(57)【要約】【課題】臨床現場での使用に適した、簡便で低廉な変異解析方法やそのためのシステムの提供。【解決手段】その３’末端がいずれも検出すべき特定部位（例えば、ＳＮＰ部位）に一致するように設計したプライマー組を用いることにより、特定部位近傍の短い領域を選択的に増幅する。さらに、核酸増幅工程における変性温度を制御することにより、真の増幅産物のみを解離・増幅させ、得られる増幅産物の検出によって特定部位の配列を解析する。【効果】擬陽性増幅を防止し、１度のＰＣＲ増幅により、容易に変異解析を行うことができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸上の特定部位を含む所望の塩基長範囲の増幅産物を得るための核酸増幅方法であって、
前記標的核酸の第一鎖の塩基配列に相補な配列を含み、かつ該第一鎖上の前記特定部位に３’末端がバイブリダイズするべく設計された第１のプライマーと、前記標的核酸の第二鎖の塩基配列に相補な配列を含み、該第二鎖上の前記特定部位と塩基対をなす部位に３’末端がバイブリダイズするべく設計された第２のプライマーとを用いて核酸増幅を行うこと、及び
前記核酸増幅における変性温度を制御することにより、前記所望の塩基長範囲の増幅産物を１本鎖に解離して、次の核酸合成反応の鋳型とすることを特徴とする、前記核酸増幅方法。
【請求項２】
前記増幅工程における変性温度を、少なくとも５サイクル目から６０〜８５℃に制御することを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記所望の塩基長範囲の増幅産物が、前記第１のプライマーと第２のプライマーの３’末端が前記標的核酸上の特定部位にハイブリダイズして合成される核酸である、請求項１又は２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
前記第１のプライマーと前記第２のプライマー塩基長が、いずれも１８〜５０であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
前記第１のプライマーと前記第２のプライマーの融解温度が実質的に同一であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸増幅方法，
【請求項６】
前記第１のプライマーと前記第２のプライマーにおけるグアニン及びシトシンの割合の和が３５〜６５％であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
標的核酸上の特定部位の配列を解析するための方法であって、
前記標的核酸の第一鎖の塩基配列に相補な配列を含み、かつ該第一鎖上の前記特定部位に３’末端がバイブリダイズするべく設計された第１のプライマーと、前記標的核酸の第二鎖の塩基配列に相補な配列を含み、該第二鎖上の前記特定部位と塩基対をなす部位に３’末端がバイブリダイズするべく設計された第２のプライマーとを用いて核酸増幅を行うこと、及び
前記核酸増幅における加熱温度を制御することにより、前記所望の塩基長範囲の増幅産物を１本鎖に解離して、次の核酸合成反応の鋳型とすることを特徴とする核酸増幅工程、ならびに
前記増幅産物を検出することにより、前記標的核酸上の特定部位の配列を解析する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
前記特定部位が一塩基多型部位であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅産物の検出が、核酸増幅に応じて生成されるピロリン酸を利用した生物化学発光反応によって行われることを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸上の特定部位の配列を解析するためのシステムであって、
標的核酸及び該標的核酸上の特定部位を含む所望の塩基長範囲の増幅産物を得るためのプライマーを含む反応溶液を収める反応槽と、
前記反応槽内の温度を制御して、前記所望の塩基長範囲の増幅産物を解離し、増幅させる温度制御機構と、
前記反応槽内で生じる発光を検出するための光検出機構とを有し、かつ、
前記生物化学発光を生じたプライマーの種類を認識して前記標的核酸に含まれる特定部位の配列を解析することを特徴とする、前記システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異解析方法及びそのためのシステムに関する。より詳しくは、遺伝子の配列を個体間や集団内で比較するための一塩基多型（ＳＮＰ）を解析するための方法と該方法のためのシステムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノム解読後の次なる研究である「ポストゲノム研究」の重要な課題として、個体ごとの配列の微細な違いを調べる一塩基多型解析がある。ヒトにおける一塩基多型（ＳＮＰ）の総体は、個体の「個性」そのものを意味する。ＳＮＰはヒトゲノム中１５００塩基に一ヶ所の頻度で現れ、その中には疾病に対する罹りやすさや治癒のしやすさ、薬剤に対する感受性、あるいは環境ストレス応答に影響しているものが多数存在すると考えられている。したがってポストゲノム研究が進むと、同じ診断名や類似の症状の疾患であっても、その背景となる疾患を起こす仕組みの違いが分子レベルで明らかとなる。そして、その違いを考慮に入れた薬剤の使い分けなど、医療の個別化（オーダーメイド化）が可能になることが期待される。また、個人個人の疾患に対する罹りやすさ（疾患易罹患性）のリスク判定が可能となり、必要に応じて疾患を避けるためのライフスタイルを構築することで、疾患の予防、発症の遅延、早期発見・早期治療が実現できると考えられる。
【０００３】
ＳＮＰは、減数分裂したゲノム中の遺伝子配列が他の塩基に置き換わり、それが交配により遺伝的に受け継がれたものである。そのため、多くの個体からなるグループの配列を調べると、遺伝子の特定部位の配列が一定の頻度で２種類現れることになる。ＳＮＰはその存在する位置によって５種類に分類される。翻訳領域に存在しアミノ酸配列の変化を伴わないｓＳＮＰ、アミノ酸変化を伴う若しくはタンパク質が作られなくなるｃＳＮＰ、調節領域に存在し遺伝子発現量へ影響する可能性のあるｒＳＮＰやｉＳＮＰ、他の領域に存在し遺伝子発現量への影響はほとんどないｇＳＮＰである。
【０００４】
