(57)【要約】【課題】培養工程を経ることなく、多様な微生物資源から効率よくハロペルオキシダーゼ遺伝子を単離する手段を提供する。【解決手段】複数のハロペルオキシダーゼ間でアミノ酸配列が高度に保存された領域に基づいて設計したプライマーにより、試料中に含まれるハロペルオキシダーゼ遺伝子断片を増幅し、この断片と既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子とによってハイブリッド遺伝子を作製し、ハロペルオキシダーゼ遺伝子を単離する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５４又は５５記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列、又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマーとして実質的な機能を有するハロペルオキシダーゼ遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号４５〜４９記載のいずれかの塩基配列、又はそれと相補的な配列の一部又は全部を含み、かつプライマーとして実質的な機能を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用することを特徴とするハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の単離法。
【請求項４】
請求項３記載の方法で単離されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の両端部を、既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子の配列で補い、ハイブリッド遺伝子を作製することを特徴とするハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離法。
【請求項５】
既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子が配列番号５６記載のアミノ酸配列をコードするハロペルオキシダーゼ遺伝子である請求項４記載のハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離法。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とするハロペルオキシダーゼ遺伝子単離用キット。
（ａ）請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
（ｂ）既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子の５’末端領域を含むＤＮＡ断片。
（ｃ）既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子の３’末端領域を含むＤＮＡ断片。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項８】
配列番号２３〜４４のいずれかの塩基配列で表され、ハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項７又は８記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
請求項９記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地で培養し、得られる培養物から請求項１０記載のタンパク質を回収することを特徴とするハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１２】
過酸化水素の存在下、請求項９記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を有機化合物とともに培養することを特徴とするハロゲン化化合物又は酸化化合物の生産方法。
【請求項１３】
過酸化水素の存在下、請求項１０記載のタンパク質を有機化合物に作用させることを特徴とするハロゲン化化合物又は酸化化合物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする新規遺伝子の単離方法、該方法に有用なオリゴヌクレオチド、及び該方法によって単離された新規遺伝子に関するものである。本発明の単離方法は、細菌等の微生物の培養工程を経ずに酵素遺伝子を単離する方法であり、特に自然界の遺伝資源から新規遺伝子を単離するのに有効である。本発明で得られる遺伝子から生産されるハロペルオキシダーゼは、生体触媒として化学工業における有用物質生産に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
酸化反応は基本的かつ重要な反応の一つであり、その研究の歴史は古い。現在まで、様々な酸化剤が開発され、高水準の反応性、選択性が達成されている。なかでも、酵素による酸化反応はその特異的な基質特異性から幅広く応用が検討されている。特に、極限環境に棲息する微生物からはユニークな酵素が単離され、現在でも勢力的に微生物の単離・同定が行われている。
【０００３】
細菌等から酵素遺伝子を単離するためには、一般的に、その細菌を培養し、酵素活性を指標として酵素タンパク質の精製を行い、アミノ酸配列を解読した後、該アミノ酸配列に基づいてプライマー又はプローブを設計してゲノムＤＮＡから目的遺伝子を単離・同定するという作業が行われる。あるいは、近年では、ゲノム解析によって解読された塩基配列からＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）のコードするタンパク質の機能を推定し、目的の機能を持つと推定される遺伝子をオリゴヌクレチドの化学合成等によって作製するといった方法も行われている。このようにして作製された遺伝子は、適当な宿主に導入して発現させることにより、目的の機能を有するかどうかを確認する。
【０００４】
しかしながら、いずれの方法も細菌の単離・培養を必要とするため、細菌に限らず微生物の多様性を十分に利用しているとは言えない。一般に、培養が可能であると報告されている微生物は、土壌、海洋等の生息環境を問わず１％以下と言われ（Ｖｉｇｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５：  ２４０−２４５  （２００２），  Ｔｈｏｍａｓ  Ｐ．  Ｃｕｒｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ．，  ９９：  １０４９４−１０４９９  （２００２））、微生物遺伝資源は未だに未利用の状態にあると言っても過言ではない。
【０００５】
このような未利用の遺伝資源を利用するため、最近では、微生物の培養を経ずに土壌や海水等の環境サンプルから直接ＤＮＡを抽出し、遺伝子を単離するといった試みが行われるようになってきた。そのような方法としては、環境サンプルから抽出したＤＮＡ断片を適当なベクターにクローニングしてＤＮＡライブラリーを構築する方法と（非特許文献１）、目的とする機能を有する既知のタンパク質又は遺伝子のアミノ酸配列又は塩基配列からプライマーを設計し、環境サンプルから抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行う方法とが挙げられる（特許文献１及び非特許文献２）。
【０００６】
前者の方法では、酵素活性を指標としたスクリーニングや既知配列に基づいて設計されたプローブを用いたスクリーニングが行われるが、圧倒的に多数のネガティブクローンが生じるため、スクリーニングには多くの手間と労力を要する。
【０００７】
一方、後者の方法では、目的とする遺伝子の核酸断片を効率よくクローニングすることができる。しかし、得られる核酸断片は目的とする遺伝子の一部分であることが多く、遺伝子として機能する全長配列を得るためには、やはりＤＮＡライブラリーからのスクリーニング等が必要となる場合が多い。
【０００８】
後者の方法におけるこのような欠点を補うために、最近、既知遺伝子との間でハイブリッド遺伝子を作製し、機能遺伝子全長を得る方法が開発された（非特許文献３）。この方法は、プライマーによる増幅反応で増幅されない遺伝子の両端部を既知類似遺伝子の塩基配列で補うものである。第一段階の核酸増幅反応のプライマーに既知遺伝子とアニーリングするアッセンブリー配列を付加しておき、第一段階の核酸増幅反応の終了後、増幅された核酸断片を既知遺伝子の５’末端断片及び３’末端断片とアニーリングさせて伸長反応を行う。これにより、中央部が環境抽出ＤＮＡ由来の新規遺伝子配列、両端部が既知遺伝子配列からなるハイブリッド遺伝子が生成されるのである。非特許文献３には、この方法によって、環境中から新規２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子を単離したことが報告されている。
【０００９】
ハロペルオキシダーゼは、ハロゲン含有天然物（Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  ｖａｎ  Ｐｅｅ，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７５：  ２５０−２５８  （２００１））の生合成に関与する酵素であり、試験管内では過酸化水素の酸化力によってハロニウムアニオン（Ｂｒ−、Ｃｌ−、Ｉ−）をカチオンにし、種々の化合物をハロゲン化する。さらには、酸素添加反応をも触媒する。
