(57)【要約】【課題】　長期保存の利く診断検定法で対照として使用するキットおよび核酸ハイブリッド形成検定用キットを製造する。【解決手段】　無傷の真核細胞を、ジエチルピロカルボネートで処理されてヌクレアーゼを含有していない等張性の水溶液中で凍結乾燥する。その結果、−２０℃で４週間経過後に、前記細胞をゲル電気泳動法で測定した場合、同細胞の１８ＳｒＲＮＡの５０％を超える量が無傷である、診断検定法で対照として使用するためのキットが提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
　ジエチルピロカルボネートで処理されてヌクレアーゼを含有していない等張性の水溶液中で凍結乾燥された真核細胞を含んでなり、
　−２０℃で４週間経過後に、前記細胞をゲル電気泳動法で測定した場合、同細胞の１８ＳｒＲＮＡの５０％を超える量が無傷である
診断検定法で対照として使用するためのキット。
【請求項２】
　請求項１に記載のキットにおいて、
　前記細胞がＲＮＡウイルスに感染している
ことを特徴とするキット。
【請求項３】
　請求項１に記載のキットにおいて、
　前記細胞がリンパ球である
ことを特徴とするキット。
【請求項４】
　ジエチルピロカルボネートで処理されてヌクレアーゼを含有していない等張性の水溶液中で凍結乾燥された真核細胞を含んでなり、
　−２０℃で４週間経過後に、前記細胞をゲル電気泳動法で測定した場合、同細胞の１８ＳｒＲＮＡの５０％を超える量が無傷である
核酸ハイブリッド形成検定用キット。
【請求項５】
　請求項４に記載のキットにおいて、
　前記細胞がヒトの細胞である
ことを特徴とするキット。
【請求項６】
　請求項４に記載のキットにおいて、
　さらに、公知の標的核酸とハイブリッドを形成するよう選択された、細胞を含有していない核酸を含んでなる
ことを特徴とするキット。
【請求項７】
　請求項４に記載のキットにおいて、
　さらに、少なくとも一つの増幅プライマー対を含んでなる
ことを特徴とするキット。
【請求項８】
　請求項４に記載のキットにおいて、
　さらに、標識された核酸を含んでなる
ことを特徴とするキット。
【請求項９】
　請求項４に記載のキットにおいて、
　前記核酸ハイブリッド形成検定が増幅ベースの検定法である
ことを特徴とするキット。
【請求項１０】
　請求項９に記載のキットにおいて、
　前記増幅ベースの検定法が、リガーゼ連鎖反応ベースの検定法またはポリメラーゼ連鎖反応ベースの検定法である
ことを特徴とするキット。
【請求項１１】
　請求項４に記載のキットにおいて、
　前記核酸ハイブリッド形成検定が、凍結乾燥された細胞から抽出されたＲＮＡを使用する
ことを特徴とするキット。
【請求項１２】
　請求項１１に記載のキットにおいて、
　さらに、逆転写酵素を含んでなる
ことを特徴とするキット。
【請求項１３】
　請求項１１に記載のキットにおいて、
　前記ＲＮＡが、検定試験中に相補的ＤＮＡに転写される
ことを特徴とするキット。
【請求項１４】
　請求項４に記載のキットにおいて、
　さらに、前記細胞が中に入っていて、その細胞が大気の水分と接触するのを防止するため密閉されているバイアルびんを含んでなる
ことを特徴とするキット。
【請求項１５】
　請求項４に記載のキットにおいて、
　前記細胞がＲＮＡウイルスに感染している
ことを特徴とするキット。
【請求項１６】
　請求項４に記載のキットにおいて、
　前記細胞がリンパ球である
ことを特徴とするキット。
【請求項１７】
　無傷の真核細胞を、ジエチルピロカルボネートで処理されてヌクレアーゼを含有していない等張性の水溶液中で凍結乾燥するステップ含んでなり、
　その結果、−２０℃で４週間経過後に、前記細胞をゲル電気泳動法で測定した場合、同細胞の１８ＳｒＲＮＡの５０％を超える量が無傷である、診断検定法で対照として使用するためのキットを製造する方法。
【請求項１８】
　請求項１７に記載の製造方法において、
　前記細胞がＲＮＡウイルスに感染している
ことを特徴とする方法。
【請求項１９】
　請求項１７に記載の製造方法において、
　前記細胞がリンパ球である
ことを特徴とする方法。
【請求項２０】
　無傷の真核細胞を、ジエチルピロカルボネートで処理されてヌクレアーゼを含有していない等張性の水溶液中で凍結乾燥するステップを含んでなり、
　その結果、−２０℃で４週間経過後に、前記細胞をゲル電気泳動法で測定した場合、同細胞の１８ＳｒＲＮＡの５０％を超える量が無傷である、核酸ハイブリッド形成検定用キットを製造する方法。
【請求項２１】
　請求項２０に記載の製造方法において、
　前記細胞がヒトの細胞である
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
　請求項２０に記載の製造方法において、
　前記検定用キットが、さらに、公知の標的核酸とハイブリッドを形成するよう選択された、細胞を含有していない核酸を含んでなる
ことを特徴とする方法。
【請求項２３】
　請求項２０に記載の製造方法において、
　前記検定用キットが、さらに、少なくとも一つの増幅プライマー対を含んでなる
ことを特徴とする方法。
【請求項２４】
　請求項２０に記載の製造方法において、
　前記検定用キットが、さらに、標識された核酸を含んでなる
ことを特徴とする方法。
【請求項２５】
　請求項２０に記載の製造方法において、
　前記核酸ハイブリッド形成検定が増幅ベースの検定法である
ことを特徴とする方法。
【請求項２６】
　請求項２５に記載の製造方法において、
　前記増幅ベースの検定法が、リガーゼ連鎖反応ベースの検定法またはポリメラーゼ連鎖反応ベースの検定法である
ことを特徴とする方法。
【請求項２７】
　請求項２０に記載の製造方法において、
　前記核酸ハイブリッド形成検定が、凍結乾燥された細胞から抽出されたＲＮＡを使用する
ことを特徴とする方法。
【請求項２８】
　請求項２７に記載の製造方法において、
　前記検定用キットが、さらに、逆転写酵素を含んでなる
ことを特徴とする方法。
【請求項２９】
　請求項２７に記載の製造方法において、
　前記ＲＮＡが、検定試験中に相補的ＤＮＡに転写されるものである
ことを特徴とする方法。
【請求項３０】
　請求項２０に記載の製造方法において、
　前記検定用キットが、さらに、前記細胞が中に入っていて、その細胞が大気の水分と接触するのを防止するため密閉されているバイアルびんを含んでなる
ことを特徴とする方法。
【請求項３１】
　請求項２０に記載の製造方法において、
　前記細胞がＲＮＡウイルスに感染している
ことを特徴とする方法。
【請求項３２】
　請求項２０に記載の製造方法において、
　前記細胞がリンパ球である
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、真核細胞を凍結乾燥し、その細胞から無傷の核酸を単離することにより製造する、診断検定法で対照として使用するキットおよび核酸ハイブリッド形成検定用キット並びにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　ウイルス、生物活性分子および細菌を凍結乾燥する、すなわち「フリーズドライ」する方法は、研究室で日常的に利用されている。一般に、凍結乾燥される細胞または分子は、凍結処理の後、所望の活性を回復できる溶液中に懸濁される。凍結乾燥溶液用の理想的な製剤は、凍結乾燥を行う前の限定された期間、安定化する環境を提供し、凍結乾燥中は優れた熱特性と凍結特性を提供し、かつ所望の活性を極低温に対して保護しなければならない。
【０００３】
　従来の凍結乾燥法は、真核細胞のタンパク質の保存および細菌の保存を行うのに糖類を使用することに主として集中していた。例えば、細菌の細胞を凍結乾燥するのに使用する溶液の主成分は濃度が５〜１０％の糖であり、この糖は前記細胞を安定化するために用いられている（Greaves著、「Fundamental Aspects of Freeze-drying Bacterial and Living Cells」、Aspects Theoriques et Industriels de la Lyophilisation、４０７〜４１０頁（Rey編、１９６４年）。しかし、核酸特にＲＮＡを保存するのに有効な真核細胞凍結乾燥法はまだ確立されていない。真核細胞の等張凍結乾燥製剤中にラクトースなどの糖を含有させると、核酸は、凍結乾燥細胞から高収率で単離されなかった。低濃度のメタノールまたはエタノールなどの保存剤を凍結乾燥溶液に含有させると、凍結乾燥後、無傷の核酸を単離するのにやはり効果的でないことが見出された。
【０００４】
　真核細胞由来の核酸を長期間保存する方法が、疾患の診断および法医学に対して分子生物学の方法を利用するために要望されている。かような検定法では、標準供給源由来の陽性および陰性の対照（positive and negative control）が特に有用である。以前の患者由来の臨床試料および公知の遺伝子型を有する細胞系が、検査の対照細胞の供給源として使用されることが多い。しかし、患者由来の臨床試料は、一般に、限定された量しか入手できない、培養細胞系は対照細胞の便利な供給源であるが、新たに培養された細胞を各検定毎に用いることは、培養細胞の増殖と維持のために時間、経費および労力が必要であるため問題がある。
【非特許文献１】Greaves著、「Fundamental Aspects of Freeze-drying Bacterial and Living Cells」、Aspects Theoriques et Industriels de la Lyophilisation、４０７〜４１０頁（Rey編、１９６４年
【非特許文献２】Singleton他、Dictionary of Microbiology and Molecμｌar Biology（第二版、１９９４年）
【非特許文献３】The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker編、１９８８年）
【非特許文献４】Hale &Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology（１９９年）
【非特許文献５】Blackburn, J. Biol. Chem.、２５４巻、１２４８４頁（１９７０年）
【非特許文献６】Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）（１９８９年）
【非特許文献７】Ausubel他、Current Protocols in Molecular Biology（１９８７年）
【非特許文献８】Freshney, Culture of Animal Cells（３版、１９９４年）
【非特許文献９】GibcoBRL/Life Technologies Catalogue and Reference Guide
【非特許文献１０】Jennings,IVD Technology、３巻、３８〜４９頁（１９９７年）
【非特許文献１１】Connors他、Chemical Stability of Pharmaceuticals, A handbook for Pharmacists
【非特許文献１２】Farrell, RNA Methodologies（１９９３年）
【非特許文献１３】Chomczynski, Biotechniques、１５巻、５３２〜５３５頁（１９９３年）
【非特許文献１４】Castillo他、Digestion、４８巻、１４９〜１５６頁（１９９１年）
【非特許文献１５】Faulkner-Jones他、J. Virol. Methods、４１巻、２７７〜２９６頁（１９９３年）
【非特許文献１６】Meyer他、Mol. Cell. Probes、８巻、２６１〜２７１頁（１９９４年）
【非特許文献１７】Mary他、J.Virol. Methods、４９巻、９〜２３頁（１９９４年）
【非特許文献１８】McPherson, J. Clin. Lab. Anal.、８巻、３６９〜３７７頁（１９９４年）
