(57)【要約】　　　（修正有）【課題】植物におけるミトコンドリアへのタンパク質ターゲティングシグナルを提供すること。【解決手段】本発明のタンパク質輸送シグナルは、植物由来の特定なアミノ酸配列または他の特定なアミノ酸配列を含む。本発明によれば、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、およびその５’側に本発明のタンパク質輸送シグナルをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを作成する工程、および該プラスミドを植物細胞に導入する工程によって、植物において所望のタンパク質をミトコンドリアに特異的に発現させることができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１の１位から１６位までのアミノ酸配列を含む、植物ミトコンドリアへのタンパク質輸送シグナル。
【請求項２】
配列表の配列番号１の１位から５６位までのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質輸送シグナル。
【請求項３】
配列表の配列番号２の１位から９位までのアミノ酸配列を含む、植物ミトコンドリアへのタンパク質輸送シグナル。
【請求項４】
配列表の配列番号２の１位から４８位までのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のタンパク質輸送シグナル。
【請求項５】
植物において所望のタンパク質をミトコンドリアに特異的に発現させる方法であって、
該所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、およびその５’側に請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質輸送シグナルをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを作成する工程、および
該プラスミドを植物細胞に導入する工程
を含む、方法。
【請求項６】
所望のタンパク質をミトコンドリアに特異的に発現する植物の作成方法であって、
該所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、およびその５’側に請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質輸送シグナルをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを作成する工程、
該プラスミドを植物細胞に導入する工程、および
該植物細胞を培養して植物体を得る工程
を含む、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって得られた、所望のタンパク質をミトコンドリアに特異的に発現する植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物ミトコンドリアへタンパク質を特異的に輸送するためのシグナルに関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核生物において、ほとんどのミトコンドリアタンパク質は、核遺伝子によってコードされており、サイトゾルで合成され、そしてミトコンドリアに輸送される。これらの核遺伝子は、細胞進化の過程中にミトコンドリアから核に転移されたと考えられる（非特許文献１参照）。そのため、核がコードしているミトコンドリアタンパク質は、ミトコンドリアへ誘導されるためのターゲティングシグナルが必要である。このようなターゲティングシグナルは、Ｎ末端拡張領域においてプレ配列としてコードされ得ることが報告されている（非特許文献２参照）。これまでに、多くのミトコンドリア遺伝子が核ゲノムから単離されており、そして一般的に、プレ配列が次のような特徴を有することが認められている：種々のタンパク質の中で一次アミノ酸配列の類似性がないこと、塩基性残基が比較的豊富であるが酸性残基がまれであること、両親媒性のα−ヘリックス構造を形成し得ることなど（非特許文献１参照）。これらの特徴は、植物ミトコンドリアのプレ配列にも類推されるが（非特許文献３参照）、植物においていくつかの例外が知られている。例えば、プレ配列における顕著な相同性が、種々のミトコンドリア遺伝子間で見出されている（非特許文献４〜６参照）。同様の証拠が、葉緑体遺伝子のターゲティング配列において報告されている（非特許文献７参照）。
【０００３】
発明者らは、これまでに、イネの核ゲノムからミトコンドリアリボソームタンパク質Ｓ１０（ＲＰＳ１０）およびＳ１４（ＲＰＳ１４）をコードする２つの遺伝子（ｒｐｓ１０およびｒｐｓ１４）を単離している（非特許文献８および９参照）。これらのホモログは、他の植物種のミトコンドリアゲノムにおいて存在が認められているので、これらは、比較的最近になって核に転移されたと考えられる。これらの２つの遺伝子ｒｐｓ１０およびｒｐｓ１４は、ミトコンドリアへ輸送されるためのターゲティングシグナルを有すると考えられる。一般的にターゲティングシグナルが存在すると考えられるＮ末端側については、ｒｐｓ１０遺伝子は、明らかなＮ末端拡張配列を有さないが、ｒｐｓ１４遺伝子は、ミトコンドリアゲノムでコードされた他の遺伝子と比較して長いＮ末端拡張配列を有する。しかし、タンパク質のどの部分が２つの遺伝子産物についてのミトコンドリアターゲティングに関連するかは全く不明である。
