(57)【要約】【課題】イムノクロマトグラフ法を用いて複数の検査を行う場合の煩雑さを解決する。【解決手段】支持体上に試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部が支持体の面積５×１０−３ｍ２あたり３以上存在することを特徴とするイムノクロマトグラフ媒体ならびに中心部から複数の展開部が放射状に延びてなり、各展開部は中心部でのみ結合している形状の支持体上の中心部以外の部分に、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部が形成されてなることを特徴とするイムノクロマトグラフ媒体。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部が支持体の面積５×１０−３ｍ２あたり３以上存在することを特徴とするイムノクロマトグラフ媒体。
【請求項２】
試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な標識微粒子と、被検出物質とを反応させたクロマト反応液を、支持体上に試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部が支持体の面積５×１０−３ｍ２あたり３以上存在するイムノクロマトグラブ媒体上を移動させ、被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部で捕捉して被検出物質を検出することを特徴とするイムノクロマトグラフ法。
【請求項３】
イムノクロマトグラフ媒体の片端に添加したクロマト反応液を反対端に展開させ、クロマト反応液が３カ所以上の検出部を連続して通過することを特徴とする請求項２のイムノクロマトグラフ法。
【請求項４】
中心部から複数の展開部が放射状に延びてなり、各展開部は中心部でのみ結合している形状の支持体上の中心部以外の部分に、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部が形成されてなることを特徴とするイムノクロマトグラフ媒体。
【請求項５】
１つの展開部に１種類の試料中の検出すべき被検出物と結合可能な物質が固定化されてなることを特徴とする請求項４記載のイムノクロマトグラフ媒体。
【請求項６】
試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な標識微粒子と、被検出物質とを反応させたクロマト反応液を、中心部から複数の展開部が放射状に延びてなり、各展開部は中心部でのみ結合している形状の支持体上の中心部以外の部分に、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部が形成されてなるイムノクロマトグラフ媒体の中心部から放射状にクロマト反応液を移動させ、被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部で捕捉して被検出物質を検出することを特徴とするイムノクロマトグラフ法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、動物、特にヒトの血液、唾液、尿、糞尿、汗など試料に含有される被検出物質を抗原−抗体反応を利用して検出する免疫測定法の一種であるイムノクロマトグラフ法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、微粒子を用いたイムノクロマトグラフ法にはコロイド状金属粒子、コロイド状金属酸化物粒子などが標識粒子として広く用いられており、特開昭５５−１５１００及び特開昭６４−３５３７２に記載されているごとくすでに公知である。
また、高分子ラテックス粒子および染料等により染色された高分子ラテックス粒子も標識粒子として使用されるようになり、特開平５−１０９５０号に記載されているごとくすでに公知である。本法を利用したものとして、ヒトゴナドトロピン（ｈＣＧ）を検出する妊娠診断薬がすでに市販されている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平８−９４６１８号公報
【特許文献２】
特開平５−１０９５０号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来、イムノクロマトグラフ法は被検出物質が存在する場合、クロマトグラフ検出部に判定ラインが現れ、それを目視で判定する方法である。
