(57)【要約】      （修正有）【課題】ＳＥ FliC９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなり、ＳＥ感染鶏及び現在市販のＳＥ不活化ワクチン接種鶏とを血清学的に検査するための抗原処方物及びこれを含む検査キット、並びにこの抗原を含んだストレス反応性の低いＳＥサブユニットワクチンの提供。【解決手段】１つの容器内に、支持体上へサルモネラ種のべん毛抗原の主要抗原である５３ｋＤａポリペプチド中のＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を担持させた支持体と、種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液およびオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）希釈液を夫々れ収容した各試薬容器とを含む構成とする。【選択図】図１
0003114060.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
酵素抗体法により野外型感染鶏とワクチン接種鶏とを血清学的に検査し、血清試料、卵黄試料又は体液及び組織抽出液からなる流動体試料内のサルモネラに対する抗体を検出するための検査キットであり、１つの容器内に、支持体上へサルモネラ種のべん毛抗原の主要抗原である５３ｋＤａポリペプチド中のＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を担持させた支持体と、種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液及びオルトフェニレンジアミン希釈液を夫々れ収容した各試薬容器とを含むものとなしたサルモネラ抗原処方物を使用した抗体検査キット。  
【請求項２】
ＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を担持させた支持体は、該９ｋＤａポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合させた融合蛋白質を支持体上へ担持させるものとなしたことを特徴とする請求の範囲１に記載のサルモネラ抗原処方物を使用した抗体検査キット。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、サルモネラ抗原処方物を使用して野外型感染動物とワクチン接種動物とを識別するための検査用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ属の細菌は人及び動物の両方に於いて病原性を示すことが知られている。とりわけ、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis 以下ＳＥと云う）は、人の食中毒の原因菌の一つとして１９８０年代後半より注目されてきた。このＳＥは多くの研究により、養鶏場に於いて産生される殻付き卵を汚染していることが知られるようになり、養鶏場（採卵場）に於けるＳＥ対策が重要視されている。
【０００３】
近年、養鶏場のＳＥ対策として一般的な衛生管理を向上させることの他に、採卵鶏の若齢期にＳＥ不活化ワクチンを接種することが試みられている。しかしながら、この場合、次のような問題点がある。
【０００４】
（１）ＳＥ不活化ワクチンを接種した場合、ＳＥ特異抗体は産生されるが、この産生されたＳＥ特異抗体は野外型ＳＥの自然感染と血清学的に区別することができない。
（２）現在広く普及しているＳＥ不活化ワクチンは、菌体を不活化した抗原、即ちＳＥの菌体をホルマリンにより死菌としたものを中心抗体として使用しているため、菌体内の毒素（Enterotoxin）を含んでおり、ワクチンを接種することにより様々な副反応（例えば鶏増体重を阻害する）を引き起こすことが知られている。また、不活化ワクチンの内、優れた免疫応答を誘導するものとして知られている油性アジュバントワクチンも、接種鶏にストレスを誘発するという欠点を持っている。
