(57)【要約】【課題】α−１，３−グルコシド結合を有するニゲロオリゴ糖等のオリゴ糖や配糖体を効率的に生成させることができる、α−１，３−グルコシド結合を効率的に生成し得る新規α−グルコシダーゼを供給する。新規α−グルコシダーゼの製造方法及びその製造方法に使用できる新規な菌株の提供。【解決手段】非還元性末端にα−１，４−グルコシド結合を有する糖質に作用して、糖転移反応によりα−１，３−グルコシド結合を生成し、α−１，６−グルコシド結合を生成しないα−グルコシダーゼ。アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する微生物を培養して、得られる培養物から上記のα−グルコシダーゼを採取するα−グルコシダーゼの製造方法。アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元性末端にα−１，４−グルコシド結合を有する糖質に作用して、糖転移反応によりα−１，３−グルコシド結合を生成し、α−１，６−グルコシド結合を生成しないことを特徴とするα−グルコシダーゼ。
【請求項２】
α−１，４グルコシド結合、α−１，３グルコシド結合、α−１，２グルコシド結合、α‐１，６グルコシド結合の加水分解反応によりグルコースを生成する請求項１に記載のα−グルコシダーゼ。
【請求項３】
下記の理化学的性質を有するα−グルコシダーゼ。
（１）作用
非還元性末端にα−１，４−グルコシド結合を有する糖質に作用して、糖転移反応によりα−１，３−およびα−１，４−グルコシド結合を生成し、α−１，６−グルコシド結合を生成しない。加水分解反応によりグルコースを生成する。
（２）分子量
５１０００と６００００の２つのポリペプチドを一つの単位とした、４４００００の４量体を構成する。
（３）等電点
ｐＩ　４．５
（４）至適温度
５０から５５℃
（５）至適ｐＨ
ｐＨ　７．０
（６）温度安定性
４５℃以下で９０％以上の残存活性を示す。
（７）ｐＨ安定性
ｐＨ６〜１１で９０％以上の残存活性を示す。
【請求項４】
アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する微生物を培養して、得られる培養物から請求項１〜３のいずれか１項に記載のα−グルコシダーゼを採取することを特徴とするα−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項５】
前記微生物が、アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株、アクレモニウム・ルズレー（Ａ．　ｌｕｚｕｌａｅ）、アクレモニウム・フシジオイデス（Ａ．　ｆｕｓｉｄｉｏｉｄｅｓ）、アクレモニウム・スクレロチゲナム（Ａ．　ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）、またはアクレモニウム・インプリカタム（Ａ．　ｉｍｐｌｉｃａｔｕｍ）である請求項４記載のα−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項６】
アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規α−グルコシダーゼ及びその製造方法、並びに新規α−グルコシダーゼ生成能を有する新規菌株に関する。さらに詳細には、本発明は、糖転移反応によりα−１，３−グルコシド結合を生成し、α−１，６−グルコシド結合を生成しないα−グルコシダーゼとその製造方法、及びこの新規α−グルコシダーゼ生産能を有する新規菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
α−グルコシダーゼは多くの微生物、動植物が有する酵素であるが、その基質特異性は幅広い。現在、工業的なイソマルトオリゴ糖の製造にはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）起源のα−グルコシダーゼが用いられている。しかし、このα−グルコシダーゼを用いた糖転移反応では、α−１，６−グルコシド結合を有するイソマルトオリゴ糖が主生成物として得られ、その他の様々なα−グルコシド結合を有するイソマルトオリゴ糖も同時に生成される。そのため、最終的には様々な結合様式を有するオリゴ糖混合物が得られる。
【０００３】
近年、様々なオリゴ糖や配糖体の合成において、目的とするグルコシド結合を効率よく生成させ、高い特異性で目的とする反応生成物を得られる酵素が求められている。特にグルコースがα−１，３−グルコシド結合で結合したニゲロオリゴ糖に関しては、免疫調節機能（非特許文献１参照）や、天然色素の退色抑制効果（特許文献１参照）などの特有の機能性が見出されている。そのため、α−１，３−グルコシド結合を効率的に生成する特異性の高い酵素が求められていた。
【０００４】
α−１，３−グルコシド結合を効率的に生成する糖転移反応を触媒する糖転移酵素として、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）起源の酵素が報告されている（特許文献２参照）。特許文献２に記載の酵素は、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用し、その非還元末端グルコース部の３位にグルコース単位をα−１→３結合する活性、及びその後にα−１→３結合を保持したまま近接するα−１→４結合を切断して得られたオリゴ糖を低分子化する活性を有する糖転移酵素である。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｓ．ムロサキ（Ｍｕｒｏｓａｋｉ）ら著、インターナショナル・イムノファーマコロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）　２、２００２年、オランダ、ｐ．１５１−１５９
