(57)【要約】【課題】慢性肝炎患者における、肝細胞癌の検出法を提供すること。【解決手段】被検組織における肝細胞癌低発現遺伝子の発現レベルを検出することを特徴とする、肝細胞癌の検出法および検出ツール。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定することにより、肝細胞癌を検出することを特徴とする癌細胞の検出方法。
【請求項２】
プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定することにより、肝細胞癌を検出することを特徴とする癌細胞の検出方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルの測定を、遺伝子転写物の測定により行う請求項１又は２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項４】
転写物から調製されたｃＤＮＡをもとに、該遺伝子ＤＮＡの全域または一部を増幅し定量化する工程を有する請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
遺伝子の発現レベルの測定を、インベーダー法により行う請求項１又は２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
転写物から調製された標識化ｃＤＮＡに対して、固層化された当該遺伝子ＤＮＡの全域または一部とハイブリダイゼーションさせることにより発現レベルの測定がなされる請求項１又は２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
被検組織が、慢性肝炎患者の肝組織である請求項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
次の工程を含む肝細胞癌の判定方法。
ａ）アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定する工程、
ｂ）ａ）で測定した発現レベルとコントロールにおける前記遺伝子の発現レベルとを比較する工程。
【請求項９】
次の工程を含む肝細胞癌の判定方法。
ａ）プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定する工程、
ｂ）ａ）で測定した発現レベルとコントロールにおける前記遺伝子の発現レベルとを比較する工程。
【請求項１０】
アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを定期的に測定することを特徴とする肝細胞癌の早期検出方法。
【請求項１１】
プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを定期的に測定することを特徴とする肝細胞癌の早期検出方法。
【請求項１２】
アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群を構成する遺伝子ＤＮＡの全域又はその一部を固層化してなる、遺伝子の発現レベルを測定するためのＤＮＡチップ。
【請求項１３】
プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群を構成する遺伝子ＤＮＡの全域又はその一部を固層化してなる、遺伝子の発現レベルを測定するためのＤＮＡチップ。
【請求項１４】
肝細胞癌を検出するための、請求項１２又は１３に記載のＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、慢性肝炎患者等の被検組織における遺伝子の発現レベルの測定による肝細胞癌の検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在ウイルス性肝炎の患者は世界中で５億人とも言われている。特に、南アジアにおいては、人口の２４．８％がＢ型もしくはＣ型肝炎に感染しており、その５％が慢性化している。さらに、この慢性型肝炎は約２０年の長期間を経て肝細胞癌に移行することが知られている。
【０００３】
肝細胞癌の検出及び診断は、現在、腹部超音波検査、腹部ＭＲＩ検査、腹部ＣＴ、血管造影、血清中腫瘍マーカーの生化学的検査、肝生検などが広く行われているが、遺伝子レベルでの有効な方法はまだ知られていない。
【０００４】
一方、癌化は、正常細胞が外界からの種々の要因によって影響を受け、遺伝子レベルでの変化あるいは変異を生じ、これがタンパクレベルに反映し、最終的に正常細胞の営みが破綻した結果の一つであって、ヒト肝細胞癌においても遺伝子レベルでの変化又は変異について、多くの報告が見受けられる。たとえば、ｃ−ｍｙｃについて、３３．３％から３６．４％の遺伝子発現量の増加が報告されている（たとえば非特許文献１および２参照。）。Ｋ−ｒａｓでは０％から１６．７％の頻度で点突然変異が生じていることが報告されている（たとえば非特許文献３および４参照。）。Ｐ５３でも２３．１％から５０％の頻度で点突然変異の生じることが報告されている（たとえば非特許文献５，６，７，８および９参照。）。さらに、Ｒｂおよびｐ５３では、ヘテロ接合（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）の消失が、それぞれ４２．９−４３．１％及び５０−５２．９％で生じることが観察されている（たとえば非特許文献７，８，１０および１１参照。）。しかし、これらの遺伝子の変化の数値は、前癌性の肝炎が肝細胞癌に移行するメカニズムを解明するには十分なものではない。
