(57)【要約】【課題】脂肪組織における脂肪量増加抑制能力を有する物質を探索するために必須となる、簡便な脂肪量増加抑制能力の検定方法を提供すること。【解決手段】脂肪量増加抑制能力の検定方法であって、（１）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼと被験物質との接触系内における前記モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を測定する第一工程、及び（２）第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の脂肪量増加抑制能力を評価する第二工程、を有することを特徴とする脂肪量増加抑制能力の検定方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪量増加抑制能力の検定方法であって、
（１）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼと被験物質との接触系内における前記モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を測定する第一工程、及び
（２）第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の脂肪量増加抑制能力を評価する第二工程、
を有することを特徴とする脂肪量増加抑制能力の検定方法。
【請求項２】
請求項１記載の検定方法により評価された脂肪量増加抑制能力に基づき脂肪量増加抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とする脂肪量増加抑制物質の探索方法。
【請求項３】
請求項２記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする脂肪量増加抑制剤。
【請求項４】
モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする脂肪量増加抑制剤。
【請求項５】
モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼが哺乳動物由来であることを特徴とする請求項１記載の脂肪量増加抑制能力の検定方法。
【請求項６】
モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼが下記のいずれかの蛋白質であることを特徴とする請求項１記載の脂肪量増加抑制能力の検定方法。
＜蛋白質群＞
（ａ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ａ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｂ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｄ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｄ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｅ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｅ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｆ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｆ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
【請求項７】
脂肪量増加抑制能力が、脂肪蓄積抑制能力であることを特徴とする請求項１、５又は６のいずれか記載の検定方法。
【請求項８】
請求項７記載の検定方法により評価された脂肪蓄積抑制能力に基づき脂肪蓄積抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とする脂肪蓄積抑制物質の探索方法。
【請求項９】
請求項８記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする脂肪蓄積抑制剤。
【請求項１０】
モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする脂肪蓄積抑制剤。
【請求項１１】
脂肪量増加抑制能力が、リポ蛋白合成抑制能力であることを特徴とする請求項１、５又は６のいずれか記載の検定方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の検定方法により評価されたリポ蛋白合成抑制能力に基づきリポ蛋白合成抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とするリポ蛋白合成抑制物質の探索方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするリポ蛋白合成抑制剤。
【請求項１４】
モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするリポ蛋白合成抑制剤。
【請求項１５】
モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質がＮ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミンであるとすることを特徴とする請求項１４記載のリポ蛋白合成抑制剤。
【請求項１６】
Ｎ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミンを有効成分として含有する、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤。
【請求項１７】
下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする蛋白質。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列
（ａ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｂ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｃ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｄ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｅ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｆ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
【請求項１８】
下記のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列
（ａ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｂ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｃ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｄ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｅ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｆ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
【請求項１９】
請求項１７記載の蛋白質からなる、下記の反応の触媒。
２又は１−モノアシルグリセロール＋アシル−ＣｏＡ　⇒　１，２−ジアシルグリセロール＋ＣｏＡ
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂肪量増加抑制能力の検定方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
体内における脂肪は、体組織の細胞中に蓄積される脂肪と、血液中に存在する脂肪とに大きく分類することができる。
前者の脂肪は、例えば、哺乳動物等の身体において、（１）腹側部、大腿部、臀部もしくは胸部等の皮下脂肪組織、（２）腎臓もしくは副睾丸等に接する脂肪組織、腸間膜脂肪組織、又は、大網脂肪組織等の腹腔内脂肪組織、（３）肝臓に含まれる脂肪組織、あるいは（４）胸腔内脂肪組織、等の各種組織に蓄積する。脂肪組織、特に、例えば、腹腔内脂肪組織（中でも腸間膜脂肪組織及び大網脂肪組織等の門脈に流入する血管の周囲に存在する腹腔内脂肪組織）への脂肪の蓄積による該組織量の増大が、耐糖能低下、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化などの代謝性疾患や、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞などの心血管障害等の疾患の発症と密接に関連すること等が明らかにされている。このため、脂肪組織、特に、例えば、腹腔内脂肪組織への脂肪蓄積を抑制し、脂肪組織量の増大を抑えることにより、脂肪組織への脂肪の蓄積に密接に関連する前記疾患の治療または予防が可能となる。
【０００３】
血液中の脂肪は、細胞内で合成された脂肪が血液中へ放出されたものであり、具体的には、アポ蛋白と呼ばれる蛋白質コアと複合体粒子（リポ蛋白）を形成して血液中を循環している。近年血液中の脂肪量の増大、つまり高トリグリセライド血症が、糖尿病、高血圧又は喫煙などとともに、虚血性心疾患や脳梗塞などの動脈硬化性疾患の危険因子の１つである、と考えられるようになった。このことから、血液中への脂肪供給を担う臓器、具体的には小腸や肝臓などにおける脂肪合成を抑制し、血中の脂肪量の増大を抑えることによって、血中脂肪量の増大に密接に関連する前記疾患の治療または予防が可能となる。
【０００４】
これまでに、脂肪量増加抑制能力を有する物質を見い出すためのいくつかの方法が知られている（例えば、特許文献１）が、必ずしも簡便で十分なものではなかった。
【０００５】
一方、以下の反応：
２又は１−モノアシルグリセロール＋アシル−ＣｏＡ
⇒　１、２または１、３−ジアシルグリセロール＋ＣｏＡ
を触媒する酵素、すなわちモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（以下ＭＧＡＴと略すことがある。）の、脂肪蓄積および、リポ蛋白合成による血中脂肪量の増大における寄与の程度は不明であった。また、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの配列については、これまでに報告例があるものの（非特許文献１）、該配列は、リポ蛋白合成及び血中へのトリグリセリドの放出に関与している肝臓や小腸においてほとんど発現しておらず、ヒトの生体内で有効に働いている前記酵素の配列は知られていなかった。
【特許文献１】
国際公開第００／４４７５４号パンフレット
【非特許文献１】
ＲＶ　Ｆａｒｅｓｅ　Ｊｒ．ら著，　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　ｐ８５１２−８５１７，　２００２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このために、脂肪量増加抑制能力を有する物質を探索するために必須となる、簡便かつ優れた脂肪量増加抑制能力の検定方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、モノアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）阻害活性を有する物質が、脂肪細胞への脂肪蓄積および小腸、肝臓におけるリポ蛋白質合成を抑制する作用を有し、脂肪量増加抑制剤として有効であることを見出した。また、ヒト、マウスおよびラットの新規なＭＧＡＴの塩基配列及びアミノ酸配列を同定すると同時に、前記ＭＧＡＴ阻害活性を有する物質が、本発明において同定した配列からなるＭＧＡＴの酵素活性を阻害することによって、脂肪細胞における脂肪量増加、又は小腸もしくは肝臓細胞におけるリポ蛋白合成を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、
１．脂肪量増加抑制能力の検定方法であって、
（１）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼと被験物質との接触系内における前記モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を測定する第一工程、及び
（２）第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の脂肪量増加抑制能力を評価する第二工程、
を有することを特徴とする脂肪量増加抑制能力の検定方法；
２．項１記載の検定方法により評価された脂肪量増加抑制能力に基づき脂肪量増加抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とする脂肪量増加抑制物質の探索方法；
３．項２記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする脂肪量増加抑制抑制剤；
４．モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする脂肪量増加抑制剤；
５．モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼが哺乳動物由来であることを特徴とする項１記載の脂肪量増加抑制能力の検定方法；
６．モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼが下記のいずれかの蛋白質であることを特徴とする項１記載の脂肪量増加抑制能力の検定方法；
＜蛋白質群＞
（ａ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ａ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｂ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｄ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｄ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｅ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｅ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｆ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｆ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
７．脂肪量増加抑制能力が、脂肪蓄積抑制能力であることを特徴とする項１、５又は６のいずれか記載の検定方法；
８．項７に記載の検定方法により評価された脂肪蓄積抑制能力に基づき脂肪蓄積抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とする脂肪蓄積抑制物質の探索方法；
９．項８に記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする脂肪蓄積抑制剤；
１０．モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする脂肪蓄積抑制剤；
１１．脂肪量増加抑制能力が、リポ蛋白合成抑制能力であることを特徴とする項１、５又は６のいずれか記載の検定方法；
１２．項１１に記載の検定方法により評価されたリポ蛋白合成抑制能力に基づきリポ蛋白合成抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とするリポ蛋白合成抑制物質の探索方法；
１３．項１２に記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするリポ蛋白合成抑制剤；
１４．モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするリポ蛋白合成抑制剤；
１５．モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質がＮ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミンであるとすることを特徴とする項１４記載のリポ蛋白合成抑制剤；
１６．Ｎ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミンを有効成分として含有する、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤；
１７．下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする蛋白質；
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列
（ａ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｂ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｃ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｄ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｅ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｆ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
１８．下記のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とする遺伝子；
