(57)【要約】【課題】Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現を強制するために修飾された集団細胞の投与を含み、修飾細胞集団が、そのような発現を強制するための処理後に少なくとも７０％の細胞生存率を有する処置の方法を提供すること。【解決手段】本開示は、対象において炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害または病状またはがんを処置する方法を対象とする。本方法は、組織修復／再生またはがん処置を必要とする対象への、細胞の天然集団のＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチン結合レベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞集団の投与を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害または病状を処置するための組成物であって、
造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）を発現する幹細胞の集団を含み、前記集団が、幹細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＨＣＥＬＬを発現し、前記幹細胞の集団が前記対象へと静脈内投与されることを特徴とし、
前記幹細胞の集団の投与が、前記炎症および／または損傷組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致した時間で行われ、
前記幹細胞の集団が、前記投与された幹細胞の天然集団と比較して前記炎症および／または損傷膵臓組織内で増大された局在化および／または定着を呈示する、組成物。
【請求項２】
対象の炎症および／または損傷組織への幹細胞の送達を増大するための、および／または前記対象の前記炎症および／または損傷組織における幹細胞の組織定着を増大するための組成物であって、
造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）を発現する幹細胞の集団を含み、前記集団が、幹細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＨＣＥＬＬを発現し、前記幹細胞の集団が、前記対象へと静脈内投与されることを特徴とし、
前記幹細胞の集団の投与が、前記炎症および／または損傷組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致した時間で行われる、組成物。
【請求項３】
対象における炎症および／または損傷組織への幹細胞の送達を改善するための組成物であって、
造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）を発現する幹細胞の集団を含み、前記集団が、幹細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＨＣＥＬＬを発現し、前記幹細胞の集団が、前記対象へと静脈内投与されることを特徴とし、
前記幹細胞の集団の投与が、前記炎症および／または損傷組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致した時間で行われ、
前記投与された幹細胞の集団が、幹細胞の天然集団と比較して増大されたホーミング、定着および生着のうちの１つまたは複数を実現する、組成物。
【請求項４】
対象の炎症および／または損傷組織への幹細胞の送達、付着、定着および／または生着を増大するための組成物であって、
造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）を発現する幹細胞の集団を含み、前記集団が、幹細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＨＣＥＬＬを発現し、前記幹細胞の集団が前記対象の血管系を通じて静脈内投与されることを特徴とし、
前記投与が、前記炎症および／または損傷組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致した時間で行われる、組成物。
【請求項５】
対象における炎症および／または損傷組織の処置のための医薬の製造に使用するための造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）を発現する幹細胞の集団であって、前記処置が、前記対象にＨＣＥＬＬを発現する前記幹細胞の集団を静脈内投与するステップを含み、前記集団が、前記幹細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＨＣＥＬＬを発現し、
前記処置が、前記集団を前記炎症および／もしくは損傷膵臓組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致した時間で投与するステップを含む、幹細胞の集団。
【請求項６】
前記幹細胞が、神経幹細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物または請求項５に記載の幹細胞の集団。
【請求項７】
前記炎症および／または損傷組織が、神経組織である、請求項１から４または６のいずれか一項に記載の組成物または請求項５または６のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項８】
前記炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害または病状が、多発性硬化症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記対象が、多発性硬化症を有する、請求項２から４または６から７のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項１０】
前記炎症および／または損傷組織の環境において、前記投与された幹細胞の集団がさらに生着することを特徴とする、請求項１から４または６から９のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項１１】
免疫調節効果が、前記炎症および／または損傷組織内における前記投与された幹細胞の定着により実現される、請求項１から４および６から１０のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９から１０のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項１２】
組織修復効果が、前記炎症および／または損傷組織内における前記投与された幹細胞の定着により実現される、請求項１から４および６から１１のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９から１１のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項１３】
前記投与が、前記幹細胞集団の１回または一連の注射を含む、請求項１から４および６から１２のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９から１２のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項１４】
前記投与が、ＨＣＥＬＬを発現する前記幹細胞の集団の毎日、毎週、隔週、毎月または毎年の注射を含む、請求項１から４および６から１３のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９から１３のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項１５】
前記対象における事前投与の免疫調節効果が低下したら、前記幹細胞集団が１回または複数回さらに前記対象に投与されることを特徴とする、請求項１から４および６から１４のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９から１４に記載の幹細胞の集団。
【請求項１６】
前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシである、請求項１から４および６から１５のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９から１５のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項１７】
前記対象がヒト患者である、請求項１から４および６から１６のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９から１６のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項１８】
前記幹細胞の集団が、ＨＣＥＬＬが強制発現された幹細胞の修飾集団を形成するように処理され、前記幹細胞集団が、前記処理の２４時間後に少なくとも７０％の生存率を有する、請求項１から４および６から１７のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９から１７のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項１９】
前記幹細胞の集団が、前記処理の４８時間後に少なくとも７０％の生存率を有する、請求項１から４および６から１８のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９から１８のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【請求項２０】
前記組成物または前記幹細胞の集団が、末梢血管アクセスまたは中心血管アクセスのいずれかによって全身的に静脈内投与される、請求項１から５および６から１９のいずれか一項に記載の組成物または請求項５から７および９から１９のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、米国国立衛生研究所によって与えられ補助金ＰＯ１  ＨＬ１０７１４６（ＮＨＬＢＩ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＲＯ１  ＨＬ７３７１４、およびＲＯ１  ＨＬ６０５２８の下で政府支援によってなされた。政府は、本開示において特定の権利を有している。
【０００２】
本開示は、細胞表面を修飾するための組成物および方法、ならびに炎症状態、組織傷害／損傷およびがんの細胞ベースの処置におけるそのような修飾細胞の改善された効率および適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞ベースの治療法（別名「養子細胞治療法」）の成功は、関連する細胞を目的とする生物学的効果を達成するのに充分な量で必要とされる部位にそれらを提供することにかかっている。臨床適応症のための細胞の送達は、問題の組織への直接（局所）注射により、血管内投与（例えば、全身的にまたは特定の血管床へカテーテルベースの送達により）により、または罹患領域（例えば、皮膚潰瘍、熱傷等に対する）上への細胞の直接塗布／配置により達成することができる。細胞投与の全ての形態において、対象とする効果、例えば、炎症の制御、組織修復、拒絶反応の排除、がんの根絶等を達成するのに重要な組織微環境内の正確な投与部位における細胞の付着（ｌｏｄｇｅｍｅｎｔ）を促進し得る膜分子を保有することは、投与された細胞にとって有利になる。微小血管系の健全性および新たな微小血管の産生（すなわち、「血管形成」）が、組織再生／修復の重要な必要条件であることが周知であるので、そのような微環境部位の一つは、損傷組織内の微小血管中およびその周りに存在する「血管周囲領域」である。実際、組織傷害、炎症およびがん部位の全てで、罹患組織の微小血管内の内皮細胞は、標的部位への循環細胞（血液由来）の動員に重要な役割を果たす接着分子に特徴的なセットを呈示する。これらの内皮分子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン１（ＩＬ−１）などの炎症性サイトカインによって上方制御され、ヒトにおいて分子Ｅ−セレクチン、マウスにおいて分子Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンを含み、これらの分子は、「セレクチン」として公知の接着分子のファミリーに属するレクチンである（以下でより詳細に記述される）。加えて、任意の炎症部位（がんを含む）または組織傷害／損傷部位に動員された白血球は、Ｌ−セレクチン、「白血球」セレクチンを呈示し、したがって、投与された細胞上のＬ−セレクチンに対するリガンドの発現は、罹患組織における白血球浸潤の領域へのそのような細胞の付着を促進し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
細胞の濃縮ボーラスを罹患領域に適用できることを特に考慮すると、一見して、直接送達が、細胞投与に最も効果的な手法であると思われる。しかしながら、局所注射は、対象とする治療効果に対して実際のところ逆効果になり得る状況があり、さらに局所注射は、特定の解剖学的位置の場合にしか実用的でない：（１）静水圧下で培地懸濁液に適切な細胞を導入することにより、注射手順は、送達された細胞を傷つける可能性があり、さらに、組織の完全性をさらに損ない、初期の組織修復および／または宿主防御過程を混乱させ、それにより炎症状態を悪化させるか、またはｉｎ  ｓｉｔｕで適当な免疫反応を妨害する可能性がある；（２）侵襲的方法であるために、注射針／デバイス（および懸濁液）は、標的組織損傷を誘導し、そして／または副次的な組織損傷を推進する可能性がある；（３）直接注射は、明確に定義された解剖学的境界を有する器官／組織（例えば、心臓）に最も都合が良く、広範囲に及ぶ結合組織支持がない組織（例えば、肺）には非実用的である；（４）特に比較的到達困難であり、そして／または脆弱な器官／組織（例えば、中枢神経系）の場合、注射手順は、実質的な画像支援を伴う高度な送達システムの使用を必要とする技術的に厳しく労働集約型になる可能性がある；（５）最も重要なことには、多くの変性および炎症症状は広範囲に分布しており、元来多病巣性であり（例えば、骨粗鬆症、炎症性大腸疾患、多発性硬化症等）、したがって、直接注射は実用的でも有効でもない。したがって、局所注射が都合の良い臨床症状／状況はあるが、血管ルートの投与が、全ての広汎な「全身性」障害、ならびに接近に問題があり、そして／または局所注射に適さない解剖学的構造を持つ任意の組織（例えば、糖尿病の膵臓、慢性閉塞性肺疾患の肺）に対しては必須である。最小限の労力で細胞を反復して投与できることは、全身注入の別の重要な実用的長所である。したがって、炎症環境に直接注射された細胞の接着／付着と罹患部位に血管内投与された細胞の生理学的遊走の両方を指令する分子エフェクターの発現／活性を最適化する方法論の作り上げることが、細胞ベースの治療法全ての大いなる展望を実現する鍵となる。
【０００５】
予め定められた位置への血液由来細胞の遊走（「ホーミング」）を指令する能力は、様々な生理学的および病理学的過程に深い意味がある。特定の解剖学的部位への循環細胞の動員は、標的組織における血流と血管内皮内にある細胞間との不連続な接着性相互作用により開始される。これらの接触を媒介する分子は「ホーミング受容体」と呼ばれ、歴史的に定義されているように、これらの構造は、血液中の細胞の向性をそれぞれの標的組織へと導く。歴史的に、３つの「組織特異的ホーミング受容体」：末梢リンパ節に対するＬ−セレクチン、腸および消化管関連リンパ組織に対するα４β７（ＬＰＡＭ−１）、ならびに皮膚への細胞遊走を促進する「皮膚リンパ球抗原」（ＣＬＡ）として特に公知である分子Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）の特殊なグリコフォーム（R.  Sackstein、Curr  Opin  Hematol  １２巻、４４４頁（２００５年））が記述されている。特に、これらの組織とは別に、循環細胞、特に造血幹細胞（ＨＳＣ）が、骨髄へ効果的に進むことは、数十年間認識されてきており（T.  Lapidot、A.  Dar、O.  Kollet、Blood  １０６巻、１９０１頁（２００５年））、いくつかの研究は、髄へのＨＳＣの動
員の媒介において、ＨＳＣ  Ｅ−セレクチンリガンドに結合するセレクチン、主にＥ−セレクチンが果たす役割を指し示した。
【０００６】
生物物理学的な観点から、ホーミング受容体は、初期の係留、その後主な血流速度以下での血管内皮上への血流中の細胞の持続的なローリング接触をもたらす分子制動装置として機能する（ステップ１）（R.  Sackstein、Curr  Opin  Hematol  １２巻、４４４頁（２００５年））。その後、インテグリン接着性の活性化（ステップ２）、強い附着（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）（ステップ３）および内皮移行（ステップ４）をもたらす、一般にケモカインにより高められる事象のカスケードが続いて起こる（T.  A.  Springer、Cell  ７６巻、３０１頁（１９９４年））。この「多段階式パラダイム」は、組織特異的遊走が、所与の循環細胞上のホーミング受容体とケモカイン受容体発現の別個の組み合わせにより調節され、それにより器官特異的様式で、標的内皮内で発現される関連する血管接着性リガンドおよびケモカインによって呈示される適切な「交通信号」を認識可能になることを保持する。骨髄への細胞の輸送を指令するホーミング受容体の会合後に、いく通りもの証拠が、１つのケモカイン、特にＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）が、この部位へのステップ２で媒介される細胞の動員に必須の役割を果たすことを示している（T.  Lapidot、A.  Dar、O.  Kollet、Blood  １０６巻、１９０１頁（２００５年）；A.  Peledら、Science  
２８３巻、８４５頁（１９９９年）；D.  A.  Sipkinsら、Nature  ４３５巻、９６９頁
（２００５年））。しかしながら、ＳＤＦ−１の発現は髄に限定されるものではなく、このケモカインは、組織傷害／炎症のある全ての部位で代表的には発現される（R.  Sackstein、Immunol.  Rev.  ２３０巻：１４０〜１６３頁（２００９年））。
【０００７】
ステップ１のローリング相互作用の最も効果的なエフェクターは、セレクチン（Ｅ−、Ｐ−およびＬ−セレクチン）およびそれらのリガンドである（R.  Sackstein、Curr  Opin  Hematol  １２巻、４４４頁（２００５年））。文字通り、セレクチンは、四糖シアリルルイスＸ（ｓＬｅｘ；Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１−））として原型において呈示されるα（２，３）連結シアル酸置換およびα（１，３）連結フコース修飾を含有するシアロフコシル化からなる特定の炭水化物決定因子に結合するレクチンである（R.  Sackstein、Curr  Opin  Hematol  １２巻、４４４頁（２００５年）；M.  J.  Polleyら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  ８８巻、６２２４頁（１９９１年））。ｓＬｅｘグリカンは、「ＨＥＣＡ４５２」として公知のｍＡｂを含めた様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により認識される。Ｅ−およびＰ−セレクチンは、血管内皮上（Ｐ−セレクチンは血小板上でも）で発現され、Ｌ−セレクチンは、循環白血球上で発現される（R.  Sackstein、Curr  Opin  Hematol  １２巻、４４４頁（２００５年））。Ｅ−およびＰ−セレクチンは、組織傷害ならびに炎症の部位のみで優勢に発現される代表的な誘導可能な内皮膜分子であり、それらの発現は、炎症性サイトカインに応答して生成される。しかしながら、骨髄および皮膚の微小血管系は、これらのセレクチンを構成的に発現し、セレクチンは、これらの部位への血液由来細胞の定常状態の動員に重要な役割を果たす（R  Sackstein、J  Invest.  Dermatology、１２２巻：１０６１〜１
０６９頁（２００４年））。重要なことに、霊長類（齧歯動物を除く）では炎症部位および組織傷害／損傷部位の全てにおいて、炎症性サイトカインＴＮＦおよびＩＬ−１に応答性のプロモーターエレメントがＰ−セレクチン遺伝子から欠失しているので、Ｅ−セレクチンが、細胞動員を媒介する主要な血管セレクチンである。したがって、ヒトの炎症部位の全てにおいて、血管Ｅ−セレクチンの発現は、Ｐ−セレクチンより顕著である（R.  Sackstein、Immunol.  Rev.  ２３０巻：１４０〜１６３頁（２００９年））。
【０００８】
ヒト造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）上で、Ｅ−セレクチンの２つの主要なリガンド、ＰＳＧＬ−１の高度にシアロフコシル化されたＣＬＡグリコフォーム（Z.  Laszikら、Blood  ８８巻、３０１０頁（１９９６年）、R.  Sackstein、Immunol.  Rev.  ２３０巻：１４０〜１６３頁（２００９年））および造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）として公知の特殊なシアロフコシル化ＣＤ４４グリコフォーム（C.  J.  Dimitroff、J.  Y.  Lee、S.  Rafii、R.  C.  Fuhlbrigge、R.  Sackstein、J  Cell  Biol  １
５３巻、１２７７頁（２００１年）；C.  J.  Dimitroff、J.  Y.  Lee、R.  C.  Fuhlbrigge、R.  Sackstein、Proc  Natl  Acad  Sci  US  A  ９７巻、１３８４１頁（２００
０年））が識別されている。ＣＤ４４は、どちらかといえば遍在する細胞膜タンパク質であるが、ＨＣＥＬＬ表現型は、ヒトＨＳＰＣ上に主に見られる。ＨＣＥＬＬの制限されている分布とは対照的に、ＣＬＡ／ＰＳＧＬ−１は、髄内の造血前駆細胞ならびにより成熟した骨髄系およびリンパ系細胞の間で広く発現される（Z.  Laszikら、Blood  ８８巻、
３０１０頁（１９９６年）、R.  Sackstein、Immunol.  Rev.  ２３０巻：１４０〜１６
３頁（２００９年））。ＨＣＥＬＬは、剪断（ｓｈｅａｒ）条件下でＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチンに結合するＣＤ４４として操作上定義され、Ｅ−セレクチン−Ｉｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）およびｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２と反応するＣＤ４４グリコフォームとして細胞溶解物のウェスタンブロット分析により識別され、ＨＥＣＡ４５２は、シアリルルイスＸを認識する（そして、ＨＥＣＡ４５２は、ｓＬｅｘに加えて、フコースが、１型ラクトサミン骨格内のＮ−アセチルグルコサミンにα（１，４）連結で付加されている「シアル化ルイスａ」［ｓＬｅａ］として公知のｓＬｅｘの四糖異性体を認識する）。ＣＬＡおよびＨＣＥＬＬに加えて、ヒト白血球およびＨＳＰＣは、Ｅ−セレクチンリガンドとして働き得る「ＣＤ４３−Ｅ」として公知のＣＤ４３グリコフォームを発現することもでき（Fuhlbriggeら、Blood  １０７巻：１４２１〜１４２６頁（２００６年）、Merzabanら、Blood  １１８巻：１７７４〜１７８３頁（２０１１年））、マウス白血球においては、Ｅ−セレクチンリガンド−１（ＥＳＬ−１）として公知の別のＥ−セレクチンリガンドが記述されている（Merzabanら、Blood  １１８巻：１７７４〜１７８３頁（２０１１年））
。全ての糖タンパク質において、Ｅ−セレクチン（ならびにまた、Ｌ−セレクチンおよびＰ−セレクチン）に結合するセレクチンリガンド（例えば、ＣＤ４３−Ｅ、ＣＬＡおよびＨＣＥＬＬ）は、α（２，３）−シアル酸およびα（１，３）−フコース修飾に極めて依存的である（C.  J.  Dimitroff、J.  Y.  Lee、S.  Rafii、R.  C.  Fuhlbrigge、R.  Sackstein、J  Cell  Biol  １５３巻、１２７７頁（２００１年）；C.  J.  Dimitroff、J.  Y.  Lee、R.  C.  Fuhlbrigge、R.  Sackstein、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  ９７巻、１３８４１頁（２０００年）；R.  Sackstein、C.  J.  Dimitroff、Blood  ９６巻
、２７６５頁（２０００年）；C.  J.  Dimitroff、J.  Y.  Lee、K.  S.  Schor、B.  M.  Sandmaier、R.  Sackstein、J  Biol  Chem  ２７６巻、４７６２３頁（２００１年））。ヒトＨＳＰＣ上で、ＨＣＥＬＬは、Ｎ−グリカン上に適切なシアロフコシル化セレクチン結合決定因子を呈示する（C.  J.  Dimitroff、J.  Y.  Lee、S.  Rafii、R.  C.  Fuhlbrigge、R.  Sackstein、J  Cell  Biol  １５３巻、１２７７頁（２００１年）；R.
Sackstein、C.  J.  Dimitroff、Blood  ９６巻、２７６５頁（２０００年））。血行
力学剪断応力下でのＥ−およびＬ−セレクチン結合のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、ＨＣＥＬＬが、任意のヒト細胞上で発現されるこれらの分子に対する最も強力なリガンドであることが示されている（C.  J.  Dimitroff、J.  Y.  Lee、S.  Rafii、R.  C.  Fuhlbrigge、R.  Sackstein、J  Cell  Biol  １５３巻、１２７７頁（２００１年）；C.  J.  Dimitroff、J.  Y.  Lee、K.  S.  Schor、B.  M.  Sandmaier、R.  Sackstein、J  Biol
Chem  ２７６巻、４７６２３頁（２００１年））。重要なことに、Ｅ−セレクチンは、髄および皮膚の微小血管内皮上で構成的に発現されているが、この分子は、直接的な組織傷害（例えば、熱傷、外傷、褥瘡性潰瘍等）、虚血／血管事象（例えば、心筋梗塞、脳卒中、ショック、出血、凝血障害等）、感染症（例えば、蜂巣炎、肺炎、髄膜炎、ＳＩＲＳ等）、異常増殖（例えば、乳がん、肺がん、リンパ腫等）、免疫学的／自己免疫症状（例えば、移植片対宿主病、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸疾患、紅斑性狼蒼、関節リウマチ、乾癬等）、変性疾患（例えば、骨粗鬆症、変形関節炎、アルツハイマー病等）、先天的／遺伝的疾患（例えば、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ハンチントン舞踏病等）、薬物副作用（例えば、薬物により誘導される肝炎、薬物により誘導される心傷害等）、毒性傷害（例えば、放射線被曝、化学的曝露、アルコール性肝炎、アルコール性膵炎、アルコール性心筋症、コカイン心筋症等）、代謝異常（例えば、尿毒症性心膜炎、代謝性アシドーシス等）、医原性症状（例えば、放射線により誘導される組織傷害、手術関連合併症等）および／または特発性の過程（例えば、筋萎縮側索硬化、パーソネイジ−ターナー症候群［Parsonnage-Turner  Syndrome］等）によって誘導されるかどうかにかかわ
らず、急性および慢性型両方の全ての炎症の部位で内皮ベッド上で優勢に発現される。
【０００９】
本開示の様々な態様の中で、血管内皮細胞上のＥ−セレクチン発現および／または罹患組織内の白血球浸潤がある疾患、障害または病状の処置の方法が提供される。Ｅ−セレクチンは、特定の白血球および造血幹／前駆細胞、すなわち、骨髄細胞（例えば、好中球、単球、好酸球、マクロファージ等）、樹状細胞（リンパおよび骨髄由来の両方）、リンパ球（例えば、ナイーブおよびメモリＴ細胞、ナイーブおよびメモリＢ細胞、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞［ＮＫ細胞］等）、造血前駆細胞および造血幹細胞の表面に生来存在するシアル化、フコシル化炭水化物（例えば、シアル化ルイスＸおよびルイスＡファミリーのメンバー）に結合する。したがって、これらの細胞型は、急性および慢性炎症部位で見られ、血管Ｅ−セレクチンによりそのような炎症部位に動員される。白血球およびＨＳＰＣは、Ｌ−セレクチンを特徴的に呈示する。Ｌ−セレクチンそれ自体が、ｓＬｅｘなどのシアル化、フコシル化炭水化物に結合する。したがって、炎症部位は、Ｅ−セレクチン（内皮細胞上）およびＬ−セレクチン（浸潤白血球およびＨＳＰＣ上）を発現する細胞を有する。
【００１０】
細胞ベースの治療法は、対象とする転帰を達成する能力が必要とされる部位へ投与された細胞の送達、そしてまた特定の組織微環境における投与された細胞の局在化に極めて依存的である。したがって、組織傷害／損傷の部位、炎症の部位、がんの部位、および感染症の部位への投与された細胞の血管送達を増大する方法が、当技術分野において必要である。罹患組織における投与された細胞の付着（ｌｏｄｇｅｍｅｎｔ）／定着（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を増大することも当技術分野において必要である。簡潔には、したがって、本開示は、対象において炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害または病状ならびに／またはがんを処置する方法であって、対象に細胞の天然集団を超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞集団を投与するステップを含む方法を対象とする。投与は、標的組織（例えば、炎症および／または損傷組織、がん性組織）内の内皮細胞上のＥ−セレクチンの発現と一致しておよび／または標的組織内の白血球の蓄積（例えば、白血球浸潤）と一致して行われる。投与は、標的組織内の直接注射によるか、そして／または血管系を介してか、そして／または以下でさらに詳細に記載する他の手段によることができる。
【００１１】
本開示は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の生存集団による炎症の処置の方法をさらに対象とする。生細胞集団は、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する。投与は、標的組織（例えば、炎症および／または損傷組織、がん性組織）内の内皮細胞上のＥ−セレクチンの発現と一致しておよび／または標的組織内の白血球の蓄積（例えば、白血球浸潤）と一致して行われる。投与は、標的組織への直接注射によるか、そして／または血管系を介して（および／または以下でさらに詳細に記載する他の手段による）ことができ、疾患、障害または病状の処置は、投与された細胞の長期生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）を伴う必要がない（すなわち、処置は、一過性の定着（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）または処置部位における投与された細胞の長期持続／長命または処置部位における投与された細胞の増殖または処置部位における投与された細胞の分化および／または成熟により実現され得る）。
【００１２】
本開示は、対象において炎症を処置するための医薬の製造に使用するためのＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の生存集団をさらに対象とする。生細胞集団は、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する。投与は、標的組織（例えば、炎症および／または損傷組織、がん性組織）内の内皮細胞上のＥ−セレクチンの発現と一致しておよび／または標的組織内の白血球の蓄積（例えば、白血球浸潤）と一致して行われる。投与は、標的組織への直接注射によるか、そして／または血管系を介して、そして／または以下でさらに詳細に記載する他の手段によることができる。
【００１３】
本開示は、腫瘍／悪性疾患の処置用医薬の製造に使用するためのＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の生存集団をさらに対象とし、処置が、対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記処置が、集団を腫瘍／悪性腫瘍組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または腫瘍／悪性腫瘍組織内の白血球の蓄積と一致して投与するステップを含む。
【００１４】
本開示は、炎症を現す病的状態の処置用医薬の製造に使用するためのＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の生存集団をさらに対象とし、処置が、対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記処置が、集団を腫瘍／悪性腫瘍組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現の出現と一致しておよび／または腫瘍／悪性腫瘍組織内の白血球の蓄積と一致して投与するステップを含む。
【００１５】
本明細書に記述される投与（例えば血管系を介して、そして／または組織への直接注射による、そして／または他の手段による）を含む他の方法には、例えば、対象において炎症および／または損傷組織またはがんの部位（一括して「標的」組織）における細胞送達および定着を増大する方法、対象の標的組織への細胞送達を増大し、そして／または対象の標的組織における組織定着を増大する方法、対象における標的組織への細胞送達を改善する方法、対象の標的組織への細胞送達および定着を増大する方法、対象において標的組織内の細胞集団のホーミングおよび生着を増大する方法、対象において炎症状態を処置する方法、対象における組織修復／再生を増大する方法、ならびに対象における腫瘍／悪性腫瘍疾患を処置する方法がある。
【００１６】
一般に、直接的な組織傷害（例えば、熱傷、外傷、褥瘡性潰瘍等）、虚血／血管事象（例えば、心筋梗塞、脳卒中、ショック、出血、凝血障害等）、感染症（例えば、蜂巣炎、肺炎、髄膜炎、ＳＩＲＳ等）、異常増殖（例えば、乳がん、肺がん、リンパ腫等）、免疫学的／自己免疫症状（例えば、移植片対宿主病、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸疾患、紅斑性狼蒼、関節リウマチ、乾癬等）、変性疾患（例えば、骨粗鬆症、変形関節炎、アルツハイマー病等）、先天的／遺伝的疾患（例えば、表皮水疱症、骨形成不全症、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ハンチントン舞踏病等）、薬物副作用（例えば、薬物により誘導される肝炎、薬物により誘導される心傷害等）、毒性傷害（例えば、放射線被曝、化学的曝露、アルコール性肝炎、アルコール性膵炎、アルコール性心筋症、コカイン心筋症等）、代謝異常（例えば、尿毒症性心膜炎、代謝性アシドーシス等）、医原性症状（例えば、放射線により誘導される組織傷害、手術関連合併症等）および／または特発性の過程（例えば、筋萎縮側索硬化、パーソネイジ−ターナー症候群等）によって開始されるものを含むがこれに限定されない様々な炎症状態（例えば、急性および／または慢性）および／または損傷組織のいずれも、本明細書に記述される方法により処置され得る。
【００１７】
特定の実施形態において、例えば、細胞集団によって発現されるＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドは、造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）、神経細胞接着分子Ｅ−セレクチンリガンド（ＮＣＡＭ−Ｅ）、ＣＤ４３Ｅ、およびＣＬＡのうちの１つまたは複数から選択される。一実施形態において、Ｅ−セレクチンリガンドは、造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）および／または神経細胞接着分子Ｅ−セレクチンリガンド（ＮＣＡＭ−Ｅ）である。別の実施形態において、Ｅ−セレクチンリガンドは、ＨＣＥＬＬである。別の実施形態において、Ｅ−セレクチンリガンドは、ＮＣＡＭ−Ｅである。別の実施形態において、Ｌ−セレクチンリガンドは、ＨＣＥＬＬである。特に、Ｅ−セレクチンは罹患組織の内皮ベッド内で発現され、白血球はＬ−セレクチンを特徴的に発現するので、強力なＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチンリガンドであるＨＣＥＬＬの発現は、最も強い免疫反応性／組織損傷の微環境における組織付着（ｌｏｄｇｅｍｅｎｔ）を明白に促進するのに役立ち得る。
【００１８】
本明細書の他の場所でより一層詳細に述べている通り、様々な方法を利用して、対象に投与するための細胞の集団を調製することができる。一実施形態において、集団は、細胞または細胞の集団を、適切なドナーヌクレオチド糖とともにグリコシルトランスフェラーゼと接触させることにより調製される。例えば、フコース残基（フコシル化）、シアル酸残基（シアリル化）または両方（シアロフコシル化）のグリコシルトランスフェラーゼ強制発現により、グリカン操作を使用してＣＤ４４をシアロフコシル化し、それにより造血細胞Ｅ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）の発現を強制することができる。あるいは、フコシル基トランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼを使用して、シアリル−ルイスＸまたはシアリル−ルイスａなどのインタクトなグリカン構造を細胞表面に転移させることができる。加えて、非酵素的な方法を使用して、細胞表面にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを共有結合的または非共有結合的に結合させることができる。例えば、アプタマー、ｓＬｅｘ（シアリル−ルイスＸ）、ｓＬｅｘグリカンの糖模倣体および／またはペプチド模倣体、ｓＬｅａ（シアリル−ルイスａ）、ｓＬｅａグリカンの糖模倣体および／またはペプチド模倣体、ならびにＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンを結合する他の部分は、ビオチン−ストレプトアビジン対を使用して細胞表面に非共有結合的に結合されるか、または細胞表面に共有結合的に結合され；共有結合的か非共有結合的かに関わらず、結合は直接またはリンカーを介することができる。さらなる例として、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンへの処理細胞の附着を媒介する各場合に、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンを結合するファージディスプレイ粒子または抗体を、細胞表面に共有結合的または非共有結合的に結合させることができる。
【００１９】
一般に、および細胞集団を調製する様式から独立して、調製の様式は、修飾時から２４時間で少なくとも７０％の生存率を有する修飾細胞集団を提供する。そのような一実施形態において、修飾細胞集団は、修飾時から２４時間で少なくとも８０％の生存率を有する。いくつかの実施形態において、修飾細胞集団は、修飾時から２４時間で少なくとも８５％の生存率を有する。いくつかの実施形態において、修飾細胞集団は、修飾時から２４時間で少なくとも９０％の生存率を有する。生存率は、トリパンブルー排除など当技術分野において公知の方法、またはヨウ化プロピジウムおよびアネキシンＶ染色に対する２色フローサイトメトリー判定により決定することができる。好ましくは、細胞の表現型（細胞表面修飾以外）は、処理後に維持される。維持された表現型は、細胞が、天然の機能および／または活性を維持していることを意味する。例えば、細胞が幹細胞である場合、細胞は、その再生能、例えば、その全能性またはその多能性またはその多分化能またはその単能性を保持する。
【００２０】
修飾細胞集団は、生存可能であり（すなわち、上記のように修飾時から２４時間で少なくとも７０％の生存率を有する）、細胞の天然集団と比較してＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに対して増大された結合を有する。細胞の投与は、血管系を介して、そして／または組織への直接注射による（そして／または以下で詳細に記載する他の手段による）ことができる。一実施形態において、修飾細胞集団は、炎症の出現または組織への白血球の浸潤と一致する時間に投与される。別の実施形態において、修飾細胞集団は、炎症の出現または組織への白血球の浸潤の直前に投与される。
【００２１】
細胞が、ｓＬｅｘ発現を強制するためにグリカン操作を受けるか、またはｓＬｅｘ構造により装飾される（例えば、アビジン−ストレプトアビジン技術による）場合、処理細胞上の増加したｓＬｅｘ発現の測定は、ｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２またはｓＬｅｘ決定因子を認識する他の任意のｍＡｂによる蛍光染色の後に、フローサイトメトリーして細胞蛍光強度を検出することにより実行することができる。天然の（未処理の）細胞のサンプルを最初に分析することにより、修飾細胞集団の予め定められた蛍光閾値が決定される。処理細胞のｓＬｅｘの増加は、細胞の天然集団と比較して１０％を超えるマーカー陽性細胞（例えば、ＨＥＣＡ４５２反応性細胞）の増加パーセンテージとしておよび／またはベースライン（未処理）細胞集団を超える平均チャネル蛍光強度における１０％増加により定義される。処理細胞集団が、Ｅ−セレクチンへの増加した結合を有するかどうか検出するために、Ｅ−セレクチンに対する結合を、本明細書に記載の剪断応力条件下での平行平板型フローチャンバー研究またはＥ−セレクチン−Ｉｇキメラによる染色およびフローサイトメトリーによる蛍光強度の評価のいずれかを使用して評価することができる。細胞の対照（ベースライン）サンプルは、本明細書の他の場所で記述される機能的Ｅ−セレクチン結合アッセイを使用して、または当業者に公知の一般に認められている別のＥ−セレクチン蛍光結合アッセイによりアッセイされる。Ｅ−セレクチン結合蛍光レベルが、対照（ベースライン）集団サンプルに対して測定される。Ｅ−セレクチンに対する増大された結合は、Ｅ−セレクチン特異的結合アッセイにおいてＥ−セレクチンへの増加した附着を有する処理細胞と定義される。一実施形態において、Ｅ−セレクチンに対する増大された結合は、蛍光色素コンジュゲート試薬を使用するＥ−セレクチン結合アッセイにおける蛍光シフト、例えば、フローサイトメトリーにより評価されるＥ−セレクチン−Ｉｇキメラに対する結合により定義することができ、その定義において、Ｅ−セレクチン結合を保有する集団内の細胞数は、ベースライン結合のそれより少なくとも１０％増加（すなわち、マーカー陽性集団の１０％増加）し、および／または平均チャネル蛍光において予め定められた蛍光閾値（天然の細胞集団と関連する）より少なくとも１０％高い。別の実施形態において、増加したＥ−セレクチン反応性を保有する細胞のパーセンテージは２５％増加し、および／または修飾集団は、予め定められた蛍光閾値を２５％超える。別の実施形態において、修飾集団は、ベースライン反応性および／または予め定められた蛍光閾値を５０％超える。別の実施形態において、増加したＥ−セレクチン反応性を保有する細胞のパーセンテージは、Ｅ−セレクチン結合細胞のベースライン集団に対して７５％増加し、および／または修飾集団は、予め定められた蛍光閾値を７５％超える。別の実施形態において、修飾集団中の細胞の少なくとも９０％は、ベースラインＥ−セレクチン結合集団および／または予め定められた蛍光閾値を超える。別の実施形態において、修飾集団中の細胞の少なくとも９５％は、ベースラインＥ−セレクチン結合集団および／または予め定められた蛍光閾値を超える���
【００２２】
Ｌ−セレクチンに対する増大された結合は、動的剪断応力条件下における平行平板型フローチャンバーまたはスタンパーウッドラフアッセイなど高い特異性を持つ機能的Ｌ−セレクチン結合アッセイを使用してＬ−セレクチンに対する結合の増加により決定され得、細胞処理は、Ｌ−セレクチン媒介性附着を支持する細胞のパーセンテージを増加させる。平行平板型アッセイの場合、処理細胞集団は、ベースライン（未処理細胞）と比較して、Ｌ−セレクチン（チャンバープラスチックまたはガラス支持体表面上に固定され、呈示されている）に対する係留／ローリング接着性相互作用において少なくとも１０％の増加を示す。スタンパーウッドラフアッセイの場合、増加したＬ−セレクチンリンパ球附着は、８０ｒｐｍの回転剪断下におけるＬ−セレクチン＋リンパ球に結合する処理細胞の少なくとも１０％の増加により定義され；ベースライン細胞結合は、未処理（対照集団）で評価され、処理細胞集団と直接比較される。
【００２３】
別段の規定がない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語の全ては、本開示が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記述されるものと類似のもしくは同等の方法および材料を、本開示の実践または試験に使用することができるが、適切な方法および材料については後述する。本明細書において言及する刊行物、特許出願、特許および他の参照文献の全ては、その全体を参照により組み込む。一致しない場合、本明細書が、定義を含めて、優先されることになる。加えて、材料、方法および例は、単なる例示であり限定することを意図するものではない。
【００２４】
他の目的および特徴は、一部が明白であり、一部が本明細書で以下に指摘される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
対象の標的組織への細胞送達を強化する、そして／または前記対象の前記標的組織における組織定着を増大する方法であって、
前記対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、
前記細胞の投与が、前記標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
