(57)【要約】      （修正有）【課題】励起光波長と蛍光波長が近接しているような場合でもＳ／Ｎ及びダイナミックレンジが高く、蛍光強度の低いアレイにおいても、精度良く蛍光強度の測定を実施することができるマイクロアレイの読取方法を提供する。【解決手段】マイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像し得られた画像をバックグランドとすることにより、Ｓ／Ｎ及びダイナミックレンジが高く、蛍光強度の低いアレイにおいても、精度良く蛍光強度の測定を実施できる。【選択図】図１
2004184379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブを固定化した区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させたマイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取るマイクロアレイの読取方法であって、
所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第１のステップと、
上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する第２のステップと、
上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第３のステップとを有し、
第３のステップで得られる画像をバックグランドとして、第２のステップで得られる画像から減算すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法。
【請求項２】
プローブを固定化した区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させたマイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取るマイクロアレイの読取方法であって、
所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第１のステップと、
上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を複数回、撮像する第２のステップと、
上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第３のステップとを有し、
第３のステップで得られる画像をバックグランドとして、第２のステップで得られる複数枚の画像からそれぞれ減算し、減算して得られた複数枚の画像を加算すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法。
【請求項３】
プローブを固定化した区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させたマイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取るマイクロアレイの読取方法であって、
所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第１のステップと、
上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を複数の露光時間で撮像する第２のステップと、
上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第３のステップとを有し、
第３のステップで得られる画像をバックグランドとして、第２のステップで得られる複数枚の画像からそれぞれ減算し、減算して得られた複数枚の画像を、１／露光時間に比例した値で正規化し、得られた複数枚の画像からデータを抽出すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プローブを固定化して配列したマイクロアレイに、蛍光物質を付与した検体を反応させ、励起光を照射して、励起した蛍光の量を読取るマイクロアレイ読取方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種生物におけるゲノムプロジェクトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各種の方法で調べることができる。その有力な方法の一つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝子発現解析が知られている。この解析方法においては、例えば、基板の表面、凹部、凸部またはキャピラリーの内壁部あるいはキャピラリー中空部に保持された高分子ゲル状物の区画の何れかに、例えば、異なる遺伝子ペプチド、タンパク質、抗体等の生体関連物質をプローブとして数十から数万個固定化したマイクロアレイを使用する。このプローブに対して、各種特異的反応を利用することにより、プローブとして使用された物質とその生体機能発現との関係を調べることができる。このような方法は、今日のゲノムプロジェクトを通して明らかにされつつあるような、一個体レベルという極めて多数の遺伝子の総合的・系統的解析を行うために、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論として開発されてきた。
