(57)【要約】【課題】最適化された患者特異的組織操作血管移植片のためのシステムおよび方法の提供。【解決手段】組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）上への細胞播種の最適化には、ＴＥＶＧの炎症応答の低減および術後狭窄の低減が伴うことが確立されている。細胞播種は、用量依存的にＴＥＶＧ開存性を増大させ、ＴＥＶＧ開存性は、より多くの細胞が播種されたときに改善され、しかしインキュベート継続時間がＴＥＶＧ開存性に対して最小限の影響しか示さない。移植片の開存性を維持しかつ術後狭窄を低減させるのに最適な数の細胞を含む、患者特異的ＴＥＶＧを作出する方法が提供される。ＴＥＶＧ播種のための、密閉された単回使用のカスタマイズ可能なシステムも、提供される。好ましくはシステムは、細胞播種の効力が増大するように、患者特異的移植片の形態に基づいてカスタム設計される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府により資金供与を受けた研究または開発に関する声明
この発明は、Ｎａｒｕｔｏｓｈｉ  ＨｉｂｉｎｏへのＮＩＨ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍからの助成金番号１ＵＨ５４ＨＬ１１９８１０−０１の下、またＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  ＢｒｅｕｅｒへのＮＩＨ助成金番号Ｒ０１−ＨＬ０９８２２８の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年１２月１１日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／２６６，３０９および２０１６年３月１６日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／３０９，２８５（これらの両方は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益およびこれらに対する優先権を主張する。
【０００３】
本発明は、一般に、組織操作移植片の分野にあり、詳細には、患者特異的細胞が播種された、および患者自身の組織により吸収され置き換えられるように設計された、移植片の分野にある。
【背景技術】
【０００４】
多くの複雑な先天性心奇形の外科処置は、ＧＯＲＥ−ＴＥＸ（登録商標）およびＤＡＣＲＯＮ（登録商標）など、材料の合成導管の植え込みを含む。そのような適用の一般的な例は、単心室異常に関する両大静脈肺動脈吻合法（ｔｏｔａｌ  ｃａｖｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）（ＴＣＰＣ）である。ある場合には、導管としてのこれら合成移植片の使用は、進行性閉塞、感染への感受性、および血栓塞栓性合併症のリスクを伴う。全ての場合において、心血管再構築に対する著しい制約は、合成移植物の成長の潜在性に欠ける。ＴＣＰＣの場合、そのことが、患者のサイズまたは導管のオーバーサイジングによるＦｏｎｔａｎ循環の終了の延期を含めた最適ではない管理戦略をもたらす可能性があり、その結果、呼気相逆流および流動停滞の領域などの最適ではない流動特性が得られる。
【０００５】
組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）は、足場ポリマーが分解するときに自家細胞が増殖して生理的に機能性のある血管に成熟する生分解性足場を提供することによって、これらの問題を克服する（Ｓｈｉｎ’ｏｋａら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４４巻（７号）、５３２〜５３３頁（２００１年）；Ｈｉｂｉｎｏら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．  １３９巻（２号）、４３１〜４３６頁、ｅ４３２（２０１０年  Ｒｏｈ  ＪＤら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２９巻（１０号）、１４５４〜１４６３頁（２００８年）；Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（８号）、２７３１〜２７３９頁（２０１１年）；Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（１２号）、４２５３〜４２６３頁（２０１１年）；Ｋｕｒｏｂｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１巻（１号）、８８〜９３頁（２０１５年））。しかし現行のＴＥＶＧは、個々の患者の多様な解剖学的および生理的要件に直接対処しない。先天的な心臓の外科手術での使用に対して特に設計された、成長の可能性がある、最初の組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）については、既に実証された（Ｂｒｅｎｎａｎら、Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ．  ２４８巻（３号）、３７０〜３７７頁（２００８年）；Ｉｓｏｍａｔｓｕら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．  １２６巻（６号）、１９５８〜１９６２頁（２００３年）；Ｓｈｉｎ’ｏｋａら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．
３４４巻（７号）、５３２〜５３３頁（２００１年））。ヒトの臨床試験は、ＴＥＶＧの成長能力を確認し、移植片に関連した死亡および移植片の欠陥がないことを実証した（Ｓｈｉｎ’ｏｋａら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．  １２９巻（６号）、１３３０〜１３３８頁（２００５年））。しかしこの研究の結果は、狭窄が一次性移植片関連合併症であり、移植患者のほぼ２５％がその影響を受け、レシピエントの１６％が臨界狭窄（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）（内腔径における＞７５％の減少）を発症させることも実証した（Ｈｉｂｉｎｏら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．  １３９巻（２号）、４３１〜４３６頁、ｅ４３２（２０１０年））。さらに、先天性心疾患の患者を処置するのにＴＥＶＧを使用する、将来有望な結果にも関わらず、臨床適用における移植片狭窄の高い発生率は、この技術の広範の使用を妨げる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３巻、８３〜９０頁（２０１４年）；Ｍｃａｌｌｉｓｔｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３７３巻（９６７３号）、１４４０〜１４４６頁（２００９年）；Ｗｙｓｔｒｙｃｈｏｗｓｋｉら、Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ６０巻（５号）、１３５３〜１３５７頁（２０１４年））。ＴＥＶＧの慣用的な臨床使用を推奨することができる前に、ＴＥＶＧ組み立ては、ＴＥＶＧ狭窄の形成を阻害し、かつ移植片を作製するのに必要な時間を最小限にし、かつその全体的な有用性を改善するのを助けるために、最適化されなければならない（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７巻（３号）、４０９〜４１９頁（２０１２年））。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）などの画像化技術は、手術前に、複雑な心血管の解剖学的構造の詳細な３次元（３Ｄ）的視野を外科医に提供する。しかしながら、このことを結果的に、実用的な時間および費用効果のある手法で最適化することができるシステムに繋げることは、困難であることが証明された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１４年）３巻、８３〜９０頁
【非特許文献２】Ｍｃａｌｌｉｓｔｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ（２００９年）３７３巻（９６７３号）、１４４０〜１４４６頁
【非特許文献３】Ｗｙｓｔｒｙｃｈｏｗｓｋｉら、Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ（２０１４年）６０巻（５号）、１３５３〜１３５７頁
【非特許文献４】Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１２年）７巻（３号）、４０９〜４１９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって本発明の目的は、２時間またはそれ未満で患者自身の細胞が播種され得、かつほとんどの場合に狭窄に罹らない開存移植片をもたらすことになる、患者特異的ＴＥＶＧを作製する方法および材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
３Ｄ印刷されたマンドレルの周りに被覆された、ポリ（乳酸−グリコール酸などのＦＤＡに認可された生分解性ナノ繊維材料を使用する、患者特異的組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）が、開発されてきた。ＴＥＶＧに細胞を播種することにより、用量依存的な手法で、マクロファージの浸潤の程度が低減し、細胞付着の効率が高まり、狭窄が低減し、かつ移植片の開存性が高まり、それに対して細胞のインキュベート時間はＴＥＶＧ開存性に影響を及ぼさない。
【０００９】
細胞がないまたは細胞が少ない移植片に比べて、移植片の術後狭窄を低減させるかまたは予防するのに有効な量の生存細胞を含む、患者特異的ポリマー血管移植片または導管が、提供される。典型的には、移植片には、約０．５×１０３細胞／ｍｍ２移植片から３００×１０３細胞／ｍｍ２移植片の間（両端の値を含む）、好ましくは約１．０×１０３細胞／ｍｍ２移植片から１００×１０３細胞／ｍｍ２移植片の間（両端の値を含む）の量の生存細胞が付着されている。好ましい細胞は、患者の骨髄から得られる。好ましい実施形態において、血管移植片には、自家細胞である生存細胞が播種される。特定の実施形態では、細胞がヒト骨髄単核細胞である。ポリマー血管移植片または導管は、抗新生内膜剤（ａｎｔｉ−ｎｅｏｉｎｔｉｍａ  ａｇｅｎｔ）、化学療法剤、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症物質、従来の免疫療法剤、免疫抑制物質、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子からなる群より選択される１種または複数の追加の薬剤を含むことができる。
【００１０】
患者特異的ポリマー血管移植片または導管は、移植片形態のコンピュータ支援設計モデリング；移植片のマンドレルモデルの３Ｄ印刷；マンドレルの形態をベースにした移植片の電界紡糸；および移植片に細胞を播種することを使用して創出される。典型的には、移植片または導管に接触させるのに使用される細胞の数は、移植片の表面積に比例し、細胞の数は約１．０×１０４細胞／ｍｍ２移植片から１．０×１０６細胞／ｍｍ２移植片の間（両端の値を含む）、好ましくは０．７×１０５細胞／ｍｍ２移植片から７．０×１０５細胞／ｍｍ２移植片の間（両端の値を含む）である。一部の実施形態では、患者特異的ポリマー血管移植片または導管に、０．５×１０６細胞から５００×１０６細胞の間（両端の値を含む）、好ましくは１．０×１０６細胞から１００×１０６細胞の間の量の細胞を接触させる。好ましい実施形態では、移植片に、３時間未満、好ましくは２時間未満、細胞を接触させる。接触は、典型的には滅菌された密閉播種チャンバー内で実施する。
【００１１】
ポリマー血管移植片または導管の開存性を増大させるための方法であって、移植片または導管上に、生存細胞を有効量投与して、移植片に対するマクロファージの浸潤を低減させるステップ、移植片への宿主細胞の動員を促進させるステップ、または血小板活性化を低減させるかもしくは予防するステップを含む、方法も提供される。
【００１２】
被験体における術後狭窄を低減させるかまたは低減させるかもしくは予防する方法が、開発されている。被験体は、再狭窄または他の血管増殖障害のリスクがあるまたそれらの障害を持つ被験体とすることができる。例えば一部の実施形態では、被験体は、血管外傷、血管形成、血管手術、または移植動脈症に罹ったか、罹っているか、または罹ることになる。方法は、処置していない対照被験体に比べて、被験体における新生内膜形成、狭窄、もしくは再狭窄を低減させ、血栓症を低減させるかもしくは予防し、またはこれらの任意の組み合わせである。
【００１３】
患者特異的血管移植片または導管内に細胞を播種するための、カスタマイズ可能なシステムおよび組成物も提供される。システムは、好ましくは、１つまたは複数の細胞型を含有する溶液を用いた移植片の真空支援播種に使用される、密閉された単回使用のカスタマイズ可能なシステムである。システムは、吸引ロッド、足場特異的マンドレル、足場締結具、および播種チャンバーを含むことができる。好ましい実施形態では、吸引ロッド、足場特異的マンドレル、足場締結具、および播種チャンバーの１つまたは複数は、３Ｄ印刷の方法によって生成される。患者特異的ポリマー血管移植片または導管を含むシステムも提供される。生存細胞が播種された患者特異的ポリマー血管移植片または導管を作製する、患者特異的血管移植片または導管に細胞を播種するための、カスタマイズ可能な単回使用システムを使用する方法も提供される。典型的には、方法は、移植片形態をコンピュータ支援設計モデリングするステップ；移植片のマンドレルモデルを３Ｄ印刷するステップ；マンドレルの形態をベースにして移植片を製作するステップ；ならびに真空播種のために、密閉された使い捨ておよびカスタマイズ可能なシステム内で、移植片に細胞を播種するステップを含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
植え込みの前に、細胞がないまたは細胞が少ない移植片に比べて、移植片の術後狭窄を低減させるかまたは予防するのに有効な量の生存細胞を含む、ポリマー血管移植片または導管。
（項目２）
前記移植片に、約０．５×１０３細胞／ｍｍ２移植片から３００×１０３細胞／ｍｍ２移植片の間（両端の値を含む）の量の生存細胞が付着されている、項目１に記載のポリマー血管移植片または導管。
（項目３）
前記移植片に、約１．０×１０３細胞／ｍｍ２移植片から１００×１０３細胞／ｍｍ２移植片の間（両端の値を含む）の量の生存細胞が付着されている、項目１に記載のポリマー血管移植片または導管。
（項目４）
ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（またはポリカプロラクトン、ポリアミド、多糖、コラーゲン、ならびにこれらのブレンド、コポリマー、および組み合わせからなる群より選択される１種またはポリマーを含む、項目１から３のいずれか一項に記載のポリマー血管移植片または導管。
（項目５）
前記生存細胞が自家細胞である、項目４に記載のポリマー血管移植片または導管。
（項目６）
前記生存細胞が骨髄単核細胞である、項目５に記載のポリマー血管移植片または導管。（項目７）
前記移植片が、抗新生内膜剤、化学療法剤、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症物質、従来の免疫療法剤、免疫抑制物質、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子からなる群より選択される１種または複数の追加の薬剤をさらに含む、項目４に記載のポリマー血管移植片または導管。
（項目８）
前記移植片が、
（ａ）移植片形態をコンピュータ支援設計モデリングするステップ、
（ｂ）前記移植片のマンドレルモデルを３Ｄ印刷するステップ、
（ｃ）前記マンドレルの形態をベースにして前記移植片を電界紡糸するステップ、および（ｄ）前記移植片に細胞を接触させるステップ
を含む方法により創出される、項目４に記載のポリマー血管移植片または導管。
（項目９）
前記移植片に接触させるのに使用される細胞の数が、前記移植片の表面積に比例し、前記細胞の数が、約１．０×１０４細胞／ｍｍ２移植片から１．０×１０６細胞／ｍｍ２移植片の間（両端の値を含む）、好ましくは０．７×１０５細胞／ｍｍ２移植片から７．０×１０５細胞／ｍｍ２移植片の間（両端の値を含む）である、項目８に記載のポリマー血管移植片または導管。
（項目１０）
前記移植片に、０．５×１０６細胞から５００×１０６細胞の間（両端の値を含む）、好ましくは１．０×１０６細胞から１００×１０６細胞の間の量の細胞を接触させる、項目８に記載のポリマー血管移植片または導管。
（項目１１）
前記移植片に、３時間未満、好ましくは２時間未満にわたり細胞を接触させる、項目８に記載のポリマー血管移植片または導管。
（項目１２）
前記移植片に、滅菌された密閉播種チャンバー内で細胞を接触させる、項目８に記載のポリマー血管移植片または導管。
（項目１３）
ポリマー血管移植片の開存性を増大させるための方法であって、前記移植片へのマクロファージの浸潤を低減させるか、前記移植片への宿主細胞の動員を促進させるか、または血小板活性化を低減させるかもしくは予防するのに有効な量の生存細胞を前記移植片に投与することを含む、方法。
（項目１４）
被験体における術後狭窄を低減させるかまたは低減させるかまたは予防するための方法であって、前記被験体に、項目１から１２のいずれか一項に記載のポリマー血管移植片または導管を投与することを含む、方法。
（項目１５）
前記被験体が、再狭窄または他の血管増殖障害のリスクにあるかまたはそれらを有する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記被験体が、血管外傷、血管形成、血管手術、または移植動脈症に罹ったか、罹っているか、または罹ることになる、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ポリマー血管移植片または導管が、対照被験体に比べて、被験体における術後新生内膜形成、狭窄または再狭窄を低減させるかまたは予防し、血栓症を低減させるかまたは予防し、あるいはこれらの任意の組み合わせを行う、項目１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
吸引ロッド、足場特異的マンドレル、足場締結具、および播種チャンバーを含む、ポリマー血管移植片または導管に細胞を真空播種するための密閉された使い捨てのカスタマイズ可能なシステムであって、
前記吸引ロッド、前記足場特異的マンドレル、前記足場締結具、および前記播種チャンバーの１つまたは複数が、３Ｄ印刷の方法によって生成される、システム。
（項目１９）
ポリマー血管移植片または導管をさらに含む、項目１８に記載のシステム。
（項目２０）
生存細胞が播種された患者特異的ポリマー血管移植片または導管を作製する方法であって、
（ａ）移植片形態をコンピュータ支援設計モデリングするステップ、
（ｂ）前記移植片のマンドレルモデルを３Ｄ印刷するステップ、
（ｃ）前記マンドレルの形態をベースにして前記移植片を製作するステップ、および
（ｄ）前記移植片に細胞を播種するステップ
を含み、真空播種のために、前記移植片への細胞の播種が、項目１８または１９に記載の密閉された使い捨てのカスタマイズ可能なシステムを使用して実施される、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】図１Ａは、細胞および／または移植片、例えば組織移植片の播種、培養、貯蔵、輸送および／または試験のための例示的密閉システム（１０００）を示す図である。
【図１−２】図１Ｂは、図１Ａに示す播種チャンバー（１８）の代わりに使用することができる先進型播種チャンバー（１８０）の斜視図を示す図である。図１Ｃは、図１Ａに示す播種チャンバー（１８）の代わりに使用することができる播種チャンバー（１８０）の断面斜視図を示す図である。図１Ｄは、図１Ａに示す播種チャンバー（１８）の代わりに使用することができる、ねじ付き上端部（１７０）を備える吸引ロッド（２３０）の斜視図を示す図である。図１Ｅは、ねじ付き上端部（１７０）を備え、対応する形状のクリップ（６００）を受容するように構成された基部のくぼみ（２３２）をも備える、吸引ロッド（２３０）の断面斜視図を示す図である。同様のくぼみは、吸引ロッドの上端部にも形成されている。図１Ｆは、図１Ａに示す播種チャンバー（１００）内でＯリング（２２）の代わりに使用することができる、クリップ（６００）の斜視図を示す図である。クリップ（６００）は典型的に、中空であり、中空中心部（６１０）を取り囲む中実壁（６２０）を有する。任意選択で、壁（６２０）は、クリップ（６００）の開閉を容易にするためのヒンジを備える。図１Ｇは、図１Ａに示す播種チャンバー（１００）内のクリップ（６００）の断面斜視図を示す図である。
【図１−３】図１Ｈは、吸引ロッド（２３０）、足場（２０）、足場クリップ（６００）および播種チャンバー（１８０）を含む、図１Ａに示す播種チャンバーアセンブリ（１００）の代わりに使用することができる播種チャンバーアセンブリ（２００）の様々な構成要素のアセンブリを示す分解組立図である。