【非特許文献１９】Dante他、Lab. Invest.、７１巻、１８８〜１９２頁（１９９４年）
【非特許文献２０】Budowle他、J. Forensic Sci.、４０巻、３８〜４４頁（１９９５年）
【非特許文献２１】Kasi他、J. Forensic Sci.、３５巻、１１９６〜１２００頁（１９９１年）。
【非特許文献２２】PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification、Erlich編（１９８９年）
【非特許文献２３】PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, Gelfland, Sninsky & White編（１９９０年）
【非特許文献２４】Mattila他、NucleicAcids Res.、１９巻、４９６７頁（１９９１年）
【非特許文献２５】Eckert & Kunkel, PCR Methods and Applications、１巻、１７頁（１９９１年）
【非特許文献２６】Wallace他、Ligase Chain Reaction, in Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations、３０７〜３２２頁、Pfiefer編（１９９６年）
【非特許文献２７】Rowley, Nature、２４３巻、２９０〜２９３頁（１９７３年）
【非特許文献２８】Shtivelman他、Nature、３１５巻、５５０〜５５４頁（１９８５年）
【非特許文献２９】Kawasaki他、PNAS USA、８５巻、５６９８〜５７０２頁（１９８８年）
【非特許文献３０】Lee他、PCR Methodsand Applications、４巻、２８３〜２８７頁（１９９５年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　したがって、この発明は、ヌクレアーゼを含有せず真核細胞用の凍結乾燥溶液として使用され、該細胞から無傷のＤＮＡおよびＲＮＡを単離できる等張溶液を提供するものである。この発明は、真核細胞由来の核酸を長期間にわたって貯蔵し保存するのに有用な方法を提供し、その方法を利用して、診断検定法および法医学検定法などの検定法に対照として使用する標準の核酸試料を含む検定用キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　一態様において、この発明は、真核細胞内に含有されている核酸を長期間保存する方法であって、（１）無傷の真核細胞の水溶液であって、該細胞に対して等張性でありヌクレアーゼを含有していない水溶液を凍結乾燥し、（２）凍結乾燥された細胞を大気水分との接触を防止するのに十分な密閉条件下にて維持する工程からなる方法を提供する。
【０００７】
　また、一実施態様では、前記水溶液がジエチルピロカルボネートで処理され、他の実施態様では、前記水溶液が０．８〜１．０ｗ／ｖ％の濃度の塩化ナトリウムを含有している。その他の実施態様では、前記水溶液が標準のリン酸緩衝食塩水を含有している。さらに他の実施態様では、前記溶液のｐＨは６．８〜８．２である。
【０００８】
　一実施態様では、前記真核細胞が哺乳類の細胞である。他の実施態様では、前記細胞がヒトの細胞である。さらに別の実施態様では、前記細胞がリンパ球である。さらに別の実施態様では、前記細胞が、ＲＮＡウイルスに感染した細胞である。さらに別の実施態様では、前記細胞は培養してから凍結乾燥される。
【０００９】
　他の実施態様で、この発明は、凍結乾燥された細胞から無傷の核酸を単離する方法であって、（１）生きている真核細胞の水溶液であって、該細胞に対して等張性でありヌクレアーゼを含有していない水溶液を凍結乾燥し、（２）凍結乾燥された細胞を密閉条件下にて少なくとも３０日間維持し、（３）その細胞を開放し、（４）その細胞タンパク質を変性させて無傷の核酸と変性された細胞タンパク質の混合物を生成させ、（５）前記細胞が生き返ることがない条件下にて変性された細胞タンパク質と核酸の混合物から無傷の核酸を単離する工程からなる方法を提供するものである。
【００１０】
　一実施態様では、単離される核酸がリボ核酸である。他の実施態様では、前記細胞がリンパ球である。
【００１１】
　また、この発明は、−２０℃で４週間後の細胞が電気泳動法で測定した場合その１８ＳｒＲＮＡの５０％以上が無傷である、診断検定法で対照として使用する凍結乾燥真核細胞を含んでいる検定用キット（標準化密閉バイアルびんのコレクション）を提供するものである。　一実施態様では、前記細胞がリンパ球である。他の実施態様では、前記細胞がＲＮＡウイルスに感染した細胞である。さらに別の実施態様では、前記検定用キットがＲＮＡの分解を減少させるのに有効な量のＲＮアーゼ阻害剤を含んでいる。
【００１２】
　他の態様では、この発明は、凍結乾燥された真核細胞を有している核酸ハイブリッド形成キットを提供するものである。
【００１３】
　一実施態様では、前記細胞がヒトの細胞である。他の実施態様では、前記細胞がリンパ球である。さらに他の実施態様では、前記細胞がＲＮＡウイルスに感染した細胞である。
【００１４】
　他の実施態様では、上記のキットが、公知の標的核酸とハイブリッドを形成させるために選択された細胞を含有しない核酸を有している。他の実施態様では、上記キットが、標識核酸を有している。さらに、他の実施態様では、核酸ハイブリッド形成検定法が凍結乾燥された細胞から抽出したＲＮＡを使用する。
【００１５】
　他の実施態様では、核酸ハイブリッド形成検定法が増幅に基づいた検定法である。さらに他の実施態様では、増幅に基づいた検定法が、リガーゼ連鎖反応に基づいた検定法又はポリメラーゼ連鎖反応に基づいた検定法である。さらに他の実施態様では、上記キットが、少なくとも一つのＰＣＲプライマー対を含んでいる。他の実施態様では、上記キットが、逆転写酵素を含んでいる。さらに他の実施態様では、uＲＮＡが検定中に相補的ＤＮＡに転写される。
【００１６】
　他の実施態様では、上記キットが、細胞を含んでいるバイアルびんであって、同バイアルびんが大気の水分に細胞が接触しないように密閉されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
　Ｉ．諸言
　この発明は、診断用キットに用いる凍結乾燥細胞の核酸の安定な製剤を提供するものである。細胞が等張溶液中で凍結乾燥されると、報告によれば、細胞膜が等張溶液内ではその無傷性(integrity)を維持するので、核酸は、全てのヌクレアーゼから保護されると予想される。我々は、従来技術の等張溶液を用いて凍結乾燥された細胞中で、核酸が迅速に分解することを発見した。予想に反して、内因性細胞ヌクレアーゼ類が顕著ではないが細胞の核酸を分解している。我々は、驚くべきことには、等張溶液を使用しているにもかかわらず、細胞が、短時間の低温凍結乾燥操作の直前または該操作中、外因性ヌクレアーゼ類に対して透過性になることを発見したのである。凍結乾燥緩衝液中の外因性ヌクレアーゼ類のこの問題は、ヌクレアーゼを含有していない凍結乾燥を使用することで解決した。
【００１８】
　病理学者らは、癌、遺伝病、および感染症等の診断を助成するため、分子生物学的方法を使うことが多い。その上、法医学の技術分野の研究者達も、犯罪の研究および父系の決定のためにＤＮＡプローブ分子分析法を使用している。この分子分析法は、真核細胞からＤＮＡまたはＲＮＡを単離し、一般に、続いて増幅させゲル電気泳動法にかける形をとることが多い。これらの試験の主な問題点は、陽性および陰性の核酸対照用の標準細胞供給源がないことである。この発明は、診断分析法と法医学分析法で対照として用いる凍結乾燥真核細胞を提供するものである。これらの細胞はヌクレアーゼを含有していない等張溶液内で凍結乾燥される。何故ならば、その溶液が、ヌクレアーゼ阻害剤で処理されているからであり、或いはヌクレアーゼ阻害剤を含んでいるからである。この凍結乾燥法は、細胞の長期間貯蔵方法を提供し、その細胞から無傷の核酸を単離して、例えば分子生物学の検定法の対照として使用できる。
【００１９】
　ＩＩ．諸定義
　特に規定しない限り、この明細書で使用される技術用語と科学用語は、全て、この発明の属する技術分野の当業者が共通して理解している意味をもっている。以下の参考文献は、当業技術者に、この発明に用いられる多数の用語の一般的定義を提供している。すなわち、Singleton他、Dictionary of Microbiology and Molecμｌar Biology（第二版、１９９４年）、The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker編、１９８８年）、およびHale &Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology（１９９年）である。この明細書に記載されているのと類似または均等の方法と材料はこの発明の試験に利用できるが、好ましい方法と材料が記載されている。この明細書で使用される場合、以下の用語は、特に規定しない限り、それら用語に与えられた意味をもっている。
【００２０】
　「長期間の保存」は、核酸が、２５℃またはそれ以下で貯蔵されたとき、約１ヶ月以上の期間にわたって、比較的分解せずに無傷であるように、凍結乾燥された細胞を貯蔵することを意味する。
【００２１】
　「凍結乾燥」は、溶液を凍結し乾燥する方法を意味する。
【００２２】
　「等張」溶液は、例えば生きている細胞のような基準細胞と同じ水ポテンシャル（浸透ポテンシャルと圧力ポテンシャルの合計）を有する溶液を意味する。従って、基準細胞がその溶液内にあるとき一般に基準細胞の含水量に正味の増減がなく、かつ基準細胞の細胞膜はその無傷性を保持している。
【００２３】
　「密閉条件」は、大気中の水分との接触を避けるため、容器を閉じることを意味する。
【００２４】
　「標準のリン酸緩衝食塩水」は、リン酸塩で緩衝された食塩水の化学的に許容できる配合物を意味し、市販配合物と研究室の処方で製造される配合物がある。
【００２５】
　「培養」細胞は、生体外(ex vivo)で増殖される細胞を意味する。
【００２６】
　「無傷の核酸」は、実質的に分解されていない核酸を意味する。　「ヌクレアーゼを含有しない」溶液は、ヌクレアーゼを実質的に含有していない溶液を意味し、細胞をその溶液に再懸濁し凍結乾燥した後、その細胞から無傷の核酸を回収することができる。ヌクレアーゼを含有しない溶液は、市販のヌクレアーゼを含有しない薬剤を用いるか、または凍結乾燥のために使用する溶液を、特異的もしくは非特異的ヌクレアーゼ阻害剤である化合物もしくは方法で処理することによって得ることができる。非特異的ヌクレアーゼ阻害剤としては、例えば、酵素を不活性化するジエチルピロカルボネートによる溶液の処理；またはグアニジンイソチオシアネートもしくはドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）等のタンパク質を変性するカオトロピック剤の添加がある。特異的ヌクレアーゼ阻害剤としては、胎盤ＲＮアーゼ阻害剤酵素（placental RNase inhinitor enzyme）などのＲＮアーゼ阻害剤（Blackburn, J. Biol. Chem.、２５４巻、１２４８４頁、１９７０年）およびバナジル−リボヌクレオシド複合体がある。
【００２７】
　新しい（凍結乾燥されていない）対照細胞から単離されたＲＮＡと凍結乾燥された細胞から単離されたＲＮＡを比較することによって、溶液はヌクレアーゼなしと定義される。対照細胞および凍結乾燥された細胞由来のＲＮＡは、同じ方法で単離される。対照細胞は、ＲＮＡ単離緩衝液中に直接、再懸濁させて、凍結乾燥溶液に接触させない。凍結乾燥細胞由来の２８Ｓと１８ＳのｒＲＮＡの無傷性および全ＲＮＡの収率が、対照細胞由来のＲＮＡの無傷性と収率の９０％以内であれば、その溶液はヌクレアーゼを含有していないとみなされる。培養細胞および血液などの組織試料の場合、対照細胞は一般に、低速度遠心分離法を用いて培地からペレット化し、次にＲＮＡ単離緩衝液中に直接、再懸濁させる。組織試料の場合、新たに単離した組織をＲＮＡ単離緩衝液中に直接再懸濁させる。
