(57)【要約】      （修正有）【課題】精子系列細胞で発現する新規なヒストンシャペロンCIA-IIの提供。【解決手段】特定の塩基配列を有するCIA-IIのポリヌクレオチドが、哺乳類の初期精子系列細胞である精原細胞と精母細胞において局所的に発現することを見出した。また該ポリペプチドの発現産物である特定のアミノ酸配列で示すCIA-IIのタンパク質が、インビボおよびインビトロにおいてヒストンタンパク質と相互作用し、ヌクレオソーム集合反応を促進する活性を持つ核内局在タンパク質であることを示した。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴；
（ａ）    配列番号２のアミノ酸配列を有し、精子系列細胞で発現するヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩをコードする；
（ｂ）    ｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列、または配列番号１における１以上の塩基が欠失または付加、もしくは他の塩基に置換されている塩基配列からなる；
を有するヒトＣＩＡ−ＩＩ遺伝子。
【請求項２】
請求項１のヒトＣＩＡ−ＩＩ遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製したポリヌクレオチド、またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする非ヒト動物遺伝子。
【請求項４】
請求項３のヒト動物遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製したポリヌクレオチド、またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５の組換えベクターによる形質転換体細胞。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を有し、精子系列細胞で発現するヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩ。
【請求項８】
請求項２のポリヌクレオチドの発現産物である請求項７のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩ。
【請求項９】
哺乳動物細胞の細胞死を促進する方法であって、請求項１のヒト遺伝子または請求項３の非ヒト遺伝子の発現を抑制する工程を含む方法。
【請求項１０】
哺乳動物細胞が、哺乳動物体内の細胞である請求項９の方法。
【請求項１１】
請求項１のヒトＣＩＡ−ＩＩ遺伝子の発現を抑制する因子をスクリーニングする方法であって、請求項１のヒト遺伝子を発現する細胞に候補物質を接触させる工程を含み、前記遺伝子発現を抑制する候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項７のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの活性を抑制する因子をスクリーニングする方法であって、請求項７のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩとヒストンと候補物質とを接触させる工程を含み、ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩとヒストンとの結合を阻害または低下させる候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項７のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの活性を促進する因子をスクリーニングする方法であって、請求項７のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩとヒストンと候補物質とを接触させる工程を含み、ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩとヒストンとの結合を促進させる候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、哺乳動物細胞の精子系列細胞で発現する新規なヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩと、その利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
真核生物のゲノムＤＮＡは、核内でヌクレオソーム構造を形成する（非特許文献１）。ヌクレオソーム構造の転換反応は、ＤＮＡ介在性の反応を調節する上で決定的な段階である（非特許文献２−４）。ヒストン修飾酵素（すなわち、アセチル化酵素、脱アセチル化酵素、およびメチル化酵素）およびクロマチンリモデリング因子（すなわち、ＡＴＰ加水分解酵素）に加えて、ヒストンシャペロンはヌクレオソームの集合を促進するタンパク質である（非特許文献５、６）。このヒストンシャペロンはコアヒストンに結合し、トポイソメラーゼＩとコアヒストンの存在下において、環状プラスミドを弛緩した形状から超らせんの形状へ転換させる（非特許文献５）。この転換活性は、ヒストンとＤＮＡとの集合を促進すると考えられており、ヌクレオソーム集合活性と呼ばれる。この活性は、ミクロコッカスヌクレアーゼ消化検定法により確認されるが、この方法によればヒストンおよびＤＮＡがヒストンシャペロンとともにインキュベートされると、ヌクレオソームの単位に応じたＤＮＡラダーが電気泳動パターンとして検出されることを特徴とする（非特許文献５）。ヌクレオソーム集合活性をもつこの種のタンパク質としては、ヌクレオプラスミン（非特許文献７）、ヌクレオソーム集合因子−Ｉ（ＮＡＰ−Ｉ）（非特許文献８、９）、鋳型活性化因子−Ｉ（ＴＡＦ−Ｉ）（非特許文献１０）、Ｔｙの抑圧因子−６（ＳＰＴ６）（非特許文献１１）、およびＣＣＧ１相互作用因子−Ａ（ＣＩＡ）（非特許文献１２）が知られている。
【０００３】
ＣＩＡは、現在までに特性が明らかにされた中で最も保存されたヒストンシャペロンである（非特許文献１２）。その名が示す通り、ＣＩＡはヒト細胞周期遺伝子１（ヒトＣＣＧ１）と相互作用するヒト因子として同定された（非特許文献１２、１３）。ＴＦＩＩＤは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写される真核生物遺伝子のプロモーター内に見られる基本配列であるＴＡＴＡボックスと特異的に結合する因子である（非特許文献１４）。ＴＦＩＩＤのサブユニットとして、ＣＣＧ１はＴＡＴＡボックス結合性タンパク質（ＴＢＰ）と結合し（非特許文献１５）、そのＮ−末端領域を介してＴＢＰによるＴＡＴＡボックスへの結合を阻害する（非特許文献１６、１７）。現在までのところ、ＣＩＡはＴＦＩＩＤと結合することが知られている唯一のヒストンシャペロンである（非特許文献１２、１３）。
【０００４】
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＣＩＡの相同遺伝子は、抗サイレンシング機能−１（ＡＳＦ１）として遺伝的に同定されており、外因性に過剰発現されると、抑制された遺伝子座に局在する遺伝子の抑制解除を引き起こす（非特許文献１８）。酵母におけるＡＳＦ１の過剰発現は、テロメアに近位の領域、ｒＤＮＡ遺伝子座や接合型遺伝子座の遺伝子の抑制解除をもたらす（非特許文献１８−２０）。酵母ＡＳＦ１は、ヌクレオソーム集合活性を有し、その高度に保存されたドメインは、ヒストン結合、ヌクレオソーム集合、細胞増殖、および抗抑制活性に必須であり、ＣＩＡ／Ａｓｆ１の機能が進化的に保存されていることが示唆されている（非特許文献２０）。このような活性を通じ、ＣＩＡは遺伝子転写（非特許文献１３）、ＤＮＡ複製（非特許文献２１）およびＤＮＡ修復（非特許文献１８）といったクロマチンＤＮＡが介在する反応に寄与すると考えられる。
【０００５】
遺伝子転写におけるＡｓｆ１ｐ（ＡＳＦ１の遺伝子産物として生じるタンパク質）の関与は、そのＳＰＴ表現型の活性により示唆される（非特許文献１３）。重要なことに、Ａｓｆ１ｐは酵母のブロモドメイン因子１（ｙＢｄｆ１ｐ）と物理的に結合する（非特許文献１３）。ｙＢｄｆ１ｐは、出芽酵母ｙＣＣＧ１／ＴＡＦＩＩ１４５において欠損しているブロモドメインに相当する（非特許文献２２）。これらの報告は、ＣＩＡ／Ａｓｆ１ｐが遺伝子転写に関与していることを示唆している。ＣＣＧ１はまた、非許容温度におけるハムスター細胞株ｔｓＢＮ４６２およびｔｓ１３の増殖欠損を補足することから、細胞周期調節にも関与していると考えられる（非特許文献２３−２７）。ＴＦＩＩＤ相互作用性ヒストンアセチル化酵素Ｔｉｐ６０（非特許文献２８、２９）は、アポトーシス性細胞死の調節に関わることから（非特許文献３０）、ＣＩＡは細胞死の調節にも関係すると考えられている（非特許文献３１）。しかしながら、多細胞生物の発生や細胞分化におけるＴＦＩＩＤ相互作用性のクロマチン因子の寄与はほとんどわかっていない。また、哺乳類の発生または分化の調節におけるヒストンシャペロンの関与については、ほとんど解明されていない。
【０００６】
一方、ヌクレオソームの集合に先立ち、ＴＦＩＩＤのプロモーター上への結合がインビトロにおける遺伝子の活性化に必須である（非特許文献３２）。また、ＴＦＩＩＤがコアヒストンのサブユニットと配列類似性を示すサブユニットを含んでいることから（非特許文献３３−３６）、この出願の発明者らは先の研究において、ヒトのツーハイブリッドｃＤＮＡライブラリーを用いてＴＦＩＩＤと相互作用する哺乳類の因子をスクリーニングし、ヒトＣＩＡのｃＤＮＡをクローニングした（非特許文献１２）。そしてこのスクリーニングの過程で、発明者らは、ＣＩＡに対する配列類似性をもつ新規な因子をコードしているヒトｃＤＮＡを単離し、これをＣＩＡ−ＩＩと命名した。
【０００７】
この出願の発明は、この新規因子ＣＩＡ−ＩＩとその遺伝子操作材料、並びにＣＩＡ−ＩＩの利用発明を提供することを課題としている。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，  Ｒ．  Ｄ．  （１９７４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １８４，  ８６８−８７１
【非特許文献２】
Ａｄａｍｓ，  Ｃ．  Ｒ．  ＆  Ｋａｍａｋａｋａ，  Ｒ．  Ｔ．  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．，  ９，  １８５−１９０