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列
（ａ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｂ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｃ−１）配列番号１３、１５又は１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｄ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｅ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２、４又は１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
（ｆ−１）配列番号１４、１６又は１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
１９．項１７記載の蛋白質からなる、下記の反応の触媒。
２又は１−モノアシルグリセロール＋アシル−ＣｏＡ　⇒　１，２−ジアシルグリセロール＋ＣｏＡ
；
等を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本明細書において、「脂肪」とは、哺乳動物の生体内の任意の細胞、組織又は体液に含まれる脂肪を表し、具体的には、トリグリセライド等のグリセロール脂肪酸エステルを指す。
「脂肪量増加抑制能力」とは、脂肪蓄積抑制能力または脂肪合成抑制能力を共に含む概念であり、具体的には、脂肪細胞、脂肪組織もしくは肝細胞等への脂肪蓄積の抑制能力、又は、小腸もしくは肝臓等における脂肪合成の抑制能力等を意味する。
【００１０】
前記「脂肪組織」とは、哺乳動物の任意の脂肪組織を表し、具体的には、（１）腹側部、大腿部、臀部もしくは胸部等の皮下脂肪組織、（２）腎臓もしくは副睾丸等に接する脂肪組織、腸間膜脂肪組織、又は、大網脂肪組織等の腹腔内脂肪組織、（３）肝臓に含まれる脂肪組織、あるいは（４）胸腔内脂肪組織、等が挙げられる。脂肪細胞とは該脂肪組織を構成する個々の細胞を意味する。
脂肪組織においては、トリグリセライド等のグリセロール脂肪酸エステルが脂肪として蓄積される。
【００１１】
一方、血液における脂肪は、トリグリセライド等のグリセロール脂肪酸エステルがアポ蛋白と複合体を形成したリポ蛋白の形で存在する。該リポ蛋白は、その密度によって、カイロミクロン、ＶＬＤＬ（超低密度リポ蛋白）、ＬＤＬ（低密度リポ蛋白）、ＨＤＬ（高密度リポ蛋白）などに分類される。
血中へのトリグリセライドの供給組織は小腸と肝臓であり、小腸は食物からのトリグリセライド吸収を、肝臓は血中リポ蛋白の回収と再分泌を行うことによって血液のトリグリセライド量を調節する。小腸においては、食物中のトリグリセライドが膵リパーゼの働きによって腸管内でモノアシルグリセロールと脂肪酸に分解された後、小腸上皮細胞に吸収され、小腸細胞内でトリグリセライドに再合成される。再合成されたトリグリセライドは小腸細胞内においてリポ蛋白の一種であるカイロミクロンに組み込まれ、血液中に分泌される。カイロミクロンは末梢組織にトリグリセライドを供給しながらカイロミクロンレムナントと呼ばれる粒子に変換され、最終的には肝臓に吸収される。肝臓においては、肝臓細胞中の脂肪酸を利用してトリグリセライド合成が行われ、合成されたトリグリセライドはリポ蛋白の一種であるＶＬＤＬに組み込まれて血中に分泌される。ＶＬＤＬはカイロミクロンと同様、末梢組織にトリグリセライドを供給しながら体内を循環し、最終的にＬＤＬの形で肝臓に回収される。
すなわち、前記の脂肪合成抑制能力とは、好ましくは、小腸もしくは肝臓におけるリポ蛋白合成抑制能力を表す。
【００１２】
本発明検定方法において用いられるモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼとは、下記の反応を触媒する酵素である（以下、本酵素と記すこともある。）。
２又は１−モノアシルグリセロール＋アシル−ＣｏＡ　⇒　１，２−ジアシルグリセロール＋ＣｏＡ
【００１３】
このような酵素が有する活性は、例えば、以下のような方法（例えば、Ｓ．Ｃ．　Ｊａｍｄａｒらの方法（Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　１９９２；２９６（２）：４１９−２５）で測定することができる。
本酵素を含有する酵素サンプルを１５０μＬの反応用緩衝液（２４ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ　７．５）、５０ｍＭ　塩化カリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、１．２５ｍｇ／ｍＬ　ウシ血清アルブミン、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　２−モノオレオイルグリセロール）に懸濁し、当該懸濁液に５μＬの９００μＭ　（０．２ＭＢｑ／μＬ）［１４Ｃ］パルミトイル−コエンザイムＡ水溶液を加えて、この混合物を室温で１０分間保温する。当該混合物に３００μＬのヘプタン／２−プロパノール／水（＝８０：２０：２）を加えて撹拌することにより反応を停止させる。１０分間放置した後、さらに当該混合物に２００μＬのヘプタン及び１００μＬの水を加えて撹拌する。その後、当該混合物を遠心分離して得られた有機層に含まれる反応生成物を薄層クロマトグラフィーにより分離し、バイオイメージングアナライザシステムＢＡＳ−２０００（富士フィルム社）等を用いて検出及び定量する。
【００１４】
本酵素としては、ヒト、マウス、ラット等の哺乳動物由来のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを好ましいものとしてあげることができる。また、例えば、（ａ）配列番号１、３又は１１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｂ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（一文字表記：ＭＡＶＴＶＥＥＡＰＷＬＧＷＩＶＡＫＡＬＭＲＦＡＦＭＶＡＮＮＬＶＡＩＰＳＹＩＣＹＶＩＩＬＱＰＬＲＶＬＤＳＫＲＦＷＹＩＥＧＬＭＹＫＷＬＬＧＭＶＡＳＷＧＷＹＡＧＹＴＶＭＥＷＧＥＤＩＫＡＩＡＫＤＥＡＶＭＬＶＮＨＱＡＴＧＤＶＣＴＬＭＭＣＬＱＤＫＧＰＶＶＡＱＭＭＷＬＭＤＨＩＦＫＹＴＮＦＧＩＶＳＬＩＨＧＤＦＦＩＲＱＧＲＡＹＲＤＱＱＬＬＶＬＫＫＨＬＥＨＮＹＲＳＲＤＲＫＷＩＶＬＦＰＥＧＧＦＬＲＫＲＲＥＴＳＱＡＦＡＫＫＮＮＬＰＦＬＴＨＶＴＬＰＲＦＧＡＴＮＩＩＬＫＡＬＶＡＲＱＥＮＧＳＰＡＧＧＤＡＲＧＬＥＣＫＳＲＧＬＱＷＩＩＤＴＴＩＡＹＰＫＡＥＰＩＤＩＱＴＷＩＬＧＹＲＫＰＴＶＴＨＶＨＹＲＩＦＰＩＧＤＶＰＬＥＴＥＤＬＴＳＷＬＹＱＲＦＩＥＫＥＤＬＬＳＨＦＹＫＴＧＡＦＰＰＰＱＧＱＫＥＡＶＣＲＥＭＴＬＳＮＭＷＩＦＬＩＱＳＦＡＦＬＳＧＹＬＷＹＨＩＩＱＹＦＹＨＣＬＦ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｂ２）配列番号３で示されるアミノ酸配列（一文字表記：ＭＡＩＴＬＥＥＡＰＷＬＧＷＬＬＶＫＡＬＭＲＦＡＦＭＶＶＮＮＬＶＡＩＰＳＹＩＣＹＶＩＩＬＱＰＬＲＶＬＤＳＫＲＦＷＹＩＥＧＩＭＹＫＷＬＬＧＭＶＡＳＷＧＷＹＡＧＹＴＶＭＥＷＧＥＤＩＫＡＶＳＫＤＥＡＶＭＬＶＮＨＱＡＴＧＤＶＣＴＬＭＭＣＬＱＤＫＧＬＶＶＡＱＭＭＷＬＭＤＨＩＦＫＹＴＮＦＧＩＶＳＬＶＨＧＤＦＦＩＲＱＧＲＳＹＲＤＱＱＬＬＬＬＫＫＨＬＥＮＮＹＲＳＲＤＲＫＷＩＶＬＦＰＥＧＧＦＬＲＫＲＲＥＴＳＱＡＦＡＫＫＮＮＬＰＦＬＴＮＶＴＬＰＲＳＧＡＴＫＩＩＬＮＡＬＶＡＱＱＫＮＧＳＰＡＧＧＤＡＫＥＬＤＳＫＳＫＧＬＱＷＩＩＤＴＴＩＡＹＰＫＡＥＰＩＤＩＱＴＷＩＬＧＹＲＫＰＴＶＴＨＶＨＹＲＩＦＰＩＫＤＶＰＬＥＴＤＤＬＴＴＷＬＹＱＲＦＶＥＫＥＤＬＬＳＨＦＹＥＴＧＡＦＰＰＳＫＧＨＫＥＡＶＳＲＥＭＴＬＳＮＬＷＩＦＬＩＱＳＦＡＦＬＳＧＹＭＷＹＮＩＩＱＹＦＹＨＣＬＦ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｂ３）配列番号１１で示されるアミノ酸配列（一文字表記：ＭＡＶＴＶＥＥＡＰＷＬＧＷＩＶＡＫＡＬＭＲＦＡＦＭＶＡＮＮＬＶＡＩＰＳＹＩＣＹＡＩＩＬＱＰＬＲＶＬＤＳＫＲＦＷＹＩＥＧＬＭＹＫＷＬＬＧＭＶＡＳＷＧＷＹＡＧＹＴＶＭＥＷＧＥＤＩＫＡＩＡＫＤＥＡＶＭＬＶＮＨＱＡＴＧＤＶＣＴＬＭＭＣＬＱＤＫＧＰＶＶＡＱＭＭＷＬＭＤＨＩＦＫＹＴＮＦＧＩＶＳＬＩＨＧＤＦＦＩＲＱＧＲＡＹＲＤＱＱＬＬＶＬＫＫＨＬＥＨＮＹＲＳＲＤＲＫＷＩＶＬＦＰＥＧＧＦＬＲＫＲＲＥＴＳＱＡＦＡＫＫＮＮＬＰＦＬＴＨＶＴＬＰＲＦＲＡＴＮＩＩＬＫＡＬＶＡＲＱＥＮＧＳＰＡＧＧＤＡＲＧＬＥＣＫＳＲＧＬＱＷＩＩＤＴＴＩＡＹＰＫＡＥＰＩＤＩＱＴＷＩＬＧＹＲＫＰＴＶＴＨＶＨＹＲＩＦＰＩＡＤＶＰＬＥＴＥＤＬＴＮＷＬＹＱＲＦＩＥＫＥＤＬＬＳＨＦＹＫＴＧＡＦＰＰＰＱＧＱＫＥＡＶＳＲＡＭＴＬＳＮＶＷＩＬＬＩＱＳＦＡＦＬＳＧＹＬＷＹＨＶＩＱＹＦＹＨＣＬＦ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｂ４）配列番号１３で示されるアミノ酸配列（一文字表記：ＭＶＳＷＫＧＩＹＦＩＬＦＬＦＡＧＳＦＦＧＳＩＦＭＬＧＰＩＬＰＬＭＦＩＮＬＳＷＹＲＷＩＳＳＲＬＶＡＴＷＬＴＬＰＶＡＬＬＥＴＭＦＧＶＲＶＶＩＴＧＤＡＦＶＰＧＥＲＳＶＩＩＭＮＨＲＴＲＶＤＷＭＦＬＷＮＣＬＭＲＹＳＹＬＲＶＥＫＩＣＬＫＳＳＬＫＳＶＰＧＦＧＷＡＭＱＶＡＡＦＩＦＩＨＲＫＷＫＤＤＫＳＨＦＥＤＭＩＤＹＦＣＡＩＨＥＰＬＱＬＬＩＦＰＥＧＴＤＬＴＥＮＮＫＡＲＳＮＤＦＡＥＫＮＧＬＱＫＹＥＹＶＬＨＰＲＴＴＧＦＴＦＶＶＤＲＬＲＥＧＫＮＬＤＡＶＨＤＩＴＶＡＹＰＹＮＩＰＱＴＥＫＨＬＬＬＧＤＦＰＫＥＩＨＦＨＶＱＲＹＰＡＤＳＬＰＴＳＫＥＤＬＱＬＷＣＨＲＲＷＥＥＫＥＥＲＬＲＳＦＹＱＧＥＫＮＦＨＦＴＧＱＳＴＶＰＰＣＫＳＥＬＲＶＬＶＶＫＬＬＳＩＶＹＷＡＬＦＣＳＡＭＣＬＬＩＹＬＹＳＰＶＲＷＹＦＩＩＳＩＶＦＦＶＬＱＥＲＩＦＧＧＬＥＩＩＥＬＡＣＹＲＦＬＨＫＨＰＨＬＮＳＫＫＮＥ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｂ５）配列番号１５で示されるアミノ酸配列（一文字表記：ＭＶＳＷＫＧＩＹＦＩＬＴＬＦＷＧＳＦＦＧＳＩＦＭＬＳＰＦＬＰＬＭＦＶＮＰＳＷＹＲＷＩＮＮＲＬＶＡＴＷＬＴＬＰＶＡＬＬＥＴＭＦＧＶＫＶＩＩＴＧＤＡＦＶＰＧＥＲＳＶＩＩＭＮＨＲＴＲＭＤＷＭＦＬＷＮＣＬＭＲＹＳＹＬＲＬＥＫＩＣＬＫＡＳＬＫＧＶＰＧＦＧＷＡＭＱＡＡＡＹＩＦＩＨＲＫＷＫＤＤＫＳＨＦＥＤＭＩＤＹＦＣＤＩＨＥＰＬＱＬＬＩＦＰＥＧＴＤＬＴＥＮＳＫＳＲＳＮＡＦＡＥＫＮＧＬＱＫＹＥＹＶＬＨＰＲＴＴＧＦＴＦＶＶＤＲＬＲＥＧＫＮＬＤＡＶＨＤＩＴＶＡＹＰＨＮＩＰＱＳＥＫＨＬＬＱＧＤＦＰＲＥＩＨＦＨＶＨＲＹＰＩＤＴＬＰＴＳＫＥＤＬＱＬＷＣＨＫＲＷＥＥＫＥＥＲＬＲＳＦＹＱＧＥＫＮＦＹＦＴＧＱＳＶＩＰＰＣＫＳＥＬＲＶＬＶＶＫＬＬＳＩＬＹＷＴＬＦＳＰＡＭＣＬＬＩＹＬＹＳＬＶＫＷＹＦＩＩＴＩＶＩＦＶＬＱＥＲＩＦＧＧＬＥＩＩＥＬＡＣＹＲＬＬＨＫＱＰＨＬＮＳＫＫＮＥ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｂ６）配列番号１７で示されるアミノ酸配列（一文字表記：ＭＶＳＷＫＧＩＹＦＩＬＦＬＦＡＧＳＦＦＧＳＩＦＭＬＧＰＩＬＰＬＭＦＩＮＬＳＷＹＲＷＩＳＳＲＬＶＡＭＷＬＴＬＰＶＡＬＬＥＴＭＦＧＶＫＶＶＩＴＧＤＡＦＶＰＧＥＲＳＶＩＩＭＮＨＲＴＲＶＤＷＭＦＬＷＮＣＬＭＲＹＳＹＬＲＬＥＫＩＣＬＫＳＳＬＫＳＶＰＧＦＧＷＡＭＱＶＡＡＦＩＦＩＨＲＫＷＫＤＤＫＳＨＦＥＤＭＶＤＹＦＣＡＩＨＥＰＬＱＬＬＩＦＰＥＧＴＤＬＴＥＮＮＫＡＲＳＮＤＦＡＥＫＮＧＬＱＫＹＥＹＶＬＨＰＲＴＴＧＦＴＦＶＶＤＲＬＲＥＲＲＮＬＤＡＶＨＤＩＴＶＡＹＰＹＮＩＰＱＴＥＫＨＬＬＬＧＤＦＰＫＥＩＨＦＨＶＨＲＹＰＶＤＴＬＰＴＳＫＥＤＬＱＬＷＣＨＫＲＷＥＥＫＥＥＲＬＲＳＦＹＱＧＥＫＮＦＨＦＴＧＱＳＴＶＰＰＣＫＳＥＬＲＶＬＶＶＫＬＬＳＩＶＹＷＡＬＦＣＳＡＭＣＬＬＩＹＬＹＳＰＶＲＷＹＦＩＩＳＩＶＦＦＶＬＱＥＲＩＦＧＲＬＥＩＩＥＬＡＣＹＲＦＬＨＫＨＰＨＬＮＳＫＫＮＥ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｃ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｃ２）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｃ３）配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｃ４）配列番号１３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｃ５）配列番号１５で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｃ７）配列番号１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｄ１）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｄ２）配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｄ３）配列番号１２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｄ４）配列番号１４で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｄ５）配列番号１６で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｄ６）配列番号１８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｅ１）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｅ２）配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｅ３）配列番号１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｅ４）配列番号１４で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｅ５）配列番号１６で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｅ６）配列番号１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｆ１）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｆ２）配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｆ３）配列番号１２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質，（ｆ４）配列番号１４で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｆ５）配列番号１６で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、（ｆ６）配列番号１８で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質等を好ましいものとしてあげることもできる。
【００１５】
ここで、前記（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２），（ｂ３），（ｂ４），（ｂ５）．（ｂ６）にある「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」や前記（ｃ）、（ｃ１）、（ｃ２），（ｃ３），（ｃ４），（ｃ５），（ｃ６）及び（ｅ）、（ｅ１）、（ｅ２），（ｅ３），（ｅ４），（ｅ５），（ｅ６）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号１、３、１１、１３，１５又は１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｂ４）、（ｂ５）、（ｂ６）にある「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１、３、１１、１３，１５又は１７で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４））を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ　ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
前記（ｆ）、（ｆ１）．（ｆ２）、（ｆ３）、（ｆ４）、（ｆ５）、（ｆ６）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１５Ｍ　クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎ．　Ｙ．　（１９８９），　６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×ＳＳＣで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１６】
本酵素の調製方法について以下に説明する。
本酵素が、例えばミクロソーム画分のように、本酵素を含有する酵素サンプルの形態である場合には、本酵素を含む脂肪組織を生体材料にして通常の細胞分画法により、本酵素を調製すればよい。具体的には、例えば、Ｗａｎｇ　Ｆａｎｇ　Ｃａｏらの方法（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，　２９６（２），　４１９−４２５　（１９９２））に記載された方法等をあげることができる。