【０００３】
プローブと検体の反応物を検出する方法においては、まず、蛍光標識した検体と、マイクロアレイにプローブとして固定化された生体関連物質とを反応させる。次いで、蛍光レーザースキャナーや蛍光顕微鏡等の蛍光測定装置により蛍光量を検出することにより、蛍光標識された検体が、どのプローブと反応物を形成したかを検出することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
蛍光レーザースキャナーのような装置は、蛍光物質を励起するための励起光源としてレーザーを使用しているため、励起光波長帯が狭く、蛍光の波長帯との分離が比較的容易である。このため、蛍光を検出したときのＳ／Ｎとしては高い物が得られる。しかし、レーザーをスキャンするための機構が必要であり、比較的高価になりやすいと共に、メンテナンス性にも問題がある。
【０００５】
これに対して、蛍光顕微鏡のような装置は、白色光源を使用して、光学フィルタによって励起光と蛍光の分離を行う。このため、例えば蛍光物質を変更したような場合、光学フィルタの組合せを変更するという、比較的容易な手法で対応が可能であり、メンテナンスも容易である。しかし、励起光波長と蛍光波長が近接しているような場合、光学フィルタの特性から励起光と蛍光を完全に分離することが困難であり、このためにＳ／Ｎ及びダイナミックレンジの低下を招く。
【０００６】
本発明は、励起光波長と蛍光波長が近接しているような場合でもＳ／Ｎ及びダイナミックレンジが高く、蛍光強度の低いアレイにおいても、精度良く蛍光強度の測定を実施することができるマイクロアレイの読取方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討を行った結果、マイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像し得られた画像をバックグランドとすることにより、Ｓ／Ｎ及びダイナミックレンジが高く、蛍光強度の低いアレイにおいても、精度良く蛍光強度の測定を実施できることを見いだし本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、プローブを固定化した区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させたマイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取るマイクロアレイの読取方法であって、所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第１のステップと、上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する第２のステップと、上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第３のステップとを有し、第３のステップで得られる画像をバックグランドとして、第２のステップで得られる画像から減算すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法、である。
【０００９】
また、本発明は、プローブを固定化した区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させたマイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取るマイクロアレイの読取方法であって、所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第１のステップと、上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を複数回、撮像する第２のステップと、上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第３のステップとを有し、
第３のステップで得られる画像をバックグランドとして、第２のステップで得られる複数枚の画像からそれぞれ減算し、減算して得られた複数枚の画像を加算すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法、である。
【００１０】