【図１−４】図１Ｉは、図１Ｈに示す組み立て済み播種チャンバーアセンブリ（２００）の斜視図を示す図である。図１Ｊは、図１Ｉに示す播種チャンバーアセンブリ（２００）の部分断面図を示す図である。
【００１５】
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、非播種（対照）試料およびそれぞれ０時間および１２時間インキュベートされた播種試料のそれぞれに関して、インキュベート時間（時間）にわたる開存（白抜きの四角形）移植片対臨界狭窄（黒塗りの四角形）移植片の百分率によって決定された臨界狭窄率（％）を示したヒストグラム（ｐ＜０．０００１）（図２Ａ）；ならびに非播種（対照）試料、ならびにそれぞれ０．１、１．０および１０．０×１０６細胞で播種した試料のそれぞれに関して、細胞播種用量（×１０６）にわたる開存（白抜きの四角形）移植片対臨界狭窄（黒塗りの四角形）移植片の百分率によって決定された臨界狭窄率（％）を示したヒストグラム（ｐ＜０．０００１）（図２Ｂ）である。
【００１６】
【図３】図３は、非播種（対照）試料、ならびにそれぞれ０．１、１．０および１０．０×１０６細胞で播種した試料のそれぞれに関して、細胞播種用量（×１０６）にわたるＦ４／８０陽性細胞／ＨＰＦ（４００倍）（０〜２００）を示したヒストグラム（ｐ＜０．０００１）である。
【００１７】
【図４】図４Ａは、示された平均値のそれぞれに付随する対応エラーバーを含め、それぞれ０時間（黒塗りの丸）、０．５時間（黒塗りの四角形）、２時間（黒塗りの上向き三角形）、および１２時間（黒塗りの下向き三角形）インキュベートした試料のそれぞれに関して、時間（時間）にわたる付着細胞（０〜６０×１０３／ｍｍ２）を示したヒストグラムである。図４Ｂは、それぞれ０時間、０．５時間、２時間、および１２時間インキュベートした試料のそれぞれに関して、時間（時間）にわたる細胞播種効率（０〜６０％）を示したグラフである。図４Ｃは、それぞれ０．１×１０６（黒塗りの丸）、１．０×１０６（黒塗りの四角形）、および１０．０×１０６細胞（黒塗りの上向き三角形）で播種した試料のそれぞれに関して、付着細胞（０〜２００×１０３／ｍｍ２）を示したヒストグラム（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）である。図４Ｄは、それぞれ０．１×１０６（黒塗りの丸）、１．０×１０６（黒塗りの四角形）、および１０．０×１０６細胞（黒塗りの上向き三角形）で播種した試料のそれぞれに関して、細胞播種効率（０〜５０％）を示したグラフである。
【００１８】
【図５】図５Ａは、１２．５ｍｌ（黒塗りの丸）、２５ｍｌ（黒塗りの四角形）、および５０ｍｌ（黒塗りの上向き三角形）の試料のそれぞれに関して、容積（ｍｌ）にわたる総播種細胞（０〜４００×１０６）を示したヒストグラムである。図５Ｂは、１２．５ｍｌ（黒塗りの丸）、２５ｍｌ（黒塗りの四角形）、および５０ｍｌ（黒塗りの上向き三角形）の試料のそれぞれに関して、容積（ｍｌ）にわたる付着細胞（０〜８×１０３／ｍｍ２）を示したヒストグラムである。図５Ｃは、１２．５ｍｌ（黒塗りの丸）、２５ｍｌ（黒塗りの四角形）、および５０ｍｌ（黒塗りの上向き三角形）の試料のそれぞれに関して、容積（ｍｌ）にわたる細胞播種効率（０〜５０％）を示したヒストグラムである。
【００１９】
【図６】図６Ａ〜図６Ｅは、患者特異的組織操作血管移植片を製造するために提案されるプロセスを示すフローチャートを提示する。図６Ａは、脈管構造のセグメント化３Ｄ画像を示す。図６Ｂは、コンピュータ支援設計システムを使用して手術前ＣＴ画像から作成した患者特異的移植片設計を示す。図６Ｃは、マンドレルの完成画像である。図６Ｄは、ステンレス鋼から製作した３Ｄ印刷マンドレルの画像である。図６Ｅは、患者特異的ナノ繊維移植片の図である。
【００２０】
【図７】図７Ａ〜図７Ｆは、動物（ヒツジ）モデルシステムにおける患者特異的ナノ繊維組織操作血管移植片の製造および外科的植え込みを表した例示的ワークフロー模式図を示す。胸部下大静脈（ＩＶＣ）の寸法および形状がヒツジモデルにおける手術前の血管造影から測定される（図７Ａ、図７Ｂ）。電界紡糸マンドレルがコンピュータ支援設計によってモデル化され、その後、３Ｄ印刷される（図７Ｃ）。ナノ繊維足場は、３Ｄ印刷マンドレル上に電界紡糸された（図７Ｄ）。図７Ｅおよび図７Ｆは、ヒツジモデルにおけるＩＶＣ間置導管（ｉｎｔｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｕｉｔ）としての患者特異的無細胞ナノ繊維ＴＥＶＧの植え込みを実証する。
【００２１】
【図８】図８Ａは、それぞれネイティブＩＶＣ（黒塗りの丸）、６ヶ月ＴＥＶＧ（黒塗りの四角形）、および手術前ＴＥＶＧ（黒塗りの上向き三角形）の試料のそれぞれに関して、破裂圧力（０〜４０，０００ｍｍＨｇ）を示したヒストグラムである。図８Ｂは、それぞれネイティブＩＶＣ（黒塗りの丸）、６ヶ月ＴＥＶＧ（黒塗りの四角形）、および手術前ＴＥＶＧ（黒塗りの上向き三角形）の試料のそれぞれに関して、コンプライアンス（０〜８％ｍｍＨｇ）を示したヒストグラム（＊ｐ＜０．０５）である。
【００２２】
【図９−１】図９Ａ〜図９Ｄは、グラフである。図９Ａは、それぞれネイティブＩＶＣ（黒塗りの丸）、近位ＴＥＶＧ（黒塗りの四角形）、中央（Ｍｉｌｄ）ＴＥＶＧ（黒塗りの上向き三角形）、遠位ＴＥＶＧ（黒塗りの下向き三角形）の試料のそれぞれに関して、倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）（１．０〜２．５）を示したグラフである。図９Ｂは、それぞれ３ヶ月および６ヶ月ＴＥＶＧの試料に関して、圧力勾配（０〜１０ｍｍＨｇ）を示したグラフである。図９Ｃは、それぞれネイティブＩＶＣおよびＴＥＶＧの試料に関して、エラスチン（０〜１０μｇ／ｍｇ）を示したグラフ（＊＊ｐ＝０．００４５）である。図９Ｄは、それぞれネイティブＩＶＣおよびＴＥＶＧの試料に関して、コラーゲン（１．４〜２．４μｇ／ｍｇ）を示したグラフである。
【図９−２】図９Ａ〜図９Ｄは、グラフである。図９Ａは、それぞれネイティブＩＶＣ（黒塗りの丸）、近位ＴＥＶＧ（黒塗りの四角形）、中央（Ｍｉｌｄ）ＴＥＶＧ（黒塗りの上向き三角形）、遠位ＴＥＶＧ（黒塗りの下向き三角形）の試料のそれぞれに関して、倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）（１．０〜２．５）を示したグラフである。図９Ｂは、それぞれ３ヶ月および６ヶ月ＴＥＶＧの試料に関して、圧力勾配（０〜１０ｍｍＨｇ）を示したグラフである。図９Ｃは、それぞれネイティブＩＶＣおよびＴＥＶＧの試料に関して、エラスチン（０〜１０μｇ／ｍｇ）を示したグラフ（＊＊ｐ＝０．００４５）である。図９Ｄは、それぞれネイティブＩＶＣおよびＴＥＶＧの試料に関して、コラーゲン（１．４〜２．４μｇ／ｍｇ）を示したグラフである。
【００２３】
【図１０】図１０は、それぞれネイティブＩＶＣおよびＴＥＶＧの試料に関して、コラーゲン面積（％）を示したグラフである。
【００２４】
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂ、はグラフである。図１１Ａは、それぞれネイティブＩＶＣおよびＴＥＶＧのそれぞれに関して、壁厚（ｍｍ）を示したグラフ（＊＊ｐ＝０．００９１）である。図１１Ｂは、壁厚（ｍｍ）にわたるＣＤ６８＋マクロファージ／ＨＰＦを示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ｉ．  定義
「マンドリル」という用語は、円筒状デバイスまたは管、例えば金属バーであって、その周りに材料、例えば細胞を播種し、成長させるためのマトリクス足場が注型され、成形され、鍛造され、曲げられ、またはその他の手法で形作られた、コアとして働くものを指す。ある特定の実施形態では、本明細書に記述されるマンドリルは、少なくとも１つの端部が開放されている。追加の実施形態では、本明細書に記述されるマンドリルは、その軸（即ち、その長さ）に沿って、穴または穿孔を含有していてもよい。
【００２６】
「弁」という用語は、例えば、１つまたは複数のポート（例えば、入口または出口）または通路を開放し、遮断し、または部分的に閉塞させる可動部分によって、液体、気体、またはゆるい材料の流れを開始させ、停止させ、または調節することができるデバイスまたはデバイスの部分を指す。
【００２７】
「生体適合性」という用語は、過剰な線維化または拒絶反応を引き起こすことなく生体系内での植え込み、例えば組織の植え込みが可能である、身体が重篤な免疫応答なしに全体的に受け入れられる材料を指す。
【００２８】
「生分解性」という用語は、水、酵素、またはｉｎ  ｖｉｖｏ環境に曝露されたときに物質または材料が破壊される能力を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「多孔質」という用語は、液体および／もしくは気体によって満たされまたは潅流され得る、あるいはその内部を液体および／または気体が流れることが可能な、１つまたは複数の開口、細孔、穿孔、または穴を有することに関する。
【００３０】
用語、組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）は、動脈および静脈などの１つまたは複数の血管修復または増強するのに使用される、身体に挿入するために設計された血管移植片または導管デバイスを指す。
【００３１】
「患者特異的移植片」という用語は、意図されるレシピエント内への挿入が意図される部位の形態に従ってモデル化された、移植片を指す。例えば、コンピュータをベースにした画像化システムを使用して、移植片の挿入部位の正確な配向および形状を特定することができる。
【００３２】
「血小板活性化」という用語は、内皮の損傷または離断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）などの組織損傷に応答して循環血小板の接着および凝集を引き起こす、段階的な生理的プロセスである。血小板活性化は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）およびトランスホーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）などの走化性作用物質の発現および分泌を引き起こす。
【００３３】
本明細書で使用される「狭窄」は、７５％またはそれよりも大きい、管腔直径の低減を指す。
【００３４】
ＩＩ．  細胞播種ＴＥＶＧを作製する方法
患者特異的ＴＥＶＧなどの細胞播種ＴＥＶＧを作製する方法について記述する。典型的には、細胞播種ＴＥＶＧは、適用が意図される部位の、特定の解剖学的要件に従って製造され、次いで細胞が播種される。患者特異的ＴＥＶＧのカスタム設計および製造されたＴＥＶＧへの細胞播種の方法を、以下に、より詳細に記述する。
【００３５】
Ａ．  患者特異的ＴＥＶＧの製造
患者特異的組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）として使用するための、ポリマー血管移植片または導管を作製する方法が、提供される。典型的には、方法は、画像支援型のコンピュータによる設計方法を使用してマンドレルモデルをカスタム設計するステップ、例えば３Ｄ印刷を使用してマンドレルモデルを製作するステップ、および例えば電界紡糸を使用してマンドレルモデルからＴＥＶＧを製作するステップを含む。動物におけるナノ繊維移植片の製造および外科的植え込みを例示する、例示的な概略的ワークフローを、図６Ａ〜６Ｅに示す。
【００３６】
１．  患者特異的マンドレルモデルのカスタム設計
患者特異的ＴＥＶＧを作製する方法は、典型的には、患者特異的移植片をカスタム設計するための１つまたは複数のステップを含む。
【００３７】
ＴＥＶＧは、意図される使用に求められる機能が最適に発揮されるように、任意のサイズおよび形状で設計することができる。典型的には、患者特異的ＴＥＶＧは、その形状が実質的に管状であり、丸いまたは実質的に丸い断面を有し、開放端形態を有する。管状移植片は、移植片の長さ全体にわたって延びる管腔を有する。移植片は、移植片の意図される外科的使用に適した、任意の適切な長さおよび直径のものであってもよい。典型的には、移植片は、置き換えられるまたは増強される動脈または静脈の長さよりも、僅かに長くなるべきである。ＴＥＶＧ壁の厚さおよびＴＥＶＧ自体の直径は、意図される使用に応じて、かつ／またはコンピュータをベースにした設計基準により画定されるように、均一にすることができまたは移植片の長さ全体にわたって変化させることができる。一部の実施形態では、管状移植片は多孔質導管である。移植片の細孔は、移植片への細胞の動員および一体化を可能にする。
【００３８】
カスタム設計プロセスは、手術前の先天性心疾患の複雑な心臓および血管の解剖学的構造の詳細な３次元（３Ｄ）的視野が得られるように、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、および磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）などの画像化技術を使用して、患者から３Ｄ画像を得るステップを含むことができる。一部の実施形態では、患者から得られる画像は、患者特異的マンドレルモデルを印刷し、その後、例えば繊維を電界紡糸してカスタムマンドレルの周りに血管移植片を形成することによって血管移植片を創出する目的で、コンピュータモデルにより修正される。好ましい実施形態では、マンドレルモデルは、特定の患者の解剖学的構造に一致するように形作られる。一部の実施形態では、マンドレルをモデル化するための設計基準は、例えば流動力学シミュレーションに基づいて計算されるように、流体流についてマンドレルの形状および寸法を最適化するステップを含む。マンドレルモデルが術前血管造影画像に基づいて設計される場合、ＴＥＶＧを受容することになる血管の直径および長さなどのパラメータを測定し、一致する移植片モデルを、例えば適切なコンピュータソフトウェアを使用して設計する。術前画像化データに基づいてマンドレルモデルを設計するのに適したソフトウェアパッケージは、市販されている。例示的なソフトウェアの一式は、ＣＡＤソフトウェアの一式である。
【００３９】
２．  マンドレルモデルの製作
ＴＥＶＧの形成に使用されるマンドレルは、当技術分野で公知の手段を使用して製作することができる。マンドレルを製作するための例示的な方法は、３Ｄ印刷を含む。一部の実施形態では、最終的なマンドレルの設計は、３Ｄ製作に適切なコンピュータ可読フォーマットに変換される。例示的なコンピュータ可読フォーマットは、ＳＴＬフォーマットである。マンドレルモデルの３Ｄ印刷に適切な材料は、ポリマーおよび金属および炭素、ならびにこれらの組み合わせ、合金、および／または積層体を含む。一部の実施形態では、マンドレルは、液化可能な材料で作製され、それによって容易な手法で移植片からマンドレルを取り外すことが可能になる。液化可能なマンドレルの使用は、移植片の複雑な形状を形成することも可能にする。典型的には、カスタム設計マンドレルモデルの製作は、患者特異的移植片が手術から１週間以内で、または手術から１、２、３、４、５、もしくは６日以内で生成することができるように、短い時間で実施される。
【００４０】
３．  組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）の製作
カスタム設計されたマンドレルなど、鋳型構造をベースにしてＴＥＶＧを製作する方法が、提供される。ＴＥＶＧは、電界紡糸、スタンピング、鋳型法（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ）、成形、ウィービング、ならびに溶融加工、溶媒加工、浸出、発泡、押出し、射出成形、圧縮成形、ブロー成形、噴霧乾燥、押出しコーティング、および繊維の紡糸と、その後に続く織られた構築物または不織構築物への加工との組み合わせなど、任意の適切な方法を使用して製作することができる。
【００４１】
ＴＥＶＧの寸法は、典型的には、置き換えられることになる血管の寸法に等しい。一部の実施形態では、ＴＥＶＧは、約１ｍｍから約１００ｍｍの間（両端の値を含む）、好ましくは３ｍｍから１０ｍｍの間の長さを有する。ＴＥＶＧの内径は、典型的には、置き換えられることになる血管のものに等しい。一部の実施形態では、ＴＥＶＧは、約０．１ｍｍから３０ｍｍの間（両端の値を含む）、好ましくは０．５ｍｍから１ｍｍの間の内径を有する。例示的なＴＥＶＧは、内径が０．８２ｍｍおよび長さが３ｍｍの寸法を有する、ポリ−Ｌ−ラクチドおよびε−カプロラクトンのコポリマーシーラント溶液を含むポリグリコール酸のシートである。
【００４２】
一部の実施形態では、ＴＥＶＧは、移植片内に細孔を含むように製作される。細孔は、塩浸出、昇華、溶媒蒸発、噴霧乾燥、発泡、繊維への材料の加工、およびその後に続く、織られたデバイスまたは不織デバイスへの加工を含む、任意の適切な方法によって誘導することができる。好ましい実施形態では、足場の繊維マトリクスは、細胞が接着および成長および／または分化することが可能になるように、適切なサイズの細孔を含む。細胞の直径は約１０μｍから２０μｍであるので、この範囲内の孔径が、ある特定の実施形態では望まれる。好ましくは、デバイスの細孔は、その直径が５から５００μｍの間であり、より好ましくは５から２５０μｍの間であり、より好ましくは５から１００μｍの間である。ある特定の実施形態では、ポリマー足場は、播種細胞の成長および分化を促進させかつそこに成長させた足場または細胞の移植および／または植え込みを容易にするために、天然の細胞外マトリクスの構造および組成をより緊密に模倣するために、発生させるかまたは製作される。
【００４３】
好ましい実施形態では、ＴＥＶＧは、１種または複数のポリマーを含有するストック溶液の電界紡糸によって製作される。典型的には、ＴＥＶＧを製作するのに使用される１種または複数のポリマーは、生分解性ポリマーである。したがって、一部の実施形態では、ＴＥＶＧを製作する方法は、術前患者特異的電界紡糸繊維血管移植片を創出するステップを含む。好ましくは、記述された方法により調製された電界紡糸繊維移植片は、細胞の接着および増殖を促進させ、それによって導管狭窄（即ち、異常に狭くなること）を予防し、血管および移植片の開存性が維持される。
【００４４】
Ｂ．  患者特異的ＴＥＶＧへの細胞の播種
組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）への細胞播種用量は、細胞インキュベート時間に関わらず、移植片の性能および有用性を改善するための効果依存性変数であることが、確立されている。典型的には、被験体に埋め込む前に、ＴＥＶＧに細胞が播種される。典型的には、細胞は、意図されるレシピエントからの自家細胞であり、播種する方法は、レシピエントから細胞を採取するステップを含むことができる。１つまたは複数の細胞型を、当技術分野で公知の任意の技法を使用して、細胞の混合物から単離することができる。したがって方法は、適用（即ち、播種）前に細胞を単離または精製するステップを含むこともできる。
【００４５】
実施例に記述されるヒト臨床試験で使用されるＴＥＶＧの組み立ては、細胞採取および単離、足場上への細胞播種、ならびにある期間にわたる播種移植片のインキュベートのステップを含む（Ｓｈｉｎ’ｏｋａら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．  １２９巻（６号）、１３３０〜１３３８頁（２００５年））。
【００４６】
一部の実施形態では、ＴＥＶＧへの細胞の播種は、キットまたはデバイスを使用して実施される。好ましくは、キットまたはデバイスは、制御可能な量の細胞による、ＴＥＶＧの無菌かつ効率的な播種を可能にする。
【００４７】
１．  播種用量
典型的には、ＴＥＶＧに播種される細胞の量は、術後移植片の開存性に正比例する。したがって好ましい実施形態では、ＴＥＶＧには、開存性を増強するまたはＴＥＶＧの術後再狭窄率が低減するのに有効、かつ十分な量の細胞が播種される。細胞をＴＥＶＧに手作業で播種するための方法は、当技術分野では公知である（Ｕｄｅｌｓｍａｎら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １７巻（７号）、７３１〜７３６頁（２０１１年））。
【００４８】
播種される細胞の最適な数は、細胞型と、ＴＥＶＧのサイズおよび形状、ならびに意図される使用に応じて変更することができる。ＴＥＶＧには、典型的には細胞は、１．０×１０６細胞から５００×１０６細胞の間（両端の値を含む）、好ましくは３．０×１０６細胞から２５０×１０６細胞の間の量で接触させる。例示的なＴＥＶＧは、ポリ−Ｌ−ラクチドおよびε−カプロラクトンのコポリマーシーラント溶液を含む、内径０．８２ｍｍおよび長さ３ｍｍの寸法を有するポリグリコール酸シートである。密閉型円筒状ＴＥＶＧの場合、表面積（Ａ）は、式Ｉ：
Ａ＝２πｒｈ＋２πｒ２
【００４９】
（式中、ｈはＴＥＶＧの長さであり、ｒは半径である）
により計算することができる。公称壁厚を持つ管状ＴＥＶＧの場合、教示表面の利用可能な表面積は、内表面および外表面のそれぞれで２πｒｈである。
【００５０】
内径０．８２ｍｍ（半径０．４１ｍｍ）および長さ３ｍｍの寸法を有するＴＥＶＧの場合、利用可能な表面積はおよそ２（７．７２８３１７９）（即ち、およそ１５ｍｍ２）である。１０×１０６細胞を播種するとき、得られる播種密度は、およそ７．０×１０５細胞／ｍｍ２の播種密度である。したがって好ましい実施形態では、ＴＥＶＧは、約１．０×１０４細胞／ｍｍ２から１．０×１０６細胞／ｍｍ２の間（両端の値を含む）、好ましくは０．７×１０５細胞／ｍｍ２から７．０×１０５細胞／ｍｍ２の間（両端の値を含む）の密度で播種される。