すべてのＳＮＰは多型マーカーとして疾患の発症や増悪に関連する遺伝子をみつけるために有用であるが、臨床分野で重要なのは疾患のリスク診断や薬剤の使い分けなどに直接関係するｃＳＮＰやｒＳＮＰである。この医学的に重要と考えられるＳＮＰの数について見積もる。３０億塩基対からなるヒトゲノムには３００万〜６００万箇所のＳＮＰが存在することになる。ヒトゲノム計画の結果、ヒト遺伝子の数はおおよそ２６，０００〜２８，０００種でサイズが平均１  ｋｂ（１，０００塩基）であることがわかっている。このため、意味のあるＳＮＰの存在する領域は２６〜２８  Ｍｂの範囲に絞り込まれる。遺伝子からのタンパク質翻訳では、３塩基ごとの配列組み合わせであるトリプレットコドンでアミノ酸が決定される。このうち、３番目の塩基が変化しても、同じアミノ酸に翻訳されたり類似性質のアミノ酸に置き換わったりするだけなので、タンパク質の機能に影響が出るものは全体の２／３となる。よって、タンパク質の機能に関与するＳＮＰはおおよそ１７〜１９  Ｍｂの範囲に存在することになる。ＳＮＰの出現頻度を１．５  ｋｂに１ヶ所とすると、機能に関与するＳＮＰは最大１３，０００ヶ所となる。
このうち、個人のＳＮＰとして解析の意味のあるものがどのくらい含まれるかが、医療分野でのＳＮＰ解析市場を決定づけるひとつの要因になる。つまり、ｃＳＮＰとｒＳＮＰを合わせても利用価値のあるＳＮＰは遺伝病の数と同程度の数千に絞り込まれる可能性が高い。
【０００５】
このように産業上重要なＳＮＰには限りがあり、疾病との因果関係が予測されるＳＮＰの探索が盛んに行われている。探索にはＳＮＰを大量解析する方法が必要であり、そのための方法や装置の開発が多数報告されている。例えば、全くの未知領域からＳＮＰ候補を探し出す方法としては、複数の試料で特定領域の配列を解析して比較する従来からのＤＮＡシーケンス法がある。また、ある程度絞り込まれたＳＮＰ候補の解析方法としては、ＤＮＡが高次構造を形成するときの安定化エネルギーが１塩基の違いで異なることを利用したＳＳＣＰ法や、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、加熱変性ＨＰＬＣ法（ＷＡＶＥ （登録商標）システム）、ＳＮＰ部位を含む試料を混合して得られるキメラ２本鎖のＳＮＰ部位を選択的に化学切断する方法（ＣＣＭ）、同じくキメラ部分を酵素切断するＳ１ヌクレアーゼ法、公知のＳＮＰにおけるタイピングを行うインベーダー法、ＴａｑＭａｎ法、プローブとのハイブリダイゼーション安定性の違いを比べるＤＮＡチップ法、ＳＮＰ塩基部位のみの局所的な配列を決定するミニシーケンス法（例えば、非特許文献１参照）、ミニシーケンスと質量分析を組み合わせたマスアレー法等が開発されている。さらに、ＳＮＰの臨床検査を目的とした解析方法として、生物化学発光を利用したＢＡＭＰＥＲ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）法（例えば、特許文献１及び非特許文献２参照）がある。
【０００６】
ＢＡＭＰＥＲ法では、標的遺伝子に対して、その３’末端がＳＮＰアレルに一致するように設計された２種類のプローブを用いて伸長反応を行い、その際に生成するピロリン酸を、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による生物化学発光によって検出する。伸長反応は、用いたプローブに対応する変異が標的遺伝子に存在する場合にのみ進行するため、発光を測定することにより、数分間で標的遺伝子のＳＮＰの配列を判定することができる。ＢＡＭＰＥＲ法は、試薬を加えるだけでＳＮＰ解析ができ、しかも簡単な光学系の発光測定装置で実施可能という点では、臨床現場での使用に適した解析方法と考えられる。
【０００７】
しかしながら、ＢＡＭＰＥＲ法によるＳＮＰ解析は２度の相補鎖合成反応含む４段階の反応を必要とする。以下、図１にしたがって各工程について説明する。
▲１▼検出対象となるＳＮＰ部位を含む数１００塩基長からなる部分のＰＣＲ増幅：
この工程は、試料の増幅のみならず、ＳＮＰ部位を含む限られた領域を増幅することで、以後のＳＮＰ検出反応の擬陽性増幅反応を低減する目的がある。結果として、ＳＮＰ部位３を持つセンス鎖１とＳＮＰ部位に相補な部分４を持つアンチセンス鎖１’のＰＣＲ産物と反応残査２であるｄＮＴＰとプライマーの混合物ができる。
【０００８】
▲２▼ＰＣＲ反応液からのＰＣＲ産物精製：
ＢＡＭＰＥＲ反応では、プローブの伸長反応で生成するピロリン酸を検出するため、ＰＣＲで使用されるプライマーやｄＮＴＰからなるＰＣＲ残査２は測定の妨害となる。すなわち、ＰＣＲプライマーはＰＣＲ産物にハイブリダイズしてＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成を起こし、ピロリン酸を産出する。また、ｄＮＴＰはピロリン酸を検出のための発光反応の擬似基質となる。したがって、これらを除去するため、図１では、ＰＣＲ残査２をＳｈｒｉｍｐ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅとＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉで分解している。なお、ＢＡＭＰＥＲ法の最初の報告（非特許文献２）では、ビオチン標識したプライマーでＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をストレプトアビジン付磁気ビーズに捕捉することで余分なＰＣＲプライマーやｄＮＴＰを除去している。補足したＰＣＲ産物は、アルカリ変性させることにより、ビーズに固定化された鎖のみを次のＢＡＭＰＥＲ伸長反応の鋳型として用いることができる。
【０００９】
▲３▼ＢＡＭＰＥＲ反応前段（ＢＡＭＰＥＲプローブによる相補鎖伸長反応）：
精製された鋳型ＰＣＲ産物に、ＳＮＰ部位にプローブ５の３’末端が相補な構造を有する、２０〜３０塩基長程度のＢＡＭＰＥＲプローブをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用により相補鎖伸長反応を行わせる。ここで、ＳＮＰ配列に対応したプローブ伸長反応の忠実度を高めるために、プローブの３’末端から３乃至４番目の塩基には予め試料ＤＮＡ配列とミスマッチになるような塩基配列を挿入しておく（例えば、非特許文献２及び３参照）。
【００１０】
プローブがＳＮＰ部位に相補な配列を３’末端に有するときのみ、伸長反応が起こり、６の伸長鎖とピロリン酸７を生成する。１塩基伸長につき１分子のピロリン酸が生成するため、ピロリン酸の量は伸長反応に伴って増加する。３’末端が非相補なプローブは伸長反応を起こさず、ピロリン酸も生成しない。通常反応サイクルは、生成するピロリン酸量を増加させるために、９４℃の変性工程（１０秒間）と、５０〜６０℃のハイブリダイズ及び伸長反応工程（１０秒間）を５回程度繰り返す。ＢＡＭＰＥＲ反応におけるＤＮＡ伸長鎖長は最長でも２００塩基長程度のため、短時間の反応サイクルでも十分に伸長反応が起きる。
【００１１】
