(57)【要約】【課題】極めて耐熱性が高く、その活性発現に重金属を必要としない、食品製造、特にチーズの熟成に有用な耐熱性プロリンジペプチド分解酵素を提供する。【課題解決手段】パイロコッカス・ホリコシ菌由来の耐熱性プロリンジペプチド分解酵素遺伝子を用いて、遺伝子工学的手法により、上記課題を解決しうる新規な耐熱性プロリンジペプチド分解酵素を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロリンを構成アミノ酸として少なくとも一つ含有するジペプチドを加水分解する活性を有し、至適反応温度８０℃以上で、かつ至適ｐＨ９である性質を有することを特徴とする、耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素。
【請求項２】
パイロコッカス　ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）に由来する請求項１に記載の耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素。
【請求項３】
配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素。
【請求項４】
配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素。
【請求項５】
請求項３または４に記載の耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項６】
配列表の配列番号３に記載のポリヌクレオ配列を有することを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
配列表の配列番号３に記載のポリヌクレオ配列とハイブリダイズでき、且つ耐熱性プロリン含有ジペプチド活性を有する有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組み替えベクター。
【請求項９】
耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素の発現用のプロモータを有し、耐熱性ジペプチド分解酵素を発現する能力を有することことを特徴とする、請求項８に記載の組み換えベクター。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のベクターにより形質転換されたことを特徴とする、形質転換体。
【請求項１１】
微生物細胞、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞を宿主とすることを特徴とする、請求項１０に記載の形質転換体
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を培養する工程、得られる培養物より耐熱性ジペプチド分解酵素を回収する工程を含む、耐熱性プロリンジペプチド分解酵素活性を有するポリペプチドの製造方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素、該耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素をコードするＤＮＡ、耐熱性プロリン含有ジプチド分解酵素をコードするＤＮＡにより形質転換された形質転換体、および形質転換体を用いる耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
チーズおよび醤油製造等の食品産業においては、苦味成分除去のための技術開発が望まれている。チーズ中のプロリンを含んだジペプチドが分解され、チーズの苦味成分を減少させるので、プロリンを放出する酵素は、チーズ熟成剤として重要である。プロリンは環状構造としてペプチド内に含まれており、通常のペプチダーゼ、プロテアーゼでは分解できないため、プロリンを含有するジペプチドを分解してプロリンを放出できる分解酵素が有望である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これまで見出されている耐熱性のプロリン含有ジペプチド分解酵素は、活性発現にコバルトあるいはマンガンを必要とし、反応至適ｐＨが７付近のものであった（例えば非特許文献１参照）。食品工業に応用するためには、重金属を活性発現に必要とせず、広い特異性と安定性を持った特徴のある耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素が必要である。
【非特許文献１】Ｊ．　Ｂａｃｔ．　（１９９８），　１８０．　４７８１−４７８９
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、種々の耐熱性細菌の遺伝子を鋭意探索した結果、９０℃以上で生育するパイロコッカス　ホリコシ（ＪＣＭ９９７４、ＪＣＭ微生物カタログ第７版（１９９９））の遺伝子中に、プロリンジペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子部分と推定しうるＤＮＡ配列を見いだすとともに、該遺伝子を鋳型として該プロリンジペプチダーゼ遺伝子を調製し、この遺伝子を用いてプロリンジペプチダーゼを生産して、その性質を解明した。　その結果、このプロリンジペプチダーゼは、基本的にはプロリダーゼ（３．４．１３．９）に属するが、従来、この種の酵素においてあまりみられないＰｒｏ−Ｐｒｏ分解活性をも有し、また、極めて高い耐熱性を有するとともに、重金属の不存在下においても酵素活性を示す等の新規かつ有用な性質を有することを確認し、本発明を完成させるに至ったものである。
