(57)【要約】【課題】本発明は、大気中の窒素からの窒素固定を促進するための方法および関連する生成物に関する。【解決手段】外因性ｎｉｆクラスターを有する内部寄生細菌は、穀物用植物のための窒素固定を促進する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大気中の窒素から固定された窒素を提供するための方法であって、外因性のｎｉｆクラスターを有する改変細菌を、穀物用植物または穀物用植物または種子が生育するかまたは植えられる土壌に送達することを含み、ここで、改変細菌が固定された窒素を提供する、前記方法。
【請求項２】
ｎｉｆクラスターがネイティブなｎｉｆクラスターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｎｉｆクラスターがリファクターされたｎｉｆクラスターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
改変細菌がガンマプロテオバクテリアである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
改変細菌がサルモネラ・チフィリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サルモネラ・チフィリウム株が、ＳＬ１３４４、ＬＴ２、およびＤＷ０１から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
改変細菌が、大腸菌、任意には、Ｈ７：Ｏ１５７株である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｎｉｆクラスターが、クレブシエラ野生型ｎｉｆクラスター、シュードモナス・スタッツェリｎｉｆクラスター、またはパエニバチルスクラスターである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
穀物用植物が、コムギ、ライムギ、オオムギ、ライコムギ、カラスムギ、アワ、ソルガム、テフ、フォニオ、ソバ、キノア、トウモロコシ、およびイネから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子が、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）によって調節される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
植物成長刺激ペプチドが、根または茎の組織に直接送達される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
植物内共生を可能にするための外因性遺伝子を有する改変非病原性細菌を、穀物用植物あるいは穀物用植物または種が生育するかまたは植えられる土壌に送達することを含む方法。
【請求項１４】
非病原性細菌が大腸菌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子が分泌系のためのエフェクターまたは装置をコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
分泌系のための装置が、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
外因性遺伝子がコントローラを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
コントローラが、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
コントローラが、２つのｐａｒオペロン（ｐａｒＣＢＡおよびｐａｒＤＥ）によってコードされる分配系である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
分配系がＲＫ２  ｐａｒ系である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）農業的に適切なキャリア；および（ｂ）農業的に適切なキャリア上または当該キャリア中に存在する外因性ｎｉｆクラスターを有するガンマプロテオバクテリアを含む組成物。
【請求項２２】
ガンマプロテオバクテリアが、サルモネラ・チフィリウムまたは大腸菌である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ｎｉｆクラスターがネイティブなｎｉｆクラスターである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
ｎｉｆクラスターがリファクターされたｎｉｆクラスターである、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２５】
植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
農業的に適切なキャリアが、種子、種皮、顆粒状キャリア、土壌、固体キャリア、液体スラリーキャリア、および懸濁液キャリアからなる群から選択される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
農業的に適切なキャリアが、湿潤剤、合成界面活性剤、油中水型エマルジョン、水和剤、顆粒、ゲル、寒天の細切りまたはペレット、増粘剤、微小カプセル化粒子、または水性流動物または水性懸濁液などの液体を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
外因性ｎｉｆクラスターがコントローラを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
コントローラが、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
コントローラが、２つのｐａｒオペロン（ｐａｒＣＢＡおよびｐａｒＤＥ）によってコードされる分配系である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
分配系がＲＫ２  ｐａｒ系である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
種子または苗の外表面に改変細菌が関連している、穀物用植物の種子または苗。
【請求項３３】
改変細菌が外因性ｎｉｆクラスターを有する、請求項３２に記載の種子または苗。
【請求項３４】
ｎｉｆクラスターがネイティブなｎｉｆクラスターである、請求項３２に記載の種子または苗。
【請求項３５】
ｎｉｆクラスターがリファクターされたｎｉｆクラスターである、請求項３２に記載の種子または苗。
【請求項３６】
改変細菌がガンマプロテオバクテリアである、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の種子または苗。
【請求項３７】
ガンマプロテオバクテリアがサルモネラ・チフィリウムである、請求項３６に記載の種子または苗。
【請求項３８】
サルモネラ・チフィリウム株が、ＳＬ１３４４、ＬＴ２、およびＤＷ０１から選択される、請求項３７に記載の種子または苗。
【請求項３９】
改変細菌が、大腸菌、任意には、Ｈ７：Ｏ１５７株である、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の種子または苗。
【請求項４０】
ｎｉｆクラスターが、クレブシエラ野生型ｎｉｆクラスター、シュードモナス・スタッツェリｎｉｆクラスター、またはパエニバチルスクラスターである、請求項３３に記載の種子または苗。
【請求項４１】
穀物用植物が、コムギ、ライムギ、オオムギ、ライコムギ、カラスムギ、アワ、ソルガム、テフ、フォニオ、ソバ、キノア、トウモロコシ、およびイネから選択される、請求項３２に記載の種子または苗。
【請求項４２】
植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の種子または苗。
【請求項４３】
植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子が、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）によって調節される、請求項４２に記載の種子または苗。
【請求項４４】
改変細菌が外因性ｎｉｆクラスターを有する、植物中に改変細菌を有する穀物用植物。
【請求項４５】
ｎｉｆクラスターがリファクターされたｎｉｆクラスターである、請求項４４に記載の穀物用植物。
【請求項４６】
植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項４４または４５に記載の穀物用植物。
【請求項４７】
植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子が、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）によって調節される、請求項４６に記載の穀物用植物。
【請求項４８】
外因性遺伝子が、分泌系のためのエフェクターまたは装置をコードする、請求項４６に記載の穀物用植物。
【請求項４９】
外因性遺伝子が植物の根または茎の組織に存在する、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の穀物用植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年１０月５日に出願された米国仮出願番号第６２／２３７，４２６号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の利益を主張し、この出願は、その全体を参照して本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
窒素の利用可能性は、特に、食物、飼料、繊維および燃料の植物生産のための農業用土壌における、作物の生育および発生を制限する主要な要素のうちの１つである。有害な藻類ブルームを引き起こし、有益な土壌微生物コミュニティを破壊する点で、増大する人口の食糧需要を満たすための合成肥料の過剰な使用は、環境上の脅威を提示する［１］。一方、肥料の提供が乏しい多数の途上国での過農耕は、農業用土を損傷し、小規模農家を乏しい収率の作物に悩ませる［２］。
【０００３】
サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、大腸菌(Escherichia coli)Ｏ１５７：Ｈ７などのヒト病原性細菌による植物の内部寄生菌の首尾よいコロニー形成が実証されている［３−５］。サルモネラは、適切な宿主として植物を認識し、アルファルファおよびオオムギの根の組織にコロニー形成することができる（［６，７］）。
【発明の概要】
【０００４】
