(57)【要約】【課題】パルス又はインパルスによって細胞へ刺激を与え、時として細胞の細胞膜に一過性の破断を伴うような刺激を与え、この刺激によって細胞を分化誘導することができる細胞分化誘導法を提供する。【解決手段】細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し電気パルス又はインパルスを印加する。電圧は０．０１〜５０ｋＶ、印加時間は０．５〜５００ｍＳｅｃ程度が好適である。電極間距離は０．１〜１５０ｍｍが好ましい。環境温度は０〜５０℃が好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し電気パルス又はインパルスを印加することを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項２】
請求項１において、パルス又はインパルスを所定周期で繰り返し印加することを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項３】
請求項１又は２において、温度０℃〜５０℃の環境下で前記パルス又はインパルスを印加する細胞分化誘導方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記パルス又はインパルスを印加するための電極間距離が０．１〜１５０ｍｍであることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、振幅が０．０１ｋＶ〜５０ｋＶ、印加時間が０．５ｍＳｅｃ〜５００ｍＳｅｃであるパルスを印加することを特徴とする細胞分化誘導方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、パルスの波形が指数関数、矩形波、三角波、台形波、のこぎり波、正弦波、又はこれらの複合波であることを特徴とする細胞分化誘導方法。
【請求項７】
請求項１において、インパルスの波形がデルタ関数であることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、細胞が幹細胞であることを特徴とする細胞分化誘導方法。
【請求項９】
請求項８において、幹細胞が胚性幹細胞であることを特徴とする細胞分化誘導方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、細胞の培養工程において前記パルス又はインパルスの印加を行うことを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法による病変血管の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、原核細胞や動物細胞の分化誘導方法及び該方法を利用した病変血管の治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の分化は細胞分裂と異なり、いくつかの細胞へ変化する可能性があり、特に幹細胞のような多分化能を有する細胞の場合には多種多様な細胞へ分化することが可能である。組織工学においては、培養した細胞又は培養している細胞を目的とする細胞へ分化誘導する必要があり、従って、細胞を選択的に分化誘導することは重要な技術である。
【０００３】
従来、細胞培養時に適当な薬剤による刺激を行うことによって、選択的に目的の細胞へ分化誘導している。これら薬剤としては、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、インスリン様増殖因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、アンジオポイエチン、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、形質転換増殖因子β、アクチビン、骨形質タンパク、繊維芽細胞増殖因子、腫瘍増殖因子βなどのサイトカインがあり、主として細胞の培養系へ添加することで増殖と分化を同時に行う手法で行われている（例えば、特開２０００−２８７６８０）。
【０００４】
【特許文献１】
特開２０００−２８７６８０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら薬剤には特定の細胞にしか効果がないものも多く、必ずしも目的とする細胞へ分化誘導することができるわけではなかった。また、単層培養、浸盪培養、浮遊培養など各細胞が培養液にほぼ均等に浸漬されている培養系であれば、均質性が良好であるものの三次元構造のスキャホールド材へ接着した細胞を分化誘導する場合、スキャホールド材の内部に生着した細胞まで刺激剤が浸透拡散しにくく、未分化の細胞が残る可能性があった。
【０００６】
胚性幹細胞は近年注目される再生医学、再生医療に利用できる可能性が大きい細胞であるが、未分化の状態で生体内へ移植された場合、腫瘍細胞となる危険性があることは公知の事実である。従って、再生医療において胚性幹細胞を未分化のものを残すことなく分化させること、特に、スキャホールド材へ生着させた細胞を均質に分化誘導する技術の確立は大きな課題である。
【０００７】
本発明は、かかる課題を達成することができる細胞分化誘導法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し電気パルス又はインパルスを印加することを特徴とするものである。
【０００９】
パルス又はインパルスによって細胞へ刺激を与え、時として細胞の細胞膜に一過性の破断を伴うような刺激を与えることができる。この刺激によって細胞を分化誘導することができる。
【００１０】