（項目２）
対象における炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害、または病状を処置する方法であって、
前記対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、
前記細胞投与が、前記標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われ、
前記集団が、前記投与された細胞の天然集団と比較して前記炎症および／または損傷組織内で増大された局在化および／または定着を呈示する方法。
（項目３）
対象における標的組織への細胞送達を改善する方法であって、
前記対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を、血管への送達によっておよび／または直接組織注射によって（すなわち、罹患組織部位に直接）および／または髄腔内および／または腔内および／または膀胱内および／または解剖学的管路（胆管系、泌尿器系等）中および／または組織上に（すなわち、罹患組織上への配置）投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、
前記細胞の投与が、前記標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われ、
前記投与された細胞の集団が、細胞の天然集団と比較して増大されたホーミング、定着および生着のうちの１つまたは複数を実現する方法。
（項目４）
対象の炎症および／または損傷組織において細胞送達および定着を増大する方法であって、
Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を前記炎症および／または損傷組織へ直接注射するまたはその上／中に配置するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、
前記注射／配置が、前記標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
（項目５）
対象の標的組織への細胞送達、定着および／または生着を増大する方法であって、
前記対象の血管系を通じてＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、
前記投与が、前記標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
（項目６）
対象において標的組織内での細胞集団の付着、定着および／または生着を増大する方法であって、
Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を前記標的組織に直接注射するまたは前記標的組織上へ配置するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、
前記注射が、前記標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われ、
前記集団が、前記細胞の天然集団と比較して増大された標的組織定着を実現する方法。（項目７）
対象における炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害、または病状を処置する方法であって、
前記対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、
前記注射が、前記炎症および／または損傷組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または前記炎症および／または損傷組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
（項目８）
対象において腫瘍／悪性疾患を処置する方法であって、
前記対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、
前記投与が、腫瘍／悪性細胞を保有している組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または腫瘍／悪性細胞を保有している前記組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
（項目９）
対象における炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害、または病状の処置用医薬の製造に使用するためのＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団であって、前記処置が、前記対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の前記集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、
前記処置が、前記集団を前記炎症および／または損傷組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致してならびに／または前記炎症および／もしくは損傷組織内の白血球の蓄積と一致して投与するステップを含む、集団。
（項目１０）
腫瘍／悪性疾患の処置用医薬の製造に使用するためのＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団であって、前記処置が、対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の前記集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、
前記処置が、前記集団を前記腫瘍／悪性組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または前記腫瘍／悪性組織内の白血球の蓄積と一致して投与するステップを含む、集団。
（項目１１）
前記細胞投与が、前記標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現、およびＬ−セレクチンを有する白血球の浸潤と一致して行われる、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目１２）
前記投与／注射が、ある／前記炎症および／または損傷組織への白血球の浸潤の間に行われる、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目１３）
ある／前記炎症および／または損傷組織の環境における、前記投与された細胞の集団の生着をさらに含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目１４）
免疫調節効果が、ある／前記炎症および／または損傷組織における細胞の定着により実現される、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目１５）
組織修復効果が、ある／前記炎症および／または損傷組織における投与された細胞の定着により実現される、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目１６）
増大された宿主防御／免疫応答効果が、ある／前記炎症および／または損傷組織における投与された細胞の送達および定着により実現される、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目１７）
抗悪性効果が、ある／前記腫瘍／悪性組織部位における投与された細胞の定着により実現される、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目１８）
前記投与／注射が、前記細胞集団の１回または一連の注射を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目１９）
前記投与／注射が、前記細胞集団の毎日、毎週、隔週、毎月または毎年の注射を含む、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
（項目２０）
前記対象における事前投与／注射の免疫調節効果が低下したら、前記細胞集団を１回または複数回追加で投与／注射するステップをさらに含む、項目１から９のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
（項目２１）
前記細胞集団が、静脈内投与／注射される、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
（項目２２）
前記細胞集団が、前記炎症および／または損傷組織への直接注射により投与される、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
（項目２３）
前記細胞集団が、前記炎症組織および／または損傷組織上に配置される、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
（項目２４）
前記細胞集団が、ある／前記炎症組織および／または損傷組織上に配置される、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
（項目２５）
前記細胞集団が、他の促進剤、抗炎症剤、または組織骨格／移植可能なデバイス／ゲルと組み合わせて利用される、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
（項目２６）
細胞の前記集団が、Ｅ−セレクチンリガンドおよびＬ−セレクチンリガンドを発現する、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目２７）
前記Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドが、造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）、神経細胞接着分子Ｅ−セレクチンリガンド（ＮＣＡＭ−Ｅ）、ＣＤ４３Ｅ、ＣＬＡおよびＥＳＬ−１のうちの１つまたは複数から選択される、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目２８）
前記Ｅ−セレクチンリガンドが、造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）および／または神経細胞接着分子Ｅ−セレクチンリガンド（ＮＣＡＭ−Ｅ）である、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目２９）
前記Ｅ−セレクチンリガンドが、ＨＣＥＬＬである、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目３０）
前記Ｅ−セレクチンリガンドが、ＮＣＡＭ−Ｅである、項目１から２９のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目３１）
前記Ｌ−セレクチンリガンドが、ＨＣＥＬＬである、項目１から３０のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目３２）
前記細胞集団が、上皮、内皮、ニューロン、脂肪、心臓、骨格筋、繊維芽および免疫細胞（例えば、樹状細胞、単球、マクロファージ、白血球［例えば、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球などのリンパ球、または調節性リンパ球（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋）などのＴリンパ球のサブセット］、細胞傷害性リンパ球、等）、肝、脾、肺、循環血液細胞、血小板、生殖細胞、消化管、腎臓、骨髄、膵臓細胞、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、組織幹／前駆細胞［例えば、神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞］、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞、または誘導多能性幹細胞、または胚性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞から得られる分化した前駆細胞、または成体幹細胞から得られる分化した前駆細胞、または任意の組織（例えば、脳、肝臓、肺、腸、胃、脂肪、筋肉、精巣、子宮、卵巣、皮膚、脾臓、内分泌器および骨）から単離される初代細胞、または培養により増大された前駆細胞集団、または培養により増大された幹細胞集団、または培養により増大された初代細胞集団のうちの１つまたは複数を含む、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目３３）
前記細胞集団が、間葉系幹細胞、造血幹細胞、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞または胚性幹細胞である、項目１から３２のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目３４）
前記細胞集団が、白血球（例えば、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球などのリンパ球、または調節性リンパ球［ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋］、細胞傷害性Ｔ細胞等などのＴリンパ球のサブセット等）である、項目１から３３のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目３５）
前記疾患、障害または病状が、直接的な組織傷害（例えば、熱傷、外傷、褥瘡性潰瘍等）、虚血／血管事象（例えば、心筋梗塞、脳卒中、ショック、出血、凝血障害等）、感染症（例えば、蜂巣炎、肺炎、髄膜炎、敗血症、ＳＩＲＳ等）、異常増殖（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、リンパ腫、白血病等）、免疫学的／自己免疫症状（例えば、移植片対宿主疾患、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸疾患、紅斑性狼蒼、関節リウマチ、乾癬等）、変性疾患（例えば、骨粗鬆症、変形関節炎、アルツハイマー病等）、先天的／遺伝的疾患（例えば、表皮水疱症、骨形成不全症、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ハンチントン舞踏病等）、薬物副作用（例えば、薬物により誘導される肝炎、薬物により誘導される心傷害等）、毒性傷害（例えば、放射線被曝、化学的曝露、アルコール性肝炎、アルコール性膵炎、アルコール性心筋障害、コカイン心筋症等）、代謝異常（例えば、尿毒症性心膜炎、代謝性アシドーシス等）、医原性症状（例えば、放射線により誘導される組織傷害、手術関連合併症等）および／または特発性の過程（例えば、筋萎縮側索硬化、パーソネイジ−ターナー症候群等）のうちの１つまたは複数である、項目１から３４のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目３６）
前記疾患、障害または病状が、糖尿病である、項目１から３５のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目３７）
前記疾患、障害または病状が、多発性硬化症である、項目１から３６のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目３８）
前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシである、項目１から３７のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目３９）
前記対象がヒト患者である、項目１から３８のいずれか一項に記載の方法または集団。（項目４０）
前記細胞集団が、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドが強制発現された修飾細胞集団を形成するように処理され、前記細胞集団が、前記処理の２４時間後に少なくとも７０％の生存率を有する、項目１から３９のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目４１）
前記細胞集団が、前記処理の２４時間後に少なくとも８０％の生存率を有する、項目１から４０のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目４２）
前記細胞集団が、前記処理の４８時間後に少なくとも７０％の生存率を有する、項目１から４０のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目４３）
対象へ前記細胞集団を投与すると、前記細胞集団が浸潤白血球を含む組織中に付着する、項目１から４２のいずれか一項に記載の方法または集団。
（項目４４）
前記投与が、前記組織への直接注射または前記組織上への配置である、項目４３に記載の方法または集団。
（項目４５）
前記投与が血管に対してである、項目４３に記載の方法または集団。
（項目４６）
前記集団が、末梢血管アクセスまたは中心血管アクセスのいずれかによって全身的に投与される、項目１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
（項目４７）
前記集団が、カテーテルに基づく手法、または対象とする部位に血管への細胞のボーラスを送達し得る他の血管アクセスデバイスを使用して、前記対象とする組織部位の解剖学的栄養血管内に血管内投与される、項目１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
（項目４８）
前記集団が、脊柱管および／または脳室内への導入により投与される、項目１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
（項目４９）
前記集団が、カテーテルに基づく手法または直接注射のいずれかにより体腔へと直接投与される、項目１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
（項目５０）
前記集団が、血管内手法もしくは経皮手法のいずれかを使用して局所組織直接注射により、もしくは解剖学的に到達可能な組織部位へ直接、および／または画像技術による誘導で投与される、項目１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。（項目５１）
前記集団が、関連する組織表面／部位への直接配置により投与される、項目１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
（項目５２）
前記集団が、骨格内に投与され、もしくは組織中に配置された骨格内に埋め込まれ、そして／またはゲル中にて投与され、そして／または促進剤と一緒に投与される、項目１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
（項目５３）
前記集団が、脳脊髄液へ投与される、項目１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１（Ａ）〜図１（Ｄ）は、マウス間葉系幹細胞（ＭＳＣ）によるＥ−セレクチンリガンド発現におけるエクソフコシル化（Exofucosylation）（ＦＴＶＩ処理）の効果を示す。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６骨髄に由来するＭＳＣは、ＣＤ４５の発現を欠き、特徴的マウスＭＳＣマーカーであるＳｃａ−１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現する。ＭＳＣは元々、ｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２およびＥ−セレクチン−Ｉｇキメラ（ｍＥ−Ｉｇ）（アイソタイプ（istoype）＝赤色および抗体＝青色）との反応性を欠く。（Ｂ）フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＴＶＩ）修飾されたＭＳＣ（実線）は、ｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２が陽性に染色され、ｍＥ−Ｉｇと反応性であった。ブロメラインおよびプロテイナーゼＫによるＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの消化（網掛けヒストグラム）は、マウスＥ−セレクチン−Ｉｇキメラ（ｍＥ−Ｉｇ）反応性を有意に低減させたが、ＨＥＣＡ４５２染色を低減させず、ブロメライン感受性糖タンパク質が、グリカン修飾された（すなわち、ＦＴＶＩ処理された）ＭＳＣ上の主要なＥ−セレクチンリガンド（単数または複数）として働くことを示す。破線は、染色対照（ＨＥＣＡ４５２染色に対してはアイソタイプ対照であり、ｍＥ−Ｉｇ染色に対してはＥＤＴＡによるカルシウムキレート化）を表す。（Ｃ）未修飾ＭＳＣ（−）およびＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣ（＋）の細胞溶解物のＨＥＣＡ４５２（左）およびｍＥ−Ｉｇ（右）反応性のウェスタンブロット解析。ＦＴＶＩ修飾は、ほぼ１００ｋＤａのダブレット糖タンパク質バンドにおいて優勢にＨＥＣＡ４５２およびｍＥ−Ｉｇ反応性部分を誘導した。（Ｄ）ＦＴＶＩ修飾（＋）または未修飾（−）ＭＳＣ由来の均等量の細胞溶解物からＣＤ４４を免疫沈降した。次に、免疫沈降物を電気泳動し、ＣＤ４４（ｍＡｂ  ＫＭ１１４およびＩＭ７；左）およびＨＥＣＡ４５２（右）によりブロットした。
【００２６】
【図２】図２は、ＴＮＦ−α処理したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）へのＦＴＶＩ修飾および未修飾野生型ＭＳＣ附着性の平行平板型フローチャンバー（parallel  plate  flow  chamber）アッセイを示す。ＦＴＶＩ修飾は、０．５ダイン／ｃｍ２においてＨＵＶＥＣへのＭＳＣ接着を顕著に改善し、結合は、２０ダイン／ｃｍ２を超えた剪断応力において明らかである。抗Ｅ−セレクチン（抗ＣＤ６２Ｅ）機能遮断ｍＡｂによるＨＵＶＥＣの処理は、ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣのローリング接着性相互作用を、未修飾ＭＳＣのものと同様のレベルまで低減した。同様に、ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣのシアリダーゼ処理によるｓＬｅｘ決定基の除去は、接着を未修飾ＭＳＣと等価なレベルまで低減した。
【００２７】
【図３】図３（Ａ）〜図３（Ｃ）は、新たな発症の糖尿病ＮＯＤマウスの高血糖に対する未修飾およびＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの静脈内投与の効果を示す。（Ａ）ＰＢＳを注射した高血糖性ＮＯＤ（未処置対照）は、高血糖の回復を示さなかった（６００ｍｇグルコース／ｄＬを上回るグルコースレベル）。未修飾ＭＳＣの注入（Ｂ）と比較して、ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの注入（Ｃ）は、正常血糖へと復帰したマウスの数および糖尿病回復の耐久性の著しい増加をもたらした。Ｘ軸における矢印は、ＭＳＣ注入の日を表示する。
【００２８】
【図４】図４（Ａ）〜図４（Ｈ）は、膵臓におけるＥ−セレクチンの発現およびＭＳＣの局在化を評価するための、膵島の免疫蛍光染色を示す。図４（Ａ）および図４（Ｂ）：（Ａ）糖尿病抵抗性ＢＡＬＢ／ｃマウスおよび（Ｂ）ＮＯＤマウスの膵島を、インスリン（緑色）およびＥ−セレクチン（赤色）の発現に関して染色した。膵島は、破線によって境界を画定する。ＢＡＬＢ／ｃ（Ａ）と比較して、ＮＯＤマウス（Ｂ）は、膵島炎によるインスリン産生縮小を示す。図４（Ｃ）〜図４（Ｇ）において、ＭＳＣ処置ＮＯＤマウス由来の膵臓のクリオスタット切片をＤＡＰＩ（青色）で染色した。図４（Ｃ）および図４（Ｄ）：ＮＯＤ膵臓の連続切片の染色は、内皮マーカーＣＤ３１（Ｃ）およびＥ−セレクチン（Ｄ）の同時局在化を実証し、膵島周囲内皮細胞上のＥ−セレクチンの存在を確認する。図４（Ｅ）：ＤＡＰＩ（青色）、Ｔ細胞マーカーＣＤ３（緑色）およびインスリン（赤色）によるＮＯＤ膵島の同時染色（Ｅ）は、膵島の周縁部における特徴的Ｔ細胞浸潤を明らかにする。図４（Ｆ）および図４（Ｇ）：浸潤ＭＳＣ（ＦＩＴＣコンジュゲート抗ｓＬｅｘ  ｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２により可視化；緑色）、膵島（Ｆ）（ＡＰＣコンジュゲート抗インスリンｍＡｂによって可視化；赤色）およびＥ−セレクチン発現微小血管（Ｇ）（ＰＥコンジュゲート抗Ｅ−セレクチンｍＡｂにより可視化；赤色）を染色したクリオスタット切片の免疫蛍光像。染色は、膵島周囲区域におけるＥ−セレクチン発現微小血管に近接した、およびリンパ球性浸潤物（すなわち、Ｌ−セレクチンを特徴的に発現する細胞）の区域内でクラスター形成した、膵島炎のゾーンにおけるＨＥＣＡ４５２＋ＭＳＣを識別する。図４（Ｈ）：ＮＯＤおよびＢＡＬＢ／ｃ宿主へと静脈内投与されたＭＳＣの膵臓浸潤。ＮＯＤマウスの膵臓へのＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの蓄積は、未修飾ＭＳＣのものと比較して３倍多かったが（ｐ＜０．０１）、膵臓浸潤の差は、ＢＡＬＢ／ｃ宿主において観察されなかった（１群当たりｎ＝３マウス；６０×拡大率にて１群当たり最小で３０視野を計数）。
【００２９】
【図５】図５（Ａ）〜図５（Ｂ）は、ＭＳＣのＦＴＶＩ修飾が、細胞生存または免疫抑制能力に影響を与えないことを示す。（Ａ）ｐＨＲＳＴ−ｈＧＨ形質導入したＦＴＶＩ修飾または未修飾ＭＳＣによる注射後の異なる時点のＮＯＤマウスの血清において、同様のレベルのｈＧＨが検出された。（Ｂ）ＦＴＶＩ修飾および未修飾ＭＳＣは、ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激したＮＯＤ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を等しく抑制し、グリカン修飾が、リンパ球増殖を抑制するＭＳＣ能力を増加させないことを示す。
【００３０】
【図６】図６（Ａ）〜図６（Ｄ）は、ＣＤ４４発現の欠如が、全身投与されたＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの抗糖尿病効果を抑止することを示す。（Ａ）未修飾野生型ＭＳＣ（図３Ｂ）と比較して、ＣＤ４４欠損ＭＳＣの投与は、中程度の抗糖尿病効果を示す。未修飾ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣを与えた（７匹のうち）１匹のＮＯＤマウスのみが、高血糖の回復を示したが、これは一過性であり（ほぼ３０日目に糖尿病再発）、７匹の糖尿病ＮＯＤマウスのうち６匹は、高血糖性のままであった。（Ｂ）ＦＴＶＩ修飾野生型ＭＳＣを与えたマウスの結果（図３Ｃ）と比較して、ＦＴＶＩ修飾ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣの投与は、最小の抗糖尿病効果を付与し、６匹のＮＯＤマウスのうち１匹のみが、高血糖の回復を示す。（Ｃ）ＮＯＤ膵臓におけるＭＳＣの蓄積は、未修飾ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣを与えたマウス（黒いバー）と比較して、ＦＴＶＩ修飾ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣを与えたマウス（白いバー）において異なることなく（ｐ＜０．０１）、各事例において、未修飾ＭＳＣを与えた場合と同様であった（図４Ｈ）。×６０拡大率においてＭＳＣ浸潤を定量化した。（Ｄ）ＦＴＶＩ修飾および未修飾ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣは両者共に、免疫抑制能力を保持し、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞刺激アッセイにおいてＴ細胞増殖を同様に弱める。
【００３１】
【図７】図７は、マウス骨髄由来ＭＳＣの特徴付けを示す。ＭＳＣは、骨細胞、脂肪細胞および軟骨細胞に分化した（×２００拡大率）。
【００３２】
【図８】図８は、ＣＤ４４−／−ＭＳＣのＦＴＶＩ修飾が、野生型（ＷＴ）ＭＳＣと同様の、ＨＥＣＡ４５２反応性の増加をもたらすことを示す。未修飾ＭＳＣ（点線）は、ＨＥＣＡ４５２との反応性を示さないが、ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣ（実線）およびＦＴＶＩ修飾されたＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣ（灰色で塗った部分）は、ＨＥＣＡ４５２による同様のレベルの染色を示し、エクソフコシル化が、ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣにおける代替（すなわち、非ＣＤ４４）骨格にシアロフコシル化（sialofucosylated）エピトープを生じることを示す。
【００３３】
【図９Ａ】図９（Ａ）〜図９（Ｂ）は、神経幹細胞（ＮＳＣ）が、Ｅ−セレクチンリガンドを欠くが、多数の他の細胞表面接着分子を発現することを示す。（Ａ）ＮＳＣ上のＨＥＣＡ４５２、ＫＭ９３、ＣＳＬＥＸ−１、Ｅ−セレクチンリガンド（Ｅ−セレクチン−Ｉｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）に結合）およびＰ−セレクチンリガンド（Ｐ−セレクチン−Ｉｇキメラ（Ｐ−Ｉｇ）結合）発現のフローサイトメトリー解析。対応するアイソタイプ対照は、調査した抗体毎に重複するシグナルを示した、すなわち、ラットＩｇＭ（ＨＥＣＡ−４５２に対する；ＭＦＩ：１．９）、マウスＩｇＭ（ＫＭ９３およびＣＳＬＥＸ−１に対する；ＭＦＩ：２．７）およびヒトＩｇＧ１（Ｅ−ＩｇおよびＰ−Ｉｇに対する；ＭＦＩ：３．５）。典型的なＥ−Ｉｇ結合プロファイルを表すヒストグラムプロットは、細胞の９９％超が、フコシルトランスフェラーゼＶＩによる細胞表面処理によるグリコシルトランスフェラーゼプログラム化立体置換（glycosyltransferase-programmed  stereosubstitution）（ＧＰＳ）後に、Ｅ−Ｉｇ結合を一貫して発現することを図解する。（Ｂ）ＣＤ４３（Ｓ７および１Ｂ１１）、ＰＳＧＬ−１（２ＰＨ１、４ＲＡ１０）、ＣＤ４４（ＩＭ７、ＫＭ１１４）、ＮＣＡＭ、ＰＳＡ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ２９、ＬＰＡＭ−１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８およびＣＸＣＲ４のフローサイトメトリー解析。点線はアイソタイプ対照であり、黒い線は特異的抗体である。表示されている全結果は、ＮＳＣにおいて行われたｎ＝５フローサイトメトリー実験の代表である。
【図９Ｂ】同上
【００３４】
【図１０Ａ】図１０（Ａ）〜図１０（Ｃ）は、ＮＳＣのＧＰＳ処理（すなわち、ＦＴＶＩ処理によるα（１，３）−エクソフコシル化）が、その一部がグリコシルホスファチジルイノシトール（glycophosphatidylinositol）（ＧＰＩ）結合している、主に糖タンパク質上でシアロフコシル化を生じることを示す。（Ａ）ＢＴ−ＮＳＣ（黒いバー）およびＧＰＳ−ＮＳＣ（灰色のバー）上のＨＥＣＡ４５２、ＣＤ１５、ＫＭ９３、ＣＳＬＥＸ１、Ｅ−ＩｇおよびＰ−Ｉｇ反応性のフローサイトメトリー解析。調査した抗体毎に対応するアイソタイプ対照を次に示す：ラットＩｇＭ（ＨＥＣＡ−４５２に対する；ＭＦＩ：１．８）、マウスＩｇＭ（ＣＤ１５、ＫＭ９３およびＣＳＬＥＸ−１に対する；ＭＦＩ：１．９）およびヒトＩｇＧ１（Ｅ−ＩｇおよびＰ−Ｉｇに対する；ＭＦＩ：３．２）。表示されている結果は、５回の別々の実験の代表である。（Ｂ）ＧＰＳ処理に先立ち未消化（黒いバー）またはブロメラインで消化した（灰色のバー）ＧＰＳ−ＮＳＣのＨＥＣＡ４５２反応性のフローサイトメトリー解析。値は、平均±ＳＥＭである（各群ｎ＝３）。（Ｃ）未消化（黒いバー）またはホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）で消化してＧＰＩアンカーを切断した（灰色のバー）ＧＰＳ−ＮＳＣのＨＥＣＡ４５２反応性のフローサイトメトリー解析。値は、平均±ＳＥＭである（各群ｎ＝３）。
【図１０Ｂ】同上
【図１０Ｃ】同上
【００３５】
【図１１Ａ】図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）は、ＮＳＣのＧＰＳ処理が、ＨＣＥＬＬおよびＮ−ＣＡＭ−Ｅに対応する１００、１２０および１４０−ｋＤａの一過性Ｅ−セレクチンリガンドを生じることを示す。（Ａ）ＧＰＳ処理（ＧＰＳ）またはバッファー処理した（ＢＴ）ＮＳＣ由来の等価量の細胞溶解物から、ＣＤ４４を免疫沈降した（ＣＤ４４に対するＩＭ７およびＫＭ１１４  ｍＡｂにより）。ＮＳＣの免疫沈降物および免疫沈降物由来の上清（ＳＮ）においてウェスタンブロット解析を行い、これらを電気泳動し、ＨＥＣＡ４５２、Ｅ−ＩｇおよびＣＤ４４によりブロットした。（Ｂ）ＰＮＧａｓｅＦで処理した（＋）または処理しなかった（−）、ＧＰＳ処理（＋）またはバッファー処理した（−）ＮＳＣ由来の均等量の細胞溶解物から、Ｎ−ＣＡＭを免疫沈降した（Ｎ−ＣＡＭ  １３により）。次に、免疫沈降物を電気泳動し、Ｅ−ＩｇおよびＮ−ＣＡＭによりブロットした。Ｃａ２＋の存在下でＥ−Ｉｇによる染色を行った。（Ｃ）０日目にＧＰＳでＮＳＣを処理し、通常の成長培地においてさらに３日間培養した。２４時間毎に、細胞のアリコートを取り出し、フローサイトメトリーによってＥ−セレクチンリガンド活性に関してアッセイした。図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）、図１２（Ａ）〜図１２（Ｂ）および図１３（Ａ）〜図１３（Ｆ）も参照されたい。
【図１１Ｂ】同上
【図１１Ｃ】同上
【００３６】
【図１２Ａ】図１２（Ａ）〜図１２（Ｂ）は、ＧＰＳ−ＮＳＣが、規定の剪断応力条件下で、内皮Ｅ−セレクチンとの顕著に増大された剪断抵抗性接着性相互作用を有することを示す。（Ａ）１．０ｄｙｎ／ｃｍ２で、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α刺激ＨＵＶＥＣ上にＢＴ−ＮＳＣまたはＧＰＳ−ＮＳＣを灌流した。次に、剪断応力１、２、４、８、１６、２５および３２ｄｙｎ／ｃｍ２におけるＮＳＣ蓄積を決定した。ＧＰＳ−ＮＳＣは、最大３２ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断応力でＨＵＶＥＣにおけるローリング接着性相互作用を示す。ＧＰＳ−ＮＳＣの結合の特異性の対照とするために、接着アッセイにおける使用前に、アッセイバッファーにＥＤＴＡを添加した（ＥＤＴＡ群）か、または刺激されたＨＵＶＥＣをＥ−セレクチンに対する機能遮断ｍＡｂで前処理した（抗Ｅ−Ｓｅｌ群）。値は、平均±ＳＥＭである（各群ｎ＝４）。全剪断応力レベルにおける他の全群に対するＧＰＳ−ＮＳＣの比較に関して、Ｐ≦０．００１。（Ｂ）０．６ダイン／ｃｍ２におけるＮＳＣのＨＥＣＡ−４５２反応性膜糖タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロット上に灌流したＣＨＯ−Ｅ細胞の、ブロットローリングアッセイの接着棒グラフ（ローリング細胞／ｍｍ２）。アッセイを行う前に、ＢＴ−ＮＳＣ（黒いバー）およびＧＰＳ−ＮＳＣ（灰色のバー）の両方由来のＣＤ４４／ＨＣＥＬＬおよび汎ＮＣＡＭの免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＨＥＣＡ−４５２に対してブロットした。膜糖タンパク質へのＣＨＯ−Ｅ結合の特異性の対照とするために、接着アッセイにおける使用前に、ＣＨＯ−Ｅ細胞を含有するバッファーにＥＤＴＡを添加した；この条件下で細胞結合は見られなかった（データ図示せず）。提示されている結果は、ＮＳＣの複数の（ｎ＝３）膜調製物のＨＥＣＡ−４５２ブロットにおける複数のラン（ｎ＝４）の代表である。
【図１２Ｂ】同上
【００３７】
【図１３−１】図１３（Ａ）〜図１３（Ｆ）は、ＧＰＳ−ＮＳＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏのＥＡＥモデルにおいて改善されたホーミングを示すことを示す。（Ａ〜Ｄ）ＧＰＳ−ＮＳＣは、ＢＴ−ＮＳＣよりも効率的に、ＣＮＳ実質へと遊走する。１×１０６個のＧＰＳ−ＮＳＣまたはＢＴ−ＮＳＣをＰＫＨ２６色素で標識し、免疫化後（ＰＩ）９日目および１３日目にＭＯＧ誘導ＥＡＥマウスへと静脈内注射した。（Ａ）ＢＴ−ＮＳＣまたはＧＰＳ−ＮＳＣのいずれかを与えたＥＡＥマウスの前脳の解析（ＰＩ  １７日目）は、ＧＰＳ−ＮＳＣと比較してＢＴ−ＮＳＣを注射した動物において、より少ない数のＰＫＨ２６陽性細胞が見られたことを明らかにした。黄色の矢じりはＮＳＣを示し、白色の矢印は浸潤を示す。白色の破線は、髄膜境界を示す。図２０（Ａ）〜図２０（Ｂ）は、ＮＳＣ（ＰＫＨ２６；赤色）が、Ｆｌｋ−１血管（緑色）の外側に位置し、これが、ＳＯＸ−２陽性（緑色）であることを確認するために、これらの切片のさらなる解析を示す。（Ｂ）腰部仙髄（インサート）をＰＩ  １７日目に収集した。ＰＩ  １７日目に、ＢＴ−ＮＳＣよりも多くのＧＰＳ−ＮＳＣが、血管から脊髄実質へと遊走した。Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ２；緑色）染色によって血管を可視化した。脊髄実質の縁は、白色の点線により強調されている。ＰＫＨ２６色素により標識されたＮＳＣは赤色で示し、ＴＯ−ＰＲＯ−３で対比染色した核は青色である。ＷＭ、白質。Ｖ、血管。（Ｃ）挿入図は、Ａにおける矢印によって示される遊走したＮＳＣの三次元（dimentional）表示を示す。（Ｄ）ＰＩ  １７日目の脊髄区域当たりの２００×遊走当たりのＢＴ−ＮＳＣおよびＧＰＳ−ＮＳＣの数の定量化を決定した。ＢＴ−ＮＳＣを上回る遊走するＧＰＳ−ＮＳＣの数の有意な増加が明らかであった、＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＮＳＣの体内分布の定量化。ＧＰＳ−ＮＳＣ（灰色のバー）またはＢＴ−ＮＳＣ（黒いバー）をＣＦＤＡ−ＳＥで標識し、免疫化後９日目および１３日目にＭＯＧ処理Ｃ５７ＢＬ６マウスへと静脈内注射した。最後の注射から１６時間後に脳、リンパ節、脾臓、肝臓および肺を解析して、ＮＳＣを表す規定のゲート内に存在するＣＦＳＥ陽性細胞のパーセンテージを決定した。ＧＰＳ−ＮＳＣまたはＢＴ−ＮＳＣを与えた非ＥＡＥマウスを使用して、検査した各組織において観察されるシグナルを標準化した。細胞を与えなかったマウスを使用して、バックグラウンドシグナルを決定した。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。データは、１群当たり１０匹のマウスを検査した２回の別々の実験の代表である。（Ｆ）エクソフコシル化ＮＳＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏの脾臓においてＣＤ４  Ｔ細胞と密接に接触して見出されたことのｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点実証（ＮＳＣは、ピンク色に標識され、ＣＤ４  Ｔ細胞は緑色で示す）；ＮＳＣおよびリンパ球のこのような同時局在化は、リンパ球Ｌ−セレクチンへのＮＳＣ  ＨＣＥＬＬ結合によって生じるであろう。
【図１３−２】同上
【図１３−３】同上
【００３８】
【図１４−１】図１４（Ａ）〜図１４（Ｉ）は、ＧＰＳ−ＮＳＣが、神経保護増大によりＥＡＥ症状の有意な寛解に寄与することを示す。（Ａ）０日目にＭＯＧ  ３５−５５により免疫化し、その後、免疫化後９日目および１３日目に、１×１０６個のＧＦＰ標識したバッファー処理ＮＳＣ（ＢＴ−ＮＳＣ；赤色で塗った三角形；ｎ＝３０）、ＧＰＳ処理ＮＳＣ（ＧＰＳ−ＮＳＣ；緑色で塗った丸；ｎ＝３０）を注射したＣ５７ＢＬ／６マウスまたは偽処置マウス（ＮＳＣなし；黒色で塗った丸；ｎ＝３０）におけるＥＡＥ臨床スコアを決定した。ＧＰＳ−ＮＳＣを与えたマウスは偽処置マウス（ｐ＝０．０００１）およびＢＴ−ＮＳＣをｉ．ｖ．注射したマウス（ｐ＝０．００６）と比較して、著明な臨床改善を呈示した。（Ｂ）（Ａ）における曲線の傾きを比較する線形回帰解析を行うことにより、疾患の累積的負担を評価した。これらのデータは、ＧＰＳ−ＮＳＣ（緑色の点線）が、ＢＴ−ＮＳＣ（赤い線）を上回って臨床スコアを有意に改善することを強調する。ＧＰＳ−ＮＳＣまたはＢＴ−ＮＳＣのいずれかを与えたマウスは、ＮＳＣを与えなかったマウス（ＮＳＣなし；黒い線）と比較して、有意に改善された臨床スコアを呈示した。これらのデータは、ＢＴ−ＨＳＰＣ（青い線）およびＧＰＳ−ＨＳＰＣ（紫の線）が、疾患を悪化させたことも示唆する（図２１（Ｃ）を参照）。（Ｃ）抗ＣＤ１１ｂ  ｍＡｂ（緑色）および核標識Ｔｏ−Ｐｒｏ３（青色）で染色することにより、ＮＳＣを注射したＥＡＥマウス由来の脳のＰＩ  ３０日目における神経病理学を解析した。ＧＰＳ−ＮＳＣ注射は、３個の異なる脊髄の２０枚の異なる切片由来のＣＤ１１ｂマクロファージ／マイクログリアの数表現によって測定される、脳切片当たりの有意に少ない傷害をもたらす。棒グラフは、ＮＳＣなし、ＢＴ−ＮＳＣまたはＧＰＳ−ＮＳＣを与えたＥＡＥマウス由来の高倍率視野（ＨＰＦ）当たりの脊髄切片におけるＣＤ１１ｂマクロファージ／マイクログリアの数表現を描写し、また、Ｔｏ−Ｐｒｏ３染色に基づき、ＨＰＦ当たりの浸潤の数表現を計算した。白色のボックスは、より高拡大率の像に対応する。黄色の矢じりは、活性化されたマイクログリアに対応し、白色の矢印は、髄膜（ｍ）における浸潤に対応する。ＮＳＣなし試料におけるマイクログリアが、ＢＴ−ＮＳＣおよびＧＰＳ−ＮＳＣ試料に見出されるものよりも活性化されていることに留意されたい。また、髄膜における浸潤のサイズは、ＮＳＣなし試料において、ＢＴ−ＮＳＣ試料のものよりも大きかった。上パネルはスケールバー、１００μｍ。下パネルはスケールバー、５０μｍ。（Ｄ）ＮＳＣなし（ＥＡＥ  ＮＳＣなし）、ＢＴ−ＮＳＣ（ＥＡＥ  ＢＴ−ＮＳＣ）またはＧＰＳ−ＮＳＣ（ＥＡＥ  ＧＰＳ−ＮＳＣ）のいずれかを与えたマウス由来の３個の別々の脳の２０枚の異なる切片を、ＣＤ４（Ｔ細胞浸潤を測定するため）、ＣＮＰａｓｅ（再ミエリン化細胞を定量化するため）、Ｏｌｉｇ−２（オリゴデンドログリア分化を測定するため）またはＳＯＸ−９（神経前駆体の多分化能を測定するため）（緑色）およびＴｏ−Ｐｒｏ３（青色）で染色することにより、ＮＳＣを注射したＥＡＥマウス由来の脳の神経病理学を解析した。ＧＰＳ−ＮＳＣ注射は、有意に少ないＴ細胞浸潤、増大された再ミエリン化、より多い数のオリゴデンドログリアおよび前駆数の保存をもたらす。（Ｅ）棒グラフは、ＮＳＣなし、ＢＴ−ＮＳＣまたはＧＰＳ−ＮＳＣ（（Ｄ）に概要を述べた）を与えたＥＡＥマウス由来の高倍率視野（ＨＰＦ）当たりの脳切片におけるＣＤ４  Ｔ、ＣＮＰａｓｅ、Ｏｌｉｇ２、ＳＯＸ−９細胞の数表現を描写し、ＧＰＳ−ＮＳＣを与えた動物が、前駆細胞の神経保護増大を呈示することを示す。（Ｆ〜Ｉ）ＧＰＳ−ＮＳＣおよびＢＴ−ＮＳＣ注射は、５００回を超える個々の測定におけるＧＡＰ４３ピクセル強度の定量的共焦点イメージングによって評価される、増加したＧＡＰ−４３（緑色；ｐ＜０．００１）染色（Ｆ）およびモノクローナル抗体ＳＭＩ３２（赤色；ｐ＜０．００１）による減少した染色（Ｈ）によって測定される通り、ＮＳＣなし対照と比較して、増加した軸索再生および軸索保護をもたらす。Ｔｏ−Ｐｒｏ３染色色素を使用して、細胞核（青色）を検出した。（Ｇ、Ｈ）ピクセル強度の５００回を超える個々の測定の定量的共焦点イメージングに基づき（Imitola,  J.、Cote,  D.ら、２０１１年）、ＧＡＰ−４３（Ｇ）およびＳＭＩ３２（Ｉ）のグラフ表示を決定した；ＳＭＩ３２パターン（Ｉ）が、ＥＡＥを有する動物における軸索卵形を実証したが、ＮＳＣを注射した動物における低減（Ｉ）およびＳＭＩ３２ピクセル強度は、ＧＰＳ−ＮＳＣによる動物における軸索統合性の漸進的補正を示したことに留意されたい。（Ｉ）の下の絵に描写される通り、対照およびＢＴ−ＮＳＣと比較して、軸索卵形および軸索断片の低減が見られる。スケールバーが５０μｍのＳＭＩ３２染色を除いて、スケールバー、１００μｍ。
【図１４−２】同上
【図１４−３】同上
【図１４−４】同上
【図１４−５】同上
【図１４−６】同上
【図１４−７】同上
【００３９】
【図１５】図１５は、炎症性サイトカイン処理が、マウスＮＳＣにおけるセレクチンリガンド発現を誘導しないことを示す。１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮγにより独立してまたは組み合わせて（全て１０ｎｇ／ｍｌで）ＮＳＣを刺激した。２４時間目に、ＮＳＣを収集し、Ｅ−セレクチン結合に関してフローサイトメトリーによって解析した。対照は、未処理ＮＳＣおよびＫｇ１ａ細胞（Ｅ−セレクチン結合の陽性対照）を含んだ。
【００４０】
【図１６】図１６（Ａ）〜図１６（Ｃ）は、ＨＣＥＬＬが、ある（例示的な）ヒトＮＳＣ系統（ＣＣ−２５９９）におけるＧＰＳ処理によって作製されたＥ−セレクチンリガンドのみであることを示す。（Ａ）ＧＰＳで処理（灰色のバー）またはバッファー処理（ＢＴ；黒いバー）したヒトＮＳＣにおけるＣＤ１５、ＣＳＬＥＸ−１、ＨＥＣＡ４５２およびＥ−セレクチンリガンド（Ｅ−Ｉｇ結合）発現のフローサイトメトリー解析。測定した抗体毎の平均蛍光強度を示す。（Ｂ）ＣＤ４４、ＰＳＧＬ−１、ＮＣＡＭおよびＣＤ４３のフローサイトメトリー解析。（Ｃ）マウスおよびヒト供給源由来のＮＳＣ溶解物のＥ−Ｉｇ反応性のウェスタンブロット解析。ＧＰＳ処理（＋）またはバッファー処理（−）マウスＮＳＣまたはヒトＮＳＣ由来の均等量の細胞溶解物から、ＣＤ４４およびＮＣＡＭを免疫沈降した。次に、免疫沈降物を電気泳動し、Ｅ−Ｉｇによりブロットした。Ｅ−ＩｇによるＧＰＳ処理ＮＳＣの染色は、Ｃａ２＋の存在下で行った。
【００４１】