自然界においては、クロラムフェニコール等のハロゲン含有抗生物質の合成に関与していることが知られており、その他にも様々な生理活性物質の合成に関与していると考えられている。このようなユニークな特性から、ハロペルオキシダーゼは、化学物質及び生理活性物質の工業スケールでの生産における触媒としての利用が検討されている（Ｍａｒｉｏｎ  Ｐ．  Ｊ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５３：  １３１８３−１３２２０）。既知のハロペルオキシダーゼとしては、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）属菌、カルダリマイセス（Ｃａｌｄａｒｉｍｙｃｅｓ）属菌、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｓ）属菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌等から単離されたものがあるが、何れのハロペルオキシダーゼもそれらの微生物を培養後、単離・解析されたものである。既知ハロペルオキシダーゼを触媒とした人工的な有用物質生産の可能性が検討されているが、工業スケールでの実用化に到った例は未だない。
【００１０】
しかしながら、これまでに単離されたハロペルオキシダーゼは全て培養の容易な微生物から単離されたものであり、難培養微生物の持つハロペルオキシダーゼについては未利用のままである。こうした未利用のハロペルオキシダーゼの中に、工業的利用に適した性質を持つものが存在する可能性は否定できない。また、難培養微生物由来のハロペルオキシダーゼを含めた多数のハロペルオキシダーゼの構造を解析することにより、有用なハロペルオキシダーゼを人工的に創出できる可能性もある。そのためには、現在未開拓となっている難培養微生物のハロペルオキシダーゼを含めた、より多くの新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離が必要である。
【００１１】
【特許文献１】
特許公開公報２０００−１２５８７１号
【００１２】
【非特許文献１】
Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ｒ．  Ｒｏｎｄｏｎ，  Ｐａｕｌ  Ｒ．  Ａｕｇｕｓｔ，  Ａｌａｎ  Ｄ．  Ｂｅｔｔｅｒｍａｎｎ，  Ｓｅａｎ  Ｆ．  Ｂｒａｄｙ，  Ｔｒｕｄｙ  Ｈ．  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  Ｍａｒｋ  Ｒ．  Ｌｉｌｅｓ，  Ｋａｒａ  Ａ．  Ｌｏｉａｃｏｎｏ，  Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ａ．  Ｌｙｎｃｈ，  Ｉａｎ  Ａ．  ＭａｃＮＥＩＬ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍｉｎｏｒ，  Ｃｈｏｉ  Ｌａｉ  Ｔｉｏｎｇ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｇｉｌｍａｎ，  Ｍａｒｃｈｉａ  Ｓ．  Ｏｓｂｕｒｎｅ，  Ｊｏｎ  Ｃｌａｒｄｙ，  Ｊｏ  Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ，  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍ．  Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｏｉｌ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ：  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６６：  ２５４１−２５４７  （２０００）．
【００１３】
【非特許文献２】
Ｐｈｉｌｉｐ  Ｊ．  Ｌ．  Ｂｅｌｌ，  Ａｎｗａｒ  Ｓｕｎｎａ，  Ｍｏｒｅｌａｎｄ  Ｄ．  Ｇｉｂｂｓ，  Ｎａｔａｌｉｅ  Ｃ．  Ｃｕｒａｃｈ，  Ｈｅｌｅｎａ  Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｌ．  Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ，  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌ  ｌｉｐａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １４８：  ２２８３−２２９１  （２００２）．
【００１４】
【非特許文献３】
Ａｋｉｋｏ  Ｏｋｕｔａ，  Ｋｏｕｈｅｉ  Ｏｈｎｉｓｈｉ，  Ｓｈｉｇｅａｋｉ  Ｈａｒａｙａｍａ，  ＰＣＲ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｅｃｈｏｌ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｎｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅｓ．  ＧＥＮＥ，  ２１２：  ２２１−２２８  （１９９８）．
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、培養工程を経ることなく、多様な微生物資源から効率よくハロペルオキシダーゼ遺伝子を単離する手段を提供することにある。さらには、新規なハロペルオキシダーゼ遺伝子及び該遺伝子によって生産されるハロペルオキシダーゼを提供し、該酵素によって種々の化合物をハロゲン化又は酸化する手段を提供するものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、複数のハロペルオキシダーゼ間でアミノ酸配列が高度に保存された領域を見出し、該領域に基づいて設計したプライマーにより、試料中に含まれる未知ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の増幅が可能であることを見出した。さらに、増幅されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片と既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子とによって形成されたハイブリッド遺伝子が、ハロペルオキシダーゼ活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１２）を提供するものである。
（１）配列番号５４又は５５記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列、又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマーとして実質的な機能を有するハロペルオキシダーゼ遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。
（２）配列番号４５〜４９記載のいずれかの塩基配列、又はそれと相補的な配列の一部又は全部を含み、かつプライマーとして実質的な機能を有する（１）記載のオリゴヌクレオチド。
（３）（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用することを特徴とするハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の単離法。
（４）（３）記載の方法で単離されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の両端部を、既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子の配列で補い、ハイブリッド遺伝子を作製することを特徴とするハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離法。
（５）既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子が配列番号５６記載のアミノ酸配列をコードするハロペルオキシダーゼ遺伝子である（４）記載のハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離法。
（６）以下の（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とするハロペルオキシダーゼ遺伝子単離用キット。
（ａ）請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
（ｂ）既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子の５’末端領域を含むＤＮＡ断片。
（ｃ）既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子の３’末端領域を含むＤＮＡ断片。
