(57)【要約】【課題】テロメレース阻害剤およびテロメレース阻害方法を提供すること。【解決手段】ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を示す二重鎖ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、並びにこれらを形成するＲＮＡおよびポリヌクレオチド、その転写物が上記ＲＮＡ干渉効果を示すＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、これらの１つ以上を含むテロメレース逆転写酵素の阻害剤およびテロメレース阻害剤、およびこれらの１つ以上を用いることを特徴とするテロメレース逆転写酵素の阻害方法およびテロメレース阻害方法の提供により本発明を達成し、さらにこれらの１つ以上を含む医薬組成物、これらの１つ以上からなる試薬キット、および該二重鎖ＲＮＡの同定方法を提供した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１から６のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＲＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＡ）であって、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＢ）であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＢ。
【請求項４】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＣ）であって、配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＣ。
【請求項５】
配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＤ）であって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＤ。
【請求項６】
配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＥ）であって、配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＥ。
【請求項７】
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＦ）であって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＦ。
【請求項８】
配列表の配列番号１から６のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチド
【請求項９】
下記の群から選ばれるいずれか１つの二重鎖ポリヌクレオチドであって、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とする二重鎖ポリヌクレオチド；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
および
（ｉｉｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
下記の群から選ばれるいずれか１つの二重鎖ポリヌクレオチド；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
および
（ｉｉｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
下記の群から選ばれるいずれか１つのポリヌクレオチドであって、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＧ）であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端と配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＧ、
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＨ）であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端と配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＨ、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＩ）であって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端と配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＩ、
（ｉｖ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＪ）であって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端と配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＪ、
（ｖ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＫ）であって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端と配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＫ、
および
（ｖｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＬ）であって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端と配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＬ。
【請求項１２】
下記の群から選ばれるいずれか１つのポリヌクレオチドであって、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＭ）であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端と配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＭ、
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＮ）であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端と配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＮ、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＯ）であって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端と配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＯ、
（ｉｖ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＰ）であって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端と配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＰ、
（ｖ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＱ）であって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端と配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＱ、
および
（ｖｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＲ）であって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端と配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＲ。
【請求項１３】
配列表の配列番号７から１２のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項１４】
下記の群から選ばれるいずれか１つのＤＮＡであって、その転写物がヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするＤＮＡ；
（ｉ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ１）であって、配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端と配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端とが結合したＤＮＡ１、
（ｉｉ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ２）であって、配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端と配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端とが結合したＤＮＡ２、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ３）であって、配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端と配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端とが結合したＤＮＡ３、
（ｉｖ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ４）であって、配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端と配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端とが結合したＤＮＡ４、
（ｖ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ５）であって、配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端と配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端とが結合したＤＮＡ５、
および
（ｖｉ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ６）であって、配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端と配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端とが結合したＤＮＡ６。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１６】
