(57)【要約】【課題】核酸が精製された溶液を調製することなく、核酸吸着膜に吸着させたまま、核酸増幅反応が適応でき、さらに同時に核酸増幅反応の進行を検出することができる核酸検出用器具を提供することにある。さらに、この器具を含んだ核酸検出用キットを提供する。【解決手段】筒状の構造体の一端に核酸吸着膜を設置し、もう一方の端を、吸引／排出機器に接続可能としておく。その核酸検出用筒状体と、核酸増幅反応容器とを組み合わせて用いて、検体中の核酸を、核酸吸着膜に吸着させたまま、核酸増幅反応を適応し、同時に核酸増幅反応の進行を光学的手段を用いて検出する。医療や食品工業の現場で簡単に遺伝子の変異、有害菌の検出を行うことができる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
両端が開放された筒状体において、核酸を吸着する膜がその筒状体の一端の開放部を覆うように設置されていて、該膜が核酸増幅反応容器中の核酸増幅反応溶液に接触して、かつ、該筒状体が該核酸増幅反応容器に密閉されるように収納可能であり、さらに収納された状態で核酸増幅反応が可能である核酸検出用筒状体。
【請求項２】
膜が設置されていないもう一方の開放部が、膜を通過した溶液の吸引あるいは排出が可能な吸引／排出手段に接続可能である請求項１記載の核酸検出用筒状体。
【請求項３】
核酸吸着膜が不織布である請求項１または請求項２に記載の核酸検出用筒状体。
【請求項４】
筒状体の膜が核酸増幅反応容器中の核酸増幅反応溶液の液面によって形成される水平面に対して、傾斜をなすように設置された請求項１〜請求項３のいずれかに記載の核酸検出用筒状体。
【請求項５】
核酸増幅反応を行う場合に生じる気泡を上部へ移送するための溝が、外側部分に刻まれている請求項１〜請求項４のいずれかに記載の核酸検出用筒状体。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸検出用筒状体と、核酸増幅反応容器とからなる核酸検出用器具であって、その筒状体の核酸吸着膜が核酸増幅反応容器中の核酸増幅反応溶液に接触して、かつ、該筒状体が核酸増幅反応容器に密閉されるように収納可能であり、さらに収納された状態で核酸増幅反応が可能であり、光学的性質の変化を用いてその核酸増幅反応の検出が可能である核酸検出用器具。
【請求項７】
核酸増幅反応溶液が核酸インタカレーターを含み、核酸増幅反応に伴う蛍光強度の変化が検出可能である請求項６記載の核酸検出用器具。
【請求項８】
核酸増幅反応に伴って増幅した核酸に対して、相補的な核酸を含むオリゴ核酸をハイブリダイズさせ、それに伴う蛍光強度の変化が検出可能である請求項６記載の核酸検出用器具。
【請求項９】
核酸増幅反応に伴って生成する不純物による光の透過度の変化が検出可能である請求項６記載の核酸検出用器具。
【請求項１０】
核酸増幅反応が、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で行われる請求項６〜請求項９のいずれかに記載の核酸検出用器具。
【請求項１１】
核酸増幅反応が、ＬＡＭＰ  （Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏ  ｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応で行われる請求項６〜請求項９のいずれかに記載の核酸検出用器具。
【請求項１２】
イ．請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸検出用筒状体を含み、更に、ロ．検体から、核酸を遊離させる遊離液、ハ．核酸を吸着させた後、不純物を膜から洗浄除去する洗浄液、ニ．核酸増幅反応を行う、プライマー、基質、酵素を含む核酸増幅反応試薬のロ〜ニのいずれか１つ以上をセットにした核酸検出用キット。
【請求項１３】
イ．請求項６〜請求項９のいずれかに記載の核酸検出用器具を含み、更に、ロ．検体から、核酸を遊離させる遊離液、ハ．核酸を吸着させた後、不純物を膜から洗浄除去する洗浄液、ニ．核酸増幅反応を行う、プライマー、基質、酵素を含む核酸増幅反応試薬のロ〜ニのいずれか１つ以上をセットにした核酸検出用キット。
【請求項１４】
核酸増幅反応試薬が、ＰＣＲを達成できるものである請求項１２または請求項１３に記載の核酸検出用キット。
【請求項１５】
核酸増幅反応試薬が、ＬＡＭＰ反応を達成できるものである請求項１２または請求項１３に記載の核酸検出用キット。