【０００４】
インビボでタンパク質の細胞内局在を検討するために、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が用いられている。ＧＦＰは、生存細胞において毒性がないことおよび特別なコファクターまたは基質を必要としないことなどの利点を有する。そのため、生存植物細胞においてタンパク質を可視化する目的で、増強されたＧＦＰ構築物を得るように遺伝子操作される（例えば、非特許文献１０参照）。このシステムはまた、インビボで植物ミトコンドリアを可視化するために適用されている（非特許文献１１および１２参照）。これまで、植物ミトコンドリアタンパク質の局在を検討するために、ならびにインビボでＧＦＰを用いることによって（例えば、非特許文献１３参照）およびインビトロ実験で（例えば、非特許文献１４参照）プレ配列の機能決定基を明らかにするために、いくつかの分析が行われてきた。しかし、ＧＦＰを用いた植物リボソームタンパク質の分析はまだ限られている（非特許文献１５〜１７参照）。特に、ミトコンドリアリボソームタンパク質のターゲティングに関連する配列決定基の同定についての分析は行われていない。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｇｒａｙ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１９９２年，第１４１巻、ｐ．２３３−３５７
【非特許文献２】
Ｔａｍｍ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９１年，第１０７１巻，ｐ．１２３−１４８
【非特許文献３】
Ｗｈｅｌａｎ，Ｊ．およびＧｌａｓｅｒ，Ｅ．、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７年，第３３巻，ｐ．７７１−７８９
【非特許文献４】
Ｋａｄｏｗａｋｉ，Ｋ．ら、ＥＭＢＯ　Ｊ．，１９９６年，第１５巻，ｐ．６６５２−６６６１
【非特許文献５】
Ａｄａｍｓ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０５巻，ｐ．３５４−３５７
【非特許文献６】
Ａｄａｍｓ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１年，第１５８巻，ｐ．１２８９−１３００
【非特許文献７】
Ａｒｉｍｕｒａ，Ｓ．およびＴｓｕｔｓｕｍｉ，Ｎ．、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，１９９９年，第４５０巻，ｐ．２３１−２３４
【非特許文献８】
Ｋｕｂｏ，Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９年，第９６巻，ｐ．９２０７−９２１１
【非特許文献９】
Ｋｕｂｏ，Ｎ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００年，第２６３巻，ｐ．７３３−７３９
【非特許文献１０】
Ｃｈｉｕ，Ｗ．Ｌ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１９９６年，第６巻，ｐ．３２５−３３０
【非特許文献１１】
Ｋｏｈｌｅｒ，Ｒ．ら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，１９９７年，第１１巻，ｐ．６１３−６２１
【非特許文献１２】
Ｎｉｗａら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，１９９９年，第１８巻，ｐ．４５５−４６３
【非特許文献１３】
Ｄｕｂｙ，Ｇ．ら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，２００１年，第２７巻，ｐ．５３９−５４９
【非特許文献１４】
Ｔａｎｕｄｊｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９年，第２７４巻，ｐ．１２８６−１２９３
【非特許文献１５】
Ｈａｎｄａ，Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２００１年，第２６５巻，ｐ．５６９−５７５
【非特許文献１６】
Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，２００１年，第１３巻，ｐ．２７１９−２７３０
【非特許文献１７】
Ｍｏｌｌｉｅｒ，ｐ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，２００２年，第４０巻，ｐ．４０５−４０９
【非特許文献１８】
Ｗｉｓｃｈｍａｎｎ，Ｃ．およびＳｃｈｕｓｔｅｒ，Ｗ．、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．，１９９５年，第３７４巻，ｐ．１５２−１５６
【非特許文献１９】
Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｐ．ら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，１９９９年，第１８巻，ｐ．６０１−６０９
【非特許文献２０】
Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｐ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９９年，第２６２巻，ｐ．１３９−４４