【００５１】
一部の実施形態では、ＴＥＶＧには、約０．１×１０４細胞／ｍｌから１０×１０７細胞／ｍｌの間（両端の値を含む）の濃度を有する溶液中で細胞が播種される。細胞溶液の典型的な容積は、１ｍｌから１００ｍｌに及び（両端の値を含む）、好ましくは１０ｍｌから５０ｍｌの間である。
【００５２】
付着される細胞の数／面積は、用量依存的に増加する。好ましくは、ＴＥＶＧには、０．１×１０３細胞／ｍｍ２から５．０×１０３細胞／ｍｍ２の間、好ましくは１．０×１０３細胞／ｍｍ２から２．０×１０３細胞／ｍｍ２の間の細胞密度を得るのに十分な量で、細胞が播種される。これは、約１０〜２０％の播種効率に相関する。したがって、自家細胞が播種された移植片の場合、患者から採取された骨髄の量が増加すると、移植片における細胞付着が用量依存的に増加する。
【００５３】
実施例で実証されるように、細胞播種は、細胞用量依存的にＴＥＶＧの臨界狭窄の形成を阻害することが確立されており、ここで「臨界狭窄」は、少なくとも７５％の移植片開存性の低減を表す。好ましくは、ＴＥＶＧには、非播種対照に対して狭窄率を少なくとも５０％低減させるのに有効な量の細胞が播種される。例えば、一部の実施形態では、ＴＥＶＧには、非播種対照移植片に対して５０％から１００％の間、例えば６０％〜９０％、最も好ましくは少なくとも６４％、植え込み後２週間で臨界狭窄（即ち、少なくとも７５％の開存性の低減）の量を低減させるのに十分な量の細胞が播種される。
【００５４】
自家骨髄単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）が播種用に調製されるとき、５ｍｌ／ｋｇ骨髄からの細胞が、十分な播種用量を典型的には提供する。臨床的展望から、著しい有害作用を引き起こすことなく最大で２０ｍｌ／ｋｇ骨髄を個体から採取することができ、骨髄移植用に骨髄を採取するのに慣用的に使用される。
【００５５】
２．  播種方法
播種に利用可能な細胞の数が限られる場合、ＴＥＶＧの播種は、播種細胞がＴＥＶＧに接着する能力を増強する手法で、ＴＥＶＧが可能な限り多くの細胞と接触するように、好ましくは接触プロセスの効率を最大限にする方法を使用して実施される。ＴＥＶＧと接触する細胞の量は、インキュベート時間よりも、術後狭窄を低減させ、細胞付着を増強させることにおいてより有意であるので、播種方法は、典型的には、播種効力が増強するように、可能な限り最も短い時間でＴＥＶＧが最大数の細胞と接触する能力を増強する。
【００５６】
好ましくは、ＴＥＶＧは、適切な培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｓｉｇｍａ））中で、および適切な温度で（例えば、３７℃で）細胞と接触して、細胞接着を最適化する。一部の実施形態では、播種は、ＣＯ２の存在下で、例えばＣＯ２インキュベーターを使用して実施される。
【００５７】
播種効率を測定する方法およびアッセイについて記述する。細胞播種効率を最大限にするパラメータは、細胞型およびグラフ形態に依存するので、当業者なら、所与の移植片に播種され、付着することができる所与の細胞型の数を最大限にするために、播種の条件を最適化することが可能であることを認識するであろう。ＴＥＶＧ狭窄の形成に対する細胞播種用量の効果を調査する例示的な方法は、ＴＥＶＧに、漸進的に増加する数の細胞、例えば０．１×１０６、１×１０６、または１０×１０６細胞をそれぞれ、非播種対照と並行して播種し、混合物を固定期間にわたってインキュベートすることを含む。術後狭窄は、当技術分野で公知の方法により評価することができる。例示的な方法では、播種されたＴＥＶＧは個体に植え込まれ、後の時点で、例えば植え込み後２週間で移植片開存性を評価するように比較される。
【００５８】
ＴＥＶＧでのマクロファージ浸潤は細胞用量依存的に生ずることが確立され、したがってＴＥＶＧ上に播種される細胞の数が増加すると、非播種対照よりもまたは最小数の細胞が播種されたＴＥＶＧよりもマクロファージ浸潤の量が低減する。
【００５９】
ＴＥＶＧのマクロファージ浸潤に対する細胞播種用量の影響を調査する例示的な方法は、同等のＴＥＶＧに、漸進的に増加する数の細胞、例えば０．１×１０６、１×１０６、または１０×１０６細胞を、固定期間にわたって播種し、播種ＴＥＶＧを個体に挿入することを含む。細胞用量が、ＴＥＶＧへのマクロファージ浸潤に影響を及ぼすか否かを決定するために、浸潤するマクロファージの数を、植え込み後のある時間、例えば植え込み後２週間で評価する。マクロファージ浸潤を評価するための例示的な方法は、定量的組織学的な形態計測解析である。
【００６０】
したがって、ＴＥＶＧに播種するのに使用される細胞の用量は、好ましくは、非播種または最小限に播種された対照に比べ、ＴＥＶＧへのマクロファージ浸潤を低減させるのに十分である。
【００６１】
例示的な実施形態では、ＴＥＶＧの細胞付着および播種効率に対する細胞播種用量の影響は、細胞をＴＥＶＧに接触させ、漸進的に増加する数の細胞、例えば０．１×１０６、１．０×１０６、および１０．０×１０６細胞を含む混合物を、固定期間にわたりインキュベートすることによって決定する。細胞用量の関数としての、細胞接着の効率は、細胞カウントのための任意の適切なアッセイを使用して決定することができる。例示的なアッセイはｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡアッセイである。
【００６２】
ａ．  細胞インキュベート時間
ＴＥＶＧ技術を使用した最良の臨床転帰を確実にするには、ＴＥＶＧ組み立てのための時間を最適化し、外科手順の時間を最小限にし、汚染の可能性を低下させ、それによってこの技術を使用することに関連するリスクを低下させることが重要である。
【００６３】
細胞インキュベート継続期間はＴＥＶＧ開存性に影響を及ぼさないので（実施例と図２Ａおよび２Ｂで論じられるように）、ある特定の実施形態では、播種されたＴＥＶＧを組み立てるのに必要な時間を、播種された細胞がＴＥＶＧと接触するインキュベート時間の長さを低減することによって、最小限にすることができる。
【００６４】
ＴＥＶＧを組み立てるのに必要な時間は、細胞を単離するための時間を低減する密閉使い捨てシステムを使用して既に低減されており、ＴＥＶＧ開存性に影響を及ぼすことなく播種された（Ｋｕｒｏｂｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１巻（１号）、８８〜９３頁（２０１５年）；Ｋｕｒｏｂｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ
Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、（２０１４年））。実施例で論じられる初期ヒト臨床試験では、２時間のインキュベート時間が任意に選択されたが、最適なインキュベート時間は、ＴＥＶＧの開存性に影響を及ぼすことなくＴＥＶＧ組み立てを強化するのに、ならびに患者の安全性を改善するために、重要である。
【００６５】
実施例に記述された研究は、細胞用量および最適なインキュベート時間に焦点を当てて、ＴＥＶＧ組み立てを改良する。例示的な実施形態では、細胞付着およびＴＥＶＧの播種効率に対するインキュベート継続時間の影響は、細胞をＴＥＶＧに接触させかつ混合物を漸進的に長くした期間にわたり、例えば０、０．５、２、および１２時間にわたりインキュベートすることによって、決定する。インキュベート時間の関数としての、細胞接着の効力は、細胞カウントのための任意の適切なアッセイを使用して決定することができる。例示的なアッセイは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡアッセイである。
【００６６】
一部の実施形態では、方法は、５時間未満の期間、例えば４時間、３時間、２時間、または２時間未満にわたり、ＴＥＶＧに接触させることを含む。好ましい実施形態では、ＴＥＶＧに細胞を、２時間未満、例えば６０分または６０分未満、例えば最長５０分、最長４０分、最長３０分、または３０分未満にわたり接触させる。一部の実施形態では、流動溶液中で、ＴＥＶＧに細胞を接触させる。流量は、ＴＥＶＧ全体にわたる細胞透過を最適化するように調整することができる。例えば、一部の実施形態では、インキュベート時間は、所望の量の細胞をＴＥＶＧ内に通すのに必要とされる時間の長さに等しい。
【００６７】
ＩＩＩ．  ＴＥＶＧを作製するための材料
ポリマーおよび細胞を含む、ポリマー血管移植片または導管について、記述する。ポリマー血管移植片または導管は、追加の活性剤を任意選択で含むことができる。
【００６８】
Ａ．  ポリマー
ＴＥＧＶ足場は、１種または複数のポリマーから合成することができる。一部の実施形態では、ポリマーが生分解性である。他の実施形態では、ポリマーが非生分解性である。一部の実施形態では、ＴＥＶＧは、単一ポリマーよりも多くのポリマーの混合物から形成される。生分解性ポリマーが使用される場合、例えば、所望の長持ちするＴＥＶＧ移植物が提供されるように、生分解性および非生分解性ポリマーの混合物を使用することができる。
【００６９】
ある特定の実施形態では、ＴＥＶＧは、ランダムなまたは整列した構成の、織られたメッシュまたは不織メッシュに組み立てられたポリマー（ホモポリマーおよび／またはコポリマー）繊維で形成された、３次元マトリクスである。好ましくは、ナノ繊維材料は、ＦＤＡで認可された生分解性ナノ繊維材料である。
【００７０】
足場マトリクスを含む繊維は、任意の所望のサイズのものとすることができるが、一般に約１．５ｍｍから１ｎｍの間である。ある特定の実施形態では、繊維は、ナノスケール（即ち、約１ｎｍから約１０００ｎｍ）および／またはマイクロスケール（約１μｍから約１０００μｍ）である。
【００７１】
ＴＥＶＧの形成に使用される足場を創出するのに有用なポリマーは、無機（例えば、シロキサン、硫黄鎖、黒リン、ホウ素−窒素、シリコーン）または有機（炭素を含有することを意味する）であってもよい。有機ポリマーは、天然（例えば、デンプン、セルロース、ペクチン、海藻ガム、植物ガムなどの多糖；カゼイン、アルブミン、グロブリン、ケラチン、コラーゲン、インスリン、ＤＮＡなどのポリペプチド；および炭化水素）、合成（熱可塑性物質（非加硫エラストマー（ｕｎｖｕｌｃａｎｉｚｅｄ  ｅｌａｓｔｏｍｅｒ）、ナイロン、ポリ塩化ビニル、直鎖状ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、アクリレート樹脂）；熱硬化性物質（例えば、加硫エラストマー、架橋ポリエチレン、フェノール、アルキド、ポリエステル）、および半合成（例えば、レーヨン、メチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロース系；および化工デンプン）など）であってもよい。さらに、本発明で有用な足場は、水溶性または水不溶性セルロース化合物から形成されたヒドロゲルを含んでいてもよい。当業者に容易に理解され得るように、足場の特定のタイプおよび組成は、所望の適用に応じて変化することになる。しかし、足場を含むポリマー材料は生体適合性である（即ち、望ましくない免疫反応を引き出すことがない）ことが、一般に好ましい。ある特定の実施形態では、足場が生分解性である。例示的な分解性ポリマーには、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（またはポリカプロラクトン、ポリアミド、多糖、およびコラーゲンが含まれる。好ましい実施形態では、ポリマーはポリ（乳酸−グリコール酸）である。一実施形態では、患者特異的ＴＥＶＧは、ポリグリコール酸−繊維チューブから製作された、生分解性管状足場から形成される。チューブは、比が５０：５０のポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリ−カプロラクトンなどの、コポリマーで被覆することができる。
【００７２】
一実施形態では、移植片は、管状導管に形成することができるポリマーのフェルトまたはシート様材料から形成される。例えばデバイスは、押し出されたポリマー繊維から、不織の、織られた、または編まれた構造として製作することができる。典型的には、ポリマーシートは、織物、編物、編組、またはフィラメントワインディングを含むがこれらに限定されない任意の布地構築を使用して形成される。電界紡糸などの任意の適切な方法を使用して、不織のまたは織られたポリマー布地を製作することができる。
【００７３】
ポリマー血管移植片を製作するのに選択されるポリマーおよび製作方法は、血管導管として使用するのに適した生体力学的性質を持つ移植片を生成するのに適している。血管移植片の機能に重要な生体力学的性質には、初期破裂圧力、縫合保持強度、および弾性が含まれる。一実施形態では、ポリマー血管移植片の初期破裂圧力は、約１，５００ｍｍＨｇから約５０，０００ｍｍＨｇの間、好ましくは約２，０００ｍｍＨｇから約１０，０００ｍｍＨｇの間である。別の実施形態では、ポリマー血管移植片は、約１Ｎから約５Ｎの間、好ましくは約２Ｎから約４Ｎの間の縫合保持強度を保有する。別の実施形態では、血管移植片の固有弾性が約１０ＭＰａから約５０ＭＰａの間、好ましくは約１５ＭＰａから約４０ＭＰａの間である。別の実施形態では、血管移植片の初期引張り強さが約１ＭＰａから約１０ＭＰａの間、好ましくは約３ＭＰａから約６ＭＰａの間である。
【００７４】
Ｂ．  細胞
ある特定の実施形態では、患者特異的ＴＥＶＧ足場は、１つまたは複数のタイプの細胞を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のタイプの細胞は、ＴＥＶＧの管腔内に、ＴＥＶＧの壁全体にわたる多孔質空間内に、ＴＥＶＧの外側および表面上に、または組み合わせに含まれる。典型的には細胞は、ＴＥＶＧの表面に、直接または１つもしくは複数の付属物質を通して付着される。例示的な付属物質には、ポリマー、多糖、タンパク質、小分子、脂質、および細胞が含まれる。一部の実施形態では、細胞は、細胞播種ＴＥＶＧの意図されるレシピエントの１つまたは複数の組織から誘導された、自家細胞である。他の実施形態では、細胞は、移植片の意図されるレシピエントに対して外来性である。細胞は、多能性幹細胞などの未分化細胞、または分化細胞とすることができる。好ましい実施形態では、細胞は、生存可能なヒト細胞である。ＴＥＶＧに含めるための例示的な細胞型には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および抗原提示細胞などの免疫細胞、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、筋線維芽細胞、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ）、平滑筋細胞、骨髄前駆細胞、赤血球、胚性幹細胞、および組み合わせが含まれる。特定の実施形態では、自家骨髄単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）がＴＥＶＧ内に含まれる。
【００７５】
記述される患者特異的ＴＥＶＧと共に使用される細胞は、複数の供給源から得ることができる。細胞の混合物から、１つまたは複数の細胞型を単離し、任意選択で操作するための方法は、当技術分野で公知である。例示的な実施形態では、骨髄は、被験体（例えば、ＴＥＶＧの意図されるレシピエント）の１つまたは複数の長骨（例えば、大腿骨および／または脛骨）から収集され、単核細胞は、密度遠心分離法を使用して単離される（Ｌｅｅら、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．（８８巻）、（２０１４年）；Ｕｄｅｌｓｍａｎら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １７巻（７号）、７３１〜７３６頁（２０１１年））。
【００７６】
Ｃ．  追加の活性剤
骨髄由来単核細胞が播種されたＴＥＶＧは、パラクリン作用を介して術後狭窄の発生を低減させ予防することが、確立されている。細胞播種の利点には、フィードバックとは無関係に薬物を放出する薬物溶出足場とは異なって、身体のフィードバックメカニズムに応答する放出シグナルが含まれる。したがって一部の実施形態では、細胞播種ＴＥＶＧは、播種細胞のパラクリン作用を複製する、１種もしくは複数の非細胞ベースの合成または非合成化合物と組み合わせて使用される。
【００７７】
患者特異的ＴＥＶＧは、例えば血管移植片に対する細胞の接着を増強する、または挿入後の移植片の術後狭窄の発生を低減させる、追加の活性剤を含むことができる。活性剤には、抗新生内膜剤、化学療法剤、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症物質、従来の免疫療法剤、免疫抑制物質、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００７８】
骨髄成長を刺激するための成長因子の使用は、ＢＭ−ＭＮＣの収量を増加させるための追加的ストラテジを表す。したがって一部の実施形態では、ＴＥＶＧが成長因子を含む。ＴＥＶＧに組み込むための例示的な成長因子には、細胞外マトリクスの沈着を刺激する、組織損傷に対する生理的応答により放出される成長因子、例えば血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、強力な走化性作用物質、およびトランスホーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）が含まれる。
【００７９】
ＩＶ．  ＴＥＶＧに細胞を播種するための方法および材料
Ａ．  ＴＥＶＧを播種するためのシステム
ＴＥＶＧに細胞を播種するためのそのシステムおよび方法は、当技術分野で公知である。例示的なシステムは、米国特許第９，０９０，８６３号に記載されている（図１Ａ）。図１Ａに例示されるデバイスは、細胞および／もしくは移植片、例えば組織移植片を播種し、培養し、貯蔵し、輸送し、かつ／または試験するための密閉システム（１０００）である。従来の播種システムの操作、構造、および結果は、米国特許第９，０９０，８６３号およびＴｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ．（１巻）：８８〜９３頁（２０１４年）にさらに論じられ例示されている。
【００８０】
典型的には、組織操作血管移植片内に細胞を播種するためのシステムは、患者から生体材料を抽出するために患者に接続されてチャンバーまたは足場に入る、真空を創出するための手段を含む。足場は、インキュベーターとして作用し、生体材料の少なくとも一部を足場に接触させ、相互作用させる。足場は、選択可能な流体を生体材料から移送し、患者に戻すのを可能にするフィルター／スイッチの組み合わせに流体連絡している。患者に移送されて戻される例示的な生体材料には、血清、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ）、血小板、白血球、および組み合わせが含まれる。選択された生体材料を、足場に接触する流体から抽出することにより、足場に所望の細胞型を播種するのに必要とされる時間が低減され、患者の治癒速度を増大させる。
【００８１】
１．  播種システムの構成要素
米国特許第９，０９０，８６３号に記載される例示的なシステムの構成要素部品を、図１Ａに例示する。ある特定の実施形態において、システムは、容器（３）などの、細胞単離物、例えば、細胞単離物流体を含有する器（ｖｅｓｓｅｌ）を含む。例示的な容器は、滅菌することが可能なかつ／または気密封止される培地バッグまたは任意の柔軟なまたは硬質の容器を含む（例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＦＬ  １Ｌ培地バッグ）。ある特定の実施形態では、細胞単離物流体容器（３）は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、ポリカーボネート、ＰＶＣ、またはステンレス鋼などの、滅菌することが可能な生体適合性の硬質材料から形成される。容器（３）は、細胞単離物流体を含有するための任意の適切な容積を有することができる。好ましい実施形態では、容器（３）は、流体、例えば骨髄穿刺液の無菌充填および／または分配に適合された少なくとも１つのポートを有する。例えば、骨髄穿刺液（例えば、５ｃｃ／ｋｇ体重）は、ポート（１）またはポート（２）を介して容器（３）に無菌的に収集され、通され、例えば注入される。
【００８２】
典型的には、容器（３）は、少なくとも１つの入口および１つの出口を有する。一部の実施形態では、容器（３）は、流体または気体の一方向の流れを可能にする、１つまたは複数の弁を有するポートを含む。例えば、参考のため図１Ａに示される実施形態を使用すると、ポート１は、無針アクセスポートなどの、スワバブル弁（ｓｗａｂｂａｂｌｅ  ｖａｌｖｅ）を含むことができかつ／またはスワバブル弁の形をとることができる。弁は、当業者に公知の任意の適切な連結または締結手段、例えばクランプ、ネジ、またはルアーコネクター、圧力嵌め、摩擦嵌め、または連結などを使用して、容器（３）に接続することができ、かつ／または容器（３）に連絡している流体ラインに関連付けることができる。図１Ａに例示されるシステム（１０００）の実施形態によれば、弁（５）が導管に、例えば流体ライン（５１）に関連付けられ、容器（３）と連絡している。任意選択で、容器（３）は、例えば約４０から約１５０ミクロンの範囲の例えば開口または細孔構造を有する例えばスクリーン要素または織られた要素を含む、プレフィルター要素（４）を含む。そのようなプレフィルター要素は、流体が容器から通過するときに、例えば骨細片、血餅、および／または脂肪沈着物などの望ましくない材料を除去するのに使用することができる。