【請求項１６】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸検出用筒状体と、核酸増幅反応容器とからなる核酸検出用器具を用いて、核酸吸着膜に検体の核酸を吸着させた後に、核酸吸着膜と核酸増幅反応溶液が接触して核酸吸着膜に吸着されている検体の核酸の増幅反応が行えるように核酸検出用筒状体を核酸増幅反応容器に収納し、密閉し、この核酸増幅反応を実施してその光学的性質の変化を用いて核酸増幅反応を検出することを特徴とする核酸検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な構造を有する核酸検出用器具に関する。詳しくは、核酸を含む試料から、核酸吸着物質に核酸を吸着させ、核酸吸着物質に吸着した核酸を鋳型にして核酸増幅反応を行い、同時に核酸反応による光学的な性質の変化を検出するのに用いられる核酸検出用器具に関する。
さらに、この器具を含んだ核酸検出用キットおよび核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、核酸を用いた検出反応においては、検体中の核酸を様々な方法で精製して、核酸溶液とし、それを増幅反応溶液に添加して行うことが一般的であった。近年、核酸を精製する場合において、核酸溶液を調製する手間を省くことのできる技術が開発された。この技術により、核酸増幅用容器の器壁内側の核酸増幅反応液が接触する面に、核酸吸着性樹脂の粒子をコーティングしたものが、市販されるに至った（ＸｔｒａＢｉｎｄ、Ｘｔｒａｎａ社）。この商品は、溶液中に核酸を含む試料を、該容器に導入して、該核酸を樹脂に吸着させ、洗浄液で樹脂を洗った後、容器にＰＣＲ等の核酸増幅反応液を入れて核酸増幅を行うことができる。この容器では、核酸溶液を調製する必要がないので、手間が省けて有用である。
【０００３】
一方、核酸の増幅反応の検出において、検出までの時間を短縮するために、増幅反応を行いながら、同時に検出反応を行う手法が開発されている。たとえば核酸の増幅反応として広く用いられているＰＣＲ法では、核酸増幅反応液中にインターカレーターと呼ばれる物質を共存させて、核酸増幅反応によって生じる２本鎖ＤＮＡに、該インターカレターが結合（インタカレート）して、蛍光を発するようになることを利用して、反応と検出を同時に行う、いわゆるリアルタイム検出を行う手法が開発されている。
【０００４】
しかし、上記の２つの技術を融合して、核酸を吸着した状態で、核酸増幅を適用し、更に、同時に核酸増幅反応を検出することは不可能であった。それは、増幅反応液が接している器壁に、核酸吸着樹脂がコーティングされているため、更に樹脂が光学的に透明でない為である。すなわち、核酸増幅反応において、核酸が精製された溶液を調製することなく、核酸吸着性担体に結合させたまま、核酸増幅反応が適応でき、さらに同時に核酸増幅反応の進行を検出することができる器具が要望されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、核酸が精製された溶液を調製することなく、核酸吸着性膜に吸着させたまま、核酸増幅反応が適応でき、さらに同時に核酸増幅反応の進行を検出することができる器具及び核酸検出用キットを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、本発明者らのなした国際特許公表公報  ＷＯ０３／００６６５０号の発明をもとに、前記の課題を解決するために鋭意検討を進めた結果、図１に示したように、筒状の構造体（１ａ）の一端（１ｂ）が、吸引機器に接続可能になっている開放端、もう一方の端に、核酸吸着膜（１ｃ）を設置し、その筒状体（２ａ）を、図２に模式的に示したように市販されている注射器などの吸引器具（２ｂ）と、核酸増幅反応容器（２ｃ）に組み合わせて用いることで、前述の課題を一挙に解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明の基本原理は、図３に示したように、筒状体（３ａ）に設置された核酸吸着膜（３ｂ）に吸着させた核酸を鋳型として、核酸増幅反応容器（３ｃ）の中で、核酸増幅反応溶液（３ｄ）を添加し、核酸増幅反応を進行させながら、同時に、光（３ｅ）などを用いて核酸増幅反応の進行を検出することができるようになっているものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）  両端が開放された筒状体において、核酸を吸着する膜がその筒状体の一端の開放部を覆うように設置されていて、該膜が、核酸増幅反応容器中の核酸増幅反応溶液に接触して、かつ、該筒状体が該核酸増幅反応容器に密閉されるように収納可能であり、さらに収納された状態で核酸増幅反応が可能である核酸検出用筒状体。
（２）膜が設置されていないもう一方の開放部が、膜を通過した溶液の吸引あるいは排出が可能な吸引／排出手段に接続可能である（１）に記載の核酸検出用筒状体。