【００２８】
　「核酸」は、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、類縁の天然産生構造変異体、およびその合成の非天然産生類似体）からなるポリマー；類縁の天然産生構造変異体；およびその合成の非天然産生類似体を意味する。これらのポリマーは一本鎖型もしくは二本鎖型でもよい。したがって、この用語には、ヌクレオチドおよびヌクレオチド間の結合が非天然産生の合成類似体を含んでいるヌクレオチドポリマーが含まれている。このようなポリヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用して合成することができる。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子でコードされているｍＲＮＡと相互に交換して使用される。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合、「Ｔ」を「Ｕ」で代替するＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むものとする。
【００２９】
　標的核酸と「ハイブリッドを形成させる」ために選択された核酸は、その標的配列が全細胞ＤＮＡもしくはＲＮＡの製剤中に存在している場合、その特定の標的のＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列とのみハイブリッドを形成するか、二重になる（deplex）か、または結合する。
【００３０】
　「相補的」核酸配列または「標的」核酸配列は、核酸プローブと選択的にハイブリッドを形成する核酸配列を意味する。適正なアニーリング条件は、例えば、プローブの長さ、塩基組成およびプローブのミスマッチの数とその位置によって決まり、試験によって決定しなければならないことが多い「核酸プローブの設計とアニーリング条件を考察する場合は、例えば、Sambrook他「Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）（１９８９年）、Ausubel他、Current Protocols in Molecular Biology（１９８７年）を参照のこと。
【００３１】
　「増幅」プライマーは、標的核酸配列を増幅する場合の基礎として働く天然ヌクレオチドまたは類似ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドである。これらのプライマーとしては、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとリガーゼ連鎖反応のオリゴヌクレオチドの両方がある。増幅に基づいた検定法または反応の例としては、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応がある。
【００３２】
　「標識する」は、検出可能な指標、例えば放射性標識ヌクレオチドまたはアビジンもしくはストレプタビジンに結合するビオチニル部分のようなリガンドの組込みを意味する。標識の例としては、制限はないが、以下のもの、すなわち放射線同位元素（例えば3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ）、蛍光もしくは燐光の標識（例えばＦＩＴＣ、ローダミン）、酵素の標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ（性）ホスフアターゼ）、ビオチニル基およびエピトープがある。いくつかの実施態様において、標識は、例えば、可能性がある立体障害を減らすため、各種の長さのスペーサーアームによって結合されている。
【００３３】
　ＩＩＩ．真核細胞と細胞培養物
　この発明の方法は、診断検定法および法医学検定法において陽性および陰性の対照として一般に用いるため、核酸が単離される真核細胞を提供するのに利用される。生体内から取り出された細胞および生体内で培養された細胞を含む適切な真核細胞を、この方法を使用して凍結乾燥することができる。その細胞はヒトの細胞が好ましい。生体内組織由来の一次細胞(primary cell)としては腫瘤細胞、造血細胞、筋肉細胞、肝細胞および皮膚細胞がある。好ましく一次細胞のタイプとしては、癌細胞、造血細胞（例えば、リンバ球）およびウイルスに感染した細胞がある。生体内の組織由来の一次細胞は、標準の方法、例えば、生検、解剖、吸引、静脈穿刺および掻爬によって単離される。
【００３４】
　培養細胞は、一次移植片、例えばマウスの胎仔、鶏の胎仔、ニューロン、星状細胞、造血細胞、角質細胞および繊維芽細胞のような皮膚細胞、肝細胞、筋肉細胞、腫瘤細胞から取り出すことができる。培養細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＳＡＭ−１細胞、Ｄｒ１１細胞、ＢＡＬＢ／ｃ細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞繊維芽細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢＨＫ−２１細胞などの株化細胞系からも得られる。培養細胞は、ＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスに感染させてもよい。好ましい培養細胞タイプとしては、リンパ球細胞系、ウイルス感染した細胞、および腫瘤由来細胞系がある。一次細胞の移植片培養物は、培養細胞系と同様に標準法によって得られ、培養される（例えば、Freshney, Culture of Animal Cells（３版、１９９４年）；Ausubel他、前掲文献の付録３Ｆ参照）。
【００３５】
　細胞を培養する環境としては、細胞増殖用の基体、気相、培地および温度などの因子が考慮される。細胞増殖に用いる基体は、細胞が増殖する方式、例えば、基体に付着させて行う（単層培養）とか、アガロースのような半固体培地内で行うとか或いは液体内で行う（懸濁培養）ことによって変化する。基体に付着して増殖する細胞の場合、一般にプラスチック製の皿またはフラスコが用いられる。ガラスおよび金属などで製造された他の人工の基体も使用できる。基体は、エッチングによって、またはコラーゲン、コンドロネクチン、フィブロネクチンおよびラミニン等の物質でコーティングすることによって処理することが多い。細胞フィーダー層（cell feeder layer）と微細な細管（microcapillary）も使用される。基体に付着させる必要がない非接着性細胞の場合、細胞は寒天中にプレートされるかまたは循環培地「スピナー培養物（spinner culture）」中で増殖することができる。培養容器のタイプは、例えば、多数のウエルプレート、ペトリ皿、組織培養管、フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアおよびスピナーボトル等の培養条件に依存する。細胞は、細胞タイプに基づいて試験で決定される密度で増殖させる。例えば、ＨｅＬａのような細胞系の一般的な細胞密度は、培地１ｍｌ当たり１×１０5細胞〜１０×１０5細胞の範囲内で変化する。
【００３６】
　気相の重要な成分は酸素と二酸化炭素である。大部分の細胞培養物に対して、一般に大気酸素の圧力が利用されるが、いくつかの培養物は大気酸素より高いかまたは低い酸素圧力を必要とする。培養容器は、大気透過性キャップを用いることによって或いは培養容器を密閉しないようにすることによって、インキュベーターの大気と通気させて気体交換を行えるようになっている。二酸化炭素は、細胞培地中の緩衝剤とともにｐＨを安定化する役割を果しており、一般に、インキュベーター内に１〜１０％の濃度で存在している。　　　　
【００３７】
　培養細胞は、適切な温度、例えばその細胞が得られた動物の体温を、領域によって温度が変化することを理解しながら（皮膚細胞は僅かに低い温度を好む）もたらすインキュベーター内で通常増殖される。一般に、３７℃が細胞培養に好ましい温度である。大部分のインキュベーターは、ほぼ大気の条件まで加湿される。
【００３８】
　細胞の規定培地は、包装された、予め混合された粉末または予め減菌した溶液として入手できる。通常用いられる培地の例としては、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、およびマッコイの培地（McCoy's Medium）がある（例えば、GibcoBRL/Life Technologies Catalogue and Reference Guide 参照）。細胞の規定培養培地は、５〜２０％の血清、例えば馬、仔ウシおよびウシ胎仔の血清を補充される場合が多い。この培地は通常緩衝されて、細胞を６．８〜８．２の範囲、好ましくは７．４のｐＨに維持する。この培地に対する他の補充物としては、例えば、抗生物質類、アミノ酸類、糖類および成長因子類がある。
【００３９】
　ＩＶ．凍結乾燥の手順
　細胞を単離するか又は培養して増殖させた後、凍結乾燥の準備を行う。接着性細胞は、トリプシン処理などの標準の方法を利用して培養基体から取り外す。基体から取り外されたか又は懸濁培養中の細胞を、低速遠心分離を利用してペレット化し、次いで標準の方法によって凍結乾燥溶液中に再懸濁させる。細胞は、約１×１０4〜１×１０9細胞／ｍｌの濃度で、好ましくは約１×１０6〜１×１０7細胞／ｍｌの濃度で凍結乾燥溶液中に再懸濁される。
【００４０】
　細胞は、ヌクレアーゼを含有していない等張凍結乾燥溶液中に再懸濁される。ヌクレアーゼとＲＮアーゼに対する阻害剤としては、例えば、ジエチルピロカルボネート（「ＤＥＰＣ」）、胎盤ＲＮアーゼ阻害剤酵素（Blackburn, J. Biol. Chem.、２５４巻、１２４８４頁、１９７０年）、タンパク質類を変性するカオトロピック剤、バナジル−リボヌクレオシド複合体またはマカロイド（macaloid）のようなクレーで溶液を処理する方法がある。好ましいヌクレアーゼ阻害剤は、凍結乾燥溶液をＤＥＰＣで処理することである。一般に、容器中の凍結乾燥溶液に０．０５〜０．１％ｖ／ｖのＤＥＰＣを添加し次に容器を密閉して室温にて、４時間〜一夜、振盪することによってＤＥＰＣで処理した凍結乾燥溶液が製造される。次に、その溶液は標準の条件によってオートクレーブで処理され冷却される。ＤＥＰＣで処理した水はＴＲＩＳを含有する溶液を作るのに使用できる。何故ならば、ＤＥＰＣはＴＲＩＳと反応するからである。胎盤ＲＮアーゼ阻害剤酵素は、製造メーカーが提案する濃度、例えば２５０〜５００単位／ｍｌ溶液で使用される。バナジル−リボヌクレオシド複合体は製造メーカーが提案する濃度で添加される。
【００４１】
　上記凍結乾燥溶液は、核酸の単離に用いる方法と薬剤に一般に適合する等張溶液である。リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）およびＴＲＩＳ緩衝食塩水（「ＴＢＳ」）などの等張再懸濁溶液が凍結乾燥溶液の例である。これら等張溶液は、一般にｐＨが６．８〜８．３の範囲内、好ましくは７．２〜７．４の範囲内である。これら等張溶液は、一般にＮａＣｌの濃度が約０．１〜０．２の範囲内すなわち約０．８〜１．０％ｗ／ｖの範囲内である。ＮａＣｌの濃度は、好ましくは０．１５Ｍすなわち０．９％ｗ／ｖである。
【００４２】