【００８３】
ある特定の実施形態では、細胞単離物流体を接触させるための手段は、流体または気体を保持することが可能な滅菌および／または気密封止された容器を画定する本体を含み、この本体は、流体を充填しかつ／または分配するよう適合された１つまたは複数のポートも画定する。ある特定の実施形態では、本体は、１つまたは複数のポートを画定し、少なくとも１つのポートが、弁、例えば一方向弁を有する。さらに別の実施形態では、本体は、弁を含む出口ポートを画定する。
【００８４】
システムで使用され得る流体の例には、滅菌流体、造影剤流体、生物学的流体、細胞、血液、血清、骨髄穿刺液を含有する流体、または培養培地を含有する流体が含まれるがこれらに限定するものではない。好ましい実施形態において試験、播種、および培養中に、流体は、人体温度で有利に保持され得ること、およびヒト血液の粘度に近い流体から構成され得ることが理解されよう。血液の粘度に近い、ある例証的な溶液の例は、グリセロールを含む生理食塩液である。
【００８５】
容器（３）に含有される流体は、容器から図１Ａの流体ライン（５１）を通過する。好ましい実施形態では、流体は、真空によって容器（３）から離れるように方向付けられる。他の実施形態では、システムは、流体ポンプの使用を組み込む。流体ポンプは、複数の商業的供給元から入手可能である（例えば、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｒｉｖｅ蠕動ポンプ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ製）。
【００８６】
流体ライン（５１）ならびにシステム内の他の全ての流体ライン（例えば、ライン５２、５３、５４、５５、５６，５７、５８ａ〜５８ｄ、および５９）は、使用中の流体または気体を輸送するのに適切な、任意のタイプの医療グレードの滅菌可能な耐久性管状材料で作製され得る。例えば流体ラインは、柔軟なまたは硬質プラスチックとすることができる。
【００８７】
システムは、少なくとも１つの入口、少なくとも１つの出口、および少なくとも１つの濾過材（例えば、フィルターハウジング内に配置される）を含む少なくとも１つのフィルターを間に含む、流動チャネル（７）も含む。好ましい実施形態では、フィルターは、流動チャネル（７）を通る流れ方向にほぼ垂直な角度で配置されるが、一部の実施形態では、フィルターは、例えば接線流濾過に関わる、流れ方向にほぼ平行な角度で配置することができる。好ましい実施形態では、フィルターは、少なくとも２方向を流れることが可能になるように適合され、例えば第１および第２の方向がほぼ反対であり、例えば流体は、第１の方向でフィルターの上流表面から下流表面内を通過することができ、かつ流体は、第２の方向でフィルターの下流表面から上流表面内を通過することができる。この実施形態の実施例において、細胞単離物流体は、第１の方向で、適切な孔径（またはメッシュサイズ）を有するフィルター内を通過し、濾過材は流れ方向にほぼ垂直な角度にあり、したがってフィルターは、フィルターを通過するには大きすぎる細胞および／または生体材料を保持するようになる。第２の流体は、その後、保持された細胞および／または生体材料を濾過材から洗い落とすことができる第２の方向で、フィルター内を通過する。流動チャネル内で使用するのに用いることができるフィルターは、当技術分野で周知であり、例えばＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを含むことができる。さらに追加の実施形態では、フィルター（例えば、少なくとも１つの濾過材）は、細胞、例えば骨髄由来単核細胞を保持するのに適した多孔度を有する。ある特定の実施形態では、フィルターは、例えばリガンド−受容体相互作用に基づいて目的の細胞を可逆的に結合し保持するように設計されたマトリクスを含む。他の実施形態では、本明細書に記述されるシステム内での使用のために複数のフィルターを直列にまたは並列に組み立てることができる。システムおよび方法は、任意の数の所望の流路および遮断を有することができることが企図される。液体または気体は、本発明によりその全てが明確に包含されかつ企図される、注射器、ポンプ、または真空源を介するなどの、正圧または負圧によって、システム内に供給することができる。
【００８８】
ある特定の実施形態では、システムは、収集流体を含有するための手段を含む。ある特定の実施形態では、手段は、滅菌することが可能でありかつ／または気密封止される培地バッグ（例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＦＬ  １Ｌ培地バッグ）または任意の柔軟なもしくは硬質の容器などの、容器（１３）である。ある特定の実施形態では、収集容器（１３）は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、ポリカーボネート、アクリル、ＰＶＣ、またはステンレス鋼などの、滅菌することが可能な任意の生体適合性の硬質材料から形成される。容器（１３）は、収集流体を含有するための任意の適切な容積を有することができる。
【００８９】
好ましい実施形態では、容器（１３）は、例えば骨髄穿刺液の濾液またはフロースルーなど、流体の無菌充填および／または分配に適合された、少なくとも１つのポートを有する。例えば、骨髄穿刺液（例えば、５ｃｃ／ｋｇ体重）は、無菌的に収集され、容器（３）内に通され、例えば注入され、その後、通過する（例えば、任意選択のプレフィルター（４）を通して、かつ流体流動ライン（５１）および（５２）を介して、フィルターを含む流動チャネル（７）を通る。フィルターは、目的の細胞および／または生体材料を保持し、濾液は、流体ライン（５３）および（５４）と入口ポート（１１）を流れて容器（１３）に入ることが可能になる。別の好ましい実施形態では、容器（１３）は、少なくとも１つの流動ポート、例えば二方向流動ポートを有するが；典型的には容器（１３）は、少なくとも２つのポートを有する。ある特定の実施形態では、容器（１３）は、入口ポートおよび／または出口ポートを含む。図１Ａに例示される実施形態では、容器（１３）は、入口ポート（１１）および出口ポート（１４）を含む。さらに別の実施形態では、容器（１３）は、流体または気体の一方向流動を可能にする１つまたは複数の弁を有するポートを含む。弁は、当業者に公知の任意の適切な連結または締結手段、例えばクランプ、ネジ、またはルアーコネクター、圧力嵌め、または摩擦嵌めなどを使用して、容器（１３）に接続することができかつ／または容器（１３）に連絡する流体ラインに関連付けることができる。図１Ａに例示される実施形態によれば、システム（１０００）は、流体ライン（５４）に関連付けられた弁（１０）を含む。
【００９０】
ある特定の実施形態では、収集流体を含有するための手段は、流体または気体を保持することが可能な、滅菌および／または気密封止容器を画定する本体を含み、この本体は、流体の充填および／または分配に適合させた１つまたは複数のポートも画定する。ある特定の実施形態では、本体は、１つまたは複数のポートを画定し、少なくとも１つのポートは弁を、例えば一方向弁を有する。さらに別の実施形態では、本体は、弁を含む出口ポートを画定する。
【００９１】
ある特定の実施形態では（例えば、より詳細に以下に述べるように、溶出流体が流動チャネル（７）を通過し細胞が播種容器（１８）に入った後）、容器（１３）に含有された収集流体または濾液が流体ライン（５９）および（５７）を通過し、播種容器（１８）内に入る（図１Ａにおいて）。
【００９２】
好ましい実施形態では、流体は、真空によって容器（１３）から離れるように方向付けられる。他の実施形態では、流体ポンプを使用する（例えば、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｒｉｖｅ蠕動ポンプ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ製であるが、当業者なら、様々な市販のポンプから選択することができよう）。
【００９３】
ある特定の実施形態では、システムは、溶出流体を含有するための手段を含む。ある特定の実施形態では、手段は、滅菌することが可能でありかつ／または気密封止される、培地バッグ、注射器、または任意の柔軟なもしくは硬質の容器などの容器（９）である（例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＦＬ  １Ｌ培地バッグ）。ある特定の実施形態では、溶出流体容器（９）は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、ポリカーボネート、アクリル、ＰＶＣ、またはステンレス鋼などの、滅菌することが可能な任意の生体適合性の硬質材料で形成される。容器（９）は、溶出流体を含有するための任意の適切な容積を有することができる。
【００９４】
好ましい実施形態では、容器（９）は、流体、例えば溶出または洗浄流体の無菌充填および／または分配に適合させた少なくとも１つのポートを有する。ある特定の実施形態では、溶出流体は、細胞培地、生理食塩液、例えばリン酸緩衝生理食塩液、デキストランを含む生理食塩液、または細胞を採取しまたは培養するための当業者に公知の任意のその他の適切な流体、例えば乳酸リンゲル溶液、ノーマルセーライン（ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ）、ダルベッコ改変イーグル培地、国際公開ＷＯ９８／０４５４１３およびＷＯ０５／０９４９１４に開示される流体などとすることができる。別の好ましい実施形態では、容器（９）は少なくとも１つの流動ポート、例えば二方向流動ポートを有する。ある特定の実施形態では、容器（９）は、入口および／または出口を含む。さらに別の実施形態では、容器（９）は、流体もしくは気体の一方向流動を可能にする１つまたは複数の弁を有するポートを含み、かつ／または１つもしくは複数の弁は、容器（９）に連絡する流体ラインに関連付けられる。図１Ａに例示される実施形態によれば、システム（１０００）は、流体ライン（５５）に関連付けられた弁（８）を含む。弁は、当業者に公知の任意の適切な連結または締結手段、例えばクランプ、ネジ、またはルアーコネクター、圧力嵌め、または摩擦嵌めなどを使用して、容器（９）に接続することができかつ／または流体ラインに関連付けることができる。溶出または洗浄流体は、図１Ａにおいて、弁（８）および流体ライン（５３）、流動チャネル（７）、流体ライン（５２）、（５６）、および（５７）を通過し、播種容器（１８）に入る。
【００９５】
ある特定の実施形態では、溶出または洗浄流体を含有するための手段は、流体または気体を保持することが可能な、滅菌および／または気密封止容器を画定する本体を含み、この本体は、流体の充填および／または分配に適合させた１つまたは複数のポートも画定する。ある特定の実施形態では、本体は１つまたは複数のポートを画定し、少なくとも１つのポートは、弁、例えば一方向弁を有する。さらに別の実施形態では、本体は、弁を含む出口ポートを画定する。
【００９６】
一実施形態では、容器（９）は、滅菌溶出または洗浄流体が充填された注射器である。溶出または洗浄流体は、図１Ａにおいて、弁（８）、流体ライン５３、５２、５６、および５７を経て、流動チャネル７を通過し播種容器（１８）に入る。この実施形態では、例えば、手動であるいは機械式および／または電気デバイスを介して注射器プランジャーを押し下げることにより、流体にかかる圧力に起因して、流体は容器９から離れるように方向付けられる。あるいは、例えば容器（９）は、圧縮することができる柔軟な容器とすることができる。しかし、当業者が容易に理解できるように、流体ポンプを使用することもできる（例えば、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｒｉｖｅ蠕動ポンプ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ製であるが、当業者なら様々な市販のポンプから選択することができよう）。
【００９７】
ある特定の実施形態では、システムは、細胞播種アセンブリを含有するための手段を含む。ある特定の実施形態では、手段は、滅菌することが可能なかつ／または気密封止された、培地バッグまたは任意の柔軟なもしくは硬質の容器などの播種容器（１８）である。例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＦＬ  １Ｌ培地バッグを使用することができる。ある特定の実施形態では、容器１８は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、ポリカーボネート、アクリル、ＰＶＣ、またはステンレス鋼などの、滅菌することが可能な任意の生体適合性の硬質材料から構成されてもよい。播種容器（１８）は、任意の適切な容積を有することができる。
【００９８】
ある特定の実施形態では、播種容器（１８）は、内ネジおよび外ネジ、または結合剤の使用など、任意の標準的手段を通して固定されかつ耐漏出性にされた、２つまたはそれよりも多くのセクションを含んでいてもよい。例えば、図１Ａに例示される実施形態によれば、播種容器（１８）は、ネジを含む本体セクションを含む硬質材料と、ネジ付きキャップ（１７）とを含む。あるいは、播種容器は、バッグなどの柔軟な材料を含む。容器内の、足場または移植片、例えば血管移植片を見るために、観察ポートを容器上の任意の点または場所に配置してもよく、あるいは容器を、ポリカーボネートまたはＰＶＣなどの光学的に透明な材料で作製してもよい。検索
【００９９】
好ましい実施形態では、播種容器１８は、流体、例えば本明細書に記述される溶出もしくは洗浄流体および／または収集もしくは濾液流体の、無菌充填および／または分配に適合された少なくとも１つのポートを有する。ある特定の実施形態では、容器（１８）は、入口および／または出口を含む。さらに別の実施形態では、容器（１８）は、少なくとも入口および出口ポートを含む（図１Ａに例示される実施形態では、播種容器（１８）は、入口ポート（１６）、出口ポート（２４）、サンプリングポート（１９）（例えば、播種容器から流体試料を無菌的に獲得して、例えば微生物汚染および／または幹細胞計数を決定する）、およびベントポート（２６）を含み、キャップ１７（図１Ａ）はポートを含む）。参照のため図１Ａに例示される実施形態を使用すると、ポート１９は、無針アクセスポートなどのスワバブル弁を含むことができる。特に好ましい実施形態では、出口ポートは、細胞播種アセンブリと共に適合される。ある特定の実施形態では、容器（１８）は、流体または気体の一方向流動を可能にする１つまたは複数の弁を有する入口ポートを含む。あるいは、または追加として、１つまたは複数の弁は、播種容器に連絡する１つまたは複数の流体ラインに関連付けることができる。弁は、当業者に公知の任意の適切な連結または締結手段、例えばクランプ、ネジ、またはルアーコネクター、圧力嵌め、または摩擦嵌めなどを使用して、容器１８に接続することができ、かつ／または播種容器１８に連絡する流体ラインに関連付けることができる。
【０１００】
好ましい実施形態では、播種容器１８は、入口ポート１６および出口ポート２４を含み、容器内へのおよび容器を通した流体の潅流および／または循環が可能になる。入口ポート１６および出口ポート２４は、容器１８を流体ライン５７および５８ａにそれぞれ取着するのにも使用される。流体ライン５８ａは、密閉システムを維持しながら、播種容器１８を１つまたは複数の残留播種細胞流体容器３５ａおよび３５ｂに接続する。ただ１つの播種容器１８しか図１Ａには示されていないが、流体ライン、例えば流体ライン５７または５８ａは、１つより多い播種容器が並列にシステムに接続するように分岐していてもよいことを理解されたい。
【０１０１】
任意選択で、播種容器１８は、例えば国際公開ＷＯ９１／０１７８０９に開示されるように、少なくとも１つの疎水性微小孔膜を含む（好ましくは、ハウジング内に配置される）少なくとも１つのベントをさらに含むことができる。例えば図１Ａに例示される実施形態では、好ましくは細菌遮断細孔レーティング（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ
ｐｏｒｅ  ｒａｔｉｎｇ）を提供するベント２６は、少なくとも１つの播種容器ポート２５に連絡させて配置することができる。いかなる特定の理論またはメカニズムにも拘束されるものではないが、ベントは、例えば播種足場が浸漬されている間に気体交換を可能にし得る。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、播種アセンブリを含有するための手段は、流体または気体を保持することが可能な滅菌および／または気密封止容器を画定する本体であって、流体の充填および／または分配に適合された１つまたは複数のポートも画定する本体と、播種アセンブリとを含む。ある特定の実施形態では、本体は、１つまたは複数のポートを画定し、少なくとも１つのポートは弁、例えば一方向弁を有する。さらに別の実施形態では、本体は出口ポートを画定する。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、残留播種細胞流体を含有するための手段は、滅菌することが可能でありかつ／または気密封止される、培地バッグまたは任意の柔軟なもしくは硬質の容器など、少なくとも１つの残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂである。例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＦＬ  １Ｌ培地バッグを使用することができる。ある特定の実施形態では、容器３５ａ、３５ｂは、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、ポリカーボネート、ＰＶＣ、またはステンレス鋼などの滅菌することが可能な任意の生体適合性の硬質材料から構成されてもよい。
【０１０４】
好ましい実施形態では、流体は、真空源を含む真空アセンブリ、例えばポンプおよびレギュレーター２８の使用を通して、容器１８から引き出されて、ポート２５および流体ライン５８ａを介して残留播種細胞流体容器３５ａ内に引き入れられ、このポンプからの負圧は、残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂ、および播種容器１８に接続された流体ラインを通して伝達される。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、播種容器（１８）は、多孔質チューブ（２０）および足場（２１）、例えば血管移植片足場などの細胞または組織の足場または移植片を含む、播種アセンブリ（１００）を収容する。多孔質チューブ（２０）は、流体透過性にされ得る、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、ＰＶＣ、ポリカーボネート、プラスチック、金属、例えばステンレス鋼などの任意の適切な硬質材料を含んでいてもよい。適切な多孔質管状材料の、ある例示的な実施例は、Ｐｏｒｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の多孔質プラスチック管状材料である。あるいは多孔質チューブ２０は、拡張し収縮することが可能であり流体透過性にすることができる、ＰＥＴまたは血管形成バルーンなどの任意の適切なエラストマー材料を含んでいてもよい。播種容器１８およびチューブ２０は共に、任意の長さまたは直径の血管移植片足場２１を保持するような、任意の長さまたは直径にされてもよい。このことは、任意のサイズの血管移植片を滅菌し、播種し、培養し、貯蔵し、輸送し、試験するのにシステムを使用することができるので、有利である。クリップ（６０）、ｏリング、またはグロメットなどの１つまたは複数の保持要素は、播種、培養、貯蔵、輸送、または処置中に足場がチューブ上の所定位置に保持されるよう、チューブ上の、例えば足場（２１）の両端に配置されてもよい。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、多孔質チューブ（２０）は、マンドリルを含む。例示的なマンドリルを、図１２Ｃ／１２Ｄに例示する。図１２Ｃ／１２Ｄを参照すると：マンドリルマニホールドの開放端は、吸引ロッドの閉鎖端付近にアパーチャーを有する吸引ロッド（２３）上に挿入される。次いでマンドリルを、例えば適切なサイズの連結リングで添着させ、次いで穿孔されたマンドリル上に挿入し、例示的には、マンドリルを、１つまたは複数のｏリング（２２）（図１Ａに示される）を介して播種容器（１８）内に摩擦により保持する。一部の実施形態では、ｏリング（２２）は、ヒンジクリップ（６０）などのクリップである（図１Ｆ、１Ｇに示される）。このアセンブリは、マンドリルマニホールドを経てアパーチャーに入りかつ開口から出る流体の移動を可能にする。本明細書に記述されるように、流体は、残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂに連絡する真空手段（例えば、ポンプ）を介して、マンドリルを経て吸引ロッド（２３）を介して播種容器（１８）の外に、かつ流体ライン５８ａ〜５８ｂを通してマンドリルへと、方向付けられる。