請求項９または１０のいずれか１項に記載の二重鎖ポリヌクレオチド、請求項１１または１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３または１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、および請求項１５に記載のベクターのうちの少なくとも１つを含んでなるテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現阻害剤。
【請求項１７】
請求項９または１０のいずれか１項に記載の二重鎖ポリヌクレオチド、請求項１１または１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３または１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、および請求項１５に記載のベクターのうちの少なくとも１つを含んでなるテロメレース阻害剤。
【請求項１８】
請求項９または１０のいずれか１項に記載の二重鎖ポリヌクレオチド、請求項１１または１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３または１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、および請求項１５に記載のベクターのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現阻害方法。
【請求項１９】
請求項９または１０のいずれか１項に記載の二重鎖ポリヌクレオチド、請求項１１または１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３または１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、および請求項１５に記載のベクターのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするテロメレース阻害方法。
【請求項２０】
請求項９または１０のいずれか１項に記載の二重鎖ポリヌクレオチド、請求項１１または１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３または１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、および請求項１５に記載のベクターのうちの少なくとも１つを有効量含んでなる医薬組成物。
【請求項２１】
請求項９または１０のいずれか１項に記載の二重鎖ポリヌクレオチド、請求項１１または１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３または１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、および請求項１５に記載のベクターのうちの少なくとも１つを有効量含んでなる癌疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項２２】
請求項９または１０のいずれか１項に記載の二重鎖ポリヌクレオチド、請求項１１または１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３または１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、および請求項１５に記載のベクターのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とする癌疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項２３】
請求項９または１０のいずれか１項に記載の二重鎖ポリヌクレオチド、請求項１１または１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３または１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、および請求項１５に記載のベクターのうちの少なくとも１つを含有することを特徴とする試薬キット。
【請求項２４】
テロメレース阻害作用を有する二重鎖ポリヌクレオチドの同定方法であって、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子を発現していない細胞またはヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子およびヒトテロメレースＲＮＡ遺伝子を発現していない細胞を用い、該細胞にヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子発現ベクターおよびヒトテロメレースＲＮＡ遺伝子発現ベクターと共に被検物質である二重鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクションし、ついで、テロメレース活性を測定し、二重鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクションしなかったときと比較してテロメレース活性を低下させた二重鎖ポリヌクレオチドを選択することを特徴とする同定方法。
【請求項２５】
ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子を発現していない細胞またはヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子およびヒトテロメレースＲＮＡ遺伝子を発現していない細胞が、ヒト骨肉腫由来Ｓａｏｓ−２細胞である請求項２４に記載の同定方法。
【請求項２６】
トランスフェクションがリポフェクション法である請求項２４または２５に記載の同定方法。
【請求項２７】
リポフェクション法が、カチオン性リポソームを用いたリポフェクション法である請求項２６に記載の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はテロメレース阻害活性を示す二重鎖ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、並びにこれらを形成するＲＮＡおよびポリヌクレオチドに関する。また、その転写物がテロメレース阻害活性を示すことを特徴とするＤＮＡに関する。さらに、該ＤＮＡを含有するベクターに関する。また、テロメレース逆転写酵素の阻害剤およびテロメレース逆転写酵素の阻害方法に関する。さらに、テロメレース阻害剤およびテロメレース阻害方法に関する。また、該二重鎖ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド、該ＤＮＡおよび該ベクターのうちの少なくとも１つを含んでなる医薬組成物、癌疾患の防止剤および／または治療剤、並びに試薬キットに関する。さらに、該二重鎖ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド、該ＤＮＡおよび該ベクターのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とする癌疾患の防止方法および／または治療方法に関する。また、テロメレース逆転写酵素を発現していない細胞を用いた、テロメレース阻害活性を有する二重鎖ポリヌクレオチドの同定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
テロメレース（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）は染色体のテロメア部分の伸張反応を行う酵素であり、細胞の不死化に関与することが知られている。テロメアは真核細胞の染色体ＤＮＡの末端部分に存在する単純な繰り返し配列であり、染色体の安定性維持に寄与している。細胞分裂においてＤＮＡの複製を司る通常のＤＮＡポリメラーゼではＤＮＡの最末端まで完全に複製が行われないため、細胞分裂に伴いテロメアは短縮される。正常な体細胞では一定回数分裂後に増殖が停止し、細胞の老化あるいは細胞死が生じる。一方、無限増殖性を有する生殖細胞や不死化した癌細胞の大多数では、テロメレースの発現が認められている。細胞分裂に伴い短縮されたテロメアのテロメレースによる伸張が、細胞の無限増殖性獲得機序の１つであると考えられる。
【０００３】
ヒトテロメレース（ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）は、ヒトテロメレース逆転写酵素（ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；以下、ｈＴＥＲＴと略称する。）およびヒトテロメレースＲＮＡ（ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＲＮＡ；以下、ｈＴＲと略称する。）を含む複合体である（非特許文献１）。
【０００４】
テロメレースはテロメア伸張反応において、まずテロメアの相補的配列を有するｈＴＲによりテロメア配列を認識して結合する。ついで、ｈＴＲを鋳型とし、触媒サブユニットであるｈＴＥＲＴによりテロメアの伸張を行う。実験的にｈＴＲとｈＴＥＲＴのみでテロメレース活性が認められたことから、これら２つのサブユニットがテロメレース活性に必要十分な要素と考えられる。また、ｈＴＲは癌のみならず正常組織でも広く発現しているのに対し、ｈＴＥＲＴは癌組織特異的に発現していることから、ｈＴＥＲＴがテロメレース活性の決定因子であると考えられる。
【０００５】
テロメレースが癌細胞の不死化に関与していることから、テロメレース阻害剤の開発が検討されている。例えば、ｈＴＲを標的としたアンチセンス法（非特許文献２および３）、ｈＴＥＲＴのドミナントネガティブフォームを用いた方法（非特許文献４）、リボザイムを用いた方法（非特許文献５）、およびＧ−カドラプレックスＤＮＡインターラクティブコンパウンドを用いた方法（非特許文献６）等によるテロメレースの阻害が報告されている。これらの方法は、何れも欠点があり、実用的な薬剤として開発されているものはほとんど無い。
【０００６】
近年、ＲＮＡを利用して遺伝子の発現を抑制する方法として、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を利用する方法が開発された（非特許文献７および８）。哺乳動物においては、目的遺伝子のｍＲＮＡの部分配列からなる２０ｂｐないし２５ｂｐの短いＲＮＡ（いわゆるセンスＲＮＡ）と該ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）とからなる短い二重鎖ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；以下、ｓｉＲＮＡと略称する。）が、該ｍＲＮＡを効果的に分解し、該遺伝子の発現を阻害することが報告されている（非特許文献７）。ｓｉＲＮＡと同様に、ヘアピン構造を有する短鎖二重鎖ＲＮＡであるショートヘアピンＲＮＡ（以下、ｓｈＲＮＡと略称する。）がＲＮＡ干渉効果を有することが報告されている（非特許文献８）。ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが例えばポリヌクレオチド等により連結され、センスＲＮＡ由来部分とアンチセンスＲＮＡ由来部分が二重鎖を形成するため、ヘアピン様構造を呈する。ＲＮＡ干渉は、アンチセンス法やリボザイム法等の他の遺伝子発現阻害法と比較して、低濃度および高確率で特異的に目的遺伝子の発現を阻害することができる有用な方法である。
【０００７】
テロメレースについても、ｓｉＲＮＡによる抑制が報告されている（非特許文献９）。しかし、該ｓｉＲＮＡはテロメレースの抑制作用が弱く且つその効果は一過性であった。
【０００８】
以下に、本明細書で引用した文献を列記する。
