(57)【要約】【課題】医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性カルボン酸類またはアミド類の製造方法を提供する。【解決手段】シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４由来またはシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株由来の新規立体選択的アミド加水分解酵素とそれぞれをコードするＤＮＡを提供する。該アミド加水分解酵素を用いてアミドを立体選択的に加水分解し、キラルカルボン酸またはアミド（Ｎ−アルキルアミドを含む）、特にキラル含窒素複素間化合物カルボン酸またはそのアミド（Ｎ−アルキルアミドを含む）を生産することができる。本発明によるアミド加水分解酵素は、活性と立体選択性に優れる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有する立体選択的アミダーゼ。
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したみかけの分子量が２９，０００〜３１，０００程度である；
（Ｂ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドまたは（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適ｐＨがｐＨ８付近である；
（Ｃ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドまたは（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適温度が４５〜５０℃である；
（Ｄ）ｐＨ８．０付近において４５℃以下の温度で安定である；
（Ｅ）ｐ−クロロ水銀安息香酸、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋により活性が完全に阻害される；及び
（Ｆ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の立体選択性が、（Ｒ）−体選択的であり、Ｅ値が３０〜６０である。
【請求項２】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するアミノ酸配列；または
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に６０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するアミノ酸配列。
【請求項３】
下記の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に６０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列；
（Ｅ）配列番号２に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子またはベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子またはベクターを有する形質転換宿主細胞。
【請求項６】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
2004105152.tif 000048
（式中、Ａは、置換されていてもよい主鎖原子数２〜５の炭化水素鎖を示し、該炭化水素鎖には二重結合が含まれていてもよいし、窒素原子または窒素原子以外のヘテロ原子が一個含まれていてもよい。Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立に、水素原子、置換されていてもよいアルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す。ｎは０または１を示す。）で表されるカルボン酸アミド類に、請求項１若しくは２に記載のアミダーゼ若しくはタンパク質、または請求項５に記載の形質転換宿主細胞若しくはその処理物を作用させることにより、（Ｒ）−体のアミド結合を選択的に加水分解させた後、下記一般式（ＩＩ）
【化２】
2004105152.tif 000049
（式中、Ａ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｒ）−体のカルボン酸類および／または下記一般式（ＩＩＩ）
【化３】
2004105152.tif 000050
（式中、Ａ、Ｒ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを特徴とする光学活性なカルボン酸類および／またはアミド類の製造方法。
【請求項７】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、または配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するアミノ酸配列；または
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に６０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するアミノ酸配列。
【請求項８】
下記の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、または配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に６０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に記載の塩基配列、または配列番号４に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｄ）配列番号４に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子またはベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えＤＮＡ分子またはベクターを有する形質転換宿主細胞。
【請求項１１】
下記一般式（Ｉ）
【化４】
2004105152.tif 000051
（式中、Ａは、置換されていてもよい主鎖原子数２〜５の炭化水素鎖を示し、該炭化水素鎖には二重結合が含まれていてもよいし、窒素原子または窒素原子以外のヘテロ原子が一個含まれていてもよい。Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立に、水素原子、置換されていてもよいアルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す。ｎは０または１を示す。）で表されるカルボン酸アミド類に、請求項７記載のタンパク質又は請求項１０に記載の形質転換宿主細胞若しくはその処理物を作用させることにより、（Ｒ）−体のアミド結合を選択的に加水分解させた後、下記一般式（ＩＩ）
【化５】
2004105152.tif 000052
（式中、Ａ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｒ）−体のカルボン酸類および／または下記一般式（ＩＩＩ）
【化６】
2004105152.tif 000053
（式中、Ａ、Ｒ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを特徴とする光学活性な（Ｒ）−カルボン酸類および／または（Ｓ）−カルボキサミド類の製造方法。
【請求項１２】
請求項３に記載されたＤＮＡまたは請求項４に記載された組換えＤＮＡ分子若しくはベクターと、該ＤＮＡと５０％以上の相同性を示す１種以上のＤＮＡとをランダムリコンビネーションし、立体選択的アミダーゼ活性を指標として選択することを特徴とする立体選択的アミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアミド結合を立体選択的に加水分解するアミダーゼタンパク質、そのタンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子及びベクター、該ベクター又は組換えＤＮＡ分子またはベクターを有する形質転換宿主細胞、並びに該タンパク質または該形質転換宿主細胞またはその処理物をカルボン酸アミド類に作用させ、医・農薬中間原料として有用なキラルカルボン酸類及び／又はキラルカルボン酸アミド類を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ラセミ体の含窒素複素環含有カルボキサミド類を生物工学的に加水分解し、医・農薬中間体として有用な（Ｒ）−カルボン酸類及び／又は（Ｓ）−カルボキサミド類を製造する方法としては、シュードモナス　アゾトフォルマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）　ＩＡＭ１６０３株又はその処理物（特許文献１参照）、あるいはシュードモナス　エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）　ＭＣＩ３４３３株又はシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株あるいはそれらの処理物（特許文献２参照）をラセミ体Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドに作用させ、高い光学純度の（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸及び／又は（Ｓ）−Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボン酸アミドを取得する方法が知られている。
【０００３】