【０１０７】
好ましい実施形態では、マンドリルは、複数の穴または穿孔を含む。しかし穿孔は、本発明の記述に鑑みて当業者に明らかにされ得るいくつもの方法で変更することができる、かつ本発明により包含され意図される、任意の所望のサイズ、形状、および／または構成のものであってもよいことを理解すべきである。多孔質チューブ（２０）は、任意の所望の長さおよび／または直径のものであってもよいことも企図される。例えば直径は、種々の移植片サイズおよび／または適用に合わせて変更してもよく、これらは本発明により明らかに包含され企図される。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、播種容器（１８）は、多孔質チューブ（１８）および足場（２１）を含む播種アセンブリ（１００）を収容する。
【０１０９】
本明細書に記述される実施形態のいずれかにおいて、足場は、播種アセンブリ内の本明細書に記載される多孔質チューブに、例えばマンドリルに並置することができる。例えば、足場は多孔質チューブの一部分にのみ接触してもよいことが企図される。あるいは足場は、多孔質チューブの一部または全てを実質的に取り囲んでもよいことが企図される。一般に足場は、可能な限り多くの細胞の播種を容易にするために足場の可能な限り多くを通って流体が流れるように、多孔質チューブの穿孔部分に並置されまたは隣接されることが好ましい。
【０１１０】
本発明の実施形態によれば、例えば、多孔質チューブを含む播種アセンブリ（好ましくは、マンドリルおよび足場）を含む複数の播種容器は、例えば種々のサイズの移植片および／または種々の適用に合わせて、事前に組み立てられて、望まれるときにシステムの一部として組み立てることができる。典型的には、例えば播種容器は、事前に組み立てられ、滅菌され、例えば無菌ドッキングによってシステムの残りに無菌的に接続することができる。このように、最適なシステムは、必要なときに迅速にセットアップすることができる。
【０１１１】
別の好ましい実施形態では、流動チャネルは、細胞単離物容器、収集流体容器、溶出または洗浄流体容器、および播種容器の間に位置決めされる。この構成は、図１Ａにより具体化される。さらに別の実施形態では、流動チャネルが、上記容器のそれぞれに選択的に流体連絡している。実施形態において、ハウジングは、入口、出口、および少なくとも１つの濾過材、例えば多孔質白血球除去媒体を含むフィルターを含む、流動チャネルを含む（例えば、好ましい実施形態では、流動チャネルは、入口および出口を有しかつこの入口と出口との間に流体流路を画定するハウジングを含むフィルターデバイスと、流体流路を横断してハウジング内に配置された少なくとも１つの多孔質濾過材を含むフィルターとを含む）。別の実施形態では、ハウジングは、流動チャネル、入口、出口、およびそれらの間のフィルター、ならびに弁を含む。ある特定の実施形態では、弁は、少なくとも１つの開放位置と少なくとも１つの閉鎖位置とを有する。
【０１１２】
好ましい実施形態のいずれかにおいて、本発明により提供されるシステムは、その内部を流体および／または気体が流れることが可能な流動ラインを含む。
【０１１３】
したがって好ましい実施形態では、細胞および／または組織移植片を播種し、培養し、貯蔵し、輸送し、かつ／または試験するためのシステムは、細胞単離物流体容器；細胞単離物流体容器、収集流体容器、溶出流体容器、および播種容器の間に配置された流動チャネルを含み、流動チャネルが入口、出口、およびそれらの間にあるフィルターを含み、フィルターが、少なくとも２つの方向に流れることが可能になるよう適合され、流動チャネルが、細胞単離物流体容器、収集流体容器、溶出流体容器、および播種容器のそれぞれに、選択的にそれぞれ流体連絡しており；播種容器は播種アセンブリを含む。
【０１１４】
一実施形態では、播種アセンブリは、穿孔マンドリルと、マンドリルの少なくとも一部に並置される生体適合性３次元足場とを含む。別の実施形態では、システムは、少なくとも１つの残留播種細胞流体容器を含み、この残留播種細胞流体容器は、播種容器に選択的に流体連絡する。
【０１１５】
別の実施形態では、システムは、残留播種細胞流体容器に流体連絡する真空源を含む。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、システムが使い捨てである。密閉使い捨てシステムは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、既に記述された方法（Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００３年；２４巻：２３０３〜８頁；およびＦＤＡ  ＩＤＥ  １４１２７）に比べ、類似の播種効率を達成しながら迅速に実行することができる、組織操作移植片、例えば血管移植片を構築するための手順を可能にする。さらに、システムの使用は、足場輸送の必要性を排除して、組織操作移植片、例えば血管移植片をポイントオブケアで（即ち、手術室で）構築することを可能にする。
【０１１７】
２．  ＴＥＶＧ播種システムの製作
好ましい実施形態では、播種システムの構成要素部品の１つまたは複数は、患者特異的ＴＥＶＧの寸法に順応してアセンブリが最適にサイズ決めされるように、カスタム設計される。好ましくは、システムまたはシステムの部分は、適切な材料の３Ｄ印刷を使用して製作される。例示的な実施形態では、図１Ａに例示されるシステムの播種チャンバーの構成要素部品の１つまたは複数は、適切な材料の３Ｄ印刷によって製作される。特定の実施形態では、３Ｄ印刷される構成要素は、播種チャンバー（１８０）（図１Ｂ、１Ｃ）、吸引ロッド（２３０）（図１Ｄ、１Ｅ）、および任意選択で一体型ヒンジ（ｌｉｖｉｎｇ  ｈｉｎｇｅ）を有するクリップ（６００）（図１Ｆ、１Ｇ）の１つまたは複数を含む。構成要素は、製造された足場（２１）（図１Ｈ）と共に組み立てられるとき、播種チャンバーアセンブリ（１００）（図１Ｉ、１Ｊ）に組み立てることができる。播種システムの構成要素部品の寸法は、例えば患者特異的血管移植片の寸法に、望まれるものに応じて変更することができる。
【０１１８】
例示的な実施形態では、播種チャンバー基部は、１０から１００ｍｍの間、例えば３３ｍｍの半径を有する。例示的な実施形態では、播種チャンバーの上部は、１０から１００ｍｍの間、例えば３８．１ｍｍの直径を有する。例示的な実施形態では、播種チャンバー基部は、２０から１０００ｍｍの間、例えば１８０ｍｍの高さを有する。典型的には、播種チャンバーアパーチャーの内径は、５から９０ｍｍの間、例えば２５．８６ｍｍである。播種チャンバーの壁についての典型的な厚さは、０．５から１０ｍｍの間、例えばおよそ２ｍｍである。播種チャンバーがネジ付き上部を有する場合、ネジ付きセクションの高さは、典型的にはチャンバーの全長のおよそ１０％、例えば２０．５５ｍｍである。マンドリル（２０）、播種チューブ（１８）、および１つまたは複数の足場クリップ（６０）は、典型的には、血管移植片（２１）、播種チャンバーの所望のサイズに対応してサイズ決めされ、播種チャンバー内で一緒に適合するようにサイズ決めされ、典型的には対応するサイズ決めされた播種チャンバーに応じてサイズ決めされる。例示的な実施形態では、１８０ｍｍの長さの播種チャンバー内に嵌め込まれることになるマンドリルの長さは、約１２８ｍｍである。
【０１１９】
一部の実施形態では、患者特異的マンドレルの寸法を使用して、播種チャンバー（１８０）と、吸引ロッド（２３０）およびネジ付きキャップ（１７０）（図１Ｄ、１Ｅ））を含む播種チャンバーアセンブリ（１００）（図１Ｉ、１Ｊ）の対応する構成要素部品と、足場特異的マンドレル（２０）と、足場締結具またはクリップ（６００）（図１Ｆ、１Ｇ）と、播種チャンバー（１８０）（図１Ｂ、１Ｃ）との寸法のコンピュータ支援設計を可能にする。好ましい実施形態では、播種システムの播種チャンバーの構成要素部品の全ては、３Ｄ印刷の方法によって生成される。アセンブリの、３Ｄ印刷された構成要素は、カスタム設計された播種チャンバーアセンブリ（１００）（図１Ｉ、１Ｊ）が生成されるように、足場または移植片（２１）と共に組み立てることができる（図１Ｈの概略図により）。
【０１２０】
ＴＥＶＧ播種システムの３Ｄ印刷に適切な材料には、ポリマー、ならびにステンレス鋼、イリジウム、白金、金、タングステン、タンタル、パラジウム、銀、ニオブ、ジルコニウム、アルミニウム、銅、インジウム、ルテニウム、モリブデン、ニオブ、スズ、コバルト、ニッケル、亜鉛、鉄、ガリウム、マンガン、クロム、チタン、アルミニウム、バナジウム、および炭素を含むがこれらに限定されない金属、ならびにこれらの組み合わせ、合金、および／または積層体が含まれる。一部の実施形態では、マンドレルは液化可能な材料で作製され、それによって、容易な手法で移植片からマンドレルを取り外すことが可能になる。液化可能なマンドレルの使用は、移植片の複雑な形状の形成も可能にする。典型的には、カスタム設計されたマンドレルモデルの製作は短時間で実施され、したがって患者特異的移植片を、手術から１週間またはそれよりも短い期間内、手術から１、２、３、４、５、または６日以内で生成できるようになる。
【０１２１】
Ｂ．  密閉システム内でＴＥＶＧ移植片を播種するための方法
システム（図１Ａ参照）は、骨髄由来単核細胞の単離を可能にし、無菌システムを維持する間または密閉滅菌システムを維持する間、生体適合性３次元足場上に細胞を播種し、これを短期間のインキュベート後に（例えば、３時間またはそれよりも短く、より好ましくは約２時間またはそれよりも短い）組織操作血管移植片として使用することができる。
【０１２２】
システムは、無菌システムとして使用することができ、無菌播種容器は、構成要素を取り扱うのに滅菌グローブを使用して、手術室などの滅菌領域で無菌技法を使用して組み立てられる。組み立てられた播種容器は、密閉された無菌様式で事前に組み立てられたシステムの他の構成要素に接続することができる。
【０１２３】
あるいは、好ましくはシステムは、密閉滅菌システムを維持しながら使用することができ、システムは、事前に組み立てられかつ使用前に滅菌されている。
【０１２４】
この技術の利点には、滅菌フードまたはＩＳＯクラス７ルームの必要なしに、組織操作構築物の組み立てを可能にすることが含まれ、したがってそのような設備または施設の必要性が除外されることにより、組織操作生成物を生成するためのコストが劇的に低減されると同時に組織操作生成物の使用の臨床上の有用性が増大する。別の利点は、既に利用可能なものよりも少ない時間で移植片を提供することである。
【０１２５】
好ましい実施形態では、流体は、細胞懸濁液の全てが足場を通過しかつ残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂに収集されるまで加えられる真空によって、例えば−２０ｍｍＨｇで（または、流動チャネル２内のフィルターの泡立ち点未満の別の適切な値）、播種容器から除去される。
【０１２６】
別の実施形態では、ハウジングは、入口、出口、およびフィルターを含む流動チャネルを含む。別の実施形態では、ハウジングは、流動チャネル、入口、出口、およびそれらの間のフィルター、および弁を含む。ある特定の実施形態では、弁は、少なくとも１つの開放位置および少なくとも１つの閉鎖位置を有する。
【０１２７】
図１Ａを参照すると、（ｉ）骨髄穿刺液（例えば、５ｃｃ／ｋｇ体重）が無菌的に収集され、細胞単離物流体容器（３）に注入され；（ｉｉ）真空を使用して、骨髄穿刺液は、フィルターを含む流動チャネル（７）を通過し、このフィルターは、穿刺液が濾過材の上流表面から濾過材の下流表面を通るときに骨髄由来単核細胞を捕捉するものであり；（ｉｉｉ）骨髄穿刺液の残りの部分（典型的には、主に血漿から構成されるが、赤血球および／または血小板を含んでいてもよい）は収集流体容器（１３）に収集され；（ｉｖ）溶出流体容器（９）内の溶出溶液は流動チャネル（７）を通過し、この溶出溶液は、濾過材の下流表面から濾過材の上流表面を経て播種容器（１８）に入り、その結果フィルターは、播種容器内に収集された骨髄由来単核細胞を解放するようになり；（ｖ）播種容器（１８）は、穿孔されたマンドリル（２０）上に挿入された足場を含有し；（ｖｉ）骨髄由来単核細胞懸濁液は、播種容器（１８）を満たし、穿孔されたマンドリル（２０）上に挿入された足場を完全に覆い；（ｖｉｉ）細胞懸濁液の全てが足場を通過しかつ少なくとも１つの残留播種細胞流体容器（３５ａ、３５ｂ）内に収集されるまで、真空（例えば、−２０ｍｍＨｇ）が適用され；（ｖｉｉｉ）典型的には血漿を主に含む、濾過された骨髄穿刺液は、真空により誘導された流れを使用して、収集容器（１３）から、播種足場を含有する播種容器（１８）に入り、それによって播種足場を浸漬する。
【０１２８】
別の実施形態では、方法は、骨髄穿刺液（例えば、５ｃｃ／ｋｇ体重）を、無菌的に容器３に収集することを含み、少なくとも弁５１は閉鎖されている（典型的には、弁６、７、８、１０、および１５の１つまたは複数も閉鎖されている）。クランプ５および１０は開放されており、真空を使用して、骨髄穿刺液は流動チャネル７フィルターを通過し（流体ライン５１および５２を介して）、そこで骨髄由来単核細胞が捕捉される。骨髄穿刺液の残りの部分（典型的には、主に血漿から構成される）は、収集流体容器１３に収集される（流体ライン５３および５４とポート１１を介して）。その後、クランプ５および１０を閉じ、弁８および６を開き、溶出溶液をフィルター７に通して（流体ライン５５および５３を介して）、骨髄由来単核細胞を解放し、この細胞は流体ライン５２、５６、および５７とポート１６を通過して、播種容器１８に収集される。播種容器（１８）は、穿孔された多孔質チューブ／マンドリル（２０）上に挿入される足場２１を含む播種アセンブリ（１００）を含有する。好ましい実施形態では、骨髄由来単核細胞懸濁液が、播種容器１８を満たし、穿孔されたマンドリル（２０）上に挿入される足場（２１）を完全に覆う。その後、弁６および１０を閉じ、弁（２７）を開き、残留播種細胞流体容器３５ａにポート２４および流体ライン５８ａを介して細胞懸濁液の全てが足場を通過し収集されるまで（過剰な流体がある場合には、残留播種細胞容器３５ｂに流体ライン５８ｂを介して追加の細胞懸濁液を収集する）、レギュレーター２８を含む真空アセンブリを使用して真空（例えば、−２０ｍｍＨｇ）を適用する。
【０１２９】
真空を止めた後、弁２７を好ましくは閉じ、弁１５を開き、容器１３内の血清を、好ましくは真空を使用して、流体ライン５９および５７とポート１６を介して播種容器１８に排出させ、それによって播種足場を浸漬する。任意選択のベント２６が、播種容器１８の部分として含まれる場合、例えば浸漬されている最中に気体交換を行ってもよい。望む場合には、例えば細胞を浸漬しながら播種容器および／または播種容器構成要素（マンドリルおよび／または足場など）の取り扱いを容易にするために、フィルター７、溶出容器９、収集容器１３、および／または細胞単離物容器３などの、播種容器１８の上流の１つまたは複数のシステム構成要素を除去し（例えば、適切な流体ラインのヒートシール後）廃棄することができる。
【０１３０】
追加の選択肢として、装置全体を、例えばおよそ１０〜１００％の湿度、３５〜３７°、３〜５％のＣＯ２で）、約２時間、インキュベーター内に配置し、その後、播種足場を無菌的に容器から除去することができ（例えば、キャップ１７（図１Ａ）を除去した後または柔軟な容器を切り開いた後（図３））、組織操作血管移植片として使用することができる。
【０１３１】
Ｖ．  細胞が播種されたＴＥＶＧの使用方法
細胞が播種された患者特異的ＴＥＶＧは、細胞が存在しない同等のＴＥＶＧでの狭窄率に対し、ＴＥＶＧの術後狭窄率を低減させるかまたは予防することができる。したがって、患者特異的ＴＥＶＧには、炎症を含めた術後狭窄の発症を伴う免疫プロセスの１つまたは複数を低減させるかまたは予防するのに有効な量の細胞を播種することができる。
【０１３２】
組織修復は：ａ）凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）／凝集（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）；ｂ）炎症；ｃ）線維芽細胞の移行／増殖；およびｄ）正常な組織機構が修復される最終リモデリング相を含む、４つの全く異なる段階がある。組織損傷後の最も早い段階では、上皮細胞および／または内皮細胞が炎症性メディエーターを放出し、仮の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の凝固および発達を引き起こす抗線維素溶解−凝集カスケードを開始する。血小板の凝集および後続の脱顆粒は、血管の拡張を促進させ、透過性を増大させ、損傷組織への好中球、マクロファージ、リンパ球、および好酸球などの炎症性細胞の効率的な動員が可能になる。好中球は、創傷治癒の最も早い段階で最も豊富な炎症性細胞であるが、好中球の脱顆粒後に、マクロファージによって迅速に置き換わる。活性化マクロファージおよび好中球が創傷を清拭し、侵入するいかなる生物も排除し、炎症応答を増幅すると共に線維芽細胞増殖および動員を引き起こす、様々なサイトカインおよびケモカインを生成する。活性化の際、線維芽細胞は筋線維芽細胞に変換され、α−平滑筋アクチンおよびＥＣＭ構成成分を分泌する。最後に、リモデリング相では、上皮／内皮細胞が分裂し、一時的なマトリクス上を移行して、損傷組織を再生する。このように治癒および新生組織発生は、過剰な肥厚化および狭窄または線維化なしで、組織を再生し血管の壁を厚くする必要性のバランスをとる、微細に調整されたプロセスである。
【０１３３】
マクロファージ
循環単球および浸潤マクロファージの存在は、創傷治癒および新生組織発生に極めて重要であることが示されている（Ａｒｒａｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０１巻（１号）：４０〜５０頁（１９９８年））。しかし、組織損傷部位でのマクロファージ浸潤の程度も、増殖性調節不全および新生内膜形成に相関していた（Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（１２号）：４２５３〜６３頁（２０１１年））。さらに、数多くの研究は、マクロファージおよび線維芽細胞が、線維化の病因に関わる主なエフェクター細胞であることを示している（Ｗｙｎｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４巻（８号）：５８３〜９４頁（２００４年）で概説されている）。
【０１３４】
血管損傷後、炎症性単球細胞（ヒトにおけるＣＤ１６−ｈｉ、ＣＤ６４−ｈｉ、およびＣＤ１４−ｈｉ；マウスにおけるＣＤ１１５＋、ＣＤ１１ｂ＋、およびＬｙ６ｃ−ｈｉ）を損傷組織に動員し、局所成長因子、炎症促進性サイトカイン、および微生物化合物に曝露して活性化マクロファージ（ヒトにおけるＥｍｒ１−ｈｉ；マウスにおけるＦ４／８０−ｈｉ）に分化させる（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７巻：６５６〜６６１頁（２０１０年））。過剰なマクロファージ浸潤は狭窄をもたらすが、マクロファージ浸潤の完全な阻害は、新生組織形成を予防する（Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（１２号）：４２５３〜６３頁（２０１１年）。
【０１３５】
マクロファージに関する分極活性化（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）の２つの全く異なる状態は、定義されている：古典的に活性化された（Ｍ１）マクロファージ表現型、および代替的に活性化された（Ｍ２）マクロファージ表現型である（ＧｏｒｄｏｎおよびＴａｙｌｏｒ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５巻：９５３〜９６４頁（２００５年）；Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３巻：５４９〜５５５頁（２００２年））。古典的に活性化された（Ｍ１）マクロファージの役割は、ＴＨ１細胞免疫応答におけるエフェクター細胞であり、それに対して代替的に活性化された（Ｍ２）マクロファージは、免疫抑制および創傷治癒／組織修復に関わるように見える。Ｍ１およびＭ２マクロファージは、全く異なるケモカインおよびケモカイン受容体プロファイルを有し、Ｍ１は、ＴＨ１細胞誘引性ケモカインＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０を分泌し、Ｍ２マクロファージはケモカインＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、およびＣＣＬ２４を発現する。
【０１３６】
Ｍ２マクロファージの存在は、新生内膜発生および狭窄に関連付けられていた（Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（１２号）：４２５３〜６３頁（２０１１年））。組織移植片植え込み後の、ある時点でのマクロファージ浸潤の程度、新生組織形成、および狭窄の間の相関は、マクロファージ活性のモジュレーションを通して狭窄を予防する手段を提供する。
【０１３７】