【図１７】図１７は、ＧＰＳ処理が、ニューロスフェアを形成するＮＳＣの能力に影響しないことを示す。ＧＰＳ処理の直後に７日間、９６ウェルプレートにウェル当たり２００個の生存ＧＦＰ＋ＮＳＣを蒔いた。その結果得られたニューロスフェアを計数し、蒔いた細胞の数で割ったニューロスフェアの数として、ニューロスフェア頻度を計算した。ＢＴ−ＮＳＣおよびＧＰＳ−ＮＳＣの間で、形成されたニューロスフェアの密度またはニューロスフェアの数に統計的有意差はなかった。このような実験に使用したＧＦＰ＋ニューロスフェアの代表的な像を示し、この像において、赤色蛍光はネスチン発現を示し、緑色蛍光はＧＦＰを示す。ＢＴ−およびＧＰＳ−ＧＦＰ＋ＮＳＣが両者共に、等しくニューロスフェアを形成することができたことに留意されたい。この図は、図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）に関係している。
【００４２】
【図１８−１】図１８（Ａ）〜図１８（Ｄ）は、ＧＰＳ処理が、ニューロン（Ａ）、アストロサイト（Ｂ、Ｄ）またはオリゴデンドロサイト前駆体（Ｃ、Ｄ）へのＮＳＣの分化能力に影響しないことを示す。１×１０５個のＢＴ−およびＧＰＳ−ＮＳＣを適切な分化培地において培養し、１２０時間後に、２０×視野当たりのＭＡＰ−２＋ニューロン（Ａ）、ＧＦＡＰ＋アストロサイト（Ｂ、Ｄ）およびＮＧ２＋オリゴデンドロサイト（Ｃ）の数を計数した。これら３系列に沿って分化するＢＴおよびＧＰＳ−ＮＳＣの能力の間に統計的有意差はなかった（ｐ＝０．１）。（Ｄ）ＧＦＡＰ＋アストロサイトおよびＮＧ２＋オリゴデンドロサイトを赤色で示し、Ｔｏ−Ｐｒｏ３を使用して、対照バッファー（ＢＴ）またはＦＴＶＩ（ＧＰＳ）によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理した神経幹細胞の核を染色する。スケールバー、５０μｍ。これらの図は、図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）に関係している。
【図１８−２】同上
【００４３】
【図１９−１】図１９（Ａ）〜図１９（Ｃ）は、ＧＰＳ処理が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＮＳＣの免疫調節機能に影響しないことを示す。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスから単離されたＬＮＣと放射線照射したＮＳＣとを同時培養することにより、リンパ節細胞（ＬＮＣ）におけるＮＳＣの直接的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制効果を測定した。放射線照射されたＢＴ−ＮＳＣおよびＧＰＳ−ＮＳＣの両方が、用量依存的様式でコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に応答して、ＬＮＣへの３Ｈ−チミジン取込み（Ａ）を抑制すると共に、ＥＬＩＳＡによって測定される炎症性サイトカイン産生（Ｂ）も等しい程度まで抑制した；比は、ＮＳＣの数対ＬＮＣの数に対応する（１：４、１：２、１：１、２：１および４：１）。ＬＮＣ単独（第１のバー）と比較して、ＮＳＣ：ＬＮＣの比を増加させることにより、３Ｈ−チミジン取込みの量が有意に減少した（ｐ＝０．０００５）ことに留意されたい。増殖を阻害するＢＴ−ＮＳＣおよびＧＰＳ−ＮＳＣの能力の間に統計的有意差がなかった（ｐ＝０．２）ことにも留意されたい。（Ｃ）ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成に先立ち、炎症性サイトカイン（１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮ−γおよび１５ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α）ありまたはなし、およびＥ−Ｉｇ（５ｎｇ／ｍＬ）ありまたはなしで、１×１０６個のＢＴ−ＮＳＣまたはＧＰＳ−ＮＳＣを２４時間処理した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、２−ΔΔＣＴ方法を使用して計算された遺伝子発現の倍数変化（ＢＴまたはＧＰＳ−ＮＳＣ単独に関する）を明らかにし、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子と比べたＬＩＦ  ｍＲＮＡの相対的発現をアッセイした。値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４回の実験）である。これらの図は、図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）に関係している。
【図１９−２】同上
【図１９−３】同上
【００４４】
【図２０−１】図２０（Ａ）〜図２０（Ｂ）は、ＧＰＳ−ＮＳＣが、ＢＴ−ＮＳＣよりも効率的にＣＮＳ実質へと遊走することを示す。１×１０６個のＧＰＳ−ＮＳＣまたはＢＴ−ＮＳＣをＰＫＨ２６色素で標識し、免疫化後（ＰＩ）９日目および１３日目に、ＭＯＧ誘導性ＥＡＥマウスへと静脈内注射した。ＰＩ  １７日目に脳を収集し、手早く（snap）凍結し、その後に２０μｍ切片を調製し、抗体：抗Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ２；緑色）または抗ＳＯＸ−２（赤色）で染色して、それぞれ血管およびＮＳＣのポジションを明らかにした。（Ａ）ＢＴ  ＮＳＣは主に、ＦＬＫ−１＋内皮細胞と共に局在化する一方、ＧＰＳ−ＮＳＣは、内皮と交差した実質に見出される。これらのＮＳＣは、神経幹細胞のマーカーであるｓｏｘ−２を発現する（Ｂ）。これらの図は、図１３（Ａ）〜図１３（Ｆ）に関係している。
【図２０−２】同上
【００４５】
【図２１Ａ】図２１（Ａ）〜図２１（Ｃ）は、ＧＰＳ処理が、マウスＨＳＰＣにおける頑強なＥ−セレクチンリガンド活性を生じるが、これが、ＥＡＥの寛解に繋がらないことを示す。（Ａ）ＢＴ−およびＧＰＳ−マウス造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ；系列ｎｅｇＣ−ｋｉｔｐｏｓ）におけるＥ−Ｉｇ反応性のフローサイトメトリー解析。ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照、ＢＴ−ＨＳＰＣにおけるＥ−Ｉｇ反応性およびＧＰＳ−ＨＳＰＣにおけるＥ−Ｉｇ反応性の各ヒストグラムの上に平均蛍光強度を示す。これらの細胞を対照として、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＥＡＥ実験に使用した。（Ｂ）０日目にＭＯＧ  ３５−５５により免疫化し、その後、免疫化後９日目および１３日目に１×１０６個のバッファー処理ＨＳＰＣ（ＢＴ−ＨＳＰＣ；青線菱形；ｎ＝３０）、ＧＰＳ処理ＨＳＰＣ（ＧＰＳ−ＨＳＰＣ；紫線菱形；ｎ＝３０）を注射したＣ５７ＢＬ／６マウスまたは偽処置マウス（ＮＳＣなし；黒色で塗った丸；ｎ＝３０）におけるＥＡＥ臨床スコアを決定した。ＢＴ−またはＧＰＳ−ＨＳＰＣのいずれかを与えたマウスにおける臨床スコアの有意な改善は明らかでなかった。（Ｃ）（Ｂ）の曲線の傾きを比較する線形回帰解析を行うことにより、疾患の累積的負担を評価した。これらの図は、図１４（Ａ）〜図１４（Ｈ）に関係している。
【図２１Ｂ】同上
【図２１Ｃ】同上
【００４６】
【図２２】図２２は、ＥＡＥマウスに注射されたＢＴ−またはＧＰＳ−ＮＳＣのいずれからもＰＩ  ３０日目にＧＦＰシグナルの証拠が観察されなかったことを示す。ＭＯＧ  ３５−５５（０日目）による免疫化、また、その後の９日目および１３日目における１×１０６個のバッファー処理ＮＳＣ（ＢＴ−ＮＳＣ）、ＧＰＳ処理ＮＳＣ（ＧＰＳ−ＮＳＣ）または偽処置マウス（ＮＳＣなし）による注射後の３０日後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを屠殺し、ＧＦＰ＋細胞の免疫組織化学検査を行った。ＰＩ  ３０日目に、ＧＦＰに対する抗体（赤色）を内在性ＧＦＰシグナル（ＥＧＦＰ；緑色）と比較した場合であっても、関連する研究群の切片においてＧＦＰ＋細胞は識別されなかった。注射前の培養されたＮＳＣを陽性対照として使用したところ（ＮＳＣ−Ｐｒｅ  Ｔｘ）、頑強なＧＦＰシグナルを示した。スケールバー、５０μｍ。この図は、図１４（Ａ）〜図１４（Ｈ）に関係している。
【００４７】
【図２３】図２３は、ＥＡＥマウスにおける内皮Ｅ−セレクチンに効率的に結合する新規ステップ１エフェクター、ＨＣＥＬＬおよびＮＣＡＭ−Ｅを作製する天然ＮＳＣ表面タンパク質、ＣＤ４４およびＮＣＡＭのＧＰＳ処理によって提供される、神経回復（neurorestoration）のモデルを示す。傷害の結果として、内皮細胞およびグリアは、対照マウスよりも多い数で傷害誘導性ニッチへとＧＰＳ−ＮＳＣを方向付ける傷害シグナル（例えば、ＳＤＦ−１αおよびＥ−セレクチン）を産生することができる。増加した数のＮＳＣが動員されるにもかかわらず、細胞置き換えの代わりに、ＮＳＣは、ＳＯＸ−９＋／Ｏｌｉｇ−２＋オリゴデンドログリアの数を増加させることにより、免疫の局所モジュレーションおよびＣＮＳの内在性再生を提供する。これはその後、より成熟したオリゴデンドログリア細胞（ＣＮＰａｓｅ＋）、少ない軸索損失およびより多くの軸索再生をもたらす。原始的神経幹細胞によって分泌されるニッチ分子は、それらの定着増加によってもたらされる効果のいくつかを促進することができる。
【００４８】
【図２４】図２４は、痩せた対象および肥満対象由来の脂肪由来ＭＳＣのＦＴＶＩＩ処理が、細胞表面上のｓＬｅｘ構造の作製をもたらすことを示す。棒グラフは、脂肪由来ＭＳＣ（痩せたおよび肥満対象に由来するＭＳＣのｎ＝４試料）のα（１，３）−エクソフコシル化後の、ｓＬｅｘ発現（ＨＥＣＡ４５２反応性）のフローサイトメトリー結果（ＭＦＩ、平均±ＳＥＭ）を表示する。
【００４９】
【図２５】図２５は、脂肪由来ＭＳＣの細胞溶解物のウェスタンブロット解析を示す。骨髄（ＢＭ−ＭＳＣ）ならびに痩せたおよび肥満した脂肪組織（Ａ−ＭＳＣ）由来のＭＳＣの溶解物をＦＴＶＩＩによりエクソフコシル化（＋）またはバッファー単独で処理し（−）、続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＨＥＣＡ４５２または抗ヒトＣＤ４４  ｍＡｂによりブロットした。造血細胞株ＫＧ１ａ（対照）および線維芽細胞の細胞株ＰＩＦの溶解物を同時電気泳動し、ブロットした。ＫＧ１ａ細胞は、ＨＣＥＬＬ（ほぼ８０ｋＤａのｍｗのＨＥＣＡ−４５２反応性ＣＤ４４）を発現する。本図に示す通り、ＦＴＶＩＩ処理は、ＰＩＦ細胞ならびに痩せたおよび肥満対象の脂肪組織に由来するＭＳＣ上でＨＣＥＬＬ（ＨＥＣＡ４５２反応性ＣＤ４４）の強制発現をもたらす（上部パネル）；各溶解物におけるＣＤ４４の発現の染色は、ＨＥＣＡ４５２ブロットの下に示す。ＨＣＥＬＬ（ほぼ８０ｋＤａ  ＨＥＣＡ４５２反応性バンド）の発現は、細胞のシアリダーゼ処理後に抑止され（下部パネル）、ＨＣＥＬＬ発現のシアリダーゼ感受性と一貫した（すなわち、ｓＬｅｘの排除）。ＨＣＥＬＬが、ほぼ８０ｋＤａのダブレットとして出現することができ（下部パネルにおけるＦＴＶＩＩ処理Ａ−ＭＳＣのプロファイルを参照）、これが、ＨＣＥＬＬ分子のＥ−セレクチンまたはＬ−セレクチンリガンド活性に影響しないコアＣＤ４４糖タンパク質の可変的グリコシル化を反映することに留意されたい。
【００５０】
【図２６】図２６は、ＴＮＦ刺激ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）上に灌流されたＭＳＣの平行平板型フローチャンバー研究の結果を示す。規定の血行動態剪断条件（ダイン／ｃｍ２、ｘ軸に示す）下で測定される通り、痩せた対象（ＬＡ−ＭＳＣ）および肥満対象（ＯＡ−ＭＳＣ）に由来するＡ−ＭＳＣのα（１，３）−エクソフコシル化（ＦＴＶＩＩ処理）は、ＴＮＦ刺激ＨＵＶＥＣ上に呈示されたＥ−セレクチンに対する強力なＥ−セレクチン結合を付与する；ＦＴＶＩＩ処理（ＨＣＥＬＬ＋）脂肪由来ＭＳＣのＥ−セレクチンリガンド活性は、ＦＴＶＩＩ処理（ＨＣＥＬＬ＋）骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ；下部パネル）のものと等価である。未処理ＭＳＣは、剪断応力レベルのいずれにおいてもＨＵＶＥＣに対する有意な結合相互作用を持たなかった。
【００５１】
【図２７】図２７（Ａ）〜図２７（Ｃ）は、様々な白血球のＥ−セレクチン結合に対するα（１，３）−エクソフコシル化の効果の解析を示す。（Ａ）内皮Ｅ−セレクチン（ＴＮＦ刺激ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）上に発現される）と天然末梢血白血球との係留およびローリング相互作用の平行平板型フローチャンバー解析。単球、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＢ細胞を新鮮なうちに単離し、続いて０．５〜１６ダイン／ｃｍ２に及ぶ流速でＴＮＦ刺激（simtulated）ＨＵＶＥＣ（すなわち、ＴＮＦは、Ｅ−セレクチンを発現するようにＨＵＶＥＣを誘導する）上に灌流し、細胞ローリングを観察し、ビデオ解析に記録した。単球およびＣＤ４  Ｔ細胞は、最大１６ダイン／ｃｍ２の剪断応力でＴＮＦ活性化ＨＵＶＥＣにおけるローリング接着性相互作用を示す一方、ＣＤ８およびＢ細胞は、最小の接着性剪断抵抗性接着性相互作用を示す。単球の細胞ローリングが、ＣＤ４  Ｔ細胞よりも３倍大きかったことに留意されたい。値は、最小で３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。（Ｂ）単球、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞ならびにＢ細胞のＥ−セレクチン−Ｉｇキメラ（「Ｅ−Ｉｇ」、Ｅ−セレクチンリガンドのプローブ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製））（左）およびｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２（右）による染色の代表的フローサイトメトリーヒストグラム。塗りつぶされた曲線は、アイソタイプ対照（または、Ｅ−Ｉｇ染色に関しては、インプットＣａ２＋の非存在下におけるＥ−セレクチン結合）を表し、塗りつぶされていない曲線は、特異的反応性（Ｅ−Ｉｇに関しては、インプットＣａ２＋の存在下における結合）を示す。（Ｃ）未処理（黒い実線）またはプロテアーゼ（ブロメライン）処理（点線）細胞を、ＨＥＣＡ４５２  ｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。プロテアーゼ（ブロメライン）処理（点線）は、単球、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＢ細胞のＨＥＣＡ４５２染色を顕著に減少させ、糖タンパク質が、これらの細胞上のｓＬｅｘ決定基の主要な担体であることを示す。
【００５２】
【図２８−１】図２８（Ａ）〜図２８（Ｃ）は、単球およびリンパ球上の機能的Ｅ−セレクチンリガンド発現が、α（１，３）−エクソフコシル化処理によって増加することを示す。（Ａ）ヒト単球をＦＴＶＩＩ処理またはバッファー処理（モック）し、Ｅ−セレクチン−Ｉｇキメラ（「Ｅ−Ｉｇ」、Ｅ−セレクチンリガンドのプローブ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製））による免疫沈降と、続くＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、それぞれＨＥＣＡ−４５２、抗ＣＤ４３、抗ＣＤ４４および抗ＰＳＧＬ−１  ｍＡｂによりブロットした。顕著にＣＤ４４（すなわち、ＨＣＥＬＬの作製）およびＣＤ４３（ＣＤ４３−Ｅ−セレクチンリガンド（「ＣＤ４３−Ｅ」）の作製）上の、単球のＦＴＶＩＩ処理後のＥ−Ｉｇによる免疫沈降の増加に留意されたい。（Ｂ）ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＢ細胞の溶解物からの、ＰＳＧＬ−１、ＣＤ４３およびＣＤ４４の連続的免疫沈降のウェスタンブロット解析と、続くＥ−Ｉｇによる染色。（Ｃ）ＴＮＦ−ａ活性化ＨＵＶＥＣ（Ｅ−セレクチンを発現する）上の、未処理（「ｕｎｔ」）およびＦＴＶＩＩ処理（すなわち、α（１，３）−エクソフコシル化；「ＦＴ７」）した単球、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞ならびにＢ細胞の係留およびローリング相互作用の平行平板型フローチャンバー解析。ＦＴＶＩＩ処理（「ＦＴ７」）は、検査した全剪断応力レベル下で、ＨＵＶＥＣへの流動細胞のＥ−セレクチン媒介性附着性を顕著に増強する。
【図２８−２】同上
【００５３】
【図２９】図２９（Ａ）〜図２９（Ｃ）は、単球由来樹状細胞（すなわち、ＣＤ１４発現による単球の選択後に培養された（ＣＤ１４−Ｓ  ｍｏ−ＤＣ））によって発現されたＣＤ４４が、Ｅ−セレクチンに結合することを示す。（Ａ）ｍｏ−ＤＣのＨＥＣＡ−４５２  ｍＡｂおよびＥ−Ｉｇ反応性染色の代表的フローサイトメトリーヒストグラム。灰色の線は、アイソタイプ対照、またはＥ−Ｉｇに関しては、Ｃａ２＋の非存在下における染色を表す一方、黒い点線は、ＰＡ−Ｓ  ｍｏ−ＤＣを表し、黒い実線は、ＣＤ１４−Ｓ  ｍｏ−ＤＣである。（Ｂ）ＣＤ１４−ＳおよびＰＡ−Ｓ  ｍｏ−ＤＣ溶解物のＥ−セレクチン染色のウェスタンブロット解析。２×１０６個のｍｏ−ＤＣに相当するホールセル溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分離し、イムノブロットした。ＭＷマーカーをＹ軸に沿って示す（ｋＤａ単位）。ＣＤ１４ビーズ上で培養されたＭｏ−ＤＣ（ＣＤ１４−Ｓ  Ｍｏ−ＤＣ）は、プラスチック上で培養されたもの（ＰＡ  Ｍｏ−ＤＣ）よりも高いＨＣＥＬＬ発現（ほぼ８０ｋＤａバンド）を有する。（Ｃ）ＣＤ１４−ＳおよびＰＡ−Ｓ  ｍｏ−ＤＣの細胞溶解物から免疫沈降されたＣＤ４４のウェスタンブロット解析。次に、ＣＤ４４免疫沈降物（ＣＤ４４  ＩＰ）をブロットし、Ｅ−Ｉｇキメラまたは抗ＣＤ４４  ｍＡｂで染色した。ＭＷマーカーは、Ｙ軸に沿って示す通りである（ｋＤａ単位）。ＣＤ１４−Ｓ  ｍｏ−ＤＣにおける著明なＨＣＥＬＬ発現に留意されたい。
【００５４】
【図３０】図３０（Ａ）〜図３０（Ｅ）は、ヒトｍｏ−ＤＣのα（１，３）−エクソフコシル化が、より高いＥ−セレクチンリガンド活性を強制し、内皮Ｅ−セレクチン発現が、エクソフコシル化ＤＣの経内皮遊走（ＴＥＭ）を促進することを示す。（Ａ）２×１０６個のＫＧ１ａ細胞およびｍｏ−ＤＣの溶解物のＥ−セレクチン結合（Ｅ−Ｉｇ）を比較するウェスタンブロット解析。（Ｂ）バッファー処理（−）またはＦＴＶＩ処理（＋）したｍｏ−ＤＣのＥ−Ｉｇ反応性のウェスタンブロット解析。ＦＴＶＩ処理は、ほぼ８０ｋＤａにおけるＥ−Ｉｇ結合を誘導し、ＨＣＥＬＬの強制発現を示す。（Ｃ）ＴＮＦ−α刺激ＨＵＶＥＣにおける剪断流条件（２ダイン／ｃｍ２）下でのバッファー処理（ＢＴ）およびＦＴＶＩ処理ｍｏ−ＤＣの経内皮遊走（ＴＥＭ）アッセイ。ＴＥＭ値は、未処理ＨＵＶＥＣにおいて遊出された細胞（最小であった）と比較した、ＴＮＦ−α刺激ＨＵＶＥＣ上の細胞の遊走の倍数増加である。異なる条件下でＴＥＭを解析した：機能遮断抗Ｅ−セレクチンｍＡｂクローン６８−５Ｈ１１と共にプレインキュベートしたＨＵＶＥＣ、機能遮断抗ＶＬＡ−４  ｍＡｂ  ＨＰ２／１またはアイソタイプｍＡｂと共にプレインキュベートしたｍｏ−ＤＣ、およびシアリダーゼまたは百日咳毒素（ＰＴＸ）で処理したｍｏ−ＤＣ。示されている通り、エクソフコシル化ＤＣは、未処理細胞よりも高いＴＥＭを有する；ＴＥＭは、細胞のＥ−セレクチンおよびＶＬＡ−４に対する機能遮断抗体、ならびにシアリダーゼまたはＰＴＸ処理によって抑止される。（Ｄ）ＴＥＭアッセイにおける係留およびローリングｍｏ−ＤＣの数（内皮表面積１ｃｍ２当たり）、ならびに堅固に附着している細胞の数（内皮表面積１ｃｍ２当たり）の解析。エクソフコシル化ＤＣによるより高い係留／ローリング相互作用に留意されたい。（Ｅ）ＴＥＭアッセイにおけるバッファー処理（ＢＴ）およびＦＴＶＩ処理ｍｏ−ＤＣの平均ローリング速度。２．０ダイン／ｃｍ２剪断応力において細胞数を計数した（すなわち、２．０ダイン／ｃｍ２剪断応力でＴＮＦ−α刺激ＨＵＶＥＣ上に灌流した）。値は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。統計的有意差（ｐ＜０．０５）は、角括弧および星印によって示す。ＦＴＶＩ処理ＤＣのより遅いローリングは、血行動態剪断条件下における内皮Ｅ−セレクチンへのＤＣ結合相互作用のより高い効率を示す。
【００５５】
【図３１】図３１は、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体ならびにＩＬ−２補充の存在下におけるヒトＣＤ４＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増大によって生成された調節性Ｔ細胞上のＦｏｘＰ３の発現を示す。培養されたＣＤ４＋／ＣＤ１２７−ｌｏｗ  Ｔ細胞上のＣＤ４およびＦｏｘＰ３の発現を示すデュアルカラーフローサイトメトリーヒストグラム；高ＦｏｘＰ３染色は、培養により増大された細胞の全てがＴｒｅｇであることを示す。
【００５６】
【図３２】図３２は、バッファー処理（薄灰色塗りつぶし）およびエクソフコシル化（ＦＴＶＩＩ処理；黒色塗りつぶし）ＴｒｅｇのｓＬｅｘ発現（ＨＥＣＡ４５２染色）のフローサイトメトリープロファイルを示す。バッファー処理Ｔｒｅｇには、ｓＬｅｘ発現がない（すなわち、プロファイルは、アイソタイプ対照染色（破線）と同様である）一方、ＦＴＶＩＩ処理細胞が、高レベルのｓＬｅｘを呈示することに留意されたい。
【００５７】
【図３３】図３３は、ヒト骨髄性白血病細胞株ＫＧ１ａと比較した、ＦＴＶＩＩ処理およびバッファー処理（ＢＴ）ＴｒｅｇのＥ−Ｉｇ染色のウェスタンブロット解析を示す。バッファー処理Ｔｒｅｇには、Ｅ−セレクチンリガンドがない。α（１，３）−エクソフコシル化は、ＨＣＥＬＬ（ほぼ８０ｋＤａバンド）の発現を含む、Ｔｒｅｇ上のいくつかの糖タンパク質Ｅ−セレクチンリガンドの発現を誘導する。ＫＧ１ａ細胞は元々、ＨＣＥＬＬを発現する。
【００５８】
【図３４】図３４は、異種間移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）における調節性Ｔ細胞投薬の用量設定を示す。異種間ＧＶＨＤ関連の体重減少（ＰＢＭＣの注射後５０日目に測定）は、１．５×１０５個のＴｒｅｇの静脈内注射によって抑止されるが、同様の用量のバッファー処理Ｔｒｅｇの注射によっては抑止されない（体重値は、Ｎ＝３匹のマウスの平均である）。しかし、５×１０５個のＴｒｅｇの注射は、投与されるＴｒｅｇ細胞のα（１，３）−エクソフコシル化に関係なくＧＶＨＤ体重減少を防止する（Ｎ＝３匹のマウスの平均）。よって、Ｔｒｅｇのα（１，３）−エクソフコシル化は、ＧＶＨＤの免疫調節における効力を３倍増加させる。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
（実施形態）
本開示は、対象において炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害または病状またはがんを処置する方法を対象とする。本方法は、組織修復／再生またはがん処置を必要とする対象への、細胞の天然集団のＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチン結合レベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞集団の投与を含む。細胞の組成物は、対象への投与のためまたは対象への投与前に貯蔵する（例えば、冷凍保存する）ために薬学的に許容される溶液、懸濁液、担体または媒体中に置かれる。
【００６０】
治療適応症のための本明細書に記述される細胞集団の投与は、臨床的に保証／指示されている各場合において、様々な解剖学的接近デバイス、様々な投与デバイス、および解剖学的画像手段（例えば、放射線学的、ＭＲＩ、超音波、等）またはマッピング技術（例えば、表面生理学的マップ手順、筋電図記録手順、電気診断手順、等）の支援を用いるもしくは用いない様々な解剖学的手法を使用する様々な方法で実現することができる。細胞は、末梢血管アクセス（例えば、静脈内配置、末梢静脈アクセスデバイス、等）または中心血管アクセス（例えば、中心静脈カテーテル／デバイス、動脈アクセスデバイス／手法、等）によって全身的に投与され得る。細胞は、カテーテルベースの手法または対象とする部位に細胞の血管ボーラスを送達し得る他の血管アクセスデバイス（例えば、心臓カテーテル、等）を使用して対象とする組織部位の解剖学的栄養血管内に血管内送達され得る。細胞は、脊柱管および／または脳室内に導入され得る（すなわち、脳脊髄液内および／または脳室内に分布させるためにクモ膜下腔へ、硬膜下腔内に）。細胞は、カテーテルベースの手法もしくは直接注射（例えば、腹腔内、胸膜腔内、心膜内、小嚢内［例えば、膀胱、胆嚢に、骨髄、胆管系（胆管および膵管ネットワークを含む）、尿道内、腎盂／尿管内手法によって、腟内、等］）のいずれかによって体腔または解剖学的区画に直接投与され得る。細胞は、血管内手法（例えば、心内膜心筋注射）もしくは経皮手法のいずれかを使用して直接局所組織注射により、または組織への外科的曝露／手法によって、または腹腔鏡／胸腔鏡／内視鏡／結腸鏡手法によって、または解剖学的に到達可能な組織部位へ直接導入されおよび／または画像技術により誘導され得る（例えば、関節内、椎間板および他の軟骨、骨、筋肉、皮膚、結合組織内、ならびに中枢神経系、末梢神経系、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、等などの関連する組織／器官内）。細胞は、関連する組織表面／部位へ直接配置する（例えば、組織へ直接の、潰瘍、熱傷表面、漿膜または粘膜表面、心外膜、等への配置）こともできる。細胞はまた、組織もしくは構造支持デバイス（例えば、組織骨格デバイス）内に投与され、そして／もしくは組織中に配置された骨格内に埋め込まれ、そして／またはゲル中にて投与され、そして／または促進剤（例えば、支持細胞、サイトカイン、成長因子、レゾルビン、抗炎症剤、等と混合される）と一緒に投与され得る。
【００６１】
細胞集団は、対象の１つまたは複数の組織内の血管内皮上のＥ−セレクチンの誘導発現の間に（すなわち、一致して）（好ましくは、誘導発現の出現と一致して）対象に投与される。投与された細胞の表面上のＥ−セレクチンリガンドの強制的な発現は、血管再生、宿主防御（例えば、感染症またはがんに対する）および／もしくは組織修復／再生を補助し、そして／または炎症を弱め、そして／または炎症を予防し得る免疫調節過程を媒介し得る。Ｅ−セレクチンに対するリガンドの発現は、炎症の部位の内皮細胞上で発現される血管Ｅ−セレクチンに対する血液由来細胞の結合を媒介することにより、炎症の部位への血管内投与された細胞の送達を導く。さらに、細胞が、脊柱管内および／または脳室内へ（すなわち、脳脊髄液内に分布させるためにクモ膜下腔へ、硬膜下腔内に）全身的に、血管内に、直接局所組織注射により、もしくは関連する組織表面／部位上への配置により体腔もしくは区画内へ直接に投与されるかどうかに関わらず、標的部位内でＥ−セレクチン（すなわち、内皮細胞）および／またはＬ−セレクチン（すなわち、白血球）をそれぞれ持つ細胞と同格で、投与された細胞上のＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに対するリガンドの発現は、罹患組織環境内での細胞の付着を促進する。したがって、標的組織内での投与された細胞の空間分布ならびに局在化は、投与された細胞上のＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現によりモジュレートされる。
【００６２】
特に、投与された細胞がＥ−セレクチンに対する結合を増大するように、炎症の部位における所望の細胞型の定着は、投与された細胞上での細胞表面Ｅ−セレクチンリガンドの強制的な発現の結果として起こり、それにより罹患部位に直接注射した場合に所望の細胞の全身送達および／または細胞の付着が促進される。例えば、有利なことに、Ｅ−セレクチンリガンド（例えば、ＨＣＥＬＬ、ＣＤ４３−Ｅ、ＣＬＡ／ＰＳＬＧ−１、ＥＳＬ−１、ＮＣＡＭ−Ｅ等）の強制的な発現は、炎症、組織傷害またはがんの部位においてＥ−セレクチン発現血管に注射された細胞を直接つなぎ留めることができる。したがって、本方法は、例えば、組織修復幹細胞を送達する、免疫調節性細胞（例えば、間葉系幹細胞、Ｔ調節性細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、等）を送達する能力、および誘発炎症過程もしくはがんに対抗するために免疫エフェクター細胞を送達する（例えば、感染または悪性の場合、病原体特異的免疫エフェクターＴ細胞またはがん特異的細胞傷害性Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞それぞれの送達）能力を含めた炎症、組織傷害、またはがんの部位でのもしくはそこへの関連する細胞の送達の効率を増大させ；そのような免疫学的細胞（調節性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、樹状細胞、等）は、抗原パルス、腫瘍細胞パルス、ウイルスパルスして、ならびに他の手段で抗原特異性を作製することができる。同様に、有利なことに、Ｌ−セレクチンリガンド（例えば、ＨＣＥＬＬ、ＰＳＧＬ−１、等）の強制的な発現は、直接注射された細胞を炎症、組織傷害またはがんのＬ−セレクチン発現細胞浸潤部位につなぎ留めることができる。
【００６３】
細胞表面上のＥ−セレクチンリガンドの増大された発現は、Ｅ−セレクチンが発現される任意の部位への細胞の血管ホーミングを駆動し得る。様々な実施形態において、細胞集団は、造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）および／または神経細胞接着分子Ｅ−セレクチンリガンド（ＮＣＡＭ−Ｅ）を発現する。細胞により発現され得る他のＥ−セレクチンリガンドには、例えば、ＣＤ４３−Ｅ、ＥＳＬ−１、ＰＳＧＬ−１およびＰＳＧＬ−１のＣＬＡグリコフォームがある。例えば、ＣＤ４４は、偏在して発現される細胞膜タンパク質であり、「成体」と胎児型両方の幹／前駆細胞集団において示されるので、ＨＣＥＬＬ（ＣＤ４４グリコフォーム）表現型を作製するためにｅｘ  ｖｉｖｏでのグリカン操作によりこのタンパク質のグリコシル化を修飾する能力は、髄またはＥ−セレクチンが発現される任意の組織／器官部位への（例えば、血管内に）注射された（養子導入）細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの遊走を駆動し得る。したがって、修飾細胞を、治療設定に使用して、例えば、ごくわずかの状態を挙げれば、骨疾患、免疫疾患、感染性疾患ならびにがん治療法を含めた様々な生理学的および病理学過程において標的した細胞遊走を達成することができる。
【００６４】
対象において、細胞集団の分化がなくても、付随する炎症がある疾患、障害、または病状を、即時の方法を使用して処置できることも発見された。すなわち、問題の組織の型にかかわりなく、投与された細胞の持続的な生着および／または再増殖はないが、炎症の部位において投与された細胞による栄養作用がある。これらの栄養作用は、血管再生を促進する（例えば、ＶＥＧＦ）、組織修復を促進する（例えば、ＴＧＦ−β）、免疫調節性の（例えば、ＩＬ−１０）、組織常在前駆細胞の成長／増殖（例えば、ＳＣＦ、ＬＩＦ、等）および他の多くの組織修復過程（例えば、細胞へのミトコンドリア送達）を刺激するサイトカイン／成長因子の放出を含む。加えて、投与された細胞（例えば、Ｔｒｅｇ、ＭＳＣ、樹状細胞等）は、活性化したリンパ球の直接的抑制（例えば、ＰＤＬ−１の発現による）を含めた、強力な免疫調節性特性を有することができる。
【００６５】
図４（Ａ）〜図４（Ｈ）によって例証され、実施例においてより詳細に記載の通り、増大されたＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチン結合活性を有するように修飾された細胞集団は、この細胞型の天然集団と比較して、Ｅ−セレクチン発現血管系の近傍において組織をホーミング、浸潤および定着する能力を増加させた。さらに、一実施形態において、そのような細胞は、内皮細胞上でＥ−セレクチンに結合することにより炎症の部位に付着するか、または炎症部位内の浸潤白血球の部位に付着する（例えば、図４（Ｆ）および４（Ｇ）を参照のこと）。さらに、部位において投与された細胞の付着後に細胞の分化（または長期生着）がなくても、有益な効果（例えば、疾患の寛解）が、非経口送達または炎症の部位もしくは浸潤白血球の部位への直接注射により実現され得る（すなわち、一時的な生着は、対象とする生物学的効果をもたらすのに十分であり得る）。
【００６６】
特定の実施形態において、生細胞集団におけるＨＣＥＬＬ発現の強制に関する米国特許第８，０８４，２３６号に記述され、以下で詳細に述べられるグリカン操作の方法は、そのような細胞上のＥ−セレクチンリガンドの発現をより多量に誘導して炎症の部位へのそれらの血管送達を促進することができ、罹患組織環境内での細胞の付着を促進することができるＥ−セレクチンリガンドおよびＬ−セレクチンリガンドをより多量に誘導することができる。
【００６７】
対象の処置とは、個体において付随する炎症がある疾患、障害もしくは病状の臨床症候を減少させるもしくは除去するか、または個体においてそのような疾患、障害もしくは病状の臨床症候の出現を遅延させるもしくは予防することを指す。例えば、処置は、急性および／または慢性炎症によって特徴づけられる症状の症候を、例えば、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％少なくとも９５％または少なくとも１００％減少させることを意味し得る。急性および慢性炎症に関連する実際の症候は周知であり、急性および／もしくは慢性炎症の位置、急性および／もしくは慢性炎症の原因、急性および／もしくは慢性炎症の重症度、ならびに／または急性および／もしくは慢性炎症に罹患した組織もしくは器官を含むがそれだけには限らない因子を考慮することにより当業者によって決定され得る。当業者は、特定の型の急性および／または慢性炎症と関連する適当な症候または指標を承知しているであろうし、個体が、本明細書に開示する処置の候補であるかどうか決定する方法を承知しているであろう。
【００６８】
本明細書に記述される方法によって処置され得る対象には、疾患に罹り得る哺乳動物など任意の哺乳動物（例えば、ヒト）がある。例には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはマウス、ラット、ハムスターもしくはモルモットなどの齧歯動物がある。対象は、付随する炎症がある疾患、障害または病状と診断されるか、さもなければ疾患、障害または病状を有することが公知の対象であることができ、その結果または症候は急性および／または慢性炎症である。いくつかの実施形態において、対象は、付随する炎症がある疾患、障害または病状を発症する危険性があると診断されるか、または危険性があることが公知であり得る。特定の実施形態において、対象は、対象における公知の疾患、障害または病状に基づいて処置のために選択されることができ、その結果または症候は急性および／または慢性炎症である。いくつかの実施形態において、対象は、対象における疑わしい付随する炎症がある疾患、障害または病状に基づいて処置のために選択され得る。いくつかの実施形態において、疾患、障害または病状は、生体サンプル（例えば、尿、痰、全血、血清、便等、またはそれらの任意の組合せ）中の変異または他の異常を検出することによって診断され得る。したがって、修飾細胞集団は、対象から得られる少なくとも１つのサンプル（例えば、生検サンプルまたは他の任意の生体サンプル）において変異、症候または他の異常が検出されるという事実に少なくとも部分的に基づいて対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、糖尿病、多発性硬化症またはがん（例えば）が、対象において検出できないか、または位置を探せなかった場合でも、少なくとも１つの生体サンプルにおける糖尿病、多発性硬化症またはがんと関連する変異、症候または他の異常の存在は、本明細書に記述される方法により対象に修飾細胞を投与するのに十分であり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、糖尿病、多発性硬化症またはがんなどの疾患、障害または病状の発症を予防するために投与され得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、既存の疾患、障害または病状の存在が疑われ得るが、まだ識別されていない場合、開示の組成物は、疾患、障害または病状のさらなる成長または発症を予防するために投与され得る。投与される細胞は、自己起源（すなわち、宿主自体から得られる）、同系起源（一卵性双生児から得られる）、または同種異系起源（遺伝的に非同一のドナーから得られる）から得ることができる。
（投与のタイミング）
【００６９】
上記したように、細胞集団は、対象の内皮細胞によるＥ−セレクチンの誘導発現と一致して（好ましくは誘導発現の出現と一致して）、または罹患組織における予想される増加したＥ−セレクチン発現の直前に（すなわち、Ｅ−セレクチン誘導性炎症性刺激［例えば、放射線療法］の送達に先行してまたはそれと一致して予防として）または血管Ｅ−セレクチン発現のその後の上方制御を伴う病原体との反応もしくは疾患過程を見越して（例えば、感染性因子への曝露またはそれの内在的再活性化後、自己免疫疾患の明白な突発の前、移植片対宿主病［ＧＶＨＤ］の発生前等）対象に投与される。したがって、本明細書に記述される処置方法は、例えば、対象（例えば、ヒト患者）が、１つまたは複数の炎症の症候もしくは予期される炎症の突発により医師または保健医療提供者に診察を受けに行く場合に実施され得る。糖尿病の対象の場合、例えば、そのような初期症候は、多尿、夜間多尿、体重減少／増加および／または満腹感の欠如を含むことがあり、その時点で（および糖尿病性ケトアシドーシスの出現前に）、対象は本開示による修飾細胞を投与され得る。多発性硬化症の対象の場合、例えば、そのような初期症候は、一過性の知覚混乱（例えば、麻痺、刺痛）および／または線維束攣縮（単収縮）および／または筋無力症状の発現を含み得る。
【００７０】
一般に、修飾細胞の投与の一時的な態様は、例えば、特定の修飾細胞、または処置される疾患、障害もしくは病状（および付随する炎症、組織傷害またはがん）の性質によって決まり得る。他の考慮すべき点には、疾患、障害または病状の重症度；利用される特定の細胞または細胞断片および修飾の活性；利用される特定の組成物；対象の年齢、体重、健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路および排出速度；処置期間；処置体制と併用してまたは一致して使用される薬物；などの因子があり得る。
【００７１】
したがって、修飾細胞の投与は、１回の事象または経時的な処置として行うことができる。例えば、修飾細胞は、時間毎に（例えば、１時間毎、２時間毎、３時間毎、４時間毎、５時間毎、６時間毎、など）、毎日、毎週、隔週、隔月または毎月投与され得る。急性症状の処置の場合、例えば、処置の時間経過は、少なくとも数時間、数日間または数週間であることができる。特定の症状は、数日間から数週間、数カ月間または数年間へ処置を延長する可能性がある。例えば、処置は、１週間、２週間もしくは３週間以上、またはより長く（例えば、１から数カ月間に）に及ぶ可能性がある。より慢性的な症状の場合、処置は、数週間から数カ月間、１もしくは数年間、またはそのような処置を必要とする患者の生涯に及ぶ可能性がある。あるいは、化合物および薬剤は、予防的または治療的手段として１時間毎、毎日、毎週、隔週、隔月もしくは毎月、数週間、数カ月間、数年間、または患者の一生にわたって投与され得る。
【００７２】
投薬の頻度が、対象における疾患、障害もしくは病状（および付随する炎症）の性質および重症度ならびに／または疾患、障害もしくは病状の段階に基づいて増減され得ることも理解されよう。例えば、これらのおよび他の因子に依存して、処置の開始時に低頻度の投与が望ましくなる場合があり、末期またはそれ近傍において高頻度の投与が望ましくなる場合があり、その逆も同じである。様々な標的および症候は、追跡することもでき（例えば、糖尿病の対象におけるインスリンレベル）、したがって投与および投薬量は修正することができる。
【００７３】
必要に応じて、細胞は、投与のために複数回の投薬に分割することができ；結果的に、１回の投薬組成物は、そのような量または１回の投薬を構成する量の約数を含有することができる。
（適応症）
【００７４】
本開示は、疾患、障害または病状の処置を対象とし、Ｅ−セレクチンが罹患組織の内皮ベッドにおいて発現され、そして／またはＬ−セレクチン発現白血球は、罹患組織において浸潤／蓄積している。前述のとおり、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンは、シアル化、フコシル化炭水化物にそれぞれ結合し、細胞表面上のこれらのシアロフコシル化グリカン構造の強制的な発現は、これらのセレクチンに対する結合をプログラムするのに役立つ。したがって、本開示は、投与された細胞上のＥ−セレクチンリガンドの発現を増大させることにより標的組織へのホーミングを増大する方法について記述し；さらに、投与された細胞上の強力なＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬなど）の発現を増大して、血管内皮細胞上のＥ−セレクチンへのおよび／または罹患組織内の組織浸潤白血球上のＬ−セレクチンへの附着を促進する方法について記述し、本開示は、生物学的効果が意図される関連する組織微環境内の細胞の定着／付着を増大させる手段を提供する。一般に、本明細書に記述される方法は、免疫療法適用（例えば、がんまたは感染性疾患適用のために培養により増大された抗原特異性Ｔ細胞および／もしくは培養により増大されたＮＫ細胞の投与、培養により増大されたキメラ抗原受容体［ＣＡＲ］Ｔ細胞の投与、抗原パルスされた樹状細胞の投与等）、免疫調節性／免疫抑制性治療適用（例えば、培養により増大された調節性Ｔ細胞［Ｔｒｅｇ］の投与、抗原パルスされた樹状細胞の投与、間葉系幹細胞の投与、培養により増大されたＮＫＴ細胞の投与等）、または組織修復／再生医学適用（例えば、組織再生／回復のための幹および／または前駆細胞または他の組織修復細胞の使用；組織再生／回復のための培養により増大された幹細胞および／または培養により増大された前駆細胞の使用）においても、細胞ベースの任意の治療的手法の転帰を改善する有用性を有する。再生医学適用における有用性の中で、投与された細胞は、組織特異的細胞を生じる長期の生着（付随して増殖／分化を伴う）によって標的組織を再生するのにそれ自体寄与することができ（例えば、血液細胞産生のための造血幹細胞の移植においてなど）、および／または長期の生着もしくは分化なしに組織常在細胞に組織回復／修復効果をもたらすことができる（例えば、常在幹／前駆細胞を刺激して損傷組織を修復する栄養作用をもたらすことによっておよび／または傷害を促進し、修復を妨げる炎症過程を弱めることによって）ものと理解される。本明細書に記述される全ての適応に対する全ての適用は、単独でまたは促進剤（例えば、成長因子、組織骨格等）と組み合わせて使用され得る。
【００７５】
直接的な組織傷害（例えば、熱傷、外傷、骨折、骨奇形、褥瘡性潰瘍等）、虚血／血管事象（例えば、心筋梗塞、脳卒中、ショック、出血、凝血障害等）、感染症（例えば、蜂巣炎、肺炎、髄膜炎、膀胱炎、敗血症、ＳＩＲＳ等）、異常増殖（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎細胞がん、リンパ腫、白血病等）、免疫学的／自己免疫症状（例えば、急性または慢性ＧＶＨＤ、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸疾患［例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎］、関節リウマチ、乾癬等）、変性疾患（例えば、骨粗鬆症、変形関節炎、椎間板変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症等）、先天的／遺伝的疾患（例えば、表皮水疱症、骨形成不全症、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ハンチントン舞踏病等）、薬物副作用（例えば、化学療法により誘導される組織／臓器毒性、放射線療法毒性、薬物により誘導される肝炎、薬物により誘導される心傷害等）、毒性傷害（例えば、放射線被曝、化学的曝露、アルコール性肝炎、アルコール性膵炎、アルコール性心筋症、コカイン心筋症等）、代謝異常（例えば、尿毒症性心膜炎、代謝性アシドーシス等）、医原性症状（例えば、放射線により誘導される組織傷害、手術関連合併症等）および／または特発性の過程（例えば、筋萎縮側索硬化、パーソネイジ−ターナー症候群等）によって開始されるものを含むがこれに限定されない付随する炎症（例えば、急性および／または慢性）を有する疾患、障害もしくは病状、組織傷害／損傷または新生物症状の全ては、本明細書に記述される方法により処置され得る。
【００７６】
本明細書に記述される方法によって処置され得る他の一般的なおよび特定の疾患、障害または病状には、これに限らないが、以下がある：
【００７７】
急性白血病（例えば、急性二形質性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性未分化白血病）；
【００７８】
骨髄異形成症候群、例えば、アミロイドーシス慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、難治性貧血（ＲＡ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、移行期の芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ−Ｔ）および環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）；
【００７９】
骨髄増殖症候群、例えば、急性骨髄線維症、原因不明骨髄様化生（骨髄線維症）、本態性血小板血症、慢性骨髄性白血病および真性多血症；
【００８０】
食細胞障害、例えば、チェディアック−東症候群、慢性肉芽腫症、白血球接着不全症、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、好中球アクチン欠損症および細網異形成症；
【００８１】
リソソーム蓄積症、例えば、副腎白質ジストロフィー、アルファマンノシドーシス、ゴーシェ病、ハンター症候群（ＭＰＳ−ＩＩ）、ハーラー症候群（ＭＰＳ−ＩＨ）、クラッベ病、マロトーラミー症候群（ＭＰＳ−ＶＩ）、異染性白質異栄養、モルキオ症候群（ＭＰＳ−ＩＶ）、ムコリピドーシスＩＩ（Ｉ細胞病）、ムコ多糖蓄積症（ＭＰＳ）、ニーマンピック病、サンフィリポ症候群（ＭＰＳ−ＩＩＩ）、シャイ症候群（ＭＰＳ−ＩＳ）、スライ症候群、ベータ−グルクロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ−ＶＩＩ）およびウォールマン病；