（３）  核酸吸着膜が不織布である（１）または  （２）に記載の核酸検出用筒状体。
（４）筒状体の膜が核酸増幅反応容器中の核酸増幅反応溶液の液面によって形成される水平面に対して、傾斜をなすように設置された（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸検出用筒状体。
（５）核酸増幅反応を行う場合に生じる気泡を上部へ移送するための溝が、外側部分に刻まれている（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸検出用筒状体。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の核酸検出用筒状体と、核酸増幅反応容器とからなる核酸検出用器具であって、その筒状体の核酸吸着膜が核酸増幅反応容器中の核酸増幅反応溶液に接触して、かつ、該筒状体が核酸増幅反応容器に密閉されるように収納可能であり、さらに収納された状態で核酸増幅反応が可能であり、光学的性質の変化を用いてその核酸増幅反応の検出が可能である核酸検出用器具。
（７）核酸増幅反応溶液が核酸インタカレーターを含み、核酸増幅反応に伴う蛍光強度の変化が検出可能である（６）に記載の核酸検出用器具。
（８）核酸増幅反応に伴って増幅した核酸に対して、相補的な核酸を含むオリゴ核酸をハイブリダイズさせ、それに伴う蛍光強度の変化が検出可能である（６）に記載の核酸検出用器具。
（９）核酸増幅反応に伴って生成する不純物による光の透過度の変化が検出可能である（６）に記載の核酸検出用器具。
（１０）核酸増幅反応が、ＰＣＲで行われる（６）〜（９）のいずれかに記載の核酸検出用器具。
（１１）核酸増幅反応が、ＬＡＭＰ反応で行われる（６）〜（９）のいずれかに記載の核酸検出用器具。
（１２）イ．前記（１）〜（５）のいずれかに記載の核酸検出用筒状体を含み、更に、ロ．検体から、核酸を遊離させる遊離液、ハ．核酸を吸着させた後、不純物を膜から洗浄除去する洗浄液、ニ．核酸増幅反応を行う、プライマー、基質、酵素を含む核酸増幅反応試薬のロ〜ニのいずれか１つ以上をセットにした核酸検出用キット。
（１３）イ．前記（６）〜（９）のいずれかに記載の核酸検出用器具を含み、更に、ロ．検体から、核酸を遊離させる遊離液、ハ．核酸を吸着させた後、不純物を膜から洗浄除去する洗浄液、ニ．核酸増幅反応を行う、プライマー、基質、酵素を含む核酸増幅反応試薬のロ〜ニのいずれか１つ以上をセットにした核酸検出用キット。
（１４）核酸増幅反応試薬が、ＰＣＲを達成できるものである（１２）または（１３）に記載の核酸検出用キット。
（１５）核酸増幅反応試薬が、ＬＡＭＰ反応を達成できるものである（１２）または（１３）に記載の核酸検出用キット。
（１６）  前記（１）〜（５）のいずれかに記載の核酸検出用筒状体と、核酸増幅反応容器とからなる核酸検出用器具を用いて、核酸吸着膜に検体の核酸を吸着させた後に、核酸吸着膜と核酸増幅反応溶液が接触して核酸吸着膜に吸着されている検体の核酸の増幅反応が行えるように核酸検出用筒状体を核酸増幅反応容器に収納し、密閉し、この核酸増幅反応を実施してその光学的性質の変化を用いて核酸増幅反応を検出することを特徴とする核酸検出方法。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。まず本発明は前記したような核酸検出用筒状体に関する。本発明の筒状体を図１に一形態として例示して説明すると、筒状体（１ａ）において、開放部（１ｂ）は、核酸を含む試料を膜に通過させるために、吸引あるいは排出が可能な器具に接合可能ないずれかの形状に加工されていることが好ましい。これらを用いることにより、核酸吸着性膜（１ｃ）に、試料を通過させることが可能になる。吸引あるいは排出が可能な器具としては、注射筒（図２参照）、マイクロピペット、マイクロピペットの先端に取り付けるチップ、スポイト、真空ポンプ、あるいはこれらに接続できる管が挙げられる。試料を通過させ、さらに洗浄液で不純物を除いた筒状体は、あらかじめ核酸増幅反応試薬を添加した核酸増幅反応用マイクロテストチューブに設置され、図３に示した状態で核酸増幅反応が適用されると同時に、核酸増幅反応の有無が検出される。なお、核酸増幅反応の検出は、反応終了後に行われてもよい。また反応終了後の試料を、容器から取り出して検出することも可能であるが、この方法は、増幅反応産物を飛散させ、別の試料中への増幅産物を混入させる可能性を高めることになり、検査における偽陽性（本来は、核酸増幅反応がおこらない試料においても、鋳型ＤＮＡの混入による増幅反応が起きてしまうこと）が発生する原因となる。従って、核酸反応容器を開放することなく、密閉状態を保ったまま、検出を行うことが好ましい。