【非特許文献３】
Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，  Ｒ．  Ｄ．  ＆  Ｌｏｒｃｈ，  Ｙ．  （１９９９）  Ｃｅｌｌ，  ９８，  ２８５−２９４
【非特許文献４】
Ｎａｒｌｉｋａｒ，  Ｇ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｃｅｌｌ，  １０８，  ４７５−４８７
【非特許文献５】
Ｉｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ２，  ５９３−６００
【非特許文献６】
Ｗｏｒｋｍａｎ，  Ｊ．  Ｌ．  ＆  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｒ．  Ｅ．  （１９９８）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６７，  ５４５−５７９
【非特許文献７】
Ｌａｓｋｅｙ，  Ｒ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ｎａｔｕｒｅ  ，２７５，  ４１６−４２０
【非特許文献８】
Ｉｓｈｉｍｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ，１４２，  ４３１−４３９
【非特許文献９】
Ｉｓｈｉｍｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ，１６２，  １９−２４
【非特許文献１０】
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ，２６８，  １０５８２−１０５８７
【非特許文献１１】
Ｂｏｒｔｖｉｎ，  Ａ．  ＆  Ｗｉｎｓｔｏｎ，  Ｆ．  （１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７２，  １４７３−１４７６
【非特許文献１２】
Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ５，  ２２１−２３３
【非特許文献１３】
Ｃｈｉｍｕｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｎａｔｌ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９９，  ９３３４−９３３９
【非特許文献１４】
Ｒｏｅｄｅｒ，  Ｒ．  Ｇ．  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，２１，  ３２７−３３５
【非特許文献１５】
Ｔａｋａｄａ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９，  １１８０９−１１８１３
【非特許文献１６】
Ｋｏｋｕｂｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ，  （１９９３）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  ７，  １０３３−１０４６
【非特許文献１７】
Ｌｉｕ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｃｅｌｌ，  ９４，  ５７３−５８３
【非特許文献１８】
Ｌｅ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｙｅａｓｔ，  １３，  １０２９−１０４２
【非特許文献１９】
Ｓｉｎｇｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １５０，  ６１３−６３２
【非特許文献２０】
Ｕｍｅｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ７，  ５９−７３
【非特許文献２１】
Ｔｙｌｅｒ，  Ｊ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０２，  ５５５−５６０
【非特許文献２２】
Ｍａｔａｎｇｋａｓｏｍｂｕｔ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １４，  ９５１−９６２
【非特許文献２３】
Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ７，  １６８３−１６８７
【非特許文献２４】
Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ  （１９９１）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １１，  ３３１７−３３２５
【非特許文献２５】
Ｈｉｓａｔａｋｅ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２，  １７９−１８１
【非特許文献２６】
Ｒｕｐｐｅｒｔ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２，  １７５−１７９
【非特許文献２７】
Ｓｕｚｕｋｉ−Ｙａｇａｗａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，１７，  ３２８４−３２９４
【非特許文献２８】
Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｔ．  ＆  Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，  Ｍ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２，  ３０５９５−３０５９８
【非特許文献２９】
Ｋｉｍｕｒａ，  Ａ．  ＆  Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，  Ｍ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ３，  ７８９−８００
【非特許文献３０】
Ｉｋｕｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ，  １０２，  ４６３−４７３
【非特許文献３１】
Ｙａｍａｋｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ６，  １０４４３−１０５４
【非特許文献３２】
Ｗｏｒｋｍａｎ，  Ｊ，  Ｌ．  ＆  Ｒｏｅｄｅｒ，  Ｒ．  Ｇ．  （１９８７）  Ｃｅｌｌ，  ５１，  ６１３−６２２
【非特許文献３３】
Ｋｏｋｕｂｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６７，  ４８４−４８７
【非特許文献３４】
Ｘｉｅ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８０，  ３１６−３２２
【非特許文献３５】
Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８０，  ３５６−３５９
【非特許文献３６】
Ｂａｎｄｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２１，  ５９１−５９７
【０００９】
【発明を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１３）の発明を提供する。
（１）    以下の特徴；
（ａ）    配列番号２のアミノ酸配列を有し、精子系列細胞で発現するヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩをコードする；
（ｂ）    ｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列、または配列番号１における１以上の塩基が欠失または付加、もしくは他の塩基に置換されている塩基配列からなる；
を有するヒトＣＩＡ−ＩＩ遺伝子。
（２）    前記発明（１）のヒトＣＩＡ−ＩＩ遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製したポリヌクレオチド、またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチド。
（３）    前記発明（２）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする非ヒト動物遺伝子。
（４）    前記発明（３）の非ヒト動物遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製したポリヌクレオチド、またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチド。
（５）    前記発明（２）のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
（６）    前記発明（５）の組換えベクターによる形質転換体細胞。
（７）    配列番号２のアミノ酸配列を有し、精子系列細胞で発現するヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩ。
（８）    前記発明（２）のポリヌクレオチドの発現産物である前記発明（７）のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩ。
（９）    哺乳動物細胞の細胞死を促進する方法であって、前記発明（１）のヒト遺伝子または前記発明（３）の非ヒト遺伝子の発現を抑制する工程を含む方法。
（１０）  哺乳動物細胞が、哺乳動物体内の細胞である前記発明（９）の方法。
（１１）  前記発明（１）のヒトＣＩＡ−ＩＩ遺伝子の発現を抑制する因子をスクリーニングする方法であって、前記発明（１）のヒト遺伝子を発現する細胞に候補物質を接触させる工程を含み、前記遺伝子発現を抑制する候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