【非特許文献２１】
Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｐ．ら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，２００１年，第２７巻，ｐ．４２７−４３８
【非特許文献２２】
Ｏｄａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９２年，第２２３巻，ｐ．１−７
【非特許文献２３】
Ｋｎｏｏｐ，Ｖ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９５年，第２７巻，ｐ．５５９−５６４
【非特許文献２４】
Ｚａｎｌｕｎｇｏ，Ｓ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９５年，第２７巻，ｐ．５６５−５７１
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物におけるミトコンドリアへのタンパク質ターゲティングシグナルを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記のイネ核ゲノム由来の２種類の遺伝子を用い、ミトコンドリアの局在に必要な配列を絞り込み、二次構造予測から重要な配列を破壊することによって、ミトコンドリアへのタンパク質輸送機能が失われることを見出した。すなわち、イネにおいてミトコンドリアへの局在を支配する配列を明らかにし、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、配列表の配列番号１の１位から１６位までのアミノ酸配列を含む、植物ミトコンドリアへのタンパク質輸送シグナルを提供する。
【０００９】
好適な実施態様では、上記タンパク質輸送シグナルは、配列表の配列番号１の１位から５６位までのアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本発明はまた、配列表の配列番号２の１位から９位までのアミノ酸配列を含む、植物ミトコンドリアへのタンパク質輸送シグナルを提供する。
【００１１】
好適な実施態様では、上記タンパク質輸送シグナルは、配列表の配列番号２の１位から４８位までのアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明はさらに、植物において所望のタンパク質をミトコンドリアに特異的に発現させる方法を提供し、該方法は、
該所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、およびその５’側に上記のいずれかのタンパク質輸送シグナルをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを作成する工程、および
該プラスミドを植物細胞に導入する工程を含む。
【００１３】
本発明はまた、所望のタンパク質をミトコンドリアに特異的に発現する植物の作成方法を提供し、該方法は、
該所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、およびその５’側に上記のいずれかのタンパク質輸送シグナルをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを作成する工程、
該プラスミドを植物細胞に導入する工程、および
該植物細胞を培養して植物体を得る工程を含む。
【００１４】
本発明はさらに、上記の作成方法によって得られた、所望のタンパク質をミトコンドリアに特異的に発現する植物を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明において、「イネのミトコンドリアリボソームタンパク質Ｓ１０（ＲＰＳ１０）」とは、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をいい、イネ核ゲノムのｒｐｓ１０遺伝子によってコードされている。このイネｒｐｓ１０遺伝子は、既に単離されており、公知の配列である（非特許文献８および９参照）。
【００１６】
ｒｐｓ１０遺伝子は、イネ以外のいくつかの高等植物の核ゲノムからも単離されている（非特許文献５、９、および１８参照）。植物種間のｒｐｓ１０遺伝子構造を比較すると、それらのＮ末端拡張のサイズには大きな変動がある。例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｒｐｓ１０遺伝子は、５’部分に拡張されたリーディングフレームを有する（非特許文献１８参照）。反対に、イネ、トウモロコシ、ホウレンソウ、およびカタバミ属の植物のｒｐｓ１０遺伝子は、ミトコンドリアターゲティングシグナルに関する明らかなＮ末端拡張を有さない（非特許文献５および９参照）。
【００１７】
本発明において、「イネのミトコンドリアリボソームタンパク質Ｓ１４（ＲＰＳ１４）」とは、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をいい、イネ核ゲノムのｒｐｓ１４遺伝子によってコードされている。イネｒｐｓ１４遺伝子は、既に単離されており、公知の配列である（非特許文献８および９参照）。
【００１８】
