本実験によって、乳汁を分泌するマウスの乳腺が、定常的にＨ２Ｏ２を産生できるシステムを有することが示された。Ｈ２Ｏ２産生によって抗菌性システムが活性化するので、乳腺中には細菌がほとんど生存していない。保存中は外部から遊離アミノ酸が供給されないのでＬＡＯはＨ２Ｏ２を産生できない。しかしながら、細菌が乳腺で生存する場合もある。乳房炎は酪農産業における世界的な疾病であり、経済的損失の主要な原因となっている。乳房内部への細菌の感染に応答して炎症反応が生じ、これによって乳房上皮がかなりのダメージを受け、乳汁産生が永久的に減少する。アメリカだけで、経済的損失は、年間２０億ドルと推定されている。
【０１４８】
〔実施例２〕
実施例１と同様の方法（「（１−３）ＬＡＯ活性の測定」参照）によって、混合アミノ酸、Ｌ−Ｐｈｅ単独又はＬ−Ｌｅｕ単独の存在下における過酸化水素の発生量を４２０ｎｍにおける吸光度（Ａ４２０）を指標として測定した。その結果を図１１に示す。図１１に示すように、いずれの条件下においても時間経過に伴って過酸化水素の発生量が増加した。過酸化水素の発生量は、混合アミノ酸の存在下において最も大きく、また、Ｌ−Ｐｈｅの存在下における過酸化水素の発生量は、混合アミノ酸の存在下における過酸化水素の発生量と近い量であった。
【０１４９】
〔実施例３〕
過酸化水素（０，０．０３，０．３，３，３０ｍＭ）の存在下、３７℃で４時間、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）を培養し、培養後の細菌数を測定することにより、スタフィロコッカス・アウレウスに対する過酸化水素の抗菌作用又は殺菌作用を調べた。なお、スタフィロコッカス・アウレウスは、乳房炎に罹患しているウシの乳汁から単離したものを用いた。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、過酸化水素の濃度の増加に伴って、スタフィロコッカス・アウレウスの細菌数は減少した。この結果から、過酸化水素が乳房炎の原因菌であるスタフィロコッカス・アウレウスに対して抗菌作用又は殺菌作用を有することが確認された。
【０１５０】
〔実施例４〕
乳清フラクションのゲル濾過（実施例１参照）によって得られたＬＡＯ活性を有するフラクション（図３参照）を含有する細菌用培養液（２０％スキムミルク０．５ｍＬ、細菌懸濁液０．０５ｍＬ、ＬＡＯ活性フラクション又は緩衝液０．２ｍＬ、アミノ酸混合液＋緩衝液０．３０ｍＬ）１．０５ｍＬを用いて、各種細菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））を３７℃で４時間培養し、培養後の細菌数を測定することにより、マウス乳汁ＬＡＯによって産生される過酸化水素の各種細菌に対する抗菌作用又は殺菌作用を調べた。なお、各種細菌は、乳房炎に罹患しているウシの乳汁から単離したものを用いた。また、細菌用培養液中の緩衝液は、１／１５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．４）及び１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有し、アミノ酸混合液（ＭＥＭ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ．　カタログ番号１１１３０．　Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）は、１ｍＬあたり、アルギニン１２６μｇ、シスチン２４μｇ、ヒスチジン４２μｇ、イソロイシン５２．４μｇ、ロイシン５２．４μｇ、リシン７２．５μｇ、メチオニン１５．１μｇ、フェニルアラニン３３μｇ、スレオニン４７．６μｇ、トリプトファン１０．２μｇ、チロシン３６μｇ、バリン４６．８μｇを含有する。
スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・アガラクチエ、大腸菌及び肺炎桿菌に関する結果をそれぞれ図１３〜１６に示す。なお、図１３〜１６中、「ＡＡ」はアミノ酸、「−」はＬＡＯ又はアミノ酸の不存在下、「＋」はＬＡＯの存在下を表し、「Ｘ０」、「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ４」、「Ｘ８」は、細菌用培養液中の「アミノ酸混合液＋緩衝液」の組成が、０ｍＬ＋０．３０ｍＬ、０．０２ｍＬ＋０．２８ｍＬ、０．０４ｍＬ＋０．２６ｍＬ、０．０８ｍＬ＋０．２２ｍＬ、０．１６ｍＬ＋０．１４ｍＬであることを表す。
図１３〜１６に示すように、アミノ酸混合液の添加量の増加（すなわちマウス乳汁ＬＡＯによって産生される過酸化水素量の増加）に伴って、いずれの細菌の細菌数も減少した。この結果から、マウス乳汁ＬＡＯによって産生される過酸化水素が、乳房炎の原因菌であるスタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・アガラクチエ、大腸菌、肺炎桿菌に対して抗菌作用又は殺菌作用を有することが確認された。
【０１５１】
【発明の効果】
本発明によって、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する新規タンパク質（哺乳動物のＬ−アミノ酸オキシダーゼを含む）、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及び上記タンパク質に対する抗体が提供される。
【０１５２】
また、本発明によって、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する新規タンパク質（哺乳動物のＬ−アミノ酸オキシダーゼを含む）を過酸化水素供給成分として含有する抗菌・殺菌組成物が提供される。本発明の抗菌・殺菌組成物に含有されるＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質が、遊離Ｌ−アミノ酸の存在下において産生する過酸化水素は抗菌作用、殺菌作用を発揮できるとともに、感染症の原因となる細菌の抗菌又は殺菌を通じて細菌性感染症の予防・治療作用を発揮できる。したがって、本発明の抗菌・殺菌組成物は、医薬組成物（例えば、感染菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、又は細菌性感染症の予防・治療剤）、食品添加用組成物（例えば、食品混入菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、食品の防腐剤）、化粧品添加用組成物（例えば、化粧品混入菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、化粧品の防腐剤）として有用である。
【０１５３】
