(57)【要約】【課題】高い抗がん効果が得られる、複数の剤を組み合わせて投与されるがん用医薬組成物を提供する。【解決手段】ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含み、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与されるがん用医薬組成物。【選択図】図６Ｉ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含み、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与される、がん用医薬組成物。
【請求項２】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤を有効成分として含む、請求項１に記載のがん用医薬組成物。
【請求項３】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤又はＭＥＴ阻害剤を有効成分として含む、請求項１に記載のがん用医薬組成物。
【請求項４】
前記ＭＥＴ阻害剤は、ＭＥＴ特異的阻害剤である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のがん用医薬組成物。
【請求項５】
前記ＭＥＴ阻害剤は、カプマチニブ、テポチニブ、チバンチニブ、サボリチニブ（ＡＺＤ６０９４）、ＡＭＧ３３７、及びＯＭＯ−１からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のがん用医薬組成物。
【請求項６】
前記ＭＥＴ阻害剤は、カプマチニブである、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のがん用医薬組成物。
【請求項７】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ゴルジ体機能阻害剤である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のがん用医薬組成物。
【請求項８】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ＭＥＴ成熟阻害剤である、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のがん用医薬組成物。
【請求項９】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ピタバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、及びメバスタチンからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のがん用医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ピタバスタチンである、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のがん用医薬組成物。
【請求項１１】
ＧＧＰＳ１をバイオマーカーとして前記がん用医薬組成物に感受性を有すると判断された対象に投与される、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載のがん用医薬組成物。
【請求項１２】
前記がんは、口腔扁平上皮がん又は食道扁平上皮がんである、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のがん用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、がん用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは悪性新生物とも呼ばれ、その治療は医学における大きな目標の１つとなっている。従来、放射線、化学的抗がん剤を用いた治療などが行われてきたが、その効果はがんの種類によっても大きく異なり、全てのがんに対して高い効果が得られるわけではない。
【０００３】
いくつかのがん腫に対して、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が有用であることが示唆されている。現在のところ、例えば以下のような報告がなされている。
例えば、非特許文献１には、メバロン酸経路の阻害剤、具体的には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（スタチン系化合物）は、ヒト悪性腫瘍に対して抑制効果を有することが開示されている。
【０００４】
例えば、非特許文献２には、ピタバスタチンが転写因子ＦＯＸＯ３ａ（Forkhead box O3）を活性化させることで、ＦＯＸＯ３ａがＰＵＭＡ（p53 upregulated modulator of apoptosis）を活性化させ、口腔扁平上皮がん細胞のアポトーシスを誘導したことが開示されている。
【０００５】
例えば、非特許文献３には、黒色腫細胞に対してピタバスタチン及び抗悪性腫瘍剤であるダカルバジンを２剤同時添加することによって、黒色腫細胞のアポトーシスとオートファジーが活性化され、黒色腫細胞に対して相乗的な細胞毒性をもたらしたことが開示されている。
【０００６】
例えば、非特許文献４には、卵巣がん細胞に対してピタバスタチン及び合成副腎皮質ホルモン製剤であるプレドニゾロンを２剤同時添加することによって、卵巣がん細胞のメバロン酸経路が阻害され、卵巣がん細胞に対して相乗的な細胞死を誘発したことが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】A. Gobel, M. Rauner, L. C. Hofbauer, T. D. Rachner, Cholesterol and beyond - The role of the mevalonate pathway in cancer biology. Biochim Biophys Acta Rev Cancer 1873, 188351 (2020)
【非特許文献２】N. Lee, N. T. Pun, WJ. Jang, J. W. Bae, CH. Jeong, Pitavastatin induces apoptosis in oral squamous cell carcinoma through activation of FOXO3a. J Cell Mol Med, 00:1-12 (2020)
【非特許文献３】A. Al-Qatati, S. Aliwaini, Combined pitavastatin and dacarbazine treatment activates apoptosis and autophagy resulting in synergistic cytotoxicity in melanoma cells. Oncol Lett 14, 7993-7999 (2017)
【非特許文献４】M. I. Abdullah, M. N. Abed, F. Khanim, A. Richardson, Screening a library of approved drugs reveals that prednisolone synergizes with pitavastatin to induce ovarian cancer cell death. Sci Rep 9, 9632 (2019)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の抗がん剤によっても十分な治療効果が得られない場合があり、さらなる抗がん剤の開発が望まれる。
【０００９】
本開示は、上記に鑑みなされたものであり、高い抗がん効果が得られる、複数の剤を組み合わせて投与されるがん用医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞  ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含み、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与される、がん用医薬組成物。
＜２＞  ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤を有効成分として含む、上記＜１＞に記載のがん用医薬組成物。
＜３＞  ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤又はＭＥＴ阻害剤を有効成分として含む、上記＜１＞に記載のがん用医薬組成物。
＜４＞  前記ＭＥＴ阻害剤は、ＭＥＴ特異的阻害剤である、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のがん用医薬組成物。
＜５＞  前記ＭＥＴ阻害剤は、カプマチニブ、テポチニブ、チバンチニブ、サボリチニブ（ＡＺＤ６０９４）、ＡＭＧ３３７、及びＯＭＯ−１からなる群より選択される少なくとも１つを含む、上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載のがん用医薬組成物。
＜６＞  前記ＭＥＴ阻害剤は、カプマチニブである、上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載のがん用医薬組成物。
＜７＞  前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ゴルジ体機能阻害剤である、上記＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載のがん用医薬組成物。
＜８＞  前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ＭＥＴ成熟阻害剤である、上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のがん用医薬組成物。
＜９＞  前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ピタバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、及びメバスタチンからなる群より選択される少なくとも１つである、上記＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載のがん用医薬組成物。
＜１０＞  前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ピタバスタチンである、上記＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載のがん用医薬組成物。
＜１１＞  ＧＧＰＳ１をバイオマーカーとして前記がん用医薬組成物に感受性を有すると判断された対象に投与される、上記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載のがん用医薬組成物。
＜１２＞  前記がんは、口腔扁平上皮がん又は食道扁平上皮がんである、上記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載のがん用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本開示によれば、高い抗がん効果が得られる、複数の剤を組み合わせて投与されるがん用医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＦＤＡ承認薬ライブラリを使用した、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞によるスクリーニングの結果と、ＦＤＡ承認薬ライブラリのうち、細胞増殖率が低かった薬剤上位１５種類のリストを示す。
【図１Ｂ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に対する、ピタバスタチン（０．１、０．２５、０．５、１、又は２μＭ）又は対照溶媒（２μＭ相当）処理７２時間後における細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。なお図中、ＮＣは、陰性対照を示す。以下の説明においても、同様に、ＮＣは陰性対照を示す。図中、Ｐｉｔａは、ピタバスタチンを示す。以下の説明においても、同様に、Ｐｉｔａはピタバスタチンを示す。