種々の側面において、本発明は、大気中の窒素から固定された窒素を提供するための方法に関し、外因性ｎｉｆクラスターを有する改変細菌を、穀物用植物、あるいは、穀物用植物または種子が生育するかまたは植えられる土壌に送達することを含み、ここで、改変細菌は、固定された窒素を提供する。
いくつかの態様において、ｎｉｆクラスターは、ネイティブなｎｉｆクラスターである。いくつかの態様において、ｎｉｆクラスターは、リファクターされたｎｉｆクラスターである。
【０００５】
他の態様において、改変細菌は、ガンマプロテオバクテリアである。いくつかの態様において、改変細菌は、サルモネラ・チフィリウム(Salmonella typhimurium)である。
いくつかの態様において、サルモネラ・チフィリウム株は、ＳＬ１３４４、ＬＴ２、およびＤＷ０１から選択される。
他の態様において、改変細菌は、大腸菌、任意には、Ｈ７：Ｏ１５７株の大腸菌である。
【０００６】
他の態様において、ｎｉｆクラスターは、クレブシエラ(Klebsiella)野生型ｎｉｆクラスター、シュードモナス・スタッツェリ(Pseudomonas Stutzi)ｎｉｆクラスター、またはパエニバチルス（paenibacillus）クラスターである。いくつかの態様において、ｎｉｆクラスターは、リファクターされたｎｉｆクラスターである。
いくつかの態様において、穀物用植物は、コムギ、ライムギ、オオムギ、ライコムギ、カラスムギ、アワ、ソルガム、テフ、フォニオ(fonio)、ソバ、キノア、トウモロコシ、およびイネから選択される。
いくつかの態様において、本発明はさらに、植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子を含む。
いくつかの態様において、植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子は、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）によって調節される。
いくつかの態様において、植物成長刺激ペプチドは、根または茎の組織に直接送達される。
【０００７】
本発明の側面は、植物の内共生を可能にする外因性遺伝子を有する改変非病原性細菌を、穀物用植物、あるいは、穀物用植物または種子が生育するかまたは植えられる土壌に送達することを含む方法を含む。
いくつかの態様において、非病原性細菌は大腸菌である。
いくつかの態様において、遺伝子は、分泌系のエフェクターまたは装置をコードする。
他の態様において、分泌系のための装置は、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）である。
【０００８】
本発明の側面は、農業的に適切または適合性のキャリアおよび農業的に適切または適合性のキャリア上またはその中に存在する外因性ｎｉｆクラスターを有するガンマプロテオバクテリアを含む組成物を含む。
いくつかの態様において、プロテオバクテリアは、サルモネラ・チフィリウムまたは大腸菌である。
他の態様において、ｎｉｆクラスターは、ネイティブなｎｉｆクラスターである。
いくつかの態様において、ｎｉｆクラスターは、リファクターされたｎｉｆクラスターである。
いくつかの態様において、本発明は、植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子をさらに含む。
【０００９】
いくつかの態様において、農業的に適切または適合性のキャリアは、種子、種皮、顆粒状キャリア、土壌、土壌キャリア、液体スラリーキャリア、および懸濁液キャリアからなる群から選択される。他の態様において、農業的に適切なキャリアとしては、湿潤剤、合成界面活性剤、油中水型エマルジョン、水和剤、顆粒、ゲル、寒天の細切り(strips)またはペレット、増粘剤、微小カプセル化粒子、または水性流動物（flowables）または水性懸濁液などの液体が挙げられる。
【００１０】
他の態様において、外因性ｎｉｆクラスターまたは遺伝子は、コントローラを含む。コントローラは、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸であり得る。代替的には、コントローラは、２つのｐａｒオペロン（ｐａｒＣＢＡおよびｐａｒＤＥ）によってコードされる分配系であり得る。いくつかの態様において、分配系は、ＲＫ２  ｐａｒ系である。
種子または苗の外表面と関連する改変細菌を有する穀物用植物の種子または苗は、本発明の他の側面において提供される。いくつかの態様において、改変細菌は、外因性ｎｉｆクラスターを有する。
【００１１】
他の側面において、本発明は、植物中に改変細菌を有する穀物用植物であり、ここで、改変細菌は、外因性ｎｉｆクラスターを有する。
ｎｉｆクラスターは、ネイティブなｎｉｆクラスターまたはリファクターされたｎｉｆクラスターであり得る。いくつかの態様において、ｎｉｆクラスターは、クレブシエラ野生型ｎｉｆクラスター、シュードモナス・スタッツェリｎｉｆクラスター、またはパエニバチルスクラスターである。いくつかの態様において、改変細菌は、サルモネラ・チフィリウム、任意には、ＳＬ１３４４、ＬＴ２、およびＤＷ０１から選択されるサルモネラ・チフィリウム株などのガンマプロテオバクテリア、あるいは、大腸菌、任意には、Ｈ７：Ｏ１５７株である。
【００１２】
いくつかの態様において、穀物用植物は、コムギ、ライムギ、オオムギ、ライコムギ、カラスムギ、アワ、ソルガム、テフ、フォニオ(fonio)、ソバ、キノア、トウモロコシ、およびイネから選択される。
任意には、種子または苗は、植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子をさらに含む。植物成長刺激ペプチドをコードする外因性遺伝子は、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）によって調節される。
いくつかの態様において、外因性遺伝子は、穀物用植物の根または茎の組織に存在する。
【００１３】
いくつかの態様において、改変細菌は、溶液、分散物、菌核、ゲル、層、クリーム、コーティングまたは浸漬(dip)の形態で提供される。
いくつかの態様において、植物、植物の一部、または植物を囲む領域は、葉、種、枝、土壌、茎、根から選択される。いくつかの態様において、改変細菌は、植物、植物の一部、植物を囲む領域と関連しているか（すなわち、混合されているか、物理的に接触しているかまたはその近くに存在する）またはそこに組み込まれている。いくつかの態様において、種子は、改変細菌を接種されているかまたはコーティングされている。特定の態様において、改変細菌は、果実、種子、葉、もしくは根、またはその一部から選択される成熟した農業用植物の標的組織内で検出可能な有効量で処置される。
【００１４】
他の態様において、植物、種子または苗は、その外表面に改変細菌を、少なくとも約１００ＣＦＵ、例えば、少なくとも約２００ＣＦＵ、少なくとも約３００ＣＦＵ、少なくとも約５００ＣＦＵ、少なくとも約１，０００ＣＦＵ、少なくとも約３，０００ＣＦＵ、少なくとも約１０，０００ＣＦＵ、少なくとも約３０，０００ＣＦＵ、少なくとも１００，０００ＣＦＵ、またはそれ以上を含む。
【００１５】
別の態様において、改変細菌は、植物、種子、または苗の外表面またはその組織内に、少なくとも約１００ＣＦＵ、例えば、少なくとも約２００ＣＦＵ、少なくとも約３００ＣＦＵ、少なくとも約５００ＣＦＵ、少なくとも約１，０００ＣＦＵ、少なくとも約３，０００ＣＦＵ、少なくとも約１０，０００ＣＦＵ、少なくとも約３０，０００ＣＦＵ、少なくとも１００，０００ＣＦＵの量で検出可能な有効量で処置される。
【００１６】
本発明の制限の各々は、本発明の種々の態様を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組合せを含む本発明の制限の各々は、本発明の各側面において含まれ得ることが期待される。本発明は、その適用において、以下の詳細な説明に示されるかまたは図面に例示される構成の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の態様が可能であり、種々の様式で実践または実施される。
【００１７】
添付の図面は、一定の縮尺で描かれることは意図されていない。図面において、種々の図面において例示される各々同一またはほとんど同一の構成要素は、同様の数字によって示される。明確性の目的で、全ての構成要素が全ての図面において標識され得るわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、サルモネラ株におけるニトロゲナーゼ活性を示す。多様なサルモネラ株におけるネイティブおよびリファクターされたｎｉｆクラスターのニトロゲナーゼ活性は、アセチレン還元アッセイによって測定した。検出可能でないエチレン生成は、アスタリスクによって示した。
【００１９】
【図２】図２は、腸内細菌によるトウモロコシ(Zea mays)Ｂ７３の内部寄生菌のコロニー形成を示す。チフス菌(S. typhi)ATCC 14028または大腸菌MG1655（対照）のいずれかによるトウモロコシの根の内部コロニー形成を調査した。表面殺菌した粉砕したトウモロコシの根からは大腸菌MG1655のＣＦＵは存在せず、チフス菌ATCC 14028細胞は、根の組織内部から回収された。エラーバーは、標準偏差を示す（MG1655についてｎ＝６、そして、ATCC14028についてｎ＝１０）。
【００２０】
【図３】図３は、トウモロコシ植物の苗におけるエチレン生成を示す。ボックス中のプロットは、遺伝子操作したチフス菌ATCC 14028および対照野生型チフス菌ATCC 14028（ｎｉｆクラスターなし）を接種した植物苗の間でのエチレン生成分布を示す。ドットは、ある群（ｎ＝３３（対照）、３９（ネイティブｎｉｆ）、３９（リファクターされたｎｉｆ））における個々の植物からのエチレン生成を示す。ボックスは、２５％から７５％の四分位にわたる。中央の線は、ある群のエチレン生成の中央値を示す。ウィスカーは、７５％四部位  ＋  １．５×四部位範囲（上方ウィスカー）および２５％四分位  −  １．５×四分位範囲（下方ウィスカー）を示す。アスタリスクは、リファクターされたｎｉｆと対照群との間の統計学的有意差を示す（スチューデントｔ検定、***P < 0.0001）。
【００２１】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、表面滅菌した根から得たサルモネラ株における遺伝子系の安定性を示す。図４Ａは、センサー、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、および選択マーカーから構成されるコントローラ装置が、ゲノムベースの発現系からの喪失がなかったことを示す。図４Ｂは、ｐＢＢＲ１の複製起点に基づくｎｉｆプラスミド上のＲＫ２  ｐａｒ系が、プラミド安定性の増加を生じることを示す。