【０００５】
また、発現量の低下する遺伝子として、アルドラーゼＢ（たとえば非特許文献１２参照。）、アルブミン（たとえば非特許文献１３参照。）に関する報告がある。また、ラット肝発ガンモデルにおいて、カルバミルフォスフェート合成酵素１の発現量が癌の悪性度に比例して低下するという報告もある（たとえば非特許文献１４参照。）。
【０００６】
しかし、肝細胞癌を検出するための有効な方法は、未だ確立されていなかった。
【０００７】
【非特許文献１】
オンコロジー（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ），　１９９９年，　５７巻，　ｐ．１５７−１６３
【０００８】
【非特許文献２】
ジャーナル　オブ　フォルモス　メヂカル　アソーシエイション　（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　ＦｏｒｍｏｓＭｅｄｉｃ　ａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），　１９９３年，　９２巻，　ｐ．８６６−８７０
【０００９】
【非特許文献３】
アンテイキャンサー　リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），　１９９５年，　１５巻，　ｐ．８５９−８６１
【００１０】
【非特許文献４】
オンコジーン　（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ），　１９９１年，　６巻，　ｐ．８５７−８６２
【００１１】
【非特許文献５】
キャンサー　（Ｃａｎｃｅｒ），　１９９４年，　７４巻，　ｐ．３０−３７
【００１２】
【非特許文献６】
ギャトロエンテロジー（Ｇａｔｒｏｅｎｔｅｒｌｏｇｙ），　１９９９年，　１１７巻，　ｐ．１５４−１６０
【００１３】
【非特許文献７】
ジャーナル　オブ　ヘパトロジー　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），　１９９３年，　　１９巻，　ｐ．３１２−３１５
【００１４】
【非特許文献８】
ブリテイッシュ　ジャーナル　オブ　キャンサー　（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　　Ｃａｎｃｅｒ），　１９９９年，　８０巻，　ｐ．５９−６６
【００１５】
【非特許文献９】
ジャーナル　オブ　ギャストロエンテロロジカル　ヘパトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），　１９９５，　年１０巻，　ｐ．１７９−１８５
【００１６】
【非特許文献１０】
キャンサー　リサーチ　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），　１９９４年，　５４巻，　ｐ．４１７７−４１８２
【００１７】
【非特許文献１１】
ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　キャンサー　（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒａｎａｌ　ｏｆ　　Ｃａｎｃｅｒ），　１９９９年，　３５巻，　ｐ．１７３０−１７３４
【００１８】
【非特許文献１２】
ジャーナル　オブ　クリニカル　ラボラトリ　アナリシス　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ），　１９９４年，　８巻，　ｐ．１４４−１４８
【００１９】
【非特許文献１３】
ジャーナル　オブ　ヒストケミストリ　アンド　サイトケミストリ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　１９９７年，　４５巻，　ｐ．７９−８７
【００２０】
【非特許文献１４】
サイエンチア　シニカ　シリーズ　ビ　（Ｓｃｉｅｎｔｉａ　Ｓｉｎｉｃａ　Ｓｅｒｉｅｓ　Ｂ），　１９８８年，　３１巻，　ｐ．１９７−２０３