（１２）  前記発明（７）のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの活性を抑制する因子をスクリーニングする方法であって、前記発明（７）のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩとヒストンと候補物質とを接触させる工程を含み、ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩとヒストンとの結合を阻害または低下させる候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
（１３）  前記発明（７）のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの活性を促進する因子をスクリーニングする方法であって、前記発明（７）のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩとヒストンと候補物質とを接触させる工程を含み、ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩとヒストンとの結合を促進させる候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法。
【００１０】
なお、この発明において、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が複数個（例えば１００個以上）結合した分子を言う。
【００１１】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等に記載されている。
【００１２】
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
発明（１）のヒトＣＩＡ−ＩＩ遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩをコードするヒト遺伝子である。またこのＣＩＡ−ＩＩ遺伝子は、転写されるｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列、または配列番号１における１以上の塩基が欠失または付加、もしくは他の塩基に置換されている塩基配列を有している。ここで、「１以上の塩基が欠失または付加、もしくは他の塩基に置換されている」とは、基本となる塩基配列に比較して１または２以上の塩基の付加または欠失、もしくは１また２以上の塩基の他塩基への置換といった変異が存在するが、基本となる無変異配列と同等の機能（すなわち、ヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの機能）を保持していることを意味する。
【００１４】
この発明（１）の遺伝子は、例えば、配列番号１の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌクレオチドをプローブとしてヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００１５】
発明（２）は、発明（１）のゲノム遺伝子やこの遺伝子が転写するｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ等から精製したポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）である。例えば、ｃＤＮＡは酵母細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として、公知の方法（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  １６１−１７０，  １９８２；  Ｇｅｎｅ，  １５０，  ２４３−２５０，  １９９４）を用いて合成することができる。あるいは、合成プライマ−を用いて、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。このようにして調製したｃＤＮＡは、具体的には配列番号１の塩基配列を有している。
【００１６】
発明（２）のポリヌクレオチドはまた、発明（１）のゲノム遺伝子やこの遺伝子が転写するｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡから精製したポリヌクレオチドの一部連続配列からなるポリヌクレオチドである。すなわち、この部分ポリヌクレオチドの一態様は、配列番号１におけるコード領域（ＯＲＦ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００１７】
この出願の発明（３）は、前記発明（２）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする非ヒト動物遺伝子であり、発明（４）は、この非ヒト動物遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製したポリヌクレオチド、またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチドである。これらの非ヒト動物遺伝子およびそのポリヌクレオチドは、この発明のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩと実質的に同一機能を有する非ヒトタンパク質をコードする。すなわち、１本鎖ポリヌクレオチド配列は、相同性の程度によって相手鎖とハイブリダイズする。このとき、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）をより厳密に設定することによって、より相同性の高い配列を特定することができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアミド等）の濃度、温度条件によって規定される。詳しくは、米国特許Ｎｏ．  ６，１００，０３７等に詳しく記述されている。このようなストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションスクリーニングによって特定される発明（４）のポリヌクレオチドは、発明（２）のポリヌクレオチドと７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有している。
【００１８】
発明（５）の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜なものを使用する。例えば、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域をインサートとしてこの発明のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩを生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、ゲノム遺伝子ＤＮＡをインサートとする場合には、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。
【００１９】
発明（６）の形質転換体細胞は、例えば、前記発明（５）の組換えベクターを用いてヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩを製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
【００２０】
発明（７）のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩは、配列番号２のアミノ酸配列を有し、ヒトの精子系列細胞で発現することを特徴としている。
【００２１】
このヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩは、ヒト細胞（特に精子系列細胞）から単離する方法、配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法等によって得ることができるが、好ましくは、前記発明（２）のポリヌクレオチドを用いて遺伝子工学的に製造することができる。すなわち、インビトロ転写翻訳系や、発明（６）の形質転換細胞の培養物から単離精製されるヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩ（発明（８））である。
【００２２】
例えば、ヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩをインビトロ転写翻訳系で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作製する。このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ転写翻訳系に添加すれば、目的とするヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。
【００２３】
ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、目的の酵素を発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的タンパク質を大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００２４】
さらに、ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩを真核細胞で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成する。このベクターを真核細胞内に導入して培養すれば、目的とするタンパク質を発現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３Ｔ、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２５】
形質転換細胞で発現させたヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩを単離または精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２６】