【０００９】
核酸吸着膜面は、光学的な検出が妨害されないように核酸増幅反応試薬の中に生じる気泡を、核酸増幅反応容器の上部側あるいは側面などに逃がすことが好ましく、このために、図４に示すように、筒状体に設置される核酸吸着膜（４）を、水平面に対して傾斜角度をつけることが好ましい。この傾斜角度は５〜６０度が望ましい。または、図５に示すように、気泡の通り道として筒状体に溝（５）をつけることが好ましい。傾斜および溝は同時に筒状体に設けても良い。
【００１０】
筒状体の材質としては、本発明の形状に加工できるものであれば、特に限定されるものではないが、診断に用いる為に、安く大量に生産するには、プラスチックを加工して作成するのが望ましい。特に、射出成形により作成するのが好ましい。このような加工を行える材質としては、例えば、塩化ビニール樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリウレタン樹脂、テフロン樹脂、ナイロン樹脂、ポリスチレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂等が挙げられる。
【００１１】
核酸吸着性膜としては、不織布、織布、濾紙、グラスフィルターなどが挙げられる。このうち、不織布は、作成するコストがかからず、核酸の吸着性もよく、また次いで行われる核酸増幅反応を阻害しないので、特に好ましい。不織布とは、短繊維またはフィラメントを機械的、熱的、化学的な手段を用いて接着または交絡させて作るシート状またはウェブ構造のものである（第２版  繊維便覧  繊維学会編  丸善）。不織布は、さまざまな方法で生産されるが、基本的な工程はウェブ（繊維の方向がある程度揃った繊維塊のシート状のもの）の形成工程、ウェブの接着工程および仕上げ工程である。ウェブを形成する方式は、湿式、乾式および直接式に大別される。直接式は紡糸直結式ともいわれる方法で、溶融高分子溶液から紡糸された繊維を集めて直接ウェブとする工程である。これに含まれる方法は、スパンレース法、スパンボンド法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、ステッチボンド法等であるが、本発明においては、メルトブロー法でつくられた超極細繊維不織布が最も好ましい。不織布には、天然繊維から化学繊維まで種々の繊維が用いられているが、一般的に用いられるのは、綿、レーヨン、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維、ナイロン繊維であり、その他にもアクリル繊維、ビニロ繊維ン、ガラス繊維、パルプ、炭素繊維等が使用される。
【００１２】
核酸吸着性膜を筒状物体に取り付ける方法としては、大量に生産する場合においては、接着剤、あるいは溶着によって取り付ける方法が好ましい。また、実験的に数十個の量を作成する場合においては、図６に示したように、筒状体を内筒（６ａ）と外筒（６ｂ）の２重構造にし、核酸吸着膜（６ｃ）を、機械的に挟み込む方法などでもよい。従って、これらの方法に限定されるものではない。
【００１３】
また、本発明はこのような核酸検出用筒状体と核酸増幅反応容器とからなり、この容器の中で核酸増幅反応が可能である核酸検出用器具に関する。核酸増幅反応としては、該容器の中で達成されるものであれば限定されないが、広く行われているＰＣＲは好適である。またＰＣＲやＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）のように温度を変化させるのではなくて、一定の温度で増幅させることが可能であるＬＡＭＰ、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆＮｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ
（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）も好適である。特にＬＡＭＰ法は、増幅効率が高く、反応に伴って生成するピロリン酸と、反応溶液中のマグネシウムイオンの反応による白濁によって核酸の増幅反応を検出できるので、特に好ましい。
核酸増幅反応容器が核酸増幅反応を検出するための光は、例えばＬＡＭＰ反応による濁度の変化を検出するためには、可視光であり、蛍光強度の変化を検出するためには、可視光あるいは紫外光である。
【００１４】
さらに、本発明は、このようなイ．核酸検出用筒状体または核酸検出用器具と、ロ．検体から核酸を遊離させる遊離液、ハ．核酸を核酸吸着膜に吸着させた後に、不純物を膜から洗浄除去する洗浄液、二．核酸増幅反応を行う、プライマー、基質、酵素を含む核酸増幅反応用試薬のロ〜ニの少なくとも一種の成分とをセットにした核酸検出用キットに関する。