イネおよびトウモロコシの核ｒｐｓ１４遺伝子は、他の植物種のミトコンドリアゲノムにおいてコードされた対応する遺伝子と比較した場合、非常に長いＮ末端拡張配列を有する（それぞれ２５０および２４８アミノ酸長）（非特許文献８および１９参照）。核ｒｐｓ１４遺伝子の拡張配列は、４９〜２４９位にコハク酸デヒドロゲナーゼサブユニットＢ（ＳＤＨＢ）のコード領域の一部と相同な配列を含むことを特徴とする。なお、例外として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの核ｒｐｓ１４遺伝子は、より短い遺伝子を有し、そしてその配列は、イネおよびトウモロコシの配列と全体的に異なることが報告されている（非特許文献２０参照）。
【００１９】
上記の知見から、植物ミトコンドリアへのタンパク質輸送シグナルは、進化の過程で生じたミトコンドリアから核への遺伝子転移事象の後に、植物種において独立して獲得されたＮ末端領域における迅速な配列改変によって生じた配列と考えられる。
【００２０】
本発明の植物ミトコンドリアへのタンパク質輸送シグナルは、１つの実施態様において、少なくとも配列表の配列番号１の１位から１６位までのアミノ酸配列を含み、そして植物ミトコンドリアにタンパク質を輸送する機能を有する。この１位から１６位までのアミノ酸配列は、上記ＲＰＳ１０タンパク質のＮ末端側に存在し、α−ヘリックス構造を形成し得るアミノ酸配列である。この配列が、ミトコンドリアへの局在に関与し得ると考えられる。好ましくは、本発明のタンパク質輸送シグナルは、そのＮ末端部に配列番号１の１位から１６位までのアミノ酸配列を有する。本発明のタンパク質輸送シグナルは、好ましくは１６アミノ酸長より長く、６０アミノ酸長以下、より好適には５０アミノ酸長以下、さらに好ましくは３０アミノ酸長以下の長さである。好適には、配列表の配列番号１の１位から５６位までのアミノ酸配列であり、より好適には、配列表の配列番号１の１位から１６位までのアミノ酸配列である。
【００２１】
本発明の植物ミトコンドリアへのタンパク質輸送シグナルは、他の実施態様においては、少なくとも配列表の配列番号２の１位から９位までのアミノ酸配列を含み、そして植物ミトコンドリアへのタンパク質輸送機能およびその後の輸送シグナルの切り離し機能を有する。この１位から９位までのアミノ酸配列は、上記ＲＰＳ１４タンパク質のＮ末端側に存在し、α−ヘリックス構造を形成し得るアミノ酸配列である。この配列が、ミトコンドリアへの局在に関与し得ると考えられる。好ましくは、本発明のタンパク質輸送シグナルは、そのＮ末端部に配列番号２の１位から９位までのアミノ酸配列を有する。本発明のタンパク質輸送シグナルは、好ましくは９アミノ酸長より長く、６０アミノ酸長以下、より好適には５０アミノ酸長以下、さらに好ましくは３０アミノ酸長以下の長さである。好適には、配列表の配列番号２の１位から４８位までのアミノ酸配列であり、より好適には、配列表の配列番号２の１位から９位までのアミノ酸配列である。
【００２２】
本発明の植物ミトコンドリアへのタンパク質輸送シグナルは、上記のイネ核ゲノムのｒｐｓ１０遺伝子およびｒｐｓ１４遺伝子によってコードされるタンパク質ＲＰＳ１０およびＲＰＳ１４の二次構造予測から推測することができる。二次構造予測は、どのような方法で行ってもよい。例えば、５つの異なるアルゴリズムの組み合わせによるＮｅｗ　Ｊｏｉｎｔ法（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．およびＮｏｇｕｃｈｉ，Ｔ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９１年，第２０２巻，ｐ．３１−４４）で行うことが好適である。この方法による二次構造予測は、図１に示すとおりである。
【００２３】
詳細には、イネＲＰＳ１０のＮ末端領域（配列番号１の１〜１６位）は、α−ヘリックス構造にフォールディングし得る。ＲＰＳ１０のＣ末端領域（配列番号１の５１〜８５位および８９〜１０８位）には、他のα−ヘリックスストレッチがある。ヘリカルホイール投射分析では、イネＲＰＳ１０のＮ末端の１６アミノ酸が両親媒性α−ヘリックス構造を形成し、そこでは親水性および疎水性の残基がα−ヘリックスにおいて互いに反対側に位置する。イネＲＰＳ１０の他の領域は、このような構造を示さない。
【００２４】
一方、イネＲＰＳ１４では、Ｎ末端領域（配列番号２の１〜９位）にα−ヘリックス構造があり、続いてＮ末端拡張領域に４つのα−ヘリックスクラスター（配列番号２の８０〜８８位、１６１〜１６７位、２１７〜２２３位、および２２６〜２３３位）がある。ヘリカルホイール投射分析では、イネＲＰＳ１４は、上記のイネＲＰＳ１０のＮ末端の１６アミノ酸に見られるような特別な構造を示さない。
【００２５】
本発明によれば、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、およびその５’側に上記のいずれかのタンパク質輸送シグナルをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを作成する工程、および該プラスミドを植物細胞に導入する工程によって、植物において所望のタンパク質をミトコンドリアに特異的に発現させることができる。すなわち、所望のタンパク質は、上記のタンパク質輸送シグナルとの融合タンパク質として発現することによって、発現後、ミトコンドリアに特異的に輸送される。
【００２６】
本発明において用いられる植物細胞としては、特に限定されない。例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、サトウキビ、ダイズなどの植物細胞が挙げられる。特に、イネ、タバコ、トマト、ニンジン、サトウキビなどの細胞が好ましい。