【非特許文献１】ケラー（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  Ｃ．）ら、「トレンズ  イン  バイオケミカル  サイエンシズ（ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、２００２年、第２７巻、ｐ．５７２−５７９。
【非特許文献２】フェン（Ｆｅｎｇ  Ｊ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９５年、第２６９巻、ｐ．１２３６−１２４１。
【非特許文献３】コンドウ（Ｋｏｎｄｏ  Ｓ．）ら、「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．３３２３−３３３０。
【非特許文献４】ハーン（Ｈａｈｎ  Ｗ．Ｃ．）ら、「ネイチャー  メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９９年、第１０巻、ｐ．１１２９−１１３０。
【非特許文献５】ヨコヤマ（Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｙ．）ら、「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９８年、第５８巻、ｐ．５４０６−５４１０。
【非特許文献６】サン（Ｓｕｎ  Ｄ．）ら、「ジャーナル  オブ  メディシナルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第４０巻、ｐ．２１１３−２１１６。
【非特許文献７】エルバシ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４−４９８。
【非特許文献８】パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ  アンド  ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８。
【非特許文献９】コシオレク（Ｋｏｓｃｉｏｌｅｋ  Ｂ．Ａ．）ら、「モレキュラー  キャンサー  セラピューティクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、２００３年、第２巻、第３号、ｐ．２０９−２１６。
【非特許文献１０】サムブルックら編、「モレキュラークローニング、ア  ラボラトリーマニュアル」、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、１９８９年。
【非特許文献１１】村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、丸善株式会社、１９８８年。
【非特許文献１２】エールリッヒ編、「ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用」、ストックトンプレス、１９８９年。
【非特許文献１３】ウルマー（Ｕｌｍｅｒ  Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１。
【非特許文献１４】キム（Ｋｉｍ  Ｎ．Ｗ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９４年、第２６６巻、第５１９３号、ｐ．２０１１−２０１５。
【非特許文献１５】ウェン（Ｗｅｎｚ  Ｃ．）ら、「ザ  エンボ  ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、２００１年、第２０巻、第１３号、ｐ．３５２６−３５３４。
【非特許文献１６】タテマツ（Ｔａｔｅｍａｔｓｕ  Ｋ．）ら、「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９６年、第１３巻、第１０号、ｐ．２２６５−２２７４。
【非特許文献１７】ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ．）ら、「クリニカル  ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年、第４５巻、第１０号、ｐ．１７１８−１７２４。
【非特許文献１８】マエサワ（Ｍａｅｓａｗａ  Ｃ．）ら、「ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第３１巻、第２号、ｐ．Ｅ４−４。
【非特許文献１９】「バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、２００２年、第３２巻、第５号、ｐ．１１５４−１１５６、１１５８、１１６０。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、テロメレースに極めて特異的で且つ有用性のあるテロメレース阻害剤およびテロメレース阻害方法を提供することである。また本発明の目的は、該テロメレース阻害剤を含む医薬組成物、例えば癌疾患の防止剤および／または治療剤を提供することである。さらに、本発明の目的は、該テロメレース阻害剤を用いることを特徴とする癌疾患の防止方法および／または治療方法を提供することである。
【００１０】
【課題解決のための手段】
本発明者らは、上記課題解決のため鋭意検討を重ね、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉を示すことによりテロメレースを阻害し得る二重鎖ポリヌクレオチドを見出して本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、
１．配列表の配列番号１から６のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＲＮＡ、
２．配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＡ）であって、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＡ、
３．配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＢ）であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＢ、
４．配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＣ）であって、配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＣ、
５．配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＤ）であって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＤ、
６．配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＥ）であって、配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＥ、
７．配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＦ）であって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチドＦ、
８．配列表の配列番号１から６のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチド
９．下記の群から選ばれるいずれか１つの二重鎖ポリヌクレオチドであって、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とする二重鎖ポリヌクレオチド；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
および
（ｉｉｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
１０．下記の群から選ばれるいずれか１つの二重鎖ポリヌクレオチド；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
および
（ｉｉｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
１１．下記の群から選ばれるいずれか１つのポリヌクレオチドであって、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＧ）であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端と配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＧ、
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＨ）であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端と配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＨ、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＩ）であって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端と配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＩ、
（ｉｖ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＪ）であって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端と配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＪ、
（ｖ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＫ）であって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端と配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＫ、
および
（ｖｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ループ構造を形成するポリヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＬ）であって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端と配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＬ、
１２．下記の群から選ばれるいずれか１つのポリヌクレオチドであって、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＭ）であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端と配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＭ、
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＮ）であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端と配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＮ、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＯ）であって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端と配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＯ、