【図５】図５は、mini-Tn7挿入のためのコントローラ（pR6K-T7RM）の概略を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
宿主植物と共生である内部寄生細菌は、宿主へタンパク質を送達するように遺伝子操作され、これにより、植物の特性を調節することができる。非穀物用植物において、細菌は、固定された窒素を提供し、窒素が豊富な肥料の必要性を減少させることができる。しかしながら、穀物用植物において、固定された窒素を提供するための細菌系は、かかる系を開発しようとする何年にもわたる多数の試みに関わらず、未だ開発されていない。固定された窒素を穀物用植物に提供することができるように内部寄生細菌を操作する方法は、本発明に従って開発された。内部寄生菌は、葉、茎、花、果実、種または根を含む、植物組織の細胞内または細胞外空間を占めることができる。
【００２３】
本発明の方法は、肥料の需要を減少させる、肥料汚染を減少させる、環境に優しい作物生産を提供する、作物生産を強化する、植物における油量を改善させる、植物におけるタンパク質含量を改善させる、水の窒素混入を減少させる、および土壌の有機相に関して窒素および炭素に対する炭素含量を増加させるなどのいくつかの目的のために有用である。
【００２４】
農業用作物の作物生産性のための限定因子は、土壌および水中の窒素含量である。この元素の供給は、作物需要が増加するにつれて経時的に減少している。窒素は、植物を含む全ての形態の生命に必須の主要な栄養の１つである。しかしながら、窒素は、植物が利用できる形態に最初に変換しなければならない。生物学的窒素固定（ＢＮＦ）は、酵素ニトロゲナーゼを使用する大気中の窒素（Ｎ２）のアンモニア（ＮＨ３）への変換である。この反応は、Ｎ２が三重結合を含有するため、莫大な量のエネルギーを消費する。窒素分子における結合エネルギーは、約２２５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。「ニトロゲナーゼ酵素複合体」を構成するいくつかの細菌種と植物との間の共生関係の結果として、ＢＮＦが天然で実施されることはほとんどない。
【００２５】
ニトロゲナーゼ酵素複合体を産生する細菌種としては、シアノバクテリア、アゾトバクター、根粒菌、およびフランキアなどのジアゾ栄養生物が挙げられる。しかしながら、ごく少数の植物のみが、ジアゾ栄養生物と共生関係で生きることができる。例えば、マメ科植物のエンドウマメ植物は、根粒菌ファミリー由来の細菌と共生して生きている。詳細には、根粒菌細菌は、エンドウマメ植物の根に侵入し、植物が炭素（糖）を供給する間に、窒素を（アンモニアに）固定する細菌を含有する根粒を創出する。したがって、共生または宿主範囲の拡大のいずれかを改善することは、植物の生存に有利であるが、この目的を達成することは、プロセスの複雑さおよび基本的知識の欠如を含む多数のチャレンジを含む。
【００２６】
生物学的窒素固定は、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤおよびｎｉｆＫによってコードされる３つのタンパク質の複合体（ニトロゲナーゼ）によって実施され、これらはアセンブリされ、さらなる１７の遺伝子によって活性化される［８］。ｎｉｆクラスターを新しい宿主に移入することは、この経路が遺伝子発現における小さな変化に非常に感受性であり、そして、多数の生物における調節制御が十分に確立されていないという事実のため、非常に困難である［８，９］。例に示されるように、リファクター化方法を、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）M5a1由来の１６の遺伝子のｎｉｆクラスターに適用し、ｎｉｆを調節するための系を操作した。この方法は、遺伝子クラスターを一連の十分に特徴付けられた遺伝子部分にモジュール化した。リファクター化は、新しい宿主において機能する調節の交換を容易にする大規模部分置換のためのプラットフォームとして使用できる。リファクター化はまた、アンモニアおよび酸素を含むネイティブなｎｉｆクラスターを抑制するシグナルへの応答を除去する際に価値がある。
【００２７】
かなり驚くべきことに、内部共生細菌に移入された、野生型およびリファクターされたｎｉｆの両方のｎｉｆクラスターが、穀物用植物において、その細菌が固定された窒素を提供することを可能にすることを発見した。これは、ネイティブおよび共生のｎｉｆクラスターの内部共生細菌への移入により、固定された窒素を作物に供給できるという最初の実証である。以下の例で提示された実験は、リファクターされたｎｉｆクラスターに連結された遺伝子センサーが、化学的シグナルに応答して、３つの異なるサルモネラ株の窒素固定経路を首尾よく調節したことを実証する。リファクターされたｎｉｆクラスターは、窒素を作物に送達する効率的な共生のための、植物から単離された大集団の腸内細菌の試験を可能にする。
【００２８】
野生型およびリファクターされたｎｉｆクラスターをコードする合成核酸を使用して、遺伝子改変細菌を産生することができる。本発明に従う有用な改変細菌は、内部共生体である内部寄生菌である。内部共生体は、その生活環のいくつかまたは全ての間、植物において見かけ上の疾患を引き起こさない。内部寄生細菌は、α−プロテオバクテリア、β−プロテオバクテリア、γ−プロテオバクテリア、ファーミキューテスおよびアクチノバクテリアを含む、広範な分類群に属し得る。本発明の方法に従って、γ−プロテオバクテリアを使用することが特に好ましい。
【００２９】
いくつかの態様において、γ−プロテオバクテリアである内部寄生細菌の例としては、サルモネラ種、チフス菌(Yersinia pestis)、コレラ菌(Vibrio cholera)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸菌(Escherichia coli)、カンキツかいよう病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri)およびキウイフルーツかいよう病菌(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、γ−プロテオバクテリアは、サルモネラおよび大腸菌を含む。
【００３０】
本発明の改変細菌を使用して、大気中の窒素からの窒素の固定を促進する。本明細書で使用される場合、用語「植物」は、穀物用植物を指す。この用語は、発芽種子、発生する苗、ならびに、全ての地下部分（根など）および地上部分を含む植生などの植物の全ての部分を含む。穀物は、イネ科草本（イネ科）の栽培形態であり、例えば、コムギ（スペルト、ヒトツブコムギ、エンマー、カムート、デュラムおよびライコムギを含む）、ライムギ、オオムギ、イネ、野生型イネ、メイズ（トウモロコシ）、アワ、ソルガム、テフ、フォニオおよびカラスムギが挙げられる。用語穀物用植物はまた、アマランス、キノアおよびソバなどの偽穀物が挙げられる。
【００３１】
さらに、改変細菌は、植物成長刺激ペプチドのような他の因子を根または茎の組織に直接送達するように遺伝子操作することができる。例えば、植物に影響する遺伝子発現タンパク質を３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）に遺伝子操作することができる。合成対照は、細菌におけるＴ３ＳＳの発現により調節することができる。この様式で細菌を遺伝子操作する方法は、Widmaier, D. M. et al.に記載されている［３］。
【００３２】
したがって、本発明に従う方法はまた、細菌を遺伝子改変して、さらに穀物用植物を処理することを含み得る。用語「遺伝子改変細菌」は、組み換えＤＮＡ技術の使用によって、その細菌ゲノムにネイティブではないＤＮＡの挿入発列を含むように、または、その種のゲノムにネイティブなＤＮＡの欠失を示すように、遺伝材料が修飾されている細菌を指す。しばしば、特定の遺伝子改変細菌は、組み換えＤＮＡ技術によってその遺伝子改変を得た細菌である。典型的には、１以上の遺伝子が、遺伝子改変細菌の遺伝子材料に組み込まれている。遺伝子は、Ｔ３ＳＳ領域に挿入され得る。
【００３３】
ｎｉｆクラスターは、生きている生物に利用可能な窒素の形態に大気中の窒素を固定するのに関与する酵素をコードする遺伝子のコレクションである。ｎｉｆ遺伝子によってコードされる主な酵素は、種々の目的のためにその生物が使用できるアンモニアのような他の窒素形態に大気中の窒素（Ｎ２）を変換することを担当するニトロゲナーゼ複合体である。ニトロゲナーゼ酵素に加えて、ｎｉｆ遺伝子はまた、窒素固定に関与する多数の調節タンパク質をコードする。ｎｉｆ遺伝子は、自由に生きている窒素固定細菌において、および、種々の植物に関連する共生細菌においての両方で見出されている。ネイティブなｎｉｆ遺伝子の発現は、低濃度の固定された窒素および酸素濃度に応答して誘導される（低酸素濃度は、宿主植物の根の環境で能動的に維持される）。リファクターされたｎｉｆクラスターは、外因性因子によって調節されるように設計されてもよく、および／または構成的に調節されてもよい。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「遺伝子クラスター」は、遺伝子産物をコードする２以上の遺伝子のセットをいう。標的の、天然に存在する、すなわち、野生型の遺伝子クラスターは、リファクター化のためのオリジナルモデルとして機能するものである。いくつかの態様において、遺伝子産物は酵素である。いくつかの態様において、リファクターされる遺伝子クラスターは、ｎｉｆ窒素固定経路である。
【００３５】
各遺伝子クラスターは、複数のモジュラーユニットから構成される転写単位に組織化される。モジュラーユニットは、１以上の遺伝子成分を構成する別々の核酸配列である。遺伝子成分は、遺伝子断片において典型的に見い出される何かを含み得る。例えば、遺伝子成分としては、遺伝子、調節因子、スペーサー、非コードヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。これらのうちのいくつかまたは全てが、各モジュラーユニット内に見出される。モジュラーユニット内で、１以上の合成調節因子が、遺伝子クラスターの１以上のタンパク質コード配列に遺伝子的に連結され得る。
【００３６】
複数のモジュラーユニットは、同じ遺伝子および調節因子から構成されてもよいが、ユニットは、遺伝子および調節因子の向き、位置、数などの点で、お互いに異なっていてもよい。他のモジュラーユニットは、他のモジュラーユニットと共通のいくつかの因子を有していてもよいが、いくつかの異なる因子を含む。なお他のモジュラーユニットは、他のモジュラーユニットと完全に別個であって、重複しなくてもよい。モジュラーユニットの大きな多様性は、ライブラリー中のアセンブリされた遺伝子クラスターの多様性を生じるものである。
【００３７】