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（８）配列番号２３〜４４のいずれかの塩基配列で表され、ハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（９）（７）又は（８）記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
（１０）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（１１）（９）記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地で培養し、得られる培養物から（１０）記載のタンパク質を回収することを特徴とするハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
（１２）過酸化水素の存在下、（９）記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を有機化合物とともに培養することを特徴とするハロゲン化化合物又は酸化化合物の生産方法。
（１３）過酸化水素の存在下、（１０）のタンパク質を有機化合物に作用させることを特徴とするハロゲン化化合物又は酸化化合物の生産方法。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド
本発明のハロペルオキシダーゼ遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド（以下、本オリゴヌクレオチドという）は、配列番号５４又は５５記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列、又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマーとして実質的な機能を有するオリゴヌクレオチドである。本オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の単離が可能となる。
【００１９】
本発明において、「ハロペルオキシダーゼ活性」とは、過酸化水素によってハロニウムアニオン（Ｃｌ−、Ｂｒ−又はＩ−）をカチオン（Ｃｌ＋、Ｂｒ＋又はＩ＋）に酸化し、このハロニウムカチオンによって有機物をハロゲン化する反応を触媒する作用を意味する。また、「ハロペルオキシダーゼ」とは、ハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質を意味する。
【００２０】
また、本発明において、「オリゴヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれをも意味し、「核酸」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれをも意味する。
【００２１】
本オリゴヌクレオチドは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に登録されている２４種のハロペルオキシダーゼ（アクセション番号：Ｇ８３３０４、ＡＦ３６１４７０、ＡＦ３１４４、Ｆ９８１４３、ＡＦ４１６３３、Ｂ９５９８６、ＡＤ２９８６、ＡＥ００７９０８、ＡＧ３２０７、ＪＮ０８２８、Ａ５５２１１、ＡＬ５９１７９０、ＡＦ０３１１５３、ＡＥ０１２３２４、ＡＥ０１０７６５、ＡＥ０１１８３９、Ｆ９５８４８、ＡＦ２９８２、ＡＦ３３５４９３、ＡＧ３１６７、Ｓ５９９２９、Ｓ２７６１４、Ｈ６９８３８及びＨ９７２３０）のアミノ酸配列に基づいて設計されたものである。すなわち、本オリゴヌクレオチドは、これらの配列のアライメントによって予測されたハロペルオキシダーゼの保存領域に基づき設計されたものである。
【００２２】
また、本オリゴヌクレオチドは、プライマーとして実質的な機能を有するように設計される。本発明において「プライマーとして実質的な機能を有する」とは、特異的なアニーリング又はハイブリダイズが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリング又はハイブリダイズが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有する、という意味である。すなわち、本オリゴヌクレオチドは、その配列の長さが短いために又はその塩基組成が適切ではないために非特異的なアニーリングを頻繁に起こし、ハロペルオキシダーゼの特異的な増幅に使用できないオリゴヌクレオチドを排除することを意図するものである。
【００２３】
本オリゴヌクレオチドがプライマーとして実質的な機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６塩基以上であり、最も好ましくは１８塩基以上である。すなわち、配列番号５４又は５５記載のアミノ酸全部をコードする塩基配列又はそれと相補的な塩基配列の全長を含むものが最も好ましい。
【００２４】
また、本オリゴヌクレオチドには、後述するハイブリッド遺伝子の作製のために、５’末端にアッセンブリー配列が付加されていてもよい。アッセンブリー配列とは、既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片とアニーリングすることができる配列のことである。
【００２５】
本オリゴヌクレオチドをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして用いて増幅されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片は、フォワードプライマーとリバースプライマーで挟まれた領域の配列しか有していない。すなわち、開始コドンを含む５’末端の配列と終始コドンを含む３’末端の配列が欠けている。この欠けている配列は、既知のハロペルオキシダーゼ遺伝子の５’末端断片及び３’末端断片とアニーリングさせ、伸長反応を行うことにより、補うことができる。このとき、既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子の５’末端断片又は３’末端断片とのアニーリングに供される配列が、アッセンブリー配列である。
【００２６】
本オリゴヌクレオチドがフォワードプライマーとして使用される場合には、アッセンブリー配列は、通常、既知５’末端断片の３’末端配列となる。また、本オリゴヌクレオチドがリバースプライマーとして使用される場合には、アッセンブリー配列は、通常、既知３’末端断片の５’末端配列となる。本オリゴヌクレオチドには、このアッセンブリー配列が付加されたものも含まれる。
【００２７】
付加されるアッセンブリー配列の長さは、既知５’末端断片又は３’末端断片とのアニーリングが可能であり、かつ核酸増幅反応の妨げとならない長さであればよい。好ましくは５〜５０塩基であり、さらに好ましくは１０〜２０塩基である。
アッセンブリー配列が付加された本オリゴヌクレオチドの例としては、配列番号４５〜５９記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００２８】
また、本オリゴヌクレオチドには、配列番号５４又は５５記載のアミノ酸配列に基づく塩基配列及び上記記載のアッセンブリー配列以外の配列、例えばシークエンス反応用のタグ配列や制限酵素認識配列等の付加配列が含まれていてもよい。このような付加配列は、特に本オリゴヌクレオチドをプライマーとして核酸増幅反応を行った場合に、増幅された核酸断片のクローニング又はシークエンスを行う際に有用である。
【００２９】
本オリゴヌクレオチドは、ホスファイト法やホスホトリエステル法等の当業者に公知の方法に従って合成することができる。
【００３０】
２．新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子又はその断片の単離
新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の単離は、「１．ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド」の項に記載のオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。通常は、本オリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行うことにより、新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片を単離することができる（以下、本単離法という）。
【００３１】
本単離法において、新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の単離を行う対象となる試料は、原核生物由来の核酸が含まれていると思われるものであればどのようなものでもよい。試料の例としては、微生物を人工的に培養した培養物の他、未知の微生物が雑多に含まれている環境由来の試料等が挙げられる。環境由来の試料の例としては、例えば、海水、淡水、土壌等が挙げられる。
【００３２】
本単離法においては、通常、試料から核酸の抽出を行う。抽出する核酸は、核ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法など、またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などを利用することができる。
【００３３】