さらに、本発明は、プローブを固定化した区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させたマイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取るマイクロアレイの読取方法であって、所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第１のステップと、上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を複数の露光時間で撮像する第２のステップと、上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第３のステップとを有し、第３のステップで得られる画像をバックグランドとして、第２のステップで得られる複数枚の画像からそれぞれ減算し、減算して得られた複数枚の画像を、１／露光時間に比例した値で正規化し、得られた複数枚の画像からデータを抽出すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法、である。
【００１１】
【発明の実施形態】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を説明する。
【００１２】
図１は、蛍光顕微鏡を用いたマイクロアレイの読取を行う装置の概略構成図である。
【００１３】
図１に示すように、蛍光顕微鏡１６を用いてマイクロアレイの読取を行うマイクロアレイの読取装置１は、蛍光物質を励起させるための光をマイクロアレイＡに照射する励起用光源６と、マイクロアレイＡ上の検体に付与された蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する撮像手段であるＣＣＤカメラ４と、このＣＣＤカメラ４によって撮像された画像に基づいて、検体を解析する検出手段５と、を有する。
【００１４】
また、蛍光顕微鏡１６は、所定の光を透過し又は反射させるダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、励起用フィルタ１２、及び、マイクロアレイＡに対する対物レンズ１４から構成される光学系を有する。さらに、マイクロアレイの読取装置１は、マイクロアレイＡを保持し、水平面内で所望の位置に移動させるＸＹステージ１８と、ＣＣＤカメラ４に写されるマイクロアレイＡの像のピントを調節するため、ＸＹステージ１８又は対物レンズ１４を上下動させるフォーカスステージ（図示せず）、及び、ＸＹステージ１８等を制御する制御装置２０とを有する。
【００１５】
また、励起用光源６は、蛍光顕微鏡１６の鏡筒の側面から鏡筒内に光を射出するように配置されている。好ましくは、励起用光源６として、マイクロアレイＡ上の蛍光物質を励起することができる波長成分の光を多く含む光源を選択する。本実施形態に置いては、励起用光源６として、高圧水銀ランプが使用されている。
【００１６】
励起用フィルタ１２は、励起用光源６から射出された光の中の、マイクロアレイＡ上の蛍光物質を励起させることができる波長成分だけを透過し、それ以外の波長成分を遮断するように構成されている。また、吸収用フィルタ１０は、マイクロアレイＡから発せられる蛍光の波長の光を透過させ、蛍光物質を励起させる波長成分の光を透過させないように構成されている。ダイクロックミラー８は、励起用フィルタ１２を透過した、蛍光物質を励起させることができる波長成分の光を反射してマイクロアレイＡの方に差し向けるように構成され、配置されている。また、このダイクロックミラー８は、マイクロアレイＡ上の蛍光物質から発せられた蛍光の波長の光を透過させるように構成されている。
【００１７】
本実施形態においては、蛍光物質としてＣｙ３を使用した。吸収用フィルタ１０、励起用フィルタ１２、ダイクロックミラー８としては、市販のＣｙ３用フィルタセットを使用し、それぞれ、吸収用フィルタ１０として、中心波長６１０ｎｍ、半値幅７５ｎｍのバンドパスフィルタが、励起用フィルタ１２として、中心波長５４５ｎｍ、半値幅３０ｎｍのバンドパスフィルタが、ダイクロックミラー８として、約５７０ｎｍ以下の波長の光を反射し、それ以上の波長の光を透過させるミラーを使用した。なお、ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、励起用フィルタ１２は、使用する蛍光物質の励起波長及び蛍光物質が発する蛍光の波長に合わせて選択、構成し、複数の蛍光物質を使用する場合には、蛍光顕微鏡１６において、容易に切替え可能に構成するのが良い。
【００１８】
ＣＣＤカメラ４は、その光軸が蛍光顕微鏡１６の光軸と整合するように、蛍光顕微鏡１６の鏡筒の、対物レンズ１４の反対側端部に取り付けられている。好ましくは、ＣＣＤカメラ４として、マイクロアレイＡから発せられる微弱な蛍光を、少ないノイズで撮像することができるように、カメラの冷却機能を備えた冷却ＣＣＤカメラを使用する。本実施形態においては、１３９２×１０４０有効画素を有し、−３０℃に冷却して使用するＣＣＤカメラが用いられている。また、本実施形態においては、蛍光顕微鏡１６は落射蛍光顕微鏡であり、倍率２倍の対物レンズを使用し、ＣＣＤカメラの手前に０．５倍の結像レンズを挿入して、等倍の光学系を使用している。