【００８２】
遺伝的赤血球異常、例えば、ベータ地中海貧血、ブラックファンダイヤモンド貧血、赤芽球癆および鎌状赤血球症；
【００８３】
遺伝的血小板異常、例えば無巨核球症／先天性血小板減少、灰色血小板症候群；
【００８４】
実質器官悪性腫瘍、例えば、脳腫瘍、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、腎細胞癌、肺がん、乳がん、胃がん、食道がん、皮膚がん、口腔がん、内分泌がん、肝臓がん、胆管系がん、膵臓がん、前立腺がんおよび精巣がん；
【００８５】
他の適用、例えば、骨髄移植、心疾患（心筋梗塞）、肝疾患、筋ジストロフィー、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、椎間板疾患／変性、骨疾患、骨折、脳卒中、末梢血管疾患、頭部外傷、水疱性疾患、ミトコンドリア病、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ増大させた幹および前駆細胞集団、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精適用および増大、造血救出事態（Hematopoietic  Rescue  Situations）（強い化学／放射線）、様々な組織起
源から得られる幹細胞および前駆細胞、ヒトおよび動物における適用、ならびに四肢再生、再建外科手順／適応、単独または促進剤との組み合わせ；
【００８６】
慢性白血病、例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＪＣＭＬ）および若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、
【００８７】
幹細胞障害、例えば、無形成性貧血（重度）、先天性血球減少、先天性角化不全、ファンコニ貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；
【００８８】
リンパ増殖性疾患、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫および前リンパ球性白血病；
【００８９】
組織球障害、例えば、家族性赤血球食細胞性リンパ組織球症、血球貪食、血球貪食リンパ組織球症、ヒスチオサイトーシスＸ、およびランゲルハンス細胞組織球症；
【００９０】
先天性（遺伝性）免疫系障害、例えば、ＴおよびＢ細胞の非存在、Ｔ細胞の非存在、正常Ｂ細胞ＳＣＩＤ、毛細管拡張性運動失調症、裸リンパ球症候群、分類不能型免疫不全症、ディジョージ症候群、コストマン症候群、白血球接着不全症、オーメン症候群、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、アデノシンデアミナーゼ欠乏を伴うＳＣＩＤ、ヴィスコットアルドリッチ症候群およびＸ連鎖リンパ増殖性疾患；
【００９１】
他の遺伝性疾患、例えば、軟骨毛髪低形成、セロイドリポフスチン症、先天性造血性ポルフィリン症、家族性地中海熱、グランツマン血小板無力症、レッシュナイハン症候群、大理石骨病およびサンドホフ病；
【００９２】
形質細胞疾患、例えば、多発性骨髄腫、形質細胞白血病およびワルデンストレームマクログロブリン血症；および
【００９３】
自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、強直性脊椎炎、真性糖尿病および炎症性大腸疾患。
【００９４】
関節および骨疾患／症状、例えば、椎間板変性、滑膜疾患、軟骨変性、軟骨外傷、軟骨裂傷、関節炎、骨折、骨奇形、骨再建、骨形成不全症、先天性骨疾患／症状、遺伝的骨疾患／症状、骨粗鬆症。大理石骨病、低ホスファターゼ血症、代謝性骨疾患等。
【００９５】
水疱性疾患、乾癬、湿疹、表皮水疱症、潰瘍性皮膚症状、軟部組織奇形（術後皮膚および軟部組織奇形を含む）、形成外科／再建手術適応等などの皮膚／軟部組織疾患および症状。
【００９６】
一般に、発熱、疼痛、水腫、充血、紅斑、挫傷、圧痛、硬直、膨れ、悪寒、呼吸窮迫、血圧低下、高血圧、鼻詰まり、頭重感、呼吸障害、体液貯留、凝血塊、食欲不振、体重減少、多尿、夜間多尿、無尿、呼吸困難、運動性呼吸困難、筋力低下、知覚変化、心拍数増加、心拍数低下、不整脈、多飲、肉芽腫の形成、線維素性、膿、非粘稠性漿液、または潰瘍、があるがこれに限定されない付随する炎症症候。急性および／または慢性炎症に関連する実際の症候は周知であり、炎症の位置、炎症の原因、炎症の重症度、罹患した組織または器官、および関連障害を含むがそれに限定されない因子を考慮することにより当業者によって決定され得る。
【００９７】
急性および／または慢性炎症の特定のパターンは、炎症が上皮表面において起こるか、または化膿菌が含まれるなどの場合に、身体に生じる特定の状況の間に見られる。例えば、肉芽腫性炎症は、結核、ライ病、サルコイドーシスおよび梅毒を含むがこれに限定されない、限定されているが多数の疾患から生じる肉芽腫の形成に起因する炎症である。化膿性炎症は、多量の膿をもたらす炎症であり、膿は、好中球、死細胞および体液からなる。ブドウ球菌属などの化膿菌による感染症は、この種の炎症に特徴的である。漿液性炎症は、一般に漿膜の中皮細胞により産生されるが、血漿から得ることができる非粘稠性漿液の大量の滲出に起因する炎症である。皮膚水疱は、このパターンの炎症を例証する。潰瘍性炎症は、上皮表面からの組織の壊死性消失に起因し、下層を曝露し、潰瘍を形成する炎症である。
【００９８】
急性および／または慢性炎症症候は、様々な疾患および障害の根底にある障害の大きく、無関係な群と関連し得る。免疫系は、アレルギー反応、関節炎症状といくつかのミオパチーの両方において実証される急性および／または慢性炎症性障害、異常な炎症をもたらす多くの免疫系障害としばしば関係している。急性および／または慢性炎症過程に病因論の起源がある非免疫性疾患には、がん、アテローム性動脈硬化症および虚血性心疾患がある。症候として急性および／または慢性炎症を呈示する障害の非限定的な例には、ざ瘡、酸逆流／胸やけ、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、アレルギー、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、筋萎縮側索硬化、貧血、虫垂炎、動脈炎、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫不全、亀頭炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、水疱性天疱瘡、熱傷、滑液包炎、がん、心停止、心炎、セリアック病、蜂巣炎、子宮頸管炎、胆管炎、胆嚢炎、絨毛羊膜炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（および／またはその急性増悪）、肝硬変、大腸炎、うっ血性心不全、結膜炎、薬物により誘導される組織傷害（例えば、シクロホスファミドにより誘導される膀胱炎）、嚢胞性線維症、膀胱炎、感冒、涙腺炎、褥瘡性潰瘍、認知症、皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性ネフロパシー、糖尿病潰瘍、消化器疾患、湿疹、気腫、脳炎、心内膜炎、内分泌障害、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、線維筋痛、線維形成、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、糸球体腎炎、舌炎、心疾患、心臓弁機能不全、肝炎、化膿性汗腺炎、ハンチントン舞踏病、高脂血症膵臓炎、高血圧、回腸炎、感染症、炎症性大腸疾患、炎症性心臓肥大症、炎症性神経病変、インスリン抵抗性、間質性膀胱炎、間質性腎炎、虹彩炎、虚血、虚血性心疾患、角膜炎、角結膜炎、喉頭炎、狼瘡性腎炎、黄斑変性、乳腺炎、乳様突起炎、髄膜炎、代謝症候群（症候群Ｘ）、片頭痛、粘膜炎、多発性硬化症、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、ニューロン炎、非アルコール性脂肪肝、肥満、臍炎、卵巣炎、精巣炎、骨軟骨炎、骨減少、骨髄炎、骨粗鬆症、骨炎、耳炎、膵炎、パーキンソン病、耳下腺炎、骨盤炎症性疾患、尋常性天疱瘡（pemphigus  vularis）、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、胸膜炎、肺炎、多嚢胞腎炎、直腸炎、前立腺炎、乾癬、歯髄炎、腎盂腎炎、門脈炎、放射線により誘導される傷害、腎不全、再灌流傷害、網膜炎、リウマチ熱、鼻炎、卵管炎、サルコイドーシス、唾液腺炎、副鼻腔炎、直腸痙攣、鬱血性皮膚炎、狭窄、口内炎、脳卒中、外科合併症、滑膜炎、腱炎、腱症、滑液鞘炎、血栓性静脈炎、甲状腺炎、扁桃炎、外傷、外傷性脳傷害、移植拒絶反応、三角炎、結核、腫瘍、潰瘍、尿道炎、ウルシティス（ursitis）、ブドウ膜炎、膣炎、血管炎および陰門炎があるがこれに限定され
ない。
【００９９】
急性および／または慢性炎症をもたらし得るさもなければ原因になり得る疾患、障害および外傷の一般的な区分には、遺伝的疾患、異常増殖、直接組織傷害、自己免疫疾患、感染性疾患、血管疾患／合併症（例えば、虚血／再灌流傷害）、医原性の原因（例えば薬物有害作用、放射線傷害等）およびアレルギー性徴候があるが、これに限定されない。
【０１００】
一実施形態において、急性および／または慢性炎症は組織炎症を含む。一般に、組織炎症は、特定の組織もしくは器官に限定される急性および／または慢性炎症である。したがって、例えば、組織炎症は、皮膚の炎症、筋肉の炎症、腱の炎症、靭帯の炎症、骨の炎症、軟骨／関節の炎症、肺の炎症、心臓の炎症、肝臓の炎症、胆嚢の炎症、膵臓の炎症、腎臓の炎症、膀胱の炎症、歯肉の炎症、食道の炎症、胃の炎症、腸の炎症、肛門の炎症、直腸の炎症、血管の炎症、腟の炎症、子宮の炎症、精巣の炎症、陰茎の炎症、外陰の炎症、ニューロンの炎症、口腔の炎症、眼の炎症、耳の炎症、脳の炎症、心室／髄膜（meningial）の炎症および／または中枢もしくは末梢神経系細胞／エレメントを含む炎症を含み得
る。
【０１０１】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、全身性炎症を含む。組織炎症と同一でなくても含まれる過程は類似しているが、全身性炎症は、特定の組織に限られず、むしろ上皮、内皮、神経組織、漿膜表面および器官系を含めた身体の複数部位を含む。それが感染症による場合、用語敗血症は、細菌敗血症に特異的に適用される菌血症およびウイルス敗血症に特異的なウイルス血症で使用され得る。血管拡張および器官機能不全は、敗血症性ショックおよび死亡に至る場合がある広範囲にわたる感染と関連する深刻な問題である。
【０１０２】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は関節炎により誘導される。関節炎は、例えば、変形性関節炎、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎の様な脊椎関節症、反応性関節炎（ライター症候群）、乾癬性関節炎、炎症性大腸疾患と関連する腸炎性関節炎、ウィップル病およびベーチェット病、化膿性関節炎、痛風（痛風関節炎、結晶性滑膜炎、代謝性関節炎とも一般に呼ばれる）、偽痛風（ピロリン酸カルシウム沈着症）、およびスティル病を含めた滑膜の炎症による、身体の関節への損傷を含む症状の一群を含む。関節炎は、単一の関節（単関節炎）、２〜４つの関節（少数関節炎）または５つもしくはより多くの関節（多発関節炎）に罹患することがあり、自己免疫疾患または非自己免疫疾患のいずれかであることができる。
【０１０３】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、自己免疫不全により誘導される。自己免疫疾患は、各疾患の主要な臨床病理的特徴に応じて、全身性および器官特異性自己免疫不全に大まかに分割され得る。全身性自己免疫疾患には、例えば、全身性紅斑性狼蒼（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチおよび多発筋炎がある。局所自己免疫疾患には、内分泌性（１型真性糖尿病、橋本病、アジソン病等）、皮膚病学的（尋常天疱瘡）、血液学的（自己免疫溶血性貧血）、神経性（多発性硬化症）があり、または体組織の任意の限局性の塊を実質的に含み得る。自己免疫障害の型には、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、アレルギーまたは過敏症、筋萎縮側索硬化（ＡＬＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、関節炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性膵炎、水疱性天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（その急性増悪を含む）、１型真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、子宮内膜症、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）、間質性膀胱炎、狼瘡（円板状エリテマトーデス、薬物により誘導される紅斑性狼蒼。狼瘡性腎炎、新生児狼瘡、亜急性皮膚エリテマトーデス、および全身性エリテマトーデスを含める）、限局性強皮症、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、ミオパチー、ナルコレプシー、神経性筋強直、尋常天疱瘡、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、再発性播種性脳脊髄炎（多相性播種性脳脊髄炎）、リウマチ熱、統合失調症、強皮症、シェーグレン症候群、滑液鞘炎、血管炎および白斑があるがこれに限定されない。特定の一実施形態において、急性および／または慢性炎症は、対象の糖尿病に起因する、さもなければそれにより引き起こされる。別の特定の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、対象の多発性硬化症に起因する、さもなければそれにより引き起こされる。
【０１０４】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、ミオパチーにより誘導される。一般に、ミオパチーは、免疫系が筋肉の構成要素を不適切に攻撃する場合に引き起こされ、筋肉に炎症をもたらす。ミオパチーには、例えば、炎症性ミオパチーおよび自己免疫性ミオパチーがある。ミオパチーには、例えば、皮膚筋炎、封入体筋炎および多発筋炎がある。
【０１０５】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、血管炎により誘導される。血管炎は、白血球遊走ならびにその結果として生じる損傷による、静脈（静脈炎）、動脈（動脈炎）および毛細管の様なリンパ管および血管を含めた血管壁の炎症を特徴とする様々な群の障害である。炎症は、身体の任意の場所の、任意のサイズの血管に罹患し得る。それは、動脈および／または静脈のいずれにも罹患し得る。炎症は、血管内の単一の位置に罹患することを意味する巣状であることができ、または炎症は、特定の器官もしくは組織全体に点在する炎症の領域で広範囲にわたることができ、または身体の２つ以上の器官系に罹患することもできる。血管炎には、バーガー病（閉塞性血栓性血管炎）、脳血管炎（中枢神経系血管炎）、ＡＮＣＡ関連血管炎、チャーグストラウス動脈炎、クリオグロブリン血症、本態性クリオグロブリン血症性血管炎、巨大細胞（側頭）動脈炎、ゴルファーの血管炎、ヘノッホシェーンライン紫斑病、過敏性血管炎（アレルギー性血管炎）、川崎病、顕微鏡的多発性動脈炎／多発血管炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛（ＰＭＲ）、リウマトイド血管炎、高安動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、再発性多発性軟骨炎、ベーチェット病の様な結合組織障害、または他の結合組織障害に伴う血管炎、ウイルス感染症に伴う血管炎があるがこれに限定されない。
【０１０６】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、皮膚障害により誘導される。皮膚障害には、例えば、尋常性ざ瘡を含めたざ瘡、水疱性類天疱瘡（bullous  phemigoid）、アトピー性皮膚炎ならびに急性および／または慢性光線性皮膚炎を含めた皮膚炎、湿疹様アトピー性湿疹、接触湿疹、乾燥性湿疹、脂漏性皮膚炎、発汗異常症、貨幣状湿疹、静脈湿疹、皮膚炎、疱疹状皮膚炎、神経皮膚炎、および自己湿疹化、および鬱血性皮膚炎、糖尿病性皮膚合併症、化膿性汗腺炎、扁平苔癬、尋常性乾癬（plaqure  psoriasis）、爪乾癬、滴状乾癬、頭皮乾癬、倒置乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症（erythrodermis  psoriasis）および乾癬性関節炎を含めた乾癬、酒さおよび限局性強皮症を含めた強皮症、潰瘍がある。
【０１０７】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、消化管障害により誘導される。消化管障害には、例えば、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病および潰瘍性大腸炎の様な潰瘍性直腸炎を含めた炎症性大腸疾患、左側結腸炎、全結腸炎ならびに劇症大腸炎がある。
【０１０８】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、心血管疾患により誘導される。ＬＤＬコレステロールが、動脈壁に埋め込まれると、それは免疫応答を呼び起こし得る。急性および／または慢性炎症は、動脈を最終的に損傷する場合があり、それは動脈を破裂させる場合がある。一般に、心血管疾患は、心臓自体ならびに／または血管系、特に心臓へおよび心臓から通じる静脈および動脈に罹患する多くの特異的疾患のうちのいずれかである。例えば、高血圧、心内膜炎、心筋炎、心臓弁機能不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、糖尿病性心臓症状、動脈炎、静脈炎、血管炎の様な血管炎症；動脈硬化および狭窄の様な動脈閉塞疾患、炎症性心臓肥大症、末梢動脈疾患；動脈瘤；塞栓；解剖；偽動脈瘤；血管奇形；血管母斑；血栓症；血栓性静脈炎；拡張蛇行静脈；脳卒中を含めて６０個を超える型の心臓血管障害がある。心臓に罹患する心臓血管障害の症候には、胸痛、または胸部不快感（狭心症）、一方もしくは両腕、左肩、頸部、顎もしくは背中の疼痛、息切れ、眩暈、速い鼓動、悪心、異常な鼓動、疲労感があるがこれに限定されない。脳に罹患する心臓血管障害の症候には、顔面、腕もしくは脚、特に身体の片側における突然の麻痺または脱力、突然の発話もしくは会話の理解の混乱または問題、突然の一方もしくは両眼の視力の問題、突然の眩暈、歩行困難またはバランスもしくは協調の消失、原因不明の突然の激しい頭痛があるがこれに限定されない。脚、骨盤および／または腕に罹患する心臓血管障害の症候には、筋肉の疼痛、痛みまたは痙攣である跛行および特に夜間の足もしくはつま先における冷えまたは麻痺感があるがこれに限定されない。
【０１０９】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、がんにより誘導される。一般に、炎症は、腫瘍の周りの微環境を組織化し、増殖、生存および遊走を助長する。例えば、線維素性炎は、フィブリンが血管を通ることを可能にする血管透過性の大きな増加に起因する。がん細胞など適当な凝血促進性刺激が存在する場合、線維性滲出液は沈着する。沈着は、漿膜間で瘢痕への線維性滲出液の変換が起こり得る漿膜腔において一般に見られ、漿膜の機能を制限する。別の例において、がんは、ＮＦ−κＢ駆動炎症性がんの様な炎症性癌である。
【０１１０】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、薬理学的に誘導される炎症である。重要なビタミンおよびミネラルの欠乏を含めた特定の薬物または外因性化合物が、炎症をもたらすことは公知である。例えば、ビタミンＡ欠乏症は、炎症性応答の増加を引き起こし、ビタミンＣ欠乏症は、結合組織疾患を引き起こし、およびビタミンＤ欠乏症は、骨粗鬆症をもたらす。特定の薬理学的薬剤は、炎症性合併症、例えば、薬物により誘導される肝炎を誘導する可能性がある。コカインおよびエクスタシーなどの特定の違法薬物は、炎症と密接に関連する転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ）を活性化することにより、いくつかの有害作用を及ぼし得る。放射線療法は、曝露および投薬の部位によって、肺毒性、熱傷、心筋炎、粘膜炎および他の組織傷害を誘導する可能性がある。
【０１１１】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、感染症により誘導される。感染性生物は、身体の他の部分に伝染することができる場合、循環系またはリンパ系を介して隣接する組織の境界に逃れることができる。生物が、急性炎症の作用に含有されない場合、近傍のリンパ管を経てリンパ系に接近することができる。リンパ管の感染症は、リンパ管炎として公知であり、リンパ節の感染症は、リンパ腺炎として公知である。病原体は、循環系へのリンパ排液によって血流に接近することができる。感染症には、細菌性膀胱炎、細菌脳炎、汎発性インフルエンザ、ウイルス脳炎およびウイルス性肝炎（Ａ、ＢおよびＣ）があるがこれに限定されない。
【０１１２】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、組織または器官傷害により誘導される。組織または器官傷害には、熱傷、裂傷、創傷、穿刺または外傷があるがこれに限定されない。
【０１１３】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、移植拒絶反応により誘導される。レシピエントの免疫系が移植器官または組織を攻撃するので、移植器官または組織が移植レシピエントの身体に受け入れられない場合に移植拒絶反応は起こる。適応免疫応答、移植拒絶反応は、Ｔ細胞媒介と体液免疫（抗体）機序の両方によって媒介される。移植拒絶反応は、超急性拒絶反応、急性拒絶反応または慢性拒絶反応に分類することができる。移植器官または組織の急性および／もしくは慢性拒絶反応は、拒絶反応が、よく理解されていない急性および／もしくは慢性炎症性であり、移植組織に対する免疫応答によるところである。移植拒絶反応としては、急性または慢性ＧＶＨＤいずれかの移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）も挙げられる。ＧＶＨＤは、移植された髄において機能的免疫細胞が、レシピエントを「外来である」と認識し、免疫学的攻撃を開始する同種骨髄移植の一般的な合併症である。それは、特定の状況下で輸血において起こる可能性もある。ＧＶＨＤは、急性および慢性形態に分けられる。急性および慢性ＧＶＨＤは、異なる免疫細胞サブセット、異なるサイトカインプロファイル、幾分異なる宿主標的を含むように見え、処置に対して異なる応答を示す。別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、Ｔｈ１媒介性炎症性疾患により誘導される。正しく機能している免疫系において、免疫応答により免疫誘起を行うのに適するバランスのとれた炎症誘発性Ｔｈ１応答および抗炎症性Ｔｈ２応答が得られるはずである。一般的に言って、炎症誘発性Ｔｈ１応答が一旦開始されると、身体は、Ｔｈ２応答により呼び起こされる抗炎症性応答を利用して、このＴｈ１応答を打ち消す。この反作用の応答は、アトピーにおけるＩｇＥおよび好酸性応答の促進と関連する、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３、さらに抗炎症性応答を有するＩＬ−１０などのＴｈ２型サイトカインの放出を含む。Ｔｈ１媒介性炎症性疾患は、急性および／または慢性炎症をもたらすＴｈ１細胞により生じる過剰な炎症誘発性応答を含む。Ｔｈ１媒介性疾患は、ウイルス的、細菌的または化学的（例えば、環境的）に誘導され得る。例えば、Ｔｈ１媒介性疾患を引き起こすウイルスは、慢性または急性感染症を引き起こす可能性があり、呼吸器障害またはインフルエンザを引き起こし得る。
【０１１４】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、急性および／または慢性神経原性炎症を含む。急性および／または慢性神経原性炎症とは、末梢知覚神経終末から放出されるＳＰもしくはＣＧＲＰの様な炎症性分子の放出によって開始および／または維持される炎症応答（すなわち、これら神経における脊髄への正常な求心性シグナル伝達と対照的に、遠心性機能）のことを指す。急性および／または慢性神経原性炎症には、一次炎症および二次神経原性炎症の両方がある。一次神経原性炎症とは、一次知覚神経終末（ＣおよびＡ−デルタ線維など）からの物質の放出により開始される、またはそれに起因する組織炎症（炎症症候）のことを指す。二次神経原性炎症とは、知覚神経終末を刺激し、神経からの炎症メディエータの放出を引き起こすペプチドまたはサイトカインなど、非ニューロン起源の炎症メディエータ（例えば、肥満細胞または免疫細胞など間質から得られる血管ベッドもしくは組織由来の溢出物）により開始される組織炎症のことを指す。急性および／または慢性神経原性炎症の両方の形態（一次および二次）の正味の作用は、末梢知覚神経線維の感作により維持される炎症状態を有し得る。得られた急性および／または慢性神経原性炎症の生理的結末は、例えば、皮膚痛覚（アロディニア、痛覚過敏）、関節疼痛および／または関節炎、内臓疼痛および機能不全、肺機能不全（喘息、ＣＯＰＤ）ならびに膀胱機能障害（疼痛、過活動膀胱）などを生じる問題とする組織によって決まる。
（投与経路）
【０１１５】
Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞集団は、いくつかの適当な投与経路により対象に投与され得る。典型的な方法には、血管注射、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または対象の標的部位への細胞の直接内植があり得る。
【０１１６】
送達の他の方法には、気管内送達、鞘内送達、骨内送達、肺送達、口腔送達、エアゾール送達、吸入送達および経口送達があり得る。さらに他の方法には、動脈内送達、大脳内送達、腸内送達、心臓内送達、皮下送達、筋肉内送達、眼窩内送達、包内送達、脊椎内送達、腹腔内送達、胸骨内送達、膀胱内送達、リンパ管内送達、体腔内送達、膣送達、直腸送達、経尿道送達、真皮内送達、眼内送達、耳送達、乳房内送達、同所性送達、気管内送達、病巣内送達、経皮送達、内視鏡的送達、経粘膜送達、舌下送達、および体表上の直接の塗布（例えば、皮膚表面に直接）があり得る。
【０１１７】
細胞は、対象への注射または内植による導入を容易にする送達デバイスに挿入され得る。そのような送達デバイスには、レシピエント対象の身体に細胞および流体を注射するための管、例えば、カテーテルがあり得る。そのような送達デバイスには、内視鏡送達デバイスおよび方法もあり得る。好ましくは、管は、それにより本開示の細胞が所望の位置で対象に導入され得る針、例えば、注射器をさらに有する。
【０１１８】
細胞は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチン結合活性を増大するための操作／手順の後に送達され得る、またはいくつかの実施形態において、冷凍保存され、その後対象への投与前に解凍され得る。細胞は、送達のために様々な異なる形態で調製され得る。例えば、そのような送達デバイスに含有される場合、細胞は溶液もしくはゲルに懸濁され、または支持基質内に包埋され得る。細胞は、本開示の細胞が生存可能なままである薬学的に許容される担体または希釈剤と混合され得る。薬学的に許容される担体および希釈剤には、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒および／または分散媒がある。そのような担体および希釈剤の使用については、当技術分野において周知である。溶液は、好ましくは無菌の流体である。好ましくは、溶液は、製造および貯蔵状態で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の使用により細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される。溶液は、薬学的に許容される担体または希釈剤および、必要に応じて、他の成分中に本明細書に記載の細胞を組み込み、その後フィルター殺菌することにより調製され得る。
【０１１９】
細胞投与に針または血管支援デバイス（例えば、カテーテルベースの）注射技術による血管内送達を使用して、血管系全体に、または例えば肝臓、もしくは腎臓もしくは他の任意の器官など特定の器官の血管系への分布を達成することもできる。これは、血管系の非特異的標的化を含む。別法として、例えば、肝臓門脈など特定の注射部位を選択することにより、任意の器官を標的とすることができる。別法として、注射は、身体の任意の静脈へ全身的に実行され得る。この方法は、高齢の患者において幹細胞数を増大するのに有用である。加えて、細胞は、空いている幹細胞ニッチに定住するように機能する、または新たな幹細胞を作製して器官を補充し、このように器官機能を改善することができる。例えば、細胞は、血管系内の周皮細胞位置を利用することができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞集塊（例えば、膵島）、組織または器官の一部として、例えば、器官移植方法の一部として対象に導入される。
【０１２１】
細胞の送達を使用して、活性がある血管形成の部位を標的することもできる。例えば、内皮前駆細胞または間葉系幹もしくは前駆細胞の送達は、創傷部位での血管形成応答を増大することができる。血管形成の標的化は、媒体として細胞を使用して腫瘍に薬物を標的するのにも有用であり得る。
（修飾細胞およびそれらの調製方法）
【０１２２】
少なくとも一部において、それらの増加したホーミング能力により、特定のＥ−および／またはＬ−セレクチン発現細胞は、本明細書に記述される方法に有用である。例として、細胞は、本明細書に記述される方法による再生治療法のために臨床移植におけるＨＳＰＣなどの幹細胞の生着、細胞ベースの療法におけるＭＳＣの使用（例えば、骨疾患の場合）、または受傷／損傷組織での前駆／幹細胞の遊走および浸潤の方向付けを改善することができる。
【０１２３】
したがって、本明細書に記述される方法に使用される細胞は、Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する。したがって、例えば、修飾後に、細胞は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンを結合する。様々な実施形態において、修飾細胞は、Ｐ−セレクチンを結合することができる。特定の一実施形態において、修飾後に、細胞は造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）として公知のシアロフコシル化ＣＤ４４グリコフォームを発現する。別の特定の実施形態において、修飾後に、細胞は神経細胞接着分子Ｅ−セレクチンリガンド（ＮＣＡＭ−Ｅ）を発現する。特定の実施形態において、修飾後に、細胞はＨＣＥＬＬとＮＣＡＭ−Ｅの両方を発現する。特定の実施形態において、細胞はＨＣＥＬＬおよび／またはＣＤ４３−Ｅおよび／またはＣＬＡを発現する。修飾後に、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨髄および／または炎症の部位にホーミングできる。
【０１２４】
特定の実施形態において、本明細書に記述される方法に使用される細胞は、Ｌ−セレクチンリガンドを発現する。特定の一実施形態において、修飾後に、細胞は造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）、シアロフコシル化ＣＤ４４グリコフォームとして公知の強力なＬ−セレクチンリガンドを発現する。別の実施形態において、細胞は、増加量のＬ−セレクチンリガンドであるＨＣＥＬＬおよび／もしくはＰＳＧＬ−１、またはＥ−セレクチンリガンドであるＨＣＥＬＬ、ＣＬＡ、ＣＤ４３−Ｅ、ＮＣＡＭ−ＥもしくはＥＳＬ−１を発現する。そのような細胞は、内皮細胞上でＥ−セレクチンに結合することにより、または炎症部位内の浸潤白血球で発現されるＬ−セレクチンに結合することにより炎症の部位に付着することができる。
【０１２５】
グリコシルトランスフェラーゼを使用する生細胞表面グリカンのｅｘ  ｖｉｖｏでの特別操作の場合、処理後に処理細胞は、生存可能なままであり、表現型が保存されていることが必須である。これまで、マンガンなどの二価金属補因子が、α（１，３）−フコシル基トランスフェラーゼの酵素活性に重要であると考えられ、明らかに細胞毒性があるレベル（例えば、１０ｍＭ  Ｍｎ＋＋）でそのような補因子が使用された。しかしながら、これらのグリコシルトランスフェラーゼが、二価金属補因子（例えば、マンガン、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、コバルトまたはニッケルなどの二価カチオン）の非存在下、または存在下、比較的少量で酵素活性を保有することがここで知らてれている。さらに、これらの酵素は、それ自体細胞に毒性があり得るグリセロールなどの安定剤の非存在下で保存され得る。米国特許第７，８７５，５８５号に記述される特定のグリコシルトランスフェラーゼ組成物は、生細胞上のグリカンの修飾に特に有用であり、その細胞および／またはその粒子もしくは断片は、本明細書に記述される処理方法において次いで使用され得る。幹細胞を利用する適用において、特徴的な系統に沿う分化が、酵素的処理による影響を受けるかどうか分析することも重要である。
【０１２６】
様々な方法が、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンを結合する細胞を調製するのに利用され得る。
【０１２７】
例えば、米国特許第７，８７５，５８５号ならびに第８，０８４，２３６号は、生細胞上の細胞表面グリカンのｅｘ  ｖｉｖｏ修飾のための組成物および方法を提供し、その後者は、本明細書に記載の急性または慢性炎症の処置の方法に利用され得る。組成物は、細胞生存率を保持するために特別に処方された反応緩衝液および反応条件において適当なドナーヌクレオチド糖と一緒に使用するために、精製したグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよび生理的に許容可能な溶液を含む。特定の好ましい実施形態において、生理的に許容可能な溶液は、二価金属補因子を含まないか、または細胞生存率が損なわれないような程度で実質的に含まない。これらのおよび他の好ましい実施形態において、組成物は、例えば、グリセロールなどの安定剤化合物を含まないか、または実質的に含まない。グリコシルトランスフェラーゼには、例えば、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ（sialytransferase）およびＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼがある。一実施形態において、フコシルトランスフェラーゼは、アルファ１，３フコシルトランスフェラーゼＩＩＩ、アルファ１，３フコシルトランスフェラーゼＩＶ、アルファ１，３フコシルトランスフェラーゼＶ、アルファ１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩ、アルファ１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩＩまたはアルファ１，３フコシルトランスフェラーゼＩＸなどのアルファ１，３フコシルトランスフェラーゼである。シアリルトランスフェラーゼは、ＳＴ３ＧａｌＩＩ、ＳＴ３ＧａｌＩＶまたはＳＴ３ＧａｌＶＩであり得る。
【０１２８】
グリカンは、細胞の集団を上記グリコシルトランスフェラーゼ組成物の１つまたは複数と接触させることにより細胞の表面で修飾される。細胞は、グリコシルトランスフェラーゼが酵素活性を有する条件下で適当なヌクレオチド糖ドナー（例えば、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸）と一緒にグリコシルトランスフェラーゼ組成物と接触される。この方法によるグリカン修飾は、処理の２４時間後またはそれを超えて少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い生存率を有する細胞をもたらす。一実施形態において、例えば、細胞は、処理の４８時間後で少なくとも７０％の生存率を有する。そのような一実施形態において、例えば、細胞は、処理の４８時間後で少なくとも７５％の生存率を有する。一実施形態において、例えば、細胞は、処理の４８時間後で少なくとも８０％の生存率を有する。加えて、細胞の表現型（グリカン修飾以外）は、処理後に好ましくは維持される。維持された表現型は、細胞が、天然の機能および／または活性を維持していることを意味する。例えば、細胞が幹細胞である場合、細胞は、特定の幹細胞型に特徴的になるような能力、すなわち、関連する全能性または多能性または多分化能または単能性を保持する。
【０１２９】
本明細書に記述される処置方法に使用する細胞を修飾する別の方法は、米国特許出願第２０１３／００４０８３７号に見ることができる。そこに記述されている方法によると、非核酸標的に特異的に結合する核酸（例えば、アプタマー）を、細胞膜上に固定化することができる。アプタマーは、特定のタンパク質に結合できるものなど特定の標的に対して選択され得る。したがって、例えば、細胞表面受容体／細胞接着分子（例えば、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン）に結合するアプタマーを、細胞の表面に固定化して、細胞標的化を改善することができる。アプタマーは、（ｉ）細胞（トリプシン処理後に懸濁液中にある）をスルホン化ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ−ビオチン）で処理して細胞表面にビオチン基を導入するステップと、（ｉｉ）ストレプトアビジンと複合体形成させるステップと、（ｉｉｉ）ビオチン化アプタマーとカップリングするステップとを含む３ステップ修飾過程を使用して細胞表面にコンジュゲートされ得る。この手法を使用して、Karpらは、この手順を使用して、代表的には細胞当たり約２１，０００個の分子が付加され、細胞表面上のアプタマーの部位密度が、コンジュゲーションに使用するアプタマー濃度を調整することにより容易に調整され得ることを、ＵＳ２０１３／００４０８３７に報告した。
【０１３０】
セレクチン結合の発現は、ｓＬｅｘもしくはｓＬｅａ部分またはセレクチンを結合する他のオリゴ糖複合体の共有結合による付加によっても誘導され得る。例えば、ＵＳ２０１１／０２０６７４０においてKarpらによってより完全に記述され、例証されているように、ビオチン−ストレプトアビジンコンジュゲーションを利用して、細胞表面にシアリル−ルイスＸ部分を化学的に組み込んだ。より具体的には、細胞の表面に存在する遊離アミン基を、ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド基と反応させて、細胞表面をビオチン化した。このステップは、その後続けて、細胞表面のビオチン部分をストレプトアビジン分子と反応させた。ビオチンとストレプトアビジンの間の強い相互作用により、ストレプトアビジン分子を細胞表面に固定化することが可能になる。ストレプトアビジンを、ビオチン化ＳＬｅＸ（シアリル−Ｌｅｘ−ＰＡＡ−ビオチン）と次いで反応させて、細胞表面にＳＬｅＸを導入する。
【０１３１】
細胞表面のグリカン操作のための別の手法において、例えば、Srivastavaら、J.  Biol.  Chem.  １９９２年、２６７巻：２２３５６〜２２３６１頁により記述されるようにフコシル基トランスフェラーゼを使用して、細胞表面にｓＬｅｘまたはｓＬｅａグリカンのアセンブリ全体を組み込まれる。より具体的には、Srivastavaらは、フコース残基１個の転移にドナーとしてＧＤＰ−フコースを通常使用する人乳から部分的に精製したＬｅ−ＦｕｃＴが、非常に大きく立体的に厳しい構造によりＣ−６で置換されているフコース残基も転移され得ることを報告した。したがって、フコシル基トランスフェラーゼを使用してシアリル−ルイスＸなどのグリカンを転移させて、それにより集団細胞の表面上のＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現のレベルをそのような細胞の天然集団の発現のレベルより高く増加させ得る。
【０１３２】
別の実施形態において、様々な二官能性化学的リンカーを使用して、ｓＬｅｘもしくはｓＬｅａグリカン、またはｓＬｅｘもしくはｓＬｅａの糖模倣体、またはｓＬｅｘもしくはｓＬｅａのペプチド模倣体（例えば、ファージディスプレイ技術により生成することができる）を共有結合により付加することができる。同様に、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに結合するｍＡｂもしくはそのｍＡｂ断片を細胞表面にコンジュゲートして、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに対する結合をそれぞれ増大することができる。
【０１３３】
前述に加えて、細胞（単数）もしくは細胞（複数）を修飾して、Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現させる他の任意の方法を利用することができる。この方法は、例えば、細胞表面とリガンド、ファージディスプレイ産物などとの共有結合性および／もしくは非共有結合性相互作用、水素結合、ならびに／またはファンデルワールス力（van  der  Wals）を促進するステップを含む。
【０１３４】
一般に、任意の型の細胞が、本明細書に記述される処理方法で修飾および使用され得る。動物使用の場合、細胞は動物起源のものであることが好ましく、一方でヒト使用の場合、細胞はヒト細胞であることが好ましく；各場合において、自己細胞起源を使用することができ、同系（syngeniec）起源細胞を使用することができ、同種異系起源細胞を使用す
ることができ（所与の細胞産物における同種異系ドナー細胞の組み合わせを含める）、または異種細胞起源を使用することができる。細胞は、初代細胞、例えば、初代肝細胞、初代ニューロン細胞、初代筋芽細胞、初代間葉系幹細胞、初代前駆細胞であることができ、または細胞は、樹立細胞株または培養により増大された細胞（例えば、Ｔ細胞、樹状細胞等）の細胞であることができる。細胞は、細胞分裂を受ける能力がある必要はなく；最終分化した細胞を、本明細書に記述される方法に使用することができる。この文脈において、細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、誘導多能性幹細胞、血液前駆細胞、組織前駆細胞、上皮、内皮、ニューロン、脂肪、心臓、骨格筋、繊維芽、免疫細胞（例えば、樹状細胞、単球、マクロファージ、白血球［例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球などのリンパ球、または調節性リンパ球（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋）などのＴリンパ球のサブセット］、ナイーブ  Ｔ細胞、セントラルメモリＴ細胞、エフェクターメモリＴ細胞、エフェクターＴ細胞、ＮＫ細胞等）、肝、脾、肺、循環血液細胞、血小板、生殖細胞、消化管細胞、腎臓細胞、骨髄細胞、心臓細胞、内皮細胞、内分泌細胞、皮膚細胞、筋細胞、ニューロン細胞および膵臓細胞を含むがこれに限定されない任意の細胞型であり得る。細胞は、細胞株、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、組織幹／前駆細胞［例えば、神経幹細胞、消化管幹細胞、筋幹細胞、心筋前駆細胞／幹細胞、内皮前駆細胞、または肺幹細胞］、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞、または脳、肝臓、肺、腸、胃、脂肪、筋肉、精巣、子宮、卵巣、皮膚、脾臓、内分泌器および骨等を含むがこれに限定されない任意の組織から単離される初代細胞であることができる。
【０１３５】
細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で維持される場合、従来の組織培養条件および方法を使用することができ、それらは当業者に公知である。様々な細胞に対する単離および培養方法は、当業者の知見の範囲内である。
【０１３６】
加えて、異種および同種の細胞集団の両方が、本明細書に記述される方法および組成物での使用に考えられる。加えて、細胞の集塊、粒子に取り付いているまたはその中に封入されている細胞、ヒドロゲルなど注射可能な送達媒体内の細胞、および移植可能な基材（骨格を含む）に取り付いているまたは骨格／移植可能な基材を保有する組織中に塗布されている細胞が、本明細書に記述される方法および組成物での使用に考えられる。さらに、細胞は、組織増殖／促進剤および／または抗炎症剤（例えば、成長因子、サイトカイン、プロスタグランジン、栄養剤、レゾルビン、ＮＳＡＩＤＳ、ステロイド等）と併用して使用され得る。
【０１３７】
本開示は、以下に挙げた実施形態をさらに含む。
【０１３８】
実施形態１．対象の標的組織への細胞送達を増大するおよび／または対象の標的組織における組織定着を増大する方法であって、対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記細胞投与が、標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
【０１３９】
実施形態２．対象における炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害、または病状を処置する方法であって、対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記細胞投与が、標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われ、前記集団が、投与された細胞の天然集団と比較して炎症および／または損傷組織内で増大された局在化および／または定着を呈示する方法。
【０１４０】