本発明では、前記したように、検体に遊離液を加えて検体から核酸を遊離させ、これを核酸吸着性膜を通過させて核酸を核酸吸着膜に吸着させ、洗浄液を用いて不純物を核酸吸着膜から除去し、これを核酸増幅反応を行うプライマー、基質、酵素などとともに核酸検出用器具の中で密閉状態で核酸増幅反応を行う。
反応終了後もしくは反応途中で、検体中に検出対象となる核酸が含まれていたか否かを、核酸の増幅反応に伴う光学的な性質の変化を外部から測定することによって検出する。
【００１５】
本発明において検体としては、例えば、人の疾患の診断に用いる臨床検体である喀痰、唾液、尿、便、精液、血液、組織、臓器、その他の体液、これらの体液の画分、微生物汚染の検査に用いる食品、飲料水、土壌、排水、河川水、海水、ふき取り液、ふき取り綿などが挙げられる。また、例えば大腸菌などの細菌懸濁液を使用することができる。また、ロの検体から核酸を遊離させる遊離液としては界面活性剤やカオトロピック剤などを含む溶液が用いられる。検体に遊離液を加えただけでは固形成分等が残るような場合には、加熱、機械的振動等の手段による処理により、核酸吸着膜を通過できる性状とすることが望ましい。ハの核酸を核酸吸着膜に吸着させた後、不純物を膜から洗浄除去する洗浄液には、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）やトリトンＸ−１００などの界面活性剤、ＮａＣｌなどの塩溶液、エタノール等の有機溶媒などを使用するが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、除去する不純物に応じて選択すればよい。また場合によっては、洗浄工程を省略することも可能である。さらに、ニのプライマーとしては、使用する核酸増幅反応に応じ、また検出する対象となる目的の核酸の配列に応じて、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドなどが用いられる。オリゴヌクレオチドは使用する核酸増幅反応に応じて、ＤＮＡからなる、あるいはＲＮＡからなる、あるいは、ＤＮＡとＲＮＡの混成からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。また、ジゴキシゲニン、ビオチンなどの化合物で修飾したオリゴヌクレオチドを用いることもある。基質としてはデオキシアデニン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアニン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ）の混合溶液（一般にｄＮＴＰと記載されている）などが用いられる。
【００１６】
使用する核酸増幅反応によっては、アデニン、チミン、グアニン、シトシン以外の塩基からなるデオキシ塩基三リン酸を用いることもある。例えば、デオキシウラシル三リン酸（ｄＵＴＰ）を追加した、あるいはｄＧＴＰの代わりにｄＵＴＰを加えたｄＮＴＰ溶液を使用する、などである。また、塩基部分をジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン、蛍光物質などの化合物で修飾したデオキシ三リン酸を用いることもある。酵素としては、使用する核酸増幅反応によってＤＮＡポリメラ−ゼ、ＲＮＡポリメラ−ゼ、ＤＮＡリガーゼ、逆転写酵素、制限酵素などが単独あるいは組み合わせて用いられる。たとえばＰＣＲの場合は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラ−ゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼなどが、ＬＡＭＰ反応の場合には、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラ−ゼなどの鎖置換型ＤＮＡポリメラ−ゼなどが用いられる。この他に、核酸増幅反応による反応液の光学的変化を検出するために、エチジウムブロマイド、サイバーグリーン等のインターカレーターを加えておいてもよい。
前記ロ〜ニの少なくとも一種の成分をイの核酸検出用筒状体または核酸検出器具と組み合わせて核酸検出キットにしておくと医療の現場、食品製造の現場等で検体中の核酸を即座に検出することができるので有用である。
【００１７】
【発明実施の形態】
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらにより限定されるものではない。
【００１８】
【実施例１】