【００２７】
所望のタンパク質は、ミトコンドリアで発現させることを目的とする任意のタンパク質であり、どのようなタンパク質であってもよい。また、複数のタンパク質を含む融合タンパク質であってもよい。例えば、検出可能なタンパク質、ミトコンドリア酵素を活性化または阻害し得るタンパク質（酵素）などが挙げられる。検出可能なタンパク質としては、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどが挙げられる。ミトコンドリア酵素を活性化または阻害し得るタンパク質（酵素）としては、ミトコンドリア酵素のアナログなどが挙げられる。
【００２８】
本発明において、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列とタンパク質輸送シグナルをコードするＤＮＡ配列とを有するプラスミドは、植物細胞に対して通常用いられるプラスミドを用いて作成される。例えば、各種アグロバクテリウム由来のＴｉプラスミドなどが挙げられる。タンパク質輸送シグナルをコードするＤＮＡ配列は、イネゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。また、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列も、そのタンパク質の起源生物のゲノムライブラリーから得られ得る。あるいは、予め所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する市販のプラスミドを用いてもよい。それぞれの配列を、タンパク質輸送シグナルをコードするＤＮＡ配列が上流側に配置されるように、適切なベクターにサブクローニングする。得られたプラスミド構築物のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認し得る。
【００２９】
得られたプラスミドは、植物細胞に対して通常用いられる種々の遺伝子導入方法によって、植物細胞に導入される。このような方法としては、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどが挙げられる。例えば、プラスミド構築物を含む金ビーズを作成し、このビーズを植物細胞に導入することによって、植物細胞をトランスフェクトできる。あるいは、プラスミド構築物を、例えば、エレクトロポレーション法によって、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由来ベクターを使用して、植物細胞に導入することもできる。
【００３０】
プラスミドが導入された細胞は、適切な条件下で培養され、所望のタンパク質をミトコンドリアに特異的に発現する植物体が作成される。例えば、所望のタンパク質として検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質が発現されていれば、このタンパク質がミトコンドリアに特異的に分布したことを容易に観察することができる。
【００３１】
【実施例】
（実施例１：イネＲＰＳ１０およびＲＰＳ１４の二次構造の予測）
核ゲノムにコードされるミトコンドリアタンパク質のプレ配列部分は、両親媒性α−ヘリックス構造を形成し得るものが多いことから、イネＲＰＳ１０およびＲＰＳ１４の領域がこのような構造を形成し得るかを検討した。すなわち、イネ公知のイネｒｐｓ１０およびｒｐｓ１４から推定されるＲＰＳ１０およびＲＰＳ１４のアミノ酸配列の二次構造を、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ｐａｐｉａ／ｈｏｗｔｏｕｓｅ／ｈｏｗｔｏｕｓｅ＿ｓｓｐ＿ｓｅｑ．ｈｔｍｌ）によるＮｅｗ　Ｊｏｉｎｔ法（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．およびＮｏｇｕｃｈｉ，Ｔ．、１９９１年，前出）によって予測した。これは、以下の５つの異なるアルゴリズムの組み合わせを用いて行った：Ｎｉｓｈｉｋａｗａ−Ｏｏｉ（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．およびＯｏｉ，Ｔ．、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１９７４年，第４３巻，ｐ．３５１−３７４）、Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ（Ｑｉａｎ，Ｎ．およびＳｅｊｎｏｗｓｋｉ，Ｔ．Ｊ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８８年，第２０２巻，ｐ．８６５−８８４）、Ｐｔｉｔｓｙｎ−Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ（Ｐｔｉｔｓｙｎ，Ｏ．Ｂ．およびＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｖ．、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９８１年，第１３巻，ｐ．３３９−３８６）、ＳＳＴｈｒｅａｄ（Ｉｔｏ，Ｍ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１９９７年，第１３巻，ｐ．４１５−４２４）、およびＧｉｂｒａｔ−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ（Ｇｉｂｒａｔ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７年，第１９８巻，ｐ．４２５−４４２）。