また、試料が海水、淡水等の液体である場合には、核酸の抽出作業を行う前に、試料の濃縮作業を行うことが望ましい。試料の濃縮は、適当な孔径のフィルターで試料をろ過することにより行うことができる。ろ過に使用するフィルターの材質は、フィルターに一般的に使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、セルロースアセテート、ニトロセルロース、セルロース混合エステル、ポリビニリデンジフロライド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、銀等が例示される。ろ過は、試料中の夾雑物や原生動物及び微細藻類等の真核性プランクトンを除去する工程、及び試料中の細菌を濃縮する工程の２段階により行うことが望ましい。試料中の夾雑物や真核性プランクトンを除去する工程においては、真核性プランクトンの細胞よりも小さく細菌の細胞よりも大きい孔径を持つフィルターを用いてろ過を行う。そのような孔径のフィルターとしては、１〜５０μｍのものが挙げられる。また、細菌を濃縮する工程においては、細菌の細胞よりも小さい孔径のフィルターを用いてろ過を行う。そのような孔径のフィルターとしては、０．０２５〜１０μｍのものが挙げられ、０．１〜０．５μｍのものが好ましい。また、細菌を濃縮する工程においては、限外ろ過膜を使うこともできる。限外ろ過膜を使用する場合、分画分子量は１０，０００〜５，０００，０００のものを例示することができ、より好ましいのは５００，０００〜１，０００，０００のものである。また、限外ろ過を行う際には、クロスフロー方式で行うことが望ましい。限外ろ過膜の材質としては、リエールテルスルホン、再生セルロース等を例示することができる。
【００３４】
以上のようにして濃縮した試料からは、必要に応じてＳＤＳ等の界面活性剤等で細胞を破壊した後、上記記載の適当な方法で核酸を抽出することができる。
【００３５】
また、試料が土壌である場合にも、当業者に公知の技術によって、核酸を抽出することができる。土壌から核酸を抽出する方法としては、例えば、Ｚｈｏｕらの方法（Ｚｈｏｕ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６２：  ３１６−３２２  （１９９６））やＧｒｉｆｆｉｔｈｓらの方法（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｒ．  Ｉ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６６：  ５４８８−５４９１  （２０００））を挙げることができる。
【００３６】
上記のように抽出した核酸から、「１．ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド」の項に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより、ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片を単離することができる。
【００３７】
（１）ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の増幅
上記のように抽出した核酸を鋳型とし、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行うことにより、ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片を特異的に増幅することができる。通常、配列番号５４記載のアミノ酸配列に基づいて設計された本オリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列番号５５記載のアミノ酸配列に基づいて設計された本オリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用する。なお、核酸増幅反応においてプライマーとして使用する本オリゴヌクレオチドは、縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）であってもよい。
【００３８】
核酸増幅反応を行う手法は、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行うことができる方法であれば特に限定されないが、最も適した方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。
【００３９】
例えば、ＰＣＲ法は、ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４０】
またＲＴ−ＰＣＲ法では、まず、ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを作製し、その後、作製したｃＤＮＡを鋳型として一対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うものである。
【００４１】
本オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた場合において、ハロペルオキシダーゼ遺伝子の特異的な増幅が起こるような条件は、プライマーとして用いた本オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基組成から、当業者であれば適宜設定することができる。
【００４２】
増幅されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片は、アガロースゲル電気泳動等によって分画し、増幅の確認されたバンドを切り出して、ＤＮＡを抽出することによって得ることができる。
【００４３】
（２）ハイブリッド遺伝子の増幅によるハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離
（１）記載の方法で増幅されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片は、本オリゴヌクレオチドとアニーリングする領域に挟まれた領域の配列しか含まない。すなわち、開始コドンを含む５’末端領域及び終始コドンを含む３’末端領域は含まれていない。そのため、（１）記載の方法で増幅されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片では、ハロペルオキシダーゼ遺伝子としての機能を持たない場合がある。この問題を解決し、ハロペルオキシダーゼ遺伝子として機能するＤＮＡ断片を得るためには、（１）記載の方法で増幅されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の両端を既知のハロペルオキシダーゼ遺伝子の配列で補えばよい。
【００４４】
両端部の補充に使用する既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子は、これまでに公知となっている細菌由来のハロペルオキシダーゼ遺伝子であれば、どのようなものでもよいが、配列番号５４及び５５記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることが好ましい。そのようなハロペルオキシダーゼ遺伝子の例としては、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに登録されているアクセッション番号Ｇ８３３０４、ＡＦ３６１４７０、ＡＦ３１４４、Ｆ９８１４３、ＡＦ４１６３３、Ｂ９５９８６、ＡＤ２９８６、ＡＥ００７９０８、ＡＧ３２０７、ＪＮ０８２８、Ａ５５２１１、ＡＬ５９１７９０、ＡＦ０３１１５３、ＡＥ０１２３２４、ＡＥ０１０７６５、ＡＥ０１１８３９、Ｆ９５８４８、ＡＦ２９８２、ＡＦ３３５４９３、ＡＧ３１６７、Ｓ５９９２９、Ｓ２７６１４、Ｈ６９８３８又はＨ９７２３０のハロペルオキシダーゼ遺伝子を挙げることができる。また、配列番号５６記載のアミノ酸配列をコードするシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ１１１７２株由来のハロペルオキシダーゼ遺伝子も挙げられる。
【００４５】
（１）記載の方法で増幅されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の両端部を既知のハロペルオキシダーゼ遺伝子の配列で補うことにより、中央部が未知ハロペルオキシダーゼ遺伝子の塩基配列であり、両末端部が既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子の塩基配列であるハイブリッド遺伝子を作製することができる。このハイブリッドハロペルオキシダーゼ遺伝子は、適当な宿主に導入することにより、ハロペルオキシダーゼを生産することが可能である。
【００４６】
該ハイブリッドハロペルオキシダーゼ遺伝子は、（１）記載の方法でハロペルオキシダーゼ遺伝子断片の増幅を行った後、既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子の５’末端領域（開始コドンから（１）記載の増幅法で使用されたフォワードプライマーとアニーリングする領域まで：以下、５−ａｒｍフラグメントという）と、３’末端領域（（１）記載の増幅法で使用されたリバースプライマーとアニーリングする領域から終始コドンまで：以下、３−ａｒｍフラグメントという）とアニーリングさせた後、伸長反応を行うことによって得ることができる。