【図１Ｃ】４３種類のＥＳＣＣ細胞株に対する、ピタバスタチン（２μＭ）又は対照溶媒（２μＭ相当）処理７２時間後における細胞増殖率の結果を示す。各データは、２回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１Ｄ】２３種類のＯＳＣＣ細胞株に対する、ピタバスタチン（２μＭ）又は対照溶媒（２μＭ相当）処理７２時間後における細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１Ｅ】ピタバスタチン（０．１、０．５、又は１μＭ）で７２時間処理された、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞、ＫＹＳＥ７０細胞、ＫＹＳＥ１５０細胞、ＫＹＳＥ２００細胞、ＫＹＳＥ５１０細胞、ＫＹＳＥ１１９０細胞、及びＫＹＳＥ１４４０細胞における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図１Ｆ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞を用いたｉｎ ｏｖｏ実験の概略、腫瘍の画像、及び腫瘍重量の結果を示す。対照群［酢酸を含むＰＢＳ］の検体数はｎ＝２４とし、ピタバスタチン群の検体数はｎ＝２４とした。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１Ｇ】ＫＹＳＥ２００細胞を用いたｉｎ ｏｖｏ実験における、腫瘍の画像、及び腫瘍重量の結果を示す。対照群［酢酸を含むＰＢＳ］の検体数はｎ＝９とし、ピタバスタチン群の検体数はｎ＝１２とした。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１Ｈ】マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験の概略、腫瘍の画像、及び腫瘍重量の結果を示す。対照群［酢酸を含むＰＢＳ］の検体数はｎ＝４とし、ピタバスタチン群［１ｍｇ／ｋｇ］の検体数はｎ＝５、又はピタバスタチン群［２ｍｇ／ｋｇ］の検体数はｎ＝４とした。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１Ｉ】ピタバスタチン（１ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇ）で処理又は対照溶液で処理した、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞の腫瘍増殖曲線を示す。腫瘍サイズは、腫瘍サイズ（ｍｍ３）=［（長さ）×（幅）２］／２）の式を利用して計測した。エラーバーは標準偏差を表す。
【００１３】
【図２Ａ】メバロン酸経路の概略図である。なお図中の略号は、本開示に記載の略号と同様である。
【図２Ｂ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に、ピタバスタチン（１μＭ）、及び、各代謝物（メバロン酸［５００μＭ］、ＩＰＰ［５μＭ］、ＧＰＰ［５μＭ］、ＦＰＰ［５μＭ］、コレステロール［５０μＭ］、又はＧＧＰＰ［５μＭ］）で７２時間処理した場合の、細胞増殖率の結果を示す。各データは、２回又は３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図２Ｃ】図２Ｂの実験と同様の実験条件における、ＦＡＣＳによるアポトーシス率の結果を示す。各データは、２回又は３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図２Ｄ】図２Ｂの実験と同様の実験条件における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図２Ｅ】ＫＹＳＥ１５０細胞に、ピタバスタチン（１μＭ）、及び、各代謝産物（メバロン酸［５００μＭ］、ＩＰＰ［５μＭ］、ＧＰＰ［５μＭ］、ＦＰＰ［５μＭ］、コレステロール［５０μＭ］、又はＧＧＰＰ［５μＭ］で７２時間処理した場合の、細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図２Ｆ】図２Ｅの実験において、細胞の種類をＫＹＳＥ２００細胞に変更した場合の、細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図２Ｇ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞及びＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞に、ピタバスタチン（０．１、０．２５、０．５、１、又は２μＭ）又は対照溶媒（２μＭ相当）で７２時間処理した場合の、細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図２Ｈ】ピタバスタチン（０．１、０．５、又は１μＭ）で７２時間処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【００１４】
【図３Ａ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に、ｓｉ−ＮＣ、ｓｉ−ＧＧＰＳ１＃１、又はｓｉ−ＧＧＰＳ１＃２を導入してから７２時間後における、ＧＧＰＰ（５μＭ）有無による、細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図３Ｂ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に、ｓｉ−ＮＣ、ｓｉ−ＧＧＰＳ１＃１、又はｓｉ−ＧＧＰＳ１＃２を導入してから１２０時間後における、ＧＧＰＰ（５μＭ）有無による、細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図３Ｃ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に、各ｓｉＲＮＡを導入してから１２０時間における、ＧＧＰＰ有無による、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図３Ｄ】ＫＹＳＥ１５０細胞に、ｓｉ−ＮＣ、ｓｉ−ＧＧＰＳ１＃１、又はｓｉ−ＧＧＰＳ１＃２を導入してから７２時間後における、ＧＧＰＰ（５μＭ）有無による、細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図３Ｅ】ＫＹＳＥ１５０細胞に、各ｓｉＲＮＡを導入してから７２時間における、ＧＧＰＰ有無による、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図３Ｆ】ＤＧＢＰ（１μＭ）で処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞、ＫＹＳＥ１５０細胞、及びＫＹＳＥ２００細胞における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図３Ｇ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞を用いたｉｎ ｏｖｏ実験の概略、腫瘍の画像、及び腫瘍重量の結果を示す。対照群［ＤＭＳＯを含むＰＢＳ］の検体数はｎ＝１７とし、ＤＧＢＰ群の検体数はｎ＝１８とした。エラーバーは標準偏差を表す。
【００１５】
【図４Ａ】ヒトリン酸化ＲＫＴアレイの結果を示す。図中、四角枠内の位置は、ＭＥＴを検出している位置を示す。
【図４Ｂ】ピタバスタチン（０．１、０．５、又は１μＭ）処理７２時間後における、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞及びＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞内の、ＭＥＴ及びリン酸化ＭＥＴ（ｐＭＥＴ）に関するウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図４Ｃ】ｑＲＴ−ＰＣＲによる、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞及びＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞におけるＭＥＴのｍＲＮＡ発現レベルの結果を示す。各データは、２回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図４Ｄ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に、ピタバスタチン（１μＭ）、及び、各代謝産物（メバロン酸［５００μＭ］、ＩＰＰ［５μＭ］、ＧＰＰ［５μＭ］、ＦＰＰ［５μＭ］、コレステロール［５０μＭ］、又はＧＧＰＰ［５μＭ］）で７２時間処理した場合の、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図４Ｅ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に、ｓｉ−ＮＣ、ｓｉ−ＧＧＰＳ１＃１、又はｓｉ−ＧＧＰＳ１＃２を導入してから７２時間後における、ＧＧＰＰ有無による、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図４Ｆ】ＫＹＳＥ２２０細胞及びＴＥ１４細胞に、ピタバスタチン（８μＭ）、及びＧＧＰＳ１特異的ｓｉＲＮＡの導入有無から７２時間後における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図４Ｇ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に、ピタバスタチン（１μＭ）処理し、メバロン酸有無又はＧＧＰＰ有無の条件にて、ＭＥＴ（緑色）及びＧＢＦ１（赤色）を染色した結果である。
【図４Ｈ】ｓｉ−ＧＧＰＳ１＃２を導入したＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に、ピタバスタチン（１μＭ）処理し、メバロン酸有無又はＧＧＰＰ有無の条件にて、ＭＥＴ（緑色）及びＧＢＦ１（赤色）を染色した結果である。
【図４Ｉ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に、ピタバスタチン（１μＭ）処理し、メバロン酸有無又はＧＧＰＰ有無の条件にて、ＭＥＴ（緑色）及びＧＭ１３０（赤色）を染色した結果である。
【図４Ｊ】ｓｉ−ＧＧＰＳ１＃２を導入したＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞に、ピタバスタチン（１μＭ）処理し、メバロン酸有無又はＧＧＰＰ有無の条件にて、ＭＥＴ（緑色）及びＧＭ１３０（赤色）を染色した結果である。
【図４Ｋ】メバロン酸又はＧＧＰＰの存在下又は非存在下で、ピタバスタチン処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞におけるＡｒｆ1−ＧＴＰプルダウンアッセイを行った結果である。各データは、２回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図４Ｌ】ピタバスタチン（０．５μＭ又は１μＭ）又は対照溶媒で４８時間処理された後、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、図に示されるタンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図４Ｍ】ピタバスタチン（１μＭ又は２μＭ）、シンバスタチン（５μＭ、１０μＭ、又は２０μＭ）、ロスバスタチン（１０μＭ又は２０μＭ）、フルバスタチン（１μＭ、２μＭ、又は４μＭ）、又は対照溶媒で７２時間処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。図中、Ｓｉｍｖａ、Ｒｏｓｕｖａ、Ｆｌｕｖａは、それぞれ、シンバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチンを示す。以下の説明においても、同様に、Ｓｉｍｖａ、Ｒｏｓｕｖａ、Ｆｌｕｖａは、それぞれ、シンバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチンを示す。
【図４Ｎ】ピタバスタチン（１μＭ）、ＤＧＢＰ（１μＭ）、ＣＤＤＰ（１０μＭ）、クリゾチニブ（１μＭ）、又は対照溶媒で７２時間処理された、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞、ＫＹＳＥ１５０細胞、及びＫＹＳＥ２００細胞における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。図中、Ｃｒｉｚｏは、クリゾチニブを示す。以下の説明においても、同様に、Ｃｒｉｚｏはクリゾチニブを示す。