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、肝細胞癌の有効な検出方法、より具体的には、遺伝子の発現レベルを測定することによる肝細胞癌の検出方法又は診断方法を提供することにある。さらに、肝細胞癌を検出するための有効な手段及び材料を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、慢性肝炎患者の肝臓における癌部位と非癌部位における遺伝子の発現レベルを網羅的に比較検討した。その結果、癌化により発現量の著しく低下する遺伝子が存在することを見出し、更に検討を重ねて、本発明を完成するに到った。
【００２３】
即ち、本発明は、以下の事項に係る。
【００２４】
項１：アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定することにより、肝細胞癌を検出することを特徴とする癌細胞の検出方法。
【００２５】
項２：プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定することにより、肝細胞癌を検出することを特徴とする癌細胞の検出方法。
【００２６】
項３：遺伝子の発現レベルの測定を、遺伝子転写物の測定により行う項１又は２のいずれかに記載の検出方法。
【００２７】
項４：転写物から調製されたｃＤＮＡをもとに、該遺伝子ＤＮＡの全域または一部を増幅し定量化する工程を有する項３に記載の検出方法。
【００２８】
項５：遺伝子の発現レベルの測定を、インベーダー法により行う項１又は２のいずれかに記載の検出方法。
【００２９】
項６：転写物から調製された標識化ｃＤＮＡに対して、固層化された当該遺伝子ＤＮＡの全域または一部とハイブリダイゼーションさせることにより発現レベルの測定がなされる項１又は２のいずれかに記載の検出方法。
【００３０】
項７：被検組織が、慢性肝炎患者の肝組織である項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
【００３１】
項８：次の工程を含む肝細胞癌の判定方法。
【００３２】
ａ）アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定する工程、
ｂ）ａ）で測定した発現レベルとコントロールにおける前記遺伝子の発現レベルとを比較する工程。
【００３３】
項９：次の工程を含む肝細胞癌の判定方法。
【００３４】
ａ）プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定する工程、
ｂ）ａ）で測定した発現レベルとコントロールにおける前記遺伝子の発現レベルとを比較する工程。
【００３５】
項１０：アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを定期的に測定することを特徴とする肝細胞癌の早期検出方法。
【００３６】
項１１：プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを定期的に測定することを特徴とする肝細胞癌の早期検出方法。
【００３７】
項１２：アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群を構成する遺伝子ＤＮＡの全域又はその一部を固層化してなる、遺伝子の発現レベルを測定するためのＤＮＡチップ。
【００３８】
項１３：プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群を構成する遺伝子ＤＮＡの全域又はその一部を固層化してなる、遺伝子の発現レベルを測定するためのＤＮＡチップ。
【００３９】
項１４：肝細胞癌を検出するための、項１２又は１３に記載のＤＮＡチップ。
【００４０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４１】
なお、本明細書におけるアミノ酸、蛋白質、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００４２】
癌化により発現レベルが低下している遺伝子
本発明者が慢性肝炎患者の肝臓における癌部位と非癌部位における遺伝子の発現レベルを網羅的に比較検討した。
【００４３】
具体的には、上記両組織から調製したｍＲＮＡをもとに、蛍光標識化したｃＤＮＡライブラリーを合成し、これを電気泳動にて分離した。次いで、両組織における蛍光強度の差異を調べ、癌部位における顕著な発現の低下が認められるものを、候補遺伝子としてピックアップした（図１）。次いで、該候補遺伝子をクローニングし、それらの塩基配列を決定した。更に、該候補遺伝子について、再度癌部位および非癌部位から調製したｍＲＮＡ溶液を用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの手法で定量化を行い、実際に、肝細胞癌において低発現であることを確認した。
【００４４】
この結果、８つの遺伝子が、肝細胞癌において発現レベルが低下している遺伝子であることが明らかになった。
【００４５】
この８つの遺伝子について、ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子データベースを用いて解析した結果、配列表の配列番号１〜８に示す遺伝子であることがわかった。