実施形態３．対象における標的組織への細胞送達を改善する方法であって、対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を、血管への送達によっておよび／または直接組織注射によって（すなわち、罹患組織部位に直接）および／または髄腔内（intrethecally）および／または腔内および／または膀胱内
および／または解剖学的管路（胆管系、泌尿器系等）中および／または組織上に（すなわち、罹患組織上への配置）投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記細胞投与が、標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われ、前記投与された細胞集団が、細胞の天然集団と比較して増大されたホーミング、定着および生着のうちの１つまたは複数を実現する方法。
【０１４１】
実施形態４．対象の炎症および／または損傷組織において細胞送達および定着を増大する方法であって、Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を前記炎症および／または損傷組織へ直接注射するまたはその上／中に配置するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記注射／配置が、標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
【０１４２】
実施形態５．対象の標的組織への細胞送達、定着および／または生着を増大する方法であって、対象の血管系を通じてＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記投与が、標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
【０１４３】
実施形態６．対象において標的組織内での細胞集団の付着、定着および／または生着を増大する方法であって、Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を標的組織に直接注射するまたは標的組織上へ配置するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記注射が、標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われ、前記集団が、細胞の天然集団と比較して増大された標的組織定着を実現する方法。
【０１４４】
実施形態７．対象における炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害、または病状を処置する方法であって、対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記注射が、炎症および／または損傷組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または炎症および／または損傷組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
【０１４５】
実施形態８．対象において腫瘍／悪性疾患を処置する方法であって、対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記投与が、腫瘍／悪性細胞を保有している組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または腫瘍／悪性細胞を保有している組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
【０１４６】
実施形態９．対象における炎症および／または損傷組織として現れる疾患、障害、または病状の処置用医薬の製造に使用するためのＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団であって、処置が、対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記処置が、集団を炎症および／もしくは損傷組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致してならびに／または炎症および／もしくは損傷組織内の白血球の蓄積と一致して投与するステップを含む、集団。
【０１４７】
実施形態１０．腫瘍／悪性疾患の処置用医薬の製造に使用するためのＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団であって、処置が、対象にＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを発現し、前記処置が、集団を腫瘍／悪性組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現と一致しておよび／または腫瘍／悪性組織内の白血球の蓄積と一致して投与するステップを含む、集団。
【０１４８】
実施形態１１．前記細胞投与が、標的組織内の内皮細胞上のＥ−セレクチン発現、およびＬ−セレクチンを有する白血球の浸潤と一致して行われる、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１４９】
実施形態１２．前記投与／注射が、ある／その炎症および／または損傷組織への白血球の浸潤の間に行われる、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１５０】
実施形態１３．ある／その炎症および／または損傷組織の環境における、投与された細胞の集団の生着をさらに含む、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１５１】
実施形態１４．免疫調節効果が、ある／その炎症および／または損傷組織における細胞の定着により実現される、実施形態１から１３のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１５２】
実施形態１５．組織修復効果が、ある／その炎症および／または損傷組織における投与された細胞の定着により実現される、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１５３】
実施形態１６．増大された宿主防御／免疫応答効果が、ある／その炎症および／または損傷組織における投与された細胞の送達および定着により実現される、実施形態１から１５のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１５４】
実施形態１７．抗悪性効果が、ある／その腫瘍／悪性組織部位における投与された細胞の定着により実現される、実施形態１から１６のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１５５】
実施形態１８．前記投与／注射が、細胞集団の１回または一連の注射を含む、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１５６】
実施形態１９．前記投与／注射が、細胞集団の毎日、毎週、隔週、毎月または毎年の注射を含む、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の方法または細胞の集団。
【０１５７】
実施形態２０．対象における事前投与／注射の免疫調節効果が低下したら、細胞集団を１回または複数回追加で投与／注射するステップをさらに含む、実施形態１から９のいずれか１つに記載の方法または細胞の集団。
【０１５８】
実施形態２１．細胞集団が、静脈内投与／注射される、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の方法または細胞の集団。
【０１５９】
実施形態２２．細胞集団が、炎症および／または損傷組織への直接注射により投与される、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法または細胞の集団。
【０１６０】
実施形態２３．細胞集団が、炎症組織および／または損傷組織上に配置される、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法または細胞の集団。
【０１６１】
実施形態２４．細胞集団が、ある／その炎症組織および／または損傷組織上に配置される、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法または細胞の集団。
【０１６２】
実施形態２５．細胞集団が、他の促進剤、抗炎症剤、または組織骨格／移植可能なデバイス／ゲルと組み合わせて利用される、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法または細胞の集団。
【０１６３】
実施形態２６．細胞の集団が、Ｅ−セレクチンリガンドおよびＬ−セレクチンリガンドを発現する、実施形態１から２５のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１６４】
実施形態２７．Ｅ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドが、造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）、神経細胞接着分子Ｅ−セレクチンリガンド（ＮＣＡＭ−Ｅ）、ＣＤ４３Ｅ、ＣＬＡおよびＥＳＬ−１のうちの１つまたは複数から選択される、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１６５】
実施形態２８．Ｅ−セレクチンリガンドが、造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）および／または神経細胞接着分子Ｅ−セレクチンリガンド（ＮＣＡＭ−Ｅ）である、実施形態１から２７のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１６６】
実施形態２９．Ｅ−セレクチンリガンドが、ＨＣＥＬＬである、実施形態１から２８のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１６７】
実施形態３０．Ｅ−セレクチンリガンドが、ＮＣＡＭ−Ｅである、実施形態１から２９のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１６８】
実施形態３１．Ｌ−セレクチンリガンドが、ＨＣＥＬＬである、実施形態１から３０のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１６９】
実施形態３２．細胞集団が、上皮、内皮、ニューロン、脂肪、心臓、骨格筋、繊維芽および免疫細胞（例えば、樹状細胞、単球、マクロファージ、白血球［例えば、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球などのリンパ球、または調節性リンパ球（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋）などのＴリンパ球のサブセット］、細胞傷害性リンパ球、等）、肝、脾、肺、循環血液細胞、血小板、生殖細胞、消化管、腎臓、骨髄、膵臓細胞、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、組織幹／前駆細胞［例えば、神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞］、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞、または誘導多能性幹細胞、または胚性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞から得られる分化した前駆細胞、または成体幹細胞から得られる分化した前駆細胞、または任意の組織（例えば、脳、肝臓、肺、腸、胃、脂肪、筋肉、精巣、子宮、卵巣、皮膚、脾臓、内分泌器および骨）から単離される初代細胞、または培養により増大された前駆細胞集団、または培養により増大された幹細胞集団、または培養により増大された初代細胞集団のうちの１つまたは複数を含む、実施形態１から３１のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１７０】
実施形態３３．細胞集団が、間葉系幹細胞、造血幹細胞、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞または胚性幹細胞である、実施形態１から３２のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１７１】
実施形態３４．細胞集団が、白血球（例えば、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球などのリンパ球、または調節性リンパ球［ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋］、細胞傷害性Ｔ細胞などのＴリンパ球のサブセット、等）である、実施形態１から３３のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１７２】
実施形態３５．疾患、障害または病状が、直接的な組織傷害（例えば、熱傷、外傷、褥瘡性潰瘍等）、虚血／血管事象（例えば、心筋梗塞、脳卒中、ショック、出血、凝血障害等）、感染症（例えば、蜂巣炎、肺炎、髄膜炎、敗血症、ＳＩＲＳ等）、異常増殖（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、リンパ腫、白血病等）、免疫学的／自己免疫症状（例えば、移植片対宿主疾患、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸疾患、紅斑性狼蒼、関節リウマチ、乾癬等）、変性疾患（例えば、骨粗鬆症、変形関節炎、アルツハイマー病等）、先天的／遺伝的疾患（例えば、表皮水疱症、骨形成不全症、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ハンチントン舞踏病等）、薬物副作用（例えば、薬物により誘導される肝炎、薬物により誘導される心傷害等）、毒性傷害（例えば、放射線被曝、化学的曝露、アルコール性肝炎、アルコール性膵炎、アルコール性心筋症、コカイン心筋症等）、代謝異常（例えば、尿毒症性心膜炎、代謝性アシドーシス等）、医原性症状（例えば、放射線により誘導される組織傷害、手術関連合併症等）および／または特発性の過程（例えば、筋萎縮側索硬化、パーソネイジ−ターナー症候群等）のうちの１つまたは複数である、実施形態１から３４のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１７３】
実施形態３６．疾患、障害または病状が、糖尿病である、実施形態１から３５のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１７４】
実施形態３７．疾患、障害または病状が、多発性硬化症である、実施形態１から３６のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１７５】
実施形態３８．対象が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシである、実施形態１から３７のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１７６】
実施形態３９．対象がヒト患者である、実施形態１から３８のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１７７】
実施形態４０．細胞集団は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドが強制発現された修飾細胞集団を形成するように処理され、細胞集団が、処理の２４時間後に少なくとも７０％の生存率を有する、実施形態１から３９のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１７８】
実施形態４１．細胞集団が、処理の２４時間後に少なくとも８０％の生存率を有する、実施形態１から４０のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１７９】
実施形態４２．細胞集団が、処理の４８時間後に少なくとも７０％の生存率を有する、実施形態１から４０のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１８０】
実施形態４３．対象へ細胞集団を投与すると、細胞集団が浸潤白血球を含む組織中に付着する、実施形態１から４２のいずれか１つに記載の方法または集団。
【０１８１】
実施形態４４．投与が、組織への直接注射または組織上への配置である、実施形態４３に記載の方法または集団。
【０１８２】
実施形態４５．投与が血管に対してである、実施形態４３に記載の方法または集団。
【０１８３】
実施形態４６．集団が、末梢血管アクセスまたは中心血管アクセスのいずれかによって全身的に投与される、実施形態１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
【０１８４】
実施形態４７．集団が、カテーテルに基づく手法、または対象とする部位に血管への細胞のボーラスを送達し得る他の血管アクセスデバイスを使用して、対象とする組織部位の解剖学的栄養血管内に血管内投与される、実施形態１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
【０１８５】
実施形態４８．集団が、脊柱管および／または脳室内への導入により投与される、実施形態１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
【０１８６】
実施形態４９．集団が、カテーテルに基づく手法または直接注射のいずれかにより体腔へと直接投与される、実施形態１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
【０１８７】
実施形態５０．集団が、血管内手法もしくは経皮手法のいずれかを使用して局所組織直接注射により、もしくは解剖学的に到達可能な組織部位へ直接、および／または画像技術による誘導で投与される、実施形態１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
【０１８８】
実施形態５１．集団が、関連する組織表面／部位への直接配置により投与される、実施形態１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
【０１８９】
実施形態５２．集団が、骨格内に投与される、もしくは組織中に配置された骨格内に埋め込まれるか、および／またはゲル中にて投与される、および／または促進剤と一緒に投与される、実施形態１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
【０１９０】
実施形態５３．集団が、脳脊髄液へ投与される、実施形態１から２１または２５から４２のいずれかに記載の方法または集団。
【０１９１】
本開示について詳細に記述したが、添付の請求の範囲に定義される本開示の範囲を逸脱することなく改変および変更が可能であることは明らかである。さらにまた、本開示にある例の全てが、非限定的な例として提供されていることは、理解されるべきである。
【実施例】
【０１９２】
次の非限定的な実施例は、本開示をさらに示すために提供される。当業者であれば、後述の実施例に開示されている技法が、本発明者らが、本開示の実践において十分に機能することを見出したアプローチを表し、よって、その実践の形態の例を構成すると考慮することができることを認められよう。しかし、当業者は、本開示を踏まえて、開示されている具体的な実施形態に多くの変更を加えても、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、類似または同様の結果を依然として得ることができることを認めるべきである。
（実施例１）
脂肪由来間葉系幹細胞のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ処理は、ＨＣＥＬＬの発現を強制する
【０１９３】
先の研究は、α（１，３）−フコシルトランスフェラーゼによって骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をグリカン操作して、強力なＥ−およびＬ−セレクチンリガンドＨＣＥＬＬを作製することができることを示した（R  Sacksteinら、Nature  Medicine  １４巻：１８１〜１８７頁（２００８年））。非骨髄供給源に由来するＭＳＣ上のＨＣＥＬＬ発現が強制され得るか決定するために、本発明者らは、脂肪由来間葉系幹細胞上のα（１，３）−エクソフコシル化の効果を解析した。この目的のため、痩せたおよび肥満対象の両方に由来する脂肪吸引材料から脂肪組織を得て、記載されている通りに間葉系幹細胞を培養した（R  Sacksteinら、Nature  Medicine  １４巻：１８１〜１８７頁（２００８年））。正常酸素（２１％Ｏ２）および低酸素（＜５％Ｏ２）条件下の両方で、ＦＢＳ（２０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）またはヒト血小板溶解物（５％ヒト血小板溶解物および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）のいずれかを補充したＭＳＣ培地において、細胞を低密度（コンフルエンス＜６０％）で育成した。コンフルエンスが６０％に近づいたらＭＳＣを継代し、継代３〜６でＭＳＣを収集した。次に、２０ｕｇ／ｍｌのフコシルトランスフェラーゼＶＩＩ（ＦＴＶＩＩ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって、二価カチオンを含まない懸濁液中に調製）でまたはフコシルトランスフェラーゼＶＩ（６０ｍＵ／ｍｌ（R  Sacksteinら、Nature  Medicine  １４巻：１８１〜１８７頁（２００８年）））でＭＳＣ（２０×１０６／ｍｌ）を処理し、いずれの場合でも、二価カチオンを含まず、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ヒト血清アルブミンおよび１ｍＭ  ＧＤＰ−フコース（Ｓｉｇｍａ）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で６０分間３７℃で処理した一方、対照細胞（バッファー処理）は、ＦＴＶＩＩを含まないまたはＦＴＶＩを含まない同じバッファー中で処理した。ヨウ化プロピジウムおよびアネキシンＶ染色を使用したデュアルレーザーフローサイトメトリーにより、細胞生存率をルーチンに評価した。細胞生存率は、ＦＴＶＩまたはＦＴＶＩＩのいずれかによるα（１，３）−エクソフコシル化後２４時間目に、一貫して８０％を超えていた。図２４〜図２６を参照されたい。
（実施例２）
ヒト血液白血球のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ処理は、細胞上の高レベルＥ−セレクチンリガンド活性を誘導し、ＨＣＥＬＬの発現を強制する
【０１９４】
所望の細胞（例えば、幹細胞、前駆細胞、白血球等）の表面上のＥセレクチンリガンド（すなわち、ＨＣＥＬＬおよび他のＥ−セレクチンリガンド）の強制発現は、罹患組織（単数または複数）内の内皮細胞上の血管Ｅ−セレクチン発現に基づき、組織炎症／損傷の部位および腫瘍／がん浸潤の部位へと血管内輸送するこれらの細胞の高い能力を付与すると考えられる。その上、投与された細胞は、内皮細胞において発現されたＥ−セレクチンへのＥ−セレクチンリガンド附着性により血管周囲区域内に集まり、さらに、投与された細胞は、Ｌ−セレクチンリガンド附着性により、炎症／損傷またはがん組織環境内の浸潤する白血球の表面に呈示されたＬ−セレクチンにもつなぎ留めるため、ひとたび血管外遊出すると、関連する投与された細胞の表面上のＨＣＥＬＬ（または他の強制されたＥ−セレクチン／Ｌ−セレクチンリガンド）の発現は、標的組織内における投与された細胞の定着を促進するよう機能するであろう。したがって、幹細胞／前駆細胞上および特異的白血球サブセット（例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、単球、樹状細胞および顆粒球、ならびに治療目的のために培養において増大された関連する白血球（例えば、抗原特異的Ｔ細胞、増大されたＮＫ細胞、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ
Ｔ細胞）等）を含む）上のＨＣＥＬＬならびに他のＥ−セレクチンリガンドおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現の強制は、養子細胞療法において利用することができる（組織再生／修復のため、および／または免疫を増強するもしくは免疫を弱めるための免疫療法のため）。よって、決定的なことに、ＨＣＥＬＬの強制発現は、Ｅ−セレクチン依存性内皮相互作用による標的部位への血管内投与された細胞の効率的な輸送を可能にし、血液で運ばれる細胞の動員を生じ、その後、別々の組織微小環境による、血管外遊出した細胞のＥ−セレクチン媒介性およびＬ−セレクチン媒介性の付着を生じるであろう。さらに、同様に、斯かる細胞を、炎症組織／損傷の罹患部位（単数または複数）またはがんの部位へと直接注射した場合、ＨＣＥＬＬおよび他のＥ−セレクチン／Ｌ−セレクチンリガンドの強制発現は、組織環境内における細胞のＥ−セレクチン媒介性およびＬ−セレクチン媒介性の付着／定着を促進するであろう。
【０１９５】
細胞表面α（１，３）−エクソフコシル化の分子標的、ならびに白血球Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンリガンド活性に対するエクソフコシル化の効果を解析するために、クエン酸塩処理（citrated）全血から得た初代ヒト末梢血白血球で研究を行った。免疫磁気ビーズ選別（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により、白血球を単球（ＣＤ１４＋細胞）、ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球およびＢ細胞（ＣＤ１９＋細胞）に分離した。２０ｕｇ／ｍｌのフコシルトランスフェラーゼＶＩＩ（ＦＴＶＩＩ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって、二価カチオンを含まない懸濁液中に調製）でまたはフコシルトランスフェラーゼＶＩ（６０ｍＵ／ｍｌ（R  Sacksteinら、Nature  Medicine  １４巻：１８１〜１８７頁（２００８年）））で細胞を処理し、いずれの場合でも、二価カチオンを含まず、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ヒト血清アルブミンおよび１ｍＭ  ＧＤＰ−フコース（Ｓｉｇｍａ）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で６０分間３７℃で処理した一方、対照細胞（バッファー処理）は、ＦＴＶＩＩを含まないまたはＦＴＶＩを含まない同じバッファー中で処理した。ヨウ化プロピジウムおよびアネキシンＶ染色を使用したデュアルレーザーフローサイトメトリーにより、細胞生存率をルーチンに評価した。細胞生存率は、ＦＴＶＩまたはＦＴＶＩＩのいずれかによるエクソフコシル化後２４時間目に、一貫して８０％を超えていた。図２７（Ａ）〜図２７（Ｃ）および図２８（Ａ）〜図２８（Ｃ）を参照されたい。
（実施例３）
ヒト樹状細胞の初代培養物のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ処理は、細胞上の高レベルＥ−セレクチンリガンド活性を誘導し、ＨＣＥＬＬの発現を強制する
【０１９６】
ヒト樹状細胞のＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチンリガンド活性をモジュレートするα（１，３）−エクソフコシル化の能力を評価するために、抗ＣＤ１４コーティングされた磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して（ＣＤ１４−Ｓ）、またはプラスチック附着により（ＰＡ−Ｓ）、ヒト末梢血単核細胞から単球を単離し、続いて標準プロトコールに従って、サイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦと共に６日間培養して、単球由来樹状細胞（ｍｏ−ＤＣ）への分化を誘導した。ＣＤ１４の発現に関してフローサイトメトリーによって単球純度を評価し、ＢＤＣＡ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６（それぞれＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）の発現を染色することによりｍｏ−ＤＣの分化および成熟を評価した。次に、２０ｕｇ／ｍｌのフコシルトランスフェラーゼＶＩＩ（ＦＴＶＩＩ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって、二価カチオンを含まない懸濁液中に調製）でまたはフコシルトランスフェラーゼＶＩ（６０ｍＵ／ｍｌ（R  Sacksteinら、Nature  Medicine  １４巻：１８１〜１８７頁（２００８年）））でＭｏ−ＤＣを処理し、いずれの場合でも、二価カチオンを含まず、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ヒト血清アルブミンおよび１ｍＭ  ＧＤＰ−フコース（Ｓｉｇｍａ）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で６０分間３７℃で処理した一方、対照細胞（バッファー処理）は、ＦＴＶＩＩを含まないまたはＦＴＶＩを含まない同じバッファー中で処理した。ヨウ化プロピジウムおよびアネキシンＶ染色を使用したデュアルレーザーフローサイトメトリーにより、細胞生存率をルーチンに評価した。細胞生存率は、ＦＴＶＩまたはＦＴＶＩＩのいずれかによるエクソフコシル化後２４時間目に、一貫して８０％を超えていた。図２９（Ａ）〜図２９（Ｃ）および図３０（Ａ）〜図３０（Ｅ）を参照されたい。
（実施例４）
ヒト調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の初代培養物のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ処理は、細胞上の高レベルＥ−セレクチンリガンド活性を誘導し、ＨＣＥＬＬの発現を強制する；ＨＣＥＬＬ＋Ｔｒｅｇ投与は、自家細胞によって誘導される異種間ＧＶＨＤを抑制する
【０１９７】
炎症部位への免疫調節細胞（ＭＳＣおよびＴｒｅｇ等）の送達を増大する能力は、免疫性疾患（例えば、ＧＶＨＤ、関節リウマチ等）および感染に対する過剰増殖性炎症性応答（例えば、敗血症、劇症ウイルス肝炎等）における組織損傷を弱める養子細胞療法の潜在力を改善するよう機能するであろう。この目的のため、本発明者らは、ヒト−マウスＧＶＨＤモデルに対する異種間移植片対宿主病を処置する血管内投与された初代ヒトＴｒｅｇの能力におけるα（１，３）−エクソフコシル化の効果を調査した。本発明者らは、ＧＶＨＤを誘導した自家リンパ球供給源に由来するＴｒｅｇの能力を評価しようと試みたが、その理由として、この戦略が、臨床造血幹細胞移植に関連する（すなわち、Ｔｒｅｇは、ドナー造血／免疫細胞接種材料から増大され、したがって、ドナーＴｒｅｇは、ドナー免疫細胞によって誘導されたＧＶＨＤの処置に使用される）ことが挙げられる。この目的のため、健常ヒトドナーの全血のフィコール勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。負の選択の磁気イムノビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ＣＤ４−ｈｉｇｈ／ＣＤ１２７−ｌｏｗ  Ｔ細胞を単離し、ＩＬ−２を補充した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  ｍＡｂ存在下の培養において増大させて、ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋／ＣＤ２５＋細胞（Ｔｒｅｇ）を産生した。同じドナー対象由来の未分画ＰＢＭＣを、ＮＳＧ宿主マウスの腹腔内にＩＰ注射した（１０７細胞／マウス）。注射から１４日後に（したがって、Ｔｒｅｇ増大の１４日目に）、増大されたＴｒｅｇ細胞を採取し、続いて、２０ｕｇ／ｍｌのフコシルトランスフェラーゼＶＩＩ（ＦＴＶＩＩ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって、二価カチオンを含まない懸濁液中に調製）でまたはフコシルトランスフェラーゼＶＩ（６０ｍＵ／ｍｌ（R  Sacksteinら、Nature  Medicine  １４巻：１８１〜１８７頁（２００８年）））で処理し、いずれの場合でも、二価カチオンを含まず、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ヒト血清アルブミンおよび１ｍＭ  ＧＤＰ−フコース（Ｓｉｇｍａ）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で６０分間３７℃で処理した一方、対照細胞（バッファー処理）は、ＦＴＶＩＩを含まないまたはＦＴＶＩを含まない同じバッファー中で処理した（ヨウ化プロピジウムおよびアネキシンＶ染色を使用したデュアルレーザーフローサイトメトリーにより、細胞生存率をルーチンに評価した；細胞生存率は、ＦＴＶＩまたはＦＴＶＩＩのいずれかによるエクソフコシル化後２４時間目に、一貫して８０％を超えていた）。次に、マウスに、２．５×１０５細胞／マウスの用量のバッファー処理（ＢＴ）Ｔｒｅｇまたはエクソフコシル化Ｔｒｅｇのいずれかを血管内注射した。次に、マウスを臨床的に経過観察し、初回ＰＢＭＣ注射後から５０日間マウスの体重をモニターした。図に示すデータは、ヒトＴｒｅｇのＦＴＶＩＩ処理が、ＨＣＥＬＬを含むＥ−セレクチンリガンドの発現を誘導することを明らかにする。異種間ＧＶＨＤ（自家ＰＢＭＣの事前の投与によって誘導）を有するマウスへのエクソフコシル化された自家由来Ｔｒｅｇの注射は、体重減少の回復によって証明される通り、ＧＶＨＤの弱まりをもたらす；エクソフコシル化Ｔｒｅｇは、���フコシル化ＴｒｅｇよりもＧＶＨＤの回復において３倍強力である。図３１〜図３４を参照されたい。
（実施例５）
ＭＳＣおよびヒト血液白血球のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ処理は、スタンパーウッドラフリンパ球附着性アッセイによって評価される通り、細胞上のＬ−セレクチンリガンド活性を誘導する
【０１９８】
スタンパーウッドラフリンパ球附着性アッセイは、Ｌ−セレクチンリガンド活性を評価するための従来のツールである（R.  Sackstein、Immunol.  Rev.２３０巻：１４０〜１
６３頁（２００９年））。リンパ節高内皮細静脈へのリンパ球結合の分子基盤を評価するために１９７０年代半ばに考案されたこのアッセイは、関連する細胞の表面に発現されたその同族リガンド（単数または複数）に取り付くＬ−セレクチン（生きているリンパ球の表面において元々発現されている）の能力を測定する。本アッセイは、回転性剪断条件下で行われ、これにより、結合相互作用に別々の生物物理学的制限を設ける：最も強力なＬ−セレクチンリガンド（ガラスに取り付いている細胞の表面に提示）のみが、回転するリンパ球懸濁液上に呈示されたＬ−セレクチンの附着性を支持し得る。実際に、このアッセイにおけるリンパ球のＬ−セレクチン媒介性結合の支持に十分なほど頑強な唯一のＬ−セレクチンリガンドは、リンパ節高内皮細静脈において呈示されたＨＣＥＬＬおよび「内皮」Ｌ−セレクチンリガンド（まとめると、これらのＬ−セレクチンリガンドは、「アドレシン」と呼ばれる）である（R.  Sackstein、Immunol.  Rev.２３０巻：１４０〜１６３頁（２００９年））。
【０１９９】
α（１，３）−エクソフコシル化によって誘導されるＬ−セレクチンリガンド活性の発現を評価するために、天然細胞、バッファー処理細胞およびα（１，３）−エクソフコシル化細胞のサイトスピン調製物に対してスタンパーウッドラフを行った。簡潔に説明すると、ヒト血液から新鮮に調製されたリンパ球懸濁液（ＲＰＭＩ  １６４０培地中に１０７／ｍｌリンパ球）により、細胞遠心分離（cytocentrifugation）によってスライド上に置かれた関連する細胞の調製物を含有するガラス製スライドの表面を覆った。剪断（８０ｒｐｍ）下、４℃で３０分間のインキュベーションのため、回転プラットフォームにスライドを置いた。次に、スライドをＰＢＳでリンスして、非附着性リンパ球を除去し、３％グルタルアルデヒドにおいて固定し、メチルグリーン−チオニンで染色した。光学顕微鏡により、細胞遠心分離された細胞へのリンパ球附着性に関してスライドを検鏡した。２５０×拡大率下で接眼グリッド（ocular  grid）を使用して、細胞遠心分離した細胞のコンフルエント区域に附着性のリンパ球の数を計数することにより、Ｌ−セレクチンリガンド活性を測定した。附着性リンパ球（lymphcyte）を有する細胞遠心分離した細胞をスコア化
し、細胞遠心分離した細胞の総細胞叢（lawn）内の斯かる細胞のパーセンテージを定量化する（表１のキーに示す通り）。
【表１】
2022003094.tif 000002
【０２００】
表１に示す通り、天然ＭＳＣは、Ｌ−セレクチン結合活性がないが、ＭＳＣのα（１，３）−エクソフコシル化は、著しいＬ−セレクチン結合活性を誘導し、Ｌ−セレクチン媒介性リンパ球結合が、本質的に全てのエクソフコシル化細胞において観察される。ヒトＣＤ４  Ｔ細胞、ヒト単球およびヒト樹状細胞はそれぞれ、中程度のＬ−セレクチン結合活性を呈示するが、これらの細胞は、α（１，３）−エクソフコシル化後に頑強なＬ−媒介性リンパ球附着性を支持する。ヒトＴｒｅｇ、Ｂ細胞およびＣＤ８細胞は、Ｌ−セレクチンリガンド活性を元々保持しないが、各細胞型は、α（１，３）−エクソフコシル化によってＬ−セレクチンに結合するように誘導することができ、エクソフコシル化Ｔｒｅｇは、Ｌ−セレクチン附着性の著しい増加を示す。よって、Ｌ−セレクチン結合は、α（１，３）−エクソフコシル化後に本質的に全てのヒト白血球において増大され、特に、Ｌ−セレクチンリガンド活性は、α（１，３）−エクソフコシル化によってヒトＭＳＣ、ＣＤ４
Ｔ細胞、単球、樹状細胞およびＴｒｅｇにおいて著しく誘導され得る。いずれの場合でも、このＬ−セレクチン結合活性は、強制されたＨＣＥＬＬ発現の反映であり、図２５、図２８（Ａ）〜図２８（Ｃ）、図３０（Ａ）〜図３０（Ｅ）および図３３に表示されているｓＬｅｘ／Ｅ−Ｉｇを染色するウェスタンブロットデータによって示される通り、これらの細胞上のＨＣＥＬＬ発現の結果と釣り合っている。
（実施例６）
マウスＭＳＣ上のＨＣＥＬＬ発現は、ＮＯＤマウスにおける向膵臓性（Pancreatotropism）を認可し、自己免疫性糖尿病の耐久性のある回復を付与する
（序文）
【０２０１】
糖血症管理の薬物療法における有意な進歩にもかかわらず、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は依然として、有意な罹患率および死亡率を伴い、革新的処置戦略を要求する主要な公衆衛生上の負担を課し続ける［１、２］。細胞に基づく免疫調節療法が、Ｔ１Ｄの処置における有望なアプローチとして登場した［３］。それらの免疫調節特性、安全性プロファイル、容易な取得および頑強なｅｘ  ｖｉｖｏ増大のため、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、Ｔ１Ｄを含む様々な難治性免疫媒介性疾患の処置のための最も急速に成長している細胞療法になった［４〜７］。ＮＯＤマウスを使用した前臨床モデルにおいて、本発明者らおよび他の研究者らは近年、全身投与されたＭＳＣが、自己免疫性糖尿病の減弱において有用性を有することを報告した［８〜１３］。しかし、高血糖の回復におけるＭＳＣ治療法の利益は一時的なものであり、Ｔ１Ｄに対するＭＳＣに基づく治療法の有効性を改善するための戦略を開発する差し迫った必要を強調する［６］。
【０２０２】
免疫調節細胞療法の効力は、炎症組織へと輸送する注入された細胞の能力に密接に関係している［１４、１５］。一部の器官（例えば、心臓）に関して、罹患部位への細胞の直接（局所）注射は、生理的利益に必要な定着を達成することができる［１６］。しかし、Ｔ１Ｄの処置に関して、膵臓実質への細胞の直接注射は、著しい生命にかかわる膵臓炎症を誘導し得るプロテアーゼおよび他の酵素の放出を誘発しかねないため、細胞送達の血管経路が義務付けられる。組織への血液由来の細胞の遊走は、標的組織内皮上の係留／ローリング接着性相互作用によって惹起される。このような結合相互作用の最も強力なメディエータは、それらのそれぞれのリガンド上に発現されたシアロフコシル化グリカン決定基に結合する、３種のＣａ＋＋依存性レクチンのファミリーであるセレクチン（Ｅ−、Ｐ−およびＬ−セレクチン、それぞれＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２ＰおよびＣＤ６２Ｌとしても公知）である［１７］。重要なことに、あらゆる炎症性部位の微小血管系内において、内皮セレクチンであるＥ−セレクチンは、ＴＮＦ−α等、炎症性サイトカインに応答して誘導的に発現される［１７、１８］。Ｅ−セレクチンは、「シアル酸付加されたルイスＸ」（ｓＬｅｘ）として公知のシアロフコシル化四糖を原型において呈示する循環細胞上の膜糖タンパク質および／または糖脂質に結合する。しかし、ＭＳＣは、Ｅ−セレクチンリガンドを元々発現しない［１９］。このような輸送上の欠損は、静脈内投与後に炎症末梢組織におけるＭＳＣの生着を限定し［１７、２０］、ＭＳＣに基づく治療法の有用性を制約する。したがって、本発明者らは、炎症した膵臓へのＭＳＣ輸送が、Ｅ−セレクチンリガンド発現を強制するための細胞表面グリカン修飾により認可され得るか、また、これが、ＮＯＤマウスの新たに発症した自己免疫性糖尿病におけるＭＳＣ治療効果（単数または複数）に影響するか調査しようと試みた。本発明者らの知見は、糖尿病におけるＭＳＣ効果の生物学に関する新たな洞察を提供し、糖尿病ＮＯＤマウスにおける高血糖を回復するマウスＭＳＣの能力の増大における、Ｅ−セレクチンリガンドＨＣＥＬＬの強制発現の特有かつ卓越した役割を強調する。
（材料と方法）
（マウス）
【０２０３】
Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂ６．１２９（Ｃｇ）−Ｃｄ４４ｔｍ１Ｈｂｇ／Ｊ（ＣＤ５７ＢＬ／６遺伝的背景におけるＣＤ４４−／−；ＣＤ４４−ノックアウト（「ＣＤ４４−ＫＯ」））、ＢＡＬＢ／ｃおよびＮＯＤマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、ハーバード・メディカル・スクールの動物管理収容施設（Harvard  Medical  School  Facilities  for  Animal  Care  and  Housing）において病原体を含まない環境で収容および／または飼育した。マウスの使用を必要とする実験は、施設内実験動物委員会（Institutional  Animal  Care  and  Use  Committee）によって承認された。
（ＭＳＣ培養）
【０２０４】
以前に記載された通りに骨髄ＭＳＣを得た［９、１０］。手短に説明すると、Ｃ５７ＢＬ／６（野生型）またはＣＤ４４−ＫＯマウスから単離された骨髄細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｏｎｚａ）、１０ｎｇ／ｍｌ線維芽細胞増殖因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ変法イーグル培地からなる培養培地においてフラスコ内に播種した。培養継代４〜６におけるＭＳＣを実験に使用した。
（ＭＳＣ特徴付けおよび分化）
【０２０５】
関連するアイソタイプ対照と共に、細胞表面マーカーＳｃａ１、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ４５、ＣＤ２９およびＣＤ１０５に対する抗マウス抗体（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）を使用したフローサイトメトリーによってＭＳＣを特徴付けた。組換えマウスＥ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）−ヒトＦｃキメラは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。以前に記載された通り、様々な中胚葉系列へと分化するそれらの能力に関してＭＳＣを検査した［２１、２２］。簡潔に説明すると、培養培地におけるアスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）およびＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）により、ＭＳＣの軟骨形成分化を誘導した。培養３週間後に、プレートをＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、光学顕微鏡による軟骨可視化のために０．０５％アルシアンブルーで染色した。培養培地におけるアスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、β−グリセロリン酸ナトリウム（１０ｍＭ）およびデキサメタゾン（１０ｎＭ）により、骨形成分化を誘導した。２週間後、プレートを洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、特徴的なカルシウム沈着物の可視化のために２％アリザリンレッドで染色した。１％ウシ胎児血清、１％グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＦ１２培地におけるデキサメタゾン（１００ｎＭ）およびインスリン（６ｎｇ／ｍｌ）の添加により、脂肪形成分化を誘導した。細胞を４％パラホルムアルデヒド（parafomaldehyde）において固定し、６０％イソプロパノール中０
．３％オイルレッド溶液で染色して、脂質を含んだ液胞を評価した。
（ＭＳＣエクソフコシル化）
【０２０６】