【００１６】
【図５Ａ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、ピタバスタチン（０．１２５、０．２５、０．５、１、又は２μＭ）及び／又はカプマチニブ（０．１、０．５、又は１μＭ）による７２時間処理後の細胞増殖率の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ａの実験における、ピタバスタチンとカプマチニブとの相乗効果の分析結果を示す。なおＣＩ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）値に関して、ＣＩ＝１は相加効果を有することを示し、ＣＩ＜１は相乗効果を有することを示し、ＣＩ＞１は拮抗作用を有することを示す。
【図５Ｃ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、ＦＡＣＳによるアポトーシス率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。図中、Ｃａｐは、カプマチニブを示す。以下の説明においても、同様に、Ｃａｐはカプマチニブを示す。なお、図中、以下においても同様に、Ｃｏｍｂｏは、２剤の組み合わせを示す。
【図５Ｄ】ピタバスタチン（１μＭ）及び／又はカプマチニブ（０．５μＭ）で７２時間処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図５Ｅ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞における、ピタバスタチン（０．１２５、０．２５、０．５、１、又は２μＭ）及び／又はカプマチニブ（０．１、０．５、又は１μＭ）による７２時間処理後の細胞増殖率の結果を示す。
【図５Ｆ】ＫＹＳＥ１５０細胞における、ピタバスタチン（０．１２５、０．２５、０．５、１、又は２μＭ）及び／又はカプマチニブ（０．１、０．５、又は１μＭ）による７２時間処理後の細胞増殖率の結果を示す。
【図５Ｇ】ＫＹＳＥ２００細胞における、ピタバスタチン（０．１、０．２５、０．５、１、又は２μＭ）及び／又はカプマチニブ（０．１２５、０．５、又は１μＭ）による７２時間処理後の細胞増殖率の結果を示す。
【図５Ｈ】図５Ｅ〜図５Ｇの実験における、ピタバスタチンとカプマチニブとの相乗効果の分析結果を示す。
【図５Ｉ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞、ＫＹＳＥ１５０細胞、及びＫＹＳＥ２００細胞における、ＦＡＣＳによるアポトーシス率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図５Ｊ】ピタバスタチン（１μＭ）及び／又はカプマチニブ（０．５μＭ）で７２時間処理したＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞、ＫＹＳＥ１５０細胞、及びＫＹＳＥ２００細胞における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図５Ｋ】ピタバスタチン（０．５μＭ）、カプマチニブ（０．５μＭ）、ピタバスタチン及びカプマチニブの組み合わせ（各０．５μＭ）、又は対照溶媒で４８時間処理した後、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理したＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図５Ｌ】カプマチニブ（０．１、０．５、又は１μＭ）と、シンバスタチン（０．６２５、１．２５、２．５、５、又は１０μＭ）による７２時間処理後の、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞の細胞増殖率の結果を示す。
【図５Ｍ】カプマチニブ（０．１、０．５、又は１μＭ）と、ロスバスタチン（２．５、５、１０、２０、又は４０μＭ）による７２時間処理後の、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞の細胞増殖率の結果を示す。
【図５Ｎ】カプマチニブ（０．１、０．５、又は１μＭ）と、フルバスタチン（０．１２５、０．２５、０．５、１又は２μＭ）による７２時間処理後の、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞の細胞増殖率の結果を示す。
【図５Ｏ】図５Ｌ〜図５Ｎの実験における、各スタチン系化合物とカプマチニブとの相乗効果の分析結果を示す。なお分析は、図５Ｌ〜図５Ｎ中のそれぞれにおける太枠四角形内の数値を使用して実施した。
【図５Ｐ】ピタバスタチン（０．１２５、０．２５、０．５、１、又は２μＭ）及び／又はクリゾチニブ（０．１２５、０．２５、又は０．５μＭ）による７２時間処理後の、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞の細胞増殖率の結果を示す。
【図５Ｑ】ピタバスタチン（０．１２５、０．２５、０．５、１、又は２μＭ）及び／又はＭＧＣＤ−２６５（グレサチニブ）（０．５、１又は２μＭ）による７２時間処理後の、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞の細胞増殖率の結果を示す。
【図５Ｒ】図５Ｐ〜図５Ｑの実験における、各ＭＥＴ阻害剤とピタバスタチンとの相乗効果の分析結果を示す。
【図５Ｓ】ピタバスタチン（０．１２５、０．２５、０．５、１、又は２μＭ）及び／又はテポチニブ（０．５、１又は２μＭ）による７２時間処理後の、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞の細胞増殖率の結果を示す。
【図５Ｔ】ピタバスタチン（０．５μＭ）及び／又はテポチニブ（２μＭ）で７２時間処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図５Ｕ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、ピタバスタチン（０．５μＭ）での処理、及び／又はｓｉ−ＭＥＴ＃１又はｓｉ−ＭＥＴ＃２によるノックダウンから７２時間後の、細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図５Ｖ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、ピタバスタチン（０．５μＭ）での処理、及び／又はｓｉ−ＭＥＴ＃１又はｓｉ−ＭＥＴ＃２によるノックダウンから７２時間後の、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図５Ｗ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞において、ピタバスタチン（１μＭ）及びカプマチニブ（０．５μＭ）、並びに、各代謝産物（メバロン酸［５００μＭ］、ＩＰＰ［５μＭ］、ＧＰＰ［５μＭ］、ＦＰＰ［５μＭ］、コレステロール［５０μＭ］、又はＧＧＰＰ［５μＭ］）で７２時間処理した後の細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図５Ｘ】ＫＹＳＥ１５０細胞において、ピタバスタチン（１μＭ）及びカプマチニブ（０．５μＭ）、並びに、各代謝産物（メバロン酸［５００μＭ］、ＩＰＰ［５μＭ］、ＧＰＰ［５μＭ］、ＦＰＰ［５μＭ］、コレステロール［５０μＭ］、又はＧＧＰＰ［５μＭ］）で７２時間処理した後の細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図５Ｙ】ＫＹＳＥ２００細胞において、ピタバスタチン（１μＭ）及びカプマチニブ（０．５μＭ）、並びに、各代謝産物（メバロン酸［５００μＭ］、ＩＰＰ［５μＭ］、ＧＰＰ［５μＭ］、ＦＰＰ［５μＭ］、コレステロール［５０μＭ］、又はＧＧＰＰ［５μＭ］）で７２時間処理した後の細胞増殖率の結果を示す。各データは、３回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図５Ｚ】各代謝産物で処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、ＦＡＣＳによるアポトーシス率の分析の結果を示す。各データは、２回の実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図５ＡＡ】各代謝産物で処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞における、タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【００１７】
【図６Ａ】ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞を用いたｉｎ ｏｖｏ実験の概略、腫瘍の画像、及び腫瘍重量の結果を示す。対照群［酢酸を含むＰＢＳ］の検体数はｎ＝９とし、ピタバスタチン［５μＭ］群の検体数はｎ＝９とし、カプマチニブ［５μＭ］群の検体数はｎ＝９とし、ピタバスタチン及びカプマチニブの組み合わせ群の検体数はｎ＝１０とした。エラーバーは標準偏差を表す。図中、ＮＳは、有意差がないことを示す。以下の説明においても、同様に、ＮＳは有意差がないことを示す。
【図６Ｂ】ＫＹＳＥ２００細胞を用いたｉｎ ｏｖｏ実験の概略、腫瘍の画像、及び腫瘍重量の結果を示す。対照群［酢酸を含むＰＢＳ］の検体数はｎ＝８とし、ピタバスタチン［５μＭ］群の検体数はｎ＝７とし、カプマチニブ［５μＭ］群の検体数はｎ＝８とし、ピタバスタチン及びカプマチニブの組み合わせ群の検体数はｎ＝８とした。エラーバーは標準偏差を表す。
【図６Ｃ】ピタバスタチン（２ｍｇ／ｋｇ）及び／又はカプマチニブ（１ｍｇ／ｋｇ）で処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞の腫瘍増殖曲線の結果を示す。対照群［酢酸を含むＰＢＳ］の検体数はｎ＝１０とし、ピタバスタチン［２ｍｇ／ｋｇ］群の検体数はｎ＝９とし、カプマチニブ［１ｍｇ／ｋｇ］群の検体数はｎ＝１０とし、ピタバスタチン及びカプマチニブの組み合わせ群の検体数はｎ＝１０とした。エラーバーは標準偏差を表す。
【図６Ｄ】図６Ｃの実験における、腫瘍の画像及び腫瘍重量の結果を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図６Ｅ】ピタバスタチン（１ｍｇ／ｋｇ）及び／又はカプマチニブ（１ｍｇ／ｋｇ）で処理されたＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞の腫瘍増殖曲線の結果を示す。対照群［酢酸を含むＰＢＳ］の検体数はｎ＝４とし、ピタバスタチン［１ｍｇ／ｋｇ］群の検体数はｎ＝４とし、カプマチニブ［１ｍｇ／ｋｇ］群の検体数はｎ＝４とし、ピタバスタチン及びカプマチニブの組み合わせ群の検体数はｎ＝５とした。エラーバーは標準偏差を表す。
【図６Ｆ】図６Ｅの実験における、腫瘍の画像及び腫瘍重量の結果を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図６Ｇ】図６Ｃの実験における、腫瘍標本におけるリン酸化ＭＥＴの免疫組織化学分析の代表的な写真を示す。
【図６Ｈ】図６Ｇの実験における、各腫瘍標本のリン酸化ＭＥＴ陽性領域を、肉眼で定量化した結果を示す。
【図６Ｉ】メバロン酸経路と細胞増殖との関係の推定、及び、ピタバスタチンとカプマチニブの細胞増殖阻害のメカニズムの推定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本開示に係る実施形態について詳細に説明する。但し、本開示は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の開示において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示を制限するものではない。
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲には、「〜」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本文中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において組成物中の各成分の含有率は、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計の含有率を意味する。
本開示において、「阻害」及び「抑制」との語は、対象となる物質又はその機能を少なくとも一部低減することを表し、対象となる物質又はその機能を完全に妨げることを必ずしも意味するものではない。