また通常の遺伝子工学的方法等を用いて、まず、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）、例えば、（Ｉ）配列番号１、３、１１、１３，１５又は１７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、（ＩＩ）配列番号２、４、１２、１４，１６又は１８で示される塩基配列、等の塩基配列を有する遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法）に準じて取得する。次いで、得られた本遺伝子を用いることにより、通常の遺伝子工学的方法に準じて本酵素を製造・取得する。このようにして本酵素を調製することもできる。
【００１７】
例えば、本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物から本酵素を取得すればよい。上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。例えば、哺乳動物細胞での発現に使用されるベクターは、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Ｒａｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａ　Ｖｉｒｕｓプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター、ａＰ２遺伝子プロモーターなどのプロモーターを含む発現ベクターであって、これらは、東洋紡社、宝酒造社などから市販されている。
【００１８】
宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、本酵素の本来の構造を維持することが期待できるという観点では、哺乳動物細胞等を好ましく挙げることができる。
前記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により前記宿主細胞に導入することができる。
形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば哺乳動物細胞の場合、適当な炭素源、窒素源、ビタミン等の微量栄養物およびウシ血清等の細胞増殖因子を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
本酵素の取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離等で集め、該形質転換体を破砕または溶解せしめ、必要であれば蛋白質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、もしくは組み合わせることにより精製すればよい。また、通常の遺伝子工学的手法により、本酵素のＮ末端若しくはＣ末端に、アフィニティ精製に適したアミノ酸配列を付加することにより、アフィニティ精製を行ってもよい。さらに必要であれば、精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。
【００１９】
本発明検定方法は、（１）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼと被験物質との接触系内におけるモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を測定する第一工程、及び（２）第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の脂肪量増加抑制能力を評価する第二工程、を有する。
本発明検定方法では、脂肪量の直接的な測定を行うことなく、例えば、本酵素阻害能力を評価するための指標となる阻害率（詳細は後述する）を算出することだけで被験物質の脂肪量増加抑制能力を評価することができるため、簡便であり、１次スクリーニング等に最適である。
【００２０】
本発明検定方法の感度を高めるためには、例えば、第一工程における接触系内に、マグネシウムイオン等の２価の金属陽イオンやジチオスレイトール（以下ＤＴＴと記す。）等を添加することがよい。例えば、マグネシウムイオンの場合には、その添加濃度は、例えば、２ｍＭ以上で、好ましくは５ｍＭ〜１０ｍＭである。ＤＴＴの場合には、その添加濃度は、例えば、５０μＭ以上で、好ましくは０．２ｍＭ〜２ｍＭである。また、基質の反応性を高めるために、上記の接触系内にホスファチジルコリン（以下、ＰＣと記すこともある。）やホスファチジルセリン（以下、ＰＳと記すこともある。）等を添加してもよい。例えば、ＰＣやＰＳの場合には、その添加濃度は、例えば、５μｇ／ｍＬ以上で、好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬである。
【００２１】
本発明検定方法の第一工程は、（Ａ）２種の基質（例えば、２又は１−モノアシルグリセロール（好ましくは、２−モノアシルグリセロール）及びアシル−ＣｏＡ）と被験物質との３者が本酵素と接触する形態、及び（Ｂ）２種の基質（例えば、２又は１−モノアシルグリセロール及びアシル−ＣｏＡ）のうちの一方と被験物質との２者が本酵素と接触する形態（すなわち、被験物質を前記２種の基質のうちの他の一方として取り扱う場合）、のいずれの形態であってもよい。
【００２２】
さらに、本発明検定方法の第一工程において、本酵素に被験物質及び基質を接触させる順序は、（ａ）本酵素と被験物質とを先ず接触させ、一定時間保温した後、２種もしくは１種の基質を添加するような形態、（ｂ）本酵素、被験物質及び２種もしくは１種の基質を同時に接触させるような形態、（ｃ）本酵素と２種もしくは１種の基質とを先ず接触させ、一定時間保温した後、被験物質を添加するような形態、のいずれの形態であってもよいが、好ましくは（ａ）の形態がよい。
上記（ａ）の場合には、本酵素と被験物質との接触時間として、例えば、１分間以上を、好ましくは１分間以上１時間以内をあげることができる。当該接触系における保温温度としては、例えば、０℃〜７０℃を、好ましくは４℃〜４０℃をあげることができる。
また上記（ｃ）の場合には、当該接触系における保温温度として、例えば、０℃〜７０℃を、好ましくは４℃〜４０℃をあげることができる。
【００２３】
本発明検定方法の第一工程における被験物質の濃度は、例えば、１ｎＭ〜１０ｍＭで、好ましくは０．０１μＭ〜５ｍＭである。基質の濃度は、例えば、１μＭ〜１ｍＭで、好ましくは５μＭ〜１００μＭである。
本発明検定方法の第一工程において被験物質と接触させる本酵素の形態は、（Ａ）本酵素の精製物、粗精製物等であってもよいし、また（Ｂ）細胞内に含有される本酵素（例えば、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子が導入されてなる形質転換細胞（以下、本形質転換細胞と記すこともある。）に被験物質を接触させる方法である場合）等であってもよい。さらに細胞は、組織から分離された状態の細胞であってもよいし、また同一の機能・形態を持つ集団を形成している状態の細胞であってもよい。
例えば、上記（Ａ）の場合には、被験物質と接触させる本酵素の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍｌ以上で、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以上である。
また上記（Ｂ）の場合には、被験物質と接触させる本酵素の濃度は、例えば、本形質転換細胞の濃度として１×１０３細胞／ｍｌ以上で、好ましくは１×１０４細胞／ｍｌ以上である。
【００２４】
本形質転換細胞は、以下のようにして調製することができる。
本遺伝子を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、本遺伝子を導入する細胞において使用可能なベクターに発現可能な形でプロモーターと接続されるように挿入することにより、プラスミドを作製する。ここで用いられるプロモーターは、本遺伝子が導入される細胞で機能可能なものであればよく、該細胞が動物細胞である場合には、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Ｒａｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａ　Ｖｉｒｕｓプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター、ａＰ２遺伝子プロモーター等が挙げられる。尚、このようなプロモーターをマルチクローニング部位の上流に含む市販のベクターを利用してもよい。
次いで、前記プラスミドを細胞へ導入する。細胞への導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気穿孔導入法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル形成法等を挙げることができる。リン酸カルシウム法としてはＧｒｉｍｍ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９３，　１０９２３−１０９２７等に記載される方法、電気穿孔導入法及びＤＥＡＥデキストラン法としてはＴｉｎｇ，　Ａ．　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　１５，　６１８９−６１９６等に記載される方法、ミセル形成法としてはＨａｗｋｉｎｓ，　Ｃ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９３，　１３７８６−１３７９０等に記載される方法を挙げることができる。ミセル形成法を用いる場合には、リポフェクトアミン（ギブコ製）やフュージーン（ベーリンガー製）等の市販の試薬を利用するとよい。
前記プラスミドの導入処理を施した細胞を、例えば、当該ベクターに予め含まれる選抜マーカー遺伝子を利用し、当該選抜マーカー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、本形質転換細胞を選抜することができる。さらに選抜を続けて、本遺伝子が染色体に導入されてなる安定形質転換体となった本形質転換細胞を取得してもよい。導入された本遺伝子が細胞中に存在する染色体上に組込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いるＰＣＲや、本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、ゲノムＤＮＡ中の本遺伝子の存在を検出・確認すればよい。
【００２５】
本発明検定方法の第一工程における、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（即ち、本酵素）の活性を測定する方法としては、例えば、本酵素、被験物質及び基質を含有する混合液を一定時間反応させた後、当該反応における基質等の原料物の減少量を分析する方法、あるいは、当該反応における生成物の増加量を分析する方法等をあげることができる。これらの方法は公知のいずれかの活性測定法であってもよい。具体的には、前述のようなＡｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　１９９２；２９６（２）：４１９−２５等に記載されるような方法等があげられる。本発明検定方法の第一工程における活性測定時の反応温度は、例えば、１５℃〜７０℃であればよく、好ましくは２０℃〜４０℃である。反応時間は、例えば、１分間以上で、好ましくは１５分間〜１時間である。反応ｐＨは、例えば、６．０〜９．５で、好ましくはｐＨ７．０〜８．０である。
【００２６】
酵素反応における基質等の原料物又は生成物の検出又はその量の測定には、反応液を、例えば、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー等で分離した後、当該原料物又は生成物の紫外線吸収や放射活性（予めラジオアイソトープで標識された前記原料物を用いた場合）等を検出したり、又は紫外線吸収度や放射活性度等を測定するような方法を用いればよい。尚、上記分析の際に反応液から蛋白質を除去しておく必要がある場合には、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　２８０，　２１１−２２１等に記載される方法により反応液から蛋白質を除去すればよい。
【００２７】
上記のようにして測定された活性と対照（即ち、基準物質、ネガティブコントロール等）における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の脂肪量増加抑制能力を評価する。即ち、上記のようにして測定された活性が、対照における活性よりも低い場合には、前記物質は脂肪量増加抑制能力を有すると評価すればよい。
このようにして被験物質が有する脂肪量増加抑制能力の検定（本発明検定方法）を行うことができる。
本発明検定方法において、測定された活性と対照における活性とを比較する場合には、異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が脂肪量増加抑制能力を有さない物質（例えば、溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等のネガティブコントロールであってもよい。）とすることで、他方の被験物質が有する脂肪量増加抑制能力を評価してもよいし、また前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質（例えば、基準物質）が有する脂肪量増加抑制能力を基準としながら他方の被験物質が有する脂肪量増加抑制能力を評価してもよい。もちろん両者で評価してもよい。
【００２８】
より具体的には、例えば、本発明検定方法の第一工程が、前記（Ａ）２種の基質（例えば、２又は１−モノアシルグリセロール（好ましくは、２−モノアシルグリセロール）及びアシル−ＣｏＡ）と被験物質との３者が本酵素と接触する形態の場合で、対照としてネガティブコントロールを用いた場合には、下記の式に従って阻害率を求めるとよい。
阻害率（％）＝｛対照（ネガティブコントロール）値−測定（被験物質）値｝×１００／対照（ネガティブコントロール）値
そして算出された阻害率により脂肪量増加抑制能力を評価すればよい。即ち、上記のようにして算出された各種被験物質における阻害率を比較し、その結果、阻害率が高い値を示す被験物質は、阻害率が低い値を示す被験物質よりも高い脂肪量増加抑制能力を有すると評価すればよい。
一方、本発明検定方法の第一工程が、前記（Ａ）２種の基質（例えば、２又は１−モノアシルグリセロール（好ましくは、２−モノアシルグリセロール）及びアシル−ＣｏＡ）と被験物質との３者が本酵素と接触する形態の場合であって、対照として、脂肪量増加抑制能力を有する物質（基準物質）を用いた場合には、対照（基準物質）値と測定（被験物質）値を比較することで、脂肪量増加抑制能力を評価すればよい。この場合、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも低い値であれば、該被験物質は該基準物質よりも脂肪量増加抑制能力が高いと評価する。
また、例えば、本発明検定方法の第一工程が、前記（Ｂ）２種の基質のうちの一方（例えば、２又は１−モノアシルグリセロール（好ましくは、２−モノアシルグリセロール）及びアシル−ＣｏＡ）と被験物質との２者が本酵素と接触する形態（すなわち、被験物質を前記２種の基質のうちの他の一方として取り扱う場合）である場合には、対照として脂肪量増加抑制能力を有する物質（基準物質）を用い、対照（基準物質）値と測定（被験物質）値を比較することで、脂肪量増加抑制能力を評価すればよい。この場合、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも高い値であれば、当該被験物質は当該基準物質よりも本酵素の基質として優れていること、すなわち、当該被験物質は当該基準物質よりも本酵素の競合阻害剤として優れていることになる。
【００２９】
脂肪量増加抑制物質を探索するには、本発明検定方法により評価された脂肪量増加抑制能力に基づき脂肪量増加抑制能力を有する物質を選抜すればよい（本発明探索方法）。
例えば、上記（Ａ）の場合であって、対照としてネガティブコントロールを用いた場合には、被験物質の脂肪量増加抑制能力を評価するための指標となる阻害率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、上記の式における阻害率が３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、脂肪量増加抑制能力を有する物質として選抜する。一方、上記（Ａ）の場合であって、対照として脂肪量増加抑制能力を有する物質（基準物質）を用いた場合には、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも低い値を示す物質を脂肪量増加抑制能力を有する物質として選抜する。また、例えば、上記（Ｂ）の場合には、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも高い値を示す物質を脂肪量増加抑制能力を有する物質として選抜する。尚、当該物質は、脂肪量増加抑制能力を有する限り、低分子化合物、蛋白質又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
【００３０】
本発明探索方法によって選抜された物質は脂肪量増加抑制能力を有しており、脂肪量増加抑制剤の有効成分として使用してもよい。
このような物質（即ち、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質）として、例えば、Ｎ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミンをあげることができる。
【００３１】
本発明探索方法によって選抜されたモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤（以下、阻害剤）が、脂肪量増加抑制能力を有することは、本明細書実施例に記載の方法、又は国際公開第００／４４７５４号パンフレットに記載された方法等、公知の方法で確認することができる。
また、本発明探索方法によって選抜された阻害剤が、リポ蛋白合成抑制能力を有することは、以下の公知の方法によって確認することができる。