さらにマクロファージは、コラーゲン生成筋線維芽細胞の近くに典型的には位置付けられ、単球由来のマクロファージは、線維化に必須であるとして損傷後に炎症性応答を臨床的に長続きさせることが示されてきた（ＷｙｎｎおよびＢａｒｒｏｎ、Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．、３０巻（３号）：２４５〜２５７頁（２０１０年））。マクロファージは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、強力な走化性作用物質、およびトランスホーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）を含む、線維芽細胞を活性化する線維化促進メディエーターを生成する。特に、マクロファージの非古典的Ｍ２（ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋）サブセットの著しい増大は、慢性肝疾患に罹っている患者における炎症促進性サイトカインおよび臨床的進行に相関していた。線維化進行中、単球由来マクロファージは、慢性炎症を長続きさせるサイトカインを放出すると共に、肝星細胞（ＨＳＣ）を直接活性化させ、その結果、増殖および分化転換が生じてコラーゲン生成筋線維芽細胞になる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ、５巻（６号）：ｅ１１０４９（２０１０年））。
【０１３８】
血小板
凝集した血小板は、創傷を治癒させるために周囲の結合組織から、または調節不全炎症応答の場合には瘢痕組織から、創傷領域に線維芽細胞を誘引する化学物質を分泌することによって、血管の修復を支援する。組織損傷に応答して、血小板は活性化され、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、強力な走化性作用物質、ならびにトランスホーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）などの細胞外マトリクスの沈着を刺激する複数の成長因子を放出する。これらの成長因子は共に、結合組織の修復および再生において、有意な役割を果たすことが示されてきた。ＰＤＧＦは、線維芽細胞および炎症性細胞の流入を著しく増大させると共に細胞増殖および遺伝子発現を刺激する、１次マイトジェンおよび化学誘引物質として機能する。ＰＤＧＦは、白血球を血管壁にしっかり付着させることができ、最終的には内皮下組織に遊出することが可能になる。しかし血小板由来ケモカインは、平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖を誘発し、新生内膜増殖および器官線維化において役割を果たすことも公知である（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、３５巻、３号、５５５〜５６２頁（２０００年））。ＰＤＧＦおよびその受容体の発現の増加は、強皮症肺および皮膚組織に関連付けられる。特に、強皮症肺および皮膚線維芽細胞におけるオートクリンＰＤＧＦ受容体媒介シグナル伝達ループに関する証拠があり、強皮症における慢性線維症でのＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦ経路を共に示唆している（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ；４７巻：ｖ２〜ｖ４頁（２００８年））。さらに、ＰＤＧＦシグナル伝達の調節解除は、肺高血圧症およびアテローム性動脈硬化症などの心血管適応に関連付けられる。
【０１３９】
損傷誘発性ＰＤＧＦに応答した、中間層（ｍｅｄｉａ  ｌａｙｅｒ）平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖および移行は、新生内膜の肥厚化に寄与する必須事象であり（Ｆｉｎｇｅｒｌｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．、８６巻：８４１２頁（１９８９年）；Ｃｌｏｗｅｓら、Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．、５６巻：１３９〜１４５頁（１９８５年））、これらは最終的には血管の狭小化および狭窄をもたらす。
【０１４０】
血小板により放出される他の治癒関連成長因子には、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子１、血小板由来上皮成長因子、および血管内皮成長因子が含まれる。
【０１４１】
患者特異的ＴＥＶＧには、創傷治癒を増大しかつ再狭窄を予防する再生促進免疫環境を創出するのに有効な量の細胞を播種することができる。患者特異的ＴＥＶＧには、血小板の活性および機能をモジュレートさせるのに有効な量の細胞を播種することもできる。このように患者特異的ＴＥＶＧには、血小板凝集および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の生成／発現などの、血小板の生体機能を低減させるかまたは予防するのに有効な量の細胞を播種することもできる。
【０１４２】
移植片の術後狭窄を低減させるために、細胞が播種された、記述される患者特異的組織操作血管移植片を使用する方法は、患者内に細胞播種移植片を外科的に植え込むこと、または他の方法で投与することを含む。典型的には、植え込みの方法は、置き換えられることになるまたは増強されることになる動脈のセクションに移植片を付着させることを含む。血管移植片を付着させる方法は、当技術分野で公知である。方法は、典型的には、マクロファージ細胞の浸潤、またはＭ１からＭ２表現型へのマクロファージ細胞の変換、またはその両方を、細胞が播種されていないまたは細胞が少ししか播種されていない同等の移植片などの対照に比べて低減させるかまたは阻害する。一部の実施形態では、方法は、血管新生組織の発生を低減または阻害することなく、マクロファージ細胞の増殖を低減させるかまたは阻害する。被験体は、狭窄、再狭窄、もしくはその他の血管増殖障害を有する可能性があり、または再狭窄もしくは他の血管増殖障害のリスクにあることを特定することができ、例えば被験体は、血管外傷、血管形成、手術、または移植動脈症などに罹ったか、罹っているか、または罹ることになる。記述される方法のいずれかは、処置を必要とする被験体を特定するステップを含み得る。
【０１４３】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されよう。
【実施例】
【０１４４】
（実施例１：患者特異的組織操作血管移植片の迅速な調製のための密閉使い捨て播種システムの３Ｄ印刷）
材料および方法
研究設計
先天性心奇形の緩和のための最初のＦＤＡ承認組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）は、ＩＳＯクラス７クリーンルーム内での開放術（ｏｐｅｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により調製される。自家骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）は、密度勾配遠心分離により濃縮され、その後、生分解性管状足場上に真空播種される。自家骨髄単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）は、密度勾配遠心分離により濃縮され、その後、生分解性管状足場上に真空播種される。しかし、ＧＭＰ準拠クリーンルーム維持の複雑さに加えて、移植片調製の時間、労力、および資源集約的な性質は、本手法の広範な採用を制限している。
【０１４５】
足場播種を最適化する試みは、これまで小動物および大型動物モデルで確認されてきた、ＢＭ−ＭＮＣ単離用フィルタベースシステムおよび密閉使い捨て播種デバイスの開発をもたらした。手術前造影研究、コンピュータ血流力学モデリング（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）、コンピュータ支援設計、および３Ｄ印刷の統合は、最適な患者特異的ＴＥＶＧ足場および密閉播種システムの創出を可能にする。前臨床評価に適した、３Ｄ印刷によって製作された改善された単回使用ＴＥＶＧ播種プロトタイプを記載する。
【０１４６】
設計基準
足場播種システムの設計は、費用効果の高いデバイス設計、３６時間以内での製作、ＦＤＡ承認材料のみの使用、システム滅菌能力、ＰＡＬＬ  ＬＥＵＫＡＨＡＲＶＥＳＴ（登録商標）などの既存のフィルターとの統合、臨床ＴＥＶＧ放出基準をモニタリングするためのサンプリング部、ＤＩＣＯＭ適合性設計ワークフロー、多様な解剖学的要件に応じて容易に調節可能であること、足場の取り扱いを最小限に抑えることを含む基準を満たすように行われる。
【０１４７】
３Ｄ印刷
プロトタイプ３Ｄ印刷密閉使い捨て播種システムを設計し、３Ｄプリンタを使用して印刷した。右胸心、大血管転位、ならびにＴＡＰＶＲ修復および右側両方向性Ｇｌｅｎｎシャント手術後の全肺静脈還流異常（ＡＰＶＲ）状態を有する候補ＴＥＶＧレシピエントの手術前ＭＲＩ造影を使用して、患者特異的播種システムを設計した。汎用熱溶解積層方式モデル（ｆｕｓｅｄ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｅｒ）（Ｕｌｔｉｍａｋｅｒ２）を使用して、３６時間にわたり、ポリ乳酸フィラメントから播種システムの構成要素を印刷した。
【０１４８】
印刷した構成要素は、吸引ロッド、カスタム設計マンドレル、足場、足場締結具、および播種チャンバーを含む。
【０１４９】
３Ｄ印刷播種システムの組み立て
吸引ロッドを足場特異的マンドレルに通し、足場をマンドレル上に配置し、気密締結具を使用して気密シールを作製し、マンドレルおよび足場を播種チャンバーに通し、次に、チャンバーを通して真空を適用することにより足場を播種するステップに従って、構成要素部品の３Ｄ印刷後の播種システムの組み立てを行った。
【０１５０】
結果
患者特異的移植片は、それが非線形であること、３．０ｍｍの漸進的内径増大があること、および移植片全体の長さが臨床的に使用される移植片（１３ｃｍ）より大きいことという点で、現在使用されている足場と大きく異なる。上記の差異は、患者特異的手法の利点および有効性を際立たせる。カスタム足場および密閉単回使用播種システムのＣＡＤレンダリングは、迅速なインシリコプロトタイピングおよび３Ｄ印刷を可能にする。
【０１５１】
本実施例の複雑なケースは、理想的な血管導管は、現在利用されている一定の直径を有する線形移植片ではないという状況を表しており、本手法の利点および実現可能性を際立たせている。３Ｄ印刷された密閉使い捨て播種システムの臨床への転換は、先天性心疾患のポイントオブケア処置のために即利用可能な患者特異的ＴＥＶＧを可能にする。
【０１５２】
（実施例２：改善された組織操作血管移植片の合理的設計）
材料および方法
研究設計
ＴＥＶＧ組み立てを最適化し、ＴＥＶＧの開存性を高めるため、研究を行い、細胞播種用量を含む最適なパラメータおよび播種後の移植片インキュベート時間を決定した。細胞播種用量およびインキュベート時間の組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）開存性に対する効果を調査する研究により、ＢＭ−ＭＮＣ用量を増大させインキュベート時間を減少させることが、移植片の性能および有用性を改善するための実行可能なストラテジであることを確認した。
【０１５３】
種々の用量の骨髄由来単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）を、ＴＥＶＧ上に播種し、０〜１２時間インキュベートし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに植え込んだ。様々な用量のヒトＢＭ−ＭＮＣをＴＥＶＧ上に播種し、細胞付着を測定した。ＴＥＶＧを最適化するために、ＴＥＶＧにおける血管新生組織形成の基礎にある細胞および分子機構を調査するためのマウスモデルを開発した（Ｒｏｈら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９巻（１０号）、１４５４〜１４６３頁（２００８年））。
【０１５４】
マウス移植片のための骨髄採取および播種
同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨および脛骨から骨髄を収集し、密度遠心分離法を使用して単核細胞を単離した（Ｌｅｅら、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．（８８巻）、（２０１４年））。全ての動物実験は、動物の使用および取り扱いのためのＮａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ機関ガイドライン（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
【０１５５】
最適な細胞インキュベート時間の決定
最適な細胞インキュベート時間を決定するために、細胞１×１０６個／移植片を、ポリ−Ｌ−ラクチドとε−カプロラクトンのコポリマーシーラント溶液によりポリグリコール酸シートから形成された生分解性足場（内径０．８２ｍｍおよび長さ３ｍｍ）（グンゼ株式会社、京都、日本）上に、静的に播種した。足場を、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にてＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）中で、それぞれ０、０．５、２および１２時間インキュベートした。
【０１５６】
最適な細胞用量の決定
最適な細胞用量を決定するために、それぞれ細胞０．０、０．１×１０６、１×１０６、および１０×１０６個／移植片という、４つの異なる用量の単離単核細胞を静的に播種し、一晩インキュベートした。インキュベート後、移植片を使用して、足場への細胞付着を定量化するためにＤＮＡアッセイを使用した細胞カウント（ｎ＝６／群）を行い、または下大静脈（ＩＶＣ）間置移植片としてのマウスへの植え込み（ｎ＝２５／群）を行った（Ｌｅｅら、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．（８８巻）、（２０１４年））。
【０１５７】
ヒト移植片のための細胞供給源および播種
ヒト骨髄をＬｏｎｚａ（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。１２．５、２５、および５０ｍＬ／移植片（それぞれｎ＝５、７、８）という、３つの異なる用量の骨髄（ＢＭ）を本研究において使用した。１００μｍフィルターを通してＢＭを濾過した後、密度遠心分離法によりＢＭ−ＭＮＣを単離した（Ｕｄｅｌｓｍａｎら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １７巻（７号）、７３１〜７３６頁（２０１１年））。単離したＢＭ−ＭＮＣの総数をカウントした後、真空播種法を使用して細胞を生分解性足場（直径１８ｍｍおよび長さ約１２０ｍｍ、グンゼから提供）上に播種し（Ｕｄｅｌｓｍａｎら、Ｔｉｓｓｕｅ
Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、１７巻（７号）、７３１〜７３６頁（２０１１年））、現在行われている臨床試験（ＩＤＥ  １４１２７）と同様に２時間インキュベートした。足場を５ｍｍ２の切片に切り出し、ＤＮＡアッセイを使用して細胞付着を定量化した。
【０１５８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡアッセイ
蛍光定量ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を製造元の指示に従って使用してＤＮＡ含量を測定することにより、ＴＥＶＧ足場上への細胞付着を決定した。ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ｄｓＤＮＡ試薬は、溶液中の二本鎖ＤＮＡの定量化のための蛍光性核酸染料である。足場に付着した細胞を溶解した後、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、ｄｓＤＮＡ中の結合染料を検出した。既知量のヒトＢＭ細胞を使用して、蛍光の関数として細胞数の標準曲線を生成し、各足場上に播種された細胞の数を決定した。要約すると、付着細胞総数を管腔表面積で除算することにより、付着細胞数／面積を計算して、１０３細胞／面積ｍｍ２として表し、付着細胞／面積を、播種細胞／面積で除算することにより播種効率を計算した（Ｕｄｅｌｓｍａｎら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １７巻（７号）、７３１〜７３６頁（２０１１年））。
【０１５９】
外科的植え込み
移植片を、ＩＶＣ間置移植片として、前述の通り６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに植え込んだ（Ｌｅｅら、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．（８８巻）、（２０１４年））。要約すると、麻酔導入（ケタミン１００ｍｇ／ｋｇ；キシラジン１０ｍｇ／ｋｇ；ケトプロフェン５ｍｇ／ｋｇを鎮痛薬として腹腔内）の後、正中開腹切開を行い、大動脈とＩＶＣを鈍に分離した。大動脈とＩＶＣの両側に２つのマイクロクランプを留置し、ＩＶＣを横に切断した。１０．０プロリーン縫合糸を使用して、末端間のＩＶＣ間置移植片としてＴＥＶＧを植え込んだ。植え込みの２週間後にＴＥＶＧを採取した。新たに採取した試料を１０％ホルマリンで灌流固定し、組織学および免疫組織化学のために使用した。
【０１６０】
組織学および免疫組織化学
外植したＴＥＶＧを、１０％中性緩衝ホルマリン中に一晩固定し、パラフィン内に包埋し、前述の通り切片にした（４μｍ厚切片）（Ｒｏｈら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２９巻（１０号）、１４５４〜１４６３頁（２００８年））。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ハーツ（Ｈａｒｔ’ｓ）、マッソントリクローム、およびアルシアンブルーで染色した。免疫組織化学を通じて、マクロファージ、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−９を同定した。脱パラフィン、再湿潤化（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）、および、内因性ペルオキシダーゼ活性および非特異的背景染色をブロックした後、切片を以下の一次抗体、ラット抗Ｆ４／８０（１：１０００、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）、ウサギ抗ＭＭＰ−２（１：２００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、およびウサギ抗ＭＭＰ−９（１：２００、Ａｂｃａｍ）でインキュベートした。種に適したビオチン化二次抗体、すなわち、それぞれヤギ抗ラットＩｇＧ（１：２００、Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、およびヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００、Ｖｅｃｔｏｒ）でのインキュベート、続いて西洋ワサビペルオキシターゼストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ）の結合および３，３−ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ）による以降の発色現像により、一次抗体結合を検出した。細胞核をヘマトキシリン（Ｇｉｌｌ’ｓ  Ｆｏｒｍｕｌａ、Ｖｅｃｔｏｒ）で対比染色した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ａ２顕微鏡により、明視野画像を得た。免疫蛍光染色法を使用して、内皮細胞（ＥＣ）および平滑筋細胞（ＳＭＣ）を同定した。ウサギ抗−ＣＤ３１（１：５０、Ａｂｃａｍ）およびマウスα−ＳＭＡと交差反応するマウス抗ヒト平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、１：５００、Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）の一次抗体溶液で、スライドを一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（登録商標）ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：３００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（登録商標）ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：３００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体により、抗体結合を検出した。４’，６−ジアミジノ（ｄｉａｍｉｄｉｎｉ）−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による以降の対比染色により、細胞核を同定した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１倒立顕微鏡により蛍光画像を得て、適切な陰性対照により露光時間を伝達した。