【００１９】
≪がん用医薬組成物≫
本開示に係るがん用医薬組成物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含み、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与される。
【００２０】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含み、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与されるがん用医薬組成物は、高い抗がん効果を有する。
【００２１】
なお本開示に係るがん用医薬組成物の作用は明確ではないが、以下のように推定される。
がん細胞における細胞生存又は細胞増殖のメカニズムの推定を、図６Ｉに示す。がん細胞内において、グルコースの解糖系又は脂肪酸のβ酸化において生成されたアセチルＣｏＡは、アセチルＣｏＡ同士が反応することで、アセトアセチルＣｏＡに変換される。アセトアセチルＣｏＡは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）合成酵素の働きによって、ＨＭＧ−ＣｏＡに変換される。ＨＭＧ−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）の働きによって、メバロン酸に変換される。さらにメバロン酸はイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に変換され、ＩＰＰはゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）に変換され、ＧＰＰはファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）に変換される。ＦＰＰは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＳ１）によって、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）に変換される。ＧＧＰＰは、ゴルジ体の機能を制御する。ゴルジ体において、未成熟なＭＥＴタンパク質（Immature MET）は、切断修飾され、成熟ＭＥＴ（Mature MET）となる。そして成熟ＭＥＴは、細胞膜まで輸送され、膜貫通型チロシンキナーゼ受容体として働くことができるようになる。受容体となった成熟ＭＥＴは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）との結合を経て、二量体化され、成熟ＭＥＴの細胞内側に存在するキナーゼ領域中のチロシンがリン酸化されることで、成熟ＭＥＴは活性化状態となる。そして、前記活性化された成熟ＭＥＴは、一連の細胞内カスケード反応を引き起こし、ＡＫＴ又はＥＲＫを介して、細胞の生存又は細胞の増殖を促進する。
よって、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の働きを阻害することで、ゴルジ体の機能によるＭＥＴの成熟を阻害し、細胞の生存又は細胞の増殖を阻害することができると考えられる。
さらには、ＭＥＴ阻害剤は、細胞膜まで輸送された成熟ＭＥＴの働きを阻害することで、細胞の生存又は細胞の増殖を阻害することができると考えられる。
上記したように、前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と前記ＭＥＴ阻害剤は、単独でも細胞の生存又は細胞の増殖を阻害することができるが、前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と前記ＭＥＴ阻害剤とを併用することで、より強力にＭＥＴの働きを阻害することができ、より効率の高いがん用医薬組成物として利用することができると考えられる。
なお、本開示は、上記推定機構には何ら制限されない。
【００２２】
本開示において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含むがん用医薬組成物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤を有効成分として含むがん用医薬組成物、とすることができる。つまり、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤を、配合剤として投与することができる。
【００２３】
本開示において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含むがん用医薬組成物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤又はＭＥＴ阻害剤を有効成分として含むがん用医薬組成物、とすることができる。つまり、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤又はＭＥＴ阻害剤を、単剤として投与することができる。
【００２４】
（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤）
本開示において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することができる剤であれば、特に限定されない。例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の機能を抑制する剤であってもよく、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の遺伝子転写又はタンパク質発現を抑制する剤であってもよい。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤はスタチン系化合物としても知られる。
【００２５】
本開示において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ゴルジ体機能阻害剤であることが好ましい。ゴルジ体機能阻害剤とは、ゴルジ体の機能、例えば、タンパク質のプロセシング又はタンパク質の輸送などを阻害することができる剤をいう。ゴルジ体機能阻害剤は、ゴルジ体の機能を阻害することにより、ＭＥＴの成熟を阻害するものであることが好ましい。
【００２６】
本開示において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ＭＥＴ成熟阻害剤であることがより好ましい。本開示において、ＭＥＴの成熟とは、ＭＥＴの細胞膜への移行が可能となるようにＭＥＴが切断修飾されることをいう。ＭＥＴ成熟阻害剤は、ＭＥＴの成熟を阻害できる剤であれば特に限定されない。ＭＥＴ成熟阻害剤としては、例えば、ゴルジ体においてＭＥＴを切断修飾できないようにすることができる剤が挙げられる。
【００２７】
本開示において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ピタバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン及びメバスタチンからなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。なお本開示において、上記したようなスタチン類を、まとめて、スタチン系化合物という。本開示において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、高い抗がん効果を得ることができる観点から、ピタバスタチンが特に好ましい。なお、上記スタチン系化合物として例示される化合物は、上記化合物の薬学的に許容される塩又はその水和物を包含するものとする。例えばピタバスタチンは、ピタバスタチンカルシウム水和物であってもよく、本開示において、ピタバスタチンは、ピタバスタチンカルシウム水和物を含む。
【００２８】
（ＭＥＴ阻害剤）
本開示において、ＭＥＴ阻害剤は、ＭＥＴを阻害することができる剤であれば、特に限定されない。ＭＥＴを阻害するとは、例えば、ＭＥＴの遺伝子転写又はタンパク質発現抑制による阻害であってもよく、又はＭＥＴのチロシンキナーゼ活性抑制による阻害であってもよく、つまり、ＭＥＴの下流に続くシグナルを阻害するものであればよい。なお本開示において、ＭＥＴ成熟阻害剤、すなわち、ＭＥＴの細胞膜への移行が可能となるようなＭＥＴの切断修飾を阻害する物質は、本項における「ＭＥＴ阻害剤」には含めないものとする。なおＭＥＴは、ｃ−Ｍｅｔ、又はＨＧＦＲ（hepatocyte growth factor receptor）とも呼ばれる。
【００２９】
本開示において、ＭＥＴ阻害剤は、ＭＥＴ特異的阻害剤であってもよく、マルチキナーゼ阻害剤であってもよい。ＭＥＴ特異的阻害剤は、ＭＥＴを選択的に阻害する一方、マルチキナーゼ阻害剤は、ＭＥＴ以外のキナーゼも阻害する。ＭＥＴ特異的阻害剤としては、例えば、カプマチニブ、テポチニブ、チバンチニブ、サボリチニブ（ＡＺＤ６０９４）、ＡＭＧ３３７及びＯＭＯ−１などが挙げられる。マルチキナーゼ阻害剤としては、例えば、クリゾチニブ、カボザンチニブ、フォレチニブ、ＭＧＣＤ−２６５（グレサチニブ）、アムバチニブ及びゴルバチニブなどが挙げられる。高い抗がん効果を得ることができる観点からは、ＭＥＴ阻害剤は、ＭＥＴ特異的阻害剤であることが好ましい。ＭＥＴ特異的阻害剤の例としては、ＭＥＴエクソン１４スキッピング（ＭＥＴｅｘ１４）変異に特異的なＭＥＴ特異的阻害剤（例えば、カプマチニブ）であることが好ましい。
【００３０】
本開示において、ＭＥＴ阻害剤は、カプマチニブ、テポチニブ、チバンチニブ、サボリチニブ（ＡＺＤ６０９４）、ＡＭＧ３３７、及びＯＭＯ−１からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。本開示におけるＭＥＴ阻害剤は、高い抗がん効果を得ることができる観点から、カプマチニブであることがより好ましい。
【００３１】
（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤との組み合わせ）
本開示の、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含み、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与される、がん用医薬組成物において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤はピタバスタチンであって、ＭＥＴ阻害剤はカプマチニブである組み合わせが、高い抗がん効果を得ることができる観点から特に好ましい。
【００３２】
（口腔扁平上皮がん及び食道扁平上皮がん）
がんの種類の中でも、例えば口腔がん及び食道がんは、リンパ節に容易に転移する傾向があり、予後不良となりやすいことが知られている。特に食道がんは、世界で６番目に多いがん関連死因である。特に、アジア諸国、南アフリカなどの発展途上国における口腔がん及び食道がんの発症が目立っている。日本を含むアジア諸国では、口腔がん及び食道がんのうちの９０％以上が、口腔扁平上皮がん（ＯＳＣＣ）又は食道扁平上皮がん（ＥＳＣＣ）と診断されている。
【００３３】
本開示におけるがん用医薬組成物は、高い抗がん効果を得ることができる観点から、口腔扁平上皮がん用及び食道扁平上皮がん用の医薬組成物であることが好ましい。
【００３４】
≪がん用医薬組成物の投与≫
本開示において、がん用医薬組成物の投与量、投与回数、投与頻度、投与方法、及び投与経路は特に限定されない。
【００３５】
本開示において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤又はＭＥＴ阻害剤の投与量は、がんの種類、位置、重症度、治療を受ける対象の年齢、体重、及び状態等に応じて適宜調整できる。例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤が組み合わされずに使用される場合の最大投与量、最低投与量、推奨投与量等を、本開示のがん用医薬組成物の投与量に適用することができる。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の一日あたりの用量は、例えば、対象がヒト成人である場合、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、より具体的には０．１ｍｇ〜１０ｍｇとすることができる。ＭＥＴ阻害剤の一日あたりの用量は、例えば、対象がヒト成人である場合、０．００１ｍｇ〜１０ｇ、より具体的には０．０１ｍｇ〜１ｇとすることができる。なお、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与される場合であっても、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤のそれぞれの一日あたりの用量は、前記したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の用量及びＭＥＴ阻害剤の用量と同様である。