【特許文献１】
特開平２０００−１８９１０１号公報
【特許文献２】
特開平５−５９５５９号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、α−１，３−グルコシド結合を有するニゲロオリゴ糖等のオリゴ糖や配糖体を効率的に生成させることができる、α−１，３−グルコシド結合を効率的に生成し得る新規α−グルコシダーゼを供給することである。さらに、本発明は、そのような新規α−グルコシダーゼの製造方法及びその製造方法に使用できる新規な菌株の提供を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、新たにα−１，３−グルコシド結合を効率的に生成するα−グルコシダーゼを検索した。その結果、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する新規菌株が、α−１，３−グルコシド結合を効率的に生成し、α−１，６−グルコシド結合を生成しない新規α−グルコシダーゼを生産することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
更に、本発明者らは、前記新規α−グルコシダーゼを生産する微生物を、公知菌株より検索し、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属するアクレモニウム・ルズレー（Ａ．　ｌｕｚｕｌａｅ）、アクレモニウム・フシジオイデス（Ａ．　ｆｕｓｉｄｉｏｉｄｅｓ）、アクレモニウム・スクレロチゲナム（Ａ．　ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）、アクレモニウム・インプリカタム（Ａ．　ｉｍｐｌｉｃａｔｕｍ）の菌株が、α−１，３−グルコシド結合を効率的に生成し、α−１，６−グルコシド結合を生成しないα−グルコシダーゼを生産することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の通りである。
（１）非還元性末端にα−１，４−グルコシド結合を有する糖質に作用して、糖転移反応によりα−１，３−グルコシド結合を生成し、α−１，６−グルコシド結合を生成しないことを特徴とするα−グルコシダーゼ。
（２）α−１，４グルコシド結合、α−１，３グルコシド結合、α−１，２グルコシド結合、α‐１，６グルコシド結合の加水分解反応によりグルコースを生成する（１）に記載のα−グルコシダーゼ。
（３）下記の理化学的性質を有するα−グルコシダーゼ。
（１）作用
非還元性末端にα−１，４−グルコシド結合を有する糖質に作用して、糖転移反応によりα−１，３−およびα−１，４−グルコシド結合を生成し、α−１，６−グルコシド結合を生成しない。加水分解反応によりグルコースを生成する。
（２）分子量
５１０００と６００００の２つのポリペプチドを一つの単位とした、４４００００の４量体を構成する。
（３）等電点
ｐＩ　４．５
（４）至適温度
５０から５５℃
（５）至適ｐＨ
ｐＨ　７．０
（６）温度安定性
４５℃以下で９０％以上の残存活性を示す。
（７）ｐＨ安定性
ｐＨ６〜１１で９０％以上の残存活性を示す。
（４）アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する微生物を培養して、得られる培養物から（１）〜（３）のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを採取することを特徴とするα−グルコシダーゼの製造方法。
（５）前記微生物が、アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株、アクレモニウム・ルズレー（Ａ．　ｌｕｚｕｌａｅ）、アクレモニウム・フシジオイデス（Ａ．　ｆｕｓｉｄｉｏｉｄｅｓ）、アクレモニウム・スクレロチゲナム（Ａ．　ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）、またはアクレモニウム・インプリカタム（Ａ．　ｉｍｐｌｉｃａｔｕｍ）である（４）のα−グルコシダーゼの製造方法。
（６）アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の新規α−グルコシダーゼは、非還元性末端にα−１，４−グルコシド結合を有する糖質に作用して、糖転移反応によりα−１，３−グルコシド結合を生成し、α−１，６−グルコシド結合を生成しないことを特徴とする。
糖転移反応の条件は、後述の実施例４において説明する。
ここで、非還元性末端にα−１，４−グルコシド結合を有する糖質とは、例えば、マルトオリゴ糖や澱粉などである。
【００１１】
さらに、本発明のα−グルコシダーゼは、マルトオリゴ糖のほか、コージビオース、ニゲロースなどの結合様式の異なるオリゴ糖やパラニトロフェニル−α−マルトシド（ｐＮＰαＧ２）などの人工基質、さらに微弱ではあるがイソマルトースやパラニトロフェニル−α−グルコシド（ｐＮＰαＧ）などに対する加水分解反応によりグルコースを生成する。
加水分解反応の条件は、１ｍＭのマルトース、ニゲロース、コージビオース、イソマルトース、トレハロース、ショ糖、マルトトリオース、マルトテトラオース、ｐＮＰαＧ、ｐＮＰαＧ２および１（ｗ／ｖ）％の可溶性澱粉に対して、３７℃、ｐＨ７の条件で、０．００５Ｕの本酵素を添加し、２時間反応した。