すなわち、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質（以下本阻害剤と称する場合がある。）の存在下に、リポ蛋白合成能力をもつ細胞を試験管内で培養し、トリグリセライド量を測定し、本阻害剤非存在下におけるトリグリセライド量と比較する。該細胞としては、生体組織から調製した小腸細胞もしくは肝臓細胞、小腸もしくは肝臓由来の培養細胞、又はモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子を外部から導入することによってリポ蛋白合成能力を獲得した細胞などを挙げることができる。組織からの小腸細胞の調製は、例えばＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｍｉｌｔｏｎ　Ｍ．　Ｗｅｉｓｅｒ，　ｐ２５３６−２５４１，　１９７３記載の方法、つまり回収した小腸細胞を培地に懸濁する方法や、あるいはＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｊｅａｎ−Ｆｒａｎｃｏｉｓ　Ｂｅａｕｌｉｅｕ　ｅｔ　ａｌ．，ｐ３４−４２，　ｐ１９９８記載の方法、つまり回収した小腸細胞をプレート器壁に接着させて培養する方法などにより、行うことができる。肝臓細胞の調製は、例えばＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｎａｔｈａｎ　Ｒ．　Ｓｅｃｋｌ　ｅｔ　ａｌ．，　ｐ４７５４−４７６１，　１９９５記載の方法、つまり摘出した肝臓をコラゲナーゼで処理することにより肝臓細胞を調製する方法や、得られた肝臓細胞をプレート器壁に接着させて培養する方法などにより、行うことができる。小腸由来の培養細胞は、一般的な培養細胞系として確立されているものはないが、ヒト大腸癌由来の細胞、例えばＣａＲ−１，２，３やＣａＣｏ−２細胞などが、小腸のリポ蛋白合成能力を有する細胞として代替的に使用可能である。肝臓由来の培養細胞としては、ＪＨＨ−１，２，３やｈｕＨ−１，２，４、ＨｅｐＧ２など多数が一般的に利用可能であるが、通常はヒト肝臓モデルとしてＨｅｐＧ２がよく用いられる。
【００３２】
上記の肝臓や小腸細胞のトリグリセライド量を定量する方法としては、脂肪酸あるいはグリセロールを細胞に添加して一定時間培養し、上清画分あるいは細胞に含まれるトリグリセライドを定量する方法が挙げられる。トリグリセライドの定量法としては、放射標識体を用いる方法と、放射標識を用いず直接トリグリセライドを定量する方法の２つがある。前者の方法としては例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｊｏａｎ　Ａ．　Ｈｉｇｇｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，　ｐ１７２８−１７３９，　２０００記載の方法や、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｍ．　Ｍａｈｍｏｏｄ　Ｈｕｓｓｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．　ｐ１９５６５−１９５７２，　１９９９記載の方法がある。後者の方法としては、例えば、Ｃａｃｏ２などの小腸様細胞あるいは肝臓の培養細胞を試験管内で培養し、その培養上清からクロロホルム／メタノールなどの有機溶媒によってトリグリセライドを抽出・定量する方法を挙げることが出来る。いずれの方法についても、好ましくは、上記方法によって培養した培養上清を密度によって分画し、肝臓細胞の場合はＶＬＤＬ、小腸細胞の場合はカイロミクロンに含まれるトリグリセライドを定量する方法がよい。阻害剤によるリポ蛋白合成抑制能力の評価は、阻害剤接触下で上述のトリグリセライド合成を行わせ、阻害剤非接触下でのトリグリセライド合成能力と比較することにより実施することができる。前記ＶＬＤＬ及びカイロミクロンは、遠心分離等の当業者によく知られた方法によって単離することができる。
または、マウスなどに本阻害剤を投与し、血中トリグリセライド（＝リポ蛋白）量を測定し、本阻害剤を投与しない場合の血中トリグリセライド量と比較することによって、本阻害剤のリポ蛋白合成抑制能力を確認することもできる。具体的には、絶食によって血中トリグリセライドの濃度を下げ、これに脂質投与を行った際の血中トリグリセライド濃度の上昇を測定する方法（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｂｅｓｉｔｙ，　Ｋ．　Ｃｉａｎｆｌｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，　ｐ７０５−７１３，　２００１記載の方法）等が挙げられる。
【００３３】
モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする脂肪量増加抑制剤（即ち、本発明脂肪量増加抑制剤）は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明脂肪量増加抑制剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明脂肪量増加抑制剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の本発明脂肪量増加抑制剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等にモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質またはその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本脂肪量増加抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明脂肪量増加抑制剤の適用可能な疾患としては、例えば、インスリン抵抗性に伴う耐糖能低下、ＩＩ型糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等の代謝性疾患や、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞等の心血管障害等の疾患をあげることができる。
【００３４】
このように、本発明では、生体に、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を阻害するために薬理学上有効な量のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を有する物質を投与することにより、脂肪量増加を抑制することができる。
また本発明では、脂肪量増加抑制能力を評価するための指標を提供する試薬としての、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの使用や、脂肪量増加抑制能力を評価するための指標を提供する試薬としての、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の使用等も提供する。前者の例としては、本発明検定方法、本発明探索方法等に関連したモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの利用をあげることができる。また後者の例としては、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの発現を制御することにより脂肪量増加を抑制する場合における、脂肪量増加抑制能力を評価するための指標を提供する試薬としての利用をあげることができる。より具体的には、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＤＮＡチップ等といった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法におけるプライマー又はプローブとしての使用等があげられる。
【００３５】
【実施例】
以下に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
実施例１　（脂肪組織からのミクロソーム画分（本酵素を含有する酵素サンプルの一形態）の調製）
（１−１）脂肪組織の摘出
１４週齢のウィスター系雄ラット（日本エスエルシー社）３０匹を屠殺・開腹し、腸間膜に付着した脂肪組織（以下、腸間膜脂肪組織と記す。）を摘出した。摘出した組織を、リン酸緩衝液（０．２０ｇ／Ｌ　ＫＣｌ、０．２０ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、８．００ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、２．１６ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１００ユニット／ｍｌペニシリン（ギブコ社）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ社）、２５０ｎｇ／ｍｌアンフォテリシン（ギブコ社））約１００ｍｌに浸し、室温で洗浄した。
（１−２）脂肪組織からのミクロソーム画分（本酵素を含有する酵素サンプルの一形態）の調製
まず、上記（１−１）で摘出された脂肪組織に、当該脂肪組織の容量の３倍量のＭｅｄｉｕｍＡ（０．２５Ｍ　Ｓｕｃｒｏｓｅ、１ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（以下、ＥＤＴＡ・４Ｎａと記す。）、１ｍＭのジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと記す。））を添加し、ホモジナイザー（ウィートン社）で当該脂肪組織を粉砕均等化した。粉砕均等化した脂肪組織を６００ｇ×１５分、４℃で遠心分離することにより、上層（Ｆａｔ　Ｃａｋｅ）および下層（夾雑物）を含まない中間層を分取した。分取された中間層をさらに１６，０００ｇ×１５分、４℃で遠心分離した。得られた上清を１０５，０００ｇ×６０分、４℃で遠心分離することにより沈殿（ミクロソーム画分）を回収した。回収された沈殿を前記ＭｅｄｉｕｍＡに懸濁した後、１０５，０００ｇ×６０分、４℃で遠心分離することにより洗浄した。洗浄された沈殿を前記ＭｅｄｉｕｍＡに再度懸濁することにより、蛋白質濃度１ｍｇ／ｍｌのミクロソーム画分を調製した。
【００３７】
実施例２　（ミクロソーム画分（本酵素を含有する酵素サンプルの一形態）のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性の測定）
アッセイ液（２４ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ　塩化カリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、１．２５ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン、１ｍＭ　ＤＴＴ）１４０μｌに８００μｇ／ｍｌの被験物質（１％　ジメルスホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）溶解液）０．７５μｌ、１ｍｇ／ｍｌのミクロソーム画分５μｌを添加した。このアッセイ液にさらに１００ｍＭの２−モノオレオイルグリセロール（シグマ社）０．７μｌを添加し混合した。この混合物に０．４５ｍＭの［１４Ｃ］パルミトイルコエンザイムＡ（アマシャム社）１０μｌ（０．０３μＣｉ／反応液全量１５０μｌ）を添加し、室温で５分間保温した。尚、被験物質無添加区では、前記の被験物質のＤＭＳＯ溶液に代えて１％のＤＭＳＯのみ０．７５μｌを添加すること以外は前記と同様な方法を用いた。また、バックグラウンド区では、前記の被験物質及び２−モノオレオイルグリセロールに代えてＤＭＳＯのみを添加すること以外は、被験物質及び２−モノオレオイルグリセロール添加区と同様な方法を用いた。
次に５分間保温終了後、前記反応混合物にイソプロパノール／ヘプタン／水（８０：２０：２、ｖ／ｖ）３００μｌを添加することにより反応を停止し、さらにヘプタン２００μｌ及び水１００μｌを添加した後、懸濁した。この懸濁液を３，０００ｒｐｍ×１分、室温にて遠心分離することにより、下層を取り除いた後、残った上層（有機溶媒層）を乾固した。このようにして得られた乾固物をクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）３０μｌに懸濁した。次にこの懸濁液を薄層クロマトグラフィー用ガラスプレート（Ｋ５シリカゲル１５０オングストローム、ワットマン社、以下、ＴＬＣプレートと記すこともある。）上にスポットした。密閉容器にヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７５：２５：１、ｖ／ｖ）の展開溶媒を入れ、当該展開溶媒を用いて前記ＴＬＣプレートを展開した後、当該ＴＬＣプレートを室温で乾燥した。乾燥された当該ＴＬＣプレートにイメージングプレート（富士フィルム社）を１６時間露光させた。露光終了後、イメージングプレートをバイオイメージアナライザー（ＢＡＳ２５００、富士フィルム社）で分析し、前記ＴＬＣプレート上の１，２−ジアシルグリセロール及びトリグリセライドの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定した（以下、１，２−ジアシルグリセロール部分の展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定値Ａ、トリアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定値Ｂと記す。）。これらの測定値から、被験物質を添加した場合のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性（測定値Ａ＋測定値Ｂ／２、以下、活性値１と記す）を算出した。被験物質無添加区及びバックグラウンド区についても、前記と同様な方法を用いてＴＬＣプレート上の１，２−ジアシルグリセロール及びトリグリセライドの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定した（以下、被験物質無添加区の１，２−ジアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定値Ｃ、被験物質無添加区のトリアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定値Ｄ、バックグラウンド区の１，２−ジアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の放射活性を測定値Ｅ、バックグラウンド区のトリアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の放射活性を測定値Ｆと記す。）。これらの測定値から、被験物質無添加区のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性（測定値Ｃ＋測定値Ｄ／２、以下、活性値２と記す。）及びバックグラウンド区のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性（測定値Ｅ＋測定値Ｆ／２、以下、活性値３と記す。）を算出した。得られた活性値から被験物質のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を阻害率（（活性値２−活性値１）×１００／（活性値２−活性値３））として算出した。
その結果、被験物質である公知化合物　Ｎ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（以下、化合物Ａと記すこともある。）における阻害率は４４〜５０％であった。さらに被験物質の供試濃度を変化させながら、前記と同様な方法を用いて各供試濃度における阻害率を算出した。その結果を前者の結果と併せて表１に示した。
【００３８】
【表１】
2004105165.tif 000002
＊　　参考例１の結果に基づく値
＊＊　参考例２の結果に基づく値
また被験物質が他の公知の脂肪量増加抑制能力を有する物質である場合においても同様な傾向の結果を得た。
以上より、本酵素阻害能力を評価するための指標となる阻害率と、蓄積される脂肪量の直接的な測定に基づく結果である、後述の参考例１及び参考例２での抑制率との関係は、特定な濃度範囲においては少なくとも用量的依存性を示しており、この関係は正の相関関係であることが確認された。
【００３９】
参考例１
（１−１）脂肪組織の摘出
１４週齢のウィスター系雄ラット（日本エスエルシー社）３２匹を屠殺・開腹し、腸間膜脂肪組織を摘出した。摘出した組織を、リン酸緩衝液（０．２０ｇ／Ｌ　ＫＣｌ、０．２０ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、８．００ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、２．１６ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１００ユニット／ｍｌペニシリン（ギブコ社）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ社）、２５０ｎｇ／ｍｌアンフォテリシン（ギブコ社））に浸し、室温で洗浄した。
【００４０】
（１−２）脂肪組織からの脂肪細胞の調製と培養
洗浄後の腸間膜脂肪組織について次に示す処理を行った。