しかしながら、例えば特許文献１に記載の手法では菌体又はその処理物を加水分解触媒として用いているが、目的の反応を触媒する酵素含量が不充分、かつ酵素自体が不安定性であり、十分に反応を触媒するには多量の菌体を用意する必要があり、さらに反応生産物の精製に多大な負荷がかかるため、経済的に有利な手法ではなかった。また、例えば特許文献２に記載の手法では微生物菌体またはその処理物の立体選択性が不充分であるため、生産される（Ｒ）−体カルボン酸の光学純度が不充分であり、また、（Ｓ）−体カルボキサミドは高い光学純度の生産物が得られるが、その収率が低いため経済的に有利な手法ではなかった。
【０００４】
【特許文献１】
特開平１０−２７６７９４号公報
【特許文献２】
特開平１０−３２７８９０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、含窒素複素環含有カルボン酸アミド類の（Ｒ）−体を立体選択的に加水分解する能力を有する新規アミダーゼ及びそれをコードするＤＮＡを取得すること、並びに該アミダーゼを用いて光学純度の高い（Ｒ）−含窒素複素環含有カルボン酸類及び／又は（Ｓ）−含窒素複素間含有カルボキサミド類を製造する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、（Ｒ）−Ｎ−アルキルピペラジン−２−カルボキサミドを不充分ながら選択的に加水分解することで知られているシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株から（Ｒ）−Ｎ−アルキルピペラジン−２−カルボキサミドを選択的に加水分解する酵素を単離し、それをコードするＤＮＡを取得した。このＤＮＡを用いて製造される立体選択的アミダーゼに富んだ組み換え体生物又は高濃度アミダーゼ溶液により、より高い生産性でより高い立体選択的なカルボン酸アミド類の加水分解反応が進行すること見出した。さらに上記アミダーゼのアミノ酸配列と高い一致度（６５％）を有するタンパク質を、シュードモナス　エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　ＰＡＯ１株から単離し、該ＤＮＡを有する形質転換宿主細胞を作成し、該形質転換宿主細胞あるいはその生産するタンパク質を、ラセミ体含窒素複素間含有カルボキサミドに作用し、（Ｒ）−体特異的にそのアミド結合を加水分解することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、以下の理化学的性質を有する立体選択的アミダーゼが提供される。
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したみかけの分子量が２９，０００〜３１，０００程度である；
（Ｂ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドまたは（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適ｐＨがｐＨ８付近である；
（Ｃ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドまたは（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適温度が４５〜５０℃である；
（Ｄ）ｐＨ８．０付近において４５℃以下の温度で安定である；
（Ｅ）ｐ−クロロ水銀安息香酸、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋により活性が完全に阻害される；及び
（Ｆ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の立体選択性が、（Ｒ）−体選択的であり、Ｅ値が３０〜６０である。
【０００８】
本発明の別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、または配列番号１若しくは３に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加、若しくは置換されているアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するアミノ酸配列；または
（Ｃ）配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に６０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するアミノ酸配列。
【０００９】
本発明の更に別の側面によれば、下記の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、または配列番号１若しくは３に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加、若しくは置換されているアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に６０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列；
（Ｅ）配列番号４に記載の塩基配列、または配列番号２若しくは４に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加、若しくは置換されている塩基配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｆ）配列番号２若しくは４に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子またはベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の組換えＤＮＡ分子またはベクターを有する形質転換宿主細胞が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記一般式（Ｉ）
【００１１】
【化７】
2004105152.tif 000002
【００１２】
（式中、Ａは、置換されていてもよい主鎖原子数２〜５の炭化水素鎖を示し、該炭化水素鎖には二重結合が含まれていてもよいし、窒素原子または窒素原子以外のヘテロ原子が一個含まれていてもよい。Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立に、水素原子、置換されていてもよいアルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す。ｎは０または１を示す。）で表されるカルボン酸アミド類に、上記した本発明のアミダーゼ若しくはタンパク質、または形質転換宿主細胞若しくはその処理物を作用させることにより、（Ｒ）−体のアミド結合を選択的に加水分解させた後、下記一般式（ＩＩ）
【００１３】
【化８】
2004105152.tif 000003
【００１４】
（式中、Ａ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｒ）−体のカルボン酸類および／または下記一般式（ＩＩＩ）
【００１５】
【化９】
2004105152.tif 000004
【００１６】
（式中、Ａ、Ｒ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを特徴とする光学活性なカルボン酸類および／またはアミド類の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡまたは組換えＤＮＡ分子若しくはベクターと、該ＤＮＡと５０％以上の相同性を示す１種以上のＤＮＡとをランダムリコンビネーションし、立体選択的アミダーゼ活性を指標として選択することを特徴とする立体選択的アミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの調製方法が提供される。
【００１７】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施形態および実施方法について詳細に説明する。
（１）本発明のアミダーゼおよびタンパク質
本発明は、以下の理化学的性質を有する立体選択的アミダーゼに関するものである。
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したみかけの分子量が２９，０００〜３１，０００程度である；
（Ｂ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドまたは（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適ｐＨがｐＨ８付近である；
（Ｃ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドまたは（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適温度が４５〜５０℃である；
（Ｄ）ｐＨ８．０付近において４５℃以下の温度で安定である；
（Ｅ）ｐ−クロロ水銀安息香酸、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋により活性が完全に阻害される；及び
（Ｆ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の立体選択性が、（Ｒ）−体選択的であり、Ｅ値が３０〜６０である。
【００１９】
本発明のアミダーゼの例としては、例えば、配列番号１または３記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、それらのホモログであって（Ｒ）−体選択的にピペラジン−２−カルボキサミドを加水分解する酵素活性を有するタンパク質、または配列番号１または３記載のアミノ酸配列又はそのホモログのアミノ酸配列を分子内に含むタンパク質である。
【００２０】