▲４▼ＢＡＭＰＥＲ反応後段（発光反応によるピロリン酸定量検出）：
最後に、ＢＡＭＰＥＲプローブの伸長反応で生じたピロリン酸７をＡＴＰに変換し、ルシフェリン−ルシフェラーゼによる発光反応で検出する。すなわち、ＡＴＰとルシフェラーゼの作用で生成した励起状態の酸化ルシフェリンが基底状態に戻るときに生じる、５３０ｎｍ近傍の発光を検出する。ＳＮＰ配列と相補なＢＡＭＰＥＲプローブのみが発光を生じうるため、発光を生じたＢＡＭＰＥＲプローブの３’末端の配列により、ＳＮＰの配列を決定することができる。
【００１２】
【特許文献１】
特開２００２−１０１８９９号公報
【非特許文献１】
Ａ．Ｊａｌａｎｋｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （１９９２），  ３８，  ｐ３９−４３
【非特許文献２】
Ｇｕｏ−ｈｕａ  Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，  （２００１），  ２９，  ｅ９３
【非特許文献３】
Ｋ．Ｏｋａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  （１９９８），  １９，  ｐ３０７１−３０７８
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
上記のとおり、ＢＡＭＰＥＲ法によるＳＮＰ解析は２度の相補鎖合成反応含む４段階の反応を必要とする。これがより少ない工程で実施できれば、操作はさらに簡単なものとなり、処理の自動化も容易になることが期待される。
【００１４】
すなわち、本発明の課題は、ＢＡＭＰＥＲ法によるＳＮＰ解析技術を改良し、より臨床現場での使用に適した、簡便で低廉なＳＮＰ解析方法やそのためのシステムを提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために鋭意検討した結果、発明者らはＢＡＭＰＥＲ法によるＳＮＰ解析における、前記▲１▼のＰＣＲ増幅と▲３▼のＢＡＭＰＥＲプローブによる相補鎖伸長反応は、いずれもＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成反応であることに注目した。そして、ＰＣＲに用いるどちらかのプライマーをＢＡＭＰＥＲプローブと同様に３’末端がＳＮＰ部位に一致するように設計すれば、ＰＣＲとＢＡＭＰＥＲプローブによる相補鎖伸長反応を一緒に行うことができると考えた。
【００１６】
しかしながら、実際にはプライマーの非特異的なハイブリダイズによる擬陽性増幅が起きるため、上記の方法のみではＳＮＰ配列を特異的に検出することは困難であった。そこで、発明者らはさらに検討を行い、プライマーやＰＣＲ条件に工夫を加えることにより、ＳＮＰ近傍の短い領域を選択的に増幅し、擬陽性増幅を起こすことなく、１回のＰＣＲでＳＮＰ配列を検出する方法を見出した。
【００１７】
すなわち、本発明は、標的核酸上の特定部位を含む所望の塩基長範囲の増幅産物を得るための核酸増幅方法であって、
前記標的核酸の第一鎖の塩基配列に相補な配列を含み、かつ該第一鎖上の前記特定部位に３’末端がバイブリダイズするべく設計された第１のプライマーと、前記標的核酸の第二鎖の塩基配列に相補な配列を含み、該第二鎖上の前記特定部位と塩基対をなす部位に３’末端がバイブリダイズするべく設計された第２のプライマーとを用いて核酸増幅を行うこと、及び
前記核酸増幅における変性温度を制御することにより、前記所望の塩基長範囲の増幅産物を１本鎖に解離して、次の核酸合成反応の鋳型とすることを特徴とする、前記核酸増幅方法を提供する。
【００１８】
前記方法において、核酸増幅における変性温度は、最初は通常どおり高く（例えば、９４℃前後に）設定して増幅反応を進め、プライマーからの短鎖の増幅産物がある程度増えたら６０〜８５℃に下げるように制御する。具体的には、少なくとも５サイクル目からは６０〜８５℃に下げるように制御することが好ましい。これにより、プライマーからの真の増幅産物である短鎖の核酸のみが解離され、次の核酸合成反応の鋳型となるため、プライマーの非特異的ハイブリダイゼーションによる擬陽性増幅が防止される。
【００１９】
本発明において、所望の塩基長範囲の増幅産物とは、前記第１のプライマーと第２のプライマーの３’末端が前記標的核酸上の特定部位にハイブリダイズして合成される核酸である。したがって、所望の塩基長範囲は、前記第１のプライマーと第２のプライマーの塩基長によって規定される値（両プライマーの塩基長の和から１を減じた塩基長）となる。
【００２０】
前記第１のプライマーと第２のプライマーの塩基長は１８〜５０塩基長で、実質的に同一の融解温度を有することが望ましい。また、前記第１のプライマーと第２のプライマーにおけるグアニン及びシトシンの割合の和は３５〜６５％であることが望ましい。
【００２１】
本発明はまた、標的核酸上の特定部位の配列を解析するための方法を提供する。該方法は、前記標的核酸の第一鎖の塩基配列に相補な配列を含み、かつ該第一鎖上の前記特定部位に３’末端がバイブリダイズするべく設計された第１のプライマーと、前記標的核酸の第二鎖の塩基配列に相補な配列を含み、該第二鎖上の前記特定部位と塩基対をなす部位に３’末端がバイブリダイズするべく設計された第２のプライマーとを用いて核酸増幅を行うこと、及び
前記核酸増幅における加熱温度を制御することにより、前記所望の塩基長範囲の増幅産物を１本鎖に解離して、次の核酸合成反応の鋳型とすることを特徴とする核酸増幅工程、ならびに
前記増幅産物を検出することにより、前記標的核酸上の特定部位の配列を解析する工程を含む。
【００２２】
ここで、検出すべき特定部位としては、例えば一塩基多型部位を挙げることができる。
また、増幅産物の検出方法としては、電気泳動など公知のいずれの方法を用いてもよいが、核酸増幅に応じて生成されるピロリン酸を生物化学発光反応によって検出する方法が、装置や操作が簡便であるという点で好ましい。
【００２３】
本発明はまた、前記解析方法のためのシステムを提供する。該システムは、標的核酸及び該標的核酸上の特定部位を含む所望の塩基長範囲の増幅産物を得るためのプライマーを含む反応溶液を収める反応槽と、
前記反応槽内の温度を制御して、前記所望の塩基長範囲の増幅産物を解離、増幅させる温度制御機構と、
前記反応槽内で生じる発光を検出するための光検出機構とを有し、かつ、
前記生物化学発光を生じたプライマーの種類を認識して前記標的核酸に含まれる特定部位の配列を自動的に解析する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明のＳＮＰ解析方法は、プライマーとＰＣＲ条件を工夫することにより、ＢＡＭＰＥＲ法で必要とされた▲１▼ＰＣＲ増幅、▲２▼精製、▲３▼ＳＮＰ特異的相補鎖伸長反応の３段階の工程を単一操作で行い、操作の簡素化と迅速化を図るものである。