【０００５】
すなわち、以下の（１）〜（１２）に関するものである。
（１）　プロリンを構成アミノ酸として少なくとも一つ含有するジペプチドを加水分解する活性を有し、至適反応温度８０℃以上で、かつ至適ｐＨ９である性質を有することを特徴とする、耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素。
（２）　パイロコッカス　ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）に由来する請求項１に記載の耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素。
（３）　配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素。
（４）　配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素。
（５）　（３）たは（４）に記載の耐熱性ジペプチド分解酵素をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
（６）　配列表の配列番号３に記載のポリヌクレオ配列を有することを特徴とする（５）に記載のＤＮＡ。
（７）　配列表の配列番号３に記載のポリヌクレオ配列とハイブリダイズでき、且つ耐熱性ジペプチド活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（８）　（５）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組み替えベクター。
（９）　耐熱性ジペプチド分解酵素の発現用のプロモータを有し、耐熱性ジペプチド分解酵素を発現する能力を有することことを特徴とする、（８）に記載の組み換えベクター。
（１０）　（８）または（９）に記載のベクターにより形質転換されたことを特徴とする、形質転換体。
（１１）　微生物細胞、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞を宿主とすることを特徴とする、（１０）に記載の形質転換体
（１２）　請求項１１に記載の形質転換体を培養する工程、得られる培養物より耐熱性ジペプチド分解酵素を回収する工程を含む、耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素活性を有するポリペプチドの製造方法
（１１）　微生物細胞、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞を宿主とすることを特徴とする、上記（１０）に記載の形質転換体
（１２）　上記（１１）に記載の形質転換体を培養する工程、得られる培養物より耐熱性プロリンジペプチド分解酵素を回収する工程を含む、耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素活性を有するポリペプチドの製造方法。
【０００６】
本発明の耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素は、プロリンを構成アミノ酸として少なくとも一つ含むジペプチドを基質として、ジペプチドのアミド結合を加水分解する。具体的な基質としては、Ｘ−Ｐｒｏである（なお。Ｘはアミノ酸残基を表す。）るが、特にＰｒｏ−Ｐｒｏ分解活性も有する。
【０００７】
本酵素の至適ｐＨは９であり、一方、従来のプロリダーゼが至適ｐＨが７付近であって、この点で明確な差異がある。また、至適反応温度は、ｐＨ９で８０℃以上、１１０℃でも６０％に近い酵素活性を保持し、さらに１００ｍＭリン酸緩衝液中においても１００℃で１２０分で活性を維持しており、極めて耐熱性が高い。また、従来のプロリダーゼが、活性発現にコバルトあるいはマンガンを必要としたのに対し、本発明の耐熱性プロリン含有ジペプチッド分解酵素は、これら重金属あるいはその他の金属の不存在下においても酵素活性を示す。
本発明の耐熱性プロリンジ含有ペプチド分解酵素のアミノ酸配列は配列表の配列番号４に示されるが、これに限らず変異等により、配列番号４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸の欠失し、または置換され、あるいは付加されたものであっても、プロリン含有ジペプチドの分解活性を有するものであれば本発明の耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素に含まれる。
【０００８】
本発明の耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素遺伝子は、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡであればいずれのポリヌクレオ配列でもよいが、具体的には、配列表の配列番号３に示されるポリヌクレオ配列を有する。　このＤＮＡは、パイロコッカス　ホリコシ菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により調製したものである。
さらに、本発明においては、配列番号３に示されるＤＮＡとハイブリダイズでき、かつ耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素をコードするＤＮＡ　も包含される。
【０００９】
本発明において、耐熱性プロリン含有ジペプチドの生産は、遺伝子組み換え技術を用いて常法により行うことができる。