ここで、本発明のタンパク質のホモログとは、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上のホモロジーを有するタンパク質であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をいう。これらのホモログには、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列で表されるタンパク質であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２１】
ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、ＦＡＳＴＡプログラムやＢＬＡＳＴプログラムなどを用いて行うことができる。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）などのアミノ酸配列データベースを対象としてＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列番号１に記載のアミノ酸配のホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中で最も高いアミノ酸アイデンティティーを示したのは、配列番号２に記載のシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株のｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＰＡ３５９８（６５％）（Ｓｔｏｖｅｒ、Ｃ．Ｋ．ら、〔Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０６（６７９９）：９５９−９６４〕）であった。次に相同性の高いタンパク質として、シノリゾビウム　メリロティ　１０１２株のｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＮＣＢＩ登録番号：ＣＡＣ４７０７５）が検索されたが、そのアミノ酸アイデンティティーは３６％（Ｇａｌｉｂｅｒｔ、Ｆ．ら〔Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２００１）、２９３（５５３０）：６６８−６７２〕）であり有意な相同性があるとはいえなかった。
【００２２】
また、「配列番号１または３のアミノ酸配列又はそのホモログのアミノ酸配列を分子内に含むタンパク質」とは、該タンパク質のＮ末端やＣ末端に蛋白質相互作用、リガンド結合機能又は別の特殊な機能を有するタンパク質を結合させた融合タンパク質を意味する。
融合タンパク質としては、例えば、通常の分子遺伝学的手法を用いてＧｉｌｂｅｒｔ　Ｈ．Ｊ．ら〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４、７５９−７６７、（１９９０）〕やＳｈｏｓｅｙｏｖ　Ｏ．ら〔米国特許第５４９６９３４号〕が報告しているようなセルロース結合機能を有するアミノ酸配列を本発明のタンパク質のＮ末端やＣ末端に付加したもの、ニッケル結合機能を有するヒスチジンのヘキサマーを結合させて、該タンパク質に特異的結合能を与えたもの、またＫｉｍＧ．Ｊ．ら〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．、６８、２１１−２１７、（２０００）〕記載のような手法により本発明のタンパク質を他の機能を有するタンパク質と融合させたもの等が挙げられる。
【００２３】
本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が明らかになっているので、後述するように、配列番号１または３のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を基にして作成したＤＮＡプローブを用いることにより、（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボキサミド加水分解活性を有する任意の微生物から（Ｒ）−体選択的−ピペラジン−２−カルボキサミド加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することができる。また、ＤＮＡ合成装置を用いて（Ｒ）−体選択的ピペラジン−２−カルボキサミド加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを合成することもできる。さらに、得られたＤＮＡを用いて分子遺伝学的手法により多量の該タンパク質を製造し、そこから通常の方法により該タンパク質単離することができる。また、上記ＤＮＡを有する微生物、例えばシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株の培養菌体より精製することも出来る。
【００２４】
尚、シュードモナス　エスピーＭＣＩ３４３４株、及びシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株はともに公知の微生物であり、前者は独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１６１７０として寄託登録されており、後者はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）においてシュードモナス　エルギノーサ　ＡＴＣＣ４７０８５として、またそのゲノムＤＮＡがＡＴＣＣ４７０８５Ｄとして登録されており、容易に入手可能である。
【００２５】
微生物の培養菌体から本発明のタンパク質を単離する方法としては、一般的なタンパク質の精製方法が応用できる。例えば、上記微生物を一般的な微生物用栄養培地、好ましくは窒素源としてニュートリエントブロス及び炭素源としてリンゴ酸を含む培地で培養することで十分に増殖させた後に遠心分離により回収し、超音波破砕処理やフレンチプレス処理により無細胞抽出液とする。この無細胞抽出液から、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、電気泳動などの操作により蛋白質の物理化学的な性質の差異を利用して目的とするタンパク質を単離することができる。より推奨される手法としては、上記微生物から無細胞抽出液を調製し、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィー等を用いて本発明のタンパク質を精製できる。別法として、後述するように配列番号２または４記載のＤＮＡを適当な発現プロモーターとリボゾーム結合配列の下流に保有するベクターを組み込んだ組み換え体生物、好ましくはエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（以下これを「Ｅ．ｃｏｌｉ」と略称することがある。））の培養菌体から、超音波破砕処理及び遠心分離により無細胞抽出液を調製し、硫安分画、及びイオン交換クロマトグラフィーを用いて本願タンパク質を単離することもできる。
【００２６】
以下に、シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株より単離された、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の物理学的、及び酵素学的性質を示す。
2004105152.tif 000005
２．サブユニット構成：　モノマー
３．アミダーゼ反応至適ｐＨ：　ｐＨ８．０
４．アミダーゼ反応至適温度：　４５℃
５．耐熱性：４５℃以下で安定である。
６．本タンパク質のアミダーゼ活性を完全に阻害する化合物：ｐ−クロロ水銀安息香酸、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋。
７．基質特異性：β−アラニンアミド、Ｄ−グルタミンアミド、及び（Ｒ）体の含窒素複素環カルボン酸アミド類に対し、高いアミダーゼ活性を示す。より好ましい基質としては、（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボキサミド、ピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｒ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドなどが挙げられる。
８．立体選択性：ラセミ体ピペラジン−２−カルボキサミドに作用させた場合、Ｅ値は５９である。
【００２７】
また、シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株より単離された配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の物理学的、及び酵素学的性質を以下に示す。
2004105152.tif 000006
２．サブユニット構成：　ホモダイマー
３．アミダーゼ反応至適ｐＨ：　ｐＨ８．０
４．アミダーゼ反応至適温度：　５０℃
５．耐熱性：４５℃以下で安定である。
６．本タンパク質のアミダーゼ活性を完全に阻害する化合物：Ｎ−エチルマレイミド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｇ＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｔｌ＋、Ｐｂ２＋。
７．立体選択性：ラセミ体ピペラジン−２−カルボキサミドに作用させた場合、Ｅ値は３０である。
【００２８】
（２）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとは上記（１）本発明のアミダーゼおよびタンパク質をコードするＤＮＡである。このＤＮＡには上記タンパク質のホモログをコードするＤＮＡ（以下これを「ＤＮＡホモログ」と略称することがある。）も含まれる。
上記タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２または４で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログとは、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
【００２９】