【００２５】
特に、上記プライマーとＰＣＲ条件の工夫によって、本発明は核酸検出時に問題となる擬陽性増幅の問題を克服している点に大きな特徴がある。以下、本発明について詳細に説明する。
【００２６】
１  プライマー
１）プライマーの機能
本発明では、その３’末端がいずれも検出すべき特定部位（例えば、ＳＮＰ部位）に一致するように設計したプライマー組を用いることにより、特定部位近傍の短い領域を選択的に増幅する。同時に、前記プライマーはＢＡＭＰＥＲプローブとしても機能するため、ＰＣＲ増幅のみによって、標的核酸における特定部位の配列を解析することができる。
【００２７】
また、本発明ではセンス鎖とアンチセンス鎖に対応するプライマーの両方の３’末端がＳＮＰ部位に一致するように設計することで、検出すべき配列に対する選択性を向上させている。すなわち、プライマーがゲノムに非特異的にハイブリダイズしておきる擬陽性増幅が起きたとしても、ＰＣＲ産物中の最小の産物が目的とする真の増幅産物となる。したがって、後述するＰＣＲ増幅時の変性温度を制御することによって、短鎖の真の増幅産物を選択的に解離させ、次の核酸合成反応の鋳型とすることで、擬陽性増幅を防止することができる。なお、本明細書中において「真の増幅産物」とは、第１のプライマーと第２のプライマーの３’末端が前記標的核酸上の特定部位にハイブリダイズして合成される増幅産物を意味する。
【００２８】
２）プライマー組
プライマーは、標的核酸の第一鎖の塩基配列に相補な配列を含み、かつ該第一鎖上の特定部位に３’末端がバイブリダイズするべく設計された第１のプライマーと、前記標的核酸の第二鎖の塩基配列に相補な配列を含み、該第二鎖上の前記特定部位と塩基対をなす部位に３’末端がバイブリダイズするべく設計された第２のプライマーからなる１対のプライマー組で構成される。このプライマー組は、一塩基多型検出の場合、各アレルに対応して少なくとも２組、場合によっては３組乃至４組必要となる。すなわち、プライマーの３’末端の配列としては、Ａ／Ｃ組、Ａ／Ｇ組、Ａ／Ｔ組、Ｃ／Ｇ組、Ｃ／Ｔ組、Ｇ／Ｔ組、Ａ／Ｃ／Ｇ組、Ａ／Ｃ／Ｔ組、Ａ／Ｇ／Ｔ組、Ｃ／Ｇ／Ｔ組、Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔのプライマー組が考えられる。
【００２９】
３）ミスマッチの導入
上記プライマーは、少なくとも片方のプライマー、可能であれば両プライマーにおいて、その３’末端から５’側に３塩基乃至４塩基目の位置に、対応するゲノム試料の配列と異なる構造（ミスマッチ）を導入することが好ましい。これにより、ＰＣＲにおける増幅反応の変異部位（例えば、ＳＮＰアレル）配列特異性が格段に高まる。従来のＢＡＭＰＥＲ法においても、同様のミスマッチをプライマーに導入しているが、通常のＰＣＲでは、プライマー同士が離れた位置にハイブリダイズするように設計されるため、片方のプライマーにしか人工的非相補部位（ミスマッチ）を導入することができない。本発明のプライマーは３’末端がオーバーラップした構造のため、両方のプライマーにミスマッチを入れることが可能となる。これにより、解析の精度は格段に向上する。
【００３０】
このようなＳＮＰ位置に３’末端が一致するようなプライマー組でのＰＣＲでは、ＰＣＲプライマーの設計に自由度が無く、ほぼ一義的に配列位置が決まる。このため、プライマー中にパリンドロームが出現する場合はプライマー自体が高次構造をとり、鋳型ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションが阻害されるケースが頻繁に起きる。これを回避するため、プライマーの少なくとも一方が４塩基、６塩基、あるいは８塩基等のパリンドロームを形成するような構造の場合、該パリンドロームを形成する配列部位の５’末端側から半分のいずれか１塩基を本来の配列と異なる塩基とすることでパリンドローム構造を解消する。
【００３１】
４）塩基長
本発明で用いられるプライマーは、通常のＰＣＲプライマーと同様に、１８〜５０塩基長、特に１８〜３０塩基長程度であることが好ましい。
本発明では、両プライマーの３’末端が共に標的核酸上の特定部位（ＳＮＰ部位等）にハイブリダイズするように設計されている。したがって、第１のプライマーと第２のプライマーの３’末端が前記標的核酸上の特定部位にハイブリダイズして合成される「真の増幅産物」の塩基長は、前記第１のプライマーと第２のプライマーの塩基長によって規定される。すなわち、真の増幅産物の塩基長は「第１のプライマーと第２のプライマーの塩基長の和から１を減じた塩基長」となる。例えば、１８〜５０塩基長のプライマー組を用いた場合、所望の塩基長範囲は、３５〜９９塩基となる。
【００３２】
５）融解温度（Ｔｍ）
本発明において、第１のプライマーと第２のプライマーのそれぞれの融解温度（Ｔｍ）は、実質的に同じであることが好ましい。ここで、実質的に同じであるとは、計算上完全に同一ではないが、その差は５℃以下程度のわずかなものであって、実験をする上ではほぼ同一のＴｍとして扱えることを意味する。
【００３３】
６）ＧＣ含量（％）
また、前記第１のプライマーと第２のプライマーのグアニン及びシトシンの割合（ＧＣ含量（％））の和は、３５％〜６５％であることが望ましい。
本発明において、真の増幅産物のＧＣ含量（％）は、両プライマーのＧＣ含量（％）の和にほぼ等しくなる。核酸のＴｍはその塩基長とＧＣ含量（％）で変化するが、後述するよう、擬陽性増幅を起こすことなく、６０〜８５℃の変性温度で３５〜９９塩基長程度の短鎖（３５〜９９塩基長程度）の真の増幅産物を選択的に解離させるためには、増幅産物のＧＣ含量（％）は３５％〜６５％、特に４０％〜６０％であることが望ましい。したがって、両プライマーのＧＣ含量（％）の和は３５％〜６５％、特に４０％〜６０％であることが望ましい。
【００３４】
２．ＰＣＲ条件
本発明のもう１つの特徴は、ＰＣＲ増幅時の温度制御にある。核酸増幅工程においては、通常のＰＣＲ反応サイクル同様、鋳型核酸を１本鎖に解離するための変性温度、アニーリングのための温度、伸長反応のための温度に、順次温度を変化させることが必要である。特に本発明の場合、核酸増幅における変性温度は、最初は通常どおり高く、例えば９０〜１００℃、好ましくは９４℃前後に設定して増幅反応を進めるが、プライマーからの短鎖の真の増幅産物がある程度増えたら、変性温度を６０〜８５℃に下げるように制御する。具体的には、少なくとも５サイクル目から６０〜８５℃、好ましくは８０〜８５℃に制御することが好ましい。これにより、短鎖の真の増幅産物のみが解離可能となり、擬陽性増幅が起きたとしてもその産物は次の核酸合成の鋳型となることはない。