（３）現在、養鶏場ではＳＥ以外のサルモネラ菌属、例えばネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・インファンティスなどの汚染があり、ワクチネーションの回数を減らすためにも、サルモネラ菌属の多価ワクチンの開発が要望されているが、多くのサルモネラの菌体を混合することは必要以上のストレスを鶏に与えたり、必要な抗原量を安定的に確保するのが困難であるため、所望される菌体抗原を用いた多価ワクチンは製造上困難とされている。
【０００５】
本考案者らは既に、上記問題点（１）を解決するために、様々なＳＥ表面抗原物質に対し、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏とＳＥ感染鶏との間に産生される抗体の種類に差があるかどうか調べ、ＳＥ表面抗原の１つであるべん毛抗原に対して、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏と、ＳＥ感染鶏との間に差があることを明らかにしている。
【０００６】
ＳＥの表面抗原としては、繊毛抗原として１４ｋＤａ、１７ｋＤａ及び２３ｋＤａのポリペプチドが知られ、夫々れサブユニットワクチンの抗原として研究されているが、未だワクチンとして効果的な抗原であることの報告はなされていない。
一方、べん毛をサルモネラワクチンに関する適当な検出可能マーカー抗原とみなし、野生型形態に於いてはべん毛を保持するが、フラジェリン又はべん毛の抗原決定基の少なくとも一つに対する抗体を誘導する能力をもはや有さないサルモネラ属の細菌を利用するものとしたワクチンが記載されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
他方、問題点（２）のアジュバントによる問題に対して、例えば特許文献２にはには、親水性油性アジュバントを使用して水中油中水滴型エマルションとなしたワクチン製剤により解決しようとすることが記載されているが、ＳＥ不活化ワクチンは菌体を死滅させた抗原を大量に含んでいるため、問題点（３）に示すように、サルモネラ属全体の多価ワクチンを作成することは困難とされている。この解決策としては、ＳＥ菌体の中で有効な抗原のみを取り出し、サブユニットワクチンとして多価ワクチンを作成することが有用と考えられるが、これまでサブユニットワクチンとしての有効なＳＥ抗原は報告されていない。
【特許文献１】特開２００１−１８６８７４号公報
【特許文献２】特開２００２−８０３９６号公報
【考案の開示】
【考案が解決しようとする課題】
【０００８】
ワクチン接種鶏と野外型感染鶏とを容易に識別でき、また鶏に対してストレスの少ないＳＥ不活化ワクチン或いはＳＥの有効な抗原を含む単価或いは多価サブユニットサルモネラワクチンの開発が強く望まれているが、何れについても未だ有効なものは確認されていない。本考案者らは、これに鑑みて鋭意研究を進めたところ、ＳＥべん毛抗原の主体を成すFliC（べん毛の主要抗原）であるＳＥ５３ｋＤａポリペプチド（ＳＥFliC）の中の一部９ｋＤａポリペプチドが鶏に接種されたＳＥ不活化ワクチンにより産生された抗体を特異的に検出できる抗原であることを見出し、このＳＥFliC９ｋＤａポリペプチド又はその複合物を用いて、現在市販のＳＥ不活化ワクチン接種鶏を血清学的に検出するための抗原処方物を使用した検査キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本考案は、酵素抗体法により野外型感染鶏とワクチン接種鶏とを血清学的に検査するために使用され、血清試料、卵黄試料又は体液及び組織抽出液からなる流動体試料内のサルモネラに対する抗体を検出するための検査キットを、１つの容器内に、支持体上へサルモネラ種のべん毛抗原の主要抗原である５３ｋＤａポリペプチド中のＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を担持させた支持体と、種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液及びオルトフェニレンジアミン（以下ＯＰＤと云う）希釈液を夫々れ収容した各試薬容器とを含む構成となす。