当業者であれば、配列番号２または４記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄＥｄｔ．，　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）ＰＣＲ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することによりＤＮＡホモログを得ることが可能である。
【００３０】
またＤＮＡホモログには、配列番号２または４で表される塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ　Ｅｄ．（ｅｄ．　ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．　ａｎｄ　Ｒｕｓｓｓｅｌ　Ｄ．Ｗ．）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　２００１、以後　「モルキュラークローニング第３版」　と略称することがある。）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３２】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって取得することができる。先ず、（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボキサミドのアミド結合加水分解活性を有する微生物、またはＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）などのアミノ酸配列データベースを対象としてＢＬＡＳＴプログラムを用いてアミノ酸配のホモロジー検索により配列番号２、４、またはそれらのホモログを有することが判明した微生物から調製してきた染色体ＤＮＡを用いて、常法によりプラスミドライブラリー又はファージライブラリーを作製する。次に、該タンパク質の部分アミノ酸配列の情報を用いて、該タンパク質をコードするＤＮＡの部分断片を取得し、常法によりＤＮＡプローブを作製する。このＤＮＡプローブで上述染色体ＤＮＡライブラリーから本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを特定し、適当なＤＮＡをサブクローニングすることにより該タンパク質をコードするＤＮＡを取得できる。
【００３３】
より具体的には、以下の方法により本発明に係るＤＮＡを取得できる。
１．シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株より得られた精製（Ｒ）−体選択的アミダーゼのＮ末端、及び内部アミノ酸配列の情報を基に、シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株の染色体ＤＮＡを鋳型としてｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクションの略）を行い（Ｋｎｏｔｈ，Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、（１９８８）、１６：１０９３２、及びＬｅｅ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（１９８８）、２３９：１２８８−１２９１）、求める（Ｒ）−体選択的アミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分断片を得る。これを放射性同位元素を含む核酸により標識し、ＤＮＡプローブを作製する。
２．シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株から染色体ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素（例えばＦｂａＩなど）で部分分解する。
３．上記２で得られたＤＮＡ断片と、１で作製したＤＮＡプローブを用い、サザンハイブリダイゼーションを行う。
４．上記３で特定されたＤＮＡを抽出精製し、適当なプラスミドベクターに結合し、大腸菌を形質転換する。
５．上記１で作製したＤＮＡプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡ配列を含むクローンのプラスミドを取得する。
６．上記５で得られたプラスミドを用いて、ベクターに組み込まれたシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来のＤＮＡの塩基配列を決定する。
７．決定されたＤＮＡ塩基配列中に立体選択的アミダーゼのアミノ酸配列の読み取り枠を見いだし、上記工程で得られたＤＮＡ断片中に、アミダーゼの全コード領域が存在することを確認する。
【００３４】
上記工程中でＤＮＡ、及び組み換え体宿主としてのＥ．ｃｏｌｉの取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で行われているものであり、例えばモルキュラークローニング第３版に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り製品で指定されている使用条件に従えば完全にそれらの目的を達成することができる。特に、上記１．において菌株からの染色体ＤＮＡ抽出は、例えばＳａｉｔｏら［Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，７２，６１９−６２９（１９６３）］の方法に準じて行うことができる。また、ＤＮＡの標識化は従来から汎用されている放射性同位元素あるいはジゴキシゲニン、ビオチン、フルオレセイン等の非放射性化合物のいずれも使用可能であり、ＲｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭＩＩ　ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株））やＡｌｋＰｈｏｓＴＭ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株））等を用いれば容易に実施できる。
【００３５】
上記４．におけるベクターとしては、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等を使用することができる。
上記６．におけるＤＮＡ塩基配列の決定もモルキュラークローニング第３版等に記された公知の方法を用いることができる。例えば、Ｌｉ−ｃｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　４０００Ｌ等の機器を付属のマニュアルインストラクションに従って使用すれば容易に実施できる。
【００３６】
さらに、配列番号２または４に表される塩基配列を有するＤＮＡ又はそのＤＮＡホモログと、それらのうちいずれかと相同性の高い塩基配列を有するＤＮＡをｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏでランダムに組み換えることのにより、アミダーゼ活性を有する新しい塩基配列のＤＮＡを取得することができる。この場合、「相同性が高い」とは核酸レベルのアイデンティティーが５０％以上ある塩基配列を示す。ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＤＮＡのランダムな組み換えについては、Ｃｈｅｒｒｙ　Ｊ．Ｒ．ら〔Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７、３３３−３３４（１９９９）〕の方法、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡのランダムな組み換えについては、Ｓｔｅｍｍｅｒ　Ｗ．Ｐ．Ｃ．〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、１０７４７−１０７５１（１９９４）〕の方法、またはＺｈａｏ　Ｈ．ら〔Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６、２５８−２６１（１９９８）〕の方法に従えば実施可能である。特に、ＣｒａｍｅｒｉＡ．ら〔Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８−２９１（１９９８）〕の方法に従えば、お互いに相同性の高い、加水分解酵素をコードするＤＮＡを数種用いてｉｎｖｉｔｒｏで組み換えを行い、比活性や立体選択性が向上した立体特異的アミダーゼをコードするＤＮＡを取得することが可能である。
【００３７】
（３）本発明のベクター及び形質転換体
上記（２）で取得された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入することにより、立体選択的アミダーゼ発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで生物細胞を形質転換することにより形質転換体（組み換え体）を得ることができ、得られた形質転換体を培養することにより、立体選択的アミダーゼを取得することができる。
【００３８】
本発明の立体選択的アミダーゼを発現させるための形質転換の対象となる宿主細胞としては、宿主自体が本酵素反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、宿主ベクター系が確立されている細菌、放線菌、酵母、カビなどの微生物、及び昆虫細胞、植物細胞、動物細胞が好適に利用できる。具体的には以下に示すような微生物、及び高等生物細胞を挙げることができる。
【００３９】
エシェリヒア属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、蚕、菜種、大豆など。
【００４０】
上記で宿主細胞として好ましくは、エシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、及びロドコッカス属微生物であり、特に好ましくは、エシェリヒア属、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属微生物である。