【０１６１】
定量的免疫組織化学
ＴＥＶＧに浸潤するマクロファージの数を、各外植足場に関して定量化した。４００倍の高倍率視野（ＨＰＦ）で、各切片の５つの等しい間隔を置いた領域において、陽性Ｆ４／８０発現を有する細胞核を造影し、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用してカウントし総計した（Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（１２号）、４２５３〜４２６３頁（２０１１年））。
【０１６２】
ＴＥＶＧ形態測定
Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して、Ｈ＆Ｅ染色スライドから移植片管腔径を測定した。管腔の円周をπで除算することにより、管腔径を決定した。測定した管腔径と元の移植片管腔径との比を使用して、移植片の狭窄率を計算した。「臨界狭窄」を、元の管腔径に対して７５％より多い管腔径減少として定義した（Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（１２号）、４２５３〜４２６３頁（２０１１年））。
【０１６３】
統計分析
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、細胞付着の差を決定した。フィッシャーの直接確率法を使用して、移植片の狭窄率を比較した。０．０５未満のｐ値が統計的有意性を示した。数値を平均±標準偏差として列挙する。
【０１６４】
結果
インキュベート時間は、ＴＥＶＧ開存性に対して最小の効果を示した。しかし、ＴＥＶＧに細胞を播種することは、用量依存的に、ＴＥＶＧ開存性を著しく増加させた。ヒト移植片では、より多くの骨髄を播種に使用すると、用量依存的に細胞付着が増大した。
【０１６５】
マウスモデルにおける新生組織形成の自然歴
これまでの研究は、ＴＥＶＧ狭窄は典型的に植え込み後の最初の２週間以内に発生することを実証した（Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（１２号）、４２５３〜４２６３頁（２０１１年））。肉眼での観測では、ＴＥＶＧは部分的に分解され、植え込み後２週間で有意な新生組織形成が起きていた。開存および閉塞ＴＥＶＧの代表的組織学画像は、開存ＴＥＶＧが管腔表面に沿ってコンフルエントな内皮細胞（ＥＣ）層を発生させ、その下に平滑筋細胞（ＳＭＣ）が出現したことを示した。対照的に、閉塞移植片は、閉塞管腔または狭い内皮裏打ち管腔と共にコラーゲンに埋め込まれた、ＳＭＣから主に構成される新生組織形成の崩壊を示した。開存移植片と閉塞移植片は共に、主に残存移植片の周囲において、エラスチン、コラーゲン、およびグリコサミノグリカンの初期発生を示した。残留足場材料付近の新生組織においてＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性も観察され、これは組織リモデリングが進行中であることを示唆する。
【０１６６】
インキュベート継続期間はＴＥＶＧ開存性に影響しない
ＴＥＶＧ狭窄に対するインキュベート継続時間の効果を評価するため、本発明者らは、０時間および１２時間のインキュベートにより、１×１０６ＢＭ−ＭＮＣ播種ＴＥＶＧを植え込んだ（ｎ＝２５／群）。ＴＥＶＧを植え込みの２週間後に採取し、移植片開存性を比較した。臨界狭窄率は、それぞれ０時間および１２時間インキュベート群よりも、非播種群において有意に高かった（８４％対１２％および２０％、ｐ＜０．０００１、図２Ａ）。０時間群と１２時間群との間では、統計的差異はなかったが、０時間群がやや高い開存性を示した（図２Ｂ）。０時間インキュベート群と１２時間インキュベート群の開存率は共に、非播種対照群の開存率よりも有意に高かった。したがって、細胞播種後のインキュベート継続期間はＴＥＶＧ開存性に影響しない。
【０１６７】
細胞播種は用量依存的にＴＥＶＧ臨界狭窄の形成を阻害する
ＴＥＶＧ狭窄の形成に対する細胞播種用量の効果をさらに調査するため、非播種対照と並んで、それぞれ０．１×１０６、１×１０６、または１０×１０６細胞を移植片に播種し、ＩＶＣ間置移植片として植え込んだ（ｎ＝２５／群）。植え込み後２週間で、非播種対照および０．１×１０６細胞播種群と比較して、１×１０６細胞播種群および１０×１０６細胞播種群の両方で、狭窄率の有意な減少があった（２０％および５％対８４％および６４％、ｐ＜０．０００１；図２Ｂ）。移植片に１０×１０６細胞を播種すると、１×１０６細胞の播種と比較して、狭窄率はさらに低下したが、有意ではなかった（図２Ｂ）。
【０１６８】
ＴＥＶＧにおけるマクロファージ浸潤は細胞用量依存的に発生する
細胞用量がＴＥＶＧへのマクロファージ浸潤に影響するかどうかを決定するために、浸潤マクロファージを定量的かつ組織学的な形態計測分析により評価した。非播種対照および０．１×１０６播種群は、浸潤マクロファージにおいて統計的差異を示さなかったが、１×１０６群および１０×１０６群の両方でマクロファージの数は有意に減少した（１５９．０５±１１．５９および１５９．１７±１６．６４対１２２．０２±１４．７６および１２０．６８±２２．９１細胞／ＨＰＦ、ｐ＜０．０００１、図３）。したがって、ＴＥＶＧ開存性と同様に、非播種対照および０．１×１０６細胞播種群における浸潤マクロファージの数は、１×１０６および１０×１０６の両方の群よりも有意に高かった。
【０１６９】
インキュベート継続期間は細胞付着および播種効率に影響しない
ＴＥＶＧ技術を使用して最良の臨床転帰を確保するために、ＴＥＶＧ組み立ての時間を最適化し、外科手順のための時間を最小限に抑え、汚染の潜在性を減少させ、それにより本技術の使用に伴うリスクを減少させることが重要である。ヒト臨床試験で使用されるＴＥＶＧの組み立ては、細胞採取および単離、足場上への細胞播種、および播種された移植片の一定時間のインキュベートというステップを含む（Ｓｈｉｎ’ｏｋａら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．  １２９巻（６号）、１３３０〜１３３８頁（２００５年））。ＴＥＶＧを組み立てるのに必要な時間は、以前、ＴＥＶＧ開存性に影響を及ぼすことなく細胞単離および播種のための時間を低減する密閉使い捨てシステムを使用して低減されていた（Ｋｕｒｏｂｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１巻（１号）、８８〜９３頁（２０１５年）；Ｋｕｒｏｂｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、（２０１４年））。初期のヒト臨床試験では、２時間というインキュベート時間が任意に選択されたが、最適なインキュベート時間は、患者の安全性を向上させることに加え、ＴＥＶＧ開存性に影響を及ぼすことなくＴＥＶＧ組み立てを強化する上で重要である。
【０１７０】
これらの研究は、細胞用量および最適なインキュベート時間に焦点を当てた上でＴＥＶＧの組み立てを精緻化する。ＴＥＶＧ狭窄の形成に対する細胞用量およびインキュベート継続期間の効果を、マウスモデルを使用して調査し、このプロセスの基礎にある機序に対する見識を得るために、結果をマクロファージ浸潤の程度と相関させた。
【０１７１】
細胞付着および播種効率に対するインキュベート継続時間の効果を評価するため、１×１０６ＢＭ−ＭＮＣを生分解性足場上に播種し、０、０．５、２、および１２時間インキュベートした（ｎ＝６／群）。
【０１７２】
細胞カウントのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡアッセイは播種細胞数の統計的差異を示さず、播種効率はインキュベート継続時間に伴い低下したが、有意なものではなかった（図４Ａおよび図５Ｂ）。
【０１７３】
細胞付着および播種効率は細胞播種用量依存的に増加する
細胞播種用量が細胞付着および播種効率に効果を及ぼすか否かを決定するために、生分解性足場に、それぞれ０．１×１０６、１×１０６、および１０×１０６ＢＭ−ＭＮＣを播種し、一晩インキュベートした（ｎ＝６／群）。１×１０６細胞播種群は、０．１×１０６播種群と比較して、１２倍より多い細胞付着の増加を示した（１９．０９±１３．０３×１０３対１．５６±１．２３×１０３細胞／ｍｍ２、ｐ＜０．００１、図４Ｃ）。１０×１０６細胞播種群は、１×１０６細胞播種群と比較して、１０倍の細胞が播種されたが、細胞付着の有意な（５倍の）増加を示した（９５．８５±４８．３９×１０３対１９．０９±１３．０３×１０３細胞／ｍｍ２、ｐ＜０．００１、図４Ｃ）。１０×１０６群における対応する細胞播種効率はまた、０．１または１×１０６細胞播種群と比較して、２倍近く低下した（９．１６±４．０９対１４．８±１１．６９および１８．００±１１．７１％、図４Ｄ）。
【０１７４】
ヒト移植片における細胞付着もマウス移植片と同様に用量依存的である
このマウス研究からヒト臨床研究に至るまでの細胞付着および播種効率を比較するために、３つの異なる用量のヒト骨髄、１２．５ｍｌ、２５ｍｌ、および５０ｍｌ／移植片（それぞれｎ＝５、７、および８）を、ヒト臨床試験に使用される方法に従って播種した（Ｕｄｅｌｓｍａｎら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、１７巻（７号）、７３１〜７３６頁（２０１１年））。１２．５ｍｌ、２５ｍｌ、および５０ｍｌ群のそれぞれから単離された総ＢＭ−ＭＮＣは、それぞれ細胞数５７±２１、９１±２６、および１６５±９６×１０６細胞であった（図５Ａ）。細胞播種後、付着細胞／面積は、用量依存的に増大した。特に、５０ｍｌ群における細胞付着は、１２．５ｍｌ群よりも有意に高かった（２．８３±１．６７対０．８８±０．２１×１０３細胞／ｍｍ２、ｐ＜０．０５、図５Ｂ）。全３群の播種効率は、マウス移植片の播種効率と同程度であり、１０〜２０％であった。上記の結果は、患者から採取される骨髄の量を増加させると、マウス移植片と同様に、用量依存的に移植片におけるＢＭ−ＭＮＣ付着性を増加させ得ることを示唆している。
【０１７５】
考察
細胞用量およびインキュベート継続期間の役割を調査するための実験を行い、ＴＥＶＧの安全性および臨床的有効性を改善するためのストラテジを同定した。細胞播種は、ＴＥＶＧ開存性を用量依存的に増加させ、ＴＥＶＧ開存性は、より多くの細胞が播種されたときに改善されたが、インキュベート継続時間はＴＥＶＧ開存性に対して最小限の効果を示した。
【０１７６】
加えて、播種に使用する骨髄の量を増加させることにより、ＢＭ−ＭＮＣ数および付着性が増大した。このデータに基づいて、ＢＭ−ＭＮＣの超生理的用量、すなわち、単一ドナーから採取できる量を超えたＢＭ−ＭＮＣは、追加の細胞播種を行っても足場に付着する細胞の数が有意に増加することがない点まで、足場を飽和させ得る（図５Ａ〜図５Ｃ）。
【０１７７】
ヒト臨床試験においてＴＥＶＧを作製するために使用される細胞の用量は経験的に選択され、５ｍｌ／ｋｇの骨髄から単離され得るＢＭ−ＭＮＣの数を表していた。臨床的観点から、著しい有害作用を引き起こすことなく、最大２０ｍｌ／ｋｇの骨髄が、個体から採取可能であり、骨髄移植用骨髄を採取するために慣用的に使用されている（Ｅｌｚｏｕｋｉら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、（Ｅｄ．＾（Ｅｄｓ）．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、３１７９巻（２０１２年））。２．５ｋｇの患者から採取する骨髄を、５ｍｌ／ｋｇ（１２．５ｍｌ）から２０ｍｌ／ｋｇ（５０ｍｌ）に増加させると、潜在的にＢＭ−ＭＮＣが３〜４倍の増加がもたらされることがあり、足場に付着する細胞の数が約３００〜４００％増加することがある（図５Ａ〜図５Ｃ）。
【０１７８】
ヒトの状態に関連するマウス研究に基づいて、細胞付着の推定４００％の増加は、記載された細胞用量ストラテジにより、狭窄の発生率の４０〜８０％の減少をもたらすことがある。細胞用量をさらに増加させることが可能であるが、その使用については、＞２０ｍｌ／ｋｇ骨髄の採取に伴うことがある有害な血流力学的結果のリスクの増大および輸血の必要に対して測定する必要がある（Ｅｌｚｏｕｋｉら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、（Ｅｄ．＾（Ｅｄｓ）．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、３１７９巻（２０１２年））。骨髄成長を刺激するための成長因子の使用は、ＢＭ−ＭＮＣの収量を増加させるための追加的ストラテジを示し、ＴＥＶＧを組み立てるのに必要な時間量を最小限に抑えることにより、その有効性が高まる。組み立ては、ＢＭ−ＭＮＣを単離するプロセス；足場を播種するプロセス；播種された構築物をインキュベートするプロセスを含むことができる。フィコール中で密度遠心分離法を使用してＢＭ−ＭＮＣを単離し、続いて２時間のインキュベートを行うことに基づく、現在の方法論では、ＴＥＶＧを組み立てるのに約２６８±９分が必要である（Ｓｈｉｎ’ｏｋａら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．  １２９巻（６号）、１３３０〜１３３８頁（２００５年））。
【０１７９】
ＴＥＶＧ組み立てに必要な時間を短縮するため、濾過／溶出システムを使用してＢＭ−ＭＮＣの単離および播種のプロセスの時間を最小限に抑える密閉使い捨てシステムが、以前に開発された（Ｋｕｒｏｂｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、（２０１４年））。このシステムは、ヒツジモデルを使用して、開存性に大きな影響を及ぼすことなく、細胞単離および播種に必要な時間を劇的に最小化する可能性をもたらした（Ｋｕｒｏｂｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１巻（１号）、８８〜９３頁（２０１５年））。しかし、上記の結果は、インキュベート時間がＴＥＶＧ開存性に影響を及ぼさず、足場に付着する細胞の数は、実際には、インキュベート期間の増大に伴い減少することを示した。したがって、密閉装置および短縮されたインキュベート期間を使用することは、ＴＥＶＧを組み立てるのに要する時間を２６８±９分から１７±２分に短縮し、安全性および臨床的有効性をさらに高める（Ｋｕｒｏｂｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１巻（１号）、８８〜９３頁（２０１５年））。
【０１８０】
狭窄は一次性移植片関連合併症である。以前の研究は、移植片狭窄が過剰なマクロファージ浸潤の増加により引き起こされること、およびより重要な点として、細胞播種が単球／マクロファージ浸潤および炎症促進性マーカーの発現を減少させたことを示唆した（Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（１２号）、４２５３〜４２６３頁（２０１１年））。この研究では、細胞用量を増加させるとマクロファージ浸潤の程度が減少することが実証され、この有益な効果の基礎にある作用の機序が免疫介在性のものであることが示唆された。これらの知見は、細胞播種が宿主マクロファージ浸潤の程度を減少させ非播種対照と比較して狭窄を阻害することを実証する以前の研究と整合している。ＴＥＶＧインキュベートの時間はＴＥＶＧ開存性に影響せず、ＴＥＶＧ組み立てに必要な時間を最小限に抑える手段が可能であることも示されている。
【０１８１】
血管新生組織は隣接血管壁からの内皮細胞および平滑筋細胞の内殖（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）から生じること、ならびに古典的な組織工学のパラダイムに反して、播種された細胞は血管新生組織に寄与せず、むしろ植え込み後に迅速に消失することが明らかになった（Ｒｏｈら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２９巻（１０号）、１４５４〜１４６３頁（２００８年）；Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（８号）、２７３１〜２７３９頁（２０１１年））。血管新生組織形成が宿主マクロファージ介在性の再生プロセスであること、および細胞播種が血管新生組織形成にとって必須ではないことも確立された（Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（１２号）、４２５３〜４２６３頁（２０１１年））。逆に、宿主マクロファージ浸潤の程度はＴＥＶＧ狭窄の発生率に正比例すること（Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５巻（１２号）、４２５３〜４２６３頁（２０１１年））、および骨髄単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）播種はＴＧＦ−β免疫介在パラクリン効果を介したＴＥＶＧ狭窄の形成を阻害すること（Ｄｕｎｃａｎら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ６５巻（５号）、５１２〜５１４頁（２０１５年））が、以前に確立された。したがって、ＢＭ−ＭＮＣを播種することは、新生組織形成自体には寄与しないが、狭窄を防止し開存性を向上させる役割を果たす。これらの結果はＢＭ−ＭＮＣ播種の重要性を際立たせている。
【０１８２】
（実施例３：ヒツジモデルにおいて３Ｄ印刷を使用した、患者特異的ナノ繊維組織操作血管移植片の前臨床試験）
材料および方法
研究設計
組織操作血管移植片（ＴＥＶＧ）は、自家細胞が増殖し生理機能をもたらす生分解性足場を提供することによる、先天性心疾患における再構築に関する、現在の手法の限界を克服することができる。しかし、現在のＴＥＶＧは、個々の患者の多様な解剖学的要件に対処していない。したがって、３Ｄ印刷と電界紡糸技術を組み合わせて使用して、患者特異的ＴＥＶＧを構築した。
【０１８３】
ヒツジ胸部下大静脈の手術前造影に基づいたコンピュータ支援設計の後に、電界紡糸マンドレルを３Ｄ印刷した。次に、ＴＥＶＧ足場を、３Ｄ印刷マンドレルの周囲に電界紡糸した。
【０１８４】
ヒツジモデルにおいて無細胞下大静脈（ＩＶＣ）間置導管として６個の患者特異的ＴＥＶＧを植え込み、組織学、生化学、および生体力学的評価のため、６ヶ月後に外植した。
【０１８５】
手術前造影および３Ｄモデル／マンドレル作成
手術前血管造影画像に基づいて、ヒツジＩＶＣの直径および長さを測定し、コンピュータ支援設計ソフトウェア（Ｓｏｌｉｄｗｏｒｋｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、一致する移植片モデルを設計した。最終的マンドレル設計を立体リソグラフィ形式（ｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒｍａｔ）に変換し、ステンレス鋼からの３Ｄ製作のためにＳｈａｐｅｗａｙｓ（ＮＹ、ＵＳＡ）にエクスポートする（図６Ａ〜図６Ｅ）。
【０１８６】
足場製作
共電界紡糸ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリラクチド−コ−カプロラクトン（ＰＬＣＬ）足場を作製するため、１０重量％のＰＧＡをヘキサフルオロイソプロパノール中に溶解させ、５重量％のＰＬＣＬをヘキサフルオロイソプロパノール中に溶解させた。電磁攪拌棒を介して、各溶液を、室温で少なくとも３時間撹拌した。別々の注射器で、ＰＧＡ溶液を２．５ｍＬ／時の流量で分配し、ＰＬＣＬ溶液を５．０ｍＬ／時の流量で分配し、ＰＧＡ：ＰＬＣＬ比１：１で移植片を作製した。針先端から２０ｃｍに位置付けされ３０ＲＰＭで回転するカスタム３Ｄ印刷マンドレル上に、両方の溶液を同時に電界紡糸した。＋２５ｋＶの電荷を各注射器先端に印加し、所望の壁厚が達成されるまで、電界紡糸ナノ繊維を、接地したマンドレル上に堆積させた。次いで、電界紡糸した足場をマンドレルから取り外し、２つのガラススライドの間に足場を配置して、挟みゲージで壁厚を測定した。ＰＧＡ／ＰＬＣＬチューブを１．５ｃｍの長さに切り出した。内径は１２ｍｍであった。次に、足場をＴＹＶＥＫ（登録商標）ポーチに包装し、ガンマ線照射で最終滅菌した。図７Ａ〜図７Ｆにプロセス全体をフローチャートとして示す。
【０１８７】
機械的試験
汎用機械的試験機（ＭＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＮ、ＵＳＡ）を使用して、コンプライアンスおよび破裂圧力データを取得した。要約すると、１０〜４ポンドの力分解能および１０〜８インチの線形変位分解能を有する５０ｌｂロードセルを取り付けた荷重フレームを使用して、データを取得した。ラプラスの法則を利用して、毎分１．５ｍｍの変位速度および毎秒４データポイントの取得速度を使用し、コンプライアンス試験を実施し（Ｒａｇｈａｖａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｃｈ．  ２０００年；３３巻：４７５〜４８２頁；Ｖｏｒｐら、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．  ２００３年；７５巻：１２１０〜１２１４頁）、線形力および変位をコンプライアンスに相関させた。ラプラスの法則を利用して、毎分５０ｍｍの変位速度および毎秒４データポイントの取得速度を使用し、破裂圧力試験を実施し（Ｒａｇｈａｖａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｃｈ．  ２０００年；３３巻：４７５〜４８２頁；Ｖｏｒｐら、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．  ２００３年；７５巻：１２１０〜１２１４頁）、線形力および変位を破裂圧力に相関させた。