【００３２】
予測した結果を図１に示す。（Ａ）はイネＲＰＳ１０および（Ｂ）はＲＰＳ１４についての予測結果である。一文字表記によるアミノ酸配列および５つのアルゴリズムの結果を、上から下へ示し、Ｎｅｗ　Ｊｏｉｎｔ法での最終結果を最下列に示す。「Ｈ」、「Ｅ」、および「Ｃ」は、それぞれα−ヘリックス、β−シート、およびコイル構造を表す。塩基性残基を「＋」で示す。アミノ酸残基の数を、括弧で示す。
【００３３】
予測結果から、イネＲＰＳ１０のＮ末端領域（配列番号１の１〜１６位）は、Ｎｅｗ　Ｊｏｉｎｔ法においてＨで表されており、α−ヘリックス構造にフォールディングし得ることがわかった。さらに、ＲＰＳ１０のＣ末端領域（配列番号１の５１〜８５位および８９〜１０８位）には、他のα−ヘリックスストレッチがあった。ヘリカルホイール投射分析では、イネＲＰＳ１０のＮ末端の１６アミノ酸が両親媒性α−ヘリックス構造を形成し、そこで親水性および疎水性の残基がα−ヘリックスにおいて互いに反対側に位置することを示した。イネＲＰＳ１０の他の領域では、このような構造は見られなかった（データを示さず）。
【００３４】
また、イネＲＰＳ１４では、Ｎ末端部分（配列番号２の１〜９位）にα−ヘリックス構造があり、続いてＮ末端拡張領域（配列番号２の１〜２５０位）内に他に４つのα−ヘリックスクラスター（配列番号２の８０〜８８位、１６１〜１６７位、２１７〜２２３位、および２２６〜２３３位）があった。ヘリカルホイール投射分析では、イネＲＰＳ１４のＮ末端は、イネＲＰＳ１０のＮ末端の１６アミノ酸で見られるような特別な構造を示さなかった（データを示さず）。
【００３５】
一般的に、プレ配列は、ミトコンドリアへのターゲティング情報だけでなく、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）によるプロセシングのための情報も含む。植物のＭＰＰプロセシング部位は、プロセシング部位の近傍の保存されたアルギニンの位置に関して３つのグループ：−２位のアルギニン残基、−３位のアルギニン残基、および保存されたアルギニンがない）に分類されることが知られている（非特許文献２１参照）。プレ配列に相当すると考えられるイネＲＰＳ１４のＮ末端拡張配列には、アミノ酸２４〜２８位にＲ−３開裂モチーフがあることが報告されている（非特許文献１９参照）。しかし、イネＲＰＳ１４ペプチドの成熟サイズは、タンパク質ブロット分析によって１６．５ｋＤａと推定され、これはｒｐｓ１４遺伝子全体から予測されるサイズより明らかに短かった（非特許文献８参照）。したがって、他の内部開裂部位が下流領域に存在すると考えられるが、実際のプロセシング部位は未だ明らかではない。一方、このような保存されたモチーフは、イネＲＰＳ１０では見られなかった。また、これまでのタンパク質ブロット分析では、イネＲＰＳ１０タンパク質のサイズは、そのｃＤＮＡ配列から予測されたものと類似することが示されている（非特許文献９参照）。したがって、ＲＰＳ１０タンパク質は、ミトコンドリアへのタンパク質輸入後においても、長いペプチド配列のプロセシングが起こらないと考えられる。
【００３６】
（実施例２：ＧＦＰ融合タンパク質の構築および可視化）
ＲＰＳ１０およびＲＰＳ１４タンパク質は、２つのタンパク質に対して惹起した特異的抗体でのタンパク質ブロット分析により、イネミトコンドリアに存在することが検出されている（非特許文献８および９参照）。イネＲＰＳ１０およびＲＰＳ１４タンパク質が、実際にミトコンドリアにソーティングされるかどうかを評価するために、タンパク質の細胞内局在を、ＧＦＰを用いることによってインビボで検討した。
【００３７】
図２に示すように、ＲＰＳ１０のＮ末端領域をＧＦＰの上流側に融合させたタンパク質ＲＰＳ１０Ｎ−ＧＦＰ（Ｃ）、ＲＰＳ１０のＮ末端領域をＧＦＰの下流側に融合させたタンパク質ＧＦＰ−ＲＰＳ１０Ｃ（Ｄ）、およびＲＰＳ１４のＮ末端領域をＧＦＰの上流側に融合させたタンパク質ＲＰＳ１４Ｎ−ＧＦＰ（Ｅ）を発現するように、プラスミドを構築した。図２において、３５Ｓは、カリフラワーモザイクウイルス由来の構成的プロモーター；ＧＦＰは、合成ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）ｃＤＮＡのＯＲＦ；そしてＮＯＳ３’は、ノパリンシンターゼターミネーターを示す。（Ｃ）ＲＰＳ１０Ｎ−ＧＦＰおよび（Ｄ）ＧＦＰ−ＲＰＳ１０Ｃ構築物において、ＲＰＳ１０コード領域を、「ＲＰＳ１０」と記載した灰色のボックスで示す。（Ｅ）において、ＳＤＨＢを灰色のボックス、そしてミトコンドリアでコードされたＲＰＳ１４に相同な領域を黒のボックスで示す。ｒｐｓ１４においてＳＤＨＢよりも上流の領域を、タータンチェックのボックスで示す。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーを、矢印で示す。
【００３８】
まず、イネｒｐｓ１０およびｒｐｓ１４遺伝子の一部を、イネゲノムから、プライマーとして、
Ｐ１：５’−ａａｔｔｃｇｇｇｔｃｇａｃｃｃｃｃａｇｔｃｃ−３’（配列番号３）とＰ２：５’−ｃｔｔｇａｃａｔｔｃａｔｇａａｇａａｃｔｇｃｔ−３’（配列番号４）；