　好ましい凍結乾燥溶液は、１ｘＰＢＳである。１ｘＰＢＳの標準の配合物としては、市販の溶液または標準の研究室の処方で作製した溶液を利用できる。１ｘＰＢＳは、一般にＮａＣｌとリン酸イオンを含有し、そのｐＨは６．８〜８．３、好ましくは７．２〜７．４である。ＮａＣｌの濃度は一般に０．１〜０．２Ｍすなわち０．８〜１．０％ｗ／ｖの範囲内である。１ｘＰＢＳは、塩化ナトリウム、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムに加えて、約１０〜４０ｍＭリン酸塩の範囲内で、一塩基リン酸カリウム、一塩基もしくは二塩基のリン酸ナトリウムおよび他のリン酸塩を含有してもよい。また、１ｘＰＢＳは、ピルビン酸ナトリウムのような追加の成分を含有してもよい（例えば、GibroBRL/Life Technologies Product and Reference Guide; Ausubel他の前掲文献；Sambrook他の前掲文献参照）。１ｘＰＢＳの一つの配合物は、０．１５ＭのＮａＣｌ（０．９％ｗ／ｖ）と４ｍＭのリン酸イオンを７．２〜７．４のｐＨにて含有している。他の１ＸＰＢＳは、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、４．３ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１．４ｍＭのＫＨ2ＰＯ4を７．３のｐＨで含有している（Ausual他の前掲文献）。
【００４３】
　他の適切な等張凍結乾燥溶液はＴＢＳである。ＴＢＳの一配合物は、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．５ＭｇＣｌ2、２５ｍＭのＴＲＩＳ塩基、０．７ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、および０．９ｍＭのＣａＣｌ2を含有している。このような溶液は市場で入手可能であり、粉末の形態で、または予め混合された減菌溶液として販売されている。細胞を適当な凍結乾燥溶液中に再懸濁させたならば、同細胞を約１００μｌ〜１ｍｌづつ適切なバイアルびんに分取する。好ましくは、一凍結乾燥バイアルびん当たり、溶液中の細胞１００〜５００μｌを分取する。凍結乾燥容器の大きさと試験の要求に応じて、細胞は分取量を増減して使用される。この場合、凍結乾燥バイアルびんはヌクレアーゼなしでかつ減菌される。一般に、減菌オートクレーブ処理がなされたガラス製またはプラスチック製のバイアルびんが使用されるが、ガラス製のバイアルびんが好ましい。これらのバイアルびんは、細胞の試料が大気中の水分と接触するのを避けるために、密閉できるキャップ又は蓋を備えている。適切なキャップの例は、凍結乾燥が完了した後、金属リング付き端縁のまわりに圧着されるプラスチック製の蓋である。
【００４４】
　細胞は、一般に、市販の自動凍結乾燥器を使って凍結乾燥されるが、より小型の非自動式凍結乾燥器も使用できる。細胞は、凍結乾燥溶液中に再懸濁させた後、迅速に凍結させ、次いで−２０℃以下、好ましくは−４０℃の温度で凍結乾燥する。凍結乾燥の条件は、機械、凍結乾燥溶液の容積、およびバイアルびんのタイプに応じて、標準の手順で実験することによって決定される（例えば、Jennings,IVD Technology、３巻、３８〜４９頁、１９９７年参照）。一般に、試料は、乾燥するまで約４〜４８時間、一般に１２〜２４時間、凍結乾燥される。凍結乾燥は一般に約１００ミクロン（ミリトル）〜２００ミクロンの範囲内の圧力の減圧下で行われる。凍結乾燥手順の温度は、一般に約−２０℃〜−４０℃で出発し、次いで凍結乾燥工程中に約室温まで徐々に上昇する。
【００４５】
　細胞は、凍結乾燥を行った後、約２５℃〜約−７０℃の温度で貯蔵する。好ましくは、凍結乾燥された細胞は約−２０℃以下で貯蔵される。貯蔵温度は、リアルタイムテスト（real time test）および応力負荷安定性試験（stressed stability test）を用いる標準方法によって決定される。応力負荷安定性すなわち加速安定性の試験は、貯蔵寿命を予備決定するために行う試験であり、一般に、続いて行うリアルタイム安定性試験で確定される。この試験は、高温で試料に応力をかけて薬剤の安定性を監視することによって行われる。次に、通常用いられるアレニウスのモデルのような適当なモデルを使って計算を行い、高温時の安定性と、承認された貯蔵温度で予想される安定性との関連づけを行う。
【００４６】
　分解の動力学に関するアレニウスの式は、関係式：Ｋ2＝Ｃｅ-Ea/RT（式中、Ｃは衝突因子であり、Ｒ＝１．９８７２であり、Ｅａは活性化エネルギーであり（標準推定値２０Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｔは温度であり、Ｋは遅延時間である）に従って起こる反応の速度定数を規定する。擬一次速度（pseudo first order rate）の場合、上記速度はｄ[ａ]／ｄｔ＝Ｋ[Ａ]或いはｅ(Ea/RT2ーEa/RT1)＝ｔ２／ｔ１である。この計算によれば、２５℃で１日間の貯蔵は、−２０℃で１年間の貯蔵にほぼ等しい（例えば、Connors他、Chemical Stability of Pharmaceuticals, A handbook for Pharmacists、１９７９年参照）。
【００４７】
　Ｖ．核酸の単離
　選択した真核細胞を凍結乾燥して貯蔵した後、同真核細胞が無傷の核酸を単離するのに使用される。前記細胞から単離したＤＮＡとＲＮＡは、診断検定法と法医学検定法に用いる陽性の対照と陰性の対照を提供することを含む適切な分子生物学の用途に使用することができる。上記核酸は変異した遺伝子または転写産物のために陽性または陰性の対照として使用することができる。また、上記核酸は、プロウイルス、エピソーマルゲノム、ＤＮＡもしくはＲＮＡのゲノムおよびウイルスゲノムからの転写産物の存在に対する陽性もしくは陰性の対照としても役立つ。また、上記核酸は、異なる形態のウイルスゲノム間、例えば組み込まれたプロウイルスとエピソーマルゲノムの間、ＤＮＡかまたはＲＮＡかを識別するのにも使用できる。さらに、上記核酸は、両方の遺伝子および／またはそれらの転写産物に対する対照として使用してこれら二つを識別できる。
【００４８】
　幾多の試薬が、凍結乾燥された細胞から無傷のＲＮＡを単離するのに役立つ。これらの試薬はそれぞれ細胞を溶解し、それに伴い、ＲＮＡ単離操作中、ヌクレアーゼの活性を最小限にするか或いは除去する。これら試薬としては、例えばグアニジン塩酸、グアニジンイソチオシアネート、ドデシル硫酸ナトリウムもしくはサルコシル；およびプロテイナーゼＫもしくはプロナーゼがある（例えば、Farrell, RNA Methodologies、１９９３年参照）。
【００４９】
　凍結乾燥された細胞からＲＮＡを単離するのに、標準の試験室の方法が使用される（例えば、Sambrook他の前掲文献；Ausubel他の前掲文献参照）。細胞からＲＮＡを単離する一つの好ましい方法は、Chomczynski, Biotechniques、１５巻、５３２〜５３５頁、１９９３年の方法に基づいている。この方法は、ＲＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡを単離するために単一の試薬を使用している。最初に、グアニジンイソチオシアネート−フェノール緩衝液を使って細胞を溶解する。試料をこの緩衝液内でホモジナイズし、次にクロロホルムを添加し遠心分離を行うことによって、水性相と有機相に分離する。次いでＲＮＡを水性相から沈澱させＲＮアーゼを含有していない溶液内に再懸濁させる。また、ＤＮＡも、この方法を用いて、ＲＮＡとともに単離することができる。この方法に基づいたキット、例えばＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Molecular Research Center, Inc.）が市販されている。また、各種の他の方法、例えばＳＤＳ又はプロテイナーゼＫを用いて処理し次いでフェノール溶液で抽出するなどの方法がＲＮＡを単離するのに適用され得る。ＲＮＡは、塩化セシウム密度勾配遠心分離法を用いてさらに精製することができる。また、ＲＮＡはシリカゲル結合／アニオン交換法を使用して単離することもできる。ＲＮアーゼを含有しないＤＲアーゼで処理することによって、ＤＮＡはＲＮＡから除去することができる。
【００５０】
　凍結乾燥された細胞からＤＮＡを単離するのに、標準の試験室の方法が使用される。先に述べたように、ＲＮＡとＤＮＡが同時に単離されるか、またはＲＮアーゼで処理することによってＤＮＡが単離される。凍結乾燥された細胞からＤＮＡを単離する標準方法には、通常、細胞を溶解し、次いで除タンパクを行い、ＤＮＡを回収する工程が含まれている（例えば、Ausubel他の前掲文献；Sambrook他の前掲文献参照）。また、凍結乾燥された細胞からＤＮＡを単離するのに用いるキットの商品も利用できる。
【００５１】
　核酸は、凍結乾燥された細胞から単離された後、無傷であることを保証するため検査される。一般に、ＲＮＡとＤＮＡの両者は、標準の手順による電気泳動法を用いて無傷性（無傷であること）について分析することができる。核酸を単離した後、溶液中の核酸の濃度を標準の分光測光法で測定し、次に標準量をゲルに塗布する。電気泳動を完了した後、そのゲルを臭化エチジウムで染色する。この染色によって、核酸を視覚化することができる。ＲＮＡの場合、無傷ＲＮＡの一つの指標は、２８ＳｒＲＮＡ／１８ＳｒＲＮＡの比率である。前記ゲルの目視検査に基づいて、ｒＲＮＡ類は、２８ＳｒＲＮＡ／１８ＳｒＲＮＡの比率が少なくとも約１でゲル上のバンドとして存在していなければならない。好ましくは、ｒＲＮＡの前記比率は１より大であり、例えば１．４〜１．５である。また、２８ＳｒＲＮＡ／１８ＳｒＲＮＡの比率は、例えば、前記ゲルの写真のデンシトメトリーによって測定することもできる。無傷のＲＮＡの他の指標は、ｍＲＮＡの存在に起因するゲル全体のバックグランドの蛍光である。またＲＮＡの安定性は、新たに増殖させた細胞と比較した相対的なＲＮＡの収率から測定することもできる。一般に、ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳなどの等張溶液中で凍結乾燥した細胞は、新たに増殖させペレット化した対照細胞とほぼ同量のＲＮＡを生成する。
【００５２】
　また、ＤＮＡの無傷性も、ゲル電気泳動法で検査される。無傷のゲノムＤＮＡは、比較的高い分子量（一般に長さが約１０，０００ｂｐを超え、好ましくは２０，０００ｂｐを超える範囲内にある）で存在していなければならない。エピソーマルＤＮＡもこの方法で単離することができる。標準のゲル電気泳動法とパルスフィールドゲル電気泳動法の両者を使用してＤＮＡを検査できる。
【００５３】
　ＶＩ．診断検定法と法医学検定法
　核酸は、凍結乾燥された細胞から単離されたならば、広範囲の用途に使用することができる。また、この発明は、凍結乾燥細胞入りのバイアルびんを備えた核酸のハイブリッド形成用キットのみならず、診断および法医学の用途に用いるバイアルびんに入った凍結乾燥細胞を提供するものである。この発明の凍結乾燥細胞の用途の例としては、癌、遺伝病および感染症などの診断検定法に、一般に検定法の対照として用いる用途がある。
【００５４】
　凍結乾燥された細胞およびその細胞から単離して得られた無傷の核酸は、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、ヒト乳頭腫ウイルス（「ＨＰＶ」）、肝炎ウイルスＡ、Ｂ、ＣおよびＤ（「ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ」）、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、インフルエンザウイルス、マイコバクテリウム感染、トリパノソーム感染およびクラミジア感染などの感染症の病因を検出する検定法に用いることができる（例えば、Castillo他、Digestion、４８巻、１４９〜１５６頁、１９９１年；Faulkner-Jones他、J.