まず、上記（１−１）で摘出された脂肪組識を、コラゲナーゼ（タイプＩＩ又はＶＩＩＩ、シグマ社）、ペニシリン（ギブコ社）、ストレプトマイシン（ＧＩＢＶＩＩＩＣＯ社製）及びアンフォテリシン（ギブコ社）をそれぞれ終濃度１ｍｇ／ｍｌ、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ及び２５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコース及び５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有、ギブコ社）約３００ｍｌ中でハサミを用いて約５ｍｍ角に細断した。次いで、これを３７℃で６０分間振とう（約１７０ｒｐｍ）し、ナイロンメッシュ（８０Ｓ［目の大きさが２５０μｍ］、三紳工業社）で濾過し、濾液（細胞懸濁液）を回収した。当該濾液を室温で１８００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、液層をデカンテーションにより静かに除去し、沈査を得た。この沈査を、ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。）（ギブコ社）、アスコルビン酸（和光純薬工業社）、ペニシリン（ギブコ社）、ストレプトマイシン（ギブコ社）及びアンフォテリシン（ギブコ社）をそれぞれ終濃度１０％、２００μＭ、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ及び２５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコース及び５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有、ギブコ社、以下、ＦＢＳ含有培地と記すこともある。）５０ｍｌに懸濁し、懸濁液をナイロンメッシュ（４２０Ｓ［目の大きさが２５μｍ］、三紳工業社）で濾過した。濾液を回収し、室温で１８００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、液層をデカンテーションにより静かに除去し、沈査を再度ＦＢＳ含有培地５０ｍｌに懸濁した。当該懸濁液について、遠心分離、液層除去、ＦＢＳ含有培地に懸濁するという操作を更に２回、前記と同様に行い、懸濁液（１２０ｍｌ）を調製した。当該懸濁液を細胞培養用フラスコ（接着細胞用Ｔ１５０、岩城硝子社）に３０ｍｌずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養開始２〜３時間後に培地を除き、フラスコの器壁を１５ｍｌの前記リン酸緩衝液で洗浄した。洗液を除き、当該洗浄操作を再度行った後、リン酸緩衝液を除き、３０ｍｌのＦＢＳ含有培地をフラスコに添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養開始１日後に培地を除き、１５ｍｌのリン酸緩衝液でフラスコの器壁を１回洗浄した後、当該フラスコにトリプシン−エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと記す。）溶液（０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ、ギブコ社）を細胞が浸る程度に添加し、３７℃で５分放置した。これに、ＦＢＳ含有培地をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液の約１０倍量添加し、細胞懸濁液を得た。
【００４１】
（１−３）被験物質の脂肪量増加抑制能力の測定（その１）
上記の（１−２）で腸間膜脂肪組織から調製された細胞懸濁液中の細胞数を血球計算盤を用いて測定し、１．４×１０５細胞／ｍｌになるようにＦＢＳ含有培地を加えることにより当該細胞懸濁液を希釈した。このようにして得られた希釈液を９６穴プレート（接着細胞培養用、岩城硝子社）に１ウェルあたり１００μｌずつ分注し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて２〜３日間培養した後、９６穴プレートの各ウェルから培地を除き、１０μｇ／ｍｌインシュリン（シグマ社製）、０．２５μＭデキサメサゾン（和光純薬工業社）、０．５ｍＭ　３−イソブチル−１−メチル−キサンチン（シグマ社製）及び５μＭ　１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（Ｃａｙｍａｎ社）を含むＦＢＳ含有培地１００μｌを各ウェルに添加して５％ＣＯ２存在下、３７℃にて２日間培養した。次いで、各ウェルの培地を除き、１０μｇ／ｍｌインシュリン及び５μＭ　１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２を含むＦＢＳ含有培地１００μｌを各ウェルに添加した。さらに２日間、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養した後、各ウェルの培地を除き、１０μｇ／ｍｌインシュリン、５μＭ　１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２、被験物質５０μＭ、０．５％ＤＭＳＯ（和光純薬工業社）を含むＦＢＳ含有培地１００μｌを各ウェルに添加し、同様に培養した。尚、被験物質無添加区では、前記培地の代わりに１０μｇ／ｍｌインシュリン、５μＭ　１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２、０．５％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ含有培地１００μｌを添加する以外は前記と同様な方法で培養を行なった。２日間培養した後、オイルレッド　Ｏ（Ｓｕｄａｎ　ＩＩ、和光純薬工業社）を用いて細胞内の脂肪を染色し、比色定量法により染色された脂肪の量を測定した。即ち、まず、細胞培養液の入った各ウェルに直接、０．０７５％オイルレッド　Ｏ染色液／６０％リン酸トリエチル溶液３０μｌを添加した。室温で３０分間放置後、オイルレッド　Ｏ染色液を含む培地を除き、２０％リン酸トリエチル水溶液１００μｌを各ウェルに添加した。添加後、２０％リン酸トリエチル水溶液を各ウェルから除き、新たに同水溶液１００μｌを各ウェルに添加した。再度前記の操作を繰り返した後、細胞溶解液（２％ＳＤＳ、０．２Ｎ　ＮａＯＨ）１００μｌを各ウェルに添加した。これを３７℃で３時間以上保温した後、各ウェルについて４９０ｎｍの波長の吸光度をプレートリーダー（Ｖｍａｘ、ベックマン社）を用いて測定した（以下、測定値１と記す。）。被験物質無添加区についても、前記と同様な方法により細胞内の脂肪を染色し、比色定量法により染色された脂肪の量を測定した（以下、測定値２と記す。）。これらの測定値から、被験物質の脂肪量増加抑制能力を抑制率として下記の式に従って算出した。
抑制率（％）＝｛（測定値２−測定値１）／測定値２｝×１００
その結果、被験物質である公知化合物　Ｎ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（即ち、化合物Ａ）の抑制率は７２％であった。
【００４２】
参考例２　（被験物質の脂肪量増加抑制能力の測定（その２））
（２−１）脂肪組織片の調製
１４週齢のウィスター系（日本エスエルシー社）３２匹を屠殺・開腹し、腸間膜に付着した脂肪組織（即ち、腸間膜脂肪組織）を全て摘出した。また、腹側部から大腿部にかけての皮下の脂肪組織（以下、腹側部脂肪組織と記す。）を一匹あたり片側からのみ摘出した。摘出されたこれらの組織を、２ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコース及び５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有、ギブコ社）で洗浄した後、同培地中でハサミを用いて約１ｍｍ角に細断した。
【００４３】
（２−２）被験物質の脂肪量増加抑制能力の測定（その２）
まず、４８穴プレート（接着細胞培養用、住友ベークライト社）にダルベッコ改変イーグル培地−低グルコース（１．０ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコース及び５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有、ギブコ社）をウェル当り５００μｌずつ分注し、さらに、ＤＭＳＯに溶解させた被験物質を、当該被験物質の終濃度が５０μＭ、ＤＭＳＯの終濃度が０．５％となるように添加した。各ウェルに、前記（２−１）で調製された脂肪組織片５０〜１００ｍｇを入れ、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３０分間保温した。尚、被験物質無添加区では、前記の被験物質のＤＭＳＯ溶液に代えてＤＭＳＯのみを終濃度０．５％となるよう添加すること以外は前記と同様な方法を用いた。保温開始３０分後に放射性同位体標識されたグルコース溶液（Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］グルコース、７．４ＭＢｑ／ｍｌ、アマシャム社）１５μｌを各ウェルに添加し、さらに５％ＣＯ２存在下、３７℃で７時間保温した。次に保温終了後、各ウェルの脂肪組織片をヘプタン／イソプロパノール（ヘプタン：イソプロパノール＝３：２）７５０μｌ中に移し、室温で約１５時間放置した。次いで前記の液から脂肪組織片を取り除き、ヘプタン及びイソプロパノールを揮発させ、得られた残査のうち６μｌをクロロホルム／メタノール（クロロホルム：メタノール＝２：１）１２０μｌに溶解し、当該溶解液のうち６μｌを薄層クロマトグラフィー用ガラスプレート（Ｋ５シリカゲル１５０オングストローム、ワットマン社、以下、ＴＬＣプレートと記すこともある。）上にスポットした。密閉容器にヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（７５：２５：１）の展開溶媒を入れ、当該展開溶媒を用いて前記ＴＬＣプレートを展開した後、当該ＴＬＣプレートを室温で乾燥した。乾燥された当該ＴＬＣプレートにイメージングプレート（富士フィルム社）を４〜５時間露光させた。露光終了後、イメージングプレートをバイオイメージアナライザー（ＢＡＳ２０００、富士フィルム社）で分析し、前記ＴＬＣプレート上のトリグリセライドの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定した（以下、測定値５と記す。）。被験物質無添加区についても、前記と同様な方法を用いてＴＬＣプレート上のトリグリセライドの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定した（以下、測定値６と記す。）。これらの測定値から、下記の式に従って、被験物質の脂肪量増加抑制能力を、脂肪組織単位体積当たりの脂肪（トリグリセライド）蓄積の抑制率として算出した。
脂肪組織単位体積当たりの脂肪量増加の抑制率（％）＝｛（測定値６−測定値５）／測定値６｝×１００
その結果、被験物質である公知化合物　Ｎ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（即ち、化合物Ａ）における抑制率は８４％であった。さらに被験物質の供試濃度を変化させながら、前記と同様な方法を用いて各供試濃度における抑制率を算出した。その結果を前者の結果と併せて表２に示した。
【００４４】
【表２】
2004105165.tif 000003
【００４５】
実施例３　（マウス由来の本遺伝子のクローニング（その１））
マウス由来の本遺伝子（ｍＡＴ１２）を有するＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅するために、まずＭｏｕｓｅ　Ｎｏｒｍａｌ　Ａｄｉｐｏｓｅ　ｃＤＮＡ　（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社）１μＬ、配列番号５で示される塩基配列からなるプライマー５　２０ｐｍｏｌ、配列番号６で示される塩基配列からなるプライマー６　２０ｐｍｏｌ、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社）２Ｕ、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ添付のバッファー　５μＬ及びＴａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ添付のｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）４μＬを含む５０μＬのＰＣＲ用反応液を調製し、これをＰＣＲに供した。ＰＣＲは、まず９４℃で３０秒間、次いで６０℃で３０秒間、更に７２℃で１分間からなる保温サイクルを５０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約１．２Ｋｂｐを示すＰＣＲ産物を回収した。回収されたＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にサブクローニングすることにより調製されたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養することにより得られる培養菌体から前記プラスミドをＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離・精製することにより、マウス由来の本遺伝子（ｍＡＴ１２）の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドを得た。
【００４６】
実施例４　（マウス由来の本遺伝子の塩基配列の決定（その１））
実施例３で得られたＰＣＲ産物（約１．２ｋｂｐ）を含むプラスミドを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＩＩダイ・ターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社）及びＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列読み取り装置（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、サンガーの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ、Ａ．Ｒ．ＣｏｕｌｓｏｎＡ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），　７４，　５４６３−５４６７）により、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡからなるマウス由来の本遺伝子（ｍＡＴ１２）の塩基配列を決定した。
【００４７】
実施例５　（ヒト由来の本遺伝子のクローニング（その１））
ヒト由来の本遺伝子（ｈＡＴ１２）を有するＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅するために、まずＨｕｍａｎ　Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μＬ、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー７　２０ｐｍｏｌ、配列番号８で示される塩基配列からなるプライマー８　２０ｐｍｏｌ、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社）２Ｕ、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ添付のバッファー　５μＬ及びＴａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ添付のｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）４μＬを含む５０μＬのＰＣＲ用反応液を調製し、これをＰＣＲに供した。ＰＣＲは、まず９４℃で３０秒間、次いで６０℃で３０秒間、更に７２℃で１分間からなる保温サイクルを５０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約１．２Ｋｂｐを示すＰＣＲ産物を回収した。回収されたＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にサブクローニングすることにより調製されたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養することにより得られる培養菌体から前記プラスミドをＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離・精製することにより、ヒト由来の本遺伝子（ｈＡＴ１２）の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドを得た。
【００４８】
実施例６　（ヒト由来の本遺伝子の塩基配列の決定（その１））
実施例５で得られたＰＣＲ産物（約１．２ｋｂｐ）を含むプラスミドを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＩＩダイ・ターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社）及びＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列読み取り装置（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、サンガーの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ、Ａ．Ｒ．ＣｏｕｌｓｏｎＡ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），　７４，　５４６３−５４６７）により、配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡからなるヒト由来の本遺伝子（ｈＡＴ１２）の塩基配列を決定した。
【００４９】
実施例７　（ラット由来の本遺伝子のクローニング及びその塩基配列の決定（その１））
実施例３及び４に記載される方法に準じて、ラット由来の本遺伝子（ｒＡＴ１２）の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドを得、さらに、配列番号１２で示される塩基配列を有するＤＮＡからなるラット由来の本遺伝子（ｒＡＴ１２）の塩基配列を決定した。
【００５０】