【００１９】
ＸＹステージ１８は、ＣＣＤカメラ４によってマイクロアレイＡの各部を撮像するため、マイクロアレイＡを水平面内で移動させることができるように構成されている。フォーカスステージ（図示せず）は、ＣＣＤカメラ４に写されるマイクロアレイＡの像のピントを調節するため、ＸＹステージ１８又は対物レンズ１４を上下動させるように構成されている。また、制御装置２０は、ＣＣＤカメラ４による撮像、ＸＹステージ１８の移動、励起用光源６のＯＮ／ＯＦＦ、フォーカスステージの移動等を制御する。或いは、励起用光源６として、頻繁にＯＮ／ＯＦＦを繰り返すような使用に適さない種類の光源を使用する場合には、励起用光源６の前に光を遮断するためのシャッター（図示せず）を設け、このシャッターの開閉を制御装置２０によって制御する。制御装置２０は、例えば、各装置を作動させるアクチュエータと、このアクチュエータに信号を送るパーソナルコンピュータ等によって構成することができる。
【００２０】
次に、図２を参照して、本発明の実施形態によるマイクロアレイの読取に使用するマイクロアレイＡを説明する。
【００２１】
図２に示すように、マイクロアレイＡは、区画Ｃが貫通穴により形成されており、且つ区画Ｃが複数個、整然と配列されたマイクロアレイである。そのようなマイクロアレイは、例えば、ＷＯ  ００／５３７３６号、特開２０００−６０５５４号、特開２０００−７８９９８号公報記載の方法により作成される。
【００２２】
各区画には、区画の内壁部に直接、又はゲルを介してプローブとなりうる生体関連物質が固定されている。
【００２３】
区画以外の基材部分Ｂは、区画Ｃと光透過率が異なれば、その構成に特に限定はない。また基材部分Ｂと区画Ｃは、光透過率に差があれば良く、どちらが透明であるかは問題ではない。
【００２４】
好ましくは、基材部分Ｂが不透明材料で構成されている。ここで「不透明」とは、マイクロアレイＡのプローブが固定された区画よりも光を透過しにくい性質を意味し、必ずしも、光の透過率が０％であることを意味するものではない。
【００２５】
図２では、区画Ｃとして中空円形状物を例示しているが、区画の外形は円形に限定されるものではない。区画Ｃの構造内径は１７０μｍ、外径は２２０μｍである。
【００２６】
また、図２では区画Ｃの肉厚部分及びそれを包含する樹脂製の基材部分Ｂにおいて、光透過率が１％以下になる材料で構成されているマイクロアレイを例示している。区画Ｃの肉厚部分は、カーボンブラックを２％混合したＰＭＭＡ又はポリカーボネート樹脂により成形されている。この区画Ｃは、並行に縦横５列ずつ４２０μｍピッチで等間隔に配置しており、その周囲は、カーボンブラックを２．５％混合したウレタン樹脂で包含されている。
【００２７】
次に、本発明の実施形態によるマイクロアレイの読取方法について説明する。
【００２８】
まず、各区画Ｃにプローブを含む高分子ゲル状物が充填されたマイクロアレイＡを用意する。また、適用によっては、各区画Ｃの内壁に直接プローブを固定することもできる。一方、解析すべき検体には蛍光物質を付与し、この検体を、マイクロアレイＡに作用させる。或る検体が、所定の構造のプローブに作用すると、プローブと検体が反応し、反応物が形成されるので、検体に付与された蛍光物質が、マイクロアレイＡの区画Ｃの中に固定される。従って、解析すべき検体とハイブリッドを形成することができる構造のプローブが固定されている区画Ｃの中にのみ蛍光物質が存在することになる。
【００２９】
マイクロアレイＡの読取を開始する前に、マイクロアレイの読取装置１のＸＹステージ１８の上には何も置かず、励起用光源６から光を照射し、この状態で検出される光をＣＣＤカメラ４によって撮像する。このとき、ＸＹステージ１８の、対物レンズ１４から励起光が照射される部分は、励起光が遮断されず、透過する構造になっていることが望ましい。撮像された画像の情報は、励起用光源６の光量斑を表す情報であると共に、マイクロアレイＡの蛍光測定を実施する際、マイクロアレイＡから発せられる蛍光以外の光としてＣＣＤカメラ４によって撮像されるノイズ光を表す情報となり、検出手段５に補正用画像１００として記憶させておく。また、ＣＣＤカメラ４の暗電流等によるノイズを除去するために、上記補正用画像１００としては、励起用光源６をＯＦＦ又はシャッターを閉にして、励起光を照射しないようにした状態で、励起光を照射してＣＣＤカメラ４で撮像したときと同じ露光時間だけ露光してＣＣＤカメラ４で撮像した画像を減算した画像を使用することが望ましい。図３にＣＣＤカメラ４によって撮像された補正用画像１００の一例を示す。
【００３０】