複数の別個の天然に存在しない遺伝子クラスターが、特定の遺伝子成分の数、順序、および／または向きに基づいて、天然に存在する遺伝子クラスターとは別個であるように、遺伝子クラスター内のモジュラーユニットは配置される。モジュラーユニット内の遺伝子成分の数は、容易に変更し得る。例えば、１つのモジュラーユニットは、単一のプロモーターまたはターミネーターを有していてもよいが、別のモジュラーユニットは、５つのプロモーターおよび２つのターミネーターを有していてもよい。このファクターの操作によって達成し得るバリエーションは、顕著である。さらに、モジュラーユニット内の構成要素の順序も劇的に変更してもよい。２つの構成要素の単一の順序が交換され得る、複数のセットのモジュラーユニットを生成してもよい。このファクターはまた、顕著な多様性を生成するだろう。モジュラーユニット中の構成要素の向きを変更することはまた、多様性を生み出す実行可能な方法である。１以上の遺伝子成分の向きを交換することは、機能性に干渉し得ると予測され得るが、本明細書において、異なる向きを有する遺伝子ｎｉｆクラスターは、実際に機能的であることが実証されている。
【００３８】
リファクター化プロセスは、遺伝子クラスターのいくつかのレベルの再構築を含む。例えば、ｎｉｆクラスターなどの遺伝子クラスター中の必須遺伝子のコドンは、野生型（ＷＴ）遺伝子から派生したＤＮＡ配列を創出するように変更される。これは、コドン最適化を介して達成され得る。再コードされた遺伝子は、内部の調節因子を同定するためにコンピュータスキャンしてもよい。次いで、これらの調節構成要素は除去してもよい。これらは、オペロンに組織化され、スペーサー部分によって機能的に分離される合成部分（プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーター）の制御下に配置される。最後に、遺伝子発現の条件および動態を調節する遺伝子センサーおよび回路からなるコントローラを追加してもよい。
【００３９】
リファクターされた遺伝子クラスター中の遺伝子成分は典型的には、少なくとも１つの合成調節因子を含む。合成調節因子は、遺伝子発現を調節する役割を果たし、天然に存在する調節因子とは異なる任意の核酸配列である。それは、天然に存在する因子と、例えば、１ヌクレオチド異なり得る。あるいは、それは、１以上の非天然ヌクレオチドを含み得る。あるいは、それは、全く異なる因子であり得る。各場合において、それは、外因性調節因子（すなわち、天然に存在するバージョンと同一ではない）であると考えられ得る。したがって、「調節因子」は、転写または翻訳の開始または速度、あるいは、転写または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響するヌクレオチド配列を有する核酸をいう。調節領域としては、これらに限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、リボザイム、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導性因子、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、転写終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、およびこれらの組合せが挙げられる。
【００４０】
いくつかの態様において、調節配列は、遺伝子の発現を増加させる。他の態様において、調節配列は、遺伝子の発現を減少させる。いくつかの態様において、調節配列は、タンパク質結合部位、例えば、転写因子結合部位であり得る。いくつかの態様において、調節配列は、ポリメラーゼ結合部位であり得る。いくつかの態様において、調節配列は、ターミネーターである。ターミネーターは、転写のための配列の終わりを示すさらなるファクター、例えば、ｒｈｏ非依存ターミネーターを必要とし得る。いくつかの態様において、調節配列は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）などのリボソームを結合する配列である。いくつかの態様において、調節配列は、どこで翻訳が始まるかを示す。調節配列は、調節の強度において異なることが当業者に明らかである。
【００４１】
例えば、強力なプロモーター配列が存在し、それからの遺伝子発現は、弱いプロモーター配列からの遺伝子発現よりも高い。同様に、弱いと特徴づけられるＲＢＳ配列よりも高い親和性で、リボソームを回収および結合する強力なＲＢＳ配列が存在する。いくつかの態様において、調節配列は、誘導性または条件的調節配列であり得る。いくつかの態様において、調節配列は、タンパク質コード配列の５’または上流に存在する。他のいくつかの態様において、調節配列は、タンパク質コード配列の３’または下流に存在する。なお他の態様において、調節配列は、タンパク質コード配列内に存在してもよい。任意の所定のタンパク質コード配列は、１以上の調節配列によって調節されてもよい。調節配列の非制限的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、シグマ７０プロモーター、シグマ５４プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｈｏ非依存的ターミネーター、ステムループ／ｒｈｏ非依存的ターミネーターが挙げられる。
【００４２】
核酸に関して「外因性」とは、核酸が、組み換え核酸構築物の一部であること、または、その天然環境に存在しないことを示す。例えば、外因性核酸は、別の種に導入されたある種由来の配列（すなわち異種核酸）であり得る。典型的には、かかる外因性核酸は、組み換え核酸構築物を介して、他の種に導入される。外因性核酸はまた、ある生物にネイティブであり、その生物の細胞に再導入される配列であり得る。ネイティブな配列を含む外因性核酸はしばしば、外因性核酸に連結される非天然配列（例えば、組み換え核酸構築物中のネイティブな配列に隣接する非ネイティブな調節配列）の存在によって天然に存在する配列から区別できる。さらに、安定に形質転換された外因性核酸は典型的には、ネイティブな配列が見いだされる位置以外の位置に組み込まれる。外因性因子は、例えば、遺伝子組み換えを使用することによって、構築物に追加されてもよい。遺伝子組み換えは、ＤＮＡ鎖を切断および再結合して、新規なセットの遺伝子情報をコードする新たなＤＮＡ分子を形成する。
【００４３】
「発現」は、ポリヌクレオチドの遺伝子情報の、酵素ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される転写を介するＲＮＡへの変換、そして、リボソーム上のｍＲＮＡの翻訳を介するタンパク質への変換のプロセスを指す。
【００４４】
プロモーターは、構成的または誘導性であり得る。構成的プロモーターの例としては、これらに限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを用いる）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを用いる）［例えば、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター[Invitrogen]が挙げられる。
【００４５】
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外的に提供される化合物、温度などの環境因子、または特定の生理学的状態の存在（例えば、急性期）、細胞の特定の分化状態によって、または、複製細胞のみにおいて、調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、これらに限定されないが、インビトロゲン、クローンテックおよびアリアドを含む種々の市販の供給源から入手可能である。多数の他の系が、記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外的に提供されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系[WO 98/10088];エクジソン昆虫プロモーター[No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)]、テトラサイクリン抑制系[Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]、テトラサイクリン誘導性系[Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995)、またHarvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)を参照]、RU486誘導性系[Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)およびWang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)]およびラパマイシン誘導性系[Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]が挙げられる。この文脈において有用であり得るさらに他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的条件（例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態）によって調節されるか、または、複製細胞のみにおいて調節されるプロモーターである。
【００４６】
調節因子は、いくつかの場合において、組織特異的であり得る。組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は、当該分野で周知である。例示的な組織特異的調節配列としては、これらに限定されないが、以下の組織特異的プロモーターが挙げられる：肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン−１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、α−ミオシン重鎖（ａ−ＭＨＣ）プロモーター、または心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター。
【００４７】