【００４６】
このうち、配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子は、アルドラーゼＢをコードする遺伝子である。
【００４７】
配列番号２で表される塩基配列を有する遺伝子は、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉをコードする遺伝子である。
【００４８】
配列番号３で表される塩基配列を有する遺伝子は、プラスミノーゲンをコードする遺伝子である。
【００４９】
配列番号４で表される塩基配列を有する遺伝子は、ＥＳＴ５１５４９（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡ３４５５２２）であって、その機能は未だ明らかにされていない。
【００５０】
配列番号５で表される塩基配列を有する遺伝子は、アルブミンをコードする遺伝子である。
【００５１】
配列番号６で表される塩基配列を有する遺伝子は、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１をコードする遺伝子である。
【００５２】
配列番号７で表される塩基配列を有する遺伝子は、レチノール結合タンパク４をコードする遺伝子である。
【００５３】
配列番号８で表される塩基配列を有する遺伝子は、オーガニックアニオントランスポーターＣをコードする遺伝子である。
【００５４】
該８つの遺伝子は、表１に示されるように、肝細胞癌における発現レベルが著しく低下していた。
【００５５】
検出方法
本発明の検出方法は、慢性肝炎患者等の被検組織において上記８つの遺伝子の発現レベルを測定することを特徴とする。
【００５６】
上述したように、該８つの遺伝子は、肝細胞癌における発現レベルが顕著に低下しており、これら遺伝子の発現レベルの変化を測定することによって、肝細胞癌等の癌細胞を検出することが可能となる。
【００５７】
具体的には、アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定することにより、肝細胞癌を検出することができる。
【００５８】
本発明の検出法は、８つの遺伝子のうちいずれか一つを含む遺伝子群の発現レベルの測定によって行ってもよく、或いは、８つの遺伝子のうちの数個の組合せを含む遺伝子群、又は８個全ての遺伝子を含む遺伝子群の発現レベルの測定によって、行ってもよい。
【００５９】
８つのうち数個の組合せを含む遺伝子群を用いた検出法としては、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定することによる肝細胞癌の検出方法等が挙げられる。
【００６０】
遺伝子の発現レベルを測定する方法は、従来公知の方法を適宜用いることができ、特に制限されることはない。
【００６１】
具体的には、被検組織に存在する目的遺伝子の転写物を定量する方法、目的遺伝子の翻訳物を定量する方法などを挙げることができる。
【００６２】
遺伝子の転写物を定量する方法とは、被検組織中からｍＲＮＡを抽出し、該遺伝子由来ＲＮＡ量を測定する方法である。
【００６３】
被検組織からのＲＮＡ抽出および精製は、常法に従って、行うことができるが、具体的には、以下のように、行うことができる。被検組織にフェノールとチオシアン酸グアニジンを含む溶液を添加し、溶解またはホモジナイズした後、クロロホルムを加え、遠心分離操作により上層の水溶液層と下層の有機層に分離する。ＲＮＡは、水層に回収されるため、上層を分取することによりＲＮＡを回収する。次いで、回収液にたとえばイソプロパノールを添加し、ＲＮＡを沈殿せしめ洗浄することにより高純度のＲＮＡを得る。抽出されたＲＮＡは、トータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌＲＮＡ）として用いてもよく、もしくは精製ｍＲＮＡとして用いてもよい。
【００６４】
該ＲＮＡ量を測定する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、インベーダー法、ＤＮＡアレイ、ノーザンブロット解析又はその他の各種方法等を挙げることができる。
【００６５】
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ｍＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、適当なプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（一般的には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて目的領域のＤＮＡを合成するものである。通常、ＤＮＡの変性、アニール、伸長反応の工程を繰り返すことによって、ＤＮＡを増幅させることにより、ＲＮＡ量を測定する。
【００６６】