実施例８　（配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ末端にＦＬＡＧが付与された融合蛋白質を発現するプラスミドの調製）
実施例３で分離・精製されたプラスミド０．０５μｇ、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマー９　２０ｐｍｏｌ及び配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマー１０　２０ｐｍｏｌ、Ｔａｋａｒａ　ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社）０．５Ｕ、Ｔａｋａｒａ　ＥｘＴａｑポリメラーゼ添付のバッファー　５μＬ及びＴａｋａｒａ　ＥｘＴａｑポリメラーゼ添付のｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）　４μＬ含む５０μＬのＰＣＲ用反応液を調製し、これをＰＣＲに供した。ＰＣＲは、まず９４℃を１分間、次いで６０℃を３０秒間、更に７２℃で１分間からなる保温サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約１．１Ｋｂｐを示すＰＣＲ産物を回収した。回収されたＰＣＲ産物をｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にサブクローニングすることにより調製されたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養することにより得られる培養菌体から前記プラスミドをＱＩＡＧＥＮＱＩＡｆｉｌｔｅｒ　Ｍｅｇａ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離・精製することにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ末端にＦＬＡＧ（一文字表記によるアミノ酸配列：ＭＤＹＫＤＤＤＤＫＳＰＧＧＳＰＧＬＱＥＦ）が付与された融合蛋白質（以下、ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質と記すこともある。）を発現するプラスミドを得た。さらに、当該プラスミドに変異がないことを実施例４に記載される方法により確認した。
【００５１】
実施例９　（本酵素を含む除核細胞抽出液の調製（その１）：ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質を含む除核細胞抽出液の調製）
実施例８で得られたＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質発現用プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ　ＰＬＵＳ試薬キット（インビトロジェン社）を用いて、当該試薬キットに添付される手順書に従って、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬社）に導入した。発現用プラスミドが導入されたＣＨＯ−Ｋ１の細胞を、当該細胞の購入時に配布される手順書に従って２４時間培養した。培養後、細胞をＤ−ＰＢＳ（ギブコ社）で２回洗浄した後、セルスクレイパーによりかき集め、これを遠心分離することにより細胞を回収した。回収された細胞を５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ　７．５）、０．２５Ｍスクロース、１ｍＭエチレングリコールビス２アミノエチルエーテル四酢酸（以下、ＥＧＴＡと記す。）、１ｍＭジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと記す。）、１００分の１容量のプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を含む緩衝液（以下、緩衝液Ａと記す。）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理（氷冷下、５秒間×６回）することにより懸濁液中の細胞を破砕した後、得られた細胞破砕液を１０００×ｇ、３０秒間、４℃で遠心分離することにより、未破砕の細胞及び核画分を沈殿として取り除いた。得られた上清について、ウシ血清アルブミンを標準としたブラッドフォード法により蛋白質の濃度を測定し、それぞれ２μｇ／μＬとなるように緩衝液Ａを加えて希釈したものを、除核細胞抽出液とした。
【００５２】
実施例１０　（対照となる除核細胞抽出液の調製（その１））
対照（ネガティブコントロール）として、ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質発現用プラスミドの代わりにｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（インサートを含まないもの）を用いる以外は実施例９に記載される方法と同様の方法により、除核細胞抽出液（対照）を得た。
【００５３】
実施例１１　（本酵素の分離及び検出（その１））
実施例９及び１０で得られた除核細胞抽出液５μＬを用いて、抗ＦＬＡＧタグＭ２抗体（シグマ社）を用いたイムノブロッティングを行ったところ、対照（ネガティブコントロール）の除核細胞抽出液の場合には、何も検出されなかった。一方、ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質発現用プラスミドが導入された細胞より調製された除核細胞抽出液の場合には、約４５ｋＤａの分子量の単一バンドである蛋白質が検出された。
【００５４】
実施例１２　（モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性の測定（その１））
実施例９及び１０で得られた除核細胞抽出液１０μＬを１５０μＬの反応用緩衝液（２４ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ　７．５）、５０ｍＭ　塩化カリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、１．２５ｍｇ／ｍＬ　ウシ血清アルブミン、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　２−モノオレオイルグリセロール）に懸濁した後、当該懸濁液に５μＬの９００μＭ　（０．２ＭＢｑ／μＬ）［１４Ｃ］パルミトイル−コエンザイムＡ水溶液を加えた。この混合物を室温で１０分間保温した。尚、２−モノオレオイルグリセロールを含まない以外は上記の同じ組成である反応用緩衝液を用いて上記と同様の操作を行った試験系をバックグラウンド区とした。
次に、当該混合物に３００μＬのヘプタン／２−プロパノール／水（＝８０：２０：２）を加えて撹拌し、１０分間放置した後、さらに当該混合物に２００μＬのヘプタン及び１００μＬの水を加えて撹拌した。攪拌後、当該混合物を遠心分離することにより下層を取り除いた後、残った上層を遠心エバポレータを用いて乾固した。このようにして得られた乾固物（脂肪画分）をクロロホルムに再溶解した。次にこの溶解液をシルカゲル１５０薄層クロマトグラフィー用ガラスプレート（Ｋ５シリカゲル１５０オングストローム、ワットマン社）にスポットし、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７５：２５：１）の展開溶媒を用いて展開することにより、当該溶解液に含まれる［１４Ｃ］１，２−ジアシルグリセロールを分離した。分離された［１４Ｃ］１，２−ジアシルグリセロールを、バイオイメージングアナライザシステムＢＡＳ−２０００（富士フィルム社）を用いて定量した。２−モノオレオイルグリセロールを含む反応用緩衝液での測定値から、バックグラウンド区での測定値を差し引いた値を酵素活性として算出した。対照（ネガティブコントロール）のプラスミドが導入された試験系及びＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質発現用プラスミドが導入された試験系において、それぞれの除核細胞抽出液中のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を表３に示した。
【００５５】
【表３】
2004105165.tif 000004
以上より、ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質発現用プラスミドが導入された試験系では、対照（ネガティブコントロール）のプラスミドが導入された試験系と比較して、除核細胞抽出液中のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性が上昇したことから、配列番号１に示したアミノ酸配列からなる蛋白質がモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を示すことが確認された。
【００５６】
実施例１３　（マウス由来の本遺伝子のクローニング（その２））
マウス由来の本遺伝子（ｍＡＴ１４）を有するＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅するために、まずＭｏｕｓｅ　Ｎｏｒｍａｌ　Ａｄｉｐｏｓｅ　ｃＤＮＡ　（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社）１μＬ、配列番号１９で示される塩基配列からなるプライマー１９２０ｐｍｏｌ、配列番号２０で示される塩基配列からなるプライマー２０　２０ｐｍｏｌ、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社）２Ｕ、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ添付のバッファー　５μＬ及びＴａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ添付のｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）４μＬを含む５０μＬのＰＣＲ用反応液を調製し、これをＰＣＲに供した。ＰＣＲは、まず９４℃で６０秒間保温した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる保温サイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で４分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約１．３Ｋｂｐを示すＰＣＲ産物を回収した。回収されたＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にサブクローニングすることにより調製されたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養することにより得られる培養菌体から前記プラスミドをＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離・精製することにより、マウス由来の本遺伝子（ｍＡＴ１４）の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドを得た。
【００５７】
実施例１４　（マウス由来の本遺伝子の塩基配列の決定（その２））
実施例１３で得られたＰＣＲ産物（約１．３ｋｂｐ）を含むプラスミドを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＩＩダイ・ターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社）及びＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列読み取り装置（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、サンガーの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ、Ａ．Ｒ．ＣｏｕｌｓｏｎＡ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），　７４，　５４６３−５４６７）により、配列番号１４で示される塩基配列を有するＤＮＡからなるマウス由来の本遺伝子（ｍＡＴ１４）の塩基配列を決定した。
【００５８】
実施例１５　（ヒト由来の本遺伝子のクローニング（その２））
ヒト由来の本遺伝子（ｈＡＴ１４）を有するＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅するために、まずＨｕｍａｎ　Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μＬ、配列番号２１で示される塩基配列からなるプライマー２１　２０ｐｍｏｌ、配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマー２２　２０ｐｍｏｌ、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社）２Ｕ、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ添付のバッファー　５μＬ及びＴａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ添付のｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）４μＬを含む５０μＬのＰＣＲ用反応液を調製し、これをＰＣＲに供した。ＰＣＲは、まず９４℃で６０秒間保温した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる保温サイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約１．４Ｋｂｐを示すＰＣＲ産物を回収した。回収されたＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にサブクローニングすることにより調製されたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養することにより得られる培養菌体から前記プラスミドをＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離・精製することにより、ヒト由来の本遺伝子（ｈＡＴ１４）の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドを得た。
【００５９】
実施例１６　（ヒト由来の本遺伝子の塩基配列の決定（その２））
実施例１５で得られたＰＣＲ産物（約１．４ｋｂｐ）を含むプラスミドを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＩＩダイ・ターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社）及びＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列読み取り装置（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、サンガーの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ、Ａ．Ｒ．ＣｏｕｌｓｏｎＡ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），　７４，　５４６３−５４６７）により、配列番号１６で示される塩基配列を有するＤＮＡからなるヒト由来の本遺伝子（ｈＡＴ１４）の塩基配列を決定した。
【００６０】
実施例１７　（ラット由来の本遺伝子のクローニング（その２））
ラット由来の本遺伝子（ｒＡＴ１４）を有するＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅するために、まずＲａｔ　Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μＬ、配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマー２３　２０ｐｍｏｌ、配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマー２４　２０ｐｍｏｌ、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社）２Ｕ、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ添付のバッファー　５μＬ及びＴａｋａｒａ　Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ添付のｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）４μＬを含む５０μＬのＰＣＲ用反応液を調製し、これをＰＣＲに供した。ＰＣＲは、まず９４℃で６０秒間保温した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる保温サイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約１．３Ｋｂｐを示すＰＣＲ産物を回収した。回収されたＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にサブクローニングすることにより調製されたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養することにより得られる培養菌体から前記プラスミドをＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離・精製することにより、ラット由来の本遺伝子（ｒＡＴ１４）の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドを得た。
【００６１】
実施例１８　（ラット由来の本遺伝子の塩基配列の決定（その２））