なお、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明の酵素タンパク質の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、メチル化などである。
【００２７】
なお、発明（７）および（８）のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩには、その部分アミノ酸配列からなるペプチドも含まれる。すなわち、このペプチドは、ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの活性部分を構成する任意領域に対応するタンパク質断片と同一のアミノ酸配列からなり、例えば、化学合成によってペプチドを合成する方法や、部分ポリヌクレオチドを用いて遺伝子工学的に作成する方法、あるいは前記発明のヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩを適当なプロテアーゼで消化する方法等によって作成することができる。
【００２８】
発明（９）は、哺乳動物細胞の細胞死を促進する方法であって、前記発明（１）のヒト遺伝子または前記発明（３）の非ヒト遺伝子の発現を抑制する工程を含む方法である。すなわち、この発明のヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの酵母対応因子であるＡＳＦ１を遺伝子欠損させると酵母は自発的な細胞死（アポトーシス様の細胞死）を引き起こすことが知られている（非特許文献３１）。またヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの相互作用因子であるＣＣＧ１に変異が生じるとハムスター細胞は自発的な細胞死を起こすことも知られている（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２１８，  ４９０−４９８）。従ってこの発明によって提供されるヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩ遺伝子を機能欠損させることによって、ヒトを含めた哺乳動物細胞（特に、その存在が動物個体の機能、生存等に対して負に作用する細胞。例えば癌細胞など）を効果的に細胞死させることが可能となる。
【００２９】
この方法は、例えば培養条件下にある細胞、または哺乳動物の体内（好ましくは人体内）にある細胞を対象とするものであり、具体的には体内の癌細胞を細胞死させる方法である。具体的な手段としては、ヒト細胞の場合には、例えば発明（１）のヒトＣＩＡ−ＩＩ遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ鎖を用いたアンチセンス法や、２本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法等によってこの細胞死促進方法を実施することができる。
【００３０】
発明（１１）は、前記発明（１）のヒトＣＩＡ−ＩＩ遺伝子の発現を抑制する因子をスクリーニングする方法であって、前記発明（１）のヒト遺伝子を発現する細胞に候補物質を接触させる工程を含み、前記遺伝子発現を抑制する候補物質を目的物質として特定することを特徴とする方法である。
【００３１】
すなわち、ヒトＣＩＡ−ＩＩ遺伝子の発現を抑制する因子は、前記発明（９）（１０）と同様に、癌細胞等の好ましくなく細胞の細胞死を促進するための薬剤成分として利用することができる。ＣＩＡ−ＩＩ遺伝子の発現量は、例えば、発明（６）の形質転換細胞のゲノムＤＮＡを対象とする定量的なＰＲ−ＰＣＲ法等によって遺伝子の転写産物を定量する方法や、形質転換細胞の発現産物であるヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの発現量を測定する方法等によって実施することができる。また、候補物質としては、例えば有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、タンパク質、ペプチド等が含まれる。また前記発明（９）に使用するアンチセンス鎖や２本鎖ＲＮＡ分子等もこの候補物質に含まれる。候補物質を形質転換細胞に接触させる方法としては、細胞の培養培地に候補物質を添加する方法や、あるいは候補物質をリポソームベクター等によって細胞内に取り込ませる方法を採用することができる。またアンチセンス鎖や２本鎖ＲＮＡ分子を候補物質とする場合には、通常の形質転換法に用いられる遺伝子導入法に準じた方法を使用することができる。
【００３２】
発明（１２）は、前記発明（７）のヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの活性を抑制する因子をスクリーニングする方法であり、また発明（１３）は、ヒト・ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの活性を促進する因子をスクリーニングする方法である。すなわち、後記の実験的データから明らかなように、ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩは精子系列細胞の精原細胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉｕｍ，  −ａ）と精母細胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅ）において局所的に発現し、ヒストンと相互作用してヌクレオソームの集合に働く。従って、ヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの活性を抑制する因子は、例えば、避妊薬の有効成分となりうるし、逆にヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの活性を促進する因子は、男性不妊の治療薬の成分となりうる。
【００３３】
さらに、ヒストンの化学修飾反応は抗がん剤の標的として近年注目を集めている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，  Ｒ．  Ｗ．  （２００２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  １，  ２８７−２９９；  Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ，  Ｂ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｃｕｒｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．  ２，  ３３７−３５３）。従って、ヒストンと結合し、ＤＮＡの高次構造に影響を与えるヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩの活性を抑制または促進する因子は、ヒストンを標的とする抗がん剤として有用である。
【００３４】
以下、この発明のタンパク質機能解析のために行った実験を示す。
（１）    材料および方法
（１−１）    酵母ツーハイブリッドスクリーン
酵母のツーハイブリッドスクリーン（Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ５，  ２２１−２３３；Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｓ．  ＆  Ｓｏｎｇ，  Ｏ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４０，  ２４５−２４６；  Ｄｕｒｆｅｅ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  ７，  ５５５−５６９）を用いることにより、ヒトＣＣＧ１のブロモドメイン（１３４２から１６２９までの残基）と相互作用する因子を探索し、ＣＩＡ−ＩＩのｃＤＮＡを単離した。ｐＡＣＴにおいてＧａｌ４活性化ドメインと融合したヒト末梢血リンパ球ｃＤＮＡライブラリーを、ｐＡＳＩ−ＣＹＨ２−ＣＣＧ１プラスミド（Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ５，  ２２１−２３３）とともに、Ｙ１９０酵母細胞に形質導入した。酵母の形質転換体（約０．９ｘ１０６細胞）をＴｒｐ（−）Ｌｅｕ（−）プレート上で培養し、２５ｍＭの３−アミノトリアゾール含むＴｒｐ（−）Ｌｅｕ（−）Ｈｉｓ（−）プレート上にレプリカした。結果として得られたコロニーを、Ｘ−ｇａｌを用いることにより、β−ガラクトシダーゼ活性について調べた。特異的な相互作用を検出するためのこのアッセイは、文献（Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ５，  ２２１−２３３；Ｂａｎｄｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２１，  ５９１−５９７）の記載に従って行った。このスクリーニングにより、ＣＩＡ−ＩＩ配列を含む約１．６ｋｂｐのインサートＤＮＡをもつ二つの独立したクローンを単離した。クローンの一つ（ＢＲＤ＃１０１）をシーケンスし、このインサートＤＮＡが１６５９ヌクレオチドから成り、ＣＩＡ−ＩＩの完全長配列を含むことを見出した。ＣＩＡ−ＩＩ  ｃＤＮＡの完全なコード配列はまた、抗サイレンシング機能１Ｂ（ＡＳＦ１Ｂ）（  Ｓｉｌｌｊｅ，  Ｈ．  Ｈ．  ＆  Ｎｉｇｇ，  Ｅ．  Ａ．  （２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．，  １１，  １０６８−１０７３）または仮説的タンパク質ＦＬＪ１０６０４（各々、ＧｅｎＢａｎｋ／ＡＦ２７９３０７およびＮＭ＿０１８１５４）としても同定されている。タンパク質−タンパク質相互作用の確認のため、インサートｃＤＮＡを適当な制限酵素により切除し、次にそれを他のベクターとオープンリーディングフレーム内において連結することにより、「プレイ（餌食）」ベクター（ｐＡＣＴＩＩ）中に「ベイト（餌）」ｃＤＮＡをもつプラスミド、および「ベイト」ベクター（ｐＡＳ１−ＣＹＨ２）中に「プレイ」ｃＤＮＡをもつプラスミドを構築した。ｐＡＳ１−ＣＹＨ２およびｐＡＣＴＩＩ誘導体の同時形質転換体をフィルター（ＰＲＯＴＲＡＮ  ＢＡ８５；シュライシャー＆シュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、ドイツ）上にスポットし、β−ガラクトシダーゼ活性を調べた。ＣＩＡ−ＩＩとの相互作用検定用にヒストンＨ３．３（残基９７から１３５まで）のｃＤＮＡを用いたが、その理由はこのクローンがＣＩＡとの相互作用因子として得られたからである（Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ５，  ２２１−２３３）。ヒストンＨ３．３のアミノ酸配列は、体細胞Ｈ３の対応する領域と同一である。