本発明のタンパク質をｉｎ　ｖｉｖｏで製造するには、宿主生物中において安定に存在するベクター中に本発明のＤＮＡを導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に相同組み換え等の手法により本発明のＤＮＡを導入して組み換えＤＮＡ分子を作成し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００４１】
このとき、プロモーター及びリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を本発明のＤＮＡ鎖の５’側上流に、より好ましくは転写終結因子を３’側下流にそれぞれ組み込む必要がある。このプロモーター、ＲＢＳ及び転写終結因子としては、宿主として利用する細胞中において機能することが知られているプロモーター、ＲＢＳ及び転写終結因子であれば特に限定されず、これら各種生物において利用可能なベクター、プロモーター、ＲＢＳ、及び転写終結因子に関しては、例えばモルキュラークローニング第３版や「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳述されている。
【００４２】
具体的には、例えばエシェリヒア属、特にＥ．ｃｏｌｉについては、べクターとしてｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドが挙げられ、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、　ｔｒｃ、ｌｐｐ、λファージ　ＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結因子としては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、リボゾーマルＲＮＡ由来、及びｌｐｐ由来などが挙げられる。このようにＥ．ｃｏｌｉをタンパク質合成系として用いる場合には、目的タンパク質は本願ＤＮＡを含むベクターの組み換え体Ｅ．ｃｏｌｉの生育に伴い構成的に、あるいはイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下ＩＰＴＧ）などのタンパク質合成誘導剤の添加により誘導的に製造される。
【００４３】
上記記載の方法によりｉｎ　ｖｉｖｏで立体選択的アミダーゼを製造できるほか、Ｅ．ｃｏｌｉや小麦胚芽の無細胞蛋白質合成系を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏでも該アミダーゼを製造することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉではＫｉｇａｗａら［ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、４４２、１５−１９（１９９９）］、小麦胚芽を用いた該合成系についてはＭａｄｉｎら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、５５９−５６４（２０００）］の方法に準じて行うことができる。
【００４４】
（４）本発明のアミダーゼを用いた光学活性なカルボン酸及び／またはアミド類の製造
また、本発明は、本発明のタンパク質又は上記で得られる形質転換体を下記一般式（Ｉ）
【００４５】
【化１０】
2004105152.tif 000007
【００４６】
（式中、Ａは、置換されていてもよい主鎖原子数２〜５の炭化水素鎖を示し、該炭化水素鎖には二重結合が含まれていてもよいし、窒素原子または窒素原子以外のヘテロ原子が一個含まれていてもよい。Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立に、水素原子、置換されていてもよいアルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す。ｎは０または１を示す。）で表されるカルボン酸アミド類に作用させることにより、（Ｒ）−体のアミド結合を選択的に加水分解させた後、下記一般式（ＩＩ）
【００４７】
【化１１】
2004105152.tif 000008
【００４８】
（式中、Ａ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｒ）−体のカルボン酸類または／及び下記一般式（ＩＩＩ）
【００４９】
【化１２】
2004105152.tif 000009
【００５０】
（式中、Ａ、Ｒ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを特徴とする光学活性なカルボン酸類及び／またはアミド類を製造する方法である。
上記一般式（Ｉ）中、Ａは、置換されていてもよい主鎖原子数２〜５の炭化水素鎖を示し、該炭化水素鎖には二重結合が含まれていてもよいし、窒素原子または窒素原子以外のヘテロ原子が一個含まれていてもよい。すなわちＡは、それが結合している窒素原子及び炭素原子と一体となって含窒素複素環基を形成する基であり、形成される含窒素複素環基には、窒素原子以外のヘテロ原子が含まれていても良い。ここで、炭化水素鎖Ａ置換基としては、例えばハロゲン原子、アルキル基、アリール基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基、アルコキシ基等が挙げられる。
【００５１】
上記含窒素複素環基として好ましくは５〜７員の含窒素複素環であり、より好ましくは窒素原子を１又は２個含有し、それ以外のヘテロ原子を含有しない含窒素複素環基が挙げられる。上記含窒素複素環基の好ましい具体例としては、ピペリジル基、ピペラジル基、ピラジル基、ピロリジル基が挙げられる。
また、上記含窒素複素環基は反応を阻害しない限りにおいて置換基を有していても良く、上記置換基の具体例としては、置換基Ｒ’及びＡの置換基と同様の原子または基、すなわちハロゲン原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基、アルコキシ基等が挙げられ、このうち好ましくは、炭素数１〜４のアルキル基が挙げられる。
【００５２】
上記一般式（Ｉ）中の置換基ＲおよびＲ’としては、水素原子、置換されていても良いアルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す。
上記アルキル基は、直鎖、分岐鎖或いは環状のアルキル基が挙げられ、このうち好ましくは炭素数１〜６のものであり、上記アリール基としてはフェニル基又はナフチル基が挙げられる。
【００５３】
上記アルキル基又はアリール基の置換基としては、上記Ａの炭化水素鎖の置換基として記載したのと同様の基が挙げられる。
上記置換されていても良いアルキル基又はアリール基として好ましい具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、シクロヘキシル基、ベンジル基、トリフルオロメチル基、１−ヒドロキシカルボニルエチル基、フェニル基、トリル基等が挙げられる。
【００５４】
上記置換基Ｒとして、好ましくは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有するフェニル基であり、より好ましくは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基及びｐ−ニトロフェニル基である。
この製造方法においては、本発明のタンパク質を蓄積している組み換え体生物、組み換え体生物処理物、本発明のタンパク質が蓄積した無細胞蛋白質合成系反応液及び／又はその処理物が酵素触媒として反応系に添加される。具体的には、上記組み換え体生物を培養して得られた細胞そのまま、あるいはトルエン、界面活性剤などの有機化合物による処理、凍結乾燥処理、物理的破砕処理など公知の手法にて処理した処理物、上記無細胞蛋白質合成系の反応液、さらには上記組み換え体生物処理物、及び無細胞蛋白合成反応液から本発明の立体選択的アミダーゼ活性画分を粗精製画分、又は精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた組み換え体生物、組み換え体生物処理物、酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。以下、「高濃度酵素調製物」という用語を、上記組み換え体生物、、無細胞蛋白質合成系反応物、それらの処理物、酵素画分、及び固定化物の全ての概念を包含する言葉として用いる。
【００５５】
本反応において、反応原料であるラセミ体のカルボン酸アミド類は、基質濃度が高すぎると酵素が基質阻害を受ける可能性もあるため、通常、０．１ｍＭ〜１Ｍの濃度で、より好ましくは１０〜５００ｍＭの濃度で反応液に添加する。これらは、反応開始時に一括して添加しても良いが、生成物の蓄積濃度を向上させために連続的もしくは間欠的に添加することもできる。
【００５６】
本反応は、水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合液中で行われ、上記、水性媒体としては、水、あるいは、リン酸カリウム水溶液、トリス−塩酸水溶液等の緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、エタノール、プロパノール等のアルコール類；アセトン等のケトン類；テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；トルエン等の芳香族炭化水素類；クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ｎ−ヘキサン等脂肪族炭化水素類；ジメチルスルホキシド等の有機化合物が使用できる。
【００５７】
反応液のｐＨはアルカリ状態で反応が好適に進行するが、ｐＨ６．０〜９．５であることが好ましく、ｐＨ７．０〜９．５がより好ましい。この条件を満たすために、反応中、必要に応じて、希薄な酸またはアルカリ溶液を随時添加してｐＨを希望の範囲に維持することもできる。