次に、マイクロアレイＡをＸＹステージ１８にセットする。ＸＹステージ１８にマイクロアレイＡをセットする時のＸＹステージ１８の位置と、マイクロアレイＡの測定を行う時のＸＹステージ１８の位置が異なる場合、ＸＹステージ１８を測定位置に移動する。
【００３１】
次にＸＹステージ１８上にセットされているマイクロアレイＡに、励起用光源６から励起光を照射し、マイクロアレイＡに配置されている各区画Ｃに充填されているゲル状物に固定化された蛍光物質からの蛍光を、ＣＣＤカメラ４によって撮像する。撮像された画像は、蛍光画像１０１として検出手段５に記憶させておく。また、ＣＣＤカメラ４の暗電流等によるノイズを除去するために、蛍光画像１０１としては、励起用光源６をＯＦＦ又はシャッターを閉にして、励起光を照射しないようにした状態で、励起光を照射してＣＣＤカメラ４で撮像したときと同じ露光時間だけ露光してＣＣＤカメラ４で撮像した画像を減算した画像を使用することが望ましい。図４にＣＣＤカメラ４によって撮像された蛍光画像１０１の一例を示す。
【００３２】
蛍光画像１０１は、励起用光源６の光量斑及び、蛍光顕微鏡１６で構成している各部レンズ等の反射による迷光を含み、特に励起光波長と蛍光波長が近接しているような場合、励起用フィルタ１２、ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０の特性により、励起光と蛍光の完全な分離が困難となり、上記迷光によるバックグランドの上昇が大きくなり、結果としてＳ／Ｎが悪くなる。図４の画像上の直線Ｄにおけるラインプロファイルを図５に示す。
【００３３】
ここで、上記迷光は、特に対物レンズ１４を構成するレンズ群による励起光の反射光がダイクロックミラー８及び吸収用フィルタ１０の特性により低減されるものの、完全に除去できずにＣＣＤカメラ４に入る光が主たる要因と考えられ、その強度分布は補正用画像１００にほぼ比例している。また補正用画像１００は対物レンズ１４からマイクロアレイＡに照射される励起光の強度分布にもほぼ比例している。
【００３４】
次に、蛍光画像１０１から、補正用画像１００に所定の値を乗算した画像を減算し、迷光補正蛍光画像１０２として検出手段５に記憶させておく。この操作により、上記迷光に相当する部分を画像から除去する。
【００３５】
次いで、励起光の斑による蛍光発光斑を補正するため、迷光補正蛍光画像１０２を補正用画像１００で除算し、更に補正用画像１００の平均値を乗算し、迷光及び励起光斑補正蛍光画像１０３として検出手段５に記憶させておく。上記画像の演算は、それぞれの画像を浮動小数点形式の画像として実施することが望ましい。また、上記手法では補正用画像１００の平均値を乗算したが、これに限る物ではない。例えば最大値、最小値、一定値とすることができ、一定値とした場合、励起用光源６が経時変化によってその強度が低下したような場合でも、同一レベルの励起光が照射された形の値に補正することができる。
【００３６】
図６に、図４の蛍光画像から、図３の補正用画像に、［（図４の蛍光画像の露光時間）／（図３の補正用画像の露光時間）］に相当する値を乗算した画像を減算し、次いで図３の補正画像で除算し、更に図３の画像の平均値を乗算した、迷光及び励起光斑補正蛍光画像を示す。また、図６の画像上の直線Ｄにおけるラインプロファイルを図７に示す。ここで、図３の補正用画像に、［（図４の蛍光画像の露光時間）／（図３の補正用画像の露光時間）］に相当する値を乗算しているが、乗算する値としてはこれに限った物ではなく、補正用画像１００と迷光強度との関係によって設定することができる。
【００３７】
以上の操作によって、迷光及び励起光照射斑の影響を除去し、Ｓ／Ｎを向上させた画像を得ることができる。しかし、迷光のレベルが大きい場合、ＣＣＤカメラ４の飽和によって、十分な露光時間が得られず、蛍光強度の弱い区画の測定が困難な場合がある。そこで、ＣＣＤカメラ４が飽和しない範囲の露光時間で、複数ｎ枚の蛍光画像１０１−１，１０１−２，…，１０１−ｎを撮像し、それぞれについて上記迷光及び励起光照射斑の補正を行い、更にそのｎ枚の迷光及び励起光斑補正蛍光画像を加算することによって、見かけ上の露光時間を延ばし、それによって蛍光強度の弱い区画の測定を可能にすることができる。ｎ枚の迷光及び励起光斑補正蛍光画像を加算した画像は、ｎ枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像１０４−ｎとして検出手段５に記憶させておく。図８に、ｎ＝５として、図４の蛍光画像を撮像した条件と同一条件で５枚の蛍光画像を撮像し、上記手法による処理を実施したときの、５枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像をに示す。また、図８の画像上の直線Ｄにおけるラインプロファイルを図９に示す。ここで、上記手法においてはＣＣＤカメラ４が飽和しない範囲の露光時間で複数枚の蛍光画像を取り込むようにしたが、蛍光強度が強い区画についてはＣＣＤカメラ４の飽和を許容し（測定値は無視する）、蛍光強度の低い区画について精度良く測定したい場合には、蛍光強度が強い区画の飽和が、他の測定したい区画に影響しない範囲で露光時間を長くして複数枚の蛍光画像を取り込むこともできる。