これにより、サルモネラ菌に自然感染した野外型感染鶏とＳＥ不活化ワクチン接種により感染したワクチン接種鶏とを血清学的に正確に識別することが可能となる。
【００１０】
また、この際、上記ＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を担持させた支持体は、該９ｋＤａポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下ＧＳＴと云う）と融合させた融合蛋白質となして支持体上への定着を安定させたものとなしたりする。
【考案の効果】
【００１１】
本考案によれば、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏とＳＥ感染鶏との間に血清学的な違いが確認されたFliC９ｋＤａのポリペプチド又はその複合物を担持させた支持体を、各試薬とセットさせることにより、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏とＳＥ感染鶏とを簡便に識別することができるものとなる。
【考案を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を参照して本考案の実施の形態を説明する。
図１は本考案の一実施の態様を示す検査キット１の収容状態図である。２は容器であり、該容器２の中に、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏とＳＥ感染鶏との間に血清学な違いを確認させる抗原を担持させた支持体３と、種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液及びオルトフェニレンジアミン（以下ＯＰＤと云う）希釈液を夫々れ収容した各試薬容器４が収納されている。
本考案の抗原処方物に使用されるＳＥ fliC遺伝子は、ＳＥのべん毛を構成する主要な蛋白質であるFliC（５３ｋＤａ）をコードしており、１５１８塩基対で構成され、５０５個のアミノ酸より構成されている。また、ＳＥのアミノ酸配列と他のサルモネラのＮ末端とＣ末端のアミノ酸配列及び塩基配列を比較すると、かなり高いホモロジーが存在することが確認された。そこで、本考案では、ＳＥFliCの特異的な領域（９ｋＤａポリペプチド部分）の単離精製を遺伝子工学的に行い、ＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物を以下のようにして精製した。
【００１３】
Ａ．ＳＥ fliC遺伝子の単離と解析
１．ＰＣＲ法によるfliCの増幅及びクローニング
既知の塩基配列を基に、ＰＣＲ用プライマーＳＥＦ及びプライマーＳＥＲを設計し、ＳＥ Ｎｏ．１５株の菌体よりゲノムＤＮＡを精製し、これをテンプレートとしてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲの条件は、変性９４℃、３０秒間、アニーリング６０℃、３０秒間、増幅７２℃、９０秒間を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。また、増幅されたＤＮＡフラグメントはアガロースゲル電気泳動法（１％アガロースゲル）により確認した（図２参照）。この増幅したＰＣＲ断片（ＤＮＡ）中の不純なＤＮＡを除去して精製するために、増幅した遺伝子をｐＣＲ２．１Ｔベクターにサブクローニングした後、大腸菌内で複製し、クローニングを試みた。
【００１４】
２．fliC遺伝子の塩基配列の決定
クローニング後、単離した４クローンの内１クローンをテンプレートとし、プライマーＳＥＦ、ＳＥＲ、ＳＥＲ３、ＳＥＲ４を用い、塩基配列の決定を試みた。塩基配列の決定には、ＤＮＡオートシークエンサーＡＢＩ３１０（Aplied Biological Instrument）を用い、ダイターミネーター法により行った。サイクルシークエンス反応条件は変性９６℃、１０秒間、アニーリング５０℃、５秒間、増幅７２℃、４分間を１サイクルとして２５サイクル繰り返した。
【００１５】
Ｂ．融合蛋白質の発現及び精製
３．発現クローンの作製