反応温度は０〜５０℃で反応は進行するが、２５〜４５℃で維持することがより好ましい。反応液は必要に応じ攪拌混合される。
【００５８】
本発明のタンパク質は上記式（Ｉ）で表されるカルボン酸アミド類を立体選択的に加水分解する作用を有するので、反応液中に（Ｒ）−体のカルボン酸が生成し、（Ｓ）―体のアミド類が残存する。
上記反応で製造された（Ｒ）−体のカルボン酸及び／又は残存した（Ｓ）−体のアミド化合物（アミド類）は、溶媒抽出、クロマトグラフィー等、通常の分離・精製方法により単離することができる。
【００５９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
実施例１：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼの精製
シュードモナス　エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）　ＭＣＩ３４３４株を表１に示す培地２５．０リットルに接種し、２５℃で８時間培養し、遠心分離により菌体を取得した。
【００６０】
【表１】
2004105152.tif 000010
【００６１】
得られた菌体を超音波破砕し、遠心分離により無細胞抽出液を調製した。これを１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂に吸着させイオン交換クロマトグラフィーを行い、その１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出画分の立体アミダーゼ活性を有する画分を順次硫酸アンモニウムを用いたＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム、再度ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム、Ｇｉｇａｐｉｔｅカラム、及びＦＰＬＣ　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、本タンパク質を単離した。該タンパク質の分子量を決定するべく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株））によるサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したところ、それぞれ２９０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及び３６０００（サイズ排除クロマトグラフィー）であり、サブユニット構成はモノマーであると推定された。
【００６２】
実施例２：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼのＮ−末端アミノ酸配列の決定
実施例１で得られた精製立体特異的アミダーゼのＮ−末端アミノ酸配列を、自動エドマン分解アミノ酸シークエンサー　Ｐｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　６６２５（ミリポア）を用いて分析した。上記により決定されたＮ−末端アミノ酸配列を、配列番号５に示す。
【００６３】
実施例３：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼをコードするＤＮＡの部分断片の取得
シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株をＴＧＹ培地（表２）１００ｍＬに接種し、３０℃で１２時間培養した。
【００６４】
【表２】
2004105152.tif 000011
【００６５】
遠心分離により微生物菌体を取得し、フェノールクロロホルム法を用いて該微生物の染色体ＤＮＡを取得した。実施例２で判明した配列番号５のアミノ酸配列と配列相同性の高いアミノ酸配列を含むタンパク質をＢＬＡＳＴプログラムにより検索すると、細菌に由来する数種の加水分解酵素のアミノ酸配列がもっとも高い相同性（３０〜６０％程度）を示した。そこで、上記の高い相同性を示したシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株の機能未知蛋白質ＰＡ３５９８、ストレプトマイセス　コエリコロール　Ａ３（２）株の機能未知加水分解酵素ＳＣＬ６．１２ｃ（Ｒｅｄｅｎｂａｃｈ，Ｍら〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（１９９６）、２１（１）：７７−９６）〕及びシュードモナス　フロレッセンス　のＰＱＱＦ　５’領域のＨｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｕ．ら〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（１９９５）、６１（１１）：３８５６−３８６４〕）のアミノ酸配列をアラインメントしたところ共通に存在するアミノ酸配列を２ヶ所選択した（配列番号６：ＹＲＫＴＨＬ、配列番号７：ＤＩＥＦＰＥ）。これらの配列を基に、配列番号８及び９（３４３４ＨＡ５、及び３４３４ＨＡ７）に示すＰＣＲプライマーを設計し、耐熱型ＤＮＡポリメラーゼ存在下これらのプライマーを添加し、上記ＭＣＩ３４３４株染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。本ＰＣＲ反応の産物をアガロースゲル電気泳動したところ、１２０ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていたので、これをアガロース電気泳動ゲルから抽出精製した。そのＤＮＡの一部をｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングしてＬｉ−ｃｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　４０００Ｌを用いて（操作方法は付属のマニュアルインストラクションに従った）塩基配列を決定した（配列番号１０）。得られた塩基配列を解析した結果、ＰＣＲにより増幅された断片はシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼをコードするＤＮＡの部分断片であることが明らかになった。上記Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ＰＣＲにより増幅した１２０ｂｐの精製ＤＮＡの残りをＲｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭＩＩ　ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株））により標識し、ＤＮＡプローブを得た。
【００６６】
実施例４：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼ遺伝子の単離とその塩基配列の決定
実施例３に記載の方法によりシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株から染色体ＤＮＡを抽出した。本ＤＮＡをＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶ、またはＦｂａＩで消化した後、実施例３で作製したＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。手法はモルキュラークローニング第３版に従い、ハイブリダイゼーションは４０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中、４２℃で行った。その結果、それぞれ約２．１ｋｂｐ、約５．５ｋｂｐ、約５．３　ｋｂｐのＤＮＡバンドが検出された。これらのＤＮＡをアガロースゲルから抽出精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のそれぞれＰｓｔＩ、ＨｉｎｃＩＩまたはＢａｍＨＩ部位に挿入し、塩化カルシウムを用いた形質転換方法によりＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株に導入した。
【００６７】
得られたＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９の形質転換株を８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１Ｌの水溶液中にＢａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎ　１０．０ｇ、Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　５．０ｇ、塩化ナトリウム　１０．０ｇ、寒天１５．０ｇを含む）に塗布し、３７℃で一晩培養した。生じたコロニーをニトロセルロース膜ＨｙｂｏｎｄＴＭ　ＥＣＬＴＭ（アマシャムファルマシアバイオテク（株））にリフティングし、実施例３で取得したＤＮＡプローブを用い、４０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中、４２℃でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結果、それぞれの陽性のクローンからプラスミド（ｐＲＴＢ１−ＰｓｔＩ、ｐＲＴＢ１−ＥｃｏＲＶ、ｐＲＴＢ１−ＦｂａＩ）を取得し、Ｌｉ−ｃｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　４０００Ｌを用いて、塩基配列を決定した。各配列のオーバーラップする部分をもとにしてつなげたＦｂａＩ−ＰｓｔＩのＤＮＡ断片６６６８ｂｐの配列を配列番号１１に示す。この６６６８ｂｐのＤＮＡ配列と配列番号１０の相同性、及び６６６８ｂｐのＤＮＡをアミノ酸に翻訳した場合の配列と配列番号５に記載してある精製立体特異的アミダーゼのＮ末端アミノ酸配列の相同性より、配列番号２のＤＮＡ配列が本立体特異的アミダーゼをコードするＤＮＡであることが確認された。配列番号１にＤＮＡ配列より予測されるシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼのアミノ酸配列を記載する。