【０１８８】
環状試料を２本の平行Ｌ形鋼棒の周囲に配置し、一方の棒を試験機の基部に取り付け、他方をロードセルに取り付けた。試料を試料の長さに対して垂直に張った。それぞれ、１２０ｍｍＨｇおよび８０ｍｍＨｇの収縮期および拡張期圧を使用してコンプライアンスを計算した。破損直前の最大圧力として破裂圧力を計算した。
【０１８９】
移植片植え込み
Ｑ−Ｔｅｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの動物実験委員会（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ、ＵＳＡ）が、これらの実験のための動物の取り扱い、使用、およびモニタリングを承認した。６個のカスタム作製無細胞ナノ繊維ＴＥＶＧを、ヒツジ（体重：２３．９±５．０ｋｇ）にＩＶＣ間置移植片として植え込んだ。全てのヒツジを手術中に１．５％イソフルランで麻酔した。ＩＶＣを露出させ、ヘパリン（１００ＩＵ／ｋｇ）を静脈内投与した。標準的６−０プロリーン連続縫合糸を使用して、横隔膜上ＩＶＣ間置移植片として、ＴＥＶＧを植え込んだ。血管造影および剖検のための基準マーカーとして、２個の外科用クリップを近位および遠位吻合部に留置した。手術中および手術７日後に抗生物質処置（セファゾリン）を施した。全てのヒツジを６ヶ月のエンドポイントまでアスピリン（３２５ｍｇ／日）の毎日経口用量で維持した。
【０１９０】
血管造影
３ヶ月および６ヶ月時点におけるあらゆる潜在的移植片合併症を評価するために、血管造影を実施した。５ＦｒカテーテルをＩＶＣまでの頸静脈内に挿入し、静脈造影剤（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）を横隔膜上ＩＶＣおよび移植片中央部に手動注入した。加えて、近位および遠位吻合部でＩＶＣ血圧を測定し、移植片全体での圧力勾配を評価した。
【０１９１】
組織学および免疫組織化学
外植したＴＥＶＧ試料を、４℃で１０％ホルマリン中に２４時間固定し、次にパラフィン内に包埋した。標準的組織学のために、組織切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン、マッソントリクローム、ピクロシリウスレッド、ハーツ、およびフォン・コッサ染色法で染色した。免疫組織化学のために、組織切片を脱パラフィン処理し、再湿潤化し、内因性ペルオキシダーゼ活性および非特異的染色についてブロックした。使用した一次抗体は、フォン・ヴィレブランド因子（１：２０００、Ｄａｋｏ）、α−平滑筋アクチン（１：５００、Ｄａｋｏ）、ミオシン重鎖（１：５００、Ａｂｃａｍ）、およびＣＤ６８（１：２００、Ａｂｃａｍ）を含んでいた。ビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して抗体結合を検出し、続いて、ストレプトアビジン結合（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎａｔｅｄ）ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ）でインキュベートした。３，３−ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いた呈色反応により、発色を行った。細胞核をギル・ヘマトキシリン（Ｖｅｃｔｏｒ）で対比染色した。
【０１９２】
組織学および定量分析
Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して、ヘマトキシリンおよびエオシンならびにピクロシリウスレッド（偏光）染色から、管腔径、壁厚、残存足場領域、およびコラーゲン含量を測定した。ピクロシリウスレッド染色がコラーゲン繊維を明らかにした（Ｌａｔｔｏｕｆら、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ２０１４年；６２巻：７５１〜７５８頁）。各試料（ｎ＝６）の代表的切片から、４つの高倍率視野（ＨＰＦ、４０倍）を分析することにより、ＣＤ６８＋マクロファージを定量化し、平均した。
【０１９３】
生化学的分析
Ｆａｓｔｉｎ比色アッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ａｓｓａｙ，  Ｉｎｃ）を使用して、エラスチン含量を決定した。１００ｍｇ乾燥重量の各試料を測定し、７５０μｍの０．２５Ｍシュウ酸を含有する１．５ｍｌマイクロ遠心管に移した。次に、管を１００℃で６０分間ヒートブロック上に配置し、不溶性エラスチンを水溶性α−エラスチンに変換した。製造者のプロトコールに従った沈殿および色素結合後の５１３ｎｍでの検出および標準曲線への内挿により、各試料中のエラスチン含量を決定した。Ｓｉｒｃｏｌ比色アッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ａｓｓａｙ，Ｉｎｃ）によりコラーゲン含量を決定した。１００ｍｇ乾燥重量の各試料を測定し、一晩インキュベートすることによりコラーゲンを可溶化するため、濃度０．１ｍｇ／ｍｌの０．５Ｍ酢酸と共に、１．０ｍｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する低タンパク質結合１．５ｍｌ円錐形マイクロ遠心管に移した。製造者のプロトコールに従った沈殿および色素結合後の５５５ｎｍでの検出および標準曲線への内挿により、各試料中のコラーゲン含量を決定した。
【０１９４】
統計
全ての実験について、中央値を同定するバーを有する個々の値の散布図として、データをグラフに表す。記載の基準は平均値±標準偏差である。テューキーの多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡを介して、破裂圧力、コンプライアンス、および外径変化データを分析した。対応のある両側ｔ検定（ｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）により、圧力勾配データを分析した。対応のない両側ｔ検定により、エラスチン、コラーゲン、コラーゲン面積％、および壁厚データの分析を実施した。壁厚とＣＤ６８＋マクロファージ／ＨＰＦとの間の何らかの相関の有意性を決定するために、ピアソン相関係数を計算した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると考えた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、バージョン６、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、統計分析を実施した。
【０１９５】
結果
全てのヒツジは合併症なく生存し、全ての移植片が動脈瘤形成または異所性石灰化を伴わずに開存していた。連続血管造影は、移植片がリモデリングした３ヶ月と６ヶ月との間におけるＴＥＶＧ圧力勾配の有意な減少を明らかにした。外植時には、ナノ繊維足場はほぼ完全に再吸収され、ＴＥＶＧはネイティブＩＶＣと同様の機械的特性を示した。組織学的分析は、組織化された平滑筋細胞層、細胞外マトリクス沈着、および内皮化（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）を実証した。ＴＥＶＧとネイティブＩＶＣとの間にエラスチンおよびコラーゲン含量の有意差は同定されなかった。壁厚とＴＥＶＧへのＣＤ６８＋マクロファージ浸潤との間には有意な正の相関があった。
【０１９６】
患者特異的無細胞ナノ繊維ＴＥＶＧの機械的特性
電界紡糸により、１３６５±４７６μｍのネイティブＩＶＣ壁厚よりも有意に小さい、６５７μｍ±３６μｍの均一な壁厚を有する管状足場を作製した。
【０１９７】
ネイティブＩＶＣと比較して植え込み前の移植片の破裂圧力に有意差はなく、同様に、ネイティブＩＶＣと６ヶ月時点のＴＥＶＧとの間に破裂圧力の有意差は観察されなかった（図８Ａ；ネイティブＩＶＣ：１３０６２±６８４７対６ヶ月ＴＥＶＧ：１１６８５±１１５０６対手術前ＴＥＶＧ：６１６７±５６２７ｍｍＨｇ；ｐ＝０．２２）。手術前の移植片コンプライアンスは、ネイティブＩＶＣと比較して有意に高かった（図３Ｂ；手術前ＴＥＶＧ：４．０±１．５対ネイティブＩＶＣ：２．４±０．８５％；ｐ＜０．０５）。しかし、ネイティブＩＶＣと６ヶ月後のＴＥＶＧとの間にコンプライアンスの有意差はなかった（図８Ｂ、ネイティブＩＶＣ：２．４±０．８５対６ヶ月ＴＥＶＧ：２．３±０．４６％；ｐ＞０．０５）。
【０１９８】
高流量低圧静脈循環における生体適合性
開存性および組織リモデリングを含む移植片生体適合性は、６ヶ月の研究期間内では優秀なものであった。全てのヒツジは、狭窄、拡張、または断裂などのあらゆる移植片関連合併症を伴わずに、研究のエンドポイントまで生存した。造影剤増強血管造影法により、狭窄または拡張の証拠について、３ヶ月および６ヶ月時点で、ネイティブＩＶＣおよび患者特異的ＴＥＶＧを評価した。ネイティブＩＶＣをＴＥＶＧの近位、中央、または遠位領域と比較したとき、３ヶ月と６ヶ月との間に測定管腔径の倍数変化に有意差はなかった。ＩＶＣと患者特異的ＴＥＶＧは共に、３ヶ月時点と６ヶ月時点との間で有意な直径変化を示さなかった（図９Ａ）。６ヶ月時点でのＴＥＶＧ全体の圧力勾配は、３ヶ月時点よりも有意に低く、有利なリモデリングおよび足場分解を示唆している（図９Ｂ、３ヶ月：６．３±２．０対６ヶ月：２．１±２．２ｍｍＨｇ、ｐ＝０．００４５）。
【０１９９】
エラスチンおよびコラーゲンは静脈機能にとって極めて重要であり、十分に研究されている血管移植片リモデリングのマーカーである。生化学的定量化は、ＴＥＶＧのエラスチン含量（図９Ｃ、６．７±３．１対７．４±０．８８μｇ／ｍｇ、ｐ＝０．７４）およびコラーゲン含量（図９Ｄ、１．８±０．４対１．８±０．３５μｇ／ｍｇ、ｐ＝０．９３）が、ネイティブのヒツジＩＶＣのものと同等であることを明らかにした。
【０２００】
十分に組織化された血管新生組織形成
カスタムナノ繊維ＴＥＶＧは、６ヶ月にわたる、十分に組織化された血管新生組織形成を実証した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、ＴＥＶＧへの広範な細胞浸潤を実証し、孔径および繊維直径などの足場パラメータが宿主細胞浸潤を可能にしたことを証明した。全ての無細胞ＴＥＶＧは、合併症なしで開存したままであった。重要なことは、偏光顕微鏡下で可視化されたヘマトキシリンおよびエオシン染色が、わずか２．０９±０．６９％のナノ繊維足場材料が６ヶ月時点で残存していたことを明らかにし、血管新生組織が、評価された生化学的および機械的特性に対する主要寄与因子であったことを示すことであり、このことは本手法の安全性および有効性をさらに支持するものである。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究（データは示さず）は、ＴＥＶＧが１２週間後に全ての機械的強度を喪失することを実証する。
【０２０１】
移植片の管腔表面では、フォン・ヴィレブランド因子について細胞単層が陽性染色され、ネイティブの組織と同等の内皮化に成功したことが確認された。管腔表面は微小血栓症の証拠を示さなかった。
【０２０２】
平滑筋細胞は血管機能にとって重要であり、本発明者らは、ＴＥＶＧにおける６ヶ月時点のα−平滑筋アクチンおよびミオシン重鎖マーカーを使用して、成熟収縮性血管ＳＭＣを同定した。ミオシン重鎖陽性細胞の層は、周囲に組織化され、内膜下層において十分な壁厚を維持した。α−平滑筋アクチン陽性細胞の多層集団は、主に新生中膜（ｎｅｏｍｅｄｉａ）に存在し、ＴＥＶＧは６ヶ月時点で完全に成熟した新生ＩＶＣになっておらず、この時点ではまだ活発な血管リモデリングが生じていたことを示唆する。あるいは、α−平滑筋アクチンは、合成ＳＭＣまたは筋線維芽細胞を示し得、ＴＥＶＧに観察されるα−平滑筋アクチン＋／ミオシン重鎖染色は、新生外膜または連続的成長およびリモデリング領域を同定することがある。ＴＥＶＧにおける細胞外マトリクス構成成分は、ネイティブＩＶＣで観察された周囲配向を模倣していた。ＴＥＶＧ中の細胞外マトリクス密度（ピクロシリウスレッド、Ｆ：マッソントリクロームで染色）は、ネイティブの組織のものに類似していた。薄い繊維および厚い繊維の相対量および配向を評価することにより、コラーゲン沈着、組織化および成熟を確認した。ピクロシリウスレッド染色は、コラーゲンの面積の割合がＴＥＶＧおよびネイティブＩＶＣの両方において類似していることを示した（図１０、９．７５±６．２７対８．７５±１．３１％、ｐ＝０．７４）。ハーツ染色は、ＴＥＶＧのエラスチン組成がネイティブＩＶＣのエラスチン組成と同等であることを実証した。６ヶ月時点でフォン・コッサ染色における異所性石灰化の証拠はなかった。
【０２０３】
ＴＥＶＧの壁厚は、ネイティブＩＶＣの壁厚よりも有意に大きかった（図１１Ａ、ＴＥＶＧ（Ｎ＝６）：２．２７±０．９１ｍｍ対ネイティブＩＶＣ（Ｎ＝５）：０．８９±０．１５ｍｍ、ｐ＝０．００９１）。ＴＥＶＧ壁厚と足場へのマクロファージ浸潤との間には有意な正の相関があり（図１１Ｂ、両側ピアソン相関（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）、ｐ＝０．００３７、Ｒ２＝０．９０）、ＣＤ６８＋マクロファージが移植片中の血管リモデリングの炎症プロセスを誘導しＴＥＶＧの壁厚を増加させたことを示唆している（図１１Ｂ）。
【０２０４】
考察
本研究の結果は、コンピュータ支援設計モデリング、３Ｄ印刷、および電界紡糸により作製された患者特異的無細胞ナノ繊維ＴＥＶＧの有効性を確認するものである。患者特異的ＴＥＶＧは、機械的特性、血管造影、組織学、および免疫組織化学の点で、ネイティブＩＶＣと同等のものであった。連続血管造影は、無細胞患者特異的ＴＥＶＧとネイティブＩＶＣとの間の初期圧力勾配が、ポリマー足場が再吸収されるにつれ、研究の６ヶ月の時間経過中に徐々に消散して行ったことを明らかにした。加えて、ＴＥＶＧの機械的プロファイルは、研究のエンドポイントまでのネイティブＩＶＣの機械的プロファイルと類似していた。
【０２０５】
３Ｄ印刷技術の進歩が再生およびトランスレーショナル医療の分野と統合され、組織工学における課題に対する新しい解決策を創出することがより一般的になってきている。そのような１つの例は、３Ｄ印刷生分解性気管副子の臨床使用および開発である。しかし、ＴＥＶＧの臨床応用における３Ｄ印刷技術の関連性は、３Ｄ印刷可能な適切な材料の欠如により、限定的なものであった。近年の研究は、完全な合成性の生分解性ポリマーまたはコラーゲン、エラスチン、ゼラチン、キトサンなどの天然タンパク質とブレンドされた合成ポリマーに焦点を当てている。最新のバイオプリンティングの試みにより生物学的血管が生産されているが、組織を成熟のためにさらに培養しない限り、構築物の機械的特性は不十分なものである。
【０２０６】
以前の研究は、合成生分解性ポリマーによる溶媒注型成形プロセスを利用したＴＥＶＧ製作も検査していたが、３Ｄ印刷ＴＥＶＧ足場は、患者特異的導管作製のプロセスを最も合理化するだろう。マウスモデルにおける３Ｄ印刷ＴＥＶＧ足場の機能性も調査された。ＴＥＶＧは、非播種無細胞構築物であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で血管組織成長を支援できる適切な機械的特性を有していた（Ｍｅｌｃｈｉｏｒｒｉら、Ａｄｖ  Ｈｅａｌｔｈｃ  Ｍａｔｅｒ．、２０１５年）。３Ｄ印刷ＴＥＶＧは、免疫無防備状態のマウスにおけるＩＶＣ導管として植え込まれ、生体適合性および手術後１年の長期的有効性を実証したが、この足場（ポリ（プロピレンフマレート））の分解速度は、最適ではなかった。公知の分解プロファイルを有するＦＤＡ承認材料、３Ｄ印刷マンドレル、および電界紡糸を使用して、臨床に容易に転換できるカスタムＴＥＶＧが生産された。電界紡糸は、高度に調節可能なプロセスであり、多種多様なポリマータイプおよび繊維サイズを各種形状のマンドレルに紡糸することができ、したがって、組織操作のためのカスタム作製足場の合理的設計を可能にするという点で有利である（Ｒｏｃｃｏら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｂ  Ｒｅｖ．  ２０１４年；２０巻：６２８〜６４０頁）。
【０２０７】
現在の「フリーサイズ（ｏｎｅ−ｓｉｚｅ−ｆｉｔｓ−ａｌｌ）」パラダイムは、先天性心疾患集団に存在する可変的で複雑な解剖学的構造に十分に対処していない。患者特異的ＴＥＶＧは、心臓外ＴＣＰＣを受ける、ＳＶＡを有する患者にとって有用である。臨床研究は、ＴＣＰＣの幾何学が、最適以下の肝臓血流分布（ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｌｏｗ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）によるエネルギー損失において主要因として働くことを実証した。加えて、コンピュータモデルの進歩は、より生理学的に現実的な患者特異的シミュレーションの開発につながっている（ｄｅ  Ｚｅｌｉｃｏｕｒｔら、Ｐｒｏｇ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２０１０年；３０巻：３１〜４４頁）。コンピュータモデリングは、ＴＣＰＣエネルギー損失がＴＣＰＣ導管および肺動脈の直径減少と逆相関することを示している。これらのシミュレーションはまた、肝臓血流分布が、大静脈のオフセット、肺血流分布（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｌｏｗ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、およびＴＣＰＣとＳＶＣとの間の接合角度と相関することも見出した（Ｔａｎｇら、ＪＡＣＣ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ．  ２０１４年；７巻：２１５〜２２４頁）。更なる研究が、ＳＶＣとＩＶＣからの流れの衝突を回避し、肺への肝臓血流の均等な分布を促進するため、Ｙ−Ｆｏｎｔａｎ移植片を検査している（Ｒｅｓｔｒｅｐｏら、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．  ２０１６年；１０１巻：１８３〜１８９頁）。
【０２０８】
本明細書に記載されたナノ繊維構築物は、自家血管の成長を促進し、流れおよび直径の不整合などの、より多くの硬質材料に付随する懸念を克服する。患者特異的移植片はまた、解剖学的制限のために植え込み空間が限定される患者においてＳＶＣの位置付けをずらす必要性を回避することができる。したがって、患者特異的ＴＥＶＧは、近年の造影およびコンピュータモデリングの進歩を利用することにより、改善された臨床的および外科的成果を提供するはずである。
【０２０９】
合成生分解性材料の選択肢としてのＰＬＣＬおよびＰＧＡの使用は、以前のヒト試験において有効な移植片機械的特性およびリモデリングをもたらしたが、最適化されたナノ繊維パラメータを用いた第２世代電界紡糸ＰＧＡ／ＰＬＣＬ足場設計が現在試験されている。
【０２１０】
患者特異的ナノ繊維ＴＥＶＧは、手術後６ヶ月時点で満足のいく血管リモデリングを示した。ネイティブＩＶＣと比較して、６ヶ月時点のＴＥＶＧは、ＳＭＣの有意に厚い層を示した。血管造影は、６ヶ月時点のＴＥＶＧの圧力勾配が３ヶ月時点よりも有意に低いことを示した。加えて、６ヶ月時点で、破裂圧力およびコンプライアンスに関して、ＴＥＶＧとネイティブＩＶＣとの間に有意差はなかった。十分に組織化された血管平滑筋細胞層は、血管石灰化を防止するために必要であるが、過度の平滑筋細胞増殖は、最終的に、過形成による狭窄または完全閉塞につながる可能性がある。本研究の６ヶ月という時間経過のため、ＴＥＶＧに発生した血管平滑筋細胞層が、最終的にネイティブＩＶＣに類似したものになるか、または後の時点で閉塞性狭窄に進行するかどうかを確かめることは困難である。
【０２１１】
ＴＥＶＧ壁厚と足場へのＣＤ６８＋マクロファージ浸潤との間の有意な正の相関。骨髄単核細胞が播種された足場は、炎症媒介プロセスを介して成長、修復、およびリモデリングする能力を備えた生きている血管導管に変換することが以前に報告されている（Ｒｏｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１０年；１０７巻：４６６９〜４６７４頁）。加えて、以前の研究は、過度のマクロファージ浸潤が閉塞性血管新生組織過形成に寄与することを示唆した（Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２０１１年；２５巻：２７３１〜２７３９頁；Ｈｉｂｉｎｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２０１５年；２９巻：２４３１〜２４３８頁）。ネイティブＩＶＣと比較すると、ＴＥＶＧの壁厚はより厚く、慢性内膜過形成の進行を示し得る。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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