（１−２）    細胞内局在
ＣＩＡ−ＩＩ、ＣＩＡまたはＴＢＰをコードしているヒトの各ｃＤＮＡを、β−ガラクトシダーゼ発現ベクターｐＣＨ１１０内にそれぞれクローニングした。４０μｇのプラスミドＤＮＡによって、ＨｅＬａまたはＣＯＳ細胞を形質転換した。結果として得られた細胞を、５％ＣＯ２下、３７℃にて４〜８時間インキュベートした。細胞はさらに、１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２下、３７℃にて２日間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで洗浄の後、２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタールアルデヒド含有の１０ｍｌ  ＰＢＳを細胞に添加した。４℃にて１０分間のインキュベートの後、１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、および２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１０ｍｌのＰＢＳを細胞に添加した。５％ＣＯ２下、３７℃でのインキュベーションの後、細胞をＰＢＳで洗浄した。Ｘ−ｇａｌ染色した細胞を観察し、光学顕微鏡およびカメラで撮影した。
（１−３）    マウスＣＩＡ−ＩＩ  ｃＤＮＡの単離
マウスＣＩＡ−ＩＩまたはＣＩＡをコードしている部分的ｃＤＮＡを、ヒトＣＩＡ（Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ５，  ２２１−２３３）の＋１１５〜＋１３４および＋４３６〜＋４６１に各々相当する以下のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによりスクリーニングした。以下のプライマー配列において、「Ｉ」はＡＴＧＣの各塩基と不特定に相補塩基対を形成するイノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）を示し、配列表においては「ｎ」と記載した。また、例えば「（Ａ／Ｇ）」はＡまたはＧを意味し、配列表においては「ｒ」と記載した。同様に、（Ａ／Ｃ）は「ｍ」、（Ｃ／Ｔ）は「ｙ」、（Ａ／Ｔ）は「ｗ」、（Ｇ／Ｔ）は「ｋ」と記載した。
【００３５】
フォワード：５’−ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＴＧＧＡＡ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）ＴＩＡ（Ｃ／Ｔ）ＩＴＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＴ−３’（配列番号３）
リバース：５’−ＴＣＣＣＡＩ（Ａ／Ｔ）（Ｃ／Ｔ）ＩＡＴ（Ａ／Ｇ）Ｔ（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）ＡＡＩＣ（Ｇ／Ｔ）ＩＧＴＩＡＣ−３’（配列番号４）
テンプレートは、精巣および他の組織から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを使用した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、［９５℃／１．５分間；３７℃／２分間；６３℃／３分間］×３０サイクルとした。
【００３６】
増幅したＤＮＡ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｇｅ）、米国）のＳｍａＩ部位内にクローニングし、シーケンスした結果、ヒトＣＩＡ−ＩＩまたはヒトＣＩＡに類似したヌクレオチド配列が得られた。ヒトＣＩＡ−ＩＩ配列に類似したマウスＤＮＡフラグメントの配列を配列番号５に示す。このマウスＤＮＡフラグメントを、ランダムプライミング（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、米国）により「３２Ｐ」ｄＣＴＰを用いて標識し、ノーザンブロット分析に使用した。
（１−４）    精巣生殖細胞の調製および分離
雄のＩＣＲマウス（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｂｉｏ−Ｓｕｐｐ．  Ｃｅｎｔｅｒ、日本）を使用して、ＲＮＡブロット分析を行った。ＷＢＢ６Ｆ１−Ｗ／ＷＶおよびＷＢＢ６Ｆ１＋／＋マウス（Ｓｈｉｚｕｏｋａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｒｍ、日本）の精巣を、変異解析用として使用した（図４）。精巣生殖細胞の調製は、文献（Ｒｏｅｄｅｒ，  Ｒ．  Ｇ．  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，２１，  ３２７−３３５）の記載に準じておこなった。すなわち、２０匹の成体（８週齢）雄マウスから精巣を切り出し、鉗子により白膜を除去し、０．１％グルコースを含むＰＢＳ中で保存した。精細管の塊は０．１％グルコースおよび０．１％コラゲナーゼＳ１を含むＰＢＳ中で、３３℃で２０分間インキュベートした。分離した精子細管は０．１％グルコースを含むＰＢＳ中で洗浄し、次いで０．１％グルコース、２００Ｕ／ｍｌのトリプシン、および１２０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを含むＰＢＳ中に再懸濁し、最後に３１℃で１０分間インキュベートした。懸濁物には、氷上において、８％ウシ胎児血清、０．１％ダイズトリプシン阻害因子、および５００Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを添加した。懸濁物を濾過した後、文献（Ｍｅｉｓｔｒｉｃｈ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  ６０，  ４２８−４４１）の記載に基づいてマウス精巣生殖細胞を遠心洗浄した。
（１−５）    ＲＮＡブロット分析
ヒトのノーザンブロット分析用フィルター（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ；  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）を、５０％ホルムアルデヒド、１０×デンハード液、５×ＳＳＰＥ、２％ＳＤＳ、および１００  （ｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、［３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識したヒトＣＩＡ−ＩＩ  Ｘｂａｌ−ＸｈｏＩフラグメント（＋７８０〜＋１６７１）、ヒトＣＩＡ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメント（＋５３４〜９５０）、またはβ−アクチン遺伝子のいずれかと１６時間ハイブリダイズした。フィルターは、室温において２×ＳＳＣおよび０．０５％ＳＤＳの溶液中で１０分間にわたり、３回、次いで５０℃において０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で２０分間にわたり、２回洗浄した。オートラジオグラフィーは、増感スクリーンを用い、−８０℃で６日間行った。マウスＲＮＡは、文献（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．  ＆  Ｓａｃｃｈｉ，  Ｎ．  （１９８７）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６２，  １５６−１５９）の記載に従い、酸グアニジン／フェノール／クロロホルム（ＡＧＰＣ）法により調製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、オリゴテックス（Ｏｒｕｇｉｔｅｘ）−ｄＴ３０（宝酒造、日本）を使用して単離した。ＲＮＡは１．５％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、ナイロンフィルター（Ｇｅｎｅ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｐｌｕｓ；ＮＥＮ、米国）へ転写した。マウスのノーザンブロット分析用フィルターは、４２℃において、５０％ホルムアミド、１０×デンハード溶液、５×ＳＳＰＥ、２％ＳＤＳ、および１００  （ｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識したマウスＣＩＡ−ＩＩ  ｃＤＮＡフラグメント（ｎｔ  ２１３〜５５９）と１２時間にわたりハイブリダイズした。フィルターは、室温において２×ＳＳＣ中で１０分間にわたり、３回、次いで５０℃において２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で２０分間にわたり、２回洗浄した。露出は１日間行った。対照として、ヒトβ−アクチンｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびマウスＳ−ＩＩ−Ｔ１遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント（Ｕｍｅｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２１，  ５９８−６０３）について同様に行った。
（１−６）    組換えタンパク質
ＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩ融合タンパク質を、文献（Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ５，  ２２１−２３３）の記載に従って作成した。すなわち、ＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩ融合タンパク質を製するため、ヒトの完全長ＣＩＡ−ＩＩをコードするｃＤＮＡをｐＧＥＸ−５Ｘ−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へ挿入した。ＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内で発現させ、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび２０  （ｇ／ｍｌのロイペプチンおよびペプスタチンＡを含むＢＡＳ−５００（ＢＡは、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０％グリセロール、０．１％ＮＰ−４０および０．３５％  ２−メリカプトエタノールを含むｐＨ７．９の溶液であり、ＢＡ−５００は５００ｍＭのＮａＣｌを含むＢＡである）中で抽出した。抽出物は次に、ＢＡ−５００で平衡化したグルタチオン−セファロース樹脂（ファルマシア、スウェーデン）とともにインキュベートし、吸着したタンパク質を２０ｍＭのグルタチオンを含むＢＡ−０（すなわち、ＮａＣｌなし）中に溶出した。溶出させた分画は、ＢＡ−０で平衡化したＰｏｒｏｓ  ＨＱカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）に供し、０．２〜１Ｍ  ＮａＣｌの直線的な勾配で溶出した。ＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩタンパク質は、約０．４Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。ＨｅＬａ細胞からのコアヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４は、ヒドロキシルアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）を用いて、文献（Ｓｉｍｏｎ，  Ｒ．  Ｈ．  ＆  Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，  Ｇ．  （１９７９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ６，  ６８９−６９６）の記載と同様に混合物として精製した。
（１−７）    ＧＳＴプルダウンアッセイ
ＧＳＴプルダウンアッセイは、文献（Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ５，  ２２１−２３３）の記載に従って行った。グルタチオン−セファロース樹脂（ファルマシア、スウェーデン）を、結合緩衝液（ｐＨ７．５；２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、０．１％ＮＰ−４０、および０．３％  ２−メルカプトエタノール）で平衡化し、精製した組換えタンパク質（０．２  （ｇ）をこの樹脂に結合した。ＨｅＬａコアヒストン（３．６  （ｇ）を添加し、回転しながら４℃で２時間インキュベートした。樹脂を前記緩衝液中で洗浄し、結合したタンパク質を１５  （ｌのＳＤＳ負荷緩衝液を用いて溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
（１−８）    プラスミド超らせんアッセイ
ヌクレオソーム集合反応は、文献（Ｂｏｒｔｖｉｎ，  Ａ．  ＆  Ｗｉｎｓｔｏｎ，  Ｆ．  （１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７２，  １４７３−１４７６）の記載に従い、以下のように行った。共有結合により閉じられた環状プラスミドＤＮＡ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（２．９６ｋｂｐ）を、麦芽トポイソメラーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により弛緩させた。弛緩した環状ＤＮＡ（０．１  （ｇ；５単位のトポイソメラーゼＩによる）は、２ｍＭＡＴＰを含む集合緩衝液（ｐＨ７．５；終体積５０  （ｌ；１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中において、精製した組換えＧＳＴまたはＧＳＴ−ＣＩＡタンパク質（０．５  （ｇ）およびＨｅＬａコアヒストン（０．３  （ｇ）と反応させた。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いで同体積の停止Ａ緩衝液（２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１％ＳＤＳ、および２００  （ｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ）の添加後、３０分間インキュベートした。プラスミドはフェノール−クロロホルムにより抽出し、エタノールにより沈殿させた。精製したプラスミドは１．２％アガロースゲル中で電気泳動し、臭化エチジウムにより染色して可視化した。
（２）    結果
（２−１）    ヒストンシャペロン−関連因子ＣＩＡ−ＩＩの同定
この出願の発明者らは、ヒトＣＣＧ１のブロモドメイン含有フラグメント（ＣＣＧ１−ＢｒＤ）をコードするｃＤＮＡをベイトとして、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、ヒストンシャペロンＣＩＡに対するヒトｃＤＮＡを単離した（Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ５，  ２２１−２３３）。このスクリーニングから、発明者らは２０２個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする約１．６ｋｂｐのインサートｃＤＮＡを、正しい読み枠として同時に取得した。この配列はヒトＣＩＡのそれに類似していたことから、この推定上の生成物をＣＣＧ１−相互作用因Ａ−ＩＩ（ＣＩＡ−ＩＩ）と名づけた。図１Ａのアッセイにおいて示したように、Ｇａｌ４活性化ドメインに融合した完全長ＣＩＡ−ＩＩと、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合したＣＣＧ１−ＢｒＤとを同時発現するコロニーは、Ｘ−ｇａｌアッセイ（Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｓ．  ＆  Ｓｏｎｇ，  Ｏ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４０，  ２４５−２４６）において暗青色を示した。コロニーの色から判断されるように、ＣＩＡ−ＩＩとＣＣＧ１−ＢｒＤとの間の相互作用は明らかに、ＣＩＡとＣＣＧ１−ＢｒＤとの間の相互作用と同様に強力であった（図１Ａ）。さらに、ＣＩＡ−ＩＩと、ヒトＴＡＦＩＩ８０といった他のベイトと、またＨＭＧボックス様ドメインのようなヒトＣＣＧ１の他のドメインとの相互作用を検査したが、陽性反応は検出されなかった。このような相互作用が人為的な発現による偽陽性である可能性をさらに排除するべく、「プレイ」ベクター（ｐＡＣＴＩＩ）中に「ベイト」ｃＤＮＡをもつプラスミドと、「ベイト」ベクター（ｐＡＳＩ−ＣＹＨＺ）中に「プレイ」ｃＤＮＡをもつプラスミドを再構築した。結果（図１Ｂ）は、Ｇａｌ４  ＤＮＡ−結合ドメインに融合したＣＩＡ−ＩＩおよび、Ｇａｌ４活性化ドメインに融合したＣＧ１−ＢｒＤの同時形質転換体は、Ｘ−ｇａｌアッセイにおいて暗青色のコロニーを形成し、生体内におけるＣＩＡ−ＩＩとＣＣＧ１−ＢｒＤの間の相互作用が検証された。
（２−２）    ＣＩＡ−ＩＩの構造的特徴
図１Ｃに、ヒトＣＩＡ−ＩＩの推定されるアミノ酸配列を、ヒトＣＩＡのアミノ酸配列と整列した形で示した。ＣＩＡ−ＩＩのアミノ酸は、ＢＬＡＳＴホモロジー検索により判断されるように、ヒトＣＩＡのそれに最も類似している。即ち、ＣＩＡ−ＩＩとＣＩＡとは、全一次構造の７１％の配列同一性をもち、密接に関連している。ＣＩＡ−ＩＩの一次構造は、ＣＩＡおよび関連ポリペプチドの構造上の一つの特徴、すなわち、ＣＩＡおよび関連ポリペプチドがアミノ酸の位置３６／３７および１５３／１５４によって３つの部分に分けられることを示した（図１Ｃ、図４Ａも参照のこと）。Ｎ末端セグメント（残基１〜３６）はよく保存されており、その配列は互いに６７％の同一性を示す。中央のセグメント（３７〜１５３）はＣＩＡとＣＩＡ−ＩＩとの間で最も高度に保存されており、その９１％のアミノ酸配列が、何らギャップ配列なしに互いに同一である。この中央のセグメントはまた、進化の上でも種の間で保存されているが、ＣＩＡについての分裂酵母（ｐｏｍｂｅ）のオーソログであるｃｉａ１には、二つのギャップ配列がある（Ｕｍｅｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ７，  ５９−７３）。一方、Ｃ末端セグメント（残基１５４〜２０２／２０４）はより保存性が低く、その配列は互いに２９％の同一性を示しており、一つのギャップ配列をもつ。このＣＩＡ−ＩＩのＣ末端配列は、７つの酸性残基（１４％）を含んでおり、それはヒトＣＩＡの酸性残基（１０残基；２０％）よりも少ない。したがって、陰イオン性残基に富むＣ末端領域は、原生動物のＣＩＡオーソログ（すなわち、出芽酵母のＡｓｆｌｐおよび分裂酵母のｃｉａ１）に特異的である（Ｕｍｅｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ７，  ５９−７３）。
（２−３）    ＣＩＡ−ＩＩのヒストン結合活性