Ｐ３：５’−ｇｇｇａｇｃａｇｔｔｇｔａｃａｔｇｃａｔｇｔｃａ−３’（配列番号５）とＰ４：５’−ｇｔｇａａｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇａａｇｔｇｃ−３’（配列番号６）；および
Ｐ７：５’−ａｔｔｃｇｇｇｔｃｇａｃｇａａａｃｃｃｃａａａ−３’（配列番号９）とＰ８：５’−ｔｃｇａｇａａｃｇｃｃａｔｇｇｔｇｔｔｃｇ−３’（配列番号１０）
をそれぞれ用いて、ＰＣＲによって増幅した。増幅したＤＮＡのそれぞれを、発現ベクターＳ６５ＴＧＦＰ［ＣａＭＶ３５Ｓｐｒｏ：：Ｓ６５ＴＧＦＰ：：ＮＯＳｔｅｒ］（非特許文献１０参照；Ｄｒ．　Ｙ．　Ｎｉｗａにより供与された）においてＧＦＰとインフレームでライゲートした。得られたプラスミドのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００３９】
各１０ｍｇのプラスミドＤＮＡを、１．０μｍの球状の金ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）上に沈殿させ、そしてＰＤＳ−１０００粒子送達システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いることによって、ビーズを、懸濁培養したタバコＢＹ−２細胞に粒子衝突によって導入した。この導入の後、試料を２４℃にて暗所で２４時間インキュベートした。ＧＦＰ蛍光を、既述のように共焦点蛍光顕微鏡によって可視化した（Ｎａｋａｚｏｎｏ，Ｍ．ら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０００年，第１２４巻，ｐ．５８７−５９８；Ａｒｉｍｕｒａ，Ｓ．およびＴｓｕｔｓｕｍｉ，Ｎ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，ｐ．５７２７−５７３１参照）。また、培養した細胞のミトコンドリアを、５００ｎＭのミトコンドリア特異的染料Ｍｉｔｏ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＣＭＸＲｏｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ）で染色した。ＧＦＰおよびＭｉｔｏ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄの蛍光を別々にスキャンし、次いでそれらのイメージを組み合わせた。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＡＴＰａｓｅδのミトコンドリアターゲティングシグナルがＧＦＰの上流に融合されているプラスミドｐＷＳを、ミトコンドリアターゲティングのポジティブコントロールに用いた（Ｄｒ．　Ｗ．　Ｓａｋａｍｏｔｏにより供与された；図２（Ｂ）参照）。また、ネガティブコントロールとして、ミトコンドリアへの輸送シグナル配列を有さないＳ６５ＴＧＦＰを用いた（図２（Ａ）参照）。
【００４０】
Ｓ６５ＴＧＦＰ（Ａ）およびｐＷＳ（Ｂ）のスキャン結果の顕微鏡写真を図３に示す。ポジティブコントロールのｐＷＳプラスミドでは、ＧＦＰの蛍光は、約１μｍ直径の粒子内に局在した（図３Ｂ）。これらの粒子の位置は、ミトコンドリアの位置を示すＭｉｔｏ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄの蛍光の位置と明らかに一致し、これは、ミトコンドリアへの特異的なタンパク質ターゲティングを示した（図３Ｂ）。Ｓ６５ＴＧＦＰ構築物単独では、ＧＦＰ蛍光は、Ｃｈｉｕら（非特許文献１０参照）によって示されるように、核への局在の他に、細胞質全体への分散が見られた。また、ＧＦＰ蛍光はミトコンドリアを示すＭｉｔｏ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄの蛍光と重複しなかった（図３Ａ）。
【００４１】
イネＲＰＳ１０のＮ末端部分（配列番号１の１〜５６位）をＧＦＰの上流に融合したＲＰＳ１０Ｎ−ＧＦＰ構築物の場合、ＧＦＰ融合タンパク質の蛍光は、ｐＷＳプラスミドの場合と同様にミトコンドリアで特異的に観察された（図４Ｃ）。この結果は、ミトコンドリアへのＧＦＰの良好な輸入および局在を示し、そしてイネｒｐｓ１０遺伝子のＮ末端部分がミトコンドリアへのタンパク質をターゲティングし得ることを示す。一方、ＲＰＳ１０のＣ末端部分（配列番号１の５７〜１１２位）をＧＦＰの下流に融合したＲＰＳ１０Ｃ−ＧＦＰ構築物の場合は、ＧＦＰ融合タンパク質はサイトゾルに凝集し、そしてミトコンドリアと類似のサイズの粒子を形成した（図４Ｄ）。しかし、ＧＦＰ蛍光の位置は、Ｍｉｔｏ　ＴｒａｃｋｅｒＲｅｄの蛍光と一致しなかった。したがって、イネＲＰＳ１０のＣ末端部分は、ミトコンドリアターゲティングのための情報を含まない。
【００４２】
イネＲＰＳ１４のＮ末端部分（配列番号２の１〜４８位）をＧＦＰの上流に融合したＲＰＳ１４Ｎ−ＧＦＰ構築物では、ＧＦＰ融合タンパク質の蛍光は、明らかにミトコンドリアに局在していた（図４Ｅ）。この結果は、ターゲティング情報が、ＳＤＨＢ−相同配列の上流のＮ末端部分によりコードされていることを強く示唆する。これは、ＳＤＨＢ−相同配列とのＧＦＰ融合タンパク質が、ミトコンドリアへ局在しなかったという結果によっても支持される（データを示さず）。
【００４３】
（実施例３：プレ配列における部位特異的変異誘発）