本発明のα−グルコシダーゼは、従来利用されているアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）起源のα−グルコシダーゼと同様に、本質的には糖質加水分解酵素であり、前記特許文献２に記載の糖転移酵素とは別個のものである。
【００１２】
本発明のα−グルコシダーゼは、より具体的には下記の酵素化学的性質を有する。
（１）作用
非還元性末端にα−１，４−グルコシド結合を有する糖質に作用して、糖転移反応によりα−１，３−およびα−１，４−グルコシド結合を生成し、α−１，６−グルコシド結合を生成しない。加水分解反応によりグルコースを生成する。
（２）分子量
５１０００と６００００の２つのポリペプチドを１つの単位とした、４４００００の４量体を構成する。
（３）等電点
ｐＩ　４．５
（４）至適温度
５５℃
（５）至適ｐＨ
ｐＨ　７．０
（６）温度安定性
４５℃以下で９０％以上の残存活性を示す。
（７）ｐＨ安定性
ｐＨ６〜１１で９０％以上の残存活性を示す。
【００１３】
上記本発明のα−グルコシダーゼは、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する微生物を培養して、得られる培養物から本発明のα−グルコシダーゼを採取することにより製造することができる。アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する微生物としては、例えば、本発明の新規菌株アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株を用ることができる。
【００１４】
以下に、本発明の新規菌株アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株の菌学的性質を示す。
ポテトデキストロースアガー、オートミールアガー、麦芽寒天のそれぞれの培地で、生育はやや遅く、２５℃、１週間培養で直径１７〜１８ｍｍに達する。菌糸は綿毛状でやや低凸状の盛り上がりを示す。気中菌糸色調は白色を呈する。全ての培地において培養開始５日後あたりから白色の分生子の形成が認められる。分生子は鎖状で、培養４週間まで色調の変化は認められない。分生子柄束の形成、および可溶性色素の産生は認められない。気中菌糸の幅はほぼ一定で、時折菌糸束を形成する。分生子柄は直立し、全てが気中菌糸より単生する。二次的な分枝を示す分生子柄はほとんど認められない。フィアライドは若干屈曲した構造を成し、大きさは変化に富む。フィアライドは中腹で膨れず、先端に向かうに従い幅は細まった。菌糸およびフィアライドの表面は平滑である。分生子は１細胞性で平滑からやや粗面である。形は紡錘形で湾曲したものは観察されなかった。
【００１５】
以上に示した性質を菌類分類法に照合すると、本菌はアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属しており、本発明者らは本菌をアクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株と命名した。
本菌は平成１４年９月１３日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１１として寄託されている。
【００１６】
アクレモニウムに属する微生物としては、アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１１）以外に、例えば、公知微生物であるアクレモニウム・ルズレー（Ａ．　ｌｕｚｕｌａｅ）（寄託番号：ＩＦＯ３０５３５）、アクレモニウム・フシジオイデス（Ａ．　ｆｕｓｉｄｉｏｉｄｅｓ）（寄託番号：ＩＦＯ３１１４０）、アクレモニウム・スクレロチゲナム（Ａ．　ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）（寄託番号：ＩＦＯ８３８５）、アクレモニウム・インプリカタム（Ａ．　ｉｍｐｌｉｃａｔｕｍ）（寄託番号：ＩＦＯ３０５３８）など、及びこれらの菌株の変種・変異株も利用できる。
【００１７】
本発明のα−グルコシダーゼを得るためにアクレモニウムに属する微生物を培養するために用いる培地は、微生物が生育でき、本発明のα−グルコシダーゼを産生し得る栄養培地であればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。これらの培地に含有させる炭素源及び窒素源は特に限定されるものではなく、炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、マルトース、グルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、還元澱粉加水分解物などを、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物や尿素、コーンスティープリカー、カゼイン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆粉、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素化合物などを用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩などが適宜用いられる。更に、必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどを添加することもできる。
【００１８】
培養は、微生物が増殖し、本発明のα−グルコシダーゼを産生する条件で行なえばよく、例えば、温度４〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行い、培養時間は１２時間〜１０日で好気的に行えばよい。
【００１９】