実施例１７で得られたＰＣＲ産物（約１．３ｋｂｐ）を含むプラスミドを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＩＩダイ・ターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社）及びＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列読み取り装置（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、サンガーの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ、Ａ．Ｒ．ＣｏｕｌｓｏｎＡ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），　７４，　５４６３−５４６７）により、配列番号１８で示される塩基配列を有するＤＮＡからなるラット由来の本遺伝子（ｒＡＴ１４）の塩基配列を決定した。
【００６２】
実施例１９　（配列番号１３で示されるアミノ酸配列のアミノ末端にＦＬＡＧが付与された融合蛋白質を発現するプラスミドの調製）
実施例１３で分離・精製されたプラスミド０．０５μｇ、配列番号２５で示される塩基配列からなるプライマー２５　２０ｐｍｏｌ及び配列番号２６で示される塩基配列からなるプライマー２６　２０ｐｍｏｌ、Ｔａｋａｒａ　ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社）０．５Ｕ、Ｔａｋａｒａ　ＥｘＴａｑポリメラーゼ添付のバッファー　５μＬ及びＴａｋａｒａ　ＥｘＴａｑポリメラーゼ添付のｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）　４μＬ含む５０μＬのＰＣＲ用反応液を調製し、これをＰＣＲに供した。ＰＣＲは、まず９４℃を１分間、次いで６０℃を３０秒間、更に７２℃で１分間からなる保温サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約１．１Ｋｂｐを示すＰＣＲ産物を回収した。回収されたＰＣＲ産物をｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にサブクローニングすることにより調製されたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ培地５００ｍＬで培養することにより得られる培養菌体から前記プラスミドをＱＩＡＧＥＮ　ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ　Ｍｅｇａ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離・精製することにより、配列番号１３で示されるアミノ酸配列のアミノ末端にＦＬＡＧ（一文字表記によるアミノ酸配列：ＭＤＹＫＤＤＤＤＫＳＰＧＧＳ）が付与された融合蛋白質（以下、ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１４蛋白質と記すこともある。）を発現するプラスミドを得た。さらに、当該プラスミドに変異がないことを実施例１４に記載される方法により確認した。
【００６３】
実施例２０　（本酵素を含む除核細胞抽出液の調製（その２）：ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１４蛋白質を含む除核細胞抽出液の調製）
実施例１９で得られたＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１４蛋白質発現用プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ　ＰＬＵＳ試薬キット（インビトロジェン社）を用いて、当該試薬キットに添付される手順書に従って、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬社）に導入した。発現用プラスミドが導入されたＣＨＯ−Ｋ１の細胞を、当該細胞の購入時に配布される手順書に従って２４時間培養した。培養後、細胞をＤ−ＰＢＳ（ギブコ社）で２回洗浄した後、セルスクレイパーによりかき集め、これを遠心分離することにより細胞を回収した。回収された細胞を５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ　７．５）、０．２５Ｍスクロース、１ｍＭエチレングリコールビス２アミノエチルエーテル四酢酸（以下、ＥＧＴＡと記す。）、１ｍＭジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと記す。）、１００分の１容量のプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を含む緩衝液（以下、緩衝液Ａと記す。）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理（氷冷下、５秒間×６回）することにより懸濁液中の細胞を破砕した後、得られた細胞破砕液を１０００×ｇ、３０秒間、４℃で遠心分離することにより、未破砕の細胞及び核画分を沈殿として取り除いた。得られた上清について、ウシ血清アルブミンを標準としたブラッドフォード法により蛋白質の濃度を測定し、それぞれ２μｇ／μＬとなるように緩衝液Ａを加えて希釈したものを、除核細胞抽出液とした。
【００６４】
実施例２１　（対照となる除核細胞抽出液の調製（その２））
対照（ネガティブコントロール）として、ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１４蛋白質発現用プラスミドの代わりにｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（インサートを含まないもの）を用いる以外は実施例２０に記載される方法と同様の方法により、除核細胞抽出液（対照）を得た。
【００６５】
実施例２２　（本酵素の分離及び検出（その２））
実施例２０及び２１で得られた除核細胞抽出液５μＬを用いて、抗ＦＬＡＧタグＭ２抗体（シグマ社）を用いたイムノブロッティングを行ったところ、対照（ネガティブコントロール）の除核細胞抽出液の場合には、何も検出されなかった。一方、ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１４蛋白質発現用プラスミドが導入された細胞より調製された除核細胞抽出液の場合には、約４６ｋＤａの分子量の単一バンドである蛋白質が検出された。
【００６６】
実施例２３　（モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性の測定（その２））
実施例２０及び２１で得られた除核細胞抽出液１０μＬを１５０μＬの反応用緩衝液（２４ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ　７．５）、５０ｍＭ　塩化カリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、１．２５ｍｇ／ｍＬ　ウシ血清アルブミン、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　２−モノオレオイルグリセロール）に懸濁した後、当該懸濁液に５μＬの９００μＭ　（０．２ＭＢｑ／μＬ）［１４Ｃ］パルミトイル−コエンザイムＡ水溶液を加えた。この混合物を室温で１０分間保温した。尚、２−モノオレオイルグリセロールを含まない以外は上記の同じ組成である反応用緩衝液を用いて上記と同様の操作を行った試験系をバックグラウンド区とした。
次に、当該混合物に３００μＬのヘプタン／２−プロパノール／水（＝８０：２０：２）を加えて撹拌し、１０分間放置した後、さらに当該混合物に２００μＬのヘプタン及び１００μＬの水を加えて撹拌した。攪拌後、当該混合物を遠心分離することにより下層を取り除いた後、残った上層を遠心エバポレータを用いて乾固した。このようにして得られた乾固物（脂肪画分）をクロロホルムに再溶解した。次にこの溶解液をシルカゲル１５０薄層クロマトグラフィー用ガラスプレート（Ｋ５シリカゲル１５０オングストローム、ワットマン社）にスポットし、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７５：２５：１）の展開溶媒を用いて展開することにより、当該溶解液に含まれる［１４Ｃ］１，２−ジアシルグリセロールを分離した。分離された［１４Ｃ］１，２−ジアシルグリセロールを、バイオイメージングアナライザシステムＢＡＳ−２０００（富士フィルム社）を用いて定量した。２−モノオレオイルグリセロールを含む反応用緩衝液での測定値から、バックグラウンド区での測定値を差し引いた値を酵素活性として算出した。対照（ネガティブコントロール）のプラスミドが導入された試験系及びＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１４蛋白質発現用プラスミドが導入された試験系において、それぞれの除核細胞抽出液中のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を表４に示した。
【表４】
2004105165.tif 000005
以上より、ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１４蛋白質発現用プラスミドが導入された試験系では、対照（ネガティブコントロール）のプラスミドが導入された試験系と比較して、除核細胞抽出液中のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性が上昇したことから、配列番号１３に示したアミノ酸配列からなる蛋白質がモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を示すことが確認された。
【００６７】
実施例２４　（配列番号３および配列番号１５で示されるアミノ酸配列のアミノ末端にＦＬＡＧが付与された融合蛋白質を発現するプラスミドの調製）
実施例８と同様に、実施例５で分離・精製されたｈＡＴ−１２プラスミド、配列番号２７および２８で示される塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲ法により、配列番号３で示されるアミノ酸配列のアミノ末端にＦＬＡＧが付与された融合蛋白質（以下ＦＬＡＧ融合ｈＡＴ−１２と称することもある。）を発現するプラスミドを得た。さらに、当該プラスミドに変異がないことを実施例４に記載される方法により確認した。
また、実施例８と同様に、実施例１５で分離・精製されたｈＡＴ−１４プラスミド、配列番号２９および３０で示される塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲ法により、配列番号１５で示されるアミノ酸配列のアミノ末端にＦＬＡＧが付与された融合蛋白質（以下ＦＬＡＧ融合ｈＡＴ−１４と称することもある。）を発現するプラスミドを得た。さらに、当該プラスミドに変異がないことを実施例１６に記載される方法により確認した。
【００６８】
実施例２５　（本酵素を含む除核細胞抽出液の調製（その３）：ＦＬＡＧ融合ｈＡＴ１２蛋白質・ＦＬＡＧ融合ｈＡＴ１４蛋白質を含む除核細胞抽出液の調製）実施例２４で得られたＦＬＡＧ融合蛋白質発現用プラスミドを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し、実施例９と同様の方法で、除核細胞抽出液を調製した。
【００６９】
実施例２６　（対照となる除核細胞抽出液の調製（その３））
対照（ネガティブコントロール）として、ＦＬＡＧ融合ｈＡＴ−１２蛋白質発現用プラスミド又はＦＬＡＧ融合ｈＡＴ−１４蛋白質発現プラスミドの代わりにｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（インサートを含まないもの）を用いる以外は実施例９に記載される方法と同様の方法により、除核細胞抽出液（対照）を得た。
【００７０】
実施例２７　（本酵素の分離及び検出（その３））
実施例２５及び２６で得られた除核細胞抽出液５μＬを用いて、抗ＦＬＡＧタグＭ２抗体（シグマ社）を用いたイムノブロッティングを行ったところ、対照（ネガティブコントロール）の除核細胞抽出液の場合には、何も検出されなかった。一方、ＦＬＡＧ融合ｈＡＴ−１２蛋白質発現用プラスミド又はＦＬＡＧ融合ｈＡＴ−１４蛋白質発現用プラスミドが導入された細胞より調製された除核細胞抽出液の場合には、それぞれ、４５ｋＤおよび４６ｋＤの分子量の単一バンドである蛋白質が検出された。
【００７１】
実施例２８　（モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性の測定）
実施例１２と同様の方法で、実施例２５および２６で調製した除核細胞抽出液中のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を測定した。結果を表５に示した。
【表５】
2004105165.tif 000006
以上より、ＦＬＡＧ融合ｈＡＴ１２蛋白質発現用プラスミドおよびＦＬＡＧ融合ｈＡＴ１４蛋白質発現用プラスミドが導入された試験系では、対照（ネガティブコントロールが導入された試験系と比較して、除核細胞抽出液中のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性が上昇したことから、配列番号：３および配列番号：１５に示したアミノ酸配列からなる蛋白質がモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を示すことが確認された。
【００７２】
実施例２９　（モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現分布）
実施例８、１９及び２４において得られたプラスミド（ＦＬＡＧ−ｍＡＴ１２、ｍＡＴ１４、ｈＡＴ１２、ｈＡＴ１４）を、ＦＬＡＧ配列を除く遺伝子コード配列の両端で切れるように制限酵素処理した。ＤＮＡを電気泳動したゲルから目的の長さのバンドを切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（宝酒造社製）によりＤＮＡを精製した。このＤＮＡ約１０−１００ｎｇを鋳型にして、ランダムプライム法による３３Ｐ−ｄＣＴＰ放射標識を行った。反応はランダムプライムキット（宝酒造社製）を用い、キット添付のプロトコールに従った。反応液から未反応のｄＮＴＰｓをスピンカラムによって除去した後、プローブの比活性を液体シンチレーションカウンターにより測定し、プローブが十分に放射標識されていることを確認した。プローブの一部を熱変性・急冷させて１本鎖にした後、８ｍｌのＤＩＧ　Ｅａｓｙ−Ｈｙｂ液（ベーリンガーマンハイム社製）に添加し、これをハイブリダイズ液とした。このハイブリダイズ液中に、前もってＤＩＧ　Ｅａｓｙ−Ｈｙｂ液中でプレハイブリダイズしておいた組織ＲＮＡブロットメンブレン（Ｍｏｕｓｅ　Ａｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｍＲＮＡ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ、Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ、全てＢＩＯＣＨＡＩＮ社製）を浸し、ハイブリバッグ中にシールしてハイブリダイズを開始した。ハイブリダイズ条件は、プレハイブリダイズ：５０℃、３時間以上、ハイブリダイズ：５０℃、一晩振とう、という条件で行った。ハイブリダイズ終了後、メンブレンを２×ＳＳＣ―０．１％　ＳＤＳ、室温で２回、０．１×ＳＳＣ―０．１％　ＳＤＳ、５０℃で１回、という条件で洗浄後、メンブレンをイメージングプレートに１晩暴露した。イメージングプレートをバイオイメージングアナライザシステムＢＡＳ−２５００（富士フィルム社）を用いて読み取った結果を図１、２，３，４に示す。
これより、マウスＡＴ１２およびＡＴ１４　ｍＲＮＡは、マウス肝臓および小腸において有意に発現していること、ヒトＡＴ１２およびＡＴ１４　ｍＲＮＡは、ヒト小腸において有意に発現していることが確かめられた。
以上の結果をまとめると、ＡＴ１２およびＡＴ１４は細胞内においてモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有すること、マウスにおいて肝臓および小腸で有意に発現が見られること、ヒトにおいて小腸で有意に発現が見られることから、ＡＴ１２およびＡＴ１４は肝臓および小腸においてトリグリセライド合成に関与するモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼであると考えられる。
【００７３】
実施例３０　（ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質を安定して発現する細胞株の樹立）
実施例８で得られたＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質発現用プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ　ＰＬＵＳ試薬キット（インビトロジェン社）を用いて、当該試薬キットに添付される手順書に従って、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬社）に導入した。発現用プラスミドが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を当該細胞の購入時に配布される手順書に従って７２時間培養した後、４００μｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（ギブコ社）を含む１０％　ＦＣＳ添加Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２培地（以下、選択培地と記す）に交換し、適宜新しい培地に交換しながら、７日間培養を続けた。培養後、限外希釈法により、安定発現株のクローン化を行った。得られた細胞株の各々について、一部を５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ　７．５）、０．２５Ｍスクロース、１ｍＭエチレングリコールビス２アミノエチルエーテル四酢酸（以下、ＥＧＴＡと記す。）、１ｍＭジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと記す。）、１００分の１容量のプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を含む緩衝液（以下、緩衝液Ａと記す。）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理（氷冷下、５秒間×６回）することにより懸濁液中の細胞を破砕した後、得られた細胞破砕液を１０００×ｇ、３０秒間、４℃で遠心分離することにより、未破砕の細胞及び核画分を沈殿として取り除いた。得られた上清について、抗ＦＬＡＧタグＭ２抗体（シグマ社）を用いたイムノブロッティングを行い、約４５ｋＤａの分子量の単一バンドである蛋白質を最も多く発現している細胞株を選択し、ｍＡＴ−１２安定発現株を得た。