本体部品（筒状体２ａ）を、ポリプロピレン製のマイクロピペット用のチップ（エッペンドルフ製）を切断して、図７に示した外筒、図８に示した内筒をそれぞれ作成した。ＰＥＴ製の不織布（Ａ０４０Ｃ０１、旭化成）を直径５ｍｍの円形に切断し、それを図６に示すように、内筒と外筒の間に挟みこみ、本体部品を作成した。この本体部品（筒状体２ａ）の不織布を設置していない開放端に長さ２ｃｍ、内径３ｍｍ、外形４ｍｍの塩化ビニール製のチューブを取り付け、その先に、２．５ｍｌ用プラスチック製注射筒（テルモ社）（２ｂ）に取り付けた（図２参照）。
【００１９】
牛血液１μｌを、１ｍｌの０．５％ＳＤＳ、１００ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）を含むｐＨ＝７．６の１０ｍＭのトリス（トリスヒドロキシメチルアミノメタン／塩酸）緩衝液で溶解し、核酸を含む検体とした。この検体を、注射筒のピストンを吸引することで、本体部品の不織布を通過して注射筒へ導き、検体中の核酸を不織布に吸着させた。
【００２０】
次いで、洗浄液１（０．２ｍｌの０．５％ＳＤＳ、１００ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ＝７．６の１０ｍＭのトリス緩衝液、洗浄液２（０．２ｍｌの１Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ＝７．４の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）、洗浄液３（０．２ｍｌのＴＥ緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのトリス緩衝液））各１ｍｌで、順に、注射筒で各液を吸引することで不織布を洗浄した。
【００２１】
ＬＡＭＰ反応専用容器（栄研化学）（３ｃ）に、牛胎児胚雌雄判別キット（栄研化学）のＲＭＩ反応液（３ｄ）４０μｌに、溶解液１０μｌ、酵素液１μｌを加えた。この容器に、前記した検体中の核酸を吸着させ、洗浄した本体部品（筒状体３ａ）を入れ、蓋をして密封した後、６５℃の恒温槽で３０分間反応させた。反応後、溶液を肉眼で観察することにより、白濁を確認した。従って、本発明の器具を使用することにより、牛血液中の核酸が容易に検出されることが実証された（図３参照）。
【００２２】
【実施例２】
ＢＣＧ菌の検出
１％小川培地（極東製薬工業）上で３７℃、２０日間培養したＢＣＧ菌を白金耳で採取して、ガラスビーズが入ったディスパースチューブ（極東製薬工業）に入れた。これに１０％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を２滴加え、蓋をして撹拌ミキサー（ボルテックス社）で１５分間撹拌した。１５分静置した後、水を３ｍｌ添加して撹拌し、更に１５分間静置した。このＢＣＧ懸濁液を水で１０倍づつ希釈していき、１００μｌ中に１０、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００ＣＦＵのＢＣＧ菌を含むＢＣＧ菌の懸濁液を調製した。ＢＣＧ懸濁液、および陰性コントロール（Ｎｅｇａ）として、ＢＣＧ菌を含まない水、それぞれ１００μｌに、溶解液  （１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、２００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を１００μｌと１０％  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌを２．５μｌ加えて撹拌し、９５℃で１０分加熱してＢＣＧ溶解液とした。
ＢＣＧ菌の菌数は、以下の方法で決めた濁度と菌数の係数を利用して求めた。まず、ＭｃＦａｒｌａｎｄＮｏ１の濁度標準液と同じ濁度を示すＢＣＧの懸濁液を調製した。そのＢＣＧの懸濁液を希釈し、さらにその一定量の希釈液体を抗酸菌培養用の培地に播種した。その培地を培養し生えてきたコロニーを数えた。コロニー数と希釈倍率を考慮することで、ＭｃＦａｒｌａｎｄＮｏ１と同じ濁度のＢＣＧ菌懸濁液中には１０７ＣＦＵ／ｍｌの菌が含まれることがわかった。
【００２３】