Virol. Methods、４１巻、２７７〜２９６頁、１９９３年；Meyer他、Mol. Cell. Probes、８巻、２６１〜２７１頁、１９９４年；Mary他、J.Virol. Methods、４９巻、９〜２３頁、１９９４年；およびMcPherson, J. Clin. Lab. Anal.、８巻、３６９〜３７７頁、１９９４年参照）。凍結乾燥された細胞と単離された核酸は、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｐＳ２、ＢＣＲ／ＡＢＬなど癌に関連する遺伝子およびｍＲＮＡの変化を検出する検定法に使用できる（例えば、Dante他、Lab. Invest.、７１巻、１８８〜１９２頁、１９９４年参照）。また凍結乾燥細胞と核酸は、Ｉｇ再配列（Ｉｇ　rearrangement ）、β−サラセミア、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病および鎌状赤血球貧血などの疾患に関連する遺伝子変異を検出する検定法にも使用できる。また、凍結乾燥細胞と核酸は、例えばＤＮＡ指紋鑑定法を含む法医学検定法と父系検定法にも使用である（例えば、Budowle他、J. Forensic Sci.、４０巻、３８〜４４頁、１９９５年；Kasi他、J. Forensic Sci.、３５巻、１１９６〜１２００頁、１９９１年参照）。
【００５５】
　診断および法医学の用途に用いられる技法としては、核酸ハイブリッド形成法に基づいた広範囲の技法があり、例えば、ノーザンブロット法、サザーンブロット法、ドットブロット法、ＤＮＡ指紋鑑定法、ＲＮアーゼ保護法およびフィルターハイブリッド形成法がある。核酸ハイブリッド形成法の一つの変形に、核酸の増幅に基づいたものがあり、例えば、逆転写（「ＲＴ」）、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）および核酸配列ベースの増幅（「ＮＡＳＢＡ」）がある。
【００５６】
　ハイブリッド形成検定法に用いられる核酸のプローブとプライマーは、標的の遺伝子または転写産物とハイブリッドを形成するよう選択される。前記プローブは、ＤＮＡもしくはＲＮＡの分子、およびこれら分子の合成の非天然産生類似体でもよい。ハイブリッド形成条件は、この明細書で考察されているように、当業者が選択する。プライマーとプローブは配列と長さが異なっているが、主な識別因子は、プライマーが一般にＲＴ反応およびＰＣＲ反応の場合のように標的核酸のＤＮＡ合成を行う際の開始点として働き、一方、プローブが一般に標的核酸とのハイブリッド形成および標的核酸の検出に用いられるという機能である。プライマーまたはプローブの一般的な長さは、約７〜約５０個のヌクレオチドの範囲内である。また、プライマーまたはプローブは、同プライマーまたはプローブと標的核酸とのハイブリッド形成を検出するために検出可能な部分によって標識してもよい。
【００５７】
　プライマーまたはプローブと標的核酸とのハイブリッド形成を検出するあらゆる適切な方法を利用できる。これらの方法に使用される検出可能部分としては、例えば標識されたプローブ、増幅反応またはＲＴ反応における標識の直接組込み、および標識されたプライマーがある。
【００５８】
　一つの好ましいハイブリッド形成検定法は逆転写法である。逆転写法は、ＲＮＡをＤＮＡにコピーする増幅法である。逆転写反応は、第一ストランドのｃＤＮＡを合成する反応であるが、ＲＮＡをランダム六量体のプライマーもしくは特異的プライマーと混合し、７０℃で５分間加熱して核酸を変性し「この工程ではサーマルサイクラー（thermal cycler）を使用できる」、次いで氷上で冷却することによって行われる。酵素の製造業者の説明書またはキットの説明書にしたがって調製した反応混合物を、上記変性ＲＮＡと六量体の混合物に加え、次いで適切な温度、通常４２℃でインキュベートする。上記反応混合物が入っているチューブを７０℃で１０分間加熱することによって反応を停止させる。沈降させて短時間遠心分離を行うことによって、第一ストランドｃＤＮＡを収集し、新しい複数のチューブに分取する。そのｃＤＮＡは、ドライアイス上で迅速に凍結させ、必要に応じて後に使用するため−７０℃で貯蔵することができる。
【００５９】
　別の好ましいタイプのハイブリッド形成検定法はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）およびＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）などの増幅に基づいた検定法である。これらの検定法を実施する標準技法は当該技術分野で公知である（PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Erlich編、１９８９年)；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, Gelfland, Sninsky & White編、１９９０年)；Mattila他、NucleicAcids Res.、１９巻、４９６７頁、１９９１年；Eckert & Kunkel,PCR Methods and Applications、１巻、１７頁、１９９１年；Wallace他、Ligase Chain Reaction, in Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations、３０７〜３２２頁（Pfiefer編、１９９６年）」。ＲＴ反応とＰＣＲ反応は同じ検定法で用いられることが多いので、ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれている。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡのＤＮＡへの逆転写をこれに続くＤＮＡ増幅反応と組み合わせて単一の反応にしたものである。最適の逆転写、ハイブリッド形成および増幅の条件は、利用されるプライマーと標的の配列の組成と長さ、および専門家が選択する試験方法によって変わる。適当なプライマーの配列およびハイブリッド形成条件を選択するため、各種の指針を利用できる（例えば、Sambrook他の前掲文献参照）。
【００６０】
　例えば、ＰＣＲは、好ましくはｐＨが７〜９の緩衝された水溶液中で行われる。デオキシリボヌクレオシド三リン酸を十分な量の前記合成混合物に加え、得られた混合物の溶液を、約１〜１０分間、約８５〜１００℃で加熱する。任意の加熱時間の後、その溶液を、プライマーのハイブリッド形成のため、約２０〜４０℃まで冷却させる。重合用の試薬を前記混合物に添加して、一般にサーモサイクラーを使って、当該技術分野で公知の条件下で反応を起こさせる。この合成反応は、室温からその温度を超えると重合試薬がもはや有効に機能しない温度で生じる。重合試薬は、プライマー伸長産物の合成を達成するため機能する化合物または系であり、酵素を含んでいる。この目的に適切な酵素としては、例えば、イ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩまたはクレノウ　フラグメント、ＴａqＤＮＡポリメラーゼ、および他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼ類がある。
【００６１】
　また、この発明は、上記の核酸ハイブリッド形成検定法を実施するためのキットを提供するものである。このキットは、容易に入手できる材料と試薬から製造することができる。例えば、以下の材料：バイアルびんに入った凍結乾燥真核細胞、酵素、反応管、緩衝剤、界面活性剤、細胞を含有しないプライマーおよび公知の核酸を標的とするプローブのうちの一つ以上、ならびに説明書を上記キットが備えている。キットの凍結乾燥細胞はヒトの細胞が好ましい。一実施態様では、ヒトの細胞がリンバ球である。広範囲のキットと構成要素を、キットの予定されている使用者および使用者の特別の要求に基づいて、この発明により提供することができる。このキットは、好ましくは、ＰＣＲまたはＬＣＲなどの増幅ベースの検定法用として少なくとも一つのプライマー対をもっている。
【００６２】
　この明細書で引用される刊行物と特許願は、すべて個々の各刊行物または特許願があたかもこの明細書に参照用に包含されているように、この明細書に援用するものである。
【００６３】
　前述の発明は、明確に理解することを目的として、例示と実施例によって、いくつか詳細に説明してきたが、特定の変更と変形は、添付した特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく実施できることは、この発明の前記教示に照らして、当業技術者は容易に分かるであろう。
【００６４】
　以下の実施例は、この発明を例示することだけを目的とするものであり、この発明を限定するものではない。当業技術者には、変更または変形を行っても、本質的に類似の結果が得られる各種の決定的でないパラメーターが容易に分かるであろう。
【実施例１】
【００６５】
　真核細胞の凍結乾燥に用いる配合物
　Ａ．三つの異なる溶液中で凍結乾燥された細胞のリアルタイム／短時間の安定性とＲＮＡの無傷性
　細胞凍結乾燥用配合物を、続いて単離される核酸の無傷性を保持する溶液を確認するため、試験した。この試験では以下の３種類の配合物を、真核細胞を凍結乾燥する前に細胞と再懸濁させる溶液「凍結乾燥溶液」として使用した。すなわち（１）ＤＥＰＣで処理した水、（２）１Ｘラクトース緩衝液（１２．５ｍＭのＴＲＩＳ、３５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのアルギニン、５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン、および５０ｍｇ／ｍｌのラクトース、ｐＨ７．４）、および（３）ＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Molecular Research Center Inc.が市販しているフェノール／グアニジンイソチオシアネート溶液）である。０．０５％〜０．１％のＤＥＰＣを水に加え、次いで密閉容器内にて室温で４時間振盪することによって、水をＤＥＰＣで処理した。次に、その溶液を、標準条件によってオートクレーブ処理を行い次いで冷却した。凍結乾燥細胞の短時間の安定性を、室温と−７０℃で５日間細胞を貯蔵することによって試験した。この貯蔵期間の後のＲＮＡの無傷性を、陽性対照として、新たにペレット化した細胞由来のＲＮＡを用いて、凍結乾燥細胞から全ＲＮＡを単離して測定した。ＲＮＡの無傷性は、ゲル電気泳動法を実施した後、２８ＳＲＮＡのバンドの強度を１８ＳＲＮＡのバンドの強度と比較することによって測定した。
