(57)【要約】【課題】単球株化細胞に適する凍結保存方法及び該方法に利用される培地を提供することを目的とする。【解決手段】単球株化細胞の凍結保存方法であって、（１）単糖類と、血清と、を含む培地に前記単球株化細胞を分散させて分散液を調製する工程と（２）前記分散液を凍結させるとともに、液体窒素下で保存する工程と、を備える方法により、上記課題は解決される。前記単糖類がグルコースであり、前記血清がウシ血清胎児血清であることが好ましく、前記グルコースの濃度が、前記培地の全重量に対して少なくとも５重量％であることが好ましい。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球株化細胞の凍結保存方法であって、
（１）単糖類と、血清と、を含む培地に前記単球株化細胞を分散させて分散液を調製する工程と
（２）前記分散液を凍結させるとともに、液体窒素下で保存する工程と、を備える方法。
【請求項２】
前記単糖類はグルコースである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記グルコースの濃度は、培地の全重量に対して、少なくとも５重量％である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記血清はウシ胎児血清である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
単糖類と、血清と、を含む、単球株化細胞の凍結保存用培地。
【請求項６】
前記単糖類はグルコースである、請求項５記載の培地。
【請求項７】
前記グルコースの濃度は、培地の全重量に対して少なくとも５重量％である、請求項５又は６記載の培地。
【請求項８】
前記血清はウシ胎児血清である、請求項５記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、株化細胞の凍結保存方法及びその方法に利用される培地に係り、より詳細には、動物の単球株化細胞の凍結保存方法及びその方法に利用される培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の凍結保存は、継代による細胞変質の防止や雑菌による汚染の防止、並びに継代維持の煩雑さの解消のために行われている。
【０００３】
現在までに利用されている細胞の凍結保存用培地は、通例、ウシ胎児血清（以下「ＦＢＳ」と略称する。）と、５〜１５％のジメチルソルホキシド（以下「ＤＭＳＯ」と略称する。）やグリセリンが利用される（たとえば、非特許文献１参照）。そして、多くの細胞がかかる凍結培地にて十分に保存されることが知られている。そして、前記培地に細胞を懸濁し、クライオチューブやアンプルに詰め、プログラムフリーザーを用いて、−１℃／ｍｉｎ前後の速度で冷却し、最終的に液体窒素中（−１９６℃）での保存方法が一般的である。
【０００４】
特に、前記培地としてＤＭＳＯが古くから細胞の凍結保存に用いられる利点は、凍結保存時の細胞に存在する氷の結晶を大きくし、その後、保存状態から前記細胞を融解させたときに、細胞が死滅させないためである、といわれている。
【０００５】
しかしながら、イヌ、豚やネコなどの単球株化細胞の凍結保存のために、前述したＦＢＳとＤＭＳＯとを含む凍結培地を適用した場合には、他の細胞とは異なり、十分な保存効果を奏しないことを、本発明者は発見した。また、熱失活ＦＢＳの１０％を添加した増殖培地中で、凍結保存後の前記単球株化細胞が成長したが、前記増殖培地を頻繁にリフレッシュする必要があるという煩雑さを伴うものであった。
【０００６】
なお、イヌやブタの単球株化細胞の樹立は、本発明者がなしたものである（非特許文献２及び３を参照）。とりわけ、単球株化細胞は免疫学及び感染症学の研究に極めて有用な細胞であるため、長期間の保存が可能となれば、本研究分野のますますの進展が期待される。
【０００７】
そのため、ヒトを含む動物の単球株化細胞の凍結保存方法及び該方法に利用される培地の開発が強く要望されている。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７２（２００３）  ３５−４８
【非特許文献２】
Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ，  ２３：  ４４１−４４４
【非特許文献３】
Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ，  ２４：  ２４３−２４７