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、目的遺伝子を特異的に増幅できる領域であれば、塩基配列中のどの領域を使用してもよく、また塩基配列の長さにも特に制限はない。通常は、２０−３０ヌクレオチドのものを使用する。
【００６７】
また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて使用されるＤＮＡ鎖と親和性を有する蛍光分子としては、ＣＹＢＲグリーン（ＣＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ）、ピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）、エチジウムブロマイドなどを例示することができ、好適にはＣＹＢＲグリーンが用いられる。
【００６８】
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＤＮＡを数１０万倍に増幅でき、高感度であること、被検試料が微量ですむこと等の点から、好適に用いられる。
【００６９】
また、インベーダー法とは、ＲＮＡまたはＤＮＡ上において、これと相補的なプローブ（インベーダープローブ）および非相補的な部分を５′側に持つ相補的プローブ（シグナルプローブ）を結合させることにより、この立体構造を認識する酵素クレアべーゼ（Ｃｌｅａｖａｓｅ）にてシグナルプローブを切断せしめる工程、および切断されたシグナルプローブのいずれかの断片を検出することにより遺伝子発現レベルを測定する工程からなる方法である。
【００７０】
インベーダープローブとしては、目的転写物に対して相同的なものを用いればよく、特に塩基配列の長さに制限はない。また、シグナルプローブについても、インベーダープローブと転写物上で３重鎖構造を形成する塩基配列、具体的には５′側に非相補部位および３′側に相補部位を持ちクレアベーゼが立体構造を認識し切断できるよう設計されたプローブであれば、塩基配列の長さ等は特に制限されない。さらに、切断されたシグナルプローブ断片の測定法としては、例えばシグナルプローブ断片が転写物の非相補部位であれば、該断片と蛍光物質標識プローブによりクレアベーゼで切断せしめることにより得られた断片の蛍光シグナルを測定することにより転写物が定量化できる。この場合の蛍光物質標識プローブとしては、シグナルプローブ断片と相補的塩基配列を一部にもち、該断片がハイブリダイゼーションした時、上述と同様クレアベーゼ認識立体構造を形成するよう設計されたＤＮＡプローブであって、切断遊離部分に発光物質が、また非切断部分に消光物質が標識化されており、未切断状態において発光シグナルを発しない状態のものであればよい。発光物質は、通常蛍光物質又はりん光物質等が好適に使用され、消光物質はＣｙ３等が好適に使用される。シグナルプローブ断片が転写物の相補部位である場合は、例えば該断片に対して相補部分を含む固層化オリゴヌクレオチドに該遊離断片を捕獲させフルオレセインを取込ませ蛍光抗体法を用いて検出する方法等を例示することができ、市販の測定キットなどを用いて行うことができる。
【００７１】
インベーダー法は、プローブ自体を標識化する必要がないという点、および増幅操作を要しないという点から、特に好適に用いられる。
【００７２】
一方、遺伝子の翻訳物を定量する方法とは、目的遺伝子がコードするタンパク質を定量するものであって、該タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法、例えばウエスタンブロット解析、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ法およびその他各種方法を用いてタンパク質量を定量することにより、実施することができる。
【００７３】
上述のような転写物および翻訳物の測定値は、目的遺伝子の発現レベルを反映するものである。従って、該測定法を用いて、遺伝子発現レベルの低下した部位を調べることにより、肝細胞癌の検出を行うことができる。
【００７４】
判定方法
上述した８つの遺伝子の発現レベルを測定することによって、肝細胞癌であるかの判定を行うこともできる。
【００７５】
具体的には、次のように行うことができる。
【００７６】
まず、アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームｐ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定する。
【００７７】
次に被検組織における該遺伝子の発現レベルと、コントロールにおける前記遺伝子の発現レベルとを比較し、コントロールに比べて発現レベルが低下している場合に、被検組織中に肝細胞癌等の癌細胞の存在する可能性が高いと判定することができる。
【００７８】