【００３５】
もちろん、ＰＣＲ産物の変性可能な温度は伸長産物の塩基長やＧＣ含量（％）で変化する。例えばＧＣ含量（％）が５８％とすると、ＰＣＲ産物が６０塩基長の場合Ｔｍは７１℃、８０塩基長では７６℃、１００塩基長では７７℃、１５０塩基長では７９℃、２００塩基長では８１℃となる（図５Ｂ参照）。実質的にＰＣＲの変性温度はこれらのＴｍ値よりさらに５〜１０℃高くする必要がある。したがって、ＰＣＲ産物の塩基長が８０塩基の場合、変性温度は８０〜８５℃が好ましい（図５Ｂ参照）。換言すれば、ＧＣ含量（％）が５８％の場合、８０℃の変性温度で増幅可能なＰＣＲ産物は８０塩基長が限界となる。
【００３６】
一方、ＧＣ含量（％）が減少すれば、前記Ｔｍ値も低下し、好ましい変性温度も低下する（８０℃の変性温度で増幅可能なＰＣＲ産物の塩基長は長くなる）。また、ＧＣ含量（％）が増加すれば、前記Ｔｍ値も上昇し、好ましい変性温度も上昇する（８０℃の変性温度で増幅可能なＰＣＲ産物の塩基長は短くなる）。
【００３７】
本発明の真の増幅産物は、１８〜５０塩基長のプライマーを用いた場合、３５〜９９塩基長となるが、こうした短鎖の増幅産物は、ＧＣ含量３５〜６５％の範囲では、６０〜８５℃の範囲で変性可能となる。
なお、本発明では、増幅産物のＴｍを調整するために、必要であればＴｍ調整剤等を用いても良い。
【００３８】
３．検出方法
本発明では、標的核酸の特定部位の配列に対応するプライマー組を用いた場合にのみ、増幅反応が進行する。すなわち、増幅産物を生成したプライマー組の３’末端の配列によって、特定部位の配列を決定することができる。
【００３９】
本発明において、所望の真の増幅産物の検出は、電気泳動法、エネルギートランスファーを用いた蛍光検出など周知のいずれの検出法を用いてもよいが、以下に説明する生物化学発光を利用した検出方法が、装置と操作が簡便であると言う点で好ましい。
【００４０】
ＰＣＲでは高エネルギー３リン酸結合が１つ切断されると、無機ピロリン酸が１つ遊離する。すなわち、１塩基の伸長反応により１つのピロリン酸が生成する。そこで、このピロリン酸を検出することによって、間接的に増幅産物を検出することが可能となる。
【００４１】
ピロリン酸の検出は、ＢＡＭＰＥＲ法と同様に、ルシフェリン−ルシフェラーゼによる生物化学発光を利用して検出する。すなわち、まずピロリン酸ジホスホキナーゼあるいはＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰに変換する。変換したＡＴＰとルシフェリンをルシフェラーゼを酵素として酸化的に反応させると、オキシルシフェリンとピロリン酸、及びその他の一連の物質が生成する。生成した励起状態の酸化ルシフェリンが基底状態に戻るときに生じる、５３０ｎｍ近傍の発光を検出する。発光は、標的核酸上の特定部位（例えばＳＮＰ部位）の配列と相補なプライマーのみが生じうるため、発光を生じたプライマーの３’末端の配列により、特定部位の配列を決定することができる。
【００４２】
なお、ルシフェリン−ルシフェラーゼを用いた生物化学発光では、試料中にピロリン酸やルシフェラーゼの基質となるＡＴＰやｄＡＴＰが含まれていてはならないし、非特異的な相補鎖合成反応の原因となる短鎖のＤＮＡや１本鎖部分があってはならない。したがって、試料に含まれるピロリン酸やＡＴＰ、ｄＡＴＰは予めフォスファターゼで分解し、短鎖のＤＮＡや１本鎖部分はエキソヌクレアーゼＩで分解する。
【００４３】
４．  変異解析システム
生物化学発光を利用して本発明の方法を実施する場合、電気泳動やクロマトグラフィーのような分離分析手段は不要であり、またレーザーなどによる励起の必要もないため、操作の自動化に適している。本発明は、そのような自動解析のためのシステムを提供する。
【００４４】
例えば、前記システムは、標的核酸及び該標的核酸上の特定部位を含む所望の塩基長範囲の増幅産物を得るためのプライマーを含む反応溶液を収める反応槽と、前記反応槽内の温度を制御して、前記所望の塩基長範囲の増幅産物を解離、増幅させる温度制御機構と、前記反応槽内で生じる発光を検出するための光検出機構とを有し、かつ、前記生物化学発光を生じたプライマーの種類を認識して前記標的核酸に含まれる特定部位の配列を自動的に解析する。
【００４５】
なお、前記所望の塩基長範囲の増幅産物を解離、増幅させる温度制御機構とは、通常のＰＣＲ反応サイクルのための温度制御機構（鋳型核酸を１本鎖に解離するための変性温度、アニーリングのための温度、伸長反応のための温度に、反応槽内の温度を順次変化させる機構）に加えて、核酸増幅における変性温度を、最初は通常どおり高く（例えば９４℃前後に）設定し、プライマーからの短鎖の真の増幅産物がある程度増えたら（例えば、５サイクル目以降）、変性温度を６０〜８５℃に下げるような制御機構を意味する。
上記システムは、例えば、臨床現場におけるＳＮＰ解析等の変異解析に好適に利用できる。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
実施例１：電気泳動を利用したｐ５３エキソン８の変異解析
ｐ５３エキソン８に存在する変異をＳＮＰに見立て、本発明の方法を用いて増幅を行い、電気泳動により解析を行った。
【００４８】
１．装置及び試料
サーマルサイクラーはＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。ＰＣＲ産物の確認にはマイクロチップ電気泳動解析システムＳＶ１２１０（日立電子エンジニアリング）を使用した。ルミノメーターとしてはＷａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用した。プライマー合成はＳＩＧＭＡ社に委託した。
【００４９】
試料としては、ヒト由来ゲノムを用いた。ゲノムは血液２ｍｌに９倍容量の５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液を加えて溶血させ、３５００Ｇで遠心し、これを１０ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に懸濁して再度遠心を行い、白血球を含む沈殿を得た。この沈澱にＤＮＡｚｏｌを１ｍｌ加え、白血球を溶解し、不溶性成分を遠心により除去した。ここに等容量のブタノールを加えて遠心し、沈殿を水１００ｍｌに再溶解し、エタノール沈殿法で低分子不純物を除去した。最後にゲノム濃度が２．５〜２５  ｎｇ／μｌになるように滅菌水に溶解し、試料ゲノム溶液とした。調製した試料ゲノムは、あらかじめＳＮＰアレルの同定をおこない、２種のホモザイゴート（ＡＡ）、（ＴＴ）、及びヘテロザイゴート（ＡＴ）を、それぞれ以下の実験に使用した。
【００５０】
２．方法