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上記事情に鑑み、動物の単球株化細胞に適する凍結保存方法及び該方法に利用される培地を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的は、単球株化細胞の凍結保存方法であって、（１）単糖類と、血清と、を含む培地に前記単球株化細胞を分散させて分散液を調製する工程と（２）前記分散液を凍結させるとともに、液体窒素下で保存する工程と、を備える方法により達成される。
【００１０】
本発明の好ましい態様によれば、前記方法において、前記単糖類がグルコースであることを特徴とする。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、前記方法において、前記グルコースの濃度が、培地の全重量に対して、少なくとも５重量％であることを特徴とする。
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、前記方法において、前記血清がウシ胎児血清であることを特徴とする。
【００１３】
また、上記の目的は、単糖類と、血清と、を含む、単球株化細胞の凍結保存用培地により達成される。
【００１４】
本発明の好ましい態様によれば、前記培地において、前記単糖類がグルコースであることを特徴とする。
【００１５】
本発明の好ましい態様によれば、前記培地において、前記グルコースの濃度が、培地の全重量に対して、少なくとも５重量％であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、前記培地において、前記血清はウシ胎児血清であることを特徴とする。
【００１７】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。
本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。
【００１８】
本発明に利用される動物は、特に限定されるものではないが、イヌ、ブタ、ネコやヒトなどが挙げられる。そして、かかる動物の単球株化細胞の凍結保存を対象とする。
【００１９】
本発明に利用される単球株化細胞は、健常な種々の動物の抹消血液中から採取される単球細胞を継代させたものを利用する。たとえば、イヌの例では、健常な若年のメスのビーグル犬から採取直後の血液にヘパリンを添加して、冷却させたリン酸緩衝化生理食塩水で希釈したのちに、所定のプロトコールに従って得られた単球細胞を継代させた、単球株化細胞が、本発明において利用可能である。
【００２０】
本発明に係る凍結保存方法について、具体的に説明する。前述のように得られた単球株化細胞を、単糖類と血清とを含有する培地中に分散させ、その後、凍結させる。次いで、液体窒素下にて所望の期間、凍結保存する。
【００２１】
本発明に係る凍結保存方法に利用される血清には、入手可能の容易性から、ウシ胎児血清を利用することが好ましい。
【００２２】
また、本発明に係る凍結保存方法に利用される単糖類には、グルコース、フルクトース、ガラクトース等が挙げられる。特に、単球株化細胞の培地に好適な単糖類としては、グルコースが挙げられる。そして、本発明に係る凍結保存方法に利用される培地に添加される単糖類の量は、培地の全重量に対して少なくとも５重量％以上である必要がある。糖類の添加量が５重量％未満の場合、凍結保存後の融解させた際の生存率が低くなるため、好ましくない。
【００２３】
本発明に係る凍結保存方法に利用される培地には、必要に応じて、無機成分、ビタミン類、アミノ酸類を添加することができる。無機成分としては、たとえば、リン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等が挙げられる。これらの成分は、たとえば、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合物として添加できる。
【００２４】
ビタミン類としては、たとえば、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１），ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が添加できる。
【００２５】
アミノ酸類としては、たとえば、グリシン、フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等を添加できる。
【００２６】
一般に、前述の各成分は、無機成分が約０．１μＭ〜１００μＭ、ビタミン類及びアミノ酸類が、それぞれ約０．１〜約１００ｍｇ／ｌの濃度で用いることができる。
【００２７】
本発明に係る凍結保存方法に利用される培地には、予め凍結防止剤を添加して、凍結保存させるべき細胞を添加した後に、凍結する。前記凍結防止剤としては、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、グリセリン、ブドウ糖等が挙げられる。
【００２８】