本発明の判定方法は、８つの遺伝子のうちいずれか一つを含む遺伝子群の発現レベルの測定によって行ってもよく、或いは、８つの遺伝子のうちの数個の組合せを含む遺伝子群、又は８個全ての遺伝子を含む遺伝子群の発現レベルの測定によって、行ってもよい。
【００７９】
８つのうち数個の組合せを含む遺伝子群を用いた判定方法としては、例えば、ａ）プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを測定する工程、ｂ）ａ）で測定した発現レベルとコントロールにおける前記遺伝子の発現レベルとを比較する工程を有する肝細胞癌の判定方法等が挙げられる。
【００８０】
コントロールは、判定の目的や手段に応じて適宜設定することができるが、例えば、健常者組織或いは慢性肝炎患者における肝組織の非癌部位又は末梢血単核球等を用いることができる。
【００８１】
該判定方法は、肝炎患者の診断、治療などに有用に適用することができる。
【００８２】
早期検出法
上述の８つの遺伝子の発現レベルの変化を調べることによって、肝細胞癌又は肝細胞癌に移行する可能性の高い部位の早期検出も行うことができる。
【００８３】
具体的には、以下のように行うことができる。
【００８４】
アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームｐ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを定期的に測定し、該定期的な測定の結果、遺伝子の発現低下が見られる場合に、該被検部位を、肝細胞癌或いは肝細胞癌に移行する可能性の高い部位として検出することができる。
【００８５】
本発明の早期検出法は、８つの遺伝子のうちいずれか一つを含む遺伝子群の発現レベルの測定によって行ってもよく、或いは、８つの遺伝子のうちの数個の組合せを含む遺伝子群、又は８個全ての遺伝子を含む遺伝子群の発現レベルの測定によって、行ってもよい。
【００８６】
８つのうち数個の組合せを含む遺伝子群を用いた早期検出法としては、例えば、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群の被検組織における発現レベルを定期的に測定する方法等が挙げられる。
【００８７】
定期的に行う間隔は、特に制限されるものではないが、例えば、半年もしくは１年の間隔で行うことができ、患者や被検者の状態によって適宜設定することができる。
【００８８】
上記検出方法は、肝細胞癌の予防や治療、肝炎患者の予後の解析等に利用することができる。
【００８９】
ＤＮＡチップ
上記検出方法並びに判定方法は、８つの遺伝子を含む遺伝子群を固層化したＤＮＡチップを用いることによって、より効率よく行うことができる。
【００９０】
遺伝子群を基板に固層化したものには、一般的にＤＮＡアレイという名称もあり、これはさらにＤＮＡマイクロアレイおよびＤＮＡマクロアレイに分類されるが、本発明におけるＤＮＡチップには、該ＤＮＡアレイも包含される。
【００９１】
本発明のＤＮＡチップは、目的遺伝子ＤＮＡの全域又はその一部を合成し、該ＤＮＡを支持体に固層化することによって、製造することができる。
【００９２】
ＤＮＡチップにおける支持体（または基盤）としては、ＤＮＡを固層化できるものであれば特に制限はなく、シリコンチップ、スライドガラスおよびナイロン膜などを例示することができる。また、固層化においては、一般に用いられる方法であれば特に制限はなく、好適には、スポッターまたはアレイヤーなどを用いてＤＮＡをスポットする方法、または支持体上で順次ヌクレオチド合成を行う方法を例示することができる。
【００９３】
固層化する遺伝子のＤＮＡとしては、上記８つの遺伝子転写物より調製された標識化ｃＤＮＡと特異的にハイブリダイゼーションするものであれば、領域および塩基配列の長さは特に制限されない。ＰＣＲ産物、合成オリゴヌクレオチド或いはその部分断片なども好適に用いることができる。具体的には、アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群を構成する遺伝子ＤＮＡの全域又はその一部を上述したような方法によって固層化することによって、製造することができる。
【００９４】
本発明のＤＮＡチップにおいては、８つの遺伝子のうちのいずれか１つを含む遺伝子群を固層化して用いてよく、また、８つの遺伝子のうち数個の組合せを含む遺伝子群、或いは８個全てを含む遺伝子群を固層化して用いてもよい。
【００９５】
８つのうち数個の組合せを含む遺伝子群を固層化したＤＮＡチップとしては、例えば、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子群を構成する遺伝子ＤＮＡの全域又はその一部を固層化してなる、遺伝子の発現レベルを測定するためのＤＮＡチップ等が挙げられる。
【００９６】
８つの遺伝子は、肝細胞癌における発現レベルの低下が見られるものであることから、本発明のＤＮＡチップは、特に肝細胞癌検出用または肝細胞癌判定用として、特に好適に用いることができる。
【００９７】