他の例示的なプロモーターとしては、ベータ−アクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；アルファ−フェトプロテイン(AFP)プロモーター、Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996))、骨オステオカルシンプロモーター(Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997))；骨シアロタンパク質プロモーター(Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996))、CD2プロモーター (Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)；免疫グロブリン重鎖プロモーター；T細胞レセプターα鎖プロモーター、ニューロン特異的エロナーゼ（ＮＳＥ）プロモーターなどのニューロンプロモーター (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993))、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター(Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991))、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター(Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995))が挙げられ、これらはとりわけ当業者に明らかである。
【００４８】
いくつかの場合において、モジュラーユニットまたは遺伝子クラスターは、制限認識部位を欠くように設計され得る。制限エンドヌクレアーゼは、極端に高い配列特異性を有するＤＮＡを切断し、この特性に起因して、分子生物学および分子医薬において欠くことができないツールとなっている。三千を超える制限エンドヌクレアーゼが、広範な種々の細菌および古細菌から発見され、そして特徴付けられている。これらの認識配列および切断部位の包括的なリストは、ＲＥＢＡＳＥにおいて見出され得る。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「単離された核酸分子」は、その天然環境において存在しない核酸、例えば、（ｉ）当該分野で公知の方法によって、例えば、宿主細胞のアルカリ溶解および引き続く核酸の精製によって、例えば、シリカ吸着手順によって、細胞、例えば、藻類、酵母、植物または哺乳動物細胞から抽出および／または精製された核酸；（ｉｉ）インビトロ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された核酸；（ｉｉｉ）クローニングによって組み換え生産された核酸、例えば、発現ベクターにクローン化された核酸；（ｉｖ）例えば、インビトロでの酵素消化によって、または、せん断および引き続くゲル分離によってフラグメント化およびサイズ分離された核酸；あるいは、（ｖ）例えば、化学合成によって合成された核酸を指す。いくつかの態様において、用語「単離された核酸分子」は、（ｖｉ）任意の天然に存在する核酸とは化学的に顕著に異なる核酸を指す。いくつかの態様において、単離された核酸は、当該分野で周知の組み換えＤＮＡ技術によって容易に操作され得る。
【００５０】
したがって、ベクターにクローン化された核酸、または宿主細胞への送達された核酸、および宿主ゲノムに組み込まれた核酸は、単離されたと考えられるが、その天然の宿主における、例えば、その宿主のゲノムにおける、そのネイティブな状態の核酸は、単離されたと考えられない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、実質的に精製されている必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター内に単離されている核酸は、それが存在する細胞中にごく小さい割合の材料を含み得る点で純粋ではない。しかしながら、当該用語が本明細書で使用される場合、かかる核酸は、単離されている。
【００５１】
発現ベクターまたは発現構築物を細胞に送達するための方法は、当業者に周知である。発現ベクターを含む核酸は、関連する生物学的分野の当業者に周知の種々の方法によって原核生物および真核生物に送達され得る。本発明のいくつかの側面に従う、核酸を細胞に送達するための方法としては、これらに限定されないが、異なる化学的、電気化学的および生物学的アプローチ、例えば、ヒートショック形質転換、エレクトロポレーション、トランスフェクション、例えば、リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはリン酸カルシウムトランスフェクションが挙げられる。
【００５２】
いくつかの態様において、核酸構築物、例えば、融合タンパク質核酸配列を含む発現構築物は、遺伝子材料を導入するためのビヒクルまたはベクターを使用して宿主細胞へ導入される。遺伝子材料を細胞に導入するためのベクターは、当業者に周知であり、例えば、プラスミド、人工染色体、およびウイルスベクターなどが挙げられる。構成的または誘導性異種プロモーターを含む発現構築物、ノックアウトおよびノックダウン構築物を含む核酸構築物の構築のための方法、ならびに核酸または核酸構築物の細胞への送達のための方法およびベクターは、当業者に周知である。
【００５３】
１つの態様において、遺伝子クラスターは、天然に存在する遺伝子クラスター配列の全長に対して、少なくとも約８５％以上（例えば、天然に存在する遺伝子クラスター配列の全長の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、またはそれ以上）相同または同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、天然に存在する遺伝子クラスター配列に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同または同一である。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、そのフラグメントまたは必須配列のようにより多く保存される領域において、遺伝子クラスター配列に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同または同一であるが、その領域外ではより低い配列同一性を有する。
【００５４】
配列間の相同性または配列同一性の計算（この用語は本明細書で交換可能に使用される）は、以下のとおり実施される。２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は最適な比較目的のためにアライメントされる（例えば、第一および第二のアミノ酸または核酸配列のうちの１つまたは両方において、最適なアライメントのためにギャップが導入され得、非相同配列は、比較目的のために無視され得る）。比較目的のためにアライメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、いくつかの態様において、少なくとも９０％または１００％である。
【００５５】
対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが次いで比較される。第一の配列におけるある位置が、第二の配列における対応する位置として同じヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置において同一である（本明細書で使用されるように、核酸「同一性」は、核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００５６】
多数の場合において、本明細書に記載される天然に存在するヌクレオチドを有する核酸は、改変されていない。いくつかの場合において、核酸は、天然に存在するヌクレオチドおよび／または置換、すなわち、糖または塩基の置換または改変を含んでいてもよい。
【００５７】
１以上の置換された糖部分は、例えば、２’位置に以下のうちの１つを含む：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎは１〜約１０である）；Ｃｉ〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；リポーター基；干渉物質；核酸の薬物動態特性を改善するための基；または核酸の薬力学特性を改善するための基および類似の特性を有する他の置換基。類似の改変がまた、核酸の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチドの糖の３’位置および５’末端ヌクレオチドの５’位置においてなされ得る。核酸はまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物を有し得る。
【００５８】
核酸はまた、さらにまたは代替的に、ヌクレオチド（しばしば単に「塩基」として当該分野で称される）改変または置換を含み得る。本明細書で使用される場合、「未改変」または「天然」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。改変核酸塩基は、天然の核酸において頻繁に見出されないまたは一過的に見いだされる核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’でオキシシトシンとも称され、しばしば当該分野で５−Ｍｅ−Ｃとも称される）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシル(gentobiosyl)ＨＭＣ、イソシトシン、偽イソシトシン、および合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリンおよび２，６−ジアミノプリンまたは他のジアミノプリンを含む。例えば、Kornberg, “DNA Replication,” W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp75-77；およびGebeyehu, G., et al. Nucl. Acids Res., 15:4513 (1987))を参照のこと。当該分野で公知の「汎用性」塩基、例えばイノシンもまた含まれ得る。
【００５９】
本開示の文脈において、ハイブリダイゼーションは、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基の間の、塩基スタッキングおよび水素結合を意味し、これは、ワトソンクリック、フーグスティーンまたは逆向きのフーグスティーン水素結合であり得る。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対になる相補的核酸塩基である。相補的とは、この用語が当該分野で使用される場合、２つのヌクレオチド間で正確に対となる能力を指す。例えば、核酸の特定の位置のヌクレオチドが、第二の核酸の同じ位置のヌクレオチドと水素結合できる場合、この２つの核酸は、その位置でお互いに相補的であると考えられる。核酸は、各分子における十分な数の対応する位置が、それらの塩基を介してお互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占められる場合、お互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」は、核酸の間で安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性または正確な対形成を指すように使用される用語である。１００％相補性は必要とされていない。