【００３６】
本開示において、がん用医薬組成物は、当業者に既知の方法を用いて、がんの治療を必要とする対象に投与することができる。例えば、がん用医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、皮内、皮下、経直腸、吸入、局所投与（例えば、腫瘍内、経皮、経粘膜、より具体的には点鼻、舌下、パッチ等）によって投与することができる。なかでも、通院等の負担軽減、侵襲性の低減などの観点から経口が好ましい。
【００３７】
本開示において、がん用医薬組成物は、取り扱いの観点から、単位投与量の形態（経口剤、溶液、懸濁液、乳濁液等）に製剤化されていてもよい。
【００３８】
本開示において、がん用医薬組成物は、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回又は月２回の頻度で投与してもよい。また、投与回数は総計で例えば１回〜３０回、すなわち、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又は１１回〜３０回としてもよいが、３０回を超える回数投与しても構わない。
【００３９】
なお本開示において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とは同一の医薬組成物中に含まれていてもよく、この場合は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤の両方を含むがん用医薬組成物（合剤）が提供される。
【００４０】
本開示において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とはそれぞれ異なる医薬組成物中に含まれていてもよい。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とがそれぞれ異なる医薬組成物中に含まれている場合、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与される、とは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分とする医薬組成物とＭＥＴ阻害剤を有効成分とする医薬組成物とが同時に対象に投与されてもよく、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分とする医薬組成物とＭＥＴ阻害剤を有効成分とする医薬組成物とが順次に（つまり、異時に）対象に投与されてもよいことを意味する。それぞれの剤の投与回数、投与頻度の間の関係については特に限定はされない。
【００４１】
本開示において、同時に投与されるとは、複数の剤が混合された後に同時に投与されることと、複数の剤が予め混合されずに同時に投与されることと、を含む。
本開示において、順次に投与されるとは、複数の剤がそれぞれ１剤ずつ時間間隔をおいて投与されることを含む。順次に投与される場合、投与する剤の順番は特に限定されない。なお複数の剤は、それぞれ別々の経路で投与されてもよい。
【００４２】
ただし、本開示に係るＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とによる相乗効果を効果的に得る観点からは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を投与するタイミングとＭＥＴ阻害剤を投与するタイミングとの間の間隔（一方の剤を投与するタイミングと、それと最も時間的に近接しているもう一方の剤を投与するタイミングとの間の間隔）は、１週間以内であってもよく、１日以内であってもよく、１２時間以内であってもよく、１時間以内であってもよい。なお前記間隔は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤のそれぞれ又はそれぞれに由来する成分が、同時に有効血中濃度を満たすような時間間隔であることが好ましく、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時に対象に投与されてもよい。
【００４３】
なお、本開示において「組み合わせて投与」及び「併用」の用語は、複数の剤が同一の組成物に含有されて投与される場合、複数の剤が別々の組成物に含有されるが同時に投与される場合、複数の剤が別々の組成物に含有され別々の時点で投与される場合のいずれをも包含する意味で用いられる。
【００４４】
≪がん用医薬組成物に含まれるその他の組成≫
本開示において、がん用医薬組成物の剤型としては、例えば、散剤、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。本開示のがん用医薬組成物は、さらに薬学的に許容される添加剤を含有していてもよい。前記添加剤としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、乳化剤、可塑剤、フィルム形成剤、難水溶性高分子物質、抗酸化剤、矯味剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、香料、防腐剤、安定剤、希釈剤等が挙げられ、これらは１種又は２種以上を適宜組み合わせて使用することが可能である。なお、各添加剤の使用量は適宜決定することができる。
【００４５】
本開示において、がん用医薬組成物は、例えば、所定のｐＨに緩衝化されていてもよい無菌の液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散物又は粘性組成物として投与することもできる。前記液体調製物は、注射用の液体調製物であってもよく、経口用の液体調製物であってもよい。また、特定の組織との接触時間を長くするために、前記液体調製物を適切な粘度範囲内の粘度を有する粘性組成物の形態としてもよい。液体調製物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）及びそれらの混合物からなる溶媒又は分散媒を含んでいてもよい。
【００４６】
なおＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分とする医薬組成物及びＭＥＴ阻害剤を有効成分とする医薬組成物がそれぞれ単剤で投与される場合であっても、配合剤として投与される場合であっても、上記の剤型及び添加剤を適用することができる。
【００４７】
本開示に係るがん用医薬組成物は、本開示に係るがん用医薬組成物に加えて、さらに他の抗がん剤を含んでいてもよく、他の抗がん剤を併用してもよい。他の抗がん剤の例としては、例えば、代謝拮抗薬、分子標的薬、キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、カルシニューリン阻害薬、抗がん性抗生物質、植物アルカロイド、プラチナ製剤、ホルモン療法薬、免疫制御薬などを挙げることができる。
【００４８】
≪バイオマーカー≫
本開示に係るがん用医薬組成物は、ＧＧＰＳ１をバイオマーカーとして前記がん用医薬組成物に感受性を有すると判断された対象に、投与されることができる。
【００４９】
本開示においてＧＧＰＳ１をバイオマーカーとするとは、例えば、対象から採取した検体中の、ＧＧＰＳ１のタンパク質量又はＧＧＰＳ１のｍＲＮＡ量などを評価のターゲットとすることをいう。例えば、バイオマーカーとなりえるＧＧＰＳ１の発現が所定量以下、所定量未満、又は検出限界以下である対象を、本開示のがん用医薬組成物に感受性を有すると判断し、当該対象に本開示のがん用医薬組成物を投与することができる。さらには、ＧＧＰＳ１と他のバイオマーカーとを組み合わせて、本開示のがん用医薬組成物を投与する対象を特定してもよい。例えば、ＧＧＰＳ１とＭＥＴ遺伝子変異の有無をバイオマーカーとして、本開示のがん用医薬組成物を投与する対象を特定してもよい。
【００５０】
≪対象におけるがんの治療方法≫
本開示によれば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含み、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与される、がん用医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法が提供される。
さらには、本開示によれば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含み、口腔扁平上皮がん又は食道扁平上皮がんの治療に使用される、がん用医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法が提供される。
【００５１】
本開示に係るがんの治療方法における対象、がんの種類、用量、投与スケジュール等の、治療方法の詳細については、特に限定されない。
【００５２】
本開示に係るがん用医薬組成物をがんの治療に用いる場合、治療の対象は例えば任意の哺乳動物でよいが、例えば霊長類の動物であり、より具体的にはヒトであってもよい。治療対象は、愛玩動物又は家畜であってもよく、その例としては、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。
治療の対象となるがん（癌）は、固形がんでも血液がんでもよく、腺がん、扁平上皮がん（例えば、口腔扁平上皮がん及び食道扁平上皮がん）、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、小細胞がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、子宮頸部がん、子宮がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、肺がん、気管がん、気管支がん、結腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、胆嚢がん、精巣がん、卵巣がん等のがん、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんのほか、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫等の肉腫、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫等の芽腫、胚細胞腫瘍、リンパ腫、並びに白血病を挙げることができる。
【００５３】
本開示に係るがん用医薬組成物は、がんの確定診断がされる前であっても、対象内におけるがん細胞の存在が疑われる状況においては、対象に予防的に投与してもよい。本開示においては、このような使用形態も、がんの治療の概念に包含される。
【００５４】
≪がんの治療のためのがん用組成物の使用≫
本開示の一態様は、がんの治療のための、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含み、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与される、がん用医薬組成物の使用を含む。
さらには、本開示の一態様は、がんの治療のための、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含み、口腔扁平上皮がん又は食道扁平上皮がんの治療に使用される、がん用医薬組成物の使用を含む。
上記の使用においても、がん用医薬組成物の詳細については、前述の本開示に係るがん用医薬組成物の説明がそのまま当てはまる。
【００５５】
≪がん用治療薬の製造における使用≫
本開示によれば、がんを治療するための医薬の製造における、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含み、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与される、がん用医薬組成物の使用が提供される。
さらには、本開示によれば、がんを治療するための医薬の製造における、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含み、口腔扁平上皮がん又は食道扁平上皮がんの治療に使用される、がん用医薬組成物の使用が提供される。
上記の使用においても、がん用医薬組成物の詳細については、前述の本開示に係るがん用医薬組成物の説明がそのまま当てはまる。
【００５６】
≪ＧＧＰＳ１阻害剤≫