ＳＥ特異的であるfliC遺伝子の塩基配列中７３５ｂｐから１０１０ｂｐの領域のクローニングを試みた。７３３ｂｐから１００８ｂｐを増幅させるattBアダプタープライマーをattB1SEFepi及びattB2SERepiを設計し、fliC遺伝子の塩基配列を決定したクローンを鋳型にし、変性９４℃、３０秒間、アニーリング５５℃、３０秒間、増幅７２℃、３０秒間を１サイクルとして３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをattPサイトを含むドナーベクター（ｐＤＯＮＲＴＭ）に接続した。その後、大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換し、エントリークローンが構築されたことを確認し、このエントリークローンをデスティネーションベクター（ｐＤＥＳＴＴＭ１５）に移し換え、大腸菌（ＢＬ２１−Ｓ１ＴＭ）に形質転換して、発現クローンを作製した（図３参照）。上記ベクター及び大腸菌はInvitrogen社のものを使用した。
【００１６】
４．融合蛋白質の大量発現
次に、融合蛋白質を大量に発現させ、精製することを試みた。
形質転換体のオーバーナイトカルチャーを１ｍｌ作製し、これをＬＢ液体培地１００ｍｌに添加し、３７℃でＯＤ６００が０．５になるまで約６時間培養したあと、引き続き終濃度が０．３Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、３０℃で１２時間培養した。
【００１７】
５．融合蛋白質の精製
上記培養液を集菌し、プロテアーゼインヒビター（SIGMA製）を２５０μｌ加え、これに終濃度０．２％となるようにトライトンＸ−１００を加え、エタノールバス及びウォーターバス（６０℃）にて３回凍結融解を繰り返し、菌を破砕した。破砕した菌を遠心分離し（１３，５００ｒｐｍ、１０分、４℃）、その遠心上清をＧＳＴｒａｐ ＦＦ ５ｍｌカラム（Amersham Pharmacia Biotech製）に通し、融合蛋白質をカラム内の担体に結合させた後、１０ｍＭ還元型グルタチオン（５０ｍＭ Tris-HCl、ｐＨ８．０）５ｍｌで溶出した。溶出した融合蛋白質はＰＢＳで透析し精製標品とした。
【００１８】
本考案に於ける検査キット１は、酵素抗体法により、血清試料、卵黄試料又はその他の流動体試料内のサルモネラに対する抗体を検出するためのものであり、１つの容器２内に上記サルモネラ抗原処方物でコーティングされた支持体３の他に、種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液及びＯＰＤ希釈液を夫々れ収容した試薬容器４で構成される。コントロール血清としては、サルモネラ陽性及びサルモネラ陰性の非交差反応血清が使用される。とりわけサルモネラ抗体定量用に有利なのは、フィールドインフェクション又はワクチネーションにより免役されたサルモネラ陽性の動物から得られたコントロール血清である。
【００１９】
本考案に於けるサブユニットワクチンは、上記 FliC９ｋＤａポリペプチド抗原或いはその複合物からなる抗原性物質と医薬上許容される担体とから構成される。
以下、上記サルモネラ抗原処方物をＥＬＩＳＡ法に用いるものとして、各試薬、試料を更に詳細に説明するが、本考案はこれらに特に制限されるものではなく、他の酵素抗体法に用いてもよい。
【００２０】
支持体３（以下ＥＬＩＳＡプレートと云う）は、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチド抗原をマイクロプレートにコーティングさせたものである。即ち、ＥＬＩＳＡプレートは、上記の如く精製したＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドを融解後、蛋白濃度で０．０５μｇ／ウエルとなるようコーティング緩衝液で希釈し、マイクロプレートウエルに２〜５℃で１晩コーティングを行い、１％牛アルブミン−ＰＢＳ（滅菌リン酸緩衝生理食塩水）を用いて室温で１時間ブロッキング行い、その後ブロッキング液を除去してウエルを充分に乾燥させシールすることにより作製した。使用したコーティング緩衝液は、１０００ｍｌ中に炭酸水素ナトリウム２．９３ｇ、炭酸ナトリウム１．５９ｇ、アジ化ナトリウム０．２ｇを含有し、ｐＨ９．４〜９．６に調整されたものである。