【００３８】
更に、蛍光強度が強い区画についてＣＣＤカメラ４が飽和しない範囲の露光時間（Ｘ）で撮像した蛍光画像１０１−１（Ｘ），１０１−２（Ｘ），…，１０１−ｎ（Ｘ）と、蛍光強度の弱い区画を精度良く測定するための露光時間（Ｙ）で撮像した蛍光画像１０１−１（Ｙ），１０１−２（Ｙ），…，１０１−ｎ（Ｙ）とを撮像して、それぞれについて上記迷光及び励起光照射斑の補正、及びｎ枚の迷光及び励起光斑補正蛍光画像の加算処理を行い、複数露光時間ｎ枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像１０４−ｎ（Ｘ），１０４−ｎ（Ｙ）として検出手段５に記憶させておく。
【００３９】
マイクロアレイＡの読取は、マイクロアレイＡのそれぞれの区画について、実施する。読取を実施する画像は、迷光及び励起光斑補正蛍光画像１０３、または、ｎ枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像１０４−ｎ、または、複数露光時間ｎ枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像１０４−ｎ（Ｘ），１０４−ｎ（Ｙ）であり、複数露光時間ｎ枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像１０４−ｎ（Ｘ），１０４−ｎ（Ｙ）の読取にあたっては、露光時間（Ｙ）で撮像した蛍光画像１０１−ｍ（Ｙ），ｍ＝１，２，…，ｎが読み取る区画内で飽和していなければ、複数露光時間ｎ枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像１０４−ｎ（Ｙ）から読み取り、また読み取る区画内で飽和していれば、複数露光時間ｎ枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像１０４−ｎ（Ｘ）から読み取り、ＣＣＤカメラ４は露光時間に対してリニアな特性を示すことから、その値をＹ／Ｘ倍して読み取り値とする。ここで、複数露光時間としてＸ，Ｙの２つの露光時間の場合について説明したが、更に多くの露光時間に分割して実施することも可能である。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のマイクロアレイの読取方法によれば、蛍光強度の低い検体を用いたマイクロアレイにおいても、プローブを固定化した検出すべき区画の情報を感度良く正確に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光顕微鏡を用いたマイクロアレイの読取装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】マイクロアレイの読取装置に使用されるマイクロアレイの一例を示す平面図である。
【図３】ＣＣＤカメラによって撮像された補正用画像の一例を示す画像である。
【図４】ＣＣＤカメラによって撮像された蛍光画像の一例を示す画像である。
【図５】図４の画像上の直線Ｄにおけるラインプロファイルを示すグラフである。
【図６】図３及び図４の画像に対して、本発明の手法を適用した、迷光及び励起光斑補正蛍光画像を示す画像である。
【図７】図６の画像上の直線Ｄにおけるラインプロファイルを示すグラフである。
【図８】本発明の手法を適用した、５枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像の一例を示す画像である。
【図９】図８の画像上の直線Ｄにおけるラインプロファイルを示すグラフである。
【符号の説明】
Ａ    マイクロアレイ
Ｂ    基材部分
Ｃ    区画
Ｄ    画像上のラインプロファイルを表示する直線
１    マイクロアレイの読取装置
４    ＣＣＤカメラ
５    検出手段
６    励起用光源
８    ダイクロックミラー
１０  吸収用フィルタ
１２  励起用フィルタ
１４  対物レンズ
１６  蛍光顕微鏡
１８  ＸＹステージ
２０  制御装置
【図１】
2004184379.tif 000003
【図２】
2004184379.tif 000004
【図３】
2004184379.tif 000005
【図４】
2004184379.tif 000006
【図５】
2004184379.tif 000007
【図６】
2004184379.tif 000008
【図７】
2004184379.tif 000009
【図８】
2004184379.tif 000010
【図９】
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