（ｉｖ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＰ）であって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端と配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＰ、
（ｖ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＱ）であって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端と配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドＱ、
および
（ｖｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＲ）であって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端と配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドＲ、
１３．配列表の配列番号７から１２のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
１４．下記の群から選ばれるいずれか１つのＤＮＡであって、その転写物がヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするＤＮＡ；
（ｉ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ１）であって、配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端と配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端とが結合したＤＮＡ１、
（ｉｉ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ２）であって、配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端と配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端とが結合したＤＮＡ２、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ３）であって、配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端と配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端とが結合したＤＮＡ３、
（ｉｖ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ４）であって、配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端と配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端とが結合したＤＮＡ４、
（ｖ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ５）であって、配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端と配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端とが結合したＤＮＡ５、
および
（ｖｉ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡ（ＤＮＡ６）であって、配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端と配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端とが結合したＤＮＡ６、
１５．前記１３．または１４のＤＮＡを含むベクター、
１６．前記９．または１０．のいずれかの二重鎖ポリヌクレオチド、前記１１．または１２．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１３．または１４．のいずれかのＤＮＡ、および前記１５．のベクターのうちの少なくとも１つを含んでなるテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現阻害剤、
１７．前記９．または１０．のいずれかの二重鎖ポリヌクレオチド、前記１１．または１２．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１３．または１４．のいずれかのＤＮＡ、および前記１５．のベクターのうちの少なくとも１つを含んでなるテロメレース阻害剤、
１８．前記９．または１０．のいずれかの二重鎖ポリヌクレオチド、前記１１．または１２．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１３．または１４．のいずれかのＤＮＡ、および前記１５．のベクターのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現阻害方法、
１９．前記９．または１０．のいずれかの二重鎖ポリヌクレオチド、前記１１．または１２．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１３．または１４．のいずれかのＤＮＡ、および前記１５．のベクターのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするテロメレース阻害方法、
２０．前記９．または１０．のいずれかの二重鎖ポリヌクレオチド、前記１１．または１２．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１３．または１４．のいずれかのＤＮＡ、および前記１５．のベクターのうちの少なくとも１つを有効量含んでなる医薬組成物、
２１．前記９．または１０．のいずれかの二重鎖ポリヌクレオチド、前記１１．または１２．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１３．または１４．のいずれかのＤＮＡ、および前記１５．のベクターのうちの少なくとも１つを有効量含んでなる癌疾患の防止剤および／または治療剤、
２２．前記９．または１０．のいずれかの二重鎖ポリヌクレオチド、前記１１．または１２．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１３．または１４．のいずれかのＤＮＡ、および前記１５．のベクターのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とする癌疾患の防止方法および／または治療方法、
２３．前記９．または１０．のいずれかの二重鎖ポリヌクレオチド、前記１１．または１２．のいずれかのポリヌクレオチド、前記１３．または１４．のいずれかのＤＮＡ、および前記１５．のベクターのうちの少なくとも１つを含有することを特徴とする試薬キット、
２４．テロメレース阻害作用を有する二重鎖ポリヌクレオチドの同定方法であって、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子を発現していない細胞またはヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子およびヒトテロメレースＲＮＡ遺伝子を発現していない細胞を用い、該細胞にヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子発現ベクターおよびヒトテロメレースＲＮＡ遺伝子発現ベクターと共に被検物質である二重鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクションし、ついで、テロメレース活性を測定し、二重鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクションしなかったときと比較してテロメレース活性を低下させた二重鎖ポリヌクレオチドを選択することを特徴とする同定方法、
２５．ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子を発現していない細胞またはヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子およびヒトテロメレースＲＮＡ遺伝子を発現していない細胞が、ヒト骨肉腫由来Ｓａｏｓ−２細胞である前記２４．の同定方法、
２６．トランスフェクションがリポフェクション法である前記２４．または２５．の同定方法、
２７．リポフェクション法が、カチオン性リポソームを用いたリポフェクション法である前記２６．の同定方法、
からなる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明においては、テロメレースの阻害に有用なポリヌクレオチドを提供する。本明細書中におけるポリヌクレオチドとは、３’，５’−リン酸ジエステル結合により２個を超えるヌクレオチドが連鎖している直鎖状ポリマーを意味し、リン酸ジエステル結合によって繋がっている２個ないし１０数個程度のヌクレオチドからなる直鎖状核酸断片も含まれる。
【００１３】
本発明に係るポリヌクレオチドの１つの態様は、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの部分配列からなるＲＮＡおよび該ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡである。本発明に係るＲＮＡとしては、好ましくは配列表の配列番号１から６のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＲＮＡが挙げられる。
【００１４】
本発明に係るＲＮＡにはそれぞれ、そのＲＮＡの３’末端に、オーバーハング配列と呼ばれる１個ないし数個の塩基配列からなるヌクレオチドを結合させることが好ましい。オーバーハング配列は、その作用の１つとして、ＲＮＡをヌクレアーゼから保護する作用を有する。オーバーハング配列は、該ＲＮＡのＲＮＡ干渉効果を阻害しない限りにおいて特に制限されず、好ましくは１個ないし１０個、より好ましくは１個ないし４個、さらに好ましくは２個のヌクレオチドからなるものをいずれも用いることができる。具体的には、デオキシチミジル酸からなる配列（例えばＴＴ）、ウリジル酸からなる配列（例えばＵＵ）、デオキシチミジル酸に続いて任意のヌクレオチドが結合した配列（例えばＴＮ）といった配列を例示できる。合成を安価に行えることおよびヌクレアーゼ耐性がより強いことから、より好ましくは、２つのデオキシチミジル酸からなる配列をオーバーハング配列として使用する。オーバーハング配列は、本発明に係るＲＮＡの３’末端のリボース３’水酸基部位に、ジエステル結合によって結合させる。
【００１５】
本発明に係るＲＮＡのそれぞれにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドからなるオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲に包含される。かかるポリヌクレオチドとしては例えば、配列表の配列番号１から６のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドからなるオーバーハング配列、好ましくは２つのデオキシチミジル酸からなる配列を結合させてなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１６】
これらポリヌクレオチドの特徴の１つは、該ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに含まれるＲＮＡの相補的な塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することである。
【００１７】
例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせて得た二重鎖ポリヌクレオチドは、テロメレースを、二重鎖ポリヌクレオチドの用量依存的に阻害した。すなわち、この二重鎖ポリヌクレオチドはｈＴＥＲＴ遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を示し、該遺伝子の発現を阻害することによりテロメレースを阻害したと考えられる。本発明におけるテロメレースの阻害とは、テロメレース機能の部分的消失または完全な消失を意味する。
【００１８】
同様に、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせて得た二重鎖ポリヌクレオチドも、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を示し、テロメレースを阻害した。配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせて得た二重鎖ポリヌクレオチドもまた、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を示し、テロメレースを阻害した。
【００１９】
上記ＲＮＡおよびポリヌクレオチドは、例えば公知の化学合成法を用いて調製することができる。例えば、市販のＲＮＡ合成試薬（Ｐｒｏｌｉｇｏ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ等）を用いてＤＮＡ／ＲＮＡ合成機により調製可能である。
【００２０】
テロメレースの阻害は、１つの態様として、本発明に係るＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドと、該ＲＮＡに相補的な塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に１個ないし数個のヌクレオチドを結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチドにより達成可能である。該二重鎖ポリヌクレオチドは、これら２つのポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることにより得ることができる。ハイブリダイゼーションは、これら２つのポリヌクレオチドを慣用の方法でアニーリングすることにより実施可能である。アニーリングは、１例として、本明細書の実施例に記載した方法により行うことができる。
【００２１】
本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドは、例えば下記の群から選ばれる二重鎖ポリヌクレオチドである（図１参照。）：（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３’末端に２つのデオキシチミジル酸を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド。
【００２２】
テロメレースの阻害はまた、１つの態様として、本発明に係るＲＮＡを含みヘアピン構造を有する二重鎖を形成し得るポリヌクレオチドにより達成可能であると考える。本発明に係るＲＮＡ、該ＲＮＡに相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、およびこれら２つのＲＮＡを連結し且つループ構造を形成するポリヌクレオチドが結合してなるポリヌクレオチドであって、ｈＴＥＲＴ遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有するポリヌクレオチドも、本発明の範囲に包含される。かかるポリヌクレオチドは、好ましくは本発明に係るＲＮＡの３’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端と該ＲＮＡに相補的な塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチドであることが望ましい。あるいは、本発明に係るＲＮＡの５’末端とループ構造を形成するポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらにループ構造を形成するポリヌクレオチドの５’末端と該ＲＮＡに相補的な塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチドであってもよい。ループ構造を形成するポリヌクレオチドとは、２つのＲＮＡの間に存在して両ＲＮＡを連結でき、それ自体がループ構造を形成するものを意味する。非特許文献８に記載された配列を参考にして設計するとよい。好ましくは４個ないし２３個、より好ましくは４個ないし８個のヌクレオチドからなるものが望ましい。例えば、ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ（Ａｍｂｉｏｎ社またはＯｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ社）、ＡＡＣＧＴＴ、ＴＴＡＡ、ＣＡＡＧＣＴＴＣ等の配列を挙げることができる。ヘアピン構造を有する二重鎖の形成は、センスＲＮＡ由来部分とアンチセンスＲＮＡ由来部分とを慣用の方法でアニーリングすることにより実施可能である。
【００２３】
かかるポリヌクレオチドとしてより具体的には、下記の群から選ばれるポリヌクレオチドが例示できる：（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端と配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端と配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端と配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチド；（ｉｖ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端と配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチド；（ｖ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端と配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端とが結合したポリヌクレオチド；および（ｖｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡが結合してなるポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの５’末端と配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡの３’末端とが結合したポリヌクレオチド。
【００２４】
本発明に係るＲＮＡ、ポリヌクレオチドおよび二重鎖ポリヌクレオチドは、上記のものに制限されず、その機能を損なわない程度の１塩基ないし数塩基程度の塩基の付加、欠失、置換等を有するもの、その他一般的な修飾を受けたものであってもよい。塩基の付加、欠失、置換等を導入する手段は自体公知であり、例えば成書に記載の方法（非特許文献１０、１１および１２）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（非特許文献１３）を利用することもできる。
【００２５】
テロメレースの阻害は、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを用いることにより達成できる。例えば、これらを細胞に導入することにより実施可能である。細胞への導入は、公知の手法により実施可能であるが、好ましくはリポフェクション法によりトランスフェクションすることが、導入効率、再現性および簡便性等の観点から望ましい。リポフェクションに用いるリポソームと呼ばれる脂質小胞としては、カチオン性のものが好ましい。カチオン性リポソームとしては、リポフェクトアミン、リポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等が例示できる。あるいは、トランスメッセンジャー（ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ）（ＱＩＡＧＥＮ）、ｓｉＲＮＡトランスフェクションキットｊｅｔＳＩ（Ａｍｂｉｏｎ）、およびジーンサイレンサーｓｉＲＮＡトランスフェクションリエージェント（ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）等の市販の試薬を用いてトランスフェクションすることもできる。
【００２６】
テロメレースの阻害はまた、本発明に係るポリヌクレオチドまたはＲＮＡを細胞内でＤＮＡから転写させることにより達成できる。すなわち、その転写物がテロメレースの阻害を示すＤＮＡも本発明に含まれる。ここで、転写物とは、コード鎖に存在する本発明のＤＮＡが、細胞内で転写されることにより生成するＲＮＡを意味する。本ＤＮＡとしては、本発明に係るポリヌクレオチドまたはＲＮＡをコードするＤＮＡであればよく、転写開始点（いわゆる＋１サイト）がプリン塩基（ＧまたはＡ）となるように設計する。本ＤＮＡとその相補鎖からなる二重鎖ＤＮＡとして用いてもよいし、本ＤＮＡの相補鎖のみを鋳型ＤＮＡとして用いることもできる。
【００２７】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはＲＮＡの細胞内での転写は、本発明に係るＤＮＡをベクターに挿入し、得られたベクターを慣用の方法（非特許文献１０等）で細胞内にトランスフェクションすることにより達成できる。
【００２８】
ベクターＤＮＡは、導入する細胞の種類等により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等が挙げられる。組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等とを構成要素とし、これらを自体公知の方法により組み合わせて作製する。ベクターＤＮＡに目的の遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的の遺伝子配列に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
【００２９】