【００６０】
上に記載の種々の側面の態様は、単独、組み合わせて、または、上に記載された態様において具体的に検討されていない種々の配置で使用されてもよく、したがって、その適用において、上の詳細な説明に記載されたかまたは図面に例示される構成要素の詳細および配置に限定されない。例えば、一つの態様に記載の側面は、他の態様において記載される側面と任意の様式で組み合わせてもよい。
【００６１】
特許請求の範囲において請求項に記載の要素を修飾するための、「第一」、「第二」、「第三」などの通常の用語の使用は、それ自体が、１つの請求項の要素の他の要素に対する何らかの優先、先行、または順序、もしくは、方法の作用が実施される時間的順序を含まず、請求項の複数の要素を区別するために（しかし、通常の用語の使用のために）同じ名称を有する別の要素から、特定の名称を有する請求項のある要素を区別するための単なる標識として使用される。
【００６２】
本発明は、以下の例によってさらに例示されるが、これは、決してさらなる限定として解釈されるべきではない。本願全体に引用される全ての参考文献の内容の全体が（文献の参考文献、発行特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）、本明細書に参考として明確に組み込まれる。
【００６３】
例において示されるように、リファクター化アプローチは、大気中のＮ２をアンモニアに変換するための窒素固定経路をコードするクレブシエラ・オキシトカからのｎｉｆ遺伝子クラスターに適用されている。ネイティブな遺伝子クラスターは、７つのオペロンで２０の遺伝子からなり、２３．５ｋｂのＤＮＡにコードされている。リファクターされた遺伝子クラスターは、野生型（ＷＴ）とＤＮＡ配列同一性をほとんど共有しなくてもよい。
【００６４】
Ｎｉｆクラスターがネイティブなｎｉｆクラスターである場合、任意の天然に存在するｎｉｆクラスターのＤＮＡ配列を有していてもよい。例えば、それは、クレブシエラ・オキシトカ由来の天然に存在するｎｉｆクラスター（配列番号）、シュードモナス・スタッツェリｎｉｆクラスター（配列番号５）およびパエニバチルスｎｉｆクラスターの配列を有していてもよい。リファクターされたｎｉｆクラスターは、他の窒素形態へのＮ２変換の促進に関与するタンパク質を産生する際に活性である任意のリファクターされたｎｉｆクラスターであり得る。
【００６５】
以下の例示的なｎｉｆクラスターのＤＮＡ配列が、本発明に従って有用である。
リファクターされたｎｉｆクラスターｖ１．０
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【００６６】
リファクターされたｎｉｆクラスターｖ２．１
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【００６７】
パエニバチルスＷＬＹ７８  ｎｉｆクラスター
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【００６８】
クレブシエラ・オキシトカＭ５ａ１  ｎｉｆクラスター
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
2022000024.tif 000023
【００６９】
シュードモナス・スタッツェリＡ１５０１  ｎｉｆクラスター
【表５−１】
2022000024.tif 000024
【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
2022000024.tif 000033
【表５−１１】
2022000024.tif 000034
【００７０】
【表６−１】
2022000024.tif 000035
【表６−２】
2022000024.tif 000036
【表６−３】
2022000024.tif 000037
【００７１】
本明細書に記載される改変細菌は、宿主植物でコロニー形成することができる。特定の場合、改変細菌は、公知の技術を使用して、葉面処理、葉面噴霧、茎注射、土壌浸水、浸漬、根の浸漬、種子コーティング、またはカプセル化によって植物に適用される。
【００７２】
首尾よいコロニー形成は、植物内の細菌集団の存在を検出することによって確認され得る。例えば、細菌を種子に適用した後、高力価の細菌を、種子から発芽する植物の根およびシュートにおいて、検出することができる。さらに、顕著な量の細菌を植物の根圏において検出することができる。したがって、１つの態様では、内部寄生菌の微生物集団は、植物にコロニー形成するのに有効な量で処置される。植物のコロニー形成は、例えば、植物内の内部寄生菌の微生物の存在を検出することにより、検出することができる。これは、種子または植物の表面殺菌後の微生物の生存率を測定することによって達成することができる。内部寄生菌のコロニー形成は、微生物の内部局在化を生じ、表面殺菌の条件に対して耐性となる。
【００７３】
いくつかの場合において、改変細菌は、農業的に適切なまたは適合性のキャリアと混合される。キャリアは、固体キャリアまたは液体キャリアであり得る。キャリアは、安定性、湿潤性または分散性の増加のような種々の特性を与える多数のキャリアのいずれか１以上であり得る。非イオン性またはイオン性の界面活性剤であり得る、天然または合成の改変活性剤などの湿潤剤、またはその組み合わせを、本発明の組成物に含めてもよい。油中水エマルジョンもまた、本発明の改変細菌を含む組成物を製剤化するために使用してもよい。調製され得る適切な製剤としては、水和剤、顆粒、ゲル、寒天の細切り(strips)またはペレット、増粘剤など、微小カプセル化粒子など、水性流動物（flowables）、水性懸濁液、油中水型エマルジョンなどの液体が挙げられる。製剤は、顆粒またはマメ科植物生成物、例えば、粉砕した穀物またはマメ、穀物またはマメ由来のブロスまたは粉、スターチ、糖、または油を含み得る。
【００７４】
いくつかの態様において、農業用キャリアは、土壌または植物生育培地であり得る。使用され得る他の農業用キャリアは、植物ベースの油、保水剤またはその組み合わせを含む。代替的には、農業用キャリアは、顆粒、ペレットまたは懸濁液を含む、珪藻土、ローム、シリカ、アルギン酸、粘土、ベントナイト、バーミキュライト、種のケース、他の植物および動物生成物、または組み合わせなどの固体であり得る。上述の成分のいずれかの混合物はまた、これらに限定されないが、ぺスタ（粉およびカオリン粘土）、ローム中の寒天または粉ベースのペレット、砂、または粘土などのようなキャリアとして意図される。製剤は、オオムギ、イネ、または種、植物の部分、サトウキビのバガス、穀物加工に由来する外皮または柄、粉砕された植物材料または建築現場廃棄物由来の木材、おがくずまたはリサイクル用紙由来の小径繊維、織物、または木材などの他の生物学的材料などの培養された生物のための食物供給源を含み得る。他の適切な製剤は、当業者に公知である。
【００７５】
１つの態様において、製剤は、粘着付与剤(tackifier)または粘着剤を含み得る。かかる剤は、コーティング組成物を得るために、他の化合物（例えば、生物学的ではない制御剤）を含み得るキャリアと改変細菌を組み合わせるのに有用である。かかる組成物は、植物または種子のまわりにコーティングを創出して、微生物と他の剤と、植物または植物の一部との間で接触を維持するのに役立つ。１つの態様において、粘着剤は、アルギニン酸、ゴム、デンプン、レクチン、ホルモノネチン、ポリビニルアルコール、アルカリホルモノネチン、ヘスペレチン、酢酸ポリビニル、セファリン、アラビアゴム、キタンタンゴム、鉱物油、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アラビノガラクタン、メチルセルロース、ＰＥＧ４００、キトサン、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリアクリルニトリル、グリセロール、トリエチレングリコール、酢酸ビニル、ジェランゴム、ポリスチレン、ポリビニル、カルボキシメチルセルロース、ガムガッチおよびポリオキシエチレン−ポリオキシブチレンブロック共重合体からなる群より選択される。
【００７６】
製剤はまた、界面活性剤を含み得る。界面活性剤の非制限的な例としては、Prefer 28 (Cenex)、Surf-N(US)、Inhance (Brandt)、P-28 (Wilfarm)およびPatrol (Helena)のような窒素−界面活性剤ブレンド；Sun-It II (AmCy)、MSO (UAP)、Scoil (Agsco)、Hasten (Wilfarm)およびMes-100 (Drexel)を含むエステル化植物油；ならびにSilwet L77 (UAP)、Silikin (Terra)、Dyne-Amic (Helena)、Kinetic (Helena)、Sylgard 309 (Wilbur-Ellis)およびCentury (Precision)を含む有機ケイ素界面活性剤が挙げられる。
【００７７】
特定の場合において、製剤は、微生物安定剤を含む。かかる安定剤は、乾燥剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「乾燥剤」は、化合物（単数または複数）が液体接種材料に乾燥効果を実際に有するような濃度で使用されるかどうかに関わらず、乾燥剤として分類され得る任意の化合物または化合物の混合物を含み得る。かかる乾燥剤は、使用される改変細菌と理想的に適合性であり、微生物集団が種子への適用を生き残り、乾燥を生き残る能力を促進するはずである。適切な乾燥剤の例としては、１以上のトレハロース、スクロース、グリセロール、およびメチレングリコールが挙げられる。他の適切な乾燥剤としては、これらに限定されないが、非還元糖および糖アルコール（例えば、マニトールまたはソルビトール）が挙げられる。
【００７８】
製剤はまた、殺真菌剤、抗細菌剤、除草剤、殺線虫剤、植物生育制御因子、殺鼠剤、および栄養剤などの１以上の剤を含み得る。かかる剤は、製剤が適用される農業用種子または苗と理想的に適合性である（例えば、植物の生育または健康に有害であるべきではない）。
【００７９】
製剤が、液体溶液または懸濁液である場合、改変細菌は、水溶液で混合または懸濁され得る。適切な液体希釈液またはキャリアとしては、水溶液、石油留出物、または他の液体キャリアが挙げられる。
【００８０】