なお、本開示は上述の態様に制限されず、さらに以下の態様を含む。
本開示の一態様によれば、ＧＧＰＳ１阻害剤及びＭＥＴ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含み、ＧＧＰＳ１阻害剤とＭＥＴ阻害剤とが同時又は順次に組み合わせて投与される、がん用医薬組成物が提供される。
ＧＧＰＳ１阻害剤は、ＧＧＰＳ１を阻害するものであれば限定されない。例えば、ＧＧＰＳ１阻害剤は、ＧＧＰＳ１の作用を阻害するものであってもよく、ＧＧＰＳ１の遺伝子転写又はタンパク質発現を抑制するものであってもよい。
【実施例】
【００５７】
以下、本開示を実施例により更に具体的に説明するが、本開示はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。「％」も同様に質量基準である。
【００５８】
実施例で使用されている略語を以下に示す。
ＥＳＣＣ      ：食道扁平上皮がん
ＯＳＣＣ      ：口腔扁平上皮がん
ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞：口腔扁平上皮がん由来の細胞
ＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞：ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞を親株とするピタバスタチン耐性細胞
ＭＥＶ        ：メバロン酸
ＩＰＰ        ：イソペンテニル二リン酸
ＧＰＰ        ：ゲラニル二リン酸
ＦＰＰ        ：ファルネシル二リン酸
ＧＧＰＳ１    ：ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ
ＧＧＰＰ      ：ゲラニルゲラニル二リン酸
ＨＧＦ        ：肝細胞増殖因子
ＭＥＴ        ：ＭＥＴタンパク質
ｐＭＥＴ      ：リン酸化されたＭＥＴタンパク質
ＡＫＴ        ：ＡＫＴタンパク質
ｐＡＫＴ      ：リン酸化されたＡＫＴタンパク質
ＥＲＫ        ：ＥＲＫタンパク質
ｐＥＲＫ      ：リン酸化されたＥＲＫタンパク質
ｃＰＡＲＰ    ：切断されたポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ
ＤＧＢＰ      ：ジゲラニルビスホスホネート
ＲＴＫ        ：受容体チロシンキナーゼ
ＮＣ          ：陰性対照
Ｐｉｔａ      ：ピタバスタチン
Ｃａｐ        ：カプマチニブ
Ｓｉｍｖａ    ：シンバスタチン
Ｒｏｓｕｖａ  ：ロスバスタチン
Ｆｌｕｖａ    ：フルバスタチン
Ｃｒｉｚｏ    ：クリゾチニブ
Ｔｅｐｏ      ：テポチニブ
Ｃｏｍｂｏ    ：２剤の組み合わせ
ＣＤＤＰ      ：シスプラチン
Ｐ            ：ｔ検定を用いて統計解析した有意確率
ＳＤ          ：標準偏差
ＮＳ          ：有意差なし
【００５９】
（細胞培養及び正常組織からのＲＮＡ抽出）
合計４３種類のＥＳＣＣ細胞株を使用した。前記ＥＳＣＣ細胞株のうち、３１種類は腫瘍から確立されたＫＹＳＥシリーズ細胞株を使用し、残りの１２種類は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターによって提供されたＴＥシリーズ細胞株を使用した。また、合計２３種類のＯＳＣＣ細胞株として、東京医科歯科大学で腫瘍から確立された細胞株又はＪＣＲＢ細胞バンク（日本、大阪）から購入した細胞株を使用した。高転移性細胞株（ＨＯＣ３１３−ＬＭ）としては、ＨＯＣ３１３細胞から東京医科歯科大学で確立されたものを使用した。ＥＳＣＣ及びＯＳＣＣ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、かつ加湿された条件下で、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ培地中又はＤＭＥＭ培地中で培養した。全ての細胞株について、細胞の形態を観察することで、それぞれの細胞株が正しく培養されていることを確認した。食道、舌、及び喉の正常組織におけるＲＮＡは、ＢｉｏＣｈａｉｎ（米国、カリフォルニア州、ニューアーク）から購入した。
【００６０】
（ＦＤＡ承認薬ライブラリの細胞増殖率に関するスクリーニング）
ＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局 (Food and Drug Administration））承認薬ライブラリ（ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）ＦＤＡ承認薬ライブラリＶ２）を、エンゾライフサイエンス社（米国、ニューヨーク州、ファーミングデール）から購入した。ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞を、９６ウェルプレートに３．５×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。翌日に、７６６種類の前記ＦＤＡ承認薬を、それぞれ１μＭの濃度で各ウェルに添加した。添加２４時間後に、各ウェルの細胞をクリスタルバイオレット溶液で染色した。その後、染色された細胞を２％ＳＤＳに溶解し、細胞密度を吸収分光計（５６０ｎｍ）で測定した。
【００６１】
（細胞増殖率の測定）
前記したスクリーニングにおける細胞増殖率の測定の後に続く、各実験における細胞増殖率の測定についても、前記したように、細胞をクリスタルバイオレット溶液で染色し、染色された細胞を２％ＳＤＳに溶解し、細胞密度を吸収分光計（５６０ｎｍ）で測定することで実施した。
【００６２】
（薬剤処理及び細胞増殖率の測定）
各薬剤は、以下のものを使用した。ピタバスタチンカルシウム（製品コード：163-24861）、ロスバスタチン (製品コード：187-03361)は、富士フイルム和光純薬株式会社（日本、大阪）から購入した。カプマチニブ（別名：INCB28060）は、セレックケミカル社（米国、テキサス州、ヒューストン）から購入した。テポチニブ（製品コード：HY-14721）、ジゲラニルビスホスホネート（ＤＧＢＰ）（製品コード：HY-U00145）は、メドケムエクスプレス社（米国、ニュージャージー州、モンマス）から購入した。ＨＧＦ（製品番号100-39-10UG）は、ペプロテック社（米国、ニュージャージー州、ロッキーヒル）から購入した。シンバスタチン (製品コード：S6196)、フルバスタチン (製品コード：SML0038)、クリゾチニブ (製品コード：PZ0191)、シスプラチン (製品コード：479306)、メバロン酸、ＩＰＰ、ＧＰＰ、ＦＰＰ、コレステロール、及びＧＧＰＰは、シグマアルドリッチ社（米国、ミズーリ州、セントルイス）から購入した。ＭＧＣＤ−２６５ (製品コード：20097)は、ケイマンケミカル社 (米国、ミシガン州、アナーバー)から購入した。
細胞を各薬剤で処理し、２４時間〜７２時間後における生存細胞の数を、クリスタルバイオレット染色により評価した。なおＨＧＦ添加の場合は、はじめに細胞をピタバスタチンで７２時間処理した後、培地を無血清培地に交換した。交換１時間後、次にＨＧＦを無血清培地に添加し、添加後０分、１５分、３０分、及び６０分の時点で細胞を回収し、生存細胞の数を、クリスタルバイオレット染色により評価した。
【００６３】
（ＦＡＣＳ分析によるアポトーシス率の測定）
ＭＥＢＣＹＴＯアポトーシスキット（ＭＢＬ社、日本、名古屋）でアポトーシス細胞を染色し、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ社、米国、カリフォルニア州、サンノゼ）を使用して細胞集団分析を行うことで、細胞のアポトーシス率を測定した。キット及びフローサイトメーターの詳細な使用方法は、各製造元の指示に従って実施した。
【００６４】
（ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、及び免疫蛍光顕微鏡分析）
細胞溶解液のタンパク質濃度は、タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）を使用して測定した。前記細胞溶解液に含まれるタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いてウエスタンブロッティング分析を行った。ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、及び免疫蛍光顕微鏡分析には、次の一次抗体を使用した。
抗リン酸化Ｍｅｔ抗体（＃3077）、抗Ｍｅｔ抗体（＃8198）、抗ｃＰＡＲＰ抗体（＃9541）、抗リン酸化ＥＲＫ抗体（＃4370）、抗ＥＲＫ抗体（＃4695）、抗ホスホＡＫＴ抗体（＃9271）、及び抗ＡＫＴ抗体（＃9272）は、セルシグナリングテクノロジー社（米国、マサチューセッツ州、ビバリー）から購入した。抗β-アクチン抗体（A5441）、抗ＧＧＰＳ１抗体（sc-271679、＃E3112）、抗ＧＭ１３０抗体（ab169276）、抗ＧＢＦ１抗体（612116）、及び抗Ａｒｆ１抗体（ARF01）は、シグマアルドリッチ社、サンタクルーズバイオテクノロジー社（米国、テキサス州、ダラス）、アブカム社（米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）、ＢＤバイオサイエンス社（米国、カリフォルニア州、サンノゼ）、又はサイトスケルトン社（米国、コロラド州、デンバー）から購入した。
ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、及び免疫蛍光顕微鏡分析の詳細な方法は、各製造元の指示に従って実施した。
【００６５】
（リン酸化ＲＴＫのアレイ分析）
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒヒトリン酸化ＲＴＫアレイキットをＲ＆Ｄシステムズ社（米国、ミネソタ州、ミネアポリス）から購入し、製造元の指示に従って、リン酸化ＲＴＫのアレイ分析を実施した。なお分析に用いたタンパク質は、１μＭのピタバスタチン又は対照溶媒で７２時間処理された、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞又はピタバスタチン耐性を有するＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞から抽出した。
【００６６】
（ｉｎ ｏｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖アッセイ）
ニワトリ胚は、株式会社カントウ（日本、群馬）から購入した。ニワトリ胚を３７℃で１０日間培養した後、腫瘍細胞として３×１０６個のＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞又は２×１０６個のＫＹＳＥ２００細胞をニワトリ胚の漿尿膜（ＣＡＭ）に移植した。前記移植の２日目以降、毎日、前記移植した腫瘍に対して薬剤を投与した。前記移植の１６日目に、ニワトリを安楽死させ、腫瘍の体積を観察した。
ＳＣＩＤマウス（免疫不全マウス）は、チャールズリバーラボラトリーズ社（日本、横浜）から購入した。１００μｌのマトリゲル（登録商標）（ＢＤ社）に懸濁した１×１０７個のＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞を、ＳＣＩＤマウスの左腹壁に注入した。前記注入の１週間後から、毎日、薬剤を腹腔内に注射し、２日ごとに腫瘍サイズを測定した。腫瘍サイズは、（腫瘍サイズ（ｍｍ３）=［（長さ）×（幅）２］／２）の計算式を利用して求めた。前記注入の２４日目にマウスを解剖し、腫瘍の体積を評価した後、腫瘍切片を得るために直ちに腫瘍をホルマリン固定及びパラフィン包埋した。
【００６７】
（定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ））
ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米国、マサチューセッツ州、ウォルサム）とカパサイバーファストｑＰＣＲキット（カパバイオシステムズ社、米国、マサチューセッツ州、ウィルミントン）を使用した。システム及びキットの使用方法は、製造元の指示に従った。遺伝子発現値は、目的の遺伝子と内部標準遺伝子（ＧＡＰＤＨ）間のサイクル閾値の違いに基づく比率として評価した。なおＧＡＰＤＨは、がん細胞から分離されたＲＮＡ量の正規化因子である。