本発明に係るポリヌクレオチドのコード鎖となるＤＮＡとしてより具体的には、例えば下記の群から選ばれるＤＮＡであって、その転写物がヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を有することを特徴とするＤＮＡを例示できる：（ｉ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡであって、配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端と配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端とが結合したＤＮＡ；（ｉｉ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡであって、配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端と配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端とが結合したＤＮＡ；（ｉｉｉ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡであって、配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端と配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端とが結合したＤＮＡ；（ｉｖ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡであって、配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端と配列番号１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端とが結合したＤＮＡ；（ｖ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡであって、配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端と配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端とが結合したＤＮＡ；および（ｖｉ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡおよび配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡが結合してなるＤＮＡであって、配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５’末端と４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの３’末端とが結合し、さらに４個ないし２３個のヌクレオチドからなるＤＮＡの５’末端と配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３’末端とが結合したＤＮＡ。
【００３０】
本発明に係るポリヌクレオチドのコード鎖となるＤＮＡは、Ｕ６あるいはＨ１といったＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写を行うタイプのベクターに組み込んだ場合、転写を終結させるために転写される側の３’末端に５塩基ないし６塩基のｐｏｌｙ（Ｔ）を結合することが好ましい。さらに、ベクターによってはｐｏｌｙ（Ｔ）の後ろに、さらなる塩基配列、例えばＧＧＡＡといった塩基配列を結合して用いることが好ましい。
【００３１】
本発明に係るポリヌクレオチドのコード鎖となるＤＮＡを用いたテロメレースの阻害は、該ＤＮＡを細胞内に導入することにより達成できる。該ＤＮＡの細胞への導入については既報（非特許文献８）を参照し、例えばｐＳＨＡＧ−１ベクターシステムにより行なうことができる。あるいは、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒシリーズ（Ａｍｂｉｏｎ社）、ｐＳＵＰＥＲ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社）や、レトロウイルス用のｐＳＵＰＥＲ−Ｒｅｔｒｏ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社）等が使用可能であるがこれらに制限されることはない。
【００３２】
本発明に係るＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば配列表の配列番号７から１２のいずれか１に記載の塩基配列からなるＤＮＡが好ましく例示できる。
【００３３】
本発明に係るＲＮＡをコードするＤＮＡを用いたテロメレースの阻害は、該ＤＮＡを挿入したベクターと、該ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡをコードするＤＮＡを挿入したベクターとを細胞内にトランスフェクションすることにより細胞内で転写される２本のＲＮＡにより達成できると考える。あるいは、本発明に係るＲＮＡをコードするＤＮＡと該ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡをコードするＤＮＡとを挿入したベクターを用いて同様の効果を得ることも可能である。
【００３４】
このように上記ＤＮＡおよび該ＤＮＡを含むベクターも、テロメレースの阻害に使用可能であり、これらも本発明の範囲に包含される。
【００３５】
本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉によりｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを破壊することができるため、本発明においては上記二重鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡおよびベクターのうちの少なくとも１つを含んでなるテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現阻害剤およびこれらのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現阻害方法を提供可能である。
【００３６】
本発明においてはまた、上記二重鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡおよびベクターのうちの少なくとも１つを含んでなるテロメレース阻害剤およびこれらのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするテロメレース阻害方法を提供可能である。
【００３７】
さらに、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡおよびベクターは、テロメレースを阻害することに基づく医薬、好ましくは抗腫瘍剤、さらに好ましくは、悪性腫瘍の治療のための医薬の有効成分として有用である。テロメレース阻害作用の確認は、例えばトラップ法（ＴＲＡＰ法：非特許文献１４）、ダイレクトテロメレースアッセイ（Ｄｉｒｅｃｔ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ：非特許文献１５）、ストレッチＰＣＲアッセイ（Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ：非特許文献１６）、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ：非特許文献１７）、ＴＲＥアッセイ（非特許文献１８）、ラピッドダイレクトテロメレースアッセイ（ｒａｐｉｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ：非特許文献１９）等の方法により行うことができる。あるいは、パディソンらの方法（非特許文献８）や本明細書の実施例に具体的に記載した方法等に従って確認することも可能である。
【００３８】
本発明に係る医薬は、本発明に係る上記二重鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡおよびベクターのうちの少なくとも１つを有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体または賦形剤を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。
【００３９】
本発明に係る医薬組成物は、テロメレースの作用に基づく疾患の防止剤および／または治療剤として使用することができる。また、当該疾患の防止方法および／または治療方法に使用することができる。テロメレースの作用に基づく疾患としては、例えば癌疾患が挙げられる。
【００４０】
テロメレースが腫瘍の種類に関わらず、大多数の腫瘍において発現が確認されていることから、本発明に係る医薬組成物は多様な種類の癌細胞の増殖阻害に有効であると考えられる。したがって、本発明に係る医薬組成物を癌疾患に使用する場合には、対象となる腫瘍の種類は特に限定されず、固形腫瘍または非固形腫瘍のいずれにも適用可能である。固形腫瘍または非固形腫瘍の種類も特に限定されず、テロメレースを発現しているあらゆる種類の腫瘍において適用できる。例えば、胃癌、食道癌、大腸癌、小腸癌、十二指腸癌、肺癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、口腔癌、骨癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、脳腫瘍、神経芽腫等の固形腫瘍、あるいは白血病や悪性リンパ腫等の非固形腫瘍等を挙げることができるが、本発明に係る医薬組成物の適用対象はこれら疾患に限定されない。
【００４１】
一方、テロメレースは正常体細胞では生殖細胞を除いてほとんど発現していない。さらにｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡはｍＲＮＡのみに作用するため、ゲノム遺伝子には全く影響を及ぼさないと考えられる。これらから、本発明に係る医薬および医薬組成物は副作用が少ないと考えられ、この観点からも有用である。
【００４２】
必要な用量範囲は、特に限定されないが、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡおよびベクターの有効性、投与形態、疾病の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断により適宜選択することが望ましい。具体的には、適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり０．１μｇ乃至１００μｇの範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１〜４回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００４３】
処方は投与形態に適したものを選択すればよく、該処方は当業者によく知られたものを用いればよい。また、処方するときには、これらを単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、他のテロメレース阻害剤または抗腫瘍用医薬の有効成分等を配合してもよい。
【００４４】
本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ベクターおよび医薬組成物は、好ましくは遺伝子治療剤として用いることができる。この場合、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびＤＮＡのうちの少なくとも１つを注射により直接投与する非ウイルス性のトランスフェクション法、あるいはウイルスベクターを利用したトランスフェクション方法のいずれも適用することができる。
【００４５】