本発明に利用される凍結方法としては、▲１▼単球細胞を比較的高濃度の凍結防止剤で処理した後、液体窒素で急速に冷却する方法、▲２▼細胞を凍結防止剤で処理した後、必要に応じプラグラムフリーザーなどを用いて、−４０℃〜−８０℃まで凍結し、その後液体窒素で急冷する方法（予備凍結法）が挙げられる。凍結方法は細胞の種類に応じて適当な方法を適宜選択すればよい。
【００２９】
本発明により凍結保存した細胞は、融解、給水した後に再培養に使用できる。液体窒素中に保存した単球細胞は、たとえば、３５〜３７℃の温水で急速に融解し、次いで、凍結防止剤を除去した後、好ましくは１．０〜１．２Ｍの糖を含有する培地を加えて吸水させる。その後、従来から公知の細胞培養に用いられる培地を用いて再培養させる。
【００３０】
なお、凍結保存後に融解させた単球細胞は、染色法によりその生存率を確認することができる。
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
まず、動物の単球株化細胞についての実施例を説明する。本発明においては、イヌ、ブタ、ネコ及びヒトの血液から採取した単球株化細胞を用いて、本発明に係る凍結保存方法の利用に供した。
【００３２】
［実施例１］
健常な若年のメスのビーグル犬から採取し、ヘパリンを添加した血液の約３０ｍｌに対して、３倍量の冷ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という。）で希釈した。このようにして得られた血液を、３時間１０℃に維持し、等量の比重液（ρ＝１．０７７）の上に、上澄部を静かに重層し、遠心分離（８００ｘｇ  １５分）に供したところ、遠心管のほぼ中央部にリンパ細胞と単球からなるバンドが形成され、白血球フラクションを分離した。このようにして得られた白血球フラクションを、後述する基本細胞培養培地（以下「ＣＧＭ」という。）中にて、１ｍｌあたりの細胞が約百万個となるように懸濁させ、１０ｍｌずつ、ガラスフラスコ（培養面積４ｃｍｘ８ｃｍ）に分配し、３６．５℃にて静止培養した。基本細胞培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地を僅かに修正させたものを用いた。さらに、その基本細胞培養培地には、１０００ｍｌあたり、１ｇのグルコース、２ｇのガラクトース、１ｇのフルクトース、０．３ｇのＮ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミン、０．２ｇのＨＥＰＥＳと、０．２２ｇのピルビン酸ナトリムを、さらに添加した。ＣＧＭ中に、熱失活させたウシ胎児血清（以下「ＦＢＳ」という。）を、１０〜２０％で含有させた。また、常法にしたがって抗生物質を添加した。１日培養後、非接着細胞を除去するため、温ＣＧＭで一次培養をリンスし、次いで、培養中、３日から４日の間隔で、前記ＣＧＭの３分の１の量を置換した。このようにして、４週に亘り細胞培養した。そして、このように培養させた細胞のうちの一部を、ピペットにて取出し、ペトリ皿に移動させ、インビトロでの成長を確保した。そのうちの一つをＣｎ／Ｋ９９と指称し、継代培養させた。本発明では、第１２代及び第１５代の継代培養させた細胞を、下記の実験に利用した。
【００３３】
［実験例２］
健常な大人のメスブタから採取した血液であって、直後にヘパリンを添加した血液の約５０ｍｌに対して、カルシウム及びマグネシウム塩を含有しない冷ＰＢＳにて希釈した。リンパ球及び単球を主に含有する白血球フラクションを、遠心分離（８００ｘｇ  １５分）により得た。このようにして得られた白血球フラクションを、前述のＣＧＭにて、１ｍｌあたりの細胞が約百万個となるように懸濁させ、３６．５℃にて静止培養させるために細胞培養用ガラスフラスコにて分散させた。接着細胞のみを維持するため、一次培養を、２０時間培養中に温ＣＧＭでリンスした。３週間培養後、数多の接着細胞を同定した。実際に、ブタ単球細胞培養から取出した調製済培地の添加後、細胞成長は、顕著に向上した。そのうちの一つを、ＳＷ／Ｋ９９と指称し、ガラスフラスコ及びプラスチックフラスコにて継代培養させた。本発明では、第４８代及び第４９代の継代培養させた細胞を、後述する実験に利用した。
【００３４】
［実施例３］
健常なメスネコ（２歳）から採取した血液であって、直後にヘパリンを添加した、レトロウイルス及びコロナウイルス不存在の血液約１０ｍｌに対し、カルシウム及びマグネシウム塩を含有しない冷ＰＢＳで希釈した。リンパ球及び単球を主に含有する白血球フラクションを、実施例１と同様な条件にて濃度勾配遠心分離により得た。このようにして得られた白血球フラクションを、前述のＣＧＭにて１ｍｌあたりの細胞が約百万個となるように懸濁させ、細胞培養用ガラスフラスコにて分散させて、３６．５℃にて静止培養させた。一次培養を、２０時間培養液中にて温ＣＧＭでリンスした。このようにして、非接着細胞を除去した。２週間の培養中、１日に２回ＣＧＭを置換し、数多の上皮細胞成長を開始し、そのうちの一つをＦＬ／Ｋ０２と指称し、ガラスフラスコにて継代培養させ、第１３代及び第１４代の継代培養させた細胞を後述する実験に供した。