【００６８】
実施例５：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼのアミノ酸配列に相同性をもつタンパク質の検索
配列番号１記載のアミノ酸配列（２７４残基）を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ＢＬＡＳＴ／）により相同性の高い蛋白質を検索した。最もアミノ酸アイデンティティーの高いタンパク質は、シュードモナス　エルギノーサ（ＰＡＯ１株）のＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎ　ＰＡ３５９８であった（アミノ酸アイデンティティー：６５％）。次にアミノ酸アイデンティティーの高いタンパク質は、シノリゾビウム　メリロティ（１０２１株）のＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＣＢＩ登録番号：ＣＡＣ４７０７５）であったが、そのアミノ酸アイデンティティーは３６％であった。
【００６９】
実施例６：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼのＥ．ｃｏｌｉでの発現
ｐＲＴＢ１−ＥｃｏＲを鋳型として、プライマーＲＴＢ−ＦとＲＴＢ−Ｒ（配列番号１２及び１３）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応生成物を精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の酵素で消化したｐＵＣ１９（宝バイオ社製）に連結してｐＲＴＢ１ＥＸを作製後、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に塩化カルシウム法で形質転換した。８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）を得た。
【００７０】
実施例７：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）からの立体選択的アミダーゼ活性を有するタンパク質の精製
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）を８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地２．５Ｌで培養後、遠心分離により約１０．０ｇの菌体を得た。これを０．１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び５．０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕及び遠心分離により無細胞抽出液を得た。これに硫酸アンモニウムを添加し、０〜４０％硫酸アンモニウム飽和画分を得た。さらにこれを０．１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び５．０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（緩衝液Ａ）に溶解・透析後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに吸着させ、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで溶出した。目的の立体アミダーゼ活性を有する画分を集め、緩衝液Ａで透析した。これをＦＰＬＣ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）のＭｏｎｏＱ　ＨＲ１０／１０カラムに供し、０〜５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａの直線濃度勾配法で溶出した。溶出後、活性を含む画分を選択し、脱塩・濃縮し精製標品とした。
【００７１】
実施例８：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼの酵素学的性質
基質としてＮ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドを用いて、実施例７で取得した精製酵素のアミド加水分解反応の至適ｐＨ、及び至適温度、また本酵素の温度耐性や１ｍＭ阻害剤の影響を、加水分解反応により生じるピペラジン−２−カルボン酸をＨＰＬＣで定量することにより行った。反応は３０℃で２０分行い、反応はエタノールの添加により停止し、ＨＰＬＣのサンプルとした。なお、温度耐性を測定するための熱処理は、各温度において５分のインキュベーションを行い、３０℃に調温後その活性を測定した。また阻害剤については、酵素を１ｍＭ阻害剤存在下で３０℃、５分間インキュベートした後、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドを添加し３０℃で２０分間インキュベーションした後、エタノールの添加により反応を停止して下記ＨＰＬＣ条件Ａを用いて生成したピペラジン−２−カルボン酸の定量をした。
【００７２】
ＨＰＬＣ条件Ａ
カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ　ＯＡ−５０００
カラム温度：３０℃
溶離液：２ｍＭＣｕＳＯ４　水溶液
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ吸光度
その結果を以下の表３、表４にまとめた。
【００７３】
【表３】
2004105152.tif 000012
【００７４】
【表４】
2004105152.tif 000013
【００７５】
次に、シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼの基質選択性を検討した。基質化合物は２０ｍＭの濃度で添加し、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、３０℃で酵素反応し、分析は下記ＨＰＬＣ条件Ｂで行った。
ＨＰＬＣ条件Ｂ；
カラム：Ｓｍｉｃｈｉｒａｌ　ＯＡ−５０００、またはＯＡ−５０００Ｌ
カラム温度：３０℃
溶離液：２ｍＭ　ＣｕＳＯ４水溶液
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ吸光度
ピペラジン−２−カルボキサミドに対する活性を１００として、その相対活性を表５に示す。
【００７６】
【表５】
2004105152.tif 000014
【００７７】
シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼ活性は、ピペラジン−２−カルボキサミド、ピペリジン−３−カルボキサミド、及びβ−アラニンアミドに特に強い活性を示し、Ｄ−グルタミンアミドやピペリジン−４−カルボキサミドに弱い活性を示した。また、Ｎ−アルキルアミド化合物に対しても有意な活性を示したが、その他のＬ−あるいはＤ−アミノ酸アミド、ペプチド、脂肪族アミド、芳香族アミド、ニトリルは加水分解されなかった。
【００７８】
実施例９：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼの立体選択性の検討
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）を８０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．５ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養し、菌体を遠心分離により得た。これの湿菌体重量を測定し、２００ｍＭの（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍＬに０．４８％になるよう添加し３０℃で１．１時間反応後エタノールで反応を停止し、ＨＰＬＣ条件Ａにより生成したピペラジン−２−カルボン酸の光学純度を測定した。（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の光学純度は９７．４％ｅ．ｅ．であり、Ｅ値は５９．０であった。
【００７９】
実施例１０：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）を用いた（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドの加水分解反応
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）を８０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．５ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養し、菌体を遠心分離により得た。これの湿菌体重量を測定し、２００ｍＭの（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍＬにそれぞれ０．４％、及び２．０％になるよう添加し３０℃でインキュベートした。一定時間ごとにサンプリングを行い、エタノールで反応を停止後、上記ＨＰＬＣ条件Ａにより生成したピペラジン−２−カルボン酸の定量及び光学純度の測定を行った（図１）。その結果、生成した（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の光学純度はそれぞれ９９．７％及び９９．５％ｅ．ｅ．であった。
【００８０】
実施例１１：シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株の機能未知タンパク質ＰＡ３５９８をコードする遺伝子のクローニング