非ウイルス性のトランスフェクション法においては、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびＤＮＡのうちの少なくとも１つを注射により直接投与する方法のほか、これらをリポソーム等のリン脂質小胞に封入し、そのリポソームを投与する方法が推奨される。リポソームとしては、カチオン性リポソームの使用がより好ましい。
【００４６】
ウイルスベクターを使用するトランスフェクション法において、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡを組込んでトランスフェクションに使用するベクターとしては、好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等のＤＮＡウイルスベクター、あるいはＲＮＡウイルスベクターが挙げられる。これらウイルスベクターを用いることにより効率良い投与が可能である。さらに、ウイルスベクターを用いるトランスフェクション法においても、該ベクターをリポソームに封入して、そのリポソームを投与する方法が推奨される。リポソームとしては、カチオン性リポソームの使用がより好ましい。
【００４７】
投与形態は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与形態を選択する。例えば、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等に投与することもできる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に直接投与することが好ましい。
【００４８】
医薬形状は投与形態に応じて選択することができ、遺伝子治療剤として用いる場合は、一般的には、注射剤、点滴剤、あるいはリポソーム製剤として調製することが好ましい。そのほか、シクロデキストリン等の包接体、溶液剤、けん濁剤、脂肪乳剤、散剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤丸剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤等の作製も可能である。しかし、本発明に係る医薬の形態はこれらに限定されない。
【００４９】
製剤化にあたっては、その形態に応じて適切な製剤用添加物を用いることができ、常法に従って製剤化することができる。
【００５０】
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルム等）に溶解した溶液に、目的とする物質を溶媒に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
【００５１】
シクロデキストリン包接化は、例えば目的とする物質を溶媒に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。このとき、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
【００５２】
注射用の溶液剤は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
【００５３】
けん濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、油類を使用して製造できる。
【００５４】
脂肪乳剤化は、例えば目的とする物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油等の植物油、ＭＣＴ等）、乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖等）が例示される。
【００５５】
散剤、丸剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等についても、通常用いられる方法により調製可能である。
【００５６】
本発明においてはさらに、テロメレースを阻害する二重鎖ポリヌクレオチドの同定方法を提供する。本発明に係る同定方法は、ｈＴＥＲＴ遺伝子は発現していないがｈＴＲ遺伝子（配列番号１６）を発現している細胞、またはｈＴＥＲＴ遺伝子およびｈＴＲ遺伝子の両方を発現していない細胞を用い、該細胞にｈＴＥＲＴ遺伝子発現ベクターおよびｈＴＲ遺伝子発現ベクターと共に被検物質である二重鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクションし、ついで、テロメレース活性を測定することを１つの特徴とする。ｈＴＥＲＴ遺伝子は発現していないがｈＴＲ遺伝子を発現している細胞としては、例えばヒト骨肉腫由来Ｓａｏｓ−２細胞が挙げられるが、本発明に係る同定方法に使用できる細胞はこれに制限されることはない。ｈＴＥＲＴ遺伝子は発現していないがｈＴＲ遺伝子を発現している細胞を用いる場合、ｈＴＲ遺伝子発現ベクターは導入しなくてもよいが、好ましくはｈＴＲ遺伝子発現ベクターも導入することが推奨される。ｈＴＲ遺伝子発現ベクターに対するｈＴＥＲＴ遺伝子発現ベクターの導入比は好ましくは１：０．０１ないし１：１０である。導入比は、用いる細胞によっても異なり、より適切な導入比を実験により決定して用いることができる。トランスフェクションは、慣用のトランスフェクション法（非特許文献１０等）により実施できるが、好ましくはリポフェクションによる。リポフェクションは、リポフェクチン、リポフェクトアミン、セルフェクチン、ＤＭＲＩＥ−Ｃまたはスーパーフェクト等の市販の試薬を用いることにより行うことができるが、好ましくはカチオン性リポソームを用いることが望ましい。カチオン性リポソームとしては、リポフェクトアミン、リポフェクトアミン２０００およびオリゴフェクトアミン等が挙げられる。
【００５７】
ｈＴＥＲＴ遺伝子は発現していないがｈＴＲ遺伝子を発現している細胞、またはｈＴＥＲＴ遺伝子およびｈＴＲ遺伝子の両方を発現していない細胞に、ｈＴＥＲＴ遺伝子発現ベクターおよびｈＴＲ遺伝子発現ベクターと共に被検物質である二重鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクションすることにより構築したかかる測定系は、ｈＴＥＲＴ遺伝子が導入された細胞のみがテロメレース活性を示し、さらにその細胞には二重鎖ポリヌクレオチドも導入されている可能性が極めて高いため、トランスフェクション効率の影響をあまり受けずに二重鎖ポリヌクレオチドの効果を評価することができる。ｈＴＲ遺伝子およびｈＴＥＲＴ遺伝子の発現用ベクターはそれぞれ、通常用いられる哺乳動物用遺伝子発現ベクターにｈＴＥＲＴ  ｃＤＮＡ（配列番号１３）およびｈＴＲ  ｃＤＮＡ（配列番号１６）を挿入すること等により作製すればよい。
【００５８】
被検物質である二重鎖ポリヌクレオチドは、ｈＴＥＲＴ遺伝子の塩基配列に基づいて、ＲＮＡ干渉効果を有するＲＮＡに特有の配列を含む領域を選択し、該領域の配列から設計し、公知のヌクレオチド合成方法により作製することができる。ｈＴＥＲＴ遺伝子の配列は配列表の配列番号１３に記載された配列である。ＲＮＡ干渉効果を有するＲＮＡに特有の配列は既に広く知られている。例えば、ＡＡまたはＣＡで始まる領域で、ＧＣ含量が３０％から７０％、好ましくは５０％となる配列である。また、各塩基の偏りあるいはＧまたはＣが連続した配列が極力少ない配列が好ましい。
【００５９】
本発明に係る同定方法において、二重鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクションしなかったときと比較してテロメレース活性を低下させた二重鎖ポリヌクレオチドを選択することにより、所望の二重鎖ポリヌクレオチドを取得することができる。テロメレース活性の測定は、例えばトラップ法（非特許文献１４）、ダイレクトテロメレースアッセイ（非特許文献１５）、ストレッチＰＣＲアッセイ（非特許文献１６）、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ（非特許文献１７）、ＴＲＥアッセイ（非特許文献１８）、ラピッドダイレクトテロメレースアッセイ（非特許文献１９）等の方法により実施できる。
【００６０】
本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡおよびベクターはいずれも、それ自体を単独で、試薬等として使用できる。例えば、テロメレースを阻害するための試薬として用いることができる。該試薬はテロメレースが関与する細胞増殖や細胞老化のメカニズム、およびテロメレースの作用に基づく疾患等に関する基礎的研究等に有用である。これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。なお、製剤化にあたっては、各性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。また本発明は、これらのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットを提供する。これら試薬および試薬キットは、テロメレースの作用に基づく疾患の診断に使用できる。例えば、癌患者から癌細胞を採取し、該細胞を培養して二重鎖ポリヌクレオチドを含むキットで繰り返し処理したときに細胞死が観察されれば、テロメレース阻害剤が有効な患者と判定することができる。これらはまた、本発明に係る同定方法の陽性対照として使用することができる。
【００６１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【００６２】
【実施例１】
二重鎖ポリヌクレオチドは、ｈＴＥＲＴ遺伝子の塩基配列（配列番号１３）に基づいて設計した。まず、該遺伝子の塩基配列においてＡＡまたはＣＡで始まる部分から、各塩基の偏りあるいはＧまたはＣが連続した配列が極力少ない配列を選ぶことにより、センスＲＮＡの塩基配列を設計した。また、センスＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡを設計した。ついで、二重鎖ポリヌクレオチドのヌクレアーゼからの保護を目的とし、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡのそれぞれの３’末端に、２つのデオキシチミジル酸からなるオーバーハング配列を結合したセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを設計した。設計したセンスポリヌクレオチドとアンチセンスポリヌクレオチドの双方を、ＲＮＡ合成装置により合成した。
【００６３】
センスポリヌクレオチドとアンチセンスポリヌクレオチドとをアニーリングして二重鎖ポリヌクレオチドを調製した。まず、それぞれ５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）に希釈した後、各試料３０μｌずつと５×アニーリングバッファー（５００ｍＭ  酢酸カリウム、１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム）１５μｌを混合した（総量７５μｌ）。ついで、混合液を９０℃で１分間加熱し、遠心処理後に３７℃で６０分間静置した。この操作により、ポリヌクレオチドは二本鎖を形成し、最終濃度は２０μＭ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）になった。
【００６４】