このようにして微生物を培養後、本発明のα−グルコシダーゼを回収する。培養物からのα−グルコシダーゼの回収は常法に準じて行なうことができる。例えば、遠心分離又は濾過等の固液分離手段により菌体を除去して粗酵素溶液とすることができる。また、必要に応じて塩析、各種カラムクロマトや限外濾過などの通常の酵素精製の手段を用いて精製酵素を得ることもできる。本発明で得られたα−グルコシダーゼを用いて、特開平９−２９９０９５号公報に示されているようにニゲロオリゴ糖を含有する糖液を調製することができるが、この場合には本発明のα−グルコシダーゼは粗酵素であっても精製酵素であっても構わない。本発明のα−グルコシダーゼの精製は、公知の手法を用いて行なうことができるが、その一例として、培養物を遠心分離により除菌後、ＤＥＡＥ−トヨパール、ブチルトヨパール、トヨパールＨＷ−５５を用いて精製することにより、電気泳動的に均一な酵素を得ることができる。
【００２０】
本発明のα−グルコシダーゼを用いて、α−１，４グルコシド結合、α−１，３グルコシド結合、α−１，２グルコシド結合、α‐１，６グルコシド結合を有する、オリゴ糖や多糖を原料として、４５℃、ｐＨ７の条件で、１２〜７２時間、糖転移反応をすることにより得られる。このニゲロオリゴ糖の生成反応には、必要に応じて他の加水分解酵素などの糖質関連酵素を併用することができるのはいうまでもない。このようにして得られた、α−１，３−グルコシド結合を有するニゲロオリゴ糖は、まろやかな甘味を有し、食品の呈味改善や天然色素の退色抑制効果、免疫調節機能など様々な機能性が明らかとなっており、食品用途を中心に更に幅広い分野での利用が期待されている素材である。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）　アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株の培養
コーンスターチ（日本食品化工（株）製）０．５％（ｗ／ｖ）、シェフトンＤ（シェフィールド製）０．７５％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、炭酸ナトリウム１．０％（ｗ／ｖ）および水からなる液体培地をｐＨ８．０に調整し、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株を接種し、２８℃、１３０ｒｐｍで２４時間培養したものを種培養液とした。
【００２２】
上記と同じ組成の培養液を４Ｌ調製し、５Ｌ容三角フラスコに１Ｌずつ入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、種培養液５％（ｖ／ｖ）を接種し、２８℃、１３０ｒｐｍで９６時間培養した。除菌した培養液中の本酵素活性は、０．００３単位／ｍｌであった。
【００２３】
（実施例２）　酵素の精製
実施例１で得られた培養液を、４℃の冷却下で、１００００ｒｐｍで遠心分離して、菌体を除いた上清約４Ｌを得た。この上清をＰＭ−１０膜（ミリポア製）を用いて２００ｍｌまで濃縮し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて緩衝化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍを充填したカラム（２．６φ×４５ｃｍ）にのせ、同緩衝液にて未吸着のタンパク質が溶出し終わるまで洗浄した。その後、０→１Ｍの食塩濃度のリニアグラディエントにて酵素を溶出した。得られた活性画分を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、続いて２Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、ＰＭ−１０膜を用いて１０ｍｌまで濃縮した。この酵素溶液を２Ｍ硫安を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて緩衝化したブチル−トヨパール６５０Ｍを充填したカラム（１．６φ×６０ｃｍ）にのせ、同緩衝液にて未吸着のタンパク質が溶出し終わるまで洗浄した。その後、２→０Ｍの硫安濃度のリニアグラディエントにて酵素を溶出した。活性画分を回収し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した後、ＰＭ−１０膜を用いて２ｍｌまで濃縮した。この酵素溶液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて緩衝化したトヨパールＨＷ−５５Ｆを充填したカラム（１．６φ×９５ｃｍ）にのせ、同緩衝液にて酵素を溶出した。活性画分を回収し、ＰＭ−１０膜を用いて２ｍｌまで濃縮し、精製酵素標品とした。得られた精製酵素標品の総活性量は５．２７単位、比活性は１３．１単位／ｍｇタンパク質であった。
得られた精製酵素標品は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のタンパク質染色バンドを示し、高度に精製された標品であることを示した。
【００２４】
（実施例３）　酵素の性質の分析
実施例２で得られた精製酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、２本のタンパク質染色バンドを示し、その分子量は５１０００と６００００であった。また、ゲル濾過法で求めた分子量では４４００００を示した。本酵素は５１０００と６００００の２つのポリペプチドを１つの単位として、４量体であることが示唆された。また、精製酵素標品を等電点電気泳動に供したところ、単一のタンパク質染色バンドを示し、その等電点は４．５であった。
【００２５】