実施例５で配列番号１記載のアミノ酸配列と最も高いアミノ酸アイデンティティー（６５％）を有することが明らかになったシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株の機能未知タンパク質ＰＡ３５９８をコードするＤＮＡを取得するため、公知の（Ｓｔｏｖｅｒ、Ｃ．Ｋ．ら、〔Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０６（６７９９）：９５９−９６４〕）シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株　のゲノムＤＮＡ配列に基づき、プライマーＰＡＥ１とＰＡＥ２（配列番号１４及び１５）を設計した。これらのプライマーを用いてＡＴＣＣより購入したシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしＰＣＲを行った。本ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動し、０．９６ｋｂｐのＤＮＡをアガロース電気泳動ゲルから抽出精製した。そのＤＮＡの一部をｐＴ７Ｂｌｕｅ
Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングしてプラスミドｐＴＰＡを取得し、Ｌｉ−ｃｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　４０００Ｌを用いて（操作方法は付属のマニュアルインストラクションに従った）挿入断片の塩基配列を決定し（配列番号１６）、得られたＤＮＡ断片が配列番号３に記載のＰＡ３５９８をコードするＤＮＡであることを確認した。
【００８１】
実施例１２：シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株由来ＰＡ３５９８をコードする遺伝子のＥ．ｃｏｌｉでの発現
実施例１１において作製したＰＡ３５９８遺伝子を含むプラスミドｐＴＰＡを鋳型としてプライマーＰＡＥＸ１とＰＡＥＸ２（配列番号１７及び１８）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応生成物を精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の酵素で消化したｐＵＣ１９（宝酒造（株））に連結してプラスミドｐＡＥＸを作製後、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に塩化カルシウム法で形質転換した。８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＡＥＸ）を得た。
【００８２】
実施例１３：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＰＡＥＸ）から立体選択的アミダーゼ活性を有するタンパク質の精製
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＰＡＥＸ）を８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地２．５Ｌで培養後、遠心分離により約１０．０ｇの菌体を得た。これを０．１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び５．０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕及び遠心分離により無細胞抽出液を得た。これに塩化ナトリウムを４　Ｍ濃度になるように加え、４Ｍ　ＮａＣｌ、　０．１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び５．０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラムに通し、素通り画分を集めた。これを０．１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び５．０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（緩衝液Ａ）で透析後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに吸着させ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで溶出した。目的の立体アミダーゼ活性を有する画分を集め、緩衝液Ａで透析した。これをＦＰＬＣ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００　ＨＲ１０／３０カラムに供し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで溶出した。溶出後、活性を含む画分を選択し、脱塩・濃縮し精製標品とした。
【００８３】
実施例１４：シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株由来立体選択的アミダーゼの酵素学的性質
基質として（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを用いて、実施例１３で取得した精製酵素のアミド加水分解反応の至適ｐＨ、及び至適温度、また本酵素の温度耐性や１ｍＭ阻害剤の影響を、加水分解反応により生じるピペラジン−２−カルボン酸をＨＰＬＣで定量することにより行った。反応は３０℃で２０分行い、反応はエタノールの添加により停止し、ＨＰＬＣのサンプルとした。なお、温度耐性を測定するための熱処理は、各温度において５分のインキュベーションを行い、３０℃に調温後その活性を測定した。また阻害剤については、酵素を１ｍＭ阻害剤存在下で３０℃、５分間インキュベートした後、（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを添加し３０℃で２０分間インキュベーションした後、エタノールの添加により反応を停止して下記ＨＰＬＣ条件Ａを用いて生成したピペラジン−２−カルボン酸の定量をした。
その結果を以下の表６、表７にまとめた。
【００８４】
【表６】
2004105152.tif 000015
【００８５】
【表７】
2004105152.tif 000016
【００８６】
実施例１５：シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株由来立体選択的アミダーゼの立体選択性の検討
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＡＥＸ）を８０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．５ｍＭ　ＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養し、菌体を遠心分離により得た。これの湿菌体重量を測定し、２００ｍＭの（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍＬに０．５２％になるよう添加し３０℃で１．１時間反応後エタノールで反応を停止し、ＨＰＬＣ条件Ａにより生成したピペラジン−２−カルボン酸の光学純度を測定した。（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の光学純度は９４．４％ｅ．ｅ．であり、Ｅ値は３０．０であった。
【００８７】
【配列表】
2004105152.tif 000017
2004105152.tif 000018
【００８９】
2004105152.tif 000019
2004105152.tif 000020
2004105152.tif 000021
【００９０】
2004105152.tif 000022
2004105152.tif 000023
【００９１】
2004105152.tif 000024
2004105152.tif 000025
2004105152.tif 000026
【００９２】
2004105152.tif 000027
【００９３】
2004105152.tif 000028
【００９４】
2004105152.tif 000029
【００９５】
2004105152.tif 000030
【００９６】
2004105152.tif 000031
【００９７】
2004105152.tif 000032
【００９８】
2004105152.tif 000033
2004105152.tif 000034
2004105152.tif 000035
2004105152.tif 000036
2004105152.tif 000037
2004105152.tif 000038
【００９９】
2004105152.tif 000039
【０１００】
2004105152.tif 000040
【０１０１】
2004105152.tif 000041
【０１０２】
2004105152.tif 000042
【０１０３】
2004105152.tif 000043
2004105152.tif 000044
2004105152.tif 000045
【０１０４】
2004105152.tif 000046
【０１０５】
2004105152.tif 000047
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）による（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の生成を示す図である。図中、○は（Ｓ）−ピペラジン−２−カルボン酸（０．４％湿菌体）、●は（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸（０．４％湿菌体）、□は（Ｓ）−ピペラジン−２−カルボン酸（２．０％湿菌体）、及び■は（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸（２．０％湿菌体）を示す。（○は□と重なっているため表示されていない。）
【図１】
2004105152.tif 000054