固体組成物である製剤は、改変細菌を、ピート、コムギ、糠、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、珪藻土、フラー土、または低温殺菌土壌などの適切に配分された固体キャリア中または固体キャリア上に分散することによって調製することができる。かかる製剤を水和剤として使用する場合、非イオン性、アニオン性、両性、またはカチオン性の分散剤および乳化剤などの生物学的に適合性の分散剤が使用できる。
【００８１】
本発明の側面において有用な固体キャリアとしては、例えば、カオリン粘土、パイロフィライト、ベントナイト、モンモリロナイト、珪藻土、酸性白色土壌(acid white soil)、バーミキュライト、およびパーライトなどの鉱物キャリア、および硫酸アンモニウム、ホウ酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウムおよび炭酸カルシウムなどの無機塩が挙げられる。また、小麦粉、小麦ふすま、および米ふすまなどの有機微粒子が使用できる。液体キャリアとしては、大豆油および綿実油などの植物油、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコールなどが挙げられる。
【００８２】
本明細書中の改変細菌は、本明細書に記載の１以上の剤と組み合わせて、植物、種、または苗と組み合わせるのに適切な製剤を生じることができる。改変細菌は、例えば、合成増殖培地を使用して、培養中の増殖物から得ることができる。さらに、微生物は、固体培地、例えば、ペトリ皿で培養し、こすり取り、製剤に懸濁することができる。異なる増殖期の微生物を使用することができる。例えば、誘導期、対数初期、対数中期、対数後期、静止期、死滅初期、または死滅期の微生物が使用できる。
【００８３】
いくつかの態様において、本発明はまた、植物、種または苗とともに、またはこれらなしで、改変細菌を含む容器または装置を含む。例えば、本発明は、改変細菌を有する少なくとも１，０００個の種を含むバッグを含み得る。バッグはさらに、種および／または上記改変細菌について記載する標識を含む。
【００８４】
種子の集団は、市販に適切なバッグまたは容器中に包装され得る。かかるバッグは、本明細書に記載されるような改変細菌を含む種子の単位重量または数量を含んでおり、さらに標識を含む。１つの態様において、バッグまたは容器は、少なくとも１，０００個の種、例えば、少なくとも５，０００個の種、少なくとも１０，０００個の種、少なくとも２０，０００個の種、少なくとも３０，０００個の種、少なくとも５０，０００個の種、少なくとも７０，０００個の種、少なくとも８０，０００個の種、少なくとも９０，０００個の種、またはそれ以上を含む。別の態様において、バッグまたは容器は、別の重量の種、例えば、少なくとも１ｌｂ、少なくとも２ｌｂ、少なくとも５ｌｂ、少なくとも１０ｌｂ、少なくとも３０ｌｂ、少なくとも５０ｌｂ、少なくとも７０ｌｂ、またはそれ以上を含み得る。バッグまたは容器は、種子および／または上記改変細菌を説明する標識を含む。標識は、さらなる情報、例えば、正味重量、ロット番号、種子の地理的起源、試験日、発芽率、不活性物質含量、および、もしあれば、有害な雑草の量からなる群から選択される情報を含んでいてもよい。適切な容器または包装は、植物種子の商業化において伝統的に使用されるものを含む。
【００８５】
改変細菌を含む実質的に均一な種子の集団は、本発明の別の側面において提供される。いくつかの態様において、集団中の種子の、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上が、植物にコロニー形成するのに有効な量で改変細菌を含む。他の場合において、集団中の種子の、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上が、１個の種子当たり、その表面に少なくとも１００ＣＦＵ、例えば、少なくとも２００ＣＦＵ、少なくとも３００ＣＦＵ、少なくとも１，０００ＣＦＵ、少なくとも３，０００ＣＦＵ、少なくとも１０，０００ＣＦＵ、少なくとも３０，０００ＣＦＵ、少なくとも１００，０００ＣＦＵ、少なくとも３００，０００ＣＦＵ、少なくとも１，０００，０００ＣＦＵ、またはそれ以上を含む。
【００８６】
あるいは、実質的に均一な集団の植物が提供される。集団は、少なくとも１００の植物、例えば、少なくとも３００の植物、少なくとも１，０００の植物、少なくとも３，０００の植物、少なくとも１０，０００の植物、少なくとも３０，０００の植物、少なくとも１００，０００の植物、またはそれ以上を含む。植物は、本明細書に記載されるような改変細菌を含む種子から生育される。均一性が増加した植物は、多数の異なる様式で測定され得る。
【００８７】
いくつかの態様において、植物集団内の改変細菌に関して、均一性の増加が存在する。例えば、１つの態様において、植物の集団の実質的な部分、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の集団中の種子または植物が、閾値の数の改変細菌を含む。閾値の数は、植物または植物の部分において、少なくとも１００ＣＦＵ、例えば、少なくとも３００ＣＦＵ、少なくとも１，０００ＣＦＵ、少なくとも３，０００ＣＦＵ、少なくとも１０，０００ＣＦＵ、少なくとも３０，０００ＣＦＵ、少なくとも１００，０００ＣＦＵ、またはそれ以上であり得る。あるいは、植物の集団の実質的な部分において、例えば、集団における植物の、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上において、種子または苗に提供される改変細菌は、植物／種子における総微生物集団の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％を表す。
【００８８】
本発明は、その適用において、以下の詳細な説明に示されるかまたは図面において例示される構成の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の態様が可能であり、種々の様式で実践または実施することができる。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明の目的のためであり、限定とみなされるべきではない。本明細書における「含む(including)」、「含む(comprising)」または「有する」、「含む(containing)」、「含む(involving)」、およびそのバリエーションは、以降に列挙される項目およびその等価物ならびにさらなる項目を包含することを意味する。
【００８９】
例
例１：リファクターされたｎｉｆクラスターを使用するサルモネラにおける窒素固定
方法
細菌におけるニトロゲナーゼ活性アッセイ
アセチレン還元アッセイを使用して、自由な生育条件で、細菌のニトロゲナーゼ活性を測定した。培養は、単一コロニーを、１５ｍＬ培養管中で、適切な抗生物質と共に、１ｍＬのＬＢ培地に接種することによって開始した。３７℃で１２ｈ、２５０ｒｐｍで振盪して増殖させた培養物を、９６ウェルの深ウェルプレート中で、適切な抗生物質を含む、１ｍＬの最小培地＋１７．１ｍＭ  ＭＨ４Ａｃ中に１００倍に希釈した。プレートは、３０℃で２０ｈ、９００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。培養物を、ＰＴＦＥ−シリコンセプタスクリューキャップを有する１０ｍＬガラスバイアル中で、適切な抗生物質および誘導因子で補充した２ｍＬの無窒素最小培地中で０．５のＯＤ６００に希釈した(Supelco Analytical, Bellefonte, PA, cat. #SU860103)。ボトルのヘッドスペースを、銅触媒酸素トラップを備える真空マニフォールドを使用して１００％アルゴンガスと交換した。Ｂｕｒｒｉｓボトル中でＣａＣ２から新たに発生したアセチレンを、各培養バイアルに１０％（体積／体積）まで注入して、反応を開始した。培養物は、３０℃で２０ｈ、２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させて、続いて、各バイアルに０．３ｍＬの４Ｍ  ＮａＯＨの添加を介してクエンチした。エチレン生成は、以下のとおり、ＰＡＬヘッドスペースオートサンプラーおよび水素炎イオン化検出器を備えたAgilent 7890A GC系(Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA USA)のガスクロマトグラフィーによって分析した。３５℃まで３０ｓプレインキュベートした０．２５ｍLのヘッドスペースを注入し、６０℃および１．８ｍｌ／分のＨｅ流速で、GS-CarbonPLOTカラム(0.32 mm × 30 m、3 micron; Agilent)で５分間分離した。３５／ｍｌ／分  Ｈ２および４００ｍｌ／分  大気の気流で、３００℃まで加熱したＦＩＤ中で検出を行った。アセチレンおよびエチレンは、注入後、それぞれ、３．０分および３．７分で検出した。エチレン生成は、Agilent GC/MSD ChemStation Softwareを使用して、３．７分のピークを統合することによって定量した。
【００９０】
種子滅菌、発芽および細菌の接種
表面殺菌のために、トウモロコシＢ７３種子(U.S. National Plant Germplasm System, IA)を、７０％エタノールで最初に洗浄し、５０ｒｐｍで振盪しながら、２％過塩酸ナトリウム溶液（２５％市販漂白剤）中に１５分間浸漬し、引き続き、滅菌水で３回洗浄した。表面殺菌種子を、１μＭのジベレリン酸(Sigma-Aldrich, MO)を補充した１％バクトアガープレート上に配置し、発芽前に６日間まで室温で暗黒下でインキュベートした。１０ｍＬの滅菌水に浸した規定重量の発芽紙(Ancor Paper Co., Mn)を、無窒素Fahraeus寒天培地の底に配置した。発芽した種子を、Fahraeus寒天プレート中の発芽紙の上に移植した（４つの苗／プレート）。２日間根系を確立した後、トウモロコシの根を、滅菌水で再懸濁した５０ｍＬの細菌（ＯＤ６００＝１）で浸水させ、室温でインキュベートした。細菌は、１ｈのインキュベート後にピペッティングによって取り除いた。植物生育は、アッセイ前にさらなる２週間、２６℃で２４ｈの恒明下で継続した。
【００９１】
内部コロニー形成アッセイ
接種２週間後、カミソリの刃を使用して、苗から葉および種子を除去して、植物の根のみを保持した。内部コロニー形成を決定するために、各根を、５０ｍＬファルコンチューブ中の２０ｍＬの１．６％過塩酸ナトリウム溶液（２０％市販漂白剤）に浸漬し、１分間勢いよくボルテックスし、続いで、２５ｍＬの滅菌水で４回洗浄した。表面殺菌した根を５ｍＬのＰＢＳ中で１分間ボルテックスし、次いで、最後に洗浄し、引き続き、ＬＢ寒天プレート上に蒔いて、残った細菌を定量した。滅菌した根を、５ｍＬのＰＢＳ中で乳鉢および乳棒を使用して粉砕し、抽出液を、ＰＢＳ中で連続希釈して、選択的マーカーと共にまたはこれを使用せずに、ＬＢ寒天プレート上に蒔いて、細菌の存在およびプラスミドの安定性を決定した。プレートを、コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）を分析する前に、３７℃で２４ｈインキュベートした。