【００２１】
この際、FliC ９ｋＤａポリペプチドをＧＳＴと融合させた抗原処方物を使用することにより、該抗原処方物をマイクロプレート上にコーティングし易く、また作製されたＥＬＩＳＡプレートも良好な安定性及び均一性並びに高感度のコーティングを得るものとなった。また、ＥＬＩＳＡプレートは、検出精度を維持するために、使用時まで２〜５℃の暗所にて保存することが好ましい。
【００２２】
サルモネラ陽性血清は、ＳＥ不活化ワクチン（レイヤーミューンＳＥ）で免役した鶏より作製する。２１〜７０日齢のＳＰＦ鶏にレイヤーミューンＳＥを１．０ドース皮下接種し、アイソレーターの中で飼育する。ワクチン接種４週間後に採血し、血清分離を行い、５６℃で３０分間非動化する。市販のひな白痢診断用抗原により凝集反応（ＰＤ−ＲＰＡ）を行い、凝集価８倍を示す血清を５００倍希釈する。このものは、使用時まで−４０℃で保存するのが好ましいが、凍結乾燥させても良い。
【００２３】
サルモネラ陰性血清は、２１〜７０日齢のＳＰＦ鶏より調整する。採血後、上記サルモネラ陽性血清と同様に血清分離及び非動化を行い、ＰＤ−ＲＰＡで陰性であることを確認してプールし、牛胎児血清を用いて１０倍希釈する。このものを５ｍｌ容のバイアル瓶に１００μｌずつ分注して凍結乾燥する。また、使用時まで２〜５℃の暗所に保存することが好ましい。
【００２４】
血清希釈液は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳと云う）に牛胎児血清１０ｍｌ、ポリソルベート２０を１ｍｌ、アジ化ナトリウム０．０２ｇ、１％フェノールレッド０．３ｍｌ、ゲンタマイシン１ｍｌを加えて１０００ｍｌに調整し、スターラーを用いて溶解し、濾過滅菌後、滅菌容器に小分けして２〜５℃で保存する。
コンジュゲート希釈液は、ＰＢＳにポリソルベート２０を２ｍｌ、牛胎児血清１ｍｌ、マラカイトグリーン０．０５ｇを加えて１０００ｍｌに調整し、血清希釈液と同様にスターラーを用いて溶解し、濾過滅菌後、滅菌容器に小分けして２〜５℃で保存する。
【００２５】
ＯＰＤ希釈液は、蒸留水にクエン酸−水和物２１．０１ｇ、無水リン酸−水素ナトリウム２８．４０ｇ、３０％過酸化水素水１ｍｌを加えて１０００ｍｌに調整し、溶解後、２〜５℃で保存する。
【００２６】
上記の如く調整した試薬を用いたＥＬＩＳＡ法による検査手順を以下に示す。この際、各試薬は使用する前に室温に戻しておく。
まず、検査用試料を準備する。
試料としては鶏の血清或いは卵黄を用いたりする。該試料を１ｍｌシリンジで０．６ｍｌをマイクロテストチューブに取り、等量の血清希釈液を加えてよく混合し、試料の１次希釈液を作製する（２倍希釈）。次いで、試料希釈用マイクロプレート（FALCON製の組織培養用マイクロテストプレート平底、低蒸発タイプ、９６穴の蓋付きもの）にＡ段の１〜８列を除いて、血清希釈液を２５０μｌ／ウエルずつ分注し、試料の１次希釈液を４μｌ／ウエルずつ分注して、２０分間プレートミキサーで充分に攪拌して試料の２次希釈液を調整しておく（１２５倍希釈）。
【００２７】
１．１次血清との反応（試料との反応）
上記希釈用マイクロプレートのＡ段の１〜４列にサルモネラ陰性血清（５００倍希釈）、５〜８列にサルモネラ陽性血清（１０００倍希釈）を分注する。一方、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチド抗原を担持させたＥＬＩＳＡプレートのＡ段１〜８列を除いた全てのウエルに血清希釈液を７５μｌずつ分注し、上記試料の２次希釈液を２５μｌずつ加える（最終希釈が５００倍となる）。更に、該ＥＬＩＳＡプレートのＡ段１〜４列にサルモネラ陰性血清、５〜８列にサルモネラ陽性血清を夫々れ１００μｌずつ分注し、室温で３０分間、抗原と反応させる。
【００２８】
２．２次血清との反応（コンジュゲートとの反応）