【００６６】
　ゲル電気泳動分析の結果は、ＤＥＰＣで処理した水中で凍結乾燥したＳＡＭ−１細胞から単離した全ＲＮＡが約５０％分解していたことを示した。室温および−７０℃で、５日間貯蔵した細胞は、ＲＮＡの無傷性について類似の結果を示した。これは、これらの条件下での細胞の短期間の安定性が類似していることを示している。１Ｘラクトース緩衝液またはＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔ中で凍結乾燥したＳＡＭ−１細胞由来の全ＲＮＡはほぼ１００％分解していた。
【００６７】
　これらの試験の結果は、ラクトースなどの等張性炭水化物の配合物が、細菌細胞の凍結乾燥に使用して成功しているが、これらの溶液は、ＲＮＡの無傷性を保持する真核細胞の凍結乾燥配合物として有効でないことを示している。同様に、ＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔは、全ＲＮＡの無傷性を保持して真核細胞を凍結乾燥するのに有効でない。
【００６８】
　１０％のウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）と抗生物質を補充したＲＰＭＩ　１６４０中で、標準条件を用いて、ＳＡＭ−１細胞を培養した（例えば、Sambrook他の前掲文献参照）。ＳＡＭ−１細胞はフィラデルフィア染色体および生成する融合ＢＣＲ／ＡＢＬ転写産物を含有するヒト腫瘤細胞である。３種の凍結乾燥配合物中に再懸濁させるため、培養物を三つの等量部分に分割した。その細胞を、標準の低速遠心分離条件下でペレット化し、次いで、上記溶液類のうちの一つに、１００μｌ当り１×１０6個の細胞の濃度で再懸濁させた。凍結乾燥を行うため、１バイアルびん当り１００〜５００μｌづつ分取した。
【００６９】
　これらの細胞を、自動凍結乾燥器を使用し、標準条件下で凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞を、−７０℃と室温でそれぞれ５日間貯蔵した後、全ＲＮＡを単離した。
【００７０】
　製造業者の説明書にしたがって、ＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、凍結乾燥した細胞試料から全ＲＮＡを単離した。次に、単離された全ＲＮＡを、標準の手順にしたがって、１．５％アガロースゲルと１ＸＴＡＥ緩衝液を用いるゲル電気泳動法を利用して分析した（例えば、Sambrook他の前掲文献；Ausubel他の前掲文献参照）。全ＲＮＡの無傷性は、前記ゲルを臭化エチジウム（「ＥｔＢｒ」）で染色し、次に２８Ｓ、１８Ｓおよび５．８ＳのリボソーマルＲＮＡのバンドの強度を試験することによって評価した。前記ゲルのレーン全体にわたってバックグランドがＥｔＢｒによって染色されているのは、全ＲＮＡ製剤中にｍＲＮＡが存在していることを示している。無傷のＲＮＡの場合、２８ＳｒＲＮＡバンドの強度は、１８ＳｒＲＮＡバンドの強度と等しいまたは大きいはずであり、これは全ＲＮＡ製剤における大きさの大きい方のＲＮＡの相対的無傷性を示している。上記のように、この試験で、ｒＲＮＡバンドの相対強度で評価した結果、ＲＮＡはほぼ５０〜１００％分解していた。
【００７１】
　Ｂ．ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ中で凍結乾燥された細胞の応力負荷安定性とＲＮＡの無傷性
　ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳを試験して、次に単離される核酸の無傷性を保持する凍結乾燥溶液を確認した。細胞の凍結乾燥用の試験配合物として以下の溶液：（１）ＤＥＰＣで処理した１Ｘリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、および（２）ＤＥＰＣで処理した水を代わりに用いて、上記Ａ項の試験を繰返した。１ＸＰＢＳは標準配合品が市販されており、これを、上記Ａ項に記載したのと同様にしてＤＥＰＣで処理した。
【００７２】
　３７℃で４日間、応力負荷安定性条件下で貯蔵した（−２０℃で３年間を超えて貯蔵したのに等しい）凍結乾燥ＳＡＭ−１細胞、およびＲＮＡ無傷性に関する対照としての新たに増殖させた細胞から、全ＲＮＡを上記Ａ項に記載したのと同様にして単離した。分光測光分析法、ゲル電気泳動法および１８Ｓと２８ＳのｒＲＮＡの比較で測定すると、ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ中で凍結乾燥した細胞から単離した全ＲＮＡは、ＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔを用いて単離した後、無傷である。凍結乾燥細胞から得た全ＲＮＡの収量は、対照の新たに増殖させた細胞から得たのとほぼ同一である。しかし、ＤＥＰＣで処理した水で凍結乾燥した細胞から単離したＲＮＡは一部分解していた。
【００７３】
　応力負荷安定性試験の結果は、ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ中で凍結乾燥された細胞由来の全ＲＮＡは、３７℃で少なくとも４日間（−２０℃で３年間を超える貯蔵に等しい）安定であることを示した。比較してみると、下記Ｃ項に記載したようにして実施した応力負荷安定性試験の結果は、ＤＥＰＣで処理した水の中で凍結乾燥した細胞の全ＲＮＡは殆ど分解したことを示している。
【００７４】
　上記のようにして行った第二の試験では、ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ内で凍結乾燥した細胞を異なる条件下で貯蔵した。ＳＡＭ−１細胞を凍結乾燥し、次いで２５℃で２日間、応力負荷安定性条件下で貯蔵した。また、ＨｅＬａＳ３細胞とＳＡＭ−１細胞の試料を凍結乾燥し、次いで、−２０℃でそれぞれ３ヶ月間および６ヶ月間貯蔵した。各試料からＲＮＡを単離し、次いで、２８Ｓと１８ＳのｒＲＮＡデンシトメトリーでＲＮＡの無傷性を比較した。
【００７５】
　図１は、２８Ｓと１８ＳのｒＲＮＡデンシトメトリー走査に用いた染色ゲルの写真を示す。この試験のＨｅＬａＳ３（レーンＮ１〜２）試料とＳＡＭ−１（レーンＰ１〜２）試料は上記のように−２０℃で貯蔵した。第二のＳＡＭ−１試料（レーンＰ３〜４）は２５℃で２日間、貯蔵した。表１は、上記ゲルから、ｒＲＮＡバンドとバックグランドについて得たデンシトメトリーの値、およびバックグランドについて補正した後の２８ＳｒＲＮＡ／１８ＳｒＲＮＡの比率を示す。これらの試験結果は、ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ中で凍結乾燥を行い、次いで−２０℃にてリアルタイム条件下でまたは−２０℃にて２年間の貯蔵に等しい応力負荷安定性の条件下で貯蔵すると、全ＲＮＡは分解されず安定であることを示している。また、これら６個のすべての試料から得た全ＲＮＡは、バックグランドｍＲＮＡの染色と５．８ＳｒＲＮＡのバックグランドを示している。
【００７６】
【表１】
2004105193.tif 000003
【００７７】
　Ｃ．ＤＥＰＣで処理した水の中で凍結乾燥された細胞の応力負荷安定性とＲＮＡの無傷性
　この試験は、ＤＥＰＣで処理した水中で凍結乾燥された異なる細胞由来の全ＲＮＡが、高い全ＲＮＡの無傷性をもって単離できるかどうかを試験するために行った。ＤＥＰＣで処理した水中で凍結乾燥された細胞由来の全ＲＮＡの応力負荷安定性も試験した。
【００７８】
　ＳＡＭ−１細胞およびＧＭ０７４０５細胞を培養し、凍結乾燥配合物としてＤＥＰＣで処理した水を代わりに用いてＡ項に記載したように凍結乾燥した。ＧＭ０７４０５細胞は、米国ニュージャージー州キャムデン所在のMIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, Coriell Institute for Medical Researchから入手したヒトリンパ芽球細胞系である。凍結乾燥した試料を、３７℃で４日間貯蔵して、Ｂ項に先に記載したようにして応力負荷安定性を測定した。全ＲＮＡを、凍結乾燥細胞から単離し、次いで、Ａ項に先に記載したようにして、ゲル電気泳動分析法を用いることにより、新たに増殖させた細胞から単離したＲＮＡと比較した。
【００７９】
　ゲル電気泳動法の分析結果は、ＤＥＰＣで処理した水中で凍結乾燥させたＳＡＭ−１細胞から単離した全ＲＮＡが部分的に分解して、ＤＥＰＣで処理した水中で凍結乾燥させたＧＭ０７４０５細胞から単離した全ＲＮＡが激しく分解していることを示した。顕微鏡による観察結果は、上記試験結果が、ＤＥＰＣで処理した水中での細胞の細胞膜崩壊が原因であることを示した。
【００８０】
　Ｄ．ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ中で凍結乾燥した細胞の応力負荷安定性とＲＮＡの無傷性
　この試験は、ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ中で凍結乾燥された異なる細胞由来の全ＲＮＡが、高い全ＲＮＡの無傷性をもって単離できるかどうかを試験するために行った。凍結乾燥された細胞を、Ｂ項に記載したようにして応力負荷安定性条件下で貯蔵した。Ｄｒ１１細胞とＳＡＭ−１細胞を培養し、凍結乾燥配合物としてＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳを代わりに用いて、Ａ項に先に記載したようにして凍結乾燥した。Ｄｒ１１細胞は、ＥＢＶで形質転換されたヒト白血球細胞系である。ＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔまたはｔｈｅ　ＲＮｅａｓｙ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＡ項に先に記載したようにして、全ＲＮＡを単離し、次いでＲＮＡの無傷性をゲル電気泳動法で分析した。
【００８１】
　ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ中で凍結乾燥させた上記２種の細胞系から得た全ＲＮＡは、新たな細胞から得たＲＮＡと比較したところ無傷であった。その上に、ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ中で凍結乾燥された２種の細胞系由来の全ＲＮＡは、ＴＲＩ
Ｒｅａｇｅｎｔまたはｔｈｅ　ＲＮｅａｓｙ　Ｋｉｔを用いて、高い無傷性と純度で単離することができる。Ｂ項に先に記載した条件を用いて実施した応力負荷安定性の試験は、ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ水中で凍結乾燥した細胞の全ＲＮＡが、−２０℃で貯蔵された場合、３年を超える期間、安定であることを示した。