本発明における検出法、判定方法およびＤＮＡチップ製造において用いられる種々の操作、例えばＤＮＡにおける化学合成、切断、削除、結合あるいは付加、および転写物にあっては、ｃＤＮＡ合成に用いる酵素、あるいは単離、精製、または増幅、複製などは、本願出願前公知の情報に従って行うことができる。また、得られる塩基配列決定あるいは配列確認は、例えばジデオキシ法やマキサムギルバート法に従って行うことができる。
【００９８】
【実施例】
以下、実施例を用いて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されることはない。
【００９９】
１．肝細胞癌低発現遺伝子の決定
試料として、ウイルス性慢性肝炎患者の肝臓組織における肝細胞癌病変部の細胞（Ｂ型２、Ｃ型２）および、同一肝臓組織における非癌部位の細胞を用いた。まず、肝炎患者から採取した癌組織および非癌化組織からトータルＲＮＡを抽出した。次いで、トータルＲＮＡの１ｕｇに、３’側部分ＲＯＸ蛍光標識化オリゴ−ｄＴ（ｏｌｉｇｏ−ｄＴ；ＧＴ１５ＭＧ，　ＧＴ１５ＭＡ，　ＧＴ１５ＭＴ，　ＧＴ１５ＭＣ：ＭはＧ，　Ａ，　Ｃ　の混合／グライナーラボルテクニック　ジャパン　／日本、ジエチルピロカルボネート処理水１１ｕｌ中に５０ｐｍｏｌ含む。）を加え、７０℃で１０分間処理を行い、さらに以下の組成からなる溶液Ａを加え、最終容量２０ｕｌとした。
（溶液Ａの組成）
５Ｘファーストストランドバッファー（ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ）（０．２５Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；　０．３７５　ｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ；　０．０５　ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）および０．０１５　ｍｏｌ／Ｌ）４　ｕｌ、０．１　ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール　２　ｕｌ、２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　デオキシヌクレオチドトリフォスフェート（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ（ｄＮＴＰｓ））１ｕｌ、リボヌクレアーゼ　インヒビター（４０ユニット；和光純薬工業株式会社（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，　Ｊａｐａｎ））１ｕｌおよびスーパースクリプトＩＩリバーストランスクリプターゼ（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（２００ユニット；ＢＲＬ，　ＵＳＡ）　１ｕｌ。
【０１００】
上記ＲＮＡ溶液を、４２℃で一時間反応させ、ｃＤＮＡを合成した後、ジエチルピロカルボネート処理水８０ｕｌを添加し、５倍に希釈した。ｃＤＮＡはＰＣＲにより増幅した。添加試薬および反応条件を以下に示す。
【０１０１】
添加試薬：反応液２ｕｌ、１０ｘＰＣＲバッファー（１００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、５００　ｍｍｏｌ／Ｌ　および１ｍｇ／ｍｌ　ｇｅｒａｔｉｎ，ｐＨ８．５）　２ｕｌ、２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ　１．６　ｕｌ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（５　ユニット／ｕｌ；　Ｒｏｃｈｅ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓ，　ＮＪ）０．２ｕｌ、５　ｐｍｏｌ　３’側ＲＯＸ蛍光標識化オリゴ−ｄＴプライマーおよび１０　ｐｍｏｌ
５’側ＲＯＸ蛍光標識化オリゴ−ｄＴプライマー。
【０１０２】
反応条件：１サイクル　９５℃／３分間、４０℃／５分間、７２℃／５分間、２−４０サイクル　９５℃／３０秒間、４０℃／２分間、７２℃／５分間。
【０１０３】
合成終了後、反応液は、７．５Ｍ　尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動ゲルを行い、ＦＭ　ＢＩＯ　ＩＩイメージング　アナライザー（宝酒造株式会社））上にて、解析したところ、非癌組織と比較して癌組織における蛍光強度に差異があり、癌組織において発現レベルが低下していると考えられる遺伝子（矢印）が種々確認された（図１）。該蛍光強度に差異のみられるバンド部分を切断し、次いで、この切断フラグメントをＴＥ　バッファー１００ｕｌ中で一時間浸透することにより、ＤＮＡの抽出を行った。その後、該抽出液をテンプレートとして、ＰＣＲにより再増幅を行った。反応条件は上記ＰＣＲと同様とした。