【００４７】
ハイブリッドハロペルオキシダーゼ遺伝子を得る場合には、（１）記載の増幅法で使用するプライマーは、「１．ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド」の項で記載したアセンブリー配列を付加されたものであることが望ましい。アッセンブリー配列を付加されたプライマーを使用することにより、増幅されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片と５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメントとのアニーリング効率を高めることができる。
【００４８】
５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメントは、両端部を補う既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行うことにより作製することができる。プライマーの設計及び合成は、当業者に公知の知見に基づいて行うことができる。また、増幅反応の反応条件は、使用するプライマーの長さ及び塩基組成に基づき、当業者に公知の知見により設定することができる。
【００４９】
（１）記載の増幅反応により増幅されたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片と５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメントとのアニーリング反応、及びそれに続く伸長反応によって得られたハイブリッドハロペルオキシダーゼ遺伝子は、引き続き核酸増幅反応を行うことによって増幅することができる。増幅反応のプライマーには、５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメントをそのままプライマーとして用いることもできるが、５−ａｒｍフラグメントの開始コドンを含む領域、及び３−ａｒｍフラグメントの終始コドンを含む領域の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして加えた方が好ましい。プライマーの設計及び合成は、当業者に公知の知見に基づいて行うことができる。また、増幅反応の反応条件は、使用するプライマーの長さ及び塩基組成に基づき、当業者に公知の知見により設定することができる。
【００５０】
増幅されたハイブリッドハロペルオキシダーゼ遺伝子は、アガロースゲル電気泳動法等によって核酸断片を分画し、増幅の確認されたバンドを切り出してＤＮＡを抽出することにより単離することができる。
【００５１】
上記（１）又は（２）の項に記載の方法によって得られたハロペルオキシダーゼ遺伝子断片又はハイブリッド遺伝子が、ハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質、すなわちハロペルオキシダーゼを生産できるかどうかは、得られた核酸断片を含む発現ベクターを適当な宿主に導入し、宿主の培養菌体又は宿主菌体の細胞を破砕した粗抽出液におけるハロペルオキシダーゼ活性の有無を調べることにより確認することができる。発現ベクターの作製、宿主の選択及び宿主への発現ベクターの導入は、当業者に公知の遺伝子工学的手法により行うことができる。
【００５２】
宿主に導入する発現ベクターには、ファージ、ファージミドベクター又はプラスミドベクターを用いることができる。また、宿主は、発現ベクターが機能するものであれば真核細胞でも原核細胞でも特に限定されず、動物細胞、酵母細胞、放線菌、細菌細胞等を使用することができる。細菌細胞の中で好適なものとしては、大腸菌、枯草菌等が挙げられる。また、発現ベクターは、挿入した遺伝子断片又はハイブリッド遺伝子の上流に、プロモーター等の発現調節領域を有している必要がある。そのような発現調節領域の例としては、例えば大腸菌を宿主として使用した場合には、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。
【００５３】
発現ベクターを導入した宿主は、宿主に応じた適当な培地で培養し、得られた菌体又は菌体を破砕した粗抽出液を用いてハロペルオキシダーゼ活性の測定を行えばよい。ハロペルオキシダーゼ活性の測定は、ハロニウムアニオン、過酸化水素、及び適当な基質の存在下において、発現ベクターが発現する条件で宿主細胞を培養するか、発現ベクターを発現させて培養した宿主細胞の粗抽出液を反応させ、基質のハロゲン化が起こるかどうかを調べることにより行うことができる。ハロペルオキシダーゼ活性の測定に使用できる基質は、ハロペルオキシダーゼによるハロゲン化が報告されているものであれば特に限定されないが、例えばフェノールレッド、モノクロロジメドン等を挙げることができる。
【００５４】
上記の方法によって、ハロペルオキシダーゼ活性を有することが確認されたクローンを選択し、クローンの培養菌体からＤＮＡを抽出することにより、ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片又はハロペルオキシダーゼハイブリッド遺伝子を得ることができる。
【００５５】
３．ハロペルオキシダーゼ遺伝子単離用キット
本発明のハロペルオキシダーゼ遺伝子単離用キット（以下、本キットという）は、「２．新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子又はその断片の単離」の「（２）ハイブリッド遺伝子の増幅によるハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離」の項に記載のハイブリッドハロペルオキシダーゼ遺伝子を単離するためのものである。本キットは、少なくとも、「１．ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド」の項に記載のオリゴヌクレオチドと、「２．新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子又はその断片の単離」の「（２）ハイブリッド遺伝子の増幅によるハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離」の項に記載した５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメントを含むことを特徴としている。
【００５６】
（１）一段階目の核酸増幅反応用プライマー
「２．新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子又はその断片の単離」の「（２）ハイブリッド遺伝子の増幅によるハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離」の項に記載したように、ハイブリッドハロペルオキシダーゼ遺伝子を増幅するためには、二段階の核酸増幅反応を行う必要がある。一段階目の核酸増幅用プライマーには、「１．ハロペルオキシダーゼ遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド」の項に記載のオリゴヌクレオチドがフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使われる。具体的には、配列番号５４記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列番号５５記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用する。本キットは、これらのフォワードプライマー及びリバースプライマーを少なくとも一組含むことを特徴としている。これらのフォワードプライマー及びリバースプライマーは縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）であってもよい。
【００５７】
本キットに含まれるプライマーには、「２．新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子又はその断片の単離」の「（２）ハイブリッド遺伝子の増幅によるハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離」の項に記載したアッセンブリー配列が付加されていることが好ましい。アッセンブリー配列の付加された本キットのフォワードプライマーの例としては配列番号４５又は４６記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが挙げられ、リバースプライマーの例としては配列番号４７〜４９記載のいずれかの塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５８】
（２）５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメント
本キットは、「２．新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子又はその断片の単離」の「（２）ハイブリッド遺伝子の増幅によるハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離」の項に記載した５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメントを含むことを特徴としている。５−ａｒｍフラグメントは、既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子において、少なくとも、開始コドンから配列番号５４記載のアミノ酸配列をコードする領域までを含む核酸断片である。また、３−ａｒｍフラグメントは、既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子において、少なくとも、配列番号５５記載のアミノ酸配列をコードする領域から終始コドンまでを含む核酸断片である。なお、「（１）一段階目の核酸増幅反応用プライマー」の項に記載したプライマーが、アッセンブリー配列を付加されているものである場合には、必ずしも配列番号５４又は５５記載のアミノ酸配列をコードする領域を含んでいる必要はない。
【００５９】
５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメントの基となる既知ハロペルオキシダーゼ遺伝子は、細菌由来のものであればどのようなものでも構わないが、配列番号５４及び５５記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることが好ましい。
【００６０】
５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメントは、一本鎖ＤＮＡであってもよいし、二本鎖ＤＮＡであってもよい。
【００６１】
（３）その他の成分
本キットは、核酸増幅反応用のバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（ＤＮＡポリメラーゼ等）等を含んでいてもよい。また、二段階目の核酸増幅反応のために、５−ａｒｍフラグメントの開始コドンを含む領域に基づいて設計されたフォワードプライマーと、３−ａｒｍフラグメントの終始コドンを含む領域に基づいて設計されたリバースプライマーを含んでいてもよい。
【００６２】
４．新規ハイブリッドハロペルオキシダーゼ遺伝子
本発明の新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子（以下、本ハロペルオキシダーゼ遺伝子）は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００６３】
（ａ）のタンパク質は、「２．新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子又はその断片の単離」の「（２）ハイブリッド遺伝子の増幅によるハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離」の項に記載された方法により、海水から抽出したＤＮＡから単離されたハイブリッドハロペルオキシダーゼ遺伝子が生産するタンパク質である。（ａ）のタンパク質をコードする遺伝子の具体的な例としては、配列番号２３〜４４のいずれかの塩基配列で表される遺伝子が挙げられる。
【００６４】
（ｂ）のタンパク質は、（ａ）のタンパク質に、ハロペルオキシダーゼ活性を失わせない程度のアミノ酸変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０，  ６４８７−６５００，  １９８２）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、ハロペルオキシダーゼ活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは１０アミノ酸以内であり、更に好ましくは５アミノ酸以内である。
【００６５】
なお、本ハロペルオキシダーゼ遺伝子は、「２．新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子又はその断片の単離」の「（２）ハイブリッド遺伝子の増幅によるハロペルオキシダーゼ遺伝子の単離」の項に記載された方法において、両末端を補う既知遺伝子として、配列番号５６記載の塩基配列で表されるシュードモナス・プチダＡＴＣＣ１１１７２のハロペルオキシダーゼ遺伝子を使用している。
【００６６】
本ハロペルオキシダーゼ遺伝子は、以下に述べる方法によって得ることができる。まず、海水抽出ＤＮＡに由来する中央部の配列を公知のＤＮＡ合成法によって合成する。次に、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１１１７２株から抽出したＤＮＡを鋳型として、配列番号４６及び５０記載の塩基配列で表されるプライマーのセット、又は配列番号４９及び５１記載の塩基配列で表されるプライマーのセットを用いて核酸増幅反応を行い、５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメントを増幅する。次に、合成した中央部の配列と５−ａｒｍフラグメント及び３−ａｒｍフラグメントをアニーリングさせて伸長反応を行う。その後、配列番号５０及び５１記載の塩基配列で表されるプライマーのセットを用いて核酸増幅反応を行うことにより、本ハロペルオキシダーゼ遺伝子を増幅することができる。増幅された本ハロペルオキシダーゼ遺伝子は、アガロースゲル電気泳動法等によって分画し、１ｋｂ付近に分画されたバンドを切り出すことにより得ることができる。
【００６７】
上記のような方法によって得られたＤＮＡ断片は、チェーンターミネーター法やマキサム−ギルバート法等の公知の方法に従って塩基配列を決定することにより、本ハロペルオキシダーゼ遺伝子であることを確認することができる。
【００６８】
５．新規ハロペルオキシダーゼ
本発明の新規ハロペルオキシダーゼ（以下、本ハロペルオキシダーゼという）は、以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるタンパク質である。
（ａ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１〜２２のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００６９】
本ハロペルオキシダーゼは、「４．新規ハイブリッドハロペルオキシダーゼ遺伝子」の項で記載した本ハロペルオキシダーゼ遺伝子を含む発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、培地で培養することによって得ることができる。発現ベクターの作成及び宿主細胞への導入は、既に述べた通り、公知の方法に従って行うことができる。
【００７０】
かくして得られる本ハロペルオキシダーゼは、宿主の培養菌体を破砕した後、通常の方法に従って、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲルパーミネーションクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の蛋白質精製、蛋白質製造の分野で汎用されている方法に従って精製を行うことができる。これらのクロマトグラフィーにおける本ハロペルオキシダーゼ画分の選択は、ハロペルオキシダーゼ活性の有無を目安に行うことができる。
【００７１】
６．ハロペルオキシダーゼによるハロゲン化化合物又は酸化化合物の生産
本ハロペルオキシダーゼは、触媒として使用することにより、ハロゲン化化合物や酸化化合物を生産することが可能である（以下、本生産法という）。ハロゲン化化合物や酸化化合物の生産方法としては、本ハロペルオキシダーゼ遺伝子を含む発現ベクターを導入した宿主細胞によって生産する方法と精製したハロペルオキシダーゼによって生産する方法が挙げられる。
【００７２】
本生産法の基質となる化合物は、既知のハロペルオキシダーゼの基質として知られているいずれの化合物でもよい。本生産法によれば、例えば、アルケンからエポキシドを、アルキンからハロゲン化ケトンを、シクロプロパンからハロヒドリンを、さらに、アルケン及びアルキンからジハロゲン化生成物を生産することができる。さらに、本ハロペルオキシダーゼは、その酸化能力を利用し、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼの代替とすることも可能である。
【００７３】
本ハロペルオキシダーゼを発現させた宿主を用いて、本生産法を行う場合には、本ハロペルオキシダーゼを発現させた宿主を、ハロニウムアニオンの存在下において、適当な基質とともに培養すればよい。
【００７４】
また、本ハロペルオキシダーゼをファージ表面又は細胞表層に発現させることにより、ファージディスプレイや細胞ディスプレイ等のディスプレイ系で基質と反応させることもできる。ファージディスプレイ系では、ファージの表面タンパク質をコードする遺伝子と本ハロペルオキシダーゼ遺伝子を連結し、ファージの表面タンパク質と本ハロペルオキシダーゼとが融合タンパク質となるように、ファージに導入すればよい。ファージディスプレイに使用するファージは、本ハロペルオキシダーゼをディスプレイできるファージであればよく、Ｍ１３ファージ等を例示することができる。細胞ディスプレイ系では、細胞表層に発現し得るタンパク質をコードする遺伝子と本ハロペルオキシダーゼ遺伝子を連結し、細胞表層に発現し得るタンパク質と本ハロペルオキシダーゼとが融合タンパク質として発現するよう宿主細胞に導入すればよい。細胞表層に発現し得るタンパク質としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＰｒｏｔｅｉｎＡ、バチルス属細菌のＳ−ｌａｙｅｒ、ＣｏｔＢ、大腸菌の細胞壁結合蛋白質、酵母の接着蛋白質であるα−アグルチニン（ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、細菌べん毛等を例示することができる。また、細胞ディスプレイ系に使用可能な宿主としては、大腸菌、黄色ブドウ球菌、酵母等を例示することができる。