図２に示すｐ５３エキソン８の領域を用いて本実施例を説明する。２１がｐ５３エキソン８のセンス鎖を表し、２１’がアンチセンス鎖である。２２（相補鎖では２２’）が対象となる変位部位である。この部分は正確にはＳＮＰではなく単なる配列の変異部分であるが、本発明を説明するモデルとして使用する。従来のＢＡＭＰＥＲ法では、たとえばアンチセンス鎖２１’に相補なプライマー２４のみで伸長反応を行うが、本発明では、プライマー２３と２４を用いる。
【００５１】
使用した２種のプライマーは、プライマー２４がゲノム試料の２本鎖のアンチセンス鎖２１’に実質的に相補で、かつ、他方のプライマー２３がゲノムの他方の鎖であるセンス鎖２１に実質的に相補である。また、両プライマーの３’末端２５、及び２６は、それぞれ検出対象であるＳＮＰのアレル２２、２２’の塩基に相補である。今回、検出対象であるＳＮＰはｐ５３エキソン８に存在するＣｙｓ２７５Ｓｅｒに対応する部分である。
これはアミノ酸配列として２７５番目のコドンの多型であり、塩基配列のアレルとしてはＡ／Ｔとなる。したがって、上記プライマー組（２３及び２４）は、ＳＮＰ部位がＡであるアレルを検出するためのものと、ＳＮＰ部位がＴであるアレルを検出するためのものの２組を用意した。
【００５２】
さらに、各プライマーの３’末端から３番目の塩基には、選択性を高めるためにｐ５３エキソン８（試料ＤＮＡ）とは非相補な配列２７及び２８を導入した。すなわち、アンチセンス鎖に相補なプライマーの３’末端から３塩基目は、ｐ５３エキソン８本来の配列に相当するＴからＡに改変した。センス鎖に相補なプライマーでは本来の配列に相当するＡからＴに改変した。これにより、プライマーの３’末端がアレルに相補なプライマー組ではプライマーの３’末端近傍３塩基のうち２塩基が完全相補となりＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖伸長が起きるが、３’末端がアレルに非相補なプライマー組では３’末端と３塩基目の２塩基が非相補となるためプライマー３’末端近傍が鋳型ＤＮＡにハイブリダイズできず、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖伸長が起き難くなる。
【００５３】
プライマー２３は２０塩基長でプライマー２４は２２塩基長で、ＰＣＲ時のＴｍが５４．５℃と５５．４℃になるように設計した。なお、これらの値は実際にＰＣＲを行うときの塩強度５０ｍＭで計算した。ＰＣＲのハイブリダイゼーション時（アニーリング時）の最適温度は４７．２℃であるが、本実験は５０℃で行った。
【００５４】
以下に、使用した２組のプライマー組の配列を示す。
ＳＮＰ部位がＡのアレルを検出するためのプライマー組
ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ａａｃ  ａｇｃ  ｔｔｔ  ｇａｇ  ｇｔｇ  ｃｇｔ  ｇＡｔ  Ｔ−３’（配列番号１、２２塩基長）
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ｔｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｇｇａ  ｃａｇ  ｇｃＴ  ｃＡ−３’（配列番号２、２０塩基長）
ＳＮＰ部位がＴのアレルを検出するためのプライマー組
ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ａａｃ  ａｇｃ  ｔｔｔ  ｇａｇ  ｇｔｇ  ｃｇｔ  ｇＡｔ  Ａ−３’（配列番号３、２２塩基長）
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ｔｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｇｇａ  ｃａｇ  ｇｃＴ  ｃＴ−３’（配列番号４、２０塩基長）。
【００５５】
上記プライマーによって得られるＰＣＲ産物は４１  塩基長（ｂｐ）で、アレルＡに対応するものが、５’−ａａｃ  ａｇｃ  ｔｔｔ  ｇａｇ  ｇｔｇ  ｃｇｔ  ｇＡｔ  ＴｇＡ  ｇｃｃ  ｔｇｔ  ｃｃｔ  ｇｇｇ  ａｇａ  ｇａ−３’（配列番号５）とアレルＴに対応するものが５’−ａａｃ  ａｇｃ  ｔｔｔ  ｇａｇ  ｇｔｇ  ｃｇｔ  ｇＡｔ  ＡｇＡ  ｇｃｃ  ｔｇｔ  ｃｃｔ  ｇｇｇ  ａｇａ  ｇａ−３’（配列番号６）となる。これらのＴｍは計算上６５．４℃となる。
【００５６】
９６ウェル  ＰＣＲプレートに２．５〜２５  ｎｇ／μｌに調製したゲノムＤＮＡ試料２  μｌを加え、氷上に置いた。５  ｕｎｉｔ／μｌ  Ｔａｑ．ＤＮＡ  ポリメラーゼを（ＱＩＡＧＥＮ社製）０．０５  μｌ、２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰｓを１  μｌ、２５  ｐｍｏｌ／μｌの各アレルに対応するプライマー組（コントロールでは滅菌水を用いる）を１  μｌ混合し、さらに滅菌水、及びＰＣＲ用Ｂｕｆｆｅｒを加えて、最終的に各ウェルあたり２３  μｌとなるように調製した。実際には、Ｔａｑ．ＤＮＡ  ポリメラーゼとｄＮＴＰｓとプライマー組を含む反応液をあらかじめ必要量より１検体分多く作っておき、これを２３  μｌずつ各ウェルに入れるほうが効率がよく、ＰＣＲの再現性も高い。なお、各ゲノムＤＮＡ試料について、コントロールとしてプライマー組の代りに滅菌水を加えたものを同様に反応に供した。
【００５７】
次に、粘着シートでＰＣＲプレート上部をシーリングし、ＰＣＲサイクル反応を行った。ＰＣＲは、最初に９４℃１０秒間加熱してゲノムを変性させ、次いで、５０℃１０秒間と８０℃１０秒間のサイクルを３５回繰り返した。
【００５８】
３．結果
ＳＮＰ配列に対応する２組のプライマーを用いてＰＣＲを行い、電気泳動分離で解析した結果を図３に示す。４１、４２、４３は、それぞれホモザイゴート（Ａ／Ａ）、ホモザイゴート（Ｔ／Ｔ）、ヘテロザイゴート（Ａ／Ｔ）のゲノムから得られた結果である。図中４４、４５及び４６はアレルがＡに相補なプライマー組、４７、４８及び４９はアレルがＴに相補なプライマー組でＰＣＲ反応を行った場合の電気泳動分離パターンである。
【００５９】
ホモザイゴート（Ａ／Ａ）のゲノムからは、Ａに相補なプライマー組で増幅した場合にのみ、特異増幅ピーク５０が得られた。また、ホモザイゴート（Ｔ／Ｔ）のゲノムからは、Ｔに相補なプライマー組で増幅した場合にのみ、特異増幅ピーク５１が得られた。一方、ヘテロザイゴート（Ａ／Ｔ）のゲノムからは、Ａに相補なプライマー組とＴに相補なプライマー組のいずれで増幅した場合においても、特異的増幅ピーク５２及び５３が得られた。なお、すべての電気泳動パターンで共通して検出されるピーク５４はプローブに相当する。