本酵素の温度及びｐＨの影響を調べたところ、図１に示すように反応至適温度は５０から５５℃、また図２に示すように反応至適ｐＨはｐＨ　７．０であった。本酵素の温度安定性については、各温度で酵素溶液を１５分間処理した後、残存する酵素活性を測定した。その結果を図３に示した。また、ｐＨ安定性については、各ｐＨのＢｒｉｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液を用いて５℃、２４時間処理し、リン酸緩衝液にてｐＨを７．０に戻した後の残存活性を測定した。その結果を図４に示した。本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性は、それぞれ４５℃付近、ｐＨ
６〜１１であった。
尚、酵素活性の測定は、以下の条件で行った。
酵素活性の測定
▲１▼酵素溶液希釈溶液　１．０ｍｌを正確に試験管にはかり、３７℃±０．２℃で５分間放置し保温する。
▲２▼２％　マルトース溶液も同様に３７±０．２℃で５分間保温する。
▲３▼保温した２％　マルトース溶液１．０ｍｌを正確にはかり、保温してある酵素製剤希釈溶液　１．０ｍｌに添加し攪拌する。
▲４▼これを３７±０．２℃で正確に１０分間放置した後、０．５Ｎ塩酸　１．０ｍｌを添加し攪拌をする。
▲５▼これに０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液１．０ｍｌを添加し攪拌をする。
▲６▼発色試薬　１．０ｍｌをピペットマンにて添加し攪拌をする。
▲７▼直ちに３７±０．２℃の恒温水槽にて２５分間放置し発色反応を行う。
▲８▼攪拌後、５０５ｎｍの吸光度を測定する。この際超純水を対照とする。
【００２６】
（実施例４）　本酵素の反応
実施例２で得られた精製酵素標品を用いて、本酵素のマルトースに対する反応を調べた。マルトース（日本食品化工（株）製）を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に２０％（ｗ／ｗ）濃度となるように溶解し、マルトース固形分１グラムあたり０．５単位を添加して、５０℃にて４８時間反応を行なった。反応液を沸騰水中に１０分間放置し、酵素を失活させた後、イオン交換樹脂により脱塩を行ない、ＨＰＬＣにて反応生成物の分析を行なった。ＨＰＬＣ分析は、カラムにアサヒパック（Ａｓａｈｉｐａｋ）　ＮＨ２Ｐ−５０（昭和電工（株）製）を用い、溶離液として７５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、ＲＩ検出器を用いて行った。その結果、図５に示すように２糖画分にマルトースと異なるピークが認められ、市販標準糖質との比較からこのピークがニゲロースであることを確認し、その生成率は５．２％であった。
【００２７】
（実施例５）　公知菌株からのα−グルコシダーゼの生産とオリゴ糖の生成
公知微生物のうち、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する菌株で、本発明のα−グルコシダーゼ産生能の確認された菌株を表１に示す。これらの菌株を実施例１と同様に培養し、培養液上清のα−グルコシダーゼ産生能と、培養液上清を粗酵素として用いて実施例４と同様にマルトースを基質として反応を行った際のマルトース以外のオリゴ糖生成率も表１に示した。なお、オリゴ糖の生成率は、ＨＰＬＣを用いた分析にて、その全エリアを１００％として求めた。
いずれの菌株の酵素を用いた場合にも、アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株が産生するα−グルコシダーゼと同様にニゲロースの生成が認められ、イソマルトースの生成は認められなかった。
【００２８】
【表１】
2004105072.tif 000002
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、新規菌株であるアクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）ＹＷ１株が提供される。この菌株から産生されるα−グルコシダーゼは、α−１，３−グルコシド結合を効率的に生成することができる。このα−グルコシダーゼにより、α−１，３−グルコシド結合を有するニゲロオリゴ糖を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株の産生するα−グルコシダーゼの反応至適温度を示す図である。
【図２】アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株の産生するα−グルコシダーゼの反応至適ｐＨを示す図である。
【図３】アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株の産生するα−グルコシダーゼの温度安定性を示す図である。
【図４】アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株の産生するα−グルコシダーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図５】アクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）　ＹＷ１株の産生するα−グルコシダーゼを２０％マルトースに反応させた際のＨＰＬＣ分析チャートである。
【図１】
2004105072.tif 000003
【図２】
2004105072.tif 000004
【図３】
2004105072.tif 000005
【図４】
2004105072.tif 000006
【図５】
2004105072.tif 000007