さらに、本発明によって、遊離Ｌ−アミノ酸を過酸化水素供給成分として含有する乳房用抗菌・殺菌組成物が提供される。哺乳動物の乳房に存在するＬ−アミノ酸オキシダーゼが、本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物に含有される遊離Ｌ−アミノ酸を基質として産生する過酸化水素は抗菌作用又は殺菌作用を発揮できるとともに、感染症の原因となる細菌の抗菌又は殺菌を通じて細菌性感染症の予防・治療作用を発揮できる。したがって、本発明の乳房用抗菌・殺菌組成物は、乳房感染菌の抗菌剤若しくは殺菌剤、又は乳房における細菌性感染症（特に乳房炎）の予防・治療剤として有用である。
【０１５４】
さらに、本発明によって、家畜の乳房に遊離アミノ酸を投与する工程を含む家畜の乳房感染菌の抗菌・殺菌方法、及び家畜の乳房における細菌性感染症（特に乳房炎）の予防・治療方法が提供される。
さらに、本発明によって、生乳に遊離Ｌ−アミノ酸を添加する工程を含む生乳混入菌の抗菌・殺菌方法が提供される。
【０１５５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｌ−Ｌｅｕの存在下、Ｄ−Ｌｅｕの存在下又はＬｅｕの不存在下で乳清をインキュベートとしたときに時間依存的に産生されるＨ２Ｏ２量の測定結果を示す図である。
【図２】ゲル濾過によって得られたＬＡＯ活性を有するフラクションを各種アミノ酸とともにインキュベートとしたときの各種アミノ酸の減少率を示す図である。
【図３】乳清フラクションのゲル濾過の結果を示す図である。
【図４】ゲル濾過によって得られた１１３ｋＤａフラクションのイオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図５】ゲル濾過クロマトグラフィーによって得られた１１３ｋＤａフラクション及びイオン交換クロマトグラフィーによって得られたフラクションＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色の結果を示す図である。
【図６】各種組織におけるＬＡＯｍＲＮＡの発現に関するノーザンブロット及びエチジウムブロマイド染色の結果を示す図である。
【図７】妊娠及び乳汁分泌の様々な段階において乳腺で発現するＬＡＯｍＲＮＡに関するノーザンブロット及びエチジウムブロマイド染色の結果を示す図である。
【図８】ＬＡＯｍＲＮＡのｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図９】卵巣摘出後の乳腺におけるＬＡＯｍＲＮＡの時間依存的発現に関するノーザンブロット及びエチジウムブロマイド染色の結果を示す図である。
【図１０】コルチゾール及び／又はプロゲステロンを投与したときのＬＡＯｍＲＮＡの発現に関するノーザンブロット及びエチジウムブロマイド染色の結果を示す図である。
【図１１】混合アミノ酸、Ｌ−Ｐｈｅ又はＬ−Ｌｅｕの存在下においてＬＡＯにより産生される過酸化水素量の測定結果を示す図である。
【図１２】過酸化水素の存在下においてスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）を培養したときの細菌数を示す図である。
【図１３】ＬＡＯ及びアミノ酸の存在下においてスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）を培養したときの細菌数を示す図である。
【図１４】ＬＡＯ及びアミノ酸の存在下においてストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を培養したときの細菌数を示す図である。
【図１５】ＬＡＯ及びアミノ酸の存在下において大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を培養したときの細菌数を示す図である。
【図１６】ＬＡＯ及びアミノ酸の存在下において肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を培養したときの細菌数を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004105119.tif 000016
【図６】
2004105119.tif 000017
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月30日(2002.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡからなる請求項２記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質
（２）前記（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡからなる前記（２）記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）前記（２）又は（３）記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（５）前記（４）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）前記（１）記載のタンパク質に対する抗体。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列からなるタンパク質（以下「タンパク質（ａ）」という。）
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質（以下「タンパク質（ｂ）」という。）


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
配列番号２において、１〜２６番目のアミノ酸配列はシグナルペプチドに相当し、２７〜５２３番目のアミノ酸配列は成熟酵素であるＬ−アミノ酸オキシダーゼに相当する。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、タンパク質（ｂ）がＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は通常１〜５０個、好ましくは１〜２５個、さらに好ましくは１〜１０個である。このとき、タンパク質（ｂ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
また、配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、２７〜５２３番目のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の位置は、タンパク質（ｂ）がＬ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する限り特に限定されるものではない。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