【００６０】
このＰＣＲの系では、増幅塩基長が４１塩基長と短いため、温度サイクルは５０℃１０秒間と８０℃１０秒間と短時間でよい。また、変性温度も８０℃と低いため、温度の上昇下降に要する時間も少なくてすむという利点がある。実際、ＰＣＲに要する時間は温度上昇と下降率を３℃／秒として計算すると、１サイクルあたり５５℃から８０℃の上昇に約１０秒間、８０℃で１０秒間、８０℃から５５℃への下降に約１０秒間、５５℃で１０秒間の４０秒間かかる。つまり、全行程でも２０分間程度で終了することになる。本実施例の場合、マイクロチップ電気泳動の所要時間は３分間程度のため、ＰＣＲから検出まで含めても、ゲノムからのＳＮＰ判定（タイピング）が短時間で可能となることが確認された。
【００６１】
実施例２：ＰＣＲ条件の検討
実施例１で示したアレルに対応するプライマーとゲノムを用いて、擬陽性増幅反応の変性温度依存性について検討した。
【００６２】
図４に、ＰＣＲサイクルにおける高い方の温度が通常のＰＣＲと同じ９４℃と本発明で用いた８０℃で行ったときの増幅産物の電気泳動分離パターンを示した。６３は目的のＰＣＲ増幅産物である。６４はプローブ由来のピークである。パターン６１に現れる一連のピーク６５は、擬陽増幅に依存するものである。すなわち、ＰＣＲの高い方の温度を８０℃まで下げることにより、擬陽性増幅を防止できることが確認された。
これは、本発明のプライマーで生成するＰＣＲ産物が短鎖であるため、８５℃程度の低温でも増幅産物の変性が十分可能なことによる。
【００６３】
これをさらに検証するため、ＰＣＲの変性温度（高い方の温度）を７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、９７℃で同様に実験を行い、比較した結果を図５Ａに示す。図中●で示される７１のプロットは、目的のＰＣＲ産物由来の電気泳動分離ピーク６３の面積の相対値を表す。図中△で示される７２のプロットは、図４で観察された擬陽性増幅産物６５に関わるピーク面積の相対値を表す。ここで面積の相対値とは、６１と６２のピーク系列でピーク面積が最大となる時の温度の面積値を１．０として計算したものである。
【００６４】
図５Ａより、変性温度が８０〜８５℃の範囲では、目的のＰＣＲ産物が得られるが、擬陽性増幅は検出限界以下になっていることがわかる。一方、９０℃以上では、目的産物は得られるものの、擬陽性増幅も多くなることがわかる。なお、９７℃で産物量が低下しているが、これは酵素が熱変性するためである。
【００６５】
もちろん、ＰＣＲ産物の変性可能な温度は伸長産物の塩基長やＧＣ含量（％）で変化する。図５Ｂは伸長産物の塩基長と変性温度との関係を示したものである。本実施例ではＰＣＲ産物の塩基長が４１塩基長で計算上のＴｍ＝６５℃となる。ＧＣ含量（％）が５８％とすると、ＰＣＲ産物が６０塩基長の場合Ｔｍは７１℃、８０塩基長では７６℃、１００塩基長では７７℃、１５０塩基長では７９℃、２００塩基長では８１℃となる。実質的にＰＣＲの変性温度はこれらのＴｍ値よりさらに５〜１０℃高くする必要がある。したがって、ＰＣＲ産物の塩基長が８０塩基の場合、変性温度は６０〜８５℃、好ましくは８０〜８５℃となる。よって、８０℃の変性温度で増幅可能なＰＣＲ産物は８０塩基長が限界となる。
【００６６】
実施例３：生物化学発光を利用したｐ５３エキソン８の変異解析
実施例１で調製した試料ゲノムとプライマー組を用いて、ｐ５３エキソン８に存在するＣｙｓ２７５Ｓｅｒに対応する変異部分を、ルシフェリン・ルシフェラーゼによる生物化学発光を利用して解析した。検出対象となるＳＮＰ部位のアレルは実施例１と同様Ａ／Ｔである。
【００６７】
１．試料
シフェリン・ルシフェラーゼを用いた生物化学発光では、試料中にピロリン酸やルシフェラーゼの基質となるＡＴＰやｄＡＴＰが含まれていてはならないし、非特異的な相補鎖合成反応の原因となる短鎖のＤＮＡや１本鎖部分があってはならない。
そこで、本実施例では、実施例１の方法で調製したゲノムに含まれるピロリン酸やＡＴＰ、ｄＡＴＰを予めフォスファターゼで分解し、短鎖のＤＮＡや１本鎖部分をエキソヌクレアーゼＩで分解する必要がある。
【００６８】
すなわち、３８４ウェルＰＣＲプレートのウェルに、８〜５６  ｎｇ／μｌに調製したゲノムＤＮＡ試料を２  μｌ  、１  ｕｎｉｔ／μｌの濃度のｓｈｒｉｍｐ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＳＡＰ）を１  μｌ、  １０  ｕｎｉｔ／μｌのｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  （ＥｘｏＩ）  を０．１  μｌ、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製品）を０．５  μｌ、及び滅菌水１．４  μｌを混合したものを添加した。プレートは、壁についた液体を集めるため、スピンダウンしておく。この時点の液量は５μｌである。
【００６９】
２．ＰＣＲ反応
粘着シートでＰＣＲプレート上部をシーリングし、サーマルサイクラーにセットした。ＳＡＰとＥｘｏ  Ｉは熱に弱いため、サーマルサイクラーのヒートリッドは使わないようにし、３  ｍｍ厚シリコンシートを被せた上に重しをのせて密閉断熱した。３７℃で４０分間インキュベートして酵素反応を行った後、８０℃で１５分間加熱して酵素を失活させ、５秒間９５℃に温度上昇させてゲノムを変性させた後、氷上で急冷させた。
【００７０】
上記の前処理後のゲノム試料溶液を１μｌずつＰＣＲプレートの３カ所のウェルに分注した。５  ｕｎｉｔ／μｌ  Ｔａｑ．ＤＮＡ  ポリメラーゼを（ＱＩＡＧＥＮ社製品）０．０２  μｌ  、２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰｓを０．４  μｌ、２５  ｐｍｏｌ／μｌの各アレルに対応するプライマー組を各０．０８μｌ（コントロールは滅菌水を利用）、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製品、１５ｍＭ  Ｍｇイオンを含む）を０．８ｍｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を０．４５ｍｌ（ＰＣＲ時の最終マグネシウム濃度は２ｍＭ）、及び滅菌水を加え、各ウェル当たりの溶液が９μｌになるようにした。ここまでの操作は全て氷上で行った。なお、各ゲノムＤＮＡ試料について、コントロールとしてプライマー組の代りに滅菌水を加えたものを同様に反応に供した。
各ウェルは乾燥防止のためミネラルオイルを５  μｌ重層した後、ＰＣＲサイクル反応を行った。ＰＣＲは、５５℃１０秒間と８０℃１０秒間のサイクルを計３５回繰り返した。