【０１０４】
２回目のＰＣＲ産物に関しては、３％アガロースゲル電気泳動後、バンド部分を切断し、ＧＦＸ　ＰＣＲ　ＤＮＡおよびＧｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　ＮＪ）を用いて回収した。再増幅ＤＮＡｓは、ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｊａｐａｎ，　Ｊａｐａｎ）を用いて、クローニングを行った。そして、両ＤＮＡ鎖はＡＢＩ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　ＵＳＡ）を用いて塩基配列を決定した。
【０１０５】
以上の工程より、肝細胞癌組織において顕著に発現量の低下している８つの遺伝子を見出した。該遺伝子の塩基配列をＧｅｎＢａｎｋで解析した結果、該遺伝子が、配列番号１〜８で表される塩基配列を有する遺伝子、具体的には、アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームｐ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子であることがわかった。
【０１０６】
２．肝細胞癌低発現遺伝子の癌細胞における発現量の測定
慢性肝炎患者由来肝細胞癌組織（２０検体）から抽出し、調製されたトータルＲＮＡをもとに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０１０７】
即ち、トータルＲＮＡ溶液に対して、１０Ｘ反応バッファー（Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｄＮＴＰ．，　ＭｇＣｌ２および　ＣＹＢＲグリーンフルオレッセント（Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を２　ｕｌ、テンプレートｃＤＮＡを２ｕｌおよびオリゴヌクレオチドプライマーを含む溶液２０ｕｌを用いて増幅反応を行った。
【０１０８】
反応条件は、９５℃／１０秒間、６５℃／１０秒間、７２℃／３０秒間を４０サイクルとした。ＰＣＲ増幅装置は、ライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ；Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
【０１０９】
測定された遺伝子の発現レベルを、同一慢性肝炎患者の非癌組織部分の細胞における同じ遺伝子の発現レベルと比較し、その結果を表１に示した。
【０１１０】
【表１】
2004105013.tif 000002
【０１１１】
表１において、ＨＢＶはＢ型肝炎ウイルスを、ＨＣＶはＣ型肝炎ウイルスを示す。
【０１１２】
また、（＋）は、感染していることを、（−）は非感染であることを示す。
【０１１３】
表１における数値は、分子が、５０％以上発現レベル低下した患者数を、分母が全被検患者数を示す。また、（）内の数値は、５０％以上発現レベルの低下した患者の全被検患者に対する割合を示す。
【０１１４】
表１の結果に示されるように、慢性肝炎の種類に関係なく、肝細胞癌では８遺伝子の発現レベルが５０％以上という高率において低下していることが明らかになった。
【０１１５】
【発明の効果】
本発明に示されるように、肝細胞癌においては、アルドラーゼＢ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素Ｉ遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク４遺伝子又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子の発現レベルが低下しており、該遺伝子の発現レベルを測定することにより、肝細胞癌の検出を適切に行うことが可能となる。また、該遺伝子のＤＮＡまたはその一部を固層化することにより、同検出法の有用なツールが提供される。
【０１１６】
また、該遺伝子の発現レベルを測定することによって、肝細胞癌の判定や早期検出を適切に行うことができ、肝細胞癌の予防、診断又は治療、並びに慢性肝炎の予後の解析などに応用することができる。
【０１１７】
【配列表】
2004105013.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、肝細胞癌および非癌組織部分における遺伝子発現レベルを比較した電気泳動の図である。
ＧＴＶＣはアンカープライマーを、ＡＰはアービタリープライマーを示す。
Ａ−Ｄは被験患者を示す。また、Ａ，ＢはＢ型ウイルス感染患者を、Ｃ，ＤはＣ型ウイルス感染患者を示す。
レーンＮは、非癌組織を、レーンＴは癌組織から調製した試料の電気泳動パターンである。また、Ｍは分子量マーカーを示す。
矢印は、電気泳動上肝細胞癌において発現量が低下しているバンドを示す。
【図１】
2004105013.tif 000024