１の反応が終了後、反応液を捨て、蒸留水でウエルを３回洗浄し、水分を除去した後、酵素で標識された抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ウサギ血清をコンジュゲート希釈液で３０００倍希釈となしたものを、全てのウエルに１００μｌずつ分注し、室温で３０分間反応させる。
【００２９】
３．基質との反応（発色）
２の反応が終了後、反応液を捨て、蒸留水でウエルを３回洗浄し、水分を除去した後、オルトフェニレンジアミンをＯＰＤ希釈液で適宜希釈したものを０．０５ｍｇ／ウエルとなるように各ウエルに分注し、１０分間室温で反応させる。
【００３０】
４．反応の停止
３の反応が終了後、３規定硫酸を全てのウエルに１００μｌずつ分注し発色を停止させる。
【００３１】
５．抗体価の決定
４の反応停止後、プレートリーダーで各試料の吸光度を（ＯＤ）を４９０ｎｍで測定し、ｍ−ＯＤ値（修正ＯＤ値）を次式により計算する。
ｍ−ＯＤ値＝（Ｓ−ＮＣ）／（ＰＣ−ＮＣ）  （Ｓ：試料のＯＤ値、ＰＣ：サルモネラ陽性血清のＯＤ値、ＮＣ：サルモネラ陰性血清のＯＤ値を示す）
以下、本考案を実施例により詳細に説明する。
【実施例１】
【００３２】
・マーカー検出系としての試み及びｍ−ＯＤ値における陽性基準の設定
ＳＥ不活化ワクチン接種群を３群とし、以下の通り試料を採取した。
（１）８１〜９３日齢で市販のＳＥ不活化ワクチン（レイヤーミューンＳＥ−ＮＢ）を接種した１９２日齢の鶏群より鶏卵１８個、（２）４９〜５４日齢及び７０〜８９日齢でレイヤーミューンＳＥを接種した４２０日齢の鶏群より鶏卵１９個、（３）５７，５８日齢及び９６〜９９日齢でレイヤーミューンＳＥを接種した６９０日齢の鶏群より鶏卵２２個を採取した。従来のＳＥ抗体検出試験法として使用される市販のＣＡＦ−ＳＥエリーザ（弊社製）及びひな白痢診断用抗原を用いた急速平板凝集反応（ＰＤ−ＲＰＡ）を９ｋＤａポリペプチドをコーティングした本考案のＥＬＩＳＡ法と共に行った。結果を表１〜３に示す（表１：１９２日齢、表２：４２０日齢、表３：６９０日齢）。
【００３３】
【表１】
0003114060.tif 000003
【００３４】
【表２】
0003114060.tif 000004
【００３５】
【表３】
0003114060.tif 000005
【実施例２】
【００３６】
比較例として、約１年前に環境からＳＥが分離された農場より採取した１００個の卵の卵黄について、実施例１と同様に抗体の検出を行った。結果を表４に示す。
【００３７】
【表４】
0003114060.tif 000006
【００３８】
ここに、上記したｍ−ＯＤ値における陽性基準は、ＳＥ不活化ワクチン接種群の中で６５０〜７２０日齢の鶏群由来の卵黄を用いた試験に於いて５０％以上の陽性率となること、且つＳＥ汚染農場由来の卵黄及び購入したＳＰＦ鶏群由来の卵黄（SPAFAS社より購入した鶏卵より採取）を用いた試験に於いて全て陰性となることを条件とした。
【００３９】
・成績及び考察
ＣＡＦ−ＳＥエリーザを用いた卵黄中のＳＥ特異抗体検出率は、日齢と共に低下することが明らかとなり、ＰＤ−ＲＰＡ法では、１９２日齢鶏群由来の卵黄で１例の陽性が認められたのみであるが、本考案のＥＬＩＳＡプレートに於いては、ｍ−ＯＤ値で０．１以上を陽性とした場合、１９２日齢及び４２０日齢鶏群由来卵黄を用いた場合約９５％の陽性率、６９０日齢鶏群由来卵黄でも陽性率は約７０％であった。また、ＳＥ分離農場からの卵黄では、本考案のＥＬＩＳＡプレートに於いてｍ−ＯＤ値０．１以上を示す検体は１例もなく、１００検体の最大ｍ−ＯＤ値は、０．０７であった。また、表には示さなかったが、購入したＳＰＦ鶏群由来卵黄は、本考案のＥＬＩＳＡプレートでは全て陰性であった。また、卵黄の代わりに血清を用いた場合もほぼ同様の結果が得られた。
以上により、本考案のＥＬＩＳＡプレートは、マーカー検出としての使用を可能にするものと考察し、ｍ−ＯＤ値０．１以上を陽性基準に設定される。
【実施例３】
【００４０】