【００７１】
３．生物化学発光による検出
実施例１ではＰＣＲ産物を電気泳動で分離解析したが、本実施例では生物化学発光を利用してＰＣＲ産物の検出を行った。３ウェルを一組とするＰＣＲ終了試料に対して、あらかじめ室温に戻しておいた発光試薬（キッコーマン（株））を１８  μｌずつ加え、５回ピペッティングして混合し、ルミノメーターで測定した。キッコーマン社製の発光試薬は「食品工業  ｖｏｌ．４４  Ｎｏ．１４  ｐ２５−３４」記載のピロリン酸測定用の試薬で、ピルビン酸ホスホジキナーゼを用いてピロリン酸にＡＭＰとホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を作用させ、ＡＴＰを生成させるものである。この試薬では、耐熱性組換え日本産源氏ホタル由来ルシフェラーゼが用いられているため、試薬が安定で品質管理が容易という利点がある。
【００７２】
アレル判定は、アレルＣに相補なプライマー組から得られる信号値をＩａ、アレルＴに相補なプライマー組から得られる信号値をＩｔ、プライマーを含まないコントロールからの信号値をＩｃとして、アレルＣ由来の信号強度比（Ｉａ−Ｉｃ）／（Ｉａ＋Ｉｔ−２×Ｉｃ）とアレルＴ由来の信号強度比（Ｉｔ−Ｉｃ）／（Ｉａ＋Ｉｔ−２×Ｉｃ）を計算することにより行った。判定基準は、（Ｉａ−Ｉｃ）／（Ｉａ＋Ｉｔ−２×Ｉｃ）＜０．２（あるいは（Ｉｔ−Ｉｃ）／（Ｉａ＋Ｉｔ−２×Ｉｃ）＞０．８）の時はＴ／Ｔのホモザイゴート、（Ｉａ−Ｉｃ）／（Ｉａ＋Ｉｔ−２×Ｉｃ）＞０．８（あるいは（Ｉｔ−Ｉｃ）／（Ｉａ＋Ｉｔ−２×Ｉｃ）＜０．２）の時はＣ／Ｃのホモザイゴート、０．４＜（Ｉａ−Ｉｃ）／（Ｉａ＋Ｉｔ−２×Ｉｃ）＜０．６（あるいは０．４＜（Ｉｔ−Ｉｃ）／（Ｉａ＋Ｉｔ−２×Ｉｃ）＜０．６）の時はＣ／Ｔのヘテロザイゴートと判断することとした。
【００７３】
４．結果
図６に、３２５検体のゲノム試料についてＮＣＢＩ  ＡＦ  ５３８８４４のＳＮＰを解析した結果を示した。図６の横軸は、（Ｉａ−Ｉｃ）／（Ｉａ＋Ｉｔ−２×Ｉｃ）、縦軸は頻度を表す。アレルがＣ／Ｃのホモザイゴート由来のグループが８１、Ｔ／Ｔのホモザイゴートが８３、Ｃ／Ｔのヘテロザイゴートが８２のグループを形成した。同一検体の同一ＳＮ部位をＤＮＡシーケンシングで解析した結果、すべての検体において、本実施例の結果と一致することが判明した。この生物化学発光を利用したＳＮＰ解析は、１）ゲノム試料への不純物を分解する試薬の添加、２）ＰＣＲ増幅、３）ＰＣＲ産物への発光試薬の添加、といった極めて簡単な操作でＳＮＰ判定を行えるという利点がある。
【００７４】
【発明の効果】
本発明によれば、３’末端が特定部位（例えば、ＳＮＰ部位）に対応する一組のプライマーでＰＣＲ増幅を行うことにより、標的核酸上の特定部位の配列を正確かつ短時間で判定することができる。ゲノム試料が調製されていれば、判定は３０分間以内でできる。特に、生物化学発光を利用した系は、高価で複雑な光学系機器を必要とせず、通常の簡便なルミノメーターで測定できるため、装置システムの小型化、自動化が期待できる。さらに、この系では各ＳＮＰに対応したプライマーを準備することにより、複数のゲノム試料に由来する複数のＳＮＰ判定が可能であり、汎用性に猛るという利点もある。
【００７５】
【配列表】
2004350563.tif 000003
2004350563.tif 000004
2004350563.tif 000005
2004350563.tif 000006
【００７６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−人工配列の説明：センスプライマー
配列番号２−人工配列の説明：アンチセンスプライマー
配列番号３−人工配列の説明：センスプライマー
配列番号４−人工配列の説明：アンチセンスプライマー
配列番号５−人工配列の説明：ＰＣＲ増幅産物
配列番号６−人工配列の説明：ＰＣＲ増幅産物
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＢＡＭＰＥＲ法によるＳＮＰ解析方法の概要を示す図である。
【図２】図２は、本発明によるＳＮＰ解析方法の原理を示す図である。
【図３】図３は、本発明によるｐ５３エキソン８のＳＮＰ解析における、電気泳動結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ｐ５３エキソン８のＳＮＰ解析において、異なる変性温度（８０℃及び９４℃）でＰＣＲを行った場合の電気泳動結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明のＰＣＲ温度特性を示すグラフである。Ａは、変性温度と相対増幅量の関係を示すグラフであり、Ｂは、塩基長と解離温度の関係を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明を用いた検体多量解析の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
１…ＰＣＲ産物のセンス鎖、１’…ＰＣＲ産物のアンチセンス鎖
２…ｄＮＴＰとプライマー残査
３…センス鎖中のＳＮＰ部分
４…アンチセンス鎖中のＳＮＰ部分
５…ＳＮＰ検査用プローブ
６…伸長鎖
７…ピロリン酸
２１…ゲノムのセンス鎖、２１’…ゲノムのアンチセンス鎖
２２…ゲノムセンス鎖中のＳＮＰ部分、２２’…ゲノムアンチセンス鎖中のＳＮＰ部分
２３…ゲノムセンスに結合するＳＮＰ用プローブ
２４…ゲノムアンチセンスに結合するＳＮＰ用プローブ
２５、２６…ＳＮＰに対応する識別配列
２７、２８…ゲノムの配列とは非相補な配列部分
２９、３０…ゲノムの各鎖とＳＮＰ判定用プローブのハイブリッド
３１…ＰＣＲ産物
４１…Ａホモザイゴトート検体
４２…Ｔホモザイゴトート検体
４３…ヘテロザイゴート検体
４４、４５、４６…末端がＴのＳＮＰ検査用プローブでの電気泳動結果
４７、４８、４９…末端がＡのＳＮＰ検査用プローブでの電気泳動結果
５０、５１、５２、５３…ＰＣＲ産物のピーク
５４…プローブのピーク
６１…変性温度８０℃でのＰＣＲ結果
６２…変性温度９４℃でのＰＣＲ結果
６３…目的ＰＣＲ産物
６４…プローブ
６５…擬陽性増幅ピーク
７１…目的のＰＣＲ産物由来の電気泳動分離ピーク面積の相対値
７２…擬陽性増幅産物に関わるピーク面積の合計の相対値
８１…アレルＡの検体グループ
８２…ヘテロザイゴートの検体グループ
８３…アレルＴの検体グループ
【図１】
2004350563.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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