【００７５】
本ハロペルオキシダーゼをディスプレイしたファージ又は細胞は、適当な担体に固定化し、基質と接触させることにより、本生産法を行うことができる。また、本ハロペルオキシダーゼディスプレイ細胞を本生産法において基質とともに培養することにより、細胞外にハロゲン化化合物や酸化化合物を蓄積させることができる。
【００７６】
精製した本ハロペルオキシダーゼを用いて、本生産法を行う場合には、過酸化水素存在下において（あるいは、過酸化水素及びハロニウムアニオンの存在下において）、本ハロペルオキシダーゼを有機化合物に作用させればよい。反応温度は、ハロゲン化反応や酸化反応が起こり得る温度であれば特に限定されないが、１０〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは２０〜４０℃であり、最も好ましくは３０〜４０℃である。また、反応時のｐＨは、ハロゲン化反応や酸化反応が起こり得るｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨ３〜９が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜８であり、最も好ましくはｐＨ５〜７である。
【００７７】
また、精製酵素を使用した場合の本生産法は、溶液中にて行うことができるほか、精製した本ハロペルオキシダーゼを適当な担体に固定化し、基質と接触させることによっても行うことができる。本ハロペルオキシダーゼを固定化できる担体は、特に限定されないが、例えば、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、セルロース、キトサン、セファロース、デキストラン、ポリピニルアルコール、エチレン・酢酸ビニル共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる複合担体等が挙げられる。また、担体表面には、ハロペルオキシダーゼの固定化反応に用い得る官能基が存在することが好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、アミド基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基等が挙げられる。
【００７８】
上記担体へのハロペルオキシダーゼの固定化においては、蛋白質の立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させ、さらには非特異的吸着を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換した適当な有機分子を用いることができる。
【００７９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８０】
〔実施例１〕  海洋性細菌からのＤＮＡの調製
海水は釜石湾（岩手県）から採取した。採取した海水（２０  Ｌ）はフィルターろ過（ＧＶ  ｔｙｐｅ：  １μｍ，  ４７  ｍｍ、ミリポア社製）後（夾雑物・微細藻類等を取り除く）、ろ液を再度ろ過（ＧＶ  ｔｙｐｅ：  ０．２２μｍ，  ４７  ｍｍ、ミリポア社製）することにより海水中の細菌を選択的に濃縮した。このフィルター１枚あたりに、５  ｍｌの１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液（ｐＨ８．０：  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．３５  Ｍ  スクロース）および１０  ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液  ｐＨ８．０溶解）２００μｌを加え、３７℃で３０分間インキュベート（温和に混和）した。インキュベート後、激しく攪拌し細菌を懸濁させた。沈殿を除いた後に、ｌｙｓｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液  ，  ｐＨ８．０：  ０．３  Ｍ  ＮａＣｌ，  ２０  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２％  ドデシル硫酸ナトリウム）  ７．５  ｍｌを加え激しく攪拌した。さらに１０  ｍｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（＝  ５０  ：  ４９：  １）を加えた。５分後、遠心分離（３，０００  ｒｐｍ，  １５  分）操作を行い、上層（ＤＮＡ溶解層）を回収した。これを３回繰り返しＤＮＡ溶液を調製した。次いで、２倍量の９９％  エタノールを添加・攪拌後、冷却（−８０℃，  ２．０  時間）した。遠心分離操作（１５，０００  ｒｐｍ，  １５  分）によりＤＮＡを沈殿させ、冷却７０％  エタノールを加え、さらに遠心分離操作（１５，０００  ｒｐｍ，  １５  分）を行い精製した。エタノールを取り除いた後、乾燥ＤＮＡ（６０℃，  ３０分）をＴＥ緩衝液に溶解させた（１８  時間、室温）。２０  ｌの海水に生息する微生物由来と考えられるゲノムＤＮＡから約１００  μｇのＤＮＡが得られた。
【００８１】
〔実施例２〕  ＰＣＲプライマーの設計
プライマーは報告されている各種ハロペルオキシダーゼ（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、アクセション番号Ｇ８３３０４、ＡＦ３６１４７０、ＡＦ３１４４、Ｆ９８１４３、ＡＦ４１６３３、Ｂ９５９８６、ＡＤ２９８６、ＡＥ００７９０８、ＡＧ３２０７、ＪＮ０８２８、Ａ５５２１１、ＡＬ５９１７９０、ＡＦ０３１１５３、ＡＥ０１２３２４、ＡＥ０１０７６５、ＡＥ０１１８３９、Ｆ９５８４８、ＡＦ２９８２、ＡＦ３３５４９３、ＡＧ３１６７、Ｓ５９９２９、Ｓ２７６１４、Ｈ６９８３８、Ｈ９７２３０）のアミノ酸配列をアライメント後、それらから予測される保存領域アミノ酸配列  （ＦＨＨＧＷＰ、ＤＤＱＩＶＰ）に基づいて、合計５種類のプライマーを設計した。設計プライマーは、保存アミノ酸配列ＦＨＨＧＷＰ側（配列番号５４）として５’−ＧＡＴＧＣＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＣＡＣＴＴＹＣＡＹＣＡＴＧＧＢＴＧＧＣＣ−３’（配列番号４５）と５’−ＧＡＴＧＣＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＣＡＣＴＴＹＣＡＹＣＡＴＧＧＢＴＧＧＣＣ−３’（配列番号４６）、保存アミノ酸配列ＤＤＱＩＶＰ側（配列番号５５）として５’−ＣＡＣＣＣＣＧＧＡＧＴＴＴＴＣＡＴＡＮＧＧＮＡＣＤＡＴＹＴＧＲＴＣＲＴＣ−３’（配列番号４７）、５’−ＣＡＣＣＣＣＧＧＡＧＴＴＴＴＣＡＴＡＳＧＧＮＡＣＤＡＴＹＴＧＲＴＣＲＴＣ−３’（配列番号４８）と５’−ＣＡＣＣＣＣＧＧＡＧＴＴＴＴＣＡＴＡＳＧＧＳＡＣＤＡＴＹＴＧＲＴＣＲＴＣ−３’（配列番号４９）である。プライマー配列中ＹはＣまたはＴ、ＢはＴ、ＧまたはＣ、ＲはＡまたはＧ、ＳはＣまたはＧ、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣである。
【００８２】
〔実施例３〕  ハロペルオキシダーゼ遺伝子の増幅
実施例１で調製したＤＮＡを鋳型とし、実施例２で設計したプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅反応を行った。プライマーの組み合わせは、配列番号４５のプライマーに対して配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９、配列番号４６に対して配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９である。反応液はＤＮＡポリメラーゼＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０  ｕｎｉｔ、添付ポリメラーゼ用緩衝液５μｌ、２５  ｍＭ  ＭｇＳＯ４を４μｌ、２  ｍＭ  ｄＮＴＰを５μｌ、１０    ｐｍｏｌ／μｌのフォワード側プライマーを４μｌ、１０  ｐｍｏｌ／μｌのリバース側プライマーを４  μｌ、海水調製ＤＮＡを１００  ｎｇ添加し、最後に水で調製し合計５０μｌとした。反応は９４℃、４  分の熱変性後、９４℃で３０秒、５０℃で２０秒、６０℃で２分を１サイクルとし、これを３９サイクル行い、最後に６８℃で１０  分間反応させた。増幅の確認は２％のアガロース電気泳動で行った。想定される長さ（約０．６１  Ｋｂ）のＤＮＡをアガロースゲルから切出し、精製（Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｇ、Ｑｉａｇｅｎ社製）した。
【００８３】
〔実施例４〕  ハイブリッド遺伝子の作製