クロアカスワブ、血液及び卵は約１０倍量のハーナテトラチオン酸塩基礎培地（ＨＴＢ）に採取し、３７℃で４８時間培養後にそれをＭＬＣＢに画線塗抹し、４８時間培養後にＳＥ陽性を判定し、そこで得られたコロニーをトリプトソーヤ寒天培地に移植して２４時間培養後、サルモネラ免疫血清Ｏ９群との反応を行い凝集性の有無を確認した。剖検時に無菌的に採取した輸卵管は、片方を結紮し形成中の卵を取り除いた後、もう一方からＨＴＢを加え内容物をよくもんで取り出し、その洗浄液を試料とした。肝臓及び脾臓は夫々れ５ｇずつを無菌的に採取した後、約１０倍量のＨＴＢを加えてホモゲナイズしたものを試料とした。これらを３７℃で４８時間増菌培養した後ＭＣＬＢに画線塗抹し、更に４８時間後にＳＥ陽性を判定した。そこで得られたコロニーをトリプトソーヤ寒天培地に移植して２４時間培養後、サルモネラ免疫血清Ｏ９群との反応を行い凝集性の有無を確認した。
【００４１】
【表５】
0003114060.tif 000007
【００４２】
【表６】
0003114060.tif 000008
【００４３】
【表７】
0003114060.tif 000009
【００４４】
【表８】
0003114060.tif 000010
【００４５】
【表９】
0003114060.tif 000011
【００４６】
【表１０】
0003114060.tif 000012
【００４７】
【表１１】
0003114060.tif 000013
【００４８】
【表１２】
0003114060.tif 000014
【００４９】
・成績と考察
各試料からのＳＥ分離を行った結果、クロアカスワブからは表５に示すとおり、試験Ｎｏ．１及び２において接種群の全ての鶏より少なくとも１度はＳＥ分離が認められたが、２週間後以降からＳＥ分離が認められない個体が、試験Ｎｏ．１では２羽、試験Ｎｏ．２では１羽存在した。
卵内容物及び血液からは、表６及び７に示すとおり、何れの時期に於いてもＳＥ分離は認められなかった。
盲腸内容、肝臓、脾臓及び輸卵管からは、表８に示すとおり、盲腸内容からのみ試験Ｎｏ．１の５羽中２羽においてＳＥ分離が認められた。尚、対照群に於いては全ての試料について陰性であった。
また、血液及び卵黄中の抗体を調べた結果、表９〜１２に示すとおり、ＣＡＦ−ＳＥエリーザに於いては、２群の検体Ｎｏ．１３，１４及び１５の血液が１，２，４週後の時点で陽性を示し、検体Ｎｏ．１１，１４及び１５の卵黄が血液で陽性が見られたのよりもやや遅れて２，４，６週後の時点で陽性を示した。一方、本考案の９ｋＤａポリペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートでは、全ての検体が陰性を示した。
以上より、ＳＥ投与産卵鶏に於いてもＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの抗体検出法は、血清及び卵黄共に全てに陰性を示すことから、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏とＳＥ感染鶏の血清及び卵黄を用いた検査に於いてマーカー検出法に適していると判断される。
【実施例４】
【００５０】
・市販されているＳＥ不活化ワクチン接種鶏由来血清を用いた試験
市販のＳＥ不活化ワクチンが５３ｋＤａポリペプチドに対する抗体産生能を有しているかどうかについて検討した。
市販のＳＥ不活化ワクチンＡを２６日齢のＳＰＦ鶏５羽に０．５ｍｌ／羽接種、Ｂを３１日齢のＳＰＦ鶏１０羽に０．５ｍｌ／羽接種、Ｃを３３日齢のＳＰＦ鶏５羽に０．５ｍｌ／羽接種、Ｄを３３日齢のＳＰＦ鶏５羽に０．２５ｍｌ／羽接種、Ｅを３３日齢のＳＰＦ鶏４羽に０．２５ｍｌ／羽接種し、夫々れ接種４週後に得られた血清を用いて、ＣＡＦ−ＳＥエリーザ及び本考案のＥＬＩＳＡプレートによるＥＬＩＳＡ反応及び５３ｋＤａポリペプチド並びにＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドを抗原としたWestern Blotting （ＷＢ）反応を行い、夫々れ抗原に対する抗体産生性を確認した。ＷＢ法では２種類のポリペプチドを用いて１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、それをニトロセルロース膜に転写し、各試験血清１μｌと室温で９０分間反応させた後に２次血清として抗ニワトリＩｇＧウサギ血清を２０００倍希釈したものを用いて室温で９０分間反応させた。最後に基質として４−クロロ１−ナフトールを使用した。結果を表１３に示す。