本発明によれば、均質な薬剤刺激が行いにくい三次元のスキャホールド材へ接着したＥＳ細胞の分化誘導も可能である。また、本発明によれば、生体内組織内の細胞を分化誘導、形質転換することで種々の疾病の治療を行うことも可能である。例えば、冠状動脈の動脈硬化部位において、冠状動脈まで誘導したカテーテルに装着した電極から電気的刺激を印加することで硬化部位の血管平滑筋細胞を合成型から収縮型へと形質転換させて狭窄を防止するなど病変血管の予防的な治療を行うこともできる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の細胞分化誘導法は、細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し電気パルス又はインパルスを印加することを特徴とするものであり、好ましくは温度０〜５０℃の環境下でパルス又はインパルスを印加する。
【００１２】
パルス又はインパルスは１回のみ印加してもよいが、細胞種によっては一定周期で繰り返し印加することがより有効である場合もある。
【００１３】
パルスの振幅すなわち電圧としては０．０１ｋＶ〜５０ｋＶ、印加時間としては０．５ｍＳｅｃ〜５００ｍＳｅｃの範囲が好ましいが、これらは分化させる細胞の種類、すなわち細胞サイズ、細胞膜の構成及び分化させたい目的細胞の種類並びに電極間距離、培養液の組成、スキャホールド材の孔径や密度及び細胞間マトリックスの種類などによって適宜調整する。例えば、電極間距離が１０ｍｍの場合、原核細胞などでは１〜５０ｋＶ、動物細胞においては０．１ｋＶ〜１０ｋＶ程度の振幅が好適に使用できる。印加時間は、原核細胞などでは１〜５０ｍＳｅｃ、動物細胞においては１〜１００ｍＳｅｃ程度が好適である。
【００１４】
電極間距離は０．１〜１５０ｍｍ特に１〜１０ｍｍが好ましいが、細胞の存在する系の容積、培養液の組成、電極面積、電極抵抗によって適宜調整することができる。また、病変血管の予防又は治療に使用する場合には、部位の大きさに合わせて電極間距離を調整する。
【００１５】
パルスの波形としては、指数減衰、矩形波、三角波、台形波、のこぎり波、正弦波、およびそれらの複合波などが使用可能である。インパルスの波形としてはデルタ関数が挙げられる。パルスとインパルスとの複合波としてもよい。
【００１６】
細胞を培養液中で分化誘導するインビトロの場合、培地としてはＤａｉｇｏ’Ｔ培地，Ｈａｎｋ’ＢＳＳ培地，Ｈａｍ’Ｆ１０培地，Ｈａｍ’Ｆ１２培地，ＢＩＯＳ１０培地他、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができ、この培地に細胞を１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度播き、電極としてはプラチナ又はカーボン製のものを用いるのが好ましい。
【００１７】
インビボの場合、送電はカテーテル等を用いて経皮的に患部まで誘導する；ステントなどに送電線を組み込み電極としても利用する；または、体外からの電磁誘導などにより非侵襲的に誘導する方法が可能である。
【００１８】
本発明の分化誘導方法は、あらゆる細胞に適用できるが、増殖型・非増殖型など形質転換する血管平滑筋細胞などや、未分化細胞、好ましくは多分化能のある幹細胞、特に胚性幹細胞に好適である。
【００１９】
本発明は、電気刺激によって細胞を分化誘導又は形質転換することで疾病部位を治療する病変血管の治療方法でもある。
【００２０】
すなわち、血管内カテーテルに電極を２ヵ所以上設置することでインビトロのみならずインビボでも細胞分化、形質転換を制御することができる。
例えば、ＰＴＣＡ療法を経験した症例において、血管拡張、ステント留置の際、さらに留置後しばらく電気刺激を印加することで、血管平滑筋細胞を増殖型から収縮型へ形質転換させ再狭窄を防止することができるのである。
【００２１】
【実施例】
次に、インビトロの細胞分化誘導の実施例について説明する。
【００２２】
まず、培地温度によって形質転換されることが確認されている株化平滑筋細胞を、培地温度３３℃と３９℃の２条件で培養した。培養後、平滑筋細胞に特異的タンパク質である平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１、カルポニンの発現をノーザンブロット法及びウエスタンブロット法で確認すると、３３℃培養系では形質マーカーの発現が低く、増殖能は高かった。一方、３９℃培養地ではｍＲＮＡ、タンパク質レベルはいずれも３３℃培養系よりも１０倍程度の高値を示し、かつ増殖能は低下していた。
【００２３】
続いて、先に３３℃で培養した株化平滑筋細胞を、電極間距離０．４ｃｍにおいて電場強度０．５〜１．０ｋＶ／ｃｍ、タイムコンスタント１５〜３０ｍｓｅｃの指数関数インパルスと矩形波の複合波を印加した直後にミオシン重鎖ＳＭ１、カルポニンの発現をノーザンブロット法及びウエスタンブロット法で確認するとｍＲＮＡ、タンパク質レベルのいずれも上昇していることが確認された。
【００２４】
以上より、本発明の細胞分化誘導方法によって、平滑筋細胞が合成型から収縮型へ形質転換されていることが示唆された。
【００２５】
また、このインビボにおいても、合成型の平滑筋細胞が占有する動脈硬化部位において血管内カテーテルに装着した電極による電気インパルス又はインパルス印加によって、筋フィラメントの多い収縮型の平滑筋細胞へ形質転換できる可能性が示唆され、低侵襲型の病変血管の治療方となり得ることが示唆された。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によると、パルス又はインパルスによって細胞へ刺激を与え、時として細胞の細胞膜に一過性の破断を伴うような刺激を与え、この刺激によって細胞を分化誘導することができる。本発明によれば、電気刺激によって細胞を分化誘導又は形質転換することで疾病部位を治療することもできる。