しかしこれまでのイムノクロマトグラフ法は、一つのクロマトグラフ展開部で一種の被検出物質を検出する方法が一般的であり、検出しようとする複数種類の被検出物質が同じ試料中に存在する場合であっても、イムノクロマトグラフを被検出物質の種類ごとに用意して個別に検査する必要があり、操作が煩雑であった。
本発明は、これらの煩雑さを解決するイムノクロマトグラフ法に関するものである。
【０００５】
【問題を解決するための手段】
本発明は、支持体上に試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部が支持体の面積５×１０−３ｍ２あたり３以上存在することを特徴とするイムノクロマトグラフ媒体（以下、「媒体１」という）、中心部から複数の展開部が放射状に延びてなり、各展開部は中心部でのみ結合している形状の支持体上の中心部以外の部分に、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部が形成されてなることを特徴とするイムノクロマトグラフ媒体（以下、「媒体２」という）ならびに前記媒体１または媒体２上に試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な標識微粒子と、被検出物質とを反応させたクロマト反応液を移動させ、被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部で捕捉して被検出物質を検出することを特徴とするイムノクロマトグラフ法を提供するものである。
以下、本発明について詳細に説明する。
【０００６】
媒体１
本発明の媒体１に使用される支持体は、溶媒の存在のもと標識微粒子が安定かつスムーズにクロマトグラフ的に移動して、クロマトグラフ検出部に確実に到達できるよう、標識微粒子より大きい孔径を有することが必要であり、具体的には、例えば濾紙、ガラス繊維濾紙、ニトロセルロース膜などが使用できる。
本発明において、被検出物質と結合可能な物質をクロマトグラフ検出部に固定化する方法としては、溶媒中で被検出物質と結合可能な物質をイムノクロマトグラフ媒体の孔径よりも大きな微粒子に固定化したのちに、支持体上の所望の位置に塗布し乾燥して固定化する方法が挙げられる。ここで使用される微粒子は、無機微粒子、高分子ラテックス粒子が挙げられる。また、ここで使用される被検出物質と結合可能な物質は被検出物質の抗体が挙げられる。
【０００７】
本発明において、媒体１の形状は通常帯状で、クロマトグラフ検出部はクロマト反応液の展開方向に対して垂直となるライン状に形成される。（図１参照）
媒体１において、クロマト反応液を移動させる長さは、通常１〜１０ｃｍ程度必要あり、クロマトグラフ検出部の長さ（ライン幅）は、通常０．５〜２ｃｍ程度である。
媒体１において、クロマトグラフ検出部はイムノクロマトグラフ媒体の面積５×１０−３ｍ２当たり、３ヶ所以上形成される。このクロマトグラフ検出部の数は、被検出物質の数により任意に設定することができるが、イムノクロマトグラフ媒体の面積５×１０−３ｍ２当たり２０ヶ所程度が上限の目安である。
クロマトグラフ検出部のライン間隔は通常０．５〜１０ｍｍ程度である。
【０００８】
媒体１は、各クラマトグラフ検出部における判定ラインのにじみを回避するために、には以下の方法で製造することが好ましい。
まず、濾紙、ガラス繊維濾紙、ニトロセルロース膜などの支持体（以下、「シート」という）全面に微粒子上に固定化された被検出物質と結合可能な物質を塗布または散布して乾燥させ、シート上に被検出物質と結合可能な物質を固定化する（以下、「検出シート」という）。
この検出シートの上下に濃度が０．０５〜０．５重量％デンプンのり溶液で湿らせた複数枚のシートを重ねて置き、乾燥させる。
ここで、被検出物質を固定化させた面を有するシートと、被検出物質を固定化させないシートとを組み合わせて重ねることにより、判定ラインと判定ラインとの間隔を任意に調整することが可能である。
続いてこの重ね合わせたシートを０．５〜２ｍｍ程度の厚さとなるように、上から縦に切ることでクロマトグラフが得られる。
【０００９】
媒体２
本発明において、媒体２は、中心部から複数の展開部が放射状に延びてなり、各展開部は中心部でのみ結合している形状の支持体の中心部以外に、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部が形成されてなる。（図２参照）
ここで、媒体２の支持体の材質としては、媒体１と同様のものを挙げることができる。