まず、上記耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素をコードする遺伝子を、プラスミド、ファージ等のベクターに組み込み、得られた組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。この後、この形質転換体を培養し、培養物から上記耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素を回収することができる。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物細胞、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等の培養細胞が挙げられるが、特に宿主細胞の種類には限定されない。
【００１０】
組み換えベクターの構築において、上記耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素をコードする遺伝子を発現するためには、Ｔ７等の発現プロモ−タを使用するが、該プロモータにも特に制限はなく、それぞれの宿主−ベクター系において、発現ベクターとして、予めプロモータが予め組み込まれた通常使用されているベクターを用いればよい。
本発明の耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素遺伝子を単に増幅するのみであるなら、発現プロモータあるいは発現ベクターではなく、宿主細胞において単なる増殖能を有するベクターに組み込めばよい。
【００１１】
【実施例】
以下、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
（１）　パイロコッカス　ホリコシの培養
１３．５ｇのＮａＣｌ、　４ｇのＮａ２ＳＯ４、０．７ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＮａＨＣＯ３、０．１ｇのＫＢｒ、３０ｍｇのＨ３ＢＯ３、１０ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｇのＣａＣｌ２、２５ｍｇのＳｒＣｌ２、１．０ｍＬのレザスリン溶液（０．２ｇ／Ｌ）、１．０ｇの酵母エキス、５ｇのバクトペプトンを蒸留水１Ｌに溶かし、加圧殺菌した。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を０．２％となるように加えた。窒素ガスを飽和した後、別に加圧滅菌したＮａ２Ｓ溶液を加えて、レザスリン溶液のピンク色が着色しないことを確認して嫌気性としたのち、パイロコッカス　ホリコシ菌（ＪＣＭ９９７４，「ＪＣＭ微生物カタログ」第７版集（１９９９））を接種し、９５℃で３？４日静置培養した。
【００１２】
（２）　染色体ＤＮＡの調製
上記培養菌体を集菌し緩衝液で洗浄後、ＳＤＳ存在下プロテアーゼＫで菌体を分解後クロロホルムフェノール溶液で変性タンパク質を除去した後、核酸をアルコール沈澱させた。粗精製核酸をＲＮａｓｅを働かせＲＮＡを除去し、パイロコッカス　ホリコシ菌のＤＮＡを得た。
（３）プロリン含有ジペプチド分解酵素遺伝子を含むプラスミドの調製
パイロコッカスのゲノム情報を参考にして、プロリンジペプチド分解酵素遺伝子と推定されるＯＲＦを調製するためのＰＣＲ反応のプライマーを設計した。そのプライマーを用いて、上記のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応条件を検討したところ次ぎの条件が適していることが判明した。
Ｔｈｅ　ｕｐｐｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−　ＡＴＡ　ＡＴＧ　ＴＴＣ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＣ　ＡＴＡ　ＴＧＧ　ＡＣＡ　ＴＡＡ　Ｔ−３’（配列表の配列番号１））
；　ｔｈｅ　ｌｏｗｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ　（５’−ＴＧＡ　ＧＧＧ　ＣＣＧ　ＣＡＡ　ＴＧＧ　ＡＴＣ　ＣＡＣ　ＴＡＧ　ＡＧＣ　ＴＣＧ−３’（配列表の配列番号２））
アニーリング温度５９℃
これにより調製された遺伝子を、ベクタープラスミド（ｐＥＴ−１１ａ（ｎｏｖａｇｅｎ社製））に結合させて、プロリン含有ジペプチド分解酵素遺伝子を含むプラスミドを得た。
【００１３】
（３）　プロリン含有ジペプチド分解酵素の大腸菌への導入
上記調製したプラスミドをコンピテンシーの高い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＸＬ２Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　社製　）に形質導入した。その導入したプラスミドの遺伝子の配列を分析し、プロリン含有ジペプチド分解酵素遺伝子のポリヌクレオ配列を解明した。このポリヌクレオ配列を配列表の配列番号３に示す。
【００１４】
また、このポリヌクレオ配列に対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示す。
配列番号４に示されるアミノ酸配列は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ，　Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ，　Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及びＡｅｒｏｐｙｒｕｍ　ｐｅｒｎｉｘのプロリダーゼと，それぞれ８４％、８０％、３７％、及び３４％の相同性があった。上記相同性タンパクの配列を検討すると５種類の金属イオン結合部位が認められた。