懸濁液におけるＭＳＣ（反応液２００ｕｌ当たり１０×１０６個）を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ヒト血清アルブミンおよび１ｍＭ  ＧＤＰ−フコースを含有するＣａ２＋およびＭｇ２＋不含ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）からなる反応バッファーにおける６０ｍＵ／ｍＬフコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＴＶＩ）により（「ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣ」）、または反応バッファー単独により（未修飾ＭＳＣ）、９０分間３７℃で処理した。処理後に、０．２％ＨＳＡおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するＨＢＳＳでＭＳＣを洗浄した。トリパンブルー排除およびヨウ化プロピジウム染色により細胞生存率を評価した（剥離および処理２４時間後に一貫して＞８５％生存率）。フローサイトメトリーによってＦＴＶＩ修飾を評価した。ＦＴＶＩ酵素は、Ｒｏｌａｎｄ  Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ博士（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって提供された。
（ウェスタンブロット解析）
【０２０７】
バッファーＡ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍｇ／ｍＬフッ化フェニルメチルスルホニル、０．０２％アジ化ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））における２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）とのインキュベーションにより、ＦＴＶＩ修飾および未修飾ＭＳＣ溶解物を調製した。ホールセル溶解物または免疫沈降されたタンパク質のウェスタンブロットは全て、以前に記載された通りに７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて還元条件下で行った［１９］。各レーンにおける溶解物の量は、行ったウェスタンブロット毎に細胞数に対して正規化した。Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ）を使用したケミルミネッセンスによりブロットを可視化した。
（フローサイトメトリーおよび免疫沈降研究）
【０２０８】
フローサイトメトリーは、以前に記載された通りに行った［１９］。さらなる詳細については、補足方法セクションを参照されたい。
（平行平板型フローチャンバー接着アッセイ）
【０２０９】
以前に記載された通りに［１９］、平行平板型フローチャンバー（２５０μｍチャネル深さ×５．０ｍｍチャネル幅）を使用して動的流動接着アッセイを行って、刺激されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）上のＥ−セレクチン媒介性ＭＳＣ結合を評価した。さらなる詳細については、補足方法セクションを参照されたい。
（ｈＧＨウイルスベクターによるＭＳＣの形質導入）
【０２１０】
以前に記載された通りに［２１］、ｈＧＨプラスミド構築物を含有するレンチウイルスによりＭＳＣを形質導入した。ＭＳＣ上清および注射された動物の血清において、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によってｈＧＨのレベルを測定した。
（ＧＦＰウイルスベクターによるＭＳＣの形質導入）
【０２１１】
以前に記載された通りに［２１］、ＧＦＰを含有するレトロウイルスプラスミドによりＭＳＣを形質導入した（ＧＦＰ−ＭＳＣ）。形質導入されたＭＳＣを、蛍光顕微鏡によりＧＦＰの核周囲発現に関して評価した。ＧＦＰ−ＭＳＣを使用してホーミングを評価するための補完的アプローチにおいて、ＭＳＣ（非ＧＦＰ形質導入）を蛍光色素ＣＦＳＥで標識した。
（免疫蛍光）
【０２１２】
膵臓をＴｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ  ＯＣＴに包埋し、凍結し、クライオミクロトーム（cryomicrotome）において切片作製した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅ−１０００落射蛍光顕微鏡（×４０
０総拡大率）を使用して、免疫蛍光像を取得した。特異的染色に関するさらなる詳細については、補足方法セクションを参照されたい。
（マイトジェン刺激ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞増殖アッセイ）
【０２１３】
抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激を使用したＴ細胞増殖アッセイを使用して、ＭＳＣの免疫調節能力におけるＦＴＶＩ修飾の効果を評価した。簡潔に説明すると、１×１０５個のＮＯＤ脾細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）および１％グルタミン（Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｌｏｎｚａ）において、用量設定濃度（５×１０２〜５×１０４）の放射線照射された（３０００ｒａｄ）未修飾およびＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの存在下、精製されたマウス抗ＣＤ３ｅおよび抗ＣＤ２８（ウェル当たり各１μｇ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により７２時間刺激した。７２時間インキュベーション期間の最後の１２時間において、細胞に、１μＣｉのトリチウム標識チミジンを瞬間適用し、シンチレーション計数によりリンパ球増殖（３Ｈ−チミジン取込み）を測定した。３回複製試料の平均として（平均ｃｐｍ±ＳＥＭ）結果を報告する。
（ＮＯＤマウスにおける新たに発症した高血糖の回復の研究）
【０２１４】
高血糖（＞２５０ｍｇグルコース／ｄＬ）２日目に、ならびに高血糖発病後の７日目および３０日目に、未修飾およびＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣ（２００ｕｌにおける０．５×１０６細胞）を雌ＮＯＤマウスに麻酔なしの尾静脈経由で静脈内注射した。高血糖におけるＭＳＣ投与の効果を評価するために、以前に記載された通りに［９、１０］尾静脈より血液を得て、グルコースを測定した。
（統計学）
【０２１５】
スチューデントｔ検定およびマン・ホイットニーの検定を使用して、実験的アッセイおよび免疫組織学的実験のデータを解析した。カプラン・マイヤー解析を使用して生存データを評価した。解析を行い、グラフを作成するために、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。Ｐ値＜０．０５を有意と考慮した。データは、平均±ＳＥＭを表す。
（補足方法）
（フローサイトメトリーおよび免疫沈降研究）
【０２１６】
ビオチン化ｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２（抗ヒト皮膚リンパ球抗原、ｓＬｅｘを認識；ラットＩｇＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））および抗マウスＣＤ４４  ｍＡｂ（ＫＭ１１４；ラットＩｇＧ１）、精製された抗マウスＣＤ４４  ｍＡｂ（ＩＭ７；ラットＩｇＧ２ｂ）およびフィコエリトリン（ＰＥ）標識されたストレプトアビジン（全てＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）を使用して、以前に記載された通りに１９フローサイトメトリーを行った。ウェスタンブロッティングのため、抗ＣＤ４４免疫沈降抗体（ＫＭ１１４／ＩＭ７）または適切なアイソタイプ対照と共にＭＳＣ溶解物をインキュベートし、続いてプロテインＧ−アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により採取した。２％ＮＰ−４０、１％ＳＤＳを含有するバッファーＡを使用して、免疫沈降物を十分に洗浄し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、二フッ化ポリビニリデン膜へと転写し、ＨＥＣＡ４５２または抗マウスＣＤ４４抗体（ＫＭ１１４／ＩＭ７）で免疫染色し、続いて、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ）を使用したケミルミネッセンスによる可視化のために適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体とインキュベーションした。
（平行平板型フローチャンバー接着アッセイ）
【０２１７】
コンフルエントなＨＵＶＥＣを、ＴＮＦ−α（４０ｎｇ／ｍｌ）で６時間刺激して、Ｅ−セレクチン発現を上方調節した。野生型（ＷＴ）およびＣＤ４４ＫＯ  ＭＳＣを０．００５％トリプシン／ＥＤＴＡにより収集し、９０分間３７℃でＦＴＶＩ修飾したか、またはバッファー単独で処理した（対照）。次に、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを補充したハンクス平衡塩類溶液に、１０６細胞／ｍｌとなるようＭＳＣを再懸濁した。ＨＵＶＥＣ単層上にＭＳＣを０．５ダイン／ｃｍ２で灌流し、続いて、３分間間隔で１．０、２．０、５．０、１０．０、２０．０および３０．０ダイン／ｃｍ２の剪断応力レベルに付した。ＨＵＶＥＣと相互作用したＭＳＣ（視野においてローリングした、または１０秒間の時間枠内で視野にローリングした細胞）をチャンバー中央に見て、各剪断応力レベルにつき最小で６視野を用いた。刺激されたＨＵＶＥＣへのＥ−セレクチン結合の特異性を評価するための対照として、ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣをＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のシアリダーゼ（０．１Ｕ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ）で処理して、ｓＬｅｘから末端シアル酸を切断し、また、機能遮断抗ヒトＥ−セレクチンｍＡｂ（１０ｕｇ／ｍｌ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下での附着性も評価した。
（免疫蛍光）
【０２１８】
組織をクリオスタットで１０ｕｍ厚に切片作製し、冷アセトンにおいてスライド上で５分間固定した。乾燥させた後に、切片を１％ＢＳＡでブロッキングし、一次抗体において一晩インキュベートした。切片をＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）において３回洗浄し、二次抗体と１時間インキュベートした。一次ラット抗マウスＣＤ６２Ｅ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１：１００）および二次ＰＥコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１：５００）を使用してＥ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）染色を行った。アイソタイプマッチしたラットｍＡｂを染色対照として使用した。ラット抗マウスＣＤ３１（Ｂｉｏｃａｒｅ、１：２００）および二次ＰＥコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１：５００）を使用してＣＤ３１染色を行った。ＣＤ３１およびＥ−セレクチン同時局在化の評価を連続切片において行った。精製されたモルモット抗インスリン（Ｄａｋｏ、１：５）およびＡＰＣコンジュゲートロバ抗モルモットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１：２００）を使用してインスリン染色を行った。ＨＥＣＡ４５２  ｍＡｂ（ラット抗ＣＬＡ  ＩｇＭ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：２００））およびＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗ラットＩｇＭ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：５００）を使用して、組織切片内のＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣを検出した。マウント用培地単独で、または指示される場合はＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を含有するマウント用培地で切片の表面を覆い、カバーガラスをかけ、続いて免疫蛍光顕微鏡によって可視化した。
（結果）
（ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの発現および機能解析）
【０２１９】
糖尿病抵抗性系統であるＣ５７ＢＬ／６マウス（「野生型」）、およびＣＤ４４−ＫＯマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるＣＤ４４−／−）由来の骨髄由来ＭＳＣは、特徴的な小型の紡錘状線維芽細胞様パターンを示し、中胚葉細胞型へと分化させることができた（図７）。ＭＳＣは、ＭＳＣに特徴的な細胞表面マーカーを発現した（図１（Ａ））。ＭＳＣは、ｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２（正準シアロフコシル化Ｅ−セレクチン結合決定基（シアル酸付加されたルイスＸ（ｓＬｅｘ）等）を認識する）との反応性の非存在、およびＥ−セレクチンリガンド活性のプローブとして機能するＥ−セレクチン−Ｉｇ
キメラ（Ｅ−Ｉｇ）への結合の非存在によって示される通り、Ｅ−セレクチンリガンドを元々発現しなかった（図１（Ｂ））。
【０２２０】
ヒトＭＳＣに関する先の研究は、α−（１，３）−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＴＶＩ）を使用した細胞表面糖鎖工学的操作（すなわち、グリコシルトランスフェラーゼプログラム化立体置換（ＧＰＳ））が、天然膜ＣＤ４４から、Ｅ−セレクチンに強力に結合するＣＤ４４のフコシル化シアリルラクトサミニルグリコバリアント（sialyllactosaminyl  glycovariant）である造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）として知られる分子への変換によりＥ−セレクチン附着性を誘導することを示した［１９］。細胞表面エクソフコシル化が、マウスＭＳＣ上のＥ−セレクチンリガンド活性をプログラムすることができるか決定するために、細胞生存率を保存するように最適化された反応条件を使用して、ＦＴＶＩで細胞を処理した。ＭＳＣのＦＴＶＩ修飾は、ｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２による染色と共に、マウスＥ−セレクチン−Ｉｇキメラ（ｍＥ−Ｉｇ）との結合を顕著に誘導した（図１（Ｂ））。注目すべきことに、ＦＴＶＩ修飾に先立つＭＳＣのプロテアーゼ消化は、ｍＥ−Ｉｇ反応性を顕著に低減し、糖脂質ではなく糖タンパク質が、Ｅ−セレクチン結合決定基の優勢な担体であることを示す（図１（Ｂ））。マウスＭＳＣのエクソフコシル化後に、ホールセル溶解物（図１（Ｃ））および免疫沈降されたＣＤ４４（図１（Ｄ））のウェスタンブロットは、Ｅ−ＩｇおよびＨＥＣＡ−４５２によって認識されるシアロフコシル化でデコレートされた主要な膜糖タンパク質が、ＣＤ４４の「標準」（すなわち、スプライスバリアントエクソンを含有しない）形態である（ほぼ１００ｋＤａ）ことを明らかにした。これらのデータは、ＦＴＶＩ修飾が、マウスＭＳＣ表面ＣＤ４４をＨＣＥＬＬに変換することを示す。
（ＦＴＶＩ修飾マウスＭＳＣは、生理的剪断応力条件下でＥ−セレクチンへの結合増加を有する）
【０２２１】
生理的剪断応力条件下でＥ−セレクチンに結合するＦＴＶＩ修飾マウスＭＳＣの能力を評価するために、本発明者らは、未修飾およびＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの両方の平行平板型フローチャンバーアッセイを行った。この目的のため、先ずＨＵＶＥＣ単層をＴＮＦ−αで刺激して、Ｅ−セレクチン発現を上方調節した。図２に示す通り、ＦＴＶＩ修飾は、０．５ダイン／ｃｍ２から２０ダイン／ｃｍ２もの強さの剪断応力レベルにおけるＨＵＶＥＣへのＭＳＣ接着を可能にした。フローチャンバー研究において、機能遮断Ｅ−セレクチンｍＡｂとＨＵＶＥＣとのインキュベーションおよびＭＳＣのシアリダーゼ処理（ｓＬｅｘ呈示を排除するため）はそれぞれ、未修飾ＭＳＣと同様のレベルまで、ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの接着を著しく低減したため、刺激されたＨＵＶＥＣへのＭＳＣ附着性は、Ｅ−セレクチン受容体／リガンド相互作用に厳密に依存した（図２）。まとめると、これらの知見は、マウスＭＳＣのＦＴＶＩ修飾が、強力なＥ−セレクチン結合活性を誘導し、後毛細細静脈に典型的なものを優に越えた血行動態剪断応力レベルにおいてＥ−セレクチン附着性を持続することができることを示す［１７］。
（全身投与されたＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣは、ＮＯＤマウスにおける新たに発症した高血糖を強力に回復させる）
【０２２２】
ＦＴＶＩ修飾が、ＮＯＤマウスにおける糖尿病をモジュレートするＭＳＣの能力に影響したか否かを評価するために、新たに発症した糖尿病ＮＯＤマウスに、細胞を与えなかった（未処置対照）、または５×１０５個のＦＴＶＩ修飾もしくは５×１０５個の未修飾Ｃ５７ＢＬ／６  ＭＳＣを高血糖（グルコース＞２５０ｍｇ／ｄＬ）２日目に静脈内で（尾静脈経由）与え、続いて高血糖発病後７および３０日目に静脈内注射した。図３（Ａ）に示す通り、未処置ＮＯＤマウスは、その血中グルコースレベルの急速な増加を示し、１匹の動物を除いて、高血糖発病の数週間以内に死亡した。自己免疫性糖尿病の一時的な回復（すなわち、９匹のマウスのうち３匹が、３週間目に正常血糖であり、９匹の動物のうち２匹が、６週間目に正常血糖であり、全動物が１２週間目までに高血糖になった）をもたらす未修飾ＭＳＣの投与と比較して（図３（Ｂ））、ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの注入は、高血糖を頑強かつ永続的に回復させた（図３（Ｃ））。際だったことに、８匹のマウスのうち７匹が、３週間正常血糖であり、８匹のマウスのうち６匹が、６週間正常血糖を維持し、８匹のマウスのうち５匹は、初回処置後１２週間を超えて糖尿病がなかった（図３（Ｃ））。６００ｍｇ／ｄｌを超える血中グルコースレベルを有する未修飾およびＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣ群におけるマウスの大部分は、最大９０日間生存したが、未処置群（すなわち、ＭＳＣを与えなかった）において１匹のみ（７匹のマウスのうち）が９０日間生存した。
（ＮＯＤマウスの膵臓におけるＥ−セレクチン発現およびＭＳＣ局在化）
【０２２３】
膵臓へのＭＳＣ輸送におけるＦＴＶＩ修飾の効果を調べるために、本発明者らは先ず、免疫蛍光顕微鏡を使用して、１４週齢ＮＯＤマウスの膵臓の微小血管系内のＥ−セレクチンの発現を評価した。膵島周囲微小血管は、膵島炎をもたらす炎症性細胞輸送の原発部位であると報告されている［２３、２４］。糖尿病抵抗性マウスの膵臓にはＥ−セレクチン発現がなかった（図４（Ａ））一方、ＮＯＤマウスの膵臓の膵島周囲微小血管は、Ｅ−セレクチンを発現し（図４（Ｂ））、これは、連続切片においてＣＤ３１染色と同時局在化した（図４（Ｃ）および図４（Ｄ））。糖尿病発病におけるＮＯＤ膵臓のＣＤ３染色によって、糖尿病性膵島周縁部へのＴ細胞の浸潤が確認された（図４（Ｅ））。ＮＯＤマウスにおける全身投与されたＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの膵臓浸潤を評価するために、本発明者らは、膵臓の凍結切片を抗体ＨＥＣＡ４５２で染色した。図４（Ｆ）および図４（Ｇ）に示す通り、移植１日後に、Ｅ−セレクチン発現微小血管系の近傍内の膵島周囲区域において、ＨＥＣＡ４５２＋ＭＳＣが観察され、（Ｅ−セレクチン発現）血管周囲領域および（Ｌ−セレクチン発現）Ｔ細胞浸潤の区域に定着する。全身投与後のＦＴＶＩ修飾および未修飾ＭＳＣのホーミングの程度を評価するために、ＧＦＰ形質導入されたＦＴＶＩ修飾および未修飾ＭＳＣをＮＯＤマウスに静脈内注射し、その膵臓、膵および腸間膜リンパ節ならびに脾臓を注射後４日目に収集し、切片作製し、蛍光顕微鏡によってＭＳＣの存在を評価した。ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣは、未修飾ＭＳＣと比較して膵臓の３倍高い浸潤を示した一方、注入されたＦＴＶＩ修飾および未修飾ＭＳＣの膵臓浸潤における差は、糖尿病抵抗性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて観察されなかった（図４（Ｈ））。しかし、処置したＮＯＤマウスのリンパ系組織へのＦＴＶＩ修飾および未修飾ＭＳＣのホーミングの程度における差は示されなかった。
（エクソフコシル化は、ＭＳＣ免疫抑制能力またはｉｎ  ｖｉｖｏ生存に効果がない）
【０２２４】
本発明者らは、ｈＧＨ形質導入ＭＳＣによって産生されるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の測定が、投与されたＭＳＣの長寿命を確かめるための高感度な方法であることを以前に報告した［２１］。投与されたＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの高血糖の回復増大が、生存利点の結果であるか評価するために、高血糖の発病後２および７日目に、５×１０５個のｈＧＨ形質導入されたＦＴＶＩ修飾および未修飾ＭＳＣをＮＯＤマウスに注射し、注射後の様々な時点で血清ｈＧＨを測定した。図５（Ａ）に示す通り、ｈＧＨ産生のパターンに差はなく、ＦＴＶＩ修飾が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＳＣ持続に影響しなかったことを示す。エクソフコシル化が、ＭＳＣ免疫調節能力を修飾するか評価するために、本発明者らは、同時培養Ｔ細胞抑制アッセイを行った。Ｔ細胞増殖は、ＦＴＶＩ修飾および未修飾ＭＳＣによって等しく弱められ（図５（Ｂ））、エクソフコシル化が、ＭＳＣに追加的な免疫調節特性を付与しないことを示す。
（ＭＳＣ  ＣＤ４４発現の非存在は、ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの抗糖尿病効果を抑止する）
【０２２５】
ＣＤ４４発現が、ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの増大された抗糖尿病性効力に必要であるか否か調べるために、本発明者らは、ＣＤ４４  ＫＯマウス（Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景におけるＣＤ４４−／−）からＭＳＣを作製した。ＣＤ４４を除いて、ＣＤ４４  ＫＯマウスの骨髄から作製されたＭＳＣは、同一レベルの細胞表面接着分子を示した。フローサイトメトリーによって、エクソフコシル化ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣは、エクソフコシル化野生型ＭＳＣのものと等価なＨＥＣＡ４５２反応性を示し（図８）、シアロフコシル化決定基が、代替（すなわち、非ＣＤ４４）骨格上に作製されたことを示す。ＣＤ４４  ＫＯ
ＭＳＣの投与が、抗糖尿病活性を付与したか否かを評価するために、それぞれ５×１０５個の細胞のＦＴＶＩ修飾および未修飾ＣＤ４４  ＫＯならびにＣ５７ＢＬ／６野生型ＭＳＣを、高血糖発病後２、７および３０日目に新たに発症した糖尿病ＮＯＤマウスに注射した。未修飾ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣを与えた６匹のマウスのうち５匹、およびＦＴＶＩ修飾ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣを与えた７匹のマウスのうち６匹における自己免疫性糖尿病の回復失敗によって実証される通り、野生型ＭＳＣと比較して、ＭＳＣのＣＤ４４欠乏は、その抗糖尿病効果に有意な損壊をもたらした（それぞれ図６（Ａ）および図６（Ｂ））。ＮＯＤマウスにおける注射後に、ＣＦＳＥ標識したＦＴＶＩ修飾および未修飾ＣＤ４４
ＫＯ  ＭＳＣは、膵臓への輸送に差を示さず（図６（Ｃ））、野生型ＭＳＣに観察されるものと同様のレベルであった（図４（Ｈ））。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＭＳＣ抑制能力は、ＭＳＣ  ＣＤ４４発現の欠如によっても、ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣのエクソフコシル化によっても抑止されず（図６（Ｄ））、投与されたＦＴＶＩ処理ＣＤ４４−／−ＭＳＣの正常血糖効果（単数または複数）の非存在が、免疫調節における固有の欠損に起因し得ないことを示唆する。注目すべきことに、エクソフコシル化が、ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣ上のＨＥＣＡ４５２によって認識可能な細胞表面シアロフコシル化の発現をもたらすにもかかわらず、斯かる細胞が、糖尿病ＮＯＤマウスにおける意図される生物学的成果を実現しないという知見は、細胞表面グリカン操作によって生じる強制されたセレクチン結合の生物学的影響の規定／予測における、誘導されるＥ−ＩｇおよびＨＥＣＡ４５２免疫反応性を評価するためのごく単純なフローサイトメトリー研究を越えた、生化学的研究（例えば、ウェスタンブロット解析）の重要性を明らかに強調する。
（考察）
【０２２６】
それらの免疫調節特性、安全性プロファイルおよび頑強なｅｘ  ｖｉｖｏ増大のため、ＭＳＣは、Ｔ１Ｄを含む様々な難治性免疫媒介性疾患を処置するためのいくつかのヒト治験の焦点となった［６］。ＭＳＣは、Ｔ１Ｄの発生に決定的な病原体構成成分における多面的な免疫調節効果により膵島炎および自己免疫性糖尿病を抑制することが判明した［２５、２６］。これらの効果は、炎症性サイトカイン対調節性サイトカインの発現をモジュレートし、これにより、調節性ＤＣおよびＴ細胞の増大を促進する能力、ならびに自己反応性Ｔ細胞を直接阻害することができる負の同時刺激分子（例えば、ＰＤＬ−１）のＭＳＣ発現を含む［８〜１０、１３］。したがって、ＭＳＣ治療法は、Ｔ１Ｄ処置にとって興味深い特有の戦略となる優れた潜在力を有する。にもかかわらず、Ｔ１ＤにおけるＭＳＣに基づく治療法の効力を改善するための研究の差し迫った必要がある［６］。
【０２２７】
先の研究において、本発明者らは、完全同種異系ＭＳＣの静脈内投与が、糖尿病ＮＯＤマウスにおける高血糖の一過性回復を伴ったことを観察した［９］。本発明者らは、より頑強な抗糖尿病効果の実現における直近のハードルが、炎症した膵臓へのＭＳＣホーミングの相対的な不足であると仮定した。そこで、本発明者らは、強制されたＨＣＥＬＬ発現により増大されたホーミング能力を有するＭＳＣの全身投与が、ＮＯＤモデルにおける糖尿病の回復に影響を与えるか評価しようと試みた。この目的のため、本発明者らは、ＭＳＣの同種異系間供給源としてＣ５７ＢＬ／６系統を利用した。これは、ＣＤ４４  ＫＯ表現型をこの遺伝的背景において利用できるからである。本発明者らは、ＭＳＣの抗糖尿病効果を媒介する免疫機構を以前に調べたことがあるため［９、１０］、ＭＳＣ治療法の効力を評価するための一次エンドポイントとして代謝制御に着目した。
【０２２８】
相対的に短い期間（代表的には＜３０日間）で抗糖尿病介入の効果を特徴的に評価する他の研究とは対照的に、本研究においては、延長された観察期間（９０日間）にわたって自己免疫性糖尿病の回復におけるＭＳＣの効果を評価した。すると本発明者らのデータは、細胞表面α−（１，３）−エクソフコシル化（「ＦＴＶＩ修飾」）による天然膜ＣＤ４４からＨＣＥＬＬへの変換が、Ｅ−セレクチンへの高効率マウスＭＳＣ結合を付与することを示す。本発明者らは、膵島炎を有するＮＯＤマウスの膵臓の膵島周囲区域におけるＥ−セレクチン発現を観察したが、糖尿病抵抗性マウスの膵臓においては観察されなかった。これらの知見と整合することには、本発明者らは、糖尿病抵抗性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ宿主）の膵臓への、注射された同種異系間Ｃ５７ＢＬ／６  ＦＴＶＩ修飾および未修飾ＭＳＣのホーミングのレベルにおける差を観察しなかったが、未修飾ＭＳＣと比較して、糖尿病ＮＯＤマウスにおいて全身投与されたＣ５７ＢＬ／６（同種異系間）ＦＴＶＩ修飾されたＭＳＣの高められた膵臓浸潤が見られ、耐久性のある糖尿病回復が付随した。注目すべきことに、本発明者らは、ＦＴＶＩ修飾および未修飾ＭＳＣを与えた動物の間にリンパ系組織の浸潤における差を観察しなかったが、Ｅ−セレクチン発現微小血管の血管周囲領域内および白血球のクラスター内における細胞の付着／生着の著しい増加が見られた。まとめると、これらのデータは、自己免疫性糖尿病の抑制におけるＭＳＣ膵臓定着の主要な役割に注目を促すが、ＭＳＣの膵外効果の潜在的な寄与を除外しない。
【０２２９】
本研究および先の研究［９］における、静脈内投与された完全に同種異系間の未修飾ＭＳＣを使用して観察される抗糖尿病効果と比較して、本明細書で観察される完全に同種異系のＦＴＶＩ修飾（ＨＣＥＬＬ）ＭＳＣを使用したＴ１Ｄ回復における著しい改善は、糖鎖工学的操作されたＭＳＣそれ自体の増大された免疫抑制能力に、またはＭＳＣの糖鎖工学的操作によって賦与されるｉｎ  ｖｉｖｏ生存利点に起因し得るとは思われない。先の研究において、本発明者らは、ＮＯＲマウスから得られる半同種異系ＭＳＣの静脈内投与後に、ＮＯＤマウスにおける改善された抗糖尿病効果を観察した［１０］。これはおそらく、細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ組織定着／持続改善を生じる半同種異系ＭＳＣの拒絶減少を反映したものである。しかし、臨床適用において、特に、製造および規制上の課題は、「すぐに入手可能な（off-the-shelf）」（すなわち、培養により増大され、プールされた）
同種異系ＭＳＣ製品の使用を支持するため、完全に同種異系供給源ＭＳＣの能力を増強するための戦略を用いることが有利となるであろう。ＨＥＣ４５２反応性によって検出可能なＦＴＶＩ依存性表面シアロフコシル化決定基が明らかに作製されたにもかかわらず、エクソフコシル化ＣＤ４４  ＫＯ  ＭＳＣが、高血糖の耐久性のある回復を誘導する能力を欠くという知見は、ＣＤ４４骨格に明確に呈示されるＥ−セレクチン結合決定基（すなわち、ＨＣＥＬＬの発生）が、強力な抗糖尿病効果の達成に必要とされることを示す。これは、必要な組織ホーミングおよび血管外遊出を成就するためのＨＣＥＬＬ発現の重要な役割に関係している可能性があり［２７］、そして／または関連する微小環境部位における適切な付着を達成するためのＨＣＥＬＬ／ＣＤ４４発現の要求を反映し得る［２８］。ＭＳＣ効果（単数または複数）を達成するためのｉｎ  ｓｉｔｕ組織付着の役割は、免疫特権ゾーンを生じる膵島同種異系移植片とのＭＳＣ同時移植の研究によって強調されてきた［２９〜３１］。この点について、膵島血管周囲区域内および膵島白血球浸潤内のＨＣＥＬＬ＋ＭＳＣの観察される局在化は、免疫調節のライセンス化におけるＨＣＥＬＬの作動的役割を強調する：Ｅ−セレクチンは、罹患組織の内皮床内で発現され、白血球は、Ｌ−セレクチンを特徴的に発現するため、強力なＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチンリガンドであるＨＣＥＬＬの発現は、最も激しい免疫反応性の微小環境内で明確に組織付着を促進するように機能する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＳＣの免疫調節効果のさらなる研究が正当化されるが、本明細書におけるデータは、Ｔ１Ｄの治療法におけるＨＣＥＬＬ＋ＭＳＣの全身投与による増大された向膵臓性の潜在力を強調する。より広範には、Ｅ−セレクチンが、あらゆる炎症性部位における内皮床内でＴＮＦおよびＩＬ−１等のサイトカインによって上方調節されるという事実［１７、１８］は、多種多様な炎症性状態のためにＭＳＣに基づく治療法の効力を改善するために強制されたＭＳＣ  ＨＣＥＬＬ発現を活用する機会を提供する。
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（実施例７）
神経幹細胞の細胞表面グリカン操作は、向神経性を増強し、多発性硬化症のマウスモデルにおける回復を改善する
（序文）
【０２６１】
自然は、循環細胞を炎症および傷害の部位に送達するための極度に効率的な機構を発達させた。このプロセスは、分子相互作用の高度に秩序立てられたカスケードによって制御される（Butcher,  E.C.、１９９１年；Sackstein,  R.、２００５年；Springer,  T.A.
、１９９４年）。細胞動員における第１の必須事象は、内皮表面上の流動細胞の剪断抵抗性接着が関与し、これは、それぞれの対応する受容体に結合する、３種のＣａ２＋依存性レクチンのファミリーであるセレクチン（Ｅ−、Ｐ−およびＬ−セレクチンで構成される）によって最も効率的に媒介されるプロセスである。このような相互作用は、最初に血管壁へと細胞を係留し、血管剪断流の文脈において、一般的な血行動態流を下回る速度において内皮表面に沿って細胞をローリングさせる（ステップ１）。このプロセスは、血管周囲区域に存在する適切なケモカインへの特異的細胞由来のケモカイン受容体の会合を容易にし、これにより、インテグリンファミリーメンバーの接着性増加をもたらす内側から外側へのシグナル伝達事象を誘発する（ステップ２）。次に、活性化された細胞インテグリンと、その対応する内皮細胞カウンター受容体との間の接着性相互作用は、ローリングの静止および血管壁への細胞の堅固な接着をもたらし（ステップ３）、最終的に、経内皮遊走（血管外遊出、ステップ４）をもたらす。
【０２６２】
多発性硬化症（ＭＳ）およびその動物モデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、免疫性エフェクターの動員は、血管セレクチン、Ｅ−およびＰ−セレクチンの上方調節によって媒介される。Ｅ−およびＰ−セレクチンは、ＬＰＳまたはＴＮＦ−αによるｉｎ  ｖｉｖｏ活性化後に脳内皮において発現されるが、マウスＥＡＥにおいて、Ｐ−セレクチンは、一過性にしか発現されない（Piccio,  L.、Rossi,  B.ら、２００２年）
。注目すべきことに、Ｅ−セレクチンは、血管が枝分かれする部位においてパッチ状分布で炎症性期間を通じて発現され、優先的動員区域の存在を示唆する（Piccio,  L.、Rossi,  B.ら、２００２年）。Ｅ−セレクチンは、ＭＳ患者における急性プラーク由来の血管
においても特徴的に見出される（Lee,  S.J.およびBenveniste,  E.N.、１９９９年；Washington,  R.、Burton,  J.ら、１９９４年）。これらの知見は、Ｅ−セレクチンが、炎
症性疾患における脳への循環細胞の動員において支配的な役割を果たすことを示唆する。
【０２６３】
全３種のセレクチンは、末端四糖シアリルルイスＸ（ｓＬｅｘ）として原型において呈示される、ガラクトースにおけるα（２，３）−結合型シアル酸置換およびＮ−アセチルグルコサミンにおけるα（１，３）−結合型フコース修飾を含有するシアロフコシル化で構成された特殊な炭水化物決定基に結合する（Polley,  M.J.、Phillips,  M.L.ら、１９９１年；Sackstein,  R.、２００５年）。「ＣＤ１５」としても公知のこの構造は、タンパク質骨格（すなわち、糖タンパク質）または脂質骨格（すなわち、糖脂質）のいずれかに呈示されている可能性があり、ＣＳＬＥＸ−１およびＨＥＣＡ−４５２等のｍＡｂによって認識される（Alon,  R.、Feizi,  T.ら、１９９５年；Dimitroff,  C.J.、Lee,  J.Y.ら、２００１年；Fuhlbrigge,  R.C.、Kieffer,  J.D.ら、１９９７年；Gadhoum,  S.Z.およびSackstein,  R.、２００８年；Merzaban,  J.S.、Burdick,  M.M.ら、２０１１年
）。硫酸化に主に関与する追加的な構造修飾は、ｓＬｅｘへのＰ−およびＬ−セレクチンの結合親和性を増加させるが、斯かる修飾のいずれも、Ｅ−セレクチンの最適な結合に必要とされない（Leppanen,  A.、White,  S.P.ら、２０００年；Rosen,  S.D.、２００４
年）。
【０２６４】
神経幹細胞（ＮＳＣ）に基づく治療法は、ＣＮＳ炎症性および／または変性疾患における疾患進行の停止および／または回復に対する大きな希望を生んだ（Ben-Hur,  T.、Einstein,  O.ら、２００３年；Einstein,  O.、Fainstein,  N.ら、２００７年；Einstein,
O.、Grigoriadis,  N.ら、２００６年；Imitola,  J.、Raddassi,  K.ら、２００４年
；Lee,  S.T.、Chu,  K.ら、２００８年；Pluchino,  S.、Quattrini,  A.ら、２００３
年；Pluchino,  S.、Zanotti,  L.ら、２００５年；Ziv,  Y.、Avidan,  H.ら、２００６年）。ＮＳＣが、それぞれＣＸＣＲ４（Bezzi,  P.、Domercq,  M.ら、２００１年；Flax,  J.D.、Aurora,  S.ら、１９９８年；Imitola,  J.、Raddassi,  K.ら、２００４年）
およびＶＬＡ−４（Pluchino,  S.、Zanotti,  L.ら、２００５年；Rampon,  C.、Weiss,
N.ら、２００８年）等、ステップ２およびステップ３／４エフェクターを発現することが周知であるが、ＮＳＣがステップ１エフェクターを元々発現するか否かに関するデータはない。したがって、本発明者らは、マウスＮＳＣにおけるステップ１エフェクターの発現を調べ、このような細胞が、ステップ１エフェクター、特に、Ｅ−セレクチンリガンドを顕著に欠くことを見出した。ＥＡＥモデルを使用して、本発明者らは、細胞表面グリカン操作による強制されたＥ−セレクチンリガンド活性が、投与されたＮＳＣの遊走およびより重要なことに、投与された細胞の治療効果（単数または複数）に影響を与えるか解析した。この目的のため、本発明者らは、グリコシルトランスフェラーゼプログラム化立体置換（ＧＰＳ）と呼ばれる技術を利用して、関連するセレクチン結合グリカン決定基を細胞表面に作製した（Sackstein,  R.、Merzaban,  J.S.ら、２００８年）。本明細書にお
いて、本発明者らは、２種の神経幹細胞膜糖タンパク質であるＣＤ４４およびＮＣＡＭのグリカンを修飾し、それぞれＥ−セレクチンリガンドＨＣＥＬＬ（造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド）およびＮＣＡＭ−Ｅを作製することにより、ＧＰＳが、ＮＳＣ上のＥ−セレクチンリガンドの発現を強制することを報告する。ＮＳＣ  Ｅ−セレクチンリガンド活性の糖鎖工学的操作は、向神経性の増加をもたらし、検出可能な長期生着の非存在下でＥＡＥにおける臨床転帰の改善を生じ、このような組織特異的幹細胞が、直接的な再生効果ではなく、回復効果を生じたことを示す。重要なことに、ＧＰＳ操作されたマウス造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の投与は、ＥＡＥ臨床経過を改善しなかったため、この神経回復効果は、成体幹細胞の普遍的な特性ではない。これらの知見は、細胞遊走のエフェクターを作製するための細胞表面糖鎖工学的操作が、幹細胞に基づく治療法の効力を改善し得ることの最初の直接的な証拠の提供において、著しい臨床意義を有し、また、神経炎症性疾患の処置におけるＮＳＣの使用に関する新たな展望も提供する。
（結果）
（神経幹細胞上の細胞遊走の分子エフェクターの発現）
【０２６５】
細胞遊走のステップ１、ステップ２およびステップ３／４の分子エフェクターの発現を解析するために、マウスＮＳＣの初代培養物においてフローサイトメトリーを行った。ＮＳＣは、Ｅ−セレクチン−Ｉｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）およびＰ−セレクチン−Ｉｇキメラ（Ｐ−Ｉｇ）との反応性を欠き、炎症性メディエータの存在下であっても（図１５）、Ｅ−およびＰ−セレクチンリガンドの非存在を示す（図９（Ａ））；これらはまた、ｍＡｂ  ＣＳＬＥＸ１、ＫＭ９３またはＨＥＣＡ４５２（これらはそれぞれ、ｓＬｅｘを識別する）によって染色されなかった。ＮＳＣは、ＣＤ４４ならびにインテグリンＶＬＡ−４（ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９）およびＶＬＡ−５（ＣＤ４９ｅ／ＣＤ２９）と共にケモカイン受容体ＣＸＣＲ４を発現した；ＮＳＣマーカー発現のこのパターンは、他の研究者らによって観察されている（Back,  S.A.、Tuohy,  T.M.ら、２００５年；Campos,  L.S.、Decker,
L.ら、２００６年；Campos,  L.S.、Leone,  D.P.ら、２００４年；Imitola,  J.、Raddassi,  K.ら、２００４年；Ji,  J.F.、He,  B.P.ら、２００４年；Leone,  D.P.、Relvas,  J.B.ら、２００５年；Pluchino,  S.、Quattrini,  A.ら、２００３年；Pluchino,
S.、Zanotti,  L.ら、２００５年）（図９（Ｂ））。ＮＳＣは、十分に説明されたポリシアル酸（ＰＳＡ）に加えて、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）も特徴的に発現した（Vitry,  S.、Avellana-Adalid,  V.ら、２００１年）（図９（Ｂ））。ＮＳＣは、ＰＳＧＬ−１、ＣＤ４３、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ（α１）およびＣＤ１８（β２）鎖の両方を欠く）およびＬＰＡＭ−１（α４β７）を発現しなかった（図９（Ｂ））。これらの結果は、ＮＳＣが、細胞遊出の多段階カスケードのステップ１エフェクターの発現を欠損しているにもかかわらず、血管外遊出におけるステップ２〜４を媒介し、放射状遊走による脳の発達におけるその動員にも関与するケモカイン受容体および関連するインテグリンエフェクターを発現することを示す（Imitola,  J.、Comabella,  M.ら、２００４年）。
（ＧＰＳは、神経幹細胞上のＥ−セレクチンリガンド活性を強制する）
【０２６６】
ＮＳＣ（Deboux,  C.、Ladraa,  S.ら、２０１３年）および脳がん幹細胞（Fu,  J.、Yang,  Q.Y.ら、２０１３年）の遊走に関与する分子ＣＤ４４は、培養中のＮＳＣの間で強く発現される（図９（Ｂ））。しかし、ＮＳＣが、Ｅ−セレクチン結合を欠くという知見（図９（Ａ））は、これらの細胞が、ＨＣＥＬＬとして公知のＣＤ４４のＥ−セレクチン結合グリコフォームを元々発現しないことを示す（Dimitroff,  C.J.、Lee,  J.Y.ら、２０００年；Dimitroff,  C.J.、Lee,  J.Y.ら、２００１年；Sackstein,  R.、２００４年）。よって、本発明者らは、ＣＤ４４グリカンのグリコシルトランスフェラーゼプログラム化立体置換（ＧＰＳ）を使用した非遺伝的操作が、ＨＣＥＬＬ発現を強制するか決定しようと試みた（Sackstein,  R.、Merzaban,  J.S.ら、２００８年）。この目的のため、
本発明者らは、α（１，３）−結合特異的フコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＴＶＩ）でＮＳＣを処理した。この酵素は、末端２型−ラクトサミン単位にフコースを特異的に配置する；該ラクトサミンが、α（２，３）−結合型シアル酸によりキャッピングされる場合、ｓＬｅｘが作製される。ＮＳＣのＦＴＶＩ処理後に（ＧＰＳ−ＮＳＣ）、ｍＡｂであるＣＳＬＥＸ１、ＫＭ９３およびＨＥＣＡ４５２との反応性を誘導したところ、ｓＬｅｘエピトープの強い発現（図１０（Ａ））、関連するＥ−Ｉｇ結合（図１０（Ａ））と一貫したが、Ｐ−Ｉｇ結合の誘導（図１０（Ａ））はなかった。注目すべきことに、ＣＤ１５（ＳＳＥＡ−１またはＬｅｘとしても公知）の発現は、ＮＳＣにおいて高く（図１０（Ａ））、ＦＴＶＩは、シアル酸付加されていない末端ラクトサミンをフコシル化し、これにより、ＣＤ１５（ＳＳＥＡ−１）を得ることができるが、ＣＤ１５の発現は、強制されたフコシル化の後に変化しなかった（図１０（Ａ））。まとめると、これらのデータは、α（１，３）−エクソフコシル化が、シアル酸付加されたラクトサミニル（lactosaminyl）グリカンにおいてのみ生じたことを示す。ＧＰＳ処理に先立つＮＳＣのブロメライン消化は、ＨＥＣＡ４５２反応性を顕著に低減した（図１０（Ｂ））。これは、糖脂質ではなく糖タンパク質が、シアロフコシル化決定基の優勢な担体であることを実証する。ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によるＧＰＳ−ＮＳＣの処理は、ＦＡＣＳによるＨＥＣＡ４５２シグナルの中程度の、ただし有意な減少をもたらした（図１０（Ｃ））。これは、ｓＬｅｘデコレートされた糖タンパク質の少集団が、グリコホスファチジル（ＧＰＩ）−結合型であることを示す。
【０２６７】
ＧＰＳ−ＮＳＣ由来の細胞溶解物および免疫沈降されたＣＤ４４のウェスタンブロットは、ＨＥＣＡ４５２によって認識される必須シアロフコシル化でデコレートされた糖タンパク質の１種が、ＣＤ４４の標準のスプライシングされていない型（ほぼ１００ｋＤａ；図１１（Ａ））であり、ＣＤ４４が、Ｅ−Ｉｇとも反応した（図１１（Ａ））ことを明らかにした。しかし、ＣＤ４４の徹底的免疫沈降後に、他の候補糖タンパク質Ｅ−セレクチンリガンド（単数または複数）が、残渣上清画分におけるＥ−ＩｇおよびＨＥＣＡ４５２との反応性の証拠によって識別された。ほぼ１２０およびほぼ１４０ｋＤａに２本のバンドが見えた。これらのバンドの分子量プロファイル（図１１（Ａ））およびＥ−セレクチン結合の部分的ＰＩ−ＰＬＣ感受性（図１０（Ｃ））、ＮＣＡＭの特徴的な１２０ｋＤａ型（Gascon,  E.、Vutskits,  L.ら、２００７年；Maness,  P.F.およびSchachner,  M.