媒体２において放射状にのびた展開部の数は、被検出物質の種類数に応じて形成し、通常１つの展開部には１種のクロマトグラフ検出部を設ける。
媒体２において、クロマト反応液を移動させる長さは、通常１〜１０ｃｍ程度必要あり、クロマトグラフ検出部の長さ（ライン幅）は、通常０．５〜２ｃｍ程度である。
媒体２においても、被検出物質と結合可能な物質をクロマトグラフ検出部に固定化する方法としては、溶媒中で被検出物質と結合可能な物質をイムノクロマトグラフ媒体の孔径よりも大きな微粒子に固定化したのちに、支持体上の所望の位置に塗布し乾燥して固定化する方法が挙げられる。
イムノクロマトグラフ法
本発明において、被検出物質としては、動物、特にヒトの血液、唾液、尿、糞尿、汗など試料に含有されるものであれば特に限定されないが、例えば、タンパク質、糖タンパク質、脂質タンパク質、レセプター、酵素、ホルモン、ウイルス、ウイルス抗原・抗体等があげられる。具体的には、ヘモグロビン、ミオグロビン、ＣＲＰ、フィブリノーゲン、リウマチ因子、フェリチン、ｈＣＧ、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗体、ＨＩＶ、ＨＩＶ抗体、ＨＣＶ、ＨＣＶ抗体などが挙げられる。
【００１０】
本発明における試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質としては、一般的には前記に例示した被検出物質に対する抗体が挙げられる。
本発明における標識微粒子は、被検出物質と結合可能な物質を担持させることができるものであれば特に限定されないが、コロイド状金属粒子、コロイド状金属酸化物粒子などの無機微粒子が好ましく、コロイド状金属粒子としては、金、銀、銅などの微粒子が挙げられ、コロイド状金属酸化物粒子としては、水酸化鉄、水酸化銅、水酸化アルミニウムなどが挙げられる。
また、標識微粒子として、合成高分子からなるラテックス粒子も好ましく、さらに好ましくは、クロマトグラフ検出部でのヒトの肉眼による判定を容易にするために、染料で染色したラテックス粒子や、蛍光スキャナー等で画像処理による判定を容易にするために、蛍光染料で染色した粒子が挙げられる。
【００１１】
標識微粒子の粒径は、クロマトグラフ展開部の孔の中を通過できる大きさであれば特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１μｍ、さらに好ましくは０．０５〜０．５μｍである。粒径が０．０１μｍより小さい標識粒子はクロマトグラフ検出部での肉眼による判定がしにくくなり、また１μｍより大きい場合は、クロマトグラフ展開部の孔中の通過に支障が出てくる恐れがある。
【００１２】
被検出物質を固定化した標識微粒子と試料とを接触させ、この標識微粒子を反応部位を有する上記のクロマトグラフ媒体上でクロマトグラフ的に移動させる。
具体的には、標識微粒子の分散液と試料液とを混合し、この混合液に媒体１の場合には媒体の一端を接触させることにより、また媒体２の場合には混合液を媒体２の中心部に滴下し、当該混合液を、それが十分にクロマトグラフ検出部に到達するよう展開させればよい。
ここにおける混合液中の標識微粒子の濃度は、通常０．０００１〜０．０５重量％であり、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液などの緩衝液により調整される。ここで、緩衝液には、水溶性高分子化合物、無機塩類などの添加剤を添加して使用しても良い。
これにより、試料中に被検出物質である抗原が含有される場合には、標識微粒子に試料中の抗原が特異反応により結合すると共に、抗原がクロマトグラフ媒体のクロマトグラフ検出部における固定化試薬である抗体に結合する結果、標識微粒子が検出部に捕捉されるので、目視により判定することができる。
【００１３】
【実施例】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明がこれらによって限定されるものではない。
実施例１
標識微粒子の調製
ＪＳＲ（株）製赤色染色粒子、商品名、ＩＭＭＵＴＥＸ、Ｇ０３０１Ｒ（粒径０．３μｍ、固形分１０重量％）の懸濁液をリン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ」という）により固形分濃度が１重量％となるように希釈して得られた懸濁液１ｍｌと、ヒトフェリチンに対するモノクロナール抗体をＰＢＳで１００μｇ／ｍｌとなるように希釈して得られる抗体希釈液１ｍｌとをエッペンドルフチューブにとり、室温で２時間振とうして赤色染色粒子にフェリチン抗体を感作させた。続いて、濃度０．１重量％のウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という）を含有するＰＢＳを用いて３回遠心沈降によって洗浄し、最終的に２ｍｌとなるように再懸濁させることにより、感作粒子懸濁液Ａ―１を得た。