なお、リアルタイムＰＣＲにおいて、ＧＧＰＳ１フォワードプライマー（配列番号１）、ＧＧＰＳ１リバースプライマー（配列番号２）、ＭＥＴフォワードプライマー（配列番号３）、ＭＥＴリバースプライマー（配列番号４）、ＨＭＧＣＲフォワードプライマー（配列番号５）、ＨＭＧＣＲリバースプライマー（配列番号６）、ＧＡＰＤＨフォワードプライマー（配列番号７）、又はＧＡＰＤＨリバースプライマー（配列番号８）の各プライマーを用いた。
【００６８】
配列番号１  ：５’−ＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡ−３’
配列番号２  ：５’−ＴＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡ−３’
配列番号３  ：５’−ＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡ−３’
配列番号４  ：５’−ＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＧＴＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴ−３’
配列番号５  ：５’−ＴＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴ−３’
配列番号６  ：５’−ＣＧＴＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡ−３’
配列番号７  ：５’−ＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡ−３’
配列番号８  ：５’−ＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧ−３’
【００６９】
（発現ベクターの構築）
ＲＴ−ＰＣＲを利用してヒトＧＧＰＳ１の全長ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を得た。得たＰＣＲ産物を、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＲＦＰ＋Ｐｕｒｏベクター（システムバイオサイエンス社、米国、カリフォルニア州、パロアルト）に挿入した。レンチウイルスは、ＨＥＫ２９３ＴＮ細胞とｐＰＡＣＫパッケージキット（システムバイオサイエンス社）を使用して、製造元の指示に従って調製した。ウイルスは、ＰＥＧ−ｉｔ（システムバイオサイエンス社）を使用して製造元の指示に従って沈殿させた。コントロールとしての空ベクター、又はＧＧＰＳ１発現ベクターを含むレンチウイルスを、ＴｒａｎｓＤｕｘ（システムバイオサイエンス社）を使用して、細胞に感染させた。
なお、ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＧＧＰＳ１フォワードプライマー（配列番号９）及びＧＧＰＳ１リバースプライマー（配列番号１０）のプライマーを用いた。
【００７０】
配列番号９  ：５’−ＴＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡ−３’
配列番号１０：５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＴ−３’
【００７１】
（遺伝子発現アレイ分析と経路分析）
ＳｕｒｅＰｒｉｎｔＧ３遺伝子発現マイクロアレイＶｅｒ．３（アジレントテクノロジー社）を使用して、製造元の指示に従って遺伝子発現プロファイルの分析を実施した。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸ１４．９ソフトウェア（アジレントテクノロジー社）を用いて生データを分析した。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸ１４．９によって正規化された発現アレイデータを用いて、ＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙｓを使用して経路分析を行った。ＤＡＶＩＤツール（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）を利用してＫＥＧＧ経路分析を行った。正規化された発現アレイデータを使用してＧＳＥＡ（バージョン４．０.３）を行った。遺伝子セットのデータベースとしては「c6:oncogenic signatures gene sets」を選択した。
【００７２】
（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入）
ｓｉＲＮＡ−ＭＥＴ（s8700、s8702）、ｓｉＲＮＡ−ＧＧＰＳ１（s18107、s18108）、及びネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＮＣ）は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入した。各ｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）は、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して、製造元の指示に従って細胞に導入した。
【００７３】
（Ａｒｆ１−ＧＴＰプルダウンアッセイ）
Ａｒｆ１活性測定バイオケムキット（BK-032S）をサイトスケルトン社から購入し、製造元の指示に従ってＡｒｆ１−ＧＴＰプルダウンアッセイを実施した。タンパク質は、メバロン酸又はＧＧＰＰの存在下又は非存在下で、１μＭのピタバスタチン若しくは対照溶媒で４８時間処理したＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞から抽出した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、定量分析を実施した。
【００７４】
（がん治療応答ポータルの分析）
非造血系がん細胞における、ＧＧＰＳ１発現と、シンバスタチン及びロバスタチン耐性との相関関係を、がん治療応答ポータルのウェブサイト（https://portals.broadinstitute.org/ctrp.v2.1/）からダウンロードした。
【００７５】
（統計解析）
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）を利用して実施した。２つのグループ間の差をスチューデントのｔ検定でテストし、２因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）を適用して腫瘍の増殖を分析した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。
【００７６】
（データの寄託）
本開示に記載されたマイクロアレイデータは、ＧＥＯデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）に提出され、ＩＤ番号「GSE145624」が割り当てられている。
【００７７】
＜実施例１＞
（薬剤のスクリーニングとピタバスタチンによる細胞増殖阻害効果の確認）
ＯＳＣＣ株細胞株系統であって、高転移性細胞株であるＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞を用いて、ＯＳＣＣ及びＥＳＣＣに対して抗がん作用を有する薬剤のスクリーニングを行った。薬剤は、７６６種類の薬剤を含むＦＤＡ承認薬ライブラリ（エンゾライフサイエンス社）を用いた。各薬剤を細胞に添加し、細胞増殖率を測定した（図１Ａ）。１５種類の薬剤で有意な細胞増殖阻害が観察され、その中でも、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である、ピタバスタチン（ピタバスタチンカルシウム）は、最も顕著な細胞増殖率の減少を示した。他の１４種類の薬剤は、既知の抗がん剤及び微小管重合の阻害剤であるコルヒチンであった。
【００７８】
次に、ピタバスタチンのがん細胞増殖阻害効果について調べた。最初に、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞におけるピタバスタチンによる細胞増殖阻害を検証したところ、ピタバスタチンは、用量依存的にアポトーシスを誘導することで細胞増殖を阻害した（図１Ｂ）。次に、４３種類のＥＳＣＣ細胞株を用いてピタバスタチンによる細胞増殖への影響を評価し、カットオフ値を０．５としてピタバスタチンに対する低感受性グループ及び高感受性グループに分けた（図１Ｃ）。さらに、２３種類のＯＳＣＣ細胞株を用いてピタバスタチンによる細胞増殖への影響を評価し、カットオフ値を０．５としてピタバスタチンに対する低感受性グループ及び高感受性グループに分けた（図１Ｄ）。高感受性グループ（ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞、ＫＹＳＥ１５０細胞、及びＫＹＳＥ２００細胞）では、ピタバスタチンはＡＫＴ及びＥＲＫタンパク質の発現を抑制した（図１Ｅ）。一方で低感受性グループ（ＫＹＳＥ７０細胞、ＫＹＳＥ５１０細胞、ＫＹＳＥ１１９０細胞、及びＫＹＳＥ１４４０細胞）では、ピタバスタチンはＡＫＴ及びＥＲＫタンパク質の発現レベルに影響を与えなかった（図１Ｅ）。
【００７９】
次に、高感度細胞株であるＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞とＫＹＳＥ２００細胞を用いて、ｉｎ ｏｖｏにおける薬剤投与実験を行ったところ、ピタバスタチンは、ｉｎ ｏｖｏにおいて統計的に有意に腫瘍増殖を阻害した（図１Ｆ、図１Ｇ）。さらに、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞を用いたマウスのｉｎ ｖｉｖｏ実験では、ピタバスタチンは、腫瘍増殖を阻害した（図１Ｈ、図１Ｉ）。
【００８０】
＜実施例２＞
（ＧＧＰＳ１の役割の確認）
ピタバスタチンが細胞増殖を阻害する仕組みを明らかにするために、ピタバスタチンに対するレスキュー実験を実施した。レスキュー実験では、メバロン酸経路の各代謝産物を使用した。なおメバロン酸経路から細胞増殖までの経路の推定を図２Ａに示す。ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞又はＫＹＳＥ１５０細胞において、メバロン酸又はＧＧＰＰを添加したときのみ、細胞増殖率及びアポトーシス率が回復し、つまり、ピタバスタチンによる細胞増殖阻害効果がレスキューされた（図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ）。一方で、ＩＰＰ、ＧＰＰ、ＦＰＰ、又はコレステロールを添加しても、細胞増殖率及びアポトーシス率は回復せず、つまり、ピタバスタチンによる細胞増殖阻害効果はレスキューされなかった。また、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞においては、ピタバスタチン処理でｃＰＡＲＰの発現が増加し、さらにメバロン酸又はＧＧＰＰを添加すると、ｃＰＡＲＰの発現が抑制され、ｐＡＫＴ、ＡＫＴ、及びｐＥＲＫの発現が回復した（図２Ｄ）。以上のことから、ＧＧＰＰは細胞増殖に重要な役割を果たし、異化酵素であるＧＧＰＳ１はがん治療のターゲットとすることができる可能性が示唆された。
【００８１】
次に、ピタバスタチン耐性細胞株（ＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞）を樹立し、ピタバスタチンによる細胞増殖阻害の詳細なメカニズムを明らかにした。ＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞においては、親株であるＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞よりも、ピタバスタチンによる細胞増殖阻害の影響を受けなかった（図２Ｇ）。さらに、ＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞においては、ピタバスタチンによるＡＫＴ及びＥＲＫの発現抑制の影響は小さかった（図２Ｈ）。
【００８２】