作成した二重鎖ポリヌクレオチドの例を図１に示した。ＴＥＲＴ０２は、配列番号１および２に記載した各塩基配列からなる２つのＲＮＡの各３’末端に２つのデオキシチミジル酸が結合したポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチドである。ＴＥＲＴ０７は、配列番号３および４に記載した各塩基配列からなる２つのＲＮＡの各３’末端に２つのデオキシチミジル酸が結合したポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチドである。ＴＥＲＴ０８は、配列番号５および６に記載した各塩基配列からなる２つのＲＮＡの各３’末端に２つのデオキシチミジル酸が結合したポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチドである。配列番号１、配列番号３および配列番号５に記載の塩基配列からなるＲＮＡはそれぞれ、ｈＴＥＲＴ  ｃＤＮＡ配列（配列番号１３）の第１０４２−１０６０番目、第１７８９−１８０７番目および第１８１２−１８３０番目の部分配列から設計されたＲＮＡである。また配列番号２、配列番号４、および配列番号６に記載の塩基配列からなるＲＮＡはそれぞれ、配列番号１、配列番号３および配列番号５に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡである。
【００６５】
【実施例２】
実施例１で作製した二重鎖ポリヌクレオチドから、テロメレース阻害作用を示す二重鎖ポリヌクレオチドを選択するために、ｈＴＥＲＴ遺伝子を発現しておらずｈＴＲ遺伝子のみを発現しているヒト骨肉腫由来Ｓａｏｓ−２細胞を用い、ｈＴＥＲＴ遺伝子発現ベクターおよびｈＴＲ遺伝子発現ベクターと共に二重鎖ポリヌクレオチドとをトランスフェクションし、テロメレース活性を測定する測定系を構築した。この測定系を用いて、テロメレース阻害作用を示す二重鎖ポリヌクレオチドを選択した。
【００６６】
まず、Ｓａｏｓ−２細胞を２×１０５細胞／ｍｌに調製し、２４ウェルプレートに１ウェル当たり０．５ｍｌずつ播種し、３７℃で一晩（１２時間程度）培養した。ついで、ｈＴＥＲＴ遺伝子発現ベクターおよびｈＴＲ遺伝子発現ベクターと共に二重鎖ポリヌクレオチドを、１ウェル当たり２．５μｌのリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と０．１ｍｌの無血清培地中で混合し、細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に細胞をトリプシン処理し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄して回収した。陰性対象として、上記二重鎖ポリヌクレオチドの代わりに既知の遺伝子と相同性を持たないスクランブル二重鎖ポリヌクレオチド（配列番号１４および１５に記載の各塩基配列からなる２つのＲＮＡのそれぞれの３’末端に２つのデオキシチミジル酸が結合したポリヌクレオチドからなる二重鎖ポリヌクレオチド）を用いて同様に細胞を処理した。
【００６７】
回収した細胞中のテロメレース活性は、ＴＲＡＰｅｚｅ  ＸＬ  Ｋｉｔ（Ｏｎｃｏｒ）を用い、キットの使用説明書に従って測定した。まず、キットに付属の１×ＣＨＡＰＳ溶解バッファー１２０μｌに細胞をけん濁し、氷上で２０分間インキュベーション後に、４℃にて１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心処理し、上清を回収した。上清中の蛋白質濃度を定量後、１反応当り２００ｎｇになるように反応液中に加え、テロメレースによるオリゴＤＮＡの伸張反応を３０℃で３０分間行った。その後、反応液中に含まれるプライマー対でＰＣＲ反応を行い、テロメレース反応産物を増幅し、内部標準との比を算出して、テロメレース活性の強度を測定した。検出はプライマーに標識されたフルオレセイン（テロメレース反応産物の指標。）およびスルホローダミン（内部標準の指標。）の各蛍光強度を分光蛍光光度計を用いて計測することにより行った。
【００６８】
０．５μｇ／ｗｅｌｌのｈＴＥＲＴ遺伝子発現ベクター、０．５４μｇ／ｗｅｌｌのｈＴＲ遺伝子発現ベクター、および２０ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌまたは２ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌの二重鎖ポリヌクレオチドを用いて上記検討を行ったところ、合成した二重鎖ポリヌクレオチドのうち、ＴＥＲＴ０２、ＴＥＲＴ０７およびＴＥＲＴ０８がテロメレース阻害効果を示した（図２）。
【００６９】
さらに、ＴＥＲＴ０２およびＴＥＲＴ０８について、０．１２５μｇ／ｗｅｌｌのｈＴＥＲＴ遺伝子発現ベクター、０．７５μｇ／ｗｅｌｌのｈＴＲ遺伝子発現ベクターを用い、二重鎖ポリヌクレオチドの濃度を２０ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌから０．２ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌの範囲で変化させて同様に検討したところ、いずれも二重鎖ポリヌクレオチドの濃度依存的にテロメレースを阻害することが明らかになった（図３）。
【００７０】
一方、加熱してテロメレースの酵素活性を失活させた試料では二重鎖ポリヌクレオチドを添加しなくてもテロメレース活性が全く検出されなかったことから、ここで用いた測定系がテロメレース活性を適切に反映していることが確認できた（図２および図３）。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対するＲＮＡ干渉効果によりテロメレースの阻害を達成できる。
【００７２】
本発明はアンチセンス法やリボザイム法等の他の遺伝子発現阻害法と比較して、低濃度および高確率で特異的にヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を阻害でき、その結果テロメレースを阻害することができる。また、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは短鎖ポリヌクレオチドであるため、合成が容易であり、安価に合成できる。
【００７３】
本発明によれば、テロメレースの作用に基づく疾患の防止および／または治療が可能である。テロメレースが癌の種類を問わずほとんどの癌細胞で発現しており、生殖細胞以外の正常体細胞ではほとんど発現していないことから、例えば本発明は多様な種類の癌疾患の防止および／または治療に有効であると考えられる。
【００７４】
このように本発明は、テロメレースが関与する細胞増殖や細胞老化のメカニズムおよびテロメレースの作用に基づく疾患等に関する基礎的研究等に有用である。さらにテロメレースの作用に基づく疾患、例えば癌疾患の防止および／または治療に非常に有用である。
【００７５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子（配列番号１３）の配列に基づいて設計されたＲＮＡ。
配列番号２：配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる設計されたＲＮＡ。
配列番号３：ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子（配列番号１３）の配列に基づいて設計されたＲＮＡ。
配列番号４：配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる設計されたＲＮＡ。
配列番号５：ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子（配列番号１３）の配列に基づいて設計されたＲＮＡ。
配列番号６：配列番号５に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる設計されたＲＮＡ。
配列番号７：ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子（配列番号１３）の配列に基づいて設計されたＤＮＡ。
配列番号８：配列番号７に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる設計されたＤＮＡ。
配列番号９：ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子（配列番号１３）の配列に基づいて設計されたＤＮＡ。
配列番号１０：配列番号９に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる設計されたＤＮＡ。
配列番号１１：ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子（配列番号１３）の配列に基づいて設計されたＤＮＡ。
配列番号１２：配列番号１１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる設計されたＤＮＡ
配列番号１４：全ての遺伝子に対して相同性のない塩基配列からなる設計されたＲＮＡ。
配列番号１５：配列番号１４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる設計されたＲＮＡ。
【００７６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドの配列を示す図である。
【図２】ＴＥＲＴ０２、ＴＥＲＴ０７およびＴＥＲＴ０８の３種類の二重鎖ポリヌクレオチドがそれぞれ、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびｈＴＲ遺伝子と共に該二重鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクションしたＳａｏｓ−２細胞において、テロメレースを阻害したことを示す図である。テロメレース活性は、テロメレース活性測定における内部標準であるスルホローダミンの蛍光強度（バックグランドを減算）に対する、テロメレースにより付加されたテロメア配列の指標であるフルオレセインの蛍光強度（バックグランドを減算）の比（△ＦＬ／△Ｒ）で示した。図中、ＤＮＡ（−）およびＲＮＡ（−）はそれぞれ、ｈＴＥＲＴ遺伝子および二重鎖ポリヌクレオチドを無添加のときのテロメレース活性を示す。また、ＲＮＡ（−）Ｈｅａｔは、二重鎖ポリヌクレオチドを添加せずに試料を加熱してテロメレースの酵素活性を失活させたときのテロメレース活性を示す。スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）は既知の遺伝子と相同性を持たない二重鎖ポリヌクレオチドであり、陰性対象として用いた。
【図３】ＴＥＲＴ０２およびＴＥＲＴ０８の２種類の二重鎖ポリヌクレオチドがそれぞれ、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびｈＴＲ遺伝子と共に該二重鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクションしたＳａｏｓ−２細胞において、テロメレースを二重鎖ポリヌクレオチドの濃度依存的に阻害したことを示す図である。テロメレース活性は、テロメレース活性測定における内部標準であるスルホローダミンの蛍光強度（バックグランドを減算）に対する、テロメレースにより付加されたテロメア配列の指標であるフルオレセインの蛍光強度（バックグランドを減算）の比（△ＦＬ／△Ｒ）で示した。図中、ＲＮＡ（−）は、ｈＴＥＲＴ遺伝子および二重鎖ポリヌクレオチドを無添加のときのテロメレース活性を示す。また、ＲＮＡ（−）Ｈｅａｔは、二重鎖ポリヌクレオチドを添加せずに試料を加熱してテロメレースの酵素活性を失活させたときのテロメレース活性を示す。スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）は既知の遺伝子と相同性を持たない二重鎖ポリヌクレオチドであり、陰性対象として用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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