【００５１】
【表１３】
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【００５２】
・成績と考察
ＥＬＩＳＡ法では、ＳＥ不活化ワクチンＣ、Ｄ、Ｅは用法用量で規定されている量の半量を接種したため、低い抗体価を示す鶏群もあったが、ＷＢ法に於いては５３ｋＤａポリペプチド及びＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドを抗原とした両方の場合で全ての検体でバンドが認められたため（図４〜６参照）、市販のＳＥ不活化ワクチンは５３ｋＤａポリペプチド及び９ｋＤａポリペプチドに対する抗体産生を誘導するものと考えられる。
以上より、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏について、５３ｋＤａ或いは９ｋＤａポリペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いた検出法（ＥＬＩＳＡ法）、及びこれら抗原を用いたＷＢ法によりＳＥ感染鶏と区別することができた。
【実施例５】
【００５３】
・ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドの細胞への接着性確認試験
ＳＥ fliCの一部である９ｋＤａポリペプチドがＳＥのコロニー形成の最初のステップとなる上皮細胞への接着作用を持つかどうかの確認を行った。
ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドをコーティングしたプレート、対照抗原として市販のＳＥエリーザプレート（ＣＡＦ−ＳＥエリーザ）、ＮＤエリーザプレート及び１％牛アルブミンＰＢＳ液を０．１ｍｌ／ウエルずつ分注し、１時間室温に置いた後、液を捨てた状態のプレートに夫々れ１．９×１０４個／ウエルとなるようＭＥＭで調整したＨｅＬａ細胞を分注して、３７℃で１時間反応後、液を捨てＭＥＭでウエルを洗浄し細胞の接着状態を観察した。
【００５４】
・成績と考察
ＨｅＬａ細胞と各プレートとの反応は、牛アルブミンのみを分注したプレートでは接着（−）、市販のＳＥエリーザプレート（ＣＡＦ−ＳＥエリーザ）では（＋）、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドをコーティングしたプレートでは（＋＋）、市販のＮＤエリーザプレートでは（＋＋＋）となり、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドはＨｅＬａ細胞に接着する抗原であることがわかった。
よって、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドはＳＥ fliCの中でも上皮細胞に接着することによりコロニー形成に重要な役割を果たす抗原であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本考案に係る検査キットの収納状態を示す斜視図である。
【図２】本考案に係る試料のアガロースゲル電気泳動法による７３３〜１００８ｂｐ領域のＰＣＲ像を示す図である。
【図３】本考案に係るＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドの分子量の確認像を示す図である。
【図４】本実施例に於けるＳＥ不活化ワクチンＡ及びＥ接種鶏由来血清のＷＢ反応成績を示す図である。
【図５】本実施例に於けるＳＥ不活化ワクチンＢ及びＥ接種鶏由来血清のＷＢ反応成績を示す図である。
【図６】本実施例に於けるＳＥ不活化ワクチンＤ及びＥ接種鶏由来血清のＷＢ反応成績を示す図である。
【符号の説明】
【００５６】
１      検査キット
２      容器
３      支持体
４      試薬容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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