【００９２】
植物におけるニトロゲナーゼ活性アッセイ
アセチレン還元アッセイを使用して、トウモロコシの苗のニトロゲナーゼ活性を測定した。細菌の接種の２週間後、インタクトな苗を、ヘッドスペース置換なしで、ラバーストッパーで密閉した２ｍＬの無窒素Fahraeus培地を含む３０ｍＬ容量の嫌気培養管(Chemglass Life Sciences, NJ)に移した。リファクターされたクラスターを保有する細菌株を接種したトウモロコシの苗について、２５ｍＬの０．５Ｍ  ＩＰＴＧを、細菌接種後１３日生育させた苗の根に適用し、その後、苗は、１２ｈの恒明下でインキュベートし、１０ｍＭ  ＩＰＴＧを含む、２ｍＬの無窒素Fahraeus培地を含有する嫌気培養管に移した。Burrisボトル中のＣａＣ２から新たに生成したアセチレンを、７％（体積／体積）まで各培養管に注入し、反応を開始した。反応は、２８℃で４日まで、１８ｈの明期および６ｈの暗期の光レジメン下で継続した。エチレン生成を、ガスクロマトグラフィーによって定量した。０．５ｍＬのヘッドスペースをサンプリングして、上に記載のものと同一の様式で分析した。
【００９３】
結果
ｎｉｆクラスターのサルモネラ株への移入
クレブシエラのネイティブおよびリファクターされたｎｉｆクラスターの移入は、クレブシエラ・オキシトカM5alおよびK12 MG1655のような大腸菌において機能的であると証明された。しかしながら、ｎｉｆクラスターの異種発現が、作物用穀物にコロニー形成し得る他の腸内細菌においても活性であろうことは証明されていない。我々は、ヒトから植物の範囲の種々の宿主に感染し得る病原性サルモネラ株を回収した。我々は、ネイティブおよびリファクターされたｎｉｆクラスターを、多様なサルモネラ株に移入し、自由な生育条件で窒素固定の試験をした。また、リファクターされたクラスターと一緒に、ＩＰＴＧに応答して全ｎｉｆクラスターの発現を駆動するセンサーおよび回路をコードするコントローラプラスミドを、サルモネラ株に導入した。
【００９４】
詳細には、ネイティブまたはリファクターされたｎｉｆクラスターを含有するサルモネラ・チフィ株は、多様なサルモネラ株の中でより高いニトロゲナーゼ活性を示した。サルモネラ・ダブリン、サルモネラ・ニューポート、およびサルモネラ・ポモナのみが、窒素固定するサルモネラ・チフィ株のものよりも低い程度に、ネイティブなｎｉｆクラスターからのニトロゲナーゼ活性を示した（図１）。
【００９５】
サルモネラ・チフィによるトウモロコシＢ７３の根の内部コロニー形成
サルモネラ株が、トウモロコシ植物において内部寄生細菌となり得るか否かを決定するために、我々は、重要な商業用作物品種であるトウモロコシＢ７３の根に細菌を接種した。異種ｎｉｆ発現によって最も高いニトロゲナーゼ活性のうちの１つを示すサルモネラ・チフィATCC 14028を、内部コロニー形成アッセイのために選択した。接種の１４日後、サルモネラ・チフィATCC 14028による内部コロニー形成を、植物の苗の根を使用して分析した。サルモネラ・チフィATCC 14028のＣＦＵは、根の表面殺菌後に検出されなかった。内部コロニー形成した細菌細胞を評価するために、各植物苗の表面殺菌した根を、ＰＢＳ中で粉砕して、ＬＢプレート上に蒔いた。我々は、粉砕した根抽出物からのサルモネラ・チフィATCC 14028による約１０６ＣＦＵ／植物の内部寄生菌のコロニー形成を検出したが、同じ環境で大腸菌MG1655によるＣＦＵは検出されなかった（図２）。これは、サルモネラ・チフィATCC 14028がトウモロコシＢ７３の内部にコロニー形成できることを示す。
【００９６】
トウモロコシ植物におけるニトロゲナーゼ活性
接種の１４日後、我々は、遺伝子改変したサルモネラ・チフィATCC 14028株に感染した植物苗からのニトロゲナーゼ活性を、アセチレン生成アッセイによって分析した。各群から３０を超える植物を分析した。ネイティブなｎｉｆクラスターおよびリファクターされたｎｉｆクラスターを保有するサルモネラ・チフィATCC 14028で接種した植物のうちそれぞれ１８％および５１％が、ｎｉｆクラスターを発現しないサルモネラ・チフィATCC 14028を接種した植物と比較して、増加したエチレン生成を示した（図３）。ネイティブなｎｉｆクラスターと比較してリファクターされたｎｉｆクラスターは、植物においてアセチレン還元のバリエーションが少なかった。このことは、リファクターされたｎｉｆクラスターの発現が、複雑なネイティブな生物学的シグナルの制御下で依然として存在するネイティブなｎｉｆクラスターの調節よりも、外的に添加された誘導因子によってリファクターされたｎｉｆクラスターの発現を制御する合成コントローラ系によって付与される我々の環境とより一貫していることを示唆する。
【００９７】
遺伝子系の安定性の改善
クラスターおよびコントローラのプラスミドベースの操作は、細胞分裂の間のプラスミド安定性に依存する。抗生物質用途としてのプラスミド安定性のためのかかる選択的圧力は、インビトロ環境において簡単に適用および維持され得る。しかしながら、プラスミドは、インビボ環境における選択的な抗生物質圧力なしで、経時的に宿主細菌から治癒される。
【００９８】
細菌における遺伝子系の安定性を増加するために、２つの操作手法を使用した。第一に、我々は、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよび選択的マーカーをコードするコントローラを、mini-Tn7系を使用して標的ゲノムに導入した[Choi, K. H., (2005). A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nature methods, 2(6), 443-448.]。mini-Tn7系を用いる転移は、宿主範囲が広く、部位特異的であることが示されている。
【００９９】
ゲノム組み込みは、必須遺伝子glmSの下流に位置するTn7付着部位(attTn7)において生じる。サルモネラは、導入された遺伝子系の単一コピー挿入を保証する単一のglmS遺伝子を含有する。ゲノム組み込みのために設計された新しいコントローラプラスミドpR6K-T7RWは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよび２つのTn7末端（Tn7LおよびTn7R）に隣接する選択マーカーからなる。上流のglmS発現からの転写の読み飛ばしによる干渉を最小化するために、構成的プロモーター駆動選択マーカーおよびセンサータンパク質lacIは、glmSと向きが反対である。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの読み飛ばしは、装置とゲノムとの間のターミネーターによってブロックされた。
【０１００】
我々は、コントローラプラスミドpR6K-T7RWおよびTnsABCDトランスポサーゼをコードするヘルパープラスミドをサルモネラATCC 14028に形質転換した。コントローラ装置の挿入部位は、ＰＣＲによって確認した。我々は、装置が、サルモネラのglmS停止コドンの２５ｂｐ下流に組み込まれていることを同定した。我々は、発芽したトウモロコシ種子の接種の２週間後、ゲノムベースのコントローラまたはプラスミドベースのコントローラのいずれかを含有する、内部コロニー形成サルモネラ株における選択的マーカーに基づくプラスミド安定性を試験した。ゲノムベースの系からのマーカーの欠失はなかったが、プラスミドベースの系からは、約２０％の株のみが、抗生物質を補充したプレート上で保持されており、サルモネラゲノム上のコントローラ装置は、植物の苗において２週間を超えて選択的圧力なしで安定していることを示す（図４Ａ）。
【０１０１】
ｎｉｆ遺伝子の最適な発現レベルが、多様な内容で、プラスミド上のクラスターの遺伝子部分を交換することによって迅速にアクセスできるように、ｎｉｆクラスターは、広範な宿主範囲のプラスミドpBBR1上で構築した。プラスミドベースのｎｉｆ系の多様性および操作性を維持するために、我々は、プラスミド上のｎｉｆクラスターの安定性を保証しながら、ゲノムベースの操作の代替物を探求した。２つのｐａｒオペロン（ｐａｒＣＢＡおよびｐａｒＤＥ）によってコードされる分配系は、プラスミドＲＫ２の安定な維持に貢献する[Easter, C. L., Schwab, H., & Helinski, D. R. (1998). Role of the parCBA operon of the broad-host-range plasmid RK2 in stable plasmid maintenance. Journal of bacteriology, 180(22), 6023-6030.]。しかしながら、ＲＫ２  ｐａｒ系の機能の移入可能性は、他のタイプのプラスミド上では試験されていない。我々は、ＲＫ２  ｐａｒ系をプラスミドpBBR1に基づいて構築したｎｉｆプラスミドに組み込み、コロニー形成した根からのサルモネラ株におけるプラスミド安定性を分析した。
【０１０２】
ｐａｒ系がない、ｎｉｆプラスミド安定性は、植物への接種の１４日後に選択的な圧力の非存在下で、４％まで減少した。一方、ｎｉｆプラスミド上にｐａｒ系を追加することにより、同一の条件下で、９６％のプラスミド安定性を生じたため、このことから、ＲＫ２  ｐａｒ系は、他のプラスミドタイプの安定性を改善するモジュールとして機能することが示唆された（図４Ｂ）。これらの操作努力は、環境に放出される予定である細菌中の複雑な複数の遺伝子系の安定性を提供するための手段としてのモジュラースタンダードとなり得る。
【０１０３】
参考文献
2022000024.tif 000038
2022000024.tif 000039
【０１０４】
等価物
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様に対する等価物を理解するか、または、単なる慣用的な実験を使用することにより達成できる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本明細書に開示される、特許書類を含む、全ての参考文献は、その全体が参考文献として組み込まれる。
【図１】
2022000024.tif 000040
【図２】
2022000024.tif 000041
【図３】
2022000024.tif 000042
【図４】
2022000024.tif 000043
【図５】
2022000024.tif 000044
【配列表】
2022000024000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年9月22日(2021.9.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2022000024000001.pdf