【実施例２】
【００８２】
　診断検定法用の陽性対照と陰性対照としての、凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞の用途
　この試験は、凍結乾燥された細胞を診断検定法ににおいて、陽性対照および陰性対照として用いることの有効性を立証するために実施した。慢性骨髄性白血病（「ＣＭＬ」）に関連がある融合遺伝子の転写産物を検出するために設計されたＲＴ／ＰＣＲ検定法ににおいて、ＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞をそれぞれ陽性対照と陰性対照として使用した。
【００８３】
　Ａ．ＣＭＬの診断検定法
　フィラデルフィア染色体は、第２２染色体と第９染色体の相互転座によって生成した染色体であり、ＣＭＬ症例の９０％以上に観察される（Rowley, Nature、２４３巻、２９０〜２９３頁、１９７３年；Shtivelman他、Nature、３１５巻、５５０〜５５４頁、１９８５年）。分子レベルで、第９染色体上のｃ−ＡＢＬ遺伝子が転座によってフィラデルフィア染色体内の第２２染色体上のＢＣＲ遺伝子の方に移って、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子が生成する。また、この融合遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲ検定法を用いて検出できる融合ＲＮＡ転写産物を発現する。この検定法の場合、ＰＣＲアンプリコンに対する標準を提供して、偽陽性と偽陰性を監視するため、陽性対照の細胞と陰性対照の細胞が必要である。
【００８４】
　ＳＡＭ−１細胞は、融合転写産物を発現するＢＣＬ／ＡＢＬ融合遺伝子を含有しているので、この検定法において、陽性の対照として有用であり、一方、ＨｅＬａＳ３細胞は、正常な転写産物を発現する正常なＢＣＲ遺伝子とＡＢＬ遺伝子だけを含有しているので、有用な陰性の対照である。ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ中で凍結乾燥された細胞をＲＴ／ＰＣＲ試験で試験して、これら凍結乾燥された細胞の診断検定法における対照としての有効性を立証した。
【００８５】
　また、この検定法は凍結乾燥された細胞のＲＮＡの無傷性に対する対照も含んでいる。上記両細胞系は、構成要素として、β−２マイクログロブリン遺伝子を発現する。したがって、この遺伝子からの転写産物を、ＲＴ／ＰＣＲ反応における凍結乾燥細胞のＲＮＡ無傷性に対する対照として使用した。ＢＣＲ／ＡＢＬの融合をＲＴ／ＰＣＲ検定法で検出するのに用いる対照物質を提供するように設計された診断キットの商品に、対照商品として使用するため、凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞の入った約２０００個のバイアルびんを準備した。
【００８６】
　Ｂ．凍結乾燥、ＲＮＡの単離、およびＲＮＡの無傷性の測定
　凍結乾燥された対照細胞から単離されたＲＮＡの無傷性を、ＣＭＬの診断検定法の対照として使用する前に、試験した。３種の方法すなわち合計収量、光学濃度比および電気泳動分析法を用いて、ＲＮＡの無傷性を測定した。
【００８７】
　ＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞を実施例１に記載したようにして、凍結乾燥し、次いで−２０℃で貯蔵した。ＢＣＲ／ＡＢＬ転写産物とＢ２Ｍ転写産物のＲＴ／ＰＣＲを行うため、ＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞の各々の二つのバイアルびんから全ＲＮＡを単離した。ＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔを使用し、製造業者が提供したプロトコルを、細胞の溶解について少し修正したプロトコルにしたがって、凍結乾燥したＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞から、全ＲＮＡを調製した。ＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔを添加する前に、細胞の洗浄と細胞のペレット化を行うことなしに、バイアルびん中にＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔを直接添加することによって、バイアルびん中に入っている凍結乾燥細胞を溶解した。
【００８８】
　全ＲＮＡを調製した後、最終のＲＮＡのペレットを、ＤＥＰＣで処理しアプリコンを含有していない水中で再水和した。その再水和した全ＲＮＡの一部は、２６０ｎｍと１８０ｎｍにおける光学濃度測定に用いて濃度を測定するのに使用できる。全ＲＮＡ製剤のμｇ収量を、Ａ２６０における１ＯＤが水中の全ＲＮＡ４０μｇに等しくなる関係を利用して評価した。ＤＥＰＣで処理した１ＸＰＢＳ中で凍結乾燥された細胞の場合、その凍結乾燥細胞に対する収量は、対照として用いた新たに増殖させた細胞に対する収量とほぼ同じであった。全ＲＮＡ溶液のｕｇ収量を下記表２に列挙する。
【００８９】
【表２】
2004105193.tif 000004
【００９０】
　また、ＲＮＡの無傷性は、ＲＮＡ溶液の２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって評価できる。純粋なＲＮＡ製剤は、Ａ２６０／Ａ２８０比が１．６〜１．９のはずである。以下の表３に示すように、凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞が入った二つのバイアルびんから調製した全ＲＮＡはすべて、Ａ２６０／Ａ２８０比が１．６〜１．８の間にあり、これは全ＲＮＡの純度が高いことを立証している。
【００９１】
【表３】
2004105193.tif 000005
【００９２】
　全ＲＮＡの無傷性を評価する第三の方法には、１．５％のアガロースゲルと１ＸＴＡＥ緩衝液を用いる全ＲＮＡ溶液のアガロースゲル分析法が含まれている。電気泳動法に続いて、全ＲＮＡの無傷性は、先に実施例１に記載したように、臭化エチジウム（「ＥｔＢｒ」）で染色し、２８Ｓ、１８Ｓおよび５．８ＳのリボソーマルＲＮＡのバンドの強度を検査することによって推定される。凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞の各バイアルびんから単離した全ＲＮＡを含んでいるＥｔＢｒ染色レーンは、ヒト細胞由来の全ＲＮＡの典型的なパターンを示した。その上、２８Ｓのバンドを１８Ｓのバンドの相対比も全ＲＮＡの高い無傷性を示した（表１参照）。これらの試験結果は、凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞からＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔを使用して単離した全ＲＮＡの無傷性が診断検定法の対照として使用するのに適切なものであることを示している。
【００９３】
　Ｃ．ＲＴ反応
　ＲＮＡを凍結乾燥された細胞から単離した後に、逆転写させ、ＣＭＬの診断検定法用の陽性および陰性の対照として使用した（例えば、Kawasaki他、PNAS USA、８５巻、５６９８〜５７０２頁、１９８８年参照）。ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子からもたらされるｍＲＮＡを検出するＲＴ／ＰＣＲ検定法は、（１）逆転写酵素を用いて行う全ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製、（２）ＢＣＲとＡＢＬのプライマーによるネステッドＰＣＲ（nested ＰＣＲ）、（３）β−２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の２ラウンドのＰＣＲ；および（４）ＰＣＲアンプリコンのアガロースゲル分析のステップを含んでいる（この検定法で使用されるプライマーの説明については、図２と表４〜５を参照）。
【００９４】
　標準の反応条件と市販のキットを用いて、凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞由来の全ＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡに逆転写を行った。ＣＡＴ転写産物が、ＲＴ／ＰＣＲの有効性に対する対照として、市販のキットに提供されている。使用した市販のｃＤＮＡ製剤キットは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis Kit（GibcoBRL/Life Technologies）であった。プライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ　ＲＴ酵素に加えて、各ｃＤＮＡ反応には、１０ＸＰＣＲ 緩衝液、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰｍｉｘ、ＤＴＴおよびＲＮアーゼＨが含まれている。使用したプロトコルは、上記キットの製造業者が提供したものと同一である。下記表４に記載した特定のＲＴプライマーをＲＴ反応に使用した。ＣＡＴ　ＲＮＡ用のプライマーは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔの使用説明書（GibcoBRL/Life Techologies）に記載されている。ＢＣＲ／ＡＢＬとβ−２マイクログロブリンの転写産物に用いるプライマーは、Lee他、PCR Methodsand Applications、４巻、２８３〜２８７頁、１９９５年に記載されている（上記プライマー類、およびこれらプライマーの遺伝子／転写産物上の相対的位置を示す線図として図２を参照）。
【００９５】
　Ｄ．ＲＴ／ＰＣＲプライマーの説明
【００９６】
【表４】
2004105193.tif 000006
【００９７】
【表５】
2004105193.tif 000007
【００９８】
【表６】
2004105193.tif 000008
【００９９】
　Ｅ．ＰＣＲ反応の条件