、２００７年；Rutishauser,  U.、２００８年）に基づき、本発明者らは、ＮＣＡＭが、追加的なＥ−セレクチンリガンドとして機能していた可能性を推測した。よって、本発明者らは、汎ＮＣＡＭ  ｍＡｂによる免疫沈降を行い、ＣＤ４４の徹底的免疫沈降後に持続する残渣バンドが実際に、ＮＣＡＭのものであったことを観察した（図１１（Ｂ））。ＮＣＡＭ上の関連するシアロフコシル化が、Ｎ−グリカンにおいて呈示されたか否かを決定するために、本発明者らは、Ｎ−グリコシダーゼＦによる消化後のＧＰＳ−ＮＳＣの溶解物のウェスタンブロットにおけるＥ−Ｉｇ反応性を検査した（図１１（Ａ））；消化後のＥ−Ｉｇによる明らかな染色は観察されず、関連するＥ−セレクチン結合決定基（単数または複数）が、Ｎ−グリカンに呈示されることを示す（indicBing）。ＰＩ−ＰＬＣ処理
後のＨＥＣＡ４５２シグナル（およびＥ−Ｉｇシグナル−データ図示せず）の僅かな減少によって示される通り、ＮＳＣの強制されたフコシル化後の全体的なｓＬｅｘ発現に対するＮＣＡＭ−ＥのＧＰＩアンカー型の寄与は、中程度である（図１０（Ｃ））。したがって、マウスＮＳＣの強制されたα（１，３）−フコシル化は、ＨＣＥＬＬと共に、本発明者らが「ＮＣＡＭ−Ｅ」と命名した神経前駆体分子ＮＣＡＭの特有のＥ−セレクチンリガンド反応性型を作製した。興味深いことに、ヒトＮＳＣ（ＣＣ−２５９９）は、ＧＰＳ処理後にＨＣＥＬＬのみを発現し、ＮＣＡＭ−Ｅを発現しない（図１６（Ａ）〜図１６（Ｃ））。
【０２６８】
ＮＳＣ上のＧＰＳ操作されたＥ−セレクチンリガンド活性の安定性を評価するために、本発明者らは、強制されたエクソフコシル化後に２４時間間隔でフローサイトメトリーによりＥ−Ｉｇ反応性を測定した。Ｅ−セレクチンリガンド活性は、最大２４時間安定的であり、その後、７２時間までに検出不能レベルに減退し、これはおそらく、表面タンパク質のターンオーバーによるものと思われる（図１１（Ｃ））。ＮＳＣ生存率（図１７）は、強制されたエクソフコシル化によって影響されず、クローン形成能アッセイまたはＮＳＣ分化におけるニューロスフェアの数または増殖に差はなかった（図１８（Ａ）〜図１８（Ｄ））。よって、Ｅ−セレクチンリガンドの作製を除いて、ＮＳＣのＧＰＳ処理によって誘導される明らかな表現型の差はなかった。
【０２６９】
ＮＳＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞の増殖を阻害し（Einstein,  O.、Fainstein,  N.ら、２００７年；Einstein,  O.、Grigoriadis,  N.ら、２００６年；Martino,  G.およびPluchino,  S.、２００６年）、特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞の分裂促進的応答を
弱めることが示されている。ＮＳＣのこの免疫調節機能が、強制されたＥ−セレクチンリガンド活性によって影響されるか否かを評価するために、本発明者らは、Ｃｏｎ  Ａ活性化に応答してリンパ節細胞の増殖を抑制するＧＰＳ−ＮＳＣおよび対照バッファー処理ＮＳＣ（ＢＴ−ＮＳＣ）の能力を調べた。図１９（Ａ）〜図１９（Ｃ）に表示される通り、ＧＰＳ−およびＢＴ−ＮＳＣは両者共に、Ｔ細胞増殖を減少させると共に、等しく炎症性サイトカイン産生のレベルを抑制することができ、ＮＳＣ上のＧＰＳ処理それ自体によって提供される免疫調節上の利点または不利益がないことを示唆する。興味深いことに、本発明者らは、Ｅ−ＩｇへのＧＰＳ処理細胞の結合の際に増大された、ＢＴ−およびＧＰＳ−ＮＳＣの両方に関して、炎症性サイトカイン処理の際のＮＳＣからの白血病阻害因子（ＬＩＦ）の等しい放出も観察した（図１９（Ｃ））。よって、ＮＳＣの強制されたエクソフコシル化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって決定される通り、ＮＳＣ表現型または機能における望ましくない効果を伴うことなく一過性Ｅ−セレクチンリガンド活性を誘導した。
（ＧＰＳ−ＮＳＣは、Ｅ−セレクチンとの頑強な生理的ローリング相互作用を呈示する）
【０２７０】
生理的血流条件下におけるＧＰＳ−ＮＳＣのＥ−セレクチンリガンド活性の効力を解析するために、Ｅ−セレクチンを発現するようサイトカイン（ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α）によって刺激されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用して、平行平板型フローチャンバー研究を行った。図１２（Ａ）に示す通り、ＧＰＳ−ＮＳＣは、ＥＤＴＡの存在下でまたは遮断抗Ｅ−セレクチンｍＡｂの使用により完全に抑止される、卓越したＥ−セレクチンリガンド活性を示した。通常の後毛細細静脈剪断レベル（１〜４ダイン／ｃｍ２）内で有意な剪断抵抗性ローリング相互作用が観察され、２０ダイン／ｃｍ２を超えて持続した（図１２（Ａ））。グリカン操作されたＥ−セレクチンリガンドであるＨＣＥＬＬまたはＮＣＡＭ−Ｅのうちどちらが、ＮＳＣ上のより強力なＥ−セレクチンリガンドであるか解析するために、本発明者らは、ブロットローリングアッセイを使用した（Fuhlbrigge,  R.C.、King,  S.L.ら、２００２年）。この技法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された膜タンパク質に対する剪断依存性セレクチンリガンド相互作用の検出を可能にし、これにより、ＧＰＳ−ＮＳＣのＥ−セレクチンリガンド活性に対するＨＣＥＬＬおよびＮＣＡＭ−Ｅの個々の寄与の評価を可能にする。したがって、それぞれのＥ−セレクチン結合特性を評価するために、ＧＰＳ−ＮＳＣ溶解物のＨＥＣＡ−４５２免疫染色ブロット上に、Ｅ−セレクチントランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｅ）を灌流した。図１２（Ｂ）に図解する通り、より多くのＣＨＯ−Ｅ細胞が、ＮＣＡＭ−Ｅの１２０ｋＤまたは１４０ｋＤ型のいずれかと比較して、ＨＣＥＬＬと相互作用および附着した。５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する流動培地に懸濁されたＣＨＯ−Ｅ細胞は、ブロットの任意の領域への無視できる接着を有し、セレクチンリガンド活性と一致したＣａ２＋依存性結合を確認した。（ＧＰＳ−ＮＳＣは、ＥＡＥにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで増加したホーミングおよび組織浸潤を示す）
【０２７１】
注射されたＮＳＣが、ＣＮＳ実質に浸潤したか否かを評価するために、本発明者らは、共焦点顕微鏡研究を行った。この目的のため、ＧＰＳ−ＮＳＣおよびＢＴ−ＮＳＣをＰＫＨ２６色素で標識し、２回の別々のｉ．ｖ．注射においてＭＯＧ誘導慢性ＥＡＥマウスへと静脈内注射した：疾患発病前（免疫化後（ＰＩ）９日目）および疾患発病時（ＰＩ  １３日目）。これらの日数は、ＥＡＥの脳内皮上のＥ−セレクチン発現の先の研究に基づき選ばれた（Piccio,  L.、Rossi,  B.ら、２００２年）。２回目のＮＳＣ注射から４日後
に（ＰＩ  １７日目）、腰部仙髄および脳を収集した。脳の共焦点解析は、脳におけるより多量のＧＰＳ−ＮＳＣ（図１３（Ａ））およびＦｌｋ−１＋血管外側の局在化（図２０（Ａ）〜図２０（Ｂ））の両方を実証した。さらに、ＥＡＥにおける病理の大部分が生じる脊髄の並行して行った解析（図１３（Ｂ）〜図１３（Ｄ））は、ＰＩ  １７日目までにＢＴ−ＮＳＣ浸潤よりも２倍多い数の血管外ＧＰＳ−ＮＳＣ浸潤を実証した（図１３（Ｄ））。これらのデータは、ＧＰＳ−ＮＳＣが、脳および脊髄の両方において、ＢＴ−ＮＳＣよりも有意に有効にＣＮＳ実質に浸潤することを示す。本発明者らの共焦点データをさらに確認するために、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＳＣの短期ホーミングにおけるＧＰＳ操作されたＥ−セレクチンリガンド活性の効果を研究した。蛍光色素追跡用色素、ＣＦＳＡ−ＳＥ（カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル）を使用してＮＳＣを染色し、材料と方法に記載されている通りにＭＯＧによるＰＩ  ９日目および１３日目にＣ５７ＢＬ／６マウスへと養子移入した。２回目の細胞注射後１６時間以内に、本発明者らは、ＧＰＳ−ＮＳＣが、ＢＴ−ＮＳＣよりも３〜５倍効率的に脳、脾臓および肝臓に蓄積したことを観察した（図１３（Ｅ））。脳、脾臓および肝臓への浸潤におけるＧＰＳ−ＮＳＣの相対的利点は、ｉｎ  ｓｉｔｕでのこれらの細胞の単純な優先的増大ではなく、輸送における真の差を反映したが、このことは、それらの平均ＣＦＤＡ−ＳＥ蛍光が、ＢＴ−ＮＳＣと比べて低減されなかったことから分かる（データ図示せず）。脾臓へと遊走した細胞から実際に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞とＮＳＣとの密接な相互作用が存在することが明らかである（図１３（Ｆ））。注射された細胞は、肺にも蓄積したが、ＧＰＳ−およびＢＴ−ＮＳＣの間に差はなく、おそらく、肺微小血管における立体的トラップの反映である（図１３（Ｅ））。よって、ＧＰＳ処理後にＮＳＣに形成されたｓＬｅｘ構造は、これらの器官へのこれらの細胞の遊走を認可し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＳＣの組織特異的遊走の駆動におけるＥ−セレクチンリガンド活性の決定的役割を強調する。
（ＧＰＳ−ＮＳＣは、ＥＡＥにおける内在性間接的神経再生の増大によって、神経病理学の寛解に繋がるホーミングを増加させた）
【０２７２】
ＮＳＣの改善された組織ホーミングが、増大された治療効果を有したか否かを取り扱うために、本発明者らは、ＭＯＧ誘導慢性ＥＡＥ後にＮＳＣ注射を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスの神経学的状態をモニターし、臨床パラメータならびに組織再建および病理を解析した。ＰＩ  ９日目およびＰＩ  １３日目に２回の別々のｉ．ｖ．注射において神経前駆体を投与した。ＥＡＥマウスの５群を検査した：（１）ＧＰＳ−ＮＳＣ；（２）ＢＴ−ＮＳＣ；（３）ＨＢＳＳ（偽；すなわち、細胞なし）；（４）ＢＴ−ＨＳＰＣ；および（５）ＧＰＳ−ＨＳＰＣ。盲検法様式で個々のマウスにおける臨床スコアを毎日評価し（図１４（Ａ））、疾患の累積的負担の線形回帰を計算した（図１４（Ｂ）および表２）。
【表２】
2022003094.tif 000003
対照ＮＳＣ（ＢＴ−ＮＳＣ）の注射は、ＨＳＰＣおよび偽処置動物と比較して、ＥＡＥの臨床重症度を減弱した（ｐ＝０．００６）。しかし、ＧＰＳ−ＮＳＣのｉ．ｖ．注射（ｎ＝３０）は、ＢＴ−ＮＳＣ（ｎ＝３０；ｐ＝０．００６）、ＧＰＳ−ＨＳＰＣ（ｎ＝３０；ｐ＜０．０００１）、ＢＴ−ＨＳＰＣ（ｎ＝３０；ｐ＜０．０００１）および偽（ｎ＝３０；ｐ＜０．０００１）処置動物と比較して、より有意に改善された臨床スコアを示した。ＧＰＳ−ＨＳＰＣの注射（顕著に増加されたＥ−セレクチンリガンド活性を呈示する、図２１（Ａ）（Merzaban,  J.S.、Burdick,  M.M.ら、２０１１年）を参照）または
ＢＴ−ＨＳＰＣの注射のいずれも、対照動物と比較して、ＭＯＧ誘導動物の臨床スコアにおける改善を示さなかった（図２１（Ｂ）〜図２１（Ｃ）および表３）ため、疾患重症度のこの寛解が、ＮＳＣに特異的であることに留意することが重要である。
【表３】
2022003094.tif 000004
実際に、ＧＰＳ−またはＢＴ−ＨＳＰＣのいずれかの注射は、臨床転帰悪化に向かう傾向を示したが、これは、ＮＳＣ注入の観察される有益な効果が、成体幹細胞の一般特性ではないことを示す。
【０２７３】
注目すべきことに、ＥＡＥ誘導後３０日目の神経病理学の検査は、ＢＴ−ＮＳＣおよび偽処置動物と比較して、ＧＰＳ−ＮＳＣを与えたマウスにおける炎症および神経再生のいくつかのパラメータにおける統計的有意差を示した（図１４（Ｃ））。ＥＡＥの神経病理学におけるＮＳＣ注射の影響を決定するために、本発明者らは、多数の異なるマーカーを評価した。先ず、炎症の程度を評価するために、本発明者らは、マウスの各研究群由来の脊髄の切片を、浸潤するマクロファージおよびマイクログリアを識別するマーカーであるＣＤ１１ｂに関して染色した。ＨＢＳＳバッファー単独を与えたＥＡＥを有する動物は、高レベルのＣＤ１１ｂ染色を呈示し、細胞は、活性化された表現型の形態的証拠である、増加した数の膜プロセスを示す（図１４（Ｃ））。ＣＤ１１ｂ染色細胞の数は、ＢＴ−ＮＳＣを与えたマウスにおいて有意に減少し（ｐ＜０．０００１）、注目すべきことに、このようなレベルは、ＧＰＳ−ＮＳＣを注射した動物においてさらになお減少した（ｐ＜０．００５、ＢＴ−ＮＳＣと比較）。重要なことに、マクロファージ／マイクログリアは、活性化減少を示す、減少したＣＤ１１ｂ染色と、さらに多くの別々の膜プロセスを呈示した（図１４（Ｃ））。加えて、異なる処置群における脳ＣＤ４＋Ｔ細胞の定量化は、ＧＰＳ−ＮＳＣを与えた動物における浸潤Ｔ細胞の有意な減少を明らかにした（図１４（Ｄ）および図１４（Ｅ））。神経再生を評価するために、本発明者らは、マーカーＧＡＰ−４３およびＳＭＩ−３２に関して脊髄の切片を染色した（図１４（Ｆ）〜図１４（Ｉ））。ＧＰＳ−ＮＳＣを注射した動物において、ＢＴ−ＮＳＣまたはＨＢＳＳバッファー単独のいずれかを与えたマウスにおけるものと比較して、軸索統合性および再生に関連する分子であるＧＡＰ−４３の発現増加が存在した（図１４（Ｆ）〜図１４（Ｇ））。逆に、軸索変性のマーカーであるＳＭＩ−３２の発現の特異的低減が、ＢＴ−ＮＳＣまたはＨＢＳＳバッファーのいずれかを与えたマウスと比較して、ＧＰＳ−ＮＳＣを与えた動物において観察された（図１４（Ｈ）〜図１４（Ｉ））。これらのデータは、ＢＴ−ＮＳＣを上回るＧＰＳ−ＮＳＣによって提供される改善された臨床効果が、神経保護増大を生じる組織特異的ＮＳＣの病変遊走増加に対し二次的なものであるという概念を支持する。
【０２７４】
ＧＰＳ−ＮＳＣの観察された効果が、神経再生増加を反映するか否かをさらに評価するために、本発明者らは、ＣＮＰａｓｅ、Ｏｌｉｇ−２およびＳＯＸ９を含む、オリゴデンドロサイト形成（oligodendrogenesis）および成熟オリゴデンドロサイトに関連するマーカーに関して染色した。本発明者らは、ＢＴ−ＮＳＣまたは偽対照と比較して、ＧＰＳ−ＮＳＣを与えた動物におけるＯｌｉｇ−２、ＳＯＸ９およびＣＮＰａｓｅ細胞の数における統計的に有意な増加を観察した（図１４（Ｄ）および図１４（Ｅ））。ＰＩ  １７日目に注射されたＮＳＣの証拠が存在したが（ＳＯＸ−２＋細胞；図２０（Ａ）〜図２０（Ｂ））、本発明者らは、注射群のいずれにおいても、ＰＩ  ３０日目にＮＳＣ（ＧＦＰをタグ付け）による持続性の定着を観察せず（図２２）、ホーミング改善に関連するＮＳＣ神経保護の機構が、投与されたＮＳＣの、継続した存在も神経系列細胞に向けた分化も必要としないことを示唆する。まとめると、これらのデータは、ＧＰＳ−ＮＳＣによるマウスの処置が、ＣＮＳへのＮＳＣの送達を増大し、直接的神経再生（すなわち、細胞置き換え）ではなく、間接的神経再生効果により神経回復を提供したことを示す。
（考察）
【０２７５】
ＭＳは、髄鞘の漸進的破壊を生じ、軸索傷害および損失をもたらす、多巣性炎症性病変によって特徴付けられるＣＮＳの慢性脱髄性疾患である（Imitola,  J.、Chitnis,  T.ら、２００６年）。幹細胞に基づく治療法は、罹患細胞を置き換えることにより（直接的再生）、および／または内在性細胞による組織再建を誘起する環境における支持的／栄養性（trophic）因子の産生により（間接的再生）、損傷／炎症組織の修復の見込みを提供す
る。ＭＳ等の播種性神経学的疾患の場合、組織特異的ＮＳＣの使用は、ＣＮＳ快復の達成における臨床的有用性を立証することができるが、この目標を成し遂げるための直近のハードルは、神経傷害の部位に適切な数の細胞を送達することである。先の研究は、脳卒中、脊髄外傷およびＭＳの実験モデルにおける移植されたＮＳＣの利益を示した（Ben-Hur,
T.、Einstein,  O.ら、２００３年；Einstein,  O.、Fainstein,  N.ら、２００７年；Einstein,  O.、Grigoriadis,  N.ら、２００６年；Imitola,  J.、Raddassi,  K.ら、２００４年；Lee,  S.T.、Chu,  K.ら、２００８年；Pluchino,  S.、Quattrini,  A.ら、
２００３年；Pluchino,  S.、Zanotti,  L.ら、２００５年；Ziv,  Y.、Avidan,  H.ら、２００６年）。これらの研究において送達経路として罹患部位への直接注射を使用したが、疾患のびまん性の性質およびそれに伴う解剖的制約を考慮すると、多巣性ＣＮＳ疾患における罹患組織（単数または複数）内のＮＳＣの適切な定着を成就するために、局所投与（すなわち、ｉｎ  ｓｉｔｕ注射）であることが要求される送達の血管経路は、非実用的である。今までに、ＮＳＣ上の細胞遊走の分子エフェクターの発現を評価する研究はなく、より重要なことに、斯かるエフェクターの発現を最適化する仕方について取り組む研究のうち、ＮＳＣ向神経性を増大できたものはなかった。
【０２７６】
本発明者らの研究は、ＮＳＣが、関連するステップ２〜４エフェクターを発現するが、ステップ１エフェクターを顕著に欠損することを明らかにする：（１）これらは元々、Ｅ−セレクチンまたはＰ−セレクチンのリガンドを発現しない（炎症性サイトカインの存在下で成長した場合であっても（図１５））；（２）これらは、正準セレクチン結合決定基であるグリカンｓＬｅｘの発現を欠く；および（３）これらは、脳への輸送を媒介することが報告された、ミエリン特異的Ｔｈ１細胞上のセレクチンリガンドである糖タンパク質ＰＳＧＬ−１を発現しない（Piccio,  L.、Rossi,  B.ら、２００５年；Piccio,  L.、Rossi,  B.ら、２００２年）。重要なことに、内皮セレクチン、特に、Ｅ−セレクチンの発現は、ＭＳおよびＥＡＥにおける免疫性エフェクターの動員に関係づけられてきた（Lee,
S.J.およびBenveniste,  E.N.、１９９９年；Piccio,  L.、Rossi,  B.ら、２００２年）。よって本明細書において、本発明者らは、Ｅ−セレクチンリガンドの発現を強制するためのＮＳＣのグリカン操作が、細胞の全身送達を増大し、結果として、ＭＳモデルにおいて生物学的効果を有するか評価しようと試みた。
【０２７７】
本明細書におけるデータセットは、培養されたＮＳＣが、２種の十分に特徴付けされた神経細胞表面分子であるＣＤ４４およびＮＣＡＭ（Back,  S.A.、Tuohy,  T.M.ら、２０
０５年；Pluchino,  S.、Quattrini,  A.ら、２００３年）を発現することを示す。際だ
ったことに、マウスＮＳＣのエクソフコシル化は、顕著にこれらの糖タンパク質上のｓＬｅｘ決定基の高発現を生じ、ＣＤ４４から強力なＥ−セレクチンリガンドＨＣＥＬＬへの変換をプログラム化し（Dimitroff,  C.J.、Lee,  J.Y.ら、２０００年；Dimitroff,  C.J.、Lee,  J.Y.ら、２００１年）、また、本発明者らが「ＮＣＡＭ−Ｅ」と命名した、ほぼ１２０ｋＤａおよびほぼ１４０ｋＤａのＮＣＡＭの２種のシアロフコシル化グリコフォームの発現を誘導する。ブロットローリングアッセイは、ＨＣＥＬＬが、ＧＰＳ−ＮＳＣ上に発現される主要なＥ−セレクチンリガンドであることを明らかにした（図１２（Ｂ））。これらの知見は、ＰＩ−ＰＬＣ消化によるＮＣＡＭ−Ｅの除去後のフローサイトメトリーの結果によって裏づけされ、ＮＳＣ  ｓＬｅｘ発現およびＥ−Ｉｇ反応性の相当な保持を示す（図１０（Ｃ））。
【０２７８】
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるＮＣＡＭは、ニューロンおよびグリアの両方において発現され、従来は、それらの環境への細胞の物理的つなぎ留めを確立する細胞間の相互作用のメディエータと見られている。ＮＣＡＭタンパク質コアにおけるα−２，８−結合型ポリシアル酸（ＰＳＡ）からなる翻訳後グリカン修飾は、神経遊走における特有の特性を提供し（Gascon,  E.、Vutskits,  L.ら、２００７年；Maness,  P.F.およびSchachner,  M.、２００７年；Rutishauser,  U.、２００８年）、ＰＳＡ−ＮＣ
ＡＭは、脳における前駆体細胞遊走の媒介において決定的な役割を果たすものと思われる（Glaser,  T.、Brose,  C.ら、２００７年；Lavdas,  A.A.、Franceschini,  I.ら、２
００６年；Zhang,  H.、Vutskits,  L.ら、２００４年）。そこで、本発明者らのデータ
は、ＮＣＡＭが、ｓＬｅｘ決定基を作製するためのエクソフコシル化のアクセプターとして機能することができる関連する末端α−（２，３）−シアリルラクトサミニルグリカンを呈示することの最初の証拠を提供する。ＮＳＣの細胞表面糖鎖工学的操作後に、ＰＳＡ発現レベルは変化せず、強制されたフコシル化の７２時間以内にｓＬｅｘ発現の完全な損失があったため、誘導されたＥ−セレクチンリガンド活性は永続的なものではない（図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ））。よって、血管外遊出の後に、天然ＮＣＡＭへの一時的な復帰が起こる筈であり、続いて浸潤ＮＳＣは、内在性ＮＣＡＭ媒介性実質内ＣＮＳ遊走を起こすことができるのであろう。注目すべきことに、マウスＮＳＣは、α−（２，３）−シアリルラクトサミニルグリカンを有するＮＣＡＭを発現するが、ヒトＮＳＣ（ＣＣ−２５９９）に関する本発明者らの研究は、このような細胞が、エクソフコシル化後にＨＣＥＬＬのみを発現し、ＮＣＡＭ−Ｅを発現しないことを示す（図１５）；よって、ヒトＮＳＣは、ＣＤ４４のみにおける強制されたフコシル化のアクセプターとして機能する関連するシアロラクトサミニルグリカンを発現することができる。齧歯類系においてヒトＮＳＣが使用される異種移植研究を解釈する際に、このような種の差について考慮するべきである（Goncharova,  V.、Das,  S.ら、２０１４年）。
【０２７９】
Ｅ−セレクチンリガンド活性の誘導は、細胞輸送のための著しい意義を有し、Ｅ−セレクチンを発現する内皮床に細胞遊走を方向づけるように機能する。他の研究者らによって示される通り、本発明者らは、ＮＳＣが、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４およびインテグリンＶＬＡ−４を呈示することを観察した（図９（Ａ）〜図９（Ｂ）を参照）。ヒトＮＳＣ上のＣＸＣＲ４の発現（Bezzi,  P.、Domercq,  M.ら、２００１年；Flax,  J.D.、Aurora,  S.ら、１９９８年；Imitola,  J.、Raddassi,  K.ら、２００４年）が、対応するリ
ガンドストロマ細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α、ＣＸＣＬ１２としても公知）を局所アストロサイトおよび内皮が上方調節するＣＮＳ傷害に向けたｉｎ  ｖｉｖｏでの遊走を促進することが示されている（Imitola,  J.、Raddassi,  K.ら、２００４年）。これらの
観察は、ＣＮＳ傷害へのＮＳＣホーミングの促進における卓越したステップ２エフェクターとしてＣＸＣＲ４を規定する。ＶＬＡ−４の対応する内皮受容体であるＶＣＡＭ−１も、傷害に対する脳の炎症性応答において上方調節される（Justicia,  C.、Martin,  A.ら、２００６年）。ＣＸＣＲ４に加えてＶＬＡ−４を構成的に発現するＮＳＣのみが、ＥＡＥの罹患病変における炎症したＣＮＳ微小血管の周りに蓄積することができたという点において、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１軸は同様に、ＮＳＣの遊走において決定的な役割を果たすことが示された（Pluchino,  S.、Zanotti,  L.ら、２００５年）。近年の異種移植
研究は、インテグリンが、ラット脳卒中モデルにおけるヒトＮＳＣ上の遊走のステップ１メディエータとしての役割を果たし得ることを示唆し、セレクチン相互作用が、このモデル系に必ずしも必要ないことを示唆する（Goncharova,  V.、Das,  S.ら、２０１４年）
。さらなる研究が正当化されるが、ステップ１相互作用のメディエータとしてのインテグリンの変動する役割（単数または複数）は、使用した炎症性モデル、宿主動物系、血管の透過性、該炎症部位における内皮接着分子の発現、部位における可溶性接着分子の存在、および流速を定める血管の物理的特性（すなわち、血管の直径）における差を反映している可能性がある（Berlin,  C.、Bargatze,  R.F.ら、１９９５年；Ding,  Z.M.、Babensee,  J.E.ら、１９９９年；Zarbock,  A.、Kempf,  T.ら、２０１２年；Zarbock,  A.、Lowell,  C.A.ら、２００７年）。いずれの場合でも、ＮＳＣにおけるステップ１エフェク
ターとしてのＥ−セレクチンリガンドの発現は、ＣＸＣＲ４およびＶＬＡ−４の構成的発現を補完するように機能し、これにより、炎症性部位へのＮＳＣの動員を最適化するであろう。したがって、本発明者らは、静脈内投与された（非修飾）ＢＴ−ＮＳＣが、ＥＡＥマウスの脳に浸潤することができることを観察したが（図１３（Ｅ））、糖鎖工学的操作による強制されたＥ−セレクチンリガンド発現は、脳へのＮＳＣの顕著に増加された遊走を生じた。この増加された向神経性に伴って、ＣＮＳ炎症は顕著に縮小された（図１４（Ａ）〜図１４（Ｉ））。さらに、図１３（Ａ）〜図１３（Ｆ）に示す通り、ＣＮＳ実質におけるＮＳＣ蓄積は、注射後１７日目までにＢＴ−ＮＳＣよりもＧＰＳ−ＮＳＣの間で２倍高く、ステップ１エフェクターの強制発現が、血管外遊出を促進することを示す。
【０２８０】
増大された向神経性に加えて、短期ホーミングデータは、脾臓および肝臓における、ＢＴ−ＮＳＣよりも有意に高いＧＰＳ−ＮＳＣ蓄積も明らかにした（図１３（Ｅ））。このような知見は、全身投与されたＮＳＣが、ＥＡＥを有するマウスの脳と共に、脾臓および肝臓にも蓄積する傾向があることを報告する研究の結果と一致した（Politi,  L.S.、Bacigaluppi,  M.ら、２００７年）。脾臓におけるＥ−セレクチン発現は、ヒト、非ヒト霊
長類および齧歯類において記載されており（Alam,  H.B.、Sun,  L.ら、２０００年；Drake,  T.A.、Cheng,  J.ら、１９９３年；Redl,  H.、Dinges,  H.P.ら、１９９１年；Schweitzer,  K.M.、Drager,  A.M.ら、１９９６年）、ＣＮＳ炎症性状態で特徴的に発現さ
れる炎症誘発性サイトカインによって上方調節される（Emamgholipour,  S.、Eshaghi,  S.M.ら、２０１３年；Weishaupt,  A.、Jander,  S.ら、２０００年）；実際に、ポリマ
ーへのｓＬｅｘのコンジュゲーションは、脾臓内における斯かるポリマーの蓄積を顕著に増大することが示され（Horie,  K.、Sakagami,  M.ら、２０００年；Horie,  K.、Sakagami,  M.ら、２００４年）、ｓＬｅｘ発現が、脾臓送達を促進することの直接的な証拠を提供する。ＮＳＣによる脾臓の浸潤が、常在性脾臓細胞（例えば、マクロファージ）による炎症性サイトカインの産生を弱め、抗炎症性効果をもたらすことが報告された（Lee,  S.T.、Chu,  K.ら、２００８年）。他の研究は、血管内投与されたＮＳＣが、神経再生の増大による（Martino,  G.およびPluchino,  S.、２００６年；Pluchino,  S.、Zanotti,
L.ら、２００９年；Wang,  L.、Shi,  J.ら、２００９年）のではなく、ＣＮＳ傷害を
制限する末梢免疫抑制（Einstein,  O.、Fainstein,  N.ら、２００７年；Einstein,  O.、Grigoriadis,  N.ら、２００６年）または局所免疫調節をもたらすことを報告した。よって、ＮＳＣにおけるＥ−セレクチンリガンド活性の強制発現による観察される脾臓ホーミング増加は、免疫細胞に対するＮＳＣの組織比増加の理由から、免疫調節による神経保護に寄与する一因であり得る。この概念は、ＧＰＳ−ＮＳＣが、対照ＮＳＣにより観察されるものと比較して免疫調節利点を付与しなかったが、脾細胞に対するインプットＮＳＣの比が増加するにつれて、Ｔ細胞増殖が減少することを示す本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータによって支持される（図１９（Ａ））。
【０２８１】
細胞表面エキソグリコシル化に関する以前の研究は、異種移植モデルにおいてヒト間葉系幹細胞を利用し、炎症組織における治療的な影響、すなわち、糖鎖工学的操作された幹細胞が、炎症部位にホーミングするか否かについて、ならびに斯かる細胞が、所望の再生および／または組織保護効果（単数または複数）を有するか否かについては取り組まなかった。ＧＰＳ−ＮＳＣの注入後に、ＣＮＳへのＮＳＣの増大された動員が観察されたが、ＮＳＣの長期生着の釣り合った増加は見られなかった。よって、生理的細胞遊走を活用することにより（すなわち、ＣＮＳ組織微小環境構築物を保存するであろう非浸潤性様式で）、増大されたＣＮＳ浸潤が達成されたが、本発明者らは、投与されたＮＳＣが、ｉｎ  ｓｉｔｕで機能的ＣＮＳ組織を再生する（すなわち、直接的再生により）後代へと分化することを観察しなかった。実際には、本発明者らは、ＧＰＳ−ＮＳＣの投与が、オリゴデンドログリアになる内在性ニューロン前駆細胞の能力を改善したことを観察した（図１４（Ｄ）および図１４（Ｅ））。よって、本発明者らの知見は、直接的な神経再生のパラダイムを支持しないが、代わりに、ＣＮＳ組織修復におけるＮＳＣの優勢な役割が、内在性細胞による修復を支持する栄養性効果によるものであり（Caplan,  A.I.、２００９年；Hess,  D.C.およびBorlongan,  C.V.、２００８年；Laterza,  C.、Merlini,  A.ら、２０１３年；Phinney,  D.G.およびProckop,  D.J.、２００７年）、これにより、神経回復（すなわち、間接的な神経再生による）を生じることを示唆する。この概念と整合することには、未分化ＮＳＣは、ＬＩＦ等のニューロトロフィンの分泌により、瘢痕形成を有意に低減し、内在性グリアおよびニューロン前駆細胞の生存および機能を増加することが報告された（Laterza,  C.、Merlini,  A.ら、２０１３年）。加えて、ＮＳＣは、内在性細胞による間接的神経再生を誘発する、ＢＭＰ−４およびノギン等の分子の発現により傷害誘導性成長ニッチの形成を支持する（Imitola,  J.、Raddassi,  K.ら、２００４年；Pluchino,  S.、Zanotti,  L.ら、２００５年）。
【０２８２】
まとめると、本発明者らのデータは、Ｅ−セレクチンリガンドの発現を強制するためのＮＳＣのグリカン操作が、投与されたＮＳＣの持続性／長期生着を必要とすることなく、組織定着を高め、免疫調節および組織修復を媒介するという機構を支持する。注目すべきことに、増大されたＥ−セレクチンリガンド活性にもかかわらず、ＧＰＳ−ＨＳＰＣの注入は、ＥＡＥの経過を改善せず（実際に、ＨＳＰＣの注射は、疾患を悪化させる、図２１（Ａ）〜図２１（Ｂ）および表３を参照）、ＧＰＳ−ＮＳＣの観察される神経保護効果が、成体幹細胞の一般特性ではなく、ＮＳＣに固有の神経回復効果によるものであることを示す。成体幹細胞特異的生物学的効果（単数または複数）に関するこの知見と整合することには、ヒトＨＳＰＣは、先天性角膜疾患のマウスモデルにおける強い宿主免疫拒絶を惹起することが判明した一方で、間葉系幹細胞等、他の成体幹細胞は、宿主免疫応答を抑制する（Liu,  H.、Zhang,  J.ら、２０１０年）。ＮＳＣによる観察される神経保護を媒介する分子機構（単数または複数）に関するさらなる研究が正当化されるが、本発明者らの結果は、細胞表面グリカン操作が、神経幹細胞の自己再生能力、分化潜在力を変化させず、または先天性免疫調節能力を変更しなかったことを示す。まとめると、本明細書に提示されているデータから、本発明者らはモデル（図２３）を提唱するが、それによると、ＮＳＣ表面のエクソフコシル化による強制されたＥ−セレクチンリガンド発現は、ＣＮＳ炎症性部位における組織動員増加を生じ、これにより、それらが必要とされる場所へのＮＳＣ栄養性因子のペイロード送達を増大する。Ｅ−セレクチン発現は、ヒトにおけるあらゆる炎症部位の内皮床において顕著に上方調節されるため、本発明者らの知見は、ＭＳと共に他の壊滅的多巣性炎症性疾患に対する幹細胞療法の効力を改善するために細胞表面グリカン操作を活用する、将来の臨床治験への橋渡しとしての著しい意義を有する。
（材料と方法）
【０２８３】
倫理に関する記載：全てのマウス実験は、動物の管理および使用のためのＮＩＨガイドラインに従って、ハーバード・メディカル・スクールの施設内実験動物委員会の承認の下に行った。次の事項は、これらの実験におけるマウスの使用に関係した詳細である。使用の正当化：ＥＡＥは、ヒト疾患多発性硬化症のための価値あるモデルである。ｉｎ  ｖｉｖｏ疾患の代わりとなることができる数学的モデル、コンピュータシミュレーションまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は存在しない。ＭＳおよび他の自己免疫性疾患に利用できる処置の多くを先ず検査し、ＥＡＥにおけるそれらの機構を調査した。そのバックグラウンドにおける多くのノックアウトおよびトランスジェニックマウスを利用できるため、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるＭＯＧ誘導性ＥＡＥは価値がある。獣医学的管理：マウスは、連邦、施設およびＡＡＡＬＡＣガイドラインに従って取り扱われ管理される。有害効果を最小化するための手順：免疫化後に、毎日動物を調べる。ＥＡＥに罹患した動物は、だらりと垂れた（floppy）尾（グレード１）、部分的後肢（グレード２）、完全後肢麻痺（グレード３）、四肢不全麻痺（グレード４）、瀕死または動物死亡（グレード５）を発症する。大部分の動物は、グレード０〜３を有し、稀に、動物は、グレード４に達し、このような場合、安楽死が行われる。動物は、ＥＡＥに罹患した場合、液体への到達を確実にするためのゲルパックを与えられ、ケージ内で食物への到達手段を与えられる。施設ガイドラインに従って投与されるＣＯ２吸入により安楽死が行われる。
【０２８４】
試薬：次の抗体は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した：機能遮断マウス抗ヒトＥ−セレクチン（６８−５Ｈ１１；ＩｇＧ１）、ラット抗ヒトＣＬＡ（ＨＥＣＡ−４５２；ＩｇＭ）、マウス抗ヒトｓＬｅｘ（ＣＳＬＥＸ−１；ＩｇＭ）、マウス抗ヒトＣＤ１５（ＩｇＭ）、ラット抗マウスＰＳＧＬ−１（２ＰＨ１および４ＲＡ１０；ＩｇＧ１）、マウス抗ヒトＰＳＧＬ−１（ＫＰＬ−１；ＩｇＧ１）、ラット抗マウスＣＤ４４（ＫＭ１１４およびＩＭ７；ＩｇＧ１）、マウス抗ヒトＣＤ４４（５１５；ＩｇＧ１）、ラット抗マウスＣＤ４３（Ｓ７；ＩｇＧ２ａ）、マウス抗ヒトＣＤ４３（１Ｇ１０；ＩｇＧ１）、マウス抗（マウス抗成体および胚性汎Ｎ−Ｃａｍ）ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１３；ＩｇＧ２ｂ）、マウス抗ヒトＣＤ５６（ＮＣＡＭ１６．２；ＩｇＧ２ｂ）、ラット抗ヒトＣＸＣＲ４（２Ｂ１１；ＩｇＧ２ｂ）、マウス抗ヒトＣＸＣＲ４（１２Ｇ５；ＩｇＧ２ａ）、ラット抗マウスＣＤ１８（ＧＡＭＥ−４６；ＩｇＧ１）、ラット抗マウスＣＤ２９（ＫＭ１６；ＩｇＧ２ａ）、ラット抗マウスＣＤ４９ｄ（９Ｃ１０；ＩｇＧ２ｂ）、ラット抗マウスＣＤ１１ａ（２Ｄ７；ＩｇＧ２ａ）、ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０；ＩｇＧ２ｂ）、ラット抗マウスＣＤ４９ｅ（ＭＦＲ５；ＩｇＧ２ａ）、マウスＩｇＧ１、κアイソタイプ、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ、マウスＩｇＭアイソタイプ、ラットＩｇＧアイソタイプ、ラットＩｇＭアイソタイプおよびヒトＩｇＧ１アイソタイプ。次の二次抗体も、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した：ＰＥストレプトアビジン、ビオチン抗ラットＩｇＭおよびヤギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰ。次の二次抗体は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した：ウサギ抗ヒトＩｇＧ−ビオチン、ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＰＥ、ヤギ抗ラットＩｇＧ−ＰＥ、ヤギ抗マウスＩｇ−ビオチン、ヤギ抗ラットＩｇ−ＨＲＰおよびヤギ抗ヒトＩｇ−ＨＲＰ。組換えマウスＥ−セレクチン／ヒトＩｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）および組換えマウスＰ−セレクチン／ヒトＩｇキメラ（Ｐ−Ｉｇ）は、Ｒ＆Ｄから得た。マウス抗ヒトｓＬｅｘ（ＫＭ９３；ＩｇＭ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。ラット抗マウスＣＤ４３（１Ｂ１１；ＩｇＧ２ａ）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。ラット抗マウスＬＰＡＭ−１（ＤＡＴＫ３２；ＩｇＧ２ａ）およびマウス抗ＳＭＩ３２（ＳＭＩ−３２；ＩｇＧ１）は、Ａｂｃａｍから購入した。マウス抗ヒトＣＤ１５（８０Ｈ５；ＩｇＭ）は、Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈから購入した。ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＰＩ−ＰＬＣ、ブロメライン、ダイズトリプシン阻害剤、ＤＮａｓｅ、マウス抗Ｍａｐ２（ＨＭ−２；ＩｇＧ１）は、Ｓｉｇｍａから購入した。マウス抗ＧＦＰ（Ｂ２、ＩｇＧ２ａ）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。Ｔｏ−ｐｒｏ３は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。マウス抗ヒトポリシアル酸（ＰＳＡ；ＩｇＧ２ａ）は、Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｓｔａｍａｔｏｓ博士からのご厚意による贈答であった。フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＴＶＩ）酵素は、Ｒｏｌａｎｄ  Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ博士（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による贈答であった。
【０２８５】
細胞：以前に記載された通りにマウスＮＳＣを単離および培養した（Imitola,  J.、Comabella,  M.ら、２００４年；Imitola,  J.、Raddassi,  K.ら、２００４年）。簡潔に
説明すると、マウス胎生期１２日目の終脳ＶＺから単離された、解離されたＮＳＣの懸濁液（１ｍｌ当たり５×１０５細胞）を、コーティングされていない２５ｃｍ２フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）内で、９８％ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）、１％Ｎ２サプリメント（ＧＩＢＣＯ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、８ｍｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌ白血病阻害因子（ＬＩＦ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）において３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。大部分の実験に関して、２回目の継代後のＮＳＣを使用した。ヴェルセン（Versene）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけるニューロスフェアの機械的解離に
より、神経幹細胞の単一細胞懸濁液を達成した。
【０２８６】
マウスＨＳＰＣの単離のため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨および脛骨から骨髄を収集し、単一細胞懸濁液を作製した。赤血球細胞溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ）を使用して、赤血球細胞を溶解した。次に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製の系列細胞枯渇キットを使用した系列枯渇に先立ち、細胞を洗浄し、１００μｍ細胞濾し器（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を通して濾過した。ａｕｔｏＭＡＣＳ（商標）分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．）を使用して、細胞調製物を枯渇させた。枯渇後に、ＣＤ１１７  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．）を使用して、細胞をｃ−ｋｉｔに関して正の選択に付した。その結果得られる系列ｎｅｇＣ−ｋｉｔｐｏｓ集団（ＨＳＰＣと称される）をｉｎ  ｖｉｖｏ  ＥＡＥマウス研究に使用した。
【０２８７】
全長Ｅ−セレクチンをトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｅ）を以前に記載された通りに維持した（Dimitroff,  C.J.、Lee,  J.Y.ら、２００１年）。ヒトβＦＧＦ依存性ＮＳＣ細胞株であるＣＣ−２５９９を以前に記載された通りに培養し（Imitola,  J.、Raddassi,  K.ら、２００４年）、図１６（Ａ）〜図１６（Ｃ）
に提示するデータに使用した。
【０２８８】
ＧＰＳ処理、ＰＩ−ＰＬＣおよびブロメライン反応：マウスＮＳＣのＧＰＳ処理の手順は、ＭＳＣについて以前に記載された通りであった（Sackstein,  R.、Merzaban,  J.S.