タンパク質（ａ）及び（ｂ）は、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を用いて常法に従って製造できる。タンパク質（ａ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡを使用できる。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、マウス乳腺から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号１記載の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得られる。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
〔目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニング〕
ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングする際には、配列番号１記載の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断片を得る。ＰＣＲ増幅断片は、適当なプラスミドベクターを用いてサブクローニングしてもよい。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
ＰＣＲに使用するプライマーセットは特に限定されるものではないが、例えば、センスプライマー　５’−　ｇｇａｔｇｃｔｇｇｔｃａｃｇａｇｇｔａａ　−３’（配列番号１記載の塩基配列のうち、２６３〜２８２番目の塩基配列に相当する）及びアンチセンスプライマー　５’−　ｃｔａｇｃａｃｔｇａｇｇｃｃａｔ　−３’（配列番号１記載の塩基配列のうち、８３８〜８５３番目の塩基配列と相補的な塩基配列に相当する）からなるプライマーセット、センスプライマー　５’−　ｃｔｇａｔｇａａｇｇａａｇｇａａｃｇｃｔ　−３’（配列番号１記載の塩基配列のうち、６６９〜６８８番目の塩基配列に相当する）及びアンチセンスプライマー　５’−　ｃｇａｃｔｔｇａｔｇｇｃｇｇｔｇｔｃｔａ　−３’（配列番号１記載の塩基配列のうち、１５１３〜１５３２番目の塩基配列と相補的な塩基配列に相当する）からなるプライマーセットを使用できる。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
以上のようにして、タンパク質（ａ）をコードする遺伝子として、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡが得られる。
配列番号１記載の塩基配列のうち、タンパク質（ａ）は１１１〜１６０１番目の塩基配列によってコードされており、翻訳開始コドンＡＴＧは３３〜３５番目の塩基配列によってコードされており、終止コドンＴＡＧは、１６０２〜１６０４番目の塩基配列によってコードされており、シグナルペプチドは３３〜１１０番目の塩基配列によってコードされている。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
タンパク質（ａ）をコードする遺伝子は、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡに限定されるものではなく、タンパク質（ａ）をコードする限り、その他の塩基配列からなるＤＮＡも含まれる。そのようなＤＮＡは、その塩基配列に従って化学合成により得られる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子は、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、フェレット、ラット等の哺乳動物由来のｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをスクリーニングすることにより得られる。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの具体例としては、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
また、タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子は、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡに、例えば部位特異的変異誘発法によって人為的に変異を導入することにより得られる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　シリーズキットを用いて行うことができる。また、塩基配列が既に決定されているＤＮＡについては化学合成によっても得られる。


【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
免疫用抗原としては、例えば、（ｉ）　タンパク質（ａ）又は（ｂ）を発現している細胞又は組織の破砕物又はその精製物、（ｉｉ）　ＤＮＡ組換え技術を用いて、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡ（例えば、タンパク質（ａ）については配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ）　化学合成したペプチド等を使用できる。


【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
（２−５）ＬＡＯ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
ＬＡＯ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ＬＡＯ　ｃＤＮＡは１９４１個のヌクレオチド及び３’末端のポリ（Ａ）からなる。Ｎ末端のＬｅｕは、１１１−１１３番目のヌクレオチドによってコードされている。Ｃ末端残基はＬｅｕであり、コドンＣＴＴは１５９９−１６０１番目のヌクレオチドに存在している。終止コドンＴＡＧは、１６０２−１６０４番目のヌクレオチドであると考えられる。ＬＡＯは、１１１−１６０１番目のヌクレオチドによってコードされている。翻訳開始コドンである最初のＡＴＧは、３３−３５番目のヌクレオチドによってコードされている。シグナルペプチドは、３３−１１０番目のヌクレオチドによってコードされている。ａａｔａａａポリアデニル化シグナルは、１６４３−１６４８番目のヌクレオチドによってコードされており、ポリ（Ａ）テイルは１９４２番目のヌクレオチドに存在する。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。アミノ酸配列解析によって決定されたアミノ酸配列は、推定アミノ酸配列の２７−３２、２７−４６、１２４−１２８、１６０−１６６、３００−３１１及び５１６−５２３番目のアミノ酸配列に相当する。ＬＡＯ及びシグナルペプチドはそれぞれ４９７及び２６個のアミノ酸からなる。