【００３５】
［実施例４］
ヒトの採取直後の約３０ｍｌの血液にヘパリンを添加し、二価の陽イオン不含有の冷ダベルッコリン酸緩衝化生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という。）で希釈した。このようにして得られた血液を、等量の比重液（ρ＝１．０７７ｇ／ｍｌ）の上に、上澄部を静かに重層し、遠心分離（８００ｘｇ  １５分）に供したところ、遠心管のほぼ中央にリンパ細胞と単球からなるバンドが形成された。このバンドを、ＣＧＭにて懸濁させ、遠心分離を繰り返した。その後、１ｍｌ当たりの細胞が約２００万個となるように、１０ｍｌずつ、再度ＧＭ中にて懸濁させ、ガラス製の細胞培養フラスコ（培養面積：３２ｃｍ２）にて分配し、３６．５℃にて静止培養した。接着性細胞のみを入手するため、２０時間培養後、少なくとも１日２回、半分量のＧＭをリフレッシュした。２週間後、数多の接着性クローン細胞の成長が確認された。そのうちの特に増殖性の優れた系の一つを「Ｋ６３」と命名し、２６代までは継代培養させた。そして、後述する凍結保存の実験には１２代及び２４代と継代培養させた細胞を利用した。
［凍結保存］
上記のようにして得られた細胞を、１０％ＦＢＳを含有する栄養培地（以下「ＧＭ」という。）を用いて、ガラスフラスコにて成長させた。培養後の細胞をＥＤＴＡ−チロシン混合溶液にて分散さえ、冷ＧＭで２回洗浄し、次いで、後述する凍結保存培地にて再懸濁させた。
【００３６】
本発明の実験に供した凍結保存培地を、以下に示す。
（１）培地１：本発明に係る培地であって、７５容のＦＢＳ＋２５容の２０％（ｗ／ｖ）グルコースからなる。
（２）培地２：比較例として、６５容のＦＢＳ＋２５容の２０重量％のグルコース＋１０容のＤＭＳＯからなる。
（３）培地３：比較例として、６５容のＦＢＳ＋２５容の２０重量％のグルコース＋１０容のグリセリンからなる。
（４）培地４：比較例として、１０％ＦＢＳを含有する栄養液９０容＋１０容のＤＭＳＯとからなる。
【００３７】
各種単球細胞を、１．５ｍｌあたりの細胞が約２００万から３５０万個となるように上記培地を含有する凍結チューブ（住友ベークライト（株）製の血清チューブ）にて懸濁させた。直後に、これらのチューブを４℃で４０分間維持し、次いで、−８０℃で４０分間に維持させたのち、液体窒素にて保存した。
【００３８】
液体窒素において３０日間保存した後、細胞を３８℃の水浴中で５分間融解し、次いで、十分量の冷ＧＭで、細胞を１回洗浄した。トリパンブルー色素排除試験によって細胞の生存率を調べるために、洗浄後の細胞を前記ＧＭにて、再度、懸濁し希釈した。
【００３９】
さらに、この細胞懸濁液をＧＭで希釈して、ガラス製ペトリ皿（直径６ｃｍ）に、１皿あたり１０ｍｌ、または１スリップあたり１．５ｍｌずつ播種した。これらの培地を、温度３６．５℃、湿度９９％で、０．１％ＣＯ２ガスを還流しながら、３日間インキュベートした。５％ホルマリン含有の０．１％クリスタルバイオレット溶液で２分間染色した後、ペトリ皿中の細胞クローン数を数えた。スリップ培養をメタノールで固定し、ギムザ染色を行った。
【００４０】
図１は、本発明の実験にて行った凍結保存後の全ての単球株化細胞の融解後の回収率の結果を示す。図１に示す結果から明らかなように、本発明に係る培地１は、ＳＷ／Ｋ９９、Ｃｎ／Ｋ９９、ＦＬ／Ｋ０２及びＫ６３の各単球株化細胞に対して、それぞれ９７．５％、９５．５％、９８．５％及び９２・５％という、高い生存率にて回収することが可能であることが実証された。
【００４１】
一方、培地２〜４の結果が示すように、培地１と比較すると、各単球株化細胞の凍結保存後の融解による回収率はかなり低い結果が得られた。具体的には、ＳＷ／Ｋ９９について、ＤＭＳＯやグリセリンを含有する培地である、培地２、培地３と培地４では、それぞれ、７２．５％、７０．５％と７３．６％という回収率で、実用的ではないことが明らかとなった。対照的に、本発明に係る培地１では、単球株化細胞にとっては、実用的に有用な凍結保存用培地であることが判明した。
【００４２】
【発明の効果】
本発明による血清及び単糖類であるグルコースを含有する培地を用いれば、単球株化細胞にとって、有用な凍結保存方法及び凍結保存用培地が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明にて行った凍結保存後の全ての単球株化細胞の融解後の回収率の結果を示す。
【図１】
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