シュードモナス・プチダ  ＡＴＣＣ１１１７２からクローニングしたハロペルオキシダーゼ遺伝子（配列番号５６）から、開始コドンを含み、保存領域（アミノ酸配列ＦＨＨＧＷＰ）をコードする部位までのＤＮＡフラグメント（以下「５−ａｒｍ」とする）と、第２の保存領域（アミノ酸配列ＤＤＱＩＶＰ）をコードする部位から終始コドンまでのＤＮＡフラグメント（以下「３−ａｒｍ」）をＰＣＲによって増幅した。５−ａｒｍフラグメントについては、次の通りＰＣＲを行った。反応液はＤＮＡポリメラーゼＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０  ｕｎｉｔ、添付ポリメラーゼ用緩衝液５μｌ、２５  ｍＭ  ＭｇＳＯ４を２  μｌ、２  ｍＭ  ｄＮＴＰを５μｌ、１０    ｐｍｏｌ／μｌの配列番号５０のプライマー（５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ−３’）を４μｌ、１０  ｐｍｏｌ／μｌの配列番号４６のプライマーを４  μｌ、ｐＨＰＯ１１１７２  プラスミドベクター（シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１１１７２のハロペルオキシダーゼ遺伝子をｐＵＣ１１９クローニングベクターに挿入して作製されたプラスミドベクター）を２０  ｎｇ添加し、最後に水で調製し合計５０μｌとした。反応は９４℃、４  分の熱変性後、９４℃で１５秒、５２℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとし、これを２５サイクル行い、最後に６８℃で１０  分間反応させた。３−ａｒｍフラグメントについては、上記配列番号５０と４６の代わりに、配列番号４９のプライマーと配列番号５１のプライマー（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）を用いた。増幅の確認は２％のアガロース電気泳動で行った。想定される長さ（５−ａｒｍ：約０．１５  Ｋｂ、３−ａｒｍ：  ０．２  ｋｂ）のＤＮＡをアガロースゲルから切出・精製（Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｇ、Ｑｉａｇｅｎ社製）した。
【００８４】
次いで、実施例３で得られた海水から調製したＤＮＡを基にしたＰＣＲ産物（以下「セントラルセグメント」とする）及び５−ａｒｍと３−ａｒｍフラグメントからＰＣＲによってハイブリッド遺伝子を作製した。反応液は、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０  ｕｎｉｔ、添付ポリメラーゼ用緩衝液５μｌ、２５  ｍＭ  ＭｇＳＯ４を４  μｌ、２  ｍＭ  ｄＮＴＰを５μｌ、１００    ｐｍｏｌ／μｌの配列番号５０のプライマーを１μｌ、１００  ｐｍｏｌ／μｌの配列番号５１のプライマーを１  μｌ、セントラルセグメントを２０  ｎｇ、５−ａｒｍ  フラグメントを５  ｎｇ、３−ａｒｍフラグメントを５  ｎｇ添加し、最後に水で調製し合計５０μｌとした。反応は９４℃、４  分の熱変性後、９４℃で１５秒、５２℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとし、これを２５サイクル行い、最後に６８℃で１０  分間反応させた。増幅の確認は２％のアガロース電気泳動で行った。想定される長さ（１．０  ｋｂ）のＤＮＡをアガロースゲルから切出し、精製（Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｇ、Ｑｉａｇｅｎ社製）した。
【００８５】
〔実施例５〕  ハイブリッド遺伝子の発現
実施例４で得られたハイブリッド遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩ  およびＨｉｎｄＩＩＩで処理した。次いで、同様にプラスミドベクターｐＨＰＯ１１１７２も制限酵素ＢａｍＨＩ  およびＨｉｎｄＩＩＩで処理した。これらをライゲーション（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）後、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造社製）に形質転換した。形質転換された大腸菌ＪＭ１０９のコロニーをランダムに３００個選抜し、１００  μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製）を含むＬＢ培地（１％  トリプロトン、０．５％  イーストイクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ）２．０  ｍｌにそれぞれ接種・培養した（３０℃）。対数増殖期に達したところで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．２  ｍＭとなるように添加し、引き続き培養した（３０℃、１６時間）。培養終了後、遠心分離操作（１０，０００×ｇ、１５  分）により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）により粗抽出液（各１００  μｌ）を調製した。
【００８６】
〔実施例６〕ハロペルオキシダーゼ活性によるスクリーニング
０．０５  ｍｍｏｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、１  μｍｏｌの過酸化水素、２  μｍｏｌの臭化カリウム、１００  ｎｍｏｌのフェノールレッドからなる反応液０．１  ｍｌに、実施例５で調製した酵素粗抽出液をそれぞれ２  μｌ加え、３７℃で反応させた。６００の大腸菌クローンの粗抽出液のうち１１３クローンにハロペルオキシダーゼ活性によるブロモフェノールブルー（フェノールレッドのブロモ化）の青紫色を確認することができた。ブロモフェノールブルーの生成を、５９５  ｎｍの吸光度で確認した結果の一部を図１に示す。図１に示す通り有意なブロモフェノールブルーの生成を確認することができた。
【００８７】
〔実施例７〕  ＤＮＡ配列の解析
実施例６で陽性を示した大腸菌クローンからプラスミドを定法により調製（Ｑｉａｇｅｎ）し、ＤＮＡ塩基配列を決定した。塩基配列は、配列番号５２のプライマー（５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ−３’）と配列番号５３のプライマ−（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）を使用し、テェーンターミネーター法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｉｔｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  アプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動シークエンサー  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。同一な配列を除いたハイブリッド遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１から２２、塩基配列を配列番号２３から４４に示す。
【００８８】
〔実施例８〕
実施例７で決定したハイブリッド化ハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列中の保存領域間（配列番号５４から５５）のアミノ酸配列と、既知のハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列中の保存領域間のアミノ酸配列を比較した。配列比較はアライメントソフトＣｌｕｓｔａｌ＿Ｗ（ｗｅｂサイト、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ）を用いて行った。既知のハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列は米国ＮＣＢＩ（ｗｅｂサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢｌａｓｔ検索を行うことにより得た。配列比較の結果を図２に示す。図２の通り配列番号１から２２のアミノ酸配列中の保存領域間のアミノ酸配列は、既知のハロペルオキシダーゼ（単離細菌名を表示）のアミノ酸配列中の保存領域間のアミノ酸配列と異なる新規なものであることが示された。
【００８９】
【発明の効果】
本発明により、環境サンプル等の雑多な微生物由来の核酸を含むサンプルから、新規ハロペルオキシダーゼ遺伝子を効率的に単離する方法が提供される。本発明の方法によって提供されるハロペルオキシダーゼ遺伝子から生産されるハロペルオキシダーゼは、様々なハロゲン化有機物の生産に利用することができる。
【００９０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌形質転換細胞から調製した各粗抽出液のハロペルオキシダーゼ活性を示す図である。
【図２】配列番号１から２２の保存アミノ酸配列間の配列と既知のハロペルオキシダーゼアミノ酸配列の保存領域間の配列の系統樹を示す図である。
【図１】
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【図２】
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