同様に、フェリチン抗体の代わりにミオグロビン抗体およびβ２−マイクログロブリン抗体を用いて感作粒子懸濁液Ａ−２およびＡ−３を得た。
【００１４】
検出部をもつイムノクロマトグラフ媒体の作成
ＪＳＲ（株）製ラテックス、商品名、ＩＭＭＵＴＥＸ、Ｇ１７０１（粒径０．８μｍ、固形分１０重量％）の固形分濃度が０．６重量％となるようにＰＢＳにより希釈し、その１ｍｌと、フェリチンに対するウサギ抗体を濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈したウサギ抗体希釈液１ｍｌとをエッペンドルフチューブにとり、室温で２時間振とうしてラテックス粒子にウサギ抗体を感作させた。次いで濃度０．１重量％のＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて３回遠心沈降して洗浄し、最終的に２ｍｌとなるように懸濁させることにより、固相ラテックス粒子Ｂ−１を得た。また同様に、フェリチンのウサギ抗体の代わりに、ミオグロビンおよびβ２−マイクログロブリンに対するウサギ抗体を用いて、固相ラテックス粒子Ｂ−２およびＢ−３を得た。次いで、ガラス繊維濾紙を幅１００ｍｍ、長さ８０ｍｍに切断して、濾紙片の一端から１５ｍｍの位置に、上記固相ラテックスＢ−１の２０μｌを、自動薄層クロマトグラフサンプラー「リノマートＩＶ」（ＣＡＭＡＧ社製）を用いて窒素雰囲気中で塗布して検出部を作成した。さらに固相ラテックスＢ−１塗布位置から５ｍｍずつ間隔を開けて、同様に固相ラテックスＢ−２およびＢ−３を塗布し、冷蔵庫中で乾燥して５ｍｍ幅間隔でガラス繊維濾紙を切断して、検出部をもつイムノクロマトグラフ媒体を得た。
【００１５】
検体の測定
感作粒子懸濁液Ａ―１、Ａ−２およびＡ−３それぞれが濃度０．０００５重量％となるように、濃度０．１重量％のＢＳＡ溶液と０．００１重量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含有するＰＢＳによって希釈して感作粒子混合液Ａ−４を得た。また、フェリチン、ミオグロビンおよびβ２−マイクログロブリンが種々の濃度となるよう、表１に示す混合試料液をＰＢＳで調製した。感作粒子混合液１５０μｌと混合試料液１５０μｌをとり、混合してクロマト反応液とした。このクロマト反応液をイムノクロマトグラフ媒体において、固相ラテックスを塗布した側の下端を５ｍｍの部分にしみ込ませて、感作粒子混合液と混合試料液を展開させた。５分後の検出部における赤色シグナルを目視で判定した。結果を表２に示す。
【００１６】
実施例２
ガラス繊維濾紙を図２のように切断し、それぞれの先端部分からそれぞ５ｍｍのところに実施例１で使用したに固相ラテックスＢ−１、Ｂ−２及びＢ−３を５μｌずつ塗布し、冷蔵庫中で乾燥して５ｍｍ幅間隔でガラス繊維濾紙を切断して、検出部をもつイムノクロマトグラフ媒体を得た。実施例１で調製した感作粒子混合液Ａ−４、３００μｌと実施例１で使用した混合試料液３００μｌを混ぜてクロマト反応液とした。イムノクロマトグラフ媒体中心部分にしみ込ませて、クロマト反応液を展開させた。５分後の検出部における赤色シグナルを目視で判定した。結果を表３に示す。
【００１７】
【表１】
2004184295.tif 000002
【００１８】
【表２】
2004184295.tif 000003
【００１９】
【表３】
2004184295.tif 000004
【００２０】
【発明の効果】
本発明により、一つのクロマトグラフ展開部で複数の被検出物質の検出が可能となり、複数の検査を行う場合の煩雑さを解決することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のクロマトグラフ媒体（媒体１）の形状を示す図。
【図２】本発明のクロマトグラフ媒体（媒体２）の形状を示す図。
【符号の説明】
１  クロマトグラフ展開部
２  クロマトグラフ検出部
３  中心部
【図１】
2004184295.tif 000005
【図２】
2004184295.tif 000006