実施例１に準じて、本体部品を作製した（図６〜８参照）。本体部品の不織布部分を、上記のＢＣＧ溶解液に浸し、シリンジのピストンをゆっくり引きながらＢＣＧ溶解液を吸引した（図２参照）。次に、洗浄液１（０．２ｍｌの０．５％ＳＤＳ、１００ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ＝７．６の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）、洗浄液２（０．２ｍｌの１Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ＝７．４の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）、洗浄液（０．２ｍｌのＴＥ緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのトリス緩衝液））各１ｍｌで、順に、注射筒で各液を吸引することで不織布を洗浄した。
【００２４】
次に、別のＬＡＭＰ反応チューブに５０μｌのＬＡＭＰ反応液を加えて、この反応液にミニカラムの不織布部分が接するようにミニカラムを入れてチューブに蓋をした（図３参照）。ＬＡＭＰ反応液は次のように調製した。まず、配列番号１のＦＩＰプライマー  ２０ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号２のＢＩＰプライマー  ２０ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号３のＦＬプライマー  １０ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号４のＢＬプライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号５のＦ３プライマー２．５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号６のＢ３プライマー  ２．５ｐｍｏｌ／μｌとなるようにＬＡＭＰ用プライマーミックス（以下、ＴＢ＃０１９と記す）を調製した。プライマーは日本バイオサービス社に依頼して化学的に合成した。
【００２５】
ＬＡＭＰ反応液５０μｌ中には、４μｌのＴＢ＃０１９、２μｌのＢｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＬａｒｇｅＦｒａｇｍｅｎｔ  （８０００Ｕ／ｍｌ、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ、  １．４ｍＭｄＡＴＰ、  １．４ｍＭ  ｄＣＴＰ、１．４ｍＭ  ｄＧＴＰ、  １．４ｍＭ  ｄＴＴＰが含まれる。ＬＡＭＰ反応液にミニカラムを入れたチューブをリアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス社）にセットし、反応温度を６４℃にして１時間反応させ、ＬＡＭＰ増幅反応中の濁度をリアルタイムにて測定した。結果を図９に示す。１００ＣＦＵのＢＣＧ菌が、約３０分で検出された。従って、本発明により検体中のＢＣＧ菌が迅速かつ簡便に検出されることが実証された。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によって、核酸を用いた検出反応が容易に行うことが可能になり、例えば医療現場における感染症の病原菌検出や、ヒト遺伝子の変異検出、また食品工業分野における有害菌の検出に用いる器具やキットを提供することが可能となる。
【００２７】
【配列表】
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【００２８】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸検出用筒状体の一例の見取図（斜視図）。
【図２】本発明の核酸検出用器具の使用の模式図。
【図３】本発明の核酸検出用器具を使用した核酸検出の模式図（縦断面図）。
【図４】本発明の核酸検出用器具の改良の一例を示した模式図（縦断面図）。
【図５】本発明の核酸検出用筒状体の改良の一例を示した見取図（斜視図）。
【図６】本発明の核酸検出用筒状体の組み立て方法の一例を示した模式図（縦断面図）。
【図７】本発明の核酸検出用筒状体の部品である外筒の設計図（側面図及び見取図（斜視図））。
【図８】本発明の核酸検出用筒状体の部品である内筒の設計図（側面図及び見取図（斜視図））。
【図９】本発明の核酸検出用器具による核酸検出の結果を示すグラフ。
【符号の説明】
１ａ：筒状体
１ｂ：開放端
１ｃ：核酸吸着膜
２ａ：筒状体
２ｂ：吸引器具
２ｃ：核酸増幅反応容器
３ａ：筒状体
３ｂ：核酸吸着膜
３ｃ：核酸増幅反応容器
３ｄ：核酸増幅反応溶液
３ｅ：核酸増幅反応を検出するための光
４：核酸吸着膜
５：溝
６ａ：内筒
６ｂ：外筒
６ｃ：核酸吸着膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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