ら、２００８年）。簡潔に説明すると、先ずニューロスフェアを収集し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ（０．０２％）と１５分間３７℃でインキュベートすることにより単一細胞へと解離させた。次に、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、計数し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ヒト血清アルブミンおよび１ｍＭ  ＧＤＰ−フコースを含有するＨＢＳＳ（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋なし）における６０ｍＵ／ｍｌ  ＦＴＶＩに４０分間３７℃で再懸濁した。１時間０．１Ｕ／ｍｌを使用して、３７℃でＰＩ−ＰＬＣ反応を行った。ＨＢＳＳ＋２％ＢＳＡ＋０．１％ブロメラインにおいて１時間３７℃でブロメライン反応を行った。
【０２８９】
フローサイトメトリー：細胞のアリコート（２×１０５細胞）をＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、一次ｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（非コンジュゲートまたは蛍光色素コンジュゲートのいずれか）とインキュベートした。ＰＢＳ／２％ＦＢＳにおいて細胞を洗浄し、間接免疫蛍光のために、適切な二次蛍光色素コンジュゲート抗アイソタイプ抗体とインキュベートした。細胞洗浄後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ  ５００  ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して、ＦＩＴＣまたはＰＥ蛍光強度を決定した。
【０２９０】
免疫沈降研究：ＢＴ−ＮＳＣまたはＧＰＳ−ＮＳＣの細胞溶解物を免疫沈降用抗体または適切なアイソタイプ対照とインキュベートし、続いてプロテインＧ−アガロースとインキュベートした。２％ＮＰ−４０、１％ＳＤＳを含有するバッファーＡを使用して、免疫沈降物を十分に洗浄した。一部の実験において、以前に記載された通りに免疫沈降物をＮ−グリコシダーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した（Dimitroff,  C.J.、Lee,  J.Y.ら、２００１年）。ウェスタンブロット解析のため、全ての免疫沈降物を還元試料バッファーに希釈し、煮沸し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＰＶＤＦ膜へと転写し、ＨＥＣＡ−４５２またはＥ−Ｉｇにより免疫染色した。
【０２９１】
ウェスタンブロット解析：バッファーＡ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ、０．０２％アジ化ナトリウム；およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））における２％ＮＰ−４０を使用して、ＢＴ−およびＧＰＳ−ＮＳＣを溶解した。以前に記載された通りに、定量化されたタンパク質溶解物または免疫沈降されたタンパク質のウェスタンブロットを還元条件下で行った（Dimitroff,  C.J.、Lee,  J.Y.ら、２００１年）。Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ）を使用したケミルミネッセンスによりブロットを可視化した。
【０２９２】
平行平板型フローチャンバー接着アッセイ：平行平板型フローチャンバーアッセイ（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、ＢＴ−ＮＳＣおよびＧＰＳ−ＮＳＣのＥ−セレクチン結合能力を比較した。ＮＳＣ（０．５×１０６細胞／ｍｌ、ＨＢＳＳ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液に懸濁）で、コンフルエントなＨＵＶＥＣ単層を覆った。最初に、０．５ダイン／ｃｍ２の剪断応力でＮＳＣをＨＵＶＥＣ単層に接触させ、その後、０．５〜３０ダイン／ｃｍ２に及ぶ剪断応力を発揮するように流速を調整した。０．５、１、２、５、１０、２０および３０ダイン／ｃｍ２の剪断応力において、最終１５秒間隔でＨＵＶＥＣ単層に附着性のＢＴ−またはＧＰＳ−ＮＳＣの数を定量化した。各アッセイを少なくとも３回行い、値を平均した。アッセイバッファーに５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して、セレクチン結合に必要とされるＣａ２＋をキレート化することにより、または接着アッセイにおける使用に先立ち、ＨＵＶＥＣを機能遮断抗ヒトＥ−セレクチンｍＡｂで３７℃にて１５分間処理することにより、対照アッセイを行った。
【０２９３】
ブロットローリングアッセイ：ブロットローリングアッセイは、以前に記載されており（Dimitroff,  C.J.、Lee,  J.Y.ら、２０００年；Fuhlbrigge,  R.C.、King,  S.L.ら、２００２年；Sackstein,  R.およびFuhlbrigge,  R.、２００６年）、本明細書において
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたＮＳＣ膜タンパク質のセレクチン結合活性の検出に使用した。ＮＳＣ膜調製物のウェスタンブロットを抗ＣＬＡ（ＨＥＣＡ−４５２）で染色し、１０％グリセロールを含有するＤＭＥＭにおける浸漬により半透明にした。２ｍＭ
ＣａＣｌ２および１０％グリセロールを含有するＤＭＥＭにおいてＣＨＯ−Ｅ細胞を再懸濁した（５×１０６／ｍＬ）。平行平板型フローチャンバー下にブロットを置き、１．０ダイン／ｃｍ２の生理的に関連する剪断応力でＣＨＯ−Ｅ細胞を灌流し、流動培地における１０％グリセロールの存在による粘性の増加を償うために容積測定流速における調整を行った。染色された目的のバンドの上におけるフローチャンバーの配置を助けるガイドとして分子量マーカーを使用した。１平方ミリメートル当たりの相互作用する細胞の数は、分子量領域の関数として作表し、接着ヒストグラムにコンパイルした。流動培地における５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＣＨＯ−Ｅ細胞懸濁液を灌流することにより、非特異的接着を評価した。
【０２９４】
ＥＡＥ誘導および神経幹細胞注射のための免疫化：ＮＳＣまたは骨髄ＨＳＰＣ（系列ｎｅｇＣ−ｋｉｔｐｏｓ）を、ＧＰＳで処理したまたは処理せず、ＭＯＧ  ３５−５５による免疫化（側腹部の皮下に；補足材料における詳細を参照）後（ＰＩ）９日目および１３日目に１×１０６個の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射した。盲検法様式でＥＡＥをスコア化した；研究者は、注射に関与しておらず、群の組成を認識していなかった。使用されている類別スケールの詳細については、補足材料に概要を述べる。ＨＢＳＳの０．２ｍｌの容量で、細胞懸濁液としてＢＴ−ＮＳＣ、ＧＰＳ−ＮＳＣ、ＢＴ−ＨＳＰＣまたはＧＰＳ−ＨＳＰＣをＥＡＥマウスの尾静脈に注射した。ＨＢＳＳ単独を注射した偽処置マウス（ＮＳＣなし）を陰性対照として使用した。
【０２９５】
短期ホーミング研究：ＢＴ−ＮＳＣおよびＧＰＳ−ＮＳＣを、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩにおいて５ｍＭ  ＣＦＤＡ−ＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で５分間、室温で標識し、免疫化後（ＰＩ）９日目および１３日目に、ＭＯＧ処置Ｃ５７ＢＬ６マウスに静脈内注射した。０．２ｍＬの容量のＨＢＳＳにおける２百万個のＮＳＣを各マウスに毎日注射した。ＨＢＳＳバッファー単独を使用して、バックグラウンドシグナルを決定した。ＢＴ−ＮＳＣおよびＧＰＳ−ＮＳＣは、ＭＯＧで免疫化されていない動物にも注射し、アッセイした各組織において観察されるシグナルの標準化に使用した。２回目のＮＳＣ移入から１６時間後に、マウスを屠殺し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない１×ＰＢＳを灌流した。脳、脊髄、リンパ節、脾臓、肝臓および肺を単離した。脳および脊髄をホモジナイズした。その結果得られるペレットを０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。０．０１％ＳＢＴＩ、０．００１％ＤＮａｓｅおよび０．０７５％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭを使用して、消化プロセスを停止した。リンパ節、脾臓および肝臓を機械的に解離させ、その結果得られる単一細胞懸濁液をＦＬ１チャネルにおけるフローサイトメトリーによってＣＦＤＡ−ＳＥ陽性細胞の頻度に関して評価した。フローサイトメトリーデータを解析し、ＮＳＣを含むように設定された狭いゲート内にスキャンされた２００，０００個の細胞において検出されたＣＦＤＡ−ＳＥ陽性事象のパーセントとして表現した。検査された各組織（脳、脊髄、リンパ節、脾臓、肝臓および肺）から単離された細胞の懸濁液と培養されたＮＳＣとの混合に基づきこのゲートを決定した。
【０２９６】
ＣＮＳへのＮＳＣ遊走の解析：ＢＴ−ＮＳＣ、ＧＰＳ−ＮＳＣをＰＫＨ２６色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、免疫化後（ＰＩ）９日目および１３日目にＭＯＧ処置Ｃ５７ＢＬ６マウスに静脈内注射した。０．２ｍＬの容量のＨＢＳＳにおける百万個のＮＳＣを各マウスに毎日注射した。ＨＢＳＳバッファー単独を使用して、バックグラウンドシグナルを決定した。２回目のＮＳＣ移入から４日後に、マウスを屠殺し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない１×ＰＢＳを灌流し、腰部仙髄を収集した。Ｂ６モデルにおいて、より予測可能な位置（腰仙部領域）と共により過剰増殖性の病理を保持する脊髄と比較して（Chitnis,  T.、Najafian,  N.ら、２００１年；Rasmussen,  S.、Wang,  Y.ら、２００７年；Wang,  Y.、Imitola,  J.ら、２００８年）、前脳のＣＮＳ病変はサイズおよび位置
が非常に可変的であるため、脊髄を選んだ。ＦＡＣＳ解析のため、次に脊髄をホモジナイズし、その結果得られるペレットを０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。０．０１％ＳＢＴＩ、０．００１％ＤＮａｓｅおよび０．０７５％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭを使用して、消化プロセスを停止した。組織学解析のため、脳および脊髄を液体窒素中で手早く凍結し、切片作製まで−８０℃で貯蔵した。腰部仙髄または前、中および後脳のクリオスタット切片（２０μｍ）を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、続いて目的の抗体で染色した。血管を抗Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ２、Ｓｉｇｍａ）によって可視化し、ＮＳＣを抗ｓｏｘ−２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色した、またはＰＫＨ２６色素により赤色に可視化した。続いて、脊髄をホモジナイズし、その結果得られるペレットを０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。０．０１％ＳＢＴＩ、０．００１％ＤＮａｓｅおよび０．０７５％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭを使用して、消化プロセスを停止した。Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ２）染色によって血管を可視化した。
【０２９７】
ＥＡＥ誘導のための免疫化およびＮＳＣ／ＨＳＰＣ注射：ＮＳＣまたはＨＳＰＣ（系列ｎｅｇＣ−ｋｉｔｐｏｓ）をＧＰＳで処理したまたは処理せず、ＭＯＧ  ３５−５５による免疫化後（ＰＩ）９日目および１３日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に１×１０６個の細胞を注射した。マウス配列に対応するＭＯＧ  ３５−５５（Ｍ−Ｅ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｆ−Ｓ−Ｒ−Ｖ−Ｖ−Ｈ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｎ−Ｇ−Ｋ）は、ＱＣＢ  Ｉｎｃ．  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）によって合成され、ＨＰＬＣによって＞９９％まで精製される。０．１ｍｌ  ＰＢＳおよび０．４ｍｇ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｈ３７Ｒａ、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を含有する０．１ｍｌ  ＣＦＡにおける１５０〜２００μｇのＭＯＧペプチドにより、側腹部の皮下にマウスを免疫化し、免疫化当日および２日後に、２００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を腹腔内注射する。盲検法様式でＥＡＥをスコア化した；研究者は、注射に関与しておらず、群の組成を認識していなかった。次のグレードを使用した：グレード１、ぐったりした尾またはぐったりした尾を伴わない単離された歩調の弱さ；グレード２、部分的後肢麻痺；グレード３、全後肢または部分的後および前肢麻痺；グレード４、全後肢および部分的前肢麻痺；グレード５、瀕死または死んだ動物。０．２ｍｌの容量のＨＢＳＳにおいて、細胞懸濁液としてＢＴ−ＮＳＣ、ＧＰＳ−ＮＳＣ、ＢＴ−ＨＳＰＣ、ＧＰＳ−ＨＳＰＣをＥＡＥマウスの尾静脈に注射した。ＨＢＳＳ単独を注射した偽処置マウス（ＮＳＣなし）を陰性対照として使用した。
【０２９８】
免疫組織学的染色：屠殺する前に、５０ｍｌの通常の生理食塩水でマウスを灌流して、あらゆる血管内ＰＢＭＣを除去した。共焦点イメージングのため、ＰＢＳ中１０ｍｌの４％パラホルムアルデヒドにより動物を心臓内に灌流した。脳および脊髄を除去し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．に包埋し、液体窒素中で急速凍結し、切片作製まで−７０℃に保った。脊髄のクリオスタット切片（１０μｍ）をアセトンまたは４％パラホルムアルデヒドで固定し、続いて目的の抗体で標識した。アイソタイプマッチしたＩｇおよび一次抗体省略を陰性対照とした。最小で３枚の異なるレベルの切片作製において各検体を評価した。組織切片全体（長軸方向の脊髄切片）を所定の細胞マーカーに関して４０×拡大率で評価した。切片当たり１０個の４０×（高倍率視野）視野において、所定のマーカーが陽性に染色された細胞の数を計数した。１枚の切片の結果を集計し、切片間の結果を平均した。
【０２９９】
共焦点顕微鏡のための染色：パラホルムアルデヒド固定された切片（４０μｍ）をＰＢＳにおいて洗浄し、４％ヤギ血清、０．３％ＢＳＡおよび０．３％トリトンを含有するＰＢＳにおいてブロッキングし、その後、ブロッキング溶液において一次抗体と一晩、二次抗体と２時間インキュベートした。本発明者らは、交差反応性を回避するために高度に交差吸着された二次抗体を使用した（Ａｌｅｘａ  ４８８およびＡｌｅｘａ  ５９４）。２種の蛍光色素の潜在的な重複を回避するために、マルチトラック取得プロトコールによりＺｅｉｓｓレーザー走査型顕微鏡３Ｄ解析ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を使用して共焦点顕微鏡検査を行った。
【０３００】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＳＣ分化、自己再生能力および免疫抑制効果におけるＧＰＳ処理の効果：マウスＮＳＣのＧＰＳ処理の手順は、ＭＳＣについて以前に記載された通りであった（Sackstein,  R.、Merzaban,  J.S.ら、２００８年）。自己再生する、ニューロ
スフェアを形成する、ＭＡＰ２＋ニューロンに分化する、およびＣｏｎＡ活性化リンパ節細胞の増殖を阻害するその能力に関して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢＴ−およびＧＰＳ−ＮＳＣを比較した。ＮＳＣ分化および自己再生能力：ＦＧＦ／ＥＧＦ含有培地において最初に培養されたニューロスフェアを、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）コーティングされたガラス製カバーガラスに蒔いて増殖させ、続いて収集し、バッファー（対照）で１時間処理し、またはＦＴＶＩ（６０ｍＵ／ｍＬ）で酵素処理し、その後、その結果得られるＢＴ−ＮＳＣおよびＧＰＳ−ＮＳＣを１μｌ当たり２０個の細胞のクローン密度で蒔いて、ニューロスフェアとして９６時間から５日間増殖させた。Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（ＮＹ）によりニューロスフェアイメージングを捕捉した。ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト分化のため、２４ウェルプレート内のＰＬコーティングされたガラス製カバーガラス上に解離されたニューロスフェアを蒔き、ＦＧＦ／ＥＧＦなしで、ただし１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％抗生物質／抗真菌薬および２％Ｂ２７−サプリメントを含有するニューロベーサル（neurobasal）培地の存在下で培養した。５日目まで１日おきに新鮮培地を添加し、続いて細胞を、ＭＡＰ２（ニューロン）、ＧＦＡＰ（アストロサイト）およびＮＧ２（オリゴデンドロサイト前駆体）による免疫蛍光染色に付した。処理に関して盲検化された研究者による標準立体解析学的技法を使用して、ＭＡＰ２＋、ＧＦＡＰ＋およびＮＧ２＋細胞を計数した。神経幹細胞およびリンパ節細胞の同時培養：ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスからリンパ節を単離した。以前に記載された通りに、ウェル当たり２×１０５個の細胞で、９６ウェルプレートにおいて単一細胞懸濁液としてリンパ節細胞（ＬＮＣ）を培養した（Einstein,  O.、Fainstein,  N.ら、２００７年）。培養培地は、２
．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、Ｓｉｇｍａ）ありまたはなしで、１０％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、ＨＥＰＥＳおよび抗生物質（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０からなった。ニューロスフェアを解離させ、先ず、ＧＰＳで処理しまたは処理せず（ＢＴ）、その後、３，０００ラドで放射線照射した。放射線照射後に、解離されたＮＳＣを、ＣｏｎＡ刺激ＬＮＣと異なる比でＬＮＣ培養培地に直接添加した。ＮＳＣ数対ＬＮＣ数の検査した比は：１：４、１：２、１：１、２：１および４：１であった。次に、チミジンを添加する前に細胞を４８時間培養した。１６時間後にチミジン取込みアッセイを行った。
【０３０１】
炎症性サイトカインによるＮＳＣの処理後のＥ−セレクチンリガンドの評価：ウェル当たり３ｍｌの増殖培地を含有する６ウェルプレートに１．５×１０６細胞／ウェルを播種し、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ；４１０−ＴＲＮＣ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ；４０１−ＭＬ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ；４８５−ＭＩ）のいずれかで独立してまたは組み合わせて（全３種を１０ｎｇ／ｍｌで）刺激した。２４時間および４８時間後に、ニューロスフェアを遠心分離により収集し、フローサイトメトリー解析のためＥ−Ｉｇで染色した。
【０３０２】
ＬＩＦ  ｍＲＮＡの測定：炎症性サイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γおよび１５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α）ありまたはなしで、１×１０６個のマウス胚性ＮＳＣを２４時間処理した。次に、トリゾール試薬を使用して全ＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２２００  Ｔａｂ  ｓｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを使用して、抽出されたＲＮＡの質を測定した。高性能（high  capacity）ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡ合成を行った。ＲＴ−ＰＣＲを使用してｍＲＮＡレベルを測定し、２−ΔΔＣＴ方法を使用して遺伝子発現の倍数変化を計算した。ＬＩＦ遺伝子のフォワードプライマー配列は、ＣＣＴＡＣＣＴＧＣＧＴＣＴＴＡＣＴＣＣＡＴＣＡであり、リバースプライマーは、ＣＣＣＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＴＴ（Ｓｉｇｍａ）である。フォワードプライマーとしてＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣおよびリバースプライマーとしてＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧを使用したＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子と比べて、ＬＩＦ  ｍＲＮＡの相対的発現をアッセイした。
【０３０３】
ＣＮＳへのＮＳＣ遊走の解析：ＢＴ−ＮＳＣ、ＧＰＳ−ＮＳＣをＰＫＨ２６色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、免疫化後（ＰＩ）９日目および１３日目に、ＭＯＧ処置Ｃ５７ＢＬ６マウスに静脈内注射した。百万個のＮＳＣを各マウスに毎日注射した。ＨＢＳＳバッファー単独を使用して、バックグラウンドシグナルを決定した。２回目のＮＳＣ移入から２４時間後または４日間後のいずれかに、マウスを屠殺し、灌流し、腰部仙髄を収集した。Ｂ６モデルにおいて、より予測可能な位置（腰仙部領域）と共により過剰増殖性の病理を保持する脊髄と比較して（Chitnis,  T.、Najafian,  N.ら、２００１年；Rasmussen,  S.、Wang,  Y.ら、２００７年；Wang,  Y.、Imitola,  J.ら、２００８年）、前
脳におけるＣＮＳ病変は、サイズおよび位置が非常に可変的であるため、脊髄を選んだ。フローサイトメトリー解析のため、続いて脊髄をホモジナイズし、その結果得られるペレットを０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡに再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。０．０１％ＳＢＴＩ、０．００１％ＤＮａｓｅおよび０．０７５％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭを使用して、消化プロセスを停止した。組織学解析のため、脳および脊髄を液体窒素中で手早く凍結し、切片作製まで−８０℃で貯蔵した。腰部仙髄または前、中および後脳のクリオスタット切片（２０μｍ）を固定し、続いて目的の抗体で染色した。抗Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ２）によって血管を可視化し、抗ＳＯＸ−２でＮＳＣを染色した、またはＰＫＨ２６色素によって赤色で可視化した。神経病理学解析のため、異なる群における動物の立体解析学的解析によって細胞定量化を行った。脊髄および脳の切片を作製し、頸部および腰仙部領域の３枚毎の切片を染色し、３〜５枚の切片の細胞定量化を強拡大率で行った。電動式ステージを備えるＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡を使用して、染色強度および総細胞数／強拡大率を立体解析学的に計算した。
【０３０４】
統計的解析−データは、平均±ＳＥＭとして表現する。二元配置ＡＮＯＶＡにより平均の間の差の統計的有意性を決定した。平均が、有意に異なると示された場合、チューキー（Turkey）ｔ検定により事後に多重比較を行った。統計的有意性は、ｐ＜０．０５として規定した。
参考文献−実施例７
【０３０５】
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【０３２８】
Ｇａｄｈｏｕｍ  ＳＺ，  Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ  Ｒ．  ２００８．  ＣＤ１５  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｉａｌｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．
Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，  ４：７５１−７５７．
【０３２９】
Ｇａｓｃｏｎ  Ｅ，  Ｖｕｔｓｋｉｔｓ  Ｌ，  Ｋｉｓｓ  ＪＺ．  ２００７．  Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ：  ｆｒｏｍ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｔｏ
ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ，  ５６：１０１−１１８．
【０３３０】
Ｇｌａｓｅｒ  Ｔ，  Ｂｒｏｓｅ  Ｃ，  Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ  Ｉ，  Ｈａｍａｎｎ  Ｋ，  Ｓｍｏｒｏｄｃｈｅｎｋｏ  Ａ，  Ｚｉｐｐ  Ｆ，  Ｄｕｂｏｉｓ−Ｄａｌｃｑ  Ｍ，  Ｂｒｕｓｔｌｅ  Ｏ．  ２００７．  Ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｔｏ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｃｕｅｓ．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  ２５：３０１６−３０２５．
【０３３１】
Ｇｏｎｃｈａｒｏｖａ  Ｖ，  Ｄａｓ  Ｓ，  Ｎｉｌｅｓ  Ｗ，  Ｓｃｈｒａｕｆｓｔａｔｔｅｒ  Ｉ，  Ｗｏｎｇ  ＡＫ，  Ｐｏｖａｌｙ  Ｔ，  Ｗａｋｅｍａｎ  Ｄ，  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｌ，  Ｓｎｙｄｅｒ  ＥＹ，  Ｋｈａｌｄｏｙａｎｉｄｉ  ＳＫ．  ２０１４．  Ｈｏｍｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｅｎｏｕｓ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｉｎｔｏ  ａ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｉｎｖｏｌｖｅ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ３：２２９−２４０．
【０３３２】
Ｈｅｓｓ  ＤＣ，  Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ  ＣＶ．  ２００８．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  ４１  Ｓｕｐｐｌ  １：９４−１１４．
【０３３３】
Ｈｏｒｉｅ  Ｋ，  Ｓａｋａｇａｍｉ  Ｍ，  Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ  Ｋ，  Ｉｔｏ  Ｔ，
Ｈａｍａｎａ  Ｈ．  ２０００．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ  （ＳＬｅ（ｘ））  ｍｏｉｅｔｙ  ｏｎ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＬｅ（ｘ）−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｕｌｌｕｌａｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ４４：４０１−４０４．
【０３３４】
Ｈｏｒｉｅ  Ｋ，  Ｓａｋａｇａｍｉ  Ｍ，  Ｍａｓｕｄａ  Ｋ，  Ｎｏｔｏｙａ  Ｍ，
Ｈａｍａｎａ  Ｈ，  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｔ，  Ｈｉｒａｎｏ  Ｋ．  ２００４．  Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｕｌｌｕｌａｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｏｍｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ  ｔｏ  ｓｐｌｅｅｎ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ，  ２７：１２７５−１２８０．
【０３３５】
Ｉｍｉｔｏｌａ  Ｊ，  Ｃｈｉｔｎｉｓ  Ｔ，  Ｋｈｏｕｒｙ  ＳＪ．  ２００６．  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．  Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ，  ６３：２５−３３．
【０３３６】
Ｉｍｉｔｏｌａ  Ｊ，  Ｃｏｍａｂｅｌｌａ  Ｍ，  Ｃｈａｎｄｒａｋｅｒ  ＡＫ，  Ｄａｎｇｏｎｄ  Ｆ，  Ｓａｙｅｇｈ  ＭＨ，  Ｓｎｙｄｅｒ  ＥＹ，  Ｋｈｏｕｒｙ  ＳＪ．  ２００４．  Ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｓｔｉｍｕｌｉ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １６４：１６１５−１６２５．
【０３３７】
Ｉｍｉｔｏｌａ  Ｊ，  Ｃｏｔｅ  Ｄ，  Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  Ｓ，  Ｘｉｅ  ＸＳ，  Ｌｉｕ  Ｙ，  Ｃｈｉｔｎｉｓ  Ｔ，  Ｓｉｄｍａｎ  ＲＬ，  Ｌｉｎ  ＣＰ，  Ｋｈｏｕｒｙ  ＳＪ．  ２０１１．  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｙｅｌｉｎ  ａｎｄ  ａｘｏｎａｌ
ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ−ｌｉｋｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｏｐｔｉｃｓ，  １６：０２１１０９．
【０３３８】
Ｉｍｉｔｏｌａ  Ｊ，  Ｒａｄｄａｓｓｉ  Ｋ，  Ｐａｒｋ  ＫＩ，  Ｍｕｅｌｌｅｒ  ＦＪ，  Ｎｉｅｔｏ  Ｍ，  Ｔｅｎｇ  ＹＤ，  Ｆｒｅｎｋｅｌ  Ｄ，  Ｌｉ  Ｊ，  Ｓｉｄｍａｎ  ＲＬ，  Ｗａｌｓｈ  ＣＡ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ＣＮＳ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １ａｌｐｈａ／ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ
４  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  １０１：１８１１７−１８１２２．
【０３３９】
Ｊｉ  ＪＦ，  Ｈｅ  ＢＰ，  Ｄｈｅｅｎ  ＳＴ，  Ｔａｙ  ＳＳ．  ２００４．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＸＣＲ４，  ＣＣＲ２，  ＣＣＲ５  ａｎｄ  ＣＸ３ＣＲ１  ｉｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ
ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３５５：２３６−２４０．
【０３４０】
Ｊｕｓｔｉｃｉａ  Ｃ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ａ，  Ｒｏｊａｓ  Ｓ，  Ｇｉｒｏｎｅｌｌａ
Ｍ，  Ｃｅｒｖｅｒａ  Ａ，  Ｐａｎｅｓ  Ｊ，  Ｃｈａｍｏｒｒｏ  Ａ，  Ｐｌａｎａｓ  ＡＭ．  ２００６．  Ａｎｔｉ−ＶＣＡＭ−１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｄ  ｎｏｔ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｄａｍａｇｅ  ｅｉｔｈｅｒ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｏｒ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ，  ２６：４２１−４３２．
【０３４１】
Ｌａｔｅｒｚａ  Ｃ，  Ｍｅｒｌｉｎｉ  Ａ，  Ｄｅ  Ｆｅｏ  Ｄ，  Ｒｕｆｆｉｎｉ  Ｆ，  Ｍｅｎｏｎ  Ｒ，  Ｏｎｏｒａｔｉ  Ｍ，  Ｆｒｅｄｒｉｃｋｘ  Ｅ，  Ｍｕｚｉｏ  Ｌ，  Ｌｏｍｂａｒｄｏ  Ａ，  Ｃｏｍｉ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３．  ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｅｘｅｒｔ  ａ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＩＦ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ４：２５９７．
【０３４２】
Ｌａｖｄａｓ  ＡＡ，  Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ  Ｉ，  Ｄｕｂｏｉｓ−Ｄａｌｃｑ  Ｍ，  Ｍａｔｓａｓ  Ｒ．  ２００６．  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＳＡ  ｓｈｏｗ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｇｌｉａ，  ５３：８６８−８７８．
【０３４３】
Ｌｅｅ  ＳＪ，  Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ  ＥＮ．  １９９９．  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ９８：７７−８８．
【０３４４】
Ｌｅｅ  ＳＴ，  Ｃｈｕ  Ｋ，  Ｊｕｎｇ  ＫＨ，  Ｋｉｍ  ＳＪ，  Ｋｉｍ  ＤＨ，  Ｋａｎｇ  ＫＭ，  Ｈｏｎｇ  ＮＨ，  Ｋｉｍ  ＪＨ，  Ｂａｎ  ＪＪ，  Ｐａｒｋ  ＨＫ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００８．  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ．  Ｂｒａｉｎ  ：  ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  １３１：６１６−６２９．
【０３４５】
Ｌｅｏｎｅ  ＤＰ，  Ｒｅｌｖａｓ  ＪＢ，  Ｃａｍｐｏｓ  ＬＳ，  Ｈｅｍｍｉ  Ｓ，
Ｂｒａｋｅｂｕｓｃｈ  Ｃ，  Ｆａｓｓｌｅｒ  Ｒ，  Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｃ，  Ｓｕｔｅｒ  Ｕ．  ２００５．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｂｙ  ｂｅｔａ１  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，  １１８：２５８９−２５９９．
【０３４６】
Ｌｅｐｐａｎｅｎ  Ａ，  Ｗｈｉｔｅ  ＳＰ，  Ｈｅｌｉｎ  Ｊ，  ＭｃＥｖｅｒ  ＲＰ，  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ．  ２０００．  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｕｌｆｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｄ  ｓｕｇａｒ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ，  ２７５：３９５６９−３９５７８．
【０３４７】
Ｌｉｕ  Ｈ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊ，  Ｌｉｕ  ＣＹ，  Ｗａｎｇ  ＩＪ，  Ｓｉｅｂｅｒ  Ｍ，  Ｃｈａｎｇ  Ｊ，  Ｊｅｓｔｅｒ  ＪＶ，  Ｋａｏ  ＷＷ．  ２０１０．  Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ
ｗｉｔｈ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｌｕｍｉｃａｎ  ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ，  ５：ｅ１０７０７．
【０３４８】
Ｍａｎｅｓｓ  ＰＦ，  Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ  Ｍ．  ２００７．  Ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ｏｆ  ａｘｏｎ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  １０：１９−２６．
【０３４９】
Ｍａｒｔｉｎｏ  Ｇ，  Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  Ｓ．  ２００６．  Ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ
Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ７：３９５−４０６．
【０３５０】
Ｍｅｒｚａｂａｎ  ＪＳ，  Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＭＭ，  Ｇａｄｈｏｕｍ  ＳＺ，  Ｄａｇｉａ  ＮＭ，  Ｃｈｕ  ＪＴ，  Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅ  ＲＣ，  Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ  Ｒ．  ２０１１．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ，  １１８：１７７４−１７８３．
【０３５１】
Ｐｈｉｎｎｅｙ  ＤＧ，  Ｐｒｏｃｋｏｐ  ＤＪ．  ２００７．  Ｃｏｎｃｉｓｅ  ｒｅｖｉｅｗ：  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ／ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：  ｔｈｅ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｓ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｐａｉｒ−−ｃｕｒｒｅｎｔ  ｖｉｅｗｓ．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  （Ｄａｙｔｏｎ，  Ｏｈｉｏ），  ２５：２８９６−２９０２．
【０３５２】
Ｐｉｃｃｉｏ  Ｌ，  Ｒｏｓｓｉ  Ｂ，  Ｃｏｌａｎｔｏｎｉｏ  Ｌ，  Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ  Ｒ，  Ｇｈｏ  Ａ，  Ｏｔｔｏｂｏｎｉ  Ｌ，  Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ  ＪＷ，
Ｓｃａｒｐｉｎｉ  Ｅ，  Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｏ  Ｍ，  Ｌａｕｄａｎｎａ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｂｒａｉｎ  ｖｅｎｕｌｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ＶＩＩ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １７４：５８０５−５８１３．
【０３５３】
Ｐｉｃｃｉｏ  Ｌ，  Ｒｏｓｓｉ  Ｂ，  Ｓｃａｒｐｉｎｉ  Ｅ，  Ｌａｕｄａｎｎａ  Ｃ，  Ｇｉａｇｕｌｌｉ  Ｃ，  Ｉｓｓｅｋｕｔｚ  ＡＣ，  Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ  Ｄ，
Ｂｕｔｃｈｅｒ  ＥＣ，  Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ  Ｇ．  ２００２．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｂｒａｉｎ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓ：
ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｎｄ−１  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ（ｉ）−ｌｉｎｋｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １６８：１９４０−１９４９．
【０３５４】
Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  Ｓ，  Ｑｕａｔｔｒｉｎｉ  Ａ，  Ｂｒａｍｂｉｌｌａ  Ｅ，  Ｇｒｉｔｔｉ  Ａ，  Ｓａｌａｎｉ  Ｇ，  Ｄｉｎａ  Ｇ，  Ｇａｌｌｉ  Ｒ，  Ｄｅｌ  Ｃａｒｒｏ  Ｕ，  Ａｍａｄｉｏ  Ｓ，  Ｂｅｒｇａｍｉ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ａ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４２２：６８８−６９４．
【０３５５】
Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  Ｓ，  Ｚａｎｏｔｔｉ  Ｌ，  Ｂｒｉｎｉ  Ｅ，  Ｆｅｒｒａｒｉ  Ｓ，  Ｍａｒｔｉｎｏ  Ｇ．  ２００９．  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ，  ４５６：１０１−１０６．
【０３５６】
Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  Ｓ，  Ｚａｎｏｔｔｉ  Ｌ，  Ｒｏｓｓｉ  Ｂ，  Ｂｒａｍｂｉｌｌａ  Ｅ，  Ｏｔｔｏｂｏｎｉ  Ｌ，  Ｓａｌａｎｉ  Ｇ，  Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｏ  Ｍ，
Ｃａｔｔａｌｉｎｉ  Ａ，  Ｂｅｒｇａｍｉ  Ａ，  Ｆｕｒｌａｎ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ
ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３６：２６６−２７１．
【０３５７】
Ｐｏｌｉｔｉ  ＬＳ，  Ｂａｃｉｇａｌｕｐｐｉ  Ｍ，  Ｂｒａｍｂｉｌｌａ  Ｅ，  Ｃａｄｉｏｌｉ  Ｍ，  Ｆａｌｉｎｉ  Ａ，  Ｃｏｍｉ  Ｇ，  Ｓｃｏｔｔｉ  Ｇ，  Ｍａｒｔｉｎｏ  Ｇ，  Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  Ｓ．  ２００７．  Ｍａｇｎｅｔｉｃ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌｓ，  ２５：２５８３−２５９２．
【０３５８】
Ｐｏｌｌｅｙ  ＭＪ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＭＬ，  Ｗａｙｎｅｒ  Ｅ，  Ｎｕｄｅｌｍａｎ  Ｅ，  Ｓｉｎｇｈａｌ  ＡＫ，  Ｈａｋｏｍｏｒｉ  Ｓ，  Ｐａｕｌｓｏｎ  ＪＣ．  １９９１．  ＣＤ６２  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １  （ＥＬＡＭ−１）  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｌｉｇａｎｄ，  ｓｉａｌｙｌ−Ｌｅｗｉｓ  ｘ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ８８：６２２４−６２２８．
【０３５９】
Ｒａｍｐｏｎ  Ｃ，  Ｗｅｉｓｓ  Ｎ，  Ｄｅｂｏｕｘ  Ｃ，  Ｃｈａｖｅｒｏｔ  Ｎ，
Ｍｉｌｌｅｒ  Ｆ，  Ｂｕｃｈｅｔ  Ｄ，  Ｔｒｉｃｏｉｒｅ−Ｌｅｉｇｎｅｌ  Ｈ，
Ｃａｚａｕｂｏｎ  Ｓ，  Ｂａｒｏｎ−Ｖａｎ  Ｅｖｅｒｃｏｏｒｅｎ  Ａ，  Ｃｏｕｒａｕｄ  ＰＯ．  ２００８．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ：  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｐｉｃａｌ  ｃｕｐｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＤ４４．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  ２６：１６７３−１６８２．
【０３６０】
Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  Ｓ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｋｉｖｉｓａｋｋ  Ｐ，  Ｂｒｏｎｓｏｎ
ＲＴ，  Ｍｅｙｅｒ  Ｍ，  Ｉｍｉｔｏｌａ  Ｊ，  Ｋｈｏｕｒｙ  ＳＪ．  ２００７．  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｌｏｓａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ−ｌｉｋｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．  Ｂｒａｉｎ，  １３０：２８１６−２８２９．
【０３６１】
Ｒｅｄｌ  Ｈ，  Ｄｉｎｇｅｓ  ＨＰ，  Ｂｕｕｒｍａｎ  ＷＡ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ  ＣＪ，  Ｐｏｂｅｒ  ＪＳ，  Ｃｏｔｒａｎ  ＲＳ，  Ｓｃｈｌａｇ  Ｇ．
１９９１．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｂｕｔ  ｎｏｔ
ｔｒａｕｍａｔｉｃ／ｈｙｐｏｖｏｌｅｍｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｂｏｏｎ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １３９：４６１−４６６．
【０３６２】
Ｒｏｓｅｎ  ＳＤ．  ２００４．  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ：  ｈｏｍｉｎｇ，  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２２：１２９−１５６．
【０３６３】
Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ  Ｕ．  ２００８．  Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ９：２６−３５．
【０３６４】
Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ  Ｒ．  ２００４．  Ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｉｓ  ａｋｉｎ  ｔｏ  ｓｋｉｎ：  ＨＣＥＬＬ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｉｎｇ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，  １２２：１０６１−１０６９．
【０３６５】
Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ  Ｒ．  ２００５．  Ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｈｏｍｉｎｇ
ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ
ｐａｒａｄｉｇｍ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ，  １２：４４４−４５０．
【０３６６】
Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ  Ｒ，  Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅ  Ｒ．  ２００６．  Ｔｈｅ  ｂｌｏｔ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ：  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｕｎｄｅｒ  ｓｈｅａｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３４１：２１７−２２６．
【０３６７】
Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ  Ｒ，  Ｍｅｒｚａｂａｎ  ＪＳ，  Ｃａｉｎ  ＤＷ，  Ｄａｇｉａ
ＮＭ，  Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＪＡ，  Ｌｉｎ  ＣＰ，  Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ  Ｒ．  ２００８．  Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｇｌｙｃａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ＣＤ４４  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｔｏ  ｂｏｎｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １４：１８１−１８７．
【０３６８】
Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ＫＭ，  Ｄｒａｇｅｒ  ＡＭ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａｌｋ  Ｐ，  Ｔｈｉｊｓｅｎ  ＳＦ，  Ｚｅｖｅｎｂｅｒｇｅｎ  Ａ，  Ｔｈｅｉｊｓｍｅｉｊｅｒ  ＡＰ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｃｈｏｏｔ  ＣＥ，  Ｌａｎｇｅｎｈｕｉｊｓｅｎ  ＭＭ．  １９９６．  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｏｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １４８：１６５−１７５．
【０３６９】
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ＴＡ．  １９９４．  Ｔｒａｆｆｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｅｍｉｇｒａｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｐａｒａｄｉｇｍ．  Ｃｅｌｌ，  ７６：３０１−３１４．
【０３７０】
Ｖｉｔｒｙ  Ｓ，  Ａｖｅｌｌａｎａ−Ａｄａｌｉｄ  Ｖ，  Ｌａｃｈａｐｅｌｌｅ  Ｆ，  Ｅｖｅｒｃｏｏｒｅｎ  ＡＢ．  ２００１．  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｔｙ  ｏｆ  ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｂｒａｉｎ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７：９８３−１０００．
【０３７１】
Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｓｈｉ  Ｊ，  ｖａｎ  Ｇｉｎｋｅｌ  ＦＷ，  Ｌａｎ  Ｌ，  Ｎｉｅｍｅｙｅｒ  Ｇ，  Ｍａｒｔｉｎ  ＤＲ，  Ｓｎｙｄｅｒ  ＥＹ，  Ｃｏｘ  ＮＲ．  ２００９．  Ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ２１６：１７７−１８３．
【０３７２】
Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｉｍｉｔｏｌａ  Ｊ，  Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  Ｓ，  Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ
ＫＣ，  Ｋｈｏｕｒｙ  ＳＪ．  ２００８．  Ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ−Ｇｌｉ１  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ６４：４１７−４２７．
【０３７３】
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒ，  Ｂｕｒｔｏｎ  Ｊ，  Ｔｏｄｄ  ＲＦ，  ３ｒｄ，  Ｎｅｗｍａｎ  Ｗ，  Ｄｒａｇｏｖｉｃ  Ｌ，  Ｄｏｒｅ−Ｄｕｆｆｙ  Ｐ．  １９９４．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ３５：８９−９７．
【０３７４】
Ｗｅｉｓｈａｕｐｔ  Ａ，  Ｊａｎｄｅｒ  Ｓ，  Ｂｒｕｃｋ  Ｗ，  Ｋｕｈｌｍａｎｎ
Ｔ，  Ｓｔｉｅｎｅｋｅｍｅｉｅｒ  Ｍ，  Ｈａｒｔｕｎｇ  Ｔ，  Ｔｏｙｋａ  ＫＶ，  Ｓｔｏｌｌ  Ｇ，  Ｇｏｌｄ  Ｒ．  ２０００．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：
ｒａｐｉｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１−ｔｙｐｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １６５：７１５７−７１６３．
【０３７５】
Ｚａｒｂｏｃｋ  Ａ，  Ｋｅｍｐｆ  Ｔ，  Ｗｏｌｌｅｒｔ  ＫＣ，  Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ  Ｄ．  ２０１２．  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ａｎｄ  ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂａｌａｎｃｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ９０：３５３−３５９．
【０３７６】
Ｚａｒｂｏｃｋ  Ａ，  Ｌｏｗｅｌｌ  ＣＡ，  Ｌｅｙ  Ｋ．  ２００７．  Ｓｐｌｅｅｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｓｙｋ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｌｐｈａ（Ｌ）ｂｅｔａ（２）  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｏｎ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ２６：７７３−７８３．
【０３７７】
Ｚｈａｎｇ  Ｈ，  Ｖｕｔｓｋｉｔｓ  Ｌ，  Ｃａｌａｏｒａ  Ｖ，  Ｄｕｒｂｅｃ  Ｐ，  Ｋｉｓｓ  ＪＺ．  ２００４．  Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ
ＰＤＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，  １１７：９３−１０３．
【０３７８】
Ｚｉｖ  Ｙ，  Ａｖｉｄａｎ  Ｈ，  Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  Ｓ，  Ｍａｒｔｉｎｏ  Ｇ，  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｍ．  ２００６．  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｍｍｕｎｅ
ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，  １０３：１３１７４−１３１７９．
【図１】
2022003094.tif 000005
【図２】
2022003094.tif 000006
【図３】
2022003094.tif 000007
【図４】
2022003094.tif 000008
【図５】
2022003094.tif 000009
【図６】
2022003094.tif 000010
【図７】
2022003094.tif 000011
【図８】
2022003094.tif 000012
【図９Ａ】
2022003094.tif 000013
【図９Ｂ】
2022003094.tif 000014
【図１０Ａ】
2022003094.tif 000015
【図１０Ｂ】
2022003094.tif 000016
【図１０Ｃ】
2022003094.tif 000017
【図１１Ａ】
2022003094.tif 000018
【図１１Ｂ】
2022003094.tif 000019
【図１１Ｃ】
2022003094.tif 000020
【図１２Ａ】
2022003094.tif 000021
【図１２Ｂ】
2022003094.tif 000022
【図１３−１】
2022003094.tif 000023
【図１３−２】
2022003094.tif 000024
【図１３−３】
2022003094.tif 000025
【図１４−１】
2022003094.tif 000026
【図１４−２】
2022003094.tif 000027
【図１４−３】
2022003094.tif 000028
【図１４−４】
2022003094.tif 000029
【図１４−５】
2022003094.tif 000030
【図１４−６】
2022003094.tif 000031
【図１４−７】
2022003094.tif 000032
【図１５】
2022003094.tif 000033
【図１６】
2022003094.tif 000034
【図１７】
2022003094.tif 000035
【図１８−１】
2022003094.tif 000036
【図１８−２】
2022003094.tif 000037
【図１９−１】
2022003094.tif 000038
【図１９−２】
2022003094.tif 000039
【図１９−３】
2022003094.tif 000040
【図２０−１】
2022003094.tif 000041
【図２０−２】
2022003094.tif 000042
【図２１Ａ】
2022003094.tif 000043
【図２１Ｂ】
2022003094.tif 000044
【図２１Ｃ】
2022003094.tif 000045
【図２２】
2022003094.tif 000046
【図２３】
2022003094.tif 000047
【図２４】
2022003094.tif 000048
【図２５】
2022003094.tif 000049
【図２６】
2022003094.tif 000050
【図２７】
2022003094.tif 000051
【図２８−１】
2022003094.tif 000052
【図２８−２】
2022003094.tif 000053
【図２９】
2022003094.tif 000054
【図３０】
2022003094.tif 000055
【図３１】
2022003094.tif 000056
【図３２】
2022003094.tif 000057
【図３３】
2022003094.tif 000058
【図３４】
2022003094.tif 000059
【配列表】
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