【００１５】
（４）プロリン含有ジペプチド分解酵素の生産と精製
上記大腸菌から精製したプラスミドを酵素生産用の大腸菌（ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ　（ＤＥ３）　ＲＩＬ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製））に導入し、その大腸菌を培養した。培養液を遠心分離して菌体を集め、凍結融解してプロリン含有ジペプチド分解酵素を５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８）緩衝液で抽出した。抽出に際してはアルミナ粉末で菌体を破砕するとともにＤＮＡａｓｅで核酸を分解し抽出液の粘性を減少させた。抽出液は、８５℃で３０分間熱処理し、熱変性しやすいタンパクを沈澱除去した。上澄液に硫安を濃度が９０％になるまで加えて沈澱を作成さて分別取得した。その沈澱を蒸留水に溶かし５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）に透析後、陰イオン交換樹脂に吸着させた。食塩グラジエント（０−１．０Ｍ）で溶出させた分画を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）で透析後、硫安を１．７Ｍになるよう加えた酵素液をフェニルセファロースに吸着させ　硫安グラジエント（１．５−０Ｍ）で溶出させた。フェニルセファロースカラムクロマトを２度行なうことによりＳＤＳ電気泳動で単一バンドになるまで精製した。精製したタンパクのＮ末端分析を行なうとＭＤＩＭＮＥＫであり核酸配列から推定したアミノ酸配列と一致した。
【００１６】
（５）プロリン含有ジペプチド分解酵素の酵素的性質
以下の各酵素的性質は、基本的に、４ｍＭ濃度のプロリン含有ジペプチドを含む５０ｍＭ緩衝液を０．５ｍＬとり、所定温度で５分間加温し、２μＬの精製酵素液を加え１０分間反応させ、０．５ｍＬの氷酢酸を入れて反応を止め、０．５ｍＬのニンヒドリン試薬を入れ１５分間煮沸した後、２３℃に冷却後５１５ｎｍの吸光度を測定することにより生成するアミノ酸量を測る方法で行った。コントロールとしては、酵素２μＬの代わりに２μＬの緩衝液を使用した。
【００１７】
〔至適ｐＨ、反応温度〕
４ｍＭ濃度のプロリン含有ジペプチド（Ｍｅｔ−Ｐｒｏ）を含むｐＨ５〜１０に調整した各５０ｍｌ緩衝液において、それぞれ酵素活性を測定をした。反応条件およびその結果を図１に示す。これによればｐＨ５、６、７、８ではほとんど活性はみられず、ｐＨ９で高活性に達し、ｐＨ１０では、ｐＨ９の６６％の活性が見られた。反応温度は、８５℃で高活性を示し１００℃まではほとんど変化がなく、１０５℃、１１０℃でそれぞれ６３％、５８％になった。したがって、反応至適条件は、ｐＨ９、８５℃である。
【００１８】
〔金属イオンの影響〕
１．２ｍＭ各種金属イオン、２μＬの精製酵素液および４ｍＭ濃度のプロリン含有ジペプチド（Ｍｅｔ−Ｐｒｏ）を含む５０ｍＭ緩衝液（２−（Ｎ−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（以下、ＣＨＥＳという。））ｐＨ９を５ｍＬとり、１００℃、５分間反応させ、上記と同様にして酵素活性を測定することにより、各種金属イオンの酵素活性に及ぼす影響を調べた。表１に結果を示す。本酵素は、金属結合残基が存在するにもかかわらず、金属イオン無添加でも反応し、コバルト、マンガン、カドミウムで活性化された。
【表１】
2004105091.tif 000002
【００１９】
〔基質特異性〕
本酵素精製物２μＬ、および４ｍＭ濃度の各種ペプチドを含有する５０ｍＭ　ＣＨＥＳ（ｐＨ９．０）　緩衝液中、反応温度１００℃で反応せしめ上記と同様にして酵素活性を測定することにより基質特異性を調べた。表２に示されるように、本酵素はプロリダーゼ活性のほかにも、Ｐｒｏ−Ｐｒｏも分解しプロリナーゼ活性をも示すことを確認した。
【表２】
2004105091.tif 000003
【００２０】
〔リン酸緩衝液中の本酵素の耐熱安定性〕
本酵素を１００ｍＭリン酸緩衝液中で９０℃および１００℃の温度下に保持し、一定時間後の酵素活性を測定した。反応条件および結果を図２に示す。これによれば９０℃で３０分、１００℃で３０分でそれぞれ元の活性が５０％、２８％に低下したが、その後６０分、９０分、１２０分経過しても、その活性を維持していた。
【００２１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の新規な耐熱性プロリン含有ジペプチド分解酵素は、極めて耐熱性が高く殺菌温度でも活性を維持でき、また、重金属を酵素活性の発現に必要としないので、食品製造用の酵素として極めて有用である。特にプロリンを含んだジペプチドはチーズの苦味成分であり、プロリンを含有するジペプチドを分解する酵素はチーズの苦味成分を減少させるので、プロリンを放出する酵素はチーズ熟成剤として重要である。したがって、これらの点からみて明らかなように、本発明は、食品製造において有用な手段を提供するものである。
【００２２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の耐熱性プロリン含有ジペプチダーゼの酵素活性を、各ｐＨ緩衝液中で測定した結果を示す図である。
【図２】本発明の耐熱性プロリン含有ジペプチダーゼを、９０および１００℃のリン酸緩衝液中で一定時間保持した後の酵素活性を測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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