【００７４】
実施例３１　（ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質の精製）
実施例３０で得られたＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質を安定して発現する細胞株を選択培地中で拡大培養した。培養後、細胞をＤ−ＰＢＳ（ギブコ社）で２回洗浄した後、セルスクレイパーによりかき集め、これを遠心分離することにより細胞を回収した。回収された細胞を５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ　７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％　｛３−〔（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ〕−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ｝（以下、　ＣＨＡＰＳと記す）、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１００分の１容量のプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を含む緩衝液に懸濁した。この懸濁液を超音波処理（氷冷下、６秒間×６回）することにより懸濁液中の細胞を破砕した後、得られた細胞破砕液を１５０００×ｇ、５分間、４℃で遠心分離することにより、未破砕の細胞及び核画分を沈殿として取り除き、上清を細胞粗抽出液として得た。Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ　Ｍ２アフィニティゲル１ｍｌを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ　７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％　ＣＨＡＰＳ（以下、緩衝液Ｂと記す。）により平衡化したカラムに、細胞粗抽出液を加え、ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質を吸着させた。１０倍容量の緩衝液Ｂにてカラムを洗浄した後、流出を停止し、ＦＬＡＧペプチドを含む緩衝液Ｂを添加してインキュベートした。１０分後、再び流出を開始し、ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２タンパク質精製画分を得た。抗ＦＬＡＧタグＭ２抗体（シグマ社）を用いたイムノブロッティングを行い、本画分に約４５ｋＤａの分子量の単一バンドである蛋白質が含まれることを確認した。
【００７５】
実施例３２（精製ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性の測定）
実施例３１で得られた精製ＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２蛋白質精製画分１０μｌを反応用緩衝液（２４ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ　塩化カリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、１．２５ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　２−モノオレオイルグリセロール）１３０μｌに懸濁した後、被験物質（ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）に溶解、終濃度１％　ＤＭＳＯとなるように添加）を添加し、混合した。この混合物に１０μＬの４５０μＭ［１４Ｃ］パルミトイル−コエンザイムＡ水溶液を添加し、室温で２０分間保温した。尚、被験物質無添加区では、前記の被験物質のＤＭＳＯ溶液に代えてＤＭＳＯのみ１．５μｌを添加すること以外は前記と同様な方法を用いた。また、バックグラウンド区では、前記の被験物質及び２−モノオレオイルグリセロールに代えてＤＭＳＯのみを添加すること以外は、被験物質及び２−モノオレオイルグリセロール添加区と同様な方法を用いた。　２０分間保温終了後、前記反応混合物に３００μＬのヘプタン／２−プロパノール／水（＝８０：２０：２）を添加することにより反応を停止し、さらにヘプタン２００μｌ及び水１００μｌを添加した後、懸濁した。攪拌後、当該混合物を遠心分離することにより下層を取り除いた後、残った上層を遠心エバポレータを用いて乾固した。このようにして得られた乾固物（脂肪画分）をクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）３０μｌに再溶解した。次にこの溶解液をシリカゲル１５０薄層クロマトグラフィー用ガラスプレート（Ｋ５シリカゲル１５０オングストローム、ワットマン社）にスポットした。密閉容器にヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７５：２５：１、ｖ／ｖ）の展開溶媒を入れ、当該展開溶媒を用いて前記ＴＬＣプレートを展開した後、当該ＴＬＣプレートを室温で乾燥した。乾燥された当該ＴＬＣプレートにイメージングプレート（富士フィルム社）を１６時間露光させた。露光終了後、イメージングプレートをバイオイメージアナライザー（ＢＡＳ２５００、富士フィルム社）で分析し、前記ＴＬＣプレート上の１，２−ジアシルグリセロールおよびトリグリセライドの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定した（以下、１，２−ジアシルグリセロール部分の展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定値Ｇ、トリアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定値Ｈと記す。）。これらの測定値から、被検物質を添加した場合のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性（測定値Ｇ＋測定値Ｈ／２、以下、活性値４と記す）を算出した。また、被験物質無添加区及びバックグラウンド区についても、前記と同様な方法を用いてＴＬＣプレート上の１，２−ジアシルグリセロールおよびトリグリセライドの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定した（以下、被験物質無添加区の１，２−ジアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定値Ｉ、被験物質無添加区のトリアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定値Ｊ、バックグラウンド区の１，２−ジアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の放射活性を測定値Ｋ、バックグラウンド区のトリアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の放射活性を測定値Ｌと記す。）。これらの測定値から、被験物質無添加区のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性（測定値Ｉ＋測定値Ｊ／２、以下、活性値５と記す。）およびバックグラウンド区のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性（測定値Ｋ＋測定値Ｌ／２、以下、活性値６と記す。）を算出した。得られた活性値から被験物質のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を阻害率（（活性値５−活性値４）×１００／（活性値５−活性値６））として算出した。
その結果、被験物質である公知化合物　Ｎ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（以下、化合物Ａと記すこともある。）における阻害率は１０μＭで約６５％であった。さらに被験物質の供試濃度を変化させながら、前記と同様な方法を用いて各供試濃度における阻害率を算出した。その結果を表６に示した。
以上より、公知化合物ＡはｍＡＴ１２あるいはＦＬＡＧ融合ｍＡＴ１２のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ酵素活性を効果的に阻害することがわかった。
【表６】
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【００７６】
実施例３３　（ヒト肝臓細胞のトリグリセライド合成に対するモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤の抑制効果）
ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞（大日本製薬）を６穴プレート中でコンフルエント状態になるまで培養後、血清を含まないＤ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製、高グルコース含有）で１晩処理することによって飢餓状態にした。この細胞の培地を、終濃度１２．９μＭ［Ｕ−１４Ｃ］Ｄ−グルコース（アマシャム社製、放射活性４ｍＣｉ／Ｌ）を含むＤ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製、低グルコース含有）に交換後、直ちに被験物質（ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。））に溶解、終濃度０．５％　ＤＭＳＯとなるように添加）を添加して３７℃で４時間培養した。尚、被験物質無添加区では、前記の被験物質のＤＭＳＯ溶液に代えてＤＭＳＯのみ添加すること以外は前記と同様な方法を用いた。培養後の細胞をＰＢＳ緩衝液で１回洗浄後、細胞を１ｍｌのヘプタン・イソプロパノール（２：１）で１０分間処理した。細胞中のトリグリセライドを含むヘプタン・イソプロパノール液をピペットで回収し、回収液を遠心エバポレータを用いて乾固した。このようにして得られた乾固物（脂肪画分）をクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）３０μｌに再溶解した。次にこの溶解液をシリカゲル１５０薄層クロマトグラフィー用ガラスプレート（Ｋ５シリカゲル１５０オングストローム、ワットマン社）にスポットした。密閉容器にヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７５：２５：１、ｖ／ｖ）の展開溶媒を入れ、当該展開溶媒を用いて前記ＴＬＣプレートを展開した後、当該ＴＬＣプレートを室温で乾燥した。乾燥された当該ＴＬＣプレートにイメージングプレート（富士フィルム社）を１６時間露光させた。露光終了後、イメージングプレートをバイオイメージアナライザー（ＢＡＳ２５００、富士フィルム社）で分析し、前記ＴＬＣプレート上のトリアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定した。また、被験物質無添加区についても、前記と同様な方法を用いてＴＬＣプレート上のトリアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定した。
その結果、被験物質である公知化合物　Ｎ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（以下、化合物Ａと記すこともある。）添加時のトリグリセライド合成量は、被検物質無添加区における合成量を１００％としたとき、１０μＭで約３１％であった。さらに被験物質の供試濃度を変化させながら、前記と同様な方法を用いて各供試濃度における合成量を算出した結果を表７に示した。
この結果、公知化合物Ａはヒト肝臓細胞のトリグリセライド合成を効果的に阻害することがわかった。従って、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性阻害剤は、肝臓のトリグリセライド合成を阻害することによって、リポ蛋白（ＶＬＤＬ）合成を阻害することができると考えられる。
【表７】
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【００７７】
実施例３４　（マウスへの油脂投与後の血中トリグリセライド上昇に対するモノアシルグリセロール阻害剤の効果）
ＩＣＲマウス（１２週齢、オス、日本エスエルシー）８匹／群を１晩絶食後、Ｎ−［２−（４−ベンジル−２−エチルフェノキシ）エチル］−５，６−ジメチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（以下、化合物Ａ）を懸濁したオリーブ油（ナカライテスク社製）：５ｍｌ／ｋｇを強制経口投与した。被検物質非処理区として、化合物Ａを含まないオリーブ油をマウス８匹に経口投与した。マウスの尾静脈から経時的に１０μＬの血液を採取し、１ｍｌのイソプロパノールに溶解した。イソプロパノール抽出液中のトリグリセライド量を、トリグリセライドテストキットワコー（和光純薬工業）を用いて測定した。化合物Ａを３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した時の血中トリグリセライド量の経時変化を図５に、化合物Ａの投与量を０，１０，３０ｍｇ／ｋｇに変化させた時の３時間後の血中トリグリセライド量を測定した結果を図６に示す。
この結果、公知化合物Ａを脂質と共にマウスに投与した場合、血中のトリグリセライドの上昇が効果的に阻害されることが確認できた。従って、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤は、小腸細胞のトリグリセライド合成を阻害することによって、小腸細胞のリポ蛋白（カイロミクロン）合成・分泌を効果的に阻害し、結果として血中トリグリセライド濃度を低下させることが可能と考えられる。
【００７８】
【発明の効果】
本発明により、簡易な脂肪量増加抑制能力の検定方法等が提供可能となった。
【００７９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＡＴ１２配列をプローブにして、マウスＡｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｍＲＮＡ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔに対するノーザンハイブリダイゼーションを行った。左のレーンから順に、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺の組織ＲＮＡである。
【図２】マウスＡＴ１４配列をプローブにして、マウスＡｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｍＲＮＡ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔに対するノーザンハイブリダイゼーションを行った。左のレーンから順に、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺の組織ＲＮＡである。
【図３】ヒトＡＴ１２配列をプローブにして、ヒトＡｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔに対するノーザンハイブリダイゼーションを行った。左のレーンから順に、食道、胃、小腸、結腸、子宮、胎盤、膀胱、脂肪の組織ＲＮＡである。図の左には、各組織の由来する検体の性別（男性＝Ｍ、女性＝Ｆ）および年齢を示す。
【図４】ヒトＡＴ１４配列をプローブにして、ヒトＡｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔに対するノーザンハイブリダイゼーションを行った。左のレーンから順に、食道、胃、小腸、結腸、子宮、胎盤、膀胱、脂肪の組織ＲＮＡである。図の左には、各組織の由来する検体の性別（男性＝Ｍ、女性＝Ｆ）および年齢を示す。
【図５】マウスを２群（８匹／群）に分け、第１群にはオリーブオイルのみ、第２群にはオリーブオイルと化合物Ａを投与した。投与直後から６時間まで１時間ごとに尾静脈から約１０μｌ採血を行い、血中のトリグリセライド量を定量した。定量結果を、縦軸に血中トリグリセライド濃度（ｍｇ／ｄＬ）、横軸に時間をプロットしたグラフで示した。
【図６】マウスを３群（８匹／群）に分け、第１群にはオリーブオイルのみ、第２群にはオリーブオイル＋化合物Ａ：１０ｍｇ／ｋｇ、第３群にはオリーブオイル＋化合物Ａ：３０ｍｇ／ｋｇを投与した。各群について投与前（０ｈｒ）および投与後３時間（３ｈｒ）に尾静脈から約１０μｌ採血を行い、血中のトリグリセライド量を定量した。測定したトリグリセライド濃度（ｍｇ／ｄＬ）を縦軸に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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