次に、ＧＧＰＳ１ノックダウンが細胞増殖を阻害するかを明らかにするために、ＧＧＰＳ１特異的ｓｉＲＮＡで７２時間又は１２０時間処理したＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞又はＫＹＳＥ１５０細胞における、細胞増殖率の測定及びウエスタンブロッティング分析を行った。いずれにおいても、ＧＧＰＳ１ノックダウンでは細胞増殖率が低下し、さらにＧＧＰＰを添加することで細胞増殖率の低下はレスキューされた（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｄ）。また、ＧＧＰＳ１ノックダウンではＡＫＴ及びＥＲＫの発現が低下し、さらにＧＧＰＰを添加することでＡＫＴ及びＥＲＫの発現の低下はレスキューされた（図３Ｃ、図３Ｅ）。ＧＧＰＳ１ノックダウンでは未成熟なＭＥＴが多くみられるが、さらにＧＧＰＰを添加することで成熟ＭＥＴが増加した（図３Ｅ）。なお図３Ｅ中、ＭＥＴのタンパク質発現を確認しているメンブレンにおいて、上側矢印の位置は未成熟なＭＥＴのバンド位置を表し、下側矢印の位置は成熟したＭＥＴ（成熟ＭＥＴ）のバンド位置を表す。以下の説明においても、ＭＥＴのタンパク質発現を確認しているメンブレンにおいて、矢印は同様の意味を表す。
【００８３】
次に、細胞成長に関わるＧＧＰＳ１の阻害剤である、ジゲラニルビスホスホネート（ＤＧＢＰ）の効果も評価した。ＤＧＢＰは、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞、ＫＹＳＥ１５０細胞、及びＫＹＳＥ２００細胞におけるＭＥＴ成熟を阻害したが、これはＧＧＰＰ添加によってレスキューされた（図３Ｆ）。さらに、ｉｎ ｏｖｏ実験によると、ＤＧＢＰ処理は、ピタバスタチン処理のように、腫瘍増殖を阻害した（図３Ｇ）。
【００８４】
＜実施例３＞
（ピタバスタチンによるＭＥＴシグナル伝達経路調節機能の確認）
ピタバスタチンが腫瘍増殖を阻害する詳細なメカニズムを明らかにするために、リン酸化受容体チロシンキナーゼアレイを使用して、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のリン酸化状態を評価した（図４Ａ）。ＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞ではピタバスタチン処理によるＭＥＴのリン酸化レベルの減少は観察されなかったのに対し、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞ではピタバスタチン処理によるＭＥＴのリン酸化レベルの減少が確認された。ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞においてＭＥＴのリン酸化レベルが減少していることから、ピタバスタチンによる細胞増殖の阻害は、ＭＥＴシグナル伝達経路に関連しているとみられる。さらにＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞において、ピタバスタチンはＭＥＴのリン酸化レベル（ｐＭＥＴ）を用量依存的に減少させることができた（図４Ｂ）が、ＭＥＴのｍＲＮＡ転写量を変化させなかった（図４Ｃ）。さらには、ピタバスタチン処理によるＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞及びＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞のリン酸化ＭＥＴ（ｐＭＥＴ）及びＭＥＴのタンパク質発現量に関する実験から、ピタバスタチンがＭＥＴ成熟を阻害することによって細胞増殖を低下させていることが明らかとなった（図４Ｂ）。なおピタバスタチンによるＭＥＴ成熟の阻害は、メバロン酸又はＧＧＰＰを添加することでレスキューされた（図４Ｄ）。さらに、ＧＧＰＳ１ノックダウンでは未成熟なＭＥＴが多く確認され、これはＧＧＰＰを添加することでレスキューされた（図４Ｅ、図４Ｆ）。
【００８５】
未成熟なＭＥＴ又は非切断のＭＥＴは、ゴルジ体に局在することが知られているため、次に、メバロン酸又はＧＧＰＰの存在下又は非存在下における、ピタバスタチン処理、又はＧＧＰＳ１ノックダウン処理後のＭＥＴの局在について、抗ＭＥＴ抗体、抗ＧＢＦ１抗体、及び抗ＧＭ１３０抗体を用いて免疫蛍光染色で確認した（図４Ｇ、図４Ｈ、図４Ｉ、図４Ｊ）。ＧＢＦ１とＧＭ１３０はｃｉｓ−ゴルジ体に存在し、小胞輸送を制御する。また、ＧＢＦ１はＡｒｆのＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子）としても知られている。免疫蛍光染色により、正常な状態ではＭＥＴは細胞膜及びゴルジ体に存在したが、ピタバスタチン処理又はＧＧＰＳ１ノックダウンにより、ＭＥＴは細胞膜から細胞質及びゴルジ体に移行したことがわかった。さらに、ピタバスタチン処理又はＧＧＰＳ１ノックダウンにより、ＧＢＦ１は細胞質に認められた。このことは、ＧＢＦ１がＧＥＦとして機能していないことを示唆している。そのため、ピタバスタチン処理細胞における、Ａｒｆ１−ＧＴＰプルダウンアッセイにより、Ａｒｆ１活性化を調べた。その結果、ピタバスタチン処理によりＡｒｆ１−ＧＴＰが減少すること、及びこのピタバスタチンの作用がメバロン酸又はＧＧＰＰの添加により相殺されることがわかった（図４Ｋ）。さらに、ピタバスタチン処理後の未成熟ＭＥＴはＨＧＦの刺激に非応答であることがわかった（図４Ｌ）。これらの結果から、ピタバスタチンは、ゴルジ体の機能不全をもたらし、ＭＥＴ成熟を阻害することにより、ＭＥＴシグナル伝達経路を阻害することが明らかとなった。
【００８６】
次にメバロン酸経路が、成熟ＭＥＴの生成に関与しているかどうかを評価するために、複数の細胞株に対して、ピタバスタチン処理、シンバスタチン処理、ロスバスタチン処理、又はフルバスタチン処理し、ＤＧＢＰ又は細胞毒性薬剤（ＣＤＤＰ又はクリゾチニブ）で処理した（図４Ｍ、図４Ｎ）。スタチン系化合物によるメバロン酸経路の阻害は、ＭＥＴ成熟を阻害したが、細胞毒性薬剤（ＣＤＤＰ又はクリゾチニブ）はＭＥＴ成熟に影響を与えなかった。以上のことから、メバロン酸経路は、ゴルジ体の機能を介してＭＥＴの成熟を調節する可能性があることが明らかとなった。
【００８７】
＜実施例４＞
（ピタバスタチンとカプマチニブの組み合わせによる腫瘍増殖阻害に対する効果の確認）
ピタバスタチンとＭＥＴ特異的阻害剤であるカプマチニブとの組み合わせに関して、細胞増殖アッセイを行った。カプマチニブの単独投与では、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞、ＨＯＣ３１３−ＬＭ−Ｐｉｔａ−Ｒ細胞、ＫＹＳＥ１５０細胞、及びＫＹＳＥ２００細胞の細胞増殖に影響を与えなかったのに対して、ピタバスタチンとカプマチニブとの２剤投与では、ピタバスタチンの単独投与と比較して、細胞増殖阻害が増強された（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ、図５Ｈ、図５Ｉ）。さらに、ＫＹＳＥ１５０細胞及びＫＹＳＥ２００細胞では、ピタバスタチンとカプマチニブとの２剤投与によって、ＭＥＴの成熟及びリン酸化、並びにＭＥＴシグナルの抑制が観察された（図５Ｊ）。なお、ピタバスタチン又はカプマチニブの単独投与では、ＨＧＦによって活性化されるＭＥＴシグナルは完全に阻害されなかったが、ピタバスタチンとカプマチニブとの２剤投与では、ＭＥＴの成熟とＭＥＴのリン酸化が阻害されることにより、ＭＥＴシグナルが強力に抑制された（図５Ｋ）。
【００８８】
さらに、他のスタチン系化合物（シンバスタチン、ロスバスタチン、又はフルバスタチン）と、カプマチニブと、の２剤投与による細胞増殖を調べた。これらの組み合わせは相乗的な細胞増殖阻害を示した。これらのスタチン系化合物のうち、ピタバスタチンとカプマチニブとを組み合わせた２剤投与が、細胞増殖阻害に最も効果的であった（図５Ｌ、図５Ｍ、図５Ｎ、図５Ｏ）。また、ピタバスタチンと、他のＭＥＴ阻害剤（クリゾチニブ、ＭＧＣＤ−２６５（グレサチニブ）又はテポチニブ）と、の２剤投与による細胞増殖も評価したところ、これらの組み合わせによる細胞増殖阻害の増強が観察できた（図５Ｐ、図５Ｑ、図５Ｒ、図５Ｓ）。さらに、ピタバスタチンとテポチニブとの２剤投与によって、ＭＥＴの成熟及びリン酸化、並びにＭＥＴシグナルの抑制が観察された（図５Ｔ）。
【００８９】
次に、細胞増殖において、ＭＥＴの阻害がピタバスタチンの機能にどう影響を与えるかを評価するために、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞にＭＥＴ特異的ｓｉＲＮＡを導入することでノックダウン実験を行った（図５Ｕ、図５Ｖ）。その結果、ピタバスタチンとカプマチニブとの２剤投与と同じように、ピタバスタチンによる細胞増殖の阻害はＭＥＴノックダウンにより増強されるのに対し、ＭＥＴのノックダウンのみでは細胞増殖に影響を与えなかった。さらに、細胞増殖に対するこの２剤の組み合わせ効果は、メバロン酸又はＧＧＰＰを添加することによって抑制され、アポトーシス率に対するこの２剤の組み合わせ効果は、メバロン酸又はＧＧＰＰを添加することによって抑制された（図５Ｗ、図５Ｘ、図５Ｙ、図５Ｚ）。さらにはＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞にメバロン酸又はＧＧＰＰを添加することで、２剤の組み合わせによるＭＥＴ未成熟はレスキューされた（図５ＡＡ）。
【００９０】
次に、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞及びＫＹＳＥ２００細胞、並びにピタバスタチン及びカプマチニブを使用して、ｉｎ ｏｖｏ実験を実施した（図６Ａ、図６Ｂ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験と同様に、ピタバスタチンとカプマチニブとを組み合わせた２剤投与では、胚内において、より効果的に腫瘍増殖が阻害された。
【００９１】
さらに、ＨＯＣ３１３−ＬＭ細胞を用いたマウスのｉｎ ｖｉｖｏ実験では、ピタバスタチンとカプマチニブとの組み合わせにより、重大な有害事象も無く、ピタバスタチンの単独投与と比較して、腫瘍増殖が抑制された（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ）。次に、マウスの腫瘍標本におけるＭＥＴのリン酸化状態を評価した（図６Ｇ、図６Ｈ）。ピタバスタチンとカプマチニブとの組み合わせでは、対照サンプルと比較して、ＭＥＴのリン酸化がより有意に抑制された。
【００９２】
上記の結果から、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＭＥＴ阻害剤、特にピタバスタチンとカプマチニブとを組み合わせた２剤投与は、ＭＥＴシグナル伝達を抑制し、ＯＳＣＣ及びＥＳＣＣのがん治療に有用であることが明らかになった（図６Ｉ）。
【００９３】
以上のことから、本開示によれば、高い抗がん効果が得られる、複数の剤を組み合わせて投与されるがん用医薬組成物を提供することができ、さらには、高い抗がん効果が得られる、口腔扁平上皮がん又は食道扁平上皮がんの治療に使用されるがん用医薬組成物を提供することができることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本開示は、がんに用いられる医薬組成物として利用することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図５Ｏ】
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【図５Ｐ】
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【図５Ｑ】
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【図５Ｒ】
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【図５Ｓ】
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【図５Ｔ】
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【図５Ｕ】
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【図５Ｖ】
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【図５Ｗ】
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【図５Ｘ】
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【図５Ｙ】
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【図５Ｚ】
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【図５ＡＡ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【配列表】
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