ミトコンドリアターゲティング情報がＮ末端領域で局在する場所を検討するために、部位特異的変異誘発（点変異）を、製造業者の指示書に従ってＵ．Ｓ．Ｅ．　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を用いることによって、ＲＰＳ１０Ｎ−ＧＦＰおよびＲＰＳ１４Ｎ−ＧＦＰ構築物に導入した（図５参照）。すなわち、プライマーとしてＰ１の代わりにＰ５（配列番号７）またはＰ６（配列番号８）を用いて、変異を、ＲＰＳ１０Ｎ−ＧＦＰ構築物のＮ末端部分に導入し（Ｉｌｅ７、Ｖａｌ８、およびＭｅｔ９）、ＧｌｙまたはＰｒｏのトリプル残基に変換した。プライマーとしてＰ７の代わりにＰ９（配列番号１１）またはＰ１０（配列番号１２）を用いて、同様の変異をＲＰＳ１４Ｎ−ＧＦＰにも導入した（Ａｌａ６、Ｌｅｕ７、およびＬｅｕ８）。なお、ターゲティング特異性の喪失が、推定α−ヘリックス構造の破壊（疎水性残基の改変）によるものかあるいは塩基性残基の改変によるものかどうかを明確にするために、点変異の位置は、疎水性残基を改変し、ミトコンドリアへのタンパク質局在に重要であると考えられる塩基性残基を改変しない位置を選択した。得られた構築物を、それぞれ、ＲＰＳ１０Ｎ［Ｇｌｙ］、ＲＰＳ１０Ｎ［Ｐｒｏ］、ＲＰＳ１４Ｎ［Ｇｌｙ］、およびＲＰＳ１４Ｎ［Ｐｒｏ］と命名した（図５）。変異したプラスミドのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列決定によってモニターした。図５において、変異したアミノ酸残基および変異によって生じた二次構造の変化を、反転文字で示す。他のシンボルは、図１と同様である。
【００４４】
図５に示すように、二次構造予測は、それらのＮ末端におけるα−ヘリックスストレッチが点変異によって切断されて、短縮または破壊されることを示した。
【００４５】
次いで、これらの構築物を用いて、ＧＦＰ融合タンパク質の局在を実施例２と同様に蛍光顕微鏡で観察した。結果を図６に示す。ＲＰＳ１０Ｎ［Ｇｌｙ］−ＧＦＰおよびＲＰＳ１４Ｎ［Ｐｒｏ］−ＧＦＰ構築物では、Ｓ６５ＴＧＦＰ構築物単独と同様に、ＧＦＰ蛍光を細胞質全体にわたる広範囲で観察した。ＲＰＳ１０Ｎ［Ｐｒｏ］−ＧＦＰ構築物では、ＧＦＰタンパク質の局在は、ＧＦＰ−ＲＰＳ１０Ｃ構築物と同様であった。ＲＰＳ１４Ｎ［Ｇｌｙ］−ＧＦＰ構築物では、理由は不明であるが、蛍光は検出され得なかった（データを示さず）。このことから、特異的ミトコンドリアターゲティングは、イネＲＰＳ１０およびＲＰＳ１４のＮ末端領域における点変異によって破壊されたことが明らかである。上記の結果は、ミトコンドリアへのターゲティング情報が、２つのタンパク質のＮ末端部分によってコードされていることを強く支持し、さらに、α−ヘリックス構造が、ミトコンドリアへのタンパク質ターゲティングに役割を果たすことを示唆する。
【００４６】
したがって、ターゲティング特異性の喪失が、タンパク質ターゲティングに重要な役割を果たす疎水性残基の改変によるものであることが明らかになった。これは、タバコＡＴＰａｓｅβサブユニットについて報告されている結果と同様であった（非特許文献１３参照）。
【００４７】
上記のように、イネミトコンドリアリボソームタンパク質のＮ末端部分が、十分にミトコンドリアターゲティング機能を発揮し得ることを示し、実際に、植物ミトコンドリアにおいてリボソームタンパク質の局在に関連する決定基を明確にした。他の植物種のＲＰＳ１０と比較して、イネＲＰＳ１０のＮ末端領域にはいくつかの相違点があることは知られていた（非特許文献２２〜２４参照）。このことから、このような改変が、イネＲＰＳ１０におけるタンパク質ターゲティングシグナルの生成に関連し得ると考えられる。イネＲＰＳ１４は、ＳＤＨＢ−相同領域の一部とのキメラ配列であるが、ミトコンドリアターゲティングの特異性は、ＳＤＨＢ−相同領域ではなくＮ末端部分にあることも明らかとなった。Ｎ末端部分は両方とも、α−ヘリックス構造をとり得るが、ＲＰＳ１４は両親媒性を示さなかった。このように、Ｎ末端拡張の長さおよび進化における獲得メカニズムは２種のタンパク質間で大きく異なるにもかかわらず、２つのリボソームタンパク質におけるターゲティングシグナルの特徴が、他のミトコンドリアタンパク質で見られるものと同様であることは、興味深いことである。
【００４８】
【発明の効果】
本発明のタンパク質輸送シグナルは、ミトコンドリアへ有用物質を輸送させる際のシグナル配列として利用できる。例えば、ミトコンドリアに医薬品を蓄積させることが可能である。あるいは正常酵素と拮抗する不活化酵素を導入し、ミトコンドリア機能を妨害する不稔植物を育成することもできる。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】イネＲＰＳ１０（Ａ）およびＲＰＳ１４（Ｂ）の二次構造の予測の結果を示す図である。
【図２】ＧＦＰ構築物の概略図である。
【図３】ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４】ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】イネＲＰＳ１０およびＲＰＳ１４におけるＮ末端領域の推定二次構造の結果を示す図である。
【図６】推定ミトコンドリアターゲティングシグナルの部位特異的自己誘発分析の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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