ＣＩＡ−ＩＩはＣＩＡと相同性を持つことから、ＣＩＡ−ＩＩはヒストンシャペロンであると考えられる。このことを明らかにするべく、ヒトＣＩＡと結合するヒストンＨ３のｃＤＮＡを使用した酵母のツーハイブリッドアッセイ（Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ５，  ２２１−２３３）により、ＣＩＡ−ＩＩのヒストン相互作用活性を調べた。Ｇａｌ４結合ドメインに融合したＣＩＡ−ＩＩをコードしているプラスミドを、Ｇａｌ４活性化ドメインに融合したヒストンＨ３をコードしているプラスミドとともに酵母細胞に共発現した（図２Ａ）。ＣＩＡ−ＩＩとヒストンＨ３との間の相互作用は、β−ガラクトシダーゼアッセイにおける暗青色のコロニーから陽性と判明した（図２Ａ）。ＣＩＡ−ＩＩとＨ３との間のこの相互作用の強さは、ＣＩＡとヒストンＨ３間の相互作用の強さとほぼ同じであると考えられる。次に、ＣＩＡ−ＩＩのこの相互作用が直接的であるかどうかを決定するべく、コアヒストンに対するインビトロでのＣＩＡ−ＩＩの結合アッセイを行なった。ＧＳＴに融合した組換えＣＩＡ−ＩＩを大腸菌内で発現させ、グルタチオン−セファロース樹脂を用いてほぼ均一に精製した（図２Ｂ）。精製した組換えＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩの分子サイズは、約４８ｋＤａであった（図２Ｂ、レーン２）。この組換えタンパク質を用いて、コアヒストンに対するインビトロの結合アッセイを行なった。ＨｅＬａコアヒストンを、図２Ｃに示したようなグルタチオン−セファロース樹脂を用いて固定したＧＳＴ（レーン２）、ＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩ（レーン３）、またはＧＳＴ−ＣＩＡ（レーン４）とともにインキュベートした。吸着したヒストンはＳＤＳ試料緩衝液を用いて溶出し、１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＣＢＢ染色したゲル（図２Ｃ）は、ＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩがコアヒストンＨ３／Ｈ４に対し優先的に結合したが（レーン３）、Ｈ２Ａ／Ｈ２Ｂとは結合しなかった。一方、ＧＳＴはコアヒストンに結合しなかった（レーン２）。これらの結果は、ＣＩＡ−ＩＩがインビトロにおいてヒストンＨ３／Ｈ４と特異的かつ直接的に結合することを示唆している。
（２−４）    ＣＩＡ−ＩＩのヌクレオソーム集合活性
ＣＩＡ−ＩＩは、ヒストン相互作用活性（図２Ａおよび２Ｃ）を持つことから、ヌクレオソーム集合を促進することが想定される。そこで、インビトロにおいてプラスミドの超コイル化アッセイを行なった。図２Ｄに示したように、ＧＳＴ（レーン５）、ＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩ（レーン６）、またはＧＳＴ−ＣＩＡ（レーン７）を、弛緩した環状プラスミドおよびＨｅＬａコアヒストンと混合し、ヌクレオソーム集合活性について調べた。このアッセイでは、プラスミドＤＮＡがヌクレオソームを形成するとトポイソメラーゼＩの作用により負の超らせんが導入される。実験の結果、ＣＩＡ−ＩＩがプラスミドＤＮＡの超らせん化を促進すること、また超らせんＤＮＡを生じるためのＣＩＡ−ＩＩの活性が、ＮＡＰ−１（レーン４）またはＣＩＡ（レーン７）などの他のヒストンシャペロンの活性に匹敵することを見出した。これらの結果は、ＣＩＡ−ＩＩがヌクレオソーム集合を促進する活性を示し、実際にヒストンシャペロンのファミリーに属することを示している。
（２−５）    ＣＩＡ−ＩＩの細胞内局在性
ＣＩＡ−ＩＩはこのようにヒストンシャペロンであることが証明されるが、その細胞内での役割はまだ明らかにされていない。ＣＩＡ−ＩＩが細胞質において新規に合成されたヒストンの集合に関与しているかどうか、あるいは核におけるヌクレオソームＤＮＡ介在性の事象を調節しているかどうかを決定するため、次にＣＩＡ−ＩＩの細胞内局在を調べた。Ｇａｌ４を融合したＣＩＡ−ＩＩをＨｅＬａ細胞へ導入し、その細胞内局在性をＸ−ｇａｌを用いて可視化した（図２Ｅ）。Ｇａｌ４タンパク質は、核および細胞質の双方に拡散するが、Ｇａｌ４−ＴＢＰは核に局在化する。この正常条件下で、Ｇａｌ４−ＣＩＡ−ＩＩはＨｅＬａ細胞の核内に特異的に局在化することがわかった（図２Ｅ）。さらに、Ｇａｌ４−ＣＩＡも核内に局在化した。これらの結果は、核内でのヌクレオソームの集合においてヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩがＣＩＡと同様に関与すること、およびＣＩＡ−ＩＩが細胞質内で新規に合成されたヒストンの構造維持には寄与しないことを示唆している。
（２−６）    ＣＩＡおよびＣＩＡ−ＩＩの組織分布
ヒトゲノムはなぜ、密接に関係する核ヒストンシャペロンをコードしている二つの遺伝子、ＣＩＡおよびＣＩＡ−ＩＩを含むのであろうか。一つの可能性は、これらのヒストンシャペロンが多細胞生物の異なる細胞か、または異なる発生段階において優先的に利用される、ということである。この仮説を調べるため、１６の異なるヒト組織において、ＣＩＡ−ＩＩおよびＣＩＡの分布をノーザンブロット分析法により調べた。その結果、分析した組織（図３の中央パネル）において、ヒトＣＩＡ転写産物がほぼ偏在して分布することがわかった。一方、ヒトＣＩＡ−ＩＩ転写産物は、精巣、胸腺、小腸、および結腸などの限定的な組織においてのみ検出された（上部パネル）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの量は、β−アクチンを対照プローブとして用いたノーザンブロット分析（下部パネル）により確認した。
（２−７）    精巣生殖細胞におけるマウスＣＩＡ−ＩＩの限定的発現
ヒトＣＩＡ−ＩＩの発現は精巣において最も高かった（図３、レーン４）。精巣は、種々の生殖細胞と、セルトリ細胞、ライデッヒ細胞、およびマクロファージなどの体細胞から成る。精巣におけるＣＩＡ−ＩＩの発現が生殖細胞かまたは体細胞に限定されているかどうかを確かめるため、まずＣＩＡ−ＩＩまたはＣＩＡをコードしているｃＤＮＡを、マウスポリ（Ａ）＋ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりスクリーニングした。図４Ａにおいて概略的に示したように、ＤＮＡプライマーはＣＩＡ−ＩＩとＣＩＡの双方の高度に保存された領域に相当する遺伝子フラグメントとハイブリダイズするようデザインした（材料および方法を参照のこと）。その結果、２種類のマウスｃＤＮＡを得た。一方の配列はヒトＣＩＡ−ＩＩのそれに、他方はヒトＣＩＡのそれに類似していた。次に、ＷＢＢ６Ｆ１−Ｗ／ＷＶ突然変異マウスおよびＷＢＢ６Ｆ１＋／＋野性型マウスの精巣から、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製し、単離したマウスＣＩＡ−ＩＩ  ｃＤＮＡをプローブとして用いたノーザンブロッティングにより、マウスＣＩＡ−ＩＩ転写産物の量を比較した。成体ＷＢＢ６Ｆ１−Ｗ／ＷＶマウスの精巣は体細胞を含んでいるが、ｃ−ｋｉｔ遺伝子内の突然変異のため、精巣生殖細胞を欠損している（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １１３，  ６８９−６９９）。図４Ｂに示したように、マウスＣＩＡ−ＩＩ転写産物は成体ＷＢＢ６Ｆ１−Ｗ／ＷＶ突然変異マウスの精巣では検出されなかった（上部パネル、レーン２）が、野性型マウスにおいてはマウスＣＩＡ−ＩＩ転写産物は豊富に検出された（レーン１）。このＲＮＡをブロットしたフィルターも、転写伸長因子Ｓ−ＩＩ−Ｔ１をコードしているｃＤＮＡとハイブリダイズさせた（中央パネル）が、その理由はＳ−ＩＩ−Ｔ１が精巣の生殖細胞において特異的に発現され（Ｕｍｅｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２１，  ５９８−６０３；  Ｕｍｅｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｇｅｎｅ，  １６７，  ２９７−３０２）、ＷＢＢ６Ｆ１−Ｗ／ＷＶ突然変異マウスの精巣では失われているからである（Ｕｍｅｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２１，  ５９８−６０３）。さらに、ＷＢＢ６Ｆ１−Ｗ／ＷＶ突然変異体および野性型マウスからのＲＮＡ量がほぼ等しかったことを証明するため、β−アクチン遺伝子を用いてハイブリダイゼーションを行った（下部パネル）。これらの結果は、精巣におけるマウスＣＩＡ−ＩＩの発現が精巣の生殖細胞に特異的であることを示している。
（２−８）    減数分裂中の生殖細胞におけるマウスＣＩＡ−ＩＩの発現
雄の生殖細胞は、有糸分裂および減数分裂を通して劇的に分化する（Ｂｅｌｌｖｅ，  Ａ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ７４，  ６８−８５）。したがって、どの種類の生殖細胞においてＣＩＡ−ＩＩが発現されるのかを決定するため、マウス精巣細胞の遠心洗浄を用いることにより、タイプの異なる分化した細胞におけるＣＩＡ−ＩＩ転写産物の分布を分析した。このサイズ分画法は、各々パキテン期精母細胞、球状精細胞、伸長精細胞、および残余小体に富む異なる分画を生じることが可能である（Ｕｍｅｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２１，  ５９８−６０３）。図４Ｃは各々の分画と、比較のための精巣全体の成分を示している。これらの細胞分画を用いて、分化した精子形成細胞におけるマウスＣＩＡ−ＩＩの発現レベルを、ノーザンブロット分析法により調べた（図４Ｄ、上部パネル）。その結果、ＣＩＡ−ＩＩ転写産物はパキテン期精母細胞の分画（レーン１）および精巣全体（レーン５）に特異的に蓄積していたが、球状精細胞、伸長精細胞、または残余小体に富む分画には蓄積しないことを見い出した（各々、レーン２〜４）。この分画実験において、β−アクチン転写産物の量は、各分画において同じレベルに保たれており（下部パネル）、Ｓ−ＩＩ−Ｔ１はどの分画においても検出された（中央パネル）。
【００３７】
（２−９）  減数分裂前の生殖細胞におけるマウスＣＩＡ−ＩＩの発現