　ＢＣＲ／ＡＢＬ融合転写産物を検出する検定法には、一般に、以下の反応、すなわち（１）ＢＣＲとＡＢＬのプライマーによるネステッドＰＣＲ、（２）β２−マイクログロブリン転写産物（Ｂ２Ｍ）に対するコントロールＰＣＲ反応（ＲＮＡの無傷性を測定するため）、およびＣＡＴに対するコントロールＰＣＲ反応（ＲＴ／ＰＣＲの有効性を測定するため）が含まれている。ＲＴ／ＰＣＲの試料を、ＰＣＲアンプリコンのアガロースゲル分析法で分析した。ＢＣＲ／ＡＢＬのＲＴ／ＰＣＲ検定法は、一反応に対する内部セットプライマー（inner set primer）と一反応に対する外部セットプライマーをそれぞれ用いてネステッドＰＣＲを使用した（図２参照）。また、Ｂ２Ｍ遺伝子のＰＣＲには、第一ラウンドのＰＣＲと第二ラウンドのＰＣＲに同じプライマー対を用いる二つの遂次ＰＣＲ反応（consecutive PCR reaction）が含まれている（図２参照）。
【０１００】
　第一ＰＣＲ反応において、ＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞の全ＲＮＡから調製した（ｃＤＮＡの全容積２０μｌのうちの）ｃＤＮＡ５μｌを、鋳型供給源に使用した。第二ＰＣＲ反応において、第一ＰＣＲの１μｌを鋳型供給源として使用した。
【０１０１】
　下記のサイクリング条件を、上記診断検定法のＰＣＲ反応に使用した。
ＰＣＲ＃１
　　１サイクル　…　９４℃　５分、＋
　２５サイクル　…　９４℃　１分、６０℃　２５秒、７４℃　１分
　　１サイクル　…　７４℃　８分
ＰＣＲ＃２
　　１サイクル　…　９４℃　３分、＋
　２５サイクル　…　９４℃　１分、４８℃　２５秒、７４℃　１分
　　１サイクル　…　７４℃　８分。
【０１０２】
　ＰＣＲ反応混合物に、１０ＸＰＣＲ緩衝液（ＭｇＣｌ2含有、Perkin Elmerから入手）、ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの貯蔵品（各々１０ｍＭ）、アンプリコンなしの水、ｃＤＮＡ鋳型、およびＴＥ緩衝液中１０μＭのＰＣＲプライマーを含有させた。反応混合物におけるこれら成分の最終濃度（最終反応容積５０μｌ）を以下の表７と８に示す。異なるＲＴ／ＰＣＲ反応に使用されるｃＤＮＡの鋳型を下記表９に列挙してある。ＰＣＲ＃２の場合、ＰＣＲ＃１反応混合物１μｌを、鋳型供給源としてＰＣＲ＃２に添加した。
【０１０３】
【表７】
2004105193.tif 000009
【０１０４】
【表８】
2004105193.tif 000010
【０１０５】
【表９】
2004105193.tif 000011
【０１０６】
　Ｆ．ＲＴ／ＰＣＲの試験結果
　この試験結果全体が、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子を検出するためのＲＴ／ＰＣＲにおいて、凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞をそれぞれ陽性対照と陰性対照として使用することが有効であること立証している。対照の細胞は、試験試料細胞と共に、ＲＴ／ＰＣＲの最初のステップ（全ＲＮＡを単離するステップ）から使用できる。凍結乾燥細胞からＲＮＡを単離する場合のプロトコルは、通常使用される全ＲＮＡの試薬を使用し、比較的容易である。さらに、最後に臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルは、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子およびβ２−マイクログロブリン遺伝子のＲＴ／ＰＣＲに用いられる明確なアンプリコンのサイズの標準を提供する。ＡｍｐｌｉＴａｑまたはＲＴを用いないで実施したすべての陰性対照のＰＣＲ反応は、アンプリコンのバンドを全く生成しなかった。
【０１０７】
　例えば、特定の５２３ｂｐのアンプリコンが、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩキットで供給されるＣＡＴ対照ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ鋳型を用いてＰＣＲ反応を行うことによって産生された。この結果は、上記のｃＤＮＡ反応とＰＣＲ反応の効率が高いことを示している。
【０１０８】
　凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞および凍結乾燥されたＨｅＬａＳ３細胞由来のｃＤＮＡ鋳型を用いて、β２−マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）転写産物のＰＣＲ反応を行うことによって、ほぼ同量の特定の３７０ｂｐアンプリコンが産出された。この結果は、凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞とＨｅＬａＳ３細胞内に、ほぼ同量の正常なＢ２Ｍ　ＲＮＡが存在していることを示している。
【０１０９】
　凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞から調製されたｃＤＮＡ鋳型を用いて、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子のネステッドＰＣＲを行うことによって特定の３０４ｂｐアンプリコンが産出されたが、凍結乾燥されたＨｅＬａＳ３細胞からは産出されなかった。この結果は、ＢＣＲ／ＡＢＬｍＲＮＡが、凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞内にのみ存在し、ＨｅＬａＳ３細胞内には存在しないことを示している。
【実施例３】
【０１１０】
　診断検定法のための陽性および陰性の対照としての、凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞とＤｒ１１細胞の用途
　ＨｅＬａＳ３細胞の代わりにＤｒ１１細胞を用いて、先に実施例ＩＩで述べた試験を繰り返した。この試験で類似の試験結果が得られた。
【実施例４】
【０１１１】
　診断の対照としての、凍結乾燥された細胞由来のＤＮＡの用途
　凍結乾燥された細胞中のＤＮＡの無傷性およびＤＮＡ検定法のための対照としての凍結乾燥細胞の用途を立証するため、ゲノムＤＮＡを、凍結乾燥されたＳＡＭ−１細胞とＤｒ１１細胞から単離した。
【０１１２】
　ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ単離用キットの商品または高濃度のラウリル硫酸ナトリウムを用いる通常の細胞溶解法を利用して、凍結乾燥された培養ＳＡＭ−１細胞および培養Ｄｒ１１細胞から単離した。このＤＮＡの無傷性は、標準の条件下にてアガロースゲル電気泳動法を利用して分析した（例えば、Sambrook他の前掲文献；Ausubel他の前掲文献参照）。標準条件下にて臭化エチジウムで染色した後、前記ＤＮＡは大部分、高分子量であった。これは、前記ＤＮＡが比較的分解されていなかったことを示している。
【０１１３】
　アガロースゲル分析によるこれらの試験結果は、収量と無傷性が類似しているＤＮＡを、凍結乾燥されたＤｒ１１細胞とＳＡＭ−１細胞および新たに増殖させたこれらの細胞から得ることができることを示している。その上に、ＲＮＡの無傷性と同様に、凍結乾燥されたＤｒ１１細胞とＳＡＭ−１細胞から単離されたゲノムＤＮＡも、ＤＮＡを単離するために−２０℃で貯蔵した場合、１年間を超える期間、安定であることも見出された。ゲノムＤＮＡについて実施したパルスフィールドゲル分析法から得た結果は、新たに増殖させた細胞または凍結乾燥細胞から単離されたＤＮＡの大きさと収量が、試験した両細胞系について、著しく類似していることを立証した。
【０１１４】
　凍結乾燥細胞から単離したＤＮＡの無傷性をさらに立証するため、Ｄｒ１１細胞またはＳＡＭ−１細胞から単離したゲノムＤＮＡを、ＡＢＬ遺伝子とｚ−フィンガー遺伝子のＰＣＲに使用した。ｚ−フィンガー遺伝子とＡＢＬ遺伝子のＲＴ／ＰＣＲ実験で得たアンプリコンの大きさはそれぞれ約３５０ｂｐと１０００ｂｐであった（これらの大きさは、両遺伝子の公知の配列から予想される大きさであった）。凍結乾燥されまた新たに増殖されたＤｒ１１細胞もしくはＳＡＭ−１細胞から単離したゲノムＤＮＡ１００ｎｇから、ＡＢＬ遺伝子もしくはｚ−フィンガー遺伝子の両者について、ほぼ同じ収量のアンプリコンを得ることができる。
【０１１５】
　類似の実験で、Ｄｒ１１細胞およびＳＡＭ−１細胞から単離したＤＮＡを鋳型として用いると共にＶＮＴＲマーカー（ＤＩＳ８０）から選択した二つのオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用して、ＰＣＲを実施した（Kasai他の前掲文献）。ヒトの第１染色体上に位置しているＤＩＳ８０遺伝子座は、１６個のヌクレオチドの長さのＤＮＡの繰り返し単位で構成されている。この繰り返し回数は、異なる個体で１５〜４１回の範囲内であると報告されている（Budowle他の前掲文献）。ＤＩＳ８０遺伝子内の繰り返し回数がこのように変化することは、ＤＮＡ指紋鑑定法（ＤＮＡ推定法）の基礎になっている。
【０１１６】
　Ｄｒ１１細胞とＳＡＭ−１細胞から単離したＤＮＡを使用して、ＤＩＳ８０マーカー上で実施したＰＣＲは、大きさが異なる別個のアンプリコンの対を生成した。凍結乾燥細胞または新たに増殖させた細胞由来のＤＮＡ鋳型を用いたＰＣＲで得たアンプリコンの大きさは同一であり、これはＤＩＳ８０のＤＮＡが凍結乾燥細胞中に保存されていたことを示している。これらの結果は、凍結乾燥細胞がＤＮＡ指紋鑑定試験や遺伝子推定試験（gene profiling experiment）のための対照細胞の優れた供給源であることを示している。これらの凍結乾燥細胞は、異なるタイプの試験の対照として使用できるＤＮＡの安定した供給源を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ＤＥＰＣで処理した１ｘＰＢＳ中で凍結乾燥された細胞試料から単離されたＲＮＡを含有するゲルを臭化エチジウムで染色したものの写真である。レーンＮ１とＮ２は、−２０℃で３ヶ月間貯蔵された、ＨｅＬａＳ３試料由来のＲＮＡを含有し、レーンＰ１とＰ２は、−２０℃で６ヶ月間貯蔵されたＳＡＭ−１試料由来のＲＮＡを含有し、そしてレーンＰ３とＰ４は、２５℃で２日間貯蔵された（これは、−２０℃で２年間貯蔵されたのと等しい、下記応力負荷安定性計算法（stressed stability calcμｌation）を参照）ＳＡＭ−１試料由来のＲＮＡを含有している。このゲルを、デンシトメーターを使用して走査して、２８ＳｒＲＮＡのバンド／１８ＳｒＲＮＡのバンドの比率を判定した。
【図２】ｍＲＮＡ、β−２マイクログロブリンｍＲＮＡおよびＣＡＴｍＲＮＡを融合したＢＣＲ／ＡＢＬを増幅するのに用いたＰＣＲプライマーの線図である。
【図１】
2004105193.tif 000012
【図２】
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