減数分裂前の精原細胞を遠心洗浄により分画することは難しく、ＣＩＡ−ＩＩが初期の精子形成細胞において発現するかどうかは不明だった。精巣生殖細胞の出現は誕生後に調節されることから、ＣＩＡ−ＩＩが出現する精巣生殖細胞の段階を決定するため、マウスＣＩＡ−ＩＩ  ｍＲＮＡの発現プロファイルを、新生児マウスの精巣において調べた（図５Ａ）。まず、４日齢〜５６日齢のマウスの精巣からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。この観察期間を通じて、β−アクチン転写産物は比較的一定しており、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、各レーンにおいてほぼ同量であった（下部パネル）。パキテン期精母細胞の始まりの対照として、生後１０〜１４日でのＳ−ＩＩ−Ｔ１  ｍＲＮＡの出現（中央パネル）を示した（Ｕｍｅｈａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２１，  ５９８−６０３）。マウスＣＩＡ−ＩＩ転写産物は４日齢以降のマウスの精巣において既に存在していた（上部パネル）。減数分裂前の精原細胞は、４日齢で精巣内に存在することが知られている（Ｂｅｌｌｖｅ，  Ａ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ７４，  ６８−８５；  Ｎｅｂｅｌ，  Ｂ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９６１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １３４，  ８３２−８３３）。先に記載したとおり、ＣＩＡ−ＩＩの発現はマウス精巣の生殖細胞に特異的であり、マウスＣＩＡ−ＩＩ遺伝子は、減数分裂前の精原細胞で転写されていることを示唆している。マウスＣＩＡ−ＩＩのｍＲＮＡレベルは１４日齢〜３５日齢のマウスの精巣において比較的一定であったが、５６日齢の成体マウスの精巣においては減少していた（図５Ａ）。成体（５６日齢）の精巣では、精巣内の雄性の生殖細胞の中で精細胞が最も豊富である（細胞全体の約７０％）。したがって、マウスＣＩＡ−ＩＩ遺伝子は減数分裂後の精細胞内では転写されないことが示唆される。これらの実験プロファイルに基づき、精巣におけるマウスＣＩＡ−ＩＩの発現が、図５Ｂに概略的に示したように、減数分裂前から減数分裂の間の生殖細胞に特異的であると結論づけられる。
【００３８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、特に精子系列細胞で発現する新規なヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩが提供される。哺乳類の発生または分化の調節におけるヒストンシャペロンの役割についての理解が深まるとともに、このヒストンシャペロンＣＩＡ−ＩＩおよびその遺伝子発現を対象とした細胞死（特に癌細胞死）の促進や、各種薬剤成分のスクリーニングが可能となる。
【００３９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒストンシャペロンＣＩＡ関連因子ＣＩＡ−ＩＩの同定。（Ａ）ヒトＣＣＧ１のブロモドメインの相互作用因子としてのＣＩＡ−ＩＩの同定。ＳＮＦ４、ＣＩＡ−ＩＩ、およびＣＩＡはＧａｌ４活性化ドメインに融合され、ＳＮＦ１およびヒトＣＣＧ１のブロモドメイン含有セグメント（ＣＣＧ１−ＢｒＤ）はＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインに融合されている。これらの因子の相互作用を、酵母のツーハイブリッド系におけるβ−ガラクトシダーゼアッセイにより調べた。ＳＮＦ１−ＳＮＦ４の組合せは、このアッセイにおける陽性の相互作用を表しており、暗青色のコロニーを形成する。陰性の相互作用は白色コロニーで示されている。（Ｂ）ツーハイブリッド相互作用の確認。ＳＮＦ１、ＣＩＡ−ＩＩ、およびＣＩＡはＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合され、ＳＦＮ４およびＣＣＧ１−ＢｒＤはＧａｌ４活性化ドメインに融合されている。（Ｃ）ヒトＣＩＡ−ＩＩのアミノ酸配列。ヒトＣＩＡ−ＩＩのアミノ酸配列（上部）を、ヒトＣＩＡのアミノ酸配列（下部）とともに示した。ヒトＣＩＡ−ＩＩ  ｃＤＮＡ（配列番号１）は２０２個のアミノ酸から成るタンパク質（配列番号２）をコードしている。右側の数字はアミノ酸の位置を示す。上部の配列と同じアミノ酸は“．”で、ギャップ配列は“−”で示している。
【図２】ＣＩＡ−ＩＩのヌクレオソーム集合活性。（Ａ）インビボにおけるヒトＣＩＡ−ＩＩのヒストン結合活性。ＳＮＦ１、ヒトＣＩＡ−ＩＩ、およびヒトＣＩＡはＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインに融合され、ＳＮＦ４およびヒストンＨ３はＧａｌ４活性化ドメインに融合されている。ダッシュはインサートＤＮＡ無しを意味する。暗青色のコロニーは該当因子間で相互作用があることを示している。（Ｂ）組換えヒトＣＩＡ−ＩＩの精製。ＧＳＴ（レーン１）、ＧＳＴ融合ＣＩＡ−ＩＩ（レーン２）、またはＧＳＴ融合ＣＩＡ（レーン３）を、グルタチオン−セファロース樹脂を用いて精製した。ゲルは、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した。サイズマーカー（レーン４）の位置を右側に示す。精製した組換えＧＳＴ、ＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩ、およびＧＳＴ−ＣＩＡタンパク質は、各々約２８ｋＤａ、４８ｋＤａ、および５０ｋＤａに移動した（レーン１〜３）。（Ｃ）組換えヒトＣＩＡ−ＩＩの、コアヒストンＨ３／Ｈ４とのインビトロにおける結合。ＨｅＬａコアヒストンを、グルタチオン−セファロース樹脂に固定されたＧＳＴ（レーン２）、ＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩ（レーン３）、またはＧＳＴ−ＣＩＡ（レーン４）と反応させた。吸着したヒストンをＳＤＳ試料緩衝液で溶出し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲルはＣＢＢで染色した。レーン１はインプットしたコアヒストンの四分の一量を示す。各タンパク質の位置を左に示した。（Ｄ）プラスミド超らせん化アッセイによる、インビトロにおけるコアヒストン依存性のヒトＣＩＡ−ＩＩのヌクレオソーム集合活性。ＧＳＴ（レーン５）、ＧＳＴ−ＣＩＡ−ＩＩ（レーン６）、またはＧＳＴ−ＣＩＡ（レーン７）を、弛緩したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）プラスミド、およびＨｅＬａコアヒストンと反応させ、そのヌクレオソーム集合活性を調べた。１．２％アガロースゲルにおいては、負に超らせん化されたプラスミドの移動度は、弛緩したものの移動度よりも大きい。レーン１および２は、各々負に超らせん化および弛緩した形状のプラスミドを表している。タンパク質なし（レーン３）またはＮＡＰ−１（レーン４）でのインキュベーションは、反応のネガティブおよびポジティブな対照として各々用いた。負に超らせん化した（Ｓ）および弛緩した（Ｒ）形状のプラスミドのゲル移動度は、右に示されている。（Ｅ）ＨｅＬａ細胞におけるヒトＣＩＡ−ＩＩの細胞内局在。Ｇａｌ４融合プラスミドをＨｅＬａ細胞へ導入し、ベクターにコード化された各々のポリペプチドの細胞内局在をＸ−ｇａｌの添加により可視化した。分析に用いた構築物は以下の通りである：対照、ベクター（Ｇａｌ４）；ＣＩＡ−ＩＩ、Ｇａｌ４−ヒトＣＩＡ−ＩＩ；ＣＩＡ、Ｇａｌ４−ヒトＣＩＡ；およびＴＢＰ、Ｇａｌ４−ヒトＴＢＰ。
【図３】ヒトの組織におけるＣＩＡ−ＩＩの限定的な発現。ノーザンブロット分析において、完全長ヒトＣＩＡ（上部）、ヒトＣＩＡ−ＩＩ（中央）、またはヒトβ−アクチンｃＤＮＡ（下部）をプローブとして用いた。各々の転写産物の位置は、矢印により右に示している。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、レーンの上部に示されている１６種類の異なるヒト組織から別々に収集した（各々、レーン１〜１６）。
【図４】精子形成におけるマウスＣＩＡ−ＩＩの発現。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲによるマウスＣＩＡ−ＩＩ  ｃＤＮＡの単離。ヒトＣＩＡ−ＩＩおよびＣＩＡタンパク質を、１〜２０２および１〜２０４の長方形として、各々概略的に示した。Ｎ末端、中央、およびＣ末端のセグメントを区切って示している。番号は、セグメント化の端のアミノ酸を示す。核セグメントの配列の相同性は、パーセントにより表されている。ＲＴ−ＰＣＲ用のＤＮＡプライマーの位置、およびそれに続くノーザンブロットに使用されるマウスｃＤＮＡフラグメントの位置を、各々矢印および細い黒色のバーで下に示した。（Ｂ）成体ＷＢＢ６Ｆ１−Ｗ／ＷＶマウスの精巣におけるマウスＣＩＡ−ＩＩ転写産物の消失。ＷＢＢ６Ｆ１＋／＋（レーン１）およびＷＢＢ６Ｆ１−Ｗ／ＷＶ突然変異マウス（レーン２）の精巣から収穫した１５マイクログラムの全ＲＮＡを電気泳動した。マウスＣＩＡ−ＩＩ（上部）、精巣特異的マウスＳ−ＩＩ−Ｔ１（中央）、またはヒトβ−アクチンｃＤＮＡ（下部）をプローブとして用いた。（Ｃ）各細胞分画の顕微鏡像。パキテン期の精母細胞（ａ）、球状精細胞（ｂ）、伸長精細胞（ｃ）、および残余小体（ｄ）に富む分画を、全精巣（ｅ）と比較した。（Ｄ）精巣生殖細胞の異なる発生段階におけるマウスＣＩＡ−ＩＩ転写産物の蓄積。４つの異なる段階の雄の生殖細胞を用いて、ノーザンブロット分析を行った。パキテン期精母細胞（レーン１）、球状精細胞（レーン２）、伸長精細胞（レーン３）、残余小体（レーン４）に富む分画、および全精巣（レーン５）から調製した２０マイクログラムの全ＲＮＡを膜上にブロットし、マウスＣＩＡ−ＩＩ（上部）、精巣特異的マウスＳ−ＩＩ−Ｔ１（中央）、またはヒトβ−アクチンｃＤＮＡ（下部）とハイブリダイズした。
【図５】精巣生殖細胞の間の、マウスＣＩＡ−ＩＩの減数分裂前の発現。（Ａ）精巣成熟におけるマウスＣＩＡ−ＩＩの発現。マウス齢は、精巣の発育段階の指標として、オートラジオグラムの上に記載した。分析に使用したマウス齢は、生後４（レーン１）、７（レーン２）、１０（レーン３）、１４（レーン４）、１７（レーン５）、２１（レーン６）、２４（レーン７）、２８（レーン８）、３５（レーン９）、および５６（レーン１０）日である。各々のレーンは、２マイクログラムのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含んでいた。ＣＩＡ−ＩＩ（上部）、精巣特異的マウスＳ−ＩＩ−Ｔ１（中央）、またはβ−アクチンｃＤＮＡ（下部）をプローブとして用いた。野性型マウスの精巣における精原細胞、パキテン期精母細胞、および精細胞の発現は、矢印により上部に示した。（Ｂ）精子形成におけるＣＩＡ−ＩＩ  ｍＲＮＡの発現プロファイルの図式的要約。矢印は分化の方向を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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